(57)【要約】本発明は、大腸癌診断用組成物に関するものである。前記組成物は、大腸癌特異的な遺伝子のｍＲＮＡまたは前記遺伝子によってコードされるタンパク質発現レベルを測定するマーカーを少なくとも一つ含む。本発明によると、大腸癌の組織または血液でのみ特異的に過剰発現する遺伝子を選別することができる。本発明は、前記遺伝子のｍＲＮＡ発現及び前記遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルを同時に定量的に測定することができるので、高いレベルの信頼性をもって、大腸癌を早期に正確に診断することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを測定するマーカーを、単独または組み合わせて含む、大腸癌診断用組成物。
【請求項２】
マーカーが、配列番号１〜配列番号９の塩基配列に特異的に結合するプライマーセットである、請求項１に記載の大腸癌診断用組成物。
【請求項３】
プライマーが１５ｂｐ〜５０ｂｐの長さである、請求項２に記載の大腸癌診断用組成物。
【請求項４】
プライマーセットが、配列番号１〜配列番号９で示される塩基配列の一つに同時におよび相補的に結合して、下記１）〜９）からなる群から選択される一つである、請求項２に記載の大腸癌診断用組成物：
１）正方向である配列番号１０及び逆方向である配列番号１１；
２）正方向である配列番号１２及び逆方向である配列番号１３；
３）正方向である配列番号１４及び逆方向である配列番号１５；
４）正方向である配列番号１６及び逆方向である配列番号１７；
５）正方向である配列番号１８及び逆方向である配列番号１９；
６）正方向である配列番号２０及び逆方向である配列番号２１；
７）正方向である配列番号２２及び逆方向である配列番号２３；
８）正方向である配列番号２４及び逆方向である配列番号２５；及び
９）正方向である配列番号２６及び逆方向である配列番号２７。
【請求項５】
配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子によってそれぞれコードされるタンパク質の発現レベルを決定するマーカーを、単独または組み合わせて含む、大腸癌診断用組成物。
【請求項６】
マーカーが、配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的な抗体である、請求項５に記載の大腸癌診断用組成物。
【請求項７】
タンパク質に特異的な抗体が、微小粒子と接合した抗体である、請求項６に記載の大腸癌診断用組成物。
【請求項８】
微小粒子が、有色のラテックスまたは金コロイド粒子である、請求項７に記載の大腸癌診断用組成物。
【請求項９】
タンパク質に特異的な抗体が、免疫クロマトグラフィーストリップキット、ルミネックスアッセイキット、タンパク質マイクロアレイキット、エライザキット、または免疫学的ドットキットに適用することができる、請求項６に記載の大腸癌診断用組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物を含む、大腸癌の診断用キット。
【請求項１１】
下記の工程を含む、大腸癌の高い危険性を有する患者における大腸癌の診断方法：
１）患者から得られた生物学的試料における配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択される１または２以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程；及び
２）前記測定された発現レベル、特に増加したレベルを、大腸癌の危険性の指標として、正常な人より高い発現レベルを示す患者を選別する工程。
【請求項１２】
生物学的試料が、組織、細胞、全血、血清、血漿、唾液、痰、脳脊髄液及び尿からなる群から選択される生物学的試料である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
発現レベルが、下記によって測定されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法：
（ａ）配列番号１〜配列番号９によって示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子からなる群から選択される１または２以上の遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定すること；または
（ｂ）配列番号１〜配列番号９によって示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子からなる群から選択される１または２以上の遺伝子によって発現するタンパク質レベルを測定すること。
【請求項１４】
配列番号１〜配列番号９によって示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子からなる遺伝子群から選択される特定の遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルの測定が可能であるマーカーの使用、または大腸癌診断用組成物の製造のための、少なくとも二つの前記マーカーを含む複合マーカーの使用。
【請求項１５】
配列番号１〜配列番号９によって示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子からなる遺伝子群から選択される遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルの測定が可能であるマーカーの使用、または大腸癌診断用組成物の製造のための、少なくとも二つの前記マーカーを含む複合マーカーの使用。
【請求項１６】
配列番号１〜配列番号９によって示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子からなる遺伝子群から選択される特定の遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルの測定が可能であるマーカーの使用、または大腸癌診断用キットの製造のための、少なくとも二つの前記マーカーを含む複合マーカーの使用。
【請求項１７】
配列番号１〜配列番号９によって示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子からなる遺伝子群から選択される遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルの測定が可能であるマーカーの使用、または大腸癌診断用キットの製造のための、少なくとも二つの前記マーカーを含む複合マーカーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸癌関連マーカーを用いた大腸癌診断キット及び大腸癌診断に必要な情報を提供する方法に関するもので、より詳細には、大腸癌に特異的な遺伝子のｍＲＮＡまたは前記遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定するマーカー、または前記マーカーを少なくとも二つ以上含む複合マーカーを含有する大腸癌診断用組成物と、それを用いて大腸癌の診断に必要な情報を提供する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
大腸は、口から採取された食べ物の消化、吸収が行われる場所であり、余剰の食べ物がとどまるところでもある。また、ここで水分を吸収して大便が作られ、それとともに様々な種類の、多くの細菌が棲息するところでもある。成人の場合、大腸の長さは２ｍ程度で、結腸と直腸および肛門で構成されている。大腸粘膜がある場所であればどこででも癌ができるが、癌ができやすい部位は、エス状結腸と直腸である。
【０００３】
現在、韓国において、大腸癌発生率が著しく増加している。さらに、大腸癌による死亡は、男性の場合、胃癌、肺癌、肝臓癌についで四番目の癌に関連する死亡の原因である。また、女性の場合も類似しており、大腸癌の頻度は、女性より男性が多いことが示されている。年令別では、５０代が最も多く、６０代がその後に続いている。韓国では、ヨーロッパや米国と比較した時、発生年齢が１０歳程度若い傾向がある。５％〜１０％の頻度で３０代の若い人にも発生し、このように若い層に現われる大腸癌は、家族の間で多く発生する傾向があったりもする。大腸癌の発生に影響を及ぼすものとしては、遺伝因子よりも環境因子の比重が大きいと思われているが、食生活の急激な西欧化、特に動物性脂肪やタンパク質の過多摂取が原因であると認識されている。しかし、５％前後の大腸癌は、遺伝的素因によって発生することが知られている。これを総合してみると、大腸癌にかかりやすい危険因子としては、１）大腸ポリープにかかった経験がある場合、２）家族に癌にかかった者がいる場合、３）長期間、潰よう性大腸炎に苦しんでいる場合、４）治りにくい痔瘻にかかった場合などがある。
【０００４】
大腸癌には、デュークス分類法とＵＩＣＣの病期（ステージ）分類法が代表的である。その基準は、癌の大きさによるのではなく、大腸壁の中に癌が入って行った深さ及び遠隔転移の有無によって進行度が規定されている。下記の表１及び表２は、それぞれデュークス分類法及び病期分類法の区分基準を説明したものである。
【０００５】
【表１】
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【０００６】
【表２】
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【０００７】
二種の分類方式には、とても小さな差があるだけなので、デュークスＡは０期、１期に、デュークスＢは２期に、デュークスＣは３期に、デュークスＤは４期に該当するとして現在通用しており、特にデュークス分類は国際的に広く使用されている方法である。
【０００８】
大腸癌は、早期の発見時には、内視鏡摘出術や外科療法によって完全に治癒することができ、進行して肝臓や肺に転移（遠隔転移）しても手術が可能な時期なら外科療法による完治を期待することができる。言い換えると、現在の治療法の中では、外科療法が最も効果的であるといえる。しかし、発見が遅くなれば、肺、肝臓、リンパ節や腹膜など切除しにくい場所への転移が起きるので、前記の場合のように外科療法を用いることができず、結局、大腸癌の効果的な治療のためには早期診断及び治療が必須であるといえる。
【０００９】
外科的療法の手術を受けた後には、再発する場合がよくあるので、手術後には３〜４ヶ月の間隔で再発の有無をチェックするための定期検査を受けなければならない。体内臓器の中で肝臓、肺、腹膜などが再発しやすい臓器であり、また切除した部位で局所的に再発したりする。大腸癌は、他の癌と比較すると、早い時期に再発が発見され、再発した病巣を切除して完全に治療することもできる。再発の８０％以上は、手術後３年以内に発見されるので、手術後５年以内に再発しないことが完治の基準になる。
【００１０】
大腸癌は、早期の場合はほとんど１００％近くが完治するが、一般的に自覚症状がないので無症状である時期に見つけることはとても難しく、定期的な検査を要求すべきである。大腸癌の選別検査（スクリーニング）として代表的なものは、便潜血検査であるが、この検査で陽性反応が出たからといって大腸癌にかかったというものではなく、また逆に陰性反応であるからといって大腸癌にかからなかったといえるものでもないため、正確な診断用途として用いるには無理がある。したがって、現在用いられている有効な結果を保障する大腸癌検査法を、下記の表３に示す。
【００１１】
【表３】
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【００１２】
現在まで大腸癌を早期に見つけることができる大腸癌特有の腫瘍マーカーは、まだ明らかにされたことがない。もちろん、ＣＥＡと呼ばれるマーカーがあるが、前記表３でも言及したように、大腸癌において約半数が陽性を示すだけなので、主に大腸癌の進行度と治療効果を判定する指標として使用されているだけで、初期の診断のためのマーカーとして用いるには多少無理がある。
【００１３】
ＡＺＧＰ１（alpha-2-glycoprotein1, zinc-binding）遺伝子は、２９５のアミノ酸、３３８７２Ｄａを有する分泌タンパク質である。
【００１４】
ＣＸＣＬ６遺伝子は、サイズが１１４アミノ酸、１１，８９７Ｄａの分泌タンパク質であり、好中球、顆粒白血球に対する走化性機能を有している。
【００１５】
ＥＧＦＬ６（EGF-like-domain,multiple 6）遺伝子は、サイズが５５３アミノ酸、６１３１７Ｄａで、胎児組織から検出される。以前の研究としては、米国特許６，８０８，８９０号がある。
【００１６】
ＡＧＴ遺伝子は、アンジオテンシノ−ゲン(serpin peptidase inhibitor, cladeA, member8)で、サイズは４８５アミノ酸、５３１５４Ｄａで、妊娠期間中、ＰＲＧ２の前駆形態を有するジスルフィド結合した２：２のヘテロテトラマー(disulfide-linked2:2heterotetramer)、プロ−ＰＲＧ２及びＣ３タンパク質として複合体で存在する分泌タンパク質である。癌と関連して膵管癌組織（非特許文献１）、ヒト男子胚細胞腫瘍（非特許文献２）で報告されたことがある。
【００１７】
ＣＸＣＬ３（Ｃ−Ｘ−Ｃクモカインリガンド３）は、サイズが１０７アミノ酸、１１３４２Ｄａである分泌タンパク質で、細胞外空間に存在する。好中球(Neutrophils)に対する走化性活性を有しており、炎症反応の時に重要な役割を担う。
【００１８】
そこで本発明者らは、大腸癌と関連があると予想される遺伝子を対象にＤＮＡチップを用いて、大腸癌はもちろん胃癌、乳癌、前立腺癌、肝臓癌などと正常な組織での発現レベルを比較した結果、大腸癌組織でのみ特異的に過剰発現する遺伝子を選別して、選別された大腸癌診断マーカーとしての可能性あるＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐ遺伝子に特異的なマーカーまたはそれらの複合マーカーを通じて遺伝子発現レベルを同時に測定して大腸癌を早期に正確に診断することができ、診断の信頼性を高めることができることを確認して本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】pancreatic ductal cancer tissues,Ohta T,Amaya K,Yi S,Kitagawa H,Kayahara M,Ninomiya I,Fushida S,Fujimura T,Nishimura G,Shimizu K,Miwa K.Angiotensin converting enzyme-independent,local angiotensin II -generation in human pancreatic ductal cancer tissues.Int J Oncol.2003年,9月,第23(3)巻,p.593-8
【非特許文献２】Murty VV,Li RG,Mathew S,Reuter VE,Bronson DL,Bosl GJ,Chaganti RS.Replication error-type genetic instability at 1q42-43 in human male germ cell tumors.Cancer Res.1994年,8月1日,第54(15)巻,p.3983-5
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の一つの目的は、ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐからなる群から選択されるマーカーまたはそれらの複合マーカーを通じて大腸癌を診断することができる、大腸癌診断マーカーを提供することである。
【００２１】
本発明のもう一つの目的は、ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐからなる群から選択されるマーカーまたはそれらの複合マーカーを通じて遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の発現レベルを測定するマーカーを含む大腸癌診断用組成物を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、前記の大腸癌診断用組成物を含む大腸癌診断キットを提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、前記大腸癌診断用組成物またはキットを用いて大腸癌診断に必要な情報を提供する方法を提供することである。
【００２４】
また、本発明は、前記マーカーを前記の大腸癌診断用組成物の製造における使用を提供する。
【００２５】
また、本発明は、前記マーカーを前記大腸癌診断用キットの製造における使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明の一態様によると、本発明の配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択されるいずれか一つの遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを測定するマーカー、または前記マーカーを少なくとも二つ以上含む、複合マーカーを含む大腸癌診断用組成物を提供する。
【００２７】
本発明の他の側面によると、本発明の配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択されるいずれか一つの遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定するマーカー、または前記マーカーを少なくとも二つ以上含む複合マーカーを含む大腸癌診断用組成物を提供する。
【００２８】
本発明の他の好ましい態様によると、本発明配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択されるいずれか一つの遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを測定するマーカー、または前記マーカーを少なくとも二つ以上含む複合マーカーの、大腸癌診断用組成物の製造における使用を提供する。
【００２９】
本発明の他の好ましい態様によると、本発明配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択されるいずれか一つの遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定するマーカー、または前記マーカーを少なくとも二つ以上含む複合マーカーの、大腸癌診断用組成物の製造における使用を提供する。
【００３０】
本発明の前記配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群は、それぞれ配列番号１のＡＺＧＰ１（alpha-2-glycoprotein1）遺伝子、配列番号２のＣＸＣＬ３（C-X-C chemokine ligand3）遺伝子、配列番号３のＣＸＣＬ６[chemokine(C-X-C motif)ligand6,granulocyte chemotactic protein2]遺伝子、配列番号４のＡＧＴ[angiotensinogen(serpin peptidase inhibitor,clade A,member8)]遺伝子、配列番号５のＦＣＧＲ３Ａ遺伝子、配列番号６のＣｏｌ５Ａ２(collagen,typeV,alpha2)遺伝子、配列番号７のＳ１００Ｐ(S100 calcium binding protein P)遺伝子、配列番号８のＥＧＦＬ６(EGF-like-domain,multiple6)遺伝子、及び配列番号９のＣＴＨＲＣ１(collagen triple helix repeat containing1)遺伝子からなる遺伝子群である。
【００３１】
本発明の前記大腸癌診断用組成物は、配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択されるいずれか一つの遺伝子のｍＲＮＡまたは前記遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定するマーカーでもあり得るが、好ましくはそれらマーカーの複合マーカーであった方が良い。本発明の複合マーカーは、いずれか一つの遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルと前記遺伝子のタンパク質発現レベルを測定するマーカーからなる複合マーカーであり得、前記配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択される少なくとも二つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたは前記遺伝子によってコードされるタンパク質発現レベルを測定する複合マーカーであり得る。本発明の前記大腸癌診断用組成物が前記複合マーカーで構成される場合、大腸癌の発生と進行において大腸癌と関連した前記遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたは前記遺伝子によってコードされるタンパク質発現レベルを同時に測定することができるので、大腸癌の診断において早期に正確に診断することができ、診断の信頼性を高めることができる長所がある。
【００３２】
本発明の実施例では、大腸癌患者から採取された生物学的試料で前記遺伝子の発現変化を分析した結果、正常対照群と比較した場合、２〜９倍以上に発現が増加する遺伝子であることが分かった。
【００３３】
本発明の配列番号１〜配列番号９の遺伝子と配列相同性を示す塩基配列は、本発明の範囲内であると理解されるべきである。同様に、配列番号１〜配列番号９の遺伝子によってコードされるポリペプチド配列と配列相同性を示すポリペプチド配列を、本発明において使用することができる。
【００３４】
本発明において、配列相同性(Sequence homology)は、二つ以上の核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドの間で配列関係を記載する場合に使用され、（ａ）参照配列(reference sequence)、（ｂ）比較ウィンドウ(comparison window)、（ｃ）配列同定(sequence identity)、（ｄ）配列同定のパーセント及び（ｅ）実在的同定(substantial identity)または「相同(homologous)」を含む用語の文脈において理解することができる。
【００３５】
（ａ）「参照配列」は、配列比較のための基準に使用される明示された配列である。参照配列には、例えば、全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列、または完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列の切片のように特異的配列の小さな部分または全体がなり得る。
【００３６】
（ｂ）「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド配列が連続して特異的な切片に対するレファレンスを含み、ここでポリヌクレオチド配列は参照配列と比較され得、比較ウィンドウでポリヌクレオチド配列の一部は二つの配列の最適配列のために参照配列（付加、置換または欠失を含まない）と比較して付加、置換または欠失（すなわち、ギャップ(gaps)）を含むことができる。一般的に、比較ウィンドウは、２０個以上の連続するヌクレオチドの長さになり、選択的に３０、４０、５０、１００またはそれ以上になることができる。ポリヌクレオチド配列でギャップの含有によって参照配列と比較して高い類似性を避けるために、ギャップペナルティが一般的に導入され、多数の一致(matches)から除去されることは当業者に自明なことである。
【００３７】
比較のための配列のアラインメント方法は、当該技術分野でよく知られている。比較のための配列の最適のアラインメントは、スミスとウォーターマン(Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.,1981年,第2巻,p.482)の局部的相同性アルゴリズム(local homology algorithm)によって；ニードルマンとウンシィ(Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.,1970年,第48巻,p.443)の相同性配列アルゴリズムによって；パーソンとリップマン(Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1988年,第8巻,p.2444)の類似方法による調査によって；インテリジェネティクス(Intelligenetics)によるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ、マウンテンビュー(Mountain View)、カリフォルニア、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びウィスコンシンジェネティクスソフトウェアパッケージ(Wisconsin Genetics Software Package)のＴＦＡＳＴＡ、ジェネティクスコンピューターグループ[(GCG),7 Science Dr.,Madison,Wisconsin,USA;Higgins and Sharp,Gene,1988年、第73巻,p.237-244]によってよく記載されているＣＬＵＳＴＡＬプログラムを含むこれらのアルゴリズムのコンピューター処理された手段によって遂行することができるが、これらに限定されるものではない。データベース類似性の調査に使用できるプログラムのＢＬＡＳＴ集団は、ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列(query sequences)のためのＢＬＡＳＴＮ；タンパク質データベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＸ；タンパク質データベース配列に対するタンパク質問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＰ；ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質問い合わせ配列のためのＴＢＬＡＳＴＮ；及びヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＴＢＬＡＳＴＸを含む(Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 19,Ausubel等,Eds.,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York,1995参照)。前記プログラムまたは新しいプログラムの新規バージョンは、今後利用可能になることが明白であり、本発明とともに使用することができる。
【００３８】
（ｃ）二つの核酸またはポリペプチドの文脈における「配列相同性」または「相同性」は、特異的比較ウィンドウを通じて最大一致に調節される場合に同一で一般的な付加、欠失及び置換することができる二つの配列で残基にレファレンスを含む。配列相同性パーセントがタンパク質に対するレファレンスに使用される場合、保存するアミノ酸置換によって同じではなく、たびたび異なる残基位置を認識して、このアミノ酸残基は、類似の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を有する異なるアミノ酸残基と置換されて分子の機能的特性を有害に変化させない。配列が保存する置換と異なる場合、配列同定パーセントは置換の保存特性を訂正して上向き調節することができる。このような保存置換によって変わる配列は、配列類似性を有するようになる。このような調節のためのアプローチは当該技術分野でよく知られている。一般的にこれは、十分な不完全一致より部分的に保存的置換を点数化して、それによって配列相同性のパーセントを増加させることを含む。したがって、例えば、同一なアミノ酸に１点を与えて非保存置換に０点を与える場合、保存置換には０と１間の点数が与えられる。保存置換の点数化は、アルゴリズム(Meyers and Miller,Computer Applic.Biol.Sci.,1988年,第4巻,p.11-17)によってプログラムＰＣ／ＧＥＮＥ(Intelligenetics,Mountain View,California,米国)で提供されるとおり算出される。
【００３９】
（ｄ）「配列相同性のパーセント」は、比較ウィンドウを通じて最適に調節された二つの配列を比較して決定された値を意味し、ここで、比較ウィンドウでポリヌクレオチド配列の一部分は、二つの配列の最適アラインメントのための参照配列（付加、置換及び欠失を含まない）と比較して付加、置換または欠失を含むことができる。パーセントは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基の、比較ウィンドウでの全位置の数によって一致した位置の数を割り、配列相同性のパーセントを得るために１００を結果に掛けて一致した位置の数を収得することができる二つの配列で発生する位置の数を決定して算出される。
【００４０】
（ｅ）（ｉ）用語「実質相同性」または「相同」は、標準媒介変数を用いて記載された調節プログラムの中の一つを用いて参照配列と比較して要求される相同性、例えば、約６０％以上の相同性、好ましくは約７０％以上の相同性、より好ましくは約８０％以上の相同性、さらに好ましくは約９０％以上の相同性、もっと好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上または１００％の相同性を有する配列を含むポリヌクレオチドを意味する。記述中の一つは、それら値が計測コドン縮重(account codon degeneracy)、アミノ酸類似性、判読フレームポジションなどによって二つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の一致する相同性を決定するために適切に調節され得る。
【００４１】
これら目的のためのアミノ酸配列が、実質の相同性は、正常では約６０％以上、より好ましくは約７０％、８０％または９０％以上で、さらに好ましくは約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上または１００％の配列相同性を意味する。ヌクレオチド配列が実質同一である他の例示としては、二つの分子がストリンジェントな条件下でそれぞれ互いにハイブリダイズする。しかし、ストリンジェントな条件下でそれぞれ互いにハイブリダイゼーションしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質同一であれば、まだ実質には同一のものである。例えば、核酸コピーが遺伝子コードによって許容される最大コドン縮重を用いて生産される場合に発生し得る。二つの核酸配列が、実質同一である一つの例示は、このような交差反応性が実質同一であると思われるため二つのポリペプチドで要求されないが、一番目核酸コードが二番目核酸によってコードされるポリペプチドと免疫交差反応するポリペプチドである。
【００４２】
（ｅ）（ｉｉ）ペプチドの文脈における用語「実質相同性」または「相同」は、特異的比較ウィンドウを通じて参照配列に対して要求される相同性、例えば、約６０％以上の相同性、好ましくは７０％以上の配列相同性、より好ましくは８０％、よりもっと好ましくは８５％、より一層好ましくは９０％または９５％以上、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有する配列を含むペプチドをいう。
【００４３】
本発明で用語、「診断」は、病理状態の存在または特徴を確認することを意味する。本発明の目的上、診断は大腸癌発病の有無を確認するものである。
【００４４】
本発明で用語、「大腸癌」は、大腸の最も内側表面である粘膜で発生した癌で、直腸癌、結腸癌及び肛門癌を通称したものを意味する。
【００４５】
本発明で用語、「診断用マーカー」、「診断するためのマーカー」、または「診断マーカー」というのは、大腸癌細胞を正常な細胞と区分して診断することができる物質であり、正常な細胞と比較して大腸癌を有する細胞で増加の様相を示すポリペプチドまたは核酸（例：ｍＲＮＡなど）、脂質、糖脂質、糖蛋白質、糖（単糖類、二糖類、オリゴ糖類など）等の有機生体分子などを含み、それら有機生体分子の生体内発現変化を測定することができるプライマーと抗体も含む。本発明の目的上、大腸癌診断マーカーは、ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐからなる配列番号１〜配列番号９の遺伝子群から選択される一つ以上の遺伝子の核酸（例：ｍＲＮＡなど）、脂質、糖脂質、糖蛋白質、糖（単糖類、二糖類、オリゴ糖類など）等の有機生体分子と前記ｍＲＮＡの生体内発現様相を確認することができるプライマーセットやＤＮＡチップ、または前記タンパク質の生体内発現様相を確認することができる抗体を挙げることができる。
【００４６】
有意性ある診断マーカーの選択と適用は、診断結果の信頼性を決定する。本発明で有意性ある診断マーカーというのは、診断して得た結果が正確で妥当度が高くて反復測定時にも一貫した結果を示すように信頼性が高いマーカーを意味する。本発明の大腸癌診断マーカーは、大腸癌の発病とともに直接的または間接的要因によって発現が常に増加する遺伝子で反復された実験でも同一な結果を示し、対照群と比較して発現レベルの差が非常に大きくて、誤った結果を下す確率がほとんどない信頼性が高いマーカーである。
【００４７】
ゆえに、本発明の有意性ある診断マーカーの発現レベルを測定して得た結果を基に診断された結果は、信頼し得る。
【００４８】
ここで、正常な大腸上皮細胞と大腸癌細胞でほとんど同一の量で発現する遺伝子は除外して、例えば対照群で用いた正常な組織で発現する遺伝子と比較して大腸癌組織で発現が２〜９倍以上に増加する遺伝子を選別した。
【００４９】
本発明の大腸癌診断用組成物で、前記遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定するマーカーは、大腸癌細胞で発現されるｍＲＮＡの発現変化を測定することができるどのようなマーカーでもかまわない。好ましくは、配列番号１〜配列番号９の塩基配列に特異的に結合するプライマーセットである。本発明において、前記プライマーは前記配列番号１０〜配列番号２７の塩基配列セットから選択される。
【００５０】
本明細書において用いられるように、「プライマー」の用語は、短い自由３’末端水酸化基を有する核酸配列で相補的なテンプレートと塩基対を形成することができ、テンプレート鎖複製のための開始地点としての機能をする短い核酸配列を意味する。ＤＮＡの合成又は複製は、プライマーに加えて、適切な緩衝溶液、適度な温度、重合酵素（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）及び異なる４種のヌクレオチドトリホスフェートを必要とする。本発明のプライマーは、各マーカー遺伝子特異的なプライマーで７個ないし５０個のヌクレオチド配列を有したセンス及びアンチセンス核酸である。プライマーは、ＤＮＡ合成の開始点として作用するプライマーの基本性質を変化させない限り、追加の特徴を混入することができる。
【００５１】
本発明のプライマーは、ホスホロアミダイト固体支持体方法、またはその他広く公知された方法を用いて化学的に合成することができる。このような核酸配列は、また当該分野で公知された多くの手段を用いて改変することができる。このような改変の非制限的な例としては、メチル化、キャップ化、天然ヌクレオチド一つ以上の同族体への置換、及びヌクレオチド間の改変、例えば、荷電されない連結体（例：メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデイト、カルバメートなど）または荷電された連結体（例：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）への改変がある。核酸は、一つ以上の付加的な共有結合した残基、例えば、タンパク質（例：ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）、挿入剤（例：アクリジン、プソラレンなど）、キレート化剤（例：金属、放射性金属、鉄、酸化性金属など）、及びアルキル化剤を含むことができる。本発明の核酸配列はまた検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的に提供することができる標識を用いて改変することができる。標識の例としては、放射性同位元素、蛍光性分子、ビオチンなどがある。
【００５２】
本発明の具体的な実施例によると、前記大腸癌診断マーカー検出用組成物は、本発明の大腸癌診断用遺伝子であるＡＺＧＰ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２、Ｓ１００Ｐ、ＥＧＦＬ６、またはＣＴＨＲＣ１の中から１つまたはそれ以上の遺伝子に対して特異的な各々のプライマー対を含む（表４）。
【００５３】
【表４】
2012506253.tif 000006
【００５４】
本発明の大腸癌診断用組成物で、前記タンパク質の発現レベルを測定するマーカーは、大腸癌細胞で発現されるタンパク質の発現変化を測定するのであれば、どのようなマーカーでも使用することができる。好ましくは、前記配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子（ＡＺＧＰ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２、Ｓ１００Ｐ、ＥＧＦＬ６、またはＣＴＨＲＣ１）のタンパク質に特異的な抗体である。
【００５５】
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、抗原性部位に対して指示される特異的なタンパク質分子を意味する。本発明の目的上、抗体はマーカータンパク質に対して特異的に結合する抗体を意味して、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び組換え抗体をすべて含む。
【００５６】
前記のように大腸癌マーカータンパク質が同定されたので、当該技術分野に広く公知された技術を用いて、抗体を生産するために使用することができる。
【００５７】
ポリクローナル抗体は、上記大腸癌マーカータンパク質抗原を動物に注射して、動物から採血して抗体を含む血清を収得する、当該技術分野に広く公知された方法によって生産することができる。このようなポリクローナル抗体は、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、サル、ウマ、ブタ、ウシ、イヌ等の任意の動物種宿主から製造可能である。
【００５８】
モノクローナル抗体は、当該技術分野に広く公知されたハイブリドーマ方法(Kohler及びMilstein,European Jounral of Immunology,1976年,第6巻,p.511-519参照)、またはファージ抗体ライブラリ(Clackson等,Nature,1991年,第352巻,p.624-628;Marks等,J.Mol.Biol.1991年,第222巻,p.58,1-597)技術を用いて製造することができる。前記方法で製造された抗体は、ゲル電気泳動、透析、塩沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー等の方法を用いて分離、精製することができる。
【００５９】
また、本発明の抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する完全な形態だけではなく、抗体分子の機能的な断片を含む。抗体分子の機能的な断片というのは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどがある。
【００６０】
本発明の大腸癌診断用組成物において、前記抗体は、微小粒子と接合した抗体(
microparticle-conjugated antibody)であることが好ましい。また前記微小粒子は、有色のラテックスまたは金コロイド粒子であることが好ましい。
【００６１】
本発明の大腸癌診断用組成物において、前記抗体は、配列番号１〜配列番号９の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定することができれば、どのような抗体でもかまわない。好ましくは、免疫クロマトグラフィーストリップキット、ルミネックスアッセイキット、タンパク質マイクロアレイキット、エライザキット、または免疫学的ドットキットに含まれた抗体である。
【００６２】
好ましくは、本発明の前記大腸癌診断用組成物において、前記免疫クロマトグラフィーストリップは、（ａ）試料が吸収されるサンプルパッド；（ｂ）試料内の配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択される１個以上の遺伝子のタンパク質と結合する結合パッド；（ｃ）前記配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択される１個以上の遺伝子のタンパク質に対するモノクローナル抗体を含む検査ライン及び対照ラインが処理されている検査メンブレン；（ｄ）残量の試料が吸収される吸収パッド；及び（ｅ）支持体を含む。
【００６３】
本発明の前記大腸癌診断用組成物において使用することができる前記ルミネックスアッセイキット、前記タンパク質マイクロアレイキット、及び前記エライザキットは、配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子のタンパク質に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、そして標識物質が結合した前記ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体に対する２次抗体を、好ましくは含む。
【００６４】
本発明の他の側面によると、本発明は、配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択されるいずれか一つの遺伝子のｍＲＮＡまたは前記遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定する１個またはそれ以上のマーカーの複合構成を通じて、前記本発明の大腸癌診断用組成物を含む大腸癌診断用キットを提供する。
【００６５】
本発明の他の好ましい態様によると、本発明は、配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択されるいずれか一つの遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを測定するマーカー、または前記マーカーを少なくとも二つ以上含む複合マーカーを大腸癌診断用キットの製造における使用を提供する。
【００６６】
本発明の他の好ましい態様によると、本発明は、配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択されるいずれか一つの遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定するマーカー、または前記マーカーを少なくとも二つ以上含む複合マーカーを大腸癌診断用キットの製造における使用を提供する。
【００６７】
本明細書において用いられるように、「ｍＲＮＡ発現レベル測定」の用語または対応する語句は、大腸癌を診断するために生物学的試料で大腸癌マーカー遺伝子のｍＲＮＡ存在の有無と発現レベルを確認する過程でｍＲＮＡの量を測定する。そのため分析方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ、競争的ＲＴ−ＰＣＲ(Competitive RT-PCR)、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ(Real-time RT-PCR)、ＲＮａｓｅ保護分析法(RPA;RNase protection assay)、ノーザンブロッティング、ＤＮＡチップなどを含むが、これらに制限されるのではない。
【００６８】
本明細書において用いられるように、「タンパク質発現レベル測定」の用語または対応する語句は、大腸癌を診断するために生物学的試料で大腸癌マーカー遺伝子から発現されたタンパク質の存在の有無と発現レベルを確認する過程を示し、ここで、前記遺伝子のタンパク質に対して特異的に結合する抗体を用いる。分析方法としては、ウエスタンブロット、エライザ（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫分析（ＲＩＡ）、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈澱分析法、補体固定分析法、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）、タンパク質チップなどを含むがこれらに制限されるのではない。
【００６９】
好ましい具体的な一態様として、前記診断キットはＲＴ−ＰＣＲを遂行するために必要な必須要素を含むことを特徴とする診断用キットであり得る。ＲＴ−ＰＣＲキットは、マーカー遺伝子に対する特異的なそれぞれのプライマー対を含む。プライマーは、各マーカー遺伝子の核酸配列に特異的な配列を有するヌクレオチドで、約７ｂｐ〜５０ｂｐの長さ、より好ましくは約１０ｂｐ〜３０ｂｐの長さである。また、対照群遺伝子の核酸配列に特異的なプライマーを含むことができる。その他、ＲＴ−ＰＣＲキットは、テストチューブまたは異なる適切なコンテナ、反応緩衝液（ｐＨ及びマグネシウム濃度は多様）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ−ポリマラーゼ及び逆転写酵素のような酵素、ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ抑制剤、ＤＥＰＣ−水、滅菌水などを含むことができる。
【００７０】
本発明において、大腸癌診断に適用され得る限り、どのような形態のキットでも用いることができる。生物学的試料中のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現変化を迅速かつ正確に測定して大腸癌を診断することができるので、ＲＴ−ＰＣＲキット、免疫学的ドットキット、エライザ（ＥＬＩＳＡ）キット、免疫クロマトグラフィーキット、ルミネックスアッセイキット、又はタンパク質マイクロアレイキットであることが好ましい。好ましくは、前記大腸癌診断キットは、分析方法に適した一種類またはそれ以上の異なる構成成分、溶液または装置をさらに含むことができる。
【００７１】
本発明の大腸癌診断用キットで、前記ルミネックスアッセイキットは、配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子のタンパク質に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体と、前記ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体に対する２次抗体を含むことができる。本発明のルミネックスアッセイは、少量（１０〜２０μｌ）の患者試料を前処理しない状態で最大１００種類のアナライトを同時に測定することができる高処理定量分析方法である。ルミネックスアッセイは、感度が良く（ｐｇ単位）、早い時間内に定量が可能で（３〜４時間）、既存のエライザ（ＥＬＩＳＡ）やエリスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）を代替することができる。ルミネックスアッセイは、９６ウェルプレートにあるそれぞれのウェルで１００種以上の生物学的試料を同時に分析することができるマルチプレックス蛍光マイクロプレート分析方法で、二つの種類のレーザー感知器を用いてリアルタイムで信号伝達を進行させることで、１００個以上の異なる色の群のポリスチレンビーズを区別して定量する。前記１００個のビーズは、次のような方法で区別されるように構成される。１０×１０のビーズマトリックスにおいて、一方は、赤い蛍光ビーズが十段階以上に分けられていて、もう一方は、オレンジ蛍光ビーズが十段階に分けられて強度の差を示し、その間のビーズは、レッドとオレンジ色の割合がそれぞれ異なるの割合で混ざっていて全体的に１００色のコードビーズセットを構成している。また、それぞれのビーズには、分析しようとするタンパク質の抗体で覆われていてそれを用いた免疫抗体反応でタンパク質定量が可能である。この試料は、二つのレーザーを用いて分析するので、一つのレーザはビーズを感知してビーズ固有番号を調べ、異なるレーザーはビーズに付いている抗体と反応した試料中のタンパク質を感知するようになる。したがって、一つのウェルで同時に１００種の生体内タンパク質分析が可能である。この分析は、１５μｌ程度の少ない試料でも感知が可能であるという長所がある。
【００７２】
本発明のルミネックス(Luminex)アッセイを遂行することができるルミネックスキットは、マーカータンパク質に対する特異的な抗体を含む。抗体は、各マーカータンパク質に対する特異性及び親和性が高くて、他のタンパク質に対する交差反応性がほとんどない抗体で、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または組換え抗体とすることができる。また、ルミネックスキットは、対照群タンパク質に特異的な抗体を含むことができる。その他に、ルミネックスキットは、結合した抗体を検出することができる試薬、例えば、標識された２次抗体、発色団、酵素（例：抗体と接合したもの）及びその基質または抗体と結合することができる異なる物質などを含むことができる。前記抗体は、微小粒子と接合された抗体であり得、また前記微小粒子は有色のラテックスまたは金コロイド粒子であり得る。
【００７３】
また異なる態様では、ＤＮＡチップを遂行するために必要な必須要素を含むことを特徴とする診断キットとすることができる。ＤＮＡチップキットは、遺伝子またはその断片にあたるｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドが付着している基板、及び蛍光標識プローブを作成するための試薬、製剤、酵素などを含むことができる。また基板は、対照群遺伝子またはその断片にあたるｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００７４】
さらに、診断キットは、好ましくはエライザ（ＥＬＩＳＡ）を遂行するために必要な必須要素を含むことを特徴とする。エライザキットは、マーカータンパク質に対する特異的な抗体を含む。抗体は、各マーカータンパク質に対する特異性及び親和性が高くて他のタンパク質に対する交差反応性がほとんどない抗体で、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または組換え抗体である。また、エライザキットは、対照群タンパク質に特異的な抗体を含むことができる。その他に、エライザキットは、結合した抗体を検出することができる試薬、例えば、標識された２次抗体、発色団、酵素（例：抗体と接合したもの）及びその基質または抗体と結合することができる異なる物質などを含むことができる。
【００７５】
本発明の大腸癌診断用キットで、前記大腸癌診断用免疫クロマトグラフィーストリップを含む大腸癌診断キットは、５分以内に分析結果が分かる迅速な診断テストを遂行するために必要な必須要素を含むことを特徴とする。本発明で免疫クロマトグラフィーストリップを含む迅速なテストキットは、マーカータンパク質に対する特異的な抗体を含む。前記抗体は、各マーカータンパク質に対する特異性及び親和性が高くて他のタンパク質に対する交差反応性がほとんどない抗体で、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または組換え抗体とすることができる。また迅速なテストキットは、対照群タンパク質に特異的な抗体を含むことができる。その他に、迅速なテストキットは、結合した抗体を検出することができる試薬、例えば、特異抗体と２次抗体が固定されたニトロセルロースメンブレン、抗体が結合したビーズに結合したメンブレン、吸収パッドとサンプルパッドなど診断に必要な異なる物質などを含むことができる。
【００７６】
また、本発明の大腸癌診断用キットは、複合マーカーを同時に分析するためのタンパク質マイクロアレイを遂行するために必要な必須要素を含むことを特徴とする診断キットであり得る。本発明でタンパク質マイクロアレイキットは、固体上に結合したマーカータンパク質に対する特異的な抗体を含む。抗体は、各マーカータンパク質に対する特異性及び親和性が高くて他のタンパク質に対する交差反応性がほとんどない抗体で、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または組換え抗体とすることができる。またタンパク質マイクロアレイキットは、対照群タンパク質に特異的な抗体を含むことができる。その他に、タンパク質チップキットは、結合した抗体を検出することができる試薬、例えば、標識された２次抗体、発色団、酵素（例：抗体と接合したもの）及びその基質または抗体と結合することができる異なる物質などを含むことができる。本発明の前記タンパク質マイクロアレイは、スライドに結合した前記タンパク質に対するポリクローナル抗体及び前記タンパク質に対するモノクローナル抗体と前記ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体に対する酵素結合２次抗体を含むことができる。
【００７７】
本発明のもう一つの好ましい態様によると、本発明は下記の工程を含む、大腸癌の高い危険性を有した患者等における大腸癌の診断方法を提供する：
１）大腸癌が疑われる患者から獲得された生物学的試料で配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択される一つ以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程、及び
２）前記測定された発現レベルが、特に大腸癌の危険性の指標として増加したレベルであり、正常対照群試料のレベルより高い発現を示す患者を選別する工程。
【００７８】
ここで、前記発現レベルは、配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択されるいずれか一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル、または配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択されるいずれか一つ以上の遺伝子から発現したタンパク質の発現レベルを示す。
【００７９】
本発明のもう一つの側面によると、本発明は、大腸癌診断に必要な情報を提供するために配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群（ＡＺＧＰ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２、Ｓ１００Ｐ、ＥＧＦＬ６、またはＣＴＨＲＣ１）から選択される一つ以上の遺伝子に特異的であり、塩基配列１０〜塩基配列２７の配列の中から選択される一つ以上のプライマーセットを用いて、大腸癌が疑われる患者の生物学的試料からｍＲＮＡの発現レベルを測定する工程；及び前記測定されたｍＲＮＡの発現レベルの増加を正常対照試料のｍＲＮＡレベルと比較する工程を含む、配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを測定する方法を提供する。
【００８０】
生物学的試料からｍＲＮＡを単離する過程は、公知の工程を用いて遂行することができ、ＲＮＡレベルは多様な方法で測定することができる。
【００８１】
ｍＲＮＡレベルを測定するための分析方法では、ＲＴ−ＰＣＲ、競争的ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護分析法、ノーザンブロッティング、ＤＮＡチップなどがあるがこれらに制限されるのではない。
【００８２】
前記の検出方法を通じて、正常対照群でのｍＲＮＡ発現量と大腸癌が疑われる患者での大腸癌マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現量を比較し、ｍＲＮＡへの有意な発現量の増加有無を判断して診断する。
【００８３】
ｍＲＮＡ発現レベル測定は、大腸癌マーカーとして使用される遺伝子に特異的なプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ法またはＤＮＡチップを用いることが好ましい。
【００８４】
前記ＲＴ−ＰＣＲは、反応後に電気泳動してバンドパターンとバンドの厚さを確認することで、大腸癌診断マーカーに使用される遺伝子のｍＲＮＡ発現の有無と程度を確認可能で、これを対照群と比較することで、大腸癌発生の有無を簡便に診断することができる。一方、ＤＮＡチップは、前記大腸癌マーカー遺伝子またはその断片にあたる核酸がガラスのような基板に高密度で付着しているＤＮＡチップを用いるもので、試料からｍＲＮＡを分離して、その末端または内部を蛍光物質で標識されたｃＤＮＡプローブを調剤して、ＤＮＡチップに混成化させた後、大腸癌の発病の有無を判読することができる。
【００８５】
本発明のもう一つの側面によると、本発明は、大腸癌診断に必要な情報を提供するために配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群（ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐ）から選択される一つ以上の遺伝子のタンパク質に特異的な抗体を大腸癌が疑われる患者の生物学的試料と接触させて抗原−抗体複合体形成でタンパク質の発現レベルを測定する工程、及び前記測定されたタンパク質の発現レベルを正常対照試料のタンパク質発現レベルと比較する工程とを含む、配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択される一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定する方法を提供する。
【００８６】
生物学的試料からタンパク質を分離する過程は、公知の工程を用いて遂行することができ、タンパク質レベルは多様な方法で測定することができる。
【００８７】
本発明のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを測定する方法において、前記生物学的試料は大腸癌発病によって大腸癌マーカーの遺伝子発現レベルに差異が出る組織、細胞、全血、血清、血漿、唾液、痰、脳脊髄液または尿のような試料を含むが、これに制限されない。
【００８８】
本発明のタンパク質のレベルを測定する方法において、免疫クロマトグラフィーアッセイ、免疫学的ドット(Immunodot)アッセイ、ルミネックス(Luminex)アッセイ、エライザアッセイ、タンパク質マイクロアレイアッセイ、免疫染色法アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織染色、免疫沈澱分析法、補体固定分析法、ＦＡＣＳ、タンパク質チップなどがあるが、これに制限されるのではない。
【００８９】
本発明の前記免疫学的ドットアッセイによるタンパク質発現レベルの測定は、（ａ）生物学的試料をメンブレンにドット(dot)する工程；（ｂ）配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択される１個以上の遺伝子のタンパク質に特異的な抗体を前記ドットされたメンブレンに反応させる工程；及び（ｃ）前記反応させたメンブレンに標識体が接合された２次抗体を添加して発色させる工程によって遂行することができる。前記エライザアッセイは、好ましくは（ａ）配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択される１個以上の遺伝子のタンパク質に特異的な抗体１を固相体に固定化させる工程；（ｂ）前記固相体に固定化された抗体１と大腸癌が疑われる患者の生物学的試料を接触させて抗原−抗体複合体を形成する工程；（ｃ）標識物質が結合した配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択される１個以上の遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的な抗体２を処理して前記複合体と結合させる工程；及び（ｄ）前記標識物質を検出してタンパク質の濃度を測定する工程とを含むサンドイッチエライザアッセイである。前記タンパク質マイクロアレイアッセイは、好ましくは（ａ）配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択される１個以上の遺伝子のタンパク質に特異的なポリクローナル抗体をチップに固定させる工程；（ｂ）前記固定されたポリクローナル抗体１を大腸癌が疑われる患者の生物学的試料と接触させて抗原−抗体複合体を形成する工程；（ｃ）標識物質が結合した配列番号１〜配列番号９の塩基配列を有する遺伝子群から選択される１個以上の遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を処理して前記複合体と結合させる工程；及び（ｄ）前記標識物質を検出してタンパク質の濃度を測定する工程とを含む。
【００９０】
前記分析方法を通じて、正常対照群での抗原−抗体複合体の形成量と大腸癌が疑われる患者での抗原−抗体複合体の形成量を比較することができ、大腸癌マーカー遺伝子でタンパク質への有意な発現量の増加有無を判断して、大腸癌診断に必要な情報を提供することができる。
【００９１】
本明細書において用いられるように、用語「抗原−抗体複合体」というのは、大腸癌マーカータンパク質とそれに特異的な抗体の結合産物を意味し、抗原−抗体複合体の形成量は、検出ラベル(detection label)のシグナルの大きさを通じて定量的に測定可能である。
【００９２】
このような検出ラベルは、酵素、蛍光物質、リガンド、発光物質、微小粒子、レドックス分子及び放射性同位元素からなる群の中から選択することができるが、必ずこれに制限されるのではない。検出ラベルとして酵素が使用される場合に利用可能な酵素には、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼとＧＤＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ、グルコースオキシダーゼとルシフェラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホエノールピルベートカボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ホスホエノールピルベートデカボキシラーゼ、β−ラクタマーゼなどがあり、これらに制限されない。蛍光物質には、フルオレシン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、ピコシアニン、アロピコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレスカミン、ＤＡＰなどがあり、これらに制限されない。リガンドには、ビオチン誘導体などがありこれに制限されない。発光物質には、アクリジニウムエステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼなどがあり、これに制限されない。微小粒子には、金コロイド、有色のラテックスなどがあり、これに制限されない。レドックス分子には、フェロセン、ルテニウム錯体化合物、ビオロゲン、キノン、Ｔｉイオン、Ｃｓイオン、ジイミド、１，４−ベンゾキノン、ハイドロキノン、Ｋ４Ｗ（ＣＮ）８、［Ｏｓ（ｂｐｙ）３］２＋、［ＲＵ（ｂｐｙ）３］２＋、［ＭＯ（ＣＮ）８］４−などが含まれ、これに制限されない。放射性同位元素には、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅなどが含まれ、これに制限されない。
【００９３】
タンパク質の発現レベル測定は、エライザアッセイを用いることが好ましい。本発明でエライザアッセイは、固体支持体に固定化した抗原を認知する標識された抗体を用いる直接的エライザ、固体支持体に固定化した抗原を認知する抗体の複合体で捕捉抗体を認知する標識された抗体を用いる間接的エライザ、固体支持体に固定化した抗体と抗原の複合体で抗原を認知する標識されたまた異なる抗体を用いる直接的サンドイッチエライザ、固体支持体に固定化した抗体と抗原の複合体で抗原を認知するまた異なる抗体と反応させた後この抗体を認知する標識された２次抗体を用いる間接的サンドイッチエライザなど多様なエライザ方法を含む。固体支持体に抗体を固定化させて試料を反応させた後、抗原−抗体複合体の抗原を認知する標識された抗体を固定化させて酵素的に発色させるか、抗原−抗体複合体の抗原を認知する抗体に対して標識された２次抗体を固定化させて酵素的に発色させるサンドイッチエライザ方法によって検出することが好ましい。大腸癌マーカータンパク質と抗体の複合体形成程度を確認して、大腸癌診断に必要な情報を提供することができる。
【００９４】
また、前記大腸癌マーカーに対する一つ以上の抗体を用いたウエスタンブロットアッセイを用いることが好ましい。試料から全タンパク質を分離して、それを電気泳動して、タンパク質を大きさによって分離した後、ニトロセルロースメンブレンに移動させて抗体と反応させる。生成された抗原−抗体複合体の量を標識された抗体を用いて確認する方法で遺伝子の発現によって生成されたタンパク質の量を確認して、大腸癌発病の有無を確認することができる。前記検出方法は、対照群でのマーカー遺伝子の発現量と大腸癌が発病した細胞でのマーカー遺伝子の発現量を調査する方法で成り立つ。ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルは、上記マーカータンパク質の絶対的（例：μｇ／ｍｌ）または相対的（例：シグナルの相対強度）差で現わすことができる。
【００９５】
また、５分以内に析結果が分かる迅速なテストを遂行するために必要な必須要素を含むことを特徴とする免疫クロマトグラフィー診断キットであることが好ましい。免疫クロマトグラフィーストリップを用いた迅速なテストのキットは、マーカータンパク質に対する特異的な抗体を含む。抗体は、各マーカータンパク質に対する特異性及び親和性が高くて他のタンパク質に対する交差反応性がほとんどない抗体で、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または組換え抗体とすることができる。また、迅速なテストのキットは、対照群タンパク質に特異的な抗体を含むことができる。その他、迅速なテストキットは、結合した抗体を検出することができる試薬、例えば、特異的抗体と２次抗体が固定化されたニトロセルロースメンブレン、抗体が結合したビーズに結合したメンブレン、吸収パッドとサンプルパッドなどの異なる物質を含むことができる。
【００９６】
また、複合マーカーを同時に分析するためのルミネックスアッセイは、必要な必須要素を含むことを特徴とする診断キットで遂行することができる。ルミネックスキットは、マーカータンパク質に対する特異的な抗体を含む。抗体は、各マーカータンパク質に対する特異性及び親和性が高くて他のタンパク質に対する交差反応性がほとんどない抗体で、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または組換え抗体とすることができる。また、ルミネックスキットは、対照群タンパク質に特異的な抗体を含むことができる。その他、ルミネックスキットは、結合した抗体を検出することができる試薬、例えば、標識された２次抗体、発色団、酵素（例：抗体と接合したもの）及びその基質または抗体と結合することができる他の物質などを含むことができる。
【００９７】
本発明によるタンパク質の発現レベルを測定するのに有用な診断キットは、複合マーカーを同時に分析するためのタンパク質マイクロアレイを遂行するために必要な必須要素を含むことを特徴とする。マイクロアレイキットは、固体上に結合したマーカータンパク質に対する特異的な抗体を含む。抗体は、各マーカータンパク質に対する特異性及び親和性が高くて他のタンパク質に対する交差反応性がほとんどない抗体で、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または組換え抗体である。また、タンパク質マイクロアレイキットは、対照群タンパク質に特異的な抗体を含むことができる。その他、タンパク質マイクロアレイキットは、結合した抗体を検出することができる試薬、例えば、標識された２次抗体、発色団、酵素（例：抗体と接合したもの）及びその基質または抗体と結合することができる他の物質などを含むことができる。タンパク質マイクロアレイを用いて試料を分析する方法は、試料からタンパク質を分離して、分離したタンパク質をタンパク質チップと混成化させて抗原−抗体複合体を形成させて、それを判読して、タンパク質の存在または発現レベルを確認して、大腸癌診断に必要な情報を提供することができる。
【００９８】
好ましい態様において、タンパク質の発現レベルは、前記大腸癌マーカーに対する一つ以上の抗体を用いた免疫組織染色で測定することができる。正常な大腸上皮組織及び大腸癌が疑われる組織を採取、固定及びパラフィンブロックに包埋し、数μｍ厚さの切片にしてガラススライドに付けた後、これと前記の抗体の一つと反応させる。以後、反応しなかった抗体は洗浄して、前記言及した検出ラベル中の一つで標識して顕微鏡で抗体の標識有無を判読する。
【発明の効果】
【００９９】
本発明の大腸癌診断用マーカーは、大腸癌組織で特異的に過剰発現する遺伝子を用いて、大腸癌を早く容易な診断を促進することにより、大腸癌治療剤のための候補物質をスクリーニングするのに効率的に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、ＲＴ−ＰＣＲによって同定された、正常な組織と大腸癌組織でのＡＺＧＰ１、ＡＧＴ、ＥＧＦＬ６、及びＣＸＣＬ３の発現レベルを確認した電気泳動写真である。
【図２】図２は、ＲＴ−ＰＣＲによって同定された、正常な組織と大腸癌組織でのＣＴＨＲＣ１の発現レベルを確認した電気泳動写真である。
【図３】図３は、ＲＴ−ＰＣＲによって同定された、１０種類の大腸癌細胞株でのＡＧＴ、ＥＧＦＬ６及びＣＸＣＬ３の発現レベルを示した図である。
【図４】図４は、ウェスタンブロットによって同定された、正常な人の血清と大腸癌患者の血清でのＡＧＴ、ＥＧＦＬ６及びＣＸＣＬ３の発現有無を確認した図である。
【図５】図５は、免疫組織染色法によって同定された、正常な粘膜と大腸癌組織でＥＧＦＬ６の発現を比較した写真である。
【図６】図６は、免疫組織染色法によって同定された、正常な粘膜と大腸癌組織でＣＴＨＲＣ１の発現を比較した写真である。
【図７】図７は、免疫組織染色法によって同定された、正常な粘膜と大腸癌組織でＣＸＣＬ−３の発現を比較した写真である。
【図８】図８は、免疫組織染色法によって同定された、正常な粘膜と大腸癌組織でＡＧＴの発現を比較した写真である。
【図９】図９は、免疫学的ドットアッセイの原理を示した図である。
【図１０】図１０は、免疫学的ドットアッセイによって同定された、正常な血清と大腸癌患者の血清でタンパク質の発現を比較した写真である。
【図１１】図１１は、エライザアッセイで確立されたＡＧＴタンパク質の標準曲線を示したグラフである。
【図１２】図１２は、本発明の免疫クロマトグラフィーストリップに関する図である。
【発明を実施するための形態】
【０１０１】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。それらの実施例は、単に本発明を例示するためだけのもので、本発明の範囲がそれら実施例によって制限されると解釈されてはならない。
【０１０２】
実施例１：ＤＮＡチップを用いた大腸癌過剰発現遺伝子の発掘
正常な大腸上皮細胞と比較して大腸癌細胞でのみ特異的に過剰発現する遺伝子を１次的に抽出するためＤＮＡチップ（イルミナ社が販売する４８Ｋヒトマイクロアレイ）を用いて、２，２３０個の遺伝子に対してその発現度を調査した。
【０１０３】
全ｍＲＮＡは、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、正常な大腸上皮細胞及び大腸癌細胞から抽出し、チップ(Experion RNA StdSens, Bio-Rad社)を用いて定量的に分析した。ハイブリダイゼーションのために、イルミナトータルプレップＲＮＡ増幅キット(Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit, Ambion社)を用いて、抽出した全ｍＲＮＡをビオチン化及び増幅した。ｃＤＮＡは、Ｔ７オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて合成し、ビオチン−ＵＤＰを用いてインビトロ転写を実施してビオチン化した。
【０１０４】
作られたｃＤＮＡは、ナノドロップ(NanoDrop)を用いて定量した。正常な大腸上皮細胞及び大腸癌細胞から作られたｃＤＮＡをチップ(Human-6V2,イルミナ社)にハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、非特異的なハイブリダイゼーションを除去するためにバッファー(Illumina Gene Expression System Wash Buffer,イルミナ社)を用いてＤＮＡチップを洗浄し、洗浄したＤＮＡチップはストレプトアビジン−Ｃｙ３(Amersham社)蛍光染色薬で標識した。
【０１０５】
蛍光標識されたＤＮＡチップは、共焦点レーザースキャナ（イルミナ社）を用いてスキャニングして各スポットに存在する蛍光データを得て、ＴＩＦＦ形式のイメージファイルで保存した。ＴＩＦＦイメージファイルを、BeadStudio version3（イルミナ社）を用いて定量し、各スポットの蛍光値を定量した。定量された結果は、プログラム(Avadis Prophetic version 3.3, Strand Genomics社)のクォンタイル機能を用いて正規化した。
【０１０６】
結果として、正常大腸上皮細胞と大腸癌細胞における１，６０１の遺伝子発現レベルが分析され、大腸癌細胞でｍＲＮＡが過剰発現した遺伝子を最終的に選抜した（表５）。
【０１０７】
【表５】
2012506253.tif 000007
【０１０８】
実施例２：組織及び細胞からのｍＲＮＡ分離
ＲＴ−ＰＣＲのために、２０人の大腸癌患者由来の大腸正常上皮細胞組織と大腸癌細胞組織からなる合計４０の組織から、ｍＲＮＡを単離した。
【０１０９】
まず、外科的切除術で摘出された組織は、摘出後直ちに滅菌したリン酸緩衝食塩水中で血液を除去した後、液化窒素で凍結した。以後、グアニジウム法を用いるシングル−ステップのＲＮＡ単離方法で、全ｍＲＮＡを単離した。前記のように単離した全ｍＲＮＡは分光光度計を用いて定量した後、使用前まで−７０℃の冷凍庫に保存した。
【０１１０】
合計１０の大腸癌細胞株（ＤＬＤ−１、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６、ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＮＵＣ１、ＳＮＵＣ２Ａ、ＫＭ１２Ｃ、ＫＭ１２ＳＭ）は、大韓民国ソウル市鍾路区蓮建洞２８番地所在の韓国細胞株バンク（ＫＣＬＢ）から分譲を受けた。
【０１１１】
それぞれの細胞株は、１０％のウシ胎児血清(FBS,Hyclon社)及び１ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン(Sigma社)が添加された、DMEM(Invitrogen社)またはRPMI 1640(Invitrogen社)培地において、５〜６日間培養させた後、グアニジウム法を用いるシングル−ステップのＲＮＡ単離方法で、全ｍＲＮＡを単離した。得られたＲＮＡは、分光光度計を用いて定量し、使用前まで−７０℃の冷凍庫で保存した。
【０１１２】
実施例３：ＲＴ−ＰＣＲを用いた遺伝子発現レベルの比較
前記実施例１の結果選抜された大腸癌特異的過剰発現遺伝子に対して、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【０１１３】
各遺伝子全体のＤＮＡ塩基配列を、ＮＣＢＩのコアヌクレオチドデータベース(Core Nucleotide, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から得た。ＤＮＡ配列に基づき、プライマー３(Primer3)プログラムを用いてそれら遺伝子のプライマー配列をデザインした。これらデザインされたプライマーを用いてＰＣＲを実施し、遺伝子発現レベルを調べた。プライマーの塩基配列を、下記の表６に記載する。
【０１１４】
【表６】
2012506253.tif 000008
【０１１５】
実施例２の組織及び細胞株から単離したｍＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲを通じてｃＤＮＡを構築した。これに関し、ｃＤＮＡの構築は、ｃＤＮＡ合成キット(AccuAcript High Fielity 1st Stand cDNA Synthesis Kit,STRATAGENE)を用いて達成した。
【０１１６】
前記ｃＤＮＡから、ＰＣＲ増幅を指定のプライマーの存在下で実行した（第１サイクル：９４℃、５分；第２〜第３５サイクル：９４℃、４０秒、５６℃、４０秒、７２℃、３０秒；最終伸長(final extension)：７２℃  ７分）。
【０１１７】
その結果、正常な大腸組織細胞と大腸癌組織細胞間の遺伝子発現の差が検出された。実施例１の結果と同様に、配列番号１〜配列番号９の遺伝子が大腸癌細胞株で正常な大腸細胞と比較して発現が増加することを確認された（図１、図２、図３）。
【０１１８】
実施例４：ウエスタンブロットを用いた血清中のタンパク質発現量比較
大腸癌患者と正常な人の血清中のタンパク質レベルをウエスタンブロットを用いて比較した。
【０１１９】
まず、大腸癌患者及び正常な人から得た血液から血清を分離して、煮沸前に同量容積のサンプル緩衝溶液（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ６．８，４％ＳＤＳ，１０％グリセロール，０．００６％ブロモフェノールブルー，１．８％ＢＭＥ）で希釈した。１２％の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いてタンパク質を分離した。分子の大きさ別に分離したタンパク質が含まれた前記電気泳動ゲルは、ニトロセルロースメンブレンと接触させられ、電流が通じるようにして、タンパク質をニトロセルロースメンブレンに移動させた。そこに３％ウシ胎児血清アルブミンが含まれたＴＢＳＴ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１００ｍＭ塩化ナトリウム，０．０５％ツイーン２０）で１時間ブロッキングした後、ＡＧＴ抗体(R&D, 1:2000)を入れて４℃で一晩振盪させながらインキュベートした。以後、余分な抗体をＰＢＳＴで洗浄して除去し、ホースラディッシュペルオキシダーゼが結合した２次抗体(ABCAM, Rabbit polyclonal to Mouse IgG)を加えて、４℃で振盪させながら１時間インキュベートした。以後、ニトロセルロースメンブレンを、ミリポア(MILLIPORE)社のＥＣＬの水溶液Ａ(Luminolとenhancer含有)と水溶液Ｂ(過酸化水素含有）の１：１の混合液に浸し、１分間振盪してインキュベートした。メンブレンの水分を適当に乾燥させた後、フィルムカセットにしっかり付けて暗室にて現像した。ＥＧＦＬ６及びＣＸＣＬ−３も同様の方法で実施した。
その結果、正常な人の場合（１〜３番レーン）ではＡＧＴ、ＥＧＦＬ−６、及びＣＸＣＬ−３タンパク質が検出されないかその量が少ない一方、大腸癌患者の場合（４〜７番レーン）にはＡＧＴ、ＥＧＦＬ−６、及びＣＸＣＬ−３が過剰発現されて前記遺伝子のタンパク質が大腸癌診断のマーカーとして有用に使用できることが実証された（図４）。
【０１２０】
実施例５：免疫染色を用いた組織内のタンパク質発現レベルの比較
正常な大腸上皮組織と大腸癌組織でのタンパク質存在の有無及び発現位置を確認するため、組織スライドを対象に免疫染色を実施した。
【０１２１】
まず、外科的切除術を通じて大腸癌患者から大腸正常な上皮細胞組織と大腸癌細胞組織を摘出してパラフィン包埋ブロックを作った。これをミクロトームを用いて５μｍの厚さに切り、その後ガラススライドに付けて組織スライドを作った。それらを免疫染色法で染色して、顕微鏡で組織内のタンパク質の存在の有無及び位置を確認した。免疫染色に使用した抗体は、抗ＥＧＦＬ−６−抗体(Santa Cruz, 1:2000)、抗ＣＴＨＲＣ１−抗体(SANTA CRUZ, 1:1000)、及び抗ＣＸＣＬ−３−抗体(Aviva, 1:2000)、抗ＡＧＴ−抗体(R&D, 1:2000)である。その結果、免疫組織学的染色で、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１タンパク質は細胞膜と細胞質で発現し、大腸癌の疑いのある組織において、正常な粘膜より強く発現していた。ＣＸＣＬ３の場合、腫瘍の細胞質または核で発現し、ＡＧＴの場合、腫瘍の細胞質と細胞膜で発現し、上皮細胞(endothelial cells)でも発現していた（図５〜図８）。
【０１２２】
実施例６：イムノドット分析(immunodot analysis)による患者血清中のタンパク質測定
ポリクローナル抗体でのイムノドット方法を用いて、正常な人及び大腸癌患者由来の血清で、ＡＧＴ、ＥＦＧＬ６、ＣＸＣＬ３、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＴＨＲＣ１、及びＦＣＧＲ３Ａタンパク質の分泌レベルを比較した。ニトロセルロースメンブレンに、５〜１０倍希釈の血清試料（各患者当たり１０試料）を２μｌずつドットした後、室温で乾燥させて、１％ＢＳＡＴ(bovine serum albumin in Tris-buffered saline)溶液でブロッキングした。ＡＧＴタンパク質に対するポリクローナル抗体(R&D, 1:5000)、ＥＦＧＬ６タンパク質に対するポリクローナル抗体(Santa Cruz, 1:5000)、ＣＸＣＬ３タンパク質に対するポリクローナル抗体(Aviva, 1:5000)、Ｃｏｌ５Ａ２タンパク質に対するポリクローナル抗体(1:5000)、ＣＴＨＲＣ１タンパク質に対するポリクローナル抗体(SantaCruz, 1:1000)、ＦＣＧＲ３Ａタンパク質に対するポリクローナル抗体(1:5000)を処理した後、２次抗体接合ホースラディッシュペルオキシダーゼ(1:10000)を加えてＤＡＢ溶液(0.5mg/ml, diaminobenzidine in PBT)で発色させた。スキャンして得られた蛍光データを分析した（図９、図１０）。正常な血清より大腸癌の血清において、より多量に発現していることが分かり、それら遺伝子を大腸癌診断及び予後診断に有用なマーカーとして使用可能であることを実証している。
【０１２３】
実施例７：エライザシステムの確立及びそれを用いた大腸癌診断
７−１．エライザシステム(ELISA system)の確立
ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質に対するモノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）を、０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）を用いて１μｇ／ｍｌの濃度に希釈して、９６穴マイクロタイタープレートに１００μｌずつ分注した。４℃でオーバーナイトのインキュベーションをした後、モノクローナル抗体でコーティングされたマイクロタイタープレートを、０．０５％ツイーン２０を含んだＰＢＳ溶液（ＰＢＳ−Ｔ）を用いて３回洗浄した。１％ＢＳＡ溶液で室温で２時間ブロッキングし後、ＰＢＳ−Ｔ溶液を用いて３回洗浄した。配列番号１〜配列番号９のタンパク質を希釈して１００μｌをそれぞれ入れ、室温で２時間インキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔ溶液を用いて３回洗浄した。ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質に対するポリクローナル抗体（１：２０００希釈）を１００μｌずつ希釈した後、２時間インキュベートさせて洗浄した。２０００倍に希釈したホースラディッシュペルオキシアーゼが接合した２次抗体１００μｌを入れた後、室温で１時間インキュベートさせ後、３回洗浄して、最後にＴＭＢ溶液を用いて発色させる。発色した試料の吸光度は、４５０ｎｍ波長でELISA reader(Molecular Device,Sunnyvale, CA,米国)を用いて測定した（図１１）。
【０１２４】
７−２．エライザシステムによる患者血清中のタンパク質の測定
実施例７−１で確立したエライザシステムを用いて、患者の血清中のＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質濃度を測定した。正常な人および大腸癌患者の血清を５倍ずつ希釈した後、血清中のＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質の濃度を計算した。
【０１２５】
実施例８：キット製造及び血清中のタンパク質レベルの測定
８−１．サンドイッチ型エライザキット
次の構成要素を用いて、ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質濃度測定用キットを製造した；
Ａ．固相型抗体：抗体が吸着したマイクロタイタープレートとして、ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質に対するポリクローナル抗体１００μｌをマイクロタイタープレートに加えた後、４℃でオーバーナイトでインキュベーションし、固相体表面にアルブミンを吸着させた。
Ｂ．検出抗体：ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質に対するモノクローナル抗体
Ｃ．酵素結合抗体：ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が結合した２次抗体溶液
Ｄ．血清希釈溶液
Ｅ．基質液（ＴＭＢ）
Ｆ．洗浄液：０．０５％ツイーンを含んだリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）
Ｇ．標準溶液：ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質標準液。
【０１２６】
前記キットを用いて、患者から得られた血清は、ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２またはＳ１００Ｐのタンパク質のレベルについて、次のように検査した。
【０１２７】
前記Ａの固相型抗体に、各血清試料を血清希釈溶液（Ｄ）を適切に希釈してウェル当たり１００μｌずつ加えた後、Ｂ、Ｃ、Ｅの構成要素を用いて実施例８−１で製造したサンドイッチ型エライザキットを用いて、ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質濃度を検査した。
【０１２８】
８−２：免疫クロマトグラフィーキット
８−２−１．免疫クロマトグラフィーストリップの製造
１）抗体−金接合体(Ab-gold conjugate)製造
抗体を金コロイド粒子(colloidal gold particles)溶液に１５μｇ／ｍｌ加えた後、室温で２時間攪拌させながらインキュベートした。１０％ＢＳＡを１／１０ｖｏｌ．加えて１％濃度になるようにした後、再び１時間インキュベートさせた。１２，０００ｒｐｍで４０分間遠心分離して上澄み液を捨て、再び２ｍＭ  ホウ酸緩衝液を加えて抗体−金接合体(Ab-gold conjugate)溶液を洗浄した。この洗浄工程は、３回繰り返された。その後、１％ＢＳＡを含んだ２ｍＭホウ酸緩衝液を金の溶液約１／１０体積を加えて懸濁させた。紫外分光光度計を用いて、５３０ｎｍで吸光度を測定した後、吸光度が３．００になるように希釈した。
【０１２９】
２）サンプルパッド
試験しようとする試料を吸収するための部分として、セルロース素材のものを使用する。前記サンプルパッドは、試料を吸収することができるどのような素材でも代替可能である。
【０１３０】
３）グラスファイバー（ＧＦ）メンブレン
スクロースを含んだ２０ｍＭホウ酸緩衝液で前処理する。
【０１３１】
４）ニトロセルロース（ＮＣ）メンブレン及びライン処理
ニトロセルロースメンブレン(Millipore社)を適当な大きさ（０．７ｃｍ×５ｃｍ）にカットした。プラスチックバックキング(plastic backing)下端から約３．４ｃｍになる地点に実質的な対照ラインとしてヤギ抗−ヒツジＩｇＧ(goat anti-sheep IgG)を適用し、２．７ｃｍになる地点に実質的な検出ラインとしてＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質に対するモノクローナル抗体を適用した。
【０１３２】
５）吸収パッド
免疫反応後、未処理の物質を吸収して、それによって分析物質を含んだ試料溶液が毛細管現象によって移動するようにするセルロースメンブレンを使用する。
【０１３３】
６）接着用プラスチックバックキング
図１２に示すように、接着用プラスチックバックキング上に、サンプルパッド、ＧＦメンブレン、ＮＣメンブレン及び吸収パッドを、物質が毛細管現象によって連続的に移動することができるように重ね合わせ、免疫クロマトグラフィーストリップを提供する。
【０１３４】
８−２−２．結果判定法
サンプルパッドに６０〜７０μｌの試料（例えば、試料は血清と溶出バッファーの比を１：５）を加えて、３〜５分後に対照ラインと結果ラインの発色の有無及び発色濃度を観察した。陽性試料の場合、対照ラインと結果ラインで赤色の着色ラインを観察することができ、陰性試料の場合は対照ラインでのみ赤色の着色ラインを見ることができた。
【０１３５】
８−３ルミネックスキット
８−３−１．ルミネックスキット構築
ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質に対するポリクローナル抗体をビーズに接合した。試料を希釈して１００μｌを入れ、室温で２時間の間インキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔ溶液を用いて３回洗浄した。配列番号１〜配列番号９のタンパク質に対応するモノクローナル抗体を１００μｌずつ希釈した後、２時間インキュベートした。２０００倍希釈されたＰＥ(phycoerythrin)が接合した２次抗体１００μｌを入れた後、室温で１時間インキュベートした。ルミネックス機器で測定する前に、３回洗浄した。標準曲線を得るために、蛍光強度は、濃度に対してプロットした。
【０１３６】
８−３−２．サンドイッチ型ルミネックスキット
次の構成要素を用いて、ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質濃度測定用キットを構築した。
【０１３７】
Ａ．固相型抗体：ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質に対するポリクローナル抗体が吸着した蛍光ビーズ
Ｂ．検出抗体：ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質に対するモノクローナル抗体
Ｃ．酵素結合抗体：ペルオキシダーゼが結合した２次抗体
Ｄ．血清希釈溶液
Ｆ．洗浄液：０．０５％ツイーン含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）
Ｇ．標準溶液：ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質の標準溶液
【０１３８】
前記キットを用いて、癌患者の血清中のタンパク質検出反応を次のように検査する。成分Ａの固相型抗体に、希釈溶液（Ｄ）中の血清試料を適切に希釈してウェル当たり１００μｌずつ加え、Ｂ、Ｃ、Ｅの構成要素を用いて、ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質を分析した。
【０１３９】
８−４．タンパク質マイクロアレイキット
８−４−１．タンパク質マイクロアレイシステム
ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質に対するモノクローナル抗体で、Proteagenのウェルチップ(Well chip)をコーティングした。チップをＢＳＡ緩衝液でブロッキングした後、血清試料を希釈して１００μｌとともに、室温で１時間の間インキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔ溶液を用いて３回洗浄した。１００μｌのＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質に対する希釈モノクローナル抗体を、３７℃で１時間インキュベートさせて洗浄した。２０００倍に希釈したＣｙ３が接合した２次抗体１００μｌをとともに、室温で０．５時間インキュベートした後、５３２ｎｍで蛍光物質の発光レベルを測定する前に、３回洗浄した。標準曲線を得るために、蛍光強度は、濃度に対してプロットした。このように確立したタンパク質マイクロアレイシステムを用いて、患者の血清中のＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２またはＳ１００Ｐタンパク質濃度の決定に使用された。
【０１４０】
８−４−２．サンドイッチ型タンパク質マイクロアレイキット
次の構成要素を用いて、ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質濃度測定用キットを構築した。
【０１４１】
Ａ．固相型抗体：ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質に対するポリクローナル抗体でコーティングしたスライド
Ｂ．検出抗体：ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質に対するモノクローナル抗体
Ｃ．酵素結合抗体：Ｃｙ３が結合した２次抗体
Ｄ．血清希釈緩衝液
Ｆ．洗浄液：０．０５％ツイーン含有リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）
Ｇ．標準溶液：ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質の標準溶液。
【０１４２】
前記キットを用いて、癌患者中のＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質の血清希釈溶液を次のように分析した。成分Ａの固相型抗体に、血清希釈溶液（Ｄ）中の血清試料を適切に希釈してウェル当たり１００μｌずつ加え、Ｂ、Ｃ、及びＥの構成要素を用いて実施例８−４−１のサンドイッチ型測定方法と同様の方法で、ＡＺＧＰ１、ＥＧＦＬ６、ＣＴＨＲＣ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ−６、ＡＧＴ、ＦＣＧＲ３Ａ、Ｃｏｌ５Ａ２及びＳ１００Ｐタンパク質濃度を分析した。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
以上、説明したように、本発明よると大腸癌を早期に正確に診断して、大腸癌の転移及び予後を判断することができる診断マーカーを提供することで、大腸癌の治療及び予後管理に有用な資料を提供する。
【０１４４】
また、前記大腸癌診断マーカーは、大腸癌に特異的な遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質発現レベルを簡易かつ速かに測定することができるので、大腸癌特異的抗癌剤開発の研究にも使用することができる。
【０１４５】
本発明の好ましい実施例は、例示的目的のために記載したものに過ぎず、当業者は添付の請求項に記載された本発明の範囲及び思想から脱することなしに、多様な改変、付加及び置換が可能であるということを認知するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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