(57)【要約】  本発明の粒子を細胞質に露出させる方法は、粒子を生きた細胞に導入し、前記細胞の生理的、生化学的または生物学的環境が損傷されずに維持された状態で前記粒子を小胞から細胞質に露出させる細胞質露出添加剤を前記細胞に接触させ、前記粒子が小胞から細胞質に露出されるようにすることを特徴とする。本発明によれば、生理的、生化学的または生物学的環境が損傷されずに維持された細胞（ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌ）において、細胞内に取り込まれた粒子が小胞（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）から細胞質に効果的に露出されるようにする長所がある。  【選択図】図２
2012508007.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内に取り込まれた粒子を小胞から細胞質に露出させる細胞質露出添加剤において、ＮＤＧＡ（Ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ＮＥＭ（Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ＮＨ４Ｃｌ、ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）、パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）、メタノールおよびエタノールで構成された群から選択された少なくとも１つの化合物を含む細胞質露出添加剤。
【請求項２】
ＮＤＧＡ、ＮＥＭおよびＮＨ４Ｃｌで構成された群から選択された少なくとも１つの化合物を含む、請求項１に記載の細胞質露出添加剤。
【請求項３】
細胞内に取り込まれた粒子を小胞から細胞質に露出させる方法において、
粒子を生きた細胞に導入し、前記細胞の生理的、生化学的または生物学的環境が損なわれないように維持された状態で前記粒子を小胞から細胞質に露出させる細胞質露出添加剤を前記細胞に接触させ、前記粒子が小胞から細胞質に露出されるようにすることを特徴とする、細胞内に取り込まれた粒子を小胞から細胞質に露出させる方法。
【請求項４】
前記細胞質露出添加剤は、ＮＤＧＡ（Ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ＮＥＭ（Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ＮＨ４Ｃｌ、ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）、パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）、メタノールおよびエタノールで構成された群から選択された少なくとも１つの化合物を含む、請求項３に記載の細胞内に取り込まれた粒子を小胞から細胞質に露出させる方法。
【請求項５】
前記細胞質露出添加剤は、ＮＤＧＡ、ＮＥＭおよびＮＨ４Ｃｌで構成された群から選択された少なくとも１つの化合物を含む、請求項３または請求項４に記載の細胞内に取り込まれた粒子を小胞から細胞質に露出させる方法。
【請求項６】
前記粒子は、粒子形態を有する、または細胞内で粒子化できる物質であることを特徴とする、請求項３または請求項４に記載の細胞内に取り込まれた粒子を小胞から細胞質に露出させる方法。
【請求項７】
前記粒子は、１ないし１，５００ｎｍの直径を有することを特徴とする、請求項３または請求項４に記載の細胞内に取り込まれた粒子を小胞から細胞質に露出させる方法。
【請求項８】
前記粒子は、２０ないし３５０ｎｍの直径を有することを特徴とする、請求項７に記載の細胞内に取り込まれた粒子を小胞から細胞質に露出させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内に取り込まれた粒子を小胞から細胞質に露出させる細胞質露出添加剤および方法に関するものであって、さらに詳しくは、細胞内に取り込まれた粒子が効果的に小胞（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）から細胞質に露出されるようにする細胞質露出添加剤および方法に関する。
【０００２】
具体的に本発明は、生理的、生化学的または生物学的環境が損なわれないように維持された細胞（ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌ）において、細胞質露出添加剤により粒子が小胞（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）から細胞質へ効果的に露出されるようにする技術に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞膜（ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｏｒ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）は、反透過性脂質の二重膜であって、細胞内の構成要素（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）と細胞外環境（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）間の物理的障壁として作用する（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ．  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）。細胞膜は、選択的透過性を有し、特定の物質に対して細胞内に取り込むか、或いは細胞外に送り出すかを調節する（Ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，  ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｃｅｌｌ＿ｍｅｍｂｒａｎｅから  ２００７年  １０月  １０日  ダウンロードする）。小さい分子または脂溶性物質、すなわち疎水性でありながら非極性の物質は、速やかに脂質の二重膜を通過して細胞内に広がるが、帯電した分子、すなわち、イオンは細胞膜の通過が難しい（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ．  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）。
【０００４】
したがって、細胞内に取り込まれ難い物質を細胞内に取り込む技術は、学術的な側面および医療的な側面において極めて重要であるといえる。すなわち、特定の物質が細胞内でいかなる作用をするかを観察したり、細胞そのものの研究などにおいて特定の物質を細胞内に取り込む技術は、その意味が大きいといえる。
【０００５】
最近、ゴールドパーティクル、ビーズのような粒子が新薬開発および治療分野にて脚光を浴びているが、このような粒子（ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、細胞の標識、細胞内に物質を取り込むための伝達体、ＭＲＩイメージングなどの目的で広く使われているが、その大きさが数ｎｍないし数百ｎｍに達するため、細胞内に取り込むことが容易ではない（Ｂｅｒｒｙ  ＆  Ｃｕｒｔｉｓ，  ２００３，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｄ：  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  ３６，  Ｒ１９８−Ｒ２０６）。
【０００６】
このような粒子を細胞内に取り込むため、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、脂質を利用したリポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、蛋白質伝達ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ）を利用した伝達方法など（Ｄｅｒｆｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅ  ｔｒａｃｋｉｎｇ．  Ａｄｖ．  Ｍａｔｅｒ．  １６，  ９６１−９６６；  Ｍａｔｕｓｚｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｃｅｌｌ  ｔａｇｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ａｐｐｒｏｖｅｄ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅｓ：  ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ，  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅ，  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｏｎ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２３５，  １５５−１６１；  Ｂｅｒｒｙ  ＆  Ｃｕｒｔｉｓ，  ２００３，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｄ：  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  ３６，  Ｒ１９８−Ｒ２０６）が試みられてきた。
【０００７】
ところが、エレクトロポレーションは、高電圧電気パルスをかけ、細胞膜にナノメータ程の微小の孔を形成することによって、粒子を直接細胞質に取り込むことができるという長所があるものの、粒子を細胞内に取り込む効率が著しく劣ったり、細胞に取り込まれた粒子を過度に凝集させる等の短所を有する（Ｄｅｒｆｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅ  ｔｒａｃｋｉｎｇ．  Ａｄｖ．  Ｍａｔｅｒ．  １６，  ９６１−９６６；  Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｆｉｎｄｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｎｅｅｄｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｈａｙｓｔａｃｋ：  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ２５，  ２１２８−２１３８）。マイクロインジェクションは、マイクロニードルを利用して顕微鏡下で生きた単一細胞に粒子を直接取り込むことができる技術であるが、特殊な装備が必要であり、操作が非常に難しく、細胞１つ１つに対して粒子を取り込むため、多数の細胞に対して効率的な作業を行うことができないという限界がある。
【０００８】
このような問題点により、最近は、脂質や蛋白質伝達ドメインを利用して粒子を細胞に取り込む技術が注目を集めているが、脂質や蛋白質伝達ドメインを利用して粒子を取り込んだ場合には、ほとんどがエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により粒子が取り込まれ、粒子が小胞（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）内に存在するようになるため、細胞内に取り込まれた粒子が細胞質に露出できなくなるという短所がある（Ｄｅｒｆｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅ  ｔｒａｃｋｉｎｇ．  Ａｄｖ．  Ｍａｔｅｒ．  １６，  ９６１−９６６；  Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ２４，  １９７７−１９９２）。
【０００９】
これと関連し、脂質または蛋白質伝達ドメインを利用し、カーゴ（ｃａｒｇｏ）を細胞に取り込む場合、取り込まれたカーゴが細胞質に露出されるようにする試みが報告されたが、これらは蛋白質伝達ドメイン自体を細胞に取り込むこと（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ａ  ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆａｔｅ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９，  １２６２５−１２６３５）（非特許文献１）、細胞内にＤＮＡを取り込むこと（Ｃｉｆｔｃｉ  ＆  Ｌｅｖｙ，  ２００１，  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  ２１８，  ８１−９２）（非特許文献２）、また、細胞内に蛋白質を取り込むこと（Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔａｔ−ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３１９，  １２−２０）（非特許文献３）に関連するものであって、粒子形態の物質がエンドサイトーシスにより小胞を形成する場合の問題を解決するものではない。特に、細胞内に取り込まれた粒子を追跡したり、細胞内の構造と代謝過程を糾明するためには、細胞の生理的、生化学的または生物学的環境が損傷されずに維持された状態で粒子を小胞から細胞質に効果的に露出させなければならないが、今までは、このような問題点に対する認識さえ、学界から注目を受けられないのが、実情であり、なおかつこれに対する研究もやはり微弱な水準である。
【００１０】
結局、本発明が属する技術分野においては、細胞の生理的、生化学的または生物学的環境が損なわれないように維持された状態で粒子を小胞から細胞質に効果的に露出させることによって、細胞内に取り込まれた粒子を追跡したり、細胞内の構造と代謝過程を効果的に確認することができる技術の提供が要されているといえる。
【００１１】
これに本発明者は、生理的、生化学的または生物学的環境が損なわれないように維持された細胞（ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌ）において、細胞内に取り込まれた粒子が小胞（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）から細胞質に効果的に露出されるようにする細胞質露出添加剤および技術を開発するに至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９：  １２６２５−１２６３５，  ２００４
【非特許文献２】Ｃｉｆｔｃｉ  ＆  Ｌｅｖｙ，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  ２１８：  ８１−９２，  ２００１
【非特許文献３】Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３１９：  １２−２０，  ２００４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明は、前述したような従来技術の問題点を解決することにその目的があり、生理的、生化学的または生物学的環境が損なわれないように維持された細胞（ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌ）において、細胞内に取り込まれた粒子が小胞（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）から細胞質に効果的に露出されるようにする細胞質露出添加剤を提供することにその目的がある。
【００１４】
また、本発明は、生理的、生化学的または生物学的環境が損なわれないように維持された細胞（ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌ）において、細胞質露出添加剤を細胞に接触させることによって粒子が小胞（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）から細胞質に効果的に露出されるようにする方法を提供することにその目的がある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の細胞質露出添加剤は、粒子形態の物質がエンドサイトーシスにより細胞内で小胞を形成する場合の問題を解決するため、細胞の生理的、生化学的または生物学的環境が損なわれないように維持された状態で粒子を小胞から細胞質に効果的に露出させなければならない。すなわち、細胞内に取り込まれた粒子形態の物質を小胞から細胞質に露出させるとしても、細胞の基本骨格の構造、細胞膜、各種の細胞の小器官、および細胞内の構成物質の生理的、生化学的または生物学的活性などに決定的な変更を与える物質であってはならない。
【００１６】
本発明の一実施例の細胞質露出添加剤は、ＮＤＧＡ（Ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ＮＥＭ（Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、  ＮＨ４Ｃｌ、ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）、パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）、メタノールおよびエタノールで構成された群から選択された少なくとも１つの化合物を含む。
【００１７】
本発明の好ましい一実施例の細胞質露出添加剤は、ＮＤＧＡ、ＮＥＭおよび  ＮＨ４Ｃｌで構成された群から選択された少なくとも１つの化合物を含む。
【００１８】
本発明の粒子を細胞質に露出させる方法は、粒子を生きた細胞に導入し、前記細胞の生理的、生化学的または生物学的環境が損なわれないように維持された状態で前記粒子を小胞から細胞質に露出させる細胞質露出添加剤を前記細胞に接触させ、前記粒子が小胞から細胞質に露出されるようにすることを特徴とする。
【００１９】
本発明の一実施例の方法において、前記細胞質露出添加剤は、ＮＤＧＡ（Ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ＮＥＭ（Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ＮＨ４Ｃｌ、ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）、パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）、メタノールおよびエタノールで構成された群から選択された少なくとも１つの化合物を含む。
【００２０】
本発明の好ましい一実施例の方法において、前記細胞質露出添加剤は、ＮＤＧＡ、ＮＥＭおよび  ＮＨ４Ｃｌで構成された群から選択された少なくとも１つの化合物を含む。
【００２１】
本発明の一実施例の方法において、前記粒子は粒子形態を有する、または細胞内で粒子化することができる物質を含む。例えば、人工的に合成されたナノメータ大きさの直径を有する粒子があり得る。
【００２２】
本発明の一実施例の方法において、前記粒子は約１ないし１，５００ｎｍの直径を有する。好ましくは、前記粒子は約２０ないし３５０ｎｍの直径を有する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、生理的、生化学的または生物学的環境が損なわれないように維持された細胞（ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌ）において、細胞内に取り込まれた粒子が小胞（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）から細胞質に効果的に露出されるようにする長所がある。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１のＡは、ＡＤＲＢ２−ＥＧＦＰが発現されたＨｅＬａ細胞に粒子を取り込んだ後、細胞が生きた状態で細胞内において取り込まれた粒子の細胞内での位置を確認したものである。図１のＢは、粒子が取り込まれたＨｅＬａ細胞を固定した後、プルシアンブルー染色を施す前、細胞の透過光イメージの写真（ｂｅｆｏｒｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）とプルシアンブルー染色を施してから撮影した細胞の透過光イメージの原色写真（ａｆｔｅｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を比較して図示したものである。
【図２】細胞質露出添加剤によって小胞に取り込まれている粒子が細胞質に露出され、ＥＧＦＰ−ＡＢＬ１蛋白質によりダサチニブで改質された粒子が蛍光で標識され、その結果、粒子と蛍光が重畳して現れるのを示す細胞写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に記述する。本発明の下記の実施例は本発明を具体化するためのものに過ぎず、本発明の権利範囲を制限したり限定するものでないことはもちろんである。本発明の詳細な説明および実施例から本発明が属する技術分野の専門家が容易に類推できるのは、本発明の権利範囲に属するものと解釈される。本発明に引用された参考文献は、本発明に参考として統合される。
【実施例１】
【００２６】
実施例１：細胞内に取り込まれた粒子が小胞内に存在するか否かの確認
細胞内に取り込まれた粒子が小胞内に存在するか否かを確認するため、次のような実験を行った。
【００２７】
まず、表面が改質された粒子を用意する。本実施例に用いられる粒子は、治療目的または研究目的で当業界にて広く用いられている粒子であれば、どんなものでも使用が可能である。例えば、ゴールドパーティクル、ビーズなどを挙げることができる。本実施例においては、一例として、ストレプトアビジンが結合されたスーパーパラマグネチック磁性粒子（ストレプトアビジン−磁性粒子）を当業界にてよく知られた方法（米国特許第５，６６５，５８２号；米国公開特許第２００３／００９２０２９Ａ１号）で直接製作したり、磁性粒子を製作販売している会社から購入したりして用いることができる。
【００２８】
次に、細胞内に取り込まれた粒子が小胞内に存在するか否かを確認するための標識物質を準備する。ｐＤｏｎｒ２２１にクローニングされているＡＤＲＢ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．  ＢＣ０７３８５６）遺伝子をＯｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社で購入した後、公知の方法（Ｈａｒｔｌｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １０，  １７８８−１７９５）によって緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）が結合された形態の蛋白質を発現できる発現ベクターを製作した。製作された発現ベクターを塩基序列を分析して確認した。ＡＤＲＢ２蛋白質は、膜蛋白質であるＧＰＣＲの一種であって、細胞膜、エンドソーム、ライソゾーム等に位置するとして知られている。したがって、ＡＤＲＢ２−ＥＧＦＰは、細胞内に取り込まれた粒子が小胞内に存在するか否かを確認するための蛍光標識物質としての使用が可能である。
【００２９】
ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣから購入）を９６−ウェルプレートに５，０００〜１０，０００細胞／ウェル濃度で継代培養した後、前記用意されたＡＤＲＢ２−ＥＧＦＰ発現ベクターＤＮＡでトランスフェクションした。ＤＮＡトランスフェクションは、公知の方法、その一例としてリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎで購入）あるいはヒュージーン６（Ｆｕｇｅｎｅ  ６）（Ｒｏｃｈｅから購入）を用いて行うことができる。ＤＮＡがトランスフェクションされた細胞に前述の通りに用意された粒子を、当業界にてよく知らされた方法（Ｊｏｓｅｐｔｈｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ−Ｔａｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  １０，  １８６；  Ｄｅｒｆｕｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅ  ｔｒａｃｋｉｎｇ．  Ａｄｖ．  Ｍａｔｅｒ．  １６，  ９６１；  Ｆｒａｎｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔｓ．  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２２８，  ４８０；米国公開特許第２００５／０１３０１６７号；米国公開特許第２００５／０２７１７３２号）で取り込んだ。
【００３０】
細胞内に取り込まれた粒子とＡＤＲＢ２−ＥＧＦＰ蛋白質の蛍光が重畳するか否かを確認し、細胞内に取り込まれた粒子の細胞内の位置を確認した（図１のＡ）。細胞内に取り込まれた粒子は、透過光顕微鏡下で黒い点（ｄａｒｋ  ｓｐｏｔ）に観察された（図１のＡ、中間）、ＡＤＲＢ２−ＥＧＦＰ蛋白質による蛍光は、細胞膜およびエンドソームあるいはライソゾームのような小胞で観察された（図１のＡ、左方）。細胞内に取り込まれた粒子とＡＤＲＢ２−ＥＧＦＰ蛋白質の蛍光は、細胞内に存在する小胞で重畳して確認された（図１のＡ、右方）。
【００３１】
一方、細胞内で観察される黒い点が細胞内に取り込まれた粒子であることを確認するため、プルシアンブルー染色（Ｐｒｕｓｓｉａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ）を施した。プルシアンブルー染色は、細胞内に取り込まれた酸化鉄成分の粒子を特異的に染色し、観察するのに用いられる（Ｆｒａｎｋ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｂ．  Ｒ．，  Ａｒｂａｂ，  Ａ．  Ｓ．，  Ｚｙｗｉｃｋｅ，  Ｈ．  Ａ．，  Ｊｏｒｄａｎ，  Ｅ．  Ｋ．，  Ｌｅｗｉｓ，  Ｂ．  Ｋ．，  Ｂｒｙａｎｔ，  Ｌ．  Ｈ．，  ＆  Ｂｕｌｔｅ，  Ｊ．  Ｗ．  Ｍ．  （２００３）  Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔｓ．  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２２８：  ４８０−４８７）。粒子が取り込まれた細胞をホルムアルデヒドで固定した後、プルシアンブルー染色前に細胞を光学顕微鏡で観察し、プルシアンブルー染色後、同一視野（ｆｉｅｌｄ）で細胞を光学顕微鏡で観察した。プルシアンブルー染色は、プルシアンブルーアイアンステインキット［Ｐｒｕｓｓｉａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｉｒｏｎ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから購入、  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ２４１９９）］を用いて行った。プルシアンブルー染色の結果、細胞内で観察される黒い点が酸化鉄成分の粒子によるものであることを確認した（図１のＢ）。
【００３２】
このような結果はＡＤＲＢ２蛋白質が細胞膜、エンドソーム、ライソゾーム等に位置する蛋白質である点を勘案した時、細胞内に取り込まれた粒子は、生きた細胞においてエンドソームやライソゾームのような小胞により囲まれ、細胞内に位置していることを示唆する。
【実施例２】
【００３３】
実施例２：多様な細胞質露出添加剤の処理による粒子の細胞質露出
本発明の露出添加剤により細胞内に取り込まれた粒子が小胞から細胞質に露出されるか否かを確認するため、次のような実験を行った。細胞内に取り込まれた粒子が小胞から細胞質に露出されたか否かは、多様な方法で確認することができる。例えば、実施例１のように蛍光標識物質が小胞を標識することを利用して蛍光標識物質と黒い点に観察される粒子の重畳可否により確認することができる。本発明の細胞質露出添加剤を細胞に接触させた後、図１のＡに図示されたのとは異なり、細胞内に取り込まれた粒子である黒い点がＡＤＲＢ２−ＥＧＦＰ蛋白質の蛍光が現れる小胞の外で観察されると粒子が細胞質に露出されたと判断することができる。
【００３４】
また、より効率的な細胞質露出確認方法を使用することができるところ、本実施例においては、媒介者を利用して表面が改質された粒子に蛍光物質が標識されるか否かを観察し、粒子の細胞質露出可否を確認することができる。媒介者は本発明が属する技術分野にて使用可能なものと認識されるリンカー物質を１つまたは複数個用いて構成することができる。以下では、一例として媒介者を２つのリンカー物質で構成したものを用いて実験を行った。
【００３５】
媒介者を構成するリンカー物質の１つとしては、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）の治療剤として使われているダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）を用いた［Ｌｏｍｂａｒｄｏ，  Ｌ．  Ｊ．，  Ｌｅｅ，  Ｆ．  Ｙ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｎ−（２−ｃｈｌｏｒｏ−６−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−ｐｉｐｅｒａｚｉｎ−１−ｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−４−４−ｙｌａｍｉｎｏ）ｔｈｉａｚｏｌｅ−５−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ  （ＢＭＳ−３５４８２５），  ａ  ｄｕａｌ  Ｓｒｃ／Ａｂｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｓｓａｙｓ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４７，  ６６５８−６６６１  （２００４）；  Ｓｈａｈ，  Ｎ．  Ｐ．，  Ｔｒａｎ，  Ｃ．，  Ｌｅｅ，  Ｆ．  Ｙ．  Ｃｈｅｎ，  Ｐ．，  Ｎｏｒｒｉｓ，  Ｄ．，  Ｓａｗｙｅｒｓ，  Ｃ．  Ｌ．  Ｏｅｒｒｉｄｉｎｇ  ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＡＢＬ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５，  ３９９−４０１  （２００４）］。媒介者を構成するもう１つのリンカー物質としては、前述したリンカー物質であるダサチニブと結合するＡＢＬ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．  ＮＭ＿１９８２９１）を使用した。また、粒子の表面をダサチニブで改質するため、公知の方法でダサチニブ−ビオチンを合成した。
【００３６】
例えば、ダサチニブ−ビオチンの合成過程を説明すれば、次の通りである。
【００３７】
（１）ダサチニブはＴＨＦとＤＭＦの混合液に溶かした後、トリエチルアミンを添加した上、冷却させた；（２）ダサチニブ溶液にメタンスルホニルクロリド（ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）をゆっくり滴加した後、常温で一晩撹はんした；（３）反応液に  ＮａＮ３  を入れ、摂氏５０℃で一晩撹はんした；（４）反応液を減圧濃縮した後、残渣をコラムクロマトグラフィーにより精製した；（５）精製された産物をＴＨＦに溶解し、過量のトリフェニルホスフィン（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）を添加し、常温で５時間撹はんした；（６）反応液に水を添加し、摂氏７０℃で一晩撹はんした後、減圧濃縮した；（７）残渣を窒素大気状態でＤＭＦに溶解させた後、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）を添加した；（８）化合物２をＤＭＦに溶解して添加した後、常温で３日間撹はんした；（９）反応液を減圧濃縮した後、ＭｅＯＨ／ＭＣコラムクロマトグラフィーで精製した；（１０）合成された化合物はＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳを利用して確認した。
【００３８】
ＥＧＦＰ−ＡＢＬ１発現ベクターは、公知の方法により製作した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。
【００３９】
９６−ウェルプレートにＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣから購入、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＣＣＬ−２）をウェル当たり６，０００個細胞数（６，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）で継代培養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）した後、前記発現ベクターを実施例１のように細胞に取り込んだ。ＤＮＡが取り込まれた細胞にダサチニブで改質された粒子を、次の通り取り込んだ。
【００４０】
培養されたＨｅＬａ細胞に改質された粒子を、次のような過程によって処理した：
１）ストレプトアビジン−磁性粒子をダサチニブ−ビオチンと混合して反応させ、ダサチニブで改質された粒子を用意した；
２）前記反応後、混合液を当業界にて知られた分離方法、例えば、ＨＧＭＳ技術（Ｈｉｇｈ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）を利用して精製した（米国特許第４，２４７，３９８号（１９８１．  １．  ２７．    発行）；  Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，  Ｄ．，  Ｆ．  Ｐａｕｌ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｒｏａｔｈ  （１９７５）  Ｄｉｒｅｃｔ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２５５：７０６参照）；
３）上記の通りに用意されたダサチニブで改質された粒子を、ＤＮＡが取り込まれたＨｅＬａ細胞に当業界にてよく知らされた方法（Ｊｏｓｅｐｔｈｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ−Ｔａｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  １０，  １８６；  Ｄｅｒｆｕｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅ  ｔｒａｃｋｉｎｇ．  Ａｄｖ．  Ｍａｔｅｒ．  １６，  ９６１；  Ｆｒａｎｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔｓ．  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２２８，  ４８０；米国公開特許第２００５／０１３０１６７号；米国公開特許第２００５／０２７１７３２号）で取り込んだ。
【００４１】
ＥＧＦＰ−ＡＢＬ１発現ベクターＤＮＡとダサチニブで改質された粒子が取り込まれた細胞にＮＤＧＡ（Ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａから購入）、ＮＥＭ（Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ、Ｓｉｇｍａから購入）、またはＮＨ４Ｃｌ（Ｓｉｇｍａから購入）を各々最終２５〜５０μＭ、５〜２０μＭ、または１０ｍＭになるように処理した後、細胞を生きた状態で観察した。
【００４２】
本実施例においては、対物レンズＵｐｌａｎ  Ａｐｏ  ４０  Ｘ０．８５が装着されたオリンパス社の蛍光顕微鏡ＦＶ１０００を利用し、細胞の透過光イメージおよび蛍光イメージを得た。図２に図示するように、細胞質露出添加剤を添加する前（ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｄｄｉｔｉｖｅ）には細胞に取り込まれたダサチニブで改質された粒子が小胞に囲まれ、ＥＧＦＰ−ＡＢＬ１蛋白質により蛍光標識されず、その結果、細胞に取り込まれた粒子の黒い点とＥＧＦＰ−ＡＢＬ１蛋白質の蛍光がお互い重畳していないままに観察される（図２、左方）。しかしながら、細胞質露出添加剤を添加すれば、小胞に取り込まれた粒子が細胞質に露出され、ＥＧＦＰ−ＡＢＬ１蛋白質によりダサチニブで改質された粒子が蛍光で標識され、その結果、細胞に取り込まれた粒子の黒い点とＥＧＦＰ−ＡＢＬ１蛋白質の蛍光がお互い重畳して観察されることを確認した（図２、右方）。
【００４３】
また、ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）、パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）、メタノールおよびエタノールに対しても前述したような実験を行い、細胞質露出添加剤としての機能を確認した。ただし、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、メタノールおよびエタノールは、細胞を固定する機能をするため、これらを細胞に接触させて処理した場合、細胞を生きた状態で観察することはできないが、少なくとも細胞の生理的、生化学的または生物学的環境が損傷されずに維持された状態（ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌ）で粒子を小胞から細胞質に効果的に露出させることを確認することができた。
【００４４】
以上、本発明を前記実施例を挙げて説明したが、本発明はこれに制限されるものでない。当業者ならば本発明の趣旨および範囲を外れることなく、修正、変更することができ、このような修正と変更もまた本発明に属するものであることを知ることができる。
【図１】
2012508007.tif 000003
【図２】
2012508007.tif 000004
【国際調査報告】
2012508007.tif 000005
2012508007.tif 000006
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