(57)【要約】  バイオマス等に由来する好適な単糖類またはオリゴ糖、および様々なアルデヒドおよび／またはケトンを、生物燃料などのコモディティケミカルに変換するための、方法、酵素、組換え微生物および微生物系を提供する。また、本明細書中に記載される方法により生産されるコモディティケミカルを提供する。さらに前記コモディティケミカルによって品質が工場する、精錬所で生産される石油製品、およびその製造方法を提供する。【選択図】図１
2012511908.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コモディティケミカルまたはその中間体を生産する方法であって、アルデヒド、ケトン、またはその両方の供与源で、組換え微生物を増殖させることを含み、
前記組換え微生物が、
（ｉ）アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチド、および
（ｉｉ）アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つが外来性で、
それによって、コモディティケミカルまたはその中間体を生産することを特徴とする、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記コモディティケミカルまたはその中間体が、下記式から選択され、
2012511908.tif 000018
式中、Ｒ１は、ＣＨ３ＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２、およびＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２からなる群から選択され、
Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ、ＣＨ３ＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２、およびそれらから生産される任意の対応するアルカン類からなる群から選択され、
ここで、ｎが０〜３０であることを特徴とする、方法。
【請求項３】
前記コモディティケミカルが、さらに、酵素的または化学的に、対応するアルカンに変換されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記コモディティケミカルが、３−ヒドロキシ−２、２、４、トリメチルペンタナール、および２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオールからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオールが、さらに、酵素的または化学的に、２，２，４−トリメチルペンタンに変換されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記コモディティケミカルが、３−ヒドロキシ−２−エチルヘキサナール、２−エチル−２−ヘキセン−１−アール、２‐エチルヘキサナール、および２−エチルヘキサノールからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記コモディティケミカルが、さらに、酵素的または化学的に、２−エチルヘキサンに変換されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記コモディティケミカルが、３−ヒドロキシ−２−ブチル−１−オクタノール、２−ブチル−２−オクテン−１−アール、２−ブチル−オクタナール、および２−ブチル−オクタノールからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。  
【請求項９】
前記２−ブチル−オクタノールが、さらに、酵素的または化学的に、２−ブチル−オクタンに変換されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、アルデヒド、ケトン、またはその両方の前記供与源が、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、グルタールアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、２−メチル−ブチルアルデヒド、３−メチル−ブチルアルデヒド、４−メチルペントアルデヒド、ヘキサンアルデヒド、オクタンアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、２−フェニルアセトアルデヒド、２−（４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、２−インドール−３−アセトアルデヒド、５−アミノ−ペントアルデヒド、コハク酸セミアルデヒド、およびスクシナート４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド生合成経路、およびそれらの組み合わせから選択されるアルデヒドおよび／またはケトン生合成経路を含む組換え微生物であることを特徴とする、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記アルデヒドおよび／またはケトン生合成経路を含む前記組換え微生物が、請求項１の前記組換え微生物と同じであることを特徴とする、方法。
【請求項１２】
前記アルデヒドおよび／またはケトン生合成経路を含む前記組換え微生物が、請求項１の前記組換え微生物と異なることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記アルデヒドおよび／またはケトン生合成経路が、イソブチルアルデヒド生合成経路を含み、前記アルデヒドがイソブチルアルデヒドであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記アルデヒドおよび／またはケトン生合成経路が、ブチルアルデヒド生合成経路を含み、前記アルデヒドがブチルアルデヒドであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、前記アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ発現する前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、
（ｉ）配列番号５１〜８２に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％同じであるヌクレオチド配列、または、
（ｉｉ）配列番号５１〜８２に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列またはその相補配列に、中ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１６】
前記アルドラーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、配列番号２２３−２４４、２５５−２６０に示されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１つの生物学的に活性なモチーフを含むことを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、前記アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、
（ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３０、３１、３３、もしくは８３〜９６に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％同じであるヌクレオチド配列、または、
（ｉｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３０、３１、もしくは８３〜９６に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列またはその相補配列に、中ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１８】
前記アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、ＮＡＤＨ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、またはＮＡＤＰＨ結合モチーフのうち少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ＋、またはＮＡＤＰＨ結合モチーフが、Ｙ−Ｘ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２４５）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２４６）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２４７）、Ｙ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｙ（配列番号２４８）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｙ（配列番号２４９）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｙ（配列番号２５０）、Ｙ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２５１）、Ｙ−Ｘ−ＸＧ−Ｘ−Ｙ（配列番号２５２）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２５３）、およびＹ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２５４）からなる群から選択され、
ここで、Ｙはアラニン、グリシン、およびセリンから、独立に選択され、Ｇはグリシンで、Ｘは遺伝学的にコードされるアミノ酸から独立に選択されることを特徴とする、方法。
【請求項２０】
前記組換え微生物が、さらに、二重結合還元酵素活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチド、および／またはデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも一つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記二重結合還元酵素活性を有するポリペプチドをコードし発現する前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、
（ｉ）配列番号３５〜５０に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％同じである  ヌクレオチド配列、または、
（ｉｉ）配列番号３５〜５０に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列またはその相補配列に、中ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２２】
組換え微生物であって、
（ｉ）アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチド、および
（ｉｉ）アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチド
を含むことを特徴とする、組換え微生物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組換え微生物であって、前記微生物が、アルデヒド、ケトン、またはその両方の供与源を、コモディティケミカルまたはその中間体に変換することができ、前記コモディティケミカルまたはその中間体が、下記式から選ばれ、
2012511908.tif 000019
式中、Ｒ１は、ＣＨ３ＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２、および  ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２からなる群から選択され、
Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ、ＣＨ３ＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２、およびそれらから生産される任意の対応するアルカン類からなる群から選択され、ここで、ｎが０〜３０であることを特徴とする、組換え微生物。
【請求項２４】
さらに、（ｉｉｉ）アルデヒドおよび／またはケトン生合成経路をコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項２２に記載の組換え微生物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の組換え微生物であって、前記微生物が、適切な単糖類または好適なオリゴ糖を、コモディティケミカルまたはその中間体に変換することができ、前記コモディティケミカルまたはその中間体が、下記式から選択され、
2012511908.tif 000020
式中、Ｒ１は、ＣＨ３ＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２、  および  ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２からなる群から選択され、
Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ、ＣＨ３ＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２、  ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２、およびそれらから生産される任意の対応するアルカン類からなる群から選択され、ここで、ｎが０〜３０であることを特徴とする、組換え微生物。
【請求項２６】
請求項２２に記載の組換え微生物であって、アルデヒドおよび／またはケトン生合成経路をコードし発現する前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、グルタールアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、２−メチル−ブチルアルデヒド、３−メチル−ブチルアルデヒド、４−メチルペントアルデヒド、ヘキサンアルデヒド、オクタンアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、２−フェニルアセトアルデヒド、２−（４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、２−インドール−３−アセトアルデヒド、５−アミノ−ペントアルデヒド、コハク酸セミアルデヒド、およびスクシナート４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド生合成経路、およびそれらの組み合わせから選択されるアルデヒドおよび／またはケトン生合成経路を含むことを特徴とする、組換え微生物。
【請求項２７】
前記アルデヒドおよび／またはケトン生合成経路が、イソブチルアルデヒド生合成経路を含み、前記アルデヒドがイソブチルアルデヒドであることを特徴とする、請求項２６に記載の組換え微生物。
【請求項２８】
前記アルデヒドおよび／またはケトン生合成経路が、ブチルアルデヒド生合成経路を含み、前記アルデヒドがブチルアルデヒドであることを特徴とする、請求項６に記載の組換え微生物。
【請求項２９】
前記アルデヒドおよび／またはケトン生合成経路が、ヘキサンアルデヒド生合成経路を含み、前記アルデヒドがヘキサンアルデヒドであることを特徴とする、請求項６に記載の組換え微生物。
【請求項３０】
請求項２２に記載の組換え微生物であって、前記アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしかつ発現する前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、
（ｉ）配列番号５１〜８２に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％同じであるヌクレオチド配列、または
（ｉｉ）配列番号５１〜８２に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列またはその相補配列に、中ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含むことを特徴とする、組換え微生物。
【請求項３１】
前記アルドラーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、配列番号２２３〜２４４、２５５〜２６０に示されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１つの生物学的に活性なモチーフを含むことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
請求項２２に記載の組換え微生物であって、前記アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、
（ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３０、３１、３３、もしくは８３〜９６に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％同じであるヌクレオチド配列、または、
（ｉｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３０、３１、もしくは８３〜９６に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列またはその相補配列に、中ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、
を含むことを特徴とする、組換え微生物。
【請求項３３】
前記アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、ＮＡＤＨ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、またはＮＡＤＰＨ結合モチーフのうち少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３４】
請求項３３に記載の組換え微生物であって、
前記ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ＋、またはＮＡＤＰＨ結合モチーフが、Ｙ−Ｘ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２４５）、Ｙ−Ｘ−Ｘ‐Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２４６）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２４７）、Ｙ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｙ（配列番号２４８）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｙ（配列番号２４９）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｙ（配列番号２５０）、Ｙ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２５１）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２５２）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２５３）およびＹ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２５４）からなる群から選択され、
ここで、Ｙはアラニン、グリシン、およびセリンから、独立に選択され、Ｇはグリシンで、Ｘは遺伝学的にコードされるアミノ酸から独立に選択されることを特徴とする、組換え微生物。
【請求項３５】
二重結合還元酵素活性を有するポリペプチドをコードしかつ発現する少なくとも１つのポリヌクレオチド、および／またはデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項２２に記載の組換え微生物。
【請求項３６】
請求項３５に記載の組換え微生物であって、前記二重結合還元酵素活性を有するポリペプチドをコードし発現する前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、
（ｉ）配列番号３５〜５０に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％同じであるヌクレオチド配列、または
（ｉｉ）配列番号３５〜５０に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列またはその相補配列に、中ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることを特徴とする、組換え微生物。
【請求項３７】
コモディティケミカルまたはその中間体を生産する方法であって、
適切な単糖類またはオリゴ糖の供与源で、第一の組換え微生物を増殖させることを含み、前記第一の組換え微生物が、
（ｉ）アルデヒドまたはケトンの生合成経路、
（ｉｉ）アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、
前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つが外来性で、
それによって、コモディティケミカルまたはその中間体を生産することを特徴とする、方法。
【請求項３８】
前記適切な単糖類またはオリゴ糖の供与源が、炭素の唯一の供与源としてバイオマス由来の多糖類上で増殖することができる、第２の組換え微生物を含むことを特徴とする、請求項３７に記載の方法、
【請求項３９】
前記バイオマス由来の多糖類が、アルギナートおよびペクチンから選択されることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
コモディティケミカルまたはその中間体を生産する方法であって、バイオマス由来の多糖類で組換え微生物を増殖させることを含み、前記組換え微生物が、炭素の唯一の供与源としてバイオマス由来の多糖類上で増殖することができ、かつ前記組換え微生物が、
（ｉ）  アルデヒドまたはケトンの生合成経路、  
（ｉｉ）アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、
前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つが外来性で、
それによって、コモディティケミカルまたはその中間体を生産することを特徴とする、方法。
【請求項４１】
前記バイオマス由来の多糖類が、アルギナートおよびペクチンから選択されることを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
組換え微生物であって、
（ｉ）アルデヒドまたはケトンの生合成経路、  
（ｉｉ）アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、組換え微生物。
【請求項４３】
前記組換え微生が、炭素の唯一の供与源としてバイオマス由来の多糖類上で増殖することができることを特徴とする、請求項３７に記載の組換え微生物。
【請求項４４】
請求項１乃至４０のいずれか一項に記載の組換え微生物であって、前記微生物が、Escherichia coli、 Acetobacter aceti、 Achromobacter、 Acidiphilium、 Acinetobacter、 Actinomadura、 Actinoplanes、 Aeropyrum pernix、 Agrobacterium、 Alcaligenes、 Ananas comosus (M)、 Arthrobacter、 Aspargillus niger、 Aspargillus oryze、 Aspergillus melleus、 Aspergillus verulentus、 Aspergillus saitoi、 Aspergillus sojea、 Aspergillus usamii、 Bacillus alcalophilus、 Bacillus amyloliquefaciens、 Bacillus brevis、 Bacillus circulans、 Bacillus clausii、 Bacillus lentus、 Bacillus licheniformis、 Bacillus macerans、 Bacillus stearothermophilus、 Bacillus subtilis、 Bifidobacterium、 Brevibacillus brevis、 Burkholderia cepacia、 Candida cylindracea、 Candida rugosa、 Carica papaya (L)、 Cellulosimicrobium、 Cephalosporium、 Chaetomium erraticum、 Chaetomium gracile、 Clostridium、 Clostridium butyricum、 Clostridium acetobutylicum、 Clostridium thermocellum、 Corynebacterium (glutamicum)、 Corynebacterium efficiens、 Enterococcus、 Erwina chrysanthemi、 Gliconobacter、 Gluconacetobacter、 Haloarcula、 Humicola insolens、 Humicola nsolens、 Kitasatospora setae、 Klebsiella、 Klebsiella oxytoca、 Kluyveromyces、 Kluyveromyces fragilis、 Kluyveromyces lactis、 Kocuria、 Lactlactis、 Lactobacillus、 Lactobacillus fermentum、 Lactobacillus sake、 Lactococcus、 Lactococcus lactis、 Leuconostoc、 Methylocystis、 Methanolobus siciliae、 Methanogenium organophilum、 Methanobacterium bryantii、 Microbacterium imperiale、 Micrococcus lysodeikticus、 Microlunatus、 Mucor javanicus、 Mycobacterium、 Myrothecium、 Nitrobacter、 Nitrosomonas、 Nocardia、 Papaya carica、 Pediococcus、 Pediococcus halophilus、 Penicillium、 Penicillium camemberti、 Penicillium citrinum、 Penicillium emersonii、 Penicillium roqueforti、 Penicillum lilactinum、 Penicillum multicolor、 Paracoccus pantotrophus、 Propionibacterium、 Pseudomonas、 Pseudomonas fluorescens、 Pseudomonas denitrificans、 Pyrococcus、 Pyrococcus furiosus、 Pyrococcus horikoshii、 Rhizobium、 Rhizomucor miehei、 Rhizomucor pusillus Lindt、 Rhizopus、 Rhizopus delemar、 Rhizopus japonicus、 Rhizopus niveus、 Rhizopus oryzae、 Rhizopus oligosporus、 Rhodococcus、 Saccharophagus degradans、 Sccharomyces cerevisiae、 Sclerotina libertina、 Sphingobacterium multivorum、 Sphingobium、 Sphingomonas、 Streptococcus、 Streptococcus thermophilus Y-1、 Streptomyces、 Streptomyces griseus、 Streptomyces lividans、 Streptomyces murinus、 Streptomyces rubiginosus、 Streptomyces violaceoruber、 Streptoverticillium mobaraense、 Tetragenococcus、 Thermus、 Thiosphaera pantotropha、 Trametes、 Trichoderma、 Trichoderma longibrachiatum、 Trichoderma reesei、 Trichoderma viride、 Trichosporon penicillatum、 Vibrio alginolyticus、 Vibrio splendidus、 Xanthomonas、 yeast、 Yarrowia lipolytica、 Zygosaccharomyces rouxii、 Zymomonas、 およびZymomonus mobilisからなる群から選択されることを特徴とする、組換え微生物。
【請求項４５】
請求項１、３７、または４０のうちいずれか１項に記載の方法により生産される、コモディティケミカル。
【請求項４６】
請求項４５に記載のコモディティケミカル、および精錬所生産石油製品を含有することを特徴とする、ブレンドコモディティケミカル。
【請求項４７】
前記コモディティケミカルが、イソオクタン、２‐エチルヘキサンおよび２−ブチル−オクタンから選択されることを特徴とする、請求項４６に記載のブレンドコモディティケミカル。
【請求項４８】
前記精錬所生産石油製品が、ガソリン、ジェット燃料、およびディーゼル燃料から選択されることを特徴とする、請求項４６に記載のブレンドコモディティケミカル。
【請求項４９】
コモディティケミカルで富化した精錬所生産石油製品の生産方法であって、
（ａ）前記精錬所生産石油製品に、請求項１、３７、または４０のいずれかに記載の方法により生産されるコモディティケミカルをブレンドすることを含み、
それによって、前記コモディティケミカル富化精錬所生産石油製品を生産することを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、アルデヒドおよび／またはケトンを、イソオクタンのような、様々なコモディティケミカルまたは生物燃料に変換するための、組換え微生物および化学／酵素システムの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
石油は世界的に埋蔵量の減少に直面しており、地球温暖化が進む原因である温室効果ガス排出の３０％以上に寄与している。世界中で、年間８０００億バレルの輸送燃料が消費されている。ディーゼル燃料およびジェット燃料が、世界中の輸送燃料の５０％以上を占めている。
【０００３】
重要な法律が可決され、燃料生産企業は、輸送燃料の生産および使用からの炭素排出を制限または削減しなければならなくなっている。燃料生産企業は、既存のインフラ（例えば、精錬所、パイプライン、タンカー）によりブレンドし、供給し得る、本質的に同様の低炭素燃料を求めている。
【０００４】
石油のコストが上昇し、石油化学原料に対する信頼が高まっているため、化学工業はさらにマージンと価格の安定性を改善する方法を模索しており、一方で、環境フットプリントを縮小している。化学工業においては、現在の製品よりエネルギー効率、水効率、およびＣＯ２効率の良い環境に配慮した製品を開発するための努力が行われている。バイオマスのような生物源から生産された燃料は、その過程の一面を表わしている。
【０００５】
バイオマスを生物燃料に変換する現行の方法の多くが、リグノセルロース系バイオマスの使用に重点を置いている。しかし、この方法の使用には、付随する問題が多い。リグノセルロース系バイオマスを大規模開発するには、相当な量の耕地が必要である。そしてそれは、食用作物生産の代わりにエネルギー用作物生産や森林伐採を行い、さらに現在未開の土地を新たに耕作することによってのみ達成することができる。さらに、別の問題として、水の供給が少なくなり、水質が低下していることや、殺虫剤や肥料の使用が増えていることがある。
【０００６】
生物システムを使用するリグノセルロース系バイオマスの分解は、その本質的な機械的強度および複雑な化学成分のため、重要な課題となっている。リグノセルロースを単糖に変換するためには、約３０種類もの様々な酵素が必要である。この複雑なアプローチに取って代わる唯一の方法においては、相当量の熱、圧力および強酸が必要である。したがって、当該技術には、バイオマスを、生物燃料またはバイオガソリンとして使用する炭化水素に変換するための、経済的で、技術的に単純な方法が必要である。米国特許出願第１２／２４５，５３７号および同第１２／２４５，５４０には、バイオマスから様々な生物燃料を生産するための組換え微生物の使用、および、バイオマス由来の糖類からブチルアルデヒドやイソブチルアルデヒドといった様々なアルデヒドを生産するための、このような組換え微生物の使用が記載されている。
【０００７】
イソオクタンとして知られている２，２，４−トリメチルペンタンは、オクタン価参照で１００ポイントを規定するオクタン異性体である。イソオクタンは、ガソリンの重要な成分である。イソオクタンは、しばしば、関連する炭化水素との混合物として、石油産業において大量生産されている。イソオクタンを生産するため、石油産業は、典型的にはアルキル化プロセスに依存している。これは、強酸触媒を使用して、イソブチレンでイソブタンをアルキル化するものである。
【０００８】
その上、既存の石油備蓄は、オクタン含有量が低いため、ガソリン用としてはますます有用性が低くなっており、オクタンを追加する能力があれば、現在の石油備蓄の有用性を高めることができる。したがって、当技術分野では、イソオクタンおよびその他の関連する生物燃料を生産するための、環境にやさしく、技術的に簡便な方法を必要としている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願第１２／２４５，５３７号
【特許文献２】米国特許出願第１２／２４５，５４０号
【発明の概要】
【００１０】
本発明の実施形態は、一般に、コモディティケミカルまたはその中間体を生産する方法に関する。この方法は、アルデヒド、ケトン、またはその両方の供与源によって、組換え微生物を増殖させることを含む。そして、この組換え微生物は、（ｉ）アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチド、および（ｉｉ）アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドの少なくとも１つが外来性で、それによって、コモディティケミカルまたはその中間体を生産する。
【００１１】
ある実施形態では、このコモディティケミカルまたはその中間体は、下記式から選択される。  
2012511908.tif 000003
（式中、Ｒ１は、ＣＨ３ＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２、およびＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２からなる群から選択され、Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ、ＣＨ３ＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２からなる群から選択され、ｎは０〜３０である。）
【００１２】
ある実施形態では、このコモディティケミカルはさらに、酵素的または化学的に、対応するアルカンに変換される。
【００１３】
ある実施形態では、このコモディティケミカルが、３−ヒドロキシ−２、２、４、トリメチルペンタナール、および２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオールからなる群から選択される。ある実施形態では、この２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオールはさらに、酵素的または化学的に、２，２，４−トリメチルペンタンに変換される。
【００１４】
ある実施形態では、このコモディティケミカルは、３−ヒドロキシ−２−エチルヘキサナール、２−エチル−２−ヘキセン−１−アール、２‐エチルヘキサナール、および２−エチルヘキサノールからなる群から選択される。ある実施形態では、２−エチルヘキサノールはさらに、酵素的または化学的に、２−エチルヘキサンに変換される。
【００１５】
ある実施形態では、このコモディティケミカルは、３−ヒドロキシ−２−ブチル−１−オクタノール、２−ブチル−２−オクテン−１−アール、２−ブチル−オクタナール、および２−ブチル−オクタノールからなる群から選択される。ある実施形態では、この２−ブチル−オクタノールは、さらに、酵素的または化学的に、２−ブチル−オクタンに変換される。
【００１６】
ある実施形態では、アルデヒド、ケトン、またはその両方の供与源は、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、グルタールアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、２−メチル−ブチルアルデヒド、３−メチル−ブチルアルデヒド、４−メチルペントアルデヒド、ヘキサンアルデヒド、オクタンアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、２−フェニルアセトアルデヒド、２−（４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、２−インドール−３−アセトアルデヒド、５−アミノ−ペントアルデヒド、コハク酸セミアルデヒド、およびスクシナート４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド生合成経路、およびそれらの組み合わせから選択されるアルデヒドおよび／またはケトン生合成経路を含む組換え微生物である。
【００１７】
ある実施形態では、このアルデヒドおよび／またはケトン生合成経路を含む組換え微生物は、コモディティケミカルを産生または合成する組換え微生物と同じである。ある実施形態では、このアルデヒドおよび／またはケトン生合成経路を含む組換え微生物は、コモディティケミカルを産生または合成する組換え微生物と異なる。
【００１８】
ある実施形態では、このアルデヒドおよび／またはケトン生合成経路は、イソブチルアルデヒド生合成経路を含み、このアルデヒドはイソブチルアルデヒドである。ある実施形態では、このアルデヒドおよび／またはケトン生合成経路は、ブチルアルデヒド生合成経路を含み、このアルデヒドはブチルアルデヒドである。ある実施形態では、このアルデヒドおよび／またはケトン生合成経路は、ヘキサンアルデヒド生合成経路を含み、このアルデヒドはヘキサンアルデヒドである。
【００１９】
ある実施形態では、アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ発現する少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチドが、（ｉ）配列番号５１〜８２に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列、または、（ｉｉ）配列番号５１〜８２に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列またはその相補配列に、中ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む。ある実施形態では、アルドラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２２３−２４４、２５５−２６０に示されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１つの生物学的に活性なモチーフを含む。
【００２０】
ある実施形態では、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドは、（ｉ）  配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３０、３１、３３、もしくは８３〜９６に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列、または、（ｉｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３０、３１、もしくは８３〜９６に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列またはその相補配列に、中ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む。ある実施形態では、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、ＮＡＤＨ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、またはＮＡＤＰＨ結合モチーフのうち少なくとも１つを含む。ある実施形態では、このＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ＋、またはＮＡＤＰＨ結合モチーフが、Ｙ−Ｘ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２４５）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２４６）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２４７）、Ｙ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｙ（配列番号２４８）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｙ（配列番号２４９）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｙ（配列番号２５０）、Ｙ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２５１）、Ｙ−Ｘ−ＸＧ−Ｘ−Ｙ（配列番号２５２）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２５３）、およびＹ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２５４）からなる群から選択され、ここで、Ｙはアラニン、グリシン、およびセリンから、独立に選択され、Ｇはグリシンで、Ｘは遺伝学的にコードされるアミノ酸から独立に選択される。
【００２１】
ある実施形態では、この組換え微生物は、さらに、二重結合還元酵素活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチド、および／またはデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、この二重結合還元酵素活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号３５〜５０に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列、または、（ｉｉ）配列番号３５〜５０に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列またはその相補配列に、中ストリンジェンシー条の件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む。
【００２２】
本発明の実施形態はまた、一般に、組換え微生物に関する。この組換え微生物は、（ｉ）アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチド、および（ｉｉ）アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。
【００２３】
ある実施形態では、この微生物は、アルデヒド、ケトン、またはその両方の供与源を、コモディティケミカルまたはその中間体に変換することができる。ここで、このコモディティケミカルまたはその中間体は、下記式から選ばれる。  
2012511908.tif 000004
（式中、Ｒ１は、ＣＨ３ＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２、および  ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２からなる群から選択され、Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ、ＣＨ３ＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２からなる群から選択され、ｎは０〜３０である。）
【００２４】
ある実施形態では、この組換え微生物は、さらに、（ｉｉｉ）アルデヒドおよび／またはケトン生合成経路をコードし発現する少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、このアルデヒドおよび／またはケトン生合成経路を含む微生物は、適切な単糖類または好適なオリゴ糖を、コモディティケミカルまたはその中間体に変換することができる。ここで、このコモディティケミカルまたはその中間体は、下記式から選択される。  
2012511908.tif 000005
（式中、Ｒ１は、ＣＨ３ＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２、  および  ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２からなる群から選択され、Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ、ＣＨ３ＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２からなる群から選択され、ｎは０〜３０である。）
【００２５】
ある実施形態では、アルデヒドおよび／またはケトン生合成経路をコードし発現する少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチドが、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、グルタールアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、２−メチル−ブチルアルデヒド、３−メチル−ブチルアルデヒド、４−メチルペントアルデヒド、ヘキサンアルデヒド、オクタンアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、２−フェニルアセトアルデヒド、２−（４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、２−インドール−３−アセトアルデヒド、５−アミノ−ペントアルデヒド、コハク酸セミアルデヒド、およびスクシナート４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド生合成経路、およびそれらの組み合わせから選択される経路を含む。
【００２６】
ある実施形態では、アルデヒドおよび／またはケトン生合成経路は、イソブチルアルデヒド生合成経路を含み、このアルデヒドはイソブチルアルデヒドである。ある実施形態では、このアルデヒドおよび／またはケトン生合成経路は、ブチルアルデヒド生合成経路を含み、このアルデヒドはブチルアルデヒドである。ある実施形態では、このアルデヒドおよび／またはケトン生合成経路は、ヘキサンアルデヒド生合成経路を含み、このアルデヒドはヘキサンアルデヒドである。
【００２７】
ある実施形態では、アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしかつ発現する少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号５１〜８２に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％同じであるヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号５１〜８２に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列またはその相補配列に、中ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む。ある実施形態では、アルドラーゼ活性を有するこのポリペプチドは、配列番号２２３〜２４４、２５５〜２６０に示されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１つの生物学的に活性なモチーフを含む。
【００２８】
ある実施形態では、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３０、３１、３３、もしくは８３〜９６に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％同じであるヌクレオチド配列、または、（ｉｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３０、３１、もしくは８３〜９６に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列またはその相補配列に、中ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む。ある実施形態では、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、ＮＡＤＨ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、またはＮＡＤＰＨ結合モチーフのうち少なくとも１つを含む。ある実施形態では、このＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ＋、またはＮＡＤＰＨ結合モチーフは、  Ｙ−Ｘ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２４５）、Ｙ−Ｘ−Ｘ‐Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２４６）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２４７）、Ｙ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｙ（配列番号２４８）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｙ（配列番号２４９）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｙ（配列番号２５０）、Ｙ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２５１）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２５２）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２５３）およびＹ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号２５４）からなる群から選択され、ここで、Ｙはアラニン、グリシン、およびセリンから、独立に選択され、Ｇはグリシンで、Ｘは遺伝学的にコードされるアミノ酸から独立に選択される。
【００２９】
ある実施形態では、この組換え微生物は、二重結合還元酵素活性を有するポリペプチドをコードしかつ発現する少なくとも１つのポリヌクレオチド、および／またはデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、二重結合還元酵素活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号３５〜５０に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％同じであるヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号３５〜５０に示される少なくとも１つのヌクレオチド配列またはその相補配列に、中ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする。
【００３０】
本発明の実施形態はまた、一般にコモディティケミカルまたはその中間体を生産する方法に関する。この方法は、適切な単糖類またはオリゴ糖の供与源によって、第一の組換え微生物を増殖させることを含む。ここで、この第一の組換え微生物は、（ｉ）アルデヒドまたはケトンの生合成経路、（ｉｉ）アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドの少なくとも１つが外来性で、それによって、コモディティケミカルまたはその中間体を生産する。ある実施形態では、この適切な単糖類またはオリゴ糖の供与源は、炭素の唯一の供与源としてバイオマス由来の多糖類で増殖することができる、第２の組換え微生物を含む、ある実施形態では、このバイオマス由来の多糖類は、アルギナートおよびペクチンから選択される。
【００３１】
本発明の実施形態はまた一般にコモディティケミカルまたはその中間体を生産する方法に関する。この方法は、バイオマス由来の多糖類で組換え微生物を増殖させることを含む。ここで、この組換え微生物は、炭素の唯一の供与源としてバイオマス由来の多糖類で増殖することができ、かつこの組換え微生物は、（ｉ）アルデヒドまたはケトンの生合成経路、（ｉｉ）アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、  このポリヌクレオチドの少なくとも１つが外来性で、それによって、コモディティケミカルまたはその中間体を生産する。ある実施形態では、このバイオマス由来の多糖類は、アルギナートおよびペクチンから選択される。
【００３２】
本発明の実施形態はまた、組換え微生物に関する。この組換え微生物は、
（ｉ）アルデヒドまたはケトンの生合成経路、
（ｉｉ）アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、この組換え微生物は、炭素の唯一の供与源としてバイオマス由来の多糖類で増殖することができる。
【００３３】
ある実施形態では、この微生物は、Acetobacter aceti、 Achromobacter、 Acidiphilium、 Acinetobacter、 Actinomadura、 Actinoplanes、 Aeropyrum pernix、 Agrobacterium、 Alcaligenes、 Ananas comosus (M)、 Arthrobacter、 Aspargillus niger、 Aspargillus oryze、 Aspergillus melleus、 Aspergillus pulverulentus、 Aspergillus saitoi、 Aspergillus sojea、 Aspergillus usamii、 Bacillus alcalophilus、 Bacillus amyloliquefaciens、 Bacillus brevis、 Bacillus circulans、 Bacillus clausii、 Bacillus lentus、 Bacillus licheniformis、 Bacillus macerans、 Bacillus stearothermophilus、 Bacillus subtilis、 Bifidobacterium、 Brevibacillus brevis、 Burkholderia cepacia、 Candida cylindracea、 Candida rugosa、 Carica papaya (L)、 Cellulosimicrobium、 Cephalosporium、 Chaetomium erraticum、 Chaetomium gracile、 Clostridium、 Clostridium butyricum、 Clostridium acetobutylicum、 Clostridium thermocellum、 Corynebacterium (glutamicum)、 Corynebacterium efficiens、 Escherichia coli、 Enterococcus、 Erwina chrysanthemi、 Gliconobacter、 Gluconacetobacter、 Haloarcula、 Humicola insolens、 Humicola nsolens、 Kitasatospora setae、 Klebsiella、 Klebsiella oxytoca、 Kluyveromyces、 Kluyveromyces fragilis、 Kluyveromyces lactis、 Kocuria、 Lactlactis、 Lactobacillus、 Lactobacillus fermentum、 Lactobacillus sake、 Lactococcus、 Lactococcus lactis、 Leuconostoc、 Methylocystis、 Methanolobus siciliae、 Methanogenium organophilum、 Methanobacterium bryantii、 Microbacterium imperiale、 Micrococcus lysodeikticus、 Microlunatus、 Mucor javanicus、 Mycobacterium、 Myrothecium、 Nitrobacter、 Nitrosomonas、 Nocardia、 Papaya carica、 Pediococcus、 Pediococcus halophilus、 Penicillium、 Penicillium camemberti、 Penicillium citrinum、 Penicillium emersonii、 Penicillium roqueforti、 Penicillum lilactinum、 Penicillum multicolor、 Paracoccus pantotrophus、 Propionibacterium、 Pseudomonas、 Pseudomonas fluorescens、 Pseudomonas denitrificans、 Pyrococcus、 Pyrococcus furiosus、 Pyrococcus horikoshii、 Rhizobium、 Rhizomucor miehei、 Rhizomucor pusillus Lindt、 Rhizopus、 Rhizopus delemar、 Rhizopus japonicus、 Rhizopus niveus、 Rhizopus oryzae、 Rhizopus oligosporus、 Rhodococcus、 Saccharophagus degradans、 Sccharomyces cerevisiae、 Sclerotina libertina、 Sphingobacterium multivorum、 Sphingobium、 Sphingomonas、 Streptococcus、 Streptococcus thermophilus Y-1、 Streptomyces、 Streptomyces griseus、 Streptomyces lividans、 Streptomyces murinus、 Streptomyces rubiginosus、 Streptomyces violaceoruber、 Streptoverticillium mobaraense、 Tetragenococcus、 Thermus、 Thiosphaera pantotropha、 Trametes、 Trichoderma、 Trichoderma longibrachiatum、 Trichoderma reesei、 Trichoderma viride、 Trichosporon penicillatum、 Vibrio alginolyticus、 Vibrio splendidus、 Xanthomonas、 yeast、 Yarrowia lipolytica、 Zygosaccharomyces rouxii、 Zymomonas、 およびZymomonus mobilisからなる群から選択される。
【００３４】
本発明の実施形態はまた、一般に、本明細書に記載の方法または組換え微生物により生産されるコモディティケミカルに関する。ある実施形態は、本明細書に記載のコモディティケミカルおよび精錬所生産石油製品を含有するブレンドコモディティケミカルを包含する。ある実施形態では、このコモディティケミカルが、イソオクタン、２‐エチルヘキサンおよび２−ブチル−オクタンから選択される。ある実施形態では、この精錬所生産石油製品が、ガソリン、ジェット燃料、およびディーゼル燃料から選択される。
【００３５】
本発明はまた、コモディティケミカルで富化した精錬所生産石油製品の生産方法に関する。この方法は、（a）精錬所生産石油製品に、本明細書に記載される方法または組換え微生物により生産されるコモディティケミカルをブレンドすることを含み、それによって、このコモディティケミカルで富化された精錬所生産石油製品を生産する。
【００３６】
［関連文献とのクロスリファレンス〕
本出願は、２００８年１２月１１日付けで出願した米国仮出願第６１／１２１，８６９号に基づく優先権を主張する。この出願の全体を、参照により本明細書に援用する。  
［配列表に関する記載］
本出願に付随する配列表は、紙の写しの代わりにテキスト形式で提供され、参照として本明細書に援用される。配列表を含むテキストファイル名は、９１０１８０＿４２０ＰＣ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。このテキストファイルは、１７８ＫＢであり、２００９年１２月１１日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子提出されている。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、イソブチルアルデヒドをｉｎ  ｖｉｖｏで２，４，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオールに変換し得る典型的な経路を示す。
【図２】図２は、ＧＣ−ＭＳによって測定される、ｐＴｒｃＴＭ１５５９（Ａ）を有するＤＨ１０Ｂ株およびそのコントロール・プラスミド（Ｂ）からの３−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチルペンタナールの産生を示す。
【図３】図３は、ＧＣ−ＭＳによって測定される、ｐＴｒｃＴＭ１５５９（Ａ）を含んでいる  ＤＨ１０Ｂ株およびそのコントロール・プラスミド（Ｂ）からの２−エチル−２−ヘキセン−１−アールの産生を示す。
【図４】図４は、ＧＣ−ＭＳによって測定される、ｐＴｒｃＴＭ１５５９（Ａ）を含んでいるＤＨ１０Ｂ株およびそのコントロール・プラスミド（Ｂ）からの２−ブチル−２−オクテン−１−アールの産生を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明の実施形態は、様々なコモディティケミカルまたは生物燃料を製造する際に、組換え微生物を、様々なアルデヒドおよび／またはケトンを利用するよう改変することができる、という発見に関する。例えば、アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする、外来性の１つ以上のポリヌクレオチド、およびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする、外来性の１つ以上のポリヌクレオチドを挿入すると、微生物が、アルデヒドおよび／またはケトンを、様々なコモディティケミカルまたはその中間体に変換することが可能になり得る。ある態様では、これらのコモディティケミカルはさらに化学的または酵素的に、生物燃料を含む他のコモディティケミカルに変換されてもよい。そのような生物燃料としては、例えば、イソオクタンおよび２‐エチルヘキサンなどの中鎖から長鎖のアルカンが挙げられる。
【００３９】
ある実施形態では、本明細書中で提供される方法および組換え微生物は、様々なコモディティケミカル、特に長連から中鎖の炭化水素を製造するために利用してもよい。例えば、本発明の組換え微生物は、次の反応を触媒するために一般に利用してもよい。  
2012511908.tif 000006
（式中、Ｒ１は、ＣＨ３ＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ２、  ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２、およびＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２からなる群から選択され、Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ、ＣＨ３ＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ｎは０〜３０であり、そして、それらから生産される対応するアルカンである。）
【００４０】
典型的には、上記に例示される反応において、左から右へ数えて一番目の化学物質は、２つのアルデヒドおよび／またはケトン（同じ種類でも異なる種類でも可）の縮合により生産され、本明細書中に記載されかつ当技術分野で既知のように、アルドラーゼ活性を有する酵素によって触媒され得る。
【００４１】
このアルドラーゼ縮合ステップの後、典型的には、上記に例示した反応の第一のステップが自然に生じるが、デヒドラターゼにより触媒されてもよい。
【００４２】
第２の反応は、内在性二重結合還元酵素によって触媒され得るが、外来性二重結合還元酵素の追加によって増強されてもよい。ジオールまたはアルコールを生産する第三の反応は。本明細書中に記載され当該分野で周知のように、アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒され得る。よって、本発明の、ある組換え微生物は外来性のアルドラーゼ、そして付加的に、外来性二重結合還元酵素、および／または外来性アルコールデヒドロゲナーゼを含んでもよい。
【００４３】
上述の通り、イソオクタンとして知られている２，２，４−トリメチルペンタンは、オクタン価が１００であるオクタン異性体であるイソオクタンは、ガソリンの重要な成分である。この分子をｉｎ  ｖｉｖｏで生物学的に生産する１つの特定の例を挙げると、イソブチルアルデヒドの供与源を利用し得る組換え微生物中で、イソオクタンを生産する生合成経路を開始してもよい。ある実施形態では、イソブチルアルデヒドは、本明細書中に記載されるように、イソブチルアルデヒド生合成経路を含み、かつ、適切な単糖類またはオリゴ糖をイソブチルアルデヒドに変換することができる組換え微生物から得てもよい。
【００４４】
簡潔に述べると、イソブチルアルデヒドの供与源を問わず、本発明の組換え微生物は、イソブチルアルデヒド分子２個を縮合して３−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチルペンタナールを生成するために利用してもよく、それは、アルドラーゼ活性を有する外来性酵素を含む組換え微生物によってｉｎ  ｖｉｖｏで触媒されることが、本明細書中で示されている。ある実施形態では、３−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチルペンタナールは、次いで、アルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ）活性を有する外来性酵素を含む組換え微生物によって２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオールに容易にｉｎ  ｖｉｖｏで還元し得る。よって、ある実施形態では、アルドラーゼ酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、およびアルコールデヒドロゲナーゼ酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え微生物を、イソブチルアルデヒドの供与源から３−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチルペンタナールおよび２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオールを合成し、次いでそれらをイソオクタンに変換するのに利用してもよい。
【００４５】
イソオクタン製造の最終工程として、所望であれば、その後、２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオールを化学的方法や酵素的方法などの様々な方法によって、２，２，４−トリメチルペンタン（すなわちイソオクタン）に変換してもよい。そのような方法の１つの例として、本明細書中に記載され、かつ当該分野で周知の「水素処理法」が挙げられる。
【００４６】
アルデヒドまたはケトンをコモディティケミカルに変換する別の例としては本明細書中で提供される組換え微生物を、ブチルアルデヒド２分子を縮合して３−ヒドロキシ−２−エチルヘキサナールが生成するために利用してもよく、これは、アルドラーゼ活性を有する外来性酵素を含む組換え微生物によってｉｎ  ｖｉｖｏで触媒されることが、本明細書中で示されている。次いで、本明細書に記載のように、３−ヒドロキシ−２−エチルヘキサナールを、自然にまたは酵素的に脱水して、２−エチル−２−ヘキセン−１−アールを生成させてもよい。ある実施形態では、その後、２−エチル−２−ヘキセン−１−アールを連続的に還元して、２‐エチルヘキサナールおよび２−エチルヘキサノールを形成してもよい。前者は二重結合還元酵素によって、後者はアルコールデヒドロゲナーゼによってそれぞれ触媒される（実施例４を参照）。最終工程として、所望であれば、その後、２−エチルヘキサノールを化学的方法や酵素的方法などの様々な方法によって、当技術分野で周知であり本明細書に記載の技術を用いて、２‐エチルヘキサンに変換してもよい。
【００４７】
よって、ある実施形態では、アルドラーゼ酵素をコードする外来性の１つ以上のポリヌクレオチドおよびアルコールデヒドロゲナーゼ酵素をコードする１つ以上の外来性のポリヌクレオチドを含む組換え微生物を利用して、ブチルアルデヒドの供与源から２−エチル−２−ヘキセン−１−アールおよび２−エチルヘキサノールを合成し、それからこれらを２‐エチルヘキサンに変換してもよい。ある実施形態では、ブチルアルデヒドは、本明細書中に記載のように、ブチルアルデヒド生合成経路を含み、単糖類またはオリゴ糖をブチルアルデヒドに変換することができる組換え微生物から得てもよい。
【００４８】
本明細書中に記載の方法によれは、他の生物燃料と比較してはるかに利点が大きい生物燃料を生産することができる。特に、イソオクタンおよび中鎖から長鎖のアルカンは、エタノールやブタノールといった既存の一般的な生物燃料とくらべて多くの重要な利点を提供し、そして、将来的には、ガソリン、ディーゼル油、灯油、および重油などの石油系燃料に、長期にわたって取って代わる魅力的な燃料となる。一例として、イソオクタン、および他の中鎖から長鎖のアルカンおよびアルコールは、あらゆる石油製品およびとりわけジェット燃料中の主成分であり、従って、我々が生産するアルカンは、既存のエンジンに直接利用することができる。さらに例を挙げると、中鎖から長鎖のアルコールはエタノールよりはるかに良い燃料であり、ガソリンにほぼ匹敵するエネルギー密度を有する。上述の通り、イソオクタンはガソリンの主成分である。
【００４９】
さらに別の例として、ｎ‐アルカンは、ガソリン、ディーゼル油、灯油、および重油を含むすべての石油製品の主成分である。たとえば、Ｃ７からＣ２０以上にわたる異なる炭素鎖長のｎ‐アルカンを生産するため、組換え微生物を利用してもよい。すなわち、Ｃ７はガソリン（例えば自動車）に、Ｃ１０からＣ１５はディーゼル油（例えば自動車、列車、および船舶船）に、Ｃ８からＣ１６は、灯油（例えば航空機や船舶）およびすべての重油にというように、である。
【００５０】
本発明のある実施形態は、一般に、バイオマス由来の供給原料からイソオクタンおよびその他の中鎖から長鎖のアルカンを生産し、それによって、生物燃料の低炭素源を提供する方法に関する。例えば、バイオマスからコモディティケミカルまたは生物燃料（例えばイソオクタン）を生産する際、炭素の唯一の供与源としてペクチンまたはアルギナートなどのバイオマス由来多糖類で増殖することができる微生物などの任意の入手可能な供与源から直接、適切なバイオマス由来単糖またはオリゴ糖を最初に得てもよい。次いで、この単糖またはオリゴ糖を、アルデヒドおよび／またはケトン生合成経路を含む組換え微生物に接触させることにより、アルデヒドおよび／またはケトンに変換してもよい。
【００５１】
次いで、そのような組換え微生物が生産するアルデヒドおよび／またはケトンを、アルドラーゼ酵素およびアルコールデヒドロゲナーゼ酵素の両方を含む微生物といった本発明の組換え微生物に接触させることによって、コモディティケミカルまたは生物燃料に変換してもよい。ある実施形態では、アルデヒドおよび／またはケトン生合成経路を含む組換え微生物は、前述のアルドラーゼ酵素およびアルコールデヒドロゲナーゼ酵素を有する組換え微生物と同じでも異なっていてもよい。
【００５２】
当業者に明白なその他の用途のなかでもとりわけ、コモディティケミカルで富化した精錬所生産石油製品を生産するために、本明細書中に記載の方法および組換え微生物により生産されるコモディティケミカルおよび生物燃料を、従来の製油方法によって生産される石油製品とブレンドするための既存の精錬所において利用してもよい。この目的のため、上述の通り、燃料生産者は既存のインフラストラクチャー（精錬所、パイプライン、タンカー）によってブレンドし供給することができる実質的に同様の低炭素燃料を求めている。炭化水素として、本明細書中の方法により生産されるコモディティケミカルは、石油由来燃料と実質的に同様である、石油由来燃料からの温室効果ガスの排出量を８０％以上削減し、そのうえ、石油工業・ガス工業における既存のインフラと互換性をもつ。
【００５３】
例えば、本出願により生産されるコモディティケミカルのうち、とりわけイソオクタンのような特定のものは、ガソリン、ジェット燃料、およびディーゼル燃料といった精錬所生産石油製品、に直接ブレンドすることができる。そのような生物学的に製造されるコモディティケミカルを、ガソリン、ジェット燃料、およびディーゼル燃料用のブレンド基材として利用することによって、精錬所は温室効果ガス排出量を８０％以上削減し得る。
【００５４】
本発明を実施するにあたっては、特に反対のことを指示していない限り、当該技術分野の熟練の範囲内である、分子生物学、組換えＤＮＡテクノロジーの様々な慣用的方法を用いる。そのような方法の多くが、説明目的で、以下に記載される。そのような技術は、文献において詳細に説明される。例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, ed., 1984)を参照されたい。
【００５５】
［定義］
別段に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は本発明が属する分野の当業者が普通に理解している意味と同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同等または等価の任意の方法および材料を本発明の実施および試験に使用することができるが、好適な方法および材料を本明細書では記載する。本発明の目的のため、以下に次の用語を定義する。本明細書で参照した各文献を、参照によりその全体を本明細書に援用する。
【００５６】
本明細書で使用する冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１以上（すなわち少なくとも１つ）の、その冠詞を付した対象を文法的に指す。例えば「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つ以上の要素を意味する。
【００５７】
「約」とは、参照となる量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、重量、または長さに対し、３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％の範囲で変動する量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さを意味する。
【００５８】
「生物学的に活性のある断片」という用語は、参照となるポリヌクレオチド断片またはポリペプチド配列の断片に適用され、参照配列の活性の、少なくとも約０．１、０．５、１、２、５、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００％、またはそれ以上を有する断片をいう。
【００５９】
「参照配列」という用語は、本明細書中に記載される生物学的活性を有する、任意のポリペプチドまたは酵素（例えば、アルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、デヒドラターゼ、ジオールデヒドロゲナーゼ、二重結合還元酵素など）の、核酸がコードする配列、すなわちアミノ酸配列を一般に指し、その例としては、配列番号１〜９６および２１５〜２２２で例示されるポリヌクレオチド参照配列およびポリペプチド参照配列、さらに配列番号２２３〜２６０で例示されるモチーフ配列を含む「野生型」配列が挙げられる。参照配列としてはまた、本明細書中に記載の配列の天然の機能的変異体（すなわちオーソログまたはホモログ）が挙げられ得る。
【００６０】
本発明の範囲には、少なくとも約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、５００、６００個またはそれ以上の連続するヌクレオチド長またはアミノ酸残基長で（各数字の間のすべての整数を含めて）、かつ参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの酵素活性を有するポリペプチドを含むかまたはコードする、生物学的に活性な断片が含まれる。代表的な生物学的に活性な断片は、一般に、例えば分子内または分子間の相互作用などの相互作用に関与する。分子間相互作用は特異的結合相互作用または酵素的相互作用であってもよい。酵素的相互作用または活性の例としては、本明細書中に記載するものの中でも特に、アルドラーゼ活性、アルコールデヒドロゲナーゼ活性、デヒドラターゼ活性、リアーゼ活性、輸送体活性、イソメラーゼ活性、キナーゼ活性が挙げられる。生物学的に活性な断片は、典型的には、本明細書中に記載され当業者にも周知の、１つ以上の活性部位または酵素的／結合モチーフが含まれる。
【００６１】
「生体分子」とは、一般に、生体により産生される有機分子をいい、例えば、
タンパク質、多糖類および核酸などの大きな重合体分子（生体高分子）のほか、
一次・二次代謝産物、脂質、リン脂質、糖脂質、ステロール、グリセロ脂質、ビタミンおよびホルモンなどの小分子が挙げられる。有機分子（例えば生体分子）は主として、炭素および水素、窒素、および酸素、そして割合は低いが、リンおよび硫黄から成るが、さらにほかの要素も生体分子に組み込み得る。
【００６２】
「生体重合体」とは、一般に、反復構造単位で構成される大きな分子すなわち巨大分子をいい、典型的には、共有結合による化学的結合で連結され、生体により産生され得る。生体重合体の例としては、多糖類、核酸、およびタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
「コード配列」とは、遺伝子のポリペプチド産物のコードに寄与するあらゆる核酸配列を意味する。それに対し、「非コード配列」とは、遺伝子のポリペプチド産物のコードに寄与しない任意の核酸配列を指す。
【００６４】
本明細書の全体を通じて、文脈が別のものを要求しない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、記述された工程もしくは要素、または工程もしくは要素の群を包含するが、他のどのような工程または要素も、工程または要素の群も除外しないことを意味するということが理解されよう。
【００６５】
「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」とは、「からなる」という語句の後に続くいかなるものも含み、限定されることを意味する。したがって、「からなる」という語句は、列記される要素が必要または必須であり、他の要素は存在してはならないということを表している。
【００６６】
「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、この句の後に列記されるあらゆる要素、および記載された要素の開示において特定される活性または作用に対して干渉も寄与もしない他の要素に限定された要素を含むことを意味する。したがって、「本質的に〜からなる」という語句は、列記される要素は必要または必須であるが、他の要素は選択的であって、列記される要素の活性または作用に影響を及ぼすか否かに応じて存在することもあれば存在してもよいし、しなくてもよいということを表している。
【００６７】
「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対合則によって関連づけられたポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）をいう。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に対して相補的である。相補性は「部分的」、つまり核酸の塩基の数個のみが塩基対合則に従ってマッチするものであってもよい。または、核酸間に「完全な」または「全体的な」相補性があってもよい。核酸鎖間の相補性の度合いは、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に大きな影響を及ぼす。
【００６８】
「に対応する」または「に対応している」とは、（ａ）参照ポリヌクレオチド配列の全体、もしくは一部に対して実質的に同一、もしくは相補的であるか、またはペプチド、もしくはタンパク質のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、または（ｂ）参照ペプチド、もしくはタンパク質のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するペプチド、またはポリペプチドを意味する。
【００６９】
「誘導体」という用語は、当該技術分野で理解されるであろうように、修飾によって、例えばその他の化学的部分との結合（conjugation）（例えば、ペグ化）もしくは錯化、または翻訳後修飾技術によって、塩基配列に由来したポリペプチドを意味する。また、「誘導体」という用語には、その範囲内に、機能的に同等な分子を提供する付加、または欠失といった、親配列に加えられる変化を含む。
【００７０】
「酵素反応条件」とは、酵素の機能を可能にする環境（すなわち、温度、ｐＨ、阻害物質の欠如などの要因）において、任意の必要条件を利用できることを意味する。酵素反応性条件は、試験管内などのｉｎ  ｖｉｔｒｏでも、細胞内などのｉｎ  ｖｉｖｏでもよい。
【００７１】
本明細書で使用する、「機能」、「機能的である」などの用語は、生物学的または酵素的機能を意味する。
【００７２】
「遺伝子」とは、染色体上の特定遺伝子座を占め、かつ、転写および／もしくは翻訳調節配列、ならびに／またはコード領域および／または非翻訳配列（すなわち、イントロン、５’および３’非翻訳配列）からなる、遺伝の単位を意味する。
【００７３】
「相同性」とは、同一であるか、または保存的置換を構成するアミノ酸のパーセンテージ数をいう。相同性は、ＧＡＰ（Deveraux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395)などの配列比較プログラムによって決定してもよく、この文献を参照することにより本明細書に援用する。この方法では、本明細書中に引用されたものと類似の、または実質的に異なる配列を、アラインメント中へのギャップの挿入によって比較することが可能となり、そのようなギャップは例えば、ＧＡＰで使用される比較アルゴリズムによって決定される。
【００７４】
「宿主細胞」という用語は、本発明の任意の組換えベクターまたは単離されたポリヌクレオチドのレシピエントとなりうる、またはレシピエントとなった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞には単一の宿主細胞の子孫が含まれるが、この子孫は、自然の、偶発的または意図的な変異および／または変化が理由で元の親細胞と（形態または総ＤＮＡ相補配列において）、必ずしも完全に同一でなくてもよい。宿主細胞には、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、本発明の組換えベクターまたはポリヌクレチドによりトランスフェクト、形質転換、または感染した細胞が含まれる。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、組換え宿主細胞、組換え細胞、または組換え微生物である。
【００７５】
「単離された」とは、その天然の状態において通常それを伴う成分が、実質的に、または本質的に無い材料を意味する。例えば、本明細書で使用される「単離されたポリヌクレオチド」とは、天然に存在する状態においてその両端に位置する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、その断片に通常隣接する配列から取り出されたＤＮＡ断片をいう。あるいは、「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、本明細書で使用するように、その天然の細胞環境、および細胞の他の成分との関連から、ペプチドまたはポリペプチドの分子がｉｎ  ｖｉｔｒｏで単離および／または精製されること、つまり、それはｉｎ  ｖｉｖｏの物質が付随していないことを意味する。
【００７６】
「増強する（enhance）」「増強している（enhancing）」「増加する（increase）」、または「増加している（increasing）」とは、未改変の微生物、または異なる改変がされた微生物などの対照微生物と比較して、１つ以上の組換え微生物が、より大量の特定の産物、または分子（例えば、コモディティケミカル、生物燃料、またはその中間代謝物）を産生する能力を意味する。「増加した」量とは、典型的には、「統計的に有意な」量であり、未改変の微生物、または異なる改変がされた微生物によって産生される量の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍またはそれ以上（全ての間の整数、および少数、例えば１．５、１．６、１．７、１．８などを含めて）の増加を含み得る。増加量は、当技術分野の日頃よく使う技術によって測定してよい。例えば、コモディティケミカルの「増加」量は、論理上の最大収量に対する比率に従って測定してよい。例えば、ある実施形態では、本発明の方法が、標的分子（例えばコモディティケミカル）の産出を、理論上の最大収量の少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％まで増強し得る。ある実施形態では、この方法は、標的分子の理論上の最大収量の割合を、対照条件下または異なる条件下の同じ組換え微生物をインキュベートすることと比較して、または同様もしくは類似条件下で対照（例えば、未改変もしくは異なる改変をした）微生物をインキュベートすることと比較して、少なくとも約１０％（例えば、理論上の最大収量の約３０％から約４０％に）、１５％（例えば、約３０％から約４５％に）、２０％  、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％  増加させることを特徴としてもよい。
【００７７】
「減少させる（reduce）」という用語は一般に、診断技術における慣習的方法により測定されるように、ＮＡＤＨまたはアセテート産生などの関連する細胞性応答の「減少（decrease）」に関する。他の関連する細胞性応答（ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ）は当業者には明白である。応答の「減少」は、未改変の微生物もしくは異なる改変をされた微生物、または異なる条件下で増殖させた微生物により生じる反応と比較して「統計的に有意」な量であってよく、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％（間のすべての整数も含め）の減少であってよい。
【００７８】
「から得られる」とは、例えばポリヌクレオチド抽出物、またはポリペプチド抽出物などの試料が所望の生物体、典型的には微生物などの特定の供与源から単離されるか、またはそれに由来することを意味する。「から得られる」はまた、ポリヌクレオチド、またはポリペプチド配列が特定の生物体、もしくは微生物から単離されるか、またはそれに由来する状況を意味してもよい。例えば、ベンズアルデヒドリアーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列は、シュードモナス属などの様々な原核生物、または真核生物の微生物から単離され得る。別の例として、アルドラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列は、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritime）および大腸菌ＤＨ１０Ｂなどの様々な原核生物または真核生物の微生物から単離され得る。
【００７９】
本明細書で使用する「操作可能に連結される」という用語は、遺伝子をプロモーターの調節制御下に置き、次いでそのプロモーターが遺伝子の転写および場合により翻訳を制御することを意味する。異種プロモーター／構造遺伝子の組み合わせの構築においては、遺伝的配列またはプロモーターと、その天然の状況でそれが制御する遺伝子、すなわちその遺伝的配列またはプロモーターが由来する遺伝子との間の距離とほぼ同じである、遺伝子転写開始部位からの距離に、遺伝的配列またはプロモーターを配置することが一般に好ましい。当技術分野で公知であるように、この距離のある程度の変化は、機能の喪失を伴うことなく受け入れることが可能である。同様に、調節配列エレメントの、その制御下に配置される異種遺伝子に対する好ましい配置は、その天然の状況、すなわちその由来となる遺伝子におけるエレメントの配置によって規定される。「構成的プロモーター」は、典型的には、大部分の条件下で活性である、すなわち転写を促進する。「誘導性プロモーター」は、典型的には、特定の分子因子（例えば、ＩＰＴＧ）、または特定の環境条件（例えば、ＣＯ２濃度、栄養水準、光、熱）の存在下などの特定の状況下のみにおいて活性である。そのような条件の非存在下では、誘導性プロモーターは、典型的には、転写活性の有意なレベルにも測定可能なレベルにもならない。
【００８０】
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」、または「核酸」という記述は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＤＮＡを示す。この用語は、典型的には、リボヌクレオチド、もしくはデオキシヌクレオチドのいずれか、または修飾形態のいずれかのタイプのヌクレオチドの、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドの重合体形態をいう。この用語は、ＤＮＡの一本鎖、および二本鎖形態を含む。
【００８１】
当業者によって理解されるように、本発明のポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列、ゲノム外およびプラスミドでコードされた配列、並びにタンパク質、ポリペプチド、ペプチド等を発現するか、または発現するようにされている、より小さな改変された遺伝子セグメントを含んでもよい。このようなセグメントは、天然において単離されていても、またはヒトの手によって合成的に修飾されていてもよい。  
ポリヌクレオチドは、一本鎖（コーディングもしくはアンチセンス）であっても、二本鎖であってもよく、さらにＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくは合成）であっても、またはＲＮＡ分子であってもよい。付加的なコード配列または非コード配列が、本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよいが、必須ではない。また、ポリヌクレオチドは、その他の分子、および／または補助物質に結合していてもよいが、必須ではない。
【００８２】
ポリヌクレオチドは、天然の配列を含んでいてもよく、またはこのような配列の変異体、もしくは生物学的に機能的な等価物を含んでいてもよい。ポリヌクレオチド変異体は、更に下記に記載する通り、好ましくは、コードされたポリペプチドの酵素活性が修飾されていないポリペプチドと比較して、実質的に減弱しないように、かつ、好ましくは、コードされたポリペプチドの酵素活性が修飾されていないポリペプチドと比較して、改善される（例えば、最適化される）ように、１つ以上の置換、付加、欠失、および／もしくは挿入を含んでいてもよい。コードされたポリペプチドの酵素活性に対する効果は、一般に本明細書に記述したとおりに評価してもよい。
【００８３】
ある実施形態においては、本発明は、本明細書中に記載するなかでも特に、アルドラーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼと同一または相補的である配列の、様々な長さの連続ストレッチを含む、単離したポリヌクレオチドを提供する。この単離したポリヌクレオチドは、生物学的に活性な、短くされた酵素をコードする。
【００８４】
本出願の酵素をコードするヌクレオチド配列の例としては、完全長アルドラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ、ならびにこれらの遺伝子の完全長もしくは実質的に完全長ヌクレオチド配列の一部分、またはそれらの転写物あるいはこれらの転写物のＤＮＡコピーが挙げられる。ヌクレオチド配列の一部分が、参照ポリペプチドの生物学的活性を保持するポリペプチド部分またはセグメントをコードしてもよい。本明細書中で提供される酵素の生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列の一部は、少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００個またはそれ以上、すなわち、完全長酵素中に存在するアミノ酸のほぼ総数の連続するアミノ酸残基をコードし得る。この文脈、および本明細書中で用いられるあらゆる文脈での、「中間の長さ」とは、引用された値の中間の任意の長さ、例えば、１０１、１０２、１０３など、１５１、１５２、１５３など、２０１、２０２、２０３などを意味するということは、容易に理解されよう。
【００８５】
本発明のポリヌクレオチドは、コード配列それ自体の長さに関係なく、これらの全長がかなり変化し得るように、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、マルチクローニングサイト、その他のコードセグメント等の他のＤＮＡ配列と組み合わせてもよい。従って、ほとんど任意の長さのポリヌクレオチド断片が使用されることが考えられ、全長は、好ましくは、所定の組換えＤＮＡプロトコールで調製し易く使い易いかどうかにより限定される。
【００８６】
「ポリヌクレオチド変異体」、および「変異体」などの用語は、本明細書に記載される任意の参照ポリヌクレオチド配列または遺伝子と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、および本明細書に記述された任意の参照ポリヌクレオチド配列、または本明細書で言及した任意の遺伝子もしくはタンパク質の任意のポリヌクレオチドコード配列、さらに、以下に定義しかつ当技術分野において公知の低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または非常に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをいう。これらの用語は、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、または置換によって参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドも包含している。したがって、「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」という用語には、１つ以上のヌクレオチドが付加された、もしくは欠失した、または異なるヌクレオチドで置き換えられたポリヌクレオチドが含まれる。この点に関して、参照ポリヌクレオチドに対して突然変異、付加、欠失、および置換を含む特定の改変を加え、それにより、その改変されたポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能もしくは活性を保持したり、または参照配列と比べて活性が増加（すなわち、最適化）し得るということは、当技術分野で十分に理解されている。ポリヌクレオチド変異体は、例えば、本明細書に記載の参照ポリヌクレオチドと少なくとも５０％（および少なくとも５１％〜少なくとも９９％、ならびに間の全ての整数パーセンテージ）の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
【００８７】
また、「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」という用語は、これらの酵素をコードする天然の対立遺伝子変異体を含む。天然の変異体の例としては、対立遺伝子変異体（同じ遺伝子座）、ホモログ（異なる遺伝子座）、およびオーソログ（異なる生物体）が挙げられる。このような天然の変異体は、例えば当技術分野で既知である様々なポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーションに基づく技術を含む、周知の分子生物学技術を用いて同定および単離することができる。天然の変異体は、本明細書に記載の適切な酵素活性を有する１つ以上の遺伝子（例えば、Ｃ−Ｃリガーゼ、アルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、還元酵素、など）をコードするいかなる生物体からも単離することができる。
【００８８】
非天然の変異体は、ポリヌクレオチド、細胞、または生物体に応用される技術を含む突然変異誘発技術によって作製することができる。変異体は、ヌクレオチド置換、欠失、反転、および挿入を含むことができる。変異は、コード領域、および非コード領域のいずれか、または両方に存在することができる。ある態様において、非天然の変異体は、活性、安定性、またはその他のあらゆる望ましい特色を増大させるため、酵素を操作したりスクリーニングするなどして、特定の微生物（例えば、大腸菌）に使用するために最適化してもよい。このような変異により、（元のコードされる産物と比較して）保存的、および非保存的アミノ酸置換が生じることがある。ヌクレオチド配列については、保存的変異体は、遺伝暗号の縮重のため、参照ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする配列を含む。また、変異体ヌクレオチド配列は、例えば部位特異的突然変異誘発を用いて作製されながら、なおも生物学的に活性なポリペプチドをコードする配列といった、合成に由来するヌクレオチド配列を含む。
【００８９】
一般に、特定の参照ヌクレオチド配列の変異体は、デフォルトパラメーターを使用して、本明細書の別の箇所に記載の配列アラインメントプログラムによって決定されるように、その特定のヌクレオチド配列に対して少なくとも約３０％、４０％  ５０％  、５５％、６０％、６５％、７０％、一般に少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％〜９５％以上、更に約９７％、または９８％以上もの配列同一性を有し得る。
【００９０】
既知のアルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、二重結合還元酵素および他のヌクレオチド参照配列を、他の生物、特に他の微生物から、対応する配列および対立遺伝子を単離するために、使用してもよい。核酸配列のハイブリダイゼーション方法は、当技術分野で容易に利用可能である。他の生物からのコード配列は、本明細書中に示すコード配列との配列同一性に基づいた周知の技術に従って単離できる。そのような技術では、既知のコード配列の全体または部分が、選択された生物からクローニングしたゲノムＤＮＡ断片またはｃＤＮＡ断片（すなわちゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）の集団の中にある、他の参照コード配列に選択的にハイブリダイズするプローブとして使用される。
【００９１】
本発明ではまた、以下に記載するストリンジェンシー条件下において、基準アルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、二重結合還元酵素、もしくは他のヌクレオチド配列、またはそれらの相補配列に、ハイブリダイズする、ポリヌクレオチドを想定している。本明細書中で使用する「低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または非常に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。」という用語は、ハイブリダイゼーション、および洗浄のための条件を表す。ハイブリダイゼーション反応を行うための手引きは、Ausubel et al. “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Sections 6.3.1-6.3.6.中に見出すことができる。この文献には、水性および非水性の方法が記載されており、いずれを使用してもよい。
【００９２】
本明細書中の「低ストリンジェンシー」条件についての言及は、４２℃におけるハイブリダイゼーションについて、少なくとも約１％ｖ／ｖ〜少なくとも約１５％ｖ／ｖのホルムアミド、および少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩、並びに４２℃における洗浄について、少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩を含み、かつ包含する。また、低ストリンジェンシー条件は、６５℃におけるハイブリダイゼーションについて、１％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ  ７．２）、７％  ＳＤＳ、および室温での洗浄について、（ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ；または（ｉｉ）０．５％  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、４０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ  ７．２）、５％  ＳＤＳを含んでいてもよい。低ストリンジェンシー条件の一つの実施形態には、少なくとも約４５℃における６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）によるハイブリダイゼーションと、それに続く少なくとも５０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳにおける２回の洗浄を含む（洗浄液の温度は、低ストリンジェンシー条件について、５５℃に増加することができる）。
【００９３】
「中ストリンジェンシー」条件は、４２℃におけるハイブリダイゼーションについて、少なくとも約１６％ｖ／ｖ〜少なくとも約３０％ｖ／ｖホルムアミド、および少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩、並びに５５℃における洗浄について、少なくとも約０．１Ｍ〜少なくとも約０．２Ｍの塩を含み、かつ包含する。また、中ストリンジェンシーの条件は、６５℃におけるハイブリダイゼーションについて１％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５のＭ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ  ７．２）、７％  ＳＤＳ、および６０〜６５℃における洗浄について、（ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ；または（ｉｉ）０．５％  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、４０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ  ７．２）、５％  ＳＤＳを含んでいてもよい。中ストリンジェンシーの条件の一つの実施形態は、約４５℃にて６×ＳＳＣ中でハイブリダイゼーションと、それに続く６０℃での、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄を含む。
【００９４】
「高ストリンジェンシー」条件は、４２℃におけるハイブリダイゼーションについて、少なくとも約３１％ｖ／ｖ〜少なくとも約５０％ｖ／ｖホルムアミド、および約０．０１Ｍ〜約０．１５Ｍの塩、並びに５５℃における洗浄について、約０．０１Ｍ〜約０．０２Ｍの塩を含み、かつ包含する。また、高ストリンジェンシー条件は、６５℃におけるハイブリダイゼーションについて、１％  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ  ７．２）、７％  ＳＤＳ、および６５℃を超える温度における洗浄について、（ｉ）０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ；または（ｉｉ）０．５％  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、４０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ  ７．２）、１％  ＳＤＳを含んでいてもよい。高ストリンジェンシー条件の一つの実施形態は、約４５℃で６×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーションと、それに続く６５℃での１回以上の０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での洗浄を含む。
【００９５】
「非常に高ストリンジェンシー」条件の１つの実施形態は、６５℃で０．５Ｍのリン酸ナトリウム、７％  ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションと、それに続く６５℃での０．２×ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ中の１回以上の洗浄である、
その他のストリンジェンシー条件は、当技術分野において周知であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションの特異性を最適化するため、様々な要因を操作してよいということを認識するであろう。最終洗浄のストリンジェンシーを最適化することにより、高度なハイブリダイゼーションを保証することができる。詳細な例については、Ausubelらの上記文献の2.10.1〜2.10.16ページ、およびSambrookらの文献Current Protocols in Molecular Biology(1989)、1.101〜1.104節を参照されたい。
【００９６】
ストリンジェントな洗浄は、典型的には約４２℃〜６８℃の温度で実施されるが、当業者であれば、そのその他の温度もストリンジェント条件に適し得ることを認識するであろう。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成のための最大ハイブリダイゼーション化は、典型的にはＴｍの約２０℃〜２５℃下で生じる。Ｔｍとは、融解温度、すなわち２つの相補的ポリヌクレオチド配列が分離する温度であることは、当技術分野において周知である。Ｔｍを見積もるための方法は、当該技術分野において周知である（Ａｕｓｕｂｅｌらの上記の文献２．１０．８ページを参照されたい）。
【００９７】
一般に、完全に対合したＤＮＡの二重鎖のＴｍは、式：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−（６００／長さ）により、近似値として予測され得る（式中：Ｍは、Ｎａ＋の濃度で、好ましくは０．０１モル〜０．４モルの範囲であり；％Ｇ＋Ｃは、塩基の総数の割合としてのグアノシンおよびシトシン塩基の合計で、３０％〜７５％  Ｇ＋Ｃ間の範囲であり；％  ホルムアミドは、容積パーセントホルムアミド濃度であり；長さは、ＤＮＡ二重鎖における塩基対の数である）。二重鎖ＤＮＡのＴｍは、ランダムにミスマッチの塩基対の数が１％増加する毎に、およそ１℃ずつ下がる。洗浄は、一般に  高ストリンジェンシーでＴｍ−１５℃で、または中ストリンジェンシーでＴｍ−３０℃で行う。
【００９８】
ハイブリダイゼーション手順の一例では、固定されたＤＮＡを含む膜（例えば、ニトロセルロース膜またはナイロン膜）を、標識されたプローブを含むハイブリダイゼーションバッファー（５０％  脱イオン化ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ溶液［（０．１％フィコール、０．１％  ポリビニルピロリドン、および０．１％  ウシ血清アルブミン）、０．１％  ＳＤＳ、および２００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）中で４２℃で一晩ハイブリダイズさせる。次いで、この膜を２回連続して中ストリンジェンシー（すなわち、４５℃で１５分間の２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、５０℃で１５分間の２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ）で洗浄した後、２回連続してより高いストリンジェンシー（すなわち、５５℃で１２分間の０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、続いて６５〜６８℃で１２分間の０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ溶液）で洗浄する。上記に基づき、本明細書中に記載され当技術分野で既知のように、本発明の実施形態は、アルドラーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列などの、本明細書中に記載されたいずれの参照ポリヌクレオチド配列の相補配列にも中、高、または非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む、組換え微生物を包含する。
【００９９】
ポリヌクレオチドおよびその融合物は、当技術分野において既知で利用可能な様々な十分確立された技術のいかなるものを用いても、調製し、操作し、かつ／あるいは発現させてよい。例えば、本発明のポリペプチド、またはその融合タンパク質もしくは機能的な同等物をコードするポリヌクレオチド配列を、組換えＤＮＡ分子で使用して適切な宿主細胞における選択された酵素を直接発現させてもよい。遺伝暗号の固有の縮重に起因し、同じか、または機能的に等価なアミノ酸配列を実質的にコードするその他のＤＮＡ配列を作製してもよく、これらの配列を、特定のポリペプチドをクローニングし発現させるために使用してもよい。
【０１００】
当業者が理解するように、非天然のコドンを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を作製することが有利になる場合もあり得る。例えば、特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好まれるコドンを選択し、タンパク質発現の速度を増加させたり、あるいは、例えば、天然の配列から生成される転写物の半減期よりも長い半減期といった望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写物を生成させてもよい。このようなヌクレオチドは、典型的には「コドン最適化」といわれる。本明細書に記載のいかなるヌクレオチド配列も、このような「コドン最適化」形態に利用してよい。
【０１０１】
その上、本発明のポリヌクレオチド配列は、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、発現、および／または活性を修飾する改変を含む（それらに限定されない）様々な理由のために、ポリペプチドをコードする配列を改変するため、一般に当技術分野において既知の方法を使用して操作することができる。
【０１０２】
所望のポリペプチドを発現させるため、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または機能的な等価物を、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含むベクターに挿入してもよい。当業者に周知である方法を用いて、目的のポリペプチドをコードする配列と、適切な転写および翻訳調節エレメントと、を含む発現ベクターを構築してもよい。そのような方法としては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えが挙げられる。このような技術は  Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1989)に記載されている。
【０１０３】
目的とするポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、細胞培養物からタンパク質を発現および回収するのに好適な条件下で培養してもよい。組換え細胞により産生されるタンパク質は、配列および／または使用するベクターに応じて、分泌されても、または細胞内に含まれていてもよい。当業者が理解するように、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、コードされたポリペプチドが細胞内の所望の部位に局在するように指示する信号配列を含むよう、設計してもよい。他の組換え構築物を、目的のポリペプチドをコードする配列と、コードされたタンパク質の分泌を指図するであろうポリペプチド・ドメインをコードするヌクレオチド配列とを連結するために使用してもよい。
【０１０４】
本発明の実施形態では、コモディティケミカルを生産するための、アルドラーゼ活性、アルコールデヒドロゲナーゼ活性、二重結合還元酵素活性、または本発明に記載のその他の活性を有する、切断型、変異型および／または修飾型を含む「ポリペプチド」を含む組換え微生物の使用を想定している。「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体、並びにそれらの変異体、およびアナログをいうのに、本明細書では同義的に使用される。よって、これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の化学的アナログなどの合成非天然アミノ酸であるようなアミノ酸重合体、並びに天然アミノ酸重合体に適用される。ある態様において、ポリペプチドは、典型的には様々な化学反応を触媒する（すなわち、速度を増加させる）酵素的ポリペプチド、または「酵素」を含んでいてもよい。
【０１０５】
ポリペプチド「変異体」という記述は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、または置換によって参照ポリペプチド配列から区別されるポリペプチドをいう。ある実施態様において、ポリペプチド変異体は、１つ以上の置換によって参照ポリペプチドから区別されるが、この置換は、保存的でも非保存的でもよい。ある実施態様において、ポリペプチド変異体は、保存的置換を含む。この点に関して、いくつかのアミノ酸を、ポリペプチドの活性の性質を変えることなく広く同様の特性をもつその他のものに変えてもよいことは、当技術分野においてよく理解されている。さらに、ポリペプチド変異体は、１つ以上のアミノ酸が付加もしくは欠失され、または異なるアミノ酸残基で置換されたポリペプチドも包含する。
【０１０６】
本出願が包含する変異体タンパク質は、「生物学的に活性である」すなわち、参照ポリペプチドの酵素活性を有し続けている。そのような変異体は、例えば、遺伝的多型により生じてもよいし、または人為的操作によって生じてもよい。参照ポリペプチド配列またはその断片の生物学的に活性な変異体は、デフォルトパラメーターを使用して本明細書の別の箇所に記載した配列アラインメントプログラムによって決定されるように、参照タンパク質のための特定のアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、一般に少なくとも約７５％、８０％、８５％、通常は、９０％〜９５％以上、典型的には約９８％以上の配列類似性または同一性を有し得る。参照ポリペプチドの生物学的に活性な変異体において、そのタンパク質とのアミノ酸残基数の違いは、一般に、２００、１００、または２０という多数であってもよいし、または適切には、１〜１５，６〜１０のような１〜１０、５、４、３、２、またはわずか１という少数であってもよい。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドの参照ポリペプチド配列とのアミノ酸残基との違いは、少なくとも１つ、しかし、１５、１０，または５未満である。他の実施形態では、変異体ポリペプチドの参照配列との違いは、少なくとも１残基、しかし２０％、１５％、１０％、または５％未満である。
【０１０７】
本発明は、本明細書に記載の任意の酵素活性（例えばアルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、二重結合還元酵素など）を有する完全長ポリペプチドの変異体、これらの完全長ポリペプチドの切断型断片、切断型断片の変異体、並びにこれらに関連する生物学的に活性な断片の、本明細書に記載する方法における使用を想定している。典型的には、ポリペプチドの生物学的に活性な断片は、相互作用、例えば分子内または分子間の相互作用に関与してもよい。分子間相互作用は、特異的結合相互作用、または酵素的相互作用であってもよい（例えば、相互作用は、一過性であってもよく、共有結合が形成され、または壊される）。本明細書に記載の酵素活性を有するポリペプチド／酵素の生物学的に活性な断片は、（推定上の）完全長参照ポリペプチドのアミノ酸配列に十分に類似するか、またはそれに由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的には、生物学的に活性な断片は、少なくとも１つの酵素活性を有するドメインまたはモチーフを含み、さらに、様々な活性なドメインの１つ以上（および、場合によっては全て）を含んでいてもよい。酵素の生物学的に活性な断片は、例えば、参照ポリペプチド配列の、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４５０、５００、６００、（これらの間の全ての整数を含め）またはそれ以上の隣接するアミノ酸であるポリペプチド断片であってよい。特定の実施態様において、生物学的に活性な断片は、本明細書の別の箇所に記載され当技術分野において公知の、保存された酵素の配列、ドメイン、またはモチーフを含む。適切には、生物学的に活性な断片は、それが由来する野生型ポリペプチドの活性の約１％、１０％、２５％、５０％以上を有する。
【０１０８】
アルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、二重結合還元酵素、または他の参照ポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、短縮、および挿入を含むさまざまな方法で改変することができる。そのような操作のための方法は当技術分野において一般に既知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、ＤＮＡ中の突然変異によって調製することができる。突然変異誘発およびヌクレオチド配列の改変の方法は当技術分野において周知である。例えば、Kunkel(1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492)、Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-38２）、米国特許第4,873,192号、Watson, J. D. et al., (“Molecular Biology of the Gene”), Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987)およびそこれらの中に引用されている参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する手引きは、Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)のモデルに見出すことができる。
【０１０９】
点突然変異または短縮により作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする方法、および選択された特性を有する遺伝子産物をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、当技術分野において既知である。そのような方法は、アルドラーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼのポリペプチドのコンビナトリアル突然変異誘発によって作製された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに利用することができる。ライブラリー中の機能的突然変異体の頻度を高める手法である再帰的アンサンブル突然変異誘発（Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；  ＲＥＭ）を、ポリペプチド変異体を同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて用いることができる（Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave et al., (1993) Protein Engineering, 6: 327-331)。以下により詳細に考察するように、１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のものと交換するなどの保存的置換が望ましいかもしれない。
【０１１０】
ポリペプチド変異体は、参照アミノ酸配列と比較して、これらの配列に沿った様々な位置に保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されており、一般に以下のように下位分類することができる。
【０１１１】
酸性：この残基は生理的ｐＨでＨイオンの喪失のために負の電荷を有し、かつ、この残基は、ペプチドが生理的ｐＨの水性媒体中にある場合、内部にそれが含まれるペプチドの構造において表面の位置を求めようとして、水性溶液に誘引される。酸性側鎖を有するアミノ酸には、グルタミン酸およびアスパラギン酸が含まれる。  
塩基性：この残基は、生理的ｐＨで、またはその１つもしくは２つのｐＨ単位内で（例えば、ヒスチジン）、Ｈイオンと会合するため、正電荷を有し、かつこの残基は、ペプチドが生理的ｐＨにて水性培地中にあるときに、それが含まれるペプチドの構造において表面の位置を求めようとして、水性溶液によって引きつけられる。塩基性側鎖を有するアミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれる。
【０１１２】
荷電性：この残基は、生理的ｐＨで荷電している。従って、酸性または塩基性側鎖を有するアミノ酸（すなわちグルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リジン、およびヒスチジン）が含まれる。
【０１１３】
疎水性：この残基は、生理的ｐＨで荷電しておら、かつこの残基は、ペプチドが水性培地中にあるときに、それが含まれるペプチドの構造において内側の位置を求めようとして、水性溶液に対し反発するに。疎水性側鎖を有するアミノ酸には、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンが含まれる。
【０１１４】
中性／極性：この残基は、生理的ｐＨで荷電しておらず、残基は、ペプチドが水性培地中にあるときに、その結果それが含まれるペプチドの構造において内側の位置を求めようとして、水性溶液によって十分に引き寄せられる。中性／極性側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、システイン、ヒスチジン、セリン、およびスレオニンが含まれる。
【０１１５】
また、この説明によれば、ある種のアミノ酸は、その側鎖がたとえ極性基を有しなくても、疎水性を付与するほど十分な大きさではないため、「小型」と特徴付けられる。プロリンを例外として、「小型」アミノ酸とは、少なくとも１つの極性基が側鎖に存在する場合は炭素４個またはそれ未満、そうでない場合は炭素３個またはそれ未満のアミノ酸のことである。小型の側鎖を有するアミノ酸には、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンが含まれる。遺伝子にコードされる第二級アミノ酸であるプロリンは、ペプチド鎖の二次構造に対する既知の作用のために特殊な事例である。プロリンの構造は、その側鎖がα炭素のみならずαアミノ基の窒素にも結合しているという点で、他のすべての天然アミノ酸と異なる。しかし、いくつかのアミノ酸類似性マトリックス（例えば、Dayhoff et al., (1978), A model of evolutionary change in proteins. Matrices for determining distance relationships In M. O. Dayhoff, (ed.), Atlas of protein sequence and structure, Vol. 5, pp. 345-358, National Biomedical Research Foundation, Washington DC;およびGonnet et al., (1992, Science, 256(5062): 14430-1445によって開示されているＰＡＭ１２０マトリックスおよびＰＡＭ２５０マトリックス）においては、プロリンを、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンと同じグループに含めている。したがって、本発明の目的のため、プロリンを「小型」アミノ酸と分類する。
【０１１６】
極性または非極性としての分類をするため必要な誘引または反発の度合いは、自由に決めて構わない。したがって、本発明によって具体的に想定されているアミノ酸はそのいずれか一方に分類されている。具体的に名前が挙げられていないアミノ酸の殆どが、既知の挙動に基づき分類することができる。
【０１１７】
アミノ酸残基はさらに、残基の側鎖置換基に関する自明の分類である、環状または非環状、芳香族または非芳香族のほか、小型または大型として下位分類することができる。その残基は、別に極性置換基が存在する場合には、カルボキシル炭素を含めて全体で４個またはそれ未満の炭素原子を含む場合に小型とみなされ、置換基が存在しない場合には３個またはそれ未満を含む場合に小型とみなされる。当然ながら、小型残基は常に非芳香族である。アミノ酸残基は、その構造的特性により、２つ以上のクラスに該当することもある。天然タンパク質のアミノ酸に関し、このスキームに従う細分類を表Ａに示す。
【表１】
2012511908.tif 000007
【０１１８】
保存的アミノ酸置換もまた、側鎖に基づくグループ分けを伴う。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリンおよびトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リジン、アルギニンおよびヒスチジンであり、ならびにイオウ含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システインおよびメチオニンである。例えば、イソロイシンもしくはバリンでのロイシンの置き換え、グルタミン酸でのアスパラギン酸の置き換え、セリンでのトレオニンの置き換え、または構造的に関連したアミノ酸でのアミノ酸の同様の置き換えは、結果として生じる変異体ポリペプチドの特性に重大な影響を及ぼさないであろうと予想するのが妥当である。アミノ酸が変化した結果、機能的短縮型および／または変異体ポリペプチドが生じるか否かは、本明細書に記述したように（例えば、実施例２〜４を参照）、その酵素活性をアッセイすることによって容易に判定することができる。保存的置換を、以下の表Ｂの例示的な置換の見出しの下に示す。本発明の範囲のアミノ酸置換は、一般に、（ａ）その置換領域内のペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位の分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩、を維持するにあたり、その影響が大きくは異ならない置換を選択することにより達成される。置換が導入された後に、変異体を生物活性についてスクリーニングする。
【表２】
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【０１１９】
あるいは、保存的置換を行うための類似したアミノ酸を、その側鎖の同一性に基づき３つのカテゴリーにグループ分けすることもできる。Zubay, G., Biochemistry, third edition, Wm. C. Brown Publishers (1993)に記載されているように、第１のグループには、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジンが含まれ、これらはすべて荷電側鎖を有する。第２のグループにはグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギンが含まれ、第３のグループには、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンが含まれる。
【０１２０】
このようにして、アルドラーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼのポリペプチド中の予測される非必須アミノ酸残基が、典型的には、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、飽和突然変異誘発などによってコード配列の全体または一部に沿ってランダムに突然変異を導入し、結果として生じた突然変異体を、親ポリペプチドの活性についてスクリーニングすることで、その活性を保持している突然変異体を同定することもできる。コード配列の突然変異誘発の後に、コードされるペプチドを組換え体として発現させて、そのポリペプチドの活性を決定することができる。「非必須」アミノ酸残基とは、実施形態のポリペプチドの野生型配列から、その活性の１つ以上を消失させることも実質的に変更することもなく改変することのできる残基のことである。好適には、その改変は、これらの活性の１つを実質的に消失させず、活性が、例えば、野生型の少なくとも２０％、４０％、６０％、７０％もしくは８０％、１００％、５００％、１０００％またはそれ以上である。「必須」アミノ酸残基とは、参照ポリペプチドの野生型配列で改変した場合、その結果として、野生型活性の２０％未満が存在するように親分子の活性を消失させる残基のことである。例えば、このような必須なアミノ酸残基には、異なる種にわたって、アルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、二重結合還元酵素、またはその他の参照ポリペプチドに保存されているもの、例えば、様々な供与源からのポリペプチドの酵素部位において保存されている配列が含まれる。
【０１２１】
したがって、本発明ではまた、天然の参照ポリペプチド配列の変異体またはそれらの生物活性断片を想定しており、この変異体は、１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失、もしくは置換によって天然の配列とは区別される。一般に、変異体は、参照ポリペプチド配列に対して少なくとも約３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の類似性または配列同一性を示す。さらに、天然もしくは親配列とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上のアミノ酸の付加、欠失または置換による違いがあるものの、親ポリペプチドまたは参照ポリペプチドの特性を保持している配列が考えられる。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、変異体ポリペプチドは、アルドラーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチド配列と、少なくとも１つの、しかし５０、４０、３０、２０、１５、１０、８、６、５、４、３または２未満のアミノ酸残基が異なる。他の態様において、変異体ポリペプチドは、参照配列と、残基の少なくとも１％、しかし２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満が異なる。（この比較にアラインメントが必要であれば、類似性が最大になるように配列のアラインメントを行うべきである。欠失もしくは挿入、またはミスマッチによるループアウト配列は、差異とみなされる）
【０１２３】
ある実施形態では、変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドの対応する配列に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含み、かつその参照配列の酵素活性を有する。本明細書で用いる「配列同一性」、または例えば「に対する５０％同じ配列」を含む記述は、配列が、比較のウィンドウにわたって、ヌクレオチド単位、またはアミノ酸単位で、どの程度同一性があるかということをいう。このため、「配列一致度」は、最適にアライメントが行われた２つの配列を比較ウィンドウにわたって比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が両方の配列に存在する位置の数を決定してマッチする位置の数を得て、そのマッチする位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数（すなわち、ウィンドウのサイズ）で割り、さらに、その結果に１００を掛けて配列一致度を得ることによって算出してもよい。
【０１２４】
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列の関係を記述するために用いられる用語には、「参照配列」、「比較のウィンドウ」、「配列同一性」、「配列一致度」、および「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、長さにして、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて、少なくとも１２モノマー単位、しかししばしば１５モノマー単位から１８モノマー単位、多くの場合は少なくとも２５モノマー単位である。２つのポリヌクレオチドはそれぞれ（１）その２つのポリヌクレオチド間で類似している配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部分のみ）、および（２）その２つのポリヌクレオチド間で異なっている配列、を含みうるため、２つの（またはそれ以上の）ポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、２つのポリヌクレオチドの配列を「比較のウィンドウ」にわたって比較して、配列類似性のある局所領域を同定して比較することによって行う。「比較のウィンドウ」とは、２つの配列の最適なアラインメントを行った後に、配列が同数の隣接する位置の参照配列と比較される、少なくとも６個、通常は約５０〜約１００個、より通常は約１００〜約１５０個の隣接した位置の概念上のセグメントをいう。比較のウィンドウは、２つの配列の最適アラインメントを得るため、参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。
【０１２５】
比較のウィンドウのアラインメントを行うための配列の最適なアラインメントは、アルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）をコンピュータで実行することにより、または試験および選択した様々な任意の方法により生成される最良のアラインメント（すなわち、結果として、比較のウィンドウにわたって最も高い相同度となるということ）によって行うことができる。例えばAltschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25: 3389によって開示されているような、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラムを参照してもよい。配列解析に関する詳細な考察は、Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons Inc. 1994-1998, Chapter 15のUnit 19.3に見出される。
【０１２６】
「内在性」という用語は、一般に、遺伝的に改変されていない野生型の細胞または生物体の中に見出され得る天然のポリヌクレオチド配列またはポリペプチドをいう。例えば、ある天然の細菌、または酵母種は、典型的には、アルドラーゼ遺伝子を持たず、したがって、アルドラーゼ酵素をコードする「内在性の」ポリヌクレオチド配列は持っていない。
【０１２７】
「外来性」という用語は、一般に、野生型の細胞にも生物体にも天然には存在しないが、典型的には、分子生物学的技術、すなわち組換え微生物を作製するための改変により細胞に導入される遺伝子のコピー、ポリヌクレオチド配列もしくは核酸分子のコピー、またはポリペプチドをいう。「外来性」遺伝子またはポリヌクレオチドの例としては、所望のタンパク質もしくは酵素をコードするベクター、プラスミド、および／または人工核酸構築物が挙げられる。
【０１２８】
この点に関してまた、注意すべきは、生物体が、特定のポリヌクレオチド配列または遺伝子の内在性すなわち天然の複製を含んでいても、コードされるポリペプチドを過剰発現するか、またはさもなければその発現を調節するといった目的で、その配列をコードするプラスミドまたはベクターを導入すると、その遺伝子またはポリヌクレオチド配列の「外来性」のコピーを意味することになる、という点である。さらに、ある実施形態では、別の状況下では内在性である遺伝子またはポリヌクレオチドを、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターなどの外来性のプロモーター配列の制御下に置いて、この内在性遺伝子の発現量を増加させることは、本発明の意味の範囲内では、外来性遺伝子またはポリヌクレオチドと考えられても良い。同様に、別の条件下では内在性である遺伝子またはポリヌクレオチドに、キメラ遺伝子またはキメラポリペプチドを作製するといった目的で、非天然の配列を付加することにより修飾することも、本発明の意味の範囲内では、外来性遺伝子またはポリヌクレオチドと考えられても良い。
【０１２９】
本明細書に記載する任意の経路、遺伝子、ポリヌクレオチド、核酸分子、または酵素は、「内在性」配列を利用するか、もしくはそれに依拠してもよく、あるいは、１つ以上の「外来性」配列として提供してもよい。
【０１３０】
本発明はさらに、キメラポリペプチドまたは融合ポリペプチドを考える。本明細書で使用する、「キメラ蛋白質」、「融合タンパク質」、または「融合ポリペプチド」には、（たとえば、複合断片を作製するために）第２、第３、もしくは第４（あるいはさらにそれ以上）のポリペプチド、またはそれらの断片に結合した第１のポリペプチドが含まれてもよいが、これらに限定されない。第２、第３、または４番目のポリペプチドとは、第１のポリペプチドと同じポリペプチドを意味してもよく、この場合、その第１のポリペプチドの、ある断片を一緒に選択的に結合させる目的などのために用いられる。あるいは、第２、第３、または４番目のポリペプチドとは、典型的には、第１のポリペプチドとは異なり、かつ、同じまたは異なる生物体に由来し得るタンパク質に対応するアミノ酸配列を有する「異種ポリペプチド」を意味してもよい。ある実施形態では、融合タンパク質には、特定のポリペプチドタンパク質の少なくとも１つの（または、２、３、もしくは４以上の）生物学的に活性な部分が含まれる。融合タンパク質を構成するポリペプチドは、Ｃ末端からＣ末端方向、Ｎ末端からＮ末端方向、またはＮ末端からＣ末端方向へ連結してもよいが、典型的には、Ｎ末端からＣ末端方向への連結である。融合タンパク質のポリペプチドは、いかなる順序でもよい。
【０１３１】
ポリペプチドの活性に悪影響を及ぼさないという条件で、事実上いかなる所望の目的のためにも、融合パートナーを設計しかつ組み込んでよい。  例えば、１つの実施形態では、融合パートナーは、ネイティブ組換え型タンパク質より高い収率でそのタンパク質を発現させることを助ける配列（発現エンハンサー）を含んでもよい。他の融合パートナーは、そのタンパク質の溶解度を増加させるか、所望の細胞内区画へそのタンパク質を向けさせるか、そのタンパク質を分泌するか、または、細胞表面にそのタンパク質を繋ぎ止める目的で、選択され得る。一例として、融合タンパク質はそのＮ末端に、異種のシグナルペプチド配列を含むことができる。特定の宿主細胞では、融合ポリペプチドの分泌または細胞表面への繋ぎ止めは、１つ以上の異種のシグナルペプチド配列（典型的には、そのポリペプチドのＮ末端、またはその近傍に融合している）を使用することで、増加させることができる。
【０１３２】
「組換え」微生物は、典型的には、プラスミドまたはベクター内などに、１つ以上の外来性の遺伝子またはポリヌクレオチド配列を含む。組換え微生物として利用することができる微生物の例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。Escherichia coli、 Acetobacter aceti、 Achromobacter、 Acidiphilium、 Acinetobacter、 Actinomadura、 Actinoplanes、 Aeropyrum pernix、 Agrobacterium、 Alcaligenes、 Ananas comosus (M)、 Arthrobacter、 Aspargillus niger、 Aspargillus oryze、 Aspergillus melleus、 Aspergillus pulverulentus、 Aspergillus saitoi、 Aspergillus sojea、 Aspergillus usamii、 Bacillus alcalophilus、 Bacillus amyloliquefaciens、 Bacillus brevis、 Bacillus circulans、 Bacillus clausii、 Bacillus lentus、 Bacillus licheniformis、 Bacillus macerans、 Bacillus stearothermophilus、 Bacillus subtilis、 Bifidobacterium、 Brevibacillus brevis、 Burkholderia cepacia、 Candida cylindracea、 Candida rugosa、 Carica papaya (L)、 Cellulosimicrobium、 Cephalosporium、 Chaetomium erraticum、 Chaetomium gracile、 Clostridium、 Clostridium butyricum、 Clostridium acetobutylicum、 Clostridium thermocellum、 Corynebacterium (glutamicum)、 Corynebacterium effic
iens、 Enterococcus、 Erwina chrysanthemi、 Gliconobacter、 Gluconacetobacter、 Haloarcula、 Humicola insolens、 Humicola nsolens、 Kitasatospora setae、 Klebsiella、 Klebsiella oxytoca、 Kluyveromyces、 Kluyveromyces fragilis、 Kluyveromyces lactis、 Kocuria、 Lactlactis、 Lactobacillus、 Lactobacillus fermentum、 Lactobacillus sake、 Lactococcus、 Lactococcus lactis、 Leuconostoc、 Methylocystis、 Methanolobus siciliae、 Methanogenium organophilum、 Methanobacterium bryantii、 Microbacterium imperiale、 Micrococcus lysodeikticus、 Microlunatus、 Mucor javanicus、 Mycobacterium、 Myrothecium、 Nitrobacter、 Nitrosomonas、 Nocardia、 Papaya carica、 Pediococcus、 Pediococcus halophilus、 Penicillium、 Penicillium camemberti、 Penicillium citrinum、 Penicillium emersonii、 Penicillium roqueforti、 Penicillum lilactinum、 Penicillum multicolor、 Paracoccus pantotrophus、 Propionibacterium、 Pseudomonas、 Pseudomonas fluorescens、 Pseudomonas denitrificans、 Pyrococcus、 Pyrococcus furiosus、 Pyrococcus horikoshii、 Rhizobium、 Rhizomucor miehei、 Rhizomucor pusillus Lindt、 Rhizopus、 Rhizopus delemar、 Rhizopus japonicus、 Rhizopus niveus、 Rhizopus oryzae、 Rhizopus oligosporus、 Rhodococcus、 Saccharophagus degradans、 Sccharomyces cerevisiae、 Sclerotina libertina、 Sphingobacterium multivorum、 Sphingobium、 Sphingomonas、 Streptococcus、 Streptococcus thermophilus Y-1、 Streptomyces、 Streptomyces griseus、 Streptomyces lividans、 Streptomyces murinus、 Streptomyces rubiginosus、 Streptomyces violaceoruber、 Streptoverticillium mobaraense、 Tetragenococcus、 Thermus、 Thiosphaera pantotropha、 Trametes、 Trichoderma、 Trichoderma longibrachiatum、 Trichoderma reesei、 Trichoderma viride、 Trichosporon penicillatum、 Vibrio alginolyticus、 Vibrio splendidus、 Xanthomonas、 yeast、 Yarrowia lipolytica、 Zygosaccharomyces rouxii、 Zymomonas、または Zymomonus mobilis。
【０１３３】
「形質転換」とは、一般に、宿主細胞ゲノムへの外来性ＤＮＡの取り込みおよび組み込みの結果として起こる細胞の永久的な遺伝的変化、さらには、ある生物体から別の生物体のゲノムへの外来性遺伝子の移動をいう。
【０１３４】
「ベクター」とは、例えばプラスミド、バクテリオファージ、酵母またはウイルスに由来するポリヌクレオチド分子、好ましくはＤＮＡ分子で、その内部にポリヌクレオチドを挿入またはクローニングすることのできるものを意味する。ベクターは、好ましくは、１つ以上の固有の制限部位を含み、標的細胞もしくは組織または前駆細胞もしくはその組織を含む特定の宿主細胞内で自律複製すること、またはクローニングされた配列が複製可能なように特定の宿主のゲノムに組み込むことができる。したがって、ベクターは自律複製するベクター、すなわち染色体外のものとして存在し、その複製が染色体の複製から独立しているベクター、例えば、直鎖状もしくは閉環状プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体などでありうる。ベクターは自己複製を確実にするためのあらゆる手段を含みうる。または、ベクターは、細胞内に導入された場合にゲノム中に組み込まれて、それが組み込まれた染色体とともに複製されるものであってもよい。そのようなベクターは、宿主染色体の特定の、所望の部位に組換えさせる特異的配列を含んでも良い。
【０１３５】
ベクター系は、トランスポゾンや、宿主細胞のゲノム中に導入しようとする全ＤＮＡを共に含む単一のベクターもしくはプラスミド、２つもしくはそれ以上のベクターもしくはプラスミドを含んでもよい。ベクターの選択は、典型的には、ベクターとそのベクターを導入しようとする細胞との適合性によって決まる。本発明の場合、ベクターは、好ましくは、シアノバクテリア細胞などの細菌細胞において操作可能に機能的なものである。ベクターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのレポーター遺伝子を含むことができ、それはコードされるポリペプチドの１つ以上にインフレームで融合させてもよいし、または別々に発現させてもよい。ベクターはさらに、好適な形質転換体の選択に使用することができる抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを含んでもよい。
【０１３６】
「野生型」および「天然の」という用語は、天然の源から単離された場合の遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を意味するために、互換可能に用いられる。野生型遺伝子または野生型遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）とは、集団内で極めて高頻度で観察され、そのため、任意でその遺伝子の「正常」または「野生型」形態として意図されるものである。
【０１３７】
「バイオマス」の例としては、とりわけ、水性、または海洋バイオマス、果実廃棄物などの果実系バイオマス、および野菜廃棄物などの野菜系バイオマスが挙げられる。水性、または海洋バイオマスの例は、ケルプ、ジャイアントケルプ、海藻、藻類、および海洋微生物相、微細藻類、海草などが挙げられるが、これらに限定されない。果実系バイオマス、および／または野菜系バイオマスの例は、とりわけ、植物の皮、柑橘、オレンジ、グレープフルーツ、いも、トマト、葡萄、マンゴ、グーズベリー、ニンジン、サトウキビ、りんご等のしぼりかすのような、ペクチンの原料を挙げることができるが、それらに限定されない。ある態様では、バイオマスは、典型的には地殻の表層内で発見される炭化水素などの化石化された炭素の供与源（例えば、天然ガス、無煙炭石炭のようなほぼ純粋な炭素で構成される不揮発性材料）を含まない。
【０１３８】
「コモディティケミカル」または「その中間体」は、一般に、次の式を有する、生物燃料などのケミカル類、及びそれらから生産される任意の対応するアルカンに関する。  
2012511908.tif 000009
【０１３９】
（式中、Ｒ１は、ＣＨ３ＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２、およびＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２からなる群から選択され、Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ、ＣＨ３ＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＣＨ２からなる群から選択され、ｎは０〜３０である。）
【０１４０】
ある実施形態では、コモディティケミカルは、３−ヒドロキシ−２、２、４、トリメチルペンタナール、および／または２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオールであってよい。ある実施形態では、コモディティケミカルは３−ヒドロキシ−２−エチルヘキサナール、２−エチル−２−ヘキセン−１−アール、２‐エチルヘキサナール、２−エチルヘキサノール、および／または２‐エチルヘキサンであってよい。ある実施形態では、コモディティケミカルは３−ヒドロキシ−２−ブチル−１−オクタノール、２−ブチル−２−オクテン−１−アール、２−ブチル−オクタナール、または２−ブチル−オクタノールであってよい。
【０１４１】
ある態様では、２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオールまたは２−エチルヘキサノールなどの、ジオールまたはアルコールが、それぞれ、２，２，４−トリメチルペンタンまたは２‐エチルヘキサンなどの化学的または酵素的にその対応するアルカンに変換されてもよい。そのような方法の１つの例として、「水素添加」としても知られている「水素処理法」が挙げられる。例えば、２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオール、２−エチルヘキサノール、および２−ブチル−オクタノール、などのアルコールを、水素処理し、それぞれ、対応するアルカン、すなわち２，２，４−トリメチルペンタン、２‐エチルヘキサン、および２−ブチル−オクタンを生成させてもよい。石油精製系における「水素処理法」という方法は一般に、官能基を含む分子への水素の触媒的付加をいう。水素処理法用触媒は、一般に、焼アルミナ粒子に、モリブデンと、ニッケルと、コバルト酸化物とのある組み合わせを付加することにより調製される。アルミナ粒子は、次いで、きわめて高い内部表面積を有する（非常に多孔性）よう調製しかつ製造してもよく、触媒金属を、粒子の内部表面に「単原子的に（ｍｏｎｏ−ａｔｏｍｉｃａｌｌｙ）」蒸着させ分配してもよい。水素処理法（「水素化分解法」対して）では、アルミナ表面が、典型的には、できるだけ不活化（すなわち、化学的に受動）であるよう調製し、かつ製造する。
【０１４２】
「バイオマス由来多糖類」の一般的な例としては、アルギン酸、寒天、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ポリガラクツロネート、セルロース、ヘミセルロース、キシラン、アラビナン、およびマンナンが挙げられるが、これらに限定されない。バイオマスの、多糖類、オリゴ糖、単糖類、またはその他の糖成分の例としては、アルギナート（例えば、ｐｏｌｙＧ、ｐｏｌｙＭＧ、ｐｏｌｙＭ）、アルギン酸オリゴ糖（例えばΔＭ、ΔＧ、ΔＭＭ、ΔＭＧ、ΔＧＭ、ΔＧＧ、ＭＭ、ＭＧ、ＧＭ、ＧＧ、ＭＭＭ、ＭＧＭ、ＭＭＧ、ＭＧＧ、ＧＭＭ、ＧＭＧ、ＧＧＭ、ＧＧＧ）、寒天、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、グルコン酸、グルロナート、マンヌロナート、マンニトール、リキソース、セルロース、ヘミセルロース、セロビオース、グリセリン、キシリトール、グルコース、マンノース、ガラクトース、キシロース、キシラン、マンナン、アラビナン、アラビノース、グロクロナート、ガラクツロナート（ジガラクツロナートおよびトリガラクツロナートを含む）、ラムノース、などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
アルギナート由来多糖類の例としては、β−Ｄ−マンヌロナート、α−Ｌグルロナート、ジアルギナート、トリアルギナート、ペントアルギナート、ヘキサアルギナート、ヘプタアルギナート、オクタアルギナート、ノナアルギナート、デカアルギナート、ウンデカアルギナート、ドデカアルギナート、およびポリアルギナートなどの飽和多糖類、並びに４−デオキシ−Ｌ−エリスロ−５−ヘキソースウロースウロン酸、４−（４−デオキシ−β−Ｄ−マン−４−エヌロノシル）−Ｄ−マンヌロナート、またはＬ−グルロナート、４−（４−デオキシ−β−Ｄ−マン−４−エヌロノシル）−ジアルギナート、４−（４−デオキシ−β−Ｄ−マン−４−エヌロノシル）−トリアルギナート、４−（４−デオキシ−β−Ｄ−マン−４−エヌロノシル）−テトラアルギナート、４−（４−デオキシ−β−Ｄ−マン−４−エヌロノシル）−ペントアルギナート、４−（４−デオキシ−β−Ｄ−マン−４−エヌロノシル）−ヘキサアルギナート、４−（４−デオキシ−β−Ｄ−マン−４−エヌロノシル）−ヘプタアルギナート、４−（４−デオキシ−β−Ｄ−マン−４−エヌロノシル）−オクタアルギナート、４−（４−デオキシ−β−Ｄ−マン−４−エヌロノシル）−ノナアルギナート、４−（４−デオキシ−β−Ｄ−マン−４−エヌロノシル）−ウンデカアルギナート、および４−（４−デオキシ−β−Ｄ−マン−４−エヌロノシル）−ドデカアルギナートなどの不飽和多糖類が挙げられる。
【０１４４】
ペクチン由来多糖類の例としては、ガラクツロナート、ジガラクツロナート、トリガラクツロナート、テトラガラクツロナート、ペンタガラクツロナート、ヘキサガラクツロナート、ヘプタガラクツロナート、オクタガラクツロナート、ノナガラクツロナート、デカガラクツロナート、ドデカガラクツロナート、ポリガラクツロナート、およびラムノポリガラクツロナートなどの飽和多糖類、並びに４−デオキシ−Ｌ−スレオ−５−ヘキソースウロースウロナート、４−（４−デオキシ−α−Ｄ−グルコ−４−エヌロノシル）−Ｄ−ガラクツロナート、４−（４−デオキシ−α−Ｄ−グルコ−４−エヌロノシル）−Ｄ−ジガラクツロナート、４−（４−デオキシ−α−Ｄ−グルコ−４−エヌロノシル）−Ｄ−トリガラクツロナート、４−（４−デオキシ−α−Ｄ−グルコ−４−エヌロノシル）−Ｄ−テトラガラクツロナート、４−（４−デオキシ−α−Ｄ−グルコ−４−エヌロノシル）−Ｄ−ペンタガラクツロナート、４−（４−デオキシ−α−Ｄ−グルコ−４−エヌロノシル）−Ｄ−ヘキサガラクツロナート、４−（４−デオキシ−α−Ｄ−グルコ−４−エヌロノシル）−Ｄ−ヘプタガラクツロナート、４−（４−デオキシ−α−Ｄ−グルコ−４−エヌロノシル）−Ｄ−オクタガラクツロナート、４−（４−デオキシ−α−Ｄ−グルコ−４−エヌロノシル）−Ｄ−ノナガラクツロナート、４−（４−デオキシ−α−Ｄ−グルコ−４−エヌロノシル）−Ｄ−デカガラクツロナート、および４−（４−デオキシ−α−Ｄ−グルコ−４−エヌロノシル）−Ｄ−ドデカガラクツロナートなどの飽和多糖類が挙げられる。
【０１４５】
「好適な単糖」、または「好適な糖類」とは、一般に、供与源、または唯一の炭素源としてペクチン、アルギナート、またはその他の糖類（例えば、ガラクツロナート、セルロース、ヘミセルロースなどのバイオマス由来多糖類）で増殖する組換え微生物によって産生され得る任意の糖類をいい、さらに、一般に、生物燃料、またはバイオガソリンなどの炭化水素を産生するために本発明の生物燃料生合成経路に利用し得る任意の糖類をいう。好適な単糖またはオリゴ糖の例としては、２−ケト−３−デオキシＤ−グルコナート（ＫＤＧ）、Ｄ−マンニトール、グルロナート、マンヌロナート、マンニトール、リキソース、グリセロール、キシリトール、グルコース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、グルクロナート、ガラクツロナート、およびラムノースなどが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で言及したように、本明細書で使用する「好適な単糖類」または「好適な糖類」は、米国特許出願第１２／２４５，５３７号および１２／２４５，５４０号を中に記載されている（そのような微生物の開示のため、これらを本明細書に援用する）改変または組換え微生物により産生させてもよいし、あるいは、市販の供与源から得てもよい。
【０１４６】
本明細書で使用する「最適化された」という記述は、本来の分子、または本来の細胞の環境（例えば、特定のポリペプチドまたは野生型微生物の、野生型配列）に関連してその機能的特徴を改善する目的で、ポリペプチドのアミノ酸配列の遺伝的改変、またはポリペプチドの周囲の細胞環境の改変／修飾などの方法により改変された、生物活性を有する経路、遺伝子、ポリペプチド、酵素、またはその他の分子をいう。本明細書に記載したポリペプチドまたは酵素はどれでも、任意に「最適化」してよい。また、本明細書に記載した遺伝子またはヌクレオチド配列はどれでも、最適化されたポリペプチドまたは酵素を任意にコードしてよい。本明細書に記載した経路はどれも、任意に、１つ以上の「最適化された」酵素、または最適化された酵素もしくはポリペプチドをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含んでよい。
【０１４７】
典型的には、ポリペプチド、酵素、またはその他の分子の改善された機能的特性は、アルデヒドおよび／またはケトンを、イソオクタンなどの生物燃料に変換するための、生物学的経路（例えばアルデヒドおよび／またはケトン生合成経路、アルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ）で使用するための、ポリペプチドまたはその他の分子の適合性に関する。したがって、ある実施形態では、「最適化された」生物学的経路の使用を意図している。例示的な「最適化された」ポリペプチドは、そのアミノ酸コード配列に、特定の微生物の系または微生物における、改善された発現および／または安定性を容易にし、所望の基質に関連するポリペプチド活性（例えば、誘導可能なまたは抑制可能な活性）の調節を可能にし、細胞内のポリペプチドの局在化（例えば、細胞内局在化、細胞外分泌）を調節し、および／または所望の基質に関連するポリペプチド活性全体のレベルに効果を及ぼす（例えば、酵素活性を減少させる、または増加させる）、１つ以上の改変または突然変異（例えば点突然変異、欠失、異種配列の付加）を含んでもよい。また、ポリペプチド、またはその他の分子は、その他の変化の中でも特に、「最適化」されたポリペプチド、もしくはその他の分子の発現（例えば、アップレギュレーション）、局在化、および／もしくは活性を調節する経路を改変するという方法、または、とりわけ、望ましくない副産物の産生を最小化する経路を改変するという方法などにより、その系、または生体内の１つ以上の経路を改変することによって、特定の微生物系、または微生物で使用するために「最適化されて」いてもよい。このように、ポリペプチドまたはその他の分子は「最適化」してよいが、その場合、その野生型アミノ酸配列または本来の化学構造を改変してもしなくてもよい。最適化されたポリペプチドまたは生物学的経路は、例えば、当技術分野で既知の技術に従って、所望の表現型を得るため、直接突然変異誘発によって、または自然選択によって得てもよい。
【０１４８】
ある態様では、「最適化された」遺伝子、またはポリペプチドは、参照（例えば、野生型）遺伝子、またはポリペプチドのヌクレオチド配列、またはアミノ酸配列と５０％〜９９％（間の全ての整数を含む）同じであるヌクレオチドコード配列、またはアミノ酸配列を含んでよい。ある態様において、「最適化」されたポリペプチド酵素は、参照ポリペプチドの生物活性の、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００倍（その間の全ての整数、および１．２、１．３、１．４、１．５、５．５、５．６、５．７、６０、７０などの小数点を含む）、またはそれ以上の生物活性を有してもよい。
【０１４９】
また、本発明のある態様には、本明細書に記載する方法および組換え微生物に従って産生される生物燃料などのコモディティケミカルが含まれる。
【０１５０】
このような生物燃料（例えば、中鎖から長鎖アルカン、イソオクタン）は、放射性炭素年代測定技術により、従来の精練所によって粗製炭素源から生産される燃料などのその他の燃料から識別し得る。例えば、炭素は、２つの安定な、非放射性同位元素、炭素１２（１２Ｃ）と炭素１３（１３Ｃ）とを有する。加えて、極微量の不安定同位元素である炭素１４（１４Ｃ）が地球上に存在する。炭素１４は、５７３０年の半減期を有しており、この同位元素が地上より多く発生する大気中で、宇宙線が窒素に絶え間なく衝撃していなかったら、はるか昔に地球から消え去っていたであろう。宇宙線相互作用によって生じる中性子は、大気中の窒素分子（Ｎ２）の原子に対する以下の核反応に関与する：
2012511908.tif 000010
【０１５１】
植物およびその他の光合成生物は、光合成によって大気中の二酸化炭素を吸収する。多くの植物が動物により摂取されるため、地球上のあらゆる生きた生物は、その存在期間にわたって、その環境と常に炭素１４を交換する。しかし、一旦生物体が死ぬと、この交換が停止し、炭素１４の量は、放射性β崩壊により時間とともに段階的に減少する。
【０１５２】
採掘作業から得られる粗製油および天然ガスなどの、炭化水素系燃料の殆どは、圧縮、および地質時代にわたる古代有機材料（すなわち、油母）の加熱の成果物である。石油の形成は、典型的には、大部分が高温、および／または圧力における様々な吸熱反応において、炭化水素熱分解から生じる。今日の油は、無酸素条件下で大量に海底または湖底に沈殿した有史以前の動物プランクトン、および藻類の保存された残骸から形成された（一方、有史以前の陸上植物の残骸は、石炭を形成する傾向があった）。地質時代にわたり、有機物は、汚泥と混合し、沈降物の重い層の下に埋まった結果、高レベルの熱と圧力を生じた（続成作用として知られる）。有機物は、この過程によって化学的に変化し、最初に、世界中の種々のオイルシェール中に見出される油母として知られている蝋質材料になり、次いで、更に加熱することで、カタゲネシスとして知られている過程で液体およびガス状炭化水素になる。粗製油を原料とする炭化水素系燃料は、地質時代にわたって炭素１４崩壊過程を経ており、したがって、検出可能な炭素１４は、殆ど全く含んでいないと考えられる。それに対し、本発明の生きている微生物によって産生される特定の生物燃料は、他のあらゆる現在生きているものに匹敵するレベル（すなわち、平衡レベル）で炭素１４を含む。このように、本発明の炭化水素系生物燃料の炭素１２対炭素１４の比を測定し、その比を粗製油を原料とする炭化水素系燃料と比較することにより、本明細書に提供される方法により産生される生物燃料は、炭化水素系燃料の典型的な供与源から構造的に区別することができる。
【０１５３】
本発明の実施形態には、コモディティケミカルを製造する方法が含まれる。この方法は、アルデヒド、ケトン、またはその両方の供与源で組換え微生物を増殖させることを含み、この組換え微生物が、（ｉ）アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチド（すなわち、１つ以上のポリヌクレオチド）、および（ｉｉ）アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチド（すなわち、１つ以上のポリヌクレオチド）を含み、それによって、コモディティケミカルを産生する。ある実施形態では、この組換え微生物は、さらに二重結合還元酵素活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチド（すなわち１つ以上のポリヌクレオチド）、ならびに／または、デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでもよい。ある実施形態では、このポリヌクレオチドの少なくとも１つまたは２つが、外来性のポリヌクレオチドである。ある実施形態では、このポリヌクレオチドのどれも、外来性である。
【０１５４】
本発明の実施形態にはまた、（ｉ）アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチド、および（ｉｉ）アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組換え微生物が含まれる。ある実施形態では、そのような微生物はさらに、二重結合還元酵素活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでもよい。ある実施形態では、このポリヌクレオチドの少なくとも１つまたは２つが、外来性のポリヌクレオチドである。ある実施形態では、このポリヌクレオチドのどれも、外来性である。これらの組換え微生物は、典型的には、アルデヒド、ケトンまたはその両方の供与源から、コモディティケミカルまたはその中間体を産生することができる。
【０１５５】
本発明の実施形態にはまた、（ｉ）アルデヒドおよび／またはケトン生合成経路をコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドと、（ｉｉ）アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドと、（ｉｉ）アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドと、を含む組換え微生物が含まれる。ある実施形態では、そのような微生物はまた、二重結合還元酵素活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでもよい。ある実施形態では、そのポリヌクレオチドの少なくとも１つまたは２つが外来性のポリヌクレオチドである。ある実施形態では、そのポリヌクレオチドのどれも外来性である。これらの組換え微生物は、典型的に、アルデヒド、ケトン、またはその両方の供与源から、コモディティケミカルまたはその中間体を産生することができ、かつ、好適な単糖類またはオリゴ糖から、アルデヒド、ケトン、またはその両方の前述の供与源を産生することができる。
【０１５６】
上述の通り、ある実施形態では、組換え微生物はまた、二重結合還元酵素活性を有するポリペプチドをコードし発現する少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド、および／または、デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドを含んでもよい。これらの関連する実施形態では、所望の産物（例えば、イソオクタン）を得るために、外来性の二重結合還元酵素またはデヒドラターゼの存在または過剰発現は必要ではないであろう。そのような反応は、内在性の還元酵素およびデヒドラターゼ酵素によって触媒し得るからであるが、組換え微生物によって生産された所望の産物の量を増加させるために、使用してもよい。
【０１５７】
本明細書中で使用する「アルドラーゼ」活性を有する酵素またはポリペプチドとは、一般に、Ｄ−フルクトース−１，６−ビスリン酸を切断する可逆反応を触媒し、ジヒドロキシアセトンリン酸およびＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を生成させる酵素のクラスをいう。アルドラーゼ酵素は、すべての動物および植物組織、およびほとんどの微生物中に存在する。動物および高等植物組織に見出されるクラスＩアルドラーゼは、典型的には、二価金属共因子（cofactor）を必要としないこと、および基質ジヒドロキシアセトンリン酸によるケチミンシッフ塩基中間体の形成という特徴がある。クラスＩＩアルドラーゼは、典型的には、酵母および細菌などの微生物中に見出され、金属共因子を必要とし、ＥＤＴＡで阻害され得る。
【０１５８】
１つの典型的なアルドラーゼとして、フルクトース１、６−ビスリン酸アルドラーゼ（アルドラーゼＡ）があるが、これは解糖およびエネルギー生産における重要な反応を触媒する。アルドラーゼＢはアルドラーゼＡのイソ酵素であり、フルクトース１リン酸を切断して、グリセルアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸を生成させる。しかし、この反応は可逆的で、グリセルアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸を縮合するために利用することができる。
【０１５９】
グリセルアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンのリン酸縮合に加え、アルドラーゼ酵素はアルデヒドおよび／またはケトン間の他の有用な縮合反応を触媒することが発見されている。特に、アルドラーゼ酵素の触媒活性の可逆的な性質が、アルデヒドおよび／またはケトンの様々な組み合わせの縮合産物から様々なコモディティケミカル、またはその中間体を生成させるのに有用であること、が本明細書中で明らかにされている。例えば、本発明のアルドラーゼ酵素は、イソブチルアルデヒドの２つの分子の縮合を触媒し、３−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチルペンタナールを生成させることが可能であり得る。別の例として、本発明のアルドラーゼ酵素は、２つのブチルアルデヒド分子の縮合を触媒し、３−ヒドロキシ−２−エチルヘキサナールを生成させることが可能であり得る。別の例として、本発明のアルドラーゼ酵素は、２つのヘキサン分子の縮合を触媒し、２−ブチル−オクタナールを生成させることが可能であり得る。
【０１６０】
よって、ある態様では、「アルドラーゼ」はという記述は、様々なアルデヒドおよび／またはケトンの縮合を触媒することができる酵素をいう。様々なアルデヒドおよび／またはケトンとしては、特に、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、グルタールアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、２−メチル−ブチルアルデヒド、３−メチル−ブチルアルデヒド、４−メチルペントアルデヒド、ヘキサンアルデヒド、ヘプタンアルデヒド、オクタンアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、２−フェニルアセトアルデヒド、２−（４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、２−インドール−３−アセトアルデヒド、５−アミノ−ペントアルデヒド、コハク酸セミアルデヒド、および／またはスクシナート４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、さらにそれらの組み合わせがある。アルデヒドおよび／またはケトンの縮合は、当業者に認知されているものの中でも特に、プロパナール、ブタナール、イソブタナール、ペンタナール、２−メチルブタナール、３−メチルブタナール、ヘキサナール、２−メチルペンタナール、３−メチルペンタナール、４−メチルペンタナール、ヘプタナール、オクタナール、２−メチルヘプタナール、ノナナール、デカナール、ウンデカナール、ドデカナールのようなケミカルを生産するために利用してよい。
【０１６１】
本明細書で使用する「アルドラーゼ」酵素または「アルドラーゼ」には、ＡＣＰチオエステラーゼ活性などのアシル‐アシル輸送タンパク質（ＡＣＰ）活性を有する酵素が含まれる。そのようなＡＣＰエステラーゼは、典型的には、酵素反応条件下で、脂肪アシル−ＡＣＰ基質（例えば、Ｃ８−Ｃ１４）からの遊離脂肪酸（類）の産生を触媒する能力を有する。しかし、アシル−ＡＣＰエステラーゼはまた、イソブチルアルデヒドおよびブチルアルデヒドなどの、２種類のアルデヒドおよび／またはケトンの縮合を触媒し、それぞれ、３−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチルペンタナールと２−エチル−２−ヘキセン−１−アールなどの対応するアルキルアルデヒドを生成させることができると考えられる。
【０１６２】
そのようなエステラーゼは、本明細書中に提供される特定の例示配列、および関連する情報源から入手可能である。例えば、クヘア (Cuphea) 属の中のいくつかの種、例えば、プロクンベンス (procumbens) 、ルテア (lutea)、フーケリアナ (hookeriana) 、ヒッソピフォリア (hyssopifolia) 、ライチイ (wrightii) およびインフラータ (inflata)は、その種子中に、中位鎖脂肪酸を含有するトリグリセリドを蓄積する。もう一つの、中位鎖脂肪酸の天然植物源は、クスノキ科(Lauraceae)（例えば、ピサ (Pisa)(Actinodophne hookeri) およびゲッケイジュ (Laurus nobilis)） の種子である。その他の植物源としては、ニレ科 (Ulmaceae)(ニレ) 、ニクズク科 (Myristicaceae)、ニガキ科 (Simarubaceae) 、ウォキシア科 (Vochysiaceae)、 およびニレ科 (Salvadoraceae)、ならびにエリスマ (Erisma) 、ピクランニア (Picramnia)、およびビロラ (Virola) の雨林種が挙げられ、C14脂肪酸を蓄積するという報告がある。ＦＡＴＢ１およびＦＡＴＢ２などのアルドラーゼ活性を有する典型的なエステラーゼは、米国特許第５，２９８，４２１号、５，３０４，４８１号、５，３４４，７７１号、５，４５５，１６７号、および５，６６７，９９７号のほか、Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．（PNAS USA 92:10639-634, 1995）に記載されており、これらの文献を、それらのＡＣＰ‐アシルチオエステラーゼのポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列について、本明細書に援用する。
【０１６３】
ある実施形態では、組換え微生物は、アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を含んでよい。ここで、このポリヌクレオチドは、配列番号２１５〜２２２、または本明細書中に記載され当技術分野で既知である条件下でその相補配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列と、８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する。配列番号２１５は、クフェア・フーケリアナ（Cuphea hookeriana）由来のＦＡＴＢ２酵素をコードする。配列番号２１６は、クフェア・ランケオラータ(Cuphea lanceolata)由来のＦＡＴＢ３酵素をコードする。配列番号２１７および２１８は、それぞれに、クフェア・ランケオラータ(Cuphea lanceolata)由来のケトアシルｋｅｔｏａｃｙｌ−ＡＣＰシンターゼＩＶ（ＫＡＳＩＶ）をコードする。配列番号２１９は、クフェア・ランケオラータ(Cuphea lanceolata)由来のＡＣＰ１−２酵素をコードし、配列番号２２０は、クフェア・ランケオラータ(Cuphea lanceolata)由来のＡＣＰ１−３酵素をコードし、配列番号２２１は、クフェア・ランケオラータ(Cuphea lanceolata)由来のＡＣＰ１−１酵素をコードする。配列番号２２２は、クフェア・ランケオラータ(Cuphea lanceolata)由来のＡｃｌ１をコードする。
【０１６４】
アルドラーゼ酵素はまた、特に、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）および大腸菌ＤＨ１０Ｂなどの生物から得てもよい。例えば、ある実施形態では、アルドラーゼ酵素は配列番号５１〜８２に示されるポリヌクレオチド参照配列、および／またはこれらのポリヌクレオチド参照配列によってコードされるポリペプチド参照配列に基づいてもよい。よって、本発明のある組換え微生物は、本明細書に記載され当技術分野で既知のように、配列番号５１〜８２に示される１つ以上のヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％同じであるポリヌクレオチド配列、またはそれらの相補配列に、中ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、を含む。
【０１６５】
本発明のある「アルドラーゼ」酵素、またはそのような酵素をコードするポリヌクレオチド配列はまた、特定の保存されたモチーフまたはドメインという特徴を有してもよい。この点に関し、大腸菌ＤＨ１０β由来の２０種類のアルドラーゼ酵素を含む様々なアミノ酸配列を、共通配列モチーフについて、ＰＲＯＳＩＴＥデータベースを使用して解析した。これらの配列の多くが、既知の配列プロフィルと強いマッチを示した。例えばＥＣＤＨ１０Ｂ０００８（配列番号６３）によってコードされるＡＬＤＯＬ１、ＥＣ  ＥＣＤＨ１０Ｂ０８９４（配列番号６４）によってコードされるＡＬＤＯＬ２、ＥＣＤＨ１０Ｂ２６２９（配列番号７２）によってコードされるＡＬＤＯＬ１０、およびおよびＥＣＤＨ１０Ｂ４１３５（配列番号８１）によってコードされるＡＬＤＯＬ１９は、モチーフ「トランスアルドラーゼ署名配列１」および「トランスアルドラーゼ署名配列２」を共通に有していた（下記の表４を参照）。さらにＥＣＤＨ１０Ｂ１９９１（配列番号６７）によってコードされるＡＬＤＯＬ  ５は、２つのモチーフ、「ＫＤＰＧおよびＫＨＧアルドラーゼ活性部位」のモチーフならびに「ＫＤＰＧおよびＫＨＧアルドラーゼシッフ塩基形成残基」のモチーフを含む。（下記の表４を参照）さらに、ＥＣＤＨ１０Ｂ２２４９（配列番号６８）によってコードされるＡＬＤＯＬ６ＥＣＤＨ１０Ｂ３１００（配列番号７４）によってコードされるＡＬＤＯＬ１２、およびＥＣＤＨ１０Ｂ３３１０（配列番号７８）によってコードされるＡＬＤＯＬ１６は、モチーフ、「フルクトース二リン酸アルドラーゼクラスＩＩ署名配列１」および「フルクトース二リン酸アルドラーゼクラスＩＩ署名配列２」を共通に有する（下記の表４を参照）。
【０１６６】
典型的なアルドラーゼ・モチーフを、下記の表３に、また、マッチングしたＥＣＤＨ１０Ｂ（大腸菌ＤＨ１０Ｂ）アルドール配列断片を、表４に示す。
【表３】
2012511908.tif 000011
【表４】
2012511908.tif 000012
【０１６７】
このように、ある実施形態では、本発明の組換え微生物は、アルドラーゼ酵素またはポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含んでよい。ここで、このアルドラーゼ酵素またはポリペプチドは、表３および４に例示したドメインもしくはモチーフ、または、アルデヒドおよび／またはケトンの様々な組み合わせの縮合の触媒作用を促進することができるこれらのモチーフの生物学的に活性な変異体、の１つ以上を含む。
【０１６８】
「アルコールデヒドロゲナーゼ」活性を有する酵素またはポリペプチドとは、一般に、アルデヒドまたはケトンの置換基のアルコールまたはジオールへの変換を触媒する酵素をいい、第二級アルコールデヒドロゲナーゼを含んでもよい。例えば、２，２，４−トリメチルペンタナールは、アルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ）活性を有する酵素により、２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタナールに還元してもよいが、これは、イソブチルアルデヒドをイソオクタンに変換する際の一つの工程である。
【０１６９】
ある態様では、組換え微生物は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３０、３１、および８３〜９６から選択されるヌクレオチド参照配列によってコードされる１つ以上のアルコールデヒドロゲナーゼ、またはこれらのポリヌクレオチド配列のうち任意のものによってコードされるポリペプチドもしくは酵素を含んでよい。ここでこのポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４から選択されるポリペプチド配列などで、その生物学的に活性な断片もしくは最適化された変異体などの変異体を包含する。本発明のある組換え微生物は、配列番号１〜３４または８３〜９６と、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する、１つ以上のヌクレオチド配列もしくはポリペプチド配列を含んでよい。
【０１７０】
上記に言及したアルコールデヒドロゲナーゼ配列として、配列番号１は、シュードモナス・ブチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０から単離された第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（２ａｄｈ−１：  ＰＰ＿１９４６）のヌクレオチド配列で、配列番号２は、同酵素のポリペプチド配列である。配列番号３は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０から単離された第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（２ａｄｈ−２：  ＰＰ＿１８１７）のヌクレオチド配列で、配列番号４は、同酵素のポリペプチド配列である。
【０１７１】
配列番号５は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０から単離された第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（２ａｄｈ‐３：  ＰＰ＿１９５３）のヌクレオチド配列で、配列番号６は、同酵素のポリペプチド配列である。配列番号７は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０から単離された第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（２ａｄｈ‐４：  ＰＰ＿３０３７）のヌクレオチド配列で、配列番号８は、同酵素のポリペプチド配列である。
【０１７２】
配列番号９は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０から単離された第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（２ａｄｈ‐５：  ＰＰ＿１８５２）のヌクレオチド配列で、配列番号１０は、同酵素のポリペプチド配列である。配列番号１１は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０から単離された第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（２ａｄｈ‐６：  ＰＰ＿２７２３）のヌクレオチド配列で、配列番号１２は、同酵素のポリペプチド配列である
配列番号１３は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０から単離された第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（２ａｄｈ‐７：  ＰＰ＿２００２）のヌクレオチド配列で、配列番号１４は、同酵素のポリペプチド配列である。配列番号１５は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０から単離された第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（２ａｄｈ‐８：  ＰＰ＿１９１４）のヌクレオチド配列で、配列番号１６は、同酵素のポリペプチド配列である。
【０１７３】
配列番号１７は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０から単離された第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（２ａｄｈ‐９：  ＰＰ＿１９１４）のヌクレオチド配列で、配列番号１８は、同酵素のポリペプチド配列である。配列番号１９は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０から単離された第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（２ａｄｈ‐１０：  ＰＰ＿３９２６）のヌクレオチド配列で、配列番号２０は、同酵素のポリペプチド配列である。
【０１７４】
配列番号２１は、シュードモナス・ルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）Ｐｆ−５から単離された第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（２ａｄｈ‐１１：  ＰＰ＿１７５６）のヌクレオチド配列で、配列番号２２は、同酵素のポリペプチド配列である。配列番号２３は、クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae）ＭＧＨ  ７８５７８から単離された第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（２ａｄｈ‐１２：  ＫＰＮ＿０１６９４）のヌクレオチド配列で、配列番号２４は、同酵素のポリペプチド配列である。
【０１７５】
配列番号２５は、クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエ  （Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae）ＭＧＨ  ７８５７８から単離された第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（２ａｄｈ‐１３：  ＫＰＮ＿０２０６１）のヌクレオチド配列で、配列番号２６は、同酵素のポリペプチド配列である。配列番号２７は、クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエ  （Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae）ＭＧＨ  ７８５７８から単離された第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（２ａｄｈ‐１４：ＫＰＮ＿００８２７）のヌクレオチド配列で、配列番号２８は、同酵素のポリペプチド配列である。
【０１７６】
配列番号２９は、クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエ  （Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae）ＭＧＨ  ７８５７８から単離された第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（２ａｄｈ‐１６：ＫＰＮ＿０１３５０）のヌクレオチド配列で、配列番号３０は、同酵素のポリペプチド配列である。配列番号３１は、クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエ  （Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae）ＭＧＨ  ７８５７８から単離された第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（２ａｄｈ‐１７：ＫＰＮ＿０３３６９）のヌクレオチド配列で、配列番号３２は、同酵素のポリペプチド配列である。配列番号３３は、クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエ  （Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae）ＭＧＨ  ７８５７８から単離された第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（２ａｄｈ‐１８：ＰＰ＿０３３６３）のヌクレオチド配列で、配列番号３４は、同酵素のポリペプチド配列である。
【０１７７】
配列番号８３〜９６のアルコールデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、シュードモナス−プチダ（Pseudomonas putida）から得た。
【０１７８】
ある態様では、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）、第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（２ａｄｈ）、またはその断片、変異体、誘導体、あるいは、そのような活性な部位を利用するその他の酵素は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、ＮＡＤＨ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、またはＮＡＤＰＨの結合モチーフの少なくとも１つを含んでもよい。ある実施形態では、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ＋またはＮＡＤＰＨの結合モチーフは、Ｙ−Ｘ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号：２４５）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号：２４６）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号：２４７）、Ｙ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｙ（配列番号２４８）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｙ（配列番号：２４９）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｙ（配列番号：２５０）、Ｙ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号：２５１）、Ｙ−Ｘ−ＸＧ−Ｘ−Ｙ（配列番号：２５２）、Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号：２５３）およびＹ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号：２５４）からなる群から選択してもよく、ここで、Ｙはアラニン、グリシン、およびセリンから、独立に選択され、Ｇはグリシンで、Ｘは遺伝学的にコードされるアミノ酸から独立に選択される。
【０１７９】
ある実施形態では、微生物システムまたは組換え微生物は、シュードモナス（Pseudomonads）、ロドコッカス・エリスポリス（Rhodococcus erythropolis）ＡＴＣＣ４２７７、ノルカディア・フスカ（Norcadia fusca）ＡＫＵ２１２３、クレブシエラ（Klebsialla）、またはその他の好適な生物由来の天然のまたは最適化されたアルコールデヒドロゲナーゼを含んでもよい。当技術分野で既知の技術に従い、これらおよびその他の生物から、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離し、本明細書に記載のように、組換え微生物に導入してもよい。
【０１８０】
「二重結合還元酵素」活性を有する酵素またはポリペプチドとは、一般に、次の一般的な反応を触媒する酵素をいう。  
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【０１８１】
本明細書中で言及したように、ある実施形態では、本発明を実行するのに、二重結合還元酵素活性を有する外来性酵素を付加する必要がないように、上記の反応を、特定の微生物の中で、内在性酵素によって触媒してもよい。とは言え、ある態様では、二重結合還元酵素酵素を過剰発現させること、または、意図された特異的反応の構成要素に対する親和性が増加した特定の二重結合還元酵素を発現させることで、所望のコモディティケミカルまたはその中間体の生産を増加させることができる。
【０１８２】
二重結合還元酵素は、特に、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・アングスタ（Pichia angusta）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、およびシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）のような生物から得てもよい。
【０１８３】
ある実施形態では、二重結合還元酵素は配列番号３５〜５０に示すポリヌクレオチド参照配列、および／またはこれらのポリヌクレオチドによりコードされる対応するポリペプチド参照配列に基づいてよい。よって、本発明のある組換え微生物は、配列番号３５〜５０と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％同じである１つ以上のポリヌクレオチド配列、または本明細書に記載され当技術分野で既知の条件で、それらの相補配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド、を含んでもよい。
【０１８４】
本発明の「二重結合還元酵素」酵素、またはそのような酵素をコードするポリヌクレオチド配列はまた、本明細書中に記載され当技術分野で既知のように、特定の保存されたモチーフまたはドメインによって特徴付けられ得る。
【０１８５】
ある実施形態では、コモディティケミカルまたはその中間体を形成するためアルドラーゼ活性を有する酵素によって縮合されるアルデヒド、ケトン、またはその両方の供与源が、アルデヒドおよび／またはケトン生合成経路を含む組換え微生物を含んでもよい。ある実施形態では、そのような生合成経路としては、アルデヒド生合成経路、ケトン生合成経路、またはその両方が挙げられる。
【０１８６】
ある実施形態では、生合成経路としては、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、グルタールアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、２−メチル−ブチルアルデヒド、３−メチル−ブチルアルデヒド、４−メチルペントアルデヒド、ヘキサンアルデヒド、オクタンアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、２−フェニルアセトアルデヒド、２−（４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、２−インドール−３−アセトアルデヒド、５−アミノ−ペントアルデヒド、コハク酸セミアルデヒド、および／またはスクシナート４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド生合成経路、さらにこれらの様々な組み合わせのなかから１つ以上が含まれ得る。
【０１８７】
ある態様では、生合成経路には、ブチルアルデヒドまたはイソブチルアルデヒド生合成経路が含まれる。典型的なアルデヒドおよびケトン生合成経路は、本明細書中および米国特許出願第１２／２４５，５３７および同１２／２４５，５４０号に記載されており、これらの文献を、アルデヒド／ケトン生合成経路に関する記載について、参照することにより、本明細書に援用する。
【０１８８】
ある態様では、プロピオンアルデヒド生合成経路として、大腸菌などの生物由来のスレオニンデアミナーゼ（ｉｌｖＡ）遺伝子、およびラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis），などの生物由来のケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ｋｉｖｄ）遺伝子、ならびに／または、これらの酵素の機能的変異体、さらにそのホモログまたはオーソログに加えて、その最適化された変異体を含み得る。これらの酵素は、一般に、Ｌ−スレオニンをプロピオンアルデヒドに変換するために利用してもよい。
【０１８９】
ある態様では、ブチルアルデヒド生合成経路は、大腸菌のような生物由来のチオラーゼ（ａｔｏＢ）遺伝子、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutyricum）（例えば、ＡＴＣＣ８２４）などの生物由来のベータ・ヒドロキシ・ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｈｂｄ）遺伝子、クロトナーゼ（ｃｒｔ）遺伝子、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｂｃｄ）遺伝子、電子伝達フラビン蛋白質Ａ（ｅｔｆＡ）遺伝子、および／または、電子伝達フラビン蛋白質Ｂ（ｅｔｆＢ）遺伝子、さらには、クロストリジウム・ベエイジェリンキー・アセトブチリカム（Clostridium beijerinckii acetobutyricum）ＡＴＣＣ８２４などの生物由来の、補酵素共役ブチルアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ａｌｄ）遺伝子の少なくとも１つを含み得る。ある態様では、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutyricum）ＡＴＣＣ８２４などの生物由来の補酵素Ａ共役アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ２）遺伝子を、ａｌｄ遺伝子の代用として使用してもよい。
【０１９０】
ある態様では、イソブチルアルデヒド生合成経路は、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）などの生物由来のアセト乳酸シンターゼ（ａｌｓＳ）、またはクレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae subsp. Pneumoniae）ＭＧＨ７８５７８（大腸菌タンパク質発現のためコドン使用頻度を最適化してよい）などの生物からのａｌｓ遺伝子を含んでもよい。そのような経路はまた、大腸菌などの生物由来のアセト乳酸リダクトイソメラーゼ（ｉｌｖＣ）および／または２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸塩デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ）遺伝子のほか、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）などの生物由来のケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ｋｉｖｄ）遺伝子を含んでもよい。
【０１９１】
ある態様では、３−メチルブチルアルデヒドおよび２−メチルブチルアルデヒド生合成経路は、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）などの生物由来のアセト乳酸シンターゼ（ａｌｓＳ）、またはクレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae subsp. Pneumoniae）ＭＧＨ７８５７８（大腸菌タンパク質発現のためコドン使用頻度を最適化してよい）などの生物からのａｌｓ遺伝子を含んでもよい。そのような経路のある態様はまた、大腸菌などの生物由来のアセト乳酸リダクトイソメラーゼ（ｉｌｖＣ）、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸塩デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ）、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ＬｅｕＡ）、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ（ＬｅｕＣとＬｅｕＤ）、および３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＢ）遺伝子のほか、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）などの生物由来のケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ｋｉｖｄ）遺伝子を含んでもよい。
【０１９２】
ある態様では、フェニルアセトアルデヒドおよび４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド生合成経路は、大腸菌などの生物由来の３−デオキシ−７−ホスホヘプツロン酸合成酵素（ａｒｏＦ、ａｒｏＧおよびａｒｏＨ）、３−デヒドロキナ酸シンターゼ（ａｒｏＢ）、３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（ａｒｏＤ）、デヒドロシキミ酸レダクターゼ（ａｒｏＥ）、シキミ酸キナーゼＩＩ（ａｒｏＬ）、シキミ酸キナーゼ（ａｒｏＫ）、５−エノルピルビルシキマート‐３‐リン酸シンターゼ（ａｒｏＡ）、コリスミ酸シンターゼ（ａｒｏＣ）、融合コリスミ酸ムターゼＰ／プレフェン酸デヒドラターゼ（ｐｈｅＡ）、および／または融合コリスミ酸ムターゼＴ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ）遺伝子のほか、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）などの生物由来のケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ｋｉｖｄ）遺伝子のうち１つ以上を含んでよい。
【０１９３】
ある実施形態では、アルデヒド、ケトン、またはその両方の供与源である組換え微生物が、アルデヒドまたはケトンをコモディティケミカルに変換する組換え微生物と同じでもよい。例えば、イソオクタンの生産においては、そのような組換え微生物は、イソブチルアルデヒド生合成経路、アルドラーゼ酵素、場合により二重結合還元酵素、およびアルコールデヒドロゲナーゼを含んでよく、好適な単糖類をイソブチルアルデヒドに変換し、次いで、３−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチルペンタナールおよび２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオールに変換することができるであろう。これらの態様および関連する態様において、２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオールはさらに、本明細書中に記載され当技術分野で既知である「水素処理法」などの方法によりイソオクタンに変換され得る。
【０１９４】
また別の例として、２−エチルヘキサノールおよび２‐エチルヘキサンなどのコモディティケミカルの生産においては、そのような組換え微生物は、ブチルアルデヒド生合成経路、アルドラーゼ酵素、場合により二重結合還元酵素、およびアルコールデヒドロゲナーゼを含んでよく、好適な単糖類をブチルアルデヒドに変換し、次いで３−ヒドロキシ−２−エチルヘキサナール、２−エチル−２−ヘキセン−１−アール、２−エチルヘキサナール、そして最終的には２−エチルヘキサノールに変換できるであろう。これらの態様および関連する態様において、２−エチルヘキサノールはさらに本明細書中に記載され当技術分野で既知である「水素処理法」などの方法により２‐エチルヘキサンに変換されてもよい。
【０１９５】
ある実施形態では、アルデヒド、ケトンまたはその両方の供与源である組換え微生物が、アルデヒドまたはケトンをコモディティケミカルに変換する組換え微生物と異なってもよい。これらの態様および関連する態様において、
アルデヒドおよび／またはケトン生合成経路を含む、第１の組換え微生物を、１種類以上のアルデヒドまたはケトンを生産するための供与源または原料として利用し、次いで、このアルデヒドアルドラーゼ、場合により外来性の二重結合還元酵素、およびアルコールデヒドロゲナーゼを含む第２の組換え微生物によって、２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオールまたは２−エチルヘキサノールなどの所望のコモディティケミカルに変換してもよい。これらの実施形態および関連する実施形態では、２つの組換え微生物を共培養してもよい。別の方法としては、アルデヒド、ケトンまたはその両方を、第一の組換え微生物によって別々に産生させ、次いで、アルドラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼを含む第２の組換え微生物でインキュベートしてもよい。この点に関し、様々な他の組み合わせおよび本発明の態様が当業者に明白である。
【０１９６】
他の実施形態では、イソブチルアルデヒドなどのアルデヒドおよび／またはケトンの供与源は市販の供与源などの他の好適な供与源であってもよい。これらおよび任意の実施形態では、アルデヒド、ケトンまたはその両方の「供与源」は、アルデヒドまたはケトン自体を含んでいてもよく、このアルデヒドまたはケトンは、必要に応じて、微生物培養系に直接加えてもよい。
【０１９７】
本明細書中に記載したすべての経路および酵素に関しては、アルドラーゼ、オプションとして二重結合還元酵素、およびアルコールデヒドロゲナーゼ、ならびに、本明細書中に記載したアルデヒドおよび／またはケトン生合成経路の各々のための構成要素は、内在的か外来的かに関わらず、組換え微生物に存在してよい。特定の生合成経路の効率を改善するため、例えば、内在性遺伝子を、他の条件下でなら内在性である遺伝子の追加のコピー（すなわち外来性遺伝子）を組換え微生物中に導入するという方法などによって、アップレギュレートまたは過剰発現させてもよい。そのような経路はまた、機能性を改善するため、突然変異誘発によって、遺伝子の内在性バージョンを改変することにより最適化し、次いで、この改変遺伝子を微生物中へ導入してもよい。内在性遺伝子の発現は、当技術分野で既知であり本明細書中に記載した技術に従い、アップレギュレート、ダウンレギュレート、あるい消失させることができる。同様に、外来性の遺伝子またはポリヌクレオチド配列の発現量を、様々な構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの使用などの方法により、所望のように調節できる。そのような遺伝子またはポリヌクレオチドはまた、本明細書中に記載され当技術分野で既知のように、「コドン最適化」してもよい。さらに、本明細書中で記載された遺伝子および酵素／ポリペプチドの機能的天然変異体も、そのホモログまたはオーソログを含めて包含される。
【０１９８】
いかなる微生物も、本発明に従い、利用できる。ある態様では、微生物は真核微生物または原核微生物である。ある態様では、微生物はＳ．セレビシエ（S.cerevisiae）などの酵母である。ある態様では、微生物は、グラム陽性菌または、グラム陰性菌などの細菌である。増殖率が速く、遺伝学的に研究が進み、様々な遺伝学的ツールが利用でき、しかも異種タンパク質の生産能を有する、ということから判断すれば、遺伝的に改変された大腸菌を、本明細書中に記載した微生物システムの実施形態において使用してもよく、この場合、アルギン酸もしくはペクチンなどの多糖類の分解および代謝などのためでも、生物燃料などのコモディティケミカルの生成または生合成のためでもよい。
【０１９９】
本発明に従い、その他の微生物を、宿主生物との酵素および代謝産物の親和性を一つの基準として、使用してもよい。例えば、Escherichia coli、 Acetobacter aceti、 Achromobacter、 Acidiphilium、 Acinetobacter、 Actinomadura、 Actinoplanes、 Aeropyrum pernix、 Agrobacterium、 Alcaligenes、 Ananas comosus (M)、 Arthrobacter、 Aspargillus niger、 Aspargillus oryze、 Aspergillus melleus、 Aspergillus pulverulentus、 Aspergillus saitoi、 Aspergillus sojea、 Aspergillus usamii、 Bacillus alcalophilus、 Bacillus amyloliquefaciens、 Bacillus brevis、 Bacillus circulans、 Bacillus clausii、 Bacillus lentus、 Bacillus licheniformis、 Bacillus macerans、 Bacillus stearothermophilus、 Bacillus subtilis、 Bifidobacterium、 Brevibacillus brevis、 Burkholderia cepacia、 Candida cylindracea、 Candida rugosa、 Carica papaya (L)、 Cellulosimicrobium、 Cephalosporium、 Chaetomium erraticum、 Chaetomium gracile、 Clostridium、 Clostridium butyricum、 Clostridium acetobutylicum、 Clostridium thermocellum、 Corynebacterium (glutamicum)、 Corynebacterium efficiens、 Enterococcus、 Erwina chrysanthemi、 Gliconobacter、 Gl
uconacetobacter、 Haloarcula、 Humicola insolens、 Humicola nsolens、 Kitasatospora setae、 Klebsiella、 Klebsiella oxytoca、 Kluyveromyces、 Kluyveromyces fragilis、 Kluyveromyces lactis、 Kocuria、 Lactlactis、 Lactobacillus、 Lactobacillus fermentum、 Lactobacillus sake、 Lactococcus、 Lactococcus lactis、 Leuconostoc、 Methylocystis、 Methanolobus siciliae、 Methanogenium organophilum、 Methanobacterium bryantii、 Microbacterium imperiale、 Micrococcus lysodeikticus、 Microlunatus、 Mucor javanicus、 Mycobacterium、 Myrothecium、 Nitrobacter、 Nitrosomonas、 Nocardia、 Papaya carica、 Pediococcus、 Pediococcus halophilus、 Penicillium、 Penicillium camemberti、 Penicillium citrinum、 Penicillium emersonii、 Penicillium roqueforti、 Penicillum lilactinum、 Penicillum multicolor、 Paracoccus pantotrophus、 Propionibacterium、 Pseudomonas、 Pseudomonas fluorescens、 Pseudomonas denitrificans、 Pyrococcus、 Pyrococcus furiosus、 Pyrococcus horikoshii、 Rhizobium、 Rhizomucor miehei、 Rhizomucor pusillus Lindt、 Rhizopus、 Rhizopus delemar、 Rhizopus japonicus、 Rhizopus niveus、 Rhizopus oryzae、 Rhizopus oligosporus、 Rhodococcus、 Saccharophagus degradans、 Sccharomyces cerevisiae、 Sclerotina libertina、 Sphingobacterium multivorum、 Sphingobium、 Sphingomonas、 Streptococcus、 Streptococcus thermophilus Y-1、 Streptomyces、 Streptomyces griseus、 Streptomyces lividans、 Streptomyces murinus、 Streptomyces rubiginosus、 Streptomyces violaceoruber、 Streptoverticillium mobaraense、 Tetragenococcus、 Thermus、 Thiosphaera pantotropha、 Trametes、 Trichoderma、 Trichoderma longibrachiatum、 Trichoderma reesei、 Trichoderma viride、 Trichosporon penicillatum、 Vibrio alginolyticus、 Vibrio splendidus、 Xanthomonas、 yeast、 Yarrowia lipolytica、 Zygosaccharomyces rouxii、 Zymomonas、 および Zymomonus mobilis を、本明細書中で提供される組換え微生物として利用してもよく、よって、本発明の様々な方法に従い利用してよい。
【０２００】
本明細書中に記載した様々な実施形態は、さらに進んだ実施形態を提供するために組み合わせてよい。本明細書中で言及され、かつ／あるいは出願データシートに列挙されている米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は全て、その全体を参照することにより本明細書に援用する。実施形態の諸態様は、さらに進んだ実施形態を提供するための様々な特許、出願、および出版物の概念を使用するため、必要であれば変更することができる。
【０２０１】
上記の詳細な記載内容に鑑みて、実施形態に変更を加えてよい。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、この特許請求の範囲をある実施形態の開示内容に限定すると解釈されるべきではなく、この特許請求の範囲が権利を与えられている等価物の全範囲と併せて、すべの可能な実施形態を包含すると解釈されるべきである。したがって、その特許請求の範囲は、開示内容により限定されない。
【０２０２】
以下の実施例は、限定ではなく例示として提示するものである。
【実施例】
【０２０３】
［実施例１］
アルデヒド／ケトン生合成経路
ブチルアルデヒドおよびイソブチルアルデヒドなどのアルデヒド類ならびに／またはケトン類の有用な供与源を提供するために、アルデヒドおよび／またはケトン生合成経路を含み、かつ好適な単糖類またはオリゴ糖をアルデヒドまたはケトンに変換することができる組換え微生物を構築した。
【０２０４】
大腸菌由来のチオラーゼ（ａｔｏＢ）遺伝子、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutyricum）ＡＴＣＣ８２４由来ベータ・ヒドロキシ・ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｈｂｄ）、クロトナーゼ（ｃｒｔ）、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｂｃｄ）、電子伝達フラビン蛋白質Ａ（ｅｔｆＡ）および電子伝達フラビン蛋白質Ｂ（ｅｔｆＢ）遺伝子、クロストリジウム・ベエイジェリンキー・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４（Clostridium beijerinckii acetobutyricum）ＡＴＣＣ８２４由来の補酵素Ａ共役ブチルアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ａｌｄ）遺伝子を含むブチルアルデヒド生合成経路を大腸菌内で構築し、そのブチルアルデヒド生産能を試験した。また、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutyricum）ＡＴＣＣ８２４由来の補酵素Ａ共役アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ２）遺伝子をａｌｄの代わりに用いて、ブタノール生産能を試験した。
【０２０５】
バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）由来のアセト乳酸シンターゼ（ａｌｓＳ）、またはクレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae subsp. Pneumoniae）ＭＧＨ７８５７８（大腸菌タンパク質発現のためコドン使用頻度を最適化してよい）由来のアセト乳酸シンターゼ（ａｌｓ）、ならびに大腸菌由来のアセト乳酸リダクトイソメラーゼ（ｉｌｖＣ）および２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸塩デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ）遺伝子のほか、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）由来のケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ｋｉｖｄ）遺伝子を含む、イソブチルアルデヒド生合成経路を構築し、イソブチルアルデヒド生産能を試験し、イソブタナール生産により測定した。
【０２０６】
ｐＢＡＤＢｕｔＰの構築
クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutyricum）ＡＴＣＣ８２４のｈｂｄ、ｃｒｔ、ｂｃｄ、ｅｔｆＡ、およびｅｔｆＢをコードするＤＮＡ配列を、５０ｎｇのクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutyricum）ＡＴＣＣ８２４ゲノム（ＡＴＣＣ）から、５０μｌで、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。増幅したＤＮＡ断片は、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、これらの制限酵素によりあらかじめ切断しておいたｐＢＡＤ３３にライゲートした。
【０２０７】
ｐＢＡＤＢｕｔＰ−ａｔｏＢの構築
大腸菌ＤＨ１０ＢのａｔｏＢをコードするＤＮＡ配列を、５０ｎｇの大腸菌ＤＨ１０Ｂから、５０μｌで、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。増幅したＤＮＡ断片はＸｂａＩおよびＰｓｔＩで消化し、これらの制限酵素によりあらかじめ切断しておいたｐＢＡＤＢｕｔＰにライゲートした。
【０２０８】
ｐＢＡＤａｔｏＢ−ａｌｄの構築
大腸菌ＤＨ１０ＢのａｔｏＢおよびクロストリジウム・ベエイジェリンキー（Clostridium beijerinckii）由来のａｌｄをコードするＤＮＡ配列を、５０μｌの大腸菌ＤＨ１０ＢのａｔｏＢまたはクロストリジウム・ベエイジェリンキー（Clostridium beijerinckii）から、それぞれ５０μｌで、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。増幅したＤＮＡ断片をゲルで精製し、３０μｌのＥＢバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）に溶出した。それぞれのＤＮＡ溶液から５μｌずつを混合し、それぞれのＤＮＡ断片を、２回目のＰＣＲを行って結合した。結合した断片は、ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、これらの制限酵素であらかじめ消化しておいたｐＢＡＤＢｕｔＰにライゲートした。
【０２０９】
ｐＢＡＤＢｕｔＰ−ａｔｏＢ−ＡＬＤの構築
大腸菌ＤＨ１０Ｂのクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、Ｐ１５複製起点、ａｒａＢＡＤプロモーター、ａｔｏＢ、およびクロストリジウム・ベエイジェリンキー（Clostridium beijerinckii）のａｌｄをコードするＤＮＡ断片１ならびにａｒａＢＡＤプロモーター、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutyricum）ＡＴＣＣ８２４のｈｂｄ、ｃｒｔ、ｂｃｄ、ｅｔｆＡ、およびｅｔｆＢをコードするＤＮＡ断片２を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって５０ｎｇのｐＢＡＤａｔｏＢ−ａｌｄまたはｐＢＡＤＢｕｔＰのいずれかから、別々に、５０μｌで、それぞれ増幅した。増幅したＤＮＡ断片は、ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩで消化し、互いにライゲートした。
【０２１０】
ｐＢＡＤａｌｓ−ｉｌｖＣＤの構築
大腸菌での過剰発現のためにそのコドン使用頻度を最適化された、クレブシエラ‐ニューモニエ亜種ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae）ＭＧＨ７８５７８のａｌｓをコードするＤＮＡ断片を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、５０ｎｇのｐＥＴａｌｓから、５０μｌで増幅した。増幅したＤＮＡ断片は、ＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化し、これらの制限酵素によりあらかじめ切断しておいたｐＢＡＤｉｌｖＣＤにライゲートした。
【０２１１】
ｐＢＡＤａｌｓＳ−ｉｌｖＣＤの構築
バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）Ｂ２６のａｌｓＳの前半と後半をそれぞれコードするＤＮＡ断片を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、５０ｎｇのバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）Ｂ２６ゲノム（ＡＴＣＣ）から、５０μｌで、増幅した。増幅したＤＮＡ断片をゲル精製し、３０μｌのＥＢバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）に溶出した。それぞれのＤＮＡ溶液から５μｌずつを混合し、２回目のＰＣＲを行うことによって、それぞれのＤＮＡ断片を結合した。結合した断片は、内部にＸｂａＩ部位が存在せず、よってＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化し、さらにこれらの制限酵素によってあらかじめ消化しておいたｐＢＡＤｉｌｖＣＤにライゲートした。
【０２１２】
ｐＴｒｃＢＡＬＫの構築
ラクトコッカス・ラブティス（Lactococcus lavtis）のケトイソ吉草酸塩デカルボキシラーゼ（ｋｉｖｄ）をコードするＤＮＡ配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、５０ｎｇのｐＥＴＢＡＬから、５０μｌで増幅した。増幅したＤＮＡ断片は、ＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化し、これらの制限酵素によりあらかじめ切断しておいたｐＴｒｃＢＡＬにライゲートした。
【０２１３】
ｐＴｒｃＢＡＬＤの構築
クロストリジウム・ベエイジェリンキー（Clostridium beijerinckii）の補酵素Ａ共役アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄ）をコードするＤＮＡ配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、５０ｎｇのｐＥＴＢＡＬから、５０μｌで増幅した。増幅したＤＮＡ断片は、ＳａｃＩおよびＨｎｄＩＩＩで消化し、これらの制限酵素によりあらかじめ切断しておいたｐＴｒｃＢＡＬにライゲートした。
【０２１４】
ｐＢＢＲＰｄｕＣＤＥＧＨの構築
クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae）ＭＧＨ７８５７８のプロパンジオールデヒドラターゼの中（ｐｄｕＤ）および小（ｐｄｕＥ）サブユニット、並びにプロパンジオールデヒドラターゼの大（ｐｄｕＧ）および小（ｐｄｕＨ）サブユニットをコードするＤＮＡ配列を、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって、５０ｎｇのクレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae）ＭＧＨ７８５７８から、５０μｌで増幅した。増幅したＤＮＡ断片は、ＳａｃＩＩおよびＸｂａＩで消化し、これらの制限酵素によりあらかじめ切断しておいたｐＴｒｃ９９Ａにライゲートし、ｐＢＢＲＰｄｕＤＥＧＨを合成した。
【０２１５】
クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae）ＭＧＨ７８５７８のプロパンジオールデヒドラターゼの大（ｐｄｕＧ）サブユニットをコードするＤＮＡ配列を、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって、５０ｎｇのクレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae）ＭＧＨ７８５７８から、５０μｌで増幅した。増幅したＤＮＡ断片は、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで消化し、これらの制限酵素によりあらかじめ切断しておいたｐＢＢＲＰｄｕＤＥＧＨにライゲートした。
【０２１６】
ブチルアルデヒド生合成経路を試験するために、ｐＢＡＤＢｕｔＰ−ａｔｏＢ／ｐＴｒｃＢＡＬＤ、およびｐＢＡＤＢｕｔＰ−ａｔｏＢ−ＡＬＤ／ｐＴｒｃＢ２ＤＨ／ｐＢＢＲｐｄｕＣＤＥＧＨを有するＤＨ１０Ｂを３７℃、２００ｒｐｍにて、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃｍ５０）、および１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｍｐ１００）を含むＬＢ培地で一晩増殖させた。各少量の種培養物を、Ｃｍ５０、およびＡｍｐ１００を含む新鮮なＴＢ培地に接種し、３７℃にて、２００ｒｐｍのインキュベーションシェーカー中で増殖させた。接種の３時間後に、培養物を１３．３ｍＭアラビノース、および１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導して、一晩増殖させた。この培養物７００μｌを等量の酢酸エチルで抽出して、ＧＣ−ＭＳで解析した。
【０２１７】
イソブチルアルデヒド生合成経路を試験するために、ｐＢＡＤａｌｓ−ｉｌｖＣＤ／ｐＴｒｃＢＡＬＫ、またはｐＢＡＤａｌｓＳ−ｉｌｖＣＤ／ｐＴｒｃＢＡＬＫを有するＤＨ１０Ｂ細胞を、３７℃、２００ｒｐｍにて、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃｍ５０）、および１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｍｐ１００）を含むＬＢ培地において一晩増殖させた。各少量の種培養物を、Ｃｍ５０、およびＡｍｐ１００を含む新鮮なＴＢ培地に接種し、３７℃、２００ｒｐｍにて、インキュベーションシェーカーにおいて増殖させた。接種の３時間後に、培養物を１３．３ｍＭアラビノース、および１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導して、一晩増殖させた。この培養物７００μｌを等量の酢酸エチルで抽出して、イソブチルアルデヒドの産生についてＧＣ−ＭＳで解析した。図２は、これらの培養物からのイソブタナールの産生を示す。この株はまた、微量成分（示さず）として２−メチルブチルアルデヒドと３−メチルブチルアルデヒドをも生産した。
【０２１８】
［実施例２］
イソブチルアルデヒドからの、３−ヒドロキシ−２，２，４およびトリメチルペンタナールの生産
アルドラーゼ活性を有する酵素の、イソブチルアルデヒドの２分子を縮合させて３−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチルペンタナールを生成させる能力を、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。以下の実施例５に記載するように、プラスミドＴｒｃＴＭ１５５９を構築し、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）から得られたアルドースをコードするポリヌクレオチド配列を組み込んだ。
【０２１９】
ｐＴｒｃＴＭ１５５９を有する大腸菌ＤＨ１０Ｂの単一コロニーを、Ａｍｐ１００を含む新鮮なＬＢ培地に接種し、３７℃にて、撹拌培養機中で一晩増幅させた。この培養物の１パーセントをＡｍｐ１００を含む新鮮なＴＢ培地に接種し、培養物を３７℃にて撹拌培養機中で増殖させた。培養物が０．６のＯＤ６００ｎｍに増殖したとき、培養物に０．５ｍＭ  のＩＰＴＧによって誘導をかけた。５０ｍＭのイソブチルアルデヒドを添加し、培養物を１日間増殖させた。５００μｌの培養物を、５００μｌの酢酸エチルで抽出し、抽出物をＧＣ−ＭＳにより解析した。３−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチルペンタナールの生成が観察された（図２参照）。
【０２２０】
［実施例３］
イソブチルアルデヒドからの２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオールの生産
アルドラーゼ酵素およびアルコールデヒドロゲナーゼを含む組換え微生物の、イソブチルアルデヒドを２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオールに変換する能力を試験する。プラスミドＴｒｃＴＭ１５５９は、上記の実施例２に記載されている。様々なアルコールデヒドロゲナーゼを、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）Ｐｆ−５、およびクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）ＭＧＨ７８５７８（配列番号１〜３４を参照）から単離し、米国特許出願第１２／２４５，５３７号および同第１２／２４５，５４０号に記載されている通りに、発現プラスミドにクローニングした。これらの文献を参照することにより、アルコールデヒドロゲナーゼについてのそれらの記載、構築、および試験に関して、本明細書に援用する。追加のアルコールデヒドロゲナーゼもまた、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）（配列番号８３〜９６を参照）から得た。
【０２２１】
ｐＴｒｃＴＭ１５５９およびアルコールデヒドロゲナーゼを発現するプラスミドの両方を有する大腸菌ＤＨ１０Ｂ株の単一コロニーをＡｍｐ１００を含む新鮮なＬＢ培地に接種し、３７℃にて、撹拌培養機中で一晩増幅させる。この培養物の１パーセントをＡｍｐ１００を含む新鮮なＴＢ培地に播種し、培養物を３７℃にて撹拌培養機中で増殖させる。培養物が０．６のＯＤ６００ｎｍに増殖したら、培養物に０．５ｍＭのＩＰＴＧによって誘導をかける。５０ｍＭのイソブチルアルデヒドを添加し、培養物を１日間増殖させる。５００μｌの培養物を、５００μｌの酢酸エチルで抽出し、抽出物をＧＣ−ＭＳにより解析する。２，２，４−トリメチルペンタンジオールの生成が観察される。
【０２２２】
［実施例４］
その他の中鎖から長鎖の炭化水素の生産
２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオール、次いで２，２，４，トリメチルペンタン（イソオクタン）を生産するために、上述の経路に加え、酵素的アルドール縮合に続いてアルコール脱水素を行なうことにより、出発物質としての様々なアルデヒドおよびケトンから、様々な中鎖から長鎖の炭化水素を産出することができる。これらのアルデヒドおよび／またはケトンは、米国特許出願第１２／２４５，５３７号および同第１２／２４５，５４０号に記載されているアルデヒドおよび／またはケトン生合成経路による組換え微生物によって生産することができる。これらの経路の記述、構築、および試験に関してこれらの文献を参照することにより、本明細書に援用する。
【０２２３】
一例が本明細書中に示される。ここでは、ブチルアルデヒドの２分子をアルドラーゼで縮合して、３−ヒドロキシ−２−エチルヘキサナールを生成させた。ついで、この分子を自然にまたは酵素的に脱水して２−エチル−２−ヘキセン−１−アールを生成させた。次いでこれを二重結合還元酵素およびアルコールデヒドロゲナーゼを触媒として、連続的に還元して、２‐エチルヘキサナールルおよび２−エチルヘキサノールを生成させてもよい。
【０２２４】
さらに、本明細書中には、アルドラーゼによりヘキサンアルデヒドの２つの分子を縮合させて３−ヒドロキシ−２−ブチル−１−オクタナールを生成させる反応が例として示されている。次いで、この分子を自然にまたは酵素的に脱水し、２−ブチル−２−オクテン−１−アールを生成させた。次いでこれを連続的に還元して、２−ブチル−オクタナールおよび２‐ブチル‐オクタノールを生成させてもよい。
【０２２５】
２−エチル−２−ヘキセン−１−アールの生産を試験するため、ｐＴｒｃＴＭ１５５９を有する大腸菌ＤＨ１０Ｂの単一コロニーを、Ａｍｐ１００を含む新鮮なＬＢ培地に接種し、３７℃にて、撹拌培養機中で一晩増殖させた。この培養物の１パーセントをＡｍｐ１００を含む新鮮なＴＢ培地に接種し、培養物を３７℃の撹拌培養機内で増殖させた。培養物が０．６のＯＤ６００ｎｍに増殖したとき、培養物に０．５ｍＭのＩＰＴＧによって誘導をかけた。５０ｍＭのイソブチルアルデヒドまたは５０ｍｍのヘキサンアルデヒドのいずれかを添加し、培養物を１日間増殖させた。５００μｌの培養物を、５００μｌの酢酸エチルで抽出し、抽出物をＧＣ−ＭＳにより解析した。２−エチル−２−ヘキセン−１−アールの生成が観察された（図３を参照）。さらに、２−ブチル−２−オクテン−１−アールの生成も観察された。（図４を参照）
［実施例５］
アルドラーゼの単離およびクローニング
アルドラーゼ活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）および大腸菌ＤＨ１０Ｂから単離して、発現ベクターにクローニングした。
【０２２６】
ｐＴｒｃＴＭ００４０、ｐＴｒｃＴＭ００６６、ｐＴｒｃＴＭ０２７３、ｐＴｒｃＴＭ０２８３、ｐＴｒｃＴＭ０２９５、ｐＴｒｃＴＭ０３４３、ｐＴｒｃＴＭ０７２０、ｐＴｒｃＴＭ１０７２、ｐＴｒｃＴＭ１４１９、ｐＴｒｃＴＭ１５２１、ｐＴｒｃＴＭ１５５９、およびｐＴｒｃＴＭ１７４４の構築
ＴＭ０２７３、ＴＭ０２８３、ＴＭ０７２０、ＴＭ１５５９、およびＴＭ１７４４をコードするＤＮＡ配列は、内部ＮｃｏＩ部位を含んでいるため、各遺伝子のＮｃｏＩ部位のフランキング領域をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々に増幅した。９８℃にて１０秒、６０℃にて１５秒、および７２℃にて３０分を、３０回繰り返した。反応液は、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ緩衝液（ＮＥＢ）、２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭ  フォワードプライマーおよびリバースプライマー（表５参照）、１Ｕ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、および５０ｎｇのサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）ゲノムを、５０μＬ中に含んでいた。
【表５】
2012511908.tif 000014
サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）のＴＭ００４０、ＴＭ００６６、ＴＭ０２７３、ＴＭ０２８３、ＴＭ０２９５、ＴＭ０３４３、ＴＭ０７２０、ＴＭ１０７２、ＴＭ１４１９、ＴＭ１５２１、ＴＭ１５５９、およびＴＭ１７４４をコードするＤＮＡ配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。９８℃にて１０秒、６０℃にて１５秒、および７２℃にて１分を、３０回繰り返した。反応液は、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ緩衝液（ＮＥＢ）、２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭ  フォワードプライマーおよびリバースプライマー（表５参照）、１Ｕ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、および５０ｎｇのサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）ゲノムを、５０μＬに含んでいた（（注：ＴＭ０２７３、ＴＭ０２８３、ＴＭ０７２０、ＴＭ１５５９、およびＴＭ１７４４については、前の項目に記載のとおりに調製した断片を使用した）。増幅されたＤＮＡ断片は、ＮｃｏＩおおびＸｂａＩで消化し、同じ制限酵素であらかじめ消化しておいたｐＴｒｃ９９Ａにライゲートした。
【表６】
2012511908.tif 000015
【０２２７】
ｐＴｒｃＤＨ１０Ｂｘｘｘの構築
ＥＣ１６４８およびＥＣ４０７１をコードするＤＮＡ配列は、内部ＮｃｏＩ部位を含み、ＥＣ２２４９をコードするＤＮＡ配列は、ＸｂａＩ部位を含んでいた。それぞれの遺伝子の制限部位のフランキング領域を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々に増幅した。９８℃にて３０秒、５５℃にて１５秒間、および７２℃にて４５秒間を、３０回繰り返した。反応液は、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ緩衝液（ＮＥＢ）、２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭフォワードプライマーおよびリバースプライマー（表７参照）、１Ｕ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、および２０ｎｇの大腸菌ＤＨ１０βを含んでいた。
【表７】
2012511908.tif 000016
【０２２８】
大腸菌ＤＨ１０βの、ＥＣ０００８、ＥＣ０８９４、ＥＣ０９４０、ＥＣ１６４８、ＥＣ１９９１、ＥＣ２２４９、ＥＣ２２５０、ＥＣ２４６５、ＥＣ２６２９、ＥＣ２９６９、ＥＣ３１００、ＥＣ３２３３、ＥＣ３２９９、ＥＣ３３０５、ＥＣ３３１０、ＥＣ４０７１、ＥＣ４０９２、ＥＣ４１３５、およびＥＣ４５３９をコードするＤＮＡ配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。９８℃にて３０秒、５５℃にて３０秒、および７２℃にて４５秒を、３０回繰り返した。反応液は、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ緩衝液（ＮＥＢ）、２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．３μＭ  フォワードプライマーおよびリバースプライマー（表８参照）、１Ｕ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、および２０ｎｇの大腸菌ＤＨ１０βゲノムを、５０μｌに含んでいた（注：ＥＣ１６４８については、前の項目で調製したＥＣ２２４９およびＥＣ４０７１の断片を用いた）。
【表８】
2012511908.tif 000017
【０２２９】
ＥＣ３３０５およびＥＣ３３１０をコードする増幅された断片を、オーバーラップＰＣＲ方法を用いて、ともにライゲートした。（ＰＣＲ）：９８℃にて３０秒、５５℃にて３０秒、および７２℃にて１分を、３０回繰り返した。反応液は、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ緩衝液（ＮＥＢ）、２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．３μＭ  フォワードプライマーおよびリバースプライマー（フォワードプライマー：ｃａｔｇｃｃａｔｇｇｇｇａｔｇａａａｃａｔｃｔｇａｃａｇａａａｔｇ（配列番号１８９）、リバースプライマー：ｇｃｔｃｔａｇａｔｔａｔｇｃｔｇａａａｔｔｃｇａｔｔｃｇ（配列番号１９０））、１Ｕ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、および３μＬのＰＣＲ産物を含んでいた。
【０２３０】
増幅したＤＮＡ断片を、ＮｃｏＩおよびＸｂａＩにより切断し、同じ制限酵素によってあらかじめ切断しておいたｐＴｒｃ９９Ａにライゲートした。
【図１】
2012511908.tif 000021
【図２】
2012511908.tif 000022
【図３】
2012511908.tif 000023
【図４】
2012511908.tif 000024
【配列表】
2012511908000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年10月7日(2011.10.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え微生物であって、
（１）イソブチルアルデヒド
（２）３−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチルペンタナール
（３）アルドラーゼをコードする組換えＤＮＡ
を含有し、前記アルドラーゼが前記微生物で発現し、前記イソブチルアルデヒドが前記アルドラーゼによって３−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチルペンタナールに変換される、組換え微生物。
【請求項２】
前記微生物が酵母である、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記微生物が大腸菌である、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項４】
前記アルドラーゼがThermotoga maritima由来である、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記組換えＤＮＡが配列番号５１からなる塩基配列を含む、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項６】
請求項１の微生物を準備する工程と、
前記アルドラーゼが発現し、前記イソブチルアルデヒドが前記アルドラーゼによって３−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチルペンタナールに変換される条件下で、前記微生物を増殖させる、方法。
【請求項７】
前記微生物が酵母である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物が大腸菌である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記アルドラーゼがThermotoga maritima由来である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物中で、３−ヒドロキシ−２，２，４−トリメチルペンタナールがさらにコモディティケミカルに変換される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記コモディティケミカルが、２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオールである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記コモディティケミカルが、２，２，４−トリメチルペンタンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
組換え微生物であって、
（１）ヘキサナール
（２）２−ブチル−２−オクテン−１−アール
（３）アルドラーゼをコードする組換えＤＮＡ
を含有し、前記アルドラーゼは、前記微生物で発現し、前記ヘキサナールは、前記アルドラーゼによって２−ブチル−２−オクテン−１−アールに変換される、組換え微生物。
【請求項１４】
前記微生物が酵母である、請求項１３に記載の組換え微生物。
【請求項１５】
前記微生物が大腸菌である、請求項１３に記載の組換え微生物。
【請求項１６】
前記アルドラーゼがThermotoga maritima由来である、請求項１３に記載の組換え微生物。
【請求項１７】
前記組換えＤＮＡが配列番号５１からなる塩基配列を含む、請求項１３に記載の組換え微生物。
【請求項１８】
請求項１３の微生物を準備する工程と、
前記アルドラーゼが発現し、前記ヘキサナールが前記アルドラーゼによって２−ブチル−２−オクテン−１−アールに変換される条件下で、前記微生物を増殖させる、方法。
【請求項１９】
前記微生物が酵母である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記微生物が大腸菌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記アルドラーゼがThermotoga maritima由来である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記組換えＤＮＡが配列番号５１からなる塩基配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記微生物中で、２−ブチル−２−オクテン−１−アールがさらにコモディティケミカルに変換される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記コモディティケミカルが、２−ブチル−１−オクタナールである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記コモディティケミカルが、２−ブチル−１−オクタノールである、請求項２３に記載の方法。
【国際調査報告】
2012511908.tif 000025
2012511908.tif 000026
2012511908.tif 000027