(57)【要約】  保護基を使用しない酵素的合成による環状ジグアノシン一リン酸（ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ）を生産する方法を開示する。この方法は、２つのグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）分子をカップリングさせて、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ分子を形成することを含む。これは、アミノ酸配列Ｖ１５３Ｍ１５４Ｇ１５５Ｇ１５６を含む突然変異体ジグアニル酸シクラーゼ（ＤＧＣ）の影響下で行われる。ＤＧＣを封入体から得ることができること、およびこれを用いてｃ−ｄｉ−ＧＭＰ合成を改善するために十分な量のＤＧＣを入手可能にすることができることが判明した。詳細には、後述のｃ−ｄｉ−ＧＭＰ合成を、市販のバルク化学薬品から出発してワンポット法で行うことができ、および商業生産規模への規模拡大が可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
封入体の形態で提供される、修飾ＲＸＸＤモチーフを含む突然変異体ジグアニル酸シクラーゼ（ＤＧＣ）。
【請求項２】
ＧＭＧＧ、ＶＭＧＧ、ＧＧＶＡ、ＧＲＤＣ、ＧＶＧＤ、ＭＥＧＤ、ＧＧＮＨ、ＲＥＳＥ、ＲＮＲＤ、ＲＶＤＳ、ＲＡＧＧ、およびＲＧＱＤから成る群より選択される、修飾ＲＸＸＤモチーフをアミノ酸１５３−１５６に含む、請求項１に記載の突然変異体ＤＧＣ。
【請求項３】
Ｃ．クレセンタス（Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）ＤｇｃＡ（ＣＣ３２８５）アミノ酸配列Ｖ１５３Ｍ１５４Ｇ１５５Ｇ１５６を有する、請求項２に記載の突然変異体ＤＧＣ。
【請求項４】
適する宿主における適するＤＧＣ遺伝子の過発現、およびそれによって得られた封入体からのＤＧＣの採取を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の組換えＤＧＣを製造する方法。
【請求項５】
環状ジグアノシン一リン酸（ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ）を、酵素的合成によって、生産する方法であって、修飾ＲＸＸＤモチーフを含む突然変異体ジグアニル酸シクラーゼ（ＤＧＣ）の影響下で、２つのグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）分子をカップリングさせてｃ−ｄｉ−ＧＭＰ分子を形成することを含むものであり、ＧＴＰがグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）の転化によって形成されるワンポット反応によって行われるものであり、適する反応媒体への（ａ）ＧＭＰ、（ｂ）無水リン酸ドナー、（ｃ）グアニル酸キナーゼ（ＧｍｐＫ）、（ｄ）ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮｄＫ）、および（ｅ）ＤＧＣの添加、混合、およびこの反応混合物をインキュベートしてｃ−ｄｉ−ＧＭＰを形成することを含む方法。
【請求項６】
ＤＧＣが、請求項１から３のいずれか一項に記載の封入体から得ることができる、または請求項４に記載の方法によって作られた、リフォールディングされたＤＧＣである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＤＧＣが、０．１μＭから１０μＭの量で使用される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
ＤＧＣが、１から２μＭの量で使用される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１から３のいずれか一項に記載の、または請求項４に記載の方法によって作られた、突然変異体ジグアニル酸シクラーゼ（ＤＧＣ）の影響下で、２つのグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）分子をカップリングさせてｃ−ｄｉ−ＧＭＰ分子を形成することを含む、環状ジグアノシン一リン酸（ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ）を、酵素的合成によって、生産する方法。
【請求項１０】
ＤＧＣが合成中に補足される、請求項５から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項５から１０のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、９９％を超える純度のｃ−ｄｉ−ＧＭＰ少なくとも１０ｇのバッチ。
【請求項１２】
少なくとも１００ｇのサイズを有する、請求項１１に記載のバッチ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジグアニル酸シクラーゼ（ＤＧＣ）の影響下で２個のグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）分子をカップリングさせることによる、環状ジグアノシン一リン酸（ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ）の酵素的合成の分野に存する。詳細には、本発明は、ＤＧＣの大規模資源の提供に関する。また、本発明は、工業規模でのｃ−ｄｉ−ＧＭＰの生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
環状ジグアノシン一リン酸（ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ）は、バイオフィルム形成、抗生物質耐性、および病原菌のこれらの動物宿主における存続に関係づけられている、細菌のセカンドメッセンジャーである。
【０００３】
例えば、ＷＯ２００５／０３０１８６は、細菌病原体のビルレンスを減弱するまたは細菌病原体によるコロニー形成を阻害するもしくは減少させる方法におけるｃ−ｄｉ−ＧＭＰの使用に関する。ＵＳ２００５／０２０３０５１は、癌細胞増殖を阻害するためのまたは癌細胞アポトーシスを増加させるためのｃ−ｄｉ−ＧＭＰの使用に関する。ＵＳ２００６／００４０８８７は、患者における免疫もしくは炎症反応を刺激もしくは増進するための、またはワクチンに対する免疫反応を強化するためのアジュバントとしての、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰの使用に関する。また、ＥＰ１  ７８２  ８２６は、治療的または予防的ワクチン接種のためのアジュバントとしてのｃ−ｄｉ−ＧＭＰのような化合物の使用、およびワクチンなどの医薬組成物におけるこれらの使用に関する。広範な感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、腫瘍、アレルギー、および受精調節の処置における活性成分としてのこれらの化合物の使用がさらに考えられる。
【０００４】
これらの使用のためのｃ−ｄｉ−ＧＭＰは、化学合成によって生産される。このような合成に関する参考文献は、Ｈａｙａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５９（２００３），６４６５−６４７１である。この文献は、著者もさらなる参考文献、即ちＨｙｏｄｏ  ａｎｄ  Ｈａｙａｋａｗａ，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，７７，２０８９−２０９３（２００４）において認めているように、様々な合成段階で低い収率を示す。しかし、以前の方法の非常に低い総合収率に対して相当な改善を主張しているが、これらの段階の幾つかが生成物の大きな損失を依然として示すことは明白であり、総合収率は、感心させられるほどのものでは全くない、即ち２５％未満である。後述の内容は、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰの合成が、この分子全体にわたって比較的多数の保護基の使用を必要とすることに鑑みて、特に障害となる。合成およびこの完全除去は、困難を呈する。
【０００５】
保護基を使用せずに、例えば酵素的合成により、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰを生産できることが望ましい。このような生産ができれば、化学合成が必然的に被りやすい欠点、例えば多段階合成の結果として生ずる最適以下の総合収率が解決される。Ｍ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（ＰｈＤ  Ｔｈｅｓｉｓ  ２００７）の場合、１３５頁がこれを説明している：ｃ−ｄｉ−ＧＭＰの化学合成は、２つの構成要素の複雑な合成のため、有意な商業的価値がない。
【０００６】
しかし、今日までのところｃ−ｄｉ−ＧＭＰの酵素的合成も、まだ実際の商業規模での生産に適さない。これを実験室規模で合成して、この存在をＨＰＬＣによって証明することができる分析量を生じさせることはできるが、例えばＮＭＲによる構造同定および収率は発表されていない。分取ＨＰＬＣによる技術などの、ＨＰＬＣから化合物を得る技術これ自体は、実際の工業規模での生産除外するものではないが、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰの現行の酵素的合成をすぐに規模拡大することはできない。
【０００７】
ｃ−ｄｉ−ＧＭＰの天然合成と類似して、現行の酵素的合成は、ジグアニル酸シクラーゼ（ＤＧＣ）の影響下での２つのグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）分子のカップリングを含む。この方法は、生成物フィードバック阻害によって妨げられる。ｃ−ｄｉ−ＧＭＰのためのアロステリック結合部位が、ＤＧＣの非競合的生成物阻害の原因であると考えられている。このことを考慮して、Ｍ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎ（２００７）は、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰシグナリングメカニズムを解明するための補助として、様々なＤＧＣ突然変異体を調査した。
【０００８】
コアｃ−ｄｉ−ＧＭＰ結合部位であることが判明したＲＸＸＤモチーフが、例えばカウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）ＤｇｃＡ（ＣＣ３２８５）タンパク質においてＲ１５３Ｅ１５４Ｓ１５５Ｄ１５６からＶ１５３Ｍ１５４Ｇ１５５Ｇ１５６に変更された、ＤＧＣ突然変異体が同定された。この場合、アミノ酸の国際１文字命名法に従って、Ｒはアルギニンを、Ｅはグルタミン酸を、Ｓはセリンを、Ｄはアスパラギン酸を、Ｖはバリンを、Ｍはメチオニンを、およびＧはグリシンを表す。これらを用いて、フィードバック阻害を防止することにより、多少の収率向上を達成できたが、開示されている合成は、概して、ミリグラムの実験室規模生産をもたらし、およびｃ−ｄｉ−ＧＭＰの実際の工業規模での生産を可能にしない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００５／０３０１８６号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０２０３０５１号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００６／００４０８８７号明細書
【特許文献４】欧州特許第１７８２８２６号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｈａｙａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５９（２００３），６４６５−６４７１
【非特許文献２】Ｈｙｏｄｏ  ａｎｄ  Ｈａｙａｋａｗａ，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，７７，２０８９−２０９３（２００４）
【非特許文献３】Ｍ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（ＰｈＤ  Ｔｈｅｓｉｓ  ２００７）
【非特許文献４】Ｍ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎ（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰの改善された酵素的合成、ならびに詳細には商業生産に適する実際の工業規模で行うことができる合成、ならびにさらに詳細には高収率および高純度での合成を提供することが、望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上述の要求の１つ以上により良く対処するために、本発明は、１つの実施形態において、修飾ＲＸＸＤモチーフ、例えば、Ｃ．クレセンタスＤｇｃＡ（ＣＣ３２８５）アミノ酸配列Ｖ１５３Ｍ１５４Ｇ１５５Ｇ１５６を含む突然変異体ジグアニル酸シクラーゼ（ＤＧＣ）を提示し、このＤＧＣを封入体の形態で提供する。
【００１３】
本発明は、もう１つの実施形態において、ＧＴＰをグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）の転化によって形成するワンポット合成を提示し、この合成は、適する反応媒体に、（ａ）ＧＭＰ、（ｂ）無水リン酸ドナー、（ｃ）グアニル酸キナーゼ（ＧＭＰＫ）、（ｄ）ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮｄＫ）、および（ｅ）修飾ＲＸＸＤモチーフ、例えばＣ．クレセンタスＤｇｃＡ（ＣＣ３２８５）アミノ酸配列Ｖ１５３Ｍ１５４Ｇ１５５Ｇ１５６を含む突然変異体ジグアニル酸シクラーゼ（ＤＧＣ）を添加すること、混合すること、およびこの反応混合物をインキュベートしてｃ−ｄｉ−ＧＭＰを形成することを含む。
【００１４】
さらのもう１つの実施形態において、本発明は、環状ジグアノシン一リン酸（ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ）を、酵素的合成によって、生産する方法に関し、この方法は、修飾ＲＸＸＤモチーフ、例えばＣ．クレセンタスＤｇｃＡ（ＣＣ３２８５）アミノ酸配列Ｖ１５３Ｍ１５４Ｇ１５５Ｇ１５６を含む突然変異体ジグアニル酸シクラーゼ（ＤＧＣ）の影響下で、２つのグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）分子をカップリングさせてＣ−ｄｉ−ＧＭＰ分子を形成することを含み、このＤＧＣは、封入体から得ることができるリフォールディングされたＤＧＣである。
【００１５】
さらなる実施形態において、本発明は、商業規模で上述の反応を行うために十分に多い量のＤＧＣを得る方法を提供し、この方法は、適する宿主細胞において適するＤＧＣ遺伝子を過発現させること、およびそれによって得られた封入体からＤＧＣを採取することを含む。
【００１６】
尚、さらなる実施形態において、本発明は、イオン交換材料を用いる溶出によって酵素反応混合物から純粋なｃ−ｄｉ−ＧＭＰを単離する方法を提供し、この場合の溶離剤は、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰを最終溶出画分として得られるように選択される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下の説明において、用語「ＤＧＣ」は、修飾ＲＸＸＤモチーフを含む突然変異体ジグアニル酸シクラーゼ（ＤＧＣ）を指す。ジグアニル酸シクラーゼにおけるｃ−ｄｉ−ＧＭＰのためのアロステリック結合部位のこのＲＸＸＤモチーフについては、Ｃｈｒｉｓｎｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８１，Ｉｓｓｕｅ  ４２，３２０１５−３２０２４，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０，２００６を参照する。ＤＧＣは、好ましくは、ＧＭＧＧ、ＶＭＧＧ、ＧＧＶＡ、ＧＲＤＣ、ＧＶＧＤ、ＭＥＧＤ、ＧＧＮＨ、ＲＥＳＥ、ＲＮＲＤ、ＲＶＤＳ、ＲＡＧＧ、およびＲＧＱＤ（すべての文字は、上述の１文字命名法に従う）から成る群より選択される修飾ＲＸＸＤモチーフをアミノ酸１５３−１５６に含む。好ましくは、ＤＧＣは、アミノ酸配列Ｖ１５３Ｍ１５４Ｇ１５５Ｇ１５６を含むＣ．クレセンタス突然変異体ジグアニル酸シクラーゼＤｇｃＡ（ＣＣ３２８５）である。
【００１８】
広義で、本発明は、比較的大規模にＤＧＣを得ることが判明した方法を、ＧＴＰのｃ−ｄｉ−ＧＭＰに対する酵素的カップリングの際にＤＧＣの量を実質的に増加させることにより用いる。
【００１９】
本発明によると、ＤＧＣは、例えばエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における過発現に基づき封入体としてこれを採取することによって得られる。封入体は、細胞内凝集体内に蓄積する不活性、変性タンパク質を主として含む。これらは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における高レベルの組換えタンパク質の発現の結果として生ずることが多い。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｌｄｉｎｇ，Ｌ．Ｍ．Ｇｉｅｒａｓｃｈ  ａｎｄ  Ｐ．Ｋｉｎｇ（Ｅｄｓ），Ａｍ．Ａｓｓ．Ａｄｖ．Ｓｃｉ．，１３６−１４２（１９９０）におけるＫｒｕｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，」；Ｍａｒｓｔｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２４０：１−１２（１９８６）；Ｍｉｔｒａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．７：８００−８０７（１９８９）；Ｓｃｈｅｉｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．７：１１４１−１１４７（１９８９）；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．４：５５３−５５７（１９８６）を参照することができる。封入体は、直径が２から３μｍである、および細胞溶解後に低速遠心分離により可溶性細菌タンパク質から分離することができる組換えタンパク質から主として成る、稠密凝集体である（Ｓｃｈｏｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：１５１−１５４（１９８５））。
【００２０】
当業者は理解していることであるが、封入体として発現されるＤＧＣは、変性されており、酵素的合成での使用前にこの天然配座にリフォールディングさせなければならない。タンパク質封入体のリフォールディングのための技術は、当業者に公知である。リフォールディングされたタンパク質の単離および精製は、当分野において公知の方法で行うことができる。リフォールディングされたタンパク質を精製せずに使用することもある。
【００２１】
一般的な意味で、生化学者は、特に、タンパク質をリフォールディングするおよび活性を回復させる必要に鑑みて、酵素的に活性なタンパク質を封入体として生産することに通常は駆り立てられない。しかし、本発明の場合、封入体でのＤＧＣの発現が、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰの生産にとって少なからぬ利点をもたらす。
【００２２】
これは、第一に、ＤＧＣの利用可能性−上述のＣｈｒｉｓｔｅｎ（２００７）参考文献では非常に低い−が、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰの生産の規模拡大にとっての制限要因であることの、本発明による容認に基づく。言い換えると、本発明に従って得ることができるＤＧＣの純然たる量は、工業規模で行うことができる生産方法を可能にする。
【００２３】
さらに、本発明の方法では、どちらかといえば従来欠点であった封入体としてのＤＧＣのまさにこの存在が、大規模生産についての適性の一因となる改善をもたらす。酵素的に活性なＤＧＣタンパク質の大規模発現は、タンパク質生産細胞にとって毒性である。従って、大規模ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ生産に必要とされるＤＧＣ量を天然タンパク質発現の手順によって適度に産生することはできない。本発明は、ｄｇｃＡ発現構築物の同定および酵素的に不活性な封入体の高い発現レベルを可能にする発現条件の結果として大規模ＤｇｃＡ生産の可能性に備えるものである。ＤｇｃＡタンパク質の不活性は、Ｅ．コリ細胞に対するこの毒性のため、この酵素の大規模生産には不可欠の利点である。さらに、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ生産の方法は、ＤＧＣ供給に依存するので、ＤＧＣを大量に生産することばかりでなく、これを貯蔵できること、および必要なときに必要な量でこれを使用できることも重要である。封入体としてのＤＧＣの採取により、本質的に安定した、従って良好に貯蔵可能な、形態のタンパク質が得られる。この形態、即ち変性ＤＧＣから、タンパク質をリフォールディングすることができ、所望されるときに所望どおりの量で使用することができる。ＤＧＣは、概して、少なくとも０．１μＭから１０μＭ、および好ましくは１から２μＭの量で使用される。
【００２４】
封入体を生産するためのＤＧＣの過発現は、当分野において一般に公知の方法で行うことができる。
【００２５】
一般に、例えばエレクトロポレーションおよび形質転換などの周知の技術を用いて、ターゲットタンパク質の発現のための組換え構築物を宿主細胞に導入することができる。ベクターは、例えば、プラスミドであり得る。
【００２６】
ターゲットタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、宿主における繁殖のために、選択マーカーを含有するベクターに連結させることができる。対象のポリヌクレオチドに対するシス作用性制御領域を含むベクターが好ましい。適切なトランス作用性因子は、宿主によって供給されることがあり、相補性ベクターによって供給されることがあり、または宿主への導入に基づきこのベクターこれ自体によって供給されることがある。
【００２７】
特異的発現に備えるベクターとしては、誘導可能であり得るものが挙げられる。このようなベクターの中で、温度および栄養添加物などの操作が容易である環境因子によって誘導可能なものが、特に好ましい。
【００２８】
ターゲットタンパク質の発現に有用な発現ベクターとしては、例えば、細菌プラスミドに由来するベクターが挙げられる。
【００２９】
ターゲットタンパク質についての遺伝子を含有するＤＮＡインサートを、ファージＴ７などの適切なプロモーターに作動可能に連結させなければならない。他の適するプロモーターは、当業者に公知である。前記発現構築物は、さらに、転写開始、終結のための部位、および転写領域内に翻訳のためのリボソーム結合部位を含有する。構築物によって発現されるターゲット転写産物のコーディング部分は、翻訳すべきポリペプチドの最初に翻訳開始および末端に適切に位置する終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を好ましくは含む。
【００３０】
示したように、発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを好ましくは含む。Ｅ．コリおよび他の細菌において培養するための、このようなマーカーとしては、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコールまたはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、Ｅ．コリなどの細菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記宿主細胞のための適切な培養基および条件は、当分野において公知である。
【００３１】
ターゲットタンパク質の細菌発現での使用に好ましいベクターには、Ｎｏｖａｇｅｎから入手できるｐＥＴベクターが挙げられる。他の適するベクターは、当業者には容易にわかる。
【００３２】
本発明の特に好ましい実施形態において、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰは、ワンポット反応で生産される。この場合、ＧＴＰは、適する反応媒体に（ａ）ＧＭＰ、（ｂ）無水リン酸ドナー、（ｃ）グアニル酸キナーゼ（ＧＭＰＫ）、（ｄ）ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮｄＫ）、および（ｅ）ＤＧＣを添加すること、混合すること、およびインキュベートしてｃ−ｄｉ−ＧＭＰを形成することを含む、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）の転化によって形成される。
【００３３】
ワンポット合成が一般に好ましいことは、当業者には明らかである。一般に、ワンポット合成により、反応中間体を単離および精製するときに通常被る収量の損失が避けられる。さらに、この場合、ＧＴＰは、希少であり、高価であり、その上、工業規模への拡大に対する別の制限要因になるので、ＧＴＰではなくＧＭＰから出発できることが、商業生産のためのさらなる恩恵をもたらす
ワンポット合成を、次のスキームに示す。
【００３４】
【化１】
2012511313.tif 000002
【００３５】
【化２】
2012511313.tif 000003
【００３６】
この場合、ＡＴＰは、アデノシン三リン酸であり、ＡＤＰは、アデノシン二リン酸であり、および他の略語は上に与えた。
【００３７】
ＧＴＰの形成までの工程順序は可逆的であるので、ＤＧＣの利用可能性は、ワンポット方法にとって重要である。従って、単一反応媒体中に存在するすべての反応物を用いて、反応をｃ−ｄｉ−ＧＭＰの形成に向かわせるようにＧＴＰを除去することが絶対必要である。本発明は、ＧＴＰの除去を、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰへのこの転化（即ち、カップリング）により、可能にする。上述の大量のＤＧＣの利用可能性は、このための重要なツールである。この利用可能性が、合成中のＤＧＣの補足、即ちＤＧＣの恒常的供給の提供を可能にして、ＧＴＰをカップリングさせてｃ−ｄｉ−ＧＭＰを形成してＧＴＰを除去する反応を駆動することができる。
【００３８】
ワンポット合成についての条件を当業者は十分に決定することができる。適する反応媒体は、例えば、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）を緩衝剤として含む弱アルカリ性ｐＨの水性緩衝液である。他の緩衝剤は、公知である。反応物および酵素の典型的な量は、ＮｄＫおよびＧＭＰＫについては０．０１から１Ｕ／ｍＬ、ならびにＤｇｃＡについては０．１から１０μＭの範囲であり；反応体としては、０．１から２０ｍＭ  ＧＭＰおよび０．２から５０ｍＭ  ＡＴＰである。適する無水リン酸ドナーは公知であり、最もよく知られており、好ましい例は、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）である。異なる種からの任意のＮｄＫおよびＧＭＰＫ酵素を使用できるが、Ｅ．コリ酵素が最も特性づけされている。
【００３９】
本発明に従って得ることができるＤＧＣに加えて、酵素的合成において使用される出発原料は、市販されており、または当分野においてこれ自体公知である様式で調製および単離することができる。
【００４０】
本発明に従って得たｃ−ｄｉ−ＧＭＰの単離および精製を、当分野において一般に公知の方法で行うことができる。これらの方法としては、一般に、イオン交換材料、典型的にはイオン交換カラムを用いる溶出が挙げられる。これに関して、本発明は、さらに有利な実施形態を提供する。驚くべきことに、上で説明した酵素的ワンポット方法の結果として得られる混合物は、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰの溶出の前にすべての他の成分の溶出を（溶離剤の賢明な選択により）可能にする。典型的な溶離剤は、低濃度ＨＣｌと塩化リチウムである。水、酢酸アンモニウム、２０ｍＭ  ＨＣｌおよび４０ｍＭ  ＬｉＣｌを含有する水溶液で洗浄することにより、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰからすべての試薬および副生成物を分離することができる。生成物は、２０ｍＭ  ＨＣｌ／５００ｍＭ  ＬｉＣｌによって高濃度画分でこのカラムから最後に溶出される。最終精製は、アセトン：ＥｔＯＨ中でのまたは他の有機／水不混和性溶媒系中でのｃ−ｄｉ−ＧＭＰの水溶液の沈殿によって行う。アンモニアの添加により、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰのジアンモニウム塩が得られる。
【００４１】
封入体として大量のＤＧＣを利用できることの単なる結果としてワンポット酵素的合成を可能にしたが、別の供給源からの十分なＤＧＣを利用できる場合には、ワンポット合成これ自体に付随する利点も利用できることは理解される。
【００４２】
好ましくは、ワンポット合成において使用するＤＧＣは、実際には、上で説明した封入体から得ることができるリフォールディングされたＤＧＣである。
【００４３】
本発明のｃ−ｄｉ−ＧＭＰの酵素的合成は、商業、工業規模での生産を本質的に可能にする。用語「商業規模」および「工業規模」は、（前に言及した出版物に記載されている）実験室において概して見出されるものと生産規模を区別するために用いている。後述の実験室のものは、一般に、最高でも１０ｍｇを大きく超えることがない生産規模を伴う。商業規模は、キログラム規模までの、何十から何百ものグラム数を含む。本発明における生産は、少なくとも１グラムの規模、詳細には数十グラム、好ましくは少なくとも１００グラム、およびさらに好ましくは少なくとも１ｋｇの規模である。
【００４４】
ＤＧＣの利用可能性の制限が本発明に従って解決された今、規模拡大これ自体を、当分野において標準的な方法で行うことができる。
【００４５】
このことにより、本発明は、上で説明した方法による酵素的合成によって得ることができる、（ＨＰＬＣ分析に従って）９５％を超える純度のおよび特に（ＨＰＬＣ分析に従って）純度１００％のｃ−ｄｉ−ＧＭＰ少なくとも１０ｇ、好ましくは少なくとも１００ｇおよびさらに好ましくは少なくとも１ｋｇのバッチの形態での製品にも関する。ＮＭＲ分析による（上で説明した方法によって合成した）ｃ−ｄｉ−ＧＭＰの定量分析は、８０から９０％（ｗ／ｗ）の範囲の純度を示す。アンモニア（概して５％（ｗ／ｗ）の範囲内）、水（概して５から１５％（ｗ／ｗ）の範囲内）ならびに残りの量のアニオン性およびカチオン性の塩（例えば、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、ＰＯ４２＋、Ｃｌ−）の添加により、質量バランスを満たすことができる。
【００４６】
本発明のｃ−ｄｉ−ＧＭＰは、この通常の方法で使用することができるにもかかわらず、酵素的合成に付随する高純度と併せて商業規模生産の利点を有する。本発明により利用できる大量のｃ−ｄｉ−ＧＭＰは、ヒトおよび動物健康に関わる感染性および他の疾患の処置の際のｃ−ｄｉ−ＧＭＰの使用を可能にする。大規模合成は、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ誘導体の半合成生産も可能にする。例えば、チオホスファート、リン酸エステル、アセチル化およびアルキル化ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ誘導体が、ｃ−ｃｉ−ＧＭＰの化学的変換によって入手できるようになる。
【００４７】
後続の非限定的実施例および添付の図面を参照して、本発明を下でさらに説明する。
【実施例１】
【００４８】
この実施例は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）からのグアニル酸キナーゼおよびヌクレオシド二リン酸キナーゼの遺伝子クローニング、過発現、精製および特性づけを説明するものである。
【００４９】
ａ）Ｅ．コリｇｍｐｋおよびＥ．コリｎｄｋの遺伝子クローニング
Ｅ．コリＧｍｐＫ（Ｍ８４４００）およびＥ．コリＮｄＫ（Ｘ５７５５５）のＧｅｎｂａｎｋデータベースＤＮＡ配列に基づき、それぞれの遺伝子のＰＣＲ増幅のためのプライマーを設計した：
【００５０】
【化３】
2012511313.tif 000004
導入されたクローニング部位にアンダーラインを引く。遺伝子の開始および終結コドンは太字である。
【００５１】
標準的な方法（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．）により、ゲノムＤＮＡをＥ．コリＪＭ１０９から単離した。４ｎｇ／ｍＬのゲノムＤＮＡテンプレートおよび０．５Ｍのそれぞれのプライマーを使用して、標準ＰＣＲ（３０サイクル、３０秒の伸長時間、それぞれ５７℃および６２℃のアニーリング温度）でＰＣＲを行った。１％ＴＡＥアガロースゲル電気泳動後、ｇｍｐＫおよびｎｄＫ遺伝子を表す予想ＤＮＡバンドが観察された。
【００５２】
それぞれのＰＣＲバンドを切り出し、これらのＤＮＡフラグメントをＧｅｎｅＣｌｅａｎ（登録商標）によって精製し、ｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏにライゲートした。ＧｍｐＫおよびＮｄＫについての２つの独立したプラスミドクローンをそれぞれ単離し、ＤＮＡインサートをシークエンシングした。すべてのプラスミド・クローン・インサートの導出タンパク質配列は、それぞれのデータベースタンパク質配列と同一であった。
【００５３】
ｂ）Ｅ．コリにおけるＧｍｐＫおよびＮｄＫ過発現実験
過発現実験のために、Ｅ．コリｇｍｐｋおよびＥ．コリｎｄｋのオープン・リーディング・フレームを、導入した隣接するＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位により、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−ｃｕｔ  ｐＱＥ３０にサブクローニングした。
【００５４】
その後、これらの得られたプラスミドをＥ．コリＭ１５に導入した。標準的なプロトコル（簡単にいうと：新しいＬＢ−Ａｍｐ−Ｋａｎ中でのオーバーナイトＬＢ−Ａｍｐ−Ｋａｎ培養物１＋９の希釈、２時間、３７℃での成長、１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加、さらに４．５時間、３７℃での成長、採取）により、発現実験を行った。
【００５５】
ＧｍｐＫとＮｄＫの両方の精製についての手順：
１リットルのＩＰＴＧ誘導培養物の採取した細胞ペレットを、さらなるプロセッシングまで、−２０℃で凍結させておいた。さらなるプロセッシング：０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００と、１ｍｇ／ｍＬリゾチームと、２５Ｕ／ｍＬベンゾヌクレアーゼとを補足した４０ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０／ＮａＯＨ）にこれらの凍結ペレットを入念に再懸濁させた。これらの懸濁液を氷上で１時間インキュベートし（→溶解産物：Ｌｙｓ）、その後、２５００ｇで１時間、遠心分離した。補足物を伴う１０ｍＬの溶解緩衝液でこれらのペレットを１回洗浄し、遠心分離した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析のために５０ｍＬの２％ＳＤＳにこれらの洗浄したペレットを再懸濁させた（→ペレット；Ｐｅ）。その後、これらの併せた遠心分離上清（Ｓｎ）を、補足物を伴わない溶解緩衝液と予め平衡させておいた４ｍＬ  Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）カラムに適用した。フロースルーを回収し（Ｆｔ）、このカラムを５カラム量の洗浄緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８．０／ＮａＯＨ）で洗浄した。溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８．０／ＮａＯＨ）で溶出を行い、５ｍＬの画分を回収した（Ｅｌｕ  １−５）。溶解産物プロセッシングおよびＮｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム溶出物のすべての画分を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシンブルー染色によって分析した。
【実施例２】
【００５６】
ａ）Ｃ．クレセンタスｄｇｃＡの遺伝子クローニング
Ｃ．クレセンタスｄｇｃＡのＧｅｎｂａｎｋデータベースＤＮＡ配列（ｃｃ＿３２８５；ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＥ００５６７３）に基づき、それぞれの遺伝子のＰＣＲ増幅のためのプライマーを設計した：
【００５７】
【化４】
2012511313.tif 000005
導入されたクローニング部位にアンダーラインを引く。ｄｇｃＡの開始コドンは太字である。
【００５８】
Ｃ．クレセンタスＣＢ１５テンプレートの４ｎｇ／ｍＬのゲノムＤＮＡと１．０μＭのプライマーＣａｃｒ−００２／Ｃａｃｒ−００４を用いて、標準ＰＣＲ（３５サイクル、３０秒の伸長時間、５５℃のアニーリング温度）で、ＰＣＲを行った。Ｒ１５３Ｖ−Ｅ１５４Ｍ−Ｓ１５５Ｇ−Ｄ１５５Ｇ突然変異を含むｄｇｃＡ遺伝子の３’末端を表す予想ＤＮＡバンドが、１％ＴＢＥアガロースゲル電気泳動後に観察された。それぞれのＰＣＲバンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によってＤＮＡフラグメントを精製し、メガプライマーとして、次のＰＣＲ反応において、プライマー１．０μＭ  Ｃａｃｒ−０１０プライマー、およびＣ．クレセンタスＣＢ１５テンプレートの４ｎｇ／ｍＬのゲノムＤＮＡと併用した。Ｒ１５３Ｖ−Ｅ１５４Ｍ−Ｓ１５５Ｇ−Ｄ１５５Ｇ突然変異を含む完全ｄｇｃＡ遺伝子を表す予想ＤＮＡバンドが、１％ＴＢＥアガロースゲル電気泳動後に観察された。それぞれのＰＣＲバンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によってＤＮＡフラグメントを精製し、ｐＣＲ−ＩＩ  ＴＯＰＯにライゲートしてｐＣａｃｒ−００３ｂを形成した。ＤｇｃＡＶＭＧＧについての２つの独立したプラスミドクローンを単離し、これらのＤＮＡインサートをシークエンシングした。すべてのプラスミド・クローン・インサートの導出タンパク質配列は、Ｒ１５３Ｖ−Ｅ１５４Ｍ−Ｓ１５５Ｇ−Ｄ１５５Ｇ突然変異を有さずに、それぞれのデータベースタンパク質配列と同一であった。
【００５９】
１ｎｇ／ｍＬのｐＣａｃｒ−００３ｂテンプレートおよび１．０μＭのプライマーＣａｃｒ−０１１／Ｃａｃｒ−０１４を使用して、標準ＰＣＲ（３５サイクル、３０秒の伸長時間、５５℃のアニーリング温度）で、別のＰＣＲを行った。Ｒ１５３Ｖ−Ｅ１５４Ｍ−Ｓ１５５Ｇ−Ｄ１５５Ｇ突然変異を含むｄｇｃＡＶＭＧＧ遺伝子を表す予想ＤＮＡバンドが、１％ＴＢＥアガロースゲル電気泳動後に観察された。それぞれのＰＣＲバンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によってＤＮＡフラグメントを精製し、ｐＣＲ−ＩＩ  ＴＯＰＯにライゲートしてｐＣａｃｒ−０１８ａを形成した。ＤｇｃＡＶＭＧＧについての２つの独立したプラスミドクローンを単離し、これらのＤＮＡインサートをシークエンシングした。すべてのプラスミド・クローン・インサートの導出タンパク質配列は、Ｒ１５３Ｖ−Ｅ１５４Ｍ−Ｓ１５５Ｇ−Ｄ１５５Ｇ突然変異を有さずに、それぞれのデータベースタンパク質配列と同一であった。
【００６０】
ｂ）この実施例は、Ｃ．クレセンタスからのＤｇｃＡの獲得を例証するものである
過発現実験のために、プラスミドｐＣａｃｒ−１８ａからＣ．クレセンタスｄｇｃＡＶＭＧＧのオープン・リーディング・フレームを、隣接するＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩ部位により、ＢａｍＨＩ／ＮｅｄＩ−ｃｕｔ  ｐＥＴ−１５ｂにサブクローニングした。その後、これらの得られたプラスミドｐＣａｃｒ−２０をＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。
【００６１】
発現プラスミドｐＣａｃｒ−２０を有するＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を伴うＬＢ培地において３７℃で成長させ、Ａ６００  ０．４のイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを１ｍＭの最終濃度まで添加することにより発現を誘導した。誘導後、細胞をさらに４時間、３７℃で成長させた。遠心分離によって採取した後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％グリセロール、２０μＬ／ｇ  細胞ペレットＬｙｓｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含有する緩衝液に細胞を再懸濁させ、室温で１５分間インキュベートし、フレンチ・プレス・セル（Ｆｒｅｎｃｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｅｌｌ）に通すことによって溶解した。３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホナート（ＮＤＳＢ−２０１）を１２５ｍＭの最終濃度まで添加し、この混合物をさらに１５分間、室温でインキュベートした。１５分間、８，０００×ｇでの遠心分離により、可溶性タンパク質画分と不溶性タンパク質画分を分離した。封入体を含有するペレットを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％グリセロール、１ｍＭ  トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、および１２５ｍＭ  ＮＤＳＢ−２０１を含有する洗浄緩衝液（１０ｍＬ／（細胞ペレット１ｇ））で１回洗浄し、１５分間、８，０００×ｇで遠心分離した。封入体を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％グリセロール、および１ｍＭ  ＴＣＥＰを含有する再懸濁緩衝液（１０ｍＬ／（細胞ペレット１ｇ））で２回洗浄し、１５分間、８，０００×ｇで遠心分離した。精製された封入体を−８０℃で保管するか、攪拌しながら６０分間、室温で、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、７Ｍ塩酸グアニジンおよび１０ｍＭ  ＴＣＥＰを含有する緩衝液に再懸濁させた。１５分間、２５，０００×ｇおよび４℃での遠心分離により、可溶性タンパク質画分と不溶性タンパク質画分を分離した。変性ＤｇｃＡを含有する上清を、０．４５μｍフィルターに通して濾過することによって滅菌し、使用するまで−８０℃で保管した。リフォールディングのために、５００ｍＭ  Ｌ−アルギニン、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５を含有する２５容量の緩衝液に、変性ＤｇｃＡ（５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、攪拌しながら４℃で１８時間インキュベートした。
【実施例３】
【００６２】
この実施例は、ＧＭＰからのｃ−ｄｉ−ＧＭＰの生産を例証するものである
１２５０ｍＬ  新たにリフォールディングしたＤｇｃＡ、５０００Ｕ  ＮｄＫ（５０％グリセロール中、２．８Ｕ／μＬ）、５０００Ｕ  ＧｍｐＫ（５０％グリセロール中、３．６Ｕ／μＬ）、グアノシン５’一リン酸（ＧＭＰ、４ｇ、１１ｍｍｏｌ）、１３．７５ｇ  アデノシン５’三リン酸・二ナトリウム塩（ＡＴＰ）、および３７５０ｍＬ  反応緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有）を混合し、３０℃で１６時間、８０ｒｐｍで弱く振盪しながらインキュベートした。
【００６３】
精製
粗反応混合物（４８００ｍＬ）をセルロースに通して濾過し、アニオン交換カラム（Ｄｏｗｅｘ  １×２、４００ｍＬ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＸＫ２６、内径２．５ｃｍ、長さ約７０ｃｍ；Ｃｌ−型、０．５％酢酸で大規模に洗浄し、水（２０００ｍＬ）で平衡させたもの；流量１０ｍＬ／分）に添加した。
【００６４】
このカラムを水（２０００ｍＬ、１０ｍＬ／分）、２Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ（２０００ｍＬ、１０ｍＬ／分）、水（１５００ｍＬ、１０ｍＬ／分）、１０ｍＭ  ＨＣｌ／５０ｍＭ  ＬｉＣｌ（１０００ｍＬ、１０ｍＬ／分）で洗浄した。
【００６５】
１０ｍＭ  ＨＣｌ／５００ｍＭ  ＬｉＣｌ（２０００ｍＬ、１０ｍＬ／分）により、このイオン交換カラムから生成物を溶出させた。
【００６６】
生成物（約８００ｍＬ）を含有するイオン交換クロマトグラフィーの水性溶出物を、アンモニア（１．５ｍＬ、３２％  ｗ／ｗ）の添加により、塩基性ｐＨに調整した。減圧下で溶媒を蒸発させて、高粘度の懸濁液を得た。ＥｔＯＨ：アセトン（１：１（ｖ：ｖ）；３００ｍＬ）の添加により生成物を沈殿させ、１５分間、室温で攪拌した。固体を濾過（細孔３）によって分離し、５％ＮＨ３（２５ｍＬ）に溶解し、ＥｔＯＨ：アセトン（１：１（ｖ：ｖ）；３００ｍＬ）の添加により再び沈殿させた。この溶解／沈殿手順をもう一度繰り返した。得られた固体を１％ＮＨ３（２０ｍＬ）に溶解し、濾過し（０．４５μｍ  細孔径；ＰＥＴフィルター）、一晩、凍結乾燥させた。
【００６７】
収量ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ×２ＮＨ３（１．７９ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を、オフホワイトの固体として、４５％の総収率（出発原料ＧＭＰに基づいて算出）で得た。
【００６８】
生成物特性づけ
酵素的に生産されたｃ−ｄｉ−ＧＭＰの素性を、ＮＭＲおよびＬＣＭＳにより、化学合成されたｃ−ｄｉ−ＧＭＰとデータを比較することによって確証した。ＬＣＭＳおよびＮＭＲにより不純物は検出されなかった。
【００６９】
１Ｈ  ＮＭＲ：ｓ（８．０，２Ｈ）、ｓ（６．０，２Ｈ）、ｍ（５．０，２Ｈ）、ｍ（４．８，２Ｈ＋Ｈ２Ｏシグナル）、ｍ（４．４，４Ｈ）、ｍ（４．１，２Ｈ）；ＨＰＬＣ−ＭＳ：３．３６分（２１０および２５４ｎｍで純度１００％）；［Ｍ＋１］＝６９１（ｔｈ．６９１）。ＨＰＬＣ：Ａｔｌａｎｔｉｓ−ＨＰＬＣ−カラム、４．６＊５０ｍｍ、ｄＣ１８、３μｍ；溶媒系：水（＋０．１％ギ酸）＝溶媒Ａ；アセトニトリル（＋０．１％ギ酸）＝溶媒Ｂ；方法：５分間、０から１０％  Ｂ（＝１００から９０％  Ａ）；１０％  Ｂで１分；全実行時間：８分。定量ＮＭＲ分析により、高いｃ−ｄｉ−ＧＭＰ純度（ｗ／ｗ％＝８２．１％）が確認された。イオンクロマトグラフィーにより、最終生成物中のナトリウム（ｗ／ｗ％＝０．４％）、アンモニウム（ｗ／ｗ％＝５．３％）およびリチウム（ｗ／ｗ％＝０．０４％）カチオンならびに少量のリン酸アニオン（ｗ／ｗ％＝０．１５％）および塩化物アニオン（ｗ／ｗ％＝０．７％）の存在が確認された。カール・フィッシャー滴定を用いて、水の量を決定した。（非水性溶媒系へのｃ−ｄｉ−ＧＭＰの不溶性のため）ＭｅＯＨ懸濁液中で測定を行った。決定された水の量（ｗ／ｗ％＝約１０％）を概算推定値として使用する。
【配列表】
2012511313000001.app
【国際調査報告】
2012511313.tif 000006
2012511313.tif 000007
2012511313.tif 000008
2012511313.tif 000009
2012511313.tif 000010
2012511313.tif 000011