(57)【要約】本発明は、初期段階の皮膚腫瘍の予防的又は治療的処置に使用するためのＴＧＦ−β１阻害ペプチドであって、ジシターチド又はその誘導体であるペプチドに関し、また上記使用のために治療上有効な量の該ペプチドを含む薬学的組成物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
初期段階の皮膚腫瘍の予防的又は治療的処置における使用のためのＴＧＦ−β１阻害ペプチドであって、ジシターチド又はその誘導体であるペプチド。
【請求項２】
初期段階の皮膚腫瘍の予防的又は治療的処置におけるその使用のためのジシターチド。
【請求項３】
皮膚乳頭腫の発生及びその癌への進行の阻害剤として使用される請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
日光性角化症の予防的又は治療的処置に使用される請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の治療上有効な量のペプチドを、少なくとも一の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と一緒に含有する、初期段階の皮膚腫瘍の予防的又は治療的処置における使用のための薬学的組成物。
【請求項６】
ヒトを含む哺乳類の初期段階の皮膚腫瘍の予防的又は治療的処置のための医薬の製造のにおける請求項１又は２に記載のペプチドの使用。
【請求項７】
皮膚乳頭腫の発生及びそれらの癌への進行を阻害する医薬の製造のための請求項１又は２に記載のペプチドの使用。
【請求項８】
日光性角化症の予防的又は治療的処置のための医薬の製造における請求項１又は２に記載のペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は初期段階の皮膚腫瘍の予防的又は治療的処置に関する。より具体的には、本発明は初期段階の皮膚腫瘍の予防的又は治療的処置のために、好ましくは局所適用によるＴＧＦ−β１阻害ペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚癌は皮膚の確定した細胞型の悪性腫瘍であり、太陽の放射は最も良く知られた原因の一つであるが、多くの原因を持ちうる。皮膚癌は一般的に皮膚の最外層である上皮に発生するが、真皮にもまた局在しうる。皮膚癌の最も良く起こる種類は、基底細胞癌（ＢＣＣ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）及びメラノーマである。基底細胞癌はゆっくり成長する傾向があり、めったに広がらない。扁平上皮癌は通常は基底細胞癌より侵襲性が強く、体の他の部位へより広がりやすい。最も危険な種の皮膚癌はメラノーマであり、とりわけ悪性メラノーマは早期に治療しないと命に関わりうる。皮膚癌は最も早く成長する癌の一つであり、肺、乳房、結腸直腸又は前立腺の癌の症例数を超えている。
【０００３】
トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）は、細胞増殖、分化、アポトーシス、組織リモデリング及び血管新生などの、様々な細胞プロセスを制御する多機能サイトカインである。
【０００４】
遺伝子改変マウスの様々な実験モデル(W. Cui等, "TGFbeta1 inhibits the formation of benign skin tumors, but enhances progression to invasive spindle carcinomas in transgenic mice", Cell 1996, vol. 86, pp. 531-542)は、培養角化細胞のインビトロ研究にて補完され(G. Portella 等, "Transforming growth factor beta is essential for spindle cell conversion of mouse skin carcinoma in vivo: implications for tumor invasion", Cell. Growth. Differ. 1998, vol. 9, pp. 393-404)、ＴＧＦ−β１が皮膚の発癌において２つの機能を有していることを示唆している。腫瘍発生の初期段階において良性腫瘍の形成の抑制因子として、また発癌の最終段階での悪性進行のトリガーとして双方に働き、浸潤及び転移を促進する(R.J.Akhurst等, "Genetic events and the role of TGF beta in epithelial tumour progression", J. Pathol. 1999, vol. 187, pp. 82-90)。従って、発癌の最終段階における本因子の阻害は、悪性進行に対する抑制効果を有していると期待されるべきであり、一方腫瘍増殖の初期段階でのその阻害は良性腫瘍の形成及びそれらの悪性癌への進行を刺激する効果を有しているはずである。
【０００５】
国際公開第００／３１１３５号公報はＰ１４４ペプチド（その国際一般的名称はジシターチド（ｄｉｓｉｔｅｒｔｉｄｅ），配列番号：１である）を最初に記述している。それはこのペプチドが肝臓疾患、より具体的には肝線維症の治療にどのように使用されうるかをも記述している。
【０００６】
国際公開第０７０４８８５７号公報は、免疫応答の調節剤としての、及び癌の治療におけるジシターチドの使用を記載している。癌治療におけるジシターチドの使用は上記研究に沿っており、発癌の最終段階における悪性進行に対する該因子の刺激効果を示唆している。
【０００７】
しかしながら、現時点では、癌への進行を避けるために、早期段階にて皮膚腫瘍の予防的又は治療的処置のために局所的に適用することができ、効果的で耐容性が良好である別の治療法が必要であり続けている。
【発明の概要】
【０００８】
驚くべきことに、決定されたＴＧＦ−β１阻害ペプチドは初期段階で皮膚腫瘍の形成を阻害し、続く癌への進行もまた阻害することが見出された。とりわけ、ジシターチドはマウスにおいて乳頭腫の形成を阻害し、それらの癌への進行を遅延させることが見出された。
【０００９】
ジシターチドは進行した段階の癌の治療において有用であることが知られているが、従来技術では、早期段階での皮膚腫瘍の治療のためのジシターチドの使用に関しては何も言及されていないし示唆もされていない。
【００１０】
よって、本発明の一態様は、初期状態での皮膚腫瘍の予防的又は治療的処置における使用のためのＴＧＦ−β１阻害ペプチドに関し、ここでペプチドはジシターチド又はその誘導体である。
【００１１】
本発明の他の態様は、初期段階の皮膚腫瘍の予防的又は治療的処置での使用のための、少なくとも一種の薬学的に許容される担体、添加剤又は希釈剤と共に、上に定義されたペプチドの治療に効果的な量を含有する薬学的組成物に関する。  
【００１２】
最後に、本発明のその他の態様は、ヒトを含む哺乳類において初期段階での皮膚腫瘍の予防的又は治療的処置のための医薬の製造のための、上に定義されたペプチドの使用に関する。
【００１３】
本発明の最後の態様は、ヒトを含む哺乳類において初期段階での皮膚腫瘍、とりわけ乳頭腫又は日光性角化症を予防し又は治療する方法において、薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に、上に定義されたペプチドの治療的に効果的な量を含有する組成物の哺乳類の皮膚への適用を含む方法に関する。好ましい実施態様では、哺乳類は初期段階の皮膚腫瘍を提示し、その方法は腫瘍を治療し癌への進行を防ぐために、組成物を哺乳類の皮膚へ適用することを含む。他の好ましい実施態様では、哺乳類は皮膚腫瘍を提示せず、その方法は腫瘍を予防するために組成物を哺乳類の皮膚へ適用することを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
実施例が示すように、動物モデルとして使用されるマウスの皮膚に対して本発明に係るペプチドを局所適用すると、ＤＭＢＡ／ＴＰＡにより誘導される良性乳頭腫及びＳＣＥ双方の発生を防ぐ。従って、これらの結果は、本発明のペプチドが初期段階の乳頭腫又は日光性角化症のような皮膚腫瘍の予防又は治療に有用であることを示している。本発明のペプチドは必要であれば一般的に哺乳類の皮膚にも適用できるが、優先的に人間の皮膚に適用される。
【００１５】
この発明のＴＧＦ−β１阻害ペプチドの中で、配列番号：１の配列（ジシターチド）又はその誘導体が含まれる。ジシターチド（ペプチドの国際一般的名称はＰ１４４）は、国際公開第００／３１１３５号公報において最初に記述された。この公報に記載の通り、ＴＧＦ−β１のタイプＩＩＩ受容体（受入番号Ｑ０３１６７，ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）のアミノ酸７３０−７４３を含有する。
【００１６】
「初期段階の腫瘍」という用語は、周囲の組織を侵襲していない発生場所に限定された腫瘍、及び他の組織を侵しているが浸潤の範囲は局所に限定された腫瘍を意味する。この定義は皮膚癌を含む大部分の癌に適用できる。紫外線又は日光性角化症は皮膚癌の発生の最初期段階と考えられている。より具体的には、日光性角化症は前癌状態であり、ＳＣＣの主要な前駆体である。皮膚乳頭腫は初期段階のその他の種類の腫瘍と考えられる：それらは良性の非癌性腫瘍である。
【００１７】
「誘導体又はジシターチド」という用語は、ＴＧＦ−β１の生物学的活性を阻害する能力を維持することを条件とし、配列番号：１の配列の哺乳類のフラグメント、アナログ又はホモログを含む。ＴＧＦ−βの生物学的活性を阻害する本発明のペプチドの能力は評価することができ、必要があればＭｖ−１−Ｌｕ細胞株の増殖を阻害するアッセイ法によって定量化できる。国際公開第００／３１１３５号に記述さたように、これはバイソン肺上皮由来の細胞株で、その増殖はＴＧＦ−β１により阻害される。
【００１８】
「フラグメント」という用語はもとの配列番号：１の配列より少なくとも一アミノ酸は短く、もとの配列から、ある連続アミノ酸長、好ましくは少なくとも６残基長を含有する任意のアミノ酸配列を意味する。
【００１９】
「アナログ」という用語は、配列番号：１の一又はそれ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸に置換されたペプチドを含む。アミノ酸の保存的置換が望ましい。保存的置換とはアミノ酸がその他の生物学的に似た残基により置換される置換である。保存的置換の例は、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンのような疎水性残基を別の疎水性残基への置換、又はアルギニンとリジンの間、グルタミン酸とアスパラギン酸の間のように極性残基を別の極性残基に置換することを含む。ＴＧＦ−β１の生物学的活性を阻害するペプチドの能力が維持されている条件で、保存的置換はまた非置換アミノ酸の代わりに置換アミノ酸の使用を含む。また、配列番号：１の一又はそれ以上のアミノ酸の挿入又は欠損を有するペプチドをアナログとして含む。これらの修飾（置換、欠失又は挿入）は配列番号:１に関する特定のペプチドの相同性の度合いにより表されうる。従って、今回の発明のＴＧＦ−β１阻害ペプチドの中で、ＴＧＦ−β１の生物学的活性を阻害する能力が維持されるかぎり、ジシターチドのアミノ酸配列と少なくとも７５％相同性、好ましくは少なくとも８５％の相同性、更に好ましくはこのペプチドと少なくとも９０％の相同性を有するペプチドも含まれる。更に、本発明のペプチドは、アミノ酸の化学修飾を示しうる。配列番号：１の配列又はそのフラグメントを含有するハイブリッド又はダイマーの融合ペプチドもまたアナログとして含まれる。
【００２０】
「哺乳類のホモログ」という用語はヒト以外の種由来の同じ生物学的機能を持つペプチドを含む。従って、ジシターチドの哺乳類のホモログペプチドは、ラットのタイプＩＩＩのＴＧＦ−β１受容体（受付番号Ｐ２６３４２,ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）のアミノ酸７３１−７４２を含む、配列番号：２のペプチドＰ５４である。国際公開第００／３１１３５号によれば、ジシターチドはＰ５４ペプチドと同等である。ジシターチドとＰ５４双方のＴＧＦ−β１阻害剤としての能力は、国際公開第００／３１１３５号に記述されたとおり以前に示されている。
【００２１】
好ましい実施態様では、初期段階の皮膚腫瘍の予防的又は治療的処置に使用されるペプチドはジシターチド（配列番号：１）である。
【００２２】
好ましくは、今回の発明のペプチドは、皮膚乳頭腫の発生及び癌への進行の阻害剤として有用である。さらにより好ましくは、今回の発明のペプチドは日光性角化症の予防又は治療的処置に有用である。
【００２３】
本発明のペプチドは、国際公開第００／３１１３５号に記述されるように、例えば固相化学合成技術による従来法で得られ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製できる。もし必要あらば、それらは配列決定及び質量分析、アミノ酸分析、核磁気共鳴等により分析できる。別の方法として、本発明のペプチドは組換えＤＮＡ技術により得ることができる。
【００２４】
この発明の範囲内で、本発明のペプチドの薬学的に許容される塩が見いだされる。「薬学的に許容される塩」という用語は、金属塩又は酸添加塩を形成することに常に使用される塩を含む。塩の特質は薬学的に許容される限り重要ではない。本発明のペプチドの薬学的に許容される塩は、有機又は無機の酸又は塩基から得られる。これらの塩は当業者には良く知られた一般的な方法で得ることができる。
【００２５】
ペプチドは任意の投与経路により投与することができる。好ましくは、本発明のペプチドは局所的に投与される。
【００２６】
従って、その他の態様では、本発明は、初期段階の皮膚腫瘍の予防的又は治療的処置における使用のための、少なくとも一種の薬学的に許容される添加剤、希釈剤、担体と共に、治療に効果的な量の本発明のペプチドを含有する薬学的組成物に関する。本発明の薬学的組成物は、一又はそれ以上の本発明のペプチドを、場合によっては一又はそれ以上の別のＴＧＦ−β１阻害剤と共に含有しうる。この薬学的組成物は哺乳類の体、好ましくはヒトの体への投与に有用である。本発明の薬学的組成物は、好ましくは局所用組成物であり、例えば、ローション、ポマード、ゲル、クリーム、パッチ又はスプレーの形態を採りうる。
【００２７】
本発明の薬学的組成物に存在するペプチド又はペプチドの薬学的に許容される塩の量は幅広い範囲で変わりうる。本発明のペプチド及び／又は薬学的組成物による初期段階の皮膚腫瘍の予防的又は治療的処置のための投与量は、年齢、患者の状態、疾患又は病理学的障害の重症度、投与の経路及び頻度及びまた投与される本発明のペプチドを含む数多くの要因に依存するであろう。
【００２８】
この薬学的組成物の製造における本発明のペプチドの使用はこの発明の更なる態様である。
【００２９】
好ましい実施態様では、本発明は乳頭腫の発生及びそれらの癌への進行を阻害する医薬の製造のための本発明のペプチドの使用に関する。その他の好ましい実施態様では、本発明は日光性角化症の予防的又は治療的処置のための医薬の製造のための本発明のペプチドの使用に関する。
【００３０】
明細書及び特許請求の範囲を通じて、「含有する」という単語及びその変形は、他の技術的特徴、添加剤、成分又は工程をあえて排除しないものである。
【００３１】
当業者にとって、他の目的、利益及び発明の特徴は、部分的には明細書から、また部分的には本発明の実施から得られる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は実施例に記述したように、異なる群を代表する処置マウスの背面皮膚の画像を示す。
【実施例】
【００３３】
次の実施例は例証のために与えられるもので、それらが本発明の範囲を限定することを示唆するものではない。
【００３４】
実施例１．局所製剤の調製
一つのビヒクル局所製剤とジシターチド（３００μｇ／ｇ）を含むものを調製した。賦形剤製剤は次の成分を混合して調製した：１０％ジメチコン、４３．５％流動パラフィン、０．０２％メチルパラベン、０．０１％プロピルパラベン、０．５％セトリミド及び１．５％セトステアリルアルコール。この混合物は５０−６０℃に加熱し、１００％精製水（もまた５０−６０℃に）で乳化した。ジシターチド製剤は、事前に０．２ｍｌのジメチルスルホキシド（０．２２％ｐ／ｐ）に溶解した０．３３％ジシターチドを水に加えた混合物に水を置換した点を除いて、同様にして調製した。
【００３５】
実施例２．乳頭腫の形成及び既に確定した乳頭腫の成長及び進行へのジシターチドの影響
材料及び方法
動物
Ｈａｒｌａｎ Ｓ．Ｌ．（バルセロナ、スペイン）から入手した雌のスイスアルビノマウス（４−６週齢）を使用した。処置前に、動物は１−２週間の間、通常温度及び湿気の条件下にて１−２週間の間、適応させられた。滅菌水及び標準食餌が自由に与えられた。全ての動物実験は学会の実験動物に対する配慮と使用のためのガイドラインに沿って承認され実施された。
【００３６】
化学発癌
２段階のマウス皮膚の化学発癌のプロトコールを適用した。マウス皮膚は、新生物発生に関連した変化を研究するための実験モデルとして特定の利点を持つ上皮組織である。このプロトコールは単一用量の発癌イニシエータ、具体的には７，１２−ジメチルベンズ（α）アントラセン（ＤＭＢＡ）によるマウスの処理を含み、その後腫瘍プロモーター、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）を反復適用した。この処理は良性腫瘍の発生を引き起こす（乳頭腫）。たいていの良性乳頭腫は消滅し又は再発するが、それらのごく一部（５−１０％）は悪性扁平上皮癌（ＳＣＣ）に進行し、基底膜を貫通して下層の真皮、皮下組織及び筋肉を着実に侵す。
【００３７】
腫瘍は６−８週齢のマウスの剃毛背面皮膚に、ＤＭＢＡ（２００μｌのアセトン中に３２μｇ）の単一局所適用により誘導させた後、１２週間にわたり２００μｌのアセトン（１０−４Ｍ）中の１２．５μｇのＴＰＡにより週に２回処理した。加えて、マウスの群は、下に明記した通りに、ジシターチドを含むか又は含まないクリーム形態の局所製剤により処理した。各週、直径２ｍｍより大きい腫瘍の数が各マウスにおいて記録された。実験の終了時には、動物は麻酔をかけて死なせ（ＤＭＢＡによるイニシエーションから３２週間後）、腫瘍を１０％ホルムアルデヒドで固定し、組織学研究のためにパラフィン包埋した。
【００３８】
ジシターチドによる処理のための実験計画
ジシターチドの可能性のある腫瘍促進効果を試験するために、化学発癌の促進段階の間、ＴＰＡを、ジシターチドを含む局所製剤クリーム（群２、５匹の動物からなる）、又は賦形剤のみ（群１、５匹のマウスからなる）による処理に置き換えた。同様にジシターチドの可能性のある発癌活性を、２３週間の間２日ごとにジシターチドを反復適用することで、５匹のマウスの群において分析した。乳頭腫はイニシエーション後７−８週間あたりで発生するので、ＤＭＢＡでイニシエートされＴＰＡで促進されたマウスを、ジシターチドが皮膚癌発生を妨ぐことができるかを試験するために、更に４及び１２週間２日ごとに（それぞれ群５及び６、各々１０匹の動物）ジシターチドで処理した。ジシターチドによる処理は、マウスがＤＭＢＡ（０週）によりイニシエートされたのと同じ週に開始し、これ及びＴＰＡの適用は１日おきに実施した。コントロールとして、マウスの一群（群４，５匹の動物からなる）は賦形剤のみ（コントロールクリーム）で１２週間処理した。最後に、腫瘍を持つ動物の一群（群７，１０匹の動物からなる）はＤＭＢＡによるイニシエーション後１２週から３２週の２０週間２日ごとにジシターチドで処理した。この群のマウスは本ペプチドによる可能性のある抗腫瘍効果を試験するために含めた。ジシターチドは、ジシターチドの用量を１２０μｇ（クリーム４００μｌ中）まで増加させた群７のマウスを除いて、クリームとして局所製剤２００μｌ中６０μｇの用量で適用した。
【００３９】
結果
マウスの群は単一用量のＤＭＢＡでのイニシエーションによる化学皮膚発癌にさらされた後、１２週間にわたりＴＰＡで週２回促進した。この処理はＤＭＢＡによるイニシエーション後８週間から複数の乳頭腫の発生を引き起こした。加えて、動物の二つの群はＤＭＢＡが開始されたのと同じ日に開始し（それぞれ群５及び６）、ジシターチドを含有する皮膚クリームで４及び１２週間２日ごとに処理した。双方の場合、イニシエーション後１０及び１４週後に見られたように（表１，図１）、未処理のマウス（群３）又は賦形剤のみで処理されたマウス（群４）よりも、３０−６０％少ない良性乳頭腫が発生した。興味深いことに、ジシターチドによるより短期間の処理（４週間）は乳頭腫の数及び大きさを阻害することに対してより大きな効果があった。
【００４０】
我々はまたジシターチドが発癌プロモーターとしてＴＰＡと置換できるかを試験した。この目的のために、ＤＭＢＡでイニシエートされたマウスはジシターチドを含有するクリーム又は賦形剤のみで１２週間（それぞれ群１及び２）促進された。期待された通り、これらの群では、イニシエーション後３０週で双方とも自発的に小さな腫瘍（＜直径５ｍｍ）を発生した賦形剤のみで促進された群１の２匹のマウスを除いて、腫瘍は誘導されなかった（表１）。ジシターチドは２０週間以上２日ごとの反復適用後、正常な皮膚に対して悪影響を示さなかった（データ示さず）。これらの結果はジシターチドの局所クリーム製剤としての皮膚への適用は、発癌をイニシエート又は促進できないことを示している。反対にジシターチドの局所適用は化学皮膚発癌に対する保護効果を有している。
【００４１】
既に確定した乳頭腫の発生及び進行に対するジシターチドの影響を分析するために、マウスの一群（群７））を含めて、Ｐ１４４の適用を、個々のマウスが平均７−８乳頭腫を持っていた時であって（表１）、ＤＭＢＡでイニシエーション後１２週に開始し、２０週間続けた。この群では、乳頭腫の数又は大きさに有意な減少は観察されなかった。実はイニシエーション後１４週は、マウスあたりの直径＞２ｍｍの腫瘍の平均数が、全ての群において均等傾向であった（表１）。同じことが直径＞５ｍｍの腫瘍の平均数について起こった（表２）。しかしながら、イニシエーション後３２週は、直径＞２ｍｍ及び＞５ｍｍ双方の腫瘍の数は、一般的にジシターチドで処理した群においてより低かった。再び、最も著しい減少はイニシエーション後４週間処理された群に観察された（表１及び２）。
【００４２】
初期の乳頭腫は一般に小さく（図１参照）、しかし大きくなるにつれて狭い又は広い底のどちらかを持つカリフラワー様の構造をとる。ＳＳＣは、一方通常は潰瘍面を持つ平板として存在する内生腫瘍である。これらの特徴に基づいて、我々は毎週おのおののマウスに癌の存在を調べた。表３に示したように、コントロールマウス（群３及び４）及びジシターチドで４週間処理したマウス（群５）において最初に観察可能な癌は、イニシエーション後１７−１８週に起こった。特記すべきは、処理開始時点で乳頭腫をもっていて、１２−３２週の間ジシターチドで処理したマウス（群７）は、癌の最初の発生に１４週間の遅延を示した。イニシエーション後ジシターチドで１２週間処理したマウスは（群６）、より短い約６週間の遅延を有した。これらの結果は皮膚へのジシターチドの局所適用は、腫瘍形成を妨げるだけでなく悪性転換を延期することを示している。
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【００４３】
マウスにおける上記結果は、ジシターチドが化学的な皮膚発癌を保護することができることを示している。ＴＰＡでの腫瘍の促進中にジシターチドを皮膚へ局所適用すると、良性乳頭腫の早期出現を減じた。加えて、ジシターチドを含有する局所製剤を腫瘍の表面に直接適用した場合には、乳頭腫から悪性癌へのその転換が遅延した。これらの結果は、皮膚癌の出現に対するジシターチドの保護効果を示している。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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