(57)【要約】  Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病関連疾患の診断、予後および／または治療のための方法および組成物を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において成熟Ｂ細胞慢性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）の発展を阻害するための方法であって：
ｉ）細胞においてＮＦ−κＢ経路を阻害する工程、およびｉｉ）細胞においてアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）を活性化する工程の１以上によって、被験体において細胞中のＴｃｌ１の過剰発現を阻害する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
Ｂ−ＣＬＬの高悪性度型の治療に有用な、ＮＦ−κＢを阻害し、そして／またはＡＰ−１を活性化する組成物を含む、薬学的組成物。
【請求項３】
Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病関連疾患の被験体を治療する方法であって：
ｉ）細胞においてＮＦ−κＢ経路を阻害する工程、およびｉｉ）細胞においてアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）を活性化する工程の１以上によって、Ｔ細胞白血病／リンパ腫１（Ｔｃｌ１）の過剰発現を阻害することが可能な組成物の療法的有効量を投与する
工程を含む、前記方法。
【請求項４】
Ｔ細胞白血病／リンパ腫１（Ｔｃｌ１）の過剰発現を阻害することが可能な組成物を含む、薬学的組成物。
【請求項５】
被験体においてＢ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）関連疾患を治療する方法であって：
被験体において細胞中で発現される少なくともＴｃｌ１の量を、対照細胞Ｔｃｌ１に比較して測定し；そして
ｉ）細胞においてＮＦ−κＢ経路を阻害する工程、およびｉｉ）細胞においてアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）を活性化する工程の１以上によってＴｃｌ１の発現を阻害するための少なくとも１つの化合物の有効量を被験体に投与することによって、被験体において発現されるＴｃｌ１の量を改変して、
被験体におけるＢ−ＣＬＬ関連疾患の増殖が阻害されるようにする
工程を含む、前記方法。
【請求項６】
療法がＢ細胞慢性リンパ球性白血病関連疾患を防止し、診断し、そして／または治療する有効性を評価する方法であって：
有効性を評価している療法に、動物を供し、そして
Ｔｃｌ１に関する少なくとも１つのバイオマーカーを評価することによって、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病関連疾患を治療するかまたは防止する際の、試験される治療の有効性レベルを決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項７】
候補療法剤が：薬学的組成物、栄養補助組成物、およびホメオパシー組成物の１以上を含む、請求項６の方法。
【請求項８】
評価される療法がヒト被験体で使用するためのものである、請求項７の方法。
【請求項９】
個体においてＢ細胞慢性リンパ球性白血病関連疾患合併症を治療し、防止し、逆転させるかまたはその重症度を制限するための薬剤製造のための、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病関連疾患反応シグナル伝達経路に干渉する剤の使用であって、該剤がＴｃｌ１に関する少なくとも１つのバイオマーカーを含む、前記使用。
【請求項１０】
その必要がある個体においてＢ細胞慢性リンパ球性白血病関連疾患合併症を治療し、防止し、逆転させるかまたはその重症度を制限する方法であって：
少なくともＢ細胞慢性リンパ球性白血病関連疾患反応カスケードに干渉する剤を個体に投与する工程を含み、ここで該剤は：
ｉ）細胞においてＮＦ−κＢ経路を阻害し、そして／または
ｉｉ）細胞においてアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）発現を活性化する
Ｔｃｌ１に関する少なくとも１つのバイオマーカーを含む、前記方法。
【請求項１１】
個体において癌関連疾患合併症を治療し、防止し、逆転させるかまたはその重症度を制限するための薬剤製造のための、少なくともＢ細胞慢性リンパ球性白血病関連疾患反応カスケードに干渉する剤の使用であって、該剤が：ｉ）細胞においてＮＦ−κＢ経路を阻害し、そして／またはｉｉ）細胞においてアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）発現を活性化する、Ｔｃｌ１に関する少なくとも１つのバイオマーカーを含む、前記使用。
【請求項１２】
エピトープおよびアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）間の相互作用の少なくとも１つを調節する、Ｔｃｌ１上のエピトープに結合する抗体。
【請求項１３】
請求項１２の抗体を含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
哺乳動物においてアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）の活性を改変する、Ｂ−ＣＬＬ疾患状態を治療する方法であって：
Ｔｃｌ１タンパク質上のエピトープに結合可能な抗体の療法的有効量を哺乳動物に投与し、それによって、Ｔｃｌ１が増進するアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）の活性を調節する
工程を含む、前記方法。
【請求項１５】
哺乳動物においてアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）の活性を改変する、Ｂ−ＣＬＬ疾患状態を治療する方法であって：
アクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）のペプチド断片の療法的有効量を哺乳動物に投与する
ここで、該ペプチド断片がアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）に結合し、それによって、Ｔｃｌ１が増進するアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）のキナーゼ活性を調節する
工程を含む、前記方法。
【請求項１６】
Ｔｃｌ１模倣体を含む化合物であって、該Ｔｃｌ１模倣体が、いかなる細胞においてもアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）に結合し、そしてＴｃｌ１が増進するアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）の活性化を模倣するのに機能的に活性である、前記化合物。
【請求項１７】
哺乳動物においてアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）の活性を改変する、疾患状態を治療する方法であって：
Ｔｃｌ１模倣体の療法的有効量を哺乳動物に投与する
ここで、該Ｔｃｌ１模倣体がアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）に結合し、それによって、Ｔｃｌ１が増進するアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）のキナーゼ活性を活性化する
工程を含む、前記方法。
【請求項１８】
Ｔｃｌ１アンタゴニストを含む化合物であって、該Ｔｃｌ１アンタゴニストが、いかなる細胞においてもアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）に結合し、そしてＴｃｌ１が増進するアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）の活性化を調節するのに機能的に活性である、前記化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
[0001]本出願は、その全開示が本明細書に明確に援用される、２００８年１１月２１日出願の米国仮出願第６１／１１６，７８６号の優先権を請求する。
【０００２】
連邦が支援する研究に関する言及
[0002]本発明は、米国癌研究所助成金によって授与されるＰ０１  ＣＡ０８１５３４の元で政府の援助を受けて行われた。米国政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
本発明の技術分野および産業適用性
[0003]本発明は、一般的に、分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、被験体における細胞中のＴｃｌ１の制御解除（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を阻害することによって、被験体において成熟Ｂ細胞白血病の発展を阻害するための方法に関する。
【０００４】
[0004]本発明の特定の側面には、Ｂ細胞リンパ球性白血病関連障害の診断、療法、および予後における適用が含まれる。
【背景技術】
【０００５】
[0005]本セクションに開示される背景技術が法的に先行技術を構成することは承認されない。
[0006]Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）のリンパ球は、大部分、成熟した外見およびＢ２２０＋ＣＤ５＋表現型を持つ休止細胞である。Ｔ細胞白血病／リンパ腫１（ＴＣＬ１）癌遺伝子は、Ｔ細胞前リンパ球性白血病における１４ｇ３１．２での染色体転位置および逆位のターゲットとして発見された。
【０００６】
[0007]Ｂ細胞においてＴＣＬ１を過剰発現しているトランスジェニックマウスは、Ｂ−ＣＬＬの高悪性度型を発展させ、そして高悪性度ヒトＢ−ＣＬＬはＴｃｌ１を過剰発現することから、ＴＣＬ１の制御解除は、Ｂ−ＣＬＬの高悪性度型の病因形成において非常に重要であることが示される。以前、本発明者らは、Ｔｃｌ１が、Ｔ細胞における非常に重要な抗アポトーシス分子であるＡｋｔ腫瘍性タンパク質のコアクチベーターであることを立証した。より最近、Ｔ細胞において活性ミリスチル化（ｍｙｒｉｓｔｙｌａｔｅｄ）Ａｋｔを恒常的に発現しているトランスジェニックマウスは、Ｔ細胞白血病を発展させることが報告された。これらの結果は、Ａｋｔが、Ｔ細胞において、Ｔｃｌ１が仲介するリンパ腫形成に関与しうることを示唆する。Ａｋｔは、Ｐｔｅｎのホモ接合性欠失によってマウスＢ細胞において頑強に活性化されうる。驚くべきことに、これらのマウスは、Ｂ細胞悪性腫瘍を発展させず、Ｂ細胞におけるＴｃｌ１制御解除が、Ａｋｔ活性化以外の機構によってＢ−ＣＬＬを引き起こすことが示唆される。
【０００７】
[0008]トランスジェニックマウスモデルの最近の研究によって、Ｂ−ＣＬＬにおけるＮＦ−ＫＢ経路の重要性が立証された。例えば、ＮＦ−ＫＢ活性化に関与するＴＮＦスーパーファミリーのメンバーである増殖誘導ＴＮＦリガンド（ＡＰＲＩＬ）のトランスジェニック発現は、Ｂ２２０＋ＣＤ５＋細胞の有意な拡大を生じた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
[0009]これらの疾患を治療する療法に関してかなりの研究がなされているにも関わらず、これらを有効に診断しそして治療するのは困難なままであり、そして患者において観察される死亡率は、これらの疾患の診断、治療および防止において改善が必要であることを示す。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
[0010]最初の広い側面において、本明細書において、被験体において成熟Ｂ細胞白血病の発展を阻害するための方法であって、被験体において細胞中のＴｃｌ１の制御解除を阻害する工程を含む、前記方法を記載する。
【００１０】
[0011]別の広い側面において、本明細書において、被験体において成熟Ｂ細胞慢性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）の発展を阻害するための方法であって：ｉ）細胞においてＮＦ−κＢ経路を阻害する工程、およびｉｉ）細胞においてアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）を活性化する工程の１以上によって、被験体において細胞中のＴｃｌ１の過剰発現を阻害する工程を含む、前記方法を提供する。
【００１１】
[0012]別の広い側面において、本明細書において、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病関連疾患の被験体を治療する方法であって：ｉ）細胞においてＮＦ−κＢ経路を阻害する工程、およびｉｉ）細胞においてアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）を活性化する工程の１以上によって、Ｔ細胞白血病／リンパ腫１（Ｔｃｌ１）の過剰発現を阻害することが可能な組成物の療法的有効量を投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【００１２】
[0013]別の広い側面において、本明細書において、被験体においてＢ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）関連疾患を治療する方法であって：被験体において細胞中で発現される少なくともＴｃｌ１の量を、対照細胞Ｔｃｌ１に比較して測定し；そして：ｉ）細胞においてＮＦ−κＢ経路を阻害する工程、およびｉｉ）細胞においてアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）を活性化する工程の１以上によってＴｃｌ１の発現を阻害するための少なくとも１つの化合物の有効量を被験体に投与することによって、被験体において発現されるＴｃｌ１の量を改変して、被験体におけるＢ−ＣＬＬ関連疾患の増殖が阻害されるようにする工程を含む、前記方法を提供する。
【００１３】
[0014]別の広い側面において、本明細書において、療法がＢ細胞慢性リンパ球性白血病関連疾患を防止し、診断し、そして／または治療する有効性を評価する方法であって：有効性を評価している療法に、動物を供し、そしてＴｃｌ１に関する少なくとも１つのバイオマーカーを評価することによって、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病関連疾患を治療するかまたは防止する際の、試験される治療の有効性レベルを決定する工程を含む、前記方法を提供する。
【００１４】
[0015]特定の態様において、候補療法剤は：薬学的組成物、栄養補助組成物、およびホメオパシー組成物の１以上を含む。やはり、特定の態様において、評価される療法はヒト被験体で使用するためのものである。
【００１５】
[0016]別の広い側面において、本明細書において、個体においてＢ細胞慢性リンパ球性白血病関連疾患を治療し、防止し、逆転させるかまたはその重症度を制限するための薬剤製造のための、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病関連疾患反応シグナル伝達経路に干渉する剤の使用であって、該剤が、Ｔｃｌ１に関する少なくとも１つのバイオマーカーを含む、前記使用を提供する。
【００１６】
[0017]別の広い側面において、本明細書において、その必要がある個体においてＢ細胞慢性リンパ球性白血病関連疾患合併症を治療し、防止し、逆転させるかまたはその重症度を制限する方法であって：少なくともＢ細胞慢性リンパ球性白血病関連疾患反応カスケードに干渉する剤を個体に投与する工程を含み、ここで該剤は：ｉ）細胞においてＮＦ−κＢ経路を阻害し、そして／またはｉｉ）細胞においてアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）発現を活性化する、Ｔｃｌ１に関する少なくとも１つのバイオマーカーを含む、前記方法を提供する。
【００１７】
[0018]別の広い側面において、本明細書において、個体において癌関連疾患合併症を治療し、防止し、逆転させるかまたはその重症度を制限するための薬剤製造のための、少なくともＢ細胞慢性リンパ球性白血病関連疾患反応カスケードに干渉する剤の使用であって、該剤が：ｉ）細胞においてＮＦ−κＢ経路を阻害し、そして／またはｉｉ）細胞においてアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）発現を活性化する、Ｔｃｌ１に関する少なくとも１つのバイオマーカーを含む、前記使用を提供する。
【００１８】
[0019]別の広い側面において、本明細書において、エピトープおよびアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）間の相互作用の少なくとも１つを調節する、Ｔｃｌ１上のエピトープに結合する抗体を提供する。別の広い側面において、本明細書において、こうした抗体を含む、薬学的組成物を提供する。
【００１９】
[0020]別の広い側面において、本明細書において、哺乳動物においてアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）の活性を改変する、Ｂ−ＣＬＬ疾患状態を治療する方法であって、Ｔｃｌ１タンパク質上のエピトープに結合可能な抗体の療法的有効量を哺乳動物に投与し、それによって、Ｔｃｌ１が増進するアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）の活性を調節する工程を含む、前記方法を提供する。
【００２０】
[0021]別の広い側面において、本明細書において、哺乳動物においてアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）の活性を改変する、Ｂ−ＣＬＬ疾患状態を治療する方法であって：アクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）のペプチド断片の療法的有効量を哺乳動物に投与する、ここで、該ペプチド断片がアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）に結合し、それによって、Ｔｃｌ１が増進するアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）のキナーゼ活性を調節する工程を含む、前記方法を提供する。
【００２１】
[0022]別の広い側面において、本明細書において、Ｔｃｌ１模倣体を含む化合物であって、該Ｔｃｌ１模倣体が、いかなる細胞においてもアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）に結合し、そしてＴｃｌ１が増進するアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）の活性化を模倣するのに機能的に活性である、前記化合物を提供する。
【００２２】
[0023]別の広い側面において、本明細書において、哺乳動物においてアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）の活性を改変する、疾患状態を治療する方法であって、Ｔｃｌ１模倣体の療法的有効量を哺乳動物に投与する、ここで、該Ｔｃｌ１模倣体がアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）に結合し、それによって、Ｔｃｌ１が増進するアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）のキナーゼ活性を活性化する工程を含む、前記方法を提供する。
【００２３】
[0024]別の広い側面において、本明細書において、Ｔｃｌ１アンタゴニストを含む化合物であって、該Ｔｃｌ１アンタゴニストが、いかなる細胞においてもアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）に結合し、そしてＴｃｌ１が増進するアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）の活性化を調節するのに機能的に活性である、前記化合物を提供する。
【００２４】
[0025]本発明の多様な目的および利点は、付随する図を踏まえて読むと、好ましい態様の以下の詳細な説明から、当業者には明らかとなるであろう。
[0026]特許または出願ファイルは、カラーおよび／または１以上の写真で作成される１以上の図を含有しうる。カラーの図（単数または複数）および／または写真（単数または複数）を含む本特許または特許出願刊行物のコピーは、要望があり、そして必要な料金の支払いがあれば、特許局によって提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】[0027]図１Ａ〜１Ｃ：  Ｔｃｌ１はＮＦ−κＢ依存性転写を活性化する：[0028]図１Ａ：頬スワブ体質的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ）ＤＮＡ、Ｂ−ＣＬＬ  ＤＮＡ、およびＢ−ＣＬＬ細胞由来のＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ（Ｔ３８１突然変異体に関する）の結果の配列決定から得られた、Ｔ３８１、Ｅ４０Ｄ、Ｒ５２Ｈ突然変異を取り巻く配列のクロマトグラム。
【図１Ｂ】[0027]図１Ａ〜１Ｃ：  Ｔｃｌ１はＮＦ−κＢ依存性転写を活性化する：[0029]図１Ｂ：  Ｔｃｌ１はＮＦ−κＢを活性化する。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を、５０ｎｇのｐＮＦ−ｋＢ−Ｌｕｃレポーターおよび５０ｎｇのｐＲＬ−ＴＫウミシイタケ属（Ｒｅｎｉｌｌａ）レポーター構築物で同時トランスフェクションした。さらに、１．５μｇのＣＭＶ５空ベクター、あるいは０．７５μｇのＣＭＶ５空ベクターおよび０．７５μｇのＣＭＶ５−Ｔｃｌ１  ＷＴ、またはＣＭＶ５−Ｔｃｌ１  Ｔ３８１構築物の組み合わせを用いた。示す箇所で、５ナノグラムのｐＦＣ−ＭＥＫＫを添加した。示す箇所で、細胞を２００ｎｍｏｌ／Ｌのワートマニンで一晩処理した。ＣＭＶ５空ベクターでトランスフェクションしたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞におけるｐＮＦ−ｋＢ−Ｌｕｃの標準化プロモーター活性を１に設定した。
【図１Ｃ】[0027]図１Ａ〜１Ｃ：  Ｔｃｌ１はＮＦ−κＢ依存性転写を活性化する：[0030]図１Ｃ：  Ｔｃｌ１はｐ３００と相互作用する。（上部）いくつかの２９３細胞を、ｐ３００−ＨＡおよびＯｍｎｉ−Ｆｈｉｔまたはｐ３００−ＨＡおよびＯｍｎｉ−Ｔｃｌ１構築物で同時トランスフェクションした。溶解後、抗ＨＡ、ＩｇＧ、または抗ｏｍｎｉ抗体で免疫沈降を行った。示すようにウェスタンブロット分析を行った。（下部）Ｄａｕｄｉ細胞を溶解し、そして抗Ｔｃｌ１抗体、ＩｇＧ、または抗ｐ３００抗体で免疫沈降を行った。Ｔｃｌ１パネル中の標識されていないより高いバンドはＩｇＧに相当する。示すようにウェスタンブロット分析を行った。
【図２Ａ】[0031]図２Ａ〜２Ｇ：  Ｔｃｌ１はＡＰ−１活性を阻害する：[0032]図２Ａ：いくつかの２９３細胞を、５００ｎｇのｐＡＰ−１−Ｌｕｃレポーターおよび５０ｎｇのｐＲＬ−ＴＫウミシイタケ属レポーター構築物で同時トランスフェクションした。さらに、１．５μｇのＣＭＶ５空ベクター、ＣＭＶ５−Ｔｃｌ１ＷＴ、または突然変異体構築物および２．５ｎｇのｐＦＣ−ＭＥＫＫ（示す箇所）を用いた。示す箇所で、細胞を２００ｎｍｏｌ／Ｌのワートマニンで一晩処理した。ＣＭＶ５空ベクターでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞におけるｐＡＰ−１−Ｌｕｃの標準化プロモーター活性を１に設定した。
【図２Ｂ】[0031]図２Ａ〜２Ｇ：  Ｔｃｌ１はＡＰ−１活性を阻害する：[0033]図２Ｂ：  ｐＦＣ−ＭＥＫＫ構築物の代わりに、示すように、５ｎｇのｃ−Ｆｏｓ−Ｖ５、ｃ−Ｊｕｎ、ＪｕｎＢ、または５ｎｇのｃ−Ｆｏｓ−Ｖ５およびＳｎｇのｃ−ＪｕｎまたはＪｕｎＢの組み合わせを添加した以外、図２Ａと同様である。
【図２Ｃ】[0031]図２Ａ〜２Ｇ：  Ｔｃｌ１はＡＰ−１活性を阻害する：[0034]図２Ｃ：いくつかの２９３細胞を、ｃ−Ｆｏｓ−Ｖ５およびＣＭＶ５−Ｔｃｌ１  ＷＴまたはｃ−Ｆｏｓ−Ｖ５およびＣＭＶ５−Ｔｃｌ１  Ｔ３８１構築物で同時トランスフェクションした。溶解後、抗ｃ−Ｆｏｓ、ＩｇＧ、または抗ＴｃＩ１抗体で免疫沈降を行った。示すようにウェスタンブロット分析を行った。
【図２Ｄ】[0031]図２Ａ〜２Ｇ：  Ｔｃｌ１はＡＰ−１活性を阻害する：[0035]図２Ｄ〜２Ｆ：示すように、いくつかの２９３細胞を、ｍｙｃ−Ｔｃｌ１  Ｔ３８１またはｍｙｃ−Ｆｈｉｔと、ｃＦｏｓ−Ｖ５（図２Ｄ）、ｃ−Ｊｕｎ−ＨＡ（図２Ｅ）、またはＪｕｎＢ（図２Ｆ）で同時トランスフェクションした。溶解後、示すように、抗ｍｙｃ、ＩｇＧ、および抗ｃ−Ｆｏｓ（図２Ｄ）、抗ＨＡ（図２Ｅ）、および抗ＪｕｎＢ（図２Ｆ）抗体で免疫沈降を行った。示す抗体でウェスタンブロット分析を行った。
【図２Ｅ】[0031]図２Ａ〜２Ｇ：  Ｔｃｌ１はＡＰ−１活性を阻害する：[0035]図２Ｄ〜２Ｆ：示すように、いくつかの２９３細胞を、ｍｙｃ−Ｔｃｌ１  Ｔ３８１またはｍｙｃ−Ｆｈｉｔと、ｃＦｏｓ−Ｖ５（図２Ｄ）、ｃ−Ｊｕｎ−ＨＡ（図２Ｅ）、またはＪｕｎＢ（図２Ｆ）で同時トランスフェクションした。溶解後、示すように、抗ｍｙｃ、ＩｇＧ、および抗ｃ−Ｆｏｓ（図２Ｄ）、抗ＨＡ（図２Ｅ）、および抗ＪｕｎＢ（図２Ｆ）抗体で免疫沈降を行った。示す抗体でウェスタンブロット分析を行った。
【図２Ｆ】[0031]図２Ａ〜２Ｇ：  Ｔｃｌ１はＡＰ−１活性を阻害する：[0035]図２Ｄ〜２Ｆ：示すように、いくつかの２９３細胞を、ｍｙｃ−Ｔｃｌ１  Ｔ３８１またはｍｙｃ−Ｆｈｉｔと、ｃＦｏｓ−Ｖ５（図２Ｄ）、ｃ−Ｊｕｎ−ＨＡ（図２Ｅ）、またはＪｕｎＢ（図２Ｆ）で同時トランスフェクションした。溶解後、示すように、抗ｍｙｃ、ＩｇＧ、および抗ｃ−Ｆｏｓ（図２Ｄ）、抗ＨＡ（図２Ｅ）、および抗ＪｕｎＢ（図２Ｆ）抗体で免疫沈降を行った。示す抗体でウェスタンブロット分析を行った。
【図２Ｇ】[0031]図２Ａ〜２Ｇ：  Ｔｃｌ１はＡＰ−１活性を阻害する：[0036]図２Ｇ：いくつかの２９３細胞をｍｙｃ−Ｔｃｌ１でトランスフェクションし、そして溶解２時間前に、５０ｎｇ／ｍＬ  ＰＭＡおよび１μｇ／ｍＬイオノマイシンで処理して、内因性ｃ−Ｊｕｎ発現を増加させた。抗ｃ−Ｊｕｎ、ＩｇＧ、または抗ｍｙｃ抗体で免疫沈降を行った。
【図２Ｈ】[0037]図２Ｈ：溶解２時間前に、Ｄａｕｄｉ細胞を５０ｎｇ／ｍＬ  ＰＭＡおよび１μｇ／ｍＬイオノマイシンで処理した。抗Ｔｃｌ１、ＩｇＧ、または抗ｃ−Ｊｕｎ抗体で免疫沈降を行った。
【図３】[0038]ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、およびＴｃｌ１の細胞内局在。いくつかの２９３細胞をｃ−Ｊｕｎ−ＨＡ、ｃ−Ｆｏｓ−Ｖ５、およびＯｍｎｉ−Ｔｃｌ１構築物で同時トランスフェクションした。１６時間後、細胞を固定し、透過処理し、そしてラット抗ＨＡ、マウス抗ｃ−Ｆｏｓ、およびウサギ抗ｏｍｎｉ抗体で免疫染色した。二次ヤギ抗ラットＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、およびヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体を用いて、ｃ−Ｊｕｎ（青色）、ｃ−Ｆｏｓ（赤）、およびＴｃｌ１（緑）の細胞間位置を視覚化した。ｃ−ＦｏｓおよびＴｃｌ１の共局在を黄色で示す。
【図４Ａ】[0039]図４Ａ−４：  Ｔｃｌ１はＭＥＫＫ１が仲介する細胞死を阻害する：[0040]図４Ａ：いくつかの２９３細胞を、１．５μｇのｐＣＭＶ５空ベクター、０．５μｇのｐＦＣ−ＭＥＫＫおよび１μｇのｐＣＭＶ５空、ｐＣＭＶ５−Ｔｃｌ１  ＷＴ、またはｐＣＭＶ５−Ｔｃｌ１  Ｔ３８Ｉ構築物でトランスフェクションした。本明細書に記載するようにウェスタンブロット分析を行った。
【図４Ｂ】[0041]図４Ｂ〜４Ｃ：いくつかの２９３細胞を、１．５μｇのｐＣＭＶ５空ベクター、あるいは０．５μｇのｐＦＣ−ＭＥＫＫおよび１μｇのｐＣＭＶ５空またはｐＣＭＶ５−Ｔｃｌ１  ＷＴ構築物でトランスフェクションした。１６時間後、細胞を固定し、透過処理し、そしてＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。[0042]図４Ｂ：アポトーシス細胞の割合。各トランスフェクションに関して、死亡細胞（断片化された核によって示される）の割合を計測するため、少なくとも２０視野を選択した。
【図４Ｃ】[0041]図４Ｂ〜４Ｃ：いくつかの２９３細胞を、１．５μｇのｐＣＭＶ５空ベクター、あるいは０．５μｇのｐＦＣ−ＭＥＫＫおよび１μｇのｐＣＭＶ５空またはｐＣＭＶ５−Ｔｃｌ１  ＷＴ構築物でトランスフェクションした。１６時間後、細胞を固定し、透過処理し、そしてＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。[0043]図４Ｃ：共焦点顕微鏡を用いることによって、同じ実験の結果を視覚化した。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
[0044]本開示全体で、同定する引用によって、多様な刊行物、特許および公開特許明細書に言及する。これらの刊行物、特許および公開特許明細書の開示は、本発明が属する技術分野の到達水準をより詳細に記載するため、本開示内に援用される。
【００２７】
[0045]本発明は、Ｔｃｌ１が転写制御因子として働き、そして慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の病因形成に直接関与するという、本発明者らの発見に、少なくとも部分的に基づく。
【００２８】
[0046]Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）は、最も一般的なヒト白血病である。マウスＢ細胞におけるＴ細胞白血病／リンパ腫１（ＴＣＬ１）癌遺伝子の制御解除は、高悪性度ヒトＢ−ＣＬＬに類似のＣＤ５陽性白血病を引き起こす。Ｔｃｌ１タンパク質がＢ細胞において発癌活性を発揮する機構を調べるため、本発明者らは、本明細書において、ＮＦ−κＢおよびアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）活性に対するＴｃｌ１発現の影響を調べた。
【００２９】
[0047]本明細書において、ここで、Ｔｃｌ１がｃ−Ｊｕｎ、ＪｕｎＢ、およびｃ−Ｆｏｓと物理的に相互作用し、そしてＡＰ−１転写活性を阻害することが示されている。さらに、Ｔｃｌ１は、ｐ３０Ｏ／ＣＲＥＢ結合タンパク質と物理的に相互作用することによって、ＮＦ−κＢを活性化する。
【００３０】
[0048]６００のＢ−ＣＬＬ試料においてＴＣＬ１遺伝子を配列決定し、そして２つのヘテロ接合性突然変異を発見した：Ｔ３８ＩおよびＲ５２Ｈ。どちらの突然変異体も、ＡＰ−１阻害剤としての機能獲得を示したことに注目されたい。結果によって、Ｔｃｌ１過剰発現が、ＮＦ−κＢ活性を直接増進し、そしてＡＰ−１を阻害することによって、Ｂ−ＣＬＬを引き起こすことが示される。
【００３１】
[0049]Ｂ−ＣＬＬ特異的機能獲得型Ｔｃｌ１突然変異体を発展させた。６００のＢ−ＣＬＬ試料においてＴＣＬ１遺伝子を配列決定した。すべてのコードＴＣＬ１エクソンの配列決定分析の結果、アミノ酸置換、Ｔ３８ＩおよびＲ５２Ｈを生じる２つのヘテロ接合性突然変異が同定された（図１Ａ）。
【００３２】
[0050]第一の患者の正常頬スワブＤＮＡは、Ｔ３８Ｉ突然変異を示さなかった（図１Ａ）。Ｒ５２Ｈ突然変異はまた、マッチした正常頬スワブＤＮＡにも存在し（図１Ａ、右）、体質的変動が示された。ＲＴ−ＰＣＲの結果、Ｔ３８Ｉ突然変異体ＴＣＬ１  ｍＲＮＡは、元来のＢ−ＣＬＬにおいて主に発現されるアレルであり、ＴＣＬ１  ｍＲＮＡの８０％を占め、そしてＲ５２Ｈアレルは、発現される唯一のアレルであることが示される（図１Ａ）。
【００３３】
[0051]Ｔｃｌ１発現がＮＦ−κＢのトランス活性化活性に影響を及ぼすかどうかを決定するため、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ１（ＭＥＫＫ１）の能力に基づく系を用いて、ＮＦ−ＫＢレポーター構築物である、ＮＦ−κＢ応答配列の調節下でルシフェラーゼを発現するｐＮＦ−κＢ−Ｌｕｃを活性化した。
【００３４】
[0052]ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を、図１Ｂに示す構築物でトランスフェクションした。図１Ｂは、Ｔｃｌ１がＮＦ−κＢ活性を約４倍活性化し（５０対１３）、一方、２つの突然変異体は、活性を２〜３倍活性化したことを示す。
【００３５】
[0053]Ｔｃｌ１はＡｋｔのコアクチベーターであるため、このＮＦ−κＢ活性化がＴｃｌ１によるＡｋｔ活性化によって引き起こされる可能性があった。この可能性を排除するため、ＰＩ３キナーゼ阻害剤であるワートマニンの存在下で同じ実験を行った（ワートマニンはＡｋｔ活性を完全に阻害する）。
【００３６】
[0054]図１Ｂは、Ｔｃｌ１がＮＦ−κＢを活性化する能力に、ワートマニンが影響を及ぼさなかったことを示す；ワートマニンの存在下で、Ｔｃｌ１発現は、ＮＦ−κＢを＞４倍活性化し（７８対１６）、一方、Ｔｃｌ１突然変異体の発現は、２．５〜３倍の活性化を生じた。
【００３７】
[0055]さらに、野生型（ＷＴ）Ｔｃｌ１およびＴ３８Ｉ突然変異体は、Ａｋｔを用いた共免疫沈降実験において、いかなる相違も示さなかった（データ未提示）。これらのデータは、Ｔｃｌ１が、Ａｋｔとは独立の機構によって、ＮＦ−κＢを活性化することを示す。
【００３８】
[0056]この活性化の分子機構を解明するため、２９３細胞の同時トランスフェクションを用いることによって、Ｔｃｌ１ならびにＮＦ−κＢ１、ＮＦ−κＢ２、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、およびｃ−Ｒｅｌ間の共免疫沈降を行った。Ｔｃｌ１およびＮＦ−κＢファミリーメンバー間の物理的相互作用の証拠は見出されなかった（データ未提示）。
【００３９】
[0057]転写活性化因子ＣＲＥＢ結合タンパク質／ｐ３００は、ＮＦ−κＢ経路を含む、いくつかのシグナル伝達経路によって仲介されるトランス活性化に関与する遍在性の核転写因子である。ｐ３００はＮＦ−κＢのコアクチベーターであるため、本発明者らは、本明細書において、Ｔｃｌ１がｐ３００と相互作用するかどうかを調べた。まず、共免疫沈降実験を行い、タグ化Ｔｃｌ１およびｐ３００構築物を２９３細胞内に同時トランスフェクションした。
【００４０】
[0058]図１Ｃ−上部は、ｐ３００がＴｃｌ１と共免疫沈降され、一方、Ｔｃｌ１がｐ３００免疫複合体中で検出されたことを示す。陰性対照として用いた、ｐ３００およびＦｈｉｔ間には共免疫沈降は検出されなかった。
【００４１】
[0059]検出された相互作用が２つのタンパク質の過剰発現の結果ではないことを証明するため、中程度のレベルのＴｃｌ１発現を示す、Ｄａｕｄｉバーキットリンパ腫細胞において、共免疫沈降実験を行った。
【００４２】
[0060]図１Ｃ−下部は、ｐ３００がＴｃｌ１免疫複合体中で検出され、一方、Ｔｃｌ１がｐ３００と共免疫沈降されたことを示す。これは、Ｔｃｌ１が、ｐ３００と相互作用することによって、おそらくコンホメーションを変化させ、そしてＮＦ−κＢコアクチベーターとして機能する能力を増進することによって、ＮＦ−κＢ依存性転写を誘導することを示す。
【００４３】
[0061]結果によって、Ｔｃｌ１突然変異体が、ＷＴ  Ｔｃｌ１より低い度合いまで、ＮＦ−κＢ依存性転写を活性化することを示す（〜３倍対４倍）。本発明者らは、本明細書において、ここで、ＮＦ−κＢの活性化は、Ｂ−ＣＬＬの病因形成において重要であると考えている。また、本発明者らは、本明細書において、ここで、Ｔｃｌ１突然変異体がＮＦ−κＢの活性化において機能獲得を示さないことを示す。さらに、Ｔｃｌ１  Ｔ３８Ｉ突然変異体タンパク質は、ｐ３００を用いた同時免疫沈降実験において、ＷＴ  Ｔｃｌ１と類似であった（データ未提示）。
【００４４】
[0062]本発明者らは、Ｔｃｌ１がＡＰ−１依存性転写を阻害しうるかどうかを調べた。ＡＰ−１の活性を評価するため、ＭＥＫＫ１の能力に基づく系を用いて、ＡＰ−１レポーター構築物である、ＡＰ−１応答配列の調節下でルシフェラーゼを発現するｐＡＰ−１−Ｌｕｃを活性化した。いくつかの２９３細胞を図２Ａ〜２Ｈに示す構築物でトランスフェクションした。本発明者らは、本明細書において、Ｔｃｌ１  ＷＴおよび突然変異体が２９３細胞において内因性ＡＰ−１の活性を阻害するかどうかもまた調べた。２９３細胞をＭＥＫＫ１でトランスフェクションして、ＡＰ−１を活性化した。
【００４５】
[0063]図２Ａは、ＡＰ−１活性がＭＥＫＫ１によって６５２倍誘導されたことを示す。Ｔｃｌ１発現は、ＡＰ−１依存性トランス活性化を〜２．５倍阻害し、一方、Ｔｃｌ１  Ｔ３８Ｉは、劇的な〜１００倍の阻害を引き起こした（６５２対６．３）。Ｒ５２Ｈ突然変異体もまた、ＷＴ  Ｔｃｌ１に比較してより強力な効果を示した（６５２と比較して、１７６対２８７）。ワートマニンで処理した細胞で、類似の結果が得られた（図２Ａ）。Ｔｃｌ１発現は、ＡＰ−１依存性トランス活性化を−２．５倍阻害し、一方、Ｔ３８Ｉ突然変異体は、１５０倍阻害を引き起こした（９８１対６．５）。これらの結果は、Ｔｃｌ１によるＡＰ−１の阻害がＡｋｔ非依存性であることを示す。Ｔｃｌ１がＡＰ−１複合体の個々の構成要素を阻害するかどうかを決定するため、ＷＴ  Ｔｃｌ１およびＴ３８Ｉ突然変異体を用いて、類似の実験を行った。ＡＰ−１は、ＭＥＫＫ１を用いることによるより、単一のＡＰ−１構成要素の過剰発現によって活性化された。
【００４６】
[0064]図２Ｂ−左図は、Ｔｃｌ１が、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、およびＪｕｎ−Ｂを別個に阻害し、一方、Ｔｃｌ１  Ｔ３８Ｉ突然変異体は、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、およびＪｕｎ−Ｂを２倍より効果的に阻害したことを示す。ｃ−Ｊｕｎ／ｃ−ＦｏｓおよびＪｕｎＢ／ｃ−Ｆｏｓヘテロ二量体で類似の結果が得られた（図２Ｂ−右図）。
【００４７】
[0065]これらの場合すべてにおいて、Ｔｃｌ１  Ｔ３８Ｉ突然変異体はＷＴ  Ｔｃｌ１よりもより強力に阻害した。これらの結果（図２Ａおよび図２Ｂ）は、Ｔｃｌ１突然変異体がＡＰ−１阻害において機能獲得効果を示すことを強力に示す。
【００４８】
[0066]この阻害の機構を解明するため、一連の共免疫沈降実験を行った。図２Ｃ〜２Ｆは、一過性に発現されるタンパク質を用いたこれらの実験の結果を示す。Ｔ３８Ｉ突然変異体タンパク質は、ＷＴ  Ｔｃｌ１よりもｃ−Ｆｏｓとはるかに頑強な共免疫沈降を示し（図２Ｃ−下部対図２Ｃ−上部）、ＷＴ  Ｔｃｌ１と比較して該突然変異体のＡＰ−１阻害がより強力であることとの関連が示唆された。この相互作用の特異性を図２Ｄに示し；Ｔｃｌ１はどちらの方向でもｃ−Ｆｏｓと共免疫沈降され、一方、Ｆｈｉｔ（陰性対照として用いる）およびｃ−Ｆｏｓ（図２Ｄ−下部対図２Ｄ−上部）間で陽性の共免疫沈降は検出されなかった。
【００４９】
[0067]同様に、Ｔｃｌ１はｃ−Ｊｕｎと共免疫沈降されたが、Ｆｈｉｔはされず（図２Ｅ）、そしてＴｃｌ１はＪｕｎＢと共免疫沈降されたが、Ｆｈｉｔはされなかった（図２Ｆ）。
【００５０】
[0068]図２Ｇは、２９３細胞において、内因性ｃ−ＪｕｎがトランスフェクションされたＴｃｌ１と共免疫沈降し、一方、Ｔｃｌ１が内因性ｃ−Ｊｕｎの免疫複合体中で検出されたことを示す。Ｄａｕｄｉ細胞における内因性Ｔｃｌ１およびｃ−Ｊｕｎの物理的相互作用が図２Ｈに示される。Ｔｃｌ１は内因性ｃ−Ｊｕｎの免疫複合体中に存在し、そしてｃ−ＪｕｎはＴｃｌ１と共免疫沈降された。これらの実験において（図２Ｇおよび図２Ｈ）、ｃ−Ｊｕｎは非常に低レベルで発現されるため、細胞をホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）およびイオノマイシンで前処理した。こうした処理は、２９３およびＤａｕｄｉ細胞において、ｃ−Ｊｕｎ発現を有意に誘導した。図２Ａ〜２Ｈに記載する結果に少なくとも部分的に基づいて、本発明者らは現在、Ｔｃｌ１がＡＰ−１構成要素と物理的に相互作用して、そしてＡＰ−１阻害剤として機能すると考えている。Ｂ−ＣＬＬ患者で同定されたＴｃｌ１突然変異体はどちらも、この経路において機能獲得特性を示すという事実から、Ｔｃｌ１がＡＰ−１依存性転写を阻害する能力がＢ−ＣＬＬの病因形成に非常に重要であることが示唆される。
【００５１】
[0069]Ｔｃｌ１は核および細胞質の両方に局在する。しかし、ｃ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｆｏｓは、大部分、核タンパク質である。Ｔｃｌ１−ＡＰ−１複合体の細胞内局在を決定するため、２９３細胞において免疫蛍光実験を行った。図３は、４つの異なる視野における、Ｔｃｌ１、ｃ−Ｊｕｎ、およびｃ−Ｆｏｓの細胞内位置を示す。ｃ−Ｊｕｎ（青）およびｃ−Ｆｏｓ（赤）は、核に共局在した。しかし、Ｔｃｌ１（緑）は、核および細胞質中に局在した。図３−右図は、Ｔｃｌ１−ＡＰ−１複合体（黄色）が核内の別個の区画に局在したことを示す。これらのデータは、Ｔｃｌ１が直接会合することによってＡＰ−１機能を阻害するさらなる証拠として働く。
【００５２】
[0070]Ｔｃｌ１は、転写複合体に直接関与することによって、ＮＦ−ＫＢ依存性転写を誘導し、そしてＡＰ−１依存性転写を抑制する（図１および図２）；こうしたものとして、本発明者らは、本明細書において、ここで、Ｔｃｌ１のこれらの作用が細胞死阻害を生じると考えている。ＭＥＫＫ１は、ｃ−ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）およびＡＰ−１活性化によって、２９３細胞においてアポトーシスを誘導するため、本発明者らは、図２において、ＡＰ−１を誘導するのに用いたＭＥＫＫ１のキナーゼドメインを発現する構築物を用いた。
【００５３】
[0071]図４Ａ〜Ｃは、２９３細胞においてＡＰ−１が仲介するアポトーシスをＴｃｌ１が実際に阻害することを示す。ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）の１１６ｋＤａの損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）型がアポトーシス細胞および非アポトーシス細胞の両方に存在し、一方、８５ｋＤａの切断されたＰＡＲＰ１アイソフォームはアポトーシス細胞にのみ存在する。ＭＥＫＫ１発現は、切断された８５ｋＤａ  ＰＡＲＰ１の出現を生じた（図４Ａ）。
【００５４】
[0072]Ｔｃｌ１発現は、８５ｋＤａバンド強度の減少を引き起こし、一方、Ｔｃｌ１  Ｔ３８Ｉ突然変異体の発現は、８５ｋＤａ  ＰＡＲＰ１発現のさらなる減少を生じた（図４Ａ）。この知見は、２９３細胞においてＭＥＫＫ１が誘導するアポトーシスをＴｃｌ１が阻害する一方、Ｔｃｌ１  Ｔ３８Ｉ突然変異体の発現がさらにより強い阻害を生じることを示す。アポトーシス細胞の数を評価するため、トランスフェクション２０時間後の２９３細胞において、断片化された核の数を評価した。図４Ｂおよび図４Ｃは、ＭＥＫＫ１トランスフェクションが２９３細胞において３０％アポトーシスを生じる一方、Ｔｃｌ１発現が１２．５％までのアポトーシスの減少を生じたことを示す。これらの結果は、Ｔｃｌ１がＡＰ−１活性化によって引き起こされたアポトーシスを阻害することを示唆する。
【００５５】
[0073]Ｔｃｌ１は、ＡＰ−１阻害剤として機能し、こうして、Ｂ−ＣＬＬ発展に関与する分子機構に関わる重要な洞察を提供する。これらの結果の重要性は、体細胞Ｔ３８Ｉ突然変異体が機能獲得特性を示す事実によって、非常に増進される。Ｒ５２Ｈ突然変異は、同じ患者の体質的ＤＮＡに存在し、そしてまた、ＡＰ−１阻害の機能獲得を導いた。理論によって束縛することは望まないが、本発明者らは、本明細書において、この変化がＢ−ＣＬＬへの遺伝的素因を引き起こす稀な多型に相当すると考えている。Ｔｃｌ１、ならびにｐ３００およびＡＰ−１構成要素などの転写因子間の物理的相互作用は、Ｔｃｌ１機能の新規分子機構を提供し、そしてＴｃｌ１のこの機能がＡｋｔに独立であることを立証する。
【００５６】
[0074]さらに、Ｔｃｌ１は、異なる構造および機能の多数のタンパク質（例えばＡｋｔ、ｐ３００、ｃ−Ｊｕｎ、およびｃ−Ｆｏｓ）に結合するため、本発明者らは、本明細書において、ここで、Ｔｃｌ１が他の機能（例えば輸送体としての機能）を有すると考えている。
【００５７】
[0075]本明細書に記載する本発明者らの発見は、ここで、ＮＦ−ＫＢを阻害するかまたはＡＰ−１を活性化する方法が、Ｂ−ＣＬＬの高悪性度型の治療に有用でありうることを示す。
【００５８】
[0076]本発明は、以下の実施例においてさらに定義され、ここで、別に言及しない限り、すべての部分および割合は重量であり、そして度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示すが、例示目的のためのみに提供されることを理解しなければならない。上記考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認可能であり、そして本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の多様な変化および修飾を作製して、多様な使用および条件に適応させることも可能である。本明細書において言及される特許および非特許文献を含むすべての刊行物は、本明細書に完全に援用される。
【実施例】
【００５９】
[0077]実施例
[0078]方法
[0079]Ｂ−ＣＬＬ試料、ゲノム配列決定、およびＲＴ−ＰＣＲ
[0080]ＣＬＬ研究コンソーシアムから、Ｂ−ＣＬＬと診断された患者よりインフォームドコンセントを得た後、総数６００のＢ−ＣＬＬ試料を得た。オハイオ州立大学の施設内倫理委員会の認可を得て研究を行った。簡潔には、ＣＬＬ患者から血液を得て、そしてＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ勾配遠心分離（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を通じてリンパ球を単離し、そして標準的ＴＲＩｚｏｌ法を用いることによって、ＲＮＡ抽出のためにプロセシングした。
【００６０】
[0081]ゲノムＤＮＡ  ＰＣＲおよび配列決定で用いたオリゴヌクレオチドは：
[0082]ＴＣＬ１＿１４９Ｆ、５’−ＣＡＴＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＴＡＴＡＡＡＧ−３’［配列番号１］；
[0083]ＴＣＬ１＿５３９Ｒ、５’−ＴＧＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＴＣＣＴＡＴＴＣＡＴ−３’［配列番号２］；
[0084]ＴＣＬ１３  １  Ｆ、５’−ＧＡＡＧＴＧＡＧＣＴＴＣＡＧＧＧＡＡＣＡＧＴ−３’；［配列番号３］；および
[0085]ＣＬ１＿８８０Ｒ、５’−ＡＣＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＧＡＣＴＡＡＧＡＧＧ−３’［配列番号４］
であった。
【００６１】
[0086]ＲＴ−ＰＣＲおよび配列決定で用いたオリゴヌクレオチドは：
[0087]ＴＣＬ１Ｄ５、５’−ＣＣＴＧＴＧＧＧＣＣＴＧＧＧＡＧＡＡＧＴ−３’［配列番号５］および
[0088]ＴＣＬ１Ｒ５、５’−ＴＣＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＴＣＡＡＴＣＴＴ−３’［配列番号６］
であった。
【００６２】
[0089]ＤＮＡ構築物
[0090]標準的プロトコルを用いて、全長ヒトＴＣＬ１およびＦＨＩＴ  ＯＲＦをｐｃＤＮＡ４−ＨｉｓＭａｘＣベクターにクローニングした（それぞれ、Ｏｍｎｉ−Ｔｃｌ１、Ｏｍｎｉ−Ｆｈｉｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。全長ヒトＴＣＬ１  ＯＲＦもまた、ｐＣＭＶ５ベクターにクローニングして、ｐＣＭＶ５−ＴＣＬ１  ＷＴ構築物を得た。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＰＣＲに基づく標準的突然変異誘発キットを用いることによって、ｐＣＭＶ５−ＴＣＬ１  Ｔ３８１およびｐＣＭＶ５−ＴＣＬ１  Ｒ５２Ｈ構築物を生成した。ｐＣＭＶ−Ｍｙｃベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にＭｙｃタグを付加し、５’および３’末端両方にＭｙｃタグを生成して該ベクターを修飾した、ｐＣＭＶ−２ｘＭｙｃベクターに、ＷＴおよび突然変異体ＴＣＬ１ならびにＦＨＩＴ  ＯＲＦをクローニングした。生じた構築物を２ｘＭｙｃ−Ｔｃｌ１  ＷＴ、２ｘＭｙｃ−Ｔｃｌ１  Ｔ３８１、および２ｘＭｙｃ−Ｆｈｉｔと命名した。
【００６３】
[0091]ｃ−ＪｕｎおよびＪｕｎＢに関する哺乳動物発現構築物（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６ベクター中）をＡＴＣＣから購入した。ｃ−Ｊｕｎ  ＯＲＦをｐＣＭＶ−ＨＡベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に挿入することによって、ｃ−Ｊｕｎ−ＨＡを構築した。ｃ−Ｆｏｓ−Ｖ５構築物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ｐ３００−ＨＡ構築物をＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。Ａｋｔ−ＨＡ構築物は先に記載されてきている（Ｐｅｋａｒｓｋｙ  Ｙ．ら（２０００）  Ｔｃｌ１  ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ａｋｔ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｔｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ；  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ／Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：３０２８−３０３３）。二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系およびウミシイタケ属ルシフェラーゼレポーターベクターｐＲＬ−ＴＫをＰｒｏｍｅｇａから購入した。ＡＰ−１レポーター構築物、ｐＡＰ１−Ｌｕｃ、ＮＦ−ＫＢレポーター構築物、ｐＮＦ−ｋＢ−Ｌｕｃ、およびＣＭＶプロモーターの調節下でＭＥＫＫ１のキナーゼドメインをコードする構築物であるｐＦＣ−ＭＥＫＫを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから購入した。
【００６４】
[0092]細胞培養、トランスフェクション、ウェスタンブロット分析、および免疫沈降
[0093]ＮＩＨ３Ｔ３および２９３細胞を、１０％ＦＢＳおよび１００．ｓｇ／Ｌゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ培地１６４０中、３７℃で増殖させた。ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬およびプロテアーゼ阻害剤混合物錠剤をＲｏｃｈｅから得た。ルシフェラーゼアッセイ実験以外のトランスフェクション、細胞溶解物調製、およびウェスタンブロット分析を行った。Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＣＬウェスタンブロット分析基質またはＴｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ最高感度基質を用いることによって、免疫ブロットを現像した。用いた抗体は：抗Ｔｃｌ１（ウェスタンブロット分析およびｐ３００との免疫沈降のためのｓｃ−３２３３１；ｃ−Ｊｕｎとの免疫沈降のためのｓｃ−１１１５６およびｓｃ−１１１５５）、抗Ｏｍｎｉ（免疫沈降およびウェスタンブロット分析のためのｓｃ−７２７０；免疫蛍光のためのｓｃ−４９９）、抗ｐ３００（ｓｃ−３２２４４）、抗Ｍｙｃ（９Ｅ１０）、抗Ｍｙｃ−ＨＲＰ（９Ｅ１０）、抗ｃ−Ｊｕｎ（免疫沈降のためのｓｃ−１６９４）、抗Ｊｕｎｇ（免疫沈降のためのｓｃ−８０５１；ウェスタンブロット分析のためのｓｃ−４６）、抗ｃ−Ｆｏｓ（免疫沈降および免疫蛍光のためのｓｃ−４４７）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ｃ−Ｊｕｎ（ウェスタンブロット分析のための６１０３２６、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＨＡ（ＨＡ．１  １）（Ｃｏｖａｎｃｅ）、抗Ｖ５−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ラット抗ＨＡ（免疫蛍光のため）、および抗ＨＡ−ＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ）であった。
【００６５】
[0094]免疫蛍光
[0095]ＨＥＫ２９３細胞をヒト・フィブロネクチンＣｅｌｌｗａｒｅ  ２ウェル培養スライド（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で増殖させた。Ｚｅｉｓｓ  ＬＣＭ  ５１０共焦点顕微鏡を用いて免疫蛍光実験を行った。免疫蛍光に用いた二次抗体は以下の通りであった：ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６（赤）、ヤギ抗ラットＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（赤外）、およびヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（緑）、すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入。
【００６６】
[0096]ルシフェラーゼアッセイ
[0097]ＮＩＨ３Ｔ３細胞または２９３細胞を、示す構築物でトランスフェクションした。ホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）およびウミシイタケ属ルシフェラーゼ活性を二重ルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）でアッセイし、そして製造者によって示唆されるように、ホタル・ルシフェラーゼ活性をウミシイタケ属ルシフェラーゼ活性に対して標準化した。すべての実験を３つ組で行い、そして３回反復して、一貫した結果を得た。
【００６７】
[0098]細胞死分析
[0099]１０．ｓｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色して、断片化された核を示す細胞数を記録することによって、アポトーシスを評価した。アポトーシス検出の代替法もまた用いた。ＨＥＫ２９３細胞を、１．５μｇのｐＣＭＶ５空ベクター、あるいは１μｇのｐＣＭＶ５空またはｐＣＭＶ５−Ｔｃｌ１  ＷＴまたはｐＣＭＶ５−Ｔｃｌ１  Ｔ３８１構築物を伴う０．５μｇのｐＦＣ−ＭＥＫＫのいずれかでトランスフェクションした。２４時間後、死亡細胞および生存細胞の両方を収集し、そして溶解した。これらの溶解物を抗ＰＡＲＰ１抗体（５５６３６２；  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で探査した（ｐｒｏｂｅｄ）。ＰＡＲＰ１の１１６ｋＤａの損なわれていない型が非アポトーシス細胞およびアポトーシス細胞の両方に存在した。８５ｋＤａ  ＰＡＲＰ１切断断片はアポトーシス細胞にのみ存在した。
【００６８】
[00100]療法／予防法および組成物
[00101]本発明は、被験体に有効量の療法剤、すなわち本発明のモノクローナル（またはポリクローナル）抗体、ウイルスベクター、Ｔｃｌ１模倣体またはＴｃｌ１アンタゴニストを投与することによる治療法および予防法を提供する。好ましい側面において、療法剤は実質的に精製される。被験体は好ましくは動物であり、限定されるわけではないが、ウシ、ブタ、ニワトリなどが含まれ、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。
【００６９】
[00102]多様な送達系が知られ、そして本発明の療法剤の投与に用いられ、例えばリポソーム中の被包、微小粒子、微小カプセル、組換え細胞による発現、受容体が仲介するエンドサイトーシス、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての療法核酸の構築などがある。導入法には、限定されるわけではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、および経口経路が含まれる。任意の好適な経路によって、例えば注入またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜裏打ち（ｍｕｃｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｌｉｎｉｎｇ）（例えば口腔粘膜、直腸および腸粘膜等）を通じた吸収によって化合物を投与し、そして他の生物学的活性剤とともに投与してもよい。投与は全身または局所でもよい。さらに、脳室内およびクモ膜下腔内注射を含む、任意の適切な経路によって、本発明の薬学的組成物を中枢神経系に導入することが望ましい可能性もあり；例えばリザーバー、例えばオンマヤリザーバーに取り付けた脳室内カテーテルによって、脳室内注射を容易にしてもよい。
【００７０】
[00103]特定の態様において、本発明の薬学的組成物を、治療が必要な領域に局所的に投与することが望ましい可能性もある；これは、例えば、そして限定ではなく、手術中の局所注入、局部適用、例えば手術後の創傷包帯と組み合わせることによって、注射によって、カテーテルによって、座薬によって、または移植物によって達成可能であり、移植物は、多孔性、非多孔性、またはゼラチン性材料のものであり、膜、例えばシアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜、または繊維のものが含まれる。１つの態様において、投与は悪性腫瘍あるいは新生物または前新生物組織の部位（または以前の部位）での直接注射による。
【００７１】
[00104]療法剤が、タンパク質療法剤をコードする核酸である、特定の態様において、該核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、そして細胞内になるように投与するか、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でコーティングすることによって、あるいは核に進入することが知られるホメオボックス様ペプチドと連結して投与することによって、核酸をｉｎ  ｖｉｖｏで投与して、コードされるタンパク質の発現を促進する。あるいは、核酸療法剤を細胞内に導入して、そして相同組換えによって、発現のため、宿主細胞ＤＮＡ内に取り込ませてもよい。
【００７２】
[00105]本発明はまた、薬学的組成物も提供する。こうした組成物は、療法的に有効な量の療法剤、および薬学的に許容されうるキャリアーまたは賦形剤を含む。こうしたキャリアーには、限定されるわけではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせが含まれる。キャリアーおよび組成物は無菌であってもよい。配合物は、投与様式に適合するであろう。
【００７３】
[00106]組成物は、望ましい場合、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝剤もまた含有してもよい。組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、持続放出配合物、または粉末であってもよい。組成物を座薬として、伝統的な結合剤およびキャリアー、例えばトリグリセリドとともに配合してもよい。経口配合物には、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的キャリアーが含まれてもよい。
【００７４】
[00107]好ましい態様において、組成物を、ヒトへの静脈内投与に適した薬学的組成物として、ルーチンの方法にしたがって配合する。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物にはまた、可溶化剤、および注射部位での疼痛を和らげる、リグノカインなどの局所麻酔剤も含まれる。一般的に、成分は、単位投薬型で、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの密封容器中、乾燥凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として、別個にまたは一緒に混合されて供給される。組成物を注入によって投与しようとする場合、無菌製薬等級水または生理食塩水を含有する注入瓶とともに分配される。組成物を注射によって投与する場合、注射用無菌水または生理食塩水のアンプルを提供し、成分を投与前に混合する。
【００７５】
[00108]本発明の療法剤を中性または塩型で配合する。薬学的に許容されうる塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するものなどの、未結合（ｆｒｅｅ）アミノ基とともに形成されるもの、および水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するものなどの、未結合カルボキシル基とともに形成されるものが含まれる。
【００７６】
[00109]特定の障害または状態の治療に有効であろう本発明の療法剤の量は、障害または状態の性質に応じ、そして標準的臨床技術によって決定される。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを場合によって使用して、最適投薬量範囲を同定するのを補助してもよい。配合物中で使用すべき正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重篤性に応じるであろうし、そして医師の判断および各患者の状況にしたがって決定される。しかし、静脈内投与に適した投薬範囲は、一般的に、ｋｇ体重あたり、約２０〜５００マイクログラムの活性化合物である。鼻内投与に適した投薬範囲は、一般的に、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得た用量反応曲線から有効用量を外挿してもよい。
【００７７】
[00110]本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１以上の成分が充填された１以上の容器を含む薬学的パックまたはキットも提供する。こうした容器（単数または複数）に場合によって付随するのは、薬剤または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する行政機関によって規定される形式の通知であり、こうした通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売の、行政機関による認可を反映する。
【００７８】
[00111]本発明は、多様なそして好ましい態様に言及して記載されてきているが、本発明の本質的な範囲を逸脱することなく、多様な変化を行ってもよく、そしてその要素を同等物で置換してもよいことが、当業者には理解されなければならない。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、本発明の解説に対して、特定の状況または物質を適応させるよう、多くの修飾を行ってもよい。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【国際調査報告】
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