(57)【要約】  本発明は、抗脂抗体またはそのフラグメントの結晶形態を提供する。前記抗脂抗体またはそのフラグメントは、前記抗体および／または塩、金属または補因子の脂質リガンドをさらに含み得る。このような結晶および共結晶を作製する方法が提供される。前記脂質は、生物活性脂質（例えば、スフィンゴ脂質（例えば、Ｓ１Ｐ））であり得る。このような結晶のＸ線座標が、この情報を抗体設計または最適化において用いる方法として、提供される。脂質に対するヒト化抗体を設計する方法が提供される。これらの方法は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで実行され得、抗体のその本来の標的脂質に対する結合親和性の向上および／または結合特異性の変更を意図し得る。これらの方法によって作製された抗体も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗脂抗体またはそのフラグメントを含む結晶質組成物であって、前記脂質は生物活性脂質であり、任意にスフィンゴ脂質またはリゾ脂質であり、前記抗脂抗体またはそのフラグメントは、モノクローナル抗脂抗体またはそのフラグメントであり、前記フラグメントは、任意にＦａｂフラグメントである、結晶質組成物。
【請求項２】
前記抗体の脂質リガンドをさらに含む、請求項１に記載の結晶質組成物。
【請求項３】
少なくとも１つの補因子、塩、または金属をさらに含む、請求項１に記載の結晶質組成物。
【請求項４】
表１０または表１１中に示す構造座標のセットによって規定される抗脂抗体を含む、請求項１に記載の結晶質組成物。
【請求項５】
抗体Ｆａｂフラグメントおよびその生物活性脂質リガンドを含む共結晶を含む、請求項１に記載の結晶質組成物。
【請求項６】
コンピュータで読み出し可能なデータを記録するコンピュータで読み出し可能な記録媒体であって、前記データは、請求項１に記載の結晶質組成物由来の抗脂抗体またはそのフラグメントの全てまたは選択された一部の構造座標を含み、前記データは、表１０または表１１に示す構造座標の全てまたは選択された一部を任意に含む、コンピュータで読み出し可能な記憶媒体。
【請求項７】
請求項１に記載の結晶質組成物の使用であって、
ａ．前記抗体の構造を決定する工程、
ｂ．前記抗体またはそのフラグメントあるいは前記抗体の変異体または当該変異体のフラグメントのリガンドに対する結合特性を決定する工程、
ｃ．脂質、任意に生物活性脂質に対して特異的に反応性を有する抗体またはそのフラグメントを設計する工程、および／または
ｄ．モノクローナル抗体の脂質に対する親和性を最適化または変化させる工程、
における、請求項１に記載の結晶質組成物の使用。
【請求項８】
抗体または抗体フラグメントおよびその脂質リガンドを含む共結晶を含む請求項２に記載の結晶質組成物を作製する方法であって、
ａ．抗脂モノクローナル抗体またはそのフラグメント、任意にＦａｂフラグメントを提供する工程と、
ｂ．抗体―リガンド複合体または抗体フラグメント―リガンド複合体が形成される条件下において、前記抗体またはそのフラグメントと、過剰量の前記脂質リガンドとを混合する工程と、
ｃ．抗体―リガンド共結晶または抗体フラグメント―リガンド共結晶が形成される条件下において、前記抗体―リガンド複合体または抗体フラグメント―リガンド複合体をインキュベートし、これにより、抗体または抗体フラグメントおよびその脂質リガンドの共結晶を作製する工程と、
を含む、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法によって作製された、抗体または抗体フラグメントおよびその脂質リガンドの共結晶であって、前記脂質は、任意に生物活性脂質であり、任意にスフィンゴ脂質またはリゾ脂質である、共結晶。
【請求項１０】
脂質に対して最適化された抗体を設計する方法であって、
ａ．第１のヒト化抗脂抗体の重鎖または軽鎖の少なくとも１つの可変領域のアミノ酸配列を提供する工程であって、前記抗脂抗体は、第１の脂質、任意にスフィンゴ脂質またはリゾ脂質に対して特異的であり、前記可変領域内の任意に少なくとも１つの相補性決定領域を特定する、工程と、
ｂ．前記少なくとも１つの可変領域内の１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸と置換して、変異体アミノ酸配列を得る工程であって、前記アミノ酸置換は相補性決定領域内である、工程と、
ｃ．前記変異体アミノ酸配列を含む第２のヒト化抗脂抗体を作製する工程であって、前記第１のヒト化抗脂抗体および前記第２のヒト化抗脂抗体のアミノ酸配列は、前記変異体アミノ酸配列のみにおいて異なる、工程と、
ｄ．前記第２のヒト化抗体の１つ以上の活性基準を、任意に分子モデリング、ＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴によって決定する工程であって、前記活性基準のうちの少なくとも１つは、前記第１の脂質に対して任意選択的に結合親和性があり、第２の脂質に対して結合親和性があり、または前記第１の脂質に対して任意選択的に特異性があるかまたは第２の脂質に対して特異性があり、前記第１の脂質および第２の脂質は異なる脂質種である、工程と、
ｅ．前記活性基準のうち１つ以上に基づいて最適化された抗体を選択する工程であって、前記最適化された抗体は前記第２のヒト化抗体である、工程と
を含み、
前記方法は任意にｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで行われる、
方法。
【請求項１１】
前記第１の抗体および前記第１の脂質の結合に関する三次元構造情報を用いて、前記アミノ酸置換の位置および／または種類を選択する工程をさらに含み、任意に、前記三次元構造情報は、分子モデリングデータまたはｘ線結晶学データである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１５に従って最適化された抗体。
【請求項１３】
前記第１のヒト化抗脂抗体はＬＴ１００９であり、任意に、前記置換された１つ以上のアミノ酸は、軽鎖内の位置３０、３１および３２におけるアスパラギン酸、位置５０におけるグルタミン酸、位置９２におけるアスパラギン酸、位置９４におけるロイシン、および位置９６におけるフェニルアラニン；および重鎖内の位置３３におけるトレオニン、位置３５におけるヒスチジン、位置５０におけるアラニン、位置５２におけるセリン、位置５４におけるヒスチジン、位置５６におけるイソロイシン、位置５８におけるリシン、位置９７におけるフェニルアラニン、位置９８におけるチロシン、位置１００Ａにおけるトレオニンまたは位置１００Ｃにおけるトリプトファン、からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１３に従って作製された、ＬＴ１００９の最適化された抗体変異体であって、任意に、ＬＴ１００９の前記可変領域のうち１つ以上内の１つ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸と置換されて変異体アミノ酸配列が得られ、前記１つ以上の置換されたアミノ酸は、軽鎖内の位置３０、３１および３２におけるアスパラギン酸、位置５０におけるグルタミン酸、位置９２におけるアスパラギン酸、位置９４におけるロイシンおよび位置９６におけるフェニルアラニン；および重鎖内の位置３３におけるトレオニン、位置３５におけるヒスチジン、位置５０におけるアラニン、位置５２におけるセリン、位置５４におけるヒスチジン、位置５６におけるイソロイシン、位置５８におけるリシン、位置９７におけるフェニルアラニン、位置９８におけるチロシン、位置９９におけるグリシン、位置１００におけるセリン、位置１００Ａにおけるトレオニンまたは位置１００Ｃにおけるトリプトファン、からなる群から選択される、
【請求項１５】
ａ．標的生物活性脂質と特異的に反応するコンセンサス抗脂抗体を設計する方法であって、
（ｉ）標的生物活性脂質と特異的に反応する第１の親抗体種からの少なくとも第１のＣＤＲアミノ酸配列と、前記標的生物活性脂質と特異的に反応する第２の親抗体種からの少なくとも第２のＣＤＲアミノ酸配列とを特定する工程であって、前記第１のＣＤＲアミノ酸配列および第２のＣＤＲアミノ酸配列は、どちらもＣＤＲ  Ｈ１、どちらもＣＤＲ  Ｈ２、どちらもＣＤＲ  Ｈ３、どちらもＣＤＲ  Ｌ１、どちらもＣＤＲ  Ｌ２またはどちらもＣＤＲ  Ｌ３ＣＤＲアミノ酸配列である、工程と、
（ｉｉ）前記第１のＣＤＲアミノ酸配列および第２のＣＤＲアミノ酸配列を整列させて、コンセンサスＣＤＲアミノ酸配列を決定する工程と、
（ｉｉｉ）前記コンセンサスＣＤＲアミノ酸配列をコードする核酸配列を、抗体重鎖または軽鎖の可変領域を含む遺伝子に工学設計して、標的生物活性脂質に対して特異的に反応するコンセンサス抗脂抗体を設計する工程と、任意に、
（ｉｖ）前記標的生物活性脂質に結合する抗体または抗体フラグメントを生成する工程と、
を含む、方法と、
ｂ．標的生物活性脂質に対して特異的に反応する抗体変異体または抗体フラグメント変異体を設計する方法であって、
（ｉ）ソース生物活性脂質に対して特異的に反応する抗体または抗体フラグメントと結合する標的生物活性脂質の初期表現を含む第１の構造表現を提供する工程であって、前記標的生物活性脂質および前記ソース生物活性脂質は同一であるかまたは異なる生物活性脂質種であり、前記初期表現は、分子モデリングデータまたはｘ線結晶学データから任意に導出された前記抗体または抗体フラグメントの三次元構造情報を含む、工程と、
（ｉｉ）前記第１の構造表現において表現される少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換して、修飾された結合中の前記標的生物活性脂質の後続表現を前記修飾された抗体または抗体フラグメントと関連して含む第２の構造表現を特定し、これにより、前記標的生物活性脂質に対して特異的に反応する抗体変異体または抗体フラグメント変異体を設計する工程であって、前記抗体変異体または抗体フラグメントは、前記生物活性脂質に対して、任意に修飾された結合関連および任意選択的に向上した結合関連を有する、工程と、
を含む、方法と、
からなる群から選択される方法。
【請求項１６】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５（ａ）に従って作製された、抗体または抗体フラグメント、任意にヒト化抗体またはそのフラグメント。
【請求項１８】
前記標的生物活性脂質は、（ｉ）前記ソース生物活性脂質と同一であるか、または（ｉｉ）前記ソース生物活性脂質と異なり、いずれの場合においても、前記標的生物活性脂質は任意選択的にＳ１Ｐである、請求項１５（ｂ）に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的生物活性脂質に結合する前記抗体変異体または抗体フラグメント変異体をコードする１つ以上の核酸配列を工学設計する工程をさらに含み、前記抗体変異体または抗体フラグメント変異体を生成する工程を任意にさらに含む、請求項１５（ｂ）に記載の方法。
【請求項２０】
標的生物活性脂質に対して特異的に反応する抗体または抗体フラグメントまたはこのような抗体または抗体フラグメントを含む組成物であって、いずれの場合においても、前記抗体または抗体フラグメントは請求項１９に従って作製される、抗体または抗体フラグメントまたは組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
助成金援助
本出願の内容は、Ｓｍａｌｌ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＳＢＩＲ）（助成番号１  Ｒ４３  ＧＭ  ０８８９５６−０１）による支援を少なくとも部分的に受けたものである。そのため、本明細書中、特定の権利を米国政府が持ち得る。
【０００２】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、結晶形態の抗脂抗体、その作製方法、および前記結晶形態の抗脂抗体から導出されたデータを抗体設計および最適化において用いる方法に関する。抗体または抗体フラグメントを設計する方法が提供される。この方法において、抗体標的は脂質（例えば、生物活性脂質）である。
【背景技術】
【０００３】
以下の記載は、本発明の理解において有用となり得る情報が含まれる。下記に記載される情報のいずれも、また具体的または暗示的に言及される公開文献のいずれについても、従来技術であるか本発明に関連すると自白するものではない。
【０００４】
２．背景
生物活性シグナル伝達脂質
脂質およびその誘導体は、細胞膜中の単純な構造要素またはβ酸化、解糖または他の代謝過程のエネルギー源としてだけではなく、今や医学研究における重要な対象となっている。特に、特定の生物活性脂質は、動物およびヒトの疾病において重要なシグナル伝達メディエーターとして機能する。細胞膜脂質のほとんどは専門的な構造的役割を果たすものの、そのうちごく一部は、細胞外刺激の細胞内への伝達に関与している。「脂質シグナル伝達」とは、細胞膜脂質を二次メッセンジャーとして用いる細胞間情報伝達経路を指し、また、脂質シグナル伝達分子とその固有の特異受容体との間の直接相互作用も指す。脂質シグナル伝達経路は、成長因子から炎症性サイトカインに及ぶ多様な細胞外刺激によって活性化され、細胞運命の決定（例えば、アポトーシス、分化および増殖）を調節する。より多くの生物活性脂質が特定されまたその作用が特徴付けられるにつれ、生物活性脂質シグナル伝達に関する研究が盛んに科学調査の対象となっている。
【０００５】
生物活性脂質の例を挙げると、エイコサノイド（例えば、カンナビノイド、ロイコトリエン、プロスタグランジン、リポキシン、エポキシエイコサトリエン酸、およびイソエイコサノイド）（例えば、ヒドロキシエイコサテトラエン酸（ＨＥＴＥ（例えば、５−ＨＥＴＥ、１２−ＨＥＴＥ、１５−ＨＥＴＥおよび２０−ＨＥＴＥ））、非エイコサノイドカンナビノイドメディエーター、リン脂質およびその誘導体（例えば、ホスファチジン酸（ＰＡ）およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、血小板活性化因子（ＰＡＦ）およびカルジオリピンおよびリゾりん脂質（例えば、リソホスファチジルコリン（ＬＰＣ）および多様なリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ））がある。生物活性シグナル伝達脂質メディエーターもまた、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴミエリン、セラミド、セラミド−１−リン酸、スフィンゴシン、スフィンゴシルホスホリルコリン、スフィンガニン、スフィンガニン−１−リン酸（ジヒドロ−Ｓ１Ｐ）、およびスフィンゴシン−１−リン酸を含み。スフィンゴ脂質およびその誘導体は、重要な細胞過程に対して多面発現効果を有する細胞外シグナル伝達分子および細胞内シグナル伝達分子の群を表す。生物活性シグナル伝達脂質の他の例を挙げると、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＡ）、ジアシルグリセリド（ＤＧ）、スルファチド、ガングリオシドおよびセレブロシドがある。
【０００６】
スフィンゴ脂質は独自の種類の脂質であり、その初期性質が神秘的であることから、スフィンクスにちなんで名付けられた。スフィンゴ脂質は初期においては細胞膜の一次構造成分として特徴付けられていたが、最近の研究により、スフィンゴ脂質は細胞間シグナル伝達分子および制御分子としても機能することが分かっている（Ｈａｎｎｕｎら、Ａｄｖ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２５：２７〜４１、１９９３；Ｓｐｅｉｇｅｌら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１０：１３８８〜１３９７、１９９６；Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １２２：１０８０−１０８７、１９９７；Ｈｌａ、Ｔ．（２００４）．Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、１５、５１３〜２；Ｇａｒｄｅｌｌ、Ｓ．Ｅ．、Ｄｕｂｉｎ、Ａ．Ｅ．＆  Ｃｈｕｎ、Ｊ．（２００６）．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、１２、６５〜７５）。スフィンゴ脂質は、細胞膜の一次構造成分であり、細胞シグナル伝達および制御性分子としても機能する（ＨａｎｎｕｎおよびＢｅｌｌ、Ａｄｖ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２５：２７〜４１、１９９３；Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ１２２：１０８０〜１０８７、１９９７）。スフィンゴ脂質シグナル伝達メディエーター、セラミド（ＣＥＲ）、スフィンゴシン（ＳＰＨ）およびスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）について大きく研究が進んでおり、その結果、心臓血管系、血管形成および腫瘍生物学におけるその機能が近年解明されてきている（Ｃｌａｕｓら、Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  １：１８５〜２０５、２０００年；Ｌｅｖａｄｅら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８９：９５７〜９６８、２００１；Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３５３４３〜５０、１９９９；ＷａｓｃｈｏｌｏｗｓｋｉおよびＧｉａｎｎｉｓ、Ｄｒｕｇ  Ｎｅｗｓ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．１４：５８１〜９０、２００１年；Ｓｐｉｅｇｅｌ，Ｓ．＆  Ｍｉｌｓｔｉｅｎ，Ｓ．（２００３年）．Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ａｎ  ｅｎｉｇｍａｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｌｉｐｉｄ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、４、３９７〜４０７）。
【０００７】
スフィンゴ脂質代謝の総説については、ＬｉｕらのＣｒｉｔ  Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．（３６：５１１〜５７３、１９９９年）を参照されたい。スフィンゴミエリンシグナル伝達経路の総説については、ＨａｎｎｕｎらのＡｄｖ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．（２５：２７〜４１、１９９３年）、ＬｉｕらのＣｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．（３６：５１１〜５７３、１９９９年）、Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｊ．のＢｉｏｃｈｅｍ．（１２２：１０８０〜１０８７、１９９７年）、ＯｒａｌらのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２７２：４８３６〜４８４２、１９９７年）、およびＳｐｉｅｇｅｌらのＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃｏｗ）（６３：６９〜８３、１９９８年）を参照されたい。
【０００８】
スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）
Ｓ１Ｐは、細胞増殖のメディエーターであり、生存経路の活性化を通じてアポトーシスから保護する（Ｍａｃｅｙｋａら（２００２）、ＢＢＡ、ｖｏｌ．１５８５：１９２〜２０１、およびＳｐｉｅｇｅｌら（２００３）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．４：３９７〜４０７）。ＣＥＲ／ＳＰＨレベルとＳ１Ｐとの間のバランスにより、細胞が死経路に向かっているのかあるいはアポトーシスから保護されているのかを決定するレオスタット機構が得られることが提案されている。レオスタット機構の主要な制御酵素はスフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）であり、その役割は、死促進生物活性シグナル伝達脂質（ＣＥＲ／ＳＰＨ）を成長促進Ｓ１Ｐに変換することである。Ｓ１Ｐがたどる行き先は２通りあり、１つの行き先においては、Ｓ１Ｐをホスホエタノールアミンおよびヘキサデカナールに開裂させる酵素であるＳ１Ｐリアーゼによって分解されるか、または、より稀な場合にＳ１ＰホスファターゼによってＳＰＨに加水分解される。
【０００９】
Ｓ１Ｐの多面的生物活性は、内皮分化遺伝子（ＥＤＧ）として本来知られているＧプロテインカップルレセプター（ＧＰＣＲ）のファミリーを介して媒介される。以下の５個のＧＰＣＲが、高親和性Ｓ１Ｐ受容体（Ｓ１ＰＲ）として特定されている（すなわち、Ｓ１Ｐ１／ＥＤＧ‐１、Ｓ１Ｐ２／ＥＤＧ‐５、Ｓ１Ｐ３／ＥＤＧ‐３、Ｓ１Ｐ４／ＥＤＧ‐６、およびＳ１Ｐ５／ＥＤＧ‐８）。これらの受容体のみが、１９９８年になってやっと特定された（Ｌｅｅら、１９９８年）。Ｓ１Ｐによって誘起される多くの反応は、異なるヘテロ三量体Ｇプロテイン（Ｇｑ‐、Ｇｉ、Ｇ１２〜１３）およびＲｈｏファミリーの小さなＧＴＰアーゼに結合する（Ｇａｒｄｅｌｌら、２００６年）。
【００１０】
成人においては、Ｓ１Ｐは血小板（Ｍｕｒａｔａら、２０００年）およびマスト細胞から放出され、これにより、（Ｓ１ＰＲのＫｄを越えるのに十分な）自由Ｓ１Ｐの局在パルスが生成されて、創傷治癒が促進され、また、炎症反応に関与する。通常の条件下において、血漿中のＳ１Ｐ総量は極めて高い（３００〜５００ｎＭ）が、ほとんどのＳ１Ｐは血清タンパク質（特に、リポタンパク質（例えば、ＨＤＬ＞ＬＤＬ＞ＶＬＤＬ）およびアルブミン）によって「緩衝」され、そのため、生物学的に利用可能なＳ１Ｐ（またはＳ１Ｐの遊離分画）がＳ１ＰＲをはっきりと活性化させるのには不十分となる（Ｍｕｒａｔａら、２０００年）という仮説が出ている。これが当てはまらない場合、不適切な血管形成および炎症が発生する。Ｓ１Ｐの細胞内作用についても提案されている（例えば、Ｓｐｉｅｇｅｌ  Ｓ、Ｋｏｌｅｓｎｉｃｋ  Ｒ（２００２年）、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、ｖｏｌ．１６：１５９６〜６０２；Ｓｕｏｍａｌａｉｎｅｎら（２００５年）、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、ｖｏｌ．１６６：７７３〜８１を参照）。
【００１１】
細胞表面Ｓ１Ｐ受容体が幅広く発現した場合、Ｓ１Ｐは、広範の細胞間反応（例えば、増殖、接着、収縮、運動、形態形成、分化、および生存）へ影響を与えることができる。このような反応範囲は、細胞および組織系内のＳ１Ｐ受容体の発現パターンの重複または差異に依存するようにみえる。加えて、Ｓ１Ｐと、成長因子シグナル伝達経路（例えば、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ））との間にクロストークがあることも近年実証されている（例えば、Ｂａｕｄｈｕｉｎら（２００４年）、ＦＡＳＥＢ  Ｊ、ｖｏｌ．１８：３４１〜３を参照）。Ｓ１Ｐが関与する多様な細胞過程の調節は、ニューロンシグナル伝達、血管緊張、創傷治癒、免疫細胞輸送、再生および心血管系機能などに特に影響を与える。これらの系内のＳ１Ｐの内在レベルが変化した場合、いくつかの病態生理学的状態（例えば、癌、炎症、血管形成、心臓病、ぜんそく、および自己免疫疾病）の原因となる悪影響が発生し得る。
【００１２】
多様な疾病および疾患（例えば、心臓血管疾患、脳血管障害および多様な癌）の治療に対するより新規なアプローチでは、生物学的に利用可能なＳ１Ｐのレベル低減を単独でまたは他の治療と組み合わせて行う。スフィンゴ脂質代謝経路の鍵酵素（例えば、ＳＰＨＫ）を標的とした、スフィンゴ脂質を用いた治療戦略が提案されているが、脂質メディエーターＳ１Ｐそのものとの干渉については近年まで強調されていなかった。その主な原因は、この脂質標的の直接的低減が困難であるためであり、特に、Ｓ１Ｐ標的を検出する抗体を作成することが困難であるためである。
【００１３】
近年、Ｓ１Ｐに対して特異的な抗体の生成について記載されている（例えば、共有されている米国特許出願シリアル番号第２００７０１４８１６８；ＷＯ２００７／０５３４４７を参照）。このような抗体は、例えば血清からＳ１Ｐを選択的に吸収することのできる分子スポンジとして機能し、細胞外Ｓ１Ｐを中和させる。共有されている米国特許第６，８８１，５４６号および６，８５８，３８３号および米国特許出願シリアル番号第１０／０２９，３７２号も参照されたい。スフィンゴマブ（商標）は、Ｌｐａｔｈ，Ｉｎｃ．によって開発されたたマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり、上記において羅列した特定の特許または特許出願において記載されている。スフィンゴマブについて、ヒト疾病モデルにおいて有効であることが判明している。状況によっては、特にヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応が発生し得るヒトへの治療的使用においては、マウス抗体よりもヒト化抗体の方が好ましい場合がある。このような反応により、結合活性の中和および／または抗体の身体内での循環の高速除去により、当該抗体の有効性が低減し得る。また、ＨＡＭＡ反応があると、その後マウス抗体を投与する際にも毒性の原因となり得る。
【００１４】
ファーストインクラスのヒト化抗Ｓ１Ｐ抗体（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ、ＬＴ１００９）が開発されており、本明細書中、このヒト化抗Ｓ１Ｐ抗体について記載する。この抗体は、Ｓ１Ｐ結合における有効性、Ｓ１Ｐ中和、およびＳ１Ｐに関連する疾病状態の調節の点においてマウスｍＡｂの利点全てを備えていると期待されており、また、マウスｍＡｂがヒトに用いられた場合の不都合が発生する可能性は無い。本明細書中以下の例において説明するように、このヒト化抗体は、動物疾病モデル中の親（マウス）抗体よりも高い活性を実際に示している。現在、Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂについて、癌および加齢黄斑変性症についての臨床試験が行われている。
【００１５】
リゾ脂質
リゾ脂質は、低分子量脂質であり、１つまたは両方の可能なアシル化位置においてアシル基が無いため、極性頭部基および単一の炭化水素骨格を含む。ｓｎ−３における極性頭部基に対して、炭化水素鎖はｓｎ−２および／またはｓｎ−１位置（単数または複数）にあり得る（「リゾ」という用語は、もともとは溶血に関連する用語であり、脱アシル化を指すものとしてＩＵＰＡＣによって再定義されている）（「Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｌｉｐｄｓ、ｗｗｗ．Ｃｈｅｍ．Ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｐａｃ／ｌｉｐｉｄ／ｌｉｐ１ｎ２．ｈｔｍｌを参照のこと）。これらの脂質は、シグナル伝達、生物活性脂質、およびその生物的および医学的重要性を示すものであり、また、治療目的、診断目的／予後目的または研究目的における脂質シグナル伝達分子の標的化の成否において重要な役割を果たしている（Ｇａｒｄｅｌｌら（２００６年）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌ  １２：６５〜７５）。医学的に重要なリゾ脂質の２つの具体的な例として、ＬＰＡ（グリセロール骨格）およびＳ１Ｐ（スフィンゴイド骨格）がある。他のリゾ脂質を挙げると、スフィンゴシン、リソホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、スフィンゴシルホスホリルコリン（リゾスフィンゴミエリン）、セラミド、セラミド−１−リン酸、スフィンガニン（ジヒドロスフィンゴシン）、ジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸およびＮ−アセチル−セラミド−１−リン酸がある。これとは対照的に、プラズマロゲンは、Ｃ―１（ｓｎ１）においてＯ―アルキル（―Ｏ―ＣＨ２―）またはＯ―アルケニルエーテルをそしてＣ―２においてアシルを含み、リゾ脂質属からは除外される。
【００１６】
選択されたＬＰＡ、Ｓ１Ｐ、およびジヒドロＳ１Ｐの構造を以下に示す。
【化１】
2012511026.tif 000002
【００１７】
ＬＰＡは、単一の分子的実体ではなく、内因性構造変異体の集合であり、異なる長さの脂肪酸および異なる飽和レベルを有する（Ｆｕｊｉｗａｒａら（２００５年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、ｖｏｌ．２８０：３５０３８〜３５０５０）。ＬＰＡの構造骨格は、グリセロールベースのリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）またはホスファチジン酸（ＰＡ））から導出される。Ｓ１Ｐなどのリゾスフィンゴ脂質の場合、セラミド骨格の脂肪酸がｓｎ−２において欠失している。Ｓ１Ｐ、ジヒドロＳ１Ｐ（ＤＨＳ１Ｐ）およびスフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）の構造骨格は、スフィンゴミエリンに由来するスフィンゴシンに基づく。
【００１８】
ＬＰＡおよびＳ１Ｐは、同一クラスの複数の膜貫通ドメインＧプロテインカップルレセプター（ＧＰＣＲ）に結合することにより、多様な細胞シグナル伝達経路を調節する（Ｃｈｕｎ  Ｊ、Ｒｏｓｅｎ  Ｈ（２００６年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ、ｖｏｌ．１２：１６１〜１７１、およびＭｏｏｌｅｎａａｒ、ＷＨ（１９９９年）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．２５３：２３０〜２３８）。Ｓ１Ｐ受容体は、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４およびＳ１Ｐ５（以前はＥＤＧ‐１、ＥＤＧ‐５／ＡＧＲ１６、ＥＤＧ‐３、ＥＤＧ‐６およびＥＤＧ‐８）として分類され、ＬＰＡ受容体は、ＬＰＡ１、ＬＰＡ２、ＬＰＡ３（以前はＥＤＧ‐２、ＥＤＧ‐４、およびＥＤＧ‐７）として分類される。このファミリーの第４のＬＰＡ受容体はＬＰＡ（ＬＰＡ４）として特定され、これらのリゾりん脂質に対する他の推定受容体も報告されている。
【００１９】
リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）
ＬＰＡは、真核細胞および原核細胞双方におけるリン脂質生合成の前駆体として長く知られているが、ごく最近になって、ＬＰＡは活性化細胞（特に血小板）によって高速に生成および放出されるシグナル伝達分子であることが分かっており、特異的な細胞表面受容体上へ作用することにより標的細胞に影響を与える（例えば、Ｍｏｏｌｅｎａａｒら（２００４年）、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ、ｖｏｌ．２６：８７０〜８８１、およびｖａｎ  Ｌｅｅｗｅｎら（２００３）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ、ｖｏｌ  ３１：１２０９〜１２１２を参照）。小胞体中のより複雑なリン脂質としての合成および処理の他に、ＬＰＡは、既存のリン脂質の加水分解後に細胞活性化を行うことによっても生成することができる。例えば、ｓｎ−２位置では脱アシル化に起因して脂肪酸残基が欠失していることが多く、そのため、脂肪酸にエステル化されたｓｎ−１ヒドロキシルのみが残る。その上、ＬＰＡ生成における鍵酵素、自家毒素（リゾＰＬＤ／ＮＰＰ２）が、多くの腫瘍型アップレギュレート自家毒素として癌遺伝子の産物として発生し得る（Ｂｒｉｎｄｌｅｙ、Ｄ．（２００４）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、ｖｏｌ．９２：９００〜１２）。例えば高感度の特異的なＬＣ／ＭＳ手順を用いたヒト血漿および血清中のＬＰＡ濃度の決定について報告されている（Ｂａｋｅｒら（２００１）、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、ｖｏｌ  ２９２：２８７〜２９５）。例えば、新たに調製したヒト血清を２５℃で１時間放置した場合、想定されるＬＰＡ濃度はおよそ１．２μＭであり、ＬＰＡアナログとして１６：０、１８：１、１８：２、および２０：４が優勢種となった。同様に、新たに調製したヒト血漿を２５℃で１時間放置した場合、想定されるＬＰＡ濃度はおよそ０．７μＭであり、１８：１および１８：２ＬＰＡが優勢種となった。
【００２０】
ＬＰＡは、広範囲の生物反応（例えば、細胞増殖の誘導、細胞移動の刺激および神経突起退縮、ギャップ結合閉鎖、およびさらには粘菌走化性）に影響を与える（Ｇｏｅｔｚｌら（２００２年）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ、ｖｏｌ．２：３２４〜３３８）。ＬＰＡ反応性についての細胞系試験がより多く行われるにつれ、ＬＰＡの生物学に関する知識体系も増大し続けている。例えば、細胞の成長および増殖の刺激に加えて、ＬＰＡは、創傷修復および再生において重要なイベントである細胞間張力および細胞表面フィブロネクチン結合を促進することが今や知られている（Ｍｏｏｌｅｎａａｒら（２００４）、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ、ｖｏｌ．２６：８７０〜８８１）。近年、抗アポトーシス活性もＬＰＡに帰するものであり、最近、ペルオキシソーム増殖受容体ガンマはＬＰＡの受容体／標的であることが報告されている（Ｓｉｍｏｎら（２００５）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、ｖｏｌ．２８０：１４６５６〜１４６６２）。ＬＰＡは今や、癌の病因に関与する主要なシグナル伝達分子として認識されている（Ｍｕｒｐｈ、ＭおよびＭｉｌｌｓ、ＧＢ（２００７）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９：１〜１８）。
【００２１】
ＬＰＡは、抗体産生の標的として困難であることが分かっているが、ＬＰＡに対するポリクローナルマウス抗体の産生についての記載が科学文献中にある（Ｃｈｅｎら（２０００年）Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ、ｖｏｌ  １０：１６９１〜３）。
【００２２】
Ｌｐａｔｈでは、ＬＰＡに対するモノクローナル抗体のヒト化を行っており、これについて、米国特許出願第ＵＳ２００８０１４５３６０（代理人ドケット番号ＬＰＴ−３１００−ＵＴ４）中に記載がある。ヒト化抗ＬＰＡ抗体であるＬＴ３０１５は、表面プラズモン共鳴によってピコモルレベルでの結合親和性が示され、ＬＰＡに対して特に特異的である。
【００２３】
モノクローナル抗体の構造および設計
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）クラスの可溶性抗体は、一対の重鎖および軽鎖からなる。これらの重鎖および軽鎖は、鎖内ジスルフィド結合および鎖間ジスルフィド結合によって共に保持され、これにより、特徴的なＹ字型構造が生成される（図１）。タンパク質三次構造について、抗体全体は、免疫系の多くのエフェクター分子に共通するフォールドである免疫グロブリンドメインからなる。重鎖は、１つの可変ドメイン（Ｖｈ）から始まってその後３つの定常ドメイン（Ｃｈ１〜３）が続き、カッパ軽鎖は、１つの可変ドメイン（Ｖｋ）とその後に続く１つの定常ドメイン（Ｃｋ）とからなる。アミノ末端ＶｈおよびＶｋドメイン内の（特に、６個のループ（ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３）内の）可変性に起因するエピトープ結合特異性は、高頻度可変性領域としても知られている。
【００２４】
プロテアーゼパパインによる精製全ＩｇＧ調製の処理により、一対のＣｈ２ドメインおよびＣｈ３ドメインを含むＦｃドメインから、可変ドメインとＣｋドメインおよび定常ドメインの双方からなるＦａｂフラグメントを分離する。Ｆａｂフラグメントは、１つの可変領域全体を保持しているため、抗体とエピトープとの間の１：１の相互作用の生化学的検討において有用なツールとして機能する。さらに、Ｆａｂフラグメントは柔軟性に欠け、また、一般的に天然精製全ＩｇＧ固有のグリコシル化に欠けるため、Ｆａｂフラグメントは一般的には、単結晶ｘ線回折を用いた構造研究において優れたプラットホームである。
【００２５】
現在、２０種類を越える治療用抗体が市販されており、主にヒト化ｍＡｂは高い安全性プロフィールを有しているため、この分野は、最も成長が著しい治療分野である。アバスチン、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ、ＨｕｍｉｒａおよびＲｅｍｉｃａｄｅなどの抗体分子スポンジの大きな成功から、このモードにおける抗体治療の使用は、細胞外空間中の標的（引用例においてはタンパク質成長因子）を中和し、そのリガンドから受容体を欠乏させることにより、癌、ＡＭＤ、炎症および自己免疫疾患の治療においても有効であることが実証されている。
【００２６】
ＬｐａｔｈのＩｍｍｕｎｅＹ２（商標）技術により、細胞外脂質シグナル伝達メディエーターに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成が可能になる。Ｌｐａｔｈでは、ファーストインクラスの治療薬であるヒト化モノクローナル抗体Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ（商標）（ＬＴ１００９；ＳｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂおよびＬＴ１００９は、本明細書中同じ意味として用いられる）を、マウス形態の抗体であるスフィンゴマブ（商標）から導出した。Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂは、生物活性脂質シグナル伝達メディエーターであるスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）を中和する。Ｓ１Ｐは、調節不全血管形成を伴う癌、多発性硬化症、炎症疾病および眼疾患における疾患に貢献する。Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ、ＡＳＯＮＥＰ（商標）のシステム製剤は現在、癌についてのフェーズ１の試験が進んでおり、同一のｍＡｂ、ｉＳＯＮＥＰ（商標）の眼用製剤は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）についてフェーズ１の臨床試験が進んでいる。Ｌｐａｔｈはまた、ヒト化ｍＡｂ  Ｌｐａｔｈｏｍａｂ（商標）（ＬＴ３０１５；ＬｐａｔｈｏｍａｂおよびＬＴ３０１５の名称は、本明細書中同じ意味として用いられる）も近年開発しており、これは、生物活性脂質メディエーターであるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）に対するｍＡｂである。生理学的反応（例えば、細胞接着、運動、細胞骨格変化、増殖、血管形成、神経突起退縮、および細胞生存）の調節に加えて、ＬＰＡは、重症疾患（例えば、癌、線維症、神経因性疼痛、および炎症疾病）の発症および進行にも関与する。
【００２７】
３．定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明の文脈において用いられるいくつかの用語について定義する。これらの用語に加えて、本明細書の他の場所において他の用語についても必要に応じて定義する。本明細書中明示的に定義無き限り、本明細書において用いられる分野の用語は、当該分野において認識されている意味を有する。
【００２８】
「抗体」（「Ａｂ」）または「免疫グロブリン」（Ｉｇ）とは、抗原またはエピトープと結合可能な免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメントから導出されるか、これらの遺伝子またはフラグメントからモデル化されるかまたはコード化された任意の形態のペプチド、ポリペプチドを指す（例えば、ＩＭＭＵＮＯＢＩＯＬＯＧＹ、第５版、Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ、Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ、Ｍ．、Ｗａｌｐｏｒｔ、Ｍ．Ｊ．Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋｅｄ．、ｅｄ．Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２００１年）を参照）。「抗体」という用語は、本明細書中最も広い意味で用いられ、モノクローナル、ポリクローナルまたは多特異性抗体、ミニボディー、ヘテロコンジュゲート、二重特異性抗体、三重特異性抗体、キメラ抗体、合成抗体、抗体フラグメント、および抗原結合活性を保持する親抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはその変異体を用いた結合剤を包含する。本明細書中、抗体とは、親抗体の少なくとも１つの所望の活性を保持するものとして定義される。所望の活性には、抗原に特異的に結合する能力、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでプロレレーションを阻害する能力、ｉｎ  ｖｉｖｏで血管形成を阻害する能力、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでサイトカインプロファイル（単数または複数）を変化させる能力、が含まれ得る。
【００２９】
天然抗体（天然免疫グロブリン）は通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成されることが多い。この重鎖のサイズはおよそ５０ｋＤであり、軽鎖はおよそ２５ｋＤａである。各軽鎖は１つの共有結合ジスルフィド結合によって重鎖へと連結するのが典型的であるが、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖によって異なる。各重および軽鎖はまた、規則的に空間を空けて配置された鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端において、可変ドメイン（ＶＨ）に続いて複数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端において可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他端において定常ドメインを有する。この軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一の定常ドメインとアラインしており、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインとアラインしている。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間の境界をなすと考えられている。
【００３０】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の軽鎖を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる種類に割り当てることができる。これら２種類の軽鎖比率は種によって異なる。一例として、平均的なκ対λの比はマウスにおいて２０：１であり、ヒトにおいて２：１であり、ウシにおいて１：２０である。
【００３１】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。５つのクラスの主要な免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）があり、これらのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）にさらに分割され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、アルファ、デルタ、エプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構造が、周知である。
【００３２】
「抗体誘導体」とは、免疫により誘導された物質（すなわち、抗体由来の分子）である。これには抗体（Ａｂ）または免疫グロブリン（Ｉｇ）が含まれ、また、免疫グロブリン遺伝子に由来するか、免疫グロブリン遺伝子を元にモデル化されたかまたは免疫グロブリン遺伝子によってコード化された任意の形態のペプチド、ポリペプチドあるいは抗原またはエピトープへ結合可能なこのようなペプチドまたはポリペプチドのフラグメントを指す。これには、例えば、抗原に対して所望のレベルの結合活性を保持する抗体変異体、抗体フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、多価抗体、抗体コンジュゲートなどが含まれる。
【００３３】
本明細書中用いられる「抗体フラグメント」とは、インタクトな抗体の一部を指し、インタクトな抗体の抗原結合部位または可変領域を含む。この部分は、インタクトな抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメインを（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を欠いていてもよい。あるいは、定常重鎖ドメインの部分（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を「抗体フラグメント」に含めてもよい。抗体フラグメントは、抗原結合を保持し、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、およびＦｖフラグメント、二重特異性抗体、三重特異性抗体、単一鎖の抗体分子（ｓｃ−Ｆｖ）、ミニボディー、ナノボディー、および抗体フラグメントから形成された多特異性抗体を含む。抗体のパパイン消化により、２つの同一の抗原結合フラグメント（「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる）と、残りの「Ｆｃ」フラグメントとが生成される。２つの「Ｆａｂ」フラグメントはそれぞれ各単一の抗原結合部位を有し、残りの「Ｆｃ」フラグメントという名称は、結晶化が容易であるという能力を反映している。ペプシン処理により、２つの抗原会合部位を有しておりなおかつ抗原架橋能がある２つのＦ（ａｂ’）２フラグメントが生成される。例として、Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。「Ｆｖ」とは、完全な抗原認識・結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの強固な非共有結合の二量体からなる。この構成において、各可変ドメインの３つの高頻度可変性領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位が規定される。これら６つの高頻度可変性領域は、共に抗体に対して抗原結合特異性を付与する。しかし、１つの可変ドメイン（または抗原に対して特異的な高頻度可変性領域を３つだけ含むＦｖの半分）であっても、完全な結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し、抗原と結合することができる。「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含み、これにより、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能になる。ｓＦｖについての総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｖｏｌ．１１３、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２６９〜３１５（１９９４年）を参照されたい。
【００３４】
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントがＦａｂフラグメントと異なる点として、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステイン（単数または複数）を含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に数個の残基が付加されている点がある。本明細書中、Ｆａｂ’―ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を保持しているＦａｂ’を表す。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、本来は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメント対として作製された。他にも、抗体フラグメントの化学的結合が公知である。
【００３５】
本明細書中、「抗体変異体」とは、抗体配列中の１つ以上のアミノ酸残基（単数または複数）が付加、欠失および／または置換されている点において同一抗原に向けられた天然抗体または親抗体のアミノ酸配列と異なる分子であり、また、親抗体の少なくとも１つの所望の活性を保持する分子である。所望の活性は、抗原に特異的に結合する能力、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖を阻害する能力、ｉｎ  ｖｉｖｏで血管形成を阻害する能力、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでサイトカインプロファイルを変化させる能力を含み得る。抗体変異体内のアミノ酸変化（単数または複数）は、軽鎖および／または重鎖の可変領域または定常領域（例えば、Ｆｃ領域、Ｆａｂ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびヒンジ領域）内にあり得る。一実施形態において、変異体は、親抗体の１つ以上の高頻度可変性領域（単数または複数）中の１つ以上のアミノ酸置換（単数または複数）を含む。例えば、変異体は、少なくとも１つの（例えば、約１〜１０のおよび好適には約２〜５の）親抗体の１つ以上の高頻度可変性領域内の置換を含み得る。通常は、変異体が有するアミノ酸配列は、親抗体重または軽鎖可変ドメイン配列とのアミノ酸配列同一性が少なくとも５０％であり、より好適には少なくとも６５％であり、より好適には少なくとも８０％であり、より好適には少なくとも８５％であり、より好適には少なくとも９０％であり、最も好適には少なくとも９５％である。本明細書中、この配列に対する同一性または相同性は、配列をアラインし、必要であればギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後の、親抗体残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義する。Ｎ末端、Ｃ末端もしくは内部延長、欠失または抗体配列中への挿入は、いずれも、配列同一性または相同性に影響を及ぼすものと解釈されるべきではない。変異体は、ＬＰＡと結合する能力を保持し、好ましくは親抗体よりも優れた所望の活性を有する。例えば、変異体は、より強い結合親和性、より高い血管形成低減能力および／またはより高い腫瘍進行抑制能力を持ち得る。このような所望の特性（例えば、免疫原性の低減、半減期の延長、安定性の増強、能力の増強）を分析するには、本明細書中に開示されている生物活性アッセイにおいて抗スフィンゴ脂質抗体の形式がその活性に影響を及ぼすことが分かっていることから、例えば、変異体のＦａｂ型と親抗体のＦａｂ型とを比較するか、あるいは変異体の全長型と親抗体の全長型を比較する。本明細書において特に注目される変異体抗体は、少なくとも約１０フォールド、好適には少なくとも約５、２５、５９％、またはそれ以上の少なくとも１つの所望の活性を示すものであり得る。好ましい変異体は、親抗体と比べて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定されるようなより優れた生物物理学的特性またはｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで測定されるようなより優れた生物学的活性を有するものである。
【００３６】
「抗ＬＰＡ剤」とは、ＬＰＡに結合し、かつ、抗体、抗体変異体、ＬＰＡに結合する抗体由来の分子または非抗体由来の物質ならびにその変異体を含む任意の治療薬を指す。
【００３７】
「抗ＬＰＡ抗体」または「ＬＰＡに反応する免疫誘導部分」とは、ＬＰＡに結合する任意の抗体または抗体由来の分子を指す。これらの定義から分かるように、抗体または免疫誘導部分は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、多様な手段を通じて生成しかつ／または動物（ヒト被験者を含む）から単離してもよい。
【００３８】
「抗Ｓ１Ｐ剤」とは、Ｓ１Ｐに結合し、かつ、抗体、抗体変異体、抗体由来の分子またはＬＰＡに結合する非抗体由来の物質およびその変異体を含む任意の治療薬を指す。
【００３９】
「抗Ｓ１Ｐ抗体」または「Ｓ１Ｐに反応する免疫誘導部分」とは、Ｓ１Ｐに結合する任意の抗体または抗体由来の分子を指す。これらの定義から理解されるように、抗体または免疫誘導部分は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、多様な手段を通じて生成され得かつ／または動物（ヒト被験者を含む）から単離され得る。
【００４０】
「生物活性脂質」とは、脂質シグナル伝達分子を指す。生物活性脂質は、細胞外および／または細胞内シグナル伝達を媒介する点におて構造脂質（例えば、膜結合型リン脂質）から区別されており、そのため、分化、移動、増殖、分泌、生存および他のプロセスを調節することにより多くの種類の細胞の機能の制御に関与している。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、細胞外液中にみられる生物活性脂質は、他の分子（例えば、血清タンパク質（例えば、例えばアルブミンおよびリポタンパク質））と複合体を形成しているか、または「遊離」形態（すなわち、別の分子種と複合体を形成していない）であり得る。細胞外メディエーターとして、いくつかの生物活性脂質は、膜結合型イオンチャネルまたはＧＰＣＲまたは酵素または因子を活性化させ、その結果、細胞の機能または生存に変化をもたらす複雑なシグナル伝達系を活性化させることにより、細胞のシグナル伝達を変更する。細胞内メディエータとして、生物活性脂質は、細胞内成分（例えば、酵素、イオンチャネルまたは構造エレメント（例えば、アクチン））と直接相互作用することにより、作用を及ぼし得る。生物活性脂質の代表例としては、ＬＰＡおよびＳ１Ｐがある。
【００４１】
生物活性脂質の例を挙げると、スフィンゴ脂質（例えば、セラミド、セラミド−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）、スフィンゴシン、スフィンガニン、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）およびスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ））がある。スフィンゴ脂質およびその誘導体および代謝産物は、（スフィンゴミエリン由来の）スフィンゴイド骨格により、特徴付けられる。スフィンゴ脂質およびその誘導体ならびに代謝産物は、重要な細胞過程に対して多面発現効果を有する、細胞外シグナル伝達分子および細胞内シグナル伝達分子のグループを表す。これらは、スルファチド、ガングリオシドおよびセレブロシドを含む。他の生物活性脂質は、グリセロールベースの骨格（例えば、リゾりん脂質（例えば、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）および多様なリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ））、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＡ）、ホスファチジン酸、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、カルジオリピン、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）およびジアシルグリセリド（ＤＧ））により、特徴付けられる。さらに、アラキドン酸由来の生物活性脂質が他にもあり、例えば、エイコサノイド（例えば、エイコサノイド代謝産物（例えば、ＨＥＴＥ、カンナビノイド、ロイコトリエン、プロスタグランジン、リポキシン、エポキシエイコサトリエン酸およびイソエイコサノイド））、非エイコサノイドカンナビノイドメディエーター）がある。他の生物活性脂質（例えば、他のリン脂質およびその誘導体）も本発明に従って使用可能である。
【００４２】
本発明の実施形態において、スフィンゴシンベースの生物活性脂質（スフィンゴイド骨格を有するもの（例えば、スフィンゴシンおよびＳ１Ｐ））とは対照的に、抗体産生のためにグリセロールベースの生物活性脂質（グリセロール由来の骨格を有するもの（例えば、ＬＰＡ））を標的にすると好適な場合がある。他の実施形態において、抗体産生のためにアラキドン酸由来の生物活性脂質を標的にすると良い場合もある。他の実施形態において、スフィンゴイド由来の生物活性脂質ではなく、アラキドン酸由来のおよびグリセロール由来の生物活性脂質が好適である。本発明の文脈において、アラキドン酸由来の生物活性脂質およびグリセロール由来の生物活性脂質を「非スフィンゴイド生物活性脂質」と総称する場合がある。
【００４３】
本発明の生物活性脂質のクラスから具体的に除外されるものとして、主に細胞膜の内葉および／または外葉の構造材として機能するホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリン、その代謝産物および誘導体がある。
【００４４】
抗体または抗体フラグメントまたは変異体の文脈における「生物学的に活性」とは、所望のエピトープと結合することができ、かつ、何らかの方法で生物学的作用を発揮し得る抗体または抗体フラグメントまたは抗体変異体を指す。生物学的効果を非限定的に挙げると、成長シグナルの調節、抗アポトーシスシグナルの調節、アポトーシスシグナルの調節、エフェクター機能カスケードの調節および他のリガンド相互作用の調節がある。
【００４５】
「バイオマーカー」は、疾病の進行または治療の効果を測定する際に有用な特定の分子的特徴を有する体内の特定の生化学物質である。例えば、Ｓ１Ｐは、特定の過剰増殖性状態および／または心血管状態に対するバイオマーカーである。
【００４６】
「心臓治療薬」とは、心臓および心筋疾患および障害によって引き起こされるまたはそのような疾患に関連する疾患に対する治療薬となる薬剤を指す。
【００４７】
「心血管治療」とは、心臓治療（心筋虚血および／または心不全の治療）ならびに心臓血管系に関連する他の疾病（例えば、心臓病）の予防および／または治療を包含する。「心臓病」という用語は、心臓組織または心筋組織に関連する任意の種類の疾病、疾患、外傷または外科的処置を包含する。特に対象となるものとして、組織リモデリングに関連する状態がある。「心臓治療薬」という用語は、心臓および心筋の疾病および疾患に起因するかまたは関連する疾病および疾患の治療に用いられる薬剤を指す。
【００４８】
「担体」とは、ハプテンへのコンジュゲーションによりハプテンを免疫原性とするよう適合された物質を指す。代表的なクラスの担体を非限定的に挙げるとタンパク質があり、その例を挙げると、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、ヘマグルタニン、破傷風、およびジフテリアトキソイドがある。本発明に基づいた使用に適した担体の他のクラスおよび例が当該分野において公知である。上記の天然担体または合成担体ならびに今後発見されるかまたは発明される天然担体または合成担体を、本発明に従った適用に適合させることができる。
【００４９】
本明細書中用いられる「細胞」、「細胞株」および「細胞培養」という表現は、同じ意味として用いられ、このような用語は全て、子孫を含む。そのため、「形質転換体」および「形質転換細胞」という用語は、初代対象細胞と、トランスファーの回数に関係無くそれに由来する培養物とを含む。また、すべての子孫は、意図的な突然変異または故意でない突然変異に起因して、ＤＮＡ内容において正確に同一ではない場合があることが理解される。最初にトランスフォーメーションされた細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。別の命名が意図される場合には、それは文脈から明らかであろう。
【００５０】
「脳血管治療」とは、脳虚血および／または低酸素症に関連する疾患および障害の予防および／または治療に向けられる療法を指す。特に注目されるものとして、限定されるものではないが、心不全を含む心臓病に起因する全虚血から起こる脳虚血および／または低酸素症がある。
【００５１】
「化学療法薬」とは、抗癌剤および他の抗過剰増殖剤を意味する。そのため、化学療法薬は、一般的に治療薬の一部である。化学療法薬の例を非限定的に挙げると、ＤＮＡ傷害薬およびＤＮＡ合成を阻害する薬剤（アントラサイクリン（ドキソルビシン、ドノルビシン、エピルビシン））、アルキル化剤（ベンダムスチン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、イフォスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、ミトタン、マイトマイシン、ピポブロマン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、チオテパ、およびトリエチレンメラミン）、白金誘導体（シスプラチン、カルボプラチン、シスジアミン―ジクロロ白金）、およびトポイソメラーゼ阻害剤（カンプトサー）、抗代謝産物（例えば、カペシタビン、クロロデオキシアデノシン、シタラビン（およびその活性化形態、ａｒａ―ＣＭＰ）、シトシンアラビノシド、デカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、５―フルオロウラシル、５―ＤＦＵＲ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、６―メルカプトプリン、メトトレキサート、ペントスタチン、トリメトレキサート、６―チオグアニン）、抗脈管形成剤（ベバシズマブ、サリドマイド、サニチニブ、レナリドミド、ＴＮＰ−４７０、２―メトキシエストラジオール、ラニビズマブ、ソラフェニブ、エルロチニブ、ボルテゾミブ、ペガプタニブ、エンドスタチン）、血管障害剤（フラボノイド／フラボン、ＤＭＸＡＡ、コンブレタスタチン誘導体（例えば、ＣＡ４ＤＰ、ＺＤ６１２６、ＡＶＥ８０６２Ａなど）、抗体などのバイオロジックス（ヘルセプチン、アバスチン、パノレックス、リツキシン、ゼバリン、マイロターグ、キャンパス、ベキサール、エルビタックス）、内分泌療法、アロマターゼ阻害剤（４―ヒドロアンドロステンジオン、エキセメスタン、アミノグルテヒミド、アナストラゾール、レトゾール）、抗エストロゲン作用薬（タモキシフェン、トレミフィン、ラオキシフェン、ファスロデックス）、ステロイド（例えば、デキサメタゾン）、免疫調節剤（サイトカイン（例えば、ＩＦＮ―βおよびＩＬ２）、インテグリン、他の接着タンパク質およびマトリックスメタロプロテイナーゼに対する阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えば、スベロイルアニリドヒドロキサム酸）、シグナル伝達阻害剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、熱ショックタンパク質阻害剤（例えば、１７―Ｎ―アリルアミノ―１７―デメトキシゲルダナマイシン）、レチノイド（例えば、全てのトランスレチノイン酸）、増殖因子受容体または増殖因子そのものの阻害剤、抗有糸分裂化合物および／またはチューブリン脱重合薬（例えば、タキソイド（パクリタキセル、ドセタキセル、タキソテール、ＢＡＹ５９―８８６２）、ナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビン）、抗炎症薬（例えば、ＣＯＸ阻害剤および細胞周期レギュレーター（例えば、チェックポイントレギュレーターおよびテロメラーゼ阻害剤））がある。
【００５２】
「キメラ」抗体（または免疫グロブリン）という用語は、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属す抗体中の対応する配列と同一または相同であるが、その鎖の残りの部分は別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である重鎖および／または軽鎖を含む分子、ならびに所望の生物活性を示す限り、このような抗体のフラグメントを指す（Ｃａｂｉｌｌｙら、ｉｎｆｒａ；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｖｏｌ．８１：６８５１（１９８４年））。
【００５３】
「併用治療」とは、指示された治療効果を得るために少なくとも２つの異なる療法の提供を含む治療計画を指す。例えば、併用治療は、２種類以上の化学的に異なる有効成分（例えば、速効型化学療法薬および抗脂抗体）あるいは２つの異なる抗体の投与を含み得る。あるいは、併用治療は、他の処置（例えば、放射線療法および／または外科術）の展開を伴う抗脂質抗体の投与を含み得る。さらに、併用治療は、１つ以上の他の生物薬剤（例えば、抗ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦまたはｂＦＧＦ剤）、化学療法薬ならびに他の治療（例えば、放射線療法および／または外科術）を伴う抗脂質抗体の投与を含み得る。２つ以上の化学的に異なる活性成分を用いた併用療法については、これらの有効成分は同じ組成物の一部として投与することもできるし、あるいは異なる組成物として投与することもできることが理解される。別個の組成物として投与する場合、異なる有効成分を含む組成物を、同時または異なる時間に、同じまたは異なる経路で、同じまたは異なる投与計画を用いて投与することができる（全て、特定の背景に応じ、また、担当医の判断に従う）。同様に、単独または１つ以上の化学療法薬と組み合わせた、１以上の抗脂質抗体種、例えば抗ＬＰＡ抗体を、例えば放射線および／または外科術と併用する場合、これらの薬剤（単数または複数）は外科術または放射線処置の前または後に展開することができる。
【００５４】
「定常ドメイン」とは、抗体重鎖または軽鎖のＣ末端領域を指す。一般的に、定常ドメインは、抗原に対する抗体分子の結合特性に直接的な関与はしないが、抗体依存性の細胞傷害における抗体の関与といった種々のエフェクター機能を示す。ここで、「エフェクター機能」とは、Ｆｃドメインと免疫系のタンパク質との分子的相互作用による免疫細胞の動員により媒介される、抗体の多様な生理学的作用（例えば、オプソニン作用、細胞溶解、マスト細胞、好塩基球および好酸球の脱顆粒および他のプロセス）を指す。重鎖のアイソタイプは、抗体の機能的特性を決定する。それらの明瞭に異なる機能特性は、重鎖のカルボキシ末端部分によって付与され、これらの重鎖は軽鎖に関連しない。
【００５５】
「制御配列」とは、特定の宿主生物において作動可能なように連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適した制御配列を挙げると、プロモーター、必要に応じたオペレーター配列およびリボソーム結合サイトがある。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを使用する点が知られている。
【００５６】
「誘導体化生物活性脂質」とは、生物活性脂質（例えば、ＬＰＡ）であり、極性頭部基および少なくとも１つの炭化水素鎖を有し、ここで、炭化水素鎖内の炭素原子は、保護され得るかまたは保護され得ないペンダント反応性基［例えば、スルフヒドリル（チオール）基、カルボン酸基、シアノ基、エステル、ヒドロキシル基、アルケン、アルキン、酸塩化物基またはハロゲン原子］により、誘導体化される。この誘導体化により、分子反応（例えば、担体へのコンジュゲーション）のために生物活性脂質が活性化される。
【００５７】
「誘導体化生物活性脂質コンジュゲート」とは、担体と共有結合的にコンジュゲートされている誘導体化生物活性脂質を指す。担体は、タンパク質分子であってもよいし、あるいはポリエチレングリコール、金コロイド、アジュバントまたはシリコーンビーズなどの物質であってもよい。誘導体化生物活性脂質コンジュゲートは、本発明に従って抗体を生じるために免疫原として使用することができ、同じまたは異なる生物活性脂質コンジュゲートを、このようにして産生された抗体を検出するための検出試薬として使用することもできる。いくつかの実施形態において、誘導体化生物活性脂質コンジュゲートを検出のために使用する場合、当該誘導体化生物活性脂質コンジュゲートは固体支持体に結合されている。
【００５８】
「二重特異性抗体」とは、２つの抗原結合サイトを有する小さな抗体フラグメントを指し、これらのフラグメントは、同じポリペプチド鎖内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ―ＶＬ）。同じ鎖上の２つのドメイン間で対合するには短すぎるリンカーを使用することで、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合して、２つの抗原結合部位を作り出すことを余儀なくされる。二重特異性抗体についてのより詳細については、例えば以下に記載されている（ＥＰ４０４、０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８（１９９３年））。
【００５９】
「有効濃度」とは、例えば特定の望ましくない生物活性脂質の絶対的、相対的および／または利用可能な濃度および／または活性を指す。換言すれば、生物活性脂質の有効濃度は、その生物学的機能を行うために利用可能かつ必要な脂質の量である。本発明において、免疫誘導部分（例えば、生物活性脂質（例えば、Ｃ１Ｐ）に向けられたモノクローナル抗体）は、脂質に結合しそして当該脂質がその生物学的機能を行うことができなくなるようにすることにより、脂質の有効濃度を低減することができる。この例において、脂質そのものは未だ存在している（すなわち、脂質は抗体によって分解するのではない）が、当該脂質はその受容体または他の標的と結合する能力はもはや無く、これにより下流効果が発生するため、絶対濃度ではなく「有効濃度」が適切な測定となる。生物活性脂質の有効濃度を直接的にかつ／または間接的に測定するための方法およびアッセイが存在している。
【００６０】
「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体に由来する抗体抗原結合部分と反応する抗原の部分を指す。
【００６１】
「発現カセット」とは、構造遺伝子（すなわち、本発明の抗体などのタンパク質コード配列）の、このような配列に適合した宿主での発現に影響を及ぼし得るヌクレオチド分子を指す。発現カセットとしては、ポリペプチドコード配列とまた任意選択的に他の配列（例えば、転写終結シグナル）と、作動可能なように連結された少なくとも１つのプロモーターがある。また、発現の達成に必要または有用な付加的調節エレメント（例えば、エンハンサー）を用いてもよい。よって、発現カセットは、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、任意の形態の組換え型の「裸のＤＮＡ」ベクターなどに含まれる。
【００６２】
「完全ヒト抗体」とは、遺伝子操作が施された（すなわち、トランスジェニックの）マウス（例えば、Ｍｅｄａｒｅｘからのもの）内において産生された抗体を指し得、このような抗体は、免疫原と共に存在すると、必ずしもＣＤＲグラフトを必要としないヒト抗体が産生され得る。これらの抗体は、動物（例えば、マウス）からの完全ヒト（１００％のヒトタンパク質配列）であり、これらの抗体において、非ヒト抗体遺伝子は抑制され、ヒト抗体遺伝子発現と置換される。出願人の考えによれば、関連ＣＤＲのためのヒトフレームワークを産生し得るこれらの遺伝子操作が施されたマウスまたは他の動物に生物活性脂質を付与した場合、生物活性脂質に対して抗体が産生され得る。
【００６３】
「ハプテン」とは、非免疫原性であるが抗体または抗体由来の抗原結合部分と反応することが可能な物質である。換言すれば、ハプテンは、免疫原性ではなく抗原性を有する。ハプテンは一般的には小さな分子であり、ほとんどの状況下において、担体（例えば、タンパク質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金コロイド、シリコーンビーズなど）に付着している場合のみに、免疫反応を示すことができる（すなわち、抗原として機能することができる）。担体は、担体自身は免疫反応を示さないものであってもよい。代表的なクラスのハプテン分子を非限定的に挙げると、タンパク質（例えば、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、ヘマグルタニン、破傷風、およびジフテリアトキソイド）がある。ハプテン分子の他のクラスおよび例が、当該分野において公知である。上記の天然ハプテンまたは合成ハプテンならびに今後発見されるかまたは発明される天然ハプテンまたは合成ハプテンは、本発明に従った適用に適合させることができる。
【００６４】
「ヘテロ共役抗体」とは、２つの共有結合的に結合された抗体を指す。このような抗体は、架橋剤の使用を含む合成タンパク質化学における公知の方法を用いて作製することができる。本明細書において用いられる「コンジュゲート」とは、１以上の抗体フラグメント（単数または複数）または結合部分と１以上のポリマー分子（単数または複数）の共有結合によって形成された分子を指す。
【００６５】
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体とは、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。あるいは、別の見方をすれば、ヒト化抗体とは、ヒト配列の代わりに非ヒト（例えば、マウス）抗体からの選択された配列を含むヒト抗体である。ヒト化抗体は、保存的アミノ酸置換、またはその結合活性および／または生物活性を有意に変化させない、同じ種または異なる種に由来する非天然残基を含み得る。このような抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、ほとんどの部分では、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特性を有するマウス、ラット、ラクダ、ウシ、ヤギまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基で置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合によって、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基と置換される。
【００６６】
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含むこともできる。これらの改変、は抗体の性能をさらに精密にし、最大限とするために行われる。そのため、一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つのそして一局面において２つの可変ドメイン全てを含み、ここで、非ヒト免疫グロブリンのものに対応する全ての高頻度可変性ループまたは高頻度可変性ループの全てと、全てのまたは実質的に全てのＦＲ領域とは、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意選択的に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）のうち少なくとも一部またはヒト免疫グロブリンのＦｃのうち少なくとも一部を含む（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許第０，１２５，０２３Ｂ１号、Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号、Ｂｏｓｓら、欧州特許第０，１２０，６９４Ｂ１号、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ８６／０１５３３、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，欧州特許第０，１９４，２７６Ｂ１号、Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号、Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００Ｂ１号、Ｐａｄｌａｎら、欧州特許出願第０，５１９，５９６Ａ１号、Ｑｕｅｅｎら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、ｖｏｌ．８６：１００２９〜１００３３を参照。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５（１９８６年）、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２９（１９８８年）、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ。Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６（１９９２年）およびＨａｎｓｅｎ、ＷＯ２００６１０５０６２を参照）。
【００６７】
「過剰増殖性疾患」とは、制御不可能な細胞増殖に関連する疾患および障害（その例を非限定的に挙げると、癌または新生物および良性腫瘍の原因となる器官および組織の細胞の制御されない増殖を含む）を指す。内皮細胞に関連する過剰増殖性障害は、血管腫、子宮内膜症、肥満、加齢性黄斑変性および種々の網膜症などの脈管形成の疾患、ならびにアテローム性動脈硬化症の処置におけるステント留置の結果として再狭窄を引き起こす内皮細胞および平滑筋細胞の増殖などを含む。繊維芽細胞を含む過剰増殖性障害（例えば、繊維形成）を非限定的に挙げると、過剰瘢痕化疾患（すなわち、線維症）（例えば、加齢による黄斑変性症、心筋梗塞に関連する心臓リモデリングおよび心不全）、過剰創傷治癒（例えば、外科術または損傷、ケロイド、および繊維性腫瘍およびステント留置の結果として通常発生するもの）がある。
【００６８】
「免疫誘導部分」とは、任意の抗体（Ａｂ）または免疫グロブリン（Ｉｇ）を含み、免疫グロブリン遺伝子由来の、免疫グロブリン遺伝子に基づいてモデル化されたかまたは免疫グロブリン遺伝子によってコードされた任意の形態のペプチド、ポリペプチド、あるいは抗原またはエピトープに結合可能なこのようなペプチドまたはポリペプチドのフラグメントを指す（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第５版、Ｊａｎｅｗａｙ、Ｔｒａｖｅｒｓ、Ｗａｌｐｏｒｔ、Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋｅｄ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２００１年）を参照）。本発明において、抗原は、脂質分子（例えば、生物活性脂質分子）である。
【００６９】
「免疫原」とは、免疫原が投与された動物において特異的免疫応答（特に抗体応答）を誘導し得る分子である。本発明において、免疫原は、担体にコンジュゲートされた誘導体化生物活性脂質（すなわち、「誘導体化生物活性脂質コンジュゲート」）である。免疫原として用いられる誘導体化生物活性脂質コンジュゲートは、免疫原に応答して生成される抗体の検出のための捕捉材料として使用することができる。そのため、免疫原は検出試薬としても使用可能である。あるいは、捕捉材料として用いられる誘導体化生物活性脂質コンジュゲートは、免疫原におけるものとは異なるリンカーおよび／または担体物質を有し得る。
【００７０】
「ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ」という表現は、自然プロセスまたは実験室プロセスをモデル化したコンピュータシミュレーションを指す。
【００７１】
「阻害」とは、特に生物学的現象の文脈において、低減、抑制または遅延を意味する。例えば、「腫瘍形成の阻害」をもたらす処置は、腫瘍を全く形成しないこと、または無治療対照群の場合よりも腫瘍形成が遅いかまたは腫瘍数が少ないことを意味し得る。
【００７２】
「単離された」抗体とは、その天然環境の成分から同定および分離および／または回収された抗体である。その天然環境の夾雑成分は、抗体の診断上または治療上の使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモンおよびその他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含み得る。好適な実施形態において、抗体は、（１）ローリー法によって測定した場合に抗体が９５重量％を超える、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によって少なくとも１５残基のＮ末端または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、または（３）コオマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いた還元または非還元条件下でのＳＤＳ―ＰＡＧＥにより均質となるまで、精製される。単離された抗体には、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないことから、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕ抗体を含む。しかしながら、通常、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により、調製される。
【００７３】
本明細書中用いられる「標識」とは、抗体に直接的または間接的にコンジュゲートされている検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体で検出可能であるか（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）、または、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物または組成物の化学変化を触媒し得る。
【００７４】
「リガンド」とは、生体分子に結合し、生体分子と共に複合体を形成して、生物学的目的を果たすことが可能な物質である。そのため、抗原は、抗原が結合する抗体のリガンドとして記述することができる。
【００７５】
「リポソーム」とは、薬剤（本明細書に開示される抗スフィンゴ脂質抗体、および任意選択的に化学療法薬など）を哺乳類にデリバリーするのに有用な多様な種類の脂質、リン脂質および／または界面活性剤からなる小胞である。リポソームの成分は、一般的に、生体膜の脂質配置と類似した二重層の形に配置されている。「単離された」核酸分子は、天然源の抗体核酸において通常会合されている少なくとも１種類の夾雑核酸分子から同定および分離されている核酸分子である。単離された核酸分子は、自然状態で見られる形態または状態以外にある。従って、単離された核酸分子は、天然細胞中に存在している場合の核酸分子とは区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、例えば核酸分子が天然細胞の場合と異なる染色体位置にある抗体を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
【００７６】
本発明の文脈において、「液体組成物」とは、製造者からエンドユーザー（例えば、医師または看護士）へ供給される充填済みの最終形態において、固体とは対照的な液体または溶液であるものを指す。ここで、「固体」とは、液体または溶液でない組成物を指す。例えば、固体としては、リオフィライゼーション、凍結乾燥、沈殿および同様の手法によって調製された乾燥組成物が含まれる。
【００７７】
「線状抗体」という表現は、本出願において用いられる場合、ＺａｐａｔａらによるＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７〜１０６２（１９９５年）に記載されている抗体を指す。簡潔に言うと、これらの抗体は、１対の抗原結合領域を形成する１対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ―ＣＨ１―ＶＨ―ＣＨ１）を含む。線状抗体は、二重特異性または単一特異性である。
【００７８】
「代謝産物」とは、ＬＰＡが作製される原料となる化合物およびＬＰＡの分解から生じる化合物（すなわち、リゾりん脂質代謝経路に関与する化合物）を指す。「代謝前駆体」という用語は、スフィンゴ脂質が作製される原料となる化合物を指す際に用いることができる。
【００７９】
本明細書中用いられる「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体または前記抗体の集合を指す。その集団に含まれる個々の抗体は、わずかな量で存在し得る自然発生突然変異の可能性があること以外は、本質的に同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位に向けられている。さらに、一般に異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられている。修飾詞「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られたという抗体の特徴を示すものであり、その抗体をいずれかの特定の方法によって生産することが必要である旨を示すものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５年））によって初めて記載されたハイブリドーマ法によって作製することができるか、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作製することができる。「モノクローナル抗体」はまた、例えばＣｌａｃｋｓｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８（１９９１年））およびＭａｒｋｓら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７（１９９１年））に記載されている技術または当該分野において公知の他の方法を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。本明細書中、モノクローナル抗体は特に、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属す抗体の対応する配列と同一または相同であるが、その鎖の残りの部分は、別種に由来する、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属す抗体、ならびに所望の生物活性を示す限りは、そのような抗体のフラグメンの対応する配列と同一または相同であるキメラ抗体を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１〜６８５５（１９８４年））。
【００８０】
「単剤療法」とは、単回投与としての投与であれ、経時的に数回の投与であれ、１種類の治療的に有効な量の化合物のデリバリーに基づく治療計画を指す。
【００８１】
「多特異性抗体」とは、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体またはモノクローナル抗体を指し得る。一実施形態において、これらのエピトープは、同じ抗原に由来する。別の実施形態において、これらのエピトープは、２つ以上の異なる抗原に由来する。多特異性抗体を作製する方法は、当技術分野において公知である。多特異性抗体を挙げると、（２つのエピトープに対して結合特性を有する）二重特異性抗体、三重特異性抗体（３つのエピトープ）などがある。例えば、多特異性抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現を用いて、組換え的に産生させることができる。あるいは、多特異性抗体は、化学的結合を用いて作製することもできる。当業者ならば、これらの方法または当技術分野で公知であるような他の方法を用いて、多特異性抗体を生産することができる。多特異性抗体は、多特異性抗体フラグメントを含む。本発明に包含される多特異的な抗体（この場合、二重特異性な抗体）の一例として、Ｓ１ＰエピトープおよびＣ１Ｐエピトープに対して結合特性を有する抗体があり、従って、この抗体は、Ｓ１ＰおよびＣ１Ｐの双方を認識し、それらと結合することができる。本発明に包含される二重特異性抗体の別の例として、生物活性脂質由来のエピトープおよび細胞表面抗原由来のエピトープに結合特性を有する抗体がある。よって、この抗体は生物活性脂質を認識し、当該生物活性脂質と結合することができ、例えば標的化のために細胞を認識し、当該細胞と結合することができる。
【００８２】
「新生物」または「癌」とは、異常かつ制御不能な細胞成長を指す。「新生物」または腫瘍とは、異常でり、制御されずかつ無秩序な細胞成長の増殖であり、一般に癌と呼ばれる。新生物は良性または悪性であり得る。破壊的な増殖、浸潤性および転移の特性を持つ新生物は、悪性または癌性である。浸潤性とは、一般に組織の境界を規定している基底膜を破り、それによりしばしば身体の循環系に入り込む、周囲組織の浸潤または破壊による新生物の局部的拡散を指す。転移とは、典型的には、リンパ管または血管による腫瘍細胞の伝播を指す。転移とはまた、漿液腔、またはくも膜下もしくは他の空間を通じた直接的拡大による腫瘍細胞の移動を指す。転移の過程を通じて、腫瘍細胞の身体の他の部位への移動により、最初出現部位から遠隔領域へと新生物が形成される。
【００８３】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係におかれている場合に、「作動可能なように連結されている」。例えば、あるポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現させる場合には、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡがそのポリペプチドのＤＮＡに作動可能なように連結され、ある配列の転写に影響を及ぼす場合には、プロモーターまたはエンハンサーがそのコード配列に作動可能なように連結され、あるいは翻訳を容易にするように配置される場合には、リボソーム結合部位がコード配列に作動可能なように連結される。一般的に、「作動可能なように連結される」とは、連結される核酸分子が隣接していること、分泌リーダーの場合には、隣接しかつ読み取り相にあること、を意味する。しかし、エンハンサーは隣接していなくてもよい。連結は、好都合な制限部位における連結反応により、達成される。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来方法に従って用いられる。
【００８４】
本明細書中、「親」抗体とは、変異体の作製に用いられるアミノ酸配列によってコードされているものである。親抗体は、天然抗体であり得るか、または、変異体（例えば、キメラ抗体）であり得る。例えば、親抗体は、ヒト化またはヒト抗体であり得る。
【００８５】
本発明の「特許性のある」組成物、方法、装置、または製品とは、分析が実施される時点においてその内容が特許性に関する全ての法定要件を満たすことを意味する。例えば、新規性、非自明性などに関して、後の調査により、１以上のクレームが新規性、非自明性などを否定することになる１以上の実施形態を包含することが明らかになった場合、「特許性のある」実施形態に限定されるクレーム（単数または複数）は、当然ながら、具体的に特許性のない実施形態（単数または複数）を排除する。また、本明細書に添付したクレームは、最も広い妥当な範囲を提供するとともに、それらの有効性を保持するものとして解釈されるである。さらに、特許性に関する１以上の法定要件が訂正されるか、あるいは、本願が特許として出願または発行される時点から１以上の添付クレームの妥当性が疑問視される時点までにおいて、特許性に関する特定の法定要件を満たすかどうかを評価するための基準が変化する場合には、クレームは、（１）それらの有効性を保持し、（２）その状況下において最も広い妥当な解釈を提供するものと解釈されるべきである。
【００８６】
「薬学上許容される塩」とは、本発明の薬剤および化合物の生物学的有効性および特性を保持し、かつ、生物学的にまたは他の点において不都合がない塩を指す。多くの場合、本発明の薬剤および化合物は、荷電基（例えば、荷電アミノ基および／またはカルボキシル基またはそれに類似する基）の存在に起因して、酸塩および／または塩基塩を形成することができる。薬学上許容される酸付加塩は、無機酸および有機酸から製造することができ、薬学上許容される塩基付加塩は、無機および有機塩基から製造することができる。薬学上許容される塩の総説に関しては、Ｂｅｒｇｅら（１９７７年）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．６６，１〜１９を参照されたい。
【００８７】
「複数（の）」とは、１を超えることを意味する。
【００８８】
「プロモーター」という用語は、細胞内のコード配列の転写を駆動し得る全ての配列を含む。よって、本発明の構築物において用いられるプロモーターは、遺伝子転写の時期および／または速度の調節または変調に関与するシス作用制御エレメントおよび調節配列を含む。例えば、プロモーターは、転写調節に関与するシス作用転写制御エレメント（例えば、エンハンサー、プロモーター、転写ターミネーター、複製起点、染色体組込み配列、５’および３’非翻訳領域、またはイントロン配列を）であり得る。本発明での使用に好適な転写調節領域を非限定的に挙げると、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、および原核生物のまたは真核細胞またはそれらのウイルスにおいて遺伝子発現を制御することが知られている他のプロモーターがある。
【００８９】
「組換えＤＮＡ」とは、ヒトにより操作、作出または改変された核酸およびそれらから発現される遺伝子産物を指す。「組換え」ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって、例えば、所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードする外来ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から産生されたポリペプチドまたはタンパク質である。「合成」ポリペプチドまたはタンパク質は、化学合成によって製造されたものである。
【００９０】
「分離された」、「精製された」、「単離された」および同様の用語は、サンプルを収容する容器内に含まれるサンプルの１つ以上のコンポーネントが、容器内に存在する１つ以上のその他のサンプルコンポーネントの存在下で、物理的に除去されるかまたは希釈されるか、あるいはされていることを意味する。分離または精製ステップ中に除去または希釈され得るサンプル成分を挙げると、化学反応生成物、非反応化学物質、タンパク質、炭水化物、脂質、および非結合分子がある。
【００９１】
「固相」とは、非水性マトリックス（例えば、本発明の抗体が接着可能である非水性マトリックス）を意味する。本明細書に包含される固相の例としては、部分的または完全にガラスからなるもの（例えば、細孔性ガラス）、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコーンが挙げられる。特定の実施形態において、文脈にもよるが、固相はアッセイプレートのウェルを含んでもよく、他には精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）がある。この用語はまた、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されているものなどの離散粒子の不連続な固相も含む。
【００９２】
本明細書中、「種」は、多様な文脈で用いられる（例えば化学療法剤の特定の種）。それぞれの文脈において、この用語は、特定の文脈において言及される種類の化学的に区別できない分子の集団を指す。
【００９３】
「特異的」または「特異性」とは、抗体・抗原の相互作用の文脈において、抗体とその標的エピトープとの間の選択的な非無作為相互作用を指す。ここで、「抗原」という用語は、抗体分子または他の免疫誘導部分により認識され、結合する分子を指す。抗体が結合する抗原の特異的部分は、「エピトープ」と呼ばれる。この相互作用は、これらの分子間の適切な化学的または分子的な相互作用を可能にする構造内の疎水性／親水性および／または静電気的な特色の存在に依存する。そのため、抗体は、その標的抗原のエピトープと「結合する」（または「特異的に結合する」）あるいはその標的抗原のエピトープ「に反応性がある」（または「特異的に反応性がある」）（または同等に「に対して反応性がある」）あるいは同等にその標的抗原のエピトープ「に対して反応性がある」（または「に対して特異的に反応性がある」）と一般的に言うことができる。抗体は、当技術分野で一般的に、抗体の抗原との結合に関して、抗原「に対して」または短く「に」と記載される。そのため、「Ｃ１Ｐに結合する抗体」、「Ｃ１Ｐに対して反応性がある抗体」、「Ｃ１Ｐに反応する抗体」、「Ｃ１Ｐに対する抗体」、および「抗Ｃ１Ｐ抗体」は全て、当該分野において同じ意味を有する。抗体分子の結合特異性についての試験は、所望の抗原に対する結合と、無関連の抗原または類似体抗原または抗原混合物に対する結合とを付与された一連の条件下において比較することにより、行うことができる。好適には、本発明による抗体は、無関連の抗原と、または標的抗原の類似体とさえ、有意な結合をしない。「特異的に会合する」および「特異的会合」などとは、２つの分子間の特異的な非無作為の相互作用を指し、この相互作用は、分子間の適切な化学的または分子的相互作用を可能とする構造的、疎水的／親水的、および／または静電的特徴の存在に依存する。
【００９４】
本明細書中用いられる「スフィンゴ脂質」という用語は、当該分野においてスフィンゴ脂質として知られているクラスの化合物を指し、その例を非限定的に挙げると、以下の化合物がある（対応する化合物の化学式、構造等の情報については、ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｌｉｐｉｄｍａｐｓ．ｏｒｇを参照）。
スフィンゴイド塩基［ＳＰ０１］
スフィング―４―エニン（スフィンゴシン）［ＳＰ０１０１］
スフィンガニン［ＳＰ０１０２］
４−ヒドロキシスフィンガニン（フィトスフィンゴシン）［ＳＰ０１０３］
スフィンゴイド塩基ホモログおよび変異体［ＳＰ０１０４］
スフィンゴイド塩基１−リン酸［ＳＰ０１０５］
リゾスフィンゴミエリンおよびリゾグリコスフィンゴ脂質［ＳＰ０１０６］
Ｎ―メチル化スフィンゴイド塩基［ＳＰ０１０７］
スフィンゴイド塩基アナログ［ＳＰ０１０８］
セラミド［ＳＰ０２］
Ｎ―アシルスフィンゴシン（セラミド）［ＳＰ０２０１］
Ｎ―アシルスフィンガニン（ジヒドロセラミド）［ＳＰ０２０２］
Ｎ―アシル―４−ヒドロキシスフィンガニン（フィトセラミド）［ＳＰ０２０３］
アシルセラミド［ＳＰ０２０４］
セラミド１−リン酸［ＳＰ０２０５］
ホスホスフィンゴ脂質［ＳＰ０３］
セラミドホスホコリン（スフィンゴミエリン）［ＳＰ０３０１］
セラミドホスホエタノールアミン［ＳＰ０３０２］
セラミドホスホイノシトール［ＳＰ０３０３］
ホスホノスフィンゴ脂質［ＳＰ０４］
中性グリコスフィンゴ脂質［ＳＰ０５］
単純Ｇｌｃ系（ＧｌｃＣｅｒ、ＬａｃＣｅｒなど）［ＳＰ０５０１］
ＧａｌＮＡｃｂ１−３Ｇａｌａ１−４Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃ−（Ｇｌｏｂｏ系）［ＳＰ０５０２］
ＧａｌＮＡｃｂ１−４Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃ−（Ｇａｎｇｌｉｏ系）［ＳＰ０５０３］
Ｇａｌｂ１−３ＧｌｃＮＡｃｂ１−３Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃ−（Ｌａｃｔｏ系）［ＳＰ０５０４］
Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ１−３Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃ−（Ｎｅｏｌａｃｔｏ系）［ＳＰ０５０５］
ＧａｌＮＡｃｂ１−３Ｇａｌａ１−３Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃ−（ＩｓｏＧｌｏｂｏ系）［ＳＰ０５０６］
ＧｌｃＮＡｃｂ１−２Ｍａｎａ１−３Ｍａｎｂ１−４Ｇｌｃ−（Ｍｏｌｌｕ系）［ＳＰ０５０７］
ＧａｌＮＡｃｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ１−３Ｍａｎｂ１−４Ｇｌｃ−（Ａｒｔｈｒｏ系）［ＳＰ０５０８］
Ｇａｌ−（Ｇａｌａ系）［ＳＰ０５０９］
他［ＳＰ０５１０］
酸性グリコスフィンゴ脂質［ＳＰ０６］
ガングリオシド［ＳＰ０６０１］
スルホグリコスフィンゴ脂質（スルファチド）［ＳＰ０６０２］
グルクロノスフィンゴ脂質［ＳＰ０６０３］
ホスホグリコスフィンゴ脂質［ＳＰ０６０４］
他［ＳＰ０６００］
塩基性グリコスフィンゴ脂質［ＳＰ０７］
両性グリコスフィンゴ脂質［ＳＰ０８］
砒素スフィンゴ脂質［ＳＰ０９］
【００９５】
本発明は、抗スフィンゴ脂質抗体などの抗脂剤に関する。これらの抗スフィンゴ脂質抗体は、以下にさらに詳細に記載されるように、過剰増殖性疾患（例えば、癌および心臓血管または脳血管障害および疾患および多様な眼疾患）の治療または予防に有用である。本発明は、特に、Ｓ１Ｐに対する抗体およびその変異体に関し、その例を以下に非限定的に挙げる。スフィンゴシン−１−リン酸［スフィンゲン−１−リン酸；Ｄ―エリスロ―スフィンゴシン−１−リン酸；スフィング―４―エニン−１−リン酸；（Ｅ、２Ｓ、３Ｒ）―２―アミノ―３―ヒドロキシ―オクタデク―４―エノキシ］ホスホン酸（ＡＳ２６９９３―３０―６）、ＤＨＳ１Ｐは、ジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸［スフィンガニン−１−リン酸；［（２Ｓ、３Ｒ）―２―アミノ―３―ヒドロキシ―オクタデコシ］ホスホン酸；Ｄ―エリスロ―ジヒドロ―Ｄ―スフィンゴシン−１−リン酸（ＣＡＳ１９７９４―９７―９］として定義され；ＳＰＣは、スフィンゴシルホスホリルコリン、リゾスフィンゴミエリン、スフィンゴシルホスホコリン、スフィンゴシンホスホリルコリン、エタンアミニウム；２―（（（（２―アミノ―３―ヒドロキシ―４―オクタデセニル）オキシ）ヒドロキシホスフィニル）オキシ）―Ｎ、Ｎ、Ｎ―トリメチル―、クロリド、（Ｒ―（Ｒ＊、Ｓ＊―（Ｅ）））、２―［［（Ｅ、２Ｒ、３Ｓ）―２―アミノ―３―ヒドロキシ―オクタデク―４―エノキシ］―ヒドロキシ―ホスホリル］オキシエチル―トリメチル―アザニウムクロリド（ＣＡＳ１０２１６―２３―６）。
【００９６】
「スフィンゴ脂質代謝産物」とは、スフィンゴ脂質が作られる元となる化合物および特定のスフィンゴ脂質の分解から生じる化合物を指す。換言すれば、「スフィンゴ脂質代謝産物」は、スフィンゴ脂質代謝経路に関与する化合物である。代謝産物は、代謝前駆体および代謝生成物を含む。「代謝前駆体」とは、スフィンゴ脂質が作られる元となる化合物を指す。特に注目される代謝前駆体を非限定的に挙げると、ＳＰＣ、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴシン、ジヒドロセラミド、および３−ケトスフィンガニンがある。「代謝生成物」とは、スフィンゴ脂質の分解から生じる化合物（例えば、ホスホリルコリン（例えば、ホスホコリン、コリンホスフェート）、遊離脂肪酸などの脂肪酸、およびヘキサデカナール（例えば、パルミトアルデヒド）を指す。
【００９７】
本明細書中、「安定な」とは、２つの分子（例えば、ペプチドとＴＬＲ分子）が所望の目的または操作のために維持され得るのに十分安定である、２分子間の相互作用を指す。例えば、ペプチドとＴＬＲ分子の間の「安定な」相互作用とは、そのペプチドが、所望の効果を達成するのに十分な期間にわたってＴＬＲ分子と結合しかつ結合を維持するものを指す。
【００９８】
「対象」または「患者」とは、本発明の分子によって達成され得る処置を必要とする動物を指す。本発明に従って治療され得る動物としては、脊椎動物、哺乳類（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタおよび霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類を含む））などの動物が特に好ましい例である。
【００９９】
「サロゲートマーカー」とは、病態に対する処置の効果を間接的に示す、体内の生物活性の検査指標を指す。過剰増殖性症状および／または心血管症状に関するサロゲートマーカーの例としては、ＳＰＨＫおよび／またはＳ１ＰＲがある。
【０１００】
「治療薬」とは、治療効果を提供することを意図した薬剤または化合物を指し、その例を非限定的に挙げると、抗炎症薬（例えば、ＣＯＸ阻害剤および他のＮＳＡＩＤＳ）、抗脈管形成剤薬、上記にて定義したような化学療法薬、心血管剤、免疫調節薬、神経変性疾患の治療に用いられる薬、眼用薬、抗線維化剤などがある。
【０１０１】
「治療上有効な量」（または「有効量」）とは、当該治療を必要としている対象に投与した際に当該治療を達成するのに十分な有効成分（例えば、本発明の薬剤）の量を指す。そのため、本発明の組成物の治療上有効な量を構成するものは、当業者であれば容易に決定することができる。癌治療の文脈において、「治療上有効な量」とは、癌細胞の生存または代謝に関連する１以上のパラメーターにおいて客観的に測定される変化をもたらすもの（例えば、特定の癌に関連する１以上の遺伝子の発現の増強または低減、腫瘍負荷の低減、癌細胞の溶解、生体サンプル（例えば、生検、および全血、血漿、血清、尿などの体液の分注）における１以上の癌細胞死マーカーの検出、誘導型アポトーシスまたは他の細胞死経路の誘導など）である。もちろん、治療上有効な量は、処置される特定の対象および症状、対象の体重および年齢、病態の重篤度、選択される特定の化合物、準拠すべき投与計画、投与タイミング、投与様式などによって異なり、これらは全て、当業者であれば容易に決定することができる。併用療法の文脈において、治療上有効な量の特定の有効成分の詳細は、単剤療法（すなわち、有効成分として１つの化学種だけを用いる治療計画）として投与される場合の治療上有効な量の有効成分の詳細とは異なり得る。
【０１０２】
本発明の組成物は、生物活性脂質ベースの治療方法において用いられる。本明細書中用いられる「治療」および「治療的」という用語は、全ての範囲の疾病、疾患または外傷の予防および／または治療を包含する。本発明の「治療」剤は、リスクがあると特定され得る個体に対してデザインされた手順を組み込んだものを含む予防的または回避的な様式（薬理遺伝学）、または本質的に緩和的または治癒的な様式で働く場合もあるし、あるいは処置される疾患または障害の少なくとも１つの症状の進行の速度または程度を緩慢にする働きをする場合もあるし、あるいは必要な時間、不快感もしくは痛みの存在もしくは程度、または疾患、障害もしくは物理的外傷からの回復に関連する物理的制限を最小化する働きをする場合もあるし、あるいは他の療法および処置に対する補助として使用される場合もある。「治療」または「治療する」とは、疾病または疾患の任意の処置を意味し、例えば、疾患または障害に対する防止または保護（すなわち、臨床徴候を発症させないこと）；疾患または障害の阻害（すなわち、臨床徴候の発症の阻止または抑制）；および／または疾患または障害の緩和（すなわち、臨床徴候を回復させること）を含む。当然のことながら、疾患または障害の「防止」と「抑制」の間の区別は、最終的に誘発される事象が未知であり、または潜在性である場合もあるため、常に可能であるわけではない。「処置を必要としている」者とは、疾患を既に持っている者および疾患を予防すべき者が含まれる。よって、「予防」とは、「防止」と「抑制」の双方を含む「処置」の一種をなすと理解される。よって、「処置」には「予防」が含まれる。
【０１０３】
「治療計画」とは、化学療法薬および細胞毒性薬、放射線療法、外科術、遺伝子療法、ＤＮＡワクチンおよび療法、ｓｉＲＮＡ療法、抗脈管形成療法、免疫療法、骨髄移植、アプタマーおよび他の生物製品（抗体および抗体変異体など）、受容体デコイおよび他のタンパク質に基づく治療薬を用いた、任意の疾患または障害の処置を意味する。
【０１０４】
抗体の「可変」領域は、フレームワークおよび相補性決定領域（ＣＤＲ、高頻度可変性領域としても知られる）を含む。可変性は、抗体の可変ドメインにおいて均等に分布していない。可変性は、６個のＣＤＲセグメントに集中しており、これら６個のセグメントはそれぞれ３つずつ軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメイン内にある。可変ドメインのより保存性の高い部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、４つのＦＲ（それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含み、主として、３つの高頻度可変性領域によって接続されたβ―シート構造をとり、このβ―シートを接続し、場合によってはその一部をなすループを形成している。「高頻度可変性領域」という用語は、本明細書中において用いられる場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。高頻度可変性領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基を含む（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）および重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年））ならびに／または「高頻度可変性ループ」由来の残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、および重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７年））。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基とは、本明細書中に定義されているような高頻度可変性領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１０５】
当該分野において、アミノ酸残基のナンバリングのための１つを超えるシステムが一般的に用いられている点に留意されたい。上記のＣＤＲは、Ｋａｂａｔのナンバリング方式に従って記述およびナンバリングされている（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年））が、連続的ナンバリングを用いてもよい。連続的ナンバリングおよびＫａｂａｔナンバリングは、ＬＴ１００９軽鎖全体において同じであり、ＬＴ１００９重鎖内において位置５２まで同じである。重鎖（ＶＨ）において、Ｋａｂａｔナンバリングによれば、位置５２後に単一の残基挿入があり、位置８２後に３つの残基挿入があり、位置１００後に４つの残基挿入がある。そのため、Ｋａｂａｔシステムに従ったこれらの挿入を反映するように、５２Ａ、１００Ａ、１００Ｃなどと残基をナンバリングすることができるようにみえる。
【０１０６】
各鎖内の高頻度可変性領域は、ＦＲに近接して共に保持され、他の鎖からの高頻度可変性領域は、抗体の抗原結合部位の形成に貢献する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年）、６４７〜６６９ページを参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接的には関与しないが、多様なエフェクター機能（例えば、抗体依存性の細胞傷害性に対する抗体の関与）を示す。
【０１０７】
「ベクター」または「プラスミド」または「発現ベクター」とは、１以上の組換え遺伝子の発現を果たすために細胞内で一時的または安定的に維持可能な核酸を指す。ベクターは、単独のまたは他の化合物と複合体を形成した核酸を含み得る。ベクターは、任意選択的に、ウイルスまたは細菌核酸および／またはタンパク質、および／または膜を含む。ベクターを非限定的に挙げると、ＤＮＡ断片を結合させ、複製可能となるレプリコン（例えば、ＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）がある。よって、ベクターを非限定的に挙げると、ＲＮＡ、自律的自己複製環状または直鎖ＤＮＡまたはＲＮＡがあり、また、発現プラスミドおよび非発現プラスミドの双方がある。プラスミドは、商業的に入手可能であり、制限無く、公的に入手可能であるか、または公開されているプロトコルで報告されているように、入手可能なプラスミドから構築することができる。さらに、発現ベクターもまた、真核細胞培養ではジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性など、あるいは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性など、形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するための遺伝子も含み得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０１０８】
本発明は、前記抗体の脂質リガンドおよび／または塩、金属および／または補因子をさらに含み得る抗脂抗体またはそのフラグメントの特許性のある結晶形態を提供する。このような結晶を作製する方法が提供される。前記脂質は、生物活性脂質（例えば、Ｓ１Ｐを含むスフィンゴ脂質）であり得る。このような結晶のＸ線座標を提供し、この情報は抗体設計または最適化に用いられる。
【０１０９】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで実行可能な、脂質に対するヒト化抗体を設計する方法が提供される。これらの方法により、その本来の標的脂質に対する抗体の結合親和性が向上し得、または、結合特異性を変化させることを意図してもよい。
【０１１０】
以下、本発明の上記の局面および他の局面ならびに実施形態について、より詳細に説明する。本発明の上記の局面および他の局面は、以下の詳細な説明、添付図面および特許請求の範囲からより明らかとなる。本発明の実施または試験の際、本明細書中に記載の方法および材料に類似または均等の方法および材料を用いることが可能であるが、適切な方法および材料について、以下に説明する。さらに、以下の材料、方法および例はひとえに例示的なものであり、限定を意図していない。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
本願は、少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面（単数または複数）を含む本願のコピーは求めに応じ、必要な料金を払えば提供される。各図面の簡単な要約を以下に示す。
【０１１２】
【図１】抗Ｓ１ＰＦａｂ／Ｓ１Ｐ複合体の精製、結晶化、ｘ線回折、および構造。図１ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。この結果は、抗体Ｆａｂフラグメントの純度と、Ｆｃフラグメント夾雑からのその分離とを示す。図１ｂは、実体顕微鏡のアイピースを通じて見たＦａｂ／Ｓ１Ｐ複合体共結晶を含む懸滴の写真である。図１ｃは、Ｆａｂ／Ｓ１Ｐ結晶によって回折されたｘ線の１度のオシレーションイメージである。ＳＤＳＵ  ＭＸＣＦにおいてＲ−ＡｘｉｓＩＶ＋＋画像プレート検出器上において、１００Ｋにおいてデータを収集した。図１ｄはリボン図構造であり、抗体Ｆａｂ／Ｓ１Ｐ複合体結晶構造を示す。重鎖を暗いオレンジ色で示し、軽鎖を明るいオレンジ色で示す。Ｓ１Ｐは、ｃｐｋ原子色づけによるスティックで現わされている。２つの灰色の球は、Ｃａ２＋イオンである。
【０１１３】
【図２】ＬＴ１００９変異体のＳ１Ｐへの結合。図２ａは、棒グラフであり、ＬＴ１００９変異体の計算された濃度と、直接結合ＥＬＩＳＡを用いて最大半量のＳ１Ｐ結合を生成するＷＴとを示す。図２ｂは、色付け構造図であり、ＬＴ１００９  Ｆａｂ／Ｓ１Ｐ複合体の構造を示す。軽（緑）鎖および重（青）鎖の原子を球として示す。ＬＴ１００９変異体内で置換されたアミノ酸側鎖中の原子をマゼンタで色付けしている。結合Ｓ１Ｐの炭素、酸素およびリン原子をそれぞれ、灰色、赤色、黄色で色付けしている。
【０１１４】
【図３】ＬＴ１００９によるＳ１Ｐ結合上での金属キレーターおよび突然変異の効果。図３ａはリボンモデルであり、Ｓ１Ｐ（灰色）と、抗Ｓ１Ｐ抗体中の鍵となるアミノ酸残基との相互作用を示す。カルシウム原子を紫色で示す。図３ｂは線グラフであり、キレーターＥＧＴＡおよびＥＤＴＡがＬＴ１００９−Ｓ１Ｐ結合に対して与えるマイナス効果を示す。図３ｃは線グラフであり、特定のアミノ酸残基の突然変異がＬＴ１００９−Ｓ１Ｐ結合に対して与える効果を示す。アミノ酸残基のナンバリングは、シーケンシャルである。
【０１１５】
【図４】抗体特異性の変換。ＬＴ１００９の軽鎖の位置５０における単一アミノ酸を突然変異させた（ＧｌｕＬ５０からＧｌｎＬ５０）。この図は線グラフであり、直接ＥＬＩＳＡによって示すように、その結果得られた抗体変異体のＬＰＡコンジュゲートに対する親和性がＳ１Ｐコンジュゲートに対してのものよりもずっと高いことを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１６】
１．抗体化合物
抗体分子または免疫グロブリンは、分子量がおよそ１５０ｋＤａの大きな糖タンパク質分子であり、通常は２つの異なる種類のポリペプチド鎖からなる。重鎖（Ｈ）はおよそ５０ｋＤａである。軽鎖（Ｌ）はおよそ２５ｋＤａである。各免疫グロブリン分子は通常、２つの重鎖および２つの軽鎖からなる。これら２つの重鎖は、ジスルフィド結合によって相互に連結し、その数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。各軽鎖は、１つの共有結合ジスルフィド結合により、重鎖に連結される。任意の所与の天然抗体分子において、２つの重鎖および２つの軽鎖は同一であり、２つの同一の抗原結合部位を内部に含み、そのため、二価（すなわち、２つの同一の分子に同時に結合する能力を有する）であるといわれる。
【０１１７】
任意の脊椎動物種からの抗体分子の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なる種類であるカッパ（ｋ）およびラムダ（ｌ）のうちの１つに割り当てることができる。２種類の軽鎖の比は、種によって異なる。一例として、平均ｋ／λ比は、マウスの場合に２０：１であり、ヒトの場合に２：１であり、ウシの場合に１：２０である。
【０１１８】
任意の脊椎動物種からの抗体分子の重鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、アイソタイプと呼ばれる５つの明瞭に異なる種類のいずれかを割り当てることができる。いくつかのアイソタイプは、数種のサブタイプを有する。５つの主要な免疫グロブリンクラスは、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、および免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）である。ＩｇＧは、最も多いアイソタイプであり、数種のサブクラス（ヒトでは、ＩｇＧ１、２、３および４）を有する。Ｆｃフラグメントおよびヒンジ領域は、異なるアイソタイプの抗体において異なるため、その機能特性を決定づける。しかしながら、これらのドメインの全体的な構成は全てのアイソタイプにおいて同様である。
【０１１９】
抗体ソースは、本明細書中に例示したもの（例えば、マウスおよびヒト化マウス抗体）に限定されない。抗体は、多くの種（例えば、哺乳類種（例えば、マウス、ラット、ラクダ、ウシ、ヤギ、ウマ、モルモット、ハムスター、ヒツジおよびウサギ））およびトリ（アヒル、ニワトリ）内において産生させることができる。産生された抗体は、産生された動物と異なる種に由来し得る。例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．フレモントＣＡ）では、完全ヒトモノクローナル抗体が生成される。特定の目的のため、天然ヒト抗体（例えば、Ｓ１Ｐ自己抗体の力価を示し得る個人から単離されたＳ１Ｐに対する自己抗体）が用いられ得る。あるいは、ヒト抗体配列ライブラリーを用いて、ヒト配列を含む抗体を生成することもできる。
【０１２０】
２．抗体の用途
１つ以上の望ましくない生物活性脂質またはその前駆体または代謝産物の活性または濃度を変化させる治療薬があれば、治療において有用である。これらの薬剤（抗体を含む）は、有効濃度（すなわち、特定の望ましくない生物活性脂質の絶対濃度、相対濃度、有効濃度および／または利用可能な濃度および／または活性）を変化させることにより、作用する。生物活性脂質の有効濃度を低下させることを、標的脂質またはその望ましくない効果（下流効果を含む）を「中和する」と呼ぶ。ここで、「望ましくない」とは、疾病プロセスへの関与（例えば、シグナル伝達分子としての関与）に起因する生物活性脂質または過剰に存在する場合に疾病に貢献する望ましくない量の生物活性脂質を指す。
【０１２１】
特定の理論に縛られるものではないが、不適切な濃度の生物活性脂質（例えば、Ｓ１Ｐおよび／またはその代謝産物または下流エフェクター）があると、多様な疾病および疾患の原因または発症の原因となり得ると考えられている。そのため、上記組成物および方法を用いて、特に特定の標的脂質（例えば、Ｓ１Ｐまたはその変異体）の有効ｉｎ  ｖｉｖｏ濃度を低下させることにより、疾病および疾患を治療することができる。詳細には、本発明の組成物および方法は、異常新血管形成、血管形成、線維成長、線維症、瘢痕化、炎症、および免疫反応によって少なくとも部分的に特徴付けられる疾病の治療において有用であると考えられる。
【０１２２】
生物活性脂質を標的とする抗体によって治療可能な疾病の例について、以下の出願人の係属中の特許出願および登録済み特許中に記載がある（例えば、ＷＯ２００８／０７０３４４（代理人ドケット番号ＬＰＴ−３０１０−ＰＣ）およびＷＯ２００８／０５５０７２（代理人ドケット番号ＬＰＴ−３０２０−ＰＣ）を参照）。ここで、同文献の全体を参考目的および全ての目的のために援用する。
【０１２３】
患者内の望ましくないスフィンゴ脂質または他の生物活性脂質の量を制御する１つの方法として、１つ以上のスフィンゴ脂質に結合する１つ以上のヒト化抗スフィンゴ脂質抗体を含む組成物を提供することにより、遊離している望ましくないスフィンゴ脂質のレベルを低下させる治療用「スポンジ」として作用させる方法がある。化合物が「遊離している」と表現した場合、その化合物は、その望ましくない効果を及ぼす当該サイト（単数または複数）まで到達する点において何ら制限を受けていない状態である。典型的には、遊離化合物は血液および組織中に存在し、これらの血液および組織のいずれか自身が遊離化合物が作用するサイト（単数または複数）を含むか、あるいは、これらの血液および組織から化合物が遊離してその作用サイト（単数または複数）へと移動することができる。遊離化合物は、化合物を望ましくない化合物へと変換させる任意の酵素による作用を受ける際にも、利用可能であり得る。
【０１２４】
任意の特定の理論に縛られるものではないが、望ましくないスフィンゴ脂質（例えば、ＳＰＨまたはＳ１Ｐ）のレベルおよび／またはその代謝産物は、心臓および心筋疾病および疾患の発症の原因となるかまたはそのような発症に寄与すると考えられている。
【０１２５】
スフィンゴ脂質は、肝組織の線維成長および創傷治癒（Ｄａｖａｉｌｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３４２６８〜３４６３３、２０００；Ｉｋｅｄａら、ＡｍＪ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７９：Ｇ３０４〜Ｇ３１０、２０００）、血管の創傷治癒（Ｌｅｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７８：Ｃ６１２〜Ｃ６１８、２０００）、ならびに他の疾病状態または疾患あるいはこのような疾病または疾患に関連する発症（例えば、過剰線維化および炎症に関連する癌、血管形成、多様な眼疾患）（Ｐｙｎｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４９：３８５〜４０２、２０００年）にも寄与することから、本開示の組成物および方法を、疾病および疾患ならびに心臓および心筋疾病および疾患の治療に適用することができる。
【０１２６】
１つの形態のスフィンゴ脂質に基づいた治療では、望ましくない毒性スフィンゴ脂質の実際の濃度、相対濃度および／または利用可能なｉｎ  ｖｉｖｏ濃度を低下させるために、スフィンゴ脂質の代謝経路を操作する。本発明は、疾病、疾患または物理的外傷の治療または予防のための組成物および方法を提供する。前記組成物および方法において、ヒト化抗スフィンゴ脂質抗体を患者に投与して、望ましくない毒性スフィンゴ脂質またはその代謝産物と結合させる。
【０１２７】
このようなヒト化抗スフィンゴ脂質抗体は、医薬組成物として処方することができ、多様な目的（例えば、疾病、疾患または物理的外傷の治療）において有用である。本発明の１つ以上のヒト化抗スフィンゴ脂質抗体を含む医薬組成物は、このような治療のためのキットおよび医療デバイスにも採用することができる。医療デバイスを用いて、必要としている患者に対して本発明の医薬組成物を付与することができ、本発明の一実施形態によれば、このようなデバイスを含むようにキットが提供される。このようなデバイスおよびキットは、本発明の医薬組成物の日常投与（例えば、自己投与）用に設計され得る。このようなデバイスおよびキットはまた、緊急用途（例えば、救急車または救急治療室、または外科手術用、または負傷の可能性があるが万全な医学治療を迅速に得ることが不可能な場所における活動（例えば、ハイキングおよびキャンピング、または戦闘状態））用に設計することもできる。
【０１２８】
３．投与方法
本明細書中に記載される疾病および症状の治療は、異なる製剤およびデバイスを用いた多様な経路により本発明の薬剤および組成物を投与することにより、達成可能である。適切な薬学上許容される希釈剤、担体および賦形剤が、当該分野において周知である。当業者であれば、任意の特定の治療プロトコル合わせて投与すべき量は、容易に決定することができることを理解する。期待される適切な量は、１０μｇ／用量〜１０ｇ／用量、好適には１０ｍｇ／用量〜１ｇ／用量の範囲であり得る。
【０１２９】
薬剤物質は、限定されるものではないが、当技術分野で既知の技術（例えば、全身、皮下、皮内、粘膜（吸入によるものを含む）および局所投与）によって投与することができる。粘膜とは、身体の内腔をつなぐ上皮組織を指す。例えば、粘膜は、消化管（例えば、口、食道、胃、腸および肛門）、気道（例えば、鼻腔、気管、気管支および肺）ならびに性器を含む。本明細書の目的のため、粘膜には、眼の外表面（すなわち、角膜および結膜）も含まれる。（全身投与とは対照的な）局所的投与を用いると有利であり得る。何故なら、このアプローチは、潜在的な全身性副作用を制限しつつ、治療効果を得られるからである。
【０１３０】
本発明において用いられる医薬組成物を非限定的に挙げると、溶液、エマルションおよびリポソーム含有製剤がある。これらの組成物は、多様な成分（例を非限定的に挙げると、既製の液体、自己乳化固体および自己乳化半固体）から調製することができる。
【０１３１】
本発明において用いられる医薬製剤は、製薬業界において周知の従来技術に従って、調製することができる。このような技術を挙げると、有効成分を医薬担体（単数または複数）または賦形剤（単数または複数）と会合させるステップがある。好適な担体を挙げると、特に該組成物がヒトの治療目的での使用を意図したものである場合には、薬学上許容されるものがある。非ヒトの治療用途（例えば、愛玩動物、家畜、魚または家禽の処置）においては、獣医学上許容される担体も使用することができる。一般的に、当該製剤は、有効成分を液体担体または微粉固体担体あるいは双方と均一かつ緊密に会合させた後、必要であればその生成物を成形することにより、調製される。
【０１３２】
本発明の組成物は、多くの可能な投与形（例を非限定的に挙げると、錠剤、カプセル、液体シロップ、ソフトゲル、坐剤および浣腸など）のいずれかへ製剤化することができる。本発明の組成物は、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液として製剤化することもできる。水性懸濁液は、例えば、懸濁液の粘度を高める物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストラン）をさらに含有し得る。懸濁液は、安定化剤も含み得る。
【０１３３】
一実施形態において、医薬組成物は、泡沫として製剤化および使用することができる。医薬泡沫の製剤様態を非限定的に挙げると、エマルション、ミクロエマルシン、クリーム、ゼリーおよびリポソームがある。
【０１３４】
基本的には天然のものと同様であるが、これらの製剤は、最終生成物の成分およびコンシステンシーにおいて様々である。このような組成物および製剤の調製に関するノウハウは、製薬および調剤分野の当業者に一般に知られており、本発明の組成物の製剤に適用することができる。
【０１３５】
一実施形態において、免疫誘導部分へのデリバリーは、例えば、局所用点滴剤または軟膏、眼周囲の注射を介して眼へ、眼前房内に前房または硝子体中へ、埋め込みデポー剤を介して、または全身的に注射もしくは経口投与により、行うことができる。抗体の使用量は、当業者であれば容易に決定することができる。
【０１３６】
眼への治療薬のデリバリーにおける従来のアプローチには、局所適用、全身投与後の眼への再分布後、または直接的な眼球内／眼周囲への注射が含まれる［Ｓｕｌｔａｎａら（２００６年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、ｖｏｌ  ３：２０７〜２１７；ＧｈａｔｅおよびＥｄｅｌｈａｕｓｅｒ（２００６年）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ、ｖｏｌ  ３：２７５〜２８７；およびＫａｕｒおよびＫａｎｗａｒ（２００２）、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、ｖｏｌ  ２８：４７３〜４９３］。抗Ｓ１Ｐまたは他の抗生物活性脂質抗体治療薬は、これらのいずれの方法とも併用可能であるが、これらに全てについて、利点および欠点がある程度認識されている。すなわち、局所点眼剤は便利であるが、局所点滴剤の場合、前眼部へは適用した薬剤の５％未満そして後眼部へはその用量のうちさらに少量しかデリバリーできないことが多いうえ、主に鼻涙排液に起因して、洗い流されてしまう。点眼剤の他には、スプレー剤を用いれば、別の様式の局所投与が得られる。３つめの様式は、製剤と眼球表面との接触時間を長くするために使用され得る眼用の軟膏またはエマルションであるが、視野のぼやけ、瞼のもつれが問題となり得る。眼球障害を処置するための治療剤の全身投与は、全身を薬剤の潜在毒性に曝すおそれがあるため、このような局所的アプローチが依然として好ましい。
【０１３７】
加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、後部ブドウ膜炎および緑内障は、米国および他の先進国において視力喪失の主因となっているため、後眼部の処置は、医学上重要である（Ｍｙｌｅｓら（２００５年）、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ；５７：２０６３〜７９）。最も有効な後眼部への薬剤デリバリー様式は、扁平部を介した硝子体内注射である。しかし、直接的注射の場合、デリバリーを達成するためには熟練した医療従事者が必要となり、また、多くの患者において処置が制限される懸念が生じる。眼周囲注射（すなわち結膜下、眼球裏、眼球周辺および後部テノン嚢下注射を含むアプローチ）の場合、硝子体内注射よりもいくぶん侵入性が低い。硝子体内注射を反復的かつ長期にわたって行った場合、合併症（例えば、硝子体出血、網膜剥離または眼内炎）の原因になり得る。
【０１３８】
抗生物活性脂質抗体処置は、より新規の眼球デリバリー系の１つを用いて行ってもよく［Ｓｕｌｔａｎａら（２００６年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、ｖｏｌ  ３：２０７〜２１７；およびＧｈａｔｅおよびＥｄｅｌｈａｕｓｅｒ（２００６年）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ、ｖｏｌ  ３：２７５〜２８７］、例えば、徐放系または制御放出系（例えば、（ａ）眼球インサート（可溶性、浸食性、非浸食性またはヒドロゲル系）、角膜シールド、例えば、眼への薬剤のデリバリーコントロールを提供するコラーゲンに基づく眼帯およびコンタクトレンス、（ｂ）眼内でゲル形態に変換される点眼剤として投与の簡易性を提供し、これにより眼内の薬剤のある程度の徐放効果を提供するｉｎ  ｓｉｔｕゲル化系、（ｃ）標的化デリバリー、生体適合性および視力のぼやけがないという利点があるリポソーム、ニオソーム／ディスコームなどの小胞系、（ｄ）眼内への良好な保持を提供する粘膜付着系、（ｅ）プロドラッグ、（ｆ）浸透促進剤、（ｇ）凍結乾燥担体系、（ｈ）微粒子、（ｉ）サブミクロンエマルション、（ｊ）イオン泳動、（ｋ）デンドリマー、（ｌ）生体接着性マイクロスフェアを含むマイクロスフェア、（ｍ）ナノスフェアおよび他のナノ粒子、（ｎ）コラソーム、および（ｏ）相加的またはさらには相乗的な有益な効果を提供するための、上記系のうち１つ以上を組み合わせた薬剤デリバリー系）がある。これらのアプローチうちほとんどは、前眼部を標的とし、前眼部の疾患を標的とするのに有効であり得る。しかし、比較的低分子量の脂質は眼内でかなりの移動可能である可能性が高いため、これらのアプローチのうち１つ以上は、後眼部の生物活性脂質の濃度に影響を与えるのにもやはり有用であり得る。さらに、前眼部に導入された抗体も、特により低分子量の抗体変異体（例えば、Ｆａｂフラグメント）によって製造されれば、眼全域において遊走することができる可能性がある。認可されたものや開発中のものなど（前掲の参照文献を参照）、後眼部に対する徐放性薬剤デリバリー系も使用可能である。
【０１３９】
上述したように、後部網膜、脈絡膜および黄斑の疾患の処置は、医学上極めて重要である。この点について、経強膜的イオン泳動［Ｅｌｊａｒｒａｔ−ＢｉｎｓｔｏｃｋおよびＤｏｍｂ（２００６年）、Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１１０：４７９〜８９］は重要な前進であり、後眼部に抗体をデリバリーする効果的な方法を提供し得る。
【０１４０】
また、治療成績を向上させるか、当該療法がより簡便になるか、または、製剤化された抗体が意図および認可された目的のみのためにのみ使用されるように、多様な賦形剤を製剤化抗体に添加することもできる。賦形剤の例を挙げると、ｐＨを制御する化学物質、抗菌薬、抗体効力の損失を防ぐための保存剤、眼球専用の製剤であることを識別するための染料、製剤中の抗体の濃度を高めるための可溶化剤、浸透促進剤、浸透圧および／または粘度を調節するための薬剤の使用がある。例えばプロテアーゼの阻害剤は、抗体の半減期を延長するために加えることができる。一実施形態において、抗体は、眼に好適なｐＨのリン塩緩衝生理食塩水を含む溶液を用いた硝子体内注射により、眼にデリバリーされる。
【０１４１】
抗Ｓ１Ｐ剤（例えば、ヒト化抗体）は、上述した製剤またはデバイスのうちの１つにより投与されるプロドラッグが得られるように、化学的に修飾することもできる。その後、内在酵素の作用により、活性型の抗体が放出される。本願において考えられる、可能性のある眼球酵素を挙げると、種々のシトクロムｐ４５０、アルデヒドレダクターゼ、ケトンレダクターゼ、エステラーゼまたはＮ―アセチル―β―グルコサミダーゼがある。抗体に対す他の化学修飾により、その分子量を増加させ、その結果、眼内の抗体滞留時間を延長することができる。このような化学修飾の一例として、ペグ化［ＨａｒｒｉｓおよびＣｈｅｓｓ（２００３）年、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ；２：２１４〜２１］があり、これは、官能基（例えば、ジスルフィド）［Ｓｈａｕｎａｋら（２００６年）、Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ；２：３１２〜３］またはチオール［Ｄｏｈｅｒｔｙら（２００５年）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ；１６：１２９１〜８］に対して一般的または特異的であり得るプロセスである。
【０１４２】
４．従来の抗体産生および特徴付け
抗体親和性は、本明細書の下記の例に記載されるように、求めることができる。好適なヒト化または変異体抗体は、約１×１０―７Ｍ以下、好ましくは約１×１０―８Ｍ以下、最も好ましくは約５×１０―９Ｍ以下のＫｄ値でスフィンゴ脂質と結合するものである。
【０１４３】
スフィンゴ脂質に対して強い結合親和性を有する抗体の他、治療の観点から他の有益な特性を有するヒト化または変異体抗体を選択することも望ましい。例えば、該抗体は、血管形成を低下させ、腫瘍進行を変化させるものであり得る。好適には、前記抗体を直接結合ＥＬＩＳＡアッセイにて測定した場合の抗体の有効濃度（ＥＣ５０）値は、約１０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは約１μｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは約０．１μｇ／ｍｌ以下である。好適には、前記抗体の有効濃度は、１μＭのＳ１Ｐの存在下での細胞アッセイで測定した場合に約１０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは約１μｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは約０．１μｇ／ｍｌ未満の有効濃度値を有し、例えば、これらの濃度において、前記抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるスフィンゴ脂質により誘発されたＩＬ―８の放出を少なくとも１０％阻害することができる。好適には、前記抗体は、レーザー火傷後のＣＮＶ動物モデルにて測定した場合の有効濃度値が約１０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは約１μｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは約０．１μｇ／ｍｌ以下であり、例えば、これらの濃度において、前記抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてスフィンゴ脂質により誘発された新血管新生を少なくとも５０％阻害することができる。
【０１４４】
本発明の抗スフィンゴ脂質抗体の活性を決定するためのアッセイとしては、以下の例に示されるようなＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。
【０１４５】
好適には、前記ヒト化または変異体抗体は、治療上有効な量の抗体をヒト患者に投与した際に、免疫応答を惹起することができない。免疫応答が惹起される場合、当該応答があった場合でも、好適には、当該抗体によって治療された患者は、当該抗体による治療利益を受けることができる。
【０１４６】
本発明の一実施形態によれば、ヒト化抗スフィンゴ脂質抗体は、本明細書において定義される「エピトープ」と結合する。着目する抗体が結合するスフィンゴ脂質上のエピトープと結合する抗体（例えば、スフィンゴ脂質に対する抗体の結合を遮断するもの）をスクリーニングするには、常用の交叉遮断アッセイ（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８年）に記載されているもの）を行うことができる。あるいは、エピトープマッピング（例えばＣｈａｍｐｅら、［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８〜１３９４（１９９５）］に記載されているようなもの）を行って、着目するエピトープとその抗体が結合するかどうかを決定することができる。
【０１４７】
本発明の抗体は、以下の式によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを有する。ＦＲ１―ＣＤＲＨ１―ＦＲ２―ＣＤＲＨ２―ＦＲ３―ＣＤＲＨ３―ＦＲ４（ここで、「ＦＲ１〜４」は４つのフレームワーク領域を表し、「ＣＤＲＨ１〜３」は、抗スフィンゴ脂質抗体重鎖可変ドメインの３つの高頻度可変性領域を表す）。ＦＲ１〜４は、下記の例のように「コンセンサス配列」（例えば、ヒト免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のクラス、サブクラスまたはサブグループの最も共通したアミノ酸）に由来してもよく、あるいは、個々のヒト抗体フレームワーク領域もしくは異なるフレームワーク領域配列の組合せに由来してもよい。多くのヒト抗体フレームワーク領域配列が、例えばＫａｂａｔら（前掲）に編集されている。一実施形態において、重鎖可変ＦＲはＫａｂａｔら（前掲）が編集しているように、ヒト免疫グロブリンサブグループのコンセンサス配列により、提供される。
【０１４８】
ヒト重鎖可変ＦＲ配列は好適には内部に１以上の置換を有し、例えば、ヒトＦＲ残基が対応する非ヒト残基により置換される（「対応する非ヒト残基」とは、ヒト配列および非ヒト配列がアラインされた際の、着目するヒト残基と同じＫａｂａｔ位置番号を有する非ヒト残基を意味する）が、非ヒト残基での置換は、必ずしも必要ではない。例えば、対応する非ヒト残基以外の置換ＦＲ残基を、ファージディスプレイにより選択することができる。置換可能な重鎖可変ＦＲ残基の例としては、ＦＲ残基番号：３７Ｈ、４９Ｈ、６７Ｈ、６９Ｈ、７１Ｈ、７３Ｈ、７５Ｈ、７６Ｈ、７８Ｈおよび９４Ｈ（ここではＫａｂａｔの残基ナンバリングを用いる）のいずれか１つ以上が含まれる。好適には、これらの残基のうち少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つが置換される。ＦＲ置換の特に好ましい組合せは、４９Ｈ、６９Ｈ、７１Ｈ、７３Ｈ、７６Ｈ、７８Ｈおよび９４Ｈである。重鎖超可変領域については、これらは好適には、下表２に挙げられているアミノ酸配列を有する。
【０１４９】
本明細書中の好適な実施形態の抗体は、式ＦＲ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲ４によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する。ここで、「ＦＲ１〜４」は４つのフレームワーク領域を表し、「ＣＤＲＬ１〜３」は、抗スフィンゴ脂質抗体重鎖可変ドメインの３つの高頻度可変性領域を表す。ＦＲ１〜４は、下記の例のように「コンセンサス配列」（例えば、ヒト免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のクラス、サブクラスまたはサブグループの最も共通したアミノ酸）に由来してもよく、あるいは、個々のヒト抗体フレームワーク領域または異なるフレームワーク領域配列の組合せに由来してもよい。１つの好適な実施形態において、軽鎖可変ＦＲは、Ｋａｂａｔら（前掲）が編集しているように、ヒト免疫グロブリンサブグループのコンセンサス配列により、提供される。
【０１５０】
ヒト軽鎖可変ＦＲ配列は好適には内部に置換を有し、例えば、ヒトＦＲ残基が対応するマウス残基により置換されるが、非ヒト残基での置換は必ずしも必要ではない。例えば、対応する非ヒト残基以外の置換残基を、ファージディスプレイにより選択することができる。置換可能な軽鎖可変ＦＲ残基の例を非限定的に挙げると、Ｆ４、Ｙ３６、Ｙ４９、Ｇ６４、Ｓ６７を含むいずれか１以上のＦＲ残基番号がある。
以下、本明細書中のヒト化抗スフィンゴ脂質抗体の作製方法についてより詳細に説明する。
【０１５１】
Ａ．抗体の調製
非ヒト抗スフィンゴ脂質抗体をヒト化し、抗スフィンゴ脂質抗体の変異体を作製する方法について、以下の例において説明する。抗スフィンゴ脂質抗体をヒト化するために、非ヒト抗体出発材料を調製する。変異体を作製する場合には、親抗体を作製する。このような非ヒト抗体出発材料および親抗体を作製する例示的技術について、以下に説明する。
【０１５２】
（ｉ）抗原の調製
抗体作製に用いられるスフィンゴ脂質抗原は、例えば、完全なスフィンゴ脂質またはスフィンゴ脂質の一部（例えば、「エピトープ」を含むスフィンゴ脂質のフラグメント）であり得る。抗体作製において有用な他の形態の抗原が、当業者にとって明らかである。抗体作製の際に用いられるスフィンゴ脂質抗原について、以下の例において説明する。一実施形態において、前記抗原は、スフィンゴ脂質の誘導体化形態であり、担体タンパク質を伴い得る。
【０１５３】
（ｉｉ）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は好適には、関連抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により、動物内において作製される。関連抗原と、免疫される種において免疫原性のあるタンパク質（例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリンまたは大豆トリプシン阻害剤など）とを、二官能性剤または誘導体化剤（例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介してコンジュゲーション）、Ｎ―ヒドロキスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である））を用いてコンジュゲートさせると、有用であり得る。
【０１５４】
動物を、例えば、１００μｇまたは５μｇのタンパク質またはコンジュゲート（例えば、それぞれウサギまたはマウス）と３倍容のフロイントの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ）とを合わせ、この溶液を複数の部位に皮内注射することにより、抗原、免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して免疫する。１か月後、動物に最初の量の０．１〜０．２倍の量のペプチドまたはコンジュゲート（フロイントの完全アジュバント中）を複数部位に皮下注射することにより、追加抗原刺激を行う。７~１４日後、動物を放血させ、血清の抗体力価をアッセイする。力価が平衡に達するまで、動物に追加抗原刺激を行う。好適には、動物を同じ抗原のコンジュゲートで追加抗原刺激するが、異なるタンパク質にかつ／または異なる架橋試薬を介してコンジュゲートする。また、コンジュゲートは、タンパク質融合物として組換え細胞培養でも作製することができる。また、免疫応答を増強するために、ミョウバンなどの凝集剤を適宜使用することができる。
【０１５５】
（ｉｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５年））により初めて記載されたハイブリドーマ法を用いるか、または、組換えＤＮＡ法を含む他の好適な方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）により、作製することができる。ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適当な宿主動物（例えば、ハムスターもしくはマカクザル）が、上記のように、免疫に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、または産生し得るリンパ球を惹起するように、免疫される。あるいは、リンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫してもよい。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９〜１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６年））。
【０１５６】
このようにして作製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは融合していない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１以上の物質を含む好適な培地に播種し、増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合には、ハイブリドーマの培地は一般に、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻害する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む（ＨＡＴ培地）。
【０１５７】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性のあるものである。これらの中で、好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫系統（例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（サンディエゴ、カリフォルニア、米国）から入手可能なＭＯＰ―２１およびＭ．Ｃ．―１１マウス腫瘍、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．、米国）から入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞）である。また、ヒト骨髄腫およびマウス―ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｐｐ．５１〜６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９８７年））。
【０１５８】
ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生のためにアッセイする。好適には、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））により、判定する。
【０１５９】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｕｎｓｏｎら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０年））により、判定することができる。
【０１６０】
所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を確認した後、クローンを制限希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９〜１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年））により、増殖させることができる。この目的のための好適な培養培地を挙げると、例えば、Ｄ―ＭＥＭまたはＲＰＭＩ―１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞を動物の腹水腫瘍としてｉｎ  ｖｉｖｏで増殖させることができる。
【０１６１】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、通常の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ―セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィー）により、培養培地、腹水または血清から適宜分離される。
【０１６２】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、通常の手順（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用すること）により、容易に単離および配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離後、当該ＤＮＡを発現ベクター内に移入することができ、次にこれを、通常は免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞）へトランスフェクトして、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成を得る。抗体の組換え生産について、以下に詳しく記載する。
【０１６３】
（ｉｖ）ヒト化およびアミノ酸配列変異体
抗体のヒト化の一般的法については、例えば下記に記載されている。ＵＳ５８６１１５５、ＵＳ１９９６０６５２５５８、ＵＳ６４７９２８４、ＵＳ２００００６６０１６９、ＵＳ６４０７２１３、ＵＳ１９９３０１４６２０６、ＵＳ６６３９０５５、ＵＳ２００００７０５６８６、ＵＳ６５００９３１、ＵＳ１９９５０４３５５１６、ＵＳ５５３０１０１、ＵＳ５５８５０８９、ＵＳ１９９５０４７７７２８、ＵＳ５６９３７６１、ＵＳ１９９５０４７４０４０、ＵＳ５６９３７６２、ＵＳ１９９５０４８７２００、ＵＳ６１８０３７０、ＵＳ１９９５０４８４５３７、ＵＳ２００３２２９２０８、ＵＳ２００３０３８９１５５、ＵＳ５７１４３５０、ＵＳ１９９５０３７２２６２、ＵＳ６３５０８６１、ＵＳ１９９７０８６２８７１、ＵＳ５７７７０８５、ＵＳ１９９５０４５８５１６、ＵＳ５８３４５９７、ＵＳ１９９６０６５６５８６、ＵＳ５８８２６４４、ＵＳ１９９６０６２１７５１、ＵＳ５９３２４４８、ＵＳ１９９１０８０１７９８、ＵＳ６０１３２５６、ＵＳ１９９７０９３４８４１、ＵＳ６１２９９１４、ＵＳ１９９５０３９７４１１、ＵＳ６２１０６７１、ＵＳ６３２９５１１、ＵＳ１９９９０４５０５２０、ＵＳ２００３１６６８７１、ＵＳ２００２００７８７５７、ＵＳ５２２５５３９、ＵＳ１９９１０７８２７１７、ＵＳ６５４８６４０、ＵＳ１９９５０４５２４６２、ＵＳ５６２４８２１、およびＵＳ１９９５０４７９７５２。特定の実施形態において、特にヒト化抗体のアミノ酸配列変異体がヒト化抗体の結合親和性またはその他の生物学的特性を向上させる場合、これらのヒト化抗体のアミノ酸配列変異体を作製することが望ましい場合がある。本明細書中の以下の例において、親抗体と比較して相対的に親和性が増強された抗スフィンゴ脂質抗体のアミノ酸配列変異体を作製するための方法論を記載する。
【０１６４】
抗スフィンゴ脂質抗体のアミノ酸配列変異体は、抗スフィンゴ脂質抗体ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入するかまたはペプチド合成により、作製される。このような変異体を挙げると、例えば、本明細書の例の抗スフィンゴ脂質抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または残基への挿入、および／または残基の置換がある。最終構築物が所望の特徴を持つ限り、最終構築物に到達するために、欠失、挿入および置換のいずれの組合せを行ってもよい。アミノ酸変化はまた、ヒト化または変異体抗スフィンゴ脂質抗体の翻訳後過程（例えば、グリコシル化部位の数または位置の変化）を変化させてもよい。
【０１６５】
突然変異誘発の好ましい位置である抗スフィンゴ脂質抗体のある特定の残基または領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２４４：１０８１〜１０８５（１９８９年））によって記載されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここでは、アミノ酸とスフィンゴ脂質抗原との間の相互作用に影響を与えるように、標的残基のある残基または残基群を同定し（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕなどの荷電した残基）、中性または負電荷を有するアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）で置換する。次に、これらの置換に機能的感受性を示すアミノ酸の位置を、その置換部位にまたはその置換部位に対してさらなる変異体またはその他の変異体を導入することにより、精密化する。従って、アミノ酸配列変異体を導入するための部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定する必要はない。例えば、所与の部位における突然変異の性能を分析するためには、その標的コドンまたは領域においてａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発を行い、発現された抗スフィンゴ脂質抗体変異体を所望の活性に関してスクリーニングする。アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さのアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合物、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗スフィンゴ脂質抗体またはエピトープタグと融合された抗体を含む。抗スフィンゴ脂質抗体分子の他の挿入変異体としては、抗スフィンゴ脂質抗体のＮ末端またはＣ末端と、抗体の血清半減期を延長する酵素またはポリペプチドとの融合物が含まれる。
【０１６６】
別の種類の変異体として、アミノ酸置換変異体がある。これらの変異体は、抗スフィンゴ脂質抗体分子の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されている。置換突然変異誘発に関して最も注目される部位としては超可変領域が含まれるが、ＦＲ変異も考えられる。保存的置換が、好ましい置換である。このような置換が生物活性に変化をもたらす場合には、以下に挙げられている「置換例」と表示されている、またはアミノ酸種に関して以下にさらに記載されているようなさらなる置換変異を導入し、それらの生成物をスクリーニングすることができる。
【表１】
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【０１６７】
抗体の生物特性における実質的修飾は、（ａ）例えばシートまたはヘリックスコンフォメーションとしての、置換領域におけるポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位における分子の荷電または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩、を維持する上でのそれらの作用が有意に異なる置換を選択することにより、達成される。天然に存在する残基は、側鎖の性質に基づいて、下記のグループに分類される。
（１）疎水性：ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのあるメンバーを他のクラスのものと交換することを意味する。
【０１６８】
ヒト化または変異体抗スフィンゴ脂質抗体の適切なコンフォメーションの維持に関与しないシステイン残基はいずれも、分子の酸化安定性を向上させるためにおよび異常な架橋を防ぐために、置換することができる。逆に、その安定性を向上させるために抗体にシステイン結合（単数または複数）を付加してもよい（特に、抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）。
【０１６９】
１つの種類の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つ以上の高頻度可変性領域残基を置換することを含む。一般的に、さらなる開発のために選択された、得られた変異体（単数または複数）は、それらが作出された親抗体よりも相対的に生物特性が改良されている。このような置換変異体を作出する便宜な方法は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟である。簡潔に言うと、いくつかの高頻度可変性領域部位（例えば、６〜７つの部位）を、各部位において可能なアミノ置換を全て生成するように、変異誘発させる。このようにして作出された抗体変異体は、各ファージ粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩＩ産物との融合物としての繊維状ファージ粒子から一価形式でディスプレイされる。次に、これらのファージディスプレイ変異体を本明細書に開示されているようにそれらの生物活性（例えば、結合親和性）に関してスクリーニングする。修飾のための候補高頻度可変性領域を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発を行って、抗原結合に有意に関与する高頻度可変性領域残基を同定することができる。代替的または追加的に、抗体とスフィンゴ脂質の間の接点を同定するために抗原―抗体複合体の結晶構造を分析することも、有益であり得る。このような接点残基と隣接残基は、本明細書において精密化された技術による置換の候補である。抗原‐抗体複合体の結晶（共結晶）を挙げると、任意の塩、金属（二価金属を含む）、補因子などを含む、抗原と抗体のＦａｂまたは他のフラグメントとの共結晶がある。このような変異体が一度生成されると、その変異体パネルに対して本明細書に記載されるようなスクリーニングを行い、１つ以上の関連アッセイにおいて、より優れた特性を有する抗体をさらなる開発のために選択することができる。
【０１７０】
抗体の別の種類のアミノ酸変異体は、抗体の本来のグリコシル化パターンを変化させる。変化させるとは、その抗体に見られる１以上の炭水化物結合部分を欠失させること、および／またはその抗体には存在しない１以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。
【０１７１】
抗体のグリコシル化は一般的には、Ｎ―結合および／またはＯ―結合のいずれかである。Ｎ―結合とは、アスパラギン残基の側鎖に対する炭水化物部分の結合を示す。トリペプチド配列アスパラギン―Ｘ―セリンおよびアスパラギン―Ｘ―トレオニン（ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する炭水化物部分の酵素的結合のための最も一般的な認識配列である。そのため、ポリペプチドにこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的グリコシル化部位ができる。Ｏ―結合グリコシル化とは、糖類Ｎ―アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースの１つとヒドロキシアミノ酸（最も一般にはセリンまたはトレオニンであるが、５―ヒドロキシプロリンまたは５―ヒドロキシリシンを用いてもよい）の結合を指す。
【０１７２】
抗体に対するグリコシル化部位の付加は、１つ以上の上記トリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を変更することにより、簡便に達成される（Ｎ―結合グリコシル化部位の場合）。この変更はまた、元の抗体の配列に１以上のセリンまたはトレオニン残基を付加、またはそれらに置換することにより、行ってもよい（Ｏ―結合グリコシル化部位の場合）。
【０１７３】
抗スフィンゴ脂質抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野において公知の多様な方法により、作製される。これらの方法を非限定的に挙げると、天然源からの単離（天然のアミノ酸配列変異体の場合）または抗スフィンゴ脂質抗体の先行作製された変異体もしくは非変異型のオリゴヌクレオチド媒介（または部位指定）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発およびカセット突然変異誘発による作製がある。
【０１７４】
（ｖ）ヒト抗体
ヒト化の代わりに、ヒト抗体を作製することもできる。例えば、今や、内在性免疫グロブリンを欠き、免疫付与されるとヒト抗体の全レパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えばマウス）を作製することができる。例えば、キメラおよび生殖細胞系突然変異マウスにおける抗体重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子の同形接合性が欠如すると、内在性の抗体産生の完全な阻害が発生することが、記載されている。このような生殖細胞系突然変異マウスにおいてヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを移入すると、抗原投与時にヒト抗体の産生が起こる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５−２５８（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．、７：３３（１９９３年）；および米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号および同第５，５４５，８０７号を参照されたい。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーに由来してもよい（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１年）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１年）；および米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号）。上述のように、ヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化されたＢ細胞（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号を参照）または他の好適な方法によっても、作製可能である。
【０１７５】
（ｖｉ）抗体フラグメント
特定の実施形態において、ヒト化または変異体抗スフィンゴ脂質抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントの作製のために、多様な技術が開発されている。従来、これらのフラグメントは、完全抗体のタンパク質加水分解性消化によって得られてきた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２４：１０７−１１７（１９９２年）；およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５年）を参照）。しかし、これらのフラグメントは、今や、組換え宿主細胞によって直接生産することができる。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成させることができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１６３−１６７（１９９２年））。別の実施形態において、Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆ（ａｂ’）２分子の組み立てを促進するように、ロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成される。別のアプローチによれば、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体フラグメントの生産のための他の技術が、当業者にとって明らかである。
【０１７６】
（ｖｉｉ）多特異性抗体
いくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する多重特異性（例えば、二重特異性）ヒト化または変異体抗スフィンゴ脂質抗体を作製することが望ましい場合がある。例示的な二重特異性抗体は、スフィンゴ脂質の２つの異なるエピトープに結合し得る。あるいは、抗スフィンゴ脂質アームを、異なる分子と結合するアームと組みあわせてもよい。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として、作製することができる。
【０１７７】
二重特異性抗体を作製するための別のアプローチによれば、１対の抗体分子間の界面を、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大にするように、操作することができる。好適な界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第一の抗体分子の界面に由来する１以上の小さなアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換される。この大きな側鎖と同一または類似した大きさの補償となる「キャビティ」は、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えばアラニンまたはトレオニン）に置換することにより、第二の抗体の分子の界面上に生成される。その結果、ホモ二量体などの他の不要な副生成物よりもヘテロ二量体の生産を高める機構が得られる（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照）。
【０１７８】
二重特異性抗体は、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体の一方をアビジンと結合させ、他方をビオチンと結合させることができる。ヘテロコンジュゲート抗体は、いずれの便利な架橋法を用いて作製してもよい。適切な架橋剤は当技術分野において周知であり、例えば米国特許第４，６７６，９８０号中に、いくつかの架橋技術とともに開示されている。
【０１７９】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を作製する技術も、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を用いて作製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５年））は、完全な抗体がタンパク質加水分解的に切断されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製する手順を記載している。これらのフラグメントは、隣接するジチオールを安定化させかつ分子間ジスルフィド形成を防ぐように、ジチオール複合体形成剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元させる。次に、作製されたＦａｂ’フラグメントをチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体へ変換する。次に、Ｆａｂ’―ＴＮＢ誘導体の１つを、メルカプトエチルアミンで還元することよってＦａｂ’―チオールへ再変換し、等モル量の他のＦａｂ’―ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成させる。作製された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。さらなる実施形態において、大腸菌から直接回収されたＦａｂ’―ＳＨフラグメントをｉｎ  ｖｉｔｒｏで化学的に結合させて二重特異性抗体を作製することができる（Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７〜２２５（１９９２年））。
【０１８０】
組換え細胞培養物から直接二重特異性抗体フラグメントを作製および単離するための種々の技術も、記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて作製されている（Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７〜１５５３（１９９２年））。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分と連結された。抗体ホモ二量体をそのヒンジ領域において還元して単量体を形成させた後、再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成された。この方法は、抗体ホモ二量体の作製にも利用可能である。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４〜６４４８（１９９３年））により記載されている「ダイアボディー」技術により、二重特異性抗体フラグメント作製のための別の機構が提供されている。これらのフラグメントは、同じ鎖上の２つのドメインの間で対合を可能とするには短すぎるリンカーによって、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。そのため、１つのフラグメントのＶＨドメインとＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的ＶＬドメインおよびＶＨドメインと対合して、それにより２つの抗原結合部位を形成することを余儀なくされる。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異性抗体フラグメントを作製するための別の戦略も、報告されている。例えば、Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４年）を参照されたい。あるいは、二重特異性抗体は、例えば、Ｚａｐａｔａら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７〜１０６２（１９９５年））に記載されているように作製された「線状抗体」であってもよい。
【０１８１】
また、二価を超える抗体も意図される。例えば、三重特異性抗体が作製可能である（Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１年））。
【０１８２】
１アームにつき１以上の結合部位を含む本発明の抗体（またはポリマーもしくはポリペプチド）またはそのフラグメントは、本明細書において「多価」抗体と呼ばれる。例えば、本発明の「二価」抗体は、Ｆａｂまたはそのフラグメント当たり２つの結合部位を含み、本発明の「三価」ポリペプチドはＦａｂまたはそのフラグメントにつき３つの結合部位を含む。本発明の多価ポリマーにおいて、Ｆａｂ当たり２つ以上の結合部位は、同じまたは異なる抗原と結合している可能性がある。例えば、本発明の多価ポリペプチドにおける２つ以上の結合部位は、同じ抗原（例えば、前記抗原の同じ部分もしくはエピトープまたは前記抗原の２つ以上の同じもしくは異なる部分もしくはエピトープ）に向けられてもよく、かつ／あるいは異なる抗原に向けられてもよく、あるいはその組合せに向けられてもよい。そのため、本発明の二価ポリペプチドは、２つの同じ結合部位を含んでもよいし、抗原の第一の部分もしくはエピトープに向けられた第一の結合部位および前記抗原の同じ部分もしくはエピトープに向けられた第二の結合部位または前記抗原の別部分もしくはエピトープを含んでもよいし、あるいは、抗原の第一の部分もしくはエピトープに向けられた第一の結合部位および異なる抗体に向けられた第二の結合部位を含んでもよい。しかし、本明細書中の上記の記載から明らかなように、本発明の多価ポリペプチドは、同じまたは異なる抗原に向けられる任意の数の結合部位を含み得るという点において、本発明は上記に限定されない。
【０１８３】
Ｆａｂまたはそのフラグメントにつき少なくとも２つの結合部位（ここで、少なくとも１つの結合部位は第一の抗原に向けられ、第二の結合部位は、第一の抗原とは異なる第二の抗原に向けられる）を含む本発明の抗体（またはポリマーまたはポリペプチド）は、「多重特異性」とも呼ばれる。そのため、例えば、「二重特異性」ポリマーは、第一の抗原に向けられた少なくとも１つの部位と、第二の抗原に向けられた少なくとも１つの第二の部位とを含み、「三重特異性」は、第一の抗原に向けられた少なくとも１つの結合部位と、第二の抗原に向けられた少なくとも１つのさらなる結合部位と、第三の抗原に向けられた少なくとも１つのさらなる結合部位とを含むポリマーなどである。よって、それらの最も単純な形態において、本発明の二重特異性ポリペプチドは、本発明の二価ポリペプチド（Ｆａｂ当たり）である。しかし、本明細書中の上記の記載から明らかなように、本発明の多価ポリペプチドが２つ以上の異なる抗原に向けられる任意の数の結合部位を含み得るという点において、本発明は上記に限定されない。
【０１８４】
（ｖｉｉｉ）他の修飾
ヒト化または変異体抗スフィンゴ脂質抗体の他の修飾も、企図される。例えば、本発明はまた、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素またはそのフラグメント）または放射性同位元素（例えば、ラジオコンジュゲート）などの細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされた本明細書中に記載の抗体を含む免疫複合体に関する。コンジュゲート作製は、多様な二官能性タンパク質カップリング剤（例えば、Ｎ―スクシンイミジル―３―（２―ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス―アジド化合物（ビス（ｐ―アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス―ジアゾニウム誘導体（ビス―（ｐ―ジアゾニウムベンゾイル）―エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トリエン２，６―ジイソシアネートなど）およびビス―活性フッ素化合物（１，５―ジフルオロ―２，４―ジニトロベンゼンなど））を用いて、行われる。
【０１８５】
本明細書中で開示される抗スフィンゴ脂質抗体はまた、イムノリポソームとして製剤化することができる。抗体を含むリポソームは、当技術分野において公知の方法（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎｅら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８（１９８５）年；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０（１９８０年）；および米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載されているもの）により、作製される。循環時間が高められたリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。例えば、リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ―誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ―ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法により、作製することができる。リポソームは、所望の径を有するリポソームを得るために所定の孔径のフィルターを通して、押し出される。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド交換反応を介して、Ｍａｒｔｉｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６〜２８８（１９８２年））に記載されているようなリポソームとコンジュゲートさせることができる。任意選択的に、別の有効成分をリポソーム内に収容してもよい
【０１８６】
酵素またはその他のポリペプチドは、当技術分野において周知の技術（例えば、上述のヘテロ二官能性架橋試薬の使用など）により、抗スフィンゴ脂質抗体に共有結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域が酵素の少なくとも機能的に活性な部分と結合された融合タンパク質を、当技術分野において周知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築することができる（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４〜６０８（１９８４年）を参照）。
【０１８７】
例えば、標的組織および細胞の浸透性を増強するために、完全抗体ではなく抗体フラグメントを用いる方が望ましい場合がある。この場合、その血清半減期を延長するために、抗体フラグメントを修飾することが望ましい場合がある。これは、例えば、抗体フラグメントへのサルベージ受容体結合エピトープの組み込みにより（例えば、抗体フラグメントの適当な領域の突然変異によるか、またはペプチドタグにエピトープを組み込んだ後に（例えばＤＮＡまたはペプチド合成により）いずれかの末端または中間部において抗体フラグメントと融合させことにより）、達成可能である（例えば、米国特許第６，０９６，８７１号参照）。
【０１８８】
ヒト化または変異体抗スフィンゴ脂質抗体の共有結合修飾も、本発明の範囲内に含まれる。ヒト化または変異体抗スフィンゴ脂質抗体の共有結合修飾は、適用可能であれば、化学合成によりまたは抗体の酵素的または化学的切断により、作製され得る。前記抗体の他のタイプの共有結合的修飾は、抗体の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と反応させることにより、分子に導入される。ポリペプチドの共有結合的修飾の例は、米国特許第５，５３４，６１５号に記載されており、本明細書中、同文献を参考のため特に援用する。好適な種類の抗体の共有結合修飾は、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に示される方法により、多様な非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン）のうちの１つに抗体を結合させることを含む。
【０１８９】
Ｂ．ベクター、宿主細胞および組換え法
本発明はまた、ヒト化または変異体抗スフィンゴ脂質抗体をコードする単離された核酸、前記核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに前記抗体の産生のための組換え技術も提供する。
【０１９０】
抗体の組換え生産においては、前記抗体をコードする核酸が単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のためまたは発現のために、複製可能なベクターへ挿入され得る。別の実施形態において、前記抗体は、米国特許第５，２０４，２４４号に記載されているような相同組換えにより、作製可能である。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、通常の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、容易に単離および配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分を一般的にかつ非限定的に挙げると、例えば米国特許第５，５３４，６１５号に記載されているように、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列のうち１つ以上がある。
【０１９１】
本明細書においてベクターでＤＮＡをクローニングまたは発現するための適切な宿主細胞は、上記の原核生物、酵母または高等真核生物細胞である。この目的において適した原核生物を挙げると、真正細菌（例えば、グラム陰性またはグラム陽性生物）、例えば、エシェリキア属（例えば、大腸菌）、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ菌属（例えば、マウスチフス菌）、セラチア属（例えば、レイ菌および赤痢菌属、ならびにバチルス属（例えば、枯草菌およびＢ．リケニフォルミス（例えば、Ｂ．リケニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス属（例えば、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）および放線菌属などの腸内細菌科がある。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、他の株（例えば、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５））も好適である。これらの例は、限定ではなく例示である。
【０１９２】
原核生物の他にも、線維状真菌または酵母などの真核生物も、抗スフィンゴ脂質抗体をコードするベクターの好適なクローニングまたは発現宿主である。下等真核生物の宿主微生物のうち、サッカロミセス・セレビシエまたは一般的なパン製造酵母が、最もよく用いられている。しかし、他のいくつかの属、種および株（例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ、クルイベロミセス属宿主（例えば、Ｋ．ラクチス、Ｋ．フラギリス（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ウィケラミイ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ワルチー（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランスおよびＫ．マルキシアヌス）、ヤロウイア属（ＥＰ４０２，２２６）；スクワニミセス属（例えば、ピキア・パストリス（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ；トリコデルマ・リーシア（ＥＰ２４４，２３４）；ニューロスポラ・クラッサ；スクワニミセス・オクシデンタリスなど）、糸状菌（例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリプクラジウム）、ならびにアスペルギルス宿主（例えば、Ａ．ニデュランスおよびＡ．ニゲル）も一般に利用でき、本明細書において有用である。
【０１９３】
グリコシル化抗スフィンゴ脂質抗体の発現のための適切な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株および変異体ならびに宿主からの対応する許容昆虫宿主細胞（例えば、ヨトウガ（毛虫）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）およびカイコが確認されている。例えば、トランスフェクションのための多様なウイルス株（例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ―１変異体およびカイコＮＰＶのＢｍ―５株など）が公的に入手可能であり、このようなウイルスは、本明細書において、特にヨトウガ細胞のトランスフェクションの際のウイルスとして使用可能である。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物培養細胞も、宿主として利用可能である。
【０１９４】
しかし、最大の関心は脊椎動物細胞にあり、培養脊椎動物細胞（組織培養）の増殖は一般的方法となっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統（ＣＯＳ―７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓系統（懸濁培養で増殖させるためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７年））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／―ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０年））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０年））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ―７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ―１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２年））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫系統（Ｈｅｐ  Ｇ２）がある。
【０１９５】
宿主細胞を、抗スフィンゴ脂質抗体生産のための上記の発現またはクローニングベクターにより形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適宜改変された通常の栄養培地において培養する。
【０１９６】
本発明の抗スフィンゴ脂質抗体を生産するために用いられる宿主細胞は、種々の培地で培養することができる。市販の培地（例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ―１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）など）が、宿主細胞の培養に適している。さらに、Ｈａｍら（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９年））、Ｂａｒｎｅｓら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０年））、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、または同第５，１２２，４６９号、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、または米国特許第３０，９８５号に記載されているいずれの培地も、宿主細胞の培養培地として使用可能である。これらの培地のうちいずれにも、任意選択的に、ホルモンおよび／またはその他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮細胞増殖因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩など）、バッファー（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標））、微量元素（通常、マイクロモル範囲の終濃度で存在する無機化合物として定義）およびグルコースまたは等価なエネルギー源を添加してもよい。他の必要な任意の添加物も、当業者に公知の適当な濃度で含めることができる。培養条件（例えば、温度、ｐＨ）は、発現用に選択された宿主細胞とともにこれまで用いられているものであり、当業者には明らかである。
【０１９７】
組換え技術を用いる場合、抗体を周辺質にて細胞内生産することもできるし、直接培地に分泌させることもできる。抗体が細胞内生産される場合、第一の工程として、宿主細胞または溶解フラグメントのいずれかの粒子残渣を、例えば遠心分離または限外濾過により除去する。Ｃａｒｔｅｒら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３〜１６７（１９９２年））は、大腸菌の周辺質空間に分泌される抗体を単離するための手順を記載している。簡潔に言うと、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０間にわたって解凍する。細胞残渣は、遠心分離により除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合には、このような発現系からの上清を一般にはまず市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を用いて濃縮する。タンパク質分解を阻害するため、前記の工程のいずれにＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を含めてもよく、偶然の混入物の増殖を防ぐために抗生物質を含めてもよい。
【０１９８】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができるが、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。プロテインＡの親和性リガンドとしての好適性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒト重鎖に基づく抗体を精製する際に使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１〜１３（１９８３年））。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプとヒトγ３に関して奨励される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６年））。親和性リガンドが結合されたマトリックスはほとんどの場合はアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定なマトリックス（例えば、制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン）は流速を速めることができ、また、アガロースによって達成し得る処理時間よりもより短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技術（例えば、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿法、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース（商標）でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ―ＰＡＧＥおよび硫安沈殿法）も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０１９９】
任意の予備精製工程（単数または複数）の後、着目する抗体と夾雑物とを含む混合物に対して、ｐＨ約２．５〜４．５の間で溶出バッファーを用いた、好ましくは低塩濃度（例えば約０〜０．２５Ｍ塩）で行われる低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーが行われ得る。
【０２００】
Ｃ．医薬製剤
本発明の抗体または免疫誘導部分の治療製剤は、所望の純度を有する抗体と、任意選択の生理学上許容される担体、賦形剤または安定化剤（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０年）を参照）とを、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で混合することにより、保存向けに調製される。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、用いる用量および濃度においてレシピエントに対して無毒であり、バッファー（例えば、リン酸、クエン酸およびその他の有機酸など）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸およびメチオニン）、保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、アルキルパラベン（例えば、メチルまたはプロピルパラベン）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３―ペンタノール、およびｍ―クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシン）、単糖類、二糖類およびその他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、糖類（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール）、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、金属錯体（例えば、Ｚｎ―タンパク質錯体）、および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が含まれる。
【０２０１】
本明細書中の製剤はまた、特定の処置に適合するように任意選択的に１つを超える有効化合物（好ましくは互いに悪影響を及ぼさない補足的活性を有するもの）を含んでもよい。このような分子は、意図した目的に対して効果的な量の組合せにおいて、適切に存在する。
【０２０２】
有効成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によるかまたは界面重合により調製されたマイクロカプセル（それぞれ例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン―マイクロカプセルおよびポリ―（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、または、コロイド薬物デリバリー系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルション中に、捕捉してもよい。このような技術については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１６版、Ｏｓｏｌ、Ａ．Ｅｄ．（１９８０年））に開示がある。
【０２０３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与用途に用いる製剤は、無菌でなければならない。これは、例えば無菌濾過膜を通した濾過により、容易に達成される。
【０２０４】
徐放性製剤が、作成され得る。徐放性製剤の適切な例を挙げると、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスがあり、このマトリックスは、例えばフィルムまたはマイクロカプセルなどの成型品の形態をとる。徐放性マトリックスの例を挙げると、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２―ヒドロキシエチル―メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ―グルタミン酸とγ―エチル―Ｌ―グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン―酢酸ビニル、分解性乳酸―グリコール酸コポリマー（例えば、Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（商標）（乳酸―グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドからなる注射可能なマイクロスフェア）、およびポリ―Ｄ―（―）―３―ヒドロキシ酪酸）がある。エチレン―酢酸ビニルおよび乳酸―グリコール酸などのポリマーは１００日を超える期間にわたって分子の放出が可能であるが、ある特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間留まる場合、それらは３７℃において水分に曝された結果変性または凝集する場合があり、その結果、生物活性の低下および免疫原性の変化に繋がる場合がある。関与する機構に応じて、安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機構がチオ―ジスルフィド相互作用を介した分子間Ｓ―Ｓ結合の形成であることが分かれば、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥させること、水分含量を制御すること、適切な添加剤を使用すること、および特殊なポリマーマトリックス組成物を開発することにより、安定化を達成することができる。
【０２０５】
本発明の抗体の全身投与のための好適な製剤が、本発明と共に共有されている米国仮特許出願第６１／０４２，７３６号（「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ」、出願日：２００８年４月５日）内に開示されている。この製剤について、本明細書中、以下の実施例１２において説明する。
【０２０６】
Ｄ．抗体の非治療的使用
生物活性脂質に対する抗体は、親和性精製剤として用いることができる。このプロセスにおいて、当該分野において周知の方法を用い、セファデックス樹脂または濾紙などの固相に抗体を固定する。この固定抗体と、精製対象となるスフィンゴ脂質を含有するサンプルとを接触させた後、固定抗体に結合しているスフィンゴ脂質以外のサンプル中の材料を実質的に全て除去する好適な溶媒により、この支持体を洗浄する。最後に、抗体からスフィンゴ脂質を遊離させる、例えばｐＨ３〜ｐＨ５．０の間の別の好適な溶媒（グリシンバッファーなど）により、この支持体を洗浄する。
【０２０７】
抗脂抗体はまた、例えば、特定の細胞、組織（生検サンプルなど）または体液中のその発現を検出する、標的脂質の診断アッセイにおいても有用であり得る。このような診断方法は、心臓血管または脳血管障害または疾患の診断において有用であり得る。
【０２０８】
診断適用のために、抗体は典型的には、検出可能な物質によって標識される。多くの標識が利用可能であり、一般に以下のカテゴリーに分類される。
【０２０９】
（ａ）放射性同位元素（例えば、３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、および１３１Ｉ）。抗体は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌｕｍｅ  １および２、Ｃｏｌｉｇｅｎら、Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１年））に記載されている技術を用いて放射性同位元素で標識することができ、シンチレーション計数を用いて放射活性を測定することができる。
【０２１０】
（ｂ）蛍光標識（例えば、希土類キレート（ユウロピウムキレート）またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリンおよびテキサスレッド）が利用可能である。これらの蛍光標識は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（前掲）に開示されている技術を用いて、抗体にコンジュゲートさせることができる。蛍光は、蛍光計を用いて定量することができる。
【０２１１】
（ｃ）多様な酵素−基質標識が利用可能である。例えば、米国特許第４，２７５，１４９号において、これらのうちいくつかについての総論が記載されている。この酵素は一般的には、多様な技術を用いて測定可能な発色基質の化学変化を触媒する。例えば、この酵素は、分光光度的に測定可能な、基質の色の変化を触媒し得る。あるいは、この酵素は、基質の蛍光または化学発光を変化させ得る。蛍光の変化を定量するための技術は、上述した通りである。化学発光基質は、化学反応によって電気的に励起状態となった後、（例えば、ケミルミノメーターを用いた）測定が可能な光を発し得るか、または、蛍光受容器にエネルギーを与え得る。酵素標識の例を挙げると、ルシフェラーゼ（例えば、ホタル・ルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどがある。酵素と抗体をコンジュゲートさせる技術について、Ｏ’ＳｕｌｌｉｖａｎらのＭｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．（ｅｄ  Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ＆Ｈ．ＶａｎＶｕｎａｋｉｓ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、７３：１４７〜１６６（１９８１年）に記載がある。
【０２１２】
酵素−基質の組合せの例としては、例えば、下記のものがある。
【０２１３】
（ｉ）ハイドロジンペルオキシダーゼを基質とするセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）。この場合、ハイドロジンペルオキシダーゼは、色素前駆体（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンヒドロクロリド（ＴＭＢ））を酸化させる。
【０２１４】
（ｉｉ）パラ−ニトロフェニルホスフェートを発色基質とするアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）。
【０２１５】
（ｉｉｉ）発色基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いた、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）。
【０２１６】
当業者にとって、他の多くの酵素−基質の組合せが利用可能である。これらの一般的な総説については、米国特許第４，２７５，１４９号および同第４，３１８，９８０号を参照されたい。
【０２１７】
標識は、抗体と間接的にコンジュゲートされる場合もある。当業者であれば、これを達成するための多様な技術が思い浮かぶであろう。例えば、抗体をビオチンとコンジュゲートさせ、上述の３つの広いカテゴリーの標識のうちいずれかをアビジンとコンジュゲートさせることができ、あるいは逆もまた可能である。ビオチンは、アビジンと選択的に結合するため、この標識は、このように間接的に抗体とコンジュゲートさせることができる。あるいは、標識と抗体の間接的コンジュゲーションを達成するために、抗体を小ハプテン（例えばジゴキシン）とコンジュゲートさせ、上述の異なる種の標識のうち１つを抗ハプテン抗体（例えば抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲートさせる。このように、標識と抗体との間接的コンジュゲーションを達成することができる。
【０２１８】
本発明の別の実施形態において、抗スフィンゴ脂質抗体は標識する必要がなく、抗スフィンゴ脂質抗体と結合する標識二次抗体を用いて、抗スフィンゴ脂質抗体の存在を検出することができる。
【０２１９】
本発明の抗体は、任意の公知ののアッセイ方法（例えば、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイおよび免疫沈降アッセイ）において使用可能である（例えば、Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ｐｐ．１４７〜１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７年）を参照）。
【０２２０】
競合結合アッセイは、限られた量の抗体との結合について試験サンプル分析物と競合する標識標準の能力に依存する。試験サンプル中の生物活性脂質の量は、抗体と結合している標準の量に反比例する。結合している標準の量の決定を容易にするために、一般的に競合前または競合後に抗体を不溶性とし、それにより、抗体と結合した標準および分析物を、非結合のままでいる標準および分析物から簡便に分離することができる。
【０２２１】
サンドイッチアッセイにおいては２つの抗体が用いられ、これら２つの抗体はそれぞれ、検出すべきタンパク質の異なる免疫原性部分またはエピトープと結合し得る。サンドイッチアッセイでは、試験サンプル分析物を、固相支持体上に固定された第一の抗体と結合させた後、第二の抗体をその分析物と結合させ、これにより不溶性の３成分複合体を形成させる（例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照）。第二の抗体については、第二の抗体自体を検出可能な物質で標識してもよいし（直接的サンドイッチアッセイ）、あるいは、検出可能な物質で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、１つの種類のサンドイッチアッセイがＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能な物質は酵素である。
【０２２２】
免疫組織化学については、血液または組織サンプルは、新鮮物であっても凍結品であってもよく、あるいは、例えば、パラフィンに包埋したり、ホルマリンなどの保存剤によって固定してもよい。
【０２２３】
抗体はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断アッセイにおいても使用可能である。一般的に、抗体は放射性核種（例えば、１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓ）によって標識され、これにより、結合した標的分子をイムノシンチログラフィーを用いて位置決定することができる。
【０２２４】
Ｅ．診断キット
便宜上、生物活性脂質に対する抗体をキットとして提供することができ、例えば、所定量の試薬の組み合わせに、診断アッセイを行う際のマニュアルを添付してパッケージ化する。抗体を酵素によって標識する場合、当該キット中には、その酵素が必要とする基質および補因子（例えば、検出可能な発色団または蛍光団を提供する基質前駆体）が含まれる。さらに、他の添加剤（例えば、安定化剤、バッファー（例えば、ブロッキングバッファーまたは溶解バッファー））含めてもよい。そのアッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度が得られるよう、多様な試薬の相対量を幅広く変更することができる。詳細には、これらの試薬は、乾燥粉末（通常は凍結乾燥されたもの）（溶解した際に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む）として提供することができる。
【０２２５】
Ｆ．抗体の治療用途での使用
治療適用においては、生物活性脂質に対する抗体の哺乳類（好ましくはヒト）への投与は、薬学上許容される投与形（例えば、上述したようなもの、ボーラスとしてのまたは一定時間にわたった持続的注入による静脈投与、筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、皮下経路、動脈内経路、滑液包内経路、くも膜下腔内経路、経口経路、局所経路または吸入経路によってヒトに投与し得るもの）により、行われる。
【０２２６】
疾病の予防または治療のための抗体の適切な用量は、上記で定義したような治療すべき疾患の種類、疾患の重篤度および経過、その抗体が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、それまでの治療、患者の臨床歴および抗体に対する応答、ならびに担当医の判断によって異なる。抗体は、１回でまたは一連の処置期間にわたって、患者に適切に投与される。
【０２２７】
疾患の種類および重篤度に応じて、例えば１回以上の分離投与によるものであれ、連続注入によるものであれ、約１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、患者投与のための初期候補用量となる。典型的な１日用量または週間用量は、上述の要素に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲である。数日間以上にわたる反復投与においては、症状に応じて、疾患症候の所望の抑制が見られるまで、処置を繰り返す。しかし、他の投与計画も有用であり得る。この療法の進行は、従来の技術およびアッセイ（例えば、例えばＸ線写真画像化）により、容易に監視される。
【０２２８】
本発明の別の実施形態によれば、抗体を連続的に投与するか、または、その目的に有効である別の薬剤（例えば、例えば化学療法的抗癌薬）と組み合わせて投与することにより、疾患の予防または治療における抗体の有効性を向上することができる。このような他の薬剤は、投与される組成物中に存在してもよいし、あるいは別に投与してもよい。抗体投与は、連続的にまたは他の薬剤と組み合わせて、適切に行われる。
【０２２９】
Ｇ．製品
本発明の別の実施形態において、上記の疾患の治療において有用な材料を含む製品が提供される。前記製品は、容器およびラベルを含む。好適な容器を挙げると、例えば、瓶、バイアル、シリンジおよび試験管がある。これらの容器は、多様な材料（例えば、ガラスまたはプラスチック）によって形成され得る。これらの容器は、症状の治療において有効な組成物を収容し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、この容器は、静脈溶液バッグまたは皮下注射針が貫通可能なストッパーを備えたバイアルであり得る）。組成物中の有効成分は、抗スフィンゴ脂質抗体である。容器上に設けられているかまたは容器に添付されているラベルは、選択された症状の処置のために当該組成物が使用されることを示す。製品は、薬学上許容されるバッファー（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液）を含む第２の容器をさらに含み得る。製品は、商業的および使用者の立場から望ましい他の材料（例えば、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび使用説明書）をさらに含み得る。
【０２３０】
Ｈ．生物活性脂質を認識するヒト化モノクローナル抗体の構造に基づいた設計：創薬のためのプラットホーム
Ｌｐａｔｈの所有するＩｍｍｕｎｅＹ２（商標）技術により、生物活性脂質（例えば、スフィンゴ脂質）に対するモノクローナル抗体の生成が可能になる。ＬｐａｔｈのｍＡｂｓ  ＳｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂおよびＬｐａｔｈｏｍａｂ（Ｓ１ＰおよびＬＰＡに対してそれぞれ標的される、ＬＴ１００９およびＬＴ３０１５とも呼ぶ）は、生物活性脂質に対する抗体薬のファーストインクラスの例である。
【０２３１】
ＬＴ１００９およびＬＴ３０１５の構造フレームワークは類似しており、また、ＬＴ１００９  Ｆａｂフラグメント―Ｓ１Ｐ共結晶について最近導出されたｘ線回折データの助けもあり、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリングを用いて、マウスへの免疫付与の必要無く、異なる生物活性脂質標的に対して新規ｍＡｂｓを生成することが可能であると考えられている。これは、スフィンゴ脂質および類似の生物活性脂質がタンパク質抗原と比較して比較的小さな配列／構造空間を有することにより、促進される。このｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ方法を用いることにより、高コストかつ複雑なヒト化プロセスも回避できると考えられる。ＩｍｍｕｎｅＹ２プラットホームに特有の構造活性相関（ＳＡＲ）アッセイを用いて、ＬＴ３０１５および／またはＬＴ１００９のヒト化フレームワークおよびＣＤＲを突然変異させることと、そのそれぞれのリガンドに対するその親和性および／または特異性を変更することとが提案される。最終的には、抗体の結合特異性を異なるリガンドに全体的に変換することが可能な（例えば、（ＬＴ３０１５またはＬＴ１００９が出発点であったかに応じて）ＬＰＡまたはＳ１Ｐから別の生物活性脂質へと全体的に変換することが可能な）点まで、特異性を変化させるように突然変異を起こすことができると考えられる。
【０２３２】
本発明は、下記の実施例を参照すれば、より良く理解される。これらの実施例は、単に現在本発明の実施に関して知られている最良の形態を例示することを意図したものである。本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【０２３３】
実施例１：Ｓ１Ｐに対するマウスモノクローナル抗体（スフィンゴマブ（商標）；ＬＴ１００２）
或る種類の治療用抗体は、望ましくないスフィンゴ脂質と特異的に結合して、有益な作用（例えば、（１）心臓毒性作用、腫瘍形成作用、または血管形成作用などの望ましくない作用を促進する望ましくない有毒スフィンゴ脂質の有効濃度（および／またはそれらの代謝前駆体の有効濃度）を低下させること、（２）望ましくない、毒性、腫瘍形成性、または血管形成性スフィンゴ脂質の細胞受容体への結合を阻害し、これにより、かつ／または、このような受容体との結合が可能なスフィンゴ脂質の濃度を低下させる）を達成する。このような治療効果の例を非限定的に挙げると、利用可能なＳ１Ｐの有効ｉｎ  ｖｉｖｏ血清濃度を低下させることにより、Ｓ１Ｐの腫瘍形成作用および血管形成作用ならびにＭＩ後心不全、癌、または繊維形成性疾患におけるその役割を止めるまたは少なくとも制限するための抗Ｓ１Ｐ抗体の使用が挙げられる。
【０２３４】
Ｓ１Ｐの本質的構造的特徴をＫＬＨなどの担体分子と架橋することができる反応性基を含むように、チオール化Ｓ１Ｐを合成した。免疫処置の前に、このチオ―Ｓ１Ｐ類似体を、標準的なプロトコルを用いてＩＯＡまたはＳＭＣＣ架橋を介して、タンパク質担体（例えば、ＫＬＨ）とコンジュゲートした。ＳＭＣＣは、第一級アミンおよびスルフヒドリル基と反応するヘテロ二官能性架橋剤であり、好適な架橋剤である。
【０２３５】
ＳｗｉｓｓＷｅｂｓｔｅｒマウスまたはＢＡＬＢ―Ｃマウスを、１回の注射当たり５０μｇの免疫原（チオール化Ｓ１ＰとＫＬＨのＳＭＣＣ促進性コンジュゲート）を用いて２ヶ月かけて、４回免疫処置した。第二回目、第三回目および第四回目の免疫処置の２週間後に血清サンプルを採取し、抗Ｓ１Ｐ抗体の存在について直接ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。次に、抗Ｓ１Ｐ抗体について高力価を示した動物の脾臓を用い、標準的な融合手順によってハイブリドーマを作製した。得られたハイブリドーマをコンフルエントになるまで増殖させ、その後、ＥＬＩＳＡ解析のためにその細胞上清を集めた。免疫処置した５５匹のマウスのうち、８匹は良好に応答し、Ｓ１Ｐに対して著しい抗体反応の血清力価を示した。続いて、これらのマウスの脾臓および骨髄腫細胞を用い、確立された手順に従って融合を行った。次いで、得られた１，５００のハイブリドーマを直接ＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、２８７の陽性ハイブリドーマを得た。直接ＥＬＩＳＡによってスクリーニングしたこれらの２８７ハイブリドーマのうち、１５９のハイブリドーマが著しい力価を示した。次いで、１５９のハイブリドーマそれぞれを２４ウェルプレートに増殖させた。その後、増殖させたハイブリドーマの細胞馴化培地を再スクリーニングして、目的の抗体を分泌することができる安定なハイブリドーマを同定した。６０個の最大力価の安定ハイブリドーマに対して、競合的ＥＬＩＳＡを実施した。
【０２３６】
スクリーニングした５５匹のマウスおよびほぼ１，５００個のハイブリドーマの中から、性能特性を表示した１つのハイブリドーマを発見し、この性能特性により、限界希釈クローニングが、最終的に真のモノクローナル抗体を作製するのに必要なものとして正当化された。このプロセスにより、４７個のクローンが得られ、そのうち大部分は、Ｓ１Ｐ抗体の産生について陽性であると判断した。これらの４７個のクローンのうち、６個のクローンを２４ウェルプレートに増殖させ、続いて、競合的ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。陽性のままであった４個のクローンの中から、１つのクローンを選択して、Ｓ１Ｐモノクローナル抗体の大量生産を開始した。これらの細胞をＳＣＩＤマウスに注射し、得られた腹水をプロテインＡで精製し（５０％収率）、内毒素レベルについて解析した（＜３ＥＵ／ｍｇ）。１回の腹水生産から、５０匹のマウスに注射し、合計１２５ｍＬの腹水を生産した。これらの抗体をＩｇＧ１κとアイソタイプ判定し、ＨＰＬＣにより、＞９５％純度であると判断した。抗体は１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）中で調製し、―７０℃で保存した。この抗体をＬＴ１００２またはスフィンゴマブ（商標）と命名した。
【０２３７】
陽性ハイブリドーマクローン（クローン３０６Ｄ３２６．２６と称する）を、ＡＴＣＣに寄託した（安全寄託保存番号ＳＤ―５３６２）。このクローンは、Ｓ１Ｐに対する第一のマウスｍＡｂである。このクローンは、「ヒト化」抗体変異体の作製に用いることができる抗体重鎖および軽鎖の可変領域、ならびにキメラ抗体を構築するのに必要な配列情報も含む。
【０２３８】
Ｓ１Ｐ特異的抗体についての血清および細胞上清のスクリーニングは、抗原としてチオール化Ｓ１Ｐ類似体を用いた直接ＥＬＩＳＡによるものとした。標準的なＥＬＩＳＡを、最初のインキュベーション中に５０μｌのサンプル（血清または細胞上清）を等量のＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ―２０（ＰＢＳＴ）で希釈したことを除き、下記のように実施した。ＥＬＩＳＡは、結合バッファー（３３．６ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３；ｐＨ  ９．５）中のＢＳＡとコンジュゲートさせた０．１μｇの化学合成チオール化Ｓ１Ｐでコーティングした９６ウェル高結合ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）において、実施した。ＥＬＩＳＡプレートウェル中でチオール化Ｓ１Ｐ―ＢＳＡを３７℃で１時間、４℃で一晩インキュベートした。次いで、これらのプレートをＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１０．１４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ  ７．４）で４回洗浄し、ＰＢＳＴで室温にて１時間ブロッキングした。最初のインキュベーションステップでは、７５μＬのサンプル（測定すべきＳ１Ｐを含有する）を、ＰＢＳＴで希釈した２５μＬの０．１μｇ／ｍＬ抗Ｓ１ＰｍＡｂとともにインキュベートし、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに入れた。各サンプルを３つのウェルで実施した。室温で１時間のインキュベーション後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳで４回洗浄し、各ウェルにつき１００μｌの０．１μｇ／ｍＬ  ＨＲＰヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とともに室温で１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ）に１〜１０分間曝した。等量の１ＭのＨ２ＳＯ４を加えることにより、検出反応を停止させた。ＥＬ―Ｘ―８００  ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ）を用い、４５０ｎｍで測定することにより、サンプルの光学密度を決定した。
【０２３９】
交差反応性については、競合的ＥＬＩＳＡを、次の変更を除き、上記のように実施した。最初のインキュベーションは、競合物（Ｓ１Ｐ、ＳＰＨ、ＬＰＡなど）およびビオチンコンジュゲート抗Ｓ１ＰｍＡｂによって構成した。精製モノクローナル抗体のビオチン化を、ＥＺ―Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ―ＮＨＳ―Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて実施した。ビオチン取り込みは、キットプロトコルによって決定し、１抗体につき７〜１１個のビオチン分子であった。競合物は次のとおり調製した：すなわち、脂質ストックを超音波処理し、アルゴン下で乾燥させた後、ＤＰＢＳ／ＢＳＡ［ＤＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １４０４０―１３３）中１ｍｇ／ｍｌ脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）］で再構成した。必要に応じて、精製抗Ｓ１ＰｍＡｂをＰＢＳ／０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ―１００で希釈した。競合物３に抗体１の割合を作成するように、競合物および抗体溶液を一緒に混合した。ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、シグナルを作成した。
【０２４０】
競合的ＥＬＩＳＡデータの別の結果によれば、抗Ｓ１ＰｍＡｂは、チオール化Ｓ１Ｐ類似体と、競合試験で加えられた天然Ｓ１Ｐとを区別することができない。また、この結果によれば、類似体があらゆる二重結合を含まないように構築されたため、前記抗体が酸化生成物を全く認識しない。室温で４８時間そのまま放置された二重結合を含む天然物に対しても、抗Ｓ１ＰｍＡｂを検証した。天然Ｓ１Ｐの逆相ＨＰＬＣを、これまでに報告されている方法（Ｄｅｕｔｓｃｈｍａｎら、（２００３年７月），Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．，ｖｏｌ．１４６（１）：６２−８）に従って実施し、その結果より、保持時間に差がないことが分かった。さらに、このモノクローナル抗体の結合特性と、多様な脂質とを比較したところ、この抗体によって認識されたエピトープは、天然Ｓ１Ｐの二重結合の領域の炭化水素鎖を含まないことも分かった。一方、このモノクローナル抗体によって認識されたエピトープは、スフィンゴシン塩基骨格のアミノアルコールと、遊離リン酸とを含む領域である。この遊離リン酸が（ＳＰＣと同様に）コリンと結合すると、抗体結合が若干減少した。このアミノ基が（Ｃ１Ｐと同様に）脂肪酸とエステル結合すると、抗体結合は認められなかった。このスフィンゴシンアミノアルコール骨格が（ＬＰＡと同様に）グリセロール骨格と置換されると、Ｓ１Ｐ特異的モノクローナル抗体は、結合を示さなかった。これらのエピトープマッピングデータから、このモノクローナル抗体によって認識されたＳ１Ｐにはただ１つのエピトープしかないことと、そしてこのエピトープがＳ１Ｐの独特な極性頭部基によって定義されることとが分かる。
【０２４１】
ＥＬＩＳＡ測定を用いた同様の試験において、この抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体がタンパク質担体または架橋剤のいずれも認識しないことを確認するため、好適な対照材料を評価した。例えば、ＥＬＩＳＡにおいてチオール化Ｓ１Ｐを、レイダウン材料としてのＢＳＡとコンジュゲートする際に、標準の架橋剤ＳＭＣＣをＩＯＡと交換した。ＩＯＡを用いた場合、抗体の結合特性は、ＢＳＡ―ＳＭＣＣ―チオール化Ｓ１Ｐを用いた場合とほぼ同じであった。同様に、ＫＬＨを、レイダウン材料としてチオール化Ｓ１Ｐと複合体形成するタンパク質としてのＢＳＡと交換した。この試験でも、抗体の結合特性に有意な差がなかった。
【０２４２】
結合速度論：Ｓ１Ｐと、その受容体または他の部分との結合速度論は、脂質の性質から従来から問題があるとされてきた。多くの問題が、脂質の不溶性に関連していた。ＢＩＡｃｏｒｅ測定においては、これらの問題は、Ｓ１ＰをＢＩＡｃｏｒｅチップに直接固定することにより、克服された。その後、抗体をチップの表面に流し、光学密度の変化を測定して、抗体とＳ１Ｐとの結合特性を決定した。抗体の二価結合性を回避するために、チップ上にＳ１Ｐを低密度でコーティングした。さらに、そのチップを多様な密度のＳ１Ｐ（７ＲＵ、２０ＲＵおよび１０００ＲＵ）でコーティングした。抗体結合データは、１：１相互作用モデルにグローバルにフィットした。その結果、３つの異なるＳ１Ｐ密度におけるモノクローナル抗体とＳ１Ｐとの結合に起因して光学密度が変化することが分かった。概して、Ｓ１Ｐに対するモノクローナル抗体の親和性は非常に高く、結合データの解析の際に一価結合モデルを用いたかまたは二価結合モデルを用いたかによって、およそ８８ピコモル（ｐＭ）〜９９ｎＭの範囲にあることが分かった。
【０２４３】
実施例２：ＥＬＩＳＡアッセイ
１．定量的ＥＬＩＳＡ
マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３３６１）を、１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で希釈したウサギ抗マウスＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、３１５―００５―０４７）で３７℃で１時間コーティングした。プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ―２０によって３７℃にて１時間ブロッキングした。最初のインキュベーションにおいて、非特異的マウスＩｇＧまたはヒトＩｇＧ、全分子（較正曲線に使用）および測定サンプルの希釈溶液をウェルに入れた。プレートを洗浄し、１ウェルにつき１００μｌの１：４０，０００希釈ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１１５―０３５―１４６）とともに３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、酵素反応をテトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ０４４０）によって検出し、１ＭのＨ２ＳＯ４の付加により、酵素反応を停止させた。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸを用いて、光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍで測定した。解析のために未加工データをＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアに送った。
【０２４４】
２．直接ＥＬＩＳＡ
マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３３６１）を、１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で希釈したＬＰＡ―ＢＳＡで３７℃で１時間コーティングした。プレートをＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１０．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．４）で洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ―２０で室温で１時間または４℃で一晩ブロッキングした。試験対象サンプルを、０．４μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．０１２５μｇ／ｍＬ、および０μｇ／ｍＬに希釈し、各ウェルに１００μｌを加えた。プレートを洗浄し、１ウェルにつき１００μｌのＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（１：２０，０００希釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１１５―０３５―００３）とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、酵素反応をテトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ０４４０）で検出し、１ＭのＨ２ＳＯ４を加えることにより、酵素反応を停止させた。光学密度（ＯＤ）を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸを用いて４５０ｎｍにおいて測定した。解析のために、未加工データをＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアに転送した。
【０２４５】
３．競合アッセイ
ＥＬＩＳＡアッセイにより、ｍＡｂの特異性を試験した。マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３３６１）を、１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で希釈した１８：０ＬＰＡ―ＢＳＡにより、３７℃で１時間コーティングした。プレートをＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１０．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．４）で洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ―２０により、３７℃で１時間または室温で一晩ブロッキングした。最初のインキュベーションにおいて、０．４μｇ／ｍＬ抗ＬＰＡｍＡｂと指定量の（１４：０、１６：０、１８：０、１８：１、１８：２および２０：４）ＬＰＡ、ＤＳＰＡ、１８：１ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）、Ｓ１Ｐ、セラミドおよびセラミド―１―リン酸をＥＬＩＳＡプレートのウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１ウェルにつき１００μｌのＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（１：２０，０００希釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１１５―０３５―００３）または１：５０，０００希釈ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９―０３５―００３）と共に、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、酵素反応をテトラメチルベンジジンによって検出し、１ＭのＨ２ＳＯ４を加えることにより、酵素反応を停止させた。光学密度（ＯＤ）を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸを用いて４５０ｎｍで測定した。解析のために、未加工データをＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアに転送した。
【０２４６】
実施例３：スフィンゴマブマウスｍＡｂは、Ｓ１Ｐに対して高度に特異的である
競合的ＥＬＩＳＡにより、他の生体活性脂質と比較した、Ｓ１Ｐに対するスフィンゴマブの特異性が示されている。スフィンゴマブは、Ｓ１Ｐの直接代謝前駆体であるスフィンゴシン（ＳＰＨ）またはＳ１Ｐと構造的かつ機能的に類似している重要な細胞外シグナル伝達分子であるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）に対して、交差反応性を示していない。スフィンゴマブは、構造的に類似している他の脂質および代謝産物（例えば、セラミド―１―リン酸（Ｃ１Ｐ）、ジヒドロスフィンゴシン（ＤＨ―ＳＰＨ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、またはスフィンゴミエリン（ＳＭ））を認識しなかった。スフィンゴマブは、ジヒドロスフィンゴシン―１―リン酸（ＤＨ―Ｓ１Ｐ）と、そしてより低い程度でスフィンゴシルホリルコリン（ＳＰＣ）と交差反応した。
【０２４７】
実施例４：スフィンゴマブの生物活性
スフィンゴマブは、ＣＮＶのマウスモデルの眼中の脈絡膜の新血管新生（ＣＮＶ）および瘢痕形成を顕著に低減し、マウス中の心臓瘢痕形成も阻害することが分かった。これらの結果および他の結果についれは、米国特許出願シリアル番号第１１／９２４，８９０号（代理人ドケット番号ＬＰＴ−３０１０−ＵＴ）（出願日：２００７年１０月２６日、タイトル「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−Ｐｈｏｓｐｈｓａｔｅ」）中に開示がある。本明細書中、同文献全体を援用する。
【０２４８】
実施例５：Ｓ１Ｐマウスモノクローナル抗体（ＬＴ１００２；スフィンゴマブ）の可変ドメインのクローニングおよび特性解析
この実施例では、Ｓ１Ｐに対するマウスｍＡｂのクローニングについて報告する。全体的な戦略は、軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）両方のマウス可変ドメインのクローニングにより、構成した。３０６Ｄ  ＶＨのコンセンサス配列は、定常領域フラグメントがγ２ｂアイソタイプと一致することを示している。マウス可変ドメインを、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）と、そして重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）と共にクローニングし、結果としてキメラ抗体構築物を得た。
【０２４９】
１．マウスｍＡｂのクローニング
抗Ｓ１Ｐハイブリドーマ細胞株３０６Ｄ３２６．１（ＡＴＣＣ番号ＳＤ―５３６２）由来のクローンを、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）Ｉ、４５００ｍｇ／Ｌ  Ｄ―グルコース、ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、１１１―０３５―００３）、１０％  ＦＢＳ（Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｆｅｔａｌ  Ｃｌｏｎｅ  Ｉ、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）および１Ｘグルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）中において、増殖させた。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ）に基づいた手順を用いて、全ＲＮＡを１０７個のハイブリドーマ細胞から単離した。このＲＮＡを用いて、製造業者のプロトコルに従って、最初のｃＤＮＡを作製した（１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０２５０】
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）ｃＤＮＡを、ＭＨＶ７プライマー（ＭＨＶ７：５’−ＡＴＧＧＲＡＴＧＧＡＧＣＫＧＧＲＴＣＴＴＴＭＴＣＴＴ−３’［配列番号：１］）をＩｇＧ２ｂ定常領域プライマーＭＨＣＧ１／２ａ／２ｂ／３混合物（ＭＨＣＧ１：５’−ＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧ−３’［配列番号：２］；ＭＨＣＧ２ａ：５’−ＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧＧＧＣ−３［配列番号：３］；ＭＨＣＧ２ｂ：５’−ＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＧＧＧ−３’［配列番号：４］；ＭＨＣＧ３：５’−ＣＡＡＧＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＣ−３’［配列番号：５］）と共に用いて、ＰＣＲによって増幅した。この反応産物を、ＴＯＰＯ―ＴＡクローニング（登録商標）キットおよび配列を用いて、ｐＣＲ２．１（登録商標）―ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターに連結した。次いで、このベクターからのＰＣＲによって重鎖の可変ドメインを増幅した後、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩフラグメントとして挿入し、ＨＣＭＶｉプロモーター、リーダー配列、およびガンマ−１定常領域を含む発現ベクターｐＧ１Ｄ２００（米国特許第７，０６０，８０８号）またはｐＧ４Ｄ２００（ｉｄ．）に連結して、プラスミドｐＧ１Ｄ２００３０６ＤＶＨを作製した。３０６Ｄ  ＶＨのコンセンサス配列（下記に図示）から、定常領域フラグメントがガンマ２ｂアイソタイプと一致していることが分かった。
【０２５１】
同様に、ＭＫＶ２０プライマー（５’―ＧＴＣＴＣＴＧＡＴＴＣＴＡＧＧＧＣＡ―３’［配列番号：６］）をカッパ定常領域プライマーＭＫＣ（５’―ＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧ―３’［配列番号：７］）と共に用いて、免疫グロブリンカッパ鎖可変領域（ＶＫ）を増幅した。ＴＯＰＯ―ＴＡクローニング（登録商標）キットおよび配列を用いて、この反応産物をｐＣＲ２．１（登録商標）―ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターに連結した。その後、軽鎖の可変ドメインをＰＣＲによって増幅した後、ＨＣＭＶプロモーター、リーダー配列、およびヒトカッパ定常ドメインを含む発現ベクターｐＫＮ１００（米国特許第７，０６０，８０８号）にＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして挿入し、プラスミドｐＫＮ１００３０６ＤＶＫを作製した。
【０２５２】
重および軽鎖プラスミドｐＧ１Ｄ２００３０６ＤＶＨおよびｐＫＮ１００３０６ＤＶＫをＤＨ４ａ細菌に形質転換させ、グリセロール中にストックした。製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ―ｆｒｅｅ  ＭＡＸＩＰＲＥＰ（商標）キット）によって記載されているように、大量のプラスミドＤＮＡを調製した。Ｑｉａｇｅｎ社のＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＫｉｔまたはＥｎｄｏ  Ｆｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ／Ｍａｘｉ  Ｋｉｔを用いて精製したＤＮＡサンプルを、ＡＢＩ３７３０ｘｌ自動シーケンサーを用いて配列決定した。このシーケンサーはまた、蛍光シグナルを対応する核酸塩基配列へ変換する。５’および３’末端において、得られた配列がオーバーラップするように、プライマーを設計した。プライマーの長さは１８〜２４塩基であり、好適には、これらのプライマーはＧＣ含量５０％でありかつ推定二量体または二次構造を含まないものとした。スフィンゴマブ（商標）のマウスＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８および９である（表２）。表２中、ＣＤＲ残基（Ｋａｂａｔ，ＥＡ（１９８２），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ，ｖｏｌ．３４：２３〜３８を参照）に下線を施し、下の表３において個別に示している。
【表２】
2012511026.tif 000004
【表３】
2012511026.tif 000005
【０２５３】
表４において、いくつかのキメラ抗体可変（ＶＨおよびＶＬ）ドメインのアミノ酸配列を比較している。これらの変異体を、発現ベクター内の生殖細胞系リーダー配列の後ろ側にクローニングした。表４中、これらの生殖細胞系リーダー配列について、ｐＡＴＨ２００（最初の１９アミノ酸）およびｐＡＴＨ３００配列（最初の２２アミノ酸）上において下線を引いている。ＣＤＲはボールドで示す。表４中の重鎖配列および軽鎖配列それぞれのＣ―末端に続くアミノ酸を斜体で示す。これらは、定常ドメインの最初のいくつかのアミノ酸であり、可変ドメインの一部ではない。
【０２５４】
ｐＡＴＨ２００およびｐＡＴＨ３００の番号は通常は特定の可変ドメイン変異体配列を含むベクターを指すが、便宜上、この命名法は、本明細書中、変異体可変ドメインそのものを指しかつ区別するために用いられる点に留意されたい。
【０２５５】
マウスＶＨドメインおよびＶＬドメインの配列を用いて、ヒト化抗体に採用すべきフレームワーク残基を決定するための分子モデルを構築した。
【表４−１】
2012511026.tif 000006
【表４−２】
2012511026.tif 000007
【０２５６】
２．キメラ抗体の発現および結合特性
ｐＧ１Ｄ２００３０６ＤＶＨとｐＫＮ１００３０６ＤＶＫの両方の重鎖および軽鎖プラスミドをＤＨ４ａ細菌に形質転換させ、グリセロールに入れてストックした。製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ―ｆｒｅｅ  ＭＡＸＩＰＲＥＰ（商標）キット（カタログ番号１２３６２））によって記載されているように、大量のプラスミドＤＮＡを調製した。
【０２５７】
非ヒト哺乳類系での抗体発現では、各プラスミド１０μｇを用いたエレクトロポレーション（１０７細胞／ｍｌで０．７ｍｌ）により、プラスミドをアフリカミドリザル腎臓繊維芽細胞株ＣＯＳ７にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、８ｍｌの増殖培地中で４日間培養した。キメラ３０６ＤＨ１ｘ３０６ＤＶＫ―２抗体を、１．５μｇ／ｍｌにおいて、一過性同時トランスフェクトＣＯＳ細胞馴化培地中で発現させた。この抗体とＳ１Ｐとの結合を、Ｓ１Ｐ  ＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【０２５８】
キメラ抗体の発現レベルを、定量的ＥＬＩＳＡにより、下記のように決定した。マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、０．４μｇ／ｍｌＰＢＳ希釈ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）１００μｌでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次いで、これらのプレートを２００μｌ／ウェルの洗浄バッファー（１ｘＰＢＳ、０．１％ＴＷＥＥＮ）で３回洗浄した。各希釈血清サンプルまたは融合上清の２００μＬ分注を毒素コーティングプレートに移し、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄バッファーで６回洗浄した後、ヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を１：５０００希釈で各ウェルに加えた。室温で１時間反応を行い、プレートを洗浄バッファーで６回洗浄し、各ウェルに１５０μＬのＫ―ＢＬＵＥ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｓｉｇｍａ）を加え、暗所で室温で１０分間インキュベートした。５０μｌのＲＥＤ  ＳＴＯＰ溶液（ＳｋｙＢｉｏ  Ｌｔｄ．）を加えることによりこの反応を停止させ、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒ  Ｒｅａｄｅｒ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．）を用いて、６５５ｎｍで吸収を測定した。
【０２５９】
３．２９３Ｆ発現
重鎖および軽鎖プラスミドをＴｏｐ１０大腸菌（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  Ｔｏｐ１０  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ４０４０―１０））に形質転換させ、グリセロールに入れてストックした。製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ―ｆｒｅｅ  ＭＡＸＩＰＲＥＰ（商標）キット（カタログ番号１２３６２））によって記載されているように、大量のプラスミドＤＮＡを調製した。
【０２６０】
ヒト系での抗体発現では、２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、培養に２９３Ｆ―ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、プラスミドをヒト胎児腎臓細胞株２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトした。軽鎖および重鎖プラスミドを、いずれも０．５ｇ／ｍＬでトランスフェクトした。トランスフェクションを、細胞密度１０６細胞／ｍＬで実施した。トランスフェクションから３日後、１１００ｒｐｍで２５℃で５分間の遠心分離により、上清を集めた。発現レベルを定量的ＥＬＩＳＡにより定量し（上記実施例参照）、キメラ抗体については、約０．２５〜０．５ｇ／ｍＬであった。
【０２６１】
４．抗体精製
培養上清をプロテインＡ／Ｇカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号５３１３３）に０．５ｍＬ／分で通すことによって、培養上清からモノクローナル抗体を精製した。移動相は、１Ｘ  Ｐｉｅｒｃｅ  ＩｇＧ結合バッファー（カタログ番号２１００１）および０．１ＭグリシンｐＨ２．７（Ｐｉｅｒｃｅ、溶出Ｂｕｆｆｅｒ、カタログ番号２１００４）で構成した。０．１Ｍグリシン中の抗体収集物を１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ８．０で１０％（ｖ／ｖ）希釈して、ｐＨを中和した。ＩｇＧ１収集物をプールし、１Ｘ  ＰＢＳに対して徹底的に透析した（Ｐｉｅｒｃｅ社製Ｓｌｉｄｅ―Ａ―Ｌｙｚｅｒ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ、３，５００  ＭＷＣＯ、カタログ番号６６３８２）。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ―３（１０，０００  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ、カタログ番号４２０３）を用いて、２，５００ｒｃｆで１時間の遠心分離により、溶出液を濃縮した。抗体濃度は、標準として市販の骨髄腫ＩｇＧ１ストック溶液を用いて、上記のように定量的ＥＬＩＳＡにより決定した。重鎖タイプのｍＡｂを、モノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｓｉｇｍａ、ＩＳＯ―２）を用いて、ＥＬＩＳＡにより決定した。
【０２６２】
５．抗体変異体のＳ１Ｐに対する結合比較
以下の表５は、変異株とキメラ抗体との比較分析を示している。これらの結果を得るために、マウスまたはヒトＩｇＧに対して特異的な、ＨＲＰとコンジュゲートされた二次抗体により、結合抗体を検出した。発色反応を測定し、光学密度（ＯＤ）として報告した。抗体パネルの濃度は、０．１μｇ／ｍｌであった。Ｓ１Ｐコーティングマトリックスとの二次抗体単独の相互作用は、全く検出されなかった。
【表５】
2012511026.tif 000008
【０２６３】
６．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による結合速度論の決定
Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００光学バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）上で、全結合データを収集した。マレイミドＣＭ５センサーチップに、Ｓ１Ｐを結合させた。まず、ＣＭ５チップをＮＨＳ／ＥＤＣの等量混合物で７分間活性化し、続いてエチルジアミンでの７分のブロッキングステップを行った。次に、その表面上に、濃度０．５ｍＭのｓｕｌｆｏ―ＭＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．）を含有するＨＢＳランニングバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％  ｐ２０、ｐＨ７．４）を、通過させた。Ｓ１ＰをＨＢＳランニングバッファー中に濃度０．１ｍＭまで希釈し、異なる時間の長さで注入し、２つの異なる密度のＳ１Ｐ表面（３０５ＲＵおよび４７０ＲＵ）を作成した。次に、２０１３０８、２０１３０９および２０７３０８マウス抗体それぞれについて１６．７ｎＭ、５０．０ｎＭ、５０．０ｎＭ、１６．７ｎＭおよび１６．７ｎＭからの３倍希釈系列を用いて、ｍＡｂの結合データを収集した。
【０２６４】
各濃度を、二反復で試験した。表面を、５０ｍＭ  ＮａＯＨで再生した。全データを２５℃で収集した。参照表面ならびにブランク注入を用いて、反応データを加工した。データセット（２回試験した２表面と各変異体の反応）を相互作用モデルに当てはめて、結合パラメーターを得た。異なるｍＡｂ濃度のデータに対し、１：１（マウス）または１：２（変異体）相互作用モデルを用いてグローバルフィッティングを行い、見かけの結合速度定数を決定した。括弧内の数字は、下１桁の誤差を示す。
【０２６５】
実施例６：Ｓ１Ｐに対するキメラｍＡｂ
本明細書中用いられる「キメラ」抗体（または「免疫グロブリン」）とは、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属す抗体における対応配列と同一または相同な重鎖および／または軽鎖を含むが、残りの鎖（単数または複数）は、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属す抗体における対応配列と同一または相同である分子、ならびに所望の生物活性を示す限り、このような抗体のフラグメントを指す（Ｃａｂｉｌｌｙら、前掲；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１（１９８４））。
【０２６６】
Ｓ１Ｐに対するキメラ抗体は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域とともに特定のハイブリドーマ（ＡＴＣＣ安全寄託保存番号ＳＤ−５３６２）由来のマウス抗体の活性Ｓ１Ｐ結合領域を含む可変領域（Ｆｖ）を用いて、作製された。これらのＦｃ領域は、ヒト抗体のＣＬ、ＣｈＬおよびＣｈ３ドメインを含んだ。特定の方法に限定されるものではなく、キメラ抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡまたはＩｇＭのＦｃ領域からも、作製されている。当業者であれば理解するように、「ヒト化」抗体は、マウス抗Ｓ１ＰｍＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１〜３）をＩｇＧ１のフレームワーク領域などのヒト抗体フレームワーク領域（例えば、Ｆｒ１、Ｆｒ４など）とともにグラフトすることにより、作製可能である。
【０２６７】
直接的ＥＬＩＳＡ実験においては、Ｓ１Ｐに対するキメラ抗体は、完全マウスモノクローナル抗体に対する結合特性と同等であった。ＥＬＩＳＡは、結合バッファー（３３．６ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３；ｐＨ９．５）中、ＢＳＡにコンジュゲートさせた０．１μｇの化学合成チオール化Ｓ１Ｐでコーティングした９６ウェル高結合ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）で行った。このチオール化Ｓ１Ｐ―ＢＳＡを、ＥＬＩＳＡプレート内において３７℃にて１時間または４℃にて一晩インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１０．１４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．４）で４回洗浄し、ＰＢＳＴで室温にて１時間ブロッキングした。一次インキュベーション工程では、７５μＬのサンプル（測定対象のＳ１Ｐを含有する）を、ＰＢＳＴで希釈した０．１μｇ／ｍＬ抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体２５μＬとともにインキュベートし、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに加えた。各サンプルにつき、３反復のウェルで行った。室温で１時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳで４回洗浄し、ウェル当たり１００μｌの０．１μｇ／ｍＬ  ＨＲＰヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に、室温で１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ）に１〜１０分間曝した。この検出反応を、等量の１ＭのＨ２ＳＯ４を加えることにより、停止させた。これらのサンプルの光学密度を、ＥＬ―Ｘ―８００  ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ）を用い、４５０ｎｍで測定することにより、決定した。
【０２６８】
同様に、免疫動物の血清またはハイブリドーマなどの抗体産生細胞の細胞馴化培地（たとえば、上清）の抗体力価を測定する好適な方法は、ＢＳＡなどのタンパク質担体と共有結合された標的リガンド（例えば、Ｓ１Ｐ、ＬＰＡなどのチオール化類似体）でＥＬＩＳＡプレートをコーティングすることを含む。
【０２６９】
特定の方法または例に限定されることなく、キメラ抗体は、他の脂質標的（例えば、ＬＰＡ、ＰＡＦ、セラミド、スルファチド、セレブロシド、カルジオリピン、ホスホチジルセリン、ホスホチジルイノシトール、ホスファチジン酸、ホスホチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、エイコサノイド、およびその他のロイコトリエンなど）に対しても、作製することができる。さらに、これらの脂質の多くは、所望によりグリコシル化および／またはアセチル化することもできる。
【０２７０】
実施例７：ヒト化抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体ＬＴ１００９（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）の作製および特性解析
Ｓ１Ｐと特異的に結合するマウス抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体３０６Ｄ（ＬＴ１００２；スフィンゴマブ（商標））は、多様な動物モデルにおいて血管形成および腫瘍成長を強く抑制することが証明されている。以下に記述するように、マウスＣＤＲのグラフト先となるヒトフレームワークの配列同一性および相同性検索と、いくつかのフレームワーク逆突然変異を導くコンピューター処理モデルとを用いて、ＬＴ１００２をヒト化した。２つの変異体、ＨｕＭＡｂＨＣＬＣ３（ＬＴ１００４）（軽鎖に３つの逆突然変異を含む）およびＨｕＭＡｂＨＣＬＣ５（ＬＴ１００６）（軽鎖に５つの逆突然変異を含む）は、ナノモル範囲において結合親和性を示した。ヒト化変異体の生物物理学的特性および生物学的特性を向上させる目的のため、さらなる工学的処理を行った。ＨＣＤＲ２中のフリーシステイン残基がアラニンで置き換えられたヒト化変異体ＨｕＭＡｂＨＣＣｙｓＡｌａＬＣ３（ＬＴ１００７）およびＨｕＭＡｂＨＣＣｙｓＡｌａＬＣ５（ＬＴ１００９）は、ピコモル範囲において結合親和性を示した。全てのヒト化変異体が加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）モデルにおいて血管形成を阻害し、ＨｕＭＡｂＨＣＣｙｓＡｌａＬＣ５（ＬＴ１００９）は、親マウス抗体と比較して、優れた安定性およびｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示した。この変異体ｈｕＭＡｂＨＣｃｙｓａｌａＬＣ５（ＬＴ１００９）をＳｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ（商標）と命名した。
【０２７１】
１．抗Ｓ１Ｐ抗体のヒト化設計
マウスｍＡｂＬＴ１００２（スフィンゴマブ（商標））の可変ドメインを、ＣＤＲグラフティングによってヒト化した（Ｗｉｎｔｅｒ米国特許第５，２２５，５３９号）。Ｋａｂａｔら（１９９１年）によって記載されているように、ＣＤＲ残基を配列高頻度可変性に基づいて同定した。
【０２７２】
この研究では、構造アライメントプログラム（ＳＲ  ｖ７．６）を用いたＩＭＧＴおよびＫａｂａｔデータベース内のヒト抗体の相同性検索に基づいて、好適なアクセプター構造を選択した。最初のステップは、これらのヒト重鎖可変（ＶＨ）および軽鎖可変（ＶＬ）配列データベースにＬＴ１００２  ＶＨおよびＶＬタンパク質配列それぞれについて問い合わせること、バーニア残基（Ｆｏｏｔｅ，Ｊ．  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｏｏｐｓ．Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４，４８７〜４９９（１９９２年））、カノニカル残基（Ｍｏｒｅａら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ２０，２６７〜２７９（２０００年）、およびＶＨ―ＶＬ界面残基（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．，Ｎｏｖｏｔｎｙ，Ｊ．，Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ，Ｒ．，  ＆  Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｍ．Ｄｏｍａｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｔｈｅ  ｐａｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６，６５１〜６６３（１９８５年））において、ＦＲ内に高い配列同一性を有しかつ同一カノニカルクラスおよび／または長さのＣＤＲを有するヒトフレームワーク（ＦＲ）を同定することである。このライブラリーの各メンバーの、マウス抗体の個別アライン残基に対する同一性を、前記プログラムを用いて計算した。マウスＦＲと最も同一性の高いＦＲ配列を有するヒト配列を同定し、ヒト「アクセプター」配列の最初のショートリストを作成した。バーニア残基、カノニカル残基およびＶＨ―ＶＬ界面（ＶＣＩ）残基においてマウス抗体と最も同一性の高い配列も計算した。ヒトとマウスとの間でのこれらの位置における相違は、保存的置換と非保存的置換に分類され、ＬＴ１００２との非保存的ＶＣＩの相違が最低値であることを最良のフレームワーク選択とした。ＬＴ１００２のＣＤＲループＬ３およびＨ１は、カノニカル構造に分類することができた。これらのＬ３およびＨ１構造を用いて、同一カノニカル構造を有するヒト抗体ＦＲを選択した。分類されないＣＤＲについては、ＣＤＲ長さがマウス抗体と同一であるヒトフレームワークを選択するよう、試みた。その理論的解釈は、ＣＤＲループ構造が、ＣＤＲループ配列自体にだけでなく、その基礎となるフレームワーク残基（カノニカル残基）にも依存しているということである。そのため、マッチするカノニカルＣＤＲ構造および／またはＣＤＲ長さを有するヒトフレームワークは、グラフトしたマウスＣＤＲを、抗原結合親和性を維持するのに最も適した配向で保持する可能性が高い。ＣＤＲ  Ｈ３を除く全てのＣＤＲについては、これは、ヒトフレームワーク配列の選択によって行われた。加えて、普通でないシステインまたはプロリン残基を有するフレームワークをできるだけ排除した。重鎖配列および軽鎖配列については、これらの計算を別々に実施した。最後に、最良にマッチする配列におけるフレームワーク領域全体での個別配���の相違を比較した。上記比較計算結果に最良にフィットするヒト抗体のうち、抗体ＡＹ０５０７０７およびＡＪ００２７７３を、軽鎖および重鎖それぞれについて最も適したヒトフレームワークプロバイダーとして選択した。ＡＹ０５０７０７フレームワークについては、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋら（Ｂｌｏｏｄ、２００２年４月１５日、Ｖｏｌ．９９、Ｎｏ．８、ｐｐ２８２８〜２８３４）による記載があり、およびその配列がＧｅｎｂａｎｋを介して利用可能である（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＹ０５０７０７；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃｌｏｎｅ  ＷＲ３ＶＬ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｍＲＮＡ、ｐａｒｔｉａｌ  ｃｄｓ．；２００１年１１月１３日に提出、最終版は２００２年４月８日）。
【０２７３】
同様に、ＡＪ００２７７３抗体フレームワークについて、Ｓｎｏｗら［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（１０）、３３５４〜３３６１（１９９８年）］による記載があり、その配列がＧｅｎｂａｎｋを介して利用可能である（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＪ００２７７２；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ５  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ４  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔ  ２、２；１９９８年１１月６日に提出、最終版は２００６年１０月１６日）。
【０２７４】
ＡＹ０５０７０７（軽鎖）配列およびＡＪ００２７７３（重鎖）配列はどちらとも、ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭにおいて見つけることも可能である。ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭは、ヒトおよび他の脊椎動物種からの免疫グロブリン（ＩＧ）およびＴ細胞受容体（ＴＲ）ヌクレオチド配列の総合データベースである。このデータベースは、１９８９年にＭａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ−Ｌｅｆｒａｎｃ（ＬＩＧＭ、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、フランス）によって創設され、１９９５年７月からオンライン利用が可能となっている。
【０２７５】
第２のステップでは、ＬＴ１００２の可変領域の分子モデルを生成し、抗原結合に影響を与え得るがバーニア残基、カノニカル残基および界面残基の基に含まれていないＦＲ残基を同定した。多様なＦＲ残基がＣＤＲループのコンフォメーションにどのように影響をするかおよびその逆をより深く理解するために、グラフトドナーおよびアクセプター可変ドメインの多くの構造的特徴について調査した。ＣＤＲへの影響を与える可能性の高いＬＴ１００２中の非保存のＦＲ残基をバーニア定義およびカノニカル定義（上記を参照）から同定し、これにより、ヒトＦＲのいくつかの残基を、本来のマウスアミノ酸に回復させた（逆突然変異）。
【０２７６】
２．変異原性
可変ドメイン配列内の突然変異を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ―Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００５２４）を用いて作出した。個別反応は、５０ｎｇの二本鎖ＤＮＡ鋳型、２．５ＵのＰｆｕＵｌｔｒｅ  ＨＦ  ＤＮＡポリメラーゼおよびその対応するバッファー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００５２４）、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘならびに５ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁した１２５ｎｇの各突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いて、実施した。最初の変性を９５℃で３０秒間行い、続いて１６サイクルの増幅：９５℃で３０秒間、５５℃で６０秒間および６８℃で８分間行った。温度サイクル後、最終反応物をＤｐｎＩで３７℃で１時間消化して、メチル化親ＤＮＡを除去した。得られた変異産物をｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ＸＬ１―Ｂｌｕｅ  Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換させ、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ寒天にプレーティングした。その後、コロニーを配列決定によりチェックした。次いで、各変異産物株を１ｌ振盪フラスコで培養し、Ｑｉａｇｅｎ社製、カタログ番号１２３６２のＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。
【０２７７】
３．ヒト化抗体変異体の作製
全長抗体を哺乳類細胞内で発現させるために、ＬＴ１００２の可変ドメインをκ鎖および重鎖のヒト定常領域を含むベクターにクローニングすることにより、マウス―ヒトキメラ抗体（ｃｈＭＡｂ  Ｓ１Ｐ）を構築した。ＬＴ１００２  ＶＨのＫａｂａｔＣＤＲ１、２および３を、ＡＪ００２７７３のアクセプターフレームワーク内へグラフトすることにより、ヒト化重鎖を得た。ＡＪ００２７７３に最も近い生殖細胞遺伝子はＶＨ５―５１であり、このリーダー配列をリーダー配列としてヒト化重鎖変異体に組み込んだ。ＶＨ５―５１リーダー配列を有する、最初のヒト化型ＬＴ１００２  ＶＨであるｐＡＴＨ２００のタンパク質配列を表４中に示す。ＬＴ１００２のＶＨドメインの場合では、２位、２７位、３７位、４８位、６７位および６９位の残基はバーニア残基であるかまたはＶＨおよびＶＬドメインの界面にあり、ＣＤＲ配向に影響を及ぼす可能性が高い。３７位は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの界面に重要であるように思われた。ヒトフレームワーク内のこれらの位置にある残基を、対応する位置に見られるマウス残基で逆突然変異させた。突然変異、Ｖ３７Ｍ、Ｍ４８ＩおよびＹ２７Ｆを個別に試験した。１つの型（ｐＡＴＨ２０５）は３つ全ての突然変異とともに、Ｖ６７Ａと、さらにＩ６９Ｌとを含み、別の型（ｐＡＴＨ２０６）は、５つ全ての突然変異と、Ｖ２Ａとを含んだ。
【０２７８】
ＬＴ１００２  ＶＬのＫａｂａｔ  ＣＤＲ１、２および３を、ＡＹ０５０７０７のアクセプターフレームワーク内へグラフトすることにより、ヒト化軽鎖を得た。ＡＹ０５０７０７に最も近い生殖細胞遺伝子はＬ１１であり、このリーダー配列をヒト化軽鎖構築物に組み込んだ。ｐＡＴＨ３００のタンパク質配列（ＬＴ１００２軽鎖）を表４中に示す。表４中、生殖細胞系リーダー配列に下線を付している。ＶＬの場合、４つの非保存バーニア位置４位、３６位、４９位および６４位がＣＤＲループの構造の支持に関与するため、マウス残基の逆突然変異のためにそれらの位置を選択した。ＬＴ１００２の分子モデルを調査したところ、Ｔｙｒ６７がＣＤＲ表面に近く、抗原結合面に向かって配向しており、Ｓ１Ｐと相互作用することができることが、示唆された。そのため、後のヒト化型にＳ６７Ｙ逆突然変異も追加した。２つの突然変異を別々に導入して、Ｙ４９ＳまたはＹ３６Ｆのいずれかを含む２つの型を作製した。下記の突然変異組合せを用いて、いくつかの型を作出した：（Ｙ４９Ｓ、Ｆ４Ｖ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｙ３６Ｆ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｆ４Ｖ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｇ６４Ｓ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｆ４Ｖ、Ｇ６４Ｓ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｆ４Ｖ、Ｇ６４Ｓ、Ｓ６７Ｙ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｇ６４Ｓ、Ｓ６７Ｙ）。
【０２７９】
４．ヒト化リード候補の選択
基本グラフト型（ｐＡＴＨ２００およびｐＡＴＨ３００）可変領域および逆突然変異を含む全ての変異体を、ヒトＶＨまたはＶＬ定常領域を含む発現ベクターにクローニングした。キメラ（ｃｈＭＡｂ）抗体と同じ条件下において、哺乳類細胞において全てのヒト化変異体を作製し、ＥＬＩＳＡによりＳ１Ｐとの結合について試験した。この際の収率は、ヒト化変異体についておよそ１０〜２０ｍｇ／ｌ、ｃｈＭＡｂＳ１Ｐについて０．３〜０．５ｍｇ／ｌであった。還元条件下でのＳＤＳ―ＰＡＧＥでは、軽鎖および重鎖の推定質量と一致する２５ｋＤａおよび５０ｋＤａにおいて、高純度（＞９８％）の２つのバンドが現われた。非還元条件下では、推定質量約１５０ｋの単一バンドが観察された。ｃｈＭＡｂは、親マウス抗体と同じ可変領域を含み、ヒト化抗体と同じ定常領域を有し、そのため同じＥＬＩＳＡプロトコルを用いて検出することができるため、ｃｈＭＡｂをヒト化抗体結合アッセイにおいて標準として用いた。
【０２８０】
６つのマウスＣＤＲが未変異ヒトフレームワーク内にグラフトされた最初のヒト化抗体は、Ｓ１Ｐとの検出可能な結合を全く示さなかった。４つの逆突然変異（Ｙ４９Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｆ４ＶおよびＧ６４Ｓ）を含むκ軽鎖は、キメラ重鎖を伴い、ＥＬＩＳＡによって示されるように、Ｓ１Ｐとの次善の結合を示した。Ｙ６７位へさらなる突然変異を組み込むことで、その結合が著しく改善した。逆突然変異Ｙ４９Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｆ４Ｖ、Ｇ６４ＳおよびＳ６７Ｙを含むｐＡＴＨ３０８型および逆突然変異Ｙ４９Ｓ、Ｇ６４ＳおよびＳ６７Ｙを含むｐＡＴＨ３０９型は、キメラ重鎖を伴い、いずれも、ＥＬＩＳＡによって確認されるように、キメラ抗体と同様にＳ１Ｐと結合した抗体を生じた。２つの突然変異Ｙ３６ＦおよびＦ４Ｖは、Ｓ１Ｐ結合の観点から、必要な逆突然変異とはみなされなかった。活性を回復させるためには、ＶＬフレームワーク内に３つ〜５つの逆突然変異をエンジニアリングすることが必要であった。
【０２８１】
重鎖のヒトフレームワーク内へのバーニア逆突然変異Ｖ３７Ｍの組み込みは、キメラ軽鎖を伴い、キメラ抗体と同様の結合挙動を回復させるのに十分であった。
【０２８２】
要約すれば、ＬＴ１００２  ＶＨドメインのヒト化には、マウスフレームワーク配列の１つのアミノ酸しか必要でなかったが、一方、マウス親ＬＴ１００２と同等の結合を得るためには、マウスＶＬフレームワークドメイン、３つまたは５つのマウス残基を保持する必要があった。
【０２８３】
５．ヒト化リード候補の最適化
マウス抗Ｓ１Ｐ抗体は、重鎖のＣＤＲ２内に遊離システイン残基（Ｃｙｓ５０）を含み、この残基は、抗体分子を多少不安定にさせる可能性があった。部位特異的突然変異誘発を用いて、システイン残基を、アラニン（ｈｕＭＡｂＨＣｃｙｓａｌａＬＣ３）（ｐＡＴＨ２０７）、グリシン（ｈｕＭＡｂＨＣｃｙｓｇｌｙＬＣ３）、セリン（ｈｕＭＡｂＨＣｃｙｓｓｅｒＬＣ３）およびフェニルアラニン（ｈｕＭＡｂＨＣｃｙｓｐｈｅＬＣ３）と置換することにより、ｐＡＴＨ２０１変異体を作出した。また、システイン変異株の重鎖についての試験を、５つの逆突然変異を含むヒト化軽鎖（ｐＡＴＨ３０８）（ｈｕＭＡｂＨＣｃｙｓａｌａＬＣ５＝ＬＴ１００９）を用いて行った。これらの変異体を哺乳類細胞で発現させた後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイのパネルで特性解析した。重要なことに、ヒト化変異体の発現率は、ｃｈＭＡｂ  Ｓ１Ｐの場合よりも著しく高かった。
【０２８４】
６．ヒト化リード候補の詳細特性解析
ｉ．特異性
Ｓ１Ｐおよび他のいくつかの生体脂質に対する競合的ＥＬＩＳＡアッセイにより、ヒト化変異体を特異性について試験した。このアッセイには、エピトープマッピングが可能であるというさらなる利点がある。ヒト化抗体ＬＴ１００９は、Ｓ１Ｐの直接代謝前駆体であるスフィンゴシン（ＳＰＨ）またはＳ１Ｐと構造的かつ機能的に類似している重要な細胞外シグナル伝達分子であるＬＰＡ（リゾホスファチジン酸）に対し、交差反応性を示さなかった。さらに、ｒｈｕＭＡｂ  Ｓ１Ｐは、構造的に類似している他の脂質および代謝産物（例えば、セラミド（ＣＥＲ）、セラミド―１―リン酸（Ｃ１Ｐ））を認識しなかった。しかしながら、予想通り、ＬＴ１００９は、スフィンゴシルホスホコリン（ＳＰＣ）（Ｓ１Ｐの遊離リン酸基がコリン残基と結合している脂質）とは交差反応した。重要なことに、全てのヒト化変異体は、マウス抗体に匹敵する特異性プロフィールを示した。
【０２８５】
ｉｉ．結合親和性
Ｓ１ＰコーティングチップへのＩｇＧ結合についてのＢｉａｃｏｒｅ測定により、変異体ＬＴ１００４またはＬＴ１００６が、ｃｈＭＡｂ  Ｓ１Ｐと同様の低ナノモル範囲において結合親和性を示すことが分かった。システイン残基がアラニンで置き換えられたヒト化変異体ＬＴ１００７およびＬＴ１００９は、マウス親ＬＴ１００２（スフィンゴマブ（商標））と同様のピコモル範囲において、結合親和性を示した。
【０２８６】
ｉｉｉ．安定性
高温での刺激後の安定性について、ヒト化変異体を試験した。各ヒト化変異体について、上清を６０〜７４℃の範囲の温度に供することにより、熱変性転移の近似中心点（ＴＭ）を決定した。これらの温度は、広範な温度５０〜８０℃間での温度刺激の後にマウス抗体分子で見られた変性プロフィールに基づいて、選択した。各変異体の結合特性を、温度刺激の前後に決定した。マウス抗体はＴＭ６５℃を示した。変異体ｈｕＭＡｂＨＣｃｙｓａｌａＬＣ５（ＬＴ１００９）は、他の全ての変異体と比較して、優れたＴＭを示した。表６は、リードヒト化候補と、それらの特性とを示す。
【表６】
2012511026.tif 000009
重鎖および軽鎖中の突然変異の数を示している。種類欄に、重鎖および軽鎖の識別を記載する。
【０２８７】
ｉｖ．配列
天然に存在する抗体と同様に、ＬＴ１００９は、各抗体分子に含まれる２つの軽鎖ポリペプチドそれぞれと、２つの重鎖ポリペプチドそれぞれとに、３つの相補性決定領域（それぞれ「ＣＤＲ」）を含む。これらの６つのＣＤＲそれぞれのアミノ酸配列を下記に記載する（「ＶＬ」は、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を示し、一方、「ＶＨ」は、免疫グロブリン重鎖の可変領域を示す）：
ＣＤＲ１  ＶＬ：ＩＴＴＴＤＩＤＤＤＭＮ［配列番号：１０］
ＣＤＲ２  ＶＬ：ＥＧＮＩＬＲＰ［配列番号：１１］
ＣＤＲ３  ＶＬ：ＬＱＳＤＮＬＰＦＴ［配列番号：１２］
ＣＤＲ１  ＶＨ：ＤＨＴＩＨ［配列番号：１３］
ＣＤＲ２  ＶＨ：ＡＩＳＰＲＨＤＩＴＫＹＮＥＭＦＲＧ［配列番号：１８］
ＣＤＲ３  ＶＨ：ＧＧＦＹＧＳＴＩＷＦＤＦ［配列番号：１５］
【０２８８】
実施例８：ヒト化Ｓ１Ｐ  ｍＡｂの生産および精製
この実施例では、生体活性脂質スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）と高親和性で結合する組換えヒト化モノクローナル抗体（ＬＴ１００９）の生産について、記載する。ＬＴ１００９は、２つの同一軽鎖と２つの同一重鎖とからなる、全分子量約１５０ｋＤａ、全長ＩｇＧ１ｋのアイソタイプ抗体である。重鎖は、Ｎ結合型グリコシル化部位を含む。オリゴ糖構造の性質はまだ決定されていないが、コアフコースを含む複雑な二分岐構造であると予想される。現在のところ、主要であろう糖型の性質は分かっていない。若干のＣ末端不均質性は、重鎖の定常ドメイン内にリシン残基が存在することに起因すると思われる。２つの重鎖は、２つの鎖間ジスルフィド結合を通じて互いに共有結合しており、これはヒトＩｇＧ１の構造と一致している。
【０２８９】
ＬＴ１００９は、Ｓ１Ｐで免疫処置したマウスから作製したハイブリドーマを用いて生産したマウスモノクローナル抗体（ＬＴ１００２；スフィンゴマブ（商標））から得られた。マウス抗体のヒト化では、マウス親抗体とのその構造類似性で選択されるヒト抗体フレームワークのＣＤＲの代わりに、６つのマウスＣＤＲの挿入を必要とした。ヒト化抗体をエンジニアリングするために、フレームワーク内で一連の置換を行った。これらの置換は逆突然変異と呼ばれ、ヒト残基を、抗体と抗原との相互作用において重要な役割を果たすマウス残基と置換する。最終的なヒト化型は、重鎖の可変ドメインのヒトフレームワーク内の１つのマウス逆突然変異と、軽鎖の可変ドメインのヒトフレームワーク内の５つのマウス逆突然変異とを含む。加えて、重鎖のＣＤＲ＃２内に存在する１つの残基を、アラニン残基へと置換した。この置換は、抗体分子の安定性および効力を増加させることが分かった。
【０２９０】
ヒト化可変ドメイン（重鎖および軽鎖どちらとも）をＬｏｎｚａ社のＧＳ遺伝子発現系にクローニングして、プラスミドｐＡＴＨ１００９を作製した。このＬｏｎｚａ社のＧＳ発現システムは、抗体遺伝子の定常ドメインを有する発現ベクターと、選択マーカーであるグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）とからなる。ＧＳは、グルタミン酸とアンモニアからのグルタミン生合成に関与する酵素である。抗体遺伝子と選択マーカーの両方を有するベクターを、細胞が外来性グルタミンなしに生存するのに十分なグルタミンを供給した無血清培地中での増殖に適したプロプライエタリーチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯＫ１ＳＶ）宿主細胞株にトランスフェクトする。加えて、ベクターによって提供されるＧＳ活性を有する細胞株だけが生存し得るように内因性ＧＳの活性を阻害するために、特異的ＧＳ阻害剤であるメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）をこの培地に添加する。その結果得られた、ｐＡＴＨ１００９でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株をＬＨ１と呼ぶ。
【０２９１】
上記実施例中に記載した天然生殖細胞系遺伝子リーダー配列を、プラスミドｐＡＴＨ１００９の生成に用いられるＧＳ発現ベクター骨格中のリーダー配列と置換した点に留意されたい。後者のリーダー配列は、ＬＴ１００９重鎖のＮ末端（配列番号：１９および２４）における「ｍｅｗｓｗｖ」から始まる１９個のアミノ酸として見ることができ、ＬＣリーダーは、（配列番号：２０および２６のＮ末端において示すように）「ｍｓｖｐｔ」から始まる２０個のアミノ酸である。
【０２９２】
トランスフェクトされたＣＨＯ  ＬＨ１細胞を、ＭＳＸの存在下においてグルタミンフリー培地中で成長する能力で選択し、分離株（クローン）を、活性ＬＴ１００９の高レベル分泌として選択した。ＬＨ１  ２７５は、全ロットのＬＴ１００９抗体生成のためのマスター細胞バンク（ＭＣＢ）の創設のために選択されたｐＡＴＨ１００９ベクターを含むＬＨ１  ＣＨＯ細胞株のリードクローンに付与された名称である。こうして、毒性学および臨床開発のために、毒性学研究および臨床開発のための材料が得られた。
【０２９３】
ＡＴＣＣ寄託：ｐＡＴＨ１００９プラスミドを含む大腸菌ＳｔＢ１２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託した（寄託番号ＰＴＡ―８４２１）。ｐＡＴＨ１００９ベクターを含むＣＨＯ細胞株ＬＨ１  ２７５も、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託した（寄託番号ＰＴＡ―８４２２）。
【０２９４】
配列：
ＬＴ１００９の重鎖および軽鎖ポリペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を下記に羅列する。リーダー配列（Ｌｏｎｚａ  ＧＳ発現ベクターからのもの）には下線を付し、ＣＤＲは太字にしている。
【０２９５】
可変ドメインのＬＴ１００９  ＨＣアミノ酸配列［配列番号：１９］：
【化２】
2012511026.tif 000010
【０２９６】
可変ドメインのＬＴ１００９  ＬＣアミノ酸配列［配列番号：２０］：
【化３】
2012511026.tif 000011
【０２９７】
重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードする対応するヌクレオチド配列を、下記に羅列する。リーダー配列（Ｌｏｎｚａ  ＧＳ発現ベクターからのもの）には下線を付し、リーダーに先行する配列はＨｉｎｄＩＩＩ切断部位（ａａｇｃｔｔ）およびコザックコンセンサス配列（ｇｃｃｇｃｃａｃｃ）であり、翻訳プロセスの開始において主要な役割を果たす。ＣＤＲは太字にしている：
【０２９８】
可変ドメインのＬＴ１００９  ＨＣヌクレオチド配列［配列番号：２１］
【化４】
2012511026.tif 000012
【０２９９】
可変ドメインのＬＴ１００９  ＬＣヌクレオチド配列［配列番号．２２］
【化５】
2012511026.tif 000013
【０３００】
ＬＴ１００９全長ＨＣヌクレオチド（ｃＤＮＡ）配列［配列番号：２３］について、ＣＤＲを太字で表し、リーダー領域に下線を付し、ヒンジ領域を斜体で表す。リーダーに先行する配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位（ａａｇｃｔｔ）およびコザック配列（ｇｃｃｇｃｃａｃｃ）である。
【化６】
2012511026.tif 000014
【０３０１】
ＬＴ１００９  ＨＣアミノ酸配列については、リーダー（下線を付す）があり、ヒンジ領域がマイナスである。ＣＤＲを太字で表す。［配列番号：２４］：
【化７】
2012511026.tif 000015
【０３０２】
ＬＴ１００９  ＬＣ全長ヌクレオチド配列［配列番号：２５］については、リーダーに下線を付し、ＣＤＲを太字で表す。リーダーに先行する配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位（ａａｇｃｔｔ）およびコザック配列（ｇｃｃｇｃｃａｃｃ）である。
【化８】
2012511026.tif 000016
【０３０３】
ＬＴ１００９  ＬＣアミノ酸配列については、リーダーに下線を付し、ＣＤＲを太字で表す。［配列番号：２６］：
【化９】
2012511026.tif 000017
【０３０４】
リーダー配列が無く（かつ先行するヌクレアーゼ切断部位およびコザック配列の無い）ＬＴ１００９重鎖および軽鎖の配列を下記に示す。ＣＤＲを太字で表す。
【０３０５】
可変ドメインのＬＴ１００９  ＨＣアミノ酸配列［配列番号：２７］：
【化１０】
2012511026.tif 000018
【０３０６】
可変ドメインをコードする対応するＬＴ１００９  ＨＣヌクレオチド配列［配列番号：２８］：
【化１１】
2012511026.tif 000019
【０３０７】
可変ドメインのＬＴ１００９  ＬＣアミノ酸配列［配列番号：２９］：
【化１２】
2012511026.tif 000020
【０３０８】
可変ドメインをコードする対応するＬＴ１００９  ＬＣヌクレオチド配列［配列番号：３０］：
【化１３】
2012511026.tif 000021
【０３０９】
リーダー無しの全長ＬＴ１００９重鎖および軽鎖アミノ酸配列を下記に示す（ＣＤＲは太字にしている）：
【０３１０】
リーダー無しであり（かつ先行するヌクレアーゼ切断部位およびコザック配列無しであり）かつヒンジ（下線）を含むＬＴ１００９全長重鎖アミノ酸配列（配列番号：３１）：
【化１４】
2012511026.tif 000022
【０３１１】
リーダー無しのＬＴ１００９全長軽鎖アミノ酸配列［配列番号：３２］：
【化１５】
2012511026.tif 000023
【０３１２】
（リーダーまたは先行するヌクレアーゼ切断またはコザック部位無しの）対応するヌクレオチド配列を下記に示す。遺伝コードの縮退に起因して、別のヌクレオチド配列が実質的に任意の所与のアミノ酸配列をコードし得ることが理解される。
【０３１３】
ＬＴ１００９全長重鎖ヌクレオチド（ｃＤＮＡ）配列［配列番号：３３］：
【化１６】
2012511026.tif 000024
【０３１４】
ＬＴ１００９全長軽鎖ヌクレオチド配列［配列番号：３４］：
【化１７】
2012511026.tif 000025
【０３１５】
ＬＴ１００９重鎖上のＣ末端リシンは、成熟した重鎖タンパク質上には必ずしも存在しない。
ＬＴ１００９重鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列については、リシンがタンパク質の最終（最Ｃ末端）アミノ酸残基であることが分かったが、ＬＴ１００９が（例えばＣＨＯ細胞クローンＬＨ１  ２７５中において）発現した場合、当該ＬＴ１００９は、Ｃ末端リシンを含まない。これはペプチドマッピングによって示され、理論に縛られることは望まないが、これは、哺乳類系中のタンパク質の翻訳後修飾に起因するものと考えられる。ここでも理論に縛られることは望まないが、他の発現系（特に、非哺乳類系）において、Ｃ末端リシンは、成熟したＬＴ１００９重鎖上に存在すると考えられる。
【０３１６】
ＣＨＯ細胞中に発現したＬＴ１００９重鎖アミノ酸配列（すなわち、リーダー無しかつＣ末端リシン無しのもの）を下記に示す（ＣＤＲは太字にしており、ヒンジを斜体にしている）［配列番号：３５］：
【化１８】
2012511026.tif 000026
【０３１７】
このアミノ酸配列をコードし得るヌクレオチド配列の一例を配列番号：３６として下記に示す。遺伝コードの縮退に起因して、複数のヌクレオチド配列が同一のアミノ酸配列をコードし得、そのため、アミノ酸配列をコードするものとして本明細書中に示される上記および他のヌクレオチド配列は例示目的のためのとして認識されることが理解される。ＣＤＲを太字で表し、ヒンジ領域を斜体で表す。
【化１９】
2012511026.tif 000027
【０３１８】
ＬＴ１００９のペプチドマッピング
ＬＴ１００９のペプチドマッピング（４つの異なるロット、全てＣＨＯ細胞株ＬＨ１  ２７５において発現）で、タンパク質配列が＞９９％であることが確認できた。確認されなかった唯一のペプチドは、単一アミノ酸であった。脱グリコシル反応の証拠が、重鎖のフラグメントＴ２３内に存在し、脱グリコシル時において、アスパラギン（Ｎ）がアスパラギン酸（Ｄ）に変化された。これは、重鎖アミノ酸配列のアミノ酸３０１（Ｎ）（例えば、配列番号：３１に示すもの）に対応するこの部分がグリコシル化されていたことを示す。また、ＣＨＯ細胞株ＬＨ１  ２７５内に発現したＬＴ１００９重鎖内にＣ末端リシンが存在していなかったことも、ペプチドマッピングによって分かった。
【０３１９】
実施例９：マウスｍＡｂ（スフィンゴマブ）対ヒト化ｍＡｂ（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
スフィンゴマブ（ＬＴ１００２）およびＳｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ（ＬＴ１００９）を、米国特許出願シリアル番号第１１／９２４，８９０号（代理人ドケット番号ＬＰＴ―３０１０―ＵＴ）（出願日：２００７年１０月２６日、タイトル：「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ」）中に開示されているような多様な動物およびｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて比較した。本明細書中、同文献全体を援用する。
【０３２０】
ヒト化抗体変異体およびマウス抗体を、ＡＭＤのＣＮＶ動物モデルにおける血管新生を阻害するその能力について、比較した。これらのヒト化変異体のうち３つが、ＣＮＶ領域の測定によって評価されるようなマウス抗体に実質的に相当するような様態で、血管新生を阻害した。マウスｍＡｂＬＴ１００２（スフィンゴマブ（商標））およびヒト化ｍＡｂＬＴ１００９（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ（商標））はどちらとも、このＣＮＶマウスモデル中の病変サイズを有意に低減させた。試験されたｍＡｂｓは全て、およそ８０〜９８％の病変サイズの低減を示しており、これは、全てのケースにおいて有意であった（ｐ＜０．００１対生理食塩水）。さらに、ＬＴ１００７およびＬＴ１００９はまた、非特異的抗体対照と比較しても有意な阻害（ｐ＜０．０５）を示した。病変サイズの阻害率は、ＬＴ１００２（マウス）ではおよそ８０％、ＬＴ１００４（ヒト化）では８２％、ＬＴ１００６では８１％、ＬＴ１００９では９９％であった。このように、ＬＴ１００９はこのｉｎ  ｖｉｖｏ新血管新生モデルにおいて最も活性の高いヒト化ｍＡｂ変異体であった。
【０３２１】
ＬＴ１００９はまた、未熟児網膜症のマウスモデルにおける網膜新血管形成の発生の低減においても有効であった［米国特許出願シリアル番号第１１／９２４，８９０号（代理人ドケット番号ＬＰＴ―３０１０―ＵＴ）（出願日：２００７年１０月２６日、タイトル：「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ」）本明細書中、同文献全体を援用する］。ＬＴ１００９を硝子体内投与（５．０μｇ／眼）したところ、生理食塩水対照と比較してほぼ４倍の網膜新血管形成低減がみられた。
【０３２２】
ＬＴ１００９はまた、マトリゲルプラグアッセイにおけるＶＥＧＦ誘発性血管形成も約８０％ブロックした。この低減は有意であり（ＶＥＧＦ単独と比較してｐ＜０．０５）、ＬＴ１００９の強力な抗脈管形成剤活性が確認され、ＬＴ１００９がＶＥＧＦ誘発性血管形成を有意に阻害できることが強く示唆された。この発見は、マウス同所性乳癌モデルにおいてＳ１Ｐ抗体がいくつかの血管形成因子（ＶＥＧＦを含む）の血清レベルを減少させたＬｐａｔｈのオンコロジープログラムのデータと一致する。
【０３２３】
ＬＴ１００９はまた、ブルッフ膜のレーザー破膜後の脈絡膜の新血管新生および血管漏出を有意に低減させる。脈絡膜の新血管新生の領域（ＰＥＣＡＭ―１により染色）は、ＬＴ１００９で処置した動物においておよそ０．０１５ｍｍ２であり、生理食塩水で処置した対照動物においておよびおよそ０．０３ｍｍ２であった。これは新血管新生の５０％減少である（ｐ―０．０１８）。脈絡膜新血管新生からの漏出領域（フルオレセインにより染色）は、ＬＴ１００９で処置した動物ではおよそ０．１２５ｍｍ２、生理食塩水処置対照動物ではおよそ０．２ｍｍ２であった。これは、血管漏出のおよそ３８％減少（ｐ―０．０１７）である。
【０３２４】
例えば血管形成および癌についてのＬＴ１００９（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）のモデル内での有効性を示す上記および他の結果について、米国特許出願シリアル番号第１１／９２４，８９０号（代理人ドケット番号ＬＰＴ―３０１０―ＵＴ）（出願日：２００７年１０月２６日、タイトル：「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ」）中に開示がある。本明細書中、同文献全体を援用する。
【０３２５】
実施例１０：抗Ｓ１Ｐ抗体ＬＴ１００２およびＬＴ１００９をｃ５７／ｂｌ６マウスおよびマカクザルに投与すると、リンパ球カウントが低減する
ＬＴ１００２によるマウス研究
この研究の目的は、Ｃ５７／ＢＬ６マウスへの毎日の投与後のマウス抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体ＬＴ１００２の毒性および毒物動態学的プロファイルを決定することである。この研究は、独立契約研究機関であるＬＡＢ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃによって行われた。ＬＴ１００２用量溶液を２８日間連続して各グループの動物に投与した。投与は、尾静脈を介した静脈内ボーラス注射（１日目〜１４日目）およびボーラス腹腔内注射（１５日目〜２８日目）により、およそ０．５〜１．０分間かけて行った。処置されたグループの動物に対し、ＬＴ１００２を３０、７５または２００ｍｇ／ｋｇ（各グループはｎ＝６）の用量で投与し、生理食塩水（ビヒクル）対照グループとしてＰＢＳで処置した動物と比較した。
【０３２６】
研究中、死亡率、臨床状態、体重よび摂餌量に対する効果について、動物を監視した。血液学、凝固および臨床化学のための解剖時、サブグループの動物から血液サンプルを収集した。研究用動物を安楽死させ、解剖検査を行った。選択された臓器を重さを測定し、組織の全リストを保持した。全ての対照動物からのおよび高用量動物（２００ｍｇ／ｋｇ／日）からの全組織リストならびに全ての異常について組織病理検査を行い、標的臓器についてはより低用量グループに対して行った。毒物動態学の動物（３匹の動物／性別／グループ／時点）から血液サンプルを収集し、これらの動物を安楽死させ、検査無しで廃棄した。
【０３２７】
平均リンパ球カウントは有意であり（ｐ＜０．００１）、ＬＴ１００２で処置された用量グループ全てにおいて低減しており、用量反応効果も弱かった。対照用である非処置グループの平均リンパ球カウント（１０９細胞／Ｌ＋／−ＳＤ）は２．９＋／−１．３（ｎ＝６）であり、３０、７５および２００ｍｇ／ｋｇグループにおいてそれぞれ、０．８５６＋／−０．４２６（ｎ＝６）、０．９０２＋／−０．２６９（ｎ＝５）および０．６３８＋／−０．２６２（ｎ＝４）に低減していた。これらのデータは上記実施例中のデータと一致しており、多発性硬化症のマウスＥＡＥモデルにおいて、ＬＴ１００２に起因して、軸索変性、脱髄および炎症細胞の浸潤の低減に相関するリンパ球カウントの有意な低減がみられた。
【０３２８】
非ヒト霊長類に関する研究
この研究の目的は、ＧＬＰ２８日間安全毒性研究においてカニクイザルに投与した場合のＬＴ１００９の毒性および毒物動態学プロファイルを決定することであった。この研究は、独立契約研究機関であるＬＡＢ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃによって行われた。ＬＴ１００９の投与を、３日おきに２８日間（１０用量）３０分間静脈内注射により行った。２０ｍＭリン酸ナトリウム、１４８ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％ポリソルベート−８０、ｐＨ＝６．５を含むビヒクル中にＬＴ１００９を処方し、点滴を３、１０、３０および１００ｍｇ／ｋｇの投与用量で行った。毒性評価のため、１日目、１６日目および２８日目のいくつかの時点において全動物から血液サンプルを収集した。さらに、最終用量後から４８時間、７２時間、１４４時間および２４０時間経過後に回復動物から血液を収集した。この研究時において監視されたパラメータを挙げると、死亡率、臨床症候、体重、摂餌量の定性評価、眼科学、心電図記録、および臨床病理学（血液学、臨床化学、凝固および検尿）があった。処置前、処置最終日、３５日目、４２日目および回復期間終了時において、免疫表現型検査評価のためにも血液サンプルを収集した。終結時において、肉眼での検査を行い、選択された臓器の重量を測定した。全動物に対し、組織の組織学的評価を行った。
【０３２９】
この研究時において、死亡率、処置に関連する悪い臨床症候、または体重に対する毒性的に有意な影響、眼科学結果または心電図記録結果、または臨床病理学（血液学、凝固、臨床化学および検尿）はみられなかった。臓器重量に変化はなく、ＬＴ１００９による悪影響を示す肉眼でのまたは顕微鏡による発見もみられなかった。カニクイザルに対し、２８日間にわたって３日おきにＬＴ１００９を処方した（１０回の処置）ところ、用量レベル３、１０、３０および１００ｍｇ／ｋｇにおいて良好な耐容性を示し、毒性的に有意な変化はなんらみられなかった。このように、この研究におけるＬＴ１００９について毒作用がみられないレベル（ＮＯＴＥＬ）は、１００ｍｇ／ｋｇであると考えられる。
【０３３０】
しかし、高用量（１００ｍｇ／ｋｇ）のみにおいて、末梢血リンパ球カウントに有意な低減（ｐ＜０．００１）があった。１００ｍｇ／ｋｇコホート中の１０匹の動物のうち、平均リンパ球カウント（１０９細胞／Ｌ＋／―ＳＤ）は、オス（ｎ＝５）およびメス（ｎ＝５）を分析のため組み合わせた際、処置前において５．６１＋／−２．２４であり、３．１８＋／−１．２５（ｎ＝１０）まで有意に低減した（ｐ＜０．００１）。この変化は７日間の回復において維持され、本研究条件下において有害であるとはみられなかった。ＬＴ１００９投与を用量レベル３０ｍｇ／ｋｇまで上げた後、リンパ球亜集団に対する試験製品関連の影響はみられず、ＬＴ１００９投与と、試験用量レベルのうち任意のレベルにおけるＢおよびＮＫ細胞の絶対数との間に明確な関係もみられなかった。オスおよびメス双方に１００ｍｇ／ｋｇのＬＴ１００９製剤を投与したところ、２８日目のＴ細胞の絶対数が、統計学的に有意な低減を示した。これは、リンパ球カウントの低減と一貫している。２つの主要Ｔ細胞サブセット、ヘルパーＴ（ＣＤ４）および細胞傷害性Ｔ（ＣＤ８）細胞を分析したところ、観察されたＴ細胞の低減は、ヘルパーＴ細胞の絶対数低減と相関し、細胞傷害性Ｔ細胞は影響を受けないことがわかった。
【０３３１】
これらのマウスおよび霊長類に関する研究から、抗Ｓ１Ｐ抗体処置によりリンパ球カウントを低減できることがわかった。これらの知見は、一次および二次リンパ系組織から末梢循環内へのリンパ球の輸送および放出にＳ１Ｐが関与していることを示唆する科学文献と一致する。結果的に、ヒトにおいて、リンパ球カウントの変化を、全身投与用に処方されたヒト化ＬＴ１００９薬候補のｉｎ  ｖｉｖｏ生物活性を示すことが可能な薬力学的マーカーとして用いることができる。さらに、ＬＴ１００９の全身投与を用いてリンパ球輸送を変化させれば、末梢血リンパ球カウントの低減からの恩恵を受け得る多発性硬化症または他の疾患の治療に必要なリンパ球減少を得ることができる。
【０３３２】
実施例１１：低Ｓ１ＰキャリーオーバーのＬＴ１００９抗体の精製
臨床前使用または臨床使用のために純度が高くかつ高品質の抗体を作製することは、治療薬開発において極めて重要である。細胞性タンパク質、ＤＮＡおよびウィルスが無いだけでなく、抗体が完全に活性でありかつ患者投与時にその標的に結合できるようにするために、調製抗体中にはいかなる抗原も含まれてはならない。一般的に、抗体の精製および製剤により抗原は除去されるが、抗スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）モノクローナル抗体であるＬＴ１００９の精製後、Ｌｐａｔｈでは、有意なレベルのＳ１Ｐキャリーオーバーが何度か生成抗体から確認されている。Ｓ１Ｐは、哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）によって合成された生物活性脂質である。例えばトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株ＬＨ１  ２７５（ＡＴＣＣアクセス番号第ＰＴＡ―８４２２）からのＬＴ１００９生産時において、通常の細胞内シグナル伝達の結果かつ／または細胞死亡後の細胞破裂の結果、Ｓ１Ｐの細胞内プールが培地中に放出されうる。細胞馴化培地（上清）内に発現されたＬＴ１００９抗体は、このＳ１Ｐに結合することができる。生成が進むにつれ、より多くのＳ１Ｐが放出され得、ＬＴ１００９との複合体として上清中に蓄積し得る。理論に縛られることは望まないものの、培地中での抗体とＳ１Ｐとの接触回数が多くなるほど、その細胞外Ｓ１ＰがＬＴ１００９に結合し、調製抗体中にキャリーオーバーすると考えられる。ＣＨＯ細胞内に生成された場合、ＬＴ１００９抗体調製は、抗体モルあたり０．５モル（５０モルパーセント、ｍｏｌ％）の余分なＳ１Ｐを含み得る。そのため、Ｓ１Ｐキャリーオーバー量を低減するために、上流および下流処理双方において、粗製採取物中のＳ１Ｐ量の最小化および精製時のＳ１Ｐの除去の促進のための工程を設ける必要がある。
【０３３３】
Ｓ１Ｐ定量化方法：
ＬＴ１００９抗体の多様な調製中のＳ１Ｐ濃度を、ＷｉｎｄＲｏｓｅ  ＡｎａｌｙｔｉｃａにおいてＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ−ＭＳ法によって測定した。質量分析は高速かつ高感度であり、適切に適用した場合、分析物量をピコグラム単位で定量化することができる。この分析方法においてとられるアプローチは、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＣ）により、Ｓ１Ｐをエレクトロスプレー質量分析計源内に導入することである。このＲＰＣ工程において、タンパク質、塩および他の夾雑物からＳ１Ｐを分離する。クロマトグラフィー工程後、Ｓ１Ｐを前記源中でイオン化し、イオントラップ質量分析計上に送る。適切な質量対電荷比（ｍ／ｚ＝３８０）のイオンを除く全イオンをトラップから排出する。残りのイオンをイオントラップ中でフラグメント化し、特異的な娘イオン（ｍ／ｚ＝２６４）を監視する。その結果から、３つの分析寸法（ＲＰＣ保持時間、ｍ／ｚ３８０の親イオン、およびｍ／ｚ２６４の娘イオン）においてサンプル同一性が確認される。これら３つの基準を満たす他の任意の化合物は無い可能性が高い。さらに、ＭＳ−ＭＳ工程により、信号対雑音が最大化され、そのため感度が有意に上昇する。抽出工程は不要であるため、内部標準は不要である。さらに、サンプルをＨＰＬＣ−ＭＳ中に直接注射すると、回復および感度が上昇し、複雑度および分析時間が低減する。
【０３３４】
比較のため、選択された抗体調製物中の抽出物中のＳ１Ｐ濃度を、Ｓ１Ｐ―定量化ＥＬＩＳＡを用いて決定した。４倍量の過度の１：２クロロホルム：メタノールを１ｍｇ／ｍｌ抗体サンプルに付加して、Ｓ１Ｐを抽出した。水／有機溶液に対し広範なボルテックスおよび超音波処理を行って抗体脂質複合体を崩壊させ、氷上でインキュベートした。遠心分離後、スピードバックを用いて可溶性画分を蒸発させ、乾燥したＳ１Ｐを脱脂ヒト血清中で再懸濁した。再懸濁サンプル中のＳ１Ｐ濃度を、抗Ｓ１Ｐ抗体およびＳ１Ｐコーティングコンジュゲートを用いて競合ＥＬＩＳＡによって決定した。このコーティングコンジュゲートは、共有結合的に結合したＳ１Ｐ‐ＢＳＡであり、化学合成チオール化Ｓ１Ｐとマレイミド活性化ＢＳＡとを結合させることにより、作製した。Ｓ１Ｐ標準のため、ＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１０．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．４）中の１％ＢＳＡ中に単原子層Ｓ１Ｐを超音波処理によって可溶化させて、１０μＭ  Ｓ１Ｐ（Ｓ１Ｐ‐ＢＳＡ複合体）を得た。このＳ１Ｐ‐ＢＳＡ複合体溶液を、適切な濃度まで（２μＭまで）脱脂ヒト血清によってさらに希釈した。マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ、高結合プレート）を、０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．５）中で希釈したＳ１Ｐコーティング材料により３７℃で１時間コーティングした。プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ―２０で１時間室温でブロッキングした。一次インキュベーションのため、０．４μｇ／ｍＬビオチン標識抗Ｓ１Ｐ抗体、指定量のＳ１Ｐ‐ＢＳＡ複合体および試験対象サンプルを、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに付加した。室温でのインキュベーションを１時間行った後、プレートを洗浄し、その後、ＨＲＰコンジュゲートされたストレプトアビジン（１：２０、０００希釈）の各ウェルあたり１００μｌでのインキュベーションを１時間室温で行った。洗浄後、ペルオキシダーゼ反応をＴＭＢ基質と共に発生させ、１ＭのＨ２ＳＯ４の付加によって停止させた。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸを用いて、光学密度を４５０ｎｍにおいて測定した。
【０３３５】
Ｓ１Ｐの最小化のための上流処理：
血清中には汚染Ｓ１Ｐが含まれており、ＣＨＯ細胞そのものによって作製された汚染Ｓ１Ｐが血清に付加される可能性があるため、上流処理のためには、無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０７４３―０２９）中でのＣＨＯ細胞の培養は必須である。無血清培地の使用に加えて、広範囲の細胞死亡の前にバイオリアクターから抗体を回収すると、Ｓ１Ｐの細胞内プールが培地に放出されるのが回避される。最後に、回収後すぐに下流処理を開始すると、Ｓ１Ｐの存在下においてＬＴ１００９が費やす時間と、最終調製物にキャリーオーバーされる脂質量とが最小化される。上流処理時のＳ１Ｐレベルの最小化のための試みにも拘わらず、粗製採取物内に有意なＳ１Ｐが残留することが多く、典型的には、抗体のモルあたり０．１〜０．２モル比（１０〜２０ｍｏｌ％）結合Ｓ１Ｐが残留する。
【０３３６】
そのため、Ｌｐａｔｈ社では、Ｓ１Ｐキャリーオーバーレベルが極めて低いＬＴ１００９材料を生成するために、抗体調製物から脂質を除去するための下流の方法を開発した。これらの方法（下記に記載）はＬｐａｔｈ社によって開発され、その処理方法の採用のために、Ｌａｕｒｅａｔｅ  Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．に移転された。その結果、Ｌａｕｒｅａｔｅによって生産された最終薬生成物は、極めて低いレベルの残留Ｓ１Ｐを示した（＜０．４ｍｏｌ％をＨＰＬＣ−ＭＳ−ＭＳによって測定）。
【０３３７】
Ｓ１Ｐ低減のための下流処理：
従来、培養上清または腹水からの抗体精製では、アフィニティークロマトグラフィーが用いられる。このワンステップ方法では、高度に架橋されたアガロース（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号Ｎｏ１７‐５１９９‐０４）に共有結合的に結合した組換えプロテインＡが用いられる。プロテインＡは、モノクローナル抗体のＦｃドメインのリガンドとして機能する。プロテインＡおよびＳ１Ｐ結合部位は別個であるため、ＬＴ１００９がプロテインＡ樹脂と結合した場合、Ｓ１Ｐは置換しない。ＬＴ１００９に対する高親和性および水溶性バッファー中の低溶解性により、高塩濃度バッファーでの広範囲洗浄（下記を参照）を行った後でも、ＬＴ１００９と結合したＳ１Ｐが確実に残留する。そのため、従来の抗体精製プロセスでは、プロテインＡクロマトグラフィー、低ｐＨウイルス不活化の後、中和、Ｑアニオン交換クロマトグラフィー、ウイルスナノろ過および最終限外ろ過／ダイアフィルトレーションを行っても、同時精製された（ＬＴ１００９に結合した）Ｓ１Ｐは除去されなかった。ＬＴ１００９に結合したＳ１Ｐを分離するために、Ｌｐａｔｈ社では、結合機構において特殊な機能を利用している。
【０３３８】
Ｌｐａｔｈ社における社内研究によれば、ＬＴ１００９のＳ１Ｐ結合活性は、ｐＨ＜４．０またはｐＨ＞８．５において低減することが分かった。しかし、結合Ｓ１Ｐの低減のためにｐＨ＜４．０においてプロテインＡクロマトグラフィーを実行することは不可能である。なぜならば、このような低いｐＨにおいては抗体はプロテインＡ樹脂に結合しないからである。そのため、ＬＴ１００９に結合したＳ１Ｐを低減するために、高塩濃度のｐＨ８．５での洗浄工程をプロテインＡクロマトグラフィーにおいて採用した。さらに研究を進めたところ、高塩濃度バッファー（６５０ｍＭのＮａＣｌ）および５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．５）では、ＬＴ１００９から有効にＳ１Ｐを除去できなかった。塩濃度をさらに０．６５Ｍから１Ｍ（ｐＨ８．５）へと増加し、高塩濃度洗浄工程をカラム容量４個からカラム容量５個に増やしても、残留Ｓ１Ｐのより少ない生成物は得られなかった。
【０３３９】
Ｓ１Ｐ除去のための金属キレーターの使用
Ｌｐａｔｈ社が開発した方法においては、ＣＨＯ細胞バイオリアクターキャンペーンから作製された２体積量の未精製ＬＴ１００９抗体回収物と、５０ｍＭリン酸カリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５％グリセロール（ｐＨ８．０）を含む１体積量のプロテインＡＩｇＧ結合バッファー（「Ｐｉｅｒｃｅ結合バッファー」、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ）とを事前混合した。この方法によれば、プロテインＡカラムをＰｉｅｒｃｅ結合バッファーにより平衡化し、事前混合された粗製採取物を付加し、１０カラム容量の同一結合バッファーで洗浄した。その結果得られた精製ＬＴ１００９は、Ｓ１Ｐ定量化ＥＬＩＳＡによって決定されたように、２倍以上少ないモルパーセントのＳ１Ｐを含んだ。
【０３４０】
金属キレーター（例えば、ＥＤＴＡ）は、ＬＴ１００９抗体調製物中のＳ１Ｐキャリーオーバーの有効な低減において重要またはさらには必須であると現在考えられている。実際、二価金属カチオンをキレート化するためのＥＤＴＡによるＬＴ１００９の滴定を行うと、Ｓ１Ｐ結合が抑制される。このようなＳ１ＰのＬＴ１００９との結合を分離するＥＤＴＡの能力は、ＬＴ１００９精製時におけるＳ１Ｐ除去を促進すると考えられる。結合バッファーおよび洗浄バッファー中に２ｍＭ  ＥＤＴＡを付加したところ、溶出抗体画分中のＳ１Ｐキャリーオーバーが２倍有効に低減した。本研究におけるＳ１Ｐレベルは最初は比較的低く、ＥＤＴＡを採用することで、サンプル中の脂質キャリーオーバーがさらに低減し、初期Ｓ１Ｐレベルは上昇するはずである点に留意されたい。以下の例に限定されることなく、他の金属キレーター（例えば、ＥＧＴＡ、ヒスチジン、リンゴ酸およびフィトケラチン）も、Ｓ１Ｐの抗体への結合を分離する際に有用であり得る。ＥＧＴＡおよびＥＤＴＡは、現在、抗Ｓ１Ｐ抗体からのＳ１Ｐの分離のための好適な二価金属キレーターである。
【０３４１】
これらの結果に基づいて、新規の高塩濃度バッファーが、Ｌｐａｔｈ社によって開発された。この新規の高塩濃度バッファーは、Ｐｉｅｒｃｅバッファーに匹敵するｐＨおよび伝導率を有し、新規の事前混合工程をＬＴ１００９製造プロセス中に採用した。
【０３４２】
現在の下流精製プロセスを以下に挙げる：
■  ０．１８２Ｌ  ＫＰｉ高塩濃度ＥＤＴＡバッファーに対して２Ｌの粗製採取物の比で、粗製採取物と、４Ｘカリウム高塩濃度ＥＤＴＡバッファー（２００ｍＭ  ＫＰｉ、４Ｍ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％グリセロール、ｐＨ８．０）との事前混合。この工程は、Ｓ１ＰのＬＴ１００９からの妨害および分離のためのものである。
■  粗製採取物および高塩濃度の混合物のプロテインＡカラム上への捕獲と、Ｓ１Ｐ除去のための、１０カラム容量の高塩濃度ＥＤＴＡバッファーによるカラム洗浄
■  低ｐＨ（３．６〜３．８）における、プロテインＡ樹脂からのＬＴ１００９の溶出
■  ウイルス不活化のためのｐＨ３．６〜３．８におけるプロテインＡ溶出液の低ｐＨ保持の後、溶出液の中性ｐＨへの中和
■  残留宿主細胞タンパク質およびヌクレオチドならびに浸出プロテインＡの除去のための、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑアニオン交換クロマトグラフィー
■  ウイルス除去のためのさらなる工程としての、Ｖｉｒｏｓａｒｔ  ＣＰＶナノフィルターを用いたナノろ過
■  タンパク質濃度および最終製剤のための最終ＵＦ／ＤＦろ過
【０３４３】
Ｓ１Ｐ除去のための低ｐＨおよびＣ８樹脂の使用
精製時の金属キレーター（例えば、このようなＥＤＴＡ）の使用に加えて、Ｓ１Ｐの疎水性を利用して、精製抗体調製物から脂質を除去することも可能である。この方法では、下記のツーステッププロセスが用いられる：１）抗体からの脂質の分離、および２）水溶性環境からの脂質の物理的分離。出願人は、抗体調製物からの分離を促進するための容易かつロバストな方法として、ｐＨ誘導脂質除去（ｐＨｉＬ）処理を用いる。
【０３４４】
抗体は一般的には、低ｐＨにおいて、顕著に低減した抗原結合親和性を示す。リン脂質（例えば、Ｓ１ＰおよびＬＰＡ）に対して生成された抗体は、特定の抗体および脂質によっては、ｐＨ３．０〜３．５において脂質に結合しない。解離を促進するための正確なｐＨを決定する際、結合を抑制しかつインタクトなＩｇＧを維持できるｐＨを決定するために、ｐＨ滴定実験を行う必要があり、これにより、ｐＨ増加後に結合活性が回復する。換言すれば、抗体は不可逆的に不活性化されない。このｐＨが決定された後、４℃において臨界ｐＨ（例えば、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．０〜３．５）を下回るまで、抗体をバッファーに対して透析する。これらの条件下において、脂質および抗体はどちらとも、溶液中の単離された成分として存在する。透析された溶液を、材料（例えば、Ｃ８シリカ樹脂（例えば、ＳｅｐＰａｋカートリッジ、Ｗａｔｅｒｓ、カタログ番号ＷＡＴ０３６７７５））に通す。この材料は、脂質に結合し、脂質フリーのタンパク質の分離を促進する。その結果、遊離脂質が疎水性樹脂に不可逆的に結合し（Ｃ８シリカ樹脂の場合）、抗体は有意な損失無く流れる（〜９０％まで回復）。脂質のほとんどは、カートリッジを１回通過させれば除去でき、さらに通過させることで、脂質除去を小幅に増加させることができる（表７）。
【０３４５】
上述した金属キレート化およびｐＨｉＬ法は、単一の精製手順に容易に採用することができる。ＥＤＴＡは、ほとんどのバッファーと適合可能であり、抗体安定性、溶解性またはプロテインＡ結合に悪影響を与えない。精製時において、大量のＥＤＴＡ含有バッファーによって結合ＩｇＧを洗浄すると、Ｓ１Ｐの一部がＳ１Ｐ−ＬＴ１００９複合体から除去され、他の金属依存性抗原−抗体複合体も強力に分離される。ＥＤＴＡ洗浄では脂質を十分に除去できない場合、プロテインＡカラムからの溶出液をｐＨｉＬ法を用いて処理することができる。プロテインＡからの結合ＩｇＧの溶出は典型的には、低ｐＨバッファー（ｐＨ＜３．０）を用いて達成される。抗脂抗体を脂質結合の臨界ｐＨまたはこれを下回るｐＨでカラムから溶出した場合、サンプルをＣ８シリカ樹脂に付加するだけで、脂質を除去できる。必要ならば、樹脂に付加する前に、ｐＨを容易に調節することができる。
【表７】
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【０３４６】
実施例１２：ヒト化モノクローナル抗体ＬＴ１００９を含む製剤
１．はじめに
以下の実施例においては、生物活性シグナル伝達脂質スフィンゴシン１−リン酸（Ｓ１Ｐ）に対して反応性であるヒト化モノクローナル抗体ＬＴ１００９を含むいくつかの製剤の安定性を評価するための実験について説明する。ＬＴ１００９は、２本の同一な軽鎖と２本の同一な重鎖を含む工学設計された完全長のＩｇＧ１ｋアイソタイプ抗体であり、約１５０ｋＤａの総分子量を有する。軽鎖と重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｓ１Ｐに対して産生されたマウスモノクローナル抗体に由来し、さらにＣＤＲの１つにＣｙｓからＡｌａへの置換を含んでいる。ＬＴ１００９では、ヒトフレームワーク領域が、抗体の総アミノ酸配列の約９５％を占めており、高い親和性と特異性でＳ１Ｐに結合する。
【０３４７】
本実施例に記載の試験の目的は、ＬＴ１００９の安定性と生理活性を長期間維持可能であり、全身投与に適する好ましい製剤を１つ以上開発することであった。公知のように、分子の高次構造の維持（およびよって安定性）は、少なくとも部分的にはタンパク質の分子環境および保存条件に依存する。好適な製剤は、抗体を安定させるのみならず、注射された際に患者によって忍容されなければならない。そのため、この試験では、試験された多様な製剤は、１１ｍｇ／ｍＬまたは４２ｍｇ／ｍＬのＬＴ１００９、さらに異なるｐＨ、塩、および非イオン系界面活性剤濃度を含んだ。さらに、３つの異なる保存温度（５℃、２５℃、および４０℃）も調査した（それぞれ、実際の条件、加温された条件、および温度ストレス条件）。安定性は、５つの異なる時点で、多様な製剤から得た代表的サンプルを用いて評価された：試験開始時および２週間後、１ヵ月後、２ヵ月後、および３ヵ月後。各時点において、試験は、目視検査、注射針通過性性（３０ゲージ注射針を通して吸入した場合）、およびサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を含んだ。また、ある一定の温度以上では、タンパク質は変性を受け、いくらかの凝集体形成が生じるため、タンパク質の安定性を評価するために、円二色性（ＣＤ）分光測定法も使用した。観察された遷移は、見かけの変性または「融解」温度（Ｔｍ）と呼ばれ、タンパク質の相対的安定性を示す。
【０３４８】
２．材料および方法
ａ．ＬＴ１００９
製剤サンプル（各〜０．６ｍＬ）は、２４ｍＭリン酸ナトリウム、１４８ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５中にＬＴ１００９を４２ｍｇ／ｍＬ含有する水性ストック溶液から生成した。２４ｍＭリン酸ナトリウム、１４８ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５溶液を用いて水性ストック溶液を所望する濃度に希釈することにより、ＬＴ１００９を１１ｍｇ／ｍＬ含有するサンプルを調製した。異なるｐＨ値を有するサンプルを調製するために、ＬＴ１００９（１１ｍｇ／ｍＬおよび４２ｍｇ／ｍＬ）の各濃度のｐＨを、０．１Ｍ  ＨＣｌまたは０．１Ｍ  ＮａＯＨをそれぞれ使用して、当初の６．５の値から、６．０または７．０に調整した。異なるＮａＣｌ濃度を有するサンプルを調製するために、塩濃度を、当初の１４８ｍＭから３００ｍＭまたは４５０ｍＭに上げるために、５Ｍ  ＮａＣｌをサンプルに添加した。異なる非イオン系界面活性剤濃度を有するサンプルを調製するために、最終濃度が２００ｐｐｍまたは５００ｐｐｍになるように、ポリソルベート−８０をサンプルに添加した。サンプルは全て、０．２２μｍのＰＶＤＦ膜シリンジフィルターを通して、滅菌済みの発熱物質を取り除いた１０ｍＬの血清バイアル中に無菌的に濾過した。その後、バイアルをそれぞれ、低剥離性のＰＴＦＥで裏打ちされたストッパーで密封した。このストッパーは、キャップにクリンプされることで、所定位置に固定され、汚染物から保護されている。安定性チャンバーに置く前に、バイアルを短時間２〜８℃で保管し、その後、下記の３つの指定保存条件のうちの１つに合わせて調節した安定性チャンバー内に垂直に配置した。４０℃（±２℃）／７５％（±５％）相対湿度（ＲＨ）、２５℃（±２℃）／６０％（±５％）ＲＨ、または５℃（±３℃）／大気ＲＨ。試験された製剤の変量の概要を以下の表８に示す。
【表８】
2012511026.tif 000029
【０３４９】
Ｂ．サンプルの取り出し
各製剤のサンプルを、以下の表９に記載のスケジュールに従って分析した。全時点について、各保存条件についてバイアル１瓶を使用した。サンプルを取り出す日に、バイアルを各安定性チャンバーから取り出して、１５０μＬの各サンプルをそれぞれ対応するラベルがついた別個のバイアル中に移して、試験前に１時間ベンチの上に静置した。試験対象の分注を抜き取った後、元のバイアルは、すぐに定められた安定性チャンバーに戻した。
【表９】
2012511026.tif 000030
【０３５０】
ｃ．分析手順
所定の時点について、各サンプルからの分注を使って、目視観察、注射針通過性、ｐＨ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元および非還元条件）、ＳＥ−ＨＰＬＣ、およびＩＥＦを含む一連の標準分析を実施した。タンパク質濃度は、ＵＶ分光測定法によって測定した（ＯＤ−２８０）。円二色性（ＣＤ）試験も実施した。
【０３５１】
円二色性分光測定法は、製剤試験とは別に行った。Ａｖｉｖ  ２０２  ＣＤ分光光度計を使用して、これらの分析を実施した。近紫外部ＣＤスペクトルは、４００〜２５０ｎｍの範囲で収集した。この領域では、ジスルフィドおよび芳香族側鎖が、ＣＤシグナルに寄与する。遠紫外波長領域（２５０〜１９０ｎｍ）において、スペクトルは、ペプチド骨格が優位であり、他を圧倒している。βシートタンパク質に通常使用される波長である、２０５ｎｍで観察することによって、温度変性曲線を作成した。２５℃〜８５℃まで加熱しながら、サンプル０．１ｍｇ／ｍｌを使って、データを収集した。データは、１℃のインクリメントで集めた。そのような変性スキャンに要する合計時間は、７０〜９０分であった。平均時間は２秒であった。
【０３５２】
３．結果と考察
分析した全サンプルについて、目視による外観に経時的な変化はなかった。同様に、注射適性検査により、サンプルは、３０ゲージ注射針を備えたシリンジに問題なく吸入されることが実証された。多様な分析検査の結果は一貫しており、ＳＥ−ＨＰＬＣは、ＬＴ１００９の優れた安全性評価法であることが明らかになった。これらの結果は、塩濃度が上昇すると、凝集物の生成と小さな非凝集不純物の生成のどちらも減少することを示した。また、ｐＨを低下すると、凝集物と不純物形成が低下することも発見された。さらに、ポリソルベート−８０濃度を２００ｐｐｍよりも高く上昇させると、ＬＴ１００９がそれ以上は安定しないことも、明らかになった。１１ｍｇ／ｍＬのＬＴ１００９を含むサンプルに対してＳＥ‐ＨＰＬＣ実験を行い、４２ｍｇ／ｍＬのＬＴ１００９を含むサンプルについて得られた結果に匹敵する結果が得られたが、ＬＴ１００９濃度が低い方が、高濃度と比較して凝集物形成の可能性が低いことを示し、これは、高濃度で試験した全ての条件下では、抗体の安定性が僅かに低いようであることを示している。
【０３５３】
円二色性試験から、ＬＴ１００９は、水溶液中では、ＴｙｒおよびＴｒｐ両残基周辺が秩序正しい環境である、明確な三次構造をとることが発見された。また、抗体分子中の少なくともいくつかのジスルフィドは、幾分かの結合の歪みを生じているが、これは、鎖内および鎖間ジスルフィドが存在する場合には、稀なことではない。ＬＴ１００９の二次構造は、これと言って目立ったところはなく、βシート構造に一貫する遠紫外ＣＤスペクトルを提示することが発見された。観察された遷移は、見かけの変性または「融解」温度（Ｔｍ）と呼ばれる。加熱に際しては、ＬＴ１００９は、ｐＨ７．２では、約７３℃の見かけＴｍを示した。見かけのＴｍは、ｐＨ６．０では約７７℃まで上昇した。これらの結果は、僅かに酸性のｐＨは、ＬＴ１００９の水性製剤の長期的安定性を増強することを示す。ＮａＣｌおよび／またはポリソルベート−８０の添加もまた、更なる安定性を与えた。
【０３５４】
合わせて、これらの実験からのデータは、ＬＴ１００９は、抗体濃度とは無関係に、ｐＨ６および４５０ｍＭ  ＮａＣｌ周辺で最も安定性があることを示す。確かに、ＳＥ−ＨＰＬＣ試験は、ポリソルベート−８０濃度を２００ｐｐｍに維持しながら、塩濃度を４５０ｍＭまで増加し、ｐＨを６．０まで下げると、ＬＴ１００９の安定性に極めて有益な効果があることを示した。ポリソルベート−８０を２００ｐｐｍ以上含んでも、凝集体形成に対する更なる緩和効果がなかったが、これは恐らくは、２００ｐｐｍにおいて既に臨界ミセル濃度を超えていたためである。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ＬＴ１００９における凝集体形成が試験条件下では塩濃度の上昇に伴って低下した事実は、凝集体形成は少なくとも部分的には、疎水的相互作用よりはむしろ分子間のイオン相互作用により深く基づいていることを示している可能性がある。ｐＨを７から６に下げると凝集体形成もが減少するという観察は、低ｐＨにおけるアミノ酸ヒスチジンの疎水性の低下によって説明できる。最後に、ＬＴ１００９濃度上昇時に観察された凝集体形成の傾向の増大は、分子が適切な場所で、適切な時間に互いにぶつかり合う機会が増えて凝集体を形成することにより、簡単に説明され得る。
【０３５５】
これらの実験によって示されるように、好適な水性ＬＴ１００９製剤は、２４ｍＭリン酸、４５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｐｐｍポリソルベート−８０、ｐＨ６．１を有するものである。この医薬品は、患者に投与する前に、おそらく多量のＰＢＳを含む輸液バッグ中に注入することによって希釈されるため、本製剤の比較的高い浸透圧は、全身投与について問題をもたらすことはないであろう。
【０３５６】
実施例１３：抗Ｓ１Ｐおよび抗ＬＰＡ抗体の生成および精製
Ｘ線結晶学では有意な量の材料が必要となるため、＞０．５ｍｇ／Ｌの抗Ｓ１Ｐ抗体を生成する安定なＣＨＯ細胞株が用いられる。生存率＞９５％を維持しつつ、１リットル振とうフラスコ中に、２５μＭ  Ｌ―メチオニンスルホキシイミン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ、カタログ番号Ｍ５３７９）を含む５００ｍｌのＣＤ―ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ、カタログ番号１０７４３‐０２９）と共に細胞を０．４ｘ１０６細胞／ｍｌの密度において播種する。７．５％のＣＯ２雰囲気中で細胞を１０日間成長させるかまたは生存率が４５〜５０％に低下するまで成長させる。その後、遠心分離を１５００ｒｐｍで１０分間行うことにより上清を回収し、０．２２ミクロンフィルターシステム（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｌｏｗｅｌｌ  ＭＡ、カタログ番号４３１０９８）を通じて無菌濾過する。精製した上清をＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  Ｂｉｏｍａｘ  ５０カートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ  ＭＡ、カタログ番号ＰＸＢ０５０Ａ５０）をインストールしたＬａｂｓｃａｌｅ  Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗろ過システムを用いてメーカーのプロトコルに従って１０倍に濃縮した。全てのチューブおよび導管が空になっているのを確認した後、これらのチューブおよび導管を０．５％ＮａＯＨで洗い、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅフリーの蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ、カタログ番号１０９７７―０１５）で入念にすすいだ
【０３５７】
精製および濃縮された上清を、等容積のＩｇＧ結合バッファー（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ、カタログ番号２１００１）によって希釈し、５カラム容量の結合バッファーで平衡化されたＰｒｏＳｅｐ‐ｖＡ‐Ｕｌｔｒａ樹脂でパックされた重力流カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号１１５１１５８２７）に付加した。フロースルーを収集し、１０〜１５カラム容量の結合バッファーによって結合ＩｇＧを洗浄した。溶出バッファー（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１００４）によって結合ＩｇＧを溶出させ、５ｍｌの結合バッファーを含む４０ｍｌ画分中に収集し、ｐＨを中和させた。５０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＰＢＱＫ０７６１０）を備えたアミコン攪拌セルを用いて、２８０ｎｍ（Ａ２８０）における吸収が０．１よりも高い画分をプールし、濃縮した。濃縮抗体を１Ｘ  ＰＢＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ、カタログ番号２１‐０４０）に対して広範に透析し、０．２２μＭシリンジ駆動フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＳＬＧＰ０３３ＲＳ）を通じて濾過し、４℃で保存した。
【０３５８】
Ｓ１Ｐ抗体と実質的に同じ方法で、抗ＬＰＡ抗体を生成および精製する。
【０３５９】
実施例１４：抗Ｓ１Ｐ抗体および抗ＬＰＡモノクローナル抗体からのＦａｂフラグメントの分離
プロテアーゼパパインによる精製全ＩｇＧ調製物の処理により、可変ドメインおよびＣｋおよびＣｈ１定常ドメイン双方からなるＦａｂフラグメントを、一対のＣｈ２およびＣｈ３ドメインを含むＦｃドメインから分離する。このＦａｂフラグメントは、１つの可変領域全体を保持しているため、抗体とエピトープとの間の１：１の相互作用の生化学的検討のための有用なツールとして機能する。さらに、Ｆａｂフラグメントは柔軟性に欠け、また一般的に天然精製全ＩｇＧに固有のグリコシル化にも欠けるため、Ｆａｂフラグメントは一般的には、単結晶ｘ線回折を介した構造研究のための優秀なプラットホームである。
【０３６０】
精製されたインタクトな抗Ｓ１ＰＩｇＧを、消化バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．２、２ｍＭ  ＥＤＴＡ中の１００：１  ＬＴ１００９：パパイン）中において、活性化パパイン（５．５ｍＭシステイン―ＨＣＬ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、７０μＭ  ２―メルカプトエタノール中で、３７℃で０．５時間インキュベートされた１０ｍｇ／ｍｌパパイン）によって消化した。。３７℃で２時間後、プロテアーゼ反応を５０ｍＭヨードアセトアミドでクエンチし、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９に対して透析し、２ｘ５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  Ｑカラム上にロードした。直線勾配２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、０．５Ｍ  ＮａＣｌにより結合タンパク質を溶出させ、４ｍｌ画分中に収集した。抗Ｓ１ＰＦａｂフラグメントを含む画分をプールし、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８で平衡化されたプロテインＡカラム上にロードした。Ｆａｂフラグメントがフロースルー画分中に存在している間、インタクトな抗体およびＦｃフラグメントが樹脂に結合した。Ｆａｂフラグメントをｃｅｎｔｒｉｃｏｎ―ＹＭ３０遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号４２０９）を用いて濃縮し、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７に対して透析し、４℃で保存した。
【０３６１】
抗ＬＰＡＦａｂフラグメントも同様に調製した。
【０３６２】
実施例１５：Ｆａｂ／脂質複合体の形成
単離されたＦａｂフラグメントの濃度を、吸光係数１．４ｍｌ／ｍｇを用いてＡ２８０値から計算した。メタノール中に懸濁された５倍モル過剰の１ｍＭ  Ｓ１Ｐ（Ａｖａｎｔｉ、カタログ番号８６０４２９Ｐ）を、低真空状態を３時間保持することにより、１３ｘ１００ｍｍホウケイ酸ガラスチューブ内で乾燥させた。ピペット採取および０．２２μｍのＣｏｓｔａｒ  Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心酢酸セルロースフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号８１６０）を通じたろ過により、脂質を５００μＬの精製抗Ｓ１ＰＦａｂ中に再懸濁した。ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ‐１０遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、複合体をおよそ１２ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。濃縮されたＦａｂ／脂質複合体を４℃で保存した。同様に、Ｆａｂ／ＬＰＡ複合体をＬＰＡ（Ａｖａｎｔｉ、カタログ番号８５７１２０Ｘ）を用いて作製し、ＬＰＡＦａｂを単離した。
【０３６３】
実施例１６：Ｆａｂ／脂質複合体の結晶化
スパースマトリックススクリーン（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｌｉｓｏ  Ｖｉｅｊｏ  ＣＡ）および懸滴蒸気拡散法を用いて、Ｆａｂ／脂質複合体双方について、初期結晶化条件を決定した。Ｆａｂ／Ｓ１Ｐ複合体の場合、回折試験に適した単結晶を室温において成長させた。１マイクロリットルの１２ｍｇ／ｍｌ  Ｆａｂ／Ｓ１Ｐ複合体を、２２％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール３３５０、１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）および１０％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを含む１マイクロリットルのリザーバー溶液と混合し、１ミリリットルのリザーバー溶液上で密封した。２日間で、結晶は最終サイズ０．２ｘ０．２ｘ０．２ｍｍまで成長した。これらの結晶をナイロンループにより結晶化滴から回収し、液体窒素中で直接フラッシュ冷却した。
【０３６４】
実施例１７：Ｘ線結晶学
Ｘ線結晶学は、研究者にとって分子認識機構を原子レベルで視覚化することが可能な強力なツールである。この情報は、結合特性または新規な抗原特異性の向上のために、治療用抗体およびエンジニアリングされた抗体の作用様態を理解するために、極めて貴重である。本明細書中、ｘ線結晶学を革新的生化学方法と共に用いて、２つの生物活性脂質を特異的に認識する２つのモノクローナル抗体を調査する。さらに、これらの技術を、他の脂質に対して新規な特異性を有する抗体をエンジニアリングするために用いる。この技術は、脂質経路、代謝およびシグナル伝達の研究のための新規なツールを研究者に付与し、望ましくは、脂質ベースの病理学に対する強力な新兵器を臨床医に提供する。医療においてリピドーム研究は重要な分野として出現し、また、より多くの生物活性脂質がヒト疾病に関与しているため、脂質および他の非タンパク質標的を認識する抗体は、バイオ医学研究において重要な役割を果たす可能性が高い。
【０３６５】
インタクトなＩｇＧのグリコシル化における構造的柔軟性および不均一性に起因して、ここで提案される構造試験では、抗Ｓ１Ｐおよび抗ＬＰＡ抗体からの単離されたＦａｂフラグメントに注目する。脂質標的と複合したＦａｂドメインを含む高分解能構造は、その同族抗体によるＳ１ＰおよびＬＰＡ認識の構造基板を解明するための十分な情報を含む。
【０３６６】
１．Ｘ線回折データ収集および処理
Ｆａｂ／Ｓ１Ｐ複合体について、サンディエゴ州立大学の高分子Ｘ線結晶学施設（ＭＸＣＦ）において、完全なＸ線回折データを１００ＫにおいてＲ―Ａｘｉｓ  ＩＶ＋＋画像プレート検出器（Ｒｉｇａｋｕ、Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、ＴＸ）上で収集した。Ｏｓｍｉｃ  Ｂｌｕｅ共焦点光学（Ｒｉｇａｋｕ）と共に１００ｍＡおよび５０ｋＶにおいて機能するＲＵ―Ｈ３Ｒ回転陽極ｘ線生成器により、Ｘ線を発生させた。データインデックシングおよびスケーリングをＨＫＬ２０００を用いて行った（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ、Ｚ．およびＷ．Ｍｉｎｏｒ（１９９７年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７６：３０７〜３２６）。低温冷却結晶をサンディエゴ州立大学高分子Ｘ線結晶学施設において試験したところ、分解能が２．７Åを超えたときにｘ線回折を示した（図１ｃ）。この結晶の座標データを下記の表１０中に示す。この品質のデータは構造決定に適しており、回折強度の集合全てを収集した（全体で９３．１％の完全性、最高分解能シェルにおいて８６．２％、全データシェル全体における平均の冗長性が３．３倍よりも高い、全体的Ｉ／ｓｉｇｍａ８．７、最高分解能シェルのＩ／ｓｉｇｍａ２．７、全体的Ｒｓｙｍ１２．９％、最高分解能シェルにおけるＲｓｙｍ４７．１％）。
【０３６７】
表１０  ２．７Å分解能におけるＦａｂ／Ｓ１Ｐ共結晶のＸ線座標
【表１０−１】
2012511026.tif 000031
【表１０−２】
2012511026.tif 000032
【表１０−３】
2012511026.tif 000033
【表１０−４】
2012511026.tif 000034
【表１０−５】
2012511026.tif 000035
【表１０−６】
2012511026.tif 000036
【表１０−７】
2012511026.tif 000037
【表１０−８】
2012511026.tif 000038
【表１０−９】
2012511026.tif 000039
【表１０−１０】
2012511026.tif 000040
【表１０−１１】
2012511026.tif 000041
【表１０−１２】
2012511026.tif 000042
【表１０−１３】
2012511026.tif 000043
【表１０−１４】
2012511026.tif 000044
【表１０−１５】
2012511026.tif 000045
【表１０−１６】
2012511026.tif 000046
【表１０−１７】
2012511026.tif 000047
【表１０−１８】
2012511026.tif 000048
【表１０−１９】
2012511026.tif 000049
【表１０−２０】
2012511026.tif 000050
【表１０−２１】
2012511026.tif 000051
【表１０−２２】
2012511026.tif 000052
【表１０−２３】
2012511026.tif 000053
【表１０−２４】
2012511026.tif 000054
【表１０−２５】
2012511026.tif 000055
【表１０−２６】
2012511026.tif 000056
【表１０−２７】
2012511026.tif 000057
【表１０−２８】
2012511026.tif 000058
【表１０−２９】
2012511026.tif 000059
【表１０−３０】
2012511026.tif 000060
【表１０−３１】
2012511026.tif 000061
【表１０−３２】
2012511026.tif 000062
【表１０−３３】
2012511026.tif 000063
【表１０−３４】
2012511026.tif 000064
【表１０−３５】
2012511026.tif 000065
【表１０−３６】
2012511026.tif 000066
【表１０−３７】
2012511026.tif 000067
【表１０−３８】
2012511026.tif 000068
【表１０−３９】
2012511026.tif 000069
【表１０−４０】
2012511026.tif 000070
【表１０−４１】
2012511026.tif 000071
【表１０−４２】
2012511026.tif 000072
【表１０−４３】
2012511026.tif 000073
【表１０−４４】
2012511026.tif 000074
【表１０−４５】
2012511026.tif 000075
【表１０−４６】
2012511026.tif 000076
【表１０−４７】
2012511026.tif 000077
【表１０−４８】
2012511026.tif 000078
【表１０−４９】
2012511026.tif 000079
【表１０−５０】
2012511026.tif 000080
【表１０−５１】
2012511026.tif 000081
【表１０−５２】
2012511026.tif 000082
【表１０−５３】
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【表１０−５４】
2012511026.tif 000084
【表１０−５５】
2012511026.tif 000085
【表１０−５６】
2012511026.tif 000086
【表１０−５７】
2012511026.tif 000087
【表１０−５８】
2012511026.tif 000088
【表１０−５９】
2012511026.tif 000089
【表１０−６０】
2012511026.tif 000090
【表１０−６１】
2012511026.tif 000091
【表１０−６２】
2012511026.tif 000092
【０３６８】
２．構造決定および精密化
ｘ線回折データ全体を単一のＦａｂ／Ｓ１Ｐ複合体共結晶について完全収集し、ｘ線結晶構造を解析した。データ収集を完了した。水分子およびＣａ２＋が除去されたＱ４２５モノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントの座標（ｐｄｂコード２ＡＤＧ）（Ｔ．Ｚｈｏｕら、２００５年  ＰＮＡＳ  １０２：１４５７５）をプローブとして作製し、プログラムフェーザーを用いて、１０．０〜４．０Å間の全データに対して分子置換を実施した（ＭｃＣｏｙ、Ａ．Ｊ．ら、Ｐｈａｓｅｒ  Ｃｒｙｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｊ．Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、２００７年、４０：ｐ．６５８〜６７４）。
【０３６９】
Ｒ要素を低減した４５．７％（Ｒフリー４５．３％）別個の集団として処置した４つの免疫グロブリンドメインそれぞれを、全データ３．５０Åに向かって、プログラムＲｅｆｍａｃ５による剛体精密化を行った（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ、Ｇ．Ｎ．、Ａ．Ａ．Ｖａｇｉｎ、およびＥ．Ｊ．Ｄｏｄｓｏｎ（１９９７年）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５３：２４０〜５５）。全データに対する精密化を抑制したところ、Ｒ要素が３６．１％（Ｒフリー４１．０％）までさらに低減した。この点において、アミノ酸側鎖が抗Ｓ１Ｐ配列に変更され、若干のループ再構築が、プログラムＸｔａｌｖｉｅｗ中の２｜ＦＯ〜ＦＣ｜差異電子密度マップにおいて行われた（ＭｃＲｅｅ、Ｄ．Ｅ．（１９９９年）Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ、．１２５：１５６〜６５）。さらに精密化を進めると、抗体Ｆａｂフラグメントのエピトープ結合部位内のＦＯ‐ＦＣ差異マップにおいて、明確なポジティブの電子密度が観察された。
【０３７０】
Ｈｉｃ‐ｕｐサーバ（Ｈｅｔｅｒｏ−Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｒｅ−Ｕｐｐｓａｌａ）から得られたスフィンゴシンの３‐ヒドロキシル基にリン酸基を付加することにより、スフィンゴシン−１−リン酸の座標を作製した（Ｋｌｅｙｗｅｇｔ、Ｇ．Ｊ．およびＴ．Ａ．Ｊｏｎｅｓ（１９９８）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５４：１１１９〜３１）。その結果得られた脂質構造のライブラリーを、モノマーライブラリースケッチャープログラム（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、Ｎｕｍｂｅｒ  ４、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ、１９９４年、５０（Ｐｔ５）：７６０〜３）において作製し、ポジティブピーク電子密度に導入した。さらに、２つのＣａ２＋、１つのＭｇ２＋、１つのエチレングリコール分子および２０個のＨ２Ｏ分子を付加した。我々の現在の抗Ｓ１ＰＦａｂ／Ｓ１Ｐ複合体結晶モデルは、優れた立体化学および最終結晶Ｒ要素２０％およびＲフリー２６％を示した（図１ｄ）。
【０３７１】
ここで報告された２．７ÅにおけるＬＴ１００９  Ｆａｂ／Ｓ１Ｐ複合体のほぼ完了したｘ線結晶構造に加えて、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙにおけるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｂｅａｍｌｉｎｅ  ５．０．１においてＡＤＳＣ  ２００  ＣＣＤ検出器上の高エネルギーシンクロトロン放射線を用いて、１．９Å分解能に精密化された完全なセットのｘ線反射強度の記録にも近年成功した。
【０３７２】
１．９Å分解能における座標を表１１として下記に示し、ＲＣＳＢタンパク質データバンクに提出した。表１１中の精密化されたｐｄｂファイルから、抗体フラグメント―抗原結晶中の架橋金属はカルシウムであることが分かった。さらに、５個のマグネシウム原子および６４個の水分子が精密化モデルに付加され、Ｓ１Ｐの適切な立体化学が考えられた。
【０３７３】
表１１  １．９Å分解能におけるＦａｂ／Ｓ１Ｐ共結晶のＸ線座標
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１１−３】
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【表１１−４】
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【表１１−５】
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【表１１−６】
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【表１１−７】
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【表１１−８】
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【表１１−９】
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【表１１−１０】
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【表１１−１１】
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【表１１−１２】
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【表１１−１３】
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【表１１−１４】
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【表１１−１５】
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【表１１−１６】
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【表１１−１７】
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【表１１−１８】
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【表１１−１９】
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【表１１−２０】
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【表１１−２１】
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【表１１−２２】
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【表１１−２３】
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【表１１−２４】
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【表１１−２５】
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【表１１−２６】
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【表１１−２７】
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【表１１−２８】
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【表１１−２９】
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【表１１−３０】
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【表１１−３１】
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【表１１−３２】
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【表１１−３３】
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【表１１−３４】
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【表１１−３５】
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【表１１−３６】
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【表１１−３７】
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【表１１−３８】
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【表１１−３９】
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【表１１−４０】
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【表１１−４１】
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【表１１−４２】
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【表１１−４３】
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【表１１−４４】
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【表１１−４５】
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【表１１−４６】
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【表１１−４７】
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【表１１−４８】
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【表１１−４９】
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【表１１−５０】
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【表１１−５１】
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【表１１−５２】
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【表１１−５３】
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【表１１−５４】
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【表１１−５５】
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【表１１−５６】
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【表１１−５７】
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【表１１−５８】
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【表１１−５９】
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【表１１−６０】
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【表１１−６１】
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【表１１−６２】
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【表１１−６３】
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【表１１−６４】
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【表１１−６５】
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【表１１−６６】
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【表１１−６７】
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【表１１−６８】
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【表１１−６９】
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【０３７４】
３．全体的な複合体構造：
ＬＴ１００９  Ｆａｂフラグメント構造は、標準免疫グロブリンドメインフォールドを示す。この抗体の新規な構造は、図３ａに示すように、生物活性脂質（ＫＤ＝１０‐５‐ｎＭ）およびＳ１Ｐ結合中の一対のＣａ２＋イオンの直接関与による高い親和性結合から得られる。これは、結晶構造中の抗体およびそのエピトープを架橋する金属イオンの最初の報告例であると考えられる。
【０３７５】
その複合体結合状態において、Ｓ１Ｐリガンドは、精密化された電子密度に完全に適合し、理想に近い立体化学、結合距離および角度を有するように、若干カールしたコンフォメーションを採用している。２つの架橋金属イオンに加えて、Ｓ１Ｐ：ＬＴ１００９  Ｆａｂ複合体構造の最も大きな特徴は、リガンドがその抗体によってほとんど完全に包囲されている範囲（およそ７０％）である。露出部位は、ほとんどのリン酸頭部基および炭化水素尾部の末端炭素原子を含み、ここは、誘導体化Ｓ１Ｐハプテンが免疫付与のために作製されたときの接合点であった。よって、ＬＴ１００９  Ｆａｂは、ほとんど全てのＳ１Ｐ原子と本質的に接触する。
【０３７６】
我々の精密化された構造内の金属イオンの源を決定するために、溶液中の複合体に対し、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）分光法を実施した。これらの調査から、結晶化の前の、複合体に対するＣａ２＋とタンパク質の理論混合比は、ほぼ２：１であることが明らかになった。Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋イオンが、これらの複合体中に存在する。この結果から、ｘ線構造中に観察されたこれら２つのイオンまたはＣａ２＋が抗体／リガンド複合体に固有のものであり、結晶が成長した条件の結果、電子密度内に観察されたＭｇ２＋イオンおよびエチレングリコール分子がほぼ確実に出現する。
【０３７７】
驚くべきことに、これらの２つのカルシウム原子は、抗体軽鎖の側鎖と、脂質のリン酸基との間の相互作用を媒介するようにみえる。この種の金属架橋は、抗体−抗原相互作用において極めて異例である。顕著なことに、インタクトなＩｇＧの精製、タンパク消化、Ｆａｂ精製および大規模透析全体を通して、カルシウム原子は結合したままであった。これらのインタクトなＩｇＧの精製、タンパク消化、Ｆａｂ精製および大規模透析は全て、バッファー中にカルシウム付加無しで行った。ＬＴ１００９のカルシウムに対するこの明確な強い親和性は、結晶構造と一貫し、カルシウム原子と、ＬＴ１００９中の配位酸素原子との間の距離は全て２．３Å未満であり、良好なジオメトリを示す。この構造において、金属原子は、４つのアスパラギン酸残基（ＣＤＲ  Ｌ１のアスパラギン酸Ｄ３０およびＤ３２からの２つの二価相互作用を含む）の側鎖によって配位される（図３ａ）。興味深いことに、非結合ＬＴ１００９  ＩｇＧまたはＦａｂフラグメント全体のいずれかをＩＣＰによって分析した場合、検出されたＣａ２＋の量は、結合部位当たり１個の金属イオン未満に対応した。
【０３７８】
ＬＴ１００９−Ｓ１Ｐ相互作用におけるカルシウムの役割について、金属キレート剤を用いて調査した。二価金属を非特異的にキレートするＥＤＴＡ、またはＣａ２＋を特異的にキレートするＥＧＴＡによってＬＴ１００９を滴定したところ、いずれのキレーターも約１００倍の過剰量でＳ１Ｐ結合を抑制した（図３ｂ）。理論に縛られることは望まないが、これは、結合金属の置換ではなく、結合Ｃａ２＋に対するＳ１Ｐと競合するＥＤＴＡ／ＥＧＴＡに起因する可能性が高い。なぜならば、高濃度のＥＤＴＡでの抗体のスパイク後のＬＴ１００９の大規模透析は、抗体を不活性にしないからである。ＬＴ１００９  ＩｇＧ全体を先ずを５０μＭ  ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡでインキュベートした場合、Ｓ１Ｐとの結合は、Ｍｇ２＋またはＣａ２＋のいずれかの付加により、回復することができる。これらの結果は、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋双方がＬＴ１００９抗体およびそのＳ１Ｐエピトープを架橋することが可能であることを示唆し、複合体中でのＣａ２＋の極めて安定な結合を示す。
【０３７９】
ＬＴ１００９軽鎖からのアミノ酸側鎖およびＳ１Ｐのリン酸基双方により、配位圏が構成される。Ｃａ２＋双方は、抗体軽鎖中のアスパラギン酸Ｄ３１から第１のカルシウム（Ｃａ１として記載）および抗体軽鎖中のアスパラギン酸Ｄ９２から他のカルシウム（Ｃａ２として記載）へのいずれかの１末端ｓｙｎη１結合を通じて、８面体を構成している。軽鎖中の位置３０および３２におけるアスパラギン酸の側鎖との２つの架橋相互作用により、各金属イオンへの別の一対の結合が得られる。別個の二対の水分子が、第４のリガンドおよび第５のリガンドを提供するイオン周囲において対称的に類似する位置を占有する。最終的に、Ｓ１Ｐのリン酸頭部基からの酸素原子が、架橋を介した双方のイオンの配位を完成させる。このリガンド構成により、２つのＣａ２＋が、結合原子を直接的に有することなく、相互に３．８１Å内に入ることができる。
【０３８０】
２つの結合Ｃａ２＋原子とリン酸頭部基からの酸素との間のこの静電相互作用に加えて、ＬＴ１００９と、Ｓ１Ｐのアミノアルコール領域との間の水素結合もある。Ｓ１ＰのＣ２−アミノおよびＣ３−ヒドロキシル基双方が、２つの水素結合に関与する。ＬＴ１００９軽鎖中のグルタミン酸Ｅ５０のカルボン酸基と、Ｓ１Ｐのアミノ基との間の水素結合のみが、アミノ酸側鎖に関与する。この相互作用は、特異性にとって重要であると考えられる。Ｃ３−ヒドロキシル部分はグリシン９９およびセリン１００（どちらもＣＤＲ−Ｈ３からのもの）の骨格アミドと共に、水素結合を形成する。
【０３８１】
Ｓ１Ｐと、ＬＴ１００９  Ｆａｂとの間の残りの接触は、疎水性である。これらを挙げると、軽鎖からのアミノ酸残基ロイシンＬ９４およびフェニルアラニンＦ９６、ならびに抗体重鎖からのトレオニンＴ３３、ヒスチジンＨ３５、アラニンＡ５０、セリンＳ５２、ヒスチジンＨ５４、イソロイシンＩ５６、リシンＫ５８、フェニルアラニンＦ９７、チロシンＹ９８、トレオニンＴ１００ＡおよびトリプトファンＷ１００Ｃ（Ｋａｂａｔナンバリング）がある。これらのうちいくつかは極性側鎖または荷電側鎖を含み、それぞれ、密に充填された炭素原子のネットワークの生成に貢献し、脂質脂肪尾部を包囲する疎水性チャンネルを生成する。重鎖のＣＤＲ‐Ｈ３ループは、抗体へのＳ１Ｐ結合時において脂質の上部においてフォールドするように見え、チロシンＹ９８は、「ゲート」または「ラッチ」として機能するものとみられる。すなわち、結合Ｓ１Ｐ分子を通り過し、ファン・デル・ワールス力を通じて、軽鎖の位置９４においてロイシンの側鎖にそして重鎖の位置５８においてリシンに締結する。
【０３８２】
Ｆａｂ−Ｓ１Ｐ相互作用における二価金属の機能役割の増加を実証するために、カルシウムの存在下および不在下において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、固定Ｓ１Ｐ誘導体に対するＬＴ１００９  Ｆａｂ結合を測定した。ＬＴ１００９  Ｆａｂを、ｓｕｌｆｏ‐ＭＢＳ結合を用いてＰｒｏｔｅＯｎ  ＧＬＭセンサーチップ上にコートされたＣ１８チオール化Ｓ１Ｐ（Ｓ１Ｐ‐ＳＨ）上を通過させた。その結果から、５０μＭ  ＣａＣｌ２が存在すると、平衡解離結合定数（ＫＤ）が１００フォールド低下することにより、複合体形成が有意に促進される（表１２）ことが分かった。これらのデータは、キレーターの存在における結晶構造、変異原性、および結合についての調査と全く一致しており、カルシウムを含む二価金属が、ＬＴ１００９  Ｆａｂ−Ｓ１Ｐ複合体の形成に主要な役割を果たしていることを示している。
【表１２】
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【０３８３】
実施例１８：抗体−脂質複合体の変異原性および生化学的検討
Ｌｐａｔｈ社のＩｍｍｕｎｅＹ２技術により、多くの抗体変異体の脂質結合特性を高速分析するための、強力で、高感度およびかつロバストな方法が提供される。このプラットホームは、Ｌｐａｔｈ社の特許出願第ＵＳ２００７０２８１３２０号（代理人ドケット番号ＬＰＴ−３１００−ＵＴ１）、ＵＳ２００８０１３８３３４（代理人ドケット番号ＬＰＴ−３１００−ＵＴ２）およびＵＳ２００８００９０３０３Ａ１（代理人ドケット番号ＬＰＴ−３１００−ＵＴ３）中に開示されており、本明細書中、これらの文献の全体を全ての目的のために援用する。
【０３８４】
このＩｍｍｕｎｅＹ２プラットホームは、免疫原調製ならびに検出および特徴付けの方法のための誘導体化生物活性脂質に依存する。脂肪脂質鎖の末端炭素に共有結合的に付着した高反応性スルフヒドリル基により、チオール化Ｓ１ＰおよびＬＰＡ（Ｃ１２およびＣ１８アイソタイプを含む）を表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）チップに直接結合するかまたはタンパク質（例えば、アルブミン）とコンジュゲートさせて、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のためのコーティング材料として機能させることができる。この技術を用いれば、抗体‐脂質相互作用を直接的に調査することもできるし、あるいは、プレート上にコートされた脂質と溶液中に存在する他の脂質との間の競合を介して調査することも可能になる。この競合ＥＬＩＳＡでは、多様な構造的に関連する脂質に対する野生型（ＷＴ）抗体または変異体抗体の交差反応を測定する。ＥＬＩＳＡについては、実施例１および２中において説明しており、以下においても説明する。ＥＬＩＳＡ結果により、抗Ｓ１Ｐおよび抗ＬＰＡ抗体ＬＴ１００９およびＬＴ３０１５はその脂質標的に対して高特異的であることが、確認される。直接結合ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡおよびＳＰＲ方法を用いて、抗Ｓ１Ｐおよび抗ＬＰＡ抗体の可変ドメイン内のアミノ酸の突然変異が、それらの変異体が有する脂質を認識および結合する能力に与える影響を決定する。
【０３８５】
１．抗体変異体の生成
これらの技術は、いくつかの実用的な利点（例えば、実験実施に必要な材料が比較的少量である）を有する。ＳＰＲではマイクログラム単位の量しか必要ではないが、直接結合および競合ＥＬＩＳＡでは、ナノグラム単位の特定の抗体しか用いない。そのため、ＨＥＫ２９３細胞を一時的にトランスフェクトすることにより、実質的に任意の所望の突然変異を内包する抗体を生成することができる。これらの培養により、典型的には１０〜５０μｇ／ｍｌの抗体が生成され、これにより、少量の試薬ですむため、各抗体変異体を完全に特徴付けるための十分な材料を生成するためのコスト効果が高い方法が得られる。これらの実験の別の利点としては、精製上清を用いて結合調査を行うことができるため、精製工程が不要となる点がある。しかし、上清中に分泌された抗体は、所望であれば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて容易に精製可能である。この生成方法を用いれば、複数の抗体変異体を同時に調査することが可能となる。結晶構造中の脂質と接触するアミノ酸の包括的分析を評価することで、脂質結合および特異性に与えるその影響を決定することができる。
【０３８６】
ａ．変異原性  重鎖および軽鎖の可変ドメイン内の突然変異を含むプラスミド構築物をＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００５２４）を用いて作出した。個別反応は、５０ｎｇの二本鎖ＤＮＡ鋳型、２．５ＵのＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ  ＨＦ  ＤＮＡポリメラーゼおよびその対応するバッファー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００５２４）、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘならびに５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁した１２５ｎｇの各突然変異誘発オリゴヌクレオチド（在キット中に）を用いて、実施した。初期変性を９５℃で３０秒間行い、続いて１６サイクルの増幅：９５℃３０秒間、５５℃１分間および６８℃８分間を行った。温度サイクル後、最終反応物をＤｐｎＩで３７℃で１時間消化して、メチル化親ＤＮＡを除去した。得られた変異産物をｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換させ、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ寒天にプレーティングした。その後、コロニーを配列決定によりＤＮＡスクリーニングして、突然変異の存在を確認する。各変異株を１リットル振盪フラスコで培養し、ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ（カタログ番号１２３６２））を用いて精製した。
【０３８７】
ｂ．哺乳類細胞中での変異体抗体の発現および生成  ２９３フェクチンを用い、培養用に２９３Ｆ−Ｆｒｅｅ  Ｓｔｙｌｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、突然変異を含む精製プラスミドを、ヒト胚腎臓細胞株２９３Ｆにトランスフェクトした。軽鎖および重鎖プラスミド双方を、メーカーの指示に従って、０．５ｇ／ｍＬでトランスフェクトした。純度および構造的完全性をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて判断した。還元条件下において、予測される重鎖および軽鎖の質量は２５ｋＤａおよび５０ｋＤａであり、非還元条件下において単一のバンドが観察され、予測質量は約１５０ｋＤａであった。
【０３８８】
ｃ．変異体抗体の精製  一過性トランスフェクションから発現された変異体抗体を、野生型抗体について説明したのと同様に、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。定量的ＥＬＩＳＡを用いて、抗体濃度を決定した。
【０３８９】
ｄ．定量的ＥＬＩＳＡ  ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ＴＸ、カタログ番号Ａ８０―１０４Ａ、１ｍｇ／ｍｌ）を、バッファー（１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、３３．６ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ９．５）で１：１００で希釈した。プレートを１００μｌ／ウェルのコーティング溶液でコートし、３７℃で１時間インキュベートした。その後、これらのプレートをＴＢＳ‐Ｔ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ‐２０、ｐＨ８．０）で４回洗浄し、２００μｌ／ウェルのＴＢＳ／ＢＳＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、＋１％ＢＳＡ、ｐＨ８．０）で３７℃で１時間ブロッキングした。サンプルおよび標準を十分な体積で非結合プレート上に作製し、２重で実行した。
【０３９０】
ＴＢＳ‐Ｔ／ＢＳＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ８．０）中にヒト基準血清（Ｂｅｔｈｙｌ  ＲＳ１０‐１１０；４ｍｇ／ｍｌ）を次の希釈（すなわち、５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、６２．５ｎｇ／ｍｌ、３１．２５ｎｇ／ｍｌ、１５．６２５ｎｇ／ｍｌ、７．８１２５ｎｇ／ｍｌ、および０．０ｎｇ／ｍｌ）まで希釈することにより、標準を作製した。サンプル作製は、サンプルＯＤがこの標準曲線範囲（最も線形の範囲は１２５ｎｇ／ｍｌ〜１５．６２５ｎｇ／ｍｌ）内に収まるようにＴＢＳ‐Ｔ／ＢＳＡ中適切な希釈を作製することにより、行った。プレートをＴＢＳ‐Ｔで４回洗浄後、１００μｌの標準／サンプル調製を各ウェルに付加し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、これらのプレートをＴＢＳ‐Ｔで４回洗浄し、ＴＢＳ−Ｔ／ＢＳＡで１：１５０，０００に希釈された１００μｌ／ウェルのＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ａ８０―１０４Ｐ、１ｍｇ／ｍｌ）で３７℃で１時間インキュベートした。これらのプレートをＴＢＳ‐Ｔでさらに４回洗浄し、１００μｌ／ウェルＴＭＢ基質を用いて４℃においてディベロップした。７分後、１００μｌ／ウェルの１ＭのＨ２ＳＯ４を付加することにより、反応を停止した。４５０ｎｍにおいて、ＯＤを測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｚｍソフトウェアを用いて、データを分析した。
【０３９１】
ｅ．直接結合ＥＬＩＳＡ  マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｌｏｗｅｌｌ  ＭＡ、カタログ番号３３６１）を、０．１Ｍ炭酸塩バッファー（ｐＨ９．５）中で３７℃で１時間希釈された脱脂ＢＳＡにコンジュゲートしたＳ１ＰまたはＬＰＡで１晩コートした。プレートをＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１０．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．４）で洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ−２０で室温で１時間または４℃で１晩ブロッキングした。一次インキュベーション（室温で１時間）のため、野生型または変異体抗体の希釈曲線（０．４μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．０１２５μｇ／ｍＬ、および０μｇ／ｍＬ）を構築した（１００μｌ／ウェル）。プレートを洗浄し、１００μｌ／ウェルのＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス（１：２０，０００希釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ  ＰＡ、カタログ番号１１５‐０３５‐００３）または１：５０、０００で希釈されたＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９‐０３５‐００３）により室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼをテトラメチルベンジジン基質（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ０４４０）でディベロップし、１ＭのＨ２ＳＯ４の付加によりクエンチした。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸを用いて、４５０ｎｍにおいて吸光度（ＯＤ）を測定した。未処理データをＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアに転送し、飽和結合曲線の４パラメータ非線状最小二乗法を用いて、最大半量効果（ＥＣ５０）および最大結合吸収（Ｖｍａｘ）が得られる脂質濃度を計算した。
【０３９２】
ｆ．脂質競合アッセイ  溶液中の多様な脂質が有する、ＷＴ／変異体抗体によって直接Ｓ１Ｐまたは直接ＬＰＡ結合を阻害する能力をＥＬＩＳＡアッセイフォーマットを用いて試験した。マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３３６１）を、０．１Ｍ炭酸塩バッファー（ｐＨ９．５）で希釈したＳ１Ｐで３７℃で１時間コートした。プレートをＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１０．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．４）で洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ‐２０で室温で１時間または４℃で１晩ブロッキングした。一次インキュベーションのため、０．４μｇ／ｍＬの抗体および指定量の脂質をＥＬＩＳＡプレートのウェルに付加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ウェルあたり１００μのＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス（１：２０，０００希釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１１５‐０３５‐００３）または１：５０，０００で希釈されたＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９‐０３５‐００３）で室温で１時間でインキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ反応をテトラメチルベンジジン基質によってディベロップし、１ＭのＨ２ＳＯ４の付加により停止した。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸを用いて、４５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を測定した。Ｅｘｃｅｌソフトウェアを用いたＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅプロットの線状回帰により、最大結合吸収（Ｖｍａｘ）およびパーセント阻害を計算した。
【０３９３】
ｇ．表面プラズモン共鳴  結合データは全て、ＰｒｏｔｅＯｎ光学バイオセンサ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ）で収集した。チオール化脂質をマレイミド修飾ＧＬＣセンサー・チップ（カタログ番号１７６−５０１１）と結合した。まず、ＧＬＣチップをスルホＮＨＳ／ＥＤＣの同量混合で７分間活性化し、次いでエチルジアミンによる７分間のブロッキング工程を実施した。次に、スルホＭＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、カタログ番号２２３１２）をＨＢＳランニングバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）において、０．５ｍＭの濃度で表面上に流した。チオール化脂質をＨＢＳランニングバッファー中で１０、１、０．１μＭの濃度に希釈して７分間注入し、異なる脂質密度の表面を得た（〜１００、〜３００および〜１４００ＲＵ）。次に、最高濃度として２５ｎＭから開始した３倍希釈の系列を使用して、ＷＴおよび変異体抗体の結合データを収集した。１００ｍＭ  ＨＣｌの１０秒のパルスによって表面を復元した。データはすべて２５℃で収集した。対照は、標準表面およびブランク注入により、処理した。結合パラメータを抽出するために、１サイトモデルおよび２サイトモデルを用いて、データにグローバルフィッティングを行った。
【０３９４】
２．脂質結合を抑制するように設計された突然変異
先ず、抗Ｓ１Ｐおよび抗ＬＰＡ抗体中の突然変異を、生化学技術によるｘ線構造の試験を行うように、設計した。複合体中の脂質と直接接触する可変ドメイン中のアミノ酸を、ＳＰＲ中の結合および直接結合ＥＬＩＳＡを低減するように設計されたアミノ酸と置換した。そのため、アミノ酸の帯電、極性および疎水性の重要性について調査した。予備データに基づいて、アミノ酸は静電および水素結合相互作用を用いてＳ１Ｐ頭部基を認識し、疎水性残基はＳ１Ｐの脂肪炭素鎖を安定させる、と現在考えられている。そのため、アラニンに対する脂質頭部基と接触する突然変異残基または逆帯電した残基は、脂質結合を抑制すると考えられる。さらに、疎水性ポケットを形成する選択残基を、可変ドメインの静電表面および封鎖水を疎水性結合ポケットへと劇的に変化させ、複合体の安定性を劇的に低下させるように設計された荷電極性残基（例えば、グルタミン酸）と置換する。
【０３９５】
これらの実験から、脂質結合および特異性に影響を与える可変ドメインも特定された。可変ドメイン内の位置数が限定された場合、脂質認識のための主要決定基が得られると現在考えられている。これらの位置において、わずかなアミノ酸置換（例えば、グルタミンからアスパラギンへの置換）は、脂質結合または特異性に顕著な効果をもたらすと考えられる。ここで、脂質と直接接触する残基の配向および位置を支持するフレームワーク残基の役割および側鎖のサイズを探査するための調査を設計した。保存変異原性を通じて抗体‐脂質相互作用を「ファインチューニング」することにより、抗体のその同族脂質に対する全般的親和性の向上または複合体の寿命の向上が可能であると考えられる。これは、生物活性脂質標的を抑制および中和するその能力を増加させることにより、抗体の治療可能性を増強すると考えられる。
【０３９６】
ヒト化モノクローナル抗Ｓ１Ｐ抗体ＬＴ１００９の開発時において、Ｓ１Ｐ結合、交差反応、熱安定性および溶解性を特性評価するために上述のように多数の生化学研究を開始した。抗体のいくつかの変異体は、重鎖および軽鎖内の抗原結合表面内に配置された点突然変異と共に設計された。これらの変異体を生成および精製し、上述したような直接結合ＥＬＩＳＡを用いてそのＳ１Ｐ結合親和性を測定した。溶媒に露出されたアルギニン残基（ＣＤＲ  Ｌ２中のＲ５５、ＣＤＲ  Ｈ２中のＲ５４、およびＣＤＲ  Ｈ２中のＲ６５（シーケンシャルナンバリングを使用））をいくつか突然変異させたところ、Ｓ１Ｐ結合親和性に影響はみられなかった（図２ａ）。しかし、ＣＤＲ  Ｈ１中のヒスチジンＨ３５を突然変異させたところ、野生型と比較して顕著に変化したＳ１Ｐ結合が得られた。アラニンへのこの残基の突然変異は、Ｓ１Ｐ結合を有意に変化させず、この位置におけるグルタミン置換を含む変異体は、ＥＣ５０において２倍の増加（野生型のおよそ８０ｎｇ／ｍｌからＨ３５Ｑのおよそ１６０ｎｇ／ｍｌに）を示し、Ｓ１Ｐ結合の低下を示し、この位置（Ｈ３５Ｅ）におけるグルタミン酸への突然変異により、測定可能なＳ１Ｐ結合が完全に除去された（図２ａ）。理論に縛られることは望まないものの、これらのデータは、ＣＤＲ  Ｈ１内の位置３５が複合体中のＳ１Ｐと疎水性接触を形成する可能性が高いことを示唆する。実際、これらの突然変異の位置を初期Ｘ線構造にマッピングしたところ、重鎖中のヒスチジンＨ３５がＳ１Ｐの疎水性尾部を緻密に覆っているように見え、グルタミン酸への置換により、静電環境が劇的に変化して、好ましくない結合ポケットが生成される（図２ｂ）。これは、エネルギー的に好ましい疎水性相互作用を形成するアラニン変異体がＳ１Ｐ結合を保持するという観察と一貫する。重鎖中のチロシン９８のアラニンへの突然変異によっても、結合が有意に低下した。アルギニン突然変異（ＣＤＲ  Ｌ２中のＲ５５、ＣＤＲ  Ｈ２中のＲ５４およびＣＤＲ  Ｈ２中のＲ６５）を含むその他のＬＴ１００９変異体は、ＷＴと比較してＳ１Ｐ結合において有意な差を示さなかったが、ＬＴ１００９  Ｆａｂ／Ｓ１Ｐ複合体中において結合Ｓ１Ｐから遠隔位置まで除去された。これらのデータは、構造および生化学データが良好に一致することを実証し、また、ＬＴ１００９  Ｆａｂ／Ｓ１ＰおよびＬＴ３０１５  Ｆａｂ／ＬＰＡ複合体の結晶構造により、脂質認識のための主要決定基として機能する抗体中の特定のアミノ酸残基の理解および操作のための信頼性のある構造的基板が得られることを示唆する。
【０３９７】
ＬＴ１００９  Ｆａｂ／Ｓ１Ｐ構造中において検出された興味深い特徴として、ＣＤＲ  Ｈ３中のＹ１０２の位置がある。Ｓ１Ｐ結合確認において、このチロシン残基の側鎖は、Ｓ１Ｐの炭化水素尾部上においてフォールドし、脂質上でクランプしているように見える。このコンフォメーションにおいて、前記脂質は、抗体から自由に離脱することはできない。この構造に基づいて、ＣＤＲ  Ｈ３のコンフォメーション変化またはＹ１０２側鎖回転異性体位置が発生すると、脂質の離脱が可能になると考えられる。理論に縛られることは望まないが、これは、ＬＴ１００９−Ｓ１Ｐ複合体の寿命において重要な役割を果たすものと考えられる。
【０３９８】
さらにこの「チロシンゲート」機構を調査するために、ＣＤＲ  Ｈ３中の位置１０２をアラニンへ突然変異させ、変異体のＳ１Ｐ結合を測定した。Ｙ１０２Ａ変異体の平衡Ｓ１Ｐ結合定数はＷＴよりも４倍高く、変異体の脂質に対する親和性が有意に低減したことを示す。しかし、結合の損失は、カルシウム結合部位中の突然変異と同様に、絶対ではない（図３ｃ）。突然変異Ｙ１０２のキネティック効果が平衡時よりも高いかを決定するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いた将来における実験が計画されている。やはり理論に縛られることは望まないが、変異体のオフレートは野生型抗体よりもずっと高速であることが予測される。
【０３９９】
最後に、ＬＴ１００９  ＣＤＲ  Ｌ２中の突然変異グルタミン酸Ｅ５０の効果を調査した。このアミノ酸は、Ｓ１Ｐと特異的な相互作用を形成すると予測されている。計算機による研究によれば、Ｓ１Ｐ中のアンモニウム基は、「フリー」脂質中に＋１電荷を含む可能性が高いことが示唆されている。これは、ＣＤＲ  Ｌ２中のＥ５０の負荷電側鎖との静電相互作用を形成するアンモニウムイオンを示す観察された構造と一致する。我々は、この相互作用は、Ｓ１Ｐ特異性の主要決定基である可能性が高く、この位置を突然変異させることにより、Ｓ１Ｐ結合が劇的に低下する、と仮説する。予測されるとおり、この位置をアラニンに突然変異すると、Ｓ１Ｐ結合が抑制される（図３ｃ）。最終的に、これらの研究は、ＬＴ１００９  Ｆａｂ／Ｓ１Ｐ結晶構造を確認し、脂質結合において重要なＬＴ１００９中の位置を解明する。
【０４００】
３．脂質特異性を調節するように設計された突然変異
脂質認識を支配する主要決定基を特定した後、抗体変異体を作製し、他の脂質との交差反応性を競合ＥＬＩＳＡを用いて測定した。分子モデリングソフトウェアを用いて、Ｓ１ＰおよびＬＰＡを構造的に関連する脂質にモーフィングし、置換すべき可変ドメインの位置を特定した。最終的に、変異体のライブラリーが構築され、その結果、多様な脂質の高速分析が可能となる。脂質（生物活性脂質を含む）の構造空間は小さいため、二次および三次構造においてより大きくかつより可変であるタンパク質抗原に対する抗体の場合と対照的に、抗体の脂質特異性を調節するタスクが実施可能なものとなる。
【０４０１】
Ｓ１Ｐ１についての従来のモデリング研究により、単一のグルタミン酸残基が特定されている。このグルタミン酸残基は、グルタミンに突然変異すると、受容体が活性化され、ＬＰＡによってインターナライズされる（Ｗａｎｇ，Ｄ．Ａ．ら（２００１年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００１年、２７６：４９２１３〜２０）。同じ研究グループによれば、ＬＰＡ受容体ＬＰＡ１〜３内の単一の位置も特定され、単一のグルタミンのグルタミン酸置換により、受容体のＳ１Ｐに対する反応性がより高くなる（Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ，Ｗ．Ｊ．ら（２００８年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８３：１２１７５〜８７）。このモデリング研究は、グルタミン酸／グルタミン残基がＳ１Ｐの一級アミン基と相互作用することを予測している。興味深いことに、ＬＴ１００９  Ｆａｂ／Ｓ１Ｐ複合体において、この部分は、ＣＤＲ  Ｌ２軽鎖中のグルタミン酸Ｅ５０と類似静電相互作用を形成する。そのため、ＣＤＲ  Ｌ２中のグルタミン酸Ｅ５０グルタミンへ突然変異することにより、ＬＴ１００９がＬＰＡ結合活性を得ると考えられる。あるいは、抗ＬＰＡｍＡｂからのＣＤＲ  Ｌ２全体を置換することも可能である。なぜならば、グルタミン酸Ｅ５０は、脂質と直接接触するＣＤＲ  Ｌ２中の唯一の位置にあるからである。脂質リン酸基との接触するＬＴ１００９またはＬＴ３０１５のいずれかまたはこれらの組み合わせからのＣＤＲが、他の生物活性脂質（特に、リゾ脂質）に対する抗体を設計するのに用いることができると考えられる。
【０４０２】
また、Ｖｈフレームワークは、リゾ脂質に対して好ましい普遍的結合ポケットを提示し得ると考えられる。ＬＴ１００９およびＬＴ３０１５  Ｖｈ配列は、ＣＤＲの外側において９３％同一である（予測されるように、ＣＤＲはより低い同一性を有し、この場合において４６％）。Ｖｋ配列は、ＣＤＲの外側において５９％同一である（ＣＤＲ内において１９％の同一性）。ＬＴ１００９  Ｆａｂ／Ｓ１Ｐ構造において、より少なく保存されているＶｋドメインのみが、Ｓ１Ｐの頭部基と接触しており、これはＬＰＡと対称的であり、一方、より多く保存されているＶｈドメインは、Ｓ１ＰとＬＰＡとの間で化学的に保存されている炭化水素鎖と主に接触する。可変ドメイン間の相同性が脂質領域間の化学的類似性に直接関連するという事実は、抗体−脂質相互作用の共通機構を示唆しており、これを利用して、生物活性脂質を区別する多様な構造および官能基を特異的に認識するＣＤＲのライブラリーを生成することができる。異なる組み合わせのＣＤＲを用いることにより、広範囲の治療標的に対する新規な抗体をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで開発することが可能であると考えられる。本明細書中で開示されるＳ１Ｐ−ＬＴ１００９のための結晶構造は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリングの方向のためのテンプレートとして用いられる。異なる生物活性脂質がＳ１Ｐ結合ポケット中にドックされ、本明細書中においてＬＴ１００９およびＳ１Ｐについて記載したものと類似する安定化相互作用を新規抗体が形成するように、抗体がｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでモーフィングされる。さらなる共結晶が利用可能となると（例えば、ヒト化抗ＬＰＡ抗体およびＬＰＡ）、複数の共結晶（特に、生物活性脂質―抗体共結晶）からの情報を抗脂抗体の設計にのために共に用いることが可能であることが想定される。
【０４０３】
軽鎖の位置５０におけるグルタミン酸をグルタミンへと突然変異させると、抗体特異性が変化することが今や実証されている。理論に縛られることは望まないが、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）中の結晶構造とＬＴ１００９のＦａｂフラグメントとの複合は、脂質のＣ２位置にあるアンモニウム基との相互作用によって抗体のＳ１Ｐ特異性が支配され得ることを示唆する。生理学的条件下において、この部分は、Ｓ１ＰおよびジヒドロＳ１Ｐ双方において正荷電される可能性が高い。Ｓ１ＰおよびジヒドロＳ１Ｐは、Ｆａｂに対して高親和性を示し、Ｆａｂに対して比較的低い親和性を有するスフィンゴシンおよびスフィンゴシルホスホリルコリンにおいて中性である。Ｓ１Ｐ構造において、アンモニウム基は、抗体軽鎖から突出する位置５０におけるグルタミン酸の側鎖と単一の静電相互作用を形成する。これらの観察結果から、この位置においてアミノ酸を帯電させると、他の脂質標的（例えば、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ））に対する抗体の特異性を調節することができると推測できる。
【０４０４】
このアイディアを試験するために、このグルタミン酸（ＧｌｕＬ５０）をグルタミン（ＧｌｎＬ５０）に突然変異させ、これらの抗体のＳ１ＰまたはＬＰＡへの結合を直接ＥＬＩＳＡを用いてアッセイした。予測された通り、野生型（ＷＴ）ＬＴ１００９は、Ｓ１Ｐ‐ＢＳＡコーティング材料に対して高親和性を示し、プレート上にコートされたＣ１２ＬＰＡ‐ＢＳＡに対しては結合活性は観察されなかった。これとは対照的に、ＬＴ１００９  ＧｌｎＬ５０変異体抗体は、Ｓ１Ｐ‐ＢＳＡよりもＣ１２ＬＰＡ−ＢＳＡコンジュゲートに対して有意により高い親和性を示し（図４）、このアミノ酸がＳ１Ｐ特異性において重要な役割を果たし、この位置における変化によって標的特異性が変わることが示唆される。
【０４０５】
理論に縛られることは望まないが、これらの結果は、脂質標的中の官能基およびアミノ酸側鎖の科学的性質と一貫する。Ｆａｂ−Ｓ１Ｐ結晶構造において、Ｓ１Ｐの正荷電アンモニウム基は、負荷電ＧｌｕＬ５０側鎖との静電相互作用を形成する。ＬＰＡにおいて、アンモニウム基を非荷電ヒドロキシル基と置換し、そのため、ＷＴ抗体の結合のために好ましい静電相互作用を利用することはできない。ＧｌｎＬ５０突然変異により、ＬＰＡのヒドロキシル基との水素結合を形成することが可能な中性の極性側鎖が得られる。この相互作用の存在により、変異体ＬＴ１００９のＬＰＡへの結合が明らかに安定化し、Ｓ１Ｐへの結合が不安定化される。そのため、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ抗体設計をここで用いて、抗Ｓ１Ｐ抗体を、Ｓ１ＰよりもＬＰＡにより良好に結合する抗体に変換している。
【０４０６】
４．カルシウム結合部位を破壊させる突然変異：
Ｓ１Ｐ結合における結合カルシウムの効果について、部位特異的変異原性を用いてさらに調査した。ＣＤＲ  Ｌ１中のアスパラギン酸Ｄ３０およびＤ３２をアラニンに変化させて、カルシウム結合部位を破壊した。これらの突然変異を含む抗体はいずれも、Ｓ１Ｐと全く結合しなかった（図３ｃ）。誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）分光法を用いて、野生型ＬＴ１００９抗体の金属内容物（これにより、２：１  Ｃａ２＋：ＬＴ１００９化学量論が測定される）と、Ｄ３０ＡおよびＤ３２Ａ変異体とを比較して、カルシウムの不在を確認した。
【０４０７】
実施例１９：抗ＬＰＡ抗体の生成および精製
出願人は、＞０．５ｍｇ／ｍｌのヒト化抗ＬＰＡｍＡｂであるＬＴ３０１５を発現させる哺乳類細胞株（ＣＨＯ  ＣＫ１ｓｖ）を最近開発した。５０リットルのバイオリアクターキャンペーン中にてこの安定な細胞株を用いて、大量の非ＧＭＰ材料を生成した。バイオリアクター上清からＬＴ３０１５を精製したところ、＞１０グラムの抗体材料が得られた。ＬＴ３０１５を１８ｍｇ／ｍｌにおいて２４ｍＭ  ＰＢＳ、１４８ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５中で製剤した。この調製物は、純度、凝集およびＬＰＡ結合特性についての厳しい仕様を満足した。そのため、パパイン消化、Ｆａｂフラグメントの単離、ＬＰＡとの複合体形成、およびＬＴ３０１５  Ｆａｂ／ＬＰＡ複合体の結晶化において適切な材料が利用可能となる。
【０４０８】
実施例２０：抗Ｓ１Ｐおよび抗ＬＰＡヒト化抗体の比較から得られた情報
一次構造（アミノ酸配列）および三次元（結晶）構造に基づいて、ＬＴ１００９およびＬＴ３０１５を比較した。抗体高頻度可変性領域のアミノ酸配列における差は比較的小さいが、構造および化学同一性の高い２つの生物活性脂質であるＬＰＡとＳ１Ｐとの間を区別することが可能になる。抗ＬＰＡおよび抗Ｓ１Ｐ  ＶＨ配列（重鎖可変ドメイン）は、ＣＤＲの外部において９３％同一である（予測される通り、ＣＤＲはより低い同一性（この場合、４６％）を有する）。Ｖｋ配列（軽鎖可変ドメイン）は、ＣＤＲの外部において５９％同一である（ＣＤＲ内において１９％の同一性）。２つの抗体配列間の差の位置および性質（例えば、サイズおよび／またはアミノ酸側鎖の帯電）についての情報を用いて、ＳＡＲ試験のための変異体の設計を支援する。
【０４０９】
この区別に関するより多くの情報が、２．７Å分解能において精密化されたＬＴ１００９  Ｆａｂ／Ｓ１Ｐ複合体結晶構造に基づく。類似のアプローチを用いて、上記の実施例に記載のように、ＬＴ３０１５  Ｆａｂ／ＬＰＡ複合体結晶構造の構造を決定する。Ｃｈ１‐３ドメインのアミノ酸組成物はＬＴ１００９とＬＴ３０１５との間で同一であるため、ＬＴ１００９  ＦａｂおよびＳ１Ｐの共結晶化に用いられた方法によって、ＬＴ３０１５  ＦａｂおよびＬＰＡの共結晶も得られると考えられる。
【０４１０】
本明細書において記載されたまたは請求された組成物および方法の全てを、過度の実験を要することなく作成および実行することができる。本発明の組成物および方法は、好適な実施様態として記載したが、前記組成物および方法を変更してもよいことは当業者には明らかであろう。当業者には明らかである、かかる同様の置き換えや変更はすべて、最後に追加する請求項に定義される本発明の趣旨および範囲に含まれるものとする。
【０４１１】
本明細書において述べた特許、特許出願、文献のすべては、本発明に関連する当業者の技量を示すものである。優先権または他の利点が主張されるものも含め、特許、特許出願、文献のすべては、それぞれの文献を個々に、参照により援用されるべく指示されている場合と同じレベルで、本明細書で参照することにより援用されている。
【０４１２】
本明細書において例によって説明した本発明は、特に記載されていない限り、任意の要素（単数または複数）なしで、実施してもよい。従って、例えば、本明細書における各例の、「を有する」、「から本質的になる」、「からなる」という用語のいずれも一つは、その他の２つの用語のいずれかで置き換えてもよい。用いられた用語および表現は、限定のためではなく、説明のための用語として用いられており、そのような用語および表現の使用には、提示され、説明された特徴と同等のもののいずれも、またはその一部を除外する意図はなく、むしろ請求する本発明の範囲内で多様な変更が可能であることを認識されたい。従って、本発明について好適な実施様態および選択的な特徴によって具体的に説明したが、当業者が本明細書に記載の概念の変更および変形を行ってもよいこと、そのような変更や変形が、最後に追加する請求項に定義されるがごとく、本発明の範囲に含まれるとすることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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