(57)【要約】  本開示は、人工多能性幹細胞表面上のポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）の発現に、そして排他的ではないが、特に、人工多能性幹細胞のマーカーとしてのＰＯＤＸＬの使用に関する。
2012502653.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の未分化人工多能性幹細胞を含有する試料において、単数または複数の未分化人工多能性幹細胞を同定する方法であって、表面上にポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）を発現する、試料内の単数または複数の細胞を同定する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
ＰＯＤＸＬに結合する結合部分と試料を接触させ、そして結合部分に結合していることによって、前記未分化人工多能性幹細胞（単数または複数）を同定する、請求項１の方法。
【請求項３】
表面上にＰＯＤＸＬを発現する単数または複数の細胞を単離する工程をさらに含み：
（ｉ）ＰＯＤＸＬに結合可能な結合部分と試料を、試料中の細胞表面上で発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合を可能にする条件下で接触させ；そして
（ｉｉ）結合部分に結合していない細胞から、結合部分に結合している細胞を分離する；工程を含む、請求項１の方法。
【請求項４】
分化を経たかまたは分化を経ている人工多能性幹細胞から、未分化人工多能性幹細胞を分離する方法であって、ここで、未分化人工多能性幹細胞、および分化を経たかまたは分化を経ている人工多能性幹細胞が、試料中に存在しており：
（ｉ）ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）に結合可能な結合部分と試料を、試料中の細胞表面上で発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合を可能にする条件下で接触させ；そして
（ｉｉ）結合部分に結合していない細胞から、結合部分に結合している細胞を分離する；工程を含む、前記方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項の方法によって得られる、単数または複数の単離未分化人工多能性幹細胞。
【請求項６】
請求項４の方法によって得られる、単数または複数の単離分化人工多能性幹細胞。
【請求項７】
単数または複数の未分化人工多能性幹細胞を含有する試料から、こうした細胞を単離する方法であって、表面上にＰＯＤＸＬを発現する、試料内の単数または複数の細胞を単離する工程を含む、前記方法。
【請求項８】
ＰＯＤＸＬに結合する結合部分と試料を接触させ、そして結合部分に結合していることによって、前記未分化人工多能性幹細胞（単数または複数）を試料から単離する、請求項７の方法。
【請求項９】
請求項７または８の方法によって単離される、単数または複数の未分化人工多能性幹細胞。
【請求項１０】
未分化人工多能性幹細胞、および分化を経たかまたは分化を経ている人工多能性幹細胞を含む混合物から、未分化人工多能性幹細胞を濃縮する方法であって：
（ｉ）ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）に結合可能な結合部分と混合物を、混合物中の細胞表面上で発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合を可能にする条件下で接触させ；そして
（ｉｉ）未分化人工多能性幹細胞が濃縮された細胞集団を生成するように、結合部分に結合していない細胞から、結合部分に結合している細胞を分離する；
工程を含む、前記方法。
【請求項１１】
未分化人工多能性幹細胞、および分化を経たかまたは分化を経ている人工多能性幹細胞を含む混合物から、分化を経たかまたは分化を経ている人工多能性幹細胞を濃縮する方法であって：
（ｉ）ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）に結合可能な結合部分と混合物を、混合物中の細胞表面上で発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合を可能にする条件下で接触させ；そして
（ｉｉ）分化を経たかまたは分化を経ている人工多能性幹細胞が濃縮された細胞集団を生成するように、結合部分に結合している細胞から、結合部分に結合していない細胞を分離する
工程を含む、前記方法。
【請求項１２】
未分化人工多能性幹細胞から分化した細胞を含有する組成物であって、表面上にＰＯＤＸＬを発現する未分化人工多能性幹細胞を実質的に含有しない前記組成物を調製する方法であって：
（ｉ）未分化人工多能性幹細胞、および未分化人工多能性幹細胞から分化した細胞を含む、細胞集団を提供し；
（ｉｉ）ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）に結合可能な結合部分と集団を、試料中の細胞表面上で発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合を可能にする条件下で接触させ；そして
（ｉｉｉ）結合部分に結合している細胞から、結合部分に結合していない細胞を分離する；
工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
結合部分に結合していない分離細胞を、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤と混合する工程をさらに含む、請求項１２の方法。
【請求項１４】
表面上にＰＯＤＸＬを発現する未分化人工多能性幹細胞を含有する組成物であって、未分化人工多能性幹細胞から分化した細胞を実質的に含有しない前記組成物を調製する方法であって：
（ｉ）未分化人工多能性幹細胞、および未分化人工多能性幹細胞から分化した細胞を含む、細胞集団を提供し；
（ｉｉ）ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）に結合可能な結合部分と集団を、試料中の細胞表面上で発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合を可能にする条件下で接触させ；そして
（ｉｉｉ）結合部分に結合していない細胞から、結合部分に結合している細胞を分離する；
工程を含む、前記方法。
【請求項１５】
結合部分に結合している分離細胞から、結合部分を解離させる工程をさらに含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】
結合部分に結合している分離細胞を、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤と混合する工程をさらに含む、請求項１４または１５の方法。
【請求項１７】
未分化人工多能性幹細胞に、ＰＯＤＸＬに結合可能な結合部分を結合させる方法であって、１以上の未分化人工多能性幹細胞を含有する試料と、ＰＯＤＸＬに結合可能な結合部分を、試料中の細胞表面上に発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合を可能にする条件下で接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１８】
単数または複数の未分化人工多能性幹細胞を含有する試料中のこうした細胞を破壊する方法であって、表面上にＰＯＤＸＬを発現する、試料中の単数または複数の細胞を破壊する工程を含む、前記方法。
【請求項１９】
単数または複数の未分化人工多能性幹細胞を含有する試料中のこうした細胞を除去する方法であって、表面上にＰＯＤＸＬを発現する単数または複数の細胞を試料から除去する工程を含む、前記方法。
【請求項２０】
ＰＯＤＸＬに結合する結合部分と試料を接触させ、そして結合部分に結合していることによって、前記未分化人工多能性幹細胞（単数または複数）を試料から除去する、請求項１９の方法。
【請求項２１】
結合部分が抗体である、請求項２〜４、８、１０〜１７または２０のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
抗体がｍＡｂ８４である、請求項２１の方法。
【請求項２３】
未分化人工多能性幹細胞から分化した細胞を含有する組成物であって、表面上にＰＯＤＸＬを発現する未分化人工多能性幹細胞を実質的に含有しない、前記組成物。
【請求項２４】
未分化人工多能性幹細胞を含有する組成物であって、未分化人工多能性幹細胞から分化した細胞を実質的に含有しない、前記組成物。
【請求項２５】
未分化人工多能性幹細胞が表面上にＰＯＤＸＬを発現する、請求項２４の組成物。
【請求項２６】
請求項５、６または９のいずれか一項記載の単数または複数の細胞あるいは請求項２３〜２５のいずれか一項記載の組成物を、患者に投与する工程を含む、細胞療法が必要な患者を治療する方法。
【請求項２７】
細胞療法が必要な患者を治療するための薬剤製造における、請求項５、６または９のいずれか一項記載の単数または複数の細胞あるいは請求項２３〜２５のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項２８】
細胞療法が必要な患者を治療する際に使用するための、請求項５、６または９のいずれか一項記載の単数または複数の細胞あるいは請求項２３〜２５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２９】
表面上にポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）を発現している未分化人工多能性幹細胞、および未分化人工多能性幹細胞の表面上に発現されるＰＯＤＸＬに結合している、ＰＯＤＸＬに結合可能な結合部分を含む、複合体。
【請求項３０】
ＰＯＤＸＬに結合する結合部分、および別の人工多能性幹細胞マーカーを検出するさらなる剤を含む部分のキット。
【請求項３１】
人工多能性幹細胞を生成し、そして同定する方法であって：
（ｉ）非多能性ドナー細胞を誘導して多能性状態にして、表面上にＰＯＤＸＬを発現する人工多能性幹細胞を生成し；
（ｉｉ）該人工多能性幹細胞を、ＰＯＤＸＬに結合可能な結合部分と、人工多能性幹細胞表面上で発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合を可能にする条件下で接触させ；そして（ｉｉｉ）結合部分によって結合された細胞を同定する；
工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工多能性幹細胞表面上のポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）の発現に、そして排他的ではないが、特に、人工多能性幹細胞のマーカーとしてのＰＯＤＸＬの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性および他の多能性幹細胞は、療法において大きな潜在能力を有する。こうした細胞を再生医学中で用いて、疾患または傷害によって損傷を受けている組織を修復することも可能である。しかし、医学における胚性幹細胞の使用は、ヒト胚使用に関連する重大な倫理的懸念のため限定されている。最近、山中研究室２およびＴｈｏｍｓｏｎ研究室３は、ヒト線維芽細胞が少数の遺伝子の一過性過剰発現によって再プログラミングされて、機能的および表現型的にｈＥＳＣに似た人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）になりうることを立証した。したがって、多能性幹細胞は、胚を破壊する必要性を伴わずに得られうる。
【０００３】
これらのＩＰＳＣは、機能的および表現型的に胚性幹細胞（ＥＳＣ）に似ており、そして胚を破壊する必要性を回避する。いくつかのＩＰＳＣは、ｈＥＳＣ同様、Ｏｃｔ−４、ならびにＴｒａ−１−６０／８１およびＳＳＥＡ−３／４などの他の細胞表面マーカーを発現する。しかし、ＩＰＳＣは、倍加時間がより遅く１１、全体的な遺伝子発現パターン２、３およびＤＮＡメチル化状態２が異なることによって示されるように、ＥＳＣと同一ではない。核再プログラミングが完全であるかどうか１０、そしてしたがってＩＰＳＣが分化中にｈＥＳＣと類似の経路にしたがうかどうかは未知のままである。
【０００４】
この重要なブレークスルーは、患者特異的投入細胞を用いた細胞療法が、将来、現実のものとなりうる可能性を生じさせる。倫理的懸念およびありうる免疫拒絶の問題があるｈＥＳＣと異なり、ＩＰＳＣはドナーから生成され、再プログラミングされ、適切な細胞タイプに分化し、そしてドナー内に移植し直されることも可能である。その潜在能力にもかかわらず、分化の後に残ったＩＰＳＣが奇形腫を形成する問題が残っており、そしてこれに取り組む必要がある。
【０００５】
ヒト細胞からＩＰＳＣが成功裡に生成された報告が公表される前に、本発明者らは、その内容が本出願に援用される、ＷＯ２００７／１０２７８７において未分化ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）上の表面抗原に対する一団のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成を記載した１（本明細書の図１０もまた参照されたい）。これらのｍＡｂは、未分化ｈＥＳＣ株に強い反応性を示したが、分化したもの（胚様体）には反応性を示さなかった。該ｍＡｂは、マウス線維芽細胞とは交差反応せず、そしてヒト胚性癌細胞に対して、弱い反応性を示すかまたはまったく反応を示さない。したがって、これらのｍＡｂは、ｈＥＳＣに非常に強い結合特異性を示し、そしてこの結合は、ｈＥＳＣが分化するにつれて失われた。特に、ポドカリキシン様タンパク質−１（ＰＯＤＸＬ）に結合する１つの抗体（ｍＡｂ  ８４）は、濃度依存性、補体独立方式で、未分化ｈＥＳＣおよびＮＣＣＩＴ細胞に対して細胞毒性である。ｍＡｂ  ８４は、未分化ｈＥＳＣの細胞死をインキュベーション３０分以内に誘導するが、分化ｈＥＳＣの細胞死を誘導せず、そしてｍＡｂ−抗原複合体の免疫沈降によって、抗原がポドカリキシン様タンパク質−１であることが明らかになった。重要なことに、ＳＣＩＤマウスに移植する前に、ｈＥＳＣをｍＡｂ  ８４で処理すると、腫瘍形成が存在しないことが観察される。この以前のデータによって、ｍＡｂ８４が、臨床適用のため、分化した細胞集団から残りのｈＥＳＣを排除する際に有用でありうることが示される。
【０００６】
未分化多能性幹細胞自体を細胞療法で用いてもよいが、分化し始めたかまたは分化している細胞を用いることが有益であると見なされる。未分化ヒト多能性幹細胞を特定の細胞系譜に分化させるよう促す方法が当該技術分野で周知である。この分化プロセスが開始するかまたは進行すると、そうでなければ望ましくない奇形腫を形成しうる未分化多能性幹細胞を除去するかまたは破壊することが有益である。
【０００７】
したがって、未分化ヒト多能性幹細胞を同定するかまたは単離することが有用であるこ
とがわかる（これらをそれ自体、療法で用いることも可能であるし、または療法で使用可能な特定の細胞系譜に分化させるよう促すことも可能であるため）。これらの分化細胞は療法で有用であるため、ある程度の細胞が分化し始めたかまたは分化している細胞混合物から、未分化ヒト多能性幹細胞を取り除くかまたは破壊することもまた有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００７／１０２７８７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ポドカリキシン様タンパク質−１（ＰＯＤＸＬ）が、未分化の人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）のマーカーであるという発見から生じる。
本発明において、ＩＰＳＣに結合し、そしてこれを特徴付ける抗体が発見されてきている。ＩＰＳＣを殺す能力に関してｍＡｂ８４をさらに調べた。
【００１０】
したがって、分化または未分化ＩＰＳＣを同定するか、単離するか、分離するか、精製するか、濃縮するか、または除去するための方法を提供する。未分化ＩＰＳＣを破壊する方法もまた提供する。好ましくは、これらの方法は、ＰＯＤＸＬを発現している細胞へのＰＯＤＸＬに結合可能な結合部分の結合を伴う。
【００１１】
本発明の１つの側面において、１つまたは複数の未分化人工多能性幹細胞を含有する試料において、単数または複数の未分化人工多能性幹細胞を同定する方法を提供し、該方法は、表面上にポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）を発現する、試料内の単数または複数の細胞を同定する工程を含む。
【００１２】
いくつかの態様において、ＰＯＤＸＬに結合する結合部分と試料を接触させ、そして結合部分に結合していることによって、前記未分化人工多能性幹細胞（単数または複数）を同定する。
【００１３】
いくつかの態様において、該方法は、表面上にＰＯＤＸＬを発現する単数または複数の細胞を単離する工程をさらに含み、該方法は：（ｉ）ＰＯＤＸＬに結合可能な結合部分と試料を、試料中の細胞表面上で発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合を可能にする条件下で接触させ；そして（ｉｉ）結合部分に結合していない細胞から、結合部分に結合している細胞を分離する工程を含む。
【００１４】
この方法によって得た単離未分化人工多能性幹細胞（単数または複数）を提供する。
本発明の別の側面において、分化を経たかまたは分化を経ている人工多能性幹細胞から、未分化人工多能性幹細胞を分離する方法を提供し、ここで、未分化人工多能性幹細胞、および分化を経たかまたは分化を経ている人工多能性幹細胞が、試料中に存在しており、該方法は：（ｉ）ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）に結合可能な結合部分と試料を、試料中の細胞表面上で発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合を可能にする条件下で接触させ；そして（ｉｉ）結合部分に結合していない細胞から、結合部分に結合している細胞を分離する工程を含む。
【００１５】
この方法によって得た単離未分化人工多能性幹細胞（単数または複数）を提供する。この方法によって得た単離分化人工多能性幹細胞（単数または複数）もまた提供する。
本発明の別の側面において、単数または複数の未分化人工多能性幹細胞を含有する試料から、こうした細胞を単離する方法を提供し、該方法は、表面上にＰＯＤＸＬを発現する、試料内の単数または複数の細胞を単離する工程を含む。
【００１６】
いくつかの態様において、ＰＯＤＸＬに結合する結合部分と試料を接触させ、そして結合部分に結合していることによって、前記未分化人工多能性幹細胞（単数または複数）を試料から単離する。
【００１７】
この方法によって単離した未分化人工多能性幹細胞（単数または複数）を提供する。
本発明のさらなる側面において、未分化人工多能性幹細胞、および分化を経たかまたは分化を経ている人工多能性幹細胞を含む混合物から、未分化人工多能性幹細胞を濃縮する方法を提供し、該方法は：（ｉ）ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）に結合可能な結合部分と混合物を、混合物中の細胞表面上で発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合
を可能にする条件下で接触させ；そして（ｉｉ）未分化人工多能性幹細胞が濃縮された細胞集団を生成するように、結合部分に結合していない細胞から、結合部分に結合している細胞を分離する工程を含む。
【００１８】
本発明の別の側面において、未分化人工多能性幹細胞、および分化を経たかまたは分化を経ている人工多能性幹細胞を含む混合物から、分化を経たかまたは分化を経ている人工多能性幹細胞を濃縮する方法を提供し、該方法は：（ｉ）ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）に結合可能な結合部分と混合物を、混合物中の細胞表面上で発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合を可能にする条件下で接触させ；そして（ｉｉ）分化を経たかまたは分化を経ている人工多能性幹細胞が濃縮された細胞集団を生成するように、結合部分に結合している細胞から、結合部分に結合していない細胞を分離する工程を含む。
【００１９】
本発明のさらなる側面において、未分化人工多能性幹細胞から分化した細胞を含有する組成物であって、表面上にＰＯＤＸＬを発現する未分化人工多能性幹細胞を実質的に含有しない前記組成物を調製する方法を提供し、該方法は：（ｉ）未分化人工多能性幹細胞、および未分化人工多能性幹細胞から分化した細胞を含む、細胞集団を提供し；（ｉｉ）ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）に結合可能な結合部分と集団を、試料中の細胞表面上で発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合を可能にする条件下で接触させ；そして（ｉｉｉ）結合部分に結合している細胞から、結合部分に結合していない細胞を分離する工程を含む。
【００２０】
いくつかの態様において、該方法は、結合部分に結合していない分離細胞を、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤と混合する工程をさらに含む。
本発明の別の側面において、表面上にＰＯＤＸＬを発現する未分化人工多能性幹細胞を含有する組成物であって、未分化人工多能性幹細胞から分化した細胞を実質的に含有しない前記組成物を調製する方法を提供し、該方法は：（ｉ）未分化人工多能性幹細胞、および未分化人工多能性幹細胞から分化した細胞を含む、細胞集団を提供し；（ｉｉ）ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）に結合可能な結合部分と集団を、試料中の細胞表面上で発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合を可能にする条件下で接触させ；そして（ｉｉｉ）結合部分に結合していない細胞から、結合部分に結合している細胞を分離する工程を含む。
【００２１】
いくつかの態様において、該方法は、結合部分に結合している分離細胞から、結合部分を解離させる工程をさらに含む。該方法はまた、結合部分に結合している分離細胞を、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤と混合する工程も含んでもよい。
【００２２】
本発明のさらに別の側面において、未分化人工多能性幹細胞に、ＰＯＤＸＬに結合可能な結合部分を結合させる方法を提供し、該方法は、１以上の未分化人工多能性幹細胞を含有する試料と、ＰＯＤＸＬに結合可能な結合部分を、試料中の細胞表面上に発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合を可能にする条件下で接触させる工程を含む。
【００２３】
本発明のさらなる側面において、単数または複数の未分化人工多能性幹細胞を含有する試料中のこうした細胞を破壊する方法を提供し、該方法は、表面上にＰＯＤＸＬを発現する、試料中の単数または複数の該細胞を破壊する工程を含む。
【００２４】
本発明の別の側面において、単数または複数の未分化人工多能性幹細胞を含有する試料から、こうした細胞を除去する方法を提供し、該方法は、表面上にＰＯＤＸＬを発現する単数または複数の該細胞を試料から除去する工程を含む。
【００２５】
いくつかの態様において、ＰＯＤＸＬに結合する結合部分と試料を接触させ、そして結合部分に結合していることによって、前記未分化人工多能性幹細胞（単数または複数）を試料から除去する。
【００２６】
上述の本発明の側面のいずれにおいても、いくつかの態様において、結合部分は抗体であり、そして好ましい態様において、ｍＡｂ８４である。
本発明のさらなる側面において、未分化人工多能性幹細胞から分化した細胞を含有する組成物を提供し、該組成物は、表面上にＰＯＤＸＬを発現する未分化人工多能性幹細胞を実質的に含有しない。
【００２７】
本発明の別の側面において、未分化人工多能性幹細胞を含有する組成物を提供し、該組成物は、未分化人工多能性幹細胞から分化した細胞を実質的に含有しない。未分化人工多能性幹細胞は、好ましくは、表面上にＰＯＤＸＬを発現する。
【００２８】
本発明のさらなる側面において、細胞療法が必要な患者を治療する方法を提供し、該方法は：（ｉ）本発明の方法によって得た単数または複数の単離未分化人工多能性幹細胞；（ｉｉ）本発明の方法によって得た単数または複数の単離分化人工多能性幹細胞；あるいは（ｉｉｉ）本発明記載の組成物を、患者に投与する工程を含む。
【００２９】
本発明のさらなる側面において、細胞療法が必要な患者を治療するための薬剤製造における、（ｉ）本発明の方法によって得た単数または複数の単離未分化人工多能性幹細胞；（ｉｉ）本発明の方法によって得た単数または複数の単離分化人工多能性幹細胞；あるいは（ｉｉｉ）本発明記載の組成物の使用を提供する。
【００３０】
本発明の別の側面において、細胞療法が必要な患者を治療する際に使用するための、本発明の方法によって得た単数または複数の単離未分化人工多能性幹細胞；あるいは本発明の方法によって得た単数または複数の単離分化人工多能性幹細胞；あるいは本発明記載の組成物を提供する。
【００３１】
本発明のさらにさらなる側面において、表面上にポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）を発現している未分化人工多能性幹細胞、および未分化人工多能性幹細胞の表面上に発現されるＰＯＤＸＬに結合している、ＰＯＤＸＬに結合可能な結合部分を含む、複合体を提供する。該複合体は、好ましくは、結合部分およびＰＯＤＸＬの非共有および非イオン性相互作用によって形成される。単離型で、あるいは混合物または試料の一部として、例えば細胞培養物の一部として、複合体を提供してもよい。
【００３２】
本発明のさらなる側面において、ＰＯＤＸＬに結合する結合部分、および別の人工多能性幹細胞マーカーを検出するさらなる剤を含む部分のキットを提供する。
本発明のさらなる側面において、人工多能性幹細胞を生成し、そして同定する方法を提供し、該方法は：
（ｉ）非多能性ドナー細胞を誘導して多能性状態にして、表面上にＰＯＤＸＬを発現している人工多能性幹細胞を生成し；
（ｉｉ）該人工多能性幹細胞を、ＰＯＤＸＬに結合可能な結合部分と、人工多能性幹細胞表面上で発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合を可能にする条件下で接触させ；そして（ｉｉｉ）結合部分によって結合された細胞を同定する；
工程を含む。
【００３３】
本発明の別の側面において、未分化人工多能性幹細胞の破壊におけるｍＡｂ８４の使用を提供する。したがって、こうした細胞を含有する試料中の単数または複数の未分化人工多能性幹細胞を破壊する方法を提供し、該方法は、試料中の細胞をｍＡｂ８４と接触させて、ｍＡｂ８４を特定の細胞に結合させる工程を含む。該方法は、ｍＡｂ８４に結合している細胞の破壊を可能にするのに十分な時間、試料を培養するかまたはインキュベーションする工程をさらに含んでもよい。
【００３４】
本発明のさらにさらなる側面において、ｍＡｂ８４に結合している未分化人工多能性幹細胞を含む複合体を提供する。該複合体は、好ましくは、結合部分およびＰＯＤＸＬの非共有および非イオン性相互作用によって形成される。単離型で、あるいは混合物または試料の一部として、例えば細胞培養物の一部として、複合体を提供してもよい。
【００３５】
本発明のさらなる側面を以下に示す。
本発明の１つの側面において、未分化人工多能性幹細胞を含有しうる試料において、こうした細胞を同定する方法を提供し、該方法は、表面上にポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）を発現する、試料内の単数または複数の細胞を同定する工程を含む。
【００３６】
本発明の別の側面において、未分化人工多能性幹細胞を含有する試料から、こうした細胞を単離する方法を提供し、該方法は、表面上にＰＯＤＸＬを発現する、試料内の単数または複数の細胞を単離する工程を含む。
【００３７】
本発明の別の側面において、未分化人工多能性幹細胞を含有する試料から、こうした細胞を除去する方法を提供し、該方法は、表面上にＰＯＤＸＬを発現する単数または複数の
細胞を試料から除去する工程を含む。
【００３８】
本発明の別の側面において、未分化人工多能性幹細胞を含有する試料において、こうした細胞を破壊する方法を提供し、該方法は、表面上にＰＯＤＸＬを発現する、試料中の単数または複数の細胞を破壊する工程を含む。
【００３９】
本発明の別の側面において、未分化人工多能性幹細胞を含有する試料から、こうした細胞を単離する方法によって単離した未分化人工多能性幹細胞を提供し、該方法は、表面上にＰＯＤＸＬを発現する、試料内の単数または複数の細胞を単離する工程を含む。
【００４０】
本発明の別の側面において、表面上にＰＯＤＸＬを発現する単離未分化人工多能性幹細胞を提供する。
本発明の別の側面において、未分化人工多能性幹細胞から分化した細胞を含有する組成物を提供し、該組成物は表面上にＰＯＤＸＬを発現する未分化人工多能性幹細胞を実質的に含有しない。
【００４１】
本発明の別の側面において、細胞療法が必要な患者を治療する方法を提供し、該方法は、未分化人工多能性幹細胞を含有する試料から、こうした細胞を単離する方法によって単離された未分化人工多能性幹細胞、または表面上にＰＯＤＸＬを発現する単離未分化人工多能性幹細胞、または未分化人工多能性幹細胞から分化した細胞を含有する組成物であって、表面上にＰＯＤＸＬを発現する未分化人工多能性幹細胞を実質的に含有しない前記組成物を、患者に投与する工程を含む。
【００４２】
本発明の別の側面において、細胞療法が必要な患者を治療するための薬剤製造における、本発明の上記側面にしたがった細胞、または本発明の上記側面にしたがった組成物の使用を提供する。
【００４３】
本発明の別の側面において、本発明の上記側面にしたがった方法を提供し、ここでＰＯＤＸＬに結合する結合部分と試料を接触させ、そして結合部分に結合していることによって、前記人工多能性幹細胞を試料中で同定するかまたは試料から単離するかまたは試料から除去する。好ましくは結合部分は抗体である。
【００４４】
本発明の別の側面において、ＰＯＤＸＬに結合する部分、および別の人工多能性幹細胞マーカーを検出するさらなる剤を含む部分のキットを提供する。
以下の番号付けした段落は、本明細書に開示する本発明の技術特徴の広い組み合わせの言及を含有する：
１．  未分化人工多能性幹細胞を含有しうる試料において、こうした細胞を同定する方法であって、表面上にポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）を発現する、試料内の単数または複数の細胞を同定する工程を含む、前記方法。
【００４５】
２．  未分化人工多能性幹細胞を含有する試料から、こうした細胞を単離する方法であって、表面上にＰＯＤＸＬを発現する、試料内の単数または複数の細胞を単離する工程を含む、前記方法。
【００４６】
３．  未分化人工多能性幹細胞を含有する試料から、こうした細胞を除去する方法であって、表面上にＰＯＤＸＬを発現する単数または複数の細胞を試料から除去する工程を含む、前記方法。
【００４７】
４．  未分化人工多能性幹細胞を含有する試料において、こうした細胞を破壊する方法であって、試料中の、表面上にＰＯＤＸＬを発現する単数または複数の細胞を破壊する工程を含む、前記方法。
【００４８】
５．  第２段落の方法によって単離された未分化人工多能性幹細胞。
６．  表面上にＰＯＤＸＬを発現する単離未分化人工多能性幹細胞。
７．  未分化人工多能性幹細胞から分化した細胞を含有する組成物であって、表面上にＰＯＤＸＬを発現する未分化人工多能性幹細胞を実質的に含有しない前記組成物。
【００４９】
８．  第５または６段落記載の細胞、あるいは第７段落記載の組成物を、患者に投与する工程を含む、細胞療法が必要な患者を治療する方法。
９．  細胞療法が必要な患者を治療するための薬剤製造における、第５または６段落記載の細胞、あるいは第７段落記載の組成物の使用。
【００５０】
１０．  ＰＯＤＸＬに結合する結合部分と試料を接触させ、そして結合部分に結合して
いることによって、試料中の前記未分化人工多能性幹細胞を同定するか、または試料から単離するか、または試料から除去する、第１〜３段落のいずれか１つに記載の方法。
【００５１】
１１．  結合部分が抗体である、第１０段落記載の方法。
１２．  ＰＯＤＸＬに結合する部分、および別の人工多能性幹細胞マーカーを検出するさらなる剤を含む部分のキット。
【００５２】
本発明の原理を例示する態様および実験は、ここで、付随する図に言及して論じられるであろう：
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、ｈＥＳＣ（ＨＥＳ−３）、ＩＰＳＣ（ＥＳ４ＳＫＩＮ、ＥＳＩＭＲ９０）、および線維芽細胞株（ＢＪ１、ＩＭＲ９０）に対するｍＡｂ結合の分析を示す。ｈＥＳＣ上の細胞表面抗原に対して作製した異なるｍＡｂクローン（ｍＡｂ５、８、１４、６３、８４、８５、３２９、４３２および５２９）、ＴＲＡ−１−６０に対するｍＡｂまたはＯｃｔ−４に対するｍＡｂで細胞を染色した。細胞に結合している抗体を、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗マウス抗体で検出した。赤いヒストグラムは陰性対照での染色を表し、そして緑のヒストグラムは一次抗体での染色を表す。
【図２】図２は、ｈＥＳＣ（ＨＥＳ−３）、ＩＰＳＣ（ＥＳ４ＳＫＩＮ、ＥＳＩＭＲ９０）、および線維芽細胞株（ＢＪ１、ＩＭＲ９０）に対するｍＡｂ結合の分析を示す。ｈＥＳＣ上の細胞表面抗原に対して作製した異なるｍＡｂクローン（ｍＡｂ５、８、１４、６３、８４、８５、３２０、４３２および５２９）、ＴＲＡ−１−６０に対するｍＡｂまたはＯｃｔ−４に対するｍＡｂで細胞を染色した。細胞に結合している抗体を、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗マウス抗体で検出した。赤いヒストグラムは陰性対照での染色を表し、そして緑のヒストグラムは一次抗体での染色を表す。
【図３】図３は、ｈＥＳＣ（ＨＥＳ−３）、ＩＰＳＣ（ＥＳ４ＳＫＩＮ、ＥＳＩＭＲ９０）、および線維芽細胞株（ＢＪ１、ＩＭＲ９０）に対するｍＡｂ結合の分析を示す。ｈＥＳＣ上の細胞表面抗原に対して作製した異なるｍＡｂクローン（ｍＡｂ５、８、１４、６３、８４、８５、３２０、４３２および５２９）、ＴＲＡ−１−６０に対するｍＡｂまたはＯｃｔ−４に対するｍＡｂで細胞を染色した。細胞に結合している抗体を、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗マウス抗体で検出した。赤いヒストグラムは陰性対照での染色を表し、そして緑のヒストグラムは一次抗体での染色を表す。
【図４】図４は、ｈＥＳＣ（ＨＥＳ−３）、ＩＰＳＣ（ＥＳ４ＳＫＩＮ、ＥＳＩＭＲ９０）、および線維芽細胞株（ＢＪ１、ＩＭＲ９０）に対するｍＡｂ結合の分析を示す。ｈＥＳＣ上の細胞表面抗原に対して作製した異なるｍＡｂクローン（ｍＡｂ５、８、１４、６３、８４、８５、３２０、４３２および５２９）、ＴＲＡ−１−６０に対するｍＡｂまたはＯｃｔ−４に対するｍＡｂで細胞を染色した。細胞に結合している抗体を、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗マウス抗体で検出した。赤いヒストグラムは陰性対照での染色を表し、そして緑のヒストグラムは一次抗体での染色を表す。
【図５】図５は、ｈＥＳＣ（ＨＥＳ−３）、ＩＰＳＣ（ＥＳ４ＳＫＩＮ、ＥＳＩＭＲ９０）、および線維芽細胞株（ＢＪ１、ＩＭＲ９０）に対するｍＡｂ結合の分析を示す。ｈＥＳＣ上の細胞表面抗原に対して作製した異なるｍＡｂクローン（ｍＡｂ５、８、１４、６３、８４、８５、３２０、４３２および５２９）、ＴＲＡ−１−６０に対するｍＡｂまたはＯｃｔ−４に対するｍＡｂで細胞を染色した。細胞に結合している抗体を、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗マウス抗体で検出した。赤いヒストグラムは陰性対照での染色を表し、そして緑のヒストグラムは一次抗体での染色を表す。
【図６】図６は、ｈＥＳＣ（ＨＥＳ−３）、ＩＰＳＣ（ＥＳ４ＳＫＩＮ、ＥＳＩＭＲ９０）、および線維芽細胞株（ＢＪ１、ＩＭＲ９０）に対するｍＡｂ結合の分析を示す。ｈＥＳＣ上の細胞表面抗原に対して作製した異なるｍＡｂクローン（ｍＡｂ５、８、１４、６３、８４、８５、３２０、４３２および５２９）、ＴＲＡ−１−６０に対するｍＡｂまたはＯｃｔ−４に対するｍＡｂで細胞を染色した。細胞に結合している抗体を、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗マウス抗体で検出した。赤いヒストグラムは陰性対照での染色を表し、そして緑のヒストグラムは一次抗体での染色を表す。
【図７】図７は、ｈＥＳＣ、ＩＰＳＣおよび線維芽細胞株に対するｍＡｂ８４の細胞毒性を示す。（Ａ）細胞を５μｇのｍＡｂ８４と（Ｂ）、または抗体を含まず（対照、Ａ）、４℃で４５分間インキュベーションした。その後、フローサイトメーター上でのＰＩ排除アッセイによる分析のため、細胞を回収した。スキャッタープロット中のゲート化領域は、生存細胞集団を表す。
【図８】図８。細胞毒性ｍＡｂ８４はまた、人工多能性幹細胞も殺す。図７の結果の要約を示すチャート。５μｇ  ｍＡｂ８４と（濃青色のバー）、または抗体を含まずに（淡青色のバー）、４℃で４５分間インキュベーションした後の細胞生存度パーセント。
【図９】図９。ＥＳ４ＳＫＩＮおよびＥＳＩＭＲ９０細胞による多能性マーカーＯｃｔ４  ＳＳＥＡ４およびＴｒａ−１−６０の発現を示す顕微鏡写真。
【図１０】図１０。ｈＥＳＣ（ＨＥＳ−３）、ＩＰＳＣ（ＥＳ４ＳＫＩＮおよびＥＳＩＭＲ９０）、包皮およびＩＭＲ９０細胞に対する、ある範囲のモノクローナル抗体の結合（チェックマークによって示す）を示す表。
【図１１】図１１。５２８アミノ酸ポドカリキシン様タンパク質１前駆体のアミノ酸配列（配列番号１）。
【図１２】図１２。ヒトＰＯＤＸＬ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｏ００５９２．２  ＧＩ：２２９４６２７４０のアミノ酸配列（配列番号２）。
【図１３】図１３。ヒトＰＯＤＸＬ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＩ４３３１９．１  ＧＩ：２１９５２０３０７のアミノ酸配列（配列番号３）。
【図１４】図１４。ｍＡｂ８４のＶＬ鎖のアミノ酸配列（およびコードポリヌクレオチド配列）（配列番号４および５）。下線がないアミノ酸は、フレームワーク領域に対応する。下線のアミノ酸は、相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応する。
【図１５】図１５。ｍＡｂ８４のＶＨ鎖のアミノ酸配列（およびコードポリヌクレオチド配列）（配列番号６および７）。下線がないアミノ酸は、フレームワーク領域に対応する。下線のアミノ酸は、ＣＤＲに対応する。
【図１６】図１６。２つのＰＯＤＸＬ変異体のアミノ酸配列（配列番号８および９）。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
好ましい態様の説明
方法
本発明記載の方法は、好ましくは、表面上にＰＯＤＸＬを発現する細胞へのＰＯＤＸＬ結合部分の結合を伴う。
【００５５】
本発明記載の方法は：
（ａ）未分化人工多能性幹細胞を同定する工程；
（ｂ）未分化または分化人工多能性幹細胞を単離する工程；
（ｃ）他の細胞から、例えば分化人工多能性幹細胞から、未分化人工多能性幹細胞を分離する工程；
（ｄ）未分化または分化人工多能性幹細胞を濃縮する工程；
（ｅ）未分化人工多能性幹細胞を実質的に持たない、分化人工多能性幹細胞の組成物を調製する工程；あるいは
（ｆ）分化人工多能性幹細胞を実質的に持たない、未分化人工多能性幹細胞の組成物を調製する工程
を含んでもよい。
【００５６】
本発明記載の方法は、ＰＯＤＸＬに結合可能な部分（ＰＯＤＸＬ結合部分）と試料を接触させる工程を伴ってもよい。これは、ＰＯＤＸＬへの結合部分の結合を可能にするのに適した条件下であってもよい。こうした条件は、一般の当業者に周知であり、例えば、生理学的ｐＨおよび生理学的緩衝液を含む。
【００５７】
結合部分がＰＯＤＸＬに結合するのを可能にするのに十分な時間、ＰＯＤＸＬ結合部分と試料を接触させてもよい。十分な時間は、例えば、５分間、１０分間、３０分間、４５分間、６０分間、９０分間、または２時間より長くてもよい。
【００５８】
好ましい態様において、本発明記載の方法は、ＰＯＤＸＬ結合部分と試料を接触させ、
ＰＯＤＸＬ結合部分が細胞表面上のＰＯＤＸＬに結合するのを可能にし、そしてどの細胞が結合しているＰＯＤＸＬ結合部分を有するかを決定する工程を含む。
【００５９】
本発明記載の方法は、ＰＯＤＸＬ結合部分が結合している細胞を同定する工程を含んでもよい。本発明記載の方法は、ＰＯＤＸＬ結合部分が結合している細胞を単離する工程を含んでもよい。本発明記載の方法は、ＰＯＤＸＬ結合部分が結合している細胞を分配するか、除去するか、分離するか、または精製する工程を含んでもよい。本発明記載の方法は、ＰＯＤＸＬ結合部分が結合している細胞を破壊する工程を含んでもよい。本発明記載の方法は、同定されているか、単離されているか、分離されているか、分配されているか、濃縮されているか、結合しているかまたは除去されている細胞を定量化する工程をさらに含んでもよい。
【００６０】
本明細書に開示する未分化人工多能性幹細胞を同定する方法は、未分化ＩＰＳＣを画像化するために、特に、細胞が検出可能標識でタグ化されている場合に有用であり、そしてＩＰＳＣを特徴付けるために有用である。
【００６１】
ＩＰＳＣ表面上に発現されるＰＯＤＸＬへのＰＯＤＸＬ結合部分の結合を伴う方法は、ＩＰＳＣに関する研究、およびＩＰＳＣの臨床開発に有用である。
細胞表面上に発現されるＰＯＤＸＬに結合しているＰＯＤＸＬ結合部分は、結合部分およびＰＯＤＸＬの複合体を形成する。結合部分が結合するＰＯＤＸＬを発現している細胞は、複合体の一部を形成する。
【００６２】
本発明のいくつかの方法は、例えば結合部分の存在を検出することによって、または結合部分にカップリングした検出可能標識を検出することによって、複合体を検出する工程を含む。
【００６３】
本発明のいくつかの方法は、試料からまたは試料中の他の複合体化されていない細胞から、これらの複合体を分配する工程を含み、そして例えば結合部分の存在を検出することによって、または結合部分にカップリングした検出可能標識を検出することによって、複合体を検出する工程をさらに含んでもよい。
【００６４】
本発明のいくつかの方法は、結合部分およびＰＯＤＸＬの複合体の形成を可能にするのに十分な時間、ＰＯＤＸＬ結合部分と試料を接触させ、そして試料から複合体化細胞を除去する工程を含む。こうした方法は、分化および／または未分化人工多能性幹細胞の単離および／または精製に有用である。
【００６５】
本発明の方法において、人工多能性幹細胞がアフィニティ結合によって結合可能であるように、ＰＯＤＸＬ結合部分を、固体支持体上に固定してもよく、例えば固体支持体にコンジュゲート化してもよい。好適には、固体支持体は、アガロース、アクリルアミド、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭおよびＳｅｐｈａｄｅｘＴＭなどの任意の適切なマトリックスを含む。固体支持体は、マイクロタイタープレートまたはチップ、あるいはカラムなどの固体支持体であってもよい。
【００６６】
いくつかの態様において、結合した際に、適切な磁場の提供に際して、ヒト胚性幹細胞が試料の残りから分離可能であるように、結合部分は、磁気的に標識されている（直接または間接的のいずれかで）。磁気細胞ソーティングに用いられるマイクロビーズは、しばしば、ＭＡＣＳコロイド状超常磁性マイクロビーズと呼ばれる。この方式で標識された人工多能性幹細胞は、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）によってソーティング可能である。
【００６７】
特異的細胞マーカーを含む細胞を分離する他の方法が当該技術分野に知られ、そしてこれには、結合部分が蛍光分子で標識されるＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング）が含まれる。
【００６８】
本発明記載の方法は、結合しているか、同定されているか、単離されているか、分離されているか、濃縮されているか、または除去されている、未分化または分化人工多能性幹細胞を培養する工程を含んでもよい。該方法はまた、こうして得た未分化人工多能性幹細胞を分化させる工程も含んでもよい。
【００６９】
本発明記載の方法を用いて、分化または未分化人工多能性幹細胞の濃縮されたかまたは実質的に単離された組成物を提供してもよい。こうした組成物を多様な方式で用いてもよ
く、例えばこれを細胞療法で用いてもよいし、またはこれを細胞供給源として用いて、これを次いで、特定の療法に有用な特定の細胞系譜に分化させるよう促してもよいし、またはこれを用いて、細胞が他の細胞に分化することを可能にする因子を調べてもよい（ｉｎ
ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）。
【００７０】
典型的には、人工多能性胚性幹細胞の濃縮組成物は、分化または未分化ヒト胚性幹細胞としての細胞を少なくとも５０％含有し、好ましくは少なくとも７０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％含有する。好ましくは、組成物中の細胞はすべて、前記分化または未分化人工多能性幹細胞である。
【００７１】
細胞集団を濃縮するための方法は、好ましくは、試料中の細胞濃度を増加させるか、あるいは絶対的にまたは試料中の他の細胞の数に対して相対的にのいずれかで、細胞集団（すなわち所定のタイプの細胞数）を増加させることを伴う。
【００７２】
本発明はまた、未分化人工多能性幹細胞を破壊する方法も提供し、該方法は、表面上にＰＯＤＸＬを発現する、試料中の単数または複数の細胞を破壊する工程を含む。いくつかの態様において、表面上にＰＯＤＸＬを発現している細胞に、該部分が結合するのを可能にするのに十分な時間、ＰＯＤＸＬ結合部分と細胞試料を接触させる。該部分は、結合した細胞を破壊することが可能な細胞毒性剤を含んでもよい。あるいは、結合部分自体によって細胞を破壊してもよいし、または結合部分の付着によって破壊してもよい。あるいは、結合部分と細胞毒性剤の相互作用によって細胞を破壊してもよい。したがって、該方法は、結合部分に結合している細胞を破壊するように、結合部分と相互作用可能な細胞毒性剤の添加を含んでもよい。
【００７３】
いくつかの方法において、ＰＯＤＸＬ結合部分は、腫瘍症機構によって細胞死を仲介し、腫瘍症は、細胞浸透性（ヨウ化プロピジウム／トリパンブルーなどの色素に対する浸透性によって示されるように）および細胞収縮の増加につながる膜損傷から生じる細胞死の形である。本発明の方法によって誘導される細胞死には、細胞膜の孔形成（ｐｏｒａｔｉｏｎ）、小疱形成および／または細胞凝集が先行しうる。未分化ＩＰＳＣを破壊する好ましい方法において、ＰＯＤＸＬに結合可能な部分は、ｍＡｂ８４であってもよい。
【００７４】
抗体または他の結合部分に連結可能な、適切な細胞毒性部分には、放射性原子、細胞毒性薬剤、細胞毒性タンパク質、およびプロドラッグを細胞毒性薬剤に変換する酵素系が含まれる。これらは当該技術分野に周知である。
【００７５】
好ましい態様において、本発明には、未分化人工多能性幹細胞を含有する試料において、こうした細胞を破壊する方法が含まれ、該方法は、前記細胞に対して毒性であるＰＯＤＸＬ結合部分と試料を接触させ、そして前記細胞表面上のＰＯＤＸＬに結合部分が結合するのを可能にし、そして結合部分が前記細胞を殺すのを可能にする工程を含む。結合部分は、前記細胞に対してそれ自体が細胞毒性である抗体であってもよいし、または該細胞に対して毒性であるさらなる部分を含んでもよい。
【００７６】
いくつかの態様において、細胞毒性剤と同時にまたは連続して、ＰＯＤＸＬ結合部分を試料にまたは細胞に投与する。残ったＩＰＳＣの完全な除去を確実にするため、ＰＯＤＸＬ結合部分を、他の幹細胞関連分子に結合可能な１以上の他の剤と組み合わせて投与してもよい。
【００７７】
未分化ＩＰＳＣを破壊するための方法を用いて、分化するように誘導されているＩＰＳＣ集団から、未分化細胞を除去してもよい。組織または臓器の移植前に、未分化ＩＰＳＣを破壊するための方法を用いて、残ったＩＰＳＣを排除して、こうして、特に奇形腫形成のリスクを減少させることによって、移植片の成功および安全性を増加させてもよい。
【００７８】
本発明は、表面上にＰＯＤＸＬを発現する単離未分化人工多能性幹細胞（単数または複数）、ならびにＰＯＤＸＬ結合部分が結合しているＰＯＤＸＬを表面上に発現する単離未分化人工多能性幹細胞を提供する。
【００７９】
本発明はまた、試料から、再プログラミングされた人工多能性幹細胞を生成しそして同定する方法も提供する。これによって、成功裡に再プログラミングされなかった細胞から、成功裡に再プログラミングされた人工多能性幹細胞の選択が可能になる。
【００８０】
こうした方法は、非多能性ドナー細胞を誘導して多能性状態にして、表面上にＰＯＤＸ
Ｌを発現している人工多能性幹細胞を生成し、人工多能性幹細胞表面上に発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合を可能にする条件下で、ＰＯＤＸＬに結合可能な結合部分と人工多能性幹細胞を接触させ；そして結合部分によって結合された細胞を同定する工程を含む。
【００８１】
非多能性ドナー細胞を誘導して多能性状態にするための技術が当該技術分野に知られる。例えば、どちらも本明細書に援用される、Ｔａｋａｈａｓｈｉら（（２００７）  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｆａｃｔｏｒｓ．  Ｃｅｌｌ  １３１（５）：８６１−７２）およびＹｕら（（２００７）  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８（５８５８）：１９１７−２０）によって報告されるもの。
【００８２】
こうした技術には、ウイルスベクターを用いた、幹細胞関連遺伝子および／または転写因子でのドナー細胞のトランスフェクションが含まれる。こうした遺伝子および因子には、「人工多能性幹細胞」以下に説明するように、Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕｆ５１）、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、ＮｏｎａｏｇおよびＬＩＮ２８の１以上が含まれてもよい。
【００８３】
ドナー細胞は、「人工多能性幹細胞」以下に説明するように、成体体細胞、例えば線維芽細胞を含んでもよい。
本発明記載の方法は、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、培養中の細胞を用いた実験を含むように意図され、一方、用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）多細胞生物を用いた実験を含むように意図される。
【００８４】
キット
本発明のいくつかの側面にしたがって、部分のキットを提供する。いくつかの態様において、マーカーは、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１およびＧＣＴＭ−２の１以上である。さらなる剤は、ｍＡｂ  ５、ｍＡｂ  ８、ｍＡｂ  １４、ｍＡｂ  ６３、ｍＡｂ  ８４、ｍＡｂ  ８５、ｍＡｂ  ９５、ｍＡｂ  ３７５、ｍＡｂ
４３２、ｍＡｂ  ５２９の任意の１以上であってもよい。
【００８５】
いくつかの態様において、キットは、ＰＯＤＸＬに対する抗体、ならびにＯｃｔ４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１およびＧＣＴＭ−２の１以上に対する抗体を含む。典型的には、キットはまた：免疫化学において使用するための試薬；固体支持体に固定された抗体；抗体を標識するための手段；細胞毒性部分に抗体を連結するための手段の１以上も含有してもよい。
【００８６】
試料
本発明のいくつかの方法は、細胞を含有する試料を伴う。試料は、１以上の未分化人工多能性幹細胞を含有するかまたは含有すると推測される任意の量の細胞であってもよい。試料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖した細胞の培養物であってもよい。例えば、培養物は、細胞懸濁物あるいは培養プレートまたはディッシュ中で培養された細胞を含んでもよい。
【００８７】
好ましい態様において、試料は、未分化人工多能性幹細胞を含有する。いくつかの態様において、試料は、未分化人工多能性幹細胞、および分化を経たかまたは分化を経ている人工多能性幹細胞を含有する。分化を経たかまたは分化を経ている人工多能性幹細胞は、もはや多能性ではない可能性もあり、そして好ましくは、表面上にＰＯＤＸＬを発現しない。
【００８８】
試料は、未分化人工多能性幹細胞が特定の細胞系譜に分化するよう促されている（または促進されている）ものであってもよく、そしてしたがって、試料は、未分化および分化細胞の混合物を含有してもよい（分化はしばしば効率的なプロセスではないため）。典型的には、こうした試料中で、未分化人工多能性幹細胞は、細胞総数の数パーセントを構成する。典型的には、試料中の分化細胞は、心筋細胞、膵島細胞、ニューロン前駆体細胞または間葉幹細胞であってもよく、これらは（分化によって）人工多能性幹細胞から得られ
る。潜在的に、未分化細胞は望ましくない奇形腫を形成しうるため、分化細胞を含有する試料の臨床適用前に、こうした試料由来の（またはこうした試料中の）未分化人工多能性幹細胞を除去（または破壊）することは、有用であろう。典型的には、未分化人工多能性幹細胞の少なくとも９５％を除去するかまたは破壊する。好ましくは、前記細胞すべてを除去するかまたは破壊する。
【００８９】
いくつかの態様において、試料は、非人工多能性幹細胞、例えば胚性幹細胞（ＥＳＣ）を含有しない。いくつかの好ましい態様において、試料はヒト胚性幹細胞またはヒト非人工多能性幹細胞を含有しない。
【００９０】
試料は、表面上にＰＯＤＸＬを発現している未分化ＩＰＳＣを含有してもよい。いくつかの例において、試料は、多能性が誘導されている体細胞に由来している。他の例において、試料は、他の細胞に分化するよう誘導されているＩＰＳＣを含んでもよい。試料は、他の非多能性細胞、例えばフィーダー細胞または線維芽細胞を含有してもよい。
【００９１】
ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）
本明細書においてポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）と称するポドカリキシン様タンパク質１前駆体のアミノ酸配列を図１１に示し（配列番号１）、そして該配列はまた、ＥｎｔｒｅｚＰｕｂＭｅｄを通じてアクセス可能な、ＮＣＢＩタンパク質配列データベースの寄託番号Ｏ００５９２号にも見出される（Ｋｅｒｓｈａｗら（１９９７）  Ｊ．
Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  １５７０８−１５７１４もまた参照されたい）。また、該タンパク質をＰＣＬＰＩおよびＰＯＤＸＬとも呼ぶ。便宜上、本明細書において、以後、これをＰＯＤＸＬと呼ぶ。ＰＯＤＸＬは図１１に提供するものとまったく同じ配列を有してもよいし、またはその天然存在変異体であってもよい（例えば図１６を参照されたい）。例えば、Ｏ００５９２にしたがって、Ｒは残基６２のＴに関する変異体であり、そしてＳは残基１９６のＬの変異体である。
【００９２】
成熟ＰＯＤＸＬは、５２８残基のグリコシル化細胞表面ポリペプチドであり、このうち残基１〜２２がシグナルペプチドであり、そして残基２３〜５２８は成熟タンパク質に相当する。残基２３〜４３１はタンパク質の細胞外部分であると考えられ、そして残基４３２〜４５２は膜貫通領域である。残基２３〜３０４はＳｅｒ／Ｔｈｒリッチ領域に相当する。ＰＯＤＸＬに結合する結合部分がＰＯＤＸＬの細胞外領域に、例えばＳｅｒ／Ｔｈｒリッチ領域内、またはこの領域の外に結合するのが好ましい。
【００９３】
ポドカリキシン様タンパク質は、シアロムチンタンパク質ファミリーのメンバーである。ＰＯＤＸＬは、元来、糸球体足細胞の重要な構成要素として同定された。足細胞は、互いにかみ合う足突起を持つ非常に分化した上皮細胞であり、糸球体基底膜の外面を覆っている。ＰＯＤＸＬの他の生物学的活性には、Ｎａ＋／Ｈ＋交換体制御因子を伴う膜タンパク質複合体中で細胞内細胞骨格要素に結合すること、造血細胞分化において役割を果たすこと、および血管内皮細胞中で発現され、そしてＬ−セレクチンに結合することが含まれる。
【００９４】
ＰＯＤＸＬは、シアロムチンのＣＤ３４ファミリーに属する非常にグリコシル化されたＩ型膜貫通タンパク質である。ＰＯＤＸＬは、元来、腎糸球体の足細胞上の主なシアロタンパク質として記載されたが、後に、血管内皮細胞および初期造血前駆体上で発現されることが見出された。より最近、ＰＯＤＸＬは、乳房、肝臓、および前立腺癌中の腫瘍攻撃性の指標とされてきている。ヒトＰＯＤＸＬは、染色体７ｑ３２−ｑ３３上に位置し、そして５２８アミノ酸のタンパク質をコードする。しかし、ＰＯＤＸＬの細胞外ドメインは、シアル酸付加Ｏ連結炭水化物で非常にグリコシル化され、そしてＮ連結グリコシル化の５つの潜在的な部位があるため、ＰＯＤＸＬのおよその分子量は１６０〜１６５ｋＤａである。
【００９５】
機能的に、ＰＯＤＸＬは、細胞タイプに応じて、非常に多様な役割を有すると報告されてきている。足細胞において、ＰＯＤＸＬは、電荷反発によって、足細胞足突起間に開いたろ過スリットを維持する、抗接着分子として作用する。しかし、高内皮静脈においては、ＰＯＤＸＬは、Ｌ−セレクチンに結合する接着分子として作用し、そしてリンパ球の束縛および回転を仲介する。
【００９６】
ｈＥＳＣにおいて、ＰＯＤＸＬは、未分化ｈＥＳＣにおいて高発現されることが転写的に同定された５、６。発現タグ頻度分析によって、ＰＯＤＸＬ発現レベルは、７〜８日の胚様体中でほぼ２．５倍下方制御され、そして神経外胚葉様細胞および肝細胞様細胞において、それぞれ、およそ７倍および１２倍下方制御された５。この結果は、ｈＥＳＣおよび８日のＥＢの免疫組織化学によって支持され、後者では染色が有意に減少した７。ｈＥＳＣおよびｍＥＳＣのトランスクリプトーム・プロフィールを比較する、Ｗｅｉらによる別個の研究において、Ｗｅｉらは、ＰＯＤＸＬの発現が、ｈＥＳＣに比較して、ｍＥＳＣ株Ｅ−１４において、ＭＰＳＳによっては検出されないことを観察した８。タンパク質レベルでは、ＳｃｈｏｐｐｅｒｌｅおよびＤｅＷｏｌｆ９は、ＰＯＤＸＬが、レチノイン酸に対する２つの胚性癌細胞株の曝露後、翻訳後グリコシル化変化を経ることを報告した（分子量が２００ｋＤａから１７０ｋＤａに減少する）。抗ＴＲＡ−１−６０／８１抗体が修飾ＰＯＤＸＬに結合できないことから、胚性幹細胞上に幹細胞ＰＯＤＸＬ（ＳＣ−ＰＯＤＸＬ）が存在することが示唆された。総合すると、ＥＳＣにおけるＰＯＤＸＬ発現のこれらの独立の報告は、本発明者らのフローサイトメトリーによるｍＡｂ８４の観察と緊密に対応し、ここで、結合反応性は、未分化ｈＥＳＣに比較して８日の胚様体で減少した。同時に、それぞれ、ＦＧＦ２枯渇ｈＥＳＣおよび２２日のＥＢに対するｍＡｂ８４が仲介する殺傷の減少または喪失は、分化に際してのＰＯＤＸＬ発現の下方制御に起因しうる。さらに、胚様体形成中のｈＥＳＣへのｍＡｂ８４およびＴＲＡ−１−６０結合が同時に減少することは、分化中にＳＣ−ＰＯＤＸＬが喪失することと関連しうる。
【００９７】
本発明の好ましい方法において、ＰＯＤＸＬは、ヒトＰＯＤＸＬである。ヒトＰＯＤＸＬは、配列番号１のアミノ酸配列、またはＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｏ００５９２．２  ＧＩ：２２９４６２７４０のアミノ酸配列（配列番号２；図１２）またはＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＩ４３３１９．１  ＧＩ：２１９５２０３０７のアミノ酸配列（配列番号３；図１３）を有してもよい。いくつかの態様は、図１６に開示するものなどのＰＯＤＸＬ変異体に関する（配列番号８および９）。
【００９８】
いくつかの態様において、ＰＯＤＸＬタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列に対して、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の１つの配列同一性を含む。いくつかの態様において、ＰＯＤＸＬタンパク質は、アミノ酸１〜２２を除いて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列に対して、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の１つの配列同一性を含む。好ましいＰＯＤＸＬタンパク質は、ｍＡｂ８４に結合可能なものである。
【００９９】
ＰＯＤＸＬ結合部分
適切な結合部分には、核酸アプタマー（例えば、指数的濃縮によるリガンドの系統的進化（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ））によって得られる）、抗体（ポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびに抗体断片を含む）、リガンド、酵素および他の生物学的分子が含まれる。
【０１００】
本発明のすべての態様に関して、ＰＯＤＸＬ結合部分が選択的であることが好ましいと認識されるであろう。したがって、ＰＯＤＸＬ結合部分が選択的にＰＯＤＸＬに結合する、すなわち他のヒト・タンパク質よりもより高いアフィニティーでＰＯＤＸＬに結合することが好ましい。典型的には、抗ＰＯＤＸＬ抗体は、選択的方式で、実質的に他のヒト・タンパク質には結合しない。
【０１０１】
好適には、結合部分は抗体であり、この用語には、その断片または誘導体、あるいは合成抗体または合成抗体断片が含まれる。
ＰＯＤＸＬに結合する抗体はすでに知られている。例えば、ポリクローナル抗血清が細胞外ドメインに結合する、ヒト・ポドカリキシンに特異的なヤギＩｇＧが、カタログ番号ＡＦ１６５８のもとで、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃから入手可能である。また、モノクローナル抗ヒト・ポドカリキシン抗体（マウスＩｇＧ２Ａ）が、カタログ番号ＭＡ
Ｂ１６５８のもとで、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃから入手可能である。モノクローナル抗体技術に関連した今日の技術を考慮すると、抗体は、大部分の抗原に対して調製可能である。抗原結合部分は、抗体の部分（例えばＦａｂ断片）または合成抗体断片（例えば一本鎖Ｆｖ断片［ＳｃＦｖ］）であってもよい。選択した抗原に対する適切なモノクローナル抗体は、既知の技術、例えば、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，  Ｈ  Ｚｏｌａ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８８）に、そして“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，  Ｊ
Ｇ  Ｒ  Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８２）に開示されるものによって調製可能である。キメラ抗体は、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（１９８８，  ８ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｐａｒｔ  ２，  ７９２−７９９）によって論じられる。
【０１０２】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、本発明の方法において有用であり、そして抗原上の単一のエピトープを特異的にターゲティングする抗体の均質な集団である。したがって、ＰＯＤＸＬに結合するｍＡｂは、潜在的に、特定の細胞系譜に分化する単数または複数の未分化細胞を特徴付ける抗原のレパートリーを示す生存細胞サブセットを精製するかまたは除去するのに使用可能である。
【０１０３】
ポリクローナル抗体は、本発明の方法において有用である。単一特異的ポリクローナル抗体が好ましい。当該技術分野に周知の方法を用いて、適切なポリクローナル抗体を調製してもよい。
【０１０４】
ＦａｂおよびＦａｂ２断片などの抗体断片もまた用いてもよく、遺伝子操作した抗体および抗体断片もまた用いてもよい。抗体の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインは、抗原認識に関与し、この事実は、初期のプロテアーゼ消化実験によって最初に認識された。さらなる確認は、げっ歯類抗体の「ヒト化」によって見出された。げっ歯類起源の生存ドメインを、ヒト起源の定常ドメインに融合させて、生じる抗体が、げっ歯類親抗体の抗原特異性を保持するようにしてもよい（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１，  ６８５１−６８５５）。
【０１０５】
抗原特異性は可変ドメインによって与えられ、そして定常ドメインからは独立であることは、すべて１以上の可変ドメインを含有する抗体断片の細菌発現を伴う実験から知られる。これらの分子には、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，  １０４１）；  Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａら（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，  １０３８）；  ＶＨおよびＶＬパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドを通じて連結される、一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄら（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，  ４２３；  Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５，  ５８７９）；ならびに単離Ｖドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（Ｗａｒｄら（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，  ５４４）が含まれる。特異的結合部位を保持する抗体断片合成に関与する技術の一般的な概説は、Ｗｉｎｔｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，  ２９３−２９９中に見出されるはずである。
【０１０６】
「ＳｃＦｖ分子」によって、本発明者らは、ＶＨおよびＶＬパートナードメインが、例えば柔軟なオリゴペプチドによって、共有結合されている分子を意味する。
Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片は、すべて大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）において発現可能であり、そして大腸菌から分泌可能であり、したがって、多量の前記断片の容易な産生が可能になる。
【０１０７】
全抗体、およびＦ（ａｂ’）２断片は「二価」である。「二価」によって、本発明者らは、前記抗体およびＦ（ａｂ’）２断片が２つの抗原結合部位を有することを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ断片は一価であり、１つの抗原結合部位しか持たない。また、やはり当該技術分野に周知であるファージディスプレイ技術を用いて、ＰＯＤＸＬに結合する合成抗体も作製してもよい。
【０１０８】
特定の方法において、抗体はｍＡｂ８４である。ｍＡｂ８４のＶＨおよびＶＬ鎖のアミ
ノ酸配列（およびコードポリヌクレオチド配列）が、図１４（配列番号４）および１５（配列番号５）に示すように決定されてきている。
【０１０９】
本明細書において、ｍＡｂ８４に対する言及には、配列番号４および６に対する高い配列同一性パーセントを有するＶＬおよび／またはＶＨ鎖を有する抗体が含まれる。ｍＡｂ８４に対する言及には、配列番号６に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＶＨ鎖、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の１つの配列同一性を有するＶＨ鎖を有する、ＰＯＤＸＬ（好ましくはヒトＰＯＤＸＬ）に結合する抗体が含まれる。ｍＡｂ８４に対する言及には、配列番号４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＶＬ鎖、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の１つの配列同一性を有するＶＬ鎖を有する、ＰＯＤＸＬ（好ましくはヒトＰＯＤＸＬ）に結合する抗体が含まれる。
【０１１０】
ＰＯＤＸＬに対する他のｍＡｂおよびその使用は、本明細書に援用されるＷＯ２００７／１０２７８７に記載される。
ｍＡｂ８４を用いて、分化後に、そして場合によって分化細胞の機能を試験する動物移植試験前に、残った未分化人工多能性幹細胞を除去してもよい。
【０１１１】
ｍＡｂ８４（場合によって、ＷＯ２００７／１０２７８７に記載されるような、または図１０に示すような、他のｍＡｂと組み合わせて）は、潜在的に、残った未分化ｈＥＳＣまたは未分化人工多能性幹細胞を除去して、したがって再生臨床適用において移植片の成功および安全性を増加させるために、移植前に使用可能である。
【０１１２】
本出願のＰＯＤＸＬ結合部分は、潜在的に、特定の細胞系譜に分化する単数または複数の未分化細胞を特徴付ける抗原のレパートリーを示す生存細胞サブセットを精製するかまたは除去するのに使用可能である。
【０１１３】
適切な結合部分は、配列番号１〜３、８または９の１つに対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％の１つの配列同一性を有するポリペプチドに結合可能である。
【０１１４】
いくつかの好ましい態様において、結合部分は、検出可能に標識されているか、または少なくとも検出が可能である。例えば、結合部分を放射性原子または着色分子または蛍光分子または任意の他の方式で容易に検出可能な分子で標識してもよい。適切な検出可能分子には、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、酵素基質、および放射標識が含まれる。結合部分を、検出可能標識で直接標識してもよいし、または間接的に標識してもよい。例えば、結合部分は、それ自体が標識されている別の抗体によって検出可能な非標識抗体であってもよい。あるいは、第二の抗体が、結合しているビオチンを有してもよく、そしてビオチンに対する標識ストレプトアビジンの結合を用いて、第一の抗体を間接的に標識する。
【０１１５】
幹細胞
用語「幹細胞」は、一般的に、分裂に際して、２つの発生オプションに直面する細胞を指す：娘細胞は元来の細胞と同一であってもよいし（自己再生）、またはこれらはより特殊化された細胞タイプの子孫であってもよい（分化）。したがって、幹細胞は、１つまたは別の経路を採用可能である（各細胞タイプを１つ形成可能である、さらなる経路が存在する）。したがって、幹細胞は、最終的に分化しておらず、そして他のタイプの細胞を産生可能な細胞である。
【０１１６】
本文書において、用語「幹細胞」は、特に、人工多能性幹細胞を指す。
胚性幹細胞
胚性幹（ＥＳＣ）細胞は、着床が起こる胚発生段階である胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）から単離可能である。
【０１１７】
多能性幹細胞
多能性幹細胞は、体内の任意の分化細胞を作製する潜在能力を持つ、真の幹細胞である。しかし、これらは、栄養膜に由来する胚体外膜を作製するのには寄与しえない。いくつかのタイプの多能性幹細胞が見出されてきている。
【０１１８】
多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞
多分化能幹細胞は、真の幹細胞であるが、限定された数のタイプにしか分化しえない。例えば、骨髄は、血液細胞のすべてを生じさせるが、他のタイプの細胞を生じさせない、多分化能幹細胞を含有する。多分化能幹細胞は、成体動物において見られる。体内のすべての臓器がこうした細胞を含有すると考えられ、これらは死んだ細胞または損傷を受けた細胞を置換しうる。
【０１１９】
幹細胞を特徴付ける方法が当該技術分野に知られ、そしてこれには、クローンアッセイ、フローサイトメトリー、長期培養、ならびに分子生物学的技術、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロッティングなどの標準的なアッセイ法の使用が含まれる。
【０１２０】
成体幹細胞
成体幹細胞は、非常に多様なタイプを含み、ニューロン、皮膚、および骨髄移植における活性構成要素である血液形成幹細胞を含む。
【０１２１】
これらの後者の幹細胞タイプはまた、臍帯由来幹細胞の主な特徴でもある。成体幹細胞は、実験室内および体内の両方で、機能するより特殊化された細胞タイプに成熟可能であるが、細胞タイプの正確な数は、選択した幹細胞のタイプによって制限される。
【０１２２】
人工多能性幹細胞
一般的にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略される人工多能性幹細胞は、特定の遺伝子を挿入することによって、非多能性細胞、特に成体体細胞に人工的に由来する多能性幹細胞のタイプである。ｉＰＳ細胞は、すべて本明細書に援用される、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｋ．  ＆  Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）、Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓら（２００７）、Ｗｅｒｎｉｇ  Ｍら（２００７）、Ｍａｈｅｒａｌｉ  Ｎら（２００７）、Ｙｕ  Ｊら（２００７）およびＴａｋａｈａｓｈｉら（２００７）に概説され、そして論じられる。
【０１２３】
ｉＰＳ細胞は、典型的には、非多能性細胞、例えば成体線維芽細胞内に特定の幹細胞関連遺伝子をトランスフェクションすることによって得られる。トランスフェクションは、典型的には、ウイルスベクターを通じて、例えばレトロウイルス再プログラミングを通じて達成される。トランスフェクション遺伝子には、マスター転写制御因子Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２が含まれるが、他の遺伝子が誘導効率を増進させると示唆される。３〜４週間後、少数のトランスフェクション細胞が、形態学的におよび生化学的に多能性幹細胞と類似となり始め、そして典型的には、形態学的選択、倍加時間を通じて、またはレポーター遺伝子および抗生物質感染を通じて単離される。
【０１２４】
ＩＰＳＣは、１以上の転写因子でのトランスフェクションによって、線維芽細胞などの体細胞から誘導可能である。いくつかの場合、細胞をＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４で形質転換する。転写因子および／またはマーカー遺伝子を含む他の遺伝子で、細胞をさらにトランスフェクションしてもよい。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換え系などのトランスポゾン系を用いて、または外因性再プログラミング遺伝子を含まないｉＰＳＣを生じるため、非組込みベクターを用いて、遺伝子を導入してもよい。レトロウイルスなどのウイルスベクターを用いて、トランスフェクションを達成してもよい。ウイルスは両種指向性ウイルスであってもよい。細胞がトランスフェクションされたら、細胞をＥＳＣ培地にトランスファーする前に、フィーダー細胞上で増殖させてもよい。
【０１２５】
ＩＰＳＣは、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のげっ歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、非ヒト霊長類または他の非ヒト脊椎動物生物に由来してもよい。好ましい態様において、ＩＰＳＣは、ヒト細胞に由来する。
【０１２６】
本発明で有用なｉＰＳ細胞は、肺、包皮線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、角化細胞、血液前駆体細胞、骨髄細胞、肝細胞、胃上皮細胞、膵臓細胞、神経幹細胞、Ｂリンパ球、ＥＳ由来体細胞および胚性線維芽細胞を含む、任意の適切な細胞タイプに由来してもよい。ｉＰＳ細胞は、ヒト、マウスまたは他の哺乳動物に由来してもよい。好ましくは、ｉＰＳ細胞はヒトである。いくつかの場合、細胞はヒト皮膚線維芽細胞でない。ＩＰＳＣは、ＥＳＣに類似の遺伝子発現パターンおよび表現型を示してもよい。本発明において、未分化ＩＰＳＣは表面上にＰＯＤＸＬを発現する。
【０１２７】
ＥＳＣ同様、分化人工多能性幹細胞の将来の療法的適用は、残った未分化ＩＰＳＣが混
入することによる、奇形腫形成のリスクを負う。この問題にもかかわらず、現在、これらの細胞集団を分離するために開発された戦略はそれほど多くはない。
【０１２８】
本発明は、特に、細胞表面上にＰＯＤＸＬを発現しているＩＰＳＣ、すなわちＰＯＤＸＬ結合部分に結合するのに利用可能なＰＯＤＸＬを表面上に有するＩＰＳＣに関する。本発明はまた、特に、ヒト細胞に由来するＩＰＳＣにも関する。
【０１２９】
幹細胞培養
幹細胞を培養する任意の適切な方法を、本明細書に記載する方法および組成物において用いてもよい。
【０１３０】
任意の適切な容器を用いて、本明細書に記載する方法および組成物にしたがって、幹細胞を増殖させてもよい。適切な容器には、米国特許公報ＵＳ２００７／０２６４７１３（Ｔｅｒｓｔｅｇｇｅ）に記載されるものが含まれる。
【０１３１】
容器には、例えば、バイオリアクターおよびスピナーが含まれてもよい。本文書で用いる際、用語「バイオリアクター」は、真核細胞、例えば動物細胞または哺乳動物細胞を、例えば大規模に培養するのに適した容器である。制御バイオリアクターの典型的な培養体積は、２０ｍｌ〜５００ｍｌの間である。
【０１３２】
バイオリアクターは、１以上の条件、例えば酸素分圧を調節または監視可能な制御バイオリアクターを含んでもよい。これらの条件を測定しそして制御するためのデバイスが当該技術分野に知られる。例えば、酸素分圧に関して、酸素電極を用いてもよい。選択するガス混合物（例えば空気、あるいは空気および／または酸素および／または窒素および／または二酸化炭素の混合物）の量および組成を通じて、酸素分圧を制御してもよい。酸素分圧を測定しそして制御するのに適したデバイスは、Ｂａｉｌｅｙ，  Ｊ  Ｅ．（Ｂａｉｌｅｙ，  Ｊ  Ｅ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，  第２版，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｉｎｃ．  ＩＳＢＮ  ０−０７−００３２１２−２  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，  （１９８６））またはＪａｃｋｓｏｎ  Ａ  Ｔ．  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ａ  Ｔ．，  Ｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ  ｉｎ  ｄｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  ＩＳＢＮ  ３５４０５６１９００（１９９３））に記載される。
【０１３３】
他の適切な容器にはスピナーが含まれる。スピナーは、ガラスボール攪拌装置、羽根車攪拌装置、および他の適切な攪拌装置などの多様な攪拌機構を用いて攪拌可能な、制御または非制御バイオリアクターである。スピナーの培養体積は、典型的には２０ｍｌ〜５００ｍｌの間である。回転ボトルは、４００〜２０００ｃｍ２の間の培養面積を有するプラスチックまたはガラス製の丸い細胞培養フラスコである。これらのフラスコの全内表面に沿って、細胞を培養する；細胞は培地で覆われ、これは「回転」運動によって達成され、すなわちボトルをそれ自体の個々の軸の周りに回転させる。
【０１３４】
あるいは、培養は静的であってもよく、すなわち培養／培地の能動的な攪拌を使用しなくてもよい。培養の攪拌を減少させることによって、細胞凝集塊の形成が可能になりうる。何らかの攪拌を使用して、培養細胞上への培地の分布および流動を促してもよいが、凝集塊形成を実質的に妨害しないようにこの攪拌を適用してもよい。例えば、低いｒｐｍ、例えば３０ｒｐｍ未満または２０ｒｐｍ未満の攪拌を使用してもよい。
【０１３５】
継代による増殖
本明細書に記載する方法および組成物は、培養中の継代または分割を含んでもよい。該方法は、連続的なまたは頻繁な継代を伴ってもよい。
【０１３６】
「頻繁な」または「連続的な」によって、本発明者らは、本発明者らの方法が、幹細胞が継代される、例えば増殖中のプレートまたはマイクロキャリアーから剥がされ、そして他のプレート、マイクロキャリアーまたは粒子にトランスファーされるのを可能にする方式で該細胞の増殖を可能にすることを意味し、そしてこのプロセスを少なくとも１回、例えば２回、３回、４回、５回等、反復してもよいことを意味する。いくつかの場合、これを任意の回数、例えば不確定にまたは無限に反復してもよい。
【０１３７】
培養中の細胞を、支持体またはフラスコから解離させ、そして組織培地内に希釈しそして再プレーティングすることによって、「分割する」か、継代培養するか、または継代し
てもよい。
【０１３８】
粒子上で増殖している細胞を、粒子培養に継代し直してもよい。あるいは、これらを慣用的な（２Ｄ）培養に継代し直してもよい。プレート上で増殖している組織培養細胞を粒子培養に継代し直してもよい。
【０１３９】
用語「継代」は、一般的に、細胞培養のアリコットを取り、細胞を完全にまたは部分的に解離させ、希釈し、そして培地に接種するプロセスを指してもよい。継代を１回以上反復してもよい。アリコットは、細胞培養のすべてまたは一部を含んでもよい。アリコットの細胞は、完全に集密、部分的に集密、または集密でなくてもよい。継代は、工程の以下の順列の少なくともいくつかを含んでもよい：吸引、リンス、トリプシン処理、インキュベーション、除去、急冷（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）、再植え付けおよびアリコット。カリフォルニア大学サンディエゴ校のＨｅｄｒｉｃｋ研究室によって公表されたプロトコルを用いてもよい（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｄｒｉｃｋｌａｂ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／Ｐｒｏｔｏｃｏｌ／ＣＯＳＣｅｌｌ．ｈｔｍｌ）。
【０１４０】
当該技術分野に知られる機械的または酵素的手段などの任意の適切な手段によって、細胞を解離させてもよい。機械的解離によって、例えば細胞スクレーパーまたはピペットを用いて、細胞を破壊してもよい。１００ミクロンまたは５００ミクロン篩を通じるなど、適切な篩サイズを通じて篩にかけることによって、細胞を解離させてもよい。酵素的解離によって、例えばコラゲナーゼまたはｔｒｙｐＬＥでの処理によって採取し、分割してもよい。解離は完全であってもまたは部分的であってもよい。
【０１４１】
希釈は任意の適切な希釈であってもよい。細胞培養中の細胞を任意の適切な比で分割してもよい。例えば、細胞を１：２以上、１：３以上、１：４以上または１：５以上の比で分割してもよい。したがって、幹細胞を１継代以上、継代してもよい。例えば、幹細胞を２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５継代以上、継代してもよい。継代を細胞増殖の世代として表してもよい。本発明者らの方法および組成物は、幹細胞が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５世代以上、増殖することを可能にする。
【０１４２】
また、継代を細胞倍加の回数として表してもよい。本発明者らの方法および組成物は、幹細胞が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５細胞倍加以上、増殖することを可能にする。
【０１４３】
幹細胞特性の維持
増殖した幹細胞は、霊長類またはヒト幹細胞の少なくとも１つの特性を維持しうる。幹細胞は、１回以上の継代後、該特性を維持しうる。幹細胞は、複数回の継代後、その特性を維持しうる。幹細胞は、上述のような言及する回数の継代後、該特性を維持しうる。
【０１４４】
特性は、形態学的特性、免疫組織化学的特性、分子生物学的特性等を含んでもよい。特性は、生物学的活性を含んでもよい。
幹細胞特性
本発明者らの方法によって増殖する幹細胞は、以下の幹細胞特性のいずれを示してもよい。
【０１４５】
幹細胞は、Ｏｃｔ４および／またはＳＳＥＡ−１および／またはＴＲＡ−１−６０の発現増加を示しうる。自己再生性である幹細胞は、自己再生性でない幹細胞に比較して短い細胞周期を示しうる。
【０１４６】
幹細胞は定義される形態を示しうる。例えば、標準的顕微鏡画像の二次元において、ヒト胚性幹細胞は、画像平面における高い核／細胞質比、顕著な仁、および細胞接合がほとんど認識不能な緊密なコロニー形成を示す。
【０１４７】
幹細胞はまた、以下にさらに詳細に記載するような、発現細胞マーカーによっても特徴付け可能である。
多能性マーカーの発現
維持される生物学的活性は、１以上の多能性マーカーの発現を含んでもよい。
【０１４８】
ステージ特異的胎児抗原（ＳＳＥＡ）は、特定の胚性細胞タイプに特徴的である。ＳＳＥＡマーカーに対する抗体は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ（メリーランド州ベセスダ）より入手可能である。他の有用なマーカーは、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１と称される抗体を用いて検出可能である（Ａｎｄｒｅｗｓら，  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒｓ，  Ｅ．  Ｊ．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  １９８７，  上記中）。ヒト胚性幹細胞は、典型的には、ＳＳＥＡ−１陰性およびＳＳＥＡ−４陽性である。ｈＥＧ細胞は、典型的には、ＳＳＥＡ−１陽性である。霊長類多能性幹細胞（ｐＰＳ）細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１発現の喪失、およびＳＳＥＡ−１発現増加を生じる。ｐＰＳ細胞はまた、アルカリホスファターゼ活性の存在によっても特徴付け可能であり、これは、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、そして次いで、製造者によって記載されるように、基質としてＶｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄで現像することによって検出可能である（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）。
【０１４９】
胚性幹細胞はまた、典型的には、テロメラーゼ陽性およびＯＣＴ−４陽性である。テロメラーゼ活性は、商業的に入手可能なキット（ＴＲＡＰｅｚｅ．ＲＴＭ．  ＸＫテロメラーゼ検出キット、カタログ番号ｓ７７０７；  Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏ．、ニューヨーク州パーチェス；またはＴｅｌｏＴＡＧＧＧ．ＴＭ．テロメラーゼＰＣＲ  ＥＬＩＳＡプラス、カタログ番号２，０１３，８９；  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  インディアナポリス）を用い、ＴＲＡＰ活性アッセイ（Ｋｉｍら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２０１１，  １９９７）を用いて決定可能である。また、ＲＴ−ＰＣＲによって、ｍＲＮＡレベルでｈＴＥＲＴ発現を評価してもよい。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＴｅｌｏＴＡＧＧＧＴＭ  ｈＴＥＲＴ定量化キット（カタログ番号３，０１２，３４４；  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）が、研究目的のため、商業的に入手可能である。
【０１５０】
ＦＯＸＤ３、ＰＯＤＸＬ、アルカリホスファターゼ、ＯＣＴ−４、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４等を含む、これらの多能性マーカーの任意の１以上が、増殖幹細胞によって保持されうる。
【０１５１】
マーカーの検出は、当該技術分野に知られる任意の手段を通じて、例えば免疫学的に達成可能である。組織化学染色、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、ウェスタンブロット、酵素連結イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）等が使用可能である。
【０１５２】
フロー免疫細胞化学を用いて、細胞表面マーカーを検出してもよい。細胞内または細胞表面マーカーに関して、免疫組織化学（例えば固定細胞または組織切片の）を用いてもよい。細胞抽出物に対してウェスタンブロット分析を行ってもよい。細胞抽出物または培地内に分泌される産物に関して、酵素連結イムノアッセイを用いてもよい。
【０１５３】
この目的のため、商業的供給源から入手可能であるような、多能性マーカーに対する抗体を用いてもよい。
ステージ特異的胎児抗原１および４（ＳＳＥＡ−１およびＳＳＥＡ−４）ならびに腫瘍拒絶抗原１−６０および１−８１（ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１）を含む幹細胞マーカーの同定のための抗体は、例えばＣｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ（米国カリフォルニア州テメキュラ）より得られうる。モノクローナル抗体を用いたこれらの抗原の免疫学的検出は、多能性幹細胞を特徴付けるために広く用いられてきている（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  Ｍ．Ｊ．ら（１９９８）  ＰＮＡＳ  ９５：１３７２６−１３７３１；  Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ  Ｍ．ら（２０００）．  ＰＮＡＳ  ９７：１１３０７−１１３１２；  Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｊ．Ａ．ら（１９９８）．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７；  Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  Ｂ．Ｅ．ら（２０００）．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３９９−４０４；  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ
Ｊ．Ｋ．ら（２００２）．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０：３２９−３３７；  Ｐｅｒａ  Ｍ．ら（２０００）．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１３：５−１０．）。
【０１５４】
組織特異的遺伝子産物の発現はまた、ノーザンブロット分析、ドットブロット分析によって、あるいは標準的増幅法において配列特異的プライマーを用いた逆転写酵素ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、ｍＲＮＡレベルで検出可能である。本開示に列挙する特定のマーカーに関する配列データは、ＧｅｎＢａｎｋ（ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｑｏｖ：８０／ｅｎｔｒｅｚ）などの公的データベースから得られうる。さらなる詳細に関しては、米国特許第５，８４３，７８０号を参照されたい。
【０１５５】
実質的にすべての増殖細胞、またはそのかなりの部分が、マーカー（単数または複数）を発現しうる。例えば、単数または複数のマーカーを発現する細胞の割合は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または実質的に１００％でありうる。
【０１５６】
細胞生存度
生物学的活性は、言及する回数の継代後の細胞生存度を含んでもよい。細胞生存度は、例えばトリパンブルー排除によるなど、多様な方式でアッセイされうる。生存染色のプロトコルは以下の通りである。適切な試験管に、適切な体積の細胞懸濁物（２０〜２００μＬ）および等体積の０．４％トリパンブルーを入れ、そして穏やかに混合し、室温で５分間放置する。１０μｌの染色細胞を血球計数板に入れ、そして生存（未染色）および死亡（染色）細胞の数を計数する。各象限の未染色細胞の平均数を計算し、そして２ｘ１０４を乗じて、細胞／ｍｌを見出す。生存細胞の割合は、生存細胞数を死亡細胞および生存細胞の数で割ったものである。
【０１５７】
細胞生存度は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または実質的に１００％でありうる。
【０１５８】
核型
増殖幹細胞は、増殖中または増殖後、正常な核型を保持しうる。「正常な」核型は、幹細胞が由来する親幹細胞の核型と同一であるか、類似であるかまたは実質的に類似である核型、あるいは親幹細胞と異なるが、いかなる実質的な方式でも異ならないものである。例えば、転位、染色体の喪失、欠失等のいかなる全体的な異常もあってはならない。
【０１５９】
核型は、いくつかの方法によって、例えば光学顕微鏡法のもとで視覚的に評価可能である。核型は、ＭｃＷｈｉｒら（２００６）、Ｈｅｗｉｔｔら（２００７）、ならびにＧａｌｌｉｍｏｒｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ（１９７３）に記載されるように、調製および分析可能である。また、標準的なＧバンド形成技術（カリフォルニア州オークランドのＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｌａｂなどの、ルーチンの核型決定サービスを提供する多くの臨床診断実験室で利用可能）を用いて細胞の核型を決定し、そして公表される幹細胞核型と比較してもよい。
【０１６０】
増殖細胞のすべてまたはかなりの部分が正常な核型を保持しうる。この比率は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または実質的に１００％でありうる。
【０１６１】
多能性
増殖幹細胞は、３つの細胞系譜すべて、すなわち内胚葉、外胚葉および中胚葉に分化する能力を保持しうる。幹細胞を誘導して、これらの細胞系譜の各々に分化させる方法が当該技術分野に知られ、そしてこれを用いて、増殖幹細胞の能力をアッセイしてもよい。増殖細胞のすべてのまたはかなりの部分がこの能力を保持しうる。これは、増殖幹細胞の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または実質的に１００％でありうる。
【０１６２】
生成される幹細胞の多能性は、適切なアッセイの使用によって決定可能である。こうしたアッセイは、多能性の１以上のマーカー、例えばＳＳＥＡ−１抗原、アルカリホスファターゼ活性、Ｏｃｔ−４遺伝子および／またはタンパク質発現を検出する工程を含んでもよいし、ＳＣＩＤマウスにおける奇形腫形成または胚様体形成の度合いを観察することによってもよい。Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＳＯＸ−２およびＧＣＴＭ−２などの１以上のマーカーの発現によって、ｈＥＳＣの多能性を定義してもよい。
【０１６３】
共培養およびフィーダー
方法は、共培養の存在下または非存在下で、幹細胞を培養する工程を含んでもよい。用語「共培養」は、一緒に増殖する２以上の異なる種類の細胞混合物、例えば間質フィーダー細胞の混合物を指す。２以上の異なる種類の細胞を、同じ表面上で、例えば粒子または細胞容器表面上で、または異なる表面上で、増殖させてもよい。異なる種類の細胞を異なる粒子上で増殖させてもよい。
【０１６４】
本文書で用いる場合、用語、フィーダー細胞は、異なるタイプの細胞の培養のために用いられるかまたは必要とされる細胞を意味する。幹細胞培養の状況において、フィーダー細胞は、生存、増殖、および細胞多能性の維持を確実にする機能を有する。細胞多能性は、フィーダー細胞を直接共培養することによって達成されうる。あるいは、またはさらに、フィーダー細胞を培地中で培養して、培地を馴化させてもよい。馴化培地を用いて、幹細胞を培養してもよい。
【０１６５】
培養ディッシュなどの容器の内表面を、分裂しないように処理してあるマウス胚性皮膚細胞のフィーダー層でコーティングしてもよい。フィーダー細胞は、ＥＳ細胞増殖に必要な栄養分を培地内に放出する。したがって、粒子上で増殖する幹細胞は、こうしたコーティングされた容器中で増殖可能である。
【０１６６】
フィーダー細胞が存在しないか、または必要とされない設定もまた可能である。例えば、フィーダー細胞または幹細胞によって馴化された培地中で細胞を増殖させてもよい。
培地およびフィーダー細胞
多能性幹細胞を単離しそして増殖させるための培地は、得られる細胞が望ましい特性を有し、そしてさらに増殖可能である限り、いくつかの異なる配合のいずれを有してもよい。
【０１６７】
適切な供給源は以下の通りである：Ｄｕｌｂｅｃｃｏの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２；ノックアウトＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾イーグル培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２９−０１８；  ２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ＃１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ  １１１４０−０５０；ベータ−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ＃Ｍ７５２２；ヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ＃１３２５６−０２９。例示的な血清含有胚性幹（ＥＳ）培地は、８０％  ＤＭＥＭ（典型的にはＫＯ  ＤＭＥＭ）、熱不活化されていない２０％定義ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭベータ−メルカプトエタノールで作製される。培地をろ過し、そして４℃で２週間以内、保存する。血清不含胚性幹（ＥＳ）培地は、８０％  ＫＯ  ＤＭＥＭ、２０％血清代用品（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭベータ−メルカプトエタノールで作製される。有効な血清代用品は、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２８−０２８である。培地をろ過し、そして４℃で２週間以内、保存する。使用直前、ヒトｂＦＧＦを最終濃度４ｎｇ／ｍＬまで添加する（Ｂｏｄｎａｒら、Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐ、国際特許公報ＷＯ  ９９／２０７４１）。
【０１６８】
培地は、１０％血清置換培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）、５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）および５ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ  ＡＢ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ロッキーヒル）を補充したノックアウトＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）を含んでもよい。
【０１６９】
フィーダー細胞（用いる場合）は、９０％  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２）、１０％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ＃３００７１−０３）、および２ｍＭグルタミンを含有するｍＥＦ培地中で増殖可能である。ｍＥＦをＴ１５０フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃４３０８２５）中で増殖させ、トリプシンを用いて、１日おきに１：２で細胞を分割し、細胞を集密以下に維持する。フィーダー細胞層を調製するため、増殖を阻害するが、ヒト胚性幹細胞を支持する、重要な因子の合成を可能にする線量（約４０００ｒａｄガンマ照射）で、細胞を照射する。６ウェル培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ＃３０４など）を、ウェルあたり１ｍＬの０．５％ゼラチンと、３７℃で一晩インキュベーションすることによってコーティングし、そしてウェルあたり３７５，０００の照射ｍＥＦをプレーティング
する。フィーダー細胞層は、典型的には、プレーティング５時間後〜４日後に用いられる。
【０１７０】
他の幹細胞を培養するための条件が知られ、そして細胞タイプに応じて、適切に最適化可能である。先のセクションに言及される特定の細胞タイプのための培地および培養技術は、引用する参考文献中に提供される。
【０１７１】
血清不含培地
本明細書に記載する方法および組成物には、血清不含培地中の幹細胞の培養が含まれてもよい。
【０１７２】
用語「血清不含培地」は、血清タンパク質、例えばウシ胎児血清を含まない細胞培地を含んでもよい。血清不含培地は、当該技術分野に知られ、そして例えば、米国特許５，６３１，１５９および５，６６１，０３４に記載される。血清不含培地は、例えば、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から商業的に入手可能である。
【０１７３】
血清不含培地は、タンパク質、加水分解物、および未知の組成の構成要素を欠いていてもよいという点で、タンパク質不含であってもよい。血清不含培地は、すべての構成要素が既知の化学構造を有する、化学的に定義された培地を含んでもよい。化学的に定義される血清不含培地は、変動を排除し、そして改善された再現性およびより一貫した性能を可能にし、そして不定の剤による混入の可能性を減少させる、完全に定義された系を提供するため、好適である。
【０１７４】
血清不含培地は、ノックアウトＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）を含んでもよい。
血清不含培地に、例えば５％、１０％、１５％等の濃度で、血清置換培地などの１以上の構成要素を補充してもよい。血清不含培地に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ（ニューヨーク州グランドアイランド）の血清置換培地を１０％補充してもよい。
【０１７５】
解離または脱凝集された胚性幹細胞を培養する血清不含培地は、１以上の増殖因子を含んでもよい。ＦＧＦ２、ＩＧＦ−２、ノギン、アクチビンＡ、ＴＧＦベータ１、ＨＲＧ１ベータ、ＬＩＦ、Ｓ１Ｐ、ＰＤＧＦ、ＢＡＦＦ、Ａｐｒｉｌ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、Ｗｎｔ３Ａおよびその他を含む、いくつかの増殖因子が当該技術分野に知られる。増殖因子（単数または複数）を、１ｐｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌの間などの任意の適切な濃度で用いてもよい。
【０１７６】
培地補充物
培地に１以上の添加物を補充してもよい。例えばこれらは：脂質混合物、ウシ血清アルブミン（例えば０．１％  ＢＳＡ）、大豆タンパク質の加水分解物の１以上から選択可能である。
【０１７７】
人工多能性幹細胞の供給源
現在、胚の破壊につながらない、例えば成体体細胞または生殖細胞の形質転換（誘導）による、多能性幹細胞の単離のためのいくつかの方法が提供されてきている。これらの方法には、以下が含まれる：
１．核トランスファーによる再プログラミング。この技術は、体細胞から卵母細胞または接合子内への核のトランスファーを伴う。いくつかの状況において、これは、動物−ヒト・ハイブリッド細胞の生成を導きうる。例えば、ヒト体細胞と動物卵母細胞または接合子の融合、あるいはヒト卵母細胞または接合子と動物体細胞の融合によって、細胞を生成することも可能である。
【０１７８】
２．胚性幹細胞との融合による再プログラミング。この技術は、体細胞と胚性幹細胞の融合を伴う。この技術はまた、上記１におけるように、動物−ヒト・ハイブリッド細胞の生成を導きうる。
【０１７９】
３．培養による自発的再プログラミング。この技術は、長期培養後の非多能性細胞からの多能性細胞の生成を伴う。例えば、始原生殖細胞（ＰＧＣ）の長期培養によって、多能性胚性生殖（ＥＧ）細胞が生成されてきている（本明細書に援用される、Ｍａｔｓｕｉら，  Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｇｅｒｍ  
ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｃｅｌｌ  ７０，  ８４１−８４７，  １９９２）。骨髄由来細胞の長期培養後の多能性幹細胞の発生もまた報告されてきている（本明細書に援用される、Ｊｉａｎｇら，  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ  ｍａｒｒｏｗ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１８，  ４１−４９，  ２００２）。Ｊｉａｎｇらは、これらの細胞を多分化能成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）と称した。Ｓｈｉｎｏｈａｒａらもまた、新生マウス精巣由来の生殖系列幹（ＧＳ）細胞の培養経過中に多能性幹細胞が生成可能であることを示し、これを多分化能生殖系列幹（ｍＧＳ）細胞と称した（Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａら，  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｔｅｓｔｉｓ．  Ｃｅｌｌ  １１９，  １００１−１０１２，  ２００４）。
【０１８０】
４．定義される因子による再プログラミング。例えば、レトロウイルスが仲介する、例えば上述のようなマウス胚性または成体線維芽細胞内への転写因子（例えばＯｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫＬＦ４）の導入による、ｉＰＳ細胞の生成。Ｋａｊｉら（Ｖｉｒｕｓ−ｆｒｅｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ
ｆａｃｔｏｒｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  Ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  １  Ｍａｒｃｈ  ２００９）はまた、２Ａペプチドと連結されたｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２のコード配列を含む、単一多タンパク質発現ベクターの非ウイルストランスフェクションを記載し、これは、マウスおよびヒト線維芽細胞をどちらも再プログラミング可能であった。この非ウイルスベクターで産生されたｉＰＳ細胞は、多能性マーカーの頑強な発現を示し、再プログラミング状態が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化アッセイおよび成体キメラマウスの形成によって、機能的に確認されることを示した。Ｋａｊｉらは、胚性線維芽細胞から、多能性マーカーを頑強に発現する再プログラミングヒト細胞株を確立するのに成功した。
【０１８１】
方法１〜４は、本明細書に援用される、山中伸弥による、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １，  Ｊｕｌｙ  ２００７ａ２００７  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｉｎｃ）に記載され、そして論じられる。
【０１８２】
５．単一卵割球または生検卵割球由来のｈＥＳＣ株の誘導。すべて本明細書に援用される、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ，  Ｃｈｕｎｇ  Ｙ，  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓ，  Ｌｕ  ＳＪ，  Ｌａｎｚａ  Ｒ．  Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００６；  ４４４：５１２、Ｌｅｉら  Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ，  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００７）１７：６８２−６８８、Ｃｈｕｎｇ  Ｙ，  Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ，  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓら  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｕｓｅ  ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００６；４３９：２１６−２１９．  Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ，  Ｃｈｕｎｇ  Ｙ，  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓら  Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ．
Ｎａｔｕｒｅ．  ２００６；４４４：４８１−４８５．  Ｃｈｕｎｇ  Ｙ，  Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ，  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓら  Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｍｂｒｙｏ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ２００８；２：１１３−１１７およびＤｕｓｋｏ  Ｉｌｉｃら（Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｉｏｐｓｉｅｄ  ｂｌａｓ
ｔｏｍｅｒｅｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｅｄｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ｘｅｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ−公表前の論文）を参照されたい。
【０１８３】
６．  ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、卵割を停止し、そして桑実胚および胚盤胞まで発生するのに失敗した停止胚から得られるｈＥＳＣ株。どちらも本明細書に援用される、Ｚｈａｎｇ
Ｘ，  Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃ  Ｐ，  Ｐｒｚｙｂｏｒｓｋｉ  Ｓら  Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ａｎｄ  ａｒｒｅｓｔｅｄ  ｅｍｂｒｙｏｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ
２００６；２４：２６６９−２６７６およびＬｅｉら  Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ，  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００７）１７：６８２−６８８を参照されたい。
【０１８４】
７．単為生殖。この技術は、未受精卵を化学的または電気的に刺激して、胚性幹細胞を得られうる桑実胚に発生させる工程を伴う。例えば、幹細胞を産生するために未受精中期ＩＩ卵母細胞の化学的活性化を使用した、Ｌｉｎら  Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｅｔａｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｏｏｃｙｔｅｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ２００３；２１（２）：１５２−６１を参照されたい。
【０１８５】
８．胎児起源の幹細胞。これらの細胞は、多能性の観点からは胚性および成体幹細胞の間に位置し、そしてこれを用いて、多能性または多分化能細胞を得ることも可能である。多能性マーカー（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｒｅｘ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１、β−ガラクトシダーゼ染色によって示されるような老化の証拠が最小限であること、およびテロメラーゼ活性の一貫した発現を含む）を発現するヒト臍帯由来胎児間質幹細胞（ＵＣ  ｆＭＳＣｓ）が、Ｃｈｒｉｓ  Ｈ．  Ｊｏら（本明細書に援用される、Ｆｅｔａｌ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｓｕｓｔａｉｎ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ（２００８）３３４：４２３−４３３）によって成功裡に得られている。Ｗｉｎｓｔｏｎ  Ｃｏｓｔａ  Ｐｅｒｅｉｒａら（本明細書に援用される、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ
ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｊ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ  ２００８；２：３９４−３９９）は、ヒト臍帯のＷｈａｒｔｏｎゼリーから、間葉幹細胞の純粋な集団を単離した。Ｗｈａｒｔｏｎゼリー由来の間葉幹細胞はまた、Ｔｒｏｙｅｒ  ＆  Ｗｅｉｓｓ（Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｒｅｖｉｅｗ：  Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ  Ｊｅｌｌｙ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｒｅ  ａ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００８：２６：５９１−５９９）にも概説されている。Ｋｉｍら（本明細書に援用される、Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ
ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００７  Ｗｉｎｔｅｒ；９（４）：５８１−９４）は、ヒト羊膜からヒト羊膜由来間葉細胞を単離することに成功した。臍帯は、通常廃棄される組織であり、そしてこの組織由来の幹細胞は、道徳的または倫理的な反対を招かない傾向がある。
【０１８６】
人工多能性幹細胞は、これらが胚の破壊を引き起こさない方法によって、より具体的には、ヒトまたは哺乳動物胚の破壊を引き起こさない方法によって得られうるという利点を有する。こうしたものとして、こうした細胞が得られうるヒトまたは動物胚の破壊を必然的に伴う方法のみによって調製されたのではない細胞を用いることによって、本発明の側
面を行うかまたは実施してもよい。この場合による限定は、欧州特許庁拡大審判廷の２００８年１１月２５日の決定Ｇ０００２／０６を考慮に入れることが特に意図される。
【０１８７】
未分化細胞の分化
ＩＰＳＣを誘導して、多様な異なる細胞タイプに分化させることも可能である。例えばＩＰＳＣを誘導して、心臓細胞（心筋細胞）、肝細胞、神経細胞、軟骨（軟骨細胞）、筋肉、脂肪（脂肪細胞）、骨（骨細胞）または他の細胞に分化させることも可能である。ＩＰＳＣを誘導して、上皮組織、中胚葉、内胚葉、外胚葉または表皮などの組織を形成することも可能である。
【０１８８】
幹細胞を分化させる方法は当該技術分野に知られ、そして例えば、Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ（２０００）およびＧｒａｉｃｈｅｎら（２００７）に記載され、そしてＩＰＳＣでこれらを用いてもよい。また、胚様体を形成するために培養幹細胞を用いてもよい。胚様体および胚様体を作製するための方法が当該技術分野に知られる。用語「胚様体」は、懸濁中で胚性幹細胞を増殖させることによって産生可能な、培養中に見られる球状コロニーを指す。胚様体は、混合細胞タイプのものであり、そして特定の細胞タイプの分布および出現タイミングは、胚内で観察されるものに対応する。半固形培地などの培地上に胚性幹細胞をプレーティングすることによって、胚様体を生成することも可能である。Ｌｉｍら，  Ｂｌｏｏｄ．  １９９７；９０：１２９１−１２９９に記載されるように、メチルセルロース培地を用いてもよい。
【０１８９】
例えばＩｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ（２０００）に記載される方法を用いて、胚性幹細胞を誘導して胚様体を形成してもよい。胚様体は、３つの胚性胚葉すべて（内胚葉、外胚葉、中胚葉）の細胞を含有する。
【０１９０】
例えば適切な誘導因子または環境変化への曝露によって、胚様体をさらに誘導して、異なる細胞系譜に分化させることも可能である。Ｇｒａｉｃｈｅｎら（２００７）は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路の操作によって、ヒト胚性幹細胞からの心筋細胞の形成を記載する。Ｇｒａｉｃｈｅｎは、１０μｍ未満のＳＢ２０３５８０などのｐ３８  ＭＡＰキナーゼの特異的阻害剤に曝露することによって、幹細胞から心筋細胞形成が誘導されることを示す。
【０１９１】
当該技術分野に知られるような、再生療法および細胞移植などの、任意の適切な目的のために、分化細胞を使用してもよい。
療法使用
本発明の方法によって同定されそして／または単離される分化および未分化ＩＰＳＣは、医学において、例えば細胞療法において、多様な使用を有する。細胞療法は、個々の細胞の集団として、あるいは細胞凝集物または組織の形で、ならびに／あるいは再生療法、例えば組織再生、置換および／または修復のいずれでもよい、細胞の移入または移植を含んでもよい。分化および未分化ＩＰＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養で拡大して、そして患者に直接投与してもよい。外傷後の損傷組織の再増殖および／または修復のために、これらを用いてもよい。
【０１９２】
ＩＰＳＣを、再生療法のため直接用いてもよいし、あるいはこれを用いて外胚葉、中胚葉または内胚葉前駆細胞集団を生成してもよい。ｅｘ  ｖｉｖｏ拡大によって前駆細胞を作製してもよいし、または患者に直接投与してもよい。また、外傷後の損傷組織の再増殖および／または修復のために、これらを用いてもよい。
【０１９３】
したがって、骨髄置換のために造血前駆細胞を用いてもよいし、一方、心臓不全患者のために心臓前駆細胞を用いてもよい。患者のための皮膚移植片を増殖させるために皮膚前駆細胞を使用してもよく、そしてステントまたは人工心臓などの人工装具の内皮化（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｚａｔｉｏｎ）のために内皮前駆細胞を使用してもよい。
【０１９４】
糖尿病、ハンチントン病、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの変性疾患の治療のために、外胚葉、中胚葉または内胚葉前駆細胞の供給源として、ＩＰＳＣを用いてもよい。癌の免疫療法のために、ＮＫまたは樹状細胞の中胚葉または内胚葉前駆体の供給源として、ＩＰＳＣを用いてもよい。
【０１９５】
本明細書記載の方法および組成物は、外胚葉、中胚葉または内胚葉前駆細胞の産生を可
能にし、もちろん、当該技術分野に知られる方法を用いて、これらを最終分化細胞タイプにさらに分化させることも可能である。したがって、供給源である内胚葉、中胚葉または外胚葉前駆細胞（または幹細胞）には、最終分化細胞のいかなる使用も等しく伴うであろう。
【０１９６】
本明細書記載の方法および組成物によって産生されるＩＰＳＣ、外胚葉、中胚葉または内胚葉前駆細胞および分化細胞は、疾患の治療のため、または疾患の治療のための薬学的組成物の調製のために使用可能である。こうした疾患は、再生療法によって治療可能な疾患を含んでもよく、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病および癌などの変性疾患が含まれる。
【０１９７】
本明細書記載の方法および組成物にしたがって増殖する幹細胞（および該幹細胞から得られる分化細胞）を、療法、例えば必要がある個々の患者における組織再構成または再生に用いてもよい。細胞が意図される組織部位に移植され、そして機能的に欠陥がある領域を再構成するかまたは再生するのを可能にする方式で、細胞を投与してもよい。
【０１９８】
増殖幹細胞または該幹細胞から得られる分化細胞を、組織操作のため、例えば皮膚移植片の増殖のため、用いてもよい。人工臓器または組織のバイオエンジニアリングのため、あるいはステントなどの装具のため、これらを用いてもよい。また、その必要があるヒト患者における組織再構成または再生のため、分化細胞を用いてもよい。細胞が意図される組織部位に移植され、そして機能的に欠陥がある領域を再構成するかまたは再生するのを可能にする方式で、細胞を投与してもよい。
【０１９９】
例えば、本明細書記載の方法および組成物を用いて、幹細胞の分化を調節してもよい。分化細胞を組織操作のため、例えば皮膚移植片の増殖のため、用いてもよい。人工臓器または組織のバイオエンジニアリングのため、あるいはステントなどの装具のため、幹細胞分化の調節を用いてもよい。
【０２００】
別の例において、治療中の疾患に応じて、中枢神経系の実質部位またはクモ膜下腔内部位に、神経幹細胞を直接移植する。μＬあたり２５，０００〜５００，０００細胞の密度で単細胞懸濁物または小凝集塊を用いて、移植を行う（米国特許第５，９６８，８２９号）。ＭｃＤｏｎａｌｄら（Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ５：１４１０，  １９９９）によって記載されるように、急性脊髄傷害のラットモデルにおいて、神経細胞移植の有効性を評価してもよい。成功した移植は、２〜５週間後に、病変中に移植片由来細胞が存在し、アストロサイト、オリゴデンドロサイトおよび／またはニューロンに分化し、そして病変端から脊髄に沿って移動し、そしてゲート、協調および荷重付加が改善していることを示すであろう。
【０２０１】
神経系に対する急性または慢性損傷の治療のため、特定の神経前駆細胞を設計する。例えば、癲癇、脳卒中、虚血、ハンチントン病、パーキンソン病およびアルツハイマー病を含む多様な状態において、興奮毒性が関連付けられてきている。本明細書に記載する方法にしたがって作製するような特定の分化細胞はまた、ペリツェウス・メルツバッヘル病、多発性硬化症、白質ジストロフィー、神経炎および神経疾患などのミエリン形成不全障害（ｄｙｓｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）を治療するのにもまた適切でありうる。これらの目的に適しているのは、再ミエリン形成を促進する、オリゴデンドロサイトまたはオリゴデンドロサイト前駆体が濃縮された細胞培養である。
【０２０２】
本発明者らの方法を用いて調製した肝細胞および肝細胞前駆体が肝臓損傷を修復する能力に関して、動物モデルにおいて評価してもよい。１つのこうした例は、Ｄ−ガラクトサミンの腹腔内注射によって引き起こされる損傷である（Ｄａｂｅｖａら，  Ａｍ．  Ｊ．
Ｐａｔｈｏｌ．  １４３：１６０６，  １９９３）。肝臓細胞マーカーに関する免疫組織化学染色、増殖中の組織において毛細胆管構造が形成されるかどうかの微視的決定、および治療が肝臓特異的タンパク質の合成を回復する能力によって、治療有効性を決定してもよい。直接投与によって、または被験体の肝臓組織が、劇症肝不全後に再生する間、一時的な肝機能を提供する生体補助（ｂｉｏａｓｓｉｓｔ）デバイスの一部として、療法において肝細胞を用いてもよい。
【０２０３】
例えば、Ｇｒａｉｃｈｅｎら（２００７）に記載されるような、特異的ｐ３８  ＭＡＰ
キナーゼ阻害剤であるＳＢ２０３５８０を用いて、ＭＰＡキナーゼ経路を調節することにより、幹細胞の分化を誘導することによって、心筋細胞を調製してもよい。治療を伴わないと左心室壁組織の５５％を瘢痕組織にする、心臓凍結傷害（ｃｒｙｏｉｎｊｕｒｙ）の動物モデルにおいて、こうした心筋細胞の有効性を評価してもよい（Ｌｉら，  Ａｎｎ．
Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．  ６２：６５４，  １９９６；  Ｓａｋａｉら，  Ａｎｎ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．  ８：２０７４，  １９９９、  Ｓａｋａｉら，  Ｊ．
Ｔｈｏｒａｃ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｓｕｒｇ．  １１８：７１５，  １９９９）。治療が成功すると、瘢痕面積が減少し、瘢痕拡大が限定され、そして収縮期圧、拡張期圧、および最大圧によって決定されるように、心臓機能が改善されるであろう。また、左前下行枝の遠位部分において塞栓コイルを用いて、心臓傷害をモデリングしてもよく（Ｗａｔａｎａｂｅら，  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ７：２３９，  １９９８）、そして組織学および心臓機能によって、治療有効性を評価してもよい。療法において、心筋細胞調製物を用いて、心筋を再生し、そして不十分な心臓機能を治療してもよい（米国特許第５，９１９，４４９号およびＷＯ  ９９／０３９７３）。
【０２０４】
ＩＰＳＣが多様な細胞タイプに分化するように導き、そして置換細胞および組織の再生可能供給源が、ある範囲の疾患および障害を治療する可能性を提供することも可能である。これらの疾患および障害には、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄傷害、骨傷害（例えば骨折）、脳卒中、火傷、心臓疾患、糖尿病、骨関節炎、および関節リウマチが含まれる。移植可能組織および臓器を必要とする疾患および障害が治療可能であり、そして特に例えば奇形腫の形成を防止するために、移植前に未分化細胞を破壊することが有用である場合にあてはまる。
【０２０５】
本発明は、本発明の方法のいずれかによって単離された未分化人工多能性幹細胞および分化人工多能性幹細胞を含んでもよい、薬剤および薬学的組成物を提供する。該薬剤および薬学的組成物は、上述のような医学的治療法で使用するため、提供可能である。適切な薬学的組成物は、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤をさらに含んでもよい。
【０２０６】
したがって、本発明はまた、本発明の方法を用いて、未分化ＩＰＳＣを破壊するように処理されている細胞を含む、薬学的組成物および薬剤も提供する。
ＰＯＤＸＬの細胞表面発現を通じて、未分化人工多能性幹細胞を同定し、そして選択する能力によって、未分化人工多能性幹細胞を含有し、そして分化人工多能性幹細胞を実質的に含有しないか、あるいは分化人工多能性幹細胞を含有し、そして未分化人工多能性幹細胞を実質的に含有しない、組成物および薬剤の提供が可能になる。用語「実質的に含まない」には、明記する細胞の数が、組成物中の細胞総数の約１０％未満である組成物が含まれる。より好ましくは、これは約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満である。いくつかの態様において、明記する細胞は存在しないか、または検出限界を超えるような十分に低い量でしか存在しなくてもよく、すなわち組成物は、明記する細胞を実質的に０パーセント有する。
【０２０７】
本発明記載の方法によって単離される分化および未分化人工多能性幹細胞を、医学的治療法において用いてもよい。医学的治療法は、治療の必要がある個体に、療法的に有効な量の前記薬剤または薬学的組成物を投与する工程を含んでもよい。
【０２０８】
本発明にしたがった方法および技術を通じて得られる分化および未分化人工多能性幹細胞を用いて、医学的治療法で使用するための別の細胞タイプに分化させてもよい。したがって、分化した細胞タイプは、記載する方法および技術によって得られ、続いて分化することが可能にされた幹細胞に由来してもよいし、そしてその産物と見なされてもよい。場合によって、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤とともに、こうした分化細胞を含む薬学的組成物を提供してもよい。こうした薬学的組成物は、医学的治療法において有用でありうる。
【０２０９】
治療しようとする被験体は、任意の動物またはヒトであってもよい。被験体は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。被験体は男性（雄）または女性（雌）であっ
てもよい。被験体は患者であってもよい。療法的使用は、ヒトまたは動物（獣医学的使用）におけるものであってもよい。
【０２１０】
本発明の側面にしたがった薬剤および薬学的組成物を、限定されるわけではないが、非経口、静脈内、動脈内、筋内、腫瘍内、経口および鼻を含む、いくつかの経路による投与のために配合してもよい。薬剤および組成物を注射用に配合してもよい。
【０２１１】
投与は、好ましくは、「療法的に有効な量」であり、これは、個体に対して利益を示すのに十分な量である。投与する実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療される疾患の性質および重症度に応じるであろう。治療の指示、例えば投薬量に関する決定等は、開業医および他の医師の責任の範囲内であり、そして典型的には、治療される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与法、および医師に知られる他の要因が考慮されるであろう。上述の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第２０版，  ２０００，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ刊行に見出されうる。
【０２１２】
薬学的に有用な組成物および薬剤の配合
本発明にしたがって、こうして同定される単数または複数の細胞に基づいてもよい、薬学的に有用な組成物を産生するための方法もまた提供する。本明細書に記載する方法の工程に加えて、こうした産生法は：
（ａ）単数または複数の未分化または分化人工多能性幹細胞を同定する工程；
（ｂ）単数または複数の未分化または分化人工多能性幹細胞を単離しそして／または得る工程；
（ｃ）単数または複数の未分化または分化人工多能性幹細胞と、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤を混合する工程
より選択される１以上の工程をさらに含んでもよい。
【０２１３】
工程（ｃ）は、好ましくは、療法的使用に適した薬学的組成物または薬剤の配合／調製を生じる。
配列同一性
配列同一性パーセント（％）は、配列を整列させ、そして最大配列同一性を達成するために、必要であればギャップを導入した後、そしていかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なさずに、所定の列挙する配列（配列番号によって言及する)中の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義される。配列同一性は、好ましくは、各配列の全長に渡って計算される。
【０２１４】
整列させる配列が異なる長さである場合、より短い比較配列の配列同一性を、より長い所定の配列の全長に渡って決定してもよいし、または比較配列が所定の配列より長い場合、比較配列の配列同一性を、より短い所定の配列の全長に渡って決定してもよい。
【０２１５】
アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための整列を、当業者に知られる多様な方式で達成してもよく、例えば公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ  １．８２．  Ｔ−ｃｏｆｆｅｅまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いてもよい。こうしたソフトウェアを用いる場合、好ましくは、デフォルトパラメーター、例えばギャップペナルティおよび伸長ペナルティに関するものを用いる。ＣｌｕｓｔａｌＷ  １．８２のデフォルトパラメーターは：タンパク質ギャップ・オープンペナルティ＝１０．０、タンパク質ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、タンパク質マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ、タンパク質／ＤＮＡ  ＥＮＤＧＡＰ＝−１、タンパク質／ＤＮＡ  ＧＡＰＤＩＳＴ＝４である。
【０２１６】
本発明には、記載する側面および好ましい特徴の組み合わせが含まれるが、こうした組み合わせが明らかに許容されえないかまたは明らかに回避される場合を除く。
本明細書に用いるセクション見出しは、構成上の目的のみのためであり、そして記載する主題を限定するとは意図されないものとする。
【０２１７】
例えば、付随する図に言及して、本発明の側面および態様がここで例示される。さらなる側面および態様が当業者には明らかであろう。本明細書に言及するすべての文書は、本明細書に援用される。
【０２１８】
発明の詳細な説明
例として、本発明を実施するために本発明者らに意図される最適な様式の特定の詳細を含めて、本発明の１以上の態様の詳細を、以下の付随する説明に示す。当業者には、これらの特定の詳細に限定されることなく、本発明を実施可能であることが明らかであろう。
【０２１９】
ｈＥＳＣ同様、分化人工多能性幹細胞の将来の療法的適用は、残ったＩＰＳＣが混入することによって、奇形腫形成のリスクを負う。こうした問題にも関わらず、現在、これらの細胞集団を分離するように開発された戦略はそれほど多くはない。ｍＡｂは、抗原上の単一エピトープを特異的にターゲティングする抗体の均質な集団である。したがって、本出願のｍＡｂは、潜在的に、特定の細胞系譜に分化する単数または複数の未分化細胞を特徴付ける抗原のレパートリーを示す生存細胞サブセットを精製するかまたは除去するのに使用可能である。
【０２２０】
ｍＡｂ８４を用いて、分化後に、そして分化細胞の機能を試験する動物移植試験前に、残った人工多能性幹細胞を除去してもよい。
ｍＡｂ８４（ＷＯ２００７／１０２７８７に記載されるような他のｍＡｂと組み合わせて）は、残ったｈＥＳＣまたは人工多能性幹細胞を除去して、したがって再生医学適用において移植片の成功および安全性を増加させるために、潜在的に、移植前に使用可能である。
【実施例】
【０２２１】
実施例１
材料および方法
細胞培養
ヒト胚性幹細胞株ＨＥＳ−３をＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから得た。マウスフィーダー由来の馴化培地、ΔＥ−ＭＥＦを補充したｍａｔｒｉｇｅｌコーティング臓器培養ディッシュ上で、３７℃／５％ＣＯ２で、細胞を培養した（フィーダー不含培養）。ｈＥＳＣを培養するのに用いた培地は、ノックアウト（ＫＯ）培地であった。フィーダー不含培養のため、先に記載されるように４、酵素処理後に、ｈＥＳＣを継代した。
【０２２２】
ヒト人工多能性幹細胞株、ＥＳ４ＳＫＩＮおよびＥＳＩＭＲ９０をウィスコンシン大学から得て、そして先に記載されるように４培養した。ヒト包皮線維芽細胞株、ＢＪ１（ＣＲＬ−２５２２）および肺線維芽細胞株、ＩＭＲ９０（ＣＣＬ−１８６）をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入し、そして供給者の指示にしたがって培養した。
【０２２３】
フローサイトメトリー分析
トリプシンを用いて、単細胞懸濁物として細胞を採取し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、１０μｌ体積あたり２ｘ１０５細胞に再懸濁し、そして各ｍＡｂクローン（２００μｌ  １％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、５〜１０μｇの精製ｍＡｂ）またはＴＲＡ−１−６０（２００μｌ  １％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、２．５μｇ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＭＡＢ４３６０／４３８１）と４５分間インキュベーションした。次いで、細胞を冷たい１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、そして１：５００希釈のＦＩＴＣ−コンジュゲート化ヤギα−マウス抗体（ＤＡＫＯ）と１５分間さらにインキュベーションした。インキュベーション後、細胞を再び洗浄し、そしてＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ）上で分析するため、１％ＢＳＡ／ＰＢＳおよび１．２５ｍｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（ＰＩ）中に再懸濁した。別に示さない限り、すべてのインキュベーションを４℃で行った。陰性対照として、適切なアイソタイプ対照で細胞を染色した。
【０２２４】
Ｏｃｔ−４染色のため、単細胞懸濁物を固定し、透過処理し（Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、そして１：２０希釈のＯｃｔ−４に対するマウスｍＡｂ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−５２７９）とインキュベーションした。次いで、細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、そして１：５００希釈のＦＩＴＣ−コンジュゲート化ヤギα−マウス抗体（ＤＡＫＯ）と１５分間さらにインキュベーションした。インキュベーション後、細胞を再び洗浄し、そして分析のため、１％ＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁した。すべてのインキ
ュベーションを室温で１５分間行った。陰性対照として、適切なアイソタイプ対照で細胞を染色した。
【０２２５】
細胞毒性アッセイ
ＰＩ排除アッセイおよびフローサイトメトリーを用いて、細胞に対するｍＡｂ８４の細胞毒性を評価した。上述のように、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、１０μｌ体積あたり２ｘ１０５細胞の単細胞懸濁物をｍＡｂ８４（２００μｌ  １％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、５μｇの精製ｍＡｂ）と４５分間インキュベーションした。その後、細胞を洗浄し、そしてＦＡＣＳによって分析するため、１％ＢＳＡ／ＰＢＳおよび１．２５ｍｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（ＰＩ）中に再懸濁した。陰性対照として、一次抗体を含まずに細胞をインキュベーションした。別に示さない限り、すべてのインキュベーションを４℃で行った。
【０２２６】
結果
ｈＥＳＣ、ＩＰＳＣおよび線維芽細胞株とのｍＡｂの反応性
最初の例において、多能性マーカーＯｃｔ−４およびＴｒａ−１−６０の発現に関してすべての細胞株を試験した（それぞれ、図１ａおよびｂ）。予期されるように、ｈＥＳＣおよびＩＰＳＣのみが両方のマーカーを発現する一方、どちらの線維芽細胞株においても、発現は有意に下方制御された。
【０２２７】
続いて、ｈＥＳＣに対する９つの自社ｍＡｂの一団を、５つの細胞株に対する結合に関してスクリーニングした（図２〜６）。ｈＥＳＣ同様、９つのｍＡｂすべてが、ｈＥＳＣおよびＩＰＳＣに結合することが見出された。ＥＳ４ＳＫＩＮおよびＥＳＩＭＲ９０は、それぞれ、包皮および肺由来の初代線維芽細胞から再プログラミングされているため、これらの初代細胞株をスクリーニングに採用して、「再プログラミングされた」細胞株にのみ結合し、そして親線維芽細胞株に結合しない抗体を同定した。スクリーニング結果に基づけば、ｍＡｂクローンのうち７つが、初代線維芽細胞に結合しない。しかし、ｍＡｂ５およびｍＡｂ６３に関しては、反応性が観察された。この結果は、ｈＥＳＣでの先の観察と一致する１。この結果によって、これらの２つのｍＡｂクローンに関する抗原ターゲットの発現は、すべてのヒト細胞で保存される可能性もあり、そして特にｍＡｂ５に関しては、ｈＥＳＣまたはＩＰＳＣに比較して、最終分化線維芽細胞において上方制御されうることが示唆される。
【０２２８】
細胞毒性抗体ｍＡｂ８４の特徴付け
ｍＡｂ８４がｈＥＳＣに類似のＩＰＳＣを殺すかどうかを調べるため、細胞をｍＡｂ８４とインキュベーションし、そしてＰＩ排除アッセイを用いて、細胞毒性を評価した。対照に比較して、ｍＡｂ８４（４℃で４５分間）とインキュベーションした後に、ｈＥＳＣ、ＥＳ４ＳＫＩＮおよびＥＳＩＭＲ９０細胞のそれぞれ２．５、７．６および６．４％が生存したままであることが見出された（図７および８）。対照的に、ＢＪ１およびＩＭＲ９０線維芽細胞株に関しては、生存度は１００％のままであった。ｍＡｂ８４に関する結合および細胞毒性データを総合すると（図６〜９）、ｍＡｂ８４は、ｈＥＳＣおよびＩＰＳＣの両方に結合し、そしてこれらを殺すと推測できる。ｍＡｂ８４のこの細胞毒性効果は、該ｍＡｂに結合しない細胞（ＢＪ１およびＩＭＲ９０）に対してｍＡｂ８４が細胞毒性効果を発揮しないように、細胞株に対するｍＡｂの結合と相関する。
【０２２９】
参考文献
【０２３０】
【化１−１】
2012502653.tif 000003
【０２３１】
【化１−２】
2012502653.tif 000004
【図１】
2012502653.tif 000005
【図２】
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【図３】
2012502653.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年7月16日(2010.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化を経たかまたは分化を経ている人工多能性幹細胞から、未分化人工多能性幹細胞を分離する方法であって、ここで、未分化人工多能性幹細胞、および分化を経たかまたは分化を経ている人工多能性幹細胞が、試料中に存在しており：
（ｉ）ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）に結合可能な結合部分と試料を、試料中の細胞表面上で発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合を可能にする条件下で接触させ；そして
（ｉｉ）結合部分に結合していない細胞から、結合部分に結合している細胞を分離する；
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
未分化人工多能性幹細胞、および分化を経たかまたは分化を経ている人工多能性幹細胞を含む混合物から、未分化人工多能性幹細胞を濃縮する方法であって：
（ｉ）ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）に結合可能な結合部分と混合物を、混合物中の細胞表面上で発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合を可能にする条件下で接触させ；そして
（ｉｉ）未分化人工多能性幹細胞が濃縮された細胞集団を生成するように、結合部分に結合していない細胞から、結合部分に結合している細胞を分離する；
工程を含む、前記方法。
【請求項３】
未分化人工多能性幹細胞、および分化を経たかまたは分化を経ている人工多能性幹細胞を含む混合物から、分化を経たかまたは分化を経ている人工多能性幹細胞を濃縮する方法であって：
（ｉ）ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）に結合可能な結合部分と混合物を、混合物中の細胞表面上で発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合を可能にする条件下で接触させ；そして
（ｉｉ）分化を経たかまたは分化を経ている人工多能性幹細胞が濃縮された細胞集団を生成するように、結合部分に結合している細胞から、結合部分に結合していない細胞を分離する
工程を含む、前記方法。
【請求項４】
未分化人工多能性幹細胞から分化した細胞を含有する組成物であって、表面上にＰＯＤＸＬを発現する未分化人工多能性幹細胞を実質的に含有しない前記組成物を調製する方法であって：
（ｉ）未分化人工多能性幹細胞、および未分化人工多能性幹細胞から分化した細胞を含む、細胞集団を提供し；
（ｉｉ）ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）に結合可能な結合部分と集団を、試料中の細胞表面上で発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合を可能にする条件下で接触させ；そして
（ｉｉｉ）結合部分に結合している細胞から、結合部分に結合していない細胞を分離する；
工程を含む、前記方法。
【請求項５】
結合部分に結合していない分離細胞を、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤と混合する工程をさらに含む、請求項４の方法。
【請求項６】
表面上にＰＯＤＸＬを発現する未分化人工多能性幹細胞を含有する組成物であって、未分化人工多能性幹細胞から分化した細胞を実質的に含有しない前記組成物を調製する方法であって：
（ｉ）未分化人工多能性幹細胞、および未分化人工多能性幹細胞から分化した細胞を含む、細胞集団を提供し；
（ｉｉ）ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）に結合可能な結合部分と集団を、試料中の細胞表面上で発現されるＰＯＤＸＬへの該部分の結合を可能にする条件下で接触させ；そして
（ｉｉｉ）結合部分に結合していない細胞から、結合部分に結合している細胞を分離する；
工程を含む、前記方法。
【請求項７】
結合部分に結合している分離細胞から、結合部分を解離させる工程をさらに含む、請求項６の方法。
【請求項８】
結合部分に結合している分離細胞を、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤と混合する工程をさらに含む、請求項６または７の方法。
【請求項９】
単数または複数の未分化人工多能性幹細胞を含有する試料中のこうした細胞を破壊する方法であって、表面上にＰＯＤＸＬを発現する、試料中の単数または複数の細胞を破壊する工程を含む、前記方法。
【請求項１０】
単数または複数の未分化人工多能性幹細胞を含有する試料中のこうした細胞を除去する方法であって、表面上にＰＯＤＸＬを発現する単数または複数の細胞を試料から除去する工程を含む、前記方法。
【請求項１１】
ＰＯＤＸＬに結合する結合部分と試料を接触させ、そして結合部分に結合していることによって、前記未分化人工多能性幹細胞（単数または複数）を試料から除去する、請求項１０の方法。
【請求項１２】
結合部分が抗体である、請求項１、２〜８、または１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
抗体がｍＡｂ８４である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
未分化人工多能性幹細胞から分化した細胞を含有する組成物であって、表面上にＰＯＤＸＬを発現する未分化人工多能性幹細胞を実質的に含有しない、前記組成物。
【請求項１５】
未分化人工多能性幹細胞を含有する組成物であって、未分化人工多能性幹細胞から分化した細胞を実質的に含有しない、前記組成物。
【請求項１６】
未分化人工多能性幹細胞が表面上にＰＯＤＸＬを発現する、請求項１５の組成物。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか一項記載の組成物を患者に投与する工程を含む、細胞療法が必要な患者を治療する方法。
【請求項１８】
細胞療法が必要な患者を治療するための薬剤製造における、請求項１４〜１６のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項１９】
細胞療法が必要な患者を治療する際に使用するための、請求項１４〜１６のいずれか一項記載の組成物。
【国際調査報告】
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2012502653.tif 000022