(57)【要約】  イソプロパノール経路を有する例示的な非天然存在型微生物には、イソプロパノールを産生するのに十分な量で発現されるイソプロパノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含み、及びスクシニル-CoA：3-ケト酸-CoAトランスフェラーゼを含む。4-ヒドロキシ酪酸経路を有する別の生物には、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル-CoAヒドラターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ、ホスホトランス-4-ヒドロキシブチリラーゼ、及び4-ヒドロキシ酪酸キナーゼを含む少なくとも1つの外来性核酸を含む。1,4-ブタンジオール経路を有する例示的な生物には、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル-CoAヒドラターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルコール形成）、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルデヒド形成）、及び1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼを含む。当該微生物はアセチル-CoA経路を更に含む。任意の上述した生物は、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸、又は1,4-ブタンジオールを産生するように培養される。【選択図】図１
2012511928.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプロパノールを産生するのに十分な量で発現されるイソプロパノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含むイソプロパノール経路を有する微生物を含み、該イソプロパノール経路酵素がスクシニル-CoA：3-ケト酸-CoAトランスフェラーゼを含む、非天然存在型微生物。
【請求項２】
前記スクシニル-CoA：3-ケト酸-CoAトランスフェラーゼは、HPAG1_0676、HPAG1_0677、ScoA、ScoB、OXCT1及びOXCT2からなる群から選択される遺伝子の1つ以上によりコードされる、請求項1記載の生物。
【請求項３】
アセトアセチル-CoAチオラーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを更に含む、請求項1記載の生物。
【請求項４】
前記アセトアセチル-CoAチオラーゼが、atoB、thlA、thlB、及びerg10からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項3記載の生物。
【請求項５】
前記アセト酢酸デカルボキシラーゼが、遺伝子adcによりコードされる、請求項3記載の生物。
【請求項６】
前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼが、adh及びipdhからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項3記載の生物。
【請求項７】
コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄-硫黄タンパク質、ニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質、フェレドキシン、アセチル-CoAシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、及びヒドロゲナーゼからなる群から選択される少なくとも1つの酵素又はポリペプチドを更に含む、請求項1記載の生物。
【請求項８】
前記コリノイドタンパク質がmtaC、mtaC1、mtaC2,及びmtaC3からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項7記載の生物。
【請求項９】
前記メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼが、mtaA、及びmtaA1、mtaA2からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項7記載の生物。
【請求項１０】
前記メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼが、遺伝子acsEによりコードされる、請求項7記載の生物。
【請求項１１】
前記コリノイド鉄-硫黄タンパク質が、遺伝子acsDによりコードされる、請求項7記載の生物。
【請求項１２】
前記ニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質が、acsF及びcooCからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子によりコードされる、請求項７記載の生物。
【請求項１３】
前記フェレドキシンが遺伝子orf7によりコードされる、請求項７記載の生物。
【請求項１４】
前記アセチル-CoAシンターゼが、acsB及びacsCからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子によりコードされる、請求項７記載の生物。
【請求項１５】
前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼが、遺伝子acsAによりコードされる、請求項７記載の生物。
【請求項１６】
前記ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼがpor及びydbKからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項７記載の生物。
【請求項１７】
前記ヒドロゲナーゼが、hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、moth_2178、moth_2179、moth_2180、moth_2181、hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycI、hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfI、hyfJ、hyfR、moth_2182、moth_2183、moth_2184、moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、moth_2190、moth_2191、moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、moth_0809、moth_0810、moth_0811、moth_0812、moth_0813、moth_0814、moth_0815、moth_0816、moth_1193、moth_1194、moth_1195、moth_1196、moth_1717、moth_1718、moth_1719、moth_1883、moth_1884、moth_1885、moth_1886、moth_1887、moth_1888、moth_1452、moth_1453、及びmoth_1454からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子によりコードされる、請求項7記載の生物。
【請求項１８】
遺伝子acsEpsによりコードされるポリペプチド（polypetide）AcsEpsを更に含む、請求項７記載の生物。
【請求項１９】
codh、codh-I、cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、cooL、cooK、cooM、cooT、cooJ、及びcodh-IIからなる群から選択される遺伝子によりコードされる少なくとも1つの酵素又はポリペプチドを更に含む、請求項７記載の生物。
【請求項２０】
メタノールメチルトランスフェラーゼを更に含む、請求項７記載の生物。
【請求項２１】
前記メタノールメチルトランスフェラーゼが、mtaB、mtaB1、mtaB2、及びmtaB3からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項20記載の生物。
【請求項２２】
1)メタノール及びCO、2)メタノール、CO2及びH2、3)メタノール、CO、CO2及びH2、4)メタノール、並びにCO及びH2を含む合成ガス、及び5)メタノール、並びにCO、CO2及びH2を含む合成ガスからなる群から選択される原料を利用する、請求項20記載の生物。
【請求項２３】
ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、及びメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼを更に含む、請求項７記載の生物。
【請求項２４】
前記ギ酸デヒドロゲナーゼが、moth_2312、moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfum_2706、chy_0731、chy_0732、及びchy_0733からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項23記載の生物。
【請求項２５】
前記ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼが、moth_0109、chy_2385、及びfhsからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項23記載の生物。
【請求項２６】
前記メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼが、moth_1516、folD、及びchy_1878からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項23記載の生物。
【請求項２７】
前記メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼが、moth_1516、folD、及びchy_1878からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項23記載の生物。
【請求項２８】
前記メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼが、moth_1191、metF、及びchy_1233からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項23記載の生物。
【請求項２９】
1) CO、2) CO2及びH2、3) CO及びCO2、4) CO及びH2を含む合成ガス、及び5) CO、CO2及びH2を含む合成ガスからなる群から選択される原料を利用する、請求項23記載の生物。
【請求項３０】
4-ヒドロキシ酪酸を産生するのに十分な量で発現される4-ヒドロキシ酪酸経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む4-ヒドロキシ酪酸経路を有する微生物を含み、該4-ヒドロキシ酪酸経路酵素が、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル-CoAヒドラターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ、ホスホトランス-4-ヒドロキシブチリラーゼ、及び4-ヒドロキシ酪酸キナーゼを含む、非天然存在型微生物。
【請求項３１】
前記アセトアセチル-CoAチオラーゼが、atoB、thlA、thlB、及びerg10からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項30記載の生物。
【請求項３２】
前記3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼが、hbd、msed_1423、msed_0399、msed_0389、及びmsed_1933からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項30記載の生物。
【請求項３３】
前記クロトナーゼが、crt、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、及びpaaGからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項30記載の生物。
【請求項３４】
前記クロトニル-CoAヒドラターゼが、abfD、msed_1321、及びmsed_1220からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項30記載の生物。
【請求項３５】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼが、cat2、abfT-2、abfT-1、及びabfTからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項30記載の生物。
【請求項３６】
前記ホスホトランス-4-ヒドロキシブチリラーゼが、pta及びptbからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項30記載の生物。
【請求項３７】
前記4-ヒドロキシ酪酸キナーゼが、ackA、buk1、buk2、及びproBからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項30記載の生物。
【請求項３８】
コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄-硫黄タンパク質、ニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質、フェレドキシン、アセチル-CoAシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、及びヒドロゲナーゼからなる群から選択される少なくとも1つの酵素又はポリペプチドを更に含む、請求項30記載の生物。
【請求項３９】
前記コリノイドタンパク質が、mtaC、mtaC1、mtaC2、及びmtaC3からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項38記載の生物。
【請求項４０】
前記メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼが、mtaA、及びmtaA1、mtaA2からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項38記載の生物。
【請求項４１】
前記メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼが、遺伝子acsEによりコードされる、請求項38記載の生物。
【請求項４２】
前記コリノイド鉄-硫黄タンパク質が、遺伝子acsDによりコードされる、請求項38記載の生物。
【請求項４３】
前記ニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質が、acsF及びcooCからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子によりコードされる、請求項38記載の生物。
【請求項４４】
前記フェレドキシンが、遺伝子orf7によりコードされる、請求項38記載の生物。
【請求項４５】
前記アセチル-CoAシンターゼが、acsB及びacsCからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子によりコードされる、請求項38記載の生物。
【請求項４６】
前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼが、遺伝子acsAによりコードされる、請求項38記載の生物。
【請求項４７】
前記ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼが、por及びydbKからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項38記載の生物。
【請求項４８】
前記ヒドロゲナーゼが、hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、moth_2178、moth_2179、moth_2180、moth_2181、hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycI、hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfI、hyfJ、hyfR、moth_2182、moth_2183、moth_2184、moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、moth_2190、moth_2191、moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、moth_0809、moth_0810、moih_0811、moth_0812、moth_0813、moth_0814、moth_0815、moth_0816、moth_1193、moth_1194、moth_1195、moth_1196、moth_1717、moth_1718、moth_1719、moth_1883、moth_1884、moth_1885、moth_1886、moth_1887、moth_1888、moth_1452、moth_1453、及びmoth_1454からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子によりコードされる、請求項38記載の生物。
【請求項４９】
遺伝子acsEpsによりコードされるポリペプチドAcsEpsを更に含む、請求項38記載の生物。
【請求項５０】
codh、codh-I、cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、cooL、cooK、cooM、cooT、cooJ、及びcodh-IIからなる群から選択される遺伝子によりコードされる少なくとも1つの酵素又はポリペプチドを更に含む、請求項38記載の生物。
【請求項５１】
メタノールメチルトランスフェラーゼを更に含む、請求項38記載の生物。
【請求項５２】
前記メタノールメチルトランスフェラーゼが、mtaB、mtaB1、mtaB2、及びmtaB3からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項51記載の生物。
【請求項５３】
1)メタノール及びCO、2)メタノール、CO2及びH2、3)メタノール、CO、CO2及びH2、4)メタノール、並びにCO及びH2を含む合成ガス、及び5)メタノール、並びにCO、CO2及びH2を含む合成ガスからなる群から選択される原料を利用する、請求項51記載の生物。
【請求項５４】
ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、及びメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼを更に含む、請求項38記載の生物。
【請求項５５】
前記ギ酸デヒドロゲナーゼが、moth_2312、moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfum_2706、chy_0731、chy_0732、及びchy_0733からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項54記載の生物。
【請求項５６】
前記ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼが、moth_0109、chy_2385、及びfhsからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項54記載の生物。
【請求項５７】
前記メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼが、moth_1516、folD、及びchy_1878からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項54記載の生物。
【請求項５８】
前記メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼが、moth_1516、folD、及びchy_1878からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項54記載の生物。
【請求項５９】
前記メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼが、moth_1191、metF、及びchy_1233からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項54記載の生物。
【請求項６０】
1) CO、2) CO2及びH2、3) CO及びCO2、4) CO及びH2を含む合成ガス、及び5) CO、CO2及びH2を含む合成ガスからなる群から選択される原料を利用する、請求項54記載の生物。 
【請求項６１】
1,4-ブタンジオールを産生するのに十分な量で発現する1,4-ブタンジオール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む1,4-ブタンジオール経路を有する微生物を含み、該1,4-ブタンジオール経路酵素が、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル-CoAヒドラターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルコール形成）、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルデヒド形成）、及び1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼを含む、非天然存在型微生物であって、アセチル-CoAを産生するのに十分な量で発現されるアセチル-CoA経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含むアセチル-CoA経路を更に含み、該アセチル-CoA経路酵素が、コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄-硫黄タンパク質、ニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質、フェレドキシン、アセチル-CoAシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、及びヒドロゲナーゼを含む、前記非天然存在型微生物。
【請求項６２】
前記アセトアセチル-CoAチオラーゼが、atoB、thlA、thlB、及びerg10からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項61記載の生物。
【請求項６３】
前記3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼが、hbd、msed_1423、msed_0399、msed_0389、及びmsed_1933からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項61記載の生物。
【請求項６４】
前記クロトナーゼが、crt、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、及びpaaGからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項61記載の生物。
【請求項６５】
前記クロトニル-CoAヒドラターゼが、abfD、msed_1321、及びmsed_1220からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項61記載の生物。
【請求項６６】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルコール形成）が、adhE、adhE2、mcr、rcas_2929、nap1_02720、及びmgp2080_00535からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項61記載の生物。
【請求項６７】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルデヒド形成）が、acr1、sucD、bphG、msed_0709、mcr、asd-2、及びsaci_2370からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項61記載の生物。
【請求項６８】
前記1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼが、alrA、adh2、yqhD、bdh I、bdh II、及び4hbdからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項61記載の生物。
【請求項６９】
前記コリノイドタンパク質が、mtaC、mtaC1、mtaC2、及びmtaC3からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項61記載の生物。
【請求項７０】
前記メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼが、mtaA、及びmtaA1、mtaA2からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項61記載の生物。
【請求項７１】
前記メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼが、遺伝子acsEによりコードされる、請求項61記載の生物。
【請求項７２】
前記コリノイド鉄-硫黄タンパク質が、遺伝子acsDによりコードされる、請求項61記載の生物。
【請求項７３】
前記ニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質が、acsF及びcooCからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子によりコードされる、請求項61記載の生物。
【請求項７４】
前記フェレドキシンが、遺伝子orf7によりコードされる、請求項61記載の生物。
【請求項７５】
前記アセチル-CoAシンターゼが、acsB及びacsCからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子によりコードされる、請求項61記載の生物。
【請求項７６】
前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼが、遺伝子acsAによりコードされる、請求項61記載の生物。
【請求項７７】
前記ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼが、por及びydbKからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項61記載の生物。
【請求項７８】
前記ヒドロゲナーゼが、hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、moth_2178、moth_2179、moth_2180、moth_2181、hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycI、hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfI、hyfJ、hyfR、moth_2182、moth_2183、moth_2184、moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、moth_2190、moth_2191、moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、moth_0809、moth_0810、moih_0811、moth_0812、moth_0813、moth_0814、moth_0815、moth_0816、moth_1193、moth_1194、moth_1195、moth_1196、moth_1717、moth_1718、moth_1719、moth_1883、moth_1884、moth_1885、moth_1886、moth_1887、moth_1888、moth_1452、moth_1453、及びmoth_1454からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子によりコードされる、請求項61記載の生物。
【請求項７９】
遺伝子acsEpsによりコードされるポリペプチドAcsEpsを更に含む、請求項61記載の生物。
【請求項８０】
codh、codh-I、cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、cooL、cooK、cooM、cooT、cooJ、及びcodh-IIからなる群から選択される遺伝子によりコードされる少なくとも1つの酵素又はポリペプチドを更に含む、請求項61記載の生物。
【請求項８１】
メタノールメチルトランスフェラーゼを更に含む、請求項61記載の生物。
【請求項８２】
前記メタノールメチルトランスフェラーゼが、mtaB、mtaB1、mtaB2、及びmtaB3からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項81記載の生物。
【請求項８３】
1)メタノール及びCO、2)メタノール、CO2及びH2、3)メタノール、CO、CO2及びH2、4)メタノール、並びにCO及びH2を含む合成ガス、及び5)メタノール、並びにCO、CO2及びH2を含む合成ガスからなる群から選択される原料を利用する、請求項81記載の生物。
【請求項８４】
1,4-ブタンジオールを産生するのに十分な量で発現する1,4-ブタンジオール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む1,4-ブタンジオール経路を有する微生物を含み、該1,4-ブタンジオール経路酵素が、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル-CoAヒドラターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルコール形成）、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルデヒド形成）及び1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼを含む、非天然存在型微生物であって、アセチル-CoAを産生するのに十分な量で発現するアセチル-CoA経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含むアセチル-CoA経路を更に含み、該アセチル-CoA経路酵素が、アセチル-CoAシンターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、及びメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼを含む、前記非天然存在型微生物。
【請求項８５】
前記ギ酸デヒドロゲナーゼが、moth_2312、moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfum_2706、chy_0731、chy_0732、及びchy_0733からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項84記載の生物。
【請求項８６】
前記ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼが、moth_0109、chy_2385、及びfhsからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項84記載の生物。
【請求項８７】
前記メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼが、moth_1516、folD、及びchy_1878からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項84記載の生物。
【請求項８８】
前記メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼが、moth_1516、folD、及びchy_1878からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項84記載の生物。
【請求項８９】
前記メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼが、moth_1191、metF、及びchy_1233からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項84記載の生物。
【請求項９０】
1) CO、2) CO2及びH2、3) CO及びCO2、4) CO及びH2を含む合成ガス、及び5) CO、CO2及びH2を含む合成ガスからなる群から選択される原料を利用する、請求項84記載の生物。
【請求項９１】
イソプロパノールを産生するのに十分な量で発現されるイソプロパノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含むイソプロパノール経路を有する微生物を含み、該イソプロパノール経路酵素が、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、アセトアセチル-CoA：酢酸：CoAトランスフェラーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを含む、非天然存在型微生物であって、アセチル-CoAを産生するのに十分な量で発現されるアセチル-CoA酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を更に含み、該アセチル-CoA経路酵素が、メタノールメチルトランスフェラーゼ、コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ-葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄-硫黄タンパク質、ニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質、フェレドキシン、アセチル-CoAシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、及びヒドロゲナーゼを含む、前記非天然存在型微生物。
【請求項９２】
前記アセトアセチル-CoA：酢酸：CoAトランスフェラーゼが、atoA、atoD、ctfA、及びctfBからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項91記載の生物。
【請求項９３】
イソプロパノールを産生するのに十分な量で発現されるイソプロパノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含むイソプロパノール経路を有する微生物を含み、該イソプロパノール経路酵素が、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、アセトアセチル-CoA：酢酸：CoAトランスフェラーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを含む、非天然存在型微生物であって、アセチル-CoAを産生するのに十分な量で発現するアセチル-CoA酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を更に含み、該アセチル-CoA経路酵素が、アセチル-CoAシンターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、及びメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼを含む、前記非天然存在型微生物。
【請求項９４】
前記アセトアセチル-CoA：酢酸：CoAトランスフェラーゼが、atoA、atoD、ctfA、及びctfBからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項93記載の生物。
【請求項９５】
イソプロパノール経路を有する非天然存在型微生物を培養することを含む、イソプロパノールの生産方法であって、該経路が、イソプロパノールを産生する条件下及び十分な時間でイソプロパノールを産生するのに十分な量で発現されるイソプロパノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含み、該イソプロパノール経路がスクシニル-CoA：3-ケト酸-CoAトランスフェラーゼを含む、前記生産方法。
【請求項９６】
前記スクシニル-CoA：3-ケト酸-CoAトランスフェラーゼが、HPAG1_0676、HPAG1_0677、ScoA、ScoB、OXCT1、及びOXCT2からなる群から選択される遺伝子の1つ以上によりコードされる、請求項95記載の方法。
【請求項９７】
アセトアセチル-CoAチオラーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを更に含む、請求項95記載の方法。
【請求項９８】
前記アセトアセチル-CoAチオラーゼが、atoB、thlA、thlB、及びerg10からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項95記載の方法。
【請求項９９】
前記アセト酢酸デカルボキシラーゼが、遺伝子adcによりコードされる、請求項95記載の方法。
【請求項１００】
前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼが、adh及びipdhからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項95記載の方法。
【請求項１０１】
コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄-硫黄タンパク質、ニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質、フェレドキシン、アセチル-CoAシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、及びヒドロゲナーゼからなる群から選択される少なくとも1つの酵素又はポリペプチドを更に含む、請求項95記載の方法。
【請求項１０２】
前記コリノイドタンパク質が、mtaC、mtaC1 、mtaC2、及びmtaC3からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項101記載の方法。
【請求項１０３】
前記メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼが、mtaA、及びmtaA1、mtaA2からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項101記載の方法。
【請求項１０４】
前記メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼが、遺伝子acsEによりコードされる、請求項101記載の方法。
【請求項１０５】
前記コリノイド鉄-硫黄タンパク質が、遺伝子acsDによりコードされる、請求項101記載の方法。
【請求項１０６】
前記ニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質が、acsF及びcooCからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子によりコードされる、請求項101記載の方法。
【請求項１０７】
前記フェレドキシンが、遺伝子orf7によりコードされる、請求項101記載の方法。
【請求項１０８】
前記アセチル-CoAシンターゼが、acsB及びacsCからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子によりコードされる、請求項101記載の方法。
【請求項１０９】
前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼが、遺伝子acsAによりコードされる、請求項101記載の方法。
【請求項１１０】
前記ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼが、por及びydbKからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項101記載の方法。
【請求項１１１】
前記ヒドロゲナーゼがhypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、moth_2178、moth_2179、moth_2180、moth_2181、hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycI、hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfI、hyfJ、hyfR、moth_2182、moth_2183、moth_2184、moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、moth_2190、moth_2191、moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、moth_0809、moth_0810、moih_0811、moth_0812、moth_0813、moth_0814、moth_0815、moth_0816、moth_1193、moth_1194、moth_1195、moth_1196、moth_1717、moth_1718、moth_1719、moth_1883、moth_1884、moth_1885、moth_1886、moth_1887、moth_1888、moth_1452、moth_1453、及びmoth_1454からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子によりコードされる、請求項101記載の方法。
【請求項１１２】
遺伝子acsEpsによりコードされるポリペプチドAcsEpsを更に含む、請求項101の方法。
【請求項１１３】
codh、codh-I、cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、cooL、cooK、cooM、cooT、cooJ、及びcodh-IIからなる群から選択される遺伝子によりコードされる少なくとも1つの酵素又はポリペプチドを更に含む、請求項101の方法。
【請求項１１４】
メタノールメチルトランスフェラーゼを更に含む、請求項101の方法。
【請求項１１５】
前記メタノールメチルトランスフェラーゼが、mtaB、mtaB1、mtaB2、及びmtaB3からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項114記載の方法。
【請求項１１６】
前記生物が、1)メタノール及びCO、2)メタノール、CO2及びH2、3)メタノール、CO、CO2及びH2、4)メタノール、並びにCO及びH2を含む合成ガス、及び5)メタノール、並びにCO、CO2及びH2を含む合成ガスからなる群から選択される原料を利用する、請求項114記載の方法。
【請求項１１７】
前記生物が、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、及びメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼを更に含む、請求項101記載の方法。
【請求項１１８】
前記ギ酸デヒドロゲナーゼが、moth_2312、moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfum_2706、chy_0731、chy_0732、及びchy_0733からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項117記載の方法。
【請求項１１９】
前記ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼが、moth_0109、chy_2385、及びfhsからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項117記載の方法。
【請求項１２０】
前記メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼが、moth_1516、folD、及びchy_1878からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項117記載の方法。
【請求項１２１】
前記メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼが、moth_1516、folD、及びchy_1878からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項117記載の方法。
【請求項１２２】
前記メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼが、moth_1191、metF、及びchy_1233からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項117記載の方法。
【請求項１２３】
前記生物が、1) CO、2) CO2及びH2、3) CO及びCO2、4) CO及びH2を含む合成ガス、及び5) CO、CO2及びH2を含む合成ガスからなる群から選択される原料を利用する、請求項117記載の方法。
【請求項１２４】
4-ヒドロキシ酪酸経路を有する非天然存在型微生物を培養することを含む、4-ヒドロキシ酪酸の生産方法であって、該経路が、4-ヒドロキシ酪酸を産生する条件下及び十分な時間で4-ヒドロキシ酪酸を産生するのに十分な量で発現する4-ヒドロキシ酪酸経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含み、該4-ヒドロキシ酪酸経路が、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル-CoAヒドラターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ、ホスホトランス-4-ヒドロキシブチリラーゼ、及び4-ヒドロキシ酪酸キナーゼを含む、前記生産方法。
【請求項１２５】
前記アセトアセチル-CoAチオラーゼが、atoB、thlA、thlB、及びerg10からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項124記載の方法。
【請求項１２６】
前記3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼが、hbd、msed_1423、msed_0399、msed_0389、及びmsed_1933からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項124記載の方法。
【請求項１２７】
前記クロトナーゼが、crt、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、及びpaaGからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項124記載の方法。
【請求項１２８】
前記クロトニル-CoAヒドラターゼが、abfD、msed_1321、及びmsed_1220からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項124記載の方法。
【請求項１２９】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼが、cat2、abfT-2、abfT-1、及びabfTからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項124記載の方法。
【請求項１３０】
前記ホスホトランス-4-ヒドロキシブチリラーゼが、pta及びptbからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項124記載の方法。
【請求項１３１】
前記4-ヒドロキシ酪酸キナーゼが、ackA、buk1、buk2、及びproBからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項124記載の方法。
【請求項１３２】
前記生物が、コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄-硫黄タンパク質、ニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質、フェレドキシン、アセチル-CoAシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、及びヒドロゲナーゼからなる群から選択される少なくとも1つの酵素又はポリペプチドを更に含む、請求項124記載の方法。
【請求項１３３】
前記コリノイドタンパク質が、mtaC、mtaC1、mtaC2、及びmtaC3からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項132記載の方法。
【請求項１３４】
前記メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼが、mtaA、及びmtaA1、mtaA2からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項132記載の方法。
【請求項１３５】
前記メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼが、遺伝子acsEによりコードされる、請求項132記載の方法。
【請求項１３６】
前記コリノイド鉄-硫黄タンパク質が、遺伝子acsDによりコードされる、請求項132記載の方法。
【請求項１３７】
前記ニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質が、acsF及びcooCからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子によりコードされる、請求項132記載の方法。
【請求項１３８】
前記フェレドキシンが、遺伝子orf7によりコードされる、請求項132記載の方法。
【請求項１３９】
前記アセチル-CoAシンターゼが、acsB及びacsCからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子によりコードされる、請求項132記載の方法。
【請求項１４０】
前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼが、遺伝子acsAによりコードされる、請求項132記載の方法。
【請求項１４１】
前記ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼが、por及びydbKからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項132記載の方法。
【請求項１４２】
前記ヒドロゲナーゼが、hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、moth_2178、moth_2179、moth_2180、moth_2181、hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycI、hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfI、hyfJ、hyfR、moth_2182、moth_2183、moth_2184、moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、moth_2190、moth_2191、moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、moth_0809、moth_0810、moih_0811、moth_0812、moth_0813、moth_0814、moth_0815、moth_0816、moth_1193、moth_1194、moth_1195、moth_1196、moth_1717、moth_1718、moth_1719、moth_1883、moth_1884、moth_1885、moth_1886、moth_1887、moth_1888、moth_1452、moth_1453、及びmoth_1454からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子によりコードされる、請求項132記載の方法。
【請求項１４３】
遺伝子acsEpsによりコードされるポリペプチドAcsEpsを更に含む、請求項132記載の方法。
【請求項１４４】
codh、codh-I、cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、cooL、cooK、cooM、cooT、cooJ、及びcodh-IIからなる群から選択される遺伝子によりコードされる少なくとも1つの酵素又はポリペプチドを更に含む、請求項132記載の方法。
【請求項１４５】
メタノールメチルトランスフェラーゼを更に含む、請求項132記載の方法。
【請求項１４６】
前記メタノールメチルトランスフェラーゼが、mtaB、mtaB1、mtaB2、及びmtaB3からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項145記載の方法。
【請求項１４７】
前記生物が、1)メタノール及びCO、2)メタノール、CO2及びH2、3)メタノール、CO、CO2及びH2、4)メタノール、並びにCO及びH2を含む合成ガス、及び5)メタノール、並びにCO、CO2及びH2を含む合成ガスからなる群から選択される原料を利用する、請求項145記載の方法。
【請求項１４８】
前記生物が、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、及びメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼを更に含む、請求項132記載の方法。
【請求項１４９】
前記ギ酸デヒドロゲナーゼが、moth_2312、moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfum_2706、chy_0731、chy_0732、及びchy_0733からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項148記載の方法。
【請求項１５０】
前記ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼが、moth_0109、chy_2385、及びfhsからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項148記載の方法。
【請求項１５１】
前記メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼが、moth_1516、folD、及びchy_1878からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項148記載の方法。
【請求項１５２】
前記メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼが、moth_1516、folD、及びchy_1878からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項148記載の方法。
【請求項１５３】
前記メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼが、moth_1191、metF、及びchy_1233からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項148記載の方法。
【請求項１５４】
前記生物が、1) CO、2) CO2及びH2、3) CO及びCO2、4) CO及びH2を含む合成ガス、及び5) CO、CO2及びH2 を含む合成ガスからなる群から選択される原料を利用する、請求項148記載の方法。
【請求項１５５】
1,4-ブタンジオール経路を有する非天然存在型微生物を培養することを含む、1,4-ブタンジオールの生産方法であって、該経路が、1,4-ブタンジオールを産生する条件下及び十分な時間で1,4-ブタンジオールを産生するのに十分な量で発現される1,4-ブタンジオール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含み、該1,4-ブタンジオール経路が、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル-CoAヒドラターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルコール形成）、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルデヒド形成）、1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼを含み、該生物が、アセチル-CoAを産生するのに十分な量で発現されるアセチル-CoA経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含むアセチル-CoA経路を更に含み、該アセチル-CoA経路酵素が、コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄-硫黄タンパク質、ニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質、フェレドキシン、アセチル-CoAシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、及びヒドロゲナーゼを含む、前記生産方法。
【請求項１５６】
前記アセトアセチル-CoAチオラーゼが、atoB、thlA、thlB、及びerg10からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項155記載の方法。
【請求項１５７】
前記3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼが、hbd、msed_1423、msed_0399、msed_0389、及びmsed_1933からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項155記載の方法。
【請求項１５８】
前記クロトナーゼが、crt、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、及びpaaGからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項155記載の方法。
【請求項１５９】
前記クロトニル-CoAヒドラターゼが、abfD、msed_1321、及びmsed_1220からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項155記載の方法。
【請求項１６０】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルコール形成）が、adhE、adhE2、mcr、rcas_2929、nap1_02720、及びmgp2080_00535からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項155記載の方法。
【請求項１６１】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルデヒド形成）が、acr1、sucD、bphG、msed_0709、mcr、asd-2、及びsaci_2370からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項155記載の方法。
【請求項１６２】
前記1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼが、alrA、adh2、yqhD、bdh I、bdh II、及び4hbdからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項155記載の方法。
【請求項１６３】
前記コリノイドタンパク質が、mtaC、mtaC1、mtaC2、及びmtaC3からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項155記載の方法。
【請求項１６４】
前記メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼが、mtaA、及びmtaA1、mtaA2からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項155記載の方法。
【請求項１６５】
前記メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼが、遺伝子acsEによりコードされる、請求項155記載の方法。
【請求項１６６】
前記コリノイド鉄-硫黄タンパク質が、遺伝子acsDによりコードされる、請求項155記載の方法。
【請求項１６７】
前記ニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質が、acsF及びcooCからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子によりコードされる、請求項155記載の方法。
【請求項１６８】
前記フェレドキシンが、遺伝子orf7によりコードされる、請求項155記載の方法。
【請求項１６９】
前記アセチル-CoAシンターゼが、acsB及びacsCからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子によりコードされる、請求項155記載の方法。
【請求項１７０】
前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼが、遺伝子acsAによりコードされる、請求項155記載の方法。
【請求項１７１】
前記ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼが、por及びydbKからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項155記載の方法。
【請求項１７２】
前記ヒドロゲナーゼが、hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、moth_2178、moth_2179、moth_2180、moth_2181、hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycI、hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfI、hyfJ、hyfR、moth_2182、moth_2183、moth_2184、moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、moth_2190、moth_2191、moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、moth_0809、moth_0810、moih_0811、moth_0812、moth_0813、moth_0814、moth_0815、moth_0816、moth_1193、moth_1194、moth_1195、moth_1196、moth_1717、moth_1718、moth_1719、moth_1883、moth_1884、moth_1885、moth_1886、moth_1887、moth_1888、moth_1452、moth_1453、及びmoth_1454からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子によりコードされる、請求項155記載の方法。
【請求項１７３】
前記生物が、遺伝子acsEpsによりコードされるポリペプチドAcsEpsを更に含む、請求項155記載の方法。
【請求項１７４】
codh、codh-I、cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、cooL、cooK、cooM、cooT、cooJ、及びcodh-IIからなる群から選択される遺伝子によりコードされる少なくとも1つの酵素又はポリペプチドを更に含む、請求項155記載の方法。
【請求項１７５】
メタノールメチルトランスフェラーゼを更に含む、請求項155記載の方法。
【請求項１７６】
前記メタノールメチルトランスフェラーゼが、mtaB、mtaB1、mtaB2、及びmtaB3からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項175記載の方法。
【請求項１７７】
前記生物が、1)メタノール及びCO、2)メタノール、CO2及びH2、3)メタノール、CO、CO2及びH2、4)メタノール、並びにCO及びH2を含む合成ガス、及び5)メタノール、並びにCO、CO2及びH2を含む合成ガスからなる群から選択される原料を利用する、請求項175記載の方法。
【請求項１７８】
1,4-ブタンジオール経路を有する非天然存在型微生物を培養することを含む、1,4-ブタンジオールの生産方法であって、該経路が、1,4-ブタンジオールを産生する条件下及び十分な時間で1,4-ブタンジオールを産生するのに十分な量で発現される1,4-ブタンジオール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含み、該1,4-ブタンジオール経路が、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル-CoAヒドラターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルコール形成）、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルデヒド形成）、1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼを含み、該生物が、アセチル-CoAを産生するのに十分な量で発現するアセチル-CoA経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含むアセチル-CoA経路を更に含み、該アセチル-CoA経路酵素が、アセチル-CoAシンターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、及びメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼを含む、前記生産方法。
【請求項１７９】
前記ギ酸デヒドロゲナーゼが、moth_2312、moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfum_2706、chy_0731、chy_0732、及びchy_0733からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項178記載の方法。
【請求項１８０】
前記ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼが、moth_0109、chy_2385、及びfhsからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項178記載の方法。
【請求項１８１】
前記メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼが、moth_1516、folD、及びchy_1878からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項178記載の方法。
【請求項１８２】
前記メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼが、moth_1516、folD、及びchy_1878からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項178記載の方法。
【請求項１８３】
前記メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼが、moth_1191、metF、及びchy_1233からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項178記載の方法。
【請求項１８４】
前記生物が、1) CO、2) CO2及びH2、3) CO及びCO2、4) CO及びH2を含む合成ガス、及び5) CO、CO2及びH2を含む合成ガスからなる群から選択される原料を利用する、請求項178記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2007年12月16日に出願された米国仮出願第61/138,108号の優先権の利益を主張し、当該内容は引用によりその全てが本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
（本発明の背景）
本発明は、全般に、メタノール、合成ガス及び他のガスの炭素源をより高価値の化学物質に変換できる生合成プロセス及び生物体に関する。より詳細には、本発明は、汎用化学物質、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸（hydroxybutryate）、及び1,4-ブタンジオールを生成し得る非天然存在型生物に関する。
【０００３】
安価かつ容易に利用できる原料の柔軟性を増加させ、化学生産の環境衝撃を最小化することは、持続可能な化学工業のために有益である。原料における柔軟性は、化学製造のために主原料として広範囲の材料を入手して使用できる方法の導入に左右される。
【０００４】
イソプロパノール（IPA）は、無色の可燃性液体であり、水を含む大部分の溶媒と完全に混合される。IPAの最も大規模な使用は溶媒としてであり、IPA及び水の混合物である「消毒用アルコール」として周知のその小規模の使用を含む。溶媒として、IPAは、多くの日常的な製品、例えば塗料、ラッカー、シンナー、インク、接着剤、多目的クリーナー、消毒剤、化粧品、化粧品類、除氷剤及び医薬に見出される。低等級IPAはモーター油においても使用される。2番目に大規模な使用は、イソプロピルアミン（例えば、農業製品に）、イソプロピルエーテル、及びイソプロピルエステルの生産のための化学中間体としてである。
【０００５】
イソプロパノールは、2つの石油化学経路により製造される。優勢的な方法は、硫酸触媒を用いる、又は用いない、プロピレンの水和を伴う。第2に、IPAは、アセトンの水素化を介して生産され、これはフェノール及びプロピレンオキシドの生産において形成される副産物である。高価なプロピレンは、現在、化学工業全体にわたって、費用の上昇と利益の低下を促進しており、広範な低コスト原料の必要性を動機付けている。
【０００６】
4-ヒドロキシブタン酸（4-ヒドロキシブタノアート、4-ヒドロキシ酪酸、4-HB）は、さまざまな汎用及び特殊化学物質の構成要素として産業的潜在性を有する4-炭素カルボン酸である。特に、4-HBは、溶媒、樹脂、ポリマー前駆体及び特殊化学物質を含む、化学物質の1,4-ブタンジオールファミリーへの新規なエントリポイントとして有用である潜在性を有する。
【０００７】
BDOは、高性能ポリマー、溶媒、及びファインケミカルの生産のための有益な化学物質である。それは、テトラヒドロフラン（THF）及びガンマブチロラクトン（GBL）などの他の高価値化学物質を生産する基礎である。BDOの使用には、(1)ポリマー、(2) THF誘導体、及び(3) GBL誘導体を含む。ポリマーの場合、BDOは、ポリブチレンテレフタラート（PBT）生産のためのコモノマーである。PBTは、デュポン及びジェネラルエレクトリックなどの会社により製造される中間性能エンジニアリングサーモプラスチックであり、自動車、電気製品、水道設備、及び小型家電用途における使用が見出される。THFに変換され、その後ポリテトラメチレンエーテルグリコール（PTMEG）に変換される場合、スパンデクス（Spandex）及びライクラ（Lycra）繊維及び衣料品工業は供給される市場に投入される。また、PTMEGは、特殊ポリエステルエーテル（COPE）の生産においてBDOと組み合わされる。COPEは優れた機械的特性及び油/環境抵抗性を有する高弾性エラストマーであり、それらを極端に高い及び低い温度で取扱うことを可能にする。また、PTMEG及びBDOは、標準熱可塑性押出、圧延、及び成形装置で加工される熱可塑性ポリウレタンを生産し、それらの顕著な耐久性及び耐摩耗性により特徴づけられる。BDOから生産されるGBLは、ピロリドンを生産するための原料を提供し、並びにそれ自体農薬市場用途に有用である。ピロリドンは、エレクトロニクス工業における使用並びに医薬製造における使用を増加させる抽出過程の高性能溶媒として使用される。
【０００８】
BDOは、商業運転においても追加のいくつかの経路を有する2つの主要な石油化学経路によって生産される。1つの経路は、アセチレンをホルムアルデヒドと反応させた後の水素化を含む。比較的近年、ブタン又はブタジエンの無水マレイン酸への酸化とそれに続く水素化を含むBDOプロセスが導入された。BDOは、他の化学物質及びポリマーを合成する中間体として、ほぼ排他的に使用される。合成ガス（Synthesis gas）（合成ガス（syngas））は、主としてH2及びCOの混合物であり、石炭、石油、天然ガス、バイオマス又は廃棄有機物などの任意の有機原料のガス化を介して得ることができる。多数のガス化プロセスが開発されており、大部分の設計は、例えば、0.5:1〜3:1のH2/CO混合として合成ガスを提供するための高温（500-1500℃）での有機物質の部分酸化（制限された酸素が完全な燃焼を回避する）に基づく。蒸気は、時折、典型的には水性ガス転化反応によるさらなるCO2生産を伴い、水素内容を増加させるために添加される。
【０００９】
今日、石炭は、合成ガスの工業生産のために使用される主基質であり、これは通常、加熱及び電力のために、並びにメタノール及び液化炭化水素のフィッシャー-トロブシュ合成のための原料として使用される。多くの大規模な化学及びエネルギー会社は大規模に石炭ガス化プロセスを使用し、この技術を使用する産業には経験がある。
【００１０】
概して、現在の技術は、実際上世界の任意の所在における、石炭、バイオマス、廃棄物、ポリマーなどを含む過剰の材料からの合成ガスの費用効果的な生産のために存在する。バイオマスガス化技術は、特に熱及びエネルギー生産のために、商業的に実施されている。
【００１１】
合成ガスを利用する微生物の入手可能性にもかかわらず、当該微生物は、通常、十分に特徴づけられておらず、商業開発のために十分適切でない。例えば、クロストリジウム及び関連した細菌は、ブタノールなどの高濃度の特定の生成物に不耐性である偏性嫌気性細菌であり、それゆえ力価及び商業化可能性が制限される。また、クロストリジウムは複数の生成物を生産し、これは所望の生成物を単離する際の単離の問題をもたらす。最後に、クロストリジウム遺伝子を操作するための簡易な遺伝子的ツールの開発はその初期段階にあり、従って、それらは現在において、収率を改善する急速遺伝子工学又は所望の生成物の生産特性に従わない。
【００１２】
従って、合成ガス又は他のガスの炭素源を所望の化学物質及び燃料の生産のために利用するための微生物の開発及びそれらの使用方法についての必要性が存在する。より詳細には、それらの急速工学（rapid engineering）が有用な速度及び量で有益な生成物を生産することを可能にするための既存かつ効率的な遺伝子的ツールを有する合成ガス利用のための微生物を開発する必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、同様に関連する利点を提供する。
【発明の概要】
【００１３】
（本発明の要旨）
いくつかの態様において、本発明は、イソプロパノールを産生するのに十分な量で発現されるイソプロパノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む、イソプロパノール経路を有する非天然存在型微生物を提供する。イソプロパノール経路酵素には、スクシニル-CoA：3-ケト酸-CoAトランスフェラーゼを含む。
【００１４】
他の態様において、本発明は、4-ヒドロキシ酪酸（hydroxybutryate）を産生するのに十分な量で発現される4-ヒドロキシ酪酸経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む、4-ヒドロキシ酪酸経路を有する非天然存在型微生物を提供する。4-ヒドロキシ酪酸経路酵素には、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル-CoAヒドラターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ、ホスホトランス-4-ヒドロキシブチリラーゼ、及び4-ヒドロキシ酪酸キナーゼを含む。
【００１５】
さらに他の態様において、本発明は、1,4-ブタンジオールを産生するのに十分な量で発現される1,4-ブタンジオール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む、1,4-ブタンジオール経路を有する非天然存在型微生物を提供する。1,4-ブタンジオール経路酵素には、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル-CoAヒドラターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルコール形成）、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルデヒド形成）、及び1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼを含む。当該微生物には、アセチル-CoAを産生するのに十分な量で発現されるアセチル-CoA経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を有するアセチル-CoA経路も含む。アセチル-CoA経路酵素には、コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄-硫黄タンパク質、ニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質、フェレドキシン、アセチル-CoAシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、及びヒドロゲナーゼを含む。
【００１６】
さらに他の態様において、本発明は、1,4-ブタンジオールを産生するのに十分な量で発現される1,4-ブタンジオール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む、1,4-ブタンジオール経路を有する非天然存在型微生物を提供する。1,4-ブタンジオール経路酵素には、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル-CoAヒドラターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルコール形成）、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルデヒド形成）及び1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼを含む。当該微生物は、アセチル-CoAを産生するのに十分な量で発現されるアセチル-CoA経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を有するアセチル-CoA経路も含む。アセチル-CoA経路酵素には、アセチル-CoAシンターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、及びメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼを含む。
【００１７】
なお更なる態様において、本発明は、イソプロパノールを産生するのに十分な量で発現されるイソプロパノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む、イソプロパノール経路を有する非天然存在型微生物を提供する。イソプロパノール経路酵素には、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、アセトアセチル-CoA：酢酸：CoAトランスフェラーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを含む。当該微生物には、アセチル-CoAを産生するのに十分な量で発現されるアセチル-CoA酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸も含む。アセチル-CoA経路酵素には、メタノールメチルトランスフェラーゼ、コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ-葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄-硫黄タンパク質、ニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質、フェレドキシン、アセチル-CoAシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、及びヒドロゲナーゼを含む。
【００１８】
なお更なる態様において、本発明は、イソプロパノール経路を有する非天然存在型微生物を培養することを含む、イソプロパノールの生産方法を提供する。該経路には、イソプロパノールを生産するための条件下で、かつ、十分な時間、イソプロパノールを産生するのに十分な量で発現されるイソプロパノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む。イソプロパノール経路には、スクシニル-CoA：3-ケト酸-CoAトランスフェラーゼを含む。
【００１９】
なお更なる態様において、本発明は、4-ヒドロキシ酪酸経路を有する非天然存在型微生物を培養することを含む、4-ヒドロキシ酪酸の生産方法を提供する。該経路には、4-ヒドロキシ酪酸を生産するための条件下で、かつ、十分な時間、4-ヒドロキシ酪酸を産生するのに十分な量で発現される4-ヒドロキシ酪酸経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む。4-ヒドロキシ酪酸経路には、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル-CoAヒドラターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ、ホスホトランス-4-ヒドロキシブチリラーゼ、及び4-ヒドロキシ酪酸キナーゼを含む。
【００２０】
さらに他の態様において、本発明は、1,4-ブタンジオール経路を有する非天然存在型微生物を培養することを含む、1,4-ブタンジオールの生産方法を提供する。該経路には、1,4-ブタンジオールを生産するための条件下で、かつ、十分な時間、1,4-ブタンジオールを産生するのに十分な量で発現される1,4-ブタンジオール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む。1,4-ブタンジオール経路には、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル-CoAヒドラターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルコール形成）、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルデヒド形成）、1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼを含む。当該微生物は、アセチル-CoAを産生するのに十分な量で発現されるアセチル-CoA経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む、アセチル-CoA経路も含む。アセチル-CoA経路酵素には、コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄-硫黄タンパク質、ニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質、フェレドキシン、アセチル-CoAシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、及びヒドロゲナーゼを含む。
【００２１】
最後に、いくつかの態様において、本発明は、1,4-ブタンジオール経路を有する非天然存在型微生物を培養することを含む、1,4-ブタンジオールの生産方法を提供する。該経路には、1,4-ブタンジオールを生産するための条件下で、かつ、十分な時間、1,4-ブタンジオールを産生するのに十分な量で発現される1,4-ブタンジオール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む。1,4-ブタンジオール経路は、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル-CoAヒドラターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルコール形成）、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルデヒド形成）、及び1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼを含む。当該微生物は、アセチル-CoAを産生するのに十分な量で発現されるアセチル-CoA経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を有するアセチル-CoA経路も含む。アセチル-CoA経路酵素には、アセチル-CoAシンターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、及びメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図1は、酢酸及びエタノールのためのウッド-リュングダール（Wood-Ljungdahl）経路及び形成経路を表す線図を示す。合成ガスにおいて増加し得る微生物に典型的に特有である形質転換は、1）COデヒドロゲナーゼ、2）ヒドロゲナーゼ、3）エネルギー保存ヒドロゲナーゼ（ECH）、及び4）二官能性COデヒドロゲナーゼ/アセチル-CoAシンターゼである。水素から2[H]への、又はH2Oを有するCOからCO2及び2[H]への酸化は、CO2のギ酸への、メテニル-テトラヒドロ葉酸（メテニル-THF）のメチレンテトラヒドロ葉酸（メチレン-THF）への、メチレン-THFのメチルテトラヒドロ葉酸（メチル-THF）への、及びCO2のCOへの還元のための還元等価物の減少を提供する。
【００２３】
【図２】図2Aは、CO、CO2及び／又はH2のアセチル-CoA（これはその後、細胞質量及びエタノール又は酢酸などの生成物に変換される。）への変換を含む、ガスの変換のための完全なウッド-リュングダール経路を示す。図2Bは、CO、CO2及び／又はH2を含むガス、及びメタノールからアセチル-CoA、更にイソプロパノールへの変換のための合成代謝経路を示す。図2 Cは、CO、CO2及び／又はH2を含むガス、及びメタノールからアセチル-CoA、更に4-ヒドロキシ酪酸への変換のための合成代謝経路を示す。図2Dは、CO、CO2及び／又はH2を含むガス、及びメタノールからアセチル-CoA、更に1,4-ブタンジオールへの変換のための合成代謝経路を示す。図2A-Dにおいて、生産宿主に導入できる特定の酵素的変換に番号をつける。（略語）：10FTHF：10-ホルミルテトラヒドロ葉酸、5MTHF：5-メチルテトラヒドロ葉酸、ACTP：アセチルリン酸、CFeSp：コリノイド鉄硫黄タンパク質、FOR：ギ酸、MeOH：メタノール、METHF：メチルテトラヒドロ葉酸、MLTHF：メテニルテトラヒドロ（metheneyltetrahydro）葉酸、THF：テトラヒドロ葉酸。
【００２４】
【図３】図3Aは、CO、CO2及び／又はH2などのガスのアセチル-CoA、及び更にイソプロパノールへの変換のための合成代謝経路を示す。図3Bは、CO、CO2及び／又はH2などのガスのアセチル-CoA、及び更に4-ヒドロキシ酪酸への変換のための合成代謝経路を示す。図3 Cは、CO、CO2及び／又はH2などのガスのアセチル-CoA、及び更に1,4-ブタンジオールへの変換のための合成代謝経路を示す。図3A-Cにおいて、生産宿主に導入できる特定の酵素的変換に番号をつける。（略語）：10FTHF：10-ホルミルテトラヒドロ葉酸、5MTHF：5-メチルテトラヒドロ葉酸、ACTP：アセチルリン酸、CFeSp：コリノイド鉄硫黄タンパク質、FOR：ギ酸、MeOH：メタノール、METHF：メチルテトラヒドロ葉酸、MLTHF：メテニルテトラヒドロ葉酸、THF：テトラヒドロ葉酸。
【００２５】
【図４】図4は、10マイクログラムのACS90細胞抽出物（レーン1）、ACS91細胞抽出物（レーン2）、Mta98/99細胞抽出物（レーン3及び4）、及びサイズ標準（レーン5）、並びにコントロールのM.サーモアセチカ(M. thermoacetica)CODH（Moth_1202/1203）又はMtr（Mo th 1197）のタンパク質（50、150、250、350、450、500、750、900、及び1000 ng）のウエスタンブロットを示す。
【００２６】
【図５】図5は、メチルビオローゲンアッセイにおいて使用されるキュベットを示す。ブランクは右側にあり、還元したメチルビオローゲンを有するキュベットは左側にある。各々の上部のストッパー及び真空グリースは、反応を嫌気的に保つために使用される。
【００２７】
【図６】図6は、添加したCH3-THFから精製M.サーモアセチカコリノイドタンパク質へのCH3の移転のためにアッセイされるACS90細胞抽出物のスペクトログラムを示す。
【００２８】
【図７】図7は、N2及びCOで36時間、37 Cでの組換え型大腸菌MG1655の嫌気的増殖を示す。左から右に：空ベクター、ACS90及びACS91が示される。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
(発明の詳細な説明)
本発明は、部分的には、MtaABC型メチルトランスフェラーゼ系と連動するウッド-リュングダール経路のカルボニル側鎖を触媒する酵素をコードする遺伝子を発現する非天然存在型微生物に関する。当該微生物は、合成ガス及びCO、CO2及び／又はH2を含むガスに由来し得る比較的廉価な有機原料であるメタノールを、アセチル-CoA、細胞質量、並びにイソプロパノール（IPA）、4-ヒドロキシ酪酸（4-HB）、及び1,4-ブタンジオール（BDO）などの生成物へと変換できる。本発明は、部分的には、ウッド-リュングダール経路のカルボニル及びメチル分枝を触媒する酵素をコードする遺伝子を発現する非天然存在型微生物にも関する。当該微生物は、CO、CO2及び／又はH2を含むガスを、アセチル-CoA、細胞質量、並びにIPA、4-HB及びBDOなどの生成物へと変換し得る。
【００３０】
一実施態様において、本発明は、メタノール、及び合成ガスの混合物などのガス性原料からイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールを生産し得る非天然存在型微生物を提供する。他の実施態様において、本発明は、メタノールを必要とすることなく、合成ガスの混合物からイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールを生産し得る非天然存在型微生物を提供する。
【００３１】
別の実施態様において、本発明は、これらの非天然存在型微生物を培養することによるイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールの生産方法を提供する。
【００３２】
これらの微生物を利用するバイオテクノロジープロセスは、多様な原料に基づく最低運転費用を保証するために、及び任意に油及び天然ガスなどの現在の原料の市場駆動型汎用価格設定の予想変動率を相殺するために、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸及び1,4-ブタンジオール製造業者に運用上の柔軟性を提供する。さらにまた、これらの方法は、再生可能原料を利用し、エネルギー強度を減少させ、温室効果ガス排出を低減する、持続可能な製造実施を提供する。
【００３３】
ムーレラ・サーモアセチカ(Moorella thermoacetica)、C. リュングダーリイ（C. ljungdahlii）及びC. カルボキシジボランス（carboxidivorans）などの酢酸産生菌は、ヘキソース糖から一酸化炭素にわたる様々な炭素源において増殖できる。グルコースなどのヘキソースは、はじめにエムデン-マイヤーホフ-パナス（EMP）解糖を介してピルビン酸へと代謝され、これはそれからピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（PFOR）を介してアセチル-CoAに変換される。アセチル-CoAは、バイオマス前駆体を構築するために使用でき、又は酢酸キナーゼ及びホスホトランスアセチラーゼを介してエネルギーを生産する酢酸に変換できる。グルコースの酢酸、エネルギー及び還元等価物への全体的変換は、方程式1により与えられる：
C6H12O6 + 4 ADP + 4 Pi → 2 CH3COOH + 2 CO2 + 4 ATP + 8[H]    方程式1
【００３４】
酢酸産生菌は、グルコースの酢酸への変換からより多くのエネルギーを抽出すると共に、放出されたCO2をウッド-リュングダール経路を介して酢酸へと更に変換することにより、還元のバランスも維持する。
2 CO2 + 8[H]+ n ADP + n Pi → CH3 COOH + n ATP    方程式2
【００３５】
必要な還元等価物を供給するための水素が存在する限り、多くの酢酸産生菌がグルコース不在下においてさえもウッド-リュングダール経路を介してCO2存在下で増殖できるので、上記方程式における係数nは、この変換がエネルギー生産力であることを示す。
2 CO2 + 4 H2 + n ADP + n Pi → CH3 COOH + 2 H2O + n ATP    方程式3
【００３６】
図1に図示されるウッド-リュングダール経路は、Na+又はH+イオン勾配と共役し、それぞれNa+-又はH+-依存性ATPシンターゼを介してATPを生成できる（Mullerの文献, V. Appl Environ Microbiol 69:6345-6353 (2003)）。これら公知の変換に基づき、酢酸産生菌は、唯一の炭素及びエネルギー源としてCOを利用する能力も有する。具体的には、COは、還元等価物及びCO2を生産するために酸化でき、又はバイオマス若しくは酢酸にその後変換されるアセチル-CoAへと直接的に同化される。
4 CO + 2 H2O → CH3 COOH + 2 CO2   方程式4 
【００３７】
しかしながら、十分な水素が還元等価物の必要量を満たすように存在する場合、酢酸のより高収率を達成し得る。
2 CO + 2 H2 → CH3 COOH    方程式5
【００３８】
図1からの後、アセチル-CoAを介した酢酸の産生は1つのATP分子を生成するが、アセチル-CoAからのエタノールの産生はATP分子を生成せず、かつ2つの還元等価物を必要とする。従って、合成ガスからのエタノール生産は、酢酸産生の不在下における細胞増殖のために十分なエネルギーを産生しないと推測できる。しかしながら、特定の状況下、クロストリジウム・リュングダーリイは、合成ガスからほとんどエタノールを生産し（Klassonらの文献、Fuel 72:1673-1678 (1993)）、これは当該経路のいくつかの組合せ
2 CO2 + 6 H2 → CH3 CH2OH + 3 H2O    方程式6
6 CO + 3 H2O → CH3 CH2OH + 4 CO2    方程式7
2 CO + 4 H2 → CH3 CH2OH + H2O    方程式8
が実際に細胞増殖を支持するのに十分なエネルギーを産生することを示す。R.ラブラム（R. rubrum）などの水素産生細菌は、CO及び水の水素への変換からエネルギーを産生することもできる（図1を参照）（Simpmaらの文献、Critical Reviews in Biotechnology 26:41-65 (2006)）。1つの重要な機構は、エネルギー変換ヒドロゲナーゼ（ECH）及びCOデヒドロゲナーゼの協調的作用である。COデヒドロゲナーゼは、COから電子を供給し、これはそれからECHにより陽子をH2に還元させるために使用され、当該活性がエネルギー産生プロトン輸送と共役する。正味の結果は、水-ガス転化反応を介したエネルギーの産生である。
【００３９】
本発明の実施態様は、(1)メタノールを伴う又は伴わない合成ガスのアセチル-CoAへの変換のための経路、及び(2)アセチル-CoAのイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールへの変換のための経路の組合せを記載する。このようにして、本発明は、炭水化物原料からイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールを生産するように操作された生物体を超えて固有の収率的利点を有する生物体の産生及び変換経路を提供する。例えば、グルコースからのイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸及び1,4-ブタンジオールの最大理論収率は、本明細書に記載されているアセチル-CoAに由来する代謝経路を使用する、1モルにつき1モルである。具体的には、解糖を介して1モルのグルコース当たり2モルのアセチル-CoAが誘導され、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールの1モル当たり2モルのアセチル-CoAが必要とされる。正味の変換は、以下の化学量論式により記載されている：
イソプロパノール：C6H12O6 + 1.5 O2 → C3H8O + 3 CO2 + 2 H2O
4-ヒドロキシ酪酸：C6H12O6 + 1.5 O2 → C4H8O3 + 2 CO2 + 2 H2O
1,4-ブタンジオール：C6H12O6 → C4H10O2 + CH2O2 + CO2
【００４０】
一方で、本明細書に記載されている経路を使用する、グルコースのそのより多くのより単純な成分（CO及びH2）へのガス化、及びそれに続くイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸及び1,4-ブタンジオールへのそれらの変換は、以下の最大理論収率に結果としてなる：
イソプロパノール：6 CO + 6 H2 → 1.333 C3H8O + 2 CO2 + 0.667 H2O
4-ヒドロキシ酪酸：6 CO + 6 H2 → 1.333 C4H8O3 + 0.667 CO2 + 0.667 H2O
1,4-ブタンジオール：6 CO + 6 H2 → 1.091 C4H10O2 + 1.636 CO2 + 0.545 H2O
【００４１】
グルコースのガス化が最高で6モルのCO及び6モルのH2を提供できることに注意されたい。合成ガスからのイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸及び1,4-ブタンジオールの最大理論収率は、後述するようにメタノールの添加によって更に高めることができる：
イソプロパノール：CH4O + 6 CO + 6 H2 → 1.667 C3H8O + 2 CO2 + 1.333 H2O
4-ヒドロキシ酪酸：CH4O + 6 CO + 6 H2 → 1.667 C4H8O3 + 0.333 CO2 + 1.333 H2O
1,4-ブタンジオール：CH4O + 6 CO + 6 H2 → 1.364 C4H10O2 + 1.545 CO2 + 1.182 H2O
イソプロパノール：2 CH4O + 6 CO + 6 H2 → 2 C3H8O + 2 CO2 + 2 H2O 
4-ヒドロキシ酪酸：2 CH4O + 6 CO + 6 H2 → 2 C4H8O3 + 2 H2O
1,4-ブタンジオール：2 CH4O + 6 CO + 6 H2 → 1.636 C4H10O2 + 1.455 CO2 + 1.818 H2O
従って、本明細書に記載されている微生物及び変換経路が、炭水化物をイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールへと変換する効率的な手段を提供することは明らかである。
【００４２】
本明細書で使用される用語「非天然存在型」は、本発明の微生物（microbial organism）又は微生物（microorganism）に関して使用される場合、当該微生物が、基準種の野生型種を含む天然存在型の基準種において通常見出されない少なくとも1つの遺伝的変更を有することを意味することが意図される。遺伝的変更には、例えば、代謝ポリペプチドをコードする発現可能核酸、他の核酸付加、核酸削除及び／又は当該微生物の遺伝物質の他の機能的な破壊を導入する修飾を含む。当該修飾には、例えば、基準（referenced）種に対し異種性（heterologous）、相同（homologous）、又は異種性及び相同の両方のポリペプチドのコード領域及びその機能的断片を含む。さらなる修飾には、例えば、当該修飾が遺伝子又はオペロンの発現を変える非コード制御領域を含む。例示的な代謝ポリペプチドには、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生合成経路の内の酵素又はタンパク質を含む。
【００４３】
代謝修飾とは、その天然存在型状態から変更された生化学的反応をいう。従って、非天然存在型微生物は、代謝ポリペプチド又はその機能的断片をコードする核酸に遺伝的修飾を有することができる。例示的な代謝修飾は、本明細書に開示される。
【００４４】
本明細書で使用される用語「単離される」は、微生物に関して使用される場合、当該基準微生物に天然に見出される少なくとも1つの成分を実質的に含まない生物体を意味することを意図する。当該用語は、その自然環境で見出されるいくつか又は全ての成分から取り出された微生物を含む。また、当該用語は、当該微生物が非天然存在型の環境で見出される場合のいくつか又は全ての成分から取り出された微生物を含む。従って、単離された微生物は、天然に見出される場合のような他の物質、又は非天然存在型環境で増殖させ、保存し、若しくは維持される場合のような他の物質から、部分的に若しくは完全に分離される。単離された微生物の具体例には、非天然存在型培地で培養された部分的に純粋な微生物、実質的に純粋な微生物及び微生物を含む。
【００４５】
本明細書で使用される用語「微生物（microbial）」、「微生物（microbial organism）」又は「微生物（microorganism）」は、古細菌、細菌又は真核生物のドメイン内に含まれる微視的細胞として存在する任意の微生物を意味することを意図する。従って、当該用語は、微視的サイズを有する原核生物細胞若しくは真核生物細胞又は生物体を包含し、又は全ての種の細菌、古細菌及び真正細菌、並びに酵母及び真菌などの真核微生物を含むことを意味することを意図する。当該用語には、生化学的産生のために培養できる任意の種の細胞培養物も含む。
【００４６】
本明細書で使用される用語「CoA」又は「補酵素A」とは、活性な酵素系を形成するためにその存在が多くの酵素（アポ酵素）の活性に必要とされる有機的補助因子又は補欠基（酵素の非タンパク質部分）を意味することを意図する。特定の縮合酵素における補酵素A機能は、アセチル又は他のアシル基転移、及び脂肪酸合成及び酸化、ピルビン酸酸化、及び他のアセチル化において作用する。
【００４７】
本明細書で使用される用語「実質的に嫌気性」は、培養又は増殖条件に関して使用される場合、酸素量が液体培地の溶存酸素について約10%未満飽和していることを意味することを意図する。当該用語は、約1%未満の酸素の雰囲気で維持される液体又は固体培地の密封チャンバを含むことも意図する。
【００４８】
本明細書において使用される「外来性」は、当該基準分子又は当該基準活性が宿主微生物に導入されることを意味することを意図する。当該分子は、例えば、宿主染色体への組込みによるものなどの宿主遺伝物質へのコード核酸の導入によって、又はプラスミドなどの非染色体性遺伝物質として、導入できる。従って、当該用語は、コード核酸の発現に関して使用される場合、発現可能な形態でのコード核酸の微生物への導入をいう。生合成活性に関して使用される場合、当該用語は、宿主基準微生物に導入される活性に関する。供給源は、例えば、宿主微生物への導入後に当該基準活性を発現する相同若しくは異種性のコード核酸であり得る。従って、用語「内在性」とは、宿主に存在する当該基準分子又は活性に関する。同様に、当該用語は、コード核酸の発現に関して使用される場合、微生物の内に含まれるコード核酸の発現に関する。用語「異種性」とは基準種以外の供給源に由来する分子又は活性に関し、「相同」とは宿主微生物に由来する分子量又は活性に関する。したがって、本発明のコード核酸の外来性発現は、異種性若しくは相同のいずれか又は両方のコード核酸を利用できる。
【００４９】
本発明の非天然存在型微生物は、安定な遺伝的変更を含むことができ、これは当該変更の欠失なしに5世代を超えて培養できる微生物をいう。通常、安定な遺伝的変更には、10世代を超えて持続する修飾を含み、特に安定な修飾は約25世代を超えて持続し、より具体的には、安定な遺伝的修飾は50世代（無制限を含む）を超える。
【００５０】
当業者は、本明細書に例証される代謝修飾を含む遺伝的変更が、大腸菌などの適切な宿主生物又はそれらの対応する代謝反応、又は所望の代謝経路のための遺伝子などの所望の遺伝物質のための適切な供給源微生物に関して記載されることを理解するであろう。しかしながら、多種多様な生物の完全なゲノム配列及び遺伝学領域におけるハイレベルの技術を与えられた場合、当業者は、基本的に他の全ての微生物に対して本明細書に提供される教示及びガイダンスを容易に適用し得るであろう。例えば、本明細書に例証した大腸菌の代謝的変更は、当該基準種以外の種からの同じ若しくは類似したコード核酸を組み込むことにより、他の種に容易に適用できる。当該遺伝的変更には、例えば、一般的には種ホモログの遺伝的変更、特に、オルソログ、パラログ又は非オルソロガス遺伝子置換を含む。
【００５１】
オルソログは、垂直系統に関連し、異なる微生物において実質的に同じ若しくは同一の機能の原因となる遺伝子である。例えば、マウスエポキシド加水分解酵素及びヒトエポキシド加水分解酵素は、エポキシドの加水分解の生物学的機能のためのオルソログとみなすことが可能である。遺伝子は、例えばそれらが相同である、又は共通祖先から進化により関連することを示すのに十分な量の配列類似性を共有する場合、垂直系統により関連する。遺伝子は、それらが共通祖先から進化したことを示すのに十分な量の三次元構造を共有するが、必ずしも当該一次配列類似性が同定可能でない程度まで配列類似性を共有しない場合、オルソログとみなすこともできる。オルソログ的遺伝子は、約25%〜100%アミノ酸配列同一性の配列類似性を有するタンパク質をコードすることができる。25%未満のアミノ酸類似性を共有するタンパク質をコードする遺伝子は、それらの三次元構造も類似性を示す場合、垂直系統により生じたとみなすこともできる。組織プラスミノーゲンアクチベータ及びエラスターゼを含むセリンプロテアーゼファミリー酵素のメンバーは、共通祖先から垂直系統により生じたものとみなされる。
【００５２】
オルソログには遺伝子又はそれらのコードされた遺伝子産物を含み、これは例えば進化を介して、構造又は全体的活性において分岐する。例えば、ある種が2つの機能を呈する遺伝子産物をコードする場合、及び当該機能が第2の種において異なる遺伝子に分離した場合、該3つの遺伝子及びそれらの対応する生成物はオルソログであるとみなされる。生化学的産物の生産のために、当業者は、導入又は破壊される代謝活性を有するオルソロガス遺伝子が非天然存在型微生物の構築物のために選択されることを理解するであろう。単離可能な活性を呈するオルソログの例は、異なる活性が、2種以上の、又は単一種内の異なる遺伝子産物に分離される場合である。具体例は、エラスターゼタンパク質分解及びプラスミノーゲンタンパク質分解（2種類のセリンプロテアーゼ活性）の異なった分子へのプラスミノーゲンアクチベータ及びエラスターゼとしての分離である。第2の例は、マイコプラズマ5'-3'エキソヌクレアーゼ、及びショウジョウバエDNAポリメラーゼIII活性の分離である。第1の種からのDNAポリメラーゼは、第2の種からのエキソヌクレアーゼ又はポリメラーゼのいずれか又は両方に対するオルソログとみなすことができ、逆もまた同じである。
【００５３】
対照的に、パラログは、例えば、複製とそれに続く進化的分岐に関連するホモログであり、類似又は共通であるが同一でない機能を有する。パラログは、例えば、同種から若しくは異種から生じ、又は由来し得る。例えば、ミクロソームのエポキシド加水分解酵素（エポキシド加水分解酵素I）及び可溶性エポキシド加水分解酵素（エポキシド加水分解酵素II）はパラログとみなすことができる。なぜならこれらは、異なった反応を触媒し、該同種において異なる機能を有する共通祖先から共進化した2つの異なる酵素を表すからである。パラログは、互いに顕著な配列類似性を有する同種由来のタンパク質であり、これはそれらが相同であり、又は共通祖先からの共進化を介して関連することを示唆する。パラロガスタンパク質ファミリーの群には、HipAホモログ、ルシフェラーゼ遺伝子、ペプチダーゼ、その他を含む。
【００５４】
非オルソロガス遺伝子置換は、1つの種からの非オルソロガス遺伝子であり、これは異なる種の基準遺伝子機能と置換し得る。置換には、例えば、異なる種の基準機能と比較して、起源の種において実質的に同じ又は類似の機能を果たし得るものを含む。通常、非オルソロガス遺伝子置換は、当該基準機能をコードする公知の遺伝子に構造的に関連するものとして同定可能であるが、より構造的に関連が低いものの機能的に類似する遺伝子及びそれらの対応する遺伝子産物は、それでもなお本明細書に使用される用語の意味の範囲内である。機能的類似性は、例えば、置換しようとする機能をコードする遺伝子と比較して、非オルソロガス遺伝子産物の結合領域又は活性部位において少なくとも若干の構造類似性を必要とする。従って、非オルソロガス遺伝子には、例えば、パラログ又は無関係な遺伝子を含む。
【００５５】
従って、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生合成能力を有する本発明の非天然存在型微生物を同定すること及び構築することにおいて、当業者は、本明細書に提供される教示及びガイダンスを、代謝修飾の同定がオルソログの同定及び封入又は不活化を含み得る特定の種に適用することと共に理解するであろう。パラログ及び／又は非オルソロガス遺伝子置換が、類似若しくは実質的に類似の代謝反応を触媒する酵素をコードする基準微生物に存在する程度まで、当業者はこれらの進化的に関連する遺伝子を使用することもできる。
【００５６】
オルソログ、パラログ及び非オルソロガス遺伝子置換は、当業者に公知の方法により決定できる。例えば、2つのポリペプチドの核酸又はアミノ酸配列の検査は、比較された配列間の配列同一性及び類似性を明らかにするであろう。当該類似性に基づいて、当業者は、類似性が十分に高い場合、該タンパク質が共通祖先から進化を介して関連することを示すことを決定できる。Align、BLAST、Clustal W、その他などの当業者に公知のアルゴリズムは、生の配列類似性又は同一性を比較して決定し、更に重み又はスコアを割り当てることができる配列のギャップの存在又は重要性を決定する。当該アルゴリズムも当業者に公知であり、ヌクレオチド配列の類似性又は同一性を決定するのに同様に適用できる。相関性を決定するのに十分な類似性のパラメータは統計類似性を算出するための周知の方法、又はランダムポリペプチドにおける類似のマッチを見出す可能性、及び決定されたマッチの有意性に基づいて計算される。2以上の配列のコンピュータ比較は、必要に応じて、当業者によって視覚的に最適化されることもできる。関連する遺伝子産物又はタンパク質は、高い類似性、例えば、25%〜100%の配列同一性を有すると予測できる。無関係であるタンパク質は、十分なサイズのデータベースがスキャンされる（約5%）場合、基本的に偶然生じることが予測されるのと同じ同一性を有し得る。5%〜24%の配列は、当該比較された配列が関連すると結論づけるための十分な相同性を表すことができ、又は表すことができない。データセットのサイズを与える当該マッチの有意性を決定するためのさらなる統計解析を実行して、これらの配列の関連性を決定することができる。
【００５７】
BLASTアルゴリズムを使用する2以上の配列の相関性を決定するための例示的なパラメータは、例えば、先に記載したものであり得る。簡潔にいうと、アミノ酸配列整列は、BLASTPバージョン2.0.8（1999年1月5日）及び以下のパラメータを使用して実施できる：マトリクス: 0 BLOSUM62; ギャップオープン: 11; ギャップエクステンション: 1; x_ドロップオフ: 50; 期待値: 10.0; 文字サイズ: 3; フィルタ: オン。核酸配列整列は、BLASTNバージョン2.0.6（1998年9月16日）及び以下のパラメータを使用して実施できる：マッチ: 1; ミスマッチ: -2; ギャップオープン: 5; ギャップエクステンション: 2; x_ドロップオフ: 50; 期待値: 10.0; 文字サイズ: 11; フィルタ:オフ。当業者は、どの修飾が、当該比較の厳密性を増加又は減少させるために上記パラメータに導入できるかを知っており、例えば、2以上の配列の相関性を決定するであろう。
【００５８】
大腸菌（Escherichia coli）は、よく研究された利用可能な遺伝的ツールのセットを有する一般的微生物である。合成ガスを、細胞質量成分及び多くの価値ある生成物が由来し得る中心的代謝産物であるアセチル-CoAに変換する能力を、大腸菌などの外来宿主に導入操作することは、ウッド-リュングダール経路の様々なタンパク質をコードする外来性遺伝子の発現後に達成できる。この経路は、ムーレラ・サーモアセチカ（以前には、クロストリジウム・サーモアセチカム（Clostridium thermoaceticum））などの酢酸産生微生物において活性であり、1942年のその単離以来、ウッド-リュングダール経路を解明するためのモデル微生物であった(Fontaineらの文献 J Bacteriol. 43:701-715 (1942))。ウッド-リュングダール経路は、2本の支線を含む：図2Aに示すように、CO2のメチルテトラヒドロ葉酸（Me-THF）への変換を可能するイースタン（又はメチル）支線、及びメチル-THF、CO及び補酵素Aのアセチル-CoAへの変換を可能にするウエスタン（又はカルボニル）支線。いくつかの実施態様において、本発明は、MtaABC型メチルトランスフェラーゼ系と連動するウッド-リュングダール経路のカルボニル支線を触媒する酵素をコードする遺伝子を発現する非天然存在型微生物を提供する。当該生物は、比較的廉価な有機原料であり、合成ガス、及びCO、CO2及び／又はH2を含むガスから誘導し得るメタノールを、アセチル-CoA、細胞質量及び生成物へと変換することができる。
【００５９】
いくつかの実施態様において、本発明の微生物は、図2Bに図示するように、以下の能力を有する：1）メタノール及びTHFからの5-メチルテトラヒドロ葉酸（Me-THF）の産生を可能にする機能的なメチルトランスフェラーゼ系、2）CO、補酵素 A、及びMe-THFのメチル基を組み合わせてアセチル-CoAを形成する能力、及び3）アセチル-CoAからIPAを合成する能力。他の実施態様において、本発明の生物は、図2 Cにて図示するように、機能的なメチルトランスフェラーゼ系、アセチル-CoAを合成する能力、及びアセチル-CoAから4-HBを合成する能力を有する。本明細書に記載されているさらに他の生物は、図2Dに図示される、機能的なメチルトランスフェラーゼ系、アセチル-CoAを合成する能力、及びアセチル-CoAからBDOを合成する能力を有する。
【００６０】
いくつかの実施態様において、本発明の生物は、外来性CO及び／又はCO2及びメタノールから炭素を「固定」して、アセチル-CoA、細胞質量及び生成物を合成することができる。合成ガスの酢酸への直接的変換は、エネルギー的に中立のプロセスである（図1及び2Aを参照）。具体的には、1つのATP分子はホルミル-THFシンターゼによりホルミル-THFの形成の間に消費され、1つのATP分子は酢酸キナーゼを介して酢酸の産生の間に産生される。ATPの消費は、メチル分枝生成物（メチル-THF）上のメチル基がCO2よりもむしろメタノールから得られることを保証することにより回避される。このことにより、これは、酢酸形成が細胞増殖及び維持を支持するのを助けることができる陽性ATP収率を有することを保証する。補充反応（anapleurosis）の能力も天然に有するこれらの能力により操作される宿主生物（例えば、大腸菌）は、硝酸などの適切な外部電子受容体の存在下で、メタノール及び合成ガスにより生成されたアセチル-CoAで増殖できる。この電子受容体は、コハク酸脱水素酵素を介して形成される還元キノンから電子を受け入れるために使用される。外部の電子受容体を加えることの1つの利点は、細胞増殖、維持、及び生成物形成のためのさらなるエネルギーがアセチル-CoAの呼吸から産生できることである。他の実施態様において、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（PFOR）酵素は、当該種に挿入され、外部電子受容体の不在下でバイオマス前駆体の合成を提供することができる。本発明の微生物の更なる特徴は、還元等価物を分子水素から抽出する能力である。これは、高収率の還元生成物、例えばエタノール、ブタノール、イソブタノール、イソプロパノール、1,4-ブタンジオール、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、4-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシプロピオン酸、乳酸、アジピン酸、3-ヒドロキシイソ酪酸、2-ヒドロキシイソブチル酸、メタクリル酸、及びアクリル酸を可能にする。
【００６１】
本発明の生物は、以下のものから、アセチル-CoA、細胞質量、及び目的とする化学物質、より具体的にはIPA、4-HB又はBDOを産生し得る：1）メタノール及びCO、2）メタノール、CO2、及びH2、3）メタノール、CO、CO2、及びH2、4）メタノール、並びにCO及びH2を含む合成ガス、及び5）メタノール、並びにCO、CO2及びH2を含む合成ガス。
【００６２】
成功裏に経路を生物に導入操作することには、適当なセットの酵素を同定すること、それらの対応する遺伝子を生産宿主にクローニングすること、これらの遺伝子の安定性及び発現を最適化すること、発酵条件を最適化すること、及び発酵後の生成物形成をアッセイすることを含む。多くの酵素は、合成ガス及びメタノールのアセチル-CoAへの、及び更にイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールへの変換のための経路の各ステップを触媒する。合成ガス及びメタノールの利用のために生産宿主を操作するため、当該酵素をコードする1以上の外来性DNA塩基配列を微生物において発現できる。
【００６３】
いくつかの実施態様において、本発明は、イソプロパノールを産生するのに十分な量で発現されるイソプロパノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む、イソプロパノール経路を有する非天然存在型微生物を提供する。イソプロパノール経路酵素には、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、アセトアセチル-CoA：酢酸：CoAトランスフェラーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを含む。本発明のさらなるイソプロパノール経路には、スクシニル-CoA：3-ケト酸-CoAトランスフェラーゼ（SCOT）、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを含む。
【００６４】
当該生物には、コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄-硫黄タンパク質、ニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質、フェレドキシン、アセチル-CoAシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、及びヒドロゲナーゼなどの少なくとも1つの酵素又はポリペプチドを含むこともできる。
【００６５】
いくつかの実施態様において、イソプロパノール経路を有する生物は、メタノールメチルトランスフェラーゼを有する。当該実施態様において、該生物は、1）メタノール及びCO、2）メタノール、CO2、及びH2、3）メタノール、CO、CO2、及びH2、4）メタノール、並びにCO及びH2を含む合成ガス、及び5）メタノール、並びにCO、CO2及びH2を含む合成ガス；などの原料を利用する。
【００６６】
他の実施態様において、本発明の生物は、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、及びメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼを有する。当該生物は、以下からなる群から選択される原料を利用する：1）CO、2）CO2及びH2、3) CO及びCO2、4）CO及びH2を含む合成ガス、及び5）CO、CO2及びH2を含む合成ガス。
【００６７】
また、本発明は、4-ヒドロキシ酪酸を産生するのに十分な量で発現される4-ヒドロキシ酪酸経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む、4-ヒドロキシ酪酸経路を有する非天然存在型微生物を提供する。4-ヒドロキシ酪酸経路酵素には、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル-CoAヒドラターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ、ホスホトランス-4-ヒドロキシブチリラーゼ、及び4-ヒドロキシ酪酸キナーゼを含む。
【００６８】
当該生物には、コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄-硫黄タンパク質、ニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質、フェレドキシン、アセチル-CoAシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、及びヒドロゲナーゼなどの少なくとも1つの酵素又はポリペプチドを含むこともできる。
【００６９】
いくつかの実施態様において、4-ヒドロキシ酪酸経路を有する生物は、メタノールメチルトランスフェラーゼを含み得る。当該生物は、以下のものなどの原料を利用する：1）メタノール及びCO、2）メタノール、CO2、及びH2、3）メタノール、CO、CO2、及びH2、4）メタノール、並びにCO及びH2を含む合成ガス、及び5）メタノール、並びにCO、CO2及びH2を含む合成ガス。
【００７０】
4-ヒドロキシ酪酸経路を有する他の生物は、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、及びメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼを有し得る。当該生物は、以下のものなどの原料を利用する：1）CO、2）CO2及びH2、3 )CO及びCO2、4）CO及びH2を含む合成ガス、及び5）CO、CO2及びH2を含む合成ガス。
【００７１】
また、本発明は、1,4-ブタンジオールを産生するのに十分な量で発現される1,4-ブタンジオール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む、1,4-ブタンジオール経路を有する非天然存在型微生物を提供する。1,4-ブタンジオール経路酵素には、例えば、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル-CoAヒドラターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルコール形成）、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ（アルデヒド形成）、及び1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼを含む。
【００７２】
当該生物は、コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄-硫黄タンパク質、ニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質、フェレドキシン、アセチル-CoAシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、及びヒドロゲナーゼなどの少なくとも1つの酵素又はポリペプチドも含み得る。
【００７３】
いくつかの実施態様において、1,4-ブタンジオール経路を有する生物は、メタノールメチルトランスフェラーゼを含み得る。当該生物は、以下のものなどの原料を利用する：1）メタノール及びCO、2）メタノール、CO2、及びH2、3）メタノール、CO、CO2、及びH2、4）メタノール、並びにCO及びH2を含む合成ガス、及び5）メタノール、並びにCO、CO2及びH2を含む合成ガス。
【００７４】
他の実施態様において、1,4-ブタンジオール経路を有する生物には、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、及びメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼを含み得る。当該生物は、以下からなる群から選択される原料を利用する：1）CO、2）CO2及びH2、3 )CO及びCO2、4）CO及びH2を含む合成ガス、及び5）CO、CO2及びH2を含む合成ガス。
【００７５】
また、本明細書に開示するのは、アセチル-CoAを産生するのに十分な量で発現されるアセチル-CoA経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む、アセチル-CoA経路を有する非天然存在型微生物である。アセチル-CoA経路酵素には、メタノールメチルトランスフェラーゼ、及びアセチル-CoAシンターゼを含む。
【００７６】
なお更なる実施態様において、本発明は、イソプロパノールを産生するのに十分な量で発現されるイソプロパノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む、イソプロパノール経路を有する非天然存在型微生物を提供し、前記イソプロパノール経路酵素には、メタノールメチルトランスフェラーゼ、コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄-硫黄タンパク質、ニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質、フェレドキシン、アセチル-CoAシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、及びヒドロゲナーゼを含む。
【００７７】
いくつかの実施態様において、当該生物には、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、アセトアセチル-CoA：酢酸：CoAトランスフェラーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼなどの外来性ポリペプチド又は酵素を含み得る。さらなる実施態様において、当該生物には、スクシニル-CoA：3-ケト酸-CoAトランスフェラーゼ（SCOT）、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼなどの外来性ポリペプチド又は酵素を含み得る。
【００７８】
外来宿主における改変ウッド-リュングダール経路の発現（図2Bを参照）は、メタノール及びCO及び／又はCO2により提供される炭素により提供される炭素及び水素を利用するためにメチルトランスフェラーゼのセットを必要とする。3つのメチルトランスフェラーゼタンパク質、すなわちMtaA、MtaB及びMtaCの複合体は、所望のメタノールメチルトランスフェラーゼ活性を実行する(Naidu及びRagsdaleの文献, J Bacteriol. 183:3276-3281 (2001); Ragsdale, S. W. の文献, Crit Rev.Biochem.Mol.Biol 39:165-195 (2004); Sauerらの文献, Eur.J Biochem. 243:670-677 (1997); Tallant及びKrzyckiの文献, J Bacteriol. 178: 1295-1301 (1996); Tallant及びKrzyckiの文献, J Bacteriol. 179:6902-6911 (1997); Tallantらの文献, J Biol Chem. 276:4485-4493 (2001))。
【００７９】
MtaBは、メタノールからMtaC（コリノイドタンパク質）へのメチル基の転移を触媒する亜鉛タンパク質である。MtaB及びMtaCをコードする例示的な遺伝子は、メタノサルシーナ・バルケリ（Methanosarcina barkeri）(Maederらの文献, J Bacteriol. 188:7922-7931 (2006))及びメタノサルシーナ・アセチボランス（Methanosarcina acetivorans）(Galaganらの文献, Genome Res 12:532-542 (2002))などのメタン産生古細菌、並びに酢酸産生菌であるムーレラ・サーモアセチカ(Dasらの文献, Proteins 67:167-176 (2007))に見出すことができる。一般に、MtaB及びMtaC遺伝子は、それらの活性が密接に相互依存的であるので、染色体上で互いに隣接する。M.バルケリ、M.アセチボランス及びM.サーモアセチカムにおける様々なMtaB及びMtaCコード遺伝子のタンパク質配列は、それらの以下のGenBankアクセッション番号により同定できる。
【００８０】
【表１】
2012511928.tif 000003
【００８１】
M.バルケリ由来のMtaB1及びMtaC1遺伝子（YP_304299及びYP_304298）は、大腸菌にクローン化され、配列決定された（Sauerらの文献, Eur. J Biochem. 243:670-677 (1997)）。このメタノール-コバラミンメチルトランスフェラーゼ複合体の結晶構造も利用できる（Hagemeierらの文献,. Proc Natl Acad Sci U S.A 103: 18917-18922 (2006))。M.バルケリのMtaB遺伝子（YP_307082及びYP_304612）は、YP_304299に対する配列相同性により同定された。一般に、相同性検索は、メタノールメチルトランスフェラーゼを同定する有効な手段である。MtaBコード遺伝子は、トリメチルアミン、ジメチルアミン、モノメチルアミン、又はジメチルスルフィドなどの代替的基質に作用するメチルトランスフェラーゼにほとんど又は全く類似性を示さないからである。MtaC遺伝子（YP_307081及びYP_304611）は、MtaB遺伝子に対する近接性、及びYP_304298に対する相同性にも基づいて同定された。M.アセチボランス由来のMtaB及びMtaC遺伝子の3つのセットは、遺伝的に、生理的に、及び生化学的に特徴づけられた（Pritchett及びMetcalfの文献, Mol.Microbiol 56: 1183-1194 (2005))。該セットの2つを欠失した突然変異株はメタノールで増殖することが可能であったが、MtaB及びMtaC遺伝子セットの3つのセット全てを欠失した株はメタノールで増殖できなかった。これは、遺伝子の各組がメタノール利用化に役割を果たすことを示す。M.サーモアセチカ MtaB遺伝子は、メタン産生MtaB遺伝子に対する相同性、及びさらにメタノール誘導性コリノイドタンパク質であるMtaCに対する隣接染色体近接性に基づいて同定され、これは結晶化され(Zhouらの文献. Acta Crystallogr. Sect.F Struct.Biol Cryst.Commun. 61:537-540 (2005))、さらにノーザンハイブリダイゼーション及びウエスタンブロッティングにより特徴づけられた(Dasらの文献, Proteins 67:167-176 (2007)。
【００８２】
MtaAは、MtaCからメタン産生菌の補酵素 M又は酢酸産生菌のメチルテトラヒドロ葉酸のいずれかへのメチル基の転移を触媒する亜鉛タンパク質である。MtaAは、メチルドナーとしてメチルコバラミンを利用することもできる。MtaAをコードする例示的な遺伝子は、メタノサルシーナ・バルケリ(Maederらの文献, J Bacteriol. 188:7922-7931 (2006))及びメタノサルシーナ・アセチボランス(Galaganらの文献, Genome Res 12:532-542 (2002))などのメタン産生古細菌、並びに酢酸産生菌であるムーレラ・サーモアセチカ(Dasらの文献, Proteins 67: 167-176 (2007))に見出すことができる。一般に、CH3-MtaCからのメチル基の転移を触媒するMtaAタンパク質は、他のコリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼに類似性を共有するが、染色体上でMtaB及びMtaC遺伝子に隣接して配向しないので、生物情報学的に同定することが困難である。それにもかかわらず、多くのMtaAコード遺伝子が特徴づけられている。M.バルケリ及びM.アセチボランスにおけるこれらの遺伝子のタンパク質配列は、以下のGenBankアクセッション番号により同定できる。
【００８３】
【表２】
2012511928.tif 000004
【００８４】
M.バルケリ由来のMtaA遺伝子（YP_304602）をクローン化して配列決定し、大腸菌において機能的に過剰発現させた（Harms及びThauerの文献, Eur. J Biochem. 235:653-659 (1996)）。M.アセチボランスにおいて、MtaA1はメタノールでの増殖のために要求されるが、MtaA2は、たとえメタノールからのメタン産生がMtaA2変異体において減少していても、重要でない（Boseらの文献, J Bacteriol. 190:4017-4026 (2008))。M.バルケリ及びM アセチボランスにおいて、未だ特徴付けされていないが、コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ活性も触媒し得る、複数のさらなるMtaAホモログが存在する。
【００８５】
M.サーモアセチカにおける推定MtaAコード遺伝子は、特徴づけられたメタン産生MtaA遺伝子に対するその配列類似性により同定された。具体的には、3つのM.サーモアセチカ遺伝子は、M.バルケリ由来のYP_304602に高い相同性（30%超の配列同一性）を示す。CH3-MtaCから補酵素 Mへのメチル基の転移を天然に触媒するメタン産生MtaAタンパク質とは異なり、M.サーモアセチカ MtaAは、メタン産生菌及び酢酸産生菌においてそれぞれ、メチルテトラヒドロ葉酸及び補酵素 Mの類似の役割を与えられるメチルテトラヒドロ葉酸にメチル基を転移するようである。M.サーモアセチカ由来の推定MtaAコード遺伝子のタンパク質配列は、以下のGenBankアクセッション番号により同定できる。
【００８６】
【表３】
2012511928.tif 000005
【００８７】
ACS/CODHは、ウッド-リュングダール経路のカルボニル支線の中心的酵素である。これは、二酸化炭素の一酸化炭素への可逆的還元を触媒し、一酸化炭素、補酵素 A、及びメチル化されたコリノイド-鉄-硫黄タンパク質由来メチル基からのアセチル-CoAの合成も触媒する。コリノイド-鉄-硫黄タンパク質は、メチルトランスフェラーゼを介してメチルテトラヒドロ葉酸によりメチル化される。外来宿主におけるACS/CODHの発現は、以下のタンパク質及びそれらの対応する活性の1以上を導入することによりなし得る：メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（AcsE）、コリノイド鉄-硫黄タンパク質（AcsD）、ニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質（AcsF）、フェレドキシン（Orf7）、アセチル-CoAシンターゼ（AcsB及びAcsC）、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（AcsA）又はニッケル-タンパク質アセンブリタンパク質（CooC）。
【００８８】
一酸化炭素デヒドロゲナーゼ/アセチル-CoAシンターゼ活性のために使用される遺伝子は、典型的には、天然のゲノムの限られた領域に存在し、これは拡張したオペロンであり得る（Mortonらの文献, J Biol Chem. 266:23824-23828 (1991); Ragsdale, S. W.の文献, Crit Rev.Biochem.Mol.Biol 39:165-195 (2004); Robertsらの文献, Proc Natl Acad Sci U S.A 86:32-36 (1989)）。酢酸産生菌（M.サーモアセチカ）由来の当該オペロンにおける各々の遺伝子は、既にクローン化し、大腸菌において活発に発現した（Luらの文献, J Biol Chem. 268:5605-5614 (1993); Robertsらの文献, Proc Natl Acad Sci U S.A 86:32-36 (1989)）。これらの遺伝子のタンパク質配列は、以下のGenBankアクセッション番号により同定できる。
【００８９】
【表４】
2012511928.tif 000006
【００９０】
水素産生（hydrogenogenic）細菌であるカルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォーマンス（Carboxydothermus hydrogenoformans）は、アセチル-CoAシンターゼによる増殖基質として、一酸化炭素を利用できる（Wuらの文献, PLoS Genet. 1 :e65 (1995)）。Z-2901株において、アセチル-CoAシンターゼ酵素複合体は、フレームシフト突然変異に起因する一酸化炭素デヒドロゲナーゼを欠失し（Wuらの文献, PLoS Genet. 1:e65 (1995)）、DSM 6008株において、このタンパク質の機能的な非フレームシフトの全長バージョンが精製された（Svetlitchnyiらの文献, Proc Natl Acad Sci U S.A 101 :446-451 (2004)）。Z-2901株由来のC.ハイドロゲノフォーマンス遺伝子のタンパク質配列は、以下のGenBankアクセッション番号により同定される。カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォーマンス DSM 6008のための配列は、一般公開されているデータベースにおいて未だアクセス可能でない。
【００９１】
【表５】
2012511928.tif 000007
【００９２】
メタン産生古細菌であるメタノサルシーナ・アセチボランスは、一酸化炭素で増殖でき、アセチル-CoAシンターゼ/一酸化炭素デヒドロゲナーゼ活性を呈し、酢酸及びギ酸の両方を生産できる（Lessnerらの文献, Proc Natl Acad Sci U S.A 103: 17921-17926 (2006))。この生物は、ACS/CODH活性をコードする2セットの遺伝子を含む（Rother及びMetcalfの文献 Proc Natl Acad Sci U S.A 101:16929-16934 (2004)）。M.アセチボランス遺伝子の両セットのタンパク質配列は、以下のGenBankアクセッション番号により同定できる。
【００９３】
【表６】
2012511928.tif 000008
【００９４】
AcsC、AcsD、AcsB、AcsEps及びAcsAタンパク質は、一般にメタン産生CODH/ACSのγ、δ、β、ε及びαサブユニットと呼ばれる。εをコードする遺伝子に対するホモログは、M.サーモアセチカなどの酢酸産生菌又はC.ハイドロゲノフォーマンスなどの水素産生細菌には存在しない。M.アセチボランスにおける2つの活性CODH/ACSオペロンの存在についての仮説には、炭素栄養性（carboxidotrophic）若しくは酢酸利用性の増殖、又は様々な刺激がCODH/ACS発現を誘導することを可能にする差動的遺伝子制御を支持する触媒特性（すなわち、Km、Vmax、kcat）を含む（Rotherらの文献, Arch.Microbiol 188:463-472 (2007)）。
【００９５】
M.サーモアセチカ及びC.ハイドロゲノフォーマンスの両方において、さらなるCODHコード遺伝子は、ACS/CODHオペロンの外に位置する。これらの酵素は、一酸化炭素から二酸化炭素への変換から電子（又は還元等価物）を抽出する手段を提供する。還元等価物は、それから、酸化フェレドキシン、NADP+、水又は過酸化水素など受容体に受け渡され、それぞれ、還元フェレドキシン、NADPH、H2又は水を形成する。場合によっては、ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、CODHに隣接して位置する。ロドスピリルム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum）において、コードされたCODH/ヒドロゲナーゼタンパク質は、エネルギーが、陽子勾配の形態で、COからCO2及びH2への変換から産生される部位であると提唱される膜結合酵素複合体を形成する（Foxらの文献, J Bacteriol. 178:6200-6208 (1996))。C.ハイドロゲノフォーマンスのCODH-I及びその隣接遺伝子は、R.ルブラムのCODH/ヒドロゲナーゼ遺伝子クラスターに対するそれらの類似性に基づく類似の機能的役割を触媒することが提唱された（Wuらの文献, PLoS Genet. 1:e65 (2005)）。C.ハイドロゲノフォーマンス CODH-Iは、電極に連結される場合、強いCO酸化及びCO2還元活性を呈することも示された（Parkinらの文献, J Am.Chem.Soc. 129:10328-10329 (2007))。C.ハイドロゲノフォーマンス CODH-II及びCooFをコードする遺伝子（隣接タンパク質）をクローン化し、配列決定した（Gonzalez及びRobbの文献, FEMS Microbiol Lett. 191:243-247 (2000))。結果として生じた複合体は膜結合型であった。但し、CODH-IIの細胞質画分はNADPHの形成を触媒することを示し、これは同化作用的役割を示唆するものであった（Svetlitchnyiらの文献, J Bacteriol. 183:5134-5144 (2001))。CODH-IIの結晶構造も利用できる（Dobbekらの文献, Science 293:1281-1285 (2001)）。例示的なCODH及びヒドロゲナーゼ遺伝子のタンパク質配列は、以下のGenBankアクセッション番号により同定できる。
【００９６】
【表７】
2012511928.tif 000009
【００９７】
外部電子受容体の不在下における合成ガス及びメタノールでの嫌気性増殖は、宿主生物に、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（PFOR）を介してピルビン酸合成を提供することによるMTR及びACS/CODH活性を与える。デスルホビブリオ・アフリカヌス（Desulfovibrio africanus）由来のPFORは、活性な組換え酵素を生じる大腸菌においてクローン化して発現させ、これは酸素の存在下、数日間安定であった（Pieulleらの文献, J Bacteriol. 179:5684-5692 (1997))。酸素安定性は、PFORにおいて比較的まれであり、D.アフリカヌス酵素のポリペプチド鎖における60残基の伸長により与えられることが報告される。M.サーモアセチカのPFORもよく特徴づけられており（Menon及びRagsdaleの文献, Biochemistry 36:8484-8494 (1997)）、独立栄養増殖の間、ピルビン酸合成の方向に高い活性を有することが示された（Furdui及びRagsdaleの文献, J Biol Chem. 275:28494-28499 (2000)）。更に、大腸菌は、M.サーモアセチカのPFORに51%同一であるタンパク質をコードする特徴付けられていないオープンリーディングフレームであるydbKを有する。大腸菌におけるピルビン酸オキシドレダクターゼ活性の証拠は記載されていた（Blaschkowskiらの文献, Eur.J Biochem. 123:563-569 (1982)）。これらの例示的なPFOR酵素のタンパク質配列は、下記表8に示される以下のGenBankアクセッション番号により同定される。いくつかのさらなるPFOR酵素は、Ragsdale. S. W.の文献, Chem.Rev. 103:2333-2346 (2003)に記載されている。
【００９８】
【表８】
2012511928.tif 000010
【００９９】
CO及びMeOHのアセチル-CoA又は酢酸への酸化還元中立的変換とは異なり、可能性のある最も高い収率でのより高度に還元された産物、例えばエタノール、ブタノール、イソブタノール、イソプロパノール、1,4-ブタンジオール、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、4-ヒドロキシ酪酸、3-ヒドロキシプロピオン酸、乳酸、アジピン酸、3-ヒドロキシイソブチル酸、2-ヒドロキシイソブチル酸、メタクリル酸及びアクリル酸の生産は、CO及びH2両方からのさらなる還元等価物の抽出を要する（例えば、図2Aのエタノール形成を参照されたい。）。具体的には、還元等価物（例えば、図2における2[H]）は、一酸化炭素デヒドロゲナーゼを介したCO及び水のCO2への変換により得られ、又はH2からの電子をフェレドキシン、フラボドキシン、FAD+、NAD+又はNADP+などの受容体に転移する水素利用型ヒドロゲナーゼの活性から直接的に得られる。
【０１００】
大腸菌及び他の腸内細菌固有であるのは、最高4つのヒドロゲナーゼをコードする同義遺伝子である（Sawers, G. の文献, Antonie Van Leeuwenhoek 66:57-88 (1994); Sawersらの文献, J Bacteriol. 164: 1324-1331 (1985); Sawers及びBoxerの文献, Eur.J Biochem. 156:265-275 (1986); Sawersらの文献, J Bacteriol. 168:398-404 (1986))。酵素活性の多重度が与えられた場合、大腸菌又は別の宿主生物は、入って来る分子水素を開裂し、対応する受容体を還元するために十分なヒドロゲナーゼ活性を提供できる。大腸菌の内在性ハイドロゲンリアーゼ酵素のうち、ヒドロゲナーゼ3は受容体としてフェレドキシンを使用する膜結合酵素複合体であり、ヒドロゲナーゼ4もフェレドキシン受容体を使用する。ヒドロゲナーゼ3及び4は、それぞれ、hyc及びhyf遺伝子クラスターによりコードされる。大腸菌のヒドロゲナーゼ活性は、hyp遺伝子の発現にも依存し、その対応するタンパク質はヒドロゲナーゼ複合体の構築に関与する（Jacobiらの文献, Arch .Microbiol 158:444-451 (1992); Rangarajanらの文献, J Bacteriol. 190:1447-1458 (2008))。M.サーモアセチカのヒドロゲナーゼは、十分な内在性ヒドロゲナーゼ活性を欠失した宿主に適する。M.サーモアセチカは、還元等価物がウッド-リュングダール経路を介してアセチル-CoA合成を可能にするためにH2から抽出されることを示す排他的炭素源としてのCO2により増殖できる（Drake H. L.の文献, J Bacteriol. 150:702-709 (1982); Drake及びDanielの文献, Res Microbiol 155:869-883 (2004); Kellum及びDrakeの文献, J Bacteriol. 160:466-469 (1984)) (図2Aを参照されたい。)。M.サーモアセチカは、大腸菌由来のいくつかのhyp、hyc及びhyf遺伝子にホモログを有する。これらの遺伝子によりコードされるこれらのタンパク質配列は、以下のGenBankアクセッション番号により同定される。加えて、ヒドロゲナーゼ官能性をコードするいくつかの遺伝子クラスターがM.サーモアセチカに存在し、それらの対応するタンパク質配列は以下の表9においても提供されている。
【０１０１】
【表９】
2012511928.tif 000011
【０１０２】
当該遺伝子が大腸菌hyp遺伝子に相同であるM.サーモアセチカのタンパク質は、以下の表10において示される。ヒドロゲナーゼ3タンパク質は、表11に収載される。ヒドロゲナーゼ4タンパク質は、表12に示される。
【表１０】
2012511928.tif 000012
【表１１】
2012511928.tif 000013
【表１２】
2012511928.tif 000014
【０１０３】
当該遺伝子が大腸菌のhyc及び／又はhyf遺伝子に相同であるM.サーモアセチカのタンパク質は、以下の表13に示される。M.サーモアセチカにおいてさらにヒドロゲナーゼをコードする遺伝子クラスターは、表14に示される。
【表１３】
2012511928.tif 000015
【表１４】
2012511928.tif 000016
【０１０４】
イソプロパノール生産は、アセトアセチル-CoA：酢酸：CoAトランスフェラーゼ活性をコードする天然のatoA 及びatoD遺伝子の発現増加を伴う、C.アセトブチリカム（C. acetobutylicum）由来の2つの異種遺伝子（それぞれ、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、及びアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードするthl及びadc）及びC.ベイジェリンキイ（C. beijerinckii）由来の1つ（二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードするadh）の発現の後、組換え大腸菌において達成される（Hanaiらの文献, Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007)）。
【０１０５】
アセトアセチル-CoAチオラーゼは、2分子のアセチル-CoAを各1分子のアセトアセチル-CoA及びCoAへと変換する。例示的なアセトアセチル-CoAチオラーゼ酵素には、大腸菌由来のatoB(Martinらの文献, Nat.Biotechnol 21 :796-802 (2003))、C.アセトブチリカム由来のthlA及びthlB(Hanaiらの文献, Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007); Winzerらの文献, J.Mol.Microbiol Biotechnol 2:531-541 (2000))、及び出芽酵母（S. cerevisiae）由来ERG10（Hiserらの文献, J.Biol.Chem. 269:31383-31389 (1994))の遺伝子産物を含む。
【０１０６】
【表１５】
2012511928.tif 000017
アセトアセチル-CoA：酢酸：CoAトランスフェラーゼは、アセトアセチル-CoA及び酢酸をアセト酢酸及びアセチル-CoAへと変換する。例示的な酵素には、表16に示されるように、大腸菌由来atoAD(Hanaiらの文献, Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007)、C.アセトブチリカム由来ctfAB（Jojimaらの文献, Appl Microbiol Biotechnol 77:1219-1224 (2008))、及びクロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）（Kosakaらの文献, Biosci.Biotechnol Biochem. 71 :58-68 (2007)）由来ctfABの遺伝子産物を含む。スクシニル-CoA：3-ケト酸CoAトランスフェラーゼ（SCOT）は、3-ケトアシル-CoA、アセトアセチル-CoAの3-ケト酸、アセト酢酸への変換を触媒することもできる。アセトアセチル-CoA：酢酸：CoAトランスフェラーゼとは対照的に、SCOTは、酢酸の代わりにCoA受容体としてコハク酸を利用する。例示的なスクシニル-CoA：3：ケト酸-CoAトランスフェラーゼは、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）（Corthesy-Theulazらの文献、J Biol Chem 272：25659-25667(1997)）、枯草菌（Bacillus subtilis）（Stols、L.らの文献、Protein Expr Purif 53：396-403(2007)）及びヒト（Homo sapiens）（Fukao, T.らの文献, Genomics 68: 144-151 (2000); Tanaka, H.らの文献, MoI Hum Reprod 8:16-23 (2002)）に存在する。この変換ができるさらに別のトランスフェラーゼは、ブチリル-CoA：アセト酢酸CoA-トランスフェラーゼである。例示的な酵素は、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）（Barker H.A.らの文献, J Bacteriol 152(l):201-7 (1982)）、クロストリジウムSB4（Barker H.A.らの文献, J Biol Chem 253(4): 1219-25 (1978)）及びクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）（Wiesenborn D. P.らの文献, Appl Environ Mic robiol 55(2):323-9 (1989)）に見出すことができる。多くのトランスフェラーゼは広範な特異性を有し、それゆえとりわけ、酢酸、コハク酸、プロピオン酸、酪酸、2-メチルアセト酢酸、3-ケトヘキサン酸、3-ケトペンタン酸、吉草酸、クロトン酸、3-メルカプトプロピオン酸、プロピオン酸、ビニル酢酸、酪酸など多様なCoA受容体を利用できることに留意されたい。あるいは、アセトアセチル-CoA加水分解酵素は、アセトアセチル-CoAをアセト酢酸へと変換するために利用できる。当該酵素は、様々な哺乳動物種において、一般的である（Patel, T.B.らの文献, Biochem J, 176 951-958 (1978); Rous, S.の文献, Biochem Biophvs Res Commun 69 74-78 (1976); Baird, G.D.らの文献, Biochem J 117 703-709 (1970)）。
【０１０７】
【表１６】
2012511928.tif 000018
アセト酢酸デカルボキシラーゼは、アセト酢酸を二酸化炭素及びアセトンへと変換する。例示的なアセト酢酸デカルボキシラーゼ酵素は、C.アセトブチリカム由来adc（Petersen及びBennett, Appl Environ.Microbiol 56:3491-3498 (1990)）及びクロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム（Kosakaらの文献, Biosci.Biotechnol Biochem. 71 :58-68 (2007)）由来adcの遺伝子産物によりコードされる。C.ベイジェリンキイ由来の酵素は、配列類似性から推定できる。これらのタンパク質は、以下の表17において同定される。
【０１０８】
【表１７】
2012511928.tif 000019
イソプロパノール合成経路の最終ステップは、アセトンのイソプロパノールへの還元を含む。この変換ができる例示的なアルコールデヒドロゲナーゼ酵素には、C.ベイジェリンキイ由来adh（Hanaiらの文献, Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007); Jojimaらの文献, Appl Microbiol Biotechnol 77:1219-1224 (2008)）、及びサーモアナロバクター・ブロッキイ（Thermoanaerobacter brockii）由来adh（Hanaiらの文献, Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007); Peretzらの文献, Anaerobe 3:259-270 (1997)）を含む。さらに特徴づけられた酵素には、ラルストニア・エウトロファ（Ralstonia eutropha）（以前にはアルカリゲネス・エウトロファス（Alcaligenes eutrophus））(Steinbuchel及びSchlegelらの文献, Eur.J.Biochem. 141 :555-564 (1984))及びフィトモナス（Phytomonas）種(Uttaro及びOpperdoesらの文献, Mol.Biochem.Parasitol. 85:213-219 (1997))由来のアルコールデヒドロゲナーゼを含む。
【０１０９】
【表１８】
2012511928.tif 000020
【０１１０】
アセトアセチル-CoAを3-ヒドロキシブチリル-CoAへと変換する例示的な3-ヒドロキシアシルデヒドロゲナーゼには、C.アセトブチリカム由来hbd（Boyntonらの文献, Journal of Bacteriology 178:3015-3024 (1996)）、C.ベイジェリンキイ由来hbd（Colby及びChenらの文献, Appl Environ.Microbiol 58:3297-3302 (1992)）及びメタロスファエラ・セデュラ（Metallosphaera sedula）（Bergらの文献, 2007 Science 318:1782-1786 (2007)）由来の多くの類似の酵素を含む。
【０１１１】
【表１９】
2012511928.tif 000021
【０１１２】
C.アセトブチリカム由来crtの遺伝子産物は、3-ヒドロキシブチリル-CoAのクロトニル-CoAへの脱水を触媒する（Atsumiらの文献, Metab Eng (2007); Boyntonらの文献, Journal of Bacteriology 178:3015-3024 (1996)）。更に、エノイル-CoAヒドラターゼは可逆的な酵素であり、それゆえ3-ヒドロキシブチリル-CoAのクロトニル-CoAへの脱水を触媒するための適切な候補である。P.プチダ（P. putida）のエノイル-CoAヒドラターゼであるphaA及びphaBは、フェニル酢酸異化作用の間、二重結合のヒドロキシル化を実行すると考えられている（Oliveraらの文献, Proc Nat Acad Sci U.S.A. 95:6419-6424 (1998)）。P.フルオレッセンス（P. fluorescens）由来のpaaA及びpaaBは、類似した変換を触媒する（Oliveraらの文献, Proc Nat Acad Sci U.S.A. 95:6419-6424 (1998)）。近年、多くの大腸菌遺伝子は、maoC、paaF及びpaaGを含むエノイル-CoAヒドラターゼ官能性を実証したことを示した（Ismailらの文献, European Journal of Biochemistry 270:3047-3054 (2003); Park及びLeeの文献, J Bacteriol. 185:5391-5397 (2003); Park及びLeeの文献, Appl Biochem.Biotechnol 113-116:335-346 (2004); Park及びYupの文献, Biotechnol Bioeng 86:681-686 (2004)）。
【０１１３】
【表２０】
2012511928.tif 000022
【０１１４】
インビボで天然に逆反応（すなわち、4-ヒドロキシブチリル-CoAのクロトノイル-CoAへの脱水）を触媒するいくつかの酵素は、多数の種において同定された。この変換は、クロストリジウム・アミノブチリカム（Clostridium aminobutyricum）による4-アミノ酪酸発酵に（Scherf及びBuckelの文献, Eur. J Biochem. 215:421-429 (1993)）、及びクロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）によるコハク酸-エタノール発酵（Scherfらの文献, Arch.Microbiol 161:239-245 (1994)）に使用される。該変換は、古細菌、例えばメタロスファエラ・セデュラにおける、3-ヒドロキシプロピオン酸/4-ヒドロキシ酪酸独立栄養二酸化炭素同化経路の一部としてのステップでもある（Bergらの文献, Science 318:1782-1786 (2007)）。この経路は、4-ヒドロキシブチリル-CoAを形成するために、クロトノイル-CoAの水和を使用する。4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼの可逆性は、よく考証されており（Friedrichらの文献, Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 47:3254-3257 (2008); Muhらの文献, Eur.J.Biochem. 248:380-384 (1997); Muhらの文献, Biochemistry 35:11710-11718 (1996)）、該平衡定数は、クロトノイル-CoA側の約4であることが報告された(Scherf及びBuckelの文献, Eur.J Biochem. 215:421-429 ( 1993))。これは、クロトニル-CoAで熱力学的ボトルネックを生成しないように、下流の4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼが4-ヒドロキシブチリル-CoA濃度を低く保つことを示す。
【０１１５】
【表２１】
2012511928.tif 000023
【０１１６】
4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼは4-ヒドロキシブチリル-CoAから酢酸へとCoA部分を移し、順次、4-ヒドロキシ酪酸及びアセチル-CoAを形成する。1つの例示的な4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼは、クロストリジウム・クルイベリのcat2遺伝子によりコードされる（Seedorfらの文献. Proc. Natl. Acad. Sci.U S.A. 105:2128-2133 (2008); Sohling及びGottschalkの文献 J Bacteriol. 178:871-880 (1996))。ポルフィロモナス・ギンギバリス（Porphyromonas gingivalis）由来abfT-2遺伝子は、4-ヒドロキシ酪酸及び1,4-ブタンジオールを産生させる経路の一部として導入する場合に、4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ活性を呈することも示された（Burkらの文献, WO/2008/115840 (2008)）。P.ギンギバリス由来abfT-1によりコードされるさらなる候補酵素は、配列相同性により推定できる。別の4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼは、クロストリジウム・アミノブチリカム由来abfTの遺伝子産物によりコードされる（Gerhardtらの文献, Arch. Microbiol 174: 189-199 (2000))。
【０１１７】
【表２２】
2012511928.tif 000024
【０１１８】
例示的なリン酸転移アシル基転移酵素は、ptaによりコードされるホスホトランスアセチラーゼ、及びptbによりコードされるホスホトランスブチリラーゼを含む。大腸菌由来のpta遺伝子は、アセチル-CoAをアセチルリン酸へと変換できる（逆も可能）酵素をコードする（Suzuki, T.の文献 1969 Biochim.Biophys.Acta 191:559-569 (1969)）。この酵素は、そのプロセスにおいて、アセチル-CoA形成プロピオン酸の代わりにプロピオニル-CoAを利用することもできる（Hesslingerらの文献, Mol.Microbiol 27:477-492 (1998)）。同様に、C.アセトブチリカム由来ptb遺伝子は、ブチリル-CoAをブチリル-リン酸へと変換できる酵素をコードする（Huangらの文献, J.Mol.Microbiol Biotechnol 2:33-38 (2000); (Walterらの文献, Gene 134:107-111 (1993)）。同酵素は、1,4-ブタンジオールを産生する経路の一部として利用する場合、4-ヒドロキシブチリル-CoAにおいて活性を有することが発見された（WO/2008/115840 (2008)）。さらなるptb遺伝子は、酪酸産生細菌L2-50（Ljungdahl及びAndreesenの文献, Methods Enzymol. 53:360-372 (1978)）及び巨大菌（Bacillus megaterium）（Vazquezらの文献, Curr.Microbiol 42:345-349 (2001)）において見出すことができる。
【０１１９】
【表２３】
2012511928.tif 000025
【０１２０】
例示的なキナーゼには、ackAによりコードされる大腸菌酢酸キナーゼ（Skarstedt及びSilversteinの文献, J.Biol.Chem.251 :6775-6783 (1976)）及びbukl及びbuk2によりコードされるC.アセトブチリカム酪酸キナーゼ（Huangらの文献, 2000 J.Mol.Microbiol Biotechnol 2:33-38 (2000); Walterらの文献, Gene 134: 107-111 (1993)）、及びproBによりコードされる大腸菌γ-グルタミルキナーゼ（Smithらの文献, J.Bacteriol. 157:545-551 (1984)）を含む。これらの酵素は、それぞれ、酢酸、酪酸及びグルタミン酸をリン酸化する。大腸菌由来のackA遺伝子産物も、プロピオン酸をリン酸化する（Hesslingerらの文献, Mol.Microbiol 27:477-492 ( 1998）。C.アセトブチリカム由来buk1の遺伝子産物は、Burkらの文献, WO/2008/115840 (2008)において、1,4-ブタンジオールを産生する経路の一部として利用する場合、4-ヒドロキシブチリル-CoAにおいて活性を有することが示された。
【０１２１】
【表２４】
2012511928.tif 000026
【０１２２】
アルコール形成4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ酵素は、1,4-ブタンジオールを4-ヒドロキシブチリル-CoAから形成することを必要とする2つの還元工程を触媒する。アシル-CoAをアルコールへと変換する例示的なツーステップオキシドレダクターゼは、アセチル-CoAなどの基質をエタノールに変換するもの（例えば、大腸菌由来adhE (Kesslerらの文献, FEBS.Lett. 281 :59-63 (1991)）、及びブチリル-CoAをブタノールに変換するもの（例えば、C.アセトブチリカム由来adhE2（Fontaineらの文献, J.Bacteriol. 184:821-830 (2002))を含む。C.アセトブチリカム由来のadhE2酵素は特に、4-ヒドロキシブチリル-CoAからBDOを産生することが示された（Burkらの文献, WO/2008/115840 (2008)を参照されたい）。アセチル-CoAをエタノールに還元することに加えて、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）のadhEによりコードされる酵素は、分枝鎖化合物イソブチルアルデヒドをイソブチリル-CoAに酸化することを見出した（Kazahayaらの文献, J.Gen.Appl.Microbiol. 18:43-55 (1972); Kooらの文献, Biotechnol Lett. 27:505-510 (2005))。
【０１２３】
【表２５】
2012511928.tif 000027
【０１２４】
別の例示的な酵素は、マロニル-CoAを3-HPへと変換できる。この活性を有するNADPH依存性酵素は、クロロフレクサス・オーランチアカス（Chloroflexus aurantiacus）において特徴づけられており、そこで該酵素は3-ヒドロキシプロピオン酸サイクルに関与する（Huglerらの文献, J.Bacteriol. 184:2404-2410 (2000); Strauss and Fuchs, Eur.J.Biochem. 215:633-643 (1993))。この酵素は、300kDaの質量を有し、高度に基質特異性であり、他の公知のオキシドレダクターゼにほとんど配列類似性を示さない（Huglerらの文献, J.Bacteriol. 184:2404-2410 (2002))。他の生物においては、この特異反応を触媒する酵素は見出されていない。しかし、他の生物が類似の経路を有し得るという生物情報学的証拠は存在する（Klattらの文献, Environ.Microbiol. 9:2067-2078 (2007))。ロセイフレクサス・カステンホルジイ（Roseiflexus castenholzii）、エリスロバクター種NAP1、及び海洋ガンマプロテオ細菌HTCC2080を含む他の生物における酵素候補は、配列類似性により推定できる。
【０１２５】
【表２６】
2012511928.tif 000028
【０１２６】
4-ヒドロキシブチリル-CoAからBDOへの代替的経路は、はじめにこの化合物を4-ヒドロキシブタナールに還元することを含む。いくつかのアシル-CoAデヒドロゲナーゼは、アシル-CoAをその対応するアルデヒドに還元することができる。当該酵素をコードする例示的な遺伝子には、脂肪アシル-CoAレダクターゼをコードするアシネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus）acr1（Reiser及びSomervilleの文献, Journal of Bacteriology 179:2969-2975 (1997)）、アシネトバクター種M-1脂肪アシル-CoAレダクターゼ（Ishigeらの文献, Appl.Environ.Microbiol. 68:1192-1195 (2002)）、及びクロストリジウム・クルイベリのsucD遺伝子によりコードされるCoA及びNADP依存性コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Sohling及びGottschalkの文献, J Bacteriol. 178:871-880 (1996)）を含む。P.ギンギバリスのSucDは、別のコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼである（Takahashiらの文献, J.Bacteriol. 182:4704-4710 (2000))。これらのコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは特に、1,4-ブタンジオールを産生する経路の一部として、4-ヒドロキシブチリル-CoAを4-ヒドロキシブタナールへと変換することが示された（Burkらの文献, WO/2008/115840 (2008)を参照されたい）。シュードモナス種においてbphGによりコードされるアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをアシル化する酵素は、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド及びホルムアルデヒドを酸化し、かつアシル化することが示されたので、さらに別の能力がある酵素である（Powlowskiらの文献, J Bacteriol. 175:377-385 (1993))。
【０１２７】
【表２７】
2012511928.tif 000029
【０１２８】
アシル-CoAをその対応するアルデヒドへと変換するさらなる酵素型は、マロニル-CoAをマロン酸セミアルデヒドに変換するマロニル-CoAレダクターゼである。マロニル-CoAレダクターゼは、好熱好酸性古細菌の3-ヒドロキシプロピオン酸サイクルを介した独立栄養炭素固定における主要な酵素である（Bergらの文献, Science 318:1782-1786 (2007); Thauer, R. K, Science 318:1732-1733 (2007)）。該酵素は、補因子としてNADPHを利用し、メタロスファエラ種及びスルフォロブス種において特徴づけられている（Alberらの文献, J.Bacteriol.188:8551-8559 (2006); Huglerらの文献, J.Bacteriol. 184:2404-2410 (2002))。酵素は、メタロスファエラ・セデュラのMsed_0709によりコードされる（Alberらの文献, J.Bacteriol. 188:8551-8559 (2006); Bergらの文献, Science 318: 1782-1786 (2007))。スルフォロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）由来のマロニル-CoAレダクターゼをコードする遺伝子がクローン化され、大腸菌において異種的に発現された（Alberらの文献, J.Bacteriol. 188:8551-8559 (2006))。これらの酵素のアルデヒド脱水素酵素官能性はクロロフレクサス・オーランチアカス由来の二官能性デヒドロゲナーゼに類似するにもかかわらず、ほとんど配列類似性がない。両方のマロニル-CoAレダクターゼ酵素候補は、アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、すなわちアスパルチル-4-リン酸のアスパラギン酸セミアルデヒドへの還元及び同時的脱リン酸化を触媒する酵素に高い配列類似性を有する。さらなる遺伝子候補は、スルフォロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)及びスルフォロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）を含む他の生物のタンパク質に対する配列相同性により発見できる。
【０１２９】
【表２８】
2012511928.tif 000030
【０１３０】
1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ活性を呈する酵素は、1,4-ブタンジオールを4-ヒドロキシブタナールから形成できる。アルデヒドのアルコールへの変換を触媒する酵素（すなわち、アルコールデヒドロゲナーゼ又は同等であるアルデヒドレダクターゼ）をコードする例示的な遺伝子は、C2-C14のための中鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードするalrA（Taniらの文献, Appl.Environ.Microbiol. 66:5231-5235 (2000)）、出芽酵母由来のADH2（Atsumiらの文献 Nature 451:86-89 (2008)）、C(3)より長い分子の優先度を有する大腸菌由来yqhD（Sulzenbacherらの文献, Journal of Molecular Biology 342:489-502 (2004)）、及びブチリアルデヒド(butyryaldehyde)をブタノールへと変換するC.アセトブチリカム由来bdh I及びbdh II（Walterらの文献. Journal of Bacteriology 174:7149-7158 (1992)）を含む。
【０１３１】
【表２９】
2012511928.tif 000031
【０１３２】
4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を呈する酵素（EC 1.1.1.61）もこのカテゴリに分類される。当該酵素は、ラルストニア・エウトロファ (Bravoらの文献, J.Forensic Sci. 49:379-387 (2004))、クロストリジウム・クルイベリ(Wolff及びKenealyの文献, Protein Expr.Purif. 6:206-212 (1995)) 、及びシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）(Breitkreuzらの文献, J.Biol.Chem. 278:41552-41556 (2003))において特徴づけられている。
【０１３３】
【表３０】
2012511928.tif 000032
【０１３４】
クローン化及び発現プロセスにおける第一段階は、大腸菌においてメタノールからMe-THFを生成させるのに必要な遺伝子の最小セット（例えば、MtaA、MtaB及びMtaC）を発現させることである。これらのメチルトランスフェラーゼ活性は、補因子として補酵素 B12（コバラミン）を使用する。ムーレラ・サーモアセチカにおいて、メチルトランスフェラーゼタンパク質のカスケードは、メタノール由来メチル基のアセチル-CoAシンターゼ経路への編入を媒介する。最近の研究（Dasらの文献, Proteins 67: 167-176 (2007)）は、MtaABCがMoth_1208-09及びMoth_2346によりコードされることを示す。これらの遺伝子は、プルーフリーディングPCRを介してクローン化され、抑制できるPA1-lacO1プロモータの制御下のpZE22-Sなどの、高いコピー数ベクターにおける発現のために連結される（Lutz及びBujardの文献, Nucleic Acids Res 25: 1203-1210 (1997))。クローン化遺伝子は、3遺伝子セットの発現ベクターへの構築及び挿入を実証するために、PCR及び又は制限酵素マッピングにより検査される。推定クローンのDNA塩基配列決定は、各遺伝子の予想される配列を同定するために実行される。いったん確認されたならば、該最終構築物は、大腸菌K12（MG1655）細胞において、終濃度0.05〜1mMのIPTG誘導因子の添加により発現される。クローン化遺伝子の発現は、全細胞抽出物のSDS-PAGEを使用してモニタされる。可溶物対ペレット（潜在的に封入体起源）タンパク質のレベルを最適化するために、これらのレベルにおけるプロモータの用量設定の効果を検討できる。許容可能な発現が得られない場合、プロモータ強度においてより高い又は低いコピー数のベクター又は異型が試験される。
【０１３５】
M.サーモアセチカ由来のMtaABCタンパク質の発現がメタノールからテトラヒドロ葉酸（THF）にメチル基を転移する能力を大腸菌に与えるかどうかを測定するために、組換え株に様々な濃度のメタノールを与える。メチルトランスフェラーゼ系の活性は、M.サーモアセチカのメチル供給源としてのバニリン酸(Naidu及びRagsdaleの文献, J Bacteriol. 183:3276-3281 (2001))、又はメタノサルシーナ・バルケリのメタノールメチルトランスフェラーゼ(Sauerらの文献, Eur. J Biochem. 243:670-677 (1997); Tallant及びKrzyckiの文献, J Bacteriol. 178: 1295-1301 (1996); Tallant及びKrzyckiの文献, J Bacteriol, 179:6902-6911 (1997); Tallantらの文献, J Biol Chem. 276:4485-4493 (2001))について記載されているように、嫌気的にアッセイされる。陽性対照のために、M.サーモアセチカ細胞を同時に培養し、内在性メチルトランスフェラーゼ活性を確認するために嫌気的にアッセイする。外来的に添加した補酵素B12への依存の実証は、大腸菌におけるメタノール:コリノイドメチルトランスフェラーゼ活性を確認する。
【０１３６】
いったんメチルトランスフェラーゼ発現が達成されると、発現を最適化することへ向けて更なる研究が実施される。発現ベクターのプロモータを用量設定することは、発現レベルの範囲の試験を可能にする。その後これは、単コピーに必要とされる発現に向けてのガイドとして使用され、又は単コピーのこれらの遺伝子が十分な発現をさせるか否かの決定を可能にする。その場合、メチルトランスフェラーゼ遺伝子は、単一の合成オペロンとして、染色体に組み込まれる。これは、RecETに基づく「リコンビニアリング（recombineering）」を使用する、標的化組込みを必要とする（Angrandらの文献, Nucleic Acids Res 27:e16 (1999); Muyrersらの文献, Nucleic Acids Res 27:1555-1557 (1999); Zhangらの文献, 1998 Nat.Genet. 20: 123-128 (1998))。カセットのRecETに基づく組込み及びFLP又はCreによるFRT又はloxPを結合した選択可能な標識の除去に伴う潜在的問題は、各組込み部位での組換え痕跡の生成である。これにより生じる問題は多くの方法により最小化できるが、ゲノムに痕跡を残さない他の手段を使用できる。標準的代替は、バチルス（Bacillus）sacB遺伝子により許容されるものなどの対抗選択に共役された組込み「自殺」プラスミドを使用して、所望の遺伝子を導入することであり（Linkらの文献, J Bacteriol. 179:6228-6237 (1997))、このようにして、大腸菌染色体の任意の位置の標識のない及び瘢痕のない挿入が生成できる。最終目的は、誘導性プロモータ下、（染色体に組込んだ）単コピーで、メタノール：コリノイドメチルトランスフェラーゼ活性を発現する大腸菌K12株である。
【０１３７】
標準的なPCR方法を使用して、全てのACS/CODHオペロンは、pZA33-S（P15A系）又はpZS13-S（pSC101系）などの低又は中程度のコピー数のベクターに組み込まれる。メチルトランスフェラーゼ遺伝子について記載されているように、クローン化遺伝子の構造及び配列が確認される。発現は、必要な金属（Ni、Zn、Fe）及び補酵素B12を含む厳密に嫌気的な条件下で増殖した細胞全体溶菌液のタンパク質ゲル電気泳動を介してモニタされる。必要に応じて、遺伝子クラスターは、大腸菌発現のために、任意の見かけ上のターミネータの同定及び除去、並びに大腸菌において有効であることが公知の部位から選択されるコンセンサスリボゾーム結合部位の導入により修飾される（Barrickらの文献, Nucleic Acids Res 22: 1287-1295 (1994); Ringquistらの文献, Mol. Microbiol 6:1219-1229 (1992)）。しかしながら、各遺伝子クラスターは、その天然の構造及び発現と平行する様式でクローン化されて発現される。これは、様々な遺伝子産物（そのほとんどは互いに相互作用する。）間での所望の化学量論を保証するのを助ける。いったん嫌気的条件下でCODH/ACS遺伝子クラスターの満足な発現が達成されると、CO及び／又はCO2を細胞炭素に固定するこれらの遺伝子を発現する細胞の能力がアッセイされる。開始条件は、基質レベルリン酸化又は電子受容体として硝酸を用いる嫌気呼吸を介し、炭素及びエネルギー源としての外来性グルコースにより提供される厳密に嫌気的に増殖する細胞を利用する。加えて、外来的に提供されるCH3-THFは、培地に添加される。
【０１３８】
ACS/CODH遺伝子は、メタノール-メチルトランスフェラーゼ系も発現する細胞においてクローン化され、発現される。これは、ACS/CODHを発現する互換性プラスミドのMTR発現細胞への導入により達成される。長期安定性付与のために、ACS/CODH及びMTR遺伝子は染色体に組み込むこともできる。Me-THFを産生するためにメタノールを利用でき、かつ活性なCODH/ACS遺伝子を発現できる大腸菌株を作成した後、それらは、アセチル-CoA、酢酸及び細胞質量に組み込まれるメタノール及び合成ガスの両方を利用する能力についてアッセイされる。開始条件は、炭素及びエネルギー源としての外来性グルコースにより提供される厳密に嫌気的に増殖した細胞を利用する。別法として、又は、グルコースに加えて、硝酸は、電子受容体及び増殖の開始因子として機能させるよう発酵ブロスに添加される。最終的にアセチル-CoAへと代謝される脂肪酸における大腸菌の嫌気的増殖が、硝酸の存在下で実証された（Campbellらの文献, Molecular Microbiology 47:793-805 (2003)）。その細胞内レベルが操作された酵素の任意の阻害閾値下に維持される限り、酸素は提供されていることもできる。これらの実験に適する組成物の「合成合成ガス（Synthetic syngas）」は、メタノールに加えて利用される。13C-標識メタノール又は13C標識COが細胞に提供され、分析的質量分析を利用して標識炭素の酢酸及び細胞質量（例えば、タンパク質形成アミノ酸）への組込みを測定する。
【０１３９】
M.サーモアセチカ、D.アフリカヌス（D. africanus）及び大腸菌由来のピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ遺伝子は、MTR及びACS/CODH活性を呈する株にクローン化され、発現される。条件、プロモータ、その他は、上記されている。大きなサイズのPFOR遺伝子及び対応する酵素の酸素感受性が与えられた場合、試験は、低若しくは単コピープラスミドベクター又は単コピー染色体組込みを使用して実施される。引用文献(Furdui及びRagsdaleの文献, J Biol Chem. 275:28494-28499 (2000))に記載されている活性アッセイが活性を実証するために適用される。加えて、外部電子受容体の不在下での気体性炭素源及びメタノールにおける増殖の実証は、インビボでのPFOR活性に更なる証拠を提供する。
【０１４０】
宿主生物の内在性水素を利用するヒドロゲナーゼ活性は、水素の存在下及び不在下で、先に記載した細胞を増殖させることにより試験される。発酵の間のより還元された生成物の形成への劇的な移動が観察される場合（例えば、酢酸と対比しての増殖したエタノール）、これは内在性ヒドロゲナーゼ活性が十分に活性であることを示す。この場合、クローン化及び発現される異種ヒドロゲナーゼはない。天然の酵素が十分な活性を有しないか又は必要とされた受容体を還元しない場合、個々のヒドロゲナーゼ複合体をコードする遺伝子は、MTR、ACS/CODH及びPFOR活性を呈する株にクローン化され、発現される。条件、プロモータ、その他は、上記されている。
【０１４１】
イソプロパノール合成に必要とされる非天然型遺伝子は、先に記載されるように発現プラスミドにクローン化される。宿主株は、メタノールメチルトランスフェラーゼ活性（CODH/ACS活性）及びおそらくPFOR及びヒドロゲナーゼ活性も発現する。この点で、これらの（CODH/ACS、その他）遺伝子は、ゲノムに組み込まれ、構成的に又は誘導因子を使用できるプロモータから発現される（すなわち、PA1-lacO1は、lac Iを含む細胞において誘導可能であるか又はさもなければ構成的である）。いったんイソプロパノールの発現及び収率が最適化されると、該ベースとなる株は、中立の座でのこれらの遺伝子の単コピーの組込みにより更に修飾される。比較的限られた数の遺伝子（最低3つ、多くて6つ）が与えられた場合、出願人は、要求される遺伝子をコードする人工オペロンを構築する。このオペロンは組込みプラスミドを使用して導入され、バチルスsacB遺伝子により許容されるものなどの対抗選択法に共役する（Linkらの文献, J Bacteriol. 179:6228-6237 (1997)）。このようにして、大腸菌染色体の任意の位置での標識のない及び痕跡のない挿入を生成できる。最適化には、遺伝子順序並びにリボゾーム結合部位及びプロモータを変えることを含む。
【０１４２】
任意の天然の遺伝子、例えば、イソプロパノール産生のために必要とされるC.アセトブチリカムアセチル補酵素A［CoA］アセチルトランスフェラーゼの代わりとすることができる大腸菌の天然のatoB（b2224）遺伝子を過剰発現させるために、Rec ETに基づく方法は、より強力な上流プロモータを集積するために適用される。atoBの場合、この遺伝子はオペロンの最後にあり、その次の下流遺伝子（yfaP）は必須でなく、逆方向でもない。従って、極性は問題とすべきではない。FRT又はloxP部位が横に配置されているスペクチノマイシン耐性又はクロラムフェニコール耐性などの選択可能な標識を含むカセットは、強力な構成プロモータ（例えば、pL）の導入の選択のために使用される。qRT-PCRを使用していったん正しいクローンが得られて確認されたならば、FLP又はCre発現は、FRT-又はloxP-結合標識の除去のための選択に使用される。
【０１４３】
4-ヒドロキシ酪酸合成のために必要とされる非天然遺伝子は、先に記載されているように、発現プラスミドにクローン化される。宿主株は、メタノールメチルトランスフェラーゼ活性、CODH/ACS活性、及びおそらくPFOR及びヒドロゲナーゼ活性も発現する。この点で、これらの（CODH/ACS、その他）遺伝子は、ゲノムに組み込まれ、構成的に又は誘導因子と共に使用され得るプロモータから発現される（すなわち、PA1-lacO1は、lac Iを含む細胞において誘導可能であるか又はさもなければ構成的である）。いったん4-ヒドロキシ酪酸の発現及び収率が最適化されると、基礎株は中立座でこれらの遺伝子の単コピーの組込みにより更に修飾される。比較的限られた数の遺伝子（最低5かつ最高で6）が与えられる場合、必要な遺伝子をコードする人工オペロンを構築できる。このオペロンは組込みプラスミドを使用して誘導性であり、バチルスsacB遺伝子により許容されるものなどの対抗選択法と共役する（Linkらの文献, J Bacteriol. 179:6228-6237 (1997))。このようにして、大腸菌染色体の任意の位置で標識のない、かつ痕跡のない挿入が生成できる。最適化には、遺伝子順序並びにリボゾーム結合部位及びプロモータを変えることを含む。
【０１４４】
1,4-ブタンジオール合成のために必要とされる非天然遺伝子は、先に記載されているように、発現プラスミドにクローン化される。宿主株は、メタノールメチルトランスフェラーゼ活性、CODH/ACS活性、及びおそらくPFOR及びヒドロゲナーゼ活性も発現する。この点で、これらの（CODH/ACS、その他）遺伝子は、ゲノムに組み込まれ、構成的に又は誘導因子と共に使用されることができるプロモータから発現される（すなわち、PA1-lacO1は、lac Iを含む細胞において誘導可能であるか又はさもなければ構成的である）。いったん1,4-ブタンジオールの発現及び収率が最適化されると、基礎株は中立の座でこれらの遺伝子の単コピーの組込みにより更に修飾される。比較的限られた数の遺伝子（最低5及び最高で6）が与えられる場合、要求される遺伝子をコードする人工オペロンを構築できる。このオペロンは組込みプラスミドを使用して導入され、バチルスsacB遺伝子により許容されるものなどの対抗選択法と共役する（Linkらの文献, J Bacteriol. 179:6228-6237 (1997))。このようにして、大腸菌染色体の任意の位置で標識のない、かつ痕跡のない挿入が生成できる。最適化には、遺伝子順序並びにリボソーム結合部位及びプロモータを変えることを含む。
【０１４５】
合成ガスを全ての細胞質量成分及び多くの価値ある生成物が誘導され得る中心的代謝産物であるアセチル-CoAへと変換する能力を大腸菌などの外来宿主に操作することは、ウッド-リュングダール経路の様々なタンパク質をコードする外来性遺伝子の発現の後に達成できる。この経路は、1942年のその単離以来、ウッド-リュングダール経路を解明するためのモデル生物であったムーレラ・サーモアセチカ（以前、クロストリジウム・サーモアセチカム）などの酢酸産生生物において高度に活性である（Fontaineらの文献, J Bacteriol. 43:701-715 (1942))。ウッド-リュングダール経路は、2本の支線を含む：CO2のメチルテトラヒドロ葉酸（Me-THF）への変換を可能にするイースタン（又はメチル）支線、及びメチル-THF、CO及び補酵素Aのアセチル-CoAへの変換を可能にするウエスタン（又はカルボニル）支線（図3）。いくつかの実施態様において、本発明は、ウッド-リュングダール経路のメチル及びカルボニル支線を触媒する酵素をコードする遺伝子を発現する非天然存在型生物を提供する。当該生物は、CO、CO2及び／又はH2をアセチル-CoA、細胞質量及び生成物へと変換できる。
【０１４６】
本発明の別の生物は、図3 Aにおいて表される3つの能力を含む：1）THF及びCO2の5-メチル-テトラヒドロ葉酸への変換を可能にするウッド-リュングダール経路の機能的なメチル分枝、2）CO、補酵素 A、及びMe-THFのメチル基を組み合わせてアセチル-CoAを形成する能力、及び3）アセチル-CoAからイソプロパノールを合成する能力。図3Bにおいて表される本発明に記載される第5の生物は、ウッド-リュングダール経路の機能的なメチル分枝、アセチル-CoAを合成する能力、及びアセチル-CoAから4-ヒドロキシ酪酸を合成する能力を含む。図3 Cにおいて表される本発明に記載される第6の生物は、ウッド-リュングダール経路の機能的なメチル分枝、アセチル-CoAを合成する能力、及びアセチル-CoAから1,4-ブタンジオールを合成する能力を含む。
【０１４７】
これら3生物は、外来性CO及び／又はCO2から炭素を「固定」し、アセチル-CoA、細胞質量及び生成物を合成することができる。天然に補充反応（anapleurosis）の能力も有するこれらの能力により操作される宿主生物（例えば、大腸菌）は、硝酸などの適切な外部電子受容体の存在下で、合成ガスにより生成されたアセチル-CoAで増殖できる。この電子受容体は、コハク酸脱水素酵素を介して形成された還元キノンから電子を受け入れるのに必要とされる。外部電子受容体を加えることの更なる利点は、細胞増殖、維持、及び生成物形成のためのさらなるエネルギーがアセチル-CoAの呼吸から産生できることである。代替的戦略は、外部電子受容体の不在下でバイオマス前駆体の合成を可能にするために、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（PFOR）酵素を該株に操作することを含む。操作された生物の更なる特徴は、還元等価物を分子水素から抽出する能力である。これは、高収率の還元生成物、例えばエタノール、ブタノール、イソブタノール、イソプロパノール、1,4-ブタンジオール、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、4-ヒドロキシ酪酸、3-ヒドロキシプロピオン酸、乳酸、アジピン酸、2-ヒドロキシイソブチル酸、3-ヒドロキシイソブチル酸、メタクリル酸、及びアクリル酸を可能にする。
【０１４８】
本明細書に提供される生物は、以下のものから、アセチル-CoA、細胞質量、及び目標とする化学物質、より具体的にはイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸及び1,4-ブタンジオールを産生することができる：1）CO、2）CO2及びH2、3）CO、CO2及びH2、4）CO及びH2を含む合成ガス、及び5）CO、CO2及びH2を含む合成ガス。
【０１４９】
これらの経路のいずれかを生物に成功裏に操作することには、適当な酵素のセットを同定すること、それらの対応する遺伝子を産生宿主にクローン化すること、これらの遺伝子の安定性及び発現を最適化すること、発酵条件を最適化すること、並びに発酵後の生成物形成のためのアッセイすることを含む。以下に、図3A〜3 Cにおいて表される経路のステップ1〜5を触媒する酵素を記載する。これらの酵素は、合成ガスのアセチル-CoAへの変換を可能にすることに必要とされる。図3Aのステップ6〜17並びに図3B及び3 Cのステップ6〜20のための酵素は、先に記載されている。合成ガスの使用のための産生宿主を操作するために、必要な酵素をコードする1以上の外来性DNA塩基配列は該生物において発現できる。
【０１５０】
ギ酸デヒドロゲナーゼは、ムーレラ・サーモアセチカにおけるギ酸へのCO2の組込みを触媒する2つのサブユニットセレノシステイン含有タンパク質である（Andreesen及びリュングダールの文献, J.Bacteriol. 116:867-873 (1973); Liらの文献, J.Bacteriol. 92:405-412 (1966); Yamamotoらの文献, J.Biol.Chem. 258: 1826-1832 (1983))。Moth_2312及びMoth_2313の座は、実際には、ギ酸デヒドロゲナーゼのαサブユニットをコードする役割を果たす1つの遺伝子であると共に、βサブユニットがMoth_2314によりコードされる（Pierceらの文献, Environ.Microbiol. (2008))。CO2還元の傾向を有するギ酸デヒドロゲナーゼ活性をコードする別のセットの遺伝子は、シントロホバクター・フマロキシダンス（Syntrophobacter fumaroxidans）のSfum_2703〜Sfum_2706によりコードされる（de Bokらの文献, Eur.J.Biochem. 270:2476-2485 (2003)); Redaらの文献, Proc.Natl.Acad.Sci.U S.A. 105: 10654-10658 (2008))。それらのM.サーモアセチカの対応物と同様に、Sfum_2705及びSfum_2706は実際には1つの遺伝子である。同機能を実行すると推定される遺伝子の類似の一組は、C.ハイドロゲノフォーマンスにおけるCHY_0731、CHY_0732及びCHY_0733によりコードされるものである（Wuらの文献, PLoS Genet. I:e65 (2005)）。
【０１５１】
【表３１】
2012511928.tif 000033
【０１５２】
ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼは、1つのATPを代償にしてテトラヒドロ葉酸にギ酸を連結する。この反応は、M.サーモアセチカのMoth_0109（Lovellらの文献, Arch.Microbiol 149:280-285 (1988); Lovellらの文献, Biochemistry 29:5687-5694 (1990); O'brienらの文献, Experientia.Suppl. 26:249-262 (1976)）、クロストリジウム・アシデュリシ（Clostridium acidurici）のFHS（Whitehead及びRabinowitzの文献, J.Bacteriol. 167:205-209(1986); Whitehead及びRabinowitzの文献, J.Bacteriol. 170:3255-3261 (1988))、及びC.ハイドロゲノフォーマンスのCHY_2385 (Wuらの文献, PLoS Genet. I:e65 (2005)）の遺伝子産物により触媒される。
【０１５３】
【表３２】
2012511928.tif 000034
【０１５４】
M.サーモアセチカ、大腸菌及びC.ハイドロゲノフォーマンスにおいて、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、及びメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼは、それぞれ、Moth_1516、folD及びCHY_1878の二機能性遺伝子産物により実行される（D'Ari及びRabinowitzの文献, J.Biol.Chem. 266:23953-23958 (1991); Pierceらの文献, Environ. Microbiol (2008); Wuらの文献, PLoS Genet. I:e65 (2005)）。
【０１５５】
【表３３】
2012511928.tif 000035
【０１５６】
ウッド-リュングダール経路のメチル分枝の最終ステップは、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼにより触媒される。M.サーモアセチカにおいて、この酵素は、酸素感受性であり、鉄-硫黄クラスタを含む（Clark 及びLjungdahlの文献, J Biol Chem. 259:10845-10849 (1984)）。この酵素は、大腸菌のmetF（Sheppardらの文献, J.Bacteriol. 181:718-725 (1999)）、及びC.ハイドロゲノフォーマンスのCHY_1233（Wuらの文献, PLoS Genet. I:e65 (2005)）によりコードされる。M.サーモアセチカ遺伝子及びそのC.ハイドロゲノフォーマンスの対応物は、CODH/ACS遺伝子クラスターの近くに位置し、ヒドロゲナーゼ及びヘテロジスルフィドレダクターゼ遺伝子により分離される。
【０１５７】
【表３４】
2012511928.tif 000036
【０１５８】
大腸菌は、いくらかの要求される変換能力（すなわち、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ）を天然に有するが、酢酸産生菌由来のメチル分枝酵素は非酢酸産生菌由来のものよりも著しく高い（50〜100倍）比活性を有し得ると考えられる（Mortonらの文献, Genetics and molecular biology of anaerobic bacteria, p. 389-406, Springer Verlag, New York (1992.)）。ギ酸デヒドロゲナーゼは、嫌気的条件に特化しているようでもある（Ljungdahl及びAndreesenの文献, FEBS Lett. 54:279-282 (1975))。従って、これら各々の様々な非天然バージョンは、メタノール及び合成ガス利用ができる大腸菌の株において発現される。具体的には、これらの遺伝子は、クローン化され、セットとしてそれらを発現するように操作された発現ベクターに結合される。最初に、高い又は中程度のコピー数ベクターが選択される（ColE1又はP15Aレプリコンを使用）。使用されることができる1つのプロモータは、ラムダpL又はこれのIPTG誘導可能なバージョンであるpL-lacOなどの強力な構成的プロモータである（Lutz及びBujardの文献, Nucleic Acids Res 25:1203-1210 (1997))。人工オペロンを作成するために、1つの5'末端プロモータが該セットの遺伝子の上流に配置され、各遺伝子はコンセンサスrbs要素を受ける。可能な場合にはいつでも、遺伝子の順序は、天然の順序に基づく。最後に、該遺伝子は、大腸菌染色体に組み込まれる。酵素アッセイは以下に記載されるとおりに実施される（Clark及びLjungdahlの文献, J Biol Chem. 259:10845-10849 (1984); Clark及びLjungdahlの文献, Methods Enzymol. 122:392-399 (1986); D'Ari及びRabinowitzの文献, J.Biol.Chem. 266:23953-23958 (1991); de Mata及びRabinowitzの文献 J.Biol.Chem. 255:2569-2577 (1980); Ljungdahl及びAndreesenの文献, Methods Enzymol. 53:360-372 (1978); Lovellらの文献, 1988 Arch.Microbiol 149:280-285 (1988); Yamamotoらの文献, J.Biol.Chem. 258:1826-1832 (1983))。
【０１５９】
ウッド-リュングダール経路のカルボニル及びメチル分枝の両方を発現する大腸菌株を構築した後、それらは、CO、CO2及びH2から構成される合成ガスをアセチル-CoA、細胞質量及びイソプロパノール又は1,4-ブタンジオールへの組込みのために利用する能力についてアッセイされる。初期条件は、炭素及びエネルギー源として外来性グルコースを与えられた、厳密に嫌気的で増殖した細胞を利用する。別法として、又はグルコースに加えて、硝酸は、電子受容体及び増殖の開始因子として作用させるために培養液に添加される。最終的にアセチル-CoAに代謝される脂肪酸における大腸菌の嫌気的増殖は、硝酸の存在下で実証された（Campbellらの文献, Molecular Microbiology 47:793-805 (2003)）。細胞内レベルが操作された酵素の任意の阻害閾値の下で維持される限り、酸素を提供することもできる。これらの実験に適する組成物の「合成合成ガス」が利用される。13C標識されたCO及び／又はCO2が細胞に提供され、分析的質量分析を利用して、該標識炭素の酢酸、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸、1,4-ブタンジオール、及び細胞質量（例えば、タンパク質形成アミノ酸）への組込みを測定する。
【０１６０】
本発明は、本明細書において、代謝反応、その反応物若しくは生成物に対する全般的言及、又は当該言及された代謝反応、反応物若しくは生成物に関連する、若しくはこれらを触媒する酵素をコードする1以上の核酸若しくは遺伝子、又はそれらに関連するタンパク質に対する具体的言及と共に記載される。本明細書に他に明示的に確定していない限り、当業者は、反応に対する言及が、該反応物及び該反応生成物に対する言及も構成することを理解するであろう。同様に、本明細書に他に明示的に確定していない限り、反応物又は生成物に対する言及は該反応も言及し、任意のこれらの代謝構成要素に対する言及は当該言及された反応、反応物若しくは生成物を触媒する酵素又はこれらに関与するタンパク質をコードする遺伝子も言及する。同様に、代謝生化学、酵素学及び遺伝学の周知分野が与えられる場合、本明細書における遺伝子又はコード核酸への言及は、該対応コード酵素、及びそれが触媒する反応、又は該反応に関連するタンパク質、並びに該反応の反応物及び生成物に対する言及も構成する。
【０１６１】
本発明の非天然存在型微生物は、1以上のイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生合成経路に参加する1以上の酵素又はタンパク質をコードする発現可能な核酸を導入することによって産生できる。生合成のために選択される宿主微生物に応じて、特定のイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生合成経路の一部若しくは全部のための核酸を発現できる。例えば、選択された宿主が所望の生合成経路の1以上の酵素又はタンパク質を欠損する場合、該欠損した酵素又はタンパク質のための発現可能な核酸が次の外来性発現のための宿主に導入される。あるいは、選択された宿主がいくつかの経路遺伝子の内在性発現を呈するものの他の遺伝子を欠損する場合、コード核酸は、欠損酵素又はタンパク質について、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生合成を達成するために必要である。従って、本発明の非天然存在型微生物は、所望の生合成経路を得るために外来性酵素若しくはタンパク質活性を導入することにより生成でき、又は所望の生合成経路は、1以上の内在性酵素若しくはタンパク質と共に、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールなどの所望の生成物を産生する1以上の外来性酵素若しくはタンパク質活性を導入することにより得ることができる。
【０１６２】
選択された宿主微生物のイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生合成経路構成要素に応じて、本発明の非天然存在型微生物は、少なくとも1つの外来的に発現されたイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール経路コード核酸を含み、かつ、1以上のイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生合成経路のための全てのコード核酸までを含む。例えば、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生合成は、経路酵素又はタンパク質を欠損した宿主における、該対応コード核酸の外来性発現を介して確立できる。イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール経路の全ての酵素又はタンパク質を欠損する宿主における、該経路の全ての酵素又はタンパク質の外来性発現は含まれ得る。しかしこれは、該宿主が該経路酵素又はタンパク質のうちの少なくとも1つを含む場合であってさえも、経路の全ての酵素又はタンパク質が発現できるものと理解される。例えば、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールの産生のための経路における全ての酵素又はタンパク質の外来性発現が含まれ得る。
【０１６３】
本明細書に提供される教示及びガイダンスを与えられた場合、当業者は、発現可能な形態で導入するコード核酸の数が、少なくとも、選択された宿主微生物のイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール経路欠損に対応することを理解するであろう。従って、本発明の非天然存在型微生物は、本明細書に開示されるイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生合成経路を構成する酵素又はタンパク質をコードする、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16から全ての核酸までを有し得る。いくつかの実施態様において、非天然存在型微生物は、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生合成を促進若しくは最適化する、又は該宿主微生物への他の有用な機能を与える他の遺伝的修飾も含み得る。そのような他の官能性の1つには、例えば、アセチル-CoAなどの1以上のイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール経路前駆体の合成の増強を含み得る。
【０１６４】
通常、宿主微生物は、天然産生分子として、若しくは所望の前駆体の新規産生、若しくは該宿主微生物により天然に産生される前駆体の産生増加のいずれかを提供する操作された生成物としてのいずれかで、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール経路の前駆体を産生するように選択される。例えば、アセチル-CoAは、大腸菌などの宿主生物において天然に産生される。宿主微生物は、本明細書に開示されるように、前駆体の産生を増殖させるように操作できる。加えて、所望の前駆体を産生するように操作された微生物は、宿主微生物として使用されることができ、更にイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール経路の酵素又はタンパク質を発現させるように操作できる。
【０１６５】
いくつかの実施態様において、本発明の非天然存在型微生物は、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールを合成する酵素能力を含む宿主から産生する。この特定の実施態様において、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール経路生成物の合成又は蓄積を増加させること、例えばイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール産生の方にイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール経路反応を駆動することは有用であり得る。合成又は蓄積の増加は、例えば、上記のイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸若しくは1,4-ブタンジオール経路酵素又はタンパク質の1以上をコードする核酸の過剰発現により達成できる。イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール経路の酵素及び／又はタンパク質の過剰発現は、例えば、内在性遺伝子の外来性発現により、又は異種遺伝子の外来性発現により、起こすことができる。従って、天然存在型生物は、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、すなわち全てまでのイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生合成経路の酵素又はタンパク質をコードする核酸の過剰発現を介して、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールを産生できる本発明の非天然存在型微生物であるように容易に作成できる。加えて、非天然存在型生物は、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生合成経路の酵素の活性の増加を生じる内在性遺伝子の突然変異誘起により産生できる。
【０１６６】
特に有用な実施態様において、コード核酸の外来性発現が利用される。外来性発現は、ユーザにより制御される所望の発現レベルを達成する宿主及び適用に対する発現及び／又は調節エレメントをカスタマイズして仕立てる能力を与える。しかしながら、内在性発現は、誘導性プロモータ又は他の制御エレメントに連結された場合、遺伝子のプロモータの負の調節性のエフェクタ又は誘導を取り除くことなどによる他の実施態様において利用できる。従って、天然に存在する誘導性プロモータを有する内在性遺伝子は、適当な誘導剤を提供することにより上方制御でき、又は、内在性遺伝子の制御領域は、誘導可能な制御エレメントを組み込むように導入でき、これにより所望の時間に内在性遺伝子の発現増加の制御をさせる。同様に、誘導性プロモータは、非天然存在型微生物に導入される外来性遺伝子のための制御エレメントとして含まれ得る。
【０１６７】
本発明の方法において、任意の1以上の外来性核酸は本発明の非天然存在型微生物を産生するために微生物に導入し得ることが理解される。核酸は、例えば、該微生物へのイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生合成経路を与えるように導入できる。あるいは、コード核酸は、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生合成能力を与えるいくつかの要求される反応を触媒する生合成能力を有する中間微生物を産生するために導入できる。例えば、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生合成経路を有する非天然存在型微生物は、所望の酵素又はタンパク質をコードする少なくとも2つの外来性核酸を含むことができる。従って、生合成経路の2以上の酵素又はタンパク質の任意の組合せは本発明の非天然存在型微生物に含まれ得ることが理解される。同様に、その他要求される通りに、所望の生合成経路の酵素及び／又はタンパク質の組合せがその対応する所望の生成物の産生を生じる限り、生合成経路の3以上酵素又はタンパク質の任意の組合せは本発明の非天然存在型微生物に含まれ得ることが理解される。同様に、要求される通りに、所望の生合成経路の酵素及び／又はタンパク質の組合せがその対応する所望の生成物の産生を生じる限り、本明細書に開示される生合成経路の4以上酵素又はタンパク質の任意の組合せは本発明の非天然存在型微生物に含まれ得ることが理解される。
【０１６８】
本明細書に記載されるイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールの生合成に加え、本発明の非天然存在型微生物及び方法は、他の経路により生成物生合成を達成するための当該技術分野において周知の互いの及び他の微生物及び方法との様々な組合せでも利用できる。例えば、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生産体の使用以外のイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールを生産するための1つの選択肢は、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール経路中間体をイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールに変換し得る別の微生物の添加を介することである。そのような手順には、例えば、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール経路中間体を産生する微生物の発酵を含む。イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール経路中間体は、それから、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール経路中間体をイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールに変換する第2の微生物のための基質として使用できる。イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸若しくは1,4-ブタンジオール経路中間体は第2の微生物の別の培地に直接添加でき、又はイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸若しくは1,4-ブタンジオール経路中間体生産体の元の培地は、例えば細胞分離によりこれらの微生物から枯渇させることができ、その後に続く第2の微生物の該発酵ブロスへの添加は、中間体の精製工程なしに最終生成物を提供するために利用できる。
【０１６９】
他の実施態様において、本発明の非天然存在型微生物及び方法は、例えば、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールの生合成を達成するための様々な下位経路で構成することができる。これらの実施態様において、本発明の所望の生成物のための生合成経路は異なる微生物に分離でき、該異なる微生物は最終生成物を産生させるために共培養できる。当該生合成スキームにおいて、1つの微生物の生成物は、最終生成物が合成されるまでの第2の微生物のための基質である。例えば、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールの生合成は、1つの経路中間体の別の経路中間体又は生成物への変換のための生合成経路を含む微生物を構築することにより達成できる。あるいは、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールは、同じ容器内の2つの微生物を使用する共培養又は共発酵によって微生物から生合成的に産生でき、ここで、該第1の微生物はイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール中間体を生じ、該第2の微生物は該中間体をイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールに変換する。
【０１７０】
本明細書に提供される教示及びガイダンスを与えられた場合、当業者は、下位経路を有する他の非天然存在型微生物の共培養を伴う、並びにイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールを産生するために周知の他の化学的及び／又は生化学的手順の組合せを伴う、様々な組合せ及び順列が他の微生物と本発明の非天然存在型微生物及び方法のために存在することを理解するであろう。
【０１７１】
イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール経路酵素又はタンパク質のためのコード核酸の供給源は、例えば、該コードされた遺伝子産物が当該反応を触媒することができる任意の種を含み得る。当該種には、古細菌及び真正細菌を含む細菌、並びに酵母、植物、昆虫、動物、及びヒトを含む哺乳動物を含む真核生物を含むがこれらに限定されない、原核生物及び真核生物の両方を含む。当該供給源のための例示的な種には、例えば、大腸菌、並びに本明細書に開示されるか、又は対応する遺伝子のための供給源生物として利用可能な他の例示的な種を含む。しかしながら、395種の微生物ゲノム並びに様々な酵母、真菌、植物及び哺乳動物のゲノムを含む、現在550種をこえる利用可能な完全ゲノム配列（これらのうち半分超は、NCBIなどの公共データベースで利用可能である。）を用いて、例えば、公知遺伝子のホモログ、オルソログ、パラログ及び非オルソロガス遺伝子置換、及び生物間での遺伝的変化の交換を含む、関連する又は離れた種における1以上の遺伝子についての必要なイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生合成活性をコードする遺伝子の同定は常用的であり、かつ当該技術分野において周知である。したがって、大腸菌などの特定の微生物に関して本明細書に記載されるイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールの生合成を可能にする代謝的変更は、原核生物及び真核生物などを含む他の微生物に容易に適用できる。本明細書に提供される教示及びガイダンスを与えられた場合、当業者は、1つの微生物において例証される代謝的変更が他の生物に同様に適用できるということを知っているであろう。
【０１７２】
代替的なイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生合成経路が関連性のない種の中に存在する場合などには、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生合成は、例えば、同様の、しかし同一でない代謝反応を触媒する関連性のない種から、当該反応を置き換えるためのパラログの外来性発現により宿主種に付与できる。代謝ネットワーク中の特定の差異が異なる微生物間には存在するので、当業者は、異なる微生物間の実際の遺伝子使用が異なり得ることを理解するであろう。しかしながら、本明細書に提供される教示及びガイダンスを与えられた場合、当業者は、本発明の教示及び方法を全ての微生物に適用して、本明細書に例証されたものに同様の代謝的変更を使用し、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールを合成するであろう関心対象の種において微生物を構築できることも理解するであろう。
【０１７３】
宿主微生物は、例えば細菌、酵母、真菌又は発酵プロセスに適用できる任意の他の様々な微生物、及びこれらから産生された非天然存在型微生物から選択できる。例示的な細菌には、大腸菌、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、アナエロビオスピリリウム・スクシニシプロデュセンス（Anaerobiospirilium succiniciproducens）、アクチノバチルス・スクシノジェネス（Actinobacillus succinogenes）、マンハイミア・スクシニシプロデュセンス（Mannheimia succiniciproducens）、リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）、枯草菌、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトバシルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）、クロストリジウム・アセトブチリカム、シュードモナス・フルオレッセンス及びシュードモナス・プチダから選択される種を含む。例示的な酵母又は真菌には、出芽酵母、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）から選択される種を含む。大腸菌は、遺伝子工学に適することがよく特徴づけられた微生物であるので、特に有用な宿主生物である。他の特に有用な宿主生物には、出芽酵母などの酵母を含む。
【０１７４】
非天然存在型イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールの産生宿主の発現レベルを構築及び試験する方法は、例えば、当該技術分野において周知の組換え及び検出法により実施できる。当該方法は、例えば、Sambrookらの文献, 『分子クローニング：研究室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）』, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001)；及びAusubelらの文献,『分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）』, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)の記載に見出すことができる。
【０１７５】
イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールの産生のための経路に関係する外来性核酸配列は、接合、電気穿孔法、化学的形質転換、形質導入、トランスフェクション及び超音波変換を含むがこれらに限定されない当該技術分野において周知の技術を使用して、安定的に又は一過的に宿主細胞に導入し得る。大腸菌又は他の原核細胞における外来性発現のために、真核生物核酸の遺伝子又はcDNAにおけるいくつかの核酸配列は、N末端ミトコンドリア若しくは他のターゲッティングシグナルなどのターゲッティングシグナルをコードすることができ、これは、必要に応じて、原核生物宿主細胞への形質転換の前に除去できる。例えば、ミトコンドリアリーダー配列の除去は、大腸菌における発現増加につながった（Hoffmeisterらの文献, J. Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005)）。酵母又は他の真核細胞の外来性発現のために、遺伝子は、リーダー配列を付加せずに細胞質において発現でき、又は宿主細胞に適するミトコンドリアターゲッティング又は分泌シグナルなどの適切なターゲッティング配列の付加により、糸粒体若しくは他のオルガネラ標的化でき、若しくは分泌のために標的化できる。従って、ターゲッティング配列を取り除くか又は含む核酸配列への適切な修飾は、望ましい特性を与えるために外来性核酸配列に組み込まれ得ることが理解される。さらにまた、遺伝子は、タンパク質の最適化された発現を達成するために、当該技術分野において周知の技術を用いるコドン最適化に供することができる。
【０１７６】
発現ベクターは、宿主微生物において機能的な発現制御配列に機能的に連結された本明細書に例証されるような核酸をコードする1以上のイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生合成経路を含むように構築できる。本発明の微生物宿主生物での使用に適用できる発現ベクターには、例えば、宿主染色体への安定な組込みのために操作可能なベクター及び選択配列又は標識を含む、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソーム及び人工染色体を含む。加えて、発現ベクターには、1以上の選択可能な標識遺伝子及び適切な発現制御配列を含み得る。選択可能な標識遺伝子には、例えば、抗生物質若しくは毒素に対する耐性を提供すること、栄養要求性欠損を補完すること、又は培地以外での必須栄養素を供給することも含まれ得る。発現制御配列には、当該技術分野において周知である、構成的及び誘導可能プロモータ、転写エンハンサ、転写ターミネータ等を含み得る。2以上の外来性コード核酸が共発現される場合、両方の核酸は、例えば、単一の発現ベクターに、又は別々の発現ベクターで、挿入できる。単一ベクター発現のために、コード核酸は、1つの共通発現制御配列に操作的に連結でき、又は異なる発現制御配列、例えば1つの誘導性プロモータ及び1つの構成的プロモータに操作的に連結できる。代謝若しくは合成経路に関係する外来性核酸配列の形質転換は、当該技術分野において周知の方法を使用して確認できる。当該方法には、例えば、mRNAのノーザンブロット又はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅などの核酸分析、又は遺伝子産物の発現についての免疫ブロット、又は導入核酸配列若しくはその対応遺伝子産物の発現を試験するための他の適切な分析法を含む。外来性核酸が所望の生成物を産生するように十分な量で発現されることは当業者に理解され、発現レベルが当該技術分野において周知かつ本明細書に開示される方法を使用して十分な発現を得るように最適化できることは更に理解される。
【０１７７】
本発明は、イソプロパノール経路を有する非天然存在型微生物を培養することを含む、イソプロパノールの生産方法を提供する。当該経路は、イソプロパノールを産生するために十分な量で、及びイソプロパノールを産生するのに十分な期間の条件下で発現されるイソプロパノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む。イソプロパノール経路には、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、アセトアセチル-CoA：酢酸：CoAトランスフェラーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを含む。代替的イソプロパノール経路は、スクシニル-CoA：3-ケト酸CoAトランスフェラーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを含む。
【０１７８】
生物がメタノールメチルトランスフェラーゼを有する実施態様において、培養は、1）メタノール及びCO、2）メタノール、CO2、及びH2、3）メタノール、CO、CO2、及びH2、4）メタノール、並びにCO及びH2を含む合成ガス、及び5）メタノール、並びにCO、CO2及びH2を含む合成ガスなどの原料を利用して実施できる。
【０１７９】
生物がギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、及びメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼを有する実施態様において、該生物は、1）CO、2）CO2及びH2、3) CO及びCO2、4）CO及びH2を含む合成ガス、及び5）CO、CO2及びH2を含む合成ガスなどの原料を利用できる。
【０１８０】
同様に、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールは、先に本明細書に記載した適当な生物を培養することによって産生することもできる。
【０１８１】
イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールの産生のための試験に適する精製及び／又は分析は、公知の方法を使用して実施できる。三回の培養などの適切な複製は、試験される操作された株ごとについて増殖させ得る。例えば、操作された産生宿主の生成物及び副産物形成をモニタできる。最終生成物及び中間体及び他の有機化合物は、HPLC（高性能液体クロマトグラフィ）、GC-MS（ガスクロマトグラフィ-質量分析）、LC-MS（液体クロマトグラフィ-質量分析）又は当該技術分野において周知の常用手順を使用する他の適切な分析法などの方法により分析できる。発酵ブロスにおける生成物の放出は、培養上清でも試験できる。副産物及び残余のグルコースは、例えば、グルコース及びアルコールのための屈折率検出器、及び有機酸のための紫外線検出器を使用するHPLC（Linらの文献, Biotechnol. Bioeng. 90:775-779 (2005)）、又は当該技術分野において周知の他の適切なアッセイ及び検出法により定量化できる。外来性DNA塩基配列からの個々の酵素又はタンパク質活性は、当該技術分野において周知の方法を使用してアッセイすることもできる（例えば、WO/2008/115840、及びHanaiらの文献, Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007)を参照されたい）。
【０１８２】
イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールは、当該技術分野において周知の様々な方法を使用して、培養物の他の成分から分離できる。当該分離法には、例えば、抽出手順、並びに連続液体-液体抽出、浸透気化法、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、結晶化、遠心、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、吸着クロマトグラフィ及び限外ろ過を含む方法を含む。上記の方法の全ては、当該技術分野において周知である。
【０１８３】
本明細書に記載される非天然存在型微生物のいずれかを培養して、本発明の生合成生成物を産生及び／又は分泌させることができる。例えば、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生産体は、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールの生合成産生のために培養できる。
【０１８４】
イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールの産生のために、組換株は、炭素源及び他の必須栄養素を有する培地で培養される。全体のプロセスの費用を減らすために、発酵槽の嫌気的条件を維持することは大変望ましい。当該条件は、例えば、最初に窒素で培地を散布（sparging）して、それから中隔及び圧着キャップでフラスコを封止することで得ることができる。増殖が嫌気的に観察されない株について、微好気性状態は、限られた通気のための小開口を有する中隔を穿孔することにより適用できる。例示的な嫌気的条件は先に記載されており、かつ当該技術分野において周知である。例示的な好気性及び嫌気性状態は、例えば、2007年8月10日に出願の米国特許出願シリアル番号第11/891,602号に記載されている。本明細書に開示されるように、発酵はバッチ、供給バッチ又は連続様式で実施できる。
【０１８５】
必要に応じて、培地のpHは、望ましいpH、特に、所望のpHに培地を維持するために必要なNaOH若しくは他の塩基などの塩基又は酸の添加による約7のpHなどの中性のpHで維持できる。増殖速度は、分光光度計（600nm）を使用する光学密度及び経時炭素源枯渇をモニタすることによるグルコース取込み速度を測定することにより決定できる。
【０１８６】
上記の例証されたものなどの再生可能原料に加え、本発明のイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール微生物は、その炭素源として合成ガスにおける増殖のために修飾することもできる。この具体的実施態様において、1以上のタンパク質又は酵素は、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール産生生物において発現され、合成ガス又は他のガスの炭素源の利用のための代謝経路を提供する。
【０１８７】
本発明の生物が増殖供給源として合成ガス及び／又はメタノールを利用するように設計されているにもかかわらず、それらは、例えば、非天然存在型微生物に炭素源を供給できる任意の炭水化物源を利用することもできる。当該供給源は、例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース及びデンプンなどの糖を含む。炭水化物の他の供給源には、例えば、再生可能原料及びバイオマスを含む。本発明の方法の原料として使用できる例示的な型のバイオマスは、セルロースバイオマス、ヘミセルロースバイオマス及びリグニン原料又は原料部分を含む。当該バイオマス原料は、例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース及びデンプンなどの炭素源として有用な炭水化物基質を含む。本明細書に提供される教示及びガイダンスを与えられた場合、当業者は、上記で例証されたもの以外の再生可能原料及びバイオマスも、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールの産生のための本発明の微生物を培養するために使用できることを理解するであろう。
【０１８８】
したがって、本明細書に提供される教示及びガイダンスを与えられた場合、当業者は、CO及び／又はCO2などの炭素源で増殖する場合に本発明の生合成された化合物を分泌する非天然存在型微生物を作成できることを理解するであろう。当該化合物は、例えば、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール、及びイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール経路の任意の代謝中間体を含む。要求されることの全ては、1以上の要求される酵素又はタンパク質活性を操作し、例えば、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生合成経路の一部若しくは全部の包含を含む、所望の化合物又は中間体の生合成を達成することである。したがって、本発明は、炭水化物又は他の炭素源で増殖する場合にイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールを産生及び／又は分泌する非天然存在型微生物、並びに炭水化物又は他の炭素源で増殖する場合にイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール経路に示される代謝中間体のいずれかを産生及び／又は分泌する非天然存在型微生物を提供する。本発明のイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール産生微生物は、中間体（例えば、アセチル-CoA）から合成を開始できる。
【０１８９】
本発明の非天然存在型微生物は、本明細書に例証される当該技術分野において周知の方法を使用して、十分な量でイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール経路酵素又はタンパク質をコードする少なくとも1つの核酸を外来的に発現し、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールを産生するように構築される。本発明の微生物は、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールを産生するのに十分な条件下で培養されることが理解される。本明細書に提供される教示及びガイダンスに従い、本発明の非天然存在型微生物は、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールの生合成を達成でき、約0.1〜2000mM又はそれを上回る細胞内濃度を生じる。通常、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールの細胞内濃度は、約3〜1800mM、具体的には約5〜1700mM、及びより具体的には約8〜1600mM（約100mM、200mM、500mM、800mM、又はそれ以上を含む）である。各々のこれらの例示的な範囲の間及びそれを上回る細胞内濃度も、本発明の非天然存在型微生物から提供できる。
【０１９０】
いくつかの実施態様において、培養条件は、嫌気性若しくは実質的に嫌気性増殖又は維持条件を含む。例示的な嫌気的条件は先に記載されており、当該技術分野において周知である。発酵プロセスのための例示的な嫌気的条件は本明細書に記載されており、例えば、2007年8月10日に出願の米国特許出願シリアル番号第11/891,602号に記載されている。任意のこれらの条件は、非天然存在型微生物と共に、並びに当該技術分野において周知の他の嫌気的条件と共に、利用できる。当該嫌気的条件の下で、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生産体は、5〜10mM又はそれ以上の細胞内濃度、並びに本明細書に例証される他の全ての濃度で、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールを合成できる。上記の記載が細胞内濃度に関する場合であっても、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール産生性微生物は、細胞内にイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールを産生することができ、及び／又は培地に生成物を分泌できることが理解される。
【０１９１】
培養条件には、例えば、液体培養手順並びに発酵及び他の大量培養手順を含み得る。本明細書に記載されるように、特に本発明の生合成生成物の有用な収率は、嫌気性若しくは実質的に嫌気性培養条件の下で得ることができる。
【０１９２】
本明細書に記載されるように、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールの生合成を達成するための1つの例示的な増殖条件には、嫌気培養又は発酵条件を含む。ある種の実施態様において、本発明の非天然存在型微生物は、嫌気性若しくは実質的に嫌気性条件下で持続でき、培養でき、又は発酵できる。簡潔にいうと、嫌気条件は、酸素を欠く環境に関する。実質的嫌気性条件には、例えば、培地の溶存酸素濃度が飽和の0〜10%であるような培養、バッチ発酵又は連続発酵を含む。実質的嫌気性条件には、1%未満の酸素雰囲気で維持される密封チャンバ内での液体培地における又は固体寒天上の増殖若しくは静止細胞も含む。酸素のパーセントは、例えば、N2/CO2混合又は他の適切な非酸素ガスで該培養物を散布することにより維持できる。
【０１９３】
本明細書に記載される培養条件は拡張でき、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールの生産のために連続増殖できる。例示的な増殖手順には、例えば、流加バッチ発酵及びバッチ分離；流加バッチ発酵及び連続分離、又は連続発酵及び連続分離を含む。これらのプロセスの全ては、当該技術分野において周知である。発酵手順は、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールの商業的な量の生合成産生に特に有用である。通常、及び非連続培養手順を用いるものとして、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールの連続及び／又は近連続産生は、対数期の増殖を維持及び／又は大部分維持するために十分な栄養素及び培地における本発明の非天然存在型イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール産生微生物を培養することを含む。当該条件下での連続培養には、例えば、1、2、3、4、5、6若しくは7日又はそれ以上を含み得る。加えて、連続培養には、1、2、3、4若しくは5週又はそれ以上でかつ最長数ヵ月を含み得る。あるいは、本発明の生物は、特定の適用に適する場合、何時間も培養できる。連続及び／又は近連続培養条件もこれらの例示的な期間の間の全ての時間的間隔を含み得ることは理解されるべきである。本発明の微生物を培養する時間は、所望の目的のために十分な量の生成物を産生するために十分な期間に関することが更に理解される。
【０１９４】
発酵手順は、当該技術分野において周知である。簡潔にいうと、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールの生合成産生のための発酵は、例えば、流加バッチ発酵及びバッチ分離；流加バッチ発酵及び連続分離、又は連続発酵及び連続分離において利用できる。バッチ及び連続発酵手順の例は、当該技術分野において周知である。
【０１９５】
相当量のイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールの持続産生のための本発明のイソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生産体を使用する上記発酵手順に加え、該イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオール生産体は、例えば、必要に応じて、該生成物を他の化合物へと変換する化学合成手順に同時に供し、又は該生成物を該発酵培養物から分離し、該生成物を他の化合物へと変換する化学変換に順次供することができる。
【０１９６】
合成ガス発酵のための重要なプロセスの考慮は、高いバイオマス濃度及び良好な気液物質移動である（Bredwellらの文献, Biotechnol Prog. 15:834-844 (1999))。水中のCOの溶解性は、酸素の溶解性よりもやや低い。連続的にガスを散布された発酵は、質量分析及び経時液体サンプリングによる定常オフガス分析、並びにGC及びHPLCによる分析を有する制御発酵槽において実施できる。液相は、バッチモードで機能できる。アルコール、有機酸及び残留メタノールを伴う残留グルコースなどの発酵産物は、HPLC（Shimadzu, Columbia MD）により、例えば、Aminex（登録商標）シリーズのHPLCカラム(例えば、HPX-87シリーズ) (BioRad, Hercules CA)を使用して、グルコース及びアルコールのための屈折率検出器を使用して、及び有機酸のためのUV検出器により、定量化される。増殖速度は、分光光度計（600nm）を使用する光学密度を測定することにより決定される。これらのシステムの全ての配管は、嫌気的条件を維持するガラス又は金属である。ガス散布は、泡サイズを減少させ、物質移動を向上させるガラスフリットにより実施される。様々な散布速度が試験され、それは約0.1〜1vvm（分当たりの蒸気量）の範囲である。ガス取込み速度の正確な測定を得るために、ガス流が一時的に止められる定期的なチャレンジが実施され、該気相組成物は時間の関数としてモニタされる。
【０１９７】
全体の目標産生性を達成するために、細胞保持又はリサイクルの方法が利用される。微生物濃度を上昇させる1つの方法は、側流から接線流膜を介して細胞をリサイクルすることである。ムーレラによる酢酸の産生について先に記載されたように（Sakaiらの文献, J Biosci.Bioeng 99:252-258(2005)）、反復バッチ培養を使用することもできる。様々な他の方法も使用できる（Bredwellらの文献, Biotechnol Prog. 15:834-844 (1999); Datarらの文献, Biotechnol Bioeng 86:587-594 (2004)）。物質移動を改良するための1.5気圧で超過圧などのさらなる最適化が試験できる（Najafpour及びYounesiの文献, Enzyme and Microbial Technology 38[1-2], 223-228 (2006)）。
【０１９８】
供給物として純粋なH2/COを使用していったん満足な性能が達成されたら、商業的な合成ガスに存在しそうな阻害剤を含む合成ガス混合物を生産する。例えば、典型的な不純物プロフィールは、4.5%のCH4、0.1%のC2H2、0.35%のC2H6、1.4%のC2H4及び150ppmの一酸化窒素である（Datarらの文献、Biotechnol Bioeng 86：587-594(2004)）。ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、p-キシレン、o-キシレン及びナフタレンなどの化合物により表されるタールをppmレベルで添加し、産生における任意の効果について試験する。例えば、40ppmのNOがC.カルボキシジボランス（C. carboxidivorans）に阻害的であることが示された（Ahmed及びLewisの文献, Biotechnol Bioeng 97:1080-1086 (2007))。培養物は、発酵槽へ移動する前に、振とうフラスコ培地において試験される。これらの異なるレベルの潜在的阻害性化合物は、それらが細胞増殖において有する効果を定量化するために試験される。この知識を使用して合成ガス純度についての明細書を展開し、これはスケールアップ研究及び産生のために利用される。任意の特定の成分をスケールアップのために使用する合成ガスから減少又は除去するのが困難であるとわかった場合、適応進化手順は、1以上の不純物を許容させるように細胞を適応させるために利用される。
【０１９９】
より良好な生産体を生成するために、代謝モデリングは、増殖条件を最適化するために利用できる。モデリングは、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計するために使用することもできる（例えば、米国特許公報US 2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654及びUS 2004/0009466、並びに米国特許第7,127,379号を参照されたい）。モデリング分析は、イソプロパノール、4-ヒドロキシ酪酸又は1,4-ブタンジオールのより効率的な産生の方へ代謝をシフトさせる細胞増殖への効果において信頼性の高い予測を可能にする。
【０２００】
所望の生成物の生合成を支持する代謝的変更を同定及び設計するための1つの計算方法は、OptKnock計算フレームワークである（Burgardらの文献, Biotechnol. Bioeng. 84:647-657 (2003))。OptKnockは代謝モデリング及びシミュレーションプログラムであり、目標生成物を過剰産生する遺伝的に安定な微生物を生じる遺伝子欠失戦略を示唆する。具体的には、該フレームワークは、所望の生化学が、細胞増殖の義務的副産物にさせる遺伝子操作を示唆するために、微生物の完全な代謝的及び／又は生化学的ネットワークを調べる。戦略的に配置された遺伝子欠失又は他の機能的な遺伝子破壊による細胞増殖での共役的生化学産生により、バイオリアクタでの長期間後の該操作された株に課される増殖淘汰圧は、強制的な増殖共役的生化学産生の結果として、性能の向上につながる。最後に、遺伝子欠失が構築される場合、OptKnockにより選択される遺伝子がゲノムから完全に除去されるので、該設計株はその野生型状態に復帰するごくわずかな可能性がある。従って、この計算方法論は、所望の生成物の生合成をもたらす代替経路を同定することに使用でき、又は所望の生成物の更なる最適化のために非天然存在型微生物との関連で使用できる。
【０２０１】
簡潔にいうと、OptKnockは、細胞代謝をモデル化するための計算方法及びシステムに言及するために本明細書において使用される用語である。OptKnockプログラムとは、特定の制約を流動バランス分析（FBA）モデルに組み込むモデル及び方法のフレームワークをいう。これらの制約には、例えば、質的な動力学的情報、質的な制御情報、及び／又はDNAマイクロアレイ実験データを含む。OptKnockは、例えば、遺伝子追加又は欠失の存在下で、流動バランスモデルに由来する流動境界を厳しくすること、及びその後代謝ネットワークの性能限界を探査することにより、様々な代謝課題に対する解も計算する。OptKnock計算フレームワークは、代謝ネットワークの性能限界の有効な問合わせを可能にするモデル化の構築を可能にし、その結果としての混合整数線形プログラム課題を解決するための方法を提供する。本明細書においてOptKnockと称される代謝モデリング及びシミュレーション方法は、例えば、2002年1月10日に出願された米国公報第2002/0168654号、2002年1月10日に出願の国際特許番号PCT/US02/00660、及び2007年8月10日に出願の米国特許出願シリアル番号第11/891,602号に記載されている。
【０２０２】
生成物の生合成産生を支持する代謝的変更を同定及び設計する別の計算方法は、SimPheny（登録商標）と称される代謝モデリング及びシミュレーションシステムである。この計算方法及びシステムは、例えば、2002年6月14日に出願の米国公報2003/0233218号、及び2003年6月13日に出願の国際特許出願番号PCT/US03/18838に記載されている。SimPheny（登録商標）は、インシリコでネットワークモデルを作成し、生物系の化学反応を介する質量、エネルギー又は電荷の流れをシミュレートして、該系における化学反応の任意の及び全ての可能的機能性を含む解空間を規定するために使用できる計算体系であり、これにより該生物系に許容される活性の範囲を測定する。このアプローチは、該解空間が、該包含される反応の公知の化学量論などの制約、並びに反応による最大流と関連する反応熱力学及び容量制約により規定されるので、制約系モデリングと呼ばれる。これらの制約により規定される空間は、該生物系の、又はその生化学成分の表現型能力及び挙動を決定するために調べることができる。
【０２０３】
微生物系は柔軟で、かつ多くの異なる経路で同じ結果に達し得るので、これらの計算的アプローチは微生物学的現実と整合する。生物系は、全ての生物系が対面しなければならない根本的制約により制限された進化的機構により設計される。従って、制約系モデリング戦略は、これら全般的現実を包含する。更に、制約の厳しさを介して連続的に更なる制御をネットワークモデルに課す能力は、該解空間のサイズの減少を生じ、これにより生理的性能又は表現型が予測できる精度を強化する。
【０２０４】
本明細書に提供される教示及びガイダンスを与えられた場合、当業者は、様々な計算フレームワークを、宿主微生物の所望の化合物の生合成を操作して実行させるための代謝モデリング及びシミュレーションに適用できる。当該代謝モデリング及びシミュレーション方法には、例えば、SimPheny（登録商標）及びOptKnockとして先に例証される計算システムを含む。本発明の説明のために、いくつかの方法は、モデリング及びシミュレーションについてのOptKnock計算フレームワークに関して本明細書に記載される。当業者は、OptKnockを当該技術分野において周知の任意のそのような他の代謝モデリング及びシミュレーション計算フレームワークに使用する、代謝的変更の同定、設計及び実施の適用法を知っているであろう。
【０２０５】
上記の方法は、破壊する1セットの代謝反応を提供する。該セットの範囲内の各反応の除去又は代謝的修飾は、該生物の増殖相の間の義務的生成物として、所望の生成物を生じ得る。該反応は公知であるので、二相性のOptKnock課題への解は、反応のセット中の各反応を触媒する1以上の関連する酵素をコードする遺伝子も提供する。反応のセット及び各反応に参加する酵素をコードするそれらの対応する遺伝子の同定は、通常、自動化されたプロセスであり、酵素とコード遺伝子との関係を有する反応データベースと反応の相関を介して達成される。
【０２０６】
いったん同定されたならば、所望の生成物の産生を達成するために破壊される反応のセットは、該セットの範囲内で各代謝反応をコードする少なくとも1つの遺伝子の機能的な破壊により標的の細胞又は生物において行う。該反応セットの機能的な破壊を達成する1つの特に有用な手段は、各コード遺伝子の削除によるものである。しかしながら、いくつかの例において、例えば、突然変異、プロモータ若しくは制御因子のためのシス結合部位などの制御領域の欠失を含む他の遺伝的異常により、又は任意のいくつかの位置でのコード配列の切除により該反応を破壊することは、有益であり得る。これらの後者の異常は、当該遺伝子セットの全欠失よりも低い欠失を生じ、例えば、生成物の共役の迅速な調査が望まれる場合、又は遺伝的復帰が起こる可能性が低い場合に有用であり得る。
【０２０７】
所望の生成物の増殖共役生合成を含む生合成を生じ得る破壊又は代謝修飾に更なる反応のセットをもたらす上記した二相性のOptKnock課題に対するさらなる産生的な解法を同定するために、整数カットと称される最適化方法を行うことができる。この方法は、先に例証したOptKnock課題を、反復相での整数カットと称されるさらなる制約の組込みで反復して解くことにより進められる。整数カット制約は、生成物生合成を義務的に増殖に共役させる任意の以前の反復において同定される反応の正確な同一セットを選択することから、効果的に解答手順を予防する。例えば、以前に同定された増殖共役代謝修飾が破壊のための反応1、2及び3を特定する場合、以下の制約は次の解答において同時とみなされることから前記同反応を予防する。整数カット方法は、当該技術分野において周知であり、例えばBurgardらの文献, Biotechnol. Prog. 17:791-797(2001)の記載に見出すことができる。代謝モデリング及びシミュレーションに対するOptKnock計算フレームワークと組み合わせてのそれらの使用に関して本明細書に記載される全ての方法と同様に、反復的な計算分析の冗長性を低減する整数カット法は、例えばSimPheny（登録商標）を含む当該技術分野において周知の他の計算フレームワークと共に適用することもできる。
【０２０８】
本明細書に例証される方法は、同定された遺伝的変更を含むように操作された細胞又は生物の増殖に標的生化学的生成物の産生の義務的カップリングを含む、所望の生成物を生合成的に産生する細胞及び生物の構築を可能にする。従って、本明細書に記載される計算方法は、OptKnock又はSimPheny（登録商標）から選択されるインシリコ法により同定される代謝修飾の同定及び実施を可能にする。代謝修飾のセットには、例えば、1以上の生合成経路酵素の添加及び／又は例えば遺伝子欠失による破壊を含む1以上の代謝反応の機能的な破壊を含み得る。
【０２０９】
上記のように、OptKnock方法論は、長期の増殖選択に供する場合、変異体微生物ネットワークがそれらの計算的に予測された最高増殖表現型の方へ進化できるという前提に開発された。換言すれば、該アプローチは、選択圧の下で自己最適化する微生物の能力を活用する。OptKnockフレームワークは、ネットワーク化学量論に基づく生化学的産生と細胞増殖との間の共役を推進する遺伝子欠失の組合せの包括的な列挙を可能にする。最適な遺伝子/反応ノックアウトの同定は、結果として産生されるネットワークのための最適な増殖が関心対象の生化学的産物を過剰産生するように、活性な反応のセットを選択する二相性の最適化課題の解を必要とする（Burgardらの文献, Biotechnol. Bioeng. 84:647-657 (2003))。
【０２１０】
大腸菌代謝のインシリコ化学量論的モデルは、先に例証されたように、及び例えば、米国特許公報US 2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168 654及びUS 2004/0009466並びに米国特許第7,127,379号において記載されているように、代謝経路のための必須遺伝子を同定するために利用できる。本明細書に開示するように、OptKnock数学的フレームワークは、所望の生成物の増殖共役産生をもたらすピンポイントでの遺伝子欠失に適用できる。更に、二相性のOptKnock課題の解は、1セットの欠失のみを提供する。全ての意味がある解、すなわち、増殖共役産生形成をもたらすノックアウトの全セットを列挙するために、整数カットと称される最適化技術を行うことができる。これは、上記のように、各反復で整数カットと称されるさらなる制約の組込みを用いてOptKnock課題を反復的に解くことを課す。
【０２１１】
本発明の各種実施態様の活性に実質的には効果を及ぼさない修飾も本明細書に提供される本発明の定義に含まれることが理解される。したがって、以下の実施例は、本発明の限定ではなく、例証を意図するものである。
【実施例】
【０２１２】
（実施例１）：大腸菌におけるACS/CODH遺伝子挿入
この実施例は、CODH、ACS、メチルトランスフェラーゼ、及びコリノイド鉄-硫黄タンパク質のために要求されるものを含む、M.サーモアセチカのACS/CODHオペロン遺伝子を発現する大腸菌プラスミドの作成を記載する。この実施例は、観察可能なCO酸化活性、メチルトランスフェラーゼ活性及びコリノイド鉄-硫黄タンパク質活性を生じる大腸菌におけるそれらの発現を更に記載する。最後に、この実施例は、大腸菌が高いCO濃度を許容し、かつM.サーモアセチカ由来のCO利用遺伝子産物が発現される場合にCOを消費することさえできることを実証する。
【０２１３】
発現ベクターは、Lutz及びBujardにより記載されているセットから選択され（Lutz及びBujardの文献, Nucleic Acids Res 25: 1203-1210 (1997))；これらは、コピー数の範囲をカバーする互換性を持つレプリコンを備える。加えて、各々は、prA1-laco1を含み；このT7初期遺伝子プロモータはIPTGにより誘導可能であり、IPTGの存在下で非常に高いレベルの転写をもたらすことができ、かつ他の条件において抑制できる。ACS/CODH-コードオペロンは、Moth_1204（cooC）からMoth_1197までクローン化し；Moth_1203からMoth_1197のみを含む第2バージョンも構築した。これらの断片（10〜11kbp）の両方とも、DNA塩基配列分析により確認された。これらは、高コピー数に対する培地のためのp15A及びColE1系ベクターの両方において構築された。
【０２１４】
組換え型タンパク質の終濃度を概算するために、SDS-PAGE及びそれに続くウエスタンブロット解析は、CO酸化、ACS、メチルトランスフェラーゼ、及びコリノイドFe-Sアッセイにおいて使用されるのと同じ細胞抽出物で実施した。使用される抗血清は、精製されたM.サーモアセチカのACS/CODH及びMtrタンパク質に対するポリクローナルであり、アルカリホスファターゼに連結されたヤギ-抗-ウサギ二次抗体を使用して視覚化した。ウエスタンブロットは、図4A及び4Bに示される。ACS90及びACS91におけるCODHの量は、コントロールレーンに対する比較により50ngと概算された。
【０２１５】
一酸化炭素酸化アッセイ（Seravalliらの文献、Biochemistry 43：3944-3955(2004)）は、M.サーモアセチカ由来のCODHコード遺伝子の機能発現が達成されたか否かを試験するために使用した。空ベクター、又は「Acs90」若しくは「Acs91」を発現するベクターを含む大腸菌MG1655の培養は、嫌気的条件下（シアノコバラミン、第一鉄及び還元剤を補充）のTerrific Brothで中高密度になるまで培養し、その時点でIPTGを終濃度0.2mMで添加してプロモータを誘導した。37℃で3.5時間の増殖後、該細胞を回収してスピンダウンした後、リゾチーム及び弱性界面活性剤で溶解させた。M.サーモアセチカ CODHの比活性に係るベンチマークとなる数値は、55℃での500U又は25℃での~60Uである。このアッセイには、COの存在下におけるメチルビオローゲンの還元を利用した。これは、栓をつけられた嫌気的なガラスキュベットにおいて578nmで測定される。CODHによるCO酸化に陽性の反応は、濃紫色に変わった（図5を参照）。約0.5%の細胞タンパク質は、ウエスタンブロッティングにより概算したようにCODHであり、従って、表35のデータは、純粋なM.サーモアセチカ CODHの500U/mg活性よりもおよそ50倍低い。それにもかかわらず、この実験は、ネガティブコントロールにおいて非常に少量の組換え大腸菌においてCO酸化活性を明らかに示した。ネガティブコントロールに示される少量のCO酸化（CH3ビオローゲン還元）は、大腸菌がCH3ビオローゲンを還元する限られた能力を有し得ることを示す。
【０２１６】
【表３５】
2012511928.tif 000037
【０２１７】
このアッセイは、ACS/CODH、メチルトランスフェラーゼ、及びCFeSPを使用して、メチル-テトラヒドロ葉酸、CO及びCoAからアセチル-CoAを合成するインビトロ反応である（Raybuckらの文献, Biochemistry 27:7698-7702 (1988)）。各々の関与する酵素を加える、又は除去することにより、このアッセイ法は、様々な条件下で、又は限定的な量の基質若しくは酵素を用いて、活性について1以上の精製された酵素又は細胞抽出物を試験することから該反応の動態を決定することまでの広範囲の実験に使用できる。様々な時点に取得される反応のサンプルは、アセチル-CoA最終産物から酢酸を遊離させる1M HClによりクエンチされる。Dowexカラムを用いた精製の後、酢酸は、クロマトグラフィ、質量分析により、又は放射能を測定することにより解析できる。正確な方法は、反応において使用される特定の基質により決定されるであろう。
【０２１８】
このアッセイは、大腸菌において発現されるACS/CODHオペロンがFe-Sコリノイドタンパク質活性において発現するか否かを決定するために、実行した。従って、14C標識メチル-THFは、単離された酢酸サンプルへの放射能組込みにより酢酸合成を測定するための標識された基質として使用した。6つの異なる条件を試験した：
ポジティブコントロールとしての精製されたACS/CODH、MeTr及びCFeSP
ACS90細胞抽出物を用いて精製されたACS/CODH
ACS91細胞抽出物を用いて精製されたACS/CODH
ACS90細胞抽出物を用いて精製されたACS/CODH、MeTr
ACS91細胞抽出物を用いて精製されたACS/CODH、MeTr
（MES緩衝液を除き）可能な限りACS91細胞抽出物と同程度の精製されたACS/CODH、MeTr
【０２１９】
該反応は、嫌気的なチャンバにおいて、COを充填したアッセイバイアルに収集される。総反応体積はバイアル体積に比較して小さく、試薬はCOでの充填前に加え、気密ハミルトンシリンジを使用し、かつ該試薬は嫌気的に保った。該反応（合計〜60μl）は、細胞抽出物（#1を除く）、CoA、クエン酸Ti(III)、MES（#6を除く）、精製ACS/CODH、14 C-メチル-テトラヒドロ葉酸、メチル-ビオローゲン、及びフェレドキシンから構成された。さらに、精製MeTrを#1に加え、#4〜6及び精製CFeSPを#1に加えた。
【０２２０】
該反応は、嫌気的なチャンバにおいて55度の砂浴で実施した。添加した最終試薬は14 C-メチルテトラヒドロ葉酸であり、これが反応を開始した（t=0秒）。最初のサンプルは直後に取り、その後30分、1時間及び2時間にサンプルを取った。6つの条件が並行していたので（この実験が主に質的なものであったので）、これらの時点は正確でない。15μlのサンプルを、シンチレーションバイアル中の15μlの1M HClに添加した。反応混合物を計数した後、ACS90抽出物中のコリノイドFe-Sタンパク質はポジティブコントロールのおよそ1/5に近い総活性を有する活性であることが測定された。
【０２２１】
ACS/CODHオペロン内に、アセチル-CoAの合成の一部としてのメチルテトラヒドロ葉酸からACS複合体へのCH3の移転を触媒する、必須メチルトランスフェラーゼ活性がコードされる（すなわち、これは、メチル及びカルボニル経路が互いに連結した工程である）。M.サーモアセチカのオペロン内において、Mtrコード遺伝子はMoth_1197であり、主なCODH及びACSサブユニットの後にある。従って、Mtr活性は、より近位の遺伝子が発現できる間接的な証拠を構成するであろう。
【０２２２】
Mtr活性は、分光学によりアッセイした。具体的には、Co(III)を伴うメチル化CFeSPは~450nmに小さい吸収ピークを有するが、Co(I)を伴う非メチル化CFeSPは~390nmに大きなピークを有する。このスペクトルは、コバルト及び鉄-硫黄クラスタ発色団の両方に起因する。さらに、CFeSPはCo(II)へと自発的に酸化でき、これが~470nmで広い吸収ピークを作成することに留意すべきである（Seravalliらの文献, Biochemistry 38:5728-5735 (1999)）。ACS90を含む大腸菌細胞からの結果についての図6を参照されたい。
【０２２３】
大腸菌がCOの飽和量存在下で嫌気的に増殖できるか否かを試験するために、50mlのTerrific Broth培地（NiCl2、Fe(II)NH4SO4及びシアノコバラミンを添加）を有する120mlの血清瓶を嫌気的条件において作成した。これらの瓶の1/2は30分間窒素ガスで平衡化し、1/2は30分間COガスにより平衡化した。空ベクター（pZA33）をコントロールとして使用し、該空ベクター並びにACS90及びACS91の両方をN2及びCOの両方で試験した。全ては、37℃で振盪（250rpm）しながら36時間増殖させた。36期間の最後でのフラスコの検出は、全てにおいて大量の増殖を示した（図7）。観測した増殖の大部分は、若干の（低いが見える）密度の長遅延を伴い一晩で起こった。接種原のサイズは、大腸菌株由来の~0.5 mlであった。
【０２２４】
最終的なCO濃度は、COへの曝露と同時にミオグロビンのスペクトルシフトのアッセイを使用して測定される。亜ジチオン酸ナトリウムで還元されるミオグルビンは、435nmに吸光度ピークを有し；このピークはCOを伴い423nmにシフトする。低波長（及び300nm以上の全スペクトルを記録する必要）のため、石英キュベットを使用しなければならない。CO濃度は、標準曲線に対して測定し、20℃かつ1気圧で最大水溶性が970μMのCOのためのヘンリー則定数に拠る。
【０２２５】
表36に示される結果は、非常に励みになる。株がCOの存在下又は不在下で培養されたか否かに関わらず、増殖は同程度のレベル（目視検出により）に達した。さらに、ネガティブコントロールは、ACS/CODHオペロン発現株についての688及び728μMに対し、930μMの最終CO濃度を有した。明らかに、これらの測定における誤差は、大きな標準偏差を考慮すると高い。それにもかかわらず、この試験は、2つの仮の結論を可能にする：1)大腸菌は嫌気的条件下でのCOへの曝露に許容し得る、及び2）ACS/CODHオペロンを発現する大腸菌細胞はCOの一部を代謝している可能性がある。第2の結論は第1の結論よりも著しく確実性が低い。
【０２２６】
【表３６】
2012511928.tif 000038
【０２２７】
本出願の全体にわたって、様々な刊行物は括弧内に参照されている。これらの刊行物の全体の開示は、本発明が関係する当該技術分野の水準をより完全に記載するため、引用により本明細書に組み込まれる。本発明は開示された実施態様に関して記載されているが、当業者は、先に詳述した具体的実施例及び研究が本発明の単なる例証であることを容易に認めるであろう。様々な修飾が本発明の精神を逸脱しない範囲でなされ得ることを理解すべきである。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
2012511928.tif 000039
【図２Ａ】
2012511928.tif 000040
【図２Ｂ】
2012511928.tif 000041
【図２Ｃ】
2012511928.tif 000042
【図２Ｄ】
2012511928.tif 000043
【図３Ａ】
2012511928.tif 000044
【図３Ｂ】
2012511928.tif 000045
【図３Ｃ】
2012511928.tif 000046
【図４】
2012511928.tif 000047
【図５】
2012511928.tif 000048
【図６】
2012511928.tif 000049
【図７】
2012511928.tif 000050
【国際調査報告】
2012511928.tif 000051
2012511928.tif 000052
2012511928.tif 000053