(57)【要約】  ヒトＡＤＡＭＴＳ５に結合することができる少なくとも１つの第１の免疫グロブリン可変ドメインを含んでなる単離した抗原結合タンパク質を本明細書に提供する。モノクローナル抗体である本発明の抗原結合タンパク質、前記抗原結合タンパク質を含んでなる医薬組成物および治療法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＡＤＡＭＴＳ５に結合することができる少なくとも１つの第１の免疫グロブリン可変ドメインを含んでなる、単離された抗原結合タンパク質。
【請求項２】
前記抗原結合タンパク質が、抗体またはその断片である、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３】
前記抗体が、モノクローナル抗体またはその断片である、請求項１または２に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体またはその断片が、マウス、キメラ、ヒト化、または完全ヒトである、請求項３に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項５】
前記抗原結合タンパク質が、少なくとも１つの相補性決定領域を含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項６】
前記抗原結合タンパク質が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含んでなる重鎖と、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含んでなる軽鎖とを含んでなるモノクローナル抗体であって、
前記重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、
ａ）アミノ酸配列ＤＡＷＭＤと少なくとも約８０％の配列同一性を有するＣＤＲＨｌ；
ｂ）アミノ酸配列ＥＩＲＨＫＡＮＤＨＡＩＦＹＸＥＳＶＫＧと少なくとも約７０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ２；および
ｃ）アミノ酸配列ＴＹＹＹＧＳＳＹＧＹＣＤＶまたはＰＦＡＹと少なくとも約７０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ３；
の群から選択され、かつ
前記軽鎖の相補性決定領域が、
ｄ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＧＴＴＩＶまたはＲＴＳＥＮＩＹＳＹＬＡと少なくとも約７０％の配列同一性を有するＣＤＲＬｌ；
ｅ）アミノ酸配列ＮＡＫＴＬＡＥまたはＳＡＳＮＲＸＴと少なくとも約７０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ２；および
ｆ）アミノ酸配列ＱＱＹＳＳＹＰＦＴまたはＱＨＨＹＧＴＰＷＴと少なくとも約７０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ３；
の群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含んでなる重鎖と、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含んでなる軽鎖とを含んでなるモノクローナル抗体であって、
前記重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、
（ａ）ＣＤＲＨ１が、アミノ酸配列ＤＡＷＭＤである；
（ｂ）ＣＤＲＨ２が、アミノ酸配列ＥＩＲＨＫＡＮＤＨＡＩＦＹＡＥＳＶＫＧ、ＥＩＲＮＫＡＮＮＨＡＲＨＹＡＥＳＶＫＧ、ＥＩＲＨＫＡＮＤＹＡＩＦＹＤＥＳＶＫＧ、ＥＩＲＨＫＡＮＤＨＡＩＦＹＤＥＳＶＫＧ、ＤＩＲＮＴＡＮＮＨＡＴＦＹＡＥＳＶＫＧ、またはＥＩＲＨＫＡＮＤＨＡＩＦＹＤＥＳＶＫＧから選択される；および
（ｃ）ＣＤＲＨ３が、ＴＹＹＹＧＳＳＹＧＹＣＤＶまたはＰＦＡＹである；
から選択され、かつ
前記軽鎖の相補性決定領域が、
（ｄ）ＣＤＲＬ１が、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＧＴＴＩＶ、ＲＴＳＥＮＩＹＳＹＬＡ、またはＫＡＳＱＮＶＧＴＡＶＶから選択される；
（ｅ）ＣＤＲＬ２が、アミノ酸配列ＮＡＫＴＬＡＥ、ＳＡＳＮＲＨＴ、ＳＡＳＴＲＹＴ、またはＳＡＳＮＲＹＴから選択される；および
（ｆ）ＣＤＲＬ３が、アミノ酸配列ＱＱＹＳＳＹＰＦＴ、ＱＨＨＹＧＴＰＷＴ、ＱＱＹＶＮＹＰＦＴ、またはＱＱＹＴＳＹＰＦＴから選択される；
から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項８】
ＣＤＲＨ３が、アミノ酸配列ＰＦＡＹを含んでなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２断片である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
前記第１の免疫グロブリン可変ドメインが、一本鎖可変ドメインである、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
前記抗原結合タンパク質が、第２の抗原に結合することができる第２の免疫グロブリン可変ドメインをさらに含んでなる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
前記第２の免疫グロブリン可変ドメインが、ヒト血清アルブミン、ＡＤＡＭＴＳ４、ＮＧＦ、ＯＳＭ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＶＩＰ、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ４、ＡＤＡＭＴＳ１、アグリカン、コラーゲンＩＩ、ＲＡＮＫＬ、シンデカン４、ヘッジホッグ、および／またはＩＬ−１の群から選択される少なくとも１つの抗原に結合する、請求項１１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
ヒトＡＤＡＭＴＳ５に対して約２．５×１０−１０Ｍ以下の解離定数ＫＤ（ｏｆｆ）によって特徴づけられる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
前記抗原結合タンパク質が、ＡＤＡＭＴＳ５の少なくとも１つの活性を阻止する、かつ／または減少させる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１５】
前記抗原結合タンパク質が、Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４切断部位におけるＡＤＡＭＴＳ５によるアグリカンの切断を阻止する、かつ／または減少させる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１６】
前記抗原結合タンパク質が、動物に投与される時、軟骨を透過することができる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質の少なくとも１つを含んでなる、医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の第１の抗原結合タンパク質と、第２のモノクローナル抗体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項２１】
前記第２のモノクローナル抗体が、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＮＧＦ、ＯＳＭ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＶＩＰ、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ４、ＡＤＡＭＴＳ１、アグリカン、コラーゲンＩＩ、ＲＡＮＫＬ、および／またはＩＬ−１の群から選択される抗原に結合する、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
治療を必要としている患者の治療方法であって、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物の少なくとも一回用量を前記患者に投与することを含んでなる、方法。
【請求項２３】
前記患者が軟骨の疾患を患っている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記患者が、癌、疼痛、慢性疼痛、神経因性疼痛、術後の疼痛、変形性関節症、スポーツ外傷、びらん性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、ライム関節炎、若年性関節炎、強直性脊椎症、神経痛、神経障害、痛覚、神経損傷、虚血、神経変性、炎症性疾患、軟骨変性、咽頭、気管、耳管、椎間板、靱帯、腱、関節包、または骨の発達に影響を与える疾患、椎間板変性、骨減少症、または歯周病、急性関節損傷、および／または関節破壊に関連する疾患の群から選択される少なくとも１つの疾患を患っている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記患者が、変形性関節症を患っている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記医薬組成物の少なくとも一回用量の投与が、前記患者における軟骨分解を減少させる、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記医薬組成物の少なくとも一回用量の投与が、前記患者におけるアグリカン切断を阻害する、かつ／または減少させる、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記医薬組成物が、静脈内投与、筋肉内投与、関節内投与、皮下投与、経口投与、鼻腔内投与、および／または呼吸吸入器により投与される、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ＣＤＲＨ１がＤＡＷＭＤ（配列番号２）であり、ＣＤＲＨ２がＥＩＲＮＫＡＮＮＨＡＲＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号１３）であり、ＣＤＲＨ３がＴＹＹＹＧＳＳＹＧＹＣＤＶ（配列番号１８）であり、ＣＤＲＬ１がＲＴＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号２０）であり、ＣＤＲＬ２がＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号２２）であり、ＣＤＲＬ３がＱＨＨＹＧＴＰＷＴ（配列番号２７）である、６つのＣＤＲを含んでなる、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項３０】
ＣＤＲＨ１がＤＡＷＭＤ（配列番号２）であり、ＣＤＲＨ２がＥＩＲＨＫＡＮＤＨＡＩＦＹＤＥＳＶＫＧ（配列番号１５）であり、ＣＤＲＨ３がＰＦＡＹ（配列番号５）であり、ＣＤＲＬ１がＫＡＳＱＳＶＧＴＴＩＶ（配列番号１９）であり、ＣＤＲＬ２がＳＡＳＮＲＨＴ（配列番号２３）であり、ＣＤＲＬ３がＱＱＹＴＳＹＰＦＴ（配列番号２９）である、６つのＣＤＲを含んでなる、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項３１】
請求項２９または請求項３０に記載の抗体と競合的にヒトＡＤＡＭＴＳ５と結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３２】
結合定数（Ｋａ）を測定すると、少なくとも約５×１０４Ｌ／モルの親和性でヒトＡＤＡＭＴＳ５の中和エピトープに結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３３】
前記抗体が、ヒト定常領域を含んでなる、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３４】
免疫グロブリンクラスがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩｇＭである、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３５】
前記断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖからなる群から選択される、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の抗原結合断片。
【請求項３６】
配列番号７６、８０、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３６、１３８、１４０、１４２、および１４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体ＶＨドメインを含んでなる、抗原結合タンパク質またはその断片。
【請求項３７】
配列番号７８、８２、１３０、１３２、１３４、および１４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体ＶＬドメインを含んでなる、抗原結合タンパク質またはその断片。
【請求項３８】
請求項３６に記載の抗体ＶＨドメインおよび請求項３７に記載のＶＬドメインを含んでなる、抗原結合タンパク質またはその断片。
【請求項３９】
配列番号７６を含んでなる抗体ＶＨドメインおよび配列番号７８を含んでなるＶＬドメインを含んでなる、請求項３８に記載の抗原結合タンパク質またはその断片。
【請求項４０】
配列番号８０を含んでなる抗体ＶＨドメインおよび配列番号８２を含んでなるＶＬドメインを含んでなる、請求項３８に記載の抗原結合タンパク質またはその断片。
【請求項４１】
配列番号１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、および１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体ＶＨドメイン、ならびに配列番号１３０、１３２、および１３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＶＬドメインを含んでなる、請求項３８に記載の抗原結合タンパク質またはその断片。
【請求項４２】
配列番号１３６、１３８、１４０、１４２、および１４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体ＶＨドメイン、ならびに配列番号１４６を含んでなるＶＬドメインを含んでなる、請求項３８に記載の抗原結合タンパク質またはその断片。
【請求項４３】
配列番号６８、７２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、および１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖を含んでなる、抗原結合タンパク質またはその断片。
【請求項４４】
配列番号７０、７４、９８、１００、１０２、および１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる、抗原結合タンパク質またはその断片。
【請求項４５】
配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項４３に記載の抗体重鎖、および請求項４４に記載の抗体軽鎖を含んでなる、抗原結合タンパク質またはその断片。
【請求項４６】
配列番号６８を含んでなる抗体重鎖および配列番号７０を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる、請求項４５に記載の抗原結合タンパク質またはその断片。
【請求項４７】
配列番号７２を含んでなる抗体重鎖および配列番号７４を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる、請求項４５に記載の抗原結合タンパク質またはその断片。
【請求項４８】
配列番号８４、８６、８８、９０、９２、９４、および９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖、ならびに配列番号９８、１００、および１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる、請求項４５に記載の抗原結合タンパク質またはその断片。
【請求項４９】
配列番号１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、および１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖、ならびに配列番号１１４を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる、請求項４５に記載の抗原結合タンパク質またはその断片。
【請求項５０】
配列番号７６、８０、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３６、１３８、１４０、１４２、および１４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体ＶＨドメインをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５１】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号７５、７９、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、および１５９からなる群から選択される、請求項５０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５２】
配列番号７８、８２、１３０、１３２、１３４、および１４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体ＶＬドメインをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号７７、８１、１２９、１３１、１３３、および１４５からなる群から選択される、請求項５２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５４】
配列番号６８、７２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、および１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５５】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号６７、７１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、および１５９からなる群から選択される、請求項５４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５６】
配列番号７０、７４、９８、１００、１０２、および１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体軽鎖をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号６９、７３、９７、９９、１０１、および１１５からなる群から選択される、請求項５６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５８】
治療を必要としている患者の治療方法であって、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗原結合タンパク質を前記患者に投与することを含んでなる、方法。
【請求項５９】
約５×１０−４Ｌ／秒未満の解離定数（Ｋｄ）でヒトＡＤＡＭＴＳ５の中和エピトープに結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アグリカナーゼ、特に、ＡＤＡＭＴＳ５を阻害することによって、軟骨におけるアグリカンの分解を減少させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨は、様々な機械的および生化学的刺激に反応する軟骨細胞と呼ばれる特殊な細胞が集合した無血管組織である。軟骨は、関節の内張り、間質結合組織、および基底膜に存在し、ＩＩ型コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、およびラミニンを含んでなるいくつかの基質成分を含んでなる細胞外基質を含んでなる。
【０００３】
正常な軟骨において、細胞外基質の合成は細胞外基質の分解によって相殺され、正常な基質の代謝回転をもたらす。受信信号（複数可）に応じて、次の反応は、（基質の産生および／もしくは修復を引き起こす）同化作用または（基質の分解、細胞のアポトーシス、機能喪失、および疼痛を引き起こす）異化作用のいずれかであり得る。
【０００４】
圧迫障害および／または炎症性メディエーター（例えば、炎症性サイトカイン）への曝露に応答して、軟骨細胞は基質産生を減少させ、複数の基質分解酵素の産生を増加させる。基質分解酵素の例として、アグリカナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）と基質メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）が挙げられる。これらの酵素の活性が軟骨基質の分解をもたらす。アグリカナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）は、ＭＭＰと共に、関節軟骨に存在するアグリカン、すなわちプロテオグリカン集合体を分解する。変形性関節症（ＯＡ）の関節軟骨において、プロテオグリカン染色の喪失が、初期のＯＡの表面ゾーンおよび中等度から重度のＯＡにおける軟骨侵食の隣接領域に観察される。
【０００５】
アグリカナーゼによって媒介されるアグリカンの異化は、アグリカンの中の特定の保存された部位で生じる。（配列番号４４として図５に示す）ヒトＡＤＡＭＴＳ４および（配列番号４３として図４に示す）ＡＤＡＭＴＳ５は、ネオエピトープＡＲＧＳＶＩＬ（配列番号１）を産生するアミノ酸Ｅ３７３とＡ３７４の間でアグリカンを切断することが示されている。
【０００６】
細胞外基質の過剰分解が、疼痛、慢性疼痛、神経因性疼痛、術後の疼痛、関節リウマチ、変形性関節症、スポーツ外傷、びらん性関節炎、強直性脊椎症、神経痛、神経障害、痛覚、神経損傷、虚血、神経変性、軟骨変性、脳卒中、失禁、炎症性疾患、過敏性腸症候群、歯周病、異常な血管新生、腫瘍の浸潤、および転移、角膜潰瘍、糖尿病の合併症を含んでなる多くの疾患および病状の発病に関与している。
【０００７】
従って、アグリカナーゼ活性および軟骨分解を阻害することができる化合物に対するニーズがある。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ヒトＡＤＡＭＴＳ５に結合することができ、かつ／またはヒトＡＤＡＭＴＳ５を中和することができる少なくとも１つの可変ドメインを含んでなる単離したポリペプチドを提供する。
【０００９】
本発明のポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチドも提供する。
【００１０】
本発明の少なくとも１つのポリペプチドを含んでなる医薬組成物も提供する。
【００１１】
本発明の医薬組成物を用いて、軟骨の疾患を患っている患者を治療する方法を本明細書に提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＡＤＡＭＴＳ５ｍＡｂによる、ＡＲＧＳＶＩＬ（配列番号１）ネオエピトープ生成のインビトロ阻害を示すグラフである。
【図２】７Ｂ４．１Ｅ１１マウスｍＡｂによる、ＡＲＧＳＶＩＬ（配列番号１）ネオエピトープ生成の濃度依存的なインビトロ阻害を示すグラフである。
【図３】選択したＡＤＡＭＴＳ５抗体で治療したマウス対インビボ対照のマウスの全関節スコアの平均を示すグラフおよび関節の写真である。
【図４】ヒトＡＤＡＭＴＳ５（配列番号４３）のアミノ酸配列である。
【図５】ヒトＡＤＡＭＴＳ４（配列番号４４）のアミノ酸配列である。
【図６】ヒト化抗ＡＤＡＭＴＳ５抗体の組換え抗原への結合を示すグラフである。
【図７】ヒト化抗ＡＤＡＭＴＳ５抗体の組換え抗原への結合を示すグラフである。
【図８】ヒト化抗ＡＤＡＭＴＳ５抗体の組換え抗原への結合を示すグラフである。
【図９】ヒト化抗ＡＤＡＭＴＳ５抗体の組換え抗原への結合を示すグラフである。
【図１０】ＡＤＡＭＴＳ５活性の阻害率（％）を示すグラフである。
【図１１】ＡＤＡＭＴＳ５活性の阻害率（％）を示すグラフである。
【図１２】精製した抗ＡＤＡＭＴＳ５抗体の組換え抗原への結合を示すグラフである。
【図１３】構造モデルが予測するＡｇ／Ａｂ相互作用部位を示す表およびモデル図である。
【発明の具体的説明】
【００１３】
「ポリヌクレオチド」は、一般的に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを表す。「ポリヌクレオチド」には、１本鎖および２本鎖のＤＮＡ、１本鎖および２本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖および２本鎖のＲＮＡ、ならびに１本鎖および２本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖、より典型的には、２本鎖であり得るか、または１本鎖および２本鎖の領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含んでなるハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定されない。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含んでなる３本鎖領域を表す。ポリヌクレオチドという用語には、１個以上の修飾塩基を含んでなるＤＮＡまたはＲＮＡ、安定性のために、もしくは他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも含まれる。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの独特の塩基が含まれる。様々な修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに行われるので、「ポリヌクレオチド」は、通常、自然界に見られるポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的な修飾形態、ならびにウイルスおよび細胞に典型的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドと称されることが多い比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【００１４】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、すなわち、ペプチドアイソスターにより互いに結合している２個以上のアミノ酸を含んでなる任意のペプチドまたはタンパク質を表す。「ポリペプチド」は、一般に、ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと称される短鎖、および一般にタンパク質と称される長鎖の両方を表す。ポリペプチドは、遺伝子によりコードされた２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセス、または当該技術分野で公知の化学修飾法のいずれかにより修飾されたアミノ酸配列を含んでなる。このような修飾は、基本的なテキスト、より詳細な研究書、および多数の研究文献に詳しく記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含んでなるポリペプチドのどこにでも生じ得る。同じ種類の修飾が、所定のポリペプチドのいくつかの部位で、同じ程度または異なる程度で存在し得ることは理解されよう。所定のポリペプチドは多くの種類の修飾も含み得る。ポリペプチドはユビキチン化の結果として分枝状であってもよく、分岐の有無にかかわらず、環状であってもよい。環状、分枝状、および分枝環状のポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスから生じるか、または合成法によって作製され得る。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのトランスファーＲＮＡによるタンパク質へのアミノ酸の付加、ならびにユビキチン化が含まれる。例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ,２ｎｄ Ｅｄ.,Ｔ.Ｅ.Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ,Ｗ.Ｈ.Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ,Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ,１９９３ ａｎｄ Ｗｏｌｄ,Ｆ.,Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ,ｐｇｓ.１−１２ ｉｎ ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ,Ｂ.Ｃ.Ｊｏｈｎｓｏｎ,Ｅｄ.,Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ,Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ,１９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒ,ｅｔ ａｌ.,“Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ”,Ｍｅｔｈ.Ｅｎｚｙｍｏｌ.（１９９０）１８２：６２６−６４６、ならびにＲａｔｔａｎ,ｅｔ ａｌ.,“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ”,Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（１９９２）６６３：４８−６２を参照されたい。
【００１５】
本明細書で使用する「変異体」という用語は、それぞれ参照ポリヌクレオチドまたは参照ポリペプチドとは異なるが、本質的な特性は保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、別の参照ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列の点で異なる。変異体のヌクレオチド配列における変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と変わっていてもよく、変わっていなくてもよい。以下で論じるように、ヌクレオチドの変化は、参照配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠失、融合、およびトランケーションをもたらし得る。ポリペプチドの典型的な変異体は、別の参照ポリペプチドとアミノ酸配列の点で異なる。一般的に、差異は、参照ポリペプチドおよび変種の配列が全体的に非常に類似しており、多くの領域で同一であるように限定されている。変異体および参照ポリペプチドは、１つ以上の置換、付加、欠失の任意の組み合わせによりアミノ酸配列において異なっていてもよい。置換または挿入されたアミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされる残基であっても、またはそうでなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体のように天然に存在してもよく、または天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非天然変異体は、突然変異誘発技術または直接合成により作製され得る。
【００１６】
「単離」とは、その天然状態から「ヒトの手により」変更されることを意味する。すなわち、それが天然に存在する場合、それはその元の環境から変化もしくは除去されているか、またはその両方である。例えば、天然の状態で生物に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、その天然状態で共存物質から分離された同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されており、これは、このようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドが導入されて、戻される時を含んでなるが、これに限定されない。
【００１７】
「単離された」または「実質的に純粋」な核酸またはポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡもしくは混合ポリマー）は、その天然宿主細胞内のネイティブポリヌクレオチドを天然に伴う他の細胞成分、例えば、それに天然に付随するリボソーム、ポリメラーゼ、およびゲノム配列から実質的に分離された核酸またはポリヌクレオチドである。この用語は、（１）その天然環境から除去された核酸またはポリヌクレオチド、（２）「単離されたポリヌクレオチド」が自然界に見られるポリヌクレオチドの全部もしくは一部と会合していない核酸またはポリヌクレオチド、（３）天然には連結されていないポリヌクレオチドと作動可能に連結されている核酸またはポリヌクレオチド、または（４）天然に存在しない核酸またはポリヌクレオチドを包含する。「単離」または「実質的に純粋」という用語は、組換えＤＮＡ分離体もしくはクローン化ＤＮＡ分離体、化学合成ポリヌクレオチド類似体、または異種システムにより生物学的に合成されたポリヌクレオチド類似体に関しても用いられ得る。
【００１８】
しかし、「単離」は、必ずしも、そのように記述される核酸またはポリヌクレオチドが、それ自体、その天然の環境から物理的に除去されている必要はない。例えば、生物のゲノム内の内在性核酸配列は、異種配列がこの内在性核酸配列に隣接して配置される結果、この内在性核酸配列の発現が変わる、例えば、増加する、減少する、または除去される場合、本明細書で「単離された」と考えられる。この文脈で、異種配列は、この異種配列がそれ自体、（同一宿主細胞もしくはその子孫から生じる）内在性または（異なる宿主細胞もしくはその子孫から生じる）外来性であろうとなかろうと、この内在性核酸配列と天然では隣接していない配列である。例として、プロモーター配列を、宿主細胞のゲノム中の遺伝子のネイティブプロモーターと（例えば、相同組換えによって）置換することができ、その結果、この遺伝子の発現パターンは変化し得る。この遺伝子は、天然ではその側面に位置する配列の少なくとも一部から分離されているので、今や「単離」されたことになる。
【００１９】
核酸は、それがゲノム内の対応する核酸中に天然には生じない任意の修飾を含んでなる場合にも、「単離された」と考えられる。例えば、内在性コード配列は、それが人工的に、例えば、ヒトの介入によって導入される挿入、欠失または点変異を含んでなる場合に、「単離された」と考えられる。「単離された核酸配列」は、非相同部位において宿主細胞染色体に組込まれる核酸およびエピソームとして存在する核酸コンストラクトも含んでなる。さらに、「単離された核酸配列」は、実質的に他の細胞物質を含まないか、組換え技術によって産生される時に実質的に培地を含まないか、または化学合成される時に実質的に化学的前駆体もしくは他の化学物質を含んでなることができない。
【００２０】
本明細書で使用する「炎症性メディエーター」には、炎症プロセスを誘発することができる任意の化合物が含まれる。炎症という用語は、一般に、傷害に対する血管新生した生体組織の反応プロセスを表す。このプロセスには、血流の増加、血管透過性の増加、および白血球滲出が含まれるが、これらに限定されない。炎症反応に動員される白血球は、強力な酵素および酸素フリーラジカル（すなわち、炎症性メディエーター）を放出することができるので、この炎症反応は、かなりの組織損傷を媒介することができる。炎症性メディエーターの例として、プロスタグランジン（例えば、ＰＧＥ２）、ロイコトリエン（例えば、ＬＴＢ４）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、およびインターロイキン６（ＩＬ−６）などの炎症性サイトカイン、一酸化窒素（ＮＯ）、メタロプロテイナーゼ、および熱ショックタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
本明細書で使用する「基質タンパク質」には、軟骨の細胞外基質を形成するために細胞から放出されるタンパク質が含まれる。軟骨の細胞外基質は、いくつかの別々のプロテオグリカンのファミリーに属するプロテオグリカンからなる。これらには、パールカン、ならびにアグリカンおよびバーシカンに代表されるヒアレクタン（ｈｙａｌｅｃｔａｎｓ）、デコリン、バイグリカン、およびフィブロモジュリンを含んでなるプロテオグリカンの小さなロイシンリッチファミリーが含まれるが、これらに限定されない。細胞外基質は、また、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）、リンクタンパク質、およびフィブロネクチンなどのアクセサリータンパク質と共に、３つのコラーゲンアイソタイプ、すなわち、ＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン、およびＸＩ型コラーゲンを含んでなるハイブリッドコラーゲン繊維からなる。軟骨は、ヒアレクチンと非共有結合を形成するヒアルロニン（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｎ）も含んでなる。さらに、特殊な細胞周囲基質は、プロテオグリカン、ＶＩ型コラーゲン、およびアンコリン（ａｎｃｈｏｒｉｎ）などのコラーゲン受容体タンパク質からなる軟骨細胞を取り囲んでいる。
【００２２】
本明細書で使用する「基質分解酵素」は、細胞外基質タンパク質を切断することができる酵素を表す。軟骨細胞外基質の代謝回転は、軟骨細胞外基質タンパク質を分解するために活性化を必要とする潜在的な酵素前駆体として合成される基質メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）によって調節される。酵素の３つのクラス、すなわち、ネイティブなコラーゲン繊維の分解に関与する（ＭＭＰ−１３を含んでなるが、これに限定されない）コラゲナーゼ、プロテオグリカン、およびＩＸ型コラーゲンを分解する（ＭＭＰ−３を含んでなるが、これに限定されない）ストロメリシン、ならびに変性コラーゲンを分解する（ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を含んでなるが、これらに限定されない）ゼラチナーゼは、細胞外基質タンパク質の代謝回転を調節すると考えられている。ＯＡ内の軟骨分解に最も関係があると思われる基質分解酵素の群には、それらが、ジスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼのドメイン、ならびにそれらの構造内のトロンボスポンジンモチーフを保有するので、ＡＤＡＭＴＳと呼ばれるメタロプロテイナーゼのサブ群が含まれる。ＡＤＡＭＴＳ４（アグリカナーゼ１）はＯＡ関節内で増加することが報告され、ＡＤＡＭＴＳ−５（アグリカナーゼ−２）と共に、ヒト変形性関節症軟骨で発現することが示されている。これらの酵素は、ＭＭＰが加わることなくアグリカン分解に関与すると思われる。
【００２３】
本明細書で使用するアグリカナーゼ活性の「減少（ｒｅｄｕｃｅ）」または「減少（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」は、ＡＤＡＭＴＳ４およびＡＤＡＭＴＳ５を含んでなるが、これらに限定されない少なくとも１種類の天然に存在するアグリカナーゼと関連する活性のいずれかおよび／または全てにおける低下を表す。例えば、少なくとも１つのＡＤＡＭＴＳ５活性の「減少」は、天然に存在するＡＤＡＭＴＳ５と関連する活性のいずれかおよび／または全てにおける低下を表す。例として、哺乳類におけるＡＤＡＭＴＳ５活性の減少を、ＡＤＡＭＴＳ５に結合することができる少なくとも１つのポリペプチドの対象への投与後に測定し、ＡＤＡＭＴＳ５に結合することができるポリペプチドの投与前の、同一対象におけるＡＤＡＭＴＳ５活性と比較するか、またはプラセボを投与した第２の対象と比較することができる。本明細書で使用する少なくとも１つのＡＤＡＭＴＳ５の「減少」には、少なくとも１つ以上の酵素活性の減少が含まれる。少なくとも１つのＡＤＡＭＴＳ５活性の減少には、少なくとも１つのＡＤＡＭＴＳ５の完全抑止が含まれる。少なくとも１つの酵素活性の量の減少も本定義の範囲内に含まれる。すなわち、ＡＤＡＭＴＳ５は、同一酵素の第２の活性が減少する間に維持される２種類以上の活性を有し得る。
【００２４】
本明細書で使用する「軟骨分解に関連する疾患」には、癌、疼痛、慢性疼痛、神経因性疼痛、術後の疼痛、変形性関節症、スポーツ外傷、びらん性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、ライム関節炎、若年性関節炎、強直性脊椎症、神経痛、神経障害、痛覚、神経損傷、虚血、神経変性、炎症性疾患、軟骨変性、喉頭、気管、耳道、椎間板、靱帯、腱、関節包や骨の発達に影響を与える疾患、無脊椎の椎間板変性、骨減少症、または歯周病、急性関節損傷、および／または関節破壊に関連した疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
本明細書で使用する「同時投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」または「同時投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」は、同一患者への２種類以上の化合物の投与を表す。このような化合物の同時投与は、同時もしくはほぼ同じ時（例えば、同じ時間内）であってもよく、またはそれは、互いに数時間内もしくは数日以内であってもよい。例えば、第１の化合物は週１回投与されるが、第２の化合物は毎日同時に投与されてもよい。
【００２６】
本明細書で使用する「減衰（ａｔｔｅｎｕａｔｅ）」または「減衰（ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ）」は、異化刺激への暴露後に、細胞が産生および／または放出する基質分解酵素、炎症性メディエーター、または基質タンパク質の量の正常化（すなわち、増加または減少のいずれか一方）を表す。例えば、ＩＬ−１への暴露後に、プロテオグリカンなどの基質タンパク質の軟骨細胞産生は減少するが、基質分解酵素（例えば、ＭＭＰ−１３、ＡＤＡＭＴＳ４）および活性酸素種（例えば、ＮＯ）の産生は増加する。減衰は、異化刺激の非存在下で観察されるレベルへのこれらの多様な反応の正常化を表す。
【００２７】
「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、抗原に結合することができる「単一可変ドメイン」と同じであると考えられ得る。単一可変ドメインは、ヒトの抗体可変ドメインであり得るが、（例えば、国際特許ＷＯ００／２９００４に開示されているような）齧歯類、テンジクザメやラクダ科の動物などの他の種のＶＨＨ ｄＡｂに由来する単一抗体可変ドメインも含んでなる。ラクダ科の動物のＶＨＨは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含んでなる種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインのポリペプチドであり、これは、天然に軽鎖を欠く重鎖の抗体を産生する。このようなＶＨＨドメインは、当該技術分野で利用可能な標準的な技術に従ってヒト化され得、このようなドメインは「ドメイン抗体」であると考えられる。本明細書で使用するＶＨには、ラクダ科の動物ＶＨＨドメインが含まれる。
【００２８】
「単一可変ドメイン」という語句は、異なる可変領域または可変ドメインとは無関係に、抗原またはエピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質可変ドメイン（例えば、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を表す。
【００２９】
本明細書で使用する「抗原結合タンパク質」という用語は、抗原に結合できる抗体、抗体断片、ならびに可変ドメインおよびドメイン抗体に限定されないドメインなどの他のタンパク質コンストラクトを表す。
【００３０】
抗体の抗原結合ドメインは、２つの別々の領域：重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ：これはＶκまたはＶλのいずれか一方であり得る）を含んでなる。この抗原結合部位自体は、６つのポリペプチドループ：ＶＨドメインの３つ（Ｈ１、Ｈ２およびＨ３）ならびにＶＬドメインの３つ（Ｌ１、Ｌ２およびＬ３）によって形成される。
【００３１】
抗体の構造および配列の分析は、６つの抗原結合ループのうちの５つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）が、限られた数の主鎖の構造または標準構造を有することを示している（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.,１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ.（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ,３４２：８７７）。主鎖の構造は、（ｉ）抗原結合ループの長さ、ならびに（ｉｉ）抗原結合ループおよび抗体フレームワークの中の特定の重要な位置における特定の残基、または残基の種類によって決定される。ループの長さおよび重要な残基の分析により、大部分のヒト抗体配列によってコードされるＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３の主鎖の構造を予測することが可能になった（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ.（１９９２）Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.,２２７：７９９；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ.（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ.,１４：４６２８；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ.（１９９６）Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.,２６４：２２０）。このＨ３領域は配列、長さ、および構造の点で（Ｄセグメントの使用のため）遥かに多様であるが、これは短いループ長のために限られた数の主鎖の構造も形成し、この構造は、このループおよび抗体フレームワークの中の重要な位置における特定残基の長さおよび存在、または残基の種類によって決まる（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ.（１９９６）Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.,２６３：８００；Ｓｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ.（１９９６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ,３９９：１）。
【００３２】
ＶＨとＶＬ領域の相補対を含んでなる２重特異性抗体が当該技術分野で公知である。これらの２重特異性抗体は、ＶＨとＶＬの２対を含まねばならず、各ＶＨ／ＶＬ対は単一の抗原またはエピトープに結合する。記載する方法には、ハイブリッドハイブリドーマ（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ＆ＣｕｅｌｌｏＡＣ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−４０）、ミニボディ（Ｈｕ ｅｔ ａｌ.,（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６：３０５５−３０６１）、ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ.,（１９９３）Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ９０,６４４４−６４４８；国際特許ＷＯ９４／１３８０４）、キレート組換え抗体（ＣＲＡｂｓ；Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ.,（１９９５）Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.２４６,３６７−３７３）、ｂｉｓｃＦｖ（例えば、Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ.,（１９９６）Ｍｏｌ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.３３,１３０１−１３１２）、「ノブインホール（ｋｎｏｂｓ ｉｎ ｈｏｌｅｓ）」安定化抗体（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ.,（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ.６,７８１−７８８）が含まれる。それぞれの場合において、各抗体種は２つの抗原結合部位を含み、それぞれがＶＨおよびＶＬドメインの相補対によって構築される。それによって各抗体は、２つの異なる抗原またはエピトープに同時に結合することができ、各抗原またはエピトープへの結合は、ＶＨドメインおよびその相補的ＶＬドメインによって媒介される。これらの技術のそれぞれにはそれ特有の不都合があり、例えば、ハイブリッドハイブリドーマの場合には、不活性ＶＨ／ＶＬ対が２重特異性ＩｇＧの画分を非常に減少させることができる。さらに、ほとんどの２重特異性アプローチは、２つの異なるＶＨ／ＶＬ結合部位を再形成するために、異なるＶＨ／ＶＬ対の会合またはＶＨ鎖とＶＬ鎖の会合に依存している。したがって、構築された分子において各抗原またはエピトープに対する結合部位の比を制御することは不可能であるので、構築された分子の多くは一方の抗原またはエピトープと結合するが、他方の抗原またはエピトープとは結合しないであろう。いくつかの場合において、両方の抗原もしくはエピトープに対する結合部位を有する分子の数を改善するために、サブユニットの界面に重鎖または軽鎖を遺伝子工学処理することが可能になったが（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ.,１９９７）、これによって全ての分子が両方の抗原またはエピトープに結合するようには決してならない。
【００３３】
２つの異なる抗体結合特異性を同じ結合部位に組み込むことができるという証拠がいくつかあるが、これらは一般に、構造的に関連した抗原もしくはエピトープに対応するか、または広く交差反応する抗体に対応する２つ以上の特異性を表す。例えば、交差反応性の抗体について記載されており、通常、ニワトリ卵白のリゾチームおよびシチメンチョウのリゾチーム(ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ ａｌ.,国際特許ＷＯ９２／０１０４７)、または遊離ハプテンおよび担体に結合したハプテン（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＤ  ｅｔ ａｌ.,ＥＭＢＯ Ｊ １９９４ １３：１４ ３２４５−６０）などの２つの抗原は配列および構造において関連する。さらなる例として、国際特許ＷＯ０２／０２７７３（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、「２重特異性」を有する抗体分子について記載している。言及する抗体分子は、それらの特異性が単一の抗原より多くに及ぶように、複数の抗原に対して産生または選択された抗体である。国際特許ＷＯ０２／０２７７３に記載の抗体の各相補的ＶＨ／ＶＬ対は、構造的に関連した２つ以上の抗原に対する単一結合特異性を示し、このような相補対のＶＨドメインおよびＶＬドメインはそれぞれ別々の特異性を保有しない。したがって、これらの抗体は構造的に関連する２つの抗原を包含する広範な単一特異性を有する。さらに、多反応性である天然の自己抗体について記載されており（Ｃａｓａｌｉ＆Ｎｏｔｉｏｎｓ,Ａｎｎ.Ｒｅｖ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.７，５１５−５３１）、これは、構造的に無関係の少なくとも２つ（通常はそれ以上）の異なる抗原またはエピトープと反応する。モノクローナル抗体に対するファージディスプレイ法を用いたランダムペプチドレパートリーの選択が、その抗原結合部位に適合する様々な範囲のペプチド配列を同定することも示されている。これらの配列の一部は高度に関連し、コンセンサス配列に適合するが、その他は非常に異なり、ミモトープと名付けられている（Ｌａｎｅ＆Ｓｔｅｐｈｅｎ,Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ,１９９３,５，２６８−２７１）。したがって、会合した相補的ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含んでなる天然の４本鎖抗体が、非常に多数の既知抗原からの多くの異なる抗原と結合する能力を有することは明らかである。同一の抗体の中の２つの所定の抗原、特に、必ずしも構造的に関連のない抗原に対する結合部位を形成する方法はあまり分かっていない。
【００３４】
これに関係し得るタンパク質工学的方法が提唱されている。例えば、１つの可変ドメインを介して金属イオンに結合する活性を有し、かつこの金属イオンおよび相補的可変ドメインとの接触を介してハプテン（基質）と結合する活性を有する触媒抗体を作製できることも提案されている（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ.,１９９３ Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０,６３８５−６３８９）。しかし、この場合には、基質（第１の抗原）の結合および触媒作用は、金属イオン（第２の抗原）の結合を必要とすると提唱されている。したがって、ＶＨ／ＶＬ対への結合は、単一だが多成分の抗原に関係する。
【００３５】
ラクダ抗体の重鎖単一ドメインから２重特異性抗体を作製する方法について記載されており、その中で、１つの抗原に対する結合接点を１つの可変ドメインの中に作り、第２の抗原に対する結合接点を第２の免疫グロブリン可変ドメインの中に作る。しかし、これらの可変ドメインは相補的ではなかった。したがって、第１の重鎖可変ドメインを第１の抗原に対して選択し、第２の重鎖可変ドメインを第２の抗原に対して選択し、その後、両ドメインを同一鎖上で連結して、２重特異性抗体断片を得る(Ｃｏｎｒａｔｈ ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２７０,２７５８９−２７５９４)。しかしながら、このラクダ重鎖単一ドメインは、それらが軽鎖をもたない天然のラクダ抗体に由来するという点で普通ではなく、実際、この重鎖単一ドメインは相補的なＶＨとＶＬの対を形成するようにラクダ軽鎖と会合することができない。
【００３６】
通常、軽鎖と会合している天然の抗体に由来する（モノクローナル抗体からの、またはドメインのレパートリーからの；ヨーロッパ特許ＥＰ−Ａ−０３６８６８４参照）単一重鎖可変ドメインについても記載されている。これらの重鎖可変ドメインは、１つ以上の関連抗原と特異的に相互作用することが示されているが、２つ以上の異なる抗原に対する特異性を有するリガンドを作製するために、他の重鎖または軽鎖の可変ドメインと組み合わされたことはない。さらに、これらの単一ドメインは非常に短い生体内半減期を有することが示されている。したがって、このようなドメインの治療上の価値は限られたものとなる。
【００３７】
異なる特異性の重鎖可変ドメインを（上記に記載したように）共に連結させることによって、２重特異性抗体断片を作製することが提案されている。このアプローチに伴う不都合は、単離した抗体可変ドメインが、通常は軽鎖と相互作用し、かつ溶媒に暴露される疎水性界面を有すること、ならびに「粘着性」であって、この単一ドメインを疎水性表面に結合させることができる可能性があることである。さらに、パートナーである軽鎖が存在しない場合において、２つ以上の異なる重鎖可変ドメインの組合せ、およびおそらく、それらの疎水性界面を介するそれらの会合により、それらが分離して結合することができるリガンドの両方ではなく一方に結合することを防ぐことができる。さらに、この場合において、この重鎖可変ドメインは相補的な軽鎖可変ドメインと会合しないので、安定性に乏しく、容易にアンフォールディングしてしまう（Ｗｏｒｎ＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ,１９９８ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７,１３１２０−７）。
【００３８】
本明細書で使用する、「抗体」という用語には、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖をジスルフィド結合により相互に連結した４つのポリペプチド鎖を含んでなる免疫グロブリン分子が含まれる。各重鎖は、（本明細書でＶＨと省略する）重鎖可変領域および重鎖定常領域を含んでなる。この重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含んでなる。各軽鎖は、（本明細書でＶＬと省略する）軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を含んでなる。任意の脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる種類の１つに割り当てられ得る。κ軽鎖の可変領域を本明細書でＶΚと称する。本明細書で使用するＶＬ発現は、κ型軽鎖（ＶΚ）およびλ型軽鎖の可変領域の両方を含んでなることを意図している。この軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含んでなる。このＶＨおよびＶＬの領域には、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域と共に分散される、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域が含まれる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含み、以下の順番：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される。
【００３９】
これらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体を異なるクラスに割り当てることができる。５つの主要なインタクトな抗体のクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２にさらに分けられ得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置は公知である。本発明は、前述のクラスまたはサブクラス（アイソタイプ）の全ての抗体を含んでなる。
【００４０】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、模倣抗体を含み、すなわち抗体もしくは特定断片もしくはその一部の構造および／または機能を模倣する抗体の部分を含み、一本鎖抗体およびそれらの断片を含んでなる抗体、消化断片、それらの特定部分ならびにそれらの変異体を包含するとも意図され、それぞれは少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる。機能的断片には、ＡＤＡＭＴＳ５抗原に結合する抗原結合断片が含まれる。例えば、（例えば、パパイン消化による）Ｆａｂ断片、（例えば、プラスミン消化による）ｆａｃｂ断片、（例えば、ペプシンまたはプラスミン消化による）ｐＦｃ’断片、（例えば、ペプシン消化、部分的還元、および再凝集による）Ｆｄ断片、（例えば、分子生物学的手法による）Ｆｖ断片もしくはｓｃＦｖ断片を含んでなるが、これらに限定されないＡＤＡＭＴＳ５またはその一部に結合することができる抗体断片は、本発明に包含される。抗体断片は、例えば、ドメイン除去抗体、ダイアボディ、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、および抗体断片から形成される多特異性抗体を含んでなることも意図される。
【００４１】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を表し、例えば、この集団を含んでなる個々の抗体は、天然の可能性のある突然変異または存在し得るマイナーな翻訳後の変異を除いて実質的に同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一抗原部位に対して作られる。さらに、通常、異なる決定基（エピトープ）に対して作られる異なる抗体を含んでなる従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体はこの抗原上の単一の決定基に対して作られる。修飾因子「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。本発明のモノクローナル抗体は、好ましくは、組換えＤＮＡ法によって作製されるか、または本明細書の他の場所で記載するスクリーニング法によって得られる。
【００４２】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、それらが所望の生物学的活性を示す限り、キメラ抗体中の重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種に由来する抗体中の対応する配列と同一もしくは相同であるか、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属するが、この鎖（複数可）の残りは、別の種（例えば、マウスまたはラット）に由来する抗体中の対応する配列と同一もしくは相同であるか、または別の抗体クラスまたはサブクラス、ならびにこのような抗体の断片に属する（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ.,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書における対象のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザルまたはカニクイザルなどの旧世界ザル）に由来する可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含んでなる「霊長類化」抗体が含まれる（米国特許第５，６９３，７８０号）。
【００４３】
したがって、本発明には、例えば、キメラ重鎖および／またはキメラ軽鎖を含んでなるキメラモノクローナル抗体が含まれる。このキメラ重鎖は、本明細書に記載の重鎖可変（ＶＨ）領域、または非ヒト抗体もしくはヒト抗体の重鎖定常領域に融合した重鎖可変領域の突然変異体もしくは変異体の全てを含み得る。このキメラ軽鎖は、本明細書に記載の軽鎖可変（ＶＬ）領域、または非ヒト抗体もしくはヒト抗体の軽鎖定常領域に融合した軽鎖可変領域の突然変異体もしくは変異体の全てを含み得る。
【００４４】
本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語には、カバットら（Ｋａｂａｔ,ｅｔ ａｌ.（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ,Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ,Ｕ.Ｓ.Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ,ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ.９１−３２４２参照）によって記載されるようなヒト生殖系列免疫グロブリン配列に対応する可変領域および定常領域を有する抗体が含まれる。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特に、ＣＤＲ３において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列がコードしないアミノ酸残基（例えば、インビトロのランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発によって、またはインビボの体細胞突然変異によって導入される変異）を含み得る。このヒト抗体は、アミノ酸残基、例えば、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列がコードしない、活性を高めるアミノ酸残基と置換される少なくとも１つの位置を有することができる。本発明の文脈において、このヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の一部ではないアミノ酸残基と置換される最大で２０の位置を有することができる。他の実施形態において、最大１０、最大５、最大３、または最大２つの位置が置換される。しかし、本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含んでなることを意図しない。
【００４５】
「組換えヒト抗体」という語句には、宿主細胞にトランスフェクトされる組換え発現ベクターを用いて発現させた抗体などの組換え手段によって調製、発現、作製または単離されるヒト抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニック動物から単離された抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含んでなる任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離される抗体が含まれる。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する（Ｋａｂａｔ,Ｅ.Ａ.,ｅｔ ａｌ.（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ,Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ,Ｕ.Ｓ.Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ,ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ.９１−３２４２参照）。本発明による組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列のトランスジェニック動物を用いる時は、インビボ体細胞変異誘発）に共されたヒト生殖系列免疫グロブリン配列を含んでなるので、この組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、かつ関連するが、インビボのヒト抗体生殖系列のレパートリー内に天然には存在し得ない配列である。しかし、特定の実施形態において、このような組換え抗体は、選択的変異誘発法もしくは逆突然変異またはその両方の結果である。
【００４６】
本発明の抗体は単離された抗体であり得る。本明細書で使用する「単離された抗体」には、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体が含まれる。さらに、単離された抗体には、他の細胞物質および／または化学物質が実質的に含まれ得ない。
【００４７】
インタクトな抗体には、少なくとも２つの重鎖および２つの軽鎖を含んでなるヘテロ多量体の糖タンパク質が含まれる。ＩｇＭは別として、インタクトな抗体は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖を含んでなる約１５０Ｋｄａのヘテロ４量体の糖タンパク質である。典型的には、各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結されているが、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖および各軽鎖は、鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後多くの定常領域が続く。各軽鎖は、その他端に可変ドメイン（ＶＬ）および定常領域を有する。この軽鎖の定常領域は、この重鎖の第１の定常領域と整列し、この軽鎖可変ドメインは、この重鎖の可変ドメインと整列する。ほとんどの脊椎動物種の抗体軽鎖を、この定常領域のアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる２種類のうちの１種類に割り当てることができる。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、ヒト抗体を、５つの異なるクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに割り当てることができる。ＩｇＧおよびＩｇＡを、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２のサブクラスにさらに分けることができる。種の変異体は、少なくともＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂを有するマウスおよびラットに存在する。この抗体の可変ドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる特定の可変性を示す特定領域で抗体に結合特異性を与える。この可変領域のより保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。インタクトな重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ３つのＣＤＲが結合した４つのＦＲを含んでなる。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域が近接してまとまり、他の鎖のＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。これらの定常領域は、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、Ｆｃγ受容体への結合による食作用、新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）による半減期／クリアランス率および補体カスケードのＣ１ｑ成分による補体依存性細胞傷害などの様々なエフェクター機能を示す。
【００４８】
ヒト抗体は、当該技術者に公知の多くの方法により産生され得る。ヒト抗体は、ヒト骨髄腫細胞株またはマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株を用いるハイブリドーマ法によって作製することができる。Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ １３３,３００１,（１９８４）およびＢｒｏｄｅｕｒ,Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ,ｐｐ５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ,１９８７）を参照されたい。代替方法にはファージライブラリーまたはトランスジェニックマウスの使用が含まれ、それらの両方はヒトＶ領域のレパートリーを利用する（Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ,（１９９４）,Ａｎｎｕ.Ｒｅｖ.Ｉｍｍｕｎｏｌ １２，４３３−４５５,Ｇｒｅｅｎ ＬＬ（１９９９）,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１,１１−２３参照）。
【００４９】
トランスジェニックマウスのいくつかの系統が現在利用可能であり、それらのマウスの免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト免疫グロブリン遺伝子部分と置換されている（Ｔｏｍｉｚｕｋａ Ｋ,（２０００）ＰＮＡＳ ９７，７２２−７２７；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ Ｄ.Ｍ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.１４，８４５−８５１,Ｍｅｎｄｅｚ ＭＪ,１９９７,Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ,１５，１４６−１５６参照）。抗原負荷の際、このようなマウスはヒト抗体のレパートリーを産生することができ、そのレパートリーから対象の抗体を選択することができる。特に注目すべきは、ヒトのリンパ球を放射線照射したマウスに移植するＴｒｉｍｅｒａ（商標）システム（Ｅｒｅｎ Ｒ ｅｔ ａｌ,（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９３：１５４−１６１参照）、ヒト（または他の種）のリンパ球に対して、大規模プールインビトロ抗体の産生手順、その後にデコンビュレートされた（ｄｅｃｏｎｖｕｌａｔｅｄ）限界希釈および選択手順を効果的に施す選択リンパ球抗体システム（ＳＬＡＭ,Ｂａｂｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ,ＰＮＡＳ（１９９６）９３：７８４３−７８４８参照）、ならびにＸｅｎｏｍｏｕｓｅ ＩＩ（商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ Ｉｎｃ）である。別のアプローチは、モルフォテック社（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ Ｉｎｃ）から入手可能であるＭｏｒｐｈｏｄｏｍａ（商標）技術を用いる。
【００５０】
ファージディスプレイ技術を用いて、ヒト抗体を（およびその断片）を産生することができる。ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ；Ｎａｔｕｒｅ,３４８,５５２−５５３（１９９０）およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＤ ｅｔ ａｌ（１９９４）ＥＭＢＯ １３：３２４５−３２６０を参照されたい。この手法によると、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄなどの糸上バクテリオファージのメジャーコートタンパク質またはマイナーコートタンパク質のいずれか一方の遺伝子にインフレームでクローニングし、ファージ粒子の表面上の機能性抗体断片として（通常はヘルパーファージの助けを借りて）提示させる。この抗体の機能的特性に基づく選択は、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。ァージディスプレイ法を用いて、上記に記載の疾患または障害を患っている固体、または、免疫されていないヒトドナーから得られるヒトＢ細胞から作製されるライブラリーから抗原特異的抗体を選択することができる（Ｍａｒｋｓ；Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏ.２２２，５８１−５９７,１９９１参照)。インタクトなヒト抗体がＦｃドメインを含んでなることが望まれる場合、所望の定常領域を含み、安定な発現細胞株を確立する哺乳類発現ベクターに、ファージディスプレイ由来の断片を再クローニングすることが必要である。
【００５１】
親和性成熟技術（Ｍａｒｋｓ；Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌ １０，７７９−７８３（１９９２））を用いて結合親和性を改善してもよく、ヒト１次抗体の親和性は、天然に存在する変異体でＨ鎖およびＬ鎖のＶ領域を連続して置換し、改善された結合親和性に基づいて選択することによって改善される。「エピトープインプリンティング」などのこの技術の変法も今日では利用可能である。国際特許ＷＯ９３／０６２１３を参照されたい。Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ；Ｎｕｃｌ.Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２１,２２６５−２２６６（１９９３）も参照されたい。
【００５２】
特定の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、結合定数（Ｋａ）を測定すると、少なくとも約５×１０４Ｌ／モル、１×１０５Ｌ／モル、５×１０５Ｌ／モル、または１×１０６Ｌ／モルの親和性を有する。別の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、約５×１０−４Ｌ／秒、１×１０−５Ｌ／秒、５×１０−５Ｌ／秒、または１×１０−６Ｌ／秒未満の解離定数（Ｋｄ）でヒトＡＤＡＭＴＳ５の中和エピトープに結合する。
【００５３】
ヒトの疾患または障害の治療におけるインタクトな非ヒト抗体の使用は、今日十分に確立された免疫原性の問題が起きる可能性を伴い、この免疫原性は患者の免疫システムであり、非ヒトのインタクトな抗体を非自己として認識し、中和反応を開始する。この反応は、ヒト患者への非ヒト抗体の複数投与の際に特に顕著である。様々な技術がこれらの問題を克服するために長年にわたって開発され、一般的に、免疫された動物、例えば、マウス、ラットまたはウサギから非ヒト抗体を得ることに相対的な容易さを維持しつつ、インタクトな抗体中の非ヒトアミノ酸配列の組成の減少を含んでなる。大まかに２つのアプローチを用いてこれを達成する。第１のアプローチは、一般的に、ヒト定常領域に融合させた非ヒト（例えば、マウスなどの齧歯類）の可変ドメインを含んでなるキメラ抗体である。抗体の抗原結合部位は可変領域内に局在しているので、このキメラ抗体はこの抗原に対するその結合親和性を保持するが、ヒト定常領域のエフェクター機能を獲得するので、上記に記載したようなエフェクター機能を実行することができる。キメラ抗体は、典型的には、組換えＤＮＡ法を用いて産生される。これらの抗体をコードするＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）を、（例えば、本発明の抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子、例えば、上記に記載の配列番号２、３、４、５、６、および７をコードするＤＮＡに特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）従来の方法を用いて単離および配列解析をする。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの典型的な供給源として役立つ。単離した時点で、このＤＮＡを発現ベクター中に置き、その後、抗体の合成をするために免疫グロブリンタンパク質を別の方法で産生しない大腸菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトする。このＤＮＡは、ヒトのＬ鎖およびＨ鎖のコード配列を、対応する非ヒト（例えば、マウス）のＨ定常領域およびＬ定常領域に対して置換することによって改変されてもよい（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ；ＰＮＡＳ ８１,６８５１（１９８４）参照）。
【００５４】
第２のアプローチはヒト化抗体の産生を伴い、この抗体の非ヒト内容物は、これらの可変領域をヒト化することによって減少する。ヒト化抗体は、ＣＤＲ移植によって作製することができる。ＣＤＲはこの抗体のＮ−末端近くにループを形成し、そこでＣＤＲは、フレームワーク領域によって提供される足場に取り付けられた面を形成する。この抗体の抗原結合特異性は、主に局所分布によって、およびそのＣＤＲ表面の化学的特性によって定義される。これらの特徴は、順番に、個々のＣＤＲ構造によって、これらのＣＤＲの相対的配置によって、ならびにこれらのＣＤＲを含んでなる残基の側鎖の性質および配置によって決定される。大規模な免疫原性の減少は、ヒトフレームワーク（「アクセプターフレームワーク」）および定常領域上に非ヒト（例えば、マウス）抗体（「ドナー」抗体）のＣＤＲのみを移植することによって達成することができる（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２−５２５およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎ Ｍ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９,１５３４−１５３６参照）。しかし、ＣＤＲ移植それ自体は、抗原結合特性の完全な保持をもたらすことができず、重要な抗原結合親和性を回復すべき場合には、このドナー抗体の（「逆突然変異」とも呼ばれる場合がある）いくつかのフレームワーク残基は、ヒト化分子内に保持される必要があることが頻繁に明らかになっている（Ｑｕｅｅｎ Ｃ ｅｔ ａｌ（１９８９）ＰＮＡＳ ８６,１０，０２９−１０，０３３,Ｃｏ,Ｍ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５１,５０１−５０２）。この場合において、ヒトフレームワーク（ＦＲ）を提供するために、この非ヒトドナー抗体に最も配列相同性を示すヒトＶ領域をデータベースから選択する。ヒトＦＲの選択は、ヒトコンセンサスまたは個々のヒト抗体のいずれか一方から行うことができる。このドナー抗体の必須の重要な残基をヒトアクセプターフレームワークの中に置換し、ＣＤＲ構造を維持する。この抗体のコンピューターモデリングの使用は、このような構造的に重要な残基を同定するのにおそらく役立つ（国際特許ＷＯ９９／４８５２３参照）。
【００５５】
あるいは、ヒト化は、「上張り（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」プロセスによって達成することができる。独特なヒトおよびマウスの免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の統計解析により、露出した残基の正確なパターンはヒトおよびマウスの抗体で異なっており、ほとんどの個々の表面の位置が、少数の異なる残基に対して優先度が高いことが明らかになった（Ｐａｄｌａｎ Ｅ.Ａ.ｅｔ ａｌ；（１９９１）Ｍｏｌ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.２８,４８９−４９８およびＰｅｄｅｒｓｅｎ Ｊ.Ｔ.ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.２３５；９５９−９７３参照）。したがって、通常、ヒト抗体に見られるものとは異なる、そのフレームワーク領域内の露出した残基を置換することによって、非ヒトＦｖの免疫原性を減少させることができる。タンパク質の抗原性は表面接触性と相関し得るので、これらの表面残基の置換は、ヒトの免疫システムに対してこのマウス可変領域を隠すのに十分であり得る（Ｍａｒｋ Ｇ.Ｅ.ｅｔ ａｌ（１９９４）ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｖｏｌ.１１３：Ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ,Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ,ｐｐ１０５−１３４も参照）。このヒト化の方法は、抗体の表面のみを変えるので、「上張り」とも呼ばれ、これらの支持残基は影響を受けないままである。
【００５６】
したがって、本発明は、アグリカナーゼに結合することができる少なくとも１つの第１の免疫グロブリン可変ドメインを含んでなる、単離した抗原結合タンパク質を提供する。一実施形態において、このアグリカナーゼはヒトＡＤＡＭＴＳ５である。いくつかの場合において、この抗原結合タンパク質は抗体またはその断片である。いくつかの場合において、この抗体は、ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合する。この抗体はモノクローナル抗体またはその断片であってもよい。いくつかの場合において、本発明のモノクローナル抗体またはその断片は、マウス、キメラ、ヒト化、または完全なヒトの抗体またはその断片である。
【００５７】
別の実施形態において、この抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの相補性決定領域を含んでなる。いくつかの場合において、本発明の抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含んでなる重鎖ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含んでなる軽鎖を含んでなるモノクローナル抗体であり、この重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、
アミノ酸配列ＤＡＷＭＤ（配列番号２）と少なくとも約８０％の配列同一性を有するＣＤＲＨｌ；
アミノ酸配列ＥＩＲＨＫＡＮＤＨＡＩＦＹＸＥＳＶＫＧ（配列番号３）と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するＣＤＲＨ２；
アミノ酸配列ＴＹＹＹＧＳＳＹＧＹＣＤＶ（配列番号４）またはＰＦＡＹ（配列番号５）と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するＣＤＲＨ３；
の群から選択され、かつこの軽鎖の相補性決定領域は、
アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＧＴＴＩＶ（配列番号６）またはＲＴＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号７）と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するＣＤＲＬｌ；
アミノ酸配列ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号８）もしくはＳＡＳＮＲＸＴ（配列番号９）と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の配列同一性を有するＣＤＲＬ２；
アミノ酸配列ＱＱＹＳＳＹＰＦＴ（配列番号１０）またはＱＨＨＹＧＴＰＷＴ（配列番号１１）と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するＣＤＲＬ３；
の群から選択される。
【００５８】
一実施形態において、ＣＤＲＨ２は、ＥＩＲＨＫＡＮＤＨＡＩＦＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号１２）、ＥＩＲＮＫＡＮＮＨＡＲＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号１３）、ＥＩＲＨＫＡＮＤＹＡＩＦＹＤＥＳＶＫＧ（配列番号１４）、ＥＩＲＨＫＡＮＤＨＡＩＦＹＤＥＳＶＫＧ（配列番号１５）、ＤＩＲＮＴＡＮＮＨＡＴＦＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号１６）、およびＥＩＲＨＫＡＮＤＨＡＩＦＹＤＥＳＶＫＧ（配列番号１７）から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有する。
【００５９】
一実施形態において、ＣＤＲＨ３は、アミノ酸配列ＰＦＡＹ（配列番号５）を含んでなる。
【００６０】
さらに別の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含んでなる重鎖ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含んでなる軽鎖を含んでなるモノクローナル抗体であり、この重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、
ＣＤＲＨ１が、アミノ酸配列ＤＡＷＭＤ（配列番号２）であり；
ＣＤＲＨ２が、アミノ酸配列ＥＩＲＨＫＡＮＤＨＡＩＦＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号１２）、ＥＩＲＮＫＡＮＮＨＡＲＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号１３）、ＥＩＲＨＫＡＮＤＹＡＩＦＹＤＥＳＶＫＧ（配列番号１４）、ＥＩＲＨＫＡＮＤＨＡＩＦＹＤＥＳＶＫＧ（配列番号１５）、ＤＩＲＮＴＡＮＮＨＡＴＦＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号１６）、またはＥＩＲＨＫＡＮＤＨＡＩＦＹＤＥＳＶＫＧ（配列番号１７）であり；
ＣＤＲＨ３が、ＴＹＹＹＧＳＳＹＧＹＣＤＶ（配列番号１８）またはＰＦＡＹ（配列番号５）である；
から選択され、かつこの軽鎖の相補性決定領域は、
ＣＤＲＬ１が、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＧＴＴＩＶ（配列番号１９）、ＲＴＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号２０）、またはＫＡＳＱＮＶＧＴＡＶＶ（配列番号２１）から選択され；
ＣＤＲＬ２が、アミノ酸配列ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号２２）、ＳＡＳＮＲＨＴ（配列番号２３）、ＳＡＳＴＲＹＴ（配列番号２４）、またはＳＡＳＮＲＹＴ（配列番号２５）から選択され；
ＣＤＲＬ３が、アミノ酸配列ＱＱＹＳＳＹＰＦＴ（配列番号２６）、ＱＨＨＹＧＴＰＷＴ（配列番号２７）、ＱＱＹＶＮＹＰＦＴ（配列番号２８）、またはＱＱＹＴＳＹＰＦＴ（配列番号２９）から選択される；
から選択される。
【００６１】
したがって、本発明の一実施形態において、６つのＣＤＲを含んでなる単離したモノクローナル抗体を提供し、その中のＣＤＲＨ１はＤＡＷＭＤ（配列番号２）であり、ＣＤＲＨ２はＥＩＲＮＫＡＮＮＨＡＲＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号１３）であり、ＣＤＲＨ３はＴＹＹＹＧＳＳＹＧＹＣＤＶ（配列番号１８）であり、ＣＤＲＬ１はＲＴＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号２０）であり、ＣＤＲＬ２はＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号２２）であり、ＣＤＲＬ３はＱＨＨＹＧＴＰＷＴ（配列番号２７）である。
【００６２】
本発明の別の実施形態において、６つのＣＤＲを含んでなる単離したモノクローナル抗体を提供し、その中のＣＤＲＨ１はＤＡＷＭＤ（配列番号２）であり、ＣＤＲＨ２はＥＩＲＨＫＡＮＤＨＡＩＦＹＤＥＳＶＫＧ（配列番号１５）であり、ＣＤＲＨ３はＰＦＡＹ（配列番号５）であり、ＣＤＲＬ１はＫＡＳＱＳＶＧＴＴＩＶ（配列番号１９）であり、ＣＤＲＬ２はＳＡＳＮＲＨＴ（配列番号２３）であり、ＣＤＲＬ３はＱＱＹＴＳＹＰＦＴ（配列番号２９）である。
【００６３】
さらに別の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含んでなる重鎖ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含んでなる軽鎖を含んでなるモノクローナル抗体であり、その中の重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、以下から選択される：
ＣＤＲＨ１が、アミノ酸配列ＤＡＷＭＤ（配列番号２）であり、配列番号２の全てのアミン酸配列は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、オルニチン、プロリン、セリン、タウリン、およびチロシンから選択されるアミノ酸によって一箇所置換されている；
ＣＤＲＨ２が、アミノ酸配列ＥＩＲＨＫＡＮＤＨＡＩＦＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号１２）、ＥＩＲＮＫＡＮＮＨＡＲＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号１３）、ＥＩＲＨＫＡＮＤＹＡＩＦＹＤＥＳＶＫＧ（配列番号１４）、ＥＩＲＨＫＡＮＤＨＡＩＦＹＤＥＳＶＫＧ（配列番号１５）、ＤＩＲＮＴＡＮＮＨＡＴＦＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号１６）、またはＥＩＲＨＫＡＮＤＨＡＩＦＹＤＥＳＶＫＧ（配列番号１７）から選択され、配列番号１２〜１７の全てのアミノ酸配列は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、オルニチン、プロリン、セリン、タウリン、およびチロシンから選択されるアミノ酸によって一箇所置換されている；
ＣＤＲＨ３が、ＴＹＹＹＧＳＳＹＧＹＣＤＶ（配列番号１８）またはＰＦＡＹ（配列番号５）であり、配列番号１８および配列番号５の全てのアミノ酸配列は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、オルニチン、プロリン、セリン、タウリン、およびチロシンから選択されるアミノ酸によって一箇所置換されている；
ならびに、この軽鎖の相補性決定領域は、以下から選択される：
ＣＤＲＬ１が、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＧＴＴＩＶ（配列番号１９）、ＲＴＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号２０）、またはＫＡＳＱＮＶＧＴＡＶＶ（配列番号２１）から選択され、配列番号１９〜２１の全てのアミノ酸配列は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、オルニチン、プロリン、セリン、タウリン、およびチロシンから選択されるアミノ酸によって一箇所置換されている；
ＣＤＲＬ２が、アミノ酸配列ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号２２）、ＳＡＳＮＲＨＴ（配列番号２３）、ＳＡＳＴＲＹＴ（配列番号２４）、またはＳＡＳＮＲＹＴ（配列番号２５）から選択され、配列番号２２〜２５の全てのアミノ酸配列は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、オルニチン、プロリン、セリン、タウリン、およびチロシンから選択されるアミノ酸によって一箇所置換されている；
ＣＤＲＬ３が、アミノ酸配列ＱＱＹＳＳＹＰＦＴ（配列番号２６）、ＱＨＨＹＧＴＰＷＴ（配列番号２７）、ＱＱＹＶＮＹＰＦＴ（配列番号２８）、またはＱＱＹＴＳＹＰＦＴ（配列番号２９）から選択され、配列番号２６〜２９の全てのアミノ酸配列は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、オルニチン、プロリン、セリン、タウリン、およびチロシンから選択されるアミノ酸によって一箇所置換されている。
【００６４】
特定の実施形態において、ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号２２）のＴｈｒ４はロイシン、イソロイシンまたはメチオニンである。特定の実施形態において、ＱＨＨＹＧＴＰＷＴ（配列番号２７）のＨｉｓ３はバリンである。特定の実施形態において、ＱＨＨＹＧＴＰＷＴ（配列番号２７）のＧｌｙ５はトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、またはメチオニンである。特定の実施形態において、ＥＩＲＮＫＡＮＮＨＡＲＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号１３）のＨｉｓ９はフェニルアラニンまたはチロシンである。特定の実施形態において、ＴＹＹＹＧＳＳＹＧＹＣＤＶ（配列番号１８）のＳｅｒ６はフェニルアラニンまたはチロシンである。
【００６５】
ＣＤＲのＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、およびＨ２は、構造的に、有限数の主鎖の構造のうちの１つを示す傾向がある。ＣＤＲの特定の標準構造クラスは、ＣＤＲの長さおよびループのパッキングの両方によって定義され、これらのＣＤＲおよびこれらのフレームワーク領域（構造決定残基、すなわちＳＤＲ）の両方の中の重要な位置にある残基によって決定される。ＭａｒｔｉｎおよびＴｈｏｒｎｔｏｎ（１９９６；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６３：８００−８１５）は、「重要な残基」の標準的な鋳型を定義するための自動化法を作製している。クラスター分析を用いて、ＣＤＲセットの標準的なクラスを定義し、その後、標準的な鋳型を、埋もれている疎水性の水素結合残基、保存されているグリシンおよびプロリンを分析することによって同定する。抗体配列のＣＤＲを、重要な残基の鋳型とこれらの配列を比較し、同一性または類似性の行列を用いて各鋳型をスコア化することにより、標準クラスに割り当てることができる。
【００６６】
本発明の範囲内のＣＤＲ標準の例を以下に示す。使用するアミノ酸の番号付けはカバットである。
【００６７】
配列番号１４４に記載のＣＤＲＨ１またはその変異体の標準の例は以下である：
Ａｌａ３２がＩｌｅ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、ＧｌｕまたはＡｓｐに置換されている；Ｔｒｐ３３がＴｙｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＶａｌに置換されている；Ｍｅｔ３４がＩｌｅ、ＶａｌまたはＴｒｐに置換されている；Ａｓｐ３５がＨｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｈｒに置換されている。
【００６８】
配列番号１４４に記載のＣＤＲＨ２またはその変異体の標準の例は以下である：
Ｇｌｕ５０がＡｒｇまたはＧｌｎに置換されている；Ｉｌｅ５１がＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＡｓｎに置換されている。
【００６９】
配列番号１４４に記載のＣＤＲＨ３またはその変異体の標準の例は以下である：
Ｔｙｒ１０２がＨｉｓ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｙに置換されている。
【００７０】
配列番号１４６に記載のＣＤＲＬ１またはその変異体の標準の例は以下である：
Ｓｅｒ２８がＡｓｎ、Ａｓｐ、ＴｈｒまたはＧｌｕに置換されている；Ｖａｌ２９がＩｌｅに置換されている；Ｇｌｙ３０がＡｓｐ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、ＨｉｓまたはＴｈｒに置換されている；Ｔｈｒ３１がＳｅｒ、Ａｓｎ、ＬｙｓまたはＧｌｙに置換されている；Ｔｈｒ３２がＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＡｒｇに置換されている；Ｉｌｅ３３がＭｅｔ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＰｈｅに置換されている；Ｖａｌ３４がＡｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＨｉｓまたはＰｈｅに置換されている。
【００７１】
配列番号１４４に記載のＣＤＲＬ３またはその変異体の標準の例は以下である：
Ｇｌｎ８９がＳｅｒ、Ｇｌｙ、ＰｈｅまたはＬｅｕに置換されている；Ｇｌｎ９０がＡｓｎまたはＨｉｓに置換されている；Ｔｙｒ９１がＡｓｎ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＴｈｒまたはＶａｌに置換されている；Ｔｈｒ９２がＡｓｎ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＡｌａまたはＡｓｐに置換されている；Ｓｅｒ９３がＧｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＡｌａまたはＨｉｓに置換されている；Ｔｙｒ９４がＡｓｐ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、ＰｒｏまたはＳｅｒに置換されている；Ｐｈｅ９６がＰｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、ＩｌｅまたはＴｒｐに置換されている。
【００７２】
他の態様において、この抗原結合タンパク質は、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ）２断片である。別の実施形態において、第１の免疫グロブリン可変ドメインは、一本鎖可変ドメインである。
【００７３】
本発明の一実施形態において、本明細書に記載の本発明による、定常ドメイン領域を含んでなる抗体を提供し、その結果、この抗体は、ＡＤＣＣおよび／または補体活性化またはエフェクター機能性を減少させた。このような一実施形態において、この定常ドメインは、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプの天然の機能しない定常領域または変異ＩｇＧｌ定常ドメインを含み得る。適切な修飾の例は、ヨーロッパ特許ＥＰ０３０７４３４に記載されている。一例として、２３５位および２３７位（ＥＵインデックス番号付け）のアラニン残基の置換が挙げられる。一実施形態において、このような抗体は、配列番号１５８の重鎖を含んでなる。
【００７４】
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号７６、８０、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３６、１３８、１４０、１４２、および１４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体ＶＨドメインを含んでなる。
【００７５】
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号７８、８２、１３０、１３２、１３４、および１４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体ＶＬドメインを含んでなる。
【００７６】
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号７６、８０、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３６、１３８、１４０、１４２、および１４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体ＶＨドメイン、ならびに配列番号７８、８２、１３０、１３２、１３４、および１４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＶＬドメインを含んでなる。
【００７７】
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号７６含んでなる抗体ＶＨドメインおよび配列番号７８を含んでなるＶＬドメインを含んでなる。
【００７８】
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号８０含んでなる抗体ＶＨドメインおよび配列番号８２を含んでなるＶＬドメインを含んでなる。
【００７９】
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、および１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体ＶＨドメイン、ならびに配列番号１３０、１３２、および１３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＶＬドメインを含んでなる。
【００８０】
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号１３６、１３８、１４０、１４２、および１４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体ＶＨドメイン、ならびに配列番号１４６を含んでなるＶＬドメインを含んでなる。
【００８１】
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号６８、７２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、および１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖を含んでなる。
【００８２】
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号７０、７４、９８、１００、１０２、および１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる。
【００８３】
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号６８、７２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、および１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖、ならびに配列番号７０、７４、９８、１００、１０２、および１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる。
【００８４】
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号６８を含んでなる抗体重鎖および配列番号７０を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる。
【００８５】
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号７２を含んでなる抗体重鎖および配列番号７４を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる。
【００８６】
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号８４、８６、８８、９０、９２、９４、および９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖、ならびに配列番号９８、１００、および１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる。
【００８７】
一実施形態において、この抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、および１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖、ならびに配列番号１１４を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる。
【００８８】
本発明の別の態様は、ＡＤＡＭＴＳ５への結合に対して、表３にまとめる抗体のいずれか１つと競合する抗体を含んでなる。これらには、抗体１Ｇ１０．１Ｃ９、２Ｄ３．１Ｄ４、３Ａ１２．１Ｄ７、５Ｆ１０．１Ｈ６、１１Ｆ１２．１Ｄ１２、１２Ｆ４．１Ｈ７、および７Ｂ４．１Ｅ１１が含まれる。
【００８９】
さらに別の実施形態において、この抗原結合タンパク質は、第２の抗原に結合することができる第２の免疫グロブリン可変ドメインをさらに含んでなる。この第２の免疫グロブリン可変ドメインは、抗原結合ペプチドの投与の際に担体として機能を果たし得る抗原に結合することができる。例えば、この第２の免疫グロブリン可変ドメインは、ヒトの血清アルブミンまたはトランスフェリン（これらに限定されない）などの血液タンパク質に結合し得る。さらに、この第２の免疫グロブリン可変ドメインは、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、および／もしくはＴＲＰＶｌまたは他のバニロイド受容体（これらに限定されない）などの哺乳類の痛みの調節に関連する抗原に結合し得る。さらに、この第２の免疫グロブリン可変ドメインは、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＴＲＰＶ４、ＲＡＮＫＬ、およびＩＬ−１（これらに限定されない）などの炎症反応および／または自己免疫疾患に関連するサイトカインまたはサイトカイン受容体に結合し得る。この第２の抗原は、ＡＤＡＭＴＳ４および／もしくはＡＤＡＭＴＳ５（これらに限定されない）などの第２のアグリカナーゼ、ならびに／またはＡＤＡＭＴＳ５上の第２のエピトープ、ならびに／またはＭＭＰ−１３（これに限定されない）などの多くのメタロプロテイナーゼにも結合し得る。
【００９０】
この第２の免疫グロブリン可変ドメインは、アグリカン、コラーゲンＩＩ、プロテオグリカンまたは軟骨に関連する他の分子にも結合し得る。本発明の一態様において、この第２の免疫グロブリン可変ドメインは、ＡＤＡＭＴＳ４、ＮＧＦ、ＯＳＭ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＶＩＰ、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ４、ＡＤＡＭＴＳ１、アグリカン、コラーゲンＩＩ、ＲＡＮＫＬ、シンデカン４、ヘッジホッグ、および／またはＩＬ−１からなる群から選択される抗原に結合する。
【００９１】
Ｄｅｌｇａｄｏ,ｅｔ ａｌ.Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ.７,５６３−５６８は、ＶＩＰ治療が、炎症誘発メディエーターの産生、ならびにメタロプロテイナーゼゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２）の発現を抑制すると報告している。ＭＭＰ−２は、関節炎マウスの足の関節破壊に寄与すると考えられている。インビトロ試験は、間接的な作用もＴｈ２サイトカインの産生の増強を経て仲介され得るが、ＶＩＰは滑膜細胞に直接作用し得ることを示している。それにもかかわらず、ＶＩＰは、ＣＩＡマウスモデルにおいて複数レベルで滑膜機能に影響を与えるように思われる。このペプチドはＴｈ１機能を抑制するが、Ｔｈ２機能を増大させ、おそらく免疫システムの「バランスを再びとる」。さらに、ＶＩＰは、マクロファージならびに滑膜細胞に直接的および間接的に影響を与え、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ケモカイン、および基質分解酵素の発現低下をもたらし、関節の完全性を保護する（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７,５３７−５３８（２００１））。
【００９２】
血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）は、約２０年前にリウマチ患者の滑液中で同定されており、本研究の目的は、ＶＩＰがＯＡの痛みの発生に関与し得るかどうかを検討することであった。後肢体重負荷は関節痛の方法として用いられるが、フォンフレイヘア（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｈａｉｒ）疼痛計を、２次性の機械的痛覚過敏について試験する同側後肢の足底面に適用した。正常ラットの膝関節へのＶＩＰの関節内注射は、反対側の注射していない後肢に対する体重負荷で重要な変化を引き起こし、かつ同じ側足引っ込め閾値の低下を引き起こした。これらの疼痛反応を、ＶＰＡＣ受容体アンタゴニストの同時投与によって阻止した。ＶＩＰ活性を阻害するアンタゴニストは、ＯＡの痛みの緩和に有効であると立証することができる（ＭｃＤｏｕｇａｌｌ,ｅｔ ａｌ.Ｐａｉｎ ２００６ Ｊｕｌ；１２３（１−２）：９８−１０５）。
【００９３】
神経成長因子（ＮＧＦ）は同定された最初のニューロトロフィンであり、末梢神経および中枢神経の両方の発達および生存におけるその役割は十分に特徴づけられている。ＮＧＦは、末梢交感神経細胞および胚の感覚神経細胞の発達ならびに前脳基底部コリン作動性神経細胞の発達における重要な生存維持因子であることが示されている（Ｓｍｅｙｎｅ ｅｔ ａｌ.,Ｎａｔｕｒｅ ３６８：２４６−２４９（１９９４）およびＣｒｏｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ.,Ｃｅｌｌ ７６：１００１−１０１１（１９９４））。ＮＧＦは感覚神経細胞における神経ペプチドの発現を上方制御し（Ｌｉｎｄｓａｙ ａｎｄ Ｈａｒｍｅｒ,Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３６２−３６４（１９８９））、その活性は、２つの異なる膜結合受容体、すなわちＴｒｋＡ受容体およびｐ７５共通ニューロトロフィン受容体（それぞれ、「高親和性」ＮＧＦ受容体および「低親和性」ＮＧＦ受容体と呼ばれることもある）を介して媒介される（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ.,Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：５１８−５２１（１９８６））。ＮＧＦについての概説として、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ.,Ａｎｎｕ.Ｒｅｖ.Ｎｅｕｒｏｓｃｉ.２４：６７７−７３６（２００１）；Ｂｉｂｅｌ ｅｔ ａｌ.,Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ.１４：２９１９−２９３７（２０００）を参照されたい。ＮＧＦおよびＴｒｋＡ受容体と複合体を形成しているＮＧＦの結晶構造が決定されている（Ｎａｔｕｒｅ ２５４：４１１（１９９１）；Ｎａｔｕｒｅ ４０１：１８４−１８８（１９９６）参照）。
【００９４】
オンコスタチンＭは、サイトカインのインターロイキン６（ＩＬ−６）ファミリーに属する２８ＫＤａの糖タンパク質であり、このＩＬ−６ファミリーには、ＩＬ−６、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）およびカルジオトロフィン−１様サイトカインが含まれ（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ Ｔ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｂｌｏｏｄ ８６：１２４３−１２５４）参照）、ｇｐ１３０膜貫通シグナル伝達受容体を共有する（Ｔａｇａ Ｔ ａｎｄ Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ Ｔ（１９９７）Ａｎｎｕ.Ｒｅｖ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.１５：７９７−８１９参照）。ＯＳＭは、もともとメラノーマ細胞株Ａ３７５の成長を阻害するその能力によって発見された（Ｍａｌｉｋ Ｎｅｔ ａｌ（１９８９）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９：２８４７−２８５３）。その後、より多くの効果が発見され、それは、ＩＬ−６ファミリーの他のメンバーのような多機能メディエーターであることがわかった。ＯＳＭは、マクロファージ、活性化Ｔ細胞（Ｚａｒｌｉｎｇ ＪＭ（１９８６）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８３：９７３９−９７４３）参照）、多形核好中球（Ｇｒｅｎｉｅｒ Ａ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｂｌｏｏｄ ９３：１４１３−１４２１）参照）、好酸球（Ｔａｍｕｒａ Ｓ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｄｅｖ.Ｄｙｎ.２２５：３２７−３１）、樹状細胞（Ｓｕｄａ Ｔ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １７：３３５−３４０）参照）を含んでなる様々な細胞型で産生される。ＯＳＭは、膵臓、腎臓、精巣、脾臓、胃、および脳（Ｚｎｏｙｋｏ Ｉ ｅｔ ａｌ（２００５）Ａｎａｔ Ｒｅｃ Ａ Ｄｉｓｃｏｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｖｏｌ Ｂｉｏｌ ２８３：１８２−１８６）参照）、ならびに骨髄（Ｐｓｅｎａｋ Ｏ ｅｔ ａｌ（２００３）Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ １０９：６８−７５参照）でも発現している。その主要な生物学的効果には、内皮の活性化（Ｂｒｏｗｎ ＴＪ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｂｌｏｏｄ ８２：３３−７参照）、急性期反応の活性化（Ｂｅｎｉｇｎｉ Ｆ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｂｌｏｏｄ ８７：１８５１−１８５４参照）、細胞の増殖または分化の誘導、炎症性メディエーターの放出、および造血の調節（Ｔａｎａｋａ Ｍ ｅｔ ａｌ（２００３）１０２：３１５４−３１６２参照）、骨のリモデリング（ｄｅ Ｈｏｏｇｅ ＡＳＫ（２００２）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６０：１７３３−１７４３参照）、血管形成の促進（Ｖａｓｓｅ Ｍ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １９：１８３５−１８４２参照）、ならびに創傷治癒が含まれる。
【００９５】
腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα;カケクチンとも称される）として知られるサイトカインは、エンドトキシンまたは他の刺激に応答して、１７ｋＤタンパク質サブユニットの可溶性ホモ３量体として、主に単球およびマクロファージから分泌されるタンパク質である（Ｓｍｉｔｈ,Ｒ.Ａ.ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６２：６９５１−６９５４（１９８７））。ＴＮＦの膜結合２６ｋＤ前駆体型についても記載されている（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ,Ｍ.ｅｔ ａｌ.,Ｃｅｌｌ ５３：４５−５３（１９８８））。
【００９６】
ＴＮＦが多面的な生物学的活性を有する調節サイトカインであることを示す証拠が蓄積している。これらの活性には、リポタンパク質のリパーゼ合成の阻害（「カケクチン」活性）（Ｂｅｕｔｌｅｒ,Ｂ.ｅｔ ａｌ.,Ｎａｔｕｒｅ ３１６：５５２（１９８５））、多形核白血球の活性化（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ,Ｓ.Ｊ.ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.１３６：４２２０（１９８６）；Ｐｅｒｕｓｓｉａ,Ｂ.,ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.１３８：７６５（１９８７））、細胞増殖の阻害または細胞増殖の刺激（Ｖｉｌｃｅｋ,Ｊ.ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｅｘｐ.Ｍｅｄ.１６３：６３２（１９８６）；Ｓｕｇａｒｍａｎ,Ｂ.Ｊ.ｅｔ ａｌ.,Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９４３（１９８５）；Ｌａｃｈｍａｎ,Ｌ.Ｂ.ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.１３８：２９１３（１９８７））、特定の形質転換細胞型に対する細胞毒性作用（上述のＬａｃｈｍａｎ,Ｌ.Ｂ.ｅｔ ａｌ.；Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ,Ｚ.ｅｔ ａｌ.,Ｃａｎｃ.Ｒｅｓ.４４：８３（１９８４））、抗ウイルス活性（Ｋｏｈａｓｅ,Ｍ.ｅｔ ａｌ.,Ｃｅｌｌ ４５：６５９（１９８６）；Ｗｏｎｇ,Ｇ.Ｈ.Ｗ.ｅｔ ａｌ.,Ｎａｔｕｒｅ ３２３：８１９（１９８６））、骨吸収の刺激（Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ,Ｄ.Ｒ.ｅｔ ａｌ.,Ｎａｔｕｒｅ ３１９：５１６（１９８６）；Ｓａｋｌａｔｖａｌａ,Ｊ.,Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５４７（１９８６））、コラゲナーゼ、およびプロスタグランジンＥ２の産生の刺激（Ｄａｙｅｒ,Ｊ.−Ｍ.ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｅｘｐ.Ｍｅｄ.１６２：２１６３（１９８５）)、Ｔ細胞の活性化を含んでなる免疫調節作用（Ｙｏｋｏｔａ,Ｓ.ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.１４０：５３１（１９８８））、Ｂ細胞（Ｋｅｈｒｌ,Ｊ.Ｈ.ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｅｘｐ.Ｍｅｄ.１６６：７８６（１９８７））、単球（Ｐｈｉｌｉｐ,Ｒ.ｅｔ ａｌ.,Ｎａｔｕｒｅ ３２３：８６（１９８６））、胸腺細胞（Ｒａｎｇｅｓ,Ｇ.Ｅ.ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｅｘｐ.Ｍｅｄ.１６７：１４７２（１９８８））、ならびに主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の細胞表面発現の刺激（Ｃｏｌｌｉｎｓ,Ｔ.ｅｔ ａｌ.,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ８３：４４６（１９８６）；Ｐｕｊｏｌ−Ｂｏｒｒｅｌ,Ｒ.ｅｔ ａｌ.,Ｎａｔｕｒｅ ３２６：３０４（１９８７））が含まれる。
【００９７】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、増殖刺激および炎症誘発活性を示す２２〜２７ｋＤａの分泌糖タンパク質である。ＩＬ−６は、インターフェロン−β２（ＩＦＮ−β２）、ＩＬ−１誘導性２６−ｋＤａタンパク質、肝細胞刺激因子、細胞独性Ｔ細胞分化因子、およびＢ細胞刺激因子としても知られる（Ｔｒｉｋｈａ ｅｔ ａｌ.,Ｃｌｉｎ.Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.９：４６５３−４６６５（２００３））。ＩＬ−６は種々な細胞型から分泌される。ＩＬ−６は、２種類の膜糖タンパク質からなる高親和性受容体複合体への結合を経てその活性を発揮し、その２種類の膜糖タンパク質は、低い親和性でＩＬ−６に結合する８０ｋＤａの構成受容体、および単独ではＩＬ−６には結合しないが、複合体によるＩＬ−６の高親和性結合に必要である１３０ｋＤａのシグナル伝達構成成分（ｇｐ１３０）である。ＩＬ−６Ｒを膜貫通メタロプロテイナーゼにより切断して、可溶性ＩＬ−６Ｒを得ることができる。
【００９８】
ＲＡＮＫはＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであり、細胞外領域のＣＤ４０と最も厳密に似ている。ＣＤ４０と同様に、（Ｒｏｔｈｅ ｅｔ ａｌ.,Ｃｅｌｌ ８３：１２４３,１９９５に記載の共免疫沈降アッセイによって実質的に決定されるように）ＲＡＮＫは、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３と会合する。ＴＲＡＦは、免疫反応および炎症反応の調節において非常に重要である。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの様々なメンバーとの会合を経て、シグナルが細胞に伝達される。そのシグナルは、受容体（複数可）が誘発し、ＴＲＡＦ（複数可）がこの受容体（複数可）と会合することによって、細胞の増殖、分化またはアポトーシスをもたらし、異なるシグナルは、様々なシグナル伝達事象の協調により細胞に伝達され得る。したがって、このファミリーの一員を介して伝達されるシグナルは、この細胞に伝達される他のシグナルならびに／またはこの細胞の分化の状態に応じて、増殖性シグナル、分化のシグナルまたはアポトーシスシグナルであり得る。この増殖／アポトーシス経路のこのように絶妙な調節は、病原体からの保護を発展させ、維持するために必要であり、不均衡が自己免疫疾患をもたらし得る。
【００９９】
ＲＡＮＫは、上皮細胞、一部のＢ細胞株、および活性化Ｔ細胞上で発現する。しかし、活性化Ｔ細胞上でのその発現は、活性化の約４日後と遅い。発現のこの時間的経過は、アポトーシスの既知の作用因子であるＦａｓの発現と一致する。ＲＡＮＫは、ＣＤ４０が行うことを知られているように抗アポトーシスシグナルとしての機能を果たし、ＲＡＮＫを発現する細胞をアポトーシスから救出し得る。あるいは、ＲＡＮＫは、再びＣＤ４０と同じように、適切な状況下でアポトーシスシグナルを確認することができる。ＲＡＮＫおよびそのリガンドは、免疫反応および炎症反応の調節に不可欠な役割を果たしている可能性がある。
【０１００】
ＲＡＮＫＬと呼ばれるリガンドは、約５０個未満のアミノ酸の細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および約２４０〜２５０個のアミノ酸の細胞外ドメインを有する２型膜貫通タンパク質である。それが属するＴＮＦファミリーの他のメンバーと同様に、ＲＡＮＫＬは膜貫通ドメインと受容体結合に必要ではない受容体結合ドメインの間に「スペーサー」の領域を有する。したがって、ＲＡＮＫＬの可溶型は、この受容体結合領域を含んでなる全細胞外ドメインまたはその断片を含み得る。
【０１０１】
ＴＲＰＶ４チャネル受容体は、一過性の受容体電位チャネルのバニロイドファミリーの６つの既知のメンバーの１つであり、ＴＲＰＶ１とヌクレオチドレベルで５１％の同一性を共有する。ヒトのＴＲＰＶ４チャネル受容体を含んでなるヒトバニロイド受容体型をコードするポリペプチドおよびポリヌクレオチドの例は、ヨーロッパ特許ＥＰ１１７０３６５および国際特許ＷＯ００／３２７６６の中で見つけることができる。他のファミリーメンバーと同様に、ＴＲＰＶ４チャネル受容体は、Ｃａ２＋透過性の、非選択的リガンド依存性陽イオンチャネル（ｌｉｇａｎｄ−ｇａｔｅｄ ｃａｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ）であり、浸透圧の低下、温度上昇、および小分子リガンドなどの様々な刺激に応答する（例えば、Ｖｏｅｔｓ,ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.（２００２）２７７ ３３７０４−４７０５１；Ｗａｔａｎａｂｅ,ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.（２００２）２７７：４７０４４−４７０５１；Ｗａｔａｎａｂｅ,ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.（２００２）２７７：１３５６９−４７０５１；Ｘｕ,ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.（２００３）２７８：１１５２０−１１５２７参照）。体組織のスクリーニングから、ヒトＴＲＰＶ４チャネル受容体が軟骨で最も顕著に発現している。１次細胞培養およびクローン細胞培養のスクリーニングは、軟骨細胞のみにおいて顕著に発現していることを示す。
【０１０２】
このような応答は、共通のバニロイド部分を共有するカプサイシンの構造類似体によっても引き起こされる。このような類似体の１つは、レシニフェラトキシン（ＲＴＸ）、ユーホルビアの植物の天然産物である。バニロイド受容体（ＶＲ）という用語は、カプサイシンおよびこのような関連する刺激性化合物の神経細胞膜の認識部位について記載するために作り出された。カプサイシン応答は、別のカプサイシン類似体のカプサゼピンによって競合阻害され（かつそれによって拮抗され）、非選択的陽イオンチャネル阻害薬であるルテニウムレッドによっても阻害される。これらのアンタゴニストは、わずか中程度の親和性（典型的には、１４０μＭ以上のＫｉ値）でＶＲに結合する。
【０１０３】
最近、ラットおよびヒトのカプサイシン受容体が、後根神経節細胞からクローニングされた。かかる受容体はＶＲ１とも呼ばれており、「ＶＲ１」および「カプサイシン受容体」という用語は、この種のラットおよび／またはヒトの受容体、ならびに哺乳類ホモログを表すために本明細書中で互換的に使用される。痛覚におけるＶＲ１の役割は、バニロイド誘発疼痛行動を示さず、熱と炎症に対する反応が損なっているこの受容体を欠損したマウスを用いて確認されている。このカプサイシン受容体は、温度上昇、低いｐＨ、およびカプサイシン受容体アゴニストに反応して低下する、開口の閾値を有する非選択的陽イオンチャネルである。例えば、このチャネルは、通常、約４５℃よりも高い温度で開口する。このカプサイシン受容体チャネルが開口すると、一般に、この受容体を発現する神経細胞および近くの他の神経細胞からの炎症性ペプチドの放出が続き、疼痛反応を増加する。カプサイシンによる初期の活性化後、このカプサイシン受容体は、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼによるリン酸化により迅速な脱感作を受ける。
【０１０４】
本発明の抗原結合タンパク質を、ヒトＡＤＡＭＴＳ５に対して約９．０×１０−９Ｍ以下の解離定数によって特徴づけることができ、いくつかの場合において、それは、約２．５×１０−１０Ｍ以下である。ヒトＡＤＡＭＴＳ５などの標的に対する抗原結合タンパク質の親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥまたはＯｃｔｅｔ（これらに限定されない）などの表面プラズモン共鳴によって測定することができる。ＢＩＡｃｏｒｅ動態解析を用いて、ＡＤＡＭＴＳ５抗原に対する抗体またはその断片の結合定数および解離定数を決定することができる。ＢＩＡｃｏｒｅ動態解析には、チップの表面上に抗体またはその断片を固定したチップからのＡＤＡＭＴＳ５抗原の結合および解離を解析することが含まれる（以下の実施例の欄参照）。
【０１０５】
本発明は、ＡＤＡＭＴＳ５の少なくとも１つの活性を阻止する、かつ／または減少させる抗原結合タンパク質も提供する。いくつかの場合において、本発明の抗原結合タンパク質は、Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４切断部位におけるＡＤＡＭＴＳ５によるアグリカンの切断を阻止する、かつ／または減少させる。いくつかの態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、非関節投与経路によって投与される時でも、軟骨を透過することができる。例えば、本発明の抗原結合タンパク質は、静脈内投与、筋肉内投与、関節内投与、皮下投与、経口投与、鼻腔内投与、および／または腹腔投与により投与されてもよい。
【０１０６】
本発明の抗原結合タンパク質をコードする単離したポリヌクレオチドも本発明の中で提供する。
【０１０７】
一実施形態において、この単離したポリヌクレオチドは、配列番号７６、８０、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３６、１３８、１４０、１４２、および１４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体ＶＨドメインを含んでなる抗原結合タンパク質またはその断片をコードする。一実施形態において、この単離したポリヌクレオチドは、配列番号７５、７９、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、および１５９からなる群から選択される。一実施形態において、このポリペプチドは、配列番号７５、７９、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、および１５９からなる群から選択されるポリヌクレオチドを発現する細胞から産生される抗体である。
【０１０８】
一実施形態において、この単離したポリヌクレオチドは、配列番号７８、８２、１３０、１３２、１３４、および１４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体ＶＬドメインを含んでなる抗原結合タンパク質またはその断片をコードする。一実施形態において、この単離したポリヌクレオチドは、配列番号７７、８１、１２９、１３１、１３３、および１４５からなる群から選択される。一実施形態において、このポリペプチドは、配列番号７７、８１、１２９、１３１、１３３、および１４５からなる群から選択されるポリヌクレオチドを発現する細胞から産生される抗体である。
【０１０９】
一実施形態において、この単離したポリヌクレオチドは、配列番号６８、７２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、および１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体重鎖を含んでなる抗原結合タンパク質またはその断片をコードする。一実施形態において、この単離したポリヌクレオチドは、配列番号６７、７１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、および１５９からなる群から選択される。一実施形態において、このポリペプチドは、配列番号６７、７１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、および１５９からなる群から選択されるポリヌクレオチドを発現する細胞から産生される抗体である。
【０１１０】
一実施形態において、この単離したポリヌクレオチドは、配列番号７０、７４、９８、１００、１０２、および１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗体軽鎖を含んでなる抗原結合タンパク質またはその断片をコードする。一実施形態において、この単離したポリヌクレオチドは、配列番号６９、７３、９７、９９、１０１、および１１５からなる群から選択される。一実施形態において、このポリペプチドは、配列番号６９、７３、９７、９９、１０１、および１１５からなる群から選択されるポリヌクレオチドを発現する細胞から産生される抗体である。
【０１１１】
本発明の抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞および前記宿主細胞でこの抗原結合タンパク質を発現させる方法も提供する。さらに、本発明の抗原結合タンパク質を作製する方法を提供する。
【０１１２】
本発明のベクター、宿主細胞、および抗体を作製する方法には、宿主細胞における複製および発現、ならびに／または宿主細胞からの分泌を制御することができる従来の調節制御配列と、この抗体のコード配列とを作動可能に結合させることによって作製される従来の発現ベクターまたは組換えプラスミドを用いることが含まれる。調節配列には、プロモーター配列、例えば、ＣＭＶプロモーター、および他の既知の抗体に由来し得るシグナル配列が含まれる。同様に、相補的な抗体軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡ配列を有する第２の発現ベクターを作製することができる。好ましくは、この第２の発現ベクターは、できるだけ各ポリペプチド鎖が機能的に発現することを保証するために、コード配列および選択マーカーに関する限りを除いて第１の発現ベクターと同一である。あるいは、改変抗体の配列をコードする重鎖および軽鎖は、単一ベクター上に存在してもよい。
【０１１３】
選択される宿主細胞を、従来の技術により、第１および第２のベクターの両方でコトランスフェクト（または、単一ベクターでトランスフェクト）して、組換えもしくは合成の軽鎖および重鎖の両方を含んでなる本発明のトランスフェクト宿主細胞を作る。その後、このトランスフェクト細胞を従来の技術により培養し、本発明の遺伝子工学処理した抗体を産生する。組換え重鎖および／または軽鎖の両方の会合を含んでなる抗体を、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡなどの適切なアッセイによって培養物からスクリーニングする。同様の従来の技術を使用して、他の改変抗体および改変分子を構築してもよい。
【０１１４】
本発明の方法および組成物の構築に使用されるクローニングステップおよびサブクローニングステップに適切なベクターは、当該技術者によって選択され得る。例えば、従来のｐＵＣシリーズのクローニングベクターを用いてもよい。１つのベクター、ｐＵＣ１９は、アマシャム社（バッキンガムシャー州、英国）またはファルマシア社（ウプサラ、スウェーデン）などの供給メーカーから市販されている。さらに、容易に複製でき、多数のクローニング部位および選択遺伝子（例えば、抗生物質耐性）を有し、容易に操作できる任意のベクターをクローニングに用いてもよい。したがって、このクローニングベクターの選択は、本発明の制限要素ではない。
【０１１５】
同様に、当該技術者が、抗体の発現に使用するベクターを任意の従来のベクターから選択してもよい。これらのベクターは、選択された宿主細胞における異種ＤＮＡ配列の複製および発現を指示する（ＣＭＶプロモーターまたはＲＳＶプロモーターなどの）選択された調節配列も含んでなる。これらのベクターは、この抗体または改変免疫グロブリンコード領域をコードする上記に記載のＤＮＡ配列を含んでなる。さらに、これらのベクターに、素早い操作で、所望の制限部位を挿入することによって改変し、選択した免疫グロブリン配列を組み込んでもよい。
【０１１６】
発現ベクターは、異種ＤＮＡ配列、例えば、哺乳類のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）の発現を増幅するのに適した遺伝子によっても特徴付けられ得る。他の好ましいベクター配列には、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）などに由来するポリＡシグナル配列およびβグロビンのプロモーター配列（ｂｅｔａｇｌｏｐｒｏ）が含まれる。本明細書で有用な発現ベクターは、当該技術者に公知の技術によって合成されてもよい。
【０１１７】
このようなベクターの構成要素、例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、およびシグナル配列などは、商業的または天然の供給源から入手するか、または選択宿主における組換えＤＮＡ産物の発現および／または分泌を指示するのに使用する公知の手順により合成してもよい。当該技術分野で公知である、哺乳類、細菌、昆虫、酵母、および真菌での発現のための多数の種類のうちの他の適切な発現ベクターも、この目的のために選択されてもよい。
【０１１８】
本発明は、これらの抗体またはその改変された免疫グロブリン分子のコード配列を含んでなる組換えプラスミドでトランスフェクトした細胞株も包含する。これらのクローニングベクターのクローニングおよび他の操作に有用な宿主細胞も従来のものである。しかし、最も望ましくは、大腸菌の種々の菌株の細胞を、本発明の改変抗体の構築におけるクローニングベクターの複製および他のステップに用いる。
【０１１９】
本発明の抗体の発現に適した宿主細胞または細胞株は、好ましくは、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ（例えば、ＤＧ４４）、ＣＯＳ、線維芽細胞（例えば、３Ｔ３）、および骨髄腫細胞などの哺乳類細胞であり、より好ましくは、ＣＨＯまたは骨髄腫細胞である。ヒト細胞を用いてもよいので、この分子をヒトのグリコシル化パターンで修飾することが可能になる。あるいは、他の真核生物の細胞株を使用してもよい。適切な哺乳類宿主細胞ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物生成、および精製のための方法の選択は、当該技術分野で公知である（例えば、上記で引用したＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ参照）。
【０１２０】
細菌細胞が、本発明の組換えＦａｂの発現に適した宿主細胞として有用であると判明し得る（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ,Ａ.,Ｉｍｍｕｎｏｌ.Ｒｅｖ.,１３０：１５１−１８８（１９９２）参照）。しかし、細菌細胞内で発現したタンパク質の傾向が折り畳まれていない形態か、不適切に折り畳まれた形態か、または非グリコシル化形態であるため、細菌の細胞内で産生された組換えＦａｂは、抗原結合能の保持についてスクリーニングされなければならない。細菌細胞が発現した分子が正しく折り畳まれた形態で産生された場合は、その細菌細胞は望ましい宿主であろう。例えば、発現に用いられる大腸菌の様々な菌株は、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞として公知である。枯草菌、放線菌、および他の桿菌などの様々な菌株も、本方法で使用されてもよい。
【０１２１】
望まれる場合、当該技術者に公知の酵母細胞株、ならびに昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエ、鱗翅目、およびウイルスの発現システムも、宿主細胞として利用可能である（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ.,Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ,８：２７７−２９８,Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）および本明細書で引用する参考文献参照）。
【０１２２】
これらのベクターを構築することができる一般的な方法、本発明の宿主細胞を産生するのに必要とされるトランスフェクション法、およびこのような宿主細胞から本発明の抗体を産生するのに必要な培養方法は全て従来技術である。典型的には、本発明の培養方法は、通常、無血清な懸濁液中で細胞を培養することによる無血清培養法である。同様に、産生した時点で、本発明の抗体を、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、およびゲル電気泳動などを含んでなる当該技術分野の標準的な手順に従って細胞培養内容物から精製してもよい。このような技術は、当該技術者の技量の範囲内であり、本発明を限定するものではない。例えば、改変抗体の調製は国際特許ＷＯ９９／５８６７９およびＷＯ９６／１６９９０に記載されている。
【０１２３】
抗体の発現のさらに別の方法は、米国特許第４，８７３，３１６号などに記載されているトランスジェニック動物における発現を利用してもよい。これは動物のカゼインプロモーターを用いる発現系に関し、そのカゼインプロモーターが哺乳類にトランスジェニック技術で組込まれた場合、そのメスはそのミルク中に所望の組換えタンパク質を産生することが可能になる。
【０１２４】
本発明のさらなる態様において、本発明の抗体を産生する方法を提供し、その方法は、本発明の抗体の軽鎖および／または重鎖をコードするベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を培養するステップおよびそれによって産生した抗体を回収するステップを含んでなる。
【０１２５】
一態様において、本発明は、触媒ドメインおよびディスインテグリンドメインの両方に同時に結合する分子を提供することによって、ＡＤＡＭおよびＡＤＡＭＴＳ活性を阻害する方法を提供する。特定の実施形態において、このＡＤＡＭＴＳは、ＡＤＡＭＴＳ４またはＡＤＡＭＴＳ５である。ＡＤＡＭＴＳ５ならびにＡＤＡＭＴＳ５ｍＡｂの１２Ｆ４．１Ｈ７および７Ｂ４．１Ｅ１１について別々の結晶構造を用いるインシリコの構造「最良適合」コンピューターモデルは、ＡＤＡＭＴＳ５の触媒ドメインおよびディスインテグリンドメインの両方の間での同時抗体／抗原相互作用を示唆する。ＡＤＡＭプロテアーゼおよびＡＤＡＭＴＳプロテアーゼの触媒ドメインおよびディスインテグリンドメインは、これらのドメイン間に可動性を与えるヒンジ領域で分離されており、このヒンジ領域は機能を調節するか、またはこの触媒部位への基質局在化を可能にするように作用し得る。エピトープに及ぶこのドメインで観察される高親和性ｍＡｂ結合は、ＡＤＡＭＴＳ５の触媒ドメインおよびディスインテグリンドメインを共に固定するように思われ、それによって酵素活性を中和する。一実施形態において、この分子は、ディスインテグリンドメインおよび触媒ドメインの両方に同時に結合する抗体である。別の実施形態において、この分子は、本発明の抗体または抗体断片である。別の実施形態において、本発明は、ＡＭＡＭＴＳ５の酵素活性を中和する抗体に関係し、その中で、この抗体は、ＢｉａＣｏｒｅまたはＯｃｔｅｔ ＱＫによって測定した時、約１×１０−９または２×１０−１０未満のＫＤで触媒ドメインおよびディスインテグリンドメインに同時に結合する。
【０１２６】
本発明の別の実施態様において、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の少なくとも１つを含んでなる医薬組成物を提供する。本発明は、ヒトにおける少なくとも１つのＡＤＡＭＴＳ５活性を減少させる薬剤の製造において、ＡＤＡＭＴＳ５に対する少なくとも１つの抗原結合タンパク質の使用も提供する。本発明は、ヒトにおける少なくとも１つのＡＤＡＭＴＳ５活性を減少させるために、ＡＤＡＭＴＳ５に対する少なくとも１つの抗原結合タンパク質の使用を提供し、それは、ＡＤＡＭＴＳ５に対する少なくとも１つの抗原結合タンパク質を含んでなる組成物を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる。
【０１２７】
本発明の医薬組成物は、さらに、第２の抗原結合タンパク質を含んでもよい。いくつかの場合において、この第２の抗原結合タンパク質はモノクローナル抗体であってもよい。一実施形態において、この第２のモノクローナル抗体は、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＮＧＦ、ＯＳＭ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＶＩＰ、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ４、ＡＤＡＭＴＳ１、アグリカン、コラーゲンＩＩ、ＲＡＮＫＬ、および／またはＩＬ−１の群から選択される少なくとも１つの抗原に結合する。例として、本発明の医薬組成物は、ＡＤＡＭＴＳ５に対するモノクローナル抗体およびＡＤＡＭＴＳ５にも結合し得る第２のモノクローナル抗体であり得る第１の抗原結合タンパク質を含み得る。別の例として、本発明の医薬組成物は、ＡＤＡＭＴＳ５に結合するモノクローナル抗体である第１の抗原結合タンパク質、ならびに以下のＡＤＡＭＴＳ４、ＮＧＦ、ＯＳＭ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＶＩＰ、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ４、ＡＤＡＭＴＳ１、アグリカン、コラーゲンＩＩ、ＲＡＮＫＬ、および／またはＩＬ−１のうちの１つに結合するモノクローナル抗体である第２の抗原結合タンパク質を含み得る。
【０１２８】
本発明の医薬組成物の少なくとも一回用量（ｏｎｅ  ｄｏｓｅ）を投与することを含んでなる、治療を必要としている患者を治療する方法も提供する。いくつかの態様において、この患者は、軟骨の疾患を患っている。患者は、癌、疼痛、慢性疼痛、神経因性疼痛、術後の疼痛、変形性関節症、スポーツ外傷、びらん性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、ライム関節炎、若年性関節炎、強直性脊椎症、神経痛、神経障害、痛覚、神経損傷、虚血、神経変性、炎症性疾患、軟骨変性、咽頭、気管、耳管、椎間板、靱帯、腱、関節包、または骨の発達に影響を与える疾患、椎間板変性、骨減少症、または歯周病、急性関節損傷、および／または関節破壊に関連する疾患の群から選択される１つ以上の疾患を患っている可能性がある。いくつかの場合において、この患者は変形性関節症を患っている。
【０１２９】
別の実施形態において、前記医薬組成物の少なくとも一回用量を投与することで、前記患者における軟骨分解が減少する。別の実施形態において、前記医薬組成物の少なくとも一回用量を投与することで、前記患者におけるアグリカン切断が阻害され、かつ／または減少する。
【０１３０】
本明細書に記載の方法および使用によって産生および処方され、軟骨分解に関連する疾患を治療するか、または症状を緩和することができる医薬組成物も本明細書に提供する。本発明は、単独で投与するか、または少なくとも１種類のステロイドおよび／または鎮痛剤を含んでなるがそれらに限定されない少なくとも１つの他の治療薬と組み合わせて投与するための、軟骨の疾患の治療に使用するＡＤＡＭＴＳ５抗体を提供する。本発明の抗原結合タンパク質は、同じ用量でまたは別々に他の治療薬と同時投与することができる。本発明は、本明細書に記載の方法および使用の全てのためのＡＤＡＭＴＳ５抗体またはその断片も提供する。
【０１３１】
本明細書で使用する「患者」は、ヒトまたは他の動物を表す。
【０１３２】
本明細書で使用する「治療」は、（１）治療される病状または治療される病状の生物学的徴候の１つ以上の改善もしくは予防、（２）（ａ）治療される病状につながるか、もしくは関与する生物学的カスケードの１つ以上のポイント、または（ｂ）治療される病状の生物学的徴候の１つ以上との干渉、または（３）治療される病状に関連する症状もしくは効果の１つ以上の緩和を意味する。当該技術者は、「予防」が絶対的な言葉ではないことを理解するであろう。医学において、「予防」は、病状もしくはその生物学的徴候の可能性または重症度を実質的に軽減させるか、またはそのような病状もしくはその生物学的徴候の発症を遅らせる薬剤の予防投与を表すと理解されている。
【０１３３】
本明細書で使用する、「安全な有効量」とは、健全な医学的判断の範囲内で治療される病状の肯定的な変更を顕著に誘導するのに十分であるが、重篤な副作用を（妥当な利点／リスク比で）避けるのに十分低い少なくとも１つの抗原結合タンパク質の量を意味する。本発明の少なくとも１つの抗原結合タンパク質の安全な有効量は、（例えば、この化合物の効力、有効性、および半減期を考慮して）選択される特定の化合物、選択される投与経路、治療される病状、治療される病状の重症度、治療される患者の年齢、サイズ、体重、および健康状態、治療される患者の病歴、治療期間、併用療法の性質、および所望の治療効果などの要因により変化するであろうが、それでも日常的に当該技術者によって決定され得る。
【０１３４】
本発明の抗原結合タンパク質は、全身投与と局所投与の両方を含んでなる任意の適切な投与経路によって投与され得る。全身投与には、経口投与、非経口投与、経皮投与、直腸投与、および吸入による投与が含まれる。非経口投与は、経腸投与、経皮投与、または吸入以外の投与経路を表し、典型的には注射または点滴による。非経口投与には、静脈内投与、筋肉内投与、および皮下注射または点滴、関節内投与が含まれる。吸入は、口から吸入しようが、鼻腔から吸入しようが、患者の肺への投与を表す。局所投与には、皮膚への塗布、ならびに眼内投与、耳内投与、膣内投与、および鼻腔内投与が含まれる。
【０１３５】
本発明の抗原結合タンパク質は、１回だけまたは投与計画に従って投与されてもよく、その投与計画の中で、複数の用量が一定の期間中様々な時間間隔で投与される。例えば、用量は、１日あたり１、２、３、または４回投与され得る。用量は、所望の治療効果が達成されるまで、または所望の治療効果を維持するために無期限に投与され得る。本発明の抗原結合タンパク質に適した投与計画は、吸収、分布、および半減期などのその化合物の薬物動態学的特性によって決まり、当該技術者が決定することができる。さらに、このような療法が管理される機関を含んでなる、本発明の化合物に適した投与計画は、当該技術者の知識および専門知識内の治療される病状、治療される病状の重症度、治療される患者の年齢、および健康状態、治療される患者の病歴、併用療法の性質、所望の治療効果などの要因によって決まる。適切な投与計画が、個々の患者がこの投与計画へ反応するように施される調節または時間と共に個々の患者が変化を必要とするような調節を必要とし得ることを、かかる当該技術者はさらに理解するであろう。
【０１３６】
特定の実施形態において、この抗体を用いて、軟骨に薬物を送達する。このような薬剤は、アグリカナーゼ阻害剤、抗炎症薬、ステロイドまたは疼痛管理に関連する薬物であり得る。したがって、一態様において、本発明は薬物を軟骨に送達する方法であり、本発明の抗体に薬物を裏打ちすることを含んでなる方法である。このような送達は、インビトロ、エキソビボ、またはインビボで行われ得る。
【０１３７】
別の実施形態において、この抗体を用いて軟骨に成長因子を送達し、これは、新しい軟骨の成長を促進する。このような成長因子には、骨形成タンパク質、特に、ＢＭＰ−７が含まれる。このような送達は、インビトロ、エキソビボ、またはインビボで行われ得る。
【実施例】
【０１３８】
以下の実施例は、本発明の様々な態様を説明する。
【０１３９】
実施例１−ヒトＡＤＡＭＴＳ４およびヒトＡＤＡＭＴＳ５に対するＭａｂの産生
ヒトＡＤＡＭＴＳ５タンパク質およびヒトＡＤＡＭＴＳ４タンパク質を、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞および／またはＢａｃＭａｍにより形質転換したＨＥＫ２９３細胞内で産生し、従来のクロマトグラフィー法により単離した。
【０１４０】
ＳＪＬマウスを、精製したＡＤＡＭＴＳ４（完全長）およびＡＤＡＭＴＳ５（切断型、完全長、Ｃａｔドメイン、Ｃａｔ／ｄｉｓドメイン）で共免疫化した。免疫原生を、一連の出血の血清で試験した。
【０１４１】
脾細胞およびリンパ節を単離し、Ｐ３Ｘ６３／Ａｇ８．６５３由来の融合パートナーを用いてマウス骨髄腫細胞と融合させた。不死化抗体産生細胞を作製した。ＨＡＴ選択を用いて、融合していない骨髄腫細胞を除外した。
【０１４２】
活性培養物から得られたハイブリドーマの上清を、組換えヒトＡＤＡＭＴＳ５およびＡＤＡＭＴＳ４の特異的結合および中和についてスクリーニングした。ヒットを、限界希釈または半固体培地での増殖のいずれか一方によって同定、確認およびクローニングし、単一クローンにした。
【０１４３】
所望の特性を有するモノクローナル抗体を、液体培養でスケールアップし、この抗体を標準的なクロマトグラフィー法により精製した。その後、得られた精製抗体クローンを、結合親和性と機能的効力についてさらに特徴づけた。
【０１４４】
実施例２−マウス抗体の特徴づけ
ＡＤＡＭＴＳ５ｍＡｂを、インビトロアグリカン基質切断アッセイを用いて、中和力価について特徴づけた（表１）。ＡＤＡＭＴＳ５ｍＡｂを、Ｏｃｔｅｔ ＱＫ（表１）およびＢｉａＣｏｒｅ（同程度だが図示せず）の両方の科学技術を用いて親和性について特徴づけた。抗体も、ｃｅｌＴＲＦおよびＯｃｔｅｔ ＱＫによってヒトＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１３に対する交差反応について試験し、それらの全ては陰性であった（図示せず）。全てのｍＡｂ、マウス、イヌ、およびカニクイザルのＡＤＡＭＴＳ５に対する結合および中和によるオルソログ交差反応についても評価した（表１）。ラットＡＤＡＭＴＳ５に対する結合も検出された（図示せず）。Ｏｃｔｅｔ ＱＫにおける抗ヒトＡＤＡＭＴＳ５ｍＡｂのマウス型およびキメラ型の親和性比較を表２にまとめる。
【０１４５】
【表１】
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【０１４６】
【表２】
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【０１４７】
実施例３−配列
実施例２で同定した特徴に基づいて、６個のモノクローナル抗体を同定した。これらの抗体の可変領域の配列決定を行った。アラインメントを以下に示す（表３）。コンセンサス（大多数）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、以下の配列番号３０および３１に示す。１２Ｆ４．１Ｈ７、１Ｇ１０．１Ｃ９、２Ｄ３．１Ｄ４、３Ａ１２．１Ｄ７、５Ｆ１０．１Ｈ６、および７Ｂ４．１Ｅ１１と命名するｍＡｂの重鎖可変領域を、それぞれ、配列番号３２〜３７に示し、それぞれ配列番号１４７、１５７、１５１、１５３、１５５、および１４９がコードする。２Ｄ３．１Ｄ４、３Ａ１２．１Ｄ７、５Ｆ１０．１Ｈ６、７Ｂ４．１Ｅ１１、および１２Ｆ４．１Ｈ７と命名するｍＡｂの軽鎖可変領域を、それぞれ、配列番号３８〜４２に示し、それぞれ、配列番号１５２、１５４、１５６、１５０、および１４８がコードする。
【０１４８】
【表３】
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【０１４９】
【表４】
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【０１５０】
実施例４−ヒトＯＡ軟骨外植片
ドナーのヒトＯＡ軟骨を膝の置換手術から得た。軟骨を骨から処理し、直径３ｍｍのディスクに切断した。ディスクを任意抽出し、９６ウェルプレートで培養した。これらの組織中の内因性疾患因子が、エキソビボでの軟骨分解の進行を可能にした。試料を、以下の調和させた対照ＩｇＧアイソタイプ、（７Ｂ４．１Ｅ１１および１２Ｆ４．１Ｈ７と命名し）選択した抗ＡＤＡＭＴＳ５抗体、（７Ｅ８．１Ｅ３と命名し）選択した抗ＡＤＡＭＴＳ４抗体、または以下のＧＳＫ５７１９４９（ＣＡＳ番号３２９０４０−９４−０）などの既知のアグリカナーゼ／ＭＭＰ阻害剤で処理した。各処理条件を、各ドナープレート上で８回試験した。ＡＲＧＳＶＩＬ（配列番号１）ネオエピトープ放出の阻害を、実験の過程の間の多数の時点で各試料について測定した。
【０１５１】
【化１】
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【０１５２】
以前に記載したとおり、典型的には、アグリカナーゼによるアグリカンの切断は、アグリカンの球間ドメイン内の保存領域で起こる。酵素切断は、アグリカンのＮ末端アミノ酸配列（ＡＲＧＳＶＩＬ）を有するネオエピトープを含んでなる遊離断片を産生する。この切断ネオエピトープを、この切断型に特異的に結合するが、インタクトなアグリカンには結合しないモノクローナル抗体を用いて検出および定量化することができる。ＡＤＡＭＴＳ５抗体およびＡＤＡＭＴＳ５阻害剤の両方は、対照およびＡＤＡＭＴＳ４抗体よりも、ＡＲＧＳＶＩＬ放出を著しく阻害することを示した。ＡＲＧＳＶＩＬ放出の阻害率（％）のまとめを図１に示す。これらの結果は、ＡＤＡＭＴＳ５特異的ｍＡｂが、小分子アッセイの対照化合物と比較して、２〜３週間の評価期間中に約７０％の割合で分解を阻害することができることを示す。これらの結果は、多くの個々のドナー試料内でおよび個々のドナー試料の全てで一貫している。
【０１５３】
実施例５−ヒトＯＡ軟骨外植片におけるＡＤＡＭＴＳ５抗体用量反応
ＡＲＧＳＶＩＬ放出の阻害率（％）を、選択した抗ＡＤＡＭＴＳ５抗体の用量反応について実施例４に記載したとおりに試験した（図２参照）。マウス抗体７Ｂ４．１Ｅ１１を、以下の用量：１３４０ｎ、６７０ｎＭ、３３５ｎＭ、８１．２５ｎＭで試験した。対照アグリカナーゼ／ＭＭＰ阻害剤も用いた。ＡＲＧＳＶＩＬ放出率（％）は、抗ＡＤＡＭＴＳ５の最高用量において最低であり、低用量で治療した際に減少した。調和させたアイソタイプ対照抗体の治療用量（図示せず）を用いて０％阻害を決定し、単一有効量のＧＳＫ５７１９４９を用いて１００％阻害を計算した。このｍＡｂ治療は、６７０ｎＭの用量で最大効果に達するように思える用量反応を示す（図２）。しかし、６７０ｎＭの用量ポイントでドナーが多く（ｎ＝２２）示されたが、他の用量ではドナーは少ない（ｎ≦５）ことは留意すべきである。
【０１５４】
実施例６−ＤＭＭのインビボ研究
抗ＡＤＡＭＴＳ５抗体の有効性を評価するために、不安定化内側半月（ＤＭＭ）モデルを用いて、ＯＡをマウスにおいて誘導した。２つの別々の実験を示す。ＤＭＭ手術の３日前に、マウスを以下の抗体：抗ＡＤＡＭＴＳ５（７Ｂ４．１Ｅ１１）、抗ＡＤＡＭＴＳ５（１２Ｆ４．１Ｈ７）、またはＩｇＧアイソタイプのうちの１つを０．５ｍｇ／用量で投与した。対照群には、ＤＭＭ手術で処理していないマウス、偽手術を行ったマウス、および正常マウスが含まれた。投与後６日目に、マウスを屠殺し、盲目の研究者が病理組織診断を行い、そこから、関節スコアを評価した各マウスの膝に与えた。抗ＡＤＡＭＴＳ５抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較して、著しく良好な平均関節スコアを示した。さらに、偽手術した膝および正常な膝の平均関節スコアは、未処理の膝およびＩｇＧアイソタイプと比較して、著しく良好であった。
【０１５５】
実施例７−モノクローナル抗体は、インビトロおよびインビボで軟骨を透過する。
治療抗体が組織を透過し、疾患部位に到達する能力およびそれらの特異的標的は、有効性にとって重要である。アグリカナーゼは、分泌タンパク質として分類されるが、軟骨基質内の軟骨細胞の細胞周囲の領域に優先的に局在することが示されている。そのために、治療ｍＡｂがアグリカナーゼの標的に到達するためには、軟骨基質を透過する必要性があり得る。
【０１５６】
初めに、ｍＡｂのヒト軟骨を透過する能力の評価を、選択した抗ＡＤＡＭＴＳ５ｍＡｂを含んでなる、複数の特異性を有するｍＡｂを用いて、エキソビボ組織で行った。膝関節置換手術標本から、軟骨下骨を通って滑膜表面に及ぶ全層の軟骨プラグを、規定した期間、軟骨細胞または非特異的アイソタイプ対照の表面上に位置するヒトタンパク質に対して特異性を有するマウスモノクローナル抗体の存在下で組織培養した。各時点の終わりに、組織を全層評価のために処理し、切片を作り、ＦＩＴＣ標識抗マウス検出抗体を用いて染色した。透過を、軟骨組織内の軟骨細胞染色の色の濃さと強度によって定義する。標的特異性に関係なく、ｍＡｂ透過は主に軟骨の滑膜表面に由来し、濃度に依存して３〜４日以内に全層透過に進む濃度依存的および時間依存的なプロセスであることが観察された（図示せず）。アイソタイプ対照ｍＡｂで処理した軟骨プラグについての染色は観察されなかった（図示せず）。
【０１５７】
軟骨透過のｉｎ ｖｉｖｏ評価を、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、およびアイソタイプ対照に対する選択的ｍＡｂを含んでなる、近赤外（ＮＩＲ）色素標識モノクローナル抗体を用いて行った。ＮＩＲ標識ｍＡｂを、６週間前に変形性関節症の外科的誘導（ＤＭＭ）を受けたマウスに全身（腹腔内）投与（０．５ｍｇ用量）した。ｍＡｂの体内分布を、Ｌｉｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙシステムを用いて、投与後の多数の時点において動物の全体で監視した。ｍＡｂ投与後４日目に、マウスを屠殺し、膝関節の画像化をＯｄｙｓｓｅｙで行った。その後、ＮＩＲ検出用のフィルタおよびカメラを備えた顕微鏡での高解像度解析のために、膝関節を処理し、切片を作った。ｍＡｂの全身投与後４日以内に、全層の軟骨透過を抗ＡＤＡＭＴＳ５ｍＡｂおよび抗ＡＤＡＭＴＳ４ｍＡｂでは観察することができたが、特異的な染色は、アイソタイプ対照ｍＡｂでは観察されなかった（図示せず）。特徴的な細胞周囲の軟骨細胞染色パターンは、ＡＤＡＭＴＳ５およびＡＤＡＭＴＳ４に特異的なｍＡｂでは観察された（図示せず）。
【０１５８】
実施例８−抗体のヒト化−ハイブリドーマ可変領域のクローニング
全ＲＮＡを、７Ｂ４．１Ｅ１１および１２Ｆ４．１Ｈ７のハイブリドーマ細胞から抽出し、その後、重鎖および軽鎖の可変ドメインｃＤＮＡ配列を、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって作製した。ＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマーは、マウス免疫グロブリン遺伝子リーダー配列に特異的な縮重プライマーの混合物であり、リバースプライマーはこれらの抗体の定常領域に特異的であり、この場合、７Ｂ４．１Ｅ１１に対してはアイソタイプＩｇＧ１、１２Ｆ４．１Ｈ７に対してはＩｇＧ２であった。プライマーを、ＪｏｎｅｓとＢｅｎｄｉｇ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：８８,１９９１）によって記載された戦略に基づいて設計した。ＲＴ−ＰＣＲを両方のＶ領域配列について行い、正しいＶ領域配列の配列検証を可能にした。ＲＴ−ＰＣＲによって作製したＶ領域産物をクローニングし（インビトロジェンＴＡクローニングキット）、配列データを得た。
【０１５９】
実施例９−抗体のヒト化−キメラのクローニング
キメラ抗体をコードするＤＮＡ発現コンストラクトを、哺乳類発現ベクターにクローニングするための制限部位およびヒトシグナル配列を含んでなる重複オリゴヌクレオチドを構築することにより新たに調製した。ヒトγ１定常領域を含んでなる哺乳類発現ベクター内にクローニングするために、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩの制限部位を導入し、シグナル配列（配列番号４５）を含んでなるＶＨドメインを構成した。ヒトκ定常領域を含んでなる哺乳類発現ベクター内にクローニングするために、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｉＷＩの制限部位を導入し、シグナル配列（配列番号４５）を含んでなるＶＬドメインを構成した。
【０１６０】
実施例１０−抗体のヒト化−ヒト化変異体のクローニング
ヒト化抗体の変異体をコードするＤＮＡ発現コンストラクトを、哺乳類発現ベクターにクローニングするための制限部位およびヒトシグナル配列を含んでなる重複オリゴヌクレオチドを構築することにより新たに調製した。ヒトγ１定常領域を含んでなる哺乳類発現ベクター内にクローニングするために、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩの制限部位を導入し、シグナル配列（配列番号４５）を含んでなるＶＨドメインを構成した。ヒトκ定常領域を含んでなる哺乳類発現ベクター内にクローニングするために、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｉＷＩの制限部位を導入し、シグナル配列（配列番号４５）を含んでなるＶＬドメインを構成した。
【０１６１】
【表５】
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【０１６２】
実施例１１−抗体のヒト化−（抗体の定量化を含んでなる）組換え抗体の発現
重鎖および軽鎖をコードする発現プラスミドをそれぞれＨＥＫ２９３ ６Ｅ細胞に一過的に同時トランスフェクトし、小規模で発現させて、抗体を産生した。７Ｂ４および１２Ｆ４キメラ抗体ならびに無関係の対照抗体の重鎖および軽鎖も発現させた。抗体をＥＬＩＳＡで定量化した。ＥＬＩＳＡプレートを、１μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ（シグマＩ３３８２）でコーティングし、ブロッキング溶液（トリス緩衝生理食塩水中４％ＢＳＡ）でブロッキングした。組織培養上清の種々な希釈物を加え、このプレートを室温で１時間インキュベートした。既知の標準抗体の希釈物もこのプレートに加えた。このプレートをＴＢＳＴで洗浄し、結合を、ブロッキング溶液で１／１０００希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体（シグマＡ７１６４）を添加することによって検出した。このプレートを室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄した。このプレートを、ＯＰＤ基質（シグマＰ９１８７）を加えることによって展開し、色の展開を２Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって止めた。吸光度を４９０ｎｍで測定し、検量線を、既知の標準希釈物のデータを用いてプロットした。この標準曲線を用いて、組織培養上清中の抗体の濃度を予測した。
【０１６３】
実施例１２−ＡＤＡＭＴＳ５結合ＥＬIＳＡ
結合ＥＬＩＳＡを行い、細胞培養上清中の発現抗体の組換えＡＤＡＭＴＳ５への結合を試験した。ＥＬＩＳＡプレートを、０．２μｇ／ｍｌの組換えヒトＡＤＡＭＴＳ５でコーティングし、ブロッキング溶液（トリス緩衝生理食塩水中４％ＢＳＡ）でブロッキングした。この組織培養上清の種々の希釈物を加え、このプレートを室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄した。結合を、ブロッキング溶液で１／１０００希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体（シグマＡ７１６４）を添加することによって検出した。このプレートを室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄した。このプレートを、ＯＰＤ基質（シグマＰ９１８７）を加えることによって展開し、色の展開を２Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって止めた。吸光度を、プレートリーダーを用いて４９０ｎｍで測定し、平均吸光度を濃度に対してプロットした。
【０１６４】
図６〜９に、ヒト化抗ＡＤＡＭＴＳ５抗体の組換え抗原への結合を示す。
【０１６５】
実施例１３−ＢＩＡｃｏｒｅ
抗ヒトＩｇＧ（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）、ＢＲ−１００８−３９）を、第一級アミンカップリングによりＣＭ５チップ上に固定化した。その後、この表面を用いてヒト化抗体を捕獲し、ＡＤＡＭＴＳ５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２１９８−ＡＤ）を、６４ｎｍの単一濃度でこの捕獲抗体の上を通過させ、１００ｍＭリン酸、続いて３Ｍ ＭｇＣｌ２を用いて再生を行った。結合曲線を、緩衝液注入（すなわち、０ｎＭ）で二重参照し、このデータを、１：１モデルを用いてＴ１００解析ソフトウェアに適合させた。ランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰを用いて、２５℃でＢＩＡｃｏｒｅを稼働した。得られたデータを表５に示す。特定しない限り、全ての抗体を組織培養上清から捕獲した。
【０１６６】
【表６】
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【０１６７】
実施例１４  マウス、キメラ、およびヒト化したＡＤＡＭＴＳ５ｍＡｂの親和性の比較
親和性を、２種類の形式（Ｏｃｔｅｔ ＱＫではセンサー上に抗原、およびＢｉａｃｏｒｅではセンサー上に抗体）でｍＡｂについて評価した（表６）。細胞標的を代表するＯｃｔｅｔ ＱＫ形式の妥当性は、天然に存在する細胞とインビボで会合する酵素の形態により、ＡＤＡＭＴＳ５に関連する。しかし、ＡＤＡＭＴＳ５は分泌型でも見られ得るので、Ｂｉａｃｏｒｅを用いるセンサー形式でも抗体の親和性について評価した。ＯｃｔｅｔとＢｉａｃｏｒｅ解析との間で観察される違いは、形式の差異（すなわち、Ｏｃｔｅｔ ＱＫではセンサー上に抗原およびＢｉａｃｏｒｅではセンサー上にｍＡｂ）ならびにシステム間の技術的な違いであり得る。しかし、同じ形式で稼働すると、これらのシステムは、これらのｍＡｂの全体的なＫＤの観点から非常に似ていた。おそらく、機器の設計の違いにより、ＫｄおよびＫａの違いが観察された。
【０１６８】
ヒト化ＣＳｍＡｂ（１２Ｆ４ Ｈ４Ｌ０）は、Ｏｃｔｅｔ ＱＫシステムの抗原ダウン形式（ａｎｔｉｇｅｎ ｄｏｗｎ ｆｏｒｍａｔ）で測定した時、３８．３ｐＭの全体的な親和性（ＫＤ）を示す。１２Ｆ４ Ｈ４Ｌ０ ｍＡｂは、ＢｉａｃｏｒｅシステムのｍＡｂダウン形式（ｍＡｂ  ｄｏｗｎ ｆｏｒｍａｔ）において８５ｐＭのＫＤを示す。参考のために示す７Ｂ４ Ｈ０Ｌ０は、Ｏｃｔｅｔ ＱＫシステムおよびＢｉａｃｏｒｅシステムにおいて、それぞれ２０５ｐＭおよび８６９ｐＭのＫＤを示す。各ｍＡｂのマウス型およびキメラ型の親和性の値を参考のために本明細書に示し、その親和性はヒト化後に維持されたことを示す。この実験の全ｍＡｂは、完全に機能的なＦｃ部分を含んでいた（すなわち、Ｆｃが機能しないことはなかった）。
【０１６９】
【表７】
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【０１７０】
実施例１５．ヒトＯＡ軟骨外植片実験のヒト化１２Ｆ４ Ｈ４Ｌ０用量範囲
ヒト化１２Ｆ４ Ｈ４Ｌ０のＦｃが機能しないｍＡｂを、Ｆｃが機能しない適切なアイソタイプ、他の陽性対照および陰性対照に対する用量反応形式で、ならびに単一用量における親のマウス１２Ｆ４．１Ｈ７バージョンと比較して、このシステムにおいて評価した。複数ドナー（ｎ＝４）をこの研究において個々に評価し、結果を収集して、ＯＡ患者の集団全体の平均阻害スコアを作成した。ＧＳＫ５７１９４９をアッセイ対照として単一濃度（２μＭ）で用い、最大阻害レベルを設定した。これらの結果は、無関係のヒト化アイソタイプ対照ｍＡbの用量範囲（図１０）と比較して、最大反応が最高用量（１３３３ｎｍ）で達成される明らかな１２Ｆ４ Ｈ４Ｌ０用量反応を示す。ＧＳＫ５７１９４９に関してＡＲＧＳネオエピトープのほぼ完全な阻害は、最高用量（２μＭ）で達成された。さらに、１２Ｆ４ Ｈ４Ｌ０の阻害のレベルは、これらのドナーの１２Ｆ４．１Ｈ７を超えることが示され、ヒト化後に有効性が維持されることが示唆された。このｍＡｂのヒト化バージョンの有効性のレベルは高いが、これが真の増加であるのか、またはｍＡｂ調製における違いによるものかどうかは明らかではない。追加のＯＡドナーを用いた別々の実験におけるｍＡｂの１２Ｆ４．１Ｈ７型で観察される有効性のレベル（図１）は、本明細書で観察されたものよりも高かったことは留意すべきである。このシステムのヒト疾患および観察される有効性との関連を考慮すると、このデータは、本方法およびこれらのｍＡｂの確証を強く支持する。
【０１７１】
実施例１６．ヒトＯＡ軟骨外植片の治療的パルスチェイス実験
本実験を実施例１５のように設計するが、これらのｍＡｂまたはこのシステムの飽和を可能にする化合物を用いた５日の処理期間後に、この処理を止めて、この処理を行っていない新鮮な培地に置換した。このアッセイを４週間継続し、次の軟骨分解マーカーの評価のために培地を定期的にサンプリングした。各サンプリング後、サンプルの除去した量と同じ量の新鮮な培地で置換した。この形式は治療効果の効力および期間を調べることを目的としたものであり、この組織内のＡＤＡＭＴＳ５代謝回転速度を間接的に示唆する。４人の異なるヒトＯＡドナーを用いた同一実験から収集した結果を示す（図１１）。これらの結果は、疾患状態が進行していても（すなわち、関節置換の時に）ヒトＯＡ軟骨におけるＡＤＡＭＴＳ５ｍＡｂ反応の期間が延長する証拠を提供する。さらに、これらの結果は、疾患組織におけるＡＤＡＭＴＳ５の低い代謝回転速度の証拠を提供する。
【０１７２】
実施例１７．Ｆｃが機能しないヒト化抗体
ヒト化１２Ｆ４ Ｈ４のＶＨドメインをコードする遺伝子を、改変ヒトγ１定常領域であるＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）にクローニングした。このＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）定常領域は、Ｌ２３５位およびＧ２３７位（ＥＵインデックス番号付け）におけるＣＨ２ドメインに２つのアラニン置換を含んでなる。これらの変異は、この得られた抗体が必要なＦｃ受容体または補体成分Ｃ１ｑに結合できないようにするので、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を誘導する抗体の能力を無能にする。
【０１７３】
【表８】
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【０１７４】
抗体ＢＰＣ１６２３（１２Ｆ４キメラ）、ＢＰＣ１６５９（１２Ｆ４ Ｈ４Ｌ０ ＩｇＧ１ｗｔ）およびＢＰＣ１６６１（１２Ｆ４ Ｈ４Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ））の重鎖および軽鎖をコードする発現プラスミドをＨＥＫ細胞内で発現させた。抗体をタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーにより精製し、分光光度法により定量化した。
【０１７５】
結合ＥＬＩＳＡを行い、これらの精製抗体のＡＤＡＭＴＳ５への結合を比較した。無関係のＩｇＧ１ｗｔアイソタイプの抗体およびＦｃが機能しない抗体を陰性対照として含めた。簡単に説明すると、プレートを、０．２μｇ／ｍｌの組換えヒトＡＤＡＭＴＳ５でコーティングし、ブロッキング溶液（トリス緩衝生理食塩水中４％ＢＳＡ）でブロッキングした。様々な濃度の精製抗体を加え、このプレートを室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴ（トリス緩衝生理食塩水＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した。結合を、ブロッキング溶液で１／１０００希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体（シグマＡ７１６４）を添加することによって検出した。このプレートを室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄した。このプレートを、ＯＰＤ基質（シグマＰ９１８７）を加えることによって展開し、色の展開を２Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって止めた。吸光度を、プレートリーダーを用いて４９０ｎｍで測定し、平均吸光度を濃度に対してプロットした。
【０１７６】
図１２は、精製した抗ＡＤＡＭＴＳ５抗体の組換え抗原への結合を示す。
【０１７７】
実施例１８．Ｆｃが機能しない抗体のＢｉａｃｏｒｅ
タンパク質Ａを、第一級アミンカップリングによってＣＭ５バイオセンサーチップ上に固定した。この表面を用いて、Ｆｃが機能しない抗ＡＤＡＭＴＳ５抗体、１２Ｆ４ Ｈ４Ｌ０ ＩｇＧ１ｍ（ＡＡ）（ＢＰＣ１６６１）、（ＣＨＯおよびＨＥＫ発現物質）を捕獲した。組換えヒトＡＤＡＭＴＳ５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２１９８−ＡＤ）を、６４ｎＭ、１６ｎＭ、４ｎＭ、１ｎＭ、０．２５ｎＭ、および０．０６２５ｎＭで検体として用い、緩衝液注入（すなわち、０ｎＭ）を用いて結合曲線を二重参照した。捕獲表面の再生（すなわち、捕獲抗体の除去）には５０ｍＭ ＮａＯＨを用いた。ランニング緩衝液はＨＢＳ−ＥＰであり、２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００を稼働させた。データを、この機械解析ソフトウェアに備わっている１：１モデルに適合させた。これらの結果は、結合親和性の観点から異なる細胞株で産生させた物質間で違いは無かったことを示した。
【０１７８】
【表９】
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【０１７９】
実施例１９．抗原−抗体相互作用の結晶構造モデル−エピトープおよびＭＯＡの意味
ＡＤＡＭＴＳ５およびＡＤＡＭＴＳ５ｍＡｂの１２Ｆ４．１Ｈ７のそれぞれの結晶構造を用いるインシリコの構造「最適」コンピューターモデルは、ＡＤＡＭＴＳ５の触媒ドメインおよびディスインテグリンドメインの両方の間の抗体／抗原相互作用が同時に起こることを示唆する。ＡＤＡＭプロテアーゼおよびＡＤＡＭＴＳプロテアーゼの触媒ドメインおよびディスインテグリンドメインは、これらのドメイン間に可動性を与えるヒンジ領域で分離されており、このヒンジ領域は機能を調節するか、またはこの触媒部位への基質局在化を可能にするように作用し得る。エピトープに及ぶこのドメインで観察される高親和性ｍＡｂ結合は、おそらく、ＡＤＡＭＴＳ５の触媒ドメインおよびディスインテグリンドメインを共に固定し、それによって酵素活性を中和する。ＡＤＡＭＴＳ５と１２Ｆ４．１Ｈ７ｍＡｂおよび７Ｂ４．１Ｅ１１ｍＡｂ間の相互作用の予測アミノ酸部位を図１３に示す。
【０１８０】
【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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