(57)【要約】本発明は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を３７℃より低い温度で培養すると、ハムスター乳腺腫瘍７（ＨＭＴ  ７）およびハムスターライリン両方の遺伝子の転写活性が増大するという知見に基づく。本発明は、ＨＭＴ  ７の新規なゲノム配列、ｃＤＮＡ配列およびタンパク質配列、ならびにハムスターライリンに関する新規なゲノム配列を提供する。これらのゲノム配列には、それぞれについて新規な温度誘導型プロモーター配列が含まれる；２つのプロモーター配列がＨＭＴ  ７について提供され、１つのプロモーター配列がライリンについて提供される。本発明はさらに、ＨＭＴ  ７の核酸分子に対するアンチセンス分子およびｓｉＲＮＡ分子を提供する。本発明は、本発明の新規な温度誘導型プロモーターを含む、遺伝子工学的に作製した発現ベクターをも提供する；これらは特に、哺乳動物の温度誘導性発現系の一部として有用である。本発明は、本発明の新規な核酸分子を含む宿主細胞および／またはトランスジェニック動物をも提供する。本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを、たとえば温度誘導型トランスジーン発現のために使用する方法を提供する。【選択図】図４
2012508026.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の活性フラグメントのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する、単離された核酸分子。
【請求項３】
核酸分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のポリヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の相補配列のポリヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のサブ配列のポリヌクレオチド配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のサブ配列の相補配列のポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
核酸分子が、少なくとも１つの発現制御配列に作動可能な状態で結合している、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸分子で形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項６】
体細胞および生殖細胞が請求項４に記載の単離された核酸分子を有するＤＮＡを含む、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項７】
請求項２に記載の単離された核酸分子に高度にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする、単離された核酸分子。
【請求項８】
請求項２に記載の単離された核酸分子に対応するｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
少なくとも１つのＲＮＡ鎖を含み、その１つの鎖が請求項２に記載の単離された核酸分子に対応するｍＲＮＡに相補的なポリヌクレオチド配列を有する、ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項１０】
請求項２に記載の単離された核酸分子のポリヌクレオチド配列を有する、単離された遺伝子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の単離された遺伝子の単離された対立遺伝子。
【請求項１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の相補配列のポリヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のサブ配列のポリヌクレオチド配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のサブ配列の相補配列のポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する、請求項１１に記載の単離された対立遺伝子。
【請求項１３】
ハムスターライリンをコードするポリヌクレオチド配列を有する、単離された遺伝子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の単離された遺伝子の単離された対立遺伝子。
【請求項１５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のポリヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の相補配列のポリヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のサブ配列のポリヌクレオチド配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のサブ配列の相補配列のポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する、請求項１４に記載の単離された対立遺伝子。
【請求項１６】
ＨＭＴ−７プロモーターのポリヌクレオチド配列およびライリンプロモーターのポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する、単離された温度誘導型プロモーター。
【請求項１７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７のポリヌクレオチド配列を有する、請求項１６に記載の単離された温度誘導型プロモーター。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の単離された温度誘導型プロモーターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項１９】
単離された温度誘導型プロモーターがトランスジーンの発現を調節する、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
ＨＭＴ−７プロモーターのポリヌクレオチド配列およびライリンプロモーターのポリヌクレオチド配列から選択される核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２２】
核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３である、請求項２１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２３】
ＨＭＴ−７プロモーターのポリヌクレオチド配列およびライリンプロモーターのポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する温度誘導型プロモーターを含む、温度誘導性の哺乳動物発現ベクター。
【請求項２４】
温度誘導型プロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７のポリヌクレオチド配列を有する、請求項２３に記載の温度誘導性の哺乳動物発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２３または２４に記載の温度誘導性の哺乳動物発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項２６】
宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
下記の工程を含む、細胞によるトランスジーン発現を誘導する方法：
（ａ）発現ベクターを細胞に導入し、その際、発現ベクターは哺乳動物の温度誘導型プロモーターを含み、この温度誘導型プロモーターがトランスジーンの発現を調節し；そして
（ｂ）細胞を誘導温度で培養する。
【請求項２８】
温度誘導型プロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７のポリヌクレオチド配列を有する、請求項２７に記載の細胞によるトランスジーン発現を誘導する方法。
【請求項２９】
誘導温度がその細胞の生理的温度より低い、請求項２７または２８に記載の細胞によるトランスジーン発現を誘導する方法。
【請求項３０】
誘導温度が２５℃〜３４℃の範囲である、請求項２７または２８に記載の細胞によるトランスジーン発現を誘導する方法。
【請求項３１】
哺乳動物発現ベクターを含むキットであって、哺乳動物発現ベクターがＨＭＴ−７プロモーターのポリヌクレオチド配列およびライリンプロモーターのポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する温度誘導型プロモーターを含むキット。
【請求項３２】
下記の工程を含む方法により判定された、異なる培養条件下で差次的に発現するハムスター配列：
（ａ）第１ハイブリダイゼーションプロファイルおよび第２ハイブリダイゼーションプロファイルを形成し、その際、第１ハイブリダイゼーションプロファイルは第１細胞から調製されたターゲット核酸を第１ハムスターオリゴヌクレオチドアレイと共にインキュベートすることにより形成され、第２ハイブリダイゼーションプロファイルは第２細胞から調製されたターゲット核酸を第１ハムスターオリゴヌクレオチドアレイと同一の第２ハムスターオリゴヌクレオチドアレイと共にインキュベートすることにより形成され、第１細胞は培養条件に関して第２細胞と異なり；
（ｂ）第１および第２ハイブリダイゼーションプロファイルを検出し；
（ｃ）第１および第２ハイブリダイゼーションプロファイルを比較し；そして
（ｄ）第１ハイブリダイゼーションプロファイルにおいて、第２ハイブリダイゼーションレベルにおけるそれの発現レベルに対して差次的な発現レベルをもつ少なくとも１つのハムスター配列を判定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、温度誘導型ポリヌクレオチド配列、および、たとえば誘導性の哺乳動物発現系の一部としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の生物学研究のにおいて基本的なことは、細胞系を最適状態で培養および維持できることである。特に重要なことは、遺伝子工学的に作製した原核細胞系または真核細胞系を用いて大量の組換えタンパク質を産生させることである。組換えタンパク質は、たとえば生物学研究において、または特定の疾病もしくは疾患を処置するための療法用化合物として使用できる。
【０００３】
生物薬剤用途のための組換えタンパク質の製造は、一般に多数の細胞、ならびに／あるいは細胞の増殖および／または発現に影響を与える特定の細胞培養条件を必要とする。組換えタンパク質の製造は、誘導性発現系、すなわち特定の培養条件（たとえば、細胞培養温度、外因性作用物（たとえば、テトラサイクリン、エックダイソン（ｅｃｋｄｙｓｏｎｅ）、クメート（ｃｕｍａｔｅ）、エストロゲン）の存在など）下でトランスジーン発現を誘導できる系、の使用が有益である。現在、誘導性の哺乳動物発現系はほとんどなく、市販の系は大部分が外因性作用物の添加を必要とする；温度を利用して遺伝子発現を誘導する唯一の系は細菌細胞についての使用に限定される(Qing et al. (2004) Nat. Biotechnol. 22: 877-82; Carrao et al. (2003) Mol. Microbiol. 50: 1349-60)。
【０００４】
本発明は、１）哺乳動物細胞に使用でき、かつ２）一定の培養条件下で、特に細胞を誘導温度で培養した場合に、細胞によるトランスジーンの発現を誘導できる、誘導性発現系を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Qing et al. (2004) Nat. Biotechnol. 22: 877-82
【非特許文献２】Carrao et al. (2003) Mol. Microbiol. 50: 1349-60
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ技術を利用して、特定の培養条件、特に遺伝子工学的に作製した細胞または遺伝子工学的に作製した細胞系によるトランスフェクションした遺伝子（トランスジーン）の（結果的に組換えタンパク質の）最適発現をもたらす条件に応答して調節される遺伝子および関連配列を同定する。特に、本発明はハムスターオリゴヌクレオチドアレイ（参照：Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．１１／１２８，０４９および１１／１２８，０６１）を利用して、特定の培養温度（単数または複数）下で誘導される遺伝子、たとえば細胞の生理的温度より低い温度（たとえば、３７℃より低い温度、たとえば２５℃から３４℃までの範囲の温度）で細胞を培養した場合に、より高いレベルで細胞が発現する遺伝子を同定する。
【０００７】
本発明のそのような遺伝子のひとつは、ハムスター乳腺腫瘍−７、ＨＭＴ−７である。したがって本発明は、ＨＭＴ−７のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示す）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の活性フラグメントのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを提供する。本発明は、ＨＭＴ−７の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子をも提供する；たとえば、その際、核酸分子は、ＨＭＴ−７  ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示す）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の相補配列のポリヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のサブ配列のポリヌクレオチド配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のサブ配列の相補配列のポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する。本発明の１態様において、ＨＭＴ−７の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子は、少なくとも１つの発現制御配列に作動可能な状態で結合しており、本発明の宿主細胞を形質転換もしくはトランスフェクションするために、および／または本発明のヒト以外のトランスジェニック動物を作製するために使用することもできる。本発明は、ＨＭＴ−７の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子（単数または複数）に高度にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする、単離された核酸分子（単数または複数）をも提供する。
【０００８】
本発明は、ＨＭＴ−７の発現を変更できる阻害性ポリヌクレオチドをも提供する；たとえば、ＨＭＴ−７の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子に対応するｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、少なくとも１つのＲＮＡ鎖を含むｓｉＲＮＡであってその１つの鎖がＨＭＴ−７の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子に対応するｍＲＮＡに相補的なポリヌクレオチド配列を有するものなど。
【０００９】
本発明は、ＨＭＴ−７をコードする単離された遺伝子、たとえばＨＭＴ−７遺伝子の単離された対立遺伝子、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の相補配列のポリヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のサブ配列のポリヌクレオチド配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のサブ配列の相補配列のポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する単離された対立遺伝子にも関する。
【００１０】
本発明の他の遺伝子はハムスターライリン（ｌａｙｉｌｉｎ）である。本発明は、ハムスターライリンをコードするポリヌクレオチド配列を有する単離された遺伝子、たとえばライリン遺伝子の単離された対立遺伝子、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のポリヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の相補配列のポリヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のサブ配列のポリヌクレオチド配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のサブ配列の相補配列のポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する、ライリン遺伝子の単離された対立遺伝子をも提供する。
【００１１】
他の態様において、本発明は、ＨＭＴ−７またライリンのプロモーターをコードする新規な単離されたポリヌクレオチドに関する。したがって、本発明は、ＨＭＴ−７プロモーターのポリヌクレオチド配列およびライリンプロモーターのポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する単離された温度誘導型プロモーター、たとえば下記からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する単離された温度誘導型プロモーターを提供する：ＨＭＴ−７プロモーターのポリヌクレオチド配列（たとえば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すＰ１−ＨＭＴ−７のポリヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示すＰ２−ＨＭＴ−７のポリヌクレオチド配列など）、ライリンプロモーターのポリヌクレオチド配列（たとえば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示すＰ−ライリンのポリヌクレオチド配列）、Ｐ２−ＨＭＴ−７を含む（ＨＭＴ−７遺伝子の）スモールドメインのポリヌクレオチド配列（たとえば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示すポリヌクレオチド配列）、およびＰ２−ＨＭＴ−７を含む（ＨＭＴ−７遺伝子の）ラージドメインのポリヌクレオチド配列（たとえば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７に示すポリヌクレオチド配列）。他の態様において、本発明は、本発明の単離された温度誘導型プロモーターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。
【００１２】
本発明は、本発明の温度誘導型プロモーターの使用にも関する。したがって１態様において、単離された温度誘導型プロモーターは、形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞においてトランスジーンの発現を調節する。他の態様において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。本発明は、ＨＭＴ−７プロモーターのポリヌクレオチド配列およびライリンプロモーターのポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する単離された温度誘導型プロモーターを含む、温度誘導性の哺乳動物発現ベクターをも提供する。１態様において、本発明の温度誘導性の哺乳動物発現ベクターの温度誘導型プロモーターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のポリヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のポリヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のポリヌクレオチド配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７のポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する。他の態様において、本発明は、本発明の温度誘導性の哺乳動物発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。他の態様において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
【００１３】
本発明は、本発明の温度誘導性の哺乳動物発現ベクターを使用する方法にも関する。１態様において本発明は、下記の工程を含む、細胞によるトランスジーン発現を誘導する方法を提供する：発現ベクターを細胞に導入し、その際、発現ベクターは哺乳動物の温度誘導型プロモーターを含み、この温度誘導型プロモーターがトランスジーンの発現を調節し；そして細胞を誘導温度で培養する。１態様において、温度誘導型プロモーターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のポリヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のポリヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のポリヌクレオチド配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７のポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する。本発明の１態様において、誘導温度はその細胞の生理的温度より低い。本発明の他の態様において、誘導温度は２５℃〜３４℃の範囲である。他の態様において、本発明は、哺乳動物発現ベクターを含むキットであって、哺乳動物発現ベクターがＨＭＴ−７プロモーターのポリヌクレオチド配列およびライリンプロモーターのポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する温度誘導型プロモーターを含むキットをも提供する。
【００１４】
本発明において提供される方法を用いて、異なる培養条件下で差次的に発現する他の配列、たとえば誘導性発現系に有用な可能性のあるプロモーターを単離できることは、当業者に認識されるであろう。したがって、１態様において本発明は、下記の工程を含む方法により判定された、異なる培養条件下で差次的に発現するハムスター配列を提供する：第１ハイブリダイゼーションプロファイルおよび第２ハイブリダイゼーションプロファイルを形成し、その際、第１ハイブリダイゼーションプロファイルは第１細胞から調製されたターゲット核酸を第１ハムスターオリゴヌクレオチドアレイと共にインキュベートすることにより形成され、第２ハイブリダイゼーションプロファイルは第２細胞から調製されたターゲット核酸を第１ハムスターオリゴヌクレオチドアレイと同一の第２ハムスターオリゴヌクレオチドアレイと共にインキュベートすることにより形成され、第１細胞は培養条件に関して第２細胞と異なり；第１および第２ハイブリダイゼーションプロファイルを検出し；第１および第２ハイブリダイゼーションプロファイルを比較し；そして第１ハイブリダイゼーションプロファイルにおいて、第２ハイブリダイゼーションレベルにおける発現レベルに対して差次的な発現レベルをもつ少なくとも１つのハムスター配列を判定する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】３７℃〜２８℃の温度で培養したＣＨＯ細胞によるＨＭＴ−７またはライリンの発現をリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応により測定したもの。図１には、３７℃（白い棒）、３４℃（黒い棒）、３１℃（横線を施した棒）、２８℃（斜線を施した棒）で培養したＣＨＯ細胞により発現した（Ａ）ＨＭＴ−７または（Ｂ）ライリンのＲＮＡの量（ｎｇ；ｙ軸）を示す；４または８実験（実験；ｘ軸）から、リアルタイムＰＣＲにより測定したもの。
【図２】ＨＭＴ−７ゲノム遺伝子座の図。図２にはＨＭＴ−７ゲノム遺伝子座の模式図を示し、これはＲＩＫＥＮ  ０６１００３９Ｎ１９のＡＴＧ開始部位（Ｎ１９“開始部位”）、ＨＭＴ−７の転写開始部位（転写開始部位）、ＨＭＴ−７エキソンおよび対応するペプチド配列（それぞれ長方形および黒矢）、ならびに２つの推定プロモーター部位（Ｐ１−ＨＭＴ−７、Ｐ２−ＨＭＴ−７；白矢）を表わす。
【図３Ａ】対照ヒト胎盤アルカリホスファターゼレポーター構築体、およびＰ２−ＨＭＴ−７プロモーターを含むドメインを含むヒト胎盤アルカリホスファターゼレポーター構築体の模式図。図は、下記の制御下にあるヒト胎盤アルカリホスファターゼレポーター構築体をの図を示す：（図３Ａ）ＨＭＴ−７プロモーターなし。
【図３Ｂ】対照ヒト胎盤アルカリホスファターゼレポーター構築体、およびＰ２−ＨＭＴ−７プロモーターを含むドメインを含むヒト胎盤アルカリホスファターゼレポーター構築体の模式図。図は、下記の制御下にあるヒト胎盤アルカリホスファターゼレポーター構築体をの図を示す：（図３Ｂ）ＣＭＶプロモーター。
【図３Ｃ】対照ヒト胎盤アルカリホスファターゼレポーター構築体、およびＰ２−ＨＭＴ−７プロモーターを含むドメインを含むヒト胎盤アルカリホスファターゼレポーター構築体の模式図。図は、下記の制御下にあるヒト胎盤アルカリホスファターゼレポーター構築体をの図を示す：（図３Ｃ）Ｐ２−ＨＭＴ−７を含むスモールドメイン。
【図３Ｄ】対照ヒト胎盤アルカリホスファターゼレポーター構築体、およびＰ２−ＨＭＴ−７プロモーターを含むドメインを含むヒト胎盤アルカリホスファターゼレポーター構築体の模式図。図は、下記の制御下にあるヒト胎盤アルカリホスファターゼレポーター構築体をの図を示す：（図３Ｄ）Ｐ２−ＨＭＴ−７を含むラージドメイン。
【図４】３７℃〜３１℃の温度で培養したＣＨＯ細胞によるＰ２−ＨＭＴ−７の制御下でのヒト胎盤アルカリホスファターゼレポーター遺伝子の発現をリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応により測定したもの。図４には、Ｐ２−ＨＭＴ−７を含むラージドメインの制御下にあるＳＥＡＰを含むレポーター構築体でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞（中空の棒）、またはＰ２−ＨＭＴ−７を含むスモールドメインの制御下にあるＳＥＡＰを含むレポーター構築体でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞（中実の棒）、またはプロモーターの制御下にないＳＥＡＰを含むレポーター構築体でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞（斜線を施した棒）により３７℃または３１℃（温度；ｘ軸）で培養した後に発現したヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）ＲＮＡの量／ＧＡＰＤＨ  ＲＮＡの量（ＳＥＡＰのｎｇ／ＧＡＰＤＨのｎｇ；ｙ軸）を示す。両温度において、トランスフェクションしていない対照ＣＨＯ細胞のプールにＳＥＡＰ  ＲＮＡは検出されなかった。
【図５】３７℃または３１℃で培養したＣＨＯ細胞による、ＣＭＶプロモーターまたはＰ２−ＨＭＴ−７を含むラージドメインの制御下でのヒト胎盤アルカリホスファターゼレポーター遺伝子の発現をリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応により測定したもの。図５には、Ｐ２−ＨＭＴ−７を含むラージドメインの制御下（▲、●）または対照ＣＭＶプロモーターの制御下（◆、黒四角）にあるレポーター構築体でトランスフェクションし、３７℃（◆、▲）または３１℃（黒四角、●）で培養した、２２クローンのＣＨＯ細胞（クローン番号；ｘ軸）からのヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の相対発現レベル（ＳＥＡＰ  ＲＮＡのｎｇ／ＧＡＰＤＨ  ＲＮＡのｎｇ；ｙ軸）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明者らは、ハムスターオリゴヌクレオチドアレイ（参照：Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．１１／１２８，０４９および１１／１２８，０６１；これら両者を全体として本明細書に援用する）を用いて、特定の培養条件（単数または複数）下で誘導される遺伝子、およびこれらの遺伝子の温度誘導型プロモーターを同定した；したがって、これらを誘導性の哺乳動物発現系の一部として用いて、細胞によるトランスジーン発現を特定の細胞培養条件、たとえば温度に応答してそのような発現を誘導する（たとえば増大させる）ことができるように調節できる。生理的温度より低い温度で差次的に発現した（たとえば２倍大きな発現レベルをもっていた）遺伝子を同定した（実施例１）。リアルタイムＰＣＲおよびノーザンブロット分析により、種々の培養条件での遺伝子配列の差次的な発現を確認した（実施例２）。遺伝子の詳細な特性分析（実施例３）により推定プロモーター配列を同定し、これらを用いて温度誘導性の哺乳動物発現ベクターを作製し（実施例４）、これを用いて誘導温度で組換え遺伝子の発現を誘導することができる（実施例５）。したがって、本発明は、細胞の生理的温度より低い温度で培養された細胞により誘導される（たとえばより高いレベルで発現する）遺伝子のポリヌクレオチド配列（およびサブ配列）を提供する。本発明は、トランスジーンの発現を調節するために使用できる、遺伝子配列のサブ配列（たとえば、それらの遺伝子についてのプロモーター配列および／またはエンハンサー配列）のポリヌクレオチド配列をも提供する。特に、これらの温度誘導型プロモーターを用いて、細胞を誘導温度、たとえばその細胞の生理的温度より低い温度で培養した場合に、細胞によるトランスジーン（そのような温度誘導型プロモーターの制御下にあるもの）のより高い発現を誘導できる。さらに本発明は、本発明の温度誘導型プロモーターを含む温度誘導性発現ベクター、およびそのような発現ベクターを使用する方法を提供する。
【００１７】
単離されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド
したがって、本発明は、生理的温度、たとえば３７℃で培養したＣＨＯ細胞による２種類の遺伝子の発現レベルと比較して、誘導温度、たとえばＣＨＯ細胞の生理的温度より低い温度で培養したＣＨＯ細胞において誘導される（たとえばより高いレベルをもつ）２種類の遺伝子の精製および単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。これらの遺伝子は、好ましくは、細胞による、たとえばトランスジーンの、発現を調節するための適切なターゲットである調節配列（たとえば、コード領域、プロモーター、エンハンサー、終止シグナルなど）を提供する。本発明の遺伝子、ポリヌクレオチド、タンパク質およびポリペプチドには、ハムスター乳腺腫瘍−７（ＨＭＴ−７）およびそれの相同体ならびにハムスターライリンおよびそれの相同体の遺伝子配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００１８】
したがって、本発明は、下記のいずれかまたは両方である新規な単離および精製されたポリヌクレオチドを提供する：１）細胞培養温度に応じて細胞により差次的に発現する、したがって、２）細胞表現型、たとえばトランスジーン発現、を調節するための誘導性の哺乳動物ベクター発現系の一部として使用できる。本発明の新規な単離および精製されたポリヌクレオチドに対する阻害性ポリヌクレオチドを提供することも本発明の一部であり、これはたとえば本発明の新規な単離および精製されたポリヌクレオチドに対するアンタゴニストとして使用できる。
【００１９】
本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むことができ、全体的または部分的に合成によるものであってもよい。本明細書に示すヌクレオチド配列という表現は、状況からそうではないことが要求されない限り、特定の配列またはゲノム均等物（たとえば相補配列）を含むＤＮＡ分子、および特定した配列に対応するＲＮＡ分子（ＴがＵで置き換えられている）を包含する。
【００２０】
たとえば、本発明は、ハムスター乳腺腫瘍−７（ＨＭＴ−７）、ＨＭＴ−７プロモーターおよび／またはＨＭＴ−７エンハンサーなどをコードする新規な単離および精製されたポリヌクレオチドを提供する。本発明の好ましいＤＮＡ配列には、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列および化学合成したＤＮＡ配列が含まれる。
【００２１】
新規遺伝子のヌクレオチド配列（単数または複数）、たとえばハムスター乳腺腫瘍−７をコードするゲノムＤＮＡ（ＨＭＴ−７ゲノムＤＮＡと表記する）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示すヌクレオチド配列を有する、および／または本質的にそれからなる。本発明のポリヌクレオチドには、ストリンジェントな条件下でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１もしくはそれの相補配列にハイブリダイズする、および／または全長ＨＭＴ−７の実質的な生物活性を保持するポリペプチド（すなわち活性フラグメント）をコードする、ポリヌクレオチドも含まれる。本発明のポリヌクレオチドには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示す配列の少なくとも２１の連続ヌクレオチドを含む連続部分も含まれる。
【００２２】
Ｐ１−ＨＭＴ−７およびＰ２−ＨＭＴ−７と表示される２つの新規なＨＭＴ−７プロモーターは、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示すヌクレオチド配列を有する、および／または本質的にそれからなる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド５６１６−５７６２のヌクレオチド配列であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド２４２３−２６７３のヌクレオチド配列である。本発明のポリヌクレオチドには、ストリンジェントな条件下でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２もしくは３および／またはその相補配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド、、および／またはＰ１−ＨＭＴ−７もしくはＰ２−ＨＭＴ−７の実質的な生物活性を保持するものも含まれる。本発明のポリヌクレオチドには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示す配列の少なくとも２１の連続ヌクレオチドを含む連続部分も含まれる。
【００２３】
ＨＭＴ−７をコードする新規ｃＤＮＡ（ＨＭＴ−７  ｃＤＮＡと表記する）のヌクレオチド配列（単数または複数）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示すヌクレオチド配列を有する、および／または本質的にそれからなる。本発明のポリヌクレオチドには、ストリンジェントな条件下でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４もしくはそれの相補配列にハイブリダイズする、および／または全長ＨＭＴ−７の実質的な生物活性を保持するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドも含まれる。本発明のポリヌクレオチドには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示す配列の少なくとも２１の連続ヌクレオチドを含む連続部分も含まれる。
【００２４】
新規ＨＭＴ−７タンパク質のアミノ酸配列（単数または複数）をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示す。本発明のポリペプチドには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示す配列の少なくとも７の連続アミノ酸を含む連続部分も含まれる。本発明の好ましいポリペプチドには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示す配列のいずれかの連続部分であって全長ＨＭＴ−７の実質的な生物活性を保持する部分、すなわちＨＭＴ−７の活性フラグメントも含まれる。本発明のポリヌクレオチドには、前記のハムスター由来のポリヌクレオチドのほか、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示すアミノ酸配列またはその連続部分をコードするポリヌクレオチドであって、遺伝子コードの周知の縮重のため前記のポリヌクレオチドと異なるにすぎないものも含まれる。
【００２５】
他の態様において、本発明は、ハムスターライリン、ライリンプロモーターおよび／またはライリンエンハンサーなどをコードする新規な精製および単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明の好ましいＤＮＡ配列には、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列および化学合成したＤＮＡ配列が含まれる。
【００２６】
ハムスターライリンをコードする新規遺伝子、すなわちゲノムＤＮＡ（ライリンゲノムＤＮＡと表記する）のヌクレオチド配列（単数または複数）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示すヌクレオチド配列を有する、および／または本質的にそれからなる。本発明のポリヌクレオチドには、ストリンジェントな条件下でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６もしくはそれの相補配列にハイブリダイズする、および／または全長ライリンの実質的な生物活性を保持するポリペプチド（すなわち活性フラグメント）をコードする、ポリヌクレオチドも含まれる。本発明のポリヌクレオチドには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示す配列の少なくとも２１の連続ヌクレオチドを含む連続部分も含まれる。
【００２７】
新規ライリンプロモーター（Ｐ−ライリンと表記する）のヌクレオチド配列（単数または複数）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示すヌクレオチド配列を有する、および／または本質的にそれからなる。本発明のポリヌクレオチドには、ストリンジェントな条件下でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７もしくはそれの相補配列にハイブリダイズする、および／またはＰ−ライリンの実質的な生物活性を保持する、ポリヌクレオチドも含まれる。本発明のポリヌクレオチドには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示す配列の少なくとも２１の連続ヌクレオチドを含む連続部分も含まれる。
【００２８】
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとして用いて、開示したポリヌクレオチドをコードする核酸と同一または類似の配列を有する核酸を同定および単離することができる。核酸を同定および単離するためのハイブリダイゼーション方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、サザンハイブリダイゼーション、インサイチューハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションを含み、当業者に周知である。
【００２９】
ハイブリダイゼーション反応は種々のストリンジェンシーの条件下で実施できる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーには、いずれか２つの核酸分子が互いにハイブリダイズする際の困難度が含まれる。好ましくは、ハイブリダイズする各ポリヌクレオチドはそれに対応するポリヌクレオチドに、低いストリンジェンシーの条件下で、より好ましくはストリンジェントな条件下で、最も好ましくは高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。ストリンジェンシーの条件の例を下記の表１に示す：高度にストリンジェントな条件は、たとえば条件Ａ〜Ｆと少なくとも同程度にストリンジェントである；ストリンジェントな条件は、たとえば条件Ｇ〜Ｌと少なくとも同程度にストリンジェントである；低いストリンジェンシーの条件は、たとえば条件Ｍ〜Ｒと少なくとも同程度にストリンジェントである。
【００３０】
【表１−１】
2012508026.tif 000003
【００３１】
【表１−２】
2012508026.tif 000004
【００３２】
一般に、前記のように、本発明の単離されたポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとして用いて、開示したポリヌクレオチドに対して相同なＤＮＡを同定および単離することもできる。これらの相同配列は、開示したポリヌクレオチドのものとは異なる種から、または同一種内で単離されたポリヌクレオチドであるが、開示したポリヌクレオチドに対して有意の配列類似性をもつポリヌクレオチドである。好ましくは、ポリヌクレオチド相同配列は、開示したポリヌクレオチドと少なくとも６０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも７５％の配列同一性；最も好ましくは、少なくとも９０％の配列同一性）をもつ。好ましくは、開示したポリヌクレオチドの相同配列は哺乳動物種から単離されるものである。
【００３３】
本発明の単離されたポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとして用いて、本発明のポリヌクレオチドを発現する細胞および組織ならびにそれらが発現される条件を同定することもできる。
【００３４】
さらに、本発明のポリヌクレオチドを用いて細胞または生物における本発明のＨＭＴ−７ポリヌクレオチド配列に対応する遺伝子の発現を変更する（たとえば、増大、低下、または改変する）ことができる。これらの対応する遺伝子は、転写されて本発明のＨＭＴ−７ポリヌクレオチド配列を誘導するｍＲＮＡを生成する、本発明のゲノムＤＮＡ配列である。
【００３５】
阻害性ポリヌクレオチド
細胞または生物における本発明に包含されるＨＭＴ−７またはライリンのポリヌクレオチド配列の発現変更は、種々の阻害性ポリヌクレオチド、たとえばアンチセンスポリヌクレオチド、本発明の遺伝子から転写されたｍＲＮＡを結合および／または開裂させるリボザイム、遺伝子の調節領域をターゲティングするトリプレックス形成オリゴヌクレオチド、およびターゲットｍＲＮＡを配列特異的に分解するｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用により達成できる(たとえば、Galderisi et al. (1999) J. Cell. Physiol. 181: 251-57; Sioud (2001) Curr. Mol. Med. 1: 575-88; Knauert and Glazer (2001) Hum. Mol. Genet. 10: 2243-51; Bass (2001) Nature 411: 428-29)。阻害性ポリヌクレオチドの使用はライリンに対して相同な遺伝子について記載されている(たとえば、Ｕ．Ｓ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００５／０１３６４３５および国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ  ２００５／０６０９９６  Ａ２を参照）が、本発明者らはライリンに対する阻害性ポリヌクレオチドについて公開された報告を知らないことを留意すべきである。
【００３６】
本発明の阻害性アンチセンスまたはリボザイムポリヌクレオチドは、本発明の遺伝子の全コード鎖に対して、またはその一部のみに対して相補的であってよい。あるいは、阻害性ポリヌクレオチドは本発明の遺伝子のコード鎖の非コード領域に対して相補的であってもよい。本発明の阻害性ポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の方法を用いる化学合成および／または酵素ライゲーション反応を用いて構築できる。化学合成したポリヌクレオチドのヌクレオチド結合を修飾して、それらがヌクレアーゼ仲介による分解に抵抗する能力を増強し、かつそれらの配列特異性を高めることができる。そのような結合修飾にはホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、モルホリノ、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）結合が含まれるが、これらに限定されない(Galderisi et al.,前掲; Heasman (2002) Dev. Biol. 243: 209-14; Mickelfield (2001) Curr. Med. Chem. 8: 1157-79)。あるいは、アンチセンス分子は、本発明のポリヌクレオチドをアンチセンス（すなわち逆）配向でサブクローニングした発現ベクターを用いて生物学的に製造できる。
【００３７】
さらに他の態様において、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド分子はαアノマー型ポリヌクレオチド分子である。αアノマー型ポリヌクレオチド分子は、相補的ＲＮＡと共に特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、この場合、通常のβユニットと異なり、それらの鎖は互いに平行な向きである。アンチセンスポリヌクレオチド分子は、当技術分野で既知の方法に従って２’−ｏ−メチルリボヌクレオチドまたはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体を含むこともできる。
【００３８】
本発明に包含される阻害性トリプレックス形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）は、デュプレックスＤＮＡの主溝に高い特異性および親和性で結合する(Knauert and Glazer,前掲)。本発明の遺伝子の発現は、それらの遺伝子の調節領域（すなわち、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列）に対して相補的なＴＦＯをターゲティングして、遺伝子の転写を阻害する三重らせん構造を形成することにより阻害できる。
【００３９】
本発明の１態様において、本発明の阻害性ポリヌクレオチドはｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である。これらのｓｉＲＮＡ分子は、ターゲットｍＲＮＡの配列特異的分解を引き起こす短い（好ましくは１９〜２５ヌクレオチド；最も好ましくは１９または２１ヌクレオチド）二本鎖ＲＮＡ分子である。この分解はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる（たとえば、Bass (2001) Nature 411: 428-29）。ＲＮＡｉは最初は下等生物において同定されたが、哺乳動物細胞に効果的に適用されており、最近ではＦａｓ  ｍＲＮＡをターゲティングするｓｉＲＮＡ分子で処理したマウスにおいて劇症肝炎を予防することが示された(Song et al. (2003) Nat. Med. 9: 347-51)。さらに、ラットの２モデル（アゴニスト誘導型疼痛モデルおよび神経障害性疼痛モデル）においてクモ膜下送達されたｓｉＲＮＡが疼痛応答を遮断することが最近報告された(Dorn et al. (2004) Nucleic Acids Res. 32(5): e49)。
【００４０】
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、２つの相補的一本鎖ＲＮＡ分子を互いにアニールさせることにより（それらのうち一方はターゲットｍＲＮＡの一部に一致する）(Ｆｉｒｅら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，５０６，５５９）、またはそれ自身が折りたたまれて必要な二本鎖部分を生成する単一のヘアピンＲＮＡ分子の使用により(Yu et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 6047-52)作製できる。ｓｉＲＮＡ分子は化学合成でき(Elbashir et al. (2001) Nature 411: 494-98)、あるいは一本鎖ＤＮＡ鋳型を用いてインビトロ転写により作製できる (Yu et al.,前掲)。あるいは、ｓｉＲＮＡ分子は生物学的に、一過性で(Yu et al., supra; Sui et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 5515-20)、または安定的に(Paddison et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 1443-48)、センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を含む発現ベクター（単数または複数）を用いて産生させることができる。最近、初代ヒト細胞においてターゲットｍＲＮＡのレベルが効率的かつ配列特異的に低下することが、ヘアピンＲＮＡを発現しこれがさらにプロセシングされてｓｉＲＮＡになるアデノウイルスベクターを用いて立証された(Arts et al. (2003) Genome Res. 13: 2325-32)。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドをターゲティングしたｓｉＲＮＡ分子は、当技術分野で周知の基準に基づいて設計することができる(たとえば、Elbashir et al. (2001) EMBO J. 20: 6877-88)。たとえば、ターゲットｍＲＮＡのターゲットセグメントはＡＡ（好ましい）、ＴＡ、ＧＡまたはＣＡで開始すべきである；ｓｉＲＮＡ分子のＧＣ比は４５〜５５％とすべきである；ｓｉＲＮＡ分子は３つの同一ヌクレオチドを連続して含むべきでない；ｓｉＲＮＡ分子は７つの混合Ｇ／Ｃを連続して含むべきでない；およびターゲットセグメントはターゲットｍＲＮＡのＯＲＦ領域内にあるべきであり、かつ開始ＡＴＧ後少なくとも７５ｂｐおよび終止コドン前少なくとも７５ｂｐにあるべきである。本発明のポリヌクレオチドをターゲティングするｓｉＲＮＡ分子は、以上の基準または他の既知の基準を用いて当業者が設計できる。
【００４２】
細胞または生物における本発明のポリヌクレオチドの発現変更は、そのゲノムに本発明のポリヌクレオチドを導入したヒト以外のトランスジェニック動物の作製によっても達成できる。そのようなトランスジェニック動物には、多数コピーの本発明遺伝子（すなわちトランスジーン）をもつ動物が含まれる。特定の細胞または特定の発生段階に本発明のポリヌクレオチドの発現を指向させるために、組織特異的配列（単数または複数）を作動可能な状態で本発明のポリヌクレオチドに結合させてもよい。他の態様において、トランスジーンの調節発現を可能にする選択した系を含むヒト以外のトランスジェニック動物を作製できる。当技術分野で既知であるそのような系の一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。胚の操作およびマイクロインジェクションによりトランスジェニック動物、特にマウスなどの動物を作製するための方法は当技術分野で一般的になっており、周知である(たとえば、Bockamp et al. (2002) Physiol. Genomics 11: 115-32)。本発明の少なくとも１態様において、ヒト以外のトランスジェニック動物は少なくとも１つのＨＭＴ−７ポリヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
細胞または生物における本発明の遺伝子の発現変更は、本発明のポリヌクレオチドに相当する内因性遺伝子を外因性ポリヌクレオチド配列の挿入により破壊した動物の作製によっても達成できる（すなわちノックアウト動物）。内因性遺伝子のコード領域を破壊し、これにより非機能性タンパク質を生成させることができる。あるいは、内因性遺伝子の上流調節領域を破壊するか、または異なる調節エレメントで置換し、その結果、依然として機能性の（ｓｔｉｌｌ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）タンパク質の発現を変更することができる。ノックアウト動物を作製する方法は相同組換えを含み、当技術分野で周知である(たとえば、Wolfer et al. (2002) Trends Neurosci. 25: 336-40)。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの組換え製造のために、本発明の単離されたポリヌクレオチドを、作動可能な状態で発現制御配列、たとえばｐＭＴ２およびｐＥＤ発現ベクターに結合させることができる。組換えタンパク質を発現させる一般的方法は当技術分野で周知である。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの組換え発現のために、多数のタイプの細胞が適切な宿主細胞として作動できる。哺乳動物宿主細胞にはたとえば下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、Ａ４３１細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、ジャーカット細胞、正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養からの細胞株、および初代外植体。
【００４６】
あるいは、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを下等真核細胞、たとえば酵母、または原核細胞において組換え産生できる可能性がある。適切である可能性のある酵母株には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株、およびカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）株が含まれる。適切である可能性のある細菌株には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）が含まれる。ポリペプチドを酵母または細菌において生成させる場合、機能性を得るために、それらをたとえば適宜な部位のリン酸化またはグリコシル化により修飾することが必要である可能性がある。そのような共有結合は周知の化学的方法または酵素法により達成できる。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、本発明の単離されたポリヌクレオチドを１以上の昆虫発現ベクター、たとえばバキュロウイルスベクターにおいて適切な制御配列に作動可能な状態で結合させ、そして昆虫発現系を用いることにより、組換え製造することもできる。バキュロウイルス／Ｓｆ９発現系のための材料および方法は、キットの形で市販されている（たとえば、ＭａｘＢａｃ（登録商標）キット，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールズバッド）。
【００４８】
適宜な宿主細胞において組換え発現させた後、次いで本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを、培養培地または細胞抽出物から既知の精製法、たとえばゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製することができる。精製には、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを結合することが知られている作用物によるアフィニテクロマトグラフィーも含めることができる。これらの精製法を用いて天然源からポリペプチドを精製することもできる。
【００４９】
あるいは、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、精製を容易にする形態で組換え発現させることもできる。たとえば、それらのポリペプチドをマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）などのタンパク質との融合体として発現させることができる。そのような融合タンパク質の発現および精製のためのキットが、それぞれＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（マサチュセッツ州ビバリー）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ニュージャージー州ピスカッタウェイ）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールズバッド）から販売されている。本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに低分子エピトープでタグを付け、その後そのエピトープに対して特異的な抗体を用いて同定または精製することもできる。好ましいエピトープはＦＬＡＧエピトープであり、これはＥａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ（コネチカット州ニューヘブン）から販売されている。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、既知の一般的な化学合成により製造することもできる。本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを化学合成するための方法は当業者に周知である。そのような化学合成ポリペプチドは天然の精製ポリペプチドと共通の生物学的特性をもつことができ、したがって天然ポリペプチドに代わる生物活性代替品または免疫代替品として使用できる。
【００５１】
温度誘導型のプロモーターおよび哺乳動物発現ベクター
ＨＭＴ−７の新規なｃＤＮＡおよびアミノ酸配列のほか、本発明者らは、ＨＭＴ−７をコードする遺伝子の新規配列（すなわち、ＨＭＴ−７ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列をもち、かつコードＤＮＡの前後の領域（たとえば、プロモーター、エンハンサー、ＵＴＲなど）ならびに、エキソン間のイントロン、を含むＤＮＡ）をも提供する。本発明者らは、ハムスターライリンをコードする遺伝子の新規配列（すなわち、ライリンポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列をもち、かつコードＤＮＡの前後の領域（たとえば、プロモーター、エンハンサー、ＵＴＲなど）ならびに、エキソン間のイントロン、を含むＤＮＡ）をも提供する；ハムスターライリンのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋタベース中にそれぞれアクセッション番号ＡＦ０９６７３およびＡＡＣ６８６９５で見出すことができる。これらの新規な遺伝子配列の提供に際して、本発明者らはＨＭＴ−７およびライリン両方の推定プロモーター配列をも提供する。ＣＨＯ細胞は、細胞を生理的温度より低い温度で培養した場合にＨＭＴ−７またはライリンをより高いレベルで発現するので、ＨＭＴ−７およびライリンのプロモーターは温度誘導型プロモーターとして使用できると予想される。事実、本発明者らはＨＭＴ−７プロモーター（たとえば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示すヌクレオチド配列をもち、および／または本質的にそれからなるＨＭＴ−７プロモーター）を用いて、細胞をそれの生理的温度より低い温度で培養した場合、それの制御下で細胞によるトランスジーンのより高い発現を誘導できることを立証した（実施例５）。さらに、ライリンプロモーター（たとえば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示すヌクレオチド配列をもち、および／または本質的にそれからなるライリンプロモーター）を同様に使用できると考えられる（実施例６）。したがって、本発明は温度誘導型プロモーターを提供する。
【００５２】
前記に述べたように、ＨＭＴ−７プロモーターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示すヌクレオチド配列をもち、および／または本質的にそれからなることができる；ライリンプロモーターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示すヌクレオチド配列をもち、および／または本質的にそれからなることができる。これらのプロモーターは、たとえば周知のプロモーター配列の特性に基づいて、たとえば他の既知のプロモーター配列との相同性に基づいてプロモーター領域を推定するコンピューターアルゴリズムを用いて決定された。これらの特性を用いて、当業者はＨＭＴ−７またはライリンの他のプロモーターを認識および同定することができるであろう；それらはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６中に見出せるものまたは見出せないものであってよい。さらに、本明細書に示す方法を含めた周知の方法（たとえば、レポーターアッセイを用い、細胞を種々の温度で培養する方法）を用いて、そのような当業者は、同定したプロモーターが低温誘導型プロモーターであるかどうか、および／またはそのような温度誘導型プロモーターの有効性も判定できるであろう。そのような温度誘導型プロモーターは本発明の範囲内にあるものとみなされる。
【００５３】
さらに、当業者は周知の組換えＤＮＡ技術を用いて、本発明の温度誘導型プロモーターとトランスジーンを温度誘導型プロモーターがそのトランスジーンに対する調節配列として作用するように、すなわち、温度誘導型プロモーターをも誘導する温度で温度誘導型プロモーターがそのトランスジーンの転写を誘導する（そして、おそらく最終的には組換えタンパク質を発現する）ように、組み換えることができるであろう。そのような組換えによる温度誘導型プロモーター−トランスジーン構築体を単独でまたはより容易には組換え発現ベクターの一部として宿主細胞に導入できることは、当業者に認識されるであろう。さらに、トランスジーンは本発明に用いるレポーター遺伝子またはレポーター遺伝子全般に限定されないこと、すなわちポリペプチドをコードする大部分の遺伝子および／またはｃＤＮＡを本発明の温度誘導型プロモーターの調節下におくことができることが、当業者に認識されるであろう。
【００５４】
本明細書中で用いる用語“発現ベクター”はそれに連結させた他の核酸を輸送することができる核酸分子を表わすものであることを、当業者は認識するであろう。１タイプのベクターは“プラスミド”であり、これはその中へ追加のＤＮＡセグメントをライゲートさせることができる環状二本鎖ＤＮＡループを表わす。他のタイプのベクターはウイルスベクターであり、その場合、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中へライゲートさせることができる。あるベクターはそれが導入された宿主内で自己複製することができる（たとえば、細菌の複製起点をもつ細菌ベクター、およびエピソーム型の哺乳動物ベクター）。宿主細胞への導入に際して、他のベクター（たとえば、非エピソーム型の哺乳動物ベクター）を宿主細胞のゲノム中へ組み込み、これにより宿主ゲノムと共に複製させることができる。さらに、あるベクターはそれらが作動可能な状態で連結している遺伝子の発現を指令することができる。そのようなベクターを本明細書中で“組換え発現ベクター”（または単に“発現ベクター”）と呼ぶ。
【００５５】
用語“調節配列”は、本発明の温度誘導型プロモーター、他のプロモーター、エンハンサー、およびトランスジーンの転写または翻訳を制御する他の発現制御エレメント（たとえばポリアデニル化シグナル）を包含するものとする。そのような調節配列は、たとえばGoeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。本発明の発現ベクターの設計が、本発明の温度誘導型プロモーターのほか他の調節配列の選択を含めて、形質転換される宿主細胞の選択、目的とするタンパク質の発現レベルなどの要因に依存することは、当業者に認識されるであろう。哺乳動物宿主細胞における発現のための本発明の組換え発現ベクター（すなわち、本発明の温度誘導型プロモーターを含む発現ベクター）に含まれる可能性のある他の調節配列は、好ましくは哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を指令するウイルスエレメント、たとえば下記のものに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーである：ＦＦ−１ａプロモーターおよびＢＧＨポリＡ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（たとえば、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（たとえばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（たとえば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｍａｊｏｒ  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）（ＡｄＭＬＰ））、およびポリオーマ。ウイルス性調節エレメントおよびその配列の詳細な記述については、たとえば下記を参照されたい：Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，１６８，０６２、Ｓｔｉｎｓｋｉによる，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，５１０，２４５、Ｂｅｌｌらによる、およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，９６８，６１５、Ｓｃｈａｆｆｎｅｒらによる。
【００５６】
本発明の組換え発現ベクターは、さらに他の配列、たとえば宿主細胞における複製を調節する配列（たとえば複製起点）および選択マーカー遺伝子を含むことができる。選択マーカー遺伝子は、そのベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（たとえば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔｓ  Ｎｏ．４，３９９，２１６、４，６３４，６６５および５，１７９，０１７を参照，すべてＡｘｅｌらによる）。たとえば、一般に選択マーカー遺伝子は、そのベクターが導入された宿主細胞に、薬物、たとえばＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートに対する耐性を与える。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞に使用するためのもの、メトトレキセート選択／増幅を含む）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のためのもの)が含まれる。
【００５７】
温度誘導性哺乳動物発現ベクターの使用方法
本発明は、本発明の温度誘導型プロモーターを（たとえば本発明の発現ベクターの一部として）用いてトランスジーンの発現を調節する方法、たとえば細胞を誘導温度で培養することにより細胞によるトランスジーン発現を誘導する方法をも提供する。たとえば、本発明は下記の工程を含む、細胞によるトランスジーン発現を誘導する方法を提供する：（１）発現ベクターを細胞に導入し、その際、発現ベクターは哺乳動物の温度誘導型プロモーター（たとえば、ＨＭＴ−７プロモーターのポリヌクレオチド配列およびライリンプロモーターのポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列をもち、および／または本質的にそれからなる、温度誘導型プロモーター）を含み、この温度誘導型プロモーターがトランスジーンの発現を調節する；そして、（２）細胞を誘導温度で培養する。本発明の１態様において、ＨＭＴ−７プロモーターのポリヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリヌクレオチド配列をもち、および／または本質的にそれからなる。本発明の他の態様において、ＨＭＴ−７プロモーターのポリヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のポリヌクレオチド配列をもち、および／または本質的にそれからなる。本発明のさらに他の態様において、ライリンプロモーターのポリヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のポリヌクレオチド配列をもち、および／または本質的にそれからなる。
【００５８】
本発明の温度誘導型プロモーター（または本発明の温度誘導型プロモーターを含む発現ベクター（単数または複数））を宿主である細胞または生物に導入するために利用できるいずれかの技術は当業者に周知であり、使用できる。たとえば、本発明の温度誘導型プロモーターおよび／または発現ベクターを化学的に、またはインビトロ酵素合成により合成する場合、宿主細胞または生物に導入する前に精製することができる。たとえば、温度誘導型プロモーターおよび／または発現ベクターを混合物から、溶媒もしくは樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、またはその組合わせによって精製することができる。あるいは、試料処理による損失を避けるために、温度誘導型プロモーターおよび／または発現ベクターを精製せずに、または最小限の精製で使用できる。温度誘導型プロモーターおよび／または発現ベクターを貯蔵のために乾燥させ、あるいは水溶液に溶解することができる。溶液は、温度誘導型プロモーターおよび／または発現ベクターのアニーリングおよび／または安定化を増進するために、緩衝剤または塩類を含有することができる。精製した場合、温度誘導型プロモーターおよび／または発現ベクターを細胞に直接導入し、細胞外に生物の腔もしくは間質腔内または循環中へ導入し、経口導入し、あるいは本発明の温度誘導型プロモーターおよび／または発現ベクターを含む溶液に細胞または生物を浸漬すること（ｂａｔｈｉｎｇ）により導入できる。核酸を導入するための物理的方法には、本発明の温度誘導型プロモーターおよび／または発現ベクターを含む溶液の注入、本発明の温度誘導型プロモーターおよび／または発現ベクターで被覆した粒子の衝突、溶液中での細胞または生物のソーキングまたは浸漬、あるいはエレクトロポレーションが含まれる。
【００５９】
真核細胞について、温度誘導型プロモーター（単数または複数）および／または本発明の温度誘導型プロモーターを含む発現ベクター（単数または複数）を導入するのに適切な技術には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム仲介トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルス、たとえばワクシニアを用いる形質導入（transduction）を含めることができる。好ましい態様において、ウイルス粒子内にパッケージしたウイルス構築体は、細胞内への本発明の温度誘導型プロモーターおよび／または発現ベクターの効率的な導入と、温度誘導型プロモーターにより調節されたトランスジーンの転写の両方を達成する。さらに、本発明の温度誘導型プロモーターおよび／または発現ベクターは、下記の活性のうち１以上を行う構成要素と共に導入することができる：細胞による取込みを促進する、温度誘導型プロモーターおよび／または発現ベクターの安定性を増大させる、など。最後に、導入に続いて、たとえば宿主細胞を誘導温度で培養することにより、温度誘導型プロモーターからの発現を引き起こし、または生じさせることができる。本発明の１態様において、誘導温度は宿主細胞の生理的温度より低い。本発明の他の態様において、誘導温度は約３１℃である。
【００６０】
発現の誘導は、トランスジーン生成物（たとえばｍＲＮＡおよび／またはタンパク質）のレベルが観察できるほど増大することを表わし、宿主である細胞もしくは生物の外部特性の検査により、または生化学的技術、たとえばハイブリダイゼーション反応（たとえばノーザンブロット分析、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、マイクロアレイ分析など）、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応、結合反応（たとえば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳなど）、レポーターアッセイ、薬物耐性アッセイなどにより検出できる。検出方法に応じて、本発明の温度誘導型プロモーターおよび／または発現ベクターによるトランスジーンの調節は、誘導温度（たとえば、細胞の生理的温度より低い温度）で培養した宿主細胞によるトランスジーン発現において、宿主細胞の生理的温度で培養した宿主細胞によるトランスジーン発現と比較して５％、１０％、３３％、５０％、９０％、９５％または９９％より大きい増大を誘導すべきである。さらに、宿主細胞の集団を本明細書に提示した方法により処理すると、本発明の温度誘導型プロモーターおよび／または発現ベクターにより調節されたトランスジーンの誘導発現を示す細胞画分を生じることができる（たとえば、処理した細胞の少なくとも２％、５％、１０％、２０％、５０％、７５％、９０％、９５％または９９％）。本発明の温度誘導型プロモーターおよび／または発現ベクターの用量を増加させることにより、検出される誘導の量を増加させることができる。処理した細胞（単数または複数）または生物（単数または複数）におけるトランスジーン発現の定量がタンパク質レベルと比較してｍＲＮＡレベルで異なる誘導レベルを示す可能性があることは、当業者に認識されるであろう。一例として、阻害の効率は目的遺伝子のｍＲＮＡレベルをたとえばノーザンブロット分析により検出することによって測定できるが、阻害のレベルを測定する好ましい方法はタンパク質レベルの検出によるものである。
【００６１】
本発明の温度誘導型プロモーターおよび／または発現ベクターは、前記のように、少なくとも１コピーの温度誘導型プロモーターを細胞に導入できるのに十分な量で、宿主である細胞または生物に導入できる。より高い容量（たとえば、細胞当たり少なくとも５、１０、１００、５００または１０００コピー）の本発明の温度誘導型プロモーターおよび／または発現ベクターは、誘導温度で、より効果的な誘導を生じることができる。
【００６２】
本出願において引用したすべての参考文献、特許、特許出願および刊行物の内容全体を本明細書に援用する。
【実施例】
【００６３】
以下の実施例は本発明の理解を助けるために示すものであるが、決して本発明の範囲をそれらに限定するものではなく、そのように解釈すべきではない。実施例は一般的な方法、たとえばリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、細胞培養、ＲＮＡ定量、あるいはベクターの構築、そのようなベクターおよびプラスミド中へのポリペプチドをコードする遺伝子の挿入、宿主細胞中へのそのようなベクターおよびプラスミドの導入、および宿主細胞におけるのそのようなベクターおよびプラスミドからのポリペプチドの発現に使用する方法の詳細な記述を含まない。そのような方法は当業者に周知である。
【００６４】
実施例１
異なる培養温度で差次的発現するＣＨＯ配列の決定
実施例１．１：ターゲット核酸のプールの調製
試験したそれぞれの時点および温度について、二つ組の培養物は化学的に誘導された適切な無血清培地中において２ｘ１０５細胞／ｍｌで接種し、直ちに３１℃で培養するか、または３７℃で２４時間増殖させた後に３１℃で培養した（細胞量を増加させるために）。細胞を分割または補給しなかった。２または５日後、１ｘ１０７の細胞を各培養物から収穫した。３７℃で２または５日間培養したＣＨＯ  Ｋ１細胞の各集団（対照）、および３１℃で２または５日間培養したＣＨＯ  Ｋ１細胞の各集団から、周知の方法を用いて全ＲＮＡを単離した。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．１１／１２８，０４９および１１／１２８，０６１に従って作製したオリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーションのために、全ＲＮＡをビオチニル化ｃＲＮＡに変換した。要約すると、ＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，カリフォルニア州バレンシア）を用いて製造業者のプロトコルに従って全ＲＮＡを単離した。単離した全ＲＮＡ（５μｇ）を次いで、ＢＡＣプール対照試薬を含む反応において７０℃で１０分間のインキュベーションにより、オリゴ−ｄＴプライマー（１００ｐＭｏｌｅ）にアニールさせた。次いでこのプライマー付きＲＮＡを、２００単位のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ＩＩ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールズバッド）および各０．５ｍＭのｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に１ｘ第１鎖用緩衝液中において５０℃で１時間のインキュベーションにより、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写した。４０単位のＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ、１０単位の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ、２単位のＲＮａｓｅ  Ｈ、３０μｌの第２鎖用緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、３μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）および最終体積１５０μｌとなる量のｄＨ２０を添加し、１５℃で２時間インキュベートすることにより、第２鎖合成を実施した。次いでＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（１０単位）を添加して、さらに５分間おいた。１０μｌの５００ｍＭ  ＥＤＴＡの添加により反応を停止した。得られた二本鎖ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて精製した。このｃＤＮＡ（１０μｌ）を、１７５０単位のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびビオチニル化ｒＮＴＰと共に３７℃で１６〜２０時間インキュベートすることにより、インビトロでｃＲＮＡに転写した。得られたｃＲＮＡ中へ、ビオチニル化ｒＮＴＰを用いてビオチンを取り込ませた。次いで、ｃＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて製造業者のプロトコルに従ってビオチニル化ｃＲＮＡを精製し、分光光度計を用いて定量した。
【００６５】
実施例１．２：オリゴヌクレオチドアレイへのターゲット核酸のハイブリダイゼーション
ビオチン標識ｃＲＮＡ（１５μｇ）を９５℃で３５分間、４０μｌの１ｘＦｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）中においてフラグメント化した。フラグメント化したｃＲＮＡをハイブリダイゼーション液［２６０μｌの１ｘＭＥＳ緩衝液：３００ｎｇのニシン精子ＤＮＡ、３００ｎｇのＢＳＡ、６．２５μｌの対照オリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドアレイをアラインさせるために使用（たとえば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  から販売されるＯｌｉｇｏ  Ｂ２：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘオリゴヌクレオチドプローブアレイをアラインさせるために使用）、および２．５μｌの標準曲線試薬(Hill et al. (2000) Science 290: 809-12に記載)、を含有]中に希釈し、９５℃で５分間変性させ、続いて直ちに４５℃で５分間インキュベートした。不溶性物質を短時間の遠心により除去し、ハイブリダイゼーションミックスをＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．１１／１２８，０４９および１１／１２８，０６１に記載のオリゴヌクレオチドアレイに添加した。４５℃で１６時間、６０ｒｐｍの連続回転条件下で、ターゲット核酸を相補的オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせた。インキュベーション後、ハイブリダイゼーション液を除去し、当技術分野で既知のプロトコルを用いてオリゴヌクレオチドアレイを６ｘＳＳＰＥＴおよび１ｘＳＳＰＥＴで十分に洗浄した。
【００６６】
実施例１．３：ターゲット核酸のプールをオリゴヌクレオチドアレイにハイブリダイズすることにより得られたハイブリダイゼーションプロファイルの検出および分析
各遺伝子の未加工の蛍光強度値を３μｍの解像度でＡｇｉｌｅｎｔ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒにより測定した。ある遺伝子が“存在する”か“存在しない”かを判定するためのアルゴリズムを用いるＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州サンタクララ）、およびアレイ上の各遺伝子の特異的ハイブリダイゼーション強度値を用いて、蛍光データを評価した。各ハイブリダイゼーションミックス中に少量添加した既知存在度の１１の対照転写物の発現値と照らし合わせて、各遺伝子の発現値を頻度値に正規化した；Hill et al. (2001) Genome Biol. 2(12): research 0055.1-0055.13、およびHill et al. (2000) Science 290 : 809-12の方法に従う；それらの両方を全体として本明細書に援用する。各遺伝子の頻度を計算した；これは１０６の全転写物当たりの個々の遺伝子転写物の総数に等しい値である。
【００６７】
それぞれの条件および時点を４つの生物学的複製物により表わした。四つ組の生物学的複製物を各時点につきアッセイした。各複製物を二つ組でアッセイした。次いで全実験を繰り返した。当技術分野で既知のプログラム、たとえばＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ  ２０００（Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ、メリーランド州ガイザースバーグ）を用いて、ターゲット配列の存在および不存在を分析し、１コホートの試料（たとえば、条件または時点）におけるそれの相対発現レベルを他の試料コホートと比較して判定した。すべての複製物試料において存在と呼び出されたプローブセットを、以後の分析用とみなした。ｐ値が０．０５以下である場合、一般に２倍以上の変化倍率値を統計的に有意とみなした。
【００６８】
発現プロファイルプログラムＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ  ２０００を用いて遺伝子を同定した。未知の配列をｂｌａｓｔ相同性検索により検索した。培養温度を低下させた際に遺伝子の転写活性が増大した幾つかの遺伝子が同定された。１１遺伝子の発現レベルが２倍より大きく変化した（ｐ値＜０．０５）。１１遺伝子のうち５つは、３７℃で経時的に低下するＲＮＡ発現レベルを示したが、３１℃では定常的な発現レベルをもっていた（“低温誘導遺伝子”；データは示していない）。残りの６遺伝子は、ＣＨＯ細胞を３１℃で培養した際に経時的に増大するＲＮＡ発現レベルを示した（データは示していない）。２種類の低温誘導遺伝子、ハムスター乳腺腫瘍−７（ＨＭＴ−７；ＲＩＫＥＮ  ０６１００３７Ｎ１９またはＮ１９とも呼ぶ）およびライリンを以後の分析のために選択した。
【００６９】
ＨＭＴ−７コード領域はＭＭＴ−７と９１％同一であり、ＲＭＴ−７と８９％同一である。ＲＭＴ−７およびＭＭＴ−７の寄託番号は、それぞれＡＦ４６５６１４およびＮＭ＿０２６１５９である(Wang et al. (2001) Oncogene 20: 7710-21; Katayama et al. (2005) Science 309: 1564-66; Moise et al. (2004) J. Biol. Chem. 279: 50230-42)。ライリンは、ＣＨＯ  Ｋ１細胞からクローニングされ、寄託番号ＡＦ０９３６７３にみられる配列に対して１００％相同である(Borowsky and Hynes (1998) J. Cell. Biol. 143: 429-42)。
【００７０】
生理的温度より低い温度でのＨＭＴ−７およびライリンの誘導を、実施例２に示すように、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応およびノーザンブロット分析を用いて立証した。
実施例２
ＨＭＴ−７およびライリンのゲノム配列の特性分析
実施例２．１：リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
非定量型の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）をまず用いて、各遺伝子のｃＤＮＡを部分クローニングした。これらのｃＤＮＡをベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カリフォルニア州ラホーヤ）内へクローニングし、クローニングしたｃＤＮＡフラグメントから生成したインビトロ転写物を、次いで定量した。これらのｃＤＮＡ配列に基づいてオリゴヌクレオチドおよびＴａｑ−ｍａｎプローブを設計した。リバースおよびフォワードプライマーならびにＴａｑ−ｍａｎプローブのヌクレオチド配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：を表２に挙げる。
【００７１】
【表２】
2012508026.tif 000005
【００７２】
３７℃、３４℃、３１℃および２８℃におけるＣＨＯ細胞の並行培養物から単離した全ＲＮＡにつき、定量したインビトロ転写物を標準曲線として用いるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を実施した。
【００７３】
図１には、４または８つの異なる実験からの、異なる温度で増殖させたＣＨＯ細胞により転写されたＨＭＴ−７またはライリンのいずれかのＲＮＡ転写物の量を示す。ＨＭＴ−７およびライリンは、３１℃で増殖したＣＨＯ細胞での発現において、３７℃で増殖したＣＨＯ細胞と比較してそれぞれ８倍および４倍の増加を示す（図１）。さらに、いずれの遺伝子の発現増大も温度の低下と直接相関していた（図１）。
【００７４】
実施例２．２：ノーザンブロット分析
３７℃および３１℃で培養した細胞からのＲＮＡにつき、単離されたｃＤＮＡ  ＲＴ−ＰＣＲ生成物をプローブとして用いてノーザンブロット分析を実施した。
【００７５】
要約すると、３７℃または３１℃で５日間増殖させた７つの個別のＣＨＯ  Ｋ１培養物からＲＮＡを単離した。合計５μｇのＲＮＡを分離し、一般的な様式でナイロン膜へ移した(Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Sects.)。ＨＭＴ−７またはライリンのいずれかのコード領域に対応するｃＤＮＡフラグメント（５０ｎｇ）を３２Ｐで標識し、プローブとして用いた（以下にさらに詳細に記載する）。膜への標識ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびその後の膜の洗浄を、Ｑｕｉｃｋｈｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カリフォルニア州ラホーヤ）を用いて製造業者の指示に従って行なった。
【００７６】
ＨＭＴ−７に用いたプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示すもの）は、実施例２．１に記載したＲＴ−ＰＣＲ生成物の３３４ｂｐフラグメントであった。それはＨＭＴ−７ゲノム配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のヌクレオチド１１５１４と１２２００の間のエキソンをコードし、３つのエキソンにわたる。この配列はリアルタイムＰＣＲ実験に用いた配列とオーバーラップする。ライリンプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示すもの）は３９７ｂｐのプローブであり、ライリンｍＲＮＡ配列の塩基３２５〜７２１に対応する。
【００７７】
ＨＭＴ−７のノーザンブロット分析は２つのバンドを示し（一方は１．４ｋｂに、他方は３．０ｋｂに）、これはこの遺伝子についてオルタナティブスプライス部位の可能性を示唆する（データは示していない）。ノーザンブロット分析により、前記のリアルタイムＰＣＲデータが確認された；ＨＭＴ−７およびライリンは両方とも、細胞を３１℃で培養した際にＣＨＯ細胞による発現増大を示した（データは示していない）。
【００７８】
実施例３
ＨＭＴ−７遺伝子およびライリン遺伝子の特性分析
実施例３．１：ｃＤＮＡ末端の５’側迅速増幅
転写物の５’側末端を単離するために、３１℃で培養した細胞から調製したＲＮＡについて、ｃＤＮＡ末端の５’側迅速増幅（５’  ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）（５’ＲＡＣＥ）を実施した。得られたＰＣＲ生成物を単離し、クローニングし、配列決定した。ライリンについて２つの５’ＲＡＣＥ生成物配列が実験により回収され、これらのうち一方は先に公開された配列と厳密に一致し、ライリンが２つの転写開始部位をもつことが示唆された。これらの開始部位は両方とも３１℃で存在し、低温で一方の部位が他方より好ましいことを示唆する証拠はない。ＨＭＴ−７遺伝子生成物の５’末端は、公開されたヌクレオチドデータベース中に存在するいずれの配列とも既知の相同性をもたなかった。
【００７９】
実施例３．２：プロモーター配列の遺伝子歩行および決定
次いで、ライリンおよびＨＭＴ−７両方の５’末端をプローブとして用いて、ＣＨＯ特異的ゲノム８ファージライブラリーをスクリーニングした。ライリンのスクリーニングからはクローンが単離されず、一方、ＨＭＴ−７のスクリーニングからは２つのクローンの単離および増幅に成功した。
【００８０】
ＨＭＴ−７スクリーニングからのゲノムＤＮＡフラグメントは、＞１２ｋｂのサイズであった。先に単離されたｃＤＮＡを含む３．５ｋｂのゲノムフラグメント（すなわち一部）をクローニングおよび配列決定した。次いで、ＨＭＴ−７遺伝子の残りの５’末端を、下記に従って遺伝子歩行により単離した：ＣＨＯゲノムＤＮＡを単離し、４種類の制限酵素で完全に消化し、次いで得られたゲノムＤＮＡフラグメントの５’および３’両方の末端にＤＮＡリンカーをライゲートさせた。次いで、３’末端の遺伝子特異的プライマーおよび５’末端のリンカー特異的プライマーを用いるＰＣＲにより、ＣＨＯ特異的ゲノムＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲ生成物を単離し、Ｔｏｐｏ−ＰＣＲ  ＩＩベクター中へサブクローニングし、配列決定した。‘推定プロモーター配列’（ＧＲＡＩＬソフトウェアが採用しているアルゴリズムを用いて決定；Ａｐｏｃｏｍ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，テネシー州ノックスビル）が同定されるまで、このプロセスを繰り返した。ＨＭＴ−７について２つの推定プロモーター領域が同定された（Ｐ１−ＨＭＴ−７およびＰ２−ＨＭＴ−７）。３１℃でどちらが活性であるかを判定するために、プライマー延長実験を実施し、５’ＲＡＣＥ実験を繰り返した。図２に示すように、活性プロモーター配列（Ｐ２−ＨＭＴ−７）はＨＭＴ−７遺伝子の最遠位５’末端に位置することが見出された。ＴＡＴＡボックス（プロモーターの共通特徴）に相当する配列がこの転写開始部位に対して５’側へ３３塩基の位置にあることが同定され、Ｐ２−ＨＭＴ−７は活性プロモーターであることがさらに説明される。しかし、５’ＲＡＣＥの結果およびノーザンブロット分析は２つの転写物を示し、これらは全長およびより小さな推定スプライスバリアントを指示するのに適切なサイズであって温度誘導試料においてのみ出現するものであることは、オルタナティブスプライシングが起きている可能性を示唆する。しかし、推定スプライスバリアントに相当する配列または転写物は単離またはクローニングされなかった。
【００８１】
同様に遺伝子歩行を用いてライリンのゲノム配列を単離したが、ゲノムライブラリースクリーニングからはクローンが得られなかったので、５’ＲＡＣＥ生成物を初期鋳型として用いた。得られたライリンＰＣＲ生成物を単離し、Ｔｏｐｏ−ＰＣＲ  ＩＩベクター中へサブクローニングし、配列決定し、推定プロモーター配列を同定した。
【００８２】
ＨＭＴ−７について組み立てた全長ゲノム配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として示す。この組み立てた配列は、５’側および３’側非翻訳領域（ＵＴＲ）から単離したゲノムＤＮＡを含む。２つの推定プロモーター領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド２４２２−２６７３（すなわちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド５６１５−５７６２（すなわちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）に位置する。さらに、表３にＨＭＴ−７についてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１内のエキソンの位置を挙げる。
【００８３】
【表３】
2012508026.tif 000006
【００８４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示すのは、組み立てたライリンの５’側ゲノム配列であり、これは開始メチオニンをコードするＡＴＧ（ヌクレオチド１３４１−１３４３）の上流の５’側領域１３４１塩基を含む。ライリンにおけるこの１３４１塩基ドメインは、ヌクレオチド２２３−１３４１に推定プロモーター配列を含む。同様に、ＨＭＴ−７ゲノム配列における対応するドメイン（すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１４２１−２６８５）は、ＨＭＴ−７についての推定プロモーター配列（単数または複数）を含む；たとえば、Ｐ２−ＨＭＴ−７についてはヌクレオチド２４２２−２６７３に。
【００８５】
実施例４
ＨＭＴ−７プロモーター領域を用いた温度誘導性発現ベクター系の作製
実施例３において特性分析および記載したプロモーター配列を単離し、レポーター遺伝子であるヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の上流に配置した（参照：図３Ｃおよび３Ｄ）。要約すると、Ｐ２−ＨＭＴ−７を含むＨＭＴ−７遺伝子のスモールまたはラージドメインのいずれかをＳＥＡＰの上流に配置した。スモールドメインの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド２４０４−２６８５に相当し、ラージドメインの配列はヌクレオチド１４２２−２６８５に相当する；これらの配列をそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示す。ランダム組込みにより起きるバックグラウンド発現を同定するために、ＳＥＡＰレポーター遺伝子がいずれのプロモーターの制御下にもない構築体を作製した。すべての構築体をＥＡＭ１１０１部位で線状にし、ＣＨＯ  Ｋ１細胞内へトランスフェクションした。
【００８６】
実施例５
Ｐ２−ＨＭＴ−７プロモーターをもち、および／または本質的にそれからなる誘導性発現ベクターの試験
実施例４に記載した発現ベクターを、独立してＣＨＯ  Ｋ１細胞に導入した。トランスフェクションした細胞のプールを１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の選択下で集密状態にまで増殖させた。二つ組セットのプールを３ｘ１０５細胞／ウェルで接種し、３７℃または３１℃のいずれかで７日間増殖させた。７日後、細胞を収穫し、トランスフェクションしたすべての細胞からＲＮＡを単離した。全ＲＮＡ（１００μｇ）の三重試料を、ＳＥＡＰ発現またはＧＡＰＤＨ発現についてリアルタイムＰＣＲを用いてアッセイした。図４は、Ｐ２−ＨＭＴ−７を含むＨＭＴ−７遺伝子のスモールおよびラージ両方のドメインが３７℃より３１℃においてより大きなプロモーター活性をもつことを立証する。
【００８７】
トランスフェクションした細胞のプールを試験するほか、個々のクローンをネオマイシン（Ｇ４１８）を用いて選択し、単離し、増殖させた。各クローンを９６ウェル皿に接種し、３７℃または３１℃のいずれかで７日間増殖させた。次いでクローンを洗浄し、細胞溶解し、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＥＡＳＹ（商標）キットを用いて製造業者の指示に従って全ＲＮＡを単離した。表４に挙げたオリゴ配列を用いるリアルタイムＰＣＲにより、ＳＥＡＰおよびＧＡＰＤＨ  ＲＮＡレベルを求めた。
【００８８】
【表４】
2012508026.tif 000007
【００８９】
ＧＡＰＤＨの量も定量して、ＲＮＡ発現の一般的な変動に対して正規化した。ＧＡＰＤＨの定量は、１００ｎｇの全ＲＮＡを用いて三つ組の試料において同様に測定された。ＨＭＴ−７レポーター構築体でトランスフェクションしたクローンは、対照プロモーターでトランスフェクションしたクローンと比較して始動が遅かった。各クローンを３７℃および３１℃の両方でアッセイした。図５には、ＣＭＶプロモーターの制御下にアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）でトランスフェクションした２２クローン、およびＰ２−ＨＭＴ−７プロモーターを周むラージドメインの制御下にアルカリホスファターゼでトランスフェクションした２０クローンについて、両温度で培養した細胞によるＧＡＰＤＨ発現に対して正規化したＳＥＡＰ  ＲＮＡ産生を示す。３１℃で増殖させた場合、Ｐ２−ＨＭＴ−７プロモーターを含むスモールドメインの制御下にＳＥＡＰでトランスフェクションしたクローンは、ＣＭＶプロモーターの制御下にＳＥＡＰでトランスフェクションしたクローンと同等のアルカリホスファターゼＲＮＡ増加倍率を示した（データは示していない）。これに対し、Ｐ２−ＨＭＴ−７を含むラージドメインの制御下にアルカリホスファターゼでトランスフェクションした細胞のクローン番号１からクローン番号１２までにおけるアルカリホスファターゼＲＮＡ産生の増加倍率は、細胞を３１℃で増殖させた場合、１．７倍から９．６倍の範囲であった（図５）。同様に、３１℃でＰ２−ＨＭＴ−７を含むラージドメインの制御下にアルカリホスファターゼでトランスフェクションした細胞のクローン１３〜１６によりアルカリホスファターゼの産生が増加したが、これらのクローンによるＳＥＡＰ産生レベルは３７℃では検出できず、したがって、変化倍率を計算できなかった。最後に、Ｐ２−ＨＭＴ−７を含むラージドメインの制御下にアルカリホスファターゼでトランスフェクションした細胞のクローン１７〜２２は、いずれの温度でも、検出可能なレベルのＳＥＡＰを産生しなかった。これに対し、ＣＭＶプロモーターの制御下にＳＥＡＰでトランスフェクションした細胞によるアルカリホスファターゼ発現レベルの増大は、１．８倍から９．１倍の範囲であった。その結果、Ｐ２−ＨＭＴ−７、ならびにＰ２−ＨＭＴ−７のポリヌクレオチド配列をもち、および／または本質的にそれからなるドメイン（たとえば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示すポリヌクレオチド配列をもつドメイン）は、誘導性哺乳動物発現系の一部として使用できる温度誘導型プロモーターであると結論できる。
【００９０】
実施例６
ライリンプロモーターをもち、および／または本質的にそれからなる誘導性発現ベクターの試験
実施例３において特性分析および記載したライリンプロモーター配列を単離し、レポーター遺伝子であるヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の上流に配置する。推定ライリンプロモーターの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のヌクレオチド２２３−１３４１に相当し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示されている。前記の実施例４および５と同様に、ランダム組込みにより起きるバックグラウンド発現を同定するために、ＳＥＡＰレポーター遺伝子がいずれのプロモーターの制御下にもない構築体を作製する。すべての構築体をＥＡＭ１１０１部位で線状にし、ＣＨＯ  Ｋ１細胞内へトランスフェクションする。
【００９１】
ライリンプロモーターの制御下にあるＳＥＡＰレポーター遺伝子を含む発現ベクターを、ＣＨＯ  Ｋ１細胞に導入する。トランスフェクションした細胞のプールを１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の選択下で集密状態にまで増殖させる。二つ組のセットのプールを３ｘ１０５細胞／ウェルで接種し、３７℃または３１℃のいずれかで７日間増殖させる。７日後、細胞を収穫し、トランスフェクションしたすべての細胞からＲＮＡを単離する。全ＲＮＡ（１００μｇ）の三重試料を、ＳＥＡＰ発現またはＧＡＰＤＨ発現についてリアルタイムＰＣＲを用いてアッセイする。トランスフェクションした細胞のプールのほか、個々のクローンをネオマイシン（Ｇ４１８）を用いて選択し、単離し、増殖させる。各クローンを９６ウェル皿に接種し、３７℃または３１℃のいずれかで７日間増殖させる。次いでクローンを洗浄し、細胞溶解し、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＥＡＳＹ（商標）キットを用いて製造業者の指示に従って全ＲＮＡを単離する。前記の表４に挙げたオリゴ配列を用いるリアルタイムＰＣＲにより、ＳＥＡＰおよびＧＡＰＤＨ  ＲＮＡレベルを求める。
【図１】
2012508026.tif 000008
【図２】
2012508026.tif 000009
【図３Ａ】
2012508026.tif 000010
【図３Ｂ】
2012508026.tif 000011
【図３Ｃ】
2012508026.tif 000012
【図３Ｄ】
2012508026.tif 000013
【図４】
2012508026.tif 000014
【図５】
2012508026.tif 000015
【配列表】
2012508026000001.app
【国際調査報告】
2012508026.tif 000016
2012508026.tif 000017
2012508026.tif 000018
2012508026.tif 000019
2012508026.tif 000020