(57)【要約】低分子ＲＮＡ標的核酸、好ましくは、ｍｉＲＮＡ標的核酸を検出するための組成物および方法であって、該標的核酸の高感度で特異的な検出をもたらす組成物および方法が提供される。該組成物および方法は、好ましくはエクステンダープライマーである第１の増幅オリゴマーと、好ましくは少なくとも部分的に二本鎖の標的捕捉オリゴマーと、プロモータープライマー／プロモータープロバイダーと、好ましくはユニバーサルプライマーであるリバースプライマーと、検出プローブとのうちの１または複数を用いるステップを包含する。該組成物および方法は、診断、予後診断、処置有効性のモニタリング、および／または処置の決定に有用である。
2012509675.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中における標的核酸の存在を検出する方法であって、
（ａ）捕捉領域および末端領域と、それらが両側に位置する内部の標的ハイブリダイズ配列とで構成される、部分的に二本鎖のヘアピン構造をハイブリダイズ条件下において形成する標的捕捉プローブを供給するステップであって、前記末端領域は、前記捕捉領域に結合して、前記ヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成し、前記標的ハイブリダイズ領域は、前記ヘアピン構造の一本鎖ループ部分を形成するステップと、
（ｂ）ｍｉＲ−２２１標的核酸を含有することが疑われる試料を、前記捕捉プローブと混合するステップと、
（ｃ）前記捕捉プローブの前記標的ハイブリダイズ配列を、前記ｍｉＲ−２２１標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズさせるステップと、
（ｄ）特異的結合対のメンバーを併せて結合させることにより、前記捕捉領域を、捕捉支持体に結合させた固定化プローブに結合させ、これにより、前記ｍｉＲ−２２１標的核酸と、前記捕捉プローブと、前記捕捉支持体に結合させた前記固定化プローブとで構成される捕捉ハイブリッド体を形成させるステップと、
（ｅ）前記捕捉支持体に結合させた前記捕捉ハイブリッド体を、前記試料中における他の成分から分離するステップと、
（ｆ）前記ｍｉＲ−２２１標的核酸を、前記捕捉ハイブリッド体からリリースするステップと、
（ｇ）前記リリースされたｍｉＲ−２２１標的核酸と、前記標的捕捉プローブとを含む混合物に、その一部が、前記標的捕捉プローブの前記標的ハイブリダイズ領域の一部と実質的に同一な標的ハイブリダイズ配列を含む、少なくとも第１の増幅オリゴマーを供給するステップと、
（ｈ）あるセットの条件をもたらし、前記第１の増幅オリゴマーを前記ｍｉＲ−２２１標的核酸にハイブリダイズさせて増幅反応を引き起こし、前記標的捕捉プローブを部分的に二本鎖でヘアピン形成させるステップと、
（ｉ）増幅反応において検出可能な増幅産物を生成させるステップであって、前記第１の増幅オリゴマーにより、前記ｍｉＲ−２２１標的核酸からｃＤＮＡ鎖を生成させるステップと、
（ｊ）前記増幅産物を検出して、前記試料中におけるｍｉＲ−２２１標的核酸の存在を示すステップと
を含む、方法。
【請求項２】
試料中における標的核酸の存在を検出する方法であって、
（ａ）捕捉領域および末端領域と、それらが両側に位置する内部の標的ハイブリダイズ配列とで構成される、部分的に二本鎖のヘアピン構造をハイブリダイズ条件下において形成する標的捕捉プローブを供給するステップであって、前記末端領域は、前記捕捉領域に結合して、前記ヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成し、前記標的ハイブリダイズ領域は、前記ヘアピン構造の一本鎖ループ部分を形成するステップと、
（ｂ）ｍｉＲ−２２１標的核酸を含有することが疑われる試料を、前記捕捉プローブと混合するステップと、
（ｃ）前記捕捉プローブの前記標的ハイブリダイズ配列を、前記ｍｉＲ−２２１標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズさせるステップと、
（ｄ）特異的結合対のメンバーを併せて結合させることにより、前記捕捉領域を、捕捉支持体に結合させた固定化プローブに結合させ、これにより、前記ｍｉＲ−２２１標的核酸と、前記捕捉プローブと、前記捕捉支持体に結合させた前記固定化プローブとで構成される捕捉ハイブリッド体を形成させるステップと、
（ｅ）前記捕捉支持体に結合させた前記捕捉ハイブリッド体を、前記試料中における他の成分から分離するステップと、
（ｆ）前記ｍｉＲ−２２１標的核酸を前記捕捉ハイブリッド体からリリースし、あるセットの条件をもたらし、前記標的捕捉プローブを、部分的に二本鎖のヘアピン構造とするステップと、
（ｇ）前記リリースされたｍｉＲ−２２１標的核酸と、前記標的捕捉プローブとを含む混合物に、複数の増幅オリゴマーを供給するステップであって、前記複数のオリゴマーは、少なくとも第１の増幅オリゴマーと、プロモーターベースのオリゴマーとを含み、前記第１の増幅オリゴマーは、その一部が、前記標的捕捉プローブの前記標的ハイブリダイズ領域の一部と実質的に同一な標的ハイブリダイズ配列を含み、前記プロモーターベースのオリゴマーは、その一部が、前記標的捕捉プローブの前記標的ハイブリダイズ領域の一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む、複数の増幅オリゴマーを供給するステップと、
（ｈ）あるセットの条件をもたらし、前記ヘアピン捕捉プローブの存在下において、前記第１の増幅オリゴマーを、前記ｍｉＲ−２２１標的核酸にハイブリダイズさせるステップと、
（ｉ）前記複数の増幅オリゴマーを用いて増幅反応を実施し、前記ｍｉＲ−２２１標的核酸から増幅産物を生成させるステップと、
（ｊ）前記増幅産物を検出して、前記試料中におけるｍｉＲ−２２１標的核酸の存在を示すステップと
を含む、方法。
【請求項３】
試料中における標的核酸の存在を特異的に検出する多重増幅法であって、
（ａ）ｍｉＲ−２２１標的核酸を捕捉する標的捕捉プローブと、ｍｉＲ−１８２標的核酸を捕捉する標的捕捉プローブとを供給するステップであって、前記標的捕捉プローブの各々は、捕捉領域および末端領域と、それらが両側に位置する内部の標的ハイブリダイズ配列とで構成され、前記末端領域は、前記捕捉領域に結合して、ヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成し、前記標的ハイブリダイズ領域は、前記ヘアピン構造の一本鎖ループ部分を形成し、前記ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブの前記標的ハイブリダイズ配列は、ｍｉＲ−２２１配列の全部または一部と実質的に相補的であり、前記ｍｉＲ−１８２標的捕捉プローブの前記標的ハイブリダイズ配列は、ｍｉＲ−１８２配列の全部または一部と実質的に相補的であるステップと、
（ｂ）ｍｉＲ−２２１標的核酸およびｍｉＲ−１８２標的核酸を含有することが疑われる試料を、前記捕捉プローブと混合するステップと、
（ｃ）前記捕捉プローブの前記標的ハイブリダイズ配列を、それら各々の標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズさせるステップと、
（ｄ）特異的結合対のメンバーを併せて結合させることにより、前記捕捉領域を、捕捉支持体に結合させた固定化プローブに結合させ、これにより、前記ｍｉＲ−２２１標的核酸と、前記捕捉プローブと、前記捕捉支持体に結合させた前記固定化プローブとで構成される捕捉ハイブリッド体、ならびに前記ｍｉＲ−１８２標的核酸と、前記捕捉プローブと、前記捕捉支持体に結合させた前記固定化プローブとで構成される捕捉ハイブリッド体を形成させるステップと、
（ｅ）前記捕捉ハイブリッド体を、前記試料中における他の成分から分離するステップと、
（ｆ）前記ｍｉＲ−２２１標的核酸およびｍｉＲ−１８２標的核酸を前記捕捉ハイブリッド体からリリースし、あるセットの条件をもたらし、前記標的捕捉プローブを、部分的に二本鎖のヘアピン構造とするステップと、
（ｇ）前記リリースされたｍｉＲ−２２１標的核酸およびｍｉＲ−１８２標的核酸ならびに前記標的捕捉プローブを含む混合物に、複数の増幅オリゴマーを供給するステップであって、前記複数のオリゴマーは、
（ｉ）少なくとも第１の増幅オリゴマーと、ｍｉＲ−２２１標的核酸またはそのｃＤＮＡ鎖に特異的にハイブリダイズするプロモーターベースのオリゴマーとを含み、前記第１の増幅オリゴマーは、その一部が、前記ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブの前記標的ハイブリダイズ領域の一部と実質的に同一な標的ハイブリダイズ配列を含み、前記プロモーターベースのオリゴマーは、その一部が、前記ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブの前記標的ハイブリダイズ領域の一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含み、
（ｉｉ）少なくとも第１の増幅オリゴマーと、ｍｉＲ−１８２標的核酸またはそのｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズするプロモーターベースのオリゴマーとを含み、前記第１の増幅オリゴマーは、その一部が、前記ｍｉＲ−１８２標的捕捉プローブの前記標的ハイブリダイズ領域の一部と実質的に同一な標的ハイブリダイズ配列を含み、前記プロモーターベースのオリゴマーは、その一部が、前記ｍｉＲ−１８２標的捕捉プローブの前記標的ハイブリダイズ領域の一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む、
複数の増幅オリゴマーを供給するステップと、
（ｈ）あるセットの条件をもたらし、前記第１の増幅オリゴマーを、それら各々の標的核酸にハイブリダイズさせるステップと、
（ｉ）前記複数の増幅オリゴマーを用いて増幅反応を実施し、前記ｍｉＲ−２２１標的核酸およびｍｉＲ−１８２標的核酸から増幅産物を生成させるステップと、
（ｊ）前記増幅産物を検出して、前記試料中におけるｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、またはこれらの両方の存在を示すステップと
を含む、方法。
【請求項４】
前記捕捉領域が、前記標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列の３’端に接合される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記捕捉領域が、前記標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列の５’端に接合される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記捕捉領域を前記固定化プローブに結合させるステップが、前記捕捉領域および前記固定化プローブの相補的配列をハイブリダイズさせる結果として生じる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記捕捉領域が、ｄＴ０〜３Ａ１０〜３０からなる群より選択されるヌクレオチド配列である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記捕捉領域が、ｄＡ１２である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記標的核酸を、前記捕捉ハイブリッド体からリリースするステップにより、前記捕捉プローブが、前記固定化プローブからさらにリリースされる、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ｍｉＲ−２２１標的核酸に特異的にハイブリダイズする前記標的捕捉プローブが、配列番号２４と少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ｍｉＲ−２２１標的核酸に特異的にハイブリダイズする前記標的捕捉プローブが、配列番号４４と少なくとも９５％相補的な標的ハイブリダイズ配列を有する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ｍｉＲ−２２１標的核酸に特異的にハイブリダイズする前記標的捕捉プローブが、配列番号２４である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の増幅オリゴマーが、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーであり、前記３’側の標的ハイブリダイズ配列が、その各々の標的核酸の３’端における約９つ以上の連続核酸と実質的に相補的である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｍｉＲ−２２１の第１の増幅オリゴマーが、配列番号４９と少なくとも９５％同一な伸長核酸配列を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｍｉＲ−２２１の第１の増幅オリゴマーが、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーであり、前記３’側の標的ハイブリダイズ配列が、前記ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブの前記標的ハイブリダイズ配列の５’端における約９つ以上の連続核酸と実質的に同一である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｍｉＲ−２２１の第１の増幅オリゴマーが、配列番号４９と少なくとも９５％同一な伸長核酸配列を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｍｉＲ−２２１標的捕捉オリゴマーが、配列番号２４である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の増幅オリゴマーが、配列番号１７である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
プロモーターベースのオリゴマーと、リバースプライマーオリゴマーとを、ステップ（ｇ）の混合物に供給し、ステップ（ｈ）の増幅反応に関与させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記プロモーターベースのオリゴマーが、前記ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ領域の３’端における１７以上の連続核酸と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項２または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｍｉＲ−２２１の第１の増幅オリゴマーが、配列番号４９と少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｍｉＲ−２２１標的捕捉オリゴマーが、配列番号２４である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記プロモーターベースの増幅オリゴマーが、配列番号１１である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の増幅オリゴマーが、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーであり、前記リバースプライマーが、前記伸長核酸配列と相補的な核酸増幅産物の一部を標的とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
リバースプライマーオリゴマーを、ステップ（ｇ）の混合物に供給し、ステップ（ｉ）の増幅反応に関与させる、請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の増幅オリゴマーが、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーであり、前記リバースプライマーが、前記伸長核酸配列と相補的な核酸増幅産物の一部を標的とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
リバースプライマーオリゴマーを、ステップ（ｇ）の混合物に供給し、ステップ（ｉ）の増幅反応に関与させる、請求項３に記載の方法。
【請求項２８】
ｍｉＲ−２２１を標的とする前記第１の増幅オリゴマーが、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーであり、前記リバースプライマーが、前記伸長核酸配列と相補的な核酸増幅産物の一部を標的とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２８】
ｍｉＲ−１８２を標的とする前記第１の増幅オリゴマーが、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーであり、前記リバースプライマーが、前記伸長核酸配列と相補的な核酸増幅産物の一部を標的とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記伸長核酸配列が、配列番号４９と少なくとも９５％同一である、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記リバースプライマーが、ユニバーサルプライマーである、請求項１９から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記リバースプライマーが、配列番号２０である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ｇ）が、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーである第１の増幅オリゴマーであって、前記３’側の標的ハイブリダイズ配列が、前記ｍｉＲ−２２１標的核酸の３’端における約９つ以上の連続核酸と実質的に相補的であるオリゴマーを供給するステップを含み、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側のプロモーター配列とを含むプロモーターベースの増幅オリゴマーであって、前記標的ハイブリダイズ配列が、前記ｍｉＲ−２２１標的核酸の５’端における１７以上の連続核酸と実質的に同一であるオリゴマーを供給するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ｇ）が、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーである第１の増幅オリゴマーであって、前記３’側の標的ハイブリダイズ配列が、前記ｍｉＲ−２２１標的核酸の３’端における約９つ以上の連続核酸と実質的に相補的であるオリゴマーを供給するステップ、ならびに３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側のプロモーター配列とを含むプロモーターベースの増幅オリゴマーであって、前記標的ハイブリダイズ配列が、前記ｍｉＲ−２２１標的核酸の５’端における１７以上の連続核酸と実質的に同一であるオリゴマーを供給するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ｇ）が、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーである、ｍｉＲ−２２１標的核酸に特異的にハイブリダイズする第１の増幅オリゴマーであって、前記３’側の標的ハイブリダイズ配列が、前記ｍｉＲ−２２１標的核酸の３’端における約９つ以上の連続核酸と実質的に相補的であるオリゴマーを供給するステップを含み、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側のプロモーター配列とを含む、ｍｉＲ−２２１標的核酸のｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズするプロモーターベースの増幅オリゴマーであって、前記標的ハイブリダイズ配列が、前記ｍｉＲ−２２１標的核酸の５’端における１２以上の連続核酸と実質的に同一であるオリゴマーを提供するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（ｇ）が、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーである、ｍｉＲ−１８２標的核酸に特異的にハイブリダイズする第１の増幅オリゴマーであって、前記３’側の標的ハイブリダイズ配列が、前記ｍｉＲ−１８２標的核酸の３’端における約９つ以上の連続核酸と実質的に相補的であるオリゴマーを供給するステップを含み、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側のプロモーター配列とを含む、ｍｉＲ−１８２標的核酸のｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズするプロモーターベースの増幅オリゴマーであって、前記標的ハイブリダイズ配列が、前記ｍｉＲ−１８２標的核酸の５’端における１２以上の連続核酸と実質的に同一であるオリゴマーを提供するステップをさらに含む、請求項３または請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ｍｉＲ−２２１標的核酸を捕捉するように構成された前記標的捕捉プローブが、配列番号４４と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項３２から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ｍｉＲ−１８２標的核酸を捕捉するように構成された前記標的捕捉プローブが、配列番号４１と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項３、３５、または３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記増幅反応を、標的捕捉プローブの存在下において実施し、前記増幅反応の条件を、前記標的捕捉プローブのヘアピン形成を維持するように構成する、請求項３２から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記増幅反応が、等温増幅反応である、請求項３２から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
増幅産物を、検出プローブオリゴマーを用いて検出する、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記検出プローブオリゴマーが、直鎖検出プローブである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記検出プローブオリゴマーが、ヘアピン検出プローブである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記検出プローブオリゴマーを標識する、請求項４１または請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記検出プローブオリゴマーを二重標識する、請求項４１または請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記標的核酸の検出が、リアルタイムの検出である、請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記標的核酸の検出が、がんの診断、がんに関連する予後診断の提供、がん処置の有効性のモニタリング、またはこれらの組合せに有用である、請求項１から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記がんが、前立腺がんである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
配列番号４４の全部または一部と実質的に相補的な内部の標的ハイブリダイズ配列を包含する連続直鎖配列で構成される、ヘアピン構造である少なくとも部分的な二本鎖構造をハイブリダイズ条件下において形成する標的捕捉プローブであって、前記内部の標的ハイブリダイズ配列は、前記ヘアピン構造の一本鎖ループ部分を形成し、捕捉領域と、前記捕捉領域に結合して前記ヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成する末端領域とが両側に位置し、前記捕捉領域は、実質的にホモポリマーの核酸配列をさらに含み、前記末端領域は、前記捕捉領域配列と相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列をさらに含むプローブを含む、組成物。
【請求項４９】
前記捕捉領域の配列が、ｄＴ０〜３Ａ１０〜３０からなる群より選択される、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記捕捉プローブが、配列番号２４と少なくとも９５％同一である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５１】
（ａ）配列番号４４の全部または一部と実質的に相補的な内部の標的ハイブリダイズ配列を包含する連続直鎖配列で構成される、ヘアピン構造である少なくとも部分的な二本鎖構造をハイブリダイズ条件下において形成するｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブであって、前記内部の標的ハイブリダイズ配列は、前記ヘアピン構造の一本鎖ループ部分を形成し、かつ捕捉領域と、前記捕捉領域に結合して前記ヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成する末端領域とが両側に位置し、また、前記捕捉領域は、実質的にホモポリマーの核酸配列をさらに含み、前記末端領域は、前記捕捉領域配列と相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列をさらに含むプローブと、
（ｂ）３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーである、ｍｉＲ−２２１標的核酸にハイブリダイズするように構成された第１の増幅オリゴマーであって、前記３’側の標的ハイブリダイズ配列は、前記ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブの前記標的ハイブリダイズ配列の５’端における約９つ以上の連続核酸と実質的に同一であるオリゴマーと
を含む、増幅反応混合物。
【請求項５２】
前記ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブの３’端における１２以上の連続核酸と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む、プロモーターベースのオリゴマーをさらに含む、請求項５１に記載の増幅反応混合物。
【請求項５３】
前記プロモーターベースのオリゴマーが、配列番号１１と少なくとも９５％同一である、請求項５２に記載の増幅反応混合物。
【請求項５４】
前記プロモーターベースのオリゴマーが、配列番号１１である、請求項５２に記載の増幅反応混合物。
【請求項５５】
前記ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブが、配列番号２４と少なくとも９５％同一である、請求項５１から５４のいずれか一項に記載の増幅反応混合物。
【請求項５６】
前記ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブが、配列番号２４である、請求項５１から５４のいずれか一項に記載の増幅反応混合物。
【請求項５７】
前記ｍｉＲ−２２１エクステンダープライマーが、配列番号１７と少なくとも９５％同一である、請求項５１から５６のいずれか一項に記載の増幅反応混合物。
【請求項５８】
前記ｍｉＲ−２２１エクステンダープライマーが、配列番号１７である、請求項５１から５６のいずれか一項に記載の増幅反応混合物。
【請求項５９】
リバースプライマーをさらに含む、請求項５１から５８のいずれか一項に記載の増幅反応混合物。
【請求項６０】
前記リバースプライマーが、前記伸長核酸配列と相補的な配列の一部を標的とする、請求項５９に記載の増幅反応混合物。
【請求項６１】
前記リバースプライマーが、配列番号２０である、請求項５９に記載の増幅反応混合物。
【請求項６２】
前記標的捕捉プローブが、前記標的ハイブリダイズ配列内において、少なくとも１つの２’−ＯＭｅ残基を含む、請求項５１から６１のいずれか一項に記載の増幅反応混合物。
【請求項６３】
配列番号４１の全部または一部と実質的に相補的な内部の標的ハイブリダイズ配列を包含する連続直鎖配列で構成される、ヘアピン構造である少なくとも部分的な二本鎖構造をハイブリダイズ条件下において形成するｍｉＲ−１８２標的捕捉プローブであって、前記内部の標的ハイブリダイズ配列は、前記ヘアピン構造の一本鎖ループ部分を形成し、かつ捕捉領域と、前記捕捉領域に結合して前記ヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成する末端領域とが両側に位置し、前記捕捉領域は、実質的にホモポリマーの核酸配列をさらに含み、前記末端領域は、前記捕捉領域配列と相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列をさらに含むプローブをさらに含む、請求項５１から６２のいずれか一項に記載の増幅反応混合物。
【請求項６４】
３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーである、ｍｉＲ−１８２標的核酸にハイブリダイズするように構成された第１の増幅オリゴマーであって、前記３’側の標的ハイブリダイズ配列が、前記ｍｉＲ−１８２標的捕捉プローブの前記標的ハイブリダイズ配列の５’端における約９つ以上の連続核酸と実質的に同一であるオリゴマーをさらに含む、請求項５１から６３のいずれか一項に記載の増幅反応混合物。
【請求項６５】
前記ｍｉＲ−１８２標的捕捉プローブの３’端における１２以上の連続核酸と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む、プロモーターベースのオリゴマーをさらに含む、請求項６４に記載の増幅反応混合物。
【請求項６６】
前記プロモーターベースのオリゴマーが、配列番号１０と少なくとも９５％同一である、請求項６５に記載の増幅反応混合物。
【請求項６７】
前記プロモーターベースのオリゴマーが、配列番号１０である、請求項６５に記載の増幅反応混合物。
【請求項６８】
前記ｍｉＲ−１８２捕捉プローブが、配列番号２３と少なくとも９５％同一である、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の増幅反応混合物。
【請求項６９】
前記ｍｉＲ−１８２捕捉プローブが、配列番号２３である、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の増幅反応混合物。
【請求項７０】
前記ｍｉＲ−１８２エクステンダープライマーが、配列番号１６と少なくとも９５％同一である、請求項６４から６９のいずれか一項に記載の増幅反応混合物。
【請求項７１】
前記ｍｉＲ−１８２エクステンダープライマーが、配列番号１６である、請求項６４から６９のいずれか一項に記載の増幅反応混合物。
【請求項７２】
リバースプライマーをさらに含む、請求項６４から７１のいずれか一項に記載の増幅反応混合物。
【請求項７３】
前記リバースプライマーが、前記伸長核酸配列と相補的な配列の一部を標的とする、請求項７２に記載の増幅反応混合物。
【請求項７４】
前記リバースプライマーが、配列番号２０である、請求項７２に記載の増幅反応混合物。
【請求項７５】
前記標的捕捉プローブが、前記標的ハイブリダイズ配列内において、少なくとも１つの２’−ＯＭｅ残基を含む、請求項６４から７４のいずれか一項に記載の増幅反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００８年１１月２５日に出願された仮出願番号６１／１１７，９１３号の米国特許法１１９条（ｅ）項の下での利益を主張し、この仮出願は、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、核酸アッセイの分野に関し、また特に、生物学的試料中に存在する低分子ＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列など、試料中に存在する特異的標的の低分子核酸の検出に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
試料中における核酸の検出は、診断適用、治療適用、法医学適用、農業適用、食品科学適用、および他の領域において有用である。核酸検出の方法には一般に、マトリックスまたは支持体の内部または表面において核酸を捕捉し、その後、捕捉された核酸、および／またはこれらから作製される増幅産物の存在を検出することなどによる、核酸の物理的分離を用いる方法が含まれる。質量分析、配列決定、色素もしくは挿入剤、または検出プローブを核酸にハイブリダイズさせることによるなど、当技術分野で公知の多数の方法を介して検出を行うことができる。一部の方法では、標的核酸を鋳型として用いることから作製される産物を生成させ、産物を検出することにより、例えば、ＤＮＡから作製されるＲＮＡ転写物を検出することにより、またはＲＮＡ転写物から作製される翻訳タンパク質を検出することにより、核酸を間接的に検出する。他の間接的な方法では、検出される核酸と関連する酵素反応により作製される産物を検出し、例えば、酵素の基質がもたらされると検出可能な反応を生成する、標的核酸にハイブリダイズする酵素連結プローブである。核酸検出の一部の方法は、核酸配列を増幅して、大量の核酸を生成させ、これを検出するステップに依拠する。増幅法の例には、クローン配列の多数のコピーを作製するステップと、酵素による核酸配列の多数のコピーの合成を用いる、インビトロの増幅手順とが含まれる。
【０００４】
核酸を検出する多くの技法が、試料中における比較的大量または比較的大きな比率の標的核酸の存在を必要とするのに対し、他の技法は、核酸の増幅を用いて、試料中におけるより少量の標的核酸から検出される核酸の量または比率を増大させる。試料中に存在する核酸の一部または全部を濃縮することにより、対象の核酸の検出を容易にすることができる。核酸を濃縮および検出するための多くの公知の手順は、煩瑣であるか、長時間を要するか、または、このような手順を、多くの試料の迅速なスクリーニング、ポイントオブケア診断、または検査室外の現場における検出など、多くの適用に望ましくないものとする、設備もしくは危険な化学物質（例えば、カオトロープ、変異誘発物質、または放射性化合物）の使用を必要とする。したがって、比較的単純な手順と、対象の核酸を検出するのに十分な感度および／または特異性を提供する方法が、依然として必要とされている。
【０００５】
一部の核酸の物理的性質または相対量は、試料中におけるそれらの検出を妨げる場合がある。例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡまたは短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、および低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）などの低分子ＲＮＡ（約１７〜２７ｎｔ）は、公知の方法を用いることにより他の試料成分から分離および／または検出することが難しい。低分子ＲＮＡは、生物学的試料中において比較的希少であることが多く、これが、それらの検出の困難に寄与している。これらの低分子ＲＮＡ分子の検出をさらに複雑にしているのは、これらの短鎖鋳型ＲＮＡ種が、緊密な関連ファミリーメンバー間において高度の配列相同性を共有することが多いことである。当技術分野における大半の低分子ＲＮＡ検出法は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔｒｉｚｏｌ試薬、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ＡＢＩ  ｍｉｒＶａｎａ、およびＡＢＩ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（カリフォルニア州、カールズバッド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製；カリフォルニア州、ラホーヤ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製；カリフォルニア州、フォスターシティ、ＡＢＩ社製）など、一般的なＲＮＡ単離法を用い、これらのすべては、それらに標的の低分子ＲＮＡ分子（複数可）も含まれうるが、他の多くの非標的核酸も含まれうる無差別的に大量のＲＮＡ種をもたらす。これらの非標的核酸は、標的配列の分析を妨げることが多い。これらの「１つのサイズですべてに適合する」手法は、低分子ＲＮＡの発現プロファイリング実験に、バイアスおよび実験誤差を導入する。低分子ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して、遺伝子の発現を調節するかまたはサイレンスさせる制御分子なので、生物学的過程および疾患状態を理解するのに重要な分子であり、疾患予防剤または疾患治療剤として重要な分子である。研究は、癌性細胞と、非癌性細胞とでは、異なる低分子ＲＮＡ発現が生じることを示している。したがって、下流の分析のために、試料から低分子ＲＮＡを迅速かつ正確に単離する組成物および方法が必要とされている。生物学的試料中における１または複数の低分子ＲＮＡの存在を迅速かつ正確に単離および検出して、生物学的試料中におけるそれらの量、相対量、発現レベル、安定性、治療的有効性、または他の特徴を決定することが必要とされている。各種の生物学的試料中において異なって発現する低分子ＲＮＡの相対量を、腫瘍の転移能の決定を介する、また、その適切な処置を開発する際における、癌性状態の指標として、かつ／またはがんの予後診断の一部として、迅速かつ正確に検出することがさらに必要とされている。
【０００６】
生物学的試料中における低分子ＲＮＡを検出する現行の方法は、長時間を要し、不正確である。一般的な技法には、ＰＣＲ（ＲＴ  ＰＣＲおよびｑＲＴ  ＰＣＲ）、インサイチューハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護アッセイ、ＲＮＡを検出するためのノーザンブロット、ウェスタンブロット、イムノアッセイ、および蛍光検出アッセイが含まれる（特許文献１、Ｌｉら；特許文献２、Ｂｕｍｃｒｏｔら）。試料中のすべてのｍｉＲＮＡに、単一のユニバーサル伸長プライマーまたはアダプターを付加するなど、低分子ＲＮＡに付加配列を付加して、プライミングおよび検出を容易にする検出法もまた存在する（Ｃｈｅｎら：特許文献３；  Ｒａｙｍｏｎｄら、ＲＮＡ、１１巻：１７３７〜４４頁（２００５年））。次いで、これらの付加された核酸配列を、低分子ＲＮＡを増幅するためのプライマー結合部位として、かつ／または捕捉プローブ結合部位として用いる（Ｍｕｌｌｉｎａｘら、特許文献４；  Ｊａｃｏｂｓｅｎら、特許文献５）。加えて、これらの付加された核酸配列を、第１の増幅のためのプライマーとして用いることができる（Ｃｈｅｎら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．、３３巻（２０号）：ｅｌ７９頁（２００５年））。低分子ＲＮＡを増幅および検出する別の方法は、低分子ＲＮＡ分子および固有の核酸分子の両方と相補的な架橋形成オリゴを用いるステップの後で、該低分子ＲＮＡと該固有の核酸とを接合するライゲーションステップを包含する（Ｙｅａｋｌｅｙ、特許文献６）。残念ながら、これらの方法は、不正確である；特に、スループットが増大するにつれて、結果データのばらつきもまた増大する（例えば、Ｍｅｓｔｄａｇｈ、Ｃｈｅｎら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．、３６巻（２１号）：ｅ１４３頁（２００８年）およびＮｅｌｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、１１７９巻（１１号）：７５８〜６５頁（２００８年））。したがって、当技術分野における方法は、これらの低分子ＲＮＡのうちの１または複数が役割を果たす障害を診断するのに用いられる、信頼できる低分子ＲＮＡの発現データを提供するのにそれほど十分ではない。さらに、当技術分野における試料処理法は、試料対応答の自動化、多数の検体に対するハイスループット処理の同定、特に、バイオマーカーの検証および診断的適用には粗く、かつ不十分である。試料中における１または複数の低分子ＲＮＡの存在および相対量を正確に検出して、障害を診断およびモニタリングするほか、該障害を予後診断し、かつ／または該障害に対する処置の有効性をモニタリングする方法が必要とされている。また、低分子ＲＮＡなどのバイオマーカーに対するハイスループット分析と、これらを用いる診断とに有用な方法および試薬も必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第００／０４４９１４号
【特許文献２】国際公開第０５／００４７９４号
【特許文献３】米国特許第７，６０１，４９５号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００８／０１８２２３５号明細書
【特許文献５】国際公開第０５／０９８０２９号
【特許文献６】米国特許出願公開第２００６／００１９２５８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本出願は、生物学的試料中における１または複数の低分子ＲＮＡを含め、試料中における１または複数の核酸を単離および検出するのに有用であり、完全に自動化されたプラットフォームに適する方法および組成物を開示することにより、迅速、正確、かつ有効な核酸検出アッセイに対する必要に応えるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の概要）
本発明のある態様は、試料中における核酸の存在を検出する方法であって、マイクロＲＮＡのｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、またはｍｉＲ−８０２である低分子ＲＮＡ標的核酸を含有する試料を供給するステップと；捕捉領域と、該捕捉領域に結合してヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成する末端領域と、それらが両側に位置する実質的な一本鎖ループ部分を形成する内部の標的ハイブリダイズ配列とで構成される、部分的に二本鎖のヘアピン構造をハイブリダイズ条件下において形成する核酸捕捉プローブと該試料とを混合するステップと；該捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ配列を、該標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズさせるステップと；特異的結合対のメンバーを併せて結合させることにより、該捕捉領域を、捕捉支持体に結合させた固定化プローブに結合させ、これにより、該標的核酸と、該捕捉プローブと、該捕捉支持体に結合させた該固定化プローブとで構成される捕捉ハイブリッド体を形成させるステップと；該捕捉支持体に結合させた該捕捉ハイブリッド体を、試料成分から分離するステップと；該捕捉ハイブリッド体から、該標的核酸をリリースし、次いで、検出プローブを、該標的核酸に特異的にハイブリダイズさせて、検出ハイブリッド体を形成するステップと；該検出ハイブリッド体から生成されるシグナルを検出して、該試料中における該標的核酸の存在を示すステップとを包含する方法である。一実施形態では、捕捉領域が、捕捉プローブの３’端近傍に位置し、末端領域が、捕捉プローブの５’端近傍に位置する。別の実施形態では、捕捉領域が、捕捉プローブの５’端近傍に位置し、末端領域が、捕捉プローブの３’端近傍に位置する。一実施形態では、捕捉領域を固定化プローブに結合させるステップにより、捕捉領域と、固定化プローブの相補的配列とがハイブリダイズする。別の実施形態では、捕捉領域を固定化プローブに結合させるステップにより、リガンドおよびその受容体など、特異的結合対の、核酸以外のメンバーを併せて結合させる。一実施形態では、標的核酸を、捕捉ハイブリッド体からリリースするステップにより、捕捉プローブが、固定化プローブからさらにリリースされる。一実施形態では、増幅ステップで、標的捕捉プローブがハイブリダイズする配列と同じ標的配列の全部または一部に特異的にハイブリダイズする第１の増幅オリゴマーを用いる。一実施形態では、増幅ステップで、標的捕捉プローブがハイブリダイズする標的配列の全部または一部と相補的な標的配列に特異的にハイブリダイズするプロモーターベースの増幅オリゴマーを用いる。一実施形態では、検出ステップで、捕捉プローブの標的ハイブリダイズ配列にハイブリダイズする配列と同じ標的配列である標的配列に特異的にハイブリダイズする検出プローブを用いる。別の実施形態では、検出プローブが、捕捉プローブの標的ハイブリダイズ配列にハイブリダイズする標的配列とは異なるか、またはこれと重複する標的配列に特異的にハイブリダイズする。好ましい実施形態では、検出するステップにより、均一系反応において生成されるシグナルが検出される。
【００１０】
本発明の別の態様は、試料中における標的核酸の存在を検出する方法であって、マイクロＲＮＡのｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、またはｍｉＲ−８０２である低分子ＲＮＡ標的核酸を含有する試料を供給するステップと；該試料を、標的ハイブリダイズ領域および捕捉領域を包含する、核酸の第１の鎖と、該第１の鎖の配列と相補的な配列を含有する、核酸の第２の鎖とで構成される、少なくとも部分的な二本鎖構造である捕捉プローブと混合するステップと；該捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ領域を、該標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズさせるステップと；該捕捉領域を、捕捉支持体に結合させた固定化プローブに結合させ、これにより、該標的核酸と、該捕捉プローブの該第１の鎖と、該捕捉支持体に結合させた該固定化プローブとで構成される捕捉ハイブリッド体を形成するステップと；該捕捉支持体に結合させた該捕捉ハイブリッド体を、他の試料成分から分離するステップと；該捕捉ハイブリッド体から、該標的核酸をリリースし、次いで、検出プローブを、該標的核酸に特異的にハイブリダイズさせて、検出ハイブリッド体を形成するステップと；該検出ハイブリッド体から生成されるシグナルを検出して、これにより、該試料中における該標的核酸の存在を示すステップとを包含する方法である。一実施形態では、第１の鎖が、３’側の標的ハイブリダイズ領域と共有結合する５’側の捕捉領域を含有し、第２の鎖が、該第１の鎖の該捕捉領域と相補的な３’側配列を含有し、これにより、該第１の鎖の該捕捉領域が、該第２の鎖の該相補的な３’側配列にハイブリダイズすると、部分的な二本鎖構造を形成する。別の実施形態では、第１の鎖が、３’側の捕捉領域と共有結合する５’側の標的ハイブリダイズ領域を含有し、第２の鎖が、該第１の鎖の該３’側の捕捉領域と相補的な５’側配列を含有し、これにより、該第１の鎖の該捕捉領域が、該第２の鎖の該相補的な５’側配列にハイブリダイズすると、部分的な二本鎖構造を形成する。一実施形態では、増幅ステップで、標的捕捉プローブがハイブリダイズする配列と同じ標的配列の全部または一部に特異的にハイブリダイズする第１の増幅オリゴマーを用いる。一実施形態では、増幅ステップで、標的捕捉プローブがハイブリダイズする標的配列の全部または一部と相補的な標的配列に特異的にハイブリダイズするプロモーターベースの増幅オリゴマーを用いる。
【００１１】
本発明の別の態様は、ハイブリダイズ条件下において少なくとも部分的な二本鎖構造を形成し、標的ハイブリダイズ配列と、特異的結合対のメンバーを用いることにより固定化プローブと結合する捕捉領域とを包含する、核酸捕捉プローブである。一実施形態では、該部分的な二本鎖構造が、捕捉領域と、該捕捉領域に結合してヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成する末端領域と、それらが両側に位置する内部の標的ハイブリダイズ配列とを包含する連続直鎖配列で構成されるヘアピン構造であり、該標的ハイブリダイズ領域が、該ヘアピン構造の実質的な一本鎖ループ部分を形成する。捕捉領域が、ヘアピン構造を形成する、連続直鎖配列の５’側領域であり、末端領域がその３’側領域の場合もあり、代替的に、捕捉領域が、該連続直鎖配列の５’側領域であり、末端領域がその３’側領域の場合もあることが理解される。捕捉プローブの別の実施形態では、第１の鎖および第２の鎖の相補的配列によるハイブリダイゼーションが、少なくとも部分的な二本鎖構造を生成するように、該構造が、標的ハイブリダイズ領域および捕捉領域を包含する該第１の鎖と、該第１の鎖の配列と相補的な配列を包含する別個の該第２の鎖とで構成される。第１の鎖が、５’側の標的ハイブリダイズ領域および３’側の捕捉領域を有する場合もあり、代替的に、３’側の標的ハイブリダイズ領域および５’側の捕捉領域を有する場合もあり、また、別個の第２の鎖の相補的な配列が、該第１の鎖の該標的ハイブリダイズ領域または該捕捉領域と相補的でありうることが理解される。好ましい実施形態では、第２の鎖の相補的配列が、第１の鎖の捕捉領域と相補的である。
【００１２】
一実施形態は、試料中における標的核酸の存在を検出する方法であって、捕捉領域および末端領域と、それらが両側に位置する内部の標的ハイブリダイズ配列とで構成される、部分的に二本鎖のヘアピン構造をハイブリダイズ条件下において形成する標的捕捉プローブを供給するステップであって、該末端領域が、該捕捉領域に結合して、該ヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成し、該標的ハイブリダイズ領域が、該ヘアピン構造の一本鎖ループ部分を形成するステップと；低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸を含有することが疑われる試料を、該捕捉プローブと混合するステップと；該捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ配列を、該低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズさせるステップと；特異的結合対のメンバーを併せて結合させることにより、該捕捉領域を、捕捉支持体に結合させた固定化プローブに結合させ、これにより、該低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸と、該標的捕捉プローブと、捕捉支持体に結合させた固定化プローブとで構成される捕捉ハイブリッド体を形成させるステップと；該捕捉支持体に結合させた該捕捉ハイブリッド体を、該試料中における他の成分から分離するステップと；該捕捉ハイブリッド体から、該低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸をリリースするステップと；該リリースされた低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸と、該標的捕捉プローブとを含む混合物に、その一部が、該標的捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ領域の一部と実質的に同一な標的ハイブリダイズ配列を含む、少なくとも第１の増幅オリゴマーを供給するステップと；あるセットの条件をもたらし、該第１の増幅オリゴマーを、該低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸にハイブリダイズさせて増幅反応を引き起こし、該標的捕捉プローブを部分的に二本鎖でヘアピン形成させるステップと；増幅反応において検出可能な増幅産物を生成させるステップであって、該第１の増幅オリゴマーにより、該低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸からｃＤＮＡ鎖を生成させるステップと；該増幅産物を検出して、該試料中における低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸の存在を示すステップとを含む方法である。
【００１３】
別の実施形態は、試料中における標的核酸の存在を検出する方法であって、捕捉領域および末端領域と、それらが両側に位置する内部の標的ハイブリダイズ配列とで構成される、部分的に二本鎖のヘアピン構造をハイブリダイズ条件下において形成する標的捕捉プローブを供給するステップであって、該末端領域が、該捕捉領域に結合して、該ヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成し、該標的ハイブリダイズ領域が、該ヘアピン構造の一本鎖ループ部分を形成するステップと；低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸を含有することが疑われる試料を、該捕捉プローブと混合するステップと；該捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ配列を、該ｍｉＲ−２２１標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズさせるステップと；特異的結合対のメンバーを併せて結合させることにより、該捕捉領域を、捕捉支持体に結合させた固定化プローブに結合させ、これにより、該低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸と、該捕捉プローブと、捕捉支持体に結合させた固定化プローブとで構成される捕捉ハイブリッド体を形成させるステップと；該捕捉支持体に結合させた該捕捉ハイブリッド体を、該試料中における他の成分から分離するステップと；該低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸を、該捕捉ハイブリッド体からリリースし、あるセットの条件をもたらし、該標的捕捉プローブを部分的に二本鎖のヘアピン構造とするステップと；該リリースされた低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸と、該標的捕捉プローブとを含む混合物に、複数の増幅オリゴマーを供給するステップであって、該複数のオリゴマーが、少なくとも第１の増幅オリゴマーと、プロモーターベースのオリゴマーとを含み、該第１の増幅オリゴマーは、その一部が、該標的捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ領域の一部と実質的に同一な標的ハイブリダイズ配列を含み、該プロモーターベースのオリゴマーは、その一部が、該標的捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ領域の一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む、ステップと；あるセットの条件をもたらし、該ヘアピン捕捉プローブの存在下において、該第１の増幅オリゴマーを、該低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸にハイブリダイズさせるステップと；該複数の増幅オリゴマーを用いて増幅反応を実施し、該低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸から増幅産物を生成させるステップと；該増幅産物を検出して、該試料中における低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸の存在を示すステップとを含む方法である。
【００１４】
別の実施形態は、試料中における標的核酸の存在を特異的に検出する多重増幅法であって、低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸を捕捉する第１の標的捕捉プローブと、低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸を捕捉する第２の標的捕捉プローブとを供給するステップであって、該標的捕捉プローブが、異なる標的核酸を標的とするように構成され、該標的捕捉プローブの各々が、捕捉領域および末端領域と、それらが両側に位置する内部の標的ハイブリダイズ配列とで構成され、該末端領域が、該捕捉領域に結合して、ヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成し、該標的ハイブリダイズ領域が、該ヘアピン構造の一本鎖ループ部分を形成し、該捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ配列が、低分子ＲＮＡ配列である、ｍｉＲ２１配列、ｍｉＲ−３４ｂ配列、ｍｉＲ−１８２配列、ｍｉＲ−２２１配列、ｍｉＲ−２２２配列、またはｍｉＲ−８０２配列の全部または一部と実質的に相補的であり、該ｍｉＲ−１８２標的捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ配列が、低分子ＲＮＡである、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、またはｍｉＲ−８０２の全部または一部と実質的に相補的であるステップと；低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸の２つ以上を含有することが疑われる試料を、該捕捉プローブと混合するステップと；該捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ配列を、それら各々の標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズさせるステップと；特異的結合対のメンバーを併せて結合させることにより、該捕捉領域を、捕捉支持体に結合させた固定化プローブに結合させ、これにより、該低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸と、該第１の捕捉プローブと、捕捉支持体に結合させた固定化プローブとで構成される捕捉ハイブリッド体、ならびに該低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸と、該第２の捕捉プローブと、該捕捉支持体に結合させた該固定化プローブとで構成される別の捕捉ハイブリッド体を形成させるステップと；該捕捉ハイブリッド体を、該試料中における他の成分から分離するステップと；該標的核酸を該捕捉ハイブリッド体からリリースし、あるセットの条件をもたらし、該第１および第２の標的捕捉プローブを部分的に二本鎖のヘアピン構造とするステップと；該リリースされた標的核酸および該標的捕捉プローブを含む混合物に、複数の増幅オリゴマーを供給するステップであって、該複数のオリゴマーが、（ｉ）少なくとも、第１の標的捕捉プローブにより捕捉される低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、もしくはｍｉＲ−８０２標的核酸、またはそのｃＤＮＡ鎖に特異的にハイブリダイズする、第１の増幅オリゴマーとプロモーターベースのオリゴマーとを含み、該第１の増幅オリゴマーは、その一部が、該第１の標的捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ領域の一部と実質的に同一な標的ハイブリダイズ配列を含み、該プロモーターベースのオリゴマーは、その一部が、該第１の標的捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ領域の一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含み、（ｉｉ）少なくとも、該第２の標的捕捉プローブにより捕捉される低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、もしくはｍｉＲ−８０２標的核酸、またはそのｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズする、第１の増幅オリゴマーとプロモーターベースのオリゴマーとを含み、該第１の増幅オリゴマーは、その一部が、該第２の標的捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ領域の一部と実質的に同一な標的ハイブリダイズ配列を含み、該プロモーターベースのオリゴマーは、その一部が、該第２の標的捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ領域の一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む、ステップと；あるセットの条件をもたらし、該第１の増幅オリゴマーを、それら各々の標的核酸にハイブリダイズさせるステップと；該複数の増幅オリゴマーを用いて増幅反応を実施し、該第１および第２の標的捕捉プローブにより捕捉される該低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸、およびｍｉＲ−１８２標的核酸から増幅産物を生成させるステップと；該増幅産物を検出して、該試料中における、該第１の標的捕捉プローブにより捕捉される低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、もしくはｍｉＲ−８０２標的核酸、該第１の標的捕捉プローブにより捕捉される低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、もしくはｍｉＲ−８０２標的核酸、またはこれらの両方の存在を示すステップとを含む方法である。多重法は、同様に、２つを超える標的核酸を含むことができ、用いられるオリゴマーは、それにしたがって増加する。
【００１５】
別の実施形態は、試料中における標的核酸の存在を検出する方法であって、捕捉領域および末端領域と、それらが両側に位置する内部の標的ハイブリダイズ配列とで構成される、部分的に二本鎖のヘアピン構造をハイブリダイズ条件下において形成する標的捕捉プローブを供給するステップであって、該末端領域が、該捕捉領域に結合して、該ヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成し、該標的ハイブリダイズ領域が、該ヘアピン構造の一本鎖ループ部分を形成するステップと；ｍｉＲ−２２１標的核酸を含有することが疑われる試料を、該捕捉プローブと混合するステップと；該捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ配列を、該ｍｉＲ−２２１標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズさせるステップと；特異的結合対のメンバーを併せて結合させることにより、該捕捉領域を、捕捉支持体に結合させた固定化プローブに結合させ、これにより、該ｍｉＲ−２２１標的核酸と、該捕捉プローブと、捕捉支持体に結合させた固定化プローブとで構成される捕捉ハイブリッド体を形成させるステップと；該捕捉支持体に結合させた該捕捉ハイブリッド体を、該試料中における他の成分から分離するステップと；該ｍｉＲ−２２１標的核酸を、該捕捉ハイブリッド体からリリースするステップと；該リリースされたｍｉＲ−２２１標的核酸と、該標的捕捉プローブとを含む該混合物に、その一部が、該標的捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ領域の一部と実質的に同一な標的ハイブリダイズ配列を含む、少なくとも第１の増幅オリゴマーを供給するステップと；あるセットの条件をもたらし、該第１の増幅オリゴマーを該ｍｉＲ−２２１標的核酸にハイブリダイズさせて増幅反応を引き起こし、該標的捕捉プローブを部分的に二本鎖でヘアピン形成させるステップと；増幅反応において検出可能な増幅産物を生成させるステップであって、該第１の増幅オリゴマーにより、該ｍｉＲ−２２１標的核酸からｃＤＮＡ鎖を生成させるステップと；該増幅産物を検出して、該試料中におけるｍｉＲ−２２１標的核酸の存在を示すステップとを含む方法である。
【００１６】
別の実施形態は、試料中における標的核酸の存在を検出する方法であって、捕捉領域および末端領域と、それらが両側に位置する内部の標的ハイブリダイズ配列とで構成される、部分的に二本鎖のヘアピン構造をハイブリダイズ条件下において形成する標的捕捉プローブを供給するステップであって、該末端領域が、該捕捉領域に結合して、該ヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成し、該標的ハイブリダイズ領域が、該ヘアピン構造の一本鎖ループ部分を形成するステップと；ｍｉＲ−２２１標的核酸を含有することが疑われる試料を、該捕捉プローブと混合するステップと；該捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ配列を、該ｍｉＲ−２２１標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズさせるステップと；特異的結合対のメンバーを併せて結合させることにより、該捕捉領域を、捕捉支持体に結合させた固定化プローブに結合させ、これにより、該ｍｉＲ−２２１標的核酸と、該捕捉プローブと、捕捉支持体に結合させた固定化プローブとで構成される捕捉ハイブリッド体を形成させるステップと；該捕捉支持体に結合させた該捕捉ハイブリッド体を、該試料中における他の成分から分離するステップと；該ｍｉＲ−２２１標的核酸を、該捕捉ハイブリッド体からリリースし、あるセットの条件をもたらし、該標的捕捉プローブを部分的に二本鎖のヘアピン構造とするステップと；該リリースされたｍｉＲ−２２１標的核酸と、該標的捕捉プローブとを含む該混合物に、複数の増幅オリゴマーを供給するステップであって、該複数のオリゴマーが、少なくとも第１の増幅オリゴマーと、プロモーターベースのオリゴマーとを含み、該第１の増幅オリゴマーは、その一部が、該標的捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ領域の一部と実質的に同一な標的ハイブリダイズ配列を含み、該プロモーターベースのオリゴマーは、その一部が、該標的捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ領域の一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む、ステップと；あるセットの条件をもたらし、該ヘアピン捕捉プローブの存在下において、該第１の増幅オリゴマーを該ｍｉＲ−２２１標的核酸にハイブリダイズさせるステップと；該複数の増幅オリゴマーを用いて増幅反応を実施し、該ｍｉＲ−２２１標的核酸から増幅産物を生成させるステップと；該増幅産物を検出して、該試料中におけるｍｉＲ−２２１標的核酸の存在を示すステップとを含む方法である。
【００１７】
別の実施形態は、試料中における標的核酸の存在を特異的に検出する多重増幅法であって、ｍｉＲ−２２１標的核酸を捕捉する標的捕捉プローブと、ｍｉＲ−１８２標的核酸を捕捉する標的捕捉プローブとを供給するステップであって、該標的捕捉プローブの各々が、捕捉領域および末端領域と、それらが両側に位置する内部の標的ハイブリダイズ配列とで構成され、該末端領域が、該捕捉領域に結合して、ヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成し、該標的ハイブリダイズ領域が、該ヘアピン構造の一本鎖ループ部分を形成し、該ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブの該標的捕捉領域が、ｍｉＲ−２２１配列の全部または一部と実質的に相補的であり、該ｍｉＲ−１８２標的捕捉プローブの該標的捕捉領域が、ｍｉＲ−１８２配列の全部または一部と実質的に相補的であるステップと；ｍｉＲ−２２１標的核酸およびｍｉＲ−１８２標的核酸を含有することが疑われる試料を、該捕捉プローブと混合するステップと；該捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ配列を、それら各々の標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズさせるステップと；特異的結合対のメンバーを併せて結合させることにより、該捕捉領域を、捕捉支持体に結合させた固定化プローブに結合させ、これにより、該ｍｉＲ−２２１標的核酸と、該捕捉プローブと、捕捉支持体に結合させた固定化プローブとで構成される捕捉ハイブリッド体、ならびに該ｍｉＲ−１８２標的核酸と、該捕捉プローブと、該捕捉支持体に結合させた該固定化プローブとで構成される捕捉ハイブリッド体を形成させるステップと；該捕捉ハイブリッド体を、該試料中における他の成分から分離するステップと；該ｍｉＲ−２２１標的核酸およびｍｉＲ−１８２標的核酸を、該捕捉ハイブリッド体からリリースし、あるセットの条件をもたらし、該標的捕捉プローブを部分的に二本鎖のヘアピン構造とするステップと；該リリースされたｍｉＲ−２２１標的核酸およびｍｉＲ−１８２標的核酸ならびに該標的捕捉プローブを含む混合物に、複数の増幅オリゴマーを供給するステップであって、該複数のオリゴマーが、（ｉ）少なくとも、ｍｉＲ−２２１標的核酸またはそのｃＤＮＡ鎖に特異的にハイブリダイズする、第１の増幅オリゴマーとプロモーターベースのオリゴマーとを含み、該第１の増幅オリゴマーは、その一部が、該ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ領域の一部と実質的に同一な標的ハイブリダイズ配列を含み、該プロモーターベースのオリゴマーは、その一部が、該ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ領域の一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含み、（ｉｉ）少なくとも、ｍｉＲ−１８２標的核酸またはそのｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズする、第１の増幅オリゴマーとプロモーターベースのオリゴマーとを含み、該第１の増幅オリゴマーは、その一部が、該ｍｉＲ−１８２標的捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ領域の一部と実質的に同一な標的ハイブリダイズ配列を含み、該プロモーターベースのオリゴマーは、その一部が、該ｍｉＲ−１８２標的捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ領域の一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む、ステップと；あるセットの条件をもたらし、該第１の増幅オリゴマーを、それら各々の標的核酸にハイブリダイズさせるステップと；該複数の増幅オリゴマーを用いて増幅反応を実施し、該ｍｉＲ−２２１標的核酸およびｍｉＲ−１８２標的核酸から増幅産物を生成させるステップと；該増幅産物を検出して、該試料中における、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、またはこれらの両方の存在を示すステップとを含む方法である。
【００１８】
該方法の一部の態様では、捕捉領域が、標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列の３’端に接合される。一部の態様では、捕捉領域が、標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ配列の５’端に接合される。一部の態様では、捕捉領域を固定化プローブに結合させるステップが、捕捉領域および固定化プローブの相補的配列をハイブリダイズさせる結果として生じる。一部の態様では、捕捉領域が、ｄＴ０〜３Ａ１０〜３０（これは、該捕捉領域のポリＴ部分が、０〜３ヌクレオチドの長さであり、該捕捉領域のポリＡ部分が、１０〜３０ヌクレオチドの長さであることを意味する）からなる群より選択されるヌクレオチド配列である。一部の態様では、捕捉領域が、ｄＡ１２である。一部の態様では、捕捉ハイブリッド体から、標的核酸をリリースするステップにより、捕捉プローブが、固定化プローブからさらにリリースされる。
【００１９】
該方法の一部の態様では、標的捕捉プローブが、低分子ＲＮＡ標的核酸に特異的にハイブリダイズする。一部の態様では、標的捕捉プローブが、ｍｉＲ−２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸に特異的にハイブリダイズする。一部の態様では、標的捕捉プローブが、標的核酸に特異的にハイブリダイズし、配列番号４４、４１、４７、３８、２９、または３４と少なくとも９５％相補的な標的ハイブリダイズ配列を有する。一部の態様では、標的捕捉プローブが、ｍｉＲ−２２１標的核酸に特異的にハイブリダイズし、配列番号２４と少なくとも９５％同一な標的ハイブリダイズ配列を有する。一部の態様では、標的捕捉プローブが、ｍｉＲ−２２１標的核酸に特異的にハイブリダイズし、配列番号４４と少なくとも９５％相補的なヌクレオチド配列を有する。一部の態様では、ｍｉＲ−２２１標的核酸に特異的にハイブリダイズする標的捕捉プローブが、配列番号２４である。一部の態様では、ｍｉＲ−２１標的核酸に特異的にハイブリダイズする標的捕捉プローブが、配列番号２２である。一部の態様では、ｍｉＲ−１８２標的核酸に特異的にハイブリダイズする標的捕捉プローブが、配列番号２３である。一部の態様では、ｍｉＲ−２２２標的核酸に特異的にハイブリダイズする標的捕捉プローブが、配列番号２５である。一部の態様では、ｍｉＲ−８０２標的核酸に特異的にハイブリダイズする標的捕捉プローブが、配列番号２６である。
【００２０】
該方法の一部の態様では、第１の増幅オリゴマーが、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーであり、該３’側の標的ハイブリダイズ配列が、その各々の標的核酸の３’端における、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７以上の連続核酸と実質的に相補的である。該方法の一部の態様では、第１の増幅オリゴマーが、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーであり、該３’側の標的ハイブリダイズ配列が、その各々の低分子ＲＮＡ標的核酸の３’端における、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７以上の連続核酸と実質的に相補的である。該方法の一部の態様では、第１の増幅オリゴマーが、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーであり、該３’側の標的ハイブリダイズ配列が、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、またはｍｉＲ−８０２である標的核酸の３’端における、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７以上の連続核酸と実質的に相補的である。一部の態様では、第１の増幅オリゴマーが、配列番号４９と少なくとも９５％同一な伸長核酸配列を有する。一部の態様では、第１の増幅オリゴマーが、ｍｉＲ−２２１を標的とし、配列番号４９と少なくとも９５％同一な伸長核酸配列を有する。一部の態様では、第１の増幅オリゴマーが、ｍｉＲ−１８２を標的とし、配列番号４９と少なくとも９５％同一な伸長核酸配列を有する。一部の態様では、第１の増幅オリゴマーが、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸を標的とするエクステンダープライマーであり、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含み、該３’側の標的ハイブリダイズ配列が、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、またはｍｉＲ−８０２を標的とする標的捕捉プローブの標的ハイブリダイズ配列の５’端における約９つ以上の連続核酸と実質的に同一である。一部の態様では、第１の増幅オリゴマーが、ｍｉＲ−２２１を標的とするエクステンダープライマーであり、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含み、該３’側の標的ハイブリダイズ配列が、ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブの標的ハイブリダイズ配列の５’端における約９つ以上の連続核酸と実質的に同一である。一部の態様では、第１の増幅オリゴマーが、ｍｉＲ−１８２を標的とするエクステンダープライマーであり、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含み、該３’側の標的ハイブリダイズ配列が、ｍｉＲ−１８２標的捕捉プローブの標的ハイブリダイズ配列の５’端における約９つ以上の連続核酸と実質的に同一である。一部の態様では、伸長核酸配列が、配列番号４９と少なくとも９５％同一である。一部の態様では、標的捕捉オリゴマーが、配列番号２４であり、また、第１の増幅オリゴマーが、配列番号１７である。
【００２１】
該方法の一部の態様では、プロモーターベースのオリゴマーと、リバースプライマーオリゴマーとを、混合物に供給し、増幅反応に関与させる。一部の態様では、プロモーターベースのオリゴマーが、標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ領域の３’端における、該核酸の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む。一部の態様では、プロモーターベースのオリゴマーが、標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ領域の３’端における、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７以上の連続核酸と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む。一部の態様では、プロモーターベースのオリゴマーが、ｍｉＲ−２１標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ領域、ｍｉＲ−３４ｂ標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ領域、ｍｉＲ−１８２標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ領域、ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ領域、ｍｉＲ−２２２標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ領域、またはｍｉＲ−８０２標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ領域の３’端における、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７以上の連続核酸と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む。一部の態様では、プロモーターベースのオリゴマーが、ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ領域の３’端における、約１２以上の連続核酸と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む。一部の態様では、プロモーターベースのオリゴマーが、標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ領域の３’端における、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７以上の連続核酸と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含み、第１の増幅オリゴマーが、配列番号４９と少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有する。一部の態様では、プロモーターベースのオリゴマーが、ｍｉＲ−２１標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ領域、ｍｉＲ−３４ｂ標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ領域、ｍｉＲ−１８２標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ領域、ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ領域、ｍｉＲ−２２２標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ領域、またはｍｉＲ−８０２標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ領域の３’端における、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７以上の連続核酸と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含み、第１の増幅オリゴマーが、配列番号４９と少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有する。一部の態様では、プロモーターベースのオリゴマーが、ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ領域の３’端における、約１２以上の連続核酸と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含み、第１の増幅オリゴマーが、配列番号４９と少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有する。一部の態様では、プロモーターベースのオリゴマーが、標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ領域の３’端における、該核酸の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含み、標的捕捉オリゴマーが、配列番号２４である。一部の態様では、プロモーターベースのオリゴマーが、標的捕捉プローブ標的ハイブリダイズ領域の３’端における、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７以上の連続核酸と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含み、標的捕捉オリゴマーが、配列番号２４である。一部の態様では、プロモーターベースのオリゴマーが、配列番号２４である標的捕捉オリゴマーの３’端における約１２以上の連続核酸と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む。一部の態様では、プロモーターベースの増幅オリゴマーが、配列番号１１である。一部の態様では、リバースプライマーが、第１の増幅オリゴマーの伸長核酸配列と相補的な核酸増幅産物の部分を標的とする。
【００２２】
該方法の一部の態様では、増幅反応が、標的核酸に特異的にハイブリダイズするように構成された第１の増幅オリゴマーを含み、リバースプライマーが、該第１の増幅オリゴマーの伸長核酸配列の相補体を標的とする。一部の態様では、増幅反応が、標的核酸に特異的にハイブリダイズするように構成された第１の増幅オリゴマーを含み、ユニバーサルリバースプライマーが、該第１の増幅オリゴマーの伸長核酸配列の相補体を標的とする。一部の態様では、増幅反応が、標的核酸に特異的にハイブリダイズするように構成され、配列番号４９と実質的に同一な伸長核酸配列を含む、第１の増幅オリゴマーを含み、リバースプライマーが、該第１の増幅オリゴマーの伸長核酸配列の相補体を標的とする。一部の態様では、増幅反応が、標的核酸に特異的にハイブリダイズするように構成され、配列番号４９と実質的に同一な伸長核酸配列を含む、第１の増幅オリゴマーを含み、リバースプライマーが、配列番号２０である。一部の態様では、増幅反応が、ｍｉＲ−２２１に特異的にハイブリダイズするように構成された第１の増幅オリゴマーを含み、ユニバーサルリバースプライマーが、該第１の増幅オリゴマーの伸長核酸配列の相補体を標的とする。一部の態様では、増幅反応が、ｍｉＲ−２２１に特異的にハイブリダイズするように構成され、配列番号４９と実質的に同一な伸長核酸配列を含む、第１の増幅オリゴマーを含み、リバースプライマーが、該第１の増幅オリゴマーの伸長核酸配列の相補体を標的とする。一部の態様では、増幅反応が、ｍｉＲ−２２１に特異的にハイブリダイズするように構成され、配列番号４９と実質的に同一な伸長核酸配列を含む、第１の増幅オリゴマーを含み、リバースプライマーが、配列番号２０である。一部の態様では、増幅反応が、ｍｉＲ−１８２に特異的にハイブリダイズするように構成された第１の増幅オリゴマーを含み、ユニバーサルリバースプライマーが、該第１の増幅オリゴマーの伸長核酸配列の相補体を標的とする。一部の態様では、増幅反応が、ｍｉＲ−１８２に特異的にハイブリダイズするように構成され、配列番号４９と実質的に同一な伸長核酸配列を含む、第１の増幅オリゴマーを含み、リバースプライマーが、該第１の増幅オリゴマーの伸長核酸配列の相補体を標的とする。一部の態様では、増幅反応が、ｍｉＲ−１８２に特異的にハイブリダイズするように構成され、配列番号４９と実質的に同一な伸長核酸配列を含む、第１の増幅オリゴマーを含み、リバースプライマーが、配列番号２０である。一部の態様では、増幅反応が、各々が異なる標的核酸に特異的にハイブリダイズするように構成された、少なくとも２つの第１の増幅オリゴマーを含む多重増幅である。一部の態様では、増幅反応が、各々が異なる標的核酸に特異的にハイブリダイズするように構成された、少なくとも２つの第１の増幅オリゴマーを含む多重増幅であり、リバースプライマーが、各第１の増幅オリゴマーの伸長核酸配列の相補体を標的とする。一部の態様では、増幅反応が、各々が異なる標的核酸に特異的にハイブリダイズするように構成された、少なくとも２つの第１の増幅オリゴマーを含む多重増幅であり、ユニバースリバースプライマーが、各第１の増幅オリゴマーの伸長核酸配列の相補体を標的とする。一部の態様では、増幅反応が、各々が異なる標的核酸に特異的にハイブリダイズするように構成され、配列番号４９と実質的に同一な伸長核酸配列を含む、少なくとも２つの第１の増幅オリゴマーを含む多重増幅であり、リバースプライマーが、各第１の増幅オリゴマーの伸長核酸配列の相補体を標的とする。一部の態様では、増幅反応が、各々が異なる標的核酸に特異的にハイブリダイズするように構成され、配列番号４９と実質的に同一な伸長核酸配列を含む、少なくとも２つの第１の増幅オリゴマーを含む多重増幅であり、リバースプライマーが、配列番号２０である。一部の態様では、増幅反応が、そのうちの１つがｍｉＲ−２２１に特異的にハイブリダイズするように構成された、少なくとも２つの第１の増幅オリゴマーを含む多重増幅であり、リバースプライマーが、ある第１の増幅オリゴマーの伸長核酸配列の相補体を標的とするか、またはリバースプライマーが、各第１の増幅オリゴマーの伸長核酸配列の相補体を標的とするユニバーサルリバースプライマーである。伸長核酸配列は、配列番号４９と実質的に同一でありうる。リバースプライマーは、配列番号２０と実質的に同一でありうる。一部の態様では、増幅反応が、そのうちの１つがｍｉＲ−１８２に特異的にハイブリダイズするように構成された、少なくとも２つの第１の増幅オリゴマーを含む多重増幅であり、リバースプライマーが、ある第１の増幅オリゴマーの伸長核酸配列の相補体を標的とするか、またはリバースプライマーが、各第１の増幅オリゴマーの伸長核酸配列の相補体を標的とするユニバーサルリバースプライマーである。伸長核酸配列は、配列番号４９と実質的に同一でありうる。リバースプライマーは、配列番号２０と実質的に同一でありうる。一部の態様では、増幅反応が、そのうちの１つがｍｉＲ−２２１に特異的にハイブリダイズするように構成され、また、そのうちの１つがｍｉＲ−１８２にハイブリダイズするように構成された、少なくとも２つの第１の増幅オリゴマーを含む多重増幅であり、リバースプライマーが、第１の増幅オリゴマーのうちの１つの伸長核酸配列の相補体を標的とし、別のリバースプライマーが、他の第１の増幅オリゴマーの伸長核酸配列の相補体を標的とするか、またはリバースプライマーが、各第１の増幅オリゴマーの伸長核酸配列の相補体を標的とするユニバーサルリバースプライマーである。伸長核酸配列は、配列番号４９と実質的に同一でありうる。リバースプライマーは、配列番号２０と実質的に同一でありうる。
【００２３】
該方法の一部の態様では、増幅反応が、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーである第１の増幅オリゴマーであって、該３’側の標的ハイブリダイズ配列が、該ｍｉＲ−２２１標的核酸の３’端における約９つ以上の連続核酸と実質的に相補的であるオリゴマーを含み、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側のプロモーター配列とを含むプロモーターベースの増幅オリゴマーであって、該標的ハイブリダイズ配列が、該ｍｉＲ−２２１標的核酸の５’端における１７以上の連続核酸と実質的に同一であるオリゴマーを供給するステップをさらに含む。一部の態様では、増幅反応が、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーである、ｍｉＲ−２２１標的核酸に特異的にハイブリダイズする第１の増幅オリゴマーであって、該３’側の標的ハイブリダイズ配列が、該ｍｉＲ−２２１標的核酸の３’端における約９つ以上の連続核酸と実質的に相補的であるオリゴマー；ならびに３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーである、ｍｉＲ−１８２標的核酸に特異的にハイブリダイズする第１の増幅オリゴマーであって、該３’側の標的ハイブリダイズ配列が、該ｍｉＲ−１８２標的核酸の３’端における約９つ以上の連続核酸と実質的に相補的であるオリゴマーを含み、ｍｉＲ−２２１標的核酸のｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズするプロモーターベースの増幅オリゴマーであって、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側のプロモーター配列とを含み、該標的ハイブリダイズ配列が、該ｍｉＲ−２２１標的核酸の５’端における１２以上の連続核酸と実質的に同一であるオリゴマー；ならびにｍｉＲ−１８２標的核酸のｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズするプロモーターベースの増幅オリゴマーであって、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側のプロモーター配列とを含み、該標的ハイブリダイズ配列が、該ｍｉＲ−１８２標的核酸の５’端における１２以上の連続核酸と実質的に同一であるオリゴマーを提供するステップをさらに含む。一部の態様では、増幅反応が、１または複数の標的捕捉プローブを含む。一部の態様では、増幅反応が、ｍｉＲ−２２１標的核酸を捕捉するように構成された標的捕捉プローブを含む。一部の態様では、増幅反応が、１または複数の標的捕捉プローブを含む。一部の態様では、増幅反応が、配列番号４４と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む、ｍｉＲ−２２１標的核酸を捕捉するように構成された標的捕捉プローブを含む。一部の態様では、増幅反応が、配列番号２４と実質的に同一な標的捕捉プローブを含む。一部の態様では、増幅反応が、ｍｉＲ−１８２標的核酸を捕捉するように構成された標的捕捉プローブを含む。一部の態様では、増幅反応が、１または複数の標的捕捉プローブを含む。一部の態様では、増幅反応が、配列番号４１と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む、ｍｉＲ−１８２標的核酸を捕捉するように構成された標的捕捉プローブを含む。一部の態様では、増幅反応が、配列番号２３と実質的に同一な標的捕捉プローブを含む。一部の態様では、増幅反応を、標的捕捉プローブの存在下において実施し、該増幅反応の条件を、該標的捕捉プローブのヘアピン形成を維持するように構成する。一部の態様では、増幅反応が、等温増幅反応である。
【００２４】
該方法の一部の態様では、増幅産物を、検出プローブオリゴマーを用いて検出する。該方法の一部の態様では、増幅産物を、標的核酸に対応する増幅産物の一部を標的とする検出プローブオリゴマーを用いて検出する。該方法の一部の態様では、増幅産物を、伸長核酸配列に対応する増幅産物の一部を標的とする検出プローブオリゴマーを用いて検出する。一部の態様では、検出プローブオリゴマーが、直鎖検出プローブである。一部の態様では、検出プローブオリゴマーが、ヘアピン検出プローブである。一部の態様では、検出プローブオリゴマーを、標識する。一部の態様では、検出プローブオリゴマーを、二重標識する。一部の態様では、標的核酸の検出が、リアルタイムの検出である。一部の態様では、検出プローブオリゴマーが、直鎖検出プローブである。一部の態様では、検出プローブオリゴマーが、ヘアピン検出プローブである。一部の態様では、検出プローブオリゴマーを、標識する。一部の態様では、検出プローブオリゴマーを、二重標識する。一部の態様では、標的核酸の検出が、リアルタイムの検出である。
【００２５】
一部の態様では、該方法が、がんの診断、がんに関連する予後診断の提供、がん処置の有効性のモニタリング、またはこれらの組合せに有用である。一部の態様では、がんが、前立腺がんである。
【００２６】
一実施形態は、本明細書で記載される任意の１または複数のオリゴマーを含む組成物である。一部の態様は、配列番号４４、４１、４７、３８、２９、または３４の全部または一部と実質的に相補的な内部の標的ハイブリダイズ配列を包含する連続直鎖配列で構成されるヘアピン構造である少なくとも部分的な二本鎖構造をハイブリダイズ条件下において形成する標的捕捉プローブであって、該内部の標的ハイブリダイズ配列は、該ヘアピン構造の一本鎖ループ部分を形成し、かつ捕捉領域と、該捕捉領域に結合して該ヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成する末端領域とが両側に位置し、該捕捉領域は、実質的にホモポリマーの核酸配列をさらに含み、該末端領域は、該捕捉領域配列と相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列をさらに含むプローブを提供する。一部の態様では、捕捉領域の配列が、ｄＴ０〜３Ａ１０〜３０からなる群より選択される。一部の態様では、捕捉プローブが、配列番号２２、２３、２４、２５、または２６と少なくとも９５％同一である。
【００２７】
一実施形態は、本明細書で記載される任意の１または複数のオリゴマーを含む、増幅反応混合物を提供する。一態様では、増幅反応混合物が、本明細書で記載される標的捕捉オリゴマーのうちの任意の１または複数を含む。一態様では、増幅反応混合物が、本明細書で記載される第１の増幅オリゴマーのうちの任意の１または複数を含む。一態様では、増幅反応混合物が、本明細書で記載されるプロモーターベースの増幅オリゴマーのうちの任意の１または複数を含む。一態様では、増幅反応混合物が、本明細書で記載されるリバースプライマーオリゴマーのうちの任意の１または複数を含む。一態様では、増幅反応混合物が、本明細書で記載される検出プローブオリゴマーのうちの任意の１または複数を含む。一態様では、増幅反応混合物が、本明細書で記載される標的捕捉オリゴマー、本明細書で記載される第１の増幅オリゴマー、本明細書で記載されるプロモーターベースのオリゴマー、本明細書で記載されるリバースプライマーオリゴマー、また、本明細書で記載される検出プローブオリゴマーのうちの任意の１または複数を含む。一態様では、低分子ＲＮＡである、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、またはｍｉＲ−８０２の全部または一部と実質的に相補的な内部の標的ハイブリダイズ配列を包含する連続直鎖配列で構成されるヘアピン構造である少なくとも部分的な二本鎖構造をハイブリダイズ条件下において形成する低分子ＲＮＡ標的捕捉プローブである、ｍｉＲ２１標的捕捉プローブ、ｍｉＲ−３４ｂ標的捕捉プローブ、ｍｉＲ−１８２標的捕捉プローブ、ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブ、ｍｉＲ−２２２標的捕捉プローブ、またはｍｉＲ−８０２標的捕捉プローブであって、該内部の標的ハイブリダイズ配列は、該ヘアピン構造の一本鎖ループ部分を形成し、かつ捕捉領域と、該捕捉領域に結合して該ヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成する末端領域とが両側に位置し、該捕捉領域は、実質的にホモポリマーの核酸配列をさらに含み、該末端領域は、該捕捉領域配列と相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列をさらに含むプローブと；３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーである、低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸にハイブリダイズするように構成された第１の増幅オリゴマーであって、該３’側の標的ハイブリダイズ配列が、該標的捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ配列の５’端における約９つ以上の連続核酸と実質的に同一であるオリゴマーとを含む増幅反応混合物が提供される。一態様では、配列番号３８、２９、４１、４４、４７、または３４の全部または一部と実質的に相補的な内部の標的ハイブリダイズ配列を包含する連続直鎖配列で構成されるヘアピン構造である少なくとも部分的な二本鎖構造をハイブリダイズ条件下において形成するｍｉＲ２１標的捕捉プローブ、ｍｉＲ−３４ｂ標的捕捉プローブ、ｍｉＲ−１８２標的捕捉プローブ、ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブ、ｍｉＲ−２２２標的捕捉プローブ、またはｍｉＲ−８０２標的捕捉プローブであって、該内部の標的ハイブリダイズ配列は、該ヘアピン構造の一本鎖ループ部分を形成し、かつ捕捉領域と、該捕捉領域に結合して該ヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成する末端領域とが両側に位置し、該捕捉領域は、実質的にホモポリマーの核酸配列をさらに含み、該末端領域は、該捕捉領域配列と相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列をさらに含むプローブと；３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーである、低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸にハイブリダイズするように構成された第１の増幅オリゴマーであって、該３’側の標的ハイブリダイズ配列が、該標的捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ配列の５’端における約９つ以上の連続核酸と実質的に同一であるオリゴマーとを含む増幅反応混合物が提供される。一態様では、配列番号４４の全部または一部と実質的に相補的な内部の標的ハイブリダイズ配列を包含する連続直鎖配列で構成されるヘアピン構造である少なくとも部分的な二本鎖構造をハイブリダイズ条件下において形成するｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブであって、該内部の標的ハイブリダイズ配列は、該ヘアピン構造の一本鎖ループ部分を形成し、かつ捕捉領域と、該捕捉領域に結合して該ヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成する末端領域とが両側に位置し、該捕捉領域は、実質的にホモポリマーの核酸配列をさらに含み、該末端領域は、該捕捉領域配列と相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列をさらに含むプローブと；３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーである、ｍｉＲ−２２１標的核酸にハイブリダイズするように構成された第１の増幅オリゴマーであって、該３’側の標的ハイブリダイズ配列が、該ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ配列の５’端における約９つ以上の連続核酸と実質的に同一であるオリゴマーとを含む増幅反応混合物が提供される。一態様では、（ａ）配列番号４４の全部または一部と実質的に相補的な内部の標的ハイブリダイズ配列を包含する連続直鎖配列で構成されるヘアピン構造である少なくとも部分的な二本鎖構造をハイブリダイズ条件下において形成するｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブであって、該内部の標的ハイブリダイズ配列は、該ヘアピン構造の一本鎖ループ部分を形成し、かつ捕捉領域と、該捕捉領域に結合して、該ヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成する末端領域とが両側に位置し、該捕捉領域は、実質的にホモポリマーの核酸配列をさらに含み、該末端領域は、該捕捉領域配列と相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列をさらに含むプローブを含み；配列番号４１の全部または一部と実質的に相補的な内部の標的ハイブリダイズ配列を包含する連続直鎖配列で構成されるヘアピン構造である少なくとも部分的な二本鎖構造をハイブリダイズ条件下において形成するｍｉＲ−１８２標的捕捉プローブであって、該内部の標的ハイブリダイズ配列は、該ヘアピン構造の一本鎖ループ部分を形成し、かつ捕捉領域と、該捕捉領域に結合して、該ヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成する末端領域とが両側に位置し、該捕捉領域は、実質的にホモポリマーの核酸配列をさらに含み、該末端領域は、該捕捉領域配列と相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列をさらに含むプローブをさらに含み；（ｂ）３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーである、ｍｉＲ−２２１標的核酸にハイブリダイズするように構成された第１の増幅オリゴマーであって、該３’側の標的ハイブリダイズ配列が、該ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ配列の５’端における約９つ以上の連続核酸と実質的に同一であるオリゴマーを含み、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーである、ｍｉＲ−１８２標的核酸にハイブリダイズするように構成された第１の増幅オリゴマーであって、該３’側の標的ハイブリダイズ配列が、該ｍｉＲ−１８２標的捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ配列の５’端における約９つ以上の連続核酸と実質的に同一であるオリゴマーをさらに含む、多重増幅のための増幅反応混合物が提供される。一態様では、（ａ）低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸のうちの２つ以上に特異的にハイブリダイズするように構成された２つ以上の標的捕捉プローブであって、該標的捕捉オリゴマーは、それらの標的核酸の各々の全部または一部と実質的に相補的な内部の標的ハイブリダイズ配列を包含する連続直鎖配列で構成されるヘアピン構造である少なくとも部分的な二本鎖構造をハイブリダイズ条件下において形成し、該内部の標的ハイブリダイズ配列は、該ヘアピン構造の一本鎖ループ部分を形成し、かつ捕捉領域と、該捕捉領域に結合して該ヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成する末端領域とが両側に位置し、該捕捉領域は、実質的にホモポリマーの核酸配列をさらに含み、該末端領域は、該捕捉領域配列と相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列をさらに含む２つ以上の標的捕捉プローブと；（ｂ）３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長核酸配列とを含むエクステンダープライマーである、低分子ＲＮＡ標的核酸である、ｍｉＲ２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸のうちの２つ以上にハイブリダイズするように構成された２つ以上の第１の増幅オリゴマーであって、該３’側の標的ハイブリダイズ配列が、対応する該標的捕捉プローブの該標的ハイブリダイズ配列の５’端における約９つ以上の連続核酸と実質的に同一である２つ以上のオリゴマーとを含む、多重増幅のための増幅反応混合物が提供される。
【００２８】
一部の態様では、増幅反応混合物が、ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブの３’端における１２以上の連続核酸と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む、プロモーターベースのオリゴマーをさらに含む。一部の態様では、プロモーターベースのオリゴマーが、配列番号１１と少なくとも９５％同一である。一部の態様では、プロモーターベースのオリゴマーが、配列番号１１である。一部の態様では、増幅反応混合物が、ｍｉＲ−１８２標的捕捉プローブの３’端における１２以上の連続核酸と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む、プロモーターベースのオリゴマーをさらに含む。一部の態様では、プロモーターベースのオリゴマーが、配列番号１０と少なくとも９５％同一である。一部の態様では、プロモーターベースのオリゴマーが、配列番号１０である。一部の態様では、ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブが、配列番号２４と少なくとも９５％同一である。一部の態様では、ｍｉＲ−２２１標的捕捉プローブが、配列番号２４である。一部の態様では、ｍｉＲ−１８２標的捕捉プローブが、配列番号２３と少なくとも９５％同一である。一部の態様では、ｍｉＲ−１８２標的捕捉プローブが、配列番号２３である。一部の態様では、ｍｉＲ−２２１エクステンダープライマーが、配列番号１７と少なくとも９５％同一である。一部の態様では、ｍｉＲ−２２１エクステンダープライマーが、配列番号１７である。一部の態様では、ｍｉＲ−１８２エクステンダープライマーが、配列番号１６と少なくとも９５％同一である。一部の態様では、ｍｉＲ−１８２エクステンダープライマーが、配列番号１６である。一部の態様では、増幅反応混合物が、リバースプライマーをさらに含む。一部の態様では、リバースプライマーが、エクステンダープライマーの伸長核酸配列と相補的な配列の一部を標的とする。一部の態様では、リバースプライマーが、配列番号２０である。一部の態様では、標的捕捉プローブが、該標的ハイブリダイズ配列内において、少なくとも１つの２’−ＯＭｅ残基を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、標的核酸（配列ｄｃｂａと示されている）と、標的相補的領域（配列ａ’ｂ’ｃ’ｄ’と示され、標的ハイブリダイズ配列とも呼ばれる）の両側に位置する、その５’および３’末端で相補的な配列（ポリＴおよびポリＡ領域と示されている）を有するヘアピン捕捉プローブとを混合して、開いた捕捉プローブの標的ハイブリダイズ領域とハイブリダイズした標的核酸、および相補的な固定化プローブ（捕捉支持体に結合したポリＴと示されている）とハイブリダイズした捕捉プローブの一部（ポリＡ領域）で構成される捕捉ハイブリッド体を形成し、続いて溶液中に標的をリリースし、そこでそれが、標的核酸とハイブリダイズした検出プローブ（配列ｄ’ｃ’ｂ’ａ’によって示されている）からなる検出ハイブリッド体を形成して、検出可能なシグナル（星型の符号によって示されている）をもたらし、標的の存在を示すことによって、標的核酸の捕捉および検出を示す実施形態を示す図である。増幅ステップは、この図には示していない。検出は、単離した標的核酸において直接的に行うことができ、または増幅ステップを含め、検出をリアルタイムまたはエンドポイントで行うことができる。
【図２】図２は、標的核酸（配列ａｂｃｄｅと示されている）と、２本の鎖上の相補的な配列（ポリＡおよびポリＴ配列と示されている）および１つの標的相補的領域（ポリＴ含有鎖上に配列ａ’ｂ’ｃ’と示され、標的ハイブリダイズ配列とも呼ばれる）を含有する完全または部分的に二本鎖の捕捉プローブとを混合し、捕捉プローブ鎖の標的ハイブリダイズ領域にハイブリダイズした標的核酸、および相補的な固定化プローブ（捕捉支持体に結合したポリＡと示されている）とハイブリダイズした捕捉プローブ鎖の別の部分（ポリＴ）からなる捕捉ハイブリッド体を形成し、続いて溶液中に標的核酸をリリースして、標的核酸とハイブリダイズした検出プローブ（配列ａ’ｂ’ｃ’ｄ’ｅ’によって示されている）からなる検出ハイブリッド体を形成し、検出可能なシグナル（星型の符号によって示されている）をもたらし、標的の存在を示す、標的核酸の捕捉および検出を示す実施形態を示す図である。増幅ステップは、この図には示していない。検出は、単離した標的核酸において直接的に行うことができ、または増幅ステップを含み、検出をリアルタイムまたはエンドポイントで行うことができる。
【図３】図３は、エクステンダープライマーオリゴマー、プロモーターベースのオリゴマーおよびリバースプライマーオリゴマーを用いる、ｍｉＲＮＡ  ＴＭＡ増幅反応の一般的な概略を示す図である。
【図４】図４ａ〜ｄは、ｍｉＲＮＡ  ＴＭＡアッセイの特異性を示す図である。Ａ）試験した成熟ｍｉＲＮＡの配列。Ｂ）合成ｍｉＲＮＡ標的の様々なインプットコピー数におけるｍｉＲ−８０２アッセイの試験から得た増幅曲線。ＲＦＵ：相対的な蛍光単位。Ｃ）Ｂにおける増幅曲線に関する較正図。Ｄ）成熟標的対プレｍｉＲ−８０２転写物の様々なコピー数インプットにおいて試験したｍｉＲ−８０２アッセイに関する較正図。
【図５】図５ａ〜ｃは、ｍｉＲ  ＴＭＡアッセイの特異性を示す図である。Ａ）試験した成熟ｍｉＲＮＡの配列。Ｂ）関連しないｌｅｔ−７ｄの非標的核酸を伴う関連ｍｉＲ−３４ファミリーメンバーの様々なコピー数インプットにおける、ｍｉＲ−３４ｂアッセイの試験から得た増幅曲線。ＲＦＵ：相対的な蛍光単位。Ｃ）Ｂにおける増幅曲線に関する較正図。
【図６】図６ａ〜ｂは、ｍｉＲ  ＴＭＡアッセイの特異性を示す。Ａ）前立腺がん候補ｍｉＲＮＡの鋳型依存性増幅。増幅反応は、（標的捕捉なしに）三連で実行した。傾きおよびＲ２値は、対数コピー点１．７から７．７（反応につき５から５×１０７コピー）から決定した。Ｂ）ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−８０２の関連および関連しない非標的核酸と比較したときのｍｉＲ−２２１標的核酸についてのｍｉＲ−２２１アッセイの特異性試験。
【図７−１】図７ａ〜ｄは、標的捕捉を用いるｍｉＲＮＡアッセイを示す図である。Ａ）ＳＴＭ緩衝液、または全細胞ＲＮＡ（示されているように、ＶＣａＰまたはＬＮＣａＰ細胞に由来する）１０ｎｇを含有するＳＴＭに直接的に添加した、合成ｍｉＲ−２２１の既知のインプットの捕捉および検出。コントロールの反応は、増幅試薬中に直接的にスパイクした合成ｍｉＲ−２２１を用いて実行した（標的捕捉も全ＲＮＡもなし）。Ｂ）市販のＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイによって決定したｍｉＲ−２２１コピーレベル。Ｃ）ｍｉＲリアルタイムＴＭＡアッセイによって決定したｍｉＲ−２２１コピーレベル（標的捕捉あり）。Ｄ）市販のＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイ（標的捕捉なし）およびｍｉＲリアルタイムＴＭＡアッセイ（標的捕捉あり）を用いて、前立腺がん異種移植片において決定したｍｉＲ−２２１コピー数。全リアルタイムＴＭＡ試料に関して、１反応あたり、１０ｎｇの全ＲＮＡを三連でアッセイした。
【図７−２】図７ａ〜ｄは、標的捕捉を用いるｍｉＲＮＡアッセイを示す図である。Ａ）ＳＴＭ緩衝液、または全細胞ＲＮＡ（示されているように、ＶＣａＰまたはＬＮＣａＰ細胞に由来する）１０ｎｇを含有するＳＴＭに直接的に添加した、合成ｍｉＲ−２２１の既知のインプットの捕捉および検出。コントロールの反応は、増幅試薬中に直接的にスパイクした合成ｍｉＲ−２２１を用いて実行した（標的捕捉も全ＲＮＡもなし）。Ｂ）市販のＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイによって決定したｍｉＲ−２２１コピーレベル。Ｃ）ｍｉＲリアルタイムＴＭＡアッセイによって決定したｍｉＲ−２２１コピーレベル（標的捕捉あり）。Ｄ）市販のＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイ（標的捕捉なし）およびｍｉＲリアルタイムＴＭＡアッセイ（標的捕捉あり）を用いて、前立腺がん異種移植片において決定したｍｉＲ−２２１コピー数。全リアルタイムＴＭＡ試料に関して、１反応あたり、１０ｎｇの全ＲＮＡを三連でアッセイした。
【図８】図８ａ〜ｂは、Ａ）ｍｉＲ−２１ならびにＢ）ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２およびｍｉＲ−１８２に関する絶対的なコピー数の決定を示す図である。合成成熟マイクロＲＮＡは、各標準曲線の作図のために、１反応あたり１×１０９コピーから１０倍希釈した。各逆転写反応に関して、１０ｎｇの全ＲＮＡを用いて、製品説明書にしたがって三連で反応を実行した。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
（詳細な説明）
本発明は、試料中に存在する対象の標的核酸を検出するのに有用である。低分子ＲＮＡは、マイクロＲＮＡのｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、またはｍｉＲ−８０２であることが好ましい。該方法は、比較的少数で実施の容易なステップを用いて、他の試料成分から標的核酸を単離および／または濃縮し、該標的核酸を検出する。試料は、障害についてのバイオマーカーである標的核酸の存在または量を決定するのに用いうる検体として得られる、１または複数の細胞であることが典型的である。例えば、試料は、バイオマーカーが血液細胞内に存在する障害を決定するのに用いうる、１または複数の血液細胞でありうる。別の例として述べると、試料は、そこから生検が採取される組織内または内臓内にバイオマーカーが存在する障害の存在を決定するのに用いうる、１または複数の生検細胞でありうる。該方法は、試料から標的核酸を単離するステップを包含する。一部の場合には、標的核酸が存在することが疑われる細胞を溶解させることにより、該細胞から該標的核酸をリリースさせる。一部の場合には、次いで、リリースされた標的核酸を、試料の他の成分（これには、細胞溶解によってそこから該標的核酸がリリースされた細胞の細胞破砕物が含まれうる）から単離する。単離には、一般的な核酸単離が含まれる場合があり、これは、ｍｉｒＶａｎａキット（カリフォルニア州、フォスターシティ、ＡＢＩ社製）；Ｔｒｉｚｏｌ  ＬＳ（カリフォルニア州、カールズバッド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）；マイクロＲＮＡ単離キット（カリフォルニア州、ラホーヤ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）；およびＨｉｇｈ−Ｐｕｒｅ  ｍｉＲＮＡ単離キット（インディアナ州、インディアナポリス、Ｒｏｃｈｅ社製）などのキットを用いて行うことができる。好ましくは、標的核酸（複数可）の単離は、１または複数の標的捕捉プローブを用いて、捕捉支持体に連結された捕捉ハイブリッド体を形成することにより標的核酸を捕捉する、捕捉ステップを包含する。次いで、非標的核酸を含めた他の試料成分から、捕捉ハイブリッド体を分離する。次いで、捕捉された標的核酸を、捕捉支持体からリリースし、増幅反応および／または検出反応など、下流における１または複数の方法によりアッセイする。標的核酸は、試料細胞溶解物から直接的に捕捉することもでき、全ＲＮＡ単離物、または低分子ＲＮＡ集団などの画分化ＲＮＡ集団など、単離された核酸から捕捉することもできる。
【００３１】
非標的核酸は、アッセイ系のオリゴマーと非特異的にハイブリダイズし、反応物を混み合わせて希少な標的核酸種を検出できなくするか、またはその検出を信頼できないものとすることにより、また、他の形でアッセイを妨げることにより、低分子ＲＮＡの検出に負の影響を及ぼす可能性があるため、その除去は有益である。核酸の一般的な集団、例えば、全ＲＮＡまたはサイズ画分化ＲＮＡの存在下で検出反応を実施する場合、反応物中における非標的配列はアッセイオリゴヌクレオチドと非特異的にハイブリダイズし得、これにより、アッセイから必要とされる試薬を除去する。非特異的にハイブリダイズした試薬は、その意図される標的とは結合できず、さらにまた、非特異的標的が偽陽性シグナルを生成するのにも用いられうる。標的捕捉ステップは、一般的な核酸単離手順の代わりに実施することもでき、このような一般的な単離から取り出された核酸に対して実施することもできる。標的核酸は、下流のアッセイにおいて検出することが好ましい。検出ステップは、核酸プローブベースの検出ステップであることが好ましい。場合によっては、検出ステップの前に増幅ステップを実施することもあるが、これは必須ではない。
【００３２】
標的核酸は、約１７〜２７ヌクレオチドの長さであることが典型的である。標的核酸を捕捉し、次いで検出する場合、標的捕捉オリゴマーおよび検出プローブオリゴマーは、互いと実質的に類似の標的ハイブリダイズ配列を含む。したがって、これら２つのオリゴマーは、標的核酸について競合する、標的ハイブリダイズ配列を有する。一実施形態では、第１のセットの条件下において、それがヘアピン形態ではなく、したがって、その標的ハイブリダイズ配列が、標的核酸にハイブリダイズすることが可能であるように、標的捕捉オリゴマーが構成される。しかし、第２セットの条件下では、標的捕捉オリゴマーが、ヘアピン形態となる。他方、この第２セットの条件下では、検出プローブが、標的核酸にハイブリダイズするように構成される。したがって、検出プローブが存在して低分子標的核酸にハイブリダイズする条件下では、標的捕捉プローブが、該標的にハイブリダイズすることが不可能であるように構成される。ある方法では、第１セットの条件下において、１または複数の標的核酸を、試料または一般的な核酸単離物から捕捉し、残りの破砕物および／または非標的核酸から単離する。１または複数の標的核酸を、それら各々の標的捕捉オリゴマーと共に溶液中へとリリースし、該標的核酸の各々に特異的な、１または複数の検出プローブオリゴマーと混合する。この時点における溶液は、標的核酸（複数可）、標的捕捉オリゴマー（複数可）、および検出プローブオリゴマー（複数可）を含有し、標的核酸にハイブリダイズするように構成された、標的捕捉オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列と、検出プローブオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列とは、実質的に同一である。次いで、標的捕捉オリゴマーではなく、検出プローブオリゴマーが、標的核酸に優先的にハイブリダイズするように、あるセットの条件を溶液に適用する。標的核酸を捕捉し、増幅し、次いで、検出する場合、標的捕捉オリゴマーと、増幅オリゴマーとは、互いと実質的に類似するか、または実質的に同一な標的ハイブリダイズ配列を含む。したがって、これらのオリゴマーは、標的核酸について競合するか、または共にハイブリダイズしうる、標的ハイブリダイズ配列を有する。一実施形態では、第１のセットの条件下において、それがヘアピン形態ではなく、したがって、その標的ハイブリダイズ配列が、標的核酸にハイブリダイズすることが可能であるように、標的捕捉オリゴマーが構成される。しかし、第２セットの条件下では、標的捕捉オリゴマーが、ヘアピン形態となる。他方、この第２セットの条件下では、増幅オリゴマーが、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズするように構成される。したがって、増幅オリゴマーが存在して低分子標的核酸またはその相補体にハイブリダイズする条件下では、標的捕捉プローブが、該標的にハイブリダイズすることが不可能であるように構成される。ある方法では、第１セットの条件下において、１または複数の標的核酸を、試料または一般的な核酸単離物から捕捉し、残りの破砕物および／または非標的核酸から単離する。１または複数の標的核酸を、それら各々の標的捕捉オリゴマーと共に溶液中へとリリースし、該標的核酸の各々に特異的な増幅オリゴマーと混合する。この時点における溶液は、標的核酸（複数可）、標的捕捉オリゴマー（複数可）、および増幅オリゴマー（複数可）を含有し、標的捕捉オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列と、第１の増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列とは、標的核酸上における同じ標的配列の全部または一部にハイブリダイズするように構成され、また、第２の増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列の全部または一部が、標的捕捉オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列の全部または一部と実質的に同一である。次いで、標的捕捉オリゴマーではなく、増幅オリゴマーが、標的核酸に優先的にハイブリダイズするように、あるセットの条件を溶液に適用し、増幅産物を生成させる。
【００３３】
これらの方法は、試料中における１または複数の標的核酸の存在または不在を検出するのに有用である。これらの方法は、試料中における１または複数の標的核酸の量（発現レベルを含めた）を検出するのに有用である。これらの方法は、試料中において低濃度で存在しうる低分子標的核酸、例えば、尿中に排出される低分子核酸、または細胞抽出物もしくは組織抽出物中に存在する低分子核酸を検出するのに特に有用である。捕捉ステップおよび検出ステップを、試料につき１つずつの反応チャンバー内で実施しうるため、これらの方法はまた、多くの試料を、好ましくは、自動化されたハイスループットシステムなどにおいて同時に、または迅速な連続手順でアッセイするのにも有用である。試料中に存在する１または複数の標的核酸を直接的に検出するステップに加えて、本明細書に記載の方法は、標的核酸（複数可）が増幅され、増幅産物（複数可）が検出される核酸増幅をさらに包含する。標的核酸を、細胞破砕物および／または非標的核酸から単離することが好ましい。非標的核酸による干渉が低減されるので、単離された標的核酸は、より正確に増幅および検出される。１または複数の標的核酸の捕捉および増幅では、標的捕捉オリゴマーと、少なくとも第１の増幅オリゴマーとを用いる。したがって、標的捕捉オリゴマーと、第１の増幅オリゴマーとは、低分子標的配列とのハイブリダイゼーションについて競合する。さらなる増幅オリゴマーには、プロモーターベースの増幅オリゴマー、リバースプライマーオリゴマー、またはこれらの両方が含まれる。標的捕捉オリゴマーと、プロモーターベースのオリゴマーとは、共にハイブリダイズしうる。したがって、増幅反応を妨げられなくなるように構成した化学的および／または物理的条件下に、標的捕捉オリゴマーを置くことが好ましい。不能な標的捕捉オリゴマーは、二本鎖構造であるか、または部分的な二本鎖構造であることが好ましい。不能な標的捕捉オリゴマーは、ヘアピン構造であることが好ましい。
【００３４】
増幅法には、ＰＣＲ（ＲＴ  ＰＣＲまたはｑＲＴ  ＰＣＲ）法、転写媒介増幅法、または他の増幅法が含まれる。増幅法は、転写媒介増幅法であり、増幅オリゴマーには、標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズし、該標的核酸に伸長核酸配列をさらに付加するように構成された、第１のプライマーオリゴマーと、該標的核酸と相補的なｃＤＮＡ鎖部分にハイブリダイズするように構成された、プロモーターベースの増幅オリゴマーと、該伸長配列の一部にハイブリダイズするように構成された、リバースプライマーオリゴマーとが含まれることが好ましい。２つ以上の標的核酸を検出する多重反応では、第１のプライマーオリゴマーが、各標的核酸に同じ伸長核酸配列を付加することが好ましく、この場合、リバースプライマーオリゴマーは、ユニバーサルプライマーオリゴマーである。標的核酸の存在または量を検出する方法は、標的捕捉オリゴマーの存在下で生じる増幅反応を包含することが好ましい。増幅反応は、１または複数の標的捕捉オリゴマーの存在下において、該標的捕捉オリゴマーからの干渉なしに、１または複数の標的核酸を増幅するように構成されることが好ましい。１または複数の標的捕捉オリゴマーは、標的核酸がリリースされる条件下においてヘアピン構造を形成し、増幅反応中もヘアピン構成を維持するように構成されることが好ましい。１または複数の標的捕捉オリゴマーは、標的核酸がリリースされる条件下においてヘアピン構造を形成し、転写媒介増幅反応中もヘアピン構成を維持するように構成されることが好ましい。
【００３５】
本開示のオリゴマーおよび方法を用いると、試料中における１または複数の標的核酸の存在および量が正確に決定される。標的核酸は、疾患状態を決定するためのバイオマーカーの場合もあり、予後診断を決定するためのバイオマーカーの場合もあり、医薬化合物を開発するためのバイオマーカーの場合もあり、処置の有効性をモニタリングするためのバイオマーカーの場合もある。バイオマーカーの存在、またはその相対量は、このような試みにおいて有用である。しかし、非標的核酸を含めた夾雑物により結果が負の影響を受ける場合は、バイオマーカー検出アッセイから受容される情報の価値が下落する。非標的核酸に関する一部の問題には、オリゴマー試薬が非標的核酸と非特異的にハイブリダイズし、これにより、試薬を枯渇させ、かつ／または非標的増幅産物を偽陽性シグナルとしてもたらすことが含まれる。加えて、細胞破砕物および非標的核酸が存在すると、オリゴマー試薬が低分子で少量の標的核酸とハイブリダイズできないように、それらの標的を埋没させる場合があり、これにより、偽陽性がもたらされる。したがって、標的核酸の存在または量を決定する検出法は、干渉夾雑物から標的核酸を単離するステップを包含することが好ましい。
【００３６】
本発明の各種の実施形態をよりよく理解するため、本発明の記載において用いられる用語の一部を、以下においてより詳しく記載する。
【００３７】
「核酸」とは、共有結合した２つ以上のヌクレオシド、または窒素含有ヘテロ環塩基もしくは塩基類似体を有するヌクレオシド類似体を含む多量体化合物を指し、ヌクレオシドが、ホスホジエステル結合または他の結合により一体に連結され、ポリヌクレオチドを形成する。核酸には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはキメラＤＮＡ−ＲＮＡポリマーもしくはキメラＤＮＡ−ＲＮＡオリゴヌクレオチド、およびこれらの類似体が含まれる。核酸「骨格」は、糖−ホスホジエステル結合、ペプチド核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡについては、ＰＣＴ第ＷＯ９５／３２３０５号を参照されたい）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはこれらの組合せのうちの１または複数を含めた、各種の結合からなりうる。核酸の糖部分は、リボースまたはデオキシリボースの場合もあり、公知の置換基、例えば、２’メトキシ置換基および２’ハロゲン化物置換基（例えば、２’−Ｆ）を有する類似の化合物の場合もある。窒素含有塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、プリン塩基またはピリミジン塩基の誘導体（例えば、Ｎ４−メチルデオキシグアノシン（Ｎ４−ｍｅｔｈｙｌ  ｄｅｏｘｙｇａｕｎｏｓｉｎｅ）、デアザプリンまたはアザプリン、デアザピリミジンまたはアザピリミジン、第５または６位において置換基を有するピリミジン塩基、２−アミノ−６−メチルアミノプリンなど、第２、６および／または８位において変異または代置による置換を有するプリン塩基、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、およびＯ４−アルキル−ピリミジン、ならびに非置換または３−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンなどのピラゾロ化合物；米国特許第５，３７８，８２５号、同第６，９４９，３６７号、ＰＣＴ第ＷＯ９３／１３１２１号）が含まれる、それらの類似体（例えば、イノシン、５−メチルイソシトシン、イソグアニン；  「Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」、５〜３６頁、Ａｄａｍｓら編、第１１版、１９９２年；Ａｂｒａｈａｍら、２００７年、  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４３巻：６１７〜２４頁）でありうる。核酸は、その骨格が、１または複数の残基について窒素含有塩基を包含しない、「非塩基性」残基を包含しうる（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡにおいて見出される従来の糖、塩基、および結合だけを含む場合もあり、従来の化合物および置換基を包含する場合（例えば、２’メトキシ骨格により連結された従来の塩基、または従来の塩基と、１または複数の塩基類似体との混合物を含めた核酸）もある。核酸には、１または複数のヌクレオチド単量体が、ＲＮＡにおいてロックされた二環式のフラノースユニット（糖コンフォメーションを模倣する）を有し、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）における相補的な配列に対するハイブリダイゼーションアフィニティーを増強する「ロックト核酸」（ＬＮＡ）（Ｖｅｓｔｅｒら、２００４年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４３巻（４２号）：１３２３３〜４１頁）が含まれうる。核酸は、その機能または��動を変化させる修飾塩基、例えば、それにさらなるヌクレオチドが付加されることを阻止する、３’末端におけるジデオキシヌクレオチドの付加を包含しうる。当技術分野では、インビトロにおいて核酸を作製するための合成法が周知であるが、日常的な技法を用いて、天然の供給源から核酸を精製することもできる。
【００３８】
核酸「骨格」とは、例えば、糖−ホスホジエステル結合、２’−Ｏ−メチル結合、ＤＮＡ内におけるグアニジンリンカー（「ＤＮＧ」）、Ｓ−メチルチオ尿素リンカー、リン酸メチル結合、ホスホルアミダイト結合、ポリアミドもしくはペプチド核酸（ＰＮＡ）内におけるアミド骨格の修飾、ホスホロチオエート結合、ホスホン酸エステルによる核酸結合、ピラノシルオリゴヌクレオチド結合、二環式核酸結合および三環式核酸結合、ホルムアセタール結合および３’−チオホルムアセタール結合、モルホリノ結合、または核酸間における天然のホスホジエステル結合の他の修飾、あるいは単一の骨格内におけるこのような結合の組合せ（Ｍａｊｌｅｓｓｉら、１９９８年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２６巻（９号）：２２２４〜２２２９頁；  Ｄｅｍｐｃｙら、１９９５年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９２巻：６０９７〜６１０１頁；  Ｂｒｏｗｎｅら、１９９５年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９２巻：７０５１〜７０５５頁；  ＡｒｙａおよびＢｒｕｉｃｅ、１９９８年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ、１２０巻：６６１９〜６６２０頁；  Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、１９９６年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２４巻（２２号）：４５８４〜４５９１頁；  ＧｒｙａｚｎｏｖおよびＣｈｅｎ、１９９４年、Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１１６巻：３１４３〜３１４４頁；  Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら、１９９６年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２４巻（１２号）：２３１８〜２３２３頁；  ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ、１９９６年、Ｂｉｏｏｒｇ．  ＆  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．、４巻：５〜２３頁；  Ｈｙｄｉｇ−Ｈｉｅｌｓｅｎら、ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／３２３０５号；  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｓｙｎ．  Ｌｅｔｔ．、１９９７年１１月：１２８７〜１２９０頁；  Ｐｅｙｍａｎら、１９９６年、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．、３５巻（２２号）：２６３６〜２６３８頁；  Ａｅｒｓｃｈｏｔら、１９９５年、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．、３４巻（１２号）：１３３８〜１３３９頁；  Ｋｏｓｈｋｉｎら、１９９８年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１２０巻：１３２５２〜１３２５３頁；  ＳｔｅｆｆｅｎｓおよびＬｅｕｍａｎｎ、１９９７年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１１９巻：１１５４８〜１１５４９頁；  Ｊｏｎｅｓら、１９９３年、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．、５８巻：２９８３〜２９９１頁；  ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ、１９９７年、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．、７巻：１８７〜１９５頁；  Ｓｔｉｒｃｈａｋら、１９８９年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１７巻（１５号）：６１２９〜６１４１頁）など、当技術分野（Ｅｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒ、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８４巻：２１１８〜２１２４頁）で公知の基または結合を指す。核酸骨格は、同じ核酸内における結合の混合物を包含する場合（例えば、糖−ホスホジエステル結合およびホスホロチオエート結合）もあり、全１種類の結合を有する場合（例えば、オリゴマー内におけるすべてのアミド修飾結合）もある。
【００３９】
互換的な用語である「オリゴマー」、「オリゴ」、および「オリゴヌクレオチド」は、約５ヌクレオチド（ｎｔ）残基の下限から、約５００〜９００ｎｔ残基の上限に及ぶ範囲内にあるポリマーを含め、一般に、１，０００ｎｔ残基未満の核酸を指す。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、約１２〜１５ｎｔの下限と、約５０〜６００ｎｔの上限とを有するサイズ範囲内にあり、他の実施形態は、約１５〜２０ｎｔの下限と、約２２〜１００ｎｔの上限とを有するサイズ範囲内にある。オリゴヌクレオチドは、天然の供給源から精製することもでき、各種の周知の酵素的方法または化学的方法のうちのいずれかを用いて合成することもできる。オリゴヌクレオチドという用語は、該試薬の任意の特定の機能を示すものではなく、本明細書で記載されるこのような試薬すべてを包括する目的で一般的に用いられる。オリゴヌクレオチドは、各種の異なる機能をもたらしうる。例えば、相補鎖に特異的で、これにハイブリダイズすることが可能であり、核酸ポリメラーゼの存在下ではさらに伸長しうる場合、オリゴヌクレオチドはプライマーとして機能することが可能であり、ＲＮＡポリメラーゼにより認識される配列を含有し、転写を可能とする場合（例えば、プロモーターベースのオリゴマーの場合）、オリゴヌクレオチドはプロモーターを提供することが可能であり、適切に配置され、かつ／または修飾される場合、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションを防止するか、またはプライマーの伸長を妨げるように機能することが可能である。
【００４０】
「標的」または「標的配列」または「標的核酸」とは、例えば、標準的な相補的塩基対合の使用により別の配列が結合する、核酸中または核酸の部分中に存在するヌクレオチド塩基の配列を指す。本明細書では、標的核酸が、約１７〜約２７の連続ヌクレオチド長を有する低分子ＲＮＡであることが好ましい。低分子ＲＮＡ標的核酸には、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｎＲＮＡなどが含まれる。当業者は、標的核酸が、異なる形態、すなわち、一本鎖、二本鎖、三本鎖、または、部分的に二本鎖のヘアピン構造、または部分的に二本鎖の二重鎖構造など、これらの混合物で存在しうることを理解し、標的配列が、該構造のうちのいずれの鎖（＋鎖または−鎖）上にも存在しうることをさらに理解する。当技術分野では、核酸を、標準法用いることにより、例えば、その溶融温度（Ｔｍ）を超えて加熱すること、かつ／または化学的変性剤を用いることなどにより、複数鎖核酸が、その一本鎖の構成要素へと容易に転換されることが周知である。
【００４１】
核酸について「相補的」である、または核酸の「相補性」とは、核酸の１つの鎖内におけるヌクレオチド配列が、その官能基の配向性により、向かい側の核酸鎖上における別の配列と水素結合することを意味する。相補的な塩基は、ＤＮＡにおけるＡとＴ、およびＣとＧ、ＲＮＡにおけるＣとＧ、およびＵとＡであることが典型的である。「実質的に相補的」とは、一方の鎖における配列が、向かい側の鎖における配列と完全に（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ）および／または完全に（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ）相補的なわけではないが、ハイブリダイゼーション条件のセット（例えば、塩濃度および温度）では、２つの鎖上における塩基間において、安定的なハイブリッド複合体を形成するのに十分な結合が生じることを意味する。配列と、当業者に公知の、ハイブリダイズ鎖のＴｍを予測するための標準的な数値計算を用いることにより、または日常的な方法を用いてＴｍを経験的に決定することにより、このような条件を予測することができる。Ｔｍとは、２つの核酸鎖間において形成されるハイブリダイゼーション複合体の集団が、５０％変性する温度を指す。Ｔｍより低い温度では、ハイブリダイゼーション複合体の形成に有利であるのに対し、Ｔｍより高い温度では、ハイブリダイゼーション複合体内における鎖の溶融または分離に有利である。例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を用いることにより、１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液中において公知のＧ＋Ｃ含量を有する核酸のＴｍを推定することができるが、当技術分野では、核酸の構造的特徴を考慮する他のＴｍ計算法も公知である。核酸配列は、それらの連続するヌクレオチドの配置が同じである場合に同一である。同一の配列には、残基が基本的に同じである限りにおいて、一方の配列には修飾残基を有するが、他方の配列にはこれを有さない配列も含まれる（例えば、一方の配列における２’−ＯＭｅ残基は、該２’ＯＭｅ修飾を欠く鎖と、やはり同一である）。実質的に同一な配列とは、それらの２つの鎖の間で配列の差違を含有するが、それらの鎖が類似のハイブリダイゼーション特性を保持する配列である。配列間における同一性および実質的な同一性は、当業者により理解されており、容易に決定される。本明細書において、別の配列と少なくとも特定の百分率同一であるかまたは相補的な配列とは、該配列が、該基準の百分率から１００％までのすべての有理数百分率による同一性を包含することを意味する。例えば、少なくとも８０％とは、すべての自然数による百分率である８０、８１、８２、８２、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、および１００のほか、これらの間の任意の端数（例えば、８２．６、９１．１、９７．９など）も意味する。当業者は、百分率による相補性、また、百分率による同一性を決定することができる。
【００４２】
「ハイブリダイゼーション条件」とは、１つの核酸鎖が、相補的な鎖間相互作用および水素結合により第２の核酸鎖に結合し、ハイブリダイゼーション複合体をもたらす累積的環境を指す。このような条件には、核酸を含有する水溶液または有機溶液の化学成分およびそれらの濃度（例えば、塩、キレート剤、ホルムアミド）、ならびに混合物の温度が含まれる。インキュベーション時間または反応チャンバーの大きさなど、他の周知の因子も、該環境に寄与しうる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、１．９０〜１．９１、９．４７〜９．５１、１１．４７〜１１．５７頁（ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社、１９８９年））。
【００４３】
「標識」とは、例えば、検出可能なシグナルをもたらす反応を触媒することにより、検出可能であるか、または直接的もしくは間接的に検出可能な反応もしくはシグナルをもたらす分子部分を指す。標識には、発光部分（蛍光化合物、生物発光化合物、または化学発光化合物など）、放射性同位体、特異的結合対のメンバー（例えば、ビオチンおよびアビジン）、酵素もしくは酵素基質、反応基、または検出可能な色彩を結果としてもたらす色素もしくは粒子などの発色団が含まれる。
【００４４】
「検出プローブ」とは、標的配列に特異的に結合し、その結合の結果、該標的配列の存在を示す検出可能なシグナルを直接的または間接的にもたらすオリゴマーまたはポリマーである。検出プローブは、検出可能なシグナルをもたらすように標識される必要はなく、例えば、プローブがその標的配列に結合する結果として生じる電気インパルスは、検出可能なシグナルでありうる。「標識プローブ」とは、標識を含有するか、または、標識と直接的もしくは間接的に連結されたプローブである。標識プローブを作製および／または使用する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、１０章；米国特許第６，３６１，９４５号、Ｂｅｃｋｅｒら；同第５，６５８，７３７号、Ｎｅｌｓｏｎら；同第５，６５６，２０７号、Ｗｏｏｄｈｅａｄら；同第５，５４７，８４２号、Ｈｏｇａｎら；同第５，２８３，１７４号、Ａｒｎｏｌｄら；同第４，５８１，３３３号、Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら；同第５，７３１，１４８号、Ｂｅｃｋｅｒら）。例えば、検出プローブには、ヌクレオチド以外のリンカーと、該リンカーに結合させた化学発光標識とが含まれうる（米国特許第５，１８５，４３９号、同第５，５８５，４８１号、および同第５，６３９，６０４号、Ａｒｎｏｌｄら）。
【００４５】
検出プローブの例には、標識を結合させた、約５〜５０ヌクレオチドの長さの直鎖オリゴヌクレオチドまたはヘアピンオリゴヌクレオチドが含まれる。直鎖プローブには、ＴａｑＭａｎプローブおよびＡＥプローブが含まれる。ヘアピンプローブには、分子トーチおよび分子ビーコンが含まれる。分子トーチプローブは、それが標的に結合しているかどうかに応じて、オープンコンフォメーションおよびクローズドコンフォメーションで存在することを可能とする、標的結合ドメインおよびクロージングドメインを含む（また、米国特許第６，８４９，４１２号；同第６，８３５，５４２号；同第６，５３４，２７４号；および同第６，３６１，９４５号も参照されたい）。分子ビーコンは、一般に、Ｔｙａｇｉら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻：４９〜５３頁；ならびに米国特許第５，１１８，８０１号；および同第５，３１２，７２８号において記載されている。このようなヘアピンプローブを用いて標的配列の存在を検出する方法は、当技術分野において周知である。ある場合には、検出プローブが、アッセイで用いられる捕捉プローブの標的ハイブリダイズ配列と同じセンスであり、アッセイで用いられる捕捉プローブの標的ハイブリダイズ配列と実質的に同一な標的ハイブリダイズ配列を含むヌクレオチド配列を有する。他の場合には、エクステンダープライマーを用いるとき、該エクステンダープライマーの標的ハイブリダイズ配列の全部もしくは一部、または該エクステンダープライマーの伸長配列の全部もしくは一部を含みうる、増幅産物と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を有するように、検出プローブが構成される。
【００４６】
標識検出プローブには、化学発光マーカー、例えば、アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物（米国特許第５，１８５，４３９号、同第５，６３９，６０４号、同第５，５８５，４８１号、および同第５，６５６，７４４号）を結合させることができる。アクリジニウムエステル標識は、該ＡＥの両側のヌクレオチド塩基のアミンを制限し、かつ挿入部位を提供する、ヌクレオチド以外のリンカーを用いることにより、ＡおよびＴの塩基対領域の近傍にある、プローブの中央領域に結合させることが典型的である。代替的に、ＡＥ標識を、検出プローブの３’端または５’端に結合させ、次いで、これを、該検出プローブに隣接して標的核酸にハイブリダイズする第２のオリゴマーと共に用いて、該標的核酸が寄与する近傍アミンの効果を制限する。別の実施形態では、関連非標的ポリヌクレオチド配列とのミスマッチ部位の周囲にある二重鎖領域が、関連非標的配列にハイブリダイズしたプローブ上のＡＥ領域を加水分解しやすくするのに十分な程度に不安定化するので、このミスマッチ部位またはその近傍に該ＡＥ標識を結合させ、差違が１ヌクレオチドだけでありうる、該関連配列と標的配列との区別を可能とする。また、標識プローブは、特定の波長または範囲の光を吸収し、別の発光波長または発光範囲の光を発光する蛍光標識（「Ｆ」）により一方の端部を標識し、該フルオロフォアの近傍にあると、励起されたＦから発せられるシグナルを部分的にまたは完全に減衰させる消光剤（「Ｑ」）により他方の端部を標識することができる。このようなプローブを、蛍光剤／消光剤（Ｆ／Ｑ）対により標識したプローブと称することができる。さらに、標識したプローブは、ＡＥとＦとを含んでシグナルを増幅することもでき、ＡＥとＱとを含んでシグナルを消光させることもできる。
【００４７】
「均一検出標識」とは、それが標的に結合しているかまたは結合していないかに応じて、その存在を均一の形で検出しうる標識を指す。均一検出標識は、検出ステップの前に、混合物から、該標識の結合しなかった形態を物理的に分離することなく、「均一反応」中において検出することができる。均一反応は、溶液中、または、マイクロアレイ、バイオチップ、もしくは遺伝子チップなど、支持体上において生じうることが理解される。好ましい均一検出標識と、それらの検出のための条件とは公知である（米国特許第５，２８３，１７４号、Ａｒｎｏｌｄら；同第５，６５６，２０７号、Ｗｏｏｄｈｅａｄら；同第５，６５８，７３７号、Ｎｅｌｓｏｎら）。
【００４８】
「固定化プローブ」は、標的核酸を含有する捕捉ハイブリッド体を、捕捉支持体へと接合する手段をもたらす。好ましい固定化プローブは、支持体へと接合され、標的核酸に直接的または間接的に結合して、他の試料成分など、結合しなかった物質からの、結合した標的核酸の分離を容易にする、核酸オリゴマーまたは核酸ポリマーである。好ましい実施形態では、標的核酸が、標的捕捉プローブを介して、固定化プローブに間接的に結合する。各種の材料のうちのいずれかを、捕捉支持体として用いることができる（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリル酸、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン、および磁性誘引物質から作られるマトリックスまたは粒子）。単分散磁性球は、サイズが比較的均一であり、好ましくは自動システム内において、反応容器に磁力を適用することにより、溶液から容易に回収されるので、捕捉支持体の好ましい実施形態である。固定化プローブは、例えば、各種の共有結合、キレート化、またはイオン性相互作用のうちのいずれかを用いることにより、捕捉支持体に直接的に連結することもでき、該支持体へと接合される１または複数のリンカーを介して間接的に連結することもできる。
【００４９】
「捕捉プローブ」、「標的捕捉プローブ」、または「標的捕捉オリゴマー」は、好ましくは、相補的配列のハイブリダイゼーションにより、標的核酸と、固定化プローブとを接合する手段をもたらす。捕捉プローブは、標的ハイブリダイズ配列と、該捕捉プローブまたは該捕捉プローブを包含するハイブリダイゼーション複合体を固定化プローブへと結合させるための結合メンバーとを含む。このような結合メンバーは、固定化プローブの配列と相補的なホモポリマーまたは実質的にホモポリマーのヌクレオチド配列の場合もあり、または特異的結合対の第１の結合メンバーの場合もあり、ここで第２の結合メンバーは固体支持体に結合している（例えば、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン）。好ましい実施形態では、第１の結合メンバーが、実質的にホモポリマーのヌクレオチド配列であり；より好ましくは、該実質的にホモポリマーのヌクレオチド配列が、ポリＴ０〜３Ａ５〜３０であり、該第１および第２の結合メンバーが、適切な条件下においてハイブリダイズするように、第２の結合メンバーは、該第１の結合メンバーと実質的に相補的な配列である（例えば、これらの両方が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１１０，６７８号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ０６／０７５６７号を参照されたい）。
【００５０】
捕捉プローブの例は、標的核酸と相補的な、少なくとも１０ヌクレオチドの標的ハイブリダイズ配列を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはこれらの類似体のオリゴマーである。標的捕捉オリゴマーは、約２０ヌクレオチドの標的ハイブリダイズ配列を含むことが典型的である。標的ハイブリダイズ領域は、標的核酸との結合を増強する、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル残基構造を包含しうる。捕捉プローブの実施形態には、その３’端および／または５’端において実質的にホモポリマーの配列と共有結合する、約１５〜２５ヌクレオチドの標的ハイブリダイズ配列を有するオリゴマーが含まれる。捕捉プローブに好ましい一部の実施形態には、その３’端および５’端の両方において、１０〜３０ヌクレオチドの長さの、実質的にホモポリマーの核酸配列が両側に位置する、標的ハイブリダイズ配列を含むオリゴマーが含まれる。このような好ましい標的捕捉オリゴマーは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、Ｘｎは、ｎ個の残基を含む、実質的にホモポリマーの配列であるＸを示し、ａ’ｂ’ｃ’は、標的ハイブリダイズ配列を示し、Ｙｎは、ｎ個の残基を含む、実質的にホモポリマーの配列であるＹを示す）と図式化することができる。ｎ＝約１０〜約３０の長さの連続ヌクレオチドであることが好ましい。Ｘｎ配列およびＹｎ配列は、全捕捉プローブが、標的ハイブリダイズ配列をループとして伴うヘアピン構造を形成するよう、二本鎖ステム構造を形成するように構成される。ヘアピン捕捉プローブの例には、図１に示す通り、ポリｄＴ領域およびポリｄＡ領域が互いと結合する場合に、標的ハイブリダイズ領域がヘアピン構造のループを形成するように、標的ハイブリダイズ領域に隣接する５’ポリｄＴ領域と、３’ポリｄＡ領域とが含まれる。この実施形態では、標的ハイブリダイズ領域が、ヘアピン構造内において、実質的な一本鎖を維持する。当業者は、５’側領域および３’側領域に位置する任意の相補的配列を用いて、オリゴマー内の標的ハイブリダイズ領域の両側に位置させ、これにより、ヘアピン捕捉プローブ構造を形成しうることを理解する。
【００５１】
捕捉プローブの他の実施形態には、個々の一本鎖各々の少なくとも一部が向かい側の一本鎖の一部と相補的な２つのオリゴマー鎖からなる、部分的または完全な二本鎖構造が含まれる。このような実施形態は、
（第１の鎖）５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’３’
（第２の鎖）３’Ｙｎａｂｃ５’
（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、標的ハイブリダイズ配列を示し、ａｂｃは、該標的ハイブリダイズ配列と相補的な任意選択の配列を示し、該第１および第２の鎖は、二本鎖構造を形成しうる）と図式化することができる。このような捕捉プローブを、図２に示す。捕捉プローブの他の実施形態は、３’側または５’側の標的ハイブリダイズ領域と、固定化プローブに結合する連続領域とで構成される一本鎖オリゴマーであり、これは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’３’；または５’ａ’ｂ’ｃ’Ｘｎ３’（ここで、Ｘｎは、ｎ個の残基を含む配列であるＸを示し、ａ’ｂ’ｃ’は、標的ハイブリダイズ配列を示す）と図式化することができる。
【００５２】
「試料」または「生物学的試料」とは、対象の標的核酸が存在しうる任意の組成物または混合物を指し、これには、植物物質もしくは動物物質、老廃物、法医学分析のための物質、標的核酸を含有しうる、生存生物もしくは死亡生物に由来する任意の組織、細胞、または抽出物、例えば、末梢血、骨髄、血漿、血清、生検組織、例えば、前立腺、呼吸器組織または滲出物、消化器組織、尿、便、精液、または他の体液などが含まれるがこれらに限定されない。
【００５３】
「分離」または「単離」または「精製」とは、試料など、複合混合物から１または複数の成分を取り出すことを指す。試料成分には、標的核酸および非標的核酸と、塩、酸、塩基、洗浄剤、タンパク質、炭水化物、脂質、および他の有機物質または無機物質など、他の物質とが含まれ得る。分離するステップ、単離するステップ、または精製するステップは、標的核酸の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは約９５％を、他の試料成分から取り出すことが好ましい。分離するステップ、単離するステップ、または精製するステップは、場合によって、非標的試料成分を除去する、さらなる洗浄ステップも包含しうる。
【００５４】
捕捉ハイブリッド体の「リリース」とは、標的捕捉プローブから標的核酸を分離すること、および／または固定化プローブから標的捕捉プローブを分離することなど、捕捉ハイブリッド体の１または複数の構成要素を互いから分離することを指す。標的核酸鎖をリリースすると、標的は、捕捉ハイブリッド体の他の構成要素から分離され、検出プローブまたは増幅オリゴマーとの結合が可能となる。捕捉ハイブリッド体の他の構成要素、例えば、捕捉プローブ鎖は、標的の検出に影響を及ぼすことなく、捕捉支持体上において、固定化プローブとの結合を維持しうる。捕捉ハイブリッド体の１または複数の構成要素のリリースは、１または複数の条件を変化させて構成要素の解離を促進する（例えば、特定のＴｍまで加熱する、塩濃度を変化させる、混合物に変性剤または競合的結合部分を添加する）ことによって達成することもでき、鎖置換法など他の周知の方法を用いることによって達成することもできる。
【００５５】
「本質的に〜からなる」は、本発明の基本的特徴および新規の特徴を物質的に変化させない、さらなる成分（複数可）、組成物（複数可）、または方法ステップ（複数可）を、本発明の組成物、キット、または方法に包含させうることを意味するのに用いる。このような特徴には、オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列が試料中の標的核酸に特異的に結合またはハイブリダイズする能力、捕捉ハイブリッド体が他の試料成分から分離される能力、または検出プローブが該標的核酸にハイブリダイズして、検出シグナルをもたらし、試料中における該標的の存在を示す能力が含まれる。
【００５６】
「〜するように構成された」という用語は、試薬の実際の配置を示す。例えば、オリゴヌクレオチドについて論じるのに用いる場合、〜するように構成されたとは、言及される該オリゴヌクレオチドのポリヌクレオチド配列構成の実際の配置を指す。ヘアピン構造を形成するように構成されたオリゴヌクレオチドとは、該オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が、あるセットの条件下において、ステム部分およびループ部分を形成するように配置されることを意味する。同様に、第１セットの条件下または第２セットの条件下において、２つの異なるオリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズするように構成されている場合、それは、該２つのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が各々、その規定されたセットの条件下において、該標的配列にハイブリダイズするように配置されていることを意味する。あるセットの条件を論じるのに用いる場合、この用語は、化学的特性および／または物理的特性の実際の配置を示す。例えば、ある核酸配列を別の核酸配列にハイブリダイズさせるように構成されたあるセットの条件とは、その下で該ハイブリダイゼーションが生じる実際の温度範囲を意味し得る。
【００５７】
「増幅オリゴマー」とは、その少なくとも３’端が標的核酸と相補的であり（「標的ハイブリダイズ配列」）、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズして核酸増幅反応に関与するオリゴマーである。増幅オリゴマーの例は、標的核酸にハイブリダイズし、増幅過程においてポリメラーゼにより伸長する３’ＯＨ端を含有する「プライマー」である。増幅オリゴマーの別の例は、標的ハイブリダイズ配列と、適切なポリメラーゼにより転写を開始するプロモーター配列とを含む、「プロモーターベースの増幅オリゴマー」である。プロモーターベースの増幅オリゴマーは、標的ハイブリダイズ配列の３’端が、プライマーベースの伸長を防止するように修飾（例えば、３’遮断端）されているかどうかに応じて、プライマーベースの伸長において、ポリメラーゼにより伸長可能な場合もあり、伸長可能でない場合もある。プライマーベースの伸長を防止するように修飾されていない標的ハイブリダイズ配列を含む、プロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチドを、「プロモータープライマー」と称する。プライマーベースの伸長を防止するように修飾されている標的ハイブリダイズ配列を含む、プロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチドを、「プロモータープロバイダー」と称する。増幅オリゴマーの別の例は、３’側の標的ハイブリダイズ配列と、５’側の伸長配列とを含むエクステンダープライマーである。伸長配列は、ステムおよびループを形成するように構成されることが好ましいが、必須ではない。増幅オリゴヌクレオチドのサイズ範囲には、約８〜約７０ｎｔの長さである標的ハイブリダイズ配列を含むサイズ範囲が含まれる。当業者により理解される通り、この範囲のすべての整数（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、・・・、６７、６８、６９、および７０）がその内に包含される。
【００５８】
核酸ポリメラーゼによるプライマーベースの伸長が意図されないオリゴマーは、増幅反応において、酵素を介するオリゴマーの伸長を防止するように、３’ＯＨを置換する遮断基を包含しうる。一部の実施形態では、３’端近傍の遮断基が、該３’端から５残基以内の可能性があり、ポリメラーゼがオリゴマーに結合することを制約するのに十分な程度に大型である。他の実施形態では、遮断基が、３’末端と共有結合する。アルキル基、ヌクレオチド以外のリンカー、アルカンジオールジデオキシヌクレオチド残基、およびコルジセピンなど、多くの異なる化学基を用いて３’端を遮断することができる。
【００５９】
本明細書で用いられる「プロモーター」とは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「トランスクリプターゼ」）により、特定の部位において核酸と結合してＲＮＡの転写を開始するシグナルとして認識される、特定の核酸配列である。
【００６０】
本明細書で用いられる「プロモータープロバイダー」または「プロバイダー」とは、第１領域および第２領域を含み、その３’末端からのＤＮＡ合成の開始を防止するように修飾されているオリゴヌクレオチドを指す。プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドの「第１領域」は、ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズする塩基配列を含み、この場合、このハイブリダイズ配列は、プロモーター領域の３’側に位置するが、必ずしもこれに隣接しない。プロモーターオリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ部分は、少なくとも１０ヌクレオチドの長さであることが典型的であるが、５０ヌクレオチド以上の長さまで伸長しうる。該「第２領域」は、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む。プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドは、好ましくは、上記で記載した通り、その３’末端において遮断部分を含むことにより、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、リバーストランスクリプターゼ）を介する伸長が不可能であるように構成される。この修飾により、プロモータープロバイダーが、プロモータープライマーから区別される。プロモータープライマーまたはプロバイダーのプロモーター部分は、Ｅ．  ｃｏｌｉならびにバクテリオファージＴ７、Ｔ３、およびＳＰ６に由来するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターであることが好ましいが、他のプロモーターまたはこれらの改変形もまた用いることができる。
【００６１】
「優先的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下において、オリゴヌクレオチドが、その標的配列またはそれらの複製配列にハイブリダイズして、安定的なオリゴヌクレオチド：標的配列ハイブリッド体を形成する一方、同時に、安定的なオリゴヌクレオチド：非標的配列ハイブリッド体の形成が最小化されることを意味する。例えば、プローブオリゴヌクレオチドが、非標的配列を十分に上回る程度に、標的配列またはその複製配列に優先的にハイブリダイズすると、増幅中において形成される、該標的配列のＲＮＡ複製配列または相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を正確に検出することが当業者には可能となる。当技術分野では、プローブオリゴヌクレオチド、増幅オリゴヌクレオチド、標的捕捉オリゴヌクレオチド、遮断オリゴヌクレオチド、および他のオリゴヌクレオチドに適切なハイブリダイゼーション条件が周知であり、配列組成に基づいてこれを予測することもでき、日常的な試験法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版（ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社、１９８９年）、１．９０〜１．９１、７．３７〜７．５７、９．４７〜９．５１、および１１．４７〜１１．５７節、特に、９．５０〜９．５１、１１．１２〜１１．１３、１１．４５〜１１．４７、および１１．５５〜１１．５７節）を用いることによりこれを決定することもできる。
【００６２】
図１は、部分的に二本鎖であり、標的ハイブリダイズ配列を包含する一本鎖ループ領域を含有する、ヘアピン構造を形成するように構成された捕捉プローブを用いる方法の実施形態を示す。捕捉プローブは、ヘアピンの二本鎖ステム部分を形成するように構成された、相補的な５’側配列および３’側配列（ポリＴおよびポリＡとして示される）を含む。これらのホモポリマー配列は、ループを形成するように構成された標的ハイブリダイズ配列（ａ’ｂ’ｃ’ｄ’として示される；ここで、ａ、ｂ、ｃ、およびｄは、配列が存在することを示すに過ぎず、単独ではヌクレオチド配置を示さず、「’」の存在または不在は、ａ’ｂ’ｃ’ｄ’が、ａｂｃｄと実質的に相補的な核酸配列であるような極性を示す）の両側に位置する。この実施形態では、あるセットの条件下において（例えば、Ｔｍより高温に加熱して、水素結合を解離させる）、ヘアピン捕捉プローブの５’端および３’端を分離して、直鎖の一本鎖捕捉プローブとする。ここで直鎖となった捕捉プローブを、あるセットの条件下で、標的核酸（配列ｄｃｂａとして示される）にハイブリダイズさせる。標的核酸が二本鎖分子である場合は、まず、標準的な化学的方法または物理的方法を用いて、これを一本鎖分子へと解離することができる。例えば、捕捉プローブを直鎖化し、二本鎖の標的核酸鎖を解離させる、単一の溶融ステップにおいて、標的核酸の二本鎖を溶融させた後で、該捕捉プローブと該標的核酸とのハイブリダイゼーションを実施することができる。捕捉プローブにより標的核酸を捕捉した後で、過剰な捕捉プローブ、例えば、標的核酸にハイブリダイズしなかったプローブは、あるセットの条件下においてヘアピン構造を再形成し、これらの過剰捕捉プローブが、混合物中の他の成分、または固定化プローブに非特異的に結合することを有効に防止する。
【００６３】
この実施形態では、捕捉ハイブリッド体が、捕捉プローブの標的ハイブリダイズ配列にハイブリダイズする標的核酸と、捕捉支持体に結合させた相補的な固定化プローブ（ここではポリＴとして示される）にハイブリダイズする、該捕捉プローブの実質的にヘテロポリマーの配列（ここでは３’ポリＡとして示される）のうちの１つとで構成される。用いられる条件および／またはこれらのオリゴヌクレオチドの構成に応じて、これらのハイブリダイゼーションステップのうちの１または複数を、逐次的または同時的に実施することができる。捕捉ハイブリッド体を形成した後で、各種の公知の方法、例えば、遠心分離、濾過、磁性捕捉支持体の磁性誘引のうちのいずれかを用いて、過剰なヘアピン捕捉プローブ、非標的核酸、および細胞破砕物を含めた他の試料成分から、捕捉支持体を物理的に分離することにより、これらの成分から捕捉ハイブリッド体を単離する。捕捉ハイブリッド体の任意の部分に非特異的に付着する他の試料成分からの標的核酸の単離をさらに促進するため、捕捉ハイブリッド体を、１または複数回にわたり洗浄して、他の試料成分を希釈および除去することができる。適切な水溶液（例えば、１０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中および適切な条件（例えば、構成要素のＴｍより高い温度）下において、捕捉ハイブリッド体を、その個別の構成要素へと解離させ、次いで、該捕捉ハイブリッド体の再形成を可能とするように該条件を再調整することにより、洗浄を達成することができる。ステップの操作を容易にし、これを最小化するため、捕捉ハイブリッド体を維持する条件を用いることにより、洗浄により、溶液中において捕捉支持体に結合した完全な捕捉ハイブリッド体をすすぐことが好ましい。
【００６４】
該方法は、捕捉ハイブリッド体から標的をリリースすることにより、次に進む。例えば、捕捉ハイブリッド体をその個別の構成要素へとリリースして、標的核酸を溶液中へと遊離させることにより、検出の前に増幅ステップを実施するかしないかに応じて、該標的核酸が、検出プローブまたは第１のプライマーオリゴマーとハイブリダイズすることを可能にする。図１では、標的核酸を検出するために、捕捉プローブおよび該標的核酸が、溶液中へとリリースされるものとして示されている。捕捉プローブおよび検出プローブは、同じ標的ハイブリダイズ配列を含み、したがって、標的核酸とのハイブリダイゼーションについて競合しうるものとして示されている。標的核酸とのハイブリダイズについて捕捉プローブが競合することを防止するため、あるセットの条件をもたらし、ヘアピン構造の捕捉プローブを形成させる。次いで、あるセットの条件下において検出プローブを標的にハイブリダイズさせ、標的核酸の存在もしくは不在または量を決定する。捕捉プローブおよび標的核酸を溶液中へとリリースするステップの後に、増幅ステップを介在させることも可能であろう。増幅ステップは、第１の増幅オリゴマーが、標的核酸にハイブリダイズすることを必要とする。この場合、増幅オリゴマーおよび捕捉プローブは、いずれも、低分子の標的核酸とのハイブリダイズについて競合する標的ハイブリダイズ配列を含み、したがって、これらのオリゴヌクレオチドは、実質的に同一の標的ハイブリダイズ配列、または少なくとも、低分子の標的配列上において重複する標的配列にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ配列を含む。標的核酸とのハイブリダイズについて捕捉プローブが競合することを防止するため、あるセットの条件をもたらし、ヘアピン構造の捕捉プローブを形成させる。次いで、あるセットの条件下において増幅オリゴマーを標的核酸にハイブリダイズさせ、該標的核酸を増幅する。第２の増幅オリゴマーは、標的捕捉オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列の全部または一部と相補的な標的ハイブリダイズ配列を含みうる。したがって、標的捕捉オリゴマーは、その意図される標的配列にハイブリダイズして、第２の増幅オリゴマーに干渉しうる。
【００６５】
図２は、２つの鎖上における相補的な配列（一方の鎖上における３’ポリＡ領域と、他方の鎖上における５’ポリＴ領域として示される）と、少なくとも１つの標的ハイブリダイズ配列（ポリＴを含有する鎖上におけるａ’ｂ’ｃ’として示される）とを含有する、完全にまたは部分的に二本鎖の捕捉プローブを用いることにより、標的核酸を捕捉する方法の実施形態を示す。この実施形態では、捕捉プローブのうちの一本鎖だけが、標的核酸（配列ａｂｃｄｅとして示される）にハイブリダイズする。標的配列に結合する捕捉プローブ鎖はまた、固定化プローブ（捕捉支持体上におけるポリＡ鎖として示される）に結合する、特異的な結合パートナーのメンバーも含有する。部分的に二本鎖の捕捉プローブは、通常、捕捉ハイブリッド体を形成する前に解離するが、該捕捉プローブの標的ハイブリダイズ配列に標的が結合することにより引き起こされる鎖置換が、捕捉プローブ鎖を分離させる場合もある。図２は、２つの鎖が、互いと相補的な部分（一方の鎖上におけるポリＡと、他方の鎖上におけるポリＴとして示される）を含有し、一方の鎖が標的ハイブリダイズ配列を含有する一方、他方の鎖が該標的ハイブリダイズ配列と相補的な配列を含有する、完全に二本鎖の実施形態を示す。当業者は、捕捉プローブが、部分的に二本鎖でありうる（例えば、図２に示されるポリＡ−ａｂｃ鎖を、ポリＡ鎖に置き換える）ことを理解する。完全に二本鎖の捕捉プローブと、部分的に二本鎖の捕捉プローブとでは、同じアッセイステップを用いるが、場合によって、一方の捕捉プローブ鎖の標的ハイブリダイズ部分が、標的核酸にハイブリダイズすることを可能とする標準的な方法を用いて、捕捉プローブ鎖を分離することからこれを始める。２つの捕捉プローブ鎖は再ハイブリダイズすると（例えば、ポリＡがポリＴに結合することにより）、該捕捉プローブ鎖の標的ハイブリダイズ配列が、標的核酸に結合することを妨げる可能性があるため、当業者は、該標的核酸とのハイブリダイゼーションを最適化する修飾を加えて該捕捉プローブを合成しうることを理解する。
【００６６】
この実施形態では、捕捉ハイブリッド体が、一方の捕捉プローブ鎖の標的ハイブリダイズ配列にハイブリダイズした標的核酸からなり、同じ捕捉プローブ鎖の別の部分（ポリＴとして示される）が、捕捉支持体に結合させた固定化プローブ（ポリＡとして示される）に結合する。上記で記載した通り、支持体に結合させた捕捉ハイブリッド体を他の試料成分から分離し、場合によってはこれを洗浄して、試料成分と、該捕捉ハイブリッド体に結合しなかった捕捉プローブ鎖とを除去する。標的配列に結合しない捕捉プローブ鎖は、部分的または完全な二本鎖構造を再形成することが可能であり、結合しなかった一本鎖と共に洗い流すことができる。次いで、標的核酸を捕捉ハイブリッド体からリリースするか、または捕捉ハイブリッド体をその構成要素へと分離し、リリースされた標的には、溶液中において、検出プローブ（配列ａ’ｂ’ｃ’ｄ’ｅ’として示される）を結合させて、シグナルを生成する検出ハイブリッド体（星印の構造として示される）を形成させ、これを検出して、試料中における該標的核酸の存在を示す。図２で示す通り、捕捉ハイブリッド体からリリースされた捕捉プローブ鎖は溶液中にとどまるが、検出プローブと同じセンス鎖なのでこれには結合しない。同様に、検出ステップの前に増幅ステップを実施する場合は、増幅オリゴマーが、標的ハイブリダイズ配列であるａ’ｂ’ｃ’ｄ’ｅ’の全部または一部を含み、標的核酸とのハイブリダイズについて捕捉プローブと競合する。当業者は、検出プローブまたは増幅オリゴマーが、その標的核酸との結合に有利となる構造（例えば、配列長の延長、および／または骨格の修飾）を包含して、リリースされた捕捉プローブ鎖との競合を最小化するように構成されることを理解する。ある実施形態では、リリースされた捕捉プローブを、増幅反応においてプライマーメンバーとして用いることができる。一態様では、リリースされた捕捉プローブ配列が、プロモーター配列を含むことが可能であり、これを、プロモーターベースの増幅オリゴマーとして用いることができる。
【００６７】
本明細書で記載される方法を用いる典型的なアッセイは、１または複数の対象の低分子ＲＮＡを含有することが疑われる試料を供給するステップを伴う。このような試料は、アッセイで直接用いることもでき、溶解液により体液を希釈する単純な方法から、当技術分野において周知のより複雑な方法（例えば、Ｓｕら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｄｉａｇｎ．  ２００４年、６巻：１０１〜１０７頁；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、７．３７〜７．５７頁；および米国特許第５，３７４，５２２号、同第５，３８６，０２４号、同第５，７８６，２０８号、同第５，８３７，４５２号、および同第６，５５１，７７８号）まで、各種の方法のうちのいずれかを用いることにより調製することもできる。試料を加熱して、該試料中における酵素を不活化し、該試料中における核酸を一本鎖とすることが典型的である（例えば、２〜１０分間にわたり９０〜１００℃で加熱し、次いで、０〜５℃まで急速に冷却する）。捕捉ハイブリッド体を形成するためには、捕捉プローブ（上記で記載した構成のプローブであることが好ましい）と、捕捉支持体に結合させた固定化プローブとの存在下において、適切なハイブリダイゼーション条件で試料をインキュベートする。効率的な方法では、これらの構成要素を、ハイブリダイゼーション反応混合物中において併せて混合し、第１の条件を用いて、捕捉プローブの標的ハイブリダイズ配列と標的核酸とのハイブリダイゼーションを促進し、その後、第２の条件を用いて、該捕捉プローブ：標的核酸複合体が、固定化プローブに結合することを促進する。例えば、第１の条件では、反応混合物を、捕捉プローブの標的ハイブリダイズ配列および標的核酸のためのＴｍよりは低いが、該捕捉プローブと固定化プローブとを結合させる、配列のハイブリダイゼーションのためのＴｍよりは高い温度でインキュベートし、その後固定化プローブ配列に結合する捕捉プローブのためのＴｍより低い第２の温度でインキュベートし得る（米国特許第６，１１０，６７８号）。核酸のハイブリダイゼーションを必要としない特異的結合対のメンバー（例えば、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン）を用いることにより、捕捉ハイブリッド体を捕捉支持体に結合させる実施形態では、選択した結合対のメンバーに適切な条件を用いる。代替的な手法では、ヘアピン捕捉プローブを開き、捕捉プローブと標的核酸とをハイブリダイズさせ、次いで、ハイブリダイズしなかった捕捉プローブにはヘアピン構造を再形成させるように構成された条件下において、該標的捕捉オリゴマーおよび該標的核酸をインキュベートする。次いで、標的捕捉オリゴマー：標的核酸複合体と、固定化プローブとをハイブリダイズさせるように構成された条件下において、該固定化プローブおよび支持体を反応混合物へと混合し、捕捉ハイブリッド体を得る。捕捉ハイブリッド体を形成させた後では、捕捉支持体に適切な周知の方法、例えば、濾過、遠心分離、重力、磁力などを用いることによる、フィルター、膜、または粒子を介する溶液相からの取り出しを用いることにより、該捕捉支持体に結合させた該捕捉ハイブリッド��を、他の試料成分から物理的に分離する。捕捉ハイブリッド体を結合させた捕捉支持体を、他の試料成分から分離したら、任意選択の洗浄ステップを包含させて、捕捉された標的核酸をさらに精製することができるが、これは、該捕捉ハイブリッド体が、該捕捉支持体に結合した状態を維持しながら実施することが好ましい。次いで、標的核酸または捕捉ハイブリッド体のすべての構成要素を溶液中へとリリースして、標的を検出ステップへと解放する。標的または捕捉ハイブリッド体の構成要素のリリースは、例えば、混合物の温度または化学組成を変化させて、該捕捉ハイブリッド体が、その核酸構成要素のうちの１または複数へと解離することを促進することなど、任意の公知の方法により実施することができる。典型的には、例えば、低イオン強度の水溶液中９０〜１００℃で５分間にわたる単純な加熱ステップを実施して、標的鎖および捕捉プローブ鎖を溶融させ、その後０〜５℃へと急速に冷却する。図１に示す通り、捕捉プローブは、分子間のハイブリダイゼーションによりヘアピン形態へと再形成される。その後の増幅ステップおよび／または検出ステップは、検出プローブ／増幅オリゴマーを、リリースされた標的核酸を含有する可溶相へと直接添加し、この混合物を、検出プローブ／増幅オリゴマーと標的配列とを結合させるように構成されたハイブリダイゼーション条件（例えば、該可溶相に塩を添加して、適切なイオン強度の溶液を作製し、２５〜６０℃でインキュベートする）においてインキュベートすることにより、該可溶相中で実施することができる。検出プローブが標的核酸に結合し、検出ハイブリッド体を形成した後で、該ハイブリッド体からのシグナルを検出し、被験試料中における標的の存在を示す。
【００６８】
本発明は、本明細書で記載される、標的核酸を検出する方法を実施するのに有用な組成物を包含する。本明細書に記載の一部の組成物には、標的核酸にハイブリダイズする、１または複数の標的捕捉オリゴマーが含まれる。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する一部の方法において、組成物は、各々が、それら各々の標的核酸の各々に選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上の標的捕捉オリゴマーを包含する。一部の標的捕捉オリゴマーは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、マイクロＲＮＡの全部または一部と実質的に相補的であり、ＸおよびＹは、互いと相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の標的捕捉オリゴマーは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−２１の全部または一部と実質的に相補的であり、ＸおよびＹは、互いと相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の標的捕捉オリゴマーは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−３４ｂの全部または一部と実質的に相補的であり、ＸおよびＹは、互いと相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の標的捕捉オリゴマーは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−１８２の全部または一部と実質的に相補的であり、ＸおよびＹは、互いと相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の標的捕捉オリゴマーは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−２２１の全部または一部と実質的に相補的であり、ＸおよびＹは、互いと相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の標的捕捉オリゴマーは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−２２２の全部または一部と実質的に相補的であり、ＸおよびＹは、互いと相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の標的捕捉オリゴマーは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−８０２の全部または一部と実質的に相補的であり、ＸおよびＹは、互いと相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列である）のフォーマットで構成されている。
【００６９】
本明細書に記載の一部の組成物は、標的核酸にハイブリダイズする、１または複数の第１の増幅オリゴマーを包含する。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する一部の方法において、組成物は、各々が、それら各々の標的核酸の各々に選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上の第１の増幅オリゴマーを包含する。一部の第１の増幅オリゴマーは、５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、マイクロＲＮＡ配列の全部または一部と実質的に相補的であり、Ｚは、伸長核酸配列である）のフォーマットで構成されている。第１の増幅オリゴマーのａ’ｂ’ｃ’領域は、全マイクロＲＮＡ配列と実質的に相補的でありうる。第１の増幅オリゴマーのａ’ｂ’ｃ’領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大２０の連続ヌクレオチドである。第１の増幅オリゴマーのａ’ｂ’ｃ’領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大２０の連続ヌクレオチドである。第１の増幅オリゴマーのａ’ｂ’ｃ’領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大１５の連続ヌクレオチドである。第１の増幅オリゴマーのａ’ｂ’ｃ’領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大１０の連続ヌクレオチドである。第１の増幅オリゴマーのａ’ｂ’ｃ’領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７の連続ヌクレオチドである。第１の増幅オリゴマーのａ’ｂ’ｃ’領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列の３’端における５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７の連続ヌクレオチドである。第１の増幅プライマーの５’Ｚｎ領域は、ヘアピン構造を形成するように構成することが好ましい。第１の増幅プライマーの５’Ｚｎ領域は、リバースプライマーオリゴマーもしくは検出プローブオリゴマーまたはこれらの両方にハイブリダイズする、標的配列またはその相補体を含有するように構成することができる。一部の第１の増幅オリゴマーは、５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−２１配列の全部または一部と実質的に相補的であり、Ｚは、伸長核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の第１の増幅オリゴマーは、５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−３４ｂ配列の全部または一部と実質的に相補的であり、Ｚは、伸長核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の第１の増幅オリゴマーは、５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−１８２配列の全部または一部と実質的に相補的であり、Ｚは、伸長核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の第１の増幅オリゴマーは、５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−２２１配列の全部または一部と実質的に相補的であり、Ｚは、伸長核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の第１の増幅オリゴマーは、５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−２２２配列の全部または一部と実質的に相補的であり、Ｚは、伸長核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の第１の増幅オリゴマーは、５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−８０２配列の全部または一部と実質的に相補的であり、Ｚは、伸長核酸配列である）のフォーマットで構成されている。
【００７０】
本明細書に記載の一部の組成物は、標的核酸配列の実質的な相補体を含有するｃＤＮＡにハイブリダイズする、少なくとも１つのプロモーターベースのオリゴマーを包含する。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する一部の方法において、組成物は、各々が、それら各々の標的核酸の実質的な相補体を含有するｃＤＮＡに選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーを包含する。一部のプロモーターベースのオリゴマーは、５’プロモーターａｂｃ３’（ここで、ａｂｃは、マイクロＲＮＡ配列の全部または一部と実質的に同一であり、該プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列である）のフォーマットで構成されている。プロモーターベースのオリゴマーのａｂｃ領域は、全マイクロＲＮＡ配列と実質的に同一でありうる。プロモーターベースのオリゴマーのａｂｃ領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に同一な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大２０の連続ヌクレオチドである。プロモーターベースのオリゴマーのａｂｃ領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に同一な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大２０の連続ヌクレオチドである。プロモーターベースのオリゴマーのａｂｃ領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に同一な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大１５の連続ヌクレオチドである。プロモーターベースのオリゴマーのａｂｃ領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に同一な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大１０の連続ヌクレオチドである。プロモーターベースのオリゴマーのａｂｃ領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に同一な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７の連続ヌクレオチドである。プロモーターベースのオリゴマーのａｂｃ領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に同一な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列の５’端における５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７の連続ヌクレオチドである。一部のプロモーターベースのオリゴマーは、５’プロモーターａｂｃ３’（ここで、ａｂｃは、ｍｉＲ−２１配列の全部または一部と実質的に同一である）のフォーマットで構成されている。一部のプロモーターベースのオリゴマーは、５’プロモーターａｂｃ３’（ここで、ａｂｃは、ｍｉＲ−３４ｂ配列の全部または一部と実質的に同一である）のフォーマットで構成されている。一部のプロモーターベースのオリゴマーは、５’プロモーターａｂｃ３’（ここで、ａｂｃは、ｍｉＲ−１８２配列の全部または一部と実質的に同一である）のフォーマットで構成されている。一部のプロモーターベースのオリゴマーは、５’プロモーターａｂｃ３’（ここで、ａｂｃは、ｍｉＲ−２２１配列の全部または一部と実質的に同一である）のフォーマットで構成されている。一部のプロモーターベースのオリゴマーは、５’プロモーターａｂｃ３’（ここで、ａｂｃは、ｍｉＲ−２２２配列の全部または一部と実質的に同一である）のフォーマットで構成されている。一部のプロモーターベースのオリゴマーは、５’プロモーターａｂｃ３’（ここで、ａｂｃは、ｍｉＲ−８０２配列の全部または一部と実質的に同一である）のフォーマットで構成されている。一部のプロモーターベースのオリゴマーは、場合によって、５’側のプロモーター領域と３’側のａｂｃ領域との間にタグ配列を含みうる。ユニバーサル増幅オリゴマーを用いる一部の増幅法では、第１のプロモーターベースのオリゴマーが、５’側のプロモーター領域と３’側のａｂｃ領域との間にタグ配列を含み、第２のプロモーターベースのオリゴマーが、このタグ配列の相補体にハイブリダイズするように構成される。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する一部の方法において、組成物は、各々が、それら各々の標的核酸の実質的な相補体を含有するｃＤＮＡに選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーを包含し、該２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーの各々は、５’側のプロモーター領域と３’側のａｂｃ領域との間にタグ配列を含む。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する一部の方法において、組成物は、各々が、それら各々の標的核酸の実質的な相補体を含有するｃＤＮＡに選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーを包含し、該２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーの各々は、５’側のプロモーター領域と３’側のａｂｃ領域との間にタグ配列を含み、これら２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーの各々の内における該タグ配列の各々は、実質的に同一である。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する一部の方法において、組成物は、各々が、それら各々の標的核酸の実質的な相補体を含有するｃＤＮＡに選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーを包含し、該２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーの各々は、５’側のプロモーター領域と３’側のａｂｃ領域との間にタグ配列を含み、これら２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーの各々の内における該タグ配列の各々は、実質的に同一であり、該組成物は、該タグ配列ともまた実質的に同一な標的ハイブリダイズ配列を含む、さらなるプロモーターベースのオリゴマーをさらに包含する。一部の組成物は、プロモータープライマーである、少なくとも１つのプロモーターベースのオリゴマーを包含する。一部の組成物は、プロモータープロバイダーである少なくとも１つのプロモーターベースのオリゴマーを包含する。
【００７１】
一部の組成物は、標的核酸配列にハイブリダイズする、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを包含する。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する一部の方法において、組成物は、各々が、それら各々の標的核酸の各々に選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上の検出プローブオリゴマーを包含する。標的核酸配列にハイブリダイズする一部の検出プローブオリゴマーは、直鎖プローブである。一部の検出プローブオリゴマーは、標識直鎖プローブである。一部の検出プローブオリゴマーは、二重標識直鎖プローブである。一部の検出プローブオリゴマーは、ヘアピンプローブである。一部の検出プローブオリゴマーは、標識ヘアピンプローブである。一部の検出プローブオリゴマーは、二重標識ヘアピンプローブである。一部の検出プローブオリゴマーは、分子ビーコンである。一部の検出プローブオリゴマーは、分子トーチである。一部の検出プローブオリゴマーは、マイクロＲＮＡの全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含み、該一部は、該マイクロＲＮＡのうち、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７の連続ヌクレオチドである。一部の検出プローブオリゴマーは、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含み、該一部は、該マイクロＲＮＡの３’端における５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７の連続ヌクレオチドである。一部の検出プローブオリゴマーは、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含み、該一部は、該マイクロＲＮＡの５’端における５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７の連続ヌクレオチドである。一部の検出プローブオリゴマーは、ｍｉＲ−２１の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、ｍｉＲ−３４ｂの全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、ｍｉＲ−１８２の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、ｍｉＲ−２２１の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、ｍｉＲ−２２２の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、ｍｉＲ−８０２の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、マイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズするように構成される。一部の検出プローブオリゴマーは、本明細書で記載される増幅オリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズするように構成される。一部の検出プローブオリゴマーは、本明細書で記載される第１の増幅オリゴマー、本明細書で記載されるプロモーターベースのオリゴマー、本明細書で記載されるリバースプライマーオリゴマー、またはこれらの組合せから選択される増幅オリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズするように構成される。一部の検出プローブオリゴマーは、本明細書で記載される５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’のフォーマットである、第１の増幅オリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズするように構成され、該検出プローブオリゴマーは、伸長核酸配列の一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、本明細書で記載される５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’のフォーマットである、第１の増幅オリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズするように構成され、該検出プローブオリゴマーは、該マイクロＲＮＡ鋳型の全部または一部と実質的に同一な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、本明細書で記載される５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’のフォーマットである、第１の増幅オリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズするように構成され、該検出プローブオリゴマーは、伸長核酸配列の一部と実質的に相補的であり、それ自体が該マイクロＲＮＡ鋳型と相補的な増幅産物配列の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、本明細書で記載されるプロモーターベースのオリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズするように構成され、該検出プローブオリゴマーは、該プロモーターベースのオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列の全部または一部と実質的に同一な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、本明細書で記載される、タグ配列を含有するプロモーターベースのオリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズするように構成され、該検出プローブオリゴマーは、該プロモーターベースのオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列の全部もしくは一部、該タグ配列の全部もしくは一部、またはこれらの組合せと実質的に同一な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、本明細書で記載されるプロモーターベースのオリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズするように構成され、該検出プローブオリゴマーは、ＲＮＡ転写物の増幅産物と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。
【００７２】
本発明はまた、本明細書で記載される標的核酸を検出する方法を実施するための構成要素を含有するキットも包含する。一部のキットは、標的核酸にハイブリダイズする、少なくとも１つの標的捕捉オリゴマーを含有する。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する一部のキットは、各々が、それら各々の標的核酸の各々に選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上の標的捕捉オリゴマーを含有する。一部のキットは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、マイクロＲＮＡの全部または一部と実質的に相補的であり、ＸおよびＹは、互いと相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列である）のフォーマットである、少なくとも１つの標的捕捉オリゴマーを含有する。一部のキットは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−２１の全部または一部と実質的に相補的であり、ＸおよびＹは、互いと相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列である）のフォーマットである、少なくとも１つの標的捕捉オリゴマーを含有する。一部のキットは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−３４ｂの全部または一部と実質的に相補的であり、ＸおよびＹは、互いと相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列である）のフォーマットである、少なくとも１つの標的捕捉オリゴマーを含有する。一部のキットは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−１８２の全部または一部と実質的に相補的であり、ＸおよびＹは、互いと相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列である）のフォーマットである、少なくとも１つの標的捕捉オリゴマーを含有する。一部のキットは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−２２１の全部または一部と実質的に相補的であり、ＸおよびＹは、互いと相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列である）のフォーマットである、少なくとも１つの標的捕捉オリゴマーを含有する。一部のキットは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−２２２の全部または一部と実質的に相補的であり、ＸおよびＹは、互いと相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列である）のフォーマットである、少なくとも１つの標的捕捉オリゴマーを含有する。一部のキットは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−８０２の全部または一部と実質的に相補的であり、ＸおよびＹは、互いと相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列である）のフォーマットである、少なくとも１つの標的捕捉オリゴマーを含有する。
【００７３】
一部のキットは、標的核酸にハイブリダイズする、少なくとも１つの第１の増幅オリゴマーを含有する。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する一部のキットは、各々が、それら各々の標的核酸の各々に選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上の第１の増幅オリゴマーを包含する。一部のキットは、５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、マイクロＲＮＡ配列の全部または一部と実質的に相補的であり、Ｚは、伸長核酸配列である）のフォーマットである、少なくとも１つの第１の増幅オリゴマーを含有する。第１の増幅オリゴマーのａ’ｂ’ｃ’領域は、全マイクロＲＮＡ配列と実質的に相補的であることが好ましい。第１の増幅オリゴマーのａ’ｂ’ｃ’領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的であり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大２０の連続ヌクレオチドであることが好ましい。第１の増幅オリゴマーのａ’ｂ’ｃ’領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的であり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大２０の連続ヌクレオチドであることが好ましい。第１の増幅オリゴマーのａ’ｂ’ｃ’領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的であり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大１５の連続ヌクレオチドであることが好ましい。第１の増幅オリゴマーのａ’ｂ’ｃ’領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的であり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大１０の連続ヌクレオチドであることが好ましい。第１の増幅オリゴマーのａ’ｂ’ｃ’領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的であり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７の連続ヌクレオチドであることが好ましい。第１の増幅オリゴマーのａ’ｂ’ｃ’領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的であり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列の３’端における５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７の連続ヌクレオチドであることが好ましい。第１の増幅プライマーの５’Ｚｎ領域は、ヘアピン構造を形成するように構成することが好ましい。第１の増幅プライマーの５’Ｚｎ領域は、リバースプライマーオリゴマーもしくは検出プローブオリゴマーまたはこれらの両方にハイブリダイズする、標的配列またはその相補体を含有するように構成することが好ましい。一部のキットは、５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−２１配列の全部または一部と実質的に相補的であり、Ｚは、伸長核酸配列である）のフォーマットである、少なくとも１つの第１の増幅オリゴマーを含有する。一部のキットは、５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−３４ｂ配列の全部または一部と実質的に相補的であり、Ｚは、伸長核酸配列である）のフォーマットである、少なくとも１つの第１の増幅オリゴマーを含有する。一部のキットは、５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−１８２配列の全部または一部と実質的に相補的であり、Ｚは、伸長核酸配列である）のフォーマットである、少なくとも１つの第１の増幅オリゴマーを含有する。一部のキットは、５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−２２１配列の全部または一部と実質的に相補的であり、Ｚは、伸長核酸配列である）のフォーマットである、少なくとも１つの第１の増幅オリゴマーを含有する。一部のキットは、５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−２２２配列の全部または一部と実質的に相補的であり、Ｚは、伸長核酸配列である）のフォーマットである、少なくとも１つの第１の増幅オリゴマーを含有する。一部のキットは、５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−８０２配列の全部または一部と実質的に相補的であり、Ｚは、伸長核酸配列である）のフォーマットである、少なくとも１つの第１の増幅オリゴマーを含有する。
【００７４】
一部のキットは、標的核酸配列の実質的な相補体を含有するｃＤＮＡにハイブリダイズする、少なくとも１つのプロモーターベースのオリゴマーを含有する。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する一部のキットは、各々が、それら各々の標的核酸の実質的な相補体を含有するｃＤＮＡに選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーを含有する。一部のキットは、５’プロモーターａｂｃ３’（ここで、ａｂｃは、マイクロＲＮＡ配列の全部または一部と実質的に同一であり、該プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列である）のフォーマットである、少なくとも１つのプロモーターベースのオリゴマーを含有する。プロモーターベースのオリゴマーのａｂｃ領域は、全マイクロＲＮＡ配列と実質的に同一であることが好ましい。プロモーターベースのオリゴマーのａｂｃ領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に同一であり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大２０の連続ヌクレオチドであることが好ましい。プロモーターベースのオリゴマーのａｂｃ領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に同一であり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大２０の連続ヌクレオチドであることが好ましい。プロモーターベースのオリゴマーのａｂｃ領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に同一であり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大１５の連続ヌクレオチドであることが好ましい。プロモーターベースのオリゴマーのａｂｃ領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に同一であり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大１０の連続ヌクレオチドであることが好ましい。プロモーターベースのオリゴマーのａｂｃ領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に同一であり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７の連続ヌクレオチドであることが好ましい。プロモーターベースのオリゴマーのａｂｃ領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に同一であり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列の５’端における５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７の連続ヌクレオチドであることが好ましい。一部のキットは、５’プロモーターａｂｃ３’（ここで、ａｂｃは、ｍｉＲ−２１配列の全部または一部と実質的に同一である）のフォーマットである、少なくとも１つのプロモーターベースのオリゴマーを含有する。一部のキットは、５’プロモーターａｂｃ３’（ここで、ａｂｃは、ｍｉＲ−３４ｂ配列の全部または一部と実質的に同一である）のフォーマットである、少なくとも１つのプロモーターベースのオリゴマーを含有する。一部のキットは、５’プロモーターａｂｃ３’（ここで、ａｂｃは、ｍｉＲ−１８２配列の全部または一部と実質的に同一である）のフォーマットである、少なくとも１つのプロモーターベースのオリゴマーを含有する。一部のキットは、５’プロモーターａｂｃ３’（ここで、ａｂｃは、ｍｉＲ−２２１配列の全部または一部と実質的に同一である）のフォーマットである、少なくとも１つのプロモーターベースのオリゴマーを含有する。一部のキットは、５’プロモーターａｂｃ３’（ここで、ａｂｃは、ｍｉＲ−２２２配列の全部または一部と実質的に同一である）のフォーマットである、少なくとも１つのプロモーターベースのオリゴマーを含有する。一部のキットは、５’プロモーターａｂｃ３’（ここで、ａｂｃは、ｍｉＲ−８０２配列の全部または一部と実質的に同一である）のフォーマットである、少なくとも１つのプロモーターベースのオリゴマーを含有する。一部のキットは、場合によって、５’側のプロモーター領域と３’側のａｂｃ領域との間にタグ配列を含有しうる。一部のキットは、場合によって、５’側のプロモーター領域と３’側のａｂｃ領域との間のタグ配列、ならびにこのタグ配列の相補体にハイブリダイズするように構成された第２のプロモーターベースのオリゴマーを含有しうる。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する一部のキットは、各々が、それら各々の標的核酸の実質的な相補体を含有するｃＤＮＡに選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーを含有し、該２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーの各々は、５’側のプロモーター領域と３’側のａｂｃ領域との間にタグ配列を含有する。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する一部のキットは、各々が、それら各々の標的核酸の実質的な相補体を含有するｃＤＮＡに選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーを含有し、該２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーの各々は、５’側のプロモーター領域と３’側のａｂｃ領域との間にタグ配列を含有し、これら２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーの各々の内における該タグ配列の各々は、実質的に同一である。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する一部のキットは、各々が、それら各々の標的核酸の実質的な相補体を含有するｃＤＮＡに選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーを含有し、該２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーの各々は、５’側のプロモーター領域と３’側のａｂｃ領域との間にタグ配列を含有し、これら２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーの各々の内における該タグ配列の各々は、実質的に同一であり、該キットは、該タグ配列ともまた実質的に同一な標的ハイブリダイズ配列を含む、さらなるプロモーターベースのオリゴマーをさらに含有する。一部のキットは、プロモータープライマーである、少なくとも１つのプロモーターベースのオリゴマーを含有する。一部のキットは、プロモータープロバイダーである少なくとも１つのプロモーターベースのオリゴマーを含有する。
【００７５】
一部のキットは、標的核酸配列にハイブリダイズする、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有する。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する一部のキットは、各々が、それら各々の標的核酸の各々に選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上の検出プローブオリゴマーを含有する。一部のキットは、標的核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有し、該検出プローブオリゴマーは、直鎖プローブである。一部のキットは、標的核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有し、該検出プローブオリゴマーは、標識直鎖プローブである。一部のキットは、標的核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有し、該検出プローブオリゴマーは、二重標識直鎖プローブである。一部のキットは、標的核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有し、該検出プローブオリゴマーは、ヘアピンプローブである。一部のキットは、標的核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有し、該検出プローブオリゴマーは、標識ヘアピンプローブである。一部のキットは、標的核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有し、該検出プローブオリゴマーは、二重標識ヘアピンプローブである。一部のキットは、標的核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有し、該検出プローブオリゴマーは、分子ビーコンである。一部のキットは、標的核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有し、該検出プローブオリゴマーは、分子トーチである。一部のキットは、マイクロＲＮＡの全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有する。一部のキットは、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有し、該一部は、該マイクロＲＮＡのうち、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７の連続ヌクレオチドである。一部のキットは、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有し、該一部は、該マイクロＲＮＡの３’端における５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７の連続ヌクレオチドである。一部のキットは、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有し、該一部は、該マイクロＲＮＡの５’端における５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７の連続ヌクレオチドである。一部のキットは、ｍｉＲ−２１の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有する。一部のキットは、ｍｉＲ−３４ｂの全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有する。一部のキットは、ｍｉＲ−１８２の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有する。一部のキットは、ｍｉＲ−２２１の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有する。一部のキットは、ｍｉＲ−２２２の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有する。一部のキットは、ｍｉＲ−８０２の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有する。一部のキットは、マイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズする、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有する。一部のキットは、本明細書で記載される増幅オリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズする、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有する。一部のキットは、本明細書で記載される第１の増幅オリゴマー、本明細書で記載されるプロモーターベースのオリゴマー、本明細書で記載されるリバースプライマーオリゴマー、またはこれらの組合せから選択される増幅オリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズする、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有する。一部のキットは、本明細書で記載される５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’のフォーマットである、第１の増幅オリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズする、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有し、該検出プローブオリゴマーは、伸長核酸配列の一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む。一部のキットは、本明細書で記載される５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’のフォーマットである、第１の増幅オリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズする、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有し、該検出プローブオリゴマーは、該マイクロＲＮＡ鋳型の全部または一部と実質的に同一な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部のキットは、本明細書で記載される５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’のフォーマットである、第１の増幅オリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズする、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有し、該検出プローブオリゴマーは、伸長核酸配列の一部と実質的に相補的であり、それ自体が該マイクロＲＮＡ鋳型と相補的な増幅産物配列の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部のキットは、本明細書で記載されるプロモーターベースのオリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズする、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有し、該検出プローブオリゴマーは、該プロモーターベースのオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列の全部または一部と実質的に同一な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部のキットは、本明細書で記載される、タグ配列を含有するプロモーターベースのオリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズする、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有し、該検出プローブオリゴマーは、該プロモーターベースのオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列の全部もしくは一部、該タグ配列の全部もしくは一部、またはこれらの組合せと実質的に同一な標的ハイブリダイズ配列を含む。一部のキットは、本明細書で記載されるプロモーターベースのオリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズする、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含有し、該検出プローブオリゴマーは、ＲＮＡ転写物の増幅産物と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。
【００７６】
一部のキットは、酵素、基質、混合物のｐＨを調整する酸または塩基、塩、緩衝剤、キレート剤、変性剤、試料調製剤、試料保存媒体または試料輸送媒体、細胞溶解剤、全ＲＮＡ単離成分および全ＲＮＡ単離試薬、部分一般化ＲＮＡ単離成分および部分一般化ＲＮＡ単離試薬、固体支持体、ならびに他の無機化合物または有機化合物など、本明細書に記載の方法を実施するのに用いられる化合物を含有する。キットは、本明細書で言及される成分と、本明細書では言及されない他の成分との任意の組合せを包含しうる。キットの成分は、混合物として、または個別の容器内において、互いと組み合わせて包装することができる。本発明が、多くの異なるキット構成を包含することは、当業者に明らかである。
【００７７】
本発明は、本明細書で記載される低分子ＲＮＡ標的核酸の存在または量を検出する方法を包含する。該方法は、試料からの、高感度で高度に選択的な、低分子ＲＮＡ標的核酸の検出を提供する。該方法は、状態を診断するか、状態についての予後診断を行うか、状態に対する療法をモニタリングするか、または状態に対する処置を決定するための、高感度で高度に選択的なバイオマーカーの検出を提供する。該方法は、状態を診断するか、状態についての予後診断を行うか、状態に対する療法をモニタリングするか、または状態に対する処置を決定するための、高感度で高度に選択的な、マイクロＲＮＡ標的核酸の検出を提供する。該方法は、状態を診断するか、状態についての予後診断を行うか、状態に対する療法をモニタリングするか、または状態に対する処置を決定するための、高感度で高度に選択的な、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−８０２、またはこれらの組合せの検出を提供する。該方法は、がんを診断するか、がんについての予後診断を行うか、がん療法をモニタリングするか、またはがん処置を決定するための、高感度で高度に選択的な、がんを示すことが疑われる試料中におけるバイオマーカーの検出を提供する。該方法は、前立腺がんを同定するか、前立腺がんを診断するか、前立腺がんについての予後診断を行うか、前立腺がん療法をモニタリングするか、または前立腺がん処置を決定するのに有用な、高感度で高度に選択的な、試料中におけるバイオマーカーの検出を提供する。該方法は、正常組織および／または無痛性腫瘍を、侵襲性疾患または転移性疾患と識別するための、高感度で高度に選択的な、試料中に存在するバイオマーカーの検出を提供する。該方法は、正常前立腺組織および／または無痛性前立腺がん腫瘍を、侵襲性前立腺がんまたは転移性前立腺がんと識別するための、高感度で高度に選択的な、試料中に存在するバイオマーカーの検出を提供する。該方法は、正常前立腺組織および／または無痛性前立腺がん腫瘍を、侵襲性前立腺がんまたは転移性前立腺がんと識別するための、高感度で高度に選択的な、試料中に存在するｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、またはこれらの組合せの検出を提供する。該方法は、状態を診断するか、状態についての予後診断を行うか、状態に対する療法をモニタリングするか、または状態に対する処置を決定するのに有用な試料種類を同定するための、高感度で高度に選択的な、複数の異なる試料種類からのバイオマーカーの検出を提供する。該方法は、状態を診断するか、状態についての予後診断を行うか、状態に対する療法をモニタリングするか、または状態に対する処置を決定するのに有用な試料種類を同定するための、高感度で高度に選択的な、複数の異なる試料種類からのマイクロＲＮＡ標的核酸の検出を提供する。該方法は、状態を診断するか、状態についての予後診断を行うか、状態に対する療法をモニタリングするか、または状態に対する処置を決定するのに有用な試料種類を同定するための、高感度で高度に選択的な、複数の異なる試料種類からのｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−８０２、またはこれらの組合せの検出を提供する。該方法は、ある試料種類中における１または複数のバイオマーカーの存在および／または量を同定し、これにより、状態を診断するか、状態についての予後診断を行うか、状態に対する療法をモニタリングするか、または状態に対する処置を決定するのに用いうる該試料種類のプロファイルを作製するための、高感度で高度に選択的な、複数の異なる試料種類からのバイオマーカーの検出を提供する。本明細書に記載の方法は、単一反応でありうる。本明細書に記載の方法は、多重反応でありうる。複数の単一反応を、並行して実施することができる。本明細書に記載の方法は、反応の品質および／または定量化についての内部対照を包含しうる。本明細書に記載の方法は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、またはｍｉＲ−８０２のうちの１つを検出する単一反応の場合があり、場合によって、内部対照を包含しうる。本明細書に記載の方法は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−８０２のうちの１または複数を検出する単一反応の場合があり、場合によって、内部対照を包含しうる。
【００７８】
本明細書に記載の一部の方法は、標的核酸にハイブリダイズする、１または複数の標的捕捉オリゴマーを包含する。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する一部の方法では、各々が、それらの各標的核酸の各々に選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上の標的捕捉オリゴマーを用いうる。一部の標的捕捉オリゴマーは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、マイクロＲＮＡの全部または一部と実質的に相補的であり、ＸおよびＹは、互いと相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の標的捕捉オリゴマーは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−２１の全部または一部と実質的に相補的であり、ＸおよびＹは、互いと相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の標的捕捉オリゴマーは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−３４ｂの全部または一部と実質的に相補的であり、ＸおよびＹは、互いと相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の標的捕捉オリゴマーは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−１８２の全部または一部と実質的に相補的であり、ＸおよびＹは、互いと相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の標的捕捉オリゴマーは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−２２１の全部または一部と実質的に相補的であり、ＸおよびＹは、互いと相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の標的捕捉オリゴマーは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−２２２の全部または一部と実質的に相補的であり、ＸおよびＹは、互いと相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の標的捕捉オリゴマーは、５’Ｘｎａ’ｂ’ｃ’Ｙｎ３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−８０２の全部または一部と実質的に相補的であり、ＸおよびＹは、互いと相補的な、実質的にホモポリマーの核酸配列である）のフォーマットで構成されている。本明細書に記載の一部の方法は、本明細書で記載されるヘアピン標的捕捉プローブを用いて、細胞破砕物、全ＲＮＡ、または一般ＲＮＡのサイズ画分化集団から、標的核酸を単離する、標的核酸の捕捉を包含する。単離された標的核酸は、場合によって、洗浄ステップに供する。単離された標的核酸は、標的捕捉プローブからリリースし、少なくとも１つの増幅オリゴマーを用いて、増幅反応を実施し、標的捕捉オリゴマーと、増幅オリゴマーとは、該標的核酸の標的配列との結合について競合する、標的ハイブリダイズ配列を含む。反応混合物に、あるセットの条件を適用して、標的捕捉オリゴマーを、ヘアピン構成へと形成させ、次いで、増幅反応を実施する。本明細書に記載の一部の方法は、少なくとも１つの標的核酸と、少なくとも１つの増幅オリゴマーと、ヘアピン構成の少なくとも１つの標的捕捉プローブとを含む増幅反応混合物を作製するステップを包含する。
【００７９】
本明細書に記載の一部の方法は、標的核酸にハイブリダイズする、１または複数の第１の増幅オリゴマーを包含する。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する一部の方法では、各々が、それらの各標的核酸の各々に選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上の第１の増幅オリゴマーを用いうる。一部の第１の増幅オリゴマーは、５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、マイクロＲＮＡ配列の全部または一部と実質的に相補的であり、Ｚは、伸長核酸配列である）のフォーマットで構成されている。第１の増幅オリゴマーのａ’ｂ’ｃ’領域は、全マイクロＲＮＡ配列と実質的に相補的でありうる。第１の増幅オリゴマーのａ’ｂ’ｃ’領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大２０の連続ヌクレオチドである。第１の増幅オリゴマーのａ’ｂ’ｃ’領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大２０の連続ヌクレオチドである。第１の増幅オリゴマーのａ’ｂ’ｃ’領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大１５の連続ヌクレオチドである。第１の増幅オリゴマーのａ’ｂ’ｃ’領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大１０の連続ヌクレオチドである。第１の増幅オリゴマーのａ’ｂ’ｃ’領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７の連続ヌクレオチドである。第１の増幅オリゴマーのａ’ｂ’ｃ’領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列の３’端における５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７の連続ヌクレオチドである。第１の増幅プライマーの５’Ｚｎ領域は、ヘアピン構造を形成するように構成することが好ましい。第１の増幅プライマーの５’Ｚｎ領域は、リバースプライマーオリゴマーもしくは検出プローブオリゴマーまたはこれらの両方にハイブリダイズする、標的配列またはその相補体を含有するように構成することができる。一部の第１の増幅オリゴマーは、５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−２１配列の全部または一部と実質的に相補的であり、Ｚは、伸長核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の第１の増幅オリゴマーは、５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−３４ｂ配列の全部または一部と実質的に相補的であり、Ｚは、伸長核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の第１の増幅オリゴマーは、５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−１８２配列の全部または一部と実質的に相補的であり、Ｚは、伸長核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の第１の増幅オリゴマーは、５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−２２１配列の全部または一部と実質的に相補的であり、Ｚは、伸長核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の第１の増幅オリゴマーは、５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−２２２配列の全部または一部と実質的に相補的であり、Ｚは、伸長核酸配列である）のフォーマットで構成されている。一部の第１の増幅オリゴマーは、５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’（ここで、ａ’ｂ’ｃ’は、ｍｉＲ−８０２配列の全部または一部と実質的に相補的であり、Ｚは、伸長核酸配列である）のフォーマットで構成されている。本明細書に記載の一部の方法は、低分子ＲＮＡ、好ましくはマイクロＲＮＡ、より好ましくは、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、またはｍｉＲ−８０２のうちの１つである標的核酸からｃＤＮＡ鎖を生成させるステップを包含する。本明細書に記載の一部の方法は、低分子ＲＮＡ、好ましくはマイクロＲＮＡ、より好ましくは、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、またはｍｉＲ−８０２のうちの１つである標的核酸からｃＤＮＡ鎖を生成させるステップを包含し、該ｃＤＮＡ鎖は、本明細書で記載されるエクステンダープライマーに由来する伸長核酸配列の相補体を含む。一部の方法は、少なくとも１つの第１の増幅オリゴマーと、少なくとも１つのプロモーターベースのオリゴマーとを含む反応混合物を作製するステップを包含し、該第１の増幅オリゴマーと、該プロモーターベースのオリゴマーとは、各々が、低分子ＲＮＡ標的核酸およびその相補体、好ましくはマイクロＲＮＡ標的核酸、より好ましくは、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、またはｍｉＲ−８０２のうちの１つにおける重複配列を標的とする、標的ハイブリダイズ配列を含む。一部の方法は、少なくとも１つの第１の増幅オリゴマーと、少なくとも１つのプロモーターベースのオリゴマーとを含む反応混合物を作製するステップを包含し、該第１の増幅オリゴマーと、該プロモーターベースのオリゴマーとは、各々が、低分子ＲＮＡ標的核酸およびその相補体、好ましくはマイクロＲＮＡ標的核酸、より好ましくは、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、またはｍｉＲ−８０２のうちの１つにおける非重複配列を標的とする、標的ハイブリダイズ配列を含む。一部の方法は、標的捕捉オリゴマーと、第１の増幅オリゴマーと、プロモーターベースのオリゴマーと、標的核酸とを含む反応混合物中において、増幅反応を実施するステップを包含し、該第１の増幅オリゴマーと、該標的捕捉オリゴマーとは、該標的核酸の標的配列との結合について競合する標的ハイブリダイズ配列を含み、該標的捕捉オリゴマーと、該プロモーターベースのオリゴマーとは、互いと少なくとも部分的には実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む。一部の方法は、標的捕捉オリゴマーと、第１の増幅オリゴマーと、プロモーターベースのオリゴマーと、標的核酸とを含む反応混合物中において、増幅反応を実施するステップを包含し、該第１の増幅オリゴマーと、該標的捕捉オリゴマーとは、該標的核酸の標的配列との結合について競合する標的ハイブリダイズ配列を含み、該標的捕捉オリゴマーと、該プロモーターベースのオリゴマーとは、互いと少なくとも部分的には実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含み、該標的核酸はヘアピン形態である。
【００８０】
本明細書に記載の一部の方法は、標的核酸配列の実質的な相補体を含有するｃＤＮＡにハイブリダイズする、少なくとも１つのプロモーターベースのオリゴマーを包含する。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する一部の方法では、各々が、それら各々の標的核酸の実質的な相補体を含有するｃＤＮＡに選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーを用いうる。一部のプロモーターベースのオリゴマーは、５’プロモーターａｂｃ３’（ここで、ａｂｃは、マイクロＲＮＡ配列の全部または一部と実質的に同一であり、該プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列である）のフォーマットで構成されている。プロモーターベースのオリゴマーのａｂｃ領域は、全マイクロＲＮＡ配列と実質的に同一でありうる。プロモーターベースのオリゴマーのａｂｃ領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に同一な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大２０の連続ヌクレオチドである。プロモーターベースのオリゴマーのａｂｃ領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に同一な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大２０の連続ヌクレオチドである。プロモーターベースのオリゴマーのａｂｃ領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に同一な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大１５の連続ヌクレオチドである。プロモーターベースのオリゴマーのａｂｃ領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に同一な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、最大１０の連続ヌクレオチドである。プロモーターベースのオリゴマーのａｂｃ領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に同一な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列のうち、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７の連続ヌクレオチドである。プロモーターベースのオリゴマーのａｂｃ領域は、マイクロＲＮＡの一部と実質的に同一な場合があり、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列の５’端における５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７の連続ヌクレオチドである。一部のプロモーターベースのオリゴマーは、５’プロモーターａｂｃ３’（ここで、ａｂｃは、ｍｉＲ−２１配列の全部または一部と実質的に同一である）のフォーマットで構成されている。一部のプロモーターベースのオリゴマーは、５’プロモーターａｂｃ３’（ここで、ａｂｃは、ｍｉＲ−３４ｂ配列の全部または一部と実質的に同一である）のフォーマットで構成されている。一部のプロモーターベースのオリゴマーは、５’プロモーターａｂｃ３’（ここで、ａｂｃは、ｍｉＲ−１８２配列の全部または一部と実質的に同一である）のフォーマットで構成されている。一部のプロモーターベースのオリゴマーは、５’プロモーターａｂｃ３’（ここで、ａｂｃは、ｍｉＲ−２２１配列の全部または一部と実質的に同一である）のフォーマットで構成されている。一部のプロモーターベースのオリゴマーは、５’プロモーターａｂｃ３’（ここで、ａｂｃは、ｍｉＲ−２２２配列の全部または一部と実質的に同一である）のフォーマットで構成されている。一部のプロモーターベースのオリゴマーは、５’プロモーターａｂｃ３’（ここで、ａｂｃは、ｍｉＲ−８０２配列の全部または一部と実質的に同一である）のフォーマットで構成されている。一部のプロモーターベースのオリゴマーは、場合によって、５’側のプロモーター領域と３’側のａｂｃ領域との間にタグ配列を含みうる。ユニバーサル増幅オリゴマーを用いる一部の増幅法では、第１のプロモーターベースのオリゴマーが、５’側のプロモーター領域と３’側のａｂｃ領域との間にタグ配列を含み、第２のプロモーターベースのオリゴマーが、このタグ配列の相補体にハイブリダイズするように構成される。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する一部の方法において、組成物は、各々が、それら各々の標的核酸の実質的な相補体を含有するｃＤＮＡに選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーを包含し、該２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーの各々は、それらの５’側のプロモーター領域と、それらの３’側のａｂｃ領域との間にタグ配列を含む。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する一部の方法において、組成物は、各々が、それら各々の標的核酸の実質的な相補体を含有するｃＤＮＡに選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーを包含し、該２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーの各々は、それらの５’側のプロモーター領域と、それらの３’側のａｂｃ領域との間にタグ配列を含み、これら２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーの各々の内における該タグ配列の各々は、実質的に同一である。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する一部の方法において、組成物は、各々が、それら各々の標的核酸の実質的な相補体を含有するｃＤＮＡに選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーを包含し、該２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーの各々は、それらの５’側のプロモーター領域と、それらの３’側のａｂｃ領域との間にタグ配列を含み、これら２つ以上のプロモーターベースのオリゴマーの各々の内における該タグ配列の各々は、実質的に同一であり、該組成物は、該タグ配列ともまた実質的に同一な標的ハイブリダイズ配列を含む、さらなるプロモーターベースのオリゴマーをさらに包含する。一部の組成物は、プロモータープライマーである、少なくとも１つのプロモーターベースのオリゴマーを包含する。一部の組成物は、プロモータープロバイダーである少なくとも１つのプロモーターベースのオリゴマーを包含する。本明細書に記載の一部の方法は、プロモーターベースのオリゴマーを、標的核酸の全部または一部と実質的に相補的な核酸配列にハイブリダイズさせるステップと、ＲＮＡ増幅産物を生成させるための条件をもたらすステップとを包含する。本明細書に記載の一部の方法は、標的核酸と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む標的捕捉オリゴマーの存在下において、プロモーターベースのオリゴマーを、標的核酸の全部または一部と実質的に相補的な核酸配列にハイブリダイズさせるステップと、該プロモーターベースの増幅産物から、ＲＮＡ増幅産物を生成させるための条件をもたらすステップとを包含する。本明細書に記載の一部の方法は、標的核酸と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む、ヘアピン形態である標的捕捉オリゴマーの存在下において、プロモーターベースのオリゴマーを、標的核酸の全部または一部と実質的に相補的な核酸配列にハイブリダイズさせるステップと、該プロモーターベースの増幅産物から、ＲＮＡ増幅産物を生成させるための条件をもたらすステップとを包含する。本明細書に記載の一部の方法は、プロモーターベースのオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列の少なくとも一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む標的捕捉オリゴマーの存在下において、プロモーターベースのオリゴマーを、標的核酸の全部または一部と実質的に相補的な核酸配列にハイブリダイズさせるステップと、該プロモーターベースの増幅産物から、ＲＮＡ増幅産物を生成させるための条件をもたらすステップとを包含する。本明細書に記載の一部の方法は、プロモーターベースのオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列の少なくとも一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む、ヘアピン形態である標的捕捉オリゴマーの存在下において、プロモーターベースのオリゴマーを、標的核酸の全部または一部と実質的に相補的な核酸配列にハイブリダイズさせるステップと、該プロモーターベースの増幅産物から、ＲＮＡ増幅産物を生成させるための条件をもたらすステップとを包含する。本明細書に記載の一部の方法は、プロモーターベースのオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列の少なくとも一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む標的捕捉オリゴマーの存在下において、プロモーターベースのオリゴマーを、ｍｉＲ−２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸の全部または一部と実質的に相補的な核酸配列にハイブリダイズさせるステップと、該プロモーターベースの増幅産物から、ＲＮＡ増幅産物を生成させるための条件をもたらすステップとを包含する。本明細書に記載の一部の方法は、プロモーターベースのオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列の少なくとも一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む、ヘアピン形態である標的捕捉オリゴマーの存在下において、プロモーターベースのオリゴマーを、ｍｉＲ−２１標的核酸、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸、ｍｉＲ−１８２標的核酸、ｍｉＲ−２２１標的核酸、ｍｉＲ−２２２標的核酸、またはｍｉＲ−８０２標的核酸の全部または一部と実質的に相補的な核酸配列にハイブリダイズさせるステップと、該プロモーターベースの増幅産物から、ＲＮＡ増幅産物を生成させるための条件をもたらすステップとを包含する。本明細書に記載の一部の方法は、少なくとも１つのプロモーターベースのオリゴマーと、少なくとも１つの標的捕捉オリゴマーとを含む増幅反応混合物を作製するステップを包含し、該プロモーターベースのオリゴマーは、ｍｉＲ−２１標的核酸配列、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸配列、ｍｉＲ−１８２標的核酸配列、ｍｉＲ−２２１標的核酸配列、ｍｉＲ−２２２標的核酸配列、またはｍｉＲ−８０２標的核酸配列の全部または一部と実質的に同一な標的ハイブリダイズ配列を含み、該標的捕捉オリゴマーは、ｍｉＲ−２１標的核酸配列、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸配列、ｍｉＲ−１８２標的核酸配列、ｍｉＲ−２２１標的核酸配列、ｍｉＲ−２２２標的核酸配列、またはｍｉＲ−８０２標的核酸配列の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。本明細書に記載の一部の方法は、少なくとも１つのプロモーターベースのオリゴマーと、少なくとも１つの標的捕捉オリゴマーと、少なくとも１つの第１の増幅オリゴマーとを含む増幅反応混合物を作製するステップを包含し、該プロモーターベースのオリゴマーは、ｍｉＲ−２１標的核酸配列、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸配列、ｍｉＲ−１８２標的核酸配列、ｍｉＲ−２２１標的核酸配列、ｍｉＲ−２２２標的核酸配列、またはｍｉＲ−８０２標的核酸配列の全部または一部と実質的に同一な標的ハイブリダイズ配列を含み、該標的捕捉オリゴマーは、ｍｉＲ−２１標的核酸配列、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸配列、ｍｉＲ−１８２標的核酸配列、ｍｉＲ−２２１標的核酸配列、ｍｉＲ−２２２標的核酸配列、またはｍｉＲ−８０２標的核酸配列の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含み、該第１の増幅オリゴマーは、ｍｉＲ−２１標的核酸配列、ｍｉＲ−３４ｂ標的核酸配列、ｍｉＲ−１８２標的核酸配列、ｍｉＲ−２２１標的核酸配列、ｍｉＲ−２２２標的核酸配列、またはｍｉＲ−８０２標的核酸配列の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。本明細書に記載の一部の方法は、増幅オリゴマーと、少なくとも１つの標的捕捉オリゴマーとを含む増幅反応混合物中において増幅反応を実施するステップを包含し、該標的捕捉オリゴマーは、あるセットの条件下でヘアピン形態へと形成され、該増幅反応は、該標的捕捉オリゴマーをヘアピンとして維持するように構成された、あるセットの条件において進行する。
【００８１】
一部の方法は、標的核酸配列にハイブリダイズする、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを包含する。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する一部の方法では、各々が、それらの各標的核酸の各々に選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上の検出プローブオリゴマーを用いうる。標的核酸配列にハイブリダイズする一部の検出プローブオリゴマーは、直鎖プローブである。一部の検出プローブオリゴマーは、標識直鎖プローブである。一部の検出プローブオリゴマーは、二重標識直鎖プローブである。一部の検出プローブオリゴマーは、ヘアピンプローブである。一部の検出プローブオリゴマーは、標識ヘアピンプローブである。一部の検出プローブオリゴマーは、二重標識ヘアピンプローブである。一部の検出プローブオリゴマーは、分子ビーコンである。一部の検出プローブオリゴマーは、分子トーチである。一部の検出プローブオリゴマーは、マイクロＲＮＡの全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含み、該一部は、該マイクロＲＮＡのうち、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７の連続ヌクレオチドである。一部の検出プローブオリゴマーは、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含み、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列の３’端における５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７の連続ヌクレオチドである。一部の検出プローブオリゴマーは、マイクロＲＮＡの一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含み、該一部は、該マイクロＲＮＡ配列の５’端における５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７の連続ヌクレオチドである。一部の検出プローブオリゴマーは、ｍｉＲ−２１の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、ｍｉＲ−３４ｂの全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、ｍｉＲ−１８２の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、ｍｉＲ−２２１の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、ｍｉＲ−２２２の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、ｍｉＲ−８０２の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。本明細書に記載の一部の方法は、増幅産物にハイブリダイズする、少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを包含する。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する、本明細書に記載の一部の方法では、各々が、該２つ以上の標的核酸から生成された増幅産物にハイブリダイズするように構成された、２つ以上の検出プローブオリゴマーを用いうる。２つ以上の標的核酸の存在または量を検出する、本明細書に記載の一部の方法では、各々が、該２つ以上の標的核酸から生成された増幅産物に選択的にハイブリダイズするように構成された、２つ以上の検出プローブオリゴマーを用いうる。一部の検出プローブオリゴマーは、マイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズするように構成される。一部の検出プローブオリゴマーは、本明細書で記載される増幅オリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズするように構成される。一部の検出プローブオリゴマーは、本明細書で記載される第１の増幅オリゴマー、本明細書で記載されるプロモーターベースのオリゴマー、本明細書で記載されるリバースプライマーオリゴマー、またはこれらの組合せから選択される増幅オリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズするように構成される。一部の検出プローブオリゴマーは、本明細書で記載される５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’のフォーマットである、第１の増幅オリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズするように構成され、該検出プローブオリゴマーは、伸長核酸配列の一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、本明細書で記載される５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’のフォーマットである、第１の増幅オリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズするように構成され、該検出プローブオリゴマーは、該マイクロＲＮＡ鋳型の全部または一部と実質的に同一な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、本明細書で記載される５’Ｚｎａ’ｂ’ｃ’３’のフォーマットである、第１の増幅オリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズするように構成され、該検出プローブオリゴマーは、伸長核酸配列の一部と実質的に相補的であり、それ自体が該マイクロＲＮＡ鋳型と相補的な増幅産物配列の全部または一部と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、本明細書で記載されるプロモーターベースのオリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズするように構成され、該検出プローブオリゴマーは、該プロモーターベースのオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列の全部または一部と実質的に同一な標的ハイブリダイズ領域を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、本明細書で記載される、タグ配列を含有するプロモーターベースのオリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズするように構成され、該検出プローブオリゴマーは、該プロモーターベースのオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列の全部もしくは一部、該タグ配列の全部もしくは一部、またはこれらの組合せと実質的に同一な標的ハイブリダイズ配列を含む。一部の検出プローブオリゴマーは、本明細書で記載されるプロモーターベースのオリゴマーを用いてマイクロＲＮＡ鋳型から生成された増幅産物にハイブリダイズするように構成され、該検出プローブオリゴマーは、ＲＮＡ転写物の増幅産物と実質的に相補的な標的ハイブリダイズ領域を含む。
【００８２】
本明細書に記載の一部の方法では、酵素、基質、混合物のｐＨを調整する酸または塩基、塩、緩衝剤、キレート剤、変性剤、試料調製剤、試料保存媒体または試料輸送媒体、細胞溶解剤、全ＲＮＡ単離成分および全ＲＮＡ単離試薬、部分一般化ＲＮＡ単離成分および部分一般化ＲＮＡ単離試薬、固体支持体、ならびに他の無機成分または有機成分などの化合物を用いる。方法は、本明細書で言及される化合物および本明細書では言及されない他の化合物の任意の組合せを用いるステップを包含しうる。該方法において有用な反応混合物は、市販品の一部として提供することができる。該方法において有用な反応混合物は、市販品の一部としてあらかじめ混合するか、または部分的にあらかじめ混合して提供することができる。該方法において有用な反応混合物は、市販品の一部としての個別の構成要素として提供することができる。
【００８３】
以下の実施例では、本発明の態様および実施形態が例示される。核酸の合成、ハイブリダイゼーション、標識の検出のための方法および試薬は、実質的に本明細書で記載した通りに用いたが、当業者は、同等の結果を達成するのに、他の日常的な方法および標準的な試薬もまた用いうることを理解する。オリゴヌクレオチドは、標準的なホスホルアミダイト化学反応（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５４巻：２８７頁）を用いて合成し、日常的なクロマトグラフィー法（例えば、ＨＰＬＣ）を用いて精製し、典型的には、１０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中、室温〜−８０℃で保管する。実施例において例示される標的捕捉ステップでは、アッセイ容器の外側に磁場を適用することにより、可溶相とは分離された捕捉支持体として磁性粒子を用いたが、当業者は、他の分離手段を用いうることを理解する。可溶性成分を含有する上清を除去し、粒子に結合したハイブリダイゼーション複合体を洗浄した（通常は約２５℃の洗浄温度で、磁性粒子に対する、捕捉されたハイブリッド体の結合を維持するのに十分なイオン強度を有する洗浄液により、１〜３回にわたり洗浄した）。洗浄は、一般に、洗浄液中に粒子を懸濁させ、粒子を分離し、上清を除去し、各回の洗浄につきこれらのステップを反復することにより、室温で実施する。検出ステップでは、検出プローブ配列およびその標的配列について予測されるＴｍ未満の温度で、通常３０〜６０分間にわたり、適切な塩および緩衝液を含有する水溶液中において、該検出プローブを、該リリースされた標的核酸と共にインキュベートした。ＡＥ標識した検出プローブを用いたときは、標的に結合させたＡＥ標識プローブと比較して異なる、結合しなかったプローブ上におけるＡＥ標識の加水分解を用いる、均一検出ステップ（米国特許第５，２８３，１７４号において詳細に記載されている）を実施した。例えば、加水分解は、結合しなかったプローブ上におけるＡＥ標識の加水分解を促進する選択試薬（例えば、塩基性溶液）を添加して実施し、その後、結合したプローブに結合させたＡＥからの化学発光を触媒する検出試薬（例えば、Ｈ２Ｏ２）を添加し、ルミノメーター（例えば、ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０ＨＣ＋；カリフォルニア州、サンディエゴ、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ社製）上で化学発光シグナル（相対光単位またはＲＬＵとして言及される）を検出した。
【００８４】
以下の実施例では、これらのアッセイで用いられる、一部の好ましい実施形態および試薬について記載する。当業者は、方法ステップを実施するのに、本明細書で記載される試薬および条件を、他の試薬および条件に置き換えうることを理解する。例えば、シグナルを発生させて検出するための試薬および条件は、選択した検出プローブ標識に基づき、当業者により選択される。当業者は、相補的な配列にハイブリダイズしうる、任意の選択された標的核酸配列を用いて本発明の方法を実施し得、すなわち、該方法が、任意の特定のプローブまたは標的配列に依存しないことを理解する。当業者は、標的配列を選択し、次いで、日常的な方法を用いることにより、本明細書で記載される捕捉プローブ形態のうちのいずれか、および標的特異的な検出プローブに適切な標的ハイブリダイズ配列をデザインおよび合成しうることを理解する。すなわち、特定のアッセイは、標的配列と、本明細書で記載される構造的特徴を包含する捕捉プローブおよび検出プローブ中に含有される、適切な標的ハイブリダイズ配列との選択に依拠し、このような選択は、標準的な手順の後で、本明細書で記載される方法を用いることにより、該選択された標的の検出を最適化するようにデザインされた構成要素に対する日常的な試験を用いて、当業者が実施しうる。
【実施例】
【００８５】
（実施例１：異なる標識プローブを用いる低分子標的核酸の検出）
検出プローブを設計するために、ヒトヘルペスウイルス５（サイトメガロウイルス）株（Ｄｕｎｎら、２００３年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １００巻（２４号）１４２２３〜１４２２８頁；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ１４６９９９、ＡＣ１４６８５１およびＡＹ３１５１９７）のゲノム配列に共通であり、かつ蛍光タンパク質遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３０３１６６、ＡＹ３０３１６７およびＡＹ２３７１５７）の一部に相補的な配列から２３ｎｔの標的配列を選択した。標的配列に完全に相補的であった２３ｎｔのオリゴマーを、５２％ＧＣ含有量を有する２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドとしてインビトロで合成した。３つの型のプローブを、異なる位置（２３ｍｅｒの塩基８〜９、１２〜１３、ならびに１３〜１４の間）でリンカーを用いて標識し、ＡＥ標識を、以前に詳細に記載された方法（米国特許第５，１８５，４３９号、同第５，２８３，１７４号および同第５，６５６，７４４号）を用いることによって、リンカーで結合させた。標識したプローブ（反応につき０．１ｐｍｏｌ）を、１５μｌのハイブリダイズ試薬（１９０ｍＭのコハク酸塩、１７％（ｗ／ｖ）リチウムラウリルサルフェート（ＬＬＳ）、１００ｍＭのＬｉＯＨ、３ｍＭのＥＤＴＡおよび３ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ５．１）を含有する３０μｌ反応混合物中で、相補的な合成ｓｓＲＮＡ標的配列（反応につき１０ｐｍｏｌ）と、６０℃で１時間、個々にハイブリダイズさせた。次いで、ハイブリダイズ混合物を、ハイブリダイズ試薬を用いて、５００μｌに希釈し、２０μｌのアリコートを取り、検出ステップを行うために、各検出反応混合物に、８０μｌのハイブリダイズ試薬、および次いで２００μｌの選択試薬（６００ｍＭのホウ酸、１８２．５ｍＭのＮａＯＨ、１％（ｖ／ｖ）オクトキシノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）、ｐＨ８．５）を添加し、様々な時間の間、加水分解を５０℃で行った。次いで、シグナルの生成および検出を、２００μｌの検出試薬（１ｍＭの硝酸および３２ｍＭのＨ２Ｏ２）を添加し、続いて２００μｌの１．５ＭのＮａＯＨを添加することによって行い、ルミノメーターを用いることによって化学発光シグナル（ＲＬＵ）を（２秒間）測定した。同じ検出反応方法を、ｓｓＲＮＡ標的なしに個々のプローブを含有したアリコートについて行い、非結合のプローブ上のＡＥ標識の加水分解を測定した。これらの結果から、相補的な標的鎖が存在したかまたは存在しなかったとき、各プローブ組成物についての検出可能な標識の半分が加水分解された時間（Ｔ１／２）を決定した。標的なしの３つの全プローブ（すなわち、非結合プローブ）についてのＴ１／２は、０．６９〜１．０５分の間であったが、標的が存在したとき（すなわち、結合プローブ）、Ｔ１／２は２５．８〜１２５分の間であり、これは、検出プローブが標的と結合し、均一な反応混合物中の過度なバックグラウンドのシグナルにおいて検出可能なシグナルを生成したことを示す。プローブが標的とハイブリダイズしたとき、それらは、異なるＴ１／２の特徴を示した：位置１２〜１３の間で標識したプローブは、最も短いＴ１／２（２５．８分）を有し、位置���３〜１４の間で標識したプローブは、最も長いＴ１／２（１２５分）を有し、位置８〜９の間で標識したプローブは、中間のＴ１／２（６９分）であった。これらの結果は、３つの全プローブが、相補的なＲＮＡ標的に結合できること、非結合プローブにおける標識が、異なる加水分解の特徴によって結合プローブにおける標識から区別できること、および、オリゴマー上の標識位置が標識の加水分解速度に作用することから、アッセイのための最適なプローブを通例の試験を用いて選択および設計できることを示す。
【００８６】
（実施例２：一本鎖および二本鎖標的の検出の感度）
標的検出の感度を、実施例１と同じ標的および検出プローブ配列を用い、ｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ形態であるときの、ＲＮＡ標的の検出を比較して決定した。ｓｓＲＮＡ標的オリゴマーならびに位置１３〜１４の間でＡＥで標識した検出プローブオリゴマーを、実施例１のように使用した。これらのアッセイにおいて、全反応は、０．１ｐｍｏｌのＡＥ標識プローブを含有し、ハイブリダイズ反応につき０から５ｆｍｏｌの範囲で存在するｓｓＲＮＡ標的とハイブリダイズさせた（６０℃で１時間インキュベートした１００μｌのハイブリダイズ混合物）。ハイブリダイゼーションに続いて、非結合プローブ上のＡＥ標識を、２００μｌの選択試薬を添加し、５０℃で１０分間インキュベートすることによって加水分解し、次いで結合プローブからの化学発光シグナルを実質的に実施例１に記載のように検出した。表１の列１および２に示される結果は、直線的な検出可能なシグナルが、試験した標的の量の範囲にわたって測定されたことを示す。反応におけるわずかに０．００５ｆｍｏｌのｓｓＲＮＡ標的が、標的核酸がアッセイにおいて存在しなかったとき得られたバックグラウンドシグナルを超える、検出可能なシグナルをもたらした。「正味ＲＬＵ」データ（列２）は、各試験試料について検出されたＲＬＵから、バックグラウンドＲＬＵ（標的が存在しなかったとき、５６０ＲＬＵ）を差し引くことによって計算した。
【００８７】
ｄｓＲＮＡ標的を用いて行った試験では、標的は、上記のｓｓＲＮＡ標的オリゴマーに相補的なＲＮＡ鎖を合成し、２本の相補的なＲＮＡ鎖を一緒にハイブリダイズさせることによって作製した。ｄｓＲＮＡ標的を、２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドとして合成し、位置１３〜１４の間でＡＥで標識した上記と同じプローブを用いることによって、実質的に上記のように試験した。この検出プローブは、ｄｓＲＮＡ標的における鎖のうち１本に相補的であった。ＡＥ標識プローブでハイブリダイズする前に、ｄｓＲＮＡ標的を、９０℃で５〜７分間、溶液（１０ｍＭのＬｉ−コハク酸および０．０１％ＬＬＳ、ｐＨ５．０）中で加熱することによって変性させ、続いて氷上で素早く冷却した。試験１では、５０ｐｍｏｌの標的ｄｓＲＮＡを変性させ、次いで希釈して１００μｌの各ハイブリダイズ反応に使用する異なる量の標的を作製した。試験２では、適切な量の標的ｄｓＲＮＡを分配して、５０μｌのアリコートでチューブに分け、上記のように加熱して変性させ、次いで標識プローブを含有する５０μｌのハイブリダイズ試薬を各チューブに添加し、ハイブリダイズ反応混合物を作製した。ハイブリダイズおよび検出反応は、実質的にｓｓＲＮＡ標的反応についての上記のように行い、ｄｓＲＮＡ標的についての結果は、表１の列３から５に示す。標的が存在しなかったときに検出されたバックグラウンドのシグナル（試験１においては９４２ＲＬＵ、試験２については９３２ＲＬＵ）を、ｄｓＲＮＡ標的が存在したときに検出されたシグナルから差し引いて、「正味ＲＬＵ」を得た（試験１については列４、試験２については列５）。正味ＲＬＵ測定値は、アッセイが、試験した標的の量の範囲にわたって実質的に直線的な応答である検出可能なシグナルを生成したことを示した。ポジティブシグナルは、わずか０．０１ｆｍｏｌ（試験１）から０．０５ｆｍｏｌ（試験２）の標的ＲＮＡが反応中に存在したときに検出され、これは検出ステップの感度を示す。
【００８８】
【表１−１】
2012509675.tif 000003
【００８９】
【表１−２】
2012509675.tif 000004
（実施例３：標的ＲＮＡの捕捉および検出）
これらのアッセイでは、ハイブリダイズ条件下でヘアピン構造を形成できる捕捉プローブを、試料から標的核酸を捕捉するために使用し、続いて標的核酸と標識した検出プローブとのハイブリダイゼーション、および結合した検出プローブからシグナルの検出を行った。これらの実験で使用する捕捉プローブは、すべてヘアピン構造を形成しうる構造的特徴：５’領域のホモポリマー配列、５’領域配列に完全または部分的に相補的である３’領域配列、ならびに５’および３’領域配列が両側に位置する標的ハイブリダイズ配列を含有する。５’および３’領域配列は、ヘアピン構造の「ステム」部分を形成し、標的ハイブリダイズ配列は、ヘアピン構造の「ループ」部分を形成する。
【００９０】
ヘアピン捕捉プローブの３つの型を合成し、ヘアピン捕捉プローブのステムのＴｍを決定するために、通例の方法を用いてアッセイした。３つの全プローブの相補的な５’および３’領域配列を、デオキシリボヌクレオチド連結により合成した。各ヘアピンプローブの標的ハイブリダイズ配列は、実施例１のような２３ｎｔの標的ハイブリダイズ配列であり、プローブ１および２においては２’−Ｏ−メチル連結、プローブ３においてはデオキシリボヌクレオチド連結を用いて合成した。プローブ１および３では、５’領域は（ｄＴ）１２配列であり、３’領域は（ｄＡ）１２配列であり；プローブ２では、５’領域配列は、（ｄＡ）１２の３’領域配列に部分的に相補的である（ｄＴ）５Ａ（ｄＴ）６であった。模式的に、結果として得られる捕捉プローブ配列は次のようであり、Ｎ２３は標的ハイブリダイズ配列を示す：５’ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−Ｎ２３−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ３’（プローブ１および３；配列番号１）および５’ＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴ−Ｎ２３−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ３’（プローブ２；配列番号２）。これらの直鎖配列が、５’領域と３’領域との分子内ハイブリダイゼーションによって、部分的に二本鎖のヘアピン構造を形成し、標的ハイブリダイズ配列（Ｎ２３）が、ヘアピン構造のループ部分になることは、容易に理解される。これらのヘアピンプローブの二本鎖のステム部分についてのＴｍは、約４６℃から約５７℃（プロープ２については４６．３℃、プローブ３については５５．７℃、およびプローブ１については５６．７℃）の範囲であった。
【００９１】
これらのヘアピン捕捉プローブを用いる捕捉および標的の検出は、実施例２に記載のｄｓＲＮＡ標的およびＡＥ標識プローブを用いて行い、標的の量は、反応につき０．０５から５ｆｍｏｌの範囲を用いた。臨床試料と同様の試料を供給するために、２００μｌの試料輸送溶液（１１０ｍＭのＬＬＳ、１５ｍＭのリン酸一ナトリウム、１５ｍＭのリン酸二ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ６．７）中に存在するｄｓＲＮＡ標的を、２００μｌの尿と混合し、４００μｌの最終試料量にした。この混合物を加熱して、ｄｓＲＮＡ標的を変性させ（９０℃で５分間、次いで氷上で冷却した）、捕捉プローブとのハイブリダイゼーションのためにｓｓＲＮＡ標的鎖を供給した。個々に試験される各ヘアピン捕捉プローブについて、変性したＲＮＡ標的試料を、０．３ｐｍｏｌのヘアピン捕捉プローブ、およびｄＴ１４の固定化プローブオリゴマーが共有結合した捕捉支持体（１ミクロンのＳｅｒａ−ＭａｇＴＭ  ＭＧ−ＣＭ粒子、Ｓｅｒａｄｙｎ社、インディアナポリス、ＩＮ）である５０μｇの磁性粒子を含有する１００μｌの標的捕捉試薬（２５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３１０ｍＭのＬｉＯＨ、１．８８ＭのＬｉＣｌ、１００ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．４）と混合した。混合物を６５℃で６０分間インキュベートし（各捕捉プローブのＴｍを超える温度）、次いで室温で３０分間インキュベートし、粒子と結合した捕捉ハイブリッド体を形成させた。次いで、結合した捕捉ハイブリッド体を有する粒子を、除去される液体試料成分から磁気的に分離した。結合した捕捉ハイブリッド体を有する粒子を、５００μｌの試料輸送溶液を用いて、室温で２回洗浄し、次いで結合した捕捉ハイブリッド体を有する粒子を、除去される溶液から分離した。結合した捕捉ハイブリッド体を有する洗浄した粒子を、１００μｌの水と混合し、加熱して（９０℃で５分間）、捕捉ハイブリッド体の核酸成分をリリースした（標的および捕捉プローブオリゴマーを溶液中にリリースし、固定化プローブは、捕捉支持体粒子に共有結合したままだった）。標的を検出するために、溶液を、次いで１００μｌのハイブリダイズ試薬中で、実施例２に記載のようにＡＥ標識検出プローブと混合し、検出プローブが標的鎖に結合することを可能にするハイブリダイズ条件下（５５℃で６０分間）で混合物をインキュベートした。これらの条件下で、リリースした捕捉プローブは、分子内ハイブリダイゼーションによって部分的に二本鎖のヘアピン構造を再形成し、標的鎖とのハイブリダイゼーションのための検出プローブと競合する捕捉プローブによって引き起こされる競合的阻害を最小化させることができる。検出プローブおよびヘアピン捕捉プローブの標的ハイブリダイズ配列は、同じセンス鎖であるため、それらが互いにハイブリダイズすることはない。結合した検出プローブからのシグナルの検出は、実質的に実施例１に記載のように行った。標的なしのコントロールの反応を同様に試験し、全反応についてバックグラウンドシグナルは、５３５から７１５ＲＬＵの範囲であった。これらのアッセイの実験結果は、正味ＲＬＵ（検出したＲＬＵマイナスバックグラウンドＲＬＵ）として表２の列２に示す。各アッセイについて、バックグラウンドＲＬＵに対する検出したシグナルの比率は、表２の列３に示す。
【００９２】
【表２−１】
2012509675.tif 000005
【００９３】
【表２−２】
2012509675.tif 000006
これらのアッセイの結果は、ヘアピン捕捉プローブを用いることによる標的核酸の捕捉、およびｄｓＲＮＡ標的の１本の鎖に相補的な検出プローブを用いることによる検出の組合せにより、試験したすべての標的の量について、試料中に存在する標的が効果的に検出されたことを示す。
【００９４】
（実施例４：捕捉プローブの異なる形態を比較するアッセイ）
標的の捕捉ステップを、ヘアピン構造または直鎖構造のいずれかの捕捉プローブを用いて行ったとき、これらのアッセイについて、実施例３に記載のものに同様の方法を用いて、標的配列の捕捉および検出の相対的な効率を比較した。特に明記しない限り、これらの試験に使用した試薬は、上記の実施例１から３に開示されたものと同じであった。すべてのアッセイは、２００μｌの試料輸送溶液と混合した２００μｌの尿中で、実施例２に記載のような１ｆｍｏｌのｓｓＲＮＡ標的を含有する試験試料を使用した。標的捕捉ステップについて、各４００μｌの試験試料を、実施例３に記載のような部分的に二本鎖のヘアピン捕捉プローブ（配列番号１）、またはヘアピン捕捉プローブと実質的に同じ標的ハイブリダイズ配列（Ｎ２３）を有するが、１つの追加の５’ヌクレオチド（Ｘ）を含む次の構造の直鎖状の一本鎖の捕捉プローブ：５’Ｘ  Ｎ２３ＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ３’（配列番号３）のいずれかの、異なる量（０．１、０．５、１．０、２．０、５．０、１０および２０ｐｍｏｌ）を含有する１００μｌの標的捕捉試薬と混合した。捕捉プローブのヘアピンおよび直鎖の両形態において、標的ハイブリダイズ配列を、２’−Ｏ−メチル連結で合成した。ヘアピン捕捉プローブでは、標的ハイブリダイズ配列の両側に、相補的な５’ポリｄＴおよび３’ポリｄＡ領域を位置させ、一方、直鎖形態では、標的ハイブリダイズ配列を、３’（ｄＴ）３（ｄＡ）３０配列と共有結合させた。反応混合物を６５℃で６０分間インキュベートし、次いで室温で３０分間インキュベートして捕捉ハイブリッド体の形成および固定化プローブによる捕捉支持体との結合を可能にした。結合した捕捉ハイブリッド体を有する支持体を、磁場を適用することによって、液体試料成分から分離し、実質的に実施例３に記載のように（０．５ｍｌの試料輸送溶液をそれぞれ用いて）２回洗浄した。最終洗浄溶液を除去し、結合した捕捉ハイブリッド体を有する捕捉支持体を、アッセイ当たり１００μｌの水と混合し、９０℃で５分間インキュベートし、氷上で素早く冷却して、標的鎖と検出プローブとのハイブリダイゼーションの前に、捕捉ハイブリッド体を核酸成分にリリースした。次いで各試験試料を、１００μｌのハイブリダイズ試薬中で、実施例２の０．１ｐｍｏｌのＡＥ標識検出プローブと混合し、５５℃で６０分間インキュベートして、検出プローブと標的鎖とのハイブリダイゼーションを可能にした。標的鎖と結合した検出プローブからの化学発光シグナルの検出を、実質的に実施例３に記載のように行った（２００μｌの選択試薬を添加し、５５℃で１０分間インキュベートし、２００μｌの検出試薬と混合し、ルミノメーター上で化学発光を（５秒間）測定した）。結果は表３に、列２および３に正味のＲＬＵ、ならびに列４および５に、捕捉ステップを、直鎖またはヘアピン形態の捕捉プローブを用いることによって行ったときに得られた検出の相対的な割合として示す。正味のＲＬＵは、ポジティブ試料において検出されたＲＬＵからバックグラウンドＲＬＵを差し引くことによって計算した（バックグラウンドは、ヘアピンプローブ試験について７６２ＲＬＵ、直鎖プローブ試験について７４９ＲＬＵであった）。検出の相対的な割合は、検出された最も高い正味のＲＬＵを１００％と設定し（０．１ｐｍｏｌのヘアピン捕捉プローブについての結果）、他の試験で検出されたより低い正味のＲＬＵを、最も高い正味のＲＬＵ（２１，７７８）で割ることによって計算した。
【００９５】
【表３】
2012509675.tif 000007
これらの結果は、同じ標的配列に対して特異的な捕捉プローブの直鎖形態およびヘアピン形態を用いることによって行ったアッセイが、行った全アッセイについて検出可能なシグナルをもたらしたことを示す。検出の相対的な割合は、捕捉プローブが直鎖形態と比較してヘアピン形態であったとき、一貫してより高かった。検出の相対的な割合の違いは、２つの形態について得られた結果を、試験した捕捉プローブの最も多い量について比較したとき（反応につき２０ｐｍｏｌ）、約１０倍を超え、２つの形態について得られた結果を、試験した捕捉プローブの最も少ない量について比較したとき（反応につき０．１ｐｍｏｌ）、約２．７倍まで及んだ。リリースした直鎖形態は、アッセイの検出段階中、標的配列とのハイブリダイゼーションについて検出プローブと競合しうるが、同じ条件下のヘアピン形態は、ヘアピン構造を再形成し、標的との結合についての、捕捉プローブの標的ハイブリダイズ配列と検出プローブとの間の競合を制限するため、ヘアピン捕捉プローブ形態と直鎖の捕捉プローブ形態を用いたアッセイ間の違いは、直鎖捕捉プローブを使用したときの、より競合的な阻害に起因し得る。
【００９６】
（実施例５：部分的に二本鎖の捕捉プローブを用いるアッセイ）
この実施例は、完全または部分的に二本鎖の捕捉プローブを使用する実施形態を記載する。この実施形態の捕捉プローブは、２つの完全または部分的に相補的な鎖からなり、そのうち１本の鎖は、標的核酸の一部と結合する標的ハイブリダイズ配列を含む。捕捉プローブの１つの型は、第１捕捉プローブ鎖（配列番号４）および第２捕捉プローブ鎖（配列番号５）からなり、これらは合成および一緒にハイブリダイズされ、少なくとも、それらの相補的な３’ポリＡおよび５’ポリＴ配列：
【００９７】
【化１】
2012509675.tif 000008
のハイブリダイゼーションによって結合した、部分的に二本鎖の捕捉プローブが作製される。配列番号４のオリゴマーは、５’ポリＴ領域、およびヒトＢ１９パルボウイルスゲノム（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３８６３３０）に含有される配列に相補的な３’配列を含有し、配列番号５のオリゴマーは、５’ポリ（ＴＣ）領域および３’ポリＡ領域を含有する。別の型では、捕捉プローブは、完全に二本鎖であり、その相補的な鎖（配列番号６）とハイブリダイズした第１捕捉プローブ鎖（配列番号４）：
【００９８】
【化２】
2012509675.tif 000009
からなる。
【００９９】
分離のアッセイでは、約３．５ｐｍｏｌの各型の捕捉プローブを、（変性、場合によっては約１００から１０００ｎｔの長さのフラグメントに剪断または酵素的に消化した）パルボウイルスＢ１９ゲノムＤＮＡを含有する０．５ｍｌの血漿試料、および固定化プローブとして結合したポリ（Ａ）オリゴマーを有する捕捉支持体粒子を含有する、同量の標的捕捉試薬と混合する。すなわち、固定化ポリ（Ａ）オリゴマーは、配列番号４の捕捉プローブオリゴマーの５’ポリｄＴ部分と相補的である。混合物をインキュベートして（６０〜６５℃で２０〜６０分）、捕捉プローブを成分オリゴマーに解離させ（配列番号４および配列番号５または配列番号４および配列番号６）、配列番号４の標的特異的部分をパルボウイルスＢ１９標的ＤＮＡ中の相補的な配列とハイブリダイズさせた。次いで、混合物をより低い温度でインキュベートして（２５〜３０℃、１４〜３０分）、捕捉プローブおよび固定化プローブの相補的なホモポリマー配列をハイブリダイズさせ、これによって標的Ｂ１９ＤＮＡと、パルボウイルスＢ１９ＤＮＡ中の相補的な配列とハイブリダイズされる配列番号５の捕捉プローブ鎖を含む捕捉ハイブリッド体において磁性粒子とを結合させる。結合した捕捉ハイブリッド体を有する粒子は、容器の外側へ磁力を適用することによって、試料成分から分離し、ハイブリダイズしなかった捕捉プローブ鎖を含む液体試料成分を除去する。結合した捕捉ハイブリッド体を有する粒子を、捕捉支持体と結合した捕捉ハイブリッド体を維持するのに十分なイオン強度の水溶液中に懸濁する洗浄ステップを使用し、次いで、磁力を用いて粒子を水溶液から分離し、任意の結合しなかった捕捉プローブオリゴマーを含む洗浄液および他の試料成分を除去する。捕捉したＢ１９ＤＮＡの検出のために、結合した捕捉ハイブリッド体を有する粒子を、蛍光標識（例えば、フルオレセイン）で標識した、配列番号７の検出プローブオリゴマーを含有するハイブリダイズ試薬と混合し（反応につき０．１〜０．５ｐｍｏｌ）、検出プローブのＴｍ未満だが、ポリＡ−ポリＴ二重鎖の融解温度を超える温度で混合物をインキュベートして、Ｂ１９標的核酸を溶液相中にリリースすることによって、検出プローブを、捕捉したＢ１９ＤＮＡにおける相補的な配列とハイブリダイズさせる（例えば、５５℃で２０〜６０分間）。混合物を、次いでより低い温度でインキュベートして（例えば、２５〜３０℃で１０〜３０分間）、Ｂ１９標的ＤＮＡ、検出プローブおよびポリｄＴ含有捕捉プローブ鎖からなるハイブリダイズ複合体を、粒子上のポリ（Ａ）固定化プローブに結合させる。ハイブリダイズした検出プローブを含有する結合した複合体を有する粒子を、上記のように溶液相から分離し、結合しなかった検出プローブを含有する溶液相を廃棄する。結合した複合体を有する粒子を、場合によっては、粒子上のハイブリダイズ複合体を維持する条件下で、実質的に上記のように洗浄して、残っている結合しなかった検出プローブを除去する。最後に、粒子を大量の液体（例えば、０．５ｍｌの水）と混合し、混合物の蛍光を、標準的な蛍光光度的手段を用いて測定する。ネガティブコントロールの試料、すなわちＢ１９粒子またはＤＮＡを含有しない血漿を、上記と同様に処理し、ネガティブコントロールの試料から測定される蛍光は、アッセイについてのバックグラウンドシグナルを示す。捕捉プローブの部分的および完全な二本鎖の両型について、これらのアッセイは、ネガティブコントロールの試料が生成するバックグラウンドシグナルより顕著に大きい、パルボウイルスＢ１９核酸を含有する試験試料についての検出可能なポジティブシグナルを生成する。ポジティブシグナルは、試料中のパルボウイルスＢ１９標的核酸の存在を示す。
【０１００】
（実施例６：ｍｉＲＮＡバイオマーカーの特異的な捕捉、増幅および検出）
以下の例で使用された材料および方法。細胞株および異種移植片：ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５、ＰＣ−３およびＶＣａＰ前立腺がん株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（マナッサス、バージニア州）から入手した。ＬＮＣａＰおよびＤＵ１４５細胞株を、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ１６４０Ｃｕｓｔｏｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）中で培養した。ＰＣ−３細胞株を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび０．９ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補充し、Ｅａｒｌｅ塩（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＭＥＭ中で培養した。ＶＣａＰ細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で培養した。２１人のヒト前立腺がん重症複合型免疫不全異種移植片の新鮮な凍結試料（ＬｕＣａＰｓ２３．１２、２３．１、２３．１ＡＩ、３５、３５Ｖ、４９、７０、７７、７８、８１、８６．２、９２、９３、９６、９６ＡＩ、１０５、１１５、１４１、１４５．１、１４５．２、１５３）を、標準的な方法を用いて調製した。いくつかのこれらの異種移植片の特徴付けが、以前に報告されている（Ｌａｉｔｉｎｅｎ、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００２年、３５巻：６６〜７３頁；Ｓａｒａｍａｋｉ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００６年、１１９巻：１３２２〜１３２９頁；Ｐｏｒｋｋａ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７年、６７巻：６１３０〜６１３５頁）。正常前立腺組織試料：１００％正常であると病理学的に決定した、５つの隣接正常前立腺組織（ＯＣＴ包埋）を、Ｃｙｔｏｍｙｘ社（レキシントン、マサチューセッツ州）から購入した。これらの試料を、続くＲＮＡの抽出およびマイクロＲＮＡのプロファイリングのために、Ａｓｕｒａｇｅｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（オースチン、テキサス州）に輸送した。
【０１０１】
ＲＮＡ試料：全ＲＮＡを、Ａｍｂｉｏｎ  ｍｉｒＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いて細胞株から抽出し、製品説明書にしたがってＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて異種移植片組織の凍結切片から抽出した。合成成熟ｍｉＲＮＡを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（コーラビル、アイオワ州）から購入した。ヒトプレｍｉＲ−８０２配列を、Ｓａｎｇｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのｍｉＲＢａｓｅ（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００６年、３４巻：Ｄ１４０−４）から入手し、合成ヘアピン前駆体を、ＬＮＣａＰゲノムＤＮＡから９４ｎｔプレｍｉＲ−８０２配列のＰＣＲ増幅を用いて合成し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）にクローニングし、インビトロの転写物として発現させた。
【０１０２】
リアルタイム定量的ＰＣＲ：ｃＤＮＡを、特異的ＴａｑＭａｎ  Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ逆転写プライマーおよびＴａｑＭａｎ  ｍｉＲＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、合成成熟ｍｉＲＮＡまたは全ＲＮＡから調製した。成熟ｍｉＲＮＡの絶対的なコピー数を、ｃＤＮＡ増幅のためのＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）と一緒に、ＴａｑＭａｎ  Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄプライマーおよびプローブセットを用いて、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。増幅および分析を、ＡＢＩ７０００配列検出系において実行した。細胞当たりのコピーを、記載のように、細胞当たり推定１５ピコグラムの全ＲＮＡを用いて、全ナノグラムのＲＮＡから決定した（Ｃｈｅｎ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００５年、３３巻：ｅ１７９頁）。
【０１０３】
リアルタイム転写媒介型増幅：リアルタイムＴＭＡアッセイで使用する全緩衝液および酵素試薬は、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ社（サンディエゴ、カリフォルニア州）から得たＡＰＴＩＭＡ（登録商標）試薬であった。全反応を、三連で実行した。増幅反応を、共通のリバースプライマーおよび分子ビーコンと一緒に、特別に設計したＴ７プロバイダー（米国特許第７，３７４，８８５号）および３’エクステンダーオリゴヌクレオチドを含有する９６穴マイクロタイタープレート中で調製した。プレートを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  ＲＴＭ機器に移し、４２℃で５分間インキュベートした。次に、ＡＰＴＩＭＡ酵素試薬を、素早く各穴にピペットで入れ、シールカードでプレートに覆った。簡潔な混合ステップ（４２℃で１分）の後、プレートを、４２℃に事前に加熱したＭＪ  Ｃｈｒｏｍｏ４機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）に移した。蛍光の読取りを、４２℃で６０分間、２０秒毎に行った。出現時間を、較正基準に対して比較し、ｍｉＲＮＡコピー数を引き出した。これらの実施例に使用したＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、それぞれ３’−（逆極性）−ｄＣヌクレオチド（５’−５’−ホスホジエステル連結）を含有し、３’伸長をブロックした（米国特許第７，３７４，８８５号）。リアルタイムＴＭＡアッセイは、異なるｍｉＲＮＡについて、表４の次のオリゴヌクレオチドを使用した。
【０１０４】
【表４−１】
2012509675.tif 000010
【０１０５】
【表４−２】
2012509675.tif 000011
全アッセイに、同じリバースプライマー（５’−ＣＧＧＵＣＧＣＡＧＡＧＡＴＴＡＡＣＴ）、およびＦＡＭで５’末端、Ｄａｂｃｙｌで３’末端に標識した分子ビーコン（５’−ＣＣＧＡＣＡＡＧＣＧＵＧＧＵＣＧＡＣＧＵＣＧＧ）を使用した。ｍｉＲＮＡの特異的な標的捕捉：成熟ｍｉＲＮＡの捕捉を、次のキメラヘアピン標的捕捉オリゴマー（ＴＣＯ）を用いて行った：
【０１０６】
【化３】
2012509675.tif 000012
（米国特許出願公開第２００６／００６８４１７号）。ＴＣＯを、溶液輸送媒体（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ社）中のＲＮＡ試料に、ＡＰＴＩＭＡ標的捕捉試薬と共に添加し、９６穴深穴ヒーター（ブロック６２０−５０３６を有するモデルＩＣ２５、Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、サンマルコス、カリフォルニア州）中で７５℃で１５分間加熱し、ヘアピンを変性させた。反応混合物を、次いで３０分にわたって室温まで冷却し、各特異的ｍｉＲＮＡをその設計ＴＣＯにアニールした。ｍｉＲＮＡとの結合後、ＴＣＯの３’ポリＡ尾部を、ポリＴ誘導体化磁性ビーズのポリＴ尾部とハイブリダイズした（ＡＰＴＩＭＡ標的捕捉試薬）。ビーズを、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ９６  ＰＣＲチップヘッド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いて収集し、ＡＰＴＩＭＡ洗浄液中で洗浄し、上記のように、９６穴ＰＣＲプレート中で、増幅および検出オリゴヌクレオチドを含有するＡＰＴＩＭＡ増幅試薬と混合した。ＴＣＯからｍｉＲＮＡを遊離するために、ＰＣＲプレートを９０℃で５分間インキュベートし、次いですぐに氷上で５分間冷却した。
【０１０７】
マイクロＲＮＡプロファイリング：全ＲＮＡを、Ｐｏｌｙｔｒｏｎによる均質化により、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いて、２２人のヒト前立腺がん異種移植片から抽出した。試料を、マイクロＲＮＡプロファイリングのためにＡｓｕｒａｇｅｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓに輸送した。マイクロＲＮＡプロファイリング試験のための試料を、Ａｓｕｒａｇｅｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓによって該会社の標準的な操作手順にしがたって処理した。簡潔には、Ｓａｎｇｅｒ  ｍｉｒＢａｓｅ９．２および公表された報告書に由来するマイクロＲＮＡプローブに対し、Ａｍｂｉｏｎからのカスタム製造Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐを設計した（Ｃｕｍｍｉｎｓ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００６年、１０３巻：３６８７〜３６９２頁；Ｂｅｎｔｗｉｃｈ、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２００５年、３７巻：７６６〜７７０頁；Ｂｅｒｅｚｉｋｏｖ、Ｃｅｌｌ  ２００５年、１２０巻；２１〜２４頁；Ｘｉｅ、Ｎａｔｕｒｅ  ２００５年、４３４巻：３３８〜３４５頁）。アレイを、各マイクロＲＮＡを表すように２つのスタッガードプローブにより設計した。Ａｍｂｉｏｎ  ｍｉＲＣＨＩＰ用に実行したシグナル工程は、プローブ特異的なシグナル検出コール、バックグラウンドの推定および補正、定分散安定化、およびアレイスケーリングまたは全体的正規化のいずれかを含む複数ステップの工程である。各プローブについて、Ｇ−Ｃマッチ抗ゲノムコントロールの中位シグナルに由来する推定バックグラウンド値を差し引く。特異的な分析実験内のアレイを、分散安定化方法にしたがって一緒に正規化した（Ｈｕｂｅｒ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００２年、１８  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ９６〜１０４頁）。検出コールは、ＧＣ含量マッチ抗ゲノムプローブからのシグナルの分布と比較して、マイクロＲＮＡプローブシグナルのＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定に基づいた。統計的仮定検定について、等分散の前提を有する２標本ｔ検定を適用した。ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを、２超の実験的グルーピングまたは同じ因子のレベルでの、実験的な設計に使用した。これらの検定は、どのプローブが、デフォルトのｐ値０．００１およびｌｏｇ２差＞１に基づき、有意に異なって発現したか、または有意であると考えられるかを規定する。
【０１０８】
マイクロアレイのＴａｑＭａｎ検証は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２について、正常および異種移植片の結果である：成熟マイクロＲＮＡの絶対的なコピー数を、ｃＤＮＡ増幅のため、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、ＣＡ）と一緒に、Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ  ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを用いて、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって決定した。増幅および分析を、ＡＢＩ７０００配列検定系において行った。細胞当たりのコピーを、記載のように、細胞当たり推定１５ｐｇの全ＲＮＡを用いて決定した（Ｃｈｅｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００５年、３３巻：ｅ１７９頁）。
【０１０９】
（実施例７：リアルタイムＴＭＡアッセイは、プレｍｉＲＮＡ配列ならびに関連および関連しない非標的ｍｉＲＮＡ配列から、成熟ｍｉＲＮＡ配列を区別する）
ｍｉＲ８０２は、染色体領域２１ｑ２２．１２にあり、これは、前立腺がんの侵襲性形態と関連付けられた、ＴＭＰＲＳＳ２およびＥｔｓファミリーメンバーの染色体ブレークポイント（２１ｑ２１．２−２１．３）に近い領域である（Ｋｕｍａｒ−Ｓｉｎｈａ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００８年、８巻：４９７〜５１１頁；Ｍｅｈｒａ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８年、６８巻：３５８４〜３５９０頁）。関連しないｍｉＲＮＡ  ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−３４ｂおよびｍｉＲ−５４８ｄと比較したとき、ならびにプレｍｉＲ−８０２前駆体と比較したときの、成熟ｍｉＲ−８０２鋳型の特異的な検出について、リアルタイムＡＴＭアッセイを行った（図４Ａ〜Ｃ）。標的核酸は次のようであった：それぞれ配列番号３４、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３２および配列番号３３。標的核酸を、５×１０７コピーで調製し、５コピーまで下がった１０倍の連続希釈を作製した。ネガティブコントロールは水であった。増幅反応は三連で行い、標的または非標的核酸のうち１つを含む。増幅および検出オリゴマーは、配列番号１３、１９、２０および２１であった。結果は、表５および図４に示す。
【０１１０】
【表５−１】
2012509675.tif 000013
【０１１１】
【表５−２】
2012509675.tif 000014
いくつかの非特異的な増幅を、５０分の閾値時間（Ｔ時間）後に、ｌｅｔ−７ｄおよびｍｉＲ−３４ｄについて（図４Ｂ）、ならびに鋳型を含有しないコントロール反応において観察した。ｍｉＲ−８０２についてのＴ時間は、約２０分から約５２分に及び、反応当たりわずか５コピーを検出し、特異的および高感度な増幅および検出を示した。
【０１１２】
成熟配列についてのｍｉＲ−８０２アッセイの特異性を、成熟ｍｉＲ−８０２およびプレｍｉＲ−８０２；成熟ｍｉＲのヘアピン前駆体のインビトロの転写物において試験した。成熟プロセシングされたｍｉＲＮＡは、それらのヘアピン前駆体とは異なる細胞機能を有するため、それらは検出系によって区別されるのが望ましい。標的核酸を５×１０７コピーで調製し、５コピーまで下がった１０倍の連続希釈を作製した。非標的核酸を５×１０７コピーで調製し、５コピーまで下がった１０倍の連続希釈を作製した。ネガティブコントロールは水であった。増幅反応は三連で行い、１つの標的核酸および１つの非標的核酸をそれぞれ等量で含む。図４に示されるように、ｍｉＲ−８０２アッセイは、各種の５０〜５００コピーの間で差異検出を有し、その対応するヘアピン前駆体からの、成熟ｍｉＲ−８０２鋳型の優れた識別を示した。増幅および検出オリゴマーおよび方法により、関連しない非標的核酸の存在および前駆体核酸分子の存在下における、高感度および特異的結果がもたらされる。
【０１１３】
ｍｉＲＮＡファミリーメンバーは、１つまたは複数のヌクレオチドによって配列が異なりうるため、発明者等は、次に、関連非標的核酸に対する発明者等のリアルタイムＴＭＡアッセイの配列特異性を示すように系を設計した。ｍｉＲ−３４ｂを特異的に検出するためのリアルタイムＴＭＡアッセイを、ｍｉＲ−３４ファミリーメンバーであるｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｃおよび他の非標的ｍｉＲＮＡであるｌｅｔ−７ｄに対して試験した。標的核酸は次のようであった：それぞれ配列番号２９、配列番号３５、配列番号３６および配列番号２７。増幅および検出オリゴマーは、配列番号９、１５、２０および２１であった。標的核酸を５×１０７コピーで調製し、５コピーまで下がった１０倍の連続希釈を作製した。ネガティブコントロールは水であった。増幅反応は三連で行い、１つの標的または非標的核酸を含む。図５および表６に示されるように、ｍｉＲ−３４ｂアッセイは、合成成熟ｍｉＲＮＡファミリーメンバーであるｍｉＲ−３４ａおよびｍｉＲ−３４ｃならびに関連しないｍｉＲＮＡであるｌｅｔ−７ｄと比較して、ｍｉＲ−３４ｂ合成ｍｉＲＮＡ鋳型を用いて、反応につき５×１０７インプットコピーで、約２０分で鋳型依存的増幅を示した。いくつかの交差反応性が、約４２分で、関連種であるｍｉＲ−３４ｃの反応につき５×１０７で見られ（図５Ｂ）、これは、バックグラウンドシグナルが、鋳型のないコントロール反応において検出されたおよその時間である（約４５分）。したがって、ｍｉＲ−３４ｂ種についてのこのアッセイの分析的感度は、関連標的核酸の存在下において、反応につき５０，０００コピーより少なかった。増幅および検出オリゴマーおよび方法により、関連非標的核酸の存在下での、高感度および特異的な結果がもたらされる。
【０１１４】
【表６−１】
2012509675.tif 000015
【０１１５】
【表６−２】
2012509675.tif 000016
密接関連ファミリーメンバー間を識別する必要は、診断アッセイに高く望まれる。上記のデータは、本組成物および方法により、関連しない標的核酸、関連前駆体核酸および関連成熟ｍｉＲの存在下において、約５から約５０００コピーの標的核酸からの感度を有する高度選択的アッセイがもたらされることを示す。関連核酸分子の存在下においてこの性能を改善するために、３’エクステンダープライマーの長さを増大させた。いくつかの場合において、これは、おそらくＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドとの増加した配列オーバーラップのために、上昇したバックグラウンドシグナルをもたらした（すなわち、非特異的増幅をもたらす）。標的核酸を特異的にハイブリダイズおよび単離するために、標的捕捉オリゴマーを使用することにより、アッセイの感度および特異性がさらに改善される。
【０１１６】
これらのアッセイの特定の利点は、新鮮であるかまたは凍結した組織に加えて、ＦＦＰＥ片を、便利な輸送および／または貯蔵のために、ＳＴＭに直接的に置けることである。ｍｉＲＮＡ標的を、次いで追加のＲＮＡ精製なしに、ＳＴＭ緩衝液から直接的に特異的に捕捉することができる。
【０１１７】
（実施例８：診断パネルについてのｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２）
いくつかのｍｉＲＮＡは、発明者等のマイクロアレイアッセイにおいて決定した、それらの相対発現レベルに基づいて、優先順位を付けた（実施例６）。上位の候補を、染色体位置、予測した生物学的コンテクストおよび公表された研究などの基準においてさらに選択した。実施例６において、発明者等は、ヒト前立腺がん異種移植片のｍｉＲＮＡプロファイルを試験して、どのｍｉＲＮＡが、中程度から高い存在量で検出され、どれが正常な前立腺組織と比較して異なって発現したかを決定した。この分析に基づいて、発明者等は、ｍｉＲ−８０２が、異種移植片において高度に発現せず、正常試料と腫瘍試料との間で異なって発現しなかったと結論付けた。対照的に、発明者等は、高い発現レベルを示し、および／または異種移植片において異なって発現したいくつかのｍｉＲＮＡを同定した。これらの４つのｍｉＲＮＡ、すなわちｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−１８２を、リアルタイムＴＭＡアッセイを用いる、検出のために選択した。驚くことに、ｍｉＲ２２１およびｍｉＲ２２２は、全異種移植片にわたって高い発現を示したが、正常な組織と比較して、前立腺腫瘍組織において強く下方制御された（Ｓｉｖａら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ（２００９年）、８巻：１７頁を参照されたい）。標的核酸は次のようであった：配列番号３８（ｍｉＲ−２１）、配列番号４１（ｍｉＲ−１８２）、配列番号４４（ｍｉＲ−２２１）および配列番号４７（ｍｉＲ−２２２）。増幅および検出オリゴマーは次のようであった：ｍｉＲ−２１については配列番号８、１４、２０、２１；ｍｉＲ−１８２については１０、１６、２０、２１；ｍｉＲ−２２１については配列番号１１、１７、２０、２１；およびｍｉＲ−２２２については１２、１８、２０、２１。標的核酸を５×１０７コピーで調製し、５コピーまで下がった１０倍の連続希釈を作製した。ネガティブコントロールは水であった。増幅反応は三連で行い、１つの標的核酸を含む。図６Ａに示されるように、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−１８２は、すべて優れた分析性能を示した。第２のアッセイにおいて、ｍｉＲ−２２２、ｍｉｒ−３０ｂ（配列番号５０）およびｍｉＲ−８０２の存在下において、ｍｉＲ−２２１に対する選択性を示した。増幅および検出オリゴマーは、配列番号１１、１７、２０、２１であった。標的核酸を５×１０７コピーで調製し、５コピーまで下がった１０倍の連続希釈を作製した。非標的核酸を５×１０７コピーで調製し、５コピーまで下がった１０倍の連続希釈を作製した。ネガティブコントロールは水であった。増幅反応は三連で行い、１つの標的核酸および１つの非標的核酸をそれぞれ等量で含む。結果は図６Ｂに示し、ｍｉＲ−８０２アッセイについての発明者等の以前の実証と類似している。アッセイは、５０〜５００コピーのｍｉＲ−２２１とｍｉＲ−２２２が挙げられる非標的核酸との間で差異検出を有し、標的核酸に対する優れた識別を示した。増幅および検出オリゴマーおよび方法により、関連しない非標的核酸の存在下において、および前駆体核酸分子の存在下において、高感度および特異的な結果がもたらされる。
【０１１８】
これらのｍｉＲＮＡ、すなわちｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２についてのＴＭＡアッセイは、これらの組織から得た１０ｎｇの全ＲＮＡを用いて、正確で再現性のある定量化を示した。ＴＭＡアッセイは、関連標的核酸の存在下において、優れた特異性を示した。同様の結果が、これらのｍｉＲＮＡを、ＳＴＭ抽出した臨床ＦＦＰＥ検体および尿沈降物から直接的に検出したときにも得られた（データは示していない）。
【０１１９】
（実施例９：前立腺がん細胞株および異種移植片におけるｍｉＲＮＡコピー数）
複合体混合物からｍｉＲＮＡを捕捉および検出するための発明者等のリアルタイムＴＭＡアッセイの効率を評価するために、既知の量の合成ｍｉＲ−２２１を、溶液輸送媒体（ＳＴＭ）またはＬＮＣａＰもしくはＶＣａＰ細胞から抽出した全ＲＮＡを含有するＳＴＭ（反応につき１０ｎｇの全ＲＮＡ）のいずれかに添加した（ＬＮＣａＰまたはＶＣａＰ細胞は、低いかまたは検出できないレベルの内在性ｍｉＲ−２２１を含有することを別々に示した）。コントロール反応を、増幅試薬に直接的に添加した合成ｍｉＲ−２２１転写物を用いて（標的捕捉なしおよび追加の全ＲＮＡなしに）実行した。合成ｍｉＲ−２２１の既知のインプットコピー数についての捕捉および増幅効率は、全細胞ＲＮＡの存在または非存在において同様であり（図７Ａ、「純粋ＳＴＭ」と比較した「ＬＮＣａＰ／ＳＴＭ」および「ＶＣａＰ／ＳＴＭ」についての曲線）、組み込んだ標的捕捉および増幅／検出組成物ならびに方法により、豊富な混合した非標的核酸の集団中に存在する標的核酸についてさえ、高度に正確な検出データがもたらされることを示した。さらに、組み込んだ標的捕捉および増幅／検出は、行ったコントロール反応よりわずかに低い効率で実行し、ここで標的核酸は、増幅反応混合物中に直接的に添加した（図７Ａ、「コントロール増幅」）。したがって、組み込んだ標的捕捉および増幅／検出反応は、豊富な非標的核酸の存在下において、微量の標的核酸をも検出するための、非常に堅調な系である。
【０１２０】
市販のＴａｑＭａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイおよび上記のＴＭＡアッセイを用いて、ｍｉＲ−２２１の内在性発現レベルを、前立腺がん細胞株であるＬＮＣａＰ、ＰＣ−３、ＤＵ１４５およびＶＣａＰにおいて測定した（図７Ｂ）。発明者等は、上記に報告したように、ＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ細胞において、相対的に、低いかまたは検出できないレベルの内在性ｍｉＲ−２２１を測定した。ＴａｑＭａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイから得た結果は、ＰＣ−３細胞につき３００５コピーのｍｉＲ−２２１およびＤＵ１４５細胞につき２９３コピーを示す一方、組み込んだ標的捕捉を有するＴＭＡは、２４１４および２１５コピーを示した（図７Ｂ〜Ｃ）。データにおける違いは、標的捕捉ステップを含まなかった、市販のＲＴ−ＰＣＲでの偽陽性の結果のためである可能性があった。しかし、市販のキットについての高いポジティブな結果の背後にある機構をさらに理解するために、追加の試験を行うべきである。これらの試験も、前立腺がん異種移植片試料から単離した全ＲＮＡにおいて行った（図７Ｄ）。ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２の内在性発現レベルを、組み込んだ標的捕捉、増幅および検出を有するＴＭＡアッセイを用いて測定した。腫瘍異種移植片試料におけるｍｉＲ−２１発現についての発明者等の結果は、細胞につき５０００から３５，０００コピーの範囲のコピー数を有する正常な試料と比較して、これらの組織において約５から２５倍の上方制御を示した（図８Ａ）。がんにおけるその暗示的役割および前立腺腫瘍における、正常の前立腺試料と比較して高い発現レベルのため、ｍｉＲ−２１は、正常な組織から腫瘍を識別するのに価値を有しうる。これらの結果は、ｍｉＲ−１８２が、正常な試料と比較して、大多数の腫瘍組織において高度に上方制御することも示した（図８Ｂ）。発明者等は、アンドロゲン依存的およびアンドロゲン非依存的異種移植片株の３つのマッチした対（ＬｕＣａＰ２３．１／２３．１ＡＩ、３５／３５Ｖおよび９６／９６ＡＩ、図８Ｂ）において、ｍｉ−２２１またはｍｉＲ−２２２発現における有意な差を観察しなかった。患者のコア生検、すなわち転移性リンパ節検体および非悪性前立腺組織における、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２についての発現レベルは、これらのｍｉＲＮＡが、浸潤性前立腺がんと関連しうることを示唆する。これらのおよび他の観察に基づいて、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２は、転移性サブタイプを識別するための有望なバイオマーカー候補のようである。
【０１２１】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年7月27日(2011.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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