(57)【要約】本発明は、ヒトのソニック・ヘッジホッグホモログ（Ｓｈｈ）に対する標的結合剤およびかかる薬剤の使用に関する。さらに具体的には、本発明は、Ｓｈｈを指向する完全ヒトモノクローナル抗体に関する。記載したこれらの標的結合剤は、Ｓｈｈの活性および／または過剰生産と関連する疾患の治療において、ならびに診断として有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソニック・ヘッジホッグホモログ（Ｓｈｈ）と特異的に結合する単離した抗体であり、以下の特性：
ＢＩＡｃｏｒｅによりヒトＳｈｈと１２０ｐＭ未満のＫＤで結合する；
Ｓｈｈに誘導される細胞の骨芽細胞分化を阻害する；
ｃｏｌｏ２０５異種移植腫瘍におけるマウスＧｌｉ１のｍＲＮＡレベルの８０％超の減少を示す；
ｃｏｌｏ２０５異種移植腫瘍におけるマウスＰａｔｃｈｅｄ−１のｍＲＮＡレベルの７０％超の減少を示す；または
デザート・ヘッジホッグに対する非結合を示す、
のうちの１つまたは複数を示す抗体。
【請求項２】
前記抗体が哺乳動物における腫瘍の増殖および／または転移を阻害する、請求項１に記載の単離した抗体。
【請求項３】
前記抗体がＳｈｈと１００ｐＭ未満のＫＤで結合する、請求項１または２のいずれか一項に記載の単離した抗体。
【請求項４】
前記抗体が任意の１つの１Ａ１２、１Ｇ１２、１Ｈ１０、３Ｈ８、４Ｂ６、１Ｇ１、１Ｆ４、１Ｈ８、１Ｈ１２、１Ｃ８、１Ａ５、６Ｄ７、６Ｄ７ＯＰ、６Ｄ７ＯＰ２またはそれらの任意の最適バージョンの抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離した抗体。
【請求項５】
前記抗体がモノクローナル抗体１Ｇ１２である、請求項４に記載の単離した抗体。
【請求項６】
前記抗体がモノクローナル抗体３Ｈ８である、請求項４に記載の単離した抗体。
【請求項７】
前記抗体がモノクローナル抗体６Ｄ７である、請求項４に記載の単離した抗体。
【請求項８】
前記抗体がモノクローナル抗体６Ｄ７ＯＰである、請求項４に記載の単離した抗体。
【請求項９】
前記抗体が配列番号４６の配列を含み、ここで配列番号４６は表１０の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの固有の組み合わせを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離した抗体。
【請求項１０】
前記抗体が配列番号４８の配列を含み、ここで配列番号４８は表１１の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの固有の組み合わせを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離した抗体。
【請求項１１】
前記抗体が配列番号１４の配列を含み、ここで配列番号１４は表１２の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの固有の組み合わせを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離した抗体。
【請求項１２】
前記抗体が配列番号１６を含み、ここで配列番号１６は表１３の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの固有の組み合わせを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離した抗体。
【請求項１３】
Ｓｈｈへの結合に対して、任意の１つの抗体１Ａ１２、１Ｇ１２、１Ｈ１０、３Ｈ８、４Ｂ６、１Ｇ１、１Ｆ４、１Ｈ８、１Ｈ１２、１Ｃ８、１Ａ５、６Ｄ７、６Ｄ７ＯＰまたはそれらの任意の最適バージョンと競合する完全ヒトモノクローナル抗体。
【請求項１４】
任意の１つの抗体１Ａ１２、１Ｇ１２、１Ｈ１０、３Ｈ８、４Ｂ６、１Ｇ１、１Ｆ４、１Ｈ８、１Ｈ１２、１Ｃ８、１Ａ５、６Ｄ７、６Ｄ７ＯＰまたはそれらの任意の最適バージョンと同じＳｈｈ上のエピトープに結合する、完全ヒトモノクローナル抗体。
【請求項１５】
以下
ａ）表９に示すＣＤＲ３配列；
ｂ）表９に示す任意の１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３配列；
ｃ）表９に示す可変軽鎖配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；または
ｄ）表９に示す可変重鎖配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む単離した抗体：。
【請求項１６】
Ｓｈｈと免疫特異的に結合し、以下：
（ａ）配列番号５０のＶＨ ＣＤＲ１と同一のまたは配列番号５０のＶＨ ＣＤＲ１に対して１、２もしくは３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号５０のＶＨ ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号５０のＶＨ ＣＤＲ２と同一のまたは配列番号５０のＶＨ ＣＤＲ２に対して１、２もしくは３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号５０のＶＨ ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号５０のＶＨ ＣＤＲ３と同一のまたは配列番号５０のＶＨ ＣＤＲ３に対して１、２もしくは３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号５０のＶＨ ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号５４のＶＬ ＣＤＲ１と同一のまたは配列番号５４のＶＬ ＣＤＲ１に対して１、２もしくは３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号５４のＶＬ ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５４のＶＬ ＣＤＲ２と同一のまたは配列番号５４のＶＬ ＣＤＲ２に対して１、２もしくは３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号５４のＶＬ ＣＤＲ２；ならびに
（ｆ）配列番号５４のＶＬ ＣＤＲ３と同一のまたは配列番号５４のＶＬ ＣＤＲ３に対して１、２もしくは３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号５４のＶＬ ＣＤＲ３
を含む抗体。
【請求項１７】
前記抗体が以下：
（ａ）配列番号５０のＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；ならびに
（ｂ）配列番号５４のＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３
を含む、請求項１６に記載の単離した抗体。
【請求項１８】
Ｓｈｈと免疫特異的に結合し、以下：
（ａ）配列番号１４のＶＨ ＣＤＲ１と同一のまたは配列番号１４のＶＨ ＣＤＲ１に対して１、２もしくは３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号１４のＶＨ ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１４のＶＨ ＣＤＲ２と同一のまたは配列番号１４のＶＨ ＣＤＲ２に対して１、２もしくは３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号１４のＶＨ ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１４のＶＨ ＣＤＲ３と同一のまたは配列番号１４のＶＨ ＣＤＲ３に対して１、２もしくは３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号１４のＶＨ ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ１と同一のまたは配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ１に対して１、２もしくは３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ２と同一のまたは配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ２に対して１、２もしくは３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ２；ならびに
（ｆ）配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ３と同一のまたは配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ３に対して１、２もしくは３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ３
を含む抗体。
【請求項１９】
前記薬剤が以下：
（ａ）配列番号１４のＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに
（ｂ）配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３
を含む、請求項１８に記載の単離した抗体。
【請求項２０】
Ｓｈｈと免疫特異的に結合し、以下：
（ａ）配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ１と同一のまたは配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ１に対して１、２もしくは３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ２と同一のまたは配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ２に対して１、２もしくは３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ３と同一のまたは配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ３に対して１、２もしくは３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２４のＶＬ ＣＤＲ１と同一のまたは配列番号２４のＶＬ ＣＤＲ１に対して１、２もしくは３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号２４のＶＬ ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２４のＶＬ ＣＤＲ２と同一のまたは配列番号２４のＶＬ ＣＤＲ２に対して１、２もしくは３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号２４のＶＬ ＣＤＲ２；ならびに
（ｆ）配列番号２４のＶＬ ＣＤＲ３と同一のまたは配列番号２４のＶＬ ＣＤＲ３に対して１、２もしくは３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号２４のＶＬ ＣＤＲ３
を含む抗体。
【請求項２１】
前記抗体が以下：
（ａ）配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；ならびに
（ｂ）配列番号２４のＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３
を含む、請求項２０に記載の単離した抗体。
【請求項２２】
免疫特異的にＳｈｈと結合し、配列番号２２のアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域を含み、かつ配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
【請求項２３】
免疫特異的にＳｈｈと結合し、配列番号５０のアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域を含み、かつ配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
【請求項２４】
前記抗体がモノクローナル抗体の結合断片である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の単離した抗体。
【請求項２５】
前記抗体が完全ヒトモノクローナル抗体である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の単離した抗体。
【請求項２６】
前記抗体がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびｄＡｂ断片からなる群から選択される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の単離した抗体。
【請求項２７】
以下：
ＰＴＡ−９５０５という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ６Ｄ７ＶＬと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列；
ＰＴＡ−９５０６という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ６Ｄ７ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つの重鎖ＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列；または
ＰＴＡ−９５０６という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ６Ｄ７ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つの重鎖ＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列、ならびにＰＴＡ−９５０５という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ６Ｄ７ＶＬと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列
の任意の１つを含むアミノ酸配列を含む抗体。
【請求項２８】
以下：
ＰＴＡ−９５０４という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ６Ｄ７ＶＨＯＰと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つの重鎖ＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列；
ＰＴＡ−９５０３という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ６Ｄ７ＶＬＯＰと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列；または
ＰＴＡ−９５０４という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ６Ｄ７ＶＨＯＰと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つの重鎖ＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列、ならびにＰＴＡ−９５０３という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ６Ｄ７ＶＬＯＰと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列
の任意の１つを含むアミノ酸配列を含む抗体。
【請求項２９】
以下：
ＰＴＡ−９５０７という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ１Ｇ１ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つの重鎖ＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列；
ＰＴＡ−９５０９という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ１Ｇ１ＶＬと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列；または
ＰＴＡ−９５０７という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ１Ｇ１ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つの重鎖ＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列、ならびにＰＴＡ−９５０９という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ１Ｇ１ＶＬと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列
を含むアミノ酸配列を含む抗体。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の標的剤または抗体を含む組成物。
【請求項３１】
前記抗体または請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬品組成物。
【請求項３２】
前記抗体または請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸分子。
【請求項３３】
動物における悪性腫瘍を治療する方法であって、悪性腫瘍の治療を必要としている動物を選択すること、および請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抗体の治療有効量を前記動物に投与することを含む方法。
【請求項３４】
前記動物がヒトである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体が完全ヒトモノクローナル抗体１Ａ１２、１Ｇ１２、１Ｈ１０、３Ｈ８、４Ｂ６、１Ｇ１、１Ｆ４、１Ｈ８、１Ｈ１２、１Ｃ８、１Ａ５、６Ｄ７、６Ｄ７ＯＰまたはそれらの任意の最適バージョンからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記悪性腫瘍が、黒色腫、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、グリオーマ、肝細胞（肝臓）ガン、甲状腺腫瘍、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））ガン、前立腺ガン、乳ガン、卵巣ガン、膀胱ガン、肺ガン、グリア芽腫、子宮内膜ガン、腎臓ガン、結腸ガン、膵臓ガン、食道ガン、頭頸部ガン、中皮腫、肉腫、胆管（ｂｉｌｉａｒｙ）ガン（胆管ガン（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ））、小腸腺ガン、小児悪性腫瘍および扁平上皮ガンからなる群から選択される、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
悪性腫瘍を治療するための請求項３０に記載の組成物の使用。
【請求項３８】
前記悪性腫瘍が、黒色腫、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、グリオーマ、肝細胞（肝臓）ガン、甲状腺腫瘍、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））ガン、前立腺ガン、乳ガン、卵巣ガン、膀胱ガン、肺ガン、グリア芽腫、子宮内膜ガン、腎臓ガン、結腸ガン、膵臓ガン、食道ガン、頭頸部ガン、中皮腫、肉腫、胆管（ｂｉｌｉａｒｙ）ガン（胆管ガン（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ））、小腸腺ガン、小児悪性腫瘍および扁平上皮ガンからなる群から選択される、請求項３７に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ソニック・ヘッジホッグホモログ（Ｓｈｈ）に対する標的結合剤およびかかる薬剤の使用に関する。さらに具体的には、本発明は、Ｓｈｈを指向する完全ヒトモノクローナル抗体に関する。記載したこれらの標的結合剤は、ヘッジホッグタンパク質の活性および／または過剰生産と関連する疾患の治療において、ならびに診断として有用である。
【背景技術】
【０００２】
ヘッジホッグは、胚のパターン形成のメディエーターとしてショウジョウバエにおいて同定された。哺乳動物では、ヘッジホッグファミリーには、ソニック・ヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、インディアン・ヘッジホッグ（Ｉｈｈ）、およびデザート・ヘッジホッグ（Ｄｈｈ）の３つのメンバーがあり、組織のパターン形成を特定し、細胞の増殖および分化に影響を与えることにより臓器のホメオスタシスを調節する。ヘッジホッグタンパク質は、１２回膜貫通型受容体Ｐａｔｃｈｅｄ（ヒトではＰｔｃｈ、マウスではＰｔｃ）のリガンドであり、通常、ＧＣＰＲ様膜貫通型タンパク質Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（ＳＭＯ）の機能を抑制する。Ｓｈｈが結合すると、ＳＭＯが転写因子Ｇｌｉファミリーのメンバーを介してシグナル伝達できるように、ＰａｔｃｈｅｄによるＳＭＯの抑性が軽減される。転写の活性化は、Ｇｌｉ１およびＰｔｃｈのような経路構成成分の合成をもたらす。
【０００３】
ヘッジホッグ／ＳＭＯシグナル伝達経路の調節不全は腫瘍形成に関わる。Ｐｔｃｈを不活性化するまたはＳｍｏを恒常的に活性化する変異が、基底細胞ガン、髄芽腫および横紋筋肉腫で報告された。おそらく、これらの変異は、経路の恒常的活性化をもたらし、腫瘍形成を促進する。さらに、Ｓｈｈの過剰発現が、前立腺腫、膵臓腫、小細胞肺腫、結腸直腸腫、食道腫、胃腫、黒色腫、および多発性骨髄腫のような多数の腫瘍型において報告された。多くの症例において、Ｇｌｉ１およびＰｔｃｈの発現上昇がＳｈｈの過剰発現と共に観察され、一部のコンテクストにおいて、腫瘍細胞内の恒常的な経路活性化が、リガンド依存的な方法で腫瘍形成を促進し得るという結論が支持される。このモデルは、ＬＮＣａＰ前立腺ガン細胞内でのＳｈｈの異所性過剰発現が、インビボの腫瘍増殖を高めるという観察によって支持される（Ｆａｎ ２００４.Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１４５：３９６１）。
【０００４】
どのようにしてＳｈｈの過剰発現がガンの発生を引き起こし得るかを説明するために、いくつかのモデルが提唱された。第１のモデルでは、Ｓｈｈが腫瘍細胞によって異所的に過剰発現し、それが腫瘍細胞の表面上のＰｔｃｈと結合することで自己分泌シグナルを発生し、細胞増殖を誘発する。第２のモデルでは、腫瘍細胞によって分泌されたＳｈｈが、間質細胞内でＳＭＯシグナル伝達を活性化し、それが次に、腫瘍細胞増殖を高める因子の生産をもたらす。このモデルを支持して、Ｓｈｈを発現する腫瘍細胞が間質細胞内のＧｌｉ１発現を誘発することが示された（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ.２００４.Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１４５：３９６１；Ｙａｕｃｈ ｅｔ ａｌ.２００８.Ｎａｔｕｒｅ：４５５,４０６−４１０）。さらに、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の共移植（ｃｏｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）が、Ｓｈｈを発現する準最適数のＨＴ−２９腫瘍細胞の腫瘍形成および増殖を促進した（Ｙａｕｃｈ ｅｔ ａｌ.２００８.Ｎａｔｕｒｅ：４５５,４０６−４１０）。ＭＥＦ内のＳＭＯの標的欠損がかなり小さい腫瘍をもたらしたので、腫瘍増殖を高めるＭＥＦの能力は、インタクトなＳｈｈ／ＳＭＯシグナル伝達を必要とした。最終的に、Ｓｈｈは、様々な組織内の幹細胞の増殖および分化に関わった（Ｔａｉｐａｌｅ ａｎｄ Ｂｅａｃｈｙ.２００１.Ｎａｔｕｒｅ４１１：３４９−３５４）。このように、化学療法および／もしくは放射線療法による治療後に、ガン幹細胞の自己再生を促進することによって、Ｓｈｈは腫瘍形成または再発を促進し得るということが提唱された。
【０００５】
増殖および生存のために、腫瘍がＳｈｈ／Ｓｍｏシグナル伝達に依存することが、シクロパミン（ＳＭＯへの直接結合を介して作用する、コーンリリー（ｃｏｒｎ ｌｉｌｌｙ）由来の経路の天然アンタゴニスト）を用いた前臨床モデルにおいて示された。シクロパミンが、黒色腫、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍、および小細胞肺腫瘍を含む多数の腫瘍細胞系の増殖をインビトロならびにインビボで阻害することが報告された。シクロパミンは２２ＲＶ−１前立腺ガンの異種移植片の増殖を阻害したが、下流転写因子Ｇｌｉ１を安定して過剰発現している２２ＲＶ−１腫瘍の増殖は阻害しなかったので、シクロパミンの阻害効果は特異的であるように思われた（Ｋａｒｈａｄｋａｒ ｅｔ ａｌ.２００４.Ｎａｔｕｒｅ４３１：７０７）。さらに最近になって、無関係の小分子ＳＭＯアンタゴニストＨｈＡｎｔａｇが、Ｐｔｃ１の変異およびＳｈｈを過剰発現しているヒト異種移植片腫瘍を介して、ＳＭＯ経路が恒常的に活性化されている髄芽腫瘍の同種移植片の増殖を阻害することが示された（Ｒｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ.２００４.Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ６：２２９；Ｙａｕｃｈ ｅｔ ａｌ.２００８.Ｎａｔｕｒｅ：４５５,４０６−４１０）。
【０００６】
ヒトＳｈｈと交差反応する、ラットＳｈｈのＮ末端シグナル伝達領域に対して産生させた抗体が記載された（Ｅｒｉｃｓｏｎ ｅｔ ａｌ.１９９６.Ｃｅｌｌ８７：６６１−６７３）。Ｇｌｉ１受容体遺伝子によって測定した場合、Ｓｈｈ経路の特異的遮断が、食道、胃および膵臓から樹立した腫瘍細胞内での増殖の阻害と相関することを示すために、５Ｅ１と名付けられたこの抗体が使用された。５Ｅ１は、また、樹立した小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）細胞系および１回継代の膵臓異種移植片由来の腫瘍細胞のインビトロ増殖および生存能を減少させた（Ｗａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ.Ｎａｔｕｒｅ,４２２：３１３−３１７（２００３）；Ｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ.２００３.Ｎａｔｕｒｅ４２６：８４６）。最終的に、５Ｅ１は、ＨＴ５５およびＨＴ２９の結腸直腸の腫瘍異種移植片の増殖をインビボで阻害することが示された（Ｙａｕｃｈ ｅｔ.２００８.Ｎａｔｕｒｅ）。
【０００７】
単剤として腫瘍細胞の増殖および生存能を阻害することに加えて、Ｓｈｈ／ＳＭＯアンタゴニストは、化学療法および放射線療法の抗腫瘍活性を増大させ得る（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ.Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ,６：１８２６−１８３０（２００７））。Ｓｉｍｓ−Ｍｏｕｒｔａｄａ ｅｔ ａｌ.Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.,１２：６５６５−６５７２,（２００６）は、放射線治療後、ＳＥＧ−１食道腺ガンの異種移植片が再生するにつれて、Ｇｌｉ１陽性細胞の数が劇的に増加したことを報告した。Ｇｌｉ１染色細胞の出現はＫｉ６７陽性細胞の増加に先行し、Ｓｈｈシグナル伝達が、推定ガン幹細胞のような抵抗性細胞（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ）の小集団の拡大を促進し、最終的に腫瘍再増殖をもたらし得たことが示唆される。ＳＥＧ−１異種移植片とパクリタキセルおよびシクロパミンとの併用療法は、一方の薬剤の単独使用と比べて、優れた効果をもたらした。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｆａｎ ２００４.Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１４５：３９６１
【非特許文献２】Ｙａｕｃｈ ｅｔ ａｌ.２００８.Ｎａｔｕｒｅ：４５５,４０６−４１０
【非特許文献３】Ｔａｉｐａｌｅ ａｎｄ Ｂｅａｃｈｙ.２００１.Ｎａｔｕｒｅ４１１：３４９−３５４
【非特許文献４】Ｋａｒｈａｄｋａｒ ｅｔ ａｌ.２００４.Ｎａｔｕｒｅ４３１：７０７
【非特許文献５】Ｒｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ.２００４.Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ６：２２９
【非特許文献６】Ｅｒｉｃｓｏｎ ｅｔ ａｌ.１９９６.Ｃｅｌｌ８７：６６１−６７３
【非特許文献７】Ｗａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ.Ｎａｔｕｒｅ,４２２：３１３−３１７（２００３）
【非特許文献８】Ｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ.２００３.Ｎａｔｕｒｅ４２６：８４６
【非特許文献９】Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ.Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ,６：１８２６−１８３０（２００７）
【非特許文献１０】Ｓｉｍｓ−Ｍｏｕｒｔａｄａ ｅｔ ａｌ.Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.,１２：６５６５−６５７２,（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
Ｓｈｈを指向する中和抗体を用いてＳｈｈ／ＳＭＯシグナル伝達経路と拮抗することが、多数のヒトガンのための効果的な治療であり得るという論理的根拠が、上記に引用した証拠により支持される。従って、Ｓｈｈシグナル伝達の新規の阻害剤を同定することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、Ｓｈｈに特異的に結合し、Ｓｈｈの生物活性を阻害する標的結合剤に関する。本発明の実施形態は、Ｓｈｈに特異的に結合し、Ｓｈｈの受容体Ｐａｔｃｈｅｄ、例えば、Ｐａｔｃｈｅｄ‐１および／またはＰａｔｃｈｅｄ２へのＳｈｈの結合を阻害する標的結合剤に関する。一実施形態において、本発明の抗体はＳｈｈに対して特異的である。
【００１１】
本発明の実施形態は、Ｓｈｈに特異的に結合し、Ｐａｔｃｈｅｄ‐１および／またはＰａｔｃｈｅｄ‐２へのＳｈｈの結合を阻害する標的結合剤に関する。一実施形態において、この標的結合剤は、この標的結合剤の無い状態で生じる結合と比較して、ＳｈｈのＰａｔｃｈｅｄ‐１への結合を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％阻害する。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤は、５ナノモル濃度（ｎＭ）未満の結合親和性（ＫＤ）でＳｈｈと結合する。他の実施形態において、この標的結合剤は、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭまたは１ｎＭ未満のＫＤで結合する。本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤は、９５０ピコモル濃度（ｐＭ）未満のＫＤでＳｈｈと結合する。本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤は、９００ｐＭ未満のＫＤでＳｈｈと結合する。他の実施形態において、この標的結合剤は、８００ｐＭ、７００ｐＭまたは６００ｐＭ未満のＫＤで結合する。本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤は、５００ｐＭ未満のＫＤでＳｈｈと結合する。他の実施形態において、この標的結合剤は、４００ｐＭ未満のＫＤで結合する。さらに他の実施形態において、この標的結合剤は、３００ｐＭ未満のＫＤで結合する。いくつかの他の実施形態において、この標的結合剤は、２００ｐＭ未満のＫＤで結合する。いくつかの他の実施形態において、この標的結合剤は、１００ｐＭ未満のＫＤで結合する。具体的な一実施形態において、本発明の標的結合剤は、５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭまたは１０ｐＭ未満の親和性ＫＤでヒトＳｈｈと結合し得る。別の具体的な実施形態において、本発明の標的結合剤は、１ｐＭ未満の親和性ＫＤでヒトＳｈｈと結合し得る。ＫＤは、本明細書記載の方法または当業者に知られた方法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ）（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して評価し得る。
【００１３】
本発明の標的結合剤または抗体の結合特性は、解離速度または会合速度（各々、ｋｏｆｆおよびｋｏｎ）を参照することによっても測定し得る。
【００１４】
本発明の一実施形態において、標的結合剤または抗体は、少なくとも１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも２×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ速度（抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋｏｎ→Ａｂ−Ａｇ）を有し得る。
【００１５】
本発明の別の実施形態において、標的結合剤または抗体は、５×１０−１ｓ−１未満、１０−１ｓ−１未満、５×１０−２ｓ−１未満、１０−２ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−３ｓ−１未満、５×１０−４ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、または１０−１０ｓ−１未満のｋｏｆｆ速度（（Ａｂ―Ａｇ）ｋｏｆｆ→抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ））を有し得る。
【００１６】
本発明の標的結合剤は、特異的にヒトＳｈｈと結合する。一部の例において、本発明の標的結合剤は、他の種由来の他のＳｈｈタンパク質と交差反応性を示す。一実施形態において、本発明の標的結合剤は、マウスＳｈｈと交差反応性を示す。別の実施形態において、本発明の標的結合剤は、カニクイザルＳｈｈと交差反応性を示す。別の実施形態において、本発明の標的結合剤は、カニクイザルＳｈｈおよびマウスＳｈｈと交差反応性を示す。
【００１７】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤は、他の種由来のＳｈｈタンパク質に対してほぼ同等の親和性を有する。一つの具体例において、本発明のヒトＳｈｈ標的結合剤は、マウスＳｈｈに対してほぼ同等の親和性を有する。同等レベルの親和性とは、ヒトＳｈｈ４に関する親和性が１である時、カニクイザルＳｈｈに関する抗体の親和性は０．２〜５または０．２〜２であることを意味する。
【００１８】
別の実施形態において、本発明のいくつかの標的結合剤は、関連ヘッジホッグメンバーと結合し得る。一実施形態において、この標的結合剤は、ヒトインディアン・ヘッジホッグホモログ（ＩＨＨ）と結合し得る。例えば、６Ｄ７はヒトインディアン・ヘッジホッグおよびマウスインディアン・ヘッジホッグの両方と結合し得る。
【００１９】
別の実施形態において、本発明のいくつかの標的結合剤は、関連ヘッジホッグメンバーと結合することができない。例えば、３Ｈ８および１Ｇ１はＩＨＨへの結合を示さない。さらに、本発明の標的結合剤のいずれもＤＨＨと結合しない。
【００２０】
さらに別の実施形態において、本発明の標的結合剤は、Ｓｈｈを用いて誘発した細胞の骨芽細胞分化を阻害する。一例において、この標的結合剤の保有する活性は、１０μＭ未満のＩＣ50濃度（５０％阻害に達する濃度）で示すことができる。別の例において、本発明の標的結合剤は、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３または２ｎＭ未満のＩＣ50濃度を有し得る。
【００２１】
さらに別の実施形態において、本発明の標的結合剤は、Ｇｌｉ１およびＰａｔｃｈｅｄ−１のｍＲＮＡの誘導を阻害する。一例において、この標的結合剤の保有する活性は、１０μＭ未満のＩＣ50濃度（５０％阻害に達する濃度）で示すことができる。別の例において、本発明の標的結合剤は、５０、４０、３０、２０、１０、５、４または２ｎＭ未満のＩＣ50濃度を有し得る。
【００２２】
さらに別の実施形態において、この標的結合剤は、Ｇｌｉ１およびＧｌｉ２ならびにＰａｔｃｈｅｄ−１およびＰａｔｃｈｅｄ−２を阻害し得る。例えば、本発明の抗体は、対照（標的結合剤なし）と比べてＧｌｉ１およびＰａｔｃｈｅｄ−１のＲＮＡの５０％超、例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の阻害を示し得る。
【００２３】
本発明の別の実施形態において、この標的結合剤は、Ｐａｔｃｈｅｄ−１への結合に対して、本明細書記載の任意の１つの完全ヒトモノクローナル抗体と競合する。
【００２４】
本発明の標的結合剤は、有益有効な薬物動態特性および／または薬力学的特性を保有する。一例において、本発明の標的結合剤は、良好で安全な特性を示し、例えば、心血管毒性効果を示さない。
【００２５】
いくつかの実施形態において、この標的結合剤は、異常なＳｈｈ活性と関連する症状を治療または予防し得る。本発明の一実施形態において、この標的結合剤は腫瘍細胞増殖を阻害する。この標的結合剤は、腫瘍増殖および／もしくは転移を阻害するために、化学療法養生法のような他の抗ガン治療と組み合わせて、または単独で使用できる。
【００２６】
（ｉ）感染性／炎症性傷害および腫瘍によって誘発される傷害と共に、外傷、化学傷害、血管の傷害および欠損（発作に起因する虚血など）を含む神経系への急性、準急性、または慢性傷害；（ｉｉ）アルツハイマー病を含む神経系の老化；（ｉｉｉ）パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋委縮性側索硬化症など、ならびに脊髄小脳変性病を含む神経系の慢性神経変性疾患；ならびに（ｉｖ）多発性硬化症を含む神経系のまたは神経系に影響を与える慢性免疫疾患に由来する神経学的症状の治療（予防および／または重症度の軽減）に、本発明の抗体は使用できる。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤は抗体である。本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤はモノクローナル抗体である。本発明の一実施形態において、この標的結合剤は完全ヒトモノクローナル抗体である。本発明の別の実施形態において、この標的結合剤は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの完全ヒトモノクローナル抗体である。本発明の別の実施形態において、この標的結合剤は、ＩｇＧ２アイソタイプの完全ヒトモノクローナル抗体である。ＩｇＧ２アイソタイプは、他のアイソタイプと比較してエフェクター機能を引き出す可能性を減少させ、これは毒性を減少させ得る。本発明の別の実施形態において、この標的結合剤は、ＩｇＧ１アイソタイプの完全ヒトモノクローナル抗体である。ＩｇＧ１アイソタイプは、他のアイソタイプと比較してＡＤＣＣを引き出す可能性を増加させ、これは有効性を改善し得る。ＩｇＧ１アイソタイプは、他のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ４と比較して安定性を改善し、これは生物学的利用能を改善し、もしくは製造の容易さを改善し得、または半減期がより長くなり得る。一実施形態において、ＩｇＧ１アイソタイプの完全ヒトモノクローナル抗体は、z、zaまたはfのアロタイプの抗体である。
【００２８】
さらなる実施形態は、Ｓｈｈへ特異的に結合し、表９に示される相補性決定領域（ＣＤＲ）配列のうちの１つを含む配列を含む標的結合剤または抗体である。本発明の実施形態は、表９に示されるような重鎖可変領域の任意の１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列を含む配列を含む標的結合剤または抗体を含む。さらなる実施形態は、Ｓｈｈへ特異的に結合し、表９に示されるような重鎖可変領域の２つのＣＤＲ配列を含む配列を含む標的結合剤または抗体である。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表９に示されるような重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含む。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表９に示されるような軽鎖可変領域のＣＤＲ配列のうちの１つを含む配列を含む。本発明の実施形態は、表９に示されるような重鎖可変領域の任意の１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列を含む配列を含む標的結合剤または抗体を含む。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表９に示されるような重鎖可変領域の２つのＣＤＲ配列を含む配列を含む。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表９に示されるような軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含む。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表９に示されるような重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および表９に示されるような軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含み得る。いくつかの実施形態において、この標的結合剤は抗体である。特定の実施形態において、この標的結合剤は、完全ヒトモノクローナル抗体である。特定の他の実施形態において、この標的結合剤は、完全ヒトモノクローナル抗体の結合断片である。
【００２９】
一実施形態において、本発明は、Ｓｈｈと免疫特異的に結合する抗体を含み、（ａ）配列番号５０のＶＨ ＣＤＲ１と同一のまたは配列番号５０のＶＨ ＣＤＲ１に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号５０のＶＨ ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号５０のＶＨ ＣＤＲ２と同一のまたは配列番号５０のＶＨ ＣＤＲ２に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号５０のＶＨ ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号５０のＶＨ ＣＤＲ３と同一のまたは配列番号５０のＶＨ ＣＤＲ３に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号５０のＶＨ ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号５４のＶＬ ＣＤＲ１と同一のまたは配列番号５４のＶＬ ＣＤＲ１に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号５４のＶＬ ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号５４のＶＬ ＣＤＲ２と同一のまたは配列番号５４のＶＬ ＣＤＲ２に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号５４のＶＬ ＣＤＲ２；（ｆ）配列番号５４のＶＬ ＣＤＲ３と同一のまたは配列番号５４のＶＬ ＣＤＲ３に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号５４のＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【００３０】
さらに別の実施形態において、本発明は、Ｓｈｈと免疫特異的に結合する抗体を含み、（ａ）配列番号１４のＶＨ ＣＤＲ１と同一のまたは配列番号１４のＶＨ ＣＤＲ１に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号１４のＶＨ ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１４のＶＨ ＣＤＲ２と同一のまたは配列番号１４のＶＨ ＣＤＲ２に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号１４のＶＨ ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号１４のＶＨ ＣＤＲ３と同一のまたは配列番号１４のＶＨ ＣＤＲ３に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号１４のＶＨ ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ１と同一のまたは配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ１に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ２と同一のまたは配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ２に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ２；（ｆ）配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ３と同一のまたは配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ３に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号１６のＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【００３１】
さらに別の実施形態において、本発明は、Ｓｈｈと免疫特異的に結合する抗体を含み、（ａ）配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ１と同一のまたは配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ１に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ２と同一のまたは配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ２に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ３と同一のまたは配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ３に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号２４のＶＬ ＣＤＲ１と同一のまたは配列番号２４のＶＬ ＣＤＲ１に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号２４のＶＬ ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号２４のＶＬ ＣＤＲ２と同一のまたは配列番号２４のＶＬ ＣＤＲ２に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号２４のＶＬ ＣＤＲ２；（ｆ）配列番号２４のＶＬ ＣＤＲ３と同一のまたは配列番号２４のＶＬ ＣＤＲ３に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する配列番号２４のＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【００３２】
別の実施形態において、この標的結合剤は、２００８年９月１７日にＰＴＡ‐９５０４、ＰＴＡ−９５０６、ＰＴＡ−９５１８、またはＰＴＡ−９５０６という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ６Ｄ７ＶＨＯＰ、Ｍａｂ１Ｇ１ＶＨ、Ｍａｂ３Ｈ８ＶＨ、およびＭａｂ６Ｄ７ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる可変重鎖配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３のうちの任意の１つを含む配列を含み得る。別の実施形態において、この標的結合剤は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０３、ＰＴＡ−９５０９、ＰＴＡ−９５１５、またはＰＴＡ−９５０４という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ６Ｄ７ＶＬＯＰ、Ｍａｂ１Ｇ１ＶＬ、Ｍａｂ３Ｈ８ＶＬ、およびＭａｂ６Ｄ７ＶＬと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる可変軽鎖配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３のうちの任意の１つを含む配列を含み得る。
【００３３】
一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０４という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ６Ｄ７ＶＨＯＰと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＤＲ３を含む可変重鎖アミノ酸配列を含む。
【００３４】
一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０４という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ６Ｄ７ＶＨＯＰと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＤＲ３を含む可変重鎖アミノ酸配列を含み、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０３という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ６Ｄ７ＶＬＯＰと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＤＲ３を含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００３５】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０４という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ６Ｄ７ＶＨＯＰと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列を含む。
【００３６】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０３という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ６Ｄ７ＶＬＯＰと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００３７】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０４という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ６Ｄ７ＶＨＯＰと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列を含み、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０３という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ６Ｄ７ＶＬＯＰと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００３８】
一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０７という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ１Ｇ１ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＤＲ３を含む可変重鎖アミノ酸配列を含む。
【００３９】
一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０７という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ１Ｇ１ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＤＲ３を含む可変重鎖アミノ酸配列を含み、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０９という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ１Ｇ１ＶＬと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＤＲ３を含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００４０】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０７という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ１Ｇ１ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列を含む。
【００４１】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０９という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ１Ｇ１ＶＬと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００４２】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０７という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ１Ｇ１ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列を含み、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０９という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ１Ｇ１ＶＬと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００４３】
一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５１８という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ３Ｈ８ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＤＲ３を含む可変重鎖アミノ酸配列を含む。
【００４４】
一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５１８という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ３Ｈ８ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＤＲ３を含む可変重鎖アミノ酸配列を含み、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５１５という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ３Ｈ８ＶＬと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＤＲ３を含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００４５】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５１８という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ３Ｈ８ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列を含む。
【００４６】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５１５という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ３Ｈ８ＶＬと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００４７】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５１８という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ３Ｈ８ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列を含み、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５１５という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ３Ｈ８ＶＬと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００４８】
当業者は容易にＣＤＲ決定をすることができることに留意されたい。例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ,Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１）、ｖｏｌｓ.１−３を参照されたい。カバット（Ｋａｂａｔ）は、多数の種の抗体アイソタイプから免疫グロブリン鎖の多重配列アライメントを提供している。この整列された配列は、シングル付番方式（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）であるカバット付番方式（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）に従って番号が付けられる。カバット配列は、１９９１年の発表以来アップデートされており、電子配列データベースとして利用できる（最新のダウンロード可能バージョンは１９９７）。任意の免疫グロブリン配列は、カバットに従って、カバット参照配列を用いて整列させることによって番号が付けられ得る。従って、カバット付番方式は、免疫グロブリン鎖の番号付けのための統一システムを提供する。
【００４９】
一実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表９に示される任意の１つの重鎖配列を含む配列を含む。別の実施形態において、この標的結合剤および抗体は、抗体６Ｄ７、３Ｈ８、１Ｇ１、６Ｄ７ＯＰ２、６Ｄ７ＯＰ、または３Ｈ８ＯＰの任意の１つの重鎖配列を含む配列を含む。
【００５０】
軽鎖の混在は、当該技術分野において十分に確立されており、従って、抗体６Ｄ７、３Ｈ８、１Ｇ１、６Ｄ７ＯＰ、６Ｄ７ＯＰ２、もしくは３Ｈ８ＯＰもしくは本明細書に開示される別の抗体の任意の１つの重鎖配列を含む配列を含む標的結合剤または抗体は、表９に示される任意の１つの軽鎖配列または抗体６Ｄ７、３Ｈ８もしくは１Ｇ１、６Ｄ７ＯＰ、６Ｄ７ＯＰ２、３Ｈ８ＯＰもしくは１Ｇ１ＯＰもしくは本明細書に開示される別の抗体の任意の１つの軽鎖配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００５１】
一実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表９に示される任意の１つの軽鎖配列を含む配列を含む。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、抗体６Ｄ７、３Ｈ８もしくは１Ｇ１、６Ｄ７ＯＰ、６Ｄ７ＯＰ２、３Ｈ８ＯＰもしくは１Ｇ１ＯＰの任意の１つの軽鎖配列を含む配列を含む。いくつかの実施形態において、この抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００５２】
いくつかの実施形態において、この標的結合剤は、１Ａ１２、１Ｇ１２、１Ｈ１０、３Ｈ８、４Ｂ６、１Ｇ１、１Ｆ４、１Ｈ８、１Ｈ１２、１Ｃ８、１Ａ５、６Ｄ７、６Ｄ７ＯＰ、６Ｄ７ＯＰ２、３Ｈ８ＯＰまたは１Ｇ１ＯＰからなる群から選択されるモノクローナル抗体である。一実施形態において、この標的結合剤は、１つまたは複数の完全ヒトモノクローナル抗体１Ａ１２、１Ｇ１２、１Ｈ１０、３Ｈ８、４Ｂ６、１Ｇ１、１Ｆ４、１Ｈ８、１Ｈ１２、１Ｃ８、１Ａ５、６Ｄ７、６Ｄ７ＯＰ、６Ｄ７ＯＰ２、３Ｈ８ＯＰまたは１Ｇ１ＯＰを含む。特定の実施形態において、この標的結合剤は、モノクローナル抗体６Ｄ７である。特定の他の実施形態において、この標的結合剤は、モノクローナル抗体３Ｈ８である。特定の他の実施形態において、この標的結合剤は、モノクローナル抗体１Ｇ１である。特定の他の実施形態において、この標的結合剤は、モノクローナル抗体６Ｄ７ＯＰである。特定の他の実施形態において、この標的結合剤は、モノクローナル抗体３Ｈ８ＯＰである。特定の他の実施形態において、この標的結合剤は、モノクローナル抗体１Ｇ１ＯＰである。
【００５３】
一実施形態において、標的結合剤または抗体は、表９に示される任意の１つの配列から選択される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む配列を含み得る。一実施形態において、標的結合剤または抗体は、表９に示される任意の１つの配列から選択される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む配列を含み得る。一実施形態において、標的結合剤または抗体は、抗体１Ａ１２、１Ｇ１２、１Ｈ１０、３Ｈ８、４Ｂ６、１Ｇ１、１Ｆ４、１Ｈ８、１Ｈ１２、１Ｃ８、１Ａ５、６Ｄ７、または６Ｄ７ＯＰ２の任意の１つのＣＤＲから選択される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む配列を含み得る。
【００５４】
一実施形態において、標的結合剤または抗体は、抗体１Ａ１２、１Ｇ１２、１Ｈ１０、３Ｈ８、４Ｂ６、１Ｇ１、１Ｆ４、１Ｈ８、１Ｈ１２、１Ｃ８、１Ａ５、６Ｄ７、または６Ｄ７ＯＰ２の任意の１つのＣＤＲから選択される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む配列を含み得る。
【００５５】
別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表９に示されるような任意の１つの完全ヒトモノクローナル抗体６Ｄ７、３Ｈ８、１Ｇ１、６Ｄ７、または６Ｄ７の任意の１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３を含む配列を含み得る。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表９に示されるような任意の１つの完全ヒトモノクローナル抗体６Ｄ７、３Ｈ８、１Ｇ１または６Ｄ７の任意の１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３を含む配列を含み得る。一実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表９に示されるような完全ヒトモノクローナル抗体６Ｄ７、３Ｈ８、１Ｇ１または６Ｄ７ＯＰのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む配列を含み得る。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表９に示されるような完全ヒトモノクローナル抗体６Ｄ７、３Ｈ８、１Ｇ１または６Ｄ７ＯＰのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む配列を含み得る。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表９に示されるような完全ヒトモノクローナル抗体６Ｄ７、３Ｈ８、１Ｇ１または６Ｄ７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む配列ならびに表９に示されるような完全ヒトモノクローナル抗体６Ｄ７、３Ｈ８、１Ｇ１または６Ｄ７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含み得る。いくつかの実施形態において、この抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００５６】
別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表９に示されるような完全ヒトモノクローナル抗体６Ｄ７の可変重鎖および／または可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含む。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表９に示されるような完全ヒトモノクローナル抗体３Ｈ８の可変重鎖および／または可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含む。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表９に示されるような完全ヒトモノクローナル抗体１Ｇ１の可変重鎖および／または可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含む。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表９に示されるような完全ヒトモノクローナル抗体６Ｄ７ＯＰ２または６Ｄ７ＯＰの可変重鎖および／または可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態において、この抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００５８】
本発明のさらなる実施形態は、表９に示されるような任意の１つの配列のフレームワーク領域およびＣＤＲ、具体的にはＦＲ１〜ＦＲ４またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３に及ぶ近接配列を含む配列を含む標的結合剤または抗体である。一実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表９に示されるようなモノクローナル抗体６Ｄ７、３Ｈ８、１Ｇ１の任意の１つの配列のフレームワーク領域およびＣＤＲ、具体的にはＦＲ１〜ＦＲ４またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３に及ぶ近接配列を含む配列を含む。いくつかの実施形態において、この抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００５９】
別の実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号１４の配列を含む重鎖ポリペプチドを含む。一実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号１６の配列を含む軽鎖ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、この抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００６０】
一実施形態は、配列番号２２の配列を含む重鎖ポリペプチドを含む、標的結合剤または抗体、またはその抗原結合部分を提供する。一実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号２４の配列を含む軽鎖ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、この抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００６１】
別の実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号４６の配列を含む重鎖ポリペプチドを含む。別の実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号４８の配列を含む軽鎖ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、この抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００６２】
別の実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号５０の配列を含む重鎖ポリペプチドを含む。別の実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号５２の配列を含む軽鎖ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、この抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００６３】
別の実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号５０の配列を含む重鎖ポリペプチドを含む。別の実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号５６の配列を含む軽鎖ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、この抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００６４】
別の実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号２２の配列を含む重鎖ポリペプチドを含む。別の実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号５６の配列を含む軽鎖ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、この抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００６５】
別の実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号５８の配列を含む重鎖ポリペプチドを含む。別の実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号６０の配列を含む軽鎖ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、この抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００６６】
一実施形態において、この標的結合剤または抗体は、開示されたＣＤＲまたは重鎖もしくは軽鎖配列の中に、２０、１６、１０、９以下、例えば、１、２、３、４、もしくは５個ほどのアミノ酸の付加、置換、欠失、および／または挿入を含む。かかる修飾は、ＣＤＲの中の任意の残基で潜在的に行い得る。いくつかの実施形態において、この抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００６７】
一実施形態において、この標的結合剤または抗体は、本明細書に開示されたＣＤＲのバリアントもしくは誘導体、フレームワーク領域およびＣＤＲ（具体的にはＦＲ１〜ＦＲ４またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）に及ぶ近接配列、本明細書に開示された軽鎖もしくは重鎖配列、または本明細書に開示された抗体を含む。バリアントは、表９に示されるような任意のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３の中に、２０、１６、１０、９以下、例えば、１、２、３、４、５もしくは６個ほどのアミノ酸の付加、置換、欠失、および／または挿入を有する配列、表９に示されるようなフレームワーク領域およびＣＤＲ（具体的にはＦＲ１〜ＦＲ４またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）に及ぶ近接配列、本明細書に開示された軽鎖もしくは重鎖配列、または本明細書に開示されたモノクローナル抗体を含む標的結合剤または抗体を含む。バリアントは、表９に示されるような任意のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３と少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８もしくは約９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列、表９に示されるようなフレームワーク領域およびＣＤＲ（具体的にはＦＲ１〜ＦＲ４またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）に及ぶ近接配列、本明細書に開示された軽鎖もしくは重鎖配列、または本明細書に開示されたモノクローナル抗体を含む標的結合剤または抗体を含む。２つのアミノ酸配列の同一性パーセントは、ペアワイズタンパク質アライメントを含むがそれに限定されない、当業者に知られる任意の方法によって決定できる。一実施形態において、バリアントは、天然に存在する、または組換えＤＮＡ法もしくは突然変異誘発法を使用する天然配列のインビトロ操作によって導入される本明細書に開示されたＣＤＲ配列または軽鎖もしくは重鎖ポリペプチドの中に変化を含む。天然に存在するバリアントは、外来抗原に対する抗体の産生中に、対応する生殖系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）ヌクレオチド配列中にインビボで生成されるバリアントを含む。一実施形態において、誘導体は、２つ以上の抗体が共に連結された抗体である異種抗体であり得る。誘導体は、化学的に修飾された抗体を含む。例として、水溶性ポリマーのような１つまたは複数のポリマー、Ｎ−結合もしくはＯ−結合炭水化物、糖、リン酸、および／または他のかかる分子の共有結合が挙げられる。誘導体は、結合される分子の種類または位置のいずれかの点で、天然に存在する抗体もしくは開始抗体とは異なる方法で修飾される。誘導体は、抗体上に天然に存在する１つまたは複数の化学基の欠失をさらに含む。
【００６８】
一実施形態において、この標的結合剤は、２重特異性抗体である。２重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。２重特異性抗体を作製する方法は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ,Ｎａｔｕｒｅ,３０５：５３７−５３９（１９８３）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ,ＥＭＢＯ Ｊ,１０：３６５５−３６５９（１９９１）；Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ, Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ,１２１：２１０（１９８６）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ,１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ,９０：６４４４−６４４８（１９９３）；Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ,１５２：５３６８（１９９４）；米国特許第４，４７４，８９３号；同第４，７１４,６８１号；同第４，９２５，６４８号；同第５，５７３，９２０号；同第５，６０１，８１号；同第９５，７３１，１６８号；同第４，６７６，９８０号；および同第４，６７６，９８０号；ＷＯ９４／０４６９０号；ＷＯ９１／００３６０号; ＷＯ９２／２００３７３号；ＷＯ９３／１７７１５号；ＷＯ９２／０８８０２号；および欧州特許第０３０８９号を参照されたい）。
【００６９】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤または抗体は、配列番号１４を含む配列を含む。特定の実施形態において、配列番号１４は、表１２の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列番号１４は、表１２に示されるような任意の１つ、任意の２つ、または３つ、または３つ全部の生殖系列残基を含む。特定の実施形態において、配列番号１４は、表１２の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの固有の組み合わせを含む。他の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、１つまたは複数の残基が、その位置において、対応する生殖系列残基をもたらすように変化させた生殖系列配列に由来する。
【００７０】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の標的結合剤または抗体とＳｈｈへの結合を求めて競合する標的結合剤または抗体である。本発明の別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体とＳｈｈへの結合を求めて競合する抗体がある。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、任意の１つの完全ヒトモノクローナル抗体とＳｈｈへの結合を求めて競合する。「競合する」とは、この標的結合剤または抗体が任意の１つの完全ヒトモノクローナル抗体１Ａ１２、１Ｇ１２、１Ｈ１０、３Ｈ８、４Ｂ６、１Ｇ１、１Ｆ４、１Ｈ８、１Ｈ１２、１Ｃ８、１Ａ５、６Ｄ７、６Ｄ７ＯＰ、６Ｄ７ＯＰ２、３Ｈ８ＯＰ、または１Ｇ１ＯＰとＳｈｈへの結合を求めて競合する、すなわち競合は一方向であることを示す。
【００７１】
本発明の実施形態は、任意の１つの完全ヒトモノクローナル抗体１Ａ１２、１Ｇ１２、１Ｈ１０、３Ｈ８、４Ｂ６、１Ｇ１、１Ｆ４、１Ｈ８、１Ｈ１２、１Ｃ８、１Ａ５、６Ｄ７、６Ｄ７ＯＰ、６Ｄ７ＯＰ２、３Ｈ８ＯＰ、または１Ｇ１ＯＰとＳｈｈへの結合を求めて相互に競合する標的結合剤または抗体を含む。「相互に競合する」とは、この標的結合剤または抗体が、任意の１つの完全ヒトモノクローナル抗体１Ａ１２、１Ｇ１２、１Ｈ１０、３Ｈ８、４Ｂ６、１Ｇ１、１Ｆ４、１Ｈ８、１Ｈ１２、１Ｃ８、１Ａ５、６Ｄ７、６Ｄ７ＯＰ、６Ｄ７ＯＰ２、３Ｈ８ＯＰ、または１Ｇ１ＯＰとＳｈｈへの結合を求めて競合し、逆もまた同様である、すなわち競合が両方向であることを示す。
【００７２】
本発明のさらなる実施形態は、Ｓｈｈへの結合を求めて競合する標的結合剤または抗体である。本発明の別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体とＳｈｈへの結合を求めて相互に競合する標的結合剤または抗体がある。
【００７３】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の標的結合剤または抗体と同じＳｈｈ上のエピトープに結合する標的結合剤または抗体である。本発明の実施形態は、任意の１つの完全ヒトモノクローナル抗体１Ａ１２、１Ｇ１２、１Ｈ１０、３Ｈ８、４Ｂ６、１Ｇ１、１Ｆ４、１Ｈ８、１Ｈ１２、１Ｃ８、１Ａ５、６Ｄ７、６Ｄ７ＯＰ、６Ｄ７ＯＰ２、３Ｈ８ＯＰ、または１Ｇ１ＯＰと同じＳｈｈ上のエピトープに結合する標的結合剤または抗体も含む。
【００７４】
本発明の他の実施形態は、本明細書記載の任意の標的結合剤または抗体をコードする単離した核酸分子、本明細書記載の標的結合剤または抗体をコードする単離した核酸分子を有するベクターまたはかかる任意の核酸分子で形質転換した宿主細胞を含む。本発明の実施形態は、特異的にＳｈｈと結合し、ＳｈｈのＰａｔｃｈｅｄ−１への結合を阻害する完全なヒトの単離した標的結合剤をコードする核酸分子を含む。本発明は、本明細書において定義されるようなストリンジェントなまたはストリンジェントが低いハイブリダイゼーションの条件下、本明細書記載の任意の標的結合剤または抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドも含む。本発明の実施形態は、この結合剤をコードする核酸分子を含むベクターも含む。追加の実施形態は、この核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を含む。
【００７５】
当該技術分野において知られるように、抗体は、有利に、例えば、ポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および／または完全ヒト抗体であり得る。
【００７６】
本発明の実施形態が、いずれの特定の型の抗体または産生方法もしくは生産方法にも限定されないことが理解されるであろう。本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤は完全ヒトモノクローナル抗体の結合断片である。例えば、この標的結合剤は、（例えば、インタクトなヒトＦｃ領域を有する）完全長の抗体または抗体結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’もしくはＦ（ａｂ’）２、ＦＶまたはｄＡｂ）であり得る。さらに、これらの抗体は、ｄＡｂ断片のような、Ｓｈｈに結合するラクダまたはヒトの単一ＶＨもしくはＶＬ領域のような単一領域抗体であり得る。
【００７７】
本明細書記載の本発明の実施形態は、これらの抗体を産生するための細胞も提供する。細胞の例として、Ｓｈｈに対する抗体を産生するハイブリドーマ、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ細胞のバリアント（例えば、ＤＧ４４）およびＮＳ０細胞のようなＳｈｈに対する抗体を産生する組換え細胞が挙げられる。ＣＨＯ細胞のバリアントの詳細情報は、Ａｎｄｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｒｅｉｌｌｙ（２００４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１５、４５６−４６２の中で見出し得、これは参照により本明細書にその全体が組み込まれる。この抗体は、この抗体を分泌するハイブリドーマから、またはこの抗体をコードする１つまたは複数の遺伝子で形質転換またはトランスフェクトされている組換え操作された細胞から製造し得る。
【００７８】
さらに、本発明の一実施形態は、本発明の抗体を産生するために核酸分子を発現させてからこの抗体を回収する条件下、宿主細胞を培養することによって本発明の抗体を産生する方法である。本発明の実施形態は、抗体産生のために宿主細胞にトランスフェクトした時、抗体または抗体の断片の収率を増加させるために最適化された核酸配列を含む、本発明の抗体または抗体の断片をコードする任意の核酸分子も含むことを認識されたい。
【００７９】
本明細書のさらなる実施形態は、ヒトＳｈｈを発現する細胞、ヒトＳｈｈを含む単離した細胞膜、精製したヒトＳｈｈ、もしくはその断片、および／または１つまたは複数のそのオルソロガスな配列もしくはその断片を用いて哺乳動物を免疫化することによって、特異的にＳｈｈと結合し、Ｓｈｈの生物活性を阻害する抗体を産生する方法を含む。
【００８０】
他の実施形態において、本発明は、本発明の標的結合剤もしくは抗体、またはその結合断片、および製薬上許容可能な担体もしくは希釈剤を含む組成物を提供する。
【００８１】
本発明のさらなる実施形態は、治療有効量の、Ｓｈｈに特異的に結合する標的結合剤を動物に投与することによって、増殖性疾患、血管新生疾患を患う動物を効果的に治療する方法を含む。特定の実施形態において、この方法は、腫瘍、ガン、および／または細胞増殖性疾患の治療を必要としている動物を選択し、治療有効量の、Ｓｈｈに特異的に結合する標的結合剤をその動物に投与することをさらに含む。
【００８２】
本発明のさらなる実施形態は、治療有効量の、Ｓｈｈに特異的に結合する標的結合剤を動物に投与することによって、腫瘍性疾患を患う動物を効果的に治療する方法を含む。特定の実施形態において、この方法は、腫瘍性疾患の治療を必要としている動物を選択し、治療有効量の、Ｓｈｈに特異的に結合する標的結合剤をその動物に投与することをさらに含む。
【００８３】
本発明のさらなる実施形態は、治療有効量の、Ｓｈｈに特異的に結合する標的結合剤を動物に投与することによって、悪性腫瘍を患う動物を効果的に治療する方法を含む。特定の実施形態において、この方法は、悪性腫瘍の治療を必要としている動物を選択し、治療有効量の、Ｓｈｈに特異的に結合する標的結合剤をその動物に投与することをさらに含む。
【００８４】
本発明のさらなる実施形態は、治療有効量の、Ｓｈｈに特異的に結合する標的結合剤を動物に投与することによって、Ｓｈｈ発現と関連する疾患または症状を患う動物を効果的に治療する方法を含む。特定の実施形態において、この方法は、Ｓｈｈ発現と関連する疾患または症状の治療を必要としている動物を選択し、治療有効量の、Ｓｈｈに特異的に結合する標的結合剤をその動物に投与することをさらに含む。
【００８５】
悪性腫瘍は、黒色腫、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、グリオーマ、肝細胞（肝臓）ガン、甲状腺腫瘍、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））ガン、前立腺ガン、乳ガン、卵巣ガン、膀胱ガン、肺ガン、グリア芽腫、子宮内膜ガン、腎臓ガン、結腸ガン、膵臓ガン、食道ガン、頭頸部ガン、中皮腫、肉腫、胆管（ｂｉｌｉａｒｙ）ガン（胆管ガン（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ））、小腸腺ガン、小児悪性腫瘍および扁平上皮ガンからなる群から選択され得る。
【００８６】
治療可能な増殖性疾患または血管新生疾患は、黒色腫、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、グリオーマ、進行型非小細胞肺ガン、肝細胞（肝臓）ガン、甲状腺腫瘍、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））ガン、胆嚢ガン、前立腺ガン、乳ガン、卵巣ガン、膀胱ガン、腎細胞ガン、肺ガン、グリア芽腫、子宮内膜ガン、腎臓ガン、結腸ガン、膵臓ガン、食道ガン、頭頸部ガン、中皮腫、肉腫、胆管（ｂｉｌｉａｒｙ）ガン（胆管ガン（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ））、小腸腺ガン、小児悪性腫瘍、扁平上皮ガンならびにＧｌｅｅｖｅｃ耐性ＣＭＬを含む慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む白血病、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、ならびに多発性骨髄腫を含む骨髄腫のような腫瘍性疾患を含む。一実施形態において、本発明は、Ｓｈｈのみに依存する、またはＳｈｈに部分的に依存する腫瘍患者のＳｈｈの阻害における使用に適している。
【００８７】
本発明のさらなる実施形態は、増殖性関連疾患または血管新生関連疾患を患う動物の治療のための薬剤調製における、本発明の標的結合剤または抗体の使用を含む。特定の実施形態において、この使用は、増殖性関連疾患または血管新生関連疾患の治療を必要としている動物を選択することをさらに含む。
【００８８】
本発明のさらなる実施形態は、腫瘍性疾患を患う動物の治療のための薬剤調製における、本発明の標的結合剤または抗体の使用を含む。特定の実施形態において、この使用は、腫瘍性疾患の治療を必要としている動物を選択することをさらに含む。
【００８９】
本発明のさらなる実施形態は、非腫瘍性疾患を患う動物の治療のための薬剤調製における、本発明の標的結合剤または抗体の使用を含む。特定の実施形態において、この使用は、非腫瘍性疾患の治療を必要としている動物を選択することをさらに含む。
【００９０】
本発明のさらなる実施形態は、悪性腫瘍を患う動物の治療のための薬剤調製における、本発明の標的結合剤または抗体の使用を含む。特定の実施形態において、この使用は、悪性腫瘍の治療を必要としている動物を選択することをさらに含む。
【００９１】
本発明のさらなる実施形態は、Ｓｈｈ発現に関連する疾患または症状を患う動物の治療のための薬剤調製における、本発明の標的結合剤または抗体の使用を含む。特定の実施形態において、この使用は、Ｓｈｈ発現に関連する疾患または症状の治療を必要としている動物を選択することをさらに含む。
【００９２】
本発明のさらなる実施形態は、増殖性関連疾患または血管新生関連疾患を患う動物の治療のための薬剤として使用するための本発明の標的結合剤または抗体を含む。
【００９３】
本発明のさらなる実施形態は、腫瘍性疾患を患う動物の治療のための薬剤として使用するための本発明の標的結合剤または抗体を含む。
【００９４】
本発明のさらなる実施形態は、悪性腫瘍を患う動物の治療のための薬剤として使用するための本発明の標的結合剤または抗体を含む。
【００９５】
本発明のさらなる実施形態は、Ｓｈｈ発現に関連する疾患または症状を患う動物の治療のための薬剤として使用するための本発明の標的結合剤または抗体を含む。
【００９６】
本発明のさらなる実施形態は、Ｓｈｈ誘発性疾患を患う動物の治療のための薬剤として使用するための本発明の標的結合剤または抗体を含む。
【００９７】
一実施形態において、
腫瘍性疾患；
悪性腫瘍；
神経疾患；
眼疾患；
慢性炎症性疾患；または
Ｓｈｈ発現に関連する疾患または症状
の治療は、任意の前述の疾患または症状を管理する、改善する、予防することを含む。
【００９８】
一実施形態において、腫瘍性疾患の治療は、腫瘍増殖の阻害、腫瘍増殖の遅延化、腫瘍の軽減、腫瘍の縮小、治療中断時の腫瘍再増殖までの時間の延長、腫瘍再発までの時間の延長、疾患進行の緩徐化を含む。
【００９９】
本発明のいくつかの実施形態において、治療される動物はヒトである。
【０１００】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【０１０１】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤は、完全ヒトモノクローナル抗体１Ａ１２、１Ｇ１２、１Ｈ１０、３Ｈ８、４Ｂ６、１Ｇ１、１Ｆ４、１Ｈ８、１Ｈ１２、１Ｃ８、１Ａ５、６Ｄ７、６Ｄ７ＯＰ、６Ｄ７ＯＰ２、３Ｈ８ＯＰ、または１Ｇ１ＯＰからなる群から選択される。
【０１０２】
本発明の実施形態は、本明細書記載の標的結合剤および治療薬を含む結合体を含む。本発明のいくつかの実施形態において、この治療薬は毒素である。他の実施形態において、この治療薬は放射性同位体である。さらに他の実施形態において、この治療薬は医薬組成物である。
【０１０３】
別の態様において、患者のガン性細胞を選択的に殺す方法を提供する。この方法は、患者に完全ヒト抗体結合体を投与することを含む。この完全ヒト抗体結合体は、Ｓｈｈと結合し得る抗体および薬剤を含む。この薬剤は毒、放射性同位体、またはガン細胞を殺す別の物質である。従って、この抗体結合体は、選択的にガン細胞を殺す。
【０１０４】
一態様において、Ｓｈｈへ特異的に結合する接合された完全ヒト抗体を提供する。抗体に薬剤が付着し、この抗体が細胞に結合すると、この薬剤がこの細胞へ送達される。一実施形態において、上記の接合された完全ヒト抗体は、Ｓｈｈの細胞外領域に結合する。別の実施形態において、この抗体および接合された毒素は、Ｓｈｈを発現する細胞によって内部に移行する。別の実施形態において、この薬剤は細胞毒性剤である。別の実施形態において、この薬剤は、例えば、サポリン、またはアウリスタチン、緑膿菌外毒素、ゲロニン、リシン、カリケアマイシンもしくはマイタンシンに基づく免疫結合体などである。さらに別の実施形態において、この薬剤は放射性同位体である。
【０１０５】
本発明の標的結合剤または抗体は、単独で投与することもでき、追加的抗体もしくは化学療法薬または放射線治療と組み合わせて投与することもできる。例えば、細胞増殖を阻止するＳｈｈ抗体のモノクローナル、オリゴクローナルまたはポリクローナル混合物は、腫瘍細胞増殖を阻害することが示された薬剤と組み合わせて投与することができる。さらに、本発明のＳｈｈ標的結合剤は、他の化学療法治療、例えば、抗ＶＥＧＦ剤を含む治療が無効であった患者において使用できる。
【０１０６】
本発明の別の実施形態は、疾患または症状を診断する方法を含み、ここで本明細書に開示された抗体は患者または患者試料中のＳｈｈ量を検出するために利用される。一実施形態において、患者試料は血液または血清または尿である。さらなる実施形態において、危険因子の同定、疾患の診断、および疾患の病期分類の方法が提供され、この方法は、抗Ｓｈｈ抗体を使用するＳｈｈの発現および／または過剰発現の同定を含む。いくつかの実施形態において、この方法は、細胞上のＳｈｈに選択的に結合する完全ヒト抗体結合体を患者に投与することを含む。この抗体結合体は、Ｓｈｈに特異的に結合する抗体および標識を含む。この方法は、患者における標識の存在を観察することをさらに含む。相対量の多い標識は、相対的リスクの高い疾患を示し、相対量の少ない標識は、相対的リスクの低い疾患を示す。一実施形態において、この標識は緑色蛍光タンパク質である。
【０１０７】
本発明は、患者試料中のＳｈｈ量をアッセイする方法をさらに提供し、この方法は本明細書に開示される抗体を患者由来の生体試料と接触させることと、前記試料中のＳｈｈと前記抗体との結合量を検出することを含む。より具体的な実施形態において、生体試料は血液、血漿または血清である。
【０１０８】
本発明の別の実施形態は、血清または細胞を本明細書に開示された抗体と接触させ、その後、Ｓｈｈの存在を検出することによって、細胞内のＳｈｈ発現と関連する症状を診断する方法を含む。一実施形態において、この症状は、腫瘍性疾患を含むがそれに限定されない増殖性関連疾患であり得る。
【０１０９】
別の実施形態において、本発明は、Ｓｈｈ関連疾患を選別するために、哺乳動物の組織、細胞、または体液中のＳｈｈを検出するアッセイキットを含む。このキットは、本明細書に開示される抗体、および存在する場合、抗体のＳｈｈとの反応を示すための手段を含む。一実施形態において、この抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態において、Ｓｈｈに結合する抗体は標識される。別の実施形態において、この抗体は標識されない一次抗体であり、このキットはこの一次抗体を検出する手段をさらに含む。一実施形態において、検出するための手段は、抗免疫グロブリンである標識された二次抗体を含む。この抗体は、蛍光色素、酵素、放射線核種および放射線不透過物質からなる群から選択されたマーカーで標識され得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体は、補体に結合し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に関与する能力を高めるように修飾できる。他の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、エフェクター細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する能力を高めるように修飾できる。さらに他の実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体は、エフェクター細胞を活性化して抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する能力を高めることと、補体に結合して補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に関与する能力を高めることの両方のために修飾できる。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体は、補体に結合し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に関与する能力を低下させるように修飾できる。他の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、エフェクター細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する能力を低下させるように修飾できる。さらに他の実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体は、エフェクター細胞を活性化して抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する能力を低下させることと、補体に結合して補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に関与する能力を低下させることの両方のために修飾できる。
【０１１２】
特定の実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体の半減期および本発明の組成物の半減期は、少なくとも約４〜７日間である。特定の実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体の平均半減期および本発明の組成物の平均半減期は、少なくとも約２〜５日間、３〜６日間、４〜７日間、５〜８日間、６〜９日間、７〜１０日間、８〜１１日間、８〜１２日間、９〜１３日間、１０〜１４日間、１１〜１５日間、１２〜１６日間、１３〜１７日間、１４〜１８日間、１５〜１９日間、または１６〜２０日間である。他の実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体の平均半減期および本発明の組成物の平均半減期は、少なくとも約１７〜２１日間、１８〜２２日間、１９〜２３日間、２０〜２４日間、２１〜２５日間、２２〜２６日間、２３〜２７日間、２４〜２８日間、２５〜２９日間、または２６〜３０日間である。さらなる実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体の半減期および本発明の組成物の半減期は、最長約５０日間であり得る。特定の実施形態において、本発明の抗体および組成物の半減期は、当該技術分野において知られる方法によって延長できる。かかる延長は、次に、抗体組成物の投与量および／または投与頻度を減少させ得る。インビボ半減期が改善された抗体およびそれらの抗体を調製する方法は、米国特許第６，２７７，３７５号、ならびに国際公開ＷＯ９８／２３２８９号およびＷＯ９７／４６６１号に開示されている。
【０１１３】
別の実施形態において、本発明は容器を含む製品を提供する。この容器は、本明細書に開示される標的結合剤または抗体を含む組成物を含み、Ｓｈｈの発現または過剰発現によって特徴付けられる疾患を含むがそれらに限定されない細胞増殖関連疾患を治療するために、この組成物が使用できることを示す添付文書または表示を含む。
【０１１４】
他の実施形態において、本発明は、本明細書に開示される標的結合剤もしくは抗体を含む組成物、ならびに治療を必要としている被験体にこの組成物を投与するための使用説明書を含むキットを提供する。
【０１１５】
本発明は、バリアントＦｃ領域を含むタンパク質の製剤を提供する。これは、天然に存在しないＦｃ領域、例えば、１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸残基を含むＦｃ領域である。アミノ酸の欠失、付加および／または修飾を含むＦｃ領域も、本発明のバリアントＦｃ領域に含まれる。
【０１１６】
Ｆｃ領域を含むタンパク質の血清半減期は、このＦｃ領域のＦｃＲｎに対する結合親和性を増加することによって増加し得る。一実施形態において、このＦｃバリアントタンパク質は類似分子と比べて血清半減期が高まっている。
【０１１７】
別の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３９、３３０および３３２からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含むＦｃバリアントを提供する。具体的な実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３９Ｄ、３３０Ｌおよび３３２Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含むＦｃバリアントを提供する。任意で、このＦｃ領域は、カバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２５２、２５４、および２５６からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、天然に存在しない追加的アミノ酸をさらに含み得る。具体的な実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３９Ｄ、３３０Ｌおよび３３２Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸、ならびにカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅからなる群から選択される１つまたは複数の位置で、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含むＦｃバリアントを提供する。
【０１１８】
別の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３４、２３５および３３１からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含むＦｃバリアントを提供する。具体的な実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙおよび３３１Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含むＦｃバリアントを提供する。さらに具体的な実施形態において、本発明のＦｃバリアントは、カバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３４Ｆ、２３５Ｆ、および３３１Ｓの天然に存在しないアミノ酸残基を含む。別の具体的な実施形態において、本発明のＦｃバリアントは、カバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３４Ｆ、２３５Ｙ、および３３１Ｓの天然に存在しないアミノ酸残基を含む。任意で、このＦｃ領域は、カバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２５２、２５４、および２５６からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、天然に存在しない追加的アミノ酸をさらに含み得る。具体的な実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙおよび３３１Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含み、１つまたは複数の位置にある少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅからなる群から選択されるＦｃバリアントを提供する。
【０１１９】
別の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３９、３３０および３３２からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含むＦｃバリアントタンパク質製剤を提供する。具体的な実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３９Ｄ、３３０Ｌおよび３３２Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含むＦｃバリアントタンパク質製剤を提供する。任意で、このＦｃ領域は、カバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２５２、２５４、および２５６からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、天然に存在しない追加的アミノ酸をさらに含み得る。具体的な実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３９Ｄ、３３０Ｌおよび３３２Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含み、１つまたは複数の位置にある少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅからなる群から選択されるＦｃバリアントタンパク質製剤を提供する。
【０１２０】
別の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３４、２３５および３３１からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含むＦｃバリアントタンパク質製剤を提供する。具体的な実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙおよび３３１Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含むＦｃバリアントタンパク質製剤を提供する。任意で、このＦｃ領域は、カバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２５２、２５４、および２５６からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、天然に存在しない追加的アミノ酸をさらに含み得る。具体的な実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙおよび３３１Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含み、１つまたは複数の位置にある少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅからなる群から選択されるＦｃバリアントタンパク質製剤を提供する。
【０１２１】
天然に存在しないＦｃ領域を生成する方法は、当該技術分野において知られている。例えば、アミノ酸の置換および／または欠失は、部位特異的変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ８２：４８８−４９２（１９８５））、ＰＣＲ変異誘発（Ｈｉｇｕｃｈｉ,ｉｎ“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”,Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ,Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ,ｐｐ.１７７−１８３（１９９０））、ならびにカセット式変異誘発（Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ,Ｇｅｎｅ４６：３１５−３２３（１９８５））を含むがそれらに限定されない突然変異誘発法によって生成し得る。好ましくは、部位特異的変異誘発は、オーバーラップ伸長ＰＣＲ法によって行い得る（Ｈｉｇｕｃｈｉ,ｉｎ“ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”,Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ,Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ,ｐｐ.６１−７０（１９８９））。オーバーラップ伸長ＰＣＲの技術（前記Ｈｉｇｕｃｈｉ）は、標的配列（開始ＤＮＡ）に任意の所望の（１つまたは複数の）変異を導入するためにも使用できる。例えば、オーバーラップ伸長法におけるＰＣＲの第１段階は、外側プライマー（プライマー１）および内部変異誘発プライマー（プライマー３）を用いて、ならびに第２外側プライマー（プライマー４）と内部プライマー（プライマー２）を用いて別個に標的配列を増幅し、２つのＰＣＲ断片（断片Ａおよび断片Ｂ）を得ることを含む。内部変異誘発プライマー（プライマー３）は、標的配列に対して所望の（１つまたは複数の）変異を特定するミスマッチを含むように設計される。ＰＣＲの第２段階において、ＰＣＲの第１段階の産物（断片Ａおよび断片Ｂ）は、２つの外側プライマー（プライマー１および４）を使用するＰＣＲによって増幅される。生成した全長ＰＣＲ断片（断片Ｃ）は制限酵素で切断され、生成した制限断片は適切なベクターにクローニングされる。変異誘発の第１ステップとして、（例えば、Ｆｃ融合タンパク質、抗体または単にＦｃ領域をコードする）開始ＤＮＡは、変異誘発ベクターに動作可能にクローニングされる。これらプライマーは、所望のアミノ酸置換を反映するように設計される。バリアントＦｃ領域を生成する有用な他の方法が、当該技術分野において知られている（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号、同第５，８８５，５７３号、同第５，６７７，４２５号、同第６，１６５，７４５号、同第６，２７７，３７５号、同第５，８６９，０４６号、同第６，１２１，０２２号、同第５，６２４，８２１号、同第５，６４８，２６０号、同第６，５２８，６２４号、同第６，１９４，５５１号、同第６，７３７，０５６号、同第６，８２１，５０５号、同第６，２７７，３７５号、米国特許公開第２００４／０００２５８７号、ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１号、ＷＯ９９／５８５７２号、ＷＯ００／４２０７２号、ＷＯ０２／０６０９１９号、ＷＯ０４／０２９２０７号、ＷＯ０４／０９９２４９号、ＷＯ０４／０６３３５１号参照）。
【０１２２】
本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗体の糖鎖付加パターンは、ＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能を高めるために修飾される。Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ ｅｔ ａｌ,（２００２）ＪＢＣ.２７７：２６７３３；Ｓｈｉｎｋａｗａ Ｔ ｅｔ ａｌ,（２００３）ＪＢＣ.２７８：４６６６およびＯｋａｚａｋｉ Ａ ｅｔ ａｌ,（２００４）Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.,３３６：１２３９を参照されたい。いくつかの実施形態において、Ｆｃバリアントタンパク質は、１つまたは複数の改変した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）グリコフォーム、すなわちＦｃ領域を含む分子と共有結合している炭水化物組成物を含む。改変したグリコフォームは、エフェクター機能を高めるまたは低下させることを含むがそれらに限定されない様々な目的に有用であり得る。改変したグリコフォームは、当業者に知られる任意の方法によって、例えば、改変したもしくはバリアントの発現系を使用することによって、１つもしくは複数の酵素、例えば、ＤＩＮ‐アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１）と共発現することによって、様々な生物もしくは様々な生物由来の細胞系の中でＦｃ領域を含む分子を発現することによって、またはＦｃ領域を含む分子の発現後に（１つまたは複数の）炭水化物を修飾することによって産生し得る。改変したグリコフォームを生成する方法は、当該技術分野において知られており、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ,１９９９,Ｎａｔ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ,２００１７ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ７４：２８８−２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ,２００２,Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ,２００３,Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：４６６６−４６７３、米国特許第６，６０２，６８４号;米国特許出願第１０／２７７，３７０号;米国特許出願第１０／１１３，９２９号;ＰＣＴＷＯ００／６１７３９Ａ１号;ＰＣＴＷＯ０１／２９２２４６Ａ１号;ＰＣＴＷＯ０２／３１１１４０Ａ１号;ＰＣＴＷＯ０２／３０９５４Ａ１号;Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ,Ｉｎｃ.Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ,Ｎ.Ｊ.）；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）糖鎖付加遺伝子工学技術（ＧＬＹＣＡＲＴ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＧ,Ｚｕｒｉｃｈ,Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載される方法を含むがそれらに限定されない。例えば、ＷＯ０００６１７３９号;ＥＡ０１２２９１２５号;米国特許公開第２００３０１１５６１４号;Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ,２００４,ＪＭＢ,３３６：１２３９−４９を参照されたい。
【０１２３】
Ｆｃ領域の糖鎖付加は、エフェクター機能を増加させるまたは減少させるように修飾できることも当該技術分野において知られている（例えば、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ,１９９９,Ｎａｔ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１７：１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ,２００１,Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ７４：２８８−２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ,２００２,Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ,２００３,Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７８：４６６６−４６７３、米国特許第６，６０２，６８４号；米国特許出願第１０／２７７，３７０号；米国特許出願第１０／１１３，９２９号；ＰＣＴＷＯ００／６１７３９Ａ１号、ＰＣＴＷＯ０１／２９２２４６Ａ１号；ＰＣＴＷＯ０２／３１１１４０Ａ１号；ＰＣＴＷＯ０２／３０９５４Ａ１号；Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ,Ｉｎｃ.Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ,Ｎ.Ｊ.）；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）糖鎖付加遺伝子工学技術（ＧＬＹＣＡＲＴ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＧ,Ｚｕｒｉｃｈ,Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）参照）。従って、一実施形態において、本発明の抗体のＦｃ領域は、アミノ酸残基の改変した糖鎖付加を含む。別の実施形態において、アミノ酸残基の改変した糖鎖付加は、エフェクター機能の低下をもたらす。別の実施形態において、アミノ酸残基の改変した糖鎖付加は、エフェクター機能を増加させる。具体的な実施形態において、このＦｃ領域は、フコシル化を減少させている。別の実施形態において、このＦｃ領域はアフコシル化される（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２２６８６７号参照）。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】Ｃｏｌｏ２０５異種移植腫瘍の間質における、特定の抗体によるマウスＧｌｉ１およびＰｔｃ１の薬理学的調節の結果を示す棒グラフを示す。
【図２】棒グラフの形で示したＣｏｌｏ２０５異種移植腫瘍の中の間質ヘッジホッグ標的マウスＧｌｉ１およびＰｔｃ１の量に対して、線グラフとして０．５ｍｇ／ｋｇの単回投与の後の特定の抗体の薬物動態を示す３つのパネルからなる。
【図３Ａ】抗体３Ｈ８によるＨＴ−２９異種移植腫瘍増殖阻害を示す線グラフを示す。
【図３Ｂ】抗体治療によって増殖が阻害されたＨＴ−２９異種移植腫瘍の間質で発現したヘッジホッグ標的遺伝子に対する抗体３Ｈ８の薬理学的効果を示す棒グラフを示す。
【図４Ａ】ヌードマウスにおける、特定の抗体による初期結腸ガン腫瘍モデルＨＣＸＦ−００１の増殖阻害を示す線グラフを示す。
【図４Ｂ】特定の抗体を用いた処置によって増殖が阻害されたＨＸＣＦ−００１異種移植腫瘍の、間質におけるヘッジホッグ標的遺伝子の薬理学的調節の結果を示す棒グラフを示す。
【図５】抗体６Ｄ７によるＨＴ−５５異種移植腫瘍増殖阻害を示す線グラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２５】
本発明の実施形態は、例えば、ＳｈｈのＰａｔｃｈｅｄ１／２への結合を阻害する抗体のような新規セットのＳｈｈブロッキング分子に関する。かかる分子は、単剤として、あるいは、他の結合抗体／結合剤と組み合わせて使用できる。これらの分子は、任意の標準的なまたな新規の抗ガン剤と組み合わせても使用できる。
【０１２６】
本発明の実施形態は、Ｓｈｈに結合する標的結合剤に関する。いくつかの実施形態において、この標的結合剤はＳｈｈに結合し、Ｓｈｈの受容体Ｐａｔｃｈｅｄ−１／２へのＳｈｈの結合を阻害する。いくつかの実施形態において、この結合は、Ｓｈｈ関連作用の１つまたは複数の態様を中和、阻止、阻害、無効、または干渉し得る。一実施形態において、この標的結合剤は、モノクローナル抗体、またはその結合断片である。かかるモノクローナル抗体は、本明細書において抗Ｓｈｈ抗体と称され得る。
【０１２７】
本発明の他の実施形態は、治療に有効な完全ヒト抗Ｓｈｈ抗体および抗体製剤を含む。一実施形態において、本発明の抗Ｓｈｈ抗体の調製は、Ｓｈｈに対する強い結合親和性、内皮細胞アポトーシスを促進するまたは内皮細胞増殖を阻害する能力ならびにＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を介して内皮細胞毒性を誘発する能力を含む所望の治療特性を有する。
【０１２８】
さらに、本発明の実施形態は、疾患を治療するためにこれらの抗体を使用する方法を含む。本発明の抗Ｓｈｈ抗体は、Ｓｈｈ媒介性腫瘍細胞増殖を予防するのに有用である。転移ガン、リンパ腫瘍、および血液ガンを含む任意のタイプの悪性腫瘍によって特徴付けられる任意の疾患は、抗Ｓｈｈ抗体の阻害機序によっても治療することができる。ヒトの典型的なガンは、膀胱腫瘍、腎細胞ガン、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、基底細胞ガン、胆道ガン、膀胱ガン、骨肉腫、脳およびＣＮＳガン（例えば、グリオーマ腫瘍）、子宮頸ガン、絨毛ガン、結腸および直腸ガン、結合組織ガン、消化器ガン；子宮内膜ガン、食道ガン；眼ガン；頭頸部ガン；胃ガン；上皮内新生物；腎ガン；喉頭ガン；白血病；肝臓ガン、（例えば、小細胞および非小細胞）肺ガン、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；黒色腫；多発性骨髄腫を含む骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔（例えば、唇、舌、口、および咽頭）ガン、卵巣ガン；膵臓ガン、網膜芽腫；横紋筋肉腫；直腸ガン、腎ガン、呼吸器系ガン；肉腫、皮膚ガン；胃ガン、精巣ガン、甲状腺ガン；子宮ガン、泌尿器系ガン、ならびに他のガンおよび肉腫を含む。イヌ、ネコ、および他のペットにおいて一般に診断される悪性疾患は、リンパ肉腫、骨肉腫、乳腺腫瘍、肥満細胞腫、脳腫瘍、黒色腫、腺扁平上皮ガン、カルチノイド肺腫瘍、気管支腺腫瘍、気管支腺ガン、線維腫、粘液軟骨腫、肺肉腫、神経肉腫、骨腫、乳頭腫、網膜芽腫、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、バーキットリンパ腫、小膠細胞腫、神経芽細胞腫、骨巨細胞腫、口腔腫瘍、線維肉腫、骨肉腫および横紋筋肉腫、生殖扁平上皮細胞ガン、伝染性の性病の腫瘍、精巣腫瘍、精上皮腫、セルトリ細胞腫瘍、血管周囲細胞腫、組織球腫、緑色腫（例えば、顆粒球性肉腫）、角膜乳頭腫、角膜扁平上皮細胞ガン、血管肉腫、胸膜中皮腫、基底細胞腫、胸腺腫、胃腫瘍、副腎ガン、口腔乳頭腫、血管内皮腫および嚢胞腺腫、濾胞性リンパ腫、腸リンパ肉腫、線維肉腫および肺扁平上皮細胞ガンを含むがそれらに限定されない。フェレットのようなげっ歯類の典型的なガンは、インスリノーマ、リンパ腫、肉腫、神経腫、膵島細胞腫瘍、胃ＭＡＬＴリンパ腫および胃腺ガンを含む。農業家畜に影響を与える腫瘍は、ウシにおいて白血病、血管周囲細胞腫およびウシの眼の腫瘍；ウマにおいて包皮線維肉腫、潰瘍扁平上皮細胞ガン、包皮ガン、結合組織腫瘍および肥満細胞腫；ブタにおいて肝細胞ガン；ヒツジにおいてリンパ腫および肺腺腫症；鳥類において肺肉腫、リンパ腫、ラウス肉腫、細網内皮症、線維肉腫、腎芽細胞腫、Ｂ‐細胞リンパ腫およびリンパ性白血病；魚において網膜芽腫、肝臓異常増殖、リンパ肉腫（リンパ芽球性リンパ腫）、形質細胞白血病および浮袋肉腫；乾酪性リンパ節炎（ＣＬＡ）（細菌のコリネバクテリウム偽結核菌によって引き起こされるヒツジおよびヤギの慢性疾患、感染性疾患、伝染性疾患）ならびにヤーグジークテによって引き起こされるヒツジの伝染性肺腫瘍を含む。
【０１２９】
本発明の他の実施形態は、生体試料中のＳｈｈ量を具体的に決定するための診断アッセイを含む。このアッセイキットは、かかる抗体を検出するために必要な標識と共に本明細書に開示された標的結合剤または抗体を含み得る。これらの診断アッセイは、腫瘍性疾患を含むがそれに限定されない細胞増殖関連疾患をスクリーニングするのに有用である。
【０１３０】
本発明の別の態様は、Ｓｈｈの生物活性のアンタゴニストであり、このアンタゴニストはＳｈｈに結合する。一実施形態において、このアンタゴニストは抗体のような標的結合剤である。このアンタゴニストは、本明細書記載の抗体、例えば、抗体１Ａ１２、１Ｇ１２、１Ｈ１０、３Ｈ８、４Ｂ６、１Ｇ１、１Ｆ４、１Ｈ８、１Ｈ１２、１Ｃ８、１Ａ５、６Ｄ７、６Ｄ７ＯＰ、６Ｄ７ＯＰ２、３Ｈ８ＯＰ、または１Ｇ１ＯＰから選択され得る。
【０１３１】
一実施形態において、Ｓｈｈの生物活性のアンタゴニストはＳｈｈに結合し、その結果リガンドがヘッジホッグ受容体Ｐａｔｃｈｅｄ−１に結合するのを阻害または抑制し、その結果細胞増殖が阻害され得る。
【０１３２】
一実施形態は、完全ヒトモノクローナル抗体１Ａ１２、１Ｇ１２、１Ｈ１０、３Ｈ８、４Ｂ６、１Ｇ１、１Ｆ４、１Ｈ８、１Ｈ１２、１Ｃ８、１Ａ５、６Ｄ７、６Ｄ７ＯＰ、６Ｄ７ＯＰ２、３Ｈ８ＯＰ、または１Ｇ１ＯＰと同じ１つまたは複数のエピトープに結合する標的結合剤である。
【０１３３】
一実施形態は、完全ヒトモノクローナル抗体１Ａ１２、１Ｇ１２、１Ｈ１０、３Ｈ８、４Ｂ６、１Ｇ１、１Ｆ４、１Ｈ８、１Ｈ１２、１Ｃ８、１Ａ５、６Ｄ７、６Ｄ７ＯＰ、６Ｄ７ＯＰ２、３Ｈ８ＯＰ、または１Ｇ１ＯＰと同じ１つまたは複数のエピトープに結合する抗体である。
【０１３４】
一実施形態は、本明細書で上記した標的結合剤を産生するハイブリドーマである。一実施形態は、本明細書で上記した抗体の軽鎖および／または重鎖を産生するハイブリドーマである。一実施形態において、このハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖および／または重鎖を産生する。別の実施形態において、このハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体１Ａ１２、１Ｇ１２、１Ｈ１０、３Ｈ８、４Ｂ６、１Ｇ１、１Ｆ４、１Ｈ８、１Ｈ１２、１Ｃ８、１Ａ５、６Ｄ７、６Ｄ７ＯＰ、６Ｄ７ＯＰ２、３Ｈ８ＯＰ、または１Ｇ１ＯＰの軽鎖および／または重鎖を産生する。あるいは、このハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体１Ａ１２、１Ｇ１２、１Ｈ１０、３Ｈ８、４Ｂ６、１Ｇ１、１Ｆ４、１Ｈ８、１Ｈ１２、１Ｃ８、１Ａ５、６Ｄ７、６Ｄ７ＯＰ、６Ｄ７ＯＰ２、３Ｈ８ＯＰ、または１Ｇ１ＯＰと同じ１つまたは複数のエピトープに結合する抗体を産生し得る。
【０１３５】
別の実施形態は、本明細書で上記した標的結合剤をコードする核酸分子である。一実施形態において、核酸分子は、本明細書で上記した抗体の軽鎖または重鎖をコードする。一実施形態において、この核酸分子は、完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖または重鎖をコードする。さらに別の実施形態は、抗体１Ａ１２、１Ｇ１２、１Ｈ１０、３Ｈ８、４Ｂ６、１Ｇ１、１Ｆ４、１Ｈ８、１Ｈ１２、１Ｃ８、１Ａ５、６Ｄ７、６Ｄ７ＯＰ、６Ｄ７ＯＰ２、３Ｈ８ＯＰ、または１Ｇ１ＯＰから選択される完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖または重鎖をコードする核酸分子である。
【０１３６】
本発明の別の実施形態は、本明細書で上記した１つまたは複数の核酸分子を含むベクターであり、このベクターは、上記に定義される標的結合剤をコードする。本発明の一実施形態において、ベクターは本明細書で上記した１つまたは複数の核酸分子を含み、このベクターは、上記に定義される抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする。
【０１３７】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書で上記したベクターを含む宿主細胞である。あるいは、この宿主細胞は、２つ以上のベクターを含み得る。
【０１３８】
さらに、本発明の一実施形態は、核酸分子が標的結合剤を産生するために発現し、その後この標的結合剤を回収する条件下、宿主細胞を培養することによって本発明の標的結合剤を産生する方法である。本発明の一実施形態は、核酸分子が抗体を産生するために発現し、その後この抗体を回収する条件下、宿主細胞を培養することによって本発明の抗体を産生する方法である。
【０１３９】
一実施形態において、本発明は、本明細書で上記した標的結合剤をコードする少なくとも１つの核酸分子で、少なくとも１つの宿主細胞をトランスフェクトし、宿主細胞の中でこの核酸分子を発現させ、この標的結合剤を単離することによって標的結合剤を作製する方法を含む。一実施形態において、本発明は、本明細書で上記した抗体をコードする少なくとも１つの核酸分子で、少なくとも１つの宿主細胞をトランスフェクトし、宿主細胞の中でこの核酸分子を発現させ、この抗体を単離することによって抗体を作製する方法を含む。
【０１４０】
別の態様に従って、本発明は、本明細書で上記したアンタゴニストを投与することによって、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する方法を含む。この方法は、細胞増殖の治療を必要としている動物を選択し、Ｓｈｈの生物活性の治療有効量のアンタゴニストをその動物に投与することを含み得る。
【０１４１】
本発明の別の態様は、本明細書で上記した標的結合剤を投与することによってＳｈｈの生物活性と拮抗する方法を含む。この方法は、細胞増殖の治療を必要としている動物を選択し、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する治療有効量の標的結合剤を、その動物に投与することを含み得る。
【０１４２】
本発明の別の態様は、本明細書で上記した抗体を投与することによってＳｈｈの生物活性と拮抗する方法を含む。この方法は、細胞増殖の治療を必要としている動物を選択し、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する治療有効量の抗体を、その動物に投与することを含み得る。
【０１４３】
本発明の別の態様によると、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する治療効果のある量のアンタゴニストを投与することによって、動物における細胞増殖を治療する方法を提供する。この方法は、細胞増殖の治療を必要としている動物を選択し、Ｓｈｈの生物活性の治療有効量のアンタゴニストを、その動物に投与することを含み得る。
【０１４４】
本発明の別の態様によると、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する治療効果のある量の標的結合剤を投与することによって、動物における細胞増殖を治療する方法を提供する。この方法は、細胞増殖の治療を必要としている動物を選択し、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する治療有効量の標的結合剤を、その動物に投与することを含み得る。この標的結合剤は単独で投与できる、または追加的抗体もしくは化学療法薬もしくは放射線治療と組み合わせて投与できる。
【０１４５】
別の態様によると、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する治療効果のある量の抗体を投与することによって、動物における細胞増殖を治療する方法を提供する。この方法は、細胞増殖の治療を必要としている動物を選択し、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する治療有効量の抗体を、その動物に投与することを含み得る。この抗体は単独で投与できる、または追加的抗体もしくは化学療法薬もしくは放射線治療と組み合わせて投与できる。
【０１４６】
別の態様によると、Ｓｈｈの生物活性の治療効果のある量のアンタゴニストを投与することによって、動物におけるガンを治療する方法を提供する。この方法は、ガンの治療を必要としている動物を選択し、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する治療有効量のアンタゴニストをその動物に投与することを含み得る。このアンタゴニストは単独で投与できる、または追加的抗体もしくは化学療法薬もしくは放射線治療と組み合わせて投与できる。
【０１４７】
別の態様によると、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する治療効果のある量の標的結合剤を投与することによって、動物におけるガンを治療する方法を提供する。この方法は、ガンの治療を必要としている動物を選択し、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する治療有効量の標的結合剤を、その動物に投与することを含み得る。この標的結合剤は単独で投与できる、または追加的抗体もしくは化学療法薬もしくは放射線治療と組み合わせて投与できる。
【０１４８】
別の態様によると、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する治療効果のある量の抗体を投与することによって、動物におけるガンを治療する方法を提供する。この方法は、ガンの治療を必要としている動物を選択し、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する治療有効量の抗体を、その動物に投与することを含み得る。この抗体は単独で投与できる、または追加的抗体もしくは化学療法薬もしくは放射線治療と組み合わせて投与できる。
【０１４９】
別の態様によると、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する治療効果のある量の抗体を投与することによって、動物における腫瘍細胞増殖を減少させるまたは阻害する方法を提供する。この方法は、増殖の減少または阻害を必要としている動物を選択し、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する治療有効量の抗体を、その動物に投与することを含み得る。この抗体は単独で投与できる、または追加的抗体もしくは化学療法薬もしくは放射線治療と組み合わせて投与できる。
【０１５０】
別の態様によると、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する治療効果のある量の抗体を投与することによって、動物における腫瘍増殖および／または転移を減少させる方法を提供する。この方法は、腫瘍増殖および／または転移の減少を必要としている動物を選択し、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する治療有効量の抗体を、その動物に投与することを含み得る。この抗体は単独で投与できる、または追加的抗体もしくは化学療法薬もしくは放射線治療と組み合わせて投与できる。
【０１５１】
本発明の別の態様によると、細胞増殖の治療の薬剤の製造のために、Ｓｈｈの生物活性のアンタゴニストを使用することを提供する。一実施形態において、Ｓｈｈの生物活性のアンタゴニストは、本発明の標的結合剤である。一実施形態において、Ｓｈｈの生物活性のアンタゴニストは、本発明の抗体である。
【０１５２】
本発明の別の態様によると、細胞増殖の治療の薬剤として使用するための、Ｓｈｈの生物活性のアンタゴニストを提供する。一実施形態において、Ｓｈｈの生物活性のアンタゴニストは、本発明の標的結合剤である。一実施形態において、Ｓｈｈの生物活性のアンタゴニストは、本発明の抗体である。
【０１５３】
本発明の別の態様によると、細胞増殖の治療の薬剤の製造のために、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する標的結合剤または抗体を使用することを提供する。
【０１５４】
本発明の別の態様によると、細胞増殖の治療の薬剤として使用するための、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する標的結合剤または抗体を提供する。
【０１５５】
本発明の別の態様によると、疾患関連細胞増殖の治療の薬剤の製造のために、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する標的結合剤または抗体を使用することを提供する。
【０１５６】
本発明の別の態様によると、疾患関連細胞増殖の治療の薬剤として使用するための、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する抗体を提供する。
【０１５７】
本発明の別の態様によると、哺乳動物のガン治療の薬剤の製造のために、Ｓｈｈの生物活性のアンタゴニストを使用することを提供する。一実施形態において、Ｓｈｈの生物活性のこのアンタゴニストは、本発明の標的結合剤である。一実施形態において、Ｓｈｈの生物活性のこのアンタゴニストは、本発明の抗体である。
【０１５８】
本発明の別の態様によると、哺乳動物のガン治療の薬剤として使用するための、Ｓｈｈの生物活性のアンタゴニストを提供する。一実施形態において、Ｓｈｈの生物活性のこのアンタゴニストは、本発明の標的結合剤である。一実施形態において、Ｓｈｈの生物活性のこのアンタゴニストは、本発明の抗体である。
【０１５９】
本発明の別の態様によると、哺乳動物のガン治療の薬剤の製造のために、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する標的結合剤を使用することを提供する。
【０１６０】
本発明の別の態様によると、哺乳動物のガン治療の薬剤として使用するための、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する標的結合剤を提供する。
【０１６１】
本発明の別の態様によると、哺乳動物のガン治療の薬剤の製造のために、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する抗体を使用することを提供する。
【０１６２】
本発明の別の態様によると、哺乳動物のガン治療の薬剤として使用するための、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する抗体を提供する。
【０１６３】
別の態様によると、哺乳動物における増殖を減少させるもしくは阻害する薬剤の製造のために、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する標的結合剤または抗体を使用することを提供する。
【０１６４】
別の態様によると、哺乳動物における増殖および／または血管新生を減少させるもしくは阻害する薬剤として使用するための、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する標的結合剤または抗体を提供する。
【０１６５】
別の態様によると、哺乳動物における腫瘍増殖および／または転移を減少させる薬剤の製造のために、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する標的結合剤または抗体を使用することを提供する。
【０１６６】
別の態様によると、哺乳動物における腫瘍増殖および／または転移を減少させる薬剤として使用するための、Ｓｈｈの生物活性と拮抗する標的結合剤または抗体を提供する。
【０１６７】
一実施形態において、本発明は、Ｓｈｈ受容体シグナル伝達のみに依存する、または部分的に依存する腫瘍を有する患者において、Ｓｈｈと拮抗するのに特に適している。
【０１６８】
本発明の別の態様によると、Ｓｈｈの生物活性のアンタゴニストおよび製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、このアンタゴニストは抗体を含む。本発明の別の態様によると、Ｓｈｈの生物活性のアンタゴニストおよび製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、このアンタゴニストは抗体を含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、Ｓｈｈに特異的に結合する抗体の投与後、循環している過剰の抗体を血液から除去するために、洗浄剤が投与される。
【０１７０】
抗Ｓｈｈ抗体は、患者試料中のＳｈｈの検出に有用であり、従って、本明細書で上記した病状の診断として有用である。さらに、（以下の実施例で示されるように）Ｓｈｈ媒介性シグナル伝達活性を顕著に阻害する能力に基づいて、抗Ｓｈｈ抗体はＳｈｈ発現に起因する徴候および症状を治療することに治療的効果を有する。具体的な実施形態において、本明細書の抗体および方法は、Ｓｈｈによって誘発される増殖および／または細胞内シグナル伝達に起因する徴候の治療に関する。さらなる実施形態は、黒色腫、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、グリオーマ、肝細胞（肝臓）ガン、甲状腺腫瘍、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））ガン、前立腺ガン、乳ガン、卵巣ガン、膀胱ガン、肺ガン、グリア芽腫、子宮内膜ガン、腎臓ガン、結腸ガン、および膵臓ガンのような腫瘍性疾患を含む細胞増殖関連疾患を治療するために、本明細書で上記した抗体および方法を使用することを含む。
【０１７１】
本発明の別の実施形態は、細胞増殖関連疾患をスクリーニングするために、哺乳動物の組織、細胞、または体液において、Ｓｈｈを検出するアッセイキットを含む。このキットは、Ｓｈｈと結合する標的結合剤、および存在する場合、この標的結合剤とＳｈｈの反応を示す手段を含む。一実施形態において、Ｓｈｈと結合する標的結合剤は標識されている。別の実施形態において、この標的結合剤は標識されていない薬剤で、このキットはこの標的結合剤を検出するための手段をさらに含む。好ましくは、この標的結合剤は、蛍光色素、酵素、放射線核種および放射線不透過物質からなる群から選択されるマーカーで標識される。
【０１７２】
本発明の別の実施形態は、増殖関連疾患をスクリーニングするために、哺乳動物の組織、細胞、または体液において、Ｓｈｈを検出するアッセイキットを含む。このキットは、Ｓｈｈに結合する抗体、および存在する場合、この抗体とＳｈｈの反応を示すための手段を含む。この抗体は、モノクローナル抗体であり得る。一実施形態において、Ｓｈｈに結合する抗体は標識されている。別の実施形態において、この抗体は標識されていない一次抗体で、このキットはこの一次抗体を検出するための手段をさらに含む。一実施形態において、この手段は、抗免疫グロブリンである標識された二次抗体を含む。好ましくは、この抗体は、蛍光色素、酵素、放射線核種および放射線不透過物質からなる群から選択されるマーカーで標識される。
【０１７３】
本明細書に開示された抗体に関するさらなる実施形態、特徴などは、以下の追加的な詳細の中で提供される。
【０１７４】
配列表
本発明の実施形態は、以下の表１に記載した特異的抗体を含む。この表は、対応する重鎖および軽鎖の遺伝子ならびにポリペプチド各々の可変領域の配列番号と共に、各々の抗Ｓｈｈ抗体の認識番号を示す。各々の抗体に認識番号を与えた。
【表１】
2012502967.tif 000002
2012502967.tif 000003
【０１７５】
定義
特に定義されない限り、本明細書において使用する科学および専門用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、本文が特に必要としない限り、単数用語は複数形を含み、複数用語は単数形を含む。一般に、本明細書で上記した細胞および組織の培養、分子生物学、およびタンパク質化学、オリゴまたはポリヌクレオチド化学、およびハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法および技術は、当該技術分野においてよく知られており、一般に使用されているものである。
【０１７６】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために標準的な技術が使用される。酵素反応および精製技術は製造業者の取扱説明書に従って、または当該技術分野において一般に達成されるようにまたは本明細書で上記したように行われる。前述の技術および手順は、一般に、当該技術分野においてよく知られている従来方法に従って、ならびに本明細書全体を通して引用および説明される一般的およびより具体的な様々な参考文献の中に記載されたように行った。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ. Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ, Ｎ.Ｙ.（２００１））を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる。本明細書記載の分析化学、有機合成化学、および医薬化学と関連して利用される命名法ならびにそれらの検査法および検査技術は、当該技術分野においてよく知られており、一般に使用されるものである。標準的技術は、化学合成、化学分析、医薬調製、医薬処方、および医薬送達、ならびに患者の治療に使用される。
【０１７７】
本開示に従って利用されるように、以下の用語は、特に示されない限り、以下の意味を有するものと理解される。
【０１７８】
アンタゴニストまたは阻害剤は、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、低分子量化合物、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、アンチセンス、組換えタンパク質、抗体、またはそれらの断片もしくはそれらの接合体もしくはそれらの融合タンパク質であり得る。ＲＮＡｉの総説としてＭｉｌｈａｖｅｔ Ｏ，Ｇａｒｙ ＤＳ，Ｍａｔｔｓｏｎ ＭＰ．（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ.２００３ Ｄｅｃ：５５（４）：６２９−４８.Ｒｅｖｉｅｗ）を、アンチセンスの総説としてＯｐａｌｉｎｓｋａ ＪＢ，Ｇｅｗｉｒｔｚ ＡＭ．（Ｓｃｉ ＳＴＫＥ.２００３ Ｏｃｔ ２８：２００３（２０６）：ｐｅ４７.）を参照されたい。
【０１７９】
化合物とは、約２０００ダルトン未満の分子量を有する任意の低分子量化合物を表す。
【０１８０】
「ソニック・ヘッジホッグホモログ」または「Ｓｈｈ」という用語は、ソニック・ヘッジホッグホモログタンパク質、またＨＨＧ１、ＨＨＧ−１、ＨＬＰ３、ＨＰＥ３、ＳＭＭＣＩ、ＴＰＴ、ＴＰＴＰＳ、ＭＣＯＰＣＢ５、およびソニック・ヘッジホッグタンパク質前駆体として知られる分子を表す。
【０１８１】
「中和する」または「阻害する」という用語は、抗体のような標的結合剤を表す時、標的抗原の活性を除去する、減少させる、または顕著に減少させる抗体の能力に関連する。従って、本発明の「中和」抗Ｓｈｈ抗体は、Ｓｈｈ活性を除去するまたは顕著に減少させることができる。中和Ｓｈｈ抗体は、例えば、Ｓｈｈ受容体Ｐａｔｃｈｅｄ、例えば、Ｐａｔｃｈｅｄ−１またはＰａｔｃｈｅｄ−２へのＳｈｈの結合を阻止することによって作用し得る。この結合を阻止することによって、Ｓｈｈシグナル伝達に仲介される活性は顕著に、または完全に除去される。理想的には、Ｓｈｈに対する中和抗体は、腫瘍細胞増殖を阻害するか、または腫瘍細胞増殖を促進する因子の間質細胞による生産を阻害するか、またはガン幹細胞の自己再生を阻害する。
【０１８２】
「Ｓｈｈの生物活性のアンタゴニスト」は、Ｓｈｈ活性を除去する、減少させるまたは顕著に減少させることができる。「Ｓｈｈの生物活性のアンタゴニスト」は、Ｓｈｈシグナル伝達を除去する、減少させるまたは顕著に減少させることができる。「Ｓｈｈの生物活性のアンタゴニスト」は、腫瘍細胞増殖を除去し得るまたは顕著に減少させ得る。
【０１８３】
「Ｓｈｈシグナル伝達を減少する」とは、本発明の標的結合剤、抗体またはアンタゴニストが存在しない場合におけるシグナル伝達量と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％のＳｈｈシグナル伝達の減少を含む。
【０１８４】
「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチド配列を有する天然のタンパク質、断片、または類似体を表すために、一般用語として本明細書において使用される。それゆえ、天然のタンパク質、断片、および類似体は、ポリペプチド属の種である。本発明に従った好ましいポリペプチドは、κまたはλ軽鎖免疫グロブリン分子のような軽鎖免疫グロブリン分子、ならびにそれらの断片および類似体と重鎖免疫グロブリン分子を含む組み合わせによって、ならびに逆もまた同様に形成されるヒト重鎖免疫グロブリン分子およびヒトκ軽鎖免疫グロブリン分子、および抗体分子を含む。本発明に従った好ましいポリペプチドは、単に、ヒト重鎖免疫グロブリン分子またはその断片も含み得る。
【０１８５】
「最適化」された配列は、可変重鎖または軽鎖配列のＣＤＲおよび／またはフレームワーク配列が、１つまたは複数の非生殖系列配列を除去するために変異させた抗体配列であり、糖鎖付加部位または対になっていないシステインのような配列からの構造的障害の除去をさらに含み得る。
【０１８６】
物に適用され、本明細書において使用される時、「天然」または「天然に存在する」という用語は、物が自然界で見つけられ得る事実を表す。例えば、自然界の供給源から単離できる（ウイルスを含む）生物に存在し、実験室でヒトによってまたは別の方法によって意図的に修飾されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は天然に存在する。
【０１８７】
本明細書において使用される時、「動作可能に連結する」という用語は、構成成分の目的とする方法でそれらの構成成分が機能できる関係にあると表される構成成分の位置を表す。例えば、コード配列に「動作可能に連結された」対照配列は、対照配列と両立する条件下、コード配列が発現するという方法で結合される。
【０１８８】
本明細書において表される時、「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも１０塩基長のヌクレオチド（リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）の重合体型、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾型、またはＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ２本鎖を意味する。この用語は、ＤＮＡの１本鎖および２本鎖型を含む。
【０１８９】
本明細書において表される時、「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然に存在する、および天然に存在しない結合によって共に連結された天然に存在する、および修飾されたヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に２００塩基以下の塩基長を含むポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは１０〜６０塩基長であり、最も好ましくは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０塩基長である。オリゴヌクレオチドは、通常、例えばプローブの場合は１本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子変異体の構築で使用する場合は２本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０１９０】
本明細書において表される時、「天然に存在するヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書において表される時、「修飾されたヌクレオチド」という用語は、修飾または置換された糖基などを有するヌクレオチドを含む。本明細書において表される時、「オリゴヌクレオチド結合」という用語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロジセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホラニラデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホロアミデートなどのオリゴヌクレオチド結合を含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ.Ｎｕｃｌ.Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ.１４：９０８１（１９８６）；Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ.Ｊ.Ａｍ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ.１０６：６０７７（１９８４）；Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ.Ｎｕｃｌ.Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ.１６：３２０９（１９８８）；Ｚｏｎ ｅｔ ａｌ.Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ６：５３９（１９９１）；Ｚｏｎ ｅｔ ａｌ.Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ,ｐｐ.８７−１０８（Ｆ. Ｅｃｋｓｔｅｉｎ, Ｅｄ,Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ,Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））；Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ.米国特許第５，１５１，５１０号；Ｕｈｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ９０：５４３（１９９０）を参照されたく、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。必要な場合、オリゴヌクレオチドは検出のための標識を含み得る。
【０１９１】
本明細書において表される時、「選択的にハイブリダイズする」という用語は、検出可能なおよび特異的な結合を意味する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびそれらの断片は、非特異的な核酸への相当量の検出可能な結合を最小限にするハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件下、核酸鎖と選択的にハイブリダイズする。ストリンジェントの高い条件は、当該技術分野において知られており、本明細書において説明されるような選択的ハイブリダイゼーション条件を達成するために使用できる。一般に、所望のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または抗体断片と核酸配列との間の核酸配列相同性は少なくとも８０％で、より一般的に、好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％と相同性が高くなる。
【０１９２】
ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、約４５℃、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）（０．９Ｍ塩化ナトリウム、９０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）の中での膜結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、続いて約５０〜６５℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの中での１回または複数回の洗浄を含み、より高いストリンジェント条件は、約４５℃、６×ＳＳＣの中での膜結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、続いて約６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳの中での１回または複数回の洗浄であり、または当該技術分野において知られている任意の他のストリンジェントハイブリダイゼーション条件が含まれるがそれらに限定されない（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ,Ｆ.Ｍ.ｅｔ ａｌ,ｅｄｓ.１９８９ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ,ｖｏｌ.１,Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ,Ｉｎｃ.ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ,Ｉｎｃ,ＮＹ ｐ６．３．１〜６．３．６および２．１０.３参照）。２つのアミノ酸配列間に部分的または完全な同一性がある場合、２つのアミノ酸配列は「相同」である。例えば、８５％の相同性は、２つの配列を最大一致するように整列させた時、アミノ酸の８５％が同一であることを意味する。（一致させられた２つの配列のいずれかに存在する）ギャップは一致を最大化させることができ、５以下のギャップ長が好ましく、２以下のギャップ長がより好ましい。あるいはおよび好ましくは、もし２つのタンパク質配列が、変異データ行列および６以上のギャップペナルティを用いるＡＬＩＧＮプログラムを使用して、（標準偏差単位で）５より大きい整列スコアを有する場合、２つのタンパク質配列（または少なくとも約３０アミノ酸長のそれらに由来のポリペプチド配列）は、この用語が本明細書において使用される場合に、相同である。Ｄａｙｈｏｆｆ,Ｍ.Ｏ,ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ,ｐｐ.１０１−１１０（Ｖｏｌｕｍｅ ５,Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ （１９７２））およびこの巻に対するＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２,ｐｐ.１−１０を参照されたい。２つの配列またはそれらの一部は、ＡＬＩＧＮプログラムを使用して最適に整列させた時、これらのアミノ酸が５０％以上同一である場合は、より好ましくは相同である。２つのオルソロガスな配列の中の相同性のある異なる領域があり得ることを理解されたい。例えば、マウスおよびヒトのオルソログの機能部位が、非機能部位よりも高い相同性を有し得る。
【０１９３】
本明細書において使用される時、「に対応する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が参考ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部と相同である（すなわち、同一で、厳密に進化的に関係はない）こと、またはポリペプチド配列が参考ポリペプチド配列と同一であることを意味する。
【０１９４】
対照的に、本明細書において使用される時、「と相補的」という用語は、相補的な配列が参考ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部と相同であることを意味する。例として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に相当し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」と相補的である。
【０１９５】
「配列同一性」という用語は、比較枠上で、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチドまたは残基対残基の基準で）同一であることを意味する。「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、比較枠上で最適に整列させられた２つの配列を比較し、一致した位置数を得るために同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、もしくはＩ）またはアミノ酸残基が両配列内で生じる位置数を決定し、一致した位置数を比較枠（すなわち、枠サイズ）の中の合計の位置数で割り、配列同一性のパーセンテージを得るためにその結果に１００をかけることによって計算される。本明細書において使用される時、「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の特性を示し、少なくとも１８ヌクレオチド（６アミノ酸）の位置の比較枠上の参照配列と比較して、高い頻度で、少なくとも２４〜４８ヌクレオチド（８〜１６アミノ酸）の位置の枠上の参照配列と比較して、ポリヌクレオチドおよびアミノ酸は、少なくとも８５％配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５％配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％配列同一性を有する配列を含み、配列同一性のパーセンテージは、比較枠上で合計２０％以下の参照配列の欠失または付加を含み得る配列と参照配列を比較することによって計算される。参照配列は、より長い配列のサブセットであり得る。
【０１９６】
本明細書において使用されるように、２０個の標準的アミノ酸およびそれらの略称は、標準的利用に従う。Iｍｍｕｎｏｌｏｇｙ―Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ,Ｅ.Ｓ.Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｄ.Ｒ.Ｇｒｅｎ,Ｅｄｓ.,Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ,Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ,Ｍａｓｓ.（１９９１））を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる。２０個の標準的アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α−、α−２基置換アミノ酸のような非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非標準的アミノ酸は、本発明のポリペプチドの適切な構成成分でもあり得る。非標準的アミノ酸の例として、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書において使用されるポリペプチド表記の中で、標準的利用および習慣に従い、左手方向はアミノ末端方向であり、右手方向はカルボキシ末端方向である。
【０１９７】
同様に、特に特定されない限り、１本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は５’末端であり、２本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は５’方向として称される。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’方向の付加は、転写方向として称され、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域およびＲＮＡ転写物の５’末端側の配列領域は「上流配列」と称され、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域およびＲＮＡ転写物の３’末端側の配列領域は「下流配列」と称される。
【０１９８】
ポリペプチドに適用されるように、「実質的に同一」という用語は、例えば、ギャップウェイト（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）初期値を使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって最適に整列させた場合、２つのペプチド配列が、少なくとも８０％配列同一性、好ましくは少なくとも９０％配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基の位置は、同類アミノ酸置換によって異なる。同類アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を表す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好ましい同類アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【０１９９】
本明細書において説明したように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列内の少数の変化は本発明に含まれるように意図され、アミノ酸配列内の変化は、本明細書に記載された抗体または免疫グロブリン分子に対して少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、および最も好ましくは９９％配列同一性を維持する。特に、同類アミノ酸置換を意図する。同類置換は、関連側鎖を有するアミノ酸ファミリーの中で置き換わる置換である。遺伝的にコードされるアミノ酸は、一般に、（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）無電荷極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンのファミリーに分けられる。より好ましいファミリー類：セリンおよびスレオニンは脂肪族ヒドロキシファミリーであり、アスパラギンおよびグルタミンはアミド含有ファミリーであり、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは脂肪族ファミリーであり、ならびにフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは芳香族ファミリーである。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンとの、アスパラギン酸のグルタミン酸との、スレオニンのセリンとの単独置換（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、またはアミノ酸と構造的に関係があるアミノ酸との類似置換は、もし置換がフレーム部位内のアミノ酸を巻き込まない場合、生じる分子の結合機能もしくは特性に深刻な影響を与えないことを期待することは理にかなっている。アミノ酸変化が機能的ペプチドをもたらすが否かは、ポリペプチド誘導体の特異的活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。アッセイを本明細書に詳細に記載する。抗体または免疫グロブリン分子の断片もしくは類似体を、当業者は容易に調製することができる。複数の断片または類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能領域の境界近くに存在する。構造的および機能的領域は、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データと公共のまたは私有の配列データベースとを比較することによって同定できる。好ましくは、コンピューター制御の比較方法を、既知の構造および／または機能を有する他のタンパク質の中に存在する配列モチーフまたは予測タンパク質立体構造領域を同定するために使用する。既知の三次元構造の中に折りたたまれたタンパク質配列を同定する方法は知られている。Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ.Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４（１９９１）。従って、前述の例は、当業者が、本明細書記載の抗体に従って、構造的および機能的領域を定義するために使用できる配列モチーフおよび構造的立体構造を認識することができることを示す。
【０２００】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、高い頻度で脱アミド化され、各々対応するグルタミルおよびアスパルチル残基になる。これらの残基は、中性または塩基性条件下、脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化型は、本発明の範囲に含まれる。
【０２０１】
一般に、タンパク質のシステイン残基は、システイン−システインジスルフィド結合に関わるか、またはそれらが折りたたまれたタンパク質領域の一部である時、ジスルフィド結合形成から立体的に保護されるかのいずれかである。タンパク質のジスルフィド結合形成は、環境の酸化還元電位およびチオールジスルフィド交換の専門酵素によって決定される複雑な工程である（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ,Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ.１０７,３０５−３２９,１９８４；Ｈｏｕｅｅ−Ｌｅｖｉｎ,Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ.３５３,３５−４４，２００２）。システイン残基がタンパク質構造中にペアを持たず、折りたたまれることによって立体的に保護されていない時、それは、ジスルフィドシャッフリング（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）として知られる工程で、溶液の遊離システインとジスルフィド結合を形成することができる。ジスルフィドスクランブリング（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ）として知られる別の工程で、遊離システインは、また、天然に存在するジスルフィド結合（例えば、抗体構造の中に存在するジスルフィド結合）と干渉し、弱い結合、低い生物活性および／または低い安定性を示す。
【０２０２】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する脆弱性を減少させる（２）酸化に対する脆弱性を減少させる（３）タンパク質複合体形成の結合親和性を変える（４）結合親和性を変える、ならびに（４）その類似体の他の物理化学的または機能的特性を与えるまたは修飾する置換である。類似体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々な変異を含み得る。例えば、１つまたは多数のアミノ酸置換（好ましくは同類アミノ酸置換）は、天然に存在する配列の中で（好ましくは、分子間接触を形成する領域の外側のポリペプチドの部分で）起こり得る。同類アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させるべきではない（例えば、置換アミノ酸は親配列に生じるヘリックスを切断するか、または親配列を特徴づける他の種類の二次構造を破壊する傾向にあるべきではない）。当該技術分野において承認されているポリペプチドの二次および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ,Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ,Ｅｄ,Ｗ.Ｈ.Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ,Ｎｅｗ Ｙｏｒk（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ.Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｊ.Ｔｏｏｚｅ,ｅｄｓ,Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ,Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ,Ｎ.Ｙ.（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ.Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５（１９９１）に記載されており、各々参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０３】
さらに、かかる方法は、鎖内のジスルフィド結合に関わる、可変領域の１つまたは複数のシステイン残基のアミノ酸の置換または欠失を行い、鎖内の１つまたは複数のジスルフィド結合が無い抗体分子を産生するために使用できる。
【０２０４】
「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」という用語は、抗体に抗原結合特異性を与える抗体の重鎖および軽鎖の超可変領域を示すことを意図する。ＣＤＲは、カバットシステム（Ｋａｂａｔ,Ｅ.Ａ.ｅｔ ａｌ.（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ,５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ.ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ,Ｐｕｂｌｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅ,ＮＩＨ,Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）および最新版に従って定義され得る。抗体は、一般的に、３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲを含む。この場合、ＣＤＲまたはＣＤＲ類という用語は、抗体が認識する抗原またはエピトープに対する抗体の親和性による結合に関与するアミノ酸残基の大部分を含むこれらの領域の１つまたはこれらの領域のいくつかもしくは全体を示すために本明細書において使用される。
【０２０５】
重鎖の３番目のＣＤＲ（ＨＣＤＲ３）はより大きなサイズの変動性（基本的に、それを引き起こす遺伝子配列の機序によるより大きな多様性）を有する。既知の最長サイズは２６個であるが、ＨＣＤＲ３は２個のアミノ酸ほどの短さでもよい。ＣＤＲ長は、特に基本的なフレームワークによって収容できる長さによっても変化し得る。機能的には、ＨＣＤＲ３は、抗体の特異性の決定に、部分的に重要な役割を担う（Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ,ＰＮＡＳ,７１：４２９８−４３０２,１９７４,Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ,Ｓｃｉｅｎｃｅ,２３３：７４７−７５３,１９８６,Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ,Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ,１９６：９０１−９１７,１９８７,Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ,Ｎａｔｕｒｅ,４６２：８７７−８８３,１９８９,Ｃａｔｏｎ ｅｔ ａｌ,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ,１４４：１９６５−１９６８,１９９０,Ｓｈａｒｏｎ ｅｔ ａｌ,ＰＮＡＳ,８７：４８１４−４８１７,１９９０,Ｓｈａｒｏｎ ｅｔ ａｌ,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ,１４４：４８６３−４８６９,１９９０,Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ,１４７：１７０９−１７１９,１９９１）。
【０２０６】
本明細書で表される時、「ＣＤＲセット」という用語は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。従って、ＨＣＤＲセットは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲセットはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を表す。
【０２０７】
アミノ酸配列が本明細書において記載される、ならびにＳｈｈに対する標的剤および抗体に利用できるバリアントを含めて、本発明のＶＨおよびＶＬ領域ならびにＣＤＲのバリアントは、配列変化または配列変異の方法によっておよび所望の特徴を用いて標的にする抗原のスクリーニングの方法によって入手できる。所望の特徴の例として、抗原に特異的な既知抗体に対する抗原の結合親和性の増加、活性が知られているのであれば、抗原に特異的な既知抗体に対する抗原活性の中和の増加、特異的なモル比での、抗原に対する既知の抗体またはリガンドの有する特定化された競合能力、リガンド−受容体複合体を免疫沈降する能力、特定化されたエピトープへの結合能力、直鎖状エピトープ、例えば、ペプチド結合スキャン（ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｃａｎ）、例えば、直鎖状のおよび／もしくは制限された立体構造にあるスクリーニングされたペプチドを使用して同定されたペプチド配列、不連続残基によって形成された立体構造エピトープへの結合能力、Ｓｈｈもしくは下流の分子の新しい生物活性を調節する能力、Ｓｈｈに結合するおよび／もしくはＳｈｈを中和する能力、ならびに／または任意の他の所望の特性が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２０８】
ＣＤＲ、抗体ＶＨまたはＶＬ領域および抗原結合部位のアミノ酸配列の中での置換を行うのに必要とされる技術は、当該技術分野において利用可能である。本明細書に開示される抗体分子のバリアントは、本発明において産生および使用できる。多変量データ解析技術を構造／活性相関（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｐｒｏｐｅｒｔｙ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）に適用することによる計算化学の先例（Ｗｏｌｄ,ｅｔ ａｌ. Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ.Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ−Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｅｄ．： Ｂ.Ｋｏｗａｌｓｋｉ）,Ｄ.Ｒｅｉｄｅｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ,Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ,Ｈｏｌｌａｎｄ,１９８４）に続いて、抗体の定量的活性−特性相関（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ）が、統計的回帰、パターン認識およびパターン分類のようなよく知られている数学的技法を使用して導かれる（Ｎｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ.Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ.Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｐｒｉｌ １９９８）；Ｋａｎｄｅｌ,Ａｂｒａｈａｍ ＆ Ｂａｃｋｅｒ,Ｅｒｉｃ.Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅａｓｏｎｉｎｇ ｉｎ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ.Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ ＰＴＲ,（Ｍａｙ １１, １９９５）；Ｋｒｚａｎｏｗｓｋｉ,Ｗｏｊｔｅｋ.Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ,Ｎｏ ２２（Ｐａｐｅｒ））．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０００）；Ｗｉｔｔｅｎ,Ｉａｎ Ｈ. ＆ Ｆｒａｎｋ,Ｅｉｂｅ. Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｗｉｔｈ Ｊａｖａ Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ. Ｍｏｒｇａｎ Ｋａｕｆｍａｎｎ；（Ｏｃｔｏｂｅｒ １１,１９９９）：Ｄｅｎｉｓｏｎ Ｄａｖｉｄ Ｇ. Ｔ.（Ｅｄｉｔｏｒ）,Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｃ.Ｈｏｌｍｅｓ,Ｂａｎｉ Ｋ.Ｍａｌｌｉｃｋ,Ａｄｒｉａｎ Ｆ.Ｍ.Ｓｍｉｔｈ.Ｂａｙｅｓｉａｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）.Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：（Ｊｕｌｙ ２００２）；Ｇｈｏｓｅ, Ａｒｕｐ Ｋ. ＆ Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｎ,Ｖｅｌｌａｒｋａｄ Ｎ.Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ,Ｓｏｆｔｗａｒｅ,Ｔｏｏｌｓ,ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）。場合によっては、抗体の特性は、抗体配列の経験および理論モデル（例えば、有望な接触残基または計算された物理化学特性の解析）から導き出すことができ、機能的構造および三次元構造ならびにこれらの特性は、単独でおよび組み合わせて考慮する��とができる。
【０２０９】
ＶＨ領域およびＶＬ領域から構成される抗体抗原結合部位は、一般に、ポリペプチドの６つのループ（軽鎖可変領域（ＶＬ）からの３つおよび重鎖可変領域（ＶＨ）からの３つ）によって形成される。既知の原子構造の抗体解析により、抗体結合部位の配列と三次元構造との関係が明らかにされている。これらの関係は、ＶＨ領域の第３の領域（ループ）を除いて、結合部位ループが少数の主鎖配座である正準構造の１つを有することを示唆する。特定のループの中で形成される正準構造は、そのサイズならびにそのループおよびフレームワーク領域の両方における重要部位での特定残基の存在によって決定されることが示されている。
【０２１０】
配列−構造関係のこの研究は、抗体のＣＤＲループの三次元構造を維持するのに重要で、従って結合特異性を維持する、既知配列であるが未知の三次元構造を有する抗体における残基の予測のために使用できる。これらの予測は、主要な最適化実験から得られる結果に対する予測の比較によって裏付けることができる。構造的アプローチにおいて、任意に自由に使用できるまたはＷＡＭのような市販パッケージを使用して抗体分子のモデルを作製できる。次いで、Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ,Ｉｎｃ.）またはＤｅｅｐ Ｖｉｅｗのようなタンパク質の視覚化および解析ソフトウェアパッケージを使用して、ＣＤＲの各位置において可能な置換を評価し得る。次いで、この情報は、活性に最小限のもしくは有益な効果をもたらすと思われるまたは他の所望の特性を与えると思われる置換を行うために使用し得る。
【０２１１】
本明細書において使用される時、「ポリペプチド断片」という用語は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、例えば全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然に存在する配列の中の対応する位置と同一であるポリペプチドを表す。一般に、断片は、少なくとも５、６、８または１０個のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも１４個のアミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸の長さ、通常、少なくとも５０個のアミノ酸の長さ、さらにより好ましくは少なくとも７０個のアミノ酸の長さである。本明細書において使用される時、「類似体」という用語は、一部の推定アミノ酸配列と実質的な同一性を有し、以下の少なくとも１つの特性：（１）適切な結合条件下のＳｈｈへの特異的結合（２）適切なＳｈｈ／Ｐａｔｃｈｅｄ−１結合を阻止する能力または（３）Ｇｌｉ活性を促進する能力を有する、少なくとも２５個のアミノ酸の部分を含むポリペプチドを表す。一般に、ポリペプチド類似体は、天然に存在する配列に関して同類アミノ酸置換（または付加または欠失）を含む。一般に、類似体は、少なくとも２０個のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも５０個以上のアミノ酸の長さであり、多くの場合、天然に存在する全長ポリペプチドほどの長さであり得る。
【０２１２】
ペプチド類似体は、鋳型ペプチドの類似体に似た特性を有する非ペプチド薬として製薬業界において一般に使用される。これらの種類の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と称される（Ｆａｕｃｈｅｒｅ,Ｊ.Ａｄｖ.Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ.１５：２９（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ ａｎｄ Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ＴＩＮＳ ｐ.３９２（１９８５）；およびＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ.Ｊ.Ｍｅｄ.Ｃｈｅｍ.３０：１２２９（１９８７）、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。かかる化合物は、多くの場合、コンピューター制御の分子モデリングに支持されて発展した。治療に有用なペプチドに構造的に似たペプチド模倣体は、同等の治療効果または予防効果を生むために使用できる。一般に、ペプチド模倣体は、ヒト抗体のような模範ポリペプチド（すなわち、生化学的特性または薬理学的特性を有するポリペプチド）に構造的に似ているが、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群から選択される結合によって、当該技術分野においてよく知られる方法によって任意に置換される１つまたは複数のペプチド結合を有する。コンセンサス配列の１つまたは複数のアミノ酸の、同じ種類のＤ−アミノ酸との系統的な置換（例えばＬ−リジンの代わりのＤ−リジン）が、より安定なペプチドを産生するために使用できる。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列のバリエーションを含む制限されたペプチドを、当該技術分野において知られる方法（Ｒｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ Ａｎｎ.Ｒｅｖ.Ｂｉｏｃｈｅｍ. ６１：３８７（１９９２）、参照により本明細書に組み込まれる）によって、例えば、ペプチドを環化する、分子内ジスルフィド架橋を形成することのできる内部システイン残基を付加することによって産生し得る。
【０２１３】
抗体は、オリゴクローナル、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ−接合抗体、多特異性抗体、２重特異性抗体、触媒抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、抗イディオタイプ抗体、ならびに、可溶型または結合型で標識され得る抗体、および、単独または周知の技術によって提供される他のアミノ酸配列と組み合わせた抗体の断片、バリアントもしくは誘導体であり得る。抗体はいずれの種に由来してもよい。
【０２１４】
本明細書において使用される時、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」（免疫グロブリン）という用語は、（完全長モノクローナル抗体を含む）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体（ｃａｍｅｌｉｓｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）およびキメラ抗体を含む。本明細書において使用される時、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、抗原の抗原決定基の特性に相補的な内部表面形および電荷分布を有する三次元結合空間を有するポリペプチド鎖の折りたたみから形成される、少なくとも１つの結合領域を含むポリペプチドまたはポリペプチド群を表す。天然抗体は、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ４量体の糖タンパク質であり、２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖から成る。各々の軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に連結され、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各々の重鎖および軽鎖は、規則的に間隔のあいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各々の重鎖は、一端に可変領域（ＶＨ）を有し、続いて多くの定常領域を有する。各々の軽鎖は、一端に可変領域（ＶＬ）を、他端に定常領域を有し、軽鎖の定常領域は重鎖の第１の定常領域と共に整列し、軽鎖可変領域は重鎖可変領域と共に整列する。軽鎖は、軽鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいてλ鎖またはκ鎖のいずれかに分類される。κ軽鎖可変領域は、本明細書においてＶＫとも示され得る。「可変領域」という用語は、重鎖または軽鎖可変領域を記載するためにも使用できる。特定のアミノ酸残基が、軽鎖および重鎖可変領域の間の界面を形成すると考えられている。各々の軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。かかる抗体は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスなどを含むがそれらに限定されない任意の哺乳動物から生じ得る。
【０２１５】
「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、本発明の抗体の結合断片を含み、例示的な断片は、１本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、単一領域抗体、領域抗体、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、所望の生物活性を示す抗体断片、ジスルフィド固定可変領域（ｄｓＦｖ）、２量体可変領域（２重特異性抗体）、（例えば、本発明の抗体に対する抗−Ｉｄ抗体を含む）抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、細胞内抗体、直鎖状抗体、上記の任意の抗体断片およびエピトープ結合断片から形成される１本鎖抗体分子および多特異性抗体を含む。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性断片、すなわち抗原結合部位を含む分子を含む。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。
【０２１６】
抗体の酵素パパインによる切断は、抗原結合活性はないが、結晶化する能力を有する「Ｆａｂ」断片および「Ｆｃ」断片としても知られる２つの同一の抗原結合断片をもたらす。抗体の酵素ペプシンによる切断は、抗体分子の２つのアームが連結されたままの状態で、２つの抗原結合部位を含む「Ｆ（ａｂ’）２」断片をもたらす。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗原を架橋する能力を有する。
【０２１７】
「Ｆｖ」とは、本明細書において使用される時、抗原認識および抗原結合部位の両方を保持する抗体の最小断片を表す。この領域は、堅固な非共有結合性または共有結合性の会合にある１つの重鎖および１つの軽鎖可変領域の２量体からなる。この配置で、各々の可変領域の３つのＣＤＲは、ＶＨ−ＶＬ２量体の表面上の抗原結合部位を定義するために相互作用する。合計６つのＣＤＲは抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一可変領域（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、全体の結合部位よりも低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を有する。
【０２１８】
「Ｆａｂ」とは、本明細書において使用される時、軽鎖の定常領域および重鎖のＣＨ１領域を含む抗体の断片を表す。
【０２１９】
「ｄＡｂ」とは、本明細書において使用される時、ヒト抗体の最小の機能的結合単位である抗体の断片を表す。「ｄＡｂ」は単一領域抗体であり、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ領域）または抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ領域）のいずれかを含む。各々のｄＡｂは６つの天然に存在するＣＤＲの３つを含む（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ,Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ.Ｎａｔｕｒｅ ４６１,５４４−５４６（１９８９）；Ｈｏｌｔ,ｅｔ ａｌ,Ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ,Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.２１,４８４−４９（２００３））。それらは１１〜１５ｋＤａの範囲の分子量を有し、抗原結合（Ｆａｂ）２断片よりも４倍小さく、１本鎖のＦｖ（ｓｃＦｖ）分子の半分のサイズである。
【０２２０】
「ラクダ化」とは、本明細書において使用される時、軽鎖を欠いているが、それにもかかわらず、広範な抗原結合レパートリーを有する重鎖２量体から成る抗体分子を表す（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ,Ａｔａｒｈｏｕｃｈ Ｔ,Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ,Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｇ,Ｈａｍｅｒｓ Ｃ,Ｓｏｎｇａ ＥＢ,Ｂｅｎｄａｈｍａｎ Ｎ,Ｈａｍｅｒｓ Ｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ.Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６−４４８）。
【０２２１】
「２重特異性抗体」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を表し、その断片は、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）の中に軽鎖可変領域（ＶＬ）に結合する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。あまりにも短すぎるために同一鎖上の２つの領域間で対を形成できないリンカーを使用することによって、それらの領域は別の鎖の相補領域と対を形成し、２つの抗原結合部位を作ることを余儀なくされる。２重特異性抗体は、例えば、欧州特許第４０４，０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ,９０：６４４４−６４４８（１９９３）により詳細に記載されている。
【０２２２】
完全な抗体の断片は、抗原を結合する機能を遂行し得ることが示された。結合断片の例として、（Ｗａｒｄ,Ｅ.Ｓ.ｅｔ ａｌ,（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ４６１,５４４−５４６）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１領域からなるＦａｂ断片、（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ,４６８,５５２−５５４）ＶＨおよびＣＨ１領域からなるＦｂ断片、（Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１,４８４−４９０）単一抗体のＶＬおよびＶＨ領域からなるＦｖ断片、（ｉｖ）ＶＨまたはＶＬ領域からなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ,Ｅ.Ｓ.ｅｔ ａｌ,Ｎａｔｕｒｅ ４６１,５４４−５４６（１９８９）,ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ,４６８,５５２−５５４,Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１,４８４−４９０）、（ｖ）単離したＣＤＲ領域、（ｖｉ）連結した２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｖｉｉ）ＶＨ領域およびＶＬ領域は、２つの領域を会合し抗原結合部位の形成を可能にするペプチドリンカーによって連結された１本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ,（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ,２４２,４２３−４２６,Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ,（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ,８５,５８７９−５８８３）、（ｖｉｉｉ）２重特異性１本鎖Ｆｖ２量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）および、（ｉｘ）「２重特異性抗体」、遺伝子融合によって構築された多価または多特異性断片（ＷＯ９４／１３８０４号、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ,Ｐ.（１９９３）ｅｔ ａｌ,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ９０ ６４４４−６４４８）が挙げられる。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたは２重特異性抗体分子は、ＶＨおよびＶＬ領域を連結するジスルフィド架橋の組み込みによって安定化し得る（Ｒｅｉｔｅｒ,Ｙ.ｅｔ ａｌ,Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ,１４,１２３９−１２４５,１９９６）。ＣＨ３領域に結合したｓｃＦｖを含む小型抗体も作製し得る（Ｈｕ,Ｓ.ｅｔ ａｌ,（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ,５６,３０５５−３０６１）。結合断片の他の例として、重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端におけるいくつかの残基の付加によってＦａｂ断片とは異なるＦａｂ'（抗体のヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む）、および定常領域のシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片であるＦａｂ’−ＳＨが挙げられる。
【０２２３】
「可変」という用語は、可変領域の特定部分が抗体間の配列において大きく異なっており、その特定抗原に対する各々の特定抗体の結合特異性に関与するという事実を表す。しかしながら、可変性は、抗体の可変領域を通して均一に分布されていない。それは、軽鎖および重鎖可変領域の両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる区分に集中している。可変領域のより高度に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の各々の可変領域は４つのＦＲ領域を含み、大部分はβシート配置をとり、βシート構造を結合しているループ、およびいくつかの場合において、βシート構造の部分を形成するループを形成する３つのＣＤＲにより結合されている。各々の鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域により、および他方の鎖のＣＤＲと共に近接でまとまり、抗体の抗原結合部位の形成に貢献する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ,Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ,５ｔｈ Ｅｄ.Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ,Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ,Ｂｅｔｈｅｓｄａ,ＭＤ（１９９１）参照）。定常領域は、一般に、抗原結合に直接には関わらないが、抗原結合親和性に影響を与え、抗体のＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および／またはアポトーシスへの関与のような様々なエフェクター機能を示し得る。
【０２２４】
本明細書で使用される時、「超可変領域」という用語は、抗原への結合に関連する抗体のアミノ酸残基を表す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変領域の残基２４〜４６（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変領域の残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ,Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａl Ｉｎｔｅｒｅｓｔ,５ｔｈ Ｅｄ.Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ,Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ,Ｂｅｔｈｅｓｄａ,ＭＤ（１９９１））および／または「超可変ループ」のそれらの残基（例えば、軽鎖可変領域の残基２６〜３２（Ｌｌ）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変領域の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ,Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ，１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、ＣＤＲに隣接するそれらの可変領域の残基である。ＦＲ残基は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、領域抗体、２重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、ワクチン抗体（ｖａｃｃｉｂｏｄｉｅｓ）、直鎖状抗体、および２重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）の中に存在する。
【０２２５】
本明細書において使用されるように、標的結合剤、標的結合タンパク質、特異的結合タンパク質などの用語は、選択的に標的部位に結合する抗体、またはその結合断片を表す。一実施形態において、この標的結合剤は、唯一の標的部位に対して特異的である。他の実施形態において、この標的結合剤は２つ以上の標的部位に対して特異的である。一実施形態において、この標的結合剤はモノクローナル抗体であり、この標的部位はエピトープであり得る。
【０２２６】
抗体の「結合断片」は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな抗体の酵素分解または化学分解によって産生される。結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂおよび１本鎖抗体を含む。「２重特異性」または「２機能性」抗体以外の抗体は、同一の各々のその結合部位を有すると理解される。抗体は、実質的に、受容体の対抗受容体への接着を阻害し、（インビトロ競合結合アッセイにおいて測定される時）過剰の抗体は、少なくとも約２０％、４０％、６０％もしくは８０％、および８０％超、通常約８５％超で対抗受容体と結合した受容体の量を減少させる。
【０２２７】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体への特異的結合ができる任意のタンパク質決定因子を含む。エピトープの決定因子は、通常、アミノ酸または糖の側鎖のような分子の化学的活性表面集団からなり、特異的三次元構造特性および特異的電荷特性を、必ずしもいつもではないが、有し得る。抗体は、解離定数が１μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下および最も好ましくは１０ｎＭ以下の時、抗原に特異的に結合すると言われている。
【０２２８】
「薬剤」という用語は、化学化合物、化学化合物の混合物、生体高分子、または生体物質から作られた抽出物を示すために本明細書において使用される。
【０２２９】
Ｓｈｈポリペプチドに対して「活動的」または「活性」とは、天然Ｓｈｈポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を有するＳｈｈポリペプチドの一部を表す。本明細書において使用される時、「生物学的」とは、天然Ｓｈｈポリペプチドの活性に由来する生物学的機能を表す。好ましいＳｈｈ生物学的活性は、例えば、Ｓｈｈに誘発される細胞増殖を含む。
【０２３０】
「哺乳動物」とは、本明細書において使用される時、哺乳動物とみなされる任意の動物を表す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０２３１】
「動物」とは、本明細書において使用される時、哺乳動物とみなされる動物を含む。好ましくは、動物はヒトである。
【０２３２】
「ｍＡｂ」という用語は、モノクローナル抗体を表す。
【０２３３】
「リポソーム」とは、本明細書において使用される時、本発明のＳｈｈポリペプチドまたはかかるＳｈｈポリペプチドに対する抗体を含み得る薬剤の哺乳動物への送達に有用であり得る小胞を表す。
【０２３４】
本明細書において使用される時、「標識」または「標識された」とは、ポリペプチドへの検出可能な部分、例えば、放射標識、蛍光標識、酵素標識、化学発光法により標識された基またはビオチニル基の付加を表す。放射性同位体または放射性核種は３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉを含み得、蛍光標識はローダミン、ランタニド蛍光体またはＦＩＴＣを含み得、酵素標識は西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼを含み得る。
【０２３５】
追加の標識は、例証として、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（「Ｇ６ＰＤＨ」）、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸脱水素酵素およびペルオキシダーゼのような酵素；色素；追加の蛍光標識または蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒｓ）、例えばフルオロセインおよびその誘導体、蛍光色素、ＧＦＰ（「緑色発光タンパク質」のＧＦＰ）、ダンシル、ウンベリフェロン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレスカミン、ランタニドクリプタートのようなフルオロフォアおよびキレート、例えば、ユウロピウムなど（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ａｎｄ Ｃｉｓ Ｂｉｏｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；イソルミノ−ル、ルミノールおよびジオキセタンのような化学発光標識または化学ルミネセンス；感光薬；補酵素；酵素基質；ラテックスまたはカーボン粒子のような粒子；金属ゾル；結晶；リポソーム；色素、触媒または他の検出可能な基を用いてさらに標識し得る細胞など；ビオチン、ジゴキシゲニンまたは５−ブロモデオキシウリジンのような分子；例えば、緑膿菌外毒素（ＰＥまたは細胞毒性断片またはその変異体）、ジフテリア毒素または細胞毒性断片またはその変異体、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦ、リシンまたはその細胞毒性断片、例えば、リシンＡ、アブリンまたはそれらの細胞毒性断片、サポリンまたはその細胞毒性断片、ヤマゴボウ抗ウイルス毒素またはその細胞毒性断片、およびブリオジン（ｂｒｙｏｄｉｎ）１またはその細胞毒性断片の群から選択される毒素部分のような毒素部分を含むがそれらに限定されない。
【０２３６】
本明細書において使用される時、「医薬品または調合薬」という用語は、適切に患者に投与される時、所望の治療効果を誘発することができる化学化合物または化学組成物を表す。本明細書における他の化学用語は、当該技術分野における従来の使用に従って使用され、例としてＴｈｅ ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ,Ｓ,Ｅｄ,ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ,Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５））が挙げられる（参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２３７】
本明細書において使用される時、「実質的に純粋」とは、対象種が優勢種として存在する（すなわち、モル基準で、組成物の中で任意の他の個々の種よりもより豊富である）ことを意味し、好ましくは、実質的精製画分は、対象種が（モル基準で）存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％を含む組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の約８０％超、より好ましくは約８５％、９０％、９５％、および９９％超を含む。最も好ましくは、対象種は、組成物が基本的に単一の高分子種からなる基本的同一性にまで精製される（混入物種は従来の検出方法によって組成物の中で検出されることができない）。
【０２３８】
「患者」という用語は、ヒトおよび獣医学の対象を含む。
【０２３９】
「抗体依存性細胞媒介細胞毒性」および「ＡＤＣＣ」とは、ＩｇＦｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、好中球、およびマクロファージ）が、標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を表す。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する初代細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ,Ａｎｎｕ.Ｒｅｖ.Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページの表３にまとめられている。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを行うことができる。かかるアッセイの有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、また追加として、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボ、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ.ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９８８）に開示されている動物モデルにおいて評価できる。「補体依存性細胞傷害」および「ＣＤＣ」とは、抗体がその細胞死機能を実行する機序を表す。それは、補体の第１構成成分の成分であるＣ１ｑの、抗原と複合体の状態にあるＩｇ、ＩｇＧまたはＩｇＭのＦｃ領域への結合によって開始される（Ｈｕｇｈｓ−Ｊｏｎｅｓ， Ｎ．Ｃ， ａｎｄ Ｂ． Ｇａｒｄｎｅｒ． １９７９． ＭｏＩ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６：６９７）。Ｃ１ｑは、７０μｇ／ｍｌの濃度でヒト血清に存在する約４１０ｋＤａの大きな複雑な構造をもつ糖タンパク質である（Ｃｏｏｐｅｒ,Ｎ.Ｒ.１９８５.Ａｄｖ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.３７：１５１）。２つのセリンプロテアーゼＣ１ｒおよびＣ１ｓと共に、Ｃ１ｑは補体の第１の構成成分である複合体Ｃ１を形成する。Ｃ１ｑの少なくとも２つのＮ末端球状頭部は、Ｃ１活性化に対して、従って補体カスケードの開始に対してＩｇのＦｃに結合しなければならない（Ｃｏｏｐｅｒ,Ｎ.Ｒ.１９８５.Ａｄｖ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.３７：１５１）。
【０２４０】
本明細書において使用される時、「抗体半減期」という用語は、抗体投与後、抗体分子の平均生存時間の尺度である抗体の薬物動態特性を意味する。抗体半減期は、例えば、血清または血漿の中、すなわち循環する半減期、または他の組織の中で測定されるような患者の体もしくはその特異的区画からの免疫グロブリンの既知量の５０％を排除するのに必要とする時間として表すことができる。半減期は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンのクラスによって変化し得る。一般に、抗体半減期の増加は、投与される抗体の循環中の平均滞留時間（ＭＲＴ）の増加になる。
【０２４１】
「アイソタイプ」という用語は、抗体の重鎖または軽鎖の定常領域の分類を表す。抗体の定常領域は抗原への結合に関与しないが、様々なエフェクター機能を示す。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、所定のヒトの抗体または免疫グロブリンは、５つの主要クラスの免疫グロブリンＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの１つに割り当てることができる。これらのクラスのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１（γ１）、ＩｇＧ２（γ２）、ＩｇＧ３（γ３）、およびＩｇＧ４（γ４）、ならびにＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分類し得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、各々α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンの構造および三次元配置はよく知られている。様々なヒト免疫グロブリンクラスの中で、唯一ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭだけが補体を活性化することが知られている。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ヒトにおいて媒介することが知られている。ヒト軽鎖定常領域は、２つの主要クラス、κおよびλに分類し得る。
【０２４２】
所望の場合、Ｓｈｈに特異的に結合する抗体のアイソタイプは、例えば、異なるアイソタイプの生物学的特性をうまく利用するためにスイッチできる。例えば、いくつかの状況において、Ｓｈｈに対する治療用抗体としての抗体の産生に関連して、抗体が補体に結合し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に関与することができることが所望であり得る。これができる抗体のアイソタイプがいくつかあり、以下のマウスＩｇＭ、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＧ１、およびヒトＩｇＧ３を含むがそれらに限定されない。他の実施形態において、Ｓｈｈに対する治療用抗体としての抗体の産生に関連して、抗体は、エフェクター細胞上Ｆｃ受容体に結合し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与することができることが所望であり得る。これができる抗体のアイソタイプがいくつかあり、以下のマウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ１、およびヒトＩｇＧ３を含むがそれらに限定されない。産生される抗体は、初めはかかるアイソタイプを保有する必要はなく、代わりに、産生される抗体は任意のアイソタイプを保有することができ、その後、この抗体を当該技術分野においてよく知られている従来の技術を使用してアイソタイプをスイッチできることが理解されるであろう。かかる技術は、数ある中でも、組換え技術（例えば、米国特許第４，８１６，３９７号参照）、細胞融合技術（例えば、米国特許第５，９１６，７７１号および同第６，２０７，４１８号参照）の直接的な使用を含む。
【０２４３】
例として、本明細書において議論される抗Ｓｈｈ抗体は、完全ヒト抗体である。抗体がＳｈｈへの所望の結合を保有する場合、この抗体はヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＧ1、またはヒトＩｇＧ３アイソタイプを産生するようにアイソタイプをすぐにスイッチできるが、（抗体の特異性および抗体の親和性の一部を定義する）同じ可変領域を依然として保有する。その後、かかる分子は、補体に結合し、ＣＤＣに関与することができるおよび／またはエフェクター細胞上のＦｃ受容体に結合し、ＡＤＣＣに関与することができる。
【０２４４】
「全血アッセイ」は、天然のエフェクターの供給源として未分画の血液を使用する。血液は、多形核細胞（ＰＭＮ）および単核細胞（ＭＮＣ）のようなＦｃＲを発現している細胞のエフェクターと共に血漿の中に補体を含む。従って、全血アッセイは、インビトロのＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機序の両方の相乗効果を同時評価することができる。
【０２４５】
本明細書において使用される時、「治療有効」量とは、被験体にある程度の改善または恩恵をもたらす量である。別の方法で規定される「治療有効」量とは、少なくとも１つの臨床症状においてある程度の軽減、緩和、および／または減少をもたらす量である。本発明の方法によって治療することができる疾患と関連する臨床症状は、当業者によく知られている。さらに、ある程度の恩恵が被験体にもたらされる限り、治療効果は完全なまたは治癒的な効果である必要はないことを、当業者は理解するであろう。
【０２４６】
本明細書において使用される時、「および／または」という用語は、他のものがあろうとなかろうと、２つの特定化された特徴または構成成分の各々の具体的な開示として解釈されるべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、あたかも各々が本明細書において個別に述べられているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々の具体的な開示として解釈されるべきである。
【０２４７】
抗体構造
基本の抗体構造単位は４量体を含むことが知られている。各々の４量体は、２本の同一ポリペプチド鎖の対から成り、各々の対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗体認識に関与する約１００〜１１０またはそれより多いアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能に関与する定常領域を定義する。ヒト軽鎖はκおよびλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεとして分類され、各々ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖および重鎖の中で、可変および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はさらに約１０のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ.７（Ｐａｕｌ,Ｗ,ｅｄ.,２ｎｄ ｅｄ.Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ,Ｎ.Ｙ.（１９８９））を参照されたい（全目的のためにその全体が参照により組み込まれる）。各々の軽／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。
【０２４８】
従って、インタクトな抗体は２つの結合部位を有する。２機能性または２重特異性抗体の中を除いて、２つの結合部位は同じものである。
【０２４９】
鎖はすべて、３つの超可変領域（ＣＤＲとも呼ばれる）によって連結される相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ全体構造を示す。各々対の２本鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域のそばに整列し、特異的エピトープへの結合を可能にする。軽鎖および重鎖の両方のＮ末端〜Ｃ末端は、領域ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各々の領域に対するアミノ酸の配置は、ＫａｂａｔＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ,Ｂｅｔｈｅｓｄａ,Ｍｄ.（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ.Ｎａｔｕｒｅ ４６２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。
【０２５０】
２重特異性抗体または２機能性抗体は、２つの異なる重／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。２重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む様々な方法によって産生できる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ Ｃｌｉｎ. Ｅｘｐ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.７９：３１５−３２１（１９９０）,Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ.Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい。２重特異性抗体は、単一結合部位を有する断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦｖ）の形態では存在しない。
【０２５１】
ＶＨまたはＶＬ領域は単独で使用して抗原に結合させることができるが、一般に、ＶＨ領域はＶＬ領域と対になって抗原結合部位を抗体に提供する。ＶＨ領域（表１２参照）は、抗体の抗原結合部位がＶＨおよびＶＬ領域の両方を含んで形成されるように、ＶＬ領域（表１３参照）と対になり得る。
【０２５２】
ヒト抗体および抗体のヒト化
ヒト抗体は、マウスまたはラットの可変および／または定常領域を保有する抗体に関連するいくつかの問題を避ける。かかるマウスまたはラット由来のタンパク質の存在は、抗体の迅速除去につながるか、または患者による抗体に対する免疫反応の発生につながり得る。マウスまたはラット由来の抗体の利用を避けるために、げっ歯類、他の哺乳動物または動物が完全ヒト抗体を産生できるように、機能的ヒト抗体の遺伝子座をげっ歯類、他の哺乳動物または動物の中に導入することを通して、完全ヒト抗体を産生することができる。
【０２５３】
完全ヒト抗体の産生のための１つの方法は、ヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の１０００ｋｂ以下のサイズの生殖系列で構成された断片を含むように操作されたマウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統を使用することである。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ.Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１５：１４６−１５６（１９９７）およびＧｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ｊ.Ｅｘｐ.Ｍｅｄ.１８８：４８３−４９５（１９９８）を参照されたい。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統は、Ａｍｇｅｎ社（Ｆｒｅｍｏｎｔ,Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ,Ｕ.Ｓ.Ａ）から入手可能である。
【０２５４】
かかるマウスはヒト免疫グロブリンの分子および抗体を産生でき、マウス免疫グロブリンの分子および抗体は産生できない。この調製をなし遂げるために利用される技術は、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願第０８／７５９，６２０号および１９９８年６月１１日に公開されたＷＯ９８／２４８９３号および２０００年１２月２１日に公開されたＷＯ００／７６３１０号に開示されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１５：１４６−１５６（１９９７）も参照されたく、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５５】
マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統の作製は、１９９０年１月１２日に出願された米国特許出願第０７／４６６，００８号、１９９０年１１月８日に出願された同第０７／６１０，５１５号、１９９２年７月２４日に出願された同第０７／９１９，２９７号、１９９２年７月３０日に出願された同第０７／９２２，６４９号、１９９３年３月１５日に出願された同第０８／０３１，８０１号、１９９３年８月２７日に出願された同第０８／１１２，８４８号、１９９４年４月２８日に出願された同第０８／２４６，１４５号、１９９５年１月２０日に出願された同第０８／３７６，２７９号、１９９５年４月２７日に出願された同第０８／４３０,９３８号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６４，５８４号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６４，５８２号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６３，１９１号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６２，８３７号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４８６，８５３号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４８６，８５７号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４８６，８５９号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６２，５１３号、１９９６年１０月２日に出願された同第０８／７２４，７５２号、１９９６年１２月３日に出願された同第０８／７５９，６２０号、２００１年１１月３０日に出願された米国特許公開第２００３／００９３８２０号、米国特許第６，１６２，９６３号、同第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号、同第６，０７５，１８１号および同第５，９３９，５９８号ならびに日本特許第３０６８１８０号、同第３０６８５０６号および同第３０６８５０７号にさらに説明され、詳述されている。１９９６年６月１２日に出願公開された欧州特許第０４６３１５１号、１９９４年２月３日に公開されたＷＯ９４／０２６０２号、１９９６年１０月３１日に公開されたＷＯ９６／４６０９６号、１９９８年６月１１日に公開されたＷＯ９８／２４８９３号、２０００年１２月２１日に公開されたＷＯ００／７６３１０号も参照されたい。上記に引用された特許、特許出願、および参考文献の各々の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５６】
１つの代替的なアプローチにおいて、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社を含む他者は、「ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」アプローチを利用している。ミニ遺伝子座アプローチでは、Ｉｇ遺伝子座からの複数の小片（個々の遺伝子）を含むことにより、外来性Ｉｇ遺伝子座を模倣する。従って、１つまたは複数のＶＨ遺伝子、１つまたは複数のＤＨ遺伝子、１つまたは複数のＪＨ遺伝子、μ定常領域、および通常、第２の定常領域（好ましくはγ定常領域）が動物に挿入するためのコンストラクトの中に形成される。このアプローチは、Ｓｕｒａｎｉｅｔ ａｌによる米国特許第５，５４５，８０７号、ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙによる各々の米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，７７０，４２９号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号、および同第６，２５５，４５８号、ＫｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔおよびＢｅｒｎｓによる米国特許第５，５９１，６６９号および同第６，０２３．０１０号、Ｂｅｒｎｓｅｔ ａｌによる米国特許第５，６１２，２０５号、同第５，７２１，３６７号、および同第５，７８９，２１５号、ならびにＣｈｏｉおよびＤｕｎｎによる米国特許第５，６４３，７６３号、ならびに１９９０年８月２９日に出願されたＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの米国特許出願第０７／５７４，７４８号、１９９０年８月３１日に出願された同第０７／５７５，９６２号、１９９１年１２月１７日に出願された同第０７／８１０，２７９号、１９９２年３月１８日に出願された同第０７／８５３，４０８号、１９９２年６月２３日に出願された同第０７／９０４，０６８号、１９９２年１２月１６日に出願された同第０７／９９０，８６０号、１９９３年４月２６日に出願された同第０８／０５３，１３１号、１９９３年７月２２日に出願された同第０８／０９６，７６２号、１９９３年１１月１８日に出願された同第０８／１５５，３０１号、１９９３年１２月３日に出願された同第０８／１６１，７３９号、１９９３年１２月１０日に出願された同第０８／１６５，６９９号、１９９４年３月９日に出願された同第０８／２０９，７４１号に記載され、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。欧州特許第０５４６０７３号、ＷＯ９２／０３９１８号、ＷＯ９２／２２６４５号、ＷＯ９２／２２６４７号、ＷＯ９２／２２６７０号、ＷＯ９３／１２２２７号、ＷＯ９４／００５６９号、ＷＯ９４／２５５８５号、ＷＯ９６／１４４３６号、ＷＯ９７／１３８５２号、およびＷＯ９８／２４８８４号ならびに米国特許第５，９８１，１７５号も参照されたく、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。さらに、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ,１９９２,Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ,１９９３,Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ,１９９３,Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ,１９９３,Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ,（１９９４）,Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ,（１９９４）、およびＴｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ,（１９９５）,Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ,（１９９６）を参照されたく、これらは参���によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２５７】
Ｋｉｒｉｎは、ミクロ細胞融合によって、染色体の大きな一部、または染色体全体が導入されたマウスからのヒト抗体の産生も示した。欧州特許出願第７７３２８８号および同第８４３９６１号を参照されたく、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。さらに、ＫｉｒｉｎのＴｃマウスとＭｅｄａｒｅｘのミニ遺伝子座（Ｈｕｍａｂ）マウスの異種交配の結果得られたＫＭ（商標）マウスが作製された。これらのマウスは、ＫｉｒｉｎマウスのヒトＩｇＨトランス染色体（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）およびＧｅｎｐｈａｒｍマウスのκ鎖トランス遺伝子を保有する（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ,Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ,（２００２）４：９１−１０２）。
【０２５８】
ヒト抗体は、インビトロ方法によっても生成することができる。適切な例として、ファージディスプレイ（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ,Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ,Ｄｙａｘ,Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ,Ｘｏｍａ,Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ,Ａｌｅｘｉｏｎ（旧Ｐｒｏｌｉｆｅｒｏｎ）,Ａｆｆｉｍｅd）、リボソームディスプレイ（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、酵母ディスプレイなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２５９】
抗体の調製
本明細書記載の抗体を、下記のとおり、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を用いて調製した。かかるマウスはヒト免疫グロブリンの分子および抗体を産生でき、マウス免疫グロブリンの分子および抗体は産生できない。この調製をなし遂げるために利用される技術は、本明細書の背景項目に開示した特許、特許出願、および参考文献に開示されている。しかしながら、特に、その技術によるマウスおよび抗体の遺伝子導入生産の好ましい一実施形態は、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願第０８／７５９，６２０号および１９９８年６月１１日に公開された国際公開ＷＯ９８／２４８９３号および２０００年１２月２１日に公開されたＷＯ００／７６３１０号に開示されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（１９９７）（本開示は参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
【０２６０】
かかる技術を用いて、種々の抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体が生産されている。基本的には、マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統を対象の抗原（例えばＳｈｈ）で免疫化し、超免疫マウスからリンパ細胞（Ｂ細胞など）を回収し、回収したリンパ細胞を骨髄タイプの細胞系と融合して不死ハイブリドーマ細胞系を調製する。これらのハイブリドーマ細胞系をスクリーニングし、対象の抗原に対して特異的な抗体を生産するハイブリドーマ細胞系を選択して同定する。本明細書は、Ｓｈｈに対して特異的な抗体を生産する複数のハイブリドーマ細胞系の生産方法を提供する。さらに、本明細書はかかる細胞系により生産された抗体の特性化（かかる抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の分析を含む）を提供する。
【０２６１】
あるいは、骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを産生する代わりに、Ｂ細胞を直接アッセイできる。例えば、ＣＤ１９＋Ｂ細胞を超免疫ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウスから単離して、抗体分泌形質細胞を増殖および分化させることができる。次いで細胞上清由来の抗体のＳｈｈ免疫原に対する反応性をＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。この上清もＳｈｈ断片に対する免疫反応性についてスクリーニングして、さらにＳｈｈ上の機能的な対象領域に結合する異なる抗体をマッピングしてもよい。抗体は、他の関連ヒトエンドグリコシダーゼならびにラット、マウス、および非ヒト霊長類（カニクイザルなど）に対して、Ｓｈｈのオルソログについてスクリーニングして、最後に種交差反応を決定してもよい。対象の抗体を含むウェルからのＢ細胞は、各種方法（融合して個々のウェルもしくはプールしたウェルのいずれかから、またはＥＢＶ感染により、もしくは既知の不死化遺伝子によるトランスフェクトにより、ハイブリドーマを作製することを含む）により不死化してから、適切な培地に入れてよい。あるいは、所望の特異性を伴う単独の抗体分泌形質細胞を次いでＳｈｈ特異性溶血性プラークアッセイを用いて単離する（例えばＢａｂｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７８４３−４８（１９９６）を参照されたい）。溶解を標的とした細胞は好ましくはＳｈｈ抗原でコーティングしたヒツジ赤血球細胞（ＳＲＢＣ）である。
【０２６２】
対象の免疫グロブリンを分泌する形質細胞および補体を含むＢ細胞培養の存在下、プラーク形成は、特異的Ｓｈｈ媒介性の、対象の形質細胞を囲むヒツジ赤血球細胞の溶解を示す。プラーク中心の単独の抗原特異性形質細胞を単離することができ、抗体の特異性をコードする遺伝子情報は単形質細胞から単離される。逆転写を使用後、ＰＣＲを行って（ＲＴ−ＰＣＲ）、抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡをクローン化できる。かかるクローン化ＤＮＡは次いで適切な発現ベクター、好ましくはベクターカセット（ｐｃＤＮＡなど）、より好ましくは免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の定常領域を含むｐｃＤＮＡベクターなどにさらに挿入できる。この産生したベクターは次いで宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞）にトランスフェクトして、転写の誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変した従来の栄養培地で培養できる。
【０２６３】
理解されるであろうとおり、Ｓｈｈに対して特異的に結合する抗体はハイブリドーマ細胞系以外の細胞系で発現し得る。適切な哺乳動物の宿主細胞を形質転換させるために、特定の抗体をコードする配列を使用できる。形質転換は宿主細胞中へポリヌクレオチドを導入する任意の既知の方法（例えばウイルス内（またはウイルスベクター内）へのポリヌクレオチドの封入およびウイルス（またはベクター）による宿主細胞の形質導入を含む）により、または、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、および同第４，９５９，４５５号（これらの特許は参照により本明細書に組み込まれる）に例示されているように当該技術分野において知られているトランスフェクション手順により可能である。使用した形質転換手順は形質転換される宿主に応じて変わる。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入する方法は当該技術分野においてよく知られており、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチド（１つまたは複数）のカプセル封入、およびＤＮＡの核への直接的なマイクロインジェクションが挙げられる。
【０２６４】
発現宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は当該技術分野においてよく知られており、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より入手可能な多くの不死化細胞系（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞ガン細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、ヒト上皮腎臓２９３細胞、およびいくつかの他の細胞系を含むがそれらに限定されない）が挙げられる。どの細胞系の発現値が高くて構成的Ｓｈｈ結合特性を有する抗体を生産するかの決定を通して、特に好ましい細胞系を選択する。
【０２６５】
細胞融合技術により、任意の所望のアイソタイプを伴う重鎖を有する骨髄腫、ＣＨＯ細胞または他の細胞系が調製され、軽鎖を有する別の骨髄腫、ＣＨＯ細胞または他の細胞系が調製される。その後、かかる細胞を融合して、インタクトな抗体を発現する細胞系を単離することができる。
【０２６６】
従って、抗体候補は上で議論したように所望の「構造性」特性を満たすように産生されるため、通常、アイソタイプのスイッチを介した所望の「機能的」特性を少なくともある程度伴う抗体候補を提供することができる。
【０２６７】
治療的投与および製剤
本発明の実施形態としては、疾患の治療に有用である抗Ｓｈｈ抗体の滅菌医薬品製剤が挙げられる。かかる製剤は天然ＳｈｈのＰａｔｃｈｅｄ−１への結合を阻害し、それにより、例えば、血清または組織のＳｈｈ発現が異常に上昇した症状を効果的に治療する。抗Ｓｈｈ抗体は、好ましくは天然ＳｈｈのＰａｔｃｈｅｄ−１への結合を強力に阻害する適切な親和性を有し、好ましくは適切な作用持続時間を有して、ヒトに対する低頻度の投与を可能とする。延長した作用持続時間により、代替的な非経口経路（皮下または筋肉注射など）による、低頻度でより便利な投薬計画が可能となる。
【０２６８】
滅菌製剤は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過により、抗体の凍結乾燥および再構成の前または後に作製できる。この抗体は通常、凍結乾燥形態または溶液中に保存される。治療上の抗体組成物は、通常、滅菌アクセスポートを有する容器（例えば、静脈内溶液バッグ）、または製剤の回収を可能にするアダプター（皮下注射針によって穿通可能な栓など）を有するバイアルに入れられる。
【０２６９】
抗体の投与経路は、既知の方法（例えば、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、鞘内への注射もしくは注入、吸入もしくは病巣内経路、腫瘍部位への直接注射、または下記の徐放系）と一致する。抗体は好ましくは注入またはボーラス注射により持続投与される。
【０２７０】
治療上用いられる抗体の有効量は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の症状に応じて変わる。従って、最適治療効果を得る上で必要とされるように療法士が投与量を滴定して投与経路を変更することが好ましい。典型的には、臨床医は投与量が所望の効果に達するまで抗体を投与する。この療法の進行は従来のアッセイにより、または本明細書記載のアッセイにより容易にモニタリングされる。
【０２７１】
本明細書記載の抗体は、製薬上許容可能な担体との混合物中で調製できる。この治療組成物は静脈内または鼻もしくは肺経由で、好ましくは液体または粉末エアゾール（凍結乾燥された）として投与できる。この組成物は所望により非経口または皮下投与してもよい。全身投与時、この治療組成物は、滅菌性で、発熱性物質を含まず、ｐＨ、等張性、および安定性に関して非経口的に許容可能な溶液中にあるべきである。これらの条件は当業者に知られている。簡単に述べると、本明細書記載の化合物の投薬製剤は、製薬上許容可能な担体、賦形剤、または安定剤と所望の純度を有する化合物とを混合することにより、保存または投与用に調製される。かかる材料は使用投与量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、緩衝液（トリスＨＣｌ、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩および他の有機酸塩など）；酸化防止剤（アスコルビン酸など）；低分子量（約１０残基未満）ペプチド（ポリアルギニンなど）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリジノンなど）；アミノ酸（グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンなど）；単糖類、二糖類、および他の炭水化物（セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（ＥＤＴＡなど）；糖類アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；対イオン（ナトリウムなど）ならびに／または非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳまたはポリエチレングリコールなど）を含む。
【０２７２】
注射用の滅菌組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｅｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（２００３））に記載されているような従来の製薬学的実践に従い製剤化できる。例えば、製薬上許容可能な担体（水、または胡麻油、落花生油、もしくは綿実油のような天然植物油、またはオレイン酸エチルのような合成脂肪ビヒクルなど）への活性化合物の溶解または懸濁が所望され得る。承認されている製薬学的実践に従い緩衝液、防腐剤、酸化防止剤などを組み入れることができる。
【０２７３】
徐放調製物の適切な例としては、ポリペプチドを含む固形疎水性ポリマーの半透性基質が挙げられ、これらの基質は造形品、フィルムまたはマイクロカプセル状である。徐放基質の例としては、Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ，（１９８１） １５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈ，（１９８２） １２：９８−１０５により記載されているようなポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー類（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，（１９８３） ２２：５４７−５５６）、非分解性エチレン−酢酸ビニル（前記Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ）、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー類（ＬＵＰＲＯＮ Ｄｅｐｏｔ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア）など）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）が挙げられる。
【０２７４】
ポリマー（エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸など）が分子を１００日間に渡って放出し得るのに対し、特定のヒドロゲルはより短期間でタンパク質を放出する。体内に被包性タンパク質が長時間残る場合、それらは３７℃で湿気に曝露した結果、変性または凝集し、生物活性を喪失して免疫原性を変化させる可能性がある。タンパク質安定化のための合理的な戦略は、関与する機序に応じて考案できる。例えば、凝集機序がジスルフィド相互変換を介した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが見出された場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含湿量の管理、適切な添加剤の使用、および特異性ポリマーマトリックス組成物の生成により安定化し得る。
【０２７５】
徐放組成物としては、懸濁液中の結晶を維持できる適切な製剤中で懸濁した抗体結晶の調製物も挙げられる。これらの調製物は皮下注射または腹腔内注射時に徐放効果をもたらし得る。他の組成物としては、リポソームに封入された抗体も挙げられる。かかる抗体を含むリポソームは基本的に既知の方法：ドイツ特許第３，２１８，１２１号；Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８５） ８２：３６８８−３６９２；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８０） ７７：４０３０−４０４６；欧州特許第５２，３２２号；欧州特許第３６，６７６号；欧州特許第８８，０４６号；欧州特許第１４３，９４９号；同第１４２，６４１号；日本特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびに欧州特許第１０２，３２４号により調製される。
【０２７６】
患者に投与される抗体製剤の投与量は、薬物作用を変更することが知られている各種要素（疾患の重症度および種類、体重、性別、食事、投与時間および投与経路、他剤ならびに他の関連ある臨床的要素を含む）を考慮して主治医により決定される。治療有効量はインビトロまたはインビボ方法のいずれかにより決定してよい。
【０２７７】
本明細書に記載の、治療上用いられる抗体の有効量は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の症状に応じて変わる。従って、最適治療効果を得る上で必要とされるように療法士が投与量を滴定して投与経路を変更することが好ましい。典型的な１日投与量は患者の体重あたり約０．０００１ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇから最大１００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、１００００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲でよく、上述した要素に応じて変わる。投与量は患者の体重あたり０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ／ｋｇまたは０．０１〜０．１０ｍｇ／ｋｇでよく、上述の要素に応じて変わる。典型的には、臨床医は投与量が所望の効果に達するまで治療抗体を投与する。この療法の進行は従来のアッセイにより、または本明細書記載のように容易にモニタリングされる。
【０２７８】
本発明の抗体の投与は反復してよく、この投与は少なくとも１日間、２日間、３日間、５日間、１０日間、１５日間、３０日間、４５日間、２ヶ月間、７５日間、３ヶ月間、または少なくとも６ヶ月間の間隔でよい。
【０２７９】
本明細書の組成物および方法による治療実体は、改善された移動、送達、忍容性などを得るために製剤に組み込まれた適切な担体、賦形剤、および他の薬剤と併用投与されることが理解されるであろう。これらの製剤としては、例えば、粉末剤、泥膏、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、小胞（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）など）を含む脂質（陽イオン性または陰イオン性）、ＤＮＡ結合体、無水吸収泥膏、水中油型および油中水型エマルション、エマルションカーボワックス（各種分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。上記の混合物はいずれも、製剤中の活性成分が製剤によって不活性化されず、製剤が生理的に適合して投与経路に忍容である場合、本発明による治療および療法に適し得る。Ｂａｌｄｒｉｃｋ Ｐ． “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ： ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｕｉｄａｎｃｅ．” Ｒｅｇｕｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３２（２）：２１０−８（２０００），Ｗａｎｇ Ｗ． “Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．” Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． ２０３（１−２）：１−６０（２０００），Ｃｈａｒｍａｎ ＷＮ “Ｌｉｐｉｄｓ，ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ ｏｒａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｏｍｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｃｏｎｃｅｐｔｓ．” Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ．８９（８）：９６７−７８（２０００），Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ． “Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ” ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ． ５２：２３８−３１１（１９９８）ならびにそれらに引用されている製薬学的化学者によく知られている製剤、賦形剤および担体と関連する付加的情報も参照されたい。
【０２８０】
他の治療の設計および産生
本発明により、および本明細書でＳｈｈに関して生成され特性化された抗体の活性に基づき、抗体部分以外に他の治療様式の設計が容易になる。かかる様式は、高度抗体治療（２重特異性抗体、免疫毒素、および放射性標識化治療など）、単領域抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｄＡｂなど）、ペプチド治療の産生、新規足場中のＳｈｈ結合領域、遺伝子療法、特に細胞内抗体、アンチセンス治療、および低分子を含むがそれらに限定されない。
【０２８１】
抗原結合部位は、非抗体足場タンパク質（フィブロネクチンまたはシトクロムＢなど）上のＣＤＲ配列を用いて（Ｈａａｎ ＆ Ｍａｇｇｏｓ（２００４） ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，１２（５）： Ａ１−Ａ６；Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８４： １１４１−１１５１；Ｎｙｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７： ４６３−４６９）、または足場タンパク質内ループのアミノ酸残基を無作為化または変化して所望の標的に対する結合特異性を付与することによって提供し得る。タンパク質の新規結合部位の遺伝子工学のための足場はＮｙｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ． （Ｎｙｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７： ４６３−４６９）により詳細に概説されている。抗体模倣体の足場タンパク質は参照により本明細書にその全体が組み込まれる国際公開第００４６７８４号に開示されており、この発明者らは少なくとも１つの無作為化ループを有するフィブロネクチンタイプＩＩＩ領域を含むタンパク質（抗体模倣体）について述べている。免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの任意の領域メンバーにより、１つまたは複数のＣＤＲ（例えば一群のＨＣＤＲ）を移植する適切な足場を提供し得る。この足場はヒトまたは非ヒトタンパク質でよい。非抗体足場タンパク質の長所は少なくともいくつかの抗体分子よりも製造する上でより小さなおよび／またはより容易な分子足場における抗原結合部位を提供してよい。小サイズの結合メンバーは有用な生理的特性（細胞に入る、組織内に深く浸透する、または他の構造内の標的に到達する、または標的抗原のタンパク質腔内で結合する能力など）を付与し得る。非抗体足場タンパク質内の抗原結合部位の使用についてはＷｅｓｓ，２００４（Ｗｅｓｓ，Ｌ． Ｉｎ： ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，Ｔｈｅ Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ＢｉｏＢｕｓｉｎｅｓｓ，１２（４２），Ａ１−Ａ７，２００４）で概説されている。典型的なものは、安定した骨格および１つもしくは複数の可変ループを有するタンパク質であり、その中でこのループ（１つまたは複数）のアミノ酸配列は具体的にまたは無作為に変異して標的抗原と結合する抗原結合部位を形成する。かかるタンパク質としては、黄色ブドウ球菌、トランスフェリン、アルブミン、テトラネクチン、フィブロネクチン（例えば１０番目のフィブロネクチンタイプＩＩＩ領域）、リポカリンならびにγ−クリスタリンおよび他のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）足場（Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）由来のプロテインＡのＩｇＧ結合領域が挙げられる。他のアプローチの例としては、分子内ジスルフィド結合を有するサイクロチド−小タンパク質に基づく合成「マイクロ体」、マイクロタンパク質（Ｖｅｒｓａｂｏｄｉｅｓ（商標）、Ａｍｕｎｉｘ）およびアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ）が挙げられる。
【０２８２】
抗体配列および／もしくは抗原結合部位に加えて、本発明による標的結合剤は、他のアミノ酸、例えばペプチドもしくはポリペプチド形態、折りたたまれた領域などを含み得、または抗原結合能に加えて分子の別の機能的特性を与え得る。本発明の標的結合剤は検出可能な標識を有してよく、あるいは、毒素または標的部分または酵素に結合してもよい（例えばペプチジル結合またはリンカーを介す）。例えば、標的結合剤は触媒作用部位（例えば酵素領域内）ならびに抗原結合部位（抗原に結合する抗原結合部位）を含み得、それにより触媒作用部位は抗原を標的とし得る。この触媒作用部位は抗原の生物学的機能を、例えば切断により阻害し得る。
【０２８３】
高度抗体治療薬の産生に関連して、補体結合は所望の特性であり、例えば、２重特異性抗体、免疫毒素、または放射線標識の使用を介した細胞死のための補体依存を回避することが可能であり得る。
【０２８４】
例えば、（ｉ）一方はＳｈｈに対して特異性を有し、他方は互いに結合している二番目の分子に対して特異性を有する２つの抗体、（ｉｉ）Ｓｈｈに対して特異的である一鎖と第二分子に対して特異的である第二鎖を有する単抗体、または（ｉｉｉ）Ｓｈｈおよび他の分子に対して特異性を有する単鎖抗体、を含む２重特異性抗体を産生できる。かかる２重特異性抗体は、例えば、（ｉ）および（ｉｉ）に関連して（例えば、Ｆａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：７２−８１（１９９４）および前記Ｗｒｉｇｈｔ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓを参照されたい）、および（ｉｉｉ）に関連して（例えば、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｕｐｐｌ．） ７：５１−５２（１９９２）を参照されたい）よく知られている技術を用いて産生できる。各例において、第二の特異性はＣＤ１６またはＣＤ６４（例えば、Ｄｅｏ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １８：１２７（１９９７）を参照されたい）またはＣＤ８９（例えば、Ｖａｌｅｒｉｕｓ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ ９０：４４８５−４４９２（１９９７）を参照されたい）を含むがそれらに限定されない重鎖活性化受容体に生成できる。
【０２８５】
抗体は、当該技術分野においてよく知られている技術を利用して、免疫毒素として作用するように修飾もできる。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １４：２５２（１９９３）を参照されたい。米国特許第５，１９４，５９４号も参照されたい。放射性標識化抗体の調製に関連して、かかる修飾抗体は当該技術分野においてよく知られている技術を利用しても容易に調製できる。例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６５５−６８６（２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｆｎｅｒ ａｎｄ Ｌｏｎｇｏ，ｅｄｓ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｒａｖｅｎ（１９９６））を参照されたい。米国特許第４，６８１，５８１号、同第４，７３５，２１０号、同第５，１０１，８２７号、同第５，１０２，９９０号（ＲＥ３５，５００）、同第５，６４８，４７１号、および同第５，６９７，９０２号も参照されたい。各免疫毒素または放射性標識化分子は、所望の多重結合酵素サブユニットオリゴマー化領域を発現する細胞を殺す可能性がある。
【０２８６】
抗体が薬剤（例えば、放射性同位体、医薬品組成物、または毒素）と結合される時、この薬剤は、抗分裂剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、アルカロイド剤、ＣＯＸ−２剤、および抗生剤ならびにそれらの組み合わせの群から選択される製薬学的特性を保有すると意図される。薬剤はナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、代謝拮抗物質、抗生物質、酵素、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、カンプトテシン、オキサリプラチン、ドキソルビシンおよびそれらの類似体、ならびにそれらの組み合わせの群から選択できる。
【０２８７】
毒素の例としてはさらに、ゲロニン、緑膿菌外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、α毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、緑膿菌内毒素、分子のエンジインファミリーメンバー（カリケアマイシンおよびエスペラマイシンなど）、ならびにそれらの誘導体、組み合わせおよび修飾が挙げられる。化学的毒素はデュオカルマイシン（例えば、米国特許第５，７０３，０８０号および米国特許第４，９２３，９９０号を参照されたい）、メトトレキサート、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ｃｉｓ−ｐｌａｔｉｎｕｍ）、エトポシド、ブレオマイシンおよび５−フルオロウラシルからなる群から選択することもできる。化学治療薬の例としては、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソテール（ドセタキセル）、ブスルファン、シトキシン（Ｃｙｔｏｘｉｎ）、タキソール、メトトレキサート、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（米国特許第４，６７５，１８７号を参照されたい）、メルファラン、および他の関連ナイトロジェンマスタードも挙げられる。適切な毒素および化学治療薬がＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． １９９５）およびＧｏｏｄｍａｎ Ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，７ｔｈ Ｅｄ．（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． １９８５）に記載されている。他の適切な毒素および／または化学治療薬は当業者に知られている。
【０２８８】
放射性同位体の例としては、局在化および／または療法に使用できるγ−放射体、陽電子放射体、およびＸ線放射体、ならびに療法に使用できるβ−放射体およびα−放射体が挙げられる。診断、予後および病期分類に有用として先に記載されている放射性同位体は、治療にも有用である。
【０２８９】
抗ガン剤または抗白血病剤の非限定的な例としては、アントラサイクリン、例えばドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、イダルビシン、デトルビシン、カルミノマイシン、エピルビシン、エソルビシン、およびモルホリノならびにそれらの置換誘導体、組み合わせおよび修飾が挙げられる。代表的な医薬品としては、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシ尿素、テモゾロミド、サリドマイド、およびブレオマイシン、ならびにそれらの誘導体、組み合わせおよび修飾が挙げられる。好ましくは、抗ガン剤または抗白血病剤はドキソルビシン、モルホリノドキソルビシン、またはモルホリノダウノルビシンである。
【０２９０】
本発明の抗体は、哺乳動物（好ましくはヒト）における半減期（例えば、血清半減期）が非修飾抗体の半減期より長期化した抗体も包含する。前記抗体の半減期は約１５日間超、約２０日間超、約２５日間超、約３０日間超、約３５日間超、約４０日間超、約４５日間超、約２ヶ月超、約３ヶ月超、約４ヶ月超、または約５ヶ月超でよい。哺乳動物（好ましくはヒト）における本発明の抗体またはその断片の長期化した半減期により、哺乳動物における前記抗体もしくは抗体断片のより高い血清力価に至り、それにより、前記抗体もしくは抗体断片の投与頻度を減らすおよび／または投与する前記抗体もしくは抗体断片の濃度を減少させる。長期化したインビボ半減期を有する抗体またはその断片は当業者に知られている技術により産生できる。例えば、長期化したインビボ半減期を有する抗体またはその断片は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎ受容体間の相互作用に関わると同定されたアミノ酸残基を修飾（例えば、置換、欠失または付加）して産生できる（例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ９７／４６６３１号およびＷＯ０２／０６０９１９号を参照されたい）。前記抗体または抗体断片ポリマー分子（高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）に結合することにより長期化したインビボ半減期を有する抗体またはその断片を産生できる。ＰＥＧは、前記抗体もしくは抗体断片のＮもしくはＣ末端に対するＰＥＧの部位特異性接合またはリシン残基上に存在するイプシロン−アミノ基のいずれかを介した多機能リンカーを伴いまたは伴わず、前記抗体または抗体断片に結合できる。生物活性の喪失が最小限に抑えられる線形または分枝ポリマー誘導体化が使用される。この接合度はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により密接にモニタリングされ、抗体に対するＰＥＧ分子の適切な接合を確実にする。無反応のＰＥＧは、例えば、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーにより抗体−ＰＥＧ結合体から分離できる。
【０２９１】
当業者に理解されるであろうとおり、上の実施形態において、親和性値は重要であるが、この抗体の特定の機能によって他の要素も同様にまたはより重要であり得る。例えば、免疫毒素（抗体関連毒素）において、この抗体の標的に対する結合作用は有用であり得る；しかしながら、いくつかの実施形態において、所望の最終結果はこの毒素の細胞内への内部移行である。従って、高い内部移行パーセントを有する抗体がこれらの状況において所望され得る。従って、一実施形態において、内部移行の高効率を伴う抗体が意図される。内部移行の高効率は内部抗体パーセントとして測定でき、低値から１００％までであり得る。例えば、様々な実施形態において、０．１〜５、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜９９、および９９〜１００％が高効率であり得る。当業者に理解されるであろうとおり、所望の効率は、異なる実施形態において、例えば、関連剤、部位に投与できる抗体量、抗体−薬剤複合体の副作用、治療されるべき問題の種類（例えば、ガンの種類）および重症度によって異なり得る。
【０２９２】
他の実施形態において、本明細書に開示される抗体は、Ｓｈｈ発現変化と関連する疾患または障害をスクリーニングするために哺乳動物組織または細胞におけるＳｈｈ発現の検出アッセイキットを提供する。このキットは、Ｓｈｈと結合する抗体、および存在する場合、抗体抗原反応を示す手段を含む。
【０２９３】
併用
本明細書に定義した標的結合剤または抗体は単独療法として適用してもよいし、本発明の化合物に加えて、従来の外科手術または放射線療法または化学療法に関わってもよい。かかる化学療法としては、１種またはそれ以上の以下の種類の抗腫瘍剤を挙げ得る：
（ｉ）内科的腫瘍学において使用される、アルキル化剤（例えばシスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、テモゾロミドおよびニトロソ尿素）；代謝拮抗物質（例えばゲムシタビンおよび葉酸拮抗剤（５−フルオロウラシルおよびテガフルのようなフルオロピリミジンなど）、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシド、およびヒドロキシ尿素）；抗腫瘍抗生物質（例えばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシンおよびミトラマイシンのようなアントラサイクリン）；抗分裂剤（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンのようなビンカアルカロイドならびにタキソールおよびタキソテールのようなタキソイドならびにポロキナーゼ阻害剤）；ならびにトポイソメラーゼ阻害剤（例えばエトポシドおよびテニポシドのようなエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカンならびにカンプトテシン）のような他の抗増殖性／抗新生物剤およびそれらの組み合わせ；
（ｉｉ）抗エストロゲン剤（例えばタモキシフェン、フルベストラント、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェンおよびヨードキシフェン）、抗アンドロゲン剤（例えばビカルタミド、フルタミド、ニルタミドおよび酢酸シプロテロン）、ＬＨＲＨアンタゴニストもしくはＬＨＲＨアゴニスト（例えばゴセレリン、リュープロレリンおよびブセレリン）、プロゲストゲン（例えば酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（例えばアナストロゾール、レトロゾール、ボラゾールおよびエキセメスタンとして）ならびにフィナステリドなどの５α−還元酵素阻害剤のような細胞増殖抑制剤；
（ｉｉｉ）抗浸潤剤（例えば４−（６−クロロ−２，３−メチレンジオキシアニリノ）−７−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エトキシ］−５−テトラヒドロピラン−４−イルオキシキナゾリン（ＡＺＤ０５３０；国際公開ＷＯ０１／９４４６１号）およびＮ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−｛６−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］−２−メチルピリミジン−４−イルアミノ｝チアゾール−５−カルボキサミド（ダサチニブ、ＢＭＳ−３５４８２５；Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ，２００４，４７，６６５８−６６６１）のようなｃ−Ｓｒｃキナーゼファミリー阻害剤、ならびにマリマスタットのようなメタロプロテナーゼ阻害剤、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体機能阻害剤または、カテプシン阻害剤、セリンプロテアーゼ阻害剤、例えばマトリプターゼ、ヘプシン、ウロキナーゼ、ヘパラナーゼ阻害剤）；
（ｉｖ）細胞傷害性剤（フルダラビン、２−クロロデオキシアデノシン、クロラムブシルまたはドキソルビシンなど）およびそれらの組み合わせ（フルダラビン＋シクロホスファミド、ＣＶＰ：シクロホスファミド＋ビンクリスチン＋プレドニゾン、ＡＣＶＢＰ：ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋ビンデシン＋ブレオマイシン＋プレドニゾン、ＣＨＯＰ：シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋ビンクリスチン＋プレドニゾン、ＣＮＯＰ：シクロホスファミド＋ミトキサントロン＋ビンクリスチン＋プレドニゾン、ｍ−ＢＡＣＯＤ：メトトレキサート＋ブレオマイシン＋ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋ビンクリスチン＋デキサメタゾン＋ロイコボリン、ＭＡＣＯＰ−Ｂ：メトトレキサート＋ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋ビンクリスチン＋プレドニゾン固定用量＋ブレオマイシン＋ロイコボリン、またはＰｒｏＭＡＣＥ ＣｙｔａＢＯＭ：プレドニゾン＋ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋エトポシド＋シタラビン＋ブレオマイシン＋ビンクリスチン＋メトトレキサート＋ロイコボリンなど）。
（ｖ）成長因子機能の阻害剤、例えばかかる阻害剤としては、成長因子抗体および成長因子受容体抗体（例えば抗ｅｒｂＢ２抗体トラスツズマブ［ハーセプチン（商標）］、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブ、抗ｅｒｂＢ１抗体セツキシマブ［アービタックス(Ｅｒｂｉｔｕｘ）、Ｃ２２５］およびＳｔｅｒｎ ｅｔ ａｌ． Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００５，Ｖｏｌ． ５４，ｐｐ１１−２９により開示された任意の成長因子または成長因子受容体抗体）が挙げられ、かかる阻害剤としては、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば上皮成長因子ファミリー阻害剤（例えばＮ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ゲフィチニブ、ＺＤ１８３９）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６,７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン（エルロチニブ、ＯＳＩ−７７４）および６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）−キナゾリン−４−アミン（ＣＩ１０３３）のようなＥＧＦＲファミリーのチロシンキナーゼ阻害剤）、ｅｒｂＢ２チロシンキナーゼ阻害剤（ラパチニブなど）、肝細胞成長因子ファミリー阻害剤、血小板由来成長因子ファミリー阻害剤（イマチニブなど）、セリン／トレオニンキナーゼ阻害剤（例えばＲａｓ／Ｒａｆシグナル伝達阻害剤（ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）など）、ＭＥＫおよび／またはＡＫＴキナーゼを介した細胞シグナル伝達阻害剤、肝細胞成長因子ファミリー阻害剤、ｃ−キット阻害剤、ａｂｌキナーゼ阻害剤、ＩＧＦ受容体（インスリン様成長因子）キナーゼ阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤（例えばＡＺＤ１１５２、ＰＨ７３９３５８、ＶＸ−６８０、ＭＬＮ８０５４、Ｒ７６３、ＭＰ２３５、ＭＰ５２９、ＶＸ−５２８およびＡＸ３９４５９）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ＣＤＫ２および／またはＣＤＫ４阻害剤など）、ならびに生存シグナル伝達タンパク質阻害剤（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ例えばＡＢＴ−７３７など）も挙げられる；
（ｖｉ）血管内皮成長因子の効果を阻害するもののような抗血管新生薬［例えば抗血管内皮細胞成長因子抗体ベバシズマブ（アバスチン（商標））およびＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えば４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４；ＷＯ０１／３２６５１号内の実施例２）、４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１；ＷＯ００／４７２１２号内の実施例２４０）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７；ＷＯ９８／３５９８５号）およびＳＵ１１２４８（スニチニブ；ＷＯ０１／６０８１４号）、国際公開ＷＯ９７／２２５９６号、ＷＯ９７／３００３５号、ＷＯ９７／３２８５６号、ＷＯ９８／１３３５４号、ＷＯ００／４７２１２号およびＷＯ０１／３２６５１号に開示されている化合物ならびに他の機序によって働く化合物（例えばリノマイド、インテグリンαｖβ３機能阻害剤およびアンジオスタチン）］またはコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）またはＣＳＦ１受容体；
（ｖｉｉ）コンブレタスタチンＡ４および国際公開ＷＯ９９／０２１６６号、ＷＯ００／４０５２９号、ＷＯ００／４１６６９号、ＷＯ０１／９２２２４号、ＷＯ０２／０４４４６号およびＷＯ０２／０８２１３号に開示されている化合物のような血管傷害性薬剤；
（ｖｉｉｉ）アンチセンス療法（例えば、Ｇ−３１３９（ゲナセンス（Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ））、抗ｂｃｌ２アンチセンスなどの上に列挙する標的を指向するもの）；
（ｉｘ）例えば異常ｐ５３または異常ＢＲＣＡ１もしくはＢＲＣＡ２のような異常遺伝子の置換アプローチ、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼもしくは細菌性ニトロ還元酵素を用いるもののようなＧＤＥＰＴ（遺伝子指向型酵素プロドラッグ療法）アプローチ、ならびに多剤耐性遺伝子療法のような化学療法もしくは放射線療法に対する患者の忍容性を高めるアプローチを含む遺伝子療法アプローチ；ならびに
（ｘ）例えばアレムツズマブ（キャンパス（ｃａｍｐａｔｈ）−１Ｈ（商標））による治療、ＣＤ５２指向のモノクローナル抗体、またはＣＤ２２指向の抗体による治療、サイトカイン（インターロイキン２、インターロイキン４または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子など）を用いるトランスフェクションのような患者の腫瘍細胞の免疫原性を高めるための生体外およびインビボアプローチ、Ｔ細胞アネルギーを減少させるアプローチ（ＣＴＬＡ−４機能を阻害するモノクローナル抗体治療など）、サイトカイントランスフェクト樹状細胞のようなトランスフェクト免疫細胞を用いるアプローチ、サイトカイントランスフェクト腫瘍細胞系を用いるアプローチおよび抗イディオタイプ抗体を用いるアプローチを含む免疫療法アプローチ。
（ｘｉ）ベルケード（ボルテゾミブ）などのプロテアソーム阻害剤のようなタンパク質分解阻害剤。
（ｘｉｉ）例えば、受容体リガンドの隔離、受容体結合リガンドの阻止または受容体シグナル伝達の減少（例えば増大した受容体分解または減少した発現値による）のいずれかを行うペプチドまたはタンパク質（抗体または溶解性外受容体領域構造など）を用いる生物治療学的治療アプローチ。
【０２９４】
一実施形態において、本明細書に定義した抗腫瘍治療は、本発明の化合物に加えて、内科的腫瘍学において使用される他の抗増殖性／抗新生物薬およびそれらの組み合わせによる治療（アルキル化剤（例えばシスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、テモゾロミドおよびニトロソ尿素）；代謝拮抗物質（例えばゲムシタビンおよび葉酸拮抗剤（５−フルオロウラシルおよびテガフルのようなフルオロピリミジン、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシド、およびヒドロキシ尿素など）；抗腫瘍抗生物質（例えばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシンおよびミトラマイシンのようなアントラサイクリン）；抗分裂剤（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンのようなビンカアルカロイドならびにタキソールおよびタキソテールのようなタキソイドならびにポロキナーゼ阻害剤）；ならびにトポイソメラーゼ阻害剤（例えばエトポシドおよびテニポシドのようなエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカンならびにカンプトテシン）など）を含んでよい。
【０２９５】
一実施形態において、本明細書に定義した抗腫瘍治療は、本発明の化合物に加えて、ゲムシタビンによる治療を含み得る。
【０２９６】
かかる併用治療（ｃｏｎｊｏｉｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、治療の個々の成分の同時、逐次または分割投与方法によりなし遂げ得る。産生物のかかる組み合わせは、本明細書に上記した投与量範囲の本発明の化合物、または製薬上許容可能なその塩、ならびに承認された投与量範囲の他の製薬的活性剤を使用する。
【実施例】
【０２９７】
下記の実施例（実施した実験および達した結果を含む）は例証的な目的のみで提供しており、本明細書の教示を制限する意図はない。
【実施例１】
【０２９８】
免疫化および力価測定（ｔｉｔｅｒｉｎｇ）
免疫化
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウスの逐次的な免疫化によりヒトソニック・ヘッジホッグ（Ｓｈｈ）に対するモノクローナル抗体を生成した。キャンペーン１の免疫化を溶解性組換えヒトＳｈｈ（Ｃａｔ番号１３１４−ＳＨ／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＫＬＨ接合Ｓｈｈ（Ｓｈｈ−ＫＬＨ）を用いて行った。キャンペーン１では、初回ブーストにおいて組換えヒトＳｈｈ（１０μｇ／マウス）をＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ番号Ｔ２６８４）と腹腔内（ＩＰ）投与した。続く６ブーストでは５μｇのＳｈｈ／マウスを用い、ＣｐＧ ＤＮＡ（ＩｍｍｕｎＥａｓｙ Ｍｏｕｓｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ、ｃａｔ番号３０３１０１、Ｑｉａｇｅｎ）とＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（リン酸アルミニウムゲル、ｃａｔ番号１４５２−２５０、ＨＣＩ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ）の混合物の尾内注射と、ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄと併用したＳｈｈのＩＰ注射とを交互にした。これら６ブーストを週２回投与した。別の９ブーストは、５μｇのＳｈｈ−ＫＬＨ／マウスをＣｐＧ ＤＮＡ＋Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓと尾内により、そしてＴｉｔｅｒＭａｘ ＧｏｌｄとＩＰ注射により交互に行った。これら９ブースト中、最初の６ブーストを週２回投与し、最後の３回を週１回投与した。Ｓｈｈ−ＫＬＨ５μｇのＰＢＳ溶液の最終ブーストを尾元、ＩＰ（ｂａｓｅ ｏｆ ｔａｉｌ ＩＰ）投与した。
【０２９９】
全長ヒトＳｈｈで一過的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞をキャンペーン２における免疫原として用いた。Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓと混合した２×１０６細胞の初回注射は、ＩＰで投与した。次の１６ブーストにおいて、１×１０６細胞をＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓと尾またはＩＰのいずれかに注射し、最後に最終２ブーストを尾元、ＩＰ注射した。最初の１４ブーストを週２回投与し、残りの５ブーストを週１回投与した。
【０３００】
力価により回収するための動物の選択
Ｓｈｈ結合アッセイを用いてヒトＳｈｈに対する抗体価を決定した。２とおりの方法を使用した：２９３Ｔ細胞上に一過的に発現したＳｈｈと結合する抗体をフローサイトメトリーを用いて測定し、固定化ビオチニル化Ｓｈｈと結合する抗体をＥＬＩＳＡ形式において評価した。免疫化プログラム終了時、実施例２に記載するように、免疫化したマウスの脾臓およびリンパ節から単離したマウス骨髄腫細胞およびリンパ細胞を用いて、エレクトロポレーションを用いて融合を実施した。
【実施例２】
【０３０１】
リンパ細胞の回収、Ｂ細胞単離、ハイブリドーマの融合および産生
免疫性を与えられたマウスを頸部の脱臼により屠殺し、各コホートから流入領域リンパ節を回収してプールした。このプログラムのために２とおりの回収を実施した。回収１ではＩＤ番号１５９５０７、１５９５０８、１５９８２１、１５９８２３、１６３２７３、および１６３３２５の６匹のマウスを用いた。回収２ではＩＤ番号１５９１８４、１５９５３３、１５９５３４、１５９８８５、１６３３３５、および１６３３３７の６匹のマウスを用いた。
【０３０２】
リンパ系細胞をＤＭＥＭ中で細砕することによって解離し、細胞を組織から放出し、細胞をＤＭＥＭ中で懸濁した。この細胞を計数し、０．９ｍｌのＤＭＥＭ／１億リンパ細胞を細胞ペレットに添加して、この細胞を穏やかに、ただし完全に再懸濁した。１００μｌのＣＤ９０＋電磁ビーズ／１億細胞を用いて、この細胞を電磁ビーズと４℃で１５分間インキュベートして標識した。最大１０８の陽性細胞を含む磁気によって標識した細胞懸濁液（または最大２×１０９の総細胞）をＬＳ＋カラムに装填し、このカラムをＤＭＥＭで洗浄した。総流出をＣＤ９０−陰性フラクションとして採取した（これらの細胞はほとんどＢ細胞であることが予期された）。
【０３０３】
洗浄し濃縮した６日目のＢ細胞を、ＡＴＣＣから購入したｃａｔ番号ＣＲＬ１５８０の非分泌骨髄腫Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３細胞（Ｋｅａｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２３，１９７９，１５４８−１５５０）と１：４の比率で混合して融合した。この細胞混合物を遠心分離により４００×ｇで４分間穏やかにペレット化した。この上清を静かに移した後、この細胞を１ｍｌピペットを用いて穏やかに混合した。予熱したＰＥＧ（１ｍｌ／１０６Ｂ細胞）を穏やかに撹拌しながら１分間かけてゆっくりと添加後、１分間混合した。次いで予熱したＩＤＭＥＭ（２ｍｌ／１０６Ｂ細胞）を穏やかに撹拌しながら２分間かけて添加した。最後に予熱したＩＤＭＥＭ（８ｍｌ／１０６Ｂ細胞）を３分間かけて添加した。
【０３０４】
この融合した細胞を４００×ｇで６分間スピンダウンし、２０ｍｌの選択培地［ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、Ｌ−グルタミン、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、ＭＥＭ非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより）、ＨＡ−アザセリン・ヒポキサンチンおよびＯＰＩ（オキサロ酢酸、ピルビン酸塩、ウシインスリン）（共にＳｉｇｍａから）ならびにＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で補充］／１０６Ｂ細胞中で再懸濁した。細胞を３７℃で２０〜３０分間インキュベートしてから、２００ｍｌの選択培地内で再懸濁して、Ｔ１７５フラスコ内で３〜４日間培養した。
【０３０５】
融合後３日目に細胞を採取し、４００×ｇで８分間スピンし、１０ｍｌ中の選択培地／１０６融合Ｂ細胞中で再懸濁した。ハイブリドーマ集団のＦＡＣＳ分析を実施してから、細胞を凍結した。
【０３０６】
ハイブリドーマは定期的に選択培地内で増殖させた。潜在的に抗ヒトＳｈｈ抗体を生産するハイブリドーマから採取した全ての上清を続くスクリーニングアッセイの対象とした。
【実施例３】
【０３０７】
抗体価の測定：Ｓｈｈを一過的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞への天然抗原の結合
ヒトＳｈｈを一過的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞上でＦＡＣＳ分析を実施し、親２９３Ｔ細胞と比較して、実施例１および２に記載したように生産したヒトＳｈｈに対する抗体価を測定した。トランスフェクトした細胞または親細胞を５０，０００細胞／ウェルで播種し、２μｌの試料（１：５０希釈）で１時間、４℃でインキュベートした。次いでこのウェルを洗浄し、２μｇ／ｍＬのＣｙ５−結合ヤギ抗ヒト抗体と７−アミノ−アクチノマイシン（７ＡＡＤ）５μｇ／ｍＬで３０分間４℃でインキュベートした。ＦＡＣＳ分析を用いて結合Ｓｈｈを検出した。陽性対照はラット抗Ｓｈｈ抗体（ｃａｔ番号ＭＡＢ４６４１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、陰性対照はＸＭＧ２未投与血清およびＸＭＧ４（ＸＭ３Ｃ−１）未投与血清などであった。続くハイブリドーマ産生のために選択した動物からの血清の分析から得られたフローサイトメトリーデータを表２に列挙する。
【表２】
2012502967.tif 000004
【実施例４】
【０３０８】
抗体価の測定：固定化ビオチン−Ｓｈｈへの結合
固定化ビオチニル化ヒトＳｈｈへの結合のＥＬＩＳＡアッセイを用いて、実施例１および２に記載したように生産した抗体価を測定した。
【０３０９】
抗体価を測定するため、３７℃で１時間インキュベーションして、プレート（Ｃｏｓｔａｒ３３６８ ９６ウェル培地結合プレート）を１×ＰＢＳ、０．０５％アジ化物中のニュートラアビジン８μｇ／ｍｌによりコーティングした。プレートを１％ミルクのＰＢＳ溶液の２５０μｌ／ウェルで３０分間ＲＴでブロッキングした。続いて、５０μｌの５００ｎｇ／ｍｌビオチニル化Ｓｈｈの１×ＰＢＳ、１％ミルク（ｗｔ／ｖｏｌ）を各ウェルに添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。次いで抗体を、ブロッキングバッファー（１×ＰＢＳ、１％ミルク）中で１：１００希釈から開始し、２つずつ（ｉｎ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）１：３で量を変え（ｔｉｔｒａｔｅ）、各ウェルに添加した。このプレートを室温で１時間インキュベートし、洗浄してから、１：１０００希釈した二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＰＯＤ；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で室温で１時間インキュベートした。続いてプレートを洗浄し、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＴＭＢ溶液（５０μｌ／ウェル）を添加して、ＲＴで３０分間生成させた。生成反応を同容積の１Ｎ ＨＣｌでクエンチした。吸光度を４５０ｎｍで測定した。陽性対照は、１μｇ／ｍｌから１：３で量を変えたヤギ−抗Ｓｈｈ（ｃａｔ番号ＡＦ４６４、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびラット−抗Ｓｈｈ（ｃａｔ番号ＭＡＢ４６４１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（二次抗体：各々、１：１２５０希釈したウサギ−抗ラットＩｇＧ Ｆｃ ＰＯＤおよび１：１０００希釈したウサギ−抗ヤギＩｇＧ Ｆｃ ＰＯＤ）であった。陰性対照はＸＭＧ２未投与血清およびＸＭＧ４（ＸＭ３Ｃ−１）未投与血清などであった。表３に、結合抗体の分析から得られたＥＬＩＳＡ測定値の概要を提示する。値は、ＯＤ４５０測定値２を得る希釈計算値を示す。１：１００希釈時にＯＤ＜２であった血清において、１：１００時に得られたＯＤを提示する。
【表３】
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【実施例５】
【０３１０】
結合アッセイを用いたハイブリドーマ上清のスクリーニング
実施例１および２に記載したように生産した抗体を含むハイブリドーマ上清を、固定化ビオチニル化Ｓｈｈへの結合を測定するアッセイによりスクリーニングした。
【０３１１】
ハイブリドーマ上清のＳｈｈ結合活性をスクリーニングするため、ＥＬＩＳＡ形態における固定化ビオチン−Ｓｈｈに対する抗体結合を基本的に実施例４に記載したように実施した。４℃で一晩インキュベーションして、プレート（Ｃｏｓｔａｒ３７０２培地結合３８４ウェルプレート）を１×ＰＢＳ、０．０５％アジ化物中のニュートラアビジン４μｇ／ｍｌでコーティングした。１％ミルクのＰＢＳ溶液でブロッキング後、４０μｌの５００ｎｇ／ｍｌビオチニル化Ｓｈｈの１×ＰＢＳ溶液、１％ミルク（ｗｔ／ｖｏｌ）を各ウェルに添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。ハイブリドーマ上清（１０μｌ／ウェル）を４０μｌの１％ミルク、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０のＰＢＳ溶液／ウェルに添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄して二次抗体（１００ｎｇ／ｍｌのヤギ−抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰ）によりインキュベーション後、ウェルをＴＭＢ基質で生成させてから、１Ｎ ＨＣｌでクエンチした。結合抗体分析から得られたＥＬＩＳＡ測定値の概要を表４に提示する。
【表４】
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【０３１２】
ハイブリドーマ上清では、ＦＭＡＴ（蛍光測定マイクロ容積アッセイ技術）を用いて、一過的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞表面上に発現した天然ヒトＳｈｈに対する結合活性についてもスクリーニングした。１μｇのＤＮＡおよび１μｌの２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）／１×１０６細胞を用いて２９３Ｔ細胞の一過的なトランスフェクションを実施した。細胞を、１×１０６細胞／ｍｌ、５％ＣＯ２中、３７℃で一晩維持した。トランスフェクト細胞を３８４ウェルプレート中、２５００細胞／ウェルで１７，５００非トランスフェクト親細胞／ウェルと共に播種した。上清を各ウェルに添加し（１０μｌ／ウェル）、ＲＴで１．５時間インキュベートした。Ｃｙ５標識ヤギ−抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ二次抗体を各ウェルに添加して（１０μｌ／ウェル）最終濃度を４．２５μｇ／ｍｌとし、ＲＴで３時間インキュベートした。Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステムでプレートを読取った。結果を表５に表す。総シグナル（ＦＬ１×カウント）を、ウェル中の陽性細胞数（カウント）×陽性細胞の平均蛍光強度（ＦＬ１）として定義する。
【表５】
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【０３１３】
最後に、排出したハイブリドーマ上清中の抗体の天然Ｓｈｈに対する結合を、フローサイトメトリーを用いて評価した。ヒトＳｈｈは、実施例５に上記したように、一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞表面上で発現した。トランスフェクト細胞または親細胞をＶ底ウェル（５０，０００細胞／ウェル）プレートに播種した。排出した上清（５０μｌの１：１０希釈）を各ウェルに添加し、４℃で１時間インキュベートした。ラット−抗Ｓｈｈ ＭＡＢ４６４１を陽性対照として用いた。５０μｌの容積中２μｇ／ｍｌの濃度まで添加した。細胞を洗浄し、二次抗体（Ｃｙ５標識ヤギ−抗ヒトＩｇＧまたはＣｙ５標識ヤギ−抗ウサギＩｇＧ）２μｇ／ｍｌ溶液５０μｌを各ウェルに添加した。７ＡＡＤを５μｇ／ｍｌの濃度まで添加し、混合物をＲＴで３０分間インキュベートした。次いで各試料の平均蛍光をフローサイトメトリーを用いて決定した。結果を表６に示す。
【表６】
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【実施例６】
【０３１４】
抗体含有上清の相対活性の決定
共培養アッセイ系のＮＩＨ ３Ｔ３細胞中で発現するＧｌｉ１ルシフェラーゼリポーターの誘導をいかによく阻害したか測定することにより、各種抗体を含む上清の相対効能を比較した。このＮＩＨ ３Ｔ３細胞は、プロモーター領域においてルシフェラーゼ転写開始部位上流にＧｌｉ１結合部位の複数コピーを含むホタルルシフェラーゼリポーターコンストラクトを安定して発現する。この細胞は非特異的効果を標準化するために使用されるウミシイタケルシフェラーゼコンストラクトも有する。
【０３１５】
ＮＩＨ ３Ｔ３−Ｇｌｉ１細胞を６０００細胞／ウェルで１０％ＦＢＳを添加したフェノールレッド非含有ＤＭＥＭ溶液中に９６ウェルプレートに播種して、５％ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベートした。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にｐＪＰ１１０、ｐＣＲ３．１ベース（ｃａｔ番号１２３４７０１９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の哺乳動物発現コンストラクトを全長ヒトＳｈｈのについて一過的にトランスフェクトした。２９３フェクチン脂質試薬を用いて、細胞に１μｇのＤＮＡ／１０６細胞をトランスフェクトし、それらを振とうさせながら５％ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベートした。Ｓｈｈ−トランスフェクトした２９３Ｔ細胞（２４，０００細胞／ウェル）を２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ハイブリドーマ上清と総容積１００μｌの培地で３７℃で２時間プレインキュベートした。培地をＮＩＨ ３Ｔ３−Ｇｌｉ１細胞から除去し、ハイブリドーマ上清を含む培地中で７５μｌのトランスフェクトした２９３Ｔ細胞と置換した。この細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で一晩共培養した。翌日、７５μｌのＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬（ｃａｔ番号Ｅ２９４０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加し、ＲＴで１０分間インキュベートした。次いでＴｅｃａｎ社の照度計上で５００ミリ秒の読取時間にてホタルルシフェラーゼシグナルを直ちに測定した。Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ停止液（４０μｌ／ウェル）を各ウェルに添加し、１０分間インキュベートした。次いでウミシイタケルシフェラーゼのシグナルをＴｅｃａｎ社の機器を用いて５００ミリ秒間読取って得た。４０の抗Ｓｈｈハイブリドーマ上清について重複実験の結果を表７に示す。
【０３１６】
抗Ｓｈｈハイブリドーマ上清の中和活性も、溶解性Ｓｈｈ−Ｎ、つまりＳｈｈのＮ末端シグナル伝達領域を含む馴化培地（ＣＭ）を用いたＧｌｉ１リポーター活性を刺激する同様のリポーターアッセイにおいて検討した。
【０３１７】
共培養リポーターアッセイと同じプロトコールにいくつかの修正を加えたものを用いて、ＣＭリポーターアッセイを実施した。Ｓｈｈ含有馴化培地（１２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）をハイブリドーマ上清（２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）の１０％ＦＢＳ含有フェノールレッド非含有ＤＭＥＭ溶液で３７℃で２時間プレインキュベートした。ＮＩＨ ３Ｔ３−Ｇｌｉ１細胞（６０００細胞／ウェルで播種）を７５μｌのＳｈｈ ＣＭ−上清ミックスで５％ＣＯ２中、３７℃で一晩処置した。翌日、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を上記のように決定した。重複実験の結果を表７に示す。
【表７】
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【実施例７】
【０３１８】
Ｇｌｉ１リポーターアッセイにおける精製抗体の相対活性の決定
Ｇｌｉ１リポーターアッセイにおいて、候補抗体のハイブリドーマサブクローンに由来する精製した抗体材料の活性を検討した。これらのアッセイを実施例６に記載したように行った。精製抗体を２０μｇ／ｍｌの濃度から開始して順次１：５希釈した。共培養したトランスフェクト２９３Ｔ細胞により、または馴化培地中でＳｈｈ源が供給される両アッセイ形式における重複実験の結果を表８に報告する。有意な阻害は２０μｇ／ｍｌのみで観察されたため、それらのデータのみを示す。
【表８】
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【実施例８】
【０３１９】
ＳＨＨ抗体の構造的分析
この抗体の可変重鎖および可変軽鎖の配列を解析してそれらのＤＮＡ配列を決定した。抗Ｓｈｈ抗体の完全な配列情報を、各γおよびκ鎖の組み合わせのためのヌクレオチドとアミノ酸配列を載せた配列表に提示する。この可変重鎖配列を分析してＶＨファミリー、Ｄ領域配列およびＪ領域配列を決定した。次いでこの配列を翻訳して一次アミノ酸配列を決定し、生殖系列ＶＨ、ＤおよびＪ領域配列と比較して体細胞超変異を評価した。
【０３２０】
下表９は、抗体重鎖領域をそれらの同族生殖系列の重鎖領域と比較し、抗体軽鎖領域をそれらの同族生殖系列の軽鎖領域と比較した表である。
【表９】
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【０３２１】
免疫グロブリン遺伝子は免疫反応の成熟中に各種修飾（Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント間の組換え、アイソタイプスイッチ、および可変領域の超変異を含む）を行う。組換えおよび体細胞超変異は、抗体多様性および親和性成熟を生じる基盤であるが、それらはかかる免疫グロブリンの市販治療薬としての製造を困難にし得るかまたはこの抗体の免疫原性リスクを増大し得る配列障害も生じ得る。一般的に、ＣＤＲ領域の変異は改善された親和性および機能に寄与する可能性が高い一方、フレームワーク領域の変異は免疫原性リスクを増大し得る。このリスクはフレームワーク変異を生殖系列へ戻すことにより減らすことができ、一方、抗体活性は悪影響を受けないことを確実にする。一部の構造的障害は多様化プロセスにより生じ得るし、重鎖および軽鎖可変領域に寄与する生殖系列配列にも存在し得る。不安定性、凝集、産生物の異質性、または増大した免疫原性に至り得る潜在的な構造的障害は、その原因に関わらず、除去することが所望され得る。望ましくない障害の例としては、不対システイン（ジスルフィド結合スクランブリング、または可変スルフヒドリル付加体形成に至り得る）、Ｎ結合グリコシル化部位（構造および活性の異質性に至り得る）、ならびに脱アミド化（例えばＮＧ、ＮＳ）、異性体化（ＤＧ）、酸化（曝露メチオニン）、および加水分解（ＤＰ）部位が挙げられる。
【０３２２】
リード抗体の免疫原性リスクを減らして製薬学的特性を改善するために、生殖系列の変異数を減らすおよび／または構造的障害を除去することが所望され得る。
【０３２３】
従って、一実施形態において、特定の抗体がその各生殖系列配列とアミノ酸レベルで異なる場合、抗体配列は変異させて生殖系列配列に戻すことができる。かかる矯正変異は、標準分子生物学的技術を用いて、１、２、３もしくはそれ以上の位置、または任意の変異した位置の組み合わせで起こり得る。非限定的な例として、残基番号３１位のＴからＳへの変異（変異１）および残基番号８０位のＮからＹ、または残基番号１０８位のＰからＹにより、対応する生殖系列配列と異なるｍＡｂ ３Ｈ８の重鎖配列（配列番号１４）を表１２に示す（表９参照）。従って、アミノ酸またはｍＡｂ ３Ｈ８重鎖をコードするヌクレオチド配列を修飾して変異１を変化させ、変異１部位の生殖系列配列を得ることができる。さらに、アミノ酸またはｍＡｂ ３Ｈ８重鎖をコードするヌクレオチド配列を修飾して変異２を変化させ、変異２部位の生殖系列配列を得ることができる。さらに、アミノ酸またはｍＡｂ ３Ｈ８重鎖をコードするヌクレオチド配列を修飾して変異３を変化させ、変異３部位の生殖系列配列を得ることができる。なおさらに、アミノ酸またはｍＡｂ ３Ｈ８重鎖をコードするヌクレオチド配列を修飾して変異１、変異２および変異３、または２つ以上の変異の任意の他の組み合わせを変化させ、それらの特定部位の生殖系列配列を得ることができる。ｍＡｂ ６Ｄ７、３Ｈ８、および１Ｇ１の生殖系列のかかるバリエーションの位置を下表１０〜１５に例証する。各行は太字で指定の位置の生殖系列および非生殖系列残基の固有の組み合わせを表す。
【０３２４】
別の実施形態において、本発明は、本発明の抗体の異質性に影響を及ぼし得る配列における任意の構造的障害の置換を含む。かかる障害としては、グリコシル化部位、不対システイン、表面曝露メチオニンなどが挙げられる。かかる異質性リスクを減らすために、１つまたは複数のかかる構造的障害を除去するように変化させることが提唱される。
【０３２５】
一実施形態において、抗体生殖系列または抗体配列から１つまたは複数の共通Ｎ結合グリコシル化部位を除去することが所望され得る。当業者はかかるグリコシル化部位を容易に同定できるであろう。典型的にＮ結合グリコシル化共通部位配列は中央アミノ酸がプロリン（Ｐｒｏ）ではあり得ないＡｓｎ−任意のＡＡ−ＳｅｒまたはＴｈｒの配列を有する。グリコシル化部位の発現例は６Ｄ７重鎖中のＮＤＳ（配列番号４６の残基番号１０１〜３位）である。この例では、グリコシル化部位ＮＤＳの１０１位のＮはＱに変異した。しかしながら、Ｎは、類似した側鎖特性を有する任意の適切なアミノ酸に変異し得た。グリコシル化部位ＮＤＳの１０３位のＳの修飾はＳｈｈ結合を減少させたことに留意されたい。
【０３２６】
別の例では、不対システインは単独でまたは他の構造的変化と接合して置換することができる。不対システインの例は、抗体６Ｄ７の３３位の軽鎖ＣＤＲ１に発現する。この不対システインは、類似した側鎖特性を有する適切なアミノ酸（セリンなど）に変異させることができる。別の例では、不対システインは抗体１Ｇ１の３３位の軽鎖ＣＤＲ１に発現する。この不対システインも同様に、類似した側鎖特性を有する適切なアミノ酸（セリンなど）に変異させることができる。
【０３２７】
本明細書記載のように、最適化された配列は１つもしくは複数の位置が変異してその生殖系列配列に戻っている、または１つもしくは複数の構造的障害を除去するために修飾され得る配列である。最適化された配列としては、１つまたは複数の位置が変異してその生殖系列配列に戻っており、１つまたは複数の構造的障害を除去するためにさらに修飾もされている配列も含み得る。
【表１０】
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【０３２８】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤または抗体は、配列番号４６を含む配列を含む。特定の実施形態において、配列番号４６は、表１０の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列番号４６は、表１０に示されるような生殖系列残基の任意の１つ、任意の２つ、任意の３つ、任意の４つ、任意の５つ、任意の６つ、任意の７つ、任意の８つ、または８つ全部を含む。特定の実施形態において、配列番号４６は、表１０の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの固有の組み合わせを含む。しかしながら、１０３位のＳのＹアミノ酸残基への修飾は抗体のＳｈｈ結合を減少させることに留意されたい。他の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、ＶＨ４−３１、Ｄ４−１７およびＪＨ２領域を有する生殖系列配列に由来し、１つまたは複数の残基が、その位置において、対応する生殖系列残基をもたらすように変異している。特定の生殖系列配列に変異している６Ｄ７重鎖可変領域の具体例としては、６Ｄ７ ＶＨＯＰ（非生殖系列配列４６位のＮがＧに変異し、８５位のＴがＳに変異して最適化されている）が挙げられる。修飾配列はまた、潜在的なグリコシル化部位ＮＤＳを除去するためにさらに修飾／最適化されている、すなわち１０１位に生じたＮがＱに変異している。最適化された６Ｄ７の各種可変重鎖配列を表１６に示す。さらに、Ｎ３０の生殖系列Ｓへの修飾は効能を喪失させることに留意されたい。
【表１１】
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【０３２９】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤または抗体は、配列番号４８を含む配列を含む。特定の実施形態において、配列番号４８は、表１１の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列番号４８は、表１１に示されるような生殖系列残基の任意の１つ、任意の２つ、任意の３つ、任意の４つ、任意の５つ、任意の６つ、任意の７つ、任意の８つ、任意の９つ、または９つ全部を含む。特定の実施形態において、配列番号４８は、表１１の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの固有の組み合わせを含む。特定の生殖系列配列に変異している６Ｄ７軽鎖可変領域の具体例としては、表１１に示す６Ｄ７ ＶＬＯＰ２（７７位のＡがＴに変異して最適化されている）または６Ｄ７ ＶＬＯＰ３（非生殖系列配列４８位のＦがＹに変異し、７７位のＡがＴに変異して最適化されている）が挙げられる。さらに、６Ｄ７軽鎖は不対システインを除去するためにさらに修飾できる。不対システインの一例は抗体６Ｄ７軽鎖ＣＤＲ１の３３位に発現する。この不対システインは、類似した側鎖特性を有する適切なアミノ酸（セリンなど）に変異させ得る。６Ｄ７ ＶＬＯＰ２および６Ｄ７ ＶＬＯＰ３はこの構造的障害を除去するためにさらに最適化されている。
【表１２】
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【０３３０】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤または抗体は、配列番号１４を含む配列を含む。特定の実施形態において、配列番号１４は、表１２の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列番号１４は、表１２に示されるような生殖系列残基の任意の１つ、任意の２つ、任意の３つ、または３つ全部を含む。特定の実施形態において、配列番号１４は、表１２の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの固有の組み合わせを含む。他の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、ＶＨ３−３３、Ｄ３−１０およびＪＨ４領域を有する生殖系列配列に由来し、１つまたは複数の残基が、その位置において、対応する生殖系列残基をもたらすように変異している。特定の生殖系列配列に変異した３Ｈ８重鎖可変領域の具体例としては、表１６に示すように、３Ｈ８ＶＬ ＯＰ（非生殖系列配列８０位のＮがＹに変異して最適化されている）が挙げられる。
【表１３】
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【０３３１】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤または抗体は、配列番号１６を含む配列を含む。特定の実施形態において、配列番号１６は、表１３の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列番号１６は、表１３に示されるような生殖系列残基の任意の１つ、任意の２つ、任意の３つ、任意の４つ、任意の５つ、または５つ全部を含む。特定の実施形態において、配列番号１６は、表１３の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの固有の組み合わせを含む。特定の生殖系列配列に変異した３Ｈ８軽鎖可変領域の具体例としては、表１６に示すように、３Ｈ８ ＶＬＯＰ（非生殖系列配列４９位のＦがＹに変異して最適化されている）が挙げられる。
【表１４】
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【０３３２】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤または抗体は、配列番号２２を含む配列を含む。特定の実施形態において、配列番号２２は、表１４の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列番号２２は、表１４に示されるような生殖系列残基の任意の１つ、任意の２つ、任意の３つ、または３つ全部を含む。特定の実施形態において、配列番号２２は、表１４の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの固有の組み合わせを含む。他の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、ＶＨ３−２１、Ｄ４−１７およびＪＨ６領域を有する生殖系列配列に由来し、１つまたは複数の残基が、その位置において、対応する生殖系列残基をもたらすように変異している。ＲＧＤの構造的障害配列における修飾は、ＧがＡに変異した時、活性を除去することに留意されたい。
【表１５】
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【０３３３】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤または抗体は、配列番号２４を含む配列を含む。特定の実施形態において、配列番号２４は、表１５の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列番号２４は、表１５に示されるような生殖系列残基の任意の１つ、任意の２つ、任意の３つ、任意の４つ、任意の５つ、任意の６つ、任意の７つ、または７つ全部を含む。特定の実施形態において、配列番号２４は、表１５の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの固有の組み合わせを含む。
【表１６】
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【０３３４】
当業者は、ＣＤＲ範囲を定義する代替方法があることを認識するであろう。表１のＶＨ ＣＤＲ１の開始残基は、Ｓｃａｖｉｎｅｒ Ｄ，Ｂａｒｂｉｅ Ｖ，Ｒｕｉｚ Ｍ，Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ−Ｐ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｓｐｌａｙｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｈｅａｖｙ，Ｋａｐｐａ ａｎｄ Ｌａｍｂｄａ Ｖａｒｉａｂｌｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ． Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ １９９９，１６：２４６−２４０に記載された方法により定義されている。表９の残りのＣＤＲ範囲はカバット定義により定義されている。
【０３３５】
表９のＣＤＲ範囲はすべてカバット定義により定義されている。
【実施例９】
【０３３６】
ＳＨＨ抗体の機能的効能の決定
ＳｈｈがＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の骨形成を誘導する骨芽細胞分化アッセイにおける精製したＳｈｈ抗体の効能を決定した。
【０３３７】
播種培地（ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−グルタミン）中５０００細胞／ウェルで３８４ウェル透明底プレート（ｃａｔ番号４３３６、Ｍａｔｒｉｘ）にてＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を播種し、５％ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベートした。抗体をアッセイ培地中の半対数増分中で順次希釈し、同容積のＳｈｈ含有１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）馴化培地（ＣＭ）と併合した。量を変えた抗体を、ポリプロピレン希釈プレート中でＳｈｈと４５分間、５％ＣＯ２中、３７℃でプレインキュベートした。抗体の最終濃度範囲は５０μｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌであった。Ｓｈｈ含有ＣＭを５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の最終濃度で使用した。５％ＣＭ中のＳｈｈのＮ末端シグナル伝達領域の濃度を約１０ｎＭと決定した。プレインキュベーション工程が完了後、播種培地をすべてのウェルから除去してＳｈｈと抗体の混合物を含む３０μｌの培地に取り替えた。この細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で７２時間インキュベートした。
【０３３８】
骨芽細胞分化をアルカリホスファターゼ産生により評価した。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄してから、１５μｌ／ウェルＲＩＰＡ溶解および抽出バッファー（ｃａｔ番号８９９００、Ｐｉｅｒｃｅ）で溶解した。プレートを−８０℃で２０分間凍結し、ベンチトップ上で解凍した。基質溶液（１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルリン酸、ｃａｔ番号Ｎ２７６５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１Ｍジエタノールアミン（ｃａｔ番号Ｄ８８８５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．８、新規作製）を各ウェルに添加した（４５μｌ／ウェル）。プレートを３７℃で少なくとも９０分間インキュベートし、吸光度を４０５ｎｍで測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでデータ分析を実施した。ＩＣ５０値を用量反応曲線から計算し、これを表１７に報告する。
【表１７】
2012502967.tif 000053
【０３３９】
Ｓｈｈ処置Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞中のＧｌｉ１およびＰｔｃ１のｍＲＮＡ誘導を阻害する精製抗体の能力を測定するアッセイ
播種培地（ＭＥＭ、０．５％ＦＢＳ、１％Ｌ−Ｇｌｕｔ）中１０，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレート（２００μｌ／ウェル）にてＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を播種し、５％ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベートした。抗体を順次希釈し、実施例９に上記したようにプレインキュベートした。プレインキュベーションが完了後、播種培地をすべてのウェルから除去し、Ｓｈｈと抗体の混合物を含む１００μｌの培地に取り替えた。この細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で７２時間インキュベートした。
【０３４０】
製造業者の指示に従い、Ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｃＴキット（ｃａｔ番号ＡＭ１７２８、ＡＢＩ）を用いて定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）のためにＲＮＡを調製した。簡単に述べると、細胞を冷ＰＢＳですすいだ。ＤＮａｓｅＩを添加して溶菌液を調製し、５０μｌの溶菌液を各ウェルに添加し、ＲＴで５分間インキュベートした。続いて、５μｌの停止液を各ウェルに添加し、ＲＴで２分間インキュベートした。プレートを−８０℃で保存した。ｃＤＮＡを１０μｌの細胞可溶化物、２５μｌの２×逆転写酵素（ＲＴ）バッファー、および２．５μｌの２０×ＲＴ酵素ミックスと調製して４０μｌ／試料の最終容積とした。このＲＴ反応を３７℃で６０分間実施し、９５℃で５分間インキュベートすることにより反応を停止させた。試料を−８０℃で一晩保存した。
【０３４１】
定量ＰＣＲ反応を実施し、マウスＧｌｉ１およびＰｔｃ１量をＨＰＲＴ１と比較して測定した。下記のＡＢＩ ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを使用した：マウスＧｌｉ１、Ｍｍ００４９４６５４＿ｍ１；マウスＰｔｃ１、Ｍｍ００４３６０２６＿ｍ１；およびマウスＨＰＲＴ１、Ｍｍ００４４６９６８＿ｍ１。１０μｌのユニバーサル２×ＰＣＲマスターミックス、１μｌの２０×プローブ／プライマーミックス、および５μｌのｃＤＮＡ鋳型を混合して（最終容積２０μｌ）、熱サイクル反応を調製した。試料を５０℃に２分間熱した後、９５℃に１０分間熱した。サイクルを９５℃で１５秒間および６０℃で１分間４０回、ＡＢＩ ７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲ系で実施した。内標準としてマウスＨＰＲＴ１を用いた各試料のデルタデルタＣｔ値を計算することにより、各試料中のマウスＧｌｉ１およびＰｔｃ１のＲＮＡ量を決定した（表１８参照）。
【表１８】
2012502967.tif 000054
【実施例１０】
【０３４２】
精製ＳＨＨ抗体のヒトＳＨＨとの結合
ＥＬＩＳＡベースの方法を用いて、精製抗体の組換えヒトＳｈｈへの結合を測定した。ＳｈｈのＮ末端シグナル伝達領域、つまりＳｈｈ−Ｎは２つの形態：脂質修飾欠損の細菌から単離した精製タンパク質として、および馴化培地の構成要素としてＮ末端パルミトイル修飾を含むがＣ末端コレステロール部分欠損の形態で提示した。
【０３４３】
プレート（黒色フレーム、白色ウェルＢ＆Ｗ ＩｓｏＰｌａｔｅ Ｈｉｇｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙポリスチレン製ＥＬＩＳＡプレート、ｃａｔ番号６００５５８０、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を１．５μｇ／ｍｌ（１００μｌ／ウェル）組換えヒトＳｈｈ（組換えヒトソニック・ヘッジホッグＣ２４ＩＩアミノ末端ペプチド、ｃａｔ番号１８４５−ＳＨ−０２５／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のＰＢＳ溶液、またはＰＢＳで希釈した１００μｌ／ウェルの３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｓｈｈ馴化培地（ＣＭ）でコーティングした。このプレートを密封し、５℃で一晩、振とう機に入れた。翌日、このプレートをＰＢＳと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で４回洗浄した。このプレートをＰＢＳ中に希釈した基本的にグロブリンを含まないＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ｃａｔ番号３１５６）１％で室温で１時間ブロッキングした。このプレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。１００μｌのＰＢＳ−Ｔ中で精製抗体の量を変え（３０μｇ／ｍＬの濃度から開始し、少なくとも６対数に渡り半対数で連続希釈）、ウェルに添加して、振とうしながら４℃で一晩インキュベートした。抗体対照はヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、各々Ｃａｔ番号Ｉ５４０４および番号Ｉ４６３９）などであった。このプレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。ヤギ−抗ヒトＩｇＧ Ｈ＋Ｌのアリコート１００μｌ（ＫＰＬ、ｃａｔ番号０７４−１００６）をＰＢＳ−Ｔで１：５０，０００希釈して各ウェルに添加し、このプレートを振とうしながら室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、化学発光ペルオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ番号ＣＰＳ−２−６０）を室温で添加し、プレートをホイルで覆い１０分間インキュベートした。各ウェルをＳｐｅｃｔｒｏｍａｘ ５ｅで１００ミリ秒間読取り、ＲＬＵを決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて各抗体の見かけ上の結合親和性（ＫＤ）を決定し、これを表１９に示す。
【表１９】
2012502967.tif 000055
【実施例１１】
【０３４４】
ＳＨＨのＮ末端シグナル伝達領域に対する精製抗体の結合親和性の決定
ヒトＩｇＧ２定常領域背景で発現して精製した４つの組換え抗体の結合親和性を高分解Ｂｉａｃｏｒｅにより測定した。すべての実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００機器を用いて２３℃で実施した。各組換えＩｇＧ２抗体（６Ｄ７、３Ｈ８、１Ｇ１、および１Ｈ８）を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１００３−４９）中で２０μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。慣例的なアミンカップリング化学を用いてすべてのｍＡｂをＣＭ５バイオセンサーチップと共有結合させた。各抗体の固定化量の範囲は１７７〜８３８ＲＵであった。ＨＢＳ−Ｐランニングバッファー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１００３−６８、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％Ｐ−２０）を脱ガスして調製後、濾過した保存液中のＢＳＡを添加して最終濃度を１００μｇ／ｍＬとした。Ｓｈｈ含有馴化培地（ＣＭ）を用いた実験のため、１．５ｍＬアリコートを１３，２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。すべてのＳｈｈ馴化培地試料および組換えヒトＳｈｈ Ｃ２４ＩＩ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ番号１８４５−ＳＨ／ＣＦ、Ｌｏｔ番号ＭＪＣ０９）をＨＢＳ−Ｐランニングバッファーで希釈した。Ｓｈｈ試料を、２重参照のため分散させた数回の緩衝液注入サイクルにて３重に無作為に注射した。すべてのセンサーグラムデータをＳｃｒｕｂｂｅｒを用いて処理し、ＣＬＡＭＰを用いて１：１相互作用モデルにフィットさせた（質量輸送のｋｍという用語を含む）。馴化培地とランニングバッファーの間の有意なバルク反射指数差のため、バルク反射指数因子をｍＡｂ １Ｈ８の最高馴化培地濃度のセンサーグラムにフィットさせる必要があった。得られた結合定数を表２０に列挙する。
【０３４５】
表２０のアスタリスクは、これらのｍＡｂの反応がほぼ拡散制御会合速度により極度に制限される質量輸送であるため完全には信頼できないキネティクスを示す。しかしながら、比率（ｑｕｏｔｉｅｎｔ）を用いて信頼できるＫＤを計算する際、測定されたキネティクスにおける任意の質量輸送効果、つまりｋｍは相殺されるため、生じた平衡解離定数（ＫＤ＝ｋｄ＊ｋｍ／ｋａ＊ｋｍ）は信頼できる。さらに、Ｓｈｈ（ＣＭとＣ２４ＩＩペプチド形態の両方）のｍＡｂ ６Ｄ７への結合はセンサーグラムにおけるいくつかの複雑性を示すため、決定したＫＤは概算値に過ぎないとみなされるべきである。
【表２０】
2012502967.tif 000056
【実施例１２】
【０３４６】
細胞表面上で発現した全長ＳＨＨに対する精製抗体の結合親和性の決定
安定したＨＥＫ２９３細胞プールの表面上で異所的に発現する全長Ｓｈｈに対する精製抗体の結合親和性をフローサイトメトリーを用いて決定した。抗体の最終濃度範囲が２０ｎＭ〜８０ｐＭとなるようにＰＢＳ中で様々に希釈したハイブリドーマ由来の抗体とＨＥＫ２９３−Ｓｈｈ−ＦＬ細胞を混合した。抗体を、ポリプロピレンマイクロタイタープレート中の約７４，０００細胞／ウェル（最終容積３００μｌ）の細胞と混合した。このプレートを振とうしながら４℃で５時間インキュベートした。氷冷ＰＢＳで洗浄後、２２５μＬの９９ｎＭ Ｃｙ５ヤギα−ヒトポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｃａｔ番号１０９−１７５−００８）を３Ｈ８および６Ｄ７と結合した細胞に添加した。このプレートを４℃で２０分間振とうした。ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ ＨＴＳフローサイトメトリー機器を用いて１０，０００事象の平均蛍光を各試料で記録した。抗体濃度の関数として平均蛍光のプロットをＳｃｉｅｎｔｉｓｔ３．０ソフトウェアにより非線形にフィットさせてＫＤを推定した。結果を表２１に示す。
【表２１】
2012502967.tif 000057
【０３４７】
ヒトＩｇＧ２定常領域で構成された精製組換え抗体の結合親和性も、ＣＡＯＶ３卵巣ガン細胞の安定したクローン表面上で発現したＳｈｈ全長において、上記の方法によりフローサイトメトリーを用いて決定した。最終容積３００μｌのＰＢＳ中の様々に希釈した抗体と細胞を混合し、８４，０００細胞／ウェルの濃度でインキュベートした。このプレートを振とうしながら４℃で５時間インキュベートした。氷冷ＰＢＳで洗浄後、ヒト抗Ｓｈｈ抗体と結合した細胞をＣｙ５ヤギα−ヒト二次抗体で上記のように染色した。抗体濃度の関数としての平均蛍光プロットをＳｃｉｅｎｔｉｓｔ３．０ソフトウェアにより非線形にフィットさせてＫＤを推定した。結果を表２２に報告する。
【表２２】
2012502967.tif 000058
【実施例１３】
【０３４８】
競合結合アッセイを用いた、精製ＳＨＨ抗体のエピトープ・ビン（ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎ）の解明
ＥＬＩＳＡベースの方法（基本的に実施例１０に記載のもの）を用いて、過剰量の非標識競合抗体の存在下、組換えヒトＳｈｈ−Ｎに対するビオチニル化精製抗体の結合を決定した。
【０３４９】
製造業者の指示に従い、Ｐｉｅｒｃｅ ＥＺ−リンクＮＨＳ ＰＥＧ４−ビオチンキット（Ｃａｔ番号２１３２９）により抗体６Ｄ７および３Ｈ８をビオチニル化した。簡単に述べると、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラムを用いて各抗体アリコート５００μｇの緩衝液をＢｕｐＨリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｉｅｒｃｅ、ｃａｔ番号２８３７２）に交換した。超純水（１７０μｌ）を用いて２ｍｇのＮＨＳ ＰＥＧ４−ビオチンを溶解し、２０ｍＭ原液を調製した。製造業者の推奨に基づき、３〜５分子のビオチン／ＩｇＧ分子で抗体を標識するＩｇＧおよびビオチンの適量を計算した。ＩｇＧとビオチンを混合して氷上で２時間インキュベートし、Ｚｅｂａ脱塩カラムで無反応のＮＨＳ ＰＥＧ４−ビオチンを除去した。製造業者の指示に従い、吸光度５００ｎｍにてビオチニル化ＩｇＧ添加後のＨＡＢＡ／アビジン溶液の変化を測定して計算することにより、標識化効率を決定した。
【０３５０】
プレート（黒色フレーム、白色ウェルＢ＆Ｗ ＩｓｏＰｌａｔｅ Ｈｉｇｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙポリスチレン製ＥＬＩＳＡプレート、ｃａｔ番号６００５５８０、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を振とうしながら５℃で一晩インキュベーションすることにより、ＰＢＳ溶液で希釈した１００μｌ／ウェルの３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｓｈｈ馴化培地（ＣＭ）でコーティングした。翌日、このプレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄してから、１％ＢＳＡのＰＢＳ−Ｔ溶液で５℃で５時間ブロッキングした。
【０３５１】
各ビオチニル化抗体を６対数濃度範囲（３μｇ／ｍｌ〜１ｐｇ／ｍｌ）に渡って１０倍希釈系を作製し、各々希釈したビオチニル化抗体の結合を過剰な非標識競合抗体の不在または存在下でＳｈｈ結合ＥＬＩＳＡにより測定した。各非標識競合抗体をその競合抗体について測定したＫＤを超える各種濃度で含んだ。ＫＤ＋１、ＫＤ＋２、ＫＤ＋４、ＫＤ＋８、およびＫＤ＋１６の濃度の各競合抗体を様々に希釈した各ビオチニル化抗体と混合した。このプレートをブロッキングしてＰＢＳ−Ｔで洗浄後、希釈したビオチニル化抗体を、非標識競合抗体を伴いまたは伴わずに添加してＰＢＳ−Ｔの最終容積を１００μｌとし、振とうしながら５℃で一晩インキュベートした。翌日、このプレートを２００μｌのＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓｃａｔ番号ＤＹ９９８ ｌｏｔ１１５７７７２）をＰＢＳ−Ｔで１：４００希釈し、各ウェルに１００μｌを添加後、振とうしながら室温で２時間インキュベーションした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、化学ルミネセンスペルオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ、ＣＰＳ−２−６０）を添加し（１００μｌ／ウェル）、プレートをホイルで覆い室温で１０分間インキュベートした。各ウェルをＳｐｅｃｔｒｏｍａｘ ５ｅで１００ミリ秒間読取り、ＲＬＵを決定した。
【０３５２】
各標識抗体の結合曲線がｘ軸（ビオチニル化抗体の濃度）上で右に移動し、標識抗体の見かけ上のＫＤの上昇に至ることによって競合が示された。交差競合を示した抗体を共通のエピトープ・ビンを占めるものとして定義した。
【０３５３】
予期したとおり、非標識６Ｄ７はビオチニル化６Ｄ７の結合と競合することに成功した。過剰３Ｈ８の濃度上昇はビオチニル化３Ｈ８結合曲線を徐々に右へ移動し、非標識３Ｈ８の最高濃度時に標識６Ｄ７の見かけ上のＫＤの５倍上昇に至った。１Ｇ１も１Ｈ８も６Ｄ７結合に対して何も効果を及ぼさなかった。過剰な非標識３Ｈ８は標識３Ｈ８の結合と競合した。過剰な非標識６Ｄ７は効果的にビオチニル化３Ｈ８結合を競合し、非標識６Ｄ７の最高濃度時に見かけ上のＫＤの９倍上昇に至った。固定化Ｓｈｈとの結合について、１Ｇ１も１Ｈ８も標識３Ｈ８と競合しなかった。これらの結果により、６Ｄ７と３Ｈ８は、１Ｇ１または１Ｈ８のいずれとも共有しない共通のオーバーラップエピトープを共有することが示される。
【実施例１４】
【０３５４】
精製したＳＨＨ抗体のヒトＩＨＨおよびＤＨＨならびにマウスＳＨＨ／ＩＨＨに対する交差反応性
精製抗体の交差反応性を、ヒトヘッジホッグファミリーメンバーＩｈｈおよびＤｈｈに対して、ならびにＳｈｈ、Ｉｈｈ、およびＤｈｈのマウスオルソログに対して試験した。ヒトとマウスＩｈｈはＮ末端シグナル伝達領域にて１００％配列同一性を共有するため、１つのタンパク質のみを用いて抗体結合を評価した。
【０３５５】
交差反応実験を行い、（実施例１０に記載のように）ＥＬＩＳＡベースのアッセイを用いて測定した。簡単に述べると、１〜２μｇ／ｍｌ組換えヒトＩｈｈ（組換えヒト／マウスインディアン・ヘッジホッグＣ２８ＩＩ、アミノ末端ペプチド、ｃａｔ番号１７０５−ＨＨ／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒトＤｈｈ（組換えヒトデザート・ヘッジホッグＣ２３ＩＩ、アミノ末端ペプチド、ｃａｔ番号４７７７−ＨＨ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはマウスＳｈｈ（組換えマウスソニック・ヘッジホッグＣ２５ＩＩ、Ｎ末端、ｃａｔ番号４６４−ＳＨ／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む１００μｌのＰＢＳ溶液でプレートをコーティングし、振とうしながら４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄して１％ＢＳＡでブロッキング後、ＰＢＳ−Ｔの半対数連続希釈により３０μｇ／ｍｌ〜１ｐｇ／ｍｌにわたる濃度に調製した抗体タイトレーション（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ)をウェルに添加し、振とうしながら４℃で一晩インキュベートした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて見かけ上の結合親和性（ＫＤ）を計算し、結果を表２３に提示する。
【表２３】
2012502967.tif 000059
【０３５６】
精製した、最適化された配列の抗体６Ｄ７ＯＰおよび３Ｈ８ＯＰのマウスＳｈｈおよびＩｈｈとの交差反応性を高分解Ｂｉａｃｏｒｅを用いてさらに確証した。これらの実験において、最適化された形態の６Ｄ７ＯＰおよび３Ｈ８ＯＰのヒトＳｈｈに対する結合を確認した。標準アミン結合化学を用いてプロテインＧをＣＭ５チップ表面に結合した。ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０カラムを用いてプロテインＧ’からトリスを除去した。主要な２．７５〜３．９４ｍＬフラクション（〜０．７８ｍｇ／ｍＬ）を採取し、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．６５）中２０μｇ／ｍｌにアリコートを希釈した。約５００ＲＵのプロテインＧをフローチャンバー２（Ｆｃ２）表面に共有結合させた。各サイクルの初め、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液中で０．５μｇ／ｍｌに希釈した関連のあるＩｇＧ（６Ｄ７ＯＰまたは３Ｈ８ＯＰ）をプロテインＧの表面上にて５μＬ／分で５０秒間流した後、６０秒間を固定化期間とした。固定化量はサイクル間で再現性があった。ＩｇＧ固定化量を低く保ち、親和性決定に対する質量輸送効果を避けた（６Ｄ７において１００ＲＵ、３Ｈ８において１３５ＲＵ）。任意の潜在的な質量輸送効果を最小限に抑えるため、分析物を高流速５０μｌ／分で３００秒間注入し、解離を１２００秒間モニタリングした後、流速３０μｌ／分でグリシン（ｐＨ１．７５）の２回の４０秒パルスで表面を再生した。すべてのセンサーグラムをラングミュア１：１モデル（ＲＩ＝０、ｇｌｏｂａｌ ｋｏｎ、ｇｌｏｂａｌ ｋｏｆｆおよびｇｌｏｂａｌ Ｒｍａｘ設定）を用いてＴ−１００評価ソフトウェアにおいてフィットさせた（データを２重参照した；従ってバルクＲＩ反射指数変更はなかった）。
【０３５７】
ヒトＳｈｈに対する精製抗体の結合親和性（表２４）は配列の最適化前に行った先の６Ｄ７および３Ｈ８との観察とほぼ同じであった（表２０と比較）。さらに、最適化された各配列の抗体のマウスＳｈｈに対する結合親和性はヒトＳｈｈにて観察された結合親和性とほぼ同じであり、これはＮ末端シグナル伝達領域の２つのタンパク質間における単独のアミノ酸相異に基づき予期された。
【表２４】
2012502967.tif 000060
【実施例１５】
【０３５８】
精製ＳＨＨ抗体によるＩＨＨ活性の中和
このアッセイを実施して精製抗体のインディアン・ヘッジホッグに誘導されたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の骨芽細胞分化阻害能を測定した。
【０３５９】
精製抗体６Ｄ７ＯＰの両ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅ形式におけるヒトおよびマウスインディアン・ヘッジホッグ（Ｉｈｈ）への結合を示した。この抗体の中和活性を骨芽細胞分化アッセイにおいて評価した。
【０３６０】
骨芽細胞分化アッセイを、基本的に上記の実施例９を数ヶ所修正して実施した。５０００細胞／ウェルの播種培地中、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を３８４ウェル透明底プレートに播種し、５％ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベートした。アッセイ培地中で抗体を、半対数または２倍増分に順次希釈し、２８位のシステインを２つのイソロイシン残基と置換したＩｈｈのＮ末端シグナル伝達領域の修飾形態の同容積と混合した（ＩＨＨ−Ｎ Ｃ２８ＩＩ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ番号１７０５−ＨＨ）。このアッセイで用いたＩｈｈ−Ｎ Ｃ２８ＩＩの最終濃度は２μｇ／ｍｌであった。量を変えた抗体をＩｈｈ−Ｎ Ｃ２８ＩＩと４５分間、ポリプロピレン希釈プレート中で５％ＣＯ２中、３７℃でプレインキュベートした。抗体の最終濃度範囲は２５μｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌであった。プレインキュベーション工程を完了後、播種培地をすべてのウェルから除去し、Ｉｈｈと抗体の混合物を含む３０μｌ培地に取り替えた。この細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で７２時間インキュベートした。
【０３６１】
骨芽細胞分化を上記のようにアルカリホスファターゼ産生によって評価した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによりデータ分析を実施し、ＩＣ５０値を表２５に報告する。６Ｄ７ＯＰはＩｈｈに誘導された骨芽細胞分化を阻害し、抗体によるリガンド結合が生物活性の中和化をもたらすことを示す；一方３Ｈ８ＯＰはＩｈｈと結合せず、その活性に対して無効であった。
【表２５】
2012502967.tif 000061
【実施例１６】
【０３６２】
精製抗体のインビボ活性決定：Ｃｏｌｏ２０５異種移植腫瘍の間質における、マウスＧｌｉ１およびＰｔｃ１の薬理学的調節の評価
Ｃｏｌｏ２０５ヒト結腸直腸腺ガン細胞をＡＴＣＣから得て、ＲＰＭＩ １６４０、１０％ＦＢＳおよび１％Ｌ−グルタミン中で維持した。雌ヌードマウスの右横腹に４×１０６細胞／マウスを皮下移植して異種移植腫瘍を確立した。腫瘍は約２００ｍｍ３まで増殖し、この時点でマウスにビヒクルまたは抗体の腹腔内単用量１、３、または１０ｍｇ／ｋｇを投与した。投与後３日目にマウスを屠殺し、腫瘍を切り取った。採取した腫瘍を切り刻んだ直後、５ｍｌのＲＮＡＬａｔｅｒ中、４℃で一晩保持した。続いて、ＲＮＡを単離するまで腫瘍を−２０℃で保持した。
【０３６３】
製造業者の指示に従いＲＮｅａｓｙキット（ｃａｔ番号７４１０４、Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを腫瘍から抽出した。Ｆａｓｔ Ｐｒｅｐ ２４ホモジナイザー機器（設定６．０で４０秒間）を用いて腫瘍塊をホモジナイズした。４０００ＲＣＦで５分間ＲＴで遠心分離して残屑をペレット化した。同容積の７０％エタノールを上清に添加し、混合物をＲＮｅａｓｙカラムに添加した。このカラムを４ｍｌの緩衝液ＲＷ１で平衡化し、２ｍｌの緩衝液ＲＰＥで２回平衡化した。ＲＮＡを２７０μｌのＲＮａｓｅ非含有水で溶出し、−８０℃で保存した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏキット（Ｃａｔ番号５０６７−１５１１）を用いてＲＮＡ量および質を評価した。
【０３６４】
定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて、腫瘍中のマウスＧｌｉ１およびＰｔｃ１値をマウスＨＰＲＴ１と比較して決定した。高能力ｃＤＮＡ逆転写キット（ｃａｔ番号４３６８８１４、ＡＢＩ）を用いて２μｇのＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。反応物を２５℃で１５分間、３７℃で２時間、８５℃で５分間インキュベートした後、４℃で保持した。ＲＮａｓｅ非含有水でｃＤＮＡ試料を容積２００μｌに希釈した。ｑＲＴ−ＰＣＲの反応混合物は、２０μｌの最終容積中、各試料からの５μｌのｃＤＮＡ、１μｌの各プライマー／プローブセット、および１０μｌの２×ＴａｑＭａｎ緩衝液（ＡＢＩ、ｃａｔ番号４３６９５１４）を含んだ。このＡＢＩプライマー／プローブセットはマウスＨＰＲＴ対照遺伝子（Ｍｍ００４４６９６８＿ｍ１）、マウスＧｌｉ１（Ｍｍ００４９４６５４＿ｍ１）、およびマウスＰｔｃ１（Ｍｍ００４３６０２６＿ｍ１）を含んだ。試料を５０℃に２分間熱してから、９５℃で１０分間熱した。サイクルを９５℃で１５秒間および６０℃で１分間４０回、ＡＢＩ ７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲ系で実施した。内標準としてＨＰＲＴ１を用いて各試料のデルタデルタＣｔ値を計算することにより、各試料におけるマウスＧｌｉ１およびＰｔｃ１のＲＮＡ量を決定した。
【０３６５】
マウスＧｌｉ１値およびＰｔｃ１値の有意な減少が観察され（図１）、最低用量で試験時（１ｍｇ／ｋｇ）でも、各抗体の堅固な中和活性が示された。各抗体はｍＰｔｃ１値よりｍＧｌｉ１値を大いに一貫して減少させた。
【実施例１７】
【０３６６】
ｃｏｌｏ２０５異種移植片モデルを用いた精製抗体の薬物動態−薬力学的関連の決定
実施例１４に記載した雌ヌードマウスの横腹中でＣｏｌｏ２０５腫瘍を確立した。腫瘍が約２００ｍｍ３サイズに達した時、マウスに０．５または１．０ｍｇ／ｋｇのいずれかで単ＩＰ用量の６Ｄ７、３Ｈ８、または１Ｇ１を投与した。５匹のマウス群を投与後、各種時点（０．５、１、２、４、６、２４、４８、７２時間目ならびに７および１４日目）に屠殺した。心穿刺により血清を採取し、５００〜８００ｍｌの血液を血清分離Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒチューブ（ＢＤカタログ番号３６５９５６）中に移した。血液試料を室温で２０〜３０分間凝固させてから、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。血清全量を１．７ｍｌエッペンドルフチューブ中に採取し、さらに注射した試験抗体濃度を決定するプロセシングまで−８０℃で保存した。屠殺した動物から腫瘍組織を切り取り、ＲＮＡを単離するまで上記のようにＲＮＡＬａｔｅｒ中で保持した。
【０３６７】
抗ヒトＨＣ＋ＬＣ捕捉および抗ヒトＨＣ＋ＬＣ検出を用いる、総ヒトＩｇＧを測定する正規のＥＬＩＳＡプロトコールを用いて、ヒト抗体の血清濃度を決定した。ＥＬＩＳＡプレートを０．５μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異性）で２〜８℃で一晩コーティングし、ＰＢＳと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、Ｉ−ブロッキングバッファー（Ｔｒｏｐｉｘ）で室温で１〜２時間ブロッキングした。ＭＡｂ参照標準、品質対照（ＱＣ）および希釈した試験試料を１０％血清（アッセイマトリックス）中で調製し、ブロッキングしたプレートに室温で２時間添加した。上記のようにプレートを洗浄し、１：２００００希釈したＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃで室温でさらに１時間インキュベートした。洗浄して結合しない検出抗体を除去し、１００μｌのＴＭＢ基質をプレートウェルに５分間添加した。５０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加して発色を止めた。１５分以内に４５０ｎｍでＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ３８４プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によりプレートを読取った。ＱＣにおける抗体濃度および各プレート上の希釈した試験試料をプレートの参照標準曲線を用いて測量した。このアッセイ範囲は１００％血清中で３１〜４０００ｎｇ／ｍｌであった。薬物動態（ＰＫ）分析をＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（バージョン５．２、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて実施した。各抗体のために決定したＰＫパラメーターを表２６に示す。投与後２４時間、各抗体はｍＧｌｉ１およびｍＰｔｃ１値を最大８０〜９０％減少することを示した（図２）。同様の阻害値が７２時間通して維持された。しかしながら、各抗体の投与７日以内にｍＧｌｉ１およびＰｔｃ１値は元に戻り始めた。
【表２６】
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【実施例１８】
【０３６８】
ラットにおける最適化された配列を有する精製抗体の薬物動態の決定
ラットにおける６Ｄ７ＯＰおよび３Ｈ８ＯＰの薬物動態分析も行った。単静脈内ボーラス用量１、１０、３０ｍｇ／ｋｇの６Ｄ７ＯＰまたは１、１０、２８ｍｇ／ｋｇの３Ｈ８ＯＰをハンス・ウィスター・ラット（Ｈａｎｓ Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔ）に投与した。投与後以下の時間：０、１、４、８および２４時間目、２、４、７、１０、１５、２１および２８日目に抗凝血剤を何も用いず血液試料を尾静脈より採取した。血液試料をスピンし、１００μｌの血清を分注して凍結した。総ヒトＩｇＧを測定する上記のＥＬＩＳＡ法を用いてｍＡｂの血清濃度を決定した。ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（バージョン５．２、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて個々の動物の血清濃度データ上で非コンパートメント分析を実施し、この薬物動態データの概要を表２７に提示する。
【表２７】
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【０３６９】
６Ｄ７ＯＰのＰＫはラットにおける用量に関して非線形と思われる。ＣＬは、１ｍｇ／ｋｇ用量時の３８．５５２ｍＬ／ｋｇ／ｄから１０ｍｇ／ｋｇ時の１０．０４９ｍＬ／ｋｇ／ｄまで増量時に減少した。３Ｈ８ＯＰの非線形性は６Ｄ７ＯＰほど明らかではなかった。１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量群において、６Ｄ７ＯＰおよび３Ｈ８ＯＰのＣＬはラットにおいてヒトＩｇＧについて予期した範囲内であった。ラットにおける３Ｈ８ＯＰの終末半減期は１０および２８ｍｇ／ｋｇ群で、各々約１２および１３日間である。ラットにおける６Ｄ７ＯＰの終末半減期は１０および３０ｍｇ／ｋｇ群で、各々約９および１０日間である。
【実施例１９】
【０３７０】
精製抗体の腫瘍増殖の阻害は各種異種移植腫瘍モデルにおけるマウス間質細胞内ヘッジホッグ標的遺伝子の薬理学的調節に一致する
（ｉ）ＨＴ−２９結腸ガン異種移植片モデルを用いたインビボ抗腫瘍活性の実証
ＨＴ−２９結腸直腸腫瘍細胞をＡＴＣＣから得て１０％ウシ胎児血清および１％Ｌ−グルタミンを含むＭｃＣｏｙの５ａ培地中で５％ＣＯ２中、３７℃で維持した。これらの細胞を試験して、マイコプラズマおよびウイルスの汚染がないことを認めた。３×１０６細胞／マウスの１００μｌウシ胎児血清非含有ＭｃＣｏｙの５ａ培地を６〜７週齢ＮＣｒヌード雌マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＹ）の右横腹領域に皮下移植後、雌ヌードマウスにおいてＨＴ−２９異種移植腫瘍を確立した。腫瘍は約１００ｍｍ３に増殖し、投与開始前の腫瘍サイズに基づき無作為化した。抗体を０．９％生理食塩水中で１０ｍｇ／ｋｇ、隔週で４週間腹腔内投与した。週２回カリパスで測定し、式０．５×（長さ）×（幅）２を用いて、腫瘍体積をモニタリングした。片側ｔ検定を用いて、試験終了時の平均腫瘍体積の統計的分析を実施した。３Ｈ８処置は、ＨＴ−２９異種移植腫瘍の増殖をビヒクル処置と比較して５５％阻害した（Ｐ＜０．０５）（図３）。
【０３７１】
最終投与後３日目の試験終了時に腫瘍を切り取り、３Ｈ８の薬力学的効果を検討した。採取した腫瘍を両断して直ちに５ｍｌのＲＮＡＬａｔｅｒ中で４℃で一晩保持または液体窒素中で急速冷凍した。続いてＲＮＡＬａｔｅｒ中で保持した腫瘍をＲＮＡを単離するまで−２０℃で保存した。実施例９に記載した定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて、マウスＨＰＲＴ１と比較して、マウスＧｌｉ１、Ｇｌｉ２、Ｇｌｉ３、Ｐｔｃ１、Ｐｔｃ２、Ｈｈｉｐ、およびＳｍｏ値を決定した。以下のＡＢＩ ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを使用した：マウスＧｌｉ１、Ｍｍ００４９４６５４＿ｍ１；マウスＧｌｉ２、Ｍｍ０１２９３１１７＿ｍ１；マウスＧｌｉ３、Ｍｍ００４９２３３３＿ｍ１；マウスＰｔｃ１、Ｍｍ００４３６０２６＿ｍ１；マウスＰｔｃ２、Ｍｍ００４３６０４７＿ｍ１；マウスＨｈｉｐ、Ｍｍ０１２４１５０３＿ｍ１；マウスＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、Ｍｍ０１１６２７０５＿ｍ１；およびマウスＨＰＲＴ１、Ｍｍ００４４６９６８＿ｍ１。３Ｈ８処置はマウスＧｌｉ１、Ｐｔｃ１、およびＰｔｃ２値を約５０％減少させる（図３Ｂ）。
【０３７２】
（ｉｉ）原発結腸ガン体外移植モデルＨＣＸＦ−００１を用いたインビボ抗腫瘍活性の実証
６６歳の白人男性から外科的に除去した約１ｇの原発結腸ガンをＡｓｔｅｒａｎｄ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）から得てＳＣＩＤマウスに移植し、原発体外移植異種移植片モデルを確立した。この原発腫瘍を１０％ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ１６４０培地ですすぎ、解剖用メスで切り刻んだ。この切り刻んだ腫瘍試料を移植時まで氷上に置いた。この切り刻んだ腫瘍を１３ゲージのガン移植外套針中に装填し、この外套針をマウス４匹の右横腹に皮下挿入して外套針の中身を背面脂肪体下に分配させることにより腫瘍を移植した。腫瘍（第０継代、つまりＰ０と定義）が８００〜１０００ｍｍ３に達した時に腫瘍を切り取り、約３×３×３ｍｍ断片に切断した。単独のＰ０腫瘍断片を個々のマウスで２次継代（ｓｕｂｐａｓｓａｇｅ）した。有効性試験は典型的に第２継代（Ｐ２）を過ぎた腫瘍により行う。
【０３７３】
個々のＳＣＩＤマウスに単独の腫瘍断片を皮下移植し、平均腫瘍体積が約１００〜２００ｍｍ３に達した時に抗Ｓｈｈ抗体処置を開始した。いったん処置を開始後、この抗体の０．９％生理食塩水を１０ｍｇ／ｋｇで隔週で（ｂｉｗｅｅｋｌｙ）４週間ＩＰ投与した。腫瘍体積をカリパス測定により週２回モニタリングし、試験終了時の各処置群の幾何平均腫瘍体積の統計的分析を片側ｔ検定を用いて実施した。腫瘍を採取しなかった動物は各群から除外した。６Ｄ７ＯＰまたは３Ｈ８ＯＰの単剤処置により、特に対照ＩｇＧ１ ｍＡｂで処置した動物における腫瘍増殖と比較すると、腫瘍増殖の中程度の阻害が観察された（図４Ａ）。６Ｄ７ＯＰまたは３Ｈ８ＯＰ処置により、ＩｇＧ１対照と比較して腫瘍サイズは４８〜５９％縮小した（Ｐ＜０．０５）。
【０３７４】
この抗Ｓｈｈ抗体の薬力学的効果を、上記のように最終投与から３日後に採取した腫瘍中で検討した。間質ヘッジホッグ標的遺伝子（ｍＧｌｉ１、ｍＧｌｉ２、ｍＧｌ１３、ｍＰｔｃ１、ｍＰｔｃ２、およびｍＨｈｉｐ）値を、上記の実施例１９に述べたＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを用いた、実施例９に記載した定量ＲＴ−ＰＣＲを用いてｍＨＰＲＴ１と比較して決定した。６Ｄ７ＯＰはｍＧｌｉ１値を劇的に減少させた（＞８０％）；一方、３Ｈ８ＯＰ処置では、ｍＧｌｉ１値はより中程度で５０％減少した。両抗体によりｍＧｌｉ２、ｍＰｔｃ１、およびＰｔｃ２のより中程度の阻害を観察した。
【０３７５】
（ｉｉｉ）ＨＴ−５５結腸異種移植片モデルを用いたインビボ抗腫瘍活性の実証
ユーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）からＨＴ−５５結腸ガン細胞を得て、５％ＣＯ２のＥＭＥＭ溶液（ＥＢＳＳ）、２ｍＭグルタミン、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、および２０％ウシ胎児性血清（ＦＢＳ）中で３７℃で維持した。これらの細胞を試験し、マイコプラズマおよびウイルス汚染（ＭＡＰ）のないことを見出した。基本的に上記のように６〜７匹の雌ヌードマウスの横腹内に１００μｌのウシ胎児血清非含有ＥＭＥＭ培地中の５×１０６細胞／マウスの皮下移植後、雌ヌードマウスにおいて異種移植腫瘍を確立した。腫瘍は約１００ｍｍ３まで増殖し、投与前に無作為化した。抗体の０．９％生理食塩水を１０ｍｇ／ｋｇ、隔週で３．５週間ＩＰ投与した。腫瘍体積をカリパス測定により週２回モニタリングし、試験終了時の各処置群の幾何平均腫瘍体積の統計的分析を片側ｔ検定を用いて実施した。６Ｄ７ＯＰ処置は異種移植片増殖をビヒクル対照と比較して３２％およびＩｇＧ１対照と比較して５２％（Ｐ＜０．０５）阻害した（図５）。３Ｈ８ＯＰはＨＴ−５５腫瘍増殖に対してほとんど効果がないか無効であった。
【０３７６】
参照による組み込み
本明細書に引用されたすべての参考文献（特許、特許出願、文書、テキストなど、およびそれらに引用された参考文献を含む）はそれらがまだない範囲まで参照により本明細書にその全体が組み込まれる。
【０３７７】
均等物
上記の明細書は、当業者が本発明を実践することを可能にする上で十分であるとみなされる。上記の説明および実施例は本発明の特定の好ましい実施形態を詳述し、本発明者らが最善の実施態様と意図するものを述べる。しかしながら、上記が本文中でいかに詳細と思われるかを問わず、本発明は多くの方法で実践してよく、本発明は、添付の特許請求の範囲およびそれらの任意の均等物に従い解釈すべきであることが理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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