(57)【要約】陽イオン性ポリマーと核酸と金属イオンとを含む複合体が提供される。いくつかの実施形態において、複合体は、核酸を細胞へ送達するための手段として使用され得る。いくつかの実施形態において、複合体は、遺伝子治療の一部として使用され得る。陽イオン性ポリマーと核酸と金属イオンとを含む複合体を作製する方法もまた記載される。陽イオン性ポリマーと核酸とを含むポリプレックスを凝集する方法もまた提供される。本発明は、陽イオン性ポリマーと核酸と金属イオンとを含む組成物であって、上記陽イオン性ポリマー、上記核酸、および上記金属イオンは複合体を形成する、組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
陽イオン性ポリマーと核酸と金属イオンとを含む組成物であって、該陽イオン性ポリマー、該核酸、および該金属イオンは複合体を形成する、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記陽イオン性ポリマーは約１５，０００ダルトンまたはそれよりも小さい分子量を有する、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、前記陽イオン性ポリマーは約１０，０００ダルトンまたはそれよりも小さい分子量を有する、組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物であって、前記陽イオン性ポリマーは約５，０００ダルトンまたはそれよりも小さい分子量を有する、組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物であって、前記陽イオン性ポリマーは細胞透過ペプチドである、組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物であって、前記陽イオン性ポリマーはＨＩＶ−１  ＴＡＴペプチドである、組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物であって、前記金属イオンはカルシウムである、組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物であって、前記複合体は、約５００ナノメートルより小さいサイズまたは約５００ナノメートルと等しいサイズを有する、組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の組成物であって、前記複合体は、約３０ナノメートル〜約１５０ナノメートルの範囲内のサイズを有する、組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物であって、前記複合体は、約１５０ナノメートルより小さいサイズまたは約１５０ナノメートルと等しいサイズを有する、組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物であって、前記金属イオンは、約２０ミリモル濃度〜約８００ミリモル濃度の範囲内で存在する、組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の組成物であって、前記陽イオン性ポリマーは、約３０％と約１００％の間の陽イオン性アミノ酸を含むペプチドである、組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物であって、前記核酸はＲＮＡである、組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の組成物であって、前記核酸はｓｉＲＮＡである、組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載の組成物であって、前記複合体は５ｍｇ／ｍｌよりも大きいＩＣ５０を有する、組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載の組成物であって、前記複合体は１ｍｇ／ｍｌよりも大きいＩＣ５０を有する、組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載の組成物であって、前記複合体は５００μｇ／ｍｌよりも大きいＩＣ５０を有する、組成物。
【請求項１８】
核酸を陽イオン性ポリマーに加える工程；
該核酸および該陽イオン性ポリマーにポリプレックスを形成させる工程；
金属イオンを該ポリプレックスに加える工程；
該金属イオンおよび該ポリプレックスに複合体を形成させる工程
を包含する方法であって、該複合体は陽イオン性ポリマーと核酸と金属イオンとを含む、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記陽イオン性ポリマーは約１５，０００ダルトンまたはそれよりも小さい分子量を有する、方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法であって、前記陽イオン性ポリマーは約１０，０００ダルトンまたはそれよりも小さい分子量を有する、方法。
【請求項２１】
請求項１８に記載の方法であって、前記陽イオン性ポリマーは約５，０００ダルトンまたはそれよりも小さい分子量を有する、方法。
【請求項２２】
請求項１８に記載の方法であって、前記陽イオン性ポリマーは細胞透過ペプチドである、方法。
【請求項２３】
請求項１８に記載の方法であって、前記陽イオン性ポリマーはＨＩＶ−１  ＴＡＴペプチドである、方法。
【請求項２４】
請求項１８に記載の方法であって、前記金属イオンはカルシウムである、方法。
【請求項２５】
請求項１８に記載の方法であって、前記複合体は、約５００ナノメートルよりも小さいサイズまたは約５００ナノメートルと等しいサイズを有する、方法。
【請求項２６】
請求項１８に記載の方法であって、前記複合体は、約３０ナノメートル〜約１５０ナノメートルの範囲内のサイズを有する、方法。
【請求項２７】
請求項１８に記載の方法であって、前記複合体は、約１５０ナノメートルよりも小さいサイズまたは約１５０ナノメートルと等しいサイズを有する、方法。
【請求項２８】
請求項１８に記載の方法であって、前記金属イオンは、約２０ミリモル濃度〜約８００ミリモル濃度の範囲内で存在する、方法。
【請求項２９】
請求項１８に記載の方法であって、前記陽イオン性ポリマーは、約３０％と約１００％の間の陽イオン性アミノ酸を含むペプチドである、方法。
【請求項３０】
請求項１８に記載の方法であって、前記核酸はＲＮＡである、方法。
【請求項３１】
請求項１８に記載の方法であって、前記核酸はｓｉＲＮＡである、方法。
【請求項３２】
請求項１８に記載の方法であって、前記複合体は５ｍｇ／ｍｌよりも大きいＩＣ５０を有する、方法。
【請求項３３】
請求項１８に記載の方法であって、前記複合体は１ｍｇ／ｍｌよりも大きいＩＣ５０を有する、方法。
【請求項３４】
請求項１８に記載の方法であって、前記複合体は５００μｇ／ｍｌよりも大きいＩＣ５０を有する、方法。
【請求項３５】
請求項１に記載の組成物を、組織または細胞に導入する工程を包含する、方法。
【請求項３６】
陽イオン性ポリマーと核酸とを含むポリプレックスを提供する工程；および、該ポリプレックスを凝集し複合体を形成するために金属イオンを加える工程、
を包含する方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、前記金属イオンは、２０ミリモル濃度と８００ミリモル濃度の間の濃度を有するカルシウムである、方法。
【請求項３８】
請求項３６に記載の方法であって、前記陽イオン性ポリマーは、約３０％と約１００％の間の陽イオン性アミノ酸を含むペプチドである、方法。
【請求項３９】
請求項３６に記載の方法であって、前記陽イオン性ポリマーは約１５，０００ダルトンまたはそれよりも小さい分子量を有する、方法。
【請求項４０】
請求項３６に記載の方法であって、前記陽イオン性ポリマーは約１０，０００ダルトンまたはそれよりも小さい分子量を有する、方法。
【請求項４１】
請求項３６に記載の方法であって、前記陽イオン性ポリマーは約５，０００ダルトンまたはそれよりも小さい分子量を有する、方法。
【請求項４２】
請求項３６に記載の方法であって、前記核酸はＲＮＡである、方法。
【請求項４３】
請求項３６に記載の方法であって、前記核酸はｓｉＲＮＡである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００８年１１月２６日に出願された米国特許出願第６１／１１８，０６０号に優先権を主張し、前述の米国特許出願は、本明細書中で参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
特定の実施形態によると、本開示は、一般的に核酸送達に関連する。特に、いくつかの実施形態において、本開示は、陽イオン性ポリマーと核酸と金属イオンとを含む複合体を使用して、細胞に核酸を送達するための組成物および方法を提供する。
【０００３】
遺伝子治療、つまり遺伝子発現の治療的操作は、多数の状態（遺伝性疾患および感染性疾患の両方、ならびに癌を含む）のための合理的な新しい処置の選択肢として提案されてきた。遺伝子治療はまた、損傷した組織の局所的な治癒を促進するために使用され得る。さらに最近では、遺伝子発現操作は、干渉ＲＮＡテクノロジーを通して成し遂げられてきた。それぞれのこれらの徴候は、特定の治療標的および別個の送達戦略を必要とする。
【０００４】
治療に関する徴候のための遺伝物質の効率的な発現は、主に、依然として送達の問題のままである。ＤＮＡは、ＤＮＡが分解を回避し、標的細胞に入り、細胞質へと逃げ、そして発現のために細胞核に送達されることができる様式で、パッケージングされなければならない。同様の障壁の干渉ＲＮＡの細胞への送達を妨げる。
【０００５】
現在、細胞への遺伝子導入は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターいずれかに主に頼っている。現在までの最も成功した遺伝子治療の戦略は、ウイルスベクターの使用を採用する。この背景において通例使用されるウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、およびヘルペスウイルスである。しかし、これらベクターは、一般的に、免疫原性、細胞毒性、および変異誘発に関連する問題に苦しんでいる。
【０００６】
非ウイルスベクターは、ウイルスベクターに対するより安全な代案であると典型的に考えられる。通例使用される非ウイルスベクターとしては、ポリマー、リポソーム、ペプチドおよび多糖類が挙げられる。これら物質はまた、ＲＮＡを基本とした治療剤（ＲＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を送達するために探求されている。残念ながら、遺伝子治療の背景における非ウイルスベクターの使用は、一般的に、非効率的であり、時に毒性である。例えば、最近の研究は、ＤＮＡ送達に効果的であるこのポリマー／ＤＮＡ複合体（例えば、ポリエチレンイミン／ＤＮＡ）が高い毒性にしばしば苦しむことを明らかにしている。さらに、ペプチドまたは多糖類を含む、生物分解性ポリマーの遺伝子ベクターは、ウイルスベクターよりも毒性が少なく、インビボで十分に生物分解性であるが、それらは、遺伝子発現レベルおよび遺伝子発現持続性を制御（例えば、増進または減少）することがしばしばできない。分子医学において、これら治療法の現在の可能性を十分に利用するための、非毒性かつ効率的な核酸送達法の切迫した必要性が存在することが、十分に認識されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（概要）
本開示は、陽イオン性ポリマーと核酸と金属イオンとを含む複合体を提供する。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、核酸の細胞への送達のための手段として使用され得る。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、遺伝子治療の一部として使用され得る。陽イオン性ポリマーと核酸と金属イオンとを含む複合体を作製する方法もまた、記載される。さらに、陽イオン性ポリマーと核酸とを含むポリプレックス（ｐｏｌｙｐｌｅｘ）の凝集の方法もまた、提供される。
【０００８】
本開示およびその開示の利点のより完全な理解のために、ここで、同封の図面と組み合わせて以下の説明に参照がなされる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびＴＡＴの両方の細胞毒性試験を示すグラフである。
【図２】図２は、ＣａＣｌ２の細胞毒性試験を示すグラフである。
【図３】図３は、ＰＥＩ複合体（Ｎ／Ｐ  ５，Ｎ／Ｐ  １０）の粒子サイズおよびＴＡＴ−Ｃａ複合体の粒子サイズに対するＣａＣｌ２の濃度の効果を示すグラフである。
【図４】図４は、ＰＥＩ複合体（Ｎ／Ｐ  ５，Ｎ／Ｐ  １０）の電荷およびＴＡＴ−Ｃａ複合体の電荷に対するＣａＣｌ２の濃度の効果を示すグラフである。
【図５】図５は、様々な濃度のＣａＣｌ２でのＴＡＴポリプレックス（ｐｏｌｙｐｌｅｘ）およびＰＥＩポリプレックスの両方のトランスフェクション効率を示すグラフである。
【図６】図６は、０．３ＭのＣａＣｌ２を有するＴＡＴ複合体およびＰＥＩ複合体の両方、ならびに０．３ＭのＣａＣｌ２を有しないＴＡＴ複合体およびＰＥＩ複合体の両方のトランスフェクション効率を示すグラフである。
【図７】図７は、ＴＡＴ−Ｃａ複合体およびＰＥＩ複合体の両方のトランスフェクション効率を示すグラフである。
【図８】図８は、ＴＡＴ複合体およびＰＥＩ複合体の両方に対するＣａＣｌ２の濃度の効果を示すグラフである。
【図９】図９は、ヘパリンの関数として、ＴＡＴ複合体およびＰＥＩ複合体の両方の非パッケージングを示すグラフである。
【図１０】図１０は、ＴＮＢＳアッセイの使用によって、ＴＡＴ複合体およびＰＥＩ複合体の両方の凝集を示すグラフである。
【図１１】図１１は、Ａ５４９細胞において、ＴＡＴ−Ｃａ複合体によって媒介されるルシフェラーゼ遺伝子のサイレンシング効率およびＰＥＩ  ｓｉＲＮＡ（３０ｎＭのｓｉＲＮＡ）複合体によって媒介されるルシフェラーゼ遺伝子のサイレンシング効率を示すグラフである。
【図１２】図１２Ａは、様々なＣａＣｌ２濃度でのｐＤＮＡ−ＣａＣｌ２複合体を示すゲル電気泳動研究である；１＝０．１ＭのＣａＣｌ２、２＝０．２ＭのＣａＣｌ２、３＝０．３ＭのＣａＣｌ２、４＝０．４ＭのＣａＣｌ２、５＝０．５ＭのＣａＣｌ２、６＝０．６ＭのＣａＣｌ２、７＝０．７ＭのＣａＣｌ２、８＝０．８ＭのＣａＣｌ２、９＝０．９ＭのＣａＣｌ２、１０＝１．０ＭのＣａＣｌ２、１１＝３ＭのＣａＣｌ２、１２＝５ＭのＣａＣｌ２、１３＝７ＭのＣａＣｌ２。図１２Ｂは、様々なＮ／Ｐ比での０．３ＭのＣａＣｌ２を有するＴＡＴ−ｐＤＮＡ複合体を示すゲル電気泳動研究である。図１２Ｃは、様々なＮ／Ｐ比でのＴＡＴ−ｐＤＮＡ複合体を示すゲル電気泳動研究である。図１２Ｄは、様々なＣａＣｌ２濃度でのＴＡＴ−ＣａＣｌ２複合体（Ｎ／Ｐ  ２５）を示すゲル電気泳動研究である；１＝０ｍＭのＣａＣｌ２、２＝６２．５ｍＭのＣａＣｌ２、３＝１２５ｍＭのＣａＣｌ２、４＝２５０ｍＭのＣａＣｌ２、５＝３００ｍＭのＣａＣｌ２、７＝４００ｍＭのＣａＣｌ２、８＝５００ｍＭのＣａＣｌ２、および１０＝２ＭのＣａＣｌ２。図１２Ｅは、分枝ＰＥＩ−ｐＤＮＡ複合体を示すゲル電気泳動研究である。図１２Ｆは、直鎖ＰＥＩ−ｐＤＮＡ複合体を示すゲル電気泳動研究である。
【図１３】図１３は、１０％のＦＢＳ非存在下または１０％のＦＢＳ存在下での、Ａ５４９細胞におけるＴＡＴ複合体およびＰＥＩ複合体の両方のトランスフェクション効率を示すグラフである。
【図１４】図１４Ａおよび図１４Ｂは、血清の非存在下での、濃度の関数および時間の関数として粒子サイズの安定性を示すグラフである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、様々な分子量におけるＰＬＬによるｐＤＮＡ（ｐＧＬ３）の凝集を示すグラフである。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、様々な分子量におけるＰＥＩによるｐＤＮＡ（ｐＧＬ３）の凝集を示すグラフである。
【図１６】図１６は、ポリアミンによるｐＤＮＡ（ｐＧＬ３）の凝集に対するＣａＣｌ２の濃度の効果を示すグラフである。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ｐＤＮＡ／ＰＬＬ複合体の遺伝子発現に対するＣａＣｌ２の濃度の効果を示すグラフである。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ複合体の遺伝子発現に対するＣａＣｌ２の濃度の効果を示すグラフである。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ｐＤＮＡ／ポリアミンの遺伝子発現に対するＣａＣｌ２の濃度の効果を示すグラフである。
【図１８Ａ】図１８Ａは、細胞毒性アッセイの結果を示すグラフである。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、細胞毒性アッセイの結果を示すグラフである。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、細胞毒性アッセイの結果を示すグラフである。
【図１８Ｄ】図１８Ｄは、細胞毒性アッセイの結果を示すグラフである。
【図１８Ｅ】図１８Ｅは、細胞毒性アッセイの結果を示すグラフである。
【図１９Ａ】図１９Ａは、ｓｉＲＮＡ送達の結果を示すグラフである。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ｓｉＲＮＡ送達の結果を示すグラフである。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、ｓｉＲＮＡ送達の結果を示すグラフである。
【図１９Ｄ】図１９Ｄは、ｓｉＲＮＡ送達の結果を示すグラフである。
【図１９Ｅ】図１９Ｅは、ｓｉＲＮＡ送達の結果を示すグラフである。
【図１９Ｆ】図１９Ｆは、ｓｉＲＮＡ送達の結果を示すグラフである。
【図２０】図２０は、２日後のＡ５４９細胞における様々なＣＰＰ−Ｃａ／ｐＤＮＡ（０．３Ｍ）の複合体およびＰＥＩ複合体のトランスフェクション効率を示すグラフである。
【図２１】図２１Ａおよび図２１Ｂは、１０％のＦＢＳの非存在下および１０％のＦＢＳの存在下における、経時的なＣＰＰ−Ｃａ／ｐＤＮＡ（０．３Ｍ）の安定性を示すグラフである。
【図２２】図２２は、ＰＥＩおよびＣＰＰの両方の細胞毒性試験を示すグラフである。
【図２３Ａ】図２３Ａは、異なる濃度のＣａＣｌ２（７５ｍＭ、１５０ｍＭ、３００ｍＭ）でのＣＰＰ−Ｃａ／ｐＤＮＡ複合体（Ａｒｇ７／ｐＧＬ３）のトランスフェクション効率を示すグラフである。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、異なる濃度のＣａＣｌ２（７５ｍＭ、１５０ｍＭ、３００ｍＭ）でのＣＰＰ−Ｃａ／ｐＤＮＡ複合体（Ａｒｇ９／ｐＧＬ３）のトランスフェクション効率を示すグラフである。
【図２３Ｃ】図２３Ｃは、異なる濃度のＣａＣｌ２（７５ｍＭ、１５０ｍＭ、３００ｍＭ）でのＣＰＰ−Ｃａ／ｐＤＮＡ複合体（Ａｈｐ／ｐＧＬ３）のトランスフェクション効率を示すグラフである。
【図２３Ｄ】図２３Ｄは、異なる濃度のＣａＣｌ２（７５ｍＭ、１５０ｍＭ、３００ｍＭ）でのＣＰＰ−Ｃａ／ｐＤＮＡ複合体（Ａｌｐ／ｐＧＬ３）のトランスフェクション効率を示すグラフである。
【図２４】図２４は、Ｎ／Ｐ比およびＣａＣｌ２の濃度の両方を変動させた、ＴＡＴ複合体のトランスフェクション効率を示すグラフである。
【図２５Ａ】図２５Ａは、Ｎ／Ｐ比およびＣａＣｌ２の濃度の両方を変動させた、ＴＡＴ２複合体のトランスフェクション効率を示すグラフである。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、Ｎ／Ｐ比およびＣａＣｌ２の濃度の両方を変動させた、ＴＡＴ３複合体のトランスフェクション効率を示すグラフである。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、Ｎ／Ｐ比およびＣａＣｌ２の濃度の両方を変動させた、ＴＡＴ４複合体のトランスフェクション効率を示すグラフである。
【図２５Ｄ】図２５Ｄは、Ｎ／Ｐ比およびＣａＣｌ２の濃度の両方を変動させた、ＴＡＴ５複合体のトランスフェクション効率を示すグラフである。
【図２６】図２６は、ＨｅＬａ細胞において、ＴＡＴ−Ｃａ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ  ｓｉＲＮＡ複合体（５０ｎＭのｓｉＲＮＡ）によって媒介されるＧＡＰＤＨ遺伝子サイレンシング効率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本開示は、様々な改変および代替の形態の余地があるが、具体的な例示的実施形態は図で示され、そして以下でより詳細に記載される。しかしながら、具体的な例示的実施形態の記載は、本発明を開示された特定の形態に限定することを意図せず、しかし対照的に、本開示は、添付された特許請求の範囲によって部分的に例示される、全ての改変および全ての均等物を包含すべきであると理解されるべきである。
【００１１】
（説明）
特定の実施形態によると、本開示は、一般的に核酸送達に関連する。特に、いくつかの実施形態において、本開示は、陽イオン性ポリマーと核酸と金属イオンとを含む複合体を使用して、細胞に核酸を送達するための組成物および方法を提供する。
【００１２】
一つの実施形態において、本開示は、陽イオン性ポリマーと核酸と金属イオンとを含む複合体を提供する。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、核酸のための細胞への送達ビヒクルとして使用され得る。さらに、いくつかの実施形態においては、本開示の複合体は、遺伝子治療の一部として使用され得、そのなかで、宿主細胞は本開示の複合体をトランスフェクトされる。本開示の組成物および方法についての可能性のある多数の利点のうちの一つは、それらが、とりわけ、高い遺伝子発現および／または持続した遺伝子発現を提供し得、そして、通例使用される遺伝子ベクター（例えば、ポリエチレンイミン）と比較して最小の毒性を提示し得ることである。さらに、いくつかの実施形態において、本開示の方法および組成物は、通例使用される遺伝子ベクターと比較した場合、増進したトランスフェクション効率を提供し得る。
【００１３】
前に記載されたように、本開示は、陽イオン性ポリマーを含む複合体を提供する。本開示の組成物において使用に適している陽イオン性ポリマーは、一般的に、陽性に荷電したペプチドであり、いくつかの実施形態において、高い相対的存在量の陽性に荷電したアミノ酸（例えば、リジンまたはアルギニン）を含むアミノ酸組成を有する。いくつかの実施形態において、本開示において使用に適している陽イオン性ポリマーは、約３０％と約１００％の間の陽イオン性アミノ酸を含み得る。上記陽イオン性ポリマーの正電荷が、陽イオン性ポリマーを核酸のうちの負に荷電したリン酸バックボーンと、非共有結合の静電気的相互作用を通して相互作用させると考えられる。そのような静電気的に結合した陽イオン性ポリマー−核酸複合体は、本明細書中で、「ポリプレックス」として言及される。いくつかの実施形態において、本開示における使用に適している陽イオン性ポリマーは、約５，０００ダルトンより小さい分子量または約５，０００ダルトンに等しい分子量を有するペプチドである。他の実施形態において、本開示における使用に適している陽イオン性ポリマーは、約１５，０００ダルトンより小さい分子量または約１５，０００ダルトンに等しい分子量を有するペプチドである。他の実施形態において、本開示における使用に適している陽イオン性ポリマーは、約１０，０００ダルトンより小さい分子量または約１０，０００ダルトンに等しい分子量を有するペプチドである。
【００１４】
特定の実施形態において、上記陽イオン性ポリマーは、ポリプレックスの安定性を改善するためのドメイン、ポリプレックスのサイズを減少させるためのドメイン、そのポリプレックスに機能を付与するためのドメイン（例えば、ターゲッティング）、そのポリプレックスに機能を加えるためのドメイン（例えば、バイオイメージング）、または、当業者にとって明らかである同様の拡張物を含み得る、大きな構築物の一部である。例えば、特定の実施形態において、陽イオン性ポリマーは、上記複合体を目的の領域に標的化するように機能する標的化部分を含み得る。適している標的化部分の例としては、限定されないが、抗体フラグメント、ペプチド、アプタマー（ａｐｔｉｍｅｒｓ）、および低分子が挙げられる。上記陽イオン性ポリマーが複合体を形成することが可能である限り、どのような標的化部分も適している。いくつかの実施形態において、上記標的化部分は、スペーサーを介して陽イオン性ポリマーに連結され得る。適しているスペーサーの例としては、ＰＥＧ、反復親水性アミノ酸から形成されるペプチドなどが挙げられる。上記陽イオン性ポリマーが複合体の形成することが可能である限り、どのようなスペーサーも適している。いくつかの実施形態において、上記スペーサーは、標的化部分に連結され得る。
【００１５】
特定の実施形態において、本開示における使用に適している陽イオン性ポリマーは、細胞透過ペプチド（ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＣＰＰ）を含み得る。ＣＰＰは、非共有結合の相互作用を介して、そのペプチドと関連した核酸の細胞への取り込みを促進し得る短いペプチドである。本開示における使用に適しているＣＰＰは、高い相対的存在量の陽性に荷電したアミノ酸を含むアミノ酸組成を典型的に有する。特定の実施形態において、本開示における使用に適している陽イオン性ポリマーがＣＰＰを含むことが望ましい。なぜなら、ＣＰＰは、生物学上の細胞膜を迅速に横切ることがしばしばできるからである。いくつかの実施形態において、本開示における使用に適しているＣＰＰは、約５，０００ダルトンよりも小さい分子量または約５，０００ダルトンに等しい分子量を有する。
【００１６】
本開示における使用に適しているＣＰＰのひとつの例は、以下で「ＨＩＶ−１  ＴＡＴ」として言及される、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）由来のトランスに活性化させる転写活性化因子（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）（ＴＡＴ）である。ＨＩＶ−１  ＴＡＴは、タンパク質形質導入ドメインおよび核局在配列を含むペプチドである。タンパク質形質導入ドメイン由来のペプチド配列は、酸性環境中でエンドソーム膜を選択的に溶解することができ、それは細胞質放出を導くと考えられる。さらに、ＨＩＶ−１  ＴＡＴペプチドの上記核局在配列は、その内因性の細胞質−核の輸送機構との相互作用に起因して核輸送を促進することが可能である。
【００１７】
陽イオン性ポリマーに加えて、本開示の複合体はまた、核酸を含む。本開示における使用に適している核酸は、細胞に送達するために有用である任意の核酸（例えば、生物活性の核酸（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ））であり得る。本明細書中で使用される用語「核酸」は、リボ核酸（ＲＮＡ）のオリゴマーもしくはポリマー、またはデオキシボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーもしくはポリマー、あるいはその擬似物を表す。この用語は、天然に存在する核酸塩基と糖類と共有ヌクレオチド間（バックボーン）結合からなる核酸、および天然に存在しない同様に作用する部分を有する核酸を含む。そのような改変された核酸または置換された核酸は、望ましい特性（例えば、増進した細胞への取り込み、核酸標的に対する増進した親和性、およびヌクレアーゼ存在下における上昇した安定性）のために、ネイティブの形態よりもしばしば好ましい。いくつかの実施形態において、核酸は、周知の活性メカニズムを達成するために設計された構造を有し得、そして核酸には、限定されないが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、触媒ＲＮＡ（リボザイム）、触媒ＤＮＡ、アプタザイム（ａｐｔａｚｙｍｅ）もしくはアプタマー結合リボザイム、調節可能リボザイム、触媒オリゴヌクレオチド、ヌクレオザイム（ｎｕｃｌｅｏｚｙｍｅ）、ＤＮＡザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）、ＲＮＡ酵素、ミニザイム（ｍｉｎｉｚｙｍｅ）、リードザイム（ｌｅａｄｚｙｍｅ）、オリゴザイム（ｏｌｉｇｏｚｙｍｅ）またはアンチセンス核酸が挙げられ得る。
【００１８】
従って、送達されるべき核酸は、ＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子、またはそれらの任意の改変体もしくはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、上記核酸は、ホスホジエステル結合以外のヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、メチルホスホジエステル結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホルアミデート結合、ホスホトリエステル結合またはリン酸エステル結合）を含み得、これにより上昇した安定性を生じる。オリゴヌクレオチドの安定性はまた、３’−デオキシチミジンまたは２’−置換されたヌクレオチド（例えば、アルキル基で置換）をオリゴヌクレオチドに合成中に組み込むことによって上昇し得、あるいはフェニルイソ尿素誘導体としてオリゴヌクレオチドを提供することによって上昇し得、あるいは他分子（例えば、アミノアクリジンまたはポリ−リジン）をオリゴヌクレオチドの３’末端に連結させることによって上昇し得る。ＲＮＡヌクレオチドの改変および／またはＤＮＡヌクレオチドの改変は、上記オリゴヌクレオチドの至るところまたは上記オリゴヌクレオチドの選択された領域（例えば、５’末端および／または３’末端）において、存在し得る。上記核酸は、標準化学合成法、構成物質であるオリゴヌクレオチドのライゲーション、および上記オリゴヌクレオチドをコードしているＤＮＡの転写を含む、当該分野おける公知の任意の方法によって作製され得る。例えば、上記オリゴヌクレオチドは、周知の技術である固相合成法を介して、簡便かつ慣習的に作製され得る。そのような合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を含むいくつかの業者によって販売される。当該分野における公知のそのような合成のためのどのような他の手段も、付加的にまたは代替的に利用され得る。上記オリゴヌクレオチドはまた、適切なベクターにおける標的配列の全てまたは一部の発現によって、生成され得る。
【００１９】
ひとつの実施形態において、上記核酸は、アンチセンス核酸配列であり得る。そのアンチセンス配列は、５’非翻訳配列の少なくとも一部、３’非翻訳配列の少なくとも一部、またはコードする配列の少なくとも一部に相補的である。そのようなアンチセンス核酸配列は、標的配列と特異的に相互作用（ハイブリッド形成）するための十分な長さでなければならないが、上記核酸が単一の塩基の差異を識別できないほど長くはない。例えば、特異性のために、上記核酸は、長さにおいて少なくとも６つのヌクレオチドである。阻害効率、特異性（交差反応性がないことを含む）などに依存して、より長い配列もまた使用され得る。配列の最大の長さは、その配列のハイブリダイゼーションの特異性の維持に依存し（その特異性は、物質のＧ−Ｃ含有量、融解温度（Ｔｍ）および他の因子に同様に依存する）、計算もしくは実験によって（例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＮＹ，ｐｐ．２．１０．１−２．１０．１６において記載される核酸分子のハイブリダイゼーションを検出するためのストリンジェントな条件）、またはフリーソフトウェアの利用（例えば、Ｏｓｐｒｅｙ  （Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２（１７）：ｅ１３３）もしくはＥＭＢＯＳＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｋ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＥＭＢＯＳＳ））によって容易に決定され得る。
【００２０】
別の実施形態において、上記核酸は、阻害的ＲＮＡ配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）であり得る。阻害ＲＮＡ分子の設計は、当該分野において周知であり、それら設計のための確立したパラメータが公開されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．２００１；２０：６８７７−６８８８）。同様に、ＲＮＡｉ指向性遺伝子サイレンシング（ＲＮＡｉ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を使用する方法は、当該分野において公知であり慣習的に行われ、Ｄ．Ｍ．Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ４：４５７−６７（２００３）およびＪ．Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１７３−７８（２００４）において記載された方法を含む。いくつかの実施形態において、２つのＡＡジヌクレオチド配列で始まる標的配列が好ましい。なぜなら、３’で突出しているＵＵジヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡが最も効果的だからである。ｓｉＲＮＡ設計において、一本鎖のＧ残基でリボヌクレアーゼによって切断されるｓｉＲＮＡの可能性のために、突出部位においてＧ残基は避けることが推奨される。適しているｓｉＲＮＡは、いくつかの方法（例えば、化学合成、インビトロでの転写、ｓｉＲＮＡ発現ベクター、およびＰＣＲ発現カセット）によって生成され得る。
【００２１】
別の実施形態において、上記核酸は、リボザイムであり得る。リボザイムの設計および効力の試験は、当該分野において周知である（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１；６５：１６３６−１６４４）。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ＲＮＡ中に５’  ＵＨ  ３’（配列番号：１）配列（ここでＨは、Ａ、Ｃ、またはＵであり得る）を必要とすること、ヘアピンリボザイムは５’  ＲＹＮＧＵＣ  ３’（配列番号：２）配列（ここでＲは、ＧまたはＡであり得る；ＹはＣまたはＵであり得る；Ｎは任意の塩基を表す）を必要とすること、そしてＤＮＡ−酵素は５’  ＲＹ  ３’（配列番号：３）配列（ここで、ＲはＧまたはＡであり得る；ＹはＣまたはＵであり得る）を必要とすることが、公知である。前記の設計パラメータに基づいて、当業者は、ハンマーヘッド、ヘアピン、またはＤＮＡザイムのフォーマットのいずれかにおいて効果的なリボザイムを設計することができる。所定のリボザイムの相対的な活性を試験するために、共通の標的配列を含むＲＮＡ基質が使用され得る。
【００２２】
陽イオン性ポリマーおよび核酸に加えて、本開示の複合体はまた、金属イオンを含む。一般的に、適している金属イオンは生物適合性であり、適している毒性レベルを有するべきである。特定の実施形態において、上記金属イオンは、複合体を形成するために、陽イオン性ポリマーと核酸とを含むポリプレックスを凝集することができる任意の金属イオンであり得る。適している金属イオンの例としては、二価の金属陽イオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｂａ２＋、およびＣａ２＋）が挙げられる。
【００２３】
本開示の複合体において存在する金属イオンの量は、望ましい結果を達成するために調整され得る。例えば、上記金属イオンは、遺伝子発現を最大にする量（いくつかの適用において、遺伝子発現は金属イオン濃度の関数であり得る）、毒性を最小にする量、上記複合体のサイズを最小／凝集する量（より小さい複合体は、送達（例えば、遺伝子トランスフェクション）を改善する傾向がある）、かつ／または、上記核酸の送達能力を最適化する量（例えば、細胞へ一回送達されるとき上記核酸が陽イオン性ポリマーから外されることができるような濃度を使用すること）で存在し得る。いくつかの実施形態において、上記金属イオン濃度は、約２０ｍＭと約１０００ｍＭの間、好ましくは、約２５ｍＭと約６００ｍＭの間、そしてより好ましくは、約２５ｍＭと約２５０ｍＭの間である。しかしながら、単一の金属イオンまたは金属イオンの混合物を用いた他の実施形態は、本開示の複合体をナノスケールの大きさまで凝集することができるより広い範囲の濃度を有し得、そのことは、細胞への核酸移動のために、効率的かつ／または低い毒性であり得る。
【００２４】
本開示の複合体は、約５００ナノメートル（ｎｍ）よりも小さい直径を一般的に有する。いくつかの実施形態において、本発明の複合体は、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態において、本開示の複合体が細胞へのそれの取り込みを促進するために１５０ｎｍよりも小さい直径を有することが、特に望ましくあり得る。
【００２５】
本開示の複合体は、一般的に、非細胞毒性または最小限に細胞毒性である。特定の実施形態において、本開示の複合体は、約５ｍｇ／ｍｌよりも大きいＩＣ５０（最大の半分を阻害する濃度）または約５ｍｇ／ｍｌと等しいＩＣ５０（最大の半分を阻害する濃度）を有し得る。他の実施形態において、本開示の複合体は、約１ｍｇ／ｍｌよりも大きいＩＣ５０（最大の半分を阻害する濃度）または約１ｍｇ／ｍｌと等しいＩＣ５０（最大の半分を阻害する濃度）を有し得る。他の実施形態において、本開示の複合体は、約５００μｇ／ｍｌよりも大きいＩＣ５０（最大の半分を阻害する濃度）または約５００μｇ／ｍｌと等しいＩＣ５０（最大の半分を阻害する濃度）を有し得る。
【００２６】
特定の実施形態において、本開示は方法を提供し、その方法は、核酸を陽イオン性ポリマーに加える工程；上記核酸および上記陽イオン性ポリマーにポリプレックスを形成させる工程；上記ポリプレックスに金属イオンを加える工程；上記金属イオンおよび上記ポリプレックスに複合体を形成させる工程を含み、ここで、上記複合体は陽イオン性ポリマーと核酸と金属イオンとを含む。
【００２７】
特定の実施形態において、本開示は方法を提供し、その方法は、複合体を形成する陽イオン性ポリマーと核酸と金属イオンとを含む組成物を組織または細胞に導入する工程を含む。
【実施例】
【００２８】
（実施例）
（実施例１）
材料。ホタルのルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＧＬ３、４．８ｋｂｐ）を、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）から得、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５α）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。寒天培地のプレートから選ばれた形質転換したシングルコロニーを、プラスミドＤＮＡの調製のために、ＬＢ  Ｂｒｏｔｈ  Ｂａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）液体中で培養した。プラスミドＤＮＡ（「ｐＤＮＡ」）を、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｇｉｇａ  Ｋｉｔ（５）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を用いて、その製造者の説明書に従って精製した。全てのｐＤＮＡは、ＵＶ／Ｖｉｓ（Ａ２６０／Ａ２８０）による検査によって決定した場合に、１．８またはそれよりも高い純度レベルを有した。ＴＡＴペプチド（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：４）；ＭＷ＝１３３８．８５Ｄａ）を、学内で合成した。Ａｒｇｉｎｉｅ７（Ａｒｇ７）ペプチド、Ａｒｇｉｎｉｎｅ９（Ａｒｇ９）ペプチド、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａヘプタペプチド（Ａｈｐ）ペプチド、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａリーダーペプチド（Ａｌｐ）ペプチドを、π  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から得た。分枝ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、２５ｋＤａ）を、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から得た。塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）およびアガロース培地を、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から購入した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬を（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入した。
【００２９】
ヒトの肺癌細胞系Ａ５４９細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。細胞培養培地  （Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２Ｋ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｌ−グルタミンを含有したＫａｉｇｈｎの改変型）を、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃを通して購入した。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を、Ｈｙｃｌｏｎｅから購入した。ペニシリン−ストレプトマイシンを、ＭＢ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（ＬＬＣ）から購入した。トリプシン−ＥＤＴＡを、Ｇｉｂｃｏを通して購入した。ＭＴＳ試薬［テトラゾリウム化合物；３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，内部塩］を、Ｐｒｏｍｅｇａから購入した。
【００３０】
ＴＡＴ−Ｃａ／ｐＤＮＡ複合体およびＴＡＴ−Ｃａ／ｓｉＲＮＡ複合体の調製。ナノサイズのＴＡＴ−Ｃａ複合体の粒子を、１０μＬのｐＤＮＡ（０．１μｇ／μＬ）または１０μＬのｓｉＲＮＡ（３０−５０ｎＭ）のいずれかを１５μＬのＴＡＴ溶液（１μｇ／μＬ）に迅速に加え攪拌することによって、合成した。この溶液に、既知のモル濃度（例えば、０．３Ｍ）の１５μＬのＣａＣｌ２を加え、激しいピペッティングによって混合し、引き続いて、使用する前に、室温または４℃で２０分〜３０分間インキュベートした。
【００３１】
ＰＥＩ／ｐＤＮＡ複合体の調製。ポリエチレンイミン−ＤＮＡ複合体を、１０μｌのｐＤＮＡ溶液（０．１μｇ／μＬ）を１５μＬのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液（Ｎ／Ｐ比が５または１０）に攪拌しながら滴下（ｄｒｏｐ−ｗｉｓｅ）して加えることによって、調製した。複合体を、１５μＬの適切なバッファー（例えば、ヌクレアーゼなしの水またはＣａＣｌ２）を用いた１．７倍希釈前に、室温で２０分〜３０分間インキュベートした。複合体をそれぞれ個々の実験前に新たに調製した。
【００３２】
サイズ測定およびゼータ電位測定。ＴＡＴまたはＰＥＩを含有する複合体を含む懸濁物を、０．１μｇ／μＬの濃度のｐＤＮＡを用いて、前述のように調製した。光散乱分析が意図される全ての試料を、１０ｍＭのＴｒｉｓバッファー（ｐＨ７．４）（任意の微量の粒子も取り除くために、０．２２μｍ  のフィルターを用いて前もって濾過した）を使用して調製した。粒子サイズを、動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＤＬＳ））によって測定し、その測定には、９０００ＡＴ自己相関器と、５３２ｎｍで作動する５０ｍＷ  ＨｅＮｅレーザー（ＪＤＳ  Ｕｎｉｐｈａｓｅ）と、ＥＭＩ  ９８６３光電子増倍管と、ＢＩ  ２００Ｍゴニオメーターとを備えたＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ（Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ，  ＮＹ）の器機を使用した。入射光から９０°における光散乱を、キュムラント法（ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｃｕｍｕｌａｎｔｓ）を用いた自己相関関数にあてはめた。ゼータ電位測定値を、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｚｅｔａ  ＰＡＬＳ器機を使用した光散乱の位相分析によって得た。上記試料の電気泳動移動度を、印加した電場の１０サイクルの平均から決定した。複合体のゼータ電位を、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ近似法による電気泳動移動度から決定した。
【００３３】
アガロースゲル電気泳動アッセイ。上記のＴＡＴ−Ｃａ／ｐＤＮＡ複合体および上記のＰＥＩ／ＤＮＡ複合体のｐＤＮＡ結合能を、アガロースゲル電気泳動によって分析した。１μｇのルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む、ＴＡＴ−Ｃａ／ｐＤＮＡ複合体およびＰＥＩ／ＤＮＡ複合体を、様々なＮ／Ｐ比で、記載したように調製した。このＮ／Ｐ比とは、プラスミドＤＮＡ中のリン酸基（負電荷を表す）に対する陽イオン性ポリマー中のアミン基（陽電荷を表す）のモル比をいう。様々なＮ／Ｐ比のＤＮＡ複合体の溶液（すなわち、２５μＬ）を、４μＬの１０×Ｔｒｉｓ−アセテート−ＥＤＴＡ  （ＴＡＥ）ゲルランニングバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）および４μＬの１００×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えることによって希釈した。６×ＤＮＡローディングバッファー（７μＬ）を、上記の複合体の溶液に加えた。その混合物は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ色素でのＤＮＡの標識を確実にするために、室温で４０分間インキュベートさせた。その後、複合体を１％アガロース１×ＴＡＥゲルバッファーの個々のウェルに詰め、１１０Ｖで３０分間の電気泳動に供した。同一体積の溶液で希釈された非複合型ＤＮＡをコントロールとして使用した。生じたＤＮＡ移動パターンを、ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）を使用して明らかにした。
【００３４】
細胞培養。ヒトの肺の上皮細胞系Ａ５４９の培養を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎによって提供されたプロトコールに従って行った。Ａ５４９を、１０ｖ／ｖ％のＦＢＳおよび１ｖ／ｖ％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＦ−１２Ｋ中で、３７℃で５％のＣＯ２を含む湿気のある空気（ａｉｒ  ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）中で増殖させた。
【００３５】
インビトロでの細胞トランスフェクション研究。Ａ５４９細胞をトリプシン処理し、計数し、そしておよそ８０，０００細胞／ｍＬの濃度に希釈した。次に、０．１ｍＬのその希釈液を、９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに加え、そして細胞を５％ＣＯ２インキュベーターの湿気のある空気中で、３７℃で２４時間インキュベートした。トランスフェクションの直前に、上記細胞を、ＰＢＳを用いて一度洗浄し、１００μｌの試料（８０％の血清を含まない細胞培養培地に対して２０％の複合体）をそれぞれのウェルに加えた。細胞を上記複合体とともに５時間インキュベートした。次に、トランスフェクション剤を吸引によって取り除き、１００μｌの新しい血清培地を加え、引き続いてさらにインキュベートした。Ｐｒｏｍｅｇａ製のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを、製造者の推薦するプロトコールに従って使用して、遺伝子発現を決定した。発光量（ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔｓ）を、細胞抽出液中のタンパク質濃度に対して正規化した（タンパク質濃度をＣｏｏｍａｓｓｉｅ  ＰｌｕｓＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した）。トランスフェクションの結果を、細胞内タンパク質１ｍｇあたりの相対発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔｓ  （ＲＬＵ））として表した。
【００３６】
細胞毒性アッセイ（ＭＴＳアッセイ）。複合体の細胞毒性を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）によって決定した。Ａ５４９細胞を、トランスフェクション実験で記載したように増殖させた。細胞を、上記試料で約２４時間処理した。次に、培地を取り除き、１００μＬの新しい培養培地と２０μＬのＭＴＳ試薬溶液との混合物で取り替えた。上記細胞を５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で３時間インキュベートした。次に、それぞれのウェルの吸光度を、マイクロタイタープレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ，Ｍ２５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，ＣＡ）を用いて４９０ｎｍで測定し、細胞の生存能力を決定した。
【００３７】
ＴＡＴ／ｐＤＮＡ複合体およびＰＥＩ／ｐＤＮＡ複合体のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎアッセイ。ＴＡＴまたはＰＥＩとの複合体形成（ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ）の後のｐＤＮＡの接近可能性の程度を、二本鎖ＤＮＡ結合試薬ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって評価した。手短に言えば、１０μＬのｐＤＮＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を、１５μＬのＴＡＴ溶液または１５μＬのＰＥＩ溶液と混合し、次に、１５μＬの脱イオン水または１５μＬの金属溶液を加えた。次に、複合体を使用前に３０分間室温で形成させた。インキュベート後、１２０μＬの脱イオン水および１６０μＬの１０×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ溶液を加えた。そして、次に、それぞれの試料のうち８０μＬを９６ウェル細胞培養プレートの三連のウェルに加えた。そのプレートを、蛍光プレートリーダー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５；Ｅｘ．，２５０ｎｍ；Ｅｍ，５２０ｎｍ）によって測定した。
【００３８】
ＴＡＴ／ｐＤＮＡ複合体およびＰＥＩ／ｐＤＮＡ複合体のＴＮＢＳアッセイ。ｐＤＮＡとの複合体形成の後のＴＡＴの遊離アミン基の接近可能性の程度およびｐＤＮＡとの複合体形成の後のＰＥＩの遊離アミン基の接近可能性の程度を、アッセイ試薬として２，４，６−トリニトロ−ベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた比色アッセイ（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）によって測定した。手短に言えば、１０μＬの複合体溶液を１９０μＬの脱イオン水に加え、次に、０．１Ｍの炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ８．５）中の０．０２％のＴＮＢＳ溶液（２００μＬ）を加えた。その溶液を迅速に混合した。３７℃で２時間インキュベート後、８０μＬの試料を９６ウェル細胞培養プレートの三連ウェルに加えた。３３５ｎｍでの吸光度をプレートリーダー（ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５）で決定した。
【００３９】
（結果）
分枝ＰＥＩおよびＣａＣｌ２は細胞毒性（それぞれＩＣ５０が約３５μｇ／ｍＬおよび約０．２１Ｍ）を誘導したのに対して、ＴＡＴは細胞毒性効果の証拠を明らかにせず、細胞は高い生存能力を維持した（図１および図２）。
【００４０】
ＴＡＴ／ｐＤＮＡ複合体へのカルシウムの添加は、粒子サイズにおけるいくらかの増加を示したＰＥＩ／ｐＤＮＡ複合体と比較して、粒子サイズにおける実質的な減少を誘導した（図３）。
【００４１】
ＣａＣｌ２の濃度の上昇につれて、ゼータ電位のわずかな上昇を観測した。その値は１１ｍＶ〜２７ｍＶで変動した（図４）。
【００４２】
ＴＡＴと複合体を形成したルシフェラーゼ遺伝子発現を、トランスフェクションの１日後、ＣａＣｌ２の濃度を関数として、評価した。ＴＡＴ複合体は、ＣａＣｌ２の非存在下で高いトランスフェクション効率を有したＰＥＩと比較して、０．３ＭのＣａＣｌ２においてより高い遺伝子発現レベルを示した（図５）。
【００４３】
ＴＡＴ−Ｃａ／ｐＤＮＡ複合体によって誘導された遺伝子発現レベルは、トランスフェクション効率を有する分枝ＰＥＩと同様であり、はじめの４日間を通して上昇したが、ＰＥＩ／ｐＤＮＡ複合体の遺伝子発現は、同じ期間中著しい減少を示した（図６）。
【００４４】
上記遺伝子発現は、少なくとも１０日間検出可能であり、ＴＡＴ−Ｃａ／ｐＤＮＡ複合体は、ＰＥＩ／ｐＤＮＡ複合体と比較して、８日目および１０日目においてより高い遺伝子発現レベルを維持した（図７）。
【００４５】
ＴＡＴと複合体を形成したｐＤＮＡの接近可能性は、ＣａＣｌ２の濃度が３５０ｍＭ（ストック濃度）よりも高くなった場合に、上昇した。ＰＥＩについては、ＣａＣｌ２の濃度が１０００ｍＭよりも高いと、上記色素に対するｐＤＮＡの接近可能性が上昇するようである（図８）
ＣａＣｌ２を有するＴＡＴおよびＰＥＩ、ならびにＣａＣｌ２を有しないＴＡＴおよびＰＥＩの異なる複合体の非パッケージングを、ヘパリンを用いた競合結合によって決定した。ＣａＣｌ２を有する複合体は、より簡単にヘパリンによって置換された（図９）。
【００４６】
ＴＮＢＳ比色アッセイ（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）を、異なるｐＤＮＡ複合体の遊離アミン基の程度を決定するために、実行した。ＴＡＴ複合体およびＰＥＩ複合体中の遊離アミン基は、ＣａＣｌ２によって部分的に妨げられるようであった（図１０）。
【００４７】
ＴＡＴ−Ｃａ複合体は、Ａ５４９細胞中におけるルシフェラーゼ発現サイレンシングのｓｉＲＮＡサイレンシング（約８０％のサイレンシング）を示し、ＰＥＩ複合体と匹敵した（図１１）。
【００４８】
ゲル電気泳動の結果は、より低いＮ／Ｐ比およびより高いＮ／Ｐ比における蛍光の減少を示し、そのことは、ＴＡＴおよびＰＥＩがｐＤＮＡを完全に覆い保護することを示唆した。対照的に、ＣａＣｌ２は、高い濃度（１Ｍ）でさえも、プラスミドＤＮＡを凝集させる能力がないことを示した（図１２）。
【００４９】
血清は、ＴＡＴ−Ｃａ複合体によって媒介されるトランスフェクション効率を著しくは阻害しなかった。対照的に、ＰＥＩ複合体は、１０％のＦＢＳの存在下で、トランスフェクション効率のわずかな減少を示した（図１３）。
【００５０】
ＣａＣｌ２を有さないＴＡＴ／ｐＤＮＡ複合体によって、粒子は、１時間〜８日間の期間を通して１０％ＦＢＳの非存在下（図１４Ａ）および１０％ＦＢＳの存在下（図１４Ｂ）で、いくらかの凝集挙動を示した。しかしながら、ＴＡＴ−Ｃａ／ｐＤＮＡ複合体は、血清を含まない１０％のＦＢＳの培養培地で同じ期間中、良好な安定性を示した。また一方で、ＰＥＩ／ｐＤＮＡ複合体は、血清およびＣａＣｌ２の非存在下で８日間の期間を通して、安定したままであり、そのサイズを保持したが（図１４Ａ）、ＰＥＩ−Ｃａ／ｐＤＮＡの粒子サイズは、同じ期間中に１０％ＦＢＳ存在下で減少を示した（図１４Ｂ）
（実施例２）
材料。ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）から得た。ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）臭化水素酸塩（分子量は、１，０００−５，０００、１，５００−８，０００、４，０００−１５，０００、１５，０００−３０，０００）、ポリ−Ｌ−アルギニン（ＰＬＡ）塩酸塩（分子量は、５，０００−１５，０００）、ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ＰＬＨ）塩酸塩（分子量５０００以上）、サケ由来プロタミン、仔牛胸腺由来ヒストン、ＰＥＩ  ２５ＫＤ  分枝、ＰＥＩ  ８００  ＫおよびＰＥＩ  ２０００  Ｋ、硫酸マンガン一水和物，および塩化亜鉛を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）から購入した。ルシフェラーゼアッセイキットをＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）から購入した。ＴＡＴペプチドを研究室で固相ペプチド合成法によって、調製した。塩化カルシウム、塩化ニッケル六水和物、硫酸ニッケル六水和物、ＭｎＣｌ２、ＭｎＳＯ４、ＭｇＣｌ２、およびＭｇＳＯ４、塩化コバルト（ＩＩ）、塩化銅（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）を、Ｆｉｓｈｅｒから得た。そうでないと言明しない限り、水とは、ＭｉｌｌｉＱ超純水（抵抗＞１８  ＭΩ  ｃｍ）を意味する。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ＰｌｕｓＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキットを、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＩＬ）から得た。
【００５１】
プラスミド。ホタルのルシフェラーゼ酵素をコードしているプラスミドＤＮＡ（ｐＧＬ３、４．８ｋｂｐ）を、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）から得た。プラスミドｃＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５α）中で増幅し、プラスミドＧｉｇａ  Ｋｉｔ（５）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、そしてその濃度を２６０ｎｍで光度計測により決定した。
【００５２】
細胞培養。ヒトの肺の癌細胞系Ａ５４９を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。それを、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％（ｖ／ｖ）のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＦ−１２Ｋ培地（Ｋａｉｇｈｎ改変型のＨａｍのＦ−１２培地）中で培養した。上記細胞を、９５％の空気および５％のＣＯ２の湿気のある空気中で、単層として培養した。
【００５３】
ＴＡＴ／ｐＤＮＡ複合体およびポリアミン／ｐＤＮＡ複合体の調製。手短に言えば、１５μｌまたは２２．５μｌの水中のＴＡＴまたは水中のポリアミンを、１０μｌまたは１５μｌの水中のｐＤＮＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）に加え、上下にピペッティングすることによって混合した。次に、１５μｌまたは２２．５μｌの水または水中の金属を加え、上下にピペッティングすることによって混合した。複合体を、短時間、微小遠心機（ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）中でスピンダウンした。その複合体を、使用前に、３０分間室温で形成させた。
【００５４】
ポリアミン／ｐＤＮＡ複合体のためのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎアッセイ。ポリアミンとの複合体形成の後のｐＤＮＡの接近可能性の程度を、二本鎖ＤＮＡ結合試薬ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって評価した。手短に言うと、１０μＬのｐＤＮＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を、１５μＬのＴＡＴ溶液またはＰＥＩ溶液と混合し、次に、１５μｌの脱イオン水または金属溶液を加えた。上記複合体を、使用前に、３０分間室温で形成させた。インキュベーション後、１２０μｌの脱イオン水および１６０μｌの１０×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ溶液を加えた。次に、それぞれの試料のうち８０μｌを９６ウェル細胞培養プレートの３連ウェルに加えた。そのプレートを、蛍光プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５；Ｅｘ．，２５０ｎｍ；Ｅｍ．，５２０ｎｍ）によって測定した。
【００５５】
ポリアミン／ｐＤＮＡ複合体のためのＴＮＢＳアッセイ。ｐＤＮＡとの複合体形成後のポリアミンの遊離アミン基の接近可能性の程度を、アッセイ試薬として２，４，６−トリニトロ−ベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた比色アッセイによって測定した。手短に言えば、１０μｌの複合体の溶液を１９０μｌの脱イオン水に加え、次に、０．１Ｍの重炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．５）中の２００μｌのＴＮＢＳ溶液（０．０２％）を加えた。その溶液を迅速に混合した。３７℃で２時間のインキュベーション後、試料のうち８０μｌを９６ウェル細胞培養プレートの三連ウェルに加えた。３３５ｎｍでの吸光度を、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５）で決定した。
【００５６】
インビトロでの細胞トランスフェクション研究。Ａ５４９細胞を、１ウェルあたりおよそ８，０００細胞で９６ウェルプレート上で培養し、湿気のある５％のＣＯ２インキュベーター中で３７℃でインキュベートした。１８時間〜２４時間インキュベート後、培地を取り除き、血清を含まない細胞培養培地で一回洗浄した。次に、その細胞を１００μｌの試料（３つのウェルについて２４０μｌの血清を含まない細胞培養培地を６０μｌの複合体に加えた）で処理した。５時間のトランスフェクション後、細胞を１００μｌの血清培地でさらに培養した。示した時間の後、細胞をＰＢＳで一回洗浄し、１ウェルあたり４０μｌの溶解バッファーを使用して溶解した。２０μｌの細胞の溶解物を使用して、Ｐｒｏｍｅｇａ製のルシフェラーゼアッセイキットによってルシフェラーゼ活性を測定した。５０μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬を加えて、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５）によって蛍光の放出を測定した。別の２０μｌの細胞溶解物を用いて、合計の細胞内タンパク質濃度をＣｏｏｍａｓｓｉｅ  ＰｌｕｓＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＩＬ）によって決定した。それぞれのウェルのルシフェラーゼ活性を、細胞溶解物のタンパク質１μｇにおける相対発光量（ＲＬＵ）に正規化した。
【００５７】
細胞毒性アッセイ。複合体の細胞毒性を、Ｐｒｏｍｅｇａ製のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  キット（ＭＴＳアッセイ）によって決定した。Ａ５４９細胞を１ウェルあたりおよそ８，０００細胞で９６ウェルプレート上で培養し、湿気のある５％のＣＯ２インキュベーター中で３７℃で培養した。１８時間〜２４時間のインキュベート後、培地を取り除き、上記細胞を１００μｌの血清を含まない培地で洗浄した。細胞を上記試料で１２時間〜２４時間処理した。次に、血清を含まない培地を取り除き、１００μｌの新しい培養培地と２０μｌのＭＴＳ試薬溶液との混合液で取り替えた。上記細胞を、１時間〜４時間、３７℃で５％のＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。細胞の生存能力を、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５）によって４９０ｎｍでの吸光度の測定によって評価し、コントロール試料に対するインヒビターで処理した細胞のＡ４９０の比として表した。
【００５８】
トランスフェクション効率。２日後のＡ５４９細胞における、異なるＣＰＰ（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａヘプタペプチド（ＡＨｐ）、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａリーダーペプチド（ＡＬｐ））の複合体およびＰＥＩの複合体のトランスフェクション効率を、表１に示されるペプチドを使用して研究した。
【００５９】
【表１】
2012509904.tif 000002
（結果）
ポリアミンによるｐＤＮＡの凝集。異なる分子量のＰＬＬおよびＰＥＩによるｐＤＮＡ（ｐＧＬ３）の凝集を、図１５Ａおよび図１５Ｂにおいて示す。ＰＬＬおよびＰＥＩの最適のＮ／Ｐ比は、それぞれ２〜４および２．５〜１０であった。
【００６０】
ポリアミンによるｐＤＮＡの凝集に対するＣａＣｌ２の濃度の効果。ＣａＣｌ２の濃度が９３．８ｍＭよりも高かった場合、ＰＬＬ−１，０００−５，０００を用いたｐＤＮＡ（ｐＧＬ３）の凝集は減少した。別の３つのＰＬＬについては、１８７．５ｍＭのＣａＣｌ２の濃度から、ｐＤＮＡ（ｐＧＬ３）の凝集が減少し始めた（図１６）。
【００６１】
ｐＤＮＡ／ポリアミンの遺伝子発現に対するＣａＣｌ２の濃度の効果。４つのタイプのＰＬＬ複合体は、その複合体において４６．９ｍＭのＣａＣｌ２（ＣａＣｌ２のストック濃度は１２５ｍＭ）あたりで最も高い遺伝子発現を示した（図１７Ａ）。ＰＬＡ、プロタミン、ヒストンおよびＰＥＩ−８００は、同様の結果を示した（図１７Ｂおよび図１７Ｃ）。しかしながら、ＰＥＩ−２，０００およびＰＥＩ  ２５ＫＤの遺伝子発現は、ＣａＣｌ２の濃度によって影響されなかった（図１７Ｂ）。
【００６２】
細胞毒性アッセイ。ＰＥＩ−２５ＫＤ、ＰＬＡおよびプロタミンは、Ａ５４９細胞における細胞毒性を示した（図１８Ａおよび図１８Ｂ）。ＩＣ５０は、それぞれ、３０μｇ／ｍｌ、２０１μｇ／ｍｌ、および８９０μｇ／ｍｌであった。ＰＬＨは、その試験の条件では細胞毒性を示さなかった（図１８Ｂ）。ＰＥＩ−８００およびＰＬＬ−１，０００−５，０００のＩＣ５０は、試験された最も高い濃度よりも高かった（図１８Ａおよび図１８Ｃ）。４００μｇ／ｍｌの濃度におけるＰＬＬ−１，０００−５，０００およびＣａＣｌ２を有するその複合体およびＣａＣｌ２を有さないその複合体は、どんな細胞毒性も示さなかった（図１８Ｄ）。単独の、またはその複合体中の４６．９ｍＭのＣａＣｌ２もまた、Ａ５４９細胞において細胞毒性を示さなかった（図１８Ｄおよび図１８Ｅ）。Ａ５４９細胞におけるインキュベート２日後の、ＣａＣｌ２（ＣＰＰ−Ｃａ）存在下での異なるタイプの細胞透過ペプチド（ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）のトランスフェクション効率は、より高い遺伝子発現レベルを示した（図２０）。
【００６３】
（実施例３）
材料。ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）臭化水素酸塩（分子量１，０００−５，０００）、サケ由来プロタミンおよび分枝ＰＥＩ  ２５ＫＤを、Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）から購入した。ルシフェラーゼアッセイキットをＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）から購入した。ＴＡＴペプチドを、研究室で固相ペプチド合成法によって調製した。塩化カルシウムをＦｉｓｈｅｒから得た。そうでないと言明しない限り、水とは、ＭｉｌｌｉＱ超純水（抵抗＞１８  ＭΩ  ｃｍ）を意味する。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ＰｌｕｓＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキットを、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＩＬ）から得た。２１−ヌクレオチド長のルシフェラーゼｓｉＲＮＡ  ＧＬ３およびネガティブコントロールｓｉＲＮＡをＡｍｂｉｏｎから購入した。ｐＧＬ３基本プラスミド（ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄ）のホタルのルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケのルシフェラーゼプラスミドｐＧＬ４．７５および二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステムはＰｒｏｍｅｇａ製だった。
【００６４】
ＰＥＩ／ＤＮＡ（Ｎ／Ｐ＝１０）複合体の調製。手短に言えば、ｐＧＬ３とｐＧＬ４．７５との混合物を含む１５μｌの水中のｐＤＮＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）（ｐＧＬ３対ｐＧＬ４．７５の比は３９対１である）を、２２．５μｌの水中のＰＥＩに加え、上下にピペッティングすることによって混合した。そして、次に２２．５μｌの水を加え、上下にピペッティングすることによって混合した。複合体を、微小遠心機中で短時間スピンダウンし、使用前に、３０分間室温でインキュベートした。
【００６５】
ポリアミン／ｓｉＲＮＡ複合体の調製。手短に言えば、１０μｌの水中のｓｉＲＮＡを１５μｌの水中のペプチドＴＡＴまたは１５μｌの水中の他のポリアミンに加え、上下にピペッティングすることによって混合した。そして、次に、３５μｌの水またはＣａＣｌ２溶液を加え、上下にピペッティングすることによって混合した。複合体を、微小遠心機中で短時間スピンダウンし、使用前に、３０分間室温でインキュベートした。ｓｉＲＮＡを含む、ペプチドＴＡＴ、ＰＥＰおよびＰＬＬ＿１，０００−５，０００のＮ／Ｐ比は、それぞれ３０、１０、および５だった。ｓｉＲＮＡの凝集のためのプロタミンの濃度は、７．５μｇ／ｍｌだった。複合体中のＣａＣｌ２の終濃度は、４６．９ｍＭだった。複合体中のｓｉＲＮＡ濃度は、５０ｎＭおよび２５０ｎＭだった。
【００６６】
コトランスフェクションのためのポリアミン／ｐＧＬ３、ｐＧＬ４．７５およびｓｉＲＮＡ複合体の調製。手短に言えば、１５μｌのｐＧＬ３とｐＧＬ４．７５とｓｉＲＮＡとの水中の混合物（ｐＧＬ３対ｐＧＬ４．７５の比は４対１）を、２２．５μｌの水中のペプチドＴＡＴまたは２２．５μｌの水中のポリアミンに加え、上下にピペッティングすることによって混合した。そして、次に、２２．５μｌの水またはＣａＣｌ２溶液を加え、上下にピペッティングすることによって混合した。複合体を、微小遠心機中で短時間スピンダウンし、使用前に３０分間室温でインキュベートした。ｓｉＲＮＡを含む、ペプチドＴＡＴ、ＰＥＰおよびＰＬＬ  １，０００−５，０００のＮ／Ｐ比は、それぞれ３０、１０および４だった。ｓｉＲＮＡの凝集のためのプロタミンの濃度は７．５μｇ／ｍｌだった。複合体中のＣａＣｌ２の終濃度は、４６．９ｍＭだった。複合体中のｓｉＲＮＡ濃度は２５ｎＭ、５０ｎＭ、１２５ｎＭおよび２５０ｎＭだった。
【００６７】
コトランスフェクションのためのポリアミン／ｐＧＬ３およびｓｉＲＮＡ複合体の調製。手短に言えば、１５μｌのｐＧＬ３とｓｉＲＮＡとの水中の混合物を、２２．５μｌの水中のペプチドＴＡＴまたは２２．５μｌの水中のポリアミンに加え、上下にピペッティングすることによって混合した。そして、次に、２２．５μｌの水またはＣａＣｌ２溶液を加え、上下にピペッティングすることによって混合した。複合体を、微小遠心機中で短時間スピンダウンし、使用前に３０分間室温でインキュベートした。ｐＧＬ３とｓｉＲＮＡとを含む、ペプチドＴＡＴ、ＰＥＰおよびＰＬＬ＿１，０００−５，０００のＮ／Ｐ比は、それぞれ３０、１０および４だった。複合体中のＣａＣｌ２の終濃度は、４６．９ｍＭだった。複合体中のｓｉＲＮＡ濃度は、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１２５ｎＭおよび２５０ｎＭだった。
【００６８】
ｐＤＮＡ複合体およびｓｉＲＮＡ複合体の個別のトランスフェクション。Ａ５４９細胞を、１ウェルあたりおよそ８，０００細胞で９６ウェルプレート上で培養し、湿気のある５％のＣＯ２インキュベーター中で３７℃でインキュベートした。１８時間〜２４時間のインキュベート後、培地を取り除き、血清を含まない細胞培養培地で一回洗浄した。次に、その細胞を１００μｌの試料（３つのウェルについて２４０μｌの血清を含まない細胞培養培地を６０μｌのＰＥＩ／ＤＮＡ複合体（Ｎ／Ｐ＝１０）に加えた）で処理した。４時間のトランスフェクション後、細胞を１００μｌの血清培地で２０時間、さらに培養した。その培地を取り除き、血清を含まない細胞培養培地で再び洗浄した。次に、その細胞を、ｓｉＲＮＡ複合体（３つのウェルについて２４０μｌの血清を含まない細胞培養培地を６０μｌのポリアミン／ｓｉＲＮＡ複合体に加えた）で５時間処理した。示した時間の後、細胞をＰＢＳで一度洗浄し、１ウェルあたり４０μｌの受動的溶解バッファー（ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を使用して溶解した。２０μｌの細胞溶解物を使用して、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）によってルシフェラーゼ活性を測定した。５０μｌのＬＡＲ  ＩＩ試薬を加えて、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５）によってホタルのルシフェラーゼの蛍光の放出を測定した。別の５０μｌのＳｔｏｐ＆ＧＬＯ試薬を加えて、プレートリーダーによってウミシイタケのルシフェラーゼの蛍光の放出を測定した。別の２０μｌの細胞溶解物を用いて、合計の細胞内タンパク質濃度をＣｏｏｍａｓｓｉｅ  ＰｌｕｓＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＩＬ）によって決定した。それぞれのウェルにおけるルシフェラーゼ活性を、細胞溶解物のタンパク質１μｇにおける相対発光量（ＲＬＵ）に正規化した。
【００６９】
ｐＧＬ３とｐＧＬ４．７５とｓｉＲＮＡとの複合体のコトランスフェクション。Ａ５４９細胞を、１ウェルあたりおよそ８，０００細胞で９６ウェルプレート上で培養し、湿気のある５％のＣＯ２インキュベーター中で３７℃でインキュベートした。１８時間〜２４時間のインキュベート後、培地を取り除き、血清を含まない細胞培養培地で一回洗浄した。次に、その細胞を１００μｌの試料（３つのウェルについて２４０μｌの血清を含まない細胞培養培地を６０μｌの複合体に加えた）で処理した。５時間のトランスフェクション後、細胞を１００μｌの血清培地でさらに培養した。示した時間の後、細胞をＰＢＳで一度洗浄し、１ウェルあたり４０μｌの溶解バッファーを使用して溶解した。示した時間の後、細胞をＰＢＳで一回洗浄し、１ウェルあたり４０μｌの受動的溶解バッファーを使用して溶解した。ホタルのルシフェラーゼおよびウミシイタケのルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性を、上述の方法によって測定した。
【００７０】
ｐＧＬ３とｓｉＲＮＡとの複合体のコトランスフェクション。Ａ５４９細胞を、１ウェルあたりおよそ８，０００細胞で９６ウェルプレート上で培養し、湿気のある５％のＣＯ２インキュベーター中で３７℃でインキュベートした。１８時間〜２４時間のインキュベート後、培地を取り除き、血清を含まない細胞培養培地で一回洗浄した。次に、その細胞を１００μｌの試料（３つのウェルについて２４０μｌの血清を含まない細胞培養培地を６０μｌの複合体に加えた）で処理した。５時間のトランスフェクション後、細胞を１００μｌの血清培地でさらに培養した。示した時間の後、細胞をＰＢＳで一回洗浄し、１ウェルあたり４０μｌの溶解バッファーを使用して溶解した。示した時間の後、細胞をＰＢＳで一回洗浄し、１ウェルあたり４０μｌの受動的溶解バッファーを使用して溶解した。ホタルのルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性を、上述の方法によって測定した。
【００７１】
（結果）
ホタルのルシフェラーゼ活性およびウミシイタケのルシフェラーゼ活性を、ＴＡＴとｓｉＲＮＡとの複合体またはＰＥＩとｓｉＲＮＡとの複合体のトランスフェクション後１日〜３日に測定した（図１９Ａ〜図１９Ｃ）。ネガティブコントロールとしてのコントロールｓｉＲＮＡ（非特異性ｓｉＲＮＡ）は、ホタルのルシフェラーゼ活性を阻害しなかった。ＣａＣｌ２の存在下において、ｓｉＲＮＡ（ＧＬ３）は、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子発現についての特異的な阻害を示し、この遺伝子発現は、５０ｎＭのｓｉＲＮＡ（ＧＬ３）で、ウミシイタケのルシフェラーゼ（内部コントロール（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ））と比較して７５％阻害された。ウミシイタケのルシフェラーゼの発現は、ｓｉＲＮＡの存在によって影響されず、このことは、阻害が標的遺伝子に特異的であることを示唆した。ＣａＣｌ２がない場合、ｓｉＲＮＡ（ＧＬ３）は、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子発現の特異的な抑制を示さなかった（図１９Ａ〜図１９Ｃ）。
【００７２】
ＣａＣｌ２存在下での、ＴＡＴとｓｉＲＮＡとｐＧＬ３とｐＧＬ４．７５との複合体またはＰＥＩとｓｉＲＮＡとｐＧＬ３とｐＧＬ４．７５との複合体のコトランスフェクションによって、同様の結果を得た。ＴＡＴ複合体およびＰＥＩ複合体いずれも５０ｎＭのｓｉＲＮＡ（ＧＬ３）によって阻害効果は９０％よりも大きい（図１９Ｄおよび図１９Ｅ）。
【００７３】
ＣａＣｌ２存在下におけるＴＡＴおよびＰＥＩによるｓｉＲＮＡとｐＧＬ３との複合体のコトランスフェクションを実行した。９０％よりも大きい阻害効果を、５０ｎＭのｓｉＲＮＡ（ＧＬ３）で得た（図１９Ｆおよび図１９Ｇ）。
【００７４】
ＣａＣｌ２を含まないＣＰＰ／ｐＤＮＡ複合体によって、粒子は、０時間〜１時間の期間中、１０％のＦＢＳの非存在下および１０％のＦＢＳの存在下でいくらかの凝集挙動を示した。しかしながら、ＣＰＰ−Ｃａ／ｐＤＮＡの複合体は、血清を含まない培養培地および血清を含む培養培地において、同じ期間中、良好な安定性を示した（図２１Ａおよび図２１Ｂ）。
【００７５】
ＣＰＰペプチドは、最小の細胞毒性効果の証拠を明らかにした。Ａｌｐは、高濃度で非常に小さい細胞毒性を示し（ＩＣ５０約２１４４μｇ／ｍＬ）、細胞は高い生存能力を維持し、一方で、分枝ＰＥＩポリマーは、多くの細胞死を誘導した（ＩＣ５０  約３５μｇ／ｍＬ）（図２２）。
【００７６】
ＣＰＰと複合体を形成したルシフェラーゼ遺伝子の発現を、ＣａＣｌ２の濃度およびＮ／Ｐ比の関数として、トランスフェクションの１日後に評価した。ＣＰＰ複合体は、７５ｍＭのＣａＣｌ２および１５０ｍＭのＣａＣｌ２におけるＣＰＰ複合体と比較して、３００ｍＭの添加されたＣａＣｌ２（終濃度は約１１５ｍＭ）においてより高い遺伝子発現レベルを示した（図２３ａ、図２３ｂ、図２３ｃおよび図２３ｄ））。
【００７７】
ＴＡＴと複合体を形成したルシフェラーゼ遺伝子の発現を、ＣａＣｌ２の濃度およびＮ／Ｐ比の関数として、トランスフェクションの１日後に評価した。ＴＡＴ複合体は、７５ｍＭのＣａＣｌ２および１５０ｍＭのＣａＣｌ２におけるＣＰＰ複合体と比較して、３００ｍＭの添加されたＣａＣｌ２においてより高い遺伝子発現レベルを示した（図２４）。
【００７８】
ＴＡＴ２複合体、ＴＡＴ３複合体、ＴＡＴ４複合体、およびＴＡＴ５複合体を形成したルシフェラーゼ遺伝子の発現を、ＣａＣｌ２の濃度およびＮ／Ｐ比の関数として、トランスフェクションの１日後に評価した。ＴＡＴ２、ＴＡＴ３、ＴＡＴ４、およびＴＡＴ５の配列を、以下の表２に示す。
【００７９】
【表２】
2012509904.tif 000003
ＴＡＴ２複合体、ＴＡＴ３複合体、およびＴＡＴ４複合体は、１５０ｍＭのＣａＣｌ２でより高い遺伝子発現レベルを示したが、しかしながら、ＴＡＴ５複合体は、３００ｍＭのＣａＣｌ２でより高い遺伝子発現レベルを明らかにした（図２５Ａ〜図２５Ｄ）。
【００８０】
ＴＡＴ−Ｃａ複合体は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ複合体と比較して、高いサイレンシング効率（約８０％）でのｓｉＲＮＡ（ＧＡＰＤＨ）のＨｅＬａ細胞への首尾よい送達を示した（図２６）。
【００８１】
従って、本発明は、記載された目的および利点、ならびに本発明に本来備わっている目的および利点に達成することに、十分に適合している。多数の変更が当業者によってなされ得るが、そのような変更は、添付された特許請求の範囲によって部分的に例示される本発明の意図の中に包含される。
【図１２ａ）】
2012509904.tif 000004
【図１２ｂ）】
2012509904.tif 000005
【図１２ｃ）】
2012509904.tif 000006
【図１２ｄ）】
2012509904.tif 000007
【図１２ｅ）】
2012509904.tif 000008
【図１２ｆ）】
2012509904.tif 000009
【図１】
2012509904.tif 000010
【図２】
2012509904.tif 000011
【図３】
2012509904.tif 000012
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2012509904.tif 000016
【図８】
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【図９】
2012509904.tif 000018
【図１０】
2012509904.tif 000019
【図１１】
2012509904.tif 000020
【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
2012509904.tif 000023
【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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