(57)【要約】【課題】骨形成タンパク質複合体の新規投与形態を提供する。【解決手段】本発明は、少なくとも１種の不溶性カルシウム塩及び骨形成タンパク質と多糖類との少なくとも１種の複合体を含有する共沈物から成る骨形成組成物であって、前記共沈物は分割形態にある、骨形成組成物に関する。本発明はまた、本発明を実施するためのキットにも関する。本発明はまた、少なくとも１種の不溶性カルシウム塩及び骨形成タンパク質と多糖類との少なくとも１種の複合体を含有する、分割した形の共沈物の製造方法にも関する。本発明はまた、前記共沈物を含有する製剤、医薬品及び医療用具にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
不溶化形態にある骨形成タンパク質とアニオン性多糖類との少なくとも１種の複合体、及び少なくとも１種の不溶性カルシウム塩から成る共沈物であって、前記共沈物は分割形態にある、共沈物。
【請求項２】
前記不溶性カルシウム塩は、単独で又は混合物として無水形態又は水和形態にあるオルトリン酸カルシウムから成る群より選択される、請求項１に記載の共沈物。
【請求項３】
シュウ酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、炭酸カルシウム及び硫酸カルシウムから成る群より選択される少なくとも１種の不溶性カルシウム塩を含有する、請求項１又は２に記載の共沈物。
【請求項４】
前記不溶性カルシウム塩は、カルシウムカチオンイオンと、１、２又は３塩基性リン酸、カルボン酸多糖類、炭酸、水酸化物及び塩基により生じ得るアニオンのようなアニオンイオンとの間に形成される混合塩から成る群より選択される、請求項１に記載の共沈物。
【請求項５】
化学的吸引力及び血管形成力を有する少なくとも１種の成長因子をも含有する、請求項１ないし４のうちいずれか１項に記載の共沈物。
【請求項６】
前記アニオン性多糖類は、疎水性誘導体によって官能化された多糖類から成る群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし５のうちいずれか１項に記載の共沈物。
【請求項７】
前記アニオン性多糖類は、一般式ＩＸ：
2012509303.tif 000017
（式中、
ｑは、Ｆ−Ｒ−Ｇ−Ａｈにより置換された多糖類のカルボキシル官能基のモル分率を表すものであって、０．０１ないし０．７であり、
Ｆ’は、アミド官能基を表し、
Ｇは、エステル、チオエステル、カーボネート又はカルバメート官能基を表し、
Ｒは、枝分れ状であっても、及び／又は不飽和であっても、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有していてもよく、そして少なくとも１つの酸官能基−ＣＯ２Ｈを有する１ないし１８個の炭素原子を含有する鎖を表し、
Ａｈは、疎水性アルコールのヒドロキシル官能基と、Ｒ基により保有される少なくとも１つの求電子性官能基との間のカップリングから生じる、疎水性アルコールの残基を表し、
多糖類のカルボキシル官能基がＦ’−Ｒ−Ｇ−Ａｈにより置換されていない場合、多糖類のカルボキシル官能基（群）は、カルボン酸カチオン、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンのカルボキシレートを表し、
前記カルボキシル官能基を含有する多糖類は、中性ｐＨにて両親媒性である。）
で表される、疎水性アルコールによって部分的に置換されたカルボキシル官能基を含有する多糖類から成る群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし６のうちいずれか１項に記載の共沈物。
【請求項８】
前記カルボキシル官能基を含有する多糖類は、一般式Ｘ：
2012509303.tif 000018
［式中、
天然多糖類は、大部分が（１，６）型及び／又は（１，４）型及び／又は（１，３）型及び／又は（１，２）型のグリコシド結合から成る多糖類群より選択され、
Ｌは、リンカーＱと、前記多糖類の−ＯＨ官能基との間のカップリング由来のものであって、エステル官能基、チオエステル官能基、カーボネート官能基、カルバメート官能基又はエーテル官能基であり、
ｒは、前記多糖類の糖単位当りのＬ−Ｑ置換基のモル分率を表し、
Ｑは、枝分れ状であっても、及び／又は不飽和であっても、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有していてもよく、そして少なくとも１つのカルボキシル官能基−ＣＯ２Ｈを有する１ないし１８個の炭素原子を含有する鎖を表す］
で表される、１００の糖単位当り少なくとも１５のカルボキシル官能基がグラフトされた、カルボキシル官能基を天然に含有する多糖類から得られるか、又は中性多糖類から得られる合成多糖類であることを特徴とする、請求項１ないし７のうちいずれか１項に記載の共沈物。
【請求項９】
前記アニオン性多糖類は、
下記の一般式Ｉ：
2012509303.tif 000019
［式中、
多糖類は、大部分が（１，４）及び／又は（１，３）及び／又は（１，２）型のグリコシド結合からなり、
Ｆは、リンカーアームＲと、中性又はアニオン性多糖類の−ＯＨ官能基との間のカップリング由来のものであって、エステル官能基、チオエステル官能基、アミド官能基、カーボネート官能基、カルバメート官能基、エーテル官能基、チオエーテル官能基又はアミン官能基のいずれかを表し、
Ｒは、枝分れ状であっても、及び／又は不飽和であっても、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有していてもよく、そして少なくとも１つの酸官能基−ＣＯ２Ｈを有する１ないし１８個の炭素原子を含有する鎖を表し、
Ｔｒｐは、トリプトファン誘導体のアミンと、Ｒ基により保有される少なくとも１つの酸及び／又はアニオン性多糖類により保有される少なくとも１つの酸との間のカップリングから生じるＬ−又はＤ−トリプトファン誘導体の残基を表し、
ｎは、Ｔｒｐにより置換された基Ｒのモル分率であって、０．０５ないし０．７であり、
ｏは、Ｔｒｐにより置換された多糖類の酸官能基のモル分率であって、０．０５ないし０．７であり、
ｉは、糖単位当りの基Ｒにより保有される酸官能基のモル分率であって、０ないし２であり、
ｊは、糖単位当りのアニオン性多糖類により保有される酸官能基のモル分率であって、０ないし１であり、
（ｉ＋ｊ）は、糖単位当りの酸官能基のモル分率であって、０．１ないし２であり、
ＲがＴｒｐにより置換されていない場合、基Ｒの酸（群）は、カルボン酸カチオンであって、前記カチオンは、好ましくはＮａ又はＫのようなアルカリ金属のカチオンであり、
前記多糖類がアニオン性多糖類である場合、多糖類の１つ以上の酸官能基（群）がＴｒｐにより置換されておらず、その場合にそれらはカチオンにより塩化されており、前記カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンであり、
前記多糖類は、中性ｐＨにて両親媒性である。］
に対応する少なくとも１種のトリプトファン誘導体により官能化された、大部分が（１，４）、（１，３）及び／又は（１，２）型のグリコシド結合を含有するアニオン性多糖類からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし６のうちいずれか１項に記載の共沈物。
【請求項１０】
前記アニオン性多糖類は、下記の一般式ＩＩＩ
2012509303.tif 000020
（式中、
Ｒは、枝分れ状であっても、及び／又は不飽和であっても、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有していてもよく、そして少なくとも１つの酸官能基−ＣＯ２Ｈを有する１ないし１８個の炭素原子を含有する鎖を表し、
Ｆは、リンカーＲと、中性の又はアニオン性の多糖類の−ＯＨ官能基との間のカップリング由来のものであって、エステル官能基、チオエステル官能基、アミド官能基、カーボネート官能基、カルバメート官能基、エーテル官能基、チオエーテル官能基又はアミン官能基のいずれかを表し、
ＡＡは、アミノ酸のアミンと、基Ｒにより保有される酸との間のカップリングから生じる疎水性のＬ−又はＤ−アミノ酸残基を表し、前記疎水性のアミノ酸は、トリプトファン、トリプトファノール、トリプトファンアミド及び２−インドールエチルアミンのようなトリプトファン誘導体、及びそれらのアルカリ金属カチオン塩より選択されるか、或いは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン及びバリン、及びそのアルコール、アミド又は脱カルボキシル化誘導体より選択され、
ｔは、グリコシド単位当りの置換基Ｆ−Ｒ−［ＡＡ］ｎのモル分率であって、０．１ないし２であり、
ｐは、ＡＡにより置換された基Ｒのモル分率であって、０．０５ないし１であり、
ＲがＡＡにより置換されていない場合、Ｒ基の酸（群）は、カルボン酸カチオンであって、前記カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンである）
で表される官能化されたアニオン性多糖類からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし６のうちいずれか１項に記載の共沈物。
【請求項１１】
前記骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα（ｄｉｂｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７（エプトテルミンα（ｅｐｔｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−１４及びＧＤＦ−５の単独、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし１０のうちいずれか１項に記載の共沈物。
【請求項１２】
前記化学的吸引力及び血管形成力を有する少なくとも１種の成長因子は、ＰＤＧＦである、請求項５ないし１１のうちいずれか１項に記載の共沈物。
【請求項１３】
少なくともＢＭＰ−２及びＰＤＧＦ−ＢＢを含有する、請求項６ないし１２のうちいずれか１項に記載の共沈物。
【請求項１４】
少なくともＢＭＰ−７及びＰＤ−ＢＢを含有する、請求項６ないし１２のうちいずれか１項に記載の共沈物。
【請求項１５】
少なくともＧＤＦ−５及びＰＤＧＦ−ＢＢを含有する、請求項６ないし１２のうちいずれか１項に記載の共沈物。
【請求項１６】
前記骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα）、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７（エプトテルミンα）、ＢＭＰ−１４及びＧＤＦ−５の単独、及びそれらの組み合わせからなる群より選択され、そして前記化学的吸引力及び血管形成力を有する少なくとも１種の成長因子は、ＶＥＧＦである、請求項６ないし１２のうちいずれか１項に記載の共沈物。
【請求項１７】
少なくとも、
ａ−少なくとも１種の骨形成タンパク質を含有する組成物、
ｂ−少なくとも１種の多糖類を含有する組成物、
ｃ−少なくとも１種の可溶性カルシウム塩を含有する組成物、
ｄ−不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩を含有する組成物
を含有する、骨形成インプラントを調製するためのキット。
【請求項１８】
少なくとも１種の塩基を含有する付加的な組成物をさらに含有する、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
組成物ｂ、ｃ又はｄに添加され得る第２の塩基をさらに含有する、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記骨形成タンパク質を含有する組成物は、前記複合体を形成する多糖類をさらに含有し得る、請求項１７ないし１９のうちいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１】
前記複合体を含有する組成物は、不溶性カルシウム塩を形成し得るアニオンの可溶性塩及び／又は塩基をさらに含有し得る、請求項１７ないし１９のうちいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】
前記多糖類を含有する組成物は、不溶性カルシウム塩を形成し得る可溶性アニオン塩及び／又は塩基をさらに含有し得る、請求項１７ないし１９のうちいずれか１項に記載のキット。
【請求項２３】
前記可溶性カルシウム塩を含有する組成物は、塩基をさらに含有し得る、請求項１７ないし１９のうちいずれか１項に記載のキット。
【請求項２４】
ａ−少なくとも１種の骨形成タンパク質を含有する組成物、
ｂ−少なくとも１種のアニオン性多糖類、少なくとも１種の塩基及び不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩を含有する組成物、
ｃ−少なくとも１種の可溶性カルシウム塩を含有する組成物
を含有するキット。
【請求項２５】
ａ−少なくとも１種の骨形成タンパク質を含有する組成物、
ｂ−少なくとも１種のアニオン性多糖類及び不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩を含有する組成物、
ｃ−少なくとも１種の可溶性カルシウム塩及び少なくとも１種の塩基を含有する組成物
を含有するキット。
【請求項２６】
前記アニオン性多糖類は、疎水性誘導体により官能化された多糖類から成る群より選択される、請求項１７ないし２５のうちいずれか１項に記載のキット。
【請求項２７】
前記アニオン性多糖類は、一般式ＩＸ：
2012509303.tif 000021
［式中、
ｑは、Ｆ−Ｒ−Ｇ−Ａｈで置換された多糖類のカルボキシル官能基のモル分率を表すものであって、０．０１ないし０．７であり、
Ｆ’は、アミド官能基を表し、
Ｇは、エステル官能基、チオエステル官能基、カーボネート官能基又はカルバメート官能基のいずれかを表し、
Ｒは、枝分れ状であっても、及び／又は不飽和であっても、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有していてもよく、そして少なくとも１つの酸官能基−ＣＯ２Ｈを有する１ないし１８個の炭素原子を含有する鎖を表し、
Ａｈは、疎水性アルコールのヒドロキシル官能基と、Ｒ基により保有される少なくとも１つの求電子性官能基との間のカップリングから生じる、疎水性アルコールの残基を表し、
多糖類のカルボキシル官能基がＦ’−Ｒ−Ｇ−Ａｈにより置換されていない場合、多糖類のカルボキシル官能基（群）は、カルボン酸カチオンであって、前記カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンを表し、
前記カルボキシル官能基を有する多糖類は、中性ｐＨにて両親媒性である。］
で表される、疎水性アルコールにより一部が置換されたカルボキシル官能基を含有する多糖類からなる群より選択されることを特徴とする、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記カルボキシル官能基を含有する多糖類は、一般式Ｘ：
2012509303.tif 000022
［式中、
天然多糖類は、大部分が（１，６）型及び／又は（１，４）型及び／又は（１，３）型及び／又は（１，２）型のグリコシド結合から成る多糖類群より選択され、
Ｌは、リンカーＱと、前記多糖類の−ＯＨ官能基との間のカップリング由来のものであって、エステル官能基、チオエステル官能基、カーボネート官能基、カルバメート官能基又はエーテル官能基であり、
ｒは、前記多糖類の糖単位当りのＬ−Ｑ置換基のモル分率を表し、
Ｑは、枝分れ状であっても、及び／又は不飽和であっても、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有していてもよく、そして少なくとも１つの酸官能基−ＣＯ２Ｈを有する１ないし１８個の炭素原子を含有する鎖を表す］
で表される、１００の糖単位当り少なくとも１５のカルボキシル官能基がグラフトされた、カルボキシル官能基を天然に含有する多糖類から得られるか、又は中性多糖類から得られる合成多糖類であることを特徴とする、請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】
前記アニオン性多糖類は、下記の一般式Ｉ：
2012509303.tif 000023
［式中、
多糖類は、大部分が（１，４）及び／又は（１，３）及び／又は（１，２）型のグリコシド結合からなり、
Ｆは、リンカーアームＲと、中性又はアニオン性多糖類の−ＯＨ官能基との間のカップリング由来のものであって、エステル官能基、チオエステル官能基、アミド官能基、カーボネート官能基、カルバメート官能基、エーテル官能基、チオエーテル官能基又はアミン官能基のいずれかを表し、
Ｒは、枝分れ状であっても、及び／又は不飽和であっても、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有していてもよく、そして少なくとも１つの酸官能基−ＣＯ２Ｈを有する１ないし１８個の炭素原子を含有する鎖を表し、
Ｔｒｐは、トリプトファン誘導体のアミンと、Ｒ基により保有される少なくとも１つの酸及び／又はアニオン性多糖類により保有される少なくとも１つの酸との間のカップリングから生じるＬ−又はＤ−トリプトファン誘導体の残基を表し、
ｎは、Ｔｒｐにより置換された基Ｒのモル分率であって、０．０５ないし０．７であり、
ｏは、Ｔｒｐにより置換された多糖類の酸官能基のモル分率であって、０．０５ないし０．７であり、
ｉは、糖単位当りの基Ｒにより保有される酸官能基のモル分率であって、０ないし２であり、
ｊは、糖単位当りのアニオン性多糖類により保有される酸官能基のモル分率であって、０ないし１であり、
（ｉ＋ｊ）は、糖単位当りの酸官能基のモル分率であって、０．１ないし２であり、
ＲがＴｒｐにより置換されていない場合、基Ｒの酸（群）は、カルボン酸カチオンであって、前記カチオンは、好ましくはＮａ又はＫのようなアルカリ金属のカチオンであり、
前記多糖類がアニオン性多糖類である場合、多糖類の１つ以上の酸官能基（群）がＴｒｐにより置換されておらず、その場合にそれらはカチオン、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンにより塩化されており、
前記多糖類は、中性ｐＨにて両親媒性である。］
に対応する、少なくとも１種のトリプトファン誘導体により官能化された、大部分が（１，４）型及び／又は（１，３）型及び／又は（１，２）型のグリコシド結合を含有するアニオン性多糖類からなる群より選択されることを特徴とする、請求項２６に記載のキット。
【請求項３０】
前記アニオン性多糖類は、下記の一般式ＩＩＩ
2012509303.tif 000024
（式中、
Ｒは、枝分れ状であっても、及び／又は不飽和であっても、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有していてもよく、そして少なくとも１つの酸官能基−ＣＯ２Ｈを有する１ないし１８個の炭素原子を含有する鎖を表し、
Ｆは、リンカーＲと、中性の又はアニオン性の多糖類の−ＯＨ官能基との間のカップリング由来のものであって、エステル官能基、チオエステル官能基、アミド官能基、カーボネート官能基、カルバメート官能基、エーテル官能基、チオエーテル官能基又はアミン官能基のいずれかを表し、
ＡＡは、アミノ酸のアミンと、基Ｒにより保有される酸との間のカップリングから生じる疎水性のＬ−又はＤ−アミノ酸残基を表し、前記疎水性のアミノ酸は、トリプトファン、トリプトファノール、トリプトファンアミド及び２−インドールエチルアミンのようなトリプトファン誘導体、及びそれらのアルカリ金属カチオン塩より選択されるか、或いは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン及びバリン、及びそのアルコール、アミド又は脱カルボキシル化誘導体より選択され、
ｔは、グリコシド単位当りの置換基Ｆ−Ｒ−［ＡＡ］ｎのモル分率であって、０．１ないし２であり、
ｐは、ＡＡにより置換された基Ｒのモル分率であって、０．０５ないし１であり、
ＲがＡＡにより置換されていない場合、Ｒ基の酸（群）は、カルボン酸カチオンであって、前記カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンである）
で表される官能化されたアニオン性多糖類からなる群より選択されることを特徴とする、請求項２６に記載のキット。
【請求項３１】
前記骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα（ｄｉｂｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７（エプトテルミンα（ｅｐｔｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−１４及びＧＤＦ−５の単独、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１７ないし３０のうちいずれか１項に記載のキット。
【請求項３２】
前記化学的吸引力及び血管形成力を有する少なくとも１種の成長因子は、ＰＤＧＦである、１７ないし３０のうちいずれか１項に記載のキット。
【請求項３３】
少なくともＢＭＰ−２及びＰＤＧＦ−ＢＢを含有する、請求項１７ないし３０のうちいずれか１項に記載の共沈物。
【請求項３４】
少なくともＢＭＰ−７及びＰＤ−ＢＢを含有する、請求項１７ないし３０のうちいずれか１項に記載のキット。
【請求項３５】
少なくともＧＤＦ−５及びＰＤＧＦ−ＢＢを含有する、請求項１７ないし３０のうちいずれか１項に記載のキット。
【請求項３６】
前記骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα）、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７（エプトテルミンα）、ＢＭＰ−１４及びＧＤＦ−５の単独、及びそれらの組み合わせからなる群より選択され、そして前記化学的吸引力及び血管形成力を有する少なくとも１種の成長因子は、ＶＥＧＦである、請求項１７ないし３０のうちいずれか１項に記載のキット。
【請求項３７】
前記可溶性カルシウム塩は、塩化カルシウム、Ｄ−グルコン酸カルシウム、ギ酸カルシウム、Ｄ−サッカリンカルシウム、酢酸カルシウム、Ｌ−乳酸カルシウム、グルタミン酸カルシウム及びアスパラギン酸カルシウムから成る群より選択される、請求項１７ないし３６のうちいずれか１項にキット。
【請求項３８】
前記可溶性カルシウム塩は、塩化カルシウムである、請求項１７ないし３６のうちいずれか１項に記載のキット。
【請求項３９】
前記カルシウムイオンとの沈澱物を形成し得る可溶性アニオン塩は、アニオンが、リン酸イオンＰＯ４３−、リン酸水素イオンＨＰＯ４２−及びリン酸二水素イオンＨ２ＰＯ４−を包含するリン酸アニオンから成る群より選択される可溶性塩である、請求項１７ないし３８のうちいずれか１項に記載のキット。
【請求項４０】
前記塩基は、無機及び有機塩基より選択される、請求項１７ないし３８のうちいずれか１項に記載のキット。
【請求項４１】
前記無機塩基は、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム及び炭酸ナトリウムから成る群より選択される、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記有機塩基は、アミン及び脱プロトン化されたアミノ酸から成る群より選択される、請求項４０に記載のキット。
【請求項４３】
前記有機塩基は、イミダゾール及びその誘導体から成る群より選択され、とりわけ、ヒスチジン、プロリン、エタノールアミン及びセリンである、請求項４０に記載のキット。
【請求項４４】
少なくとも１種の有機マトリックス又は無機マトリックス又は混合マトリックスをさらに含有する、請求項１７ないし４３のうちいずれか１項に記載のキット。
【請求項４５】
前記マトリックスは、架橋ポリマーをベースとしたヒドロゲル及び／又はマトリックスから成る群より選択される有機マトリックスである、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記ヒドロゲルは、ポリマー鎖の化学的又は物理的架橋により得られたヒドロゲルである、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記架橋ポリマーは、架橋され且つ滅菌された精製天然コラーゲンである、請求項４５に記載のキット。
【請求項４８】
前記ヒドロゲルは、エチレングリコールと乳酸とのコポリマー、エチレングリコールとグリコール酸とのコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリビニル酸、ポリアクリルアミド及びポリアクリル酸を包含する合成ポリマー群より選択される、請求項４６に記載のキット。
【請求項４９】
前記ヒドロゲルは、ヒアルロン酸、ケラタン、プルラン、ペクチン、デキストラン、セルロース及びセルロース誘導体、アルギン酸、キサンタン、カラギーナン、キトサン、コンドロイチン、コラーゲン、ゼラチン、ポリリシン、フィブリン、並びに生物学的に許容され得るそれらの塩を包含する天然ポリマー群より選択される、請求項４５に記載のキット。
【請求項５０】
前記キットを構成する組成物は、水溶液である、請求項１７ないし５０のうちいずれか１項に記載のキット。
【請求項５１】
前記キットを構成する組成物は、凍結乾燥物である、請求項１７ないし５０のうちいずれか１項に記載のキット。
【請求項５２】
カルシウムイオン塩溶液の添加により、前記アニオン性ポリマーと前記骨成長タンパク質との複合体を沈澱させる段階、
与えられたｐＨにおける、不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩を含有する組成物の添加により、カルシウムイオンを沈澱させる段階、
により与えられる共沈段階を含み、
前記アニオン性ポリマーと骨形成タンパク質との複合体は、前記アニオン性多糖類溶液を前記骨形成タンパク質溶液に添加することにより得られる、請求項１ないし１６のうちいずれか１項に定義される共沈物の製造方法。
【請求項５３】
前記カルシウム塩の沈澱は、可溶性リン酸溶液の添加により、リン酸カルシウムの形態で生じる、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成製剤の分野に、より特に、骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）であるＢＭＰファミリーに属する骨形成タンパク質の製剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨形成誘発の機構に伴う成長因子である。ＢＭＰは骨形成タンパク質（ＯＰ）としても知られており、１９６５年にＵｒｉｓｔにより最初に特定された（非特許文献１）。皮質骨から単離されるこれらタンパク質は、多種の動物の骨形成を誘発し得る（非特許文献１）。
【０００３】
ＢＭＰは、翻訳後成熟の後に１０４ないし１３９残基の長さを有するプロペプチドの形態で発現する。それらは互いに大きな相同性の配列を有しており、且つ類似の三次元構造を有している。特に、それらは、所謂“システイン集団（ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｋｎｏｔ）”を形成する分子内ジスルフィド架橋に包含される６個のシステイン残基を有している（非特許文献２及び３）。ＢＭＰのうちの数種は、ダイマーの形成に関与する分子間ジスルフィド架橋に包含される７番目のシステインを有している（非特許文献２）。
【０００４】
それらの活性形態において、ＢＭＰは、Ｉｓｒａｅｌ等により記載されるように、ホモダイマーとして及びヘテロダイマーとしてさえ会合する（非特許文献４）。ダイマー状ＢＭＰは、ＢＭＰＲ型の膜透過受容体と相互作用する（非特許文献５）。この認識は、特にＳｍａｄタンパク質を含有する一連の細胞内シグナル伝達を引き起こし、このことが標的遺伝子の活性化又は抑制化を誘発する。
【０００５】
ＢＭＰ１及び３を除いて、ＢＭＰは、間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）を分化させるのに直接的な且つ間接的な役割を果しており、このことが骨芽細胞へのその分化を誘発する（非特許文献６）。それらはまた、走化性の特性を有し、且つ増殖、分化及び血管形成を誘発する。
【０００６】
幾種かのヒト組換体ＢＭＰ、特にｒｈＢＭＰ−２及びｒｈＢＭＰ−７は、ヒトの生体内での骨形成を誘発する能力を明らかに示しており、そして幾つかの医療用途のため承認されている。このように、ヒト組換体ＢＭＰ−２、即ち国際的な一般名に従うとジボテルミンα（ｄｉｂｏｔｅｒｍｉｎ  ａｌｆａ）は、米国ではインフーズ（ＩｎＦｕｓｅ）（登録商標）、そして欧州ではインダクトＯｓ（ＩｎｄｕｃｔＯｓ）（登録商標）の名称で販売される製品中に配合されている。この製品は、腰椎融合に対して、及び“非結合”骨折に対する脛骨の骨再生に対して処方される。腰椎の融合のためのインフーズの場合、外科的処置はまず第一に、ｒｈＢＭＰ−２溶液中にコラーゲンスポンジを浸し、その後、腰椎間に前もって移植された中空ケージ（ＬＴケージ）にそのスポンジを置くことからなる。
【０００７】
ヒト組換体ＢＭＰ−７、即ち国際的な一般名に従うとエプトテルミンα（ｅｐｔｏｔｅｒｍｉｎ  ａｌｆａ）は、ＢＭＰ−２と同じ治療指標を有し、２つの製品、即ち脛骨の開裂骨折に対するＯＰ−１インプラント（ＯＰ−１Ｉｍｐｌａｎｔ）及び腰椎融合に対するＯＰ−１パテ（ＯＰ−１Ｐｕｔｔｙ）の基盤を形成している。ＯＰ−１インプラントは、ｒｈＢＭＰ−７及び０．９％生理的食塩水に吸収されるコラーゲンを含有する粉末からなる。得られたペーストはその後、外科的処置中に骨折部に適用される。ＯＰ−１パテは、一方がｒｈＢＭＰ−７及びコラーゲンを含み、他方がカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む、２種類の粉末の形態にある。外科的処置中に、ＣＭＣの溶液は０．９％生理的食塩水によって再構成され、そしてｒｈＢＭＰ−７及びコラーゲンと混合される。こうして得られたペーストは、治療部位に適用される。
【０００８】
骨形成タンパク質の投与は、それらの不安定性、及び最少量の骨形成タンパク質を含有する骨形成製剤を得るのに生じる必要性のために大きな問題となっている。このことは、これらタンパク質の高濃度により生じる副作用を回避することであり、そしてこれらタンパク質のコストのためでもある。
【０００９】
例えば、Ｓｅｅｈｅｒｍａｎによる見解において引用されている、多くの製剤が開発されてきており（非特許文献７）、そこにはデリバリー系の性質の重要性が強調されている。
【００１０】
使用されるデリバリー系は、投与部位でのタンパク質の保持時間を増加させて、使用されるタンパク質量の全体的な放出を得、且つ投与部位外へ拡散し得る過度に突然の放出を回避し得なければならない。
【００１１】
使用されるデリバリー系はまた、治療される部位における骨形成のためのマトリックスとして補助され得るべきである一方で、同時に、治療される部位でのこの骨形成の限界を定めなければならない。
【００１２】
現時点で４種の材料：天然ポリマー、合成ポリマー、無機材料、及びこれら材料の混合物が、デリバリー系において使用されている。
【００１３】
しかしながら、開発された系のいずれも、ＢＭＰ投与量を有意に低減することは出来なかった。このことは、とりわけ、製剤中のタンパク質の不安定性か、或いは支持体の構造のための生体適合性に乏しいことと関連している。
【００１４】
天然ポリマーとして、コラーゲン、ヒアルロナン、フィブリン、キトサン、アルギネート及び他の天然多糖類が使用されている。
【００１５】
組換え体のコラーゲンをベースとしたスポンジは、この天然ポリマーの既知の欠点の殆どを克服し得るが、スポンジへの骨形成タンパク質の導入は、現時点では不満足である。
【００１６】
ヒドロゲル形態にある他の天然多糖類は、ゲルの形に前もって架橋されないならば、あまりに急速に再吸収されるという欠点を本質的に有しており、それが前述のコラーゲンスポンジと同様の欠点を引き起こす。
【００１７】
合成ポリマーに関しては、最も一般に使用されるものは、ポリラクチド（ＰＬＡ)、ポリグリコリド（ＰＬＧ）及びそれらのコポリマー（ＰＬＧＡ）のような、ポリ（α−ヒドロキシ酸）ポリマーである。
【００１８】
これらポリマーの主要な欠点は、それらの分解によるｐＨの低下であり、そしてそれらが引き起こし得る炎症反応である。
【００１９】
無機材料に関しては、リン酸カルシウムと骨形成誘発タンパク質とを組み合わせたデリバリー系が開発されてきた。
【００２０】
これらのうち、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）及びリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）のようなリン酸カルシウムをベースとしたセラミックス、並びに“非セラミックス”のリン酸カルシウム、例えばリン酸カルシウムをベースとしたセメント（ＣＰＣ）が言及されている。
【００２１】
１９７０年台以降、Ｍ．Ｂｏｈｎｅｒによる見解において回想されているように（非特許文献８）、リン酸カルシウムセラミックスは、骨再構成において価値あるものであり得ることが既知である。
【００２２】
しかしながら、ＢＭＰ−２の有効投与量は、コラーゲンスポンジ中よりもセラミック中の方がより高いことが認められている。ヒトの後側部融合の臨床的研究は（非特許文献９）、メドトロニック  ソファモア社（ｃｏｍｐａｎｙ  Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｓｏｆａｍｏｒ）により開発された製品である、ＢＣＰ顆粒（６０％ＨＡＰ及び４０％ＴＣＰ）を用いたＢＭＰ−２投与量（４０ｍｇ）が、リン酸カルシウムを含有しないコラーゲンスポンジ中（１２ｍｇ）よりも高いことを報告している。
【００２３】
この欠点を克服するために、非セラミック性のリン酸カルシウムのうちリン酸カルシウムセメントをベースとした非常に多数の系が開発されてきた。セメントは、Ｂｒｏｗｎ及びＣｈｏｗにより１９８０年台に発見され、下記の定義：“リン酸カルシウムセメントは、水溶液及び１種以上のリン酸カルシウムから成る。一緒に混合すると、リン酸カルシウム（群）は、溶解性の低いリン酸カルシウム塩として溶解し、そして沈澱する。沈澱の間、リン酸カルシウム結晶は、大きくなり、そして重なり合い、それがセメントの機械的剛性をもたらす” に対応している（非特許文献８）。
【００２４】
Ｋｉｍによる文献（非特許文献１０）は、ＢＭＰ−２と共にエテックス社（ｃｏｍｐａｎｙ  Ｅｔｅｘ）により開発されたセメントである、α−ＢＳＭの使用を記載している。この新規製品は、実際に、マトリックスの骨形成誘発活性をもたらす。
【００２５】
しかしながら、このマトリックスに導入されたＢＭＰ−２は、その活性の大部分を失い、このことにより、配合されるＢＭＰ−２量を増加させる必要がある。従って、コラーゲンスポンジ中に使用されるＢＭＰ−２の２０μｇの代わりに、ＢＭＰ−２の４０μｇの投与量が、ラットの異所性骨の形成のモデルに使用される。
【００２６】
事実の点で、セメントは２つの欠点を有している。第一に、それらの前駆体であるリン酸カルシウム（群）は、タンパク質と相容れない条件下にて予め合成されなければならない。従って、特許文献１は、α−ＢＳＭの化合物の１種である非晶質リン酸カルシウムの製造に必要な反応条件を記載している。この条件は、非常に多量の水酸化ナトリウムが使用されるため、タンパク質と相容れない。さらには、この生成物は、硝酸カルシウムのような毒性化合物が使用されるために厳格な精製を必要とする。
【００２７】
特許文献２においてグラフティス社（ｃｏｍｐａｎｙ  Ｇｒａｆｔｙｓ）により記載されているような他のセメント例が、ジクロロメタンがリン酸カルシウムの合成において使用されるためにタンパク質と相容れない条件下で、得られている。特許文献３においてリソファーム社（ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｉｓｏｐｈａｒｍ）により記載されているセメントは、同様にタンパク質と相容れない水酸化カルシウムの存在下で得られている。
【００２８】
さらには一般に、セメントの形成は、可溶性リン酸カルシウム塩を、反応させ得るように４００℃を超える温度で処理された固体リン酸カルシウム塩と反応させることにより、得られる。これら２種の化合物間の反応は制御されず、主として発熱性であり、タンパク質をそのバルク中に封鎖する堅固な構造のセメントをもたらす。
【００２９】
特許文献４においては、ＢＭＰ−２の化学的安定性に害をなすか否かについて記載することなく、固体中の“反応性ホール”の存在について記載されている。
【００３０】
形成された固体塊中のタンパク質の損失を低減させるために、セメントの所謂“堅固な”性質を低減し得る発泡性化合物を反応混合物に添加することが有利であることが、特許文献１に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３１】
【特許文献１】米国特許第５６５０１７６号明細書
【特許文献２】欧州特許第１８９１９８４号明細書
【特許文献３】米国特許第２００９／０１５５３２０号明細書
【特許文献４】米国特許第５６３４６１号明細書
【非特許文献】
【００３２】
【非特許文献１】Ｕｒｉｓｔ  ＭＲ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６５；１５０，８９３
【非特許文献２】Ｓｃｈｅｕｆｌｅｒ  Ｃ．２００４  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９；２８７，１０３
【非特許文献３】Ｓｃｈｌｕｎｅｇｇｅｒ  ＭＰ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９３；２３１，４４５
【非特許文献４】Ｉｓｒａｅｌ  ＤＩ，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，１９９６，１３（３−４），２９１
【非特許文献５】Ｍｕｎｄｙ他  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，  ２００４，２２（４），２３３
【非特許文献６】Ｃｈｅｎｇ  Ｈ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，２００３，８５Ａ  １５４４−１５５２
【非特許文献７】Ｓｅｅｈｅｒｍａｎ，Ｈ．他，Ｓｐｉｎｅ  ２００２，２７（１６  Ｓｕｐｐｌ．１），Ｓ１６−Ｓ２３
【非特許文献８】Ｂｏｈｎｅｒ，Ｍ．，Ｉｎｊｕｒｙ  ２０００，３１  Ｓｕｐｐｌ．４，３７−４７
【非特許文献９】Ｂｏｄｅｎ，Ｓ．Ｄ．他，Ｓｐｉｎｅ  ２００２，２７（２３），２６６２−２６７３
【非特許文献１０】Ｋｉｍ、Ｈ．Ｄ．他，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００４，２３８，４９−６４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３３】
これら改良にもかかわらず、異所性ラットモデルの骨形成を達成するのに必要とされる量のタンパク質は高いままである、という事態は回避され得ていない。
【００３４】
混合系に関し、それらは、これまで上記問題を克服し得ていない。
【００３５】
概して、合成ポリマー、天然ポリマー或いはリン酸カルシウムセメント又はセラミックスのような無機材料の使用に関する従来記載の系は、骨修復の用途に課される基準を十分には満足していない。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
出願人は、その信用において、骨修復の用途に課される基準を満足し得る、骨形成タンパク質を可溶性カルシウム塩及び可溶性リン酸塩と接触させることから成る、新規方法を開発した。
【００３７】
この新規方法は、一方では、タンパク質を沈澱させ得るが、存在する試薬との接触によるいかなる化学的分解をも回避し得、他方、タンパク質を、不溶性カルシウム塩、好ましくはリン酸カルシウムと共沈させ得る方法であって、前記共沈物は、セメントにおいて観察されるような固体塊中の損失を著しく抑える分割形態にある。
【００３８】
このように、出願人は、少なくとも１種の不溶性カルシウム塩及び骨形成タンパク質と多糖類との少なくとも１種の複合体を含有する共沈物から成る新規骨形成組成物であって、前記共沈物は分割形態にある組成物を開発した。
【００３９】
これら２つの事象の結合が、ずっと少ない量のタンパク質を含有する非常に骨形成的な製剤を得ることを可能にした。
【００４０】
この新規組成物は従って、患者への投与後の副作用を低減させるための、主たる目的であるより少ないタンパク質量を包含するという利点を有する。
【００４１】
さらには、これらタンパク質は非常に高価であるため、タンパク質量を低減することにより治療コストを低下させることを可能にする。
【００４２】
少なくとも１種の骨形成タンパク質、可溶性の二価カチオン塩及びマトリックスを含有する骨形成組成物を記載及び特許請求している、参照によりその出願の大部分の内容が本願に組み込まれている、本出願人の名称での仮特許出願第６１／１２９０２３号及び第６１／１２９６１７号が既知である。
【００４３】
少なくとも１種の骨形成タンパク質、少なくとも１種の血管形成タンパク質、可溶性二価カチオン塩、所望によりアニオン性多糖類及び所望によりマトリックスを含有する骨形成組成物を記載及び特許請求している、参照によりその出願の大部分の内容が本願に組み込まれている、本出願人の名称での仮特許出願６１／１２９０１１号及び第６１／１２９６１８号が既知である。
【００４４】
本出願人は、少なくとも１種の骨形成タンパク質／アニオン性多糖類複合体、可溶性の少なくとも二価のカチオン塩及びマトリックスを含有する骨形成組成物を記載及び特許請求している、大部分の内容が参照により本願に組み込まれている、仮特許出願第６１／１２９６１６号及び第６１／１２９０１２号を開示している。
【００４５】
本出願人は、少なくとも１種の骨形成タンパク質／アニオン性多糖類複合体、可溶性の少なくとも二価のカチオン塩及びヒドロゲルを形成するポリマーを含有する骨形成組成物を記載及び特許請求している、参照により内容の大部分が本願に組み込まれている、仮特許出願米国第６１／１９３２１６号を開示している。
【００４６】
少なくとも１種の骨形成タンパク質、可溶性の少なくとも二価のカチオン塩、及びヒドロゲルを形成するポリマーを含有する骨形成組成物を記載及び特許請求している、参照によりその大部分の内容が本願に組み込まれている、本出願人の名称での、２００８年１１月６日出願の、仮特許出願米国第６１／１９３２１７号が既知である。
【００４７】
本発明に関し、本出願人はまた、少なくとも１種の不溶性カルシウム塩及び骨形成タンパク質と多糖類との少なくとも１種の複合体を含有する、分割形態にある共沈物の製造方法をも開発した、
【００４８】
本発明はまた、前記共沈物を含有する製剤、医薬品及び医療用具にも関する。
【００４９】
この方法を利用するための、及び該共沈物を得るための組成物及びキットもまた、以下記載する本発明である。
【００５０】
本共沈物は、
カルシウムイオン塩溶液の添加により、アニオン性ポリマーと骨形成タンパク質との複合体を沈澱させる段階、
与えられたｐＨにおける、不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩を含有する組成物の添加により、カルシウムイオンを沈澱させる段階、
により与えられる共沈段階
により得られる。
【００５１】
一の態様において、共沈物は同時沈澱により生じる。
【００５２】
一の態様において、共沈物は、逐次沈澱により生じる。
【００５３】
アニオン性ポリマーと骨形成タンパク質との複合体は、アニオン性多糖類溶液を骨形成タンパク質溶液に添加することにより得られる。
【００５４】
一の態様において、カルシウム塩の沈澱は、可溶性リン酸塩溶液の添加により、リン酸カルシウムの形態で生じる。
【００５５】
リン酸カルシウム塩が、ｐＨ及び複合体を構成するアニオン性多糖類及びタンパク質に応じて種々の固体相を有するため、共沈物の性質及び形態は、接触される溶液のｐＨに応じて変化し得る。
【００５６】
本発明は、不溶化形態にある、骨形成タンパク質と多糖類との少なくとも１種の複合体、及び少なくとも１種の不溶性カルシウム塩から構成される共沈物であって、前記共沈物は分割形態にある共沈物に関する。
【００５７】
一の態様において、共沈物はさらに、化学的吸引力及び血管形成力を有する少なくとも１種の成長因子を含有する。
【００５８】
一の態様において、不溶性カルシウム塩は、単独で又は混合物として無水形態又は水和形態にあるオルトリン酸カルシウムから成る群より選択される。
【００５９】
一の態様において、共沈物はまた、シュウ酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、炭酸カルシウム及び硫酸カルシウムから成る群より選択される少なくとも１種の不溶性カルシウム塩を含有する。
【００６０】
前記不溶性カルシウム塩は、カルシウムカチオンと、１、２又は３塩基性リン酸、カルボン酸多糖類、炭酸、水酸化物及び塩基により生じ得る可能なアニオンのようなアニオンイオンとの間に形成される混合塩であり得る。
【００６１】
オルトリン酸カルシウムは、カルシウム塩によるリン酸の種々の酸性度の中和により生じる塩であり、文献によれば、ｐＫａ値は、２５℃にて２．１２ないし１２．６７の範囲である。
【００６２】
主たる不溶性オルトリン酸カルシウムは、リン酸二カルシウムＤＣＰ、無水又は二水和リン酸オクタカルシウムＯＣＰ、リン酸三カルシウムＴＣＰ、リン酸カルシウムヒドロキシアパタイトＨＡＰ又はＰＣＡ、及びリン酸四カルシウムＴＴＣＰである。
【００６３】
アニオン性ポリマー／骨形成タンパク質複合体は、出願人の名称でのＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５９８３２に記載される複合体から成る。
【００６４】
それらは、仏国特許第０８５４６２１号及び第６１／１２９６１６号に記載される可溶性カルシウム塩の添加により不溶化される。
【００６５】
望ましい効果に応じて、共沈物は、所望により、予定の数値にｐＨを調節し得る塩基の存在中で得られる。
【００６６】
それは、分割形態にある固体の化学組成物を得ること、とりわけ、組成物中に含有される骨形成タンパク質のデリバリーを制御することを可能にする。
【００６７】
分割形態にあるこの固体の化学組成物は、室温条件下で自発的に得られ、そしてその分割状態は、生理学的な試験管内条件下で安定である。
【００６８】
一の態様において、本発明は、
ａ−少なくとも１種の骨形成タンパク質を含有する組成物、
ｂ−少なくとも１種の多糖類を含有する組成物、
ｃ−少なくとも１種の可溶性カルシウム塩、
ｄ−不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩を含有する組成物
を含有する、骨形成インプラントを調製するためのキットを構成する。
【００６９】
一の態様において、キットはまた、少なくとも１種の塩基を含有する付加的な組成物を含有する。
【００７０】
一の態様において、第２の塩基が組成物ｂ、ｃ又はｄに添加され得る。
【００７１】
これら組成物の幾つかは、バイアル数を減らすために、共沈物の形成前に組み合わされ得る。
【００７２】
一の態様において、骨形成タンパク質を含有する組成物はまた、複合体を形成するための多糖類を含有し得る。
【００７３】
骨形成タンパク質を含有する組成物又は複合体を含有する組成物はまた、不溶性カルシウム塩を形成し得る可溶性アニオン塩及び／又は塩基を含有し得る。
【００７４】
一の態様において、多糖類を含有する組成物はまた、不溶性カルシウム塩を形成し得る可溶性アニオン塩及び／又は塩基を含有し得る。
【００７５】
一の態様において、可溶性カルシウム塩を含有する組成物はまた、塩基を含有し得る。
【００７６】
一の態様において、キットは、
ａ−少なくとも１種の骨形成タンパク質を含有する組成物、
ｂ−少なくとも１種のアニオン性多糖類、及び不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩を含有する組成物、
ｃ−少なくとも１種の可溶性カルシウム塩を含有する組成物
ｄ−少なくとも１種の塩基を含有する組成物
を含有する。
【００７７】
この態様においては、組成物ｄの塩基と同一であるか又は相違し得る第２の塩基が、組成物ｂ及びｃに添加され得る。
【００７８】
一の態様において、キットは、
ａ−少なくとも１種の骨形成タンパク質を含有する組成物、
ｂ−少なくとも１種のアニオン性多糖類を含有する組成物、
ｃ−少なくとも１種の可溶性カルシウム塩及び少なくとも１種の塩基を含有する組成物、
ｄ−不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩を含有する組成物
を含有する。
【００７９】
一の態様において、組成物ｃの塩基と同一であるか又は相違し得る第２の塩基が、組成物ｂ及びｄに添加され得る。
【００８０】
一の態様において、キットは、
ａ−少なくとも１種の骨形成タンパク質を含有する組成物、
ｂ−少なくとも１種のアニオン性多糖類及び少なくとも１種の塩基を含有する組成物、
ｃ−少なくとも１種の可溶性カルシウム塩を含有する組成物、
ｄ−不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩を含有する組成物
を含有する。
【００８１】
一の態様において、組成物ｂの塩基と同一であるか又は相違し得る第２の塩基が、組成物ｃ及びｄに添加され得る。
【００８２】
一の態様において、キットは、
ａ−少なくとも１種の骨形成タンパク質及び不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩を含有する組成物、
ｂ−少なくとも１種のアニオン性多糖類を含有する組成物、
ｃ−少なくとも１種の可溶性カルシウム塩を含有する組成物、
ｄ−少なくとも１種の塩基を含有する組成物
含有する。
【００８３】
この態様においては、組成物ｄの塩基と同一であるか又は相違し得る第２の塩基が、組成物ｂ及びｃに添加され得る。
【００８４】
一の態様において、キットは、
ａ−少なくとも１種の骨形成タンパク質を含有する組成物、
ｂ−少なくとも１種のアニオン性多糖類を含有する組成物、
ｃ−少なくとも１種の可溶性カルシウム塩を含有する組成物、
ｄ−不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩及び少なくとも１種の塩基を含有する組成物
を含有する。
【００８５】
この態様においては、組成物ｄの塩基と同一であるか又は相違し得る第２の塩基が、組成物ｂ及びｃに添加され得る。
【００８６】
一の態様において、キットは、
ａ−少なくとも１種の骨形成タンパク質を含有する組成物、
ｂ−少なくとも１種のアニオン性多糖類及び不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩を含有する組成物、
ｃ−少なくとも１種の可溶性カルシウム塩を含有する組成物、
ｄ−少なくとも１種の塩基を含有する組成物
を含有する。
【００８７】
この態様においては、組成物ｄの塩基と同一であるか又は相違し得る第２の塩基が、組成物ｂ及びｃに添加され得る。
【００８８】
一の態様においては、キットは、
ａ−少なくとも１種の骨形成タンパク質を含有する組成物、
ｂ−少なくとも１種のアニオン性多糖類、少なくとも１種の塩基及び不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩を含有する組成物、
ｃ−少なくとも１種の可溶性カルシウム塩を含有する組成物
を含有する。
【００８９】
一の態様において、キットは、
ａ−少なくとも１種の骨形成タンパク質／アニオン性多糖類複合体及び不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩を含有する組成物、
ｂ−少なくとも１種の可溶性カルシウム塩を含有する組成物、
ｃ−少なくとも１種の塩基を含有する組成物
を含有する。
【００９０】
この態様においては、組成物ｃの塩基と同一であるか又は相違し得る第２の塩基が、その他の組成物に添加され得る。
【００９１】
一の態様において、キットは、
ａ−少なくとも１種の骨形成タンパク質を含有する組成物、
ｂ−少なくとも１種のアニオン性多糖類及び不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩を含有する組成物、
ｃ−少なくとも１種の可溶性カルシウム塩及び少なくとも１種の塩基を含有する組成物
を含有する。
【００９２】
この態様においては、組成物ｃの塩基と同一であるか又は相違し得る第２の塩基が、組成物ｂに添加され得る。
【００９３】
一の態様において、キットは、
ａ−少なくとも１種の骨形成タンパク質を含有する組成物、
ｂ−少なくとも１種のアニオン性多糖類及び不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩を含有する組成物、
ｃ−少なくとも１種の可溶性カルシウム塩を含有する組成物
を含有する。
【００９４】
一の態様において、キットは、
ａ−少なくとも１種の骨形成タンパク質／アニオン性多糖類複合体を含有する組成物、
ｂ−少なくとも１種の可溶性カルシウム塩及び少なくとも１種の塩基を含有する組成物、
ｃ−不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩を含有する組成物
を含有する。
【００９５】
この態様においては、組成物ｂの塩基と同一であるか又は相違し得る第２の塩基が、その他の組成物に添加され得る。
【００９６】
一の態様において、キットは、
ａ−少なくとも１種の骨形成タンパク質／アニオン性多糖類複合体を含有する組成物、
ｂ−少なくとも１種の可溶性カルシウム塩を含有する組成物、
ｃ−不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩を含有する組成物
を含有する。
【００９７】
一の態様において、キットは、
ａ−少なくとも１種の骨形成タンパク質／アニオン性多糖類複合体を含有する組成物、
ｂ−少なくとも１種の可溶性カルシウム塩を含有する組成物、
ｃ−不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩及び少なくとも１種の塩基を含有する組成物
を含有する。
【００９８】
この態様においては、組成物ｃの塩基と同一であるか又は相違し得る第２の塩基が、その他の組成物に添加され得る。
【００９９】
一の態様において、キットは、
ａ−少なくとも１種の骨形成タンパク質／アニオン性多糖類複合体及び不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩を含有する組成物、
ｂ−少なくとも１種の可溶性カルシウム塩を含有する組成物
を含有する。
【０１００】
一の態様において、キットは、
ａ−少なくとも１種の骨形成タンパク質／アニオン性多糖類複合体及び不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩を含有する組成物、
ｂ−少なくとも１種の可溶性カルシウム塩及び少なくとも１種の塩基を含有する組成物
を含有する。
【０１０１】
一の態様において、キットは、
ａ−少なくとも１種の骨形成タンパク質／アニオン性多糖類複合体及び不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩及び少なくとも１種の塩基を含有する組成物、
ｂ−少なくとも１種の可溶性カルシウム塩を含有する組成物
を含有する。
【０１０２】
一の態様において、キットは、
ａ−少なくとも１種の骨形成タンパク質／アニオン性多糖類複合体及び不溶性カルシウム塩を形成し得る少なくとも１種の可溶性アニオン塩及び少なくとも１種の塩基を含有する組成物、
ｂ−少なくとも１種の可溶性カルシウム塩及び少なくとも１種の塩基を含有する組成物
を含有する。
【０１０３】
一の態様において、少なくとも１種の骨形成タンパク質を含有する組成物はまた、化学的吸引力及び血管形成力を有する少なくとも１種の成長因子を含有する。
【０１０４】
一の態様において、キットはまた、少なくとも１種の有機マトリックス又は無機マトリックス又は混合マトリックスを含有する。
【０１０５】
一の態様において、キットを構成する組成物は、水溶液である。
【０１０６】
一の態様において、キットを構成する組成物は、凍結乾燥物である。
【０１０７】
一の態様において、キットを構成する組成物の幾つかは、凍結乾燥物である。
【０１０８】
この態様においては、凍結乾燥物は、水又は溶液中のその他の組成物のうちの１つの溶液を用いて、反応前に再水和される。
【０１０９】
従って、例えば、凍結乾燥形態にある骨形成タンパク質を含有する組成物は、アニオン性多糖類を含有する溶液を用いて、又はアニオン性多糖類及び不溶性カルシウム塩を形成し得る可溶性アニオン塩及び／又は塩基を含有する溶液を用いて、再水和され得る。
【０１１０】
一の態様において、前記沈澱物を含有する製剤、医療用具及び医薬品は、水性懸濁液である。
【０１１１】
一の態様において、前記沈澱物を含有する医薬製剤及び医薬品は、凍結乾燥物である。
【０１１２】
この態様においては、凍結乾燥物は、使用前に、生理的食塩水又は血液を用いて再水和される。
【０１１３】
用語“骨形成タンパク質”とは、骨形成成長因子又はＢＭＰ単独で、或いは治療効果のあるＢＭＰ群（骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ））より選択されるＢＭＰとの組み合わせを意味する。
【０１１４】
より特に、骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα（ｄｉｂｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７（エプトテルミンα（ｅｐｔｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−１４及びＧＤＦ−５単独及び組み合わせからなる群より選択される。
【０１１５】
使用されるＢＭＰは、当業者に既知の技術に従い得られるか、或いは、例えば、リサーチ  ダイアグノスチック社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｃ．）（ＵＳＡ）のような供給者から購入される、組換え体ヒトＢＭＰである。
【０１１６】
用語“化学的吸引力及び血管形成力を有する少なくとも１種の成長因子”とは、ＰＤＧＦ、とりわけＰＤＧＦ−ＢＢ、ＶＥＧＦ又はＦＧＦ、とりわけＦＧＦ−２のようなタンパク質を意味する。
【０１１７】
一の態様において、骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα）、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７（エプトテルミンα）、ＢＭＰ−１４及びＧＤＦ−５の単独、及びそれらの組み合わせからなる群より選択され、そして化学的吸引力及び血管形成力を有する少なくとも１種の成長因子はＰＤＧＦである。
【０１１８】
一の態様において、組成物は、少なくともＢＭＰ−２及びＰＤＧＦ−ＢＢを含有する。
【０１１９】
一の態様において、組成物は、少なくともＢＭＰ−７及びＰＤＧＦ−ＢＢを含有する。
【０１２０】
一の態様において、組成物は、少なくともＧＤＦ−５及びＰＤＧＦ−ＢＢを含有する。
【０１２１】
一の態様において、骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα）、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７（エプトテルミンα）、ＢＭＰ−１４及びＧＤＦ−５の単独、及びそれらの組み合わせからなる群より選択され、そして化学的吸引力及び血管形成力を有する少なくとも１種の成長因子はＶＥＧＦである。
【０１２２】
一の態様において、骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα）、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７（エプトテルミンα）、ＢＭＰ−１４及びＧＤＦ−５の単独、及びそれらの組み合わせからなる群より選択され、そして化学的吸引力及び血管形成力を有する少なくとも１種の成長因子はＦＧＦである。
【０１２３】
可溶性カルシウム塩は、アニオンが、塩化物イオン、Ｄ−グルコン酸イオン、ギ酸イオン、Ｄ−サッカリンイオン、酢酸イオン、Ｌ−乳酸イオン、グルタミン酸イオン及びアスパラギン酸イオンから成る群より選択される、カルシウム塩である。
【０１２４】
一の態様において、可溶性カルシウム塩は、塩化カルシウムである。
【０１２５】
“カルシウムイオンとの沈澱物を形成し得る可溶性アニオン塩”とは、アニオンが、リン酸イオンＰＯ４３−、リン酸水素イオンＨＰＯ４２−及びリン酸二水素イオンＨ２ＰＯ４−を包含するリン酸アニオンから成る群より選択される可溶性塩を意味する。
【０１２６】
一の態様において、シュウ酸アニオン、アスコルビン酸アニオン及び硫酸アニオンから成る群より選択される第２のアニオンがまた、リン酸アニオンを含有する組成物に添加される。
【０１２７】
カルシウムイオンとの沈澱物を形成し得る可溶性アニオン塩は、リン酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムから成る群より選択される。
【０１２８】
用語“アニオン性多糖類”とは、疎水性誘導体により官能化された多糖類群より選択される多糖類を意味する。
【０１２９】
一の態様において、多糖類は、特許出願仏国特許第０８／５５５６７号に記載される少なくとも１種のトリプトファン誘導体により官能化された、大部分が（１，４）型及び／又は（１，３）型及び／又は（１，２）型のグリコシド結合から成る多糖類誘導体群より選択される。
【０１３０】
これら多糖類は、大部分が（１，４）型及び／又は（１，３）型及び／又は（１，２）型のグリコシド結合から成る。それらは中性である、即ち、酸又はアニオン性官能基も、そして酸官能基も有していない。
【０１３１】
それらは、少なくとも１つのトリプトファン誘導体（Ｔｒｐ）によって官能化され、
前記トリプトファン誘導体は、酸官能基によるカップリングによって多糖類にグラフトされているか又は結合されており、前記酸官能基が、アニオン性多糖類の酸官能基及び／又は官能基Ｆを介して多糖類に結合しているリンカーＲによって保有されている酸官能基となることを可能にしており、前記官能基Ｆは、リンカーＲと、中性の又はアニオン性多糖類の−ＯＨ官能基との間のカップリング由来のものであり、
Ｆは、エステル官能基、チオエステル官能基、アミド官能基、カーボネート官能基、カルバメート官能基、エーテル官能基、チオエーテル官能基又はアミン官能基であり、
Ｒは、枝分れ状であっても、及び／又は不飽和であっても、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有していてもよく、そして少なくとも１つの酸官能基を有する１ないし１８個の炭素原子を含有する鎖を表し、
Ｔｒｐは、トリプトファンのアミンと、Ｒ基により保有されている少なくとも１つの酸及び／又はアニオン性多糖類により保有されている１つの酸との間のカップリングにより生じるＬ−又はＤ−トリプトファン誘導体の残基である。
【０１３２】
本発明に従うと、少なくとも１種のトリプトファン誘導体により官能化された、大部分が（１，４）、（１，３）及び／又は（１，２）型のグリコシド結合を含有するアニオン性多糖類は、下記の一般式Ｉ：
2012509303.tif 000002
［式中、
多糖類は、大部分が（１，４）及び／又は（１，３）及び／又は（１，２）型のグリコシド結合からなり、
Ｆは、リンカーアームＲと、中性又はアニオン性多糖類の−ＯＨ官能基との間のカップリング由来のものであって、エステル官能基、チオエステル官能基、アミド官能基、カーボネート官能基、カルバメート官能基、エーテル官能基、チオエーテル官能基又はアミン官能基のいずれかを表し、
Ｒは、枝分れ状であっても、及び／又は不飽和であっても、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有していてもよく、そして少なくとも１つの酸官能基−ＣＯ２Ｈを有する１ないし１８個の炭素原子を含有する鎖を表し、
Ｔｒｐは、トリプトファン誘導体のアミンと、Ｒ基により保有される少なくとも１つの酸及び／又はアニオン性多糖類により保有される少なくとも１つの酸との間のカップリングから生じるＬ−又はＤ−トリプトファン誘導体の残基を表し、
ｎは、Ｔｒｐにより置換された基Ｒのモル分率であって、０．０５ないし０．７であり、
ｏは、Ｔｒｐにより置換された多糖類の酸官能基のモル分率であって、０．０５ないし０．７であり、
ｉは、糖単位当りの基Ｒにより保有される酸官能基のモル分率であって、０ないし２であり、
ｊは、糖単位当りのアニオン性多糖類により保有される酸官能基のモル分率であって、０ないし１であり、
（ｉ＋ｊ）は、糖単位当りの酸官能基のモル分率であって、０．１ないし２であり、
ＲがＴｒｐにより置換されていない場合、基Ｒの酸（群）は、カルボン酸カチオンであって、前記カチオンは、好ましくはＮａ又はＫのようなアルカリ金属のカチオンであり、
前記多糖類がアニオン性多糖類である場合、多糖類の１つ以上の酸官能基（群）がＴｒｐにより置換されておらず、その場合にそれらはカチオンにより塩化されており、前記カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンであり、
前記多糖類は、中性ｐＨにて両親媒性である。］
に対応する。
【０１３３】
一の態様において、Ｆは、エステル、カーボネート、カルバメート又はエーテルを表す。
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，４）型のグリコシド結合からなる。
一の態様において、大部分が（１，４）型のグリコシド結合からなる多糖類は、プルラン、アルギネート、ヒアルロナン、キシラン、ガラクツロナン及び水溶性セルロースからなる群より選択される。
一の態様において、多糖類はプルランである。
一の態様において、多糖類はアルギネートである。
一の態様において、多糖類はヒアルロナンである。
一の態様において、多糖類はキシランである。
一の態様において、多糖類はガラクツロナンである。
一の態様において、多糖類は水溶性セルロースである。
【０１３４】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，３）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，３）型のグリコシド結合から成る多糖類は、カードランである。
【０１３５】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，２）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，２）型のグリコシド結合から成る多糖類は、イヌリンである。
【０１３６】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，４）及び（１，３）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，４）及び（１，３）型のグリコシド結合から成る多糖類は、グルカンである。
【０１３７】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，４）及び（１，３）及び（１，２）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，４）及び（１，３）及び（１，２）型のグリコシド結合から成る多糖類は、マンナンである。
【０１３８】
一の態様において、本発明に従う多糖類は、基Ｒが下記の基：
2012509303.tif 000003
又はそれらのアルカリ金属カチオン塩より選択されることを特徴とする。
【０１３９】
一の態様において、本発明に従う多糖類は、トリプトファン誘導体が、トリプトファン、トリプトファノール、トリプトファンアミド及び２−インドールエチルアミン及びそれらのアルカリ金属カチオン塩からなる群より選択されることを特徴とする。
【０１４０】
一の態様において、本発明に従う多糖類は、トリプトファン誘導体が式ＩＩ：
2012509303.tif 000004
[式中、
Ｅは、直鎖状の又は枝分れ状のＣ１ないしＣ８アルキル基、直鎖状の又は枝分れ状のＣ６ないしＣ２０アルキルアリール基又はアリールアルキル基であり得る基である。]
で表されるトリプトファンエステルより選択されることを特徴とする。
【０１４１】
多糖類は、１０ないし１００００の重合度ｍを有し得る。
一の態様において、多糖類は、１０ないし１０００の重合度ｍを有する。
別の態様において、１０ないし５００の重合度ｍを有する。
【０１４２】
一の態様において、多糖類は、仏国特許第０７／０２３１６号明細書に記載される、トリプトファン及びトリプトファン誘導体のような疎水性アミノ酸によって官能化されたデキストラン群より選択される。
【０１４３】
本発明によれば、官能化されたデキストランは、下記の一般式ＩＩＩ
2012509303.tif 000005
［式中、
Ｒは、枝分れ状であっても、及び／又は不飽和であっても、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有していてもよく、そして少なくとも１つの酸官能基−ＣＯ２Ｈを有する１ないし１８個の炭素原子を含有する鎖を表し、
Ｆは、リンカーＲと、中性の又はアニオン性の多糖類の−ＯＨ官能基との間のカップリング由来のものであって、エステル官能基、チオエステル官能基、アミド官能基、カーボネート官能基、カルバメート官能基、エーテル官能基、チオエーテル官能基又はアミン官能基のいずれかを表し、
ＡＡは、アミノ酸のアミンと、Ｒ基により保有される酸との間のカップリングから生じる疎水性のＬ−又はＤ−アミノ酸残基を表し、
ｔは、グリコシド単位当りの置換基Ｆ−Ｒ−［ＡＡ］ｎのモル分率であって、０．１ないし２であり、
ｐは、ＡＡにより置換されたＲ基のモル分率であって、０．０５ないし１であり、そして、
ＲがＡＡにより置換されていない場合、基Ｒの酸（群）は、カルボン酸カチオンであって、前記カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンであり、
前記デキストランは、中性ｐＨにて両親媒性である。］
に対応し得る。
【０１４４】
一の態様において、アルカリ金属カチオンはＮａ＋である。
一の態様において、Ｆは、エステル、カーボネート、カルバメート又はエーテルのいずれかである。
【０１４５】
一の態様において、本発明に従う多糖類は、式ＩＶ：
2012509303.tif 000006
で表されるカルボキシメチレートデキストラン又は対応する酸である。
【０１４６】
一の態様において、本発明に従う多糖類は、式Ｖ：
2012509303.tif 000007
で表されるデキストランのモノコハク酸エステル又は対応する酸である。
【０１４７】
一の態様において、本発明に従う多糖類は、Ｒ基が下記の基：
2012509303.tif 000008
又はそれらのアルカリ金属カチオン塩より選択されることを特徴とする。
【０１４８】
一の態様において、本発明に従うデキストランは、疎水性アミノ酸が、トリプトファン、トリプトファノール、トリプトファンアミド及び２−インドールエチルアミン、及びそれらのアルカリ金属カチオン塩より選択されることを特徴とする。
【０１４９】
一の態様において、本発明に従うデキストランは、トリプトファン誘導体が、上記定義された式ＩＩで表されるトリプトファンエステルより選択されることを特徴とする。
【０１５０】
一の態様において、本発明に従うデキストランは、式ＶＩ：
2012509303.tif 000009
で表されるトリプトファンで変性されたカルボキシメチレートデキストランである。
【０１５１】
一の態様において、本発明に従うデキストランは、式ＶＩＩ：
2012509303.tif 000010
で表されるトリプトファンで変性されたモノコハク酸エステルである。
【０１５２】
一の態様において、本発明に従うデキストランは、疎水性アミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン及びバリン、及びそれらのアルコール、アミド又は脱カルボキシル誘導体より選択されることを特徴とする。
【０１５３】
一の態様において、本発明に従うデキストランは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン及びバリン誘導体が、式ＶＩＩＩ：
2012509303.tif 000011
（式中、Ｅは、上記定義されたとおりである）
で表されるこれらアミノ酸のエステルより選択されることを特徴とする。
【０１５４】
一の態様において、本発明に従うデキストランは、疎水性アミノ酸が、フェニルアラニン、又はそのアルコール、アミド又は脱カルボキシル誘導体であることを特徴とする。
【０１５５】
デキストランは、１０ないし１００００の重合度ｍを有し得る。
一の態様において、デキストランは、１０ないし１０００の重合度ｍを有する。
別の態様において、デキストランは、１０ないし５００の重合度ｍを有する。
【０１５６】
一の態様において、多糖類は、仏国特許出願第０８／０５５０６号明細書に記載されるもののような、少なくとも１つがＡｈで表される疎水性アルコール誘導体により置換されたカルボキシル官能基を含む多糖類群より選択され：
前記疎水性アルコール（Ａｈ）は、カップリングアームＲを介してアニオン性多糖類にグラフトされているか又は結合されており、前記カップリングアームは、官能基Ｆ’を介してアニオン性多糖類に結合しており、前記官能基Ｆ’は、リンカーＲのアミン官能基と、アニオン性多糖類のカルボキシル官能基との間のカップリング由来のものであり、前記カップリングアームは、カップリングアームのカルボキシル官能基、イソシアネート官能基、チオ酸又はアルコール官能基と、疎水性アルコールの官能基との間のカップリング由来の官能基Ｇによって疎水性アルコールに結合しており、未置換のアニオン性多糖類のカルボキシル官能基は、カルボン酸カチオンの形態にあり、該カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンであり、
Ｆ’は、アミド官能基を表し、
Ｇは、エステル官能基、チオエステル官能基、カーボネート官能基又はカルバメート官能基のいずれかを表し、
Ｒは、枝分れ状であっても、及び／又は不飽和であっても、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有していてもよく、そして少なくとも１つの酸官能基−ＣＯ２Ｈを有する１ないし１８個の炭素原子を含有する鎖を表し、
Ａｈは、疎水性アルコールのヒドロキシル官能基と、Ｒ基により保有される少なくとも１つの求電子性官能基との間のカップリングから生じる、疎水性アルコールの残基を表し、
カルボキシル官能基を含有する前記多糖類は、中性ｐＨにて両親媒性である。
【０１５７】
疎水性アルコールによって部分的に置換されたカルボキシル官能基を含有する多糖類は、一般式ＩＸ：
2012509303.tif 000012
［式中、
ｑは、Ｆ−Ｒ−Ｇ−Ａｈで置換された多糖類のカルボキシル官能基のモル分率であって、０．０１ないし０．７であり、
Ｆ’、Ｒ、Ｇ及びＡｈは上記定義に対応し、そして多糖類のカルボキシル官能基がＦ’−Ｒ−Ｇ−Ａｈによって置換されていない場合、多糖類のカルボキシル官能基（群）は、カルボン酸カチオン又はカルボン酸カチオン群であって、前記カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンを表す］
で表されるカルボキシル官能基を含有する多糖類より選択される。
【０１５８】
一の態様において、カルボキシル官能基を含有する多糖類は、カルボキシル官能基を本来保有する多糖類であって、アルギン酸、ヒアルロナン及びガラクツロナンより選択される。
【０１５９】
一の態様において、一般式Ｘ：
2012509303.tif 000013
［式中、
天然多糖類は、大部分が（１，６）及び／又は（１，４）及び／又は（１，３）及び／又は（１，２）型のグリコシド結合によって成る多糖類群より選択され、
Ｌは、リンカーＱと、多糖類の官能基−ＯＨとの間のカップリング由来の結合であって、エステル官能基、チオエステル官能基、カーボネート官能基、カルバメート官能基又はエーテル官能基を表し、
ｒは、多糖類の糖単位当りの置換基Ｌ−Ｑのモル分率を表し、
Ｑは、枝分れ状であっても、及び／又は不飽和であっても、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有していてもよく、そして少なくとも１つのカルボキシル官能基−ＣＯ２Ｈを有する１ないし１８個の炭素原子を含有する鎖を表す］
で表されるカルボキシル官能基を含有する多糖類は、カルボキシル官能基を本来含有する多糖類から、又は１００の糖単位当り少なくとも１５のカルボキシル官能基がグラフトされた中性多糖類から得られる合成多糖類である。
【０１６０】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，６）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，６）型のグリコシド結合から成る多糖類は、デキストランである。
【０１６１】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，４）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，４）型のグリコシド結合から成る多糖類は、プルラン、アルギネート、ヒアルロナン、キシラン、ガラクツロナン及び水溶性セルロースからなる群より選択される。
一の態様において、多糖類はプルランである。
一の態様において、多糖類はアルギネートである。
一の態様において、多糖類はヒアルロナンである。
一の態様において、多糖類はキシランである。
一の態様において、多糖類はガラクツロナンである。
一の態様において、多糖類は水溶性セルロースである。
【０１６２】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，３）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，３）型のグリコシド結合から成る多糖類は、カードランである。
【０１６３】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，２）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，２）型のグリコシド結合から成る多糖類は、イヌリンである。
【０１６４】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，４）及び（１，３）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，４）及び（１，３）型のグリコシド結合から成る多糖類は、グルカンである。
【０１６５】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，４）及び（１，３）及び（１，２）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，４）及び（１，３）及び（１，２）型のグリコシド結合から成る多糖類は、マンナンである。
【０１６６】
一の態様において、本発明に従う多糖類は、Ｑ基が以下の基：
2012509303.tif 000014
より選択されることを特徴とする。
【０１６７】
一の態様において、ｒは０．１ないし２である。
一の態様において、ｒは０．２ないし１．５である。
【０１６８】
一の態様において、本発明に係るＲ基は、アミノ酸より選択されることを特徴とする。
一の態様において、アミノ酸は、α−アミノ酸より選択される。
一の態様において、α−アミノ酸は、天然のα−アミノ酸より選択される。
一の態様において、天然のα−アミノ酸は、ロイシン、アラニン、イソロイシン、グリシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンより選択される。
【０１６９】
一の態様において、疎水性アルコールは、脂肪アルコールより選択される。
一の態様において、疎水性アルコールは、４ないし１８の炭素原子を含有する飽和又は不飽和アルキル鎖から成るアルコールより選択される。
一の態様において、脂肪アルコールは、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、ブチルアルコール、オレイルアルコール及びラノリンより選択される。
一の態様において、疎水性アルコールは、コレステロール誘導体より選択される。
一の態様において、コレステロール誘導体は、コレステロールである。
一の態様において、疎水性アルコールＡｈは、トコフェロールより選択される。
一の態様において、トコフェロールは、α−トコフェロールである。
一の態様において、α−トコフェロールは、ラセミ体α−トコフェロールである。
一の態様において、疎水性アルコールは、アリール基を有するアルコールより選択される。
一の態様において、アリール基を有するアルコールは、ベンジルアルコール及びフェネチルアルコールより選択される。
【０１７０】
多糖類は、１０ないし１００００の重合度ｍを有し得る。
一の態様において、多糖類は、１０ないし１０００の重合度ｍを有する。
別の態様において、多糖類は、１０ないし５００の重合度ｍを有する。
【０１７１】
一の態様において、多糖類は、トリプトファンにより官能化されたデキストラン、オクタノールフェニルアラニネートにより官能化されたデキストラン、オクタノールグリシネートにより官能化されたデキストラン、ドデカノールグリシネートにより官能化されたデキストラン及びトリプトファンエチルエステルにより官能化されたデキストランから成る群より選択される。
【０１７２】
混合物中に存在する酸性化合物を中和するために、塩基が無機塩基又は有機塩基より選択される。
【０１７３】
無機塩基のうち、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム及び炭酸ナトリウムが挙げられる。
【０１７４】
有機塩基のうち、アミン及び脱プロトン化されたアミノ酸が挙げられる。
【０１７５】
有機塩基のうち、イミダゾール及びその誘導体、とりわけ、ヒスチジン、プロリン、エタノールアミン及びセリンが挙げられる。
【０１７６】
一の態様において、有機マトリックスは、修復を促進するために使用され得；精製され、滅菌され、且つ架橋された天然コラーゲンをベースとしたマトリックスより選択される。
【０１７７】
コラーゲンのような天然ポリマーは、細胞付着、移動及び分化を促進する細胞外マトリックス成分である。それらは、顕著に生体適合性であるという利点を有し、そして酵素消化機構によって分解される。コラーゲンをベースとしたマトリックスは、ウシ又はブタの腱又は骨から抽出される繊維状コラーゲンＩ型又はＩＶ型から得られる。これらコラーゲンはまず精製され、その後架橋され、そしてその後滅菌される。
【０１７８】
それらはまた、自家骨の酸性媒体中の吸収により得られ、それにより、無機塩化した成分の大部分が除去されるが、コラーゲン又は成長因子を含む非コラーゲンタンパク質が保持される。これら脱無機塩化されたマトリックスはまた、カオトロピック剤を用いた抽出後に不活性形態で調製され得る。これらマトリックスは、本質的に、不溶性且つ架橋されたコラーゲンＩ型から成る。
【０１７９】
混合材料、例えばコラーゲンと無機粒子とを組み合わせる、マトリックスがまた使用され得る。これら材料は、強化された機械的特性を有する複合材料の形態であるか、又はコラーゲンがバインダーとして作用する“パテ”の形態であり得る。
【０１８０】
使用され得る無機材料は、主要な利点が骨の化学組成に非常に近い化学組成である、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ)、二相性リン酸カルシウム（ＢＣＰ)又は非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）のような、リン酸カルシウムをベースとしたセラミックスを実質的に含有する。これら材料は、良好な機械的特性を有し、そして免疫学的に不活性である。これら材料は、粉末、顆粒又はブロックのような種々の形態であり得る。これらの材料は、それらの組成に応じて非常に種々の分解速度を有している。即ち、ヒドロキシアパタイトは非常にゆっくりと分解するが（数ヶ月）、リン酸三カルシウムはより迅速に分解する（数週間）。二相性のリン酸カルシウムは中間の吸収速度を有するために、この目的のために開発された。これらの無機材料は、主として骨誘導性として既知である。
【０１８１】
一の態様において、有機マトリックスは、架橋されたヒドロゲルである。
【０１８２】
架橋されたヒドロゲルは、ポリマー鎖を架橋することにより得られる。鎖間共有結合が有機マトリックスを定義する。有機マトリックスを構成するのに使用され得るポリマーは、Ｈｙｄｏｇｅｌｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ，２００２，４３，３−１２）なる表題の、Ｈｏｆｆｍａｎによる概説に記載されている。
【０１８３】
一の態様において、インプラントは、非架橋ヒドロゲルを含有する。
【０１８４】
用語“非架橋ヒドロゲル”とは、多量の水又は生体液体を吸収し得る、親水性の三次元ポリマー網目構造を意味する（Ｐｅｐｐａｓ他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２０００，５０，２７−４６）。このヒドロゲルは、物理学的相互作用から成り、そしてそれ故、ポリマー鎖の化学的架橋により得られない。
【０１８５】
ヒドロゲルを形成するポリマーのリストは非常に長く、且つ広いが、Ｈｙｄｏｇｅｌｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ，２００２，４３，３−１２）なる表題の、Ｈｏｆｆｍａｎによる概説においては、完全なリストは与えられていない。これらポリマーは、合成ポリマー及び天然ポリマーである。ヒドロゲルを形成する多糖類をカバーする他の概説が、本発明に使用できるポリマーを選択することを可能にしている（Ａｌｈａｉｑｕｅ他，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，２００７，１１９，５−２４）。
【０１８６】
一の態様において、ヒドロゲルを形成するポリマーは、エチレングリコールと乳酸とのコポリマー、エチレングリコールとグリコール酸とのコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリビニル酸、ポリアクリルアミド及びポリアクリル酸を包含する合成ポリマー群より選択される。
【０１８７】
一の態様において、ヒドロゲルを形成するポリマーは、ヒアルロン酸、ケラタン、プルラン、ペクチン、デキストラン、セルロース及びセルロース誘導体、アルギン酸、キサンタン、カラギーナン、キトサン、コンドロイチン、コラーゲン、ゼラチン、ポリリシン、フィブリン、並びに生物学的に許容され得るそれらの塩を包含する天然ポリマー群より選択される。
【０１８８】
天然ポリマーは、ヒアルロン酸、アルギン酸、デキストラン、ペクチン、セルロース及びその誘導体、プルラン、キサンタン、カラギーナン、キトサン、コンドロイチン、及び生物学的に許容され得るそれらの塩を包含する、ヒドロゲルを形成する多糖類群より選択される。
【０１８９】
一の態様において、天然ポリマーは、ヒアルロン酸、アルギン酸、及び生物学的に許容され得るそれらの塩を包含する、ヒドロゲルを形成する多糖類群より選択される。
【０１９０】
一の態様において、ヒドロゲルは、移植又は注射直前に製造され得る。
一の態様において、ヒドロゲルは、予備充填されたシリンジ中で製造され且つ保管されて、その後に移植又は注射され得る。
一の態様において、ヒドロゲルは、移植又は注射直前に凍結乾燥物の再水和によって製造され得るか、又は脱水形態で移植され得る。
【０１９１】
種々のマトリックスのうち、例えば、ヘリスタット（Ｈｅｌｉｓｔａｔ）（登録商標）（インテグラライフサイエンス，プラインスボロ（Ｉｎｔｅｇｒａ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ），ニュージャージー）、ＤＢＭ（脱塩された骨マトリックス（Ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ））のようなコラーゲンスポンジ単独か、又は、他の有機材料、例えば、多糖類、グリセロール又はゼラチン、例えばオステオフィル（Ｏｓｔｅｏｆｉｌ）（登録商標）（メドトロニック（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ））、アロマトリックス（Ａｌｌｏｍａｔｒｉｘ）（登録商標）（ライト（Ｗｒｉｇｈｔ））、グラフトン（Ｇｒａｆｔｏｎ）（登録商標）（オステオテック（Ｏｓｔｅｏｔｅｃｈ））、ＤＢＸ（登録商標）（ＭＴＦ／シンセス（Ｓｙｎｔｈｅｓ））、バイオセット（Ｂｉｏｓｅｔ）（登録商標）（レジェネレーションテクノロジー（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、無機相から成るマトリックス、例えばヴィトス（Ｖｉｔｏｓｓ）（登録商標）（オルチビスタ（Ｏｒｔｈｉｖｉｓｔａ））、オステオセット（Ｏｓｔｅｏｓｅｔ）（登録商標）（ライト）、或いは、混合マトリックス、例えばマスターグラフト（ＭａｓｔｅｒＧｒａｆｔ）（登録商標）（メドトロニック）、ヒーロス（Ｈｅａｌｏｓ）（登録商標）（デピュイ  スパイン（Ｄｅｐｕｙ  Ｓｐｉｎｅ））、コピオス（ＣｏｐｉＯｓ）（登録商標）（ジマー（Ｚｉｍｍｅｒ））、サンマックス  コラーゲン  ボーン  グラフト  マトリックス（サンマックス（Ｓｕｎｍａｘ））との混合物として使用され得る。
【０１９２】
共沈物形成後の系は、液相と固体相の二相から成る。
【０１９３】
本明細書において、容量の概念が用いられている場合には、この二相から成る総量である。
【０１９４】
キットの種々の形態の組成物を一緒に混合した後に生じる生成物中の単位体積当りの量が下記に与えられ、混合マトリックス又は無機マトリックスが使用された場合のマトリックスから生じるカルシウムイオン又はリン酸イオンの量は含まない。
【０１９５】
一の態様において、単位体積当りの種々のタンパク質の総量は、得られた懸濁液１ｍＬ当り、０．０１ｍｇないし２ｍｇであり、好ましくは０．０５ｍｇないし１．５ｍｇであり、より好ましくは０．１ｍｇないし１．５ｍｇである。
【０１９６】
単位体積当りのリン酸塩の総量は、得られた懸濁液１ｍＬ当り、０．０２ｍｍｏｌないし０．５ｍｍｏｌであり、好ましくは０．０５ないし０．２５ｍｍｏｌである。
【０１９７】
単位体積当りのカルシウムの総量は、単位体積当り、０．０１ｍｍｏｌないし１ｍｍｏｌであり、好ましくは０．０５ないし１ｍｍｏｌであり、そしてより好ましくは０．１ｍｍｏｌないし０．５ｍｍｏｌである。
【０１９８】
固体相中のカルシウムイオンのパーセンテージは、導入されるカルシウムイオンの６０％ないし９５％である。
【０１９９】
単位体積当りの多糖類の総量は、得られた懸濁液１ｍＬ当り、１ないし１００ｍｇであり、好ましくは２ないし４０ｍｇである。固体相中の多糖類のパーセンテージは、導入された多糖類の８０％よりも高い。
【０２００】
使用される塩基量は、リン酸イオンにより与えられるプロトンに対して、およそ０．１ないし２当量に対応する。
【０２０１】
使用される容量及び組成物数に応じて、開始組成物中に使用される量は、計算により決定され得る。このことは、キットの種々の態様のために行われる。
【０２０２】
一の態様において、脊椎用インプラントについては、骨形成成長因子の投与量は、０．０１ｍｇないし２０ｍｇであり、好ましくは０．０５ｍｇないし８ｍｇであり、好ましくは０．１ｍｇないし４ｍｇであり、そしてより好ましくは０．１ｍｇないし２ｍｇであるが、文献中で一般に許容される投与量は、８ないし１２ｍｇである。
【０２０３】
一の態様において、脊椎用インプラントについては、血管形成成長因子の投与量は、０．０５ｍｇないし８ｍｇであり、好ましくは０．１ｍｇないし４ｍｇであり、より好ましくは０．１ｍｇないし２ｍｇである。
【０２０４】
一の態様において、本発明に従う共沈物を含有するインプラントの処方について、３つのバイアルを含むキットが調製され、前記バイアルは、
第一に、凍結乾燥形態にある骨形成タンパク質の２ないし１０ｍｇ、
第二に、０．１５ないし０．５０Ｍの濃度を有する、１０ないし５０ｍｇ／ｍＬの濃度の多糖類とリン酸水素ナトリウムＮａ２ＨＰＯ４及びリン酸二水素ナトリウムＮａＨ２ＰＯ４の等モル混合物溶液２ないし６ｍＬ、
第三に、０．２５ないし０．９０Ｍの濃度の塩化カルシウム溶液の２ないし６ｍＬ
を含有する。
【０２０５】
一の態様において、第二のバイアルはまた、０．０５ないし０．８Ｍの濃度の重炭酸ナトリウムを含有する。
【０２０６】
一の態様において、第二及び第三のバイアルはまた、０．０２ないし０．２Ｍの濃度のヒスチジン溶液を含有する。
【０２０７】
一の態様において、第三のバイアルはまた、０．０５ないし０．３Ｍの濃度でプロリン溶液を含有する。
【０２０８】
溶液は、移植と同時に、又は直前に、１５ないし３０ｍＬの容量を有するコラーゲンスポンジに添加される。
【０２０９】
一の態様において、本発明に従う共沈物を含有するインプラントの処方について、
第一に、０．３３ないし２ｍｇ／ｍＬの濃度の骨形成タンパク質を含有する１ないし３ｍＬ容量、
第二に、５ないし１５ｍｇ／ｍＬの濃度の多糖類、並びに、０．０５ないし０．１５Ｍの濃度を有するリン酸水素ナトリウムＮａ２ＨＰＯ４及びリン酸二水素ナトリウムＮａＨ２ＰＯ４の等モル混合物を含有する１ないし３ｍＬ容量、
第三に、０．２５ないし０．５０Ｍの濃度の塩化カルシウムを含有する１ないし３ｍＬ容量
を含有する３種の溶液が一緒に混合される。
【０２１０】
一の態様において、０．２０ないし０．４Ｍの濃度の重炭酸ナトリウム溶液が、得られた混合物に添加される。
【０２１１】
一の態様において、０．０２ないし０．１５Ｍの濃度のヒスチジン溶液が、得られた混合物に添加される。
【０２１２】
一の態様において、０．０５ないし０．３Ｍの濃度のプロリン溶液が、得られた混合物に添加される。
【０２１３】
本発明に従う共沈物を含有する混合物はその後、凍結乾燥される。
【０２１４】
使用時には、それは、初期容量のおよそ３５％までの注射水及び／又は血液を用いて再水和される。
【０２１５】
本発明はまた、例えば、骨欠損を充填するための、脊椎融合又は顎顔面の復元を行うための、或いは、骨折連結、特に偽関節の欠損を治療するための、移植による本発明の組成物の使用にも関する。
【０２１６】
本発明はまた、骨欠損、とりわけ骨粗鬆症により引き起こされるものの治療のための、及び経皮的に治療され得るあらゆる他の病状のための、注射による本発明の組成物の使用にも関する。
【０２１７】
本発明はまた、骨インプラントとしての本発明に従う組成物の使用にも関する。
【０２１８】
一の態様において、本組成物は、人工脊椎又は籠型脊椎融合の人工器官と組み合わせて使用され得る。
【０２１９】
本発明はまた、骨再構成における、本組成物を使用した治療方法及び外科的方法にも関する。
【０２２０】
これら種々の治療上の使用において、マトリックスの寸法及び骨形成成長因子の量は、治療部位の容量に依存する。
【０２２１】
本発明の種々の態様の例が下記に与えられる。
【０２２２】
キットの例を、限定されない例として与える。
【実施例】
【０２２３】
実施例１：５バイアルを含むキットの調製
キット１：５バイアルのキットは、凍結乾燥形態又は溶液形態にある骨形成タンパク質を含有するバイアル、凍結乾燥形態又は溶液形態にあるポリマーを含有するバイアル、凍結乾燥形態又は溶液形態にある可溶性カルシウム塩を含有するバイアル、凍結乾燥形態又は溶液形態にある可溶性リン酸塩を含有するバイアル、及び凍結乾燥形態又は溶液形態にある塩基を含有するバイアルを含む。
【０２２４】
実施例２：４バイアルを含むキットの調製
キット２：４バイアルのキットは、凍結乾燥形態又は溶液形態にある骨形成タンパク質を含有するバイアル、凍結乾燥形態又は溶液形態にあるポリマーを含有するバイアル、凍結乾燥形態又は溶液形態にある可溶性カルシウム塩を含有するバイアル、及び凍結乾燥形態又は溶液形態にある可溶性リン酸塩を含有するバイアルを含む。
【０２２５】
実施例３：４バイアルを含むキットの調製
キット３：４バイアルのキットは、凍結乾燥形態又は溶液形態にある骨形成タンパク質を含有するバイアル、凍結乾燥形態又は溶液形態にあるポリマー及び可溶性リン酸塩を含有するバイアル、凍結乾燥形態又は溶液形態にある可溶性カルシウム塩を含有するバイアル、及び凍結乾燥形態又は溶液形態にある塩基を含有するバイアルを含む。
【０２２６】
実施例４：４バイアルを含むキットの調製
キット４：４バイアルのキットは、凍結乾燥形態又は溶液形態にある骨形成タンパク質を含有するバイアル、凍結乾燥形態又は溶液形態にあるポリマーを含有するバイアル、凍結乾燥形態又は溶液形態にある可溶性カルシウム塩及び塩基を含有するバイアル、及び凍結乾燥形態又は溶液形態にある可溶性リン酸塩を含有するバイアルを含む。
【０２２７】
実施例５：４バイアルを含むキットの調製
キット５：４バイアルのキットは、凍結乾燥形態又は溶液形態にある骨形成タンパク質及びポリマーを含有するバイアル、凍結乾燥形態又は溶液形態にある可溶性カルシウム塩を含有するバイアル、凍結乾燥形態又は溶液形態にある可溶性リン酸塩を含有するバイアル、及び凍結乾燥形態又は溶液形態にある塩基を含有するバイアルを含む。
【０２２８】
実施例６：３バイアルを含むキットの調製
キット６：３バイアルのキットは、凍結乾燥形態又は溶液形態にある骨形成タンパク質を含有するバイアル、凍結乾燥形態又は溶液形態にあるポリマー及び可溶性リン酸塩を含有するバイアル、凍結乾燥形態又は溶液形態にある可溶性カルシウム塩及び塩基を含有するバイアルを含む。
【０２２９】
実施例７：３バイアルを含むキットの調製
キット７：３バイアルのキットは、凍結乾燥形態又は溶液形態にある骨形成タンパク質を含有するバイアル、凍結乾燥形態又は溶液形態にあるポリマー及び可溶性リン酸塩を含有するバイアル、凍結乾燥形態又は溶液形態にある可溶性カルシウム塩を含有するバイアルを含む。
【０２３０】
実施例８：３バイアルを含むキットの調製
キット８：３バイアルのキットは、凍結乾燥形態又は溶液形態にある骨形成タンパク質とポリマーとの複合体を含有するバイアル、凍結乾燥形態又は溶液形態にある可溶性リン酸塩を含有するバイアル、凍結乾燥形態又は溶液形態にある可溶性カルシウム塩及び塩基を含有するバイアルを含む。
【０２３１】
実施例９：３バイアルを含むキットの調製
キット９：３バイアルのキットは、凍結乾燥形態又は溶液形態にある骨形成タンパク質とポリマーとの複合体を含有するバイアル、凍結乾燥形態又は溶液形態にある可溶性リン酸塩を含有するバイアル、及び凍結乾燥形態又は溶液形態にある可溶性カルシウム塩を含有するバイアルを含む。
【０２３２】
実施例１０：２バイアルを含むキットの調製
キット１０：２バイアルのキットは、骨形成タンパク質と凍結乾燥されたポリマーとの複合体及び凍結乾燥形態又は溶液形態にある可溶性リン酸塩を含有するバイアル、並びに凍結乾燥形態又は溶液形態にある可溶性カルシウム塩を含有するバイアルを含む。
【０２３３】
実施例１１：２バイアルを含むキットの調製
キット１１：２バイアルのキットは、骨形成タンパク質と凍結乾燥されたポリマーとの複合体及び凍結乾燥形態又は溶液形態にある可溶性リン酸塩を含有するバイアル、並びに凍結乾燥形態又は溶液形態にある可溶性カルシウム塩及び塩基を含有するバイアルを含む。
【０２３４】
ポリマーの合成例を、限定されない例として与える。
【０２３５】
実施例１２：トリプトファンにより官能化されたデキストランの製造
ポリマー１は、仏国特許出願第０７／０２３１６号明細書に記載の方法に従い、４０ｋｇ／モルの質量平均分子量を有するデキストラン（ファルマコスモス（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ））から得られた、Ｌ−トリプトファンのナトリウム塩により変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートである。トリプトファンにより変性されていなくても、又は変性されていてもよいナトリウムメチルカルボキシレートのモル分率、即ち、本願式ＩＩＩ中のｔは、１．０３である。トリプトファンにより変性されたナトリウムメチルカルボキシレートのモル分率、即ち式ＩＩＩ中のｐは、０．３６である。
【０２３６】
実施例１３：オクタノールフェニルアラニネートにより官能化されたデキストランの製造
ポリマー２は、特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２００９００７０５４に記載の方法に従い、４０ｋｇ／モルの質量平均分子量を有するデキストラン（ファルマコスモス）から得られた、Ｌ−フェニルアラニンのオクタン酸エステルにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートである。Ｌ−フェニルアラニンのオクタン酸エステルにより変性されていなくても、又は変性されていてもよいナトリウムメチルカルボキシレートのモル分率、即ち、本願式Ｘ中のｒは、１．１１である。Ｌ−フェニルアラニンのオクタン酸エステルにより変性されたナトリウムメチルカルボキシレートのモル分率、即ち式ＩＸ中のｑは、０．０９である。
製造最後におけるポリマー２の溶液は、３０．４５ｍｇ／ｍＬであった。
【０２３７】
実施例１４：オクタノールグリシネートにより官能化されたデキストランの製造
ポリマー３は、仏国特許出願第０８／０５５０６号明細書に記載の方法に従い、４０ｋｇ／モルの質量平均分子量を有するデキストラン（ファルマコスモス）から得られた、Ｌ−グリシンのオクタン酸エステルにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートである。Ｌ−グリシンのオクタン酸エステルにより変性されていなくても、又は変性されていてもよいナトリウムメチルカルボキシレートのモル分率、即ち、本願式Ｘ中のｒは、１．０９である。Ｌ−グリシンのオクタン酸エステルにより変性されたナトリウムメチルカルボキシレートのモル分率、即ち式ＩＸ中のｑは、０．２２である。
【０２３８】
実施例１５：トリプトファンにより官能化されたデキストランの製造
ポリマー４は、仏国特許出願第０７／０２３１６号明細書に記載の方法に従い、７０ｋｇ／モルの質量平均分子量を有するデキストラン（ファルマコスモス）から得られた、Ｌ−トリプトファンのナトリウム塩により変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートである。トリプトファンにより変性されていなくても、又は変性されていてもよいナトリウムメチルカルボキシレートのモル分率、即ち、本願式ＩＩＩ中のｔは、１．１４である。トリプトファンにより変性されたナトリウムメチルカルボキシレートのモル分率、即ち式ＩＩＩ中のｐは、０．４１である。
【０２３９】
実施例１６：オクタノールフェニルアラニネートにより官能化されたデキストランの製造
ポリマー５は、仏国特許出願第０８／０５５０６号明細書に記載の方法に従い、４０ｋｇ／モルの質量平均分子量を有するデキストラン（ファルマコスモス）から得られた、Ｌ−フェニルアラニンのオクタン酸エステルにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートである。Ｌ−フェニルアラニンのオクタン酸エステルにより変性されていなくても、又は変性されていてもよいナトリウムメチルカルボキシレートのモル分率、即ち、本願式Ｘ中のｒは、１．１２である。Ｌ−フェニルアラニンのオクタン酸エステルにより変性されたナトリウムメチルカルボキシレートのモル分率、即ち式ＩＸ中のｑは、０．２２である。
【０２４０】
実施例１７：ドデカノールグリシネートにより官能化されたデキストランの製造
ポリマー６は、仏国特許出願第０８／０５５０６号明細書に記載の方法に従い、４０ｋｇ／モルの質量平均分子量を有するデキストラン（ファルマコスモス）から得られた、Ｌ−グリシンのドデカン酸エステルにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートである。Ｌ−フェニルグリシンのドデカン酸エステルにより変性されていなくても、又は変性されていてもよいナトリウムメチルカルボキシレートのモル分率、即ち、本願式Ｘ中のｒは、１．０４である。Ｌ−グリシンのドデカン酸エステルにより変性されたナトリウムメチルカルボキシレートのモル分率、即ち式ＩＸ中のｑは、０．１３である。
【０２４１】
実施例１８：トリプトファンのエチルエステルにより官能化されたデキストランの製造
ポリマー７は、仏国特許出願第０７／０２３１６号明細書に記載の方法に従い、４０ｋｇ／モルの質量平均分子量を有するデキストラン（ファルマコスモス）から得られた、Ｌ−トリプトファンのエチルエステルにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートである。トリプトファンのエチルエステルにより変性されていなくても、又は変性されていてもよいナトリウムメチルカルボキシレートのモル分率、即ち、本願式ＩＩＩ中のｔは、１．０９である。トリプトファンのエチルエステルにより変性されたナトリウムメチルカルボキシレートのモル分率、即ち式ＩＩＩ中のｐは、０．４７である。
【０２４２】
実施例１９：トリプトファンにより官能化されたデキストラン溶液の製造
水３５．２４ｇ中にポリマー１の凍結乾燥物９．１３ｇ（水分含量およそ２５％）を溶解することにより、ポリマー１の濃縮溶液を製造した。溶液を３０分間攪拌した。乾燥抽出物中に決定したポリマー１の濃度は、１６２．９ｍｇ／ｇであった。密度は１．０８であった。ポリマー１の濃度は従って、１７５．９ｍｇ／ｍＬであった。
【０２４３】
実施例２０：オクタノールフェニルアラニネートにより官能化されたデキストラン溶液の製造
水６４ｇ中にポリマー２の凍結乾燥物３．１２ｇ（水分含量１４％）を溶解することにより、４０ｍｇ／ｇのポリマー２溶液を製造した。
【０２４４】
実施例２１：オクタノールグリシネートにより官能化されたデキストラン溶液の製造
水１００ｇ中にポリマー３の凍結乾燥物３．９５ｇ（水分含量４％）を溶解することにより、３８ｍｇ／ｇのポリマー３溶液を製造した。
【０２４５】
骨形成タンパク質の溶液又は凍結乾燥物の例を、限定されない例として与える。
【０２４６】
実施例２２：１ｍＭ  ＨＣｌ緩衝液中のｒｈＢＭＰ−２溶液
１ｍＭ  ＨＣｌ溶液の１０ｍＬを、凍結乾燥させたｒｈＢＭＰ−２の１．５ｍｇに加えることにより、０．１５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液の１０ｍＬを製造した。この溶液を４℃にて２時間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブラン上で無菌的に濾過した。
【０２４７】
実施例２３：インフーズ（ＩｎＦＵＳＥ）緩衝液中のｒｈＢＭＰ−２の溶液
水８００ｍＬを入れた１Ｌの目盛り付きフラスコ中に、５ｇのスクロース、２５ｇのグリシン、３．７２ｇのグルタミン酸、０．１１ｇの塩化ナトリウム及び０．１１ｇのポリソルベート８０を溶解することにより、１Ｌのインフーズ緩衝液を製造した。この溶液のｐＨをその後、１Ｎ水酸化ナトリウム１６．８ｍＬを添加することにより４．５に調節した。インフーズ緩衝液を加えて、最終的に、標線まで目盛り付きフラスコを満たした。１ｍＬインフーズ緩衝液を、凍結乾燥させたｒｈＢＭＰ−２１．５ｍｇに加えることにより、インフーズ緩衝液中の１．５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液の１ｍＬを製造した。この溶液を４℃にて２時間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通して無菌的に濾過した。
溶液をまた、凍結乾燥させることもできる。
【０２４８】
実施例２４：１０ｍＭ  ＨＣｌ緩衝液中のｒｈＢＭＰ−７の溶液
１ｍＭ  ＨＣｌ溶液の１ｍＬを、凍結乾燥させたｒｈＢＭＰ−７の３．８ｍｇに加えることにより、３．８ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−７溶液を製造した。この溶液のｐＨは２．２であった。この溶液を室温にて１５分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブラン上で無菌的に濾過した。
【０２４９】
実施例２５：ｐＨ３．５の５％ラクトース緩衝液中のｒｈＢＭＰ−７溶液
１Ｍ  ＨＣｌを添加することによりｐＨを３．５に設定した５％ラクトース溶液の７．８ｍＬを、凍結乾燥させたｒｈＢＭＰ−７の３０．３ｍｇに加えることにより、３．８ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−７溶液を製造した。この溶液を室温にて１５分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブラン上で無菌的に濾過した。
【０２５０】
実施例２６：１０ｍＭ  ＨＣｌ緩衝液中のｒｈＧＤＦ−５溶液
１０ｍＭ  ＨＣｌ溶液の１ｍＬ溶液を、凍結乾燥させたｒｈＧＤＦ−５の１．５ｍｇに加えることにより、１．５ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液の１ｍＬを製造した。この溶液を４℃にて２時間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブラン上で無菌的に濾過した。
【０２５１】
可溶性リン酸塩溶液の製造例を、限定されない例として与える。
【０２５２】
実施例２７：リン酸ナトリウム溶液
目盛り付きフラスコ中で、無水リン酸水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムの等モル混合物（シグマ（Ｓｉｇｍａ))から１Ｍリン酸ナトリウム溶液を製造した。この溶液を室温で３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブラン上で無菌的に濾過した。
上記備蓄溶液から、さらに希釈したリン酸ナトリウム溶液を製造した。
【０２５３】
可溶性カルシウム塩溶液の製造例を、限定されない例として与える。
【０２５４】
実施例２８：２Ｍ塩化カルシウム溶液
溶液１：目盛り付きフラスコ中で、無水又は水和塩化カルシウム（シグマ）から、２Ｍ塩化カルシウム溶液を製造した。この溶液を、室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブラン上で無菌的に濾過した。
【０２５５】
実施例２９：０．７５Ｍ塩化カルシウム溶液
溶液２：前実施例に記載の２Ｍ塩化カルシウム溶液を希釈することにより、０．７５Ｍ塩化カルシウム溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブラン上で無菌的に濾過した。
【０２５６】
実施例３０：０．７５Ｍ酢酸カルシウム溶液
溶液３：目盛り付きフラスコ中で、酢酸カルシウム（シグマ）から、０．７５Ｍ酢酸カルシウム溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブラン上で無菌的に濾過した。
【０２５７】
実施例３１：０．７５Ｍグルコン酸カルシウム溶液
溶液４：目盛り付きフラスコ中で、グルコン酸カルシウム（シグマ）から、０．７５Ｍグルコン酸カルシウム溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブラン上で無菌的に濾過した。
【０２５８】
塩基溶液の例を、限定されない例として与える。
【０２５９】
実施例３２：１Ｍヒスチジン溶液
溶液５：１Ｌ目盛り付きフラスコ中で、Ｌ−ヒスチジン（シグマ）１５５．２ｇを、標線に到達するのに必要な容量の脱イオン水中に溶解することにより、１Ｍヒスチジン溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブラン上で無菌的に濾過した。
【０２６０】
実施例３３：２Ｍプロリン溶液
溶液６：１Ｌ目盛り付きフラスコ中で、Ｌ−プロリン（シグマ）２３０．２ｇ、１０Ｎ水酸化ナトリウム２００ｍＬ及び標線に到達するのに必要な容量の脱イオン水を加えることにより、２Ｍプロリン溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブラン上で無菌的に濾過した。
【０２６１】
実施例３４：２Ｍセリン溶液
溶液７：１Ｌ目盛り付きフラスコ中で、Ｌ−セリン（シグマ）２１０．２ｇ、１０Ｎ水酸化ナトリウム２００ｍＬ及び標線に達するのに必要な容量の脱イオン水を加えることにより、２Ｍセリン溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブラン上にて無菌的に濾過した。
【０２６２】
実施例３５：２Ｍグリシン溶液
溶液８：１Ｌ目盛り付きフラスコ中で、Ｌ−グリシン（シグマ）１５０．１ｇ、１０Ｎ水酸化ナトリウム２００ｍＬ及び標線に達するのに必要な容量の脱イオン水を加えることにより、２Ｍグリシン溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブラン上で無菌的に濾過した。
【０２６３】
実施例３６：２Ｍアラニン溶液
溶液９：１Ｌ目盛り付きフラスコ中で、Ｌ−アラニン（シグマ）１７８．２ｇ、１０Ｎ水酸化ナトリウム２００ｍＬ及び標線に達するのに必要な容量の脱イオン水を加えることにより、２Ｍアラニン溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブラン上で無菌的に濾過した。
【０２６４】
実施例３７：２Ｍリシン溶液
溶液１０：１Ｌ目盛り付きフラスコ中で、Ｌ−リシン（シグマ）２９２．４ｇ、１０Ｎ水酸化ナトリウム２００ｍＬ及び標線に達するのに必要な容量の脱イオン水を加えることにより、２Ｍリシン溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブラン上で無菌的に濾過した。
【０２６５】
水か又は前述のカルシウム塩溶液を用いて希釈することにより、これら種々の塩基のさらに低濃度の溶液を得た。
【０２６６】
実施例３８：炭酸水素ナトリウム溶液
目盛り付きフラスコ中で、無水炭酸水素ナトリウム（シグマ）から１．２Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブラン上で無菌的に濾過した。
上記備蓄溶液から、さらに希釈した炭酸水素ナトリウム溶液を製造した。
【０２６７】
実施例３９：ＴＲＩＳ溶液
目盛り付きフラスコ中で、超高純度のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（シグマ）から０．５Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの０．５Ｍ溶液を製造し、そして１Ｍ塩酸を用いてｐＨ７．４に調節した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブラン上で無菌的に濾過した。
【０２６８】
ポリマー及び可溶性リン酸塩を含有する溶液の製造例を、限定されない例として与える。
【０２６９】
実施例４０：ポリマー１及びｐＨ６．５のリン酸ナトリウムを含有する溶液
溶液１１：実施例１５に記載される１７５．９ｍｇ／ｍＬのポリマー１溶液の８．６ｍＬ、実施例２７に記載の１Ｍリン酸ナトリウム溶液の１７ｍＬ及び水１１．９ｍＬを混合することにより、４０ｍｇ／ｍＬのポリマー１溶液及び０．４５Ｍリン酸塩を含有する溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２７０】
実施例４１：ポリマー１及びリン酸ナトリウムを含有する溶液
溶液１２：実施例１５に記載される１７５．９ｍｇ／ｇのポリマー１溶液の５．５ｍＬ、実施例２７に記載される１Ｍリン酸ナトリウム溶液の５．５ｍＬ及び滅菌水１３．０ｍＬを混合することにより、４０ｍｇ／ｍＬのポリマー１及び０．２３Ｍのリン酸ナトリウムを含有する溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２７１】
実施例４２：ポリマー２及びｐＨ６．５のリン酸ナトリム溶液を含有する溶液
溶液１３：実施例２０に記載の４０ｍｇ／ｇのポリマー２溶液の１０ｍＬ、実施例２７に記載の１Ｍリン酸ナトリウム溶液の９ｍＬ及び水１ｍＬを混合することにより、２０ｍｇ／ｍＬのポリマー２及び０．４５Ｍリン酸塩を含有する溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２７２】
実施例４３：ポリマー１、リン酸ナトリウム及び炭酸水素塩を含有する溶液
溶液１４：実施例１５に記載される１７５．９ｍｇ／ｇのポリマー１溶液の５．５ｍＬ、実施例２７に記載される１Ｍリン酸ナトリウム溶液の５．５ｍＬ、実施例３８に記載される備蓄溶液を希釈することにより得られた０．６Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液の１２．４ｍＬ及び滅菌水０．６ｍＬを混合することにより、４０ｍｇ／ｍＬのポリマー１、０．２３Ｍリン酸ナトリウム及び０．３１Ｍ炭酸水素ナトリウムを含有する溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２７３】
実施例４４：ポリマー１、リン酸ナトリウム及びヒスチジンを含有する溶液
溶液１５：実施例１５に記載される１７５．９ｍｇ／ｇのポリマー１溶液の５．５ｍＬ、実施例２７に記載される１Ｍリン酸ナトリウム溶液の５．５ｍＬ、実施例３２に記載される備蓄溶液を希釈することにより得られた０．２Ｍヒスチジン溶液の１０．８ｍＬ及び滅菌水２．２ｍＬを混合することにより、４０ｍｇ／ｍＬのポリマー１、０．２３Ｍリン酸ナトリウム及び０．０９Ｍヒスチジンを含有する溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２７４】
実施例４５：ポリマー２、リン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムを含有する溶液
溶液１６：実施例１３に記載される３０．４５ｍｇ／ｍＬのポリマー２溶液３．４５ｍＬ、実施例２７において得られた１．２Ｍリン酸ナトリウム溶液の２．０ｍＬ、実施例３８に記載される１．２Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液の２．７ｍＬ及び滅菌水２．４ｍＬを混合することにより、１０ｍｇ／ｍＬのポリマー２、０．２３Ｍのリン酸ナトリウム及び０．３１Ｍの炭酸水素ナトリウムを含有する溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２７５】
実施例４６：ポリマー５、リン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムを含有する溶液
溶液１７：実施例１６に記載される３６．８７ｍｇ／ｍＬのポリマー５溶液の１．３ｍＬ、実施例２７において得られた１．２Ｍリン酸ナトリウム溶液の０．４５ｍＬ及び実施例３８に記載される１．２Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液の０．６ｍＬを混合することにより、２０ｍｇ／ｍＬのポリマー５、０．２３Ｍのリン酸ナトリウム及び０．３１Ｍの炭酸水素ナトリウムを含有する溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２７６】
実施例４７：ポリマー６、リン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムを含有する溶液
溶液１８：実施例１７に記載されるポリマー６溶液の１．０ｍＬ、実施例２７において得られた１．２Ｍリン酸ナトリウム溶液の０．４５ｍＬ、実施例３８に記載される１．２Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液の０．６ｍＬ及び滅菌水０．３ｍＬを混合することにより、２０ｍｇ／ｍＬのポリマー６、０．２３Ｍのリン酸ナトリウム及び０．３１Ｍの炭酸水素ナトリウムを含有する溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２７７】
実施例４８：ポリマー７、リン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムを含有する溶液
溶液１９：実施例１８に記載される７５．９ｍｇ／ｍＬのポリマー７溶液の１．２６ｍＬ、実施例２７において得られた１．２Ｍリン酸ナトリウム溶液の０．４５ｍＬ、実施例３８に記載される１．２Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液の０．６ｍＬ及び滅菌水０．０６ｍＬを混合することにより、４０ｍｇ／ｍＬのポリマー７、０．２３Ｍのリン酸ナトリウム及び０．３１Ｍの炭酸水素ナトリウムを含有する溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２７８】
骨形成タンパク質とポリマーとの複合体の製造例を、限定されない例として与える。
【０２７９】
実施例４９：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体の製造
溶液２０：１．４６ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液の２２μＬを、６０．０ｍｇ／ｍＬのポリマー１溶液の２６７μＬ及び滅菌水の３５１μＬに添加した。このｒｈＢＭＰ−２及びポリマー１の溶液はｐＨ７．４であった。この溶液を４℃にて２時間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２８０】
実施例５０：ｒｈＢＭＰ−７／ポリマー１複合体の製造
溶液２１：１．５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−７溶液５０μＬを、６０．６ｍｇ／ｍＬのポリマー１溶液の１００μＬと混合した。このｒｈＢＭＰ−７及びポリマー１の溶液はｐＨ７．４であった。この溶液を４℃にて２時間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２８１】
実施例５１：ｒｈＢＭＰ−７／ポリマー２複合体の製造
溶液２２：０．１５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−７溶液５０μＬを、２２．７ｍｇ／ｍＬのポリマー２溶液の１００μＬと混合した。このｒｈＢＭＰ−７及びポリマー２の溶液はｐＨ７．４であった。この溶液を４℃にて２時間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２８２】
実施例５２：ｒｈＧＤＦ−５／ポリマー２複合体の製造
溶液２３：１．５ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−２溶液５０μＬを、２２．７ｍｇ／ｍＬのポリマー２溶液を１００μＬと混合した。このｒｈＧＤＦ−５及びポリマー２の溶液はｐＨ７．４であった。この溶液を４℃にて２時間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２８３】
実施例５３：リン酸ナトリウム存在下でのｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体の製造
溶液２４：ｒｈＢＭＰ−２の７．８５ｍｇのみを含有するインフーズ緩衝液中のｒｈＢＭＰ−２凍結乾燥物の１８４．０ｍｇを、実施例４１に記載される溶液の１９ｍＬに入れた。該溶液を４℃にて２時間インキュベートした。得られた溶液は清澄であり、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２８４】
実施例５４：リン酸ナトリウム及び及び炭酸水素ナトリウムの存在下でのｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体の製造
溶液２５：ｒｈＢＭＰ−２の６．９５ｍｇのみを含有するインフーズ緩衝液中のｒｈＢＭＰ−２凍結乾燥物の１６５．５ｍｇを、実施例４３に記載される溶液の１７．１ｍＬに入れた。該溶液を４℃にて２時間インキュベートした。得られた溶液は清澄であり、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２８５】
実施例５５：リン酸ナトリウム及びヒスチジンの存在下でのｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体の製造
溶液２６：ｒｈＢＭＰ−２の６．９５ｍｇのみを含有するインフーズ緩衝液中のｒｈＢＭＰ−２凍結乾燥物の１６５．５ｍｇを、実施例４４に記載される溶液の１７．１ｍＬに入れた。該溶液を４℃にて２時間インキュベートした。得られた溶液は清澄であり、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２８６】
実施例５６：リン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムの存在下でのｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体の製造
溶液２７：インフーズ緩衝液中の１．５５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液の１．９８ｍＬを、１７４．７ｍｇ／ｇのポリマー１溶液の３．５ｍＬに添加した。次に、０．７４Ｍリン酸ナトリウム及び１．２Ｍ炭酸水素ナトリウム及び滅菌水０．２８ｍＬを含有する溶液の９．６ｍＬをまた添加した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。該混合物の組成は、０．２ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２、４０ｍｇ／ｍＬのポリマー１、０．４５Ｍのリン酸ナトリウム及び０．７５Ｍの炭酸水素ナトリウムであった。
【０２８７】
実施例５７：リン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムの存在下でのｒｈＢＭＰ−７／ポリマー１複合体の製造
溶液２８：１０ｍＭのＨＣｌ緩衝液中の３．６９ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−７溶液の１．７１ｍＬを、実施例１５に記載される１７５．９ｍｇ／ｇのポリマー１溶液の３．４ｍＬに添加した。次に、実施例２７に記載される１Ｍリン酸ナトリウム溶液の３．３ｍＬ及び実施例３８に記載される備蓄溶液を希釈することにより得られた０．６Ｍの炭酸水素ナトリウム溶液の７．５ｍＬ、滅菌水１４．１ｍＬを添加した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。該混合物の組成は、０．２ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−７、２０ｍｇ／ｍＬのポリマー１、０．１１Ｍのリン酸ナトリウム及び０．１５Ｍの炭酸水素ナトリウムであった。
【０２８８】
実施例５８：リン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムの存在下でのｒｈＢＭＰ−２／ポリマー２複合体の製造
溶液２９：インフーズ緩衝液中のｒｈＢＭＰ−２の凍結乾燥物の６５．２ｍｇを、溶液１６の１０．５ｍＬ中に入れた。この溶液を室温にて１時間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。該混合物の組成は、０．４ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２、１０ｍｇ／ｍＬのポリマー２、０．２３Ｍのリン酸ナトリウム及び０．３１Ｍの炭酸水素ナトリウムであった。
【０２８９】
実施例５９：リン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムの存在下でのｒｈＢＭＰ−２／ポリマー５複合体の製造
溶液３０：インフーズ緩衝液中のｒｈＢＭＰ−２の凍結乾燥物の２５．７ｍｇを、溶液１７の２．４ｍＬ中に入れた。この溶液を室温にて１時間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。該混合物の組成は、１．５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２、２０ｍｇ／ｍＬのポリマー５、０．２３Ｍのリン酸ナトリウム及び０．３１Ｍの炭酸水素ナトリウムであった。
【０２９０】
実施例６０：リン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムの存在下でのｒｈＢＭＰ−２／ポリマー６複合体の製造
溶液３１：インフーズ緩衝液中のｒｈＢＭＰ−２の凍結乾燥物の２４．８ｍｇを、溶液１８の２．４ｍＬ中に入れた。この溶液を室温にて１時間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。該混合物の組成は、１．５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２、２０ｍｇ／ｍＬのポリマー６、０．２３Ｍのリン酸ナトリウム及び０．３１Ｍの炭酸水素ナトリウムであった。
【０２９１】
実施例６１：リン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムの存在下でのｒｈＢＭＰ−２／ポリマー７複合体の製造
溶液３２：インフーズ緩衝液中のｒｈＢＭＰ−２の凍結乾燥物の２５．６ｍｇを、溶液１９の２．４ｍＬ中に入れた。この溶液を室温にて１時間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。該混合物の組成は、１．５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２、４０ｍｇ／ｍＬのポリマー７、０．２３Ｍのリン酸ナトリウム及び０．３１Ｍの炭酸水素ナトリウムであった。
【０２９２】
可溶性カルシウム塩及び塩基を含有する溶液の製造例を限定されない例として与える。
【０２９３】
実施例６２：塩化カルシウム及びヒスチジンの溶液
溶液３３：２Ｍ塩化カルシウム溶液の１１２．５ｍＬ、１Ｍヒスチジン溶液の１２０ｍＬ及び６７．５ｍＬの滅菌水を添加することにより、０．７５Ｍ塩化カルシウム及び０．４Ｍヒスチジンを含有する溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２９４】
実施例６３：塩化カルシウム及びプロリンの溶液
溶液３４：２Ｍ塩化カルシウム溶液の１１２．５ｍＬ、２Ｍプロリン溶液の１１２．５ｍＬ及び７５ｍＬの滅菌水を添加することにより、０．７５Ｍ塩化カルシウム及び０．７５Ｍプロリンを含有する溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２９５】
実施例６４：塩化カルシウム及びグリシンの溶液
溶液３５：２Ｍ塩化カルシウム溶液の１１２．５ｍＬ、２Ｍグリシン溶液の１１２．５ｍＬ及び７５ｍＬの滅菌水を添加することにより、０．７５Ｍ塩化カルシウム及び０．７５Ｍグリシンを含有する溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２９６】
実施例６５：塩化カルシウム及びアラニンの溶液
溶液３６：２Ｍ塩化カルシウム溶液の１１２．５ｍＬ、２Ｍアラニン溶液の１１２．５ｍＬ及び７５ｍＬの滅菌水を添加することにより、０．７５Ｍ塩化カルシウム及び０．７５Ｍアラニンを含有する溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２９７】
実施例６６：塩化カルシウム及びリジンの溶液
溶液３７：２Ｍ塩化カルシウム溶液の１１２．５ｍＬ、２Ｍリジン溶液の１１２．５ｍＬ及び７５ｍＬの滅菌水を添加することにより、０．７５Ｍ塩化カルシウム及び０．７５Ｍリジンを含有する溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２９８】
実施例６７：塩化カルシウム及びセリンの溶液
溶液３８：２Ｍ塩化カルシウム溶液の１１２．５ｍＬ、２Ｍセリン溶液の１１２．５ｍＬ及び７５ｍＬの滅菌水を添加することにより、０．７５Ｍ塩化カルシウム及び０．７５Ｍセリンを含有する溶液を製造した。この溶液を室温にて３０分間インキュベートし、そして０．２２μｍメンブランに通すことにより、無菌的に濾過した。
【０２９９】
ＢＭＰ、ポリマー、可溶性カルシウム塩、可溶性リン酸塩及び／又は塩基を含有する注射用懸濁液の製造例を、限定されない例として与える。
【０３００】
実施例６８：塩化カルシウム、リン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムの存在下でのｒｈＢＭＰ−２／ポリマー２複合体の注射用懸濁液の製造
０．４ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２、即ちｒｈＢＭＰ−２の１６０μｇ、１０ｍｇ／ｍＬのポリマー２、即ちポリマー２の４ｍｇ、０．２３Ｍのリン酸ナトリウム、即ち９２μｍｏｌ、及び０．３１Ｍ炭酸水素ナトリウム、即ち１２４μｍｏｌを含有する溶液２９の４００μＬ、及び０．３８Ｍ塩化カルシウム溶液の４００μＬ、即ち１５３μｍｏｌを混合することにより、ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー２複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成懸濁液を得た。注射前に、得られた懸濁液を室温にて１５分間保存した。該懸濁液は２７本の標準規格注射針によって注射可能であった。
【０３０１】
実施例６９：塩化カルシウム、リン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムの存在下でのｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体の注射用懸濁液の製造
０．５２ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２、即ちｒｈＢＭＰ−２の６５０μｇ、２０ｍｇ／ｍＬのポリマー１、即ちポリマー１の２５ｍｇ、０．２３Ｍのリン酸ナトリウム、即ち２８８μｍｏｌ、及び０．３１Ｍ炭酸水素ナトリウム、即ち３８８μｍｏｌを含有する溶液の１２５０μＬ、及び０．３８Ｍ塩化カルシウム溶液の１２５０μＬ、即ち４７７μｍｏｌを混合することにより、ＢＭＰ−２／ポリマー１複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成懸濁液を得た。注射前に、得られた懸濁液を室温にて１５分間保存した。該懸濁液は２７本の標準規格注射針によって注射可能であった。
【０３０２】
ＢＭＰ、ポリマー、可溶性カルシウム塩、可溶性リン酸塩及び／又は塩基を含有するインプラントの製造例を、限定されない例として与える。
【０３０３】
下記実施例に記載されるインプラントは、ヘリスタット（インテグラライフサイエンス，プラインスボロ，ニュージャージー）のような無菌の且つ架橋されたＩ型のコラーゲンスポンジを用いて製造された。該スポンジ容量は、用途に応じて様々であり、ラットの異所に対する用途には２００μＬであり、ウサギの脊椎融合用途については４．５ｍＬであった。
【０３０４】
実施例７０：凍結乾燥させた塩化カルシウム及びリン酸ナトリウムの存在下での、コラーゲンスポンジ／ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体インプラントの製造
インプラント１：溶液２０の４０μＬを、無菌の２００ｍｍ３架橋コラーゲンスポンジ中に導入した。コラーゲンスポンジ中で溶液を３０分間インキュベートし、その後、１．６４Ｍの濃度の塩化カルシウム溶液の１０μＬを添加した。最終的に、リン酸ナトリウム（２２．５ｍｇ／ｍＬ）の８０μＬと１Ｎ塩酸の１０μＬを混合することにより得られた０．０５３Ｍの濃度の中和されたリン酸ナトリウム溶液の９０μＬをスポンジに添加した。該スポンジをその後凍結し、そして無菌的に凍結乾燥した。スポンジ中のｒｈＢＭＰ−２投与量は２μｇであった。
【０３０５】
実施例７１：凍結乾燥させた塩化カルシウム及びリン酸ナトリウムの存在下での、コラーゲンスポンジ／ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体インプラントの製造
インプラント２：溶液２０の４０μＬを、無菌の２００ｍｍ３架橋コラーゲンスポンジ中に導入した。コラーゲンスポンジ中で溶液を３０分間インキュベートし、その後、６．８５Ｍの濃度の塩化カルシウム溶液の１０μＬを添加した。最終的に、リン酸ナトリウム（９３．８ｍｇ／ｍＬ）の８０μＬと１Ｎ塩酸の１０μＬを混合することにより得られた０．２２Ｍの濃度の中和されたリン酸ナトリウム溶液の９０μＬをスポンジに添加した。該スポンジをその後凍結し、そして無菌的に凍結乾燥した。ｒｈＢＭＰ−２投与量は２μｇであった。
【０３０６】
実施例７２：凍結乾燥させた塩化カルシウム及びアスコルビン酸ナトリウムの存在下での、コラーゲンスポンジ／ＢＭＰ−２／ポリマー１複合体インプラントの製造
インプラント３：溶液２０の４０μＬを、無菌の２００ｍｍ３架橋コラーゲンスポンジ中に導入した。コラーゲンスポンジ中で溶液を３０分間インキュベートし、その後、１．６４ｍｇ／ｍＬの濃度の塩化カルシウム溶液の１０μＬを添加した。最終的に、０．４１Ｍの濃度のアルコルビン酸ナトリウム溶液の８０μＬをスポンジに添加した。該スポンジをその後凍結し、そして無菌的に凍結乾燥した。ｒｈＢＭＰ−２投与量は２μｇであった。
【０３０７】
実施例７３：凍結乾燥させた塩化カルシウム及びリン酸ナトリウムの存在下での、コラーゲンスポンジ／ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体インプラントの製造
インプラント４：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成インプラントを、寸法５．０２×２．５４×０．３５ｃｍの架橋コラーゲンスポンジから、即ち４．５２ｍＬの容量のスポンジから得た。該スポンジに対し、０．３２５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２、即ちｒｈＢＭＰ−２の６５０μｇ、６４．５ｍｇ／ｍＬのポリマー１、即ちポリマー１の１２９ｍｇ、及びｐＨ７．４の０．１８Ｍリン酸ナトリウム、即ち３６０μｍｏｌの溶液の２ｍＬを、続いて、１．２Ｍ塩化カルシウム溶液の５００μＬ、即ち塩化カルシウムの６００μｍｏｌを、そして最後に、０．５４Ｍ水酸化ナトリウム溶液の５００μＬ、即ち水酸化ナトリウムの２７０μｍｏｌを添加した。このインプラントをその後、−８０℃にて凍結させ、そして凍結乾燥させた。移植３０分前に、凍結乾燥させたスポンジの各々を、１ｍＬの自家血液に浸した。
【０３０８】
実施例７４：凍結乾燥させた塩化カルシウム及びリン酸ナトリウムの存在下での、コラーゲンスポンジ／ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体インプラントの製造
インプラント５：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成インプラントを、寸法５．０２×２．５４×０．３５ｃｍの架橋コラーゲンスポンジから、即ち４．５２ｍＬの容量のスポンジから得た。該スポンジに対し、０．１６３ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２、即ちｒｈＢＭＰ−２の３２６μｇ、３２．５ｍｇ／ｍＬのポリマー１、即ちポリマー１の６５ｍｇ、及びｐＨ７．４の０．１８Ｍリン酸ナトリウム、即ち３６０μｍｏｌの溶液の２ｍＬを、続いて、１．２Ｍ塩化カルシウム溶液の５００μＬ、即ち塩化カルシウムの６００μｍｏｌを、そして最後に、０．５４Ｍ水酸化ナトリウム溶液の５００μＬ、即ち水酸化ナトリウムの２７０μｍｏｌを添加した。このインプラントをその後、−８０℃にて凍結させ、そして凍結乾燥させた。移植３０分前に、凍結乾燥させたスポンジの各々を、１ｍＬの自家血液に浸した。
【０３０９】
実施例７５：凍結乾燥させた塩化カルシウム及びリン酸ナトリウムの存在下での、コラーゲンスポンジ／ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体インプラントの製造
インプラント６：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成インプラントを、寸法５．０２×２．５４×０．３５ｃｍの架橋コラーゲンスポンジから、即ち４．５２ｍＬの容量のスポンジから得た。該スポンジに対し、０．０８１ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２、即ちｒｈＢＭＰ−２の１６２μｇ、１６．３ｍｇ／ｍＬのポリマー１、即ち３２．５ｍｇ、及びｐＨ７．４の０．１８Ｍリン酸ナトリウム、即ち３６０μｍｏｌの溶液の２ｍＬを、続いて、１．２Ｍ塩化カルシウム溶液の５００μＬ、即ち塩化カルシウムの６００μｍｏｌを、そして最後に、０．５４Ｍ水酸化ナトリウム溶液の５００μＬ、即ち水酸化ナトリウムの２７０μｍｏｌを添加した。このインプラントをその後、−８０℃にて凍結させ、そして凍結乾燥させた。移植３０分前に、凍結乾燥させたスポンジの各々を、１ｍＬの自家血液に浸した。
【０３１０】
実施例７６：凍結乾燥させた塩化カルシウム及びリン酸ナトリウムの存在下での、コラーゲンスポンジ／ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー４複合体インプラントの製造
インプラント７：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー４複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成インプラントを、寸法５．０２×２．５４×０．３５ｃｍの架橋コラーゲンスポンジから、即ち４．５２ｍＬの容量のスポンジから得た。該スポンジに対し、０．０４０ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２、即ちｒｈＢＭＰ−２の８０μｇ、８ｍｇ／ｍＬのポリマー４、即ち１６ｍｇ、及びｐＨ７．４の０．１８Ｍリン酸ナトリウム、即ち３６０μｍｏｌの溶液の２ｍＬを、続いて、１．２Ｍ塩化カルシウム溶液の５００μＬ、即ち塩化カルシウムの６００μｍｏｌを、そして最後に、０．５４Ｍ水酸化ナトリウム溶液の５００μＬ、即ち水酸化ナトリウムの２７０μｍｏｌを添加した。このインプラントをその後、−８０℃にて凍結させ、そして凍結乾燥させた。移植３０分前に、凍結乾燥させたスポンジの各々を、１ｍＬの自家血液に浸した。
【０３１１】
実施例７７：塩化カルシウム及びリン酸ナトリウムの存在下での、コラーゲンスポンジ／ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー４複合体インプラントの製造
インプラント８：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー４複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成インプラントを、寸法５．０２×２．５４×０．３５ｃｍの架橋コラーゲンスポンジから、即ち４．５２ｍＬの容量のスポンジから得た。該スポンジに対し、０．３１１ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２、即ちｒｈＢＭＰ−２の３３０μｇ、６２．３ｍｇ／ｍＬのポリマー４、即ち６６ｍｇ、及びｐＨ７．４の０．３４Ｍリン酸ナトリウム、即ち３６０μｍｏｌの溶液の１０６０μＬを、続いて、３．４Ｍ塩化カルシウム溶液の２７０μＬ、即ち９２０μｍｏｌを、そして最後に、１．３７Ｍ水酸化ナトリウム溶液の２７０μＬ、即ち水酸化ナトリウムの３７０μｍｏｌを添加した。
【０３１２】
実施例７８：塩化カルシウム及びリン酸ナトリウムの存在下での、コラーゲンスポンジ／ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー４複合体インプラントの製造
インプラント９：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー４複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成インプラントを、寸法５．０２×２．５４×０．３５ｃｍの架橋コラーゲンスポンジから、即ち４．５２ｍＬの容量のスポンジから得た。該スポンジに対し、０．１５１ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２、即ちｒｈＢＭＰ−２の１６０μｇ、３０．２ｍｇ／ｍＬのポリマー４、即ち３２ｍｇ、及びｐＨ７．４の０．３４Ｍリン酸ナトリウム、即ち３６０μｍｏｌの溶液の１０６０μＬを、続いて、３．４Ｍ塩化カルシウム溶液の２７０μＬ、即ち９２０μｍｏｌを、そして最後に、１．３７Ｍ水酸化ナトリウム溶液の２７０μＬ、即ち水酸化ナトリウムの３７０μｍｏｌを添加した。
【０３１３】
実施例７９：塩化カルシウム及びリン酸ナトリウムの存在下での、コラーゲンスポンジ／ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー４複合体インプラントの製造
インプラント１０：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー４複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成インプラントを、寸法５．０２×２．５４×０．３５ｃｍの架橋コラーゲンスポンジから、即ち４．５２ｍＬの容量のスポンジから得た。該スポンジに対し、０．３１１ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２、即ちｒｈＢＭＰ−２の３３０μｇ、６２．３ｍｇ／ｍＬのポリマー４、即ち６６ｍｇ、及びｐＨ７．４の０．３４Ｍリン酸ナトリウム、即ち３６０μｍｏｌの溶液の１０６０μＬを、そして最後に、１．７Ｍ塩化カルシウム溶液の５４０μＬ、即ち９２０μｍｏｌを添加した。
【０３１４】
実施例８０：凍結乾燥させた塩化カルシウム及びリン酸ナトリウムの存在下での、コラーゲンスポンジ／ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体インプラントの製造
インプラント１１：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成インプラントを、寸法５．０２×２．５４×０．３５ｃｍの架橋コラーゲンスポンジから、即ち４．５２ｍＬの容量のスポンジから得た。該スポンジに対し、０．１０７ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２、即ちｒｈＢＭＰ−２の１６０μｇ、２１．３ｍｇ／ｍＬのポリマー１、即ち３２ｍｇの溶液の１５００μＬを、続いて、１．２Ｍ塩化カルシウム溶液の５００μＬ、即ち塩化カルシウムの６００μｍｏｌを、続いて、ｐＨ７．４の０．７２Ｍリン酸ナトリウムの５００μＬ、即ち３６０μｍｏｌを、そして最後に、０．５４Ｍ水酸化ナトリウム溶液の５００μＬ、即ち水酸化ナトリウムの２７０μｍｏｌを添加した。このインプラントをその後、−８０℃にて凍結させ、そして凍結乾燥させた。移植３０分前に、凍結乾燥させたスポンジの各々を、１ｍＬの自家血液に浸した。
【０３１５】
実施例８１：塩化カルシウム、リン酸ナトリウム及びヒスチジンの存在下での、コラーゲンスポンジ／ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー４複合体インプラントの製造
インプラント１２：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー４複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成インプラントを、寸法５．０２×２．５４×０．３５ｃｍの架橋コラーゲンスポンジから、即ち４．５２ｍＬの容量のスポンジから得た。該スポンジに対し、０．４１３ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２、即ちｒｈＢＭＰ−２の３３０μｇ、２０．６５ｍｇ／ｍＬのポリマー４、即ち１６．５ｍｇ、及びｐＨ７．４の０．１１５Ｍリン酸ナトリウム、即ち９２μｍｏｌの溶液の８００μＬを、そして最後に、０．３Ｍ塩化カルシウム溶液の８００μＬ、即ち２４０μｍｏｌ、及び０．２Ｍのヒスチジン、即ち１６０μｍｏｌを添加した。
【０３１６】
実施例８２：塩化カルシウム、リン酸ナトリウム及びヒスチジンの存在下での、コラーゲンスポンジ／ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー４複合体インプラントの製造
インプラント１３：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー４複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成インプラントを、寸法５．０２×２．５４×０．３５ｃｍの架橋コラーゲンスポンジから、即ち４．５２ｍＬの容量のスポンジから得た。該スポンジに対し、０．４１３ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２、即ちｒｈＢＭＰ−２の３３０μｇ、２０．６５ｍｇ／ｍＬのポリマー４、即ち１６．５ｍｇ、及びｐＨ７．４の０．２４Ｍリン酸ナトリウム、即ち１９２μｍｏｌの溶液の８００μＬを、そして最後に、０．４Ｍ塩化カルシウム溶液の８００μＬ、即ち３２０μｍｏｌ、及び０．４Ｍのヒスチジン、即ち３２０μｍｏｌを添加した。
【０３１７】
実施例８３：塩化カルシウム、リン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムの存在下での、コラーゲンスポンジ／ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体インプラントの製造
インプラント１４：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成インプラントを、寸法５．０２×２．５４×０．３５ｃｍの架橋コラーゲンスポンジから、即ち４．５２ｍＬの容量のスポンジから得た。該スポンジに対し、０．２ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２、即ちｒｈＢＭＰ−２の１６０μｇ、４０ｍｇ／ｍＬのポリマー１、即ち３２ｍｇ、ｐＨ７．４の０．４５Ｍリン酸ナトリウム、即ち３６０μｍｏｌ、及び０．７５Ｍ炭酸水素ナトリウム、即ち６００μｍｏｌの溶液の８００μＬを、そして最後に、０．７５Ｍ塩化カルシウム溶液の８００μＬ、即ち６００μｍｏｌを添加した。
【０３１８】
実施例８４：塩化カルシウム、リン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムの存在下での、コラーゲンスポンジ／ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体インプラントの製造
インプラント１５：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成インプラントを、寸法５．０２×２．５４×０．３５ｃｍの架橋コラーゲンスポンジから、即ち４．５２ｍＬの容量のスポンジから得た。該スポンジに対し、０．２ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−２、即ちｒｈＢＭＰ−２の１６０μｇ、８ｍｇ／ｍＬのポリマー１、即ち６．４ｍｇ、０．４５Ｍリン酸ナトリウム、即ち３６０μｍｏｌ、及び０．７５Ｍの炭酸水素ナトリウム、即ち６００μｍｏｌを含有する溶液の８００μＬを、そして最後に、０．７５Ｍ塩化カルシウム溶液の８００μＬ、即ち６００μｍｏｌを添加した。
【０３１９】
実施例８５：塩化カルシウム、リン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムの存在下での、コラーゲンスポンジ／ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体インプラントの製造
インプラント１６：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成インプラントを、寸法５．０２×２．５４×０．３５ｃｍの架橋コラーゲンスポンジから、即ち４．５２ｍＬの容量のスポンジから得た。該スポンジに対し、０．２ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−２、即ちｒｈＢＭＰ−２の１６０μｇ、２０．６ｍｇ／ｍＬのポリマー１、即ち１６．５ｍｇ、０．２４Ｍリン酸ナトリウム、即ち１９２μｍｏｌ、及び０．７５Ｍの炭酸水素ナトリウム、即ち６００μｍｏｌを含有する溶液の８００μＬを、そして最後に、０．４Ｍ塩化カルシウム溶液の８００μＬ、即ち３２０μｍｏｌを添加した。
【０３２０】
実施例８６：塩化カルシウム、リン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムの存在下での、コラーゲンスポンジ／ｒｈＢＭＰ−７／ポリマー１複合体インプラントの製造
インプラント１７：０．０７１ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−７、即ちＢＭＰ−７の５μｇ、３１．３ｍｇ／ｍＬのポリマー１、即ちポリマー１の１．５ｍｇ、ｐＨ７．４の０．２４Ｍリン酸ナトリウム、即ち１６．８μｍｏｌ、及び０．４Ｍの炭酸水素ナトリウム、即ち２８μｍｏｌの溶液の７０μＬを用いた、そしてその後の、０．４Ｍ塩化カルシウム溶液の７０μＬ、即ち２８μｍｏｌを用いた、円筒形の架橋Ｉ型コラーゲンスポンジの１９８μＬの連続含浸後に、ＢＭＰ−７／ポリマー１複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成インプラントを得た。このインプラントをその後、−８０℃にて凍結させ、そして凍結乾燥させた。移植３０分前に、凍結乾燥させたスポンジの各々を、４５μＬの自家血液に浸した。
【０３２１】
実施例８７：塩化カルシウム、リン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムの存在下での、コラーゲンスポンジ／ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー２複合体インプラントの製造
インプラント１８：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー２複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成インプラントを、２．２５ｍＬの容量の架橋されたコラーゲンスポンジから得た。該スポンジに対し、０．４ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２、即ちｒｈＢＭＰ−２の１６０μｇ、１０ｍｇ／ｍＬのポリマー２、即ち４ｍｇ、０．２３Ｍリン酸ナトリウム、即ち９２μｍｏｌ、及び０．３１Ｍの炭酸水素ナトリウム、即ち１２４μｍｏｌを含有する溶液２９の４００μＬを、そして最後に、０．３８Ｍ塩化カルシウム溶液の４００μＬ、即ち１５３μｍｏｌを添加した。添加後、１５分間、各々の溶液をスポンジと接触したままとした。これら浸漬時間後に、スポンジを移植のために準備した。
【０３２２】
実施例８８：塩化カルシウム、リン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムの存在下での、コラーゲンスポンジ／ｒｈＢＭＰ−７／ポリマー３複合体インプラントの製造
インプラント１９：０．４１ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−７含有溶液の８００μＬ、即ちＢＭＰ−７の３３０μｇ、１７．５ｍｇ／ｍＬのポリマー３、即ちポリマー３の１４ｍｇ、０．４５Ｍリン酸ナトリウム、即ち３６０μｍｏｌを含有する溶液の８００μＬ、そしてその後の、０．４Ｍ塩化カルシウム、即ち６４８μｍｏｌ、及び０．６１Ｍのプロリン、即ち４８８μｍｏｌを含有する溶液の８００μＬを用いた、架橋されたＩ型コラーゲンスポンジの４５２０μＬ容量の連続含浸後に、ＢＭＰ−７／ポリマー３複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成インプラントを得た。添加後、１５分間、各々の溶液をスポンジと接触したままとした。これら浸漬時間後に、スポンジを移植のために準備した。
【０３２３】
実施例８９：凍結乾燥された塩化カルシウム、リン酸ナトリウム及びヒスチジンの存在下での、コラーゲンスポンジ／ｒｈＧＤＦ−５／ポリマー２複合体インプラントの製造
インプラント２０：０．５ｍｇ／ｍＬのＧＤＦ−５、即ちＧＤＦ−５の７５０μｇ、２０ｍｇ／ｍＬのポリマー２、即ちポリマー２の３０ｍｇを含有する溶液の１５００μＬ、そしてその後の、０．８Ｍ塩化カルシウム、即ち６４８μｍｏｌ、及び０．３８Ｍのヒスチジン、即ち２８５μｍｏｌを含有する溶液の７５０μＬを用いた、架橋されたＩ型コラーゲンスポンジの４５２０μＬ容量の連続含浸後に、ＧＤＦ−５／ポリマー２複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成インプラントを得た。添加後、１５分間、各々の溶液をスポンジと接触したままとした。これら浸漬時間後に、該スポンジを−８０℃にて凍結し、そして凍結乾燥させた。移植３０分前に、凍結乾燥させたスポンジの各々を、１．５ｍＬの自家血液に浸した。
【０３２４】
耐圧縮性マトリックス（Ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｖｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｍａｔｒｉｘ）であるＣＲＭを用いて、下記例に記載されるインプラントを製造した。この材料は、マスターグラフトマトリックス（ＭａｓｔｅｒＧｒａｆｔ  Ｍａｔｒｉｘ）の名称の下でメドトロニックにより販売されている、Ｉ型ウシコラーゲンと、１５％のヒドロキシアパタイト及び８５％のβ−リン酸三カルシウムから成るリン酸カルシウム無機塩相とから成る混合マトリックスである。かかるマトリックス容量は、用途に応じて様々であり、ラットの異所に対する用途には１４０μＬであり、ウサギの脊椎融合用途については５ｍＬであった。
【０３２５】
実施例９０：塩化カルシウム、リン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムの存在下での、ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー２複合体を含有するＣＲＭを囲むコラーゲンスポンジインプラントの製造
インプラント２１：ラビットへの移植前に、インプラント１６を用いて、５．０×１．０×１．０ｃｍ容量の乾燥ＣＲＭ５．０ｍＬの周りを包んだ。
【０３２６】
実施例９１：塩化カルシウム、リン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムの存在下での、ＣＲＭ／ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー２複合体インプラントの製造
インプラント２２：０．１４ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−２、即ちＢＭＰ−２の５μｇ、１４ｍｇ／ｍＬのポリマー２、即ちポリマー２の０．５ｍｇ、０．２３Ｍのリン酸ナトリウム、即ち８μｍｏｌ、及び０．３１Ｍの炭酸水素ナトリウム、即ち１１μｍｏｌの溶液の３５μＬを用いた１５分間の、続いて、０．３８Ｍ塩化カルシウム溶液の３５μＬ、即ち１３μｍｏｌを用いた１５分間の、ＣＲＭ１４０μＬ容量の連続浸漬後に、ＢＭＰ−２／ポリマー２複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成インプラントを得た。かかるＣＲＭを移植のために準備した。
【０３２７】
実施例９２：凍結乾燥された塩化カルシウム、リン酸ナトリウム及びヒスチジンの存在下での、ＣＲＭ／ｒｈＧＤＦ−５／ポリマー２複合体インプラントの製造
インプラント２３：０．８６ｍｇ／ｍＬのＧＤＦ−５、即ちＧＤＦ−５の３０μｇ、１４ｍｇ／ｍＬのポリマー２、即ちポリマー２の０．５ｍｇ、０．２３Ｍのリン酸ナトリウム、即ち８μｍｏｌの溶液の３５μＬを用いた１５分間の、そしてその後の、０．３４Ｍのヒスチジン溶液の１７．５μＬ、即ち６μｍｏｌ、を用いた１５分間の、そして最後に、０．７４Ｍ塩化カルシウム溶液の１７．５μＬ、即ち１３μｍｏｌを用いた１５分間の、ＣＲＭ１４０μＬ容量の連続浸漬後に、ＧＤＦ−５／ポリマー２複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成インプラントを得た。かかるＣＲＭをその後−８０℃にて凍結させ、そして凍結乾燥させた。かかる凍結乾燥させたＣＲＭを、移植３０分前に、４５μＬの自家血液に浸した。
【０３２８】
実施例９３：塩化カルシウム、リン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムの存在下での、ＣＲＭ／ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体インプラントの製造
インプラント２４：０．５２ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−２、即ちＢＭＰ−２の６５０μｇ、２０ｍｇ／ｍＬのポリマー１、即ちポリマー１の２５ｍｇ、０．２３Ｍのリン酸ナトリウム、即ち２８８μｍｏｌ、及び０．３１Ｍの炭酸水素ナトリウム、即ち３８８μｍｏｌの溶液の１２５０μＬを用いた１５分間の、そしてその後の、０．３８Ｍの塩化カルシウム溶液の１２５０μＬ、即ち４７７μｍｏｌを用いた１５分間の、ＣＲＭ５．０ｍＬ容量の連続浸漬後に、ＢＭＰ−２／ポリマー１複合体とリン酸カルシウム粒子との共沈物をベースとした骨形成インプラントを得た。かかるＣＲＭを移植のために準備した。
【０３２９】
比較例１：２０μｇのｒｈＢＭＰ−２を含有するコラーゲンスポンジインプラントの製造
インプラント２５：インフーズ型の緩衝液中の０．５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液の４０μＬを、無菌の２００ｍｍ３架橋コラーゲンスポンジ中に無菌的に導入した。移植前３０分間、該溶液をコラーゲンスポンジ中のままとした。
インプラント２５中のｒｈＢＭＰ−２投与量は２０μｇであった。
【０３３０】
比較例２：２μｇのｒｈＢＭＰ−２を含有するコラーゲンスポンジインプラントの製造
インプラント２６：インフーズ型の緩衝液中の０．０５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液の４０μＬを、ヘリスタット型の無菌の２００ｍｍ３架橋コラーゲンスポンジ（インテグラライフサイエンス，プラインスボロ，ニュージャージー）中に無菌的に導入した。移植前３０分間、該溶液をコラーゲンスポンジ中のままとした。
インプラント２６中のｒｈＢＭＰ−２投与量は２μｇであった。
【０３３１】
比較例３：５μｇのｒｈＢＭＰ−７を含有するコラーゲンスポンジインプラントの製造
インプラント２７：０．０３６ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−７溶液の１４０μＬ、即ち５μｇを用いて、円筒形の架橋Ｉ型のコラーゲンスポンジ１９８μＬを浸漬した後、ＢＭＰ−７をベースとした凍結乾燥された骨形成インプラントを得た。該インプラントをその後、−８０℃にて凍結させ、そして凍結乾燥させた。該凍結乾燥スポンジを、移植前３０分間、４５μＬの自家血液に浸した。
【０３３２】
比較例４：２．３ｍｇのｒｈＢＭＰ−２を含有するコラーゲンスポンジインプラントの製造
インプラント２８：寸法５．０２×２．５４×０．３５ｃｍの架橋Ｉ型コラーゲンスポンジ、即ち４．５２ｍＬ容量のスポンジを、１．４５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液の１６００μＬ、即ち２．３ｍｇを用いて浸漬することにより、骨形成インプラントを得た。該溶液を、移植前３０分間、コラーゲンスポンジ中のままとした。
【０３３３】
比較例５：１．３ｍｇのｒｈＢＭＰ−２を含有するコラーゲンスポンジインプラントの製造
インプラント２９：寸法５．０２×２．５４×０．３５ｃｍの架橋Ｉ型コラーゲンスポンジ、即ち４．５２ｍＬ容量のスポンジを、０．８０ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液の１６００μＬ、即ち１．３ｍｇを用いて浸漬することにより、骨形成インプラントを得た。該溶液を、移植前３０分間、コラーゲンスポンジ中のままとした。
【０３３４】
実施例９４：種々の製剤の骨誘導力の評価
この実験の目的は、ラットにおける異所性の骨形成モデルにおける種々の製剤の骨誘導力を明らかにすることである。体重１５０ないし２５０ｇの雄ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ  ＯＦＡ−ＳＤ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｆｒａｎｃｅ，Ｂ．ｐ．１０９，６９５９２  Ｉ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ）をこの実験のために使用した。
【０３３５】
鎮痛剤処理（ブプレノルフィン，テムゲシック（Ｔｅｍｇｅｓｉｃ）（登録商標），ファイザー株式会社，フランス国）を施した後に、外科的手段を行った。Ｏ２−イソフルラン混合物（１−４％）の吸入により、ラットを麻酔した。広い背中部を刈ることによって毛皮を除去した。この背面部の皮膚を、ポビドン−ヨウ素溶液（ベテジン（Ｖｅｔｅｄｉｎｅ）（登録商標）溶液，ベトキノール（Ｖｅｔｏｑｕｉｎｏｌ），フランス）を用いて消毒した。
【０３３６】
右及び左の背面部の傍脊椎筋を剥き出しにするために、およそ１ｃｍの傍脊椎切開を行った。トランス筋膜切開（ｔｒａｎｓｆａｓｃｉａｌ  ｉｎｃｉｓｉｏｎ）によって筋肉に到達した。各々のインプラントを、圧迫がそこに生じ得ないような方法で、窪みに置いた。ラット１匹当り４つのインプラントを移植した（１部位当り２つのインプラント）。その後、ポリプロピレン糸（プロレン４／０（Ｐｒｏｌｅｎｅ４／０），エチコン（Ｅｔｈｉｃｏｎ），フランス）を用いてインプラントの開口を縫合した。非吸収性縫合糸を用いて皮膚を再び閉じた。その後、ラットをそれぞれのケージに戻し、それらの回復の間、観察し続けた。
【０３３７】
２１日目に、チレタミン−ゾラゼパム（ゾレチル（ＺＯＬＥＴＩＬ）（登録商標）２５−５０ｍｇ／ｋｇ，ＩＭ，バーバック（ＶＩＲＢＡＣ），フランス）の注射によって、ラットを麻酔した。
【０３３８】
その後、ペントバルビタール（ドレタール（ＤＯＬＥＴＨＡＬ）（登録商標），ベトキノール（ＶＥＴＯＱＵＩＮＯＬ），フランス）の投与量を注射することによって、ラットを安楽死させた。その後、各々の部位の肉眼観察を行い、局所的な過敏症（炎症、壊死、出血）のいずれかの兆候、及び、骨及び／又は軟骨組織の存在をも記録し、そして以下のスケールに従い、等級分けした。  ０：なし，１：微弱，２：並み  ３：著しい，４：相当。
【０３３９】
各々インプラントをその移植部位から除去し、肉眼写真を撮った。その後、インプラントの寸法及び質量を決定した。その後、各々のインプラントを、緩衝した１０％ホルムアルデヒド溶液中に保存した。
【０３４０】
結果：
この生体内実験は、ラット背面部の筋肉にインプラントを置いたことによる、ｒｈＢＭＰ−２の骨誘導効果を測定することを可能にしている。非骨部位を異所性であるという。種々の実施例の結果を、下記表にまとめた。
2012509303.tif 000015
【０３４１】
コラーゲンスポンジ中のｒｈＢＭＰ−２の２０μｇ投与量（インプラント２５，比較例１）によって、２１日後に３８ｍｇの平均質量を有する骨化された外植片が得られた。
【０３４２】
コラーゲンスポンジ中のｒｈＢＭＰ−２の２μｇ投与量（インプラント２６，比較例２）によっては、２１日後にコラーゲンインプラントを見出し得るほどの十分ないかなる骨誘導力も有していなかった。
【０３４３】
ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体、塩化カルシウム及びリン酸ナトリウムの存在中において、コラーゲンスポンジ中に凍結乾燥された２μｇのｒｈＢＭＰ−２の投与量（インプラント１，実施例７０、及び、インプラント２，実施例７１）によって、同じ投与量のｒｈＢＭＰ−２単独を用いたものとは対照的に、骨化された外植片を生じ得た。さらには、これら外植片は、ｒｈＢＭＰ−２単独のものに相当する骨スコアよりも４倍大きい質量を有していた。従って、かかる製剤は、ｒｈＢＭＰ−２の骨形成活性を改善し得た。
【０３４４】
同様の手法において、ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体及び塩化カルシウムを含有するコラーゲンスポンジに対するアスコルビン酸ナトリウムの添加（インプラント３，実施例７２）によって、ｒｈＢＭＰ−２単独のものに相当する骨スコアよりも、質量の点で４倍大きい骨化外植片が得られた。かかる製剤もまた、ｒｈＢＭＰ−２の骨形成活性を改善し得た。
【０３４５】
実施例９５：後側部融合における種々の製剤の骨誘導力の評価
この研究の目的は、ウサギ後側部融合モデルにおける種々の製剤の骨誘導力を明らかにすることである。かかる研究は、偽関節の誘導が望ましくないために、ニコチンによる処理を省略したことを除き、Ｊ．Ｐ．Ｌａｗｒｅｎｃｅによる刊行物（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｊ．Ｐ．他，Ｓｐｉｎｅ２００７，３２（１１），１２０６−１２１３）に記載された実験プロトコルに従い、行った。
【０３４６】
脊椎融合を、移植された脊柱の触診により評価した。脊椎間の可動性の欠如は、融合と同義である。脊椎中の骨の存在を評価するために、脊柱をまた、１２週間のマイクロＣＴにより解析した。種々のインプラントについて得られた結果を、下記表にまとめた。
2012509303.tif 000016
【０３４７】
ウサギにおけるこれら後側部融合の研究から、リン酸カルシウム塩と共沈したＢＭＰ−２／ポリマー２複合体は、ＢＭＰ−２単独に関するＢＭＰ−２単独の１．３ｍｇと比べ４ないし８倍もＢＭＰ−２投与量を低減し得た。このことは、同様の融合結果を有する本願に従うこのモデルにおいて有効な投与量である。リン酸カルシウム塩と共沈したＢＭＰ−２／ポリマー複合体の場合において、０．１６ｍｇのＢＭＰ−２投与量においても、後側部融合が全てのウサギについて観察された。
【０３４８】
リン酸カルシウム塩と共沈したＢＭＰ−７／コポリマー複合体を含有するインプラントもまた、ＢＭＰ−７の低投与量について、つまりインプラント当り０．３３ｍｇのＢＭＰ−７について、脊椎融合が見られた。かかる結果は、３．５ｍｇのＢＭＰ−７投与量においてさえ、ウサギにおける１００％の脊椎融合が達成されず、上記投与量は、研究されたもの（Ｙａｏ，Ｇ．他，Ｓｐｉｎｅ２００８，３３（１８），１９３５−１９４２）よりもずっと優れていることを示している。
【０３４９】
リン酸カルシウム塩と共沈したＧＤＦ−５／ポリマー複合体を含有するインプラントもまた、ＧＤＦ−５の低投与量で、つまりインプラント当り７５０μｇのＧＤＦ−５で、１００％の脊椎融合を達成した。かかる結果は、２．５ｍｇのＧＤＦ−５投与量においてさえ、ウサギにおける１００％の脊椎融合が達成されず、上記投与量は、研究されたもの（Ｍａｇｉｔ，Ｄａｖｉｄ  Ｐ．他，Ｓｐｉｎｅ２００６，３１（１９），２１８０−２１８８）よりもずっと優れていることを示している。
【国際調査報告】
2012509303.tif 000025
2012509303.tif 000026
2012509303.tif 000027
2012509303.tif 000028
2012509303.tif 000029
2012509303.tif 000030