(57)【要約】本発明は、生体試料中の抗−ＨＩＶ抗体を検出可能なバイオセンサーであって、遺伝子工学的に改変されたアロステリック酵素と微小電極ネットワークを備えたマトリックスとの併用に基づく前記バイオセンサーを提供する。前記バイオセンサーの利点の１つには、高感度検出、簡易検出および携帯性がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）．少なくとも抗ＨＩＶ抗体により認識されるペプチドの付加による、改変アロステリック酵素、
ｂ）．微小電極ネットワークのマトリックスを含む変換器、および
ｃ）．電気化学的シグナルの検出器
を含む、バイオセンサー。
【請求項２】
アロステリック酵素がβ−ガラクトシダーゼである、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項３】
ペプチドが、ＨＩＶウイルスの膜貫通糖タンパク質ｇｐ４１のエピトープである、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項４】
改変アロステリック酵素が、配列番号：１または配列番号：２を含むリストから選択される、請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項５】
生体試料中の抗ＨＩＶ抗体を検出するための、請求項１〜４のいずれか一項記載のバイオセンサーの使用。
【請求項６】
ａ）．生体試料を抽出する工程、
ｂ）．工程ａ）の生体試料を、本発明にかかるバイオセンサーと接触させる工程、
ｃ）．工程ｂ）の生体試料とバイオセンサーに、アロステリック酵素の基質を添加する工程、および
ｄ）．工程ｃ）において発生した電気化学的シグナルを記録する工程
を含む、抗ＨＩＶ抗体を検出する方法。
【請求項７】
アロステリック酵素の基質が、ＯＮＰＧ、ＣＰＲＧ、ＦＤＧまたはＰＡＰＧを含むリストから選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
本発明にかかるバイオセンサーを含む、抗ＨＩＶ抗体を検出するためのキット。
【請求項９】
アロステリック酵素の基質をさらに含む、請求項８記載のキット。
【請求項１０】
基質が、ＯＮＰＧ、ＣＰＲＧ、ＦＤＧまたはＰＡＰＧを含むリストから選択される、請求項９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中の抗−ＨＩＶ抗体を検出することができるバイオセンサーであって、遺伝子工学的に改変されたアロステリック酵素と微小電極ネットワークを備えたマトリックスとを併用することに基づく前記バイオセンサーを提供する。本バイオセンサーの利点の１つとして、高感度検出、簡易検出および携帯性がある。
【背景技術】
【０００２】
感染症の正確な診断は、臨床医学分野および獣医学分野における最も重要な要素である。現在、既存の検査を改良するために甚大な努力が費やされており、それは、新しい検出方法の出現（Kuiken et al., 2003. Curr. Opin. Biotechnol., 14: 641-646）、並びにより高い感度で、安全に、かつ効率的に感染の早期検出を確実にする新しいストラテジーの発見（Iqbal et al., 2000. Biosens. Bioelectronics., 15: 549-578, Dominguez EA, 1993. J. Clin. Microbiol., 31: 2286-2290; Lennette EH and Smith, 1999. Laboratory Diagnosis of Viral Infections, Informa Health Care）を可能にしている。過去２０年間で、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、最もよく研究されたウイルスの１つであり、また標的としてのウイルスまたはそれに対して産生された抗体の使用に依存した新しい直接的または間接的分析手法の開発にとって主要標的であった（McDougal, 2001. AIDS Rev. 3: 183-193）。
【０００３】
直接的な方法の場合、ウイルス成分（例えば、核酸またはタンパク質）は、抗原ＥＬＩＳＡ（Schupbach et al., 2000. Int J. Antimicrob. Agents, 16: 441-445)またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）(Marie Louie, 2000. CMAJ, 163: 301-309; Elnifro et al., 2000. Clin. Microbiol. Rev., 13: 559-570; Ballagi-Pordany, 1993. Vet. Res Commun., 17: 55-72; Niesters, 2004. Clinical Microbiology Infect., 10: 5-11; Hjelle and Busch, 1989. Arch Pathol. Lab Med 113: 975-980）によって、検出可能である。
【０００４】
間接的な方法は抗ウイルス抗体の存在を実際に示すものであり、最も一般的なものとしては、抗体−ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット（Steckelberg and Cockerill, 1998. Mayo Clin. Proc., 63: 373-380）、または他の免疫アッセイ（Branson, 2007 . Clin. Infect. Dis., 45: S221-S225）がある。
【０００５】
迅速な検出を可能にする利用可能な携帯型プラットフォームを有するという実現性は、充分な医療施設のない地域では特に必要とされる。この点に関連して、バイオセンサーは、従来の分析方法に対する有望な代替手段であると考えられる（Amano and Cheng, 2005. Anal. Bioanalysts. Chem, 381: 156-164; Bobby Pejcic et al., 2006. Analyst, 131: 1079 -1090）。
【０００６】
アロステリック酵素は有効なバイオ成分として用いることができる。その理由は、該酵素の活性が、活性部位と離れた標的ペプチドの特異抗体による特異的認識によって調節されるからである（Villaverde, 2003. FEBS Lett., 554: 169-172）。アロステリックセンサーは、前記酵素の許容部位の適切な選択と病原体のペプチド抗原の適切な選択とによって改変するタンパク質挿入によって構築することができる。アロステリック反応は、酵素アッセイにおいて起こり得るし、単純な均一系のアッセイでは短い反応時間の後に起こり得る。これは、迅速な分子診断および超高速の感染症診断についての魅力的な実現性を与えるものである。
【０００７】
アロステリックセンサーとしての使用に適した種々の酵素（Villaverde, 2003. FEBS Lett., 554: 169-172）の中でも、大腸菌（Escherichia coli）により産生されるβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−ガラクトシド加水分解酵素、EC 3.2.1.23）が非常に好都合である。このタンパク質はｌａｃＺ遺伝子にコードされており、４つのサブユニットで構成され、各サブユニットは１１６３５３Ｄａであり、それらは非共有結合により連結されている（Jacobson et al., 1994. Nature, 369: 761-766）。このタンパク質は、ラクトースおよび複数の合成アナログを加水分解する能力を有する。
【０００８】
近年、活性化アガロース上に固定された大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ、ＮＦ７９５ｇｐＣを使用し、前記アロステリック酵素の作用によるＯＮＰＧ基質変換の結果として生じる呈色強度を測定する、抗ＨＩＶ抗体を検出するための方法が記載された（Ferraz et al., 2007. Enzyme and Microbial Technology, 41 (4): 492-497）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Kuiken et al., 2003. Curr. Opin. Biotechnol., 14: 641-646
【非特許文献２】Iqbal et al., 2000. Biosens. Bioelectronics., 15: 549-578
【非特許文献３】Dominguez EA, 1993. J. Clin. Microbiol., 31: 2286-2290
【非特許文献４】Lennette EH and Smith, 1999. Laboratory Diagnosis of Viral Infections, Informa Health Care
【非特許文献５】McDougal, 2001. AIDS Rev. 3: 183-193
【非特許文献６】Schupbach et al., 2000. Int J. Antimicrob. Agents, 16: 441-445
【非特許文献７】Marie Louie, 2000. CMAJ, 163: 301-309
【非特許文献８】Elnifro et al., 2000. Clin. Microbiol. Rev., 13: 559-570
【非特許文献９】Ballagi-Pordany, 1993. Vet. Res Commun., 17: 55-72
【非特許文献１０】Niesters, 2004. Clinical Microbiology Infect., 10: 5-11
【非特許文献１１】Hjelle and Busch, 1989. Arch Pathol. Lab Med 113: 975-980
【非特許文献１２】Steckelberg and Cockerill, 1998. Mayo Clin. Proc., 63: 373-380
【非特許文献１３】Branson, 2007 . Clin. Infect. Dis., 45: S221-S225
【非特許文献１４】Amano and Cheng, 2005. Anal. Bioanalysts. Chem, 381: 156-164
【非特許文献１５】Bobby Pejcic et al., 2006. Analyst, 131: 1079 -1090
【非特許文献１６】Villaverde, 2003. FEBS Lett., 554: 169-172
【非特許文献１７】Jacobson et al., 1994. Nature, 369: 761-766
【非特許文献１８】Ferraz et al., 2007. Enzyme and Microbial Technology, 41 (4): 492-497
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明では、微小電極ネットワークに基づく新たなセンサープラットフォームを開発するため、電気活性生成物であるｐ−アミノフェノールの生成をもたらす基質であるｐ−アミノフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドを使用する。Ferraz et al.（2007）記載の方法に対する本発明の重要な技術的利点は、前記酵素と微小電極ネットワークとの組み合わせによって、より高感度で、それによってＨＩＶウイルスに感染した患者の検出効率が増大する新規バイオセンサーを提供することである。
【００１１】
この意味において、本発明は、ＨＩＶウイルスに感染した患者の検出に関する問題の解決策、すなわち、この感染症の診断を迅速性と特異性の点で改善すると共に、現行の前記システムのような高価な検出器や専門スタッフを必要としない携帯可能な検出システムの提供を可能にする解決策を提示する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、遺伝子工学的に改変されたアロステリック酵素（β−ガラクトシダーゼ）と微小電極ネットワークとを併用することに基づく、生体試料中の抗ＨＩＶ抗体を検出するためのバイオセンサーを提供する。アロステリック酵素は、その立体構造に応じて異なる特異的な活性を有する。当該構造は、特異的なアロステリックエフェクターが前記酵素に結合することによって変化する。抗ＨＩＶ抗体が本来のアロステリック酵素調節であるペプチドにより前記酵素に結合する場合、その３Ｄ構造は明確に変化して、活性部位の性能に影響を及ぼし、酵素活性を刺激する。本発明で提示されるバイオセンサーの重要な点は、アロステリック酵素の基質の生成物が電気活性のあるものである基質を使用することであり、例えば前記アロステリック酵素に好適なｐＨ域内で微小電極上で別の物質に酸化され得る分子を使用することである。このバイオセンサーの別の利点は、その高い感度であり、微量の生成物を検出することが可能である。
【００１３】
生成物の濃度は、生体試料中に存在し、本来のアロステリック酵素に連結されたペプチドに結合する抗ＨＩＶ抗体の量の間接的な測定単位である。これは、上述のように、抗ＨＩＶ抗体（アロステリックエフェクターとして働く）の結合が、前記の酵素活性を支持するためである。
【００１４】
かくして、本発明は、血清試料におけるＨＩＶ感染の検出を可能にする２つの技術的な飛躍的進歩を組合せるものである。抗ＨＩＶ抗体の存在に応答する遺伝子工学的に改変されたアロステリックβ−ガラクトシダーゼが用いられる。酵素反応生成物により発生し、後述する単純なシステムにより検出される電気化学的シグナルの変換器としての微小電極ネットワークを組み立てるためのマイクロ技術も用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】０．３７Ｖの定電位で微小電極ネットワークに観察された過渡電流を示す。  Ｚ緩衝液中に、０．２５ｍｇ・ｍｌ−１の基質のみ（×）、２μｇ・ｍｌ−１のβ−ガラクトシダーゼのみ（▲）、または基質（０．２５ｍｇ・ｍｌ−１）と酵素（２μｇ・ｍｌ−１）の両方（●）を含む溶液中の電流の測定。
【図２】２８℃で１時間のインキュベーション後に０．３７Ｖで測定された過渡電流を示す。  インキュベーションは、最終の希釈物である１／６０血清と抗ＨＩＶ抗体との存在下で実施した。基質濃度は０．２５ｍｇ・ｍｌ−１であり、２μｇ・ｍｌ−１のＨｉｓＮＦ７９５ｇｐＣを含む汚染血清（■）または非感染血清（□）および０．８６μｇ・ｍｌ−１のＨｉｓＮＦ７９５ｇｐＣを含む汚染血清（▲）または清浄血清（△）であった。血清を含むがＨｉｓＮＦ７９５ｇｐＣを含まない対照（●）により生成した過渡電流の測定もまた実施した。
【図３】０．３７Ｖを微小電極ネットワークに印加した２０分後の全通過電荷を示す。  このシグナルは、抗ＨＩＶ抗体における陽性（■）または陰性（○）血清と共に２８℃で４５分間インキュベートした後に０．２５ｍｇ・ｍｌ−１の基質と接触したＨｉｓＮＦ７９５ｇｐＣの活性に相当する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
従って、本発明の第一の態様において、ａ）．少なくとも抗ＨＩＶ抗体により認識されるペプチドの付加による、改変アロステリック酵素、ｂ）．微小電極ネットワークを備えたマトリックスを含む変換器、およびｃ）．電気化学的シグナルの検出器を含む、バイオセンサーが挙げられる。
【００１７】
用語「アロステリック酵素」は、その活性が１つまたは複数のアロステリック部位により調節される酵素を意味する。アロステリック部位は、酵素活性部位から離れた部位にあり、共有結合様式ではなく可逆的にエフェクター（別名、アロステリックエフェクター）と結合する。エフェクターの結合は、前記酵素の三次元構造を改変し、活性部位の配置に影響を及ぼし、本発明の場合にはその酵素活性を高めることとなる。
【００１８】
アロステリック酵素に付加される（複数の）ペプチドは、ＨＩＶウイルス感染の結果としてヒトまたは動物により産生される抗ＨＩＶ抗体のいずれかにより認識されるものである。規定されるペプチドの配列は、免疫システムにより産生された抗体により認識されるタンパク質配列に対応し、そのようなタンパク質は抗原と称され、抗体により認識される配列はエピトープと称される。抗体がその固有の抗原だけを同定し結合することを可能にする高い特異性を有する相互作用でもって、これらのエピトープは抗体と結合する。したがって、アロステリック酵素に付加されるペプチドは、ＨＩＶウイルスタンパク質、通常ｇｐ４１またはｇｐ１２０等のエンベロープタンパク質のエピトープに対応するものであるが、他の可能性のある抗原のエピトープを排除するものではない。
【００１９】
加えて、本発明にかかるバイオセンサーの一部をなすアロステリック酵素の改変には、その配列のＮ末端および／またはＣ末端領域（例えば、ストップコドン）でのヌクレオチドまたはアミノ酸（修飾されたもの又はされていないもの）付加、ならびにその配列内部でのヌクレオチドまたはアミノ酸（修飾されたもの又はされていないもの）除去もしくは付加が含まれる。
【００２０】
バイオセンサーは、天然の生物学的構成要素と物理化学的構成要素とを組み合わせたものである。本発明におけるバイオセンサーは、生物学的センサー、変換器および検出器の３つの部分から成る。
【００２１】
本発明のバイオセンサーの変換器は、酵素生成物の出現をシグナルに変換する構成要素である。前記変換器は、生物化学的反応を定量化可能な電気信号に変換する微小電極ネットワークによって形成されるマトリックスである。
【００２２】
微小電極は、電気化学過程の研究において強力かつ多用途のツールである。微小電極の利点は、その小さなサイズ、様々な環境下での使用能、微小容量での操作および極微量の様々な成分を検出するその能力等を有する装置であるという点がある。微小電極ネットワークは、通常平行して連結された微小電極の結合体である。それらは、微小電極の利点を備え、全電流が個々の微小電極各々の電流の和となるという強力な増幅性という、さらにもう１つの非常に重要な利点も有する。微小電極ネットワークは、整列した微小電極ネットワークとして提供されてもよいし、またはランダムネットワークおよびマイクロストリック等の他の配置で提供されてもよい。
【００２３】
本発明の実施例２は、微小円盤の量、その直径およびマトリックス内でのその規則的な配置を規定する微小電極の製造に用いられるシステムを意味する。
【００２４】
ネットワークに存在する微小電極の量は、観察される電流の全体的な大きさに影響を及ぼす。従って、ネットワーク成分の数を増やすことは、記録される電流の増加という結果となる。これは、各微小電極により集められる電流が加算的なためである。これにより、低感度の機器を使用することが可能となり、機器設計および必要な構成要素を減らすことが可能である。
【００２５】
しかしながら、マトリックスを形成する構成要素の数よりもさらに重要なことは、微小電極が互いに遮蔽しないよう、微小電極の他の微小電極に対する独立した挙動を確実にするために試行錯誤可能であることである（良くすればするほど良くなることを意味するため）。これは、実験時間および関係する種の拡散係数等のパラメータにより決定される最小距離を超えて微小円盤を動かすことが達成される。分子が移動し得る距離は、以下の式を用いて概算することができる：ｄ＝√（Ｄ×ｔ）［式中、ｄは移動距離（ｍ）であり、Ｄは対象分子の拡散係数（ｍ２ｓ−１）であり、ｔは実験時間（ｓ）である］。
【００２６】
本発明においては、非常に長い時間を取り扱うため、微小電極ネットワークの拡散層は完全に重なり合い、ほぼマクロ電極のような挙動をし、その領域は微小電極ネットワークに満たされた表面であり得る。しかしながら、我々の用途を検出する製品形態の機序は、ゼロの初期濃度から出発し、生成物は最終的に溶液全体に行き渡るため、微小電極ネットワークを用いることは従来のマイクロ電極に対して高い感度を有するという利点を堅持する。
【００２７】
電気化学検出の原理は、分析される基質（アロステリック酵素の反応産物と基質）と作用電極を用いる導電体との間の電荷移動である。この電荷移動（検出されるもの）は、基準電極に対して一定の電位を印加した場合の作用電極上の生成物の酸化または還元によるものである。電気化学反応は、補助電極に沿ったおよび対する電荷移動を含むが、本研究では酵素反応産物の挙動は考慮しない。
【００２８】
本発明では、実施例に記載されるように、以下の電極を用いた：
・作用電極：  微小電極ネットワーク。
・基準電極：  Ａｇ／ＡｇＣｌ電極（３Ｍ  ＫＣｌ）。
・補助電極：  ガラス状炭素ロッド。
【００２９】
本発明で記載する種類の基準電極および補助電極の使用は、他の段落で記載する改変アロステリック酵素活性に起因する反応産物により生じる電気化学的シグナルを検出することを目的とする他の電極の使用を限定するものではない。
【００３０】
電気化学的シグナルの検出器は、電流測定に関するものであってもよし、または電量測定に関するものであってもよい。電流測定と電量測定との違いは、電流測定が分析物の酸化還元により生じ得る電流を測定するものであり、電流は全体または一部であり得る。一方、電量測定は全体の電荷、すなわち時間中の電流の総量を測定する。これが電量測定をより感度のよいものにする。これは、電荷が常に時間に対して直線的に増加するのに対して、電流は瞬間ごとに増加したり低下したりし得るためである。別の種類の検出器もまた用いることができる。例えば、電位差検出器、伝導度検出器またはキャパシトメトリック検出器（capacitometric detector）がある。
【００３１】
好ましい実施形態において、本発明のバイオセンサーに包含されるアロステリック酵素は、β−ガラクトシダーゼである。
【００３２】
この酵素は、本発明のアロステリック酵素の態様を示す天然または人工のβ−ガラクトシダーゼのいずれにも関する。β−ガラクトシダーゼは、β−ガラクトシドの単糖への加水分解を触媒する加水分解活性を有する酵素である。この酵素は、ＬａｃＺ遺伝子によりコードされ、４個のサブユニットから成り、互いに非共有結合により連結されている。β−ガラクトシダーゼは、ラクトースや主として酵素アッセイに用いられる合成類似化合物の両方を加水分解する能力を有する。
【００３３】
他の好ましい態様において、アロステリック酵素に付加されたペプチドは、ＨＩＶウイルスの膜貫通糖タンパク質ｇｐ４１のエピトープである。
【００３４】
ＨＩＶの外皮は、細胞膜に由来する脂質エンベロープである。ウイルスの膜貫通糖タンパク質であるｇｐ４１およびコートタンパク質であるｇｐ１２０がこの外皮から突き出しており、それによりＨＩＶが認識領域を介して標的細胞に結合することが可能となる。その領域はエピトープ配列であり、エピトープ配列は免疫応答により産生される抗体と結合する。ＨＩＶは、その表面に糖タンパク質ｇｐ４１およびｇｐ１２０により認識される配列を有する細胞に感染する。このようにして、ウイルスは細胞膜に結合する。
【００３５】
他の好ましい実施形態において、バイオセンサーは、配列番号：１または配列番号：２を含むリストから選択される改変アロステリック酵素から成る。第一の配列はＮＦ７９５ｇｐＣ酵素に関するものであり、第二の配列はＨｉｓＮＦ７９５ｇｐＣに関する。後者の酵素は、ＮＦ７９５ｇｐＣのアミノ末端にヒスチジンテイルおよびタバコ・プロテアーゼの開裂部位が付加されて構成されている。
【００３６】
実施例で示されるように、配列番号：２に対応する酵素は、ＮＦ７９５ｇｐＣ酵素の活性に対して低下を示さない。従って、選択されるアロステリック酵素は、そのＮ末端および／またはＣ末端領域にヌクレオチドまたはアミノ酸付加（修飾されているか又はされていない）を有していてよく、ならびにその配列の内側部分にいずれかのヌクレオチドまたはアミノ酸欠失もしくは付加を有していてよい。
【００３７】
本発明の他の態様は、生体試料中の抗ＨＩＶ抗体の検出のためのバイオセンサーの使用である。
【００３８】
用語「生体試料」は、体液、例えば血液、血漿、血清または尿および／または器官由来のいずれかの細胞組織に由来し得る単一の試料を意味する。
【００３９】
生体試料中の抗ＨＩＶ抗体の検出に関して、次の段落で記載される方法で改変アロステリック酵素に特異的という意味で結合した抗体の濃度を間接的に決定することを可能にするアロステリック酵素の適切な基質の添加を必要とする。
【００４０】
本発明の他の態様において、抗ＨＩＶ抗体を検出する方法が提供され、該方法は、ａ．生体試料を抽出する工程、ｂ．工程（ａ）の生体試料を本発明のバイオセンサーに接触させる工程、ｃ．工程（ｂ）の試料およびバイオセンサーにアロステリック酵素の基質を添加する工程、ｄ．工程（ｃ）で生じた電気化学シグナルを記録する工程、を含む。
【００４１】
生体試料の種類に応じて、効果的にするためにこの方法の次工程に同一のものと異なる処理が必要になり得る。これらの処理は、本方法の有効性を高めるために必要な希釈が含まれる。
【００４２】
インキュベーションは、酵素活性に最適な溶剤中で、すなわち酵素が活性である最適な条件に調整されたｐＨの溶剤中で実施されなければならず、ならびにその領域を保つための緩衝剤の使用がある。インキュベーションは、試料の最適な希釈（検出のより高い感度を可能にする希釈）が行われるべきであり、適切な改変アロステリック酵素濃度および酵素に付加されたペプチドに抗ＨＩＶ抗体が結合するのに要する時間で実施されるべきである。本発明の実施例５において、上記のインキュベーション条件が記載され、そこでは、ＨＩＶに罹患した患者由来の血清試料の希釈は１／３２０または１／６０であり、酵素濃度は２ｍｇ／Ｌで、インキュベーション時間は少なくとも４５分である。
【００４３】
酵素に関する化学反応、すなわち酵素反応において酵素が処理を開始する際に作用する分子は基質と称され、それらは別の分子、すなわち生成物に変換される。基質は酵素の活性部位に結合し、酵素−基質複合体を形成する。基質は酵素作用により生成物に変換され、活性部位から放出され、活性部位は他の基質を受け入れるために開放される。添加される基質濃度は過剰であってはならず、酵素作用を阻害しない濃度である。
【００４４】
後述するように、抗ＨＩＶ抗体がアロステリックタンパク質に付加されたペプチドに結合することで酵素活性を刺激し、基質が酵素の活性部位に結合することを容易にする。結合抗体の数が多くなればなるほど、より多くの量の基質が変換し得ることとなる。この工程で添加される基質は、酵素反応により生じる生成物が電気活性なものでなければならない。
【００４５】
用語「電気活性な生成物」は、電気活性な化学種、すなわち溶液中で前記の化学反応により電気活性でない化学的物質（基質）から形成された化学種である。この電気活性な種は、酸化または還元され、それによって電子流を生成し得る。この電子流を記録することは、関連する段落で記載する検出技術により実施される。本発明の実施例では、電気活性な生成物はｐ−アミノフェノール（ＰＡＰ）であり、それは酸化されると電子流を生成する。
【００４６】
好ましい態様において、アロステリック酵素の基質は、ＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、ＣＰＲＧ（クロロフェニル  レッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、ＦＤＧ（フルデオキシグルコース、別名、フルオレセイン  ジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）またはＰＡＰＧ（ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）からなるリストから選択されるものである。
【００４７】
本発明の他の態様は、本発明のバイオセンサーを含む抗ＨＩＶ抗体を検出するためのキットである。
【００４８】
好ましい実施形態において、キットはアロステリック酵素の基質もまた含む。さらに好ましい本発明の実施形態において、このキットに含まれるアロステリック酵素の基質は、ＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、ＣＰＲＧ（クロロフェニル  レッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、ＦＤＧ（フルデオキシグルコース、別名、フルオレセイン  ジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）またはＰＡＰＧ（ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）からなるリストから選択されるものである。
【００４９】
明細書および特許請求の範囲を通じて、用語「含む」およびその関連用語は、他の技術的態様、付加物、成分、または工程を排除することを意図するものではない。当業者であれば、本発明の他の目的、利点および態様を、本発明の記載から又は本発明の実地から部分的に想起し得る。添付する図面および以下の実施例は、例示を目的として提供されるものであり、本発明の限定を意図するものではない。
【００５０】
（実施例）
抗ＨＩＶ抗体の検出を記載する下記事項は、本発明者等により実施された複数の試験によって本発明を例示するものである。
【００５１】
実施例１
組換えβ−ガラクトシダーゼ  ＨｉｓＮＦ７９５ｇｐＣのクローニング、発現、精製および活性アッセイ。
ＨＩＶのエンベロープタンパク質ｇｐ４１のエピトープＢを提示するヒスチジン標識した組換えβ−ガラクトシダーゼ  ＨｉｓＮＦ７９５ｇｐＣの構築は、ＰＣＲにより、ヒスチジンテイルおよびタバコエッチウイルス（Tobacco Etch Virus）のプロテアーゼの切断サイト（これは、ヒスチジンの除去を可能にする）をＮＦ７９５ｇｐＣのアミノ末端に付加することに基づいた（Ferrer-Miralles et al., 2001. J. Biol. Chem 276: 40087-40095）。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により得られたＤＮＡバンドを、元のベクターｐＪＬＡ６０２（Schauder et al., 1987. Gene, 52: 279-283）に由来するｐＮＦ７９５ｇｐＣのユニークな制限酵素サイトであるＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩにクローン化し、ベクターｐＨｉｓＮＦ７９５ｇｐＣを得た。前記プラスミドは、改変された酵素をコードし、それは、順に、熱感受性の調節因子ｃＩ８５７により抑制された強力なファージプロモーター  ラムダｐＬおよびｐＲの制御下にある。
【００５２】
タンパク質ＨｉｓＮＦ７９５ｇｐＣを、標準的な方法を用いて大腸菌ＭＣ４１００中で産生させた（Ferrer-Miralles et al., 2001. J. Biol. Chem 276: 40087-40095）。次いで細胞を遠心分離により濃縮し、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、２ｍＭのβ−メルカプトエタノールおよびプロテアーゼインヒビターカクテル・タブレット（Roche Applied Scienceの完全ＥＤＴＡフリー）を添加したＺ緩衝液中に再懸濁した。Ｚ緩衝液は、ＰＢＳロゼンジ（Invitrogen）を用いて調製し、０．１Ｍ  ＰＢＳに１ｍＭのＭｇＳＯ４および２０ｍＭのＫＣｌを補充した０．１Ｍ  ＰＢＳの濃度を得た。この溶液は、最大１８ＭΩ  ｃｍ−１の抵抗を示す脱イオン水を用いて調製した。実験間の器具を洗浄するために漂白剤を用いた。この溶液のｐＨは、温度制御付きのｐＨメーター（ＭＥＴＲＯＨＭ８２７  ｐＨラボメーター）を用いてモニターした。
【００５３】
超音波処理および遠心分離した後に、その上清を、同じ緩衝液で平衡化したニッケルカラム（１ｍｌのＨｉＴｒａｐキレーティングＨＰカラム、GE Healthcare）上に注いだ。次いで、そのカラムを同じ緩衝液で洗浄し、タンパク質を１０−３００ｍＭイミダゾール勾配により抽出した。ヒスチジンテイルの後ろに含まれるプロテアーゼ切断標的は、この精製過程では用いなかった。なぜなら、このタンパク質の酵素活性がヒスチジンテイルの付加によって影響を受けなかったので、その必要がないと考えたためである。
【００５４】
タンパク質陽性画分を、ＥＬＩＳＡマイクロプレートで、オルト−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドを基質として用いるβ−ガラクトシダーゼの小規模な活性アッセイにより検出した。収集したタンパク質画分をＺ緩衝液に透析した。タンパク質濃度は、２６０および２８０ｎｍで測定することにより分光学的に見積もった。その酵素活性は、既報のＭｉｌｌｅｒ法（Ferrer-Miralles et al., 2001. J. Biol. Chem 276: 40087-40095）の改変法により決定した。
【００５５】
実施例２
微小電極ネットワークのキャラクタライゼーション。
本実施例で用いた薄層の微小電極ネットワークは既報のものである（Ordeig et al. 2006b. Electroanalysis, 18: 247-252, Ordeig et al. 2006c. Electroanalysis, 18: 573-578）。これらのネットワークは、１００μｍの内部中心距離を有する立体ネットワーク内に配列された１２８個の直径１０ミクロンの微小円盤から成る。まず初めに、電極をエタノールで清浄し、次いで０Ｖ〜２Ｖ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ（３ＭのＫＣｌ）の一連の電位パルスを印加することで電気化学的に活性化した。次いで電極を１ｍＭのフェロシアン化カリウム中でサイクリック・ボルタメトリーによりキャラクタライズした。異なる操作速度での限界電流の分析、例えばOrdeig et al., 2006a. Analyst, 131: 440-445に記載される分析は、実験を通じて任意の所定の時期でのネットワーク中のアクティブな微小円盤の数の解明を可能にする。この操作は、微小円盤のパシベーションの程度を決定するための各測定後に繰り返した。電極の性能は通常、用いる懸濁液中に存在する他のタンパク質の吸着により影響を受けるが、洗浄電解質溶液（clean electrolyte solution）中での電気化学的活性化の各サイクル後には、そのネットワークの初期の挙動を完全に回復することが可能であった。
【００５６】
実施例３
微小電極ネットワーク中のｐ−アミノフェノール（ＰＡＰ）電気化学。
抗ＨＩＶ抗体の検出は、４−アミノフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ＰＡＰＧからβ−ガラクトシダーゼにより生成されるｐ−アミノフェノール、すなわちＰＡＰへの酸化を通じて間接的に実施された（Niwa et al., 1993. Anal. Chem, 65: 1559-1563; Wollenberger et al., 1994. Analyst, 119: 1245-1249）。この手法の利点は、ＰＡＰが適度の電位（約０．３Ｖ  Ａｇ／ＡｇＣｌ（３Ｍ  ＫＣｌ）に対して）で可逆的に酸化され、また実質的に電極を毀損しないことである（Salavagione et al., 2005. J. Electroanal. Chem, 576: 139-145）。しかしながら、ＰＡＰは、ＥＣ機序によって酸化され（Bard and Faulkner, 2000. Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications, 2nd Edition, John Wiley & Sons, New York）、そこで初期段階の電子移動が生じ、続いて関連する化学反応が生じ、さらに広域のｐＨで加水分解されることが知られている（Wang et al., 1999. J. Electroanal. Chem, 464: 181-186）。さらに、我々は、ｐ−アミノフェノールが我々の最終目的の電極に弱く吸着したことを見出した。これは、この種の拡散係数に関する文献（Niwa et al., 1993. Anal. Chem, 65: 1559-1563, Wang et al., 1999. J. Electroanal. Chem, 464: 181-186, Robinson et al., 1990. J. Phys. Chem, 94: 1003-1005）で見られる値の範囲が原因であろう。我々の微小電極ネットワークで得られた限界電流に関する分析から、我々は適当な拡散係数（４．４５±０．４５）×１０−１０  ｍ２  ｓ−１を見積もる。我々は、本願における全ての計算でこの値を用いた。１ｍＭ  ＰＡＰを含む０．１Ｍ  ＰＢＳのＺ緩衝溶液中で、この測定を実施した。そのボルタンメトリーから、我々は後のＰＡＰの電流測定に関する測定実験においてＡｇ／ＡｇＣｌ（３Ｍ  ＫＣｌ）に対して０．３７Ｖの作用電位（working potential）を用いることにした。なぜなら、この電位では、ＰＡＰの酸化がもっぱら拡散により制御されるためである。
【００５７】
ＰＡＰの検出限界は、１００ｍＶ  ｓ−１で測定した限界電流から決定した。この操作速度で、ネットワーク中の微小円盤の拡散の独立性が確認される（Davies and Compton, 2005. J. Electroanal. Chem, 585: 63-82, Davies et al., 2005. J. Electroanal. Chem 585: 51-62）。検出限界は、LongおよびWinefordner（1983）により提唱された誤差伝播法に基づいて４μＭで評価した。それは、誤差伝播法がＩＵＰＡＣの３ｏ法（Danzer and Currie, 1998. International Union of Pure and Applied Chemistry, 70: 993-1014）よりも、より現実的な結果を提供するためである。
【００５８】
実施例４
野生型β−ガラクトシダーゼの電気化学的検出
図１は、基質も野生型β−ガラクトシダーゼも、作用電位（work potential）での２０分間の分極時間の間にはそれぞれ有意な応答が生じないことを示す。しかしながら、混合することで、この酵素活性により生成されるＰＡＰの出現が即座に起こり得る。所定濃度の酵素に対し、その反応速度は、生成物、この場合ＰＡＰの酸化電流に直接関係する。所定の基質濃度の速度のため、電流対時間の曲線に関する初期の傾きが得られる。一連の基質濃度で測定した初速度が再提示される場合、Ｋｍおよびｋｃａｔ定数の値を得ることができる。古典的ミカエリシスメンテン（Michaelis-Menten）型の機序のもとで酵素の動力学を試験し、ＫｍおよびＫｃａｔの値はそれぞれ約３．１５×１０−４ｍｏｌ  ｌ−１および約０．１８  ｓ−１であることが見出された。
【００５９】
実施例５
Ｈｉｓ−ＮＦ７９５ｇｐＣによる血清中のＨＩＶ抗体の検出。
Ｈｉｓ−ＮＦ７９５ｇｐＣ酵素は野生型酵素よりも安定であるため、測定はＢＳＡ１％（容積あたりの重量）を含有するＺ緩衝液中で行った。しかしながら、酵素活性の電気化学的モニタリングは微小電極ネットワークにより実行可能であり続けた。
【００６０】
より高い酵素濃度の場合、最大値を超えた後に電流はドロップする。低レベルの酵素では電流ドロップはなかったため、酵素濃度が高すぎる場合でも定量的な基質消費があったことが推定された。同様にしてセンサー応答に影響を及ぼし得る他の要素は、タンパク質の吸着によって生じる微小電極のパッシベーションがあるが、おそらく酵素の阻害もある。酵素の阻害は排除し得ないが、我々はこの酵素阻害は本発明の実験条件下では無視してよく、電力損失は基質消費と電極のパッシベーションとの組合せにより一般的に説明し得ると考える。
【００６１】
電気化学セルに基質を添加した直後に、ＰＡＰ酸化電流が記録される。Ｈｉｓ−ＮＦ７７９５ｇｐＣタンパク質の陽性血清とのインキュベーションは、試験した全ての場合でその活性を少なくとも５６％増強した。実際の試料を用いて実施した試験では、２ｍｇ  Ｌ−１の酵素をＨＩＶ−１に感染した患者由来の血清カクテルの１／６０最終希釈物と共に４５分間インキュベートした。
【００６２】
図３は、主要な実験結果を示し、前記実験は、感染した個人由来および健常者由来の２種の異なる血清の連続希釈の貯蔵物と酵素とを、タンパク質ＨｉｓＮＦ７９５ｇｐＣと共にインキュベーションすることを含んだ。各条件に関し、平均値とそれらに対応するエラーバーの見積もりを可能にするため、測定を３回行った。我々は、測定誤差のため９５％の信頼水準と組み合わせた標準偏差を用いる。抗体による認識は１／３２０血清希釈物の場合に最適であった。酵素活性の増加はこの血清濃度の点よりも高レベルでは増加しなかった。電流分析は、酵素反応の初速度の測定よりも又は基質を用いた反応２０分後の電流の測定よりも、より信頼性のある測定である。この電荷測定はより迅速であり、より低濃度の酵素と基質とを用いた実行を可能にする（図２）。
【００６３】
実施例の電気化学測定において用いた定電位電解装置は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＸＰのＰＣに連結され、ＧＰＥＳ４プログラムにより制御されたＡｕｔｏｌａｂ  ＰＧ１２であった。直径３ｍｍ、５ｃｍ長のガラス状炭素ロッドを補助電極として用い、Ｍｅｔｒｏｈｍ  Ｂｉｏｔｒｏｄｅ  Ａｇ／ＡｇＣｌ（３Ｍ  ＫＣｌ）を基準電極として用いた。全ての溶液の温度は恒温槽に連結された二重壁セルにより制御された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年5月2日(2011.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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