(57)【要約】  本発明は、穀類に対してアレルギーの人に用いるための、粒を除く、穀類または擬穀類の地上部の抽出物を含んでなる低アレルギー性皮膚用組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
穀粒タンパク質に対してアレルギーのある人に用いるための、粒を除く、穀類または擬穀類の地上部の抽出物。
【請求項２】
地上部が出穂前に収穫される、請求項１に記載の抽出物。
【請求項３】
穀類が、コムギ、イネ、オオムギまたはエンバクである、請求項１または２に記載の抽出物。
【請求項４】
穀類が、エンバクである、請求項３に記載の抽出物。
【請求項５】
２〜１５％のフラボノイドと０．２〜２％のＡおよびＢアベナコシドとを含んでなる、請求項４に記載の抽出物。
【請求項６】
５〜１０％レベルのイソビテキシン−２’’−Ｏ−アラビノピラノシドおよびイソオリエンチン−２’’−Ｏ−アラビノピラノシドフラボノイドを特徴とする、請求項４または５に記載の抽出物。
【請求項７】
１ｐｐｍ未満のタンパク質を含んでなる、請求項４〜６のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項８】
擬穀類が、ソバ、キノアまたはゴマである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項９】
穀粒タンパク質に対してアレルギーのある人における、粒を除く、穀類または擬穀類の地上部の抽出物を含んでなる低アレルギー性美容用組成物の使用。
【請求項１０】
穀粒タンパク質に対してアレルギーのある人において、アレルギー反応のリスクを最小化および／または防止する低アレルギー性皮膚用組成物を製造するための、粒を除く、穀類または擬穀類の地上部の抽出物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、穀類に対するアレルギーに関する。
【０００２】
本発明の意味において、穀類はイネ科(Poaceae)および擬穀類を含む。
【０００３】
「穀類(cereals)」との用語は、イネ科(Gramineae)に関し、その熟した「粒(grain)」（穎果(caryopsis)）は、特にその高いデンプン含量のために食物として用いられる(Paris R.R., Moyse H. Precis de matiere medicale. II Pharmacognosie speciale. Spermaphytes (continued): Angiospermes. Monocotyledones - Dicotyledones. Apetales et Diapetales. 第2版, Paris: Masson, 1981, p16)。「穀類」との用語は、また、特には、これらの植物の種子に関する。
【０００４】
植物学では、穀類はイネ科(PoaceaeまたはGramineae)に属す。
【０００５】
該イネ科(Gramineae)は一般に、多くの場合切れ込みと葉舌を含む葉鞘を有する二列生の葉を保持する節の間に中空の茎（桿）を持つ禾本の単子葉植物である。花は小穂に並び、多くの場合、複穂状花序(compound spikes)、または「円錐花序」と呼ばれる房に分類される。花は雄蘂と子房に分解され、２枚の包葉または穎が小穂を保護し、２つの外花穎は、そのうち１枚が前面にあり、倒れ、包み込み、しばしば禾を持ち、花と一体となっている。伸出した３本の雄蘂が振動し、それらの背面から付着する。子房には、２本の羽毛状の花柱を有し、胚珠に密着し、穎果と呼ばれる独特な１個の果実へと発達する１片の心皮があり、豊富な胚乳がデンプン質である。
【０００６】
この科にはおよそ７００属、１２０００種が含まれる。
【０００７】
ほとんどの禾本は食用に用いられる（コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ソルガム、雑穀、トウモロコシ、イネなど）。
【０００８】
最も伝統的に消費されてきた穀類の種類を下記表１に示す。
【０００９】
【表１】
2012508707.tif 000002
【００１０】
他の植物科のいくつかの粒も穀類と同様で、擬穀類(pseudocereals)と呼ばれる。穀類近縁であるがイネ科に属さず、消費され、食物アレルギーに関連する可能性のあるこのような種の例としては、下記表２に示されているものが含まれる。
【００１１】
【表２】
2012508707.tif 000003
【００１２】
穀類および擬穀類の粒は、構造タンパク質、生物機能性タンパク質および貯蔵タンパク質などの多数のタンパク質を含む。Ｏｓｂｏｒｎｅ（１９０７）は、それらを溶解度に従って、
‐水溶性アルブミン、
‐生理食塩水に可溶なグロブリン、
‐水性エタノールに可溶なプロラミン、
‐上記の溶媒に不溶で、尿素またはグアニジン溶液に部分的に可溶なグルテリン
に分類した。
【００１３】
例：
【表３】
2012508707.tif 000004
【００１４】
これに対し、地上部、特に葉のタンパク質内容物は、特に、
‐葉緑体の膜タンパク質（多くの場合、脂質および色素に関連するタンパク質）
‐葉緑体（ストロマ）の可溶性タンパク質：ＲｕＢＰＣａｓｅ
からなる。
【００１５】
キノア、ヒマワリ、エンバク、オオムギおよびワイルドライス(Zizania palustris)の葉、コムギの若い若枝(shoots)、ならびにゴマ、イネ、コムギおよびトウモロコシの芽は既に化粧品に用いられている。例えば、若い緑のオオムギ若枝は抗老化剤として用いられている。
【００１６】
先行技術においてもまたそれは開示されている。
‐特にアトピー性皮膚炎を処置するための抗炎症薬として用いられるアマランサス葉の抽出物（日本特許第２０００１４３５２４号）
‐皮膚の炎症反応を処置するための局所用の、エンバク藁の抽出物をヤナギラン抽出物とともに含有する組成物（ＥＰ１４７４１５９）
‐イネ胚芽油による酸化から保護する美容用組成物（ＥＰ１７０４８９８）
‐コムギ芽抽出物を含んでなる美容用組成物（ＷＯ９５２６１８３）
‐ヒマワリ茎の抽出物を含有する皮膚に対して再生作用を有する化粧品（ＦＲ２４８７６７４）
【００１７】
穀粉、特に、小麦粉は、製パン業者の喘息(baker's asthma)および吸入によるアレルギー性鼻炎の一因であることが知られている。最も強いＩｇＥ応答はアルブミンおよびグロブリンで見られ、これらのタンパク質は中性溶液に可溶である。しかしながら、いくつかの研究では、エタノールまたは酸性媒体に可溶なタンパク質（グルテニンおよびグリアジン）に対する反応性も示されている。さらに最近では、免疫ブロット研究で、コムギおよびオオムギ粉の中性画分の主要なアレルゲンが、製パン業者アレルギーを有する患者の血清中において、低分子量域（２０ｋＤａ前後）に存在することが示されている。
【００１８】
摂取した際に、穀類はセリアック病およびヘルペス性皮膚炎の原因となることがある。いくつかの研究で、最も関連する抗原はエタノール可溶性タンパク質のグリアジン画分であることが示されている。
【００１９】
ヒト食物における穀類の重要性にもかかわらず、それらは特に小児においてアトピー性皮膚炎症状を悪化させるおそれがある。同様に、免疫学的研究（特にＳＰＴテスト（皮膚プリックテスト）およびＲＡＳＴ（放射性アレルゲン吸着テスト）が、コムギ、エンバク、ライムギ、オオムギ、イネ、雑穀およびトウモロコシに含まれるタンパク質の同定をもたらし、コムギとオオムギまたはライムギの間の交差反応を実証している(Varjonen E, Vainio E, Kalimo K, Juntunen-Backman K, Savolainen J Skin-prick test and RAST responses to cereals in children with atopic dermatitis. Characterization of IgE-binding components in wheat and oats by an immunoblotting method. Clin Exp Allergy 1995, 25:1100-1107)(Palosuo K, Alenius H, Varjonen E, Kalkkinen N, Reunala T. Rye γ-70 and γ-35 secalins and barley γ-3 hordein cross-react with ω-5 gliadin, a major allergen in wheat-dependent, exercise-induced anaphylaxis. Clin Exp Allergy, 2001, 31 :466-473)。最も少ない可溶性タンパク質（グリアジンおよびグルテニン）は、摂取された穀類がアトピー性皮膚炎の原因となる場合に関与すると思われる。多くの予備研究が、食物過敏症がアトピー性皮膚炎を有する小児において重要な役割を果たしていること、および食物からアレルゲンを除去することが臨床改善をもたらすことを示している。
【００２０】
感受性の人において、穀粒(cereal grains)の抽出物（特に、加水分解物であれ非加水分解物であれコムギタンパク質、またゴマ）に基づく化粧品で接触性アレルギーがいくつか報告されている。アレルギー問題を緩和する１つの解決策となっているコムギタンパク質加水分解は、一方で、新たな抗原部位を明らかにする加水分解により誘導されるより強い増感構造変化であることが示されている(Pecquet C, Lauriere M. New allergens in hydrolysates of wheat proteins. Rev Fr Allerg Immunol Clin 2003, 43:21-23)。
【００２１】
穀粒タンパク質(cereal grain proteins)は、アレルギーのある人において、特に小児においては、経口経路および局所経路の双方で避けるべきものと思われる。
【００２２】
よって、穀粒に対して感受性のある、またはアレルギーのある人のための化粧品の必要と強い要求がある。
【００２３】
予期しないことに、そして驚くことに、本発明者らは、好ましくは出穂前に収穫された穀類または擬穀類の地上部の抽出物を含んでなる美容用組成物が、穀粒アレルギーに応答するタンパク質との交差反応をもたらさないこと示した。
【００２４】
よって、本発明の目的は、穀粒タンパク質に対してアレルギーのある人に用いるための、粒を除く、穀類および／または擬穀類の地上部の抽出物を提供することである。
【００２５】
穀類および／または擬穀類の地上部(aerial parts)とは、本明細書において、粒を除き、地面より上にある部分を意味する。
【００２６】
好ましくは、「穀類および／または擬穀類の地上部」とは、粒を除く、葉および／または茎および／または小穂および／または花を含む。
【００２７】
有利には、本発明による抽出物は、出穂前に収穫された穀類および／または擬穀類の地上部の抽出物である。
【００２８】
本発明の意味において、「出穂前に収穫された穀類および／または擬穀類の地上部」とは、発芽後（発芽後約２週間〜２か月）の、出穂まで（出穂期を含まない）の茎伸長期に収穫された穀類または擬穀類地上部を表す。
【００２９】
本発明の意味において、「茎伸長」とは、開花前の茎の伸長および形成中の穂の出現に相当する増殖期を表す。
【００３０】
好ましくは、本発明による抽出物は、コムギ、イネ、オオムギまたはエンバク、より好ましくはエンバクの地上部から得られる。
【００３１】
本発明に従って穀粒タンパク質に対してアレルギーの人において有利に用いられるエンバク地上部の抽出物は、２〜１５％のフラボノイドと０．２〜２％のＡおよびＢアベナコシド、好ましくは５〜１０％のイソビテキシン−２’’−Ｏ−アラビノピラノシドおよびイソオリエンチン−２’’−Ｏ−アラビノピラノシドフラボノイドおよび／または１ｐｐｍ未満のタンパク質、好ましくは０．５ｐｐｍ未満、いっそうより好ましくは０．３ｐｐｍ未満のタンパク質を含んでなる。
【００３２】
用いられるエンバク地上部の抽出物は、目的とするフラボノイドおよびサポニン含量を特徴とする。後者は各化合物種に好適な２つの異なる方法のいずれかを用いた高圧液体クロマトグラフィーによって分析される。
【００３３】
これらの種々の分子の量は抽出条件によって異なる。主要なフラボノイドはイソビテキシン−２’’−Ｏ−アラビノピラノシドおよびイソオリエンチン−２’’−Ｏ−アラビノピラノシドである。ＡおよびＢアベナコシドは主要なサポニンである。これらはビスデスモシンステロイドサポニンである。
【００３４】
有利には、本発明による抽出物は、出穂前に収穫されたコムギ、イネまたはエンバクの地上部、好ましくは出穂前に収穫されたエンバク地上部の抽出物である。
【００３５】
有利には、本発明による抽出物は、有機溶媒中に得られる抽出物である。
【００３６】
本発明による抽出物は、穀類または擬穀類（発芽約２週間〜２か月後の、出穂まで（出穂期を含まない）の伸長期）の地上部を乾燥および製粉した後に有機溶媒中で抽出することにより調製することができる。特に、ケトン、エステル、Ｃ１−Ｃ４アルコールおよび混和可能な任意の割合のその混合物からなる群から選択される有機溶媒が用いられる。有利には、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、酢酸エチル、Ｃ１−Ｃ４アルコールおよび混和可能な任意の割合のその混合物からなる群から選択される有機溶媒が用いられる。
【００３７】
抽出は攪拌下または静置法で行う。
【００３８】
抽出は還流下または室温で行う。
【００３９】
有利には、抽出は、１：７〜１：２０、好ましくは１：８〜１：１２まで可変の植物／溶媒比率で行う。
【００４０】
好ましくは、抽出は、３０分〜４８時間、より好ましくは６０〜１２０分間行う。
【００４１】
抽出は２または３回繰り返す。
【００４２】
この抽出工程から得られた搾りかすを、次に、抽出物から遠心分離または濾過により分離し、乾燥物が得られるまで溶液を多少濃縮してもよい。
【００４３】
濃縮、沈殿および濾過による脱脂により、または抽出溶液に濃縮した、もしくは非濃縮の活性炭または吸収樹脂などの吸収物質を加えることにより脱色処理を行ってもよい。
【００４４】
物質は、乾燥工程中に抽出された乾燥物に対する重量比として１〜７５％の範囲で加えることができる。物質はマルトデキストリン、ラクトースなどの糖、シリカまたは他の任意の美容上許容される物質であり得る。
【００４５】
有利には、この抽出物はアセトンまたはアセトン／水（水は２０％まで）中での抽出から得られる。アセトンまたはアセトン／水（水は２０％まで）抽出物は、目的分子であるフラボノイドおよびサポニンを含み、タンパク質混入が極めて少ない。実際、欧州薬局方に記載されているタンパク質の同定のためのアッセイ方法では上手くいかず、アセトンから沈殿させた後のＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル上での電気泳動とクーマシーブルーまたは硝酸銀染色を行うと、タンパク質の存在を示すバンドは存在しないことを示す。この同じ電気泳動に対照をスポットすることにより、タンパク質検出限界を約１ｎｇとして評価することができ、従って、この抽出物のタンパク質含量は１ｐｐｍ未満である（ゲルにスポットした抽出物の量に基づく）。好ましくは、該タンパク質含量は０．５ｐｐｍ未満、いっそうより好ましくは０．３ｐｐｍタンパク質である。
【００４６】
本発明の別の目的は、穀粒タンパク質に対してアレルギーのある人における、粒を除く穀類および／または擬穀類地上部の抽出物の使用に関する。
【００４７】
本発明の別の目的は、低アレルギー性皮膚用組成物、すなわち、穀粒タンパク質に対してアレルギーの人においてアレルギー反応のリスクを最小化かつ／または防止する組成物の製造のための、粒を除く穀類および／または擬穀類地上部の抽出物の使用に関する。
【００４８】
本発明の別の目的は、穀粒タンパク質に対してアレルギーの人における、穀類および／または擬穀類地上部の抽出物を含んでなる美容用低アレルギー性組成物の使用に関する。
【００４９】
本発明に従って用いられる皮膚用または美容用組成物は、特に、乳化剤、増粘剤、ゲル化剤、水捕捉剤、分散剤、安定剤、色素、香料および保存剤などの添加剤および処方助剤を含むことができる。
【００５０】
本発明に従って用いられる皮膚用または美容用組成物はさらに、通常の皮膚科上適合する賦形剤を含んでなる。
【００５１】
それは油中水（Ｗ／Ｏ）型または水中油（Ｏ／Ｗ）型エマルションとして、または例えば、水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型エマルションもしくは油中水中油（Ｏ／Ｗ／Ｏ）型エマルションなどの多層エマルションとして、あるいはまた水分散物もしくは脂質分散物、ゲルまたはエアゾールとして調製することができる。
【００５２】
皮膚科上適合する賦形剤は、クリーム、ローション、ゲル、軟膏、エマルション、マイクロエマルション、スプレー、シャンプーなどの形態の局所適用用組成物を得るために当業者に公知のいずれの賦形剤であってもよい。
【００５３】
有利には、本発明に従って用いられる皮膚用または美容用組成物は、粒を除く、穀類または擬穀類地上部の抽出物を組成物の総重量に対して０．１〜１０％含んでなる。好ましくは、該組成物は、本発明による穀類地上部抽出物を組成物の総重量に対して０．１〜５重量％の間の量で含んでなる。
【００５４】
以下の実施例は、限定されるものではないが、本発明の例示である。
【実施例】
【００５５】
実施例１：アセトン抽出による、出穂前に収穫されたエンバク地上部の抽出物の製造
出穂前に収穫されたエンバク地上部を乾燥させたもの４００ｋｇを製粉した後、１０容量のアセトン／水混合物の入った反応槽に、室温で１時間攪拌しながら置く。
【００５６】
固体／液体分離により、１回目の抽出汁を得ることができる。搾りかすに対し、攪拌下室温で１時間、１０容量のアセトン／水混合物で再び抽出を行う。固体／液体分離により、２回目の抽出汁を得、１回目のものと合わせる。得られた溶液を１．３３容量／ｋｇまで水に対して濃縮した後、濾過する。これにより得られた抽出物を、マルトデキストリン支持体（ｑｓｐ２５％／粗抽出物）を加えた後にマイクロ波により乾燥させる。
【００５７】
このようにして、６％フラボノイド（イソビテキシン−２’’−Ｏ−アラビノピラノシドおよびイソオリエンチン−２’’−Ｏ−アラビノピラノシド）および０．６％アベナコシドＢを含有する淡褐色粉末３６ｋｇが得られ、このようにして得られた抽出物のタンパク質含量は０．３ｐｐｍ未満である。
【００５８】
実施例２：出穂前に収穫された同じ穀類の穀粒抽出物と地上部抽出物の生化学的および免疫学的比較
穀粒抽出物と地上部抽出物の間に交差が無いことを生化学技術（抽出およびタンパク質同定）および免疫酵素技術（抗体の生成によるタンパク質存在の特異的検出）を用いて実証した。
【００５９】
粒タンパク質の抽出物は次のようにして調製することができる。
粒を製粉し、水酸化ナトリウムでｐＨ８にて抽出する。濾過の後、濾液を、塩酸をｐＨ５．４まで加えることにより沈殿させる。遠心分離の後、沈殿を取り、水溶液とし、カットオフ閾値６〜８ｋＤａの透析バッグにて、４℃で一晩、水に対して透析する。
【００６０】
地上部の抽出物は次のようにして調製することができる。
新鮮材料からは、
・Ｔｒｉｓ．ＨＣｌバッファーｐＨ８．０で可溶化することにより抽出し、濾過した後、アセトンから２回沈殿させて塩を除去するか、または
・尿素およびチオ尿素を含有する還元ＬａｅｍｍｌｉバッファーｐＨ７．５で可溶化することにより抽出し、濾過した後、アセトンから２回沈殿させて塩を除去する。
【００６１】
乾燥物からは、
尿素およびチオ尿素を含有する還元ＬａｅｍｍｌｉバッファーｐＨ７．５で可溶化することにより２７時間抽出し、濾過した後、アセトンから２回沈殿させて塩を除去する。
【００６２】
生化学的および免疫学的研究
Ｉ．電気泳動
原理：タンパク質を特異的に調べるための技術はＳＤＳ−Ｐａｇｅ電気泳動である。すなわち、ＳＤＳの存在下で、負電荷を有するタンパク質はそれらの質量だけに依存して陰極に向かってポリアクリルアミドゲル中を移動し、これらのタンパク質がクーマシーブルーまたは硝酸銀などの染色剤により検出される。
【００６３】
用いる陽性対照はエンバクの出穂前地上部の全タンパク質の抽出物か、または上記のように調製された全粒タンパク質の抽出物のいずれかに相当する。
【００６４】
ＩＩ．例示的結果−図１
クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−Ｐａｇｅ電気泳動（１２．５％ポリアクリルアミドゲル）で染色したエンバクの全粒タンパク質と出穂前地上部のプロフィールの比較。
【００６５】
図１に示される電気泳動プロフィールは、試験した両抽出物のタンパク質組成の有意な違いを特に主要なタンパク質に関して明らかにする。しかしながら、これらの２つのバッチのタンパク質間の質的な違いを確認するための唯一の方法は、特異的抗原−抗体認識を用いる免疫学的技術を用いることである。
【００６６】
免疫化学的技術
これらの技術ではまず、地上部または粒中の全タンパク質に対する抗体を準備する必要がある。このために、同じ１つの種の地上部および粒中の全タンパク質の抽出物をウサギに投与する。その後、その動物の血清からポリクローナル抗体を調製する。
【００６７】
このねらいは、出穂前エンバクの地上部タンパク質が粒のものとは異なること、および粒タンパク質と地上部タンパク質の間に交差反応がないことを実証することである。
ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット技術を使用
・出穂前の地上部タンパク質に対する抗体とエンバク粒タンパク質
・エンバク粒タンパク質に対する抗体と出穂前エンバク地上部タンパク質
【００６８】
Ｉ．直接的ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）は、溶液中の抗原の存在を検出するための免疫化学的技術である。原理は、試験溶液中のタンパク質をウェルに結合させた後、抗タンパク質ポリクローナル抗体と接触させることからなる。その後、酵素と結合した第二の抗ウサギＩｇＧ抗体が、洗浄後に、簡単な比色定量反応を用いて、ウェル内の抗原の存在を検出する。
【００６９】
ＩＩ．ウエスタンブロット
原理：ウエスタンブロット技術は、タンパク質混合物のＳＤＳ−Ｐａｇｅ電気泳動と、その後の特異的抗原−抗体相互作用による染色からなる。ポリクローナル抗体により認識されるタンパク質だけが検出される。そして、一次抗体はアルカリ性ホスファターゼなどの酵素と結合した二次抗体（ここでは、抗ウサギＩｇＧ抗体）により認識される。
【００７０】
例示的結果−図２および３
粒タンパク質と出穂前エンバク地上部タンパク質に対する抗体の間の交差（図２）および出穂前エンバク地上部タンパク質と粒タンパク質に対する抗体の間の交差（図３）。
ウエスタンブロット技術により、ＥＬＩＳＡによって得られた最初の結果、すなわち、出穂前エンバクの地上部タンパク質が粒タンパク質と異なっていることだけではなく、両者の間に交差が無いことが確認される。
従って、食事を通じてエンバク粒タンパク質に増感した患者は、タンパク質が含まれていたとしても地上部（粒を除く）抽出物には反応しない。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】電気泳動ＳＤＳ−Ｐａｇｅ（１２．５％ポリアクリルアミドゲル）のクーマシーブルー染色によるエンバクの粒と若い若枝からの全タンパク質のプロフィールの比較
【図２】抗地上部タンパク質ポリクローナル抗体によるウエスタンブロットの酵素染色
【図３】抗穀粒タンパク質ポリクローナル抗体によるウエスタンブロットの酵素染色
【図１】
2012508707.tif 000005
【図２】
2012508707.tif 000006
【図３】
2012508707.tif 000007
【国際調査報告】
2012508707.tif 000008
2012508707.tif 000009
2012508707.tif 000010
2012508707.tif 000011
2012508707.tif 000012