(57)【要約】本発明はフルフラールに対する耐性が増大している細菌及び調製方法に関する。本発明は当該細菌及び対応するキットを用いてエタノールを生産する方法にも関している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
当該細菌が参照する細菌と比較してフルフラールに対する耐性を増大している、単離された細菌。
【請求項２】
当該細菌がエタノール生産性である、請求項１に記載の単離された細菌。
【請求項３】
当該細菌が、参照する細菌と比較してエタノール生産を増大している、請求項１に記載の単離された細菌。
【請求項４】
参照する細菌と比較して、ｙｑｈＤ遺伝子の発現が減少している、請求項１に記載の単離された細菌。
【請求項５】
参照する細菌における発現と比較して、ｙｑｈＤ遺伝子及びｄｋｇＡ遺伝子の発現が減少している、請求項１に記載の単離された細菌。
【請求項６】
参照する細菌における発現と比較して、ｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少している、請求項１に記載の単離された細菌。
【請求項７】
ｙｇｈＤ遺伝子が発現されない、請求項１に記載の単離された細菌。
【請求項８】
ｙｇｈＤ遺伝子及びｄｋｇＡ遺伝子が発現されない、請求項１に記載の単離された細菌。
【請求項９】
ｙｑｈＣ遺伝子が発現されない、請求項１に記載の単離された細菌。
【請求項１０】
参照する細菌と比較して、ｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少している、請求項４、５、７又は８の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項１１】
ｙｑｈＣ遺伝子が欠失している、請求項４、５、７又は８の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項１２】
参照する細菌と比較して、ＹｑｈＤタンパク質の活性が減少している、請求項１に記載の単離された細菌。
【請求項１３】
参照する細菌と比較して、ＹｑｈＤタンパク質の活性及びＤｋｇＡタンパク質の活性が減少している、請求項１に記載の単離された細菌。
【請求項１４】
参照する細菌と比較して、ＹｑｈＣタンパク質の活性が減少している、請求項１に記載の単離された細菌。
【請求項１５】
参照する細菌と比較して、ｙｑｈＤ遺伝子の発現の調節が修正されている、請求項１に記載の単離された細菌。
【請求項１６】
参照する細菌の発現と比較して、ｙｑｈＤ遺伝子の発現の調節及びｄｋｇＡ遺伝子の調節が修正されている、請求項１に記載の単離された細菌。
【請求項１７】
参照する細菌の発現と比較して、ｙｑｈＣ遺伝子の発現の調節が修正されている、請求項１に記載の単離された細菌。
【請求項１８】
参照する細菌と比較して、ｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少している、請求項１２、１３、１５又は１６の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項１９】
ｙｑｈＣ遺伝子が欠失している、請求項１２、１３、１５又は１６の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項２０】
ｙｑｈＤ遺伝子のプロモーター又は調節タンパク質の活性に変化がある、請求項１２又は１３に記載の単離された細菌。
【請求項２１】
ｄｋｇＡ遺伝子のプロモーター又は調節タンパク質の活性に変化がある、請求項１３に記載の単離された細菌。
【請求項２２】
アンチセンスＲＮＡの付加によってＹｑｈＤ、ＤｋｇＡ、及び／又はＹｑｈＣタンパク質のレベルが減少している、請求項１に記載の単離された細菌。
【請求項２３】
ｓｉＲＮＡの付加によってＹｑｈＤ、ＤｋｇＡ、及び／又はＹｑｈＣタンパク質のレベルが減少している、請求項１に記載の単離された細菌。
【請求項２４】
当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程：
ａ）フルフラールの存在下で細菌の候補突然変異株を生育すること；及び
ｂ）フルフラールの存在下でエタノールを生産する突然変異体を選択すること：
を含有してなる処理工程によって調製される、ＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元酵素活性の発現が減少している単離された細菌。
【請求項２５】
当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程：
ａ）増大する濃度のフルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及び
ｂ）フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：
を含有してなる処理工程によって調製される、ＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元酵素活性の発現が減少している単離された細菌。
【請求項２６】
ＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元酵素がＹｑｈＤ又はＤｋｇＡである、請求項２４又は２５に記載の単離された細菌。
【請求項２７】
ＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元酵素がＹｑｈＤ及びＤｋｇＡである、請求項２４又は２５に記載の単離された細菌。
【請求項２８】
当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌は工程：
ａ）フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及び
ｂ）フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、ｙｑｈＤ遺伝子の発現が減少している単離された細菌。
【請求項２９】
当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程：
ａ）増大する濃度のフルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及び
ｂ）フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、ｙｑｈＤ遺伝子の発現が減少している単離された細菌。
【請求項３０】
当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程：
ａ）フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及び
ｂ）フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、ｙｑｈＤ遺伝子及びｄｋｇＡ遺伝子の発現が減少している単離された細菌。
【請求項３１】
当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程：
ａ）増大する濃度のフルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及び
ｂ）フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、ｙｑｈＤ遺伝子及びｄｋｇＡ遺伝子の発現が減少している単離された細菌。
【請求項３２】
ｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少している、請求項２８〜３１の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項３３】
ｙｑｈＣ遺伝子が欠失している、請求項２８〜３１の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項３４】
当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程：
ａ）フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及び
ｂ）フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、ｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少している単離された細菌。
【請求項３５】
当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程：
ａ）増大する濃度のフルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及び
ｂ）フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、ｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少している単離された細菌。
【請求項３６】
当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程：
ａ）ｙｑｈＤ遺伝子の発現を減少すること；
ｂ）フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及び
ｃ）フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：
を含有してなる処理工程によって調製される、ＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元酵素活性の発現が減少している単離された細菌。
【請求項３７】
当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程：
ａ）ｙｑｈＤ遺伝子及びｄｋｇＡ遺伝子の発現を減少すること；
ｂ）フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及び
ｃ）フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：
を含有してなる処理工程によって調製される、ＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元酵素活性の発現が減少している単離された細菌。
【請求項３８】
ｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少している、請求項３６又は３７に記載の単離された細菌。
【請求項３９】
ｙｑｈＣ遺伝子が欠失している、請求項３６又は３７に記載の単離された細菌。
【請求項４０】
当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程：
ａ）ｙｑｈＣ遺伝子の発現を減少すること；
ｂ）フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及び
ｃ）フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：
を含有してなる処理工程によって調製される、ＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元酵素活性の発現が減少している単離された細菌。
【請求項４１】
当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程：
ａ）ｙｑｈＤ遺伝子の発現を減少すること；
ａ）フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及び
ｂ）フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：
を含有してなる処理工程によって調製される、ｙｑｈＤ遺伝子の発現が減少している単離された細菌。
【請求項４２】
当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程：
ａ）ｙｑｈＤ遺伝子及びｄｋｇＡ遺伝子の発現を減少すること；
ａ）フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及び
ｂ）フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：
を含有してなる処理工程によって調製される、ｙｑｈＤ遺伝子及びｄｋｇＡ遺伝子の発現が減少している単離された細菌。
【請求項４３】
ｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少している、請求項４１又は４２に記載の単離された細菌。
【請求項４４】
ｙｑｈＣ遺伝子が欠失している、請求項４１又は４２に記載の単離された細菌。
【請求項４５】
当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程：
ａ）ｙｑｈＣ遺伝子の発現を減少すること；
ａ）フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及び
ｂ）フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：
を含有してなる処理工程によって調製される、ｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少している単離された細菌。
【請求項４６】
当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程：
ａ）フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及び
ｂ）フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、ＹｑｈＤタンパク質の活性が減少又は除去されている単離された細菌。
【請求項４７】
当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程：
ａ）増大する濃度のフルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及び
ｂ）フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、ＹｑｈＤタンパク質の活性が減少している単離された細菌。
【請求項４８】
当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程：
ａ）フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及び
ｂ）フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、ＹｑｈＤタンパク質及びＤｋｇＡタンパク質の活性が減少又は除去されている単離された細菌。
【請求項４９】
当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程：
ａ）増大する濃度のフルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及び
ｂ）フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、ＹｑｈＤタンパク質及びＤｋｇＡタンパク質の活性が減少している単離された細菌。
【請求項５０】
ｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少している、請求項４６〜４９の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項５１】
ｙｑｈＣ遺伝子が欠失している、請求項４６〜４９の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項５２】
当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程：
ａ）フルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及び
ｂ）フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、ＹｑｈＣタンパク質の活性が減少又は消去されている単離された細菌。
【請求項５３】
当該細菌がエタノールを生産できて、そして当該細菌が工程：
ａ）増大する濃度のフルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及び
ｂ）フルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：
を含有してなる処理工程によって調製される、参照する細菌と比較して、ＹｑｈＣタンパク質の活性が減少している単離された細菌。
【請求項５４】
参照する細菌と比較して、当該細菌が、フルフラールの存在下におけるエタノール生産を増大している、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項５５】
参照する細菌と比較して、当該細菌が、５−ヒドロキシメチルフルフラール（５−ＨＭＦ）の存在下におけるエタノール生産を増大している、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項５６】
参照する細菌と比較して、当該細菌が、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、及び桂皮アルデヒドよりなる群から選ばれるアルデヒドの存在下におけるエタノール生産を増大している、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項５７】
参照する細菌と比較して、当該細菌が、メチルグリオキサールの存在下におけるエタノール生産を増大している、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項５８】
参照する細菌と比較して、当該細菌が、フルフラールの還元的除去のレベルが減少している場合に、エタノール生産を増大している、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項５９】
参照する細菌と比較して、当該細菌が、フルフラールの代謝を減少している、請求項１〜５２の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項６０】
当該細菌が検出可能なフルフラールの代謝を示さない、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項６１】
参照する細菌と比較して、当該細菌の生育が増大している、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項６２】
参照する細菌と比較して、当該細菌のフルフラールの存在下での生育が増大している、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項６３】
参照する細菌と比較して、当該細菌のフルフラールの存在下での生育が増大し及びエタノール生産が増大している、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項６４】
参照する細菌と比較して、当該細菌の５−ＨＭＦの存在下での生育が増大している、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項６５】
参照する細菌と比較して、当該細菌の５−ＨＭＦの存在下での生育が増大し及びエタノール生産が増大している、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項６６】
参照する細菌と比較して、当該細菌がフルフラール還元酵素活性を減少する、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項６７】
当該細菌がＮＡＤＰＨの５−ＨＭＦ依存性酸化の速度を減少する、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項６８】
ｙｑｈＣ遺伝子中のＩＳ１０の挿入にによってｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少している、請求項１に記載の単離された細菌。
【請求項６９】
参照する細菌と比較して、当該細菌が加水分解物の存在下での生育を増大している、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項７０】
加水分解物が、バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス又はセルロース系バイオマスに由来している、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項７１】
当該細菌が主発酵産物としてエタノールを生産する、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項７２】
エタノールが嫌気的条件下で生産される、請求項７１に記載の単離された細菌。
【請求項７３】
エタノールが微好気的条件下で生産される、請求項７１に記載の単離された細菌。
【請求項７４】
当該細菌が非組み換え型である、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項７５】
当該細菌が組み換え型である、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項７６】
当該細菌がグラム陰性である、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項７７】
当該細菌がグラム陽性である、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項７８】
グラム陰性細菌が、アシネトバクター属、グルコノバクター属、ザイモモナス属、エシェリキア属、ジオバクター属、シェワネラ属、サルモネラ属、エンテロバクター属及びクレブシエラ属よりなる群から選ばれる、請求項７６に記載の単離された細菌。
【請求項７９】
グラム陽性菌が、バチルス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、オエノコッカス属、ストレプトコッカス属及びユーバクテ
リウム属よりなる群から選ばれる、請求項７７に記載の単離された細菌。
【請求項８０】
細菌が大腸菌である、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項８１】
細菌がクレブシエラ・オキシトカである、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌。
【請求項８２】
細菌が、大腸菌ＥＭＦＲ９株である、請求項８０に記載の非組み換え型細菌。
【請求項８３】
バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖を、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌と接触させて、それによってバイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産することを含有してなる、バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産する方法。
【請求項８４】
バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖を、請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌と接触させて、それによってバイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産することを含有してなる、フルフラールの存在下で、バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産する方法。
【請求項８５】
請求項１〜５３の何れか一項に記載の単離された細菌を含有してなる、キット。
【請求項８６】
Agricultural Research Culture Collection に寄託された、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０２３９で表される、大腸菌ＬＹ１８０株。
【請求項８７】
請求項８３又は８４に記載の方法で生産されたエタノール。
【請求項８８】
ｙｑｈＣ遺伝子の非存在下で発現の増大又は減少を示す遺伝子を含有してなる、マイクロアレイ。
【請求項８９】
図２８に示される配列及びその断片、並びにそれらの突然変異体を含有してなる、単離されたｙｑｈＤプロモーター。
【請求項９０】
フルフラール、５−ＨＭＦ、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、桂皮アルデヒド、及びメチルグリオキサールの内の少なくとも１つの存在下で、参照する細菌と比較して、遺伝子の発現を調節するための、ｙｑｈＤプロモーターの使用。
【請求項９１】
参照する細菌と比較して、当該細菌がフルフラールに対する耐性を増大して、そして参照する細菌と比較して、ＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素の発現及び／又は活性が減少している、単離された細菌。
【請求項９２】
当該ＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素が、ＹｑｈＤのＫｍ及び／又はＤｋｇＡのＫｍ未満か又は等しいＫｍを有している、請求項９１に記載の単離された細菌。
【請求項９３】
Agricultural Research Culture Collection に寄託された、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０２４０で表される、大腸菌ＥＭＦＲ９株。
【請求項９４】
Agricultural Research Culture Collection に寄託された、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０２４１で表される、大腸菌ＥＭＦＲ１７株。
【請求項９５】
Agricultural Research Culture Collection に寄託された、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０２４２で表される、大腸菌ＥＭＦＲ２６株。
【請求項９６】
Agricultural Research Culture Collection に寄託された、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０２４３で表される、大腸菌ＥＭＦＲ３５株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）本出願は、２００９年３月５日出願の米国仮特許出願第６１／２０９，３３４号の優先権を主張し、その開示の全てが参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
（政府の支援研究）
本発明は、米国エネルギー省から与えられた、契約番号第ＤＥ−ＦＧ０２−９６ＥＲ２０２２２、ＤＥ−ＦＧ３６−０８ＧＯ８８１４２、及びＤＥ−ＦＣ３６−ＧＯ１７０５８による米国政府の支援によってなされた。米国政府は本発明に対してある特定の権利を有している。
【背景技術】
【０００３】
多数の発酵産物は、糖を用いて基質としてのリグノセルロース系バイオマスから作ることができる（Hahn-Hagerdal et al. 2006. Trends Biotechnol. 24:549-556; Jarboe et al. 2007 Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 108:237-261, Katahira et al. 2006 Appl. Microbiol. Biotechnol. 72:1136-1143, Tokiwa et al. 2008. Can. J. Chem.86:548-555）。しかしながら、発酵の前に炭化水素ポリマーであるセルロースとヘミセルロースを、化学工程と酵素工程を組み合わせて用いて可溶性の糖に変換しなければならない（Um et al. 2003 Appl Biochem Biotechnol. 105-108:115-125; Wyman et al. 2005. 96:2026-2032）。化学工程は、微生物生体触媒の代謝に対して悪影響があるアルコール、酸、及びアルデヒドのような微量生成物の混合物を生産する副反応を伴う。アルコール類（カテコール、シリンゴール等）については、細胞膜を透過して作用すること及び分子の疎水性とよく相関している毒性が示されている（Zaldivar et al. 2000 Biotechnol. Bioeng. 68:524-530）。有機酸（酢酸塩、ギ酸塩等）は中性形態で膜を通過して細胞質内でイオン化し、プロトン駆動力を破壊して生育を阻止すると考えられている（Palmqvist et al. 2000. Bioresour. Technol. 74:25-33, Zaldivar et al. 1999. Biotechnol. Bioeng. 66: 203-210）。アルデヒドの阻害メカニズムはさらに複雑である。アルデヒドは、直接的な物理的及び代謝的作用に加えて、多くの細胞成分と反応して生成物を形成することができる（Modig et al. 2002 Biochem. J. 363:769-776, Singh et al. 1995 Mutat. Res 337:9-17）。概して、化学的な前処理由来のこれら微量生成物は細胞の生育を遅らせてバイオマス由来の糖類の発酵の速度を落とす（Horvath et al. 2001. Biotechnol. Bioeng. 75:540-549, Palmqvist et al. 2000. Bioresour. Technol. 74:17-24）。
【０００４】
フルフラール（ペントース糖類の脱水生成物）には特に重要性がある。フルフラールはリグノセルロース分解における天然の産物である。フルフラールは、酸性条件下でのセルロース系バイオマスの解重合の間に起こるペントース糖類の脱水によっても形成される（Martinez et al.  2001 Biotechnol. Prog. 17:287-293）。この化合物はヘミセルロースシロップの毒性の重要な要因であって、他の化合物の毒性を増強する（Zaldivar et al. 1999. Biotechnol. Bioeng. 65: 24-33）。ヘミセルロースの希釈加水分解物中のヘミセルロース含量が毒性と相関している（Martinez et al., 2000. Biotechnol. Bioengin. 69(5): 526-536）。フルフラールの再添加が毒性を回復させる一方で、石灰の添加（ｐＨ１０）によるフルフラールの除去は加水分解物を容易に発酵させる（Martinez et al. 2001. Biotechnol Prog 17: 287-293）。フルフラールは、ヘミセルロースの酸加水分解物中に存在していることが知られているその他の化合物の毒性を高めるということも示されている（Zaldivar et al. 1999. Biotechnol. Bioeng. 65: 24-33; Zaldivar et al. 1999 Biotechnol. Bioeng. 66: 203-210; Zaldivar et al. 2000 Biotechnol. Bioeng. 68:524-530）。フルフラールは、ＤＮＡ構造及び配列を変え（Barciszewski et al. 1997 FEBS letters. 414:457-460, Khan et al., 1995 Cancer Lett. 89:95-99）、糖分解酵素を阻害し（Gorsich et al. 2006 Appl. Microbiol. Biotechnol.71:339-349）、そして糖代謝を遅らせる（Hristozova et al. 2006. Enzyme Microbiol. Technol. 39:1108-1112）ことが報告されている。
【０００５】
リグノセルロース系バイオマスは、再生可能な燃料及び化学製品への微生物変換の重要な原料である。発酵の前に、酸、酵素又はこの組み合わせを用いて炭化水素化合物（セルロース及びヘミセルロース）を可溶性の糖に変換しなければならない（Cheng et al. 2008 Biochem. Eng J 38:105-109; Wyman et al. 2005 Bioresour Technol. 96:2026-2032; Um et al. 2003 Appl Biochem Biotechnol 105:115-125）。鉱酸を用いる蒸気前処理の間に、ヘキソース及びペントース糖類の脱水から、それぞれ５−ヒドロキシメチルフルフラール（５−ＨＭＦ）及びフルフラールが微量であるが、毒性副生成物として生成する（Martinez et al. 2000a Biotechnol Bioeng 69:526-536; Palmqvist and Hahn-Hagerdal 2000b Bioresour Technol 74:25-33）。５−ＨＭＦはエタノール生産大腸菌（E.coli:Zaldivar et al. 1999 Biotechnol Bioeng）及びサッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae:Almeida et al. 2008 Appl Microbiol Biotechnol 78:939-945; Palmqvist and Hahn-Hagerdal 2000a Bioresour Technol 74: 17-24; Taherzadeh et al. 2000 Appl Microbiol Biotechnol 53:701-708）の生育及び発酵を遅らせるということが示されている。
【０００６】
高温でｐＨ１０の過剰な石灰で処理することによって、ヘミセルロース加水分解物からフランを除去することができる（Martinez et al. 2000a Biotechnol Bioeng 69:526-536）。この処理工程は、セルロース繊維からの加水分解物シロップの効率的な分離、石灰を混合するための特殊な装置、不溶性カルシウム塩からのシロップの分離、及び廃棄処理のための固形廃棄物の作出を必要とする。フラン耐性生体触媒の開発によりこの工程の複雑さの大半を除去できた。幾つかの腸内細菌属（クレブシエラ（Klebsiella）、エンテロバクター（Enterobacter）、エシェリキア（Escherichia）、シトロバクター（Citrobacter）、エドワードシエラ（Edwardsiella）、プロテウス（Proteus））及び酵母は、５−ＨＭＦを、毒性の少ない化合物である５−ヒドロキシメチルフルフリルアルコールに変換するということが示されている（Boopathy et al. 1993 J Indus Microbiol 11:147-150; Palmqvist and Hahn-Hagerdal 2000a Bioresour Technol 74:17-24; Zaldivar et al. 1999 Biotechnol Bioeng 65:24-33）。Ｓ．セルビシエは、５−ＨＭＦ及びフルフラールを毒性の少ない生成物に還元できる、複数の酸化還元酵素（ＹＧＬ１５７Ｗ、ＡＤＨ６、及び突然変異ＡＤＨ１）を産生するということが示されている（Almeida et al. 2008 Appl Microbiol Biotechnol 78:939-945; Almeida et al. 2009 Appl Microbiol Biotechnol 82: 625-638; Heer et al. 2009 Appl Environ Microbiol doi:10.1128/AEM.01649-9; Liu et al. 2009 Gene 446: 1-10）。これらの遺伝子の増大した発現が５−ＨＭＦの幾つかの面に有用であるということが示されているが、フルフラールの最小阻止濃度を増大することは示されていない。Gorisch et al. (2006 Appl Microbiol Biotechnol 71: 339-349) は、Ｓ．セルビシエにおいて、フルフラール及び５−ＨＭＦへの感受性を増大する、多くの遺伝子不活性化を確認した。１つの遺伝子、ＺＷＦ１（グルコース６−リン酸脱水素酵素）の過剰発現はフルフラールに対する耐性を増大した。
【０００７】
これらの阻害物質の存在下で発酵生物が機能する能力は広く研究されてきた。サッカロミセス・セルビシエのアルギン酸塩への封入は、ヘミセルロースの酸加水分解物中の発酵を保護して且つ改善するということが示されている（Talebnia et al. 2006 J Biotechnol.  125:377-384）。Ｓ．セルビシエの菌株は加水分解物阻害物質に対する改善された耐性を有していると先に記載されている（Almeida et al. 2007. J. Chem. Technol. Biotechnol. 82:340-349, Martin et al. 2007.  Bioresour. Technol. 98:1767-1773, Nilsson et al. 2005. Appl. Environ. Microbiol 71:7866-7871）。大腸菌（エシェリキア・コリ、Gutierrez et al. 2006 J. Bacteriol. 121:154-164）Ｓ．セルビシエ（Almeida et al. 2008 Appl. Microbiol. Biotechnol. 78:939-945）及びその他の微生物（Boopathy et al. 1993 J. Indust. Microbiol. 11:147-150）は、フルフラールを毒性の少ない産生物であるフルリルアルコールに還元することを触媒する酵素を含有している、ということが示されている（Zaldivar et al., 2000 Biotechnol. Bioeng. 68:524-530）。大腸菌では、フルフラール還元酵素の活性はＮＡＤＰＨ依存性であると考えられる（Gutierrez et al. 2006. J. Bacteriol. 121:154-164）。ＮＡＤＰＨ依存性のフルフラール還元酵素は、他のものも存在するかもしれないが、大腸菌から精製された。５−ヒドロキシメチルフルフラール（ヘキソース糖の脱水産物）を還元する能力があるＮＡＤＰＨ依存性酵素が、Ｓ．セルビシエにおいて特定化されて、ＡＤＨ６遺伝子であると確認された（Petersson et al. 2006. YEAST.  23:455-464）。
【０００８】
ｙｑｈＤ遺伝子は、プロパンジオールの生産に用いることができる（Nakamura et al. 2003. Current Opinion in Biotechnology. 14:454-459, Zhang et al. 2006 World Journal of Microbiology & Biotechnology. 22:945-952）ＮＡＤＰＨ依存性アルデヒド酸化還元酵素をコードするということが先に示されている（Sulzenbacher et al. 2004. J. Mol. Biol. 342:489-502）。この遺伝子は活性酸素種による損傷に対する抵抗をもたらすということも示されている（Perez et al. 2008. J. Biol. Chem. 283:7346-7353）。
ｄｋｇＡ遺伝子は、アスコルビン酸の生成における重要な工程である、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の還元を触媒するということが示されている（Habrych et al. 2002. Biotechnol. Prog. 18:257-2, Yum et al. 1999 Appl. Environ. Microbiol. 65:3341-3346）。この酵素はメチルグリオキサールの還元において機能するとも考えられている（Jeudy er al. 2006. Proteins 62:302-307, Ko et al. 2005. J. Bacteriol 187:5782-5789）。
ｙｑｆＡ遺伝子の機能は知られていないが、脂肪酸代謝に関連している（McCue et al. 2001. Nucleic Acids Res.  29:774-782）酸化還元酵素の膜サブユニットではないかと提案されている（Karp et al. 2007 Nucleic Acids Res. 35:7577-7590）。
【０００９】
大腸菌（エシェリキア・コリ）のｙｑｈＣ遺伝子（ｂ３０１０）は、ＤＮＡ結合タンパク質のＡｒａＣ／ＸｙｌＳファミリーに属する転写調節因子であると予測されている。ｙｑｈＣの推定機能についての今日までの推論は、ＡｒａＣ／ＸｙｌＳファミリーの推定タンパク質配列と膜との間の類似性のみに基づいている。ｙｑｈＣは、大腸菌ゲノムにおいて、ｙｑｈＣと反対の向きに転写されるｙｑｈＤ及びｄｋｇＡに隣接している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の方法は、フルフラール及び／又は５−ＨＭＦの存在下で、微生物の成育及びエタノール生産を調節する酵素の同定を可能にする。
従って、フルフラールの存在下で生育してエタノールを生産できる微生物を産生する能力は、代替エネルギー源の産生に極めて重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の概要）
本発明は単離された細菌に関し、ここで細菌は参照する細菌と比較するとフルフラールに対する耐性が増大している。
【００１２】
一実施態様では、単離された細菌はエタノール生産性である。
【００１３】
別の実施態様では、細菌は参照する細菌と比較するとエタノールの生産を増大する。
【００１４】
別の実施態様では、参照する細菌と比較するとｙｑｈＤ遺伝子の発現が減少している。
【００１５】
別の実施態様では、参照する細菌の発現と比較すると、ｙｑｈＤ遺伝子及びｄｋｇＡ遺伝子の発現が減少している。
【００１６】
別の実施態様では、参照する細菌の発現と比較すると、ｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少している。
【００１７】
別の実施多様では、ｙｑｈＤ遺伝子が発現されない。
【００１８】
別の実施態様では、ｙｑｈＤ遺伝子及びｄｋｇＡ遺伝子が発現されない。
【００１９】
別の実施態様では、ｙｑｈＣ遺伝子が発現されない。
【００２０】
別の実施態様では、参照する細菌と比較するとｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少している。
【００２１】
別の実施態様では、ｙｑｈＣ遺伝子が欠失している。
【００２２】
別の実施態様では、参照する細菌と比較するとＹｑｈＤタンパク質の活性が減少している。
【００２３】
別の実施態様では、参照する細菌と比較するとＹｑｈＤタンパク質の活性及びＤｋｇＡタンパク質の活性が減少している。
【００２４】
別の実施態様では、参照する細菌と比較するとＹｑｈＣタンパク質の活性が減少している。
【００２５】
別の実施態様では、参照する細菌と比較するとｙｑｈＤ遺伝子の発現の調節が修正されている。
【００２６】
別の実施態様では、参照する細菌における発現と比較すると、ｙｑｈＤ遺伝子の発現及びｄｋｇＡ遺伝子の発現の調節が修正されている。
【００２７】
別の実施態様では、参照する細菌における発現と比較すると、ｙｑｈＣ遺伝子の発現の調節が修正されている。
【００２８】
別の実施態様では、参照する細菌と比較すると、ｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少している。
【００２９】
別の実施態様では、ｙｑｈＣ遺伝子が欠失している。
【００３０】
別の実施態様では、ｙｑｈＤ遺伝子プロモーターの活性に変化がある。
【００３１】
別の実施態様では、ｄｋｇＡ遺伝子プロモーターの活性に変化がある。
【００３２】
別の実施態様では、アンチセンスＲＮＡの付加によって、ＹｑｈＤ、ＤｋｇＡ及び／又はＹｑｈＣタンパク質のレベルが減少している。
【００３３】
別の実施態様では、ｓｉＲＮＡの付加によって、ＹｑｈＤ、ＤｋｇＡ及び／又はＹｑｈＣタンパク質のレベルが減少している。
【００３４】
本発明は、ＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元酵素活性の発現が減少している単離された細菌にも関していて、ここで細菌はエタノールを生産できて、そして細菌は、フルフラールの存在下で細菌の候補変異株を生育すること；及びフルフラールの存在下でエタノールを生産する変異株を選択することを含有してなる工程で調製される。
【００３５】
本発明は、ＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元酵素活性の発現が減少している単離された細菌にも関していて、ここで細菌はエタノールを生産できて、そして細菌は、増大する濃度のフルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択することを含有してなる工程で調製される。
【００３６】
別の実施態様では、ＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元酵素は、ＹｑｈＤ又はＤｋｇＡである。
【００３７】
別の実施態様では、ＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元酵素は、ＹｑｈＤ及びＤｋｇＡである。
【００３８】
本発明は、参照する細菌と比較してｙｑｈＤ遺伝子の発現が減少している単離された細菌にも関していて、ここでは細菌はエタノールを生産できて、細菌は、フルフラールの存在下に細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下にエタノールを生産する細菌を選択することを含有してなる工程で調製される。
【００３９】
本発明は、参照する細菌と比較してｙｑｈＤ遺伝子の発現が減少している単離された細菌にも関していて、ここでは細菌はエタノールを生産できて、細菌は、増大する濃度のフルフラールの存在下に細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下にエタノールを生産する細菌を選択することを含有してなる工程で調製される。
【００４０】
本発明は、参照する細菌と比較してｙｑｈＤ遺伝子及びｄｋｇＡ遺伝子の発現が減少している単離された細菌にも関していて、ここでは細菌はエタノールを生産できて、細菌は、フルフラールの存在下に細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下にエタノールを生産する細菌を選択することを含有してなる工程で調製される。
【００４１】
本発明は、参照する細菌と比較してｙｑｈＤ遺伝子及びｄｋｇＡ遺伝子の発現が減少している単離された細菌にも関していて、ここでは細菌はエタノールを生産できて、細菌は、増大する濃度のフルフラールの存在下に細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下にエタノールを生産する細菌を選択することを含有してなる工程で調製される。
【００４２】
一実施態様では、ｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少している。
【００４３】
別の実施態様では、ｙｑｈＣ遺伝子が欠失している。
【００４４】
本発明は、参照する細菌と比較してｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少している単離された細菌にも関していて、ここでは細菌はエタノールを生産できて、細菌は、フルフラールの存在下に細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下にエタノールを生産する細菌を選択することを含有してなる工程で調製される。
【００４５】
本発明は、参照する細菌と比較してｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少している単離された細菌にも関していて、ここでは細菌はエタノールを生産できて、細菌は、増大する濃度のフルフラールの存在下に細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下にエタノールを生産する細菌を選択することを含有してなる工程で調製される。
【００４６】
本発明は、ＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元酵素活性の発現が減少している単離された細菌にも関していて、ここで細菌はエタノールを生産し、ここで細菌は、ｙｑｈＤ遺伝子の発現を減少すること；フルフラールの存在下に細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下にエタノールを生産する細菌を選択することを含有してなる工程で調製される。
【００４７】
本発明は、ＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元酵素活性の発現が減少している単離された細菌にも関していて、ここで細菌はエタノールを生産し、ここで細菌は、ｙｑｈＤ遺伝子及びｄｋｇＡ遺伝子の発現を減少すること；フルフラールの存在下に細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下にエタノールを生産する細菌を選択することを含有してなる工程で調製される。
【００４８】
一実施態様では、ｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少している。
【００４９】
別の実施態様では、ｙｑｈＣ遺伝子が欠失している。
【００５０】
本発明は、ＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元酵素活性の発現が減少している単離された細菌にも関していて、ここで細菌はエタノールを生産し、ここで細菌は、ｙｑｈＣ遺伝子の発現を減少すること；フルフラールの存在下に細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下にエタノールを生産する細菌を選択することを含有してなる工程で調製される。
【００５１】
本発明は、ｙｑｈＤ遺伝子の発現が減少している単離された細菌にも関していて、ここで細菌はエタノールを生産できて、ここで細菌は、ｙｑｈＤ遺伝子の発現を減少すること；フルフラールの存在下に細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下にエタノールを生産する細菌を選択することを含有してなる工程で調製される。
【００５２】
本発明は、ｙｑｈＤ遺伝子及びｄｋｇＡ遺伝子の発現が減少している単離された細菌にも関していて、ここで細菌はエタノールを生産できて、ここで細菌は、ｙｑｈＤ遺伝子及びｄｋｇＡ遺伝子の発現を減少すること；フルフラールの存在下に細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下にエタノールを生産する細菌を選択することを含有してなる工程で調製される。
【００５３】
一実施態様では、ｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少している。
【００５４】
別の実施態様では、ｙｑｈＣ遺伝子が欠失している。
【００５５】
本発明は、ｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少している単離された細菌にも関していて、ここで細菌はエタノールを生産できて、ここで細菌は、ｙｑｈＣ遺伝子の発現を減少すること；フルフラールの存在下に細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下にエタノールを生産する細菌を選択することを含有してなる工程で調製される。
【００５６】
本発明は、参照する細菌と比較するとＹｑｈＤタンパク質の活性が減少しているか或いは除去されている単離された細菌にも関していて、ここで細菌はエタノールを生産できて、ここで細菌は、フルフラールの存在下に細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下にエタノールを生産する細菌を選択することを含有してなる工程で調製される。
【００５７】
本発明は、参照する細菌と比較するとＹｑｈＤタンパク質の活性が減少している単離された細菌にも関していて、ここで細菌はエタノールを生産できて、ここで細菌は、増大する濃度のフルフラールの存在下に細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下にエタノールを生産する細菌を選択することを含有してなる工程で調製される。
【００５８】
本発明は、参照する細菌と比較するとＹｑｈＤタンパク質及びＤｋｇＡタンパク質の活性が減少しているか或いは消去されている単離された細菌にも関していて、ここで細菌はエタノールを生産できて、ここで細菌は、フルフラールの存在下に細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下にエタノールを生産する細菌を選択することを含有してなる工程で調製される。
【００５９】
本発明は、参照する細菌と比較するとＹｑｈＤタンパク質及びＤｋｇＡタンパク質の活性が減少している単離された細菌にも関していて、ここで細菌はエタノールを生産できて、ここで細菌は、増大する濃度のフルフラールの存在下に細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下にエタノールを生産する細菌を選択することを含有してなる工程で調製される。
【００６０】
一実施態様では、ｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少している。
【００６１】
別の実施態様では、ｙｑｈＣ遺伝子が欠失している。
【００６２】
本発明は、参照する細菌と比較するとＹｑｈＣタンパク質の活性が減少しているか或いは除去されている単離された細菌にも関していて、ここで細菌はエタノールを生産できて、ここで細菌は、フルフラールの存在下に細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下にエタノールを生産する細菌を選択することを含有してなる工程で調製される。
【００６３】
本発明は、参照する細菌と比較するとＹｑｈＣタンパク質の活性が減少している単離された細菌にも関していて、ここで細菌はエタノールを生産できて、ここで細菌は、増大する濃度のフルフラールの存在下に細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下にエタノールを生産する細菌を選択することを含有してなる工程で調製される。
【００６４】
一実施態様では、細菌は、参照する細菌と比較すると、フルフラールの存在下でのエタノール生産を増大する。
【００６５】
別の実施態様では、細菌は、参照する細菌と比較すると、５−ヒドロキシメチルフルフラール（５−ＨＭＦ）の存在下でのエタノール生産を増大する。
【００６６】
別の実施態様では、細菌は、参照する細菌と比較すると、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、及び桂皮アルデヒドよりなる群から選ばれるアルデヒドの存在下でのエタノール生産を増大する。
【００６７】
別の実施態様では、細菌は、参照する細菌と比較すると、メチルグリオキサールの存在下でのエタノール生産を増大する。
【００６８】
別の実施態様では、細菌は、参照する細菌と比較すると、フルフラールの還元的除去のレベルが低減しているときの、エタノール生産を増大する。
【００６９】
別の実施態様では、細菌は、参照する細菌と比較すると、フルフラール代謝を減少する。
【００７０】
別の実施態様では、細菌は検出可能なフルフラール代謝を示さない。
【００７１】
別の実施態様では、細菌は、参照する細菌と比較すると、生育を増大している。
【００７２】
別の実施態様では、細菌は、参照する細菌と比較すると、フルフラールの存在下での生育を増大している。
【００７３】
別の実施態様では、細菌は、参照する細菌と比較すると、フルフラールの存在下での生育を増大し、そしてエタノール生産を増大する。
【００７４】
別の実施態様では、細菌は、参照する細菌と比較すると、５−ＨＭＦの存在下での生育を増大している。
【００７５】
別の実施態様では、細菌は、参照する細菌と比較すると、５−ＨＭＦの存在下での生育を増大し、そしてエタノール生産が増大している。
【００７６】
別の実施態様では、細菌は、参照する細菌と比較すると、フルフラール還元酵素活性を減少している。
【００７７】
別の実施態様では、細菌は、ＮＡＤＰＨの５−ＨＭＦ依存性酸化速度を減少している。
【００７８】
別の実施態様では、ＩＳ１０のｙｑｈＣ遺伝子への挿入によって、ｙｑｈＣ遺伝子の発現は減少する。
【００７９】
別の実施態様では、細菌は、参照する細菌と比較すると、加水分解物の存在下での生育を増大している。
【００８０】
別の実施態様では、加水分解物は、バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、又はセルロース系バイオマスに由来している。
【００８１】
別の実施態様では、細菌はエタノールを主発酵産物として生産する。
【００８２】
別の実施態様では、本発明の単離された細菌は嫌気性条件下でエタノールを生産する。
【００８３】
別の実施態様では、エタノールは微好気性条件下で生産される。
【００８４】
別の実施態様では、細菌は非組み換え体である。
【００８５】
別の実施態様では、細菌は組み換え体である。
【００８６】
別の実施態様では、細菌はグラム陰性である。
【００８７】
別の実施態様では、細菌はグラム陽性である。
【００８８】
別の実施態様では、グラム陰性細菌は、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、シュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）及びクレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）よりなる群から選ばれる。
【００８９】
別の実施態様では、グラム陽性細菌は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オエノコッカス属（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）よりなる群から選ばれる。
【００９０】
別の実施態様では、細菌は大腸菌（エシェリキア・コリ）である。
【００９１】
別の実施態様では、本発明の単離された細菌はクレブシエラ・オキシトカ（Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ）である。
【００９２】
別の実施態様では、細菌は大腸菌ＥＭＦＲ９株である。
【００９３】
本発明は、バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖を本発明の単離された細菌と接触させ、それによってバイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産することを含有してなる、バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産する方法にも関している。
【００９４】
本発明は、バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖を本発明の単離された細菌と接触させ、それによってバイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産することを含有してなる、フルフラールの存在下にバイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産する方法にも関している。
【００９５】
本発明は、本発明の単離された何れかの細菌を含有してなる、キットにも関している。
【００９６】
本発明は、Agricultural Research Culture Collection に寄託された寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０２３９で表される大腸菌ＬＹ１８０株にも関している。
【００９７】
本発明は、本発明のエタノール生産方法によって生産されたエタノールにも関している。
【００９８】
本発明は、ｙｑｈＣ遺伝子の非存在下で発現の増大又は減少を示す遺伝子を含有してなるマイクロアレイにも関している。
【００９９】
本発明は、図２８に示される配列及びそれらの断片及び突然変異体又は変異体を含有してなる単離されたｙｑｈＤプロモーターにも関している。
【０１００】
本発明は、参照する細菌と比較すると、フルフラール、５−ＨＭＦ、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、桂皮アルデヒド、及びメチルグリオキサールの内の少なくとも１つの存在下で、遺伝子の発現を調節するためのｙｑｈＤプロモーターの使用にも関している。
【０１０１】
細菌が、参照する細菌と比較するとフルフラールに対する耐性を増大していて、参照する細菌と比較するとＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素の発現及び／又は活性を減少している、単離された細菌。
【０１０２】
一実施態様では、ＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素がＹｑｈＤのＫｍ及び／又はＤｋｇＡのＫｍより低いか又は同等のＫｍを有している、単離された細菌。
【０１０３】
本発明は、ＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素の発現及び／又は活性を減少させて、フルフラール又は５−ＨＭＦに対する細菌の抵抗性又は耐性を増大する方法も提供する。
【０１０４】
本発明は、ＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素の発現及び／又は活性を減少させて、フルフラール又は５−ＨＭＦに対する細菌の抵抗性又は耐性を増大する、ＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素を同定する方法も提供する。
【０１０５】
本発明は、ＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素の発現及び／又は活性を減少させて、フルフラール又は５−ＨＭＦの存在下で細菌の生育を増大することにも関している。
【０１０６】
本発明は、ＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素の発現及び／又は活性を減少させて、フルフラール又は５−ＨＭＦの存在下での細菌によるエタノールの生産を増大することにも関している。
【０１０７】
この方法によると、ＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素は、ＹｑｈＤ又はＤｋｇＡのＫｍより低いか同等のＫｍを有する。
【０１０８】
一実施態様では、ＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素に対する好ましい基質は、ＮＡＤＰＨであって、ＮＡＤＨではない。
【０１０９】
別の実施態様では、ＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素に対する基質は、ＮＡＤＰＨであって、ＮＡＤＨではない。
【０１１０】
本発明は、Agricultural Research Culture Collection に寄託された寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０２４０で表される大腸菌ＥＭＦＲ９株にも関している。
【０１１１】
本発明は、Agricultural Research Culture Collection に寄託された寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０２４１で表される大腸菌ＥＭＦＲ１７株にも関している。
【０１１２】
本発明は、Agricultural Research Culture Collection に寄託された寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０２４２で表される大腸菌ＥＭＦＲ２６株にも関している。
【０１１３】
本発明は、Agricultural Research Culture Collection に寄託された寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０２４３で表される大腸菌ＥＭＦＲ３５株にも関している。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】図１は、ＬＹ１８０の構築に用いられる線状ＤＮＡ断片である。
【図２Ａ−Ｃ】図２Ａ〜Ｃは、キシロース１００ｇ／ＬのｐＨ制御発酵におけるフルフラールの効果である。０．４ｇ／Ｌのフルフラールを用いて発酵（Ａ、Ｂ、及びＣ）。１．０ｇ／Ｌのフルフラールを用いて発酵（Ｄ、Ｅ、及びＦ）。明確にするために、ＥＭＦＲ９及びＬＹ１８０に対するデータを、それぞれ実線及び波線で結んだ。全てに関する記号：■、ＬＹ１８０とフルフラール；▲、ＥＭＦＲ９とフルフラール；□、フルフラールなしのＬＹ１８０；△、フルフラールなしのＥＭＦＲ９。
【図２Ｄ−Ｆ】図２Ｄ〜Ｆは、キシロース１００ｇ／ＬのｐＨ制御発酵におけるフルフラールの効果である。０．４ｇ／Ｌのフルフラールを用いて発酵（Ａ、Ｂ、及びＣ）。１．０ｇ／Ｌのフルフラールを用いて発酵（Ｄ、Ｅ、及びＦ）。明確にするために、ＥＭＦＲ９及びＬＹ１８０に対するデータを、それぞれ実線及び波線で結んだ。全てに関する記号：■、ＬＹ１８０とフルフラール；▲、ＥＭＦＲ９とフルフラール；□、フルフラールなしのＬＹ１８０；△、フルフラールなしのＥＭＦＲ９。
【図３】図３Ａ〜Ｂは、フルフラール還元活性の比較である。  ３Ａは、発酵中の全細胞のインビボ活性である。ＬＹ１８０及び欠失誘導体を網無し棒で示してある。フルフラール耐性変異体、ＥＭＦＲ９及びｙｑｈＤを発現するＥＭＦＲ９（ｐＬＯＩ４３０１）を網掛け棒で示してある。  ３Ｂは、クローン化遺伝子を発現するプラスミドを包含しているＥＭＦＲ９の無細胞抽出物におけるインビトロでのフルフラール還元活性の比較である（順方向、０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘発）。
【図４】図４Ａ〜Ｃは、培地組成物のフルフラール耐性に対する効果を示す。  ４Ａは、キシロース（５０ｇ／Ｌ）を含有しているＡＭ１培地である。  ４Ｂは、グルコースを含有しているＡＭ１培地である。  ４Ｃは、キシロース及び酵母抽出物（１．０ｇ／Ｌ）を含有しているＡＭ１培地である。  全てに関する記号；４８時間培養後の、■：ＬＹ１８０（点線）、及び▲：ＥＭＦＲ９（実線）。
【図５】図５Ａ〜Ｄは、ＥＭＦＲ９における遺伝子発現のフルフラール耐性に対する効果を示す。  図５Ａは、ｄｋｇＡの発現を示す。  図５Ｂは、ｙｑｈＤの発現を示す。  図５Ｃは、ｙｑｆＡの発現を示す。  図５Ｄは、ｙｊｊＮの発現を示す。  全てに関する記号；●、挿入無しｐＣＲ２．１コントロール；□、非誘発性発現；  △、０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘発した発現。
【図６】図６は、フルフラール耐性（１．０ｇ／Ｌ）存在下における生育に対するＬＹ１８０の遺伝子欠失の効果を示す（４８時間培養）。
【図７】図７Ａ〜Ｂは、生育（Ａ）及びエタノール生産（Ｂ）に対するヘミセルロース加水分解物の効果を示す。全てに関する記号；４８時間培養後の、■：ＬＹ１８０（点線）；及び▲：ＥＭＦＲ９（実線）。
【図８】図８Ａ〜Ｃは、大腸菌ゲノムにおけるｙｑｈＣ、ｙｑｈＤ及びｄｋｇＡの配置、並びにｙｑｈＣに自然に生じる変異の位置を示す。  図８Ａは、ＬＹ１８０（フルフラール−感受性、野生型）を示す。  図８Ｂは、ＥＭＦＲ９及びＥＭＦＲ１７（フルフラール耐性）を示す。  図８Ｃは、ＭＭ２０５（フルフラール耐性、加水分解物耐性として選択）を示す。
【図９】図９は、ＲＮＡのマイクロアレイ分析で確認したｙｑｈＤ及びｄｋｇＡの発現レベルを示す。Ｙ軸の発現レベルはｌｏｇ２スケールである。ＬＹ１８０ ０及びＥＭＦＲ９ ０は、フルフラール添加前の発現レベルである。ＬＹ１８０ １５及びＥＭＦＲ９ １５は、フルフラール添加１５分後の発現レベルである。
【図１０】図１０Ａ〜Ｄは、フルフラールの存在下でのＬＹ１８０及びＬＹ１８０ΔｙｑｈＣの生育を示す。発酵期間(時間)に対する細胞密度（光学密度）の関係を示す。  図１０Ａは、ＡＭ１−５％キシロース培地で、０、０．５、１、１．５、及び２ｇ／Ｌフルフラールと培養したＬＹ１８０の生育を示す。  図１０Ｂは、ＬＹ１８０ΔｙｑｈＣの生育を示す。  図１０Ｃは、単一コピープラスミドｐＹｑｈＣを野生型ｙｑｈＣ遺伝子とともにその天然プロモーターの下に担持しているＬｙ１８０ΔｙｑｈＣの生育を示す。  図１０Ｄは、空ベクターｐＣＣ１を担持しているＬｙ１８０ΔｙｑｈＣの生育を示す。
【図１１】図１１は、Ｌｙ１８０及びＬｙ１８０ΔｙｑｈＣによるフルフラール消費の速度を示す。
【図１２】図１２は、蛍ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流にクローン化しているｙｑｈＤ遺伝子のプロモーターを有する、プラスミドｐＰｙｑｈＤ−ｌｕｃの構造を示す。
【図１３】図１３は、フルフラール添加の前及び後のルシフェラーゼの発現を示す。ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＰｙｑｈＤ−ｌｕｃをＬＹ１８０、ＥＭＦＲ９及びＥＭＦＲ１７に導入した。ルシフェラーゼのレベルをフルフラール添加の直前及び添加の１５分後に確認した。Ｙ軸上の値は相対発光単位（relative luminescence unit：ＲＬＵ）である。
【図１４】図１４は、Ｌｙ１８０及びＬｙ１８０ΔｙｑｈＣにおけるｙｑｈＤプロモーターからのルシフェラーゼの発現を示す。
【図１５】図１５は、ＹｑｈＤのプロモーターからの転写において提案されるｙｑｈＣの調節的役割を示すモデルである。
【図１６】図１６Ａ〜Ｂは、ＹｑｈＤのアミノ酸（Ａ）及び核酸（Ｂ）の配列を示す。
【図１７】図１７Ａ〜Ｂは、ＤｋｇＡのアミノ酸（Ａ）及び核酸（Ｂ）の配列を示す。
【図１８】図１８Ａ〜Ｂは、ＹｑｈＣのアミノ酸（Ａ）及び核酸（Ｂ）の配列を示す。
【図１９】図１９は、ＬＹ１８０及びＥＭＦＲ９におけるｙｑｈＣ−ｙｑｈＤ−ｄｋｇＡの配置及び周辺領域を示す。エタノール生産性株ＬＹ１８０（上部）及びフルフラール耐性誘導体ＥＭＦＲ９（下部）におけるｙｑｈＣ、ｙｑｈＤ及びｄｋｇＡのコード領域の位置及び方向を示す。ＬＹ１８０について、ｙｑｈＣの左（ｍｅｔＣ及びｙｇｈＢ）及びｄｋｇＡの右（ｙｑｈＧ、ｙｑｈＨ及びｙｇｉＱ）についての隣接遺伝子が示されている。ＥＭＦＲ９のｙｑｈＣ遺伝子内にＩＳ１０が存在している。ＥｃｏＣｙｃ（Keseler et al. 2009 Nucleic Acids Res. 37: D464-D470）で入手可能な情報に基づいて、公知のプロモーターを矢印（実線）で示してある。ｙｑｈＤの上流のプロモーターを点線の矢印で示してある。
【図２０】図２０Ａ〜Ｂは、フルフラール添加後の、ＬＹ１８０、ＥＭＦＲ９及びＬＹ１８０ΔｙｑｈＣからのｙｑｈＣ−ｙｑｈＤ−ｄｋｇＡ領域中の転写物の発現を示す。転写物レベルは、大腸菌Ｋ１２マイクロアレイに対する総ＲＮＡの発現ハイブリダイゼーションによって確認した。０．５ｇ／Ｌのフルフラール添加の直前、又は添加の１５分後に細胞を採取した。選択遺伝子に対する正規化した発現値は、チップ上に存在する各プローブの５つの複製物から算出したＳＥＭエラーバーと共に示してある。  図２０Ａは、０．５ｇ／Ｌのフルフラールで１５分処理した、或いは処理していないＬＹ１８０株及びＥＭＦＲ９株についての遺伝子ｙｑｈＣ、ｙｑｈＤ及びｄｋｇＡと隣接遺伝子ｙｇｈＢ及びｙｑｈＧの発現レベルを示す。  図２０Ｂは、フルフラールで処理する前及び処理した後のＬＹ１８０及びＬＹ１８０ΔｙｑｈＣ株についてのｙｑｈＣ、ｙｑｈＤ及びｄｋｇＡと隣接遺伝子の発現レベルを示す。
【図２１】図２１Ａ〜Ｄは、フルフラールの存在下での生育に対するｙｑｈＣ欠失の効果を示す。菌株は、５０ｇ／Ｌのキシロースを有し、０、０．５、１、１．５又は２ｇ／Ｌのフルフラールを含有しているＡＭ１培地で生育した。４８時間に渡って３０分間隔で光学密度をモニタリングした。試験した菌株は、ＬＹ１８０（Ａ）、ＬＹ１８０ΔｙｑｈＣ（Ｂ）、ｙｑｈＣ＋を担持している単一コピープラスミドｐＬＯＩ４９０１を含有しているＬＹ１８０ΔｙｑｈＣ（Ｃ）、及び空ベクトルｐＣＣＩを含有しているＬｙ１８０ΔｙｑｈＣ（Ｄ）であった。
【図２２Ａ】図２２Ａ〜Ｃは、蛍ルシフェラーゼレポーターを用いるｙｑｈＤプロモーター活性の測定を示す。  図２２Ａは、ｙｑｈＤの上流プロモーター領域に融合している蛍ルシフェラーゼ遺伝子を担持しているプラスミドｐＬＯＩ４９００の構造である。
【図２２Ｂ−Ｃ】図２２Ｂは、ＬＹ１８０におけるｙｑｈＤプロモーターからの蛍ルシフェラーゼ発現に対するフルフラール添加の効果を示す。ｐＬＯＩ４９００を担持しているＬＹ１８０の培養物をＡＭ１−キシロース（５０ｇ／Ｌ）中で、ＯＤ５５０＝０．４になるまで生育して、０、０．１、０．５、及び１ｇ／Ｌのフルフラール添加の直前（ｔ＝０）及び５、１５、及び３０分後にサンプルを採取した。ルシフェラーゼ活性を０．４ＯＤ５０単位当たりの相対発光単位（ＲＬＵ）として表した。  図２２Ｃは、ＬＹ１８０ΔｙｑｈＣ／ｐＬＯＩ４９００中のｙｑｈＤプロモーターからの蛍ルシフェラーゼ発現を示す。条件及び記号は２２Ｂの通りである。
【図２３】図２３は、選択した細菌のゲノムにおけるｙｑｈＣオルソログの配置を示す。ｙｑｈＣの周辺遺伝子の配置を大腸菌Ｋ１２（最終行）、及びｙｑｈＣオルソログを含有している選択した属について示している。各ゲノムのｙｑｈＣオルソログは太線の輪郭及びクロスハッチングを有している。存在する場合ｙｇｈＤオルソログは遺伝子の上に括弧内「ｙｇｈＤ」として、ｄｋｇＡオルソログは（ｄｋｇＡ）として示されている。遺伝子の下の数字はゲノム中の座標を示す。ゲノムの配置及びオルソログの検出は、ＥｃｏＣｙｃマルチゲノムブラウザーを用いて作成した。
【図２４】図２４Ａ〜Ｆは、嫌気的生育及び発酵に対する５−ＨＭＦの効果を示す。細胞を、キシロース（１００ｇ／Ｌ）を有するＡＭ１無機塩培地中で生育した。  図２４Ａは、１．０ｇ／Ｌの５−ＨＭＦで生育している間の細胞量を示す。  図２４Ｂは、１．０ｇ／Ｌの５−ＨＭＦと発酵している間のエタノール生産を示す。  図２４Ｃは、発酵中の５−ＨＭＦ（１．０ｇ／Ｌ）の還元を示す。  図２４Ｄは、２．５ｇ／Ｌの５−ＨＭＦで生育している間の細胞量を示す。  図２４Ｅは、２．５ｇ／Ｌの５−ＨＭＦと発酵している間のエタノール生産を示す。  図２４Ｆは、発酵中の５−ＨＭＦ（２．５ｇ／Ｌ）の還元を示す。  比較のために５−ＨＭＦ無しでの並行発酵が図Ａ及びＢに含まれている（点線）。全てのデータは標準誤差を有する平均値としてプロットされている（ｎ＝３）。全てに関する記号：□、ＬＹ１８０；及び●、ＥＭＦＲ９。
【図２５】図２５Ａ〜Ｃは、５−ＨＭＦのインビトロ還元及び５−ＨＭＦ耐性に対するＹｑｈＤ及びＦｋｇＡの効果を示す。  図２５Ａは、インビトロにおける５−ＨＭＦ還元に対する比活性度を示す。活性は溶解細胞抽出物（２ｍＭのＮＡＤＰＨ、２０ｍＭの５−ＨＭＦ）中で測定した。  図２５Ｂは、ＥＭＦＲ９（耐性変異体）の細胞収率に対する、プラスミドからのｙｑｈＤ及びｄｋｇＡ発現の効果を示している。実験は、５０ｇ／Ｌのキシロース及び１．０ｇ／Ｌの５−ＨＭＦを含有するＡＭ１培地を用いて試験管培養で実施した（４８時間培養）。プラスミド保持のためのカナマイシンの封入が５−ＨＭＦ耐性を低下することに注目されたい。誘発（Ｉｎｄ．）は０．１ｍＭのＩＰＴＧと生育したものである。  図２５Ｃは、ＬＹ１８０（親株）の細胞収率に対するｙｑｈＤ及びｄｋｇＡ欠失の効果を示す。実験は、５０ｇ／Ｌのキシロース及び２．５ｇ／Ｌの５−ＨＭＦを含有するＡＭ１培地を用いて試験管培養で実施した（４８時間培養）。全てのデータは標準誤差を有する平均値としてプロットされている（ｎ＝４）。
【図２６】図２６Ａ〜Ｃは、５−ＨＭＦ耐性に対するプラスミドからのｐｎｔＡＢ発現の効果を示す。実験は、Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ Ｃ生育曲線分析器と５０ｇ／Ｌのキシロース及び指示されるように５−ＨＭＦを含有しているＡＭ１培地を用いて実施した。全てのデータは標準誤差を有する平均値としてプロットされている（ｎ＝１０）。明確にするために、点を結ぶことを省略してある。  図２６Ａは、補完していない。  図２６Ｂは、０．９ｇ／Ｌの５−ＨＭＦで補完してある。  図２６Ｃは、１．８ｇ／Ｌの５−ＨＭＦで補完してある。全てに関する記号：△、ＬＹ１８０（ｐＴｒｃ９９ａ−対照）；○、ＬＹ１８０（ｐＴｒｃ９９ａ−ｐｎｔＡＢ）誘発されていない；●、ＬＹ１８０（ｐＴｒｃ９９ａ−ｐｎｔＡＢ）０．０１ｍＭのＩＰＴＧで誘発されている。
【図２７】図２７は、ＬＹ１８０の５−ＨＭＦ耐性に対するＬ−システインの効果を示す。実験は、５０ｇ／Ｌのキシロース及び５−ＨＭＦを含有するＡＭ１培地を用いて試験管培養で実施した（２４時間培養）。培養液は、指示されるようにフィルターで滅菌したＬ−システインで補完した。全てのデータは標準誤差を有する平均値としてプロットされている（ｎ＝４）。  図２７Ａは、１．０ｇ／Ｌの５−ＨＭＦを含有している。  図２７Ｂは、２．０ｇ／Ｌの５−ＨＭＦを含有している。
【図２８】図２８は、ｙｑｈＤ及びｄｋｇＡについてのプロモータの方向及び配列を示す。
【図２９Ａ−１】図２９は、ＬＹ１８０（図Ａ）及びＥＭＦＲ９（図Ｂ）由来のｙｑｈＣ−ｙｑｈＤ−ｄｋｇＡ領域を表す。
【図２９Ａ−２】図２９は、ＬＹ１８０（図Ａ）及びＥＭＦＲ９（図Ｂ）由来のｙｑｈＣ−ｙｑｈＤ−ｄｋｇＡ領域を表す。
【図２９Ａ−３】図２９は、ＬＹ１８０（図Ａ）及びＥＭＦＲ９（図Ｂ）由来のｙｑｈＣ−ｙｑｈＤ−ｄｋｇＡ領域を表す。
【図２９Ａ−４】図２９は、ＬＹ１８０（図Ａ）及びＥＭＦＲ９（図Ｂ）由来のｙｑｈＣ−ｙｑｈＤ−ｄｋｇＡ領域を表す。
【図２９Ｂ−１】図２９は、ＬＹ１８０（図Ａ）及びＥＭＦＲ９（図Ｂ）由来のｙｑｈＣ−ｙｑｈＤ−ｄｋｇＡ領域を表す。
【図２９Ｂ−２】図２９は、ＬＹ１８０（図Ａ）及びＥＭＦＲ９（図Ｂ）由来のｙｑｈＣ−ｙｑｈＤ−ｄｋｇＡ領域を表す。
【発明を実施するための形態】
【０１１５】
Ｉ．定義
本明細書で用いられる「単離された」は、他の細菌による汚染を部分的に受けるか又は全く受けていないことを意味する。単離された細菌は、単離された細菌の特性又は機能に影響を及ぼさない他の細菌の少量の存在下に生存できる。単離された細菌は一般に、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％純粋であろう。本発明による単離された細菌は少なくとも９８％又は少なくとも９９％純粋であることが好ましい。
【０１１６】
本明細書で用いられる「細菌」は、「非組み換え細菌」、「組み換え細菌」及び「突然変異細菌」を包含してもよい。
【０１１７】
本明細書で用いられる「非組み換え細菌」は、異種ポリヌクレオチド配列を含有していなく、そして本発明の組成物及び方法を用いて修正するのに適している、例えば形質転換できる、例えば異種ポリヌクレオチド配列を組み込むことができる、例えば遺伝子操作に適している、細菌細胞を包含する。この用語は、もともと形質転換されている細胞の子孫を包含することを意図している。特定の実施態様では、細胞はグラム陰性細菌或いはグラム陽性細胞である。
【０１１８】
細菌に関して本明細書で用いられる「組み換え体」は、異種ポリヌクレオチド配列を含有しているか、或いは天然のポリヌクレオチド配列が変異又は欠失するように処理されている細菌細胞を意味する。
【０１１９】
細菌に関して本明細書で用いられる「突然変異体」は、本明細書の下記に定義するような参照細菌と同一ではない細菌細胞を意味する。
【０１２０】
「突然変異」細菌は、「組み換え」細菌を包含する。
【０１２１】
本明細書で用いられる「エタノール生産性」は、炭化水素から主発酵産物としてエタノールを生産する細菌の能力を意味する。この用語は、天然のエタノール生産性有機物及び天然の或いは誘発された突然変異を有するエタノール生産性有機物、又は遺伝子変化を伴うエタノール生産性有機物を包含することを意図している。
【０１２２】
用語「非エタノール生産性」は細菌が炭化水素から主発酵産物としてエタノールを生産する能力がないことを意味する。この用語は、非ガス性発酵産物全体の約４０％未満を含有している微量の発酵産物としてエタノールを生産する微生物を包含することを意図している。
【０１２３】
本明細書で用いられる「エタノール生産」は、主発酵産物としての炭化水素からのエタノールの生産を意味する。
【０１２４】
本発明で用いられる「エタノールを生産できる」は、本明細書で定義されているように「エタノール生産」ができることを意味する。
【０１２５】
用語「発酵すること」及び「発酵」は、複合糖類の分解又は解重合、その糖残基のエタノール、酢酸エステル及びコハク酸エステルへの生物変換を意味する。この用語は、それによってエタノールが、特に発酵の主産物として、炭化水素から生産される（例えば、溶解物の又は精製したポリペプチド混合物の、例えば、細胞の又は無細胞の）酵素工程を包含することを意図している。
【０１２６】
用語「主発酵産物」及び「主要な発酵産物」は、本明細書で同義に用いられていて、非ガス性産物全体の約５０％以上を含有している非ガス性の発酵産物を包含することを意図している。主発酵産物は、最も大量の非ガス性産物である。本発明のある特定の実施態様では、主発酵産物はエタノールである。
【０１２７】
本明細書で用いられる用語「微量発酵産物」は、非ガス性産物全体の４０％未満を含有している非ガス性の発酵産物を包含することを意図している。本発明のある特定の実施態様では、微量発酵産物はエタノールである。
【０１２８】
用語「糖」は、糖分子（複数も）を含有している炭化水素源の何れもを包含することを意図している。このような糖は、本発明の産物及び方法に従う発酵による、解重合（所望により）及び次のアセトアルデヒドとそれに続くエタノールへの生物変換のための可能性のある糖源である。糖源は、澱粉、ほとんどの植物における貯蔵燃料の主要形態、ヘミセルロース、及びセルロース、剛体細胞壁の主要細胞外構造成分、並びに植物の線維及び木質の組織を包含する。この用語は、単糖とも呼ばれるモノサッカリド、オリゴサッカリド及びポリサッカリドを包含することを意図している。ある特定の実施態様では、糖は例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース、及びラクトースを包含する。別の実施態様では、糖はグルコースである。
【０１２９】
本明細書で用いられる「ＹｑｈＤ」は、ＮＡＤＰＨ依存性アルデヒド酸化還元酵素を意味する。ｙｑｈＤは、ＮＡＤＰＨ依存性アルデヒド酸化還元酵素遺伝子を示し、ここで用語ＹｑｈＤは、ｙｑｈＤ遺伝子産物を示す。ｙｑｈＤ遺伝子及びＹｑｈＤポリペプチドの核酸及びアミノ酸の配列は図１６に示されている。
【０１３０】
本明細書で用いられる「ＤｋｇＡ」は、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の還元を触媒する酵素を意味する。ＤｋｇＡは、メチルグリオキサールの還元において機能を果たす酵素も意味する。ｄｋｇＡは、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の還元を触媒する酵素に対応する遺伝子を示し、ここで用語ＤｋｇＡはｄｋｇＡ遺伝子産物を示す。ｄｋｇＡ遺伝子及びＤｋｇＡポリペプチドの核酸及びアミノ酸の配列は図１７に示されている。
【０１３１】
本明細書で用いられる「ＹｑｈＣ」は、転写制御因子、転写制御因子タンパク質、又は転写制御遺伝子から発現される遺伝子産物を意味する。ｙｑｈＣは転写制御因子に対応する遺伝子を示し、ここで用語ＹｑｈＣはｙｑｈＣ遺伝子産物を示す。ｙｑｈＣ遺伝子及びＹｑｈＣポリペプチドの核酸及びアミノ酸の配列は図１８に示されている。
【０１３２】
本明細書で用いられる「突然変異核酸分子」又は「突然変異遺伝子」は、ポリペプチド又は突然変異体によってコードされ得るポリペプチドが野生型の核酸分子又は遺伝子にコードされるポリペプチドとは異なる活性又は特性を示すように、或いは突然変異遺伝子からポリペプチドが産生されないように、少なくとも１つの修正（例えば、置換、挿入、欠失）を含んでいるヌクレオチド配列を有している核酸分子又は遺伝子を包含することを意図している。
【０１３３】
核酸分子又は遺伝子に関連して本明細書で用いられる「突然変異」は、核酸又は遺伝子の欠失、或いは核酸又は遺伝子の発現レベルの減少を意味し、ここで欠失及び発現の減少が、核酸分子又は遺伝子によってコードされ得るポリペプチドの欠失又はその発現の減少をもたらす。突然変異は、突然変異体によってコードされ得るポリペプチドが野生型の核酸分子又は遺伝子によってコードされるポリペプチドとは異なる活性又は特性を示すように少なくとも１つの修正（例えば、置換、挿入、欠失）を含んでいるヌクレオチド配列を有している核酸分子又は遺伝子も意味する。
【０１３４】
本明細書で用いられる「突然変異タンパク質」又は「突然変異タンパク質又はアミノ酸配列」は、ポリペプチド、又は突然変異アミノ酸配列にコードされ得るポリペプチドが野生型のアミノ酸配列にコードされるポリペプチドとは異なる活性又は特性を示すように、少なくとも１つの修正（例えば、置換、挿入、欠失）を含んでいるアミノ酸配列を包含することを意図している。
【０１３５】
タンパク質又はアミノ酸配列に関連して本明細書で用いられる「突然変異」は、アミノ酸配列のアミノ酸の欠失、或いはアミノ酸配列の発現レベルの減少を意味し、ここで欠失又は発現の減少がアミノ酸配列によってコードされ得るポリペプチドの欠失又は発現の減少をもたらす。突然変異は、ポリペプチド、又は突然変異体にコードされ得るポリペプチドが野生型のアミノ酸配列にコードされるポリペプチドとは異なる活性又は特性を示すように、少なくとも１つの修正（例えば、置換、挿入、欠失）を含んでいるアミノ酸配列を有しているタンパク質又はアミノ酸配列も意味する。
【０１３６】
本明細書で用いられる「断片」又は「サブシーケンス」は、親の又は参照する核酸配列又はアミノ酸配列の部分、或いは親の又は参照する配列、ポリペプチド又は遺伝子をコードするか又は生物学的機能又は特性を保持しているポリペプチド又は遺伝子の部分を包含することを意図している。
【０１３７】
本明細書で用いられる「部分」は、親の又は参照する核酸配列、アミノ酸配列、ポリペプチド又は遺伝子の少なくとも５０％（例えば、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％）を意味する。
【０１３８】
本明細書で用いられる「保持する」（例えば、生物学的機能又は特性を保持する）は、親の又は参照する配列、ポリペプチド又は遺伝子の機能又は特性の少なくとも５０％（例えば、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％）を示すことを意味する。
【０１３９】
「突然変異細菌」は、本明細書の上で定義した「突然変異」を含有している細菌を包含する。
【０１４０】
本明細書で用いられる「参照」又は「参照細菌」は、少なくとも、野生型細菌又は親細菌を包含する。
【０１４１】
本明細書で用いられる「野生型」は、有機体又は菌株の典型的な形態、例えば突然変異が存在しない中で自然に生じる細菌、遺伝子又は特性を意味する。「野生型」は、自然個体群における最も一般的な表現型である。野生型は遺伝子型及び表現型の参照標準である。
【０１４２】
本明細書で用いられる「親の」又は「親細菌」は、目的の細菌を生じる細菌を示す。
【０１４３】
本明細書で用いられる「遺伝子」は、酵素又はその他のポリペプチド分子の合成を誘導できる、例えば、コード配列、例えば、ポリペプチド、それらのサブシーケンス又は断片をコードする、連続するオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を含有できるか、或いはそれ自体が有機体内で機能的な、核酸である。有機体内の遺伝子は、本明細書で定義されているオペロンに群生していて、オペロンは遺伝子間ＤＮＡによって他の遺伝子及び／又はオペロンから分離している。オペロンに含まれている個々の遺伝子は、個々の遺伝子の間で、遺伝子間ＤＮＡなしで、重なり合うことができる。さらに、用語「遺伝子」は、選択された目的のための特異的遺伝子を包含することを意図している。遺伝子は、例えば、エピソームに保持されたプラスミド、又はゲノムに安定に組み込まれているプラスミド（又はその断片）のように、宿主細胞に対して内因性であるか、又は組み換え技術によって宿主細胞に導入することができる。異種遺伝子は、細胞に導入されていて、そしてその細胞由来ではない遺伝子である。
【０１４４】
用語「核酸」は、核酸分子、例えば、ポリペプチド、そのサブシーケンス又は断片をコードするオープン・リーディング・フレームを包含するポリヌクレオチドを包含することを意図していて、更に、非コード調節配列、及びイントロンを包含することができる。更に、この用語は、機能座に位置する１つ又はそれ以上の遺伝子を包含することを意図している。その上、この用語は、選択された目的のための特異的遺伝子を包含することを意図している。
一実施態様では、用語遺伝子は、フルフラール還元酵素、例えば、これに限定されないが、ｙｑｈＤ及びｄｋｇＡを包含するＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元酵素をコードする何れの遺伝子も包含する。
一実施態様では、遺伝子又はポリヌクレオチド断片は、炭化水素のエタノールへの生物変換の少なくとも一工程に関連している。
有機体内の遺伝子は、本明細書で定義されているオペロンに群生していて、オペロンは遺伝子間ＤＮＡによって他の遺伝子及び／又はオペロンから分離している。
【０１４５】
本明細書で用いられる「増加すること」又は「増加する」又は「増加した」は、例えば、参照細菌と比較して、フルフラール耐性である細菌におけるｙｑｈＤ、ｄｋｇＡ及び／又はｙｑｈＣ遺伝子の発現のレベルと比較して、少なくとも５％、例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、１００％又はそれ以上増加することを示す。
【０１４６】
本明細書で用いられる「増加すること」又は「増加する」又は「増加した」は、例えば、参照細菌と比較して、フルフラール耐性である細菌におけるｙｑｈＤ、ｄｋｇＡ及び／又はｙｑｈＣ遺伝子の発現のレベルを比較すると、少なくとも１倍、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００倍又はそれ以上増加することも意味する。
【０１４７】
本明細書で用いられる「減少すること」又は「減少する」又は「減少した」或いは「縮小した」又は「縮小すること」は、例えば、参照細菌と比較して、フルフラール耐性である細菌におけるｙｑｈＤ、ｄｋｇＡ及び／又はｙｑｈＣ遺伝子の発現のレベルと比較して、少なくとも５％、例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、１００％又はそれ以上減少すること又は縮小することを示す。
【０１４８】
本明細書で用いられる「減少すること」又は「減少する」又は「減少した」或いは「縮小した」又は「縮小すること」は、例えば、参照細菌と比較して、フルフラール耐性である細菌におけるｙｑｈＤ、ｄｋｇＡ及び／又はｙｑｈＣ遺伝子の発現のレベルを比較すると、少なくとも１倍、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００倍又はそれ以上減少又は縮小することも意味する。
【０１４９】
「減少した」又は「縮小した」は、活性、発現等のレベルが検出可能ではない、例えば、ｙｑｈＤ、ｄｋｇＡ及び／又はｙｑｈＣ遺伝子の発現レベルが検出可能ではない、或いはＹｑｈＤ、ＤｋｇＡ及び／又はＹｑｈＣタンパク質の活性レベルが検出可能ではないように除去されたことも意味する。
【０１５０】
本明細書で用いられる「活性」は、遺伝子の活性、例えば遺伝子の翻訳のレベルを示す。「活性」は、ｍＲＮＡの活性、例えば、ｍＲＮＡの複写のレベルも示す。「活性」は、タンパク質、例えば、ＹｑｈＤ又はＤｋｇＡ又はＹｑｈＣの活性も示す。
【０１５１】
「活性の増加」は、活性の速度及び／又はレベルの増加を包含する。
【０１５２】
本明細書で用いられる、「ｙｑｈＤの発現」又は「ｄｋｇＡの発現」又は「ｙｑｈＣの発現」にある「発現」は、それぞれに、ｙｑｈＤ遺伝子、ｄｋｇＡ遺伝子、及びｙｑｈＣ遺伝子のタンパク質産物の発現を示す。
【０１５３】
本明細書で用いられる、「ｙｑｈＤの発現」又は「ｄｋｇＡの発現」又は「ｙｑｈＣの発現」にある「「発現」は、それぞれに、ｙｑｈＤ遺伝子、ｄｋｇＡ遺伝子、及びｙｑｈＣ遺伝子に対応するｍＲＮＡ転写の検出可能なレベルの発現も示す。
【０１５４】
それが発現レベルを示す場合の「修正すること」は、目的の、例えば、ｙｑｈＤ、ｄｋｇＡ又はｙｑｈＣの、遺伝子、ｍＲＮＡ、又はタンパク質、の発現を減少させること又は増加させることを意味する。
【０１５５】
それが活性を示す場合の「修正すること」は、目的のタンパク質、例えば、ＹｑｈＤ、ＤｋｇＡ又はＹｑｈＣの活性を減少させること又は増加させることを意味する。
【０１５６】
本明細書で用いられる「発現されない」は、目的の、例えば、ｙｑｈＤ、ｄｋｇＡ又はｙｑｈＣの遺伝子或いはｍＲＮＡの産物のレベルが検出不能であることを意味する。
【０１５７】
本明細書で用いられる「除去する」は、検出不能なレベルまで減少させることを意味する。
【０１５８】
本明細書で用いられる「フルフラールに対する耐性」は、フルフラールの存在下、例えば、０．１ｇ／Ｌ又はそれ以上（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０ｇ／Ｌ又はそれ以上）の濃度のフルフラールの存在下で、生育或いはエタノールを生産する突然変異エタノール生産細菌の能力を意味する。フルフラールに対する耐性は、フルフラールの存在下における生育又はエタノール生産が、野生型細菌又は親細菌による生育又はエタノール生産のレベルと比較して増加しているレベルにあるエタノール生産細菌の能力も意味する。
【０１５９】
本明細書で用いられるフルフラールの存在に適用する場合の「〜の存在下で」は、少なくとも０．１ｇ／Ｌ又はそれ以上（例えば、（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０ｇ／Ｌ又はそれ以上）のフルフラールの存在下における細菌の保持を意味する。
【０１６０】
本明細書で用いられるフルフラールの非存在に適用する場合の「〜の非存在下で」は、検出不能なレベルを包含する、０．１ｇ／Ｌ未満のフルフラールを含有している培地中で細菌を保持することを意味する。
【０１６１】
本明細書で用いられる「フルフラールの還元的除去」は、フルフラール還元酵素、例えば、ＹｑｈＤ及びＤｋｇＡを限定無しに包含している、ＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元酵素の作用によるフルフラールの除去を意味する。
【０１６２】
本明細書で用いられる「フルフラール代謝」は、フルフラールの、フルフラールアルコール、フロ酸、２−ケトグルタル酸、及び酢酸の何れか１つへの分解を意味する。
【０１６３】
本明細書で用いられる「５−ＨＭＦ」は、５−ヒドロキシメチルフルフラールを意味する。
【０１６４】
本明細書で用いられる「５−ＨＭＦに対する耐性」は、５−ＨＭＦの存在下、例えば、０．１ｇ／Ｌ又はそれ以上（例えば、０．１、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０ｇ／Ｌ又はそれ以上）の濃度の５−ＨＭＦの存在下で、生育或いはエタノールを生産する突然変異エタノール生産細菌の能力を意味する。５−ＨＭＦに対する耐性は、５−ＨＭＦの存在下における生育又はエタノール生産が、野生型細菌又は親細菌による生育又はエタノール生産のレベルと比較して増加しているレベルにあるエタノール生産細菌の能力も意味する。
【０１６５】
本明細書で用いられる５−ＨＭＦの存在に適用する場合の「〜の存在下で」は、少なくとも０．１ｇ／Ｌ又はそれ以上（例えば、（例えば、０．１、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０ｇ／Ｌ又はそれ以上）の５−ＨＭＦ存在下における細菌の保持を意味する。
【０１６６】
本明細書で用いられる５−ＨＭＦの非存在に適用する場合の「〜の非存在下で」は、検出不能なレベルを包含する、０．１ｇ／Ｌ又はそれ未満（例えば、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１ｇ／Ｌ又はそれ未満）の５−ＨＭＦを含有している培地中で細菌を保持することを意味する。
【０１６７】
本明細書で用いられる「生育」は、細菌の数又は量が時間とともに、上で定義したように、増大することを意味する。
【０１６８】
本明細書で用いられる「フルフラール還元酵素」は、毒性のフルフラールを毒性の低いフルフラールアルコールに変換する酵素、例えば、ＹｑｈＤ及びＤｋｇＡを限定無しに包含している、ＮＡＤＰＨ−依存性フルフラール還元酵素、を意味する。
【０１６９】
本明細書で用いられる「ヘミセルロース加水分解物」は、これに限定されないが、バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、又はセルロース系バイオマスに由来している加水分解物を包含する。
【０１７０】
本明細書で用いられる「に由来している」は、〜が起源であるということを意味する。
【０１７１】
用語「グラム陰性細菌」は、当該技術分野で承認されているこの用語の定義を包含することを意図している。グラム陰性菌の例は、アシネトバクター属、グルコノバクター属、ザイモモナス属、エシェリキア属、ジオバクター属、シュワネラ属、サルモネラ属、エンテロバクター属及びクレブシエラ属を包含する。
【０１７２】
用語「グラム陽性細菌」は、当該技術分野で承認されているこの用語の定義を包含することを意図している。グラム陽性菌の例は、バチルス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、オエノコッカス属、ストレプトコッカス属及びユーバクテリウム属を包含する。
【０１７３】
用語「アミノ酸」は、通常タンパク質に見られる２０個のアルファアミノ酸を包含することを意図している。塩基性に荷電しているアミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン及びリジンを包含する。中性荷電のアミノ酸は、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンを包含する。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を包含する。
【０１７４】
本明細書で用いられる「選択すること」は、同定された細菌がフルフラールの存在下でエタノールを生産することを確認する過程を示す。
【０１７５】
本明細書で用いられる「同定すること」は、細菌を評価して、細菌がフルフラールの存在下でエタノールを生産することを確認する過程を示す。
【０１７６】
本明細書で用いられる「フルフラールの濃度を増大すること」は、０〜５ｇ／Ｌの増大、例えば、１μｇ／Ｌの増大、１ｍｇ／Ｌの増大又は１ｇ／Ｌの増大を意味する。
【０１７７】
本明細書で用いられる「選択すること」は、同定された細菌が５−ＨＭＦの存在下でエタノールを生産することを確認する過程を示す。
【０１７８】
本明細書で用いられる「同定すること」は、細菌を評価して、細菌が５−ＨＭＦの存在下でエタノールを生産することを確認する過程を示す。
【０１７９】
本明細書で用いられる「５−ＨＭＦの濃度を増大すること」は、０〜５ｇ／Ｌの増大、例えば、１μｇ／Ｌの増大、１ｍｇ／Ｌの増大又は１ｇ／Ｌの増大を意味する。
【０１８０】
本明細書で用いられる「プロモーターの調節」は、プロモーターの活性を、本明細書に定義するように、増大又は減少することを示す。
【０１８１】
本明細書で用いられる「欠失している」又は「ノックアウトしている」又は「不活化している」は、検出不能なレベルまでの減少を意味する。遺伝子を示す場合の「欠失している」又は「ノックアウトしている」又は「不活化している」は、当該技術分野で公知のアッセイ、例えば、ＰＣＲ又はウェスタンブロット分析によって遺伝子がもはや検出できないように、又は当該技術分野で公知のアッセイ、例えば、ＰＣＲ又はウェスタンブロット分析によって遺伝子に対応するｍＲＮＡがもはや検出できないように、或いは当該技術分野で公知のアッセイ、例えば、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は酵素によるアッセイによってコードされるタンパク質がもはや検出できないか又は機能しないように、遺伝子を除去することを意味する。
【０１８２】
本明細書で用いられる「欠失した」又は「ノックアウトした」又は「不活化した」遺伝子は、当該技術分野で公知の方法によって、発現のレベルが検出不能である遺伝子を意味する。
【０１８３】
遺伝子を不活化する方法は、ｓｉＲＮＡを用いるＲＮＡ干渉、又はアンチセンス方法を包含する。
【０１８４】
本明細書で用いる用語「ｓｉＲＮＡ」は、それぞれの螺旋がＲＮＡ、ＲＮＡ類縁体又はＲＮＡ及びＤＮＡを含有している二重螺旋の核酸を示す。通常、ｓｉＲＮＡのアンチセンス螺旋は、遺伝子の発現を減少又は不活化するために、目的の遺伝子／ＲＮＡの標的配列と十分に相補的である。
【０１８５】
「アンチセンス」とは、標的核酸配列に対して相補性を有しているヌクレオチド配列を意味する。
【０１８６】
ＲＮＡｓは遺伝子の直接的産物であって、これらの低分子ＲＮＡｓは、特異的標的ＲＮＡｓと結合できて、それらの活性を増大するか或いは減少する。特に、アンチセンス螺旋は相補性ｍＲＮＡに結合することによって、タンパク質の産生を阻止する。
【０１８７】
本開示では、「含有する」、「含有している」、「含んでいる」及び「有している」などは、米国特許法がそれらに帰している制約の無い意味を有していて、「包含する」、「包含している」などを意味する。
【０１８８】
ＩＩ．細菌
本発明は、フルフラール及び／又は５−ＨＭＦに対して耐性な細菌に関している。本発明は、非組み換え細菌、及び組み換え細菌の両方を提供する。
【０１８９】
本発明は、参照する細菌と比較すると、フルフラール及び／又は５−ＨＭＦに対して増大した耐性を有する単離された細菌を提供する。本発明の細菌は、エタノール生産性でありそして／又は参照する細菌と比較すると増大したエタノール生産性を示す細菌を包含する。
【０１９０】
一態様では、ｙｑｈＤ、ｙｑｈＣ及び／又はｄｋｇＡの発現が、参照する細菌における発現と比較すると、本発明の細菌において減少又は除去されている。
【０１９１】
これに限定されないが、参照する細菌と比較してｙｑｈＤ、ｙｑｈＣ及び／又はｄｋｇＡの発現を調節するプロモータを修正することを包含している、当該技術分野で公知の方法によって、発現が減少する。例えば、これに限定されないが、プロモーターの欠失、異なったプロモーターによるプロモーターの置き換え、プロモーターの修正（例えば、核酸を挿入、置換又は除去して、或いはプロモーター中の調節要素又はモチーフを挿入又は除去して）を包含している、当該技術分野で認められている方法によって、プロモーターは修正される。
【０１９２】
一実施態様では、発現は、ｙｑｈＣ遺伝子を修正又は欠失することにより減少又は除去される。
【０１９３】
別の態様では、本発明の細菌において、ＹｑｈＤ、ＹｑｈＣ及び／又はＤｋｇＡタンパク質の活性は、参照する細菌におけるＹｑｈＤ、ＹｑｈＣ及び／又はＤｋｇＡタンパク質の活性と比較して、減少又は修正される。これに限定されないが、ｙｑｈＤ、ｙｑｈＣ及び／又はｄｋｇＡ遺伝子の修正（例えば、遺伝子をコードする配列において核酸又はアミノ酸を挿入、置換又は除去することによって）を包含している、当該技術分野で公知の方法によって、活性は減少又は修正される。
【０１９４】
本発明は、ｙｑｈＤ、ｙｑｈＣ及び／又はｄｋｇＡ遺伝子の発現が、参照する細菌におけるｙｑｈＤ、ｙｑｈＣ及び／又はｄｋｇＡ遺伝子の発現と比較すると、減少していて、そしてｙｑｈＤ、ｙｑｈＣ及び／又はｄｋｇＡ遺伝子の調節が、参照する細菌におけるｙｑｈＤ、ｙｑｈＣ及び／又はｄｋｇＡ遺伝子の調節と比較すると、修正されている細菌も提供する。これに限定されないが、ｙｑｈＤ、ｙｑｈＣ及び／又はｄｋｇＡ遺伝子の修正（例えば、遺伝子をコードする配列において核酸又はアミノ酸を挿入、置換又は除去することによって）を包含している、当該技術分野で公知の方法によって、発現は減少又は修正される。
【０１９５】
本発明は、ｙｑｈＤ、ｙｑｈＣ及び／又はｄｋｇＡ遺伝子が、参照する細菌と比較すると、不活化又はノックアウトされている細菌を提供する。
【０１９６】
これに限定されないが、アンチセンス阻害又はアンチセンス転写のメカニズムを包含している当該技術分野で公知の何れのメカニズムによっても、遺伝子発現を改変することができる。
【０１９７】
本発明は、これに限定されないが、参照する細菌と比較して、異なったプロモーターの制御下又は追加プロモーターの制御下での、ｙｑｈＤ、ｙｑｈＣ及び／又はｄｋｇＡ遺伝子の配置を包含している、当該技術分野において公知の方法によって、ｙｑｈＤ、ｙｑｈＣ及び／又はｄｋｇＡ遺伝子の調節を改変する方法を提供する。
【０１９８】
本発明は、これに限定されないが、参照する細菌と比較して、異なった調節タンパク質の制御下又は追加の調節タンパク質の制御下での、ｙｑｈＤ、ｙｑｈＣ及び／又はｄｋｇＡ遺伝子の配置を包含している、当該技術分野において公知の方法によって、ｙｑｈＤ、ｙｑｈＣ及び／又はｄｋｇＡ遺伝子の調節を改変する方法を提供する。
一実施態様では、調節タンパク質は抑制因子である。
別の実施態様では、調節タンパク質は誘導因子である。
【０１９９】
本発明は、参照する細菌と比較して、ｙｑｈＣ遺伝子を改変又は欠失することによって、ｙｑｈＤ、又はｙｑｈＤとｄｋｇＡの調節を、調節又は改変する方法も提供する。
【０２００】
本発明は、参照する細菌と比較してフルフラール及び／又は５−ＨＭＦに対する耐性が増大している細菌も提供し、そしてここでは、当該細菌はフルフラール及び／又は５−ＨＭＦの存在下で参照する細菌と比較してエタノール生産を増大している。
【０２０１】
一態様では、本発明の細菌は、参照する細菌と比較してフルフラールの還元的除去が減少しているか存在していない場合に、参照する細菌と比較してエタノール生産を増大している。
【０２０２】
別の態様では、本発明の細菌は、参照する細菌と比較して、フルフラール代謝を減少しているか或いは除去している。
【０２０３】
本発明は、フルフラールに対する耐性が増大していて、さらに；１）参照する細菌と比較して、フルフラールの存在下又は非存在下で、生育が増大している；２）参照する細菌と比較して、生育が増大していてエタノール生産が増大している；３）参照する細菌と比較して、フルフラールの存在下で、生育が増大していてエタノール生産が増大している；４）参照する細菌と比較して、フルフラール還元酵素の活性が減少している；５）参照する細菌と比較して、加水分解産物の存在下で、生育が増大している；及び６）参照する細菌と比較して、エタノール生産が増大している：ことの少なくとも一つを示す、細菌を提供する。
【０２０４】
本発明は、５−ＨＭＦに対する耐性が増大していて、さらに；１）参照する細菌と比較して、５−ＨＭＦの存在下又は非存在下で、生育が増大している；２）参照する細菌と比較して、生育が増大していてエタノール生産が増大している；３）参照する細菌と比較して、５−ＨＭＦの存在下で、生育が増大していてエタノール生産が増大している；４）参照する細菌と比較して、５−ＨＭＦ還元酵素の活性が減少している；５）参照する細菌と比較して、加水分解産物の存在下で、生育が増大している；及び６）参照する細菌と比較して、エタノール生産が増大している：ことの少なくとも一つを示す、細菌を提供する。
【０２０５】
本発明は、これに限定されないが、バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、又はセルロース系バイオマス由来の加水分解物を包含している、多種の加水分解物を提供する。
【０２０６】
本発明は、フルフラールに対する耐性が減少している細菌も提供し、そこで、細菌は、エタノールを主発酵産物として生産することができ、そこで随意に主発酵産物は嫌気性又は微好気性条件下で生産される。
【０２０７】
本発明は、参照する細菌の発現と比較してｙｑｈＤ、ｙｑｈＣ及び／又はｄｋｇＡ遺伝子の発現が減少して、ここで細菌がフルフラールの存在下又は非存在下においてエタノールを生産できる、細菌も提供する。
【０２０８】
これに限定されないが、当該参照細菌と比較して遺伝子発現を調節するプロモーターを改変することを包含する当該技術分野で公知の方法によって、又は参照する細菌と比較してｙｑｈＣ遺伝子を改変又は欠失することによって、ｙｑｈＤ、又はｙｑｈＤとｄｋｇＡ遺伝子の発現が減少する。
【０２０９】
本発明は、参照する細菌と比較してｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少していて、そして細菌がフルフラールの存在下又は非存在下においてエタノールを生産できる、細菌も提供する。
【０２１０】
一態様では、本発明は単離された細菌を提供し、そこではｙｑｈＤ、ｙｑｈＣ及び／又はｄｋｇＡ遺伝子の発現が減少しているか又は発現されず、そして細菌はフルフラールの存在下又は非存在下においてエタノールを生産する。本発明の細菌は、１）参照する細菌と比較して、フルフラールの存在下で増大したエタノール生産及び増大した生育；２）参照する細菌と比較して、フルフラールの存在下で増大したエタノール生産及び増大した生育；３）主発酵産物としてエタノールの産生、ここで随意に主発酵産物は嫌気性又は微好気性条件下で生産される；及び４）主発酵産物としてエタノールの産生、ここで随意に主発酵産物は嫌気性又は微好気性条件下で生産される；の少なくとも１つを示してもよい。
【０２１１】
一態様では、本発明は単離された細菌を提供して、そこではｙｑｈＣ遺伝子の発現が減少又は除去されている。
【０２１２】
本発明は、ＹｑｈＤ又はＹｑｈＤ及びＤｋｇＡタンパク質の活性が、参照する細菌における活性と比較すると、減少又は除去されていて、そして細菌がフルフラールの存在下でエタノールを生産できる、細菌を提供する。
【０２１３】
本発明は、ＹｑｈＣの活性が、参照する細菌における活性と比較すると、減少又は除去されていて、そして細菌がフルフラールの存在下でエタノールを生産できる、細菌も提供する。
【０２１４】
別の態様では、ｙｑｈＤ又はｙｑｈＤ及びｄｋｇＡ遺伝子の発現が、参照する細菌におけるｙｑｈＤ又はｙｑｈＤ及びｄｋｇＡ遺伝子の発現と比較すると、減少していて、そして細菌がフルフラールの存在下でエタノールを生産できる、細菌を提供する。
【０２１５】
本発明は、ｙｑｈＤ、又はｙｑｈＤとｄｋｇＡ遺伝子の調節が、参照する細菌における調節と比較して、改変されていて、そして細菌はフルフラールの存在下でエタノールを生産できる、単離された細菌も提供する。
【０２１６】
本発明は、ｙｑｈＤ、ｙｑｈＣ及び／又はｄｋｇＡ遺伝子が、参照する細菌と比較すると、不活性化されているか又はノックアウトしていて、そして細菌はフルフラールの存在下又は非存在下でエタノールを生産できる、単離された細菌も提供する。
【０２１７】
本発明は、ｙｑｈＣ遺伝子が、参照する細菌と比較すると、不活性化されているか又はノックアウトしていて、そして細菌はフルフラールの存在下又は非存在下でエタノールを生産できる、単離された細菌を提供する。
【０２１８】
本発明は、ｙｑｈＤ又はｙｑｈＤ及びｄｋｇＡ遺伝子の調節が、参照する細菌と比較すると、改変されていて、そして細菌はエタノールを生産でき、エタノールの生産は随意にフルフラールの存在下で行われる、単離された細菌も提供する。
【０２１９】
ｙｑｈＣ遺伝子の調節が、参照する細菌と比較すると、改変されていて、そして細菌はエタノールを生産でき、エタノールの生産は随意にフルフラールの存在下で行われる、単離された細菌も提供する。
【０２２０】
一実施態様では、ｙｑｈＤ又はｙｑｈＤ及びｄｋｇＡ遺伝子の調節は、ｙｑｈＤ又はｙｑｈＤ及びｄｋｇＡ遺伝子を、参照する細菌と比較して、異なったプロモータの制御下又は追加のプロモーターの制御下に置くことによって、或いはｙｑｈＣ遺伝子を改変又は欠失することによって、改変される。
【０２２１】
一実施態様では、ｙｑｈＤ、又はｙｑｈＤとｄｋｇＡ遺伝子の調節は、ｙｑｈＤ、又はｙｑｈＤとｄｋｇＡ遺伝子を、参照する細菌と比較して、異なった調節タンパク質の制御下又は追加の調節タンパク質の制御下に置くことによって、或いはｙｑｈＣ遺伝子を改変又は欠失することによって、改変される。一実施態様では、調節タンパク質は抑制因子である。これに代わる実施態様では、調節タンパク質は誘導因子である。
【０２２２】
発現はアンチセンス阻害又はアンチセンス転写の方法によっても減少する。
【０２２３】
本発明の細菌は多種の方法で生産される。
【０２２４】
当該細菌がフルフラールの存在下でエタノールを生産できる、ＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元酵素の発現活性が減少している単離された細菌は、工程：フルフラールの存在下又は非存在下で細菌の候補突然変異株を生育すること；及びフルフラールの存在下でエタノールを生産する突然変異体を選択すること：を含有してなる工程によって調製される。
【０２２５】
或いは、細菌がフルフラールの存在下又は非存在下でエタノールを生産できる、ＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元酵素の発現活性が減少している単離された細菌は、細菌の候補株を増大する濃度のフルフラールの存在下で生育すること；及びフルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択することによって調製される。
【０２２６】
ＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元酵素は、これに限定されないが、ＹｑｈＤ又はＹｑｈＤとＤｋｇＡを包含するＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元酵素の何れかであってよい。
【０２２７】
細菌がフルフラールの存在下又は非存在下でエタノールを生産できる、ｙｑｈＤ又はｙｑｈＤとｄｋｇＡ遺伝子の発現が、参照する細菌と比較すると、減少している単離された細菌は、工程：フルフラールの存在下で細菌の候補突然変異株を生育すること；及びフルフラールの存在下でエタノールを生産する突然変異体を選択すること：或いは、細菌の候補株を増大する濃度のフルフラールの存在下で生育すること；及びフルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：を含有してなる工程によって調製される。
【０２２８】
本発明は、ｙｑｈＣ遺伝子の発現を減少するか又はｙｑｈＣ遺伝子を改変又は欠失する工程を含有する、細菌を調製する方法も提供する。
【０２２９】
細菌がフルフラールの存在下又は非存在下でエタノールを生産できる、ＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元酵素の発現活性が減少している単離された細菌は、工程：ｙｑｈＤ又はｙｑｈＤとｄｋｇＡの発現を減少すること；細菌の候補株をフルフラールの存在下で生育すること；及びフルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：を含有してなる方法によって調製される。
【０２３０】
当該細菌がフルフラールの存在下でエタノールを生産できる、ｙｑｈＤ遺伝子の発現が減少しているか又はｙｑｈＤ及びｄｋｇＡ遺伝子の発現が減少している単離された細菌は、工程：ｙｑｈＤ又はＹｙｑｈＤとｄｋｇＡの発現を減少すること；細菌の候補株をフルフラールの存在下で生育すること；及びフルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：を含有してなる方法によって調製される。
【０２３１】
当該細菌がフルフラールの存在下又は非存在下でエタノールを生産できる、ＹｑｈＤ又はＹｑｈＤとＤｋｇＡタンパク質の活性が、参照する細菌における活性と比較して、減少又は除去されている単離された細菌は、工程：フルフラールの存在下で細菌の候補突然変異株を生育すること；及びフルフラールの存在下でエタノールを生産する突然変異体を選択すること：或いは、増大する濃度のフルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：を含有してなる方法によって調製される。
【０２３２】
遺伝子の発現は、これに限定されないが、遺伝子のノックアウト又は遺伝子のサイレンシングを包含する当該技術分野で公知の方法によって減少する。
【０２３３】
当該細菌がフルフラールの存在下又は非存在下でエタノールを生産できる、ｙｑｈＤ又はｙｑｈＤとｄｋｇＡ遺伝子が、参照する細菌と比較して、不活性化又はノックアウトしている単離された細菌は、工程：フルフラールの存在下で細菌の候補突然変異株を生育すること；及びフルフラールの存在下でエタノールを生産する突然変異体を選択すること：或いは増大する濃度のフルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：を含有してなる方法によって調製される。
【０２３４】
細菌がフルフラールの存在下又は非存在下でエタノールを生産できる、ｙｑｈＤ又はｙｑｈＤとｄｋｇＡ遺伝子の調節が、参照する細菌と比較して、修正されている単離された細菌は、工程：フルフラールの存在下で細菌の候補突然変異株を生育すること；及びフルフラールの存在下でエタノールを生産する突然変異体を選択すること：或いは増大する濃度のフルフラールの存在下で細菌の候補株を生育すること；及びフルフラールの存在下でエタノールを生産する細菌を選択すること：を含有してなる方法によって調製される。
【０２３５】
本発明の方法によれば、調節は、これに限定されないが、ｙｑｈＤ又はｙｑｈＤとｄｋｇＡ遺伝子を、参照する細菌と比較して、異なったプロモーターの制御下又は追加のプロモーターの制御下に置くことを包含する、当該技術分野で公知の各種方法によって修正される。
本発明の方法によれば、調節は、これに限定されないが、ｙｑｈＤ又はｙｑｈＤとｄｋｇＡ遺伝子を、参照する細菌と比較して、異なった調節タンパク質の制御下又は追加の調節タンパク質の制御下に置くことを包含する、当該技術分野で公知の各種方法によって修正される。一実施態様では、調節タンパク質は抑制因子である。これに代わる実施態様では、調節タンパク質は誘導因子である。
本発明は、ｙｑｈＣ遺伝子を、参照する細菌と比較して、修正又は欠失することによるｙｑｈＤ又はｙｑｈＤとｄｋｇＡ遺伝子の調節も提供する。
【０２３６】
本発明は、これに限定されないが、アンチセンス転写を包含する当該技術分野で公知の何れかの方法を用いて、ｙｑｈＤ又はｙｑｈＤとｄｋｇＡ遺伝子をサイレンシングした本発明の細菌を調製する方法も提供する。
【０２３７】
本発明の細菌は、非組み換え型又は組み換え型である。
【０２３８】
一実施態様では、細菌は主発酵産物としてエタノールを生産することができ、ここで主発酵産物は随意に、嫌気性又は微好気性条件下で生産される。
【０２３９】
本発明の細菌は、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌よりなる群から選ばれ、ここで、グラム陰性細菌は、アシネトバクター属、グルコノバクター属、ザイモモナス属、エシェリキア属、ジオバクター属、シュワネラ属、サルモネラ属、エンテロバクター属及びクレブシエラ属よりなる群から選ばれて、グラム陽性細菌は、バチルス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、オエノコッカス属、ストレプトコッカス属及びユーバクテリウム属よりなる群から選ばれる。
【０２４０】
一態様では、本発明の細菌は大腸菌である。
【０２４１】
別の態様では、本発明の細菌はクレブシエラ・オキシトカである。
【０２４２】
別の態様では、本発明の細菌は大腸菌ＥＭＦＲ９株である。
【０２４３】
別の態様では、本発明の細菌は、Agricultural Research Culture Collection に寄託された寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０２４０で表される大腸菌ＥＭＦＲ９株である。
【０２４４】
別の態様では、本発明の細菌は、Agricultural Research Culture Collection に寄託された寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０２３９で表される大腸菌ＬＹ１８０株である。
【０２４５】
別の態様では、本発明の細菌は、Agricultural Research Culture Collection に寄託された寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０２４１で表される大腸菌ＥＭＦＲ１７株である。
【０２４６】
別の態様では、本発明の細菌は、Agricultural Research Culture Collection に寄託された寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０２４２で表される大腸菌ＥＭＦＲ２６株又はAgricultural Research Culture Collection に寄託された寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０２４３で表される大腸菌ＥＭＦＲ３５株である。
【０２４７】
ＩＩＩ．エタノールを生産する方法
別の態様では、本発明はオリゴ糖源からエタノールを生産する方法を提供する。方法は、それによってオリゴ糖源からエタノールを生産するために、オリゴ糖を上記のような本発明の非組み換え型細菌又は宿主細胞と接触させることを含有する。方法の特定の実施態様では、オリゴ糖は、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン及びこれらの何れかの組み合わせよりなる群から選ばれる。
【０２４８】
別の態様では、本発明は、バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖源を本発明の単離された細菌と接触させることによって、バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産することを含有してなる、バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産する方法を提供する。
【０２４９】
別の態様では、本発明は、バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖源を本発明の単離された細菌と接触させることによって、バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産することを含有してなる、フルフラールの存在下でバイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、リグノセルロース系バイオマス、セルロース系バイオマス又はオリゴ糖源からエタノールを生産する方法を提供する。
【０２５０】
本発明は、本発明の方法によって生産されたエタノールも提供する。
【０２５１】
本発明の宿主細胞は、嫌気性条件下でエタノール生産のレベルが低いという特性を有している。野生型の大腸菌は嫌気的生育の間にエタノールと酢酸塩を１：１の比で生産する。生育の静止期の間に、野生型の大腸菌は主産物として乳酸塩を生産して、総発酵産物におけるエタノールの画分は約２０％である。これらの発酵の全てにおける産物は多種の酸を含有しているので、混合酸発酵という用語に結び付いている。
【０２５２】
一般に、発酵条件は、産生宿主細胞株の最大生育動態を促進する最適なｐＨ及び温度、並びに培養によって産生する酵素の触媒条件をもたらすように選択される（Doran et al., (1993) Biotechnol. Progress. 9:533-538）。例えば、クレブシエラ、例えばＰ２株については、最適条件は３５〜３７℃及びｐＨ５．０〜ｐＨ５．４の間であると確認された。これらの条件下では、外から加えられた真菌のエンドグルカナーゼ及びエクソグルカナーゼさえも、長時間にわたって極めて安定で機能を続ける。別の条件は実施例で検討されている。更に、本発明の所定の発酵反応を最適化するためには、当該技術分野で公知の技術を用いて、通常の実験のみが必要であることを、当業者は理解できるだろう。例えば、米国特許第５，４２４，２０２号及び第５，９１６，７８７号を参照されたい、これらは参照により、明確に本明細書に取り込まれている。
【０２５３】
更に別の態様では、本発明は、上記のような本発明の非組み換え型細菌又は宿主細胞、及び本明細書に記載されている方法及び工程に従ってエタノールを生産するための使用説明書を含有してなる、キットを提供する。一実施態様では、キットは糖源を含有している。
【０２５４】
本発明は、ＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素の発現及び／又は活性を減少することによって、細菌のフルフラール又は５−ＨＭＦに対する抵抗性又は耐性を増大する方法も提供する。
【０２５５】
本発明は、ＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素の発現及び／又は活性を減少することによって、細菌のフルフラール又は５−ＨＭＦに対する抵抗性又は耐性を増大するＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素を同定する方法も提供する。
【０２５６】
本発明は、ＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素の発現及び／又は活性を減少することによって、フルフラール又は５−ＨＭＦの存在下で細菌の生育を増大することにも関している。
【０２５７】
本発明は、ＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素の発現及び／又は活性を減少することによって、フルフラール又は５−ＨＭＦの存在下で細菌によるエタノール生産を増大することにも関している。
【０２５８】
本方法によると、ＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素は、ＹｑｈＤ又はＤｋｇＡのＫｍより小さいか又は同等のＫｍを有している。
【０２５９】
一実施態様では、ＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素に対する好ましい基質はＮＡＤＰＨであってＮＡＤＨではない。
【０２６０】
別の実施態様では、ＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素に対する基質はＮＡＤＰＨであってＮＡＤＨではない。
【０２６１】
ＹｑｈＤのＫｍは約２〜３２μＭ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３１又は３２μＭである。一実施態様では、ＹｑｈＤのＫｍはおよそ４〜２４である。別の実施態様では、ＹｑｈＤのＫｍはおよそ６〜１６μＭである。別の実施態様では、ＹｑｈＤのＫｍは８μＭである。
【０２６２】
ＤｋｇＡのＫｍは約６〜９２μＭ、例えば、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１又は９２μＭである。一実施態様では、ＤｋｇＡのＫｍはおよそ１２〜７０である。別の実施態様では、ｄｋｇＡのＫｍはおよそ１８〜５０μＭである。別の実施態様では、ＤｋｇＡ（ＹｑｈＤ）のＫｍは２３μＭである。
【０２６３】
ＩＶ．使用方法
本発明は、フルフラール及び／又は５−ＨＭＦに対して増大した耐性を有している細菌を提供する。細菌は、エタノールを生産するために、そして特に、フルフラールの存在下又は非存在下に、オリゴ糖を本発明の細菌と接触させ、それによってオリゴ糖源からエタノールを生産することによるという、オリゴ糖源からエタノールを生産するために、用いることができる。
【０２６４】
本発明は、フルフラールの存在下又は非存在下で、オリゴ糖源からエタノールを生産するためのキットも提供し、そこでキットは使用説明書及び、随意に、包装手段を包含している。
【０２６５】
Ｖ．実験
本発明を、限定と見なしてはならない、以下の実施例によって更に説明する。特に明記しない限り、実施例を通して以下の材料及び方法が用いられる。
【０２６６】
材料及び方法
菌株、培地及び生育条件
本研究で用いられる菌株及びプラスミドを表１に載せてある。プラスミド及び菌株の構築はＬ培地（Miller 1992 A short course in bacterial genetics.  CSHL Press.  Plainview, New York）を用いて行った。必要に応じて抗生物質を含めた。温度条件付きプラスミドは３０℃で生育して、その他のものは３７℃で生育した。エタノール生産性菌株は、固体培地には２０ｇ／Ｌのキシロースを、そして発酵実験で用いた液体培地には５０ｇ／Ｌ又はそれ以上のキシロースを補完したＡＭ１無機塩培地（Martinez et al. 2007 Biotechnol. Lett.  29:397-404）中で保持した。菌株大腸菌ＬＹ１６８株（Jarboe et al. 2007. Adv. Biochem. Engin/Biotechnol.  108:237-261）はＫＯ１１の誘導体であって、本研究の出発点としての役割を果たした。菌株大腸菌Ｗ（ＡＴＣＣ９６３７）が、最初に大腸菌Ｂの誘導体であると報告された（Ohta et al. 1991. Appl. Environ. Microbiol. 57:893-900）ＫＯ１１に対する親株であることに注目されたい。
【０２６７】
【表１−１】
2012519485.tif 000003
【０２６８】
【表１−２】
2012519485.tif 000004
【０２６９】
【表１−３】
2012519485.tif 000005
【０２７０】
【表１−４】
2012519485.tif 000006
【０２７１】
本研究で用いた菌株及びプラスミドは先に記載されている（Miller et al. 2009a  Appl Environ Microbiol 75: 6132-6141; Miller et al. 2009b Appl Environ Microbiol 75: 4315-4323）。これらはＬＹ１８０（大腸菌のエタノール生産性誘導体）、ＥＭＦＲ９（ＬＹ１８０のフルフラール耐性誘導体）、ＬＹ１８０ΔｙｑｈＤ、ＬＹ１８０ΔｄｋｇＡ、ＬＹ１８０ΔｙｑｈＤΔｄｋｇＡ、ｙｑｈＤを含有しているｐＬＯＩ４３０１を包含する。ｄｋｇＡを含有しているプラスミドｐＬＯＩ４３０３（Miller et al. 2009b Appl Environ Microbiol 75: 4315-4323）及びｐｎｔＡＢを含有しているｐＬＯＩ４３１６（Miller et al. 2009a Appl Environ Microbiol 75: 6132-6141）も用いた。培養物は、２０ｇ／Ｌのキシロース（固体培地）、５０ｇ／Ｌのキシロース（バイオスクリーンＣ生育分析器及び試験管培養）、又は１００ｇ／Ｌのキシロース（ｐＨ制御発酵）を含有しているＡＭ１最少培地（Martinez et al. 2007 Biotechnol. Lett.  29:397-404）中、３７℃で生育した。
【０２７２】
５−ＨＭＦに対する耐性は、４ｍｌのＡＭ１及び５−ＨＭＦを含有している１３×１００ｍｍの封管を用いて、表示してあるようにして試験した。適切な場合には、プラスミド保持のために抗生物質を含有させた。試験管に０．０５ ＯＤ５５０ｎｍの初期密度で植菌した。４８時間培養（６０ｒｐｍ）した後、Spectronic ２０Ｄと分光光度計（Thermo, Waltham,MA）を用いて生育を測定した。フラン耐性に対するｐｎｔＡＢの効果を試験するために、ウェル当たり４００μｌのＡＭ１（及び５−ＨＭＦ又はフルフラール）を含有しているマルチウェルプレートに上記のように植菌した。Bioscreen C 生育分析器（Oy Growth Curves, Helsinki, Finland）を用いて、ＯＤ（４２０−５８０ｎｍ バンド幅）を７２時間にわたって測定した。
【０２７３】
発酵試験のために、ＬＹ１８０及びＥＭＦＲ９の種培養物を３５０ｍｌのＡＭ１培地を含有している小発酵槽中(３７℃、２００ｒｐｍ）で１晩生育した。２ＮのＫＯＨを自動添加して培養液をｐＨ６．５に維持した。対数増殖期中期(mid-log phase)に達した時点に、試験発酵槽に０．１ ＯＤ５５０ｎｍの初期細胞密度（３３ｍｇ乾燥細胞重量／Ｌ）で植菌した。細胞量（ＯＤ５５０ｎｍ）及びフランのレベルを１２時間間隔で既述（Martinez et al. 2000b Biotechnol Prog 16: 637-641）のようにモニタリングした。
【０２７４】
ｐＨ制御発酵槽を用いてインビボのフラン還元を測定した。培養物がおよそ１ ＯＤ５５０ｎｍに達したときに１０％ ｗ／ｖの貯蔵溶液を用いてフランを添加した。細胞量及び５−ＨＭＦを、０、１５、３０、及び６０分後に測定した。
【０２７５】
ＬＹ１８０株の構築
ＬＹ１６８株は、ヘミセルロース加水分解物中の糖の発酵に関して既に記載されている（Jarboe et al., 2007 Adv. Biochem. Engin/Biotechnol.  108:237-261）。基質領域（乳糖利用の回復、エンドグルカナーゼの組み込み、及びセロビオース利用の組み込み）を改善するために幾つかの修正が行われてＬＹ１８０が得られた。組み込みに用いた線状ＤＮＡ断片は図１に示されていて、GenBank に寄託されている。ｌａｃＺｌａｃＹｌａｃＡｃｙｎＸ’を含有している断片Ａ（Datsenko et al. 2000 PNAS 97:6640-6645, Jantama et al. 2008 Biotech. Bioeng. 30:881-893）を用いる二重相同組み換えによって、ｌａｃＹのＦＲＴ領域を天然大腸菌ＡＴＣＣ９６３７と置き換えた。組み込み株を乳糖発酵に関して直接選択した。ｆｒｄＡ：：Ｚｍｆｒｇ ｃｅｌＹＥｃ（Erwinia chrysanthemi）の下流にあるｆｒｄＢ領域を、２段階法を用いる二重相同組み換え（Jantama et al. 2008 Biotech. Bioeng. 30:881-893）によって削除した。断片Ｂ（ｆｒｄＢ’、ｃａｔ−ｓａｃＢカセット、及びｆｒｄＣ’）をクロラムフェニコール耐性に対する選択を最初に組み込んだ。次いで、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットを、蔗糖に対する耐性を選択して、ｆｒｄＡ’、Zymomonas mobilis プロモーター断片、E.crysanthemi ｃｅｌＹ、及びｆｒｄＣ’からなる断片Ｃと置き換えた。この置換体もＦＲＴ部位を欠失していた。セロビオース利用（ｃａｓＡＢ）をコードする Klevsiella oxytoca 遺伝子を、２段階法を用いる二重相同組み換え（Jantama et al. 2008 Biotech. Bioeng. 30:881-893）によって、１ｄｈＡに組み込んだ。１ｄｈＡのＦＲＴ部位をクロラムフェニコール耐性に対する選択と置き換えるために、断片Ｄ（１ｄｈＡ’、ｃａｔ−ｓａｃＢカセット、ｃａｓＡＢ、及び’１ｄｈＡ）を用いた。次いで、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットを、１ｄｈＡ’、Z. mobilis 由来のプロモーター断片、及びK.oxytoca ｃａｓＡ’よりなる断片Ｅと置き換えた。セロビオース発酵に対する直接選択によって、組み込み株を単離した。表現型及びＰＣＲ産物の分析によって、全ての構築物を確認した。
【０２７６】
フルフラール耐性菌の生育に基づく選択
１００ｇ／Ｌのキシロース及び０．５ｇ／Ｌのフルフラールで補完した３５０ｍＬのＡＭ１を含有している５００ｍｌ容器にＬＹ１８０を植菌した（初期接種、５０ｍｇｄｃｗ／Ｌ、３７℃、１５０ｒｐｍ、ｐＨ６．５）。培養液は、２４時間間隔で、又は細胞量が３３０ｍｇｄｃｗ／Ｌを越えたときに、新しい発酵槽内へ連続希釈した。フルフラールは生育を許容して１．３ｇ／Ｌまで漸増した。５４回連続移植後に、耐性菌を単離してＥＭＦＲ９と命名した。
【０２７７】
発酵中のフルフラール耐性及び代謝
フルフラール耐性を、小発酵槽（３７℃、１５０ｒｐｍ、ｐＨ６．５、可動範囲３５０ｍｌ）中で、１００ｇ／Ｌのキシロースを含有しているＡＭ１培地（Martinez et al. 2007 Biotechnol. Lett. 29:397-404）を用いて比較した。種培養物を、およそ３３ｍｇｄｃｗ／Ｌに植菌した。サンプルを定期的に採取して細胞量、エタノール、及びフルフラールを測定した。
【０２７８】
フルフラール毒性（ＭＩＣ）も、４ｍｌのＡＭ１培養液と５０ｇ／Ｌ（ｗｔ／ｖｏｌ）のろ過滅菌した糖、フルフラール、及びその他の補完物を含有する試験管培養（１３×１００ｍｍ）を用いて試験した。培養物を１７ｍｇ／ｄｃｗ／Ｌの初期密度で植菌した。３７℃で２４時間及び４８時間培養した後に細胞量を測定した。
【０２７９】
加水分解物毒性の比較
サトウキビ絞りかすのヘミセルロース加水分解物を、高温及び高圧で希硫酸を用いて製造し、そして Verenium Corporation (Boston, MA）から入手した。この加水分解物は８２ｇ／Ｌの総糖（主にキシロース）、１．４ｇ／Ｌのフルフラール、及びその他の成分を含有していた。加水分解物を、ＡＭ１培地の無機成分で補完し、４５％のＫＯＨを用いてｐＨ６．５に調節して、完全ＡＭ１（８０ｇ／Ｌのキシロース含有）で希釈した。加水分解物の希釈サンプルを１３ｍｍ×１００ｍｍの培養試験管に分配し（４ｍＬずつ）、１７ｇｄｃｗ／Ｌの初期細胞密度で植菌して、３７℃で培養した。細胞量（遠心分離及び培養液に再懸濁後）及びエタノール濃度を４８時間後に測定した。
【０２８０】
マイクロアレイ解析
培養物を、６７０ｍｇ ｄｃｗ／Ｌの密度まで小発酵槽で生育した。フルフラール（０．５ｇ／Ｌ）を添加して、培養を集菌１５分前まで続けた。全てのサンプルを直ちにエタノール−ドライアイス浴中で冷却し、遠心分離で集菌し、Quiagen RNA Later (Valencia, CA)に再懸濁して、精製するまで−８０℃で保管した。Quiagen RNeasy Mini Kit を用いてＲＮＡを精製して、マイクロアレイ比較のためにNimbleGen (Madison, WI）に送った。ArrayStar ソフトウェア（DNA Star, Madison, WI）でデータを解析した。
【０２８１】
酸化還元酵素のクローニング及び欠失
発現研究（リボソーム結合部位、コード領域、及び２００ｂｐ末端領域）のために酸化還元酵素遺伝子を、Bio-Rad iCycler (Hercules, CA）を用いてＬＹ１８０株のゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＣＲ ２．１−ＴＯＰＯベクターにライゲートして、Invitrogen TOPO TA Cloning Kit (Carlsbad, CA）を用いて大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’にクローン化した。QuiaPrep Spin Mini Prep Kit を用いてプラスミドを精製した。遺伝子の配向性をＰＣＲで確立した。
【０２８２】
ｙｑｈＤ欠失を、プラスミドｐＫＤ４及びｐＫＤ４６を用いて、Datsenko and Wanner (Datsenko, et al. 2000 PNAS. 97:6640-6645）に記載されるようにしてＬＹ１８０に構築した。ｄｋｇＡ欠失をJantama et al. (Jantama et al. 2008 Biotech. Bioeng. 30:881-893）に記載されるようにしてＬＹ１８０に構築した。ｙｑｈＤ及びｄｋｇＡの両方が欠失している二重突然変異体も構築した。ｙｑｆＡを欠失する再三の試みは成功しなかった。
【０２８３】
ＹｑｈＤ及びＤｋｇＡの精製及び動力学的分析
ｙｑｈＤ及びｄｋｇＡ遺伝子の両方をＮｏｖａｇｅｎ ｐＥＴ−１５ｂベクター内にクローン化して、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）内にＨｉｓ標識化タンパク質として発現した。細胞をＩＰＴＧでおよそ１．３ｇｄｃｗ／Ｌまで生育し、１００ｍＭのリン酸緩衝液で洗浄して、Mp Fast Prep-24 (MP Biomedical, solon OH）及び Lysing Matrix B を用いて溶解した。粗製抽出物を０．２２μｍのＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）フィルターに通して、更に１ｍＬのＨｉＴｒａｐ ニッケルカラムを用いて精製した。精製した酵素を、Thermo Slide-A-Lyser を用いて１００ｍＭのリン酸緩衝液中で透析して、Thermo BCA Assay Kit を用いて定量した。ＹｑｈＤ及びＤｋｇＡの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９０％より大きいと評価された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル内にそれぞれに対する一本のバンドが観察された。精製したタンパク質のおよその大きさは、それぞれの予測値４３ｋＤ及び３１ｋＤに一致した。明確なＫｃａｔ値及び明確なＫｍ値を両方の精製酵素についてＮＡＤＰＨ及びフルフラールを用いて測定した。
【０２８４】
発酵中のインビボフルフラール代謝の全細胞アッセイ
培養物が６７０ｍｇｄｃｗ／Ｌ密度まで生育している（対数増殖期中期）発酵槽を用いて全細胞フルフラール代謝を測定した。初期濃度０．５ｇ／Ｌでフルフラールを添加した。フルフラール及び細胞量を測定するために、培養の０時点並びに１５、３０、及び６０分後にサンプルを採取した。フルフラール代謝の具体的な速度を各試験間隔の間の平均細胞量を用いて算出した。結果を、マイクロモル／分／ｍｇ ｄｃｗで表した。
【０２８５】
フルフラール還元のインビトロアッセイ
嫌気的試験管培養物を５０ｇ／Ｌのキシロースを含有しているＡＭ１培地で生育して、対数増殖期中期（０．７〜１．０ｇ ｄｃｗ／Ｌ）に集菌した。細胞を、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍＬで１度洗浄し、およそ６．５ｇ ｄｃｗ／Ｌでリン酸緩衝液に再懸濁して、MP FastPrep-24 細胞破砕器及び Lysing Matrix B を用いて２０分間溶解した。破片を遠心分離（１３，０００ｘｇ、１０分）で除去して上澄液を、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨのフルフラール依存性酸化を測定するために用いた。アッセイは、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、２０ｍＭのフルフラール、及び０．２ｍＭの還元体（ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨ）を含んでいた。フルフラール依存性活性（マイクロモル／分／ｍｇタンパク質）を３４０ｎｍにおける吸光度の変化として測定した。活性の８０％以上がＮＡＤＰＨ依存性であった。
【０２８６】
分析
炎イオン化検出器及び１５メートルの HP-PlotQ megaboreカラムを備えた Agilent 6890N ガスクロマトグラフ（Palo Alto, CA）を用いてエタノールを測定した。Bausch & Lomb Spectronic 70 分光光度計を用いて５５０ｎｍにおける光学密度を測定することによって、乾燥細胞重量を見積もった。１．０のＯＤ５５０ｎｍはおよそ３３３．３ｍｇ ｄｃｗ／Ｌに相当する。
【０２８７】
ＡＭ１培地中のフルフラール濃度は、ＯＤ２４８ｎｍ及びＯＤ３２０ｎｍの吸光度によって測定した（Martinez et al. 2000 Biotechnol Prog. 16:637-641）。この方法の精度はＨＰＬＣ分析で確認した。サトウキビ絞りかすヘミセルロース加水分解物のフルフラール含量は、Agilent ＬＣ１１００液体クロマトグラフ（屈折率モニター及びＵＶ検出器）及び 移動相として水を用いるAminex HPX-87P イオン排除カラム（BioRad, Hercules, CA）を用いて測定した。
【０２８８】
ＰＣＲ産物の創出及びシークエンシング
ＡＭ１最少培地で生育した細菌培養物から、Quiagen DNeasy Blood and Tissue kit を用いて、ゲノムＤＮＡを作成した。目的の領域を Quiagen Taq PCR master mix でＰＣＲ増幅して、得られたＰＣＲ産物を QIAquick PCR purification kit で精製した。２−ｌｏｇ ＤＮＡラダー（ＮＥＢ）中のバンドに対応するＤＮＡを定量した後、ＡＢＩ３１３０ＤＮＡシークエンサー上で分析するために、ＤＮＡをフロリダ大学の Sanger sequencing core に提出した。得られた配列データを集めて、Vector NTI ソフトウェア（Invitrogen）を用いて比較した。
【０２８９】
フルフラール消費アッセイ
３５０ｍＬのＡＭ１−１０％キシロース培地を含有しているフリーカー中で０．６６ｄｃｗ／Ｌの細胞密度まで生育した培養物を、０．５ｇ／Ｌにフルフラールを添加する直前、並びに添加の１５、３０、及び６０分後にサンプリングした。細菌細胞を遠心分離で除去した後に培養液中の残存フルフラール濃度を測定した。既に記載されているように、分光光度法を用いた。
【０２９０】
細菌細胞中におけるルシフェラーゼレポーター活性の測定
適切なレポータープラスミドを担持している大腸菌の培養物をＡＭ１−５％キシロース中で、ＯＤ０．２〜０．４まで生育した。フルフラールの添加後、細胞をペレット化し、Quiagen Qproteome 細菌溶解緩衝液中に再懸濁して、−８０℃で保管した。溶解物を２分間３７℃で解凍して、白色の９６ウェルプレートに移した。等量（５０μＬ）の PerkinElmer BriteLite 試薬を各ウェルに添加して、Promega Glomax 96-well 光度計で発光を測定した。
【０２９１】
バイオスクリーンＣ生育曲線（BioScreen C growth curves）
フルフラールに対する耐性を、BioScreen C growth curve machine を用いて、規定濃度のフルフラールを含有しているＡＭ１−５％キシロース培地における生育によって評価した。培養物を振盪している３７℃の水浴中でＯＤが０．４〜０．６になるまで生育し、ＯＤ＝０．３に希釈して、次いで３５０ｕＬの培地を含有している１００ウェルハニカムプレートの各ウェルに５０μＬを植菌した。３７℃で６５時間の培養期間にわたり、読み取り直前に１０秒振とうして、３０分間隔で光学密度を測定した。菌株とフルフラール濃度のそれぞれの組み合わせに対して１０の複製を用いた。
【０２９２】
プラスミド構築物
蛍ルシフェラーゼ遺伝子をｐＢＡＤ２４（Guzman et al. 1995 J. Bacteriol. 177: 4121-4130）に転写して、ａｒａＣ遺伝子及びｐＢＡＤプロモーター領域をＬＹ１８０中のｙｑｈＤ遺伝子上流の１５０−ｂｐ領域と置き換えて、プラスミドｐＬＯＩ４９００を構築した。この推定ｙｑｈＤプロモーター領域をプライマーＰＣＴ６及びＰＣＴ７を用いてＰＣＲ増幅した（表２）。
【０２９３】
ｙｑｈＣ遺伝子を、プライマーＰＣＴ５０及びＰＣＴ５１でＬＹ１８０ゲノムＤＮＡから増幅し、全ｙｑｈＣ遺伝子と３５４ｂｐ領域上流（天然のプロモーター）を含有するＰＣＲ産物を作成した。この断片を、CopyControl PCR クローニングキット(Epicentre)を用いてｐＣＣ１にクローン化してｐＬＯＩ４９０１を産出した。ｐＣＣ１ベクターは大腸菌Ｆ因子に基づく単一コピープラスミドである。
【０２９４】
【表２】
2012519485.tif 000007
【０２９５】
菌株構築物
ＬＹ１８０中のｙｑｈＣ遺伝子を、相同組み換えによって欠失した。最初に、ｐＫＤ４（Datsenko et al. 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645）由来のカナマイシン（ｋａｎ）カセットを、ｙｑｈＣコード領域の両面にある領域と隣接した。プライマーｙｑｈＣ＿ｋｏ＿ｒｅｖの配列は、ｙｑｈＣの下流領域との隣接部に一致する領域に特異的であった。ｙｑｈＣ＿ｋｏ＿ｒｅｖは、ｙｑｈＣ遺伝子の３’末端の配列と相同な４１−ｂｐ尾部を含有していて、ｋａｎカセットの末端の１９ｂｐにも一致している。ｙｑｈＣの上流末端に、プライマーＰＣＴ４８及びｐＣＴ４９を用いて、ｙｑｈＣの５’末端からｙｑｈＤ遺伝子内に伸びている４１８−ｂｐ断片のＰＣＲ増幅によって隣接領域を作成した。ｋａｎカセットをｐＫＤ４から、プライマーＰＣＴ４６及びＰＣＴ４７で増幅し、次いでＸｈｏＩ部位を介してＰＣＴ４７及びＰＣＴ４８にライゲーションすることによってＰＣＴ４８プラスＰＣＴ４９ＰＣＲ産物（ｙｑｈＣ隣接上流）に結合した。最後に、このｋａｎ上流隣接構築物を最外部プライマーｙｑｈＣ＿ｋｏ＿ｒｅｖ及びＰＣＴ４９でＰＣＲ増幅して、４１−ｂｐ下流隣接部及び４１８−ｂｐ上流隣接部の間がｋａｎカセットで構成される線状ＤＮＡを作成した。レッドリコンビナーゼによる組み換えを用いてＬＹ１８０内のｙｑｈＣ遺伝子をｋａｎカセットで置き換えて、ＬＹ１８０ΔｙｑｈＣを作成した。得られた菌株をＰＣＲ解析及びシークエンシングで確認した。
【０２９６】
インビボにおけるフルフラールの還元
先に記載されているようにして（Miller et al. 2009 Appl. Environ. Microbiol. 75:4315-4323）、３５０ｍＬのＡＭ１−１００ｇ／Ｌキシロース培地を含有しているフレーカー中で細胞密度が０．６６ｇ ｄｃｗ／Ｌになるまで培養物を生育して、フルフラール（０．５ｇ／Ｌ）の添加直前並びに添加後１５、３０、及び６０分後にサンプリングした。遠心分離後の培養液中の残存フルフラールを分光光学方法（Martinez et al. 2000 Biotechnol. Prog. 16: 637-641）を用いて測定した。
【０２９７】
細菌細胞におけるルシフェラーゼレポーター活性の測定
適切なレポータープラスミドを担持している大腸菌の培養物をＡＭ１−５０ｇ／Ｌキシロース中でＯＤ０．４まで生育した。培養物をサンプリングした後、フルフラールを添加して、再びサンプリングする前５，１５又は３０分間培養を続けた。非処理及びフルフラール処理細胞をペレット化し、Qiagen Qproteome 細胞溶解緩衝液中に再懸濁して、−８０℃で保管した。溶解物を３７℃で２分間解凍して、９６ウェルプレート（白色）に移した。等容量（５０μＬ）の PerkinElmer BriteLite 試薬を各ウェルに添加した。Promega Glomax ９６ウェル照度計を用いて発光を測定した。
【０２９８】
マイクロアレイ解析
各菌株に対して、４複製培養液（３５０ｍＬ）をＯＤ＝１．５（０．６６ｇ ｄｃｗ／Ｌ）まで生育してサンプリングした。フルフラール（０．５ｇ／Ｌ）を添加して１５分培養した後サンプルを採取した。培養液サンプルをドライアイス／エタノール浴中で冷却した。細胞を４℃でペレット化し、ＲＮＡ Ｌａｔｅｒ（Quiagen）に再懸濁して、−８０℃で保管した。４発酵物から得た細胞ペレットをプールしてＲＮＡ単離（Quiagen RNeasy Mini Kit）に用いた。ＲＮＡをＤＮａｓｅで処理し、再精製して、Agilent Bioanalyzer を用いて品質を評価した。ＲＮＡサンプルをNimblegen に付してｃＤＮＡに変換し、Ｃｙ３で標識化して、大腸菌Ｋ１２ＴＩ８３３３マイクロアレイチップにハイブリダーゼーションした。このチップは、大腸菌Ｋ１２のＭＧ１６５５株に由来する３８５，０００ ６０−ｍｅｒのプローブを含有していて、遺伝子当たり平均１８プローブを有する、各プローブの５複製物を有している。Nimblegen からの正規化発現データを解析のためにArrayStar(DNA star）に取り込んだ。
【０２９９】
ヌクレオチド配列及びマイクロアレイデータの寄託番号
ＬＹ１８０及びｅＥＭＦＲ９の両方のｙｑｈＣ−ｙｑｈＤ−ｄｋｇＡ領域のＤＮＡ配列は GenBank に寄託されている（受入番号はそれぞれ、ＧＱ４７８２５１及びＧＱ４７８２５２）。マイクロアレイのデータは、受入番号ＧＳＥ１７７８６で、http://ncbi.nlm.nih.gov/geo のGen Expression Omnibus (GEO）に寄託した。
【０３００】
ＡＭ１及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含有している培養試験管（１３×１００ｍｍ）に０．０５ＯＤ５５０ｎｍまで植菌して、３７℃で培養した。これらを１〜２ＯＤ５５０ｎｍの密度で集菌した。細胞ペレットを１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で１回洗浄して、１０ＯＤ５５０ｎｍの密度で緩衝液に再懸濁した。サンプル（１ｍｌ）をLysing Matrix B を含有している２ｍｌの試験管に添加して、FastPrep-24 (MP Biomedicals, Solon, OH）を用いて崩壊した(２０秒）。ＮＡＤＰＨのフラン依存性酸化を、DU 800 分光光度計（Beckman Coulter, Fullerton, CA）を用いて、３４０ｎｍで測定した。反応物（総容量２００μｌ、３７℃）は、５０μＬの粗製抽出物、０．２ｍＭのＮＡＤＰＨ、及び２０ｍＭの５−ＨＭＦを含有していた。ＢＣＡアッセイ（Thermo Scientific, Rockford, IL）を用いてタンパク質を測定した。
【０３０１】
統計解析
データは、平均値±ＳＤ（ｎ≧３）で表している。Graphed Prism ソフトウェア（La Jolla. CA）を用いて、統計比較（両側スチューデントｔ検定）を行った。
【実施例】
【０３０２】
実施例１．フルフラール耐性突然変異体の単離及び初期特性化
１００ｇ／Ｌのキシロース及び増大する濃度のフルフラール（０．５ｇ／Ｌの開始濃度〜１．３ｇ／Ｌの最終濃度）を有するＡＭ１無機塩培地を含有しているｐＨ制御発酵槽中で５４回連続移植した後に、ＬＹ１８０のフルフラール耐性誘導体株を単離した。単一工程（固体培地及び培養液）で１．０ｇ／Ｌのフルフラールに耐性である突然変異体を直接単離する試みは成功しなかった。連続移植の間に、複合的変化と一致して、段階的に改善されたフルフラール耐性が観察された。得られた菌株、ＥＭＦＲ９は、１．０ｇ／Ｌのフルフラールの存在下で、フルフラールが存在しない親株ＬＹ１８０と同じ速度で、生育してキシロースを発酵した（図２）。ＥＭＦＲ９による生育及びエタノール生産も、フルフラールの非存在下における親株ＬＹ１８０のそれを上回った。
【０３０３】
親株ＬＹ１８０への低いフルフラール濃度（０．４ｇ／Ｌ）の添加は、生育及びエタノール生産に初期遅滞をもたらした（図２Ａ及び２Ｂ）。この遅滞の間に、フルフラールは毒性の低いフルフリルアルコールへ化学的に還元された（Zaldivar et al. 1999. Biotechnol. Bioeng. 65: 24-33; Zaldivar et al. 2000 Biotechnol. Bioeng. 68:524-530）（図２Ｃ）。生育及び発酵は、フルフラールの完全除去の直後に３倍以上増大する。ＬＹ１８０による生育及びエタノール生産は７２時間の培養にわたって１．０ｇ／Ｌのフルフラールによって強力に阻害された（図２Ｄ及び２Ｅ）．この期間の間に、ＬＹ１８０が代謝的に活性を保持していることを示して、ほぼ２０％のフルフラールが還元された（図２Ｆ）。ＬＹ１８０とは対照的に、ＥＭＦＲ９はフルフラールの存在（０．４ｇ／Ｌ又は１．０ｇ／Ｌ）によって実質的に影響を受けなかった（図２）。フルフラール還元の容量比は、主により大きい細胞集団によって、両フルフラール濃度でＬＹ１８０よりＥＭＦＲ９について高かった（図２Ｃ及び２Ｆ）。このことは更なる実験によって確認された。この実験では当該細菌が、ＥＭＦＲ（ｍｇ ｄｃｗ当たり）によるＮＡＤＰＨ依存性フルフラール還元のインビボ速度が親株ＬＹ１８０の速度の約半分であることが分かった（図３）。ＬＹ１８０と対照的に、ＥＭＦＲ９の生育及び発酵は事前にフルフラールの還元的除去を必要としない。ＥＭＦＲ９によって、０．４ｇ／ｌ及び１．０ｇ／Ｌのフルフラールの両方は生育と共にフルフリルアルコールに還元された。ＲＭＦＲ９による還元はそれぞれ１２時間及び１８時間後に完了した（図２Ｃ及び２Ｆ）。
【０３０４】
実施例２．フルフラール耐性に対する培地構成要素の効果（ＭＩＣ）
グルコースとは異なって、キシロース発酵中のＮＡＤＰＨの産生には問題があって（White, D. 2000. The Physiology and Biochemistry of Prokaryotes. 2nd edition. Oxford University Press. New York, NY）、異なった培地におけるフルフラールについてＭＩＣを測定してＮＡＤＰＨ競合仮説を試験する手法を提供する。５０ｇ／Ｌのキシロースを有する無機塩培地（図４Ａ）では、フルフラールの最小阻止濃度（ＭＩＣ）はＬＹ１８０（親株）については約１．０ｇ／Ｌで、突然変異株ＥＭＦＲ９については２．０ｇ／Ｌであった。キシロースをグルコースで置き換えるとＮＡＤＰＨプールが増大するはずである。この変化（図４Ｂ）はフルフラールのＭＩＣをＬＹ１８０に対して５０％（１．５ｇ／Ｌ）そしてＥＭＦＲ９に対して２５％（２．５ｇ／Ｌ）増大した。キシロース−無機塩培地への少量（１．０ｇ／Ｌ）の酵母抽出物の添加は、ＮＡＤＰＨを生物合成する必要性を減少することが期待できる。この補完（図４Ｃ）は親株ＬＹ１８０に対するフルフラールのＭＩＣを２倍（２．０ｇ／Ｌ）にして、ＥＭＦＲ９に対するＭＩＣを２５％（２．５ｇ／Ｌ）増大した。全ての培地で、ＥＭＦＲ９は親株ＬＹ１８０よりフルフラールに対して抵抗性であった。グルコース（ＮＡＤＰＨ産生を増大した）及び酵母抽出物（生物合成の必要性を減少した）の両方はフルフラール耐性を増大した。しかしながら、この利益は、ＥＭＦＲ９における低いレベルのフルフラール還元活性と一致して、突然変異株ＥＭＦＲ９に対するより親株、ＬＹ１８０に対して更に顕著であった。
【０３０５】
ヘミセルロース加水分解物に存在していることが知られている別の３化合物：２−ヒドロキシメチルフルフラール（類縁体、ヘキソース糖の加水分解産物）、フルフリルアルコール（フルフラールの還元産物）、及びシリンガアルデヒド（リグニンの分解産物）：についてのＭＩＣも試験した。ＥＭＦＲ９は、２−ヒドロキシメチルフルフラールに対して、ＬＹ１８０（２．５ｇ／ＬのＭＩＣ）よりやや耐性（３．０ｇ／ＬのＭＩＣ）であった。両方の菌株は、シリンガアルデヒド（２．０ｇ／ＬのＭＩＣ）及びフルフリルアルコール（１５ｇ／ＬのＭＩＣ）に対して同様に感受性であった（データを示していない）。ＥＭＦＲ９において他の化合物に対する増大した耐性が無いことは、フルフラール毒性に対する特異部位又は標的と一致している。
【０３０６】
実施例３．ｍＲＮＡマイクロアレイ解析による酸化還元酵素発現の比較
過去の研究は、大腸菌がフルフラールを毒性の低い化合物（フルフリルアルコール）に還元できるＮＡＤＰＨ依存性酵素を含有していることを明らかにしているが、遺伝子は１つも特定されていない（Gutierrez et al. 2006. J. Bacteriol.  121:154-164）。親株ＬＹ１８０の生育前のフルフラールの完全還元への依存性、及びＥＭＦＲによるこの依存性の減少は更に、フルフラールの感受性に最も重要である酸化還元酵素に関連している。
【０３０７】
ｍＲＮＡのマイクロアレイ解析を、フルフラール還元のための候補酸化還元酵素を同定するために用いた。ＬＹ１８０及びＥＭＦＲ９の培養物を、１００ｇ／Ｌ（ｗｔ／ｖｏｌ）のキシロースを用いるｐＨ制御発酵で対数増殖期中期まで生育した。この比較のために、０．５ｇ／Ｌのフルフラールの添加１５分後にＲＮＡを単離した。全部で１２個の公知の推定酸化還元酵素が、約２倍又はそれ以上差があることを見出した（表３）。
【０３０８】
【表３】
2012519485.tif 000008
【０３０９】
ＥＭＦＲ９において低いレベルで発現された４個の酸化還元酵素を同定した（表３）。これら４個の遺伝子のそれぞれをプラスミドにクローン化してＥＭＦＲ９に形質転換した。プラスミドから発現すると、これらの遺伝子のうちの３個（ｄｋｇＡ、ｙｑｈＤ及びｙｑｆＡ）がフルフラール耐性を減少することが見出された（図５）。ｙｑｈＤ及びｄｋｇＡの発現が最も有害であって、両者はＥＭＦＲ９においてフルフラールの還元酵素活性を増大することを示した（図３Ｂ）。ｙｑｆＡの発現は、ＥＭＦＲ９のフルフラール還元酵素活性を回復せずに、その生育阻害に対する効果は別の機能と関連しているだろう。生育に対する有害効果はｙｊｊＮについて観察されなかった。よって、ＥＭＦＲ９におけるｙｑｈＤ、ｄｋｇＡ、及びｙｑｆＡの発現の減少はフルフラール耐性に対して有益であると推測できる。ＥＭＦＲ９におけるｙｑｈＤ及びｄｋｇＡのサイレンシングは、フルフラール還元中のＮＡＤＰＨの生物合成との競合を減少するだろう。
【０３１０】
その他の８個の遺伝子を発現するためにＬＹ１８０からｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへクローン化した。これら８個の酸化還元酵素は親株ＬＹ１８０に比べてＥＭＦＲ９内の発現を増加した（１．８倍〜４．５倍）。これらの遺伝子をそれぞれ含有しているプラスミドをＬＹ１８０に形質転換した。しかしながら、これら８個はどれもフルフラール耐性の増大をもたらさなかった（データを示していない）。
【０３１１】
ｙｑｈＤ、ｄｋｇＡ、及びｙｑｆＡサイレングの潜在的重要性を更に試験するために、これらの遺伝子それぞれをＬＹ１８０から欠失する試みを行った。ｙｑｈＤ及びｄｋｇＡの両方の欠失は容易に回復できたが、ｙｑｆＡで同じ方法は成功しなかった。ＬＹ１８０における、ｙｑｈＤ単独の又はｄｋｇＡと組合せた欠失は、ＥＭＦＲ９のそれ（図３Ａ）と同様に、インビボにおいてフルフラール耐性の増大（図６）及びフルフラール還元酵素活性の減少を引き起こした。ＬＹ１８０においてｄｋｇＡ単独の欠失はインビボでの還元酵素酵素を低下することもフルフラール耐性を増大することもないので、ＹｑｈＤが、低濃度のフルフラールによる生育阻害に対してより重要に活動していると推測された。両方の遺伝子を欠失した後に最も低いフルフラール還元酵素活性が見出された。
【０３１２】
実施例４．ＹｑｈＤ」及びＤｋｇＡの特性化
酸化還元酵素の間の遺伝子発現の最も大きな変化は、ｙｑｈＤ及びｄｋｇＡのサイレンシングであった。ＹｑｈＤ及びＤｋｇＡの両者を、ｈｉｓ標識化タンパク質としてＢＬ２１（λＤＥ３）に発現して、識別可能な均一性にまで精製した。両酵素は、フルフラールのフルフリルアルコールへのＮＡＤＰＨ依存性還元を触媒した。フルフラールに対する見掛けのＫｍ値は、ＹｐｈＤ（９．０ｍＭ）及びＤｋｇＡ（＞１３０ｍＭ）については比較的高かった。このような値では、フルフラールが両酵素の元来の基質であるとは思われない。細胞がフルフラールに透過性であると理論的に仮定すると、ＹｑｈＤ及びＤｋｇＡの細胞内活性は、選択のために用いるフルフラール濃度（５〜１４ｍＭ；０．５〜１．３ｇ／Ｌ）の範囲にわたって変化すると期待できる。ＮＡＤＰＨに対する見掛けのＫｍ値はＹｑｈＤ（８μＭ）及びＤｋｇＡ（２３μＭ）の両者について非常に低かった。フルフラールの存在下では、両酵素のＮＡＤＰＨに対する高い親和性はＮＡＤＰＨに対する生合成反応と効果的に競合するだろう。経路におけるＮＡＤＰＨの分配は、ＮＡＤＰＨに対するＫｍ、ＮＡＤＰＨの定常状態のプールサイズ、及び競合する酸化還元酵素活性の相対存在量によって確認できるだろう。
【０３１３】
実施例５．ヘミセルロースの酸加水分解物に対する耐性
ヘミセルロースの加水分解物は、共同して微生物の生育及び発酵を阻害するように作用する化合物の混合物を含有している（Martinez et al. 2001 Biotechnol. Prog. 17:287-293; Martinez et al. 2000 Biotechnol. Bioengin. 69(5): 526-536; Zaldivar et al. 1999 Biotechnol. Bioeng. 65: 24-33; Zaldivar et al. 1999 Biotechnol. Bioeng. 66: 203-210; Zaldivar et al. 2000. Biotechnol. Bioeng. 68:524-530）。１．４ｇ／Ｌのフルフラールを含有している中和した加水分解物の希釈物中で生育及び発酵を試験した（図７）。生育及びエタノール生産に対するＭＩＣ値（３０％加水分解物）は同様であったが、ＥＭＦＲ９は、親のＬＹ１８０より、３倍の高密度で生育して、２０％加水分解物中で１０倍を超えてエタノールを多く生産した。フルフラールへの耐性を増大するためのＥＭＦＲ９の選択には、ヘミセルロース加水分解物に対する耐性の増大を伴っていて、加水分解物毒性の構成要素としてのフルフラールの重要性が確認された。
【０３１４】
実施例６．天然のフルフラール耐性突然変異体
大腸菌のゲノムにおいてｙｑｈＣは、ＹｑｈＣと反対方向に転写されているｙｑｈＤ及びｄｋｇＡ遺伝子と隣接している（図８）。
ＰＣＲとＤＮＡシークエンシングの併用による、フルフラール耐性株ＥＭＦＲ９のｙｑｈＣ領域の分析は、ＥＭＦＲ９がｙｑｈＣ遺伝子内への挿入配列ＩＳ１０の自然挿入を含有していることを明らかにした（図８）。ＲＮＡのマイクロアレイ解析（図９）及びＲＮＡの定量的リアルタイム逆転写（示していない）に基づくと、ｙｑｈＣの不活性化はｙｑｈＤ及びｄｋｇＡを下方調節する。
【０３１５】
セルロース加水分解物の存在下における生育、及び親株ＬＹ１８０と比較してフルフラールに耐性であること（示していない）に基づいて、エタノール生産株ＭＭ２０５を選択した。ＭＭ２０５のｙｑｈＣ遺伝子及び周辺領域の配列分析は、野生型１９９アミノ酸のｙｑｈＣタンパク質の代わりに予測突然変異タンパク質が２１５アミノ酸となるような、フレームシフトをもたらす、ｙｑｈＣ遺伝子内に天然の単一Ａ挿入基の存在を明らかにした。１〜１８８位の残基はＭＭ２０５ｙｑｈＣタンパク質では正常であったが、フレームシフトに起因する次の２７アミノ酸はタンパク質のＣ末端にあるその野生型残基とは異なっている。
【０３１６】
実施例７．ｙｑｈＣ遺伝子の欠失はフルフラールに対する耐性を増大する
ＬＹ１８０内で、全ｙｑｈＣ遺伝子の欠失操作を行った。この構築物において、ｙｑｈＣオープン・リーディング・フレームを選択可能なカナマイシン耐性カセットと置き換えた。ｋａｎ−ｒｅｓ転写の方向は、隣接ｙｑｈＤ及びｄｋｇＡ遺伝子と離れて、元のｙｑｈＣ遺伝子と同じ方向である。
【０３１７】
BioScreen C 生育曲線器における、異なったフルフラール濃度でのＬＹ１８０及びＬＹ１８０ΔｙｑｈＣの生育比較は、ＬＹ１８０ΔｙｑｈＣが親のＬＹ１８０より実質的にフルフラール耐性であったことを明らかにした（図１０ＡＢ）。野生型ｙｑｈＣ遺伝子のプラスミド経由で作成したコピーの、その天然のプロモーターの制御下における、ＬＹ１８０ΔｙｑｈＣ内への再導入は、フルフラール感受性を親株のＬＹ１８０と同じレベルに回復した（図１０Ｃ）。空ベクターｐＣＣ１のＬＹ１８０ΔｙｑｈＣへの導入はフルフラール耐性に影響を与えなかった（図１０Ｄ）。これらの結果は、ｙｑｈＣタンパク質の非存在がフルフラールに対する耐性の増大をもたらすことと一致する。
【０３１８】
実施例８．ｙｑｈＣ欠失突然変異体はフルフラール還元の速度を減少する
天然由来フルフラール耐性突然変異株ＥＭＦＲ９はｙｑｈＤ及びｄｋｇＡの両方の発現を減少する。これらの酸化還元酵素のレベルの低下は、フルフラールが存在すると、ＮＡＤＰＨプールの枯渇を軽減する。先に述べたように、ＥＭＦＲ９は、その他の特性化又は非特性化突然変異に加えて、ｙｑｈＣコード配列内に存在するＩＳ１０挿入配列を有している。
【０３１９】
ＬＹ１８０及びＬＹ１８０ΔｙｑｈＣによるフルフラール還元の速度を、フレーカー内のＡＭ１−１０％キシロース培地中で規定のＯＤまで２つの株を生育し、フルフラールを０．５ｇ／Ｌまで添加し、間隔を置いてサンプルを採取して、残存フルフラール濃度を分光光学的に測定することによって、直接比較した。結果（株当たり４つの同一性フレーカーから得た）は、フルフラール還元の速度がＬＹ１８０と比較してＬＹ１８０ΔｙｑｈＣで低下していることを示して(図１１)、これはｙｑｈＣの欠失が、ＮＡＤＰＨの酸化が同時に起こる、フルフラールをフルフリルアルコールへ正常に還元する酸化還元酵素の下方調節をもたらすことと一致する。
【０３２０】
実施例９．ｙｑｈＣの欠失は、フルフラールへの曝露によるｙｑｈＤプロモーターの誘発を妨げる
ｙｑｈＤプロモーターからの転写に対するフルフラールの効果を評価するために、ｙｑｈＤプロモーターの下流に、蛍ルシフェラーゼレポータを用いてプラスミドｐＰｙｑｈＤ−ｌｕｃ（図１２）を構築した。ｐＰｙｑｈＤ−ｌｕｃを担持しているＬＹ１８０におけるルシフェラーゼ活性の測定は、フルフラール添加後１５分で活性が増大したことを示した（図１３）。しかしながら、レポータープラスミドｐＰｙｑｈＤ−ｌｕｃをＥＭＦＲ９及び更なるフルフラール耐性誘導体ＥＭＦＲ１７内に転写すると、フルフラールの添加によるルシフェラーゼの発現は増大せずに（図１３）、これらの株はフルフラールが存在すると通常生じるｙｑｈＤプロモーター由来の活性を抑制するようになることを示唆した。
【０３２１】
ｙｑｈＣ欠失のｙｑｈＤプロモーター活性に対する効果を、ｐＰｙｑｈＤ−ｌｕｃをＬＹ１８０ΔｙｑｈＣ内に転写して試験した。得られた結果（図１４）は、ｐＰｙｑｈＤ−ｌｕｃレポータープラスミド由来のルシフェラーゼの誘発がｙｑｈＣの欠失によって大きく減少したことを示した。
【０３２２】
得られるデータは、ｙｑｈＣが、フルフラールを包含する、ｙｑｈＤに対する基質の添加による陽性の（positive）方法で、ｙｑｈＤの転写を調節することを明らかにしている（図１５）。ｄｋｇＡ遺伝子はそれ自身のプロモーターを有している（Gama-Castro et al., 2008 Nucleic Acids Res 36:D120-D124 ）にも関わらず、本明細書で示したデータによれば、ｙｑｈＤ及びｄｋｇＡは協調的に調節される。
【０３２３】
実施例１０．フルフラール耐性株ＥＭＦＲ９はｙｑｈＣのＩＳ１０挿入を含有している
大腸菌ＬＹ１８０のフルフラール耐性突然変異株（ＥＭＦＲ９）において２つのＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素（ｙｑｈＤ及びｄｋｇＡ）のサイレンシングがフルフラール耐性の増大をもたらすことは既に示されている（Miller et al. 2009 Appl. Environ Microbiol 75:4315-4323 ）。これらの遺伝子のコード領域に又は直ぐ上流及び下流領域において突然変異は見い出さなかった。第３の隣接遺伝子ｙｑｈＣ（図１９）もＥＭＦＲ内でサイレンシングした。マイクロアレイ分析で、親株ＬＹ１８０におけるフルフラールの添加によってこれら３つの遺伝子は強力に上方調節（＞６倍）された（図２０Ａ）。
【０３２４】
上流（ｙｑｈＣ）及び下流（ｙｑｈＧ）遺伝子にシークエンシングを延長した。ｙｑｈＣ遺伝子のＰＣＲ増幅は、側面にｙｑｈＣ由来の９塩基配列ＴＧＣＣＡＧＧＣＴのコピーが配置されている、１．３ｋｂのＩＳ１０を含有している予想外に大きいＰＣＲ産物をもたらした。下流ｙｑｈＧ領域に突然変異は見いだされなかった。大腸菌ｙｑｈＣ遺伝子はｙｑｈＤの方向と反対に転写されていて（図１９）、ＤＮＡ結合タンパク質のＡｒａＣ／ＸｙｌＳファミリーに属する予測転写制御因子をコードする（Gallegos et al. 1997 Microbiol Mol Biol. Rev. 61: 393-410）。これらの幾つかは転写の活性化因子及び抑制因子の両方として作用するものの、その多くは活性化因子である。
【０３２５】
実施例１１．ＬＹ１８０におけるｙｑｈＣの欠失はフルフラール耐性を増大した
ＬＹ１８０のｙｑｈＣ遺伝子をカナマイシン耐性カセットで置き換えてＬＹ１８０ΔｙｑｈＣを作り出した。ＬＹ１８０と欠失株のフルフラール耐性をBioScreen C 生育曲線分析器を用いて比較した。得られたプロット（図２１Ａ及びＢ）は、１．０、１．５及び２ｇ／Ｌフルフラールにおいて、ＬＹ１８０ΔｙｑｈＣが親株よりより耐性であることを明確に示した。フルフラール耐性の変化は、野生型ｙｑｈＣ遺伝子のプラスミド経由コピー（ｐＬＯＩ４９０１）をその天然のプロモーターとともに導入して、フルフラール感受性を十分回復することによる、ｙｑｈＣの突然変異によって、引き起こされたことも確認された（図２１Ｃ）。ＬＹ１８０ΔｙｑｈＣに空ベクター（ｐＣＣ１）を存在させると、フルフラール感受性に影響を与えなかった（図２１Ｄ）。（ＥＭＦＲ９における）ＩＳ１０の挿入或いは（ＬＹ１８０ΔｙｑｈＣにおける）完全欠失の何れかによるｙｑｈＣの突然変異は、フルフラール耐性の増大をもたらした。
【０３２６】
発酵中のフルフラール還元のインビボでの速度を試験した。ＬＹ１８０株によるフルフラール還元速度（０．０４２±０．００１μモル／分／ｍｇｄｃｗ）はＬＹ１８０ΔｙｑｈＣ株によるもの（０．０２５±０．００５μモル／分／ｍｇｄｃｗ）より有意に高く（６８％；ｐ＜０．０５（５％））、親株のみへのＹｑｈＤ及びＤｋｇＡの導入と一致する。
【０３２７】
実施例１２．ｙｑｈＤプロモーター（ルシフェラーゼレポーター）の転写調節
蛍ルシフェラーゼレポーターの直ぐ上流にｙｑｈＤプロモーター（１５１ｂｐ）を用いてプラスミドｐＬＯＩ４９００を構築した（図２２Ａ）。このプラスミドを、親株ＬＹ１８０及びＬＹ１８０ΔｙｑｈＣにおける転写制御を検討するために用いた。ＬＹ１８０（ｐＬＯＩ４９００）では、フルフラールの添加（１ｍＭ、５ｍＭ、及び１０ｍＭ）が５分以内に明白な、ルシフェラーゼ活性の用量依存性増加をもたらした（図２２Ｂ）。このプラスミドを内部に持つｙｑｈＣ欠失株においては、フルフラールに依存する応答は観察されなかった（図２２Ｃ）。発現の定常状態のレベルが両株で観察されたがＬＹ１８０ΔｙｑｈＣでは低かった。
【０３２８】
ｐＬＯＩ４９００を担持しているＥＭＦＲ９はＬＹ１８０ΔｙｑｈＣ（ｐＬＯＩ４９００）のそれと同様の結果をもたらした（図示せず）。フルフラールの非存在下でのルシフェラーゼの基礎レベルは低くて、フルフラールの添加はルシフェラーゼ活性を増大しなかった。ｐＬＯＩ４９００の非存在下ではルシフェラーゼ活性は検出されなかった。
【０３２９】
ヘミセルロースの希酸加水分解物中に存在していることが知られているその他のアルデヒド（Palmqvist et al. 2000 Bioresour. Technol. 74:25-33）も、ＬＹ１８０（ｐＬＯＩ４９００）及びＬＹ１８０ΔｙｑｈＣ（ｐＬＯＩ４９００）を用いて、各種濃度で試験
した。ＬＹ１８０（ｐＬＯＩ４９００）において、全てがルシフェラーゼ活性を２〜５倍増大した（データは示されていない）。これらは、アセトアルデヒド（１ｍＭ）、プロピオンアルデヒド（１ｍＭ）、ブチルアルデヒド（１ｍＭ）、５−ヒドロキシメチルフルフラール（１ｍＭ）、及び桂皮アルデヒド（０．１ｍＭ）を包含していた。メチルグリオキサール（０．１ｍＭ）もＬＹ１８０（ｐＬＯＩ４９００）においてルシフェラーゼ活性を増大することが見出された。ＬＹ１８０ΔｙｑｈＣにおいて、これらの化合物はどれもルシフェラーゼ活性を増大しなかった。
【０３３０】
これらの結果を合わせると、ＹｑｈＣが、ｙｑｈＤプロモーターからアルデヒド誘発性発現のための必須の、トランス活性転写活性化因子であることを明らかにしている。ｙｑｈＣの突然変異体（ＩＳ１０の挿入又は欠失）は、転写におけるアルデヒド誘発性増大を除去した。
【０３３１】
実施例１３．転写レベルに対するｙｑｈＣ欠失の効果
０．５ｇ／Ｌのフルフラール添加直前及び１５分後にＬＹ１８０株及びＬＹ１８０ΔｙｑｈＣ株から全ＲＮＡを調製した。ｙｑｈＣ−ｙｑｈＤ−ｄｋｇＡ領域並びに隣接遺伝子ｙｇｈＢ（保存内膜タンパク質）及びｙｑｈＧ（機能未知）に対する発現結果を図２０Ｂに示す。Ｌ１８０において、ｙｑｈＣ、ｙｑｈＤ、及びｄｋｇＡ転写産物の発現は、予測通り、フルフラールの添加によって上方調節された。ＬＹ１８０ΔｙｑｈＣにおいては、このフルフラール応答は存在しなかった。隣接遺伝子は低レベルで発現して、作用は少なかった。ＬＹ１８０ΔｙｑｈＣにおけるｙｑｈＣの低レベルの明白な発現は、ＬＹ１８０におけるｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、及びｆｒｄＢＣのような他の遺伝子欠失について観察されたものと類似していて、大腸菌Ｋ１２チップで得られたハイブリダイゼーションのバックグラウンドレベルを反映していた。これらのデータは、ｙｑｈＤプロモーターからの転写の陽性調節遺伝子としてのＹｑｈＣ作用と一致している。
【０３３２】
ｙｑｈＤとｄｋｇＡの間の遺伝子間領域に広がる転写産物の存在を、ｙｑｈＤ−ｄｋｇＡギャップに隣接するプライマーを用いて、ｑＰＣＲで調査した。フルフラール無しで生育したＬＹ１８０細胞のＲＮＡ由来ｃＤＮＡをテンプレートとして用いた。遺伝子間のギャップを架橋することが期待できる大きさのＰＣＲ産物を回収した。その量は、ｙｑｈＤの内部にあるプライマーを用いて作成したＰＣＲ産物のものよりほんの少し少ないだけであった（データは示していない）。従って、ｙｑｈＤプロモーターからの転写は、隣接ｄｋｇＡ遺伝子に広がっているように見える。ｄｋｇＡ転写産物の量は、ｙｑｈＤ又はｙｑｈＤ−ｄｋｇＡ遺伝子間領域の何れかで見られる量よりも多く、更なるｄｋｇＡプロモーターの存在を示す実験的な証拠（Gama-Castro et al. 2008 Nucleic Acids Res 36: D120-D124）と一致した。
【０３３３】
ＹｑｈＣが、ｙｑｈＣ遺伝子に隣接する領域とは別の領域を調節するか否かについての問題は、ｙｑｈＣの欠失によって異なって発現する更なる遺伝子についてのマイクロアレイデータの全てを検索して対処した。ＴＩ８３３３マイクロアレーチップ上に表された４，２３７遺伝子についての発現レベルの比較は、フルフラールの非存在下で、ＬＹ１８０とＬＹ１８０ΔｙｑｈＣの間で２倍又はそれ以上異なって発現する遺伝子が合計７２個存在することを明らかにした。これらのうち、４１個はＬＹ１８０ΔｙｑｈＣにおいて下方調節され、３１個は上方調節された。フルフラール（０．５ｇ／Ｌ）の存在下で、１３４個の遺伝子が２倍のレベルで異なって調節された（ＬＹ１８０ΔｙｑｈＣにおいて３２個が下方調節されて、１０２個が上方調節された）。両方のデータセットにおいて、合計３４個の遺伝子が２倍又はそれ以上発現が異なっていた（両方のセットで２４個が下方調節されて、両方のセットで１０個が上方調節された）。ＬＹ１８０ΔｙｑｈＣにおいて両方の条件下で下方調節された遺伝子は、ｙｑｈＣ、ｙｑｈＤ、ｄｋｇＡ、ｔａｕＡＢＣＤ及びｓｓｕＥＡＤＣＢオベロン、調節因子ｃｂｌ及びｎａｃ、並びにその他（ｆｉｍＣ、ｍｄａＢ、ｒｓｐＡ、ｙｂａＹ、ｙｂｅＨ、ｙｃｄＦ、ｙｄｈＰ、ｙｅｅＯ、ｙｊｆｙＹ、及びｙｍｃＤ）を包含していた。ＬＹ１８０と比較してＬＹ１８０ΔｙｑｈＣにおいて、両方の条件下で２倍又はそれ以上上方調節された遺伝子は、銅の代謝において作用する、ｃｕｅＯ、ｃｏｐＡ、及びｃｕｓＣＦＢ；並びにｃｈｂＢ、ｇｄｈＢ、ｈｉｐＢ、ｙｄｅＵ、及びｙｄｅＫを包含していた。
【０３３４】
これら３４個の遺伝子の発現レベルは、フルフラールの存在下又は非存在下でＬＹ１８０とＥＭＦＲ９（ｙｑｈＣにＩＳ１０挿入）を比較した先のデータセット（Miller et al. 2009 Appl Environ. Microbiol 75: 6132-6141; Miller et al. 2009 Appl. Environ. Microbiol. 75: 4315-4323）において分析した。ＥＭＦＲ９におけるｙｑｈＣのＩｓ１０不活性化は、ｙｑｈＣ欠失（ＬＹ１８０ΔｙｑｈＣにおける）に起因するものと同様な変化をもたらすだろうと結論付けた。試験した全てのデータセットにおいて、ｙｑｈＤ及びｄｋｇＡの発現は、フルフラールの非存在下及び存在下の両方で、ＬＹ１８０と比較してＥＭＦＲ９において一貫して減少していた。フルフラールによるｙｑｈＤ発現の倍減は、ＬＹ１８０と比較してＥＭＦＲ９に対して少なくとも６．０倍であって、ｄｋｇＡについては少なくとも１０．６倍であった。しかしながら、ＬＹ１８０と比べたｔａｕＡＢＣＤ及びｓｓｕＥＡＤＣＢオベロン、ｃｂｌ、並びにその他の遺伝子についての２倍又はそれ以上の下方調節は、ＥＭＦＲ９で観察されなかった。ＬＹ１８０ΔｙｑｈＣにおいて上方調節された１０個の遺伝子はＥＭＦＲ９において上方調節されなかった。ｙｑｈＣ、ｙｑｈＤ及びｄｋｇＡ以外の、遺伝子はどれも、機能的ＹｑｈＣタンパク質の非存在下で一貫して上方又は下方調節されなかった。
【０３３５】
実施例１４．別の細菌属におけるｙｑｈＣ及び関連遺伝子のオルソログ
大腸菌以外の細菌におけるｙｑｈＣオルソログ及びｙｑｈＤ及びｄｋｇＡ遺伝子の相対物の存在を、EcoCyc（Keseler et al. 2009 Nucleic Acids Res 37: D464-D470）で入手できる検索用ゲノムによって調査した。大腸菌ｙｑｈＣのオルソログを含有する４６の属のうち４０がグラム陰性細菌であった。ｙｑｈＤ及びｄｋｇＡに類似している遺伝子とｙｑｈＣオルソログとの近接さを EcoCyc マルチゲノムブラウザーを用いて試験した（図２３）。全てのグラム陽性菌を包含して、殆どの属（４６属のうち３４属）はｙｑｈＣオルソログの近くに確認しうるｙｑｈＤ又はｄｋｇＡオルソログを含有していなかった（例えば、アシネトバクター ｓｐ．及びキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））。しかしながら、３４属のうち２４属は、ゲノムの他の場所にｙｑｈＤ又はｄｋＡオルソログの一方を含有していた。４６属のうち５属はｙｑｈＣに加えて隣接ｙｑｈＤオルソログを含有していたが、ｄｋｇＡオルソログは含有しておらず（例えば、アエロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）及びビブリオ・パラヘモリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ））、そして１属（サーマトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、示していない）が隣接ｙｑｈＤオルソログを含有せずに隣接ｄｋｇＡオルソログを含有していた。５つの属が大腸菌と類似した配列で３つの遺伝子全てを含有していた。このグループは腸内細菌科に限定されて、エシェリキア属、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ属、クレブシエラ属、ペクトバクテリウム属（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、及びエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）を包含している。Ｐ．アトロセプチカム（Ｐ．ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）における遺伝子の配列は、ｙｑｈＣオルソログ（ＥＣＡ０３５２）とｙｑｈＤオルソログ（ＥＣＡ０３５０）の間に推定ニトロ還元酵素遺伝子、ＥＣＡ０３５１が存在するという点で独特であった。
【０３３６】
実施例１５．ＥＭＦＲ９株は５−ＨＭＦに対して増大した耐性を示す
フルフラール耐性突然変異体、ＥＭＦＲ９に存在している突然変異も５−ＨＭＦに対する耐性を増大した（図２４）。１．０ｇ／Ｌの５−ＨＭＦにおいて、ＥＭＦＲ９による生育及びエタノール生産は５−ＨＭＦが存在していないＬＹ１８０（親株）のそれと同等であった（図２４Ａ、２４Ｂ）。発酵の最初の２４時間の間に、細胞生産及びエタノール生産に有害な影響を及ぼさずに、ＥＭＦＲ９によって５−ＨＭＦが急速に代謝された。５−ＨＭＦのレベルが培養中にゆっくり減少したのにもかかわらず、１．０ｇ／Ｌの５−ＨＭＦによってＬＹ１８０の生育が完全に阻害された（図２４Ａ、２４Ｂ、及び２４Ｃ）。植菌なしで、減少は観察されなかった（データは示していない）ので、これは代謝活性の結果であるということが確認された。
【０３３７】
ＥＭＦＲ９を用いると、エタノール生産及び生育は２．５ｇ／Ｌの５−ＨＭＦの混入によって遅延するが、９６時間後に完了した（図２４Ｄ、２４Ｅ、及び２４Ｆ）。この高レベルの５−ＨＭＦを伴う細胞及びエタノール生産は、５−ＨＭＦなしでのＬＹ１８０に匹敵した。５−ＨＭＦのレベルはＥＭＦＲ９によって急速にそして完全に減少した。ＬＹ１８０では、５−ＨＭＦの代謝は遅くて不完全であった（図２４Ｆ）。
【０３３８】
実施例１６．５−ＨＭＦ耐性に対するＹｑｈＤ及びＤｋｇＡの効果
ＥＭＦＲ９におけるフルフラール耐性は、２つのＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素、ＹｑｈＤ及びＤｋｇＡのサイレンシングに起因していることが先に明らかにされた（Miller et al. 2009b Appl Environ Microbiol 75: 4315-4323）。これらの活性体をコードする遺伝子をｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ内にクローン化し、ＥＭＦＲ９内に転写して、０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘発した。細胞を採取し、破壊して、５−ＨＭＦ還元酵素活性について試験した（図２５Ａ）。プラスミドからのｙｑｈＤ及びｄｋｇＡの個々の発現は、ＮＡＤＰＨの５−ＨＭＦ依存性酸化の速度を５倍に増大して、ＹｑｈＤ及びＤｋｇＡが５−ＨＭＦを基質として用いることが確認された。
【０３３９】
プラスミドからのｙｑｈＤ及びｄｋｇＡの個々の発現は５−ＨＭＦに対するＥＭＦＲの耐性を減少した（図２５Ｂ）。プラスミド保持のためのカナマイシンの添加（１２．５ｍｇ／Ｌ）は全ての菌株で５−ＨＭＦ耐性を減少して、この実験において低濃度の５−ＨＭＦ（１．０ｇ／Ｌ）の使用を必要とした。プラスミドｐＣＲ２．１はＩＰＴＧの非存在下でクローン化した遺伝子を発現しやすい（Purvis et al. 2005 Appl Environ Microbiol 71:3761-3769）。ｙｑｈＤの非誘導発現でも５−ＨＭＦに対するＥＭＦＲ９の感受性を回復するのに十分であった。５−ＨＭＦによる生育阻害はｙｑｈＤの誘導によって更に増大した。ｄｋｇＡの発現は、ＥＭＦＲ９における５−ＨＭＦ感受性を保持するためには効果が弱く、誘導を必要とした。これら２つの酸化還元酵素の間の有効性の相違は、ＮＡＤＰＨに対するＤｋｇＡの２３μＭと比較してＹｑｈＤの低い見掛けＫｍ（８μＭ）に一致している（Miller et al. 2009b Appl Environ Microbiol. 75: 4315-4323）。
【０３４０】
ＬＹ１８０からのｙｑｈＤの欠失は２．５ｇ／Ｌの５−ＨＭＦに対する耐性を増大した（図２５Ｃ）。染色体にマーカーが残存している場合の欠失は効果が弱いが、ｙｑｈＤの不活性化は全ての場合で５−ＨＭＦ耐性に有益であることが確認された。
【０３４１】
実施例１７．ＮＡＤＰＨの利用可能性の増大は５−ＨＭＦ耐性を増大した
プロトン転座型トランスハイドロゲナーゼｐｎｔＡＢ（Keseler et al. 2009 Nucleic Acids Res 37: D464-70）をＬＹ１８０内で過剰発現して（図２６）ＮＡＤＰＨの利用可能性を増大した。阻害因子の非存在下で（図２６Ａ）、ベクターを有するＬＹ１８０（対照）及びＬＹ１８０（ｐＴｒｃ９９ａｐｎｔＡＢ）の両方を同じ速度で生育した。ＩＰＴＧ（０．０１ｍＭ）を用いるＬＹ１８０（ｐＴｒｃ９９ａ−ｐｎｔＡＢ）の誘導を５−ＨＭＦの非存在下で有害であった。しかしながら、非誘導ＬＹ１８０（ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｔＡＢ）は、５−ＨＭＦの存在下（０．９ｇ／Ｌ及び１．８ｇ／Ｌ）でベクター対照より早く生育した。ｐｎｔＡＢの同様な効用がフルフラールを用いて先に観察されている（Miller et al. 2009b）。従って、両方のフランによる生育阻害は、フラン還元に起因して、生合成に必要なＮＡＤＰＨのプールを消耗すると思われる。更に、ｐｎｔＡＢの過剰発現は、フルフラールの非存在下でも、７２時間後の総生育の増大をもたらし、生合成をこれらの条件下でＮＡＤＰＨによって制限できることを示した。
【０３４２】
硫黄の同化及びシステインの生合成は、ＮＡＤＰＨにとって特に高い必要性を有する。システインの補完が、大腸菌ＬＹ１８０におけるフルフラール耐性を増大することは先に示された（Miller et al. 2009a Appl Environ Microbiol 75: 6132-6141）が、５−ＨＭＦに対しては有用性が低いことが分かった（図２７）。ＬＹ１８０の生育は１ｇ／Ｌの５−ＨＭＦによってある程度阻害されて、１００μＭのシステインの補完によって完全に回復した。２．５ｇ／Ｌの５ＨＭＦの存在下での生育は、１００μＭ又は１０００μＭのシステインによって回復しなかった（図２７Ｂ）。フルフラールとは異なって、システインの補完は５−ＨＭＦに対するＭＩＣを増大しなかった。
【０３４３】
均等物
本明細書に記載されている本発明の特定の実施態様の多くの均等物を、当業者は認識し、或いは単に通常の実験程度のものを用いて確認することができるだろう。このような均等物は本発明に包含されることが意図されている。
【０３４４】
参照による取り込み
本明細書において特定されている全ての刊行物、特許出願及び特許はその全てが参照により明確に本明細書に取り込まれている。
【図１】
2012519485.tif 000009
【図２Ａ−Ｃ】
2012519485.tif 000010
【図２Ｄ−Ｆ】
2012519485.tif 000011
【図３】
2012519485.tif 000012
【図４】
2012519485.tif 000013
【図５】
2012519485.tif 000014
【図６】
2012519485.tif 000015
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ−Ｃ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ−１】
2012519485.tif 000039
【図２９Ａ−２】
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【図２９Ａ−３】
2012519485.tif 000041
【図２９Ａ−４】
2012519485.tif 000042
【図２９Ｂ−１】
2012519485.tif 000043
【図２９Ｂ−２】
2012519485.tif 000044
【配列表】
2012519485000001.app
【国際調査報告】
2012519485.tif 000045
2012519485.tif 000046
2012519485.tif 000047
2012519485.tif 000048