(57)【要約】  本発明は、シクロデキストリンを用いる、ＤＮＡポリメラーゼにより触媒されるin vitroＤＮＡ合成のための方法に関する。本発明はまた、シクロデキストリンを含んでなる、核酸の増幅のための方法、組成物およびキットに関する。シクロデキストリンを用いることで、増幅反応の特異性、感度および／または収量が改善される。本発明は、より詳しくは、ＰＣＲ反応を行うための、シクロデキストリンを含んでなるキット、組成物および方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善する方法であって、少なくとも１種のシクロデキストリンを含んでなる反応混合物中で増幅反応を行う、方法。
【請求項２】
サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善するための請求項１に記載の方法であって、次の工程：
ａ）標的核酸を含有する、または標的核酸を含有することが疑われるサンプルを、少なくとも１種のシクロデキストリンを含有する増幅反応混合物と接触させる工程；
ｂ）工程ａ）で得られた反応混合物に対して増幅反応を行う工程
を含んでなる、方法。
【請求項３】
サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善するための請求項１に記載の方法であって、次の工程：
ａ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファー、ｄＮＴＰおよびプライマーから選択される少なくとも１つの要素をシクロデキストリンと接触させる工程；
ｂ）標的核酸を含有する、または標的核酸を含有することが疑われるサンプルを、工程ａ）からの少なくとも１つの要素を含有する増幅反応混合物と接触させる工程；
ｃ）工程ｂ）で得られた反応混合物に対して増幅反応を行う工程
を含んでなる、方法。
【請求項４】
サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善するための請求項１に記載の方法であって、次の工程：
ａ）サンプルをシクロデキストリンと接触させてサンプルおよびシクロデキストリンの混合物を得る工程；
ｂ）サンプルおよびシクロデキストリンの混合物を増幅反応混合物と接触させる工程；
ｃ）工程ｂ）で得られた反応混合物に対して増幅反応を行う工程
を含んでなる、方法。
【請求項５】
サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善するための請求項１に記載の方法であって、次の工程：
ａ）サンプルを増幅反応混合物と接触させる工程；
ｂ）少なくとも１種のシクロデキストリンを加える工程；
ｃ）工程ｂ）で得られた反応混合物に対して増幅反応を行う工程
を含んでなる、方法。
【請求項６】
サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善するための請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法であって、反応混合物中のシクロデキストリンの濃度が０．１〜５０ｍＭの間である、方法。
【請求項７】
サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善するための請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法であって、反応混合物が、０．０１〜０．２単位／μｌの間の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなる、方法。
【請求項８】
サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善するための請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法であって、反応混合物が、少なくともサンプル、シクロデキストリン、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファー、ｄＮＴＰおよび少なくとも１つのプライマーを含んでなる、方法。
【請求項９】
サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善するための請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法であって、シクロデキストリンが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンおよびそれらの誘導体からなる群から選択される、方法。
【請求項１０】
サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善するための請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法であって、シクロデキストリンが、モノプロパンジアミノ−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−Ｄ−マルトシル−βシクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよび２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンからなる群から選択される、方法。
【請求項１１】
ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される核酸のin vitro合成の特異性および／または収量を改善するための方法であって、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰおよび少なくとも１種のシクロデキストリンを含んでなるＤＮＡ合成反応混合物と一本鎖核酸とを接触させることを含んでなる、方法。
【請求項１２】
ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される核酸のin vitro合成の特異性および／または収量を改善するための請求項１１に記載の方法であって、プライマーと一本鎖核酸とのアニーリングおよびプライマーの３’末端における相補的ｄＮＴＰの組み込みを含んでなる、方法。
【請求項１３】
ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される核酸のin vitro合成の特異性および／または収量を改善するための請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法であって、一本鎖核酸およびＤＮＡ合成反応混合物を含んでなる最終反応混合物中のシクロデキストリンの濃度が０．１〜５０ｍＭの間である、方法。
【請求項１４】
同じ容器に少なくとも１種のシクロデキストリンと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、核酸増幅のための反応バッファー、ｄＮＴＰおよびオリゴヌクレオチドプライマーからなる群から選択される少なくとも１つの要素とを含んでなる、サンプル中の標的核酸を増幅するためのキット。
【請求項１５】
サンプル中の標的核酸を増幅するための請求項１４に記載のキットであって、同じまたは別の容器に逆転写酵素をさらに含んでなる、キット。
【請求項１６】
シクロデキストリン、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび貯蔵バッファーを含んでなる、サンプル中の標的核酸を増幅するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、核酸増幅のためのキット、組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、ＰＣＲ法およびＰＣＲ法の変法の特異性、感度および収量を改善することに関する。
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は分子生物学、遺伝学、診断、臨床検査、法医科学、環境科学、遺伝研究、父子鑑別および他の多くの応用に広く用いられている技術である。ＰＣＲ技術の目的は、検出不可能な量の出発材料から標的核酸を増幅することである。
【０００３】
ＰＣＲはＤＮＡ増幅のための有力かつ高感度の技術である。ＰＣＲは、複数サイクルの三段階プロセスを使用することにより指数関数的に特定のＤＮＡ配列を増幅する。まず、二本鎖ＤＮＡ鋳型を高温で変性させる。次に、配列特異的プライマーを、反対側の鎖の標的配列に隣接している部位にアニーリングする。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなどの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはアニーリングしたプライマーを伸長させ、それにより元のＤＮＡ配列の量を倍化する。そして、この新たに合成された産物は次の増幅サイクルのさらなる鋳型となる。これらの三工程を２０〜３５回繰り返すと、ＤＮＡ濃度が１０５〜１０９倍に高まる。
【０００４】
この核酸増幅のためのＰＣＲ法およびＰＣＲ関連法の大きな成功にもかかわらず、反応の特異性、感度および収量、ならびにポリメラーゼの性能を改善する必要がある。
【０００５】
プライマーダイマーまたはオリゴマーなどの非特異的副産物および連結したプライマーを含むその他の二本鎖副産物を増幅および／または生成しにくい鋳型または標的核酸もある。望まない非特異的副産物の生産は、この標的核酸が極めて低濃度でしか存在しない場合には、標的核酸の増幅を完全に妨げてしまいかねない。これは、診断キットでは、偽陰性結果を生じる深刻な問題となり得る。
【０００６】
増幅反応の特異性は、非特異的対合をさせない最適な温度での、プライマーと核酸標的の特異的アニーリングによってもたらされる。しかしながら、様々な理由で、増幅が行われる前の反応混合物は、理想的なアニーリング温度よりも低い温度に保持される場合がある。反応混合物がより低い温度で維持されると、プライマーは望ましくないことに非特異的様式で非標的核酸と結合し得る。これらの副産物は標的核酸と一緒に増幅されてしまうことがあり、あるいは正確で定量的な標的核酸の増幅を完全に妨げてしまう場合がある。これはバックグラウンドとなり、特異的ＰＣＲ産物の生成を低下させる。
【０００７】
熱に依存的に反応成分を分離するために、ワックスバリアまたはワックスビーズなどの物理的遮断を用いることができる。しかしながら、ＰＣＲ反応中の反応混合物に融解した遮断材が残るのが主要な欠点である。
【０００８】
増幅反応を改善するために慣例的に用いられる方法は、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼを用いるホットスタートＰＣＲである。この技術はＰＣＲ反応の準備中のポリメラーゼ活性の阻害または遮断を可能とする。ＰＣＲサイクル前のポリメラーゼ活性を制限することにより、ホットスタートＰＣＲは非特異的増幅を減らし、ＰＣＲ産物の収量を高める。ホットスタートＰＣＲは一般に、ＤＮＡポリメラーゼの可逆的化学修飾の使用または特異的抗体を用いたＤＮＡポリメラーゼの阻害によって行われる（欧州公開第０５９２０３５号公報、欧州公開第０７７１８７０号公報、欧州公開第０９６２５２６号公報）。どちらの場合にも、ＤＮＡポリメラーゼの阻害は可逆的であり、ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲサイクルの前に行われる最初の加熱工程（いわゆる「ホットスタート」）によって活性化される。しかしながら、これらの技術には、特別に調製した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび加熱工程の使用が必要である。
【０００９】
国際公開第２００６／１１９４１９号公報は、ホットスタートＰＣＲにおける隔離試薬用の材料を記載しており、隔離剤はポリラクトンマトリックスである。ホットスタートには、ポリラクトンマトリックスからのＰＣＲ試薬の放出が必要である。
【００１０】
シクロデキストリンは、主として、「ゲスト」と呼ばれる他の分子といわゆる「包接」複合体を形成する能力によって鋭意な精査の対象となっている環状オリゴ糖である。シクロデキストリンは一般に、ゲスト分子の疎水性部分を包接することができる空洞を含んでなる。シクロデキストリンの外表は親水性であるが、内部の空洞は疎水性が高く、それより小さな多様な疎水性分子との包接複合体の形成を可能とする。空洞はグルコース単位の数に応じて種々の直径を有する。種々の分子または分子の一部と包摂複合体を形成することにより、それらはゲスト分子の物理化学的特性を変更することができる。これはゲスト分子の溶解度の上昇をもたらし、例えば、薬剤分子を活性化し、それらの生物学的利用性を高めることができる。難溶性の薬剤、急速に劣化するフレーバー、揮発性芳香または有毒分子をカプセル封入することができる。シクロデキストリンは、薬剤処方物中で有効成分の放出を制御するための手段として製薬工業で用いられる。さらに、シクロデキストリンは変化しやすい分子を安定化させ、光、温度、酸化、還元および加水分解による、またはそれらの揮発性の低下による分解から保護することができる。よって、シクロデキストリンは薬理学、食品工業および美容術を含む幅広い分野で多数の応用が見出されている。シクロデキストリンの疎水性分子との包接化合物は身体組織に浸透することができるので、これらは特定の条件下で生物学的に活性な化合物を放出させるために使用することができる。
【００１１】
シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体はある種の化学反応を触媒することが示されている。
【００１２】
シクロデキストリンはまた、分子生物学でのいくつかの応用も見いだされている。国際公開第９１／０２０４０号公報には、リガンドの標識のための蛍光物質とシクロデキストリンを含んでなる包接複合体が記載されている。この蛍光物質とシクロデキストリンの包接複合体はシグナルを増幅する。これらの包接複合体で標識されたプライマーは、核酸の配列決定に用いられる。また、国際公開第００／３７６７４号公報には、エキシマーまたはエキシプレックス標識の蛍光を増幅させるためのシーケンシング反応におけるシクロデキストリンの使用が記載されている。
【００１３】
米国特許第５，７０５，３４５号公報には、シクロデキストリンを用いた核酸調製のための方法およびキットが記載されている。この文献では、ＤＮＡ修飾または増幅反応において抽出物を中和するためのシクロデキストリンの使用を開示している。シクロデキストリンは例えばＳＤＳまたはフェノールの中和に有効である。
【００１４】
欧州公開第０７６２８９８号公報には、治療使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドとシクロデキストリンとの包接が記載されている。国際公開第９５／３２７３９号公報には、細胞送達系のためのシクロデキストリンと複合体形成したオリゴヌクレオチドが記載されている。
【００１５】
分子生物学では、シクロデキストリンは標識の蛍光を増幅するため、および治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドの送達のために用いられてきた。
【００１６】
しかしながら、核酸増幅反応におけるシクロデキストリンの使用は先行技術には記載も示唆もなされていない。
【発明の概要】
【００１７】
本発明はここで、驚くべきことに、シクロデキストリンの使用がＰＣＲ反応およびＰＣＲ反応の変法などのＤＮＡ増幅反応の特異性、感度および／または収量を改善することを示す。
【００１８】
さらに、シクロデキストリンはまた、等温ＤＮＡ増幅反応の特異性、感度および／または収量を改善する。
【００１９】
第一の態様では、この改善は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰまたはプライマーなどの増幅反応の成分の１つをシクロデキストリンで前処理することにより得られる。特に、もう１つの態様では、核酸増幅が行われる最終反応混合物にシクロデキストリンを単に加えただけでも増幅反応の改善が見られる。
【００２０】
本発明のキット、組成物および方法は、プライマーダイマーを含む非特異的増幅産物の低減をもたらすとともに特異的標的核酸の収量が改善される。
【００２１】
本発明のキット、組成物および方法は熱活性化工程（ホットスタート）を必要としないが、ホットスタートＰＣＲ技術は本発明によるシクロデキストリンの添加によりさらに改善される。
【００２２】
核酸増幅反応の全体的な効率、感度および特異性が改善される。シクロデキストリンは反応混合物に単に加えるだけでよいので、本発明によるキット、組成物および方法は実施者に大きな融通性を与える。成分の１つとシクロデキストリンとの前処理を行う場合、その前処理は単にシクロデキストリンとインキュベーションすることからなる。
【００２３】
配列表
配列番号１  プライマーＦＷＤ  ＮＵＭＢ
配列番号２  プライマーＲＥＶ  ＮＵＭＢ
配列番号３  プライマーＨＬＡ−Ｃ
配列番号４  プライマーＨＬＡ−Ｃ
配列番号５  プライマーＦＷＤ  ｔ−ＰＡ１
配列番号６  プライマーＲＥＶ  ｔ−ＰＡ１
【００２４】
本発明は、サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善する方法であって、少なくとも１種のシクロデキストリンを含んでなる最終反応混合物中で増幅反応を行う方法に関する。
【００２５】
第一の態様において、本発明は、サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善する方法であって、次の工程：
ａ）標的核酸を含有する、または標的核酸を含有することが疑われるサンプルを、少なくとも１種のシクロデキストリンを含有する増幅反応混合物と接触させる工程；
ｂ）工程ａ）で得られた反応混合物に対して増幅反応を行う工程
を含んでなる方法に関する。
【００２６】
第二の態様において、本発明は、サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善する方法であって、次の工程：
ａ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファー、ｄＮＴＰおよびプライマーから選択される少なくとも１つの成分をシクロデキストリンと接触させる工程；
ｂ）標的核酸を含有する、または標的核酸を含有することが疑われるサンプルを、工程ａ）からの少なくとも１つの成分を含有する増幅反応混合物と接触させる工程；
ｃ）工程ｂ）で得られた反応混合物に対して増幅反応を行う工程
を含んでなる方法に関する。
【００２７】
第三の態様において、本発明は、サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善する方法であって、次の工程：
ａ）サンプルをシクロデキストリンと接触させてサンプルおよびシクロデキストリンの混合物を得る工程；
ｂ）サンプルおよびシクロデキストリンの混合物を増幅反応混合物と接触させる工程；
ｃ）工程ｂ）で得られた反応混合物に対して増幅反応を行う工程
を含んでなる方法に関する。
【００２８】
第四の態様において、本発明は、サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善するための方法であって、次の工程：
ａ）サンプルを増幅反応混合物と接触させる工程；
ｂ）少なくとも１種のシクロデキストリンを加える工程；
ｃ）工程ｂ）で得られた反応混合物に対して増幅反応を行う工程
を含んでなる方法に関する。
【００２９】
好ましくは、反応混合物中のシクロデキストリンの濃度は０．１〜５０ｍＭの間である。
【００３０】
好ましくは、反応混合物は、０．０１〜０．２単位／μｌの間の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなる。
【００３１】
好ましくは、反応混合物は、少なくともサンプル、シクロデキストリン、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファー、ｄＮＴＰおよび少なくとも１つのプライマーを含んでなる。
【００３２】
好ましくは、シクロデキストリンは、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンおよびそれらの誘導体からなる群から選択される。
【００３３】
より好ましくは、シクロデキストリンは、モノプロパンジアミノ−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−Ｄ−マルトシル−βシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよび２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンからなる群から選択される。
【００３４】
本発明のもう１つの目的は、ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される核酸のin vitro合成の特異性および／または収量を改善する方法であって、一本鎖核酸を、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰおよび少なくとも１種のシクロデキストリンを含んでなるＤＮＡ合成反応混合物と接触させることを含んでなる方法である。
【００３５】
好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される核酸のin vitro合成の特異性および／または収量を改善する方法は、プライマーと一本鎖核酸とのアニーリングおよびプライマーの３’末端における相補的ｄＮＴＰの組み込みを含んでなる。
【００３６】
好ましくは、一本鎖核酸とＤＮＡ合成反応混合物を含んでなる最終反応混合物中のシクロデキストリンの濃度は０．５〜５０ｍＭの間である。
【００３７】
本発明はまた、サンプル中の標的核酸を増幅するためのキットであって、同じ容器に少なくともシクロデキストリンと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、核酸増幅のための反応バッファー、ｄＮＴＰおよびオリゴヌクレオチドプライマーからなる群から選択される少なくとも１つの成分を含んでなるキットに関する。
【００３８】
いくつかの態様では、これらのキットは同じまたは別の容器に逆転写酵素を含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、Ｔａｑポリメラーゼ＋ＳＡ１（シクロデキストリン）の試験結果を示す図である。  １：１０ｎｇ  ｇＤＮＡ、Ｔａｑ  Ｒ−ＰＯＬ−Ｐ０１  １倍＋ＳＡ１  ４ｍＭ；２：０ｎｇ  ｇＤＮＡ、Ｔａｑ  Ｒ−ＰＯＬ−Ｐ０１  １倍＋ＳＡ１  ４ｍＭ；３：１０ｎｇ  ｇＤＮＡ、Ｔａｑ  Ｒ−ＰＯＬ−Ｐ０１  １０倍希釈＋ＳＡ１  ４ｍＭ；４：０ｎｇ  ｇＤＮＡ、Ｔａｑ  Ｒ−ＰＯＬ−Ｐ０１  １０倍希釈＋ＳＡ１  ４ｍＭ；５：１０ｎｇ  ｇＤＮＡ、Ｔａｑ  Ｒ−ＰＯＬ−Ｐ０１  １倍＋ｄＨ２Ｏ；６：０ｎｇ  ｇＤＮＡ、Ｔａｑ  Ｒ−ＰＯＬ−Ｐ０１  １倍＋ｄＨ２Ｏ；７：１０ｎｇ  ｇＤＮＡ、Ｔａｑ  Ｒ−ＰＯＬ−Ｐ０１  １０倍希釈＋ｄＨ２Ｏ；８：０ｎｇ  ｇＤＮＡ、Ｔａｑ  Ｒ−ＰＯＬ−Ｐ０１  １０倍希釈＋ｄＨ２Ｏ；９：１０ｎｇ  ｇＤＮＡ、ＧｏｌｄＳｔａｒ＋ＳＡ１  ４ｍＭ；１０：０ｎｇ  ｇＤＮＡ、ＧｏｌｄＳｔａｒ＋ＳＡ１  ４ｍＭ；１１：１０ｎｇ  ｇＤＮＡ、ＧｏｌｄＳｔａｒ＋ｄＨ２Ｏ；１２：０ｎｇ  ｇＤＮＡ、ＧｏｌｄＳｔａｒ＋ｄＨ２Ｏ；Ｌ：小断片用スマートラダー。
【図２】図２は、ＨＬＡ−Ｃプライマーを伴うＴａｑ＋ＳＡ１（シクロデキストリン）の試験結果を示す図である。  Ｌ：スマートラダー；１：２ｎｇ  ｇＤＮＡ、ＳＡ１無しのＴＡＱ；２：ＮＴＣ、ＳＡ１無しのＴＡＱ；３：２ｎｇ  ｇＤＮＡ、ＴＡＱ＋ＳＡ１最終４ｍＭ；４：ＮＴＣ、ＴＡＱ＋ＳＡ１  最終４ｍＭ
【図３】図３は、Ignatov et alにおいてＰＣＲにより増幅されたＨＬＡ−Ｃを示す図である。
【図４】図４は、ＳＡ１（シクロデキストリン）およびＳＡＲ（シクロデキストリン）を用いたＴａｑポリメラーゼ調製による試験結果を示す図である。  Ｌ．スマートラダー  １.  １０ｎｇ  ｇＤＮＡを用いた場合のＴａｑ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１；２.  １ｎｇ  ｇＤＮＡを用いた場合のＴａｑ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１；３.  Ｔａｑ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１を用いた場合のＮＴＣ；４.  ９ｍＭ  ＳＡ１の存在下、１０ｎｇ  ｇＤＮＡを用いた場合のＴａｑ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１；５.  ９ｍＭ  ＳＡ１の存在下、１ｎｇ  ｇＤＮＡを用いた場合のＴａｑ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１；６.  ９ｍＭ  ＳＡ１の存在下、Ｔａｑ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１を用いた場合のＮＴＣ；７.  ９ｍＭ  ＳＡＲの存在下、１０ｎｇ  ｇＤＮＡを用いた場合のＴａｑ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１；８.  ９ｍＭ  ＳＡＲの存在下、１ｎｇ  ｇＤＮＡを用いた場合のＴａｑ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１；９.  ９ｍＭ  ＳＡＲの存在下、Ｔａｑ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１を用いた場合のＮＴＣ；１０.  １０ｎｇ  ｇＤＮＡを用いた場合のＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ；１１.  １ｎｇ  ｇＤＮＡを用いた場合のＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ；１２.  ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒを用いた場合のＮＴＣ  １.  １０ｎｇ  ｇＤＮＡを用いたＴａｑ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１；２.  １ｎｇ  ｇＤＮＡを用いた場合のＴａｑ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１；３.  Ｔａｑ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１を用いた場合のＮＴＣ；４．９ｍＭ  ＳＡ１の存在下、１０ｎｇ  ｇＤＮＡを用いた場合のＴａｑ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１；５.  ９ｍＭ  ＳＡ１の存在下、１ｎｇ  ｇＤＮＡを用いた場合のＴａｑ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１；６.  ９ｍＭ  ＳＡ１の存在下、Ｔａｑ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１を用いた場合のＮＴＣ；７.  ９ｍＭ  ＳＡＲの存在下、１０ｎｇ  ｇＤＮＡを用いた場合のＴａｑ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１；８.  ９ｍＭ  ＳＡＲの存在下、１ｎｇ  ｇＤＮＡを用いた場合のＴａｑ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１；９.  ９ｍＭ  ＳＡＲの存在下、Ｔａｑ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１を用いた場合のＮＴＣ；１０.  １０ｎｇ  ｇＤＮＡを用いた場合のＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ；１１.  １ｎｇ  ｇＤＮＡを用いた場合の；１２.  ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒを用いた場合のＮＴＣ。
【図５】図５は、種々のＴａｑ  ポリメラーゼを用いたＰＣＲにおけるＳＡＲの試験結果を示す図である。  Ｌ．  スマートラダーＳＦ  １−７．  １０ｎｇ  ｇＤＮＡを用い、ＳａＲを用いない場合のＴａｑ  Ｐｏｌ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１  ２−８．  １ｎｇ  ｇＤＮＡを用い、ＳａＲを用いない場合のＴａｑ  Ｐｏｌ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１  ３−９．  Ｔａｑ  Ｐｏｌ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１を用い、ＳａＲを用いない場合のＮＴＣ  ４−１０．  ９ｍＭ  ＳａＲの存在下、１０ｎｇ  ｇＤＮＡを用いた場合のＴａｑ  Ｐｏｌ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１  ５−１１．  ９ｍＭ  ＳａＲの存在下、１ｎｇ  ｇＤＮＡを用いた場合のＴａｑ  Ｐｏｌ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１  ６−１２．  ９ｍＭ  ＳａＲの存在下、Ｔａｑ  Ｐｏｌ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１を用いた場合のＮＴＣ  １３−１９．  １０ｎｇ  ｇＤＮＡを用い、ＳａＲを用いない場合のＥＧＴ  ＧｏｌｄＳｔａｒ  １４−２０．  １ｎｇ  ｇＤＮＡを用い、ＳａＲを用いない場合のＥＧＴ  ＧｏｌｄＳｔａｒ  １５−２１．  ＥＧＴ  ＧｏｌｄＳｔａｒを用い、ＳａＲを用いない場合のＮＴＣ  １６−２２．  ９ｍＭ  ＳａＲの存在下、１０ｎｇ  ｇＤＮＡを用いた場合のＥＧＴ  ＧｏｌｄＳｔａｒ  １７−２３．  ９ｍＭ  ＳａＲの存在下、１ｎｇ  ｇＤＮＡを用いた場合のＥＧＴ  ＧｏｌｄＳｔａｒ  １８−２４．  ９ｍＭ  ＳａＲの存在下、ＥＧＴ  ＧｏｌｄＳｔａｒを用いた場合のＮＴＣ
【図６】図６は、種々のＴａｑ  ポリメラーゼを用いたＰＣＲにおけるＳＡＲの試験結果を示す図である。  Ｌ．  スマートラダーＳＦ  １−７．  １０ｎｇ  ｇＤＮＡを用い、ＳａＲを用いない場合のＥＧＴ  ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ  ２−８．  １ｎｇ  ｇＤＮＡを用い、ＳａＲを用いない場合のＥＧＴ  ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ  ３−９．  ＥＧＴ  ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒを用い、ＳａＲを用いない場合のＮＴＣ  ４−１０．９ｍＭ  ＳａＲの存在下、１０ｎｇ  ｇＤＮＡを用いる場合のＥＧＴ  ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ  ５−１１．  ９ｍＭ  ＳａＲの存在下、１ｎｇ  ｇＤＮＡを用いる場合のＥＧＴ  ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ  ６−１２．  ９ｍＭ  ＳａＲの存在下、ＥＧＴ  ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒを用いる場合のＮＴＣ  １３−１９．  １０ｎｇ  ｇＤＮＡを用い、ＳａＲを用いない場合のロッシュ社製  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  １４−２０．  １ｎｇ  ｇＤＮＡを用い、ＳａＲを用いない場合のロッシュ社製  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  １５−２１．  ロッシュ社製  ＦａｓｔＳｔａｒｔを用い、ＳａＲを用いない場合のＮＴＣ  １６−２２．  ９ｍＭ  ＳａＲの存在下、１０ｎｇ  ｇＤＮＡを用いる場合のロッシュ社製  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  １７−２３．  ９ｍＭ  ＳａＲの存在下、１ｎｇ  ｇＤＮＡを用いる場合のロッシュ社製  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  １８−２４．  ９ｍＭ  ＳａＲの存在下、ロッシュ社製  ＦａｓｔＳｔａｒｔを用いる場合のＮＴＣ
【図７】図７は、試験：ｄＮＴＰ＋ＳＡ１とバッファー＋ＳＡ１の結果を示す図である。Ａ．（非修飾Ｔａｑ  Ｒ−ＰＯＬ−Ｐ０７−ＧｏｌｄＳｔａｒサイクリング）１．  ヒトｇＤＮＡ  １０ｎｇ−Ｎｕｍｂ２．  ヒトｇＤＮＡ  １ｎｇ−Ｎｕｍｂ３．  ＮＴＣ−ＮｕｍｂＢ．（非修飾Ｔａｑ  Ｒ−ＰＯＬ−Ｐ０７−ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒサイクリング）４．  ヒトｇＤＮＡ  １０ｎｇ−Ｎｕｍｂ５．  ヒトｇＤＮＡ  １ｎｇ−Ｎｕｍｂ６．  ＮＴＣ−ＮｕｍｂＣ．（ｄＮＴＰ＋ＳＡ１最終反応物中１０ｍＭ−ＧｏｌｄＳｔａｒサイクリング）１．  ヒトｇＤＮＡ  １０ｎｇ−Ｎｕｍｂ２．  ヒトｇＤＮＡ  １ｎｇ−Ｎｕｍｂ３．  ＮＴＣ−ＮｕｍｂＤ．（ｄＮＴＰ＋ＳＡ１最終反応物中１０ｍＭ−ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒサイクリング）４．  ヒトｇＤＮＡ  １０ｎｇ−Ｎｕｍｂ５．  ヒトｇＤＮＡ  １ｎｇ−Ｎｕｍｂ６．  ＮＴＣ−ＮｕｍｂＥ．（バッファー反応＋ＳＡ１最終１０ｍＭ−ＧｏｌｄＳｔａｒサイクリング）１．  ヒトｇＤＮＡ  １０ｎｇ−Ｎｕｍｂ２．  ヒトｇＤＮＡ  １ｎｇ−Ｎｕｍｂ３．  ＮＴＣ−ＮｕｍｂＦ．（バッファー反応＋ＳＡ１最終１０ｍＭ−ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒサイクリング）４．  ヒトｇＤＮＡ  １０ｎｇ−Ｎｕｍｂ５．  ヒトｇＤＮＡ  １ｎｇ−Ｎｕｍｂ６．  ＮＴＣ−ＮｕｍｂＧ．（ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ−ＧｏｌｄＳｔａｒサイクリング）１．  ヒトｇＤＮＡ  １０ｎｇ−Ｎｕｍｂ２．  ヒトｇＤＮＡ  １ｎｇ−Ｎｕｍｂ３．  ＮＴＣ−ＮｕｍｂＨ．（ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ−ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒサイクリング）４．  ヒトｇＤＮＡ  １０ｎｇ−Ｎｕｍｂ５．  ヒトｇＤＮＡ  １ｎｇ−Ｎｕｍｂ６．  ＮＴＣ−Ｎｕｍｂ
【図８】図８は、試験：ｄＮＴＰ＋ＳＡ１とバッファー＋ＳＡ１の結果を示す図である。Ａ．（非修飾Ｔａｑ  Ｒ−ＰＯＬ−Ｐ０７−ＧｏｌｄＳｔａｒサイクリング）１．  ヒトｇＤＮＡ  １０ｎｇ−ｔＰＡ１２．  ヒトｇＤＮＡ  １ｎｇ−ｔＰＡ１３．  ＮＴＣ−ｔＰＡ１Ｂ．（非修飾Ｒ−ＰＯＬ−Ｐ０７−ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒサイクリング）４．  ヒトｇＤＮＡ  １０ｎｇ−ｔＰＡ１５．  ヒトｇＤＮＡ  １ｎｇ−ｔＰＡ１６．  ＮＴＣ−ｔＰＡ１Ｃ．（ｄＮＴＰ＋ＳＡ１最終反応物中１０ｍＭ−ＧｏｌｄＳｔａｒサイクリング）１．  ヒトｇＤＮＡ  １０ｎｇ−ｔＰＡ１２．  ヒトｇＤＮＡ  １ｎｇ−ｔＰＡ１３．  ＮＴＣ−ｔＰＡ１Ｄ．（ｄＮＴＰ＋ＳＡ１最終反応物中１０ｍＭ−ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒサイクリング）４．  ヒトｇＤＮＡ  １０ｎｇ−ｔＰＡ１５．  ヒトｇＤＮＡ  １ｎｇ−ｔＰＡ１６．  ＮＴＣ−ｔＰＡ１Ｅ．（バッファー反応＋ＳＡ１最終１０ｍＭ−ＧｏｌｄＳｔａｒサイクリング）１．  ヒトｇＤＮＡ  １０ｎｇ−ｔＰＡ１２．  ヒトｇＤＮＡ  １ｎｇ−ｔＰＡ１３．  ＮＴＣ−ｔＰＡ１Ｆ．（バッファー反応＋ＳＡ１最終１０ｍＭ−ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒサイクリング）４．  ヒトｇＤＮＡ  １０ｎｇ−ｔＰＡ１５．  ヒトｇＤＮＡ  １ｎｇ−ｔＰＡ１６．  ＮＴＣ−ｔＰＡ１Ｇ．（ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ−ＧｏｌｄＳｔａｒサイクリング）１．  ヒトｇＤＮＡ  １０ｎｇ−ｔＰＡ１２．  ヒトｇＤＮＡ  １ｎｇ−ｔＰＡ１３．  ＮＴＣ−ｔＰＡ１Ｈ．（ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ−ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒサイクリング）４．  ヒトｇＤＮＡ  １０ｎｇ−ｔＰＡ１５．  ヒトｇＤＮＡ  １ｎｇ−ｔＰＡ１６．  ＮＴＣ−ｔＰＡ１
【図９】図９は、最初の加熱工程を用いないＰＣＲ：Ｔａｑ  ＰＯ８、Ｔａｑ  ＰＯ８＋６ｍＭシクロデキストリンおよびＨｏｔ  ＧｏｌｄＳｔａｒを用いた増幅を示す図である。
【発明の具体的説明】
【００４０】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される核酸のin vitro合成の特異性、感度および／または収量を改善する方法であって、一本鎖核酸を、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰおよび少なくとも１種のシクロデキストリンを含んでなるＤＮＡ合成反応混合物と接触させることを含んでなる方法に関する。少なくとも１種のシクロデキストリンの存在下で反応が行われる場合に、シーケンシング、ならびにプライマーのアニーリングおよびその後のＤＮＡポリメラーゼを用いたプライマー伸長を含むその他の反応が改善される。
【００４１】
変性、アニーリングおよび延長／伸長工程は、サンプル中の標的核酸を増幅するために所望の回数繰り返すことができる。よって、好ましい態様では、本発明は、シクロデキストリンを用いて核酸を増幅する方法を提供する。
【００４２】
本発明はまた、シクロデキストリンを含んでなるキットおよび組成物に関する。有利には、本発明は、核酸を増幅するためのキットおよび組成物を提供する。これらのキットおよび組成物は一般に、研究またはin vitro診断利用に意図される。
【００４３】
「増幅」とは、サンプル中の標的ヌクレオチド配列のコピー数を増加させるin vitroの方法を表す。増幅反応は通常、連続的な変性、アニーリングおよびプライマー伸長サイクルを可能とする多数回繰り返す温度サイクルからなる。しかしながら、等温増幅法も本発明の範囲内にある。本発明は、ＰＣＲまたは等温増幅などのＰＣＲ反応の変法を行うための方法、組成物およびキットを提供する。これらの方法は文献に記載されており、当業者によく知られている。
【００４４】
一般に、ＰＣＲ反応は変性工程、プライマーアニーリング工程および伸長／延長工程を含んでなる繰り返しの一連の２０〜３５回の温度サイクルを含む。反応は一般に、サーマルサイクラーにて小さな反応管で５〜１００μｌの反応容量で行われる。変性工程は、９４℃〜９５℃前後の温度で核酸の完全な変性を可能とする。この工程により、一本鎖ＤＮＡが生成される。プライマーアニーリング工程は一般に、プライマー−標的配列ＤＮＡ二重鎖部位の融解温度よりも５℃前後低い温度で行われる。この工程では、オリゴヌクレオチドプライマーは一本鎖標的配列と特異的に結合する。伸長工程は７２℃前後で行われるが、これは用いるＤＮＡポリメラーゼによって異なる。例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは７２℃にその最適条件を有する。この工程では、ＤＮＡポリメラーゼは、５’から３’方向にｄＮＴＰを付加するプライマー伸長によって、標的鎖と相補的な新たなＤＮＡ鎖を合成する。
【００４５】
本発明は、ＤＮＡまたはＲＮＡ双方の標的ヌクレオチド配列の増幅に関する。ＲＮＡ標的の増幅では、ＤＮＡ鋳型を得るために逆転写酵素が用いられる。
【００４６】
本発明の方法、キットおよび組成物は従来のＰＣＲ、慣例の溶液ＤＮＡ／ＲＮＡ定量、逆転写酵素ＰＣＲ（一段階および二段階）、リアルタイムＰＣＲ（一標識プローブ、二色素プローブ、モレキュラービーコンプローブ、スコーピオンプローブ、ｐｌｅｘｏｒプライマー、ＦＲＥＴプローブ、Ｐａｄｌｏｃｋプローブ；二本鎖ＤＮＡと結合した場合にのみ蛍光を発するｄｓＤＮＡ結合蛍光体（ＳＹＢｒＧｒｃｅｎ色素など））、核酸配列ベース増幅（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）（ＮＡＳＢＡ）、高解像度ＤＮＡ融解曲線分析（High- Resolution DNA Melt curve analysis）（ＨＲＭ）、Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification（ＭＬＰＡ）、好熱性ヘリカーゼ依存性増幅のリアルタイムモニタリング(Real-time monitoring of thermophilic helicase-dependent amplification)（ｔＨＤＡ）、プライマー伸長、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅(Rapid Amplification of cDNA Ends)（ＲＡＣＥ）、ネステッドＰＣＲ、免疫ポリメラーゼ連鎖反応（ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ)、ローリングサークル複製（ＲＣＡ）に関する方法、チップ上のクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ  ｏｎ  ｃｈｉｐ）、タンパク質、生体分子相互作用および単一コピーの病原体の検出のための近接ライゲーションを用いた利用、ならびに固相に基づく核酸アッセイに有用である。
【００４７】
本発明のキット、組成物および方法は、標的核酸の増幅と配列決定の双方を含んでなるアッセイに好適である。本発明のキット、組成物および方法は、特に診断目的、遺伝子型分析およびＳＮＰ研究に用いられる。
【００４８】
標的ヌクレオチド配列を含有する、または含有することが疑われる核酸は標識するか、またはビーズもしくは固相表面などの固相支持体と結合させることができる。オリゴヌクレオチドプライマーもまた標識するか、またはビーズを含む種々の支持体と結合させることができる。
【００４９】
本発明において、この反応におけるシクロデキストリンの目的は、例えば標識の蛍光などの標識またはマーカーのシグナルを増幅することではない。一般にシクロデキストリンは標識またはマーカーを含まない。本発明の方法およびキットでは、シクロデキストリンは増幅反応またはＤＮＡ合成反応の収量、感度および／または特異性を高めるために用いられる。
【００５０】
本発明のキット、組成物および方法は、標的核酸の増幅をもたらす。
【００５１】
好ましい態様では、本発明のキットおよび組成物は、シクロデキストリンと少なくとも核酸の増幅に必要な別の試薬を含んでなる。本発明はまた、核酸増幅のための方法において、反応の収量、特異性および／または感度を改善するためのシクロデキストリンの使用に関する。
【００５２】
シクロデキストリンは環状オリゴ糖ファミリーである。一般的なシクロデキストリンは、α１→４結合グルコシド結合により結合した５以上のα−Ｄ−グルコピラノシド単位からなる。シクロデキストリンは当業者によく知られ、例えば酵素的変換の手段によってデンプンから製造すればよい。驚くべきことに、シクロデキストリンの添加は、核酸増幅反応の特異性、感度および収量を改善する。
【００５３】
いずれのシクロデキストリン、修飾シクロデキストリンまたはそれらの混合物も本発明のキット、組成物および方法に使用可能である。
【００５４】
α−シクロデキストリン（６員糖環状分子）、β−シクロデキストリン（７員糖環状分子）、γ−シクロデキストリン（８員糖環状分子）またはそれらの誘導体が好ましい。
【００５５】
α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンおよびγ−シクロデキストリンの一般式を以下に示す。これらの天然シクロデキストリンはスキャフォールドとして役立ち、その上に官能基およびその他の置換基を構築することができる。置換シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体は本発明の方法、キットおよび組成物において使用可能である。シクロデキストリンは、ヒドロキシル基を疎水性部分または例えば糖類もしくはペプチドなどの「エフェクター基」で置換または官能基化することにより修飾してもよい。修飾β−シクロデキストリンの式（式中、Ｒは有機ラジカルである）を以下に示す。
一般式：
【化１】
2012511317.tif 000002
修飾β−シクロデキストリン（Ｒは有機ラジカルである）：
【化２】
2012511317.tif 000003
【００５６】
いずれのシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体も、増幅反応または核酸合成反応に所望の効果をもたらす限り、本発明のキット、組成物または方法に使用可能である。
【００５７】
α−シクロデキストリンのうち、好ましいシクロデキストリンとしては（２−ヒドロキシプロピル）−α−シクロデキストリンおよび３Ａ−アミノ−３Ａ−デオキシ−（２ＡＳ，３ＡＳ）−α−シクロデキストリン水和物が挙げられる。
【００５８】
β−シクロデキストリンのうち、好ましいシクロデキストリンとしては、モノプロパンジアミノ−β−シクロデキストリン（６’−（３−アミノ−プロピルアミノ）−６’−デオキシ−シクロマルトヘプタオース）、６−Ｏ−α−Ｄ−マルトシル−β−シクロデキストリン、２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン（β−シクロデキストリン２−ヒドロキシプロピルエーテル）、３Ａ−アミノ−３Ａ−デオキシ−（２ＡＳ，３ＡＳ）−β−シクロデキストリン水和物およびヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが挙げられる。
【００５９】
好ましい態様では、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが用いられ、いっそうより好ましくは、置換度がグルコース単位当たりヒドロキシプロピル基０．５〜０．７個の間の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが用いられる。最も好ましくは、置換度がグルコース単位当たりヒドロキシプロピル基０．６７個の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが用いられる。
【００６０】
γ−シクロデキストリンのうち、好ましいシクロデキストリンとしては、（２−ヒドロキシプロピル）−γ−シクロデキストリンおよび３Ａ−アミノ−３Ａ−デオキシ−（２ＡＳ，３ＡＳ）−γ−シクロデキストリン水和物が挙げられる。
【００６１】
オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび適当な反応バッファーを含む核酸増幅のための試薬または成分は文献に記載されており、当業者に既知である。
【００６２】
いずれのＤＮＡポリメラーゼも本発明のキット、組成物または方法に使用可能である。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。好ましくは、本発明の方法に使用可能な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、サーマス(Thermus)属の種々の細菌種または他の細菌源から得られるポリメラーゼが挙げられる。
【００６３】
好ましい耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはサーマス・アクアティクス(Thermus aquaticus)、サーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)、サーマス・フィリホルミス(Thermus filiformis)、サーマス・フラブス(Thermus flavus)またはPyrococcus furiosus(ピロコックス・フリオスス)、ウォッセイ(woseii)、およびサーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)から得られるものである。これらのポリメラーゼは好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を有する組換え大腸菌(Escherichia coli)から生産および精製される。
【００６４】
本発明のキット、組成物および方法はまた、少なくとも２つの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、または耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ、ＤＮアーゼもしくは３’−５’校正エキソヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼといった他の酵素との組合せを用いてもよい。
【００６５】
これらの酵素または酵素の組合せは長い核酸分子の増幅に特に有用である。
【００６６】
さらに、本発明のキット、組成物および方法は例えば化学処理または特異的モノクローナル抗体によって可逆的に不活性化されたいわゆるホットスタートＤＮＡポリメラーゼを用いてもよい。これらのＤＮＡポリメラーゼは、９０〜９５℃で５〜１０分の最初の加熱活性化工程を必要とする。
【００６７】
いくつかの試薬または成分は、反応を行うための増幅反応混合物の調製時に希釈される濃縮保存溶液として提供してもよい。成分はまた保存溶液を調製するための水または適当なバッファー中に再懸濁させることを意図した乾燥固体形態で提供してもよい。
【００６８】
「反応バッファー」とは、酵素的核酸増幅が行われる緩衝溶液を表す。反応バッファーは、一般に２倍、５倍または１０倍濃度の濃縮保存溶液として提供してもよい。本発明において、反応バッファーは、核酸増幅のためのバッファーに用いられるいずれの既知の化学物質を含んでもよい。溶液は例えば、緩衝のためにＴｒｉｓを含んでもよい。また反応バッファーは一般に、一価の陽イオン（ＫＣｌ）、二価の陽イオン（ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４）および非イオン性界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０、ＮＰ４０）を含んでもよい。バッファーはまた、例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４、トレハロース、ＤＭＳＯ、ＢＳＡ、グリセロール、ＭｇＣｌ２、ＥＤＴＡ、ベタインなどのＰＣＲ収量を向上させる試薬を含んでもよい。反応バッファーは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが必要とするいずれの補因子を含んでもよい。これらの試薬は同じ容器または別の容器で提供することができる。
【００６９】
標準的な１０倍ＰＣＲバッファーは、例えば、１５０〜７５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８〜８．８、５０〜２００ｎＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１００〜５００ｍＭ  ＫＣｌ、０〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０および０．０１％ゼラチンを含んでなってよい。
【００７０】
「貯蔵バッファー」とは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素が保存される緩衝溶液を表す。この緩衝溶液は、−２０℃または４℃で数週間または数ヶ月間、酵素の貯蔵を可能とする。通常、貯蔵バッファーは−２０℃での酵素の貯蔵のためにグリセロールを含む。
【００７１】
標準的な１倍貯蔵液は、例えば、Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ０．１ｍＭ、ＫＣｌ  １００ｍＭ、ＤＴＴ  １〜１０ｍＭ、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０  ０．５０％、Ｔｗｅｅｎ−２０  ０．１０〜０．５０％、グリセロール０〜５０％、リン酸カリウム１０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．１０％、ＰＭＳＦ  ０．５ｍＭおよびＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０  ０．５０％を含んでいてもよい。
【００７２】
ｄＮＴＰには、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰが含まれる。本発明のキット、組成物および方法ではまた、修飾または標識ｄＮＴＰまたはヌクレオシドを使用してもよい。ｄＮＴＰはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰプレミックスの平衡保存溶液として提供してもよい。
【００７３】
プレミックスｄＮＴＰとは、例えば、各５ｍＭの２’−デオキシ−アデノシン−５’−三リン酸、２’−デオキシ−シチジン−５’−三リン酸、２’−デオキシ−グアノシン−５’−三リン酸、２’−デオキシ−チミジン−５’−三リン酸の水溶液である。
【００７４】
本発明のキット、組成物および方法はまた、ｄＵＴＰを用いてもよい。プレミックスｄＮＴＰ／ｄＵＴＰ溶液は例えば、各５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰと１０ｍＭの２’−デオキシ−ウリジン−５’−三リン酸（ｄＵＴＰ）を含む。
【００７５】
「プライマー」とは、標的核酸と相補的な配列を有する、または含むオリゴヌクレオチドまたはその誘導体を表す。これらのプライマーは、変性した標的核酸と塩基対合によりハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される伸長反応を開始させる。本発明のキット、組成物および方法では好ましくは、標的核酸に隣接し、その核酸の反対の鎖とハイブリダイズする少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。本発明のキット、組成物および方法では、標識または修飾されたオリゴヌクレオチドを用いてもよい。
【００７６】
「増幅反応混合物」とは、サンプルを除き、反応を行うのに必要な成分のいくつかまたは総てを含んでなる溶液を表す。この増幅反応混合物は通常、「マスターミックス」と呼ばれる。マスターミックスは、サンプルを除き、反応を行うのに必要な成分のいくつかまたは総てからなる。マスターミックスは一般に、反応バッファー、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰの平衡混合物、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーを含んでなる。
【００７７】
「反応混合物」または「最終反応混合物」とは、サンプルを含む、反応を行うのに必要な成分の総てを含んでなる溶液を表す。反応混合物は通常、所定容量の増幅反応混合物と所定容量のサンプルを混合することにより調製される。最終反応混合物は、標的核酸を含有する、または含有することが疑われるサンプルと増幅反応混合物の双方を含んでなる。最終反応混合物は一般に、５〜１００μｌの間の容量を持つ。
【００７８】
ＰＣＲ反応またはより一般には増幅反応はまた、二本鎖ＤＮＡと結合した場合にのみ蛍光を発するｄｓＤＮＡ結合蛍光体（ＳＹＢｒＧｒｅｅｎ色素など）の存在下で行ってもよい。これはリアルタイムＰＣＲ適用または定量的ＰＣＲに特に有用である。
【００７９】
「サンプル」とは、標的核酸を含有する、または含有することが疑われるいずれの固体または液体材料も表す。サンプルは、精製した核酸、組織サンプル、生体液サンプルまたは細胞サンプルなどの生体サンプルであり得る。サンプルは例えば、血液、尿、血清または唾液であり得る。サンプルはヒト、植物、動物、細菌またはウイルス起源の固体または液体材料を含んでいてもよい。
【００８０】
核酸増幅のための反応成分は一般に、標的核酸の増幅を行うのに必要な少なくとも１以上の試薬／成分を含んでなるキットとして市販されている。
【００８１】
本発明の第一の対象は、サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善する方法であって、この増幅反応は少なくとも１種のシクロデキストリンを含んでなる反応混合物中で行われる、方法である。
【００８２】
本発明は、サンプル中の標的核酸の増幅の収量、感度および／または特異性を改善する方法であって、標的核酸を含有する、または標的核酸を含有することが疑われるサンプルを、シクロデキストリンを含有する増幅反応混合物と接触させる工程を含んでなる方法に関する。
【００８３】
シクロデキストリンおよび核酸増幅に必要な他の試薬／成分はサンプルに別々に加えて、増幅が行われる最終反応混合物としてもよい。あるいは、シクロデキストリンを核酸増幅のための他の成分と予め混合し、サンプルと接触させて増幅反応を行ってもよい。あるいは、核酸増幅のための他の成分を加える前にサンプルをシクロデキストリンと接触させてもよい。
【００８４】
もう１つの態様では、シクロデキストリンは核酸増幅の成分を前処理するために用いる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマーまたはｄＮＴＰをシクロデキストリンで前処理することができる。この前処理成分を、シクロデキストリンを含有する増幅反応混合物を調製するため、またはシクロデキストリンを含有する最終反応混合物を直接調製するために用いる。
【００８５】
本発明は、サンプル中の標的核酸の増幅反応を収量、感度および／または特異性を改善する方法であって、以下の工程：
ａ）標的核酸を含有する、または標的核酸を含有することが疑われるサンプルを、少なくとも１種のシクロデキストリンを含有する増幅反応混合物と接触させる工程；
ｂ）工程ａ）で得られた最終反応混合物に対して増幅反応を行う工程
を含んでなる方法を対象とする。
【００８６】
本発明はまた、サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善する方法であって、以下の工程：
ａ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファー、ｄＮＴＰおよびプライマーから選択される少なくとも１つの成分をシクロデキストリンと接触させる工程；
ｂ）標的核酸を含有する、または標的核酸を含有することが疑われるサンプルを、工程ａ）からの少なくとも１つの成分を含有する増幅反応混合物と接触させる工程；
ｃ）工程ｂ）で得られた最終反応混合物に対して増幅反応を行う工程
を含んでなる方法を対象とする。
【００８７】
本発明はさらに、サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善する方法であって、以下の工程：
ａ）サンプルをシクロデキストリンと接触させてサンプルとシクロデキストリンの混合物を得る工程；
ｂ）サンプルおよびシクロデキストリンの混合物を増幅反応混合物と接触させる工程；
ｃ）工程ｂ）で得られた最終反応混合物に対して増幅反応を行う工程
を含んでなる方法を対象とする。
【００８８】
本発明はさらに、サンプル中の標的核酸の増幅反応の収量、感度および／または特異性を改善する方法であって、以下の工程：
ａ）サンプルを増幅反応混合物と接触させる工程；
ｂ）少なくとも１種のシクロデキストリンを加える工程；
ｃ）工程ｂ）で得られた最終反応混合物に対して増幅反応を行う工程
を含んでなる方法を対象とする。
【００８９】
本発明による方法では、サンプルから、および増幅反応混合物からなる反応混合物中のシクロデキストリンの濃度は好ましくは、０．１〜５０ｍＭの間、より好ましくは０．５〜５０ｍＭの間である。好ましくは、０．１、０．５、１、２、４、５ｍＭ〜１０、１５、２０、２５、３０、４０および５０ｍＭの間である。シクロデキストリンの十分な濃度は、本発明による方法で用いられるシクロデキストリンによって異なり得る。本願に記載されている方法は、増幅方法の感度、特異性および／または収量の改善を得るために最良なシクロデキストリンの濃度を評価するために使用することができる。
【００９０】
好ましい態様では、シクロデキストリンは、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンおよびそれらの誘導体からなる群から選択される。いっそうより好ましくは、シクロデキストリンは、モノプロパンジアミノ−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−Ｄ−マルトシル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよび２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンからなる群から選択される。
【００９１】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの濃度は、核酸増幅法の感度、特異性および収量を決定し得るもう１つの因子である。好ましい態様では、サンプルと増幅反応混合物を含んでなる最終反応混合物は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４単位／μｌ〜０．０５、０．０７５、０．１および０．２単位／μｌの間の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなる。単位とは、７２℃で３０分のうちに酸不溶性材料中に１０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを組み込むのに必要な酵素の量と定義されるものである。
【００９２】
本発明による方法は、核酸を変性させ、かつ／または「ホットスタート」ＤＮＡポリメラーゼを活性化させるための加熱工程をさらに含んでなってもよい。この付加的工程は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが化学修飾またはモノクローナル抗体により可逆的に不活性化されている場合に必要となる。
【００９３】
有利には、本発明の方法は９５℃での加熱工程／活性化工程などを必要としない。
【００９４】
本発明による方法では、増幅反応混合物は、シクロデキストリンで前処理された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含んでいてもよい。
【００９５】
本発明の方法では、増幅反応混合物は、シクロデキストリンで前処理されたｄＮＴＰを含んでなり得る。
【００９６】
本発明の方法では、増幅反応混合物は、シクロデキストリンで前処理された少なくとも１つのプライマーを含んでいてもよい。
【００９７】
増幅反応混合物の試薬／成分のシクロデキストリンによる前処理は、それらの成分を十分な濃度のシクロデキストリンとともにインキュベートすることにより行われる。このインキュベーションは室温または好ましくは４℃で行うことができる。試薬のシクロデキストリンによる十分な前処理を得るには、通常１時間のインキュベーションで十分である。
【００９８】
あるいは、シクロデキストリンは、それにサンプルを加える増幅反応混合物を調製するため、または反応を行うための最終反応混合物を調製するために使用することができる。
【００９９】
好ましい態様では、増幅反応混合物はシクロデキストリン、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファー、ｄＮＴＰおよびオリゴヌクレオチドプライマーを含んでなる。
【０１００】
標的核酸の増幅方法は文献に記載されており、当業者にはよく知られている。ＰＣＲは核酸増幅のための標準的な技術であるが、本発明による方法ではＰＣＲ法の変法も使用可能である。
【０１０１】
本発明の方法は、核酸の最初の完全な変性のために９４〜９５℃で行われる最初の変性工程をさらに含んでなってもよい。加熱工程は一般に１、２、３または５〜１０分かかる。この最初の工程はまた、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼのための加熱活性化工程としても役立ち得る。
【０１０２】
本発明のキット、組成物および方法は、核酸増幅反応の特異性、感度および／または収量を改善する。反応をさらに改善するために他の既知の技術を本発明と併用してもよい。ＤＭＳＯ、ＢＳＡ、グリセロール、トレハロース、ベタインなどのいくつかの試薬が、反応を改善すると報告されている。いわゆるホットスタートＤＮＡポリメラーゼの使用によりさらなる改善がもたらされ得る。
【０１０３】
本発明はさらに、シクロデキストリンと核酸増幅のための少なくとも１つの試薬を含有する組成物に関する。本発明の組成物は、サンプルの添加時に反応を行う準備ができている増幅反応混合物であり得る。あるいは、本発明による組成物は濃縮保存溶液または酵素を含んでなる場合には濃縮貯蔵溶液の形態であり得る。
【０１０４】
本発明は、シクロデキストリンと、ＤＮＡポリメラーゼ、in vitro  ＤＮＡ合成のための反応バッファー、ｄＮＴＰおよびプライマーからなる群から選択される少なくとも１つの成分を含んでなる、ＤＮＡポリメラーゼにより触媒されるin vitro  ＤＮＡ合成のための組成物を提供する。
【０１０５】
本発明はまた、シクロデキストリンと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、核酸増幅のための反応バッファー、ｄＮＴＰおよびオリゴヌクレオチドプライマーからなる群から選択される少なくとも１つの成分を含んでなる、サンプル中の標的核酸を増幅するための組成物を包含する。
【０１０６】
好ましい態様では、本発明による組成物はシクロデキストリンと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなる。
【０１０７】
好ましくは、本発明による組成物はシクロデキストリン、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび貯蔵バッファーを含んでなる。貯蔵バッファーは４℃または−２０℃で耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを貯蔵するのに適合されている。
【０１０８】
一般的なこととして、核酸増幅の収量、感度および／または特異性を改善するためには、十分な濃度でシクロデキストリンを提供するのが好ましい。本発明はまた、シクロデキストリンと少なくとも１つのｄＮＴＰを含んでなる組成物に関する。好ましくは、組成物は、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの平衡混合物を含んでなる。組成物は例えば、ｄＮＴＰの平衡プレミックスとシクロデキストリンを含んでなる濃縮保存溶液である。あるいは、組成物はｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰおよびシクロデキストリンを含んでいてもよい。
【０１０９】
さらに、本発明は、シクロデキストリンと核酸増幅のための反応バッファーを含んでなる組成物に関する。
【０１１０】
もう１つの態様では、組成物は、シクロデキストリンと少なくとも１つのプライマーを含んでなる。好ましくは、組成物は、シクロデキストリンと、反対側の鎖の、標的核酸の５’および３’末端とハイブリダイズする少なくとも２つのプライマーを含んでなる。
【０１１１】
好ましい態様では、組成物は、シクロデキストリン、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび核酸増幅のための反応バッファーを含んでなる。
【０１１２】
組成物はさらに、標的核酸を含有する、または標的核酸を含有することが疑われるサンプルをさらに含んでいてもよい。
【０１１３】
組成物では、より具体的には、サンプル、そして増幅反応混合物からなる最終反応混合物では、シクロデキストリンの濃度は好ましくは０．１〜５０ｍＭの間、より好ましくは０．５〜５０ｍＭの間である。好ましくは、０．１、０．５、１、２、４、５ｍＭ〜１０、１５、２０、２５、３０、４０および５０ｍＭの間である。
【０１１４】
組成物では、より具体的には、サンプルと増幅反応混合物を含んでなる最終反応混合物では、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの量は好ましくは０．０１、０．０２、０．０３、０．０４単位／μｌ〜０．０５、０．０７５、０．１および０．２単位／μｌの間である。
【０１１５】
もう１つの態様では、組成物は、サンプル中の標的核酸配列を増幅するキットの一部である。
【０１１６】
本発明のもう１つの対象は、同じまたは別の容器に、シクロデキストリンと、ＤＮＡポリメラーゼ、in vitro  ＤＮＡ合成のための反応バッファー、ｄＮＴＰおよびプライマーからなる群から選択される少なくとも１つの成分を含んでなるキットである。好ましくは、キットは核酸の増幅のためのものである。
【０１１７】
好ましい態様では、本発明は、同じまたは別の容器に、シクロデキストリンと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、核酸増幅のための反応バッファー、ｄＮＴＰおよびオリゴヌクレオチドプライマーからなる群から選択される少なくとも１つの成分を含んでなるキットに関する。
【０１１８】
もう１つの好ましい態様では、本発明は、同じ容器に少なくともシクロデキストリンと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、核酸増幅のための反応バッファー、ｄＮＴＰおよびオリゴヌクレオチドプライマーからなる群から選択される少なくとも１つの成分とを含んでなる、サンプル中の標的核酸を増幅するためのキットを対象とする。
【０１１９】
本発明のキットでは、種々の試薬が別の容器で、またはいくつかの成分を含んでなるプレミックスとして提供される。これらの成分は、核酸増幅前に混合および希釈しなければならない濃縮保存溶液として提供してもよい。これらの成分はまた、水または適当なバッファー中に再懸濁させることを意図して、脱水、凍結乾燥または他のいずれかの固体形態で提供してもよい。
【０１２０】
これらのキットはさらにＤＮＡポリメラーゼのいずれの補因子を含んでなってもよい。
【０１２１】
これらのキットはまた、二本鎖ＤＮＡと結合した場合にのみ蛍光を発するｄｓＤＮＡ結合蛍光体（ＳＹＢＲＧｒｅｅｎなど）も含んでいてもよい。
【０１２２】
第一の態様では、本発明によるキットは同じ容器にシクロデキストリンと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなる。
【０１２３】
好ましくは、本発明によるキットは同じ容器にシクロデキストリン、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび保存バッファーを含んでなる。保存バッファーは特に、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの保存を意図され、適合させられている。
【０１２４】
シクロデキストリンを含有する保存バッファー中で維持されている耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは通常、核酸の増幅が行われる前に希釈される。
【０１２５】
第二の態様では、本発明によるキットは、同じ容器にシクロデキストリンと少なくとも１つのｄＮＴＰを含んでなる。好ましくは、この容器は、シクロデキストリンと、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの平衡濃縮プレミックスとを含んでなる。シクロデキストリンを含有するこのｄＮＴＰプレミックスは核酸増幅の前に希釈される。あるいは、この容器はシクロデキストリンとｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰの混合物を含んでなる。
【０１２６】
別の態様では、本発明によるキットは、同じ容器にシクロデキストリンと核酸増幅のための反応バッファーを含んでなる。好ましくは、この容器は濃縮反応バッファーとシクロデキストリンを含む。この保存溶液が希釈され、増幅反応混合物、そして核酸増幅が行われる最終反応混合物が調製される。
【０１２７】
さらなる態様では、本発明によるキットは、同じ容器にシクロデキストリンと少なくとも１つのプライマーを含んでなる。好ましくは、この容器はシクロデキストリンと、反対側の鎖の、増幅される標的核酸配列の５’および３’末端とハイブリダイズする少なくとも２以上のプライマーとを含んでいてもよい。
【０１２８】
別の態様では、本発明によるキットは、同じ容器にシクロデキストリン、二本鎖ＤＮＡと結合した場合にのみ蛍光を発するｄｓＤＮＡ結合蛍光体を含んでなる。
【０１２９】
別の態様では、これらのキットは、同じ容器に、標的核酸にハイブリダイズする標識プローブとシクロデキストリンを含んでなる。
【０１３０】
本発明のキットは、ＤＮＡおよびＲＮＡ双方の増幅を提供する。よって、本発明のキットはまた逆転写酵素を含んでなってもよい。逆転写酵素またはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼはＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを合成するために用いられ、その後、生じたｃＤＮＡが増幅される。好ましい逆転写酵素としては、Ｍｕ−ＭＬＶ逆転写酵素およびＡＭＬ逆転写酵素が挙げられる。
【０１３１】
いくつかの態様では、本発明のキットは等温増幅を提供する。よって、キットはヘリカーゼを含んでいてもよい。
【０１３２】
本発明のキットでは、シクロデキストリンは個別容器中の濃縮保存溶液として、またはその他の成分もしくは試薬との混合物として提供され得る。好ましい態様では、最終反応混合物中のシクロデキストリンの終濃度は好ましくは０．１〜５０ｍＭの間、より好ましくは０．５〜５０ｍＭの間、いっそうより好ましくは０．１、０．５、１、２、４、５ｍＭ〜１０、１５、２０、２５、３０、４０および５０ｍＭの間である。
【０１３３】
本発明によるキットは、溶液中に、または水または適当なバッファーに再懸濁させるための乾燥固体形態でシクロデキストリンを含んでいてもよい。シクロデキストリンはその他の成分とのプレミックスまたは濃縮保存溶液として提供してもよい。キットはまた、シクロデキストリン中に適当な濃度を有する増幅反応混合物を調製するための説明書を含んでいてもよい。シクロデキストリンは、増幅反応混合物の調製のための他の試薬にそのまま加えてもよい。あるいは、シクロデキストリンは、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰまたはオリゴヌクレオチドプライマーなどの反応成分の１つを前処理するために使用してもよい。別の態様では、シクロデキストリンは標的核酸を含有する、または含有することが疑われるサンプルに加えてもよい。
【０１３４】
好ましくは、適当な量の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを、良好な特異性、収量および感度を提供する増幅反応混合物中に用いる。好ましくは、最終反応混合物中の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの量は０．０１、０．０２、０．０３、０．０４単位／μｌ〜０．０５、０．０７５、０．１および０．２単位／μｌの間である。
【０１３５】
本発明のキットは一般に、核酸の増幅に必要な成分を必ずしも総て含んでならなくてもよい。プライマーおよびサンプルなどのいくつかの成分はキットの最終使用者によって提供されてよい。
【０１３６】
本発明のキットはまた、内部陽性対照（ＩＰＣ）を含んでいてもよい。内部陽性対照はプライマーおよび／または特異的プローブおよび対照ＤＮＡ鋳型を含んでなる。このＩＰＣはまたシクロデキストリンを含んでいてもよい。
【０１３７】
本発明はまた、シクロデキストリンと、同じまたは別の容器に核酸増幅のための少なくとも１つの試薬とを含んでなるキットの使用に関する。
【実施例】
【０１３８】
実施例１：遺伝子、プライマーおよび特異的ＰＣＲ産物
１．ＮＵＭＢ
プライマー配列：Ｎｕｍｂ
プライマーＦＷＤ：gag gtt cct aca ggc acc tgc cca g
プライマーＲＥＶ：caa aat cac ccc tca cag tac tct g
これらのプライマーの３つの塩基は一緒にハイブリダイズすることができ、低温でプライマーダイマーを生じる。
ＮＣＢＩ参照：
標的はＮＣＢＩデータベースにおいてＮＴ＿０２６４３７．１１として確認される（配列の位置：５４７４２８７７〜５４７４３１８２）。
アンプリコン長：３０６ｂｐ
【０１３９】
２．ＨＬＡ−Ｃ
ＨＬＡ−ＣおよびＰＣＲ断片は"K.B. Ignatov, A.I. Miroshnikov, V.M. Kramarov, Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2003, vol. 29 (4), 368-371."に記載されている。
プライマー配列：ＨＬＡ−Ｃ
プライマー３：gca agg att aca tcg ccc tga acg ag
プライマー４：cat cat agc ggt gac cac agc tcc aa
増幅には、難しい鋳型かつ極めて長いＰＣＲ断片
ＮＣＢＩ参照：
標的はＮＣＢＩデータベースにおいてＮＴ＿０７５９２．１４として確認される。
アンプリコン長：
１２３０ｂｐ
【０１４０】
３．ｔ−ＰＡ１
プライマー配列：ｔ−ＰＡ１
プライマーＦＷＤ：aga cag tac agc cag cct ca
プライマーＲＥＶ１：gac ttc aaa ttt ctg ctc ctc
ＰＣＲ中、場合によっては、これらのプライマーはプライマーダイマーの形成を誘発し得る。
ＮＣＢＩ参照：
標的はＮＣＢＩデータベースにおいてＮＴ＿００７９９５．１４として確認される。
アンプリコン長：３７４ｂｐ
【０１４１】
実施例２：Ｔａｇポリメラーゼ＋ＳＡ１（シクロデキストリン）の試験
ｇＤＮＡ：ヒトゲノムＤＮＡ、ロッシュ社製
プライマー：Ｎｕｍｂ；アンプリコン＝３０６ｂｐ
ＧｏｌｄＳｔａｒ＋キット参照番号：ＭＥ−００６４−０５、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社製（５Ｕ／μｌ）
Ｔａｑポリメラーゼ：Ｒ−ＰＯＬ−Ｐ０１（自家製Ｔａｑ）
２倍保存バッファー：
Ｔｒｉｓ４０ｍＭ；ｐＨ８
ＥＤＴＡ  ０．２ｍＭ
ＫＣｌ  ０．２Ｍ
ＤＴＴ  ２ｍＭ
Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０  １％（ｖ／ｖ）
Ｔｗｅｅｎ−２０  １％
シクロデキストリン：ＳＡ１
Ｃ４５Ｈ７８Ｎ２Ｏ３４＋２ＨＣｌ：モノプロパンジアミノ−β−シクロデキストリン＊または６’−（３−アミノ−プロピルアミノ）−６’−デオキシ−シクロマルトヘプタオース（クロロヒドレート型）
【０１４２】
１．ＤＮＡの調製
ｇＤＮＡの調製
【表１】
2012511317.tif 000004
試験では、１μｌ／反応量２５μｌとする。
ＮＴＣ（陰性対照）では、ＰＣＲ級Ｈ２Ｏ  １μｌ／反応量２５μｌとする。
【０１４３】
２．ポリメラーゼの調製
・Ｔａｑ  Ｒ−ＰＯＬ−Ｐ０１＋ＳＡ１
ａ．無希釈のＴａｑ
３０μｌ  Ｔａｑ＋３０μｌ  ＳＡ１  ２００ｍＭ
４℃で１時間、振盪およびインキュベーション
ｂ．１０倍希釈のＴａｑ
３μｌ  Ｔａｑ＋２７μｌ  ２倍保存バッファー＋３０μｌ  ＳＡ１  ２００ｍＭ
４℃で１時間、振盪およびインキュベーション
・Ｔａｑ  Ｒ−ＰＯＬ−Ｐ０１単独
ｃ．無希釈のＴａｑ
５μｌ  Ｔａｑ＋５μｌ  Ｈ２Ｏ
ｄ．１０倍希釈のＴａｑ
１μｌ  Ｔａｑ＋９μｌ  ２倍保存バッファー＋１０μｌ  Ｈ２Ｏ
・ＧｏｌｄＳｔａｒ（５Ｕ／μｌ）＋ＳＡ１
１．２５μｌ  ＧｏｌｄＳｔａｒ＋３．７５μｌ  ２倍保存バッファー＋５μｌ  ＳＡ１  ２００ｍＭ
４℃で１時間、振盪およびインキュベーション
０．６２５Ｕ／μｌ
・ＧｏｌｄＳｔａｒ（５Ｕ／μｌ）単独
１．２５μｌ  ＧｏｌｄＳｔａｒ＋３．７５μｌ  ２倍保存バッファー＋５μｌ  Ｈ２Ｏ
０．６２５Ｕ／μｌ
試験およびＮＴＣでは、酵素１μｌ／反応量２５μｌとする。
【０１４４】
３．マスターミックスの調製
【表２】
2012511317.tif 000005
マスターミックス２３μｌ／反応量２５μｌとする。
【０１４５】
４．温度条件
サーマルサイクラー条件
９５℃で１０分
３５サイクル：９５℃で１０秒
６０℃で５秒
７２℃で３０秒
７２℃で５分
４℃∞
１５μｌをゲルにのせる（ブルー３μｌ＋鋳型１２μｌ）
【０１４６】
５．結果
Ｔａｑポリメラーゼ＋ＳＡ１の試験結果を図１に示す。
【０１４７】
６．結論
Ｔａｑポリメラーゼ（１倍）とＳＡ１を用いた場合、Ｎｕｍｂ遺伝子からの特異的産物の増幅が見られるが、プライマーダイマーの形成も見られる。
ＳＡ１無しでＴａｑポリメラーゼ（１倍）を用いた場合、Ｎｕｍｂからの特異的産物の増幅は見られないが、プライマーダイマーの増幅が見られる。
Ｔａｑポリメラーゼ（１０倍希釈）とＳＡ１を用いた場合、Ｎｕｍｂからの特異的産物の増幅が見られるが、プライマーダイマーの形成は見られない。
ＳＡ１無しでＴａｑポリメラーゼ（１０倍希釈）を用いた場合、プライマーダイマーの増幅のみが見られる。
ＧｏｌｄＳｔａｒ＋ＳＡ１を用いた場合、Ｎｕｍｂ遺伝子からの特異的産物の増幅が見られるが、プライマーダイマーの形成は見られない。
ＳＡ１無しでＧｏｌｄＳｔａｒを用いた場合、プライマーダイマーの増幅が見られる。
これらの結果に対する１つの説明としては：
Ｔａｑポリメラーゼが１倍希釈である場合には、ＳＡ１に比べて過剰なＴＡＱが存在する。Ｔａｑポリメラーゼが１０倍希釈される場合には、ＳＡ１は総てのＴａｑポリメラーゼ分子と相互作用し、その効果が反応全体に波及する。ＳＡ１はＰＣＲ反応の特異性を高め、プライマーダイマーの形成を軽減する
ということである。
【０１４８】
実施例３：ＨＬＡ−Ｃプライマーを用いた場合のＴａｑ＋ＳＡ１（シクロデキストリン）の試験
１．材料
酵素：自家製ｔａｑ：Ｔａｑ  Ｒ−ＰＯＬ−Ｐ０１
プライマーＨＬＡ−Ｃ＿Ｐ３およびＰ４：増幅には、より難しい鋳型および長い断片
シクロデキストリン：ＳＡ１
Ｃ４５Ｈ７８Ｎ２Ｏ３４＋２ＨＣｌ  モノプロパンジアミノ−β−シクロデキストリン／６’−（３−アミノ−プロピルアミノ）−６’−デオキシ−シクロマルトヘプタオース（クロロヒドレート型）
【０１４９】
２．Ｔａｑポリメラーゼの調製
マスターミックスの直前にＴａｑ対照を調製する
【表３】
2012511317.tif 000006
→２０倍希釈
１μｌ／反応量２５μｌ
Ｔａｑ＋ＳＡ１
４℃で１時間、振盪およびインキュベーション
【表４】
2012511317.tif 000007
→２０倍希釈
１μｌ／反応量２５μｌ
【０１５０】
３．ＤＮＡの調製
ｇＤＮＡの調製
【表５】
2012511317.tif 000008
試験では、２μｌ／反応量２５μｌとする。
ＮＴＣでは、ＰＣＲ級Ｈ２Ｏ  ２μｌ／反応量２５μｌとする。
【０１５１】
４．マスターミックスの調製
対照−Ｔａｑ＋ＳＡ１（最終４ｍＭ）
【表６】
2012511317.tif 000009
２２μｌ／反応量２５μｌとする。
【０１５２】
５．サイクル
９５℃で３分
３５サイクル：９４℃で３０秒
５８℃で３０秒
７２℃で１００秒
７２℃で５分
４℃∞
【０１５３】
６．結果
ＰＣＲ結果を図２に示す。
Ａｉｄａによる定量を以下に示す。
【表７】
2012511317.tif 000010
【０１５４】
７．結論
非修飾Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応は、ＨＬＡ−Ｃからの特異的断片を示すだけでなく、プライマーダイマーおよび非特異的産物の形成も示す。
他方、Ｔａｑ−シクロデキストリン調製物は特異的ＰＣＲ断片の増幅を高め、非特異的産物を著しく低減する（プライマーダイマーは見られない）。
これらの２つのプライマーを用いたＨＬＡ−Ｃの増幅は、Ignatov K.B. et al., Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 29 (4), 2003, 368-371"に記載されている（図３参照）。
ホットスタート法を用いた（ポイント２参照）。
非特異的断片は常にゲル上に見られる。
【０１５５】
実施例４：ＳＡ１（シクロデキストリン）およびＳＡＲ（シクロデキストリン）を伴うＴａｑポリメラーゼ調製物を用いた試験
プライマーＮｕｍｂおよびＨＬＡ−Ｃを用いたＰＣＲ
１．目的
ＰＣＲにおいて終濃度９ｍＭでＳＡ１を用いて調製したＴａｑとＳＡＲを用いて調製したものとの比較試験
【０１５６】
２．材料
酵素：Ｔａｑ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１自家製およびＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社製  参照番号ＭＥ−００７３−０５）
シクロデキストリン：
ＳＡ１：６−（３−アミノ−プロピルアミノ）−６−デオキシ−シクロマルトヘプタオース／モノプロパンジアミノ−β−シクロデキストリン、ＭＷ：１２６４．０２ｇ／ｍｏｌ
ＳＡＲ：６−Ｏ−α−Ｄ−マルトシル−β−シクロデキストリン、ＭＷ：１４５９．２７ｇ／ｍｏｌ
プライマー：Ｎｕｍｂ、アンプリコン＝３０６ｂｐ
ＨＬＡ−Ｃ、アンプリコン＝１２３０ｂｐ
【０１５７】
３．ＴａｑおよびＳＡ１の調製
対照
【表８】
2012511317.tif 000011
ＳＡ１
ＳＡ１  ２５０ｍＭ：ＳＡ１保存液５００ｍＭをＨ２Ｏで２倍希釈し、−２０℃で保存。このＳＡ１保存液５００ｍＭを２倍貯蔵バッファーに再懸濁させた。
→９μｌ  ＰＣＲ級Ｈ２Ｏ＋９μｌ  ＳＡ１  ５００ｍＭを混合し、２μｌ  ＥＧＴ  Ｔａｑ  Ｐｏｌを加える。
【表９】
2012511317.tif 000012
ＳＡ１＋Ｔａｑポリメラーゼを４℃で１５分、振盪およびインキュベートした。１μｌ／ＰＣＲ反応液２５μｌを加える。
ＳＡＲ
ＳＡＲ  ２５０ｍＭ：０．０４０８ｇのＳＡＲを秤量し、５６μｌの２倍貯蔵バッファーを加え、ボルテックスにかけ、終濃度５００ｍＭとする→ＳＡＲはこの溶液に溶解しない。
再び５６μｌの２倍貯蔵バッファーを加え、ボルテックスにかける→ＳＡＲは完全に溶解し、終濃度は２５０ｍＭとなる。
【表１０】
2012511317.tif 000013
ＳＡＲ＋Ｔａｑポリメラーゼを４℃で１５分、振盪およびインキュベートした。１μｌ／ＰＣＲ反応液２５μｌを加える。
【０１５８】
４．ｇＤＮＡの調製
【表１１】
2012511317.tif 000014
【表１２】
2012511317.tif 000015
試験では、２μｌ／反応量２５μｌとする。
ＮＴＣでは、ＰＣＲ級Ｈ２Ｏ  ２μｌ／反応量２５μｌとする。
【０１５９】
５．マスターミックスの調製
室温で調製（８倍）
【表１３】
2012511317.tif 000016
ウェル当たりマスターミックス２３μｌとする。
プライマーＮｕｍｂおよびＨＬＡ−Ｃを用いた条件：
−ＥＧＴ  Ｔａｑ  Ｐｏｌを用いた場合のマスターミックス
−ＳＡ１の存在下、ＥＧＴ  Ｔａｑ  Ｐｏｌを用いた場合のマスターミックス（１：１混合）
−ＳＡＲの存在下、ＥＧＴ  Ｔａｑ  Ｐｏｌを用いた場合のマスターミックス（１：１混合）
−ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒを用いた場合のマスターミックス
【０１６０】
６．サーマルサイクラー条件（ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ用）
９５℃で１０分
３５サイクル：９５℃で１０秒
６０℃で１０秒
７２℃で３０秒
７２℃で５分
４℃∞
【０１６１】
７．結果
ＰＣＲ反応の結果を図４に示す。
１％アガロースゲル上でのＱＣ
Ａｉｄａによる定量を以下に示す。
【表１４】
2012511317.tif 000017
【０１６２】
８．結論
これらのＨｏｔＳｔａｒサイクリング条件では、Ｔａｑポリメラーゼ調製に使用したこれら２つの異なるシクロデキストリンはＰＣＲ結果に同じプラスの効果：より特異的な反応、かつ、より高い収量をもたらした。
【０１６３】
実施例５：種々のＴａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲにおけるＳＡＲの試験
１．目的
ＰＣＲ反応において、終濃度９ｍＭのＳＡＲ（シクロデキストリン）の存在下、または非存在下で以下のポリメラーゼを試験する：ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ、ＧｏｌｄＳｔａｒ、ＴａｑポリメラーゼＲ−Ｐｏｌ−Ｐ０１およびロッシュ社製のＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【０１６４】
２．材料
酵素：自家製ＴａｑポリメラーゼＲ−Ｐｏｌ−Ｐ０１
Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社製のＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ（参照番号：ＭＥ−００７３−０５）  ５Ｕ／μｌ
Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社製のＧｏｌｄＳｔａｒ（参照番号：ＭＥ−００６４−０５）  ５  Ｕ／μｌ
ロッシュ社製のＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（参照番号：１２０３２９０２００１）  ５Ｕ／μｌ
Ｔａｑ  ＰＯＬ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０１およびＧｏｌｄＳｔａｒとともに使用するための１０倍反応バッファー：
２５℃でｐＨ８．８の７５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、２００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ｔｗｅｅｎ−２０
ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒとともに使用するための１０倍反応バッファー：
２５℃でｐＨ８の１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％ｔｗｅｅｎ−２０
ＦａｓｔＳｔａｒｔとともに使用するためのロッシュ社製の１０倍ＰＣＲ反応バッファー：
５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２５℃でｐＨ８．３
ＳＡＲ：６−Ｏ−α−Ｄ−マルトシル−β−シクロデキストリン、ＭＷ：１４５９．２７ｇ／ｍｏｌ
プライマー：Ｎｕｍｂ、アンプリコン＝３０６ｂｐ
【０１６５】
３．ＴａｑポリメラーゼおよびＳＡＲの調製
対照（ＳＡＲを用いない場合のＴａｑポリメラーゼ）
【表１５】
2012511317.tif 000018
ＳＡＲを用いる場合のＴａｑポリメラーゼ
ＳＡＲ保存液２５０ｍＭ
【表１６】
2012511317.tif 000019
ＳＡＲ＋Ｔａｑポリメラーゼを４℃で１５分、振盪およびインキュベートした。
【０１６６】
４．ｇＤＮＡの調製
【表１７】
2012511317.tif 000020
【表１８】
2012511317.tif 000021
試験では、２μｌ／反応量２５μｌとする。
ＮＴＣでは、ＰＣＲ級Ｈ２Ｏ  ２μｌ／反応量２５μｌとする。
【０１６７】
５．マスターミックスの調製
室温で調製（８倍）
【表１９】
2012511317.tif 000022
ウェル当たりマスターミックス２３μｌとする。
プライマーＮｕｍｂおよびＨＬＡ−Ｃを用いた条件：
−ＳＡＲを用いず、ＥＧＴ  Ｔａｑ  Ｐｏｌを用いた場合のマスターミックス
−ＳＡＲを用い、ＥＧＴ  Ｔａｑ  Ｐｏｌを用いた場合のマスターミックス
−ＳＡＲを用いず、ＧｏｌｄＳｔａｒを用いた場合のマスターミックス
−ＳＡＲを用い、ＧｏｌｄＳｔａｒを用いた場合のマスターミックス
−ＳＡＲを用いず、ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒを用いた場合のマスターミックス
−ＳＡＲを用い、ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒを用いた場合のマスターミックス
−ＳＡＲを用いず、ｆａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合のマスターミックス
−ＳＡＲを用い、ｆａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合のマスターミックス
【０１６８】
６．サーマルサイクラー条件
サイクリングＡ−
９５℃で１０分
３５サイクル：９５℃で１０秒
６０℃で１０秒
７２℃で３０秒
７２℃で５分
４℃∞
サイクリングＢ−
９５℃で３分
３５サイクル：９５℃で１０秒
６０℃で１０秒
７２℃で３０秒
７２℃で５分
４℃∞
【０１６９】
７．結果
１％アガロースゲル上でのＱＣ
Ｎｕｍｂプライマーを用いた増幅（アンプリコンサイズ＝３０６ｂｐ）
結果は図５および図６を参照
Ａｉｄａによる定量を以下に示す。
【表２０】
2012511317.tif 000023
Ａｉｄａによる定量を以下に示す。
【表２１】
2012511317.tif 000024
【０１７０】
８．結論
シクロデキストリンＳＡＲを伴った４つの供試Ｔａｑポリメラーゼ調製物はＰＣＲ反応において極めて良好な結果を示した。
ＴａｑポリメラーゼＲ−ｐｏｌ−Ｐ０１およびＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社製のＧｏｌｄＳｔａｒでは：
・ＳＡＲの存在下で、これら２つのＴａｑはＮｕｍｂからの特異的ＰＣＲ断片を増幅する。
・ＳＡＲを用いた場合にプライマーダイマーの消失が見て取れる。
・サイクリングＡ（９５℃で１０分）よりもサイクリングＢ（９５℃で３分）で特異的バンドが強い。
Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社製のＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒでは：
・この酵素はサイクリングＢ（９５℃で３分）では活性化されない。
・サイクリングＡ（９５℃で１０分）を用いると、ＳａＲの存在下でバンドはより強くなる。
・ＳａＲの存在下ではプライマーダイマーが少ないことが分かった。
ロッシュ社製のＦａｓｔＳｔａｒｔでは：
・サイクリングＡおよびＢとも、ＳａＲの存在下でバンドはより強くなる。
・ＳａＲの存在下ではプライマーダイマーが少ないことが分かった。
【０１７１】
実施例６：試験：ｄＮＴＰ＋ＳＡ１およびバッファー＋ＳＡ１
実験の目的：ＰＣＲ反応におけるｄＮＴＰへのまたはバッファーへのＳＡ１の添加および非修飾Ｔａｑ（ＳＡ１を用いないＴａｑポリメラーゼ）の使用を試験すること。
【０１７２】
１．マスターミックスの調製
酵素：
自家製Ｔａｑ（Ｒ−ＰＯＬ−Ｐ０７）
Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社製のＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ（参照番号：ＭＥ−００７３−０５）
シクロデキストリン：ＳＡ１
Ｃ４５Ｈ７８Ｎ２Ｏ３４＋２ＨＣｌ  モノプロパンジアミノ−β−シクロデキストリン／６’−（３−アミノ−プロピルアミノ）−６’−デオキシ−シクロマルトヘプタオース（クロロヒドレート型）
供試ＤＮＡ：ヒトｇＤＮＡ
プライマー：ＮＵＭＢおよびｔＰＡ１
Ｔａｑ  Ｒ−ＰＯＬ−Ｐ０７、ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ  Ｔａｑに関しては室温で調製する（８倍）。
【表２２】
2012511317.tif 000025
ウェル当たりマスターミックス２３μｌとする。
Ｔａｑ  ＥＧＴ１＋ＳＡ１に関しては、ｄＮＴＰ中に室温で調製する（８倍）。
【表２３】
2012511317.tif 000026
ウェル当たりマスターミックス２３μｌとする。
ＳＡ１に関しては、室温にて、そのままバッファー中に調製する（８倍）。
【表２４】
2012511317.tif 000027
ウェル当たりマスターミックス２３μｌとする。
【０１７３】
２．ＳＡ１を用いない場合のＴａｑ
ＳＡ１：５００ｍＭ、新しく調製。
水５６９μｌ中、ＳＡ１  ０．３６０２ｇ。
対照は非修飾Ｔａｑ
【表２５】
2012511317.tif 000028
ＳＡ１を用いたｄＮＴＰ調製
【表２６】
2012511317.tif 000029
ｄＮＴＰを４℃で１時間、ＳＡ１とともにインキュベートした。
【０１７４】
３．ｇＤＮＡの調製
【表２７】
2012511317.tif 000030
【表２８】
2012511317.tif 000031
【０１７５】
４．サーマルサイクラー条件（ＧｅｎＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００）
ＧｏｌｄＳｔａｒサイクリング
９５℃で３分（またはＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒサイクリングに関しては９５℃で１０分）
３５サイクル：９５℃で１０秒
６０℃で２０秒
７２℃で３０秒
７２℃で１０分
４℃∞
ＡＢＩ  ９７００
【０１７６】
５．結果
結果：アガロースゲル電気泳動１％（図７および８参照）
Ａｉｄａによる定量を以下に示す。
【表２９】
2012511317.tif 000032
【０１７７】
６．結論
・ｄＮＴＰ中にＳＡ１（最終反応量中１０ｍＭ）が存在すると、プライマーダイマーも少なく、Ｎｕｍｂの良好な増幅が見られる（ｄＮＴＰ中、ＳＡ１を用いずに、非修飾Ｔａｑ  Ｒ−ＰＯＬ−Ｐ０７を用いる場合には、増幅が乏しく、多くのプライマーダイマーが見られる）。
・反応バッファー中にＳＡ１（最終反応量中１０ｍＭ）が存在すると、Ｎｕｍｂの良好な増幅が見られるものの、プライマーダイマーはＳＡ１−ｄＮＴＰ調製物を用いた場合に得られる結果に比べてやや多い。
・ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ（ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒサイクリングで）を用いると、ＮｕｍｂおよびｔＰＡ１の良好な増幅が見られる。
・ｔ−ＰＡ１の増幅に関しては、ｄＮＴＰまたは反応バッファーにＳＡ１を加えた場合、プライマーダイマーは見られない。
ｄＮＴＰに、またはさらには直接ＰＣＲバッファーにシクロデキストリンを加えると、ＰＣＲ反応の効率が高まり、特異的断片が増幅され、プライマーダイマーの形成は見られない（またはシクロデキストリンを用いない場合に見られるものよりもはるかに少ない）。
【０１７８】
実施例７：最初の加熱工程を行わないＰＣＲ反応
目的：ＴＡＱポリメラーゼ、ＴＡＱ＋ＳＡ１３およびＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、９５℃での最初の加熱工程を行わずにＰＣＲ反応を行うこと。
【０１７９】
材料：
酵素：
−自家製ｔａｑ：Ｔａｑ  Ｒ−Ｐｏｌ−Ｐ０８
−ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ  ５Ｕ／μｌ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社製、参照番号：ＭＥ−００７３−０１）
ＳＡ１３：ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン
プライマー：Ｎｕｍｂ、アンプリコン＝３０６ｂｐ
１８Ｓ、アンプリコン＝１２１ｂｐ
ｔ−ＰＡ１、アンプリコン＝３７４ｂｐ
【０１８０】
Ｔａｑ  Ｐ０８の調製：Ｔａｑ  Ｐ０８保存液を貯蔵バッファーで２０倍希釈した。
【表３０】
2012511317.tif 000033
・ＳＡ＋ｔａｑポリメラーゼを４℃で１時間、振盪およびインキュベートした。
・ＰＣＲ反応液２５μｌ当たり１μｌの酵素を加える。
【０１８１】
ｇＤＮＡの調製：
【表３１】
2012511317.tif 000034
マスターミックスの調製：
室温で調製
【表３２】
2012511317.tif 000035
２３μｌ／２５μｌ反応量とする。
【０１８２】
サイクリング：
ＰＣＲはサイクルで直接始める（活性化工程無し）
３５サイクル：９５℃で１０秒
６０℃で１０秒
７２℃で３０秒
７２℃で５分
４℃∞
Ｔａｑ  Ｐ０８に関しては、９５℃で３分の最初の活性化工程を行わず、ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒに関しては、９５℃で１０分の最初の活性化工程を行わない。
【表３３】
2012511317.tif 000036
【０１８３】
結論
ＨｏｔＧｏｌｄＳｔａｒ  Ｔａｑポリメラーゼは、ＰＣＲサイクリング前に９５℃での活性化工程を必要とする。この活性化工程を行わなければ、ＨｏｔＧｏｌｄＳａｒによる特異的遺伝子の増幅は見られない。本発明者らは、この初期加熱工程を取り除いても、非修飾ＴＡＱポリメラーゼを用い、ＴＡＱ−シクロデキストリン調製物を用いれば特異的遺伝子が増幅されることを見出した。ＴＡＱポリメラーゼにシクロデキストリンを加えると、ＰＣＲ反応の効率と感度が高まり、特異的断片が増幅され、シクロデキストリンを用いない場合に見られるものよりもプライマーダイマーがはるかに少ない。
参考文献
K.B. Ignatov, et al., Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2003, vol. 29 (4), 368-371
欧州公開第０  ５９２  ０３５号公報
欧州公開第０  ７７１  ８７０号公報
欧州公開第０  ９６２  ５２６号公報
国際公開第９１／０２０４０号公報
国際公開第００／３７６７４号公報
欧州公開第０  ７６２  ８９８号公報
国際公開第９５／３２７３９号公報
米国特許第５，７０５，３４５号公報
国際公開第２００６／１１９４１９号公報
【図１】
2012511317.tif 000037
【図２】
2012511317.tif 000038
【図３】
2012511317.tif 000039
【図４】
2012511317.tif 000040
【図５】
2012511317.tif 000041
【図６】
2012511317.tif 000042
【図７】
2012511317.tif 000043
【図８】
2012511317.tif 000044
【図９】
2012511317.tif 000045
【配列表】
2012511317000001.app
【国際調査報告】
2012511317.tif 000046
2012511317.tif 000047