(57)【要約】本発明はＥＮａＣ遺伝子発現および／または活性のモジュレーションに応答する、および／またはＥＮａＣ遺伝子発現経路をモジュレートする体質、疾患および状態の研究、診断、および治療のための化合物、組成物、および方法に関する。特に本発明はＥＮａＣ遺伝子発現に対抗するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することができる、または媒介する、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子等の小型核酸分子を含む２本鎖核酸分子に関する。
2012509688.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
相互に相補的である第１の鎖および第２の鎖を有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、少なくとも１つの鎖が下記：
５’−ＵＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＵＣ−３’（配列番号１０）；
５’−ＧＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡ−３’（配列番号１０７）；
５’−ＵＵＡＵＧＧＡＵＧＡＵＧＧＵＧＧＣＵＵ−３’（配列番号１３）；
５’−ＡＡＧＣＣＡＣＣＡＵＣＡＵＣＣＡＵＡＡ−３’（配列番号１２４）；
５’−ＧＵＧＵＧＧＣＵＧＵＧＣＣＵＡＣＡＵＣ−３’（配列番号１６）；
５’−ＧＡＵＧＵＡＧＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＣ−３’（配列番号１２５）；
５’−ＧＣＵＧＵＧＣＣＵＡＣＡＵＣＵＵＣＵＡ−３’（配列番号２１）；または、
５’−ＵＡＧＡＡＧＡＵＧＵＡＧＧＣＡＣＡＧＣ−３’（配列番号１２６）；
を含み、
ここでヌクレオチドの１つ以上は場合により化学修飾されている上記分子。
【請求項２】
ヌクレオチドの全てが未修飾である請求項１に記載の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子。
【請求項３】
下記センス鎖およびアンチセンス鎖：
【化１】
2012509688.tif 000073
を有する構造ＳＩＸ’を含む２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、
ここで、
上方の鎖はセンス鎖であり、下方の鎖は２本鎖核酸分子のアンチセンス鎖であり；該アンチセンス鎖は配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号２１に対する相補性を有する配列を含み、該センス鎖はアンチセンス鎖に対する相補性を有する配列を含み；
各Ｎは独立して未修飾か、または化学修飾されているヌクレオチドであり；
各Ｂは存在または非存在の末端キャップ部分であり；
（Ｎ）はオーバーハングしているヌクレオチドを示し、その各々は独立して未修飾であるか、または２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、または２’−デオキシリボヌクレオチドであり；
［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチドを示し；
Ｘ１およびＸ２は独立して０〜４の整数であり；
Ｘ３は１７〜３６の整数であり；
Ｘ４は１１〜３５の整数であるが、ただし、Ｘ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；
Ｘ５は１〜６の整数であり；ここで、
（ａ）ＮＸ４位置の各ピリミジンヌクレオチドは独立して２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
ＮＸ４位置の各プリンヌクレオチドは独立して２’−Ｏ−メチルヌクレオチドまたは２’−デオキシリボヌクレオチドであり；
（ｂ）ＮＸ３位置の各ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
ＮＸ３位置の各プリンヌクレオチドは独立して２’−デオキシリボヌクレオチドまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである分子。
【請求項４】
Ｘ５が３である請求項３に記載の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子。
【請求項５】
Ｘ１が２であり、およびＸ２が２である請求項３に記載の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子。
【請求項６】
Ｘ５が３であり、Ｘ１が２であり、Ｘ２が２である請求項３に記載の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子。
【請求項７】
Ｘ５が３であり、Ｘ１が２であり、Ｘ２が２であり、Ｘ３が１９であり、Ｘ４が１６である請求項３に記載の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子。
【請求項８】
ｓｉＮＡが下記：
【化２】
2012509688.tif 000074
である２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、
ここで：
各Ｂは反転無塩基キャップ部分であり；
ｃは２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
ｕは２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
Ａは２’−デオキシアデノシンであり；
Ｇは２’デオキシグアノシンであり；
Ｔはチミジンであり；
Ａはアデノシンであり；
Ｇはグアノシンであり；
Ｕはウリジンであり；
Ａは２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
Ｇは２’−Ｏ−メチル−グアノシンであり；
Ｕは２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
ヌクレオチド間連結部は化学修飾されているか、または未修飾である分子。
【請求項９】
ヌクレオチド間連結部が未修飾である請求項８に記載の２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
【請求項１０】
ｓｉＮＡが下記：
【化３】
2012509688.tif 000075
である２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、
ここで：
各Ｂは反転無塩基キャップであり；
ｃは２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
ｕは２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
Ａは２’−デオキシアデノシンであり；
Ｇは２’デオキシグアノシンであり；
Ｔはチミジンであり；
Ａはアデノシンであり；
Ｇはグアノシンであり；
Ａは２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
Ｕは２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
ヌクレオチド間連結部は化学修飾されているか、または未修飾である分子。
【請求項１１】
ヌクレオチド間連結部が未修飾である請求項１０に記載の２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
【請求項１２】
ｓｉＮＡが下記：
【化４】
2012509688.tif 000076
である２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、
ここで：
各Ｂは反転無塩基キャップ部分であり；
ｃは２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
ｕは２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
Ａは２’−デオキシアデノシンであり；
Ｇは２’デオキシグアノシンであり；
Ｔはチミジンであり；
Ａはアデノシンであり；
Ｇはグアノシンであり；
Ｕはウリジンであり；
Ａは２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
Ｇは２’−Ｏ−メチル−グアノシンであり；
Ｕは２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
ヌクレオチド間連結部は化学修飾されているか、または未修飾である分子。
【請求項１３】
ヌクレオチド間連結部が未修飾である請求項１２に記載の２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
【請求項１４】
ｓｉＮＡが下記：
【化５】
2012509688.tif 000077
である２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、
ここで：
各Ｂは反転無塩基キャップ部分であり；
ｃは２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
ｕは２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
Ａは２’−デオキシアデノシンであり；
Ｇは２’デオキシグアノシンであり；
Ｔはチミジンであり；
Ａはアデノシンであり；
Ｇはグアノシンであり；
Ｕはウリジンであり；
Ａは２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
Ｇは２’−Ｏ−メチル−グアノシンであり；
Ｕは２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
ヌクレオチド間連結部は化学修飾されているか、または未修飾である分子。
【請求項１５】
ヌクレオチド間連結部が未修飾である請求項１４に記載の２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
【請求項１６】
下記センス鎖およびアンチセンス鎖：
【化６】
2012509688.tif 000078
を有する構造ＳＸ’を含む２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、
ここで、
上方の鎖はセンス鎖であり、下方の鎖は２本鎖核酸分子のアンチセンス鎖であり；該アンチセンス鎖は配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号２１に対する相補性を有する配列を含み、該センス鎖はアンチセンス鎖に対する相補性を有する配列を含み；
各Ｎは独立して未修飾か、または化学修飾されているヌクレオチドであり；
各Ｂは存在または非存在の末端キャップ部分であり；
（Ｎ）はオーバーハングしているヌクレオチドを示し、その各々は独立して未修飾であるか、または２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、または２’−デオキシリボヌクレオチドであり；
［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチドを示し；
Ｘ１およびＸ２は独立して０〜４の整数であり；
Ｘ３は１７〜３６の整数であり；
Ｘ４は１１〜３５の整数であるが、ただし、Ｘ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；
Ｘ５は１〜６の整数であり；ここで、
（ａ）ＮＸ４位置の各ピリミジンヌクレオチドは独立して２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
ＮＸ４位置の各プリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
（ｂ）ＮＸ３位置の各ピリミジンヌクレオチドはリボヌクレオチドであり；
ＮＸ３位置の各プリンヌクレオチドはリボヌクレオチドである分子。
【請求項１７】
下記センス鎖およびアンチセンス鎖：
【化７】
2012509688.tif 000079
を有する構造ＳＸＩ’を含む２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、
ここで、
上方の鎖はセンス鎖であり、下方の鎖は２本鎖核酸分子のアンチセンス鎖であり；該アンチセンス鎖は配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号２１に対する相補性を有する配列を含み、該センス鎖はアンチセンス鎖に対する相補性を有する配列を含み；
各Ｎは独立して未修飾か、または化学修飾されているヌクレオチドであり；
各Ｂは存在または非存在の末端キャップ部分であり；
（Ｎ）はオーバーハングしているヌクレオチドを示し、その各々は独立して未修飾であるか、または２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、または２’−デオキシリボヌクレオチドであり；
［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチドを示し；
Ｘ１およびＸ２は独立して０〜４の整数であり；
Ｘ３は１７〜３６の整数であり；
Ｘ４は１１〜３５の整数であるが、ただし、Ｘ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；
Ｘ５は１〜６の整数であり；ここで、
（ａ）ＮＸ４位置の各ピリミジンヌクレオチドは独立して２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
ＮＸ４位置の各プリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
（ｂ）ＮＸ３位置の各ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
ＮＸ３位置の各プリンヌクレオチドはリボヌクレオチドである分子。
【請求項１８】
下記センス鎖およびアンチセンス鎖：
【化８】
2012509688.tif 000080
を有する構造ＳＸＩＩ’を含む２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、
ここで、
上方の鎖はセンス鎖であり、下方の鎖は２本鎖核酸分子のアンチセンス鎖であり；該アンチセンス鎖は配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号２１に対する相補性を有する配列を含み、該センス鎖はアンチセンス鎖に対する相補性を有する配列を含み；
各Ｎは独立して未修飾か、または化学修飾されているヌクレオチドであり；
各Ｂは存在または非存在の末端キャップ部分であり；
（Ｎ）はオーバーハングしているヌクレオチドを示し、その各々は独立して未修飾であるか、または２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、または２’−デオキシリボヌクレオチドであり；
［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチドを示し；
Ｘ１およびＸ２は独立して０〜４の整数であり；
Ｘ３は１７〜３６の整数であり；
Ｘ４は１１〜３５の整数であるが、ただし、Ｘ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；
Ｘ５は１〜６の整数であり；ここで、
（ａ）ＮＸ４位置の各ピリミジンヌクレオチドは独立して２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
ＮＸ４位置の各プリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
（ｂ）ＮＸ３位置の各ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
ＮＸ３位置の各プリンヌクレオチドは２’−デオキシリボヌクレオチドである分子。
【請求項１９】
下記センス鎖およびアンチセンス鎖：
【化９】
2012509688.tif 000081
を有する構造ＳＸＩＩＩ’を含む２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、
ここで、
上方の鎖はセンス鎖であり、下方の鎖は２本鎖核酸分子のアンチセンス鎖であり；該アンチセンス鎖は配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号２１に対する相補性を有する配列を含み、該センス鎖はアンチセンス鎖に対する相補性を有する配列を含み；
各Ｎは独立して未修飾か、または化学修飾されているヌクレオチドであり；
各Ｂは存在または非存在の末端キャップ部分であり；
（Ｎ）はオーバーハングしているヌクレオチドを示し、その各々は独立して未修飾であるか、または２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、または２’−デオキシリボヌクレオチドであり；
［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチドを示し；
Ｘ１およびＸ２は独立して０〜４の整数であり；
Ｘ３は１７〜３６の整数であり；
Ｘ４は１１〜３５の整数であるが、ただし、Ｘ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；
Ｘ５は１〜６の整数であり；ここで、
（ａ）ＮＸ４位置の各ピリミジンヌクレオチドはリボ様のノーザンまたはＡ型へリックス配置を有するヌクレオチドであり；
ＮＸ４位置の各プリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
（ｂ）ＮＸ３位置の各ピリミジンヌクレオチドはリボ様のノーザンまたはＡ型へリックス配置を有するヌクレオチドであり；
ＮＸ３位置の各プリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである分子。
【請求項２０】
製薬上許容し得る担体または希釈剤中に請求項１の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）を含む医薬組成物。
【請求項２１】
製薬上許容し得る担体または希釈剤中に請求項３の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む医薬組成物。
【請求項２２】
製薬上許容し得る担体または希釈剤中に請求項８の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む医薬組成物。
【請求項２３】
製薬上許容し得る担体または希釈剤中に請求項１０の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む医薬組成物。
【請求項２４】
製薬上許容し得る担体または希釈剤中に請求項１２の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む医薬組成物。
【請求項２５】
製薬上許容し得る担体または希釈剤中に請求項１４の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む医薬組成物。
【請求項２６】
製薬上許容し得る担体または希釈剤中に請求項１６の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む医薬組成物。
【請求項２７】
製薬上許容し得る担体または希釈剤中に請求項１７の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む医薬組成物。
【請求項２８】
製薬上許容し得る担体または希釈剤中に請求項１８の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む医薬組成物。
【請求項２９】
製薬上許容し得る担体または希釈剤中に請求項１９の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む医薬組成物。
【請求項３０】
吸入送達のために適応された請求項３に記載の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む医薬組成物。
【請求項３１】
吸入送達のために適応された請求項８に記載の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む医薬組成物。
【請求項３２】
吸入送達のために適応された請求項１０に記載の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む医薬組成物。
【請求項３３】
吸入送達のために適応された請求項１２に記載の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む医薬組成物。
【請求項３３】
吸入送達のために適応された請求項１４に記載の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む医薬組成物。
【請求項３４】
ＥＮａＣの作用によるか、作用の損失により媒介される状態に罹患したヒト対象を治療する方法であって、請求項３の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子の有効量を該対象に投与することを含む方法。
【請求項３５】
ＥＮａＣの作用によるか、作用の損失により媒介される状態に罹患したヒト対象を治療する方法であって、請求項８の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子の有効量を該対象に投与することを含む方法。
【請求項３６】
ＥＮａＣの作用によるか、作用の損失により媒介される状態に罹患したヒト対象を治療する方法であって、請求項１０の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子の有効量を該対象に投与することを含む方法。
【請求項３７】
ＥＮａＣの作用によるか、作用の損失により媒介される状態に罹患したヒト対象を治療する方法であって、請求項１２の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子の有効量を該対象に投与することを含む方法。
【請求項３８】
ＥＮａＣの作用によるか、作用の損失により媒介される状態に罹患したヒト対象を治療する方法であって、請求項１４の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子の有効量を該対象に投与することを含む方法。
【請求項３９】
状態が呼吸器疾患である請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
状態が呼吸器疾患である請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
状態が呼吸器疾患である請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
状態が呼吸器疾患である請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
状態が呼吸器疾患である請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
呼吸器疾患がＣＯＰＤ、喘息、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、副鼻腔炎および気管支拡張症からなる群より選択される請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
呼吸器疾患がＣＯＰＤ、喘息、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、副鼻腔炎および気管支拡張症からなる群より選択される請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
呼吸器疾患がＣＯＰＤ、喘息、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、副鼻腔炎および気管支拡張症からなる群より選択される請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
呼吸器疾患がＣＯＰＤ、喘息、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、副鼻腔炎および気管支拡張症からなる群より選択される請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
呼吸器疾患がＣＯＰＤ、喘息、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、副鼻腔炎および気管支拡張症からなる群より選択される請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
呼吸器疾患がＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、気管支拡張症、および喘息からなる群より選択される請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
呼吸器疾患がＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、気管支拡張症、および喘息からなる群より選択される請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
呼吸器疾患がＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、気管支拡張症、および喘息からなる群より選択される請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
呼吸器疾患がＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、気管支拡張症、および喘息からなる群より選択される請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
呼吸器疾患がＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、気管支拡張症、および喘息からなる群より選択される請求項４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本出願は２００９年３月６日出願の米国仮特許出願第６１／１５８，３１６号、２００８年１１月２６日出願の米国仮特許出願第６１／１１８，１６０号、２００８年１１月２６日出願の米国仮特許出願第６１／１１８，１５７号、２００８年１１月２６日出願の米国仮特許出願第６１／１１８，１５０号、２００８年１１月２６日出願の米国仮特許出願第６１／１１８，１４４号の利益を主張する。本出願は図面も含めてその全体が参照により本明細書に組み込まれる列挙した出願の全ての利益を主張する。
【０００２】
配列表
３７ＣＦＲ§１．５２（ｅ）（５）に準拠してＥＦＳに提出された配列表は参照により本明細書に組み込まれる。ＥＦＳを介して提出された配列表のテキストファイルは９８，１８３バイトの大きさである２００９年１１月１８日に作成されたファイル「ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ７２ＷＰＣＴ」を含む。
【技術分野】
【０００３】
本発明はナトリウムチャンネルノンニューロナル１（ＳＣＮＮ１）またはアミロリド感受性ナトリウムチャンネル（ＡＳＳＣ）としても知られている上皮ナトリウムチャンネル（以後ＥＮａＣと称する）、遺伝子発現および／または活性のモジュレーションに応答する体質、疾患および状態の研究、診断および治療のための化合物、組成物および方法に関する。
【０００４】
本発明はまた、上皮ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ）遺伝子発現経路または他の細胞プロセスに関与する遺伝子の発現および／または活性のモジュレーションに応答し体質、疾患および状態の維持または発生を媒介する体質、疾患および状態に関する化合物、組成物および方法に関する。特に本発明は上皮ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ）遺伝子発現に対抗するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することができる、または媒介する、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の分子等の小型核酸分子を含む２本鎖核酸分子、例えばそのような小型核酸分子のカクテルおよびそのような小型核酸分子の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤に関する。本発明はまた、内因性ＥＮａＣマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等の内因性ＲＮＡ分子の機能を阻害できる（例えばｍｉＲＮＡ阻害剤）または内因性ＥＮａＣ短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の機能を阻害できる（例えばｓｉＲＮＡ阻害剤）か、またはＲＩＳＣの機能を阻害し（例えばＲＩＳＣ阻害剤）、そのような内因性ＲＮＡまたはそのような内因性ＲＮＡに関連するタンパク質（例えばＲＩＳＣ）の調節機能を干渉することによりＥＮａＣの遺伝子発現をモジュレートする、ｓｉＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびその他等の小型核酸分子、例えばそのような小型核酸分子のカクテルおよびそのような小型核酸分子の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤に関する。そのような小型核酸分子は例えばＣＯＰＤ、喘息、好酸球性咳、気管支炎、嚢胞性線維症、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、副鼻腔炎および／または対象または生物におけるＥＮａＣ遺伝子の発現または活性に関連する他の疾患状態を含むがこれらに限定されない呼吸器の疾患、体質および状態のような、対象または生物におけるＥＮａＣ遺伝子発現のモジュレーションに応答できる、体質、疾患および状態の治療のための組成物を提供する場合に有用である。
【０００５】
以下にＲＮＡｉに関する関連技術の考察を行う。考察は以下に記載する本発明の理解のためのみに提示するものである。その要旨は以下に記載する研究のいずれかが特許請求した発明の従来技術であることを受け入れるものではない。
【０００６】
背景技術
ＲＮＡ干渉は短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される動物における配列特異的な転写後の遺伝子サイレンシングのプロセスを指す（Ｚａｍｏｒｅ等、２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３；Ｆｉｒｅ等、１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６；Ｈａｍｉｌｔｏｎ等、１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，９５０−９５１；Ｌｉｎ等、１９９９，Ｎａｔｕｒｅ，４０２，１２８−１２９；Ｓｈａｒｐ，１９９９，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．，１３：１３９−１４１；およびＳｔｒａｕｓｓ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，８８６）。植物における相当するプロセス（Ｈｅｉｆｅｔｚ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／６１６３１）は一般的には転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングとも称され、またカビにおいてはクエリングとも称される。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは外来遺伝子の発現を防止するために使用される進化的に保存された細胞の防御機序であると考えられ、一般的には多様な微生物叢または生物門により共有されている（Ｆｉｒｅ等、１９９９，ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，１５，３５８）。そのような外来遺伝子発現からの保護はウィルス感染から、または、相同性の１本鎖ＲＮＡまたはウィルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を介した宿主ゲノム内へのトランスポゾンエレメントのランダムな組み込みから誘導された２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生産に応答して進化することができる。細胞中にｄｓＲＮＡが存在することは未だ十分に特性化されていない機序を通してＲＮＡｉの応答をトリガーする。この機序はリボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断をもたらすタンパク質キナーゼＰＫＲおよび２’，５’−オリゴアデニレート合成酵素のｄｓＲＮＡ媒介活性化に起因するインターフェロンの応答等の２本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼの関与する他の知られた機序とは異なると考えられる（例えば米国特許第６，１０７，０９４号；５，８９８，０３１号；Ｃｌｅｍｅｎｓ等、１９９７，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ＆Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．，１７，５０３−５２４；Ａｄａｈ等、２００１，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，８，１１８９参照）。
【０００７】
細胞中の長鎖ｄｓＲＮＡの存在はダイサーと称されるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性を促進する（Ｂａｓｓ，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２３５；Ｚａｍｏｒｅ等、２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３；Ｈａｍｍｏｎｄ等、２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３）。ダイサーは短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られているｄｓＲＮＡの短い小片へのｄｓＲＮＡのプロセシングに関与している（Ｚａｍｏｒｅ等、２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３；Ｂａｓｓ，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２３５；Ｂｅｒｓｔｅｉｎ等、２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３）。ダイサーの活性から誘導された短鎖干渉ＲＮＡは典型的には約２１〜約２３ヌクレオチド長であり、約１９塩基対のデュプレックスを含む（Ｚａｍｏｒｅ等、２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３；Ｅｌｂａｓｈｉｒ等、２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５，１８８）。ダイサーはまた翻訳制御に関与が示唆されている保存された構造の前駆体ＲＮＡからの２１および２２ヌクレオチドの小型テンポラルＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の切り出しに関与しているとも示唆されている（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ等、２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，８３４）。ＲＮＡｉの応答はまた、ｓｉＲＮＡデュプレックスのアンチセンス鎖に対して相補的な配列を有する１本鎖ＲＮＡの切断を媒介するＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と一般的に称されるエンドヌクレアーゼ複合体を特徴としている。標的ＲＮＡの切断はｓｉＲＮＡデュプレックスのアンチセンス鎖に相補的な領域の中央において起こる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ等、２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５，１８８）。
【０００８】
ＲＮＡｉは種々の系において研究されている。Ｆｉｒｅ等、１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６は初めてＣ．ｅｌｅＧＡ  ＮｓにおいてＲＮＡｉを観察している。ＢａｈｒａｍｉａｎおよびＺａｒｂｌ，１９９９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒおよびＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９，２７４−２８３およびＷｉａｎｎｙおよびＧｏｅｔｚ，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２，７０は哺乳類系におけるｄｓＲＮＡにより媒介されるＲＮＡｉを記載している。Ｈａｍｍｏｎｄ等、２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３はｄｓＲＮＡによりトランスフェクトされたショウジョウバエの細胞におけるＲＮＡｉを記載している。Ｅｌｂａｓｈｉｒ等、２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４およびＴｕｓｃｈｌ等の国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／７５１６４はヒト胚性腎臓およびＨｅＬａ細胞を含む培養哺乳類細胞における合成２１ヌクレオチドＲＮＡのデュプレックスの導入により誘導されたＲＮＡｉを記載している。ショウジョウバエ胚分解物における最近の研究（Ｅｌｂａｓｈｉｒ等、２００１，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０，６８７７およびＴｕｓｃｈｌ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／７５１６４）は効率的なＲＮＡｉ活性を媒介するために必須であるｓｉＲＮＡの長さ、構造、化学組成および配列に関する特定の条件を解明している。これらの研究は２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡデュプレックスは３’−末端ジヌクレオチドオーバーハングを含有している場合に最も活性であることを示している。更に、２’−デオキシ（２’−Ｈ）または２’−Ｏ−メチルヌクレオチドによる一方または両方のｓｉＲＮＡ鎖の完全な置換はＲＮＡｉ活性を消失させるのに対し、２’−デオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）による３’−末端ｓｉＲＮＡオーバーハングヌクレオチドの置換は耐容されることがわかっていた。ｓｉＲＮＡデュプレックスの中心における単一ミスマッチ配列もまたＲＮＡｉ活性を消失させることがわかっていた。更に、これらの研究は標的ＲＮＡにおける切断部位の位置はｓｉＲＮＡガイド配列の５’−末端により定義され、ガイド配列の３’末端によらないことを示している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ等、２００１，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０，６８７７）。他の研究はｓｉＲＮＡデュプレックスの標的相補鎖上の５’−ホスフェートがｓｉＲＮＡ活性のために必要であること、および、ｓｉＲＮＡ上に５’−ホスフェート部分を維持するためにはＡＴＰが使用されることを示している（Ｎｙｋａｎｅｎ等、２００１，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９）。
【０００９】
研究によればデオキシリボヌクレオチドによる２ヌクレオチド３’−オーバーハングを有する２１量体ｓｉＲＮＡデュプレックスの３’末端ヌクレオチドオーバーハングセグメントの置き換えはＲＮＡｉ活性に対する有害作用を有さないことがわかっている。デオキシリボヌクレオチドによるｓｉＲＮＡの各末端上の４ヌクレオチドまでの置き換えは良好に耐容されることが報告されているのに対し、デオキシリボヌクレオチドによる完全な置換はＲＮＡｉ活性をもたらさない（Ｅｌｂａｓｈｉｒ等、２００１，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０，６８７７およびＴｕｓｃｈｌ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／７５１６４）。更に、上記のＥｌｂａｓｈｉｒ等は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドによるｓｉＲＮＡの置換はＲＮＡｉ活性を完全に消失させるとも報告している。Ｌｉ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／４４９１４およびＢｅａｃｈ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６８８３６は、ｓｉＲＮＡが窒素またはイオウのヘテロ原子少なくとも１つを含むようなホスフェート糖骨格またはヌクレオシドのいずれかの修飾を含むことができることを予め示唆しているが、いずれの出願もそのような修飾がどの程度までｓｉＲＮＡ分子において耐容されるかを推測しておらず、また、そのような修飾されたｓｉＲＮＡのいかなるそれ以上の指針または例も示していない。Ｋｒｅｕｔｚｅｒ等のカナダ特許出願第２，３５９，１８０号もまた、２本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲの活性化に対抗するためのｄｓＲＮＡコンストラクトにおける使用のための特定の化学修飾、特に２’―アミノまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、および２’−Ｏまたは４’−Ｃメチレン架橋を含有するヌクレオチドを記載している。しかしながら、Ｋｒｅｕｔｚｅｒ等も同様に、これらの修飾がどの程度までｄｓＲＮＡ分子において耐容されるかに関して例示または指針を示すことができていない。
【００１０】
Ｐａｒｒｉｓｈ等、２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，６，１０７７−１０８７は長鎖（＞２５ｎｔ）ｓｉＲＮＡ転写物を用いながらＣ．ｅｌｅＧＡ  Ｎｓにおけるｕｎｃ−２２遺伝子をターゲティングする特定の化学修飾を試験した。著者等はＴ７およびＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用いてチオホスフェートヌクレオチド類縁体を取り込むことによるこれらのｓｉＲＮＡ転写物内へのチオホスフェート残基の導入を記載しており、２つのホスホロチオエート修飾塩基を有するＲＮＡも、ＲＮＡｉとしての有効性の多大な減少を有していたことを観察した。更に、Ｐａｒｒｉｓｈ等は２つより多い残基のホスホロチオエート修飾はインビトロでＲＮＡを大きく脱安定化するために干渉活性は測定できなかったことを報告した。同上１０８１記載。著者等は長鎖ｓｉＲＮＡ転写物におけるヌクレオチド糖の２’位における特定の修飾も試験しており、リボヌクレオチドにデオキシヌクレオチドを置換することは、特にウリジンからチミジン、および／または、シチジンからデオキシシチジンへの置換の場合に、干渉活性の多大な減少をもたらすことを観察した。同上。更に、著者等は特定の塩基の修飾、例えばｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖において、ウラシルに４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、および３−（アミノアリル）ウラシルを、グアノシンにイノシンを置換することを試験している。４−チオウラシルおよび５−ブロモウラシル置換は耐容されると考えられたが、Ｐａｒｒｉｓｈによればイノシンはいずれかの鎖に取り込まれると干渉活性の多大な減少をもたらしたと報告された。Ｐａｒｒｉｓｈは、アンチセンス鎖における５−ヨードウラシルおよび３−（アミノアリル）ウラシルの取り込みが同様にＲＮＡｉ活性の多大な減少をもたらしたとも報告した。
【００１１】
より長鎖のｄｓＲＮＡの使用が記載されている。例えば、Ｂｅａｃｈ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６８８３６は内因性に誘導されたｄｓＲＮＡを用いて遺伝子発現を減衰させるための特定の方法を記載している。Ｔｕｓｃｈｌ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／７５１６４はショウジョウバエのインビトロのＲＮＡｉ系および特定の機能性ゲノムおよび特定の治療の用途のための特定のｓｉＲＮＡ分子の使用を記載しているが；Ｔｕｓｃｈｌ，２００１，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２，２３９−２４５はＲＮＡｉが遺伝子疾患またはウィルス感染を治癒させるために使用できるかは、インターフェロン応答を活性化させる危険のために疑わしいとしている。Ｌｉ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／４４９１４は特定の標的遺伝子の発現を減衰させるための特定の長さ（１４１ｂｐ〜４８８ｂｐ）の酵素的に合成された、またはベクター発現されたｄｓＲＮＡの使用を記載している。Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／３６６４６は特定の長さ（５５０ｂｐ〜７１４ｂｐ）の酵素的に合成された、またはベクター発現されたｄｓＲＮＡ分子を使用しながら哺乳類細胞において特定の遺伝子の発現を阻害するための特定の方法を記載している。Ｆｉｒｅ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／３２６１９は線虫において遺伝子発現を阻害する場合に使用するための細胞内に特定の長さのｄｓＲＮＡ分子を導入するための特定の方法を記載している。Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／０１８４６は特定の長さのｄｓＲＮＡ分子を用いながら細胞に特定の表現型を与えることを担っている特定の遺伝子を識別するための特定の方法を記載している。Ｍｅｌｌｏ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／２９０５８はｄｓＲＮＡ媒介ＲＮＡｉに関与する特定の遺伝子の同定を記載している。Ｐａｃｈｕｃｋ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／６３３６４は特定の長鎖（少なくとも２００ヌクレオチド）のｄｓＲＮＡコンストラクトを記載している。Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ  Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／０７４０９は特定の抗ウィルス剤と組み合わせた特定のｄｓＲＮＡ分子からなる特定の組成物を記載している。Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ等の国際ＰＣＴ公開番号９９／５３０５０および１９９８，ＰＮＡＳ，９５，１３９５９−１３９６４は特定のｄｓＲＮＡを用いた植物細胞における核酸の表現型発現を減少させるための特定の方法を記載している。Ｄｒｉｓｃｏｌｌ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／４９８４４はターゲティングされた生物における遺伝子サイレンシングを促進する場合の使用のための特定のＤＮＡ発現コンストラクトを記載している。
【００１２】
他の者は種々のＲＮＡｉおよび遺伝子サイレンシングの系を報告している。例えばＰａｒｒｉｓｈ等、２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，６，１０７７−１０８７はＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｎｓのｕｎｃ−２２遺伝子をターゲティングする特定の化学修飾されたｄｓＲＮＡコンストラクトを記載している。Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ，国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／３８５５１は特定のｄｓＲＮＡを用いながら植物においてポリコーム遺伝子発現を調節するための特定の方法を記載している。Ｃｈｕｒｉｋｏｖ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／４２４４３は特定のｄｓＲＮＡを用いながら生物の遺伝子特性を修飾するための特定の方法を記載している。Ｃｏｇｏｎｉ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／５３４７５はＮｅｕｒｏｓｐｏｒａサイレンシング遺伝子を単離するための特定の方法およびその使用を記載している。Ｒｅｅｄ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６８８３６は植物における遺伝子サイレンシングのための特定の方法を記載している。Ｈｏｎｅｒ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／７０９４４は特定のｄｓＲＮＡを用いながらパーキンソン病モデルとしてトランスジェニック線虫を用いる薬剤スクリーニングの特定の方法を記載している。Ｄｅａｋ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／７２７７４はショウジョウバエにおいてＲＮＡｉに関連付けることができる特定のショウジョウバエ誘導遺伝子産物を記載している。Ａｒｎｄｔ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／９２５１３はＲＮＡｉを増強する因子を用いることにより遺伝子抑制を媒介するための特定の方法を記載している。Ｔｕｓｃｈｌ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／４４３２１は特定の合成ｓｉＲＮＡコンストラクトを記載している。Ｐａｃｈｕｋ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／６３３６４およびＳａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／０４３１３は特定の長さ（２５０ｂｐ超）のベクター発現ｄｓＲＮＡを用いながら特定のポリヌクレオチド配列の機能を阻害するための特定の方法および組成物を記載している。Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／３８８０５はＲＮＡｉを介して識別された特定のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｎｓ遺伝子を記載している。Ｋｒｅｕｔｚｅｒ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／０５５６９２、ＷＯ０２／０５５６９３、およびＥＰ  １１４４６２３  ＢｌはｄｓＲＮＡを用いながら遺伝子発現を阻害するための特定の方法を記載している。Ｇｒａｈａｍ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／４９０２９およびＷＯ０１／７０９４９、およびＡＵ  ４０３７５０１は特定のベクター発現ｓｉＲＮＡ分子を記載している。Ｆｉｒｅ等、ＵＳ  ６，５０６，５５９はＲＮＡｉを媒介する特定の長さのｄｓＲＮＡ（２９９ｂｐ〜１０３３ｂｐ）コンストラクトを用いながらインビトロで遺伝子発現を阻害するための特定の方法を記載している。Ｍａｒｔｉｎｅｚ等、２００２，Ｃｅｌｌ，１１０，５６３−５７４はＨｅｌａ細胞においてＲＮＡ干渉を媒介する特定の５’−ホスホリル化１本鎖ｓｉＲＮＡを含む特定の１本鎖ｓｉＲＮＡコンストラクトを記載している。Ｈａｒｂｏｒｔｈ等、２００３，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ���，１３，８３−１０５は特定の化学的および構造的に修飾されたｓｉＲＮＡ分子を記載している。ＣｈｉｕおよびＲａｎａ，２００３，ＲＮＡ，９，１０３４−１０４８は特定の化学的および構造的に修飾されたｓｉＲＮＡ分子を記載している。Ｗｏｏｌｆ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／０６４６２６およびＷＯ０３／０６４６２５は特定の化学修飾されたｄｓＲＮＡコンストラクトを記載している。Ｈｏｒｎｕｎｇ等、２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１，２６３−２７０はＴＬＲ７を通じてプラズマ細胞様の樹状細胞における短鎖干渉ＲＮＡによるＩＦＮ−αの配列特異的な強力な誘導を記載している。Ｊｕｄｇｅ等、２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ：２０  Ｍａｒｃｈ  ２００５は合成ｓｉＲＮＡによる哺乳類生得免疫応答の配列依存性刺激を記載している。Ｙｕｋｉ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／０４９８２１およびＷＯ０４／０４８５６６は短鎖干渉ＲＮＡ配列を設計するための特定の方法および最適化された活性を有する特定の短鎖干渉ＲＮＡ配列を記載している。Ｓａｉｇｏ等、米国特許出願公開番号ＵＳ２００４０５３９３３２はＲＮＡ干渉を達成するための短鎖干渉ＲＮＡ配列を含むオリゴおよびポリヌクレオチドの配列を設計する特定の方法を記載している。Ｔｅｉ等の国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／０４４１８８は標的遺伝子の少なくとも部分的ヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有するＤＮＡおよびＲＮＡを含む２本鎖ポリヌクレオチドを用いて細胞、組織、または個体生物をトランスフェクトすることを含む標的遺伝子の発現を阻害するための特定の方法を記載している。
【００１３】
Ｍａｔｔｉｃｋ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２７−１５２８；Ｃｌａｖｅｒｉｅ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２９−１５３０；Ｓｅｔｈｕｐａｔｈｙ等、２００６，ＲＮＡ，１２，１９２−１９７；およびＣｚｅｃｈ，２００６  ＮＥＪＭ，３５４，１１：１１９４−１１９５；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ等、ＵＳ  ２００５０２２７２５６およびＴｕｓｃｈｌ等、ＵＳ  ２００５０１８２００５は全て立体ブロッキングを介してｍｉＲＮＡ機能を阻害できるアンチセンス分子を記載しており、全ては参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００１４】
以下の米国特許特許出願公開：ＵＳ−２００５０２８７５５１；ＵＳ−２００５０１６４２２０；ＵＳ−２００５０１９１６２７；ＵＳ−２００５０１１８５９４；ＵＳ−２００５０１５３９１９；ＵＳ−２００５００８５４８６；およびＵＳ−２００３０１５８１３３は一般的にｓｉＲＮＡ分子およびホスホジエステラーゼの基本的説明を記載しており；全て参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により炎症および／または呼吸器の疾患および状態の発症または維持に関連するＥＮａＣ遺伝子等の上皮ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ）遺伝子の発現をモジュレートするために有用な化合物、組成物および方法に関する。本発明はまた、小型核酸分子を用いながらＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によりＥＮａＣ遺伝子の発現および／または活性の経路に関与する他の遺伝子の発現および活性をモジュレートするために有用な化合物、組成物および方法に関する。特に本発明はＥＮａＣ遺伝子および／またはＥＮａＣ遺伝子の発現および／または活性の経路に関与する他の遺伝子の発現をモジュレートするために使用される短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の分子等の小型核酸分子を特徴としている。
【００１６】
本発明はまた、内因性のＲＮＡ分子、例えば内因性のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の機能を阻害できる（例えばｍｉＲＮＡ阻害剤）、または内因性の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の機能を阻害できる（例えばｓｉＲＮＡ阻害剤）か、或いは、ＲＩＳＣの機能を阻害（例えばＲＩＳＣ阻害剤）して、そのような内因性ＲＮＡまたはそのような内因性ＲＮＡに関連するタンパク質（例えばＲＩＳＣ）の調節機能に干渉することによりＥＮａＣ遺伝子発現をモジュレートすることができるｓｉＮＡ、ｓｉＲＮＡおよび他のもの等の小型核酸分子にも関連する。そのような分子は本明細書においては総称してＲＮＡｉ阻害剤と称する。
【００１７】
本発明のｓｉＮＡまたはＲＮＡｉ阻害剤は未修飾であるか、または化学修飾することができる。本発明のｓｉＮＡまたはＲＮＡｉ阻害剤は化学合成するか、ベクターから発現させるか、または酵素的に合成することができる。本発明はまたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により細胞におけるＥＮａＣ遺伝子の発現または活性をモジュレートすることができる種々の化学修飾された合成の短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子も特徴としている。本発明はまたｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはＲＩＳＣに干渉することにより細胞中のＲＮＡｉ活性をモジュレートし、これにより細胞または生物中でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のダウンレギュレーションまたは阻害、翻訳阻害、または転写サイレンシングを行うことができる、種々の化学修飾された合成の短鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴としている。化学修飾されたｓｉＮＡおよび／またはＲＮＡｉ阻害剤の使用はインビボのヌクレアーゼ分解に対する増大した抵抗性を通じて、および／または向上した細胞取り込みを通じて、ネイティブのｓｉＮＡ分子および／またはＲＮＡｉ阻害剤の種々の特質を向上させる。更に、より早期に公開された研究とは逆に、多重の化学修飾を有する本発明のｓｉＮＡ分子、例えば完全修飾ｓｉＮＡは、最小限に修飾された、または未修飾のｓｉＲＮＡと比較して保持された、または更に向上したＲＮＡｉ活性を有している。従って、本出願人は本明細書において、ネイティブのｓｉＲＮＡの活性を保持するか、それを向上させる、化学修飾されたｓｉＲＮＡ（本明細書においては一般的にｓｉＮＡと称する）を教示する。本発明のｓｉＮＡ分子は種々の治療、予防、化粧品、獣医科用、診断、標的バリデーション、ゲノム発見、遺伝子操作、および薬学ゲノムの用途のための有用な試薬および方法を提供する。
【００１８】
上皮ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ、またはナトリウムチャンネルノンニューロナル１（ＳＣＮＮ１）またはアミロリド感受性ナトリウムチャンネル（ＡＳＳＣ））はＬｉ＋、プロトンおよび特にＮａ＋に対して透過性である膜結合性のイオンチャンネルである。これは「構成的に活性な」チャンネルであり、即ち、ゲーティング刺激を必要とせず、休止時に開放されている。ＥＮａＣは３つの異なるサブユニット、α（ＳＣＮＮ１Ａ）、β（ＳＣＮＮ１Ｂ）およびγ（ＳＣＮＮ１Ｇ）を含むヘテロマー性のタンパク質である。厳密な化学量は最近まで不明であったが、ＡＳＩＣチャンネルとの相同性に基づけば、ほぼ確実にヘテロ三量体である（Ｊａｓｔｉ，Ｊ．等（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  ４４９  ｐｐ３１６〜３２３）。各サブユニットは２つの膜貫通へリックスおよび細胞外ループからなる。全てのポリペプチドのアミノおよびカルボキシ末端はシトゾル中に位置している。更に、４番目のいわゆるδサブユニットが存在し、それはαサブユニットと大きな相同性を共有しており、βおよびγサブユニットと共に機能的イオンチャンネルを形成することができる。
【００１９】
１つの実施形態において、本発明は表７に示すＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により参照される配列を含むα（ＳＣＮＮ１Ａ）、β（ＳＣＮＮ１Ｂ）またはγ（ＳＣＮＮ１Ｇ）サブユニット配列をコードする遺伝子等の上皮ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ）をコードするＥＮａＣ遺伝子の発現を独立して、或いは組み合わせにおいてモジュレートする１つ以上のｓｉＮＡ分子および／またはＲＮＡｉ阻害剤、および、方法を特徴としている。本明細書において「ＥＮａＣ」に言及する場合、α（ＳＣＮＮ１Ａ）、β（ＳＣＮＮ１Ｂ）またはγ（ＳＣＮＮ１Ｇ）サブユニット配列のいずれかまたは全てを含む。好ましい実施形態においては、本発明はα（ＳＣＮＮ１Ａ）サブユニットをコードするＥＮａＣ遺伝子の発現を独立して、或いは組み合わせにおいてモジュレートする１つ以上のｓｉＮＡ分子および／またはＲＮＡｉ阻害剤および方法を特徴とする。本発明の種々の特徴および実施形態の下記説明は上皮ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ）遺伝子をコードする例を参照しながら提示している。本発明はまた、上皮ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ）遺伝子発現経路をコードすることに関与する遺伝子の発現および／または活性のモジュレーションに応答する体質、疾患および状態、またはそのような体質、疾患および状態の維持または発症を媒介する他の細胞プロセスに関連する、化合物、組成物および方法にも関する。しかしながらそのような言及は例示のみを意味しており、本発明の種々の態様および実施形態はまた、別のＥＮａＣ遺伝子、例えば突然変異体ＥＮａＣ遺伝子、ＥＮａＣ遺伝子のアイソタイプ、種毎または対象毎のＥＮａＣ変異体、および、ＥＮａＣ  ｍＲＮＡのオルタナティブスプライシングによる変異体（「スプライス変異体」）を発現する他の遺伝子にも関する。そのような追加的な遺伝子は例示ＥＮａＣ遺伝子に関して本明細書において記載する方法および本明細書に記載する配列を用いながら、標的部位に関して分析できる。即ち、他の遺伝子のモジュレーションおよびそのようなモジュレーションの作用は本明細書に記載する通り実施できる。換言すれば、以下において定義する場合、および記載した実施形態において説明する場合の「ＥＮａＣ」という用語は、本明細書に記載する疾患、体質および状態の発症および／または維持に関連する遺伝子、例えばＥＮａＣポリペプチドをコードする遺伝子、ＥＮａＣ調節ポリヌクレオチド（例えばＥＮａＣ  ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ）、突然変異体ＥＮａＣ遺伝子、およびＥＮａＣ遺伝子のアイソタイプ、並びに遺伝子の発現および／または活性のＥＮａＣ経路に関与する他の遺伝子を含むことを意味している。即ち、「ＥＮａＣ」という用語に言及しつつ本明細書において説明する実施形態の各々は、その用語が本明細書において定義される場合の「ＥＮａＣ」という用語により網羅される全てのタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、および／またはポリヌクレオチドの分子に適用される。包括的には、そのような遺伝子標的はまた本明細書においては一般的に「標的」配列とも称する。
【００２０】
１つの実施形態において、本発明は異なるポリヌクレオチド標的、例えばＥＮａＣのＲＮＡまたはＤＮＡの異なる領域（例えば本明細書における２つの異なる標的部位、または、異なるアイソタイプ等のＥＮａＣ標的のいずれかの組み合わせ）またはコーディングおよび非コーディング標的の両方をターゲティングする本発明の２つ以上の異なるｓｉＮＡ分子および／またはＲＮＡｉ阻害剤（例えばｓｉＮＡ、デュプレックス形成ｓｉＮＡ、または多機能性ｓｉＮＡまたはそれらのいずれかの組み合わせ）を含む組成物を特徴とする。そのようなｓｉＮＡ分子のプールは増大した治療効果を提供できる。
【００２１】
１つの実施形態において、本発明は異なるポリヌクレオチド標的、例えば標的ＥＮａＣのＲＮＡまたはＤＮＡの異なる領域（例えば本明細書における２つの異なる標的部位、または、異なるＥＮａｃアイソタイプ等のＥＮａＣ標的または経路標的のいずれかの組み合わせ）またはコーディングおよび非コーディング標的の両方に対して特異性を有する、本発明の２つ以上の異なるｓｉＮＡ（例えばｓｉＮＡ、デュプレックス形成ｓｉＮＡ、または多機能性ｓｉＮＡまたはそれらのいずれかの組み合わせ）のプールを特徴とし、ここでそのプールは約２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い異なるＥＮａＣ標的をターゲティングするｓｉＮＡ分子を含む。
【００２２】
１つの実施形態において本発明は異なるＥＮａＣアイソタイプ標的またはそれらのいずれかの組み合わせ等のＥＮａＣ標的に対する特異性を有する２つ以上の異なるｓｉＮＡ分子および／またはＲＮＡｉ阻害剤のプールを特徴とする。１つの実施形態において、本発明はＥＮａＣに対する特異性を有する２つ以上の異なるｓｉＮＡ分子および／またはＲＮＡｉ阻害剤のプールを特徴とする。１つの実施形態において、本発明はＥＮａＣおよびそのアイソタイプに対する特異性を有する２つ以上の異なるｓｉＮＡ分子および／またはＲＮＡｉ阻害剤のプールを特徴とする。
【００２３】
異なる生物または異なる対象に渡るＥＮａＣ遺伝子の配列の変動性の潜在性のために、広範な施療適用のためのｓｉＮＡ分子の選択は、ＥＮａＣ遺伝子の保存された領域を含むと考えられる。１つの実施形態において、本発明はＥＮａＣ遺伝子の保存された領域または異なるＥＮａＣ標的に渡って保存された領域をターゲティングするｓｉＮＡ分子および／またはＲＮＡｉ阻害剤に関する。種々のＥＮａＣ標的の保存された領域をターゲティングするように設計されたｓｉＮＡ分子および／またはＲＮＡｉ阻害剤は多様な患者集団においてＥＮａＣ標的遺伝子発現の効率的な阻害を可能にする。ＥＮａＣアイソフォームの酵素活性および細胞特異的発現パターンにおける変動性のために、標的施療適用の治療のためのｓｉＮＡ分子の選択には特異的ＥＮａＣアイソタイプが関与すると考えられる。１つの実施形態において、本発明はＥＮａＣ遺伝子の保存された領域または異なるＥＮａＣ標的に渡って保存された領域をターゲティングするｓｉＮＡ分子および／またはＲＮＡｉ阻害剤に関する。別の実施形態においては、本発明はＥＮａＣの発現に影響することなく、標的ＥＮａＣ遺伝子の発現をダウンレギュレートする、または、ＥＮａＣ標的ＲＮＡの切断を指向する２本鎖ｓｉＮＡを特徴とする。種々のＥＮａＣ標的の保存された領域をターゲティングするように設計されたｓｉＮＡ分子および／またはＲＮＡｉ阻害剤は多様な患者集団においてＥＮａＣアイソタイプ発現の効率的な阻害を可能にする。
【００２４】
１つの実施形態において、本発明はｓｉＮＡ分子等の２本鎖核酸分子を特徴としており、その場合、鎖の一方はＥＮａＣ標的核酸分子における所定のヌクレオチド配列またはその一部分に対する相補性を有するヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態において、所定のヌクレオチド配列は本明細書に記載するヌクレオチドＥＮａＣ標的配列である。別の実施形態においては、所定のヌクレオチド配列は当分野で知られたＥＮａＣ標的配列である。
【００２５】
１つの実施形態において、本発明はＥＮａＣ標的遺伝子の発現をダウンレギュレートするか、または、ＥＮａＣ標的ＲＮＡの切断を指向する２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで該ｓｉＮＡ分子は約１５〜約３０塩基対を含む。
【００２６】
１つの実施形態において、本発明はＥＮａＣ標的ＲＮＡの切断を指向する２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで該ｓｉＮＡ分子は約１５〜約３０塩基対を含む。
【００２７】
１つの実施形態において、本発明はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的ＥＮａＣ  ＲＮＡの切断を指向する２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで２本鎖ｓｉＮＡ分子は第１および第２の鎖を含み、ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の第１の鎖はＲＮＡ干渉を介して標的ＥＮａＣ  ＲＮＡの分解を指向するためにｓｉＮＡ分子に対する標的ＥＮａＣ  ＲＮＡへの十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含み、該ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は第１の鎖に対して相補的であるヌクレオチド配列を含む。１つの特定の実施形態において、例えばｓｉＮＡ分子の各鎖は約１５〜約３０ヌクレオチド長である。
【００２８】
１つの実施形態において、本発明はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介してＥＮａＣ標的ＲＮＡの切断を指向する２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで２本鎖ｓｉＮＡ分子は第１および第２の鎖を含み、ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８〜約２３（例えば約１８、１９、２０、２１、２２、または２３）ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の第１の鎖はＲＮＡ干渉を介してＥＮａＣ標的ＲＮＡの分解を指向するためにｓｉＮＡ分子に対するＥＮａＣ標的ＲＮＡへの十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含み、該ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は第１の鎖に対して相補的であるヌクレオチド配列を含む。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介してＥＮａＣ標的ＲＮＡの切断を指向する化学合成された２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでｓｉＮＡ分子の各鎖は約１５〜約３０ヌクレオチド長であり；ｓｉＮＡ分子の一方の鎖はＲＮＡ干渉を介してＥＮａＣ標的ＲＮＡの分解を指向するためにｓｉＮＡ分子に対するＥＮａＣ標的ＲＮＡへの十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００３０】
１つの実施形態において、本発明はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介してＥＮａＣ標的ＲＮＡの切断を指向する化学合成された２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８〜約２３ヌクレオチド長であり；ｓｉＮＡ分子の一方の鎖はＲＮＡ干渉を介してＥＮａＣ標的ＲＮＡの分解を指向するためにｓｉＮＡ分子に対するＥＮａＣ標的ＲＮＡへの十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
１つの実施形態において、本発明はＥＮａＣ標的遺伝子の発現をダウンレギュレートするか、またはＥＮａＣ標的ＲＮＡの切断を指向するｓｉＮＡ分子を特徴とし、例えばここで、ＥＮａＣ標的遺伝子またはＲＮＡはタンパク質コード配列を含む。１つの実施形態において、本発明はＥＮａＣ標的遺伝子の発現をダウンレギュレートするか、またはＥＮａＣ標的ＲＮＡの切断を指向するｓｉＮＡ分子を特徴とし、例えばここで、ＥＮａＣ標的遺伝子またはＲＮＡはＥＮａＣ標的遺伝子発現に関与する非コーディング配列または調節エレメント（例えば非コーディングＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ等）を含む。
【００３２】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡはＥＮａＣ標的遺伝子またはＥＮａＣ標的遺伝子ファミリーの発現を阻害するために使用され、ここでＥＮａＣ遺伝子またはＥＮａＣ遺伝子ファミリー配列は配列相同性を共有している。そのような相同な配列は当分野で知られる通り、例えば配列アラインメントを用いながら識別できる。ｓｉＮＡ分子は、例えば完全相補配列を用いながら、または、追加的なＥＮａＣ標的配列を提供できる非カノニカルな塩基対、例えばミスマッチおよび／またはウオッブル塩基対を取り込むことにより、そのような相同なＥＮａＣ配列をターゲティングするように設計できる。ミスマッチが発見された場合は、非カノニカルな塩基対（例えばミスマッチおよび／またはウオッブル塩基）を用いることによりＥＮａＣ遺伝子配列の１つより多くをターゲティングするｓｉＮＡ分子を作成することができる。非限定的な例においては、ＵＵおよびＣＣ塩基対等の非カノニカルな塩基対を用いることにより配列相同性を共有している異なるＥＮａＣポリヌクレオチド標的に対する配列をターゲティングできるｓｉＮＡ分子を作成する。即ち、本発明のｓｉＮＡを使用することの１つの利点は相同な遺伝子の間で保存されているヌクレオチド配列に相補的である核酸配列を含むように単一のｓｉＮＡを設計することができる点である。この手順においては、異なる遺伝子をターゲティングするためにｓｉＮＡ分子の１つより多くを使用する代わりに、遺伝子の１つより多くの発現を阻害するために単一のｓｉＮＡを使用できる。
【００３３】
１つの実施形態において本発明はＥＮａＣ標的ＲＮＡ（例えばコーディングまたは非コーディングＲＮＡ）に対するＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を特徴とし、ここでｓｉＮＡ分子は本明細書に記載する表７に示すＥＮａＣＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を有する配列等の、いずれかのＥＮａＣ  ＲＮＡ配列に対して相補的な配列を含む。別の実施形態においては、本発明はＥＮａＣ標的ＲＮＡに対抗するＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を特徴とし、ここでｓｉＮＡ分子は、ＥＮａＣ変異体コード配列、例えば、本明細書に記載するか、別様に当分野で知られる通り疾患、体質、障害および／または状態の維持および／または発症に関連することが当分野で知られている他の突然変異体ＥＮａＣ遺伝子を有するＲＮＡに対して相補的な配列を含む。表８に示すか、別様に本明細書に記載する化学修飾を本発明のいずれかのｓｉＮＡコンストラクトに適用できる。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子はＥＮａＣ標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用することができ、それによりＥＮａＣ標的遺伝子発現のサイレンシングを媒介できるヌクレオチド配列を含み、例えばここで、ｓｉＮＡは、ＥＮａＣ標的遺伝子のクロマチン構造またはメチル化のパターンをモジュレートし、ＥＮａＣ標的遺伝子の転写を防止する細胞プロセスにより、ＥＮａＣ標的遺伝子発現の調節を媒介する。
【００３４】
１つの実施形態において本発明のｓｉＮＡ分子は対象または生物における体質、疾患または状態に関連するハプロタイプ多形に起因するＥＮａＣタンパク質の発現をダウンレギュレートまたは阻害するために使用する。ＥＮａＣ遺伝子、またはＥＮａＣのタンパク質またはＲＮＡのレベルの分析は、そのような多形を有する対象、または本明細書に記載する体質、状態、または疾患を発症する危険性のある対象を識別するために使用できる。これらの対象は治療、例えば標的遺伝子発現に関連する疾患を治療する場合に有用な本発明のｓｉＮＡ分子およびいずれかの他の組成物を用いた治療に使用できる。即ち、ＥＮａＣタンパク質またはＲＮＡのレベルの分析は対象を治療する場合に、治療の型および施療過程を決定するために使用できる。ＥＮａＣタンパク質またはＲＮＡのレベルのモニタリングは、治療の転帰を予測するために、体質、障害、状態、または疾患に関連する特定のＥＮａＣタンパク質のレベルおよび／または活性をモジュレートする化合物および組成物の薬効を測定するために使用できる。
【００３５】
本発明の１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子はＥＮａＣ標的タンパク質をコードするＥＮａＣヌクレオチド配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。ｓｉＮＡは更にセンス鎖を含み、この場合、該センス鎖はＥＮａＣ標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部分を含む。
【００３６】
別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子はＥＮａＣ標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス領域を含む。ｓｉＮＡ分子は更に、センス領域を含み、ここで該センス領域はＥＮａＣ標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部分を含む。
【００３７】
別の実施形態においては、本発明は、ヌクレオチド配列、例えば、ＥＮａＣ標的遺伝子のヌクレオチド配列または配列の一部分に相補的なｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域におけるヌクレオチド配列を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の実施形態においては、本発明は、ＥＮａＣ標的遺伝子の配列またはその一部分を含む配列に相補的な、ある領域、例えばｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス領域を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。
【００３８】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のセンス領域またはセンス鎖はＥＮａＣ標的ポリヌクレオチド配列に相補的なｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域またはアンチセンス鎖のその部分に相補的である。
【００３９】
別の実施形態においては、本発明は表７に示すＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により示される配列を含む配列または配列の一部分に相補的な配列、例えばｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス配列を含む、ｓｉＮＡ分子を特徴とする。表１ｂおよび８中、および本明細書に記載する化学修飾を、本発明のいずれかのｓｉＮＡコンストラクトに適用できる。表１０に記載するＬＮＰ製剤は本明細書に記載するいずれかのｓｉＮＡ分子またはｓｉＮＡ分子の組み合わせに適用できる。
【００４０】
本発明の１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子は、約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含み、ここでアンチセンス鎖はＥＮａＣ標的ＲＮＡ配列またはその一部分に対して相補的であり、ここで該ｓｉＮＡは更に約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを有するセンス鎖を含み、ここで、該センス鎖および該アンチセンス鎖は、各鎖中少なくとも約１５ヌクレオチドが他方の鎖に相補的である異なるヌクレオチド配列である。
【００４１】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子（例えば２本鎖核酸分子）はＥＮａＣのＥＮａＣ  ＲＮＡ配列またはその一部分に相補的な約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを有するアンチセンス（ガイド）鎖を含む。１つの実施形態において、ＥＮａＣ  ＲＮＡ配列の少なくとも１５ヌクレオチド（例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド）が本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス（ガイド）鎖に相補的である。
【００４２】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子（例えば２本鎖核酸分子）はＥＮａＣ  ＲＮＡの配列またはその一部分を含む約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを有するセンス（パッセンジャー）鎖を含む。１つの実施形態において、ＥＮａＣ  ＲＮＡ配列の少なくとも１５ヌクレオチド（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドが本発明のｓｉＮＡ分子のセンス（パッセンジャー）鎖を含む。
【００４３】
本発明の別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを有するアンチセンス領域を含み、ここでアンチセンス領域はＥＮａＣ標的ＤＮＡ配列に相補的であり、該ｓｉＮＡは更に、約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを有するセンス領域を含み、ここで該センス領域および該アンチセンス領域は線状分子中に含まれ、ここでセンス領域はアンチセンス領域に相補的な少なくとも約１５ヌクレオチドを含む。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子はＥＮａＣ遺伝子１つ以上によりコードされたＥＮａＣ  ＲＮＡの発現をモジュレートするＲＮＡｉ活性を有する。ＥＮａＣ遺伝子は相互にある程度の配列相同性を共有することができるため、ｓｉＮＡ分子は、異なるＥＮａＣ標的間で共有されているか、または特定のＥＮａＣ標的にユニークである（例えばいずれかのＥＮａＣアイソタイプにユニークである）配列を選択することにより、ＥＮａＣ遺伝子のあるクラスをターゲティングするように設計できる。従って、１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子は、１つのｓｉＮＡ分子を用いてＥＮａＣ遺伝子のクラスをターゲティングするように、数種のＥＮａＣ遺伝子変異体間で相同性を有するＥＮａＣポリヌクレオチド配列の保存された領域をターゲティングするように設計できる。従って、１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は対象または生物におけるＥＮａＣアイソフォーム１つ以上の発現をモジュレートする。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子がＲＮＡｉ活性を媒介するために必要とする高い程度の特異性のため、特定のＥＮａＣポリヌクレオチド配列（例えば単一のＥＮａＣアイソフォーム、またはＥＮａＣの１塩基多形（ＳＮＰ））にユニークな配列をターゲティングするように設計できる。
【００４５】
１つの実施形態において、ＲＮＡ干渉遺伝子サイレンシング応答のメディエーターとして作用する本発明の核酸分子は２本鎖核酸分子である。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの間に約１５〜約３０塩基対を含有するデュプレックス核酸分子からなる。更に別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は約１〜約３（例えば約１、２、または３）ヌクレオチドのオーバーハング末端を有するデュプレックス核酸分子、例えば、約１９塩基対および３’末端のモノヌクレオチド、ジヌクレオチド、またはトリヌクレオチドのオーバーハングを有する約２１ヌクレオチドのデュプレックスを含む。更に別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は平滑末端を有するデュプレックス核酸分子を含み、ここで両方の末端が平滑であるか、或いは、ここで末端の一方が平滑である。
【００４６】
１つの実施形態において、２本鎖核酸（例えばｓｉＮＡ）分子はヌクレオチドまたは非ヌクレオチドのオーバーハングを含む。「オーバーハング」とは２本鎖核酸分子の２つの鎖の間で塩基対形成していないヌクレオチド配列の末端部分を意味する（例えば図６参照）。１つの実施形態において、本発明の２本鎖核酸分子は、２本鎖核酸分子の一方または両方の鎖の３’末端においてヌクレオチドまたは非ヌクレオチドのオーバーハングを含むことができる。例えば、本発明の２本鎖核酸分子は２本鎖核酸分子のガイド鎖またはアンチセンス鎖／領域の３’末端、パッセンジャー鎖またはセンス鎖／領域の３’末端、または、ガイド鎖またはアンチセンス鎖／領域およびパッセンジャー鎖またはセンス鎖／領域の３’末端の両方に、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドのオーバーハングを含むことができる。別の実施形態においては、本発明の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子のヌクレオチドオーバーハング部分は、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ（ＦＡＮＡ），４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、ユニバーサル塩基、非環式、または５−Ｃ−メチルのヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、本発明の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子の非ヌクレオチドオーバーハング部分は、グリセリル、無塩基、または反転したデオキシ無塩基の非ヌクレオチドを含む。
【００４７】
１つの実施形態において、本発明の２本鎖核酸（例えばｓｉＮＡ）分子のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子のＥＮａＣ標的ポリヌクレオチド配列を含むヌクレオチドに相当する。従って、そのような実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、ＥＮａＣ標的ポリヌクレオチド配列に基づいた配列を含み、そこにおいては、本発明のｓｉＮＡ分子のガイド鎖またはアンチセンス鎖／領域のオーバーハング部分を含むヌクレオチドはＥＮａＣ標的ポリヌクレオチド配列におけるヌクレオチドに相補的であることができ、本発明のｓｉＮＡ分子のパッセンジャー鎖またはセンス鎖／領域のオーバーハング部分を含むヌクレオチドはＥＮａＣ標的ポリヌクレオチド配列におけるヌクレオチドを含むことができる。そのようなヌクレオチドオーバーハングはネイティブのｄｓＲＮＡからｓｉＲＮＡへのダイサープロセシングに起因する配列を含む。
【００４８】
１つの実施形態において、本発明の２本鎖核酸（例えばｓｉＮＡ）分子のオーバーハング部分を含むヌクレオチドはＥＮａＣ標的ポリヌクレオチド配列に相補的であり、場合により本明細書に記載する通り化学修飾される。即ち、１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のガイド鎖またはアンチセンス鎖／領域のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、ＥＮａＣ標的ポリヌクレオチド配列におけるヌクレオチド、即ち、ｓｉＮＡ分子のガイド鎖またはアンチセンス鎖／領域におけるオーバーハングヌクレオチドのヌクレオチド位置に相補的であるＥＮａＣ標的ポリヌクレオチド配列におけるそのようなヌクレオチド位置に相補的であることができる。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子のパッセンジャー鎖またはセンス鎖／領域のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは、ＥＮａＣ標的ポリヌクレオチド配列におけるヌクレオチド、即ち、ｓｉＮＡ分子のパッセンジャー鎖またはセンス鎖／領域におけるオーバーハングヌクレオチドの同じヌクレオチド位置に相当するＥＮａＣ標的ポリヌクレオチド配列におけるそのようなヌクレオチド位置を含むことができる。１つの実施形態において、オーバーハングはＥＮａＣ標的ポリヌクレオチド配列の一部分に相補的である２つのヌクレオチド（例えば３’−ＧＡ；３’−ＧＵ；３’−ＧＧ；３’ＧＣ；３’−ＣＡ；３’−ＣＵ；３’−ＣＧ；３’ＣＣ；３’−ＵＡ；３’−ＵＵ；３’−ＵＧ；３’ＵＣ；３’−ＡＡ；３’−ＡＵ；３’−ＡＧ；３’−ＡＣ；３’−ＴＡ；３’−ＴＵ；３’−ＴＧ；３’−ＴＣ；３’−ＡＴ；３’−ＵＴ；３’−ＧＴ；３’−ＣＴ）オーバーハングを含む。１つの実施形態において、オーバーハングはＥＮａＣ標的ポリヌクレオチド配列の一部分に相補的ではない２つのヌクレオチド（例えば３’−ＧＡ；３’−ＧＵ；３’−ＧＧ；３’ＧＣ；３’−ＣＡ；３’−ＣＵ；３’−ＣＧ；３’ＣＣ；３’−ＵＡ；３’−ＵＵ；３’−ＵＧ；３’ＵＣ；３’−ＡＡ；３’−ＡＵ；３’−ＡＧ；３’−ＡＣ；３’−ＴＡ；３’−ＴＵ；３’−ＴＧ；３’−ＴＣ；３’−ＡＴ；３’−ＵＴ；３’−ＧＴ；３’−ＣＴ）オーバーハングを含む。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子のオーバーハングヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ、および／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子のオーバーハングヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドがプリンヌクレオチドおよび／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、または２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチドである場合、オーバーハングヌクレオチドがピリミジンヌクレオチドである場合には、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子のオーバーハングにおけるプリンヌクレオチド（存在時）は、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子のオーバーハングにおけるピリミジンヌクレオチド（存在時）は、２’−デオキシ−２’−フルオロまたは２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチドである。
【００４９】
１つの実施形態において、本発明の２本鎖核酸（例えばｓｉＮＡ）分子のオーバーハング部分を含むヌクレオチドはＥＮａＣ標的ポリヌクレオチド配列に相補的ではなく、場合により本明細書に記載する通り化学修飾される。１つの実施形態において、オーバーハングはＥＮａＣ標的ポリヌクレオチド配列の一部分に相補的ではない３’−ＵＵオーバーハングを含む。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子のオーバーハング部分を含むヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ、および／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。
【００５０】
１つの実施形態において、本発明の２本鎖核酸分子（例えばｓｉＮＡ）は２つまたは３つのヌクレオチドオーバーハングを含み、ここでオーバーハングにおけるヌクレオチドは同じかまたは異なっている。１つの実施形態において、本発明の２本鎖核酸分子（例えばｓｉＮＡ）は２つまたは３つのヌクレオチドオーバーハングを含み、ここでオーバーハングにおけるヌクレオチドは同じかまたは異なっており、ここで、オーバーハングにおけるヌクレオチド１つ以上が塩基、糖および／またはホスフェート骨格において化学修飾される。
【００５１】
１つの実施形態において、本発明はＥＮａＣ標的遺伝子の発現に関連する、タンパク質をコードするＤＮＡ、またはＲＮＡ、または非コーディングＲＮＡ等のＥＮａＣ標的核酸分子に対する特異性を有する化学修飾されたｓｉＮＡコンストラクト１つ以上を特徴とする。１つの実施形態において、本発明は本明細書に記載する化学修飾１つ以上を含む核酸分子に対する特異性を有するＲＮＡ系のｓｉＮＡ分子（例えば２’−ＯＨヌクレオチドを含むｓｉＮＡ）を特徴とする。そのような化学修飾の非限定的な例は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、４’−チオリボヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド（例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる２００４年１１月５日出願のＵＳＳＮ１０／９８１，９６６参照）、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、「非環式」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ（ＦＡＮＡ、例えばＤｏｗｌｅｒ等、２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４，１６６９−１６７５参照）、および末端グリセリルおよび／または反転デオキシ無塩基残基の取り込みを含む。これらの化学修飾は、種々のｓｉＮＡコンストラクト（例えばＲＮＡ系ｓｉＮＡコンストラクト）において使用する場合、細胞におけるＲＮＡｉ活性を温存し、同時にこれらの化合物の血清中安定性を劇的に上昇させることがわかっている。
【００５２】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子はｓｉＮＡ分子の内部の位置において本明細書に記載する化学修飾（例えば２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、４’−チオリボヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、ＬＮＡ）を含む。「内部の位置」とは、ｓｉＮＡデュプレックスの塩基対形成位置を意味する。
【００５３】
１つの実施形態において、本発明は、標的ＥＮａＣ遺伝子の発現に関連するＥＮａＣタンパク質をコードするＥＮａＣ  ＤＮＡまたはＥＮａＣ  ＲＮＡ、または非コーディングＲＮＡ等の、標的ＥＮａＣ核酸分子に対する特異性を有する化学修飾されたｓｉＮＡコンストラクト１つ以上を特徴とする。
【００５４】
１つの実施形態において、本発明は本明細書に記載する化学修飾１つ以上を含む核酸分子に対する特異性を有するＲＮＡ系ｓｉＮＡ分子（例えば２’−ＯＨヌクレオチドを含むｓｉＮＡ）を特徴とする。そのような化学修飾の非限定的な例は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、４’−チオリボヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド（例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる２００４年１１月５日出願のＵＳＳＮ１０／９８１，９６６参照）、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、「非環式」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、および末端グリセリルおよび／または反転デオキシ無塩基残基の取り込みを含む。これらの化学修飾は、種々のｓｉＮＡコンストラクト（例えばＲＮＡ系ｓｉＮＡコンストラクト）において使用する場合、細胞におけるＲＮＡｉ活性を温存し、同時にこれらの化合物の血清中安定性を劇的に上昇させることがわかっている。更に、上記のＰｅｒｒｉｓｈ等により公開されたデータとは逆に、本出願人は多重（１つより多い）のホスホロチオエート置換が良好に耐容され、修飾されたｓｉＮＡコンストラクトに対して血清中安定性の大きな上昇をもたらすことを明らかにする。
【００５５】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は修飾されたヌクレオチドを含む一方で、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持している。修飾されたヌクレオチドは安定性、活性、毒性、免疫応答、および／または生体利用性等のインビトロまたはインビボの特性を向上させるために使用できる。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子はｓｉＮＡ分子中に存在するヌクレオチドの総数のあるパーセンテージとして修飾されたヌクレオチドを含むことができる。即ち、本発明のｓｉＮＡ分子は一般的に、約５％〜約１００％の修飾ヌクレオチド（例えば約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の修飾ヌクレオチド）を含むことができる。例えば、１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のヌクレオチド位置の約５％〜約１００％（例えば約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の修飾ヌクレオチド）が核酸糖修飾、例えば２’−糖修飾、例えば２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、または２’−デオキシヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子のヌクレオチド位置の約５％〜約１００％（例えば約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の修飾ヌクレオチド）が核酸塩基修飾、例えばイノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えばリボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば６−メチルウリジン）、またはプロピンの修飾を含む。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子のヌクレオチド位置の約５％〜約１００％（例えば約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の修飾ヌクレオチド）が本明細書に記載する式Ｉを有する骨格修飾等の、核酸骨格修飾を含む。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子のヌクレオチド位置の約５％〜約１００％（例えば約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の修飾ヌクレオチド）が核酸の糖、塩基、または骨格の修飾、またはいずれかのその組み合わせ（例えば本明細書における核酸の糖、塩基、骨格または非ヌクレオチドの修飾のいずれかの組み合わせ）を含む。１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の修飾されたヌクレオチドを含む。所与のｓｉＮＡ分子中に存在する修飾されたヌクレオチドの実際のパーセンテージはｓｉＮＡ中に存在するヌクレオチドの総数に依存する。ｓｉＮＡ分子が１本鎖である場合、パーセント修飾は１本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するヌクレオチドの総数に基づくことができる。同様にｓｉＮＡ分子が２本鎖である場合、パーセント修飾はセンス鎖、アンチセンス鎖、またはセンスとアンチセンス鎖の両方に存在するヌクレオチドの総数に基づくことができる。
【００５６】
本発明のｓｉＮＡ分子はｓｉＮＡ分子内部の種々の位置に修飾されたヌクレオチドを含むことができる。１つの実施形態において、本発明の２本鎖ｓｉＮＡ分子はｓｉＮＡデュプレックス内部の内部塩基対形成位置に修飾されたヌクレオチドを含む。例えば内部の位置は１９塩基対および２つのヌクレオチド３’オーバーハングを有する２１ヌクレオチドｓｉＮＡデュプレックスのセンスまたはアンチセンスの鎖または領域のいずれかの５’末端から約３〜約１９ヌクレオチドの位置を含むことができる。別の実施形態においては、本発明の２本鎖ｓｉＮＡ分子はｓｉＮＡ分子の非塩基対形成またはオーバーハングの領域に修飾されたヌクレオチドを含む。「非塩基対形成」とは、ヌクレオチドが、センス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域またはｓｉＮＡ分子との間で塩基対形成していないことを意味する。オーバーハングヌクレオチドは相当するＥＮａＣ標的ポリヌクレオチド配列に相補的であるか、それと塩基対形成することができる（例えば図６Ｃ参照）。例えば、オーバーハング位置は、１９塩基対および２つのヌクレオチド３’オーバーハングを有する２１ヌクレオチドｓｉＮＡデュプレックスのセンスまたはアンチセンスの鎖または領域のいずれかの５’末端から約２０〜約２１ヌクレオチドの位置を含むことができる。別の実施形態においては、本発明の２本鎖ｓｉＮＡ分子はｓｉＮＡ分子の末端位置に修飾されたヌクレオチドを含む。例えば、そのような末端領域はｓｉＮＡ分子のセンスおよび／またはアンチセンスの鎖または領域の３’位、５’位、または３’および５’位の両方を含む。別の実施形態においては、本発明の２本鎖ｓｉＮＡ分子は塩基対形成した、または内部の位置、非塩基対形成の、またはオーバーハングの領域、および／または末端の領域、またはこれらのいずれかの組み合わせにおいて修飾されたヌクレオチドを含む。
【００５７】
本発明の１つの態様はＥＮａＣ標的遺伝子の発現をダウンレギュレートするか、またはＥＮａＣ標的ＲＮＡの切断を指向する２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。１つの実施形態において、２本鎖ｓｉＮＡ分子は化学修飾１つ以上を含み、２本鎖ｓｉＮＡの各鎖は約２１ヌクレオチド長である。１つの実施形態において、２本鎖ｓｉＮＡ分子はいかなるリボヌクレオチドも含有しない。別の実施形態においては、２本鎖ｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチド１つ以上を含む。１つの実施形態において、２本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は独立して約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含み、ここで各鎖は他の鎖のヌクレオチドに相補的である約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、２本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の１つはＥＮａＣ標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、２本鎖ｓｉＮＡ分子の第２の鎖はＥＮａＣ標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部分と実質的に同様のヌクレオチド配列を含む。
【００５８】
別の実施形態においては、本発明は、アンチセンス領域、ただしここでアンチセンス領域はＥＮａＣ標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含むもの、および、センス領域、ただしここでセンス領域はＥＮａＣ標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部分と実質的に同様のヌクレオチド配列を含むもの、を含む、ＥＮａＣ標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする、またはＥＮａＣ標的ＲＮＡの切断を指向する、２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。１つの実施形態において、アンチセンス領域およびセンス領域は独立して約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含み、ここでアンチセンス領域はセンス領域のヌクレオチドに相補的である約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含む。
【００５９】
別の実施形態においては、本発明はセンス領域およびアンチセンス領域を含む、ＥＮａＣ標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする、またはＥＮａＣ標的ＲＮＡの切断を指向する、２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで、アンチセンス領域はＥＮａＣ標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域はアンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【００６０】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は平滑末端、即ち、いかなるオーバーハングヌクレオチドも含まない末端を含む。例えば、本明細書に記載する修飾（例えば式Ｉ〜ＶＩＩを有するヌクレオチドまたは「Ｓｔａｂ００」−「Ｓｔａｂ３６」または「Ｓｔａｂ３Ｆ」−「Ｓｔａｂ３６Ｆ」（表８）またはそのいずれかの組み合わせを含むｓｉＮＡコンストラクトを含むもの（表８参照））および／または本明細書に記載するいずれかの長さを含むｓｉＮＡ分子は平滑末端またはオーバーハングヌクレオチドを有さない末端を含むことができる。
【００６１】
１つの実施形態において、本発明のいずれかのｓｉＮＡ分子は平滑末端１つ以上を含むことができ、即ちここで、平滑末端はいかなるオーバーハングヌクレオチドも有さない。１つの実施形態において、平滑末端を有するｓｉＮＡ分子はｓｉＮＡ分子の各鎖中に存在するヌクレオチドの数に等しい塩基対の数を有する。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は１つの平滑末端を含み、例えばここで、アンチセンス鎖の５’末端およびセンス鎖の３’末端はいかなるオーバーハングヌクレオチドも有さない。別の例においては、ｓｉＮＡ分子は１つの平滑末端を含み、例えばここでアンチセンス鎖の３’末端およびセンス鎖の５’末端はいかなるオーバーハングヌクレオチドも有さない。別の例においては、ｓｉＮＡ分子は２つの平滑末端を含み、例えばここでアンチセンス鎖の３’末端およびセンス鎖の５’末端並びにアンチセンス鎖の５’末端およびセンス鎖の３’末端はいかなるオーバーハングヌクレオチドも有さない。平滑末端を有するｓｉＮＡ分子は例えば約１５〜約３０ヌクレオチド（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド）を含むことができる。平滑末端を有するｓｉＮＡ分子中に存在する他のヌクレオチドは、例えばミスマッチ、バルジ、ループ、またはウオッブルの塩基対を含むことができ、これにより、ＲＮＡ干渉を媒介するｓｉＮＡ分子の活性をモジュレートできる。
【００６２】
「平滑末端」とは対称な末端、或いはオーバーハングヌクレオチドを有さない２本鎖ｓｉＮＡ分子の末端を意味する。２本鎖ｓｉＮＡ分子の２つの鎖は末端にオーバーハングヌクレオチドを有することなく相互にアラインしている。例えば、平滑末端を有するｓｉＮＡコンストラクトはｓｉＮＡ分子のセンスおよびアンチセンス領域の間に相補的な末端ヌクレオチドを含む。
【００６３】
１つの実施形態において、本発明は、ＥＮａＣ標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする、またはＥＮａＣ標的ＲＮＡの切断を指向する、２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで、ｓｉＮＡ分子は２つの別個のオリゴヌクレオチドフラグメントから組み立てられ、ここで１つのフラグメントはセンス領域を含み、第２のフラグメントはｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。センス領域はポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカー等のリンカー分子を介してアンチセンス領域に連結することができる。
【００６４】
１つの実施形態において、本発明の２本鎖核酸分子（例えばｓｉＮＡ）分子は、ＲＮＡｉ活性を維持または増強する位置にリボヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、リボヌクレオチドはｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域に存在し、これはＲＩＳＣ内部の酵素によるセンス鎖またはセンス領域の切断を可能にすることによりＲＮＡｉ活性を与えることができる（例えばパッセンジャー鎖、センス鎖またはセンス領域の切断の位置、例えばＡＧＯ２酵素によりＲＩＳＣにおいて切断される１９塩基対のデュプレックスのパッセンジャー鎖の９位に存在するリボヌクレオチド、例えば、Ｍａｔｒａｎｇａ等、２００５，Ｃｅｌｌ，１２３：１−１１４およびＲａｎｄ等、２００５，Ｃｅｌｌ，１２３：６２１−６２９参照）。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子のガイド鎖またはガイド領域（アンチセンス鎖またはアンチセンス領域としても知られている）の５’末端の１つ以上（例えば１、２、３、４または５つ）ヌクレオチドはリボヌクレオチドである。
【００６５】
１つの実施形態において、本発明の２本鎖核酸分子（例えばｓｉＮＡ）分子は、ＲＩＳＣ複合体における酵素によるパッセンジャー鎖またはパッセンジャー領域の切断を可能にするパッセンジャー鎖またはパッセンジャー領域（センス鎖またはセンス領域としても知られている）の内部の位置のリボヌクレオチド１つ以上を含む（例えばパッセンジャー鎖の位置、例えばＡＧＯ２酵素によりＲＩＳＣにおいて切断される１９塩基対のデュプレックスのパッセンジャー鎖の９位に存在するリボヌクレオチド、例えば、Ｍａｔｒａｎｇａ等、２００５，Ｃｅｌｌ，１２３：１−１１４およびＲａｎｄ等、２００５，Ｃｅｌｌ，１２３：６２１−６２９参照）。
【００６６】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は同じかまたは異なり得る化学修飾少なくとも２、３、４、５またはそれより多くを含有する。１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は少なくとも２、３、４、５またはそれより多くの異なる化学修飾を含有する。
【００６７】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）であり、ここで２本鎖核酸分子は約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）の塩基対を含み、ここでｓｉＮＡ分子の各鎖におけるヌクレオチドの位置の１つ以上（例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）は化学修飾を含む。別の実施形態においては、ｓｉＮＡは少なくとも２、３、４、５またはそれより多くの異なる化学修飾を含有する。
【００６８】
１つの実施形態において、本発明はＥＮａＣ標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする、またはＥＮａＣ標的ＲＮＡの切断を指向する、２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでｓｉＮＡ分子は約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）の塩基対を含み、ここでｓｉＮＡ分子の各鎖は１つ以上の化学修飾を含む。１つの実施形態において、２本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は少なくとも２つ（例えば２、３、４、５、またはそれより多く）の異なる化学修飾、例えば異なるヌクレオチド糖、塩基、または骨格の修飾を含む。別の実施形態においては、２本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方はＥＮａＣ標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、２本鎖ｓｉＮＡ分子の第２の鎖はＥＮａＣ標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部分と実質的に同様のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態においては、２本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方はＥＮａＣ標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、２本鎖ｓｉＮＡ分子の第２の鎖はＥＮａＣ標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部分と実質的に同様のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）のヌクレオチドを含み、各鎖は他方の鎖のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）のヌクレオチドを含む。ＥＮａＣ標的遺伝子は例えば本明細書において言及するか、参照により本明細書に組み込まれる配列を含むことができる。ＥＮａＣ遺伝子は例えば表７に示すようなＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により参照される配列を含むことができる。
【００６９】
１つの実施形態において、本発明の２本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は「Ｓｔａｂ００」−「Ｓｔａｂ３６」または「Ｓｔａｂ３Ｆ」−「Ｓｔａｂ３６Ｆ」（表８）の修飾パターンまたはそのいずれかの組み合わせ等の化学修飾の異なるパターンを含む（表８参照）。そのような種々の修飾パターンを有するそのようなｓｉＮＡ分子のセンスおよびアンチセンス鎖の非限定的な例は図４および図５に示す通りである。
【００７０】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は１つ以上のリボヌクレオチド（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多いリボヌクレオチド）を含む。
【００７１】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子はＥＮａＣ標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス領域を含み、ｓｉＮＡは更にＥＮａＣ標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部分と実質的に同様のヌクレオチド配列を含むセンス領域を含む。別の実施形態においては、アンチセンス領域およびセンス領域は各々、約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）のヌクレオチドを含み、アンチセンス領域はセンス領域のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）のヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、２本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、少なくとも２つ（例えば２、３、４、５、またはそれより多く）の異なる化学修飾、例えば異なるヌクレオチド糖、塩基、または骨格の修飾を含む。ＥＮａＣ標的遺伝子は例えば本明細書において言及するか、参照により本明細書に組み込まれる配列を含むことができる。別の実施形態においては、ｓｉＮＡは２本鎖核酸分子であり、ここでｓｉＮＡ分子の２つの鎖の各々は独立して約１５〜約４０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０）ヌクレオチドを含み、ここでｓｉＮＡ分子の鎖の１つはＥＮａＣ標的遺伝子の核酸配列またはその一部分に相補的な少なくとも約１５（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５、またはそれより多く）のヌクレオチドを含む。
【００７２】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子はセンス領域およびアンチセンス領域を含み、ここでアンチセンス領域はＥＮａＣ標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域はアンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子は２つの別個のオリゴヌクレオチドフラグメントから組み立てられ、ここで１つのフラグメントはセンス領域を含み、第２のフラグメントはｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。別の実施形態においては、センス領域はリンカー分子を介してアンチセンス領域に連結される。別の実施形態においては、センス領域は、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー等のリンカー分子を介してアンチセンス領域に連結される。１つの実施形態において、２本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は少なくとも２つ（例えば２、３、４、５、またはそれより多く）の異なる化学修飾、例えば異なるヌクレオチド糖、塩基、または骨格の修飾を含む。ＥＮａＣ標的遺伝子は例えば本明細書において言及するか、参照により本明細書に組み込まれる配列を含むことができる。
【００７３】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれより多い）の２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジン修飾を含む（例えばｓｉＮＡの１つ以上または全てのピリミジン（例えばＵまたはＣ）の位置が２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで修飾されている場合）。１つの実施形態において、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジン修飾はセンス鎖において存在する。１つの実施形態において、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジン修飾はアンチセンス鎖において存在する。１つの実施形態において、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジン修飾はｓｉＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖の両方において存在する。
【００７４】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれより多い）の２’−Ｏ−メチルプリン修飾を含む（例えばｓｉＮＡの１つ以上または全てのプリン（例えばＡまたはＧ）の位置が２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで修飾されている場合）。１つの実施形態において、２’−Ｏ−メチルプリン修飾はセンス鎖において存在する。１つの実施形態において、２’−Ｏ−メチルプリン修飾はアンチセンス鎖において存在する。１つの実施形態において、２’−Ｏ−メチルプリン修飾はｓｉＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖の両方において存在する。
【００７５】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれより多い）の２’−デオキシプリン修飾を含む（例えばｓｉＮＡの１つ以上または全てのプリン（例えばＡまたはＧ）の位置が２’−デオキシヌクレオチドで修飾されている場合）。１つの実施形態において、２’−デオキシプリン修飾はセンス鎖において存在する。１つの実施形態において、２’−デオキシプリン修飾はアンチセンス鎖において存在する。１つの実施形態において、２’−デオキシプリン修飾はｓｉＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖の両方において存在する。
【００７６】
１つの実施形態において、本発明は、センス領域およびアンチセンス領域を含む、ＥＮａＣ標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする、またはＥＮａＣ標的ＲＮＡの切断を指向する、２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでアンチセンス領域はＥＮａＣ標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域はアンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を含み、ここでｓｉＮＡ分子は１つ以上の修飾されたピリミジンおよび／またはプリンヌクレオチドを有する。１つの実施形態において、２本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は少なくとも２つ（例えば２、３、４、５、またはそれより多く）の異なる化学修飾、例えば異なるヌクレオチド糖、塩基、または骨格の修飾を含む。１つの実施形態において、センス領域のピリミジンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドまたは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域に存在するプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。別の実施形態においては、センス領域のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域に存在するプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。別の実施形態においては、センス領域のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域に存在するプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。別の実施形態においては、アンチセンス領域のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。上記したｓｉＮＡ分子のいずれかの別の実施形態においては、センス鎖の非相補性領域（例えばオーバーハング領域）に存在するいずれかのヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチドである。
【００７７】
１つの実施形態において、本発明は、ＥＮａＣ標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする、またはＥＮａＣ標的ＲＮＡの切断を指向する、２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで、ｓｉＮＡ分子は２つの別個のオリゴヌクレオチドフラグメントから組み立てられ、ここで１つのフラグメントはセンス領域を含み、第２のフラグメントはｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含み、ここでセンス領域を含むフラグメントはフラグメントの５’末端、３’末端、または５’および３’末端の両方において末端キャップ部分を含む。１つの実施形態において、末端キャップ部分は反転デオキシ無塩基部分またはグリセリル部分である。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子の２つのフラグメントの各々は、独立して約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）のヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の２つの鎖の各々は独立して約１５〜約４０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０）ヌクレオチドを含む。非限定的な例において、ｓｉＮＡ分子の２つのフラグメントの各々は約２１ヌクレオチドを含む。
【００７８】
１つの実施形態において、本発明は修飾されたヌクレオチド少なくとも１つを含むｓｉＮＡ分子を特徴とし、ここで修飾されたヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、または、本明細書、および参照により本明細書に組み込まれる２００４年１１月５日出願のＵＳＳＮ１０／９８１，９６６に記載されるいずれかの他の修飾されたヌクレオシド／ヌクレオチドである。１つの実施形態において、本発明は少なくとも２つ（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多く）の修飾されたヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とし、ここで修飾されたヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、または、本明細書、および参照により本明細書に組み込まれる２００４年１１月５日出願のＵＳＳＮ１０／９８１，９６６に記載されるいずれかの他の修飾されたヌクレオシド／ヌクレオチドからなる群より選択される。修飾されたヌクレオチド／ヌクレオシドは同じかまたは異なることができる。ｓｉＮＡは例えば、約１５〜約４０ヌクレオチド長であることができる。１つの実施形態において、ｓｉＮＡに存在する全てのピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシ、４’−チオピリミジンヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡにおける修飾されたヌクレオチドは少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンまたは２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、ｓｉＮＡにおける修飾されたヌクレオチドは少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンおよび少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、ｓｉＮＡに存在する全てのウリジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡに存在する全てのシチジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロシジジンヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡに存在する全てのアデノシンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡに存在する全てのグアノシンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンヌクレオチドである。ｓｉＮＡは更に、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間連結部、例えばホスホロチオエート連結部を含む。１つの実施形態において、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドはピリミジンヌクレオチドを有する位置等の、リボヌクレアーゼによる切断に感受性であるｓｉＮＡにおける特定の選択された位置に存在する。
【００７９】
１つの実施形態において、本発明はｓｉＮＡ分子内に修飾されたヌクレオチド少なくとも１つを導入することを含む、リボヌクレアーゼによる切断に対抗したｓｉＮＡ分子の安定性を上昇させる方法を特徴とし、ここで修飾されたヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡに存在する全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡにおける修飾されたヌクレオチドは少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンまたは２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、ｓｉＮＡの修飾されたヌクレオチドは少なくとも１つの２’−フルオロシチジンおよび少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、ｓｉＮＡに存在する全てのウリジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡに存在する全てのシチジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡに存在する全てのアデノシンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡに存在する全てのグアノシンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンヌクレオチドである。ｓｉＮＡは更に、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間連結部、例えばホスホロチオエート連結部を含む。１つの実施形態において、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドはピリミジンヌクレオチドを有する位置等の、リボヌクレアーゼによる切断に感受性であるｓｉＮＡにおける特定の選択された位置に存在する。
【００８０】
１つの実施形態において、本発明はｓｉＮＡ分子内に修飾されたヌクレオチド少なくとも１つを導入することを含む、リボヌクレアーゼによる切断に対抗したｓｉＮＡ分子の安定性を上昇させる方法を特徴とし、ここで修飾されたヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡに存在する全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノピリミジンヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡにおける修飾されたヌクレオチドは少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノシチジンまたは２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノウリジンヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、ｓｉＮＡの修飾されたヌクレオチドは少なくとも１つの２’−フルオロシチジンおよび少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノウリジンヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、ｓｉＮＡに存在する全てのウリジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノウリジンヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡに存在する全てのシチジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノシチジンヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡに存在する全てのアデノシンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノアデノシンヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡに存在する全てのグアノシンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノグアノシンヌクレオチドである。ｓｉＮＡは更に、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間連結部、例えばホスホロチオエート連結部を含むことができる。１つの実施形態において、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチドはピリミジンヌクレオチドを有する位置等の、リボヌクレアーゼによる切断に感受性であるｓｉＮＡにおける特定の選択された位置に存在する。
【００８１】
１つの実施形態において、本発明は、センス領域およびアンチセンス領域を含む、ＥＮａＣ標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする、またはＥＮａＣ標的ＲＮＡの切断を指向する、２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでアンチセンス領域はＥＮａＣ標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域はアンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を含み、ここで、アンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチドは２’−デオキシ−プリンヌクレオチドを含む。代替の実施形態においては、アンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドを含む。上記した実施形態のいずれかにおいて、アンチセンス領域はアンチセンス領域の３’末端にホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含むことができる。或いは、上記した実施形態のいずれかにおいて、アンチセンス領域はアンチセンス領域の３’末端にグリセリル修飾を含むことができる。上記したｓｉＮＡ分子のいずれかの別の実施形態においては、アンチセンス鎖の非相補領域（例えばオーバーハング領域）に存在するいずれかのヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチドである。
【００８２】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、疾患または体質に特異的な対立遺伝子に関連する１塩基多形（ＳＮＰ）を含む配列等の、対象または生物における特定の疾患または体質に関連する対立遺伝子にユニークな配列を有する内因性転写物の一部分に相補的な配列を含む。即ち、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、疾患、状態または体質に関連する対立遺伝子に対抗して選択的ＲＮＡｉを媒介する場合に特異性を与えるために特定の対立遺伝子にユニークな配列に相補的な配列を含むことができる。
【００８３】
１つの実施形態において、本発明は、ＥＮａＣ標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする、またはＥＮａＣ標的ＲＮＡの切断を指向する、２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで、ｓｉＮＡ分子は２つの別個のオリゴヌクレオチドフラグメントから組み立てられ、ここで１つのフラグメントはセンス領域を含み、第２のフラグメントはｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。１つの実施形態において、２本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は約２１ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの約１９ヌクレオチドがｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントの相補ヌクレオチドと塩基対形成しており、ここでｓｉＮＡ分子の各フラグメントの少なくとも２つの３’末端ヌクレオチドはｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントのヌクレオチドと塩基対形成していない。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は２本鎖核酸分子であり、ここで各鎖は約１９ヌクレオチド長であり、ここでｓｉＮＡ分子の各フラグメントのヌクレオチドはｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントの相補ヌクレオチドと塩基対形成することにより少なくとも約１５（例えば１５、１６、１７，１８、または１９）の塩基対を形成し、ここでｓｉＮＡ分子の一方または両方の末端は平滑末端である。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの２つの３’末端ヌクレオチドの各々は２’−デオキシ−ピリミジンヌクレオチド、例えば２’−デオキシ−チミジンである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの２つの３’末端ヌクレオチドの各々は２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチド、例えば２’−Ｏ−メチルウリジン、シチジンまたはチミジンである。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの全てのヌクレオチドがｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントの相補ヌクレオチドと塩基対形成している。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子はセンス領域およびアンチセンス領域を有する約１９〜約２５塩基対の２本鎖核酸分子であり、ここでアンチセンス領域の約１９ヌクレオチドはＥＮａＣ標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分と塩基対形成している。別の実施形態においては、アンチセンス領域の約２１ヌクレオチドがＥＮａＣ標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分と塩基対形成している。上記の実施形態のいずれかにおいては、該アンチセンス領域を含むフラグメントの５’末端は場合によりホスフェート基を含むことができる。
【００８４】
１つの実施形態において、本発明はＥＮａＣ標的ＲＮＡ配列の発現を阻害する２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでｓｉＮＡ分子はいかなるリボヌクレオチドも含有せず、ここで２本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１５〜約３０ヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子は２１ヌクレオチド長である。非リボヌクレオチド含有ｓｉＮＡコンストラクトの例は、センス／アンチセンス化学のいずれかの組み合わせにおける表８において示す安定化化学の組み合わせ、例えばＳｔａｂ  ７／８、Ｓｔａｂ  ７／１１、Ｓｔａｂ  ８／８、Ｓｔａｂ  １８／８、Ｓｔａｂ  １８／１１、Ｓｔａｂ  １２／１３、Ｓｔａｂ  ７／１３、Ｓｔａｂ  １８／１３、Ｓｔａｂ  ７／１９、Ｓｔａｂ  ８／１９、Ｓｔａｂ  １８／１９、Ｓｔａｂ  ７／２０、Ｓｔａｂ  ８／２０、Ｓｔａｂ  １８／２０、Ｓｔａｂ  ７／３２、Ｓｔａｂ  ８／３２、またはＳｔａｂ  １８／３２（例えばＳｔａｂ  ７、８、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、または３２のセンスまたはアンチセンスの鎖またはいずれかのその組み合わせを有するいずれかのｓｉＮＡ）である。本明細書においては、数字によるＳｔａｂ化学は表８に示す化学の２’−フルオロおよび２’−ＯＣＦ３バージョンの両方を含む。例えば、「Ｓｔａｂ  ７／８」はＳｔａｂ  ７／８およびＳｔａｂ  ７Ｆ／８Ｆの両方等を指す。１つの実施形態において、本発明はＲＮＡ干渉を介してＥＮａＣ標的ＲＮＡの切断を指向する化学合成された２本鎖ＲＮＡ分子を特徴とし、ここで該ＲＮＡ分子の各鎖は約１５〜約３０ヌクレオチド長であり；ＲＮＡ分子の一方の鎖はＲＮＡ干渉を介してＥＮａＣ標的ＲＮＡの切断を指向するためのＲＮＡ分子に対するＥＮａＣ標的ＲＮＡとの十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含み；ここで、ＲＮＡ分子の少なくとも１つの鎖は場合により、本明細書に記載した化学修飾されたヌクレオチドの１つ以上、例えば限定しないが、デオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド等、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む。化学修飾されたヌクレオチドは同じかまたは異なることができる。
【００８５】
１つの実施形態において、本発明のＥＮａＣ標的ＲＮＡはＥＮａＣタンパク質をコードする配列を含む。
【００８６】
１つの実施形態において、本発明のＥＮａＣ標的ＲＮＡは非コーディングＲＮＡ配列（例えばｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等）を含み、例えばＭａｔｔｉｃｋ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２７−１５２８；Ｃｌａｖｅｒｉｅ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２９−１５３０；Ｓｅｔｈｕｐａｔｈｙ等、２００６，ＲＮＡ，１２，１９２−１９７；およびＣｚｅｃｈ，２００６  ＮＥＪＭ，３５４，１１：１１９４−１１９５を参照できる。
【００８７】
１つの実施形態において、本発明は本発明のｓｉＮＡ分子を含む医薬を特徴とする。
【００８８】
１つの実施形態において、本発明は本発明のｓｉＮＡ分子を含む活性成分を特徴とする。
【００８９】
１つの実施形態において、本発明はＥＮａＣ標的遺伝子の発現を阻害、ダウンレギュレート、または低減するための２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子の使用を特徴とし、ここでｓｉＮＡ分子は同じかまたは異なることができる化学修飾１つ以上を含み、２本鎖ｓｉＮＡの各鎖は独立して約１５〜約３０以上（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０以上）のヌクレオチド長である。１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は化学修飾１つ以上を含む２本鎖核酸分子であり、ここでｓｉＮＡ分子の２つのフラグメントの各々は独立して約１５〜約４０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０）ヌクレオチドを含み、ここで鎖の一方はＥＮａＣ標的コードＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含む。非限定的な例において、ｓｉＮＡ分子の２つのフラグメントの各々は約２１ヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は化学修飾１つ以上を含む２本鎖核酸分子であり、ここで各鎖は約２１ヌクレオチド長であり、ここでｓｉＮＡ分子の各フラグメントの約１９ヌクレオチドはｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントの相補ヌクレオチドと塩基対形成し、ここで、ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの少なくとも２つの３’末端ヌクレオチドはｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントのヌクレオチドと塩基対形成しない。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は化学修飾１つ以上を含む２本鎖核酸分子であり、ここで各鎖は約１９ヌクレオチド長であり、ここでｓｉＮＡ分子の各フラグメントのヌクレオチドはｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントの相補ヌクレオチドと塩基対形成することにより少なくとも約１５（例えば１５、１６、１７、１８、または１９）塩基対を形成し、ここでｓｉＮＡ分子の一方または両方の末端は平滑末端である。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの２つの３’末端ヌクレオチドの各々は２’−デオキシ−ピリミジンヌクレオチド、例えば２’−デオキシ−チミジンである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの２つの３’末端ヌクレオチドの各々は２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチド、例えば２’−Ｏ−メチルウリジン、シチジンまたはチミジンである。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの全てのヌクレオチドがｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントの相補ヌクレオチドと塩基対形成している。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子はセンス領域およびアンチセンス領域を有する、化学修飾１つ以上を含む約１９〜約２５塩基対の２本鎖核酸分子であり、ここでアンチセンス領域の約１９ヌクレオチドはＥＮａＣ標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分と塩基対形成している。別の実施形態においては、アンチセンス領域の約２１ヌクレオチドがＥＮａＣ標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分と塩基対形成している。上記の実施形態のいずれかにおいては、該アンチセンス領域を含むフラグメントの５’末端は場合によりホスフェート基を含むことができる。
【００９０】
１つの実施形態において、本発明はＥＮａＣ標的遺伝子の発現を阻害、ダウンレギュレート、または低減する２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子の使用を特徴とし、ここで２本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方はＥＮａＣ標的ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、他方の鎖はアンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖である。１つの実施形態において、各鎖は少なくとも２つ（例えば２、３、４、５、またはそれより多く）の化学修飾を有し、これは同じかまたは異なることができ、例えばヌクレオチド、糖、塩基、または骨格の修飾である。１つの実施形態において、２本鎖ｓｉＮＡ分子に存在するピリミジンヌクレオチドの大部分が糖修飾を含む。１つの実施形態において、２本鎖ｓｉＮＡ分子に存在するプリンヌクレオチドの大部分が糖修飾を含む。
【００９１】
１つの実施形態において、本発明はＥＮａＣ標的遺伝子の発現を阻害、ダウンレギュレート、または低減する２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで２本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方はＥＮａＣ標的ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、ここで他方の鎖はアンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖である。１つの実施形態において、各鎖は少なくとも２つ（例えば２、３、４、５、またはそれより多く）の化学修飾を有し、これは同じかまたは異なることができ、例えばヌクレオチド、糖、塩基、または骨格の修飾である。１つの実施形態において、２本鎖ｓｉＮＡ分子に存在するピリミジンヌクレオチドの大部分が糖修飾を含む。１つの実施形態において、２本鎖ｓｉＮＡ分子に存在するプリンヌクレオチドの大部分が糖修飾を含む。
【００９２】
１つの実施形態において、本発明はＥＮａＣ標的遺伝子の発現を阻害、ダウンレギュレート、または低減する２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで２本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方はあるタンパク質をコードするＥＮａＣ標的ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、他方の鎖はアンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり、ここで２本鎖ｓｉＮＡ分子に存在するピリミジンヌクレオチドの大部分は糖修飾を含む。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１５〜約３０以上（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０以上）のヌクレオチドを含み、ここで各鎖は他方の鎖のヌクレオチドに相補的である少なくとも約１５ヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子は２つのオリゴヌクレオチドフラグメントから組み立てられ、ここで一方のフラグメントはｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、第２のフラグメントはｓｉＮＡ分子のセンス領域のヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態において、センス鎖はリンカー分子、例えばポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーを介してアンチセンス鎖に連結される。その他の実施形態において、センス鎖に存在するピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域に存在するプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。別の実施形態においては、センス鎖に存在するピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域に存在するプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。また別の実施形態において、アンチセンス鎖に存在するピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。別の実施形態においては、アンチセンス鎖は１つ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドおよび１つ以上の２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、アンチセンス鎖に存在するピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。その他の実施形態において、センス鎖は３’末端および５’末端を含み、ここで末端キャップ部分（例えば反転デオキシ無塩基部分、または反転デオキシヌクレオチド部分、例えば反転チミジン）はセンス鎖の５’末端、３’末端、または５’および３’末端の両方に存在する。別の実施形態においては、アンチセンス鎖はアンチセンス鎖の３’末端においてホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含む。別の実施形態においては、アンチセンス鎖は３’末端においてグリセリル修飾を含む。別の実施形態においては、アンチセンス鎖の５’末端は場合によりホスフェート基を含む。
【００９３】
２本鎖ｓｉＮＡ分子に存在するピリミジンヌクレオチドの大部分が糖修飾を含むＥＮａＣ標的遺伝子の発現を阻害する２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子の上記実施形態のいずれかにおいて、ｓｉＮＡ分子の２つの鎖の各々は、約１５〜約３０以上（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０以上）のヌクレオチドを含むことができる。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子の各鎖の約１５〜約３０以上（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０以上）のヌクレオチドはｓｉＮＡ分子の他方の鎖の相補ヌクレオチドと塩基対形成する。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の各鎖の約１５〜約３０以上（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０以上）のヌクレオチドはｓｉＮＡ分子の他方の鎖の相補ヌクレオチドと塩基対形成し、ここでｓｉＮＡ分子の各鎖の少なくとも２つの３’末端ヌクレオチドはｓｉＮＡ分子の他方の鎖のヌクレオチドと塩基対形成しない。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの２つの３’末端ヌクレオチドの各々は２’−デオキシピリミジン、例えば２’−デオキシチミジンである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子の各鎖はｓｉＮＡ分子の他方の鎖の相補ヌクレオチドと塩基対形成する。１つの実施形態において、アンチセンス鎖の約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）のヌクレオチドはＥＮａＣ標的ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分と塩基対形成する。１つの実施形態において、アンチセンス鎖の約１８〜約２５（例えば約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）のヌクレオチドはＥＮａＣ標的ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分と塩基対形成する。
【００９４】
１つの実施形態において、本発明はＥＮａＣ標的遺伝子の発現を阻害する２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで２本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の１つはＥＮａＣ標的ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、他方の鎖はアンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むセンス鎖である。１つの実施形態において、各鎖は少なくとも２つ（例えば２、３、４、５、またはそれより多く）の異なる化学修飾、例えばヌクレオチド糖、塩基、または骨格の修飾を有する。１つの実施形態において、２本鎖ｓｉＮＡ分子に存在するピリミジンヌクレオチドの大部分は糖修飾を含む。１つの実施形態において、２本鎖ｓｉＮＡ分子に存在するプリンヌクレオチドの大部分は糖修飾を含む。１つの実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端は場合によりホスフェート基を含む。
【００９５】
１つの実施形態において、本発明はＥＮａＣ標的遺伝子の発現を阻害する２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで２本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の１つはＥＮａＣ標的ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、他方の鎖はアンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり、ここで２本鎖ｓｉＮＡ分子に存在するピリミジンヌクレオチドの大部分は糖修飾を含み、ここでアンチセンス鎖のヌクレオチド配列またはその一部分はＥＮａＣ標的ＲＮＡの未翻訳領域のヌクレオチド配列またはその一部分に相補的である。
【００９６】
１つの実施形態において、本発明はＥＮａＣ標的遺伝子の発現を阻害する２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで２本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方はＥＮａＣ標的ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、ここで他方の鎖はアンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり、ここで２本鎖ｓｉＮＡ分子に存在するピリミジンヌクレオチドの大部分は糖修飾を含み、ここでアンチセンス鎖のヌクレオチド配列はＥＮａＣ標的ＲＮＡに存在するＥＮａＣ標的ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分に相補的である。
【００９７】
１つの実施形態において、本発明は製薬上許容し得る担体または希釈剤中に本発明のｓｉＮＡ分子を含む組成物を特徴とする。別の実施形態においては、本発明は製薬上許容し得る担体または希釈剤中の２つ以上の異なる本発明のｓｉＮＡ分子（例えばＥＮａＣ標的ＲＮＡの異なる領域をターゲティングするｓｉＮＡ分子またはＥＮａＣ経路ＲＮＡをターゲティングするｓｉＮＡ分子）を特徴とする。
【００９８】
非限定的な例においては、核酸分子に化学修飾されたヌクレオチドを導入することは、外来として送達されるネイティブＲＮＡ分子に固有のインビボの安定性および生体利用性の潜在的限界を克服する上での強力な手段を提供する。例えば、化学修飾された核酸分子の使用は、化学修飾核酸分子は血清中でより長い半減期を有する傾向があることから、所定の治療効果のための特定の核酸分子の用量を低減できる。更に、特定の化学修飾は、特定の細胞または組織をターゲティングする、および／または、核酸分子の細胞取り込みを向上させるＥＮａＣによる核酸分子の生体利用性を向上させることができる。従って、化学修飾核酸分子の活性がネイティブの核酸分子と比較して、例えば全ＲＮＡ核酸分子と比較した場合に低減されても、修飾された核酸分子の全体的活性は、向上した分子の安定性および／または送達のために、ネイティブ分子のものよりも高くなり得る。ネイティブの未修飾ｓｉＮＡとは異なり、化学修飾されたｓｉＮＡはまた、ヒトにおけるインターフェロンの活性または免疫刺激を活性化する能力を最小限にできる。従ってこれらの特質は研究および施療用途の両方における使用を含む種々のインビボおよびインビトロの状況において、ネイティブのｓｉＲＮＡまたは最小限に修飾されたｓｉＲＮＡの能力を向上させＲＮＡｉを媒介する。本出願人は本明細書において、相当する未修飾または最小限修飾のｓｉＲＮＡ分子と比較して向上したＲＮＡｉ活性を有する化学修飾されたｓｉＮＡ分子を記載している。本明細書に開示した化学修飾ｓｉＮＡモチーフは未修飾または最小限修飾の活性ｓｉＲＮＡと実質的に同様のＲＮＡｉ活性を維持する能力を提供しつつ（例えばＥｌｂａｓｈｉｒ等、２００１，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０：６８７７−６８８８参照）、同時に施療用途における使用に適するヌクレアーゼ耐性および薬理学的特質を提供する。
【００９９】
本明細書に記載したｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれかにおいて、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は該アンチセンス領域の３’末端にホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含むことができる。本明細書に記載したｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれかにおいて、アンチセンス領域は該アンチセンス領域の５’末端にホスホロチオエートヌクレオチド間連結部約１〜約５つを含むことができる。本明細書に記載したｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれかにおいて、本発明のｓｉＮＡ分子の３’末端ヌクレオチドオーバーハングは核酸糖、塩基、または骨格において化学修飾されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。本明細書に記載したｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれかにおいて、３’末端ヌクレオチドオーバーハングはユニバーサル塩基リボヌクレオチド１つ以上を含むことができる。本明細書に記載したｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれかにおいて、３’末端ヌクレオチドオーバーハングは非環式ヌクレオチド１つ以上を含むことができる。
【０１００】
本発明の１つの実施形態は核酸分子の発現を可能にする様式において本発明のｓｉＮＡ分子少なくとも１つをコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。本発明の別の実施形態は、そのような発現ベクターを含む哺乳類細胞を提供する。哺乳類細胞はヒト細胞であることができる。発現ベクターのｓｉＮＡ分子はセンス領域およびアンチセンス領域を含むことができる。アンチセンス領域はＥＮａＣ標的をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ配列に相補的である配列を含むことができ、センス領域はアンチセンス領域に相補的な配列を含むことができる。ｓｉＮＡ分子は相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を有する２つの区別可能な鎖を含むことができる。ｓｉＮＡ分子は相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を有する１本鎖を含むことができる。
【０１０１】
１つの実施形態において、本発明は細胞または再建インビトロ系の内部においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することができる化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで化学修飾は下記式Ｉ：
【化１】
2012509688.tif 000003
［式中、各Ｒ１およびＲ２は独立していずれかのヌクレオチド、非ヌクレオチド、またはポリヌクレオチドであり、これは天然に存在するか、または化学修飾されていることができ、これはｓｉＮＡ分子の構造に含まれるか、またはｓｉＮＡ分子への結合点として作用することができ、各ＸおよびＹは独立してＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、または置換されたアルキルであり、各ＺおよびＷは独立してＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換されたアルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、アルカリル、アラルキル、またはアセチルであり、式中、Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺは場合により全てＯではない］を有する骨格修飾ヌクレオチド間連結を含む１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、本発明の骨格修飾はホスホノアセテートおよび／またはチオホスホノアセテートのヌクレオチド間連結部を含む（例えばＳｈｅｅｈａｎ等、２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１，４１０９−４１１８参照）。
【０１０２】
例えばいずれかのＺ、Ｗ、Ｘおよび／またはＹが独立してイオウ原子を含む式Ｉを有する化学修飾されたヌクレオチド間連結部はｓｉＮＡデュプレックスの一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖中、例えばセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖中に存在できる。本発明のｓｉＮＡ分子はセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方に式Ｉを有する１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の化学修飾されたヌクレオチド間連結部を含むことができる。例えば、本発明の例示されるｓｉＮＡ分子はセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の５’末端に式Ｉを有する約１〜約５以上（例えば約１、２、３、４、５以上）の化学修飾されたヌクレオチド間連結部を含むことができる。別の非限定的な例においては、本発明の例示されるｓｉＮＡ分子はセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖において式Ｉを有する化学修飾されたヌクレオチド間連結部を有する１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のピリミジンヌクレオチドを含むことができる。更に別の非限定的な例においては、本発明の例示されるｓｉＮＡ分子はセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖において式Ｉを有する化学修飾されたヌクレオチド間連結部を有する１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のプリンヌクレオチドを含むことができる。別の実施形態においては、式Ｉのヌクレオチド間連結部を有する本発明のｓｉＮＡ分子はまた、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかを有する化学修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含む。
【０１０３】
１つの実施形態において、本発明は細胞または再建インビトロ系の内部においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することができる化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで化学修飾は下記式ＩＩ：
【化２】
2012509688.tif 000004
［式中、各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒｌ０、Ｒ１１およびＲ１２は独立してＨ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリルまたはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、或いは式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよび／またはＶＩＩのいずれかを有する基であり、これらのいずれもがｓｉＮＡ分子の構造中に含まれるかｓｉＮＡ分子への結合点として作用することができ；Ｒ９はＯ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＯＨＣまたはＣＦ２であり、Ｂはヌクレオシド塩基、例えばアデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミン、２−アミノアデノシン、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、または標的ＲＮＡまたは非ヌクレオシド塩基に相補的または非相補的であることができるいずれかの他の天然に存在しない塩基、例えばフェニル、ナフチル、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ネブラリン、ピリドン、ピリジノン、または標的ＲＮＡに相補的または非相補的であることができるいずれかの他の天然に存在しないユニバーサル塩基である］を有する１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、Ｒ３および／またはＲ７はコンジュゲート部分およびリンカー（例えば本明細書に記載されるかまたは別様に当分野で知られているヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー）を含む。コンジュゲート部分の非限定的な例は細胞受容体に対するリガンド、例えば天然に存在するタンパク質リガンドから誘導されたペプチド；タンパク質局在化配列、例えば細胞ＺＩＰコード配列；抗体；核酸アプタマー；ビタミンおよび他のコファクター、例えばフォレートおよびＮ−アセチルガラクトサミン；重合体、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；リン脂質；コレステロール；ステロイド；およびポリアミン、例えばＰＥＩ、スペルミンまたはスペルミジンを含む。１つの実施形態において、式ＩＩを有する本発明のヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。１つの実施形態において、式ＩＩを有する本発明のヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである。１つの実施形態において、式ＩＩを有する本発明のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
【０１０４】
式ＩＩの化学修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドはｓｉＮＡデュプレックスの一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖に、例えばセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖に存在できる。本発明のｓｉＮＡ分子はセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方において式ＩＩの化学修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチド１つ以上を含むことができる。例えば、本発明の例示されるｓｉＮＡ分子はセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の５’末端において式ＩＩの化学修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチド約１〜約５以上（例えば約１、２、３、４、５、またはそれより多く）を含むことができる。別の非限定的な例においては、本発明の例示されるｓｉＮＡ分子はセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の３’末端において式ＩＩの化学修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチド約１〜約５以上（例えば約１、２、３、４、５、またはそれより多く）を含むことができる。
【０１０５】
１つの実施形態において、本発明は細胞または再建インビトロ系の内部においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することができる化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで化学修飾は下記式ＩＩＩ：
【化３】
2012509688.tif 000005
［式中、各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は独立してＨ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリルまたはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、或いはいずれもがｓｉＮＡ分子の構造中に含まれるかｓｉＮＡ分子への結合点として作用することができる式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよび／またはＶＩＩのいずれかを有する基であり；Ｒ９はＯ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＯＨＣまたはＣＦ２であり、Ｂはヌクレオシド塩基、例えばアデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミン、２−アミノアデノシン、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、または標的ＲＮＡまたは非ヌクレオシド塩基に相補的または非相補的であるために使用することができるいずれかの他の天然に存在しない塩基、例えばフェニル、ナフチル、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ネブラリン、ピリドン、ピリジノン、または標的ＲＮＡに相補的または非相補的であることができるいずれかの他の天然に存在しないユニバーサル塩基である］を有する１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、Ｒ３および／またはＲ７はコンジュゲート部分およびリンカー（例えば本明細書に記載するヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーまたは別様に当分野で知られているもの）を含む。コンジュゲート部分の非限定的な例は細胞受容体に対するリガンド、例えば天然に存在するタンパク質リガンドから誘導されたペプチド；タンパク質局在化配列、例えば細胞ＺＩＰコード配列；抗体；核酸アプタマー；ビタミンおよび他のコファクター、例えばフォレートおよびＮ−アセチルガラクトサミン；重合体、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；リン脂質；コレステロール；ステロイド；およびポリアミン、例えばＰＥＩ、スペルミンまたはスペルミジンを含む。
【０１０６】
式ＩＩＩの化学修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドはｓｉＮＡデュプレックスの一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖に、例えばセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖に存在できる。本発明のｓｉＮＡ分子はセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方において式ＩＩＩの化学修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチド１つ以上を含むことができる。例えば、本発明の例示されるｓｉＮＡ分子はセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の５’末端において式ＩＩＩの化学修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチド約１〜約５以上（例えば約１、２、３、４、５以上）を含むことができる。別の非限定的な例においては、本発明の例示されるｓｉＮＡ分子はセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の３’末端において式ＩＩＩの化学修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチド約１〜約５以上（例えば約１、２、３、４、５以上）を含むことができる。
【０１０７】
別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は式ＩＩまたはＩＩＩを有するヌクレオチドを含み、ここで式ＩＩまたはＩＩＩを有するヌクレオチドは反転配置にある。例えば、式ＩＩまたはＩＩＩを有するヌクレオチドは３’−３’、３’−２’、２’−３’、または５’−５’配置において、例えば一方または両方のｓｉＮＡ鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方において、ｓｉＮＡコンストラクトに連結されている。
【０１０８】
１つの実施形態において、本発明は細胞または再建インビトロ系の内部においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することができる化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで化学修飾は下記式ＩＶ：
【化４】
2012509688.tif 000006
［式中、各ＸおよびＹは独立してＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル、またはアルキルハロであり；ここで各ＺおよびＷは独立してＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、アルカリル、アラルキル、アルキルハロ、またはアセチルであり；ここでＷ、Ｘ、ＹおよびＺは場合により全てＯではなく、ＹはｓｉＮＡ分子への連結点として作用する］を有する５’末端ホスフェート基を含む。
【０１０９】
１つの実施形態において、本発明はＥＮａＣ標的相補鎖、例えばＥＮａＣ標的ＲＮＡに相補的な鎖の上に式ＩＶを有する５’末端ホスフェート基を有するｓｉＮＡ分子を特徴とし、ここでｓｉＮＡ分子は全ＲＮＡ  ｓｉＮＡ分子を含む。別の実施形態においては、本発明はＰＤ非移植角膜および同系（Ｌｅｗｉｓ−Ｌｅｗｉｓ）Ｅ４標的相補鎖の上に式ＩＶを有する５’末端ホスフェート基を有するｓｉＮＡ分子を特徴とし、ここでｓｉＮＡ分子はまた、一方または両方の鎖の３’末端にデオキシリボヌクレオチド約１つ〜約４つ（例えば約１、２、３または４つ）を有するヌクレオチド３’末端ヌクレオチドオーバーハング約１つ〜約３つ（例えば約１、２、または３つ）を含む。別の実施形態においては、式ＩＶを有する５’末端ホスフェート基は、本発明のｓｉＮＡ分子、例えば式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかを有する化学修飾を有するｓｉＮＡ分子のＥＮａＣ標的相補鎖上に存在する。
【０１１０】
１つの実施形態において、本発明は細胞または再建インビトロ系の内部においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することができる化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで化学修飾はホスホロチオエートヌクレオチド間連結部１つ以上を含む。例えば、非限定的な例において、本発明はｓｉＮＡ鎖１つにおいて約１、２、３、４、５、６、７、８以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を有する化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。更に別の実施形態において、本発明は両方のｓｉＮＡ鎖において約１、２、３、４、５、６、７、８以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を個々に有する化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部はｓｉＮＡデュプレックスの一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖に、例えばセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖に存在できる。本発明のｓｉＮＡ分子はセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方においてホスホロチオエートヌクレオチド間連結部１つ以上を含むことができる。例えば、本発明の例示されるｓｉＮＡ分子はセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の５’末端に連続したホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を約１〜約５以上（例えば約１、２、３、４、５以上）含むことができる。別の非限定的な例においては、本発明の例示されるｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖において１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のピリミジンホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含むことができる。更に別の非限定的な例において、本発明の例示されるｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖において１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のプリンホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含むことができる。
【０１１１】
２本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、各鎖が化学修飾の異なるパターンを含むように化学修飾１つ以上を有することができる。修飾の異なるパターンを生じさせると考えられる修飾のスキームの幾つかの非限定的な例を本明細書に記載する。
【０１１２】
１つの実施形態において、本発明はｓｉＮＡ分子を特徴とし、この場合、センス鎖は１つ以上、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、および／または、１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、および／または、約１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、および場合により、センス鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方における末端キャップ分子を含み；ここで、アンチセンス鎖は約１〜約１０以上、特に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、および／または、１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、および／または、１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、および場合により、アンチセンス鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方における末端キャップ分子を含む。別の実施形態においては、センスおよび／またはアンチセンスのｓｉＮＡ鎖の１つ以上、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオおよび／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾されており、１つ以上、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、および／または、３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方における末端キャップ分子が同じかまたは異なる鎖に存在するか、存在していない。
【０１１３】
別の実施形態においては、本発明はｓｉＮＡ分子を特徴とし、この場合、センス鎖は約１〜約５、特に約１、２、３、４、または５のホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、および／または、１つ以上（例えば約１、２、３、４、５以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、および／または、１つ以上（例えば約１、２、３、４、５以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、および場合により、センス鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方における末端キャップ分子を含み；ここで、アンチセンス鎖は約１〜約５以上、特に約１、２、３、４、５以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、および／または、１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、および／または、１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、および場合により、アンチセンス鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方における末端キャップ分子を含む。別の実施形態においては、センスおよび／またはアンチセンスのｓｉＮＡ鎖の１つ以上、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオおよび／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾されており、ここで約１〜約５以上、例えば約１、２、３、４、５以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、および／または、３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方における末端キャップ分子が同じかまたは異なる鎖に存在するか、存在していない。
【０１１４】
１つの実施形態において、本発明はｓｉＮＡ分子を特徴とし、この場合、アンチセンス鎖は１つ以上、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、および／または、約１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、および／または、１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、および場合により、センス鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方における末端キャップ分子を含み；ここで、アンチセンス鎖は約１〜約１０以上、特に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、および／または、１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、および／または、１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、および場合により、アンチセンス鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方における末端キャップ分子を含む。別の実施形態においては、センスおよび／またはアンチセンスのｓｉＮＡ鎖の１つ以上、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオおよび／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾されており、１つ以上、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、および／または、３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方における末端キャップ分子が同じかまたは異なる鎖に存在するか、存在していない。
【０１１５】
別の実施形態においては、本発明はｓｉＮＡ分子を特徴とし、この場合、アンチセンス鎖は約１〜約５以上、特に約１、２、３、４、または５以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、および／または、１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシ、４’−チオ、および／または、１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、および場合により、センス鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方における末端キャップ分子を含み；ここで、アンチセンス鎖は約１〜約５以上、特に約１、２、３、４、５以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、および／または、１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシ、４’−チオ、および／または、１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、および場合により、アンチセンス鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方における末端キャップ分子を含む。別の実施形態においては、センスおよび／またはアンチセンスのｓｉＮＡ鎖の１つ以上、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシ、４’−チオおよび／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾されており、ここで約１〜約５、例えば約１、２、３、４、５以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、および／または、３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方における末端キャップ分子が同じかまたは異なる鎖に存在するか、存在していない。
【０１１６】
１つの実施形態において、本発明はｓｉＮＡ分子の各鎖において約１〜約５以上（特に約１、２、３、４、５以上）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を有する化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【０１１７】
別の実施形態においては、本発明は２’−５’ヌクレオチド間連結部を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。２’−５’ヌクレオチド間連結部は一方または両方のｓｉＮＡ配列鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方に存在できる。更に、２’−５’ヌクレオチド間連結部は一方または両方のｓｉＮＡ配列鎖の内部の種々の別の位置に存在でき、例えば、ｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖におけるピリミジンヌクレオチドの各ヌクレオチド間連結部を含む約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上が２’−５’ヌクレオチド間連結部を含むことができ、または、ｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖におけるプリンヌクレオチドの各ヌクレオチド間連結部を含む約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上が２’−５’ヌクレオチド間連結部を含むことができる。
【０１１８】
別の実施形態においては、本発明の化学修飾されたｓｉＮＡ分子は２つの鎖を有するデュプレックスを含み、その一方または両方が化学修飾されていることができ、ここで各鎖は独立して約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチド長であり、ここでデュプレックスは約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）の塩基対を有し、ここで化学修飾は式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかを有する構造を含む。例えば、本発明の例示される化学修飾されたｓｉＮＡ分子は２つの鎖を有するデュプレックスを含み、その一方または両方は式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有する化学修飾で化学修飾されていることができ、ここで、各鎖は各々が２ヌクレオチド３’末端ヌクレオチドオーバーハングを有する約２１ヌクレオチドからなり、ここで、デュプレックスは約１９塩基対を有する。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は１本鎖のヘアピン構造を含み、ここでｓｉＮＡは約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）塩基対を有する約３６〜約７０（例えば３６、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０）ヌクレオチド長であり、ここでｓｉＮＡは式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有する構造を含む化学修飾を含める。例えば、本発明の例示される化学修飾されたｓｉＮＡ分子は式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有する化学修飾で化学修飾された約４２〜約５０（例えば約４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０）ヌクレオチドを有する線状オリゴヌクレオチドを含み、ここで、線状オリゴヌクレオチドは約１９〜約２１（例えば１９、２０、または２１）塩基対および２ヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドオーバーハングを有するヘアピン構造を形成する。別の実施形態においては、本発明の線状ヘアピンｓｉＮＡ分子はステムループモチーフを含有し、ここでｓｉＮＡ分子のループ部分は生体分解性である。例えば、本発明の線状ヘアピンｓｉＮＡ分子は、インビボのｓｉＮＡ分子のループ部分の分解により３’末端オーバーハング、例えば約２ヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチドオーバーハングを有する２本鎖ｓｉＮＡ分子が形成できるように設計される。
【０１１９】
別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子はヘアピン構造を含み、ここでｓｉＮＡは約３〜約２５（例えば約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）塩基対を有する約２５〜約５０（例えば約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０）ヌクレオチド長であり、ここでｓｉＮＡは式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有する構造を含む化学修飾１つ以上を含める。例えば、本発明の例示される化学修飾されたｓｉＮＡ分子は、式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有する化学修飾１つ以上により化学修飾されている約２５〜約３５（例えば約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５）ヌクレオチドを有する線状オリゴヌクレオチドを含み、ここで線状オリゴヌクレオチドは約３〜約２５（例えば約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）塩基対および本明細書に記載する通り化学修飾されていることができる５’末端ホスフェート基（例えば式ＩＶを有する５’末端ホスフェート基）を有するヘアピン構造を形成する。別の実施形態においては、本発明の線状ヘアピンｓｉＮＡ分子はステムループモチーフを含有し、ここでｓｉＮＡ分子のループ部分は生体分解性である。１つの実施形態において、本発明の線状ヘアピンｓｉＮＡ分子は非ヌクレオチドリンカーを含むループ部分を含む。
【０１２０】
別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は非対称ヘアピン構造を含み、ここでｓｉＮＡは約３〜約２５（例えば約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）塩基対を有する約２５〜約５０（例えば約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０）ヌクレオチド長であり、ここでｓｉＮＡは式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有する構造を含む化学修飾１つ以上を含める。例えば、本発明の例示される化学修飾されたｓｉＮＡ分子は、式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有する化学修飾１つ以上により化学修飾されている約２５〜約３５（例えば約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５）ヌクレオチドを有する線状オリゴヌクレオチドを含み、ここで線状オリゴヌクレオチドは約３〜約２５（例えば約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）塩基対および本明細書に記載する通り化学修飾されていることができる５’末端ホスフェート基（例えば式ＩＶを有する５’末端ホスフェート基）を有する非対称ヘアピン構造を形成する。１つの実施形態において、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子はステムループモチーフを含有し、ここでｓｉＮＡ分子のループ部分は生体分解性である。別の実施形態においては、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は非ヌクレオチドリンカーを含むループ部分を含む。
【０１２１】
別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子はセンスおよびアンチセンス領域を含む別個のポリヌクレオチド鎖を有する非対称２本鎖構造を含み、ここでアンチセンス領域は約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチド長であり、ここでセンス領域は約３〜約１５（例えば約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５）ヌクレオチド長であり、ここでセンス領域およびアンチセンス領域は少なくとも３つの相補ヌクレオチドを有し、ここでｓｉＮＡは式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有する構造を含む化学修飾１つ以上を含める。例えば本発明の例示される化学修飾されたｓｉＮＡ分子は、センスおよびアンチセンス領域を含む別個のポリヌクレオチド鎖を有する非対称２本鎖構造を含み、ここでアンチセンス領域は約１８〜約２３（例えば約１８、１９、２０、２１、２２、または２３）ヌクレオチド長であり、ここでセンス領域は約３〜約１５（例えば約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５）ヌクレオチド長であり、ここでセンス領域アンチセンス領域は少なくとも３つの相補ヌクレオチドを有し、ここでｓｉＮＡは式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有する構造を含む化学修飾１つ以上を含める。別の実施形態においては、非対称２本鎖ｓｉＮＡ分子はまた本明細書に記載する通り化学修飾されていることができる５’末端ホスフェート基（例えば式ＩＶを有する５’末端ホスフェート基）を有することができる。
【０１２２】
別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は環状核酸分子を含み、ここでｓｉＮＡは約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）塩基対を有する約３８〜約７０（例えば約３８、４０、４５、５０、５５、６０、６５または７０）ヌクレオチド長であり、ここでｓｉＮＡは式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有する構造を含む化学修飾を含める。例えば、本発明の例示される化学修飾ｓｉＮＡ分子は、式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有する化学修飾で化学修飾されている約４２〜約５０（例えば約４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０）ヌクレオチドを有する環状オリゴヌクレオチドを含み、ここで環状オリゴヌクレオチドは約１９塩基対および２ループを有するダンベル型構造を形成する。
【０１２３】
別の実施形態においては、本発明の環状ｓｉＮＡ分子は２つのループモチーフを含有し、ここでｓｉＮＡ分子の一方または両方のループ部分は生体分解性である。例えば、本発明の環状ｓｉＮＡ分子はインビボのｓｉＮＡ分子のループ部分の分解により３’末端オーバーハング、例えば約２ヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチドオーバーハングを有する２本鎖ｓｉＮＡ分子が形成できるように設計される。
【０１２４】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は少なくとも１つ（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の無塩基部分、例えば下記式Ｖ：
【化５】
2012509688.tif 000007
［式中、各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は独立してＨ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリルまたはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、或いは式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよび／またはＶＩＩのいずれかを有する基であり、これらのいずれもがｓｉＮＡ分子の構造中に含まれるかｓｉＮＡ分子への結合点として作用することができ；Ｒ９はＯ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦまたはＣＦ２である］を有する化合物を含む。１つの実施形態において、Ｒ３および／またはＲ７はコンジュゲート部分およびリンカー（例えば本明細書に記載されるかまたは別様に当分野で知られているヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー）を含む。コンジュゲート部分の非限定的な例は細胞受容体に対するリガンド、例えば天然に存在するタンパク質リガンドから誘導されたペプチド；タンパク質局在化配列、例えば細胞ＺＩＰコード配列；抗体；核酸アプタマー；ビタミンおよび他のコファクター、例えばフォレートおよびＮ−アセチルガラクトサミン；重合体、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；リン脂質；コレステロール；ステロイド；およびポリアミン、例えばＰＥＩ、スペルミンまたはスペルミジンを含む。
【０１２５】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は少なくとも１つ（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の反転無塩基部分、例えば下記式ＶＩ：
【化６】
2012509688.tif 000008
［式中、各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は独立してＨ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリルまたはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、或いは式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよび／またはＶＩＩのいずれかを有する基であり、これらのいずれもがｓｉＮＡ分子の構造中に含まれるかｓｉＮＡ分子への結合点として作用することができ；Ｒ９はＯ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦまたはＣＦ２であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ８またはＲ１３は本発明のｓｉＮＡ分子への結合点として作用する］を有する化合物を含む。１つの実施形態において、Ｒ３および／またはＲ７はコンジュゲート部分およびリンカー（例えば本明細書に記載されるかまたは別様に当分野で知られているヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー）を含む。コンジュゲート部分の非限定的な例は細胞受容体に対するリガンド、例えば天然に存在するタンパク質リガンドから誘導されたペプチド；タンパク質局在化配列、例えば細胞ＺＩＰコード配列；抗体；核酸アプタマー；ビタミンおよび他のコファクター、例えばフォレートおよびＮ−アセチルガラクトサミン；重合体、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；リン脂質；コレステロール；ステロイド；およびポリアミン、例えばＰＥＩ、スペルミンまたはスペルミジンを含む。
【０１２６】
別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は少なくとも１つ（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の置換ポリアルキル部分、例えば下記式ＶＩＩ：
【化７】
2012509688.tif 000009
［式中、各ｎは独立して１〜１２の整数であり、各Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立してＨ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリルまたはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、或いは式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよび／またはＶＩＩのいずれかを有する基であり、これらのいずれもがｓｉＮＡ分子の構造中に含まれるかｓｉＮＡ分子への結合点として作用することができる］を有する化合物を含む。１つの実施形態において、Ｒ３および／またはＲ１はコンジュゲート部分およびリンカー（例えば本明細書に記載されるかまたは別様に当分野で知られているヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー）を含む。コンジュゲート部分の非限定的な例は細胞受容体に対するリガンド、例えば天然に存在するタンパク質リガンドから誘導されたペプチド；タンパク質局在化配列、例えば細胞ＺＩＰコード配列；抗体；核酸アプタマー；ビタミンおよび他のコファクター、例えばフォレートおよびＮ−アセチルガラクトサミン；重合体、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；リン脂質；コレステロール；ステロイド；およびポリアミン、例えばＰＥＩ、スペルミンまたはスペルミジンを含む。
【０１２７】
「ＺＩＰコード」配列とは、細胞のトポジェニックシグナリング媒介輸送に関与するいずれかのペプチドまたはタンパク質の配列を意味する（例えばＲａｙ等、２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０６（１５０１）：１５０５）参照）。
【０１２８】
２本鎖ｓｉＮＡ分子内部の各ヌクレオチドは独立して式Ｉ〜ＶＩＩＩのいずれかの構造を含む化学修飾を有することができる。即ち、１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子の１つ以上のヌクレオチド位置は、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかの構造を有する化学修飾または本明細書に記載するいずれかの他の修飾を含む。１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子の各ヌクレオチド位置は、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかの構造を有する化学修飾または本明細書に記載するいずれかの他の修飾を含む。
【０１２９】
１つの実施形態において、本発明の２本鎖ｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖の１つ以上のヌクレオチド位置は式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかの構造を有する化学修飾または本明細書に記載するいずれかの他の修飾を含む。１つの実施形態において、本発明の２本鎖ｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖の各ヌクレオチド位置は式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかの構造を有する化学修飾または本明細書に記載するいずれかの他の修飾を含む。
【０１３０】
別の実施形態においては、本発明は式ＶＩＩを有する化合物を特徴とし、ここでＲ１およびＲ２はヒドロキシル（ＯＨ）基であり、ｎ＝１であり、Ｒ３はＯを含み、本発明の２本鎖ｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方への、または、本発明の１本鎖ｓｉＮＡ分子への、結合点である。この修飾は本明細書においては「グリセリル」と称する（例えば図７の修飾６）。
【０１３１】
別の実施形態においては、本発明の化学修飾されたヌクレオシドまたは非ヌクレオシド（例えば式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩのいずれかを有する部分）は本発明のｓｉＮＡ分子の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方に存在する。例えば、化学修飾されたヌクレオシドまたは非ヌクレオシド（例えば式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩを有する部分）はｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖、センス鎖、またはアンチセンスとセンス鎖の両方の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方に存在できる。１つの実施形態において、化学修飾されたヌクレオシドまたは非ヌクレオシド（例えば式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩを有する部分）は本発明の２本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端および３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端に存在する。１つの実施形態において、化学修飾されたヌクレオシドまたは非ヌクレオシド（例えば式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩを有する部分）は本発明の２本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端および３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端の末端位置に存在する。１つの実施形態において、化学修飾されたヌクレオシドまたは非ヌクレオシド（例えば式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩを有する部分）は本発明の２本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端および３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端の２つの末端位置に存在する。１つの実施形態において、化学修飾されたヌクレオシドまたは非ヌクレオシド（例えば式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩを有する部分）は本発明の２本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端および３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端の最後から２番目に存在する。更に、式ＶＩＩを有する部分は本明細書に記載するヘアピンｓｉＮＡ分子の３’末端または５’末端に存在できる。
【０１３２】
別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は式ＶまたはＶＩを有する無塩基残基を含み、ここで式ＶＩまたはＶＩを有する無塩基残基は３’−３’、３’−２’、２’−３’、または５’−５’配置において、例えば一方または両方のｓｉＮＡ鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方において、ｓｉＮＡコンストラクトに連結されている。
【０１３３】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は例えばｓｉＮＡ分子の５’末端、３’末端、５’と３’末端の両方、またはそのいずれかの組み合わせにおいて、１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。
【０１３４】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は例えばｓｉＮＡ分子の５’末端、３’末端、５’と３’末端の両方、またはそのいずれかの組み合わせにおいて、１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の４’−チオヌクレオチドを含む。
【０１３５】
別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は例えばｓｉＮＡ分子の５’末端、３’末端、５’と３’末端の両方、またはそのいずれかの組み合わせにおいて、１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の非環式ヌクレオチドを含む。
【０１３６】
１つの実施形態において、本発明の化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子は１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上）の２’−Ｏ−アルキル（例えば２’−Ｏ−メチル）、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ、ＦＡＮＡ、または無塩基化学修飾またはそのいずれかの組み合わせを有するセンス鎖またはセンス領域を含む。
【０１３７】
１つの実施形態において、本発明の化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子は１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上）の２’−Ｏ−アルキル（例えば２’−Ｏ−メチル）、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ、ＦＡＮＡ、または無塩基化学修飾またはそのいずれかの組み合わせを有するアンチセンス鎖またはアンチセンス領域を含む。
【０１３８】
１つの実施形態において、本発明の化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子は各々が１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上）の２’−Ｏ−アルキル（例えば２’−Ｏ−メチル）、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ、ＦＡＮＡ、または無塩基化学修飾またはそのいずれかの組み合わせを有するセンス鎖またはセンス領域およびアンチセンス鎖またはアンチセンス領域を含む。
【０１３９】
１つの実施形態において、本発明はセンス領域を含む本発明の化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである（例えば全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）。
【０１４０】
１つの実施形態において、本発明はセンス領域を含む本発明の化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のピリミジンヌクレオチドはＦＡＮＡピリミジンヌクレオチドである（例えば全てのピリミジンヌクレオチドがＦＡＮＡピリミジンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）ピリミジンヌクレオチドがＦＡＮＡピリミジンヌクレオチドである）。
【０１４１】
１つの実施形態において、本発明はアンチセンス領域を含む本発明の化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでアンチセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである（例えば全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）。
【０１４２】
１つの実施形態において、本発明はセンス領域およびアンチセンス領域を含む本発明の化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでセンス領域およびアンチセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである（例えば全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）。
【０１４３】
１つの実施形態において、本発明はセンス領域を含む本発明の化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）プリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）。
【０１４４】
１つの実施形態において、本発明はアンチセンス領域を含む本発明の化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでアンチセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例えば全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）プリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）。
【０１４５】
１つの実施形態において、本発明はセンス領域を含む本発明の化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えばここで全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり）、ここでセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えばここで全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）プリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）。
【０１４６】
１つの実施形態において、本発明はセンス領域を含む本発明の化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えばここで全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであり）、ここでセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであり（例えばここで全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）プリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであり）、ここで該センス領域に存在する３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含むいずれかのヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
【０１４７】
１つの実施形態において、本発明はセンス領域を含む本発明の化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えばここで全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであり）、ここでセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例えばここで全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）プリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドである）。
【０１４８】
１つの実施形態において、本発明はセンス領域を含む本発明の化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えばここで全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであり）、ここでセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドであり（例えばここで全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）プリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドであり）、ここで該センス領域に存在する３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含むいずれかのヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
【０１４９】
１つの実施形態において、本発明はアンチセンス領域を含む本発明の化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでアンチセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えばここで全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであり）、ここでアンチセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドである（例えばここで全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）プリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドである）。
【０１５０】
１つの実施形態において、本発明はアンチセンス領域を含む本発明の化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでアンチセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えばここで全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであり）、ここでアンチセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドであり（例えばここで全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）プリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドであり）、ここで該アンチセンス領域に存在する３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含むいずれかのヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
【０１５１】
１つの実施形態において、本発明はアンチセンス領域を含む本発明の化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでアンチセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えばここで全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであり）、ここでアンチセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えばここで全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）プリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）。
【０１５２】
１つの実施形態において、本発明はアンチセンス領域を含む本発明の化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでアンチセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えばここで全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであり）、ここでアンチセンス領域に存在するいずれか（例えば１つ以上または全て）のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドである（例えばここで全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）プリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドである）。
【０１５３】
１つの実施形態において、本発明は、センス領域、ただしここでセンス領域に存在するピリミジンヌクレオチド１つ以上が２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えばここで全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであり）、センス領域に存在するプリンヌクレオチド１つ以上が２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えばここで全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）プリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）もの、およびアンチセンス領域、ただしここでアンチセンス領域に存在するピリミジンヌクレオチド１つ以上が２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えばここで全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシピリミジンヌクレオチドであり）、アンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチド１つ以上が２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドである（例えばここで全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）プリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドである）ものを含む、細胞または再建されたインビトロの系の内部においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することができる本発明の化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。センス領域および／またはアンチセンス領域は、末端キャップ修飾、例えば場合によりセンスおよび／またはアンチセンス配列の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方に存在する、本明細書に記載した、または図７に示すいずれかの修飾を有することができる。センスおよび／またはアンチセンス領域は場合により更に、約１〜約４（例えば約１、２、３または４）の３’−末端ヌクレオチドオーバーハングを含むことができる。オーバーハングヌクレオチドは更に１つ以上（例えば約１、２、３、４以上）のホスホロチオエート、ホスホノアセテート、および／またはチオホスホノアセテートヌクレオチド間連結部を含むことができる。これらの化学修飾されたｓｉＮＡの非限定的な例は本明細書においては図４および図５および表１ｂおよび８に示す。これらの記載された実施形態のいずれかにおいて、センス領域に存在するプリンヌクレオチドは代替的には２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドであり（例えばここで全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドであるか、或いは、複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドであり）、アンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチド１つ以上は２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドである（例えばここで全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）プリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドである）。更に、これらの実施形態のいずれかにおいて、センス領域に存在するプリンヌクレオチドは代替的にはプリンリボヌクレオチドであり（例えばここで全てのプリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１より多い）プリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチドであり）、アンチセンス領域に存在するいずれかのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドである（例えばここで全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドであるか、或いは、複数の（即ち１つより多い）プリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシプリンヌクレオチドである）。更に、これらの実施形態のいずれかにおいて、センス領域に存在する、および／またはアンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチド１つ以上は、代替的に、２’−デオキシヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシヌクレオチド、および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択される（例えばここで全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシヌクレオチド、および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択されるか、或いは、複数の（即ち１より多い）プリンヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシヌクレオチド、および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択される）。
【０１５４】
別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子に、好ましくは本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖に、しかし場合によってはセンスまたアンチセンスとセンス鎖の両方にも存在するいずれかの修飾されたヌクレオチドは、天然に存在するリボヌクレオチドと同様の特質または特性を有する修飾されたヌクレオチドである。例えば本発明は、別様には「リボ様」または「Ａ型ヘリックス」配置としても知られている、ノーザン構造を有する修飾されたヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする（例えばノーザンシュードローテーションサイクル、例えばＳａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ編、１９８４参照）。そのようなノーザン構造を有するヌクレオチドはそれらがＣ３’−エンド糖パッカー構造を有することから一般的に「リボ様」と考えられている。即ち、本発明のｓｉＮＡ分子に、好ましくは本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖に、しかし場合によってはセンス及び／又はアンチセンスとセンス鎖の両方にも存在する化学修飾されたヌクレオチドはヌクレアーゼ分解に対して抵抗性であると同時にＲＮＡｉを媒介する能力を維持している。ノーザン配置を有するヌクレオチドの非限定的な例は、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）；２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド：２’−メチルチオエチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド；４’−チオヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含む。
【０１５５】
１つの実施形態において、本発明の２本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖はセンス鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方において、反転デオキシ無塩基部分等の末端キャップ部分（例えば図７参照）を含む。
【０１５６】
１つの実施形態において、本発明は細胞または再建インビトロ系の内部においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することができる化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで化学修飾は化学修飾されたｓｉＮＡ分子に共有結合されたコンジュゲートを含む。本発明の意図するコンジュゲートの非限定的な例は、図面も含めて参照により全体が本明細書に組み込まれる２００３年４月３０日に出願されたＶａｒｇｅｅｓｅ等のＵＳＳＮ１０／４２７，１６０に記載されたコンジュゲートおよびリガンドを含む。別の実施形態においては、コンジュゲートは生体分解性のリンカーを介して化学修飾されたｓｉＮＡ分子に共有結合される。１つの実施形態において、コンジュゲート分子は化学修飾されたｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖のいずれかの３’末端において結合している。別の実施形態においては、コンジュゲート分子は化学修飾されたｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖のいずれかの５’末端において結合している。更に別の実施形態において、コンジュゲート分子は化学修飾されたｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖のいずれか、またはそのいずれかの組み合わせの３’末端および５’末端の両方に連結している。１つの実施形態において、本発明のコンジュゲート分子は細胞等の生物学的な系の中への化学修飾されたｓｉＮＡ分子の送達を促進する分子を含む。別の実施形態においては、化学修飾されたｓｉＮＡ分子に結合したコンジュゲート分子は、細胞受容体に対するリガンド、例えば天然に存在するタンパク質リガンドから誘導されたペプチド；タンパク質局在化配列、例えば細胞ＺＩＰコード配列；抗体；核酸アプタマー；ビタミンおよび他のコファクター、例えばフォレートおよびＮ−アセチルガラクトサミン；重合体、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；リン脂質；コレステロール；ステロイド；およびポリアミン、例えばＰＥＩ、スペルミンまたはスペルミジンである。化学修飾されたｓｉＮＡ分子に結合できる本発明の意図する特定のコンジュゲート分子の例は、参照により本明細書に組み込まれる２００２年７月２２日に出願されたＶａｒｇｅｅｓｅ等の米国出願第１０／２０１，３９４号に記載されている。使用するコンジュゲートの型、および本発明のｓｉＮＡ分子のコンジュゲーションの程度は、ｓｉＮＡコンストラクトの向上した薬物動態プロファイル、生体利用性、および／または安定性、また同時に、ＲＮＡｉ活性を媒介するｓｉＮＡの能力を維持することに関して評価することができる。即ち、当業者であれば、種々のコンジュゲートで修飾されたｓｉＮＡコンストラクトをスクリーニングすることにより、当分野で一般的に知られる通り、ｓｉＮＡコンジュゲート複合体が向上した特質を保有しつつ、例えば動物モデルにおいてＲＮＡｉを媒介する能力を維持しているかどうかを調べることができる。
【０１５７】
１つの実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡのアンチセンス領域にｓｉＮＡのセンス領域を連結するヌクレオチド、非ヌクレオチド、または混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーをｓｉＮＡが更に含む、本発明の短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴としている。１つの実施形態において、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、または混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーは、例えば、ｓｉＮＡにコンジュゲート部分を結合させるために使用される。１つの実施形態において、本発明のヌクレオチドリンカーは２ヌクレオチド長以上、例えば約３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長のリンカーであることができる。別の実施形態においては、ヌクレオチドリンカーは核酸アプタマーであることができる。「アプタマー」または「核酸アプタマー」とは、本明細書において使用する場合、核酸分子が天然の状況においてＥＮａＣ標的分子により認識される配列を含む配列を有しているようなＥＮａＣ標的分子に特異的に結合する核酸分子を意味する。或いは、アプタマーはＥＮａＣ標的分子が天然には核酸に結合しないＥＮａＣ標的分子に結合する核酸分子であることができる。ＥＮａＣ標的分子は対象のいずれかの分子（例えばＥＮａＣまたはそのいずれかのアイソタイプ）であることができる。例えばアプタマーはタンパク質のリガンド結合ドメインに結合するために使用し、これにより、天然に存在するリガンドのタンパク質との相互作用を防止することができる。これは非限定的な例であり、他の実施形態は一般的に当分野で知られている手法を用いながら容易に発生し得ることは当業者の知る通りである。（例えばＧｏｌｄ等、１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７６３；Ｂｒｏｄｙ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７４，５；Ｓｕｎ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．，２，１００；Ｋｕｓｓｅｒ，２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，２７；Ｈｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｌ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，８２０；およびＪａｙａｓｅｎａ，１９９９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，１６２８を参照）。
【０１５８】
更に別の実施形態において、本発明の非ヌクレオチドリンカーは無塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、または他の重合体化合物（例えばポリエチレングリコール、例えば２〜１００エチレングリコール単位を有するもの）を含む。具体的な例は、全て参照により本明細書に組み込まれるＳｅｅｌａ  ａｎｄ  Ｋａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０，７８：６３５３  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８７，１５：３１１３；Ｃｌｏａｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：６３２４；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：５１０９；Ｍａ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９３，２１：２５８５  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９３，５２：１７５１；Ｄｕｒａｎｄ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０，１８：６３５３；ＭｃＣｕｒｄｙ等、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９９１，１０：２８７；Ｊｓｃｈｋｅ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９３，３４：３０１；Ｏｎｏ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９１，３０：９９１４；Ａｒｎｏｌｄ等、国際公開ＷＯ８９／０２４３９；Ｕｓｍａｎ等、国際公開ＷＯ９５／０６７３１；Ｄｕｄｙｃｚ等、国際公開ＷＯ９５／１１９１０およびＦｅｒｅｎｔｚ  ａｎｄ  Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：４０００の記載するものを含む。「非ヌクレオチド」は更に、糖および／またはホスフェートの置換を含むヌクレオチド単位の１つ以上の場所において核酸鎖内に取り込まれることができ、残余の塩基がそれらの酵素活性を呈することができるようにする、いずれかの基または化合物を意味する。基または化合物は、それが一般的に認識されるヌクレオチド塩基、例えばアデノシン、グアノシン、シトシン、ウラシルまたはチミンを、例えば糖のＣ１位に含有していないという点で無塩基であることができる。
【０１５９】
１つの実施形態において、本発明は、細胞または再建インビトロ系の内部においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することができる短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで２つの別個のオリゴヌクレオチドから組み立てられたｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖はいずれかのリボヌクレオチドも含まない。例えば、ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡのセンスおよびアンチセンス領域がオリゴヌクレオチドに存在するいずれかのリボヌクレオチド（例えば２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を有さない別個のオリゴヌクレオチドを含む単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられることができる。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡのセンスおよびアンチセンス領域が本明細書に記載したヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーにより連結されるか環化された単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられることができ、ここでオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドに存在するいずれかのリボヌクレオチド（例えば２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を有さない。本出願人は意外にも、ｓｉＮＡ分子内部のリボヌクレオチド（例えば２’−ヒドロキシル基を有するヌクレオチド）の存在がＲＮＡｉ活性を支援するために必要でも必須でもないということを発見した。即ち、１つの実施形態において、ｓｉＮＡ内部の全ての位置が、化学修飾ヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチド、例えば或いは式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせを有するヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを、細胞におけるＲＮＡｉ活性を支援するｓｉＮＡ分子の能力が維持される範囲において、含むことができる。
【０１６０】
１つの実施形態において、本発明の化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子は２つ以上（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上）の２’−Ｏ−アルキル（例えば２’−Ｏ−メチル）修飾またはそのいずれかの組み合わせを有するセンス鎖またはセンス領域を含む。別の実施形態においては、２’−Ｏ−アルキル修飾は、ｓｉＮＡのセンス鎖またはセンス領域の交互の位置、例えば１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１位等、または２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０位等にある。
【０１６１】
１つの実施形態において、本発明の化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子は２つ以上（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上）の２’−Ｏ−アルキル（例えば２’−Ｏ−メチル）修飾またはそのいずれかの組み合わせを有するアンチセンス鎖またはアンチセンス領域を含む。別の実施形態においては、２’−Ｏ−アルキル修飾は、ｓｉＮＡのアンチセンス鎖またはアンチセンス領域の交互の位置、例えば１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１位等、または２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０位等にある。
【０１６２】
１つの実施形態において、本発明の化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子は各々２つ以上（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上）の２’−Ｏ−アルキル（例えば２’−Ｏ−メチル）、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ、または無塩基化学修飾またはそのいずれかの組み合わせを有するセンス鎖またはセンス領域およびアンチセンス鎖またはアンチセンス領域を含む。別の実施形態においては、２’−Ｏ−アルキル修飾は、ｓｉＮＡのセンス鎖またはセンス領域の交互の位置、例えば１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１位等、または２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０位等にある。別の実施形態においては、２’−Ｏ−アルキル修飾は、ｓｉＮＡのセンス鎖またはセンス領域の交互の位置、例えば１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１位等、または２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０位等にある。
【０１６３】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子はｓｉＮＡ分子の１つ以上の鎖または領域内部の交互の位置に化学修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチド（例えば式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかを有するもの、例えば２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシ、または２’−Ｏ−メチルヌクレオチド）を含む。例えば、そのような化学修飾はｓｉＮＡの３’末端または５’末端から、第１および第２のヌクレオチドのいずれかで始まるＲＮＡ系ｓｉＮＡの１つ置きの位置において導入できる。非限定的な例においては、ｓｉＮＡの各鎖が２１ヌクレオチド長である本発明の２本鎖ｓｉＮＡ分子は、各鎖の１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、および２１位が化学修飾（例えば式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかを有する化合物、例えば２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシ、または２’−Ｏ−メチルヌクレオチドによる）されているという特徴を有する。別の非限定的な例においては、ｓｉＮＡの各鎖が２１ヌクレオチド長である本発明の２本鎖ｓｉＮＡ分子は、各鎖の２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０位が化学修飾（例えば式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかを有する化合物、例えば２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、または２’−Ｏ−メチルヌクレオチドによる）されているという特徴を有する。１つの実施形態において、２本鎖ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０位における化学修飾および１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、および２１位における化学修飾を含む。そのようなｓｉＮＡ分子は更に本明細書に記載する通り末端キャップ部分および／または骨格の修飾を含むことができる。
【０１６４】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は以下の特徴、即ち、プリンヌクレオチドがｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖またはアンチセンス領域（別様にはガイド配列またはガイド鎖と称する）の５’末端に（例えば５’末端から１、２、３、４、５、または６末端ヌクレオチド位のいずれかに）存在する場合、そのプリンヌクレオシドはリボヌクレオチドであることを含む。別の実施形態においては、プリンリボヌクレオチドが存在する場合は、それはｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域（別様にはパッセンジャー鎖と称する）のヌクレオチドと塩基対形成する。そのようなプリンリボヌクレオチドは別様には修飾されたヌクレオチドを含むｓｉＮＡ安定化モチーフ中に存在することができる。
【０１６５】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は以下の特徴、即ち、ピリミジンヌクレオチドがｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖またはアンチセンス領域（別様にはガイド配列またはガイド鎖と称する）の５’末端に（例えば５’末端から１、２、３、４、５、または６末端ヌクレオチド位のいずれかに）存在する場合、そのピリミジンヌクレオシドはリボヌクレオチドであることを含む。別の実施形態においては、ピリミジンリボヌクレオチドが存在する場合は、それはｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域（別様にはパッセンジャー鎖と称する）のヌクレオチドと塩基対形成する。そのようなピリミジンリボヌクレオチドは別様には修飾されたヌクレオチドを含むｓｉＮＡ安定化モチーフ中に存在することができる。
【０１６６】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は以下の特徴、即ち、ピリミジンヌクレオチドがｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖またはアンチセンス領域（別様にはガイド配列またはガイド鎖と称する）の５’末端に（例えば５’末端から１、２、３、４、５、または６末端ヌクレオチド位のいずれかに）存在する場合、そのピリミジンヌクレオシドは修飾されたヌクレオチドであることを含む。別の実施形態においては、修飾されたピリミジンリボヌクレオチドが存在する場合は、それはｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域（別様にはパッセンジャー鎖と称する）のヌクレオチドと塩基対形成する。修飾されたピリミジンヌクレオチドの非限定的な例は、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかを有するもの、例えば２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチルトリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシエトキシ、または２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含む。
【０１６７】
１つの実施形態において、本発明は下記構造ＳＩ：
【化８】
2012509688.tif 000010
［式中、各Ｎは独立して未修飾または化学修飾されていることができるヌクレオチドであり；各Ｂは存在または非存在であることができる末端キャップ部分であり；（Ｎ）は未修飾または化学修飾されていることができる非塩基対形成またはオーバーハングのヌクレオチドを示し；［Ｎ］はいずれかのプリンヌクレオチドが存在する場合にはリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置を示し；Ｘ１およびＸ２は独立して約０〜約４の整数であり；Ｘ３は約９〜約３０の整数であり；Ｘ４は約１１〜約３０の整数であるが、ただしＸ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；Ｘ５は約１〜約６の整数であり；ＮＸ３はＮＸ４およびＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；［Ｎ］ヌクレオチド位置におけるプリンヌクレオチド以外のアンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは独立して２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチドまたは２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組み合わせであり；
（ｂ）センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは独立して２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドまたは２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組み合わせであり；
（ｃ）いずれかの（Ｎ）ヌクレオチドは場合により２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、またはデオキシリボヌクレオチドである］を有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【０１６８】
１つの実施形態において、本発明は下記構造ＳＩＩ：
【化９】
2012509688.tif 000011
［式中、各Ｎは独立して未修飾または化学修飾されていることができるヌクレオチドであり；各Ｂは存在または非存在であることができる末端キャップ部分であり；（Ｎ）は未修飾または化学修飾されていることができる非塩基対形成またはオーバーハングのヌクレオチドを示し；［Ｎ］はいずれかのプリンヌクレオチドが存在する場合にはリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置を示し；Ｘ１およびＸ２は独立して約０〜約４の整数であり；Ｘ３は約９〜約３０の整数であり；Ｘ４は約１１〜約３０の整数であるが、ただしＸ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；Ｘ５は約１〜約６の整数であり；ＮＸ３はＮＸ４およびＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；［Ｎ］ヌクレオチド位置におけるプリンヌクレオチド以外のアンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
（ｂ）センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドはリボヌクレオチドであり；センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドはリボヌクレオチドであり；
（ｃ）いずれかの（Ｎ）ヌクレオチドは場合により２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、またはデオキシリボヌクレオチドである］を有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【０１６９】
１つの実施形態において、本発明は下記構造ＳＩＩＩ：
【化１０】
2012509688.tif 000012
［式中、各Ｎは独立して未修飾または化学修飾されていることができるヌクレオチドであり；各Ｂは存在または非存在であることができる末端キャップ部分であり；（Ｎ）は未修飾または化学修飾されていることができる非塩基対形成またはオーバーハングのヌクレオチドを示し；［Ｎ］はいずれかのプリンヌクレオチドが存在する場合にはリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置を示し；Ｘ１およびＸ２は独立して約０〜約４の整数であり；Ｘ３は約９〜約３０の整数であり；Ｘ４は約１１〜約３０の整数であるが、ただしＸ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；Ｘ５は約１〜約６の整数であり；ＮＸ３はＮＸ４およびＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；［Ｎ］ヌクレオチド位置におけるプリンヌクレオチド以外のアンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
（ｂ）センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドはリボヌクレオチドであり；
（ｃ）いずれかの（Ｎ）ヌクレオチドは場合により２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、またはデオキシリボヌクレオチドである］を有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【０１７０】
１つの実施形態において、本発明は下記構造ＳＩＶ：
【化１１】
2012509688.tif 000013
［式中、各Ｎは独立して未修飾または化学修飾されていることができるヌクレオチドであり；各Ｂは存在または非存在であることができる末端キャップ部分であり；（Ｎ）は未修飾または化学修飾されていることができる非塩基対形成またはオーバーハングのヌクレオチドを示し；［Ｎ］はいずれかのプリンヌクレオチドが存在する場合にはリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置を示し；Ｘ１およびＸ２は独立して約０〜約４の整数であり；Ｘ３は約９〜約３０の整数であり；Ｘ４は約１１〜約３０の整数であるが、ただしＸ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；Ｘ５は約１〜約６の整数であり；ＮＸ３はＮＸ４およびＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；［Ｎ］ヌクレオチド位置におけるプリンヌクレオチド以外のアンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
（ｂ）センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドはリボヌクレオチドであり；
（ｃ）いずれかの（Ｎ）ヌクレオチドは場合により２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、またはデオキシリボヌクレオチドである］を有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【０１７１】
１つの実施形態において、本発明は下記構造ＳＶ：
【化１２】
2012509688.tif 000014
［式中、各Ｎは独立して未修飾または化学修飾されていることができるヌクレオチドであり；各Ｂは存在または非存在であることができる末端キャップ部分であり；（Ｎ）は未修飾または化学修飾されていることができる非塩基対形成またはオーバーハングのヌクレオチドを示し；［Ｎ］はいずれかのプリンヌクレオチドが存在する場合にはリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置を示し；Ｘ１およびＸ２は独立して約０〜約４の整数であり；Ｘ３は約９〜約３０の整数であり；Ｘ４は約１１〜約３０の整数であるが、ただしＸ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；Ｘ５は約１〜約６の整数であり；ＮＸ３はＮＸ４およびＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドはリボ様の配置（例えばノーザンまたはＡ型へリックス配置）を有するヌクレオチドであり；［Ｎ］ヌクレオチド位置におけるプリンヌクレオチド以外のアンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは独立して２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
（ｂ）センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドはリボ様の配置（例えばノーザンまたはＡ型へリックス配置）を有するヌクレオチドであり；センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは独立して２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
（ｃ）いずれかの（Ｎ）ヌクレオチドは場合により２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、またはデオキシリボヌクレオチドである］を有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【０１７２】
１つの実施形態において、本発明は下記構造ＳＶＩ：
【化１３】
2012509688.tif 000015
［式中、各Ｎは独立して未修飾または化学修飾されていることができるヌクレオチドであり；各Ｂは存在または非存在であることができる末端キャップ部分であり；（Ｎ）は未修飾または化学修飾されていることができる非塩基対形成またはオーバーハングのヌクレオチドを示し；［Ｎ］はアンチセンス鎖（下方の鎖）の５’末端をセンス鎖（上方の鎖）の５’末端よりも熱安定性が低いものとする配列を含むヌクレオチド位置を示し；Ｘ１およびＸ２は独立して約０〜約４の整数であり；Ｘ３は約９〜約３０の整数であり；Ｘ４は約１１〜約３０の整数であるが、ただしＸ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；Ｘ５は約１〜約６の整数であり；ＮＸ３はＮＸ４およびＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；［Ｎ］ヌクレオチド位置におけるプリンヌクレオチド以外のアンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは独立して２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチドまたは２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組み合わせであり；
（ｂ）センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは独立して２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドまたは２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組み合わせであり；
（ｃ）いずれかの（Ｎ）ヌクレオチドは場合により２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、またはデオキシリボヌクレオチドである］を有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【０１７３】
１つの実施形態において、本発明は下記構造ＳＶＩＩ：
【化１４】
2012509688.tif 000016
［式中、各Ｎは独立して未修飾または化学修飾されていることができるヌクレオチドであり；各Ｂは存在または非存在であることができる末端キャップ部分であり；（Ｎ）は非塩基対形成またはオーバーハングのヌクレオチドを示し；Ｘ１およびＸ２は独立して約０〜約４の整数であり；Ｘ３は約９〜約３０の整数であり；Ｘ４は約１１〜約３０の整数であり；ＮＸ３はＮＸ４に相補的であり、いずれかの（Ｎ）ヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルおよび／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである］を有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【０１７４】
１つの実施形態において、本発明は下記構造ＳＶＩＩＩ：
【化１５】
2012509688.tif 000017
［式中、各Ｎは独立して未修飾または化学修飾されていることができるヌクレオチドであり；各Ｂは存在または非存在であることができる末端キャップ部分であり；（Ｎ）は未修飾または化学修飾されていることができる非塩基対形成またはオーバーハングのヌクレオチドを示し；［Ｎ］はアンチセンス鎖（下方の鎖）の５’末端をセンス鎖（上方の鎖）の５’末端よりも熱安定性が低いものとする配列を含むヌクレオチド位置を示し；［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置を示し；Ｘ１およびＸ２は独立して約０〜約４の整数であり；Ｘ３は約９〜約１５の整数であり；Ｘ４は約１１〜約３０の整数であるが、ただしＸ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；Ｘ５は約１〜約６の整数であり；Ｘ６は約１〜約４の整数であり；Ｘ７は約９〜約１５の整数であり；ＮＸ７、ＮＸ６およびＸＮ３はＮＸ４およびＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；［Ｎ］ヌクレオチド位置におけるプリンヌクレオチド以外のアンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは独立して２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチドまたは２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組み合わせであり；
（ｂ）センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドは［Ｎ］ヌクレオチド以外の２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは独立して［Ｎ］ヌクレオチド以外の２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドまたは２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組み合わせであり；
（ｃ）いずれかの（Ｎ）ヌクレオチドは場合により２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、またはデオキシリボヌクレオチドである］を有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【０１７５】
１つの実施形態において、本発明は下記構造ＳＩＸ：
【化１６】
2012509688.tif 000018
［式中、各Ｎは独立して未修飾または化学修飾されていることができるヌクレオチドであり；各Ｂは存在または非存在であることができる末端キャップ部分であり；（Ｎ）は未修飾または化学修飾されていることができる非塩基対形成またはオーバーハングのヌクレオチドを示し；［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置を示し；Ｘ１およびＸ２は独立して約０〜約４の整数であり；Ｘ３は約９〜約３０の整数であり；Ｘ４は約１１〜約３０の整数であるが、ただしＸ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；Ｘ５は約１〜約６の整数であり；ＮＸ３はＮＸ４およびＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；［Ｎ］ヌクレオチド位置におけるプリンヌクレオチド以外のアンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは独立して２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチドまたは２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組み合わせであり；
（ｂ）センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは独立して２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドまたは２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組み合わせであり；
（ｃ）いずれかの（Ｎ）ヌクレオチドは場合により２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、またはデオキシリボヌクレオチドである］を有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【０１７６】
１つの実施形態において、本発明は下記構造ＳＸ：
【化１７】
2012509688.tif 000019
［式中、各Ｎは独立して未修飾または化学修飾されていることができるヌクレオチドであり；各Ｂは存在または非存在であることができる末端キャップ部分であり；（Ｎ）は未修飾または化学修飾されていることができる非塩基対形成またはオーバーハングのヌクレオチドを示し；［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置を示し；Ｘ１およびＸ２は独立して約０〜約４の整数であり；Ｘ３は約９〜約３０の整数であり；Ｘ４は約１１〜約３０の整数であるが、ただしＸ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；Ｘ５は約１〜約６の整数であり；ＮＸ３はＮＸ４およびＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；［Ｎ］ヌクレオチド位置におけるプリンヌクレオチド以外のアンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
（ｂ）センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドはリボヌクレオチドであり；センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドはリボヌクレオチドであり；
（ｃ）いずれかの（Ｎ）ヌクレオチドは場合により２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、またはデオキシリボヌクレオチドである］を有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【０１７７】
１つの実施形態において、本発明は下記構造ＳＸＩ：
【化１８】
2012509688.tif 000020
［式中、各Ｎは独立して未修飾または化学修飾されていることができるヌクレオチドであり；各Ｂは存在または非存在であることができる末端キャップ部分であり；（Ｎ）は未修飾または化学修飾されていることができる非塩基対形成またはオーバーハングのヌクレオチドを示し；［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置を示し；Ｘ１およびＸ２は独立して約０〜約４の整数であり；Ｘ３は約９〜約３０の整数であり；Ｘ４は約１１〜約３０の整数であるが、ただしＸ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；Ｘ５は約１〜約６の整数であり；ＮＸ３はＮＸ４およびＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；［Ｎ］ヌクレオチド位置におけるプリンヌクレオチド以外のアンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
（ｂ）センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドはリボヌクレオチドであり；
（ｃ）いずれかの（Ｎ）ヌクレオチドは場合により２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、またはデオキシリボヌクレオチドである］を有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【０１７８】
１つの実施形態において、本発明は下記構造ＳＸＩＩ：
【化１９】
2012509688.tif 000021
［式中、各Ｎは独立して未修飾または化学修飾されていることができるヌクレオチドであり；各Ｂは存在または非存在であることができる末端キャップ部分であり；（Ｎ）は未修飾または化学修飾されていることができる非塩基対形成またはオーバーハングのヌクレオチドを示し；［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置を示し；Ｘ１およびＸ２は独立して約０〜約４の整数であり；Ｘ３は約９〜約３０の整数であり；Ｘ４は約１１〜約３０の整数であるが、ただしＸ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；Ｘ５は約１〜約６の整数であり；ＮＸ３はＮＸ４およびＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；［Ｎ］ヌクレオチド位置におけるプリンヌクレオチド以外のアンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
（ｂ）センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドであり；
（ｃ）いずれかの（Ｎ）ヌクレオチドは場合により２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、またはデオキシリボヌクレオチドである］を有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【０１７９】
１つの実施形態において、本発明は下記構造ＳＸＩＩＩ：
【化２０】
2012509688.tif 000022
［式中、各Ｎは独立して未修飾または化学修飾されていることができるヌクレオチドであり；各Ｂは存在または非存在であることができる末端キャップ部分であり；（Ｎ）は未修飾または化学修飾されていることができる非塩基対形成またはオーバーハングのヌクレオチドを示し；［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置を示し；Ｘ１およびＸ２は独立して約０〜約４の整数であり；Ｘ３は約９〜約３０の整数であり；Ｘ４は約１１〜約３０の整数であるが、ただしＸ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；Ｘ５は約１〜約６の整数であり；ＮＸ３はＮＸ４およびＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドはリボ様の配置（例えばノーザンまたはＡ型へリックス配置）を有するヌクレオチドであり；［Ｎ］ヌクレオチド位置におけるプリンヌクレオチド以外のアンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは独立して２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
（ｂ）センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドはリボ様の配置（例えばノーザンまたはＡ型へリックス配置）を有するヌクレオチドであり；センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは独立して２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
（ｃ）いずれかの（Ｎ）ヌクレオチドは場合により２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、またはデオキシリボヌクレオチドである］を有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【０１８０】
１つの実施形態において、本発明は下記構造ＳＸＩＶ：
【化２１】
2012509688.tif 000023
［式中、各Ｎは独立して未修飾または化学修飾されていることができるヌクレオチドであり；各Ｂは存在または非存在であることができる末端キャップ部分であり；（Ｎ）は未修飾または化学修飾されていることができる非塩基対形成またはオーバーハングのヌクレオチドを示し；［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置を示し；［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチド位置を示し；Ｘ１およびＸ２は独立して約０〜約４の整数であり；Ｘ３は約９〜約１５の整数であり；Ｘ４は約１１〜約３０の整数であるが、ただしＸ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；Ｘ５は約１〜約６の整数であり；Ｘ６は約１〜約４の整数であり；Ｘ７は約９〜約１５の整数であり；ＮＸ７、ＮＸ６およびＸＮ３はＮＸ４およびＮＸ５に相補的であり、
（ａ）アンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；［Ｎ］ヌクレオチド位置におけるプリンヌクレオチド以外のアンチセンス鎖（下方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは独立して２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチドまたは２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組み合わせであり；
（ｂ）センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのピリミジンヌクレオチドは［Ｎ］ヌクレオチド以外の２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；センス鎖（上方の鎖）に存在するいずれかのプリンヌクレオチドは独立して［Ｎ］ヌクレオチド以外の２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドまたは２’−デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの組み合わせであり；
（ｃ）いずれかの（Ｎ）ヌクレオチドは場合により２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、またはデオキシリボヌクレオチドである］を有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【０１８１】
１つの実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ、またはＳＸＩＶのいずれかを有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子は核酸分子のアンチセンス鎖またはアンチセンス領域の５’末端に末端ホスフェート基を含む。
【０１８２】
１つの実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ、またはＳＸＩＶのいずれかを有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子はＸ５＝１、２、または３；各Ｘ１およびＸ２＝１または２；Ｘ３＝１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０、およびＸ４＝１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０を含む。
【０１８３】
１つの実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ、またはＳＸＩＶのいずれかを有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子はＸ５＝１；各Ｘ１およびＸ２＝２；Ｘ３＝１９、およびＸ４＝１８を含む。
【０１８４】
１つの実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ、またはＳＸＩＶのいずれかを有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子はＸ５＝２；各Ｘ１およびＸ２＝２；Ｘ３＝１９、およびＸ４＝１７を含む。
【０１８５】
１つの実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ、またはＳＸＩＶのいずれかを有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子はＸ５＝３；各Ｘ１およびＸ２＝２；Ｘ３＝１９、およびＸ４＝１６を含む。
【０１８６】
１つの実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ、またはＳＸＩＶのいずれかを有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子はセンス鎖またはセンス領域の３’および５’末端のＢを含む。
【０１８７】
１つの実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ、またはＳＸＩＶのいずれかを有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子はアンチセンス鎖またはアンチセンス領域の３’末端のＢを含む。
【０１８８】
１つの実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ、またはＳＸＩＶのいずれかを有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子はセンス鎖またはセンス領域の３’および５’末端のＢ、およびアンチセンス鎖またはアンチセンス領域の３’末端のＢを含む。
【０１８９】
１つの実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ、またはＳＸＩＶのいずれかを有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子は更に核酸分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の３’末端上の第１の末端（Ｎ）においてホスホロチオエートヌクレオチド間連結部１つ以上を含む。例えば２本鎖核酸分子はホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、例えば（ＮｓＮ）、式中「ｓ」はホスホロチオエートを示すものを有するオーバーハングヌクレオチド位置を有するＸ１および／またはＸ２＝２を含み得る。
【０１９０】
１つの実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ、またはＳＸＩＶのいずれかを有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである（Ｎ）ヌクレオチドを含む。
【０１９１】
１つの実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ、またはＳＸＩＶのいずれかを有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子は２’−デオキシヌクレオチドである（Ｎ）ヌクレオチドを含む。
【０１９２】
１つの実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ、またはＳＸＩＶのいずれかを有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである（Ｎ）ヌクレオチドを含む。
【０１９３】
１つの実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ、またはＳＸＩＶのいずれかを有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子は、アンチセンス（下方）鎖のＮおよび［Ｎ］ヌクレオチドに対する相補性を有するＥＮａＣ標的ポリヌクレオチド配列におけるヌクレオチドに対して相補的なアンチセンス鎖（下方の鎖）における（Ｎ）ヌクレオチドを含む。
【０１９４】
１つの実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ、またはＳＸＩＶのいずれかを有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子はＥＮａＣ標的ポリヌクレオチド配列の約１５〜約３０ヌクレオチドの近接ヌクレオチド配列を含むセンス鎖（上方の鎖）における（Ｎ）ヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ、またはＳＸＩＶのいずれかを有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子は、センス鎖の近接（Ｎ）およびＮヌクレオチドがＥＮａＣ標的核酸配列のヌクレオチド配列を含むように、アンチセンス（下方）鎖に対する相補性を有するＥＮａＣ標的ポリヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列を含むセンス鎖（上方の鎖）における（Ｎ）ヌクレオチドを含む。
【０１９５】
１つの実施形態において、構造ＳＶＩＩＩまたはＳＸＩＶのいずれかを有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子は２本鎖核酸分子のセンス（上方）鎖の５’末端のみにＢを含む。
【０１９６】
１つの実施形態において、構造ＳＩ、ＳＩＩ、ＳＩＩＩ、ＳＩＶ、ＳＶ、ＳＶＩ、ＳＶＩＩ、ＳＶＩＩＩ、ＳＩＸ、ＳＸ、ＳＸＩ、ＳＸＩＩ、ＳＸＩＩＩ、またはＳＸＩＶのいずれかを有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子はアンチセンス（下方）鎖の５’末端において非対末端ヌクレオチドを含む。非対ヌクレオチドはセンス（上方）鎖に対して相補的ではない。１つの実施形態において、非対末端ヌクレオチドはアンチセンス（下方）鎖のＮおよび［Ｎ］ヌクレオチドに対する相補性を有するＥＮａＣ標的ポリヌクレオチド配列に対して相補的である。別の実施形態においては、非対末端ヌクレオチドはアンチセンス（下方）鎖のＮおよび［Ｎ］ヌクレオチドに対する相補性を有するＥＮａＣ標的ポリヌクレオチド配列に対して相補的ではない。
【０１９７】
１つの実施形態において、構造ＳＶＩＩＩまたはＳＸＩＶのいずれかを有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子はＸ６＝１およびＸ３＝１０を有する。
【０１９８】
１つの実施形態において、構造ＳＶＩＩＩまたはＳＸＩＶのいずれかを有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子はＸ６＝２およびＸ３＝９を有する。
【０１９９】
１つの実施形態において、本発明は更に製剤ＬＮＰ−０５１；ＬＮＰ−０５３；ＬＮＰ−０５４；ＬＮＰ−０６９；ＬＮＰ−０７３；ＬＮＰ−０７７；ＬＮＰ−０８０；ＬＮＰ−０８２；ＬＮＰ−０８３；ＬＮＰ−０６０；ＬＮＰ−０６１；ＬＮＰ−０８６；ＬＮＰ−０９７；ＬＮＰ−０９８；ＬＮＰ−０９９；ＬＮＰ−１００；ＬＮＰ−１０１；ＬＮＰ−１０２；ＬＮＰ−１０３；またはＬＮＰ−１０４のいずれかとして製剤化されたｓｉＮＡ分子または２本鎖核酸分子またはＲＮＡｉ阻害剤を含む組成物を特徴とする（表１０参照）。
【０２００】
１つの態様において、本発明は、相互に相補である第１の鎖および第２の鎖を有する２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、少なくとも１つの鎖が下記：
５’−ＵＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＵＣ−３’（配列番号１０）；
５’−ＧＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡ−３’（配列番号１０７）；
５’−ＵＵＡＵＧＧＡＵＧＡＵＧＧＵＧＧＣＵＵ−３’（配列番号１３）；
５’−ＡＡＧＣＣＡＣＣＡＵＣＡＵＣＣＡＵＡＡ−３’（配列番号１２４）；
５’−ＧＵＧＵＧＧＣＵＧＵＧＣＣＵＡＣＡＵＣ−３’（配列番号１６）；
５’−ＧＡＵＧＵＡＧＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＣ−３’（配列番号１２５）；
５’−ＧＣＵＧＵＧＣＣＵＡＣＡＵＣＵＵＣＵＡ−３’（配列番号２１）；または、
５’−ＵＡＧＡＡＧＡＵＧＵＡＧＧＣＡＣＡＧＣ−３’（配列番号１２６）；
を含み、
ここでヌクレオチドの１つ以上は場合により化学修飾されている上記分子を含む。この特徴の１つの実施形態において、２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子は全て未修飾であるヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子は全て化学修飾されているヌクレオチドを含む。
【０２０１】
１つの態様において、本発明は下記センス鎖およびアンチセンス鎖：
【化２２】
2012509688.tif 000024
を有する構造ＳＩＸ’を含む２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、
ここで、
上方の鎖はセンス鎖であり、下方の鎖は２本鎖核酸分子のアンチセンス鎖であり、該センス鎖はアンチセンス鎖に対して相補的な配列を含み；
該アンチセンス鎖は配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号２１に対して相補的な配列を含み、
各Ｎは独立して未修飾か、または化学修飾されているヌクレオチドであり；
各Ｂは存在または非存在の末端キャップ部分であり；
（Ｎ）はオーバーハングしているヌクレオチドを示し、その各々は独立して未修飾であるか、または２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、または２’−デオキシリボヌクレオチドであり；
［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチドを示し；
Ｘ１およびＸ２は独立して０〜４の整数であり；
Ｘ３は９〜３０の整数であり；
Ｘ４は１１〜３０の整数であるが、ただし、Ｘ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；
Ｘ５は１〜６の整数であり；ここで、
（ａ）ＮＸ４位置の各ピリミジンヌクレオチドは独立して２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
ＮＸ４位置の各プリンヌクレオチドは独立して２’−Ｏ−メチルヌクレオチドまたは２’−デオキシリボヌクレオチドであり；
（ｂ）ＮＸ３位置の各ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
ＮＸ３位置の各プリンヌクレオチドは独立して２’−デオキシリボヌクレオチドまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである上記分子を含む。ある実施形態においては、各Ｂは図２７に示すような反転無塩基キャップ部分である。
【０２０２】
別の態様において、本発明はまたｓｉＮＡが下記：
【化２３】
2012509688.tif 000025
である２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、
ここで：
各Ｂは反転無塩基キャップ部分であり；
ｃは２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
ｕは２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
Ａは２’−デオキシアデノシンであり；
Ｇは２’デオキシグアノシンであり；
Ｔはチミジンであり；
Ａはアデノシンであり；
Ｇはグアノシンであり；
Ｕはウリジンであり；
Ａは２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
Ｇは２’−Ｏ−メチル−グアノシンであり；
Ｕは２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
ヌクレオチド間連結部は化学修飾されているか、または未修飾である上記分子を含む。この態様の１つの実施形態において、ヌクレオチド間連結部は未修飾である。
【０２０３】
別の態様において、本発明はまたｓｉＮＡが下記：
【化２４】
2012509688.tif 000026
である２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、
ここで：
各Ｂは反転無塩基キャップであり；
ｃは２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
ｕは２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
Ａは２’−デオキシアデノシンであり；
Ｇは２’デオキシグアノシンであり；
Ｔはチミジンであり；
Ａはアデノシンであり；
Ｇはグアノシンであり；
Ａは２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
Ｕは２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
ヌクレオチド間連結部は化学修飾されているか、または未修飾である上記分子を含む。この態様の１つの実施形態において、ヌクレオチド間連結部は未修飾である。
【０２０４】
別の態様において、本発明はまた、ｓｉＮＡが下記：
【化２５】
2012509688.tif 000027
である２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、
ここで：
各Ｂは反転無塩基キャップ部分であり；
ｃは２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
ｕは２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
Ａは２’−デオキシアデノシンであり；
Ｇは２’デオキシグアノシンであり；
Ｔはチミジンであり；
Ａはアデノシンであり；
Ｇはグアノシンであり；
Ｕはウリジンであり；
Ａは２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
Ｇは２’−Ｏ−メチル−グアノシンであり；
Ｕは２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
ヌクレオチド間連結部は化学修飾されているか、または未修飾である上記分子を含む。この態様の１つの実施形態において、ヌクレオチド間連結部は未修飾である。
【０２０５】
別の態様において、本発明はまた、ｓｉＮＡが下記：
【化２６】
2012509688.tif 000028
である２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、
ここで：
各Ｂは反転無塩基キャップ部分であり；
ｃは２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
ｕは２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
Ａは２’−デオキシアデノシンであり；
Ｇは２’デオキシグアノシンであり；
Ｔはチミジンであり；
Ａはアデノシンであり；
Ｇはグアノシンであり；
Ｕはウリジンであり；
Ａは２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
Ｇは２’−Ｏ−メチル−グアノシンであり；
Ｕは２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
ヌクレオチド間連結部は化学修飾されているか、または未修飾である上記分子を含む。この態様の１つの実施形態において、ヌクレオチド間連結部は未修飾である。
【０２０６】
別の態様において、本発明はまた下記センス鎖およびアンチセンス鎖：
【化２７】
2012509688.tif 000029
を有する構造ＳＸ’を含む２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、
ここで、
上方の鎖はセンス鎖であり、下方の鎖は２本鎖核酸分子のアンチセンス鎖であり；該アンチセンス鎖は配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号２１に対する相補性を有する配列を含み、該センス鎖はアンチセンス鎖に対する相補性を有する配列を含み；
各Ｎは独立して未修飾か、または化学修飾されているヌクレオチドであり；
各Ｂは存在または非存在の末端キャップ部分であり；
（Ｎ）はオーバーハングしているヌクレオチドを示し、その各々は独立して未修飾であるか、または２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、または２’−デオキシリボヌクレオチドであり；
［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチドを示し；
Ｘ１およびＸ２は独立して０〜４の整数であり；
Ｘ３は９〜３０の整数であり；
Ｘ４は１１〜３０の整数であるが、ただし、Ｘ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；
Ｘ５は１〜６の整数であり；ここで、
（ａ）ＮＸ４位置の各ピリミジンヌクレオチドは独立して２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
ＮＸ４位置の各プリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
（ｂ）ＮＸ３位置の各ピリミジンヌクレオチドはリボヌクレオチドであり；
ＮＸ３位置の各プリンヌクレオチドはリボヌクレオチドである上記分子を含む。
【０２０７】
別の態様において、本発明は下記センス鎖およびアンチセンス鎖：
【化２８】
2012509688.tif 000030
を有する構造ＳＸＩ’を含む２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、
ここで、
上方の鎖はセンス鎖であり、下方の鎖は２本鎖核酸分子のアンチセンス鎖であり；該アンチセンス鎖は配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号２１に対する相補性を有する配列を含み、該センス鎖はアンチセンス鎖に対する相補性を有する配列を含み；
各Ｎは独立して未修飾か、または化学修飾されているヌクレオチドであり；
各Ｂは存在または非存在の末端キャップ部分であり；
（Ｎ）はオーバーハングしているヌクレオチドを示し、その各々は独立して未修飾であるか、または２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、または２’−デオキシリボヌクレオチドであり；
［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチドを示し；
Ｘ１およびＸ２は独立して０〜４の整数であり；
Ｘ３は９〜３０の整数であり；
Ｘ４は１１〜３０の整数であるが、ただし、Ｘ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；
Ｘ５は１〜６の整数であり；ここで、
（ａ）ＮＸ４位置の各ピリミジンヌクレオチドは独立して２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
ＮＸ４位置の各プリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
（ｂ）ＮＸ３位置の各ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
ＮＸ３位置の各プリンヌクレオチドはリボヌクレオチドである上記分子を含む。
【０２０８】
別の態様において、本発明は、下記センス鎖およびアンチセンス鎖：
【化２９】
2012509688.tif 000031
を有する構造ＳＸＩＩ’を含む２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、
ここで、
上方の鎖はセンス鎖であり、下方の鎖は２本鎖核酸分子のアンチセンス鎖であり；該アンチセンス鎖は配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号２１に対する相補性を有する配列を含み、該センス鎖はアンチセンス鎖に対する相補性を有する配列を含み；
各Ｎは独立して未修飾か、または化学修飾されているヌクレオチドであり；
各Ｂは存在または非存在の末端キャップ部分であり；
（Ｎ）はオーバーハングしているヌクレオチドを示し、その各々は独立して未修飾であるか、または２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、または２’−デオキシリボヌクレオチドであり；
［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチドを示し；
Ｘ１およびＸ２は独立して０〜４の整数であり；
Ｘ３は９〜３０の整数であり；
Ｘ４は１１〜３０の整数であるが、ただし、Ｘ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；
Ｘ５は１〜６の整数であり；ここで、
（ａ）ＮＸ４位置の各ピリミジンヌクレオチドは独立して２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
ＮＸ４位置の各プリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
（ｂ）ＮＸ３位置の各ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
ＮＸ３位置の各プリンヌクレオチドは２’−デオキシリボヌクレオチドである上記分子を含む。
【０２０９】
別の態様において、本発明は下記センス鎖およびアンチセンス鎖：
【化３０】
2012509688.tif 000032
を有する構造ＳＸＩＩＩ’を含む２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、
ここで、
上方の鎖はセンス鎖であり、下方の鎖は２本鎖核酸分子のアンチセンス鎖であり；該アンチセンス鎖は配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号２１に対する相補性を有する配列を含み、該センス鎖はアンチセンス鎖に対する相補性を有する配列を含み；
各Ｎは独立して未修飾か、または化学修飾されているヌクレオチドであり；
各Ｂは存在または非存在の末端キャップ部分であり；
（Ｎ）はオーバーハングしているヌクレオチドを示し、その各々は独立して未修飾であるか、または２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、または２’−デオキシリボヌクレオチドであり；
［Ｎ］はリボヌクレオチドであるヌクレオチドを示し；
Ｘ１およびＸ２は独立して０〜４の整数であり；
Ｘ３は９〜３０の整数であり；
Ｘ４は１１〜３０の整数であるが、ただし、Ｘ４とＸ５の総和は１７〜３６であり；
Ｘ５は１〜６の整数であり；ここで、
（ａ）ＮＸ４位置の各ピリミジンヌクレオチドはリボ様のノーザンまたはＡ型へリックス配置を有するヌクレオチドであり；
ＮＸ４位置の各プリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり；
（ｂ）ＮＸ３位置の各ピリミジンヌクレオチドはリボ様のノーザンまたはＡ型へリックス配置を有するヌクレオチドであり；
ＮＸ３位置の各プリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである上記分子を含む。
【０２１０】
上記した態様の１つの実施形態において、２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子はＸ５が３である構造ＳＩＸ’を含む。１つの実施形態において、２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子はＸ１が２であり、Ｘ２が２である構造ＳＩＸ’を含む。１つの実施形態において、２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子はＸ５が３であり、Ｘ１が２であり、Ｘ２が２である構造ＳＩＸ’を含む。１つの実施形態において、２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子はＸ５が３であり、Ｘ１が２であり、Ｘ２が２であり、Ｘ３が１９であり、Ｘ４が１６である構造ＳＩＸ’を含む。構造ＳＩＸ’、ＳＸ’、ＳＸＩ’、ＳＸＩＩ’、およびＳＸＩＩＩ’の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を含むがこれらに限定されない上記した態様の１つの実施形態において、Ｘ５＝１、２、または３；各Ｘ１およびＸ２＝１または２；Ｘ３＝１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０、およびＸ４＝１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０である。
【０２１１】
上記した態様の１つの実施形態において、Ｂはセンス鎖の３’および５’末端、場合によりアンチセンス鎖の３’末端に存在する。１つの実施形態において、Ｂはセンス鎖のみの３’および５’末端に存在する。
【０２１２】
本発明はまた、第１の鎖および第２の鎖が相互に相補的であり、ここで少なくとも１つの鎖がその全長に渡って配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号２１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有し、ここでヌクレオチドのいずれかは未修飾であるか、化学修飾されている、上記において別様に記載した２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む。１つの実施形態において、第１の鎖および第２の鎖が相互に相補的であり、少なくとも１つの鎖がその全長に渡って配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号２１の相補体に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有し、ここでヌクレオチドのいずれかは未修飾であるか、化学修飾されている。１つの実施形態において、第１の鎖および第２の鎖が相互に相補的であり、少なくとも１つの鎖がその全長に渡って、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号２１に対して少なくとも９５％の同一性、または、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号２１の相補体に対して少なくとも９５％の同一性を有し、ここでヌクレオチドのいずれかは未修飾であるか、化学修飾されている。１つの実施形態において、第１の鎖および第２の鎖が相互に対して９０％の相補性を有し、ここで少なくとも１つの鎖が配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号２１またはその相補体に対して少なくとも９５％の同一性を有する。
【０２１３】
本発明はまた、第１の鎖および第２の鎖が相互に相補的であり、ここで少なくとも１つの鎖が高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号２１またはその相補体のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能であり、ここでヌクレオチドのいずれかは未修飾であるか、化学修飾されている、上記において別様に記載した２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む。１つの実施形態において、第１の鎖および第２の鎖は相互に対して９０％の相補性を有し、少なくとも１つの鎖が高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号２１またはその相補体のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能であり、ここでヌクレオチドのいずれかは未修飾であるか、化学修飾されている。
【０２１４】
ヌクレオチド酸配列に関しては、「同一性」という用語は、最適にアラインし、適切な挿入および欠失を用いて比較した場合の、２つの核酸配列間の同一性の程度を示す。換言すれば、２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアライメントのために導入することが必要な、ギャップの数、および各ギャップの長さを考慮しながら、配列により共有される同一の位置の数の関数となる（即ち％同一性＝（同一位置数／位置総数）×１００）。配列の比較および２つの配列の間のパーセント同一性の測定は、後述する非限定的な例に記載される通り、数学的アルゴリズムを用いながら行うことができる。
【０２１５】
２つのヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０、または８０のギャップウエイト、および１、２、３、４、５、または６のレングスウエイトを用いながら、ＡｃｃｅｌｒｙのＧＣＧソフトウエアパッケージ（ウイスコンシン大学）におけるＧＡＰプログラムを用いて求める。２つのヌクレオチド配列の間のパーセント同一性はまた、ＰＡＭ１２０ウエイト残基表、１２のギャップレングスペナルティーおよび４のギャップペナルティーを用いながらＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓとＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））を用いて求めることもできる。
【０２１６】
ハイブリダイゼーションの手法は当業者には周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照できる）。好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸３ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，６）、５ｘＤｅｎｈａｒｄ溶液、１０％デキストランスルフェート、および２０マイクログラム／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中４２℃で一晩インキュベーション；その後約６５℃で０．１ｘＳＳＣ中フィルターを洗浄することを含む。
【０２１７】
本発明の別の態様は製薬上許容し得る担体または希釈剤中に本発明の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）を含む医薬組成物を含む。
【０２１８】
本発明の別の態様はＥＮａＣの作用により、または作用の損失により媒介される状態に罹患しているヒト対象を治療する方法を含み、その方法は本発明の２本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子の有効量を該対象に投与することを含む。この態様の１つの実施形態において、状態は呼吸器疾患により誘発される。本発明のこの態様により治療可能な呼吸器疾患はＣＯＰＤ、喘息、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、副鼻腔炎（特にＣＯＰＤ、嚢胞性線維症および喘息）を含む。
【０２１９】
ある態様において、本発明は医薬として使用するための本発明の２本鎖核酸の使用を含む。ある実施形態において、医薬はＥＮａＣの作用により、または作用の損失により媒介される状態を治療する場合に使用される。１つの実施形態において、医薬はＣＯＰＤ、喘息、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎からなる群より選択される呼吸器疾患の治療のために使用される。特定の実施形態においては、使用はＣＯＰＤ、嚢胞性線維症および喘息からなる群より選択される呼吸器疾患の治療のために使用される。
【０２２０】
別の態様において、本発明は医薬の製造における使用のための本発明の２本鎖核酸の使用を含む。ある実施形態において、医薬はＥＮａＣの作用により、または作用の損失により媒介される状態を治療する場合に使用される。１つの実施形態において、医薬は呼吸器疾患の治療のために使用される。ある実施形態において、医薬はＣＯＰＤ、喘息、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎からなる群より選択される呼吸器疾患の治療のために使用される。特定の実施形態においては、使用はＣＯＰＤ、嚢胞性線維症および喘息からなる群より選択される呼吸器疾患の治療のために使用される。
【０２２１】
当然ながら、上記した実施形態において、特に段落［０００１９７］〜［０００２１４］に記載した実施形態において、「短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）」という用語はＲＮＡ干渉を媒介することができる核酸分子を指す。
【０２２２】
１つの実施形態において、本発明は相互に相補的である第１の鎖および第２の鎖を各々が有する、第１の２本鎖核酸および第２の２本鎖核酸分子を含む組成物を特徴とし、ここで第１の２本鎖核酸分子の第２の鎖は第１のＥＮａＣ標的配列に相補的な配列を含み、第１の２本鎖核酸分子の第１の鎖は第２のＥＮａＣ標的配列に相補的な配列を含む。１つの実施形態において、組成物は更にカチオン性脂質、中性脂質、およびポリエチレングリコールコンジュゲートを含む。１つの実施形態において、組成物は更にカチオン性脂質、中性脂質、ポリエチレングリコールコンジュゲート、およびコレステロールを含む。１つの実施形態において、組成物は更にポリエチレングリコールコンジュゲート、コレステロールおよび界面活性剤を含む。１つの実施形態において、カチオン性脂質はＣＬｉｎＤＭＡ、ｐＣＬｉｎＤＭＡ、ｅＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、およびＤＭＬＢＡからなる群より選択される。１つの実施形態において、中性脂質はＤＳＰＣ、ＤＯＢＡ、およびコレステロールからなる群より選択される。１つの実施形態において、ポリエチレングリコールコンジュゲートはＰＥＧ−ジミリストイルグリセロールおよびＰＥＧ−コレステロールからなる群より選択される。１つの実施形態において、ＰＥＧは２ＫＰＥＧである。１つの実施形態において、界面活性剤はパルミチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコールおよびリノレイルアルコールからなる群より選択される。１つの実施形態において、カチオン性脂質はＣＬｉｎＤＭＡであり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ポリエチレングリコールコンジュゲートは２ＫＰＥＧ−ＤＭＧであり、コレステロールはコレステロールであり、界面活性剤はリノレイルアルコールである。１つの実施形態において、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＳＰＣ、２ＫＰＥＧ−ＤＭＧ、コレステロール、およびリノレイルアルコールはそれぞれ４３：３８：１０：２：７のモル比で存在する。
【０２２３】
本明細書に記載した実施形態のいずれかにおいて、本発明のｓｉＮＡ分子はＲＮＡ干渉またはＲＮＡ干渉の阻害を介してＥＮａＣ標的１つ以上の発現をモジュレートする。１つの実施形態において、ＲＮＡ干渉はＥＮａＣ標的のＲＩＳＣ媒介切断である（例えばｓｉＲＮＡ媒介ＲＮＡ干渉）。１つの実施形態において、ＲＮＡ干渉はＥＮａＣ標的の翻訳阻害である（例えばｍｉＲＮＡ媒介ＲＮＡ干渉）。１つの実施形態において、ＲＮＡ干渉はＥＮａＣ標的の転写阻害である（例えばｓｉＲＮＡ媒介転写サイレンシング）。１つの実施形態において、ＲＮＡ干渉は細胞質において起こる。１つの実施形態において、ＲＮＡ干渉は核において起こる。
【０２２４】
本明細書に記載した実施形態のいずれかにおいて、本発明のｓｉＮＡ分子は内因性ＥＮａＣ  ＲＮＡ、例えば内因性ＥＮａＣ  ｍＲＮＡ、ＥＮａＣ  ｓｉＲＮＡ、ＥＮａＣ  ｍｉＲＮＡの阻害を介して、或いはＲＩＳＣの阻害を通じて、ＥＮａＣ標的１つ以上の発現をモジュレートする。
【０２２５】
１つの実施形態において、本発明はｍｉＲＮＡ阻害、ｓｉＲＮＡ阻害、またはＲＩＳＣ阻害によりＥＮａＣ遺伝子標的１つ以上の発現をモジュレートするＲＮＡｉ阻害剤１つ以上を特徴とする。
【０２２６】
１つの実施形態において、本発明のＲＮＡｉ阻害剤は、標的ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子１つ以上に相補的である鎖１つ以上を有する本明細書に記載したｓｉＮＡ分子である。
【０２２７】
１つの実施形態において、本発明のＲＮＡｉ阻害剤は標的ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの分子またはその一部分に対して相補的なアンチセンス分子である。本発明のアンチセンスＲＮＡｉ阻害剤は約１０〜約４０ヌクレオチド長（例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオチド長）の長さであることができる。本発明のアンチセンスＲＮＡｉ阻害剤は本明細書に記載した修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチド１つ以上を含むことができる（例えば本明細書に記載した式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有する分子）。１つの実施形態において、本発明のアンチセンスＲＮＡｉ阻害剤は１つ以上または全ての２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むことができる。１つの実施形態において、本発明のアンチセンスＲＮＡｉ阻害剤は１つ以上または全ての２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含むことができる。１つの実施形態において、本発明のアンチセンスＲＮＡｉ阻害剤は１つ以上または全ての２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−メトキシエトキシまたはＭＯＥとしても知られている）ヌクレオチドを含むことができる。１つの実施形態において、本発明のアンチセンスＲＮＡｉ阻害剤は１つ以上または全てのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含むことができる。１つの実施形態において、本発明のアンチセンスＲＮＡｉ阻害剤はアンチセンスＲＮＡ阻害剤の３’末端、５’末端、または５’と３’末端の両方に末端キャップ部分を含むことができる。
【０２２８】
１つの実施形態において、本発明のＲＮＡｉ阻害剤は調節可能なアプタマー等のＲＩＳＣに対する結合親和性を有する核酸アプタマーである（例えばＡｎ等、２００６，ＲＮＡ，１２：７１０−７１６参照）。本発明のアプタマーＲＮＡｉ阻害剤は約１０〜約５０ヌクレオチド長（例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチド長）の長さであることができる。本発明のアプタマーＲＮＡｉ阻害剤は本明細書に記載した修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチド１つ以上を含むことができる（例えば本明細書に記載した式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有する分子）。１つの実施形態において、本発明のアプタマーＲＮＡｉ阻害剤は１つ以上または全ての２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むことができる。１つの実施形態において、本発明のアプタマーＲＮＡｉ阻害剤は１つ以上または全ての２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含むことができる。１つの実施形態において、本発明のアプタマーＲＮＡｉ阻害剤は１つ以上または全ての２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−メトキシエトキシまたはＭＯＥとしても知られている）ヌクレオチドを含むことができる。１つの実施形態において、本発明のアプタマーＲＮＡｉ阻害剤は１つ以上または全てのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含むことができる。１つの実施形態において、本発明のアプタマーＲＮＡｉ阻害剤はアプタマーＲＮＡ阻害剤の３’末端、５’末端、または５’と３’末端の両方に末端キャップ部分を含むことができる。
【０２２９】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾されているか未修飾であることができる本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること、ここでｓｉＮＡ鎖の１つはＥＮａＣ標的遺伝子のＲＮＡに対して相補的な配列を含むものであること；および（ｂ）細胞中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で細胞内にｓｉＮＡ分子を導入すること、を含む細胞内部におけるＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートするための方法を特徴とする。
【０２３０】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾されているか未修飾であることができる本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること、ここでｓｉＮＡ鎖の１つはＥＮａＣ標的遺伝子のＲＮＡに対して相補的な配列を含むものであり、ここでｓｉＮＡのセンス鎖の配列はＥＮａＣ標的ＲＮＡの配列と同一か実質的に同様である配列を含むものであること；および（ｂ）細胞中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で細胞内にｓｉＮＡ分子を導入すること、を含む細胞内部におけるＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートするための方法を特徴とする。
【０２３１】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾されているか未修飾であることができる本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること、ここでｓｉＮＡ鎖の１つはＥＮａＣ標的遺伝子のＲＮＡに対して相補的な配列を含むものであること；および（ｂ）細胞中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で細胞内にｓｉＮＡ分子を導入すること、を含む細胞内部における１つより多いＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートするための方法を特徴とする。
【０２３２】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾されているか未修飾であることができる本発明のｓｉＮＡ分子１つ以上を合成すること、ここでｓｉＮＡ鎖はＥＮａＣ標的遺伝子のＲＮＡに対して相補的な配列を含むものであり、ここでｓｉＮＡのセンス鎖の配列はＥＮａＣ標的ＲＮＡの配列と同一か実質的に同様である配列を含むものであること；および（ｂ）細胞中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で細胞内にｓｉＮＡ分子を導入すること、を含む細胞内部におけるＥＮａＣ標的遺伝子２つ以上の発現をモジュレートするための方法を特徴とする。
【０２３３】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾されているか未修飾であることができる本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること、ここでｓｉＮＡ鎖の１つはＥＮａＣ標的遺伝子のＲＮＡに対して相補的な配列を含むものであり、ここでｓｉＮＡのセンス鎖の配列はＥＮａＣ標的ＲＮＡの配列と同一か実質的に同様である配列を含むものであること；および（ｂ）細胞中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で細胞内にｓｉＮＡ分子を導入すること、を含む細胞内部における１つより多いＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートするための方法を特徴とする。
【０２３４】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾されているか未修飾であることができる本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること、ここでｓｉＮＡ鎖の１つはＥＮａＣ標的遺伝子のＲＮＡに対して相補的な配列を含むものであり、ここでｓｉＮＡのセンス鎖の配列はＥＮａＣ標的ＲＮＡの配列と同一か実質的に同様である配列を含むものであること；および（ｂ）細胞中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で細胞内にｓｉＮＡ分子を導入すること、を含む細胞内部におけるＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートするための方法を特徴とする。
【０２３５】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子はエクスビボの用途において試薬として使用される。例えば、ｓｉＮＡ試薬は治療効果のために対象内に移植される組織または細胞内に導入される。細胞および／または組織は後に外植片を受領する生物または対象から誘導されることができ、または、移植の前に別の生物または対象から誘導されることができる。ｓｉＮＡ分子は、細胞または組織が所望の表現型を得るか、またはインビボ移植時に機能を発揮できるように、細胞または組織中の遺伝子１つ以上の発現をモジュレートするために使用できる。１つの実施形態において、患者に由来する特定の標的細胞を抽出する。これらの抽出された細胞は、これらの細胞によるｓｉＮＡの取り込みに適する条件下で細胞内部の特定のヌクレオチド配列をターゲティングするＥＮａＣ  ｓｉＮＡと接触させられる（例えばカチオン性脂質、リポソーム等のような送達試薬を使用するか、または細胞内へのｓｉＮＡの送達を促進するエレクトロポレーション等の手法を使用する）。次に細胞を同じ患者または別の患者内に導入し戻す。
【０２３６】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾されていることができる本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること、ここでｓｉＮＡ鎖の１つはＥＮａＣ標的遺伝子のＲＮＡに対して相補的な配列を含むものであること；および（ｂ）特定の生物から誘導した組織外植片の細胞内に、組織外植片中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で、ｓｉＮＡ分子を導入すること、を含む組織外植片におけるＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートする方法を特徴とする。別の実施形態においては、方法は更に、組織の誘導元の生物内に、または、別の生物内に、その生物におけるＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で、組織外植片を導入し戻すことを含む。
【０２３７】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾されていることができる本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること、ここでｓｉＮＡ鎖の１つはＥＮａＣ標的遺伝子のＲＮＡに対して相補的な配列を含むものであり、ここでｓｉＮＡのセンス鎖の配列はＥＮａＣ標的ＲＮＡの配列と同一か実質的に同様である配列を含むものであること；および（ｂ）特定の生物から誘導した組織外植片の細胞内に、組織外植片中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で、ｓｉＮＡ分子を導入すること、を含む組織外植片におけるＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートする方法を特徴とする。別の実施形態においては、方法は更に、組織の誘導元の生物内に、または、別の生物内に、その生物におけるＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で、組織外植片を導入し戻すことを含む。
【０２３８】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾されていることができる本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること、ここでｓｉＮＡ鎖の１つはＥＮａＣ標的遺伝子のＲＮＡに対して相補的な配列を含むものであること；および（ｂ）特定の生物から誘導した組織外植片の細胞内に、組織外植片中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で、ｓｉＮＡ分子を導入すること、を含む組織外植片における１つより多いＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートする方法を特徴とする。別の実施形態においては、方法は更に、組織の誘導元の生物内に、または、別の生物内に、その生物におけるＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で、組織外植片を導入し戻すことを含む。
【０２３９】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾されていることができる本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること、ここでｓｉＮＡ鎖の１つはＥＮａＣ標的遺伝子のＲＮＡに対して相補的な配列を含むものであること；および（ｂ）対象または生物内に、対象または生物中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で、ｓｉＮＡ分子を導入すること、を含む対象または生物におけるＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートする方法を特徴とする。ＥＮａＣ標的タンパク質またはＲＮＡのレベルは当分野で周知の種々の方法を用いながら測定できる。
【０２４０】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾されていることができる本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること、ここでｓｉＮＡ鎖の１つはＥＮａＣ標的遺伝子のＲＮＡに対して相補的な配列を含むものであること；および（ｂ）対象または生物内に、対象または生物中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で、ｓｉＮＡ分子を導入すること、を含む対象または生物における１つより多いＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートする方法を特徴とする。ＥＮａＣ標的タンパク質またはＲＮＡのレベルは当分野で周知の種々の方法を用いながら測定できる。
【０２４１】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾されていることができる本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること、ここでｓｉＮＡはＥＮａＣ標的遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有する１本鎖配列を含むものであること；および（ｂ）細胞内に、細胞中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で、ｓｉＮＡ分子を導入すること、を含む細胞（例えば肺または肺上皮細胞）内部におけるＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートするための方法を特徴とする。
【０２４２】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾されていることができる本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること、ここでｓｉＮＡはＥＮａＣ標的遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有する１本鎖配列を含むものであること；および（ｂ）細胞を、細胞中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で、ｓｉＮＡ分子と、インビトロまたはインビボで接触させること、を含む細胞（例えば肺または肺上皮細胞）内部における１つより多いＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートするための方法を特徴とする。
【０２４３】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾されていることができる本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること、ここでｓｉＮＡはＥＮａＣ標的遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有する１本鎖配列を含むものであること；および（ｂ）特定の対象または生物から誘導した組織外植片の細胞を、組織外植片中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で、ｓｉＮＡ分子と接触させること、を含む、組織外植片（例えばある生物から別のものに、或いは臓器、組織または細胞の誘導元である同生物に戻るように、移植されることができるものとしての、肺またはいずれかの別の臓器、組織または細胞）におけるＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートする方法を特徴とする。別の実施形態においては、方法は更に、組織の誘導元の対象または生物内に、または、別の対象または生物内に、その対象または生物におけるＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で、組織外植片を導入し戻すことを含む。
【０２４４】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾されていることができる本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること、ここでｓｉＮＡはＥＮａＣ標的遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有する１本鎖配列を含むものであること；および（ｂ）特定の対象または生物から誘導した組織外植片の細胞内に、組織外植片中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で、ｓｉＮＡ分子を導入すること、を含む、組織外植片（例えばある生物から別のものに、或いは臓器、組織または細胞の誘導元である同生物に戻るように、移植されることができるものとしての、肺またはいずれかの別の臓器、組織または細胞）における１つより多いＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートする方法を特徴とする。別の実施形態においては、方法は更に、組織の誘導元の対象または生物内に、または、別の対象または生物内に、その対象または生物におけるＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で、組織外植片を導入し戻すことを含む。
【０２４５】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾されていることができる本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること、ここでｓｉＮＡはＥＮａＣ標的遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有する１本鎖配列を含むものであること；および（ｂ）対象または生物内に、対象または生物中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で、ｓｉＮＡ分子を導入すること、を含む対象または生物におけるＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートする方法を特徴とする。
【０２４６】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾されていることができる本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること、ここでｓｉＮＡはＥＮａＣ標的遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有する１本鎖配列を含むものであること；および（ｂ）対象または生物内に、対象または生物中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で、ｓｉＮＡ分子を導入すること、を含む対象または生物における１つより多いＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートする方法を特徴とする。
【０２４７】
１つの実施形態において、本発明は、対象または生物を、対象または生物中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で、本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、対象または生物におけるＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートする方法を特徴とする。
【０２４８】
１つの実施形態において、本発明は、対象または生物を、対象または生物中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートするのに適する条件下で、本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、対象または生物における、遺伝子の発現または活性に関連する疾患、障害、体質または状態を治療または防止するための方法を特徴とする。遺伝子発現の低減、これによる該当するタンパク質／ＲＮＡのレベルの低減は、ある程度まで、疾患、障害、体質または状態の症状を緩和する。
【０２４９】
１つの実施形態において、本発明は、対象または生物中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートするのに適する条件下で、対象または生物を、本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることにより呼吸器の疾患、体質、または状態の治療または防止を達成できるようにすることを含む、対象または生物における、１つ以上の呼吸器の疾患、体質、または状態を治療または防止するための方法を特徴とする。１つの実施形態において、本発明は、肺送達を介する等による肺の細胞および組織等の該当する組織または細胞への局所投与を介して、対象または生物を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを特徴とする。１つの実施形態において、本発明は、対象または生物において呼吸器の疾患、体質、または状態の維持または発症に関与する組織または細胞等の該当する組織または細胞への全身投与（例えばｓｉＮＡの静脈内または皮下投与）を介して、対象または生物を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを特徴とする。本発明のｓｉＮＡ分子は本明細書に記載する通り、または別様に当分野で知られる通り、製剤またはコンジュゲートすることにより対象または生物における適切な組織または細胞をターゲティングすることができる。ｓｉＮＡ分子は対象または生物における呼吸器の疾患、体質、または状態の治療または防止のために当分野で知られる通り他の施療的治療および治療様式と組み合わせることができる。
【０２５０】
１つの実施形態において、本発明は、対象または生物中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートするのに適する条件下で、対象または生物を、本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることによりＣＯＰＤ、喘息、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎および／または副鼻腔炎の治療または防止を達成できるようにすることを含む、対象または生物における、ＣＯＰＤ、喘息、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎および／または副鼻腔炎を治療または防止するための方法を特徴とする。１つの実施形態において、本発明は、ＣＯＰＤ、喘息、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、急性および慢性の肺自家移植片拒絶、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎および／または副鼻腔炎に関与する肺または気道の細胞および組織等の、該当する組織または細胞への局所投与を介して、対象または生物を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを特徴とする。１つの実施形態において、本発明は、対象または生物においてＣＯＰＤ、喘息、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、急性および慢性の肺自家移植片拒絶、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎および／または副鼻腔炎の維持または発症に関与する組織または細胞等の該当する組織または細胞への全身投与（例えばｓｉＮＡの静脈内または皮下投与）を介して、対象または生物を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを特徴とする。本発明のｓｉＮＡ分子は本明細書に記載する通り、または別様に当分野で知られる通り、製剤またはコンジュゲートすることにより対象または生物における適切な組織または細胞をターゲティングすることができる。ｓｉＮＡ分子は対象または生物におけるＣＯＰＤ、喘息、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎および／または副鼻腔炎の治療または防止のために当分野で知られる通り他の施療的治療および治療様式と組み合わせることができる。
【０２５１】
１つの実施形態において、本発明は対象または生物におけるＥＮａＣ遺伝子の発現の阻害剤の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で、対象または生物を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、対象または生物における１つ以上の呼吸器の疾患、体質、または状態を治療または防止するための方法を特徴とする。１つの実施形態において、ＥＮａＣ遺伝子発現の阻害剤はｍｉＲＮＡである。
【０２５２】
１つの実施形態において、本発明は、対象または生物中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートするのに適する条件下で、対象または生物を、本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることにより炎症性の疾患、体質、または状態の治療または防止を達成できるようにすることを含む、対象または生物における、１つ以上の炎症性の疾患、体質、または状態を治療または防止するための方法を特徴とする。１つの実施形態において、本発明は、肺送達を介する等による肺の細胞および組織等の該当する組織または細胞への局所投与を介して、対象または生物を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを特徴とする。１つの実施形態において、本発明は、対象または生物において炎症性の疾患、体質、または状態の維持または発症に関与する組織または細胞等の該当する組織または細胞への全身投与（例えばｓｉＮＡの静脈内または皮下投与）を介して、対象または生物を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを特徴とする。本発明のｓｉＮＡ分子は本明細書に記載する通り、または別様に当分野で知られる通り、製剤またはコンジュゲートすることにより対象または生物における適切な組織または細胞をターゲティングすることができる。ｓｉＮＡ分子は対象または生物における炎症性の疾患、体質、または状態の治療または防止のために当分野で知られる通り他の施療的治療および治療様式と組み合わせることができる。
【０２５３】
１つの実施形態において、本発明は対象または生物におけるＥＮａＣ遺伝子の発現の阻害剤の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で、対象または生物を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、対象または生物における１つ以上の炎症性の疾患、体質、または状態を治療または防止するための方法を特徴とする。１つの実施形態において、ＥＮａＣ遺伝子発現の阻害剤はｍｉＲＮＡである。
【０２５４】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子または２本鎖核酸分子は、２００５年７月２９日出願の米国仮特許出願第６０／６７８，５３１号および関連の米国仮特許出願第６０／７０３，９４６号、および、２００５年１１月１５日出願の米国仮特許出願第６０／７３７，０２４号（Ｖａｒｇｅｅｓｅ等）に記載されている組成物として製剤化される。
【０２５５】
対象における上皮ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ）関連の、疾患、体質、または状態を治療または防止するための上記した方法のいずれかにおいて、治療は例えばアルブテロールまたはアルブテロールスルフェートを含む一般的に当分野で知られる通り、β−２アゴニスト組成物の投与と組み合わせる。
【０２５６】
対象における上皮ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ）関連の、疾患、体質、表現型または状態を治療または防止するための上記した方法のいずれかにおいて、治療は一般的に当分野で知られる通り、ＰＤＥ４阻害剤組成物の投与と組み合わせる（例えばシルデナフィル、モタピゾン、ロリプラム、およびザプリナスト、ザルダベリンおよびトラフェントリン）。
【０２５７】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子または２本鎖核酸分子は、２００５年７月２９日出願の米国仮特許出願第６０／６７８，５３１号および関連の米国仮特許出願第６０／７０３，９４６号、および、２００５年１１月１５日出願の米国仮特許出願第６０／７３７，０２４号、および２００６年２月１４日出願のＵＳＳＮ１１／３５３，６３０、および２００６年１０月２４日出願のＵＳＳＮ１１／５８６，１０２（Ｖａｒｇｅｅｓｅ等）に記載されている組成物として製剤化される。
【０２５８】
細胞、対象、または生物において、標的１つ以上の発現をモジュレートするため、または疾患、体質、状態、または表現型を治療または防止するための本明細書に記載した方法のいずれかにおいて、本発明のｓｉＮＡ分子はＲＮＡ干渉を介してＥＮａＣ標的１つ以上の発現をモジュレートする。１つの実施形態において、ＲＮＡ干渉はＥＮａＣ標的のＲＩＳＣ媒介切断である（例えばｓｉＲＮＡ媒介ＲＮＡ干渉）。１つの実施形態において、ＲＮＡ干渉はＥＮａＣ標的の翻訳阻害である（例えばｍｉＲＮＡ媒介ＲＮＡ干渉）。１つの実施形態において、ＲＮＡ干渉はＥＮａＣ標的の転写阻害である（例えばｓｉＲＮＡ媒介転写サイレンシング）。１つの実施形態において、ＲＮＡ干渉は細胞質において起こる。１つの実施形態において、ＲＮＡ干渉は核において起こる。
【０２５９】
本発明の治療の方法のいずれかにおいて、ｓｉＮＡは、治療の過程として、例えば種々の時間間隔をおいた投与、例えば治療のコースに渡って１日当たり１回、治療のコースに渡って２日毎に１回、治療のコースに渡って３日毎に１回、治療のコースに渡って４日毎に１回、治療のコースに渡って５日毎に１回、治療のコースに渡って６日毎に１回、治療のコースに渡って週当たり１回、治療のコースに渡って隔週１回、治療のコースに渡って月当たり１回等、対象に投与できる。１つの実施形態において、治療のコースは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週毎に１回である。１つの実施形態において、治療のコースは約１〜約５２週間以上（例えば無期限）となる。１つの実施形態において、治療のコースは約１〜約４８ヶ月以上（例えば無期限）となる。
【０２６０】
１つの実施形態において、治療のコースは治療の初期コース、例えば固定された時間間隔（例えば１ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、または１０ｘ以上）の間は１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間以上毎に１回、その後は治療の維持コース、例えば追加的な固定された時間間隔（例えば１ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、または１０ｘ以上）間、４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０週間以上毎に１回とする。
【０２６１】
本発明の治療方法のいずれかにおいて、ｓｉＮＡは単剤療法として単独で、または、本明細書に記載した、または当分野で知られた追加的治療薬と組み合わせて、本明細書に記載する通り、または別様に当分野で知られる通り、対象に全身投与できる。全身投与は、例えば、一般的に当分野で知られる通り、肺（吸入、噴霧等）、静脈内、皮下、筋肉内、カテーテル留置、鼻咽頭、経皮、または経口／胃腸投与を含むことができる。
【０２６２】
１つの実施形態において、本発明の治療または防止の方法のいずれかにおいて、ｓｉＮＡは単剤療法として単独で、または、本明細書に記載した、または当分野で知られた追加的治療薬と組み合わせて、本明細書に記載する通り、または別様に当分野で知られる通り、局所的に対象に、または局所組織に、投与できる。局所投与は例えば一般的に当分野で知られる通り、吸入、噴霧、カテーテル留置、移植、直接注射、皮膚／経皮適用、ステント設置、点耳／点眼液、または該当組織への門脈投与、またはいずれかの他の局所投与の手法、方法または操作法を含む。
【０２６３】
本発明の化合物および医薬品製剤は、例えば抗炎症剤、抗コリン作用剤（特にＭ１／Ｍ２／Ｍ３受容体拮抗剤）、β２−アドレナリン作用性受容体アゴニスト、抗感染剤、例えば抗生物質、抗ウィルス剤、または抗ヒスタミンから選択される１つ以上の他の治療薬と組み合わせて使用できるか、またはこれらを含むことができる。即ち本発明は、別の態様において、式（Ｉ）の化合物または製薬上許容し得るその塩、溶媒和物または生理学的に機能性のある誘導体を、例えば抗炎症剤、例えばコルチコステロイドまたはＮＳＡＩＤ、抗コリン作用剤、β２−アドレナリン作用性受容体アゴニスト、抗感染剤、例えば抗生物質、抗ウィルス剤、または抗ヒスタミンから選択される１つ以上の他の治療活性剤と共に含む複合物を提供する。本発明の１つの実施形態は、式（Ｉ）の化合物または製薬上許容し得るその塩、溶媒和物または生理学的に機能性のある誘導体をβ２−アドレナリン作用性受容体アゴニスト、および／または抗コリン作用剤、および／またはＰＤＥ−４阻害剤、および／または抗ヒスタミンと共に含む複合物を含む。
【０２６４】
本発明の１つの実施形態は１つまたは２つの他の治療剤を含む複合物を含む。当業者のよく知る通り、適宜、他の治療成分を、塩の形態において、例えばアルカリ金属またはアミンの塩として、または酸付加塩またはプロドラッグとして、またはエステル、例えば低級アルキルエステルとして、または溶媒和物、例えば水和物として使用することにより、治療成分の活性および／または安定性および／または物理的特性、例えば溶解度を最適化することができる。同じく当然ながら、適宜、治療成分は工学的に純粋な形態で使用できる。
【０２６５】
１つの実施形態において、本発明はβ２−アドレナリン作用性受容体アゴニストと共に本発明の化合物を含む複合物を含む。β２−アドレナリン作用性受容体アゴニストの非限定的な例はサルメテロール（これはラセミ混合物であるか、単一のエナンチオマー、例えばＲエナンチオマーであることができる）、サルブタモール（これはラセミ混合物であるか、単一のエナンチオマー、例えばＲエナンチオマーであることができる）、ホルモテロール（これはラセミ混合物であるか、単一のエナンチオマー、例えばＲ，Ｒ−ジアステレオマーであることができる）、サルメファモール、フェノテロール、カルモテロール、エタンテロール、ナミンテロール、クレンブテロール、ピルブテロール、フレルブテロール、レプロテロール、バムブテロール、インダカテロール、テルブタリンおよびその塩、例えばサルメテロールのキシナフォレート（１−ヒドロキシ−２−ナフタレンカルボキシレート）塩、サルブタモールのスルフェート塩または遊離の塩基、またはホルモテロールのフマレート塩を含む。１つの実施形態において、β２−アドレナリン作用性受容体アゴニストは長時間作用性のβ２−アドレナリン作用性受容体アゴニスト、例えば約１２時間以上効果的な気管支拡張をもたらす化合物である。
【０２６６】
他のβ２−アドレナリン作用性受容体アゴニストはＷＯ０２／０６６４２２、ＷＯ０２／０７０４９０、ＷＯ０２／０７６９３３、ＷＯ０３／０２４４３９、ＷＯ０３／０７２５３９、ＷＯ０３／０９１２０４、ＷＯ０４／０１６５７８、ＷＯ２００４／０２２５４７、ＷＯ２００４／０３７８０７、ＷＯ２００４／０３７７７３、ＷＯ２００４／０３７７６８、ＷＯ２００４／０３９７６２、ＷＯ２００４／０３９７６６、ＷＯ０１／４２１９３およびＷＯ０３／０４２１６０に記載されているものを含む。
【０２６７】
β２−アドレナリン作用性受容体アゴニストの更なる例として、３−（４−{［６−（{（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−［４−ヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）フェニル］エチル}アミノ）ヘキシル］オキシ}ブチル）ベンゼンスルホンアミド；３−（３−{［７−（{（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−［４−ヒドロキシ−３−ヒドロキシメチル）フェニル］エチル}−アミノ）ヘプチル］オキシ}プロピル）ベンゼンスルホンアミド；４−{（１Ｒ）−２−［（６−{２−[（２，６−ジクロロベンジル）オキシ]エトキシ}ヘキシル）アミノ］−１−ヒドロキシエチル}−２−（ヒドロキシメチル）フェノール；４−{（１Ｒ）−２−［（６−{４−［３−（シクロペンチルスルホニル）フェニル］ブトキシ}ヘキシル）アミノ］−１−ヒドロキシエチル}−２−（ヒドロキシメチル）フェノール：Ｎ−［２−ヒドロキシル−５−［（１Ｒ）−１−ヒドロキシ−２−［{２−４−［［（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２フェニルエチル］アミノ］フェニル］エチル］アミノ］エチル］フェニル］ホルムアミド；Ｎ−２{２−[４−（３−フェニル−４−メトキシフェニル）アミノフェニル]エチル}−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２（１Ｈ）−キノリン−５−イル）エチルアミン；及び５−［（Ｒ）−２−（２−{４−[４−（２−アミノ−２−メチループロピル）−フェニルアミノ]−フェニル}−エチルアミノ）−１−ヒドロキシ−エチル］−８−ヒドロキシ−１Ｈ−キノリン−２−オンがあげられる。
【０２６８】
１つの実施形態において、β２−アドレナリン作用性受容体アゴニストは、硫酸、塩酸、フマル酸、ヒドロキシナフトエ酸（例えば１−または３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸）、桂皮酸、置換桂皮酸、トリフェニル酢酸、スルファミン酸、スルファニル酸、ナフタレンアクリル酸、安息香酸、４−メトキシ安息香酸、２−または４−ヒドロキシ安息香酸、４−クロロ安息香酸および４−フェニル安息香酸から選択される製薬上許容し得る酸と共に形成された塩の形態であることができる。適当な抗炎症剤はコルチコステロイドを含む。本発明の化合物と組み合わせて使用できるコルチコステロイドの例は、経口および吸入用のコルチコステロイドおよび抗炎症作用を有するそれらのプロドラッグである。非限定的な例はメチルプレドニソロン、プレドニソロン、デキサメタゾン、フルチカゾンプロピオネート、６α，９α−ジフルオロ−ｌｌβ−ヒドロキシ−１６α−メチル−１７α−［（４−メチル−ｌ，３−チアゾール−５−カルボニル）オキシ］−３−オキソ−アンドロスタ−ｌ，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル、６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−ｌｌβ−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−アンドロスタ−ｌ，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル（フルチカゾンフロエート）、６α，９α−ジフルオロ−ｌｌβ−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−１７α−プロピオニルオキシ−アンドロスタ−ｌ，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−（２−オキソ−テトラヒドロフラン−３Ｓ−イル）エステル、６α，９α−ジフルオロ−ｌｌβ−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−１７α−（２，２，３，３−テトラメチルシクロプロピルカルボニル）オキシ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−シアノメチルエステルおよび６α，９α−ジフルオロ−ｌｌβ−ヒドロキシ−１６α−メチル−１７α−（ｌ−メチルシクロプロピルカルボニル）オキシ−３−オキソ−アンドロスタ−ｌ，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル、ベクロメタゾンエステル（例えば１７−プロピオネートエステルまたは１７，２１−ジプロピオネートエステル）、ブデソニド、フルニソリド、モメタゾンエステル（例えばモメタゾンフロエート）、トリアムシノロンアセトニド、ロフレポニド、シクレソニド（１６α，１７−［［（Ｒ）−シクロヘキシルメチレン］ビス（オキシ）］−ｌｌβ，２１−ジヒドロキシ−プレグナ−ｌ，４−ジエン−３，２０−ジオン）、ブチキソコートプロピオネート、ＲＰＲ−１０６５４１、およびＳＴ−１２６を含む。１つの実施形態において、コルチコステロイドはフルチカゾンプロピオネート、６α，９α−ジフルオロ−ｌｌβ−ヒドロキシ−１６α−メチル−１７α−［（４−メチル−ｌ，３−チアゾール−５−カルボニル）オキシ］−３−オキソ−アンドロスタ−ｌ，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル、６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−ｌｌβ−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−アンドロスタ−ｌ，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル、６α，���α−ジフルオロ−ｌｌβ−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−１７α−（２，２，３，３−テトラメチルシクロプロピルカルボニル）オキシ−アンドロスタ−ｌ，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−シアノメチルエステルおよび６α，９α−ジフルオロ−ｌｌβ−ヒドロキシ−１６α−メチル−１７α−（ｌ−メチルシクロプロピルカルボニル）オキシ−３−オキソ−アンドロスタ−ｌ，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステルを含む。１つの実施形態において、コルチコステロイドは６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−ｌｌβ−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−アンドロスタ−ｌ，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステルである。コルチコステロイドの非限定的な例は以下の公開された特許出願および特許、即ち：ＷＯ０２／０８８１６７、ＷＯ０２／１００８７９、ＷＯ０２／１２２６５、ＷＯ０２／１２２６６、ＷＯ０５／００５４５１、ＷＯ０５／００５４５２、ＷＯ０６／０７２５９９およびＷＯ０６／０７２６００に記載されているものを含むことができる。
【０２６９】
１つの実施形態において、トランス活性化よりもトランス抑制に対して選択性を有することができ、複合療法において有用であることができるグルココルチコイドアゴニスト作用を有する非ステロイドの化合物は以下の公開された特許出願および特許、即ちＷＯ０３／０８２８２７、ＷＯ９８／５４１５９、ＷＯ０４／００５２２９、ＷＯ０４／００９０１７、ＷＯ０４／０１８４２９、ＷＯ０３／１０４１９５、ＷＯ０３／０８２７８７、ＷＯ０３／０８２２８０、ＷＯ０３／０５９８９９、ＷＯ０３／１０１９３２、ＷＯ０２／０２５６５、ＷＯ０１／１６１２８、ＷＯ００／６６５９０、ＷＯ０３／０８６２９４、ＷＯ０４／０２６２４８、ＷＯ０３／０６１６５１、ＷＯ０３／０８２７７、ＷＯ０６／０００４０１、ＷＯ０６／０００３９８およびＷＯ０６／０１５８７０に記載されているものを含む。
【０２７０】
トランス活性化よりもトランス抑制に対して選択性を有することができ、複合療法において有用であることができるグルココルチコイドアゴニスト作用を有する非ステロイドの化合物は以下の特許、即ちＷＯ０３／０８２８２７、ＷＯ９８／５４１５９、ＷＯ０４／００５２２９、ＷＯ０４／００９０１７、ＷＯ０４／０１８４２９、ＷＯ０３／１０４１９５、ＷＯ０３／０８２７８７、ＷＯ０３／０８２２８０、ＷＯ０３／０５９８９９、ＷＯ０３／１０１９３２、ＷＯ０２／０２５６５、ＷＯ０１／１６１２８、ＷＯ００／６６５９０、ＷＯ０３／０８６２９４、ＷＯ０４／０２６２４８、ＷＯ０３／０６１６５１およびＷＯ０３／０８２７７に記載されているものを含む。
【０２７１】
抗炎症剤の非限定的な例は非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）を含む。
【０２７２】
ＮＳＡＩＤの非限定的な例はナトリウムクロモグリケート、ネドクロミルナトリウム、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤（例えばテオフィリン、ＰＤＥ４阻害剤または混合型ＯＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤）、ロイコトリエン拮抗剤、ロイコトリエン合成の阻害剤（例えばモンテルカスト）、ｉＮＯＳ阻害剤、トリプターゼおよびエラスターゼの阻害剤、β−２−インテグリン拮抗剤およびアデノシン受容体のアゴニストまたは拮抗剤（例えばアデノシン２ａアゴニスト）、サイトカイン拮抗剤（例えばケモカイン拮抗剤、例えばＣＣＲ３拮抗剤）またはサイトカイン合成の阻害剤、または５−リポキシゲナーゼ阻害剤を含む。１つの実施形態において、本発明は経口投与用のｉＮＯＳ（誘導型酸化窒素シンターゼ）の阻害剤を含む。ｉＮＯＳ阻害剤の例は以下の公開された国際特許および特許出願、即ちＷＯ９３／１３０５５、ＷＯ９８／３０５３７、ＷＯ０２／５００２１、ＷＯ９５／３４５３４およびＷＯ９９／６２８７５に開示されているものを含む。ＣＣＲ３阻害剤の例はＷＯ０２／２６７２２に開示されているものを含む。
【０２７３】
１つの実施形態において、本発明は、例えば吸入に適合された処方の場合の、ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤と組み合わせた式（Ｉ）の化合物の使用を提供する。本発明のこの特徴において有用なＰＤＥ４特異的阻害剤は、ＰＤＥ４酵素を阻害することが知られているか、ＰＤＥ４阻害剤として作用することが発見されており、ＰＤＥ４阻害剤であるのみであってＰＤＥファミリーの別のメンバー、例えばＰＤＥ３およびＰＤＥ５もＰＤＥ４と同様に阻害する化合物ではない、いずれかの化合物であることができる。
【０２７４】
化合物はシス−４−シアノ−４−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）シクロヘキサン−ｌ−カルボン酸、２−カルボメトキシ−４−シアノ−４−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシフェニル）シクロヘキサン−１−オンおよびシス−［４−シアノ−４−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシフェニル）シクロヘキサン−１−オール］を含む。同様にシス−４−シアノ−４−［３−（シクロペンチルオキシ）−４−メトキシフェニル］シクロヘキサン−ｌ−カルボン酸（シロミラストとしても知られている）およびその塩、エステル、プロドラッグまたは物理的形態も挙げられ、これは１９９６年９月３日に発行された米国特許第５，５５２，４３８号に記載されており；この特許およびそれが開示している化合物は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０２７５】
その他の化合物は  ＡＷＤ−１２−２８１、販売元：Ｅｌｂｉｏｎ（Ｈｏｆｇｅｎ、Ｎ．等、１５ｔｈ  ＥＦＭＣ  Ｉｎｔ  Ｓｙｍｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ（Ｓｅｐｔ  ６−１０、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ）１９９８、Ａｂｓｔ  Ｐ．９８；ＣＡＳ参照番号：２４７５８４０２０−９）；９−ｂベンジルアデニン誘導体、登録名ＮＣＳ−６１３（ＩＮＳＥＲＭ）；Ｄ−４４１８、販売元：Ｃｈｉｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ；ベンゾジアゼピンＰＤＥ４阻害剤、識別名：ＣＩ−１０１８（ＰＤ−１６８７８７）、帰属先：Ｐｆｉｚｅｒ；ベンゾジオキソール誘導体、Ｋｙｏｗａ  ＨａｋｋｏがＷＯ９９／１６７６６において開示；Ｋ−３４、販売元：Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ；Ｖ−１１２９４Ａ、販売元：Ｎａｐｐ（Ｌａｎｄｅｌｌｓ、ＬＪ．等、Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐ  Ｊ［Ａｎｎｕ  Ｃｏｎｇ  Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐ  Ｓｏｃ（Ｓｅｐｔ  １９−２３、Ｇｅｎｅｖａ）１９９８］１９９８、１２（Ｓｕｐｐｌ．２８）：Ａｂｓｔ  Ｐ２３９３）；ロフルミラスト（ＣＡＳ参照番号１６２４０１−３２−３）およびフタラジノン（ＷＯ９９／４７５０５、この開示は参照により全体が本明細書に組み込まれる）、販売元：Ｂｙｋ−Ｇｕｌｄｅｎ；ピューマフェントリン、（−）−ｐ−［（４ａＲ＊，１０ｂＳ＊）−９−エトキシ−ｌ，２，３，４，４ａ，１０ｂ−ヘキサヒドロ−８−メトキシ−２−メチルベンゾ［ｃ］［ｌ，６］ナフチリジン−６−イル］−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルベンズアミド、これは混合型ＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤であり、製造および発表元はＢｙｋ−Ｇｕｌｄｅｎ、現在のＡｌｔａｎａ；アロフィリン、Ａｌｍｉｒａｌｌ−Ｐｒｏｄｅｓｆａｒｍａにより開発中；ＶＭ５５４／ＵＭ５６５、販売元：Ｖｅｒｎａｌｉｓ；またはＴ−４４０（Ｔａｎａｂｅ  Ｓｅｉｙａｋｕ；Ｆｕｊｉ，Ｋ．等、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，１９９８，２８４（１）：１６２）、およびＴ２５８５を含む。これ以外の化合物は公開された国際特許出願ＷＯ０４／０２４７２８（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ）、ＷＯ０４／０５６８２３（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ）およびＷＯ０４／１０３９９８（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ）に開示されている。
【０２７６】
例示される抗コリン作用剤はムスカリン性受容体において拮抗剤として作用する化合物、特にＭ１またはＭ３受容体の拮抗剤である化合物、Ｍ１／Ｍ３またはＭ２／Ｍ３の二重拮抗剤またはＭ１／Ｍ２／Ｍ３受容体の全拮抗剤である化合物である。吸入による投与のための例示される化合物はイプラトロピウム（例えば臭化物として、ＣＡＳ２２２５４−２４−６、販売名：Ａｔｒｏｖｅｎｔ）、オキシトロピウム（例えば臭化物として、ＣＡＳ３０２８６−７５−０）およびチオトロピウム（例えば臭化物として、ＣＡＳ１３６３１０−９３−５、販売名：Ｓｐｉｒｉｖａ）を含む。同様に有利なものはレバトロペート（例えば臭化水素酸塩として、ＣＡＳ２６２５８６−７９−８）およびＬＡＳ−３４２７３であり、これはＷＯ０１／０４１１８に開示されている。経口投与のための例示される化合物はピレンゼピン（ＣＡＳ２８７９７−６１−７）、ダリフェナシン（ＣＡＳ１３３０９９−０４−４、または販売名Ｅｎａｂｌｅｘの臭化水素酸塩の場合はＣＡＳ１３３０９９−０７−７）、オキシブチニン（ＣＡＳ５６３３−２０−５、販売名：Ｄｉｔｒｏｐａｎ）、テロジリン（ＣＡＳ１５７９３−４０−５）、トルテロジン（ＣＡＳ１２４９３７−５１−５、または酒石酸塩の場合はＣＡＳ１２４９３７−５２−６、販売名：Ｄｅｔｒｏｌ）、オチロニウム（例えば臭化物として、ＣＡＳ２６０９５−５９−０、販売名：Ｓｐａｓｍｏｍｅｎ）、塩化トロスピウム（ＣＡＳ１０４０５−０２−４）およびソリフェナシン（ＣＡＳ２４２４７８−３７−１、またはＹＭ−９０５としても知られており販売名Ｖｅｓｉｃａｒｅであるコハク酸塩の場合はＣＡＳ２４２４７８−３８−２）を含む。
【０２７７】
他の抗コリン作用剤は米国特許出願第６０／４８７９８１号に開示されている下記式（ＸＸＩ）：
【化３１】
2012509688.tif 000033
［式中トロパン環に結合したアルキル鎖の好ましい方向はエンドであり；Ｒ３１およびＲ３２は独立して好ましくは炭素原子１〜６個を有する直鎖または分枝鎖の低級アルキル基、炭素原子５〜６個を有するシクロアルキル基、炭素原子６〜１０個を有するシクロアルキルアルキル、２−チエニル、２−ピリジル、フェニル、炭素原子４個以下を有するアルキル基で置換されたフェニル、および炭素原子４個以下を有するアルコキシ基で置換されたフェニルからなる群より選択され；Ｘ−はＮ原子の正荷電に関連するアニオンを示す］の化合物を含む。Ｘ−はクロリド、ブロミド、ヨーダイド、スルフェート、ベンゼンスルホネート、およびトルエンスルホネートであることができるがこれらに限定されず、例えば、（３−エンド）−３−（２，２−ジ−２−チエニルエテニル）−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンブロミド；（３−エンド）−３−（２，２−ジフェニルエテニル）−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．ｌ］オクタンブロミド；（３−エンド）−３−（２，２−ジフェニルエテニル）−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタン４−メチルベンゼンスルホネート；（３−エンド）−８，８−ジメチル−３−［２−フェニル−２−（２−チエニル）エテニル］−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンブロミド；および／または（３−エンド）−８，８−ジメチル−３−［２−フェニル−２−（２−ピリジニル）エテニル］−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンブロミドであることができる。
【０２７８】
別の抗コリン作用剤は米国特許出願第６０／５１１００９号に開示された下記式（ＸＸＩＩ）または（ＸＸＩＩＩ）：
【化３２】
2012509688.tif 000034
［式中、示されているＨ原子はエキソ位置にあり；Ｒ４１はＮ原子の正電荷に関連するアニオンを示し、Ｒ４１はクロリド、ブロミド、ヨーダイド、スルフェート、ベンゼンスルホネートおよびトルエンスルホネートであることができるがこれらに限定されず；Ｒ４２およびＲ４３は独立して直鎖または分枝鎖の低級アルキル基（好ましくは炭素原子１〜６個を有する）、シクロアルキル基（炭素原子５〜６個を有する）、シクロアルキル−アルキル（炭素原子６〜１０個を有する）、ヘテロシクロアルキル（炭素原子５〜６個を有する）およびヘテロ原子としてのＮまたはＯ、ヘテロシクロアルキル−アルキル（炭素原子６〜１０個を有する）およびヘテロ原子としてのＮまたはＯ、アリール、場合により置換されたアリール、ヘテロアリール、および場合により置換されたヘテロアリールからなる群より選択され；Ｒ４４は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ３−Ｃ７）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（Ｃ３−Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（Ｃ３−Ｃ７）ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−アリール、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ヘテロアリール、−ＯＲ４５、−ＣＨ２ＯＲ４５、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＣＨ２Ｏ（ＣＯ）Ｒ４６、−ＣＯ２Ｒ４７、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ４７）ＳＯ２Ｒ４５、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ４７）（Ｒ４８）、−ＣＯＮ（Ｒ４７）（Ｒ４８）、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ４８）ＣＯ（Ｒ４６）、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ４８）ＳＯ２（Ｒ４６）、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ４８）ＣＯ２（Ｒ４５）、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ４８）ＣＯＮＨ（Ｒ４７）からなる群より選択され；Ｒ４５は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（Ｃ３−Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（Ｃ３−Ｃ７）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−アリール、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ヘテロアリールからなる群より選択され；Ｒ４６は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ３−Ｃ７）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（Ｃ３−Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（Ｃ３−Ｃ７）ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−アリール、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ヘテロアリールからなる群より選択され；Ｒ４７およびＲ４８は独立してＨ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ３−Ｃ７）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（Ｃ３−Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（Ｃ３−Ｃ７）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−アリール、および（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ヘテロアリールからなる群より選択される］の化合物を含み、例えば以下：（エンド）−３−（２−メトキシ−２，２−ジチオフェン−２−イル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンヨーダイド；３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピオニトリル；（エンド）−８−メチル−３−（２，２，２−トリフェニル−エチル）−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクタン；３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピオンアミド；３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピオン酸；（エンド）−３−（２−シアノ−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンヨーダイド；（エンド）−３−（２−シアノ−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンブロミド；３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロパン−ｌ−オール；Ｎ−ベンジル−３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピオンアミド；（エンド）−３−（２−カルバモイル−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンヨーダイド；１−ベンジル−３−［３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−尿素；１−エチル−３−［３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−尿素；Ｎ−［３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−アセトアミド；Ｎ−［３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−ベンズアミド；３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジチオフェン−２−イル−プロピオニトリル；（エンド）−３−（２−シアノ−２，２−ジチオフェン−２−イル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンヨーダイド；Ｎ−［３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−ベンゼンスルホンアミド；［３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−尿素；Ｎ−［３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−メタンスルホンアミド；および／または（エンド）−３−｛２，２−ジフェニル−３−［（１−フェニル−メタノイル）−アミノ］−プロピル｝−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンブロミドが挙げられる。
【０２７９】
その他の化合物は以下：（エンド）−３−（２−メトキシ−２，２−ジチオフェン−２−イル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンヨーダイド；（エンド）−３−（２−シアノ−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンヨーダイド；（エンド）−３−（２−シアノ−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンブロミド；（エンド）−３−（２−カルバモイル−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンヨーダイド；（エンド）−３−（２−シアノ−２，２−ジチオフェン−２−イル−エチル）−８，８−−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンヨーダイド；および／または（エンド）−３−｛２，２−ジフェニル−３−［（１−フェニル−メタノイル）−アミノ］−プロピル｝−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンブロミドを含む。
【０２８０】
１つの実施形態において、本発明は式（Ｉ）の化合物または製薬上許容し得るその塩をＨ１拮抗剤と共に含む複合物を提供する。Ｈ１拮抗剤の例は、限定しないが、アメレキサノックス、アステミゾール、アザタジン、アゼラスチン、アクリバスチン、ブロムフェニラミン、セチリジン、レボセチリジン、エフレチリジン、クロルフェニラミン、クレマスチン、サイクリジン、カレバスチン、シプロヘプタジン、カルビノキサミン、デスカルボエトキシロラタジン、ドキシルアミン、ジメチンデン、エバスチン、エピナスチン、エフレチリジン、フェキソフェナジン、ヒドロキシジン、ケトチフェン、ロラタジン、レボカバスチン、ミゾラスチン、メキタジン、ミアンセリン、ノブクラスチン、メクリジン、ノラステミゾール、オロパタジン、ピクマスト、ピリラミン、プロメタジン、テルフェナジン、トリペレンナミン、テメラスチン、トリメプラジンおよびトリプロリジン、特にセチリジン、レボセチリジンおよびエフレチリジンおよびフェキソフェナジンを含む。その他の実施形態において、本発明は式（Ｉ）の化合物または製薬上許容し得るその塩をＨ３拮抗剤（および／または逆アゴニスト）と共に含む複合物を提供する。Ｈ３拮抗剤の例は、例えばＷＯ２００４／０３５５５６およびＷＯ２００６／０４５４１６に開示されているものを含む。本発明の化合物と組み合わせて使用できる他のヒスタミン受容体拮抗剤は、Ｈ４受容体の拮抗剤（および／または逆アゴニスト）、例えばＪａｂｌｏｎｏｗｓｋｉ等、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６：３９５７−３９６０（２００３）に開示されている化合物を含む。
【０２８１】
即ち本発明は、別の態様において、式（Ｉ）の化合物および／または製薬上許容し得るその塩、溶媒和物または生理学的に機能性のある誘導体をＰＤＥ４阻害剤と共に含む複合物を提供する。
【０２８２】
即ち本発明は、別の態様において、式（Ｉ）の化合物および／または製薬上許容し得るその塩、溶媒和物または生理学的に機能性のある誘導体をβ２−アドレナリン作用性受容体アゴニストと共に含む複合物を提供する。
【０２８３】
即ち本発明は、別の特長において、式（Ｉ）の化合物および／または製薬上許容し得るその塩、溶媒和物または生理学的に機能性のある誘導体をコルチコステロイドと共に含む複合物を提供する。
【０２８４】
即ち本発明は、別の態様において、式（Ｉ）の化合物および／または製薬上許容し得るその塩、溶媒和物または生理学的に機能性のある誘導体を抗コリン作用剤と共に含む複合物を提供する。
【０２８５】
即ち本発明は、別の態様において、式（Ｉ）の化合物および／または製薬上許容し得るその塩、溶媒和物または生理学的に機能性のある誘導体を抗ヒスタミンと共に含む複合物を提供する。
【０２８６】
即ち本発明は、別の態様において、式（Ｉ）の化合物および／または製薬上許容し得るその塩、溶媒和物または生理学的に機能性のある誘導体をＰＤＥ４阻害剤およびβ２−アドレナリン作用性受容体アゴニストストと共に含む複合物を提供する。
【０２８７】
即ち本発明は、別の態様において、式（Ｉ）の化合物および／または製薬上許容し得るその塩、溶媒和物または生理学的に機能性のある誘導体を抗コリン作用剤およびＰＤＥ４阻害剤と共に含む複合物を提供する。
【０２８８】
上記した複合物は医薬品製剤の形態における使用のために好都合に提供されることができ、このため、製薬上許容し得る希釈剤または担体と共に上記定義した複合物を含む医薬品製剤は本発明の別の態様となる。
【０２８９】
そのような複合物の個々の化合物は別個の、または複合した医薬品製剤において、逐次的に、または同時に、投与することができる。１つの実施形態において、個々の化合物は複合医薬品製剤において同時に投与される。既知の治療剤の適切な用量は当業者のよく知る通りである。
【０２９０】
即ち本発明は、別の態様において、別の治療活性剤との本発明の化合物の複合物を含む医薬組成物を提供する。
【０２９１】
即ち本発明は、別の態様において、ＰＤＥ４阻害剤との本発明の化合物の複合物を含む医薬組成物を提供する。
【０２９２】
即ち本発明は、別の態様において、β２−アドレナリン作用性受容体アゴニストストとの本発明の化合物の複合物を含む医薬組成物を提供する。
【０２９３】
即ち本発明は、別の態様において、コルチコステロイドとの本発明の化合物の複合物を含む医薬組成物を提供する。
【０２９４】
即ち本発明は、別の態様において、抗コリン作用剤との本発明の化合物の複合物を含む医薬組成物を提供する。
【０２９５】
即ち本発明は、別の態様において、抗ヒスタミンとの本発明の化合物の複合物を含む医薬組成物を提供する。
【０２９６】
本発明の組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）はいずれかの適当な方法における投与のために製剤でき、従って本発明はまた、その範囲内に、本発明の組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を製薬上許容し得る希釈剤または担体１つ以上と共に、望ましくはそれとの混合物として、含む医薬組成物を含む。
【０２９７】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）は成分を混合して適当な製剤とすることを含むプロセスにより調製される。本発明の投与方法の非限定的な例は、経口、口内、舌下、非経腸、局所直腸投与または他の局所投与を含む。１つの実施形態において、本発明の組成物は通気法および吸入法により投与することができる。局所投与のための製剤の種々の型の非限定的な例は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、フォーム、経皮パッチによる送達のための調製品、粉末、スプレー、エアロゾル、カプセルまたは吸入器または通気器における使用のためのカートリッジまたは滴下液（例えば点眼液または点鼻液）、噴霧のための溶液／懸濁剤、座剤、ペッサリ、貯留浣腸剤およびチュワブルまたは舐めて使用できる錠剤またはペレット（例えばアフタ性潰瘍の治療のため）またはリポソームまたはマイクロカプセル調製品を含む。
【０２９８】
１つの実施形態において、本発明の組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤およびその医薬組成物）は例えば鼻炎の治療のために鼻に局所投与される、例えば加圧ポンプにより鼻に投与される加圧エアロゾル製剤および水性製剤が挙げられる。非加圧であり、鼻孔に局所投与するように採用された製剤が特に有利である。適当な製剤はこの目的のために希釈剤または担体として水を含有する。１つの実施形態において、肺または鼻への本発明の組成物の投与のための水性製剤は、従来の賦形剤、例えば緩衝剤、張力調節剤等と共に提供できる。別の実施形態においては、水性製剤は噴霧により鼻に投与できる。
【０２９９】
本発明の組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤およびその医薬組成物）は流体ディスペンサー、例えば流体ディスペンサーのポンプ機序へのユーザーにより適用される力の適用時に流体製剤の計量された用量が供給される際に通過する供給ノズルまたは供給オリフィスを有する流体ディスペンサーからの送達のために流体製剤として製剤できる。１つの実施形態において、本発明の流体ディスペンサーは流体製剤の多数の計量用量のリザーバを使用しており、用量は逐次的なポンプの作動により供給可能となる。１つの実施形態において、本発明の供給ノズルまたはオリフィスは、鼻腔に本発明の組成物を含む流体製剤のスプレー供給のためにユーザーの外鼻孔の内部への挿入のために設計構成されることができる。上記した型の流体ディスペンサーはＷＯ０５／０４４３５４に記載および説明されており、これは参照により全体が本明細書に組み込まれる。ディスペンサーは流体製剤を格納している容器の上に搭載された圧縮ポンプを有する流体排出装置を収容しているハウジングを有する。１つの実施形態において、ハウジングは少なくとも１つの指で開けられるサイドレバーを有し、これはハウジングに対して内部に向けて可動であり、これによりハウジング内で容器を上方にカム動作させることにより、ポンプが収縮し、ハウジングの鼻ノズルを通過しながらポンプ幹部の外部に製剤の計量用量を送液する。別の実施形態においては、流体ディスペンサーはＷＯ０５／０４４３５４の図３０〜４０に説明されている一般的な型のものである。
【０３００】
軟膏、クリームおよびゲルは、例えば適当な濃厚化剤および／またはゲル化剤および／または溶媒を添加しながら水性または油性の基剤と共に製剤できる。即ちそのような基剤の非限定的な例は、例えば水および／または油脂、例えば流体パラフィンまたは植物油、例えばピーナツ油またはヒマシ油、またはポリエチレングリコール等の溶媒を含むことができる。濃厚化剤およびゲル化剤は基剤の性質に従って使用できる。そのような剤の非限定的な例は軟質パラフィン、ステアリン酸アルミニウム、セトステアリルアルコール、ポリエチレングリコール、ラノリン、蜜蝋、カルボキシプロピルメチレンおよびセルロースの誘導体、および／またはグリセリルモノステアレートおよび／またはノニオン性乳化剤を含む。
【０３０１】
１つの実施形態において、ローションは水性または油性の基剤と共に製剤化することができ、一般的には１つ以上の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁剤または濃厚化剤を含有する。
【０３０２】
１つの実施形態において、外用の粉末はいずれかの適当な粉末基剤、例えばタルク、乳糖または澱粉を使用しながら形成できる。滴下剤は１つ以上の分散剤、可溶化剤、懸濁剤または保存料を含む水性または非水性の基剤と共に製剤できる。
【０３０３】
スプレー組成物は例えば適当な液化高圧ガスを使用しながら計量用量吸入器等の加圧パックから送達される水性の溶液または懸濁液またはエアロゾルとして製剤できる。１つの実施形態において、吸入に適する本発明のエアロゾル組成物は懸濁液または溶液のいずれかであることができ、一般的には、式（Ｉ）の化合物および適当な高圧ガス、例えばフルオロカーボンまたは水素含有クロロフオロカーボンまたはこれらの混合物、特にヒドロフルオロアルカン、特に１，１，１，２−テトラフルオロエタン、１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロ−ｎ−プロパンまたはこれらの混合物を含有する。エアロゾル組成物は場合により界面活性剤等の当分野で周知の追加的な製剤賦形剤を含有できる。非限定的な例はオレイン酸、レシチンまたはオリゴ乳酸または誘導体、例えばＷＯ９４／２１２２９およびＷＯ９８／３４５９６に記載のもの、および共溶媒、例えばエタノールを含む。１つの実施形態において、本発明の医薬品エアロゾル製剤は、本発明の化合物および高圧ガスとしてのフルオロカーボンおよび水素含有クロロフルオロカーボンまたはその混合物を、場合により界面活性剤および／または共溶媒と組み合わせて含む。
【０３０４】
本発明の組成物の製剤は、高圧ガスが１，１，１，２−テトラフルオロエタン、１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロ−ｎ−プロパンおよびこれらの混合物から選択される医薬品エアロゾルを含むことができる。
【０３０５】
本発明の製剤は適当な緩衝剤を添加することにより緩衝することができる。
【０３０６】
吸入器または通気器において、例えばゼラチンを使用するための本発明の組成物を含むカプセルおよびカートリッジは、本発明の化合物の吸入のための粉末混合物および適当な粉末基剤、例えば乳糖または澱粉を含有するように製剤できる。１つの実施形態において、各カプセルまたはカートリッジは一般的には式（Ｉ）の化合物２０μｇ〜１０ｍｇを含有できる。別の実施形態においては、本発明の化合物は乳糖等の賦形剤を伴うことなく提示できる。
【０３０７】
本発明の局所用組成物における式（Ｉ）の活性化合物の比率は、調製すべき製剤の厳密な種類によるが、一般的には０．００１〜１０重量％の範囲となる。１つの実施形態において、使用される調製品の大部分の種類の比率は０．００５〜１％、例えば０．０１〜０．５％の範囲となる。別の実施形態においては、本発明の組成物は使用される比率が通常は０．１〜５％の範囲となる吸入または通気法のための粉末を含む。
【０３０８】
本発明の組成物を含むエアロゾル製剤は好ましくはエアロゾルの各計量用量または「パフ」が２０μｇ〜１０ｍｇを含有するように設計される。１つの実施形態において、エアロゾル製剤は２０μｇ〜２０００μｇである。別の実施形態においては、エアロゾル製剤は式（Ｉ）の化合物２０μｇ〜５００μｇである。投与は１日１回、または一日数回、例えば２、３、４または８回であることができ、例えば各投与時に１、２または３用量を与えることができる。１つの実施形態において、本発明の組成物を含むエアロゾルの場合の全体的な一日当たり用量は１００μｇ〜１０ｍｇの範囲となる。別の実施形態においては、本発明の組成物を含むエアロゾルの場合の全体的な一日当たり用量は２００μｇ〜２０００μｇの範囲となる。吸入器または通気器におけるカプセルおよびカートリッジにより送達される全体的な一日当たり用量およびおよび計量用量は一般的にはエアロゾル製剤で送達されるものの二倍となる。
【０３０９】
懸濁エアロゾル製剤の場合は、粒状（例えばマイクロ化）薬品の粒径はエアロゾル製剤の投与時に肺の内部への実質的に全ての薬品の吸入が可能となるようなものでなければならない。１つの実施形態において、粒子の粒径は１００ミクロン未満となる。別の実施形態においては、粒子の粒径は２０ミクロン未満となる。粒径の範囲は１〜１０ミクロンの範囲であることができる。１つの実施形態において、粒径の範囲は１〜５ミクロンであることができる。別の実施形態においては、粒径の範囲は２〜３ミクロンである。
【０３１０】
本発明の製剤は適切な容器中における選択された高圧ガス中への医薬および本発明の化合物の分散または溶解により調製できる。１つの実施形態において、分散または溶解は超音波または高剪断混合器の使用により行う。プロセスは望ましくは制御された湿度の条件下において実施する。
【０３１１】
本発明のエアロゾル製剤の化学的および物理的な安定性および製薬上の許容性は当分野で周知の手法により測定できる。１つの実施形態において、化合物の化学的安定性は例えば生成物の長期保存後のＨＰＬＣ試験により測定できる。物理的安定性のデータは他の従来の分析手法から得ることができる。１つの実施形態において、物理的安定性のデータは漏れ試験により、弁送達試験（作動当たりの平均ショット重量）により、用量再現性試験（作動当たりの活性成分）およびスプレーの分散性の分析により得ることができる。
【０３１２】
本発明の懸濁エアロゾル製剤の安定性は従来の手法により計測できる。１つの実施形態において、懸濁エアロゾルの安定性は、バックライト散乱機材を用いて凝集物粒径分布を測定することにより、またはカスケードインパクションにより粒径分布を計測することにより、または「ツインインピンジャー」分析プロセスにより、計測することができる。
【０３１３】
本明細書において使用する場合、「ツインインピンジャー」試験とは英国薬局方１９８８年版、Ａ２０４〜２０７ページの付録ＸＶＩＩＣに定義されている通り、「装置Ａを使用した加圧吸入における放出用量の付着の測定」を意味する。そのような手法はエアロゾル製剤の「吸気可能な画分」を計算可能とする。１つの実施形態において、「吸気可能な画分」を計算するために用いる方法は、「微粒子画分」を参照することであり、これは上記したツインインピンジャー法を用いて作動当たり送達される活性成分の総量のパーセンテージとして表示した場合の、作動当たり下方のインピンジメントチャンバーにおいて収集された活性成分の量である。
【０３１４】
「計量用量吸入器」またはＭＤＩという用語は缶、缶を被覆する固定されたキャップ、および、キャップに位置する製剤計量弁を含むユニットを意味する。ＭＤＩシステムは適当なチャネリング装置を含む。本発明の適当なチャネリング装置は弁作動装置および患者の鼻または口に計量弁を経由して充填キャニスタから医薬を送達させる時に通過する円筒形または三角錐様の経路を含み、例えばマウスピース作動器が挙げられる。
【０３１５】
本発明のＭＤＩキャニスタは典型的には使用する高圧ガスの蒸気圧に耐え得る容器、例えばプラスチックまたはプラスチックコーティングされたガラスのビンまたは好ましくは金属の缶、例えばアルミニウムまたはその合金であって場合によりアノード化、ラッカーコーティング、および／またはプラスチックコーティングされていることができるもの（例えば参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９６／３２０９９、そこでは内部表面の部分または全部が場合により非フルオロカーボン重合体１つ以上と組み合わせてフルオロカーボン重合体１つ以上でコーティングされている）を含み、この容器は計量弁で閉じられる。１つの実施形態において、キャップは超音波溶接、螺子装着または嵌め込みにより缶に固定することができる。本明細書において教示したＭＤＩは当分野で知られた方法により調製できる（例えば上記ＢｙｒｏｎおよびＷＯ９６／３２０９９参照）。１つの実施形態において、本発明のキャニスタはキャップ組み立てにより装着され、その場合、薬品計量弁はキャップに位置し、キャップは所定位置に嵌め込まれる。
【０３１６】
本発明の１つの実施形態において、缶の金属内部表面はフルオロポリマーで、最も好ましくは非フルオロポリマーとブレンドしたものでコーティングされる。本発明の別の実施形態においては、缶の金属内部表面はポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）およびポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）のポリマーブレンドでコーティングされる。本発明の更に実施形態において、缶の金属内部表面の全体がポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）およびポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）のポリマーブレンドでコーティングされる。
【０３１７】
計量弁は、作動当たり製剤の計量された量を送達するように設計されており、弁を通過する高圧ガスの漏れを防止するためにガスケットを組み込んでいる。ガスケットはいずれかの適当なエラストマー物質、例えば低密度ポリエチレン、クロロブチル、ブロモブチル、ＥＰＤＭ、黒色および白色のブタジエン−アクリロニトリルゴム、ブチルゴムおよびネオプレンを含むことができる。適当な弁はエアロゾル産業でよく知られている製造元から販売されており、例えばフランスのＶａｌｏｉｓ（例えばＤＦｌＯ、ＤＦ３０、ＤＦ６０）、英国のＢｅｓｐａｋ  ｐｉｃ（例えばＢＫ３００、ＢＫ３５７）および英国の３Ｍ−Ｎｅｏｔｅｃｈｎｉｃ  Ｌｔｄ（例えばＳｐｒａｙｍｉｓｅｒＴＭ）を挙げることができる。
【０３１８】
種々の実施形態において、ＭＤＩはまた他の構造を伴って使用することもでき、例えば限定しないが、ＭＤＩを保存収容するためのオーバーラップパッケージ、例えば米国特許第６，１１９，８５３号；６，１７９，１１８号；６，３１５，１１２号；６，３５２，１５２号；６，３９０，２９１号；および６，６７９，３７４号に記載されているもの、並びに、用量カウンターユニット、例えば限定しないが米国特許第６，３６０，７３９号および６，４３１，１６８号に記載のものを挙げることができる。
【０３１９】
医薬品エアロゾル製造の当分野で周知の従来のバルク製造方法および機材を用いて充填キャニスタの商業生産のための大規模バッチの製造を行うことができる。即ち、例えば懸濁エアロゾル製剤を調製するためのあるバルク製造方法においては、計量弁をアルミ缶上に嵌め込むことにより空のキャニスタを形成する。粒状の医薬を投入管に添加し、液化高圧ガスと任意の賦形剤を投入管を通過して製造管に加圧充填する。薬品懸濁剤は充填機への再循環の前に混合し、次に薬品懸濁剤の小分量を計量弁を通過してキャニスタに充填する。溶液エアロゾル製剤を調製するためのバルク製造方法の一例においては、計量弁をアルミ缶上に嵌め込むことにより空のキャニスタを形成する。液化高圧ガスと任意の賦形剤および溶解した医薬を投入管を通過して製造管に加圧充填する。
【０３２０】
別の実施形態においては、液化製剤の小分量を、製剤が蒸発しないために十分な低温の条件下で開放されたキャニスタに添加し、次に計量弁をキャニスタ上に嵌め込む。
【０３２１】
典型的には、医薬品用途のために調製されたバッチにおいては、各々の充填されたキャニスタを確認計量し、バッチ番号でコード化し、保存用のトレー内に詰めた後にリリース試験を行う。
【０３２２】
局所調製品は患部領域に対して一日当たり一回以上の適用により投与でき；皮膚面上には閉鎖型の包帯材を好都合に使用できる。連続的または遅延された送達は、接着リザーバ系により達成することができる。
【０３２３】
内用の場合は、本発明の化合物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）は例えば経口、経鼻、非経腸または直腸投与のための従来の様式において製剤できる。１つの実施形態において、経口投与用の製剤は、シロップ、エリキシル、粉末、顆粒、錠剤およびカプセルを含み、これらは典型的には従来の賦形剤、例えば結着剤、充填剤、潤滑剤、錠剤崩壊剤、水和剤、懸濁剤、乳化剤、保存料、緩衝塩、着香剤、着色料および／または甘味剤を適宜含有する。単位剤型は以下に記載する通り好ましい場合がある。
【０３２４】
本発明の化合物は全身グルココルチコイド受容体アゴニスト療法の適応である場合には一般的には内用により投与され得る。
【０３２５】
緩徐放出または腸溶性コーティングの製剤は特に炎症性腸障害の治療のために好都合であることができる。
【０３２６】
一部の実施形態においては、本発明の化合物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）は経口投与用に製剤化される。他の実施形態において、本発明の化合物は吸入投与用に製剤化される。
【０３２７】
別の実施形態においては、本発明は、対象または生物を、対象または生物中でＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば阻害）するのに適する条件下で、本発明のｓｉＮＡ分子１つ以上と接触させることを含む、対象または生物における１つより多いＥＮａＣ標的遺伝子の発現をモジュレートする方法を特長とする。
【０３２８】
本発明のｓｉＮＡ分子は種々の核酸分子のＲＮＡｉターゲティングを通じて標的遺伝子発現をダウンレギュレートまたは阻害するように設計できる。１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば異質染色質サイレンシングまたは転写阻害を介して、標的遺伝子に相当する種々のＤＮＡをターゲティングするために使用される。１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えばＲＮＡ標的切断または翻訳阻害を介して標的遺伝子に相当する種々のＲＮＡをターゲティングするために使用される。そのようなＲＮＡの非限定的な例は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）または調節エレメント（例えばＭａｔｔｉｃｋ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２７−１５２８  ａｎｄ  Ｃｌａｖｅｒｉｅ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２９−１５３０を参照）を含み、これにはｍｉＲＮＡおよび他の小型ＲＮＡ、標的遺伝子のオルタネートＲＮＡアイソタイプ、標的遺伝子の転写後修飾ＲＮＡ、標的遺伝子のプレｍＲＮＡ、および／またはＲＮＡ鋳型が含まれる。オルタナティブスプライシングが適切なエクソンの使用により区別可能である転写物のファミリーを生成する場合、本発明は、遺伝子ファミリーメンバーを特異的に阻害するため、またはその機能間の区別を行うために、適切なエクソンを通じて遺伝子発現を阻害するために使用できる。例えば、オルタナティブスプライシングされた膜貫通ドメインを含有するタンパク質は、膜結合型および分泌型の両方で発現させることができる。膜貫通ドメインを含有するエクソンをターゲティングするための本発明の使用は、タンパク質の分泌型とは異なる膜結合型の薬学的ターゲティングの機能的コンセンサスを測定するために使用できる。これらのＲＮＡ分子をターゲティングすることに関する本発明の適用の非限定的な例は、治療用医薬品用途、化粧品用途、獣医科用途、医薬品発見用途、分篩診断および遺伝子機能の用途、および、例えば本発明のｓｉＮＡ分子による１塩基多形マッピングを用いた遺伝子マッピングを含む。このような用途は知られた遺伝子配列を用いながら、または、発現配列タグ（ＥＳＴ）から入手できる部分配列から、実施することができる。
【０３２９】
別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子はＥＮａＣファミリー遺伝子（例えばすべての知られているＥＮａＣアイソタイプ、またはＥＮａＣアイソタイプの選択されたグループ）等の遺伝子ファミリーに相当する保存された配列をターゲティングするために使用される。即ち、多種のＥＮａＣ標的をターゲティングするｓｉＮＡ分子は増大した治療効果をもたらすことができる。更に、他のＥＮａＣアイソタイプを回避することにより、毒性を回避できる。
【０３３０】
１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子は種々の用途において遺伝子の機能の経路を特性化するために使用できる。例えば本発明は遺伝子機能分析、ｍＲＮＡ機能分析または翻訳分析において未特性化遺伝子の機能を測定するために、経路における標的遺伝子の活性を阻害するために使用できる。本発明は、医薬品の開発を目標として、種々の疾患および状態に関与する潜在的な標的遺伝子経路を測定するために使用できる。本発明は例えば呼吸器、炎症、および／または自己免疫疾患、障害、体質および状態に関与する遺伝子発現の経路を理解するために使用できる。
【０３３１】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子および／または方法は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションにより参照されるＲＮＡをコードする遺伝子、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、例えば本明細書に記載するＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（例えば表７中）により本明細書において参照されるＲＮＡ配列をコードする標的遺伝子の発現をダウンレギュレートするために使用される。
【０３３２】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）所定の複雑度を有するｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを形成すること；および（ｂ）標的ＲＮＡ配列内部のＲＮＡｉ標的部位を測定するのに適する条件下で、上記（ａ）のｓｉＮＡコンストラクトを試験すること、を含む方法を特徴とする。１つの実施形態において、（ａ）のｓｉＮＡ分子は固定長、例えば約２３ヌクレオチド長の鎖を有する。別の実施形態においては、（ａ）のｓｉＮＡ分子は約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチド長の鎖を有する異なる長さのものである。１つの実施形態において、試験は本明細書に記載する再建インビトロｓｉＮＡ試験を含むことができる。別の実施形態においては、試験は標的ＲＮＡが発現される細胞培養系を含むことができる。別の実施形態においては、標的ＲＮＡのフラグメントは、標的ＲＮＡ配列の内部の最も適する部位を測定するために、例えばゲル電気泳動、ノーザンブロット分析，またはＲＮＡｓｅ保護試験により、切断の検出可能なレベルに関して分析される。標的ＲＮＡ配列は当分野で知られる通り、例えばインビトロ系のクローニングおよび／または転写により、インビボ系における細胞発現により、得ることができる。
【０３３３】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）所定の複雑度、例えば４Ｎを有するｓｉＲＮＡコンストラクトのランダム化ライブラリを形成すること、ここでＮはｓｉＮＡコンストラクト鎖の各々における塩基対形成したヌクレオチドの数を示すものであること（例えば１９塩基対を有する２１ヌクレオチドのセンスおよびアンチセンス鎖を有するｓｉＮＡコンストラクトについては、複雑度は４１９となる）；および（ｂ）標的ＲＮＡ配列内部のＲＮＡｉ標的部位を測定するのに適する条件下で、上記（ａ）のｓｉＮＡコンストラクトを試験すること、を含む方法を特徴とする。別の実施形態においては、（ａ）のｓｉＮＡ分子は固定長、例えば約２３ヌクレオチド長の鎖を有する。更に別の実施形態において、（ａ）のｓｉＮＡ分子は約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチド長の鎖を有する異なる長さのものである。１つの実施形態において、試験は再建インビトロｓｉＮＡ試験を含むことができる。別の実施形態においては、試験は標的ＲＮＡが発現される細胞培養系を含むことができる。別の実施形態においては、標的ＲＮＡのフラグメントは、標的ＲＮＡ配列の内部の最も適する部位を測定するために、例えばゲル電気泳動、ノーザンブロット分析，またはＲＮＡｓｅ保護試験により、切断の検出可能なレベルに関して分析される。標的ＲＮＡ配列は当分野で知られる通り、例えばインビトロ系のクローニングおよび／または転写により、インビボ系における細胞発現により、得ることができる。
【０３３４】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）標的遺伝子によりコードされるＲＮＡ標的の配列を分析すること；（ｂ）（ａ）のＲＮＡの領域１つ以上に相補的な配列を有するｓｉＮＡ分子のセット１つ以上を合成すること；および（ｃ）標的ＲＮＡ配列内部のＲＮＡｉ標的を測定するのに適する条件下で、（ｂ）のｓｉＮＡ分子を試験すること、を含む方法を特徴とする。１つの実施形態において、（ｂ）のｓｉＮＡ分子は固定長、例えば約２３ヌクレオチド長の鎖を有する。別の実施形態においては、（ｂ）のｓｉＮＡ分子は約１５〜約３０（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチド長の鎖を有する異なる長さのものである。１つの実施形態において、試験は本明細書に記載する再建インビトロｓｉＮＡ試験を含むことができる。別の実施形態においては、試験は標的ＲＮＡが発現される細胞培養系を含むことができる。標的ＲＮＡのフラグメントは、標的ＲＮＡ配列の内部の最も適する部位を測定するために、例えばゲル電気泳動、ノーザンブロット分析，またはＲＮＡｓｅ保護試験により、切断の検出可能なレベルに関して分析される。標的ＲＮＡ配列は当分野で知られる通り、例えばインビトロ系のクローニングおよび／または転写により、インビボ系における発現により、得ることができる。
【０３３５】
「標的部位」とは、標的配列に相補的なそれ自体のアンチセンス領域内部の配列を含有するｓｉＮＡコンストラクトにより媒介される切断に関して「ターゲティング」される標的ＲＮＡ内部の配列を意味する。
【０３３６】
「切断の検出可能なレベル」とは、標的ＲＮＡのランダムな分解により生成するＲＮＡのバックグラウンドを超えた切断産物を弁別するために十分な程度までの標的ＲＮＡの切断（および切断産物ＲＮＡの形成）を意味する。標的ＲＮＡの１〜５％からの切断産物の生成は、検出の大部分の方法に関してはバックグラウンドを超えて検出するために十分である。
【０３３７】
１つの実施形態において、本発明は、製薬上許容し得る担体または希釈剤中に化学修飾されていることができる本発明のｓｉＮＡ分子を含む組成物を特徴とする。別の実施形態においては、本発明は、製薬上許容し得る担体または希釈剤中に中に遺伝子１つ以上をターゲティングする化学修飾されていることができる本発明のｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特徴とする。別の実施形態においては、本発明は対象における疾患、体質または状態の診断に適する条件下に本発明の組成物を対象に投与することを含む、対象における疾患、体質または状態を診断するための方法を特徴とする。別の実施形態においては、本発明は、単独で、または他の治療用化合物１つ以上と連携させて、対象における呼吸器、炎症、および／または自己免疫疾患障害等の疾患、体質または状態の治療または防止に適する条件下に本発明の組成物を対象に投与することを含む、対象における疾患、体質または状態を治療または防止するための方法を特徴とする。
【０３３８】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾されていることができる本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること、ここでｓｉＮＡ鎖の１つは標的遺伝子のＲＮＡに対して相補的な配列を含むものであること；（ｂ）細胞、組織、対象または生物における標的遺伝子の発現をモジュレートするのに適する条件下で細胞、組織、対象または生物内にｓｉＮＡ分子を導入すること；および（ｃ）細胞、組織、対象または生物におけるいずれかの表現型の変化に関して試験することにより遺伝子の機能を測定すること、を含む、標的遺伝子標的を有効化するための方法を特徴とする。
【０３３９】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）化学修飾されていることができる本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること、ここでｓｉＮＡ鎖の１つは標的遺伝子のＲＮＡに対して相補的な配列を含むものであること；（ｂ）生物学的な系における標的遺伝子の発現をモジュレートするのに適する条件下で生物学的な系内にｓｉＮＡ分子を導入すること；および（ｃ）生物学的な系におけるいずれかの表現型の変化に関して試験することにより遺伝子の機能を測定すること、を含む、標的を有効化するための方法を特徴とする。
【０３４０】
「生物学的な系」とは、ヒトまたは動物を含むがこれらに限定されない生物学的原料に由来する精製されたまたは未精製の形態の物質を意味し、ここで、その系がＲＮＡｉ活性のために必要な成分を含む。「生物学的な系」という用語は例えば細胞、組織、対象、または生物、またはその抽出物を含む。生物学的な系という用語はまた、インビトロの状況において使用できる再建ＲＮＡｉ系を含む。
【０３４１】
「表現型の変化」とは、本発明の核酸分子との接触、またはそれによる治療に応答して生じる細胞のいずれかの検出可能な変化を意味する（例えばｓｉＮＡ）。そのような検出可能な変化は、形状、大きさ、増殖、運動性、タンパク質発現またはＲＮＡ発現における変化、または、当分野で知られた方法により試験できる他の物理的または化学的な変化を含むがこれらに限定されない。検出可能な変化はまた、受容体遺伝子／分子、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または発現されたタンパク質を検出するために使用される種々のタグまたは試験することができるいずれかの他の細胞成分の発現を含むことができる。
【０３４２】
１つの実施形態において、本発明は、例えば細胞、組織、対象または生物における場合を含む、生物学的な系における、標的遺伝子の発現をモジュレートするために使用できる、化学修飾されていることができる本発明のｓｉＮＡ分子を含有するキットを特徴とする。別の実施形態においては、本発明は、例えば細胞、組織、対象または生物における場合を含む、生物学的な系における、１つより多い標的遺伝子の発現をモジュレートするために使用できる、化学修飾されていることができる１つより多い本発明のｓｉＮＡ分子を含有するキットを特徴とする。
【０３４３】
１つの実施形態において、本発明は化学修飾されていることができる本発明のｓｉＮＡ分子１つ以上を含有する細胞を特徴とする。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子を含有する細胞は哺乳類細胞である。更に別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子を含有する細胞はヒト細胞である。
【０３４４】
１つの実施形態において、化学修飾されていることができる本発明のｓｉＮＡ分子の合成は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の２つの相補鎖を合成すること；（ｂ）２本鎖ｓｉＮＡ分子を得るのに適する条件下で２つの相補鎖を共にアニーリングすること、を含む。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の２つの相補鎖の合成は固相オリゴヌクレオチド合成による。更に別の実施形態において、ｓｉＮＡ分子の２つの相補鎖の合成は固相タンデムオリゴヌクレオチド合成による。
【０３４５】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の第１のオリゴヌクレオチド配列鎖を合成すること、ここで第１のオリゴヌクレオチド配列鎖はｓｉＮＡの第２のオリゴヌクレオチド配列鎖の合成のためのスカホールドとして使用できる切断可能なリンカー分子を含むものであること；（ｂ）第１のオリゴヌクレオチド配列鎖のスカホールド上にｓｉＮＡの第２のオリゴヌクレオチド配列鎖を合成すること、ここで第２のオリゴヌクレオチド配列鎖はｓｉＮＡデュプレックスを精製するために使用できる化学部分を含むものであること；（ｃ）２つのｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖がハイブリダイズして安定なデュプレックスを形成するのに適する条件下に（ａ）のリンカー分子を切断すること；および（ｄ）第２のオリゴヌクレオチド配列鎖の化学部分を利用しながらｓｉＮＡデュプレックスを精製すること、を含むｓｉＮＡデュプレックス分子を合成するための方法を特徴とする。１つの実施形態において、上記（ｃ）におけるリンカー分子の切断は、例えばメチルアミン等のアルキルアミン塩基を用いた加水分解条件下のオリゴヌクレオチドの脱保護の間に起こる。１つの実施形態において、合成方法は制御多孔性ガラス（ＣＰＧ）またはポリスチレン等の固相上の固相合成を含み、ここで、（ａ）の第１の配列はスカホールドとして固相を使用しながらスクシニルリンカー等の切断可能なリンカー上で合成される。第２の鎖を合成するためのスカホールドとして使用される（ａ）における切断可能なリンカーは、固体支持体誘導リンカーと同様の反応性を含むことができ、これにより、固体支持体誘導リンカーと（ａ）の切断可能なリンカーの切断が同時に起こるようにできる。別の実施形態においては、結合したオリゴヌクレオチド配列を単離するために使用できる（ｂ）の化学部分はトリチル基、例えばジメトキシトリチル基を含み、これは本明細書に記載する通りトリチル−オン合成の方策において使用できる。更に別の実施形態において、ジメトキシトリチル基等の化学部分は例えば酸性条件を用いながら精製の間に除去される。
【０３４６】
その他の実施形態において、ｓｉＮＡ合成のための方法は溶液相合成またはハイブリッド相合成であり、その場合、ｓｉＮＡデュプレックスの両方の鎖は、第２の配列の合成のためのスカホールドとして作用する第１の配列に結合した切断可能なリンカーを用いながらタンデムに合成される。別個のｓｉＮＡ配列鎖のハイブリダイゼーションに適する条件下のリンカーの切断により、２本鎖ｓｉＮＡ分子の形成が起こる。
【０３４７】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の１つのオリゴヌクレオチド配列鎖を合成すること、ここで配列はもう１つのオリゴヌクレオチド配列の合成のためのスカホールドとして使用できる切断可能なリンカー分子を含むものであること；（ｂ）（ａ）のスカホールド上に第１の配列鎖に対する相補性を有する第２のオリゴヌクレオチド配列を合成すること、ここで第２の配列は２本鎖ｓｉＮＡ分子の他方の鎖を含み、ここで第２の配列は更に、結合したオリゴヌクレオチド配列を単離するために使用できる化学部分を含むものであること；（ｃ）切断可能なリンカーにより連結された両方のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖を含む完全長配列を単離するのに適する条件下、２つのｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖がハイブリダイズして安定なデュプレックスを形成するのに適する条件下で、第２のオリゴヌクレオチド配列鎖の化学部分を利用しながら（ｂ）の生成物を精製すること；を含むｓｉＮＡデュプレックス分子を合成するための方法を特徴とする。１つの実施形態において、上記（ｃ）におけるリンカー分子の切断は例えば加水分解条件下、オリゴヌクレオチドの脱保護の間に起こる。別の実施形態においては、上記（ｃ）におけるリンカー分子の切断はオリゴヌクレオチドの脱保護の後に起こる。別の実施形態においては、合成方法は制御多孔性ガラス（ＣＰＧ）またはポリスチレン等の固体支持体上の固相合成を含み、ここで、（ａ）の第１の配列はスカホールドとして固体支持体を使用しながらスクシニルリンカー等の切断可能なリンカー上で合成される。第２の鎖を合成するためのスカホールドとして使用される（ａ）における切断可能なリンカーは、固体支持体誘導リンカーと同様の反応性または異なる反応性を含むことができ、これにより、固体支持体誘導リンカーと（ａ）の切断可能なリンカーの切断が同時または逐次的に起こるようにできる。１つの実施形態において、結合したオリゴヌクレオチド配列を単離するために使用できる（ｂ）の化学部分はトリチル基、例えばジメトキシトリチル基を含む。
【０３４８】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）第１および第２の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成すること、ここで第１の配列は第２の配列に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチド配列は切断可能なリンカーを介して第２の配列に連結しており、ここで末端５’保護基、例えば５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基（５’−Ｏ−ＤＭＴ）は第２の配列を有するオリゴヌクレオチド上に残存するものであること；（ｂ）オリゴヌクレオチドを脱保護し、これにより脱保護が２つのオリゴヌクレオチド配列を連結しているリンカーの切断をもたらすようにすること；および（ｃ）例えば本明細書に記載するトリチル−オン合成の方策を用いながら２本鎖ｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下、（ｂ）の生成物を精製すること、を含む単一の合成プロセスにおいて２本鎖ｓｉＮＡ分子を作成するための方法を特徴とする。
【０３４９】
別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子の合成方法は、参照により全体が本明細書に組み込まれるＳｃａｒｉｎｇｅ等の米国特許第５，８８９，１３６号；６，００８，４００号；および６，１１１，０８６号の教示を含む。
【０３５０】
１つの実施形態において、本発明はＥＮａＣ標的ポリヌクレオチドに対抗するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし、ここでｓｉＮＡコンストラクトは化学修飾１つ以上、例えばｓｉＮＡコンストラクトのヌクレアーゼ耐性を増大させる式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有する化学修飾１つ以上を含む。
【０３５１】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）ｓｉＮＡ分子に式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有するヌクレオチドを導入すること、および（ｂ）増大したヌクレアーゼ耐性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験すること、を含む増大したヌクレアーゼ耐性を有するｓｉＮＡ分子を形成するための方法を特徴とする。
【０３５２】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩ（例えば表８において参照されるｓｉＮＡモチーフ）またはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入すること、および（ｂ）向上した毒性学的プロファイルを有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験すること、を含む向上した毒性学的プロファイルを有する（例えば免疫刺激特性が減衰されているか、存在しない）ｓｉＮＡ分子を形成するための方法を特徴とする。
【０３５３】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子および本明細書に記載する、または別様に当分野で知られた送達ビヒクルまたは送達粒子を含むｓｉＮＡ製剤を形成すること、および（ｂ）向上した毒性学的プロファイルを有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ製剤を試験すること、を含む向上した毒性学的プロファイルを有する（例えば免疫刺激特性が減衰されているか、存在しない）ｓｉＮＡ製剤を形成するための方法を特徴とする。
【０３５４】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩ（例えば表８において参照されるｓｉＮＡモチーフ）またはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入すること、および（ｂ）インターフェロン応答を刺激しないｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験すること、を含む、細胞、対象、または生物においてインターフェロン応答を刺激しない（例えば無インターフェロン応答または減衰インターフェロン応答の）ｓｉＮＡ分子を形成するための方法を特徴とする。
【０３５５】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子および本明細書に記載する、または別様に当分野で知られた送達ビヒクルまたは送達粒子を含むｓｉＮＡ製剤を形成すること、および（ｂ）インターフェロン応答を刺激しないｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ製剤を試験すること、を含む細胞、対象、または生物においてインターフェロン応答を刺激しない（例えば無インターフェロン応答または減衰インターフェロン応答の）ｓｉＮＡ製剤を形成するための方法を特徴とする。１つの実施形態において、インターフェロンはインターフェロンαを含む。
【０３５６】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩ（例えば表８において参照されるｓｉＮＡモチーフ）またはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入すること、および（ｂ）サイトカイン応答を刺激しないｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験すること、を含む、細胞、対象、または生物において炎症またはプロ炎症サイトカイン応答を刺激しない（例えば無サイトカイン応答または減衰サイトカイン応答の）ｓｉＮＡ分子を形成するための方法を特徴とする。１つの実施形態において、サイトカインはインターロイキン、例えばインターロイキン−６（ＩＬ−６）および／または腫瘍壊死α（ＴＮＦ−α）を含む。
【０３５７】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子および本明細書に記載する、または別様に当分野で知られた送達ビヒクルまたは送達粒子を含むｓｉＮＡ製剤を形成すること、および（ｂ）サイトカイン応答を刺激しないｓｉＮＡ製剤を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ製剤を試験すること、を含む、細胞、対象、または生物において炎症またはプロ炎症サイトカイン応答を刺激しない（例えば無サイトカイン応答または減衰サイトカイン応答の）ｓｉＮＡ製剤を形成するための方法を特徴とする。１つの実施形態において、サイトカインはインターロイキン、例えばインターロイキン−６（ＩＬ−６）および／または腫瘍壊死α（ＴＮＦ−α）を含む。
【０３５８】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩ（例えば表８において参照されるｓｉＮＡモチーフ）またはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入すること、および（ｂ）Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）応答を刺激しないｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験すること、を含む、細胞、対象、または生物においてＴＬＲ応答を刺激しない（例えば無ＴＬＲ応答または減衰ＴＬＲ応答の）ｓｉＮＡ分子を形成するための方法を特徴とする。１つの実施形態において、ＴＬＲはＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ９を含む。
【０３５９】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子および本明細書に記載する、または別様に当分野で知られた送達ビヒクルまたは送達粒子を含むｓｉＮＡ製剤を形成すること、および（ｂ）Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）応答を刺激しないｓｉＮＡ製剤を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ製剤を試験すること、を含む、細胞、対象、または生物においてＴＬＲ応答を刺激しない（例えば無ＴＬＲ応答または減衰ＴＬＲ応答の）ｓｉＮＡ製剤を形成するための方法を特徴とする。１つの実施形態において、ＴＬＲはＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ９を含む。
【０３６０】
１つの実施形態において、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介した標的ＲＮＡの切断を指向する化学合成された２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで（ａ）該ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８〜約３８ヌクレオチド長であり；（ｂ）該ｓｉＮＡ分子の１つの鎖はＲＮＡ干渉を介した標的ＲＮＡの切断を指向するために十分な、ｓｉＮＡ分子に対する該標的ＲＮＡへの相補性を有するヌクレオチド配列を含み；（ｃ）ここで該ｓｉＮＡ分子内部のヌクレオチド位置は、ｓｉＮＡ分子の免疫刺激特性を、相当する未修飾のｓｉＲＮＡ分子のものよりも低いレベルまで低減するように化学修飾されている。そのようなｓｉＮＡ分子は未修飾または最小限修飾されたｓｉＮＡと比較して向上した毒性学的プロファイルを有するとされている。
【０３６１】
「向上した毒性学的プロファイル」とは、化学修飾された、または製剤化されたｓｉＮＡコンストラクトが、細胞、対象、または生物において、未修飾または未製剤のｓｉＮＡ、またはより少ない修飾または向上した毒性学的特徴を付与する場合に有効性が低い修飾を有するｓｉＮＡと比較して、低下した毒性を示すことを意味する。そのようなｓｉＮＡ分子はまた、「向上したＲＮＡｉ活性」を有すると考えられる。非限定的な例において、向上した毒性学的プロファイルを有するｓｉＮＡ分子および製剤は、細胞、対象、または生物において、未修飾または未製剤のｓｉＮＡ、またはより少ない修飾または向上した毒性学的特徴を付与する場合に有効性が低い修飾を有するｓｉＮＡ分子と比較して、低減された免疫刺激特性、例えば低減、低下または減衰された免疫刺激応答を伴っている。そのような向上した毒性学的プロファイルは廃絶された、または低減された免疫刺激、例えばインターフェロン（例えばインターフェロンα）、炎症性サイトカイン（例えばインターロイキン、例えばＩＬ−６および／またはＴＮＦ−α）および／またはｔｏｌｌ様受容体（例えばＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ９）の誘導の低減または廃絶を特徴としている。１つの実施形態において、向上した毒性学的プロファイルを有するｓｉＮＡ分子または製剤はリボヌクレオチドを含まない。１つの実施形態において、向上した毒性学的プロファイルを有するｓｉＮＡ分子または製剤は５未満のリボヌクレオチド（例えば１、２、３、または４リボヌクレオチド）を含む。１つの実施形態において、向上した毒性学的プロファイルを有するｓｉＮＡ分子または製剤はＳｔａｂ  ７、Ｓｔａｂ  ８、Ｓｔａｂ  １１、Ｓｔａｂ  １２、Ｓｔａｂ  １３、Ｓｔａｂ  １６、Ｓｔａｂ  １７、Ｓｔａｂ  １８、Ｓｔａｂ  １９、Ｓｔａｂ２０、Ｓｔａｂ２３、Ｓｔａｂ２４、Ｓｔａｂ２５、Ｓｔａｂ２６、Ｓｔａｂ２７、Ｓｔａｂ２８、Ｓｔａｂ２９、Ｓｔａｂ３０、Ｓｔａｂ３１、Ｓｔａｂ３２、Ｓｔａｂ３３、Ｓｔａｂ３４、Ｓｔａｂ３５、Ｓｔａｂ３６、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む（表８参照）。本明細書においては数字によるＳｔａｂ化学は表８に示す化学の２’−フルオロおよび２’−ＯＣＦ３のバージョンを含む。例えば、「Ｓｔａｂ  ７／８」はＳｔａｂ  ７／８およびＳｔａｂ  ７Ｆ／８Ｆの両方を指す等とする。１つの実施形態において、向上した毒性学的プロファイルを有するｓｉＮＡ分子または製剤は本発明のｓｉＮＡ分子および図面を含めて参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３００７７８２９号に記載されている製剤を含む。
【０３６２】
１つの実施形態において、所定のｓｉＮＡ分子に伴っている免疫刺激応答のレベルは、本明細書に記載する通り、または別様に当分野で知られる通り、例えばＰＫＲ／インターフェロン応答、増殖、Ｂ細胞活性化、および／またはサイトカイン生産のレベルを測定することにより、特定のｓｉＮＡ分子の免疫刺激応答を定量するための試験において、計測することができる（例えばＬｅｉｆｅｒ等、２００３，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２６，３１３−９；および参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，９６８，９０９号を参照）。１つの実施形態において、低減された免疫刺激応答は未修飾または最小限修飾のｓｉＲＮＡ分子と比較して約１０％〜約１００％であり、例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％低減された免疫刺激応答となる。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子に伴っている免疫応答は化学修飾の程度によりモジュレートできる。例えば修飾されたｓｉＮＡ分子のヌクレオチド位置の約１０％〜約１００％、例えば約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％または少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を有するｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載する免疫刺激特性の相当する程度を有するように選択できる。
【０３６３】
１つの実施形態において、低減された免疫刺激応答の程度は最適化されたＲＮＡｉ活性のために選択される。例えば免疫刺激の特定の程度を保持することは、免疫刺激の１００％未満の低減が最大抗ウィルス活性のために好ましい場合があるウィルス感染を治療する場合には好ましい場合がある（例えば免疫刺激の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低減）のに対し、内因性遺伝子標的の発現の阻害は、最小限の免疫刺激特性を保有するｓｉＮＡ分子の場合に、非特異的毒性またはオフターゲット作用を防止するために好ましい場合がある（例えば免疫刺激の約９０％〜約１００％低減）。
【０３６４】
１つの実施形態において、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介した標的ＲＮＡの切断を指向する化学合成された２本鎖ｓｉＮＡ分子を特徴とし、ここで（ａ）該ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８〜約３８ヌクレオチド長であり；（ｂ）該ｓｉＮＡ分子の１つの鎖はＲＮＡ干渉を介した標的ＲＮＡの切断を指向するために十分な、ｓｉＮＡ分子に対する該標的ＲＮＡへの相補性を有するヌクレオチド配列を含み；（ｃ）ここで該ｓｉＮＡ分子のヌクレオチド１つ以上は、ｓｉＮＡ分子の免疫刺激特性を、相当する未修飾のｓｉＲＮＡ分子のものよりも低いレベルまで低減するように化学修飾されている。１つの実施形態において、各鎖は他の鎖のヌクレオチドに相補的である少なくとも約１８ヌクレオチドを含む。
【０３６５】
別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の免疫刺激特性を低減するために修飾されたヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス領域を含み、更にセンス領域を含み、ここで該センス領域は該標的遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部分と実質的に同様のヌクレオチド配列を含む。その１つの実施形態において、アンチセンス領域およびセンス領域は約１８〜約３８ヌクレオチドを含み、ここで該アンチセンス領域はセンス領域のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１８ヌクレオチドを含む。その１つの実施形態において、センス領域におけるピリミジンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである。その別の実施形態においては、センス領域におけるプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。その更に別の実施形態において、センス領域に存在するピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。その別の実施形態においては、該アンチセンス領域のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。その更に別の実施形態において、該アンチセンス領域のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。そのまた別の実施形態において、該アンチセンス領域におけるプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、アンチセンス領域は該アンチセンス領域の３’末端にホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含む。別の実施形態においては、アンチセンス領域は該アンチセンス領域の３’末端にグリセリル修飾を含む。
【０３６６】
他の実施形態において、ｓｉＮＡ分子の免疫刺激特性を低減するために修飾されたヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載するｓｉＮＡ分子の構造的特徴のいずれかを含むことができる。他の実施形態において、ｓｉＮＡ分子の免疫刺激特性を低減するために修飾されたヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載するｓｉＮＡ分子の化学修飾のいずれかを含むことができる。
【０３６７】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）ｓｉＮＡ分子に修飾されたヌクレオチド１つ以上を導入すること、および（ｂ）未修飾のヌクレオチドを有する相当するｓｉＮＡ分子と比較して低減された免疫刺激特性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験すること、を含む、ｓｉＮＡ分子の免疫刺激特性を低減するために化学修飾されたヌクレオチドを有する化学合成された２本鎖ｓｉＮＡ分子を形成するための方法を特徴とする。ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８〜約３８ヌクレオチド長である。ｓｉＮＡ分子の１つの鎖はＲＮＡ干渉を介した標的ＲＮＡの切断を指向するために十分な、ｓｉＮＡ分子に対する標的ＲＮＡへの相補性を有するヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態において、低減された免疫刺激特性は、細胞、組織、または生物に導入されるｓｉＮＡに応答する炎症性またはプロ炎症性のサイトカイン、例えばインターロイキン−６（ＩＬ−６）または腫瘍壊死α（ＴＮＦ−α）の廃絶または低減された誘導を含む。別の実施形態においては、低減された免疫刺激特性は、細胞、組織、または生物に導入されるｓｉＮＡに応答するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、例えばＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９の廃絶または低減された誘導を含む。別の実施形態においては、低減された免疫刺激特性は、細胞、組織、または生物に導入されるｓｉＮＡに応答するインターフェロンα等のインターフェロンの廃絶または低減された誘導を含む。
【０３６８】
１つの実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチドに対抗するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし、ここでｓｉＮＡコンストラクトはｓｉＮＡコンストラクトのセンスおよびアンチセンス鎖の間の結合親和性をモジュレートする本明細書に記載する化学修飾１つ以上を含む。
【０３６９】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入すること、および（ｂ）ｓｉＮＡ分子のセンスおよびアンチセンス鎖の間の増大した結合親和性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験すること、を含む、ｓｉＮＡ分子のセンスおよびアンチセンス鎖の間の増大した結合親和性を有するｓｉＮＡ分子を形成するための方法を特徴とする。
【０３７０】
１つの実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチドに対抗するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし、ここでｓｉＮＡコンストラクトは、細胞内部においてｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス鎖と相補標的ＲＮＡ配列との間の結合親和性をモジュレートする本明細書に記載する化学修飾１つ以上を含む。
【０３７１】
１つの実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチドに対抗するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし、ここでｓｉＮＡコンストラクトは、細胞内部においてｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス鎖と相補標的ＤＮＡ配列との間の結合親和性をモジュレートする本明細書に記載する化学修飾１つ以上を含む。
【０３７２】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入すること、および（ｂ）ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補標的ＲＮＡ配列との間の増大した結合親和性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験すること、を含む、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補標的ＲＮＡ配列との間の増大した結合親和性を有するｓｉＮＡ分子を形成するための方法を特徴とする。
【０３７３】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入すること、および（ｂ）ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補標的ＤＮＡ配列との間の増大した結合親和性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験すること、を含む、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補標的ＤＮＡ配列との間の増大した結合親和性を有するｓｉＮＡ分子を形成するための方法を特徴とする。
【０３７４】
１つの実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチドに対抗するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし、ここでｓｉＮＡコンストラクトは、化学修飾されたｓｉＮＡコンストラクトに対する配列相同性を有する追加的内因性ｓｉＮＡ分子を形成することができる細胞ポリメラーゼのポリメラーゼ活性をモジュレートする本明細書に記載する化学修飾１つ以上を含む。
【０３７５】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入すること、および（ｂ）化学修飾されたｓｉＮＡ分子に対する配列相同性を有する追加的内因性ｓｉＮＡ分子を形成することができる細胞ポリメラーゼの増大したポリメラーゼ活性を媒介できるｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験すること、を含む、化学修飾されたｓｉＮＡ分子に対する配列相同性を有する追加的内因性ｓｉＮＡ分子を形成することができる細胞ポリメラーゼの増大したポリメラーゼ活性を媒介できるｓｉＮＡ分子を形成するための方法を特徴とする。
【０３７６】
１つの実施形態において、本発明は、細胞において標的ポリヌクレオチドに対抗するＲＮＡｉを媒介する化学修飾されたｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし、ここで化学修飾は、標的ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、および／またはＲＮＡｉのために必須であるタンパク質または他の因子とのｓｉＮＡの相互作用に対して、そのようなｓｉＮＡコンストラクトにより媒介されるＲＮＡｉの効力を低下させる様式においては、顕著な作用を有していない。
【０３７７】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入すること、および（ｂ）向上したＲＮＡｉ特異性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験すること、を含む、ポリヌクレオチド標的に対抗する向上したＲＮＡｉ特異性を有するｓｉＮＡ分子を形成するための方法を特徴とする。１つの実施形態において、向上した特異性は未修飾のｓｉＮＡ分子と比較して低減されたオフターゲット作用を有することを含む。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖または領域の３’末端、５’末端、または３’と５’末端の両方における末端キャップ部分の導入は、センス鎖またはセンス領域がセンス鎖またはセンス領域に対する相補性を有する相当する標的に対抗するＲＮＡｉ活性のための鋳型として作用しないようにすることにより、向上した特異性を有するようにｓｉＮＡを指向させることができる。
【０３７８】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入すること、および（ｂ）向上したＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験すること、を含む、標的ポリヌクレオチドに対抗する向上したＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を形成するための方法を特徴とする。
【０３７９】
更に別の実施形態において、本発明は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入すること、および（ｂ）標的ＲＮＡに対抗する向上したＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験すること、を含む、標的ＲＮＡに対抗する向上したＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を形成するための方法を特徴とする。
【０３８０】
更に別の実施形態において、本発明は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入すること、および（ｂ）標的ＤＮＡに対抗する向上したＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験すること、を含む、標的ＤＮＡに対抗する向上したＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を形成するための方法を特徴とする。
【０３８１】
１つの実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチドに対抗するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし、ここでｓｉＮＡコンストラクトはｓｉＮＡのコレステロールコンジュゲーション等のｓｉＮＡコンストラクトの細胞取り込みをモジュレートする本明細書に記載する化学修飾１つ以上を含む。
【０３８２】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入すること、および（ｂ）向上した細胞取り込みを有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験すること、を含む、向上した細胞取り込みを有する標的ポリヌクレオチドに対抗するｓｉＮＡ分子を形成するための方法を特徴とする。
【０３８３】
１つの実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチドに対抗するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし、ここでｓｉＮＡコンストラクトは、例えばポリエチレングリコールまたはｓｉＮＡコンストラクトの薬物動態を向上させる等価物コンジュゲート等の重合体コンジュゲートを結合させることによるか、またはインビボで特定の組織型または細胞型をターゲティングするコンジュゲートを結合させることにより、ｓｉＮＡコンストラクトの生体利用性を増大させる本明細書に記載する化学修飾１つ以上を含む。そのようなコンジュゲートの非限定的な例は参照により本明細書に組み込まれるＶａｒｇｅｅｓｅ等、米国特許出願第１０／２０１，３９４号に記載されている。
【０３８４】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の構造内にコンジュゲートを導入すること、および（ｂ）向上した生体利用性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験すること、を含む、向上した生体利用性を有する本発明のｓｉＮＡ分子を形成するための方法を特徴とする。そのようなコンジュゲートは細胞受容体に対するリガンド、例えば天然に存在するタンパク質リガンドから誘導されたペプチド；タンパク質局在化配列、例えば細胞ＺＩＰコード配列；抗体；核酸アプタマー；ビタミンおよび他のコファクター、例えばフォレートおよびＮ−アセチルガラクトサミン；重合体、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；リン脂質；コレステロール；コレステロール誘導体、ポリアミン、例えばスペルミンまたはスペルミジン；およびその他のものを含むことができる。
【０３８５】
１つの実施形態において、本発明は標的ＲＮＡ配列またはその一部分に相補的な第１のヌクレオチド配列および該第１の配列に対する相補性を有する第２の配列を含む２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで該第２の配列は、それがもはや、ＲＮＡ干渉を効率的に媒介するためのガイド配列として作用できない、および／または、ＲＮＡｉを促進する細胞タンパク質により認識され得ないような様式において、化学修飾されている。１つの実施形態において、ｓｉＮＡの第１のヌクレオチド配列は本明細書に記載する通り化学修飾されている。１つの実施形態において、ｓｉＮＡの第１のヌクレオチド配列は修飾されていない（例えば全てＲＮＡである）。
【０３８６】
１つの実施形態において、本発明は標的ＲＮＡ配列またはその一部分に相補的な第１のヌクレオチド配列および該第１の配列に対する相補性を有する第２の配列を含む２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで該第２の配列は、ガイド配列としての、または、標的核酸（例えばＲＮＡ）配列に相補的である配列としての、ＲＮＡｉ経路内へのその侵入を防止するような様式において、設計または修飾されている。１つの実施形態において、ｓｉＮＡの第１のヌクレオチド配列は本明細書に記載する通り化学修飾されている。１つの実施形態において、ｓｉＮＡの第１のヌクレオチド配列は修飾されていない（例えば全てＲＮＡである）。そのような設計または修飾はｓｉＮＡの活性を増強および／または本発明のｓｉＮＡ分子の特異性を向上させると期待される。このような修飾はまた、いずれかのオフターゲット作用および／または関連する毒性を最小限にすると期待される。
【０３８７】
１つの実施形態において、本発明は標的ＲＮＡ配列またはその一部分に相補的な第１のヌクレオチド配列および該第１の配列に対する相補性を有する第２の配列を含む２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで該第２の配列はＲＮＡ干渉を媒介するためのガイド配列として作用することができない。１つの実施形態において、ｓｉＮＡの第１のヌクレオチド配列は本明細書に記載する通り化学修飾されている。１つの実施形態において、ｓｉＮＡの第１のヌクレオチド配列は修飾されていない（例えば全てＲＮＡである）。
【０３８８】
１つの実施形態において、本発明は標的ＲＮＡ配列またはその一部分に相補的な第１のヌクレオチド配列および該第１の配列に対する相補性を有する第２の配列を含む２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで該第２の配列は末端５’−ヒドロキシル（５’−ＯＨ）または５’−ホスフェート基を有さない。
【０３８９】
１つの実施形態において、本発明は標的ＲＮＡ配列またはその一部分に相補的な第１のヌクレオチド配列および該第１の配列に対する相補性を有する第２の配列を含む２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで該第２の配列は該第２の配列の５’末端に末端キャップ部分を含む。１つの実施形態において、末端キャップ部分は反転無塩基、反転デオキシ無塩基、反転ヌクレオチド部分、図７に示す基、アルキルまたはシクロアルキル基、ヘテロ環、または、第２の配列がガイド配列またはＲＮＡｉのための鋳型として作用するＲＮＡｉ活性を防止するいずれかの他の基を含む。
【０３９０】
１つの実施形態において、本発明は標的ＲＮＡ配列またはその一部分に相補的な第１のヌクレオチド配列および該第１の配列に対する相補性を有する第２の配列を含む２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで該第２の配列は該第２の配列の５’末端および３’末端に末端キャップ部分を含む。１つの実施形態において、末端キャップ部分は個々に、反転無塩基、反転デオキシ無塩基、反転ヌクレオチド部分、図７に示す基、アルキルまたはシクロアルキル基、ヘテロ環、または、第２の配列がガイド配列またはＲＮＡｉのための鋳型として作用するＲＮＡｉ活性を防止するいずれかの他の基を含む。
【０３９１】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の構造内に化学修飾１つ以上を導入すること、および（ｂ）向上した特異性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験すること、を含む、標的核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば遺伝子またはその相当するＲＮＡ）の発現をダウンレギュレートまたは阻害するための向上した特異性を有する本発明のｓｉＮＡ分子を形成するための方法を特徴とする。別の実施形態においては、特異性を向上させるために使用する化学修飾はｓｉＮＡ分子の５’末端、３’末端、または５’および３’末端の両方において末端キャップ修飾を含む。末端キャップ修飾は例えば図７に示す構造（例えば反転デオキシ無塩基部分）、または、ｓｉＮＡ分子の一部分（例えばセンス鎖）をオフターゲットの核酸配列に対抗してＲＮＡ干渉を媒介できなくするいずれかの他の化学修飾を含むことができる。非限定的な例においては、ｓｉＮＡ分子はｓｉＮＡ分子のアンチセンス配列のみが相当する標的ＲＮＡ配列のＲＩＳＣ媒介分解のためのガイド配列として作用できるように設計される。これはＲＮＡｉ機序によるガイド配列としてのセンス鎖の認識を排除するセンス鎖への化学修飾の導入によりｓｉＮＡのセンス鎖を不活性化することにより達成できる。１つの実施形態において、このような化学修飾はｓｉＮＡのセンス鎖の５’末端におけるいずれかの化学基、またはセンス鎖をＲＮＡ干渉を媒介するためのガイド配列としては不活性なものとするいずれかの他の基を含む。これらの修飾は例えば、センス鎖の５’末端がもはや遊離の’−ヒドロキシル（５’−ＯＨ）または遊離の’−ホスフェート基（例えばホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、環状ホスフェート等）を有さない分子をもたらすことができる。そのようなｓｉＮＡコンストラクトの非限定的な例は本明細書に記載する通りであり、例えば「Ｓｔａｂ９／１０」、「Ｓｔａｂ  ７／８」、「Ｓｔａｂ  ７／１９」、「Ｓｔａｂ  １７／２２」、「Ｓｔａｂ２３／２４」、「Ｓｔａｂ２４／２５」、および「Ｓｔａｂ２４／２６」（例えばＳｔａｂ  ７、９、１７、２３、または２４センス鎖を有するいずれかのｓｉＮＡ）の化学、およびその変異体（表８参照）が挙げられ、その場合、ｓｉＮＡのセンス鎖の５’末端および３’末端はヒドロキシル基またはホスフェート基を含まない。本明細書においては、数字によるＳｔａｂ化学は表８に示す化学の２’−フルオロおよび２’−ＯＣＦ３バージョンの両方を含む。例えば、「Ｓｔａｂ  ７／８」はＳｔａｂ  ７／８およびＳｔａｂ  ７Ｆ／８Ｆの両方を指す等とする。
【０３９２】
１つの実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡ分子の鎖または一部分をＲＮＡｉ活性の鋳型またはガイド配列として作用できないようにする化学修飾１つ以上をｓｉＮＡ分子の構造に導入することを含む、ＥＮａＣ標的核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばＥＮａＣ遺伝子またはその相当するコーディングおよび／または非コーディングＲＮＡ）の発現をダウンレギュレートまたは阻害するための向上した特異性を有する本発明のｓｉＮＡ分子を形成するための方法を特徴とする。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子の不活性鎖またはセンス領域は、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域であり、即ち、標的核酸配列に対する相補性を有さないｓｉＮＡの鎖または領域である。１つの実施形態において、そのような化学修飾は５’−ヒドロキシル（５’−ＯＨ）または５’−ホスフェート基、またはセンス鎖またはセンス領域をＲＮＡ干渉を媒介するためのガイド配列としては不活性なものとする作用を有するいずれかの他の基を含まないｓｉＮＡのセンス鎖または領域の５’末端のいずれかの化学基を含む。そのようなｓｉＮＡコンストラクトの非限定的な例は本明細書に記載する通りであり、例えば「Ｓｔａｂ９／１０」、「Ｓｔａｂ  ７／８」、「Ｓｔａｂ  ７／１９」、「Ｓｔａｂ  １７／２２」、「Ｓｔａｂ２３／２４」、「Ｓｔａｂ２４／２５」、および「Ｓｔａｂ２４／２６」（例えばＳｔａｂ  ７、９、１７、２３、または２４センス鎖を有するいずれかのｓｉＮＡ）の化学、およびその変異体（表８参照）が挙げられ、その場合、ｓｉＮＡのセンス鎖の５’末端および３’末端はヒドロキシル基またはホスフェート基を含まない。本明細書においては、数字によるＳｔａｂ化学は表８に示す化学の２’−フルオロおよび２’−ＯＣＦ３バージョンの両方を含む。例えば、「Ｓｔａｂ  ７／８」はＳｔａｂ  ７／８およびＳｔａｂ  ７Ｆ／８Ｆの両方を指す等とする。
【０３９３】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）複数の未修飾ｓｉＮＡ分子を形成すること、（ｂ）標的核酸配列に対抗するＲＮＡ干渉を媒介することにおいて活性であるｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をスクリーニングすること、および（ｃ）（ｂ）の活性なｓｉＮＡ分子内に化学修飾（例えば本明細書に記載する、または別様に当分野で知られた化学修飾）を導入すること、を含む、標的核酸配列に対抗してＲＮＡ干渉を媒介することにおいて活性なｓｉＮＡ分子をスクリーニングするための方法を特徴とする。１つの実施形態において、方法は更に標的核酸配列に対抗するＲＮＡ干渉を媒介することにおいて活性である化学修飾されたｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ｃ）の化学修飾されたｓｉＮＡ分子を再スクリーニングすることを含む。
【０３９４】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）複数の化学修飾されたｓｉＮＡ分子（例えば本明細書に記載する、または別様に当分野で知られたｓｉＮＡ分子）を形成すること、および（ｂ）標的核酸配列に対抗するＲＮＡ干渉を媒介することにおいて活性である化学修飾されたｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をスクリーニングすること、を含む、標的核酸配列に対抗してＲＮＡ干渉を媒介することにおいて活性な化学修飾されたｓｉＮＡ分子をスクリーニングするための方法を特徴とする。
【０３９５】
「リガンド」という用語は直接または間接的に受容体等の別の化合物と相互作用することができる薬品、ペプチド、ホルモン、または神経伝達物質等のいずれかの化合物または分子を指す。リガンドと相互作用する受容体は、細胞表面上に存在できるか、または、細胞内および／または細胞間の受容体であることができる。リガンドの受容体との相互作用は生化学的反応が生じさせることができ、または単に物理的な相互作用または会合であることができる。
【０３９６】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）ｓｉＮＡ分子に賦形剤製剤を導入すること、および（ｂ）向上した生体利用性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験すること、を含む、向上した生体利用性を有する本発明のｓｉＮＡ分子を形成するための方法を特徴とする。そのような賦形剤は重合体、例えばシクロデキストリン、脂質、カチオン性脂質、ポリアミド、リン脂質、ナノ粒子、受容体、リガンド、またはその他のものを含む。
【０３９７】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）ｓｉＮＡ分子に式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有するヌクレオチドを導入すること、および（ｂ）向上した生体利用性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適する条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験すること、を含む、向上した生体利用性を有する本発明のｓｉＮＡ分子を形成するための方法を特徴とする。
【０３９８】
別の実施形態においては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を本発明のｓｉＮＡ化合物に共有結合させることができる。結合させるＰＥＧはいずれかの分子量、好ましくは約１００〜約５０，０００ダルトン（Ｄａ）であることができる。
【０３９９】
本発明は、試料および／または対象を試験するためのＲＮＡのインビトロまたはインビボの導入を実施するために、単独で、または必要な試薬少なくとも１つを有するキットの成分として、使用できる。例えばキットの好ましい成分は本発明のｓｉＮＡ分子および本明細書に記載する通り対象の細胞内へのｓｉＮＡの導入を促進するビヒクルを含む（例えば脂質または当分野で知られたトランスフェクションの他の方法を使用、例えばＢｅｉｇｅｌｍａｎ等、ＵＳ６，３９５，７１３参照）。キットは標的の有効化のために、例えば遺伝子の機能および／または活性を測定する場合に、または薬品最適化において、および薬品発見において使用できる（例えばＵｓｍａｎ等、ＵＳＳＮ６０／４０２，９９６参照）。このようなキットはまた、キットのユーザーが本発明を実施できるようにするための説明書を含むことができる。
【０４００】
「短鎖干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「短鎖干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「短鎖干渉核酸分子」、「短鎖干渉オリゴヌクレオチド分子」、または「化学修飾された短鎖干渉核酸分子」という用語は本明細書において使用する場合、ＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」または遺伝子サイレンシングを配列特異的な様式で媒介することにより遺伝子発現またはウィルス複製を阻害またはダウンレギュレートすることができるいずれかの核酸分子を指す。用語は個々の核酸分子、そのような核酸分子の複数、またはそのような核酸分子のプールの両方を指すことができる。ｓｉＮＡは自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を含む２本鎖核酸分子であることができ、その場合、アンチセンス領域は標的核酸分子におけるヌクレオチド配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部分に相当するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは２つの別個のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、その場合、一方の鎖がセンス鎖であり、もう一方がアンチセンス鎖であり、ここでアンチセンスおよびセンス鎖は自己相補的であり（即ち各鎖は他方の鎖におけるヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む；例えばアンチセンス鎖およびセンス鎖がデュプレックスまたは２本鎖の構造を形成する場合、例えば２本鎖領域が約１５〜約３０、例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０塩基対である場合；アンチセンス鎖は標的核酸分子におけるヌクレオチド配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖は標的核酸配列またはその一部分に相当するヌクレオチド配列を含む（例えばｓｉＮＡ分子の約１５〜約２５以上のヌクレオチドが標的核酸またはその一部分に相補的である）。或いは、ｓｉＮＡは単一のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、その場合、ｓｉＮＡの自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域は核酸系または非核酸系のリンカーを用いることにより連結される。ｓｉＮＡはデュプレックス、非対称デュプレックス、ヘアピンまたは非対称ヘアピンの二次構造を有し、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有するポリヌクレオチドであることができ、その場合、アンチセンス領域は別個の標的核酸分子におけるヌクレオチド配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部分に相当するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を含む、ループ構造２つ以上およびステムを有する環状１本鎖ポリヌクレオチドであることができ、その場合、アンチセンス領域は標的核酸分子におけるヌクレオチド配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部分に相当するヌクレオチド配列を有し、ここで環状ポリヌクレオチドはＲＮＡｉを媒介することができる活性なｓｉＮＡ分子を形成するためにインビボまたはインビトロのいずれかでプロセシングされることができる。ｓｉＮＡはまた、標的核酸分子におけるヌクレオチド配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を有する１本鎖ポリヌクレオチドを含むことができ（例えば、そのようなｓｉＮＡ分子が標的核酸配列またはその一部分に相当するヌクレオチド配列のｓｉＮＡ分子内部における存在を必要としない場合）、その場合、１本鎖ポリヌクレオチドは更に、末端ホスフェート基、例えば５’−ホスフェート（例えばＭａｒｔｉｎｅｚ等、２００２，Ｃｅｌｌ，１１０，５６３−５７４およびＳｃｈｗａｒｚ等、２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，１０，５３７−５６８を参照）または５’，３’−ジホスフェートを含むことができる。特定の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は別個のセンスおよびアンチセンスの配列または領域を含み、その場合、センスおよびアンチセンス領域は当分野で知られたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドのリンカー分子により共有結合されているか、またはイオン性相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、および／またはスタッキング相互作用により非共有結合的に連結されている。特定の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は標的遺伝子の数配列に相補的な数配列を含む。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は標的遺伝子の発現の阻害を誘発するような様式において標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。本明細書において使用する場合、ｓｉＮＡ分子はＲＮＡのみを含有する分子に限定される必要はないが、更に化学修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドも含む。特定の実施形態においては、本発明の短鎖干渉核酸分子は２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠いている。本出願人は特定の実施形態においてＲＮＡｉを媒介するために２’−ヒドロキシル基を有するヌクレオチドの存在を必要としない短鎖干渉核酸を記載しており、そのため、本発明の短鎖干渉核酸分子は場合によりいずれかのリボヌクレオチド（例えば２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まない。しかしながら、ＲＮＡｉを支援するためにｓｉＮＡ分子内部のリボヌクレオチドの存在を必要としないこのようなｓｉＮＡ分子は、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド１つ以上を含有する、連結されたリンカー、または他の連結または会合した基、部分、または鎖を有することができる。場合により、ｓｉＮＡ分子はヌクレオチド位置の約５、１０、２０、３０、４０、または５０％においてリボヌクレオチドを含むことができる。本発明の修飾された短鎖干渉核酸分子はまた、短鎖干渉修飾オリゴヌクレオチド「ｓｉＭＯＮ」と称されることができる。本明細書において使用する場合、ｓｉＮＡという用語は、配列特異的ＲＮＡｉを媒介することができる核酸分子、例えば短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉オリゴヌクレオチド、短鎖干渉核酸、短鎖干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）、およびその他のものを記載するために使用される他の用語と同等の意味を有する。本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的な例を本明細書の図４〜６、および表１ａおよび１ｂにおいて示す。そのようなｓｉＮＡ分子は、リボザイム、アンチセンス、トリプレックス形成、アプタマー、２，５���Ａキメラ、またはデコイオリゴヌクレオチド等の遺伝子発現の阻害を媒介する当分野で知られた他の核酸技術とは区別される。
【０４０１】
「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」とは、一般的に当分野で知られる通り、短鎖干渉核酸分子により媒介される、細胞における遺伝子発現を阻害またはダウンレギュレートする生物学的プロセスを意味し、例えばＺａｍｏｒｅ  ａｎｄ  Ｈａｌｅｙ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５１９−１５２４；Ｖａｕｇｈｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２５−１５２６；Ｚａｍｏｒｅ等、２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３；Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒ等、２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８；およびＫｒｅｕｔｚｅｒ等、国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／４４８９５；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ等、国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／３６６４６；Ｆｉｒｅ，国際ＰＣＴ公開ＷＯ９９／３２６１９；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ等、国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／０１８４６；Ｍｅｌｌｏ  ａｎｄ  Ｆｉｒｅ，国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／２９０５８；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ，国際ＰＣＴ公開ＷＯ９９／０７４０９；およびＬｉ等、国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／４４９１４；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ等、２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌ等、２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２０５６−６０；ＭｃＭａｎｕｓ等、２００２，ＲＮＡ，８，８４２−８５０；Ｒｅｉｎｈａｒｔ等、２００２，Ｇｅｎｅ＆Ｄｅｖ．，１６，１６１６−１６２６；およびＲｅｉｎｈａｒｔ＆Ｂａｒｔｅｌ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３１を参照できる。更に、本明細書において使用する場合、ＲＮＡｉという用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、または後成説等の配列特異的ＲＮＡ干渉を記載するために使用される他の用語と同等の意味を有する。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子は転写後のレベルまたは転写前のレベルの両方において遺伝子を後成的にサイレンシングするために使用できる。非限定的な例において、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の構成的モジュレーションは遺伝子発現を改変するクロマチンの構造またはメチル化のパターンのｓｉＮＡ媒介修飾に起因する場合がある（例えばＶｅｒｄｅｌ等、２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６７２−６７６；Ｐａｌ−Ｂｈａｄｒａ等、２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６６９−６７２；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ等、２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌ等、２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７を参照）。別の非限定的な例においては、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現のモジュレーションは、ＲＩＳＣを介したＲＮＡ（コーディングまたは非コーディングＲＮＡのいずれか）のｓｉＮＡ媒介切断、或いは当分野��知られる通り翻訳阻害に起因する場合がある。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現のモジュレーションは転写阻害に起因する場合がある（例えばＪａｎｏｗｓｋｉ等、２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，２１６−２２２参照）。
【０４０２】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子はデュプレックス形成オリゴヌクレオチド「ＤＦＯ」である（例えば図１１〜１２、および２００３年１２月３日出願のＶａｉｓｈらのＵＳＳＮ１０／７２７，７８０、および２００４年５月２４日出願の国際ＰＣＴ出願ＵＳ０４／１６３９０参照）。
【０４０３】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は多重機能性ｓｉＮＡである（例えば図１３〜２５、および２００４年２月１０日出願のＪａｄｈａｖ等のＵＳＳＮ６０／５４３，４８０および２００４年５月２４日出願の国際ＰＣＴ出願ＵＳ０４／１６３９０参照）。１つの実施形態において、本発明の多重機能ｓｉＮＡは例えばＥＮａＣ  ＲＮＡの領域２つ以上をターゲティングする配列を含むことができる（例えば表１ａおよび１ｂの標的配列を参照）。１つの実施形態において、本発明の多重機能ｓｉＮＡは、表１ａおよび１ｂのＥＮａＣ標的配列またはそのアイソタイプのいずれかまたはそのいずれかの組み合わせからなる群より選択されるＥＮａＣ標的のいずれかをターゲティングする配列を含むことができる。
【０４０４】
「非対称ヘアピン」とは、本明細書において使用する場合、アンチセンス領域、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含むことができるループ部分、およびアンチセンス領域と塩基対形成し、ループとデュプレックスを形成するために十分な相補ヌクレオチドをセンス領域が有する程度にまでアンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含むセンス領域を含む線状ｓｉＮＡ分子を意味する。例えば、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、細胞またはインビトロの系においてＲＮＡｉを媒介するために十分な長さ（例えば約１５〜約３０、または約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド）を有するアンチセンス領域、および約４〜約１２（例えば約４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２）ヌクレオチドを含むループ領域、およびアンチセンス領域に相補的な約３〜約２５（例えば約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）ヌクレオチドを有するセンス領域を含むことができる。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子はまた化学修飾されていることができる５’−末端ホスフェート基を含むことができる。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子のループ部分は、本明細書に記載する通り、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、またはコンジュゲート分子を含むことができる。
【０４０５】
「非対称デュプレックス」とは、本明細書において使用する場合、センス領域およびアンチセンス領域を含む２つの別個の鎖を有するｓｉＮＡ分子を意味し、ここで、センス領域はアンチセンス領域と塩基対形成し、デュプレックスを形成するために十分な相補ヌクレオチドをセンス領域が有する程度にまでアンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含む。例えば本発明の非対称デュプレックスｓｉＮＡ分子は、細胞またはインビトロの系においてＲＮＡｉを媒介するために十分な長さ（例えば約１５〜約３０、または約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド）を有するアンチセンス領域、およびアンチセンス領域に相補的な約３〜約２５（例えば約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）ヌクレオチドを有するセンス領域を含むことができる。
【０４０６】
「ＲＮＡｉ阻害剤」とは、細胞または生物におけるＲＮＡ干渉の機能または活性をダウンレギュレート、低減または阻害できるいずれかの分子を意味する。ＲＮＡｉ阻害剤はＲＮＡｉ経路のいずれかの成分、例えばタンパク質成分、例えばＲＩＳＣ、または核酸成分、例えばｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの機能と相互作用するか、これに干渉することによりＲＮＡｉ（例えば標的ポリヌクレオチドのＲＮＡｉ媒介切断、翻訳阻害、または転写サイレンシング）をダウンレギュレート、低減または阻害することができる。ＲＮＡｉ阻害剤はｓｉＮＡ分子、アンチセンス分子、アプタマー、またはＲＩＳＣ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡまたは細胞または生物におけるＲＮＡｉ経路のいずれかの他の成分の機能と相互作用するか、これに干渉する小分子であることができる。ＲＮＡｉ（例えば標的ポリヌクレオチドのＲＮＡｉ媒介切断、翻訳阻害、または転写サイレンシング）を阻害することにより、本発明のＲＮＡｉ阻害剤は標的遺伝子の発現をモジュレート（例えばアップレギュレートまたはダウンレギュレート）するために使用できる。１つの実施形態において、本発明のＲＮＡ阻害剤は、翻訳阻害、転写サイレンシング、またはポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）のＲＩＳＣ媒介切断を通じた遺伝子発現の内因性のダウンレギュレーションまたは阻害に干渉（例えば低減または防止）することにより遺伝子発現をアップレギュレートするために使用される。遺伝子発現の内因性の抑制、サイレンシング、または阻害の機序に干渉することにより、本発明のＲＮＡｉ阻害剤は従って機能の損失に起因する疾患、体質、または状態の治療のために遺伝子発現をアップレギュレートするために使用できる。１つの実施形態において、「ＲＮＡｉ阻害剤」という用語は、例えば機能の損失、疾患、体質、および／または状態の治療のために遺伝子発現を増大させる作用を有する、本明細書における種々の実施形態における「ｓｉＮＡ」という用語の代わりに使用される。
【０４０７】
「アプタマー」または「核酸アプタマー」とは、本明細書において使用する場合、標的分子に特異的に結合するポリヌクレオチドを意味し、ここで核酸分子はその天然の状況において標的分子により認識される配列とは区別可能な配列を有する。或いはアプタマーは標的分子に結合する核酸分子であることができ、ここで標的分子は天然には核酸に結合しない。標的分子はいずれかの対象のノキュベットであることができる。例えば、アプタマーはタンパク質のリガンド結合ドメインに結合することによりタンパク質との天然に存在するリガンドの相互作用を防止するために使用できる。これは非限定的な例であり、当業者の知る通り、他の実施形態も一般的に当分野で知られた手法を用いて形成することができ、例えばＧｏｌｄ等、１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７６３；Ｂｒｏｄｙ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，５；Ｓｕｎ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２，１００；Ｋｕｓｓｅｒ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，２７；Ｈｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｌ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，８２０；およびＪａｙａｓｅｎａ，１９９９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，１６２８を参照できる。本発明のアプタマー分子は一般的に当分野で知られる通り、または本明細書に記載する通り、化学修飾することができる。
【０４０８】
「アンチセンス核酸」という用語は本明細書において使用する場合、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＰＮＡ（タンパク質核酸；Ｅｇｈｏｌｍ等、１９９３  Ｎａｔｕｒｅ  ３６５，５６６）の相互作用により標的ＲＮＡに結合し、立体的相互作用によるか、またはＲＮａｓｅ  Ｈ媒介標的認識により標的ＲＮＡの活性を改変する（考察のためには例えばＳｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎｇ，１９９３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１，１００４およびＷｏｏｌｆ等、米国特許第５，８４９，９０２号を参照）核酸分子を指す。典型的にはアンチセンス分子はアンチセンス分子の単一の近接配列に沿って標的配列と総補的である。しかしながら、特定の実施形態においては、アンチセンス分子は基質分子がループを形成するように基質に結合でき、および／または、アンチセンス分子はアンチセンス分子がループを形成するように結合できる。即ち、アンチセンス分子は２つの（またはそれより多い）非近接基質配列に相補的であることができるか、またはアンチセンス分子の２つの（またはそれより多い）非近接配列部分が標的配列に相補的であることができるか、その双方である。現在のアンチセンス用法に関しては、Ｓｃｈｍａｊｕｋ等、１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２１７８３−２１７８９，Ｄｅｌｉｈａｓ等、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ，１５，７５１−７５３，Ｓｔｅｉｎ等、１９９７，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎ．Ａ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，７，１５１，Ｃｒｏｏｋｅ，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３１３，３−４５；Ｃｒｏｏｋｅ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．，１５，１２１−１５７，Ｃｒｏｏｋｅ，１９９７，Ａｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４０，１−４９を参照できる。更に、アンチセンスＤＮＡまたは２’−ＭＯＥおよび当分野で知られる通り他の修飾で修飾されたアンチセンスも、ＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用を用いてＲＮＡをターゲティングすることによりデュプレックスの標的ＲＮＡを消化するＲＮａｓｅ  Ｈを活性化するために使用できる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ切断を活性化することができるＲＮａｓｅ  Ｈ活性化領域１つ以上を含むことができる。アンチセンスＤＮＡは化学合成するか、１本鎖ＤＮＡ発現ベクターまたはその等価物の使用を介して発現させることができる。本発明のアンチセンス分子は一般的に当分野で知られる通り、または本明細書に記載する通り、化学修飾することができる。
【０４０９】
「モジュレートする」とは、遺伝子の発現、ＲＮＡ分子または１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードする等価なＲＮＡ分子のレベル、または１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットの活性が、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされることにより、発現、レベルまたは活性がモジュレーターの非存在下で観察されるものよりも高値または低値となることを意味する。例えば、「モジュレートする」という用語は「阻害する」ことを意味することができるが、「モジュレートする」という単語の使用はこの定義に限定されない。
【０４１０】
「阻害する」、「ダウンレギュレートする」または「低減する」とは、遺伝子の発現、またはＲＮＡ分子または１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードする等価なＲＮＡ分子のレベル、または１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットの活性が、本発明の核酸分子（例えばｓｉＮＡ）の非存在下で観察されるものよりも低値に低減されることを意味する。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子による阻害、ダウンレギュレーションまたは低減は不活性または弱化された分子の存在下で観察されるレベルより低値である。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子による阻害、ダウンレギュレーションまたは低減は、例えばスクランブルド配列を有する、またはミスマッチを有するｓｉＮＡ分子の存在下で観察されるレベルより低値である。別の実施形態においては、本発明の核酸分子による遺伝子発現の阻害、ダウンレギュレーションまたは低減は、核酸分子の存在下において、その非存在下よりも高値となる。１つの実施形態において、遺伝子発現の阻害、ダウンレギュレーションまたは低減は、転写後のサイレンシング、例えば標的核酸分子（例えばＲＮＡ）のＲＮＡｉ媒介切断または翻訳の阻害に関連している。１つの実施形態において、遺伝子発現の阻害、ダウンレギュレーションまたは低減は、例えばＤＮＡメチル化パターンおよびＤＮＡクロマチン構造の改変による、転写前のサイレンシングに関連している。
【０４１１】
「アップレギュレートする」または「促進する」とは、遺伝子の発現、またはＲＮＡ分子または１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードする等価なＲＮＡ分子のレベル、または１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットの活性が、本発明の核酸分子（例えばｓｉＮＡ）の非存在下で観察されるものよりも高値に増大されることを意味する。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現のアップレギュレーションまたは促進は不活性または弱化された分子の存在下で観察されるレベルより高値である。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現のアップレギュレーションまたは促進は、例えばスクランブルド配列を有する、またはミスマッチを有するｓｉＮＡ分子の存在下で観察されるレベルより高値である。別の実施形態においては、本発明の核酸分子による遺伝子発現のアップレギュレーションまたは促進は、核酸分子の存在下において、その非存在下よりも高値となる。１つの実施形態において、遺伝子発現のアップレギュレーションまたは促進は、ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシング、例えばアップレギュレートすべき対象の遺伝子の発現をダウンレギュレート、阻害、またはサイレント化するコーディングまたは非コーディングのＲＮＡ標的のＲＮＡｉ媒介の切断またはサイレンシングに関連している。遺伝子発現のダウンレギュレーションは例えばコーディングＲＮＡまたはそのコードされたタンパク質により、例えばネガティブフィードバックまたは拮抗作用を通じて、誘導することができる。遺伝子発現のダウンレギュレーションは例えば対象の遺伝子に対して調節的制御性を有する非コーディングＲＮＡにより、例えば翻訳阻害、クロマチン構造、メチル化、ＲＩＳＣ媒介ＲＮＡ切断、または翻訳阻害を介して遺伝子の発現をサイレント化することにより、誘導することができる。即ち、対象の遺伝子をダウンレギュレート、抑制、またはサイレント化する標的の阻害またはダウンレギュレーションは、治療用途を目標として対象の遺伝子の発現をアップレギュレートまたは促進するために使用できる。
【０４１２】
１つの実施形態において、本発明のＲＮＡｉ阻害剤はＲＮＡｉまたは遺伝子サイレンシングを阻害することにより遺伝子発現をアップレギュレートするために使用される。例えば本発明のＲＮＡｉ阻害剤は、例えば、特定の遺伝子の１つの対立遺伝子が突然変異（例えばフレームシフト、ミスセンス、またはナンセンス突然変異）を保有しているためにその突然変異体対立遺伝子によりコードされるタンパク質の機能の損失が起こるハプロ不全の場合のように、遺伝子発現をアップレギュレートすることにより機能損失、疾患および状態を治療するために使用できる。そのような場合、ＲＮＡｉ阻害剤は、野生型または機能的な対立遺伝子によりコードされるタンパク質の発現をアップレギュレートし、これにより突然変異体またはヌル対立遺伝子を補償することによりハプロ不全を補正するために使用できる。別の実施形態においては、本明細書に記載する、または別様に当分野で知られる通り、疾患、体質、または状態の治療の場合のように、機能的対立遺伝子の毒性ゲインの発現をダウンレギュレートするために本発明のｓｉＮＡ分子を使用しつつ、野生型または機能的な対立遺伝子の発現をアップレギュレートするために本発明のＲＮＡｉ阻害剤を同時に使用する（例えばＲｈｏｄｅｓ等、２００４，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１０１：１１１４７−１１１５２およびＭｅｉｓｌｅｒ等、２００５，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１１５：２０１０−２０１７参照）。
【０４１３】
「遺伝子」または「標的遺伝子」または「標的ＤＮＡ」とは、ＲＮＡをコードする核酸、例えばポリペプチドをコードしている構造遺伝子を含むがこれらに限定されない核酸配列である。遺伝子または標的遺伝子はまた機能的ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）または非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、例えば小型一時的ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小型核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小型核小体ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびその前駆体ＲＮＡをコードすることができる。このような非コーディングＲＮＡは機能性または調節性の細胞プロセスに関与するｆＲＮＡまたはｎｃＲＮＡの活性をモジュレートする場合に、ｓｉＮＡ媒介ＲＮＡ干渉のための標的核酸分子として作用できる。従って、疾患につながる異常なｆＲＮＡまたはｎｃＲＮＡ活性は本発明のｓｉＮＡ分子によりモジュレートすることができる。ｆＲＮＡおよびｎｃＲＮＡをターゲティングするｓｉＮＡ分子はまた、遺伝子インプリンティング、転写、翻訳、または核酸のプロセシング（例えばアミノ転移、メチル化等）等の細胞プロセスに介入することにより対象、生物または細胞の遺伝子型または表現型を操作または改変するために使用できる。標的遺伝子は細胞、内因性の遺伝子、トランスジーン、または外因性の遺伝子、例えば細胞内にその感染後に存在する例えばウィルス等の病原体の遺伝子から誘導した遺伝子であることができる。標的遺伝子を含有する細胞はいずれかの生物、例えば植物、動物、原虫、ウィルス、細菌またはカビから誘導するか、またはそれに含有されることができる。植物の非限定的な例は単子葉植物、双子葉植物、または裸子植物を含む。動物の非限定的な例は脊椎動物または無脊椎動物を含む。カビの非限定的な例は糸状菌またはコウボを含む。考察のためには例えばＳｎｙｄｅｒ  ａｎｄ  Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３００，２５８−２６０を参照できる。
【０４１４】
「非カノニカルな塩基対」がいずれかの非ワトソンクリック塩基対、例えばミスマッチおよび／またはウオッブル塩基対、例えばフリップドミスマッチ、１水素結合ミスマッチ、トランス型ミスマッチ、３塩基相互作用、および４塩基相互作用を意味する。このような非カノニカルな塩基対の非限定的な例は、ＡＣリバースフーグスティーン、ＡＣウオッブル、ＡＵリバースフーグスティーン、ＧＵウオッブル、ＡＡ  Ｎ７アミノ、ＣＣ２−カルボニル−アミノ（Ｈｌ）−Ｎ３−アミノ（Ｈ２）、ＧＡシアード、ＵＣ  ４−カルボニル−アミノ、ＵＵイミノ−カルボニル、ＡＣリバースウオッブル、ＡＵフーグスティーン、ＡＵリバースワトソンクリック、ＣＧリバースワトソンクリック、ＧＣ  Ｎ３−アミノ−アミノＮ３、ＡＡ  Ｎｌ−アミノ対称、ＡＡ  Ｎ７−アミノ対称、ＧＡ  Ｎ７−Ｎ１アミノ−カルボニル、ＧＡ＋カルボニル−アミノＮ７−Ｎ１、ＧＧ  Ｎｌ−カルボニル対称、ＧＧ  Ｎ３−アミノ対称、ＣＣカルボニル−アミノ対称、ＣＣＮ３−アミノ対称、ＵＵ  ２−カルボニル−イミノ対称、ＵＵ  ４−カルボニル−イミノ対称、ＡＡアミノ−Ｎ３、ＡＡ  Ｎｌ−アミノ、ＡＣアミノ２−カルボニル、ＡＣ  Ｎ３−アミノ、ＡＣ  Ｎ７−アミノ、ＡＵアミノ−４−カルボニル、ＡＵ  Ｎｌ−イミノ、ＡＵ  Ｎ３−イミノ、ＡＵ  Ｎ７−イミノ、ＣＣカルボニル−アミノ、ＧＡアミノ−Ｎｌ、ＧＡアミノ−Ｎ７、ＧＡカルボニル−アミノ、ＧＡ  Ｎ３−アミノ、ＧＣアミノ−Ｎ３、ＧＣカルボニル−アミノ、ＧＣ  Ｎ３−アミノ、ＧＣ  Ｎ７−アミノ、ＧＧアミノ−Ｎ７、ＧＧカルボニル−イミノ、ＧＧ  Ｎ７−アミノ、ＧＵアミノ−２−カルボニル、ＧＵカルボニル−イミノ、ＧＵイミノ−２−カルボニル、ＧＵ  Ｎ７−イミノ、ｐｓｉＵイミノ−２−カルボニル、ＵＣ  ４−カルボニル−アミノ、ＵＣイミノ−カルボニル、ＵＵイミノ−４−カルボニル、ＡＣ  Ｃ２−Ｈ−Ｎ３、ＧＡカルボニル−Ｃ２−Ｈ、ＵＵイミノ−４−カルボニル２カルボニル−Ｃ５−Ｈ、ＡＣアミノ（Ａ）Ｎ３（Ｃ）−カルボニル、ＧＣイミノアミノ−カルボニル、Ｇｐｓｉイミノ−２−カルボニルアミノ−２−カルボニル、およびＧＵイミノアミノ−２−カルボニル塩基対を含むがこれらに限定されない。
【０４１５】
「ＥＮａＣ」とは本明細書において使用する場合、いずれかの上皮ナトリウムチャンネル即ちＥＮａＣのタンパク質、ペプチド、またはポリペプチド、例えば表７に示すＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により参照される配列を含むα（ＳＣＮＮ１Ａ）、β（ＳＣＮＮ１Ｂ）またはγ（ＳＣＮＮ１Ｇ）サブユニット配列をコードする遺伝子を意味する。本明細書において「ＥＮａＣ」に言及する場合、α（ＳＣＮＮ１Ａ）、β（ＳＣＮＮ１Ｂ）またはγ（ＳＣＮＮ１Ｇ）サブユニット配列の全てを含む。好ましい実施形態においては、本発明はα（ＳＣＮＮ１Ａ）サブユニットをコードするＥＮａＣ遺伝子の発現を独立して、或いは組み合わせにおいてモジュレートする１つ以上のｓｉＮＡ分子および／またはＲＮＡｉ阻害剤および方法を特徴とする。ＥＮａＣという用語はまた、いずれかのＥＮａＣのタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸、例えば表７に示すＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により参照される配列を含むα（ＳＣＮＮ１Ａ）、β（ＳＣＮＮ１Ｂ）またはγ（ＳＣＮＮ１Ｇ）サブユニット配列をコードする核酸を指す。「ＥＮａＣ」という用語はまた、他のＥＮａＣコード配列、例えば種々の対象または生物から誘導されたＥＮａＣ配列、例えば他のＥＮａＣアイソフォーム、突然変異体ＥＮａＣ遺伝子、ＥＮａＣ遺伝子のアイソタイプ、ＥＮａＣ遺伝子の多形型、およびＥＮａＣのスプライシング変異体を含む意味も有する。
【０４１６】
「標的」とは本明細書において使用する場合、表７に示すＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によりコードされるようないずれかのＥＮａＣ標的のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを意味する。「標的」という用語はまた、表７に示すＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を有する配列によりコードされるタンパク質、ペプチド、またはポリペプチド等のいずれかの標的タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列または標的ポリヌクレオチド配列を指す。対象の標的は標的ポリヌクレオチド配列、例えば標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡを含む。「標的」という用語は他の配列、例えば異なるアイソフォーム、突然変異体標的遺伝子、標的ポリヌクレオチドのアイソタイプ、標的多形型、および非コーディング（例えばｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓＲＮＡ）または本明細書に記載する他の調節ポリヌクレオチド配列を含む意味を有する。従って、本発明の種々の実施形態において、標的ＲＮＡに対する相補性を有する本発明の２本鎖核酸分子（例えばｓｉＮＡ）を用いてｍｉＲＮＡまたは他のｎｃＲＮＡの活性を阻害またはダウンレギュレートすることができる。１つの実施形態において、ｍｉＲＮＡまたはｎｃＲＮＡの活性の阻害は、ｍｉＲＮＡまたはｎｃＲＮＡの活性に依存している遺伝子発現（例えば本明細書に記載する、または別様に当分野で知られた遺伝子標的）をダウンレギュレートまたは阻害するために使用できる。別の実施形態においては、ｍｉＲＮＡまたはｎｃＲＮＡに対する相補性を有する本発明の２本鎖核酸分子（例えばｓｉＮＡ）によるｍｉＲＮＡまたはｎｃＲＮＡの活性の阻害は、標的遺伝子の発現（例えば本明細書に記載する、または別様に当分野で知られた遺伝子標的）をアップレギュレートまたは促進するために使用することができ、この場合は、その遺伝子の発現はｍｉＲＮＡまたはｎｃＲＮＡによりダウンレギュレート、抑制、またはサイレント化される。遺伝子発現のこのようなアップレギュレーションは、一般的に当分野で知られる通り、機能の損失またはハプロ不全に関連する疾患および状態を治療するために使用できる。
【０４１７】
「経路標的」とは、遺伝子の発現または活性の経路に関与するいずれかの標的を意味する。例えば、いずれかの所定の標的は生物学的経路における上流、下流、またはモディファイアーの遺伝子を含むことができる関連経路標的を有することができる。これらの経路標的遺伝子は本明細書における疾患、状態および体質の治療において相加または相乗作用を与えることができる。
【０４１８】
１つの実施形態において、標的は標的ＲＮＡまたはその一部分のいずれかである。
【０４１９】
１つの実施形態において、標的はＥＮａＣ  ＲＮＡまたはその一部分のいずれかである。
【０４２０】
１つの実施形態において、標的はＥＮａＣ  ＤＮＡまたはその一部分のいずれかである。
【０４２１】
１つの実施形態において、標的はＥＮａＣ  ｍＲＮＡまたはその一部分のいずれかである。
【０４２２】
１つの実施形態において、標的はＥＮａＣ  ｍｉＲＮＡまたはその一部分のいずれかである。
【０４２３】
１つの実施形態において、標的はＥＮａＣ  ｓｉＲＮＡまたはその一部分のいずれかである。
【０４２４】
１つの実施形態において、標的はＥＮａＣ標的またはその一部分である。
【０４２５】
１つの実施形態において、標的は本明細書に記載する、および／または表７に示す標的配列のいずれかのＥＮａＣ（例えば１つ以上）である。１つの実施形態において、標的は表１ａまたは１ｂに示す標的配列またはその一部分のいずれか（例えば１つ以上）である。別の実施形態においては、標的は、表１ａまたは１ｂに示す標的、配列またはその相補体またはＥＮａＣ標的またはその一部分のいずれか（例えば１つ以上）に相当するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｔＲＮＡである。
【０４２６】
１つの実施形態において、標的は表７に示す標的配列のいずれかのＥＮａＣ（例えば１つ以上）である。１つの実施形態において、標的は表１ａまたは１ｂに示す標的配列（例えば配列番号１、２、３および／または４）またはその一部分のいずれか（例えば１つ以上）である。別の実施形態においては、標的は、表１ａまたは１ｂに示す標的（例えば配列番号１、２、３および／または４）またはその相補体またはその一部分のいずれか（例えば１つ以上）に相当するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｔＲＮＡである。別の実施形態においては、標的は本明細書に記載する、または表７に示す配列に相当する配列のいずれか（例えば１つ以上）に相当するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｔＲＮＡである。
【０４２７】
「相同配列」とは、遺伝子、遺伝子転写物および／または非コーディングポリペプチド等のポリペプチド配列１つ以上により共有されているヌクレオチド配列を意味する。例えば、相同配列は、異なる数の遺伝子ファミリー、異なるタンパク質エピトープ、異なるタンパク質アイソフォーム、または完全に相違する遺伝子、例えばサイトカインおよびその相当する受容体等の、関連しているが異なるタンパク質をコードする遺伝子２つ以上により共有されているヌクレオチド配列であることができる。相同配列は非コーディングＤＮＡまたはＲＮＡ、調節配列、イントロン、および転写制御または調節の部位等の非コーディングポリヌクレオチド２つ以上により共有されているヌクレオチド配列であることができる。相同配列はまた１つより多いポリヌクレオチド配列により共有されている保存された配列領域を含むことができる。部分的に相同な配列もまた、本発明が意図するものであるため（例えば９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％等）、相同性は完全な相同性（例えば１００％）である必要はない。
【０４２８】
「保存された配列領域」とは、ポリヌクレオチドの領域１つ以上のヌクレオチド配列は、世代間で、或いは１つの生物学的な系、対象、または生物からもう１つの生物学的な系、対象、または生物に渡って、顕著に変動していないことを意味する。ポリヌクレオチドはコーディングおよび非コーディングのＤＮＡおよびＲＮＡを含むことができる。
【０４２９】
「センス領域」とはｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域に対する相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。更に、ｓｉＮＡ分子のセンス領域は標的核酸配列との相同性を有する核酸配列を含むことができる。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子のセンス領域はセンス鎖またはパッセンジャー鎖とも称する。
【０４３０】
「アンチセンス領域」とは標的核酸配列に対する相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。更に、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は場合により、ｓｉＮＡ分子のセンス領域に対する相補性を有する核酸配列を含むことができる。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域はアンチセンス鎖またはガイド鎖とも称する。
【０４３１】
「標的核酸」または「標的ポリヌクレオチド」とは、それ自体の発現または活性がモジュレートされるべき、いずれかの核酸配列（例えばいずれかのＥＮａＣ配列）を意味する。標的核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであることができる。１つの実施形態において、本発明の標的核酸は標的ＲＮＡまたはＤＮＡである。
【０４３２】
「相補性」とは、核酸が、伝統的なワトソンクリックまたは本明細書に記載する他の非伝統的な型のいずれかにより、別の核酸配列と水素結合を形成できることを意味する。１つの実施形態において、各鎖が１５〜３０ヌクレオチド長であるｓｉＮＡ分子等の本発明の２本鎖核酸分子は、２本鎖核酸分子の２つの鎖の間で約１０％〜約１００％（例えば約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％）の相補性を含む。別の実施形態においては、一方の鎖がセンス鎖であり、他方の鎖がアンチセンス鎖であり、各鎖が１５〜３０ヌクレオチド長であるｓｉＮＡ分子等の本発明の２本鎖核酸分子は、２本鎖核酸分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列とその相当する標的核酸分子、例えば標的ＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡまたはウィルスＲＮＡのヌクレオチド配列との間で少なくとも約１０％〜約１００％（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％）の相補性を含む。１つの実施形態において、一方の鎖がセンス領域と称されるヌクレオチド配列を含み、他方の鎖がアンチセンス領域と称されるヌクレオチド配列を含み、各鎖が１５〜３０ヌクレオチド長であるｓｉＮＡ分子等の本発明の２本鎖核酸分子は、２本鎖核酸分子のセンス領域とアンチセンス領域との間で約１０％〜約１００％（例えば約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％）の相補性を含む。本発明の核酸分子に言及する場合、核酸分子に関するその相補配列との結合フリーエネルギーは、核酸の該当機能、例えばＲＮＡｉ活性が進行できるようにするために十分である。核酸分子に関する結合フリーエネルギーの測定は当分野で周知である（例えばＴｕｒｎｅｒ等、１９８７，ＣＳＨ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ  ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒ等、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ等、１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５参照）。パーセント相補性は第２の核酸配列と水素結合を形成（例えばワトソンクリック塩基対形成）できる核酸分子中の近接残基のパーセントを指す（例えば第１のオリゴヌクレオチド中合計１０ヌクレオチドのうち５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドが１０ヌクレオチドを有する第２の核酸配列と塩基対形成している場合、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補となる）。１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子はｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域の間で完全な相補性を有する。１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は相当する標的核酸分子に完全に相補的である。「完全に相補」とは核酸配列の近接残基の全てが第２の核酸配列の近接残基の同数と水素結合することを意味する。１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、１つ以上の標的核酸分子またはその一部分に相補的な約１５〜約３０以上（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０以上）のヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子はｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間、またはｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖またはアンチセンス領域と相当する標的核酸分子との間に、部分的相補性（例えば１００％未満の相補性）を有する。例えば部分的相補性は、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間、またはｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖またはアンチセンス領域と相当する標的核酸分子との間に、バルジ、ループ、またはオーバーハングをもたらす場合があるｓｉＮＡ構造内部の種々のミスマッチまたは非塩基対形成ヌクレオチド（例えば１、２、３、４、５以上のミスマッチまたは非塩基対形成ヌクレオチド）を含むことができる。
【０４３３】
１つの実施形態において、本発明の２本鎖核酸分子、例えばｓｉＮＡ分子は、核酸分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間に完全な相補性を有する。１つの実施形態において、本発明の２本鎖核酸分子、例えばｓｉＮＡ分子は、相当する標的核酸分子に対して完全に相補的である。
【０４３４】
１つの実施形態において、本発明の２本鎖核酸分子、例えばｓｉＮＡ分子は、２本鎖核酸分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間、または核酸分子のアンチセンス鎖またはアンチセンス領域と相当する標的核酸分子との間に、部分的相補性（例えば１００％未満の相補性）を有する。例えば部分的相補性は、２本鎖核酸分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間、または２本鎖核酸分子のアンチセンス鎖またはアンチセンス領域と相当する標的核酸分子との間に、バルジ、ループ、またはオーバーハングをもたらす場合がある２本鎖核酸分子構造内部の種々のミスマッチまたは非塩基対形成ヌクレオチド（例えば１、２、３、４、５以上のミスマッチまたは非塩基対形成ヌクレオチド、例えばヌクレオチドバルジ）を含むことができる。特定の実施形態においては、部分的相補性は２本鎖核酸分子の３’または５’末端のいずれかに位置する非塩基対形成ヌクレオチド（例えば１、２、３、４、５、または６以上の非塩基対形成ヌクレオチド）に関することができる。そのような実施形態において、２本鎖核酸分子の残余は鎖および／または標的配列の間で完全に相補的であることができる。
【０４３５】
１つの実施形態において、本発明の２本鎖核酸分子はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」とはｍＲＮＡ切断、翻訳抑制／阻害またはヘテロクロマチン性のサイレンシングのいずれかにより標的メッセンジャーＲＮＡの発現を調節する小型の２本鎖ＲＮＡを意味する（例えばＡｍｂｒｏｓ，２００４，Ｎａｔｕｒｅ，４３１，３５０−３５５；Ｂａｒｔｅｌ，２００４，Ｃｅｌｌ，１１６，２８１−２９７；Ｃｕｌｌｅｎ，２００４，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．，１０２，３−９；Ｈｅ等、２００４，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ，５，５２２−５３１；Ｙｉｎｇ等、２００４，Ｇｅｎｅ，３４２，２５−２８；およびＳｅｔｈｕｐａｔｈｙ等、２００６，ＲＮＡ，１２：１９２−１９７参照）。１つの実施形態において、本発明のマイクロＲＮＡはｍｉＲＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間、またはｍｉＲＮＡのアンチセンス鎖またはアンチセンス領域と相当する標的核酸分子との間に、部分的相補性（例えば１００％未満の相補性）を有する。例えば部分的相補性は、ｍｉＲＮＡのセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間、またはｍｉＲＮＡのアンチセンス鎖またはアンチセンス領域と相当する標的核酸分子との間に、バルジ、ループ、またはオーバーハングをもたらす場合がある２本鎖核酸分子構造内部の種々のミスマッチまたは非塩基対形成ヌクレオチド（例えば１、２、３、４、５以上のミスマッチまたは非塩基対形成ヌクレオチド、例えばヌクレオチドバルジ）を含むことができる。
【０４３６】
１つの実施形態において、標的遺伝子の発現をダウンレギュレートまたは低減する本発明のｓｉＮＡ分子は本明細書に記載する、または別様に当分野で知られた対象または生物における呼吸器の疾患、障害、体質、または状態を治療または防止するために使用される。
【０４３７】
本発明の１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子の各配列は、独立して約１５〜約３０ヌクレオチド長であり、特定の実施形態においては、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡデュプレックスは独立して約１５〜約３０塩基対（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）を含む。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子の１つ以上の鎖は、独立して、標的核酸分子に相補的な約１５〜約３０ヌクレオチド（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）を含む。更に別の実施形態において、ヘアピンまたは環状の構造を含む本発明のｓｉＮＡ分子は約３５〜約５５（例えば約３５、４０、４５、５０、または５５）ヌクレオチド長、または約３８〜約４４（例えば３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４）ヌクレオチド長であり、約１５〜約２５（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）塩基対を含む。例示される本発明のｓｉＮＡ分子を表ＩＩおよびＩＩＩおよび／または図４〜５に示す。
【０４３８】
本明細書において使用する場合、「細胞」とはその通常の生物学的意味において使用され、全体としての多細胞の生物を指すものではなく、例えば特にヒトを指すものではない。細胞は生物、例えばトリ、植物および哺乳類、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ、およびネコにおいて存在できる。細胞は原核生物（例えば細菌細胞）または真核生物（例えば哺乳類または植物細胞）であることができる。細胞は体細胞または生殖細胞系統起源、全能性または多能性、分裂性または非分裂性であることができる。細胞はまた配偶子または胚、幹細胞、または完全に分化した細胞から誘導することができ、またはそれを含むことができる。
【０４３９】
本発明のｓｉＮＡ分子は直接添加するか、または、カチオン性脂質と複合体化するか、リポソーム内にパッケージするか、または別様に標的細胞または組織に送達することができる。核酸または核酸複合体は該当組織にエクスビボで、または肺への局所送達を通じてインビボで、生物重合体中へのその取り込みを行うか行うことなく、局所投与できる。特定の実施形態においては、本発明の核酸分子は表１ａおよび１ｂおよび／または図４〜５に示す配列を含む。そのような核酸分子の例はこれらの表および図において定義された配列より本質的になる。更に、表８に記載した化学修飾されたコンストラクトおよび表１０に示す脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を本発明のいずれかのｓｉＮＡ配列またはｓｉＮＡ配列群に適用できる。
【０４４０】
別の態様において、本発明は本発明のｓｉＮＡ分子１つ以上を含有する哺乳類細胞を提供する。１つ以上のｓｉＮＡ分子を独立して、本発明の標的ポリヌクレオチド内部の同じかまたは異なる部位にターゲティングさせることができる。
【０４４１】
「ＲＮＡ」とはリボヌクレオチド残基少なくとも１つを含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とはβ−Ｄ−リボフラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。用語は２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば部分精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換え生産されたＲＮＡ、並びに、ヌクレオチド１つ以上の付加、欠失、置換および／または改変により天然に存在するＲＮＡとは異なる改変されたＲＮＡを含む。そのような改変は、ｓｉＮＡの末端または内部への、例えばＲＮＡのヌクレオチド１つ以上における、非ヌクレオチド物質の付加を含むことができる。本発明のＲＮＡ分子におけるヌクレオチドはまた、非標準のヌクレオチド、例えば天然に存在しないヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを含むことができる。これらの改変されたＲＮＡは類縁体または天然に存在するＲＮＡの類縁体と称することができる。
【０４４２】
「対象」とは増量された細胞のドナーまたはレシピエントまたは細胞自体を意味する。「対象」とはまた、本発明の核酸分子を投与できる生物を指す。対象はヒトまたはヒト細胞を含む哺乳類または哺乳類細胞であることができる。１つの実施形態において、対象は小児（例えば１ヶ月齢未満、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヶ月齢である対象）である。１つの実施形態において、対象は幼児（例えば１、２、３、４、５、または６歳齢）である。１つの実施形態において、対象は高齢者（例えば約６５歳を超えた者）である。
【０４４３】
「化学修飾」とは本明細書において使用する場合、ネイティブのｓｉＲＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチドとは異なるヌクレオチドの化学構造のいずれかの修飾を意味する。「化学修飾」という用語は、本明細書に記載する、または別様に当分野で知られる通り、修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドを有するネイティブのｓｉＲＮＡまたはＲＮＡのヌクレオシドおよびヌクレオチドの付加、置換、または修飾を含む。そのような化学修飾の非限定的な例は、本明細書の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩのいずれかを有する組成物、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、４’−チオリボヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド（例えば参照により本明細書に組み込まれる２００４年１１月５日出願のＵＳＳＮ１０／９８１，９６６参照）、ＦＡＮＡ、「ユニバーサル塩基」、ヌクレオチド、「非環式」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、末端グリセリルおよび／または反転デオキシ無塩基残基取り込み、または本明細書の式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかを有する修飾を含むがこれらに限定されない。１つの実施形態において、本発明の核酸分子（例えばｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡ等）は化学修飾により部分的に修飾（例えば約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％修飾）されている。別の実施形態においては、本発明の核酸分子（例えばｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡ等）は化学修飾により完全に修飾（例えば約１００％修飾）されている。
【０４４４】
「ホスホロチオエート」という用語は本明細書において使用する場合、式Ｉを有するヌクレオチド間連結部を指し、式中Ｚおよび／またはＷはイオウ原子を含む。従って、ホスホロチオエートという用語はホスホロチオエートおよびホスホロチオエートヌクレオチド間連結部の両方を指す。
【０４４５】
「ホスホノアセテート」という用語は本明細書において使用する場合、式Ｉを有するヌクレオチド間連結部を指し、式中Ｚおよび／またはＷはアセチルまたは保護されたアセチル基を含む。
【０４４６】
「チオホスホノアセテート」という用語は本明細書において使用する場合、式Ｉを有するヌクレオチド間連結部を指し、式中Ｚはアセチルまたは保護されたアセチル基を含み、Ｗはイオウ原子を含むか、またはＷはアセチルまたは保護されたアセチル基を含み、Ｚはイオウ原子を含む。
【０４４７】
「ユニバーサル塩基」という用語は本明細書において使用する場合、相互にほぼ区別しない、天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基の各々と塩基対を形成するヌクレオチド塩基類縁体を指す。ユニバーサル塩基の非限定的な例は、当分野で知られる通り、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチルおよび他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、およびニトロアゾール誘導体、例えば３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、および６−ニトロインドールを含む（例えばＬｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２４３７−２４４７参照）。
【０４４８】
「非環式ヌクレオチド」という用語は本明細書において使用する場合、例えばリボースの炭素のいずれか（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、またはＣ５）が独立して、または組み合わせにおいて、ヌクレオチドに存在しない、非環式のリボース糖を有するいずれかのヌクレオチドを指す。
【０４４９】
本発明の核酸分子は、個別に、または組み合わせにおいて、または他の薬品との連携において、対象または生物において、本明細書に記載する、または別様に当分野で知られた疾患、障害、状態、および体質を防止または治療するために使用できる。
【０４５０】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は治療に適する条件下、個別に、または薬品１つ以上と組み合わせて、対象に投与するか、または当分野で知られた他の適切な細胞に投与することができる。
【０４５１】
更に実施形態において、ｓｉＮＡ分子は、対象または生物における呼吸器の疾患、障害、または状態を防止または治療するための他の知られた治療と組み合わせて使用できる。例えば、記載した分子は、ＰＤＥ阻害剤、例えば８−メトキシメチル−ＩＢＭＸ（ＰＤＥ４Ｂ１阻害剤）、ロリプラム（ＰＤＥ４Ｂ阻害剤）およびデンブフィリン（ＰＤＥ４Ｂ阻害剤）等の、当分野で知られた対象または生物における本明細書に記載する疾患、障害、状態、および体質を防止または治療するための知られた化合物、治療法、または操作法１つ以上と組み合わせて使用できる。
【０４５２】
１つの実施形態において、本発明はｓｉＮＡ分子の発現を可能にする様式において、本発明のｓｉＮＡ分子少なくとも１つをコードする核酸配列を含む発現ベクターを特徴とする。例えば、ベクターはデュプレックスを含むｓｉＮＡ分子の両方の鎖をコードする配列を含有できる。ベクターはまた、自己相補的であり、このためｓｉＮＡ分子を形成する、単一の核酸分子をコードする配列も含有できる。そのような発現ベクターの非限定的な例は、Ｐａｕｌ等、２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ａｎｄ  Ｔａｉｒａ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７；Ｌｅｅ等、２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００；およびＮｏｖｉｎａ等、２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ａｄｖａｎｃｅ  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７２５に記載されている。
【０４５３】
別の実施形態においては、本発明は本発明の発現ベクターを含む哺乳類細胞、例えばヒト細胞を特徴とする。
【０４５４】
更に別の実施形態において、本発明の発現ベクターは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、例えば本明細書の表７に示すＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により参照されるＲＮＡ分子に対する相補性を有するｓｉＮＡ分子に関する配列を含む。
【０４５５】
１つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、同じかまたは異なることができる２つ以上のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。
【０４５６】
本発明の別の態様において、標的ＲＮＡ分子と相互作用し、標的ＲＮＡ分子（例えば本明細書に記載したＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により参照される標的ＲＮＡ分子）をコードする遺伝子をダウンレギュレートするｓｉＮＡ分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写ユニットから発現される。組み換えベクターはＤＮＡプラスミドまたはウィルスベクターであることができる。ｓｉＮＡ発現ウィルスベクターはアデノ関連ウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、またはαウィルスを基にして構築できるが、これらに限定されない。ｓｉＮＡ分子を発現することができる組み換えベクターは本明細書に記載する通り送達され、標的細胞中に残存できる。或いは、ｓｉＮＡ分子の一過性の発現をもたらすウィルスベクターを使用できる。そのようなベクターは必要に応じて繰り返し投与できる。発現された後、ｓｉＮＡ分子は結合し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して遺伝子の機能または発現をダウンレギュレートする。ｓｉＮＡ発現ベクターの送達は、例えば静脈内または筋肉内投与により、対象から外植された標的細胞への投与とその後の対象への再導入により、または、所望の標的細胞内への導入を可能にするいずれかの他の手段により、全身に行うことができる。
【０４５７】
「ベクター」とは所望の核酸を送達するために使用されるいずれかの核酸および／またはウィルス系の手法を意味する。
【０４５８】
本発明の他の特徴および利点は、その好ましい実施形態の以下の説明から、特許請求の範囲から、明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【０４５９】
【図１】ｓｉＮＡ分子の合成に関するスキームの非限定的な例を示す。相補的なｓｉＮＡ配列鎖、即ち鎖１および鎖２をタンデムに合成し、固体支持体上の固相合成のために使用される切断可能な連結部と同じかまたは異なることができる、ヌクレオチドスクシネートまたは無塩基スクシネート等の、切断可能な連結部により連結される。合成は固相または溶液相のいずれかによることができ、示した実施例においては、合成は固相合成である。合成はジメトキシトリチル基等の保護基がタンデムオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチド上に未損傷で残存できるように実施する。オリゴヌクレオチドの切断および脱保護により、２つのｓｉＮＡ鎖は自動的にハイブリダイズしてｓｉＮＡデュプレックスを形成し、これにより、末端保護基の特性を利用して、例えば、末端保護基を有するデュプレックス／オリゴヌクレオチドのみが単離されるトリチルオン精製方法を適用することによりデュプレックスの精製が可能となる。
【図２】本発明の方法により合成された精製されたｓｉＮＡデュプレックスのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。示されている２つのピークは別個のｓｉＮＡ配列鎖の予測質量に相当する。この結果はタンデム合成から形成されたｓｉＮＡデュプレックスが単純なトリチルオン精製方法を用いながら単一の実体として精製できることを示している。
【図３】ＲＮＡｉに関与する標的ＲＮＡの分解の非限定的な案としての機序的表示を示す。外来性の１本鎖ＲＮＡ、例えばウィルス、トランスポゾン、または他の外因性のＲＮＡからＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）により形成された２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）はＤＩＣＥＲ酵素を活性化し、次にこれがｓｉＮＡデュプレックスを形成する。或いは、合成または発現されたｓｉＮＡを適切な手段により細胞内に直接導入することができる。標的ＲＮＡを認識する活性なｓｉＮＡ複合体が形成され、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体による標的ＲＮＡの分解、またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）による追加的ＲＮＡの合成がもたらされ、これはＤＩＣＥＲを活性化し、追加的なｓｉＮＡ分子をもたらし、これによりＲＮＡｉ応答を増幅する。
【図４】本発明の化学修飾されたｓｉＮＡコンストラクトの非限定的な例を示す。図において、Ｎはいずれかのヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、シトシン、ウリジン、または場合によりチミジン）を示し、例えばチミジンは括弧により示されるオーバーハング領域において置換されることができる（ＮＮ）。種々の修飾がｓｉＮＡコンストラクトのセンスおよびアンチセンス鎖に関して示されている。（ＮＮ）ヌクレオチド位置は本明細書に記載する通り化学修飾されることができ（例えば２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ等）、相当する標的核酸配列から誘導可能または不可能である（例えば図６Ｃ参照）。更に、図４に示す配列はセンス鎖の５’末端から９番目の位置、または、ガイド鎖の５’末端から内側に１１ヌクレオチド位置を数えることによりガイド鎖の５’末端に基づいて１１番目の位置に、リボヌクレオチドを場合により含むことができる（図６Ｃ参照）。    図４Ａ  センス鎖は２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３’ヌクレオチドは場合により塩基対形成しており、ここで存在する全てのヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除いてリボヌクレオチドであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載する他の化学修飾を含むことができる。アンチセンス鎖は場合により３’末端グリセリル部分を有する２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３’ヌクレオチドは場合により標的ＲＮＡ配列に相補的であり、ここで存在する全てのヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除いてリボヌクレオチドであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載する他の化学修飾を含むことができる。修飾されたヌクレオチド間連結部、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは本明細書に記載する他の修飾されたヌクレオチド間連結部は「ｓ」として示されており、これは場合によりアンチセンス鎖における（ＮＮ）ヌクレオチドを連結する。    図４Ｂ  センス鎖は２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３’ヌクレオチドは場合により塩基対形成しており、ここで、（ＮＮ）ヌクレオチドを除いて、存在することができる全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、存在することができる全てのプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載する他の化学修飾を含むことができる。アンチセンス鎖は場合により３’末端グリセリル部分を有する２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３’ヌクレオチドは場合により標的ＲＮＡ配列に相補的であり、ここで、（ＮＮ）ヌクレオチドを除いて、存在することができる全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、存在することができる全てのプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載する他の化学修飾を含むことができる。修飾されたヌクレオチド間連結部、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは本明細書に記載する他の修飾されたヌクレオチド間連結部は「ｓ」として示されており、これは場合によりセンスおよびアンチセンス鎖における（ＮＮ）ヌクレオチドを連結する。    図４Ｃ  センス鎖は５’および３’末端キャップ部分を有する２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３’ヌクレオチドは場合により塩基対形成しており、ここで、（ＮＮ）ヌクレオチドを除いて、存在することができる全てのピリミジンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載する他の化学修飾を含むことができる。アンチセンス鎖は場合により３’末端グリセリル部分を有する２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３’ヌクレオチドは場合により標的ＲＮＡ配列に相補的であり、ここで、（ＮＮ）ヌクレオチドを除いて、存在することができる全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載する他の化学修飾を含むことができる。修飾されたヌクレオチド間連結部、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは本明細書に記載する他の修飾されたヌクレオチド間連結部は「ｓ」として示されており、これは場合によりアンチセンス鎖における（ＮＮ）ヌクレオチドを連結する。    図４Ｄ  センス鎖は５’および３’末端キャップ部分を有する２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３’ヌクレオチドは場合により塩基対形成しており、ここで、（ＮＮ）ヌクレオチドを除いて、存在することができる全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載する他の化学修飾を含むことができ、ここで存在することができる全てのプリンヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。アンチセンス鎖は場合により３’末端グリセリル部分を有する２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３’ヌクレオチドは場合により標的ＲＮＡ配列に相補的であり、ここで、（ＮＮ）ヌクレオチドを除いて、存在することができる全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、存在することができる全てのプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載する他の化学修飾を含むことができる。修飾されたヌクレオチド間連結部、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは本明細書に記載する他の修飾されたヌクレオチド間連結部は「ｓ」として示されており、これは場合によりアンチセンス鎖における（ＮＮ）ヌクレオチドを連結する。      図４Ｅ  センス鎖は５’および３’末端キャップ部分を有する２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３’ヌクレオチドは場合により塩基対形成しており、ここで、（ＮＮ）ヌクレオチドを除いて、存在することができる全てのピリミジンヌクレ���チドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載する他の化学修飾を含むことができる。アンチセンス鎖は場合により３’末端グリセリル部分を有する２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３’ヌクレオチドは場合により標的ＲＮＡ配列に相補的であり、ここで、（ＮＮ）ヌクレオチドを除いて、存在することができる全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、存在することができる全てのプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載する他の化学修飾を含むことができる。修飾されたヌクレオチド間連結部、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは本明細書に記載する他の修飾されたヌクレオチド間連結部は「ｓ」として示されており、これは場合によりアンチセンス鎖における（ＮＮ）ヌクレオチドを連結する。      図４Ｆ  センス鎖は５’および３’末端キャップ部分を有する２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３’ヌクレオチドは場合により塩基対形成しており、ここで、（ＮＮ）ヌクレオチドを除いて、存在することができる全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載する他の化学修飾を含むことができ、ここで存在することができる全てのプリンヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。アンチセンス鎖は場合により３’末端グリセリル部分を有する２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３’ヌクレオチドは場合により標的ＲＮＡ配列に相補的であり、１つの３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を有し、ここで、（ＮＮ）ヌクレオチドを除いて、存在することができる全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、存在することができる全てのプリンヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載する他の化学修飾を含むことができる。修飾されたヌクレオチド間連結部、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは本明細書に記載する他の修飾されたヌクレオチド間連結部は「ｓ」として示されており、これは場合によりアンチセンス鎖における（ＮＮ）ヌクレオチドを連結する。コンストラクトＡ〜Ｆのアンチセンス鎖は本発明のいずれかの標的核酸配列に相補的な配列を含む。更に、グリセリル部分（Ｌ）が図４Ａ〜Ｆに示すいずれかのコンストラクトに関するアンチセンス鎖の３’末端に存在する場合、修飾されたヌクレオチド間連結部は任意である。
【図５】本発明の特定の化学修飾されたｓｉＮＡ配列の非限定的な例を示す。Ａ〜Ｆは図４Ａ〜Ｆに記載した化学修飾を例示されるＥＮａＣ  ｓｉＮＡ配列に適用している。そのような化学修飾はいずれかのＥＮａＣ配列に適用できる。更に、図５に示す配列はセンス鎖の５’末端から９番目の位置、または、ガイド鎖の５’末端から内側に１１ヌクレオチド位置を数えることによりガイド鎖の５’末端に基づいて１１番目の位置に、リボヌクレオチドを含むことができる（図６Ｃ参照）。更に、図５に示す配列は場合により、アンチセンス鎖の５’末端の約４位置までにおいて、末端リボヌクレオチド（例えばアンチセンス鎖の５’末端において約１、２、３、または４末端リボヌクレオチド）を含むことができる。
【図６Ａ】本発明の異なるｓｉＮＡコンストラクトの非限定的な例を示す。  図６Ａに示す例（コンストラクト１、２および３）は１９の代表的な塩基対を有するが；本発明の異なる実施形態は本明細書に記載する塩基対のいずれかの数量を含む。括弧を付した領域は例えば約１、２、３または４ヌクレオチド長、好ましくは約２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングを示す。コンストラクト１および２はＲＮＡｉ活性のために独立して使用できる。コンストラクト２はポリヌクレオチドまたは非ヌクレオチドのリンカーを含むことができ、これは場合により生体分解性のリンカーとして設計することができる。１つの実施形態において、コンストラクト２に示すループ構造はインビボおよび／またはインビトロでコンストラクト１の形成をもたらす生体分解性リンカーを含むことができる。別の実施形態においては、コンストラクト３は同じ原理の下にコンストラクト２を形成するために使用でき、ここでリンカーはインビボおよび／またはインビトロで活性なｓｉＮＡコンストラクト２を形成するために使用され、これは場合によりインビボおよび／またはインビトロで活性なｓｉＮＡコンストラクト１を形成するために別の生体分解性リンカーを利用することができる。即ち、ｓｉＮＡコンストラクトの安定性および／または活性は、インビボまたはインビトロおよび／またはインビトロで使用するために、ｓｉＮＡコンストラクトの設計に基づいてモジュレートできる。
【図６Ｂ】図６Ｂに示す例は部分的相補性に起因するオーバーハング、バルジ、ループ、およびステム−ループを含むことができるマイクロＲＮＡ等の本発明の２本鎖核酸分子の異なる変形例を示す。バルジ、ループ、およびステム−ループを有するこのようなモチーフは一般的にｍｉＲＮＡに特徴的である。バルジ、ループ、およびステム−ループはいずれかの程度の部分的相補性、例えば本発明の２本鎖核酸分子の一方または両方の鎖における約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のヌクレオチドのミスマッチまたはバルジに起因する場合がある。
【図６Ｃ】図６Ｃに示す例はジヌクレオチド３’−オーバーハングを有する２１ヌクレオチド配列２つの１９塩基対デュプレックスを含む本発明のモデル２本鎖核酸分子を示す。上方の鎖（１）はセンス鎖（パッセンジャー鎖）を示し、中央の鎖（２）はアンチセンス（ガイド鎖）を示し、下方の鎖（３）は標的ポリヌクレオチド配列を示す。ジヌクレオチドオーバーハング（ＮＮ）は標的ポリヌクレオチドから誘導された配列を含むことができる。例えばガイド鎖における３’−（ＮＮ）配列は標的ポリヌクレオチドの５’−［ＮＮ］配列に相補的であることができる。更に、パッセンジャー鎖の５’−（ＮＮ）配列は標的ポリヌクレオチド配列の５’−［ＮＮ］配列と同じ配列を含むことができる。他の実施形態において、オーバーハング（ＮＮ）は標的ポリヌクレオチド配列から誘導されず、例えばこの場合、ガイド鎖の３’−（ＮＮ）配列は標的ポリヌクレオチド配列の５’−［ＮＮ］配列に相補的ではなく、パッセンジャー鎖の５’−（ＮＮ）配列は標的ポリヌクレオチド配列の５’−［ＮＮ］配列とは異なる配列を含むことができる。追加的実施形態において、いずれかの（ＮＮ）ヌクレオチドは例えば２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、および／または本明細書に記載する他の修飾として、化学修飾される。更に、パッセンジャー鎖はパッセンジャー鎖のリボヌクレオチド位置Ｎを含むことができる。示した代表的な１９塩基対２１量体デュプレックスに関しては、位置Ｎはパッセンジャー鎖の３’末端から内側に９ヌクレオチドであることができる。しかしながら、異なる長さのデュプレックスにおいて、位置Ｎは、ガイド鎖の５’末端から内側に１１ヌクレオチド位置を数え、パッセンジャー鎖における相当する塩基対形成ヌクレオチドを取り出すことにより、ガイド鎖の５’末端に基づいて決定される。矢印で示す通り、位置１０および１１の間でＡｇｏ２による切断が起こる。追加的実施形態においては、２つのリボヌクレオチドＮＮが、ガイド鎖の５’末端から内側に１０および１１ヌクレオチド位置を数え、パッセンジャー鎖における相当する塩基対形成ヌクレオチドを取り出すことにより、ガイド鎖の５’末端に基づいて位置１０および１１において存在する。
【図７】例えば本発明のｓｉＮＡ配列の３’末端を安定化させるために使用できる種々の安定化化学（１〜１０）の非限定的な例を示し、（１）［３−３’］−反転デオキシリボース；（２）デオキシリボヌクレオチド；（３）［５’−３’］−３’−デオキシリボヌクレオチド；（４）［５’−３’］−リボヌクレオチド；（５）［５’−３’］−３’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；（６）３’−グリセリル；（７）［３’−５’］−３’−デオキシリボヌクレオチド；（８）［３’−３’］−デオキシリボヌクレオチド；（９）［５’−２’］−デオキシリボヌクレオチド；および（１０）［５−３’］−ジデオキシリボヌクレオチドを含む。図に示した修飾および未修飾の骨格化学に加えて、これらの化学は本明細書に記載する種々の骨格修飾、例えば式Ｉを有する骨格修飾と組み合わせることができる。更に、示した末端修飾に対して５’側に示す２’−デオキシヌクレオチドは本明細書に記載する別の修飾または未修飾のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドであることができ、例えば式Ｉ〜ＶＩＩまたはそのいずれかの組み合わせのいずれかを有する修飾であることができる。
【図８】ヌクレアーゼ耐性でありつつＲＮＡｉ活性を媒介する能力を温存している本発明の化学修飾されたｓｉＮＡコンストラクトを発見するために使用される方策の非限定的な例を示す。化学修飾は教育された設計パラメーターに基づいてｓｉＮＡコンストラクト内に導入される（例えば２’−修飾、塩基修飾、骨格修飾、末端キャップ修飾等を導入する）。修飾されたコンストラクトは適切な系において試験される（例えば示されたヌクレアーゼ耐性に関してはヒト血清、またはＰＫ／送達パラメーターに関しては動物モデル）。並行して、ｓｉＮＡコンストラクトは例えばルシフェラーゼレポーター試験等の細胞培養系においてＲＮＡｉ活性を試験される。次に特定の特性を保有しつつＲＮＡｉ活性を維持しているリードｓｉＮＡコンストラクトを発見し、更に修飾して再度試験する。これと同様の手順を用いて向上した薬物動態プロファイル、送達、およびＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡコンジュゲート分子を発見することができる。
【図９】線状およびデュプレックスのコンストラクトおよびその非対称誘導体を含む本発明のホスホリル化ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。
【図１０】本発明の化学修飾された末端ホスフェート基の非限定的な例を示す。
【図１１Ａ】標的核酸配列において発見されるパリンドロームおよび／またはリピート核酸配列を利用した自己相補ＤＦＯコンストラクトを設計するために使用される方法論の非限定的な例を示す。（ｉ）パリンドロームまたはリピート配列を核酸標的配列において発見する。（ｉｉ）標的核酸配列およびパリンドローム配列に相補的な配列を設計する。（ｉｉｉ）相補配列の非パリンドローム／リピート部分の反転リピート配列を相補配列の３’末端に添付することにより核酸標的に相補的な配列を含む自己相補ＤＦＯ分子を形成する。（ｉｖ）ＤＦＯ分子は自己組み立てを行うことができ、これにより２本鎖オリゴヌクレオチドが形成される。
【図１１Ｂ】デュプレックス形成オリゴヌクレオチド配列の非限定的な代表例を示す。
【図１１Ｃ】代表的なデュプレックス形成オリゴヌクレオチド配列の自己組み立てスキームの非限定的な例を示す。
【図１１Ｄ】代表的なデュプレックス形成オリゴヌクレオチド配列の自己組み立てスキームとその後の標的核酸配列との相互作用により遺伝子発現のモジュレーションが生じる非限定的な例を示す。
【図１２】対象のいずれかの標的核酸配列に相補的な配列を有するＤＦＯコンストラクト内に取り込まれたパリンドロームおよび／またはリピートの核酸配列を利用した自己相補ＤＦＯコンストラクトの設計の非限定的な例を示す。これらのパリンドローム／リピート配列の取り込みにより、例えばＲＮＡｉによる標的遺伝子発現のモジュレーションを各鎖が媒介できるデュプレックスを形成するＤＦＯコンストラクトの設計が可能になる。第１に標的配列を発見する。次に人工パリンドローム（図中ＸＹＸＹＸＹとして示す）を形成する相補配列内にヌクレオチドまたは非ヌクレオチド修飾（ＸまたはＹとして示す）が導入された相補配列を形成する。非パリンドローム／リピート相補配列の逆リピートを相補配列の３’末端に添付することにより核酸標的に相補的な配列を含む自己相補ＤＦＯを形成する。ＤＦＯは自己組み立てを行うことができ、これにより２本鎖オリゴヌクレオチドが形成される。
【図１３】異なる標的核酸配列のＲＮＡｉ指向切断を各々が媒介できる２つの別個のポリヌクレオチド配列を含む本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。図１３Ａは、第１の標的核酸配列に相補的な第１の領域（相補領域１）および第２の標的核酸配列に相補的な第２の領域（相補領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで第１および第２の相補領域は多機能性ｓｉＮＡの各ポリヌクレオチド配列の３’末端に位置する。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列のダッシュを付された部分はｓｉＮＡデュプレックスの相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性は有さない。図１３Ｂは、第１の標的核酸配列に相補的な第１の領域（相補領域１）および第２の標的核酸配列に相補的な第２の領域（相補領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで第１および第２の相補領域は多機能性ｓｉＮＡの各ポリヌクレオチド配列の５’末端に位置する。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列のダッシュを付された部分はｓｉＮＡデュプレックスの相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性は有さない。
【図１４】異なる標的核酸配列のＲＮＡｉ指向切断を各々が媒介できる区別可能な領域を含む単一のポリヌクレオチド配列を含む本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。図１４Ａは、第１の標的核酸配列に相補的な第１の領域（相補領域１）および第２の標的核酸配列に相補的な第２の領域（相補領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで第２の相補領域は多機能性ｓｉＮＡのポリヌクレオチド配列の３’末端に位置する。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列のダッシュを付された部分はｓｉＮＡデュプレックスの相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性は有さない。図１４Ｂは、第１の標的核酸配列に相補的な第１の領域（相補領域１）および第２の標的核酸配列に相補的な第２の領域（相補領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで第１の相補領域は多機能性ｓｉＮＡのポリヌクレオチド配列の５’末端に位置する。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列のダッシュを付された部分はｓｉＮＡデュプレックスの相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性は有さない。１つの実施形態において、これらの多機能性ｓｉＮＡコンストラクトを図１３に示す通りインビボまたはインビトロでプロセシングすることにより多機能性ｓｉＮＡコンストラクトを形成する。
【図１５】異なる標的核酸配列のＲＮＡｉ指向切断を各々が媒介できる２つの別個のポリヌクレオチド配列を含む本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで多機能性ｓｉＮＡコンストラクトは更に、自己相補性、パリンドローム、またはリピートの領域を含み、これにより異なる標的核酸配列に対抗したＲＮＡ干渉を媒介できるより短い２官能性のｓｉＮＡコンストラクトをもたらす。図１５Ａは、第１の標的核酸配列に相補的な第１の領域（相補領域１）および第２の標的核酸配列に相補的な第２の領域（相補領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで第１および第２の相補領域は多機能性ｓｉＮＡの各ポリヌクレオチド配列の３’末端に位置し、ここで第１および第２の相補領域は更に自己相補性、パリンドローム、またはリピートの領域を含む。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列のダッシュを付された部分はｓｉＮＡデュプレックスの相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性は有さない。図１５Ｂは、第１の標的核酸配列に相補的な第１の領域（相補領域１）および第２の標的核酸配列に相補的な第２の領域（相補領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで第１および第２の相補領域は多機能性ｓｉＮＡの各ポリヌクレオチド配列の５’末端に位置し、ここで第１および第２の相補領域は更に自己相補性、パリンドローム、またはリピートの領域を含む。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列のダッシュを付された部分はｓｉＮＡデュプレックスの相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性は有さない。
【図１６】異なる標的核酸配列のＲＮＡｉ指向切断を各々が媒介できる区別可能な領域を含む単一のポリヌクレオチド配列を含む本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで多機能性ｓｉＮＡコンストラクトは更に、自己相補性、パリンドローム、またはリピートの領域を含み、これにより異なる標的核酸配列に対抗したＲＮＡ干渉を媒介できるより短い２官能性のｓｉＮＡコンストラクトをもたらす。図１６Ａは、第１の標的核酸配列に相補的な第１の領域（相補領域１）および第２の標的核酸配列に相補的な第２の領域（相補領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで第２の相補領域は多機能性ｓｉＮＡのポリヌクレオチド配列の３’末端に位置し、ここで第１および第２の相補領域は更に自己相補性、パリンドローム、またはリピートの領域を含む。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列のダッシュを付された部分はｓｉＮＡデュプレックスの相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性は有さない。図１６Ｂは、第１の標的核酸配列に相補的な第１の領域（相補領域１）および第２の標的核酸配列に相補的な第２の領域（相補領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで第１の相補領域は多機能性ｓｉＮＡのポリヌクレオチド配列の５’末端に位置し、ここで第１および第２の相補領域は更に自己相補性、パリンドローム、またはリピートの領域を含む。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列のダッシュを付された部分はｓｉＮＡデュプレックスの相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性は有さない。１つの実施形態において、これらの多機能性ｓｉＮＡコンストラクトを図１５に示す通りインビボまたはインビトロでプロセシングすることにより多機能性ｓｉＮＡコンストラクトを形成する。
【図１７】本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子がどのようにして２つの別個の標的核酸分子、例えば異なるタンパク質（例えば本明細書におけるＥＮａＣ標的のいずれか）をコードしている別個のＲＮＡ分子、例えばサイトカインおよびその相当する受容体、異なるウィルス系統、ウィルスの感染または複製に関与するウィルスおよび細胞タンパク質、または疾患の進行の維持に関与が疑われる共通または相違した生物学的経路に関与する異なるタンパク質をターゲティングできるかに関する非限定的な例を示す。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各鎖は別個の標的核酸分子に対する相補性を有する領域を含む。多機能性ｓｉＮＡ分子はｓｉＮＡの各鎖がＲＩＳＣ複合体により利用されることによりその相当する標的のＲＮＡ干渉媒介切断を開始することができるように設計される。これらの設計パラメーターはｓｉＮＡコンストラクトの各末端の脱安定化を含む場合がある（例えばＳｃｈｗａｒｚ等、２００３，Ｃｅｌｌ，１１５，１９９−２０８参照）。そのような脱安定化は例えばグアノシン−シチジン塩基対、オルタネート塩基対（例えばウオッブル）を用いるか、または、当分野で知られる通り末端ヌクレオチド位置において化学修飾されたヌクレオチドを脱安定化することにより達成できる。
【図１８】本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子がどのようにして同じ標的核酸分子内部の２つの別個の標的核酸配列、例えばＲＮＡのオルタネートコーディング領域、ＲＮＡのコーディングまたは非コーディング領域、またはＲＮＡのオルタネートアイソタイプ領域をターゲティングできるかに関する非限定的な例を示す。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各鎖は別個の標的核酸分子に対する相補性を有する領域を含む。多機能性ｓｉＮＡ分子はｓｉＮＡの各鎖がＲＩＳＣ複合体により利用され得ることによりその相当する標的領域のＲＮＡ干渉媒介切断を開始することができるように設計される。これらの設計パラメーターはｓｉＮＡコンストラクトの各末端の脱安定化を含む場合がある（例えばＳｃｈｗａｒｚ等、２００３，Ｃｅｌｌ，１１５，１９９−２０８参照）。そのような脱安定化は例えばグアノシン−シチジン塩基対、オルタネート塩基対（例えばウオッブル）を用いるか、または、当分野で知られる通り末端ヌクレオチド位置において化学修飾されたヌクレオチドを脱安定化することにより達成できる。
【図１９−１】本発明の係留多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの非限定的な例を示す。示されている例においては、リンカー（例えばヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー）が２つのｓｉＮＡ領域（例えば２つのセンス、２つのアンチセンス、またはセンスとアンチセンス領域を共に）連結している。第１の標的配列および第２の標的配列に相当する別個のセンス（またはセンスおよびアンチセンス）配列は、多機能性ｓｉＮＡにおけるそれらの相当するセンスおよび／またはアンチセンスの配列にハイブリダイズする。更に、選択的または向上した送達および／または薬物動態特性のために、種々のコンジュゲート、リガンド、アプタマー、重合体またはレポーター分子をリンカー領域に連結できる。
【図１９−２】本発明の係留多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの非限定的な例を示す。示されている例においては、リンカー（例えばヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー）が２つのｓｉＮＡ領域（例えば２つのセンス、２つのアンチセンス、またはセンスとアンチセンス領域を共に）連結している。第１の標的配列および第２の標的配列に相当する別個のセンス（またはセンスおよびアンチセンス）配列は、多機能性ｓｉＮＡにおけるそれらの相当するセンスおよび／またはアンチセンスの配列にハイブリダイズする。更に、選択的または向上した送達および／または薬物動態特性のために、種々のコンジュゲート、リガンド、アプタマー、重合体またはレポーター分子をリンカー領域に連結できる。
【図２０】種々のデンドリマー系の多機能性ｓｉＮＡの設計の非限定的な例を示す。
【図２１】種々の超分子多機能性ｓｉＮＡの設計の非限定的な例を示す。
【図２２】３０ヌクレオチドの前駆体ｓｉＮＡコンストラクトを用いたダイサー活用多機能性ｓｉＮＡの設計の非限定的な例を示す。３０塩基対のデュプレックスをダイサーによりいずれかの末端から２２および８塩基対の産物に切断する（８ｂ．ｐ．フラグメント、図示せず）。提示を容易にするために、ダイサーにより形成されたオーバーハングは図示しないが、補うことはできる。３つのターゲティング配列を示す。オーバーラップした所要の配列同一性は灰色枠で示す。親の３０ｂ．ｐ．のｓｉＮＡのＮは、安定した化学状態においてこれを試験する場合にダイサー切断を可能にする２’−ＯＨ位置の示唆される部位である。ダイサーＲＮａｓｅＩＩＩによる３０量体デュプレックスのプロセシングは厳密に２２＋８の切断をもたらさず、むしろ一連の緊密に関連した産物をもたらす（２２＋８が主要部位である）ことに留意されたい。従って、ダイサーによるプロセシングは一連の活性なｓｉＮＡをもたらす。
【図２３】４０ヌクレオチドの前駆体ｓｉＮＡコンストラクトを用いたダイサー活用多機能性ｓｉＮＡの設計の非限定的な例を示す。４０塩基対のデュプレックスをダイサーによりいずれかの末端から２０塩基対の産物に切断する。提示を容易にするために、ダイサーにより形成されたオーバーハングは図示しないが、補うことはできる。４つのターゲティング配列を示す。相同性を有する標的配列は枠で囲んである。この設計フォーマットはより多いＲＮＡにも拡張できる。化学的に安定化されたｓｉＮＡがダイサーにより結合されれば、次に戦略的に位置づけられたリボヌクレオチド連結部が、本発明者等による多機能性設計のより広範なレパートリーを可能にする設計用切断産物を可能にする。例えば約２２ヌクレオチドのダイサー標準に限定されない切断産物によれば、例えば約３〜約１５ヌクレオチドの範囲の標的配列同一性オーバーラップを有する多機能性ｓｉＮＡコンストラクトが可能となる。
【図２４】本発明の追加的な多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの設計の非限定的な例を示す。１つの例において、コンジュゲート、リガンド、アプタマー、標識、または他の部分を多機能性ｓｉＮＡの領域に結合させることにより向上した送達または薬物動態プロファイルを可能とする。
【図２５】本発明の追加的な多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの設計の非限定的な例を示す。１つの例において、コンジュゲート、リガンド、アプタマー、標識、または他の部分を多機能性ｓｉＮＡの領域に結合させることにより向上した送達または薬物動態プロファイルを可能とする。
【図２６】本発明のコレステロールコンジュゲートｓｉＮＡ分子を合成するために使用できるコレステロール連結ホスホラミダイトの非限定的な例を示す。ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端に連結したコレステロール部分を有する例を示す。
【図２７】核酸鎖に連結された５’および３’反転無塩基キャップ部分の実施形態を示す。
【図２８】免疫刺激アゴニストである対照レシキモド（Ｒ８４８）と比較した場合のｓｉＲＮＡ投与時のＴＬＲ７−Ｕ２ＯＳ細胞における相対的ＩＬ８ｍＲＮＡ発現（ｎ＝４、データポイント当たり６連）を示す。
【図２９】免疫刺激アゴニストである対照ｓｓＲＮＡ４０と比較した場合のｓｉＲＮＡ投与時のＴＬＲ８−Ｕ２ＯＳ細胞における相対的ＩＬ８ｍＲＮＡ発現（ｎ＝４、データポイント当たり６連）を示す。
【図３０】１００、５０、２０および１０ｎＭ濃度における標的部位７８２（配列番号５１および５２）および１１８１（配列番号５７および５８）に対する修飾されたＥＮａＣ  ｓｉＲＮＡによる組み換えＨＥＫ細胞のトランスフェクション時のＦＬＩＰＲ（蛍光画像化プレートリーダー）試験におけるナトリウム輸送の阻害を示す。［発明の詳細な説明］本発明の核酸分子の作用機序
【０４６０】
以下の考察では、現在知られており、限定的ではなく、従来技術の受け入れではない、短鎖干渉ＲＮＡにより媒介されるＲＮＡ干渉の考えられる機序を考察する。本明細書において本出願人は化学修飾された短鎖干渉核酸がｓｉＲＮＡ分子が保有するものと同様か向上したＲＮＡｉを媒介する能力を保有しており、インビボで向上した安定性および活性を保有していることを明らかにし；従って、本考察はｓｉＲＮＡにのみ限定されるものではなく、全体としてｓｉＮＡに適用できる。「向上したＲＮＡｉを媒介する能力」または「向上したＲＮＡｉ活性」とはインビトロおよび／またはインビボで計測されたＲＮＡｉ活性を含むよう意図され、ここでＲＮＡｉ活性は、ＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡの能力および本発明のｓｉＮＡの安定性の両方を反映している。本発明においては、これらの活性の産物は、全ＲＮＡ  ｓｉＲＮＡまたは複数のリボヌクレオチドを含有するｓｉＮＡと比較して、インビトロおよび／またはインビボで増大させることができる。一部の場合においては、ｓｉＮＡ分子の活性または安定性は低下させることができる（即ち１０倍未満）が、ｓｉＮＡ分子の全体的活性はインビトロおよび／またはインビボで増強される。
【０４６１】
ＲＮＡ干渉とは短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される動物における配列特異的な転写後の遺伝子サイレンシングのプロセスを指す（Ｆｉｒｅ等、１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）。植物における相当するプロセスは一般的に転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと称され、またカビにおいてはクエリングとも称される。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは多様な微生物叢または生物門により一般に共有されている外来遺伝子の発現を防止するために使用される進化的に保存された細胞の防御機序であると考えられている（Ｆｉｒｅ等、１９９９，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，１５，３５８）。そのような外来遺伝子発現からの保護はウィルス感染から、または、相同性の１本鎖ＲＮＡまたはウィルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を介した宿主ゲノム内へのトランスポゾンエレメントのランダムな組み込みから誘導された２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生産に応答して進化することができる。細胞中にｄｓＲＮＡが存在することは未だ十分に特性化されていない機序を通してＲＮＡｉの応答をトリガーする。この機序はリボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断をもたらすタンパク質キナーゼＰＫＲおよび２’，５’−オリゴアデニレート合成酵素のｄｓＲＮＡ媒介活性化に起因するインターフェロンの応答とは異なると考えられる。
【０４６２】
細胞中の長鎖ｄｓＲＮＡの存在はダイサーと称されるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性を促進する。ダイサーは短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られているｄｓＲＮＡの短い小片へのｄｓＲＮＡのプロセシングに関与している（Ｂｅｒｓｔｅｉｎ等、２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３）。ダイサーの活性から誘導された短鎖干渉ＲＮＡは典型的には約２１〜約２３ヌクレオチド長であり、約１９塩基対のデュプレックスを含む。ダイサーはまた翻訳制御に関与が示唆されている保存された構造の前駆体ＲＮＡからの２１−および２２ヌクレオチドの小型テンポラルＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の切り出しに関与しているとも示唆されている（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ等、２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，８３４）。ＲＮＡｉ応答はまた、ｓｉＲＮＡに相同な配列を有する１本鎖ＲＮＡの切断を媒介するＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と一般的に称されるｓｉＲＮＡを含有するエンドヌクレアーゼ複合体を特徴としている。標的ＲＮＡの切断はｓｉＲＮＡデュプレックスのガイド鎖に相補的な領域の中央において起こる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ等、２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５，１８８）。更に、ＲＮＡ干渉には、おそらくはクロマチンの構造を調節し、それにより標的遺伝子配列の転写を防止する細胞機序を通じた小型ＲＮＡ（例えばマイクロＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）媒介遺伝子サイレンシングが関与している場合がある（例えばＡｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ等、２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌ等、２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７参照）。即ち、本発明のｓｉＮＡ分子はＲＮＡ転写物との相互作用を介して、または、特定の遺伝子配列との相互作用により、遺伝子サイレンシングを媒介するために使用でき、ここでそのような相互作用は転写レベルまたは転写後のレベルのいずれかにおいて遺伝子サイレンシングをもたらす。
【０４６３】
ＲＮＡｉは種々の系において研究されている。Ｆｉｒｅ等、１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６は初めてＣ．ｅｌｅＧＡ  ＮｓにおいてＲＮＡｉを観察している。ＷｉａｎｎｙおよびＧｏｅｔｚ，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２，７０はマウス胚におけるｄｓＲＮＡにより媒介されるＲＮＡｉを記載している。Ｈａｍｍｏｎｄ等、２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３はｄｓＲＮＡによりトランスフェクトされたショウジョウバエの細胞におけるＲＮＡｉを記載している。Ｅｌｂａｓｈｉｒ等、２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４はヒト胚性腎臓およびＨｅＬａ細胞を含む培養哺乳類細胞における合成２１ヌクレオチドＲＮＡのデュプレックスの導入により誘導されたＲＮＡｉを記載している。ショウジョウバエ胚分解物における最近の研究は効率的なＲＮＡｉ活性を媒介するために必須であるｓｉＲＮＡの長さ、構造、化学組成および配列に関する特定の条件を解明している。これらの研究は２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡデュプレックスが２つの２ヌクレオチド３’−末端ヌクレオチドオーバーハングを含有している場合に最も活性であることを示している。更に、２’−デオキシまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドによる一方または両方のｓｉＲＮＡ鎖の置換はＲＮＡｉ活性を消失させるのに対し、デオキシヌクレオチドによる３’−末端ｓｉＲＮＡヌクレオチドの置換は耐容されることがわかった。ｓｉＲＮＡデュプレックスの中心におけるミスマッチ配列もまたＲＮＡｉ活性を消失させることがわかった。更に、これらの研究は標的ＲＮＡにおける切断部位の位置はｓｉＲＮＡガイド配列の５’−末端により定義され、３’末端によらないことを示している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ等、２００１，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０，６８７７）。他の研究はｓｉＲＮＡデュプレックスの標的相補鎖上の５’−ホスフェートがｓｉＲＮＡ活性のために必要であること、および、ｓｉＲＮＡ上に５’−ホスフェート部分を維持するためにはＡＴＰが使用されることを示している（Ｎｙｋａｎｅｎ等、２００１，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９）が；しかしながら、５’−ホスフェートを欠いているｓｉＲＮＡ分子は外因性に導入された場合に活性であり、ｓｉＲＮＡコンストラクトの５’−ホスホリル化がインビボで生じ得ることを示唆している。
本発明のデュプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）
【０４６４】
１つの実施形態において、本発明は自己組み立てにより２本鎖オリゴヌクレオチドとなるデュプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。本発明のデュプレックス形成オリゴヌクレオチドは化学合成するか、または転写ユニットおよび／またはベクターから発現させることができる。本発明のＤＦＯ分子は種々の治療、診断、農業、獣医科用、標的バリデーション、ゲノム発見、遺伝子操作、および薬学ゲノムの用途のための有用な試薬および方法を提供する。
【０４６５】
本出願人は本明細書において、限定ではなく簡便のため本明細書においてデュプレックス形成オリゴヌクレオチド、即ちＤＦＯ分子と称する特定のオリゴヌクレオチドが遺伝子発現の配列特異的調節の強力なメディエーターであることを明らかにする。本発明のオリゴヌクレオチドは、それらが、自己組み立てにより２本鎖オリゴヌクレオチドとなるように設計された線状ポリヌクレオチド配列のあるクラスであるという点において、当分野で知られた他の核酸配列（例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド等）とは区別可能であり、この場合、２本鎖オリゴヌクレオチドの各鎖はＥＮａＣ標的核酸分子に相補的なヌクレオチド配列を含む。即ち本発明の核酸分子は自己組み立てにより機能的デュプレックスとなることができ、ここでデュプレックスの各鎖は同じポリヌクレオチド配列を含み、各鎖はＥＮａＣ標的核酸分子に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【０４６６】
一般的に２本鎖オリゴヌクレオチドは２つの区別可能なオリゴヌクレオチド配列の組み立てにより形成され、その場合、一方の鎖のオリゴヌクレオチド配列は第２の鎖のオリゴヌクレオチド配列に相補的であり；そのような２本鎖オリゴヌクレオチドは２つの別個のオリゴヌクレオチドから、または、それ自体を折りたたむことにより本分野においてヘアピンステム−ループ構造と称される２本鎖構造を形成する単一の分子（例えばｓｈＲＮＡ、即ち短鎖ヘアピンＲＮＡ）から、組み立てられる。当分野で知られたこれらの２本鎖オリゴヌクレオチドは全て、デュプレックスの各鎖が区別可能なヌクレオチド配列を有しているという共通の特徴を有している。
【０４６７】
当分野で知られた２本鎖核酸分子とは異なり、本出願人は１本鎖または線状オリゴヌクレオチドから出発して２本鎖核酸分子を形成する、新規で、潜在的に費用効果的で、単純化された方法を開発した。本発明により形成された２本鎖オリゴヌクレオチドの２つの鎖は同じヌクレオチド配列を有し、相互に共有結合していない。そのような２本鎖オリゴヌクレオチド分子は当分野で知られており、本発明の範囲内である方法および試薬により合成後に容易に連結できる。１つの実施形態において、２本鎖オリゴヌクレオチドを形成する本発明の１本鎖オリゴヌクレオチド（デュプレックス形成オリゴヌクレオチド）は第１の領域および第２の領域を含み、ここで第２の領域は第１の領域のヌクレオチド配列またはその一部分の反転リピートであるヌクレオチド配列を含み、これにより、１本鎖オリゴヌクレオチドは自己組み立てによりデュプレックスオリゴヌクレオチドを形成し、それにおいてはデュプレックスの一方の鎖のヌクレオチド配列は第２の鎖のヌクレオチド配列と同じとなる。そのようなデュプレックス形成オリゴヌクレオチドの非限定的な例を図１１および図１２に示す。これらのデュプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）は場合により特定のパリンドロームまたはリピート配列を含むことができ、その場合そのようなパリンドロームまたはリピート配列はＤＦＯの第１の領域と第２の領域の間に存在する。
【０４６８】
１つの実施形態において、本発明はデュプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）分子を特徴とし、ここでＤＦＯは、ＥＮａＣ標的核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有するデュプレックス形成自己相補核酸配列を含む。ＤＦＯ分子は単一の自己相補配列、またはそのような自己相補配列の組み立てにより生じたデュプレックスを含むことができる。
【０４６９】
１つの実施形態において、本発明のデュプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）は第１の領域および第２の領域を含み、ここで第２の領域は、ＤＦＯ分子が２本鎖オリゴヌクレオチドに組み立てられることができるように、第１の領域のヌクレオチド配列の反転リピートを含むヌクレオチド配列を含む。そのような２本鎖オリゴヌクレオチドは遺伝子発現をモジュレートするための短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）として作用できる。本発明のＤＦＯ分子により形成された２本鎖オリゴヌクレオチドデュプレックスの各鎖はＥＮａＣ標的核酸分子（例えばＥＮａＣ標的ＲＮＡ）における同じヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列領域を含むことができる。
【０４７０】
１つの実施形態において、本発明は２本鎖オリゴヌクレオチドに組み立てることができる１本鎖ＤＦＯを特徴とする。本出願人は意外にも自己相補性のヌクレオチド領域を有する１本鎖オリゴヌクレオチドはデュプレックスオリゴヌクレオチドコンストラクトに容易に組み立てることができることを発見した。そのようなＤＦＯは配列特異的な様式において、遺伝子発現を阻害できるデュプレックスに組み立てることができる。本発明のＤＦＯ分子は第２の領域のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第１の領域を含み、ここで第１の領域の配列はＥＮａＣ標的核酸（例えばＲＮＡ）に相補的である。ＤＦＯは、２本鎖オリゴヌクレオチドの各鎖の一部分がＥＮａＣ標的核酸配列に相補的な配列を含む２本鎖オリゴヌクレオチドを形成できる。
【０４７１】
１つの実施形態において、本発明は２本鎖オリゴヌクレオチドの２つの鎖が相互に共有結合しておらず、ここで２本鎖オリゴヌクレオチドの各鎖がＥＮａＣ標的核酸分子における同じヌクレオチド配列またはその一部分（例えばＥＮａＣ  ＲＮＡ標的）に相補的なヌクレオチド配列を含む、２本鎖オリゴヌクレオチドを特徴とする。別の実施形態においては、２本鎖オリゴヌクレオチドの２つの鎖は少なくとも約１５、好ましくは少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチドの同一のヌクレオチド配列を共有している。
【０４７２】
１つの実施形態において、本発明のＤＦＯ分子は下記式ＤＦＯ−Ｉ：
【化３３】
2012509688.tif 000035
［式中、Ｚは例えば偶数における約２〜約２４ヌクレオチド（例えば約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、または２２または２４ヌクレオチド）の長さの、場合により１つ以上の修飾されたヌクレオチド（例えば修飾された塩基、例えば２−アミノプリン、２−アミノ−１，６−ジヒドロプリンまたはユニバーサル塩基を有するヌクレオチド）を有する、パリンドロームまたはリピート核酸配列を含み、Ｘは例えば約１〜約２１ヌクレオチド（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチド）の長さの核酸配列を示し、Ｘ’は配列Ｘまたはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を有する約１〜約２１ヌクレオチド（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１ヌクレオチド）の長さの核酸配列を含み、ｐは存在または非存在であることができる末端ホスフェート基を含み、ここで配列ＸおよびＺは、独立してまたは一緒になって、ＥＮａＣ標的核酸配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、ＥＮａＣ標的核酸配列またはその一部分（例えばＥＮａＣ  ＲＮＡ標的）と相互作用（例えば塩基対形成）するために十分な長さのものである］を有する構造を含む。例えばＸは独立して、ＥＮａＣ標的ＲＮＡにおけるヌクレオチド配列またはその一部分に相補的な約１２〜約２１以上（例えば約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１以上）のヌクレオチド長の配列を含むことができる。別の非限定的な例においては、ＥＮａＣ標的ＲＮＡまたはその一部分（例えばＥＮａＣ  ＲＮＡ標的）に相補的な、Ｘが存在する場合はＸとＺを合わせたヌクレオチド配列の長さは、約１２〜約２１以上のヌクレオチド（例えば約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１以上）である。更に別の非限定的な例においては、Ｘが非存在である場合、ＥＮａＣ標的ＲＮＡまたはその一部分に相補的なＺのヌクレオチド配列の長さは、約１２〜約２４以上のヌクレオチド（例えば約１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４以上）である。１つの実施形態において、Ｘ、ＺおよびＸ’は独立してオリゴヌクレオチドであり、ここでＸおよび／またはＺは標的におけるヌクレオチド配列またはその一部分（例えばＥＮａＣ  ＲＮＡ標的）と相互作用（例えば塩基対形成）するために十分な長さのヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一である。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一ではない。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＺ、またはＺおよびＸ’、またはＸ、ＺおよびＸ’の長さは同一または異なっている。
【０４７３】
本明細書においてある配列を他の配列と相互作用（即ち塩基対形成）するために「十分な」長さであると記載する場合、その長さとは、２つの配列の間に形成される結合（例えば水素結合）の数が、２つの配列を目的の条件下でデュプレックス形成可能とするために十分であることを意味する。そのような条件はインビトロ（例えば診断用または試験目的）またはインビボ（例えば治療目的）であることができる。そのような長さを求めることは簡単で日常的なものである。
【０４７４】
１つの実施形態において、本発明は、下記式ＤＦＯ−Ｉ（ａ）：
【化３４】
2012509688.tif 000036
［式中、Ｚは例えば偶数における約２〜約２４ヌクレオチド（例えば約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４ヌクレオチド）の長さの、場合により１つ以上の修飾されたヌクレオチド（例えば修飾された塩基、例えば２−アミノプリン、２−アミノ−１，６−ジヒドロプリンまたはユニバーサル塩基を有するヌクレオチド）を有する、パリンドロームまたはリピート核酸配列またはパリンドロームまたはリピート様の核酸配列を含み、Ｘは例えば約１〜約２１ヌクレオチド（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチド）の長さの核酸配列を示し、Ｘ’は配列Ｘまたはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を有する約１〜約２１ヌクレオチド（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１ヌクレオチド）の長さの核酸配列を含み、ｐは存在または非存在であることができる末端ホスフェート基を含み、ここでＸおよびＺはそれぞれ、独立して、ＥＮａＣ標的核酸配列またはその一部分（例えばＥＮａＣ  ＲＮＡ標的）に相補的なヌクレオチド配列を含み、ＥＮａＣ標的核酸配列またはその一部分（例えばＥＮａＣ  ＲＮＡ標的）と相互作用するために十分な長さのものである］を有する２本鎖オリゴヌクレオチドコンストラクトを特徴とする。例えば配列Ｘは独立して、標的ヌクレオチド配列またはその一部分に相補的な約１２〜約２１以上（例えば約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１以上）のヌクレオチド長の配列を含むことができる。別の非限定的な例においては、標的配列またはその一部分に相補的な、ＸとＺを合わせた（Ｘが存在する場合）ヌクレオチド配列の長さは、約１２〜約２１以上のヌクレオチド（例えば約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１以上）である。更に別の非限定的な例においては、Ｘが非存在である場合、標的配列またはその一部分に相補的なＺのヌクレオチド配列の長さは、約１２〜約２４以上のヌクレオチド（例えば約１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４以上）である。１つの実施形態において、Ｘ、ＺおよびＸ’は独立してオリゴヌクレオチドであり、ここでＸおよび／またはＺは標的配列におけるヌクレオチド配列またはその一部分（例えばＥＮａＣ  ＲＮＡ標的）と相互作用（例えば塩基対形成）するために十分な長さのヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一である。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一ではない。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＺ、またはＺおよびＸ’、またはＸ、ＺおよびＸ’の長さは同一または異なっている。１つの実施形態において、式Ｉ（ａ）の２本鎖オリゴヌクレオチドコンストラクトは、ミスマッチがＥＮａＣ標的遺伝子発現を阻害する２本鎖オリゴヌクレオチドの能力を顕著に低下させない限りにおいて、１つ以上、特に１、２、３または４つのそのようなミスマッチを含む。
【０４７５】
１つの実施形態において、本発明のＤＦＯ分子は下記式ＤＦＯ−ＩＩ：
【化３５】
2012509688.tif 000037
［式中、ＸおよびＸ’はそれぞれ独立して約１２ヌクレオチド〜約２１ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり、ここでＸは例えば約１２〜約２１ヌクレオチド（例えば約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチド）の長さの核酸配列を含み、Ｘ’は配列Ｘまたはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を有する約１２〜約２１ヌクレオチド（例えば約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１ヌクレオチド）の長さの核酸配列を含み、ｐは存在または非存在であることができる末端ホスフェート基を含み、ここでＸは標的核酸配列（例えばＥＮａＣ標的ＲＮＡ）またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列またはその一部分と相互作用（例えば塩基対形成）するために十分な長さのものである］を有する構造を含む。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一である。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一ではない。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは相対的に安定な２本鎖オリゴヌクレオチドを形成するために十分である。
【０４７６】
１つの実施形態において、本発明は、下記式ＤＦＯ−ＩＩ（ａ）：
【化３６】
2012509688.tif 000038
［式中、ＸおよびＸ’はそれぞれ独立して約１２ヌクレオチド〜約２１ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり、ここでＸは例えば約１２〜約２１ヌクレオチド（例えば約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチド）の長さの核酸配列を含み、Ｘ’は配列Ｘまたはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を有する約１２〜約２１ヌクレオチド（例えば約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１ヌクレオチド）の長さの核酸配列を含み、ｐは存在または非存在であることができる末端ホスフェート基を含み、ここでＸは標的核酸配列またはその一部分（例えばＥＮａＣ  ＲＮＡ標的）に相補的なヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列（例えばＥＮａＣ標的ＲＮＡ）またはその一部分と相互作用（例えば塩基対形成）するために十分な長さのものである］を有する２本鎖オリゴヌクレオチドコンストラクトを特徴とする。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一である。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一ではない。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは相対的に安定な２本鎖オリゴヌクレオチドを形成するために十分である。１つの実施形態において、式ＩＩ（ａ）の２本鎖オリゴヌクレオチドコンストラクトは、ミスマッチがＥＮａＣ標的遺伝子発現を阻害する２本鎖オリゴヌクレオチドの能力を顕著に低下させない限りにおいて、１つ以上、特に１、２、３または４つのそのようなミスマッチを含む。
【０４７７】
１つの実施形態において、本発明は下記式ＤＦＯ−Ｉ（ｂ）：
【化３７】
2012509688.tif 000039
［式中、Ｚは他のヌクレオチドとの塩基対形成を促進できる１つ以上の非標準または修飾されたヌクレオチド（例えば２−アミノプリンまたはユニバーサル塩基等の修飾された塩基を有するヌクレオチド）を場合により含むパリンドロームまたはリピート核酸配列を含む］を有するＤＦＯ分子を特徴とする。Ｚは例えば標的核酸（例えばＥＮａＣ標的ＲＮＡ）分子のヌクレオチド配列と相互作用（例えば塩基対形成）するために十分な長さ、好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、特に約１２〜約２４ヌクレオチド（例えば約１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４ヌクレオチド）の長さであることができる。ｐは存在または非存在であることができる末端ホスフェート基を示す。
【０４７８】
１つの実施形態において、式ＤＦＯ−Ｉ、ＤＦＯ−Ｉ（ａ）、ＤＦＯ−Ｉ（ｂ）、ＤＨＯ−ＩＩ（ａ）またはＤＦＯ−ＩＩのいずれかを有するＤＦＯ分子は、本明細書に記載する化学修飾、例えば限定しないが、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかを有するヌクレオチド、表８に記載する安定化化学状態、または本明細書の種々の実施形態に記載する修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドのいずれかの他の組み合わせを含むことができる。
【０４７９】
１つの実施形態において、式ＤＦＯ−Ｉ、ＤＦＯ−Ｉ（ａ）およびＤＦＯ−Ｉ（ｂ）を有するＤＦＯコンストラクトのＺにおけるパリンドロームまたはリピート配列または修飾されたヌクレオチド（例えば２−アミノプリンまたはユニバーサル塩基等の修飾された塩基を有するヌクレオチド）は、ＥＮａＣ標的核酸配列の一部分と相互作用することができる化学修飾されたヌクレオチドを含む（例えばワトソンクリック塩基対または非ワトソンクリック塩基対を形成できる修飾された塩基類縁体）。
【０４８０】
１つの実施形態において、本発明のＤＦＯ分子、例えば式ＤＦＯ−ＩまたはＤＦＯ−ＩＩを有するＤＦＯは、約１５〜約４０ヌクレオチド（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオチド）を含む。１つの実施形態において、本発明のＤＦＯ分子は１つ以上の化学修飾を含む。非限定的な例において、本発明の核酸分子内への化学修飾されたヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドの導入は外因性に送達される未修飾のＲＮＡ分子に固有のインビボの安定性および生体利用性の潜在的な限界を克服する場合の強力な手段を与える。例えば化学修飾された核酸分子の使用は、化学修飾された核酸分子は血清中、または細胞または組織中においてより長い半減期を有する傾向があるため、所定の治療効果のために特定の核酸分子をより低用量とすることができる。更に、特定の化学修飾は、半減期を長くすることのみならず、特定の臓器、細胞または組織への核酸分子のターゲティングを促進すること、および／または核酸分子の細胞取り込みを向上させることにより、核酸分子の生体利用性および／または力価を向上させることができる。従って、化学修飾された核酸分子の活性がネイティブ／未修飾の核酸分子と比較して、例えば未修飾のＲＮＡ分子と比較した場合に、インビトロで低減されるとしても、修飾された核酸分子の全体的活性は、分子の向上した安定性、力価、作用持続時間、生体利用性および／または送達のために、ネイティブまたは未修飾の核酸分子よりも高値となることができる。
本発明の多機能性または多重ターゲティングされたｓｉＮＡ分子
【０４８１】
１つの実施形態において、本発明は生物学的な系、例えば細胞、組織または生物における標的遺伝子１つ以上の発現をモジュレートする多機能性短鎖干渉核酸（多機能性ｓｉＮＡ）分子を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。本発明の多機能性短鎖干渉核酸（多機能性ｓｉＮＡ）分子は標的核酸配列の１つより多い領域をターゲティングでき、または１つより多い区別可能な標的核酸分子（例えばＥＮａＣ  ＲＮＡ標的）の配列をターゲティングできる。本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子は化学合成するか、または転写ユニットおよび／またはベクターから発現させることができる。本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子は種々のヒトへの用途、治療、診断、農業、獣医科用、標的バリデーション、ゲノム発見、遺伝子操作、および薬学ゲノムの用途のための有用な試薬および方法を提供する。
【０４８２】
本出願人は本明細書において、限定ではなく簡便のため本明細書において多機能性短鎖干渉核酸または多機能性ｓｉＮＡ分子と称する特定のオリゴヌクレオチドが遺伝子発現の配列特異的調節の強力なメディエーターであることを明らかにする。本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子は、それらが、多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各鎖が標的核酸分子１つ以上における区別可能な核酸配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むように設計されたポリヌクレオチド分子のあるクラスであるという点において、当分野で知られた他の核酸配列（例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド等）とは区別可能である。即ち、本発明の単一の多機能性ｓｉＮＡ分子（一般的には２本鎖分子）は、１つより多い（例えば２、３、４、５つ以上の）異なる標的核酸標的分子をターゲティングできる。本発明の核酸分子はまた、同じ標的核酸配列の１つより多い（例えば２、３、４、５つ以上の）領域をターゲティングできる。即ち、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子は標的核酸分子１つ以上の発現をダウンレギュレートまたは阻害する場合に有用である。例えば本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子はＥＮａＣ、ＥＮａＣのアイソタイプ、またはこれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される核酸分子をターゲティングする（例えばこれらに対する相補性を有する）ことができる。１つの多機能性ｓｉＮＡコンストラクトを用いて１つより多い標的核酸分子の発現を低減または阻害することにより、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子は疾患（例えば呼吸器）関連経路内部の多数の標的の同時阻害を可能にする強力な治療薬のクラスとなる。そのような同時阻害は、別個の臨床前および臨床開発の取り組みまたは複雑な規制許可過程の必要を伴うことなく、相乗作用的な施療治療方策を可能にする。
【０４８３】
標的核酸分子（例えばＥＮａＣ標的ＲＮＡまたはＤＮＡ）の１つより多い領域をターゲティングする多機能性ｓｉＮＡ分子の使用は、遺伝子発現の強力な阻害をもたらすことが期待される。例えば本発明の単一の多機能性ｓｉＮＡコンストラクトは、標的核酸分子（例えばＥＮａＣ  ＲＮＡまたはＤＮＡ）の保存された領域と可変領域の両方をターゲティングすることができ、これにより、例えば治療効果を最適化および毒性を最小限とするための異なる標的ＥＮａＣアイソフォームまたは変異体のダウンレギュレーションおよび阻害を可能とし、或いは、ＥＮａＣ標的核酸分子のコーディングおよび非コーディング領域の両方のターゲティングを可能にする。
【０４８４】
一般的に、２本鎖オリゴヌクレオチドは２つの区別可能なオリゴヌクレオチドの組み立てにより形成され、この場合、一方の鎖のオリゴヌクレオチド配列は第２の鎖のオリゴヌクレオチド配列に相補的であり；このような２本鎖オリゴヌクレオチドは一般的に２つの別個のオリゴヌクレオチド（例えばｓｉＲＮＡ）から組み立てられる。或いは、デュプレックスはそれ自体を折りたたむ単一の分子から形成できる（例えばｓｈＲＮＡ、即ち短鎖ヘアピンＲＮＡ）。これらの２本鎖オリゴヌクレオチドはＲＮＡ干渉を媒介することが当分野で知られており、全てが、１つのヌクレオチド配列領域のみ（ガイド配列またはアンチセンス配列）が標的核酸配列に対する相補性を有し、もう１つの鎖（センス鎖）は標的核酸配列に相同なヌクレオチド配列を含むという、共通の特徴を有する。一般的に、アンチセンス鎖は活性なＲＩＳＣ複合体内に保持され、配列特異的ＲＮＡ干渉を媒介するための標的配列とのアンチセンス配列の相補塩基対形成という手段により、標的ヌクレオチド配列にＲＩＳＣをガイドする。当分野で知られる通り、一部の細胞培養系においては、特定の型の未修飾のｓｉＲＮＡが「オフターゲット」作用を示す場合がある。このオフターゲット作用は、ＲＩＳＣ複合体においてｓｉＲＮＡのアンチセンス配列の代わりにセンス配列が関わっていることが関与していると推察されている（例えばＳｃｈｗａｒｚ等、２００３，Ｃｅｌｌ，１１５，１９９−２０８参照）。この場合、センス配列は意図する標的配列とは区別可能な配列（オフターゲット配列）にＲＩＳＣ複合体を指向させ、これによりオフターゲット配列の阻害をもたらすと考えられている。これらの２本鎖核酸分子において、各鎖は区別可能な標的核酸配列に相補的である。しかしながら、これらのｄｓＲＮＡにより影響されるオフターゲットは完全に予測できるものではなく、非特異的である。
【０４８５】
当分野で知られた２本鎖核酸分子とは区別可能なものとして、本出願人は単一の多機能性ｓｉＮＡコンストラクトを使用しながら１つより多い標的核酸配列の発現をダウンレギュレートまたは阻害する新規で、潜在的に費用効果的で、単純化された方法を開発した。本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子は２本鎖または部分的に２本鎖となるように設計され、その際、多機能性ｓｉＮＡの各鎖または領域の１部分は選択された標的核酸配列に相補的である。即ち、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子は相互に相補的である配列をターゲティングすることに限定されず、むしろいずれかの２つの異なる標的核酸配列を意図している。本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子は、所定の標的核酸配列に相補的である多機能性ｓｉＮＡ分子の各鎖または領域が、標的核酸配列に対抗してＲＮＡ干渉を媒介するために適当な長さ（例えば約１６〜約２８ヌクレオチド長、好ましくは約１８〜約２８ヌクレオチド長）となるように設計される。標的核酸配列と多機能性ｓｉＮＡの鎖または領域との間の相補性は、ＲＮＡ干渉による標的核酸配列の切断のために十分（少なくとも約８塩基対）でなければならない。本発明の多機能性ｓｉＮＡは上記Ｓｃｈｗａｒｚ等が記載したもの等の特定のｓｉＲＮＡ配列で観察されるオフターゲット作用を最小限にすると期待される。
【０４８６】
２９塩基対〜３６塩基対の長さのｄｓＲＮＡはＲＮＡｉを媒介しないことが報告されている（Ｔｕｓｃｈｌ等、国際ＰＣＴ出願ＷＯ０２／４４３２１）。これらのｄｓＲＮＡが不活性である１つの理由は、標的ＲＮＡ配列と相互作用する鎖のターンオーバーまたは解離が欠如しているためＲＩＳＣ複合体が標的ＲＮＡの多数コピーと効率的に相互作用することができず、これによりＲＮＡｉプロセスの力価と効率が顕著に低下することが考えられる。本出願人は意外にも本発明の多機能性ｓｉＮＡが、このハードルを克服することができ、ＲＮＡｉプロセスの効率と力価を増強することができることを発見した。即ち、本発明の特定の実施形態においては、多機能性ｓｉＮＡ分子の各鎖の１部分がＲＮＡｉを効率的に媒介するために十分な長さ（例えば約１５〜約２３塩基対）の標的核酸に相補的なヌクレオチド配列領域および標的核酸に相補的ではないヌクレオチド配列領域を含むように、約２９〜約３６塩基対の長さの多機能性ｓｉＮＡを設計することができる。多機能性ｓｉＮＡの各鎖に相補および非相補の部分の両方を有することにより、多機能性ｓｉＮＡは、ターンオーバーや解離を制約される（例えば各鎖の長さが長すぎるためそれぞれの標的核酸配列に対抗してＲＮＡｉを媒介できない場合）ことなく標的核酸配列に対抗してＲＮＡ干渉を媒介できる。更に、内部オーバーラップ領域を有する本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子の設計は、多機能性ｓｉＮＡ分子を、ＲＮＡ干渉を媒介するために好都合な（減少した）大きさ、および、治療薬としての用途に十分適している大きさとすることができる（例えば各鎖が独立して約１８〜約２８ヌクレオチド長）。非限定的な例を図１３〜２５および表１ｂに示す。
【０４８７】
１つの実施形態において、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子は第１の領域および第２の領域を含み、ここで多機能性ｓｉＮＡの第１の領域は第１の標的核酸分子の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、多機能性ｓｉＮＡの第２の領域は第２の標的核酸分子の核酸配列に相補的な核酸配列を含む。１つの実施形態において、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子は第１の領域および第２の領域を含み、この場合は多機能性ｓｉＮＡの第１の領域は標的核酸分子の第１の領域の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、多機能性ｓｉＮＡの第２の領域は標的核酸分子の第２の領域の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の実施形態においては、多機能性ｓｉＮＡの第１の領域および第２の領域はある程度の相補性を共有している別個の核酸配列を含むことができる（例えば約１〜約１０の相補ヌクレオチド）。特定の実施形態においては、別個の核酸配列を含む多機能性ｓｉＮＡコンストラクトは当分野で知られた方法および試薬により容易に合成後連結することができ、そのような連結コンストラクトは本発明の範囲内である。或いは多機能性ｓｉＮＡの第１の領域および第２の領域は、ヘアピンまたはステム−ループ構造の場合のようにある程度の自己相補性を有する単一の核酸配列を含むことができる。そのような２本鎖およびヘアピンの多機能性短鎖干渉核酸の非限定的な例はそれぞれ図１３および図１４に示す通りである。これらの多機能性短鎖干渉核酸（多機能性ｓｉＮＡ）は場合により特定のオーバーラップヌクレオチド配列を含むことができ、その場合、そのようなオーバーラップヌクレオチド配列は多機能性ｓｉＮＡの第１の領域と第２の領域の間に存在する（例えば図１５および図１６参照）。１つの実施形態において、第１の標的核酸分子および第２の核酸標的分子は１つ以上のＥＮａＣ標的配列、例えばいずれかのＥＮａＣ核酸配列またはＥＮａＣアイソタイプ核酸配列である。
【０４８８】
１つの実施形態において、本発明は多機能性短鎖干渉核酸（多機能性ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでは、多機能性ｓｉＮＡの各鎖が独立して、区別可能な標的核酸配列に相補的な核酸配列の第１の領域および標的配列に相補的ではないヌクレオチド配列の第２の領域を含む。各鎖の標的核酸配列は同じ標的核酸分子または異なる標的核酸分子内にある。１つの実施形態において、核酸標的分子は１つ以上のＥＮａＣ標的配列、例えばいずれかのＥＮａＣまたはＥＮａＣアイソタイプ核酸配列を含む。
【０４８９】
別の実施形態においては、多機能性ｓｉＮＡは２つの鎖を含み、ここで：（ａ）第１の鎖は標的核酸配列に相補的な配列を有する領域（相補領域１）および標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を有さない領域（非相補領域１）を含み；（ｂ）多機能性ｓｉＮＡの第２の鎖は第１の鎖のヌクレオチド配列に相補的な標的ヌクレオチド配列とは区別可能な標的核酸配列に対する配列相補性を有する領域（相補領域２）、および相補領域２の標的ヌクレオチド配列に対する配列相補性を有さない領域（非相補領域２）を含み；（ｃ）第１の鎖の相補領域１は第２の鎖の非相補領域２におけるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、第２の鎖の相補領域２は第１の鎖の非相補領域１におけるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。相補領域１および相補領域２の標的核酸配列は同じ標的核酸分子または異なる標的核酸分子である。１つの実施形態において、核酸標的分子は１つ以上のＥＮａＣ標的配列、例えばいずれかのＥＮａＣまたはＥＮａＣアイソタイプ核酸配列を含む。
【０４９０】
別の実施形態においては、多機能性ｓｉＮＡは２つの鎖を含み、ここで：（ａ）第１の鎖は遺伝子（例えば第１のＥＮａＣ遺伝子）から誘導された標的核酸配列に相補的な配列を有する領域（相補領域１）および相補領域１の標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を有さない領域（非相補領域１）を含み；（ｂ）多機能性ｓｉＮＡの第２の鎖は相補領域１の遺伝子とは区別可能な遺伝子（例えば第２のＥＮａＣ遺伝子）から誘導された標的核酸配列に対する配列相補性を有する領域（相補領域２）、および相補領域２の標的ヌクレオチド配列に対する配列相補性を有さない領域（非相補領域２）を含み；（ｃ）第１の鎖の相補領域１は第２の鎖の非相補領域２におけるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、第２の鎖の相補領域２は第１の鎖の非相補領域１におけるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態において、核酸標的配列は１つ以上のＥＮａＣ標的配列、例えばいずれかのＥＮａＣまたはＥＮａＣアイソタイプ核酸配列を含む。
【０４９１】
別の実施形態においては、多機能性ｓｉＮＡは２つの鎖を含み、ここで：（ａ）第１の鎖は第１の遺伝子（例えばＥＮａＣ遺伝子）から誘導された標的核酸配列に相補的な配列を有する領域（相補領域１）および相補領域１の標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を有さない領域（非相補領域１）を含み；（ｂ）多機能性ｓｉＮＡの第２の鎖は相補領域１の第１の標的核酸配列とは区別可能な第２の標的核酸配列に対する配列相補性を有する領域（相補領域２）、ただし相補領域１に関する標的核酸配列および相補領域２に対する標的核酸配列は両方とも同じ遺伝子から誘導されたもの、および、相補領域２の標的ヌクレオチド配列に対する配列相補性を有さない領域（非相補領域２）；（ｃ）第１の鎖の相補領域１は第２の鎖の非相補領域２におけるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、第２の鎖の相補領域２は第１の鎖の非相補領域１におけるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態において、核酸標的配列は１つ以上のＥＮａＣ標的配列、例えばいずれかのＥＮａＣまたはＥＮａＣアイソタイプ核酸配列を含む。
【０４９２】
１つの実施形態において、本発明は多機能性短鎖干渉核酸（多機能性ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでは多機能性ｓｉＮＡは２つの相補核酸配列を含み、ここで第１の配列は第１の標的核酸分子内部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第１の領域を含み、ここで、第２の配列は同じ標的核酸分子内部の区別可能なヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第１の領域を含む。好ましくは、第１の配列の第１の領域はまた第２の配列の第２の領域のヌクレオチド配列に相補的であり、第２の配列の第１の領域は第１の配列の第２の領域のヌクレオチド配列に相補的である。１つの実施形態において、核酸標的配列は１つ以上のＥＮａＣ標的配列、例えばいずれかのＥＮａＣまたはＥＮａＣアイソタイプ核酸配列を含む。
【０４９３】
１つの実施形態において、本発明は多機能性短鎖干渉核酸（多機能性ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでは多機能性ｓｉＮＡは２つの相補核酸配列を含み、ここで第１の配列は第１の標的核酸分子内部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第１の領域を含み、ここで、第２の配列は第２の標的核酸分子内部の区別可能なヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第１の領域を含む。好ましくは、第１の配列の第１の領域はまた第２の配列の第２の領域のヌクレオチド配列に相補的であり、第２の配列の第１の領域は第１の配列の第２の領域のヌクレオチド配列に相補的である。１つの実施形態において、核酸標的配列は１つ以上のＥＮａＣ標的配列、例えばいずれかのＥＮａＣまたはＥＮａＣアイソタイプ核酸配列を含む。
【０４９４】
１つの実施形態において、本発明は第１の領域および第２の領域を含む多機能性ｓｉＮＡ分子を特徴とし、ここで第１の領域は第１の標的核酸分子内部の核酸配列に相補的な約１８〜約２８ヌクレオチドを有する核酸配列を含み、第２の領域は第２の標的核酸分子内部の区別可能な核酸配列に相補的な約１８〜約２８ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態において、第１の核酸標的分子および第２の標的核酸分子はいずれかのＥＮａＣ標的配列、例えばいずれかのＥＮａＣまたはＥＮａＣアイソタイプ核酸配列からなる群より選択される。
【０４９５】
１つの実施形態において、本発明は第１の領域および第２の領域を含む多機能性ｓｉＮＡ分子を特徴とし、ここで第１の領域は標的核酸分子内部の核酸配列に相補的な約１８〜約２８ヌクレオチドを有する核酸配列を含み、第２の領域は同じ標的核酸分子内部の区別可能な核酸配列に相補的な約１８〜約２８ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態において、核酸標的分子はいずれかのＥＮａＣ標的配列、例えばＥＮａＣまたはいずれかのＥＮａＣアイソタイプ核酸配列からなる群より選択される。
【０４９６】
１つの実施形態において、本発明は２本鎖多機能性短鎖干渉核酸（多機能性ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで多機能性ｓｉＮＡの１つの鎖は第１の標的核酸配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する第１の領域を含み、第２の鎖は第２の標的核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第１の領域を含む。第１および第２の標的核酸配列は別個の標的核酸分子に存在することができ、または、同じ標的核酸分子の内部の異なる領域であることができる。即ち、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子は異なる遺伝子、同じ遺伝子のアイソタイプ、１つ以上の遺伝子転写物の突然変異体および保存された領域の両方、または同じかまたは異なる遺伝子または遺伝子転写物のコーディングおよび非コーディング配列の両方の発現をターゲティングするために使用できる。１つの実施形態において、第１の核酸標的配列および第２の標的核酸配列はいずれかのＥＮａＣ標的配列、例えばいずれかのＥＮａＣまたはＥＮａＣアイソタイプ核酸配列からなる群より選択される。
【０４９７】
１つの実施形態において、本発明の標的核酸分子は単一のタンパク質をコードする。別の実施形態においては、標的核酸分子は１つより多いタンパク質（例えば、１、２、３、４、５以上のタンパク質）をコードする。即ち、本発明の多機能性ｓｉＮＡコンストラクトは数種のタンパク質（例えばＥＮａＣ、いずれかのＥＮａＣアイソタイプタンパク質、またはこれらのいずれかの組み合わせのいずれか）の発現をダウンレギュレートまたは阻害するために使用できる。例えば、多機能性ｓｉＮＡ分子は、ＥＮａＣ標的、例えばＥＮａＣまたはＥＮａＣのアイソタイプのいずれかより誘導した第１の標的核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する１つの鎖における領域、および、第２のＥＮａＣ標的、例えばＥＮａＣまたはＥＮａＣのアイソタイプのいずれかに相補的なヌクレオチド配列を有する領域を含む第２の鎖を含み、これは多数のＥＮａＣ遺伝子をターゲティングすることにより特定の生物学的経路をダウンレギュレート、阻害、またはシャットダウンするために使用できる。
【０４９８】
１つの実施形態において、本発明は異なるＥＮａＣアイソフォーム、例えばＥＮａＣまたはそのアイソタイプのいずれかに存在する保存されたヌクレオチド配列を利用している。一方の鎖が種々のＥＮａＣファミリーメンバー内で保存された標的核酸配列に相補的な配列を含み、他方の鎖が場合によりＥＮａＣ経路標的核酸配列に相補的な配列を含むような様式において多機能性ｓｉＮＡを設計することにより、単一の多機能性ｓｉＮＡを使用しながらＥＮａＣ疾患関連生物学的経路を選択的および効果的にモジュレートまたは阻害することが可能となる。
【０４９９】
１つの実施形態において、本発明の多機能性短鎖干渉核酸（多機能性ｓｉＮＡ）は第１の領域および第２の領域を含み、ここで第１の領域は第１のＥＮａＣ標的の第１のＥＮａＣ  ＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含み、第２の領域は第２のＥＮａＣ標的の第２のＥＮａＣ  ＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態において、第１および第２の領域は、同じＥＮａＣアイソフォーム内部の異なるＥＮａＣ標的部位の共有または保存されたＲＮＡ配列に相補的な、またはＥＮａＣアイソフォームの異なるクラスの間で共有されたヌクレオチド配列を含むことができる。
【０５００】
１つの実施形態において、本発明の２本鎖多機能性ｓｉＮＡ分子は下記式ＭＦ−Ｉ：
【化３８】
2012509688.tif 000040
［式中、各５’−ｐ−ＸＺＸ’−３’および５’−ｐ−ＹＺＹ’−３’は独立して約２０ヌクレオチド〜約３００ヌクレオチド、好ましくは約２０〜約２００ヌクレオチド、約２０〜約１００ヌクレオチド、約２０〜約４０ヌクレオチド、約２０〜約４０ヌクレオチド、約２４〜約３８ヌクレオチド、または約２６〜約３８ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり；ＸＺは第１のＥＮａＣ標的核酸配列に相補的な核酸配列を含み；ＹＺは第２のＥＮａＣ標的核酸配列に相補的な核酸配列を含むオリゴヌクレオチドであり；Ｚは自己相補的である約１〜約２４ヌクレオチド（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチド）の長さのヌクレオチド配列を含み；Ｘは領域Ｙ’に存在するヌクレオチド配列に相補的な、約１〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１〜約２１ヌクレオチド（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチド）の長さのヌクレオチド配列を含み；Ｙは領域Ｘ’に存在するヌクレオチド配列に相補的な、約１〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１〜約２１ヌクレオチド（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチド）の長さのヌクレオチド配列を含み；各ｐは独立して存在または非存在である末端ホスフェート基を含み；各ＸＺおよびＹＺは独立して、それぞれ第１および第２の標的核酸配列またはその一部分と安定に相互作用（即ち塩基対形成）するために十分な長さのものである］を有する構造を含む。例えば、各配列ＸおよびＹは独立して、標的ＲＮＡまたはその一部分等の異なる標的核酸分子における標的ヌクレオチド配列に相補的な約１２〜約２１以上のヌクレオチド長（例えば約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１以上）の配列を含むことができる。別の非限定的な例においては、第１のＥＮａＣ標的核酸配列またはその一部分に相補的なＸとＺを合わせたヌクレオチド配列の長さは約１２〜約２１以上のヌクレオチド（例えば約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１以上）である。別の非限定的な例においては、第２のＥＮａＣ標的核酸配列またはその一部分に相補的なＸとＺを合わせたヌクレオチド配列の長さは約１２〜約２１以上のヌクレオチド（例えば約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１以上）である。１つの実施形態において、第１のＥＮａＣ標的核酸配列および第２のＥＮａＣ標的核酸配列は同じ標的核酸分子（例えばＥＮａＣ標的ＲＮＡまたはＥＮａＣ経路標的ＲＮＡ）中に存在する。別の実施形態においては、第１のＥＮａＣ標的核酸配列および第２のＥＮａＣ標的核酸配列は異なる標的核酸分子（例えばＥＮａＣ標的ＲＮＡまたはＥＮａＣ経路標的ＲＮＡ）中に存在する。１つの実施形態において、Ｚはパリンドロームまたはリピート配列を含む。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一である。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一ではない。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドＹおよびＹ’の長さは同一である。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドＹおよびＹ’の長さは同一ではない。１つの実施形態において、式ＭＦ−Ｉの２本鎖オリゴヌクレオチドコンストラクトは、ミスマッチが標的遺伝子発現を阻害する２本鎖オリゴヌクレオチドの能力を顕著に低下させない限りにおいて、１つ以上、特に１、２、３または４つのそのようなミスマッチを含む。
【０５０１】
１つの実施形態において、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子は下記式ＭＦ−ＩＩ：
【化３９】
2012509688.tif 000041
［式中、各５’−ｐ−ＸＸ’−３’および５’−ｐ−ＹＹ’−３’は独立して約２０ヌクレオチド〜約３００ヌクレオチド、好ましくは約２０〜約２００ヌクレオチド、約２０〜約１００ヌクレオチド、約２０〜約４０ヌクレオチド、約２０〜約４０ヌクレオチド、約２４〜約３８ヌクレオチド、または約２６〜約３８ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり；Ｘは第１の標的核酸配列に相補的な核酸配列を含み；Ｙは第２の標的核酸配列に相補的な核酸配列を含むオリゴヌクレオチドであり；Ｘは領域Ｙ’に存在するヌクレオチド配列に相補的な、約１〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１〜約２１ヌクレオチド（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチド）の長さのヌクレオチド配列を含み；Ｙは領域Ｘ’に存在するヌクレオチド配列に相補的な、約１〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約１〜約２１ヌクレオチド（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチド）の長さのヌクレオチド配列を含み；各ｐは独立して存在または非存在である末端ホスフェート基を含み；各ＸおよびＹは独立して、それぞれ第１および第２の標的核酸配列またはその一部分と安定に相互作用（即ち塩基対形成）するために十分な長さのものである］を有する構造を含む。例えば、各配列ＸおよびＹは独立して、ＥＮａＣ標的ＲＮＡまたはその一部分等の異なる標的核酸分子における標的ヌクレオチド配列に相補的な約１２〜約２１以上のヌクレオチド長（例えば約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１以上）の配列を含むことができる。１つの実施形態において、第１のＥＮａＣ標的核酸配列および第２のＥＮａＣ標的核酸配列は同じ標的核酸分子（例えばＥＮａＣ標的ＲＮＡまたはＥＮａＣ経路標的ＲＮＡ）中に存在する。別の実施形態においては、第１のＥＮａＣ標的核酸配列および第２のＥＮａＣ標的核酸配列は異なる標的核酸分子（例えばＥＮａＣ標的ＲＮＡおよびはＥＮａＣ経路標的ＲＮＡ）中に存在する。１つの実施形態において、Ｚはパリンドロームまたはリピート配列を含む。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一である。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一ではない。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドＹおよびＹ’の長さは同一である。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドＹおよびＹ’の長さは同一ではない。１つの実施形態において、式Ｉ（ａ）の２本鎖オリゴヌクレオチドコンストラクトは、ミスマッチが標的遺伝子発現を阻害する２本鎖オリゴヌクレオチドの能力を顕著に低下させない限りにおいて、１つ以上、特に１、２、３または４つのそのようなミスマッチを含む。
【０５０２】
１つの実施形態において、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子は下記式ＭＦ−ＩＩＩ：
【化４０】
2012509688.tif 000042
［式中、各Ｘ、Ｘ’、Ｙ、およびＹ’は独立して約１５ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、好ましくは約１８〜約４０ヌクレオチド、または約１９〜約２３ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり；Ｘは領域Ｙ’に存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み；Ｘ’は領域Ｙに存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み；各ＸおよびＸ’は独立してそれぞれ第１および第２のＥＮａＣ標的核酸配列またはその一部分と安定に相互作用（即ち塩基対形成）するために十分な長さのものであり；Ｗは配列ＹおよびＹ’を連結するヌクレオチドまたは非ヌクレオチドのリンカーを示し；多機能性ｓｉＮＡはＲＮＡ干渉を介して第１および第２のＥＮａＣ標的配列の切断を指向する］を有する構造を含む。１つの実施形態において、第１のＥＮａＣ標的核酸配列および第２のＥＮａＣ標的核酸配列は同じ標的核酸分子（例えばＥＮａＣ標的ＲＮＡまたはＥＮａＣ経路標的ＲＮＡ）中に存在する。別の実施形態においては、第１のＥＮａＣ標的核酸配列および第２のＥＮａＣ標的核酸配列は異なる標的核酸分子またはその一部分（例えばＥＮａＣ標的ＲＮＡまたはＥＮａＣ経路標的ＲＮＡ）中に存在する。１つの実施形態において、領域Ｗは配列Ｙ’の３’末端を配列Ｙの３’末端に連結する。１つの実施形態において、領域Ｗは配列Ｙ’の３’末端を配列Ｙの５’末端に連結する。１つの実施形態において、領域Ｗは配列Ｙ’の５’末端を配列Ｙの５’末端に連結する。１つの実施形態において、領域Ｗは配列Ｙ’の５’末端を配列Ｙの３’末端に連結する。１つの実施形態において、末端ホスフェート基は配列Ｘの５’末端に存在する。１つの実施形態において、末端ホスフェート基は配列Ｘ’の５’末端に存在する。１つの実施形態において、末端ホスフェート基は配列Ｙの５’末端に存在する。１つの実施形態において、末端ホスフェート基は配列Ｙ’の５’末端に存在する。１つの実施形態において、Ｗは生体分解性のリンカーを介して配列ＹおよびＹ’を連結する。１つの実施形態において、Ｗは更にコンジュゲート、標識、アプタマー、リガンド、脂質、または重合体を含む。
【０５０３】
１つの実施形態において、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子は下記式ＭＦ−ＩＶ：
【化４１】
2012509688.tif 000043
［式中、各Ｘ、Ｘ’、Ｙ、およびＹ’は独立して約１５ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、好ましくは約１８〜約４０ヌクレオチド、または約１９〜約２３ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり；Ｘは領域Ｙ’に存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み；Ｘ’は領域Ｙに存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み；各ＹおよびＹ’は独立してそれぞれ第１および第２のＥＮａＣ標的核酸配列またはその一部分と安定に相互作用（即ち塩基対形成）するために十分な長さのものであり；Ｗは配列ＹおよびＹ’を連結するヌクレオチドまたは非ヌクレオチドのリンカーを示し；多機能性ｓｉＮＡはＲＮＡ干渉を介して第１および第２のＥＮａＣ標的配列の切断を指向する］を有する構造を含む。１つの実施形態において、第１のＥＮａＣ標的核酸配列および第２のＥＮａＣ標的核酸配列は同じ標的核酸分子（例えばＥＮａＣ標的ＲＮＡまたはＥＮａＣ経路標的ＲＮＡ）中に存在する。別の実施形態においては、第１のＥＮａＣ標的核酸配列および第２のＥＮａＣ標的核酸配列は異なる標的核酸分子またはその一部分（例えばＥＮａＣ標的ＲＮＡまたはＥＮａＣ経路標的ＲＮＡ）中に存在する。１つの実施形態において、領域Ｗは配列Ｙ’の３’末端を配列Ｙの３’末端に連結する。１つの実施形態において、領域Ｗは配列Ｙ’の３’末端を配列Ｙの５’末端に連結する。１つの実施形態において、領域Ｗは配列Ｙ’の５’末端を配列Ｙの５’末端に連結する。１つの実施形態において、領域Ｗは配列Ｙ’の５’末端を配列Ｙの３’末端に連結する。１つの実施形態において、末端ホスフェート基は配列Ｘの５’末端に存在する。１つの実施形態において、末端ホスフェート基は配列Ｘ’の５’末端に存在する。１つの実施形態において、末端ホスフェート基は配列Ｙの５’末端に存在する。１つの実施形態において、末端ホスフェート基は配列Ｙ’の５’末端に存在する。１つの実施形態において、Ｗは生体分解性のリンカーを介して配列ＹおよびＹ’を連結する。１つの実施形態において、Ｗは更にコンジュゲート、標識、アプタマー、リガンド、脂質、または重合体を含む。
【０５０４】
１つの実施形態において、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子は下記式ＭＦ−Ｖ：
【化４２】
2012509688.tif 000044
［式中、各Ｘ、Ｘ’、Ｙ、およびＹ’は独立して約１５ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、好ましくは約１８〜約４０ヌクレオチド、または約１９〜約２３ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり；Ｘは領域Ｙ’に存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み；Ｘ’は領域Ｙに存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み；各Ｘ、Ｘ’、Ｙ、またはＹ’は独立してそれぞれ第１、第２、第３または第４のＥＮａＣ標的核酸配列またはその一部分と安定に相互作用（即ち塩基対形成）するために十分な長さのものであり；Ｗは配列ＹおよびＹ’を連結するヌクレオチドまたは非ヌクレオチドのリンカーを示し；多機能性ｓｉＮＡはＲＮＡ干渉を介して第１、第２、第３または第４の標的配列の切断を指向する］を有する構造を含む。１つの実施形態において、第１、第２、第３または第４のＥＮａＣ標的核酸配列は全て同じ標的核酸分子（例えばＥＮａＣ標的ＲＮＡまたはＥＮａＣ経路標的ＲＮＡ）中に存在する。別の実施形態においては、第１、第２、第３または第４のＥＮａＣ標的核酸配列は独立して異なる標的核酸分子またはその一部分（例えばＥＮａＣ標的ＲＮＡおよびＥＮａＣ経路標的ＲＮＡ）中に存在する。１つの実施形態において、領域Ｗは配列Ｙ’の３’末端を配列Ｙの３’末端に連結する。１つの実施形態において、領域Ｗは配列Ｙ’の３’末端を配列Ｙの５’末端に連結する。１つの実施形態において、領域Ｗは配列Ｙ’の５’末端を配列Ｙの５’末端に連結する。１つの実施形態において、領域Ｗは配列Ｙ’の５’末端を配列Ｙの３’末端に連結する。１つの実施形態において、末端ホスフェート基は配列Ｘの５’末端に存在する。１つの実施形態において、末端ホスフェート基は配列Ｘ’の５’末端に存在する。１つの実施形態において、末端ホスフェート基は配列Ｙの５’末端に存在する。１つの実施形態において、末端ホスフェート基は配列Ｙ’の５’末端に存在する。１つの実施形態において、Ｗは生体分解性のリンカーを介して配列ＹおよびＹ’を連結する。１つの実施形態において、Ｗは更にコンジュゲート、標識、アプタマー、リガンド、脂質、または重合体を含む。
【０５０５】
１つの実施形態において、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子（例えば式ＭＦ−Ｉ〜ＭＦ−Ｖのいずれかを有するもの）の領域ＸおよびＹは同じ標的核酸分子の部分である異なる標的核酸配列に相補的である。１つの実施形態において、そのような標的核酸配列はＲＮＡ転写物のコーディング領域内の異なる位置にある。１つの実施形態において、そのような標的核酸配列は同じＲＮＡ転写物のコーディングおよび非コーディング領域を含む。１つの実施形態において、そのような標的核酸配列はオルタナティブスプライシング転写物またはそのようなオルタナティブスプライシング転写物の前駆体の領域を含む。
【０５０６】
１つの実施形態において、式ＭＦ−Ｉ〜ＭＦ−Ｖのいずれかを有する多機能性ｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載する化学修飾、例えば限定しないが、上記の式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかを有するヌクレオチド、表８に記載する安定化化学状態、または本明細書の種々の実施形態に記載する修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドのいずれかの他の組み合わせを含むことができる。
【０５０７】
１つの実施形態において、式ＭＦ−Ｉ〜ＭＦ−ＩＩを有する多機能性ｓｉＮＡコンストラクトのＺにおけるパリンドロームまたはリピート配列または修飾されたヌクレオチド（例えば２−アミノプリンまたはユニバーサル塩基等の修飾された塩基を有するヌクレオチド）は、標的核酸配列の一部分と相互作用することができる化学修飾されたヌクレオチドを含む（例えばワトソンクリック塩基対または非ワトソンクリック塩基対を形成できる修飾された塩基類縁体）。
【０５０８】
１つの実施形態において、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子、例えばＭＦ−Ｉ〜ＭＦ−Ｖを有する多機能性ｓｉＮＡの各鎖は独立して、約１５〜約４０ヌクレオチド（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオチド）を含む。１つの実施形態において、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子は１つ以上の化学修飾を含む。非限定的な例において、本発明の核酸分子内への化学修飾されたヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドの導入は外因性に送達される未修飾のＲＮＡ分子に固有のインビボの安定性および生体利用性の潜在的な限界を克服する場合の強力な手段を与える。例えば化学修飾された核酸分子の使用は、化学修飾された核酸分子は血清中、または細胞または組織中においてより長い半減期を有する傾向があるため、所定の治療効果のために特定の核酸分子をより低用量とすることができる。更に、特定の化学修飾は、半減期を長くすることのみならず、特定の臓器、細胞または組織への核酸分子のターゲティングを促進すること、および／または核酸分子の細胞取り込みを向上させることにより、核酸分子の生体利用性および／または力価を向上させることができる。従って、化学修飾された核酸分子の活性がネイティブ／未修飾の核酸分子と比較して、例えば未修飾のＲＮＡ分子と比較した場合に、インビトロで低減されるとしても、修飾された核酸分子の全体的活性は、分子の向上した安定性、力価、作用持続時間、生体利用性および／または送達のために、ネイティブまたは未修飾の核酸分子よりも高値となることができる。
【０５０９】
別の実施形態においては、本発明は、各センス鎖の末端の一方が他のｓｉＮＡ分子のセンス鎖の末端に係留され、これにより２つのアンチセンスｓｉＮＡ鎖が、一端で相互に係留されたそれらの相当するセンス鎖にアニーリングされるように多機能性ｓｉＮＡが２つの別個の２本鎖ｓｉＮＡから組み立てられている多機能性ｓｉＮＡを特徴とする（図１９参照）。係留部またはリンカーは、一般的に当分野で知られる通り、および本明細書に記載する通り、ヌクレオチド系リンカーまたは非ヌクレオチド系リンカーであることができる。
【０５１０】
１つの実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡの一方のセンス鎖の５’末端がもう一方のｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端に係留され、これにより２つのアンチセンスｓｉＮＡ鎖の５’末端が、一端で、相互に背いて（逆方向に）相互に係留されたそれらの相当するセンス鎖にアニーリングされるように、多機能性ｓｉＮＡが２つの別個の２本鎖ｓｉＮＡから組み立てられている多機能性ｓｉＮＡを特徴とする（図１９（Ａ）参照）。係留部またはリンカーは、一般的に当分野で知られる通り、および本明細書に記載する通り、ヌクレオチド系リンカーまたは非ヌクレオチド系リンカーであることができる。
【０５１１】
１つの実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡの一方のセンス鎖の３’末端がもう一方のｓｉＮＡ分子のセンス鎖の３’末端に係留され、これにより２つのアンチセンスｓｉＮＡ鎖の５’末端が、一端で、相互に対面して相互に係留されたそれらの相当するセンス鎖にアニーリングされるように、多機能性ｓｉＮＡが２つの別個の２本鎖ｓｉＮＡから組み立てられている多機能性ｓｉＮＡを特徴とする（図１９（Ｂ）参照）。係留部またはリンカーは、一般的に当分野で知られる通り、および本明細書に記載する通り、ヌクレオチド系リンカーまたは非ヌクレオチド系リンカーであることができる。
【０５１２】
１つの実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡの一方のセンス鎖の５’末端がもう一方のｓｉＮＡ分子のセンス鎖の３’末端に係留され、これによりアンチセンスｓｉＮＡ鎖の一方の５’末端が、一端で、もう一方のアンチセンス鎖の３’末端に面するように相互に係留されたそれらの相当するセンス鎖にアニーリングされるように、多機能性ｓｉＮＡが２つの別個の２本鎖ｓｉＮＡから組み立てられている多機能性ｓｉＮＡを特徴とする（図１９（Ｃ−Ｄ）参照）。係留部またはリンカーは、一般的に当分野で知られる通り、または本明細書に記載する通り、ヌクレオチド系リンカーまたは非ヌクレオチド系リンカーであることができる。
【０５１３】
１つの実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡの一方のアンチセンス鎖の５’末端がもう一方のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の３’末端に係留され、これによりセンスｓｉＮＡ鎖の一方の５’末端が、一端で、もう一方のセンス鎖の３’末端に面するように相互に係留されたそれらの相当するアンチセンス鎖にアニーリングされるように、多機能性ｓｉＮＡが２つの別個の２本鎖ｓｉＮＡから組み立てられている多機能性ｓｉＮＡを特徴とする（図１９（Ｇ−Ｈ）参照）。１つの実施形態において、第１のアンチセンス鎖の５’末端と第２のアンチセンス鎖の３’末端の間の連結部は、多機能性ｓｉＮＡの各アンチセンス鎖の５’末端が、標的ＲＮＡのＲＮＡ干渉に基づく切断を媒介するのに適する遊離の５’末端を有するように、容易に切断可能となるような方法で設計されている（例えば生体分解性リンカー）。係留部またはリンカーは、一般的に当分野で知られる通り、および本明細書に記載する通り、ヌクレオチド系リンカーまたは非ヌクレオチド系リンカーであることができる。
【０５１４】
１つの実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡの一方のアンチセンス鎖の５’末端がもう一方のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の５’末端に係留され、これによりセンスｓｉＮＡ鎖の一方の３’末端が、一端で、もう一方のセンス鎖の３’末端に面するように相互に係留されたそれらの相当するアンチセンス鎖にアニーリングされるように、多機能性ｓｉＮＡが２つの別個の２本鎖ｓｉＮＡから組み立てられている多機能性ｓｉＮＡを特徴とする（図１９（Ｅ）参照）。１つの実施形態において、第１のアンチセンス鎖の５’末端と第２のアンチセンス鎖の５’末端の間の連結部は、多機能性ｓｉＮＡの各アンチセンス鎖の５’末端が、標的ＲＮＡのＲＮＡ干渉に基づく切断を媒介するのに適する遊離の５’末端を有するように、容易に切断可能となるような方法で設計されている（例えば生体分解性リンカー）。係留部またはリンカーは、一般的に当分野で知られる通り、および本明細書に記載する通り、ヌクレオチド系リンカーまたは非ヌクレオチド系リンカーであることができる。
【０５１５】
１つの実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡの一方のアンチセンス鎖の３’末端がもう一方のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の３’末端に係留され、これによりセンスｓｉＮＡ鎖の一方の５’末端が、一端で、もう一方のセンス鎖の３’末端に面するように相互に係留されたそれらの相当するアンチセンス鎖にアニーリングされるように、多機能性ｓｉＮＡが２つの別個の２本鎖ｓｉＮＡから組み立てられている多機能性ｓｉＮＡを特徴とする（図１９（Ｆ）参照）。１つの実施形態において、第１のアンチセンス鎖の５’末端と第２のアンチセンス鎖の５’末端の間の連結部は、多機能性ｓｉＮＡの各アンチセンス鎖の５’末端が、標的ＲＮＡのＲＮＡ干渉に基づく切断を媒介するのに適する遊離の５’末端を有するように、容易に切断可能となるような方法で設計されている（例えば生体分解性リンカー）。係留部またはリンカーは、一般的に当分野で知られる通り、または本明細書に記載する通り、ヌクレオチド系リンカーまたは非ヌクレオチド系リンカーであることができる。
【０５１６】
上記した実施形態のいずれかにおいて、第１の標的核酸配列または第２の標的核酸配列は独立してＥＮａＣおよび／またはＥＮａＣのアイソタイプを含むことができる。上記した実施形態のいずれかにおいて、第１の標的核酸配列または第２の標的核酸配列は独立してＥＮａＣまたはＥＮａＣ  ＲＮＡのアイソタイプを含むことができる。１つの実施形態において、第１のＥＮａＣ標的核酸配列はＥＮａＣ標的ＲＮＡまたはその一部分であり、第２のＥＮａＣ標的核酸配列はＥＮａＣ経路標的ＲＮＡまたはＤＮＡである。１つの実施形態において、第１の標的核酸配列は標的ＲＮＡ、ＤＮＡまたはその一部分であり、第２の標的核酸配列は別のＲＮＡ、ＤＮＡまたはその一部分である。
【０５１７】
１つの実施形態において、本明細書に記載した実施形態のいずれかにおいて、第１の標的配列はＥＮａＣ標的配列またはその一部分であり、第２の標的配列はＥＮａＣ標的配列またはその一部分である。１つの実施形態において、本明細書に記載した実施形態のいずれかにおいて、第１の標的配列はＥＮａＣ（例えばＥＮａＣまたはＥＮａＣアイソタイプのいずれか）標的配列またはその一部分であり、第２の標的配列はＥＮａＣ（例えばＥＮａＣまたはＥＮａＣアイソタイプのいずれか）標的配列またはその一部分である。
【０５１８】
核酸分子の合成
【０５１９】
１００ヌクレオチド長より大きい核酸の合成は自動化された方法を用いる場合には困難であり、そのような分子の治療上の費用は制約的である。本発明においては小型核酸モチーフ（「小型」とは１００ヌクレオチド長以下、好ましくは８０ヌクレオチド長以下、最も好ましくは５０ヌクレオチド長以下の核酸モチーフを指し；例えばタンデムに合成された個々のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド配列またはｓｉＮＡ配列）が外因性の送達のために好ましくは使用される。これらの分子の単純な構造はタンパク質および／またはＲＮＡ構造のターゲティングされた領域に侵入する核酸の能力を増大させる。本発明の例示される分子は化学合成され、その他のものは同様に合成できる。
【０５２０】
オリゴヌクレオチド（例えば特定の修飾されたオリゴヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを欠いているオリゴヌクレオチドの部分）は当分野で知られたプロトコルを用いながら、例えばＣａｒｕｔｈｅｒｓ等、１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１，３−１９，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５４４５９，Ｗｉｎｃｏｔｔ等、１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４，Ｗｉｎｃｏｔｔ等、１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＭｏＩ．Ｂｉｏ．，７４，５９，Ｂｒｅｎｎａｎ等、１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．，６１，３３−４５およびＢｒｅｎｎａｎの米国特許第６，００１，３１１号に記載される通り合成する。これらの参考文献は全て参照により本明細書に組み込まれる。オリゴヌクレオチドの合成は一般的な核酸の保護基およびカップリング基、例えば５’末端におけるジメトキシトリチルおよび３’末端におけるホスホラミダイトを使用する。非限定的な例においては、小規模の合成は３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．の合成装置上、０．２マイクロモル規模のプロトコルを用いながら、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについては２．５分のカップリング工程、２’−デオキシヌクレオチドまたは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドについては４５秒のカップリング工程としながら実施する。表９は合成サイクルにおいて使用される試薬の量および接触時間を概説している。或いは、０．２マイクロモル規模の合成は、９６穴プレート合成装置、例えばＰｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）により製造された機器において、サイクルに最小限の変更を加えながら実施できる。３３倍過剰（０．１１Ｍの６０μＬ＝６．６マイクロモル）の２’−Ｏ−メチルホスホラミダイトおよび１０５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（０．２５Ｍの６０μＬ＝１５マイクロモル）を、重合体結合５’−ヒドロキシルに対して２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルにおいて使用できる。２２倍過剰（０．１１Ｍの４０μＬ＝４．４マイクロモル）のデオキシホスホラミダイトおよび７０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（０．２５Ｍの４０μＬ＝１０マイクロモル）を、重合体結合５’−ヒドロキシルに対してデオキシ残基の各カップリングサイクルにおいて使用できる。３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成装置上の平均カップリング収率は、トリチル画分の比色定量により測定すれば、典型的には９７．５〜９９％となる。３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成装置のための他のオリゴヌクレオチド合成試薬には以下のものが含まれ、即ち、脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％ＴＣＡ（ＡＢＩ）；キャッピングはＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およびＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）を用いて実施；および酸化溶液はＴＨＦ中１６．９ｍＭ  Ｉ２、４９ｍＭピリジン、９％水（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）とする。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎの合成等級のアセトニトリルは試薬ビンから直接使用する。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセ��ニトリル中０．２５Ｍ）はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｎｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｃ．から入手した固体から調製する。或いは、ホスホロチオエート連結部の導入のためには、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド、アセトニトリル中０．０５Ｍ）を使用する。
【０５２１】
ＤＮＡ系オリゴヌクレオチドの脱保護は以下の通り行われ、即ち、重合体結合トリチル−オンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラススクリュートップのバイアルに移し、１０分間６５℃で４０％水性メチルアミンの溶液（１ｍＬ）中に懸濁する。−２０℃に冷却した後、上澄みを重合体支持体から取り出す。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ／３：１：１で３回洗浄し、回転攪拌し、次に上澄みを第１の上澄みに添加する。オリゴリボヌクレオチドを含有する合わせた上澄みを乾燥して白色粉末とする。１つの実施形態において、本発明の核酸分子は、全て参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，９９５，２５９号、米国特許第６，６８６，４６３号、米国特許第６，６７３，９１８号、米国特許第６，６４９，７５１号、米国特許第６，９８９，４４２号およびＵＳＳＮ１０／１９０，３５９に記載されている方法に従って合成、脱保護、および分析する。
【０５２２】
本発明の特定のｓｉＮＡ分子を含むＲＮＡに関して使用する合成方法は、Ｕｓｍａｎ等、１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ等、１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５４３３；ａｎｄ  Ｗｉｎｃｏｔｔ等、１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４  Ｗｉｎｃｏｔｔ等、１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９に記載されているような操作法に従い、一般的な核酸の保護基およびカップリング基、例えば５’末端におけるジメトキシトリチルおよび３’末端におけるホスホラミダイトを使用する。非限定的な例においては、小規模の合成は３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．の合成装置上、０．２マイクロモル規模のプロトコルを用いながら、アルキルシリル保護ヌクレオチドについては７．５分のカップリング工程、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについては２．５分のカップリング工程としながら実施する。表９は合成サイクルにおいて使用される試薬の量および接触時間を概説している。或いは、０．２マイクロモル規模の合成は、９６穴プレート合成装置、例えばＰｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）により製造された機器において、サイクルに最小限の変更を加えながら実施できる。３３倍過剰（０．１１Ｍの６０μＬ＝６．６マイクロモル）の２’−Ｏ−メチルホスホラミダイトおよび７５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（０．２５Ｍの６０μＬ＝１５マイクロモル）を、重合体結合５’−ヒドロキシルに対して２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルにおいて使用できる。６６倍過剰（０．１１Ｍの１２０μＬ＝１３．２マイクロモル）のアルキルシリル（リボ）保護ホスホラミダイトおよび１５０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（０．２５Ｍの１２０μＬ＝３０マイクロモル）を、重合体結合５’−ヒドロキシルに対してリボ残基の各カップリングサイクルにおいて使用できる。３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成装置上の平均カップリング収率は、トリチル画分の比色定量により測定すれば、典型的には９７．５〜９９％となる。３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成装置のための他のオリゴヌクレオチド合成試薬には以下のものが含まれ、即ち、脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％ＴＣＡ（ＡＢＩ）；キャッピングはＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およびＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）を用いて実施；酸化溶液はＴＨＦ中１６．９ｍＭ  Ｉ２、４９ｍＭピリジン、９％水（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）とする。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎの合成等級のアセトニトリルは試薬ビンから直接使用する。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｎｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から調製する。或いは、ホスホロチオエート連結部の導入のためには、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド、アセトニトリル中０．０５Ｍ）を使用する。
【０５２３】
ＲＮＡの脱保護は２ポットまたは１ポットのプロトコルのいずれかを用いて実施する。２ポットプロトコルのためには、重合体結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラススクリュートップバイアルに移し、１０分間６５℃で４０％水性メチルアミンの溶液（１ｍＬ）中に懸濁する。−２０℃に冷却した後、上澄みを重合体支持体から取り出す。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ／３：１：１で３回洗浄し、回転攪拌し、次に上澄みを第１の上澄みに添加する。オリゴリボヌクレオチドを含有する合わせた上澄みを乾燥して白色粉末とする。塩基脱保護オリゴリボヌクレオチドを無水ＴＥＡ／ＨＦ／ＮＭＰ溶液（１．４ＭのＨＦ濃度とするための１．５ｍＬのＮ−メチルピロリドン、７５０μＬのＴＥＡおよび１ｍＬのＴＥＡ・３ＨＦの溶液３００μＬ）に再懸濁し、６５℃に加熱する。１．５時間後、オリゴマーを１．５ＭのＮＨ４ＨＣＯ３でクエンチングする。１つの実施形態において、本発明の核酸分子は、全て参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，９９５，２５９号、米国特許第６，６８６，４６３号、米国特許第６，６７３，９１８号、米国特許第６，６４９，７５１号、米国特許第６，９８９，４４２号およびＵＳＳＮ１０／１９０，３５９に記載されている方法に従って合成、脱保護、および分析する。
【０５２４】
或いはワンポットプロトコルのためには、重合体結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラススクリュートップバイアルに移し、１５分間６５℃で３３％エタノール性メチルアミン／ＤＭＳＯ：１／１の溶液（０．８ｍＬ）中に懸濁する。バイアルを室温に戻し、ＴＥＡ・３ＨＦ（０．１ｍＬ）を添加し、バイアルを１５分間６５℃に加熱する。試料を−２０℃に冷却し、次に１．５ＭのＮＨ４ＨＣＯ３でクエンチングする。
【０５２５】
トリチルオンオリゴマーの精製のために、クエンチングしたＮＨ４ＨＣＯ３溶液を、アセトニトリルおよびその後の５０ｍＭ  ＴＥＡＡにより予備洗浄しておいたＣ−１８含有カートリッジ上にロードする。ロードされたカートリッジを水で洗浄した後、ＲＮＡを１３分間０．５％ＴＦＡで脱トリチル化する。次にカートリッジを再度水で洗浄し、塩を１Ｍ  ＮａＣｌに交換し、水で再度洗浄する。次にオリゴヌクレオチドを３０％アセトニトリルで溶出させる。
【０５２６】
平均の段階的なカップリングの収率は典型的には＞９８％である（Ｗｉｎｃｏｔｔ等、１９９５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４）。合成の規模は上記した例よりも大型または小型のもの、例えば限定しないが９６穴フォーマットに変更することができることは、当業者のよく知る通りである。
【０５２７】
或いは、本発明の核酸分子は別個に合成し、合成後に例えばライゲーションにより（Ｍｏｏｒｅ等、１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，９９２３；Ｄｒａｐｅｒ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２３５６９；Ｓｈａｂａｒｏｖａ等、１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９，４２４７；Ｂｅｌｌｏｎ等、１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５１；Ｂｅｌｌｏｎ等、１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．８，２０４）、または合成および／または脱保護の後のハイブリダイゼーションにより、共に連結することができる。
【０５２８】
本発明のｓｉＮＡ分子はまた、本明細書の実施例１に記載する通りタンデム合成方法を介して合成することができ、この場合、両方のｓｉＮＡ鎖は、切断可能なリンカーにより分離された単一の近接オリゴヌクレオチドのフラグメントまたは鎖として合成され、そのリンカーは後に切断されて、別個のｓｉＮＡのフラグメントまたは鎖を与え、これがハイブリダイズし、ｓｉＮＡデュプレックスの精製を可能とする。リンカーはポリヌクレオチドのリンカーまたは非ヌクレオチドのリンカーであることができる。本明細書に記載するｓｉＮＡのタンデム合成は９６穴または同様により大きい多重ウェルプラットホーム等の多重ウェル／多重プレートの合成プラットホームの両方に容易に適用できる。本明細書に記載したｓｉＮＡのタンデム合成はまた、バッチ反応器、合成カラム等を用いた大規模合成プラットホームにも容易に適用できる。
【０５２９】
ｓｉＮＡ分子はまた、２つの区別可能な核酸の鎖またはフラグメントから組み立てることができ、この場合１つのフラグメントはセンス領域を含み、第２のフラグメントはＲＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。
【０５３０】
本発明の核酸分子はヌクレアーゼ耐性基、例えば２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈによる修飾により安定性を増強するために大幅に修飾することができる（考察のためにはＵｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ  １７，３４；Ｕｓｍａｎ等、１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３を参照）。ｓｉＮＡコンストラクトは一般的な方法を用いてゲル電気泳動により精製することができ、或いは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；参照により全体が本明細書に組み込まれる上出のＷｉｎｃｏｔｔ等参照）および水中の再懸濁により精製できる。
【０５３１】
本発明の別の態様において、本発明のｓｉＮＡ分子はＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写ユニットから発現される。組み換えベクターはＤＮＡプラスミドまたはウィルスベクターであることができる。ｓｉＮＡ発現ウィルスベクターは限定しないが例えばアデノ関連ウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、またはαウィルスに基づいて構築できる。ｓｉＮＡ分子を発現できる組み換えベクターは本明細書に記載する通り送達することができ、標的細胞中で存続できる。或いは、ｓｉＮＡ分子の一過性の発現を可能にするウィルスベクターを使用できる。
本発明の核酸分子の活性の最適化
【０５３２】
修飾（塩基、糖、および／またはホスフェート）を有する化学合成核酸分子は血清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を防止でき、これによりそれらの力価を上昇させることができる（例えばすべて参照により本明細書に組み込まれるＥｃｋｓｔｅｉｎ等、国際公開番号ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ等、１９９０  Ｎａｔｕｒｅ  ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎ等、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３，３１４；Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ等、国際公開番号ＷＯ９３／１５１８７；およびＲｏｓｓｉ等、国際公開番号ＷＯ９１／０３１６２；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許第５，３３４，７１１号；Ｇｏｌｄ等、米国特許第６，３００，０７４号；およびＢｕｒｇｉｎ等、上出を参照）。上記した参考文献の全ては本明細書に記載した核酸分子の塩基、ホスフェートおよび／または糖の部分に対して行うことができる種々の化学修飾を記載している。細胞中のそれらの薬効、オリゴヌクレオチド合成時間を短縮化し、化学物質の必要性を低減するための核酸分子からの塩基の除去が望ましい。
【０５３３】
それ自体のヌクレアーゼ安定性および薬効の顕著な増強を伴いながら核酸分子に導入できる糖、塩基およびホスフェートの修飾を説明する例が当分野に幾つか存在する。例えばオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性基、例えば２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｈのヌクレオチド塩基修飾による修飾により、安定性を増強および／または生物学的活性を増強するために修飾される（考察のためにはＵｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ．１７，３４；Ｕｓｍａｎ等、１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎ等、１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０参照）。核酸分子の糖の修飾は当分野で広範に報告されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ等、国際公開ＰＣＴ番号ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ等、Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４４，５６５−５６８；Ｐｉｅｋｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５３，３１４−３１７；Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ＳｃＬ，１９９２，１７，３３４−３３９；Ｕｓｍａｎ等、国際公開ＰＣＴ番号ＷＯ９３／１５１８７；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許第５，３３４，７１１号ａｎｄ  Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等、１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２５７０２；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２６２７０；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等、米国特許第５，７１６，８２４号；Ｕｓｍａｎ等、米国特許第５，６２７，０５３号；Ｗｏｏｌｆ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／１３５２６；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９９８年４月２０日出願のＵＳＳＮ６０／０８２，４０４；Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ等、１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３９，１１３１；Ｅａｒｎｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｇａｉｔ，１９９８，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），４８，３９−５５；Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７，９９−１３４；およびＢｕｒｌｉｎａ等、１９９７，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５，１９９９−２０１０参照；参考文献全ては参照により全体が本明細書に組み込まれる）。このような公開文献は触媒をモジュレートすることのない核酸分子内への糖、塩基および／またはホスフェートの修飾の導入の位置を決定するための一般的な方法および方策を説明しており、参照により本明細書に組み込まれる。そのような教示に鑑みて、細胞におけるＲＮＡｉを促進するｓｉＮＡの能力が大きく阻害されない限り、同様な修飾を本発明のｓｉＮＡ核酸分子を修飾するために本明細書に記載する通り使用できる。
【０５３４】
１つの実施形態において、本発明の核酸分子は参照により全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２００５００２０５２１に記載される通り化学修飾される。
【０５３５】
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよび／または５’−メチルホスホネート連結によるオリゴヌクレオチドヌクレオチド間連結部の化学修飾は安定性を向上させるが、過剰な修飾は何らかの毒性または低下した活性をもたらす場合がある。従って、核酸分子を設計する場合は、これらのヌクレオチド間連結部の量は最小限にしなければならない。これらの連結部の濃度の低減は、毒性を低下させるはずであり、これらの分子の増大した薬効およびより高い特異性をもたらす。
【０５３６】
活性を維持するか増強する化学修飾を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。そのような核酸はまた、一般的に、未修飾の核酸よりもヌクレアーゼに対してより耐性である。従って、インビトロおよび／またはインビボの活性は顕著には低下しないはずである。モジュレーションが目的である場合、外因性に送達された治療用の核酸分子は、最適には、望ましくないタンパク質のレベルを低下させるために十分長く標的ＲＮＡの翻訳がモジュレートされるまで、細胞内部で安定でなければならない。この時間は疾患の状況に応じて数時間〜数日間に変動する。ＲＮＡおよびＤＮＡの化学合成の向上（Ｗｉｎｃｏｔｔ等、１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ等、１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１，３−１９（参照により本明細書に組み込まれる））は本明細書に記載する通りそれ自体のヌクレアーゼ安定性を増強するヌクレオチド修飾の導入により核酸分子を修飾する能力を増大させている。
【０５３７】
１つの実施形態において、本発明の核酸分子は１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＧクランプヌクレオチドを含む。Ｇクランプヌクレオチドは修飾されたシトシン類縁体であり、ここで修飾はデュプレックス内の相補グアニンのワトソンクリックとフーグスティーン面の両方を水素結合する能力を付与し、例えばＬｉｎ  ａｎｄ  Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，１９９８，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０，８５３１−８５３２を参照できる。オリゴヌクレオチド内部の単一のＧクランプ類縁体の置換は、相補オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした場合に、実質的に増強されたヘリックスの熱安定性およびミスマッチの判別をもたらすことができる。本発明の核酸分子におけるそのようなヌクレオチドの取り込みは増強された親和性および核酸標的、相補配列または鋳型鎖への特異性の両方をもたらす。別の実施形態においては、本発明の核酸分子は１つ以上（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＬＮＡ、即ち「ロックド核酸」ヌクレオチド、例えば２’，４’−Ｃメチレンビシクロヌクレオチドを含む（例えばＷｅｎｇｅｌ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／６６６０４およびＷＯ９９／１４２２６を参照）。
【０５３８】
別の実施形態においては、本発明は本発明のｓｉＮＡ分子のコンジュゲートおよび／または複合体を特徴とする。そのようなコンジュゲートおよび／または複合体は細胞等の生物学的系内へのｓｉＮＡ分子の送達を促進するために使用できる。本発明により提供されるコンジュゲートおよび複合体は、細胞膜を通過して治療化合物を移行させること、薬物動態を改変すること、および／または、本発明の核酸分子の局在化をモジュレートすることにより、治療活性を付与することができる。本発明は、細胞膜を通過する、小分子、脂質、コレステロール、リン脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、抗体、毒素、負荷電重合体および他の重合体、例えばタンパク質、ペプチド、ホルモン、炭水化物、ポリエチレングリコール、またはポリアミンを含むがこれらに限定されない、分子の送達のための新しいコンジュゲートおよび複合体の設計および合成を含む。一般的に、記載したトランスポーターは、単独で、または多成分系の部分として、分解可能なリンカーを伴うか伴うことなく使用されるように設計される。これらの化合物は血清の存在下または非存在下、異なる組織を起源とする多くの細胞型内への本発明の核酸分子の送達および／または局在化を向上させることが期待される（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｃｅｃｈの米国特許第５，８５４，０３８号参照）。本明細書に記載した分子のコンジュゲートは生体分解性であるリンカー、例えば生体分解性核酸リンカー分子であるリンカーを介して生物学的に活性な分子に結合させることができる。
【０５３９】
「生体分解性のリンカー」という用語は、本明細書において使用する場合、１つの分子を別の分子に、例えば生物学的に活性な分子を本発明のｓｉＮＡ分子または本発明のｓｉＮＡ分子のセンスおよびアンチセンス鎖に、結合させる生体分解性リンカーとして設計される核酸または非核酸のリンカー分子を指す。生体分解性リンカーは、特定の組織または細胞の型への送達のような、特定の目的のためにそれ自体の安定性がモジュレートされることができるように設計される。核酸系生体分解性リンカー分子の安定性は種々の化学特徴、例えばリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、および化学修飾されたヌクレオチド、例えば２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−Ｏ−アリル、および他の２’−修飾された、または塩基修飾されたヌクレオチドの組み合わせを使用することによりモジュレートできる。生体分解性核酸リンカー分子は２量体、３量体、４量体、またはより長い核酸分子、例えば約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであることができ、或いは、リン系の連結部、例えばホスホロアミデートまたはホスホジエステル連結部を有する単一のヌクレオチドを含むことができる。生体分解性核酸リンカー分子はまた、核酸骨格、核酸糖、または核酸塩基の修飾を含むことができる。
【０５４０】
「生体分解性」という用語は本明細書において使用する場合、生物学的な系における分解、例えば酵素的分解または化学分解を指す。
【０５４１】
「生物学的に活性な分子」という用語は本明細書において使用する場合、系における生物学的応答を誘発または修飾することができる化合物または分子を指す。本発明により意図される単独または他の分子との組み合わせのいずれかにおいて生物学的に活性なｓｉＮＡ分子の非限定的な例は、治療活性分子、例えば抗体、コレステロール、ホルモン、抗ウィルス剤、ペプチド、タンパク質、化学療法剤、小分子、ビタミン、コファクター、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素核酸、アンチセンス核酸、トリプレックス形成オリゴヌクレオチド、２，５−Ａキメラ、ｓｉＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アロザイム、アプタマー、デコイおよびこれらの類縁体を含む。本発明の生物学的に活性な分子はまた、他の生物学的に活性な分子、例えば脂質および重合体、例えばポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコールおよび他のポリエーテルの薬物動態および／または薬力学をモジュレートすることができる分子を含む。
【０５４２】
「リン脂質」という用語は本明細書において使用する場合、リン基少なくとも１つを含む疎水性の分子を指す。例えばリン脂質はリン含有基および場合によりＯＨ、ＣＯＯＨ、オキソ、アミン、または置換または未置換のアリール基で置換された、飽和または不飽和のアルキル基を含むことができる。
【０５４３】
最適には外因性に送達される治療用の核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、ＲＮＡ転写物のレベルを低下するために十分長くＲＮＡの逆転写がモジュレートされるまで、細胞内部において安定である。核酸分子は効果的な細胞内治療剤として機能するためにはヌクレアーゼに対して耐性である。本発明に記載した、当分野における核酸分子の化学合成における向上点は、上記の通りそれらのヌクレアーゼ安定性を増強するためにヌクレオチド修飾を導入することにより核酸分子を修飾する能力を拡張している。
【０５４４】
更に別の実施形態において、ＲＮＡｉに関与しているタンパク質の酵素活性を維持または増強する化学修飾を有するｓｉＮＡ分子が提供される。そのような核酸はまた一般的に、未修飾の核酸よりもヌクレアーゼに対してより耐性である。即ち、インビトロおよび／またはインビボの活性は顕著には低下しないはずである。
【０５４５】
本発明の核酸系分子の使用は複合療法の可能性を与えることにより、より良好な治療をもたらす（例えば異なる遺伝子に対してターゲティングされた多数のｓｉＮＡ分子；既知の小型分子モジュレーターとカップリングされた核酸分子；または異なるモチーフおよび／または他の化学的または生物学的な分子を含む分子の組み合わせを用いた間欠的治療）。ｓｉＮＡ分子による対象の治療はまた、酵素性の核酸分子（リボザイム）、アロザイム、アンチセンス、２，５−Ａオリゴアデニレート、デコイ、またはアプタマー等の核酸分子の異なる型の組み合わせを含むことができる。
【０５４６】
別の態様において、本発明のｓｉＮＡ分子は１つ以上の５’および／または３’キャップ構造を、例えば唯一センスｓｉＮＡ鎖、アンチセンスｓｉＮＡ鎖、または両方のｓｉＮＡ鎖の上に含む。
【０５４７】
「キャップ構造」とはオリゴヌクレオチドのいずれかの末端に取り込まれている化学修飾を意味する（例えば参照により本明細書に組み込まれるＡｄａｍｉｃ等の米国特許第５，９９８，２０３号参照）。これらの末端修飾はエキソヌクレアーゼ分解から核酸分子を保護し、細胞内部への送達および／または局在化を支援できる。キャップは５’末端（５’キャップ）に、または３’末端（３’キャップ）に存在でき、または、両方の末端上に存在できる。非限定的な例においては、５’キャップは、グリセリル、反転デオキシ無塩基残基（部分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；ｌ−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド；炭素環ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート連結部；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，３’−３’−反転ヌクレオチド部分；３’−３’−反転無塩基部分；３’−２’−反転ヌクレオチド部分；３’−２’−反転無塩基部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；３’−ホスホロアミデート；ヘキシルホスフェート；アミノヘキシルホスフェート；３’−ホスフェート；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；または架橋または非架橋メチルホスホネート部分を含むがこれらに限定されない。キャップ部分の非限定的な例を図１０に示す。
【０５４８】
３’キャップの非限定的な例は、グリセリル、反転デオキシ無塩基残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド；ｌ−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルホスフェート；ｌ，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート；３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１，２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−反転ヌクレオチド部分；５’−５’−反転無塩基部分；５’−ホスホロアミデート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールホスフェート；５’−アミノ；架橋および／または非架橋５’−ホスホロアミデート、ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート、架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト部分を含むがこれらに限定されない（更に詳細には参照により本明細書に組み込まれるＢｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９，１９２５を参照できる）。
【０５４９】
「非ヌクレオチド」という用語は、糖および／またはホスフェートのいずれかの置換を含むヌクレオチド単位１つ以上の代わりに核酸鎖内に取り込まれることができ、残余の塩基はそれらの酵素活性を呈することができるようにする、いずれかの基または化合物を意味する。基または化合物は、それが一般的に認識されるヌクレオチド塩基、例えばアデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンを含有せず、そのため１’位において塩基を欠いている点において、無塩基である。
【０５５０】
「アルキル」基は直鎖、分枝鎖、および環状のアルキル基を含む飽和の脂肪族炭化水素を指す。好ましくはアルキル基は１〜１２の炭素を有する。より好ましくは、これは１〜７炭素、より好ましくは１〜４炭素の低級アルキルである。アルキル基は置換または未置換であることができる。置換されている場合は、置換基は好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ２またはＮ（ＣＨ３）２、アミノ、またはＳＨである。用語はまた、直鎖、分枝鎖、および環状の基を含む、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する不飽和の炭化水素基であるアルケニル基を含む。好ましくは、アルケニル基は１〜１２炭素を有する。より好ましくは、これは１〜７炭素、より好ましくは１〜４炭素の低級アルケニルである。アルケニル基は置換または未置換であることができる。置換されている場合は、置換基は好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ２、ハロゲン、Ｎ（ＣＨ３）２、アミノ、またはＳＨである。「アルキル」という用語はまた、直鎖、分枝鎖、および環状の基を含む、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する不飽和の炭化水素基であるアルキニル基を含む。好ましくは、アルキニル基は１〜１２炭素を有する。より好ましくは、これは１〜７炭素、より好ましくは１〜４炭素の低級アルキニルである。アルキニル基は置換または未置換であることができる。置換されている場合は、置換基は好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ２またはＮ（ＣＨ３）２、アミノ、またはＳＨである。
【０５５１】
そのようなアルキル基はまた、アリール、アルキルアリール、炭素環アリール、複素環アリール、アミドおよびエステル基を含むことができる。「アリール」基は共役パイ電子系を有する環少なくとも１つを有する芳香族基を指し、炭素環アリール、ヘテロ環アリールおよびビアリール基を含み、これらは全て場合により置換されることができる。アリール基の好ましい置換基はハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシル、ＳＨ、ＯＨ、シアノ、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアミノ基である。「アルキルアリール」基はアリール基（上記）に共有結合されたアルキル基（上記）を指す。炭素環アリール基は芳香族環上の環原子が全て炭素原子である基である。炭素原子は場合により置換されている。ヘテロ環アリール基は芳香族環中の環原子として１〜３ヘテロ原子を有する基であり、環原子の残余は炭素原子である。適当なヘテロ原子は酸素、イオウ、および窒素を含み、フラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−低級アルキルピロロ、ピリミジル、ピラジニル、イミダゾリル等を含み、全て場合により置換されている。「アミド」とは−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒを指し、ここでＲはアルキル、アリール、アルキルアリールまたは水素のいずれかである。「エステル」とは−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ’を指し、ここでＲはアルキル、アリール、アルキルアリールまたは水素のいずれかである。
【０５５２】
「ヌクレオチド」とは本明細書において使用する場合、当分野で認識されている通り、天然の塩基（標準）および当分野で周知の修飾された塩基を含む。そのような塩基は一般的にはヌクレオチド糖部分の１位に位置する。ヌクレオチドは一般的に塩基、糖およびホスフェート基を含む。ヌクレオチドは未修飾であるか、または糖、ホスフェートおよび／または塩基の部分で修飾されることができる（互換的な別称として、ヌクレオチド類縁体、修飾されたヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチド等、例えばＵｓｍａｎ  ａｎｄ  ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ、上出；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０７０６５；Ｕｓｍａｎ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／１５１８７；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，上出を参照でき、全て参照により本明細書に組み込まれる）。Ｌｉｍｂａｃｈ等、１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，２１８３に総括される通り当分野で知られた修飾された核酸塩基の数例が存在する。核酸分子内に導入できる塩基修飾の非限定的な例はイノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えばリボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば６−メチルウリジン）、プロピン等を含む（Ｂｕｒｇｉｎ等、１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，上出）。「修飾された塩基」とは、この態様においては、１位のアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基またはその等価物を意味する。
【０５５３】
１つの実施形態において、本発明は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデートカーバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタールおよび／またはアルキルシリル置換１つ以上を含むホスフェート骨格修飾を有する修飾されたｓｉＮＡ分子を特徴とする。オリゴヌクレオチド骨格修飾の考察のためには、Ｈｕｎｚｉｋｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｕｍａｎｎ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１−４１７およびＭｅｓｍａｅｋｅｒ等、１９９４，Ｎｏｖｅｌ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，２４−３９を参照できる。
【０５５４】
「無塩基」とは糖部分の１’位において、核酸塩基を欠いているか、または核酸塩基の代わりに水素原子（Ｈ）または他の非核酸塩基の化学基を有する糖部分を意味し、例えばＡｄａｍｉｃ等の米国特許第５，９９８，２０３号を参照できる。１つの実施形態において、本発明の無塩基部分はリボース、デオキシリボース、またはジデオキシリボース糖である。
【０５５５】
「未修飾ヌクレオシド」とは、β−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素に連結された塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシルの１つを意味する。
【０５５６】
「修飾されたヌクレオシド」とは未修飾のヌクレオチド塩基、糖および／またはホスフェートの化学構造中に修飾を含有するいずれかのヌクレオチド塩基を意味する。修飾されたヌクレオチドの非限定的な例は図Ｉ〜ＶＩＩに示し、および／または本明細書に記載した他の修飾である。
【０５５７】
本発明のために記載した２’修飾ヌクレオチドに関連して、「アミノ」とは２’−ＮＨ２または２’−Ｏ−ＮＨ２を意味し、これは修飾されているか未修飾であることができる。そのような修飾された基は例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれるＥｃｋｓｔｅｉｎ等の米国特許第５，６７２，６９５号およびＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ等の米国特許第６，２４８，８７８号に記載されている。
【０５５８】
核酸ｓｉＮＡ構造に対する種々の修飾は、これらの分子の利用性を増強するために行うことができる。そのような修飾はシェルフライフ、インビトロの半減期、安定性および例えば細胞膜の貫通を増強し、標的細胞を認識してそれと結合する能力を付与するための標的部位へのそのようなオリゴヌクレオチドの導入の容易性を増強する。
核酸分子の投与
【０５５９】
本発明のｓｉＮＡ分子は、単独または他の治療薬と組み合わせて、呼吸器、炎症性、自己免疫疾患、体質、状態、および表現型および／または細胞または組織においてＥＮａＣ標的またはＥＮａＣ経路標的のレベルに関連するか、それに応答するいずれかの他の体質、疾患、状態または表現型を治療、防止、抑制、または低減するための使用に適合できる。１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は本明細書に記載する通り、一般的に当分野で知られる通り、肺に投与される。１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は本明細書に記載する通り、一般的に当分野で知られる通り、細胞、対象、または生物に投与される。
【０５６０】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ組成物は対象への投与のためのリポソームを含む送達ビヒクル、担体および希釈剤およびそれらの塩を含むことができ、および／または製薬上許容し得る製剤において存在できる。核酸分子の送達のための方法はＡｋｈｔａｒ等、１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，２，１３９；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ａｋｈｔａｒ編，１９９５，Ｍａｕｒｅｒ等、１９９９，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１６，１２９−１４０；Ｈｏｆｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，１９９９，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３７，１６５−１９２；およびＬｅｅ等、２０００，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，７５２，１８４−１９２に記載されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等の米国特許第６，３９５，７１３号およびＳｕｌｌｉｖａｎ等のＰＣＴ  ＷＯ９４／０２５９５は更に核酸分子の送達のための一般的な方法を記載している。これらのプロトコルは実質的にいかなる核酸分子の送達のためにも利用できる。核酸分子は、限定しないが例えば、リポソーム内へのカプセル化を含む当分野で知られた種々の方法により、イオントフォレシスにより、または他のビヒクル、例えば生体分解性重合体、ヒドロゲル、シクロデキストリン（例えばＧｏｎｚａｌｅｚ等、１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１０，１０６８−１０７４；Ｗａｎｇ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／４７５１８およびＷＯ０３／４６１８５参照）、ポリ（ラクティックコグリコール）酸（ＰＬＧＡ）およびＰＬＧＡ微小球（例えば米国特許第６，４４７，７９６号および米国特許出願公開番号ＵＳ２００２１３０４３０参照）、生体分解性ナノカプセル、および生物接着性微小球への取り込みによるか、またはタンパク質性のベクターにより（Ｏ’Ｈａｒｅ  ａｎｄ  Ｎｏｒｍａｎｄ、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／５３７２２）細胞に投与できる。別の実施形態においては、本発明の核酸分子はポリエチレンイミンおよびその誘導体、例えばポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）またはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）誘導体を用いて製剤化または複合体化することもできる。１つの実施形態において、本発明の核酸分子は参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開番号２００３００７７８２９に記載される通り製剤化される。
【０５６１】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、全て参照により全体が本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６０／６７８，５３１号、および関連の２００５年７月２９日出願の米国仮特許出願第６０／７０３，９４６号、２００５年１１月１５日出願の米国仮特許出願第６０／７３７，０２４号、２００６年２月１４日出願のＵＳＳＮ１１／３５３，６３０、および２００６年１０月２４日出願のＵＳＳＮ１１／５８６，１０２（Ｖａｒｇｅｅｓｅ等）に記載の組成物として製剤化される。このようなｓｉＮＡ製剤は一般的に「脂質核酸粒子」（ＬＮＰ）と称される。１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は表１０において本明細書に記載したＬＮＰ組成物１つ以上を用いて製剤化される（上記ＵＳＳＮ１１／３５３，６３０参照）。
【０５６２】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤および組成物はＵＳ２００６／００６２７５８；ＵＳ２００６／００１４２８９；およびＵＳ２００４／００７７５４０に記載の通り肺の組織および細胞に投与される。
【０５６３】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は図面を含めて参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開番号２００１０００７６６６に記載のもの等の膜破壊剤と複合化される。別の実施形態においては、膜破壊剤およびｓｉＮＡ分子はまた、カチオン性の脂質またはヘルパー脂質分子、例えば図面を含めて参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，２３５，３１０号に記載のものと複合化される。
【０５６４】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は図面を含めて参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３０７７８２９号および国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／０３６８３および、ＷＯ０２／０８７５４１に記載の送達系と複合体化される。
【０５６５】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は図面を含めて参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開番号ＵＳ−２００５０２８７５５１、ＵＳ−２００５０１６４２２０、ＵＳ−２００５０１９１６２７、ＵＳ−２００５０１１８５９４、ＵＳ−２００５０１５３９１９、ＵＳ−２００５００８５４８６および、ＵＳ−２００３０１５８１３３に一般的に記載される送達系と複合体化される。
【０５６６】
１つの実施形態において、本発明の核酸分子は、アテロコラーゲン複合体系性またはコンジュゲーションを介して骨格組織（例えば骨、軟骨、腱、靭帯）または骨転移腫瘍に投与される（例えばＴａｋｅｓｈｉｔａ等、２００５，ＰＮＡＳ，１０２，１２１７７−１２１８２参照）。従って、１つの実施形態において、本発明はアテロコラーゲンと複合体化された組成物としてのｄｓｉＮＡ分子１つ以上を特徴とする。別の実施形態においては、本発明は、本明細書に記載する、または別様に当分野で知られたリンカーを介してアテロコラーゲンにコンジュゲートされたｓｉＮＡ分子１つ以上を特徴とする。
【０５６７】
１つの実施形態において、本発明の核酸分子およびその製剤（例えば本発明の２本鎖核酸分子のＬＮＰ製剤）は肺送達を介して、例えば、該当する肺組織内への核酸分子の迅速な局所取り込みを可能にする吸入装置またはネブライザーにより投与されるエアロゾルまたはスプレードライ製剤の吸入により、投与される。ミクロ化された核酸組成物の吸入可能な乾燥粒子を含有する固体粒状組成物は、乾燥または凍結乾燥された核酸組成物を粉砕し、次にミクロ化された組成物を例えば４００メッシュスクリーンに通すことにより大型の凝集塊を破壊または分離することにより調製できる。本発明の核酸組成物を含む固体粒子組成物は場合によりエアロゾル並びに他の治療用化合物の製剤を促進する作用を有する分散剤を含有できる。適当な分散剤は乳糖であり、これをいずれかの適当な比、例えば１対１の重量比において核酸化合物とブレンドすることができる。
【０５６８】
本発明の核酸組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を含む液体または非液体の粒子のエアロゾルはいずれかの適当な手段により、例えばネブライザーを含む装置を用いて製造できる（例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，５０１，７２９号参照）。１つの実施形態において、本発明のネブライザー装置は、全年齢の意識のある自発呼吸をしている対象に対する、および調節換気を受けている対象に対する適用において使用される。本発明のネブライザー装置は肺へのターゲティングされた局所および全身への薬物送達のために使用できる。１つの実施形態において、ネブライザーを含む装置は肺または肺組織に局所的に本発明の組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を送達するために使用される。１つの実施形態において、ネブライザーを含む装置は本発明の組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を全身送達するために使用される。本発明のネブライザーを含む装置を用いながら治療または管理できる疾患および状態の非限定的な例は、喘息、気管支炎、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、気腫、呼吸器シンシチウムウィルス、インフルエンザウィルス、およびその他の気道または肺の疾患および感染症を含む。本発明のネブライザー装置は種々のクラスの薬品およびその組み合わせ、限定しないが例えば、ｓｉＮＡ組成物および／またはそのＬＮＰ製剤、抗ヒスタミン、抗感染剤、抗ウィルス剤、抗細菌剤、血液モディファイアー、心臓血管剤、鬱血除去剤、診断薬、免疫抑制剤、肥満細胞安定化剤、抗炎症剤、呼吸器用薬剤、皮膚および粘膜の薬剤およびその他のクラスを送達するために使用できる。１つの実施形態において、本発明のネブライザー装置はタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、プラスミド、および小分子（即ちインターロイキン、ＤＮａｓｅ、アンチセンスＲＮＡ、ストレプトコッカスＢポリペプチドおよびＨＩＶインテグラーゼ）の効果的な送達のために使用される。別の実施形態においては、本発明のネブライザー装置は少なくとも１つの活性剤のエマルジョン、マイクロエマルジョン、またはサブミクロンおよびナノ粒子の懸濁剤を含む呼吸器用分散体を送達するために使用される。共に参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７１２８，８９７号および７，０９０，８３０Ｂ２号を参照できる。
【０５６９】
本発明の組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を含む液体または非液体のエアロゾルの送達は超音波またはエアジェットのネブライザー等のいずれかの適当な装置を用いながら達成できる。１つの実施形態において、ネブライザーを含む装置は医薬品のエアロゾルの霧状物を発生させる本発明の組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を機械的に攪拌する高エネルギーの超音波を発生させるための圧電セラミック振動装置を駆動するために振動シグナルを用いる（例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，１２９，６１９Ｂ２号および７，１３１，４３９Ｂ２号参照）。別の実施形態においては、ネブライザーを含む装置はエアロゾル霧状物中に液滴を形成するために本発明の組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）との圧縮空気のエアジェット混合を用いる。
【０５７０】
ネブライザー装置は連続的または周期的に本発明の組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を含むエアロゾルを投与するために使用でき、手動、自動、または患者の呼吸と協調して調節することができる（米国特許第３，８１２，８５４号、ＷＯ９２／１１０５０参照）。１つの実施形態において、ネブライザーを含む装置はマイクロチャンネル押し出しチャンバーまたは周期的加圧単回ボーラスにより本発明の組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を周期的に投与できる。別の実施形態においては、ネブライザーを含む装置は本発明の組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を含む懸濁剤エアロゾルを連続投与するために使用できる。
【０５７１】
本発明のネブライザー装置は、本発明の組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を含む担体、典型的には水、または希薄な水性または非水性の溶液を使用できる。１つの実施形態において、ネブライザーを含む装置は本発明の組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を含む、好ましくは例えば塩化ナトリウムまたは他の適当な塩の添加により体液と等張にされた、アルコール溶液を使用する。別の実施形態においては、本発明のネブライザー装置は本発明の組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を含む非水性のフッ素化合物担体を使用する。ネブライザーを含む装置は担体製剤の約０．００１％〜９０％ｗ／ｗの量において本発明の組成物を送達できる。１つの実施形態において、ネブライザーを含む装置は、製剤の４０％ｗ／ｗまで、好ましくは２０％ｗ／ｗ未満の量で液体担体中本発明の組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を含む適当な製剤を使用する。別の実施形態においては、ネブライザーを含む装置は非液体の粒状のサブミクロンおよび／またはナノ粒子の重量と相対比較して僅か０．００１％〜９０％ｗ／ｗの本発明の組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を含む安定化された非液体の粒状のサブミクロンのナノ粒子の懸濁液を使用する（米国特許第６，９４６，１１７Ｂ１号参照）。
【０５７２】
エアロゾル製剤は、製剤が滅菌状態で調製されていない場合、保存料を含む任意の添加剤を含むことができる。非限定的な例は、ヒドロキシ安息香酸メチル、抗酸化剤、着香剤、揮発性油脂、緩衝剤および乳化剤およびその他の製剤界面活性剤を含む。１つの実施形態において、フルオロカーボンまたはパーフルオロカーボンの担体を使用することにより分解を低減し、より安全な生体適合性の非液体粒状懸濁剤の本発明の組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を提供する。別の実施形態においては、ネブライザーを含む装置は、静菌性のフッ素化合物を含むことにより圧縮装置内の微生物の生育の危険性を低下させた本発明の組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を送達する。
【０５７３】
活性組成物および界面活性剤を含む固体粒子のエアロゾルも同様にいずれかの固体粒状エアロゾル発生器を用いて製造できる。１つの実施形態において、対象に固体粒状薬剤を投与するためのエアロゾル発生器は上記した通り吸入可能な粒子を形成し、組成物の所定の計量された用量を含有するエアロゾルの容量を発生させる。別の実施形態においては、エアロゾルは、呼吸器用ブレンド物を与えるための所定の容量の懸濁媒体または界面活性剤と共に本発明の組成物（例えばｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）少なくとも１つを含む粒子の組み合わせを含む。
【０５７４】
１つの実施形態において、本発明の固体粒状エアロゾル発生器は注入器である。通気法により投与するための適当な製剤は注入器により送達できる微粉砕粉末を含む。注入器においては、粉末、例えば本明細書に記載する治療を実施するために有効なその計量された用量を、典型的にはゼラチンまたはプラスチックで形成されたカプセルまたはカートリッジ中に含有させ、これはインサイチュで穿刺または開封され、粉末は、吸入時に装置を通過して引き込まれる空気により、または手動ポンプを用いることにより、送達される。注入器において使用される粉末は活性成分のみ、または、活性成分、適当な粉末希釈剤、例えば乳糖、および任意の界面活性剤を含む粉末ブレンド物からなる。活性成分は典型的には製剤の０．１〜１００ｗ／ｗを構成する。第２の型の代表的なエアロゾル発生器は計量用量吸入器を含む。計量用量吸入器は典型的には液化高圧ガス中に活性成分の懸濁液または溶液の製剤を含有している加圧されたエアロゾル分注器である。使用時に、これらの装置は計量された容量を送達するように調整された弁を通して製剤を放出することにより、活性成分を含有する微細粒子スプレーを与える。適当な高圧ガスは特定のクロロフルオロカーボン化合物、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンおよびこれらの混合物を含む。製剤は更に１つ以上の共溶媒、例えばエタノール、乳化剤および他の製剤界面活性剤、例えばオレイン酸またはソルビタントリオレエート、抗酸化剤および適当な着香剤を含有できる。肺送達のための他の方法は例えば全て参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００４００３７７８０号、および米国特許第６，５９２，９０４号；６，５８２，７２８号；６，５６５，８８５号に記載されている。
【０５７５】
１つの実施形態において、肺送達における使用のために本明細書において提供されるｓｉＮＡおよびＬＮＰ組成物および製剤は、更に界面活性剤１つ以上を含む。本発明の組成物の取り込みを増強するための適当な界面活性剤または界面活性剤成分は、合成および天然、並びに完全またはトランケーションされた型の界面活性剤タンパク質Ａ、界面活性剤タンパク質Ｂ、界面活性剤タンパク質Ｃ、界面活性剤タンパク質Ｄおよび界面活性剤タンパク質Ｅ、ジ飽和ホスファチジルコリン（ジパルミトイル以外）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン；ホスファチジン酸、ユビキノン、リソホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルコリン、パルミトイルリソホスファチジルコリン、デヒドロエピアンドロステロン、ドリコール、スルファチジン酸、グリセロール−３−ホスフェート、ジヒドロキシアセトンホスフェート、グリセロール、グリセロ−３−ホスホコリン、ジヒドロキシアセトン、パルミテート、シチジンジホスフェート（ＣＤＰ）ジアシルグリセロール、ＣＤＰコリン、コリン、コリンホスフェート；並びに界面活性剤の成分のための天然の担体ビヒクルである天然および人工のラメラ体、ω−３脂肪酸、ポリエン酸、ポリエン酸、レシチン、パルミチン酸、エチレンまたはプロピレンオキシドの非イオン系ブロック共重合体、ポリオキシプロピレンの単量体または多量体、ポリオキシエチレンの単量体または多量体、デキストランおよび／またはアルカノイルの側鎖を有するポリ（ビニルアミン）、Ｂｒｉｊ３５、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および合成界面活性剤ＡＬＥＣ、Ｅｘｏｓｕｒｆ、ＳｕｒｖａｎおよびＡｔｏｖａｑｕｏｎｅ等を含む。これらの界面活性剤は製剤中単独または多数成分の界面活性剤の一部として、または本明細書に記載する医薬組成物の核酸成分の５’および／または３’末端への共有結合した付加物として使用できる。
【０５７６】
本発明の組成物は、吸入可能な大きさの粒子、例えば吸入時に鼻、口および喉頭を通過、および気管支および肺胞を通過するために十分小型の粒子を含む製剤として呼吸器系内に投与できる。一般的に吸入可能な粒子は約０．５〜１０ミクロンの大きさの範囲である。エアロゾル中に含まれる非吸入可能な大きさの粒子は喉に付着して嚥下される傾向を有し、これによりエアロゾル中の非吸入粒子の量は最小限にされる。鼻投与のためには、１０〜５００ｕｍの範囲の粒径が、鼻腔中保持を確保するためには好ましい。
【０５７７】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は一般的に当分野で知られる通り肝臓に投与してよい（例えばＷｅｎ等、２００４，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１０，２４４−９；Ｍｕｒａｏ等、２００２，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．，１９，１８０８−１４；Ｌｉｕ等、２００３，ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１０，１８０−７；Ｈｏｎｇ等、２００３，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５４，５１−８；Ｈｅｒｒｍａｎｎ等、２００４，Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．，１４９，１６１１−７；およびＭａｔｓｕｎｏ等、２００３，ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１０，１５５９−６６を参照）。
【０５７８】
１つの実施形態において、本発明は単球およびリンパ球を含む造血細胞に本発明の核酸分子を送達するための方法の使用を特徴とする。これらの方法はＨａｒｔｍａｎｎ等、１９９８，Ｊ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８５（２），９２０−９２８；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔ等、１９９８，Ｂｌｏｏｄ，９１（３），８５２−８６２；Ｆｉｌｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，１９９７，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３２９（２），３４５−３５６；Ｍａ  ａｎｄ  Ｗｅｉ，１９９６，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．，２０（１１／１２），９２５−９３０；およびＢｏｎｇａｒｔｚ等、１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２），４６８１−８に詳細に記載されている。そのような方法は、上記した通り、オリゴヌクレオチドによる造血細胞のトランスフェクションのための、遊離のオリゴヌクレオチド、カチオン性脂質製剤、リポソーム製剤、例えばｐＨ感受性リポソームおよびイムノリポソーム、およびバイオコンジュゲート、例えば融合性ペプチドにコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの使用を含む。
【０５７９】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は一般的に当分野で知られる通り真皮または小胞に直接または局所（例えば局部）投与される（例えばＢｒａｎｄ，２００１，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，３，２４４−８；Ｒｅｇｎｉｅｒ等、１９９８，Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，５，２７５−８９；Ｋａｎｉｋｋａｎｎａｎ，２００２，ＢｉｏＤｒｕｇｓ，１６，３３９−４７；Ｗｒａｉｇｈｔ等、２００１，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，９０，８９−１０４；およびＰｒｅａｔ  ａｎｄ  Ｄｕｊａｒｄｉｎ，２００１，ＳＴＰ  ＰｈａｒｍａＳｃｉｅｎｃｅｓ，１１，５７−６８を参照）。１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は、アルコール（例えばエタノールまたはイソプロパノール）、水を含み、場合により追加的な剤、例えばイソプロピルミリステートおよびカルボマー９８０を含む水アルコールゲル製剤を用いながら直接または局所的に投与される。
【０５８０】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子はイオントフォレシスにより、例えば特定の臓器またはコンパートメント（例えば眼、眼の後方、心臓、肝臓、腎臓、膀胱、前立腺、腫瘍、ＣＮＳ等）に投与される。イオントフォレシス送達の非限定的な例は例えば参照により全体が本明細書に組み込まれるＷＯ０３／０４３６８９およびＷＯ０３／０３０９８９に記載されている。
【０５８１】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ化合物および組成物は、単独で、または本明細書に記載した他の化合物および／または治療と組み合わせて、約１〜５０週毎（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０週毎）、全身または局所投与される。１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ化合物および組成物は、単独で、または本明細書に記載した、および／または別様に当分野で知られた他の化合物および／または治療と組み合わせて、約１〜５０週毎（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０週毎）、全身投与される（例えば静脈内、皮下、筋肉内、注入、ポンプ、インプラント等）。
【０５８２】
１つの実施形態において、本発明の送達系は、例えば水性および非水性のゲル、クリーム、多重エマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性および非水性の溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素基剤および粉末を含み、賦形剤、例えば可溶化剤、透過性増強剤（例えば脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪族アルコールおよびアミノ酸）、および親水性重合体（例えばポリカーボフィルおよびポリビニルピロリドン）を含有できる。１つの実施形態において、製薬上許容し得る担体はリポソームまたは経皮増強剤である。本発明で使用できるリポソームの例は、以下のもの、即ち：（１）ＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎ、即ちカチオン性脂質Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラメチル−Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラパルミト−ｙ−スペルミンおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１．５（Ｍ／Ｍ）リポソーム製剤（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）；（２）Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ  ＧＳＶ、即ちカチオン性脂質とＤＯＰＥの２：１（Ｍ／Ｍ）リポソーム製剤（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）；（３）ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［ｌ−（２，３−ジオレオイルオキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ−メチル−アンモニウムメチルスルフェート）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）；および（４）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、即ちポリカチオン性脂質ＤＯＳＰＡと中性脂質ＤＯＰＥの３：１（Ｍ／Ｍ）リポソーム製剤（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を含む。
【０５８３】
１つの実施形態において、本発明の送達系はパッチ、錠剤、座剤、ペサリー剤、ゲルおよびクリームを含み、賦形剤、例えば可溶化剤および増強剤（例えばポリエチレングリコール、胆汁酸塩およびアミノ酸）、および他のビヒクル（例えばポリエチレングリコール、脂肪酸エステルおよび誘導体、および親水性重合体、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒアルロン酸）を含有できる。
【０５８４】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子はポリエチレンイミン（例えば直鎖または分枝鎖のＰＥＩ）および／またはポリエチレンイミン誘導体、例えばグラフト化ＰＥＩ、例えばガラクトースＰＥＩ、コレステロールＰＥＩ、抗体誘導ＰＥＩ、およびそれらのポリエチレングリコールＰＥＩ（ＰＥＧ−ＰＥＩ）誘導体と製剤化または複合体化される（例えば参照により本明細書に組み込まれるＯｇｒｉｓ等、２００１，ＡＡＰＡ  ＰｈａｒｍＳｃｉ，３，１−１１；Ｆｕｒｇｅｓｏｎ等、２００３，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１４，８４０−８４７；Ｋｕｎａｔｈ等、２００２，Ｐｈｒａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９，８１０−８１７；Ｃｈｏｉ等、２００１，Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２２，４６−５２；Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ等、１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１０，５５８−５６１；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ等、２００２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１３，８４５−８５４；Ｅｒｂａｃｈｅｒ等、１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔ，１，１−１８；Ｇｏｄｂｅｙ等、１９９９．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９６，５１７７−５１８１；Ｇｏｄｂｅｙ等、１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，６０，１４９−１６０；Ｄｉｅｂｏｌｄ等、１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４，１９０８７−１９０９４；Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｋｌｉｂａｎｏｖ，２００２，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９９，１４６４０−１４６４５；およびＳａｇａｒａ，米国特許第６，５８６，５２４号参照）。
【０５８５】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は全て参照により本明細書に組み込まれる２００３年４月３０日に出願されたＶａｒｇｅｅｓｅ等のＵＳＳＮ１０／４２７，１６０；米国特許第６，５２８，６３１号；米国特許第６，３３５，４３４号；米国特許第６，２３５，８８６号；米国特許第６，１５３，７３７号；米国特許第５，２１４，１３６号；米国特許第５，１３８，０４５号に記載の核酸コンジュゲート等のバイオコンジュゲートを含む。
【０５８６】
即ち、本発明は安定化剤、緩衝剤等のような許容される担体中に本発明の核酸１つ以上を含む医薬組成物を特徴とする。本発明のポリヌクレオチドは、医薬組成物を形成するための安定化剤、緩衝剤等を使用するか使用しないいずれかの標準的な手段により、対象に投与（例えばＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質）して導入できる。リポソーム送達機序を使用することが望まれる場合は、リポソームの製剤に関する標準的プロトコルに従うことができる。本発明の組成物はまた、クリーム、ゲル、スプレー、オイルおよび当分野で知られた局所、皮膚、または経皮投与のための他の適当な組成物として製剤化し、使用することができる。
【０５８７】
本発明はまた、記載した化合物の製薬上許容し得る製剤を含む。これらの製剤は上記化合物の塩、例えば酸付加塩、例えば塩酸、臭化水素酸、酢酸、およびベンゼンスルホン酸の塩を含む。
【０５８８】
医薬組成物または製剤とは、細胞または例えばヒトを含む対象内への、投与、例えば全身または局所投与に適する形態における組成物または製剤を指す。適する形態は、部分的には使用または進入経路、例えば経口、経皮、または注射によるかに応じて変動する。そのような形態は組成物または製剤が標的細胞（即ち負荷電核酸の送達が望ましい細胞）に到達することを妨いではならない。例えば、血流中に注入された医薬組成物は可溶性でなければならない。他の要因は当分野で知られる通りであり、毒性、および組成物または製剤がそれ自体の作用を発揮できなくなる形態等の、懸案事項を含む。
【０５８９】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は製薬上許容し得る組成物または製剤において全身投与することにより対象に投与される。「全身投与」とは血流中の薬剤のインビボの全身吸収または蓄積とその後の身体全体に渡る分布を意味する。全身吸収をもたらす投与経路は限定しないが、静脈内、皮下、門脈、腹腔内、吸入、経口、肺内および筋肉内を含む。これらの投与経路の各々が本発明のｓｉＮＡ分子を接触可能な疾患組織（例えば肺）に曝露する。循環への薬品の進入速度は分子量および大きさの関数であることがわかっている。本発明の化合物を含むリポソームまたは他の薬剤担体の使用は、潜在的には、薬品を例えば特定の組織型、例えば網膜内皮系（ＲＥＳ）の組織に局在化することができる。リンパ球およびマクロファージ等の細胞の表面との薬品の会合を促進できるリポソーム製剤も有用である。この手順は異常細胞のマクロファージおよびリンパ球免疫認識の特異性を利用することにより標的細胞への薬品の増強された送達をもたらすことができる。
【０５９０】
「製薬上許容し得る製剤」または「製薬上許容し得る組成物」とは、本発明の核酸分子のその所望の活性に最も適する物理的位置への効果的な分布を可能にする組成物または製剤を意味する。本発明の核酸分子を用いた製剤のための適当な剤の非限定的な例は、Ｐ−糖タンパク質阻害剤（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ８５）；生体分解性重合体、例えば持続放出送達のためのポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）微小球（Ｅｍｅｒｉｃｈ，ＤＦ等、１９９９，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，８，４７−５８）；および負荷されたナノ粒子、例えばポリブチルシアノアクリレートから製造したものを含む。本発明の核酸分子の送達の方策の他の非限定的な例はＢｏａｄｏ等、１９９８，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８７，１３０８−１３１５；Ｔｙｌｅｒ等、１９９９，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，Ａｌｌ，２８０−２８４；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ等、１９９５，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．，９２，５５９２−５５９６；Ｂｏａｄｏ，１９９５，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，１５，７３−１０７；Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ等、１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６，４９１０−４９１６；およびＴｙｌｅｒ等、１９９９，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．，９６，７０５３−７０５８に記載されている物質を含む。
【０５９１】
本発明はまた、ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ修飾、または長時間循環リポソームまたはステルスリポソーム）および本発明の核酸分子を含有する表面修飾リポソームを含む組成物の使用を特徴とする。これらの製剤は標的組織における薬品（例えばｓｉＮＡ）の蓄積を増大させるための方法を与える。このクラスの薬品担体は単核貪食細胞系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン作用および排出に対して抵抗し、これにより、カプセル化された薬品に対してより長い血中循環時間および増強された組織曝露を可能にする（Ｌａｓｉｃ等、．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７；Ｉｓｈｉｗａｔａ等、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，４３，１００５−１０１１）。そのようなリポソームは、おそらくは血管新生した標的組織における管外遊出および捕獲により、腫瘍中に選択的に蓄積することがわかっている（Ｌａｓｉｃ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，２６７，１２７５−１２７６；Ｏｋｕ等、１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０）。長時間循環リポソームは、特にＭＰＳの組織中に蓄積することが知られている従来のカチオン性リポソームと比較した場合に、ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態および薬力学を増強する（Ｌｉｕ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４−２４８７０；Ｃｈｏｉ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／１０３９１；Ａｎｓｅｌｌ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／１０３９０；Ｈｏｌｌａｎｄ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／１０３９２）。長時間循環リポソームはまた、肝臓および脾臓等の代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織中の蓄積を回避するそれらの能力に基づいて、カチオン性リポソームと比較した場合により広範にヌクレアーゼ分解から薬品を保護すると考えられる。
【０５９２】
１つの実施形態において、本発明のリポソーム製剤は、全て参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，８５８，２２４号；６，５３４，４８４号；６，２８７，５９１号；６，８３５，３９５号；６，５８６，４１０号；６，８５８，２２５号；６，８１５，４３２号；米国特許第６，５８６，００１号；６，１２０，７９８号；米国特許第６，９７７，２２３号；米国特許第６，９９８，１１５号；５，９８１，５０１号；５，９７６，５６７号；５，７０５，３８５号；米国特許第２００６／００１９９１２号；米国特許第２００６／００１９２５８号；米国特許第２００６／０００８９０９号；ＵＳ２００５／０２５５１５３；米国特許第２００５／００７９２１２号；米国特許第２００５／０００８６８９号；米国特許第２００３／００７７８２９号，米国特許第２００５／００６４５９５号，米国特許第２００５／０１７５６８２号，米国特許第２００５／０１１８２５３号；米国特許第２００４／００７１６５４号；米国特許第２００５／０２４４５０４号；米国特許第２００５／０２６５９６１号およびＵＳ２００３／００７７８２９に記載されている化合物および組成物で製剤または複合体化された本発明の２本鎖核酸分子（例えばｓｉＮＡ）を含む。
【０５９３】
本発明はまた製薬上許容し得る担体または希釈剤中に所望の化合物の薬学的に有効な量を含む保存または投与のために調製された組成物を含む。治療上の使用のために許容される担体または希釈剤は製薬分野でよく知られており、例えば参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載されている。例えば、保存料、安定化剤、染料および着香剤を準備できる。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。更に、抗酸化剤および懸濁剤も使用できる。
【０５９４】
薬学的に有効な用量は疾患の状態を防止、発生の抑制、または治療（ある程度までの症状、好ましくは全ての症状の軽減）するために必要な用量である。薬学的に有効な用量は疾患の型、使用する組成物、投与経路、治療すべき哺乳類の種類、懸案となっている特定の哺乳類の身体的特徴、併用薬剤、および医学の当業者の知るその他の要因に応じたものとなる。一般的に、活性成分０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の量を負荷電重合体の力価に応じて投与する。
【０５９５】
本発明の核酸分子およびその製剤は、従来の非毒性の製薬上許容し得る担体、アジュバントおよび／またはビヒクルを含有する単位剤型において、経口、局所、非経腸で、吸入またはスプレーにより、または直腸に、投与することができる。非経腸という用語は、本明細書において使用する場合、経皮、皮下、血管内（例えば静脈内）、筋肉内、または髄腔内の注射または注入の手法等を含む。更に、本発明の核酸分子および製薬上許容し得る担体を含む医薬品製剤が提供される。１つ以上の本発明の核酸分子が１つ以上の非毒性の製薬上許容し得る担体および／または希釈剤および／またはアジュバント、所望により他の活性成分と会合して存在することができる。本発明の核酸分子を含有する医薬組成物は経口用に適する剤型において、例えば錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性または油性の懸濁液、分散性粉末または顆粒、エマルジョン、ハードまたはソフトカプセル、またはシロップまたはエリキシルであることができる。
【０５９６】
経口用に意図される組成物は医薬組成物の製造の当分野で知られるいずれかの方法に従って調製することができ、そのような組成物は１つ以上の甘味剤、着香剤、着色剤または保存料を含有することにより製薬上優れた摂取しやすい調製品とすることができる。錠剤は錠剤の製造に適する非毒性の製薬上許容し得る賦形剤との混合物として活性成分を含有する。これらの賦形剤は、例えば不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム；顆粒化および錠剤崩壊剤、例えばコーンスターチ、またはアルギン酸；結合財、例えば澱粉、ゼラチンまたはアカシア；および潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであることができる。錠剤は未コーティングであるか、またはそれらは知られた手法によりコーティングできる。一部の場合においては、そのようなコーティングは胃腸管内での崩壊および吸収を遅延させることにより長時間に渡って持続する作用をもたらすように知られた手法で調製できる。例えば、時間遅延物質、例えばグリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートを使用できる。
【０５９７】
経口用の製剤は、活性成分を不活性の固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合するハードゼラチンカプセルとして、または活性成分を水または油脂の媒体、例えばピーナツ油、流動パラフィンまたはオリーブ油と混合するソフトゼラチンカプセルとして提供することもできる。
【０５９８】
水性懸濁液は水性懸濁液の製造に適する賦形剤との混合物中に活性物質を含有する。そのような賦形剤は、懸濁剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガムであり；分散または水和剤は天然に存在するホスファチド、例えばレシチン、またはアルキレンオキシドの脂肪酸との縮合生成物、例えばポリオキシエチレンステアレート、またはエチレンオキシドの長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、またはエチレンオキシドの脂肪酸から誘導した部分エステルとヘキシトールの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、またはエチレンオキシドの脂肪酸から誘導した部分エステルと無水ヘキシトールの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであることができる。水性懸濁液はまた、１つ以上の保存料、例えばエチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１つ以上の着色剤、１つ以上の着香剤、および１つ以上の甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリンを含有することができる。
【０５９９】
油性の懸濁液は植物性の油脂、例えばアラキス油、オリーブ油、ゴマ油またはココナツ油中、または流動パラフィン等の鉱油中に活性成分を懸濁することにより製剤できる。油性の懸濁液は濃厚化剤、例えば蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコールを含有できる。甘味剤および着香剤を添加することにより摂取しやすい経口用調製品とすることができる。これらの組成物はアスコルビン酸等の抗酸化剤を添加することにより保存できる。
【０６００】
水を添加することによる水性懸濁液の調製に適する分散性粉末および顆粒は、分散または潤滑剤、懸濁剤および１つ以上の保存料との混合物として活性成分を提供する。適当な分散または潤滑剤または懸濁剤は既に上記したものから例示される。追加的な賦形剤、例えば甘味料、着香剤および着色剤もまた存在できる。
【０６０１】
本発明の医薬組成物はまた、水中油のエマルジョンの形態であることもできる。油相は植物性の油脂または鉱油、またはそれらの混合物であることができる。適当な乳化剤は天然に存在するガムであり得るが無類、例えばアカシアガムまたはトラガカントガム、天然に存在するホスファチド、例えば大豆、レシチン、および脂肪酸およびヘキシトールの無水物から誘導したエステルまたは部分エステル、例えばソルビタンモノオレエート、および該部分エステルのエチレンオキシドとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであることができる。エマルジョンは甘味剤および着香剤も含有できる。
【０６０２】
シロップおよびエリキシルは甘味剤、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコースまたはスクロースと共に製剤できる。そのような製剤はまた、粘滑剤、保存料および着香剤および着色剤も含有できる。医薬組成物は滅菌された注射用の水性または油性の懸濁液の形態であることができる。この懸濁液は上記したこのような適当な分散剤または水和剤および懸濁剤を用いながら当分野で知られる通り製剤できる。滅菌された注射用の調製品はまた、非毒性の経口許容される希釈剤または溶媒中の滅菌された注射用の溶液または懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液であることができる。使用することができる許容されるビヒクルおよび溶媒に含まれるものは、水、リンゲル溶液および等張性の塩化ナトリウム溶液である。更に、滅菌された固定油は溶剤または懸濁媒体として従来法で利用される。この目的のためには、いずれかの銘柄の固定油、例えば合成のモノまたはジグリセリドを使用できる。更に、オレイン酸等の脂肪酸も注射用の調製品中で使用できる。
【０６０３】
本発明の核酸分子はまた、例えば薬剤の直腸投与用の座薬の形態で投与できる。これらの組成物は、常温では固体であるが直腸温度では液体となるため直腸内で溶融して薬品を放出する、適当な非刺激性の賦形剤に薬品を混合することにより調製できる。そのような材料はカカオ脂およびポリエチレングリコールを含む。
【０６０４】
本発明の核酸分子は滅菌された媒体中で非経腸投与できる。薬剤はビヒクルおよび使用濃度に応じて、ビヒクル中に懸濁または溶解することができる。好都合には、局所麻酔剤、保存料および緩衝剤等の補助剤をビヒクル中に溶解することができる。
【０６０５】
一日当たりキログラム体重当たり約０．１ｍｇ〜約１４０ｍｇのオーダーの用量レベルが上記した状態の治療において有用である（一日当たり対象あたり約０．５ｍｇ〜約７ｇ）。単回剤型を製造するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は治療される宿主および特定の投与様式に応じて変動する。単位剤型は一般的に活性成分約１ｍｇ〜約５００ｍｇを含有する。
【０６０６】
当然ながら、いずれかの特定の対象に対する特定の用量レベルは、種々の要因、例えば使用する特定の化合物の活性、年齢、体重、全身状態、性別、食餌、投与時間、投与経路、および排出速度、薬品の組み合わせおよび治療を受けている特定の疾患の重症度に応じたものとなる。
【０６０７】
非ヒト動物への投与のためには、組成物は動物の飼料または飲用水中に添加することもできる。動物がその食餌と共に組成物の治療上適切な量で摂取するように動物の飼料および飲用水の組成物を製剤化することは好都合であり得る。飼料または飲用水に添加するためのプレミックスとして組成物を提供することも好都合であり得る。
【０６０８】
本発明の核酸分子はまた、全体的な治療効果を高めるために他の治療用化合物と組み合わせて対象に投与することもできる。適応症を治療するために多数の化合物を使用することは、有利な作用を増大させつつ、副作用の存在を低減することができる。
【０６０９】
１つの実施形態において、本発明は特定の細胞型に本発明の核酸分子を投与する場合に適する組成物を含む。例えばアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２）は肝細胞に独特のものであり、分枝鎖のガラクトース末端の糖タンパク質、例えばアシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）に結合する。別の実施例においては、フォレート受容体が多くのがん細胞において過剰発現されている。そのような糖タンパク質、合成糖コンジュゲート、またはフォレートの受容体への結合はオリゴ糖鎖の分枝鎖度に強く依存している親和性を伴って起こり、例えばトリアテナリ構造はビアテナリまたはモノアテナリの鎖よりも大きい親和性で結合する（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｔｅ，１９８０，Ｃｅｌｌ，２２，６１１−６２０；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ等、１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，９３９−９４５）。Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，１９８７，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．４，３１７−３２８はこの高い特異性を、ガラクトースと比較して受容体に対するより高い親和性を有する、炭水化物部分としてのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンの使用を通じて得ている。この「クラスタリング作用」はまたマンノシル末端糖タンパク質または糖コンジュゲートの結合および取り込みに関しても記載されている（Ｐｏｎｐｉｐｏｍ等、１９８１，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２４，１３８８−１３９５）。細胞膜を通過して外因性の化合物を輸送するためのガラクトース、ガラクトサミン、またはフォレート系のコンジュゲートの使用は、例えば肝臓疾患、肝臓癌、または他の癌の治療のためのターゲティングされた送達手順を与えることができる。バイオコンジュゲートの使用はまた、治療のために必要な治療用化合物の必要量の減少をもたらすことができる。更に、治療上の生体利用性、薬力学、および薬物動態のパラメーターを、本発明の核酸バイオコンジュゲートの使用を通じてモジュレートできる。そのようなバイオコンジュゲートの非限定的な例は２００１年８月１３日出願のＶａｒｇｅｅｓｅ等のＵＳＳＮ１０／２０１，３９４；および２００２年３月６日出願のＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ等のＵＳＳＮ６０／３６２，０１６に記載されている。
【０６１０】
或いは、本発明の特定のｓｉＮＡ分子は真核生物のプロモーターから細胞内で発現させることができる（例えばＩｚａｎｔ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９，３４５；ＭｃＧａｒｒｙ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３，３９９；Ｓｃａｎｌｏｎ等、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ等、１９９２，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃ等、１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ等、１９９１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６５，５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇ等、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ等、１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒ等、１９９０  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１２２２−１２２５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，２２５９；Ｇｏｏｄ等、１９９７，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，４，４５）。当業者の知る通り、いずれかの核酸は適切なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから真核生物の細胞中で発現できる。このような核酸の活性は酵素性の核酸による一次転写物からのその放出により増強できる（Ｄｒａｐｅｒ等、ＰＣＴ  ＷＯ９３／２３５６９，ａｎｄ  Ｓｕｌｌｉｖａｎ等、ＰＣＴ  ＷＯ９４／０２５９５；Ｏｈｋａｗａ等、１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１５−６；Ｔａｉｒａ等、１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９，５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａ等、１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１，３２４９−５５；Ｃｈｏｗｒｉｒａ等、１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５８５６）。
【０６１１】
本発明の別の態様において、本発明のＲＮＡ分子はＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写ユニットから発現させることができる（例えばＣｏｕｔｕｒｅ等、１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０参照）。組み換えベクターはＤＮＡプラスミドまたはウィルスベクターであることができる。ｓｉＮＡ発現ウィルスベクターはアデノ関連ウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、またはαウィルスを基にして構築できるが、これらに限定されない。別の実施形態においては、ｐｏｌ  ＩＩＩ系コンストラクトは本発明の核酸分子を発現させるために使用される（例えばＴｈｏｍｐｓｏｎの米国特許第５，９０２，８８０号および６，１４６，８８６号参照）。ｓｉＮＡ分子を発現することができる組み換えベクターは上記の通り送達され、標的細胞中に残存できる。或いは、核酸分子の一過性の発現をもたらすウィルスベクターを使用できる。そのようなベクターは必要に応じて繰り返し投与できる。発現された後、ｓｉＮＡ分子は標的ｍＲＮＡと相互作用し、ＲＮＡｉ応答を発生させる。ｓｉＮＡ分子発現ベクターの送達は、例えば静脈内または筋肉内投与により、対象から外植した標的細胞への投与とその後の対象への再導入により、または、所望の標的細胞内への導入を可能にするいずれかの他の手段により、全身に行うことができる（考察のためにはＣｏｕｔｕｒｅ等、１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０参照）。
【０６１２】
１つの態様において、本発明は本発明のｓｉＮＡ分子少なくとも１つをコードする核酸配列を含む発現ベクターを特徴とする。発現ベクターはｓｉＮＡデュプレックスの一方または両方の鎖、またはｓｉＮＡデュプレックス内に自己ハイブリダイズする単一の自己相補鎖をコードすることができる。本発明のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列はｓｉＮＡ分子の発現を可能にする様式において作動可能に連結させることができる（例えばＰａｕｌ等、２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ａｎｄ  Ｔａｉｒａ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７；Ｌｅｅ等、２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００；およびＮｏｖｉｎａ等、２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ａｄｖａｎｃｅ  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７２５参照）。
【０６１３】
別の態様においては、本発明は、ａ）転写開始領域（例えば真核生物ｐｏｌ  Ｉ、Ｉ  ＩまたはＩＩＩ開始領域）；ｂ）転写終止領域（例えば真核生物ｐｏｌ  Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ終止領域）；およびｃ）本発明のｓｉＮＡ分子少なくとも１つをコードする核酸配列を含む発現ベクターを特徴とし、ここで該配列はｓｉＮＡ分子の発現および／または送達を可能にする様式において該開始領域および該終止領域に作動可能に連結している。ベクターは場合により、本発明のｓｉＮＡをコードする配列の５’側または３’側に作動可能に連結したタンパク質に関するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；および／またはイントロン（介在配列）を含むことができる。
【０６１４】
ｓｉＮＡ分子配列の転写は真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）に対するプロモーターから駆動させることができる。ｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからの転写物は全ての細胞において高レベルで発現され；ある細胞型におけるあるｐｏｌ  ＩＩプロモーターのレベルは近くに存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサー等）の性質に応じたものとなる。原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた、原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適切な細胞で発現される限り、使用される（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６７４３−７；Ｇａｏ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ  １９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１，２８６７−７２；Ｌｉｅｂｅｒ等、１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７，４７−６６；Ｚｈｏｕ等、１９９０，ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７）。一部の研究者は、そのようなプロモーターから発現された核酸分子は哺乳類細胞中で機能できることを明らかにしている（例えばＫａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ等、１９９２，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇ等、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ等、１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｙｕ等、１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６３４０−４；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒ等、１９９２，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１１，４４１１−８；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ等、１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９０，８０００−４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，２２５９；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ＆Ｃｅｃｈ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１５６６）。より具体的には、Ｕ６小型核（ｓｎＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびアデノウィルスＶＡＲＮＡをコードする遺伝子から誘導したもの等の転写ユニットは細胞においてｓｉＮＡ等の所望のＲＮＡ分子を高濃度で形成する場合に有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、上出；Ｃｏｕｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６、上出；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ等、１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２２，２８３０；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ等、米国特許第５，６２４，８０３号；Ｇｏｏｄ等、１９９７，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，４，４５；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／１８７３６）。上記したｓｉＮＡ転写ユニットは哺乳類細胞内への導入のための種々のベクター、限定しないが例えば、プラスミドＤＮＡベクター、ウィルスＤＮＡベクター（例えばアデノウィルスまたはアデノ関連ウィルスベクター）、またはウィルスＲＮＡベクター（例えばレトロウィルスまたはαウィルスベクター）内に取り込むことができる（考察のためにはＣｏｕｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６、上出を参照できる）。
【０６１５】
別の態様において、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子少なくとも１つをコードする核酸配列を、そのｓｉＮＡ分子の発現を可能にするような様式において含む、発現ベクターを特徴とする。発現ベクターは１つの実施形態において、ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；およびｃ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも１つの鎖をコードする核酸配列、ここでその配列はｓｉＮＡ分子の発現および／または送達を可能にする様式において開始領域および終止領域と作動可能に連結しているもの、を含む。
【０６１６】
別の実施形態において、発現ベクターは、ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）オープンリーディングフレーム；およびｃ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも１つの鎖をコードする核酸配列、ここでその配列はオープンリーディングフレームの３’末端に作動可能に連結しており、ここでその配列はｓｉＮＡ分子の発現および／または送達を可能にする様式において開始領域、オープンリーディングフレームおよび終止領域と作動可能に連結しているもの、を含む。更に別の実施形態において、発現ベクターは、ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）イントロン；およびｃ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも１つをコードする核酸配列、ここでその配列は核酸分子の発現および／または送達を可能にする様式において開始領域、イントロンおよび終止領域と作動可能に連結しているもの、を含む。
【０６１７】
別の実施形態において、発現ベクターは、ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）イントロン；ｄ）オープンリーディングフレーム；およびｅ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも１つの鎖をコードする核酸配列、ここでその配列はオープンリーディングフレームの３’末端に作動可能に連結しており、ここでその配列はｓｉＮＡ分子の発現および／または送達を可能にする様式において開始領域、イントロン、オープンリーディングフレームおよび終止領域と作動可能に連結しているもの、を含む。
ＥＮａＣの生物学および生化学
【０６１８】
上皮ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ、またはナトリウムチャンネルノンニューロナル１（ＳＣＮＮ１）またはアミロリド感受性ナトリウムチャンネル（ＡＳＳＣ））はＬｉ＋、プロトンおよび特にＮａ＋に対して透過性である膜結合性のイオンチャンネルである。これは「構成的に活性な」チャンネルであり、即ち、ゲーティング刺激を必要とせず、休止時に開放されている。ＥＮａＣは３つの異なるサブユニット、α（ＳＣＮＮ１Ａ）、β（ＳＣＮＮ１Ｂ）およびγ（ＳＣＮＮ１Ｇ）を含むヘテロマー性のタンパク質である。厳密な化学量は最近まで不明であったが、ＡＳＩＣチャンネルとの相同性に基づけば、ほぼ確実にヘテロ三量体である（Ｊａｓｔｉ等、上出）。各サブユニットは２つの膜貫通へリックスおよび細胞外ループからなる。全てのポリペプチドのアミノおよびカルボキシ末端はシトゾル中に位置している。更に、４番目のいわゆるδサブユニットが存在し、それはαサブユニットと大きな相同性を共有しており、βおよびγサブユニットと共に機能的イオンチャンネルを形成することができる。そのようなδ２、β、γ４量体は、それらの機能は未知ではあるものの、膵臓、精巣および卵巣に生じる。
【０６１９】
ＥＮａＣは特に腎臓、肺および結腸の分極した上皮細胞の先端の膜に位置している。これはそれがＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅと共に達成する経上皮Ｎａ＋イオン輸送に関与している。それはＮａ＋イオンの再吸収による血液、上皮および上皮外の体液のＮａ＋およびＫ＋イオンのホメオスタシスにおいて主要な役割を果たしている。
【０６２０】
気道は２層となっている約１０マイクロメートルの深度の液体の膜で被覆されている。線毛の周囲には水分の多い線毛周囲ゾルが存在する。この上に吸入された粒子を捕獲する粘液性被覆物がある。粘液層自体が吸入された病原体／粒子を捕獲し、これにより、潜在的に傷害性の炎症応答をトリガーする必要性を伴うことなく現在進行中の粘液線毛浄化を介してそれらを除去する。線毛周囲ゾルの低い粘性のために、線毛は粘液性の被覆物を殴打し、口腔に向けて気道に沿って推進することができる。大型の気道においては、粘液は大部分は粘液腺から、ただし表面上皮における杯細胞からも生じる。水は漿液細胞による活動性のＣｌ−分泌により駆動される腺分泌により気道表面に加えられる。水は表面上皮を通過するＥＮａＣを介してＮａ＋輸送により除去される。気道の疾患においては、水の分泌から粘液の分泌にバランスがシフトする（Ｗｉｄｄｉｃｏｍｂｅ，Ｊ．Ｈ．（２００２）Ｊ．Ａｎａｔ．２０１  ｐｐ３１３−３１８）。即ちＥＮａＣは気道上皮を通過するナトリウムの吸収の律速段階となっており、そのため、気道上皮の表面からの水の吸収を制御する。ＣＯＰＤ（Ｍｅｌｔｏｎ，Ｌ．（２００２）Ｌａｎｃｅｔ  ３５９  ｐ１９２４；Ｈｏｇｇ，Ｊ．Ｃ．等（２００４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０  ｐｐ２６４５−２６５３；ｄｅＭａｒｃｏ，Ｒ．等（２００７）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１７５  ｐｐ３２−３９）および嚢胞性線維症は両方とも、粘液の付着を誘発する気道の相対的な脱水を特徴としている。その結果は粘液の停滞である。付着した粘液は気道を閉塞させ、最初は間欠的で、次に慢性となる気道感染／疾患の悪化の発症のための中核となり得る。
【０６２１】
ＣＯＰＤにおける粘液脱水はおそらく多重要因性である。相対的脱水は、より少ない気道表面液体または管腔中に存在する物質の％固体の上昇のいずれかとして顕在化する場合があることに留意することが重要である。ＣＯＰＤの重要な特徴であるゴブレット細胞の過形成（Ｈｏｇｇ等、上出）およびその結果生じるムチンの分泌亢進は、それ自体、気道表面液体の％固体含有量を増大させる場合があり、これによりＣＯＰＤにおける相対的脱水が誘発されるが、イオンおよび水の輸送における欠陥が寄与しているとも考えられる（Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｒ．Ｃ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｏｃ．１  ｐｐ６６−７０）。おそらくは粘液脱水がＣＯＰＤにおける問題であるという最も説得力のあるデータは気道表面への粘液の付着および小型気道中の粘液の閉塞を記載しているＨｏｇｇ（Ｈｏｇｇ等、上出）のものである。この研究では、ＣＯＰＤ患者における気道閉塞の進行性の病理学的作用が外科的に切除された肺組織において評価されている。ＣＯＰＤの進行は、小型気道の壁部の組織の体積の増加（ｐ＜０．００１）および管腔中の炎症性粘液滲出物の蓄積（Ｐ＜０．００１）と強力な関連性を有していた。
【０６２２】
嚢胞性線維症に関しては、Ｋｎｏｗｌｅｓ等（Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｍ，等（１９８１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０５ｐｐｌ４８９−１４９５）が嚢胞性線維症患者および対照患者において呼吸器粘膜の内外での経上皮電位差を測定している。嚢胞性線維症気道における経上皮電位差は対照よりも有意に高値であった。これは、アミロリドによる管腔表面の洗い流しが対照よりも嚢胞性線維症において経上皮電位差のより大きい減少を誘発していることによる、過剰なＥＮａＣ媒介Ｎａ＋輸送が原因となっていた。これらの独創的な観察結果は、Ｃｌ−イオン分泌の欠失のみに起因する欠陥から過剰なＮａ＋吸収に関連するものへと、嚢胞性線維症の呼吸器の病理の伏在原因の考え方を変えた。
【０６２３】
アミロリドに応答した電位差のより大きい減少は、過剰な塩の吸収と、それによる呼吸器上皮表面からの液体の吸収を示していた。これは種々のインビトロおよびインビボの研究から強力に裏付けられている（Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｒ．Ｃ（２００７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５８  ｐｐｌ５７−１７０；Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｒ．Ｃ．（２００７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１３  ｐｐ２３１−２４０；Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｒ．Ｃ．（２００７）Ｊ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．２６１  ｐｐ５−１６；Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ，Ｓ．Ｈ．ａｎｄ  Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｒ．Ｃ．（２００７）Ｃｈｅｓｔ  １３２  ｐｐｌ６３１−１６３６）。気道表面脱水の結果は粘液の停滞である。付着した粘液は気道を閉塞させ、最初は間欠的で、次に慢性となる気道感染／疾患の悪化の発症のための中核となり得る。この欠陥に着目した治療方策の開発はこれらの肺疾患を緩徐化、遅延、または潜在的に防止する理論的で有望な手段である。
【実施例】
【０６２４】
以下の実施例は本発明の核酸の選択、単離、合成および活性を示す非限定的な実施例である。
実施例１：ＥＮａＣαに対抗して活性なｓｉＲＮＡの設計、合成、および同定
ＥＮａＣα  ｓｉＮＡの合成
【０６２５】
一連の６４  ｓｉＮＡ鎖を設計し、合成し、ＥＮａＣに対抗する薬効に関して評価した。ＥＮａＣ  ｓｉＮＡの設計の主要な基準は（ｉ）ヒト、マウス、およびラットのアイソフォームの全てに渡るＥＮａＣの保存、および（ｉｉ）所有権アルゴリズムにより測定した場合の高薬効評点とした。ＥＮａＣタンパク質生産およびＲＮＡレベルに対するｓｉＮＡの作用もまた検討した。設計、合成およびＥＮａＣに対抗する薬効に関して評価されたｓｉＮＡの配列を表１ａ（標的配列）および表１ｂ（修飾された配列）に示す。
【表１】
2012509688.tif 000045
実施例２：ｓｉＮＡコンストラクトのタンデム合成
【０６２６】
本発明の例示されるｓｉＮＡ分子は切断可能なリンカー、例えばスクシニル系のリンカーを用いながらタンデムに合成される。本明細書に記載するタンデム合成に引き続き、高収率でＲＮＡｉ分子を与える１工程の精製プロセスを行う。この手順は高スループットのＲＮＡｉスクリーニングを支持してｓｉＮＡ合成に高度に適しており、多重カラムまたは多重ウェルの合成プラットホームに容易に適合できる。
【０６２７】
ｓｉＮＡオリゴおよび５’末端ジメトキシトリチル（５’−Ｏ−ＤＭＴ）基が未損傷（トリチルオン合成）のまま残存しているその相補体のタンデム合成を終了した後、オリゴヌクレオチドを上記した通り脱保護する。脱保護の後、ｓｉＮＡ配列鎖を自発的にハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーションにより、一方の鎖が５’−Ｏ−ＤＭＴ基を保持しており、相補鎖は末端５’ヒドロキシルを含むデュプレックスが生じる。一方の分子のみがジメトキシトリチル基を有する場合であっても、新しく形成されたデュプレックスは定型的な固相抽出精製（トリチルオン精製）の間、単一の分子としての挙動を示す。鎖は安定なデュプレックスを形成するため、このジメトキシトリチル基（または等価な基、例えば他のトリチル基または他の疎水性部分）は、例えばＣ１８カートリッジを使用することによりオリゴの対を精製するために必要な全てである。
【０６２８】
標準的なホスホラミダイト合成化学を、タンデムリンカー、例えば反転デオキシ無塩基スクシネートまたはグリセリルスクシネートリンカー（図１参照）または等価な切断可能なリンカーの導入の時点まで使用する。使用できるリンカーカップリング条件の非限定的な例は、ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒＯＰ）等の活性化剤試薬の存在下のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＡ）および／またはＤＭＡＰ等のヒンダード塩基を含む。リンカーがカップリングされた後、標準的な合成化学を利用することにより、末端に未損傷の５’−Ｏ−ＤＭＴを残しながら第２の配列の合成を終了する。合成の後、得られたオリゴヌクレオチドを本明細書に記載する操作法に従って脱保護し、適当な緩衝液、例えば５０ｍＭのＮａＯＡｃまたは１．５ＭのＮＨ４Ｈ２ＣＯ３でクエンチングする。
【０６２９】
ｓｉＮＡデュプレックスの精製は、例えば、１カラム容量（ＣＶ）のアセトニトリル、２ＣＶのＨ２Ｏ、および２ＣＶの５０ｍＭのＮａＯＡｃでコンディショニングされたＷａｔｅｒｓ  Ｃ１８  ＳｅｐＰａｋ  １ｇカートリッジを用いながら、固相抽出を用いて容易に達成できる。試料をロードし、次に１ＣＶのＨ２Ｏおよび５０ｍＭのＮａＯＡｃで洗浄する。誤配列を１ＣＶの１４％ＡＣ  Ｎ（５０ｍＭ  ＮａＯＡｃおよび５０ｍＭ  ＮａＣｌで水性とする）で溶出する。次にカラムを例えば１ＣＶのＨ２Ｏで洗浄し、次に例えば１％の水性トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１ＣＶをカラム通過させることによりオンカラム脱トリチル化を行い、次に１／２ＣＶの１％水性ＴＦＡをカラムに添加し、約１０分間放置する。残存するＴＦＡ溶液を除去し、カラムをＨ２Ｏ、ついで１ＣＶの１Ｍ  ＮａＣｌおよび追加のＨ２Ｏで洗浄する。次にｓｉＮＡデュプレックス産物を、例えば１ＣＶの２０％水性ＣＡＮを用いて溶出する。
【０６３０】
図２は精製されたｓｉＮＡコンストラクトのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析の例を示しており、ここで各ピークはｓｉＮＡデュプレックスの個々のｓｉＮＡ鎖の計算された質量に相当する。同じ精製ｓｉＮＡはキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）により分析した場合に３つのピーク、即ち、おそらくはデュプレックスｓｉＮＡに相当する１つのピーク、およびおそらくは別個のｓｉＮＡ配列鎖に相当する２つのピークを与える。同じｓｉＮＡコンストラクトのイオン交換ＨＰＬＣ分析は単一のピークを示すのみである。後述するルシフェラーゼレポーター試験を用いた精製ｓｉＮＡコンストラクトの試験は、別個に合成されたオリゴヌクレオチド配列鎖から形成したｓｉＮＡコンストラクトと比較した場合に、同じＲＮＡｉ活性を示していた。
実施例３：ｓｉＮＡの化学合成および精製
【０６３１】
ｓｉＮＡ分子はＲＮＡメッセージにおいて種々の部位、例えば本明細書に記載するＲＮＡ配列内部の標的配列と相互作用するように設計できる。ｓｉＮＡ分子の一方の鎖の配列は上記した標的部位配列に相補的である。ｓｉＮＡ分子は本明細書に記載する方法を用いて化学合成できる。対照配列として使用する不活性なｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子の配列をそれが標的配列に相補的とならないようにスクランブルすることにより合成できる。一般的に、ｓｉＮＡコンストラクトは本明細書に記載する固相オリゴヌクレオチド合成法を用いて合成できる（例えば全て参照により本明細書に組み込まれるＵｓｍａｎ等の米国特許第５，８０４，６８３号；５，８３１，０７１号；５，９９８，２０３号；６，１１７，６５７号；６，３５３，０９８号；６，３６２，３２３号；６，４３７，１１７号；６，４６９，１５８号；Ｓｃａｒｉｎｇｅ等の米国特許第６，１１１，０８６号；６，００８，４００号；６，１１１，０８６号参照）。
【０６３２】
非限定的な例において、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは当分野で知られる通りホスホラミダイト化学を用いて段階的な方式において合成される。標準的なホスホラミダイト化学では５’−Ｏ−ジメトキシトリチル、２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル、３’−Ｏ−２−シアノエチル、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト基、および環外アミン保護基（例えばＮ６−ベンゾイルアデノシン、Ｎ４アセチルシチジン、およびＮ２−イソブチリルグアノシン）のいずれかを含むヌクレオシドを使用する。或いは、２’−Ｏ−シリルエーテルを上出Ｓｃａｒｉｎｇｅの記載の通りＲＮＡの合成において酸不安定性の２’−Ｏ−オルトエステル保護基と組み合わせて使用できる。異なる２’化学は、異なる保護基を必要とする場合があり、例えば、２’−デオキシ−２’−アミノヌクレオシドは参照により全体が本明細書に組み込まれるＵｓｍａｎ等の米国特許第５，６３１，３６０号に記載の通りＮ−フタロイル保護を利用できる。
【０６３３】
固相合成の間、各ヌクレオチドを固体支持体結合オリゴヌクレオチドに逐次的（３’−から５’の方向）に添加する。鎖の３’末端にある第１のヌクレオシドは種々のリンカーを用いながら固体支持体（例えば制御細孔ガラスまたはポリスチレン）に共有結合する。ヌクレオチド先駆体、リボヌクレオシドホスホアミダイト、および活性化物質を合わせることにより、第１のヌクレオシドの５’末端上への第２のヌクレオシドホスホラミダイトのカップリングが起こる。次に支持体を洗浄し、未反応の５’ヒドロキシル基がある場合はそれを無水酢酸等のキャッピング試薬でキャッピングすることにより不活性な５’−アセチル部分とする。次に３価のリンの結合部を酸化してより安定なホスフェート連結部とする。ヌクレオチド付加サイクルの終了時に、５’−Ｏ−保護基を安定な条件下（例えばトリチル系の基に対しては酸性条件、シリル系の基に対してはフロリド）に切断する。次のヌクレオチドそれぞれに対してサイクルを反復する。
【０６３４】
合成条件の変更は、合成すべきｓｉＮＡの特定の化学組成に応じて、例えば異なるカップリング時間、異なる試薬／ホスホラミダイト濃度、異なる接触時間、異なる固体支持体および固体支持体リンカー化学を用いることにより、カップリング効率を最適化するために使用できる。ｓｉＮＡの脱保護および精製は、参照により全体が本明細書に組み込まれるＵｓｍａｎ等の米国特許第５，８３１，０７１号、米国特許第６，３５３，０９８号、米国特許第６，４３７，１１７号およびＢｅｌｌｏｎ等の米国特許第６，０５４，５７６号、米国特許第６，１６２，９０９号、米国特許第６，３０３，７７３号または上出のＳｃａｒｉｎｇｅに一般的に記載される通り実施できる。更にｓｉＮＡコンストラクトの最大可能な収率および純度を得るために脱保護条件を変更することができる。例えば本出願人は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが不適切な脱保護条件下では分解する場合があることを観察している。そのようなオリゴヌクレオチドは３０分間約３５℃で水性のメチルアミンを用いながら脱保護する。２’−デオキシ−２’−フルオロ含有オリゴヌクレオチドがリボヌクレオチドも含む場合は、３０分間約３５℃で水性のメチルアミンによる脱保護後に、ＴＥＡ−ＨＦを添加し、反応を更に１５分間約６５℃に維持する。ｓｉＮＡの脱保護された１本鎖はアミノ交換により精製することにより高純度を達成しつつ、高収率を維持できる。ｓｉＮＡデュプレックス分子を形成するためには、１本鎖を食塩水中等モル比率で合わせることによりデュプレックスを形成する。デュプレックスｓｉＮＡを接線濾過により濃縮および脱塩した後に、凍結乾燥する。
【０６３５】
以下は種々の合成されたｓｉＮＡを示す表である。
【表２】
2012509688.tif 000046
2012509688.tif 000047
ｓｉＮＡ組成物の製造
【０６３６】
非限定的な例において、各ｓｉＮＡ組成物について、ｓｉＮＡの２つの個別の相補鎖を固相合成を用いて別個に合成し、次にイオン交換クロマトグラフィーにより別個に精製する。相補鎖をアニーリングし２本鎖（デュプレックス）を形成する。次にデュプレックスを限外濾過および凍結乾燥に付すことにより固体のｓｉＮＡ組成物（例えば医薬組成物）を形成する。製造プロセスの非限定的な例を表１２のフローダイアグラムにおいて示す。
固相合成
【０６３７】
１本鎖オリゴヌクレオチドはＡｍｅｒｓｈａｍ  ＰｈａｒｍａｃｉａのＡＫＴＡ  Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ（例えばＯｌｉｇｏｐｉｌｏｔまたはＯｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  １００  ｐｌｕｓ）等の自動固相合成器上でホスホラミダイト化学を用いながら合成する。調節可能な合成カラムに第１のヌクレオシド残基で誘導体化した固体支持体を充填する。合成は酸不安定性の５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基の脱トリチル化により５’−ヒドロキシルを遊離させることにより開始する。アセトニトリル中のホスホラミダイトおよび安定な活性化物質は合成カラムに同時に供給することによりアミダイトの５’−ヒドロキシルへのカップリングを生じさせる。次にカラムをアセトニトリルで洗浄する。ヨウ素をカラムに送液することにより、ホスファイトトリエステル連結部Ｐ（ＩＩＩ）を酸化してそのホスホトリエステルＰ（Ｖ）類縁体とする。未反応の５’−ヒドロキシル基を２，６−ルチジンおよびＮ−メチルイミダゾールの存在下に無水酢酸等の試薬を用いてキャッピングする。伸長サイクルは次のホスホラミダイト取り込みのための脱トリチル化工程で再開される。このプロセスを所望の配列が合成されるまで反復する。合成は末端ジメトキシトリチル基の除去で完了する。
切断および脱保護
【０６３８】
合成終了時、固体支持体および会合しているオリゴヌクレオチドをフィルター漏斗に移し、真空下に乾燥し、反応容器に移す。水性の塩基を添加し、混合物を加熱することにより、スクシニル連結部の切断、シアノエチルホスフェート保護基の除去、および環外アミン保護の脱保護を行う。
【０６３９】
以下のプロセスはリボヌクレオチドを含有しない１本鎖に対して実施する。即ち、水性塩基で固体支持体を処理した後、混合物を真空下に濾過することにより固体支持体を脱保護された粗製の合成物質から分離する。次に固体支持体を水ですすぎ、洗液を濾液と合わせる。得られた塩基性の溶液を酸で中和することにより粗製の１本鎖の溶液を得る。
【０６４０】
以下のプロセスはリボヌクレオチドを含有する１本鎖に対して実施する。固体支持体を水性塩基で処理した後、混合物を真空下に濾過することにより固体支持体を脱保護された粗製の合成物質から分離する。次に固体支持体をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ですすぎ、洗液を濾液と合わせる。混合物を冷却し、３フッ化水素トリエチルアミン等のフッ化物試薬を添加し、溶液を加熱する。反応物を適当な緩衝液でクエンチングすることにより粗製の１本鎖の溶液を得る。
アニオン交換精製
【０６４１】
各粗製の１本鎖の溶液をクロマトグラフィー精製により精製する。生成物を適当な緩衝液の勾配を用いて溶出させる。画分を閉鎖滅菌容器に収集し、ＨＰＬＣで分析し、適切な画分を合わせて生成物のプールとし、これを純度（ＨＰＬＣ）、同定（ＨＰＬＣ）、および濃度（ＵＶ  Ａ２６０）に関して分析する。
アニーリング
【０６４２】
生成物のプールの分析に基づいて、等モル量（理論的消衰係数を用いて計算）のセンスおよびアンチセンスのオリゴヌクレオチド鎖を反応容器に移す。溶液を混合し、クロマトグラフィー法によりデュプレックスの純度に関して分析する。分析によりいずれかの鎖が過剰であることが示されれば、追加分の過剰でない鎖をデュプレックスが完成するまで補充する。標的生成物の純度が達成されていることが分析で示されれば、物質を濃縮と脱塩のために接線フロー濾過（ＴＦＦ）系に移す。
限外濾過
【０６４３】
アニーリングされた生成物の溶液を適切な分子量カットオフ膜を含有するＴＦＦ系を用いて濃縮する。濃縮後、生成物の溶液を、濾液の電気伝導度が水と同じになるまでＷＦＴ品質の水を用いながら透析濾過することにより、脱塩する。
凍結乾燥
【０６４４】
濃縮した溶液をシェルフ式凍結乾燥機中の滅菌されたトレーに移す。次に生成物を凍結乾燥して粉末とする。トレーを凍結乾燥機から取り出し、包装のためのクラス１００の層流（ＬＡＦ）フードに移す。
原薬の包装
【０６４５】
凍結乾燥された生成物を含有する凍結乾燥機のトレーをクラス１００ＬＡＦフード中で開封する。生成物を適切な大きさの滅菌された容器に移し、次にこれを密封しラベルを貼る。
原薬容器閉鎖システム
【０６４６】
凍結乾燥した原薬を滅菌キャップ付きの滅菌Ｎａｌｇｅｎｅ容器にバルク包装する。使用するビンの大きさはそれに入れる物質の量による。充填後、各ビンを、蓋の部分でポリエチレンテープを用いて更に密封する。
分析方法および仕様
原材料およびインプロセスの方法
【０６４７】
原材料は同定試験に付した後に原薬製造プロセスに導入する。原薬分子中に組み込まれる重要な原材料は、適宜、純度試験または検定試験を用いて更に試験する。インプロセスの試料は、最終原薬の品質をモニタリングおよび保証するために、製造プロセスの重要な管理ポイントにおいて試験する。
原薬の分析方法および仕様
【０６４８】
オリゴヌクレオチドに関する分析方法および許容基準を組み込んだ対照をバルクｓｉＮＡ組成物の臨床試験よりも前に確立する。以下の試験法および許容基準はこれらの対照の例を反映している。
分析方法の総括
同定（ＩＤ）試験
【０６４９】
ＩＤオリゴヌクレオチド主要ピーク：原薬の同一性はクロマトグラフィー法を用いて明らかにする。この測定のために使用されるデータはＨＰＬＣ試験法（純度試験参照）の１つにより発生する。原薬試料および標準物質の注入のピーク保持時間を比較する。原薬の同一性は主要ピークの保持時間の好ましい相似性により裏付けられる。
【０６５０】
分子量：原薬の同一性はスペクトル分析法を用いて明らかにする。原薬の試料を水性酢酸アンモニウムによる沈殿により分析のために調製する。原薬の分子量は質量スペクトルにより測定する。試験は理論的分子量に基づく原子質量単位の設定数内にコントロールされる。
【０６５１】
融点：この方法は２本鎖原薬の融点（Ｔｍ）の計測により原薬の同一性を裏付ける。溶液としての試料を加熱しながら、溶液の紫外線（ＵＶ）吸光度をモニタリングする。吸光度はデュプレックスから１本鎖への解離により増大するため、吸光度曲線の変曲点としてＴｍはマークされる。
検定試験
【０６５２】
オリゴヌクレオチド含有量：この検定は原薬における全オリゴヌクレオチド含有量を測定するものである。オリゴヌクレオチドは２６０ｎｍに極大値を示しながらＵＶ光を吸収する。存在するオリゴヌクレオチド種は、２本鎖ｓｉＲＮＡ産物および残留１本鎖を含む製造プロセスに由来する他の少量の関連オリゴヌクレオチド物質からなる。原薬の試料を正確に計量し、溶解し、水中に定量的に希釈する。吸光度はＵＶスペクトル分析を用いて石英セル中で計測する。全オリゴヌクレオチド検定値はワーキング標準物質の実験的に測定されたモル吸光性を用いながら計算され、固体原薬のミリグラム当たりのナトリウムオリゴヌクレオチドのマイクログラム数として報告される。
【０６５３】
純度試験：純度はクロマトグラフィー法１つ以上を用いて計測する。存在する原薬の分離および核酸類縁体の数に応じて、直交分離法を用いてＡＰＩの純度をモニタリングしてよい。分離は以下の手段により達成してよい。
【０６５４】
ＳＡＸ−ＨＰＬＣ：オリゴヌクレオチドホスホジエステルと分離を行うために緩衝塩勾配を用いた強力なアニオン交換ＨＰＬＣカラムとの間のイオン交換相互作用。
【０６５５】
ＲＰ−ＨＰＬＣ：オリゴヌクレオチドと分離を行うために水性緩衝液対有機溶媒の勾配を用いた疎水性逆相ＨＰＬＣカラムとの間の分配相互作用。
【０６５６】
キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）：ゲル充填キャピラリー内部の緩衝溶液中の分子篩による電気泳動分離。分離は電場を適用すると起こり、アニオン性のオリゴヌクレオチドはそれらがゲルマトリックスを通過しながら遊走するに従い、分子の大きさにより分離される。全ての分離方法において、ピークは一般的にオリゴヌクレオチドの長さの順番で溶出し、２６０ｎｍにおいてＵＶ検出される。
他の試験
【０６５７】
物理的外観：原薬試料を目視により検査する。この試験は物質が凍結乾燥された固体の特徴を有することを判定し、固体の色を識別し、目視可能な夾雑物が存在するかどうかを調べるものである。
【０６５８】
細菌内毒素試験：細菌内毒素試験は９６穴プレートにおいて動的濁度測定法を用いながらリムルスアメーバ様細胞分解産物（ＬＡＬ）試験により実施する。原薬に関する内毒素限度は、賦形剤と組み合わせた場合に投与される薬剤製品中の内毒素に関する一日当たりの許容限度を超過しないように、適切に設定される。
【０６５９】
好気的生物負荷：好気的生物負荷はＵＳＰの＜６１＞章に基づいた方法を用いて関連実験施設により実施する。
【０６６０】
アセトニトリル含有量：残留アセトニトリル分析はガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いながら関連実験施設により実施する。アセトニトリルは上流の合成工程において使用される主要な有機溶媒であるが、数種の他の有機試薬も合成で使用される。後の精製プロセスの工程において典型的には原薬中の溶媒は除去される。プロセス開発作業の結果に応じて他の溶媒もモニタリングしてよい。溶媒はＩＣＨ限度内に制限される。
【０６６１】
水含有量：水含有量は固体蒸発器ユニット（オーブン）を用いながら定量的カールフィッシャー（ＫＦ）滴定により測定する。水は典型的には組成物の数重量％として核酸原薬中に存在し、そのため、モニタリングされる。
【０６６２】
ｐＨ：再建された原薬のｐＨはヒトへの注射に関する適性を確保するためにモニタリングされる。
【０６６３】
イオン含有量：ナトリウム、クロリドおよびホスフェートに関する試験は、標準的な原子吸光およびイオンクロマトグラフィー法を用いながら関連実験施設により実施される。イオンの一般的なモニタリングは、原薬を配合している薬剤製品の浸透圧が許容できる生理学的範囲内となることを確保するために実施される。
【０６６４】
金属含有量：該当する金属に関する試験は、標準的な分析方法である誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）スペクトル測定を用いて、関連実験施設により実施される。
実施例４：ｓｉＮＡ活性を試験するためのＲＮＡｉインビトロ試験
【０６６５】
無細胞系においてＲＮＡｉを反復するインビトロ試験を用いてＲＮＡ標的をターゲティングしているｓｉＮＡコンストラクトを評価する。試験は標的ＲＮＡを用いた場合の使用に適合させたＴｕｓｃｈｌ等、１９９９，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３，３１９１−３１９７およびＺａｍｏｒｅ等、２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３により記載された系を含む。シンシチウム芽細胞皮膚から誘導したショウジョウバエ抽出物を用いることによりインビトロでＲＮＡｉ活性を再建する。標的ＲＮＡはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いながら、または、本明細書に記載する化学合成を介して、適切な標的発現プラスミドからのインビトロ転写を介して形成する。センスおよびアンチセンスのｓｉＮＡ鎖（例えば各々２０ｕＭ）を緩衝液（例えば１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）中、９０℃で１分間、ついで３７℃で１時間インキュベートすることによりアニーリングし、次に溶解緩衝液（例えば１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）中に希釈する。アニーリングはＴＢＥ緩衝液中のアガロースゲル上のゲル電気泳動によりモニタリングし、臭化エチジウムで染色することができる。ショウジョウバエ溶解液は塩素化され、溶解されたコウボ処理糖蜜液寒天上に収集したＯｒｅｇｏｎＲハエ由来の０〜２時間齢の胚を用いながら調製する。溶解物を遠心分離し、上澄みを単離する。試験は５０％溶解物（ｖ／ｖ）、ＲＮＡ（１０〜５０ｐＭ終濃度）およびｓｉＮＡ含有（１０ｎＭ終濃度）１０％（ｖ／ｖ）溶解緩衝液を含有する反応混合物を含む。反応混合物はまた１０ｍＭリン酸クレアチン、１０ｕｇ／ｍｌクレアチンホスホキナーゼ、１００ｕｍ  ＧＴＰ、１００ｕＭ  ＵＴＰ、１００ｕＭ  ＣＴＰ、５００ｕ  ＭＡＴＰ、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．１Ｕ／ｕＬ  ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および１００ｕＭの各アミノ酸も含有する。酢酸カリウムの終濃度は１００ｍＭに調節する。反応物は氷上に予備組み立てし、１０分間２５℃でプレインキュベートした後、ＲＮＡを添加し、次に更に６０分間２５℃でインキュベートする。反応物を４容量の１．２５ｘ受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）でクエンチングする。標的ＲＮＡの切断は、ＲＴ−ＰＣＲ分析または当分野で知られた他の方法により試験し、反応からｓｉＮＡを省いてある対照反応と比較する。
【０６６６】
或いは、試験のための内部標識された標的ＲＮＡを［α−３２Ｐ］ＣＴＰの存在下のインビトロ転写により調製し、スピンクロマトグラフィーによりＧ５０セファデックスカラムに通し、更に精製することなく標的ＲＮＡとして使用する。場合により、標的ＲＮＡはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて５’−３２Ｐ末端標識される。試験は上記した通り実施し、標的ＲＮＡおよびＲＮＡｉにより形成された特異的ＲＮＡ切断産物をゲルのオートラジオグラフ上で可視化する。切断のパーセンテージは未損傷の対照ＲＮＡまたはｓｉＮＡを用いない対照反応に由来するＲＮＡおよび試験により形成された切断産物を示すバンドのＰＨＯＳＰＨＯＲ  ＩＭＡＧＥＲ（登録商標）（オートラジオグラフィー）定量により測定する。
【０６６７】
１つの実施形態において、この試験はｓｉＮＡ媒介ＲＮＡｉ切断に関する標的ＲＮＡ標的における標的部位を調べるために使用され、その場合、複数のｓｉＮＡコンストラクトを、例えば標識された標的ＲＮＡの電気泳動によるか、またはノーザンブロッティングによるか、当分野で周知の他の方法によるかして、標的ＲＮＡ標的のＲＮＡｉ媒介切断に関してスクリーニングする。
実施例５：ＥＮａＣ遺伝子発現のダウンレギュレーションを評価するために有用な動物モデル
【０６６８】
インビトロで活性なｓｉＮＡコンストラクトを同定した後、気道ＥＮａＣ機能のげっ歯類モデルを使用してイオン輸送の低減におけるＥＮａＣをターゲティングするｓｉＮＡの有効性を評価することができる。適当なモデルはＣｏｏｔｅ，Ｋ．Ｊ．等（２００８）Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００８年９月２２日オンライン提出、ｐｐｌ−９；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｂｊｐ．２００８．３６３）により記載されているモルモットモデルである。このモデルはモルモットにおける気道上皮イオン輸送を計測するために気管の電位差を用いている。
実施例６：ＥＮａＣ遺伝子発現のＲＮＡｉ媒介阻害
【０６６９】
ｓｉＮＡコンストラクト（表１ｂ）は例えばＡ５４９ヒト肺癌細胞におけるＥＮａＣ  ＲＮＡ発現を低減する場合の薬効に関して試験してよい。Ａ５４９（ヒト；ＡＴＣＣ  ｃａｔ＃ＣＣＬ−１８５）細胞を５％ＣＯ２存在下に３７℃で培養し、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを含有するように調節され、１０％および１００Ｕ／ｍＬペニシリンの終濃度でウシ胎児血清を補給した２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有するＨａｍ’ｓＦ１２Ｋ培地中で生育させた。Ａ５４９細胞は約２４時間プレーティングした後に、７，５００細胞／ウェル、１００μｌ／ウェルで９６穴プレート中でトランスフェクトした。２４時間後、ｓｉＮＡおよびリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する複合物を以下の通り作成した。即ち、終濃度１４μｇ／ｍｌでリポフェクタミン２０００を含有するＯＰＴＩ−ＭＥＭ中のリポフェクタミン２０００の溶液を調製した。並行して、ｓｉＮＡの溶液を終濃度１５０ｎＭでＯＰＴＩ−ＭＥＭ中に調製した。両方の溶液を２０分間２０℃でインキュベートした後、等容量のｓｉＮＡ溶液およびリポフェクタミン２０００溶液をｓｉＮＡの各々に対して共に添加した。得られた溶液は終濃度７５ｎＭのｓｉＮＡおよび終濃度７μｇ／ｍｌのリポフェクタミン２０００を有する。この溶液を２０分間２０℃でインキュベートした。インキュベーションの後、溶液５０μｌをウェルの各々に添加した（３連）。各ウェル中のｓｉＮＡの終濃度は２５ｎＭであり、各ウェル中のリポフェクタミン２０００の終濃度は２．３３μｇ／ｍｌであった。プレートは、採取前に培地を交換することなく４８時間インキュベートした。用量応答曲線は、３連で実施し、各トランスフェクションにおいてリポフェクタミン２０００の一定量を維持した各濃度で同様の様式において求めた。
【０６７０】
ＲＮＡはプロトコルを僅かに変更してＩｎｖｉｔｅｋ  Ｉｎｖｉｓｏｒｂ  ＲＮＡ  Ｃｅｌｌ  ＨＴＳ  ９６キット／Ｃ（カタログ番号７０６１９０００）を用いながら９６穴プレートから抽出した。各プレートからＲＮＡを単離するためのプロトコルの詳細を以下に記載する。
１）レーキを用いて培地を吸引する。
２）１５０ｕｌ／ウェルの溶解緩衝液を添加する。
３）１分間プレート振とう器上に置く。
４）．５ｍｌの収集プレートの上面にＤＮＡ結合プレートを置く。
５）１９０ｕｌを２回ピペッティングにより上下させ、ＤＮＡ結合プレートに添加する。
６）プレートを被覆する。
７）４０００ＲＰＭで４分間プレートを遠心分離する。
８）ＤＮＡ結合プレートを傾瀉する。
９）２ｍｌの収集プレートの上面にＲＮＡ結合プレートを置く。
１０）１５０ｕｌ／ウェルの結合緩衝液Ｒを０．５ｍｌの収集プレートに添加する。
１１）０．５ｍｌの収集プレートの内容物をＲＮＡ結合プレートに移動する。
１２）１分間インキュベートする。
１３）４０００ＲＰＭで４分間プレートを遠心分離する。
１４）ＲＮＡ結合プレートに６００ｕｌ／ウェルの洗浄緩衝液Ｒ１を添加する。
１５）４０００ＲＰＭで４分間プレートを遠心分離する。
１６）２ｍｌの収集プレートから洗浄緩衝液を廃棄する。
１７）ＲＮＡ結合プレートに４００ｕｌ／ウェルの洗浄緩衝液Ｒ２を添加する。
１８）４０００ＲＰＭで４分間プレートを遠心分離する。
１９）ＲＮＡ結合プレートに４００ｕｌ／ウェルの洗浄緩衝液Ｒ２を添加する。
２０）４０００ＲＰＭで１０分間プレートを遠心分離する。
２１）２ｍｌの収集プレートから洗浄緩衝液を廃棄する。
２２）４０００ＲＰＭで３分間プレートを遠心分離する。
２３）２ｍｌの収集プレートを傾瀉し、ＲＮＡ結合プレートをマイクロタイタープレート上に置く。
２４）ＲＮＡ結合プレートに溶出緩衝液１００ｕｌ／ウェルを添加する。
２５）２分間インキュベートする。
２６）プレートを密封する。
２７）４０００ＲＰＭで３分間プレートを遠心分離する。
２８）ＲＮＡ結合プレートを傾瀉する。
２９）−８０℃の冷凍庫保存のためにマイクロプレートを被覆する。
６穴プレートトランスフェクションプロトコル
【０６７１】
トランスフェクション当日、約１５０，０００細胞を生育培地２ｍｌ中６穴プレートに播種した。約３時間後、リポフェクタミン２０００試薬（ウェル当たり２．５μｌ）を用いながら１２．５、２５、５０または１００ｎＭの終濃度のｓｉＮＡで細胞をトランスフェクトした。ｓｉＮＡ−リポフェクタミン２０００複合体（２５ｎＭ  Ｃｆにおいて）は以下の通り調製した、即ち（ａ）１μＭのｓｉＮＡ保存溶液を２５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ還元血清培地中に希釈し（得られるｓｉＮＡ濃度は２５０ｎＭであった）；（ｂ）リポフェクタミン２０００試薬のワーキング溶液を１：１００の比でＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に保存溶液を希釈することにより調製し、次にこれを混合し、室温で５分間インキュベートし；（ｃ）希釈したｓｉＮＡ２５０μｌを等容量のリポフェクタミン２０００のワーキング溶液と混合し（得られるｓｉＮＡの濃度は１２５ｎＭであった）；並びに（ｄ）混合物５００μｌをウェルに添加した（得られるｓｉＮＡの濃度は２５ｎＭである）。次に細胞を４８時間３７℃でインキュベートした。
定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）
【０６７２】
一連のプローブおよびプライマーを用いてマウス、ラット、およびヒトの細胞系統においてＥＮａＣαおよびＧＡＰＤＨの遺伝子の種々のｍＲＮＡ転写物を検出した。試験は製造元の説明書に従ってＡＢＩ７５００機器上で実施した。各実験内において、ベースラインは増幅曲線の指数期に設定し、増幅曲線とのベースラインの交点に基づいて、Ｃｔ曲線を機器により割り付けた。次にこのＣｔ曲線に標準曲線に基づいてＱＴＹ値を割り付けた。ここで種々の実験における標準曲線は、実験的トランスフェクションのために使用したものと同じ細胞系統から抽出したＲＮＡ  １ｎｇ〜３００ｎｇを使用した。
ＥＮａＣウエスタンブロット
【０６７３】
ウエスタンブロット実験用のタンパク質原料は６穴プレート中Ａ５４９細胞のトランスフェクションより得た。細胞を２ｍＬ完全培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、Ｃｅｌｌｇｒｏカタログ番号１０−０８０−ＣＶ＋１０％ＦＢＳ）に播種した（〜１５０，０００／ウェル）。細胞は、リポフェクタミン２０００を用いながら２５ｎＭ（３連）の終濃度のｓｉＮＡ分子で播種後３〜４時間にトランスフェクトした。ｓｉＮＡは４８時間インキュベートした。タンパク質試料は「ＰＡＲＩＳ」タンパク質およびＲＮＡ単離システム（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号１９２１）を用いながら製造元の説明書に従って調製した。細胞溶解物中の全タンパク質の量はＢｒａｄｆｏｒｄ染料試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号５００−０２０５）を用いながら計測した。
【０６７４】
ウエスタンブロット試験は５％  ２−メルカプトエタノールを含有する２ＸＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中タンパク質試料を１：１希釈することにより４〜１２％ＮｕＰＡＧＥプリキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＮＰＯ０３２２ＢＯＸ）上で泳動させ、９５℃で５分間インキュベートした。各レーンに２０μｇのタンパク質をロードした（製造元の推奨するプロトコルに従って加えたマーカーレーンを除く）。ゲルを約２時間、または２０ｋＤの標準マーカーがゲル底部に到達するまで、１００Ｖで泳動した。電気泳動の分割の後、タンパク質をＰＶＤＦ膜に移した（１００Ｖで１時間）。ＰＢＳ中カゼイン（１％）を使用しながら、膜をブロッキングした（室温で６０分；プレート振とう器上）。一次ウサギポリクローナル抗体（Ａｂｅａｍ＃ａｂ３４６４）を１％カゼイン／ＰＢＳ中１：５００に希釈し、一晩ロッカー上４℃で膜と共にインキュベートした。ブロットを各々０．１％Ｔｗｅｎ／ＰＢＳ溶液で５分間３回洗浄した。ブロットをロッカー上室温で３０分間１：２５，０００の希釈で二次抗体溶液（ヤギ抗ウサギ抗体、Ｊａｃｔｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１１１−０３５−１４４）と共にインキュベートした。このインキュベーションの後、ブロットを各々０．１％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ溶液で５分間３回迅速にすすいだ。ブロットを１〜２分間、ＥＣＬ＋試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ＃ＲＰＮ２１３３）と共に、製造元の説明書に従ってインキュベートした。次にブロットを画像化した。
【０６７５】
上記したウエスタンブロット試験を用いて本発明のｓｉＮＡ分子がＥＮａＣαのタンパク質レベルを低減したことを確認した。
ＲＡＣＥ分析
【０６７６】
９６穴プレートを用いながら、Ａ５４９細胞を２５ｎＭ活性または２５ｎＭ対照ｓｉＮＡのいずれかで処理した。十分なＲＮＡ（５μｇ）を得るために１つの９６穴プレートを各投与のために使用した（９６連）。２４時間のトランスフェクションの後、全ＲＮＡを標準的なＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）単離により、９６穴プレート当たり２ｍｌのＴｒｉｚｏｌを用いながら単離した。単離したＲＮＡをＲＡＣＥプロトコルのために使用した。
【０６７７】
７μｌのＨ２Ｏ中の５μｇの全ＲＮＡを凍結乾燥されたＧｅｎｅＲａｃｅｒ  Ｏｌｉｇｏに添加し、５分間６５℃でインキュベートすることにより、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  Ｏｌｉｇｏを全ＲＮＡにライゲーションした。混合物を２分間氷上に置き、短時間遠心分離し、次にこれに１μｌの１０ｘリガーゼ緩衝液、１μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ、１μｌのＲＮＡｓｅ  Ｏｕｔ（４０Ｕ／μｌ）および１μｌのＴ４  ＲＮＡリガーゼ（５Ｕ／μｌ）を添加した。混合物を穏やかに混合し、次に１時間３７℃でインキュベートした。１時間のインキュベーションの後、９０μｌのＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏおよび１００μｌのフェノール：クロロホルムを添加した。混合物を３０秒間高速回転し、次に高速で５分間遠心分離した。水層を新しいエッペンドルフ管に移した。この層に、２μｌのグリコーゲン、１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムを添加し、次に混合した。次にエタノール２２０μｌを添加した。混合物を数回反転させることにより混合し、次に１０分間ドライアイス上に置いた。これを２０分間４℃で高速遠心分離した。次に上澄みを吸引し、７０％エタノールで洗浄した。これを高速で５分間遠心分離し、上澄みを除去した。ペレットを２〜３分間乾燥させた。ペレットを１０μｌのＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏに懸濁した。
【０６７８】
ライゲーションしたＲＮＡ１０μｌに、１μｌの１０μＭＲＴ−プライマー（ＥＮａＣαプライマー１）、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、および１μｌのＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏを添加し、次に混合物を５分間６５℃でインキュベートし、その後２分間氷上に置き、短時間遠心分離した。これに４μｌの５ｘ第１鎖緩衝液、１μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ、１μｌのＲＮＡｓｅ  Ｏｕｔ（４０Ｕ／μｌ）および１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ（２００Ｕ／μｌ）を添加した。混合物を穏やかに混合し、次に５０℃で４５分間、ついで６５℃で７分間インキュベートした。ＲＴ反応は１５分間７０℃でインキュベートし、次に氷上に置くことにより不活性化した。混合物を短時間遠心分離した。次にこれに１μｌのＲＮａｓｅ  Ｈ（２Ｕ）を添加し、その後穏やかに混合し、次に２０分間３７℃でインキュベートした。次にこの混合物を−２０℃で保存するか、または即座にＰＣＲに使用した。
【０６７９】
鋳型として上記ＲＴ反応１μｌを使用しながら、標準的なＰＣＲ増幅を３４サイクル、５’ＧｅｎｅＲａｃｅｒプライマーおよび３’Ｇｅｎｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃプライマー（ＥＮａＣαプライマー１）を用いて行った。特異性は６０℃のアニーリング温度を用いることにより増大させた。鋳型として上記ＰＣＲ反応１μｌを使用しながら、ネステッドＰＣＲ反応を３４サイクル、ＧｅｎｅＲａｃｅｒネステッド５’プライマーおよびネステッド３’Ｇｅｎｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃプライマー（ＥＮａＣαプライマー２）を用いて行った。特異性は６０℃のアニーリング温度を用いることにより増大させた。試料をネイティブの６％ＰＡＧＥ上で分析した。予測された大きさのバンドを切り出し、ＧｅｎｅＲａｃｅｒキットと共に提供されたＳＮＡＰカラムを用いてゲルから溶出させた。溶出したゲルバンドをＧｅｎｅＲａｃｅｒキットと共に提供されたＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキットを用いてクローニングした。コロニーを含有しているＬＢ−Ａｍｐ寒天プレートをＰＣＲスクリーニングし、配列決定した。
【表３】
2012509688.tif 000048
【０６８０】
全てのＩＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍソフトウエア、特に単純なリガンド結合に対してジグモイドの変数傾きの曲線を用いながらデータから計算した。また、特段の記載が無い限り、ｓｉＮＡの薬効および力価（例えば％ノックダウン）の全ての計算は、非ターゲティング対照ｓｉＮＡとの相対比較において行った。報告されている場合のＰ値は不等分散に対するＷｅｌｃｈ補正を含むＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて計算した。
【０６８１】
ｍＲＮＡの％ノックダウンの計算の全てにおいて、特段の記載が無い限り、非ターゲティング対照（ＮＴＣ）を投与した試料における対象の遺伝子の発現の規格化されたレベルとの相対比較において、計算を行った。対象の遺伝子の発現レベルを、各試料におけるＧＡＰＤＨまたは３６Ｂ４（種による）の発現レベルで割った。各実験における各条件につき３連を平均し、これらの試料の標準偏差を計算した。次に以下の式を用いて対象の遺伝子のノックダウンの％を計算した。
【数１】
2012509688.tif 000049
【０６８２】
規格化されたデータをグラフ化し、その該当する反転対照ｓｉＮＡとの比較において活性なｓｉＮＡによる標的ｍＲＮＡのパーセント減少を計算する。
結果
【０６８３】
ＥＮａＣα  ｓｉＮＡは前述の通り設計して合成した。ｓｉＮＡは３つの細胞系統、ヒトＡ５４９細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３およびラットＨ−４−ＩＩ−Ｅ細胞においてスクリーニングした。３種全てにおけるＥＮａＣα  ｓｉＮＡのスクリーンから得られたデータを表３ａ、３ｂ、４ａ、４ｂ、５ａ、および５ｂに示し、特定のｓｉＮＡ分子に関するデータの総括を表６に示す。各スクリーニングは２４時間に実施した。この時点を使用する決定はこの時点で観察されたｍＲＮＡのノックダウンの程度に基づいていた。
【表４】
2012509688.tif 000050
【表５】
2012509688.tif 000051
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【０６８４】
ＲＡＣＥ実験によれば、表６における部位に相当するｓｉＮＡコンストラクトは標的ＲＮＡのＲＩＳＣ媒介切断を示したことが確認された。即ち、ＲＮＡノックダウンがＲＮＡｉ活性の直接の結果であったことが立証された。
実施例７：ヒト気管支上皮細胞におけるＥＮａＣ  ｓｉＮＡの最大ＥＮａＣ  ｍＲＮＡノックダウンおよび薬効
細胞培養物の調製
【０６８５】
Ｌｏｎｚａより入手したヒト気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ細胞）（カタログ番号ＣＣ−２５４０）を５％ＣＯ２の存在下に３７℃で生育させ、Ｂｉｏｃｏａｔコラーゲン１コーティングフラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上のＢＥＢＭ基礎培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＣＣ−３１７１）中で培養した。
【０６８６】
ヒトＵ２ＯＳ−ＴＬＲ７およびヒトＵ２ＯＳ−ＴＬＲ８細胞を５％ＣＯ２の存在下に３７℃で生育させ、１０％および１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００ｕ／ｍＬペニシリンの濃度でウシ胎児血清を補給したダルベッコの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１％非必須アミノ酸中で培養した。ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の安定な発現は、３００ｕｇ／ｍｌゲンタマイシンの添加により維持した。
【０６８７】
組み換えＨＥＫ２９３細胞系統（ＥＮａＣベータ＆ガンマを発現）ＳＣＮＮ１Ｂ（Ｐ６１８ＡＹ６２０Ｌ＋ＳＣＮＮＩ１Ｇ（Ｐ６２４終止）＃２４をＣＯ２の存在下に３７℃で生育させ、Ｍ１倍地Ｍ１＋０．５ｍｇ／ｍｌゲネチシンおよび０．２ｍｇ／ｍｌハイグロマイシン中で培養した。
トランスフェクション
【０６８８】
ＮＨＢＥにおけるｍＲＮＡノックダウンおよびＥＣ５０：細胞をコラーゲン１コーティングプレートにプレーティングし、適切な培養基中で培養した。細胞を５％ＣＯ２の存在下３７℃でプレーティング後２４時間培養した。ｓｉＮＡはＯｐｔｉＭＥＭ１中１ｕＭにまで希釈し、送達脂質ＧＳＫ２１２３５７Ａは２５ｕｇ／ｍｌとした。ｓｉＮＡの製剤のために、等容量の希釈ｓｉＮＡおよび送達脂質を混合し、室温で２０分間インキュベートした。その間細胞をトリプシン処理し、１５０，０００細胞／ｍｌで抗生物質非含有ＢＥＢＭ培地中に再懸濁した。製剤化したｓｉＮＡ２０ｕｌおよびＢＥＢＭ培地８０ｕｌを９６穴プレートのウェル当たり添加（６連／データポイント／ｓｉＲＮＡ濃度）することにより、ｓｉＲＮＡの９点用量範囲とした（１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、０．３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０１ｎＭ）。ＧＳＫ２１２３５７Ａ−ｓｉＮＡ複合体と共にインキュベートした時間は４８時間であり、２４時間で培地を１回交換した。
【０６８９】
ＴＬＲ３媒介免疫刺激：エンドソームＴＬＲ３媒介免疫刺激の計測のためにＮＨＢＥ細胞を上記の通り処理し、その際ＯＡＳ１  ｍＲＮＡアップレギュレーションに関する陽性対照としてＰｏｌｙＩ：Ｃを使用した。膜結合ＴＬＲ３媒介免疫刺激の計測のためには、ＮＨＢＥ細胞を９６穴当たり１２００細胞で培養し、ｓｉＲＮＡを（１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、０．３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０１ｎＭ）において送達ビヒクル非存在下ＰＢＳ中投与した。
【０６９０】
ＴＬＲ７およびＴＬＲ８媒介免疫刺激：ＴＬＲ７およびＴＬＲ８発現Ｕ２ＯＳ骨肉種細胞をトランスフェクションの２４時間前に２ｘ１０４細胞／ウェルの濃度で９６穴プレートのフォーマットにおいて播種した。対照（１００μｌ／ウェル）としてそれぞれＲｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（Ｒ８４８）およびＬｙｏＶｅｃ複合体化ＧＵリッチオリゴヌクレオチドｓｓＲＮＡ４０を用いながら、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１脂質トランスフェクション試薬を用いてｓｉＲＮＡで細胞をトランスフェクトした。投与培地は６時間後に抗生物質含有ＤＭＥＭと交換した。細胞をトランスフェクション後２４時間に採取した。Ｒ８４８およびｓｓＲＮＡ４０は刺激時の２つの受容体の特性化されたアゴニストであり；形質転換された骨肉種細胞は用量応答的に増大したＩＬ８発現を示した。アゴニスト濃度範囲４〜１０μｇ／ｍｌは、それが試験に関するＩＬ８  ｍＲＮＡ発現の最適レベルを誘発したことから確立されている。２つのアゴニストＲ８４８およびｓｓＲＮＡ４０の投与後に、ＴＬＲを欠いているネイティブのＵ２ＯＳ細胞系統では有意なＩＬ８発現は観察されなかった。
【０６９１】
ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１は、それが低免疫刺激作用を高送達効率と組み合わせていることから、ｓｉＲＮＡのための送達剤として使用した。
【０６９２】
ＥＮａＣαを過剰発現する細胞におけるＦＬＩＰＲを介したＥＮａＣに対する機能的作用：逆トランスフェクション法を用いてＨＥＫ組み換え細胞系統をトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ（適切な濃度にまでＯｐｔｉｍｅｍ中に希釈）５ｕｌを３８４穴の非コーティングＦＬＩＰＲプレート中、Ｏｐｔｉｍｅｍ中に希釈したＧｅｍｉｎｉ脂質トランスフェクション試薬５ｕｌと混合した。プレートを２０分間室温でインキュベートすることにより複合体を形成した。細胞を採取し、遠沈させ、３ｘ１０５／ｍｌに希釈し、トランスフェクション複合体を含有する３８４穴プレートフォーマット中４０ｕｌ／ウェル（１２Ｋ／ウェル）でプレーティングした。プレートを２０時間一晩インキュベートした。次に細胞をＢａｃＭａｍウィルス発現ＥＮａＣα（ＳＣＮＮ１Ａを発現するＢａｃＭａｍウィルス、ＧＲＩＴＳ２９７０３、力価０．３５６ｘ１０８／ｍｌ）で形質導入した。ウィルス３０ｕｌを２０Ｋ／ウェルで添加し（１．７％）、ＭＯＩは約１であった。細胞を２４時間インキュベートした。ＦＬＩＰＲ試験当日、培地を吸引し、１０ｕｌの容量とした。ウェル当たり染料２０ｕｌを負荷した（ＦＭＰ２ブルー染料、Ｒ８１８１、ＭＤＳ；各ポットにつき１３３ｍｌのＴｙｒｏｄｅｓ緩衝液を希釈して１Ｘ保存溶液とした後、試験を開始）。プレートを室温で０．５時間インキュベートし、化合物１０ｕｌをオンラインで添加した後ＦＬＩＰＲを読み取った（ＦＬＩＰＲ設定：プロトコルＮａＭＰ．ｆｃｆ、曝露長０．４秒およびフィルター２番）。化合物プレート：１ｕｌ容量、カラム１、２および３は１６、４および０ｕＭのアミロリド終濃度とした（１／２００希釈）（ＩＣ８０、ＩＣ５０および対照）。添加したＦＭＰ２染料／クエンチャーはＦＬＩＰＲ試験におけるＮａ＋、添加した阻害剤アミロリドをＩＣ８０（１６ｕＭ）またはＩＣ５０（４ｕＭ）で計測する。
【０６９３】
ＲＮＡ単離９６穴プレート：全ＲＮＡは自動化ＳＶ９６全ＲＮＡ単離システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いながら、製造元の説明書に従って、９６穴プレートフォーマットにおいて細胞から単離した。Ｂｉｏｍｅｋ２０００実験室自動ワークステーション（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてトランスフェクトした細胞の溶解物をシリカ膜に適用した。次にＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅＩを直接シリカ膜に適用することにより夾雑ゲノムＤＮＡを消化した。結合した全ＲＮＡは更に、単純な洗浄工程により、夾雑する塩、タンパク質および細胞不純物から精製した。最後にヌクレアーゼ非含有水を添加することにより膜から全ＲＮＡを溶出させた。
【０６９４】
ＲＮＡ単離３８４穴プレート：ＱｉａｇｅｎターボキャプチャーＲＮＡ調製キットを用いながら、製造元の説明書に従ってｍＲＮＡを抽出する。
【０６９５】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）：ヒト細胞系統におけるＥＮａＣα、ＯＡＳ１、ＩＬ８およびＧＡＰＤＨ（対照／規格化として）のｍＲＮＡ転写物の検出のために一連のプローブおよびプライマーを用いた。試験はＡＢＩ７９００ＨＴ機器上で製造元の説明書に従って実施した。使用したプライマープローブセット：ＧＡＰＤＨフォワード５’−ＣＡＡＧＧＴＣＡＴＣＣＡＴＧＡＣＡＡＣＴＴＴＧ−３（配列番号１２８）、’リバース５’−ＧＧＧＣＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＣＴＴＣＴ−３’（配列番号１２９）、プローブ５’ｄＦＡＭ−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣＴＧＣＣＡ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号１３０）、ＥＮａＣαフォワード５’−ＡＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＡＴＧＧＧＴＣＴＴＣ−Ｓ’（配列番号１３１）、リバース５’−ＡＣＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＡＴＴＴＣＴＣＴ−３’（配列番号１３２）、プローブ５’ｄ  ＦＡＭ−ＴＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＣＡＧＡＡＣＡＡＴＴＡＣＡＣＣＧＴＣ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号１３３）、ＯＡＳｌフォワード５’−ＡＣＣＴＡＡＣＣＣＣＣＡＡＡＴＣＴＡＴＧＴＣＡＡ−Ｓ’（配列番号１３４）、リバース５’−ＴＧＧＡＧＡＡＣＴＣＧＣＣＣＴＣＴＴＴＣ−３’（配列番号１３５）、プローブ５’ｄＦＡＭ−ＣＴＣＡＴＣＧＡＧＧＡＧＴＧＣＡＣＣＧＡＣＣＴＧ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号１３６），ＩＬ８Ｆｏｒｗａｒｄ５’−ＣＴＧＧＣＣＧＴＧＧＣＴＣＴＣＴＴＧ−３’（配列番号１３７）、リバース５’−ＣＣＴＴＧＧＣＡＡＡＡＣＴＧＣＡＣＣＴＴ−３’（配列番号１３８）、プローブ５’ｄＦＡＭ−ＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＧＡＴＴＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＴＧ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号１３９）。
計算：
【０６９６】
Ｔａｑｍａｎ：臨界閾値（Ｃｔ）を３８４穴プレートの各ウェルにおいて分析した特定の遺伝子に相当するコピー数に変換した。６つの同一のウェルを所定の処理に対して各プレートに調製した。即ち、平均遺伝子コピー数および標準偏差を計算した。パーセント変動係数（ＣＶ）（％ＣＶ＝［標準偏差／平均］＊１００）を求めることにより値が域外値であるウェルを排除できた（これにより％Ｃ．Ｖ．＜２５）。遺伝子の相対的豊富度（ａｋａ相対発現）は、その遺伝子の平均コピー数をその特定の試料中のそのＧＡＰＤＨ対応値で割ることにより求めた。
データの統計学的分析
【０６９７】
ＥＣ５０値はシグマプロットを用いながらデータから計算した。ｓｉＮＡの薬効および力価の全ての計算は非ターゲティング対照ｓｉＮＡとの相対比較において行った。
【０６９８】
パーセントノックダウンは４つの化学修飾されたｓｉＮＡ（標的部位１１８１（配列番号５７および５８）、標的部位７８２（配列番号５１および５２）、標的部位１３８３（配列番号６３および６４）および標的部位１３８８（配列番号７３および７４））の間で比較した。データはＡＮＯＶＡ試験で分析し、次に誤り発見率（ＦＤＲ）による補正を用いながら多重比較に関してｐ値を補正した。９５％信頼区間プロットも作成することにより指標が相互に有意に異なっている点をグラフで示した。
結果
【０６９９】
標的部位７８２（配列番号５１および５２）、１１８１（配列番号５７および５８）、１３８３（配列番号６３および６４）および１３８８（配列番号７３および７４）に対する高度に効果的で強力なｓｉＮＡは、ヒト正常気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ）におけるＥＮａＣα  ｍＲＮＡの最大並びに用量依存性のノックダウン（ＫＤ）を示すために用いられている。
【表１１】
2012509688.tif 000057
【０７００】
更に、１００ｎＭの最大用量における４種のｓｉＮＡのＯＡＳ１（免疫刺激のバイオマーカー）ｍＲＮＡレベルの免疫刺激ＴＬＲ３媒介％増大も評価した。９点用量応答を０．０１〜１００ｎＭ  ｓｉＮＡで実施した。
【０７０１】
エンドソームＴＬＲ３媒介免疫刺激は、ＮＨＢＥ細胞が送達ビヒクル（Ｇｅｍｉｎｉ界面活性剤ＧＳＣ１７０Ｄａｂ−ＷＯ０３／８２８０９における実施例３７）を用いて製剤化されたｓｉＮＡでトランスフェクトされた場合の、ＯＡＳ１ｍＲＮＡレベルにおける％増大を記録することにより計測した（Ｇｅｍｉｎｉ送達ビヒクル対照と相対比較した場合のＯＡＳ１ｍＲＮＡレベルの％増大）。ＴＬＲ３アゴニストＰｏｌｙ  Ｉ：ＣをＯＡＳ１ｍＲＮＡ誘導の陽性対照として使用する。
【０７０２】
ＴＬＲ７およびＴＬＲ８媒介免疫刺激は、ｓｉＮＡをＤｈａｒｍａＦｅｃｔ１（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて製剤化し、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８を安定に発現するように操作されたＵ２ＯＳ細胞に送達した場合の、ＩＬ８ｍＲＮＡレベルの増大により計測した。ＩＬ８  ｍＲＮＡ誘導に関する陽性対照として作用するそれぞれのＴＬＲ７およびＴＬＲ８アゴニストＲｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（Ｒ８４８）およびｓｓＲＮＡ４０／ＬｙｏＶｅｃを細胞に投与した。ＩＬ８ｍＲＮＡレベルはＴＬＲ７およびＴＬＲ８媒介免疫刺激のバイオマーカーとして使用した。
【０７０３】
上記した免疫刺激試験の結果は図２８および図２９および表１５に示す。
【表１２】
2012509688.tif 000058
【０７０４】
ＥＮａＣの機能的活性を阻害するＥＮａＣ  ｓｉＮＡの能力もまた試験した。図３０は標的部位７８２および１１８１をターゲティングするためのＥＮａＣ  ｓｉＮＡ、特にそれぞれ配列番号５１および５２および配列番号５７および５８に相当するｓｉＮＡを用いた組み換えＨＥＫ細胞のトランスフェクションを示す。
【０７０５】
両方のＥＮａＣ−αｓｉＮＡを用いた場合に応答の用量依存的な阻害が観察された。応答の９０％までの阻害がｓｉＮＡの最高濃度で観察された。ＦＬＩＰＲ試験における阻害の程度はＥＮａＣ  ｍＲＮＡノックダウンのレベルと相関している。８５％までのＥＮａＣ−αｍＲＮＡノックダウンが最高濃度のｓｉＮＡで観察された。結果を表１６に総括する。対照（ＵＣ−３）ｓｉＮＡ（Ｃｔｒｌ）によるトランスフェクションはＦＬＩＰＲ試験における未トランスフェクト細胞と比較して１０〜３０％のバックグラウンド阻害をもたらした。
【表１３】
2012509688.tif 000059
実施例８：適応症
【０７０６】
ＥＮａＣ研究の現時点での知見によれば、ＥＮａＣ活性を試験するための方法、および、研究、診断および治療用途のためにＥＮａＣ発現を調節できる化合物の必要性が示されている。本明細書に記載する通り、本発明の核酸分子はＥＮａＣレベルに関連する疾患状態を診断するために試験において使用できる。更に、核酸分子はＥＮａＣレベルに関連する疾患状態を治療するために使用できる。ＥＮａＣ発現のモジュレーションに関連する場合がある特定の疾患状態は、呼吸器、炎症、および自己免疫の疾患、体質、状態および表現型を含むがこれらに限定されない。そのような適応症の非限定的な例を以下に考察する。
【０７０７】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は炎症性の気道および肺胞の疾患の一例であり、その場合炎症の持続的なアップレギュレーションが役割を果たしていると考えられている。ＣＯＰＤにおける炎症は気道内への好中球、ＣＤ８陽性リンパ球、およびマクロファージの増大した浸潤を特徴としている。好中球およびマクロファージは、組織の炎症および損傷を促進するエラスターゼ、メタロプロテアーゼ、および酸素ラジカルを含む多くのメディエーターを放出するそれらの能力のため、ＣＯＰＤにおける気道炎症の発症において重要な役割を果たしている。ＣＯＰＤ患者の気道における炎症細胞の蓄積は、気道内に炎症性細胞を誘引し、それらを活性化し、それらの存在を維持するプロ炎症性サイトカインおよびケモカインの増大した放出により駆動される。存在する細胞はまた、組織に対してマイナスの影響を有し、疾患を永続させる酵素（例えばメタロプロテアーゼ）および酸素ラジカルを放出する。プロ炎症性サイトカインおよびケモカインの膨大なアレイは、ＣＯＰＤ患者の肺の内部において増大することがわかっている。それらのうち、重要な役割はＣＯＰＤ患者の気道において増大している腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン８（ＩＬ−８）により果たされている。
【０７０８】
炎症が役割を果たしていると考えられる呼吸器疾患の別の例は、喘息、嚢胞性線維症、好酸球性咳、気管支炎、肺自家移植片の急性および慢性の拒絶、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、気管支拡張症および副鼻腔炎を含む。喘息は気道の炎症、可逆性の閉塞および気道の応答亢進により定義される。この疾患においては、好中球およびマクロファージも重要である場合があるが、関与する炎症細胞は主に、好酸球、Ｔリンパ球および肥満細胞である。膨大なアレイのサイトカインおよびケモカインが気道において増大しており、炎症、閉鎖および応答亢進を促進することによりこの疾患の病態生理において役割を果たしている。
【０７０９】
好酸球性咳は慢性の咳および気道閉塞または応答亢進のない患者の気道内部の炎症性細胞、主に好酸球の存在を特徴としている。幾つかのサイトカインおよびケモカインは、それらは大部分が好酸球指向性ではあるものの、この疾患において増大する。好酸球は気道内部でリクルートされて活性化され、潜在的には、炎症および咳の永続性において役割を果たす酵素および酸素ラジカルを放出する。
【０７１０】
急性気管支炎は下気道の例えば汚染物、塵、ガスまたは化学物質による感染または刺激の事象の間に起こる急性の疾患である。慢性の気管支炎は、２年間に年間少なくとも３ヶ月間、大部分の日における咳および粘液分泌過多の存在により定義される。急性および慢性の気管支炎の間、気道内部において、炎症細胞、大部分は好中球を、広範なアレイのケモカインおよびサイトカインと共に観察できる。これらのメディエーターはこれらの疾患の間に生じる炎症、症状および粘液生成において役割を果たしていると考えられている。
【０７１１】
サルコイドーシスは慢性の非乾酪化肉芽腫が組織内部で生じる原因不明の疾患である。肺が最も罹患しやすい臓器である。肺の気管支肺胞洗浄液は大部分がリンパ球、マクロファージおよび場合により好中球および好酸球の増大を示す。これらの細胞はまたサイトカインおよびケモカインによりリクルートされて活性化され、疾患の発症に関与すると考えられている。
【０７１２】
肺線維症は慢性呼吸不全をもたらす進行性で慢性の線維症（瘢痕形成）を特徴とする肺組織の疾患である。肺線維症の種々の型および原因が存在するが、全て、炎症細胞の流入と残留、肺組織内のコラーゲン付着を伴った線維芽細胞の活性化および増殖を特徴としている。これらの事象は肺組織内部のサイトカインおよびケモカインの放出に関連すると考えられる。
【０７１３】
急性の鼻炎は鼻または上気道の例えば汚染物、塵、ガスまたは化学物質による感染または刺激の事象の間に起こる急性の疾患である。慢性鼻炎は一定の慢性の鼻汁漏出、鼻詰り、くしゃみおよび痒みの存在により定義される。上気道内部において、急性および慢性の鼻炎の間、広範なアレイのケモカインおよびサイトカインを伴って炎症細胞を観察できる。これらのメディエーターはこれらの疾患の間に生じる炎症、症状および粘液生成において役割を果たしていると考えられている。
【０７１４】
急性の副鼻腔炎は鼻詰り、鼻汁漏出、化膿性の粘液分泌過多、頭痛および副鼻腔痛を特徴とし、発熱を伴うか伴わない副鼻腔の急性の、通常は感染性の疾患である。慢性の副鼻腔炎は急性副鼻腔炎の症状の６ヶ月を超えた持続により定義される。急性または慢性の副鼻腔炎の間、上気道および副鼻腔の内部において、広範なアレイのケモカインおよびサイトカインを伴って炎症細胞を観察できる。これらのメディエーターはこれらの疾患の間に生じる炎症、症状および粘液分泌過多において役割を果たしていると考えられている。
【０７１５】
気管支拡張症は炎症した肥厚壁部を有する拡張した気道を特徴とする呼吸器疾患である。この疾患による損傷は多くの原因、例えば嚢胞性線維症、非嚢胞性線維症の原因、感染後の損傷等から生じる炎症および感染の悪性のサイクルの最終結果である。症状は、気道が慢性的に細菌に感染するに従って、慢性の咳、痰の形成、および倦怠感を含む場合がある。
【０７１６】
上記した通り、これらの炎症性呼吸器疾患は全て、症状、炎症の持続、慢性時には正常組織の破壊または破断をもたらす酵素または酸素ラジカルを放出する種々の炎症細胞をリクルートして活性化するメディエーターの存在を特徴としている。
実施例９：標的ＲＮＡ発現の多機能性ｓｉＮＡ阻害剤
多機能性ｓｉＮＡの設計
【０７１７】
標的部が多機能性ｓｉＮＡコンストラクトに対して発見されれば、ｓｉＮＡの各鎖を、異なる標的核酸配列に相補的な例えば約１８〜約２８ヌクレオチドの長さの相補領域を有するように設計する。各相補領域は、標的配列に相補的ではないが他の配列の相補領域への相補性を含む、約４〜約２２ヌクレオチドの隣接フランキング領域を有するように設計する（例えば図１３参照）。ヘアピンコンストラクトも同様に設計できる（例えば図１４参照）。異なる標的核酸配列の間で共有されている相補的なパリンドロームまたはリピート配列を発見すれば、多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの全体的長さを短くすることができる（例えば図１５および図１６参照）。
【０７１８】
非限定的な例において、単一のｓｉＮＡ分子が多数の標的をサイレント化できるようにする追加的な多機能性ｓｉＮＡ設計の３種の追加的なカテゴリーが提示される。第１の方法は指向性の様式においてｓｉＮＡ（または多機能性ｓｉＮＡ）を連結するリンカーを利用する。これによりインターフェロン応答をトリガーする潜在能力を有するＲＮＡの長い連続したストレッチを形成することなく最も強力なｓｉＮＡを連結することができる。第２の方法はオーバーラップする、または連結された多機能性の設計のデンドリマー伸長であるか；または超分子フォーマットにおけるｓｉＮＡの組織化である。第３の方法は３０塩基対を超えた長さのヘリックスを使用する。ダイサーによりこれらのｓｉＮＡをプロセシングすることにより、新しい活性な５’アンチセンス末端が明らかになるはずである。従って、長いｓｉＮＡは元の５’末端により定義される部位およびダイサープロセシングにより生じた新しい末端により定義されるものをターゲティングできる。伝統的な多機能性ｓｉＮＡ（センスおよびアンチセンス鎖が各々標的を定義している）と組み合わせて使用した場合、この手順は例えば４以上の部位をターゲティングするために使用できる。
１．係留２機能性ｓｉＮＡ
【０７１９】
基本的な考え方は２つのアンチセンスｓｉＮＡ鎖が単一のセンス鎖にアニーリングしている多機能性ｓｉＮＡの設計のための新しい手順である。センス鎖オリゴヌクレオチドはリンカー（例えば本明細書に記載する非ヌクレオチドリンカー）およびアンチセンスｓｉＮＡ鎖にアニーリングする２つのセグメントを含有する（図１９参照）。リンカーはまた場合によりヌクレオチド系のリンカーを含むことができる。この手順に関する幾つかの潜在的利点および変更例を以下に示すがこれらに限定されない。
１．２つのアンチセンスｓｉＮＡは独立している。従って標的部位の選択は、２つの部位の間の配列の保存に関する基準により制約されない。いかなる２つの高度に活性なｓｉＮＡも組み合わせて多機能性ｓｉＮＡを形成することができる。
２．相同性を有する標的部位と組み合わせて使用する場合、２つの遺伝子（例えば異なるアイソタイプ）に存在する配列をターゲティングするｓｉＮＡ、その設計は２つより多い部位をターゲティングするために使用できる。単一の多機能性ｓｉＮＡを例えば２つの異なる標的ＲＮＡのＲＮＡをターゲティングするために使用できる。
３．ある遺伝子をターゲティングするためにセンスおよびアンチセンス鎖の両方を使用する多機能性ｓｉＮＡもまた係留多機能性設計に組み込むことができる。これは単一の複合体で６以上の部位をターゲティングする可能性を残す。
４．２つより多いアンチセンス鎖ｓｉＮＡを単一の係留センス鎖にアニーリングすることが可能である。
５．設計はｄｓＲＮＡの長い連続ストレッチを回避する。従って、インターフェロン応答を開始させる可能性が低い。
６．リンカー（またはそれに結合している修飾、例えば本明細書に記載するコンジュゲート）は複合体の薬物動態特性を向上させるか、またはリポソーム内へのその取り込みを向上させることができる。リンカーに導入された修飾は、直接ｓｉＮＡに結合された場合にそれが影響すると同程度までｓｉＮＡ活性に影響してはならない（例えば図２４および図２５参照）。
７．センス鎖はコンジュゲートの結合のための追加的部位を与えるためにアニーリングされたアンチセンス鎖を超えて伸長できる。
８．複合体の極性は、両方のアンチセンスの３’末端がリンカーに隣接し、５’末端がリンカーに遠位となるように、或いはその組み合わせとなるように、切り替えることができる。
デンドリマーおよび超分子のｓｉＮＡ
【０７２０】
デンドリマーｓｉＮＡの手順において、ｓｉＮＡの合成は、まずデンドリマー鋳型を合成し、その後、種々の機能性ｓｉＮＡを結合させることにより開始される。種々のコンストラクトを図２０に示す。結合できる機能的ｓｉＮＡの数は使用するデンドリマーの寸法により制限されるのみである。
多機能性ｓｉＮＡに対する超分子の手順
【０７２１】
超分子フォーマットはデンドリマー合成の難関を簡素化する。このフォーマットにおいては、ｓｉＮＡ鎖は標準的なＲＮＡ化学とその後の種々の相補鎖のアニーリングにより合成される。個々の鎖の合成は５’末端における１つのｓｉＮＡのアンチセンスセンス配列とその後の核酸または合成リンカー、例えばヘキサエチレングリコールを含有し、その後に、５’から３’の方向に他のｓｉＮＡのセンス鎖が続く。即ち、ｓｉＮＡ鎖の合成は標準的な３’から５’の方向に実施できる。３機能性および４機能性ｓｉＮＡの代表例を図２１に示す。同様の原理に基づいて、より高機能性のｓｉＮＡコンストラクトを、種々の鎖の効率的なアニーリングが達成される限り、設計することができる。
ダイサー活用多機能性ｓｉＮＡ
【０７２２】
多数の標的のバイオインフォマティック分析を用いて、異なる標的配列の間で共有されている同一の配列のストレッチを約２〜約１４ヌクレオチド長の範囲で同定することができる。これらの同一領域は、ダイサーによるプロセシングが二次的な機能性５’アンチセンス部位を明らかにできるように、伸長されたｓｉＮＡヘリックス（例えば＞３０塩基対）内に設計することができる（例えば図２２参照）。例えば、ｓｉＮＡアンチセンス鎖（例えば３’ＴＴオーバーハングを有するデュプレックスにおける２１ヌクレオチド鎖）の最初の１７ヌクレオチドが標的ＲＮＡに相補的である場合、２５ｎＭで頑健なサイレンシングが観察された。８０％サイレンシングは同じフォーマットにおける僅か１６ヌクレオチドの相補性でも観察された。
【０７２３】
この特性を約３０〜４０以上の塩基対のｓｉＮＡの設計に組み込むと、追加的な多機能性のｓｉＮＡコンストラクトが得られる。図２２の例は３０塩基対デュプレックスがどのようにしてダイサー−ＲＮａｓｅＩＩＩによりプロセシングされた後に３つの区別可能な配列をターゲティングできるのかを説明しており；これらの配列は同じｍＲＮＡまたは異なるＲＮＡ、例えばウィルスおよび宿主ファクターメッセージ上、またはある経路（例えば炎症カスケード）に反った多数の地点に存在できる。更に、４０塩基対のデュプレックスは２機能性の設計をタンデムに組み合わせることにより４つの標的配列をターゲティングする単一のデュプレックスを与えることができる。更により進んだ手順では、１つの多機能性デュプレックスに対してサイレント化された５または６つの標的を可能とするため相同配列を使用することができる。これをどのように達成することができるかは、図２２における例が示している。３０塩基対のデュプレックスをダイサーによりいずれかの末端から２２および８塩基対の産物に切断する（８ｂｐフラグメント、図示せず）。提示を容易にするために、ダイサーにより形成されたオーバーハングは図示しないが、補うことはできる。３つのターゲティング配列を示す。オーバーラップした所要の配列同一性は灰色枠で示す。親の３０ｂｐのｓｉＮＡのＮは、安定した化学状態においてこれを試験する場合にダイサー切断を可能にする２’−ＯＨ位置の示唆される部位である。ダイサーＲＮａｓｅＩＩＩによる３０量体デュプレックスのプロセシングは厳密に２２＋８の切断をもたらさず、むしろ一連の緊密に関連した産物をもたらす（２２＋８が主要部位である）。従って、ダイサーによるプロセシングは一連の活性なｓｉＮＡをもたらす。別の非限定的な例を図２３に示す。４０塩基対のデュプレックスをダイサーによりいずれかの末端から２０塩基対の産物に切断する。提示を容易にするために、ダイサーにより形成されたオーバーハングは図示しないが、補うことはできる。４つのターゲティング配列は４色、即ち青、ライトブルーおよび赤およびオレンジで示す。オーバーラップした所要の配列同一性は灰色枠で示す。この設計フォーマットはより多きＲＮＡにも拡張できる。化学的に安定化されたｓｉＮＡがダイサーにより結合されれば、次に戦略的に位置づけられたリボヌクレオチド連結部が、本発明者等による多機能性設計のより広範なレパートリーを可能にする設計用切断産物を可能にする。例えば約２２ヌクレオチドのダイサー標準に限定されない切断産物によれば、例えば約３〜約１５ヌクレオチドの範囲の標的配列同一性オーバーラップを有する多機能性ｓｉＮＡコンストラクトが可能となる。
実施例１０：診断上の使用
【０７２４】
本発明のｓｉＮＡ分子は、種々の用途における、例えば臨床、工業上、環境、農業および／または研究の状況における分子標的（例えばＲＮＡ）の発見の場合のような、種々の診断用途において使用できる。ｓｉＮＡ分子のこのような診断上の使用では、例えば細胞溶解物または部分精製された細胞溶解物を用いた再建ＲＮＡｉ系を利用する。本発明のｓｉＮＡ分子は疾患細胞内部の遺伝子の変動および突然変異を検査するため、または細胞内の内因性または外因性、例えばウィルス性のＲＮＡの存在を検出するための、診断ツールとして使用できる。ｓｉＮＡ活性と標的ＲＮＡの構造の間の緊密な関係は、標的ＲＮＡの塩基対形成および３次元構造を改変する分子のいずれかの領域における突然変異の検出を可能にする。本発明において記載した多数のｓｉＮＡ分子を使用することにより、インビトロ、並びに細胞および組織におけるＲＮＡの構造および機能にとって重要なヌクレオチドの変化をマッピングすることができる。ｓｉＮＡ分子による標的ＲＮＡの切断は、遺伝子発現を抑制し、疾患または感染の進行における特定の遺伝子産物の役割を定義するために使用できる。この様式において、他の遺伝子標的を疾患の重要なメディエーターとして定義することができる。これらの実験は複合療法の可能性を与えることにより疾患の進行のより良好な治療をもたらす（例えば異なる遺伝子にターゲティングされた多数のｓｉＮＡ分子、知られた小分子阻害剤にカップリングされたｓｉＮＡ分子、または組み合わせのｓｉＮＡ分子および／または他の化学的または生物学的分子を用いた間欠的治療）。本発明のｓｉＮＡ分子の他のインビトロの使用は当分野でよく知られており、疾患、感染、または関連の状態に関係するｍＲＮＡの存在の検出を含む。そのようなＲＮＡは、標準的な方法、例えば蛍光共鳴放出移動（ＦＲＥＴ）を用いてｓｉＮＡ投与後の切断産物の存在を測定することにより検出される。
【０７２５】
特定の実施例において、標的ＲＮＡの野生型または突然変異体のみを切断するｓｉＮＡ分子を試験に使用する。第１のｓｉＮＡ分子（即ち標的ＲＮＡの野生型のみを切断するもの）を用いて試料中に存在する野生型ＲＮＡを発見し、第２のｓｉＮＡ分子（即ち標的ＲＮＡの突然変異体のみを切断するもの）を用いて試料中の突然変異体ＲＮＡを同定する。反応対照として、野生型と突然変異体の両方のＲＮＡの合成物質を両方のｓｉＮＡ分子で切断することにより、反応における相対的なｓｉＮＡの効率および「非ターゲティング」ＲＮＡ種の切断がないことを明らかにする。合成物質に由来する切断産物はまた、試料集団中の野生型および突然変異体のＲＮＡの分析のためのサイズマーカーを形成する働きを有する。即ち、各々の分析が２つのｓｉＮＡ分子、２つの物質、および１つの未知試料を必要とし、これは組み合わせると６つの反応となる。切断産物の存在は、各ＲＮＡの完全長および切断フラグメントがポリアクリルアミドゲルの１レンーンにおいて分析できるように、ＲＮａｓｅ保護試験を用いて測定する。突然変異体ＲＮＡの発現に関する識見および標的細胞における所望の表現型の変化の推定される危険性を求めるために結果を定量することは絶対に必要ではない。それ自体のタンパク質産物が表現型（即ち疾患関連または感染関連）の発生に関与しているｍＲＮＡの発現は、危険性を明らかにするためには不十分である。両方の転写物に関して同等な特異的活性のプローブを使用すれば、ＲＮＡレベルの定性的比較は十分であり、初期診断の費用を低減する。より高い突然変異体の野生型に対する比は、ＲＮＡレベルの比較が定性的であるか定量的であるかに関わらず、より高い危険性に相関している。
【０７２６】
明細書において言及した全ての特許および公開文献は本発明が関連する分野の当業者の知るレベルを示している。本開示において引用した全ての参考文献は、各々の参考文献が個々に参照により全体が本明細書に組み込まれる場合と同じ程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
【０７２７】
当業者の知る通り、本発明は目的を達成し、記載した目標と利点、並びにそれに固有のものを得るために十分変更することができる。好ましい実施形態の現時点における代表例として本明細書に記載した方法および組成物は例示であり、本発明の範囲を限定する意図はない。その変更および他の使用は当業者には自明であり、これは本発明の精神の範囲に含まれ、特許請求の範囲により定義されるものである。
【０７２８】
当業者の知る通り、種々の置き換えや変更を、本発明の範囲および精神から逸脱することなく本明細書に開示した本発明に対して行うことができる。即ち、そのような追加的な実施形態は本発明および後述する特許請求の範囲内である。本発明は当業者に対し、ＲＮＡｉ活性を媒介するために向上した活性を有する核酸コンストラクトを形成することを目標として本明細書に記載した化学修飾の種々の組み合わせおよび／または置き換えを試験することを教示している。そのような向上した活性は、向上した安定性、向上した生体利用性、および／またはＲＮＡｉを媒介する細胞応答の向上した活性を含むことができる。従って、本明細書に記載した特定の実施形態は限定的ではなく、本明細書に記載した修飾の特定の組み合わせは向上したＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を発見することを目標とする予定外の実験を行うことなく試験できることは、当業者が容易に理解できることである。
【０７２９】
本明細書に説明のために記載した本発明は、本明細書に特に開示していないいずれかの要素、制限の非存在下で適宜実施できる。即ち、例えば、本明細書における各例において、「含む」、「より本質的になる」および「からなる」という用語は、他の２つの用語のいずれかと相互に交換することができる。使用した用語および表現は説明の観点から使用しており、限定ではなく、そのような用語および表現の使用において、提示し記載した特徴またはその一部分のいかなる等価物も排除する意図はなく、種々の変更が特許請求の範囲に記載の本発明の範囲内で可能であると認識される。即ち、本発明は好ましい実施形態により特に開示してきたが、本明細書に開示した概念の任意の特徴、変更および変形は当業者が求めることができるものであり、このような変更および変形は、説明および添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内にあるとみなされると理解しなければならない。
【０７３０】
更に、本発明の特徴または態様をマーカッシュグループまたは他の代替グループ分けとして記載する場合、本発明はそれによりマーカッシュグループまたは他のグループのいずれかの個々のメンバーまたはメンバーのサブグループとして記載されることは当業者が認識する通りである。
実施例１１：ナノ粒子カプセル化ｓｉＮＡ／担体製剤の調製
一般的なＬＮＰの調製
【０７３１】
ｓｉＮＡナノ粒子溶液は０．９ｍｇ／ｍｌの濃度で２５ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ４．０）中ｓｉＮＡおよび／または担体の分子を溶解することにより調整した。脂質の溶液は、カチオン性脂質（例えばＣＬｉｎＤＭＡまたはＤＯＢＭＡ、構造および比に関しては表１０の製剤を参照）、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＰＥＧ−ＤＭＧ（比は表１０に示す）の混合物を約１５ｍｇ／ｍｌの濃度で無水エタノールに溶解することにより調製した。窒素のホスフェートに対する比は約３：１であった。
【０７３２】
等容量のｓｉＮＡ／担体および脂質溶液を混合用Ｔコネクタに同じ流量で２つのＦＰＬＣポンプで送達した。所望の粒径に調節するために背圧弁を使用した。得られた乳白色の混合物を滅菌ガラス瓶内に収集した。次にこの混合物を当容量のクエン酸塩緩衝液で緩徐に希釈し、イオン交換膜を通して濾過することにより、混合物中に遊離のｓｉＮＡ／担体が残存していればそれを除去した。エタノール（ＡＬＣＯスクリーンからの試験スティック）を除去するためにはクエン酸塩緩衝液（ｐＨ４．０）に対して、緩衝液を交換するためにはＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して限外濾過を使用した。最終ＬＮＰは所望の容量になるまで濃縮することにより得られ、０．２μｍフィルターを通して滅菌濾過した。得られたＬＮＰを粒径、ゼータ電位、アルコール含有量、総脂質含有量、核酸カプセル化、および総核酸濃度に関して特性化した。
ＬＮＰ製造プロセス
【０７３３】
非限定的な例において、ＬＮＰ−０８６ｓｉＮＡ／担体製剤を以下の通りバルクで調製する。プロセスに関するプロセスフローダイアグラムは図１３に示す通りであり、これはｓｉＮＡ／担体カクテル（２ｓｉＮＡ／担体デュプレックスを示す）用、または単一ｓｉＮＡ／担体デュプレックス用に適合させることができる。プロセスは（１）脂質溶液を調製すること；（２）ｓｉＮＡ／担体溶液を調製すること；（３）混合／粒子形成；（４）インキュベーション；（５）希釈；（６）限外濾過および濃縮、からなる。
１．脂質溶液の調製
要約：コンデンサーを装着した３首丸底フラスコに、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ、およびリノエイルアルコールの混合物を添加した。次にエタノールを添加した。懸濁液をアルゴン下に攪拌棒で攪拌し、プロセスコントローラーで制御される加熱マントルを使用しながら３０℃に加熱した。懸濁液が透明になった後、溶液を放冷して室温とした。
ＬＮＰの８Ｌバッチを製剤化するための詳細な操作法
１．３首２Ｌ丸底フラスコ、コンデンサー、計量シリンダー、および２つの１０Ｌ容三角ガラス容器を脱発熱物質処理する。
２．脂質を室温まで加温する。丸底フラスコを風袋調節する。ＣＬｉｎＤＭＡ（５０．４４ｇ）はピペット補助器を用いながらピペットで３首丸底フラスコに移す。
３．ＤＳＰＣ（４３．３２ｇ）、コレステロール（５．３２ｇ）およびＰＥＧ−ＤＭＧ（６．９６ｇ）を計量ペーパーで順次丸底フラスコに計り入れる。
４．リノレイルアルコール（２．６４ｇ）を別のガラスバイアル（脱発熱物質処理）に計り入れた。バイアルを最初に風袋調節し、次に化合物をピペットでバイアルに移す。
５．脂質を入れたまま丸底フラスコの総重量を計測し、風袋重量を差し引く。誤差は通常は±１．０％より遥かに低値であった。
６．脂質溶液のために必要なエタノール（１Ｌ）の八分の一を丸底フラスコに移す。
７．加熱マントル中に置いた丸底フラスコをＪ−ＣＨＥＭプロセスコントローラーに接続した。脂質懸濁液をアルゴン下に攪拌棒を用いてコンデンサーを最上部としながら攪拌した。熱電対の端子を密封アダプター付きの丸底フラスコの１つの首を通して懸濁液内に入れた。
８．懸濁液を透明になるまで３０℃で加熱した。溶液を放冷して室温とし、三角ガラス容器に移し、キャップで密封した。
２．ｓｉＮＡ／担体溶液の調製
要約：ｓｉＮＡ／担体溶液は単一のｓｉＮＡデュプレックスおよび／または担体を含むことができるか、或いは、２つ以上ｓｉＮＡデュプレックスおよび／または担体のカクテルを含むことができる。単一のｓｉＮＡ／担体デュプレックスの場合は、ｓｉＮＡ／担体を２５ｍＭのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ４．０、１００ｍＭのＮａＣｌ）に、終濃度が０．９ｍｇ／ｍｌとなるように溶解する。２つのｓｉＮＡ／担体分子のカクテルの場合は、各ｓｉＮＡ／担体分子を２５ｍＭのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ４．０、１００ｍＭのＮａＣｌ）の総予測容量の５０％中に終濃度が０．９ｍｇ／ｍｌとなるように溶解することによりｓｉＮＡ／担体の溶液を調製する。この操作法を他のｓｉＮＡ／担体分子に対して反復する。２つの０．９ｍｇ／ｍｌ  ｓｉＮＡ／担体溶液を合わせて２つのｓｉＮＡ分子を含有する総容量における０．９ｍｇ／ｍｌ溶液とする。
ｓｉＮＡカクテルを用いたＬＮＰの８Ｌバッチを製剤化するための詳細な操作法
１．３．６ｇ×水補正ファクター（約１．２）のｓｉＮＡ−１粉末を滅菌容器、例えばＣｏｒｎｉｎｇ保存ビンに図りいれる。
２．ｓｉＮＡを脱発熱物質処理した５Ｌのガラス容器に移す。計量した容器をクエン酸塩緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．０および１００ｍＭ  ＮａＣｌ）で３回洗浄し、洗浄液を５Ｌ容器に入れ、クエン酸塩緩衝液で４Ｌとする。
３．ＵＶスペクトル分析器でｓｉＮＡ溶液の濃度を側定する。一般的に、溶液から２０μｌを取り、５０倍に希釈して１０００μｌとし、クエン酸塩緩衝液でブランク値を取った後にＡ２６０ｎｍでＵＶ読み取り値を記録する。並行試料を作成して計測する。２つの試料の読み取り値に整合性があれば、平均を取り、ｓｉＮＡの消衰係数に基づいて濃度を計算する。最終濃度が０．９０±０．０１ｍｇ／ｍｌの範囲外であれば、更にｓｉＮＡ／担体粉末を添加するか、または更にクエン酸塩緩衝液を添加することにより濃度を調製する。
４．ｓｉＮＡ−２に関して反復する。
５．１０Ｌ容の脱発熱物質処理した１０Ｌガラス容器に、各０．９ｍｇ／ｍｌ  ｓｉＮＡ溶液４Ｌを移す。
滅菌濾過
プロセスは脂質／エタノール溶液を滅菌濾過するための操作法を記載する。目的はカプセル化プロセスのための滅菌原料を得ることである。濾過プロセスは膜面積２０ｃｍ２で８０ｍＬ規模で実施した。流量は２８０ｍＬ／分とした。このプロセスは配管の直径および濾過面積を増大させることによりスケールアップできる。
１．材料
ａ．Ｎａｌｇｅｎｅ５０シリコーン製配管ＰＮ８０６０−００４０オートクレーブ済み
ｂ．Ｍａｓｔｅｒ  Ｆｌｅｘペリスタポンプ７５２０−４０型
ｉ．Ｍａｓｔｅｒ  ｆｌｅｘポンプヘッド７５１８−００型
ｃ．Ｐａｌｌ  Ａｃｒｏｐａｋ２０  ０．８／０．２μｍ滅菌フィルターＰＮ１２２０３
ｄ．脱発熱物質処理済み１０Ｌ容ガラス容器
ｅ．ガラス容器用のオートクレーブ済みの蓋
２．操作法
ａ．配管をポンプヘッドに入れる。ポンプを５０％全ポンプスピードに設定し、目盛り付きシリンダーで１分間流量を計測する。
ｂ．ポンプの設定を調節し、流量が２８０ｍＬ／分と計測されるようにする。
ｃ．配管をセットアップし、フィルターをクランプで固定する。
ｄ．ポンプをセットアップし、配管をポンプヘッドに入れる。
ｅ．配管の供給末端を濾過すべき材料の中に入れる。
ｆ．注ぎ口のついたフィルターの濾液側を脱発熱物質処理したガラス容器の中に入れる。
ｇ．全ての材料が濾過されるまでフィルターを通しながら材料を送液する。
ＡＫＴＡポンプセットアップ
１．材料
ａ．ＡＫＴＡ  Ｐ９００ポンプ
ｂ．テフロン（登録商標）製配管２ｍｍＩＤ×３ｍｍＯＤ各２個ｘ２０．５ｃｍＵｐｃｈｕｒｃｈ  ＰＮ１６７７
ｃ．テフロン（登録商標）製配管１ｍｍＩＤ×３ｍｍＯＤ６．５ｃｍＵｐｃｈｕｒｃｈ  ＰＮ１６７５
ｄ．Ｐｅｅｋ製Ｔ字管、１ｍｍＩＤ各１個Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  ＰＮ  Ｐ−７１４
ｅ．１／４−２８Ｆ〜１０−３２Ｍ各２個Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  ＰＮ  Ｐ−６５２
ｆ．ＥＴＦＥ製継ぎ手、３．０ｍｍＯＤ配管用、各６個Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  ＰＮ  Ｐ−３４３ｘ
ｇ．Ｆｌａｎｇｌｅｓｓナット各６個Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  ＰＮ  Ｐ−３４５ｘ
ｈ．ＥＴＦＥ製キャップ、１／４−２８平底フィッティング用各１個Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  ＰＮ  Ｐ−７５５
ｉ．アルゴン圧縮ガス
ｊ．調節器０〜６０ｐｓｉ
ｋ．テフロン（登録商標）製配管
１．ＰｅｅｋＹフィッティング
ｍ．脱発熱物質処理済みガラス器具円錐基部、２／ポンプ
ｎ．オートクレーブ済み蓋
ｏ．圧力蓋
２．ポンプセットアップ
ａ．ポンプをオンにする。
ｂ．ポンプにセルフテストを実施させる。
ｃ．配管にキャップや圧力調節器が接続されていないことを確認する（これはポンプの過圧をもたらす）。
ｄ．ポンプを同調させるために「ＯＫ」を押す。
ｅ．ノブ４のつまみを時計回りに回して「Ｓｅｔｕｐ」とし、「ＯＫ」を押す。
ｆ．ノブ５のつまみを時計回りに回して「Ｓｅｔｕｐ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍｏｄｅ」とし、「ＯＫ」を押す。
ｇ．ノブ１のつまみを時計回りに回して「Ｄ」とし、「ＯＫ」を押す。
ｈ．「Ｅｓｃ」を２回押す。
３．ポンプの除菌
ａ．１Ｎ  ＮａＯＨ１０００ｍＬを１Ｌ容のガラス容器に入れる。
ｂ．ポンプに圧力蓋を取り付ける。
ｃ．７０％エタノール１０００ｍＬを１Ｌ容のガラス容器に入れる。
ｄ．ポンプに圧力蓋を取り付ける。
ｅ．２０００ｍＬ容のガラス容器をポンプの出口に入れる。
ｆ．ノブ１のつまみを時計回りに回して「Ｓｅｔ  Ｆｌｏｗ  Ｒａｔｅ」とし、「ＯＫ」を押す。
ｇ．ノブを時計回りに回してＦｌｏｗ  Ｒａｔｅを４０ｍｌ／分まで上昇させ；反時計回りに回して低下させ；所望のＦｌｏｗ  Ｒａｔｅが設定されれば「ＯＫ」を押す。
ｈ．時間を４０分に設定する。
ｉ．アルゴンガスを１０ｐｓｉで流す。
ｊ．ノブ２のつまみを反時計回りに回して「Ｒｕｎ」とし、「ＯＫ」を押し、タイマーを始動させる。
ｋ．ノブ１のつまみを反時計回りに回して「Ｅｎｄ  Ｈｏｌｄ  Ｐａｕｓｅ」とする。
ｌ．タイマーの音が鳴ったらポンプ上の「ＯＫ」を押す。
ｍ．ガスを止める。
ｎ．ポンプは使用時まで（一晩？）除菌溶液中に保存する。
４．ポンプ流動の確認
ａ．エタノール２００ｍＬを５００ｍＬ容の脱発熱物質処理済みガラス瓶に入れる。
ｂ．圧力キャップと共にポンプに装着する。
ｃ．滅菌クエン酸塩緩衝液２００ｍＬを５００ｍＬ容の脱発熱物質処理済みガラス瓶に入れる。
ｄ．圧力キャップと共にポンプに装着する。
ｅ．１００ｍＬ容の目盛り付きシリンダーをポンプの出口下部に入れる。
ｆ．ノブ１のつまみを時計回りに回して「Ｓｅｔ  Ｆｌｏｗ  Ｒａｔｅ」とし、「ＯＫ」を押す。
ｇ．ノブを時計回りに回してＦｌｏｗ  Ｒａｔｅを４０ｍｌ／分まで上昇させ；反時計回りに回して低下させ；所望のＦｌｏｗ  Ｒａｔｅが設定されれば「ＯＫ」を押す。
ｈ．時間を１分に設定する。
ｉ．アルゴンガスを１０ｐｓｉで流す。
ｊ．ノブ２のつまみを反時計回りに回して「Ｒｕｎ」とし、「ＯＫ」を押し、タイマーを始動させる。
ｋ．ノブ１のつまみを反時計回りに回して「Ｅｎｄ  Ｈｏｌｄ  Ｐａｕｓｅ」とする。
ｌ．タイマーの音が鳴ったらポンプ上の「ＯＫ」を押す。
ｍ．ガスを止める。
ｎ．エタノール／クエン酸塩溶液４０ｍＬが送達されることを確認する。
３．粒子形成−混合工程
ｏ．滅菌された脂質／エタノール溶液をＡＫＴＡポンプに装着する。
ｐ．滅菌されたｓｉＮＡ／担体またはｓｉＮＡ／担体カクテル／クエン酸塩緩衝溶液をＡＫＴＡポンプに装着する。
ｑ．蓋付きの脱発熱物質処理済みレシーバ容器（２ｘバッチサイズ）を装着する。
ｒ．計算された混合時間に時間設定する。
ｓ．アルゴンガスを流し、圧力を５〜１０ｐｓｉに維持する。
ｔ．ノブ２のつまみを反時計回りに回して「Ｒｕｎ」とし、「ＯＫ」を押し、タイマーを始動させる。
ｕ．ノブ１のつまみを反時計回りに回して「Ｅｎｄ  Ｈｏｌｄ  Ｐａｕｓｅ」とする。
ｖ．タイマーの音が鳴ったらポンプ上の「ＯＫ」を押す。
ｗ．ガスを止める。
４．インキュベーション
溶液は混合後２２±２時間のインキュベーションのために保持する。インキュベーションは室温（２０〜２５℃）で行い、インプロセス溶液は遮光する。
５．希釈
脂質ｓｉＮＡ溶液を当容量のクエン酸塩緩衝液で希釈する。等しい長さの配管およびＴｅｅ接続部を用いてセットアップされた二重ヘッドペリスタポンプで溶液を希釈する。流量は３６０ｍＬ／分とする。
１．材料
ｈ．Ｎａｌｇｅｎｅ５０シリコーン製配管ＰＮ８０６０−００４０オートクレーブ済み
ｉ．Ｔ字管  １／４‘ＩＤ
ｊ．Ｍａｓｔｅｒ  Ｆｌｅｘペリスタポンプ７５２０−４０型
ｉ．Ｍａｓｔｅｒ  ｆｌｅｘポンプヘッド７５１８−００型
ｉｉ．Ｍａｓｔｅｒ  ｆｌｅｘポンプヘッド７５１８−００型
ｋ．脱発熱物質処理済み２ｘ２０Ｌ容ガラス容器
ｌ．ガラス容器用のオートクレーブ済みの蓋
２．操作法
ａ．２本の等しい長さの配管をＴ字管に装着する。配管は約１メートル長としなければならない。３本目の配管をＴ字管の出口末端まで約５０ｃｍの所に装着する。
ｂ．配管装置を二重ポンプヘッドに入れる。
ｃ．配管装置の一方の供給末端をエタノール溶液に入れる。もう一方の供給末端は当容量のクエン酸塩緩衝液に入れる。
ｄ．ポンプ速度制御を５０％に設定する。時間を１分に設定する。
ｅ．配管装置の出口末端を５００ｍＬの目盛り付きシリンダーに入れる。
ｆ．ポンプを作動させ、タイマーを始動させる。
ｇ．タイマーの音がなったらポンプを停止し、送達された容量を測定する。
ｈ．ポンプの流量を３６０ｍＬ／分に調節する。
ｉ．流量が設定されれば配管を廃液する。
ｊ．配管装置の供給末端を脂質／ｓｉＮＡ溶液に入れる。もう一方の供給末端は当容量のクエン酸塩緩衝液に入れる（１６Ｌ）。
ｋ．配管装置の出口末端を２×２０Ｌ脱発熱物質処理済みガラス容器の１つ目に入れる。
ｌ．タイマーを９０分に設定し、ポンプを始動させる。目視により希釈が進行することをモニタリングすることにより流量が等しいことを確認する。
ｍ．レシーバ容器が１６リットルになった時点で、次の容器に切り替え、１６Ｌを収集する。
ｎ．材料全てが移行したらポンプを停止する。
６．限外濾過および濃縮
要約：限外濾過プロセスは時間指定プロセスであり、流量を慎重にモニタリングしなければならない。膜面積はバッチの容量に基づいて決定されている。これは２工程のプロセスであり；第１は希釈された材料を３２リットルから３６００ｍＬとし、約２ｍｇ／ｍｌの濃度とする濃縮工程である。濃縮工程は４時間±１５分である。第２の工程はエタノールクエン酸塩緩衝液をリン酸塩緩衝食塩水とする透析濾過工程である。透析濾過は３時間であり、ここでも流量を慎重にモニタリングしなければならない。この工程の間、エタノール濃度はヘッドスペースＧＣによりモニタリングする。３時間後（２０透析濾過容量）、第２の濃縮を実施することにより溶液を約６ｍｇ／ｍｌ、または容量１．２リットルまで濃縮する。この材料を脱発熱物質処理済みガラス容器に収集する。系は４００ｍｌのＰＢＳで高速流量において、透過液のラインを閉鎖してすすぐ。この材料を収集し、第１の収集分に添加する。この時点で予測される濃度は４．５ｍｇ／ｍｌである。濃度および容量を測定する。
１．材料
ｘ．Ｑｕａｔｒｏｆｌｏｗポンプ
ｙ．Ｆｌｅｘｓｔａｎｄシステム、オートクレーブ済み５Ｌリザーバ付き
ｚ．限外濾過膜ＧＥ  ＰＮ  ＵＦＰ−１００−Ｃ−３５Ａ
ａａ．ＰＢＳ  ０．０５μｍ濾過１００Ｌ
ｂｂ．０．５Ｎ水酸化ナトリウム
ｃｃ．ＷＦＩ
ｄｄ．Ｎａｌｇｅｎｅ５０シリコーン製配管ＰＮ８０６０−００４０オートクレーブ済み
ｅｅ．Ｍａｓｔｅｒ  Ｆｌｅｘペリスタポンプ７５２０−４０型
ｉ．Ｍａｓｔｅｒ  ｆｌｅｘポンプヘッド７５１８−００型
ｆｆ．透過物集容器１００Ｌ容量
ｇｇ．目盛り付きシリンダー、脱発熱物質処理済み２Ｌ、１１、５００ｍＬ
２．操作法
ａ．システム調製
ｉ．膜用の適切な大きさの除菌用品を用いながらＦｌｅｘｓｔａｎｄホルダーに膜を取り付ける。Ｆｌｅｘｓｔａｎｄをクワトロフローのポンプに装着する。配管を保持液と透過液の連結部に装着しこれらを適当な廃液容器に入れる。
ｉｉ．系の保持容量を測定する。
１．１リットルのＷＦＩをリザーバに入れる。
２．透過液のラインをクランプする。
３．クワトロフローポンプを始動させ、保持液ライン中に気泡が存在しなくなるまで再循環する。ポンプを停止する。
４．リザーバにマークし、１リットルの読み取り値を記録する。
５．２００ｍＬのＷＦＩをリザーバに添加し、１２００ｍＬのレベルをマークする。
ｉｉｉ．０．５Ｎ水酸化ナトリウム３リットルをリザーバに添加し、保持液を通してフラッシュして廃棄する。０．５Ｎ水酸化ナトリウム３Ｌをリザーバに添加し、保持液ラインを再循環し、透過液通してフラッシュして廃棄する。３回目の０．５Ｎ水酸化ナトリウム３Ｌをリザーバに添加し、３０分間、透過液ラインを通してリザーバまで再循環させる。系は一晩０．５Ｎ水酸化ナトリウム中に保存した後に使用する。
ｉｖ．水酸化ナトリウムをフラッシュして廃棄する。
ｖ．３ＬのＷＦＩをリザーバに添加し、ｐＨが中性になるまで保持液をフラッシュして廃棄し、必要に応じてＷＦＩを交換する。保持液ラインをリザーバに戻す。
ｖｉ．３リットルのＷＦＩを添加し、ｐＨが中性になるまで透過液ラインをフラッシュして廃棄し、必要に応じてＷＦＩを交換する。系を廃液する。
ｖｉｉ．クエン酸塩緩衝液３リットルをリザーバに添加する。ｐＨ＜５となるまで透過液ラインを通してフラッシュする。必要に応じてクエン酸塩緩衝液を添加する。
ｖｉｉｉ．系を廃液する。
ｂ．ＬＮＰ濃縮
ｉ．適当な長さの配管をペリスタポンプヘッドに入れる。
ｉｉ．供給末端を希釈ＬＮＰ溶液に入れ：もう一方の末端をリザーバに入れる。
ｉｉｉ．希釈ＬＮＰ溶液を４リットルマークまでリザーバに送液する。
ｉｖ．透過液ラインを清浄な廃棄物容器に入れる。
ｖ．クワトロフローポンプを始動させ、透過液の流量が３００ｍＬ／分となるようにポンプの速度を調節する。
ｖｉ．ペリスタポンプを３００ｍｌ／分に調節することにより液体のレベルがリザーバ中４Ｌで一定となるようにする。
ｖｉｉ．希釈ＬＮＰ溶液全てがリザーバに移った時点でペリスタポンプを停止する。
ｖｉｉｉ．必要に応じてポンプ速度を調節することにより希釈ＬＮＰ溶液を２４０分で３６００ｍｌまで濃縮する。
ｉｘ．透過液流量、ポンプ設定および供給および保持液の圧力をモニタリングする。
ｃ．ＬＮＰ透析濾過
ｉ．ペリスタポンプの供給配管を７２ＬのＰＢＳ（０．０５μｍ濾過）の入った容器に入れる。
ｉｉ．ペリスタポンプを始動させ、リザーバ中３６００ｍＬの一定容量が維持されるように流量を調節する。
ｉｉｉ．クアトロフローポンプの流量を４００ｍＬ／分に増大させる。
ｉｖ．透過液の流量、ポンプ設定および供給および保持液の圧力をモニタリングする。
ｖ．エタノール濃度をＧＣでモニタリングする。
ｖｉ．ＬＮＰ溶液を１８０分間ＰＢＳ（２０容量）で透析濾過する。
ｖｉｉ．ペリスタポンプを停止する。配管をリザーバから取り外す。
ｄ．終濃度
ｉ．ＬＮＰ溶液を１．２リットルのマークまで濃縮する。
ｉｉ．ＬＮＰ溶液を脱発熱物質処理済み２Ｌ容の目盛り付きシリンダーに収集する。
ｉｉｉ．４００ｍＬのＰＢＳをリザーバに添加する。
ｉｖ．ポンプを始動させ、２分間再循環させる。
ｖ．洗液を収集し、目盛り付きシリンダー中の収集されたＬＮＰ溶液に添加する。
ｖｉ．ＬＮＰ溶液の容量を記録する。
ｖｉｉ．２Ｌ容の脱発熱物質処理済みガラス容器に移す。
ｖｉｉｉ．ラベルを付して冷蔵庫に入れる。
ｅ．系の浄化
ｉ．１ＬのＷＦＩをリザーバに入れる
ｉｉ．透過液を閉鎖したまま５分間再循環する。
ｉｉｉ．系を廃液する。
ｉｖ．２Ｌの０．５Ｎ水酸化ナトリウムをリザーバに添加する。
ｖ．５分間再循環する。
ｖｉ．系を廃液する。
ｖｉｉ．２Ｌの０．５Ｎ水酸化ナトリウムをリザーバに添加する。
ｖｉｉｉ．５分間再循環してポンプを停止する。
ｉｘ．ＷＦＩで系を中和する。
ｘ．系を廃液し、膜を廃棄する。
【０７３４】
得られたＬＮＰを粒径、ゼータ電位、アルコール含有量、総脂質含有量、核酸カプセル化、および総核酸濃度に関して特性化した。
【０７３５】
明細書において言及した全ての特許および公開文献は本発明が関連する分野の当業者の知るレベルを示している。本開示において引用した全ての参考文献は、各々の参考文献が個々に参照により全体が本明細書に組み込まれる場合と同じ程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
【０７３６】
当業者の知る通り、本発明は目的を達成し、記載した目標と利点、並びにそれに固有のものを得るために十分変更することができる。好ましい実施形態の現時点における代表例として本明細書に記載した方法および組成物は例示であり、本発明の範囲を限定する意図はない。その変更および他の使用は当業者には自明であり、これは本発明の精神の範囲に含まれ、特許請求の範囲により定義されるものである。
【０７３７】
当業者の知る通り、種々の置き換えや変更を、本発明の範囲および精神から逸脱することなく本明細書に開示した本発明に対して行うことができる。即ち、そのような追加的な実施形態は本発明および後述する特許請求の範囲内である。本発明は当業者に対し、ＲＮＡｉ活性を媒介するために向上した活性を有する核酸コンストラクトを形成することを目標として本明細書に記載した化学修飾の種々の組み合わせおよび／または置き換えを試験することを教示している。そのような向上した活性は、向上した安定性、向上した生体利用性、および／またはＲＮＡｉを媒介する細胞応答の向上した活性を含むことができる。従って、本明細書に記載した特定の実施形態は限定的ではなく、本明細書に記載した修飾の特定の組み合わせは向上したＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を発見することを目標とする予定外の実験を行うことなく試験できることは、当業者が容易に理解できることである。
【表１４】
2012509688.tif 000060
【表１５】
2012509688.tif 000061
2012509688.tif 000062
2012509688.tif 000063
【表１６】
2012509688.tif 000064
【表１７】
2012509688.tif 000065
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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