(57)【要約】髄膜炎菌のヘモグロビン受容体ＨｍｂＲを、１つ以上の更なる抗原と組み合わせて、例えば、髄膜炎菌外膜小胞と、別の精製髄膜炎菌抗原（例えば、ｆＨＢＰ、２８７、ＮａｄＡ、ＮｓｐＡ、ＮｈｈＡ、Ａｐｐ、Ｏｍｐ８５、ＬＯＳ）と、結合体化髄膜炎菌莢膜糖と、などと組み合わせてワクチン抗原として使用する。また、本発明は、（ｉ）ＨｍｂＲを高発現する髄膜炎菌、および（ｉｉ）そのような細菌から調製される外膜小胞、および（ｉｉｉ）そのような細菌由来の小胞を作製する方法を提供する。
2012512240.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原および
（ｉｉ）髄膜炎菌外膜小胞
を含む、免疫原性組成物。
【請求項２】
髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原を高発現する、操作された髄膜炎菌。
【請求項３】
発現が相変動性ではないｈｍｂＲ遺伝子を含む、操作された髄膜炎菌。
【請求項４】
ＨｍｂＲを構成的に発現する、操作された髄膜炎菌。
【請求項５】
誘導プロモータの制御下にｈｍｂＲ遺伝子を含む、操作された髄膜炎菌。
【請求項６】
前記髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原を含む、請求項２、請求項３、請求項４または請求項５に記載の細菌から調製される、外膜小胞。
【請求項７】
髄膜炎菌膜小胞を作製する方法であって、請求項２、請求項３、請求項４または請求項５に記載の髄膜炎菌を破壊して該小胞を得る工程を含む、方法。
【請求項８】
（ｉ）ＨｍｂＲ抗原および
（ｉｉ）ｆＨＢＰ、２８７、ＮａｄＡ、ＮｓｐＡ、ＮｈｈＡ、Ａｐｐ、Ｏｍｐ８５およびＬＯＳからなる群より選択される１つ以上の髄膜炎菌抗原
を含む、免疫原性組成物。
【請求項９】
（ｉ）髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原および
（ｉｉ）血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５またはＹ由来の１つ以上の結合体化髄膜炎菌莢膜糖
を含む、免疫原性組成物。
【請求項１０】
式：
ＮＨ２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ
のアミノ酸配列であって、式中、Ｘは髄膜炎菌抗原配列を含むアミノ酸配列であり、Ｌは任意選択的なリンカーアミノ酸配列であり、Ａは任意選択的なＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは任意選択的なＣ末端アミノ酸配列であり、ｎは２以上の整数であり、但し、少なくとも１つのＸ部分はＨｍｂＲ抗原であるものとする、アミノ酸配列を含む、ハイブリッドポリペプチド。
【請求項１１】
Ｘ部分がｆＨＢＰ、２８７、ＮａｄＡ、ＮｓｐＡ、ＮｈｈＡ、ＡｐｐおよびＯｍｐ８５からなる群より選択される、請求項６に記載のハイブリッドポリペプチド。
【請求項１２】
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび
（ｉｖ）ＨｍｂＲ抗原
の混合物を含む、免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記ＨｍｂＲが配列番号７と少なくとも８０％の配列同一性を有し、および／または配列番号７由来のエピトープを含むアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれかに記載の組成物、細菌、小胞、方法またはポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２００８年１２月１７日に出願された米国仮特許出願６１／２０３，０８７からの優先権を主張し、上記米国仮特許出願の全容は参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は髄膜炎菌ワクチンの分野に属する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
現在、髄膜炎菌の血清群Ｂ（「ＭｅｎＢ：ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ  Ｂ  ｏｆ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ」）に対する各種ワクチンが研究されている。Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ社製ＭＥＮＺＢＴＭ製品、Ｆｉｎｌａｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製ＶＡ−ＭＥＮＧＯＣ−ＢＣＴＭ製品、およびＮｏｒｗｅｇｉａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ製ＭＥＮＢＶＡＣＴＭ製品などの一部のワクチンは外膜小胞（ＯＭＶ：ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）に基づいている。参考文献１（非特許文献１）のＮｏｖａｒｔｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ社により報告された「血清群Ｂ髄膜炎菌に対する汎用ワクチン」などの他のものは組換え蛋白質に基づいている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｇｉｕｌｉａｎｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ（２００６年）１０３（２９）：１０８３４〜９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の開示）
本発明は、髄膜炎菌のヘモグロビン受容体ＨｍｂＲ（ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）のワクチン抗原としての利用に関する。しかしながら、参考文献２と異なり、ＨｍｂＲはワクチン中の唯一の抗原として含めるものではない。もっと正確に言えば、より広範でより良好な免疫反応が得られるように、１つ以上の更なる髄膜炎菌抗原と組み合わせて含めるものである。
【０００６】
本発明は、髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原および髄膜炎菌外膜小胞を含む免疫原性組成物を提供する。
【０００７】
また、本発明は、（ｉ）ＨｍｂＲを高発現（ｈｙｐｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓ）する髄膜炎菌、および（ｉｉ）そのような細菌から調製される外膜小胞、および（ｉｉｉ）そのような細菌由来の小胞を作製する方法を提供する。
【０００８】
また、本発明は、その発現が相変動性ではないｈｍｂＲ遺伝子を含む髄膜炎菌を提供する。また、本発明は、ＨｍｂＲを構成的に発現する髄膜炎菌を提供する。また、本発明は、誘導プロモータの制御下にｈｍｂＲ遺伝子を含む髄膜炎菌を提供する。また、本発明は、（ｉ）そのような細菌から調製した外膜小胞および（ｉｉ）そのような細菌由来の小胞を作製する方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原および髄膜炎菌抗原：ｆＨＢＰ、２８７、ＮａｄＡ、ＮｓｐＡ、ＮｈｈＡ、Ａｐｐ、Ｏｍｐ８５および／またはＬＯＳのうちの１つ以上を含む免疫原性組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明は、（ｉ）髄膜炎菌ＨｍｂＲを発現する非髄膜炎菌および（ｉｉ）そのような非髄膜炎菌から調製される外膜小胞および（ｉｉｉ）そのような細菌由来の小胞を作製する方法を提供する。
【００１１】
本発明は、髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原および結合体化髄膜炎菌莢膜糖を含む免疫原性組成物を提供する。
【００１２】
また、本発明は、式：
−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］ｎ−Ｂ−
のアミノ酸配列を含むハイブリッドポリペプチドを提供する（式中、Ｘは髄膜炎菌抗原配列を含むアミノ酸配列であり、Ｌは任意選択的なリンカーアミノ酸配列であり、Ａは任意選択的なＮ−末端アミノ酸配列であり、Ｂは任意選択的なＣ末端アミノ酸配列であり、およびｎは２以上の整数であり、少なくとも１つのＸ部分はＨｍｂＲ抗原であるものとする）。好ましい非ＨｍｂＲ  Ｘ部分はｆＨＢＰ、２８７、ＮａｄＡ、ＮｓｐＡ、ＮｈｈＡ、Ａｐｐおよび／またはＯｍｐ８５である。これらのハイブリッドポリペプチドは免疫原性組成物の一部分を形成することができる。
【００１３】
また、本発明は、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび（ｉｖ）ＨｍｂＲ抗原の混合物を含む免疫原性組成物を提供する。（ｉ）および（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の混合物は参考文献１および３に開示されている。
【００１４】
また、本発明は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、長さが５００アミノ酸未満、例えば＜４００ａａ、＜３００ａａ、＜２００ａａであるポリペプチドを提供する。
【００１５】
また、本発明は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、長さが７５０アミノ酸未満、例えば＜７５０ａａ、＜７００ａａであるポリペプチドを提供する。
【００１６】
また、本発明は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、（ｉ）このポリペプチド中の配列番号２２の上流にあり、（ｉｉ）配列番号１９の１乃至２３番目のアミノ酸と同一である配列を含まないポリペプチドを提供する。
【００１７】
（ＨｍｂＲ）
本発明の組成物は、髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原を含む。完全長のＨｍｂＲ配列は、遺伝子ＮＭＢ１６６８として、公表された髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８［１０９］のゲノム配列に含まれていた（本明細書における配列番号７）。参考文献２には異なる菌株からのＨｍｂＲ配列（本明細書における配列番号８）が報告されている。本明細書の実施例では菌株ＮＺ０５／３３からの配列番号１９のクローニングを報告している。配列番号７および８は１アミノ酸だけ長さが異なり、９４．２％の同一性を有する。配列番号１９は配列番号７よりも１アミノ酸短く、これらはＣＬＵＳＴＡＬＷでは９９％の同一性（１挿入、７相違）である。本発明は任意のこのようなＨｍｂＲポリペプチドを使用することができる。
【００１８】
本発明は、完全長のＨｍｂＲ配列を含むポリペプチドを用いることができるが、多くの場合、部分的なＨｍｂＲ配列を含むポリペプチドを用いる。従って、一部の実施態様では、本発明において用いるＨｍｂＲ配列は、配列番号７と少なくともｉ％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ｉの値が５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９またはそれ以上であるアミノ酸配列を含むことができる。他の実施態様では、本発明において用いるＨｍｂＲ配列は、配列番号７からの少なくともｊ個の連続するアミノ酸の断片であって、ｊの値が７、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上であるアミノ酸の断片を含むことができる。他の実施態様では、本発明において用いるＨｍｂＲ配列は、（ｉ）配列番号７と少なくともｉ％の配列同一性を有し、および／または（ｉｉ）配列番号７からの少なくともｊ個の連続するアミノ酸の断片を含むアミノ酸配列を含むことができる。
【００１９】
ｊ個のアミノ酸の断片は、配列番号７由来のエピトープを含むことが好ましい。通常、そのようなエピトープは、ＨｍｂＲの表面にあるアミノ酸を含む。有用なエピトープとしては、ＨｍｂＲのヘモグロビンとの結合に関与するアミノ酸を有するものが挙げられる。何故なら、こうしたエピトープに結合する抗体は細菌の宿主ヘモグロビンとの結合能を遮断することができるからである。ＨｍｂＲのトポロジーおよびその重要な機能性残基については参考文献４で検討されている。膜貫通配列を保持している断片は、細菌表面上に、例えば小胞において表示させることができるので、有用である。ＨｍｂＲの長い断片の例は配列番号２１および２２に該当する。しかしながら、可溶性ＨｍｂＲを用いる場合、膜貫通配列を含めないが、通常細胞外部分由来のエピトープを保持させた配列を用いることができる。
【００２０】
本発明の最も有用なＨｍｂＲ抗原は、被験体への投与後に、配列番号７のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を誘発することができる。本発明に用いるための好都合なＨｍｂＲ抗原は、被験体への投与後に殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発することができる。
【００２１】
参考文献５と異なり、本発明のＨｍｂＲ抗原は、通常は莢膜糖抗原と結合体化しない。
【００２２】
（外膜小胞および好適な小胞産生髄膜炎菌株）
本発明の一実施態様では、（ａ）髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原および（ｂ）髄膜炎菌外膜小胞を含む免疫原性組成物を提供する。これら２つの成分（ａ）および（ｂ）を別々に調製した後、混合してこの免疫原性組成物を得ることができる［２１］。本発明の別の実施態様では、髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原を高発現する髄膜炎菌から調製される外膜小胞を提供する。そのような高発現菌株についても提供する［２１］。こうした菌株から調製される小胞は、ＨｍｂＲ抗原を含むことが好ましく、この抗原は小胞内で免疫接近可能形態にある必要がある。即ち、抗ＨｍｂＲ抗体が、小胞内に存在するＨｍｂＲに結合できる必要がある。
【００２３】
こうした外膜小胞としては、髄膜炎菌外膜の破壊またはそれからのブレブリング（ｂｌｅｂｂｌｉｎｇ）により、その外膜の蛋白質成分を含む、外膜から小胞を形成させることで得られる任意の蛋白リポソーム小胞が挙げられる。従って、この用語には、ＯＭＶ（「ブレブ（ｂｌｅｂ）」と称することもある）、微小胞  （ＭＶ：ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ［６］）、および「天然型ＯＭＶ」（「ＮＯＭＶ：ｎａｔｉｖｅ  ＯＭＶ」［７］）を含める。
【００２４】
ＭＶおよびＮＯＭＶは、細菌の増殖中に自然発生的に形成され、培養培地中に放出される天然の膜小胞である。ＭＶは、ブロス培養培地でＮｅｉｓｓｅｒｉａを培養し、このブロス培養培地中の小さなＭＶから細胞全体を（例えば、濾過または低速度で遠心分離して小さな小胞ではなく細胞のみをペレット化することによって）分離し、次いで細胞枯渇培地からＭＶを（例えば、濾過で、ＭＶの分別沈殿または凝集で、高速度遠心分離でＭＶをペレット化することで）採取することによって得ることができる。ＭＶの作製に用いるための菌株は、一般に、培養において産生されるＭＶの量に基づいて選択することができ、例えば、参考文献８および９には高ＭＶ産生のＮｅｉｓｓｅｒｉａが記載されている。
【００２５】
ＯＭＶは細菌から人工的に調製され、（例えば、デオキシコール酸塩による）界面活性剤処理または非界面活性剤手段（例えば、参考文献１０参照）を用いて調製することができる。ＯＭＶを形成させる技術としては、胆汁酸塩界面活性剤（例えば、リトコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、コール酸、ウルソコール酸などの塩、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの処理にはデオキシコール酸ナトリウム［１１＆１２］が好まれる）をこうした界面活性剤を沈殿させないために十分に高いｐＨ［１３］で用いて細菌を処理する技術が挙げられる。実質的に界面活性剤の存在しない状態で［１０］、超音波処理、ホモゲナイズ、マイクロフルイダイゼーション、キャビテーション、浸透圧ショック、粉砕、フレンチ・プレス、混合などの技術を用いる他の技術を実施することができる。界面活性剤を全く用いないか少量用いる方法ではＮｓｐＡなどの有用な抗原を保持することができる［１０］。従って、方法としては約０．５％以下、例えば約０．２％、約０．１％、０．０５％未満またはゼロのデオキシコール酸塩を含むＯＭＶ抽出緩衝液を用いることができる。
【００２６】
ＯＭＶ調製の有用な方法については参考文献１４に記載されており、粗ＯＭＶに対して高速度遠心分離ではなく限外ろ過を行うものである。この方法には、限外ろ過を行った後に超遠心分離の工程を含めることができる。
【００２７】
本発明に使用するための小胞は、任意の髄膜炎菌株から調製することができる。こうした小胞は通常、血清群Ｂ菌株由来であるが、Ａ、Ｃ、Ｗ１３５またはＹなどのＢ以外の血清群から調製することが可能である（例えば、参考文献１３には血清群Ａのための方法が開示されている）。上記の菌株は任意の血清型（例えば、１、２ａ、２ｂ、４、１４、１５、１６など）、任意の血清亜型および任意の免疫型（例えば、Ｌ１；Ｌ２；Ｌ３；Ｌ３，３，７；Ｌ１０など）のものとすることができる。髄膜炎菌は、高侵入性および高毒性系統、例えば、以下の７つの高毒性系統：サブグループＩ、サブグループＩＩＩ、サブグループＩＶ−１、ＥＴ−５複合体、ＥＴ−３７複合体、Ａ４クラスター、系統３など、を含む任意の好適な系統由来のものとすることができる。これら系統は、多座位酵素電気泳動（ＭＬＥＥ：ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  ｅｎｚｙｍｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）により規定されているが、多座位配列タイピング（ＭＬＳＴ：ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｙｐｉｎｇ）も髄膜炎菌を分類するために使用されており［参考文献１５］、例えばＥＴ−３７複合体は、ＭＬＳＴによりＳＴ−１１複合体であり、ＥＴ−５複合体はＳＴ−３２（ＥＴ−５）であり、系統３はＳＴ−４１／４４である。小胞は、以下の亜型：Ｐ１．２；Ｐ１．２，５；Ｐ１．４；Ｐ１．５；Ｐ１．５，２；Ｐ１．５，ｃ；Ｐ１．５ｃ，１０；Ｐ１．７，１６；Ｐ１．７，１６ｂ；Ｐ１．７ｈ，４；Ｐ１．９；Ｐ１．１５；Ｐ１．９，１５；Ｐ１．１２，１３；Ｐ１．１３；Ｐ１．１４；Ｐ１．２１，１６；Ｐ１．２２，１４の内の１つを有する菌株から調製することができる。
【００２８】
本発明に使用される小胞は、野生型髄膜炎菌株または（髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原を高発現するように操作された菌株を含む）変異体髄膜炎菌株から調製され得る。例えば、参考文献１６には、修飾されたｆｕｒ遺伝子を有するＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから得られる小胞の調製について開示されている。参考文献２５では、ｎｓｐＡ発現が、ｐｏｒＡおよびｃｐｓの同時ノックアウトにより上方制御されるはずであることが教示されている。参考文献２５乃至２７では、ＯＭＶ産生のためのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの更なるノックアウト変異体について開示されている。参考文献１７では、ｆＨＢＰが上方制御されている小胞について開示されている。参考文献１８では、６つの異なるＰｏｒＡ亜型を発現するように修飾された菌株に由来する小胞の構築について開示されている。ＬＰＳ生合成に関与する酵素のノックアウトによって達成された低内毒素レベルを有する変異体Ｎｅｉｓｓｅｒｉａも使用することができる［１９、２０］。これらの変異体または他の変異体は、すべて本発明に使用することができる。
【００２９】
従って、本発明に使用される菌株は、一部の実施態様では、２つ以上のＰｏｒＡ亜型を発現し得る。６価および９価のＰｏｒＡ株は、これまでに構築されている。この菌株は、ＰｏｒＡ亜型：Ｐ１．７，１６、Ｐ１．５−１，２−２、Ｐ１．１９，１５−１、Ｐ１．５−２，１０、Ｐ１．１２−１，１３、Ｐ１．７−２，４、Ｐ１．２２，１４、Ｐ１．７−１，１および／またはＰ１．１８−１，３，６のうちの２、３、４、５、６、７、８、または９つを発現することができる。他の実施態様では、菌株は、ＰｏｒＡの発現について下方制御されていてもよく、その場合、例えば、ＰｏｒＡの量は、野生型レベルと比較して（例えば、参考文献２９に開示されているような菌株Ｈ４４／７６と比較して）、少なくとも２０％（例えば、≧３０％、≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧９５％など）減少しているか、さらにはノックアウトされている。
【００３０】
一部の実施態様では、菌株は、（対応する野生型菌株と比較して）特定の蛋白質を高発現することができる。例えば、菌株は、ＮｓｐＡ、蛋白質２８７［２１］、ｆＨＢＰ［１７］、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ［２２］、Ｃｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ［２２］などを高発現することができる。前述のように、一部の実施態様では、髄膜炎菌はＨｍｂＲ抗原を（対応する野生型菌株と比較して）高発現する。従って、ＨｍｂＲコード遺伝子は野生型菌株のプロモータよりも高い発現をもたらすプロモータの制御下に置くことができ、或いはこの菌株に、例えば染色体中またはプラスミド内に組み込むことで、非天然のＨｍｂＲコード配列を備えさせることができる。
【００３１】
小胞作製にとって好都合なことに、髄膜炎菌は、これが相変動を起こしにくいｈｍｂＲ遺伝子を確実に有するように、遺伝子操作することができる。髄膜炎菌における遺伝子発現の相変動性を低減または除去する方法については参考文献２３に開示されている。例えば、ｈｍｂＲ遺伝子は、構成的または誘導プロモータの制御下に置くことができ、或いはその相変動性に関与するＤＮＡモチーフを除去または置換することができる。
【００３２】
一部の実施態様では、菌株は、参考文献２４乃至２７に開示されているノックアウトおよび／または高発現変異のうちの１つ以上を有することができる。下方制御および／またはノックアウトのための好ましい遺伝子としては、（ａ）Ｃｐｓ、ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＣ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＧａｌＥ、ＨｔｒＢ／ＭｓｂＢ、ＬｂｐＡ、ＬｂｐＢ、ＬｐｘＫ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ［２４］、（ｂ）ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＣ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＧａｌＥ、ＨｔｒＢ／ＭｓｂＢ、ＬｂｐＡ、ＬｂｐＢ、ＬｐｘＫ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｈｏＰ、ＰｉｌＣ、ＰｍｒＥ、ＰｍｒＦ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ［２５］、（ｃ）ＥｘｂＢ、ＥｘｂＤ、ｒｍｐＭ、ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＤ、ＧａｌＥ、ＬｂｐＡ、ＬｐｂＢ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ［２６］、並びに（ｄ）ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＯｐＡ、ＯｐＣ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＤ、ＳｙｎＡ、ＳｙｎＢおよび／またはＳｙｎＣ［２７］が挙げられる。
【００３３】
変異菌株が使用される場合、一部の実施態様では、これは以下の特性のうちの１つ以上または全てを有することができる：（ｉ）髄膜炎菌性ＬＯＳを切断するためのＬｇｔＢおよび／またはＧａｌＥの下方制御またはノックアウト、（ｉｉ）ＴｂｐＡの上方制御、（ｉｉｉ）ＮｈｈＡの上方制御、（ｉｖ）Ｏｍｐ８５の上方制御、（ｖ）ＬｂｐＡの上方制御、（ｖｉ）ＮｓｐＡの上方制御、（ｖｉｉ）ＰｏｒＡのノックアウト、（ｖｉｉｉ）ＦｒｐＢの下方制御またはノックアウト、（ｉｘ）Ｏｐａの下方制御またはノックアウト、（ｘ）Ｏｐｃの下方制御またはノックアウト、（ｘｉｉ）ｃｐｓ遺伝子複合体の欠失。切断されたＬＯＳは、シアリル−ラクト−Ｎ−ネオテトラオースエピトープを含んでいないものとすることができ、例えば、ガラクトース−欠損ＬＯＳとすることができる。このＬＯＳは、α鎖を有さない場合がある。
【００３４】
小胞の調製に用いる髄膜炎菌株に応じて、小胞は菌株の天然ＨｍｂＲ抗原を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい［２８］。本発明では、ＨｍｂＲ含有またはＨｍｂＲ不含の小胞を用いることができるが、ＨｍｂＲ高発現菌株からこうした小胞を調製する場合には、その目的は小胞に確実にＨｍｂＲを含有させることにある。
【００３５】
ＬＯＳが小胞に存在している場合、そのＬＯＳと蛋白質成分とを結合させるように小胞を処理することが可能である（「ブレブ内」結合［２７］）。
【００３６】
本発明は、種々の菌株に由来する小胞の混合物を使用することができる。例えば、参考文献２９では、使用国において流行している血清亜型を有する髄膜炎菌株由来の第１の小胞および使用国において流行している血清亜型を必ずしも有さない菌株由来の第２の小胞を含む、多価髄膜炎菌性小胞組成物を含むワクチンについて開示されている。参考文献３０にも、種々の小胞の有用な組み合わせが開示されている。Ｌ２およびＬ３免疫型のそれぞれの菌株に由来する小胞の組み合わせを、一部の実施態様において用いることができる。
【００３７】
ＨｍｂＲ高発現菌株を設計するための３つの有用なバックグラウンド菌株はＭＣ５８、ＮＺ０５／３３およびＧＢ０１３である。ＭＣ５８はＰｏｒＡ血清亜型１．７，１６を有し、ＮＺ０５／３３は血清亜型１．７−２，４を有し、ＧＢ０１３は血清亜型１．２２，９を有する。
【００３８】
（ｆＨＢＰ（Ｈ因子結合蛋白質））
本発明の組成物は、精製ＨｍｂＲ抗原由来の精製ポリペプチド分離物として、またはＨｍｂＲ抗原としての同ポリペプチドの一部として（即ち、ハイブリッドポリペプチドの一部として）ｆＨＢＰ抗原を含むことができる。
【００３９】
ｆＨＢＰ抗原については詳細な特徴付けが行われている。これは蛋白質「７４１」［参考文献４０における配列番号２５３５および２５３６］、「ＮＭＢ１８７０」、「ＧＮＡ１８７０」［参考文献３１乃至３３］、「Ｐ２０８６」、「ＬＰ２０８６」または「ＯＲＦ２０８６」［３４乃至３６］とも呼ばれている。これは、天然型がリポ蛋白質であり、全ての髄膜炎菌血清群にわたって発現される。ｆＨｂｐのＣ末端免疫優性ドメイン（「ｆＨｂｐＣ」）の構造はＮＭＲによって決定されている［３７］。上記蛋白質のこの部分は８本鎖βバレルを形成しており、その各鎖は可変長のループによって結合されている。このバレルには短いαヘリックスおよび柔軟なＮ末端尾部が先行している。
【００４０】
ｆＨＢＰ抗原は、３つの異なる改変体に分類され［３８］、所与のファミリーに対する血清は同じファミリー内では殺菌性であるが、その他の２ファミリーのうちの一つを発現する菌株に対しては活性がなく、即ち、ファミリー内交差防御はあるが、ファミリー間交差防御はないことが分かっている。本発明は単一のｆＨＢＰ改変体を使用することができるが、上記改変体の２または３つ由来のｆＨＢＰを有用に含む。従って、これは、（ａ）配列番号１に対して少なくともａ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または配列番号１に由来する少なくともｘ個の隣接するアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含む、第１の蛋白質、（ｂ）配列番号２に対して少なくともｂ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または配列番号２に由来する少なくともｙ個の隣接するアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含む、第２の蛋白質、並びに／或いは（ｃ）配列番号３に対して少なくともｃ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または配列番号３に由来する少なくともｚ個の隣接するアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含む、第３の蛋白質、から選択される、２または３つの異なるｆＨＢＰの組み合わせを用いることができる。
【００４１】
ａの値は、少なくとも８５、例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５またはそれ以上である。ｂの値は、少なくとも８５、例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５またはそれ以上である。ｃの値は、少なくとも８５、例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５またはそれ以上である。ａ、ｂおよびｃの値は、本質的に、互いに関連しない。
【００４２】
ｘの値は、少なくとも７（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｙの値は、少なくとも７（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｚの値は、少なくとも７（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｘ、ｙおよびｚの値は、本質的に、互いに関連しない。
【００４３】
本発明が単一のｆＨＢＰ改変体を用いる場合、組成物は、（ａ）配列番号１に対して少なくともａ％の配列同一性を有するアミノ酸配列および／または配列番号１に由来する少なくともｘ個の隣接するアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、或いは（ｂ）配列番号２に対して少なくともｂ％の配列同一性を有するアミノ酸配列および／または配列番号２に由来する少なくともｙ個の隣接するアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、或いは（ｃ）配列番号３に対して少なくともｃ％の配列同一性を有するアミノ酸配列および／または配列番号３に由来する少なくともｚ個の隣接するアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むことができる。
【００４４】
本発明が上記改変体のうちの２または３つ由来のｆＨＢＰを用いる場合、組成物は、（ａ）配列番号１に対して少なくともａ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または配列番号１に由来する少なくともｘ個の隣接するアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド、（ｂ）配列番号２に対して少なくともｂ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または配列番号２に由来する少なくともｙ個の隣接するアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチド、並びに／或いは（ｃ）配列番号３に対して少なくともｃ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または配列番号３に由来する少なくともｚ個の隣接するアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含む、第３のポリペプチド、から選択される、２または３つの異なるｆＨＢＰの組み合わせを含むことができる。上記の第１、第２および第３のポリペプチドは異なるアミノ酸配列を有する。
【００４５】
本発明が上記改変体のうちの２つ由来のｆＨＢＰを用いる場合、組成物は、（ａ）配列番号１に対して少なくともａ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または配列番号１に由来する少なくともｘ個の隣接するアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド、並びに（ｂ）配列番号２に対して少なくともｂ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または配列番号２に由来する少なくともｙ個の隣接するアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチド、の両者を含むことができる。上記の第１および第２のポリペプチドは異なるアミノ酸配列を有する。
【００４６】
本発明が上記改変体のうちの２つ由来のｆＨＢＰを用いる場合、組成物は、（ａ）配列番号１に対して少なくともａ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または配列番号１に由来する少なくともｘ個の隣接するアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド、（ｂ）配列番号３に対して少なくともｃ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または配列番号３に由来する少なくともｚ個の隣接するアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチド、の両者を含むことができる。上記の第１および第２のポリペプチドは異なるアミノ酸配列を有する。
【００４７】
一部の実施態様では、ｆＨＢＰ蛋白質（単数または複数）は、例えば、Ｎ末端システインにおいて脂質付加される。他の実施態様では、これらは脂質付加されない。
【００４８】
（２８７）
本発明の組成物は、精製ＨｍｂＲ抗原由来の精製ポリペプチド分離物として、またはＨｍｂＲ抗原としての同ポリペプチドの一部として（即ち、ハイブリッドポリペプチドの一部として）２８７抗原を含むことができる。
【００４９】
この２８７抗原は、遺伝子ＮＭＢ２１３２（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＧＩ：７２２７３８８、本明細書における配列番号９）として、公表された髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８［１０９］のゲノム配列に含まれていた。その後、多くの菌株由来の２８７抗原の配列が公表されている。例えば、参考文献３９の図５および１５並びに参考文献４０の実施例１３および図２１に２８７の対立形質（ａｌｌｅｌｉｃ  ｆｏｒｍ）をみることができる（これらの文献における配列番号３１７９乃至３１８４）。２８７抗原の各種免疫原性断片も報告されている。
【００５０】
本発明において用いるのに好ましい２８７抗原は、（ａ）配列番号９との同一性を５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）有し、および／または（ｂ）配列番号９の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸の断片を含み、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）であるものとするアミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましい断片は配列番号９由来のエピトープを含む。
【００５１】
本発明の最も有用な２８７抗原は、被験体への投与後に配列番号９のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を誘発することができる。本発明に用いるための好都合な２８７抗原は、被験体への投与後に殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発することができる。
【００５２】
（ＮａｄＡ（ナイセリア付着因子Ａ））
本発明の組成物は、精製ＨｍｂＲ抗原由来の精製ポリペプチド分離物として、またはＨｍｂＲ抗原としての同ポリペプチドの一部として（即ち、ハイブリッドポリペプチドの一部として）ＮａｄＡ抗原を含むことができる。
【００５３】
このＮａｄＡ抗原は、遺伝子ＮＭＢ１９９４（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＧＩ：７２２７２５６、本明細書における配列番号１０）として、公表された髄膜炎菌血清群Ｂ菌株ＭＣ５８［１０９］のゲノム配列に含まれていた。その後、多くの菌株由来のＮａｄＡ抗原の配列が公表され、この蛋白質のナイセリア付着因子としての活性ついて十分な記載がある。ＮａｄＡの各種免疫原性断片も報告されている。
【００５４】
本発明に用いるのに好ましいＮａｄＡ抗原は、（ａ）配列番号１０との同一性を５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）有し、および／または（ｂ）配列番号１０の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸の断片を含み、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）であるものとするアミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましい断片は配列番号１０由来のエピトープを含む。
【００５５】
本発明の最も有用なＮａｄＡ抗原は、被験体への投与後に配列番号１０のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を誘発することができる。本発明に用いるための好都合なＮａｄＡ抗原は、被験体への投与後に殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発することができる。配列番号６はそのような断片の１つである。
【００５６】
（ＮｓｐＡ（ナイセリア表面蛋白質Ａ））
本発明の組成物は、精製ＨｍｂＲ抗原由来の精製ポリペプチド分離物として、またはＨｍｂＲ抗原としての同ポリペプチドの一部として（即ち、ハイブリッドポリペプチドの一部として）ＮｓｐＡ抗原を含むことができる。
【００５７】
このＮｓｐＡ抗原は、遺伝子ＮＭＢ０６６３（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＧＩ：７２２５８８８、本明細書における配列番号１１）として、公表された髄膜炎菌血清群Ｂ菌株ＭＣ５８［１０９］のゲノム配列に含まれていた。この抗原は、すでに参考文献４１および４２から知られていた。その後、多くの菌株由来のＮｓｐＡ抗原の配列が公表された。ＮｓｐＡの各種免疫原性断片も報告されている。
【００５８】
本発明に用いるのに好ましいＮｓｐＡ抗原は、（ａ）配列番号１１との同一性を５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）有し、および／または（ｂ）配列番号１１の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸の断片を含み、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）であるものとするアミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましい断片は配列番号１１由来のエピトープを含む。
【００５９】
本発明の最も有用なＮｓｐＡ抗原は、被験体への投与後に配列番号１１のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を誘発することができる。本発明に用いるための好都合なＮｓｐＡ抗原は、被験体への投与後に殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発することができる。
【００６０】
（ＮｈｈＡ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｈｉａホモログ））
本発明の組成物は、精製ＨｍｂＲ抗原由来の精製ポリペプチド分離物として、またはＨｍｂＲ抗原としての同ポリペプチドの一部として（即ち、ハイブリッドポリペプチドの一部として）ＮｈｈＡ抗原を含むことができる。
【００６１】
このＮｈｈＡ抗原は、遺伝子ＮＭＢ０９９２（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＧＩ：７２２６２３２、本明細書における配列番号１２）として、公表された髄膜炎菌血清群Ｂ菌株ＭＣ５８［１０９］のゲノム配列に含まれていた。多くの菌株由来のＮｈｈＡ抗原の配列が、例えば、参考文献３９および４３以後に公表されており、ＮｈｈＡの各種免疫原性断片が報告されている。これはＨｓｆとしても知られている。
【００６２】
本発明に用いるのに好ましいＮｈｈＡ抗原は、（ａ）配列番号１２との同一性を５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）有し、および／または（ｂ）配列番号１２の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸の断片を含み、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）であるものとするアミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましい断片は配列番号１２由来のエピトープを含む。
【００６３】
本発明の最も有用なＮｈｈＡ抗原は、被験体への投与後に配列番号１２のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を誘発することができる。本発明に用いるための好都合なＮｈｈＡ抗原は、被験体への投与後に殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発することができる。
【００６４】
（Ａｐｐ（付着因子および侵入蛋白質））
本発明の組成物は、精製ＨｍｂＲ抗原由来の精製ポリペプチド分離物として、またはＨｍｂＲ抗原としての同ポリペプチドの一部として（即ち、ハイブリッドポリペプチドの一部として）Ａｐｐ抗原を含むことができる。
【００６５】
このＡｐｐ抗原は、遺伝子ＮＭＢ１９８５（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＧＩ：７２２７２４６、本明細書における配列番号１３）として、公表された髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８［１０９］のゲノム配列に含まれていた。その後、多くの菌株由来のＡｐｐ抗原の配列が公表されている。これは、「ＯＲＦ１」および「Ｈａｐ」としても知られている。Ａｐｐの各種免疫原性断片も報告されている。
【００６６】
本発明において用いるのに好ましいＡｐｐ抗原は、（ａ）配列番号１３との同一性を５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）有し、および／または（ｂ）配列番号１３の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸の断片を含み、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）であるものとするアミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましい断片は配列番号１３由来のエピトープを含む。
【００６７】
本発明の最も有用なＡｐｐ抗原は、被験体への投与後に配列番号１３のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を誘発することができる。本発明に用いるための好都合なＡｐｐ抗原は、被験体への投与後に殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発することができる。
【００６８】
（Ｏｍｐ８５（８５ｋＤａ外膜蛋白質））
本発明の組成物は、精製ＨｍｂＲ抗原由来の精製ポリペプチド分離物として、またはＨｍｂＲ抗原としての同ポリペプチドの一部として（即ち、ハイブリッドポリペプチドの一部として）Ｏｍｐ８５抗原を含むことができる。
【００６９】
このＯｍｐ８５抗原は、遺伝子ＮＭＢ０１８２（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＧＩ：７２２５４０１、本明細書における配列番号１４）として、公表された髄膜炎菌血清群Ｂ菌株ＭＣ５８［１０９］のゲノム配列に含まれていた。その後、多くの菌株由来のＯｍｐ８５抗原の配列が公表されている。Ｏｍｐ８５に関する更なる情報を参考文献４４および４５に見出すことができる。Ｏｍｐ８５の各種免疫原性断片も報告されている。
【００７０】
本発明に用いるのに好ましいＯｍｐ８５抗原は、（ａ）配列番号１４との同一性を５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）有し、および／または（ｂ）配列番号１４の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸の断片を含み、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）であるものとするアミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましい断片は配列番号１４由来のエピトープを含む。
【００７１】
本発明の最も有用なＯｍｐ８５抗原は、被験体への投与後に配列番号１４のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を誘発することができる。本発明に用いるための好都合なＯｍｐ８５抗原は、被験体への投与後に殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発することができる。
【００７２】
（ハイブリッドポリペプチド）
一部の実施態様では、本発明は、式：−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］ｎ−Ｂ−のアミノ酸配列を含むハイブリッドポリペプチドを提供する（式中、Ｘは髄膜炎菌抗原配列を含むアミノ酸配列であり、Ｌは任意選択的なリンカーアミノ酸配列であり、Ａは任意選択的なＮ−末端アミノ酸配列であり、Ｂは任意選択的なＣ末端アミノ酸配列であり、およびｎは２以上の整数である（通常、ｎは２または３である））。
【００７３】
上記のとおり、少なくとも１つのＸ部分はＨｍｂＲ抗原である。理想的には、少なくとも１つの更なるＸ部分は、ｆＨＢＰ、２８７、ＮａｄＡ、ＮｓｐＡ、ＮｈｈＡ、Ａｐｐおよび／またはＯｍｐ８５から選ばれる。
【００７４】
少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５またはそれ以上）の抗原を単一のポリペプチド鎖（上記「ハイブリッド」ポリペプチド）として発現させることで、主に２つの利点がある。即ち、第１に、そのままでは不安定であるかまたは発現が乏しいと考えられるポリペプチドを、この問題を解決する適切なハイブリッドパートナーを加えることでサポートすることができ、第２に、抗原として有用な２つのポリペプチドを製造するのに必要な発現および精製が１回で済むので、商業的生産が単純化される。
【００７５】
−Ｘ−部分がその野生型形態においてリーダーペプチド配列を有する場合、上記ハイブリッド蛋白質ではこれを含めてもよく、削除してもよい。一部の実施態様では、リーダーペプチドは、ハイブリッド蛋白質のＮ末端に位置する−Ｘ−部分のそれを除いて、欠失させられる。即ち、Ｘ１のリーダーペプチドは保持させるが、Ｘ２．．．Ｘｎのリーダーペプチドは削除する。これは全てのリーダーペプチドを欠失させ、部分−Ａ−としてＸ１のリーダーペプチドを用いることに等しい。
【００７６】
［−Ｘ−Ｌ−］の各ｎ例について、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在してもよく、存在しなくてもよい。例えば、ｎ＝２のとき、ハイブリッドはＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ、などとすることができる。リンカーアミノ酸配列（単数または複数）である−Ｌ−は、通常短いものとなる（例えば、２０個以下のアミノ酸、即ち、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個）。例として、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリ−グリシンリンカー（すなわち、Ｇｌｙｎ、式中、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）およびヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ、式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）が挙げられる。他の適切なリンカーアミノ酸配列は、当業者には明らかである。有用なリンカーとしては、ＧＳＧＧＧＧ（配列番号１５）またはＧＳＧＳＧＧＧＧ（配列番号１６）があり、Ｇｌｙ−ＳｅｒジペプチドはＢａｍＨＩ制限酵素部位から形成されており、従って、クローニングおよび操作に役立つものであり、そして、（Ｇｌｙ）４テトラペプチドは典型的なポリ−グリシンリンカーである。他の、特に最後のＬｎとして用いるのに適切なリンカーはＬｅｕ−Ｇｌｕジペプチドである。
【００７７】
−Ａ−は、任意選択的なＮ末端アミノ酸配列である。これは、通常短いものとなる（例えば、４０個以下のアミノ酸、即ち、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個）。例としては、蛋白質の輸送を導くためのリーダー配列、或いはクローニングまたは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、即ち、Ｈｉｓｎ、式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）が挙げられる。他の適切なＮ末端アミノ酸配列は、当業者には明らかである。Ｘ１がそれ自体のＮ末端メチオニンを欠く場合、−Ａ−は、Ｎ末端メチオニンを提供するオリゴペプチド（例えば、アミノ酸１、２、３、４、５、６、７または８個）、例えば、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒまたは単一のメチオニン残基、であることが好ましい。
【００７８】
−Ｂ−は、任意選択的なＣ末端アミノ酸配列である。これは、通常短いものとなる（例えば、４０個以下のアミノ酸、即ち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個）。例としては、蛋白質の輸送を導くための配列、或いはクローニングまたは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、配列番号１７などのヒスチジンタグ、即ち、Ｈｉｓｎを含む、式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）または蛋白質の安定性を高める配列が挙げられる。他の適切なＣ末端アミノ酸配列は、当業者には明らかである。
【００７９】
（ＬＯＳ）
髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原は、精製髄膜炎菌リポオリゴ糖（ＬＯＳ）と組み合わせて用いることができる。ＬＯＳはそのままで、またはキャリアに結合体化させて用いることができる。結合体化させる場合、ＬＯＳのリピドＡ部分を介して、または任意の他の適切な部分、例えばそのＫＤＯ残基によって結合体化させることができる。ＬＯＳのリピドＡ部分が無い場合、代替的なそのような結合が必要とされる。
【００８０】
本発明に用いるＬＯＳは任意の免疫型、例えば、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ７など、由来のものとすることができる。
【００８１】
天然ＬＯＳを用いるのではなく、修飾形態を用いることが好ましい。こうした修飾は化学的に達成することができるが、特定の生合成付加に関与する、ＭｅｎＢにおける酵素をノックアウトする方がより簡便である。例えば、ＬＯＳは、天然のラクト−Ｎ−ネオテトラオースユニットの少なくとも末端Ｇａｌを除去するべく修飾することができるが、この修飾は、１つ以上の関連する酵素をノックアウトすることによって達成することができる。天然ＬＯＳにおける２つの末端単糖（シアル酸およびガラクトース）の付加に関与する酵素は、末端Ｓｉａだけを除去するために、またはＳｉａ−Ｇａｌの二糖を除去するためにノックアウトすることができる。例えば、ｌｇｔＢ遺伝子をノックアウトすると、Ｓｉａ−Ｇａｌが除去される。ｇａｌＥ遺伝子のノックアウトによっても、有用な修飾ＬＯＳが得られる。リピドＡの脂肪トランスフェラーゼ遺伝子をノックアウトしてもよい［４６］。
【００８２】
少なくとも１つの第一級Ｏ−結合脂肪酸を、ＬＯＳから除去してもよい［４７］。ＬＯＳ１分子あたりの第二級アシル鎖の数を減らしたＬＯＳも使用することができる［４８］。このＬＯＳはα鎖を有しなくてもよい。
【００８３】
このＬＯＳは、ＧｌｃＮＡｃ−Ｈｅｐ２ホスホエタノールアミン−ＫＤＯ２−リピドＡを含むことができる［４９］。
【００８４】
（髄膜炎菌莢膜糖）
髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原は、１つ以上の髄膜炎菌莢膜糖と組み合わせて用いることができ、この糖は通常キャリア蛋白質と結合体化させることになる。
【００８５】
血清群Ｃに対する結合体化一価ワクチンは、ヒトへの使用が承認されており、ＭＥＮＪＵＧＡＴＥＴＭ、ＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣＴＭ、およびＮＥＩＳＶＡＣ−ＣＴＭが挙げられる。血清群Ａ＋Ｃに由来する結合体の混合物は公知であり［５０、５１］、血清群Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙに由来する結合体の混合物も報告されており［５２乃至５５］、２００５年にＭＥＮＡＣＴＲＡＴＭ製品として承認されている。
【００８６】
本発明の組成物は、髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹのうちの１、２、３、または４つ、例えば、Ａ＋Ｃ、Ａ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５、Ｃ＋Ｙ、Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｃ＋Ｙ、Ａ＋Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙなど、に由来する莢膜糖の１つ以上の結合体を含むことができる。血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹの４つすべてに由来する糖を含む成分が理想的である。
【００８７】
血清群Ａの髄膜炎菌の莢膜糖は、Ｃ３位およびＣ４位において部分的Ｏ−アセチル化を有する、（α１→６）−結合Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−１−ホスフェートのホモポリマーである。Ｃ−３位でのアセチル化は、７０乃至９５％とすることができる。糖を精製するために使用される条件は、（例えば、塩基性条件下において）脱−Ｏ−アセチル化を生じ得るが、このＣ−３位にＯＡｃを保持することは有用である。一部の実施態様では、血清群Ａの糖におけるマンノサミン残基の少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上）は、Ｃ−３位においてＯ−アセチル化される。アセチル基をブロッキング基で置き換えることで、加水分解を防ぐことが可能であり［５６］、そのような修飾された糖は、依然として、本発明の意図する範囲内の血清群Ａの糖である。
【００８８】
血清群Ｃの莢膜糖は、（α２→９）−結合シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸、または「ＮｅｕＮＡｃ」）のホモポリマーである。糖構造は、
【００８９】
【化１】
2012512240.tif 000003
として記述される。大部分の血清群Ｃの菌株は、シアル酸残基のＣ−７位および／またはＣ−８位にＯ−アセチル基を有するが、臨床単離株の約１５％は、これらのＯ−アセチル基が欠損している［５７、５８］。ＯＡｃ基の存在または欠損により特有のエピトープが生じ、糖に対する抗体結合の特異性は、Ｏ−アセチル化（ＯＡｃ＋）菌株および脱−Ｏ−アセチル化（ＯＡｃ−）菌株に対するその殺菌活性に影響を及ぼすと考えられる［５９乃至６１］。本発明で使用される血清群Ｃの糖は、ＯＡｃ＋またはＯＡｃ−菌株から調製することができる。承認されているＭｅｎＣ結合体化ワクチンとしては、ＯＡｃ−（ＮＥＩＳＶＡＣ−ＣＴＭ）およびＯＡｃ＋（ＭＥＮＪＵＧＡＴＥＴＭおよびＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣＴＭ）糖の両方が挙げられる。一部の実施態様では、血清群Ｃの結合体の産生のための菌株は、例えば、血清型１６、血清亜型Ｐ１．７ａ，１などのＯＡｃ＋菌株である。従って、Ｃ：１６：Ｐ１．７ａ，１のＯＡｃ＋菌株を使用することができる。血清亜型Ｐ１．１におけるＯＡｃ＋菌株、例えば、Ｃ１１菌株なども有用である。
【００９０】
血清群Ｗ１３５の糖は、シアル酸−ガラクトース二糖ユニットのポリマーである。血清群Ｃの糖のように、これは、種々のＯ−アセチル化を有するが、但し、シアル酸の７位および９位においてである［６２］。その構造は、
【００９１】
【化２】
2012512240.tif 000004
として記述される。
【００９２】
血清群Ｙの糖は、二糖繰り返しユニットがガラクトースの代わりにグルコースを含むこと以外は、血清群Ｗ１３５の糖と同様である。血清群Ｗ１３５のように、これは、シアル酸の７位および９位に種々のＯ−アセチル化を有する［６２］。血清群Ｙの構造は、
【００９３】
【化３】
2012512240.tif 000005
として記述される。
【００９４】
本発明に従って用いる糖は、上記のように（例えば、天然莢膜糖に見られるのと同じＯ−アセチル化パターンで）Ｏ−アセチル化されていてもよく、または、これは、糖環の１つ以上の位置で、部分的にまたは全体的に脱−Ｏ−アセチル化されていてもよく、または、これは、天然の莢膜糖と比較して、過剰にＯ−アセチル化されていてもよい。
【００９５】
結合体の糖部分は、髄膜炎菌から調製されるような完全長の糖を含んでいてもよく、および／または完全長の糖の断片を含んでいてもよく、即ち、こうした糖は、細菌において見られる天然の莢膜糖より短かくてもよい。従って、こうした糖は、糖の精製中あるいは精製後の、結合体化の前に行う脱重合反応により、脱重合させることができる。脱重合により、糖の鎖長は減少する。脱重合方法の１つは、過酸化水素を使用するものである［５２］。過酸化水素を、（例えば、１％の最終Ｈ２Ｏ２濃度が得られるように）糖に添加し、次いで所望の鎖長の減少が達成されるまで、この混合物を（例えば、約５５℃で）インキュベートする。別の脱重合方法は、酸加水分解を行うものである［５３］。他の脱重合方法については、当技術分野において公知である。本発明による使用のための結合体を調製するために使用する糖は、これらの脱重合方法のいずれによっても入手可能と考えられる。脱重合は、免疫原性に最適な鎖長を与えるため、および／または物理的に扱いやすいように糖の鎖長を減少させるために用いることができる。一部の実施態様では、糖は、以下の範囲の平均重合度（Ｄｐ：ｄｅｇｒｅｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ）：Ａ＝１０乃至２０、Ｃ＝１２乃至２２、Ｗ１３５＝１５乃至２５、Ｙ＝１５乃至２５、を有する。Ｄｐではなく分子量に関して言えば、有用な範囲は、すべての血清群に対して、＜１００ｋＤａ、５ｋＤａ乃至７５ｋＤａ、７ｋＤａ乃至５０ｋＤａ、８ｋＤａ乃至３５ｋＤａ、１２ｋＤａ乃至２５ｋＤａ、１５ｋＤａ乃至２２ｋＤａである。
【００９６】
一部の実施態様では、髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹのそれぞれに由来する糖の平均分子量は、特にＭＡＬＬＳによって特定される場合に、５０ｋＤａ超、例えば、≧７５ｋＤａ、≧１００ｋＤａ、≧１１０ｋＤａ、≧１２０ｋＤａ、≧１３０ｋＤａなどであり得［６３］、最大１５００ｋＤａにまで及ぶことがある。例えば、ＭｅｎＡの糖は、５０乃至５００ｋＤａ、例えば、６０乃至８０ｋＤａの範囲であり得、ＭｅｎＣの糖は、１００乃至２１０ｋＤａの範囲であり得、ＭｅｎＷ１３５の糖は、６０乃至１９０ｋＤａ、例えば、１２０乃至１４０ｋＤａの範囲であり得、および／またはＭｅｎＹの糖は、６０乃至１９０ｋＤａ、例えば、１５０乃至１６０ｋＤａの範囲であり得る。
【００９７】
組成物における血清群あたりの髄膜炎菌の糖の質量は、通常、１μｇ乃至２０μｇの間であり、例えば、血清群あたり２乃至１０μｇの間、または約４μｇ、または約５μｇ、または約１０μｇとなる。２つ以上の血清群に由来する結合体が含まれる場合、これらは、実質的に等しい質量において存在し得、例えば、各血清群の糖の質量は、お互いの＋１０％内である。同じ比率の代わりに、２倍の質量の血清群Ａの糖を使用してもよい。従って、ワクチンは、１０μｇのＭｅｎＡの糖と、それぞれ５μｇのＭｅｎＣ、Ｗ１３５およびＹの糖を含むことができる。
【００９８】
好ましいキャリア蛋白質は、ジフテリア、破傷風毒素などの細菌毒素、またはトキソイド、或いはそれらの変異体である。これらは、結合体ワクチンにおいて一般的に使用される。ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素変異体は、特に好ましい［６４］。他の好適なキャリア蛋白質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜蛋白質複合体［６５］、合成ペプチド［６６、６７］、熱ショック蛋白質［６８、６９］、百日咳菌蛋白質［７０、７１］、サイトカイン［７２］、リンホカイン［７２］、ホルモン［７２］、成長因子［７２］、様々な病原菌由来抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工蛋白質［７３］、例えば、Ｎ１９［７４］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来の蛋白質Ｄ［７５乃至７７］、ニューモリシン［７８］またはその無毒の誘導体［７９］、肺炎球菌表面蛋白質ＰｓｐＡ［８０］、鉄取込蛋白質［８１］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素ＡまたはＢ［８２］、組換えＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｉｇｉｎｏｓａエキソプロテインＡ（ｒＥＰＡ）［８３］、などが挙げられる。単一のキャリア蛋白質は、複数の異なる血清群に由来する糖を有することができるが［８４］、このアレンジメントは好ましくない。組成物が２つ以上の髄膜炎菌血清群に由来する結合体を含む場合、様々な結合体は、異なるキャリア蛋白質を使用し得るか（例えば、一方の血清群はＣＲＭ１９７で、他方は破傷風トキソイドを使用するなど）、あるいは同じキャリア蛋白質を使用し得る（例えば、２つの血清群に由来する糖を別々にＣＲＭ１９７に結合体化させ、次いで組み合わせる）。
【００９９】
１：５（即ち、過剰な蛋白質）乃至５：１（即ち、過剰な糖）の間の糖：蛋白質比（ｗ／ｗ）、例えば、１：２乃至５：１の間の比率および１：１．２５乃至１：２．５の間の比率を有する結合体を用いることができる。参考文献８５に記載されているように、混合物における異なる髄膜炎菌血清群結合体は、異なる糖：蛋白質の比率を有することができ、例えば、あるものは１：２乃至１：５の間の比率を有することができ、別のものは５：１乃至１：１．９９の間の比率を有する。
【０１００】
キャリア分子は、直接またはリンカーを介して、共有結合によりグルカンに結合体化されていてもよい。例えばアジピン酸リンカーなどの様々なリンカーが公知であり、これは、（例えば、アミノ化によって糖に導入された）遊離−ＮＨ２基とアジピン酸とを（例えば、ジイミド活性化を用いて）カップリングさせ、次いで、得られた糖−アジピン酸中間体に蛋白質をカップリングさせることによって形成され得る［８６、８７］。別の好ましいタイプの結合は、カルボニルリンカーであり、これは、修飾グルカンの遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとを反応させ［８８、８９］、次いで蛋白質と反応させてカルバメート結合を形成することによって形成され得る。他のリンカーとしては、β−プロピオンアミド［９０］、ニトロフェニル−エチルアミン［９１］、ハロアシルハライド［９２］、グリコシド結合［９３］、６−アミノカプロン酸［９４］、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ：Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）［９５］、アジピン酸ジヒドラジドＡＤＨ［９６］、Ｃ４乃至Ｃ１２部分［９７］、などが挙げられる。カルボジイミド縮合も使用することができる［９８］。
【０１０１】
参考文献９９に記載されているように、混合物は、一方として糖／蛋白質の直接の結合を有する結合体と、他方としてリンカーを介した結合を有する結合体とを含むことができる。このアレンジメントは、特に、異なる髄膜炎菌血清群に由来する糖結合体を使用する場合に適用され、例えば、ＭｅｎＡの糖とＭｅｎＣの糖を、リンカーを介して結合体化してもよいし、あるいは、ＭｅｎＷ１３５の糖とＭｅｎＹの糖を、キャリア蛋白質に直接結合体化してもよい。
【０１０２】
組成物がＭｅｎＡ、Ｃ、Ｗ、および／またはＹ結合体のうちの１つ以上を含む場合、一部の実施態様では、これは、好都合にも、さらにＨｉｂ（Ｂ型Ｈａｍｅｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ莢膜糖）結合体をも含むことができる。組成物が、２つ以上の髄膜炎菌血清群に由来する糖を含む場合、血清群あたりの平均糖質量が存在する。それぞれ実質的に等しい質量の血清群が使用される場合、平均質量は、それぞれの個々の質量と同じとなるが、等しくない質量が用いられる場合は、その平均は異なり、例えば、ＭｅｎＡＣＷＹ混合物において１０：５：５：５μｇ量が使用される場合、平均質量は、血清群あたり６．２５μｇである。Ｈｉｂ糖も含まれる場合、一部の実施態様では、その質量は、血清群あたりの髄膜炎菌の糖の平均質量と実質的に同じとなる。一部の実施態様では、Ｈｉｂ糖の質量は、血清群あたりの髄膜炎菌の糖の平均質量よりも多くなる（例えば、少なくとも１．５倍）。一部の実施態様では、Ｈｉｂ糖の質量は、血清群あたりの髄膜炎菌の糖の平均質量よりも少なくなる（例えば、少なくとも１．５倍）［１００］。
【０１０３】
（ＨｍｂＲ提示のための非髄膜炎菌）
本発明の一部の実施態様では、髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原を、例えばＥ．ｃｏｌｉ菌によるなど非髄膜炎菌によって提示させる。
【０１０４】
即ち、本発明は、髄膜炎菌ＨｍｂＲを発現する非髄膜炎菌を提供する。この細菌は、通常グラム陰性菌である。これは、理想的にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ菌である。この菌は、異種ＨｍｂＲ抗原を構成的に発現することができ、または、ｈｍｂＲ遺伝子を誘導プロモータの制御下に置くことができる。
【０１０５】
この菌株は欠損Ｔｏｌ−Ｐａｌ系を有することがあり、その結果、正常な増殖中に自然に小胞を放出し、このため、界面活性剤抽出などの必要がなくなる。Ｅ．ｃｏｌｉのそのようなＴｏｌ−Ｐａｌ変異体については、例えば、参考文献１０１および１０２に開示されており、例えば、ｔｏｌＲノックアウトを有する、例えば、機能性ＴｏｌＲ蛋白質を発現しない菌株がある。
【０１０６】
また、本発明は、そのような非髄膜炎菌から調製される外膜小胞およびそのような非髄膜炎菌由来の小胞を作製する方法を提供する。
【０１０７】
（医薬組成物）
本発明を用いて患者に投与するための医薬組成物を調製することができる。これは、通常、医薬用として許容可能なキャリアを含むことになる。医薬用として許容可能なキャリアについての詳細な説明は、参考文献１０３において入手可能である。
【０１０８】
有効な投与容量は日常的に決定することができるが、この組成物の典型的なヒト用量は、例えば、筋肉内注射では約０．５ｍｌの容量を有する。ＲＩＶＭ  ＯＭＶベースのワクチンは、大腿部または上腕部への筋肉内注射により、０．５ｍｌ容量で投与された［１０４］。ＭｅＮＺＢＴＭは、大腿部の前外側または腕の三角筋部への筋肉内注射により、０．５ｍｌで投与される。同様の用量を、他の送達経路に使用してもよく、例えば、噴霧のための鼻腔内ＯＭＶベースのワクチンは、スプレーあたり約１００μｌまたは約１３０μｌの容量を有し得るので、約０．５ｍｌの全用量を与えるために４回のスプレーが施される。
【０１０９】
本発明の組成物のｐＨは、通常６乃至８の間であり、より好ましくは６．５乃至７．５の間（例えば、約７）である。ＲＩＶＭ  ＯＭＶベースのワクチンのｐＨは、７．４であり［１０５］、本発明の組成物にはｐＨ＜７．５が好ましい。ＲＩＶＭ  ＯＭＶベースのワクチンは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液を使用することによってｐＨを維持し、本発明の組成物における安定したｐＨは、緩衝液、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、またはヒスチジン緩衝液の使用により維持することができる。このため、本発明の組成物は、一般的に、緩衝液を含むことになる。
【０１１０】
この組成物は、滅菌および／または発熱物質不含とすることができる。本発明の組成物は、ヒトに対して等張性とすることができる。
【０１１１】
患者への投与のための本発明の組成物は、免疫原性であり、より好ましくはワクチン組成物である。本発明によるワクチンは、予防的（即ち、感染を予防するため）または治療的（即ち、感染を処置するため）のいずれかとすることができるが、通常は、予防的である。ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の抗原（単数または複数）、並びに必要に応じて、任意の他の成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、単一用量または一連の用量の一部のいずれかでその量を個体に投与することが、処置または予防のために有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康状態および身体的状態、年齢、処置される個体の分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫システムの能力、所望される防御の度合い、ワクチンの処方、医学的状態に関する処置医の評価、および他の関連要因に応じて変わる。この量は、日常的な試験によって決定することができる比較的広い範囲に入ると予測される。本発明の組成物の抗原含有量は、一般的に、１用量あたりの蛋白質の量として表される。ＯＭＶベースの鼻腔内ワクチンの場合、１ｍｌあたり蛋白質約０．９ｍｇの用量が標準的である。
【０１１２】
本発明の組成物は免疫アジュバントを含むことができる。即ち、例えば、これは、アルミニウム塩アジュバントまたは水中油エマルジョン（例えば、水中スクワレンエマルジョン）を含むことができる。好適なアルミニウム塩としては、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、（例えば、参考文献１０６の第８および９章参照）、またはこれらの混合物が挙げられる。これらの塩は任意の適当な形態（例えば、ゲル、結晶性、非晶質など）をとることができ、抗原がこうした塩に吸着することが好ましい。患者に投与するための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは、５ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどである。好ましい範囲は、０．３乃至１ｍｇ／ｍｌである。最大０．８５ｍｇ／用量が好ましい。水酸化アルミニウムアジュバントは髄膜炎菌ワクチンに使用するのに特に適している。
【０１１３】
髄膜炎菌は生体の種々の部位を侵すので、本発明の組成物は各種の液状形態として調製することができる。例えば、この組成物は溶液または懸濁物としての注射剤として調製することができる。この組成物は、例えば細かいスプレーを用いた吸入器による肺内投与用に調製することができる。この組成物は、例えばスプレーまたは滴剤として鼻腔内、耳内または眼内投与用に調製することができる。筋肉内投与用注射剤が標準的である。
【０１１４】
本発明の組成物は、特に複数回用量方式においてパッケージングされる場合に、抗菌剤を含んでいてもよい。チオメルサールおよび２−フェノキシエタノールなどの抗菌薬が、一般的にワクチン中に見出されるが、水銀不含の防腐剤を使用するかまたは全く防腐剤を使用しないかのいずれかが好ましい。
【０１１５】
本発明の組成物は、界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０などのＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含んでいてもよい。界面活性剤は、一般的には、低レベル、例えば０．０１％未満で存在させる。
【０１１６】
本発明の組成物は、ＯＭＶ調製物からの残存界面活性剤（例えば、デオキシコール酸塩）を含んでいてもよい。残存界面活性剤の量は、ＭｅｎＢ蛋白質１μｇ当たり０．４μｇ未満が好ましい（０．２μｇ未満がより好ましい）。
【０１１７】
本発明の組成物がＬＯＳを含む場合、ＬＯＳの量は、蛋白質１μｇ当たり０．１２μｇ未満が好ましい（０．０５μｇ未満がより好ましい）。
【０１１８】
本発明の組成物は、張度を得るためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含んでいてもよい。ＮａＣｌの濃度は１０±２ｍｇ／ｍｌが標準的であり、例えば、約９ｍｇ／ｍｌである。
【０１１９】
（処置方法）
また、本発明は、哺乳動物において免疫反応を惹起するための方法であって、この哺乳動物に本発明の組成物を投与することを含む、方法を提供する。この免疫反応は、好ましくは防御的であり、好ましくは抗体を伴う。この方法は、既にＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対して初回免疫されている患者において、追加免疫反応を引き起こすことができる。
【０１２０】
この哺乳動物は、好ましくはヒトである。このワクチンが予防的用途のものである場合、ヒトは、好ましくは小児（例えば、幼児または乳児）または十代の若者であり、このワクチンが治療用途のものである場合、ヒトは好ましくは成人である。小児を対象としたワクチンは、例えば安全性、投与量、免疫原性などを評価するために、成人に投与することもできる。
【０１２１】
また、本発明は、医薬品としての使用のための本発明の組成物を提供する。この医薬品は、好ましくは、哺乳動物において免疫反応を惹起するために用い（即ち、これは免疫原性組成物である）、更に好ましくはワクチンである。
【０１２２】
また、本発明は、哺乳動物において免疫反応を惹起するための医薬品の製造における、本発明の組成物の使用も提供する。また、本発明は、哺乳動物において免疫反応を惹起するための医薬品の製造における、（ｉ）髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原および（ｉｉ）髄膜炎菌外膜小胞の使用も提供する。また、本発明は、哺乳動物において免疫反応を惹起するための医薬品の製造における、（ｉ）髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原および（ｉｉ）以下の髄膜炎菌抗原：ｆＨＢＰ、２８７、ＮａｄＡ、ＮｓｐＡ、ＮｈｈＡ、Ａｐｐ、Ｏｍｐ８５、ＬＯＳのうちの１つ以上の使用を提供する。また、本発明は、哺乳動物において免疫反応を惹起するための医薬品の製造における、（ｉ）髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原および（ｉｉ）髄膜炎菌莢膜糖の結合体化糖の使用を提供する。
【０１２３】
これらの使用および方法は、好ましくは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓが原因の疾患、例えば細菌性（または、より詳細には髄膜炎菌性）髄膜炎、または敗血症の予防および／または処置のためのものである。
【０１２４】
治療処置の効力を確認する方法の１つは、本発明の組成物の投与後のナイセリア感染症のモニタリングを含む。予防的処置の効力を確認する方法の１つは、この組成物の投与後の抗原に対する免疫反応のモニタリングを含む。本発明の組成物の免疫原性は、それらを試験被験体（例えば、１２乃至１６ヶ月齢の小児または動物モデル［１０７］）に投与し、次いで血清殺菌抗体（ＳＢＡ：ｓｅｒｕｍ  ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）およびＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）を含む標準的パラメータを測定することにより、求めることができる。こうした免疫反応は、一般的に、この組成物の投与の約４週間後に測定し、この組成物の投与前に測定した値と比較する。少なくとも４倍または８倍のＳＢＡ上昇が好ましい。２用量以上の組成物を投与する場合、投与後の測定を２回以上行うことができる。
【０１２５】
一般的に、本発明の組成物は、被験体に投与された後、血清殺菌抗体反応を誘導することができる。こうした反応は、マウスにおいて好都合に測定されるものであり、ワクチン効力の標準的指標である。血清殺菌活性（ＳＢＡ：ｓｅｒｕｍ  ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、補体によって媒介される細菌死滅を評価するものであり、ヒトの補体またはウサギ乳仔の補体を用いてアッセイすることができる。ＷＨＯ基準は、ワクチンが、９０％より多くのレシピエントにおいて、少なくとも４倍のＳＢＡ上昇を誘導することを要求している。ＭｅＮＺＢＴＭは、第３の用量の投与の４乃至６週間後に、ＳＢＡにおいて４倍の上昇を惹起する。
【０１２６】
好ましい組成物は、ヒト被験体患者において、満足のいく割合の被験体に対して血清防御の基準より優れた抗体力価をもたらすことができる。その力価より上では宿主が抗原に対して血清変換されると考えられる、関連抗体力価を有する抗原は周知であり、そのような力価は、ＷＨＯなどの機関により公開されている。被験体の統計学的に有意なサンプルの８０％超、より好ましくは９０％超、さらにより好ましくは９３％超、最も好ましくは９６乃至１００％が血清変換されることが好ましい。
【０１２７】
本発明の組成物は、一般的に、患者に直接投与されることになる。直接的送達は、非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、または組織の間質腔へ）により、または任意の他の好適な経路により遂行することができる。本発明を用いて全身性免疫および／または粘膜性免疫を惹起することができる。大腿部または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は、針（例えば、皮下針）を介することができるが、代わりに無針注射を用いてもよい。標準的な筋肉内用量は０．５ｍｌである。
【０１２８】
投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールとすることができる。複数回用量は、初回免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールにおいて用いることができる。初回免疫用量スケジュールに続いて、追加免疫用量スケジュールを実施することができる。初回免疫投薬間（例えば、４乃至１６週間）、および初回免疫と追加免疫との間の好適なタイミングは、日常的に決定することができる。ＯＭＶベースのＲＩＶＭワクチンは、０．２、および８ヶ月あるいは０、１、２、および８ヶ月でのワクチン接種による３用量または４用量の初回免疫スケジュールを用いて試験した。６週間の間隔で、３用量としてＭｅＮＺＢＴＭを投与する。
【０１２９】
本発明の組成物を用いて髄膜炎菌の２以上の高毒性系統に対する殺菌抗体反応を誘導することができる。特に、これは、以下の３つの高毒性系統：（ｉ）クラスターＡ４、（ｉｉ）ＥＴ５複合体、および（ｉｉｉ）系統３、のうちの２または３つに対して殺菌反応を誘導することができることが好ましい。さらに、これは、高毒性系統のサブグループＩ、サブグループＩＩＩ、サブグループＩＶ−１、またはＥＴ−３７複合体のうちの１つ以上に対する殺菌抗体反応、並びに他の系統、例えば高侵襲性系統、に対する殺菌抗体反応を誘導することができる。これは、この組成物がこれら高毒性系統内の髄膜炎菌のそれぞれおよびすべての菌株に対して殺菌抗体を誘導することができることを必ずしも意味するものではなく、この組成物によって誘導される抗体は、例えば、特定の高毒性系統のうちの４つ以上の髄膜炎菌株の任意の所与の群に対し、この群の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上）に対して殺菌性である。好ましい群の菌株としては、以下の国：ＧＢ、ＡＵ、ＣＡ、ＮＯ、ＩＴ、ＵＳ、ＮＺ、ＮＬ、ＢＲおよびＣＵのうちの少なくとも４ヶ国において単離された菌株が挙げられる。上記血清は、好ましくは、少なくとも１０２４（例えば、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８またはそれ以上、好ましくは、少なくとも２１４）の殺菌力価を有し、例えば、この血清は、１／１０２４に希釈された場合、特定の菌株の試験細菌の少なくとも５０％を殺すことができる。
【０１３０】
有用な組成物は、血清群Ｂの髄膜炎菌の以下の菌株：（ｉ）クラスターＡ４由来の菌株９６１−５９４５（Ｂ：２ｂ：Ｐ１．２１，１６）および／または菌株Ｇ２１３６（Ｂ：−）；（ｉｉ）ＥＴ−５複合体由来の菌株ＭＣ５８（Ｂ１５：Ｐ１．７，１６ｂ）および／または菌株４４／７６（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６）；（ｉｉｉ）系統３由来の菌株３９４／９８（Ｂ：４：Ｐ１．４）および／または菌株ＢＺ１９８（Ｂ：ＮＴ：−）、に対して殺菌反応を誘導することができる。より好ましい組成物は、菌株９６１−５９４５、菌株４４／７６、および菌株３９４／９８に対する殺菌反応を誘導することができる。
【０１３１】
菌株９６１−５９４５および菌株Ｇ２１３６は、両方ともＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ＭＬＳＴ参考株である［参考文献１０８のｉｄ  ６３８および１００２］。菌株ＭＣ５８は広く入手可能であり（例えば、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−３３５）、参考文献１０９において配列決定された菌株であった。菌株４４／７６は広く用いられ、特徴付けられており（例えば、参考文献１１０）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ＭＬＳＴ参考株の１つである［参考文献１０８のｉｄ  ２３７；参考文献１５の表２の３２行］。菌株３９４／９８は、もともとは１９９８年にニュージーランドにおいて単離されたものであり、この菌株を使用したいくつかの研究が公表されている（例えば、参考文献１１１および１１２）。菌株ＢＺ１９８は、別のＭＬＳＴ参考株である（参考文献１０８のｉｄ  ４０９；参考文献１５の表２の４１行）。
【０１３２】
（更なる抗原性成分）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来する抗原を含むことに加えて、組成物は、更なる病原菌に由来する抗原を含んでいてもよい。例えば、この組成物は、以下の更なる抗原のうちの１つ以上を含むことができる：
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する抗原、例えば、糖（通常、結合体）
−表面抗原ＨＢｓＡｇなどのＢ型肝炎ウイルス由来の抗原、
−Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに由来する抗原、例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに由来する百日咳ホロ毒素（ＰＴ：ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）および糸状性赤血球凝集素（ＦＨＡ：ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、また、任意選択的に、ペルタクチン並びに／或いは凝集原２および凝集原３との組み合わせ、
−ジフテリアトキソイドなどのジフテリア抗原、
−破傷風トキソイドなどの破傷風抗原、
−通常、結合体化された、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ（Ｈｉｂ：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ）に由来する糖抗原、並びに
−不活化されたポリオウイルス抗原。
【０１３３】
ジフテリア抗原がこの組成物中に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原も含まれることが好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原も含まれることが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原も含まれることが好ましい。従って、ＤＴＰの組み合わせが好ましい。
【０１３４】
Ｈｉｂ糖が含まれる場合（通常、結合体として）、この糖部分は、多糖（例えば、細菌から精製されるような完全長ポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ：ｐｏｌｙｒｉｂｏｓｙｌｒｉｂｉｔｏｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ））であってもよいが、精製された糖を断片化して、例えば加水分解によって、オリゴ糖（例えば、ＭＷは約１乃至約５ｋＤａ）とすることも可能である。組成物中のＨｉｂ結合体の濃度は、通常、０．５μｇ乃至５０μｇ、例えば、１乃至２０μｇ、１０乃至１５μｇ、１２乃至１６μｇ、などの範囲となる。この量は、約１５ｇまたは、一部の実施態様では約１２．５μｇとすることができる。５μｇ未満の質量を、好適とすることができ［１１３］、例えば、１乃至５μｇの範囲、２乃至４μｇの範囲、または約２．５μｇとすることができる。上記のように、Ｈｉｂ糖および髄膜炎菌の糖を含む組み合わせでは、前者の用量は、後者の用量に基づいて選択することができる（特に、複数の髄膜炎菌血清群の場合、それらの平均質量による）。Ｈｉｂ結合体のさらなる特性は、キャリア蛋白質の選択（例えば、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイド）、結合、比率などを含め、髄膜炎菌性結合体に対して上記において開示した通りである。
【０１３５】
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原が含まれる場合、これは、ポリペプチドまたは糖であってもよい。結合体莢膜糖は、肺炎球菌に対して免疫するために特に有用である。この糖は、細菌からのこの糖の精製の際に生じるサイズを有する多糖であってもよく、またはそのような多糖の断片化により得られるオリゴ糖であってもよい。７価のＰＲＥＶＮＡＲＴＭ製品では、例えば、６つの糖は完全な状態の多糖として与えられ、残りの１つ（１８Ｃ血清型）は、オリゴ糖として与えられる。組成物は、以下の肺炎球菌の血清型のうちの１つ以上に由来する莢膜糖を含むことができる：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび／または３３Ｆ。組成物は、複数の血清型、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３またはそれ以上の血清型を含むことができる。７価、９価、１０価、１１価および１３価の結合体の組み合わせは、２３価の結合体化されていない組み合わせと同様に、当技術分野において既に公知である。例えば、１０価の組み合わせは、血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する糖を含むことができる。１１価の組み合わせは、さらに、血清型３に由来する糖を含むことができる。１２価の組み合わせは、１０価の混合物に、血清型６Ａおよび１９Ａ、６Ａおよび２２Ｆ、１９Ａおよび２２Ｆ、６Ａおよび１５Ｂ、１９Ａおよび１５Ｂ、ｒ２２Ｆおよび１５Ｂを加えることができる。１３価の組み合わせは、１１価の混合物に、血清型１９Ａおよび２２Ｆ、８および１２Ｆ、８および１５Ｂ、８および１９Ａ、８および２２Ｆ、１２Ｆおよび１５Ｂ、１２Ｆおよび１９Ａ、１２Ｆおよび２２Ｆ、１５Ｂおよび１９Ａ、１５Ｂおよび２２Ｆ、などを加えることができる。肺炎球菌結合体のさらなる特性は、キャリア蛋白質の選択（例えば、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイド）、結合、比率などを含め、髄膜炎菌性結合体に対して上記において開示した通りである。組成物が２つ以上の結合体を含む場合、各結合体は、同じキャリア蛋白質を使用してもよいし、または異なるキャリア蛋白質を使用してもよい。参考文献１１４に、多価性肺炎球菌結合体ワクチンにおいて異なるキャリア蛋白質を使用する場合の考えられる利点が記載されている。
【０１３６】
（一般論）
本発明の実施においては、特に示さない限り、当該分野の技術の範囲内にある、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来方法を用いる。このような技術については、文献で十分に説明されている。例えば、参考文献１１５乃至１２１等を参照されたい。
【０１３７】
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、排他的にＸから成り得るか、または何かの追加、例えば、Ｘ＋Ｙ、を含み得る。
【０１３８】
数値ｘとの関連において、用語「約」は任意であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１３９】
本発明が「エピトープ」に関する場合、このエピトープはＢ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープとすることができるが、通常はＢ細胞エピトープとなる。このようなエピトープは、実験的に（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ［１２２、１２３］または同様の方法を使用して）特定することができるか、或いは、（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数［１２４］、マトリックスをベースとするアプローチ［１２５］、ＭＡＰＩＴＯＰＥ  ［１２６］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［１２７、１２８］、神経ネットワーク（ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ）［１２９］、ＯｐｔｉＭｅｒ  ＆  ＥｐｉＭｅｒ［１３０、１３１］、ＡＤＥＰＴ［１３２］、Ｔｓｉｔｅｓ［１３３］、親油性［１３４］、抗原性指数［１３５］、または参考文献１３６乃至１４０に開示されている方法などを使用して）推定することができる。エピトープは、抗体またはＴ細胞受容体の抗原結合部位によって認識され、これに結合する抗原の一部分であり、これは「抗原決定基」と呼ばれることもある。
【０１４０】
本発明が「精製」抗原を用いる場合、この抗原は自然環境から分離される。例えば、この抗原は、存在するその他の精製抗原以外の他の髄膜炎菌成分を実質的に含んでいないことになる。精製抗原の混合物は、通常、２つの抗原が自然界では混合状態で存在していても、各抗原を別々に精製し、次いでこれらを再び組み合わせることで調製することになる。
【０１４１】
２つのアミノ酸配列の間の配列同一性パーセントに言及することは、アラインメントされたときに、そのパーセンテージのアミノ酸が、その２つの配列を比較して同じであることを意味する。このアラインメントおよび相同性パーセントまたは配列同一性パーセントは、当該分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、参考文献１４１の７．７．１８節に記載されているものを使用して決定することができる。好ましいアラインメントは、ギャップオープンペナルティを１２、ギャップ伸長ペナルティを２、ＢＬＯＳＵＭマトリクスを６２とするアフィン・ギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。このＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献１４２に開示されている。
【０１４２】
語句「実質的に」は、「完全に」を排除するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない場合もある。必要に応じて、語句「実質的に」は、本発明の定義から省略される場合がある。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】図１は、デスフェラールの存在（正方形）または非存在（菱形）下におけるＭＣ５８（図１Ａ）またはＭ１２３９１（図１Ｂ）の培養物の増殖曲線（分単位の培養時間に対するＯＤ）を示す。
【図２】図２は、抗ＨｍｂＲ血清を用いたウェスタンブロットを示す。４つのレーンは、左から右へ、ＭＣ５８、デスフェラール−；ＭＣ５８、デスフェラール＋；Ｍ１２３９、デスフェラール−；Ｍ１２３９、デスフェラール＋である。矢印はＨｍｂＲを示す。
【図３】図３は、図２と同じであるが、血清は抗Ｔｂｐ２血清である。矢印はＴｂｐ２を示す。
【図４】図４は、ＭＣ５８のＦＡＣＳ分析を示す。３つの列は種々の標識抗体についてであり、左から右へ、免疫前；抗ＨｍｂＲ−２；抗Ｔｂｐ２である。２つの行はデスフェラールの非存在（上段）または存在（下段）下における細菌の増殖に関するものである。
【図５】図５は、図４と同じであるが、菌株Ｍ１２３９に関するものである。
【図６】図６は、（１および８）野生型ＭＣ５８；（２）内因性ｈｍｂＲ遺伝子をノックアウトしたＭＣ５８；（３乃至７）０、０．００１、０．０１、０．１または１ｍＭのＩＰＴＧを用いたＩＰＴＧ誘導プロモータにより制御される外因性ｈｍｂＲ遺伝子を有する上記ノックアウト菌株；（９）デスフェラールを用いて増殖させた野生型ＭＣ５８；および（１０）野生型ＮＺ菌株、におけるＨｍｂＲ発現を示すウェスタンブロットである。
【図７】図７は、ＧＢ０１３菌株におけるＨｍｂＲ発現を示すウェスタンブロットである。ｗｔ＝野生型ＧＢ０１３、ｋ／ｏ＝ＧＢ０１３ΔｈｍｂＲ、ｃ＝ＧＢ０１３ΔｈｍｂＲ−ｃｈｍｂＲ。各菌株とも０．５または１μｇの蛋白質を分析した。
【図８】図８は、各種菌株由来の外膜物質のウェスタンブロットである。レーン１乃至３は、種々に希釈した組換えＨｍｂＲ−２を含む。レーン５は、異種の髄膜炎菌ｈｍｂＲ遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１株である。レーン１２は補完ＧＢ０１３株である。他のレーンは対照である。
【図９】図９は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１の菌株の自己誘導増殖後に得られた画分のウェスタンブロットである。レーン２乃至６はΔｔｏｌＲ株に関するものであり、レーン８乃至１２はＤＥ３＊株に関するものである。レーン４、６、９および１０はＨｍｂＲの強いバンドを示す。
【図１０】図１０は、Ｅ．ｃｏｌｉのΔｔｏｌＲ株におけるＨｍｂＲ発現のＦＡＣＳ分析を示す。ＨｍｂＲ発現株に由来するピークは右側にある。
【図１１】図１１は、各種菌株由来の小胞のウェスタンブロットである。レーン１乃至３は種々に希釈した組換えＨｍｂＲ−２を含む。レーン５、７および９は、漸減希釈した、ＨｍｂＲを発現するＥ．ｃｏｌｉのΔｔｏｌＲ株からのものである。レーン１１および１２はＴｏｌＲ修飾なしのＢＬ２１株からのものである。
【発明を実施するための形態】
【０１４４】
（発明を実施するための様式）
多くの髄膜炎菌単離株はｈｍｂＲ遺伝子を有しない。さらに、ｈｍｂＲ＋菌株の遺伝子発現は、ＤＮＡレベルの可逆性変化の結果としてのオンの相（ｏｎ  ｐｈａｓｅ）とオフの相（ｏｆｆ  ｐｈａｓｅ）との間の遺伝子発現の変動である、相変動を起こしやすい［１４３］。相変動は多くの病原菌における表面露出性毒性因子の発現を制御する共通の機構である。
【０１４５】
このｈｍｂＲ遺伝子は系統ＩＩＩ菌株のパネルにおいて１２株のうち１０株で検出されている。１０株全てにおいて、この遺伝子はＭＣ５８菌株で保存されていた。
【０１４６】
ｈｍｂＲ遺伝子はＮＺ０５／３３株からクローニングした。リーダーペプチドを含むコード配列は、７９１アミノ酸ポリペプチド（配列番号１９）をコードしている２，３７３ｂｐおよびストップ（配列番号１８）である。この配列のいくつかの誘導体が作製されて以下が発現された：（ｉ）Ｃ末端ポリヒスチジンタグに融合させた、配列番号１９の２４乃至１７０番目アミノ酸（即ち、配列番号２０）を有する「ＨｍｂＲ−プラグ」；（ｉｉ）Ｃ末端ポリヒスチジンタグに融合させた、配列番号１９の１７１乃至７９１番目のアミノ酸（即ち、配列番号２１）を有する「ＨｍｂＲ−ダウン」；（ｉｉｉ）Ｃ末端ポリヒスチジンタグに融合させ、リーダーペプチドを除外した、配列番号１９の２４乃至７９１番目のアミノ酸（即ち、配列番号２２）を有する「ＨｍｂＲ−２」；および（ｉｖ）Ｃ末端ポリヒスチジンタグに融合させた、配列番号１９の１乃至７９１番目のアミノ酸を有する「ＨｍｂＲ−３」。
【０１４７】
これらのポリペプチドをコードしているベクターをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１細胞に形質転換して発現させた。発現したポリペプチドを精製し、マウスを免疫化するのに使用した。ＨｍｂＲ−プラグは可溶性で、ＭＷは１６ｋＤａであった。ＨｍｂＲ−ダウン（６８ｋＤａ）は、不溶性であったが、免疫化のために８Ｍ尿素で可溶化することができた。ＨｍｂＲ−２（８５ｋＤａ）は、不溶性であったが、免疫化のために２Ｍ尿素で可溶化することができた。これら３つの精製ポリペプチドを用いてＦｒｅｕｎｄの完全アジュバント（ＦＣＡ）と組み合わせてマウスを免疫化し、免疫血清をＳＢＡによって試験した。ＨｍｂＲ−プラグとＨｍｂＲ−ダウンとの混合物もこのようにして試験した。
【０１４８】
ＨｍｂＲポリペプチドはいずれもマウスにおいて殺菌抗体を誘導することができなかった（ＳＢＡ力価は全て＜１６）。さらに、上記血清では同種菌株ＮＺ０５／３３においてＨｍｂＲの表面露出を検出できなかった（ＦＡＣＳアッセイ）。しかしながら、蛋白質抽出物では、この血清は、（Ｍ０１−２４０１４９を除く）ｈｍｂＲ＋株において蛋白質を検出することができた。
【０１４９】
ＳＢＡ活性が無いにもかかわらず、更なる実験を行った。２５μＭのデスフェラールを存在させることで細菌の鉄利用度を制限して増殖させた細菌に対して、抗ＨｍｂＲ抗血清を試験した。２つの菌株、即ち、ｈｍｂＲ＋株（ＭＣ５８）およびｈｍｂＲ−株（Ｍ１２３９）を増殖させた。これらの菌株はデスフェラールの存在下では増殖が極めてよくなかった（図１Ａおよび１Ｂ）。
【０１５０】
ウェスタンブロットおよびＦＡＣＳ分析を行って発現を評価した。比較のために、Ｔｂｐ２を陽性対照として用いた。というのは、これまでに、この蛋白質の発現は低鉄状態で誘導されると報告されていたからである。
【０１５１】
ウェスタンブロット分析から、ＭＣ５８におけるＨｍｂＲの発現は低鉄状態で増加するが、Ｍ１２３９ではいずれの状態でもみられないことが分かった（図２）。これに対して、Ｔｂｐ２は、低鉄状態でいずれの菌株によっても発現された（図３）。ＦＡＣＳ分析では、免疫接近可能なＨｍｂＲの発現はＭＣ５８では低鉄状態で増加した（図４）が、Ｍ１２３９ではそうではなかった（図５）。
【０１５２】
上記に報告したＳＢＡの結果と対照的に、低鉄状態で増殖する菌株に対して血清を試験したところ、殺菌力価の増加がみられた。この抗ＨｍｂＲ血清を、デスフェラールの非存在（ＯＤ  ０．２５における細菌）または存在（ＯＤ  ０．１６における細菌）下で増殖させたＭＣ５８に対して試験したところ、力価は陽性対照の殺菌性抗血清に比べて以下の通りであった。
【０１５３】
【表１】
2012512240.tif 000006
更なる実験から、上記種々のＨｍｂＲ誘導体（またはそれらの組合せ）に対する血清は、デスフェラール不含培地で増殖させた場合のＭＣ５８株に対する殺菌活性を示さないが、２５μＭデスフェラールの存在下で増殖させたＭＣ５８に対してはある程度の殺菌活性を示すことが確認された。デスフェラール増殖細菌に対するバックグラウンドを超える力価は、ＨｍｂＲ−２に対する血清を用いて認められた。
【０１５４】
これらの実験は、抗ＨｍｂＲ抗体が髄膜炎菌に対して殺菌性であり得るという最初の報告である。従って、これまでの報告とは対照的に、抗ＨｍｂＲ抗体は、髄膜炎菌による感染および疾患に対して、特に、ＨｍｂＲが細菌表面に発現される増殖相において、実際に予防の役割を果たすことができる。従って、ＨｍｂＲは、髄膜炎菌ワクチンにおいて、特に、１つ以上の更なる髄膜炎菌抗原と組み合わせて使用する場合に、有用であるとすることができる。操作された細菌においてその相変動性が除去されることによってＨｍｂＲ＋小胞が容易に調製できる菌株が得られる。
【０１５５】
デスフェラールを用いずにＨｍｂＲの発現を増加させる他の方法が試みられた。ヒトヘモグロビン存在下で増殖させるとＨｍｂＲ発現が増加する可能性があり［１４３］、Ｆｕｒリプレッサを発現しないｆｕｒ変異体も最大量のＨｍｂＲを発現する可能性がある。これらの２つの状況におけるＨｍｂＲ発現のレベルを測定し、ＳＢＡも行った。
【０１５６】
４μＭのヒトヘモグロビンの存在下で増殖させても、デスフェラールを使用した際にみられるレベルを超えてＨｍｂＲ発現のレベルを向上することはなかった。従って、抗ＨｍｂＲ血清でのＳＢＡ力価は低かった。
【０１５７】
ｆｕｒ変異体は、良好なレベルのＨｍｂＲ発現を示したが、この菌株は、血清なしに補体により殺されるのでＳＢＡに用いることができなかった。
【０１５８】
また、鉄キレート剤を用いた２つの連続する培養工程ではＭＣ５８についてのＳＢＡ力価は改善しなかった。ＮＺ株ではわずかな増加が見られたが、この増加は（少なくとも部分的に）このアッセイの洗浄工程によるものであり得る。この工程は、時としてこの細菌を弱体化させることがある。
【０１５９】
全体として、これらの結果はＨｍｂＲ発現の高レベルと殺菌の高レベルとの相関関係を裏付けるものである。
【０１６０】
さらなる実験では、ＭＣ５８株を操作してその内因性ｈｍｂＲ遺伝子を除去した。このノックアウトした遺伝子は、ＩＰＴＧ誘導プロモータによって制御される外因性ｈｍｂＲ遺伝子によって補完した。図５から、この操作した菌株が野生型菌株よりもずっと高いレベルのＨｍｂＲを発現することができたことが分かる：例えば、レーン６および７。また、ＦＡＣＳを利用し、ＨｍｂＲ−２、ＨｍｂＲ−ダウンおよびＨｍｂＲ−プラグに対する血清を用いて表面発現を検討した。このＦＡＣＳによる実験から、野生型菌株の表面の発現は極めて低いこと、ノックアウト菌株の表面の発現はみられないこと、ＩＰＴＧなしに増殖させたノックアウト菌株の表面の発現はみられないが、ＩＰＴＧ誘導後の発現は良好であることが確認された。同様な高レベルは０．１および１ｍＭのＩＰＴＧ誘導でみられた。
【０１６１】
これらの菌株に対するＳＢＡ実験から、ＨｍｂＲの発現および表面露出が高いと、菌株はさらに補体に対して感受性になることが分かった。高ＩＰＴＧレベルでは、細菌は補体単独によって殺された（ウサギまたはヒト）が、ＩＰＴＧは野生型菌株には影響を示さなかった。実験から、ＨｍｂＲ高発現菌株は補体単独に結合し、この結合は用いた抗血清に依存しないことが分かった。
【０１６２】
また、ノックアウトおよび高発現菌株は、バックグラウンドとしてＧＢ０１３株を用いても得られ、ノックアウト菌株（ＧＢ０１３ΔｈｍｂＲ）および補完された菌株（ＧＢ０１３ΔｈｍｂＲ−ｃｈｍｂＲ）が得られた。補完遺伝子はＮＺ株由来のものとした。これらのＧＢ０１３をベースとした菌株は、発現、ＦＡＣＳおよびＳＢＡについてＭＣ５８をベースとした菌株と同様の結果を示した。
【０１６３】
全体として、上記データから、ウサギ／ヒト補体の存在下で、細菌により忍容され得るＨｍｂＲ発現の臨界閾値が存在することが示唆される。
【０１６４】
ＯＭＶはＧＢ０１３ベース株から調製した。図７は、抗ＨｍｂＲ−２ポリクロナール血清を用いた上記３つの菌株からのＯＭＶのウェスタンブロットを示したものである。ＯＭＶ調製物中の蛋白質濃度は０．２７２ｍｇ／ｍｌ（ｗｔ）、０．５０４ｍｇ／ｍｌ（ΔｈｍｂＲ）および０．４５７ｍｇ／ｍｌ（補完型）であった。野生型バックグラウンド菌株に比してＨｍｂＲの高発現が図７で明らかである。
【０１６５】
更なる研究において、Ｅ．ｃｏｌｉ株を操作してＮＺ株由来の髄膜炎菌ＨｍｂＲを発現させた。ＢＬ２１株（ＢＬ２１ＤＥ３＊）をｐＥＴ２１ｂ  ｈｍｂＲで形質転換した。ウェスタンブロットによってこの菌株がＨｍｂＲを発現することが確認された（例えば、図８のレーン５）。また、Ｅ．ｃｏｌｉのΔｔｏｌＲ株［１０１、１０２］をｐＥＴ２１ｂ  ｈｍｂＲで形質転換して、増殖中にＨｍｂＲ含有小胞を放出する菌株を得た（例えば、図９のレーン４および６）。ＦＡＣＳによっていずれの菌株においてもＨｍｂＲの発現が確認された。例えば、ΔｔｏｌＲ株についての図１０参照。ΔｔｏｌＲ株から調製した小胞はＨｍｂＲを含有することが確認された（例えば、図１１のレーン５）。
【０１６６】
髄膜炎菌ＧＢ０１３株およびＥ．ｃｏｌｉ株由来のＯＭＶは免疫化に用いられる。
【０１６７】
本発明を、単に例示目的で上に説明しており、本発明の範囲および精神の範囲内に留まりながら変更を加えることができることは理解される。
【０１６８】
（参考文献）
【０１６９】
【数１】
2012512240.tif 000007
【０１７０】
【数２】
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【０１７１】
【数３】
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【０１７２】
【数４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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