(57)【要約】  表面上における複数の生体分子のパターニング方法を開示する。本方法は、ポリマーペンにインクを付ける工程（生体分子を含む選択されたインクでチップにインクを付ける）、及びポリマーペンリソグラフィー技術を用いて生体分子を表面に転写する工程を含む。表面上に複数のパターニングされた生体分子の使用方法をも開示する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも2種の異なる生体分子を基板表面上に同時にプリントする方法であって、
第1の生体分子と第1の担体とを含む第1のインクを含んでなる第1の複数のウェル及び第2の生体分子と第2の担体とを含む第2のインクを含んでなる第2の複数のウェルを有する対応インクウェルアレイ中にチップアレイを浸漬させることによって、前記チップアレイの第1の複数のチップが、前記第1の複数のウェル中に浸漬されて前記第1のインクで被覆され、かつ前記チップアレイの第2の複数のチップが前記第2の複数のウェル中に浸漬されて前記第2のインクで被覆されるように、前記少なくとも2種のインクで前記チップアレイを被覆する工程
（非カンチレバー型チップを含んでなる前記チップアレイのチップは、それぞれ約1μm未満の曲率半径を有し、かつ圧縮性エラストマーポリマーを含む）；
第1の接触時間及び第1の接触圧力にて前記基板表面を前記アレイの前記被覆チップの全て又は実質的に全てと接触させて、前記基板表面上に前記第1のインクを第1セットの位置に沈着させて第1セットの表示を形成し、かつ前記基板表面上に前記第2のインクを第2セットの位置に沈着させて第2セットの表示を形成する工程（前記第1セット及び第2セットの表示は全てサイズが実質的に均一である）
を含む方法。
【請求項２】
インクジェットプリンターを用いてインクの液滴を前記ウェル中に噴出させることによって、前記第1のインクで前記第1の複数のウェルを少なくとも部分的に充填し、かつ前記第2のインクで前記第2の複数のウェルを少なくとも部分的に充填する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記インクジェットプリンターが電気流体力学的インクジェットプリンターである、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記第1セット及び第2セットの全ての前記表示のインク密度が実質的に均一である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記インクウェルが、前記チップアレイの前記チップのチップ先端間隔、チップ寸法、又は両方にそれぞれ対応するウェル間間隔、ウェル寸法、又は両方を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記第1の複数のチップの少なくとも1つの先端と、前記第2の複数のチップの少なくとも1つの先端が、200μm未満の距離によって隔てられている、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記第1セットの1つの表示と、前記第2セットの1つの表示が、100μm未満の距離によって前記表面上で隔てられている、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記第1の生体分子、前記第2の生体分子、又は前記第1の生体分子と前記第2の生体分子の各々が、抗体、抗原、タンパク質、酵素、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、オリゴ糖、多糖、又はこれらの混合物を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記第1のインクが前記第2の複数のチップに混入しなか又は実質的に混入せずに前記チップアレイを被覆する工程を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第2のインクが混入しないか又は実質的に混入せずに前記第1セットの表示を形成する工程を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第1のインク、前記第2のインク、又は前記第1のインクと前記第2のインクの各々が、グリセロール、ポリエチレングリコール、又はこれらの混合物を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記インクウェルアレイの少なくともウェル側面がフッ素化表面を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記フッ素化表面がフッ化シランを含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記フッ化シランが、1H,1H,2H,2H-ペルフルオロデシルトリクロロシランを含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記第1セットの表示、前記第2セットの表示、又は両方を1μm未満のフィーチャーサイズで形成する工程を含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第1の生体分子、前記第2の生体分子、又は両方がさらに標識を含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
前記標識が蛍光標識である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記蛍光標識が、フルオレッセイン色素、6-((7-アミノ-4-メチルクマリン-3-アセチル)アミノ)ヘキサン酸、5(及び6)-カルボキシ-X-ローダミン、ローダミン色素、ベンゾフェノキサジン、シアニン2(Cy2)色素、シアニン3(Cy3)色素、シアニン3.5(Cy3.5)色素、シアニン5(Cy5)色素、シアニン5.5(Cy5.5)色素、シアニン7(Cy7)色素、シアニン9(Cy9)色素、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレッセイン、5(6)-カルボキシ-テトラメチルローダミン、及びこれらの組合せから成る群より選択される、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記第1の生体分子が第1の標識を含み、かつ前記第2の生体分子が前記第1の標識と異なる第2の標識を含む、請求項16〜18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
前記各チップが、約0.2μm未満の曲率半径を有する、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
前記チップアレイの前記圧縮性エラストマーポリマーが、約10MPa〜約300MPaの範囲の圧縮弾性率を有する、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
前記圧縮性エラストマーポリマーが、ポリジメチルシロキサン(PMDS)を含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
前記PMDSが、トリメチルシロキシ末端ビニルメチルシロキサン-ジメチルシロキサンコポリマー、メチルヒドロシロキサン-ジメチルシロキサンコポリマー、又はこれらの混合物を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記チップアレイの各チップが同一形状である、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
前記チップ形状がピラミッド状である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記ウェルがピラミッド状である、請求項24又は25に記載の方法。
【請求項２７】
前記チップアレイ、前記基板表面、又は両方を相互に関して移動させる工程、及び前記第1の接触時間と同一又は異なる第2の接触時間及び前記第1の接触圧力と同一又は異なる接触圧力にて前記接触工程を繰り返す工程をさらに含む、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２８】
前記接触工程中の前記チップアレイと前記基板との間の横方向の移動を制限して、ドットを含む表示を形成する工程を含む、請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
前記接触時間、前記接触圧力、又は両方を制御して、約10nm〜約500μmの範囲の直径を有するドットを形成する工程を含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記チップアレイの各チップを同時に前記基板表面と接触させる工程を含む、請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３１】
前記チップアレイがさらに第3の複数のチップを含み、前記インクウェルアレイが、第3の生体分子と第3の担体とを含む第3のインクを含んでなる第3の複数のウェルを含み、かつ前記浸漬工程中に前記第3の複数のチップを被覆する工程及び前記接触工程中に前記第3の生体分子を前記基板表面上にプリントして、第3セットの位置に第3セットの表示を形成する工程をさらに含む（このとき前記第3セットの全ての表示は、前記第1セットの表示及び前記第2セットの表示とサイズが実質的に均一である）、請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第3セットの全ての表示が、前記第1セットの表示又は前記第2セットの表示と生体分子密度が実質的に均一である、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記第3セットの全ての表示が、前記第1セットの表示及び前記第2セットの表示と生体分子密度が実質的に均一である、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
前記チップアレイを入射光で背後から照らして、チップの内部表面から入射光の内部反射を引き起こす工程；
前記チップアレイのチップと前記基板表面を一緒に、z-軸に沿って、サブセットのチップと前記基板表面との間の接触点まで導く工程（接触は、前記基板表面と接触している前記サブセットのチップからの反射光の強度増加によって示され、一方、他のチップからの反射光の強度に変化がないことは非接触チップを示す）；及び
前記チップの内部表面からの反射光の強度の差異に応じて、前記チップアレイ及び前記基板表面の一方又は両方を他方に対して傾けて、前記基板表面と前記非接触チップとの間の接触を達成する工程（ここで、前記傾ける工程は、x-軸、y-軸及び／又はz-軸に沿って1回以上行なわれる）
によって、前記チップアレイのチップを前記基板表面に対して水平にする工程をさらに含む、請求項1〜33のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３５】
前記チップアレイを入射光で背後から照らして、チップの内部表面から入射光の内部反射を引き起こす工程；
前記チップアレイのチップと前記基板表面を一緒に、z-軸に沿って導いて、前記チップアレイのチップと前記基板表面とを接触させる工程；
さらに前記チップアレイ及び前記基板の一方又は両方を他方に向けてz-軸に沿って移動させて、サブセットのチップを圧縮する工程（これによって、該チップからの反射光の強度が、該チップの前記基板表面に対する圧縮度の関数として増加する）；及び
前記チップの内部表面からの反射光の強度の差異に応じて、前記チップアレイ及び前記基板表面の一方又は両方を他方に対して傾けて、前記基板表面とチップとの間の実質的に均一の接触を達成する工程（ここで、前記傾ける工程は、x-軸、y-軸及び／又はz-軸に沿って1回以上行なわれる）
によって、前記チップアレイのチップを前記基板表面に対して水平にする工程をさらに含む、請求項1〜33のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３６】
基板内にランドで隔てられた一連の凹所を含むマスターを形成する工程；
プレポリマーと、必要に応じて架橋剤とを含むプレポリマー混合物で前記凹所を充填し、かつ前記ランドを被覆する工程；
この充填かつ被覆された基板を平面ガラス層で被覆する工程；
前記プレポリマー混合物を硬化させて、前記チップアレイと共通基板とを含むポリマー構造を形成する工程；
この硬化したポリマー構造を前記マスターから除去する工程；及び
前記チップアレイ用のインクウェルアレイとして使用するための1種以上のインクで前記マスターの前記凹所を少なくとも部分的に充填する工程
をさらに含む、請求項1〜35のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３７】
凹所とランドとを有する型を製作する工程；この型でチップアレイを形成する工程；この形成されたチップアレイを前記型から除去する工程；この型の前記凹所を少なくとも部分的に1種以上のインクで充填してインクウェルアレイを形成する工程；及び次に前記チップアレイを前記インクウェルアレイ中に浸漬させることによって、前記チップアレイを前記インクで被覆する工程をさらに含む、請求項1〜35のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３８】
前記凹所及びランドを含む前記マスターの少なくとも表面をフッ素化物質で処理する工程をさらに含む、請求項36又は37に記載の方法。
【請求項３９】
前記マスターを前記プレポリマー混合物で充填する工程の前に前記処理工程を行なうことを含む、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記マスターを前記プレポリマー混合物で充填する工程の後に前記処理工程を行なうことを含む、請求項38に記載の方法。
【請求項４１】
前記フッ素化物質が、1H,1H,2H,2H-ペルフルオロデシルトリクロロシランを含む、請求項38〜40のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４２】
基板と、
第1の生体分子を含む、前記基板表面上の第1セットの表示と、
第2の生体分子を含む、前記基板表面上の第2セットの表示と
を含む物品であって、
前記第1セット及び前記第2セットの全ての表示は、サイズが実質的に均一であり、かつ前記第1セットの1つの表示と前記第2セットの1つの表示は、前記表面上で200μm未満の距離によって隔てられている、前記物品。
【請求項４３】
前記第1セット及び第2セットの全ての表示の密度が実質的に均一である、請求項42に記載の物品。
【請求項４４】
前記第1セットの1つの表示と前記第2セットの1つの表示が、前記表面上で100μm未満の距離によって隔てられている、請求項42又は43に記載の物品。
【請求項４５】
前記第1セット及び前記第2セットの全ての表示が、100μm未満のフィーチャーサイズを有する、請求項42〜44のいずれか1項に記載の物品。
【請求項４６】
前記第1の生体分子、前記第2の生体分子、又は前記第1の生体分子と前記第2の生体分子の各々が、抗体、抗原、タンパク質、酵素、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、オリゴ糖、多糖、又はこれらの混合物を含む、請求項42〜45のいずれか1項に記載の物品。
【請求項４７】
前記基板表面上に、第3の生体分子を含む第3セットの表示をさらに含み、このとき前記第3セットの全ての表示及び前記第1セットの全ての表示は、サイズが実質的に均一である、請求項42〜46のいずれか1項に記載の物品。
【請求項４８】
前記第3セットの全ての表示及び前記第1セットの全ての表示の密度が実質的に均一である、請求項47に記載の物品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願との相互参照）
この出願は、2009年4月24日に出願された米国仮特許出願第61/172,481号の利益を主張する。この米国仮特許出願の全内容を参照によって本明細書で援用する。
【０００２】
（米国政府の権利の陳述）
この発明は、国立科学基金認可第EEC-0647560号、DAPRA認可第N66001-08-102044号、及び国立衛生研究所(NIH)/国立癌研究所/ナノテクノロジーによる癌革新的医療推進センター(Centers of Cancer Nanotechnology Excellence)(NCI/CCNE)認可第1U54CA119341号のもとで米国政府の支援によって行なわれた。米国政府は、この発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
低コストかつ高処理量様式で生体分子(例えば、タンパク質)のマイクロアレイ及びナノアレイを製作する能力は、薬物スクリーニング、医療診断、バイオセンサー、及び基礎的生物学研究といった種々多様な応用にとって重要である(1〜3)。このようなマイクロアレイの製造への伝統的アプローチには、フォトリソグラフィー及びインクジェットプリンティングがある。最近、研究はタンパク質パターンのナノメーターレジーム(regime)への小型化に焦点を合わせている。高密度のタンパク質ナノアレイは検出感度を高め、かつワンチップでの数百万のバイオマーカーのスクリーニングを可能にするからである(4)。タンパク質のナノパターンは、基礎的生体プロセス(5)、例えば細胞接着(6、7)等に対する洞察にもつながり得る。マイクロコンタクトプリンティング(8、9)、ナノインプリントリソグラフィー(10)及び特定の走査プローブリソグラフィー等(4、11、12)といったタンパク質構造の小型化を目標とする多くの新技術の中で、ディップペンナノリソグラフィー(DPN)(13)は唯一の「直接書き込み(direct write)」法であり、極端に複雑な生理活性タンパク質パターンをナノスケールで作成することを可能にする(14、15)。Lee et al.(7、16)は、最初に、原子間力顕微鏡(AFM)のカンチレバーを用いて、DPNで表面上に1つのタンパク質(又は2つの連続ステップで2つの異なるタンパク質)のナノアレイを作成できることを示した。一次元(1D)(17、18)及び二次元(2D)(19、20)の平行カンチレバーアレイを使用するか又はフラットスタンプ法(21)によって、この連続書き込みプロセスの処理量を増やすことができる。重要なことに、DPNの「直接書き込み」特性は、インクの相互混入(cross contamination)を最小限にする。
【０００４】
大きい面積にわたってDPNで異なる種類のタンパク質をパターニングすることには、いくつかの理由のため課題が残っている。第一に、Si及びSi3N4カンチレバーの不透明性は、不可能ではないにしても、インクウェルを用いて複数のタンパク質にインクで付けるための2Dカンチレバーアレイを整列させるのを困難にする。第二に、異なるタンパク質の拡散速度は、それらの分子量、流体力学半径、及び他の因子の差異のため変化し得る。このような変化は、たとえチップ-基板の接触時間を一定に保ったとしても、異なるタンパク質間で不均一なフィーチャー(feature)サイズをもたらし得る。第三に、タンパク質の拡散速度は典型的に低いので、光検出目的に有用なサブミクロン又はミクロンスケールのタンパク質パターンの製作は、時間のかかるプロセスである。第四に、大規模な平行DPN実験に必要な2D Si3N4カンチレバーアレイは高価かつ脆弱である。従って、再現性のあるやり方で大きい面積にわたって複数の生体分子のパターニング沈着を可能にする方法が要望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
（概要）
本開示は、ポリマーチップアレイを用いて基板表面上に生体分子をプリントする方法に関する。さらに詳しくは、本明細書では、それぞれ約1μm未満の曲率半径を有する複数の非カンチレバー型(non-cantilevered)チップを含む圧縮性ポリマーを含んでなるチップアレイを用いて基板表面上に複数の生体分子をプリントする方法、及び2種以上の生体分子の表示(indicia)を並行して形成する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従って、一態様において、本明細書では、少なくとも2種の異なる生体分子を基板表面上に同時にプリントする方法であって、第1の生体分子と第1の担体とを含む第1のインクを含んでなる第1の複数のウェル及び第2の生体分子と第2の担体とを含む第2のインクを含んでなる第2の複数のウェルを有する対応インクウェルアレイ中にチップアレイを浸漬させることによって、チップアレイの第1の複数のチップが、第1の複数のウェル中に浸漬されて第1のインクで被覆され、かつチップアレイの第2の複数のチップが第2の複数のウェル中に浸漬されて第2のインクで被覆されるように、少なくとも2種のインクでチップアレイを被覆する工程（非カンチレバー型チップを含んでなるチップアレイのチップは、それぞれ約1μm未満の曲率半径を有し、かつ圧縮性エラストマーポリマーを含む）；第1の接触時間及び第1の接触圧力にて基板表面をアレイの被覆チップの全て又は実質的に全てと接触させて、基板表面上に第1のインクを第1セットの位置に沈着させて第1セットの表示を形成し、かつ基板表面上に第2のインクを第2セットの位置に沈着させて第2セットの表示を形成する工程（第1セット及び第2セットの表示は全てサイズが実質的に均一である）を含む方法を提供する。
【０００７】
種々の態様において、チップアレイはさらに第3の複数のチップを含み、インクウェルアレイは、第3の生体分子と第3の担体とを含む第3のインクを含んでなる第3の複数のウェルを含み、かつ前記浸漬工程中に第3の複数のチップを被覆する工程及び前記接触工程中に第3の生体分子を基板表面上にプリントして、第3セットの位置に第3セットの表示を形成する工程をさらに含み、このとき第3セットの全ての表示は、第1セットの表示及び第2セットの表示とサイズが実質的に均一である。一部の特定実施形態では、第3セットの全ての表示は、第1セットの表示又は第2セットの表示と生体分子密度が実質的に均一である。第3セットの全ての表示が、第1セットの表示及び第2セットの表示と生体分子密度が実質的に均一であり得る。
場合によっては、チップアレイの各チップを同時に基板表面と接触させる。
場合によっては、表示は、インク密度も実質的に均一である。種々の場合に、各チップは約0.2μm未満の曲率半径を有する。各チップがピラミッド状などの同一形状であってよい。各ウェルがピラミッド状などの同一形状であってよい。チップアレイの圧縮性エラストマーポリマーは、約10MPa〜約300MPaの範囲の圧縮弾性率を有する。場合によっては、圧縮性エラストマーポリマーがポリメチルシロキサン(PMDS)を含み、特定の場合には、PMDSがトリメチルシロキシ末端ビニルメチルシロキサン-ジメチルシロキサンコポリマー、メチルヒドロシロキサン-ジメチルシロキサンコポリマー、又はこれらの混合物を含む。
【０００８】
一部の実施形態では、インクウェルは、それぞれチップアレイのチップのチップ先端間隔、チップ寸法、又は両方に対応するウェル間間隔、ウェル寸法、又は両方を有する。一部の特定の場合には、第1の複数のチップの少なくとも1つのチップ先端と、第2の複数のチップの少なくとも1つのチップ先端は、200μm未満、又は100μm未満の距離によって隔てられる。種々の場合に、本方法は、第1のインクを第2の複数のチップに混入させず又は実質的に混入させずにチップアレイを被覆する工程を含む。種々の場合に、本方法は、第1セットの表示、第2セットの表示、又は両方を1μm未満のフィーチャーサイズで形成する工程を含む。
種々の実施形態において、本明細書で開示する方法は、インクジェットプリンターを用いてインクの液滴をウェル中に噴出させることによって、第1のインクで第1の複数のウェルを少なくとも部分的に充填し、かつ第2のインクで第2の複数のウェルを少なくとも部分的に充填する工程をさらに含む。場合によっては、インクジェットプリンターが電気流体力学的インクジェットプリンターである。種々の場合に、インクウェルアレイの少なくともウェル側面がフッ素化表面を含む。一部の特定の場合には、フッ素化表面がフッ化シランを含む。フッ化シランは、1H,1H,2H,2H-ペルフルオロデシルトリクロロシランを含み得る。
【０００９】
生体分子は、抗体、抗原、タンパク質、酵素、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、オリゴ糖、多糖、又はこれらの混合物を含み得る。第1のインク、第2のインク、又は第1のインクと第2のインクの各々が、グリセロール、ポリエチレングリコール、又はこれらの混合物を含み得る。場合によっては、第1の生体、第2の生体、又は両方がさらに標識を含む。種々の場合に、第1及び第2の生体がそれぞれ異なる標識を含む。標識が蛍光標識であってよい。蛍光標識を、フルオレッセイン色素、6-((7-アミノ-4-メチルクマリン-3-アセチル)アミノ)ヘキサン酸、5(及び6)-カルボキシ-X-ローダミン、ローダミン色素、ベンゾフェノキサジン、シアニン2(Cy2)色素、シアニン3(Cy3)色素、シアニン3.5(Cy3.5)色素、シアニン5(Cy5)色素、シアニン5.5(Cy5.5)色素、シアニン7(Cy7)色素、シアニン9(Cy9)色素、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレッセイン、5(6)-カルボキシ-テトラメチルローダミン、及びこれらの組合せから成る群より選択することができる。
【００１０】
一部の実施形態では、本方法は、チップアレイ、基板表面、又は両方を相互に関して移動させる工程、及び第1の接触時間と同一又は異なる第2の接触時間及び第1の接触圧力と同一又は異なる接触圧力にて接触工程を繰り返す工程をさらに含む。場合によっては、本方法は、接触工程中のチップアレイと基板との間の横方向の移動を制限して、ドットを含む表示を形成する工程をさらに含む。一部の特定実施形態では、本発明は、接触時間、接触圧力、又は両方を制御して約10nm〜約500μmの範囲の直径を有するドットを形成する工程を含む。
種々の実施形態において、本明細書で開示する方法は、チップアレイを入射光で背後から照らして、チップの内部表面から入射光の内部反射を引き起こす工程；チップアレイのチップと基板表面を一緒に、z-軸に沿って、サブセットのチップと基板表面との間の接触点まで導く工程（接触は、基板表面と接触しているサブセットのチップからの反射光の強度増加によって示され、一方、他のチップからの反射光の強度に変化がないことは非接触チップを示す）；及びチップの内部表面からの反射光の強度の差異に応じて、チップアレイ及び基板表面の一方又は両方を他方に対して傾けて、基板表面と非接触チップとの間の接触を達成する工程（ここで、前記傾ける工程は、x-軸、y-軸及び／又はz-軸に沿って1回以上行なわれる）によって、チップアレイのチップを基板表面に対して水平にする工程をさらに含む。
【００１１】
一部の実施形態では、本明細書で開示する方法は、チップアレイを入射光で背後から照らして、チップの内部表面から入射光の内部反射を引き起こす工程；チップアレイのチップと基板表面を一緒に、z-軸に沿って導いて、チップアレイのチップと基板表面とを接触させる工程；さらにチップアレイ及び基板の一方又は両方を他方に向けてz-軸に沿って移動させて、サブセットのチップを圧縮する工程（これによって、チップからの反射光の強度が、チップの基板表面に対する圧縮度の関数として増加する）；及びチップの内部表面からの反射光の強度の差異に応じて、チップアレイ及び基板表面の一方又は両方を他方に対して傾けて、基板表面とチップとの間の実質的に均一の接触を達成する工程（ここで、前記傾ける工程は、x-軸、y-軸及び／又はz-軸に沿って1回以上行なわれる）によっって、チップアレイのチップを基板表面に対して水平にする工程をさらに含む。
種々の実施形態では、本方法は、基板内にランドで隔てられた一連の凹所を含むマスターを形成する工程；プレポリマーと、必要に応じて架橋剤とを含むプレポリマー混合物で凹所を充填し、かつランドを被覆する工程；充填かつ被覆された基板を平面ガラス層で被覆する工程；プレポリマー混合物を硬化させて、チップアレイと共通基板とを含むポリマー構造を形成する工程；硬化したポリマー構造をマスターから除去する工程；及びチップアレイ用のインクウェルアレイとして使用するための1種以上のインクでマスターの凹所を少なくとも部分的に充填する工程をさらに含む。マスターの表面をフッ化シラン(例えば、1H,1H,2H,2H-ペルフルオロデシルトリクロロシラン)等のフッ素化物質で処理することができる。この処理はマスターをプレポリマー混合物で充填する前か後に行なうことができる。
一部の実施形態では、本方法は、凹所とランドとを有する型を製作する工程；この型でチップアレイを形成する工程；この形成されたチップアレイを型から除去する工程；この型の凹所を少なくとも部分的に1種以上のインクで充填してインクウェルアレイを形成する工程；及び次にチップアレイをインクウェルアレイ中に浸漬させることによって、チップアレイを前記インクで被覆する工程をさらに含む。マスターの表面をフッ化シラン(例えば1H,1H,2H,2H-ペルフルオロデシルトリクロロシラン)等のフッ素化物質で処理することができる。この処理はマスターをプレポリマー混合物で充填する前か後に行なうことができる。
【００１２】
別の態様では、本明細書では、基板と、第1の生体分子を含む、基板表面上の第1セットの表示と、第2の生体分子を含む、基板表面上の第2セットの表示とを含む物品であって、第1セットの表示と第2セットの表示は全てサイズが実質的に均一であり、かつ第1セットの1つの表示と第2セットの1つの表示は、表面上で200μm未満の距離によって隔てられている、物品を提供する。場合によっては、第1セット及び第2セットの全ての表示の密度が実質的に均一である。種々の場合、第1セットの1つの表示と第2セットの1つの表示は、表面上で100μm未満の距離によって隔てられている。場合によっては、第1セット及び第2セットの全ての表示が、100μm未満のフィーチャーサイズを有する。種々の実施形態において、第1の生体分子、第2の生体分子、又は第1の生体分子と第2の生体分子の各々が、抗体、抗原、タンパク質、酵素、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、オリゴ糖、多糖、又はこれらの混合物を含む。場合によっては、物品は、該基板表面上に第3の生体分子を含む第3セットの表示をさらに含み、このとき第3セットの全ての表示と第1セットの全ての表示は、サイズが実質的に均一である。一部の特定の場合には、第3セットの全ての表示と第1セットの全ての表示の密度が実質的に均一である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】(A)PPLによる多重タンパク質アレイのパターニングプロセスの概略図；(B)インクジェットプリンティングによって3種のタンパク質でインク付けされたSiインクウェルの蛍光画像；(C)(B)のSiインクウェルに浸漬されたポリマーペンアレイの蛍光画像；(D)(C)のポリマーペンアレイによるPPL製の多重タンパク質アレイの蛍光画像を示す(列1：Alex Fluor 647結合抗コレラ毒素β(CTβ)；列2：TRITC結合抗マウスIgG；列3：Alex Fluor 488結合抗前立腺特異抗原(PSA))。
【図２】(A)PPLによってCodelinkスライド上にパターニングされたCTβ/グリセロールのタッピングモードAFM製トポグラフィー画像；(B)(A)のズームインAFMトポグラフィー；(C)チップ-基板接触力の関数としてのパターニングされたタンパク質アレイのフィーチャーサイズ；及び(D)異なるチップ-基板接触時間及び接触力にてAlex Fluor 488結合抗PSAで標識したPSAアレイの蛍光画像（挿入図はズームイン画像である）を示す。
【図３】一実施形態におけるチップ接触時間と、結果として生じた表示のフィーチャーサイズとの間の関係を示す。
【図４】基板表面に対してチップアレイを水平にするために使用する光源との関連で、チップアレイ、ピエゾスキャナー、及び基板表面の配置の一実施形態の概略図を示し、かつチップアレイ上のチップのチップ先端がどこにあるかをさらに示す。
【図５Ａ】選択したインク材料のチップ-基板接触時間とドットサイズの関係を示す（ここで、プロットの傾斜は、対応するインクの拡散定数を反映する）。
【図５Ｂ】IgG及びβ-ガラクトシダーゼのインク拡散速度は、それぞれ1:5及び1:7.5のインク／PEG比で、チップ-基板接触時間の範囲にわたって、互いに非常に近接して調整され得ることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（詳細な説明）
本明細書では、タンパク質及び他の生体分子のアレイのパターニング方法、並びにタンパク質及び他の生体分子のパターニングされたアレイを、例えば、種々の検出アッセイで使用する方法を開示する。
最近、分子ベース材料のナノ及びミクロ構造を直接書き込むことを可能にするたった一つのリソグラフィーツールであるポリマーペンリソグラフィー(PPL)が報告された。参照によってその全体が本明細書に援用される考文献23及びWO 09/132321を参照されたい。硬いSi3N4カンチレバーの代わりに、PPLは、小さい表面積上の多数のチップで構成された(例えば、3インチ(7.6cm)径のウエハ領域上に1100万もの書込みペン)軟らかいポリマーペンアレイを用いて、走査型プローブ顕微鏡でペンアレイの移動を制御することによって表面上にインクを送達する。本明細書では、PPLを利用して、多重タンパク質及び他の生体分子のアレイをそれらのナノ及びミクロ構造を制御しながら一工程でパターニングする方法を実証する。重要なことに、様々な場合に、PPLで生成されたタンパク質アレイは、特異的な抗原-抗体認識を示す実験によって実証されるように、それらの生理活性を維持する。
【００１５】
本明細書で使用する場合、用語「生体分子」は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、抗原、抗体、ポリペプチド、タンパク質、酵素、オリゴ糖、多糖などのいずれの1つ以上のものをも意味する。
種々の態様において、生体分子は任意にさらに標識を含み得る。「標識」は、目視又は計測手段によって検出できるシグナルを生成できるいずれの物質をも意味し、例えば化学的又は物理的手段を通じてシグナルを生成する標識がある。該標識として、酵素と基質、色素原、触媒、フルオロフォア、化学発光化合物、及び放射性標識が挙げられる。
種々の場合に、標識は生体分子と共有結合している。場合によっては、標識が生体分子と非共有結合している。標識がスペーサーを介して生体分子と結合し得る。種々の場合に、スペーサーはポリマー、例えば水溶性ポリマーを含む。一部の特定の場合、ポリマーがオリゴヌクレオチド、オリゴ糖、又はポリエチレングリコールを含む。
場合によっては、標識は、フルオレッセイン色素、6-((7-アミノ-4-メチルクマリン-3-アセチル)アミノ) ヘキサン酸、5(及び6)-カルボキシ-X-ローダミン、ローダミン色素、ベンゾフェノキサジン、シアニン2(Cy2)色素、シアニン3(Cy3)色素、シアニン3.5(Cy3.5)色素、シアニン5(Cy5)色素、シアニン5.5(Cy5.5)色素、シアニン7(Cy7)色素、シアニン9(Cy9)色素、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレッセイン、5(6)-カルボキシ-テトラメチルローダミン、及びこれらの組合せから成る群より選択されるフルオロフォアを含む。放射性同位元素としては、限定するものではないが、35S、14C、125I、3H、131I、及びこれらの組合せ挙げられる。
【００１６】
他の適切な標識として、粒子状標識、例えばコロイド状金属粒子、例えば金、コロイド状非金属粒子、例えばセレン又はテルル、染色又は着色粒子、例えば染色プラスチック又は染色微生物、有機ポリマーラテックス粒子及びリポソーム、着色ビーズ、ポリマーマイクロカプセル、嚢、赤血球、赤血球ゴースト、又は直接見える物質を含む他のベシクル等が挙げられる。場合によっては、目視検出可能な標識を標識試薬の標識成分として使用し、それによって検出サイトに追加のシグナル生成成分を必要とせずに、試験サンプル中の分析物の存在又は量の直接目視又は計測読み出し情報を与える。
特定の標識の選択は本発明にとって重要ではないが、標識は、それ自体で検出可能シグナルを生成することができ、又は計測器によって検出可能であり、又は1以上の追加のシグナル生成成分、例えば酵素／基質シグナル生成系などと併用して検出可能であろう。標識試薬の標識又は特定の結合メンバー成分を変えることによって、種々の異なる標識試薬を形成することができ；当業者には当然のことながら、選択は、検出すべき分析物及び検出の所望手段の考慮を含む。
例えば、1以上のシグナル生成成分が標識と反応して検出可能シグナルを発生し得る。標識が酵素の場合、酵素を1以上の基質又はさらなる酵素及び基質と反応させて、検出可能な反応生成物を生じさせることによって、検出可能シグナルを増幅することができる。
【００１７】
タンパク質、炭水化物、核酸、及び全生物のような生物学的物質の染色用色素の使用は文献で実証されている。一定の色素は、色素及びリガンドの適合化学に基づいて優先的に特定物質を染色することが知られている。例えば、タンパク質用のクマシーブルー及びメチレンブルー、炭水化物用の過ヨウ素酸シッフ試薬、全生物用のクリスタルバイオレット、サフラニンO、及びトリパンブルー、核酸染色用の臭化エチジウム及びアクリジンオレンジ、並びに蛍光顕微鏡による検出用の蛍光色素、例えばローダミン及びカルコフロールホワイトがある。標識のさらなる例は、少なくとも、米国特許第4,695,554号；第4,863,875号；第4,373,932号；及び第4,366,241号（参照によって、全て本明細書に援用される）で見つけられる。
【００１８】
図1Aは、本明細書で開示する方法の略図を示す。あるタイプの実験では、ポリマーペンアレイのウェル間間隔及び寸法に適合するウェル間間隔及び寸法のインクウェルをまずインクジェットプリンティングによってタンパク質インクで充填する。一部の実施形態では、チップアレイの調製用の型をインクウェルとして使用する。該実施形態では、チップアレイのチップは、インクウェルのウェル間間隔、寸法、又はウェル間間隔と寸法の両方によって完全又は実質的に完全に整列する。この型インクウェルは、インクウェルの側断面図を示す下記スキームで見られる。ポリマーペンアレイチップ用の型を最初に作り出した窪みをインクで充填し、対応するインクで選択的に被覆された特定チップに使用することができる。
【００１９】
2012524909.tif 000003
【００２０】
次にインク付けされたチップを用いて基板表面上に表示を生成することができ、これにより、PPL技術を用いて、選択的にインク付けされたチップ及びチップの接触によって表示の間隔及び配置が制御される。
本明細書では、高処理量及び低コスト様式で生体分子(例えば、タンパク質)のナノ及びマイクロアレイを多重パターニングするためのPPLの使用を実証する。インクウェルでインク付けされたピラミッド状のペンは、良いアドレス指定能力(addressability)を示し、かつ隣接ペン間の相互混入を示さなかった。タンパク質及び他の生体分子のアレイは、タンパク質及び他の生体分子の生理活性を維持しながら、クロストーク(cross-talk)のない「直接書込み」法で容易に作製可能である。この方法は、生体分子の大規模な多重パターニングに適用できる一般的アプローチである。
【００２１】
（ポリマーペンリソグラフィー）
ポリマーペンリソグラフィーを明確にする特徴は、時間と圧力の両方に依存するインク輸送を示すことである。DPNと同様に、ポリマーペンリソグラフィーによって作られるフィーチャーは、チップ-基板接触時間の平方根に直線的に依存するサイズ示す。インクの拡散特徴及び送達チップの小さいサイズの結果である、ポリマーペンリソグラフィーのこの特性は、高い精度と再現性(同一実験条件下でフィーチャーサイズの変動は10%未満である)でサブミクロンのフィーチャーをパターニングできるようにする。ポリマーペンリソグラフィーの圧力依存性は、エラストマーピラミッドアレイの圧縮性に由来する。実際には、印加圧量を連続的に高めて（これは、垂直方向のピエゾ(z-ピエゾ)を単に伸長することによって制御できる）、微視的な、好ましくはピラミッド状のチップを変形させ得る。このような変形は接触プリンティングの主な欠点とみなされているが(これは「ルーフ(roof)」圧潰をもたらし、またフィーチャーサイズ解像度を制限し得る)、ポリマーペンリソグラフィーによれば、調整可能な変数として、この制御された変形を利用することができ、チップ-基板接触面積及び結果として生じるフィーチャーサイズを制御できるようにする。約5〜約25μmのz-ピエゾ伸長によって許容される圧力範囲内では、1秒という固定接触時間にてピエゾ伸長とフィーチャーサイズとの間のほぼ直線的な関係を観察することができる。興味深いことに、裏打ちエラストマー層上のチップアレイを利用したPPLアレイ実施形態によれば、最初の接触時点及び相対的な伸長が0.5μmまでは、ドットサイズが有意には異ならず、両方とも約500nmであり(この具体例では)、ピラミッドの全てと接触している裏打ちエラストマー層が、ピラミッド形状のチップが変形する前に変形することを示唆している。このタイプの緩衝は水平化にとって好運である。なぜならばこの緩衝が、チップの変形なしに、かつ意図したフィーチャーサイズを有意に変えることなく、全てのチップを表面と接触させるのに余分の許容度をもたらすからである。z-ピエゾが1μm以上伸長すると、チップは有意かつ制御可能な変形を示す。
【００２２】
ポリマーペンリソグラフィーの圧力依存性のため、大きいフィーチャーを生成するために時間のかかるメニスカス媒介インク拡散プロセスに頼る必要がない。実際には、単にチップの変形度を調整することによって、たった1回のプリンティングサイクルでナノメーター乃至マイクロメーターサイズのフィーチャーを生成することができる。概念証明として、6×6個の金の方形アレイ（一列内の各方形は、異なるチップ-基板圧力であるが、1秒という一定のチップ-基板接触時間にて1回のプリンティングサイクルで書き込まれた）をポリマーペンリソグラフィーによって製作し、引き続き湿式化学エッチングに供した。生成された最大及び最小の金の方形は縦に(on edge)4μm及び600nmだった。この実験はポリマーペンリソグラフィー実験で達成可能なフィーチャーサイズ範囲を規定するものではなく、むしろ固定のチップ-基板接触時間(この場合は1秒)でポリマーペンリソグラフィーによって到達可能な多重スケールの実証であることに留意されたい。
ポリマーペンリソグラフィーは、従来の接触プリンティングと異なり、フィーチャーのサイズ、間隔、及び形状にわたって動的に制御することによって、分子ベース及び固体状態のフィーチャーのコンビナトリアルパターニングを可能にする。これは、ポリマーチップを用いて、作りたい構造のドットパターンを形成することによって達成される。PDMSポリマーチップアレイ及び適合インクによれば、PDMSポリマーはパターニングの間じゅうインクのレザバーとして振る舞うので、頻繁にペンアレイに再びインクを付ける必要がない。多重スケールパターンのこの相対的に高処理量の生成は、電子ビームリソグラフィー(EBL)又はDPNなどの他のリソグラフィー技術によっては、不可能ではないにしても困難であろう。
ポリマーペンリソグラフィーのマスクレス特性は、処理量の妨げとなる連続プロセスを経て新しいマスターを設計するという障害なしに多くのタイプの構造を任意に作ることを可能にすることに留意されたい。加えて、ポリマーペンリソグラフィーは、閉ループスキャナーの登録能力を用いて100nm以下の解像度で使用できる。
【００２３】
（チップアレイ）
本明細書で開示するリソグラフィー法は、エラストマーポリマー材料から形成されたチップアレイを使用する。チップアレイは非カンチレバー型であり、かつ必要に応じて、いずれの形状又は間隔をも有するように設計できるチップを含む。各チップの形状は、アレイの他のチップと同一又は異なっていていてよい。予期されるチップ形状には、回転楕円体形、半回転楕円体形、ドーナツ形、多面体形、円錐形、円柱形、及びピラミッド形(例えば、三角又は四角)がある。チップは、サブミクロンパターン、例えば、約500nm未満を形成するのに適するように、鋭い。チップの尖鋭度は、その曲率半径によって測られ、本明細書で好ましいチップの曲率半径は1μm未満であり、例えば、約0.9μm未満、約0.8μm未満、約0.7μm未満、約0.6μm未満、約0.5μm未満、約0.4μm未満、約0.3μm未満、約0.2μm未満、約0.1μm未満、約90nm未満、約80nm未満、約70nm未満、約60nm未満、又は約50nm未満であり得る。
フォトリソグラフィー法を利用して作った型からチップアレイを形成することができ、次に本明細書で開示するポリマーを用いてこの型からチップアレイを形作る。任意の所望様式で整列された多数のチップとして収容できるように型を設計することができる。チップアレイのチップはいずれの所望の数であってもよく、予期されるチップ数としては、約1000〜約1500万個のチップ又はそれ以上が挙げられる。チップアレイのチップ数は約100万超え、約200万超え、約300万超え、約400万超え、約500万超え、約600万超え、約700万超え、約800万超え、約900万超え、約1000万超え、約1100万超え、約1200万超え、約1300万超え、約1400万超え、又は約1500万超えであってよい。
チップアレイのチップは、いずれの所望の厚さを有するようにも設計できるが、典型的に、チップアレイの厚さ(チップの先端からチップの底までを測定)は、約50nm〜約1μm、約50nm〜約500nm、約50nm〜約400nm、約50nm〜約300nm、約50nm〜約200nm、又は約50nm〜約100nmである。
【００２４】
ポリマーは、リソグラフィー法と適合し得る圧縮性を有するいずれのポリマーであってもよい。チップアレイで用いるのに適したポリマー材料は、線形又は分岐骨格を有してよく、かつ個々のポリマーと、チップに望ましい圧縮性の度合とに応じて、架橋されていても又は架橋されていなくてもよい。架橋剤は、ポリマー分子間に2つ以上の共有結合を形成できる多官能性モノマーを意味する。架橋剤の非限定例として、トリメチロールプロパントリメタクリラート(TMPTMA)、ジビニルベンゼン、ジエポキシ、トリエポキシ、テトラエポキシ、ジビニルエーテル、トリビニルエーテル、テトラビニルエーテル、及びこれらの組合せが挙げられる。
熱可塑性又は熱硬化性ポリマーを使用することができ、同様に架橋エラストマーも使用できる。一般に、ポリマーは多孔性及び／又は非晶質であってよい。シリコーンポリマー及びエポキシポリマーの一般的分類のポリマーを含め、種々のエラストマーポリマー材料が考えられる。例えば、25℃未満、さらに好ましくは-50℃未満のような低いガラス転移温度を有するポリマーを使用することができる。芳香族アミン、トリアジン、及び脂環式骨格に基づいた化合物に加えて、ビスフェノールAのジグリジジルエーテルを使用できる。別の例としてノボラックポリマーが挙げられる。他の予期されるエラストマーポリマーとして、メチルクロロシラン、エチルクロロシラン、フェニルクロロシラン、及びポリジメチルシロキサン(PDMS)が挙げられる。他の材料として、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリブタジエン、ポリウレタン、ポリイソプレン、ポリアクリル酸ゴム、フルオロシリコーンゴム、及びフルオロエラストマーが挙げられる。
【００２５】
チップを形成するために使用し得る適切なポリマーのさらなる例は、米国特許第5,776,748号；米国特許第6,596,346号；及び米国特許第6,500,549号で見つかる（それぞれ参照によってその全体が本明細書で援用される）。他の適切なポリマーには、He et al., Langmuir 2003, 19, 6982-6986；Donzel et al., Adv. Mater. 2001, 13, 1164-1167；及びMartin et al., Langmuir, 1998, 14-15, 3791-3795に開示されている当該ポリマーがある。ポリジメチルシロキサン等の疎水性ポリマーを例えば、強い酸化剤の溶液又は酸素プラズマへの曝露によって、化学的又は物理的に改変することができる。
チップアレイのポリマーは、インク付け及びプリンティング中のポリマーの圧潰を防止するため適切な圧縮弾性率及び表面硬度を有するが、高過ぎる弾性率及び過大な表面硬度は、プリンティング中に基板表面に順応及び適合できない脆弱な物質をもたらすことがある。Schmid, et al., Macromolecules, 33:3042 (2000)に開示されているように、ビニル及びヒドロシランプレポリマーを異なる弾性率及び表面硬度のポリマーを与えるように加工することができる。従って、ある場合には、ポリマーがビニル及びヒドロシランプレポリマーの混合物であり、このときビニルプレポリマー対ヒドロシラン架橋剤の質量比は好ましくは少なくとも約5:1、7:1、又は8:1であり、好ましくは多くとも約20:1、15:1、又は12:1、例えば約5:1〜約20:1、又は約7:1〜約15:1、又は約8:1〜約12:1の範囲である。
【００２６】
チップアレイのポリマーは好ましくはガラスの約0.2%〜約3.5%の範囲の表面硬度を有するであろう。これは、ガラス表面の抵抗性と比較した、直径1mmの剛体球による侵入に対する表面の抵抗性によって測定される(Schmid, et al., Macromolecules, 33:3042 (2000) 3044ページに記載されているように)。表面硬度は、約0.3%〜約3.3%、約0.4%〜約3.2%、約0.5%〜約3.0%、又は約0.7%〜約2.7%の範囲内であってよい。チップアレイのポリマーは、約10MPa〜約300MPaの圧縮弾性率を有し得る。チップアレイは、好ましくは約10MPa〜約300MPaの圧力下でフックの法則に従う(Hookean)圧縮性ポリマーを含む。チップアレイ上に及ぼされる圧力とフィーチャーサイズとの間の直線関係が、本開示方法及びチップアレイを用いてプリントされる表示の制御を可能にする(図2C参照)。
チップアレイは、それ自体がインク組成物レザバーとして作用するように、インク組成物に適した吸着及び／又は吸収特性を有するポリマーを含み得る。例えば、PDMSはパターニングインクを吸着することが知られている。例えば、米国特許公開第2004/228962号, Zhang, et al., Nano Lett. 4, 1649 (2004)、及びWang et al., Langmuir 19, 8951 (2003)を参照されたい。
【００２７】
チップアレイは、共通基板に固定され、かつ例えば本明細書で開示する適切なポリマーから形成された複数のチップを含むことができる。チップをランダムに又は規則的な周期性パターン(例えば、行と列のパターン、円形パターンなど)で整列させてよい。チップは全て同一形状を有するか又は異なる形状を有するように構成され得る。共通基板はエラストマー層を含むことができ、その層はチップアレイのチップを形成するポリマーと同じポリマーを含んでもよく、或いはチップアレイのポリマーと異なるエラストマーポリマーを含んでもよい。共通基板のエラストマー層は、約50μm〜約100μmの厚さを有し得る。チップアレイと共通基板の組合せを硬質支持体(例えば、ガラス、例えばスライドガラス)に添付又は接着させることができる。種々の場合に、共通基板、チップアレイ、及び／又は硬質支持体（存在する場合）は半透明又は透明である。特定の場合には、各々が半透明又は透明である。チップアレイと共通基板の組合せの厚さは、約200μm未満、好ましくは約150μm未満、さらに好ましくは約100μm未満であり得る。エラストマー層の共通基板に固定されたチップの配列の例を図4に示す。
【００２８】
（インクウェル）
本開示方法では、インクウェルを用いてチップアレイにインクを付ける。これらのインクウェルアレイは、チップアレイの各チップに対応する数、形状、及びウェルの配置を有し得る。一部の実施形態において、インクウェルアレイは、チップアレイを調製するために用いた型から再度目的を持たされる。該実施形態では、次に、インクウェルのウェルの寸法及びウェル間間隔をチップアレイのチップと実質的又は完全に整列させる。このような実質的又は完全なアラインメントが、単一のインク付け工程で、あるインクと別のインク若しくは間違ったセットのチップとほとんど又は全くクロストーク、及び／又は相互混入することなく、選択したインクによるチップのインク付けの厳密な制御を可能にすることができる。
標準的なフォトリソグラフィー技術を用いて、選択した配列で、選択した数のチップを有する型をエッチングすることができる。型上でポリマーを鋳造することによって、チップアレイを形成することができる。型からのチップアレイの形成後、次に型をチップアレイに適したインクウェルアレイとして使用することができる。チップアレイの一部のチップはあるインクでインク付けされるが、他のチップは異なるインクでインク付けされるように、種々のインクで選択的にインクウェルのウェルを充填することができる。限定するものではないが、インクジェットプリンターを用いて等、利用可能ないずれの手段によってもウェルを充填することができる。場合によっては、インクジェットプリンターが電気流体力学的インクジェットプリンターである、例えば、米国特許第7,326,439号；第7,168,791号；第6,997,539号；第7,273,270号；及び第7,434,912号、米国特許公開第2009/0133169号をも参照されたい。
【００２９】
種々の実施形態では、インクウェルアレイ表面(例えば、インクと接するであろう表面)をフッ素化物質で処理する。インクウェル表面のフッ素化は、表面を疎水性にすることによって、種々のウェル内におけるインクの相互混入を減少させ得る。疎水性表面は、インク付け領域のサイズを小さくし、かつ表面上の横方向のインクの拡散を減少させるであろう。場合によっては、インクウェル表面をフルオロシラン、例えば1H,1H,2H,2H-ペルフルオロデシルトリクロロシランで処理する。他の予期されるフッ化化合物として、フルオロポリマー、及び少なくとも1個のフッ素基を有するシラン(例えば、少なくとも1個のF置換基、好ましくは少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、又は少なくとも5個のF置換基を有するクロロシラン、メチルシラン、メトキシシラン、及びエトキシシラン)が挙げられる。例としてビス(トリフルオロプロピル)テトラメチルジシロキサン及び(ヘプタデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロデシル)トリエトキシシランが挙げられる。
図1Cは、整列かつインク付けされたインクウェルアレイに相補的な幾何学的配列を有するポリマーペンアレイを示す。インクは、ピラミッド状のペンの頂部に選択的にアドレスされる。重要なことに、z-ピエゾによってもたらされる正確な制御が、ポリマーペンアレイの裏打ち層とウェル間のインクウェルアレイのバンクとの間の接触を阻止する。このようにして、インクウェルアレイのバンクが過剰のインクを有していても、インク付けプロセス中の隣接ペン間のインクの相互混入(物理的接触又は毛細管力由来)が阻止される。このポリマーペンアレイを用いて、「直接書込み」様式で多重タンパク質アレイを容易に作ることができる。概念証明として、アレイ中の各ペンを用いて、ドット間に4μmの間隔のある5×5個のタンパク質ドットアレイを作った。この場合もやはり、PPLの一工程のトップダウン書込み特性のためクロストークが見られなかった。
【００３０】
チップ-基板の接触時間と接触力を両方とも変えることによって、100nm以下乃至多ミクロンのフィーチャーサイズを制御することができる。チップが最初に基板と接触すると、0.01秒の接触時間で65nmのフィーチャーが作られた(図2A及び2B)。フィーチャーサイズは、チップ-基板接触時間の関数として増加する(図3)。PPLのユニークなさらなる能力は、チップ-基板接触力を変えることによって可能になるフィーチャーサイズの制御である。図2Cは、固定したチップ-基板接触時間(10秒)によるz-ピエゾ伸長の関数としてのパターニングされたタンパク質のフィーチャーサイズを示す。最初の500nmの伸長では(初期接触に対して)、タンパク質フィーチャーのサイズが857±40nmである。さらにz-ピエゾを伸長すると、フィーチャーサイズは疑似線形増加となる。例えば、本ペンアレイ構造では、12μmのz-ピエゾ伸長を用いて13.32±0.32μmのドットが生成された。他のリソグラフィー法に比し、このような特性は独自に、たった数秒で大面積にわたって光学的スクリーニング目的用の(サブ)ミクロンサイズの生体分子(例えば、タンパク質)アレイを作製することができる。
重要なことに、PPLによってパターニングされた生体分子構造は、それらの生理活性を維持する。概念証明実験として、5×5個のPSAアレイをPPLによってCodelinkスライド上にチップ-基板接触時間及び接触力を増加させながらパターニングした。このタンパク質チップを、100nMのAlex Fluor 488結合抗PSAを含むPBS(pH=7.4)溶液に1時間浸漬させて、その対応する抗体で標識した後、すすぎ、乾燥させ、蛍光顕微鏡で撮像した。図2Dに示すように、抗PSAは、検出できないバックグラウンドによってPSA領域上に選択的に結合した。これは、PSAが、最小乃至抗PSA結合に必要な程度では、ポリマーペンリソグラフィープロセスの間、その生理活性を維持したことを示している。接触力を高めると、フィーチャーサイズが1.1μmから3.2μmに増大した。興味深いことに、チップ-基板接触時間を増やすと、蛍光強度が増加した。これは、おそらく、より短い接触時間で送達された低いPSA密度のためであろう。
【００３１】
（インク組成物）
本開示方法で使用するのに適したインク組成物には、均質及び不均質組成物の両者が含まれ、後者は複数の成分を有する組成物を意味し、一部の実施形態では、少なくとも1種の生体分子を含む。インク組成物はチップアレイ上で被覆される。「被覆」という用語は、本明細書で使用する場合、チップアレイの被覆と同様に、インク組成物の、チップアレイによる吸着及び吸収をも意味する。チップアレイをインク組成物で被覆すると、該チップアレイを用いて、基板表面上にインク組成物をパターニングすることができる。
インク組成物は液体、固体、半固体などであってよい。使用に適したインク組成物としては、限定するものではないが、分子溶液、ポリマー溶液、ペースト、ゲル、クリーム、膠、樹脂、エポキシ、接着剤、金属膜、粒状物質、はんだ、エッチング液、及びこれらの組合せが挙げられる。
インク組成物として、限定するものではないが、単層形成種、薄膜形成種、油、コロイド、金属、金属錯体、金属酸化物、セラミック、有機種(例えば、炭素-炭素結合を含む成分、例えば小分子、ポリマー、ポリマー前駆体、タンパク質、抗体など)、ポリマー(例えば、非生物学的ポリマー及び生物学的ポリマー、例えば一本鎖及び二本鎖DNA、RNAなど)、ポリマー前駆体、デンドリマー、ナノ粒子、及びこれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、インク組成物の1種以上の成分が、例えば、化学結合を形成することによって、イオン相互作用によって、ファンデルワールス相互作用によって、静電相互作用によって、磁性によって、接着によって、及びこれらの組合せによって、基板と関連付けるのに適した官能基を含む。
【００３２】
一部の実施形態では、インク組成物をその粘度を制御するように処方し得る。インク粘度を制御できるパラメーターには、限定するものではないが、溶媒組成、溶媒濃度、増粘剤組成、増粘剤濃度、成分の粒径、ポリマー成分の分子量、ポリマー成分の架橋度、成分の自由体積(すなわち、空隙率)、成分の流体力学半径、成分の膨潤性、インク成分間のイオン相互作用(例えば、溶媒-増粘剤相互作用)、及びこれらの組合せがある。
一部の実施形態では、インク組成物は、溶媒、増粘剤、イオン種(例えば、カチオン、アニオン、双性イオン等)のような添加剤を含み、それらの選択及び濃度を選択して、インク組成物の粘度、比誘電率、伝導率、浸透圧、密度などの1つ以上を調整することができる。
一部の実施形態では、インク組成物をその拡散又は沈着速度を制御するように処方することができる。2種以上のインクを並行様式で基板表面上に沈着させる実施形態では、拡散又は沈着速度は、基板上の各位置に沈着される物質量の標準化を制御するのに役立ち得る。例えば、生体分子に対するインク組成物中の添加剤の量を調整して、拡散又は沈着速度を調整する。場合によっては、パターニングされる生体分子と並行してパターニングされる他の生体分子に応じて、パターニングされる生体分子の拡散又は沈着速度が標準化されるように、添加剤と生体分子の量が、1:1〜約50:1、約1:1〜約40:1、約1:1〜約30:1、約1:1〜約250:1、約1:1〜約20:1、約1:1〜約15:1、約1:1〜約10:1、又は約1:1〜約5:1の範囲内である。例えば、WO 08/157550を参照されたい。
【００３３】
各インク組成物はそれ自体の拡散速度を有し、このことが複数のインの同時パターニングを難しくし、かつさらにチップ-基板接触時間及び／又は接触圧力によるフィーチャーサイズの制御を困難にし得る。インクの拡散速度は選択された種々のインク材料に応じて変化する。例えば、図5Aは、DPNリソグラフィー法を用いてパターニングされた、選択されたインク材料のチップ-基板接触時間とドットサイズとの関係のプロットを示す。図中、各プロットの傾斜は、対応するインクの拡散定数を反映する。純粋なIgGは30.81という高い拡散速度を有し得るが、抗ユビキチンについて測定された当該最高拡散速度は、たった11.30である(図5A参照)。このように、拡散速度の差異のため、同一のチップ-基板接触時間(4秒)において、生成されたドットサイズは、β-ガラクトシダーゼでは439.0nmであり、BSAでは144.7nmである。種々濃度の添加剤での生体分子のインク組成物の拡散速度の単純な試行錯誤調査によって、添加剤と生体分子の特定比を有する第2のインク組成物と同様の拡散又は沈着速度を有する、添加剤と生体分子の適切な比を有する第1のインク組成物に達することができる。例えば、IgG及びβ-ガラクトシダーゼのインク拡散速度を示すチャートは、図5Bに示すように、それぞれ1:5及び1:7.5の生体分子/PEG比で非常に近接して調整され得る。
【００３４】
一部の特定実施形態では、インク組成物が添加剤としてグリセロールを含むことができる。インク組成物中のグリセロールの存在は、ポリマーペンアレイのチップ上におけるインクの移動性を高めるのに役立ち、及び／或いはインク組成物の拡散又は沈着速度を正規化するために役立ち得る。グリセロールは、いずれの適切な濃度でインク中に存在してもよく、例えばインク組成物の少なくとも約0.1質量%、又は0.5質量%又は1質量%又は2質量%及び／又は多くてもインク組成物の約50質量%、又は25質量%、又は15質量%、又は10質量%、例えば、インク組成物の約0.1質量%〜約50質量%、約0.5質量%〜約25質量%、約1質量%〜約15質量%、又は約2質量%〜約10質量%の範囲の濃度である。
適切な増粘剤としては、限定するものではないが、カルボキシアルキルセルロース誘導体(例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース)、アルキルセルロース誘導体(例えば、メチルセルロース及びエチルセルロース)、部分酸化アルキルセルロース誘導体(例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロース)の金属塩；デンプン、ポリアクリルアミドゲル、ポリ-N-ビニルピロリドンのホモポリマー、ポリ(アルキルエーテル)(例えば、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、及びポリプロピレンオキシド)、寒天、アガロース、キサンタンガム、ゼラチン、デンドリマー、コロイド二酸化ケイ素、脂質(例えば、脂肪、油、ステロイド、ワックス、脂肪酸、例えばオレイン酸、リノール酸、リノレン酸、及びアラキドン酸のグリセリド、並びに例えばホスホコリン由来の脂質二重層)並びにこれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、増粘剤は、インク組成物の少なくとも約0.5質量%、又は1質量%又は5質量%、及び／又は多くてもインク組成物の約25質量%、20質量%又は15質量%、例えば、インク組成物の約0.5質量%〜約25%、約1質量%〜約20質量%、又は約5質量%〜約15質量%の範囲の濃度で存在する。
【００３５】
インク組成物に適した溶媒として、限定するものではないが、水、C1-C8アルコール(例えば、メタノール、エタノール、プロパノール及びブタノール)、C6-C12直鎖、分岐及び環式炭化水素(例えば、ヘキサン及びシクロヘキサン)、C6-C14アリール及びアラルキル炭化水素(例えば、ベンゼン、キシレン、及びトルエン)、C3-C10アルキルケトン(例えば、アセトン、メチルエチルケトン)、C3-C10エステル(例えば、酢酸エチル)、C4-C10アルキルエーテル(例えば、ジエチルエーテル)、及びこれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、溶媒は、インク組成物の少なくとも約1質量%、又は5質量%、又は10質量%、又は15質量%、又は25質量%、又は50質量%、又は75質量%、及び／又はインク組成物の多くても約99質量%、又は95質量%、又は90質量%、又は75質量%、又は50質量%、又は25質量%、例えばインク組成物の1質量%〜約99質量%、約5質量%〜約95質量%、約10質量%〜約90質量%、約15質量%〜約95質量%、約25質量%〜約95質量%、約50質量%〜約95質量%、又は約75質量%〜約95質量%の範囲の濃度で存在する。
【００３６】
インク組成物はエッチング液を含むことができる。本明細書で使用する場合、「エッチング液」は、表面と反応して表面の一部を除去できる成分を意味する。従って、エッチング液を用いて、表面と反応させ、かつ基板から除去され得る揮発性及び／又は可溶性物質、或いは例えば、すすぎ又は清浄法によって基板から除去可能な残渣、粒状物、又はフラグメントの少なくとも1種を形成することによって、サブトラクティブな(subtractive)フィーチャーを形成する。一部の実施形態では、エッチング液は、インク組成物の少なくとも約0.5質量%、又は1質量%、又は2質量%及び／又はインク組成物の多くても約95質量%、又は90質量%、又は85質量%、又は10質量%、例えば、インク組成物の約0.5質量%〜約95質量%、約1質量%〜約90質量%、約2質量%〜約85質量%、約0.5質量%〜約10質量%、又は約1質量%〜約10質量%の範囲の濃度で存在する。
本明細書で開示する方法で使用するのに適したエッチング液としては、限定するものではないが、酸性エッチング液、塩基性エッチング液、フッ化物ベースのエッチング液、及びこれらの組合せが挙げられる。本発明で使用するのに適した酸性エッチング液として、限定するものではないが、硫酸、トリフルオロメタンスルホン酸、フルオロスルホン酸、トリフルオロ酢酸、フッ化水素酸、塩酸、カルボラン酸、及びこれらの組合せが挙げられる。本発明で使用するのに適した塩基性エッチング液として、限定するものではないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化テトラアルキルアンモニウム、アンモニア、エタノールアミン、エチレンジアミン、及びこれらの組合せが挙げられる。本発明で使用するのに適したフッ化物ベースのエッチング液として、限定するものではないが、フッ化アンモニウム、フッ化リチウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化ルビジウム、フッ化セシウム、フッ化フランシウム、フッ化アンチモン、フッ化カルシウム、テトラフルオロホウ酸アンモニウム、テトラフルオロホウ酸カリウム、及びこれらの組合せが挙げられる。
【００３７】
一部の実施形態では、インク組成物は反応性成分を含む。本明細書で使用する場合、「反応性成分」は、基板との化学的相互作用を有する化合物又は種を意味する。一部の実施形態では、インク中の反応性成分が基板中に浸透又は拡散する。一部の実施形態では、反応性成分が基板表面上の露出官能基を変換し、該官能基に結合し、又は該官能基への結合を促進する。反応性成分としては、限定するものではないが、イオン、フリーラジカル、金属、酸、塩基、金属塩、有機試薬、及びこれらの組合せが挙げられる。反応性成分として、限定するものではないが、さらに単層形成種、例えばチオール、水酸化物、アミン、シラノール、シロキサン等、及び当業者に周知の他の単層形成種が挙げられる。反応性成分は、インク組成物の少なくとも約0.001質量%、又は0.01質量%、又は0.1質量%及び／又はインク組成物の多くても約95質量%、又は50質量%、又は25質量%、又は5質量%、例えば、インク組成物の約0.001質量%〜約95質量%、約0.001質量%〜約50質量%、約0.001質量%〜約25質量%、約0.001質量%〜約10質量%、約0.001質量%〜約5質量%、約0.001質量%〜約2質量%、約0.001質量%〜約1質量%、約0.001質量%〜約0.5質量%、約0.001質量%〜約0.05質量%、約0.01質量%〜約10質量%、約0.01質量%〜約5質量%、約0.01質量%〜約2質量%、約0.01質量%〜約1質量%、約10質量%〜約100質量%、約50質量%〜約99質量%、約70質量%〜約95質量%、約80質量%〜約99質量%、約0.001質量%、約0.005質量%、約0.01質量%、約0.1質量%、約0.5質量%、約1質量%、約2質量%、又は約5質量%の濃度で存在し得る。
【００３８】
インク組成物は、導電性及び／又は半導電性成分をさらに含むことができる。本明細書で使用する場合、「導電性成分」は電荷を伝達又は移動できる化合物又は種を意味する。導電性及び半導電性成分として、限定するものではないが、金属、ナノ粒子、ポリマー、クリームはんだ、樹脂、及びこれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、導電性成分は、インク組成物の少なくとも約1質量%、又は5質量%、又は50質量%及び／又はインク組成物の多くても約99質量%、又は95質量%、又は90質量%、又は50質量%、又は5質量%、例えば、インク組成物の約1質量%〜約99質量%、約1質量%〜約10質量%、約5質量%〜約99質量%、約25質量%〜約99質量%、約50質量%〜約99質量%、約75質量%〜約99質量%、約2質量%、約5質量%、約90質量%、又は約95質量%の濃度で存在する。
インク組成物で使用するのに適した金属として、限定するものではないが、遷移金属、アルミニウム、ケイ素、リン、ガリウム、ゲルマニウム、インジウム、スズ、アンチモン、鉛、ビスマス、これらの合金、並びにこれらの組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、インク組成物は、半導電性ポリマーを含む。本開示方法で使用するのに適した半導電性ポリマーとして、限定するものではないが、ポリアニリン、ポリ(3,4-エチレンジオキシチオフェン)-ポリ(スチレンスルホナート)、ポリピロール、アリーレンビニレンポリマー、ポリフェニレンビニレン、ポリアセチレン、ポリチオフェン、ポリイミダゾール、及びこれらの組合せが挙げられる。
【００３９】
インク組成物は、絶縁成分を含むことができる。本明細書で使用する場合、「絶縁成分」は、電荷の移動又は伝達に抵抗性の化合物又は種を意味する。一部の実施形態では、絶縁成分は、約1.5〜約8、約1.7〜約5、約1.8〜約4、約1.9〜約3、約2〜約2.7、約2.1〜約2.5、約8〜約90、約15〜約85、約20〜約80、約25〜約75、又は約30〜約70の比誘電率を有する。本明細書で開示する方法で使用するのに適した絶縁成分として、限定するものではないが、ポリマー、金属酸化物、金属炭化物、金属窒化物、これらのモノマー前駆体、これらの粒子、及びこれらの組合せが挙げられる。適切なポリマーとしては、限定するものではないが、ポリジメチルシロキサン、シルセスキオキサン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイミド、及びこれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、例えば、絶縁成分は、インク組成物の少なくとも約1質量%、又は5質量%、又は50質量%及び／又はインク組成物の多くても約99質量%、又は95質量%、又は90質量%、又は50質量%、又は5質量%、例えば、インク組成物の約1質量%〜約95質量%、約1質量%〜約80質量%、約1質量%〜約50質量%、約1質量%〜約20質量%、約1質量%〜約10質量%、約20質量%〜約95質量%、約20質量%〜約90質量%、約40質量%〜約80質量%、約1質量%、約5質量%、約10質量%、約90質量%、又は約95質量%の濃度で存在する。
【００４０】
インク組成物は、マスキング成分を含むことができる。本明細書で使用する場合、「マスキング成分」は、反応すると、周囲表面と反応できる種に抵抗性の表面フィーチャーを形成する化合物又は種を意味する。本発明で使用するのに適したマスキング成分には、伝統的なフォトリソグラフィー法で「レジスト」(例えば、フォトレジスト、化学レジスト、自己組織化単分子膜など)として一般的に使用されている物質がある。本開示方法で使用するのに適したマスキング成分として、限定するものではないが、ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、ポリ(エピクロロヒドリン-co-エチレンオキシド)、ポリスチレン、ポリ(スチレン-co-ブタジエン)、ポリ(4-ビニルピリジン-co-スチレン)、アミン末端ポリ(スチレン-co-ブタジエン)、ポリ(アクリロニトリル-co-ブタジエン)、スチレン-ブタジエン-スチレンブロックコポリマー、スチレン-エチレン-ブチレンブロック線状コポリマー、ポリスチレン-ブロック-ポリ(エチレン-ran-ブチレン)-ブロック-ポリスチレン、ポリ(スチレン-co-無水マレイン酸)、ポリスチレン-ブロック-ポリ(エチレン-ran-ブチレン)-ブロック-ポリスチレン-グラフト-無水マレイン酸、ポリスチレン-ブロック-ポリイソプレン-ブロック-ポリスチレン、ポリスチレン-ブロック-ポリ(エチレン-ran-ブチレン)-ブロック-ポリスチレン、ポリノルボルネン、ジカルボキシ末端ポリ(アクリロニトリル-co-ブタジエン-co-アクリル酸)、ジカルボキシ末端ポリ(アクリロニトリル-co-ブタジエン)、ポリエチレンイミン、ポリ(カルボナートウレタン)、ポリ(アクリロニトリル-co-ブタジエン-co-スチレン)、ポリ(塩化ビニル)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メチルメタクリラート)、ポリ(メチルメタクリラート-co-メタクリル酸)、ポリイソプレン、ポリ(1,4-ブチレンテレフタラート)、ポリプロピレン、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(1,4-フェニレンスルフィド)、ポリリモネン、ポリ(ビニルアルコール-co-エチレン)、ポリ[N,N'-(1,3-フェニレン)イソフタルアミド]、ポリ(1,4-フェニレンエーテル-エーテル-スルホン)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ[ブチレンテレフタラート-co-ポリ(アルキレングリコール)テレフタラート]、ポリ(エチレングリコール)ジアクリラート、ポリ(4-ビニルピリジン)、ポリ(DL-ラクチド)、ポリ(3,3',4,4'-ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物-co-4,4'-オキシジアニリン/1,3-フェニレンジアミン)、アガロース、ポリフッ化ビニリデンホモポリマー、スチレンブタジエンコポリマー、フェノール樹脂、ケトン樹脂、4,5-ジフルオロ-2,2-ビス(トリフルオロメチル)-1,3-ジオキサン、上記いずれかの塩、及び上記いずれかの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、マスキング成分は、インク組成物の少なくとも約1質量%、又は2質量%、及び／又はインク組成物の多くても約10質量%、又は5質量%又は2質量%、例えばインク組成物の約1質量%〜約10質量%、約1質量%〜約5質量%の範囲、又は約2質量%の濃度で存在する。
【００４１】
インク組成物は、導電性成分及び反応性成分を含むことができる。例えば、反応性成分は、導電性成分の表面中への浸透、導電性成分と表面との間の反応、導電性フィーチャーと表面との間の接着、導電性フィーチャーと表面との間の電気的接触の促進、及びこれらの組合せの少なくとも1つを促進することができる。このインク組成物を反応させることによって形成される表面フィーチャーには、添加剤非浸透性、添加剤浸透性、サブトラクティブな浸透性、及びコンフォーマルな(conformal)浸透性表面フィーチャーから成る群より選択される導電性フィーチャーが含まれる。
インク組成物は、例えば、中に導電性フィーチャー挿入物を有するサブトラクティブな表面フィーチャーを生成するのに適したエッチング液及び導電性成分を含み得る。
インク組成物は、絶縁成分及び反応性成分を含むことができる。例えば、反応性成分は、表面中への絶縁成分の浸透、絶縁成分と表面との間の反応、絶縁フィーチャーと表面との間の接着、絶縁フィーチャーと表面との間の電気的接触の促進、及びこれらの組合せの少なくとも1つを促進することができる。このインク組成物を反応させることによって形成される表面フィーチャーには、添加剤非浸透性、添加剤浸透性、サブトラクティブな浸透性、及びコンフォーマルな浸透性表面フィーチャーから成る群より選択される絶縁フィーチャーが含まれる。
インク組成物は、例えば、中に絶縁フィーチャー挿入物を有するサブトラクティブな表面フィーチャーを生じさせるのに適したエッチング液及び絶縁成分を含むことができる。
インク組成物は、例えば、表面上に電気伝導性のマスキングフィーチャーを生じさせるのに適した導電性成分及びマスキング成分を含むことができる。
本開示方法で使用するのに適したインク組成物の他の予期される成分として、チオール、1,9-ノナンジチオール溶液、シラン、シラザン、アルキン、シスタミン、N-Fmoc保護アミノチオール、生体分子、DNA、タンパク質、抗体、コラーゲン、ペプチド、ビオチン、及びカーボンナノチューブが挙げられる。
【００４２】
インク化合物及びインク組成物、並びにそれらの調製及び使用の説明については、Xia and Whitesides, Angew. Chem. Int. Ed., 37, 550-575 (1998)及びその中で引用されている参考文献；Bishop et al., Curr. Opinion Colloid & Interface Sci., 1, 127-136 (1996); Calvert, J. Vac. Sci. Technol. B, 11, 2155-2163 (1993); Ulman, Chem. Rev., 96:1533 (1996) (金上のアルカンチオール); Dubois et al., Annu. Rev. Phys. Chem., 43:437 (1992) (金上のアルカンチオール); Ulman, An Introduction to Ultrathin Organic Films: From Langmuir-Blodgett to Self-Assembly (Academic, Boston, 1991) (金上のアルカンチオール); Whitesides, Proceedings of the Robert A. Welch Foundation 39th Conference On Chemical Research Nanophase Chemistry, Houston, Tex., pages 109-121 (1995) (金に付着したアルカンチオール); Mucic et al. Chem. Commun. 555-557 (1996) (金表面への3'チオールDNAの付着方法を記載); 米国特許第5,472,881号(金表面へのオリゴヌクレオチド-ホスホロチオラートの結合); Burwell, Chemical Technology, 4, 370-377 (1974)及びMatteucci and Caruthers, J. Am. Chem. Soc., 103, 3185-3191 (1981) (シリカ及び金表面へのオリゴヌクレオチド-アルキルシロキサンの結合); Grabar et al., Anal. 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【００４３】
（パターニングすべき基板）
本明細書で開示する方法で使用するのに適した基板として、限定するものではないが、金属、合金、複合材、結晶性材料、非晶質材料、導体、半導体、光学素子、繊維、無機材料、ガラス、セラミック(例えば、金属酸化物、金属窒化物、金属ケイ化物、及びこれらの組合せ)、ゼオライト、ポリマー、プラスチック、有機材料、鉱物、生体材料、生組織、骨、これらの膜、これらの薄膜、これらの積層体、これらの箔、これらの複合材、及びこれらの組合せが挙げられる。基板は半導体を含むことができ、例えば、限定するものではないが、結晶性シリコン、多結晶性シリコン、非晶質シリコン、p-ドープトシリコン、n-ドープトシリコン、酸化シリコン、シリコンゲルマニウム、ゲルマニウム、ヒ化ガリウム、ヒ化リン化ガリウム、酸化インジウムスズ、及びこれらの組合せが挙げられる。基板はガラスを含むことができ、例えば、限定するものではないが、非ドープトシリカガラス(SiO2)、フッ素化シリカガラス、ホウケイ酸ガラス、ホウリンケイ酸(borophosphorosilicate)ガラス、有機ケイ酸ガラス、多孔性有機ケイ酸ガラス、及びこれらの組合せが挙げられる。基板は、非平面基板、例えば熱分解炭素、強化炭素-炭素複合材、炭素フェノール樹脂など、及びこれらの組合せであってよい。基板は、セラミックを含むことができ、例えば、限定するものではないが、炭化ケイ素、水素付加炭化ケイ素、窒化ケイ素、炭窒化ケイ素、オキシ窒化ケイ素、オキシ炭化ケイ素、高温再使用可能表面絶縁材(high-temperature reusable surface insulation)、繊維質耐火性複合材絶縁タイル(fibrous refractory composite insulation tile)、強化ユニピース繊維質絶縁材(toughened unipiece fibrous insulation)、低温再使用可能表面絶縁材、先進再使用可能表面絶縁材、及びこれらの組合せが挙げられる。基板は可撓性材料を含むことができ、例えば、限定するものではないが、プラスチック、金属、これらの複合材、これらの積層体、これらの薄膜、これらの箔、及びこれらの組合せが挙げられる。
【００４４】
（チップアレイの水平化及び基板表面上へのインク組成物の沈着）
本開示方法は、走査プローブ顕微鏡ベースのリソグラフィー法(例えば、ディップペンリソグラフィー)と同様のin situで撮像できる能力、並びにマイクロコンタクトプリンティングと同様の迅速様式でフィーチャーをパターニングする能力を提供する。パターニングできるフィーチャーは、サイズが100nm以下〜1mmの範囲又はそれより大きく、チップアレイの接触時間及び／又は接触圧力を変えることによって制御可能である。DPNと同様に、基板表面上に沈着されるインク組成物の量(フィーチャーサイズによって測定)は、接触時間に比例し、詳細には接触時間と平方根相関である。DPNとは異なり、チップアレイの接触圧力を用いて、基板表面上に沈着し得るインク組成物の量を変えることができる。ピエゾスキャナーのz-ピエゾによって接触圧力を制御することができる。チップアレイ上に及ぼされる圧力(力)が高いほど、フィーチャーサイズが大きい。従って、接触時間と接触力／圧力のいずれの組合せも約30nm〜約1mmの範囲又はそれより大きいフィーチャーサイズを形成するための手段をもたらし得る。数ミリ秒で「直接書込み」又はin situ様式でこのような広範なサイズのフィーチャーを調製する能力は、エレクトロニクス(例えば、回路のパターニング)及びバイオテクノロジー(例えば、生物学的アッセイ用標的の整列)といったリソグラフィー適用の主役に本開示リソグラフィー法を適応できるようにする。チップアレイの接触圧力は、例えば約10MPa〜約300MPaの範囲であり得る。
【００４５】
本明細書に記載の好ましい材料に対して非常に低い接触圧力、例えば約0.01〜約0.1g/cm2の圧力では、結果として生じる表示のフィーチャーサイズは接触圧力と無関係であり、表示のフィーチャーサイズを変えることなく基板表面上のチップアレイを水平化することができる。このような低圧は、チップアレイが取り付けられているピエゾスキャナーのz-ピエゾの0.5μm以下の伸長によって達成され、0.5μm未満のz-ピエゾの伸長によって約0.01g/cm2〜約0.1g/cm2の圧力を印加することができる。この「緩衝」圧力範囲は、チップアレイ、基板、又はその両方を操作して、チップを圧縮することなくチップと基板表面との間の初期接触を生じさせてから、チップの圧縮の度合(チップの内部表面からの反射光の変化によって観察される)を利用して、チップと基板表面との間に均一な接触度を達成できるようにする。チップアレイのチップの不均一な接触が不均一な表示につながり得るので、この水平化能力は重要である。チップアレイのチップ数の多さ(例えば1100万)及びそれらの小さいサイズを考えると、実際問題として、全てのチップが表面と接触しているかを明確に知ることは困難又は不可能であろう。例えば、チップ若しくは基板表面の欠陥、又は基板表面の不規則性が単一のチップは接触させないが、他の全てのチップが均一に接触しているということがある。従って、本開示方法は、少なくとも実質的に全てのチップが基板表面と接触できるようにする(例えば、検出可能な程度まで)。例えば、チップの少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%が基板表面と接触しているであろう。例えば、WO09/132321を参照されたい。
【００４６】
チップアレイと基板表面の相互に対しての水平化は、透明、又は少なくとも半透明のチップアレイ及び共通基板配置によれば、チップアレイの最上部(すなわち、チップ及び共通基板の底部背後)から基板表面に向かう反射光の変化を観察できるという事実によって助長され得る。チップアレイのチップから反射される光の強度は、基板表面と接触すると大きくなる(例えば、チップアレイの内部表面は接触すると異なって光を反射する)。各チップにおける反射光の変化を観察することによって、チップアレイ及び／又は基板表面を調整して、チップアレイの実質的に全て又は全てのチップの基板表面への接触を達成することができる。従って、チップアレイ及び共通基板は、基板表面と接触するとチップの反射光の変化を観察できるようにするため好ましくは半透明又は透明である。同様に、チップアレイに取り付けられるいずれの剛性裏打ち材料も好ましくは少なくとも半透明又は透明である。
チップの接触時間は、基板表面上の任意の特定点における所望のインク組成物の量に応じて、約0.001秒〜約60秒であってよい。ピエゾスキャナーのz-ピエゾを変えることによって、或いはチップアレイを横切る力の適用を制御できる他の手段によって、接触力を制御することができる。
基板表面をチップアレイと複数回接触させることができ、このときチップアレイ、基板表面、又は両方が移動して、基板表面のいろいろな部分が接触できるようになる。各接触工程の時間と圧力は、所望のパターンに応じて同一又は異なっていてよい。表示又はパターンの形状は、実際上の制限はなく、ドット、線(例えば、個々のドットから又は連続的に形成される直線又は曲線)、予め選択されたパターン、又はこれらのいずれの組合せをも含むことができる。
本開示方法から生じる表示は高度の同一性を有し、そのためサイズが均一又は実質的に均一であり、好ましくは形状及び／又は密度も均一又は実質的に均一である。いずれの適切な方法によってもフィーチャーサイズ、例えばドット径、線幅、最広点の幅、又は最狭点の幅を計測することができる。個々の表示のフィーチャーサイズ(例えば、ドット径又は線幅)は非常に均一であり、例えば、約5%、又は約1%、又は約0.5%の許容差内である。許容差は約0.9%、約0.8%、約0.7%、約0.6%、約0.4%、約0.3%、約0.2%、又は約0.1%であり得る。フィーチャーサイズ及び／又は形状の不均一性は、サブミクロンタイプのパターニングに望ましくない可能性がある表示の粗さにつながり得る。
フィーチャーサイズは、約10nm〜約1nm、約10nm〜約500μm、約10nm〜約100μm、約50nm〜約100μm、約50nm〜約50μm、約50nm〜約10μm、約50nm〜約5μm、又は約50nm〜約1μmであり得る。フィーチャーサイズは、1μm未満、約900nm未満、約800nm未満、約700nm未満、約600nm未満、約500nm未満、約400nm未満、約300nm未満、約200nm未満、約100nm未満、又は約90nm未満であり得る。
本明細書で開示する方法を用いてパターニングされたフィーチャーは基板表面上で隔てられ、チップアレイの異なってインク付けされたチップ及び表示のフィーチャーサイズの区別によって決まる。フィーチャーは、例えば500μm未満、400μm未満、300μm未満、200μm未満、又は100μm未満の距離によって隔てられ得る。
表示の密度とは、特定の表示の領域内に存在する生体分子の量(例えば、濃度)を意味する。個々の表示の密度は、約5%、又は約1%、又は約0.5%の許容差であり得る。許容差は、約0.9%、約0.8%、約0.7%、約0.6%、約0.4%、約0.3%、約0.2%、又は約0.1%であり得る。
【００４７】
（パターニングされた基板）
本明細書では、例えば、基板表面上にパターニングされた2以上の生体分子を有する物品のような本開示技術を用いてパターニングされた基板をも開示する。一部の実施形態では、物品は、第1の生体分子を含む表示と、第2の生体分子を含む表示とを含む。本開示方法は、表示の配置の制御を可能にし、かつ誤ったチップへの複数のインクの相互混入をなくすか又は実質的になくことができるので、表示が小さい距離、例えば、750μ以下、500μm以下、400μm以下、300μm以下、200μm以下、又は100μm以下によって隔てられるように、様々なインクからの表示によって表面をパターニングすることができる。このような高密度の様々な生体分子の表示は、種々のアッセイにおいて、例えば、問題の分子の標的となり得る宿主に対する生理活性を評価するために使用できる効率的なアッセイチップをもたらす。本パターニング基板は、同一又は実質的に同一密度の生体分子を有する様々な生体分子の表示の形成をも可能にする。場合によっては、表示は、約10nm〜約1nm、約10nm〜約500μm、約10nm〜約100μm、約50nm〜約100μm、約50nm〜約50μm、約50nm〜約10μm、約50nm〜約5μm、又は約50nm〜約1μmのフィーチャーサイズを有する。フィーチャーサイズは、1μm未満、約900nm未満、約800nm未満、約700nm未満、約600nm未満、約500nm未満、約400nm未満、約300nm未満、約200nm未満、約100nm未満、又は約90nm未満であり得る。
【実施例】
【００４８】
材料：500nmの熱的に蒸着されたSiO2を有するSiウエハ<100>をSilicon Quest Internationalから購入した。CodelinkスライドをSurModicsから購入した。Shipley1805フォトレジスト及びMF319現像液をMicroChemから購入した。1H,1H,2H,2H-ペルフルオロデシルトリクロロシランをGelestから購入した。TRITC結合抗マウスIgG、ウシ血清アルブミン(BSA)、前立腺特異抗原(PSA)タンパク質をSigma-Aldrichから購入した。抗PSAをR & D Systemsから購入した。Alexa Fluor 488及び647モノクロナール抗体標識キット及び抗コレラ毒素β(抗CTβ)抗体をInvitrogenから購入した。抗体をAlexa Fluor色素で製造業者の説明書に従って標識化した。10.119gのNa2HPO4(Sigma-Aldrich)と0.4487gのNaH2PO4(Sigma-Aldrich)を500mLの脱イオン水に溶かして500mLの150mM PBS(pH=8.0)を調製した。HFエッチング溶液をTransene Companyから購入した。イソプロパノール及びアセトンをFisherから購入した。
抗体標識化：抗原をスライドに結合させた後、0.1%のTween 20で補充した0.15M PBSでそれらをすすいだ。次に、0.025%のTween 20と0.1%のBSAを含む0.15M PBSで標識化抗体をそれぞれ100nMの最終濃度に希釈し、表面結合抗原と1時間インキュベートした。次にスライドを0.15M PBS及びTween 20溶液ですすぎ、水で簡単にすすぎ、遠心力で脱水した。
【００４９】
Siインクウェル及びSiマスターの製作：Shipley1805(MicroChem, Inc.)フォトレジストをSiウエハ上に500nm厚のSiO2最上層でスピンコーティングした。クロムマスクを用いてフォトリソグラフィーによって方形ウェルアレイを製作した。フォトレジストパターンをMF319現像液で現像してから30秒間O2プラズマにさらして(200mTorr)残存有機層を除去した。引き続き、基板をHFエッチング溶液内に6分間置いた。各エッチング工程後には表面を清浄化するためMiliQ水によるおびただしいすすぎが必要だった。次にフォトレジストをアセトンで洗い流してSiO2パターンを露出させた。75℃で激しく撹拌するKOHエッチング溶液(H2O:イソプロパノール(4:1v/v)中30%のKOH)に約2.5時間SiO2パターニング基板を入れた。Siウエハの未被覆領域を異方的にエッチングすると、結果として凹所のあるピラミッドが形成された。残存SiO2層を再びHFエッチング溶液で除去した。最後に、1H,1H,2H,2H-ペルフルオロデシルトリクロロシランを用いて気相シラン処理によってピラミッド状のインクウェル／マスターを改変した。
ポリマーペンアレイの製作：ポリマーペンアレイの製作のためHard PDMS(h-PDMS)を使用した。h-PDMSは、3.4gのビニル化合物リッチプレポリマー(VDT-731, Gelest)及び1.0gのヒドロシランリッチ架橋剤(HMS-301)で構成された。ポリマーの調製は典型的に、ビニルフラクションに20ppm w/wの白金触媒(キシレン中の白金ジビニルテトラメチルジシロキサン錯体, SIP 6831.1, Gelest)を添加し、この混合物に0.1% w/wのモジュレーター(2,4,6,8-テトラメチルテトラビニルシクロテトラシロキサン, Fluka)を添加する必要があった。混合物を撹拌し、脱気し、ポリマーペンアレイマスターの最上部に注いだ。予め清浄化したスライドガラスを次にエラストマーアレイの最上部に置き、この組立品全体を70℃で一晩硬化させた。このポリマーペンアレイを最後にピラミッド状マスターから分離してからポリマーペンリソグラフィー実験に用いた。
【００５０】
ポリマーペンアレイのインク付け及びインク付けされたポリマーペンアレイによる基板のパターニング：ポリマーペンアレイと適合するウェル間間隔及び寸法を有するSiインクウェルアレイをまずインクジェットプリンティングによってタンパク質インクで充填した。インク溶液は、リン酸緩衝食塩水(PBS,pH=8.0)中0.1mg/mLのタンパク質分子と5wt%のグリセロールで構成された。グリセロール分子は担体として働き、ポリマーペン上のインクの移動性を高めることに注目されたい。プライミング、吸引、及び分配サイクルを通じてPiezorray(PerkinElmer, Waltham, MA)インクジェットプリンターをプログラムして、隣接ウェルを汚すことなく、問題のタンパク質分子で選択的に各ウェルにアドレスしてインク付け(充填)した。
引き続き、ポリマーペンアレイを酸素プラズマで30秒間処理して表面を親水性にし、タンパク質分子の非特異接着を最小限にした。親水性ペンアレイをナノリソグラフィー機器(例えばNanoInk, Skokie, ILのNSCRIPTORTM又はPark Systems Co., Suwon, KoreaのPark AFMプラットフォームXEP)内に置き、ペンアレイのチップをインクウェルアレイのウェルに接触させることによって、インクウェルに約90%の湿度にて約10分間浸した。ポリマーペンアレイが透明なので、この2Dペンアレイを容易に水平化、整列、及び浸漬させ、かつインク付けを光学的確認することができる。次に、表面においてN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル末端官能基で改変されたCodelinkTMスライド上に、インク付けされたポリマーペンアレイを用いて直接書き込んだ。このパターニングされたスライドを一晩4℃でインキュベートしてタンパク質上のアミン基をNHSエステルと反応させた。最後に、スライドをウシ血清アルブミン(BSA)で1時間不動態化し、PBS緩衝液ですすぎ、乾燥させた。
【００５１】
パターニングされた基板を用いるアッセイ法：5×5個の前立腺特異抗原(PSA)アレイを、チップ-基板接触時間及び接触力を増やしながら、PPLでCodelinkTMスライド上にパターニングした。このタンパク質チップを100nMのAlex Fluor 488結合抗PSAを含むPBS(pH=7.4)溶液に1時間浸すことによって、その対応抗体で標識化した後、すすぎ、乾燥させ、蛍光顕微鏡で撮像した。図2Dに示すように、抗PSAは、検出できないバックグラウンドによって選択的にPSA領域上に結合した。これは、PSAがポリマーペンアレイプロセスの間、その生理活性を維持したことを示している。フィーチャーサイズは、接触力の増加と共に1.1μmから3.2μmに増加した。興味深いことに、チップ-基板接触時間の増加と共に蛍光強度が増加した。これはおそらく、接触時間が短いほど、沈着されるPSA密度が低いためであろう。
【００５２】
前記内容は、本発明を説明かつ例証するが、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明を限定するものではない。本明細書で開示し、また特許請求した全ての方法は、本開示に照らして、過度の実験を行なうことなく、構成かつ実行され得る。この発明の材料及び方法を特定の実施形態に関して記載したが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の材料及び／又は方法に変更を加えることができ、また本明細書に記載の方法の工程又は工程の順序に変更を加え得ることが当業者には明らかであろう。さらに詳細には、本明細書に記載の薬剤の代わりに、化学的にも生理学的にも関連する一定の薬剤を用いても同一又は類似の結果が達成されることが明らかであろう。
本明細書で引用した全ての特許、刊行物及び参考文献は、参照によって完全に本明細書に援用される。本開示と援用された特許、刊行物及び参考文献との間で矛盾する場合は、本開示が支配するものとする。
【００５３】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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