(57)【要約】  蛍光発生ペプチド基質を使用してプラスミン活性を決定するための組成物、キットおよび方法が提供される。【選択図】  図１
2012517435.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
Ｒｍ−［Ａｎ３Ａ２Ａ１］−Ｘ                （Ｉ）
［式中，
Ａ１はＬｙｓであり；Ａ２はＰｈｅであり；Ａ３はアミノ酸残基であり；
Ｒはピログルタミン酸またはＮ−末端保護基であり；
Ｘは蛍光発生基であり；
ｍは０または１であり；そして
ｎは整数≧０である］
の化合物。
【請求項２】
蛍光発生基が、４−（置換）クマリン、クマリン誘導体、ヒドロキシアリルオキシプロピルナフタルイミドｑｕａｔ、４−メトキシ−Ｎ−（３−Ｎ‘Ｎ’−ジメチルアミノプロピル）ナフタルイミド、２−ヒドロキシ−３−アリルオキシプロピルｑｕａｔ、８−（３−ビニルベンジルオキシ）−１，３，６−ピレントリスルホン酸、８−（４−ビニルベンジルオキシ）−１，３，６−ピレントリスルホン酸、８−（アリルオキシ）−１，３，６−ピレントリスルホン酸、１−（置換）ナフタレン、９−（置換）アントラセン、２−（置換）キノリン一塩酸塩、２−（置換）ベンズイミダゾール、５−（置換）フルオレセイン、３−（置換）−６，７−ジメトキシ−１−メチル−２（１Ｈ）−キノキサゾリノン、それらの混合物およびそれらの誘導体からなる群から選ばれる、請求項１の化合物。
【請求項３】
蛍光発生基が７−アミノ−４−メチルクマリンである、請求項１の化合物。
【請求項４】
Ｒがピログルタミン酸である、請求項の１の化合物。
【請求項５】
Ｎ−末端保護基が、アシル保護基、芳香族ウレタン保護基および脂肪族ウレタン保護基からなる群から選ばれる、請求項１の化合物。
【請求項６】
Ｎ−末端保護基がスクシニルまたはメトキシスクシニルである、請求項１の化合物。
【請求項７】
アシル保護基が、スクシニル、メトキシスクシニル、アセチル、ベンゾイルおよびトリフルオロアセチルからなる群から選ばれる、請求項５の化合物。
【請求項８】
芳香族ウレタン保護基がベンジルオキシカルボニルである、請求項５の化合物。
【請求項９】
脂肪族ウレタン保護基がｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルまたはアダマンチルオキシカルボニルである、請求項５の化合物。
【請求項１０】
ｎ＝０である、請求項１の化合物。
【請求項１１】
ｍ＝１であり、ｎ＝０であり、Ｒがピログルタミン酸であり、Ｘが７−アミノ−４−メチルクマリンである、請求項１の化合物。
【請求項１２】
請求項１の化合物のトリフルオロアセチル誘導体。
【請求項１３】
式：
Ｒｍ−［Ａｎ３Ａ２Ａ１］−Ｘ                （Ｉ）
［式中，
Ａ１はＬｙｓであり；Ａ２はＰｈｅであり；Ａ３はアミノ酸残基であり；
Ｒはピログルタミン酸またはＮ−末端保護基であり；
Ｘは蛍光発生基であり；
ｍは０または１であり；そして
ｎは整数≧０である］
の化合物とプラスミンを接触させることを含む、
プラスミンの活性を決定するための方法。
【請求項１４】
ｎ＝０であり、Ｒがピログルタミン酸であり、Ｘが７−アミノ−４−メチルクマリンである。請求項１３の方法。
【請求項１５】
プラスミンが、血漿由来プラスミノーゲンまたは遺伝子組み換えプラスミノーゲンから調製される、請求項１３の方法。
【請求項１６】
プラスミンと式（Ｉ）によって表される化合物との間の反応によって生産される少なくとも１種のＲ−［Ａｎ３Ａ２Ａ１］およびＸの量を決定することをさらに含み、ここで、プラスミンの活性は、少なくともＲ−［Ａｎ３Ａ２Ａ１］、Ｘまたは両方の量に基づいて決定される、請求項１３の方法。
【請求項１７】
プラスミンと式（Ｉ）によって表される化合物との間の反応によって生産されるＸの量を決定することをさらに含み、ここで、プラスミンの活性はＸの量に基づいて決定される、請求項１３の方法。
【請求項１８】
形成されたＸと本来の化合物との間の蛍光における差異に基づいてプラスミンの活性を決定することをさらに含む、請求項１３の方法。
【請求項１９】
式：
Ｒｍ−［Ａｎ３Ａ２Ａ１］−Ｘ                （Ｉ）
［式中，
Ａ１はＬｙｓであり；Ａ２はＰｈｅであり；Ａ３はアミノ酸残基であり；
Ｒはピログルタミン酸またはＮ−末端保護基であり；
Ｘは蛍光発生基であり；
ｍは０または１であり；そして
ｎは整数≧０である］
の化合物とプラスミンを接触させることを含み、ここで、プラスミンはプラスミンを投与された被験者からの生物学的サンプルから得られる、プラスミンの薬物動態を決定する方法。
【請求項２０】
式：
Ｒｍ−［Ａｎ３Ａ２Ａ１］−Ｘ                （Ｉ）
［式中，
Ａ１はＬｙｓであり；Ａ２はＰｈｅであり；Ａ３はアミノ酸残基であり；
Ｒはピログルタミン酸またはＮ−末端保護基であり；
Ｘは蛍光発生基であり；
ｍは０または１であり；そして
ｎは整数≧０である］
の化合物の存在下で、プラスミンと分子を接触させることを含む、プラスミン活性に影響を与える分子を決定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラスミン活性を決定するため、特に、蛍光発生ペプチド基質、特にクマリン−ペプチド基質を使用してプラスミン活性を決定するための組成物、キットおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プラスミン活性のための発色性基質は、Ｓ−２４０３として既知のペプチドに基づく基質（ｐｙｒｏ−ｇｌｕ−ｐｈｅ−ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド）である。プラスミンはＳ−２４０３のリジン残基後の結合を切断してｐ−ニトロアナリンを遊離することが知られており、そしてｐ−ニトロアナリンの測定がプラスミン活性に直接関連することが示されている。しかしながら、プラスミン活性を決定するための従来の組成物および方法は、検出の特異性および感度を含む限界を有する。
【０００３】
プラスミン活性を決定するための効率的な組成物、キットおよび方法に対するニーズが残されている。
【発明の概要】
【０００４】
プラスミン活性を決定するために有用な基質がここに提供される。
【０００５】
１つの態様では、本発明は、式：
Ｒｍ−［Ａｎ３Ａ２Ａ１］−Ｘ                （Ｉ）
［式中，
Ａ１はＬｙｓであり；Ａ２はＰｈｅであり；Ａ３はアミノ酸残基であり；
Ｒはピログルタミン酸またはＮ−末端保護基であり；
Ｘは蛍光発生基であり；
ｍは０または１であり；そして
ｎは整数≧０である］
の化合物を提供する。
【０００６】
その他の態様では、本発明は、式：
Ｒｍ−［Ａｎ３Ａ２Ａ１］−Ｘ                （Ｉ）
［式中，
Ａ１はＬｙｓであり；Ａ２はＰｈｅであり；Ａ３はアミノ酸残基であり；
Ｒはピログルタミン酸またはＮ−末端保護基であり；
Ｘは蛍光発生基であり；
ｍは０または１であり；そして
ｎは整数≧０である］
の化合物とプラスミンを接触させることを含む、
プラスミンの活性を決定するための方法を提供する。
【０００７】
ある態様では、本発明は、式：
Ｒｍ−［Ａｎ３Ａ２Ａ１］−Ｘ                （Ｉ）
［式中，
Ａ１はＬｙｓであり；Ａ２はＰｈｅであり；Ａ３はアミノ酸残基であり；
Ｒはピログルタミン酸またはＮ−末端保護基であり；
Ｘは蛍光発生基であり；
ｍは０または１であり；そして
ｎは整数≧０である］
の化合物とプラスミンを接触させることを含み、ここで、プラスミンはプラスミンを投与された被験者からの生物学的サンプルから得られる、
プラスミンの薬物動態を決定する方法を提供する。
【０００８】
他の態様では、本発明は、式：
Ｒｍ−［Ａｎ３Ａ２Ａ１］−Ｘ                （Ｉ）
［式中，
Ａ１はＬｙｓであり；Ａ２はＰｈｅであり；Ａ３はアミノ酸残基であり；
Ｒはピログルタミン酸またはＮ−末端保護基であり；
Ｘは蛍光発生基であり；
ｍは０または１であり；そして
ｎは整数≧０である］
の化合物の存在下で、プラスミンと分子を接触させることを含む、
プラスミン活性に影響を与える分子を決定するための方法を提供する。
【０００９】
また、本発明の化合物の１種以上を含んでなるキットが提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
Ｉ．組成物
１つの態様では、本発明は、式：
Ｒｍ−［Ａｎ３Ａ２Ａ１］−Ｘ                （Ｉ）
［式中，
Ａ１はＬｙｓであり；Ａ２はＰｈｅであり；Ａ３はアミノ酸残基であり；
Ｒはピログルタミン酸またはＮ−末端保護基であり；
Ｘは蛍光発生基であり；
ｍは０または１であり；そして
ｎは整数≧０である］
の化合物を提供する。
【００１１】
限定されるものではない蛍光発生基の例は、４−（置換）クマリン、クマリン誘導体、ヒドロキシアリルオキシプロピルナフタルイミドｑｕａｔ、４−メトキシ−Ｎ−（３−Ｎ‘Ｎ’−ジメチルアミノプロピル）ナフタルイミド、２−ヒドロキシ−３−アリルオキシプロピルｑｕａｔ、８−（３−ビニルベンジルオキシ）−１，３，６−ピレントリスルホン酸、８−（４−ビニルベンジルオキシ）−１，３，６−ピレントリスルホン酸、８−（アリルオキシ）−１，３，６−ピレントリスルホン酸、１−（置換）ナフタレン、９−（置換）アントラセン、２−（置換）キノリン一塩酸塩、２−（置換）ベンズイミダゾール、５−（置換）フルオレセイン、３−（置換）−６，７−ジメトキシ−１−メチル−２−（１Ｈ）−キノキサゾリノン、それらの混合物およびそれらの誘導体を含む。
【００１２】
１つの実施態様では、蛍光発生基は７−アミノ−４−メチルクマリンである。
【００１３】
Ｒはピログルタミン酸またはＮ−末端保護基であってもよい。Ｎ−末端保護基は、本発明の化合物のペプチドセグメントのＮ−末端を保護することができる。Ｎ−末端保護基の例は、限定されるものではないが、アシル保護基、芳香族ウレタン保護基および脂肪族ウレタン保護基を含む。例えば、アシル保護基は、スクシニル、メトキシスクシニル、アセチル、ベンゾイルおよびトリフルオロアセチルであってもよい。
【００１４】
１つの実施態様では、Ｒはピログルタミン酸である。
【００１５】
その他の実施態様では、ＲはＮ−末端保護基である。ある実施態様では、Ｎ−末端保護基はスクシニルまたはメトキシスクシニルである。
【００１６】
芳香族ウレタン保護基は、例えば，ベンジルオキシカルボニルであってもよい。
【００１７】
脂肪族ウレタン保護基は、例えば，ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルまたはアダマンチルオキシカルボニルであってもよい。
【００１８】
本発明によれば、ｎは０と同じかまたは０を超える整数であってもよい。ある実施態様では、ｎは３０を超えず、具体的には、ｎは３０，２９，２８，２７，２６，２５，２４，２３，２２，２１，２０，１９，１８，１７，１６，１５，１４，１３，１２，１１，１０，９，８，７，６，５，４，３，２，１および０である。他の実施態様では、ｍは０または１である。１つの実施態様では、ｎ＝０である。その他の実施態様では、ｍ＝１の場合のｎ＝０である。
【００１９】
他の実施態様では、ｍ＝１、ｎ＝０であり、Ｒはピログルタミン酸であり、そしてＸは７−アミノ−４−メチルクマリンである。例えば、化合物はｐｙｒｏ−ｇｌｕ−ｐｈｅ−ｌｙｓ−７−アミド−４−メチルクマリンとして特徴づけてもよい。
【００２０】
他の実施態様では、本発明は化合物のトリフルオロアセチル誘導体を提供する。
【００２１】
ＩＩ．方法
その他の態様では、本発明は、式：
Ｒｍ−［Ａｎ３Ａ２Ａ１］−Ｘ                （Ｉ）
［式中，
Ａ１はＬｙｓであり；Ａ２はＰｈｅであり；Ａ３はアミノ酸残基であり；
Ｒはピログルタミン酸またはＮ−末端保護基であり；
Ｘは蛍光発生基であり；
ｍは０または１であり；そして
ｎは整数≧０である］
の化合物とプラスミンを接触させることを含む、
プラスミンの活性を決定するための方法を提供する。
【００２２】
１つの実施態様では、ｍ＝１、ｎ＝０であり、Ｒはピログルタミン酸であり、そしてＸは７−アミノ−４−メチルクマリンである。例えば、化合物はｐｙｒｏ−ｇｌｕ−ｐｈｅ−ｌｙｓ−７−アミド−４−メチルクマリンとして特徴づけてもよい。
【００２３】
活性が決定されるプラスミンは、いかなる起源から得られてもよい。ある実施態様では、プラスミンは、限定されるものではないが、血液、血清、血漿、精液および尿を含む、生物学的流体中に存在する。他の実施態様では、プラスミンは、例えば、ストレプトキナーゼのようなプラスミノーゲン活性化因子によりプラスミノーゲンを活性化することによって調製される。例えば、プラスミノーゲンは、血漿由来かまたは遺伝子組み換えによるプラスミノーゲンであってもよい。ある実施態様では、プラスミンはヒトのプラスミンである。非ヒト由来のプラスミンは、また、マウス、ラット、サル、ネコ、イヌ、ウマ、ウシなどのプラスミンを含むことが本発明によって意図される。
【００２４】
１つの実施態様では、方法はさらに、プラスミンと式（Ｉ）によって表される化合物との間の反応によって生産される少なくとも１種の反応生産物の量を決定することを含む。例えば、Ｒｍ−［Ａｎ３Ａ２Ａ１］、Ｘまたは両方の量が決定されてもよく、ここで、プラスミンの活性は、Ｒｍ−［Ａｎ３Ａ２Ａ１］、Ｘまたは両方の量に基づいて決定される
。
【００２５】
その他の実施態様では、方法はさらに、プラスミンと式（Ｉ）によって表される化合物との間の反応によって生産されるＸの量を決定することを含み、ここで、プラスミンの活性はＸの量に基づいて決定される。
【００２６】
他の実施態様では、方法はさらに、形成されたＸと本来の化合物との間の蛍光における差異に基づいてプラスミンの活性を決定することを含む。
【００２７】
ある態様では、本発明はプラスミンの薬物動態を決定する方法を提供する。例えば、方法は、投与後の時間にわたって種々の生理学的部位における投与されたプラスミンの存在および／または量を決定することを可能にする。薬物動態は、投与されたプラスミンのレベルを調査することによって評価することができる。方法はさらに、プラスミンの吸収および分布、プラスミンの化学的修飾、ならびにプラスミンの貯蔵および排除等々を追跡することを含んでもよい。
【００２８】
１つの実施態様では、本発明は、式：
Ｒｍ−［Ａｎ３Ａ２Ａ１］−Ｘ                （Ｉ）
［式中，
Ａ１はＬｙｓであり；Ａ２はＰｈｅであり；Ａ３はアミノ酸残基であり；
Ｒはピログルタミン酸またはＮ−末端保護基であり；
Ｘは蛍光発生基であり；
ｍは０または１であり；そして
ｎは整数≧０である］
の化合物とプラスミンを接触させることを含み、ここで、プラスミンはプラスミンを投与された被験者からの生物学的サンプルから得られる、
プラスミンの薬物動態を決定する方法を提供する。１つの実施態様では、ｍ＝１、ｎ＝０であり、Ｒはピログルタミン酸であり、Ｘは７−アミノ−４−メチルクマリンである。
【００２９】
他の態様では、本発明は、式：
Ｒｍ−［Ａｎ３Ａ２Ａ１］−Ｘ                （Ｉ）
［式中，
Ａ１はＬｙｓであり；Ａ２はＰｈｅであり；Ａ３はアミノ酸残基であり；
Ｒはピログルタミン酸またはＮ−末端保護基であり；
Ｘは蛍光発生基であり；
ｍは０または１であり；そして
ｎは整数≧０である］
の化合物の存在下で、プラスミンと分子を接触させることを含む、
プラスミン活性に影響を与える分子を決定するための方法を提供する。１つの実施態様では、ｍ＝１、ｎ＝０であり、Ｒはピログルタミン酸であり、Ｘは７−アミノ−４−メチルクマリンである。
【００３０】
例えば、ある実施態様では、分子を決定する方法は、プラスミン活性に直接または間接的に影響を与える分子に対するスクリーニング方法であってもよい。例えば、方法は、プラスミン活性に影響を与える分子に対する高処理スクリーニングであってもよい。決定される分子は、プラスミン活性に影響を与えるであろういかなる種類の分子であってもよい。例えば、決定される分子は、ポリペプチド、当該技術分野において低分子と呼ばれる化合物、化学薬品、細菌、ウイルスなどであってもよい。
【００３１】
ＩＩＩ．キット
その他の態様では、本発明は化合物を含んでなるキットを提供する。化合物は、式：
Ｒｍ−［Ａｎ３Ａ２Ａ１］−Ｘ                （Ｉ）
［式中，
Ａ１はＬｙｓであり；Ａ２はＰｈｅであり；Ａ３はアミノ酸残基であり；
Ｒはピログルタミン酸またはＮ−末端保護基であり；
Ｘは蛍光発生基であり；
ｍは０または１であり；そして
ｎは整数≧０である］
によって表される。
【００３２】
１つの実施態様では、ｍ＝１、ｎ＝０であり、Ｒはピログルタミン酸であり、そしてＸは７−アミノ−４−メチルクマリンである。その他の実施態様では、化合物はピログルタミン酸−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−７−アミド−４−メチルクマリンである。種々の実施態様では、キットの構成要素は別々の区分に存在してもよい。
【００３３】
次の実施例は本発明を具体的に説明するためにのみ与えられ、そして本発明を限定するために与えられたものではない。当業者は、与えられた実施例が、特許請求されるものを具体的に説明するのみであり、そして本発明が随伴される請求項による範囲においてのみ限定されることを評価できる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】３種の異なる蛍光発生基質：（ａ）Ｔａｌ−ＴＢＭＷ２、これは、本発明の化合物の１つの実施態様に対応し、そして式：ピログルタミン酸−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−７−アミド−４−メチルクマリンによって表すことができる；（ｂ）Ｓｉｇｍａ  Ｖ−３１３８（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；および（ｃ）Ｓ２４０３（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ）との相対的応答を示すグラフである。
【実施例１】
【００３５】
３種の異なる蛍光発生基質のプラスミン加水分解によりペプチドを形成させ、そして蛍光発生基７−アミド−４−メチルクマリンが定量された。３種の基質は、（ａ）Ｔａｌ−ＴＢＭＷ２、これは、本発明の化合物の１つの実施態様に対応し、そして式：ピログルタミン酸−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−７−アミド−４−メチルクマリンによって表すことができる；（ｂ）Ｓｉｇｍａ  Ｖ−３１３８（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；および（ｃ）Ｓ２４０３（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ）であった。結果は図１において示される。
【図１】
2012517435.tif 000003
【国際調査報告】
2012517435.tif 000004
2012517435.tif 000005
2012517435.tif 000006