(57)【要約】【課題】本発明は、病理的血管新生及び／又は細胞増殖性疾患を阻害する医薬組成物を提供する。【解決手段】本発明の医薬組成物は、有効量のＬＥＣＴ２蛋白質又はＬＥＣＴ２蛋白質類似体、及び薬学上受容できるキャリアを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における病理的血管新生を阻害する組成物であって、
有効量のＬＥＣＴ２蛋白質又はＬＥＣＴ２蛋白質類似体、及び薬学上受容できるキャリアを含むことを特徴とする、病理的血管新生を阻害する組成物。
【請求項２】
上記ＬＥＣＴ２蛋白質類似体が、ＬＥＣＴ２組換え蛋白質であることを特徴とする、請求項１に記載の病理的血管新生を阻害する組成物。
【請求項３】
上記ＬＥＣＴ２蛋白質又はＬＥＣＴ２蛋白質類似体が、血管新生因子の阻害剤であることを特徴とする、請求項１に記載の病理的血管新生を阻害する組成物。
【請求項４】
上記血管新生因子が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）から選ばれたものであることを特徴とする、請求項３に記載の病理的血管新生を阻害する組成物。
【請求項５】
上記血管新生因子が血管内皮増殖因子阻害剤であることを特徴とする、請求項３に記載の病理的血管新生を阻害する組成物。
【請求項６】
上記ＬＥＣＴ２蛋白質又はＬＥＣＴ２蛋白質類似体が、内皮細胞遊走阻害剤であることを特徴とする、請求項１に記載の病理的血管新生を阻害する組成物。
【請求項７】
上記ＬＥＣＴ２蛋白質又はＬＥＣＴ２蛋白質類似体が、腫瘍血管侵入阻害剤であることを特徴とする、請求項１に記載の病理的血管新生を阻害する組成物。
【請求項８】
上記病理性の血管新生が、細胞増殖性疾患を伴うことを特徴とする、請求項１に記載の病理的血管新生を阻害する組成物。
【請求項９】
上記細胞増殖性疾患が癌であることを特徴とする、請求項８に記載の病理的血管新生を阻害する組成物。
【請求項１０】
上記癌が、肝臓癌、肺癌、乳癌、大腸癌、胃癌及び黒色腫から選ばれるものであることを特徴とする、請求項９に記載の病理的血管新生を阻害する組成物。
【請求項１１】
上記癌が、肺癌又は肝臓癌であることを特徴とする、請求項９に記載の病理的血管新生を阻害する組成物。
【請求項１２】
上記個体が、哺乳類であることを特徴とする、請求項１に記載の病理的血管新生を阻害する組成物。
【請求項１３】
上記個体が、ヒトであることを特徴とする、請求項１に記載の病理的血管新生を阻害する組成物。
【請求項１４】
個体において細胞増殖性疾患を治療及び／又は阻害する組成物であって、有効量のＬＥＣＴ２蛋白質又はＬＥＣＴ２蛋白質類似体、及び薬学上受容できるキャリアを含むことを特徴とする、細胞増殖性疾患を治療及び／又は阻害する組成物。
【請求項１５】
上記ＬＥＣＴ２蛋白質類似体は、ＬＥＣＴ２組換え蛋白質であることを特徴とする、請求項１４に記載の細胞増殖性疾患を治療及び／又は阻害する組成物。
【請求項１６】
上記細胞増殖性疾患が癌であることを特徴とする、請求項１４に記載の細胞増殖性疾患を治療及び／又は阻害する組成物。
【請求項１７】
上記癌が、肝臓癌、肺癌、乳癌、大腸癌、胃癌及び黒色腫から選ばれるものであることを特徴とする、請求項１６に記載の細胞増殖性疾患を治療及び／又は阻害する組成物。
【請求項１８】
上記癌が、肺癌又は肝臓癌であることを特徴とする、請求項１６に記載の細胞増殖性疾患を治療及び／又は阻害する組成物。
【請求項１９】
上記ＬＥＣＴ２蛋白質又はＬＥＣＴ２蛋白質類似体が、個体において腫瘍の成長を阻害することを特徴とする、請求項１４に記載の細胞増殖性疾患を治療及び／又は阻害する組成物。
【請求項２０】
上記ＬＥＣＴ２蛋白質又はＬＥＣＴ２蛋白質類似体が、腫瘍内皮細胞遊走阻害剤であることを特徴とする、請求項１４に記載の細胞増殖性疾患を治療及び／又は阻害する組成物。
【請求項２１】
上記ＬＥＣＴ２蛋白質又はＬＥＣＴ２蛋白質類似体が、腫瘍血管侵入阻害剤であることを特徴とする、請求項１４に記載の細胞増殖性疾患を治療及び／又は阻害する組成物。
【請求項２２】
上記個体が、哺乳類であることを特徴とする、請求項１４に記載の細胞増殖性疾患を治療及び／又は阻害する組成物。
【請求項２３】
上記個体が、ヒトであることを特徴とする、請求項１４に記載の細胞増殖性疾患を治療及び／又は阻害する組成物。
【請求項２４】
病理的血管新生を阻害する医薬組成物を製造することを特徴とする、ＬＥＣＴ２蛋白質又はＬＥＣＴ２蛋白質類似体の用途。
【請求項２５】
上記ＬＥＣＴ２蛋白質類似体がＬＥＣＴ２組換え蛋白質であることを特徴とする、請求項２４に記載のＬＥＣＴ２蛋白質又はＬＥＣＴ２蛋白質類似体の用途。
【請求項２６】
細胞増殖性疾患の治療及び／又は阻害に用いる医薬組成物を製造することを特徴とする、ＬＥＣＴ２蛋白質又はＬＥＣＴ２蛋白質類似体の用途。
【請求項２７】
上記細胞増殖性疾患は癌であることを特徴とする、請求項２６に記載のＬＥＣＴ２蛋白質又はＬＥＣＴ２蛋白質類似体の用途。
【請求項２８】
上記癌が、肝臓癌、肺癌、乳癌、大腸癌、胃癌および黒色腫から選ばれるものであることを特徴とする、請求項２７に記載のＬＥＣＴ２蛋白質又はＬＥＣＴ２蛋白質類似体の用途。
【請求項２９】
上記癌が、肺癌又は肝臓癌であることを特徴とする、請求項２７に記載のＬＥＣＴ２蛋白質又はＬＥＣＴ２蛋白質類似体の用途。
【請求項３０】
上記ＬＥＣＴ２蛋白質類似体がＬＥＣＴ２組換え蛋白質であることを特徴とする、請求項２６に記載のＬＥＣＴ２蛋白質又はＬＥＣＴ２蛋白質類似体の用途。
【請求項３１】
個体に対して有効量のＬＥＣＴ２蛋白質又はＬＥＣＴ２蛋白質類似体、及び薬学上受容できるキャリアを投与することを特徴とする、病理的血管新生を阻害する方法。
【請求項３２】
上記ＬＥＣＴ２蛋白質類似体がＬＥＣＴ２組換え蛋白質であることを特徴とする、請求項３１に記載の病理的血管新生を阻害する方法。
【請求項３３】
上記ＬＥＣＴ２蛋白質又はＬＥＣＴ２蛋白質類似体が、血管新生因子の活性を阻害することを特徴とする、請求項３１に記載の病理的血管新生を阻害する方法。
【請求項３４】
上記血管新生因子が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）から選ばれるものであることを特徴とする、請求項３３に記載の病理的血管新生を阻害する方法。
【請求項３５】
上記血管新生因子が、血管内皮増殖因子であることを特徴とする、請求項３３に記載の病理的血管新生を阻害する方法。
【請求項３６】
上記ＬＥＣＴ２蛋白質又はＬＥＣＴ２蛋白質類似体が、内皮細胞の遊走を阻害することを特徴とする、請求項３１に記載の病理的血管新生を阻害する方法。
【請求項３７】
上記ＬＥＣＴ２蛋白質又はＬＥＣＴ２蛋白質類似体が、腫瘍の血管侵入を阻害することを特徴とする、請求項３１に記載の病理的血管新生を阻害する方法。
【請求項３８】
上記病理的血管新生が、細胞増殖性疾患を伴うことを特徴とする、請求項３１に記載の病理的血管新生を阻害する方法。
【請求項３９】
上記細胞増殖性疾患が癌であることを特徴とする、請求項３８に記載の病理的血管新生を阻害する方法。
【請求項４０】
上記癌が、肝臓癌、肺癌、乳癌、大腸癌、胃癌および黒色腫から選ばれるものであることを特徴とする、請求項３９に記載の病理的血管新生を阻害する方法。
【請求項４１】
上記癌が、肺癌又は肝臓癌であることを特徴とする、請求項３９に記載の病理的血管新生を阻害する方法。
【請求項４２】
上記個体が、哺乳類であることを特徴とする、請求項３１に記載の病理的血管新生を阻害する方法。
【請求項４３】
上記個体が、ヒトであることを特徴とする、請求項３１に記載の病理的血管新生を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生を阻害する方法に係るものであり、特に、ＬＥＣＴ２蛋白質による血管新生、及び／又は血管新生に関連する疾患の阻害に係るものである。
【背景技術】
【０００２】
白血球細胞由来ケモタキシン２（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｎ  ２、以下において「ＬＥＣＴ２」と略する）は新しい好中球走化性因子である。ＬＥＣＴ２は植物性血球凝集素（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）誘導のヒトＴ細胞白血病ＳＷＫ３細胞の培地から精製されたものであり、１６−ｋＤaの蛋白質である（非特許文献１参照）。また、ＬＥＣＴ２をコードするｃＤＮＡの分離によって、そのｍＲＮＡは成人又は胎児の肝臓、及びヒト肝臓癌細胞株において特異的に発現されることを発見した（非特許文献２参照）。ＬＥＣＴ２はｃｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ−ＩＩ軟骨制御因子であって、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）及び成骨細胞（ｏｓｔｅｒｏｂｌａｓｔｓ）の増殖を刺激することができるウシ蛋白質である（非特許文献３参照）。現在、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）に誘発される肝炎においてマウスＬＥＣＴ２の発現は一過性的に低下することが文献により報告されている。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）に誘発される肝炎はヒト自己免疫肝炎の動物モデルであって、免疫細胞（例えばＣＤ４＋Ｔ細胞及びマクロファージ）と関連する細胞ホルモン及び細胞傷害性分子によって誘発されるものである（非特許文献４参照）。しかしながら、現時点では、ＬＥＣＴ２蛋白質は血管新生を阻害できることについて開示している文献はない。
【０００３】
血管新生とは、新しい血管が形成されることをいう。血管新生は健康な個体が傷害を受けた際に起こるものであり、傷害を修復し組織の血流供給を回復させるためのものである。血管新生のプロセスは、多くの正または負の制御因子によって厳密に制御されている。しかしながら、多くの疾患の発病時において、患者の血管新生は制御されていない状況下にある。
【０００４】
血管新生は新生児の成長において重要なプロセスであり、傷害の修復においても非常に重要である。しかし同時に、多くの臨床上の疾患の病理的特徴でもある。これらの疾患は組織炎症、関節炎、腫瘍の増殖、糖尿病性網膜症、網膜血管新生による黄斑部変性及び類似する疾患を挙げることができる。これら血管新生と関連する臨床的所見は血管新生疾患（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）ともいう。血管新生疾患は一般的に、腫瘍（固形腫瘍及び血液腫瘍を含む）、心血管疾患（例えば動脈硬化症）、慢性炎症（例えばリウマチ性関節炎及びクローン病）、糖尿病（例えば糖尿病性網膜症）、乾癬症、子宮内膜症、肥満症を含む。
【０００５】
したがって、有効的に血管新生を阻害し、上記疾患を治療又は防止する方法及び組成物は、医学界において切実に望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １３９６：１０５−１３（１９９８））
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２３７：１１６−２０（１９９７）
【非特許文献３】Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  １２５：４３６−４２（１９９９）
【非特許文献４】Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９０：１９６（１９９２）
【発明の概要】
【０００７】
本発明は病理的血管新生を阻害する方法を提供するものであり、上記方法は個体に対して有効量のＬＥＣＴ２蛋白質又はその類似体、及び薬学上受容できるキャリアを投与することを含む。
【０００８】
さらに、本発明は血管新生を阻害する組成物を提供する。上記組成物は、有効量のＬＥＣＴ２蛋白質又はその類似体、及び薬学上受容できるキャリアを含む。
【０００９】
さらに、本発明は細胞増殖性疾患を治療及び／又は阻害する方法を提供する。上記方法は、個体に対して有効量のＬＥＣＴ２蛋白質又はその類似体、及び薬学上受容できるキャリアを投与することを含む。
【００１０】
さらに、本発明は細胞増殖性疾患を治療及び／又は阻害する組成物を提供する。上記組成物は、有効量のＬＥＣＴ２蛋白質又はその類似体、及び薬学上受容できるキャリアを含む。
【００１１】
さらに、本発明は病理的血管新生を阻害する方法を提供する。上記方法は、個体に対して有効量のＬＥＣＴ２蛋白質又はその類似体、及び薬学上受容できるキャリアを投与することを含む。
【００１２】
本発明の上記及びそのほかの目的、特徴、及び優れた点をさらに明らかにするために、以下に好ましい実施例を挙げ、図面を参照しながら、以下に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】ヒト肝臓癌微小血管密度（ＣＤ３４染色）の免疫組織化学染色分析について示した図である。
【図１Ｂ】ＬＥＣＴ２蛋白質の発現量とＨＣＣ微小血管密度との間の関係を示した図である。
【図２Ａ】ベクター対照グループ細胞（ＳＫ−Ｈｅｐ１／Ｎｅｏ）、ＬＥＣＴ２過剰表現細胞（ＳＫ−Ｈｅｐ１／ＬＥＣＴ２）及び野生型細胞（ＳＫ−Ｈｅｐ１／ＷＴ）の成長曲線は類似していることを示した図である。
【図２Ｂ】ＳＫ−Ｈｅｐ１／Ｎｅｏグループの平均腫瘍体積は明かにＳＫ−Ｈｅｐ１／ＬＥＣＴ２グループより大きいことを示した図である。
【図２Ｃ】ＳＫ−Ｈｅｐ１／ＬＥＣＴ２グループの微小血管密度（ＣＤ３１染色）はベクター対照グループ（ＳＫ−Ｈｅｐ１／Ｎｅｏ）より小さいことを示した図である。
【図３Ａ】ベクター対照グループ細胞  （ＢＮＬ／Ｎｅｏ）、ＬＥＣＴ２過剰発現細胞（ＢＮＬ／ＬＥＣＴ２）と野生型細胞（ＢＮＬ／ＷＴ）の成長曲線は類似していることを示した図である。
【図３Ｂ】ＢＮＬ／Ｎｅｏグループの平均腫瘍体積は明らかにＢＮＬ／ＬＥＣＴ２グループより大きいことを示した図である。
【図３Ｃ】ＬＥＣＴ２はＢＮＬ細胞原位性腫瘍中における微小血管密度（ＣＤ３１染色）を抑制できることを示した図である。
【図４Ａ】それぞれＢＮＬ／Ｎｅｏグループ、ＢＮＬ／Ｎｅｏ＋ｒＬＥＣＴ２グループ及びＢＮＬ／ＬＥＣＴ２グループの腫瘍体積を示した図である。
【図４Ｂ】ＢＮＬ／Ｎｅｏグループの平均腫瘍体積は明らかにＢＮＬ／Ｎｅｏ＋ｒＬＥＣＴ２グループ及びＢＮＬ／ＬＥＣＴ２グループより大きいことを示した図である。
【図４Ｃ】ＢＮＬ／Ｎｅｏグループの平均腫瘍体積は明らかにＢＮＬ／Ｎｅｏ＋ｒＬＥＣＴ２グループ及びＢＮＬ／ＬＥＣＴ２グループより大きいことを示した図である。
【図５】図５はＬＥＣＴ２が過剰発現している細胞の条件培養液は新生血管の形成を破壊できることを示した図である。
【図６Ａ】ＬＥＣＴ２条件培養液は血管管状構造の形成を阻害できることを示した図である。
【図６Ｂ】内因性のＬＥＣＴ２（ｓｈＬＥＣＴ２−１及びｓｈＬＥＣＴ２−２）が阻害されるＨＣＣ移植株（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５及びＨｕｈ−７）のＬＥＣＴ２発現量を示した図である。
【図６Ｃ】対照グループ細胞と比較して、内因性ＬＥＣＴ２が阻害されるＰＬＣ／ＰＲＦ／５とＨｕｈ−７の細胞の条件培養液は血管内皮細胞中における血管管状構造の形成を促進できることを示した図である。
【図７】ＬＥＣＴ２条件培養液は明らかに血管内皮細胞の遊走を阻害することを示した図である。
【図８】ＶＥＧＦ−Ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）によって処理された細胞と比較して、ｒＬＥＣＴ２蛋白質は明らかにＶＥＧＦ−Ａ誘導による管状構造形成を阻害することを示した図である。
【図９Ａ】ＣＡＭモデルによってＬＥＣＴ２組換え蛋白質はＶＥＧＦ−Ａ誘導による血管新生を阻害できることを実証したことを示した図である。
【図９Ｂ】ＣＡＭモデルによってＬＥＣＴ２組換え蛋白質はＶＥＧＦ−Ａ誘導による血管新生を阻害できることを実証したことを示した図である。
【図１０】ＬＥＣＴ２組換え蛋白質はＶＥＧＦ−Ａ誘導の血管内皮細胞の遊走を減少させることができることを示した図である。
【図１１】ＬＥＣＴ２組換え蛋白質は血管内皮細胞内因ＶＥＧＦ−Ａ誘導の管状構造形成を阻害できることを示した図である。
【図１２】ＬＥＣＴ２組換え蛋白質は血管内皮細胞における条件培養液によって誘導される血管管状構造の形成を示した図である。
【図１３Ａ】Ｂ１６Ｆ１／Ｎｅｏグループの平均腫瘍体積は明らかにＢ１６Ｆ１／ＬＥＣＴ２グループより大きいことを示した図である。
【図１３Ｂ】Ｂ１６Ｆ１／Ｎｅｏグループの平均腫瘍体積は明らかにＢ１６Ｆ１／ＬＥＣＴ２グループより大きいことを示した図である。
【図１３Ｃ】Ｂ１６Ｆ１／ＬＥＣＴ２グループの微小血管密度はＢ１６Ｆ１／Ｎｅｏグループより小さいことを示した図である。
【図１４】ＬＥＣＴ２蛋白質はＡ５４９細胞のヌードマウス体内における腫瘍成長を阻害できることを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は病理的血管新生及び／又は細胞増殖性疾患を阻害する組成物を提供する。当該組成物は有効量のＬＥＣＴ２蛋白質又はその類似体、及び薬学上受容できるキャリアを含む。
【００１５】
本発明において上記の「ＬＥＣＴ２」又は「ＬＥＣＴ２蛋白質」とは、白血球細胞由来ケモタキシン２のすべての形をいい、活性体又は不活性体を含む。生体活性を有するいかなるＬＥＣＴ２蛋白質の類似体／フラグメントもすべて本発明の範疇に属する。類似体／フラグメントはキャリア分子（例えば免疫蛋白質）と結合して各種の応用に供することができ、上記応用は蛋白質結合部位の結合価数を増やすことを含む。また、本発明のＬＥＣＴ２蛋白質類似体は、元となる蛋白質において一個又は複数個のアミノ酸が置換、欠損、増加又は挿入されることによって得ることができ、かつ少なくとも元となる蛋白質の活性部位を保持している。
【００１６】
本発明における「ＬＥＣＴ２変異体」又は「変異蛋白質」とは、ＬＥＣＴ２蛋白質と少なくとも６０％の同一の蛋白質配列を有する蛋白質である。配列類似性は蛋白質のアミノ酸配列によって決定され、同一の部分を最大化し、配列差異を最小化する。
【００１７】
本発明のＬＥＣＴ２蛋白質は修飾されたＬＥＣＴ２蛋白質を含み、修飾されたＬＥＣＴ２蛋白質は天然のＬＥＣＴ２蛋白質に類似するものである。当業者は一般的な従来技術を用いてペプチド又はＤＮＡ配列に対して修飾を行うことができる。例えば、蛋白質配列の修飾は、コードする配列中のアミノ酸のうちの一つを改変、置換、代替、挿入また欠損させることを含む。改変、置換、代替、挿入また欠損させるために用いる方法は、一般的に知られている技術である。配列が改変、置換、代替、挿入また欠損させた後、なおＬＥＣＴ２蛋白質の活性を保持していることが好ましい。
【００１８】
本発明における「組換え蛋白質」とは、一個又は複数個の組換え部分を有する蛋白質をいう。部位特異的リコンビナーゼ（Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｓ）は、各種ウイルス及び細菌に存在する酵素であり、エンドヌクリアーゼ(endonuclease)及びリガーゼ(ligase)を同時に制限する特性を有する。該リコンビナーゼは特定ＤＮＡ配列を識別し、ＤＮＡフラグメントを改変させることができる。
【００１９】
本発明において、ＬＥＣＴ２蛋白質、ＬＥＣＴ２蛋白質類似体／フラグメント又はＬＥＣＴ２組換え蛋白質（ｒＬＥＣＴ２）は動物細胞、低等真核生物又は原核生物において発現できる。動物細胞とは、猿ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、その他の形質転換された霊長類細胞、正常の二倍体細胞、インビトロにて培養された原生組織によって派生された細胞株、原生移植体、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫ又はＪｕｒｋａｔ細胞を含む。低等真核生物は酵母菌を含み、上記酵母菌は例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クリベロマイセス菌株（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｒａｉｎｓ）、カンジダ属菌（Ｃａｎｄｉｄａ）又は任意の異源性蛋白質を発現できる酵母菌を挙げることができる。原核生物とは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バシラス‐サチリス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、又は任意の異源性蛋白質を発現できる細菌を挙げることができる。酵母菌又は細菌を用いて蛋白質を発現させる場合、発現された蛋白質をさらに修飾することができ、例えば、適切な位置においてリン酸化反応又はグリコシル化をさせることによって蛋白質に機能を持たせることができる。
【００２０】
本発明において、組成物を組織に投与し、該組織は病理的血管新生作用を有し、当該組成物は有効量のＬＥＣＴ２蛋白質又は活性ＬＥＣＴ２蛋白質を発現するヌクレオチドベクターを含む。当該組織はいかなる血管新生作用を有する組織又は臓器とすることができ、脳、皮膚、筋肉、胃、結合組織、関節、骨格及び類似組織を含む。病理的血管新生は、増殖因子によって誘導され、当該増殖因子は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を含む。
【００２１】
また、本発明におけるＬＥＣＴ２蛋白質、ＬＥＣＴ２蛋白質類似体／フラグメント、又はＬＥＣＴ２組換え蛋白質も、新生血管管状構造の形成、内皮細胞の移動と増殖、腫瘍の血管侵入又はその他の血管新生と関連する疾患を阻害することができる。血管新生と関連する疾患は、炎症性疾患、慢性リウマチ性関節炎、乾癬を含むが、これらに限定されない。血管の不正常侵入と関連する疾患は、例えば、糖尿病性網膜病変、血管新生緑内障、血管再狭窄及び細胞増殖性疾患を含むが、これらに限定されない。腫瘍又は癌と関連する疾患（例えば固形腫瘍、固形腫瘍転移、肝臓癌、肺癌、乳癌、大腸癌、胃癌及び黒色腫）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明における「細胞増殖性疾患」とは、多細胞組織中において、一個又は複数の細胞群不正常増殖が起きることによって、多細胞組織傷害を引き起こすことである。細胞増殖性疾患は、異なる動物及びヒトにおいて発生し得る。細胞増殖性疾患は、癌、血管増殖性疾患及び線維症を含むが、これらに限定されない。
【００２３】
本発明のＬＥＣＴ２蛋白質及び／又はＬＥＣＴ２蛋白質を含む薬学組成物は、経口、非胃腸、吸入、直腸、膣、皮内、経皮又は局部で投与することができ、薬剤ユニットは従来用いられてきた、毒性のない、薬学上受容できるキャリア、補助剤及び媒介物を含むことができ、蠕動性の道具を使用して投与することができる。
【００２４】
本発明におけるＬＥＣＴ２蛋白質及び／又はＬＥＣＴ２蛋白質を含む薬学組成物は、一回で投与することができ、２４時間内に多数回に渡って投与、又は連続投与することもできる。注射の方式が連続投与である場合、すでに知られている適切な方式を選ぶことができる。上記方式は、点滴静脈内注射、静脈内注射輸液ポンプ、埋め込み式輸液ポンプ又は局部投与を挙げることができるが、これらに限定されない。治療の時間は例えば血管新生の進行度及び深刻度によって、異なる状況において適宜調整することができる。ＬＥＣＴ２蛋白質単独で、又は本発明のその他の薬剤と併用して、掻痒症の治癒まで治療し、又は生涯において治療を持続する。
【００２５】
もう一つの実施形態において、本発明は病理的血管新生及び／又は細胞増殖性疾患を阻害する薬学組成物を提供するものである。当該薬学組成物は有効量のＬＥＣＴ２蛋白質又はその類似体、及び薬学上受容できるキャリアを含む。薬学上受容できるキャリアは溶媒、分散剤、錠皮、抗菌物質／抗真菌剤、等張化剤、吸収遅延剤および類似体を含み得る。
【００２６】
もう一つの実施形態において、本発明は病理的血管新生を阻害できる方法を提供する。上記方法は個体に対して有効量のＬＥＣＴ２蛋白質又はその類似体、及び薬学上受容できるキャリアを投与することを含む。
【実施例】
【００２７】
＜実施例１＞ＬＥＣＴ２蛋白質のヒト微小血管密度に対する影響
まず、免疫組織化学染色法によって１４のヒト肝臓癌（ＨＣＣ）組織のＬＥＣＴ２蛋白質発現及び内皮細胞のバイオマーカーについて分析を行った。当該ヒト肝臓癌組織は台湾大学医学院付属病院により提供されたものである。簡潔に説明すると、肝臓癌患者から原発性肝臓癌腫瘍組織を取得し、ホルマリン固定及びパラフィン包埋を行った後、免疫染色を行う。脱パラフィン、脱水処理後、ＰＢＳＴを用いて３回洗浄し、室温下において１：５００で希釈されたＣＤ３４抗体を用いて処理を行い、次にビオチンで標識された抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）で１時間処理を行い、ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて結合した抗体について検出を行った。該サンプルをジアミノベンジジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）で染色し、洗浄し、最後にデラフィールドヘマトキシリン（Ｄｅｌａｆｉｅｌｄ’ｓ  ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）で対比染色（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ）を行い、分析して結果の定量を行った。内皮細胞の抗原染色を測定することによって微小血管密度を測定し、血管新生の程度を測量した。微小血管密度（ＭＶＤ）の測定はＣＤ３４抗体によって染色された内皮細胞をカウントすることによって表示されたものである。各腫瘍において、血管が高度に発達した三つの区域に対して高倍率で拡大して分析を行い、各区域の微小血管総数、及び各腫瘍の微小血管の平均数をカウントした。図１ＡはヒトＨＣＣ微小血管密度の分析結果を示す図であり、腫瘍の位置はＣＤ３４抗体によって染色されることができる。すべての腫瘍サンプルにおいて、免疫組織化学染色法によって腫瘍の内皮細胞のＣＤ３４マーカーについて分析を行った結果、腫瘍細胞の周囲には多くの内皮細胞が存在することが実証された。この結果は臨床的に見られる高度血管化腫瘍と一致する。図１Ｂを参照すれば、ＬＥＣＴ２蛋白質の発現量は微小血管の密度と相反する傾向にあることがわかる。患者の肝臓癌細胞を二つのグループ、つまり高いＬＥＣＴ２蛋白質発現量（ＬＥＣＴ２／β−アクチン比＞０．４５）のグループ及び低いＬＥＣＴ２蛋白質発現量（ＬＥＣＴ２／β−アクチン比＜０．４５）のグループに分けた。統計上において、高いＬＥＣＴ２蛋白質発現量と低い微小血管密度は高い相関性を有する。これによって、１４個のヒト肝臓癌サンプルにおいて、ＬＥＣＴ２蛋白質発現量と微小血管密度は相反する傾向にあることが明らかになった。
【００２８】
＜実施例２＞  ＬＥＣＴ２蛋白質のヌードマウス腫瘍成長に対する影響
本実施例において、ＬＥＣＴ２蛋白質の内因性発現のないヒト肝臓癌細胞株：ＳＫ−Ｈｅｐ１を使用した。ヒトＬＥＣＴ２のｃＤＮＡをｐＳｅｃＴａｇ２Ａ真核発現ベクターに導入し、ＬＥＣＴ２蛋白質を過剰発現し、かつ同じプロモーターの下流においてハイグロマイシンＢ（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ）遺伝子を有する発現ベクターを得た。さらに、このＬＥＣＴ２蛋白質の発現キャリアを、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈ．）を用いて肝臓癌細胞（ＳＫ−Ｈｅｐ１）中にトランスフェクションさせた。ハイグロマイシンＢによってスクリーニングした後、ＬＥＣＴ２蛋白質を過剰発現している細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ１／ＬＥＣＴ２）を得ることができた。ＬＥＣＴ２蛋白質の過剰発現している細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ１／ＬＥＣＴ２）におけるＬＥＣＴ２蛋白質発現量は、対照グループの細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ１／Ｎｅｏ）の５倍以上である。図２Ａからわかるように、対照グループ細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ１／Ｎｅｏ）、野生型細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ１／ＷＴ）及びＬＥＣＴ２蛋白質過剰発現細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ１／ＬＥＣＴ２）の、単層培養細胞の成長曲線は似ている。本実施例におけるすべての実験は３回繰り返し実施された。エラーバーでは９５％の信頼区間を示した。ＬＥＣＴ２蛋白質機能の腫瘍細胞及び血管新生に対する影響を分析するために、生体内異種腫瘍移植モデルを用いて、ＨＣＣ細胞を皮下注射の方式でヌードマウスの背部に注射した。簡潔に説明すると、８週齢の胸腺摘除去メスヌードマウス（国家動物センターより購入）を病原菌のない環境中において養殖し、持続的に食料と飲用水を与えた。ランダムにヌードマウスを二つのグループに分け、それぞれにＬＥＣＴ２蛋白質の過剰発現している細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ１／ＬＥＣＴ２）及び対照グループ細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ１／Ｎｅｏ）を注射した。注射後の１０日目に、腫瘍は明らかに見えるようになり、二日ごとに腫瘍の大きさの測定を行った。腫瘍の体積は幅×長さ×０．５で表示される。腫瘍の大きさはキャリパーによって測定した。すべてのマウスにおいて注射後１０日目に、初めて明らかな腫瘍を測定することができた。図２Ｂを参照すると、細胞を注射した２０日後に、ＳＫ−Ｈｅｐ１／Ｎｅｏ細胞を注射したヌードマウスの腫瘍平均体積は、明らかにＳＫ−Ｈｅｐ１／ＬＥＣＴ２細胞株を注射した腫瘍の平均体積より大きいことが分かった。さらに、免疫組織化学染色法を利用して、ＣＤ３１抗体を用いて、原位置腫瘍組織のパラフィンサンプルにおける、微小血管密度に対するＬＥＣＴ２の影響を調べた。図２Ｃからは、安定かつ高度にＬＥＣＴ２を発現している細胞によって形成される腫瘍において、ｍｍ２単位体積ごとの微小血管数は、対照グループの１/３倍より少ないことがわかった。この実施例からは、ＬＥＣＴ２蛋白質はヌードマウス体内におけるヒト肝臓腫瘍ＳＫ−Ｈｅｐ１細胞の成長を阻害できることが明らかとなった。
【００２９】
＜実施例３＞ＬＥＣＴ２蛋白質のＢＡＬＢ／ｃマウス腫瘍成長に対する影響
また、ＬＥＣＴ２蛋白質を過剰発現している腫瘍細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに注射し、分析を行った。ＳＫ−Ｈｅｐ１ヒト肝臓癌細胞とヌードマウスとをＢＮＬマウス肝臓癌細胞とＢＡＬＢ／ｃマウスとにそれぞれ変えた以外は、本実施例の分析プロセスは実施例２と同じである。マウス（ＢＡＬＢ／ｃマウス、８週齢）に対して、安定かつ高いレベルでＬＥＣＴ２を発現しているＢＮＬマウス肝臓癌細胞（ＢＮＬ／ＬＥＣＴ２）又は対照グループＢＮＬ細胞（ＢＮＬ／Ｎｅｏ）を皮下注射し、それぞれのマウスは１×１０５個の細胞を注射した。本実施例の結果は実施例２の結果と類似である。図３Ａを参照すると、野生型細胞株（ＢＮＬ／ＷＴ）、対照グループ細胞株（ＢＮＬ／Ｎｅｏ）及びＬＥＣＴ２蛋白質過剰発現細胞株（ＢＮＬ／ＬＥＣＴ２）の単層細胞の成長曲線は類似している。図３Ｂを参照すると、ＢＮＬ／Ｎｅｏ細胞株を注射したマウスの腫瘍体積は明らかにＢＮＬ／ＬＥＣＴ２細胞株を注射したマウスの腫瘍体積より大きく、かつＣＤ３１抗体を用いて原位置腫瘍組織中の微小血管密度を分析したところ、微小血管密度は高いＬＥＣＴ蛋白質発現によって阻害されることが明らかとなった（図３Ｃ）。本実施例の結果は、ＬＥＣＴ２蛋白質はＢＡＬＢ／ｃマウス体内のマウス肝臓腫瘍ＢＮＬ細胞の成長を阻害できることを示した。
【００３０】
＜実施例４＞ＬＥＣＴ２組換え蛋白質のＢＡＬＢ／ｃマウス腫瘍成長に対する影響
本実施例は、ＬＥＣＴ２組換え蛋白質は同じようにＨＣＣ腫瘍を移植したマウスに対して影響するかどうか、ＬＥＣＴ２組換え蛋白質のＢＮＬ／Ｎｅｏ細胞を注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに対する影響について評価した。ＢＮＬ／Ｎｅｏグループの腫瘍が約１５０ｍｍ３まで成長した時、ＬＥＣＴ２組換え蛋白質（１．２５ｍｇ／ｋｇ体重あたり）、又は１ＸＰＢＳバッファー（５０μＬ）をそれぞれ腫瘍中に注射し、１０日間にわたって注射を続けた。結果は図４Ａに示す通りである。図４Ｂ−４Ｃを参照すると、細胞を注射した３５日後において、ＢＮＬ／Ｎｅｏグループの腫瘍の平均体積は、高度に発現したＬＥＣＴ２を注射したＢＮＬ／ＬＥＣＴ２グループ、及びＬＥＣＴ２組換え蛋白質を注射したＢＮＬ／ＬＥＣＴ２＋ｒＬＥＣＴ２グループより明らかに大きい。図４Ｃはそれぞれのグループの異種腫瘍移植ＢＡＬＢ／ｃマウスの腫瘍の重量を示している。同じように、ＢＮＬ／ＬＥＣＴ２＋ｒＬＥＣＴ２グループとＢＮＬ／ＬＥＣＴ２グループの腫瘍の重量は、明らかＢＮＬ／Ｎｅｏグループより少ない。これによって、ＬＥＣＴ２組換え蛋白質は、ＢＡＬＢ／ｃマウス体内のマウス肝臓腫瘍ＢＮＬ細胞の増殖を阻害できることが明らかになった。
【００３１】
＜実施例５＞ＬＥＣＴ２を発現したヒトＨＣＣ細胞条件培養液の血管新生に対する影響
本実施例において、鶏卵漿尿膜法（ｃｈｉｃｋ  ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｓｓａｙ；ＣＡＭ  ａｓｓａｙ）を用いて、ＬＥＣＴ２を過剰発現しているＳＫ−Ｈｅｐ１細胞の条件培養液の血管新生に対する影響を評価した。この培養液は、ＬＥＣＴ２又はベクターをトランスフェクションしたＳＫ−Ｈｅｐ１細胞に由来するものである。ウシ胎児血清を含まないＤＭＥＭ培養液中において、癌細胞を４８時間培養した。ＬＥＣＴ２及びベクターをトランスフェクションしたＳＫ−Ｈｅｐ１細胞の条件培養液を、低速遠心によってろ過させた。インビボにおける血管新生を研究する過程において、複数の制御因子の血管反応に対して、鶏胚のＣＡＭアッセイは適切なモデルである。受精卵を１００°Ｆ、湿度の制御されたインキュベータ中、かつ空気が流通している環境において１４日間培養した。９日目において、鶏卵の上方において小さな穴を開け、穴は主要の血管区域の上方に位置し、鶏卵漿尿膜と卵殻膜を分離させる。ＳＫ−Ｈｅｐ１／Ｎｅｏ条件培養液、ＳＫ−Ｈｅｐ１／ＬＥＣＴ２条件培養液、又は前処理された抗ＬＥＣＴ２又は抗ＩｇＧ抗体のＳＫ−Ｈｅｐ１／ＬＥＣＴ２条件培養液で処理を行った。総体積２０μＬの条件培養液を直径５ｍｍの小さな円盤状物に滴下し、小さな円盤状物で鶏卵漿尿膜を覆う（各グループでそれぞれ３つの鶏胚を処理する）。鶏卵の上方にある小さな穴を通気性テープで密封し、インキュベータに戻す。処理後の三日目（第１２日目）及び処理後の五日目（第１４日目）に、丁寧に卵を開ける。血管の長さと密度を評価することによって、鶏卵漿尿膜における血管新生を測定する。対照グループと実験グループにおける血管数量を用いてＬＥＣＴ２組換え蛋白質の血管新生に対する影響を分析し、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ４．５ソフトウェアを用いて血管の数量を分析した。図５を参照すると、過剰発現したＬＥＣＴ２蛋白質の条件培養液は鶏卵漿尿膜における毛細血管床の血管新生を阻害することができることが明らかになった。ＣＡＭアッセイにおいて以下のことが見出された。過剰発現されたＬＥＣＴ２蛋白質の条件培養液にとって、ＩｇＧ中和抗体を添加した対照グループと比較した場合、ＬＥＣＴ２抗体を添加して予め条件培養液におけるＬＥＣＴ２蛋白質と競争結合した場合、血管新生は促進される。従って、ＣＡＭアッセイにおいて、ＬＥＣＴ２の過剰発現したＳＫ−Ｈｅｐ１細胞の条件培養液は血管新生を阻害することができる。
【００３２】
＜実施例６＞ＬＥＣＴ２を過剰発現したＨＣＣ細胞条件培養液の管状構造形成に対する影響
インビトロにおいて、内皮細胞は６時間内においてマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）上に配列し、二次元微小管状ネットワークを形成する。マトリゲル分析は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分析であって、内皮細胞の形態、生化学機能及び遺伝子発現について分析を行うための生理環境を提供する。血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）をマトリゲル上に配置させ、分化、及び類微小管状構造を形成させる。マトリゲル上において、微小管状の形成は細胞―マトリックス間の相互反応、細胞間のコミュニケーション、及び細胞の遊走を必要とする。インビトロでのＬＥＣＴ２組換え蛋白質の血管新生に対する影響を分析するために、マトリゲルを覆う２４ウェル培養プレート中に血管内皮細胞を入れ、それぞれＬＥＣＴ２又はＮｅｏをトランスフェクションしたＳＫ−Ｈｅｐ１又はＨＣＣ３６細胞の条件培養液で６時間処理を行い、位相差顕微鏡で管状構造の形成を観察した。顕微鏡の観察下において、それぞれ６つのランダムに選ばれた視野における管状構造について比較した。図６Ａを参照すると、対照グループの培養液（ＳＫ−Ｈｅｐ１／Ｎｅｏ条件培養液又はＨＣＣ３６／Ｎｅｏ条件培養液）と比較して、ＳＫ−Ｈｅｐ１／ＬＥＣＴ２条件培養液又はＨＣＣ３６／ＬＥＣＴ２条件培養液はマトリゲル層における管状構造の形成を阻害できる。血管内皮細胞をマトリゲルで覆われた２４ウェルプレード中において培養し、ＶＥＧＦ−Ａで６時間処理し、正の対照グループとする。ＬＥＣＴ２組換え蛋白質は血管新生を治療するための血管新生を制御する重要因子であることを証明するために、さらにＰＬＣ／ＰＲＦ／５及びＨｕｈ−７細胞中の内因性ＬＥＣＴ２（ｓｈＬＥＣＴ２−１とｓｈＬＥＣＴ２−２）の発現を阻害する。図６Ｂを参照すると、ウェスタンプロット法によって、内因性ＬＥＣＴ２が阻害された形質転換株を分析した。図６Ｃを参照すると、内因性ＬＥＣＴ２が阻害されたＰＬＣ／ＰＲＦ／５とＨｕｈ−７の細胞の条件培養液は血管内皮細胞中における管状構造形成能力を促進することができる。これによって、ＬＥＣＴ２が阻害された細胞条件培養液は血管内皮細胞中の管状構造生成を促進することができる。
【００３３】
＜実施例７＞ＬＥＣＴ２蛋白質を過剰発現したＨＣＣ細胞の条件培養液の細胞遊走に対する影響
血管内皮細胞を２４ウェル培養プレートの（７ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）Ｍ１９９培地中において培養した。２４時間後において、血管内皮細胞単層膜に５％ウシ胎児血清を含む培養液に換えた。青ピペットの先端でライン状にスクラップして細胞を削り取り、細胞を含まない単層膜を得た。ＬＥＣＴ２の過剰発現したＨＣＣ条件培養液（ＳＫ−Ｈｅｐ１／ＬＥＣＴ２  ＣＭ）及びベクター対照グループＨＣＣ条件培養液（ＳＫ−Ｈｅｐ１／Ｎｅｏ  ＣＭ）、又は内因性ＬＥＣＴ２が阻害されたＨＣＣ条件培養液（Ｈｕｈ−７／ｓｈＬＥＣＴ２−２  ＣＭ）及びベクター対照グループＨＣＣ条件培養液（Ｈｕｈ−７／ｓｈＬｕｃ  ＣＭ）で処理を行った。３７℃下において１４時間培養した後、位相差顕微鏡で内皮細胞の遊走能力を観察し、４つのランダム選ばれた視野において、細胞遊走能力を測定した。Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ−Ｐｌｕｓ  ４．５ソフトウェアによって分析し、映像を得た。各ウェルにおいてそれぞれ４つの視野を観察し、細胞を削り取った後の傷口の幅を測定した。図７を参照すると、５０％のＬＥＣＴ２トランスフェクション又は内因性ＬＥＣＴ２が阻害された条件培養液において１４時間培養された後、血管内皮細胞は傷口区域まで移動した。ＬＥＣＴ２条件培養液は血管内皮細胞の遊走を阻害し、内因性ＬＥＣＴ２が阻害されたＨｕｈ−７条件培養液（Ｈｕｈ−７／ｓｈＬＥＣＴ２−２  ＣＭ）は血管内皮細胞の修復反応を促進させた。これによって、ＬＥＣＴ２の過剰発現したＨＣＣ条件培養液は血管内皮細胞の遊走能力を阻害できることが明らかになった。
【００３４】
＜実施例８＞ＬＥＣＴ２組換え蛋白質の血管内皮増殖因子に誘導される管状構造形成に対する影響
血管内皮細胞を２４ウェルプレートのマトリゲル上に置き、ＶＥＧＦ−Ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＰＤＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＨＧＦ（４０ｎｇ／ｍＬ）又はＬＥＣＴ２組換え蛋白質（２００ｎｇ／ｍＬ）を含む培養液で６時間処理し、微小管状構造の形成を分析した。結果からわかることは、ＬＥＣＴ２組換え蛋白質は有効にＶＥＧＦ−Ａによって誘導される血管管状構造の新生を阻害することができ、ＶＥＧＦ−Ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）グループと比較した場合、阻害率は５２％であり、図８に示す通りである。これによって、ＬＥＣＴ２組換え蛋白質は、異なるレベルで血管増殖因子ＶＥＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦによって誘発される内皮細胞管状構造の生成を阻害し、特にＶＥＧＦ−Ａの働きを阻害する。
【００３５】
＜実施例９＞ＬＥＣＴ２組換え蛋白質のＶＥＧＦ−Ａ誘導の血管新生に対する影響
ＣＡＭアッセイを用いてＬＥＣＴ２組換え蛋白質のＶＥＧＦ−Ａ誘導の血管新生に対する影響について分析を行った。９日目の鶏胚の鶏卵漿尿膜をＶＥＧＦ−Ａ、及び異なる濃度のＬＥＣＴ２組換え蛋白質（０、１．２５、２．５、５ｎＭ）又はＦｃ−Ｔａｇ（対照グループ）で処理し（各グループそれぞれ３つの鶏胚を処理する）、総体積２０μＬを直径５ｍｍの小さな円盤状物に滴下し、小さな円盤状物で鶏卵漿尿膜を覆うようにする。ＶＥＧＦ−Ａ及びＬＥＣＴ２組換え蛋白質によって鶏卵漿尿膜を処理した三日後（すなわち、１２日目に）又は５日後（すなわち１４日目に）に分析を行った。図９Ａを参照すると、対照グループと比較した場合、ＶＥＧＦ−Ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）は明らかに漿尿膜尿嚢の毛細血管床区域を促進した。図９Ｂを参照すると、ＣＡＭアッセイ結果によってわかるように、第１２日目に、２．５ｎＭと５ｎＭのＬＥＣＴ２組換え蛋白質は明らかにＶＥＧＦ−Ａ誘導の血管新生を阻害した。１４日目に、５ｎＭのＬＥＣＴ２組換え蛋白質はＶＥＧＦ−Ａによって誘導される漿尿膜尿嚢の毛細血管床区域を阻害した。これによって、ＬＥＣＴ２組換え蛋白質はＶＥＧＦ−Ａ誘導の血管新生を阻害できることが明らかになった。
【００３６】
＜実施例１０＞ＬＥＣＴ２組換え蛋白質のインビトロＶＥＧＦ−Ａ誘導の血管新生に対する影響
本実施例はＬＥＣＴ２組換え蛋白質の血管内皮細胞の遊走及び血管生成の影響について分析した。血管内皮細胞の移動は、血管新生の重要な因子の一つであり、これによってｒＬＥＣＴ２蛋白質のＶＥＧＦ−Ａ誘導の血管内皮細胞遊走の能力について分析した。それぞれ２％ＦＢＳ（対照グループ）、ＶＥＧＦ−Ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ−Ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）で異なる濃度のＬＥＣＴ２組換え蛋白質（０〜２００ｎｇ／ｍＬ）、及びＬＥＣＴ２組換え蛋白質（２００ｎｇ／ｍＬ）を１４時間処理して、内皮細胞を遊走させる。ＶＥＧＦ−Ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）は、血管内皮細胞の遊走を促進することができる。図１０からは、ＶＥＧＦ−Ａ誘導の遊走の阻害は、ＬＥＣＴ２組換え蛋白質の使用量に依存する。このほかにも、特に２００ｎｇ／ｍＬ用量のＬＥＣＴ２組換え蛋白質は明らかにＶＥＧＦ−Ａ誘導の血管内皮細胞遊走を抑制できる。ＬＥＣＴ２組換え蛋白質は、ＶＥＧＦ−Ａ誘導の細胞遊走を阻害することができるため、ＬＥＣＴ２組換え蛋白質の血管新生時の抗血管新生の反応についてさらに分析を行った。この分析において、０．１％ＢＳＡ（対照グループ）又はＶＥＧＦ−Ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）で、異なる濃度のＬＥＣＴ２組換え蛋白質（０−２００  ｎｇ／ｍＬ）と併合して、微小管状構造の形成を分析した。図１１からは、ＬＥＣＴ２組換え蛋白質と、ＶＥＧＦ−Ａ誘導の微小管状ネットワークの崩壊は、使用量に依存する。これによって、ＬＥＣＴ２組換え蛋白質は、インビトロでのＶＥＧＦ−Ａ誘導の血管内皮細胞類微小管状構造を阻害できる。
【００３７】
＜実施例１１＞  ＬＥＣＴ２組換え蛋白質の異なる癌細胞条件培養液に誘導される血管管状構造形成に対する影響
本実施例はＬＥＣＴ２組換え蛋白質の異なる癌細胞株の血管新生に対する影響について分析を行った。血管内皮細胞を２４ウェルプレートのマトリゲル上に放置し、各種癌細胞株の条件培養液で６時間処理を行った。癌細胞は肝臓癌細胞（ＳＫ−Ｈｅｐ１及びＨｕｈ−７）、肺癌細胞（Ａ５４９及びＨ１２９９）、乳癌細胞（ＭＢ−ＭＤＡ−２３１及びＭＣＦ７）、胃癌細胞（ＭＫＮ及びＮ８７）、直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）及びマウス黒色腫細胞（Ｂ１６Ｆ１）、又は癌細胞株条件培養液とｒＬＥＣＴ２（５ｎＭ）が合併したものを用いて６時間処理を行った。図１２は癌細胞条件培養液を単独で用いた場合、若しくはｒＬＥＣＴ２蛋白質（５ｎＭ）と併合したものを用いた場合の、血管内皮細胞を６時間処理した結果である。これによって、ＬＥＣＴ２組換え蛋白質は、ＳＫ−Ｈｅｐ１、Ａ５４９、ＭＣＦ−７及びＢ１６Ｆ１細胞条件培養液によって誘導される内皮細胞の血管管状構造の新生を阻害できることが明らかとなった。
【００３８】
＜実施例１２＞ＬＥＣＴ２蛋白質の黒色腫及び肺細胞腫瘍発生及び血管新生に対する影響
まず、ＬＥＣＴ２を過剰発現したマウス黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１を構築した。ハイグロマイシンＢ（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ）でスクリーニングした後、ＬＥＣＴ２の発現量を分析し、生体内異種黒色腫移植モデルを用いてＬＥＣＴ２蛋白質の腫瘍成長及び血管新生に対する影響を評価した。Ｂ１６Ｆ１細胞(Ｂ１６Ｆ１／Ｎｅｏ及びＢ１６Ｆ１／ＬＥＣＴ２)を７週齢のＣ５７ＢＬ／６メスマウスに皮下注射し、それぞれのマウスは細胞５×１０５個を注射した。図１３Ａを参照すると、細胞を注射した１８日目に、Ｂ１６Ｆ１／Ｎｅｏ細胞を注射したマウスの平均腫瘍体積は明らかにＢ１６Ｆ１／ＬＥＣＴ２細胞を注射したマウスの腫瘍体積より大きい。２４日後に、マウスを犠牲にし、皮下腫瘍を取り出し撮影を行い、結果は図１３Ｂに示す通りである。さらに、免疫組織化学染色法でＬＥＣＴ２蛋白質を過剰発現している腫瘍細胞の、異種腫瘍移植体内血管新生と血管数の影響について分析を行った。図１３Ｃを参照すると、ホルマリンで腫瘍標本を固定し、パラフィンで包埋した後特定の血管染色法を行い（内皮マーカーＣＤ３１に対して免疫組織化学染色を行う）、切片を染色する。統計結果からわかるように、ベクター対照グループ細胞の腫瘍において、ｍｍ２体積単位あたりの血管数はＬＥＣＴ２細胞株をトランスフェクションしたものの２倍である。これによって、ＬＥＣＴ２はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス体内腫瘍中におけるＢ１６Ｆ１黒色腫細胞の成長及び血管新生を阻害できることが明らかになった。
【００３９】
＜実施例１３＞ＬＥＣＴ２蛋白質のヌードマウス腫瘍成長に対する影響
肺癌Ａ５４９細胞を７週齢のメスヌードマウスに皮下注射し、それぞれのマウスに細胞５×１０６個を注射した。Ａ５４９細胞を注射した２０日後に、Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（２０  ｍｇ／ｍＬ／マウス体重１キロあたり）を腹腔内注射し、マウスを麻酔させ、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ／ＮｉｇｈｔＯＷＬ映像システムで５分間撮影した。図１４を参照すると、短時間の露出（３０秒）であるにかかわらず、カラー映像はすべてのＡ５４９／Ｌｕｃ／Ｎｅｏ腫瘍マウスの背部皮下は明るいスポットを示し、この明るいスポットはＡ５４９／Ｌｕｃ／ＬＥＣＴ２腫瘍マウスにおいて明らかに小さいものであり、ＬＥＣＴ２はヌードマウス腫瘍の肺癌細胞成長を阻害できることを示した。これによって、ＬＥＣＴ２蛋白質はＡ５４９細胞のヌードマウスの腫瘍成長を有効に阻害できることが明らかとなった。
【００４０】
以上において本発明の好ましい実施例を開示したが、しかしこれらは本発明を限定するものではなく、すべての当業者は本発明の趣旨及び範囲を脱離しない前提において、適宜変更及び応用をすることができる。よって、本発明の保護しようする範囲は後の特許請求の範囲に依拠するものである。
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１Ａ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１３Ｃ】
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【国際調査報告】
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