(57)【要約】本発明は、肺癌、卵巣癌、膵癌、肝癌、乳癌、前立腺癌および結腸癌、ならびに黒色腫および多発性骨髄腫を含む癌においてＧＯＬＰＨ３が役割を果たすという発見に部分的に基づく。したがって、本発明は、癌、例えば、肺癌、卵巣癌、膵癌、肝癌、乳癌、前立腺癌および結腸癌、ならびに黒色腫および多発性骨髄腫を診断、予知およびモニタリングするための組成物、キットおよび方法に関する。一局面において、被験体が癌に罹患しているか否か、または癌を発生するリスクがあるか否かを評価する方法が提供され、この方法は、対象試料中のマーカーのコピー数を上記マーカーの正常なコピー数と比較することを含み、上記マーカーが、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３またはその断片を含み、上記試料中の上記マーカーの変更されたコピー数が、上記被験体が癌に罹患していること、または癌を発生するリスクがあることを示す。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体が癌に罹患しているか否か、または癌を発生するリスクがあるか否かを評価する方法であって、前記方法が、対象試料中のマーカーのコピー数を前記マーカーの正常なコピー数と比較することを含み、前記マーカーが、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３またはその断片を含み、前記試料中の前記マーカーの変更されたコピー数が、前記被験体が癌に罹患していること、または癌を発生するリスクがあることを示す、方法。
【請求項２】
前記コピー数を、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって評価する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記コピー数を、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）または単一分子シーケンシングによって評価する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記正常なコピー数を、対照試料から得る、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
被験体が癌に罹患しているか否か、または癌を発生するリスクがあるか否かを評価する方法であって、前記方法が、
ａ）対象試料中の、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択されるマーカーの量、構造、細胞内局在および／または活性と、
ｂ）前記マーカーの正常な量、構造、細胞内局在および／または活性と
を比較することを含み、
前記試料中の前記マーカーの量、構造、細胞内局在および／または活性と、前記正常な量、構造、細胞内局在および／または活性との有意差が、前記被験体が癌に罹患していること、または癌を発生するリスクがあることの指標である、方法。
【請求項６】
前記マーカーがＧＯＬＰＨ３である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＧＯＬＰＨ３が、細胞リン脂質を増加させ、レトロマーによる逆輸送を調節し、または受容体リサイクリングを調節する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞リン脂質が、ＰＩＰ２およびＰＡから成る群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＧＯＬＰＨ３が、ＰＩ３Ｋ経路を調節する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＧＯＬＰＨ３が、ＡＲＦ４によってリン酸化される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象試料をＥＧＦに曝露した後、ＧＯＬＰＨ３のリン酸化レベルが低下する、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象試料をＥＧＦに曝露した後、ＧＯＬＰＨ３がゴルジ体から原形質膜に移行する、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
マーカーの量を比較する、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
マーカーの構造を比較する、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
マーカーの細胞内局在を比較する、請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
マーカーの活性を比較する、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
前記マーカーの量が、前記マーカーの発現レベルを決定することによって決定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記マーカーの量が、前記マーカーの生殖系列および／または体細胞のコピー数を決定することによって決定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記正常な量、細胞内局在、構造および／または活性が、対照試料から得られる、請求項５に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料が、組織、全血、血清、血漿、頬側掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便および骨髄から成る群から選択される、請求項１または５に記載の方法。
【請求項２１】
前記コピー数を、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）または単一分子シーケンシングによって評価する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記コピー数を、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）によって評価する、請求項１または１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣＧＨを、アレイ上において実施する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料中の前記マーカーの発現レベルを、前記試料中の前記マーカーに対応するタンパク質の存在を検出することによって評価する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記タンパク質の存在を、前記タンパク質に特異的に結合する試薬を使用して検出する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記試薬が、抗体、抗体誘導体および抗体断片から成る群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記試料中の前記マーカーの発現レベルを、前記試料中の転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の存在を検出することによって評価し、前記転写されたポリヌクレオチドが前記マーカーを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
前記転写されたポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記転写されたポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記検出ステップが、前記転写されたポリヌクレオチドを増幅することを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料中の前記マーカーの発現レベルを、前記試料中の、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記マーカーにアニーリングするまたは前記マーカーを含むポリヌクレオチドの部分にアニーリングする転写されたポリヌクレオチドの存在を検出することによって評価する、請求項１７に記載の方法。
【請求項３２】
被験体におけるｍＴＯＲ経路阻害剤の有効性の可能性を評価する方法であって、前記方法が、
ａ）対象試料中の、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択されるマーカーの量、構造、細胞内局在および／または活性と、
ｂ）前記マーカーの正常な量、構造、細胞内局在および／または活性と
を比較することを含み、
前記試料中の前記マーカーの量、構造、細胞内局在および／または活性と、前記正常な量、構造、細胞内局在および／または活性との有意差が、ｍＴＯＲ経路阻害剤が前記被験体において有意な有効性を有する可能性があることの指標である、方法。
【請求項３３】
前記マーカーがＧＯＬＰＨ３である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＧＯＬＰＨ３が、細胞リン脂質を増加させ、レトロマーによる逆輸送を調節し、または受容体リサイクリングを調節する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞リン脂質が、ＰＩＰ２およびＰＡから成る群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＧＯＬＰＨ３が、ＰＩ３Ｋ経路を調節する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ＧＯＬＰＨ３が、ＡＲＦ４によってリン酸化される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記対象試料をＥＧＦに曝露した後、ＧＯＬＰＨ３のリン酸化レベルが低下する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記対象試料をＥＧＦに曝露した後、ＧＯＬＰＨ３がゴルジ体から原形質膜に移行する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記ｍＴＯＲ経路阻害剤がラパマイシンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
マーカーの量を比較する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４２】
マーカーの構造を比較する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４３】
マーカーの細胞内局在を比較する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４４】
マーカーの活性を比較する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４５】
前記マーカーの量が、前記マーカーの発現レベルを決定することによって決定される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記マーカーの量が、前記マーカーの生殖系列および／または体細胞のコピー数を決定することによって決定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項４７】
前記正常な量、細胞内局在、構造および／または活性が、対照試料から得られる、請求項３２に記載の方法。
【請求項４８】
前記試料が、組織、全血、血清、血漿、頬側掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便および骨髄から成る群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項４９】
前記コピー数を、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）または単一分子シーケンシングによって評価する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記コピー数を、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）によって評価する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＣＧＨを、アレイ上において実施する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記試料中の前記マーカーの発現レベルを、前記試料中の前記マーカーに対応するタンパク質の存在を検出することによって評価する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記タンパク質の存在を、前記タンパク質に特異的に結合する試薬を使用して検出する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記試薬が、抗体、抗体誘導体および抗体断片から成る群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記試料中の前記マーカーの発現レベルを、前記試料中の転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の存在を検出することによって評価し、前記転写されたポリヌクレオチドが前記マーカーを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５６】
前記転写されたポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記転写されたポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記検出ステップが、前記転写されたポリヌクレオチドを増幅することを更に含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記試料中の前記マーカーの発現レベルを、前記試料中の、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記マーカーにアニーリングするまたは前記マーカーを含むポリヌクレオチドの部分にアニーリングする転写されたポリヌクレオチドの存在を検出することによって評価する、請求項４５に記載の方法。
【請求項６０】
被験体における癌の進行をモニタリングするための方法であって、
ａ）第１の時点において、対象試料中の、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択される、マーカーの量、細胞内局在および／または活性を検出すること、
ｂ）後続時点においてステップａ）を繰り返すこと、ならびに
ｃ）ステップａ）およびｂ）において検出された量、細胞内局在および／または活性を比較し、それによって前記被験体における癌の進行をモニタリングすること
を含む方法。
【請求項６１】
前記マーカーがＧＯＬＰＨ３である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ＧＯＬＰＨ３が、細胞リン脂質を増加させ、レトロマーによる逆輸送を調節し、または受容体リサイクリングを調節する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞リン脂質が、ＰＩＰ２およびＰＡから成る群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ＧＯＬＰＨ３が、ＰＩ３Ｋ経路を調節する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
ＧＯＬＰＨ３が、ＡＲＦ４によってリン酸化される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
前記対象試料をＥＧＦに曝露した後、ＧＯＬＰＨ３のリン酸化レベルが低下する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６７】
前記対象試料をＥＧＦに曝露した後、ＧＯＬＰＨ３がゴルジ体から原形質膜に移行する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６８】
前記試料が、組織、全血、血清、血漿、頬側掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便および骨髄から成る群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６９】
マーカーの活性を決定する、請求項６０に記載の方法。
【請求項７０】
マーカーの細胞内局在を決定する、請求項６０に記載の方法。
【請求項７１】
マーカーの量を決定する、請求項６０に記載の方法。
【請求項７２】
前記マーカーの量が、前記マーカーの発現レベルを決定することによって決定される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記試料中の前記マーカーの発現レベルを、前記試料中の前記マーカーに対応するタンパク質の存在を検出することによって評価する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記タンパク質の存在を、前記タンパク質に特異的に結合する試薬を使用して検出する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記試薬が、抗体、抗体誘導体および抗体断片から成る群から選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記試料中の前記マーカーの発現レベルを、前記試料中の転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の存在を検出することによって評価し、前記転写されたポリヌクレオチドが前記マーカーを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
前記転写されたポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記転写されたポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記検出ステップが、前記転写されたポリヌクレオチドを増幅することを更に含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
前記試料中の前記マーカーの発現レベルを、前記試料中の、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記マーカーにアニーリングするまたは前記マーカーを含むポリヌクレオチドの部分にアニーリングする転写されたポリヌクレオチドの存在を検出することによって評価する、請求項７２に記載の方法。
【請求項８１】
前記試料が、前記被験体から得た細胞を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項８２】
前記第１の時点および前記後続時点の間に、前記被験体が、癌の治療を受けた、癌の治療を完了した、および／または寛解にある、請求項６０に記載の方法。
【請求項８３】
被験体において癌を抑制するための試験化合物の有効性を評価する方法であって、前記方法が、
ａ）前記被験体から得られ、かつ前記試験化合物の存在下で維持される第１の試料中の、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択されるマーカーの量、細胞内局在および／または活性と、
ｂ）前記被験体から得られ、かつ前記試験化合物の非存在下で維持される第２の試料中の前記マーカーの量、細胞内局在および／または活性と
を比較することを含み、
前記第２の試料に対する前記第１の試料中のマーカーの量、細胞内局在および／または活性の有意差が、前記試験化合物が前記被験体において癌を抑制するために有効であることの指標である、方法。
【請求項８４】
前記マーカーがＧＯＬＰＨ３である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
ＧＯＬＰＨ３が、細胞リン脂質を増加させ、レトロマーによる逆輸送を調節し、または受容体リサイクリングを調節する、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記細胞リン脂質が、ＰＩＰ２およびＰＡから成る群から選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
ＧＯＬＰＨ３が、ＰＩ３Ｋ経路を調節する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
ＧＯＬＰＨ３が、ＡＲＦ４によってリン酸化される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８９】
前記対象試料をＥＧＦに曝露した後、ＧＯＬＰＨ３のリン酸化レベルが低下する、請求項８４に記載の方法。
【請求項９０】
前記対象試料をＥＧＦに曝露した後、ＧＯＬＰＨ３がゴルジ体から原形質膜に移行する、請求項８４に記載の方法。
【請求項９１】
前記第１の試料および第２の試料が、前記被験体から得た単一試料の部分である、請求項８３に記載の方法。
【請求項９２】
前記第１の試料および第２の試料が、前記被験体から得たプールされた試料の部分である、請求項８３に記載の方法。
【請求項９３】
被験体における癌を抑制するための療法の有効性を評価する方法であって、前記方法が、
ａ）前記療法の少なくとも一部を前記被験体に提供する前に前記被験体から得た第１の試料中の、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択されるマーカーの量、細胞内局在および／または活性と、
ｂ）前記療法の前記一部の提供の後に前記被験体から得た第２の試料中の前記マーカーの量、細胞内局在および／または活性と
を比較することを含み、
前記第２の試料に対する前記第１の試料中のマーカーの量、細胞内局在および／または活性の有意差が、前記療法が前記被験体において癌を抑制するために有効であることの指標である、方法。
【請求項９４】
前記マーカーがＧＯＬＰＨ３である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
ＧＯＬＰＨ３が、細胞リン脂質を増加させ、レトロマーによる逆輸送を調節し、または受容体リサイクリングを調節する、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記細胞リン脂質が、ＰＩＰ２およびＰＡから成る群から選択される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
ＧＯＬＰＨ３が、ＰＩ３Ｋ経路を調節する、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
ＧＯＬＰＨ３が、ＡＲＦ４によってリン酸化される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９９】
前記対象試料をＥＧＦに曝露した後、ＧＯＬＰＨ３のリン酸化レベルが低下する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１００】
前記対象試料をＥＧＦに曝露した後、ＧＯＬＰＨ３がゴルジ体から原形質膜に移行する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０１】
癌を調節し得る組成物を選択する方法であって、
ａ）癌細胞を含む試料を得ること、
ｂ）前記細胞を試験化合物と接触させること、および
ｃ）ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択されるマーカーの量、細胞内局在および／または活性を調節する前記試験化合物の能力を決定し、それによって癌のモジュレータを同定すること
を含む方法。
【請求項１０２】
前記マーカーがＧＯＬＰＨ３である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
ＧＯＬＰＨ３が、細胞リン脂質を増加させ、レトロマーによる逆輸送を調節し、または受容体リサイクリングを調節する、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記細胞リン脂質が、ＰＩＰ２およびＰＡから成る群から選択される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
ＧＯＬＰＨ３が、ＰＩ３Ｋ経路を調節する、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
ＧＯＬＰＨ３が、ＡＲＦ４によってリン酸化される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０７】
前記対象試料をＥＧＦに曝露した後、ＧＯＬＰＨ３のリン酸化レベルが低下する、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０８】
前記対象試料をＥＧＦに曝露した後、ＧＯＬＰＨ３がゴルジ体から原形質膜に移行する、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０９】
前記細胞を、癌の動物モデルから単離する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１０】
前記細胞が、癌細胞株からのものである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１１】
前記細胞が、癌を患う被験体からのものである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１２】
前記細胞が、肺癌細胞株、卵巣癌細胞株、黒色腫細胞株、乳癌細胞株、結腸癌細胞株、多発性骨髄腫細胞株、前立腺癌細胞株、膵癌細胞株および肝癌細胞株から成る群から選択される細胞株からのものである、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１３】
癌を調節し得る組成物を選択する方法であって、
ａ）ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択されるマーカーを試験化合物と接触させること、および
ｂ）前記ＭＣＲ中にあるマーカーの量、細胞内局在および／または活性を調節する前記試験化合物の能力を決定し、それによって癌を調節し得る組成物を同定すること
を含む方法。
【請求項１１４】
前記マーカーがＧＯＬＰＨ３である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
ＧＯＬＰＨ３が、細胞リン脂質を増加させ、レトロマーによる逆輸送を調節し、または受容体リサイクリングを調節する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記細胞リン脂質が、ＰＩＰ２およびＰＡから成る群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
ＧＯＬＰＨ３が、ＰＩ３Ｋ経路を調節する、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１８】
ＧＯＬＰＨ３が、ＡＲＦ４によってリン酸化される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１９】
前記対象試料をＥＧＦに曝露した後、ＧＯＬＰＨ３のリン酸化レベルが低下する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２０】
前記対象試料をＥＧＦに曝露した後、ＧＯＬＰＨ３がゴルジ体から原形質膜に移行する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２１】
前記試験化合物を癌の動物モデルに投与することを更に含む、請求項１０１または１１３に記載の方法。
【請求項１２２】
前記モジュレータが、ＧＯＬＰＨ３に対応する遺伝子またはタンパク質の細胞内局在を変化させるか、あるいはその量および／または活性を阻害する、請求項１０１または１１３に記載の方法。
【請求項１２３】
癌に罹患した被験体を治療する方法であって、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択されるマーカーに対応する遺伝子またはタンパク質の細胞内局在を変化させるか、あるいはその量および／または活性を調節する化合物を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１２４】
前記マーカーがＧＯＬＰＨ３である、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
ＧＯＬＰＨ３が、細胞リン脂質を増加させ、レトロマーによる逆輸送を調節し、または受容体リサイクリングを調節する、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記細胞リン脂質が、ＰＩＰ２およびＰＡから成る群から選択される、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
ＧＯＬＰＨ３が、ＰＩ３Ｋ経路を調節する、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２８】
ＧＯＬＰＨ３が、ＡＲＦ４によってリン酸化される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２９】
前記対象試料をＥＧＦに曝露した後、ＧＯＬＰＨ３のリン酸化レベルが低下する、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３０】
前記対象試料をＥＧＦに曝露した後、ＧＯＬＰＨ３がゴルジ体から原形質膜に移行する、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３１】
前記化合物が、薬学的に受容可能な製剤中で投与される、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３２】
前記化合物が、前記マーカーに対応するタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３３】
前記抗体が毒素に結合体化する、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記抗体が化学療法剤に結合体化する、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３５】
前記化合物が、前記マーカーに対応する遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ干渉剤である、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３６】
前記ＲＮＡ干渉剤がｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記化合物が、前記マーカーに対応する遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３８】
前記化合物がペプチドまたはペプチド模倣体である、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３９】
前記化合物が、前記マーカーの活性を阻害する小分子である、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１４０】
前記小分子が、マーカーと標的タンパク質との間のタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記化合物が、前記マーカーの発現または活性を阻害するアプタマーである、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１４２】
被験体が癌に罹患しているかを評価するためのキットであって、前記キットが、マーカーのコピー数を評価するための試薬を含み、前記マーカーが、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３またはその断片を含む、キット。
【請求項１４３】
癌を抑制する化合物の能力を評価するためのキットであって、前記キットが、マーカーの量、構造、細胞内局在および／または活性を評価するための試薬を含み、前記マーカーが、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択される、キット。
【請求項１４４】
被験体が癌に罹患しているかを評価するためのキットであって、前記キットが、マーカーの量、構造、細胞内局在および／または活性を評価するための試薬を含み、前記マーカーが、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択される、キット。
【請求項１４５】
ヒト癌細胞の存在を評価するためのキットであって、前記キットが、抗体またはその断片を含み、前記抗体またはその断片が、マーカーに対応するタンパク質に特異的に結合し、前記マーカーが、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択される、キット。
【請求項１４６】
癌細胞の存在を評価するためのキットであって、前記キットが核酸プローブを含み、前記プローブが、マーカーに対応する転写されたポリヌクレオチドに特異的に結合し、前記マーカーが、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択される、キット。
【請求項１４７】
前記マーカーがＧＯＬＰＨ３である、請求項１４３、１４４、１４５または１４６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４８】
前記マーカーがＧＯＬＰＨ３であり、かつＧＯＬＰＨ３が、細胞リン脂質を増加させ、レトロマーによる逆輸送を調節し、または受容体リサイクリングを調節する、請求項１４３、１４４、１４５または１４６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４９】
前記細胞リン脂質が、ＰＩＰ２およびＰＡから成る群から選択される、請求項１４８に記載のキット。
【請求項１５０】
前記マーカーがＧＯＬＰＨ３であり、かつＧＯＬＰＨ３が、ＰＩ３Ｋ経路を調節する、請求項１４３、１４４、１４５または１４６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５１】
前記マーカーがＧＯＬＰＨ３であり、かつＧＯＬＰＨ３が、ＡＲＦ４によってリン酸化される、請求項１４３、１４４、１４５または１４６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５２】
前記マーカーがＧＯＬＰＨ３であり、かつ前記対象試料をＥＧＦに曝露した後、ＧＯＬＰＨ３のリン酸化レベルが低下する、請求項１４３、１４４、１４５または１４６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５３】
前記マーカーがＧＯＬＰＨ３であり、かつ前記対象試料をＥＧＦに曝露した後、ＧＯＬＰＨ３がゴルジ体から原形質膜に移行する、請求項１４３、１４４、１４５または１４６のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００８年１０月３日に出願された米国仮出願第６１／１９５，０７１号、２００９年６月１日に出願された米国仮出願第６１／２１７，５０２号、２００９年６月３日に出願された米国仮出願第６１／２１７，６８８号および２００９年６月４日に出願された米国仮出願第６１／２１７，７６８号への優先権の利益を主張する。これらの各出願の内容は、それらの全体が参考として援用される。
【０００２】
政府の資金供与
本明細書に記載された研究は、助成金ＲＯ１  ＣＡ９３９４７およびＰ５０  ＣＡ９３６８３の下、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）によって少なくとも部分的に援助された。したがって、政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
癌は、腫瘍形成に必要な全ての生物学的性質を細胞に付与する多発性遺伝子病変の表現型エンドポイントを表す。実際、例えばＢ細胞癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌および結腸癌を含む多くの癌の際立ったゲノム的特徴は、非相互転座、増幅および欠失を含む多くの複合的な染色体構造異常の存在である。
【０００４】
核型分析（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）、染色体ＣＧＨおよびアレイＣＧＨ（非特許文献７、Ｋｉｍｕｒａ  Ｙら（２００４年）Ｍｏｄ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ５月２１日（電子出版）、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５）、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析（非特許文献１６、非特許文献１７）ならびにヘテロ接合性消失（ＬＯＨ）マッピング（非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１）は、各種の癌におけるコピー数変化または対立遺伝子欠損の再発性領域を同定した。
【０００５】
特異的な癌に関連付けられたコピー数変化または対立遺伝子欠損かかる領域を同定する標準的アプローチは、その特定の癌を有する試料において共有された、保存された遺伝的エレメントの同定を含む。このアプローチは、試料または被験体中における癌の独立予測因子として役立ちうる保存された増幅または欠失に対する重要な洞察につながったが、基礎疾患の開始、進行および維持に関連する推定された癌関連標的、ならびにゲノムの変更を有するこれらの遺伝子座の薬物応答性は、著しい同定作業を必要とする。すなわち、再発性染色体の獲得および喪失が多くの癌においてマッピングされたが、これらの遺伝子座における推定された癌関連標的の大部分は不明のままである。更に、前記アプローチは、同一ではない癌に由来する（すなわち、多発性癌型にわたる）試料間で保存された遺伝的エレメントは同定しない。したがって、臨床管理を導き、かつ新規な治療標的を提供する改善された診断系および予知系を提供するためには、癌を引き起こすことおよび癌に影響を及ぼすことを担う基礎的遺伝子を発見することの必要性があることは明らかである。更に、複数の癌の型に共通なかかる遺伝子を同定する必要性が残っている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｂ．ら（１９９２年）Ｃａｎｃｅｒ  ６９巻、１６７４〜８１頁
【非特許文献２】Ｂａｒｄｉ，  Ｇ．ら（１９９３年）Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ６７巻、１１０６〜１２頁
【非特許文献３】Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｃ．  Ａ．ら（１９９４年）Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ９巻、９３〜１００頁
【非特許文献４】Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｃ．  Ａ．ら（１９９５年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５巻、２３９４〜９頁
【非特許文献５】Ｇｏｒｕｎｏｖａ，  Ｌ．ら（１９９５年）Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １４巻、２５９〜６６頁
【非特許文献６】Ｇｏｒｕｎｏｖａ，  Ｌ．ら（１９９８年）Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ２３巻、８１〜９９頁
【非特許文献７】Ｗｏｌｆ  Ｍら（２００４年）Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ６巻（３号）２４０頁
【非特許文献８】Ｐｉｎｋｅｌら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０巻：２１１頁
【非特許文献９】Ｓｏｌｉｎａｓ−Ｔｏｌｄｏ，  Ｓ．ら（１９９６年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５６巻、３８０３〜７頁
【非特許文献１０】Ｍａｈｌａｍａｋｉ，  Ｅ．  Ｈ．ら（１９９７年）Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０巻、３８３〜９１頁
【非特許文献１１】Ｍａｈｌａｍａｋｉ，  Ｅ．  Ｈ．ら（２００２年）Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ３５巻、３５３〜８頁
【非特許文献１２】Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅ，  Ｓ．ら（１９９７年）Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １９巻：１６１〜９頁
【非特許文献１３】Ｃｕｒｔｉｓ，  Ｌ．  Ｊ．ら（１９９８年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５３巻、４２〜５５頁
【非特許文献１４】Ｇｈａｄｉｍｉ，  Ｂ．  Ｍ．ら（１９９９年）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５４巻、５２５〜３６頁
【非特許文献１５】Ａｒｍｅｎｇｏｌ，  Ｇ．ら（２０００年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  １１６巻、１３３〜４１頁
【非特許文献１６】Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｍら（２００４年）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １０９巻（３号）：３６３〜９頁
【非特許文献１７】Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｋら（２００３年）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  １２巻（５号）：７２７〜３１頁
【非特許文献１８】Ｗａｎｇ  ＺＣら（２００４年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４巻（１号）：６４〜７１頁
【非特許文献１９】Ｓｅｙｍｏｕｒ，  Ａ．  Ｂ．ら（１９９４年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４巻、２７６１〜４頁
【非特許文献２０】Ｈａｈｎ，  Ｓ．  Ａ．ら（１９９５年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５巻、４６７０〜５頁
【非特許文献２１】Ｋｉｍｕｒａ，  Ｍ．ら（１９９６年）Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １７巻、８８〜９３頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
これらの不足に対処するため、ヒト癌の内の大きな割合の病因を左右する原因事象をより容易に識別するために行われた多発性腫瘍型にわたる腫瘍ゲノム分析を、本明細書において記載する。本明細書において、（例えば、８〜５６％の全体的頻度範囲で検討された少なくとも９種の固形腫瘍型を含む）多くの癌における５ｐ１３増幅の標的として、ＧＯＬＰＨ３が同定された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける機能獲得研究および機能喪失研究による細胞内局在（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）によって、ＧＯＬＰＨ３が、強力な腫瘍原性活性を有するゴルジ体局在化タンパク質であることが確認された。機構的に、ＧＯＬＰＨ３酵母相互作用分析は、ノックダウン関連細胞サイズ低下表現型の観察と結びつけられて、ＧＯＬＰＨ３がｍＴＯＲ−Ｓ６−キナーゼシグナル伝達を活性化し、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）に対する感受性を与えることを立証する検証的生化学的および機能的研究につながった。
【０００８】
ｍＴＯＲ（セリン／スレオニンタンパク質キナーゼおよび「ラパマイシンの標的」）は、タンパク質合成および細胞成長の主要な調節因子として機能する（Ｗｕｌｌｓｃｈｌｅｇｅｒら（２００６年）Ｃｅｌｌ  １２４巻：４７１〜４８４頁）。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびマウスにおける遺伝子研究（Ｓｈｉｍａら（１９９８年）Ｅｍｂｏ  Ｊ．  １７巻：６６４９〜６６５９頁、Ｍｏｎｔａｇｎｅら（１９９９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５巻：２１２６〜２１２９頁、Ｏｌｄｈａｍら（２０００年）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １４巻：２６８９〜２６９４頁、Ｚｈａｎｇら（２０００年）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １４巻：２７１２〜２７２４頁）は、ｍＴＯＲ活性が細胞サイズ（細胞周期に入ることを左右する主要パラメーター（Ｆｉｎｇａｒら（２００４年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３巻：３１５１〜３１７１頁））に影響し得ることを示した。また、ｍＴＯＲは、細胞の増殖、成長および生存を調節するためのアミノ酸およびエネルギーストレス検知を含む多様な上流側シグナルをも統合する（Ｇｕｅｒｔｉｎら（２００７年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １２巻：９〜２２頁、Ｙａｎｇら（２００７年）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  １７巻：６６６〜６８１頁）。ｍＴＯＲは、２種の別々のシグナル伝達複合体（ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２）中に存在し、それらは、サブユニット組成物および細菌性マクロライドラパマイシンに対するそれらの感受性が異なる。ラパマイシンは、タンパク質ｒａｐｔｏｒに結合したときにｍＴＯＲ活性を阻害し、細胞成長、細胞サイズおよび増殖の低下を導く（Ａｂｒａｈａｍら（１９９６年）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４巻：４８３〜５１０頁、Ｓａｂａｔｉｎｉら（２００６年）Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ６巻：７２９〜７３４１頁、Ｗｕｌｌｓｃｈｌｅｇｅｒら（２００６年）Ｃｅｌｌ  １２４巻：４７１〜４８４頁）。
【０００９】
また、ＧＯＬＰＨ３は、癌シグナル伝達経路に入る脂質二次メッセンジャーの生合成に影響を及ぼし、細胞成長因子（例えば、ＥＧＦ）による調節を通じて腫瘍形成に影響を与えることも本明細書において示された。したがって、本明細書において記載される一実施形態は、癌の診断、予知および治療にとって重要である主要なシグナル伝達経路に関連するファーストインクラスのゴルジ体腫瘍性タンパク質としてのＧＯＬＰＨ３に関する。
【００１０】
したがって、一態様において、被験体が癌に罹患しているか否か、または癌を発生するリスクがあるか否かを評価する方法が提供され、前記方法は、対象試料中のマーカーのコピー数を前記マーカーの正常なコピー数と比較することを含み、ここで前記マーカーは、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３またはその断片を含み、前記試料中の前記マーカーの変更されたコピー数（例えば、生殖系列および／または体細胞）は、前記被験体が癌に罹患していること、または癌を発生するリスクがあることを示す。一実施形態において、前記コピー数は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって評価する。別の一実施形態において、前記コピー数は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）または単一分子シーケンシングによって評価する。更に別の一実施形態において、前記正常なコピー数は、対照試料から得られる。更に別の一実施形態において、前記試料は、組織、全血、血清、血漿、頬側掻爬物（ｂｕｃｃａｌ  ｓｃｒａｐｅ）、唾液、脳脊髄液、尿、糞便および骨髄から得られ得る。
【００１１】
別の一態様において、本開示は、被験体が癌に罹患しているか否か、または癌を発生するリスクがあるか否かを評価する方法を特徴とするものであって、前記方法は、ａ）対象試料中の、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択されるマーカーの量、構造、細胞内局在および／または活性と、ｂ）前記マーカーの正常な量、構造、細胞内局在および／または活性とを比較することを含み、前記試料中の前記マーカーの量、構造、細胞内局在および／または活性と、前記正常な量、構造、細胞内局在および／または活性との有意差は、前記被験体が癌に罹患していること、または癌を発生するリスクがあることの指標である。一実施形態において、前記マーカーはＧＯＬＰＨ３である。別の一実施形態において、前記ＧＯＬＰＨ３マーカーは、細胞リン脂質を増加させ、レトロマー（ｒｅｔｒｏｍｅｒ）による逆輸送（ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）を調節し、または受容体リサイクリングを調節する。更に別の一実施形態において、前記細胞リン脂質は、ＰＩＰ２および／またはＰＡであってもよい。更に別の一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３はＰＩ３Ｋ経路を調節する。別の一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３は、ＡＲＦ４によってリン酸化され、かつ／またはＧＯＬＰＨ３のリン酸化レベルは、細胞成長因子（例えば、ＥＧＦ）に対する前記対象試料の曝露の後に低下し、かつ／またはＧＯＬＰＨ３は、細胞成長因子（例えば、ＥＧＦ）に対する前記対象試料の曝露の後にゴルジ体（Ｇｏｌｇｉ）から原形質膜に移行する。ある種の実施形態において、前記方法は、前記マーカーの量および／または構造および／または細胞内局在および／または活性を比較することができる。一実施形態において、前記マーカーの量は、前記マーカーの発現レベルを決定することによって、および／または前記マーカーのコピー数（例えば、生殖系列および／または体細胞）を決定することによって決定される（例えば、前記コピー数は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および／または定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）および／または単一分子シーケンシングおよび／または比較ゲノムハイブリダイゼーション（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ＣＧＨ）によって、例えばアレイＣＧＨによって評価する）。別の一実施形態において、前記正常な量、細胞内局在、構造および／または活性は、対照試料から得られる。更に別の一実施形態において、前記試料は、組織、全血、血清、血漿、頬側掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便および骨髄から得られ得る。別の一実施形態において、前記試料中の前記マーカーの発現レベルは、前記マーカーに対応するタンパク質の、前記試料中の存在を検出することによって評価する（例えば、前記タンパク質の存在は、例えば抗体、抗体誘導体および抗体断片から成る群からの、前記タンパク質に特異的に結合する試薬を使用して検出される）。更に別の一実施形態において、前記試料中の前記マーカーの発現レベルは、転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の、前記試料中の存在を検出することによって評価され、前記転写されたポリヌクレオチドは前記マーカーを含み（例えば、ｍＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡ）、かつ／または、前記検出ステップは、前記転写されたポリヌクレオチドを増幅することを更に含む。更に別の一実施形態において、前記試料中の前記マーカーの発現レベルは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記マーカーにアニーリングする、またはポリヌクレオチドの部分にアニーリングする転写されたポリヌクレオチドの、前記試料中の存在を検出することによって評価され、前記ポリヌクレオチドは前記マーカーを含む。
【００１２】
更に別の一態様において、本開示は、被験体におけるｍＴＯＲ経路阻害剤の有効性の可能性を評価する方法を特徴とするものであって、前記方法は、ａ）対象試料中の、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択されるマーカーの量、構造、細胞内局在および／または活性と、ｂ）前記マーカーの正常な量、構造、細胞内局在および／または活性とを比較することを含み、前記試料中の前記マーカーの量、構造、細胞内局在および／または活性と、前記正常な量、構造、細胞内局在および／または活性との有意差は、ｍＴＯＲ経路阻害剤が前記被験体における有意な有効性を有する可能性があることの指標である。一実施形態において、前記マーカーはＧＯＬＰＨ３である。別の一実施形態において、前記ＧＯＬＰＨ３マーカーは、細胞リン脂質を増加させ、レトロマーによる逆輸送を調節し、または受容体リサイクリングを調節する。更に別の一実施形態において、前記細胞リン脂質は、ＰＩＰ２および／またはＰＡであってもよい。更に別の一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３はＰＩ３Ｋ経路を調節する。別の一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３は、ＡＲＦ４によってリン酸化され、かつ／またはＧＯＬＰＨ３のリン酸化レベルは、細胞成長因子（例えば、ＥＧＦ）に対する前記対象試料の曝露の後に低下し、かつ／またはＧＯＬＰＨ３は、細胞成長因子（例えば、ＥＧＦ）に対する前記対象試料の曝露の後にゴルジ体から原形質膜に移行する。別の一実施形態において、ｍＴＯＲ経路阻害剤はラパマイシンである。前記方法は、前記マーカーの量および／または構造および／または細胞内局在および／または活性を比較することができる。一実施形態において、前記マーカーの量は、前記マーカーの発現レベルを決定することによって、および／または前記マーカーのコピー数（例えば、生殖系列および／または体細胞）を決定することによって決定される（例えば、前記コピー数は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および／または定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）および／または単一分子シーケンシングおよび／または比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）によって、例えばアレイＣＧＨによって評価する）。別の一実施形態において、前記正常な量、細胞内局在、構造および／または活性は、対照試料から得られる。更に別の一実施形態において、前記試料は、組織、全血、血清、血漿、頬側掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便および骨髄から得られ得る。別の一実施形態において、前記試料中の前記マーカーの発現レベルは、前記マーカーに対応するタンパク質の、前記試料中の存在を検出することによって評価する（例えば、前記タンパク質の存在は、例えば抗体、抗体誘導体および抗体断片から成る群からの、前記タンパク質に特異的に結合する試薬を使用して検出される）。更に別の一実施形態において、前記試料中の前記マーカーの発現レベルは、転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の、前記試料中の存在を検出することによって評価され、前記転写されたポリヌクレオチドは前記マーカーを含み（例えば、ｍＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡ）、かつ／または、前記検出ステップは、前記転写されたポリヌクレオチドを増幅することを更に含む。更に別の一実施形態において、前記試料中の前記マーカーの発現レベルは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記マーカーにアニーリングする、またはポリヌクレオチドの部分にアニーリングする転写されたポリヌクレオチドの、前記試料中の存在を検出することによって評価され、前記ポリヌクレオチドは前記マーカーを含む。
【００１３】
更に別の一態様において、本開示は、被験体における癌の進行をモニタリングするための方法を特徴とするものであって、前記方法は、ａ）第１の時点において、対象試料中の、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択されるマーカーの量、細胞内局在および／または活性を検出すること、ｂ）後続時点においてステップａ）を繰り返すこと、ならびにｃ）ステップａ）およびｂ）において検出された量、細胞内局在および／または活性を比較し、それによって前記被験体における癌の進行をモニタリングすることを含む。一実施形態において、前記マーカーはＧＯＬＰＨ３である。別の一実施形態において、前記ＧＯＬＰＨ３マーカーは、細胞リン脂質を増加させ、レトロマーによる逆輸送を調節し、または受容体リサイクリングを調節する。更に別の一実施形態において、前記細胞リン脂質は、ＰＩＰ２および／またはＰＡであってもよい。更に別の一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３はＰＩ３Ｋ経路を調節する。別の一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３は、ＡＲＦ４によってリン酸化され、かつ／またはＧＯＬＰＨ３のリン酸化レベルは、細胞成長因子（例えば、ＥＧＦ）に対する前記対象試料の曝露の後に低下し、かつ／またはＧＯＬＰＨ３は、細胞成長因子（例えば、ＥＧＦ）に対する前記対象試料の曝露の後にゴルジ体から原形質膜に移行する。前記方法は、前記マーカーの量および／または構造および／または細胞内局在および／または活性を比較することができる。一実施形態において、前記マーカーの量は、前記マーカーの発現レベルを決定することによって、および／または前記マーカーのコピー数（例えば、生殖系列および／または体細胞）を決定することによって決定される（例えば、前記コピー数は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および／または定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）および／または単一分子シーケンシングおよび／または比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）によって、例えばアレイＣＧＨによって評価する）。別の一実施形態において、前記正常な量、細胞内局在、構造および／または活性は、対照試料から得られる。更に別の一実施形態において、前記試料は、組織、全血、血清、血漿、頬側掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便および骨髄から得られ得る。別の一実施形態において、前記試料中の前記マーカーの発現レベルは、前記マーカーに対応するタンパク質の、前記試料中の存在を検出することによって評価する（例えば、前記タンパク質の存在は、例えば抗体、抗体誘導体および抗体断片から成る群からの、前記タンパク質に特異的に結合する試薬を使用して検出される）。更に別の一実施形態において、前記試料中の前記マーカーの発現レベルは、転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の、前記試料中の存在を検出することによって評価され、前記転写されたポリヌクレオチドは前記マーカーを含み（例えば、ｍＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡ）、かつ／または、前記検出ステップは、前記転写されたポリヌクレオチドを増幅することを更に含む。更に別の一実施形態において、前記試料中の前記マーカーの発現レベルは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記マーカーにアニーリングする、またはポリヌクレオチドの部分にアニーリングする転写されたポリヌクレオチドの、前記試料中の存在を検出することによって評価され、前記ポリヌクレオチドは前記マーカーを含む。別の一実施形態において、前記試料は、前記被験体から得た細胞を含む。別の一実施形態において、前記第１の時点および前記後続時点の間に、前記被験体は、癌の治療を受けた、癌の治療を完了した、および／または寛解にある。
【００１４】
更に別の一態様において、本開示は、被験体において癌を抑制するための試験化合物の有効性を評価する方法を特徴とするものであって、前記方法は、ａ）前記被験体から得られ、かつ前記試験化合物の存在下で維持される第１の試料中の、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択されるマーカーの量、細胞内局在および／または活性と、ｂ）前記被験体から得られ、かつ前記試験化合物の非存在下で維持される第２の試料中の前記マーカーの量、細胞内局在および／または活性とを比較することを含み、前記第２の試料に対する前記第１の試料中のマーカーの量、細胞内局在および／または活性の有意差は、前記試験化合物が前記被験体における癌を抑制するために有効であることの指標である。一実施形態において、前記マーカーはＧＯＬＰＨ３である。別の一実施形態において、前記ＧＯＬＰＨ３マーカーは、細胞リン脂質を増加させ、レトロマーによる逆輸送を調節し、または受容体リサイクリングを調節する。更に別の一実施形態において、前記細胞リン脂質は、ＰＩＰ２および／またはＰＡであってもよい。更に別の一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３はＰＩ３Ｋ経路を調節する。別の一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３は、ＡＲＦ４によってリン酸化され、かつ／またはＧＯＬＰＨ３のリン酸化レベルは、細胞成長因子（例えば、ＥＧＦ）に対する前記対象試料の曝露の後に低下し、かつ／またはＧＯＬＰＨ３は、細胞成長因子（例えば、ＥＧＦ）に対する前記対象試料の曝露の後にゴルジ体から原形質膜に移行する。別の一実施形態において、前記第１の試料および第２の試料は、前記被験体から得た単一試料の部分である。更に別の一実施形態において、前記第１の試料および第２の試料は、前記被験体から得たプールされた試料の部分である。
【００１５】
更に別の一態様において、本開示は、被験体における癌を抑制するための療法の有効性を評価する方法を特徴とするものであって、前記方法は、ａ）前記療法の少なくとも部分を前記被験体に提供する前に前記被験体から得た第１の試料中の、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択されるマーカーの量、細胞内局在および／または活性と、ｂ）前記療法の部分の提供の後に前記被験体から得た第２の試料中の前記マーカーの量、細胞内局在および／または活性とを比較することを含み、前記第２の試料に対する前記第１の試料中のマーカーの量、細胞内局在および／または活性の有意差は、前記療法が前記被験体における癌を抑制するために有効であることの指標である。一実施形態において、前記マーカーはＧＯＬＰＨ３である。別の一実施形態において、前記ＧＯＬＰＨ３マーカーは、細胞リン脂質を増加させ、レトロマーによる逆輸送を調節し、または受容体リサイクリングを調節する。更に別の一実施形態において、前記細胞リン脂質は、ＰＩＰ２および／またはＰＡであってもよい。更に別の一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３はＰＩ３Ｋ経路を調節する。別の一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３は、ＡＲＦ４によってリン酸化され、かつ／またはＧＯＬＰＨ３のリン酸化レベルは、細胞成長因子（例えば、ＥＧＦ）に対する前記対象試料の曝露の後に低下し、かつ／またはＧＯＬＰＨ３は、細胞成長因子（例えば、ＥＧＦ）に対する前記対象試料の曝露の後にゴルジ体から原形質膜に移行する。
【００１６】
別の一態様において、本開示は、癌を調節し得る組成物を選択する方法を特徴とするものであって、前記方法は、ａ）癌細胞を含む試料を得ること、ｂ）前記細胞に試験化合物を接触させること、およびｃ）ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択されるマーカーの量、細胞内局在および／または活性を調節する前記試験化合物の能力を決定し、それによって癌のモジュレータを同定することを含む。一実施形態において、前記マーカーはＧＯＬＰＨ３である。別の一実施形態において、前記ＧＯＬＰＨ３マーカーは、細胞リン脂質を増加させ、レトロマーによる逆輸送を調節し、または受容体リサイクリングを調節する。更に別の一実施形態において、前記細胞リン脂質は、ＰＩＰ２および／またはＰＡであってもよい。更に別の一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３はＰＩ３Ｋ経路を調節する。別の一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３は、ＡＲＦ４によってリン酸化され、かつ／またはＧＯＬＰＨ３のリン酸化レベルは、細胞成長因子（例えば、ＥＧＦ）に対する前記対象試料の曝露の後に低下し、かつ／またはＧＯＬＰＨ３は、細胞成長因子（例えば、ＥＧＦ）に対する前記対象試料の曝露の後にゴルジ体から原形質膜に移行する。更に別の一実施形態において、前記細胞は、癌の動物モデルから単離される。更に別の一実施形態において、前記細胞は、癌細胞株からのものである。別の一実施形態において、前記細胞は、癌を患う被験体からのものである。別の一実施形態において、前記細胞は、肺癌細胞株（ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）、卵巣癌細胞株（ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）、黒色腫細胞株（ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）、乳癌細胞株（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）、結腸癌細胞株（ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）、多発性骨髄腫細胞株（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）、前立腺癌細胞株（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）、膵癌細胞株（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）および肝癌細胞株（ｌｉｖｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）からのものであってもよい。更に別の一実施形態において、前記方法は、前記試験化合物を癌の動物モデルに投与することを更に含む。更に別の一実施形態において、前記モジュレータは、ＧＯＬＰＨ３に対応する遺伝子またはタンパク質の細胞内局在を変化させるか、あるいはその量および／または活性を阻害する。
【００１７】
別の一態様において、本開示は、癌を調節し得る組成物を選択する方法を特徴とするものであって、前記方法は、ａ）ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択されるマーカーに試験化合物を接触させること、およびｂ）前記ＭＣＲ中にあるマーカーの量、細胞内局在および／または活性を調節する前記試験化合物の能力を決定し、それによって癌を調節し得る組成物を同定することを含む。一実施形態において、前記マーカーはＧＯＬＰＨ３である。別の一実施形態において、前記ＧＯＬＰＨ３マーカーは、細胞リン脂質を増加させ、レトロマーによる逆輸送を調節し、または受容体リサイクリングを調節する。更に別の一実施形態において、前記細胞リン脂質は、ＰＩＰ２および／またはＰＡであってもよい。更に別の一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３はＰＩ３Ｋ経路を調節する。別の一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３は、ＡＲＦ４によってリン酸化され、かつ／またはＧＯＬＰＨ３のリン酸化レベルは、細胞成長因子（例えば、ＥＧＦ）に対する前記対象試料の曝露の後に低下し、かつ／またはＧＯＬＰＨ３は、細胞成長因子（例えば、ＥＧＦ）に対する前記対象試料の曝露の後にゴルジ体から原形質膜に移行する。別の一実施形態において、前記方法は、前記試験化合物を癌の動物モデルに投与することを更に含む。更に別の一実施形態において、前記モジュレータは、ＧＯＬＰＨ３に対応する遺伝子またはタンパク質の細胞内局在を変化させるか、あるいはその量および／または活性を阻害する。
【００１８】
更に別の一態様において、本開示は、癌に罹患した被験体を治療する方法を特徴とするものであって、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択されるマーカーに対応する遺伝子またはタンパク質の細胞内局在を変化させるか、あるいはその量および／または活性を調節する化合物を前記被験体に投与することを含む。一実施形態において、前記マーカーはＧＯＬＰＨ３である。別の一実施形態において、前記ＧＯＬＰＨ３マーカーは、細胞リン脂質を増加させ、レトロマーによる逆輸送を調節し、または受容体リサイクリングを調節する。更に別の一実施形態において、前記細胞リン脂質は、ＰＩＰ２および／またはＰＡであってよい。更に別の一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３はＰＩ３Ｋ経路を調節する。別の一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３は、ＡＲＦ４によってリン酸化され、かつ／またはＧＯＬＰＨ３のリン酸化レベルは、細胞成長因子（例えば、ＥＧＦ）に対する前記対象試料の曝露の後に低下し、かつ／またはＧＯＬＰＨ３は、細胞成長因子（例えば、ＥＧＦ）に対する前記対象試料の曝露の後にゴルジ体から原形質膜に移行する。一実施形態において、前記化合物は、薬学的に受容可能な製剤中において投与される。別の一実施形態において、前記化合物は、前記マーカーに対応するタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である（例えば、前記抗体は、毒素および／または化学療法剤に結合体化する）。更に別の一実施形態において、前記化合物は、前記マーカーに対応する遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ干渉剤（例えば、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子）である。別の一実施形態において、前記化合物は、前記マーカーに対応する遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。更に別の一実施形態において、前記化合物はペプチドまたはペプチド模倣体である。更に別の一実施形態において、前記化合物は、前記マーカーの活性を阻害する小分子（例えば、マーカーと標的タンパク質との間のタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する小分子）である。更に別の一実施形態において、前記化合物は、前記マーカーの発現または活性を阻害するアプタマーである。
【００１９】
別の一態様において、本開示は、各種キットを特徴とする。一実施形態において、本開示は、被験体が癌に罹患しているかを評価するためのキットを特徴とするものであって、前記キットは、マーカーのコピー数を評価するための試薬を含み、前記マーカーは、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３またはその断片を含む。別の一実施形態において、本開示は、癌を抑制する化合物の能力を評価するためのキットを特徴とするものであって、前記キットは、マーカーの量、構造、細胞内局在および／または活性を評価するための試薬を含み、前記マーカーは、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択される。更に別の一実施形態において、本開示は、被験体が癌に罹患しているかを評価するためのキットを特徴とするものであって、前記キットは、マーカーの量、構造、細胞内局在および／または活性を評価するための試薬を含み、前記マーカーは、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択される。更に別の一実施形態において、本開示は、ヒト癌細胞の存在を評価するためのキットを特徴とするものであって、前記キットは、抗体またはその断片を含み、前記抗体またはその断片は、マーカーに対応するタンパク質に特異的に結合し、前記マーカーは、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択される。別の一実施形態において、本開示は、癌細胞の存在を評価するためのキットを特徴とするものであって、前記キットは核酸プローブを含み、前記プローブは、マーカーに対応する転写されたポリヌクレオチドに特異的に結合し、前記マーカーは、ヒト第５染色体の領域５ｐ１３の中にあるマーカーと、ヒト第５染色体の３２．０Ｍｂ〜３２．８Ｍｂから成るＭＣＲの中にあるマーカーと、表３に列挙されたマーカーとから成る群から選択される。別の一実施形態において、前記キットの内のいずれかのマーカーはＧＯＬＰＨ３である。別の一実施形態において、前記キットの内のいずれかのマーカーはＧＯＬＰＨ３であり、かつＧＯＬＰＨ３は、細胞リン脂質を増加させ、レトロマーによる逆輸送を調節し、または受容体リサイクリングを調節する（例えば、前記細胞リン脂質は、ＰＩＰ２および／またはＰＡであってもよい）。更に別の一実施形態において、前記キットの内のいずれかのマーカーはＧＯＬＰＨ３であり、かつＧＯＬＰＨ３はＰＩ３Ｋ経路を調節する。更に別の一実施形態において、前記キットの内のいずれかのマーカーはＧＯＬＰＨ３であり、かつＧＯＬＰＨ３は、ＡＲＦ４によってリン酸化される。別の一実施形態において、前記キットの内のいずれかのマーカーはＧＯＬＰＨ３であり、かつＧＯＬＰＨ３のリン酸化レベルは、ＥＧＦに対する前記対象試料の曝露の後に低下する。別の一実施形態において、前記キットの内のいずれかのマーカーはＧＯＬＰＨ３であり、かつＧＯＬＰＨ３は、ＥＧＦに対する前記対象試料の曝露の後にゴルジ体から移行する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｅは、５ｐ１３増幅のゲノム特性化を示す図である。図１Ａは、代表的な腫瘍検体、ならびに悪性黒色腫（Ｍｅｌ）、結腸腺癌（ＣＲＣ）、および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）からの細胞株における５ｐ１３でのＧＯＬＰＨ３増幅を詳細に示しているアレイ−ＣＧＨヒートマップを示す。ゲノムの増幅および欠失の領域を、それぞれ赤と青で示す。Ｍｂｓ＝メガ塩基対単位での第５染色体上の位置。図１Ｂは、示した腫瘍型の３０７個の腫瘍コアのＴＭＡ−ＦＩＳＨ分析による５ｐ１３のコピー数の状態のヒストグラムでのまとめを示す。ＣＲＣ＝結腸腺癌；ＮＳＣＬＣ＝小細胞肺癌；ＭＭ＝多発性骨髄腫；ＯＶ＝卵巣癌；ＰＤＡＣ＝膵管腺癌。図１Ｃは、局所増幅を有する１つの体表的な腫瘍（黒色腫Ｃ２７）からのアレイ−ＣＧＨにより定義した５ｐ１３アンプリコンの最小共通領域を示す。図１Ｄは、４つの参照細胞株および腫瘍検体を使用したゲノムｑＰＣＲによる染色体５ｐ１３アンプリコン境界の画定を示す。図１Ｅは、ＮＳＣＬＣ  ５ｐ１３を増幅した検体（ＡＭＰ）と正常な検体についてのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ発現データのヒートマップ表示を示す。＊＝複数回の試験についてのボンフェローニ補正後の有意な相関関係。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｅは、５ｐ１３増幅のゲノム特性化を示す図である。図１Ａは、代表的な腫瘍検体、ならびに悪性黒色腫（Ｍｅｌ）、結腸腺癌（ＣＲＣ）、および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）からの細胞株における５ｐ１３でのＧＯＬＰＨ３増幅を詳細に示しているアレイ−ＣＧＨヒートマップを示す。ゲノムの増幅および欠失の領域を、それぞれ赤と青で示す。Ｍｂｓ＝メガ塩基対単位での第５染色体上の位置。図１Ｂは、示した腫瘍型の３０７個の腫瘍コアのＴＭＡ−ＦＩＳＨ分析による５ｐ１３のコピー数の状態のヒストグラムでのまとめを示す。ＣＲＣ＝結腸腺癌；ＮＳＣＬＣ＝小細胞肺癌；ＭＭ＝多発性骨髄腫；ＯＶ＝卵巣癌；ＰＤＡＣ＝膵管腺癌。図１Ｃは、局所増幅を有する１つの体表的な腫瘍（黒色腫Ｃ２７）からのアレイ−ＣＧＨにより定義した５ｐ１３アンプリコンの最小共通領域を示す。図１Ｄは、４つの参照細胞株および腫瘍検体を使用したゲノムｑＰＣＲによる染色体５ｐ１３アンプリコン境界の画定を示す。図１Ｅは、ＮＳＣＬＣ  ５ｐ１３を増幅した検体（ＡＭＰ）と正常な検体についてのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ発現データのヒートマップ表示を示す。＊＝複数回の試験についてのボンフェローニ補正後の有意な相関関係。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｅは、ＧＯＬＰＨ３の機能的検証データを示す図である。図２Ａは、軟寒天中での足場非依存性増殖（左のパネル）と細胞増殖（右のパネル）に対する効果についての、非標的化ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ）またはＧＯＬＰＨ３に対する個々のｓｉＲＮＡ（ｓｉ＃１〜ｓｉ＃４）で処理した示した細胞株の結果を示す。バーは、±Ｓ．Ｄ．を示す。図２Ｂは、Ａ５４９親細胞と、野生型（ＷＴ）、あるいは非標的化ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ）またはＧＯＬＰＨ３に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＯＬＰＨ３）のいずれかで処理したｓｉＲＮＡ抵抗性ＧＯＬＰＨ３（ｓｉＲＥＳ）のいずれかを発現するそのような親細胞の、細胞増殖に対する効果についての結果を示す。バーは、±Ｓ．Ｄ．を示す。５日間のエンドポイント値を示す。図２Ｃは、ＨＲＡＳＶ１２、ＭＹＣ、およびＧＯＬＰＨ３を発現する示したベクターをトランスフェクトした初代Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ欠損ＭＥＦの結果を示す。Ｖｅｃ＝ＬａｃＺベクター対照；バーは、±Ｓ．Ｄ．を示す；両側ｔ検定：ＨＲＡＳＶ１２＋ＧＯＬＰＨ３対ＨＲＡＳＶ１２＋Ｖｅｃ、ｐ＝０．００１８。図２Ｄは、軟寒天中での足場非依存性増殖に対する影響をアッセイするためにＧＯＬＰＨ３またはＳＵＢ１のいずれかを形質導入した活性化型ＢＲＡＦＶ６００Ｅを発現するＴＥＲＴ不死化ヒトメラニン細胞（ＨＭＥＬ）の結果を示す。バーは、±Ｓ．Ｄ．を示す；コロニー数についての両側ｔ検定：ＥＶ対ＧＯＬＰＨ３、ｐ＝０．００２０；ＥＶ対ＳＵＢ１、ｐ＝０．３７３９。図２Ｅは、マウス異種移植腫瘍の増殖に対する効果をアッセイするためにＧＯＬＰＨ３を形質導入した示した細胞株の結果を示す。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｅは、ＧＯＬＰＨ３の機能的検証データを示す図である。図２Ａは、軟寒天中での足場非依存性増殖（左のパネル）と細胞増殖（右のパネル）に対する効果についての、非標的化ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ）またはＧＯＬＰＨ３に対する個々のｓｉＲＮＡ（ｓｉ＃１〜ｓｉ＃４）で処理した示した細胞株の結果を示す。バーは、±Ｓ．Ｄ．を示す。図２Ｂは、Ａ５４９親細胞と、野生型（ＷＴ）、あるいは非標的化ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ）またはＧＯＬＰＨ３に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＯＬＰＨ３）のいずれかで処理したｓｉＲＮＡ抵抗性ＧＯＬＰＨ３（ｓｉＲＥＳ）のいずれかを発現するそのような親細胞の、細胞増殖に対する効果についての結果を示す。バーは、±Ｓ．Ｄ．を示す。５日間のエンドポイント値を示す。図２Ｃは、ＨＲＡＳＶ１２、ＭＹＣ、およびＧＯＬＰＨ３を発現する示したベクターをトランスフェクトした初代Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ欠損ＭＥＦの結果を示す。Ｖｅｃ＝ＬａｃＺベクター対照；バーは、±Ｓ．Ｄ．を示す；両側ｔ検定：ＨＲＡＳＶ１２＋ＧＯＬＰＨ３対ＨＲＡＳＶ１２＋Ｖｅｃ、ｐ＝０．００１８。図２Ｄは、軟寒天中での足場非依存性増殖に対する影響をアッセイするためにＧＯＬＰＨ３またはＳＵＢ１のいずれかを形質導入した活性化型ＢＲＡＦＶ６００Ｅを発現するＴＥＲＴ不死化ヒトメラニン細胞（ＨＭＥＬ）の結果を示す。バーは、±Ｓ．Ｄ．を示す；コロニー数についての両側ｔ検定：ＥＶ対ＧＯＬＰＨ３、ｐ＝０．００２０；ＥＶ対ＳＵＢ１、ｐ＝０．３７３９。図２Ｅは、マウス異種移植腫瘍の増殖に対する効果をアッセイするためにＧＯＬＰＨ３を形質導入した示した細胞株の結果を示す。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｄは、ＧＯＬＰＨ３がＶＰＳ３５と相互作用し、細胞の大きさに影響を与えることを示す図である。図３Ａは、ＨＡ（ＧＯＬＰＨ３ＨＡ；緑）とＴＧＮ４６（ゴルジ体マーカー；赤）を同時免疫染色した、ＧＯＬＰＨ３を安定的に発現する１２０５ＬＵ黒色腫細胞（上のパネル）、およびＧＯＬＰＨ３（緑）とＴＧＮ４６（ゴルジ体マーカー；赤）を同時免疫染色したＡ５４９細胞（下のパネル）の両方における、ＧＯＬＰＨ３陽性エンドソーム様構造（矢印）を示す。ＤＮＡをＤＡＰＩで標識した。図３Ｂは、示した構築物を一次的に発現する２３９Ｔ細胞由来の、示した抗体での免疫ブロッティングのための、抗ＨＡ（左のパネル）または抗Ｖ５（右のパネル）で免疫沈降させた（ＩＰ）単離したタンパク質の免疫ブロッティングの結果を示す。ＮＳ＝非特異的バンド。図３Ｃは、ＧＯＬＰＨ３（緑）とＶＰＳ３５（赤）を同時免疫染色したＡ５４９細胞におけるエンドソーム構造でのＧＯＬＰＨ３陽性同時染色（矢印）を示す。ＤＮＡをＤＡＰＩ（青）で標識した。図３Ｄは、２つの代表的な肺腺癌におけるｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ６ＫＴｈｒ３８９（赤）の自動定量分析（ＡＱＵＡ（登録商標））を示す。サイトケラチン（緑）は、腫瘍区画と非核区画を明示する。ＦＩＳＨ比＝ＴＭＡ連続切片上でＦＩＳＨにより決定した５ｐ１３：参照値比。倍率＝２０倍。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｄは、ＧＯＬＰＨ３がＶＰＳ３５と相互作用し、細胞の大きさに影響を与えることを示す図である。図３Ａは、ＨＡ（ＧＯＬＰＨ３ＨＡ；緑）とＴＧＮ４６（ゴルジ体マーカー；赤）を同時免疫染色した、ＧＯＬＰＨ３を安定的に発現する１２０５ＬＵ黒色腫細胞（上のパネル）、およびＧＯＬＰＨ３（緑）とＴＧＮ４６（ゴルジ体マーカー；赤）を同時免疫染色したＡ５４９細胞（下のパネル）の両方における、ＧＯＬＰＨ３陽性エンドソーム様構造（矢印）を示す。ＤＮＡをＤＡＰＩで標識した。図３Ｂは、示した構築物を一次的に発現する２３９Ｔ細胞由来の、示した抗体での免疫ブロッティングのための、抗ＨＡ（左のパネル）または抗Ｖ５（右のパネル）で免疫沈降させた（ＩＰ）単離したタンパク質の免疫ブロッティングの結果を示す。ＮＳ＝非特異的バンド。図３Ｃは、ＧＯＬＰＨ３（緑）とＶＰＳ３５（赤）を同時免疫染色したＡ５４９細胞におけるエンドソーム構造でのＧＯＬＰＨ３陽性同時染色（矢印）を示す。ＤＮＡをＤＡＰＩ（青）で標識した。図３Ｄは、２つの代表的な肺腺癌におけるｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ６ＫＴｈｒ３８９（赤）の自動定量分析（ＡＱＵＡ（登録商標））を示す。サイトケラチン（緑）は、腫瘍区画と非核区画を明示する。ＦＩＳＨ比＝ＴＭＡ連続切片上でＦＩＳＨにより決定した５ｐ１３：参照値比。倍率＝２０倍。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｅは、ＧＯＬＰＨ３がｍＴＯＲ基質のリン酸化状態を調節することを示す図である。図４Ａは、非標的化（ｓｉＮＴ、青）、ＧＯＬＰＨ３に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＯＬＰＨ３、左のパネル、緑）、またはラパマイシン（Ｒａｐ、中央のパネル、緑）で処理したＡ５４９細胞についての代表的なフローヒストグラムを示す。ピーク  ＦＳＣ−Ｈはヒストグラムの中に示され、右のパネルは複数回の実験（ｎ＝３）の平均ＦＳＣ−Ｈを示す；バーは±Ｓ．Ｄ．を示す。図４Ｂは、示した抗体で免疫ブロットした、ＧＯＬＰＨ３を発現する１２０５ＬＵ（左のパネル）、Ａ５４９（中央のパネル）、およびＨＭＥＬ−ｔｅｔ−ＧＯＬＰＨ３（右のパネル；ドキシサイクリン（ＤＯＸ）を含むまたはドキシサイクリン（ＤＯＸ）を含まない）細胞から抽出したタンパク質溶解物を示す。図４Ｃは、血清枯渇状態とし、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）を含めてまたはドキシサイクリン（ＤＯＸ）を含めずに増殖させ、続いて、示した抗体での免疫ブロット分析のために３０分間ＥＧＦでまたはＥＧＦを含めずに処理したＨＭＥＬ−ｔｅｔ−ＧＯＬＰＨ３細胞の結果を示す。図４Ｄ〜４Ｅは、血清枯渇状態とし、非標的化（ｓｉＮＴ）またはＧＯＬＰＨ３に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＯＬＰＨ３）のいずれかで処理し、続いて示した抗体での免疫ブロット分析のためにＥＧＦで成長因子刺激した、Ａ５４９（図４Ｄ）およびＣＲＬ−５８８９（図４Ｅ）細胞の結果を示す。
【図４−２】図４Ａ〜４Ｅは、ＧＯＬＰＨ３がｍＴＯＲ基質のリン酸化状態を調節することを示す図である。図４Ａは、非標的化（ｓｉＮＴ、青）、ＧＯＬＰＨ３に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＯＬＰＨ３、左のパネル、緑）、またはラパマイシン（Ｒａｐ、中央のパネル、緑）で処理したＡ５４９細胞についての代表的なフローヒストグラムを示す。ピーク  ＦＳＣ−Ｈはヒストグラムの中に示され、右のパネルは複数回の実験（ｎ＝３）の平均ＦＳＣ−Ｈを示す；バーは±Ｓ．Ｄ．を示す。図４Ｂは、示した抗体で免疫ブロットした、ＧＯＬＰＨ３を発現する１２０５ＬＵ（左のパネル）、Ａ５４９（中央のパネル）、およびＨＭＥＬ−ｔｅｔ−ＧＯＬＰＨ３（右のパネル；ドキシサイクリン（ＤＯＸ）を含むまたはドキシサイクリン（ＤＯＸ）を含まない）細胞から抽出したタンパク質溶解物を示す。図４Ｃは、血清枯渇状態とし、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）を含めてまたはドキシサイクリン（ＤＯＸ）を含めずに増殖させ、続いて、示した抗体での免疫ブロット分析のために３０分間ＥＧＦでまたはＥＧＦを含めずに処理したＨＭＥＬ−ｔｅｔ−ＧＯＬＰＨ３細胞の結果を示す。図４Ｄ〜４Ｅは、血清枯渇状態とし、非標的化（ｓｉＮＴ）またはＧＯＬＰＨ３に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＯＬＰＨ３）のいずれかで処理し、続いて示した抗体での免疫ブロット分析のためにＥＧＦで成長因子刺激した、Ａ５４９（図４Ｄ）およびＣＲＬ−５８８９（図４Ｅ）細胞の結果を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＯＬＰＨ３増殖促進がラパマイシンでの処置により抑止されることを示す図である。空ベクター（ＥＶ；左のパネル）またはＧＯＬＰＨ３（右のパネル）を形質導入した黒色腫細胞株ＷＭ２３９Ａ（図５Ａ）および１２０５ＬＵ（図５Ｂ）の腫瘍を持つマウスを、処置の開始（腫瘍基準容積約１００ｍｍ３）後２日間隔でビヒクルまたはラパマイシン（６．０ｍｇ／ｋｇ）で処置した。増殖曲線を、各グループについての開始基準容積と比較した腫瘍容積の平均変化としてプロットした。バーは、複数の同じ生物学的試料についての±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。％ＴＧＩは、時間経過のエンドポイントでの腫瘍増殖阻害率（％）を示す。図５Ｃは、同じ時点（８日目、４回の投与後）での、図５Ａ〜５Ｂに示したラパマイシン処置の異種移植実験によるデータをまとめる。Ｖｅｈはビヒクルを示す；Ｒａｐはラパマイシンを示す；％ＴＧＩは、腫瘍増殖阻害率（％）を示す。ビヒクルで処置した１２０５ＬＵ−ＧＯＬＰＨ３腫瘍は、８日間の処置の間に２．５倍の大きさに増大した。これに対して、ＷＭ２３９Ａ−ＧＯＬＰＨ３腫瘍は、８日間の同じ期間の間に５．８倍の大きさに増大した。これらの２つの腫瘍コホートの％ＴＧＩは、それぞれ８１．９％および８０．９％で類似しており、これは、増殖速度がラパマイシンに対する応答に影響を与えなかったことを示している。
【図６】図６は、５ｐ１３アンプリコンのゲノム同定の結果を示す図である。ＴＭＡ−ＦＩＳＨ分析の代表的な画像を、腫瘍コア検体の５ｐ１３増幅について示す：（ｉ）右腰の良性複合母斑、（ｉｉ）左踵の悪性黒色腫、（ｉｉｉ）正常な肺、および（ｉｖ）悪性度ＩＩの肺腺癌。５ｐ１３の領域とセントロメア特異的倍数性参照を、それぞれ緑と赤で示す。
【図７−１】図７Ａ〜７Ｇは、ＧＯＬＰＨ３についての免疫ブロットと足場非依存性アッセイの更なる結果を示す図である。図７Ａは、５ｐ１３を増幅した（ＡＭＰ）黒色腫およびＮＳＣＬＣ細胞株、ならびに正常な（ＮＬ）黒色腫およびＮＳＣＬＣ細胞株におけるＧＯＬＰＨ３発現の免疫ブロット分析を示す。ＮＨＭ＝正常なヒトメラニン細胞。図７Ｂは、図２Ａに示した足場非依存性増殖および増殖アッセイのためのＮＳＣＬＣ  ＣＲＬ−５８８９（上のパネル）および黒色腫１２０５ＬＵ（下のパネル）におけるＧＯＬＰＨ３ノックダウンの確認を示す。ＧＯＬＰＨ３ノックダウンは、示したｓｉＲＮＡ（ｓｉ＃１〜ｓｉ＃４）を使用して行った。ｓｉＮＴ＝非標的化ｓｉＲＮＡ対照；Ｐ＝親Ａ５４９溶解物。図７Ｃは、図７Ｄおよび異種移植アッセイで使用したＧＯＬＰＨ３を形質導入した黒色腫１２０５ＬＵにおけるＧＯＬＰＨ３発現の確認を示す。１２０５ＬＵ溶解物を、図４Ｂに示したＧＯＬＰＨ３機能獲得実験に使用した細胞から抽出し、したがって、両方の図に示す。図７Ｄは、ＧＯＬＰＨ３がヒト黒色腫１２０５ＬＵ細胞（５ｐ１３を増幅していない）の足場非依存性増殖を促進することを示す。ＥＶは空ベクターを示す；バーは、±Ｓ．Ｄ．を示す；コロニー数についての両側ｔ検定、ｐ＝０．０００３。図７Ｅ〜７Ｆは、ＧＯＬＰＨ３を形質導入した黒色腫ＷＭ２３９Ａ細胞（図７Ｅ）およびＧＯＬＰＨ３を形質導入したＮＳＣＬＣ  Ａ５４９細胞を使用した異種移植アッセイにおけるＧＯＬＰＨ３発現の確認を示す（図７Ｆ）。全細胞溶解物を示した抗体で免疫ブロットした。図７Ｇは、ラパマイシンによるｍＴＯＲ阻害の確認を示す。ラパマイシンで処置したマウス（＋）またはラパマイシンを含めずに処置したマウス（−）から回収した代表的な空ベクター（ＥＶ；ｎ＝３）またはＧＯＬＰＨ３（ｎ＝５）ＷＭ２３９Ａ異種移植腫瘍から抽出した全細胞溶解物を、示した抗体で免疫ブロットした。
【図７−２】図７Ａ〜７Ｇは、ＧＯＬＰＨ３についての免疫ブロットと足場非依存性アッセイの更なる結果を示す図である。図７Ａは、５ｐ１３を増幅した（ＡＭＰ）黒色腫およびＮＳＣＬＣ細胞株、ならびに正常な（ＮＬ）黒色腫およびＮＳＣＬＣ細胞株におけるＧＯＬＰＨ３発現の免疫ブロット分析を示す。ＮＨＭ＝正常なヒトメラニン細胞。図７Ｂは、図２Ａに示した足場非依存性増殖および増殖アッセイのためのＮＳＣＬＣ  ＣＲＬ−５８８９（上のパネル）および黒色腫１２０５ＬＵ（下のパネル）におけるＧＯＬＰＨ３ノックダウンの確認を示す。ＧＯＬＰＨ３ノックダウンは、示したｓｉＲＮＡ（ｓｉ＃１〜ｓｉ＃４）を使用して行った。ｓｉＮＴ＝非標的化ｓｉＲＮＡ対照；Ｐ＝親Ａ５４９溶解物。図７Ｃは、図７Ｄおよび異種移植アッセイで使用したＧＯＬＰＨ３を形質導入した黒色腫１２０５ＬＵにおけるＧＯＬＰＨ３発現の確認を示す。１２０５ＬＵ溶解物を、図４Ｂに示したＧＯＬＰＨ３機能獲得実験に使用した細胞から抽出し、したがって、両方の図に示す。図７Ｄは、ＧＯＬＰＨ３がヒト黒色腫１２０５ＬＵ細胞（５ｐ１３を増幅していない）の足場非依存性増殖を促進することを示す。ＥＶは空ベクターを示す；バーは、±Ｓ．Ｄ．を示す；コロニー数についての両側ｔ検定、ｐ＝０．０００３。図７Ｅ〜７Ｆは、ＧＯＬＰＨ３を形質導入した黒色腫ＷＭ２３９Ａ細胞（図７Ｅ）およびＧＯＬＰＨ３を形質導入したＮＳＣＬＣ  Ａ５４９細胞を使用した異種移植アッセイにおけるＧＯＬＰＨ３発現の確認を示す（図７Ｆ）。全細胞溶解物を示した抗体で免疫ブロットした。図７Ｇは、ラパマイシンによるｍＴＯＲ阻害の確認を示す。ラパマイシンで処置したマウス（＋）またはラパマイシンを含めずに処置したマウス（−）から回収した代表的な空ベクター（ＥＶ；ｎ＝３）またはＧＯＬＰＨ３（ｎ＝５）ＷＭ２３９Ａ異種移植腫瘍から抽出した全細胞溶解物を、示した抗体で免疫ブロットした。
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、ＧＯＬＰＨ３相互作用タンパク質の酵母ツーハイブリッドスクリーニングの結果を示す図である。図８Ａは、酵母ツーハイブリッドスクリーニングによりＶＰＳ３５をＧＯＬＰＨ３相互作用タンパク質として同定したことを示す。ＳＣ−ロイシン−ヒスチジン−アデニン＋ＸαＧａｌ（ＳＣ−Ｌ−Ｈ−Ａ＋ＸａＧＡＬ）レポータープレート上に置いた、ＧＯＬＰＨ３（＋）または空ベクター（−）のいずれかと共にＶＰＳ３５（餌食）を同時発現する酵母レポーター株（ＡＨ１０９）は、レポーターの活性化とＧＯＬＰＨ３  餌依存性を確認する。図８Ｂは、酵母ツーハイブリッドスクリーニングのための対照を示す。陰性対照（−）、ｐＧＢＫＴ７−Ｌａｍ（餌；ＴＲＰ）とｐＧＡＤＴ７−Ｔ（餌食、ＬＥＵ）を発現するＡＨ１０９；陽性対照（＋）、ｐＧＢＫＴ７−ｐ５３（餌、ＴＲＰ）とＧＡＤＴ７−Ｔ（餌食、ＬＥＵ）を発現するＡＨ１０９；陽性対照（＋＋）、ｐＧＢＫＴ７（空ベクター、ＴＲＰ）とｐＣＬ１（ＧＡＬ４活性化ドメイン、ＬＥＵ）を発現するＡＨ１０９；ｐＣＬ１だけを発現する餌非依存性偽陽性対照（＋＋−餌）ＡＨ１０９。株を、ＳＣ−ロイシン（ＳＣ−Ｌ）から、ＳＣ−ロイシン−トリプトファン（Ｔｒｐｔｏｐｈａｎ）（ＳＣ−ＬＴ）にレプリカプレートして餌と餌食の存在を確認し、そしてＳＣ−ロイシン−ヒスチジン−アデニン＋ＸαＧａｌ（ＳＣ−Ｌ−Ｈ−Ａ＋ＸａＧＡＬ）にレプリカプレートして、増殖し、α−ガラクトシダーゼレポーターを発現する細胞の能力を通じてレポーターの活性化を確認した（青の外観により示す）。対照は、陽性クローンの選択と餌依存性試験のための比較として使用した。図８Ｃは、免疫共沈分析により決定した、内因性ＧＯＬＰＨ３のＶＰＳ３５との相互作用を示す。ＮＳＣＬＣ  Ａ５４９タンパク質抽出物を、示した抗体での免疫ブロッティングのために、対照（Ｃ）または抗ＧＯＬＰＨ３（Ｇ３）マウス血清のいずれかで免疫沈降させた（ＩＰ）。
【図９】図９は、ｍＴＯＲ基質および他のＭＡＰＫ−／ＰＩ３Ｋ−関連タンパク質におけるＧＯＬＰＨ３依存性の変化についてのウェスタンブロット分析の結果を示す図である。示した細胞株は、空ベクター（ＥＶ）またはＧＯＬＰＨ３を形質導入したか（左の２つのパネル、過剰発現）、あるいは非標的化ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ）またはＧＯＬＰＨ３に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＯＬＰＨ３）をトランスフェクトした（右の２つのパネル、ノックダウン）。全細胞溶解物を示した抗体で免疫ブロットした。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、図５に示した腫瘍についてのエンドポイント腫瘍容積測定により示した、ラパマイシン処置の異種移植実験についてのエンドポイント分析の結果を示す図である。値は、それぞれＷＭ２３９Ａ（図１０Ａ）および１２０５ＬＵ（図１０Ｂ）異種移植片についてのそれぞれの開始基準容積に対する、４回の投与または６回の投与のエンドポイント腫瘍容積の割合としてプロットした。Ｒａｐはラパマイシンを示す；ラパマイシン処置したＷＭ２３９Ａおよび１２０５ＬＵ  ＥＶ対ＧＯＬＰＨ３異種移植片についての両側ｔ検定、それぞれ、ｐ＝０．０６７７およびｐ＝０．０２６８。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＧＯＬＰＨ３の枯渇での脂質二次メッセンジャーの生合成の減少を示す図である。図１１Ａは、ＧＯＬＰＨ３の枯渇が、おそらくは、ｍＴＯＲによる経路またはリン脂質による経路のいずれかを通じて、細胞の移動を減少させることを示す。図１１Ｂは、ＧＯＬＰＨ３の枯渇が、ｉｎ  ｖｉｖｏで、癌のシグナル伝達経路に流れる脂質二次メッセンジャーの基本および成長因子をシミュレートした生合成を減少させることを示す。図１１Ｃは、図１１Ｂに示したデータの定量結果を示す。
【図１２−１】図１２Ａ〜１２Ｄは、成長因子シグナル伝達が、ＡＲＦ４を通じたＧＯＬＰＨ３の誤った局在を引き起こすことを示す図である。図１２Ａは、本明細書中でＧＯＬＰＨ３相互作用タンパク質として同定されたＧＴＰアーゼであるＡＲＦ４が、ＧＯＬＰＨ３と共にゴルジ体に共局在することを示す。図１２Ｂは、ＧＴＰによるＧＯＬＰＨ３のリン酸化がゴルジ体へのＧＯＬＰＨ３の局在に必要であること、およびＡＲＦ４の枯渇がゴルジ体からの細胞周辺を含む細胞の他の部分へのＧＯＬＰＨ３の誤った局在を引き起こすことを示す。図１２Ｃは、代表的な癌細胞株（Ａ５４９）においてＥＧＦで刺激した際のＥＧＦ受容体リン酸化の速度論を示す。図１２Ｄは、成長因子シグナル伝達（例えば、ＥＧＦ）が、ゴルジ体から細胞の他の部分へのＧＯＬＰＨ３の再分配を引き起こすことを示し、これは、ＡＲＦ４はＥＧＦが投与されると原形質膜に再局在することが公知であるので、成長因子が、ＡＲＦ４によるＧＯＬＰＨ３のリン酸化を低下させることによりそのように引き起こす可能性があることを示唆している。
【図１２−２】図１２Ａ〜１２Ｄは、成長因子シグナル伝達が、ＡＲＦ４を通じたＧＯＬＰＨ３の誤った局在を引き起こすことを示す図である。図１２Ａは、本明細書中でＧＯＬＰＨ３相互作用タンパク質として同定されたＧＴＰアーゼであるＡＲＦ４が、ＧＯＬＰＨ３と共にゴルジ体に共局在することを示す。図１２Ｂは、ＧＴＰによるＧＯＬＰＨ３のリン酸化がゴルジ体へのＧＯＬＰＨ３の局在に必要であること、およびＡＲＦ４の枯渇がゴルジ体からの細胞周辺を含む細胞の他の部分へのＧＯＬＰＨ３の誤った局在を引き起こすことを示す。図１２Ｃは、代表的な癌細胞株（Ａ５４９）においてＥＧＦで刺激した際のＥＧＦ受容体リン酸化の速度論を示す。図１２Ｄは、成長因子シグナル伝達（例えば、ＥＧＦ）が、ゴルジ体から細胞の他の部分へのＧＯＬＰＨ３の再分配を引き起こすことを示し、これは、ＡＲＦ４はＥＧＦが投与されると原形質膜に再局在することが公知であるので、成長因子が、ＡＲＦ４によるＧＯＬＰＨ３のリン酸化を低下させることによりそのように引き起こす可能性があることを示唆している。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、ＧＯＬＰＨ３（ゴルジ体局在化タンパク質）が、多くの癌（例えば、少なくとも９種の固形腫瘍型）における保存された５ｐ１３増幅の中からの新規な腫瘍遺伝子として同定されたという発見に部分的に基づく。ＧＯＬＰＨ３酵母相互作用分析は、ノックダウン関連細胞サイズ低下表現型の観察と結びつけられて、ＧＯＬＰＨ３がｍＴＯＲ−Ｓ６−キナーゼシグナル伝達を活性化し、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）に対する感受性を与えることを立証する検証的生化学的および機能的研究につながった。また、ＧＯＬＰＨ３は、癌シグナル伝達経路に入る脂質二次メッセンジャーの生合成に影響を及ぼし、細胞成長因子（例えば、ＥＧＦ）による調節を通じて腫瘍形成に影響を与えることも本明細書において示された。ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドおよびそれらの断片、例えばそれらの生物学的活性断片または抗原断片は、癌、例えば、肺癌、卵巣癌、膵癌、肝癌、乳癌、前立腺癌および結腸癌、ならびに黒色腫および多発性骨髄腫の診断に適用可能なアッセイにおける試薬または標的として提供される。特に、本発明の開示の方法および組成物は、ＧＯＬＰＨ３遺伝子またはその断片、例えばその生物学的活性断片の発現および／または活性の検出と、ＧＯＬＰＨ３遺伝子によってコードされる遺伝子産物またはそれらの断片、例えばそれらの生物学的活性断片の発現および／または活性の検出とに関する。本発明の開示の方法および組成物は、ＧＯＬＰＨ３遺伝子もしくは遺伝子配列またはそれらの断片、ならびにＧＯＬＰＨ３遺伝子の遺伝子産物および／またはそれらの断片、例えばかかるＧＯＬＰＨ３遺伝子産物に特異的に結合する抗体を利用することができる。
【００２２】
一態様において、患者における予知、診断、モニタリングおよび特性評価に関連する試料中の癌、例えば、肺癌、卵巣癌、膵癌、肝癌、乳癌、前立腺癌および結腸癌、ならびに黒色腫および多発性骨髄腫の存在、非存在、ステージおよび他の特性を検出するための方法が提供される。
【００２３】
また、本開示は、抗体（例えば、本明細書において記載されているポリペプチドの内のいずれか１種に特異的に結合する抗体）を含むものの組成物と、本明細書において記載されているポリペプチドの全てまたは断片を含む融合ポリペプチドとを特徴とする。
【００２４】
Ｉ．定義
「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という冠詞は、１つのまたは１つよりも多い（すなわち、少なくとも１つの）冠詞の文法上の対象物を指すために本明細書において使用される。例えば、「エレメント」は、１つのエレメントまたは１つよりも多いエレメントを意味する。
【００２５】
マーカーの「変更された量」またはマーカーの「変更されたレベル」という用語は、対照試料中のマーカーの発現レベルまたはコピー数との比較における、マーカーまたは染色体領域、例えばＭＣＲの増加または減少したコピー数（例えば、生殖系列および／または体細胞）、および／または癌試料中の特定のマーカー遺伝子または遺伝子の増加または減少した発現レベルを指す。また、マーカーの「変更された量」という用語は、正常な対照試料中のマーカーのタンパク質レベルとの比較における、試料中、例えば癌試料中のマーカーの増加または減少したタンパク質レベルをも含む。更に、マーカーの変更された量は、本明細書において記載されているように、マーカーの発現または活性に影響を及ぼし得るマーカーのメチル化状態を検出することによって決定され得る。
【００２６】
被験体中におけるマーカーの量、例えば、マーカーもしくはＭＣＲの発現もしくはコピー数、またはマーカーのタンパク質レベルは、マーカーの量が、量を評価するために用いられるアッセイの標準誤差よりも大きい量だけ、好ましくはその量の少なくとも２倍、より好ましくは３倍、４倍、５倍、１０倍以上正常レベルよりもそれぞれ大きいまたは小さい場合、マーカーまたはＭＣＲの正常量よりも「有意に」高いまたは低い。交互に、被験体中におけるマーカーまたはＭＣＲの量は、その量が、マーカーまたはＭＣＲの正常量よりも少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約３倍、４倍または５倍それぞれ高いまたは低い場合、正常量よりも「有意に」高いまたは低いと考えられ得る。
【００２７】
マーカーまたはＭＣＲの「変更された発現レベル」という用語は、発現またはコピー数を評価するために用いられるアッセイの標準誤差よりも大きくまたは小さく、かつ対照試料（例えば、関連疾患を有さない健康被験体からの試料）中におけるマーカーまたはＭＣＲの発現レベルまたはコピー数、好ましくは幾つかの対照試料中のマーカーまたはＭＣＲの平均の発現レベルまたはコピー数の好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは３倍、４倍、５倍または１０倍以上である、試験試料中、例えば癌を患う患者に由来する試料中のマーカーの発現レベルまたはコピー数を指す。変更された発現レベルは、発現またはコピー数を評価するために用いられるアッセイの標準誤差よりも大きくまたは小さく、かつ対照試料（例えば、関連疾患を有さない健康被験体からの試料）中におけるマーカーまたはＭＣＲの発現レベルまたはコピー数、好ましくは幾つかの対照試料中のマーカーまたはＭＣＲの平均の発現レベルまたはコピー数の好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは３倍、４倍、５倍または１０倍以上である。
【００２８】
マーカーの「変更された活性」という用語は、正常な対照試料中のマーカーの活性との比較における、例えば癌試料中の疾患状態が増大または減少したマーカーの活性を指す。マーカーの変更された活性は、例えば、マーカーの変更された発現、マーカーの変更されたタンパク質レベル、マーカーの変更された構造、あるいは例えば前記マーカーと同じもしくは異なる経路に関与する他のタンパク質との変更された相互作用または転写活性剤もしくは転写阻害剤との変更された相互作用、あるいは変更されたメチル化状態の結果であってよい。
【００２９】
マーカーの「変更された構造」という用語は、正常または野生型の遺伝子またはタンパク質との比較における、マーカー遺伝子またはマーカータンパク質（ｍａｋｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の中の突然変異または対立遺伝子変異体、例えば、マーカーの発現または活性に影響を及ぼす突然変異の存在を指す。例えば、突然変異としては、置換、欠失または付加突然変異が挙げられるが、これらに限定されるものではない。突然変異は、マーカーのコード領域または非コード領域中に存在してもよい。
【００３０】
マーカーの「変更された細胞内局在」という用語は、細胞の中の（例えば、健康なおよび／または野生型の細胞の中の）正常局在に対する細胞の中のマーカーの誤局在を指す。マーカーの正常局在の指標は、マーカーポリペプチドにおける分野において公知の細胞内局在モチーフの分析を通じて決定され得る。
【００３１】
本明細書において特に規定されない限り、「抗体」および「複数の抗体」という用語は、抗体の天然由来の形態（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）および組換え抗体、例えば、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および多重特異的抗体、ならびに前述のものの内の全ての断片および誘導体を広く包含するものであって、それらの断片および誘導体は、少なくとも１つの抗原結合部位を有する。抗体誘導体は、抗体に結合体化したタンパク質または化学的部分を含んでもよい。
【００３２】
また、本明細書において使用される「抗体」という用語は、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）をも含む。本明細書において使用される「抗原結合部分」という用語は、抗原（例えば、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたはその断片）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実施され得ることが示された。抗体の「抗原結合部分」という用語の中に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成る一価断片）、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片）、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１巻：５４４〜５４６頁）、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ）は、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対になって一価ポリペプチド（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知、例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２巻：４２３〜４２６頁、およびＨｕｓｔｏｎら、（１９８８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：５８７９〜５８８３頁、およびＯｓｂｏｕｒｎら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６巻：７７８頁参照）を形成する単一タンパク質鎖としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーによって、組換え法を使用して結合され得る。かかる一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語の中に包含されることが意図される。完全ＩｇＧポリペプチドまたは他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、特異的ｓｃＦｖのあらゆるＶＨ配列およびＶＬ配列をヒト免疫グロブリン定常領域ｃＤＮＡまたはゲノム配列に連結させることができる。また、ＶＨおよびＶＬは、タンパク質化学または組換えＤＮＡ技術を使用する免疫グロブリンのＦａｂ、Ｆｖまたは他の断片の生成においても使用され得る。また、一本鎖抗体の他の形態、例えばダイアボディも包含される。ダイアボディは、二価の二重特異性抗体であり、ここでＶＨドメインおよびＶＬドメインは単一ポリペプチド鎖上に発現するが、同じ鎖上における２つのドメインの間における対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用して、それによってドメインが別の鎖の相補的ドメインと対を形成させ、２つの抗原結合部位が生じる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，  Ｐ．ら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：６４４４〜６４４８頁、Ｐｏｌｊａｋ，  Ｒ．  Ｊ．ら（１９９４年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２巻：１１２１〜１１２３頁参照）。
【００３３】
なお更に、抗体またはその抗原結合部分は、１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの抗体または抗体部分の共有結合性または非共有結合性の会合によって形成されたより大きな免疫接着ポリペプチドの部分であってもよい。かかる免疫接着ポリペプチドの例としては、四量体ｓｃＦｖポリペプチドを作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，  Ｓ．Ｍ．ら（１９９５年）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６巻：９３〜１０１頁）、ならびに二価およびビオチン化ｓｃＦｖポリペプチドを作製するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，  Ｓ．Ｍ．ら（１９９４年）Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３１巻：１０４７〜１０５８頁）が挙げられる。抗体部分、例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、従来の技術、例えば、それぞれ完全抗体のパパインまたはペプシン消化を使用して、完全抗体から調製され得る。更に、抗体、抗体部分および免疫接着ポリペプチドは、本明細書において記載されている通りの標準的組換えＤＮＡ技術を使用して得られ得る。
【００３４】
抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル、異種、同種異系もしくは同系、またはそれらの修飾形態（例えば、ヒト化、キメラ等）であってもよい。抗体は、完全にヒトであってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたはそれらの断片に特異的にまたは実質的に特異的に結合する。本明細書において使用される「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」という用語は、抗原の特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位の１つの種のみを含む抗体ポリペプチドの集団を指すが、一方で「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、特定の抗原と相互作用し得る抗原結合部位の多数の種を含む抗体ポリペプチドの集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、典型的に、それが免疫反応する特定の抗原に対する単一の結合親和性を示す。
【００３５】
「体液」という用語は、身体から排泄または分泌された液、ならびに通常では排泄または分泌されない液（例えば、羊水、眼房水、胆汁、血液および血漿、脳脊髄液、耳垢および耳くそ、カウパー腺液または射精前液、乳糜、糜粥、糞便、雌性射出精液、間質液、細胞内液、リンパ液、月経分泌物、母乳、粘液、胸膜液、膿、唾液、皮脂、精液、血清、汗、滑液、涙液、尿、膣潤滑液、硝子体液、嘔吐物）を指す。
【００３６】
「癌」または「腫瘍」という用語は、発癌性細胞の代表的な特徴、例えば、無制御の増殖、不死、転移の潜在性、急な成長および増殖速度、ならびに特定の特徴的な形態学的特性を有する細胞の存在を指す。癌細胞は、しばしば腫瘍の形態であるが、かかる細胞は、動物中に単独で存在することができ、または非腫瘍形成性癌細胞、例えば白血病細胞であり得る。本明細書において使用される「癌」という用語は、前悪性ならびに悪性の癌を含む。癌としては、Ｂ細胞癌、例えば、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、重鎖病、例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病およびミュー鎖病、良性モノクローナルガンマグロブリン血症および免疫細胞性アミロイドーシス、黒色腫、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系の癌、末梢神経系の癌、食道癌、子宮頸癌、子宮癌または子宮内膜癌、口腔または咽頭の癌、肝癌、腎癌、精巣癌、胆道癌、小腸癌または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、血液学的組織の癌等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
「細胞成長因子」という用語は、本技術分野において周知の細胞成長因子を指し、例えば、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２  ＢＮＤＦ、ＢＭＰ、ＧＧＲＰ、ＧＤＮＦ、ＧＧＦ、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ミオトロフィン（ｍｙｔｏｔｒｏｐｈｉｎ）、ＮＧＦ、ＯＳＭ、ソマトトロフィンおよびＶＥＧＦを含む。
【００３８】
「細胞リン脂質」という用語は、本技術分野において周知の細胞リン脂質を包含し、例えば、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、ＩＰ３、ＤＡＧおよびＰＡを含む）。
【００３９】
本明細書において使用される「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されたコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指すが、一方で「非コード領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されていないヌクレオチド配列の領域（例えば、５’および３’非翻訳領域）を指す。
【００４０】
「相補的」は、２つの核酸鎖の領域の間、または同じ核酸鎖の２つの領域の間の配列相補性の幅広い概念である。第１の核酸領域のアデニン残基は、第１の領域に対して逆平行である第２の核酸領域の残基との特異的水素結合（「塩基対合」）を、その残基がチミンまたはウラシルである場合に形成し得ることが公知である。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基は、第１の鎖に対して逆平行である第２の核酸鎖の残基に、その残基がグアニンである場合に塩基対合し得ることが公知である。２つの領域が逆平行の様式で配置される際に第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第２の領域の残基と塩基対合し得る場合、核酸の第１の領域は、同じまたは異なる核酸の第２の領域に対して相補的である。好ましくは、第１の領域は第１の部分を含み、第２の領域は、第２の部分を含み、それによって、第１および第２の部分が逆平行の様式で配置される際、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％が、第２の部分中におけるヌクレオチド残基と塩基対合することができる。より好ましくは、第１の部分の全てのヌクレオチド残基は、第２の部分中におけるヌクレオチド残基と塩基対合することができる。
【００４１】
「遺伝子のコピー数」または「マーカーのコピー数」は、特定の遺伝子産物をコードする、細胞（例えば、生殖系列および／または体細胞）中におけるＤＮＡ配列の数を指す。一般に、所定の遺伝子について、哺乳動物は各遺伝子の２つのコピーを有する。しかし、コピー数は、遺伝子増幅もしくは重複によって増加させることができるか、または欠失によって減少させることができる。例えば、生殖系列のコピー数の変化としては、１つまたは複数のゲノム遺伝子座における変化が挙げられ、前記１つまたは複数のゲノム遺伝子座は、対照中における生殖系列のコピーの正常な相補物中におけるコピー数（例えば、特異的生殖系列ＤＮＡおよび対応するコピー数が決定されたものと同じ種についての生殖系列ＤＮＡの正常なコピー数）では説明されない。体細胞のコピー数の変化としては、１つまたは複数のゲノム遺伝子座の変化が挙げられ、前記１つまたは複数のゲノム遺伝子座は、対照の生殖系列ＤＮＡにおけるコピー数（例えば、体細胞ＤＮＡおよび対応するコピー数が決定されたものと同じ被験体についての生殖系列ＤＮＡにおけるコピー数）では説明されない。
【００４２】
マーカーもしくはＭＣＲの「正常」コピー数（例えば、生殖系列および／または体細胞）またはマーカーの「正常」発現レベルは、癌に罹患していない被験体、例えばヒトからの生物学的試料中、例えば、組織、全血、血清、血漿、頬側掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便および骨髄を含む試料中の発現レベル、マーカーのコピー数、またはＭＣＲのコピー数である。
【００４３】
本明細書において使用される「診断マーカー」という用語は、癌の診断において有用な、本明細書において列挙されているマーカー、例えば、療法の前、間または後における、腫瘍の過剰活性もしくは過小活性、出現、発現、成長、寛解、再発または抵抗性を含む。マーカーの予測機能は、例えば、（１）例えば、ヒト癌型または癌試料の約５％超、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％以上における、（例えば、ＦＩＳＨ、ＦＩＳＨ＋ＳＫＹ、単一分子シーケンシング（例えば、本技術分野において、少なくともＪ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８６巻：２８９〜３０１頁において記載されている通り）、もしくはｑＰＣＲによる）増加もしくは減少したコピー数、（例えば、ＩＳＨ、ノーザンブロットもしくはｑＰＣＲによる）過剰発現もしくは過小発現、（例えば、ＩＨＣによる）増大もしくは減少したタンパク質レベル、または（例えば、マーカーが関与する経路のモジュレーションによって決定された）増加もしくは減少した活性、（２）癌に罹患した被験体、例えばヒトからの生物学的試料、例えば、組織、全血、血清、血漿、頬側掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便または骨髄を含む試料中のその存在または非存在、（３）癌の患者（例えば、特定の療法に応答する患者、または抵抗性を発生する患者）の臨床的サブセットにおけるその存在または非存在によって確認され得る。
【００４４】
また、診断マーカーとしては「代理マーカー」、例えば、癌の進行の間接的マーカーであるマーカーも挙げられる。
【００４５】
分子は、基質から解離する分子の実質的割合なしで基質を液（例えば、標準クエン酸添加生理食塩水、ｐＨ７．４）ですすぐことができるようにそれが基質に共有結合または非共有結合する場合、基質に「固定」または「付着」される。
【００４６】
本明細書において使用される「相同」は、同じ核酸鎖の２つの領域の間、または２つの異なる核酸鎖の領域の間のヌクレオチド配列類似性を指す。両領域におけるヌクレオチド残基の位置が同じヌクレオチド残基によって占有される場合、前記領域は、その位置において相同である。各領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基位置が同じ残基によって占有される場合、第１の領域は、第２の領域に対して相同である。２つの領域の間の相同性は、同じヌクレオチド残基によって占有される２つの領域のヌクレオチド残基位置の割合に関して表現される。例えば、ヌクレオチド配列５’−ＡＴＴＧＣＣ−３’を有する領域、およびヌクレオチド配列５’−ＴＡＴＧＧＣ−３’を有する領域は、５０％の相同性を共有する。好ましくは、第１の領域は、第１の部分を含み、第２の領域は、第２の部分を含み、それによって、前記部分の各々のヌクレオチド残基位置の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％が、同じヌクレオチド残基によって占有される。より好ましくは、前記部分の各々の全てのヌクレオチド残基位置は、同じヌクレオチド残基によって占有される。
【００４７】
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、本発明の核酸、例えば本発明の組換え発現ベクターがその中に導入されている細胞を指すことが意図される。「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の後代または潜在的後代をも指すことが理解されるべきである。ある種の修飾が突然変異または環境的影響のために後続の世代において起こり得るので、かかる後代は、実際には親細胞と同一でない可能性があるが、それでも本明細書において使用される用語の範囲内に含まれる。
【００４８】
本明細書において使用される「ヒト化抗体」という用語は、ヒト細胞により作製される抗体によりよく似た抗体に変更された可変領域および定常領域を有する非ヒト細胞により作製された抗体を含むことが意図される。例えば、非ヒト抗体アミノ酸配列を、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列において見出されるアミノ酸を組み込むように改変することによる。本発明のヒト化抗体は、例えばＣＤＲにおいて、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発により、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞突然変異により導入された突然変異）によりコードされないアミノ酸残基を含んでもよい。また、本明細書において使用される「ヒト化抗体」という用語は、マウス等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフトされた抗体をも含む。
【００４９】
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドに作動可能に連結した場合、遺伝子産物が、実質的に、プロモーターに対応するインデュサーが細胞中に存在する場合にのみ生きたヒト細胞中において産生されるようにするヌクレオチド配列である。
【００５０】
本明細書において使用される「阻害する」という用語は、例えば、特定の作用、機能または相互作用の減少、制限または封鎖を含む。
【００５１】
癌は、その癌の少なくとも１つの徴候が軽減され、停止され、遅くされ、または予防される場合、「阻害」される。本明細書において使用される場合、癌はまた、その癌の再発または転移が低下し、遅くされ、遅延され、または予防される場合にも「阻害」される。
【００５２】
本明細書において使用される「相互作用」という用語は、２つの分子の間の相互作用を指す場合、前記分子の互いの物理的接触（例えば、結合）を指す。一般に、かかる相互作用は、前記分子の一方または両方の活性（生物学的効果を生じさせる）をもたらす。
【００５３】
本明細書において使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する単離された抗体は、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたはその断片以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。更に、単離された抗体は、他の細胞材料および／または化学物質が実質的になくてもよい。
【００５４】
本明細書において使用される「単離されたタンパク質」は、細胞から単離されるか、もしくは組換えＤＮＡ技術により作製される場合、他のタンパク質、細胞材料、分離培地および培養培地、または化学的に合成される場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないタンパク質を指す。「単離された」もしくは「精製された」タンパク質またはその生物学的活性部分は、抗体、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質が由来する細胞もしくは組織源から得られる細胞材料もしくは他の混在タンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。「細胞材料を実質的に含まない」という言い回しは、タンパク質が、それが単離または組換えにより作製される細胞の細胞成分から分離される、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたはその断片の調製物を含む。一実施形態において、「細胞材料を実質的に含まない」という言い回しは、約３０％（乾燥重量）未満の非ＧＯＬＰＨ３タンパク質（本明細書において「混在タンパク質」とも称される）、より好ましくは約２０％未満の非ＧＯＬＰＨ３タンパク質、なおより好ましくは約１０％未満の非ＧＯＬＰＨ３タンパク質、最も好ましくは約５％未満の非ＧＯＬＰＨ３タンパク質を有するＧＯＬＰＨ３タンパク質またはその断片の調製物を含む。抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質もしくはその断片、例えばその生物学的に活性な断片が組換えにより作製される場合、これも好ましくは実質的に培養培地がない、すなわち、培養培地がタンパク質調製物の体積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満を表す。
【００５５】
「キット」は、本発明のマーカーの発現を特異的に検出するための少なくとも１種の試薬、例えばプローブを含むあらゆる製品（例えば、パッケージまたは容器）である。キットは、本発明の方法を実施するための単位としてプロモートされ得るか、分配され得るか、または販売され得る。キットは、本発明のマーカー（例えば、ＧＯＬＰＨ３）を発現するために必要な１種または複数種の試薬を含むことができる。ある種の実施形態において、キットは、参照標準、例えば、細胞成長、分裂、移動、生存もしくはアポトーシスを制御するシグナル伝達経路に影響を及ぼさないかまたは調節しないタンパク質をコードする核酸を更に含むことができる。当業者は、一般的な分子タグ（例えば、緑色蛍光タンパク質およびベータ−ガラクトシダーゼ）、ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙの参照によって細胞成長、分裂、移動、生存もしくはアポトーシスを包含する経路の内のいずれにも分類されないタンパク質または遍在するハウスキーピングタンパク質を含むが限定されるものではない多くかかる制御タンパク質を想定することができる。キットの試薬は、個々の容器中において、または単一の容器中における２種以上の試薬の混合物として提供され得る。更に、キットの中における組成物の使用を記載する教材が含まれ得る。
【００５６】
「マーカー」は、正常なまたは健康な組織または細胞中におけるその発現レベルからの組織または細胞中における変更された発現レベルが癌等の疾患状態に関連付けられた遺伝子である。「マーカー核酸」は、本発明のマーカーによってコードされるか、または前記マーカーに対応する核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）である。かかるマーカー核酸としては、配列表に記載されている核酸配列の内のいずれかの全体もしくは部分配列またはかかる配列の相補物を含むＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）が挙げられる。また、マーカー核酸としては、配列表に記載されている核酸配列の内のいずれかの全体もしくは部分配列またはかかる配列の相補物を含むＲＮＡが挙げられるが、ここで全てのチミジン残基はウリジン残基で置き換えられている。「マーカータンパク質」は、本発明のマーカーによってコードされるか、または前記マーカーに対応するタンパク質である。マーカータンパク質は、配列表に記載されている配列の内のいずれかの全体または部分配列を含む。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、交換可能に使用される。
【００５７】
本明細書において使用される「最小共通領域（ＭＣＲ）」は、癌のゲノム中における獲得および増幅（増加したコピー数）または喪失および欠失（減少したコピー数）のいずれかを示す隣接染色体領域をいう。ＭＣＲは、増加または減少したコピー数を有し、かつ癌に関連付けられた少なくとも１つの核酸配列を含む。
【００５８】
マーカーの「正常」発現レベルは、癌、例えば、肺癌、卵巣癌、膵癌、肝癌、乳癌、前立腺癌および結腸癌、ならびに黒色腫および多発性骨髄腫に罹患していない被験体、例えばヒト患者の細胞中におけるマーカーの発現レベルである。マーカーの「過剰発現」または「有意により高い発現レベル」は、発現を評価するために用いられるアッセイの標準誤差より大きく、かつ対照試料（例えば、マーカー関連疾患を有さない健康被験体からの試料）中におけるマーカーの発現レベルの好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは３倍、４倍、５倍または１０倍の試験試料中の発現レベル、好ましくは、幾つかの対照試料中のマーカーの平均発現レベルを指す。マーカーの「有意により低い発現レベル」は、対照試料（例えば、マーカー関連疾患を有さない健康被験体からの試料）中におけるマーカーの発現レベルの多くとも２分の１、より好ましくは３分の１、４分の１、５分の１または１０分の１の試験試料中の発現レベル、好ましくは、幾つかの対照試料中のマーカーの平均発現レベルを指す。
【００５９】
マーカーまたはＭＣＲの「過剰発現」または「有意により高い発現レベルまたはコピー数」は、発現またはコピー数を評価するために用いられるアッセイの標準誤差よりも大きく、かつ対照試料（例えば、癌に罹患していない健康被験体からの試料）中におけるマーカーまたはＭＣＲの発現レベルまたはコピー数の好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは３倍、４倍、５倍または１０倍以上の試験試料中の発現レベルまたはコピー数、好ましくは、幾つかの対照試料中のマーカーまたはＭＣＲの平均発現レベルまたはコピー数を指す。
【００６０】
「プローブ」という用語は、特異的に意図された標的分子、例えば、マーカーによってコードされるかまたは前記マーカーに対応するヌクレオチド転写物またはタンパク質に選択的に結合し得るあらゆる分子を指す。プローブは、当業者によって合成され得るか、または適切な生物学的調製物に由来することができる。標的分子の検出の目的のために、本明細書において記載されているように、プローブは、標識されるように特異的に設計され得る。プローブとして利用され得る分子の例としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体および有機分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
本明細書において使用される「ＲＮＡ干渉剤」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的遺伝子（例えば本発明のマーカー）の発現に干渉するまたは前記発現を阻害するあらゆる剤であると定義される。かかるＲＮＡ干渉剤としては、標的遺伝子（例えば本発明のマーカー）またはその断片に対して相同であるＲＮＡ分子を含む核酸分子、短分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的遺伝子の発現に干渉するかまたは前記発現を阻害する小分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」は、進化的に保存されたプロセスであり、それによって、標的遺伝子と同一な、または高度に類似する配列のＲＮＡの発現または導入が、その標的とされた遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列特異的分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）をもたらし（Ｃｏｂｕｒｎ，  Ｇ．およびＣｕｌｌｅｎ，  Ｂ．  （２００２年）Ｊ．  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７６巻（１８号）：９２２５頁参照）、それによって、標的遺伝子の発現が阻害される。一実施形態において、前記ＲＮＡは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。このプロセスは植物、無脊椎動物および哺乳動物細胞において記載されている。天然においては、ＲＮＡｉは、長いｄｓＲＮＡの、ｓｉＲＮＡと呼ばれる二本鎖断片へのプロセッシング的切断をプロモートするｄｓＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼダイサーによって開始される。ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを認識し、かつ切断するタンパク質複合体に組み込まれる。ＲＮＡｉは、核酸分子、例えば、合成ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡ干渉剤を導入して、標的遺伝子の発現を阻害し、またはそれをサイレンシングすることによっても開始され得る。本明細書において使用される「標的遺伝子発現の阻害」または「マーカー遺伝子発現の阻害」は、標的遺伝子（例えば、本発明のマーカー遺伝子）または標的遺伝子によってコードされるタンパク質、例えば、本発明のマーカータンパク質の発現またはタンパク質活性もしくはレベルのあらゆる減少を含む。前記減少は、標的遺伝子の発現、またはＲＮＡ干渉剤によって標的とされなかった標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性もしくはレベルと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％以上の減少であり得る。
【００６３】
本明細書において「低分子干渉ＲＮＡ」とも称される「短分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）は、例えば、ＲＮＡｉによって、標的遺伝子の発現を阻害するように機能する剤であると定義される。ｓｉＲＮＡは、化学的に合成され得、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって作製され得、または宿主細胞内において作製され得る。一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、長さが約１５乃至約４０ヌクレオチド、好ましくは約１５乃至約２８ヌクレオチド、より好ましくは長さが約１９乃至約２５ヌクレオチド、より好ましくは長さが約１９、２０、２１または２２ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であり、約０、１、２、３、４または５ヌクレオチドの長さを有する各鎖上に３’および／または５’オーバーハングを含有することができる。前記オーバーハングの長さは、２つの鎖の間で独立しており、すなわち、１つの鎖上のオーバーハングの長さは、第２の鎖上のオーバーハングの長さに依存しない。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解または特異的な転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を通じてＲＮＡ干渉をプロモートすることができる。
【００６４】
別の一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、（ステムループとも呼ばれる）小さなヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。一実施形態において、これらのｓｈＲＮＡは、短い（例えば、１９〜２５ヌクレオチド）アンチセンス鎖、続く５〜９ヌクレオチドループ、および同様なセンス鎖から構成される。あるいは、センス鎖がヌクレオチドループ構造に先行し得、アンチセンス鎖がそれに続き得る。これらのｓｈＲＮＡは、プラスミド、レトロウイルスおよびレンチウイルス中に含有され得、例えば、ｐｏｌ  ＩＩＩ  Ｕ６プロモーター、または別のプロモーターから発現され得る（例えば、本明細書に参照により組み込まれるＳｔｅｗａｒｔら（２００３年）ＲＮＡ  Ａｐｒ；９巻（４号）：４９３〜５０１頁参照）。
【００６５】
ＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ分子は、癌を有する、または癌を有するリスクがある患者に投与して、本発明のマーカー遺伝子、例えば（表３に列挙されたマーカー等の）癌において過剰発現されるマーカー遺伝子の発現を阻害し、それによって被験体における癌を治療し、予防し、または阻害することができる。
【００６６】
「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドに作動可能に連結した場合、ヒト生細胞中において前記細胞のほとんどまたは全ての生理学的条件下で遺伝子産物が産生されるようにするヌクレオチド配列である。
【００６７】
本明細書において使用される「被験体」は、あらゆる健康な動物、哺乳動物もしくはヒト、または、癌、例えば、肺癌、卵巣癌、膵癌、肝癌、乳癌、前立腺癌および結腸癌、ならびに黒色腫および多発性骨髄腫に罹患したあらゆる動物、哺乳動物またはヒトを指す。「被験体」という用語は、「患者」と交換可能である。
【００６８】
「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言い回しは、タンパク質が、前記タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されている抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質の調製物を含む。一実施形態において、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言い回しは、約３０％（乾燥重量）未満の化学的前駆体または非抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質化学物質、より好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質化学物質、なおより好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質化学物質、最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質化学物質を有する抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質の調製物を含む。
【００６９】
「組織特異的」プロモーターは、遺伝子産物をコードし、または特定するポリヌクレオチドに作動可能に連結した場合、ヒト生細胞中において、実質的に、前記細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ遺伝子産物が産生されるようにするヌクレオチド配列である。
【００７０】
「転写されたポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド転写物」は、本発明のマーカーの転写、および、ある場合、ＲＮＡ転写物の正常な転写後プロセシング（例えば、スプライシング）、およびＲＮＡ転写物の逆転写によって作製された成熟ｍＲＮＡの全てもしくは部分に対して相補的であるか、または相同であるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはこのようなＲＮＡもしくはｃＤＮＡの類似体）である。
【００７１】
マーカーまたはＭＣＲの「過小発現」または「有意により低い発現レベルまたはコピー数」は、発現またはコピー数を評価するために用いられるアッセイの標準誤差より大きいが、対照試料（例えば、癌に罹患していない健康被験体からの試料）中におけるマーカーまたはＭＣＲの発現レベルまたはコピー数よりも好ましくは多くとも２分の１、より好ましくは３分の１、４分の１、５分の１または１０分の１またはそれより低い試験試料中の発現レベルまたはコピー数、好ましくは、幾つかの対照試料中のマーカーまたはＭＣＲの平均発現レベルまたはコピー数を指す。
【００７２】
本明細書において使用される「ベクター」という用語は、これが連結しているもう１つの核酸を輸送することができる核酸を指す。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これは、その中に更なるＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。もう１つの型のベクターはウイルスベクターであり、ここで更なるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされ得る。ある種のベクターは、これらが導入される宿主細胞中における自律複製が可能である（例えば、細菌性複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入される際に宿主細胞のゲノム中に組み入れられ、これにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、ある種のベクターは、作動的に連結される遺伝子の発現を行うことができる。かかるベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、プラスミドが最も一般的に用いられるベクター形態であるので、「プラスミド」および「ベクター」は、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、かかる他の発現ベクター形態、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）を含むことが意図され、これらは同等の機能を果たす。
【００７３】
遺伝コード（後記）によって定義されるように、特定のタンパク質のアミノ酸配列と前記タンパク質をコードし得るヌクレオチド配列との間には、公知の、かつ明確な対応がある。同様に、遺伝コードによって定義されるように、特定の核酸のヌクレオチド配列と前記核酸によってコードされるアミノ酸配列との間には、公知の、かつ明確な対応がある。
【００７４】
【化１】
2012504426.tif 000003
遺伝コードの重要でかつ周知の特徴は、その重複性であり、これによりタンパク質を作製するために使用されるアミノ酸のほとんどに対して、１個よりも多いコードヌクレオチドトリプレットが用いられ得る（以上に記載）。故に、多数の異なるヌクレオチド配列が１つの所定のアミノ酸配列をコードできる。かかるヌクレオチド配列は、機能的に同等と考えられるが、それは、これらが全ての生物体内において同じアミノ酸配列の作製をもたらすからである（しかし、ある種の生物体は、一部の配列が他のものに対するよりも効率的に翻訳できる）。更に、場合により、プリンまたはピリミジンのメチル化変異体が、所定のヌクレオチド配列内において見出され得る。かかるメチル化は、トリヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸との間のコードの関係には影響しない。
【００７５】
以上を鑑みて、本発明の融合タンパク質またはポリペプチド（またはそのあらゆる部分）をコードするＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡをアミノ酸配列に翻訳する遺伝コードを使用して融合タンパク質またはポリペプチドアミノ酸配列を誘導するために使用され得る。同様に、融合タンパク質またはポリペプチドアミノ酸配列に対して、融合タンパク質またはポリペプチドをコードすることができる対応するヌクレオチド配列が遺伝コードから誘導され得る（その重複性のため、これは、あらゆる所定のアミノ酸配列に対する多数の核酸配列を作製する）。したがって、融合タンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に関する本明細書における記載および／または開示は、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の記載および／または開示を含むとも考えられるべきである。同様に、本明細書における融合タンパク質またはポリペプチドアミノ酸配列の記載および／または開示は、アミノ酸配列をコードすることができる全ての可能なヌクレオチド配列の記載および／または開示を含むとも考えられるべきである。
【００７６】
Ｉ．記載
本開示は、癌、例えば、肺癌、卵巣癌、膵癌、肝癌、乳癌、前立腺癌および結腸癌、ならびに黒色腫および多発性骨髄腫癌の診断、予知およびモニタリングのための方法および組成物に関する。
【００７７】
特に、本開示の方法および組成物は、本明細書においてＧＯＬＰＨ３遺伝子と称される遺伝子またはその断片、例えばその生物学的活性断片の発現および／または活性の検出と、ＧＯＬＰＨ３遺伝子によってコードされる遺伝子産物（すなわち、「ＧＯＬＰＨ３遺伝子産物」）またはそれらの断片、例えばそれらの生物学的活性断片の発現および／または活性の検出とに関する。本開示の方法および組成物は、ＧＯＬＰＨ３遺伝子もしくは遺伝子配列またはそれらの断片、ならびにＧＯＬＰＨ３遺伝子の遺伝子産物、例えばかかるＧＯＬＰＨ３遺伝子産物に特異的に結合する抗体、またはそれらの断片を利用することができる。ＧＯＬＰＨ３遺伝子および遺伝子産物の配列、スプライス変異体および構造は、本技術分野において記載されている。例えば、Ｇｅｎｅ  Ｃａｒｄｓ．ｃｏｍのウェブサイトおよびＢｅｌｌら（２００１年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６巻：５１５２〜５１６５頁を参照すること。多くの種からのＧＯＬＰＨ３遺伝子および遺伝子産物は公知であり、それらとしては、例えば、チンパンジーＧＯＬＰＨ３（ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＸＭ＿５１７８３０．２）、ラットＧＯＬＰＨ３（ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＭ＿０２３９７７．２）、マウスＧＯＬＰＨ３（ＮＭ＿０２５６７．３）、ニワトリＧＯＬＰＨ３（ＸＭ＿４２４９９５．２）およびヒトＧＯＬＰＨ３（ＮＭ＿０２２１３０およびＮＰ＿０７１４１３）が挙げられる。ヒトＧＯＬＰＨ３配列としては、以下で列挙されるものが挙げられる。
【００７８】
【化２】
2012504426.tif 000004
ＩＩ．ＧＯＬＰＨ３抗体
単離されたＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたはその断片（またはかかるポリペプチドをコードする核酸）は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製のための標準的技術を使用して、免疫原に結合する抗体を生成するために前記免疫原として使用され得る。完全長ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドを使用することが可能であり、または、本開示は、免疫原としての使用のためのＧＯＬＰＨ３ポリペプチドの抗原ペプチド断片に関する。ＧＯＬＰＨ３の抗原ペプチドは少なくとも８個のアミノ酸残基を含み、ペプチドに対する抗体がそれぞれの完全長分子との特異的免疫複合物を形成するようにそれぞれの完全長分子中に存在するエピトープを包含する。好ましくは、抗原ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基を含む。一実施形態において、かかるエピトープは、１つの種、例えばマウスまたはヒトからの所定のポリペプチド分子に対して特異的であり得る（すなわち、種にわたって保存されていないポリペプチド分子の領域にわたる抗原ペプチドが免疫原として使用され、かかる非保存残基は、本明細書において提供されもの等のアラインメントを使用して決定され得る）。
【００７９】
一実施形態において、抗体は、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたはその断片に実質的に特異的に結合する。好ましい一実施形態において、抗体は、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたはその断片に結合し、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたはその断片とその天然の結合パートナー（複数可）またはその（それらの）断片（複数可）との間の相互作用を遮断する。
【００８０】
ＧＯＬＰＨ３免疫原は、典型的には、免疫原によって適切な被験体（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）を免疫化することによって抗体を調製するために使用される。適切な免疫原性調製物は、例えば、免疫応答が生成される組換え発現されたまたは化学的に合成された分子またはその断片を含有することができる。前記調製物は、アジュバント、例えばフロイント完全もしくは不完全アジュバント、または同様の免疫刺激剤を更に含むことができる。免疫原性調製物による適切な被験体の免疫化は、その中に含まれる抗原ペプチドに対するポリクローナル抗体応答を誘発する。
【００８１】
ポリクローナル抗体は、ポリペプチド免疫原によって適切な被験体を免疫化することによって上記のように調製され得る。免疫化された被験体におけるポリペプチド抗体力価は、例えば固定されたポリペプチドを使用する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、標準的技術によって時間と共にモニターされ得る。所望により、抗原に対する抗体は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され、周知の技術、例えばプロテインＡクロマトグラフィーによって更に精製されてＩｇＧ分画を得ることができる。免疫化の後の適切な時点において、例えば抗体力価が最も高い時、抗体産生細胞を被験体から得て、それを使用して、標準的技術、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６巻：４９５〜４９７頁）（また、Ｂｒｏｗｎら（１９８１年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２７巻：５３９〜４６頁、Ｂｒｏｗｎら（１９８０年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５５巻：４９８０〜８３頁、Ｙｅｈら（１９７６年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７６巻：２９２７〜３１頁およびＹｅｈら（１９８２年）Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２９巻：２６９〜７５頁参照）によって最初に記載されたハイブリドーマ技術、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  ４巻：７２頁）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．、７７〜９６頁）またはトリオーマ技術によってモノクローナル抗体を調製することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを作製するための技術は周知である（一般的に、Ｋｅｎｎｅｔｈ，  Ｒ．  Ｈ．  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８０年）、Ｌｅｒｎｅｒ，  Ｅ．  Ａ．  （１９８１年）Ｙａｌｅ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  ５４巻：３８７〜４０２頁、Ｇｅｆｔｅｒ，  Ｍ．  Ｌ．ら（１９７７年）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．３巻：２３１〜３６頁参照）。簡潔には、上記のように免疫原によって免疫化された哺乳動物からのリンパ球（典型的には脾細胞）に不死細胞株（典型的には骨髄腫）を融合し、得たハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、ポリペプチド抗原に好ましくは特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが同定される。
【００８２】
リンパ球および不死化細胞株を融合するために使用される多くの周知のプロトコールの内のいずれかを、抗ＧＯＬＰＨ３モノクローナル抗体を産生する目的のために適用することができる（例えば、Ｇａｌｆｒｅ，  Ｇ．ら（１９７７年）Ｎａｔｕｒｅ  ２６６巻：５５０５２頁、Ｇｅｆｔｅｒら（１９７７年）前掲、Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１年）前掲、Ｋｅｎｎｅｔｈ（１９８０年）前掲参照）。更に、当業者は、有用でもあるかかる方法の多くの変形形態があることを理解する。典型的には、不死細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）は、リンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物によって免疫化されたマウスからのリンパ球に不死化マウス細胞株を融合することによって作製され得る。好ましい不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培養培地（「ＨＡＴ培地」）に対して感受性があるマウス骨髄腫細胞株である。多くの骨髄腫細胞株の内のいずれか、例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫系を、標準的技術に従って融合パートナーとして使用することができる。これらの骨髄腫系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄから入手可能である。典型的には、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用してＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞をマウス脾細胞に融合する。次いで、前記融合から生じたハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地を使用して選択し、それによって非融合のおよび非産生的に融合した骨髄腫細胞が死滅する（非融合脾細胞は、形質転換されないので、数日後に死滅する）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、所定のポリペプチドに結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出される。
【００８３】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製することに代わるものとして、上記のポリペプチドの内の１種に対して特異的なモノクローナル抗体を、適切なポリペプチドによって組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることによって同定し、単離して、それによってポリペプチドに結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することができる。ファージディスプレイライブラリーを生成し、スクリーニングするためのキットは、商業的に入手可能である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２７−９４００−０１およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２４０６１２）。更に、抗体ディスプレイライブラリーを作成し、スクリーニングすることにおける使用に特に適した方法および試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５，２２３，４０９号、Ｋａｎｇらの国際公開第ＷＯ９２／１８６１９号、Ｄｏｗｅｒらの国際公開第ＷＯ９１／１７２７１号、Ｗｉｎｔｅｒらの国際公開第ＷＯ９２／２０７９１号、Ｍａｒｋｌａｎｄらの国際公開第ＷＯ９２／１５６７９号、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇらの国際公開第ＷＯ９３／０１２８８号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらの国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号、Ｇａｒｒａｒｄらの国際公開第ＷＯ９２／０９６９０号、Ｌａｄｎｅｒらの国際公開第ＷＯ９０／０２８０９号、Ｆｕｃｈｓら（１９９１年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （ＮＹ）  ９巻：１３６９〜１３７２頁、Ｈａｙら（１９９２年）Ｈｕｍ．  Ａｎｔｉｂｏｄ．  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３巻：８１〜８５頁、Ｈｕｓｅら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６巻：１２７５〜１２８１頁、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３年）ＥＭＢＯ  Ｊ．  １２巻：７２５〜７３４頁、Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２６巻：８８９〜８９６頁、Ｃｌａｒｋｓｏｎら（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２巻：６２４〜６２８頁、Ｇｒａｍら（１９９２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻：３５７６〜３５８０頁、Ｇａｒｒａｒｄら（１９９１年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （ＮＹ）  ９巻：１３７３〜１３７７頁、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９巻：４１３３〜４１３７頁、Ｂａｒｂａｓら（１９９１年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８巻：７９７８〜７９８２頁およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８巻：５５２〜５５４頁において見出され得る。
【００８４】
更に、ヒト部分および非ヒト部分の両方を含む組換え抗ＧＯＬＰＨ３ポリペプチド抗体、例えばキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して作製することが可能であり、本発明の範囲内である。かかるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎらの国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号、Ａｋｉｒａらの欧州特許出願第１８４，１８７号、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，  Ｍ．の欧州特許出願第１７１，４９６号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎらの欧州特許出願第１７３，４９４号、ＮｅｕｂｅｒｇｅｒらのＰＣＴ出願第ＷＯ８６／０１５３３号、Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙらの欧州特許出願第１２５，０２３号、Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０巻：１０４１〜１０４３頁、Ｌｉｕら（１９８７年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４巻：３４３９〜３４４３頁、Ｌｉｕら（１９８７年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３９巻：３５２１〜３５２６頁、Ｓｕｎら（１９８７年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８４巻：２１４〜２１８頁、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４７巻：９９９〜１００５頁、Ｗｏｏｄら（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４巻：４４６〜４４９頁およびＳｈａｗら（１９８８年）Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ８０巻：１５５３〜１５５９頁）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．  Ｌ．（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９巻：１２０２〜１２０７頁、Ｏｉら（１９８６年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４巻：２１４頁、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、Ｊｏｎｅｓら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１巻：５５２〜５２５頁、Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９巻：１５３４頁およびＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４１巻：４０５３〜４０６０頁において記載されている方法を使用して、本技術分野において公知の組換えＤＮＡ技術によって作製され得る。
【００８５】
更に、ヒト化抗体は、米国特許第５，５６５，３３２号において開示されているもの等の標準的プロトコールに従って作製され得る。別の一実施形態において、抗体鎖または特異的結合対メンバーは、例えば米国特許第５，５６５，３３２号、米国特許第５，８７１，９０７号または米国特許第５，７３３，７４３号において記載されている通りの本技術分野において公知の技術を使用して、特異的結合対メンバーのポリペプチド鎖の融合物をコードする核酸分子および複製可能な一般的なディスプレイパッケージを含むベクターと単結合対メンバーの第２のポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含むベクターとの間における組換えによって作製され得る。
【００８６】
更に、完全ヒト抗体は、ＧＯＬＰＨ３免疫原に対して作製され得る。完全ヒト抗体は、例えば、Ｈｏｇａｎら「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕｅｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに従って、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックであるマウスにおいて作製され得る。簡潔には、精製されたＧＯＬＰＨ３免疫原によってトランスジェニックマウスを免疫化する。脾臓細胞を採取し、骨髄腫細胞に融合して、ハイブリドーマを産生する。ハイブリドーマを、ＧＯＬＰＨ３免疫原に結合する抗体を産生するそれらの能力に基づいて選択する。完全ヒト抗体は、ヒトにおけるかかる抗体の免疫原性を低下させる。
【００８７】
一実施形態において、本発明において使用する抗体は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、単一の抗体ポリペプチドの中に２つの異なる抗原に対する結合部位を有する。抗原結合は、同時または連続的であり得る。トリオーマおよびハイブリッドハイブリドーマは、二重特異性抗体を分泌し得る細胞株の２つの例である。ハイブリッドハイブリドーマまたはトリオーマによって産生される二重特異性抗体の例は、米国特許第４，４７４，８９３号において開示されている。二重特異性抗体は、化学的手段（Ｓｔａｅｒｚら（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４巻：６２８頁およびＰｅｒｅｚら（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１６巻：３５４頁）およびハイブリドーマ技術（ＳｔａｅｒｚおよびＢｅｖａｎ（１９８６年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８３巻：１４５３頁ならびにＳｔａｅｒｚおよびＢｅｖａｎ（１９８６年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  ７巻：２４１頁）によって構築されている。また、二重特異性抗体は、米国特許第５，９５９，０８４号においても記載されている。二重特異性抗体の断片は、米国特許第５，７９８，２２９号において記載されている。
【００８８】
また、異なる抗体を作製するハイブリドーマまたは他の細胞を融合させ、その後両方の抗体を生成し、共構築するクローンを同定することによってヘテロハイブリドーマを作製することによって、二重特異性剤を生成することもできる。それらは、完全免疫グロブリン鎖またはその部分、例えばＦａｂ配列およびＦｖ配列の化学的または遺伝子的結合体化によって生成することもできる。抗体成分は、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたはその断片に結合することができる。一実施形態において、二重特異性抗体は、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたはその断片およびその天然結合パートナー（複数可）またはその（それらの）断片（複数可）の両方に特異的に結合することができる。
【００８９】
本発明の更に別の一態様は、免疫原性ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたはＧＯＬＰＨ３に一意的なその免疫原性部分によって動物を免疫化することと、次いでポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する動物抗体から単離することとを含むプロセスによって入手可能な抗ＧＯＬＰＨ３抗体に関する。
【００９０】
本発明の別の一態様においては、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチド断片または変異体を使用することができる。一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３変異体の変化に富んだライブラリーは、核酸レベルにおけるコンビナトリアル突然変異誘発によって生成され、変化に富んだ遺伝子ライブラリーによってコードされる。ＧＯＬＰＨ３変異体の変化に富んだライブラリーは、例えば、潜在的ポリペプチド配列の縮重セットがその中にポリペプチド配列のセットを含む個々のポリペプチドとして発現可能であるように遺伝子配列に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的にライゲーションすることによって作成され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列からポリペプチド変異体のライブラリーを作成するために使用され得る種々の方法がある。自動ＤＮＡ合成装置において縮重遺伝子配列の化学合成を行うことが可能であり、次いで、合成遺伝子を適切な発現ベクターにライゲーションする。遺伝子の縮重セットの使用は、１種の混合物における、潜在的ポリペプチド配列の所望のセットをコードする配列の内の全ての提供を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、本技術分野において公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，  Ｓ．  Ａ．（１９８３年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９巻：３頁、Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５３巻：３２３頁、Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８巻：１０５６頁、Ｉｋｅら（１９８３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １１巻：４７７頁参照。
【００９１】
更に、ポリペプチドコード配列の断片のライブラリーを使用して、所定のポリペプチドの変異体のスクリーニングおよび後続の選択のためのポリペプチド断片の変化に富んだ集団を生成することができる。一実施形態において、１つポリペプチド当たり約１回のみニッキングが起こる条件下でポリペプチドコード配列の二本鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼによって処理し、二本鎖ＤＮＡを変性し、ＤＮＡを再生して異なるニッキング産物からセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼによる処理によって再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去し、得た断片ライブラリーを発現ベクターにライゲーションすることによって、コード配列断片のライブラリーを生成することができる。この方法によって、Ｎ末端、Ｃ末端および種々のサイズのポリペプチドの内部断片をコードする発現ライブラリーを誘導することができる。
【００９２】
点突然変異またはトランケーションによって作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物のスクリーニングのための、および選択された特性を有する遺伝子産物のためのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのための幾つかの技術が、本技術分野において公知である。かかる技術は、ポリペプチドのコンビナトリアル突然変異誘発によって生成される遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適合され得る。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのハイスループット分析に適した最も広範に使用される技術としては、典型的には、複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラリーのクローニング、得たベクターのライブラリーによる適切な細胞の形質転換、および所望の活性の検出によりその産物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離が容易になる条件下におけるコンビナトリアル遺伝子の発現が挙げられる。再帰的アンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）（ライブラリー中における機能的突然変異体の頻度を増加させる技術）をスクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、ＧＯＬＰＨ３の変異体を同定することができる（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｖａｎ（１９９２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻：７８１１〜７８１５頁、Ｄｅｌａｇｒａｖｅら（１９９３年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ６巻（３号）：３２７〜３３１頁）。一実施形態において、細胞に基づくアッセイを利用して、変化に富んだポリペプチドライブラリーを分析することができる。例えば、通常ＧＯＬＰＨ３を合成する細胞株に、発現ベクターのライブラリーをトランスフェクトすることができる。次いで、完全長ポリペプチドおよび特定の突然変異体ポリペプチドが産生されるようにトランスフェクト細胞を培養し、例えば多くの機能アッセイの内のいずれかによって、細胞上清における完全長ポリペプチド活性に対する突然変異体の発現の効果を検出することができる。次いで、完全長ポリペプチド活性の阻害または相乗作用、および更に特徴付けられた個々のクローンについてスコアする細胞からプラスミドＤＮＡを回収することができる。
【００９３】
同じ型のＤ−アミノ酸によるポリペプチドアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸の系統的置換（例えば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）を使用して、より安定なペプチドを生成することができる。更に、対象となるポリペプチドアミノ酸配列または実質的に同一である配列変形物を含む限定されたペプチドは、本技術分野において公知の方法（ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ（１９９２年）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６１巻：３８７頁、これは参照により本明細書に組み込まれる）によって、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成し得る内部システイン残基を付加することによって生成され得る。
【００９４】
本明細書において開示されたアミノ酸配列は、ペプチド配列およびその配列変異体に対応するポリペプチドを当業者が作製することを可能にする。かかるポリペプチドは、多くはより大きいポリペプチドの一部として、ペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの発現によって、原核または真核宿主細胞において産生させることができる。別の場合、かかるペプチドは、化学的方法によって合成され得る。組換え宿主における異種タンパク質の発現方法、ポリペプチドの化学合成およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳は、本技術分野において周知であり、更に、Ｍａｎｉａｔｉｓら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９年）、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５２巻、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７年）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｊ．（１９６９年）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ９１巻：５０１頁、Ｃｈａｉｋｅｎ  Ｉ．  Ｍ．（１９８１年）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １１巻：２５５頁、Ｋａｉｓｅｒら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３巻：１８７頁、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｂ．（１９８６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２巻：３４２頁、Ｋｅｎｔ，  Ｓ．  Ｂ．  Ｈ．（１９８８年）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５７巻：９５７頁およびＯｆｆｏｒｄ，  Ｒ．  Ｅ．（１９８０年）Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗｉｌｅｙ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（これらは参照により本明細書に組み込まれる））において記載されている。
【００９５】
一実施形態において、ペプチドは、その天然結合パートナー（複数可）またはその（それらの）断片（複数可）のＧＯＬＰＨ３結合部位と同一または類似のアミノ酸配列を有する。一実施形態において、ペプチドは、その天然結合パートナー（複数可）またはその（それらの）断片（複数可）に対する結合についてＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたはその断片と競合する。
【００９６】
ペプチドは、典型的には、直接的化学合成によって産生され得、例えば、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたはその断片とその天然結合パートナー（複数可）またはその（それらの）断片（複数可）との間の相互作用のアンタゴニストとして使用され得る。ペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端への共有結合によって結合した非ペプチド部分によって修飾ペプチドとして産生され得る。ある種の好ましい実施形態において、カルボキシ末端もしくはアミノ末端または両方を化学的に修飾する。末端アミノおよびカルボキシル基の最も一般的な修飾は、それぞれアセチル化およびアミド化である。アシル化（例えば、アセチル化）またはアルキル化（例えば、メチル化）等のアミノ末端修飾およびアミド化等のカルボキシ末端修飾、ならびに環化等の他の末端修飾は、本発明の種々の実施形態に組み込まれ得る。あるアミノ末端および／またはカルボキシ末端修飾および／またはコア配列へのペプチド伸長により、有利な物理的、化学的および生化学的特性が提供することができる。
【００９７】
ペプチド模倣体（Ｆａｕｃｈｅｒｅ，  Ｊ．（１９８６年）Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．  １５巻：２９頁、ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ（１９８５年）ＴＩＮＳ  ３９２頁、ならびにＥｖａｎｓら（１９８７年）Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３０巻：１２２９頁（これらは、参照により本明細書に組み込まれる））は、通常、コンピューター化された分子モデリングを用いて発生させる。診断、予知および／または臨床試験モニタリング適用に有用なペプチドに構造的に類似するペプチド模倣体を使用して、同等の診断、予知および／または臨床試験モニタリング適用を生み出すことができる。一般に、ペプチド模倣体は、パラダイムポリペプチド（すなわち、生物学的または薬理学的活性を有するポリペプチド）、例えばヒトＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたはその断片に構造的に類似するが、本技術分野において公知の方法によって、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−および−ＣＨ２ＳＯ−から成る群から選択される結合によって場合によって置き換えられる１つまたは複数のペプチド結合を有し、更に、以下の参考文献に記載されている：Ｓｐａｔｏｌａ，  Ａ．  Ｆ．  ｉｎ  「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，  Ｂ．編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６７頁（１９８３年）、Ｓｐａｔｏｌａ，  Ａ．  Ｆ．、Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ（１９８３年３月）１巻、３号「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」（一般的レビュー）、Ｍｏｒｌｅｙ，  Ｊ．  Ｓ．（１９８０年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ４６３〜４６８頁（一般的レビュー）、Ｈｕｄｓｏｎ，  Ｄ．ら（１９７９年）Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔ．  Ｒｅｓ．  １４巻：１７７〜１８５頁（−ＣＨ２ＮＨ−、ＣＨ２ＣＨ２−）、Ｓｐａｔｏｌａ，  Ａ．  Ｆ．ら（１９８６年）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ３８巻：１２４３〜１２４９頁（−ＣＨ２−Ｓ）、Ｈａｎｎ，  Ｍ．  Ｍ．（１９８２年）Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  Ｉ．  ３０７〜３１４頁（−ＣＨ−ＣＨ−、シスおよびトランス）、Ａｌｍｑｕｉｓｔ，  Ｒ．  Ｇ．ら（１９０）Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２３巻：１３９２〜１３９８頁（−ＣＯＣＨ２−）、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ，  Ｃ．ら（１９８２年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ２３巻：２５３３頁（−ＣＯＣＨ２−）、Ｓｚｅｌｋｅ，  Ｍ．らＥｕｒｏｐｅａｎ  Ａｐｐｌｎ．  ＥＰ  ４５６６５（１９８２年）ＣＡ：  ９７巻：３９４０５頁（１９８２年）（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）、Ｈｏｌｌａｄａｙ，  Ｍ．  Ｗ．ら（１９８３年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．（１９８３年）２４巻：４４０１〜４４０４頁（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）、およびＨｒｕｂｙ，  Ｖ．  Ｊ．（１９８２年）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  （１９８２年）３１巻：１８９〜１９９頁（−ＣＨ２−Ｓ−）（これらの内の各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。特に好ましい非ペプチド結合は、−ＣＨ２ＮＨ−であ��。かかるペプチド模倣体は、例えば、より経済的な製造、より大きい化学的安定性、変更された特異性（例えば、生物学的活性の広域スペクトル）、低下した抗原性およびその他等のポリペプチドの実施形態全体にわたる著しい利点を有しうる。ペプチド模倣体の標識化は、通常、定量的構造−活性データおよび／または分子モデリングによって予測されるペプチド模倣体上の非干渉位置（複数可）への１つまたは複数の標識の、直接的またはスペーサー（例えば、アミド基）を通じた共有結合を含む。かかる非干渉位置とは、一般に、ペプチド模倣体が結合する、マクロポリペプチド（複数可）との直接の接触を形成しない位置である。ペプチド模倣体の誘導体化（例えば、標識化）は、ペプチド模倣体の所望の診断的および／または予知的有用性に実質的に干渉すべきではない。
【００９８】
また、これらのペプチドまたはペプチド模倣体分子は、キメラタンパク質または融合タンパク質であってもよい。本明細書において使用される「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、別のタンパク質、ペプチドもしくはペプチド模倣体分子またはその断片に作動的に連結したタンパク質、ペプチドもしくはペプチド模倣体分子またはその断片を含む。「ＧＯＬＰＨ３分子」は、ＧＯＬＰＨ３またはその断片に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指すが、一方で「非ＧＯＬＰＨ３分子」は、それぞれのＧＯＬＰＨ３分子に対して実質的に相同でないタンパク質、例えば、ＧＯＬＰＨ３分子と異なり、かつ同じまたは異なる生物体に由来するタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ＧＯＬＰＨ３融合タンパク質の中で、ＧＯＬＰＨ３部分は、完全長ＧＯＬＰＨ３分子の全体または部分に対応することができる。キメラタンパク質または融合タンパク質の中で、「作動的に連結した」という用語は、独立したタンパク質、ペプチドもしくはペプチド模倣体分子またはそれらの断片が、前記融合から独立して発現する場合に示される機能を保つような方法で互いにインフレーム融合することを示すことが意図される。
【００９９】
かかる融合タンパク質は、第１のペプチドをコードするヌクレオチド配列と第２のペプチドをコードするヌクレオチド配列との組換え発現によって作製され得る。第２のペプチドは、場合によって、第１のペプチド、例えば免疫グロブリン定常領域の溶解性、親和性、安定性または結合価を改変する部分に対応することができる。好ましくは、第１のペプチドは、ＧＯＬＰＨ３分子の少なくとも１つの生物学的活性部分を含むＧＯＬＰＨ３の部分から成る。別の好ましい一実施形態において、第１のペプチドは、生物学的活性分子の部分から成る。第２のペプチドは、例えば、ヒトＣγ１ドメインまたはＣγ４ドメイン（例えば、ヒトＩｇＣγ１またはヒトＩｇＣγ４のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＣａｐｏｎらの米国特許第５，１１６，９６４号、米国特許第５，５８０，７５６号、米国特許第５，８４４，０９５号等参照）の免疫グロブリン定常領域を含むことができる。かかる定常領域は、エフェクター機能（例えば、Ｆｃ受容体結合）を媒介する領域を保持することができるか、またはエフェクター機能を低下させるように変更され得る。得た融合タンパク質は、独立して発現した第１のペプチドと比較して、変更された溶解性、結合親和性、安定性および／または結合価（すなわち、１つのポリペプチド当たりの利用可能な結合部位の数）を有することが可能であり、タンパク質精製の効率を増加することができる。組換え技術によって作製された融合タンパク質およびペプチドを、タンパク質またはペプチドを含む細胞および培地の混合物から分泌させ、単離することができる。別の場合、タンパク質またはペプチドを細胞質内に保持し、細胞を採取し、溶解し、タンパク質を単離することができる。細胞培養物は、典型的には、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養のための適切な培地は、本技術分野において周知である。タンパク質およびペプチドは、タンパク質およびペプチドを精製するための本技術分野において公知の技術を使用して、細胞培養培地、宿主細胞またはその両方から単離することができる。宿主細胞をトランスフェクトし、タンパク質およびペプチドを精製するための技術は、本技術分野において公知である。
【０１００】
好ましくは、本発明の融合タンパク質は、標準的組換えＤＮＡ技術によって作製される。例えば、ライゲーションのための平滑末端またはねじれ末端、適切な末端を得るための制限酵素での消化、必要に応じて粘着末端の充填、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理および酵素ライゲーションを用いる従来の技術に従って、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を一緒にインフレームライゲーションさせる。別の一実施形態において、自動ＤＮＡ合成装置等の従来の技術によって融合遺伝子を合成することができる。別の場合、続いてアニールされ、再増幅されてキメラ遺伝子配列を生成することができる２つの連続した遺伝子断片の間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行うことができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２年参照）。ＧＯＬＰＨ３をコードする配列に融合部分がインフレーム連結するように、核酸をコードするポリペプチドを、かかる発現ベクターにクローニングすることができる。
【０１０１】
別の一実施形態において、融合タンパク質は、そのＮ末端において異種シグナル配列を含む。ある宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、異種シグナル配列の使用を通じてポリペプチドの発現および／または分泌を増加させることができる。
【０１０２】
本発明の融合タンパク質を免疫原として使用して、被験体において抗体を産生することができる。かかる抗体を使用して、融合タンパク質が生成されたそれぞれの天然ポリペプチドを精製することが可能であり、またはスクリーニングアッセイにおいてＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたはその断片とその天然結合パートナー（複数可）またはその（それらの）断片（複数可）との間の相互作用を阻害するポリペプチドを同定することが可能である。
【０１０３】
本発明の更に別の一態様において、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたはその断片は、ＧＯＬＰＨ３またはその断片に結合するかまたはそれと相互作用する他のポリペプチド（「ＧＯＬＰＨ３結合タンパク質」、「ＧＯＬＰＨ３結合パートナー」または「ＧＯＬＰＨ３−ｂｐ」）を同定するために、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおいて「餌タンパク質」として使用され得（例えば米国特許第５，２８３，３１７号、Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３年）Ｃｅｌｌ  ７２巻：２２３〜２３２頁、Ｍａｄｕｒａら（１９９３年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８巻：１２０４６〜１２０５４頁、Ｂａｒｔｅｌら（１９９３年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４巻：９２０〜９２４頁、Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８巻：１６９３〜１６９６頁およびＢｒｅｎｔのＷＯ９４／１０３００参照）、ＧＯＬＰＨ３活性に関与する。かかるＧＯＬＰＨ３結合タンパク質は、例えばＧＯＬＰＨ３媒介性シグナル伝達経路の下流エレメントとしてのＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたはＧＯＬＰＨ３天然結合パートナー（複数可）によるシグナルの伝播にも関与する可能性がある。別の場合、かかるＧＯＬＰＨ３結合ポリペプチドは、ＧＯＬＰＨ３阻害剤であってもよい。
【０１０４】
ツーハイブリッド系は、分離可能なＤＮＡ−結合および活性化ドメインから成るほとんどの転写因子のモジュラー性質に基づく。簡潔には、前記アッセイは２つの異なるＤＮＡ構築体を利用する。一方の構築体において、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドをコードする遺伝子は、公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他方の構築体において、同定されていないポリペプチド（「餌食」または「試料」）をコードする、ＤＮＡ配列のライブラリーからのＤＮＡ配列は、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。「餌」および「餌食」ポリペプチドが、相互作用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでＧＯＬＰＨ３依存性複合体を形成することが可能であれば、転写因子のＤＮＡ−結合および活性化ドメインは近接される。この近接は、転写因子に対して応答性である転写調節部位に作動可能に連結したレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現は容易に検出することが可能であり、機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離し、それを使用して、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドと相互作用するポリペプチドをコードするクローニングされた遺伝子を得ることができる。
【０１０５】
ＩＩＩ．本発明の使用および方法
本明細書において記載されているＧＯＬＰＨ３分子、例えば、ＧＯＬＰＨ３核酸分子、ポリペプチド、ポリペプチド相同体、抗体およびそれらの断片を含む分子は、以下の方法の内の１つまたは複数において使用され得る：ａ）スクリーニングアッセイ、およびｂ）予測医学（例えば、診断アッセイ、予知アッセイおよびモニタリング臨床試験）。
【０１０６】
更に後述するように、本発明の単離された核酸分子を使用して、例えば、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたはその断片を発現させ、（例えば、生物学的試料における）ＧＯＬＰＨ３  ｍＲＮＡもしくはその断片、またはＧＯＬＰＨ３遺伝子における遺伝子の改変を検出することができる。更に、本発明の抗ＧＯＬＰＨ３抗体またはそれらの断片を使用して、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたはそれらの断片を検出し、単離することができる。
【０１０７】
Ａ．スクリーニングアッセイ
一態様において、本発明は、被験体における、望ましくないか、または所望のものとは言えない免疫応答に関連付けられた疾患または状態を予防するための方法に関する。請求される薬剤または方法による治療から利益を受ける、疾患のリスクがある被験体は、例えば、本技術分野において公知であり、かつ本明細書において記載されている診断アッセイまたは予知アッセイの内のいずれかまたは組み合わせによって同定され得る。
【０１０８】
Ｂ．検出アッセイ
本明細書において同定されたｃＤＮＡ配列の部分または断片（および対応する完全遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法において使用され得る。例えば、これらの配列を使用して、（ｉ）染色体上のそれぞれの遺伝子をマッピングし、したがって、遺伝的疾患に関連付けられた遺伝子領域の位置を示すこと、（ｉｉ）わずかな生物学的試料から個体を同定すること（組織型別）、および（ｉｉｉ）生物学的試料の法医学的同定を助けることができる。これらの適用は、以下のサブセクションにおいて記載される。
【０１０９】
１．染色体マッピング
遺伝子の配列（または配列の一部）が単離されると、この配列を使用して染色体上における遺伝子の位置をマッピングすることができる。このプロセスは、染色体マッピングと呼ばれる。したがって、本明細書に記載されるＧＯＬＰＨ３ヌクレオチド配列の部分または断片を使用して、染色体上におけるＧＯＬＰＨ３遺伝子の位置をマッピングすることができる。染色体へのＧＯＬＰＨ３配列のマッピングは、これらの配列と疾患に関連付けられた遺伝子との相関における重要な第１ステップである。
【０１１０】
簡潔には、ＧＯＬＰＨ３ヌクレオチド配列からＰＣＲプライマー（好ましくは、長さが１５〜２５ｂｐ）を調製することによってＧＯＬＰＨ３遺伝子を染色体にマッピングすることができる。ＧＯＬＰＨ３配列のコンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮＡ中の１つのエキソンよりも長くに及ばないことで増幅プロセスを複雑にするプライマーを予測することができる。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用することができる。ＧＯＬＰＨ３配列に対応するヒト遺伝子を含有するそれらのハイブリッドのみが、増幅された断片を生じる。
【０１１１】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物からの体細胞（例えば、ヒトおよびマウス細胞）を融合させることによって調製される。ヒトおよびマウス細胞のハイブリッドを成長させ、分裂させると、それらは徐々にヒト染色体をランダムな順で失うが、マウス染色体を保持する。特定の酵素がないためにマウス細胞が発育できないがヒト細胞は発育できる培地を使用することによって、必要な酵素をコードする遺伝子を含有する１つのヒト染色体が保持される。種々の培地を使用することによって、ハイブリッド細胞株のパネルを確立することができる。パネルにおける各細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体および完全な１組のマウス染色体を含有し、個々の遺伝子の特定のヒト染色体への容易なマッピングを可能にする（Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏ，  Ｐら（１９８３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０巻：９１９〜９２４頁）。また、転座および欠失を有するヒト染色体を使用することによって、ヒト染色体の断片のみを含有する体細胞ハイブリッドを産生することもできる。
【０１１２】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体に割り当てるための迅速な手法である。単一のサーマルサイクラーを使用して１日当たり３つ以上の配列を割り当てることができる。オリゴヌクレオチドプライマーの設計のためにＧＯＬＰＨ３ヌクレオチド配列を使用し、特定の染色体からの断片のパネルによって亜局在化を行うことができる。ＧＯＬＰＨ３配列をその染色体にマッピングするために同様に使用され得る他のマッピング戦略は、インサイチュハイブリダイゼーション（Ｆａｎ，  Ｙ．ら（１９９０年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７巻：６２２３〜２７頁に記載）、標識され、フローソーティングされた染色体による予備スクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーへのハイブリダイゼーションによる予備選択を含む。
【０１１３】
更に中期染色体スプレッドへのＤＮＡ配列の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して、１つのステップで正確な染色体位置を提供することができる。染色体スプレッドは、有糸分裂紡錘体を崩壊させるコルセミド等の化学物質によってその分裂が中期で遮断された細胞を使用して作製され得る。染色体を、トリプシンによって短時間処理し、次いでギムザで染色することができる。各染色体上に明および暗バンドのパターンが現れるので、染色体を個別に同定することができる。ＦＩＳＨ技術は、５００または６００塩基もの短いＤＮＡ配列で使用され得る。しかし、１，０００塩基より大きいクローンは、簡単な検出のための十分なシグナル強度で一意的な染色体位置に結合する可能性がより高い。好ましくは１，０００塩基、より好ましくは２，０００塩基が、妥当な時間量で良い結果を得るために十分である。この技術のレビューについては、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８８年）を参照すること。
【０１１４】
染色体マッピングのための試薬を個別に使用して単一染色体もしくはその染色体上の単一部位をマークすることができるか、または多数の部位および／または多数の染色体をマークするために試薬のパネルを使用することができる。実際は、遺伝子の非コード領域に対応する試薬がマッピング目的に好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリー内で保存される可能性がより高く、しかるに染色体マッピングの間のクロスハイブリダイゼーションの機会が増加する。
【０１１５】
一旦配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上における配列の物理的位置を遺伝子マップデータと相関させることができる（かかるデータは、例えば、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙを通じてオンラインで利用可能なＭｃＫｕｓｉｃｋ，  Ｖ．、Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎにおいて見出される）。次いで、同じ染色体領域にマッピングされる遺伝子と疾患との間の関係を、例えば、Ｅｇｅｌａｎｄ，  Ｊ．ら（１９８７年）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５巻：７８３〜７８７頁に記載されている連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の共遺伝）を通じて同定することができる。
【０１１６】
更に、ＧＯＬＰＨ３遺伝子に関連付けられた疾患に罹患した個体と罹患していない個体との間のＤＮＡ配列の差を決定することができる。罹患している個体の一部または全てにおいて突然変異が認められるが、罹患していない個体においては認められない場合、突然変異は特定の疾患の原因因子である可能性がある。罹患している個体と罹患していない個体との比較は、最初に、染色体スプレッドから見えるかまたはそのＤＮＡ配列に基づくＰＣＲを使用して検出することができる染色体における構造的改変、例えば欠失または転座を探索することを一般に含む。最後に、幾つかの個体からの遺伝子の完全な配列決定を行い、突然変異の存在を確認し、突然変異を多型から区別することができる。
【０１１７】
２．組織型別
また、本発明のＧＯＬＰＨ３配列を使用して、わずかな生物学的試料から個体を同定することもできる。例えば、米国軍は、その隊員の識別のために制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）の使用を考慮しているところである。この技術において、個体のゲノムＤＮＡを１つまたは複数の制限酵素によって消化し、サザンブロット上で精査し、同定のための一意的なバンドを得る。この方法は、失われるか、切り替えられるかまたは盗まれて明確な同定を困難にし得る「ドッグタグ」という現在の制限に苦しめられることはない。本発明の配列は、ＲＦＬＰのための更なるＤＮＡマーカーとして有用である（米国特許第５，２７２，０５７号に記載）。
【０１１８】
更に、本発明の配列を使用して、個体のゲノムの選択部分の実際の塩基毎のＤＮＡ配列を決定する代わりの技術を提供することができる。しかるに、本明細書に記載されるＧＯＬＰＨ３ヌクレオチド配列を使用して、配列の５’および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製することができる。次いで、これらのプライマーを使用して、個体のＤＮＡを増幅し、続いてそれを配列決定することができる。
【０１１９】
この方法で調製される個体からの対応するＤＮＡ配列のパネルは、一意的な個体同定を提供することが可能であり、それは、各個体が対立遺伝子の相違の故にかかるＤＮＡ配列の一意的なセットを有するからである。本発明の配列を使用して、個体からおよび組織からかかる同定配列を得ることができる。本発明のＧＯＬＰＨ３ヌクレオチド配列は、ヒトゲノムの部分を一意的に表す。対立遺伝子変異は、これらの配列のコード領域においてある程度、および非コード領域においてはより大きい程度に生じる。個々のヒトの間の対立遺伝子変異は、各々５００塩基毎に約１回の頻度で生じると推定される。本明細書において記載されている配列の内の各々をある程度まで標準として使用することが可能であり、それに対して個体からのＤＮＡを同定の目的で比較することができる。非コード領域においてはより多数の多型が生じるので、個体の区別に必要な配列がより少ない。ＧＯＬＰＨ３の非コード配列は、各々１００塩基の増幅された非コード配列が得られるおそらく１０〜１，０００個のプライマーのパネルによって個体の明確な同定を提供することができる。予測されたＧＯＬＰＨ３コード配列を使用する場合、個体の明確な同定のためのより適切なプライマーの数は、５００〜２，０００である。
【０１２０】
個体のための一意的同定データベースを作成するために本明細書において記載されているＧＯＬＰＨ３ヌクレオチド配列からの試薬のパネルを使用する場合、後にその個体からの組織を同定するためにそれらの同じ試薬を使用することができる。一意的同定データベースを使用して、生存しているかまたは死滅した個体の明確な同定を非常に小さい組織試料から行うことができる。
【０１２１】
３．法医生物学におけるＧＯＬＰＨ３配列の使用
ＤＮＡに基づく同定技術を法医生物学において使用することもできる。法医生物学は、犯罪の現場において発見される生物学的証拠の遺伝子型別を、例えば犯罪の犯人を明確に同定するための手段として用いる科学分野である。かかる同定を行うため、ＰＣＲ技術を使用して、犯罪の現場において発見される組織（例えば、毛髪または皮膚）または体液（例えば、血液、唾液または精液）等の非常に小さい生物学的試料から採取されるＤＮＡ配列を増幅することができる。次いで、増幅された配列を標準と比較し、それによって生物学的試料の由来の同定を可能にすることができる。
【０１２２】
本発明の配列を使用して、ヒトゲノム中の特定の遺伝子座を標的とするポリヌクレオチド試薬、例えばＰＣＲプライマーを提供することが可能であり、それは、例えばもう１つの「同定マーカー」（すなわち、特定の個体に一意的なもう１つのＤＮＡ配列）を提供することによってＤＮＡに基づく法医学的同定の信頼性を増強することができる。上記のように、実際の塩基配列情報を、制限酵素により生成する断片によって形成されるパターンの正確な代替物として同定のために使用することができる。ＧＯＬＰＨ３の非コード領域を標的とする配列は、この使用に特に適切であり、それは、非コード領域中においてより多数の多型性が生じ、この技術を使用して個体を区別することをより容易にするからである。ポリヌクレオチド試薬の例としては、ＧＯＬＰＨ３ヌクレオチド配列またはそれらの部分、例えば、少なくとも２０塩基、好ましくは少なくとも３０塩基の長さを有するＧＯＬＰＨ３の非コード領域から誘導された断片が挙げられる。
【０１２３】
本明細書において記載されるＧＯＬＰＨ３ヌクレオチド配列を更に使用して、特定の組織、例えばリンパ球を同定するための、例えばインサイチュハイブリダイゼーション技術において使用され得るポリヌクレオチド試薬、例えば標識されたまたは標識可能なプローブを提供することができる。これは、未知の由来の組織を法病理学者に提示する場合に非常に有用であり得る。かかるＧＯＬＰＨ３プローブのパネルを使用して、種によっておよび／または臓器型によって組織を同定することができる。
【０１２４】
類似の様式で、これらの試薬、例えばＧＯＬＰＨ３プライマーまたはプローブを使用して、組織培養物を混入についてスクリーニングする（すなわち、培養物中における異なる型の細胞の混合物の存在についてスクリーニングする）ことができる。
【０１２５】
Ｃ．予測医学
また、本発明は、予知（予測）目的のために診断アッセイ、予知アッセイおよびモニタリング臨床試験を使用して、それにより個体を予防的に治療する予測医学の分野にも関する。したがって、本発明の一態様は、生物学的試料（例えば、血液、血清、細胞または組織）の文脈において、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドおよび／または核酸発現ならびにＧＯＬＰＨ３活性を決定し、それにより個体が異常なもしくは望ましくないＧＯＬＰＨ３発現もしくは活性に関連付けられた疾患もしくは障害に罹患しているか、または障害を発生するリスクがあるかを決定するための診断アッセイに関する。また、本発明は、個体がＧＯＬＰＨ３ポリペプチド、核酸発現または活性に関連付けられた障害を発生するリスクがあるかを決定するための予知（または予測）アッセイをも提供する。例えば、生物学的試料において、ＧＯＬＰＨ３遺伝子中における突然変異をアッセイすることができる。
【０１２６】
かかるアッセイを、予知目的または予測目的のために使用して、それによりＧＯＬＰＨ３ポリペプチド、核酸発現もしくは活性によって特徴付けられたまたはそれに関連付けられた障害の発症の前に個体を予防的に治療することができる。
【０１２７】
本発明の別の一態様は、臨床試験におけるＧＯＬＰＨ３の発現または活性に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。これらの薬剤および他の薬剤は、以下のセクションにおいて更に詳細に記載される。
【０１２８】
１．診断アッセイ
生物学的試料中のＧＯＬＰＨ３ポリペプチドもしくは核酸またはそれらの断片の存在または非存在を検出するための例示的方法は、試験被験体から生物学的試料を得ることと、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドもしくは核酸またはそれらの断片の存在が生物学的試料中において検出されるようにＧＯＬＰＨ３ポリペプチドもしくはＧＯＬＰＨ３ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）またはそれらの断片を検出することができる化合物または薬剤を生物学的試料に接触させることとを含む。ＧＯＬＰＨ３  ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはそれらの断片を検出するための好ましい薬剤は、ＧＯＬＰＨ３  ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはそれらの断片にハイブリダイズすることができる標識された核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、完全長ＧＯＬＰＨ３核酸またはその部分、例えば、長さが少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドであり、かつストリンジェントな条件下でＧＯＬＰＨ３  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドであってよい。本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適切なプローブは、本明細書において記載されている。
【０１２９】
一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３タンパク質のレベルが測定される。ＧＯＬＰＨ３タンパク質を検出するために抗体または抗体同等物を使用することは、一般に好ましい。タンパク質の検出のための方法は、当業者に周知であり、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ウェスタンブロットおよび免疫組織化学を含む。極めて迅速であり得るイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡまたはＲＩＡは、更に一般的に好ましい。また、抗体アレイまたはタンパク質チップを用いることも可能であり、例えば、米国特許出願第２００３００１３２０８Ａ１号、米国特許出願第２００２０１５５４９３Ａ１号、米国特許出願第２００３００１７５１５号および米国特許第６，３２９，２０９号、米国特許第６，３６５，４１８号（本明細書においてそれらの全体が参照によって組み込まれる）を参照すること。
【０１３０】
ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ手法は、ＧＯＬＰＨ３標準を（１２５Ｉや３５Ｓ等の放射性同位体またはホースラディッシュペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ等のアッセイ可能酵素で）標識し、非標識試料と共に、対応する抗体に接触させ、その上で、第２抗体を使用して、第１抗体と結合させ、放射活性または固定化酵素をアッセイする（競合アッセイ）ように実施することができる。別の場合、試料中のＧＯＬＰＨ３を、対応する固定化抗体と反応させ、放射性同位体または酵素で標識した抗ＧＯＬＰＨ３抗体をその系と反応させ、放射活性または酵素をアッセイする（ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイ）。他の従来の方法を適切であるように用いることもできる。
【０１３１】
上記技術は、本質的に「１ステップ」または「２ステップ」アッセイとして実施され得る。「１ステップ」アッセイは、抗原に固定化抗体を接触させ、洗浄することなく、この混合物に標識抗体を接触させることを含む。「２ステップ」アッセイは、洗浄の後、混合物に標識抗体を接触させることを含む。他の従来の方法を適切であるように用いることもできる。
【０１３２】
一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３レベルを測定するための方法は、選択的にＧＯＬＰＨ３に結合する抗体またはその変異体（例えば、断片）を生物学的標本に接触させるステップと、前記抗体またはその変異体が前記試料に結合しているかを検出し、それによってＧＯＬＰＨ３のレベルを測定するステップとを含む。
【０１３３】
ＧＯＬＰＨ３および／または抗体の酵素標識および放射性標識は、従来の手段によって実施され得る。かかる手段としては、一般に、特に酵素の活性に悪影響を与えないように、例えばグルタルアルデヒドによって、酵素と当該の抗原または抗体とを共有結合させることが挙げられ、これは、酵素がその基質と相互作用できる状態を維持していなければならないことを意味するが、アッセイを実施することを可能にするのに十分な酵素に活性が残っている場合には、酵素の全てが活性である必要はない。実際、酵素を結合するための幾つかの技術は、非特異的であり（例えば、ホルムアルデヒドを使用するもの）、活性酵素の割合しか得られない。
【０１３４】
通常、アッセイ系の１つの成分を支持体上に固定し、それによって前記系の他の成分をその成分と接触させて、面倒で、かつ時間かかる作業を行うことなく容易に除去できることが望ましい。第２の相を第１の相と離れたところに固定することができるが、通常、１つの相で十分である。
【０１３５】
支持体上に酵素自体を固定することができるが、固相酵素が必要な場合、次いで、抗体に結合させ、この抗体を支持体に固定することによりこれを達成することが一般に最良であり、そのためのモデルおよび系は、本技術分野において周知である。単純なポリエチレンが適切な支持体となり得る。
【０１３６】
標識化に用いることができる酵素は、特に限定されないが、例えば、オキシダーゼ群のメンバーから選択され得る。これらは、それらの基質との反応によって過酸化水素の生成を触媒し、グルコースオキシダーゼは、その良好な安定性、入手の容易さ、安価であること、およびその基質（グルコース）のすぐに入手可能であるためにしばしば使用される。オキシダーゼの活性は、本技術分野において周知の制御された条件下で酵素標識抗体と基質との反応後に形成される過酸化水素の濃度を測定することによってアッセイされ得る。
【０１３７】
本開示に基づいて、実践者の好みに応じて、ＧＯＬＰＨ３を検出するために他の技術を使用することができる。１つのそのような技術は、ウェスタンブロット（Ｔｏｗｂｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７６巻：４３５０頁（１９７９年））であり、ここでは、適切に処理した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を走らせた後、ニトロセルロースフィルタ等の固体支持体に移す。次いで、（非標識）抗ＧＯＬＰＨ３抗体を前記支持体に接触させ、標識したプロテインＡまたは抗免疫グロブリン（適切な標識としては、１２５Ｉ、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられる）等の二次免疫学的試薬によってアッセイする。クロマトグラフィー的検出を使用することもできる。
【０１３８】
免疫組織化学を使用して、例えば生検試料中の、ＧＯＬＰＨ３、例えばヒトＧＯＬＰＨ３の発現を検出することができる。適切な抗体を、例えば細胞の薄層に接触させ、洗浄し、次いで第２の標識抗体を接触させる。標識化は、蛍光マーカー、酵素、例えばペルオキシダーゼ、アビジンまたは放射性標識によるものであってもよい。アッセイは、顕微鏡を使用して視覚的にスコアされる。
【０１３９】
抗ＧＯＬＰＨ３抗体を画像化目的のために使用して、例えば、被験体の細胞および組織中におけるＧＯＬＰＨ３の存在を検出することもできる。適切な標識としては、放射性同位体、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）およびテクネチウム（９９ｍＴｃ）、蛍光標識、例えばフルオレセインおよびローダミン、ならびにビオチンが挙げられる。
【０１４０】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの画像化の目的のため、このように抗体を身体の外側から検出することができず、したがって、検出を可能にするためには標識しなければならず、または、それ以外の場合、修飾しなければならない。この目的のためのマーカーは、抗体結合に実質的には干渉しないものであってもよいが、それらは外部検出を可能にする。適切なマーカーとしては、Ｘ線写真法、ＮＭＲまたはＭＲＩによって検出され得るものを挙げることができる。Ｘ線写真法の技術について、適切なマーカーとしては、例えばバリウムまたはセシウム等、検出可能な放射線を放出するものの患者に明らかに有害とはならないあらゆる放射性同位体が挙げられる。ＮＭＲおよびＭＲＩのための適切なマーカーとしては、一般に、ジュウテリウム等、検出可能な特徴的なスピンを有するものが挙げられ、それらは、例えば関連のハイブリドーマのための栄養物質の適切な標識化によって抗体に組み込まれ得る。
【０１４１】
被験体のサイズおよび使用される画像化系は、診断画像を作成するために必要な画像化部分の量を決定する。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体については、注入される放射活性の量は、通常、約５〜２０ミリキューリーのテクネチウム９９ｍの範囲である。次いで、標識抗体または抗体断片は、ＧＯＬＰＨ３を含む細胞の位置で優先的に蓄積する。次いで、公知の技術を使用して標識抗体または抗体断片を検出することができる。
【０１４２】
ＧＯＬＰＨ３を検出するために使用され得る抗体としては、天然であるか合成であるにせよ、完全長であるかその断片であるにせよ、モノクローナルであるかポリクローナルであるにせよ、検出すべきＧＯＬＰＨ３、例えばヒトＧＯＬＰＨ３に十分に強くかつ特異的に結合するあらゆる抗体が挙げられる。抗体は、多くとも約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２ＭのＫｄを有することができる。「特異的に結合する」という句は、結合を、同一または類似のエピトープ、抗原または抗原決定基の第２の調製物によって変位することができるか、またはそれと競合することができるような方法における、例えばエピトープまたは抗原または抗原決定基への抗体の結合を指す。抗体は、関連のタンパク質等の他のタンパク質と関連するＧＯＬＰＨ３に優先的に結合することができる。
【０１４３】
抗体は、商業的に入手可能であるか、または本技術分野において公知の方法に従って調製され得る。
【０１４４】
使用され得る抗体およびそれらの誘導体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化（ＣＤＲグラフト）抗体、ベニヤ抗体または一本鎖抗体、ならびに抗体の機能的断片、すなわちＧＯＬＰＨ３結合断片を包含する。例えば、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’  断片およびＦ（ａｂ’）２断片を含むが限定されない、ＧＯＬＰＨ３またはその部分に結合し得る抗体断片を使用することができる。かかる断片は、酵素的切断によって、または組換え技術によって作製され得る。例えば、パパイン切断またはペプシン切断によって、それぞれＦａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片を生成することができる。必要な基質特異性を有する他のプロテアーゼを使用して、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片を生成することもできる。抗体は、１つまたは複数の終止コドンが天然の終止部位の上流に導入された抗体遺伝子を使用して多様な切断型でもまた作製することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコードするキメラ遺伝子を、重鎖のＣＨ、ドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計することができる。
【０１４５】
合成された抗体および遺伝子工学で得られた抗体は、例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙらの欧州特許第０，１２５，０２３Ｂ１号、Ｂｏｓｓらの米国特許第４，８１６，３９７号、Ｂｏｓｓらの欧州特許第０，１２０，６９４Ｂ１号、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，  Ｍ．  Ｓ．らのＷＯ８６／０１５３３、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，  Ｍ．  Ｓ．らの欧州特許第０，１９４，２７６Ｂ１号、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、Ｗｉｎｔｅｒの欧州特許第０，２３９，４００Ｂ１号、Ｑｕｅｅｎらの欧州特許第０４５１２１６Ｂ１号およびＰａｄｌａｎ，  Ｅ．  Ａ．らのＥＰ０５１９５９６Ａ１において記載されている。また、霊長類化抗体に関してはＮｅｗｍａｎ，  Ｒ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：１４５５〜１４６０頁（１９９２年）、ならびに一本鎖抗体に関してはＬａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号およびＢｉｒｄ，  Ｒ．  Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻：４２３〜４２６頁（１９８８年））をも参照すること。ライブラリー、例えばファージディスプレイライブラリーから作製された抗体を使用することもできる。
【０１４６】
幾つかの実施形態において、ペプチド等、抗体以外のＧＯＬＰＨ３に特異的に結合する薬剤を使用することができる。ＧＯＬＰＨ３に特異的に結合するペプチドは、本技術分野において公知のあらゆる手段によって同定することができる。例えば、ＧＯＬＰＨ３の特異的ペプチド結合剤は、ペプチドファージディスプレイライブラリーの使用についてスクリーニングすることができる。
【０１４７】
一般に、ＧＯＬＰＨ３の存在が検出されかつ／または定量されるようにＧＯＬＰＨ３ポリペプチドを検出することができる薬剤を使用することができる。本明細書において定義されるように、「薬剤」は、生物学的試料中においてＧＯＬＰＨ３を同定するかまたは検出する（例えば、ＧＯＬＰＨ３  ｍＲＮＡ、ＧＯＬＰＨ３  ＤＮＡ、ＧＯＬＰＨ３タンパク質を同定するかまたは検出する）ことができる物質を指す。一実施形態において、薬剤は、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドに特異的に結合する標識されたまたは標識可能な抗体である。本明細書において使用される「標識されたまたは標識可能な」という句は、標識（例えば、マーカーまたは指標）の結合もしくは包含、または標識（例えば、マーカーまたは指標）を結合するもしくは含む能力を指す。マーカーまたは指標としては、例えば、基質中における検出可能な変化を生じさせる放射性分子、比色分子および酵素分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１４８】
更に、ＧＯＬＰＨ３タンパク質は、質量分析、例えば、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ（飛行時間型）、ＳＥＬＤＩ／ＴＯＦ、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー−質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）、キャピラリー電気泳動−質量分析、核磁気共鳴分光法またはタンデム型質量分析（例えば、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ等）を使用して検出され得る。例えば、米国特許出願第２００３０１９９００１号、米国特許出願第２００３０１３４３０４号、米国特許出願第２００３００７７６１６号（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）を参照すること。
【０１４９】
質量分析法は、周知の技術分野であり、タンパク質等の生物分子を定量するためおよび／または同定するために使用されている（例えば、Ｌｉら（２０００年）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １８巻、１５１〜１６０頁、Ｒｏｗｌｅｙら（２０００年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０巻、３８３〜３９７頁、ＫｕｓｔｅｒおよびＭａｎｎ（１９９８年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌ．  ８巻、３９３〜４００頁参照）。更に、単離されたタンパク質の少なくとも部分的なデノボ配列決定を可能にする質量分析技術が開発されている（例えば、Ｃｈａｉｔら（１９９３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２巻、８９〜９２頁、Ｋｅｏｕｇｈ  ら（１９９９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ９６巻、７１３１〜７１３６頁、Ｂｅｒｇｍａｎ（２０００年）ＥＸＳ  ８８巻、１３３〜４４頁においてレビューされたもの参照）。
【０１５０】
ある種の実施形態において、気相イオン分光光度計が使用される。他の実施形態において、レーザ脱離／イオン化質量分析を使用して試料を分析する。最近のレーザ脱離／イオン化質量分析（「ＬＤＩ−ＭＳ」）は、２つの主な変形形態：マトリックス支援レーザ脱離／イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）質量分析および表面増強レーザ脱離／イオン化（「ＳＥＬＤＩ」）質量分析において実践することができる。ＭＡＬＤＩにおいて、分析物を、マトリックスを含有する溶液と混合し、一滴の液体を基質の表面に置く。次いで、そのマトリックス溶液は、それらの生物学的分子と共結晶化する。基質を質量分析計に挿入する。レーザエネルギーを基質表面に向け、生物学的分子を著しく断片化することなく、生物学的分子を脱離およびイオン化する。しかし、ＭＡＬＤＩは、分析用ツールとして限界を有する。ＭＡＬＤＩは、試料を分画化するための手段を提供せず、マトリックス材料は、特に低分子量の分析物の場合、検出に干渉する可能性がある（例えば、Ｈｅｌｌｅｎｋａｍｐらの米国特許第５，１１８，９３７号ならびにＢｅａｖｉｓおよびＣｈａｉｔの米国特許第５，０４５，６９４号参照）。
【０１５１】
ＳＥＬＤＩにおいて、基質表面が脱離プロセスに積極的に関与するように、基質表面を修飾する。１つの変形形態において、対象となるタンパク質を選択的に結合する吸着剤および／または捕獲試薬によって表面を誘導体化する。別の変形形態において、レーザが当たった際に脱離されないエネルギー吸収分子によって表面を誘導体化する。別の変形形態において、対象となるタンパク質を結合し、かつレーザの印加時に壊される光分解性結合を含む分子によって表面を誘導体化する。これらの方法の各々において、一般に、試料が塗布される基質表面上における特定の場所に誘導体化剤を局在化させる（例えば、ＨｕｔｃｈｅｎｓおよびＹｉｐの米国特許第５，７１９，０６０号ならびにＨｕｔｃｈｅｎｓおよびＹｉｐのＷＯ９８／５９３６１参照）。これら２つの方法は、例えば、分析物を捕獲するためにＳＥＬＤＩ親和性表面を使用し、エネルギー吸収材料を提供するため、マトリックス含有液体を、捕獲された分析物に加えることによって組み合わせることができる。
【０１５２】
質量分析計に関する更なる情報については、例えば、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、第３版、Ｓｋｏｏｇ，  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９８５年およびＫｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第４版補遺、１５巻（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９５年）、１０７１〜１０９４頁を参照すること。
【０１５３】
マーカーまたは他の物質の存在の検出は、典型的には、シグナル強度の検出を含む。これは、次に、基質に結合したポリペプチドの量および特性を反映することができる。例えば、ある種の実施形態において、第１の試料および第２の試料のスペクトルから得たピーク値のシグナル強度を（例えば視覚的に、またはコンピューター分析により）比較して、特定の生物分子の相対量を決定することができる。ソフトウェアプログラム、例えばＢｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｗｉｚａｒｄプログラム（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）を使用して、質量スペクトルの分析に役立てることができる。質量分析計およびそれらの技術は当業者に周知である。
【０１５４】
あらゆる当業者は、質量分析計の構成要素の内のいずれか（例えば、脱離ソース、質量分析器、検出等）および様々な試料調製物を、本明細書において記載されている他の適切な構成要素もしくは調製物と、または本技術分野において公知のものと組み合わせることができることを理解する。例えば、幾つかの実施形態において、対照試料は、重原子（例えば、１３Ｃ）を含んでいてもよく、これにより、試験試料を、同一の質量分析の実行において、その公知の対照試料と混合することが可能になる。
【０１５５】
一実施形態において、レーザ脱離飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計が使用される。レーザ脱離質量分析において、結合されたマーカーを伴う基質をインレット系に導入する。マーカーを、イオン化源からのレーザにより脱離し、気相にイオン化する。生成したイオンをイオン光学アセンブリによって回収し、次いで飛行時間型質量分析器内において、イオンを、短い高電圧場を通じて加速し、高真空チャンバ内に送り込む。高真空チャンバの遠端において、加速されたイオンは、異なる時点で高感度検出器の表面にぶつかる。飛行時間型は、イオンの質量の関数であるので、イオン形成とイオンの検出器への衝突との間の経過時間を用いて、特定の質量電荷比の分子の存在または非存在を同定することができる。
【０１５６】
幾つかの実施形態において、第１の試料または第２の試料中において存在する１種または複数種の生物分子の相対量を、部分的に、プログラム可能なデジタルコンピュータによりアルゴリズムを実行することによって決定する。アルゴリズムは、第１質量スペクトルおよび第２質量スペクトルにおける少なくとも１つのピーク値を同定する。次いで、アルゴリズムは、質量スペクトルの内の第１質量スペクトルのピーク値のシグナル強度を第２質量スペクトルのピーク値のシグナル強度と比較する。相対的なシグナル強度は、第１の試料および第２の試料中に存在している生物分子の量の指標である。既知量の生物分子を含有する標準を第２の試料として分析して、第１の試料中に存在している生物分子の量のより良好な定量化を提供することができる。ある種の実施形態において、第１の試料および第２の試料中の生物分子の同一性を決定することもできる。
【０１５７】
一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３レベルを検出することまたは決定することは、ＧＯＬＰＨ３  ＲＮＡレベルを検出することまたは決定することを含む。一実施形態において、試験すべき被験体からの１つまたは複数の細胞を得て、細胞からＲＮＡを単離する。好ましい一実施形態において、被験体から胸部組織細胞の試料を得る。細胞を得る際、所望の型の細胞を大部分含有する試料、例えば、細胞の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、更により好ましくは少なくとも約７０％、８０％、更により好ましくは少なくとも約９０％が所望の型のものである細胞の試料を得ることが好ましい。組織試料は、本技術分野において公知の方法に従って得られ得る。
【０１５８】
被験体から細胞試料を得て、次いでそれを所望の細胞型において富化することも可能である。例えば、細胞は、所望の細胞型の細胞表面上のエピトープに結合する抗体による単離等の種々の技術を使用して他の細胞から単離され得る。所望の細胞が固体組織中にある場合、特定の細胞を例えば顕微解剖によって解剖して取り出すことができる。
【０１５９】
一実施形態において、ＲＮＡは、単一細胞から得られる。例えば、細胞は、レーザ捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）によって組織試料から単離され得る。この技術を使用して、染色された組織切片等の組織切片から細胞を単離することが可能であり、それによって、所望の細胞が単離されることが保証される（例えば、Ｂｏｎｎｅｒら（１９９７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８巻：１４８１頁、Ｅｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋら（１９９６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４巻：９９８頁、Ｆｅｎｄら（１９９９年）Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈ．  １５４巻：６１頁およびＭｕｒａｋａｍｉら（２０００年）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．  ５８巻：１３４６頁参照）。例えば、Ｍｕｒａｋａｍｉら（前掲）は、事前に免疫染色された組織切片からの細胞の単離を記載している。
【０１６０】
また、被験体から細胞を得て、それらの細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養すること、例えばＲＮＡが抽出され得る細胞のより大きな集団を得ることも可能である。非形質転換細胞の培養物、すなわち１次細胞培養物を樹立するための方法は、本技術分野において公知である。
【０１６１】
組織試料からＲＮＡを、または個体から細胞を単離する場合、被験体から組織または細胞を取り出した後の遺伝子発現のあらゆる更なる変化を防止することは重要であり得る。発現レベルの変化は、摂動、例えば、熱ショックまたはリポ多糖（ＬＰＳ）もしくは他の試薬による活性化の後に急速に変化することが知られている。更に、組織および細胞中におけるＲＮＡは、すばやく分解状態になり得る。したがって、好ましい一実施形態において、被験体から得た組織または細胞をできるだけ早く急速凍結する。
【０１６２】
ＲＮＡは、様々な方法（例えば、グアニジンチオシアネート溶解の後、ＣｓＣｌ遠心すること）によって組織試料から抽出され得る（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、１９７９年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８巻：５２９４〜５２９９頁）。単一細胞からのＲＮＡは、単一細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製する方法、例えば、Ｄｕｌａｃ，  Ｃ．（１９９８年）Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ３６巻、２４５頁およびＪｅｎａら（１９９６年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９０巻：１９９頁において記載されている方法に記載されるように得られ得る。例えば、ＲＮＡｓｉｎを含有させることによって、ＲＮＡの分解を回避するように注意を払わなければならない。
【０１６３】
次いで、ＲＮＡ試料を特定の種において富化させることができる。一実施形態において、ＲＮＡ試料からポリ（Ａ）＋ＲＮＡを単離する。一般に、かかる精製は、ｍＲＮＡ上のポリＡテイルを利用する。特に上記のように、ポリＴオリゴヌクレオチドを固体支持体上に固定して、ｍＲＮＡに対するアフィニティリガンドとして働かせることができる。この目的のためのキットは、商業的に入手可能である（例えば、ＭｅｓｓａｇｅＭａｋｅｒキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ））。
【０１６４】
好ましい一実施形態において、ＲＮＡ集団をＧＯＬＰＨ３配列において富化させることができる。富化を、例えば、プライマー特異的ｃＤＮＡ合成、またはｃＤＮＡ合成および鋳型指向性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に基づく複数回の線形増幅によって行うことができる（例えば、Ｗａｎｇら（１９８９年）ＰＮＡＳ  ８６巻、９７１７頁、Ｄｕｌａｃら、前掲、およびＪｅｎａら、前掲参照）。
【０１６５】
特定の種あるいは配列において富化されたまたは富化されていないＲＮＡの集団を更に増幅することができる。本明細書において定義されるように、「増幅プロセス」は、ＲＮＡの中における分子を強化するか、増加させるかまたは増大させるように設計される。例えば、ＲＮＡがｍＲＮＡである場合、シグナルが検出可能になるか、または検出が増強されるように、ＲＴ−ＰＣＲ等の増幅プロセスを利用してｍＲＮＡを増幅することが可能である。特に生物学的試料、組織試料または腫瘍試料が小さい大きさまたは体積である場合、かかる増幅プロセスは有益である。
【０１６６】
種々の増幅および検出方法を使用することができる。例えば、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、その後ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行うこと、または米国特許第５，３２２，７７０号において記載されているように両ステップのための単一酵素を使用すること、またはＲ．  Ｌ．  Ｍａｒｓｈａｌｌら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ４巻：８０〜８４頁（１９９４年）により記載されているように、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、その後対称ギャップリガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）を行うことは、本発明の範囲内である。また、リアルタイムＰＣＲを使用してもよい（実施例参照）。
【０１６７】
本明細書において利用され得る他の公知の増幅方法としては、限定されるものではないが、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７巻：１８７４〜１８７８頁（１９９０年）において記載され、またＮａｔｕｒｅ  ３５０巻（６３１３号）：９１〜９２頁（１９９１年）において記載されている、いわゆる「ＮＡＳＢＡ」または「３ＳＲ」技術、公開された欧州特許出願（ＥＰＡ）第４５４４６１０号において記載されている通りのＱベータ増幅、鎖置換増幅（Ｇ．  Ｔ．  Ｗａｌｋｅｒら、Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ４２巻：９〜１３頁（１９９６年）および欧州特許出願第６８４３１５号において記載されている通りの、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３２２４６１号によって記載されている通りの標的媒介増幅、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４巻、５６０頁（１９８９年）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１巻、１０７７頁（１９８８年）参照）、自己維持配列複製（ＳＳＲ）（例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８７巻、１８７４頁（１９９０年）参照）、ならびに転写増幅（例えば、Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６巻、１１７３頁（１９８９年）参照）が挙げられる。
【０１６８】
ＲＮＡ転写物の検出は、ノーザンブロットによって達成することが可能であり、例えば、ここで、ＲＮＡの調製物を変性アガロースゲル上で走らせ、適切な支持体、例えば、活性化されたセルロース、ニトロセルロースまたはガラスもしくはナイロン膜に移す。次いで、放射標識されたｃＤＮＡまたはＲＮＡを前記調製物にハイブリダイズし、洗浄し、オートラジオグラフィによって分析する。
【０１６９】
また、インサイチュハイブリダイゼーションの視覚化を用いることも可能であり、ここで、放射活性物質で標識したアンチセンスＲＮＡプローブを生検試料の薄切片にハイブリダイズさせ、洗浄し、ＲＮアーゼによって切断し、オートラジオグラフィ用感光乳剤に曝露させる。試料をヘマトキシリンで染色して試料の組織学的組成物を示すことが可能であり、適切な濾光器による暗視野画像化は、現像されたエマルジョンを示す。また、ジゴキシゲニン等の非放射性標識を使用してもよい。
【０１７０】
別の場合、ｍＲＮＡ発現は、ＤＮＡアレイ、チップまたはマイクロアレイ上において検出され得る。患者から得た試験試料の標識核酸を、ＧＯＬＰＨ３  ＤＮＡを含む固体表面にハイブリダイズさせることができる。正のハイブリダイゼーションシグナルは、ＧＯＬＰＨ３転写物を含む試料によって得られる。ＤＮＡアレイの調製方法およびそれらの使用は、本技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，６１８，６７９６号、米国特許第６，３７９，８９７号、米国特許第６，６６４，３７７号、米国特許第６，４５１，５３６号、米国特許第５４８，２５７号、Ｕ．Ｓ．２００３０１５７４８５ならびにＳｃｈｅｎａら（１９９５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０巻、４６７〜４７０頁、Ｇｅｒｈｏｌｄら（１９９９年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ２４巻、１６８〜１７３頁およびＬｅｎｎｏｎら（２０００年）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ５巻、５９〜６５頁（それらは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。また、遺伝子発現の連続的分析（ＳＡＧＥ）を行うこともできる（例えば、米国特許出願第２００３０２１５８５８号参照）。
【０１７１】
ｍＲＮＡレベルをモニタリングするため、例えば、ｍＲＮＡを、試験すべき生物学的試料から抽出し、逆転写し、蛍光標識ｃＤＮＡプローブを生成する。次いで、ＧＯＬＰＨ３  ｃＤＮＡをハイブリダイズすることができるマイクロアレイを、標識ｃＤＮＡプローブによってプローブし、スライドを走査し、蛍光強度を測定する。この強度は、ハイブリダイゼーション強度および発現レベルと相関する。
【０１７２】
本明細書において記載されている方法において使用され得るプローブの型としては、ｃＤＮＡ、リボプローブ、合成オリゴヌクレオチドおよびゲノムプローブが挙げられる。使用されるプローブの型は、一般に、例えば、インサイチュハイブリダイゼーションのためのリボプローブ、およびノーザンブロットのためのｃＤＮＡ等、特定の状態によって規定される。一実施形態において、プローブは、ＲＮＡに一意的なヌクレオチド領域に向けられる。プローブは、ＧＯＬＰＨ３  ｍＲＮＡ転写物を区別して認識するために必要なものと同程度に短くてよく、例えば１５塩基のように短くてよいが、少なくとも１７、１８、１９または２０以上の塩基のプローブが使用され得る。一実施形態において、プライマーおよびプローブは、ストリンジェントな条件下で、ＧＯＬＰＨ３遺伝子に対応するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片に特異的にハイブリダイズする。本明細書において使用される「ストリンジェントな条件」という用語は、ヌクレオチド配列中に少なくとも９５％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こることを意味する。別の一実施形態において、配列間に少なくとも９７％の同一性がある場合、「ストリンジェントな条件」下でハイブリダイゼーションが起こる。
【０１７３】
放射性同位体、例えば、３２Ｐおよび３５Ｓの使用等、プローブの標識化の形態は、適切なものであれば何でもよい。プローブが化学的に合成されたものであっても、生物学的に合成されたものであっても、適切に標識された塩基を使用して、放射性同位体による標識化が達成され得る。
【０１７４】
一実施形態において、ゲノムＧＯＬＰＨ３コピー数（例えば、生殖系列および／または体細胞）の変化が検出される。一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３を含むゲノム遺伝子座（例えば、生殖系列および／または体細胞）のコピー数の変化の存在について生物学的試料を試験する。少なくとも３、４、５、６、７、８、９または１０のコピー数は、癌の存在または癌を発生する可能性を示す。
【０１７５】
特定のバイオマーカーまたは染色体領域（例えば、ＧＯＬＰＨ３または染色体１ｑ３２）のコピー数を評価する方法としては、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイが挙げられるが、これに限定されるものではない。ハイブリダイゼーションに基づくアッセイとしては、従来の「直接プローブ」法、例えば、サザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨおよびＦＩＳＨ＋ＳＫＹ）法、「比較プローブ」法、例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、例えば、ｃＤＮＡに基づくＣＧＨまたはオリゴヌクレオチドに基づくＣＧＨが挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記方法は、限定されるものではないが、基質（例えば、膜またはガラス）結合法またはアレイに基づくアプローチを含めた多種多様な形式において使用され得る。
【０１７６】
一実施形態において、試料中のＧＯＬＰＨ３遺伝子のコピー数の評価は、サザンブロットを含む。サザンブロットにおいて、（典型的には、電気泳動ゲル上において断片化および分離された）ゲノムＤＮＡを、標的領域（例えば、ＧＯＬＰＨ３または染色体１ｑ３２）に対して特異的なプローブにハイブリダイズさせる。標的領域に対するプローブからのハイブリダイゼーションシグナルの強度と正常ゲノムＤＮＡ（例えば、同一または関連の細胞、組織、器官等の非増幅部分）の分析からの対照プローブシグナルとの比較は、標的核酸の相対コピー数の推定値を提供する。別の場合、ノーザンブロットは、試料中のコード核酸のコピー数を評価するために利用され得る。ノーザンブロットにおいて、ｍＲＮＡを、標的領域に対して特異的なプローブにハイブリダイズさせる。標的領域に対するプローブからのハイブリダイゼーションシグナルの強度と正常ＲＮＡ（例えば、同一または関連の細胞、組織、器官等の非増幅部分）の分析からの対照プローブシグナルとの比較は、標的核酸の相対コピー数の推定値を提供する。別の場合、適切な対照（例えば、同一または関連の細胞組織、器官等の非増幅部分）に対してより高いまたはより低い発現は、標的核酸の相対コピー数の推定値を提供するように、ＧＯＬＰＨ３  ＲＮＡを検出するための本技術分野において周知の他の方法を使用することが可能である。
【０１７７】
ゲノムコピー数を決定するための代替の手段は、インサイチュハイブリダイゼーションである（例えば、Ａｎｇｅｒｅｒ（１９８７年）Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５２巻：６４９頁）。一般に、インサイチュハイブリダイゼーションは、以下のステップ：（１）分析すべき組織または生物学的構造の固定、（２）標的ＤＮＡの接近性を増加させ、および非特異的結合を減少させるための生物学的構造のプレハイブリダイゼーション処理、（３）生物学的構造または組織中における核酸への核酸の混合物のハイブリダイゼーション、（４）ハイブリダイゼーションにおいて結合しなかった核酸断片を除去するためのポスト−ハイブリダイゼーション洗浄、および（５）ハイブリダイズした核酸断片の検出を含む。これらのステップの各々において使用される試薬、および使用のための条件は、特定の適用に応じて変化する。代表的なインサイチュハイブリダイゼーションアッセイにおいて、細胞を固体支持体、典型的にはガラススライドに固定する。核酸をプローブする場合、細胞を典型的には熱またはアルカリで変性させる。次いで、中温において細胞にハイブリダイゼーション溶液を接触させて、タンパク質をコードする核酸配列に特異的な標識プローブのアニーリングを可能にする。次いで、標的（例えば、細胞）を、適切なシグナル対ノイズ比が得られるまで所定のストリンジェンシーにおいて、または増大するストリンジェンシーにおいて典型的には洗浄する。プローブは、例えば、放射性同位体または蛍光レポーターによって典型的には標識される。一実施形態において、プローブは、ストリンジェントな条件下で標的核酸（複数可）に特異的にハイブリダイズするように十分に長い。プローブは、一般に、長さが約２００塩基から約１０００塩基までの範囲である。幾つかの適用において、反復配列のハイブリダイゼーションの能力を遮断する必要がある。したがって、幾つかの実施形態において、ｔＲＮＡ、ヒトゲノムＤＮＡまたはＣｏｔ−Ｉ  ＤＮＡを使用して非特異的ハイブリダイゼーションを遮断する。
【０１７８】
ゲノムコピー数を決定するための代替の手段は、比較ゲノムハイブリダイゼーションである。一般に、ゲノムＤＮＡを、正常参照細胞から、および試験細胞（例えば、腫瘍細胞）から単離し、必要に応じて増幅する。２つの核酸を区別して標識し、次いで参照細胞の分裂中期染色体にインサイチュでハイブリダイズさせる。参照ＤＮＡおよび試験ＤＮＡの両方の中における反復配列を取り出すか、またはそれらのハイブリダイゼーション能力を、幾つかの手段によって、例えば、前記ハイブリダイゼーションの間の適切な遮断核酸および／または前記反復配列に対するかかる遮断核酸配列を含むものによるプレハイブリダイゼーションによって低下させる。次いで、必要に応じて、結合した標識ＤＮＡ配列を視覚化可能な形で表す。コピー数が増加または減少した試験細胞中における染色体領域を、２つのＤＮＡからのシグナルの比が変更される領域を検出することによって同定することができる。例えば、試験細胞中におけるコピー数が減少したそれらの領域は、ゲノムの他の領域と比較した参照よりも試験ＤＮＡからの相対的に低いシグナルを示す。試験細胞中におけるコピー数が増加した領域は、試験ＤＮＡからの相対的により高いシグナルを示す。染色体の欠失または増殖がある場合、２つの標識からのシグナルの比の差が検出され、前記比はコピー数の尺度を提供する。ＣＧＨ（アレイＣＧＨ（ａＣＧＨ））の別の一実施形態において、固定された染色体エレメントを、アレイ上における一まとまりの固体支持体結合標的核酸と置き換えて、それによって、前記一まとまりの固体支持体結合標的におけるゲノムの大きいまたは完全なパーセンテージを表すことができる。標的核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、オリゴヌクレオチド（例えば、一塩基変異多型を検出するため）等を含むことができる。アレイに基づくＣＧＨを、（２つの異なる染料によって対照および可能な腫瘍試料を標識し、それらをハイブリダイゼーションの前に混合し、それによって、アレイ上のプローブの競合ハイブリダイゼーションによる比を生じることとは異なり）単一色標識化によって行うこともできる。単一色ＣＧＨにおいて、対照を標識し、一方のアレイにハイブリダイズさせ、絶対シグナルを読み取り、可能な腫瘍試料を標識し、（同一の含有量の）第２のアレイにハイブリダイズさせ、絶対シグナルを読み取る。２つのアレイからの絶対シグナルに基づいてコピー数の差を算出する。固定された染色体またはアレイを調製し、比較ゲノムハイブリダイゼーションを行う方法は、本技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，３３５，１６７号、米国特許第６，１９７，５０１号、米国特許第５，８３０，６４５号および米国特許第５，６６５，５４９号、ならびにＡｌｂｅｒｔｓｏｎ（１９８４年）ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３巻：１２２７〜１２３４頁、Ｐｉｎｋｅｌ（１９８８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：９１３８〜９１４２頁、ＥＰＯ公開第４３０，４０２号、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３３巻：Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｃｈｏｏ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．  （１９９４年）等参照）。別の一実施形態において、Ｐｉｎｋｅｌら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０巻：２０７〜２１１頁またはＫａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ（１９９２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９巻：５３２１〜５３２５頁（１９９２年）のハイブリダイゼーションプロトコールを使用する。
【０１７９】
更に別の一実施形態において、増幅に基づくアッセイを使用して、コピー数を測定することができる。かかる増幅に基づくアッセイにおいて、核酸配列は、増幅反応における鋳型としての役割を果たす（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）。定量的増幅において、増幅産物の量は、最初の試料中の鋳型の量に比例する。適切な対照、例えば健康な組織との比較は、コピー数の尺度を提供する。
【０１８０】
「定量的」増幅の方法は、当業者に周知である。例えば、定量的ＰＣＲは、同一のプライマーを使用して既知量の対照配列を同時に共増幅することを含む。これは、ＰＣＲ反応をキャリブレートするために使用することができる内部標準を提供する。定量的ＰＣＲについての詳細なプロトコールは、Ｉｎｎｉｓら（１９９０年）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  Ｎ．Ｙ．）において提供されている。定量的ＰＣＲ分析を使用するマイクロサテライト遺伝子座におけるＤＮＡコピー数の測定は、Ｇｉｎｚｏｎｇｅｒら（２０００年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６０巻：５４０５〜５４０９頁において記載されている。遺伝子についての公知の核酸配列は、当業者が、ルーチン的にプライマーを選択して、遺伝子のいずれかの部分を増幅するのを可能にするのに十分である。蛍光発生定量的ＰＣＲを本発明の方法において使用することもできる。蛍光発生定量的ＰＣＲにおいて、定量は、蛍光シグナル、例えば、ＴａｑＭａｎおよびＳＹＢＲグリーンの量に基づく。
【０１８１】
他の適切な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４巻：５６０頁、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１巻：１０７７頁ならびにＢａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０年）Ｇｅｎｅ  ８９巻：１１７頁参照）、転写増幅（Ｋｗｏｈら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６巻：１１７３頁）、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７巻：１８７４頁）、ドットＰＣＲ、およびリンカーアダプターＰＣＲ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１８２】
ヘテロ接合性消失（ＬＯＨ）マッピング（Ｗａｎｇ，  Ｚ．Ｃ．ら（２００４年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４巻（１号）：６４〜７１頁、Ｓｅｙｍｏｕｒ，  Ａ．  Ｂ．ら（１９９４年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４巻、２７６１〜４頁、Ｈａｈｎ，  Ｓ．  Ａ．ら（１９９５年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５巻、４６７０〜５頁、Ｋｉｍｕｒａ，  Ｍ．ら（１９９６年）Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １７巻、８８〜９３頁）を使用して、増幅または欠失の領域を同定することもできる。
【０１８３】
一実施形態において、生物学的試料は、試験被験体からのポリペプチド分子を含有する。別の場合、生物学的試料は、試験被験体からのｍＲＮＡ分子または試験被験体からのゲノムＤＮＡ分子を含有することができる。好ましい生物学的試料は、対照から従来の手段によって単離される血清試料である。
【０１８４】
他の一実施形態において、前記方法は、対照被験体から対照生物学的試料を得ることと、前記対照試料にＧＯＬＰＨ３ポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはそれらの断片を検出することができる化合物または薬剤を接触させて、生物学的試料中においてＧＯＬＰＨ３ポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはそれらの断片の存在を検出することと、対照試料中のＧＯＬＰＨ３ポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはそれらの断片の存在を、試験試料中のＧＯＬＰＨ３ポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはそれらの断片の存在と比較することとを更に含む。
【０１８５】
また、本発明は、生物学的試料中のＧＯＬＰＨ３核酸、ポリペプチドまたはそれらの断片の存在を検出するためのキットをも包含する。例えば、キットは、生物学的試料中のＧＯＬＰＨ３核酸、ポリペプチドまたはそれらの断片を検出することができる標識された化合物または薬剤と、前記試料中のＧＯＬＰＨ３核酸、ポリペプチドまたはそれらの断片の量を決定するための手段と、前記試料中のＧＯＬＰＨ３核酸、ポリペプチドまたはそれらの断片の量を標準と比較するための手段とを含むことができる。化合物または薬剤は、適切な容器中において包装され得る。キットは、更に、ＧＯＬＰＨ３核酸、ポリペプチドまたはそれらの断片の検出にキットを使用するための指示書を含むことができる。
【０１８６】
２．予知アッセイ
更に、本明細書において記載される診断方法を利用して、異常なもしくは望ましくないＧＯＬＰＨ３発現もしくは活性に関連付けられた疾患もしくは障害を有するかまたは発生するリスクがある被験体を同定することができる。本明細書において使用される「異常な」という用語は、野生型ＧＯＬＰＨ３発現または活性から逸脱するＧＯＬＰＨ３発現または活性を含む。異常な発現または活性としては、増加または減少した発現または活性、ならびに発現の野生型発生パターンや発現の細胞内パターンをたどらない発現または活性が挙げられる。例えば、異常なＧＯＬＰＨ３発現または活性は、ＧＯＬＰＨ３遺伝子またはその調節配列中における突然変異によってＧＯＬＰＨ３遺伝子が過小発現するかまたは過剰発現することが引き起こされる場合、およびかかる突然変異が、非機能性ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたは野生型様式で機能しないポリペプチド、例えば、ＧＯＬＰＨ３結合パートナー（複数可）と相互作用しないポリペプチドまたは非ＧＯＬＰＨ３結合パートナー（複数可）と相互作用するものをもたらす状態を含むことが意図される。本明細書において使用される「望ましくない」という用語は、免疫細胞活性化等の生物学的応答に関与する望ましくない現象を含む。例えば、望ましくないという用語は、被験体中における望ましくないＧＯＬＰＨ３発現または活性を含む。
【０１８７】
先の診断アッセイまたは後のアッセイ等の本明細書に記載されるアッセイを利用して、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチド活性または核酸発現の誤調節に関連付けられた障害、例えば癌、例えば、肺癌、卵巣癌、膵癌、肝癌、乳癌、前立腺癌および結腸癌、ならびに黒色腫および多発性骨髄腫を有するか、または前記障害を発生するリスクがある被験体を同定することができる。別の場合、予知アッセイを利用して、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチド活性または核酸発現の誤調節に関連付けられた障害、例えば癌、例えば、肺癌、卵巣癌、膵癌、肝癌、乳癌、前立腺癌および結腸癌、ならびに黒色腫および多発性骨髄腫を有するか、または前記障害を発生するリスクがある被験体を同定することができる。したがって、本発明は、試験試料が被験体から得られ、かつＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）が検出される異常なまたは望ましくないＧＯＬＰＨ３発現または活性に関連付けられた疾患または障害を同定するための方法であって、ここで、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたは核酸の存在が、異常なまたは望ましくないＧＯＬＰＨ３発現または活性に関連付けられた疾患または障害を有するか、または前記疾患または障害を発生するリスクがある被験体の徴候を成す、方法を提供するものである。本明細書において使用される「試験試料」は、対象となる被験体から得た生物学的試料を指す。例えば、試験試料は、生物学的液（例えば、脳脊髄液または血清）、細胞試料または組織であり得る。
【０１８８】
更に、本明細書において記載される予知アッセイを使用して、異常なまたは望ましくないＧＯＬＰＨ３発現または活性に関連付けられた疾患または障害を治療するために、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣体、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小分子または他の薬物候補物質）を被験体に投与することができるかを決定することができる。例えば、かかる方法を使用して、癌、例えば、肺癌、卵巣癌、膵癌、肝癌、乳癌、前立腺癌および結腸癌、ならびに黒色腫および多発性骨髄腫の薬剤によって被験体を効果的に治療することができるかを決定することができる。したがって、本発明は、試験試料が得られ、かつＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたは核酸発現もしくは活性が検出される異常なまたは望ましくないＧＯＬＰＨ３発現または活性に関連付けられた障害の薬剤によって被験体を効果的に治療することができるかを決定するための方法を提供するものである（例えば、ここで、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたは核酸発現もしくは活性の発生量は、異常なまたは望ましくないＧＯＬＰＨ３発現もしくは活性に関連付けられた障害を治療するために前記薬剤を投与することができる被験体の徴候を成す）。
【０１８９】
また、本発明の方法を使用して、ＧＯＬＰＨ３遺伝子における遺伝子改変を検出し、それによって、変更された遺伝子を有する被験体が、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチド活性または核酸発現の誤調節によって特徴付けられる障害、例えば癌、例えば、肺癌、卵巣癌、膵癌、肝癌、乳癌、前立腺癌および結腸癌、ならびに黒色腫および多発性骨髄腫のリスクがあるかを決定することもできる。好ましい実施形態において、前記方法は、被験体からの細胞の試料中の、ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドをコードする遺伝子の完全性またはＧＯＬＰＨ３遺伝子の誤発現に影響を及ぼす少なくとも１つの改変によって特徴付けられる遺伝子改変の存在または非存在を検出することを含む。例えば、１）ＧＯＬＰＨ３遺伝子からの１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、２）ＧＯＬＰＨ３遺伝子への１つまたは複数のヌクレオチドの付加、３）ＧＯＬＰＨ３遺伝子の１つまたは複数のヌクレオチドの置換、４）ＧＯＬＰＨ３遺伝子の染色体再配置、５）ＧＯＬＰＨ３遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルの改変、６）ゲノムＤＮＡのメチル化パターン等、ＧＯＬＰＨ３遺伝子の異常な修飾、７）ＧＯＬＰＨ３遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、８）ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドの非野生型レベル、９）ＧＯＬＰＨ３遺伝子の対立遺伝子の欠損または獲得、および１０）ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドの不適切な翻訳後修飾の内の少なくとも１つの存在を確認することによって、かかる遺伝子改変を検出することができる。本明細書において記載されるように、ＧＯＬＰＨ３遺伝子中における改変を検出するために使用され得る本技術分野において公知の多数のアッセイがある。好ましい生物学的試料は、従来の手段によって被験体から単離される組織試料または血清試料である。
【０１９０】
ある種の実施形態において、改変の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号参照）、例えば、アンカーＰＣＲもしくはＲＡＣＥ  ＰＣＲにおいて、または、別の場合、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１巻：１０７７〜１０８０頁およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１巻：３６０〜３６４頁参照）におけるプローブ／ブライマーの使用を含み、その後者は、ＧＯＬＰＨ３遺伝子中における点突然変異の検出に特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら（１９９５年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３巻：６７５〜６８２頁参照）。この方法は、患者から細胞の試料を回収するステップと、前記試料の細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方）を単離するステップと、ＧＯＬＰＨ３遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下で、前記核酸試料に、ＧＯＬＰＨ３遺伝子に特異的にハイブリダイズする１種または複数種のプライマーを接触させるステップと、増幅産物の存在もしくは非存在を検出するか、または増幅産物のサイズを検出して、長さを対照試料と比較するステップとを含むことができる。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書において記載される突然変異の検出に使用される技術の内のいずれかと組み合わされた予備的増幅ステップとして使用することが望ましい可能性があると予想される。
【０１９１】
代替の増幅方法としては、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，  Ｊ．  Ｃ．ら（１９９０年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７巻：１８７４〜１８７８頁）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ，  Ｄ．  Ｙ．ら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６巻：１１７３〜１１７７頁）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ，  Ｐ．  Ｍ．ら（１９８８年）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６巻：１１９７頁）または他のあらゆる核酸増幅方法が挙げられ、当業者に周知の技術を使用する増幅分子の検出が続く。これらの検出スキームは、核酸分子の検出に特に有用であるが、それは、かかる分子が非常に少数で存在する場合である。
【０１９２】
代替の一実施形態において、試料細胞からのＧＯＬＰＨ３遺伝子中の突然変異を制限酵素切断パターンにおける改変によって同定することができる。例えば、試料および対照ＤＮＡを単離し、（場合により）増幅し、１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼによって消化し、ゲル電気泳動によって断片長サイズを決定し、比較する。試料および対照ＤＮＡの間の断片長サイズの差は、試料ＤＮＡ中における突然変異を示す。更に、配列特異的リボザイム（例えば、米国特許第５，４９８，５３１号参照）の使用を用いて、リボザイム切断部位の発生または喪失によって特異的突然変異の存在についてスコアすることができる。
【０１９３】
他の実施形態において、試料核酸および対照核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイにハイブリダイズさせることによってＧＯＬＰＨ３中における遺伝子突然変異を同定することができる（Ｃｒｏｎｉｎ，  Ｍ．  Ｔ．ら（１９９６年）Ｈｕｍ．  Ｍｕｔａｔ．  ７巻：２４４〜２５５頁、Ｋｏｚａｌ，  Ｍ．  Ｊ．ら（１９９６年）Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ２巻：７５３〜７５９頁）。例えば、Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６年）前掲において記載されているように、光生成ＤＮＡプローブを含有する２次元アレイにおいてＧＯＬＰＨ３中における遺伝子突然変異を同定することができる。簡潔には、プローブの第１ハイブリダイゼーションアレイを使用して、試料および対照中のＤＮＡの長鎖を走査し、連続的に重なるプローブの線状のアレイを作製することによって配列間の塩基の変化を同定することができる。このステップは、点突然変異の同定を可能にする。このステップには、検出される全ての変異体または突然変異に相補的な、より小さい特殊化されたプローブアレイを使用することによって特異的な突然変異の特徴付けを可能にする第２ハイブリダイゼーションアレイが続く。各突然変異アレイは、平行プローブセットから構成され、一方は野生型遺伝子に相補的であり、他方は突然変異遺伝子に相補的である。例えば生殖系列および体細胞突然変異（ｍｔｕａｔｉｏｎ）等、ＧＯＬＰＨ３中におけるかかる遺伝子突然変異は、種々の文脈において同定され得る。
【０１９４】
更に別の一実施形態において、本技術分野において公知の種々の配列決定反応の内のいずれかを使用して、ＧＯＬＰＨ３遺伝子を直接配列決定し、試料ＧＯＬＰＨ３の配列を対応する野生型（対照）配列と比較することによって突然変異を検出することができる。配列決定反応の例としては、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７４巻：５６０頁またはＳａｎｇｅｒ（１９７７年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７４巻：５４６３頁によって開発された技術に基づくものが挙げられる。診断アッセイ（Ｎａｅｖｅ，  Ｃ．  Ｗ．  （１９９５年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９巻：４４８〜５３頁）を行う場合、質量分析による配列決定（例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１６１０１号、Ｃｏｈｅｎら（１９９６年）Ａｄｖ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  ３６巻：１２７〜１６２頁、およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３年）Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３８巻：１４７〜１５９頁参照）を含む種々の自動化配列決定法の内のいずれかを利用することができることも意図される。
【０１９５】
ＧＯＬＰＨ３遺伝子中の突然変異を検出するための他の方法としては、切断剤からの保護を用いてＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロデュプレックス中のミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる（Ｍｙｅｒｓら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０巻：１２４２頁）。一般に、本技術分野の「ミスマッチ切断」の技術は、野生型ＧＯＬＰＨ３配列を含有する（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを組織試料から得た突然変異体の可能性があるＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成されるヘテロデュプレックスを提供することによって開始する。対照および試料の鎖の間の塩基対ミスマッチの故に存在するもののようなデュプレックスの一本鎖領域を切断する薬剤によって二本鎖デュプレックスを処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスをＲＮアーゼで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＳ１ヌクレアーゼで処理してミスマッチ領域を酵素的に消化することができる。他の実施形態において、ミスマッチ領域を消化するためにＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスのいずれかをヒドロキシルアミンもしくは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理することができる。ミスマッチ領域の消化の後、次いで得た材料を変性ポリアクリルアミドゲル上においてサイズにより分離し、突然変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：４３９７頁およびＳａｌｅｅｂａら（１９９２年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２１７巻：２８６〜２９５頁を参照すること。好ましい一実施形態において、検出のために対照ＤＮＡまたはＲＮＡを標識することができる。
【０１９６】
更に別の一実施形態において、ミスマッチ切断反応は、細胞の試料から得たＧＯＬＰＨ３  ｃＤＮＡ中における点突然変異を検出し、マッピングするための限定された系において二本鎖ＤＮＡ中におけるミスマッチ塩基対を認識する１種または複数種のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を用いる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチにおいてＡを切断し、ＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼはＧ／ＴミスマッチにおいてＴを切断する（Ｈｓｕら（１９９４年）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １５巻：１６５７〜１６６２頁）。例示的実施形態によれば、ＧＯＬＰＨ３配列、例えば野生型ＧＯＬＰＨ３配列に基づくプローブを試験細胞（複数可）からのｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズさせる。デュプレックスをＤＮＡミスマッチ修復酵素によって処理し、切断産物を、存在する場合、電気泳動プロトコール等から検出することができる。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照すること。
【０１９７】
他の実施形態において、ＧＯＬＰＨ３遺伝子中における突然変異を同定するために電気泳動移動度の改変が使用される。例えば、突然変異核酸および野生型核酸の間の電気泳動移動度の差を検出するために一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）を使用することができる（Ｏｒｉｔａら（１９８９年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６巻：２７６６頁、また、Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３年）Ｍｕｔａｔ．  Ｒｅｓ．  ２８５巻：１２５〜１４４頁およびＨａｙａｓｈｉ（１９９２年）Ｇｅｎｅｔ．  Ａｎａｌ．  Ｔｅｃｈ．  Ａｐｐｌ．  ９巻：７３〜７９頁も参照）。試料および対照ＧＯＬＰＨ３核酸の一本鎖ＤＮＡ断片を変性させ、再生させる。一本鎖核酸の二次構造は配列に従って変化し、結果として生じる電気泳動移動度の改変は、単一塩基変化の検出さえ可能にする。ＤＮＡ断片を標識することができるか、または標識されたプローブによって検出することができる。二次構造が配列の変化に対してより大きな感受性があるＲＮＡ（ＤＮＡではなく）を使用することによって、アッセイの感度を増強することができる。好ましい一実施形態において、本方法は、ヘテロデュプレックス分析を利用して、電気泳動移動度の変化に基づいて二本鎖ヘテロデュプレックス分子を分離する（Ｋｅｅｎら（１９９１年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  ７巻：５頁）。
【０１９８】
更に別の一実施形態において、変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲル中における突然変異断片または野生型断片の移動を変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイする（Ｍｙｅｒｓら（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３巻：４９５頁）。分析方法としてＤＧＧＥを使用する場合、例えばＰＣＲによって約４０ｂｐの高融点高ＧＣ含有ＤＮＡのＧＣクランプを付加することによって、ＤＮＡを修飾して、ＤＮＡが完全に変性しないことを保証する。更なる一実施形態において、対照ＤＮＡおよび試料ＤＮＡの移動度の差を同定するために変性勾配の代わりに温度勾配を使用する（ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７年）Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５巻：１２７５３頁）。
【０１９９】
点突然変異の検出のための他の技術の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅または選択的プライマー伸長が挙げられるが、これらに限られるものではない。例えば、公知の突然変異が中心に置かれたオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで完全なマッチが見出される場合のみにハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズさせることができる（Ｓａｉｋｉら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４巻：１６３頁、Ｓａｉｋｉら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６巻：６２３０頁）。オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション膜に結合し、標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズする際、かかる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたは多くの異なる突然変異にハイブリダイズさせる。
【０２００】
別の場合、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術を本発明と組み合わせて使用することができる。特異的増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心に（増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように）（Ｇｉｂｂｓら（１９８９年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７巻：２４３７〜２４４８頁）、または適切な条件下でミスマッチを防ぐことができるかもしくはポリメラーゼ伸長が低下する１つのプライマーの３’末端に（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３年）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １１巻：２３８頁）、対象となる突然変異を担持することができる。更に、切断に基づく検出を生ぜしめるために突然変異の領域中において新規な制限部位を導入することが望ましい可能性がある（Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ６巻：１頁）。ある種の実施形態において、増幅のためのＴａｑリガーゼを使用して増幅を行うこともできることが予想される（Ｂａｒａｎｙ（１９９１年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８巻：１８９頁）。そのような場合、５’配列の３’末端に完全なマッチがある場合のみにライゲーションが起こり、増幅の存在または非存在を探索することによって特定の部位における公知の突然変異の存在を検出することが可能になる。
【０２０１】
例えば、本明細書において記載される少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む包装済みの診断キットを利用することによって、本明細書に記載される方法を行うことが可能であり、前記キットは、例えばＧＯＬＰＨ３遺伝子を伴う疾患もしくは病気の症状または家族歴を示す患者を診断するための臨床設定において都合よく使用され得る。
【０２０２】
更に、ＧＯＬＰＨ３を発現するいずれの細胞型または組織も、本明細書において記載される予知アッセイにおいて利用することができる。
【０２０３】
別の一実施形態において、被験体におけるｍＴＯＲ経路阻害剤の有効性の可能性を評価するための方法が提供される。本明細書において、ＧＯＬＰＨ３は、ｍＴＯＲ経路の阻害剤であるラパマイシンに対する増加した感受性を与えることが明らかにされているので、ＧＯＬＰＨ３発現レベルまたはＤＮＡコピー数状態は、例えば、肺癌、卵巣癌、膵癌、肝癌、乳癌、前立腺癌および結腸癌、ならびに黒色腫および多発性骨髄腫等の癌におけるｍＴＯＲ経路阻害剤（例えば、ラパマイシン、ＣＣＩ−７７９、エベロリムス、ＣＣ−５０１３、ＡＰ２３５７３、ＴＡＦＡ９３、デフォロリムス等）に対する明確な予測バイオマーカーを含む。理論に束縛されることなく、ＧＯＬＰＨ３過剰発現細胞は、「腫瘍遺伝子依存性」の詳細に記載される現象を示し、ここで細胞は、腫瘍遺伝子（例えば、ＧＯＬＰＨ３）に対して「依存性」になり、標的とされた経路（例えば、ｍＴＯＲ経路）の阻害は、当該の細胞および／または腫瘍の成長を弱める。
【０２０４】
３．臨床試験中の効果のモニタリング
ＧＯＬＰＨ３ポリペプチドまたはその断片の発現または活性に対する薬剤（例えば薬物）の影響（例えば、細胞増殖および／または移動のモジュレーション）のモニタリングは、基本的な薬物スクリーニングに適用できるだけでなく、臨床試験にも適用することができる。例えば、ＧＯＬＰＨ３遺伝子発現、ポリペプチドレベルを増大させるか、またはＧＯＬＰＨ３活性を上方制御する、本明細書において記載されているスクリーニングアッセイによって決定される薬剤の効力を、減少したＧＯＬＰＨ３遺伝子発現、ポリペプチドレベルまたは下方制御されたＧＯＬＰＨ３活性を示す被験体の臨床試験においてモニタリングすることができる。別の場合、ＧＯＬＰＨ３遺伝子発現、ポリペプチドレベルを減少させるか、またはＧＯＬＰＨ３活性を下方制御する、スクリーニングアッセイによって決定される薬剤の効力を、増大したＧＯＬＰＨ３遺伝子発現、ポリペプチドレベルまたはＧＯＬＰＨ３活性を示す被験体の臨床試験においてモニタリングすることができる。かかる臨床試験において、ＧＯＬＰＨ３遺伝子、および、好ましくは、例えばＧＯＬＰＨ３関連障害に関与してきた他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の表現型の「読み取り値」またはマーカーとして使用することができる。
【０２０５】
例えば、限定されるものではないが、（例えば、本明細書において記載されるスクリーニングアッセイにおいて同定された）ＧＯＬＰＨ３活性を調節する薬剤（例えば、化合物、薬物または低分子）による治療によって細胞中において調節されるＧＯＬＰＨ３等の遺伝子を同定することができる。したがって、例えば臨床試験においてＧＯＬＰＨ３関連障害（例えば、無調節なＧＯＬＰＨ３活性によって特徴付けられる障害）に対する薬剤の効果を研究するため、細胞を単離し、ＲＮＡを調製し、ＧＯＬＰＨ３およびＧＯＬＰＨ３関連障害に関与する他の遺伝子の発現のレベルについてそれぞれ分析することができる。遺伝子発現のレベル（例えば、遺伝子発現パターン）は、本明細書において記載される通りのノーザンブロット分析もしくはＲＴ−ＰＣＲによって、あるいは、代わりに、産生されたポリペプチドの量を測定することによって、本明細書に記載される通りの方法の内の１つによって、またはＧＯＬＰＨ３もしくは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって定量され得る。このように、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとして役立つことができる。したがって、この応答状態は、薬剤による個体の治療の前、および最中の様々な時点で決定され得る。
【０２０６】
好ましい一実施形態において、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣体、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小分子、またはＧＯＬＰＨ３に直接もしくは間接的に作用する、本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補物質）による被験体の治療の効力をモニタリングするための方法を提供するものであって、この方法は、（ｉ）薬剤の投与の前の被験体から投与前試料を得るステップと、（ｉｉ）投与前試料中のＧＯＬＰＨ３ポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはそれらの断片の発現レベルを検出するステップと、（ｉｉｉ）被験体から１つまたは複数の投与後試料を得るステップと、（ｉｖ）投与後試料中のＧＯＬＰＨ３ポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはそれらの断片の発現または活性のレベルを検出するステップと、（ｖ）投与前試料中のＧＯＬＰＨ３ポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはそれらの断片の発現または活性のレベルを、１つまたは複数の投与後試料中のＧＯＬＰＨ３ポリペプチド、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと比較するステップと、（ｖｉ）これに従い被験体への薬剤の投与を改変するステップとを含む。例えば、ＧＯＬＰＨ３の発現または活性を検出レベルよりも高いレベルに直接的または間接的に増加させるために、すなわち薬剤の効力を増加させるためには、薬剤の投与の増加が望ましい可能性がある。別の場合、ＧＯＬＰＨ３の発現または活性を検出レベルよりも低いレベルに直接的または間接的に減少させるために、すなわち薬剤の効力を減少させるためには、薬剤の投与の減少が望ましい可能性がある。かかる一実施形態に従って、ＧＯＬＰＨ３発現または活性は、観察可能な表現型の応答が無い場合でも、薬剤の効力の指標として使用され得る。
【０２０７】
Ｄ．癌を治療するためのＧＯＬＰＨ３に基づく療法
原発腫瘍における高ＧＯＬＰＨ３レベルが癌の存在に関連付けられるという見解に少なくとも基づいて、被験体の腫瘍または組織中におけるＧＯＬＰＨ３の発現レベルを阻害するか、もしくは低下させることによって、癌を発生する可能性を減少させること、癌の進行を停止させること、または癌を完全に予防することが可能であり得る。一実施形態において、癌、例えば、肺癌、卵巣癌、膵癌、肝癌、乳癌、前立腺癌および結腸癌、ならびに黒色腫および多発性骨髄腫を治療するかまたは予防するための方法は、ＧＯＬＰＨ３の発現レベルを低下させることを含む。方法は、ＧＯＬＰＨ３遺伝子の発現を低下させること、ＧＯＬＰＨ３タンパク質の量を低下させること、またはＧＯＬＰＨ３タンパク質の活性を阻害することを含むことができる。治療のための方法において、腫瘍、例えば、原発腫瘍中におけるＧＯＬＰＨ３レベルまたは活性を低下させることができる。癌を予防するための方法において、癌を発生する可能性がある組織、例えばＧＯＬＰＨ３発現の高いレベルを示す組織中におけるＧＯＬＰＨ３レベルまたは活性を低下させることができる。
【０２０８】
腫瘍形成または転移を予防するために、疾患の非常に早期のステージにおいてであっても予防法は適切であり得る。したがって、ＧＯＬＰＨ３レベルまたは活性を低下させる薬剤の投与を、癌が診断されるとすぐに行うことができ、一般に疾患の脅威が取り除かれるまで、必要である限り治療を継続することができる。かかる治療を、ある種の癌、例えば乳癌の発生リスクが高い個体において予防的に使用することもできる。
【０２０９】
１．ＲＮＡｉ技術
一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３レベルは、１種もしくは複数種のｓｉＲＮＡの投与、または被験体中における、例えば被験体の細胞もしくは組織中における１種もしくは複数種のｓｉＲＮＡの発現によって減少する。
【０２１０】
ＧＯＬＰＨ３  ｍＲＮＡに対して特異的な単離されたＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉを媒介するものであって、本発明の方法において有用なアンタゴニストである（例えば、米国特許出願第２００３０１５３５１９Ａ１号、米国特許出願第２００３０１６７４９０Ａ１号および米国特許第６，５０６，５５９号、米国特許第６，５７３，０９９号（それらは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。
【０２１１】
一実施形態において、ＲＮＡは、短分子干渉ＲＮＡもしくは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）から構成されるか、または短分子干渉ＲＮＡもしくは低分子干渉ＲＮＡに切断され得る。本明細書において使用される「短分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」という用語は、ＲＮＡｉまたは遺伝子サイレンシングを媒介することができるあらゆる核酸分子を指すことが意図される。ｓｉＲＮＡという用語は、ＲＮＡｉ機能を有する様々な天然に生成されたまたは合成の化合物を包含することが意図される。かかる化合物としては、限定されないが、２または３塩基対の末端重複部を有する約２１〜２３塩基対のデュプレックス合成オリゴヌクレオチド、センスであり、ハイブリダイズする相補的セグメントであって、３〜５塩基対のループによって結合された２１〜２３塩基対のセグメントを有する１つのオリゴヌクレオチド鎖のヘアピン構造、および前述の構造または機能的同等物の発現につながる様々な遺伝子構築物が挙げられる。かかる遺伝子構築物は、通常、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製され、試験系内に導入されるが、宿主細胞または動物のゲノムによってコードされた天然に存在するｓｉＲＮＡ前駆体由来のｓｉＲＮＡを含むこともできる。
【０２１２】
ｓｉＲＮＡがＲＮＡのみで構成されることは、必要条件ではない。一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、１つまたは複数の化学修飾および／またはヌクレオチド類似体を含む。前記修飾および／または類似体は、それぞれ、ｓｉＲＮＡがＧＯＬＰＨ３発現を阻害する能力に負の影響を及ぼさないあらゆる修飾および／または類似体であってもよい。ｓｉＲＮＡ内に１つまたは複数の化学修飾および／またはヌクレオチド類似体が含まれることは、ヌクレアーゼ消化を防止するかまたは遅滞させ、それによって実用のためにより安定なｓｉＲＮＡを作製するために用いることができる。ＲＮＡを安定化させる化学修飾および／またはヌクレオチド類似体は、本技術分野において公知である。ホスホロチオエート誘導体は、イオウ原子による非架橋ホスホリル酸素原子の置き換えを含むものであって、ヌクレアーゼ消化に対する抵抗性の増大を示す類似体の内の一例である。化学修飾について標的とされ得るｓｉＲＮＡの部位としては、ヘアピン構造のループ領域、ヘアピン構造の５’および３’末端（例えば、キャップ構造）、二本鎖の線状ｓｉＲＮＡの３’オーバーハング領域、線状ｓｉＲＮＡのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’もしくは３’末端、ならびに前記センスおよび／またはアンチセンス鎖の１つもしくは複数のヌクレオチドが挙げられる。
【０２１３】
本明細書において使用されるｓｉＲＮＡという用語は、本技術分野において、配列特異的ＲＮＡｉを媒介し得る分子と定義されるあらゆる用語と同等であることが意図される。かかる同等物としては、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短分子干渉オリゴヌクレオチドおよび転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）が挙げられる。
【０２１４】
国際公開第ＷＯ０１７５１６４号において記載されているように、ｓｉＲＮＡを細胞に導入して、治療目的または予防目的のために遺伝子発現を抑制することができる。様々な特許、特許出願および論文において記載されているように、かかる分子を細胞に導入して、治療目的または予防目的のために遺伝子発現を抑制することができる。参照により本明細書に組み込まれ、ＲＮＡｉ技術が記載された刊行物としては、下記のもの：米国特許第６，６８６，４６３号、米国特許第６，６７３，６１１号、米国特許第６，６２３，９６２号、米国特許第６，５０６，５５９号、米国特許第６，５７３，０９９号および米国特許第６，５３１，６４４号、国際公開第ＷＯ０４０６１０８１号、国際公開第ＷＯ０４０５２０９３号、国際公開第ＷＯ０４０４８５９６号、国際公開第ＷＯ０４０４８５９４号、国際公開第ＷＯ０４０４８５８１号、国際公開第ＷＯ０４０４８５６６号、国際公開第ＷＯ０４０４６３２０号、国際公開第ＷＯ０４０４４５３７号、国際公開第ＷＯ０４０４３４０６号、国際公開第ＷＯ０４０３３６２０号、国際公開第ＷＯ０４０３０６６０号、国際公開第ＷＯ０４０２８４７１号、国際公開第ＷＯ０１７５１６４号が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの化合物の最適な使用のための方法および概念が記載された論文としては、下記のもの：Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６巻：５５０〜５５３頁（２００２年）、Ｃａｐｌｅｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ３巻：５７５〜８６頁（２００３年）、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ３月２１日３巻１〜６頁（２００３年）、Ｙｕ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９巻：６０４７〜５２頁（２００２年）、Ｐａｕｌ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９巻：５０５〜８頁（２００２年）、Ｐａｄｄｉｓｏｎ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９巻：１４４３〜８頁（２００２年）、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ、Ｎａｔｕｒｅ  ４２４巻：７９７〜８０１頁（２００３年）、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６巻：−５５０〜３頁（２００３年）、Ｓｕｉ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９巻：５５１５〜２０頁（２００２年）、Ｐａｄｄｉｓｏｎ、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １６巻：９４８〜５８頁（２００２年）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２１５】
ＧＯＬＰＨ３発現を阻害するのに有効なｓｉＲＮＡを含む組成物は、ＧＯＬＰＨ３のセンス配列を含むＲＮＡデュプレックスを含んでもよい。この実施形態において、前記ＲＮＡデュプレックスは、ＧＯＬＰＨ３のセンス配列を含む第１の鎖と、ＧＯＬＰＨ３の前記センス配列の逆相補物を含む第２の鎖とを含む。一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３のセンス配列は、長さが１０〜２５ヌクレオチドを含む。別の一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３のセンス配列は、長さが１９〜２５ヌクレオチドを含む。更に別の一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３のセンス配列は、長さが２１〜２３ヌクレオチドを含む。ＧＯＬＰＨ３のセンス配列は、翻訳開始部位を含むＧＯＬＰＨ３の配列またはヒトＧＯＬＰＨ３  ｍＲＮＡの最初の４００ヌクレオチドの中のＧＯＬＰＨ３配列の部分を含むことができる。
【０２１６】
別の一実施形態において、ＧＯＬＰＨ３発現を阻害するのに有効なｓｉＲＮＡを含む組成物は、単一分子中において、ＧＯＬＰＨ３のセンス配列と、ＧＯＬＰＨ３のセンス配列の逆相補物と、センス配列および逆相補的配列の間のデュプレックス形成を可能にする介在配列とを含むことができる。ＧＯＬＰＨ３のセンス配列は、長さが１０〜２５ヌクレオチド、長さが１９〜２５ヌクレオチド、または長さが２１〜２３ヌクレオチドを含むことができる。
【０２１７】
本発明のｓｉＲＮＡが、互いにまたはＧＯＬＰＨ３の標的領域に対して完全には相補的でないＧＯＬＰＨ３のセンス配列またはＧＯＬＰＨ３のセンス配列の逆相補物を含むことができることは、当業者に容易に明らかである。換言すれば、ｓｉＲＮＡは、センス配列または逆相補的配列の中にミスマッチまたはバルジを含むことができる。一態様において、センス配列またはその逆相補物は、完全に連続的でなくてもよい。１つの配列または複数の配列は、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を含むことができる。本発明の唯一の必要条件は、ｓｉＲＮＡセンス配列が、その逆相補物に対して、およびＧＯＬＰＨ３の標的領域に対して、ＲＮＡｉ活性を可能にするのに十分な相補性を有するということである。故に、ＲＮＡｉ活性を可能にするのに十分な相補性を保持する本発明のｓｉＲＮＡの配列修飾を提供することが、本発明の目的である。当業者は、本発明の修飾ｓｉＲＮＡ組成物が、ＧＯＬＰＨ３の相補的配列および標的領域の修飾配列の算出された結合自由エネルギーに基づいて奏効することを予測することができる。核酸の結合自由エネルギーの算出方法および鎖ハイブリダイゼーションに対するかかる値の効果は、本技術分野において公知である。
【０２１８】
多種多様な送達系が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの標的細胞への本発明のｓｉＲＮＡの送達における使用のために利用可能である。本発明のｓｉＲＮＡは、直接的または間接的に、ＧＯＬＰＨ３阻害が望まれる細胞に導入され得る。ｓｉＲＮＡは、直接、細胞に、例えば注射によって導入され得る。したがって、ＧＯＬＰＨ３を阻害するのに有効なｓｉＲＮＡを含む組成物を、注射用投与単位形態で提供することが、本発明の目的である。本発明のｓｉＲＮＡは、本発明の方法および組成物と併用した治療的使用のため、一例として静脈内注射または皮下注射され得る。かかる治療は、所望の組織中におけるＧＯＬＰＨ３発現を阻害するのに治療的に有効なレベルが達成されるまでの間欠投与または連続投与を含むことができる。
【０２１９】
間接的には、ｓｉＲＮＡをコードする１つの発現可能なＤＮＡ配列または複数の発現可能なＤＮＡ配列を細胞に導入し、その後、ｓｉＲＮＡを１つのＤＮＡ配列または複数のＤＮＡ配列から転写することができる。故に、ＧＯＬＰＨ３発現を阻害するのに有効なｓｉＲＮＡをコードする１つのＤＮＡ配列または複数のＤＮＡ配列を含む組成物を提供することが、本発明の目的である。
【０２２０】
本発明のＤＮＡ組成物は、ＧＯＬＰＨ３のセンス配列を含む第１のＲＮＡ配列をコードする第１のＤＮＡ配列と、ＧＯＬＰＨ３のセンス配列の逆相補物を含む第２のＲＮＡ配列をコードする第２のＤＮＡ配列とを含む。第１および第２のＲＮＡ配列は、ハイブリダイズさせると、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体を形成し得るｓｉＲＮＡデュプレックスを形成し、このＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体は、ＧＯＬＰＨ３発現の阻害することができる。第１および第２のＤＮＡ配列は、化学合成され得るか、またはＧＯＬＰＨ３に対する適切なプライマーを使用してＰＣＲによって合成され得る。別の場合、ＤＮＡ配列は、本技術分野において周知のクローニング技術を使用して組換え操作によって得られ得る。得られたら、ＤＮＡ配列を精製し、組み合わせ、次いでＧＯＬＰＨ３阻害が望まれる細胞に導入することができる。別の場合、前記配列を単一のベクターまたは別々のベクター内に含め、前記１つのベクターまたは複数のベクターを、ＧＯＬＰＨ３阻害が望まれる細胞に導入することができる。
【０２２１】
標的細胞への本発明のＤＮＡ組成物の送達における使用のために利用可能な送達系としては、例えば、ウイルス系および非ウイルス系が挙げられる。適切なウイルス系の例としては、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルスベクター、ワクシニア、単純ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、マウス微小ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびインフルエンザウイルスが挙げられる。また、例えば、非複合体型ＤＮＡ、ＤＮＡ−リポソーム複合体、ＤＮＡ−タンパク質複合体およびＤＮＡコート金粒子、サルモネラ菌等の細菌ベクター、ならびに他の技術、例えば、ＶＰ２２輸送タンパク質、Ｃｏ−Ｘ−遺伝子およびレプリコンベクターを伴うものを使用して、非ウイルス送達系を使用することもできる。本発明の文脈におけるウイルスベクターまたは非ウイルスベクターは、対象となる抗原を発現することができる。
【０２２２】
２．アンチセンス技術
別の一実施形態において、被験体またはその組織もしくは細胞におけるアンチセンス分子の投与または発現によってＧＯＬＰＨ３のレベルを低下または減少させる。
【０２２３】
三重螺旋形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通じて遺伝子発現を制御することができ、それらの両方の方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。ＧＯＬＰＨ３をコードする核酸分子に対して相補的なアンチセンス核酸分子は、ＧＯＬＰＨ３をコードする単離された核酸分子に基づいて設計され得る。アンチセンス核酸分子は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋの塩基対合の法則に従って構築される例えばｍＲＮＡ配列に対して相補的な核酸のコード鎖に対して相補的なヌクレオチド配列を含むことができ、核酸のコード鎖に水素結合することができる。ｍＲＮＡの配列に対して相補的なアンチセンス配列は、ｍＲＮＡのコード領域中における配列に対して相補的であることができるか、またはｍＲＮＡの５’もしくは３’非翻訳領域に対して相補的であることができる。更に、アンチセンス核酸は、配列中において、ｍＲＮＡをコードする遺伝子の調節領域、例えば転写開始配列または調節エレメントに対して相補的であることができる。一実施形態において、開始コドンに先行する領域もしくはそれにまたがる領域に対して、またはｍＲＮＡの３’非翻訳領域において相補的なアンチセンス核酸が使用される。アンチセンス核酸は、ＧＯＬＰＨ３のヌクレオチド配列に基づいて設計され得る。示された核酸のコード領域または非翻訳領域の配列に対して相補的な配列を有する核酸が設計される。別の場合、本発明の単離された核酸を有するゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができるＧＯＬＰＨ３遺伝子の配列に基づいてアンチセンス核酸を設計することができる。例えば、重要な調節エレメントの配列を標準技術によって決定することができ、調節エレメントに対してアンチセンスな配列を設計することができる。
【０２２４】
本発明のアンチセンス核酸およびオリゴヌクレオチドは、本技術分野において公知の手法を使用して、化学合成および酵素ライゲーション反応を使用して構築され得る。アンチセンス核酸またはオリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加させるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間において形成されたデュプレックスの物理的安定性を増加させるように設計された様々に修飾されたヌクレオチドを使用して化学的に合成され得る。例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。別の場合、アンチセンス核酸およびオリゴヌクレオチドは、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされた発現ベクターを使用して生物学的に産生され得る（すなわち、挿入された核酸から転写された核酸は、対象となる標的核酸に対してアンチセンス方向となる）。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形で細胞に導入され、それらの中でアンチセンス核酸が高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の考察については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，  Ｈ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｒｅｖｉｅｗｓ−−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１巻（１号）１９８６年を参照すること。
【０２２５】
更に、リボザイムを使用して、ＧＯＬＰＨ３のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を阻害することができる。例えば、本発明の核酸を更に使用して、ＧＯＬＰＨ３  ｍＲＮＡ転写物等、ＧＯＬＰＨ３タンパク質をコードする一本鎖核酸を切断することができるリボザイムを設計することができる。本発明の核酸の配列に基づくＧＯＬＰＨ３をコードするｍＲＮＡに対する特異性を有するリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ（リボザイム）を設計することができる。例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体を構築することができ、ここで、活性部位の塩基配列は、ＧＯＬＰＨ３をコードするｍＲＮＡにおいて切断されるべき塩基配列に対して相補的である（例えばＣｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号、Ｃｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号参照）。別の場合、本発明の核酸を使用して、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択することができる（例えば、ＢａｒｔｅｌおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１巻、１４１１〜１４１８頁参照）。ＲＮＡ媒介干渉（ＲＮＡｉ）（Ｆｉｒｅら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１巻、８０６〜８１１頁）を使用することもできる。
【０２２６】
３．ＧＯＬＰＨ３遮断抗体またはアプタマー
更に別の実施形態において、被験体またはその細胞もしくは組織におけるＧＯＬＰＨ３遮断抗体またはアプタマーの投与または発現によってＧＯＬＰＨ３レベルを低下させる。
【０２２７】
抗体、またはそれらの同等物および誘導体、例えば細胞内抗体または他のＧＯＬＰＨ３アンタゴニストは、癌の治療または予防のために本発明に従って使用され得る。適切な用量の抗体またはアンタゴニストの投与は、タンパク質の活性を遮断する役目をすることができ、これは、悪性腫瘍を治療するための重要な時間窓を提供することができる。
【０２２８】
治療方法は、抗体への適切な毒素の給合を含み、次いで、前記抗体は、腫瘍の領域を標的とする。かかる毒素は、本技術分野において周知であり、毒性の放射性同位体、重金属、酵素および相補的活性剤、ならびに細胞１個当たり１個または２個の分子のみのレベルで作用し得るリシン等の天然毒素を含むことができる。例えば癌を治療するために使用され得る局所化された用量の適切な生理学的に活性の化合物を送達するためにかかる技術を使用することも可能であり得る。
【０２２９】
ＧＯＬＰＨ３を阻害するために抗体を使用することの他に、他の形の阻害剤を使用することも可能であり得る。例えば、ＧＯＬＰＨ３を機能的に阻害するアンタゴニストを同定することが可能であり得る。更に、標的タンパク質へのＧＯＬＰＨ３の結合に干渉することも可能であり得る。他の適切な阻害剤は、当業者に明らかである。
【０２３０】
抗体（または他の阻害剤もしくは細胞内抗体）は、多くの方法によって投与され得る。参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ  ＷＯ９４／０２６１０においてＭａｒａｓｃｏおよびＨａｓｅｌｔｉｎｅによって１つの方法が記載されている。この方法は、抗体をコードする遺伝子の細胞内送達を開示するものである。一実施形態において、一本鎖抗体をコードする遺伝子が使用される。別の一実施形態において、抗体は、核局在化配列（例えば、ＳＶ４０核局在化シグナル）を含む。この方法によって、所望の細胞中において機能するＧＯＬＰＨ３を遮断することができる抗体を細胞内に発現することができる。
【０２３１】
本発明が例えば患者への抗体の投与を提供する場合、これは、任意の適切な経路によるものであってもよい。腫瘍が局所化されていると依然として考えられるまたは診断される場合、適切な投与方法は、その部位に直接的な注射によるものであってもよい。投与は、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射および皮内注射等の注射によるものであってもよい。
【０２３２】
アプタマーは、米国特許第５，２７０，１６３号およびＷＯ９１／１９８１３において開示されている方法を使用して作製され得る。
【０２３３】
４．他のＧＯＬＰＨ３阻害剤
ＧＯＬＰＨ３の活性を阻害する化合物を使用することもできる。かかる化合物としては、小分子、例えば、タンパク質の活性部位または結合部位、例えばＲＮＡ結合部位と相互作用する分子が挙げられる。かかる化合物は、本技術分野において公知の方法に従って同定され得る。
【０２３４】
Ｅ．医薬製剤
製剤は、投与経路にとって適切なあらゆるものであってよく、当業者に明らかである。製剤は、生理食塩水等の適切な担体を含んでもよく、増量剤、他の医薬調製物、アジュバントおよび他のあらゆる適切な医薬成分を含んでもよい。カテーテルは、別の投与様式を構成する。
【０２３５】
「薬学的に受容可能な」という用語は、過度の毒性なしで哺乳動物に投与され得る化合物および組成物を指す。例示的な薬学的に受容可能な塩としては、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等、および有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等が挙げられる。
【０２３６】
本発明の抗体、核酸またはアンタゴニストは、経口的に、局所的に、または皮下および筋肉内注射、持続的放出デポー製剤の注入、静脈内注射、鼻腔内投与等を含む非経口手段によって投与され得る。したがって、本発明の抗体または核酸は、薬学的に受容可能な担体と組み合わせて本発明の抗体または核酸を含む医薬組成物として投与され得る。かかる組成物は、水溶液、エマルジョン、クリーム、軟膏、懸濁液、ゲル、リポソーム懸濁液等であってもよい。適切な担体（賦形剤）としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ならびにエタノール、グルコース、スクロース、デキストラン、マンノース、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩、酢酸塩、ゼラチン、コラーゲン、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）の溶液、植物油等が挙げられる。１つは、適切な保存剤、安定剤、抗酸化剤、抗菌剤、および緩衝剤、例えば、ＢＨＡ、ＢＨＴ、クエン酸、アスコルビン酸、テトラサイクリン等を更に含むことができる。製剤中において有用なクリームまたは軟膏の基剤としては、ラノリン、Ｓｉｌｖａｄｅｎｅ（登録商標）（Ｍａｒｉｏｎ）、Ａｑｕａｐｈｏｒ（登録商標）（Ｄｕｋｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）等が挙げられる。他の局所製剤としては、エアゾル剤、バンデージおよび他の創傷被覆材が挙げられる。別の場合、１つは、適切なポリマーマトリックスまたは膜内に化合物を組み込むことができるかまたはカプセル化することが可能であり、したがって、局所的に治療すべき部位近傍での注入に適切な徐放性送達デバイスが提供される。他のデバイスとしては、留置カテーテルおよびデバイス、例えばＡｌｚｅｔ（登録商標）ミニポンプが挙げられる。眼用調製物は、Ｓｏｒｂｉ−ｃａｒｅ（登録商標）（Ａｌｌｅｒｇａｎ）、Ｎｅｏｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ，Ｓｈａｒｐ  ＆  Ｄｏｈｍｅ）、Ｌａｃｒｉｌｕｂｅ（登録商標）等の商業的に入手可能なビヒクルを使用して製剤化され得るか、または参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，１２４，１５５号において記載されているもの等の局所調製物を用いることができる。更に、１つは、アンタゴニストを、固体形態で、とりわけ凍結乾燥粉末として提供することができる。凍結乾燥製剤は、典型的には、安定化剤および増量剤、例えば、ヒト血清アルブミン、スクロース、マンニトール等を含有する。薬学的に受容可能な賦形剤の綿密な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．）において入手可能である。
【０２３７】
任意の特定の障害を治療するために必要とされる抗体、核酸または阻害剤の量は、もちろん、障害の性質および重症度、被験体の年齢および状態、ならびに当業者によって容易に決定される他の因子に応じて変化する。
【０２３８】
１．免疫療法
更なる態様において、本発明は、患者における癌の免疫療法のためのＧＯＬＰＨ３またはその免疫反応性ポリペプチド（または前記タンパク質もしくはポリペプチドをコードするＤＮＡ）を使用する方法を提供するものである。本明細書において使用される場合、「患者」は、あらゆる温血動物、好ましくはヒトを指す。患者は、疾患に罹患していてもよく、または検出可能な疾患がなくてもよい。したがって、ＧＯＬＰＨ３またはその免疫反応性ポリペプチドは、癌を治療するために、または癌の発生を阻害するために使用され得る。
【０２３９】
この方法によれば、タンパク質、ポリペプチドまたはＤＮＡは、一般に医薬組成物および／またはワクチンの中に存在する。医薬組成物は、完全長タンパク質または１種もしくは複数種の免疫原性ポリペプチドおよび生理学的に許容し得る担体を含むことができる。ワクチンは、完全長タンパク質または１種もしくは複数種の免疫原性ポリペプチドおよび非特異的免疫応答エンハンサー、例えば、アジュバント、生分解性マイクロスフェア（ＰＬＧ）またはリポソーム（ポリペプチドが組み込まれる）を含むことができる。
【０２４０】
別の場合、医薬組成物またはワクチンは、完全長タンパク質またはポリペプチドはインサイチュで生成されるように、ＧＯＬＰＨ３またはその免疫原性ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有することができる。かかる医薬組成物およびワクチンにおいて、ＤＮＡは、核酸発現系、細菌およびウイルス発現系を含む、当業者に公知の種々の送達系の内のいずれかの中に存在することができる。適切な核酸発現系は、患者における発現に必要なＤＮＡ配列（例えば、適切なプロモーター）を含む。細菌性送達系は、その細胞表面上における乳房細胞抗原のエピトープを発現する細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）の投与を含む。一実施形態において、非病原性（欠損）の複製コンピテントウイルスの使用を含み得るウイルス発現系（例えば、ワクシニアもしくは他のポックスウイルス、レトロウイルスまたはアデノウイルス）を使用してＤＮＡを導入することができる。適切な系は、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、ＰＮＡＳ  ８６巻：３１７〜３２１頁、１９８９年、Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５６９巻：８６〜１０３頁、１９８９年、Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ８巻：１７〜２１頁、１９９０年、米国特許第４，６０３，１１２号、米国特許第４，７６９，３３０号および米国特許第５，０１７，４８７号、ＷＯ８９／０１９７３、米国特許第４，７７７，１２７号、ＧＢ２，２００，６５１、ＥＰ０，３４５，２４２、ＷＯ９１／０２８０５、Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６巻：６１６〜６２７頁、１９８８年、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２巻：４３１〜４３４頁、１９９１年、Ｋｏｌｌｓら、ＰＮＡＳ  ９１巻：２１５〜２１９頁、１９９４年、Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、ＰＮＡＳ  ９０巻：１１４９８〜１１５０２頁、１９９３年、Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８８巻：２８３８〜２８４８頁、１９９３年、ならびにＧｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．  Ｒｅｓ．  ７３巻：１２０２〜１２０７頁、１９９３年において開示されている。かかる発現系にＤＮＡを組み込むための技術は、当業者に周知である。また、ＤＮＡは、例えば、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９０／１１０９２およびＣｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９巻：１６９１〜１６９２頁（１９９３年）によってレビューされたＵｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９巻：１７４５〜１７４９頁（１９９３年）において記載されているように、「裸」であってもよい。
【０２４１】
投与の経路および頻度、ならびに投与量は、個体間で変化し、他の疾患の免疫療法において現在使用されているものと類似していてもよい。一般に、医薬組成物およびワクチンは、注射によって（例えば、皮内、筋肉内、静脈内または皮下）、鼻腔内で（例えば、吸引によって）または経口で投与され得る。１〜１０用量を３〜２４週間にわたって投与することができる。一実施形態において、３ヵ月間隔で４用量を投与し、その後、追加免疫投与を定期的に行うことができる。代替のプロトコールが個々の患者に適切であり得る。適切な用量は、治療された患者における腫瘍細胞、例えば腎臓腫瘍細胞に対する免疫応答（細胞性および／または体液性）を高めるのに効果的なポリペプチドまたはＤＮＡの量である。適切な免疫応答は、基底（すなわち未治療）レベルを少なくとも１０〜５０％上回る。一般に、１用量に存在する（または１用量のＤＮＡによってインサイチュで産生される）ポリペプチドの量は、宿主１ｋｇ当たり約１ｐｇ〜約１００ｍｇ、約１０ｐｇ〜約１ｍｇ、または約１００ｐｇ〜約１μｇの範囲にわたる。適切な用量サイズは、患者のサイズと共に変化するが、典型的には、約０．０１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲にわたる。
【０２４２】
ＧＯＬＰＨ３またはその免疫原性ポリペプチドは、細胞に基づく免疫療法、すなわちＧＯＬＰＨ３による樹状細胞の刺激、またはＧＯＬＰＨ３を発現している細胞との融合において使用され得る。修飾された樹状細胞は、一旦患者に注射されると、細胞ワクチンであり、ここで前記樹状細胞は、ＧＯＬＰＨ３を発現している癌に対する免疫応答を活性化させる。
【０２４３】
当業者に公知のいかなる適切な担体も本発明の医薬組成物において用いることができるが、担体の型は、投与様式に応じて変化する。皮下注射等の非経口投与のために、担体は、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ロウおよび／または緩衝液を含むことができる。経口投与のために、上記の担体または固体担体、例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロースおよび／または炭酸マグネシウムの内のいずれかを用いることができる。また、生分解性マイクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド（ｐｏｌｙｌｅｐｔｉｃ  ｇａｌａｃｔｉｄｅ））を本発明の医薬組成物のための担体として用いることもできる。適切な生分解性マイクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号および米国特許第５，０７５，１０９号において開示されている。
【０２４４】
本発明のワクチンにおいて、種々の非特異的免疫応答エンハンサーの内のいずれを用いることができる。例えば、アジュバントが含まれ得る。ほとんどのアジュバントは、迅速な異化作用から抗原を保護するように設計された物質、例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油、および免疫応答の非特異的刺激物質、例えば、リピドＡ、Ｂｏｒｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む。かかるアジュバントは、例えば、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＡｄｊｕｖａｎｔおよびＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈ．）ならびにＭｅｒｃｋ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）として商業的に入手可能である。
【０２４５】
本発明は、限定するものとして解釈されるべきでない以下の実施例によって更に示される。本出願の全体にわたって引用される全ての参照、特許および公開された特許出願の内容、ならびに図は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２４６】
（実施例１）
実施例２〜９で使用した材料および方法
Ａ．細胞株
全ての細胞株を、１０％の熱不活化牛胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で、加湿雰囲気下で３７℃および５％のＣＯ２で増殖させた。ＣＲＬ−５８８９、ＳＫ−ＭＥＬ−５、１２０５ＬＵ、Ａ５４９、および２９３Ｔはアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。ＭＡＬＭＥ−３Ｍは、米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の癌の治療と診断部門（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）のＮＣＩ細胞株パネル（ＮＣＩ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｐａｎｅｌ）より入手した。Ｓｂｃｌ２、ＷＭ２３９Ａ、およびｈＴＥＲＴ／ＣＤＫ４（Ｒ２４Ｃ）／ｐ５３ＤＤ／ＢＲＡＦＶ６００Ｅメラニン細胞（ＨＭＥＬ）はこれまでに記載されている（Ｓａｔｙａｍｏｏｒｔｈｙら（１９９７年）Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ  ７、補遺２：Ｓ３５からＳ４２頁；Ｇａｒｒａｗａｙら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  ４３６：１１７〜１２２頁）。
【０２４７】
Ｂ．プラスミド、レトロウイルス形質導入、およびｓｉＲＮＡトランスフェクション
レトロウイルスＨＡ−ＧＯＬＰＨ３発現構築物ｐＢＡＢＥ−ＨＡ−ＧＯＬＰＨ３を、ＰＣＲによって生成したＧＯＬＰＨ３  ＯＲＦ（ＮＭ＿０２２１３０）をｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏ−ＨＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ）にサブクローニングすることにより構築した。ＧＯＬＰＨ３に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ＃３）に耐性となるように変異させたヌクレオチド配列を持つ野生型ＧＯＬＰＨ３タンパク質をコードするＧＯＬＰＨ３  ｓｉＲＮＡ耐性構築物ｐＢＡＢＥ−ＨＡ−ＧＯＬＰＨ３（ｓｉＲｅｓ）を、以下のプライマーを使用したｐＢＡＢＥ−ＨＡ−ＧＯＬＰＨ３ベクターの部位特異的突然変異誘発により構築した：
【０２４８】
【化３】
2012504426.tif 000005
ｐＥＦ−Ｄｅｓｔ５１−ＧＯＬＰＨ３、ｐＬｅｎｔｉ４／ＴＯ／Ｖ５−ＤＥＳＴ−ＧＯＬＰＨ３、およびｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５／ＤＥＳＴ−ＶＰＳ３５を、製造業者によるプロトコールに従い、ｐＤＯＮＲ２２３−ＧＯＬＰＨ３およびｐＤＯＮＲ２２３−ＶＰＳ３５エントリークローン（ＣＣＳＢ、ＤＦＣＩ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を使用した、それぞれ、ｐＥＦ−Ｄｅｓｔ５１、ｐＬｅｎｔｉ４／ＴＯ／Ｖ５−ＤＥＳＴ、およびｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５／ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのＧａｔｅｗａｙ組換えクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により構築した。酵母餌構築物ｐＧＢＫＴ７−ＧＯＬＰＨ３を、ｐＢＡＢＥ−ＨＡ−ＧＯＬＰＨ３からｐＧＢＫＴ７  餌ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にＧＯＬＰＨ３断片を挿入することにより構築した。ｔｅｔ誘導性ＧＯＬＰＨ３細胞株ＨＭＥＬ−ｔｅｔ−ＧＯＬＰＨ３を、製造業者によるプロトコールに従い、Ｔ−Ｒｅｘレンチウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とｐＬｅｎｔｉ４／ＴＯ／Ｖ５−ＤＥＳＴ−ＧＯＬＰＨ３を使用して作製した。レンチウイルスとレトロウイルスは、上記ベクターバックボーンと標準的なウイルスパッケージングシステムを２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトし、その後、ウイルス上清を収集することにより調製した。過剰発現実験は全て、新しく形質導入した安定な細胞株を用いて行った。全てのアッセイについて、ＨＭＥＬ−ｔｅｔ−ＧＯＬＰＨ３では、ＧＯＬＰＨ３の発現を、４８時間にわたる２μｇ／ｍｌのドキシサイクリンの添加により刺激した。
【０２４９】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）実験のために、細胞を、製造業者によるプロトコールに従い、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた時点で８０％のコンフルエンスに達するように播種した。トランスフェクションは、Ｂｌｏｃｋ−Ｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、あるいは、ＧＯＬＰＨ３標的化ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）（ｓｉＧＯＬＰＨ３と称する：ｓｉＲＮＡプール、Ｍ−００６４１４−００；ｓｉ＃１、Ｄ−００６４１４−０１、ｓｉ＃２、Ｄ−００６４１４−０２、ｓｉ＃３、Ｄ−００６４１４−０３；ｓｉ＃４、Ｄ−００６４１４−０４）、ＳＵＢ１（ｓｉＳＵＢ１と称する：ｓｉＲＮＡプール、Ｍ−００９８１５−００）、あるいは非標的化対照（ｓｉＮＴと称する：Ｄ−００１２１０−０２−２０）を用いて行った。全てのアッセイについて、細胞を集菌前に４８〜７２時間インキュベートした。他に指定のない限り、ＧＯＬＰＨ３ノックダウン実験は、ｓｉＲＮＡ  ＃３を使用して行った。軟寒天コロニー形成のために、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に細胞をプレートした。
【０２５０】
Ｃ．交差腫瘍ａＣＧＨおよび発現分析
悪性黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、および結腸腺癌（ＣＲＣ）の交差腫瘍ａＣＧＨ分析を、以前にＧＥＯに提出された黒色腫およびＣＲＣのデータ（それぞれ、受託番号ＧＳＥ７６０６およびＧＳＥ７６０４）を使用して記載されたとおりに行った（Ｍａｓｅｒら（２００７年）Ｎａｔｕｒｅ  ４４７：９６６〜９７１頁）。ＮＳＣＬＣデータセットは以前に記載されており（Ｔｏｎｏｎら（２００５年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  １０２巻：９６２５〜９６３０頁）、ｇｅｎｏｍｉｃ．  ｄｆｃｉ．  ｈａｒｖａｒｄ．  ｅｄｕでワールドワイドウェブ上で見ることができる。アレイ−ＣＧＨプロファイルで同定された５ｐ１３の増幅の数は以下のとおりであった：黒色腫、８８個の腫瘍プロファイル中に６個存在した（２つの病巣）；非小細胞肺癌、６７個のプロファイル（１５個の細胞株と５２個の腫瘍）中に１８個存在した（１つの病巣）；および結腸直腸癌、８１個のプロファイル（３８個の細胞株と４３個の腫瘍）中に４個存在した。図１Ｃに示した代表的な５ｐ１３含有腫瘍検体Ｃ２７について、Ｙ軸は参考試料（プールした正常なヒトＤＮＡ）と比較したｌｏｇ２比であり、Ｘ軸は第５染色体上の位置を示す。ＭＣＲ常在性遺伝子の発現分析のために、アレイ−ＣＧＨプロファイルが添えられたＮＳＣＬＣ発現データを分析した。アレイ−ＣＧＨ  ２２ＫプロファイルとＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧＵ１３３ｐｌｕｓ２プロファイルの両方を有した入手できた４２個の試料のうち、１４個の試料には５ｐ１３増幅事象が含まれていた。（増幅があったか、または増幅がなかった）２つのグループによる各遺伝子の発現値（同じ遺伝子についての複数のプローブによる値を平均した）を２標本ｔ検定により比較し、有意水準をボンフェローニ補正により調整した。
【０２５１】
Ｄ．ＴＭＡ−ＦＩＳＨ
以下の組織マイクロアレイを、Ｃｙｂｒｄｉ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）から購入した：ＣＣ０４−０１−００４肺癌、ＣＣ１１−１１−００５卵巣癌、ＣＣ０８−０１−００２乳癌、ＣＣ０５−２１−００１結腸腺癌、ＣＣ０３−０１−００３肝癌、およびＣＣ１９−１１−００７前立腺癌。多発性骨髄腫の組織マイクロアレイは、ＴｒｉＳｔａｒ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）によるものであった。ＰＡ８０２膵臓癌およびＭＥ１００１黒色腫の組織マイクロアレイは、ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘによるものであった。蛍光インサイチュハイブリダイゼーションを以下の標準的なプロトコールに従って準備した。ＢＡＣ  ＲＰ１１−４３７Ｐ１５を利用して、第５染色体上の３２ＭＢ（５ｐ１３）にある獲得領域に印をつけた。セントロメア特異的ＣＥＰ１プローブ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を倍数性の参考とした。ＦＩＳＨシグナルの評価と取得は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇにより開発されたフィルターセットとソフトウェアを使用して手入力で行った。１．５より大きい参考に対するシグナルの比を獲得と見なした。２．５以上の比を高い増幅レベルと見なした。
【０２５２】
Ｅ．ＴＭＡ−ＩＨＣおよび自動定量分析（ＡＱＵＡ（登録商標））
アレイをキシレンで脱パラフィンし、再水和させ、クエン酸緩衝液（ｐＨ＝６）中で２０分間、圧力鍋で処理することにより抗原賦活化させた。スライドを、０．１Ｍのトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ、ｐＨ＝８）中で０．３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共に、室温で３０分間プレインキュベートした。その後、肺癌ＴＭＡを、ＢＳＡ／ＴＢＳ中で１：２００に希釈したｍＴＯＲ一次抗体（ウサギモノクローナル、クローン７Ｃ１０、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と１：１００に希釈したマウスモノクローナル抗ヒトサイトケラチン抗体（クローンＡＥ１／ＡＥ３、Ｍ３５１５、Ｄａｋｏ）、またはＢＳＡ／ＴＢＳ中に１：２００に希釈したｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ６ＫＴｈｒ３８９一次抗体（マウスモノクローナル、クローン１Ａ５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と、１：１００に希釈した広域スペクトルウサギ抗ウシサイトケラチン抗体（Ｚ０６２２、Ｄａｋｏ）のいずれかの混合物と共に一晩インキュベートした。黒色腫のコホートについては、ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中でいずれも１：１００に希釈したマウスモノクローナルＳ１００抗体（１５Ｅ２Ｅ２、ＢｏＧｅｎｅｘ）およびウサギポリクローナルＳ１００抗体（Ｚ０３１１、Ｄａｋｏ）を、それぞれマウスおよびウサギのサイトケラチンの代わりに使用した。これに続いて、ｍＴＯＲおよびｐｈｏｓｐｈｏ  Ｓ６Ｋのそれぞれについて、ウサギＥｎＶｉｓｉｏｎ試薬（Ｋ４００３、Ｄａｋｏ）中に１：１００に希釈したＡｌｅｘａ５４６−結合ヤギ抗マウス二次抗体（Ａ１１００３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とマウスＥｎＶｉｓｉｏｎ試薬（Ｋ４００１、Ｄａｋｏ）中で１：１００に希釈したＡｌｅｘａ  ５４６結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ａ１１０１０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共に１時間のインキュベートした。１：５０希釈でチラミド（ＦＰ１１１７、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に直接結合させたシアニン５（Ｃｙ５）を、標的検出のための蛍光クロマジェンとして使用した。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含有するＰｒｏｌｏｎｇ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ培地（ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ、Ｐ３６９３１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を利用して、組織核を同定した。３０の肺癌検体から成るより小さいＴＭＡの連続切片（ＮＳＣＬＣ「試験」アレイ）をいずれのコホートとも別に染色して、アッセイの再現性を確認した。製造業者により示されているように、Ｈ１２９９細胞とＡ４３１細胞を陽性対照として利用した。一次抗体を含めなかった陰性対照切片を、各免疫染色の実施のために使用した。
【０２５３】
自動定量分析（ＡＱＵＡ（登録商標））は、Ｃａｍｐら（２００２年）Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．８巻、１３２３〜１３２７頁に記載されているように、細胞内区画でのタンパク質濃度の正確な測定が可能である。簡単に説明すると、一連の高解像度単色Ｘ線画像をＰＭ−２０００顕微鏡により撮った。各ヒストスポットについて、ピントが合っている画像とピントが合っていない画像を、ＤＡＰＩ、サイトケラチンおよびＳ１００−Ａｌｅｘａ５４６（それぞれ、肺癌および黒色腫について）、ならびにｍＴＯＲ／ｐｈｏｓｐｈｏ  Ｓ６Ｋ−Ｃｙ５チャネルによるシグナルを使用して得た。ｍＴＯＲおよびｐｈｏｓｐｈｏ  Ｓ６Ｋは、組織の自己蛍光を最少にするために、６２０ｎｍを上回る最大発光波長を持つチャネルを使用して測定した。腫瘍を、肺癌および黒色腫の検体について、それぞれ、サイトケラチンおよびＳ１００シグナルから腫瘍「マスク」を作製することにより、間質成分および非間質成分と区別した。これにより、ヒストスポットの目視検査により設定された強度閾値に基づくバイナリーマスク（各画素は、「オン」または「オフ」のいずれかである）を作製した。各細胞内区画中の目的のタンパク質のＡＱＵＡ（登録商標）スコアを、特定の区画の面積でシグナル強度（０〜２５５の目盛で採点した）を割り算することにより計算した。スポットあたりの腫瘍面積が５％未満である検体は、対応する腫瘍検体の典型ではないので、自動定量分析に含めなかった。
【０２５４】
統計分析のために、ピアソン相関係数（Ｒ）を利用して、対数で正規化したｍＴＯＲスコアとｐＳ６Ｋ  ＡＱＵＡ（登録商標）スコアとの間での相関関係、ならびに、ＮＳＣＬＣ「試験」アレイの連続切片上の同じコアを評価した。アレイ間での再現性の評価によっては、ＮＳＣＬＣ「試験」アレイの連続切片間での有意差は明らかにはならなかった（ピアソン相関係数Ｒ＝０．９５、ｐ＜０．０００１）。ｍＴＯＲおよびｐＳ６Ｋについて、核での発現に対する細胞質での発現の比を計算して、グループ間での個々のばらつきを正規化し、ＧＯＬＰＨ３遺伝子のコピー数に対して比較した。ｍＴＯＲ、ｐＳ６Ｋ  ＡＱＵＡ（登録商標）スコアと、ＧＯＬＰＨ３遺伝子のコピー数（５ｐ１３  ＦＩＳＨにより決定した）および臨床病理学的パラメーター（年齢、性別、組織型、および腫瘍分化度）との間での関係を、スピアマン順位検定を利用して分析した。ＧＯＬＰＨ３コピー数の状態はまた、ＦＩＳＨシグナルに基づき、正常（１．５未満）と獲得（１．５以上）として２値化し、ピアソン相関関係を使用する他の全てのパラメーターと不連続変数として相関させた。
【０２５５】
Ｆ．定量的ＰＣＲおよびコピー数
ゲノムＤＮＡを、複数の細胞株および黒色腫から、Ｗｉｚａｒｄキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて調製し、全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。ＤＮＡのコピー数と相対的発現レベルを、製造業者によるプロトコールに従って、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｑｉａｇｅｎ）検出化学反応とＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭＸ３０００ｐ検出システムを使用してリアルタイムＰＣＲにより決定した。比較サイクル閾値法を使用して、試料中の標的遺伝子またはｍＲＮＡのコピー数を定量化した。遺伝子のコピー数の定量化のために、腫瘍ＤＮＡ中のコピー数を、正常なヒトの対照ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中のコピー数と比較した。ＤＮＡコピー数の正規化のための参考は、Ｌｉｎｅ−１  ＤＮＡのコピー数であった。図１Ｄに示したゲノムｑＰＣＲによる染色体５ｐ１３アンプリコン境界の画定のために、試料には、腫瘍検体Ｃ２７（原発性黒色腫、赤）、Ｃ１（原発性黒色腫、青）、ＣＲＬ−５８８９（ＮＳＣＬＣ細胞株、緑）、およびＳｂｃｌ２（黒色腫細胞株、黄）を含む。
【０２５６】
Ｇ．足場非依存性増殖
軟寒天アッセイを、６ウェルプレート上で３連で行った。各ウェルについて、１×１０４細胞を、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中に０．４％のＳｅａＫｅｍ  ＬＥアガロース（Ｆｉｓｈｅｒ）を含有する細胞増殖培地中に完全に混合し、続いて、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中の０．６５％アガロースを用いて調製した下層アガロース上にプレートした。各ウェルを固化させ、続いてこれを１ｍｌのＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで覆い、１ｍｌのＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳは４日毎に新しいものに交換した。コロニーを０．０５％（ｗｔ／ｖｏｌ）塩化ヨードニトロテトラゾリウム（Ｓｉｇｍａ）で染色し、フラットベッドスキャナを使用して１２００ｄｐｉでスキャンし、続いてカウントし、Ｐｒｉｓｍ  ４（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して両側ｔ検定で計算した。
【０２５７】
Ｈ．増殖アッセイ
増殖アッセイを、１ウェルあたり７×１０３（Ａ５４９）または１×１０４（ＣＲＬ−５８８９および１２０５ＬＵ）細胞を使用して、１２ウェルプレート上で３連で行った。細胞を、ＰＢＳ中の１０％ホルマリン中に固定し、細胞接着後に開始して（Ｔ０）、２４時間ずつクリスタルバイオレットで染色した。このアッセイの終わりに、クリスタルバイオレットを１０％酢酸を使用して抽出し、５９５ｎｍ（ＡＢＳ５９５）での吸光度を測定し、評価した。
【０２５８】
Ｉ．病巣形成アッセイ
Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ欠損初代ＭＥＦを、トランスフェクションの１６時間前に、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中に８×１０５細胞／１０ｃｍの密度でプレートした。ＲＡＳ協働（ＲＡＳ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ）のために、１．５ｕｇのＨＲＡＳＶ１２ベクターを、６．５ｕｇのｐＥＦ−Ｄｅｓｔ５１−ＬａｃＺ対照ベクターＭＹＣまたはｐＤｅｓｔ５１−ＧＯＬＰＨ３と共に、製造業者の説明書に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して同時トランスフェクトした。トランスフェクトしたＤＮＡの全量は、ｐＤｅｓｔ５１−ＬａｃＺを使用して７．５ｕｇで一定に保ち、トランスフェクションは２連で３回行った。トランスフェクション後４８時間で、各トランスフェクトした１０ｃｍプレートを３枚の１０ｃｍプレートに等しく分け、１０日間、その間に培地を２回新しいものと交換してインキュベートした。細胞を洗浄し、１０％ホルマリン中に固定し、病巣の定量化のためにギムザ液（Ｓｉｇｍａ）で、室温で１０分間染色した。両側ｔ検定による計算をＰｒｉｓｍ  ４（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して行った。
【０２５９】
Ｊ．酵母ツーハイブリッド相互作用スクリーニング
形質転換前のヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、製造業者の説明書に従ってＡＨ１０９酵母レポーター株とＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してスクリーニングした（１×１０６個のクローン）。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＤＨ５αへの形質転換後、可能性がある１１９個の陽性クローンからプラスミドＤＮＡを単離し、続いて、添付の餌食ベクター特異的プライマーを使用してＤＮＡをシーケンシングした。参照配列決定データを、１１８個のクローンのうちの１０２個について得た。そのうちの４４個は、部分的なコード配列〜全長のコード配列を含んでおり、これらについて更に下流の分析をしようと考えた。ＧＯＬＰＨ３依存性を、ベクターを選択せずに陽性クローンをシリアルロス（ｓｅｒｉａｌ  ｌｏｓｓ）継代培養し、続いて、ＶＰＳ３５発現ＡＨ１０９細胞をＳＣ−ＬＴに（ＧＯＬＰＨ３  餌ベクターを含まないことを確認するため）、およびＳＣ−Ｌ−Ｈ−Ａ＋ＸαＧＡＬに（レポーターが活性化されていないことを確認するため）レプリカプレートすることにより評価した。
【０２６０】
Ｋ．異種移植実験
空ベクターまたはＨＡ−ＧＯＬＰＨ３レトロウイルス（ｐＢＡＢＥ−ＨＡ−ＧＯＬＰＨ３）のいずれかを形質導入したＷＭ２３９Ａ細胞およびＡ５４９細胞を安定的に選択し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と１：１で混合して、雌のヌード動物（Ｔａｃｏｎｉｃ）に、両脇腹にそれぞれ１．０×１０６および２．５×１０６細胞／部位で皮下移植した。ＷＭ２３９Ａ由来の腫瘍とＡ５４９由来の腫瘍を、それぞれ、２２日目および４５日目に単離し、腫瘍容積を測定した。両側ｔ検定による計算をＰｒｉｓｍ  ４（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して行った。
【０２６１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのラパマイシン実験のために、空ベクターまたはＧＯＬＰＨ３を安定的に発現することを確認した黒色腫１２０５ＬＵおよびＷＭ２３９Ａ細胞を、雌のヌード動物（Ｔａｃｏｎｉｃ）に、５．０×１０５細胞／部位で、両脇腹に皮下移植した。腫瘍をおよそ１００ｍｍ３に到達させ、その後、動物を、ビヒクル［５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＰＥＧ４００、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｗｅｅｎ−８０）またはラパマイシン（６ｍｇ／ｋｇ；ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；１００％ＥＴＯＨ中に調製し、処置用のビヒクル溶媒で新しく希釈した５０ｍｇ／ｍｌのストック）での１日おきの腹腔内注射による処置のために、別々のコホートに無作為に分けた。腫瘍容積と体重を薬物投与の際に測定した。腫瘍容積はノギスで２方向を測定することにより決定し、腫瘍容積＝（長さ×幅２）／２と公式化した。増殖曲線を各グループについて、腫瘍容積の平均変化としてプロットし、ここでは、平均変化は、所与の時点での腫瘍容積から初回投与量の投与時点での腫瘍容積を引き算した変化を示す。エンドポイント散布図を、それぞれの腫瘍の開始基準容積に対する最終投与量でのエンドポイントの腫瘍容積の割合としてプロットした。腫瘍増殖阻害率（％）を、（１−（Ｔ／Ｎ））×１００として決定した。ここでは、Ｔは、処置グループの腫瘍容積の平均変化であり、Ｎは、アッセイのエンドポイントでの対照グループの腫瘍容積の平均変化である。両側ｔ検定による計算をＰｒｉｓｍ  ４（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して行った。
【０２６２】
Ｌ．細胞の大きさの決定
Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターをＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアと共に使用して、前方散乱差分により評価した細胞の大きさの相対的変化を決定した。上記に示したような翌日のｓｉＲＮＡトランスフェクションのために、Ａ５４９細胞を６０ｍｍの皿に播種し、続いて一晩インキュベートした。細胞を２５ｎＭのラパマイシン（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含む１０ｃｍの皿またはラパマイシンを含まない１０ｃｍの皿に分け、６０時間のトランスフェクション後のエタノール固定によりフローサイトメトリーのために回収した。ＦＡＣＳ分析のために、１０，０００個の単一細胞を収集し、前方散乱を評価した。
【０２６３】
Ｍ．免疫ブロッティング、免疫蛍光、および免疫共沈分析
ＥＧＦ刺激アッセイのために、細胞を２４時間血清枯渇状態とし、続いて示したように、１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した。免疫ブロッティングのために、細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、ＮｕＰＡＧＥ  ４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上での分離のために、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１×プロテアーゼ阻害剤混合物（Ｓｉｇｍａ）、および１×ホスファターゼ阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を使用して溶解させ、ＰＶＤＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にブロットした。以下の抗体を製造業者の推奨に従って免疫ブロッティングに使用した：ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ７０  Ｓ６Ｋ（Ｔｈｒ３８９；１：１０００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐ７０  Ｓ６Ｋ（１：１０００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３、１：１０００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＡＫＴ（１：１０００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｍＴＯＲ（Ｓｅｒ２４８１、１：１０００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、α−チューブリン（１：２０，０００；Ｓｉｇｍａ）、ビンキュリン（１：５，０００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−４Ｅ−ＢＰ１（Ｔｈｒ３７／４６、１：１０００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＤＫ１（Ｓｅｒ２４１、１：１０００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＰＴＥＮ（１：７５０；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７Ｋｉｐ（Ｔｈｒ１５７；１：５００；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／２２１；１：１０００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２（Ｅｒｋ１／２；Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、１：１０００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｖ５（１：５，０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＨＡ（１：１０００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。図７Ｂで使用したウサギ抗ＧＯＬＰＨ３（ＪＪＢ；１：１０００）は、ＪＪ  Ｂｅｒｇｅｒｏｎ、ＭｃＧｉｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃより無償で得た。他の全てのＧＯＬＰＨ３免疫ブロッティングは、Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ／Ｈａｒｖａｒｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにより調製されたマウス抗ＧＯＬＰＨ３（Ｃ１９；１：１０００）を使用して行った。
【０２６４】
免疫共沈実験には、親Ａ５４９細胞、あるいはｐＢＡＢＥ−ＧＯＬＰＨ３−ＨＡ、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５／ＤＥＳＴ−ＶＰＳ３５の組合せ、または対応する空ベクターを同時トランスフェクトした２９３Ｔ細胞を使用した。これらのＡ５４９細胞またはトランスフェクタント由来の細胞質溶解物を、低張緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％ＮＰ４０、およびプロテアーゼ阻害剤）を用いてトランスフェクション後４８時間で（２９３Ｔ細胞について）調製し、タンパク質溶解物を、振盪しながら４℃で一晩の抗Ｖ５抗体、抗ＨＡ抗体、または抗ＧＯＬＰＨ３抗体のいずれかを使用した免疫沈降のために、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）および１５０ｍＭ  ＮａＣｌに調整した。プロテインＧビーズ（Ｒｏｃｈｅ）を、製造業者の推奨に従ってこの溶解物−抗体混合物に添加し、振盪しながら４℃で更に３時間インキュベートした。免疫沈降物を、抗Ｖ５  ＩＰ（ＰＢＳ＋０．１％  ＮＰ４０、および０．０５％ナデオキシコレート（Ｎａｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ））については低ストリンジェント緩衝液、または抗ＨＡと抗ＧＯＬＰＨ３  ＩＰについては高ストリンジェンシー緩衝液（５００ｍＭ  ＮａＣｌを含むＲＩＰＡ緩衝液）のいずれかで、２０分間３回洗浄した。免疫沈降複合体を、遠心分離後のＳＤＳローディング緩衝液の添加により溶出させ、Ｇｏｌｐｈ３（抗ＨＡまたは抗ＧＯＬＰＨ３）とＶｐｓ３５（抗Ｖ５）の免疫ブロッティング分析のために、ＮｕＰＡＧＥ  ４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分解した。
【０２６５】
免疫蛍光実験のために、細胞をカバースリップ上で培養し、続いて、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中で室温で１５分間固定し、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳ中で室温で１０分間透過化し、１０％のヤギまたはロバ血清／ＰＢＳ中で室温で１時間ブロッキングした。スライドを以下の抗体と共に室温で１時間インキュベートした：マウス抗ＨＡ（１：１００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）；ウサギ抗ＴＧＮ４６（１：５００；Ａｂｃａｍ）、ヤギ抗ＶＰＳ３５（１：２００；Ａｂｃａｍ）、およびマウス抗ＧＯＬＰＨ３（１：３００）。スライドを、対応するＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で室温で１時間染色した。カバースリップをＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）で染色し、封入剤でマウントした。顕微鏡画像を、横川回転盤共焦点／ＴＩＲＦシステムと浜松Ｏｒｃａ  ＥＲファイヤーワイヤーデジタルＣＣＤカメラを搭載したＮｉｋｏｎ倒立Ｔｉ顕微鏡を用い、個々の実験において各チャネルについて一定の露光時間を使用して得た。画像をコンパイルし、各色について全く同じ設定を使用してＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐで人工的に色をつけた。他に明記しない限り、倍率は１００倍である。
【０２６６】
（実施例２）
様々な腫瘍中でのＧＯＬＰＨ３のコピー数の異常
ヒトの癌のゲノムは多数の染色体変化を有し、腫瘍遺伝子を活性化することができ、腫瘍サプレッサー遺伝子を不活化させることができる原因事象、ならびに生物学的に中性であるゲノムバイスタンダー（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）を含む遺伝子エレメントの過多につながる不可逆的な数的および構造的異常を生じる。原因事象をノイズと区別することが、ゲノム科学が今日直面している中心的な課題である。三角測量アクロスモデルシステム（Ｔｒｉａｎｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｍｏｄｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ）は、生物学的に重要であると考えられる進化的に保存された合成事象を優先させるための強力なフィルターであることが証明されている（Ｋｉｍら（２００６年）Ｃｅｌｌ  １２５巻：１２６９〜１２８１頁；Ｚｅｎｄｅｒら（２００６年）Ｃｅｌｌ  １２５巻：１２５３〜１２６７頁；Ｍａｓｅｒら（２００７年）Ｎａｔｕｒｅ  ４４７巻：９６６〜９７１頁）。その同じ論理により、様々な組織系統の癌において観察されたゲノム変化が病原的に関係しており、機能的に強固である可能性が更に高いという仮説が立てられた。
【０２６７】
８３個の黒色腫の検体のアレイ−ＣＧＨ分析は、より大きな５ｐ１３領域の大きなコピー数獲得における局所増幅を明らかにした。これはまた非小細胞肺癌と結腸腺癌にも存在し（図１Ａ）、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による広範囲の検査を促した。多様な腫瘍型の３０７のコアを含む腫瘍組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）上での分析は、５ｐ１３の獲得が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）コアの５６％（４８個中２７個）、卵巣癌コアの３８％（４８個中１８個）、前立腺癌コアの３７％（４３個中１６個）、ならびに黒色腫コアの３２％（３８個中１２個）（図１Ｂ、図６、表１）を含む検査した全ての腫瘍型に有意に存在していたことを示した。参照腫瘍試料中の５ｐ１３領域の範囲全体の定量的リアルタイムＰＣＲは、４個の常在の注釈を付けた遺伝子を含む０．  ８ＭＢの最小共通領域（ＭＣＲ）を画定した（図１Ｃおよび１Ｄ）。コピー数の異常（ＣＮＡ）が無秩序な遺伝子発現を駆動する機構であると考え、本発明者らは次に、匹敵する発現を有しているＮＳＣＬＣコレクションにおいてこれらの常在の遺伝子の発現パターンを調べ、アレイ−ＣＧＨプロファイルもまた調べた。図１Ｅに示すように、ＧＯＬＰＨ３とＳＵＢ１だけが、発現レベルとコピー数の状態との間で統計的に有意な相関関係を示し、ＭＴＭＲ１２とＺＦＲは示さなかった。これは、この増幅の実行可能な候補標的（複数可）としてＧＯＬＰＨ３とＳＵＢ１を強く示している。更に、ＨａｐＭａｐコホートのおよそ１．８％（ｈａｐｍａｐ．  ｎｃｂｉ．  ｎｌｍ．  ｎｉｈ．  ｇｏｖでワールドワイドウェブを参照されたい）およびＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓにおいて癌患者のおよそ４％（ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．  ｎｉｈ．  ｇｏｖでワールドワイドウェブを参照されたい）におけるＧＯＬＰＨ３のコピー数のバリエーションの存在を含む、増大したコピー数のバリエーションが、幾つかのコホートの生殖系列のＤＮＡにおいて更に観察された。したがって、ＧＯＬＰＨ３における体細胞および／または生殖系列のコピー数のバリエーション（例えば、ＧＯＬＰＨ３のコピー数の増加）は、癌についての高いリスクの予測と考えられる（限定的ではない例として、表１に列挙する癌の型を参照されたい）。
【０２６８】
【表１】
2012504426.tif 000006
（実施例３）
機能喪失分析により評価した細胞形質転換に対するＧＯＬＰＨ３の影響
ＧＯＬＰＨ３、ＳＵＢ１、またはこれらの両方の癌との関係性を評価するために、プールしたｓｉＲＮＡ（表２）を使用したノックダウンアッセイを、内在するコピー数の状態と全体的なタンパク質発現レベルと比較して、それらの形質転換された表現形について、いずれかの遺伝子に対するヒト腫瘍（ＮＳＣＬＣおよび黒色腫）細胞株の依存性を計測するために行った（図７Ａ）。ＧＯＬＰＨ３のノックダウンは、５ｐ１３の増幅と高い発現レベルとを有する３種類のヒトの癌細胞株ＣＲＬ−５８８９（ＮＳＣＬＣ）、Ｓｂｃｌ２、およびＳＫ−ＭＥＬ−５（黒色腫）において足場非依存性増殖の有意な喪失を生じた。しかし、５ｐ１３  ＣＮＡを有さず、低いタンパク質発現を有する黒色腫細胞株１２０５ＬＵにおいては、同等のノックダウンレベルが、足場非依存性に対する最小の効果を生じた（表２）。対照的に、５ｐ１３を増幅した腫瘍株におけるＳＵＢ１の同等に有効なノックダウンは、足場非依存性に対して全く効果がなかったか、または比較的小さな効果があったかのいずれかであった。
【０２６９】
観察したノックダウン活性がＧＯＬＰＨ３  ｓｉＲＮＡのオフターゲッド効果には起因しないことを確認するために、ｓｉＲＮＡプールをデコンボリューション処理し、４つの別々のｓｉＲＮＡ二本鎖のうちの２つ（ｓｉＲＮＡ  ＃３と＃４）が、５ｐ１３を増幅したＣＲＬ−５８８９細胞において軟寒天増殖の強力な抑制と増殖の阻害につながる（図２Ａ）ＧＯＬＰＨ３のノックダウンに有効であることを確認した（図７Ｂ）。５ｐ１３の獲得を有さず、低いＧＯＬＰＨ３発現を有する１２０５ＬＵにおける同等に有効なノックダウンは最小の効果を示したが、これは、急なＧＯＬＰＨ３の枯渇は全ての細胞に広く一般的に有毒であるというわけではないことを示している（図２Ａおよび図７Ｂ）。重要なことは、ＧＯＬＰＨ３に対するｓｉＲＮＡ＃３の特異性が、ｓｉＲＮＡ＃３（ｓｉＲＥＳ）に対して非感受性となるように操作したＧＯＬＰＨ３  ｃＤＮＡによるＡ４５９の増殖のレスキューにより更に記録されたことである（図２Ｂ）。まとめると、ＲＮＡｉ媒介ノックダウンを使用したこれらの遺伝子機能喪失実験は、ＧＯＬＰＨ３をこの増幅についての可能性のある機能的に活性な標的として強く示唆した。
【０２７０】
【表２】
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（実施例４）
機能獲得分析により評価した細胞形質転換に対するＧＯＬＰＨ３の効果
ＧＯＬＰＨ３機能喪失実験を補強するために、ＧＯＬＰＨ３の異所性発現の影響を多数のモデルシステムにおいて評価した。ＧＯＬＰＨ３は、最初の形質転換していないマウスおよびヒト細胞の両方の悪性転換を生じさせることができた。具体的には、従来の同時形質転換アッセイにおいて、ＧＯＬＰＨ３は活性化型ＨＲＡＳＶ１２と協働して、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ欠損初代マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）において形質転換された病巣の形成を増大させた（図２Ｃ；ＨＲＡＳＶ１２単独と比較して３．４倍の増大）。初代ヒト細胞においては、ＧＯＬＰＨ３はＴＥＲＴ不死化ヒトメラニン細胞（以後、「ＨＭＥＬ」と呼ぶ）において腫瘍原性ＢＲＡＦＶ６００Ｅと協働し（Ｇａｒｒａｗａｙら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  ４３６巻：１１７〜１２２頁）、軟寒天中での足場非依存性増殖をもたらしたが、ＳＵＢ１はこのシステムにおいては形質転換活性を示さなかった（図２Ｄ）。同様の活性が１２０５ＬＵ黒色腫細胞株（５ｐ１３の増幅なし、低いＧＯＬＰＨ３発現）中でも観察され、ここでは、ＧＯＬＰＨ３過剰発現（図７Ｃ）がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの足場非依存性増殖と細胞増殖を増強した（図７Ｄ）。最後に、ＧＯＬＰＨ３過剰発現（図７Ｅ〜７Ｆ）は、ヒト黒色腫（ＷＭ２３９Ａ）およびＮＳＣＬＣ（Ａ５４９）細胞株（いずれも５ｐ１３の増幅なし）の異種移植腫瘍の増殖を有意に増強した（図２Ｅ）。ノックダウンと過剰発現に関して補強するこの一連の実験は、ＧＯＬＰＨ３が強力な形質転換活性を持つ真の腫瘍遺伝子であることを示す。
【０２７１】
（実施例５）
ＧＯＬＰＨ３はゴルジ体に局在する
ＧＯＬＰＨ３（別名ＧＰＰ３４；ＧＭｘ３３）は、トランス−ゴルジ体ネットワーク（ＴＧＮ）に局在した表在性膜タンパク質として最初に同定された（Ｗｕら（２０００年）Ｔｒａｆｆｉｃ  １巻：９６３〜９７５頁；Ｂｅｌｌら（２００１年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６巻：５１５２〜５１６５頁）。ラットホモログＧＭｘ３３を用いた続く実験は、このタンパク質がトランス−ゴルジ体マトリックスと動力学的に会合し、ＴＧＮから細胞質ゾルへと迅速に移動してエンドソームおよび原形質膜に局在することを明らかにした（Ｓｎｙｄｅｒら（２００６年）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ  １７巻：５１１〜５２４頁）。１つのクラスとして、ＴＧＮ局在タンパク質は癌の病因に直接関与していない。したがって、外因的に発現されたヒトＧＯＬＰＨ３と内因性のヒトＧＯＬＰＨ３がいずれも、ＴＧＮマーカーＴＧＮ４６を用いた同時免疫蛍光によりゴルジ装置に、およびエンドソーム様構造に実際に共局在したことを、共焦点顕微鏡法により本明細書中で最初に確認した（図３Ａ；Ｓｎｙｄｅｒら（２００６年）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ  １７巻：５１１〜５２４頁）。
【０２７２】
（実施例６）
酵母ツーハイブリッドスクリーニングにより同定したＧＯＬＰＨ３相互作用因子
ＧＯＬＰＨ３の生物学的機能に関する機構的見識を得るために、ＧＯＬＰＨ３相互作用タンパク質を酵母ツーハイブリッドシステムを使用してスクリーニングした（表３）。ＧＯＬＰＨ３相互作用タンパク質のうちで最も注目すべきものは、レトロマーの積荷認識複合体（ｃａｒｇｏ−ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の高度に保存されたメンバーＶＰＳ３５であったが、これは、エンドソームからＴＧＮへの、膜貫通受容体を含むタンパク質の逆行性輸送を調節する（Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏら（２００８年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０巻：４２７〜４３６頁）。酵母においてＧＯＬＰＨ３のＶＰＳ３５との餌依存性相互作用を実証した（図８Ａ〜８Ｂ）後、ヒト細胞中の外因的に発現されたＧＯＬＰＨ３および内因性ＧＯＬＰＨ３の両方とのＶＰＳ３５の物理的相互作用を、免疫共沈により明らかにした（図３Ｂおよび図８Ｃ）。共焦点同時免疫蛍光実験により、エンドソーム様構造での内因性ＶＰＳ３５とＧＯＬＰＨ３の共局在を更に確認した（図３Ｃ）。
【０２７３】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの大規模なケミカルゲノミックスプロファイリングスクリーニング（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｓｃｒｅｅｎ）（Ｘｉｅら（２００５年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０２巻：７２１５〜７２２０頁）により、ＶＰＳ３５およびＶＰＳ２９の欠失変異体が、ＴＯＲシグナル伝達の阻害剤であるラパマイシンに対して変更された感受性を示すことが明らかにされた。このことは、レトロマー複合体が分裂酵母のＴＯＲシグナル伝達経路において機能し得ることを示唆している。したがって、ＧＯＬＰＨ３がＴＯＲの哺乳動物オルトログ（ｍＴＯＲ）を調節し得、それにより、ＧＯＬＰＨ３の腫瘍化促進効果に寄与すると仮説を立てた。この仮説は、ヒトＮＳＣＬＣ腫瘍検体における、ＡＱＵＡ（登録商標）定量的免疫蛍光による、高い５ｐ１３のコピー数が、増大したｍＴＯＲ発現およびｍＴＯＲ基質Ｓ６キナーゼ（Ｓ６Ｋ）の増大したリン酸化と関係があることの観察によりサポートされる（Ｃａｍｐら（２００２年）Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ８巻：１３２３〜１３２７頁；図３Ｄおよび表４〜５）。具体的には、ｍＴＯＲ発現レベルは、核のものでも、全体のものでもなく、細胞質のｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ６ＫＴｈｒ３８９（ｐＳ６Ｋ）レベルと関係があった（ピアソン相関係数Ｒ＝０．４２、ｐ＝０．００１）。５ｐ１３のコピー数の状態を正常（１．５未満のＦＩＳＨにより決定したシグナルを有する）と獲得（１．５以上のＦＩＳＨシグナル）とに２値化し、増大したｍＴＯＲ（スピアマンのｒｈｏ係数＝０．４７５、ｐ＝０．０４）と細胞質ｐＳ６Ｋ（スピアマンのｒｈｏ係数＝０．７２４、ｐ＜０．０００１）との有意な相関を観察した。これは、５ｐ１３  ＣＮＡがＮＳＣＬＣの腺癌亜型におけるｍＴＯＲ−ｐＳ６Ｋ活性とポジティブな相関関係にあることを示している。重要なことは、５ｐ１３のコピー数を連続変数として処理した場合にもなお、ＮＳＣＬＣのこの亜型において細胞質ｐＳ６Ｋとの有意な相関関係がなおも観察されたことである（ピアソン相関係数Ｒ＝０．５１３、ｐ＜０．０２５；表４）。まとめると、酵母の遺伝的相互作用データと組み合わせたヒトの癌におけるこの相関関係は、ＧＯＬＰＨ３が哺乳動物細胞中でｍＴＯＲ活性を調節するとの仮説をサポートする。
【０２７４】
【表３−１】
2012504426.tif 000008
【０２７５】
【表３−２】
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【０２７６】
【表４】
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【０２７７】
【表５】
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（実施例７）
ＧＯＬＰＨ３はｍＴＯＲシグナル伝達を活性化する
ＧＯＬＰＨ３がｍＴＯＲシグナル伝達を活性化するという仮説を試験するために、ＧＯＬＰＨ３の調節の生物学的結果を最初に試験した。細胞の大きさの調節におけるｍＴＯＲの役割と一致して、ＲＮＡｉによるＧＯＬＰＨ３の枯渇は、Ａ５４９において細胞の大きさの有意な縮小を生じ、この効果は、ラパマイシンでの処置に匹敵した（Ｆｉｎｇａｒら（２００２年）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １６巻：１４７２〜１４８７頁；図４Ａ）。次に、ＧＯＬＰＨ３の調節の生物学的結果をアッセイした。
【０２７８】
ｍＴＯＲ基質Ｓ６Ｋは、ｍＴＯＲによりＴｈｒ３８９でリン酸化される細胞の大きさのキナーゼエフェクターであるので（Ｂｕｒｎｅｔｔら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９５巻：１４３２〜１４３７頁；Ｉｓｏｔａｎｉら（１９９９年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４巻：３４４９３〜３４４９８頁）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ６Ｋの状態を、ｍＴＯＲＣ１軸の読み出しとして調べた。５ｐ１３を増幅したＮＳＣＬＣ検体において上昇したｐＳ６Ｋを示しているヒト腫瘍のデータと一致して、ＧＯＬＰＨ３の過剰発現は、腫瘍細胞株（１２０５ＬＵおよびＡ５４９）中、ならびに、ｔｅｔに調節されるＧＯＬＰＨ３発現構築物で操作したＴＥＲＴ不死化ヒトメラニン細胞株ＨＭＥＬ−ｔｅｔ−ＧＯＬＰＨ３中で上昇したｐＳ６Ｋを生じた（図４Ｂ）。誘導システムを使用してこれらの観察が実証されるように、ＧＯＬＰＨ３の誘導は、上皮成長因子（ＥＧＦ；図４Ｃ）による成長因子刺激に応答してｐＳ６Ｋの蓄積を更に増強した。同時に、モニターしたＡＫＴのリン酸化（ｐＡＫＴ）は、ｍＴＯＲＣ２の直接の基質であるＳｅｒ４７３でモニターした（Ｈｒｅｓｋｏら（２００５年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０巻：４０４０６〜４０４１６頁；Ｓａｒｂａｓｓｏｖら（２００５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０７巻：１０９８〜１１０１頁）。ｍＴＯＲＣ１によるＳ６Ｋのリン酸化と同様に、ｐＡＫＴリン酸化の匹敵する増大が、ＧＯＬＰＨ３過剰発現細胞において観察された（図４Ｂ）。これは、ＧＯＬＰＨ３が、両方のｍＴＯＲ会合複合体を介してシグナル伝達を増強できることを示唆している。更に、ＡＫＴおよびＳ６Ｋのリン酸化は、ｓｉＧＯＬＰＨ３で処理したＮＳＣＬＣ  Ａ５４９およびＣＲＬ−５８８９細胞において、対照細胞と比較して、ＥＧＦに応答して有意に抑止された（図４Ｄ〜４Ｅ）。更なる生化学的分析は、ｍＴＯＲ基質であるＳ６ＫＴｈｒ３８９、ｐ４Ｅ−ＢＰ１Ｔｈｒ３７／４６、およびＡＫＴＳｅｒ４７３の変更されたリン酸化を示し、特にＰＴＥＮ、ＭＥＫ１／２、およびｐ４４／４２（Ｅｒｋ１／２）などを含む他のシグナル伝達タンパク質にほとんど影響がなかったかまたは全く影響はなかった（図９）。まとめると、これらのデータは、ＧＯＬＰＨ３がｍＴＯＲＣ１特異的基質およびｍＴＯＲＣ２特異的基質の両方のリン酸化を介してｍＴＯＲのシグナル伝達を活性化することを生化学的に示す。
【０２７９】
（実施例８）
ＧＯＬＰＨ３はラパマイシン感受性を調節する
記載した遺伝的実験を補うために、次に、ＧＯＬＰＨ３の発現レベルがｉｎ  ｖｉｖｏでの薬理学的ｍＴＯＲ阻害に対する腫瘍細胞の感受性に影響を与えるかどうかを問うた。ここでは、２種類のヒト黒色腫細胞１２０５ＬＵおよびＷＭ２３９Ａを、それらの正常なＧＯＬＰＨ３コピー数と低いタンパク質発現、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏで皮下（ＳＱ）腫瘍を容易に形成するそれらの能力に基づいて選択した。親細胞を、腫瘍増殖のための免疫不全動物への同所皮下移植のために、空ベクター（ＥＶ）またはＧＯＬＰＨ３のいずれかを安定的に発現するように操作した。次に、ラパマイシン処置した際の腫瘍増殖の阻害の程度（％ＴＧＩ）を、ＧＯＬＰＨ３発現腫瘍対ＥＶ対照腫瘍で比較した。
【０２８０】
上記（図２Ｅ）と矛盾なく、１２０５ＬＵ−ＧＯＬＰＨ３細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、１２０５ＬＵ−ＥＶ対照細胞と比較して有意な増殖促進を示した（ビヒクル対照コホートにおける注射後３６日目の腫瘍容積の１．  ９倍の増大、ｐ値＝０．０１４８）。腫瘍が約１００ｍｍ３の基準容積に達したら、これらの動物を、ビヒクルまたはラパマイシン（６．０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかの１日おきの腹腔内注射のために、対照コホートと処置コホートに無作為に分けた。処置試験は、いずれかのコホートの１匹の動物がＩＡＣＵＣ規則による腫瘍量のために屠殺しなければならなくなった時点で終了した。処置した腫瘍のｍＴＯＲ活性に対するラパマイシンの阻害効果をウェスタン分析により確認した（図７Ｇ）。その後、ラパマイシン処置の有効性を、ＷＭ２３９Ａについては４回の投与（８日間の試験）そして１２０５ＬＵについては６回の投与（１２日間の試験）後に、処置コホート対未処置のコホートの％ＴＧＩとして計算した。実際、ＧＯＬＰＨ３発現腫瘍は、ｉｎ  ｖｉｖｏでラパマイシン対して有意に感受性が高かった（図５Ａ〜５Ｃおよび図１０Ａ〜１０Ｂ）。したがって、ラパマイシンによる阻害がｉｎ  ｖｉｖｏでＧＯＬＰＨ３により付与された増殖促進を有効にブロックしたので、ｍＴＯＲシグナル伝達に対するＧＯＬＰＨ３の生物学的効果が、その腫瘍形成性機能の重要な側面である。
【０２８１】
それゆえ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの増強ノックダウンおよび過剰発現アッセイと組み合わせた、ゲノムの広範なコピー数および発現データの統合的分析は、多種多様なヒトの癌におけるコピー数の獲得／増幅について頻繁に標的化される真の腫瘍形成タンパク質として、ＧＯＬＰＨ３を同定した。癌関連シグナル伝達の調節において疑われるゴルジ装置の役割は、ＲＡＳのような一部の細胞質膜腫瘍形成タンパク質が、ゴルジ装置に一時的に存在する時に機能的にシグナル伝達できるとの観察に基づいて推測されている（Ｃｈｉｕら（２００２年）Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４巻：３４３〜３５０頁）。しかし、ＧＯＬＰＨ３のような、ＴＧＮに優先的に局在するタンパク質は、遺伝子レベルでは癌と直接関連付けられていない。したがって、ＧＯＬＰＨ３は画期的なゴルジ体腫瘍形成タンパク質となる。機構的には、ｍＴＯＲシグナル伝達の増強された活性化は、ＧＯＬＰＨ３の腫瘍形成活性についての分子的機序を示す。この観点から、ｉｎ  ｖｉｖｏでの増強された持続するｍＴＯＲ活性は、ヒトの癌の大部分におけるＧＯＬＰＨ３遺伝子の増大したコピー数または発現の根拠であろう、有意な増殖促進を癌細胞にもたらすと予想できる。
【０２８２】
まず最初に、エンドソームとＴＧＮとの間でのタンパク質輸送を担うレトロマー複合体とＧＯＬＰＨ３との間での物理的相互作用についての分子データ（Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏら（２００８年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０巻：４２７〜４３６頁）が、癌におけるこの生物学的プロセスを遺伝的に意味する。これは、正常な発育と新生物の発生の両方に重要であるＷｎｔｌｅｓｓ受容体の調節およびＷＮＴモルフォゲンの適正な分泌におけるレトロマーと逆輸送の必須の役割についての最近の報告と一致する（Ｅａｔｏｎ（２００８年）Ｄｅｖ．  Ｃｅｌｌ  １４巻：４〜６頁）。同じように、ショウジョウバエにおけるＶＰＳ３５の枯渇は、下流のシグナル伝達で同時に起こる変化を伴うＲＴＫのエンドサイトーシスを阻害した（Ｋｏｒｏｌｃｈｕｋら（２００７年）Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １２０巻：４３６７〜４３７６頁）。まとめると、ＧＯＬＰＨ３は、鍵分子の受容体リサイクリングを調節するようにＶＰＳ３５およびレトロマーと一緒に機能し得、それにより、ｍＴＯＲを介する下流でのシグナル伝達に影響を及ぼし得る。
【０２８３】
ＧＯＬＰＨ３の酵母ホモログＶｐｓ７４がゴルジ装置へのグリコシルトランスフェラーゼの適正なドッキングと局在に必要であることが最近発見された（Ｓｃｈｍｉｔｚら（２００８年）Ｄｅｖ．  Ｃｅｌｌ  １４巻：５２３〜５３４頁；Ｔｕら（２００８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１巻：４０４〜４０７頁）。タンパク質のグリコシル化は翻訳後修飾の最も一般的な形態の１つであり、変更されたグリコシル化は癌の顕著な特徴である（Ｏｈｔｓｕｂｏら（２００６年）Ｃｅｌｌ  １２６巻：８５５〜８６７頁）。グリコシル化が受容体の選別、リガンドの結合、およびエンドサイトーシスを媒介するので、グリコシル化が膜貫通受容体の成長因子活性化に重要であることが公知であることは注目すべきことである。（Ｏｈｔｓｕｂｏら（２００６年）Ｃｅｌｌ  １２６巻：８５５〜８６７頁；Ｔａｋａｈａｓｈｉら（２００４年）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．  Ｊ．  ２０巻：２０７〜２１２頁）。それゆえ、ヒトＧＯＬＰＨ３が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてそうであるように、グリコシルトランスフェラーゼのドッキングにおいて同様の機能を担い得、したがって膜ＲＴＫに対するその効果を通じて下流のｍＴＯＲシグナル伝達応答に影響を与え得ると考えるのが妥当である。
【０２８４】
ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲシグナル伝達カスケードはほぼ全ての癌において活性化され、それにより、抗癌剤の開発のための集中的な注目を示している。しかし、ラパマイシンとそのアナログに対する臨床応答は弱い（Ｓａｂａｔｉｎｉら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ６巻（９号）、７２９〜７３４頁（２００６年））。本明細書中に記載するように、前臨床の状況でのｍＴＯＲシグナル伝達を活性化し、ラパマイシンに対する増大した感受性を付与するＧＯＬＰＨ３の役割は、ＧＯＬＰＨ３の発現レベルまたはコピー数の状態がｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性を予測できることを示す。実際、記載した前臨床処置実験のエンドポイント分析は、ラパマイシンが高レベルのＧＯＬＰＨ３を発現する異種移植腫瘍に対してはるかにより有効であったことを示したが（ｐ＝０．０２６８；エンドポイントでの１２０５ＬＵ−ＧＯＬＰＨ３対１２０５ＬＵ−ＥＶ腫瘍容積；図１０Ｂ）、それにより、ＧＯＬＰＨ３レベルがラパマイシン感受性の陽性な予測因子であり得ることを示している。
【０２８５】
（実施例９）
ＧＯＬＰＨ３の枯渇は脂質二次メッセンジャーの産生を減少させ、ＰＩ３Ｋ経路を調節する
ＧＯＬＰＨ３の枯渇が、おそらくｍＴＯＲ媒介経路またはリン脂質媒介経路のいずれかにより、細胞移動を減少させることが示された（図１１Ａ）。ＧＯＬＰＨ３の枯渇はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで、癌のシグナル伝達経路に流れる脂質二次メッセンジャーの、基本因子と成長因子に刺激される生合成を減少させることも示された（図１１Ｂ〜１１Ｃ）。
【０２８６】
（実施例１０）
成長因子シグナル伝達はＡＲＦ４を介してＧＯＬＰＨ３の誤った局在を生じる
肺Ａ５４９細胞中での免疫蛍光アッセイを使用して、ＡＲＦ４がＧＯＬＰＨ３と共局在することを示した（図１２Ａ）。ＡＲＦ４がゴルジ装置でのＧＯＬＰＨ３の局在を調節し得るかどうかを決定するために、ＡＲＦ４  ｓｉＲＮＡをＡ５４９細胞にトランスフェクトした。ＧＯＬＰＨ３がＡＲＦ４  ｓｉＲＮＡと共にゴルジ体を離れることが示されたが、これは、ＡＲＦ４がＧＯＬＰＨ３のリン酸化に必要なＧＴＰアーゼであることを実証している（図１２Ｂ）。最後に、ＧＯＬＰＨ３の局在がＥＧＦＲ刺激により変化するかどうかを実証するために、Ａ５４９細胞を特定の時点でＥＧＦで処理し、ＧＯＬＰＨ３の局在を免疫蛍光によってモニターした。ＥＧＦがゴルジ体からのＧＯＬＰＨ３の再分配を引き起こしたことも示された（図１２Ｃ〜１２Ｄ）。まとめると、これらの結果は、成長因子が膜へのＡＲＦ４の移動を刺激し（Ｋｉｍら（２００３年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８巻：２６６１〜２６６８頁）、それにより、ゴルジ体からのＧＯＬＰＨ３の再分配を調節することを実証している。
【０２８７】
理論にとらわれず、ＧＯＬＰＨ３がシグナル伝達を調節するであろう１つの機構は、膜貫通受容体リサイクリングにおいて重要な役割を担うレトロマー複合体の中心的な構成要素であるＶＰＳ３５とのその会合と関係がある。レトロマー複合体は、例えば、発育プロセスおよび癌の発病において重要な役割を提供するＷｎｔファミリータンパク質の分泌を調節するレトロマー複合体の能力においてそうであるように、癌において重要である（Ｂｅｌｅｎｋａｙａら（２００８年）Ｄｅｖ．  Ｃｅｌｌ  １４巻：１２０〜１３１頁；Ｆｒａｎｃｈ−Ｍａｒｒｏら（２００８年）Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０巻：１７０〜１７７頁；Ｐａｎら（２００８年）Ｄｅｖ．  Ｃｅｌｌ  １４巻：１３２〜１３９頁；Ｐｏｒｔら（２００８年）Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０巻：１７８〜１８５頁；Ｙａｎｇら（２００８年）Ｄｅｖ．  Ｃｅｌｌ  １４巻：１４０〜１４７頁；Ｃｌｅｖｅｒｓ（２００６年）Ｃｅｌｌ  ３巻：４６９〜４８０頁）。ＶＰＳ３５の枯渇によるレトロマー機能の阻害は、Ｗｎｔの分泌を調節する膜貫通タンパク質であるＷｎｔｌｅｓｓを、そのリサイクリングおよびインターナライゼーション後の更なる使用を妨げることにより、不安定化する。別の例においては、ショウジョウバエでの遺伝子スクリーニングにより、Ｒａｃ１依存性アクチン重合の調節におけるＶＰＳ３５の役割が発見された（Ｋｏｒｏｌｃｈｕｋら（２００７年）Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １２０巻：４３６７〜４３７６頁）。ＶＰＳ３５の枯渇が、Ｔｏｌｌ受容体ＥＧＦＲおよびＰＤＧＦ、ならびにＶＥＧＦ受容体関連受容体（ＰＶＲ）を含む幾つかの膜貫通タンパク質のエンドサイトーシスを阻害すること、それと同時に、原形質膜での局在の増大およびそれに対応する、下流の構成要素によるシグナル伝達の増大を阻害することを見出した。これらの総合データは、ＧＯＰＬＨ３がＶＰＳ３５と共に、重要な分子の受容体リサイクリングを調節するように機能し、それにより、ＡＫＴ／ｍＴＯＲによる下流でのシグナル伝達に影響を与えることを示す。
【０２８８】
上記実施例（例えば、酵母ツーハイブリッドスクリーニングによる実施例）に基づき、ＧＯＬＰＨ３が、細胞表面受容体および他のタンパク質のタンパク質逆輸送を調節するＡＲＦ４  ＧＴＰアーゼと相互作用することを見出した。ＡＲＦ４は、ゴルジ装置から原形質膜へと循環し、ここで、ＡＲＦ４はＡｋｔ／ｍＴＯＲの上流の受容体チロシンキナーゼ（例えば、ＥＧＦＲ）に結合する（Ｋｉｍら（２００３年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８巻：２６６１〜２６６８頁）。加えて、上記実施例は以下を実証する。１）ＡＲＦ４とＧＯＬＰＨ３はゴルジ体に共局在する。２）ＲＮＡｉでのＡＲＦ４の枯渇はゴルジ体の外側へのＧＯＬＰＨ３の再局在を引き起こす（ＧＴＰアーゼ活性がゴルジ体でのＧＯＬＰＨ３の局在（これはリン酸化に依存する）に必要であることを示している）。ならびに、３）ＧＯＬＰＨ３の局在は、ＥＧＦでＥＧＦＲを刺激すると変化する。これらのデータは、ＥＧＦＲの刺激がゴルジ体から原形質膜へのＡＲＦ４の再分配を引き起こし（Ｋｉｍら（２００３年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８巻：２６６１〜２６６８頁）、それにより生じるゴルジ体でのＡＲＦ４  ＧＴＰアーゼ活性の喪失が、ＡＲＦ４  ＫＤを表現型模写し、それにより細胞質へのＧＯＬＰＨ３の再分配が生じるモデルを提供する。ＧＯＬＰＨ３がゴルジ体と動力学的に会合し、ＧＯＬＰＨ３リン酸化依存性の様式で細胞質へ、そして細胞質から移行することが示されているという事実（Ｓｎｙｄｅｒら（２００６年）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ  １７巻：５１１〜５２４頁）とまとめると、これらの結果は、ＧＯＬＰＨ３、ＡＲＦ４、およびレトロマー複合体が、成長因子刺激に応答して受容体リサイクリングを調節するように協働したことを示す。
【０２８９】
理論にとらわれず、ＧＯＬＰＨ３はまた、ゴルジ装置へのグリコシルトランスフェラーゼの局在を調節するその酵素ホモログＶＰＳ７４と同様に、シグナル伝達を調節するとみられる（Ｓｃｈｍｉｔｚら（２００８年）Ｄｅｖ．  Ｃｅｌｌ  １４巻：５２３〜５３４頁；Ｔｕら（２００８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１巻：４０４〜４０７頁）。タンパク質のグリコシル化は翻訳後修飾の最も一般的な形態の１つであり、変更されたグリコシル化は腫瘍発生の顕著な特徴である（Ｏｈｔｓｕｂｏら（２００６年）Ｃｅｌｌ  １２６巻：８５５〜８６７頁）。グリカン構造は、腫瘍の進行についての周知のマーカーであり、細胞増殖、接着、移動、および浸潤、免疫認識、およびシグナル伝達を含む癌の多数の病理学的事象と関係がある。シグナル伝達の場合には、グリコシル化が膜貫通受容体の成長因子活性化に重要であることが証明されている（Ｔａｋａｈａｓｈｉら（２００４年）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．  Ｊ．  ２０巻：２０７〜２１２頁）。例えば、ＥＧＦＲは１２個のＮ−グリコシル化コンセンサス部位を含み（ＣａｒｐｅｎｔｅｒおよびＣｏｈｅｎ（１９９０年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５巻：７７０９〜７７１２頁）、そしてこれらの残基でのグリコシル化が、ＥＧＦＲ選別とその後のリガンド結合の両方に不可欠である（ＳｏｄｅｒｑｕｉｓｔおよびＣａｒｐｅｎｔｅｒ（１９８４年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５９巻：１２５８６〜１２５９４頁；ＧａｍｏｕおよびＳｈｉｍｉｚｕ（１９８８年）Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０４巻：３８８〜３９６頁）。更に、ゴルジ体グリコシルトランスフェラーゼ活性は、受容体リガンドに対する変化した感受性をもたらすことができる膜貫通受容体のエンドサイトーシスを変化させることができる（Ｏｈｔｓｕｂｏら（２００６年）Ｃｅｌｌ  １２６巻：８５５〜８６７頁）。ＥＧＦＲの場合は、Ｎ−グリコシル化が修飾されると、インターナライゼーションに抵抗することにより原形質膜でＥＧＦＲが封鎖され、それにより成長因子に対する応答性が延長される（Ｐａｒｔｉｄｇｅら（２００４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６巻：１２０〜１２４頁）。
【０２９０】
参照による引用
本明細書中で言及した全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されるのと同程度に、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、本明細書中の全ての定義を含む本出願が支配する。
【０２９１】
ゲノム科学研究所（Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（ＴＩＧＲ）によりワールドワイドウェブ上でｔｉｇｒ．  ｏｒｇで、および／または国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）によりワールドワイドウェブ上でｎｃｂｉ．  ｎｌｍ．  ｎｉｈ．  ｇｏｖで維持されているデータベースのような公的データベース中の登録に対応する受託番号を参照する全てのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列もまた、それらの全体が参照により組み込まれる。
【０２９２】
等価物
当業者は、日常的に行われている実験以上のものを使用することなく、本明細書中に記載した本発明の具体的な実施形態の多くの等価物を理解するか、または確認することができる。そのような等価物は以下の特許請求の範囲に含まれるように意図される。
【図１−１】
2012504426.tif 000012
【図１−２】
2012504426.tif 000013
【図２−１】
2012504426.tif 000014
【図２−２】
2012504426.tif 000015
【図３−１】
2012504426.tif 000016
【図３−２】
2012504426.tif 000017
【図４−１】
2012504426.tif 000018
【図４−２】
2012504426.tif 000019
【図５】
2012504426.tif 000020
【図６】
2012504426.tif 000021
【図７−１】
2012504426.tif 000022
【図７−２】
2012504426.tif 000023
【図８】
2012504426.tif 000024
【図９】
2012504426.tif 000025
【図１０】
2012504426.tif 000026
【図１１】
2012504426.tif 000027
【図１２−１】
2012504426.tif 000028
【図１２−２】
2012504426.tif 000029
【手続補正書】
【提出日】平成23年6月8日(2011.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2012504426000001.app
【国際調査報告】
2012504426.tif 000030
2012504426.tif 000031
2012504426.tif 000032
2012504426.tif 000033
2012504426.tif 000034