(57)【要約】  本発明は、アンチセンス鎖とセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡであって、前記アンチセンス鎖の全部または一部がアンチセンス二重鎖領域を含み、前記センス鎖の全部または一部がセンス二重鎖領域を含み、前記アンチセンス二重鎖領域が前記センス二重鎖領域と少なくとも部分的に相補的であり、前記ｓｉＲＮＡが前記アンチセンス二重鎖領域と前記センス二重鎖領域とからなる二重鎖領域を含み、ａ）前記アンチセンス鎖が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６８、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のヌクレオチド配列を含むか、またはｂ）前記アンチセンス鎖が、全部もしくは一部が配列番号１もしくは７０の一部と相補的であるアンチセンス二重鎖領域を含むｓｉＲＮＡに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンチセンス鎖とセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡであって、前記アンチセンス鎖の全部または一部がアンチセンス二重鎖領域を含み、前記センス鎖の全部または一部がセンス二重鎖領域を含み、前記アンチセンス二重鎖領域が前記センス二重鎖領域と少なくとも部分的に相補的であり、前記ｓｉＲＮＡが前記アンチセンス二重鎖領域と前記センス二重鎖領域とからなる二重鎖領域を含み、
ａ）前記アンチセンス鎖が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６８、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のヌクレオチド配列を含むか、または
ｂ）前記アンチセンス鎖が、全部または一部が配列番号１または７０の一部と相補的であるアンチセンス二重鎖領域を含むｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
前記センス鎖が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、または１０３のヌクレオチド配列を含む請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
前記アンチセンス鎖および前記センス鎖が、各々、１９〜２５ヌクレオチドの長さである請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
前記二重鎖領域が、１９〜２５ヌクレオチドである請求項３に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項５】
前記二重鎖領域が、１９〜２５の連続ヌクレオチド塩基対からなる請求項４に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
ａ）両方の末端が平滑末端であるか、
ｂ）一方の末端において突出を有し、他方の末端において平滑末端を有するか、または
ｃ）両方の末端において突出を有する
請求項１、２、３、４、または５に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項７】
前記センス鎖および／または前記アンチセンス鎖の１個以上の一つおきのヌクレオチドが修飾されている請求項１、２、３、４、または５に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項８】
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の両方の前記一つおきのヌクレオチドが、２’位においてＯ−メチル基により修飾されている請求項７に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項９】
奇数番号を付した前記ヌクレオチドのそれぞれが前記アンチセンス鎖にて修飾され、偶数番号を付した前記ヌクレオチドのそれぞれが前記センス鎖にて修飾されている請求項８に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のｓｉＲＮＡと、リポソームとを含む、リポプレックス。
【請求項１１】
前記リポソームが、
ａ）約５０モル％のβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド、好ましくは、β−（Ｌ−アルギニル）−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドと、
ｂ）約４８〜４９モル％の１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）と、
ｃ）約１〜２モル％の１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリエチレングリコール、好ましくは、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩と
からなる請求項１０に記載のリポプレックス。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれかに記載の核酸を含むかまたはコードするベクター。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸またはベクターを含む細胞であって、ヒト細胞である場合には、前記ヒト細胞が単離細胞であることを条件とする細胞。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれかに記載のｓｉＲＮＡと、生理学的に許容可能な賦形剤とを含む組成物。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ分子を含む治療有効量の組成物を対象に投与するステップを含む炎症性疾患を治療する方法。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ分子を含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む、ヒトの疾患または病理学的状態を治療する方法。
【請求項１７】
医薬を製造するための請求項１〜９のいずれかに記載のｓｉＲＮＡの使用。
【請求項１８】
ヒトの疾患または病理学的状態の治療のための医薬を製造するための請求項１から９のいずれかに記載のｓｉＲＮＡの使用。
【請求項１９】
前記ヒトの疾患または病理学的状態が、皮膚の過剰増殖性状態、または他の過剰増殖性疾患である請求項１６または１８に記載の方法または使用。
【請求項２０】
前記ヒトの疾患または病理学的状態が、乾癬、接触皮膚炎、網膜症、子宮内膜症、子宮筋腫、機能不全性血管増殖、子宮内膜微小血管増殖、炎症、関節炎、関節リウマチ、急性肺傷害（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、アテローム性動脈硬化、遺伝性出血性毛細血管拡張症、海綿状血管腫、血管新生誘導性肥満、移植後動脈症、糖尿病性網膜症、炎症性腸疾患、および歯周病、腹水、月経過多、肺高血圧、肺炎、子癇前症、肺線維症、肺気腫、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、膵炎、敗血症、血栓症、虚血性心疾患、多発性硬化症、脳卒中、または黄斑変性、肝硬変、マラリア、全身性エリテマトーデスである、請求項１６または１８に記載の方法または使用。
【請求項２１】
請求項１５、１６、および２０のいずれかに記載の方法において使用するための、請求項１〜９のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ、または請求項１０および１１のいずれかに記載のリポプレックス、または請求項１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＮＧ２の発現を阻害するのに適した二本鎖核酸と、その使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
受容体チロシンキナーゼＴｉｅ２は、血管の発達に必要であり、２つのリガンドであるアンジオポエチン（ＡＮＧ１およびＡＮＧ２）は、十分に特徴付けされている（ＦｉｅｄｌｅｒおよびＡｕｇｕｓｔｉｎ、２００６）。ＡＮＧ１は、血管周囲細胞によって発現され、Ｔｉｅ２の活性化因子である。ＡＮＧ１はまた、発達時における血管の安定化および成熟にも必要である。しかし、ＡＮＧ２は、培養内皮細胞上におけるＴｉｅ２を活性化しない（ある程度の例外もある）。ＡＮＧ２は、血管のリモデリングが活発な内皮細胞内において選択的に発現することが示唆されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
当技術分野では、炎症性疾患を治療するか、または炎症を軽減するためのｓｉＲＮＡの使用を含め、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡＮＧ２の発現をサイレンシングまたはノックダウンする手段が継続的に必要とされている。本発明は、組成物、ＡＮＧ２を指向するｓｉＲＮＡを使用する方法、およびこれを作製する方法を発見することによって、これらの満たされていない必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、発現したＡＮＧ２のＲＮＡ転写物（本明細書では、場合によって、「標的核酸」と称する）を指向する短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む組成物に関する。これらのｓｉＲＮＡ分子は、ＡＮＧ２遺伝子産物の発現を低減することが望ましい各種の疾患および障害を治療するのに用いることができる。
【０００５】
以下の図面から、さらなる特徴、実施形態、および利点について理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】Ｔｉｅ２／Ａｎｇ（１、２）シグナル伝達経路に関するシグナルの影響度を示す影響力の均衡図である。
【図２】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるスクリーニングのためにデザインされた１９マーのＡｎｇ２−ＡｔｕＲＮＡｉ分子の配列を示す図である。太字のヌクレオチドは、２’位においてＯ−メチル基により修飾されている。
【図３】マウスＢ１６Ｖ細胞およびＭＳ１細胞における、強力なＡｎｇ２−ｓｉＲＮＡ分子（１９マーのＡｔｕＲＮＡｉ分子）を得るためのスクリーニングを示す図である。試験された１９マーのｓｉＲＮＡ−Ａｎｇ２は、図２で同定した通りである。本明細書で開示される任意のｓｉＲＮＡ分子の特異性についての呼称は、次の通り、「ｈ」はヒト、「ｍ」はマウス、「ｒ」はラット、「ｈｍ」はヒトおよびマウス、「ｈｒ」はヒトおよびラット、「ｍｒ」はマウスおよびラット、ならびに「ｈｍｒ」はヒト、マウス、およびラットである。
【図４】ｅｘ  ｖｉｖｏにおける、ＰＬＹにより誘導される血管透過性の測定、ならびにＩＰＭＬ（単離灌流マウス肺）モデルの使用についての実験概略を示す図である。
【図５】ＩＰＭＬ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）アッセイおよび肺炎感染（ｉｎ  ｖｉｖｏ）アッセイにより示されるｓｉＲＮＡＡｎｇ２リポプレックスの処置後における血管透過性の低減を示す図である。これらのアッセイでは、図２で同定した７番のｓｉＲＮＡ分子を用いた。
【図６】肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を感染させた肺を用いたｉｎ  ｖｉｖｏの透過性アッセイにおける、ｓｉＲＮＡＡｎｇ２リポプレックス処置の効果を示す図である（Ａ）。対応する処置群に由来する肺におけるＡｎｇ２のｍＲＮＡおよびＴｉｅ２のｍＲＮＡに対するノックダウンを示す図である（Ｂ）。表示のｓｉＲＮＡ濃度でｓｉＲＮＡＡｎｇ２リポプレックスおよびｓｉＲＮＡＬｕｃリポプレックスをトランスフェクトしたＨＵＶＥＣにおける、ＲＮＡｉを介するＡｎｇ２−ｍＲＮＡ発現の抑制を示す図である（Ｃ）。これらのアッセイでは、図２で同定した７番のｓｉＲＮＡ分子を用いた。
【図７】Ｂ１６Ｖにおいて、Ａｎｇ２  ｓｉＲＮＡを、１９マーから２３マーへと伸長させたことを示す図である。９番のｓｉＲＮＡ（図１１）の活性を、７番のｓｉＲＮＡ（図１１）の活性と比較する。試験により、図１１で同定される９番のｓｉＲＮＡ分子が、Ａｎｇ２  ｍＲＮＡ発現を抑制するのに強力なｓｉＲＮＡ分子であることが確立される。
【図８】１９マーまたは２３マーのｓｉＲＮＡＡｎｇ２リポプレックスにより静脈内処置されたマウスに由来する肺における血管透過性の低減を示す図である。パネルＡおよびＢにおいてそれぞれ、７番のｓｉＲＮＡ分子（図２）および９番のｓｉＲＮＡ分子（図１１）が比較される。
【図９】トランスフェクション実験において、９番のＡｔｕＲＮＡｉ分子（図１１）を、公表されているｓｉＲＮＡ（Ｂｈａｎｄａｒｉら、２００６）およびこれらの誘導体と比較して調べたことを示す図である。
【図１０】Ｂ１６Ｖにおいて、Ａｎｇ２−ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉの有効性を比較したことを示す図である。異なる濃度のｓｉＲＮＡにおける２つの実験である。凡例：１は、９番のｓｉＲＮＡ（図１１）。２は、Ａｌｎｙｌａｍ社製のＴＴ突出を有する２１マーのＡｎｇ２−Ｂｈａｎｄａｒｉ（Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００６年１１月；１２（１１）：１２８６〜９３による配列）。３は、平滑末端の２３マー（３’末端からの伸長）としての「Ｂｈａｎｄａｒｉ配列」であるＡｎｇ２−Ｂｈａｎｄａｒｉ  ３。４は、５’末端から伸長させた２３マーのＡｔｕＲＮＡｉ「Ｂｈａｎｄａｒｉ配列」であるＡｎｇ２−Ｂｈａｎｄａｒｉ  Ａｔｕ２３。
【図１１】スクリーニングのための代替的な２３マーのＡｎｇ２  ＡｔｕＲＮＡｉ分子を示す図である。９つの異なるｓｉＲＮＡ分子を示す。太字のヌクレオチドは、Ｏ−メチル基により２’位が修飾されている。
【図１２】Ｂ１６Ｖにおいて、Ａｎｇ２に対するさらなる２３マー（図１１に示す）のスクリーニングと、それらの有効性の試験を示す図である。
【図１３−１４】Ｂ１６Ｖおよび組織培養物中において、図１１の各種のＡｎｇ２  ｓｉＲＮＡ分子を特徴付けしたことを示す図である。
【図１５】ＨＵＶＥＣにおいて、ＡＮＧ２リードｓｉＲＮＡである１９マー、ならびに対応する２３マーの有効性を試験したこと示す図である。
【図１６−１８】ヒトＡＮＧ２に対する強力な分子をスクリーニングするためにデザインされた代替的な２３マーのＡｎｇ２  ＡｔｕＲＮＡｉ分子について示す図である。１６個の異なるｓｉＲＮＡ分子を示す。ＨＵＶＥＣにおいてトランスフェクション実験を行うことにより、ＡＮＧ２遺伝子の発現を阻害する効力が明らかとなった。
【図１９】マウスにおいて、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を感染させたときの、アンジオポエチン−Ｔｉｅ２系（ＡＮＧ１、ＡＮＧ２、Ｔｉｅ２）の遺伝子発現に対する差次的制御について示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（配列の簡単な説明）
配列番号１は、ヒトＡＮＧ２をコードするｍＲＮＡ配列である。この配列は、参照することによりその全体が本明細書の一部をなすものとするＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１４７．２において示されるｃＤＮＡ配列から転換されたものである。
【０００８】
配列番号２〜６９および７３〜１０４は、例示的なセンスｓｉＲＮＡ配列およびアンチセンスｓｉＲＮＡ配列である。
【０００９】
配列番号７０は、マウスＡＮＧ２をコードするｍＲＮＡ配列である。この配列は、参照することによりその全体が本明細書の一部をなすものとするＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００７４２６．３において示されるｃＤＮＡ配列から転換されたものである。
【００１０】
配列番号７１および７２は、ヒトＡＮＧ２の変異体のｍＲＮＡ配列である。これらの配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１１８８８７．１およびＮＭ＿００１１１８８８８．１において示されるｃＤＮＡ配列から転換されたものである。これらのＧｅｎＢａｎｋ受託番号の各々は、参照することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする。
【００１１】
（詳細な説明）
本発明は、発現したＡＮＧ２のＲＮＡ転写物（本明細書では、場合によって、「標的核酸」と称する）を指向する短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む組成物に関する。本発明のｓｉＲＮＡは、二本鎖領域または二重鎖領域を含む核酸分子である。本発明はさらに、ＡＮＧ２の発現レベルを低減するｓｉＲＮＡ組成物を用いる方法にも関する。遺伝子発現に言及するときに本明細書で用いられる「サイレンシング」または「ノックダウン」という用語は、遺伝子発現の低減を意味する。本発明はさらに、ｓｉＲＮＡを作製する方法にも関する。
【００１２】
一態様では、標的核酸が、哺乳動物ＡＮＧ２遺伝子から発現したＲＮＡである。一実施形態では、標的核酸が、マウスＡＮＧ２から発現したＲＮＡである。別の実施形態では、標的核酸が、ヒトＡＮＧ２から発現したＲＮＡである。別の実施形態では、標的核酸が、ヒトＡＮＧ２  ｍＲＮＡである。別の実施形態では、標的核酸が、ヒトＡＮＧ２  ｈｎＲＮＡである。別の実施形態では、標的核酸が、配列番号１、７０、７１、または７２の配列を含むｍＲＮＡである。
【００１３】
本発明のｓｉＲＮＡは、ＡＮＧ２の発現を阻害するのに適する。したがって、本発明によるｓｉＲＮＡは、哺乳動物細胞におけるＡＮＧ２  ｍＲＮＡの低減を結果としてもたらすＲＮＡ干渉反応を誘発するのに適する。本発明によるｓｉＲＮＡはさらに、遺伝子発現をｍＲＮＡレベルで減少させることにより、ＡＮＧ２タンパク質の発現を減少させるのにも適する。
【００１４】
ｓｉＲＮＡのデザイン：本発明のｓｉＲＮＡは、核酸の二本の鎖、すなわち第１のアンチセンス鎖および第２のセンス鎖を含む。核酸は通常、リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドからなるが、核酸は、本明細書で説明されるデオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）を含む場合がある。ｓｉＲＮＡはさらに、アンチセンス鎖の全部または一部と、センス鎖の全部または一部とにより形成される二本鎖核酸部分または二重鎖領域も含む。センス鎖と共に二重鎖領域を形成するアンチセンス鎖の部分を、アンチセンス鎖二重鎖領域、または単に、アンチセンス二重鎖領域とし、アンチセンス鎖と共に二重鎖領域を形成するセンス鎖の部分を、センス鎖二重鎖領域、または単に、センス二重鎖領域とする。二重鎖領域は、アンチセンス鎖とセンス鎖との間で形成される最初の塩基対で始まり、アンチセンス鎖とセンス鎖との間で形成される最後の塩基対で終わるもの（最初の塩基対と最後の塩基対を含む）として定義される。ｓｉＲＮＡの二重鎖領域の両側の部分は隣接領域である。アンチセンス二重鎖領域の両側におけるアンチセンス鎖部分は、アンチセンス隣接領域である。アンチセンス二重鎖領域に対して５’側にあるアンチセンス鎖部分は、５’側のアンチセンス隣接領域である。アンチセンス二重鎖領域に対して５’側にあるアンチセンス鎖部分は、３’側のアンチセンス隣接領域である。センス二重鎖領域の両側におけるセンス鎖部分は、センス隣接領域である。センス二重鎖領域に対して５’側にあるセンス鎖部分は、５’側のセンス隣接領域である。センス二重鎖領域に対して５’側にあるセンス鎖部分は、３’側のセンス隣接領域である。
【００１５】
相補性：一態様では、アンチセンス二重鎖領域とセンス二重鎖領域とが、相互に完全に相補的であり、少なくとも部分的に相補的である。このような相補性は、ワトソン−クリックによる塩基対合（すなわち、Ａ：ＵおよびＧ：Ｃの塩基対合）に基づく。ｓｉＲＮＡの長さに応じて、アンチセンス二重鎖領域とセンス二重鎖領域との塩基間相補性の点で完全なマッチが必ずしも必要とされることはないが、アンチセンス鎖とセンス鎖とは、生理学的条件下でハイブリダイズ可能でなければならない。
【００１６】
一実施形態では、アンチセンス鎖とセンス鎖との相補性が完全である（いずれの鎖にもヌクレオチドのミスマッチ、または付加／欠失ヌクレオチドがみられない）。
【００１７】
一実施形態では、アンチセンス二重鎖領域とセンス二重鎖領域との相補性が完全である（いずれの鎖の二重鎖領域にもヌクレオチドのミスマッチ、または付加／欠失ヌクレオチドがみられない）。
【００１８】
別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域とセンス二重鎖領域との相補性が完全ではない。一実施形態では、アンチセンス二重鎖領域とセンス二重鎖領域の相補的配列との同一性が、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％からなる群から選択され、アンチセンス二重鎖領域とセンス二重鎖領域とを含むｓｉＲＮＡが、ＡＮＧ２の発現を低減するのに適する。別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域と、センス二重鎖領域の相補的配列との同一性が、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％からなる群から選択されるｓｉＲＮＡが、ＡＮＧ２の発現を、アンチセンス二重鎖領域とセンス二重鎖領域との同一性が完全な二重鎖領域を有する比較ｓｉＲＮＡの、少なくとも２５％、５０％、または７５％低減しうる。本明細書で用いられる「比較ｓｉＲＮＡ」という用語とは、特定の差違を除き、それが比較されるｓｉＲＮＡと同一であり、同一の条件下で調べられるｓｉＲＮＡである。
【００１９】
ｓｉＲＮＡを用いるＲＮＡｉは、アンチセンス鎖の全部または一部と、標的核酸の一部との間における二重鎖領域の形成を伴う。アンチセンス鎖と標的配列との間で形成される最初の塩基対で始まり、アンチセンス鎖と標的配列との間で形成される最後の塩基対で終わる領域（最初の塩基対と最後の塩基対を含む）として定義される、アンチセンス鎖と共に二重鎖領域を形成する標的核酸の部分を、標的核酸配列、または単に、標的配列とする。アンチセンス鎖とセンス鎖との間で形成される二重鎖領域は、アンチセンス鎖と標的配列との間で形成される二重鎖領域と同じでありうるが、そうである必要はない。すなわち、センス鎖は、標的配列と異なる配列を有しうるが、アンチセンス鎖は、センス鎖および標的配列のいずれとも二重鎖構造を形成することが可能でなければならない。
【００２０】
一実施形態では、アンチセンス鎖と標的配列との相補性が完全である（いずれの核酸にもヌクレオチドのミスマッチ、または付加／欠失ヌクレオチドがみられない）。
【００２１】
一実施形態では、アンチセンス二重鎖領域（センス鎖と共に二重鎖領域を形成するアンチセンス鎖の部分）と標的配列との相補性が完全である（いずれの核酸にもヌクレオチドのミスマッチ、または付加／欠失ヌクレオチドがみられない）。
【００２２】
別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域と標的配列との相補性が完全ではない。一実施形態では、アンチセンス二重鎖領域と標的配列の相補的配列との同一性が、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％からなる群から選択され、アンチセンス二重鎖領域を含むｓｉＲＮＡが、ＡＮＧ２の発現を低減するのに適する。別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域と標的配列の相補的配列との同一性が、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％からなる群から選択されるｓｉＲＮＡが、ＡＮＧ２の発現を、アンチセンス鎖と標的配列との同一性が完全である比較ｓｉＲＮＡの、少なくとも２５％、５０％、または７５％低減しうる。
【００２３】
別の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡが二重鎖領域を含み、アンチセンス二重鎖領域が、センス二重鎖領域内のヌクレオチドと塩基対合しない、１、２、３、４、および５からなる群から選択される数のヌクレオチドを有し、前記ｓｉＲＮＡが、ＡＮＧ２の発現を低減するのに適する。塩基対合の欠如は、塩基間において相補性が欠如する（すなわち、ワトソン−クリックによる塩基対合が見られない）ためであるか、またはバルジが創出されるように、アンチセンス二重鎖領域もしくはセンス二重鎖領域において対応するヌクレオチドが存在しないためである。一実施形態では、センス二重鎖領域と塩基対合しない、１、２、３、４、および５からなる群から選択される数のヌクレオチドを有するアンチセンス二重鎖領域を含むｓｉＲＮＡが、ＡＮＧ２の発現を、前記アンチセンス二重鎖領域のすべてのヌクレオチドが、前記センス二重鎖領域のすべてのヌクレオチドと塩基対合する比較ｓｉＲＮＡの、少なくとも２５％、５０％、または７５％低減しうる。
【００２４】
別の実施形態では、アンチセンス鎖が、センス鎖と塩基対合しない、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０からなる群から選択される数のヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡが、ＡＮＧ２の発現を低減するのに適する。相補性の欠如は、塩基間において相補性が欠如するためであるか、またはアンチセンス鎖もしくはセンス鎖において対応するヌクレオチドが存在しないためである。対応するヌクレオチドの欠如は、アンチセンス鎖またはセンス鎖において、一本鎖の突出またはバルジ（二重鎖領域の場合）を結果としてもたらす。一実施形態では、センス鎖と塩基対合しない、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０から選択される数のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡが、ＡＮＧ２の発現を、前記アンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが、センス鎖のすべてのヌクレオチドと相補的である比較ｓｉＲＮＡの、少なくとも２５％、５０％、または７５％低減しうる。一実施形態では、標的配列とミスマッチする、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０から選択される数のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡが、ＡＮＧ２の発現を、前記アンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが前記センス鎖のすべてのヌクレオチドと相補的である比較ｓｉＲＮＡの、少なくとも２５％、５０％、または７５％低減しうる。別の実施形態では、ミスマッチヌクレオチドのすべてが二重鎖領域の外にある。
【００２５】
別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域が、センス二重鎖領域と塩基対合しない、１、２、３、４、または５から選択される数のヌクレオチドを有し、前記アンチセンス二重鎖領域を含むｓｉＲＮＡが、ＡＮＧ２の発現を低減するのに適する。相補性の欠如は、塩基間において相補性が欠如するためであるか、またはアンチセンス二重鎖領域またはセンス二重鎖領域においてバルジが創出されるように、アンチセンス二重鎖領域もしくはセンス二重鎖領域において対応するヌクレオチドが存在しないためである。一実施形態では、センス二重鎖領域と塩基対合しない、１、２、３、４、および５からなる群から選択される数のヌクレオチドを有するアンチセンス二重鎖領域を含むｓｉＲＮＡが、ＡＮＧ２の発現を、前記アンチセンス二重鎖領域のすべてのヌクレオチドが、前記センス二重鎖領域のすべてのヌクレオチドと相補的である比較ｓｉＲＮＡの、少なくとも２５％、５０％、または７５％低減しうる。
【００２６】
別の実施形態では、アンチセンス鎖が、標的配列と塩基対合しない、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０から選択される数のヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡが、ＡＮＧ２の発現を低減するのに適する。相補性の欠如は、塩基間において相補性が欠如するためであるか、またはアンチセンス鎖もしくは標的配列において対応するヌクレオチドが存在しないためである。対応するヌクレオチドの欠如は、アンチセンス鎖または標的配列において、バルジを結果としてもたらす。一実施形態では、標的配列と塩基対合しない、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０から選択される数のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡが、ＡＮＧ２の発現を、前記アンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが前記標的配列のすべてのヌクレオチドと相補的である比較ｓｉＲＮＡの、少なくとも２５％、５０％、または７５％低減しうる。一実施形態では、標的配列とミスマッチする、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０から選択される数のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡが、ＡＮＧ２の発現を、前記アンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが前記標的配列のすべてのヌクレオチドと相補的である比較ｓｉＲＮＡの、少なくとも２５％、５０％、または７５％低減しうる。
【００２７】
別の実施形態では、ｓｉＲＮＡのアンチセンス二重鎖領域と、センス二重鎖領域および標的配列両方との相補性が、アンチセンス二重鎖領域と、センス二重鎖領域または標的配列とが、生理学的条件（生理学的緩衝液中において３７℃）下で互いにハイブリダイズするような相補性であり、ｓｉＲＮＡが、ＡＮＧ２の発現を低減するのに適する。一実施形態では、生理学的条件下においてセンス二重鎖領域および標的配列にハイブリダイズするアンチセンス二重鎖領域を含むｓｉＲＮＡは、ＡＮＧ２の発現を、アンチセンス鎖と標的配列との相補性が完全である比較ｓｉＲＮＡの、少なくとも２５％、５０％、または７５％低減しうる。
【００２８】
別の実施形態では、ｓｉＲＮＡのアンチセンス二重鎖領域とセンス二重鎖領域との相補性が、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、７０℃の条件下でアンチセンス二重鎖領域とセンス二重鎖領域とがハイブリダイズするような相補性であり、ＡＮＧ２の発現を低減するのに適する。４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、７０℃の条件下で互いにハイブリダイズするアンチセンス二重鎖領域およびセンス二重鎖領域を含むｓｉＲＮＡは、ＡＮＧ２の発現を、アンチセンス二重鎖領域とセンス二重鎖領域との相補性が完全である比較ｓｉＲＮＡの、少なくとも２５％、５０％、または７５％低減しうる。
【００２９】
別の実施形態では、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との相補性が、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、７０℃の条件下でアンチセンス鎖と標的配列とがハイブリダイズするような相補性であり、ｓｉＲＮＡが、ＡＮＧ２の発現を低減するのに適する。４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、７０℃の条件下で標的配列にハイブリダイズするアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡは、ＡＮＧ２の発現を、アンチセンス鎖と標的配列との相補性が完全である比較ｓｉＲＮＡの、少なくとも２５％、５０％、または７５％低減しうる。
【００３０】
長さ：より短いＲＮＡｉ分子が一般には好ましいが、数十または数百の塩基対を含む長い核酸分子を用いるＲＮＡ干渉が観察されている。
【００３１】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ二重鎖領域の長さが、約１６〜３５、１６〜３０、１７〜３５、１７〜３０、１７〜２５、１７〜２４、１８〜２９、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、２０〜２５、２０〜２４、２１〜２５、および２１〜２４塩基対からなる群から選択される。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ二重鎖領域の長さが、約１６〜３５、１６〜３０、１７〜３５、１７〜３０、１７〜２５、１７〜２４、１８〜２９、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、２０〜２５、２０〜２４、２１〜２５、および２１〜２４連続塩基対からなる群から選択される。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ二重鎖領域の長さが、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５塩基対からなる群から選択される。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ二重鎖領域の長さが、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５連続塩基対からなる群から選択される。
【００３２】
一実施形態では、アンチセンス鎖の長さが、約１６〜３５、１６〜３０、１７〜３５、１７〜３０、１７〜２５、１７〜２４、１８〜２９、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、２０〜２５、２０〜２４、２１〜２５、および２１〜２４ヌクレオチドからなる群から選択される。一実施形態では、アンチセンス鎖の長さが、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５ヌクレオチドからなる群から選択される。
【００３３】
一実施形態では、センス鎖の長さが、約１６〜３５、１６〜３０、１７〜３５、１７〜３０、１７〜２５、１７〜２４、１８〜２９、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、２０〜２５、２０〜２４、２１〜２５、および２１〜２４ヌクレオチドからなる群から選択される。一実施形態では、センス鎖の長さが、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５ヌクレオチドからなる群から選択される。
【００３４】
一実施形態では、アンチセンス鎖の長さおよびセンス鎖の長さが、約１６〜３５、１６〜３０、１７〜３５、１７〜３０、１７〜２５、１７〜２４、１８〜２９、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、２０〜２５、２０〜２４、２１〜２５、および２１〜２４ヌクレオチドからなる群から独立して選択される。一実施形態では、アンチセンス鎖の長さおよびセンス鎖の長さが、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５ヌクレオチドからなる群から独立して選択される。一実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖の長さが等しい。別の実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖の長さが等しく、該長さが、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５ヌクレオチドからなる群から選択される。
【００３５】
一実施形態では、アンチセンス鎖の長さが、約１６〜３５、１６〜３０、１７〜３５、１７〜３０、１７〜２５、１７〜２４、１８〜２９、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、２０〜２５、２０〜２４、２１〜２５、および２１〜２４ヌクレオチドからなる群から選択され、アンチセンス鎖が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、または６８のヌクレオチド配列を含む。
【００３６】
一実施形態では、アンチセンス鎖の長さが、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５ヌクレオチドからなる群から選択され、アンチセンス鎖が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、または６８のヌクレオチド配列を含む。
【００３７】
一実施形態では、センス鎖の長さが、約１６〜３５、１６〜３０、１７〜３５、１７〜３０、１７〜２５、１７〜２４、１８〜２９、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、２０〜２５、２０〜２４、２１〜２５、および２１〜２４ヌクレオチドからなる群から選択され、センス鎖が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、または６９のヌクレオチド配列を含む。
【００３８】
一実施形態では、センス鎖の長さが、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５ヌクレオチドからなる群から選択され、センス鎖が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、または６９のヌクレオチド配列を含む。
【００３９】
一実施形態では、アンチセンス鎖の長さおよびセンス鎖の長さが、約１６〜３５、１６〜３０、１７〜３５、１７〜３０、１７〜２５、１７〜２４、１８〜２９、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、２０〜２５、２０〜２４、２１〜２５、および２１〜２４ヌクレオチドからなる群から独立して選択され、アンチセンス鎖が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、または６８のヌクレオチド配列を含み、センス鎖が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、または６９のヌクレオチド配列を含む。
【００４０】
一実施形態では、アンチセンス鎖の長さおよびセンス鎖の長さが、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５ヌクレオチドからなる群から独立して選択され、アンチセンス鎖が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、または６８のヌクレオチド配列を含み、センス鎖が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、または６９のヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
一実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖の長さが等しく、該アンチセンス鎖が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、または６８のヌクレオチド配列を含み、センス鎖が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、または６９のヌクレオチド配列を含む。
【００４２】
別の実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖の長さが等しく、該長さが、約１６〜３５、１６〜３０、１７〜３５、１７〜３０、１７〜２５、１７〜２４、１８〜２９、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、２０〜２５、２０〜２４、２１〜２５、および２１〜２４ヌクレオチドからなる群から選択され、アンチセンス鎖が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、または６８のヌクレオチド配列を含み、センス鎖が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、または６９のヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
別の実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖の長さが等しく、該長さが、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５ヌクレオチドからなる群から選択され、アンチセンス鎖が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、または６８のヌクレオチド配列を含み、センス鎖が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、または６９のヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
特定の実施形態は、アンチセンス鎖およびセンス鎖の組合せ（配列番号により同定される）、すなわち、２および３、４および５、６および７、８および９、１０および１１、１２および１３、１４および１５、１６および１７、１８および１９、２０および２１、２２および２３、２４および２５、２６および２７、２８および２９、３０および３１、３２および３３、３４および３５、３６および３７、３８および３９、４０および４１、４２および４３、４４および４５、４６および４７、４８および４９、５０および５１、５２および５３、５４および５５、５６および５７、５８および５９、６０および６１、６２および６３、６４および６５、６６および６７、ならびに６８および６９を提供する。
【００４５】
末端（突出末端および平滑末端）：本発明のｓｉＲＮＡは、突出を含む場合もあり、平滑末端である場合もある。本明細書で用いられる「突出」は、当技術分野において通常かつ常套的な意味、すなわち、二本鎖核酸における相補鎖の末端ヌクレオチドを超えて伸長する核酸の一本鎖部分という意味を有する。「平滑末端」という用語は、末端のヌクレオチド（複数可）が塩基対合しているかどうかに関わらず、同じ位置で終結する二本鎖核酸を包含する。一実施形態では、平滑末端におけるアンチセンス鎖およびセンス鎖の末端のヌクレオチドが塩基対合する。別の実施形態では、平滑末端におけるアンチセンス鎖およびセンス鎖の末端のヌクレオチドが塩基対合しない。別の実施形態では、平滑末端におけるアンチセンス鎖およびセンス鎖の末端の２つのヌクレオチドが塩基対合する。別の実施形態では、平滑末端におけるアンチセンス鎖およびセンス鎖の末端の２つのヌクレオチドが塩基対合しない。
【００４６】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡが、一方の末端において突出を有し、他方の末端において平滑末端を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、両方の末端において突出を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、両方の末端において平滑末端である。一実施形態では、ｓｉＲＮＡが、一方の末端において平滑末端である。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、アンチセンス鎖の５’末端およびセンス鎖の３’末端を有する末端において平滑末端である。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、アンチセンス鎖の３’末端およびセンス鎖の５’末端を有する末端において平滑末端である。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、両方の末端において平滑末端である。
【００４７】
別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、３’末端または５’末端において突出を含む。一実施形態では、ｓｉＲＮＡが、アンチセンス鎖において３’突出を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、センス鎖において３’突出を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、アンチセンス鎖において５’突出を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、センス鎖において５’突出を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、アンチセンス鎖の５’末端および３’末端の両方において突出を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、センス鎖の５’末端および３’末端の両方において突出を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、アンチセンス鎖において５’突出を有し、センス鎖において３’突出を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、アンチセンス鎖において３’突出を有し、センス鎖において５’突出を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、アンチセンス鎖において３’突出を有し、センス鎖において３’突出を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、アンチセンス鎖において５’突出を有し、センス鎖において５’突出を有する。
【００４８】
一実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端における突出が、１、２、３、４、および５ヌクレオチドからなる群から選択される長さである。一実施形態では、センス鎖の３’末端における突出が、１、２、３、４、および５ヌクレオチドからなる群から選択される長さである。一実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端における突出が、１、２、３、４、および５ヌクレオチドからなる群から選択される長さである。一実施形態では、センス鎖の５’末端における突出が、１、２、３、４、および５ヌクレオチドからなる群から選択される長さである。
【００４９】
修飾：別の態様は、ｓｉＲＮＡの修飾に関する。本発明によるｓｉＲＮＡは、リボ核酸または修飾リボ核酸である。本発明のｓｉＲＮＡの化学修飾は、天然ＲＮＡ分子に固有の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける安定性およびバイオアベイラビリティーが含まれるがこれらに限定されない潜在的な限界を克服するのに強力なツールを提供する。化学修飾ｓｉＲＮＡはまた、ヒトにおけるインターフェロン活性を活性化する可能性も最小化しうる。化学修飾はさらに、標的細胞への、ｓｉＲＮＡの機能的な送達も増強しうる。本発明の修飾ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖またはセンス鎖の一方または両方に対する、１個以上の化学修飾リボヌクレオチドを含みうる。リボヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸部分の化学修飾を含みうる。
【００５０】
塩基部分に対する修飾：二次的な態様は、塩基部分に対する修飾に関する。本発明のｓｉＲＮＡの１個以上のヌクレオチドは、修飾塩基を含みうる。「修飾塩基」とは、１’位におけるアデニン、グアニン、シトシン、またはウラシル以外のヌクレオチド塩基を意味する。
【００５１】
一態様では、ｓｉＲＮＡが、修飾塩基を含む少なくとも１つのヌクレオチドを含む。一実施形態では、修飾塩基が、アンチセンス鎖上にある。別の実施形態では、修飾塩基が、センス鎖上にある。別の実施形態では、修飾塩基が、二重鎖領域にある。別の実施形態では、修飾塩基が、二重鎖領域の外、すなわち一本鎖領域にある。別の実施形態では、修飾塩基が、アンチセンス鎖上にあり、二重鎖領域の外にある。別の実施形態では、修飾塩基が、センス鎖上にあり、二重鎖領域の外にある。別の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端のヌクレオチドが、修飾塩基を有するヌクレオチドである。別の実施形態では、センス鎖の３’末端のヌクレオチドが、修飾塩基を有するヌクレオチドである。別の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドが、修飾塩基を有するヌクレオチドである。別の実施形態では、センス鎖の５’末端のヌクレオチドが、修飾塩基を有するヌクレオチドである。
【００５２】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡが、１つの修飾塩基を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、約２〜４個の修飾塩基を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、約４〜６個の修飾塩基を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、約６〜８個の修飾塩基を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、約８〜１０個の修飾塩基を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、約１０〜１２個の修飾塩基を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、約１２〜１４個の修飾塩基を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、約１４〜１６個の修飾塩基を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、約１６〜１８個の修飾塩基を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、約１８〜２０個の修飾塩基を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、約２０〜２２個の修飾塩基を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、約２２〜２４個の修飾塩基を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、約２４〜２６の修飾塩基を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、約２６〜２８個の修飾塩基を有する。各場合において、前記修飾塩基を含むｓｉＲＮＡは、同じではあるが前記修飾塩基を有さないｓｉＲＮＡと比較して、その活性の少なくとも５０％を保持する。
【００５３】
一実施形態では、修飾塩基がプリンである。別の実施形態では、修飾塩基がピリミジンである。別の実施形態では、プリンのうちの少なくとも半分が修飾されている。別の実施形態では、ピリミジンのうちの少なくとも半分が修飾されている。別の実施形態では、プリンのすべてが修飾されている。別の実施形態では、ピリミジンのすべてが修飾されている。
【００５４】
別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、修飾塩基を含むヌクレオチドを含み、塩基が、２−アミノアデノシン、２，６−ジアミノプリン、イノシン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）、６−アザピリミジン、６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピン、ケウオシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、ワイブトシン、ワイブトキソシン、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケウオシン、１−メチルアデノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、３−メチルシチジン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、ベータ−Ｄ−マンノシルケウオシン、ウリジン−５−オキシ酢酸、および２−チオシチジンからなる群から選択される。
【００５５】
別の態様では、本発明のｓｉＲＮＡが、脱塩基ヌクレオチドを含む。本明細書で用いられる「脱塩基」という用語は、１’位において、塩基を欠くか、または塩基の代わりに他の化学基を有する部分、例えば、３’、３’連結または５’、５’連結された脱塩基デオキシリボース誘導体を指す。本明細書で用いられる、修飾塩基を有するヌクレオチドは、脱塩基ヌクレオチドを包含しない。一態様では、ｓｉＲＮＡが、少なくとも１つの脱塩基ヌクレオチドを含む。一態様では、脱塩基ヌクレオチドが、アンチセンス鎖上にある。別の態様では、脱塩基ヌクレオチドが、センス鎖上にある。別の態様では、脱塩基ヌクレオチドが、二重鎖領域にある。別の態様では、脱塩基ヌクレオチドが、二重鎖領域の外にある。別の実施形態では、脱塩基ヌクレオチドが、アンチセンス鎖上にあり、二重鎖領域の外にある。別の実施形態では、脱塩基ヌクレオチドが、センス鎖上にあり、二重鎖領域の外にある。別の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端のヌクレオチドが、脱塩基ヌクレオチドである。別の実施形態では、センス鎖の３’末端のヌクレオチドが、脱塩基ヌクレオチドである。別の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドが、脱塩基ヌクレオチドである。別の実施形態では、センス鎖の５’末端のヌクレオチドが、脱塩基ヌクレオチドである。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、１、２、３、４、５、および６からなる群から選択される数の脱塩基ヌクレオチドを有する。
【００５６】
糖部分に対する修飾：別の二次的な態様は、糖部分に対する修飾に関する。本発明のｓｉＲＮＡの１個以上のヌクレオチドは、修飾リボース部分を含みうる。
【００５７】
２’−ＯＨが置換される２’位における修飾には、アルキル、置換アルキル、アルカリル−、アラルキル−、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＯＣＮ、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、ＨＳ−アルキル−Ｏ、−Ｏ−アルケニル、−Ｓ−アルケニル、−Ｎ−アルケニル、−ＳＯ−アルキル、−アルキル−ＯＳＨ、−アルキル−ＯＨ、−Ｏ−アルキル−ＯＨ、−Ｏ−アルキル−ＳＨ、−Ｓ−アルキル−ＯＨ、−Ｓ−アルキル−ＳＨ、−アルキル−Ｓ−アルキル、−アルキル−Ｏ−アルキル、−ＯＮＯ２、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ−、アミノアルキル−、アミノアルコキシ、アミノ酸、アミノアシル−、−ＯＮＨ２、−Ｏ−アミノアルキル、−Ｏ−アミノ酸、−Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル−、ヘテロシクロアルカリル−、アミノアルキルアミノ−、ポリアルキルアミノ−、置換シリル−、メトキシエチル−（ＭＯＥ）、アルケニル、およびアルキニルからなる群から選択される非限定的な例が含まれる。２’ヒドロキシルが、例えば、メチレン架橋を介して、同じリボース糖の４’炭素に連結される「ロックされた」核酸（ＬＮＡ）も、本発明の２’修飾としてさらに含まれる。好ましい置換基は、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロである。
【００５８】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡが、１〜５個の２’修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、５〜１０個の２’修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、１５〜２０個の２’修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、２０〜２５個の２’修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、２５〜３０個の２’修飾ヌクレオチドを含む。
【００５９】
一実施形態では、アンチセンス鎖が、１〜２個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約２〜４個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約４〜６個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約６〜８個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約８〜１０個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約１０〜１２個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約１２〜１４個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約１４〜１６個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約１６〜１８個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約１８〜２０個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約２２〜２４個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約２４〜２６個の２’修飾ヌクレオチドを含む。
【００６０】
一実施形態では、センス鎖が、１〜２個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約２〜４個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約４〜６個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約６〜８個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約８〜１０個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約１０〜１２個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約１２〜１４個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約１４〜１６個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約１６〜１８個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約１８〜２０個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約２２〜２４個の２’修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約２４〜２６の２’修飾ヌクレオチドを含む。
【００６１】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡが、１〜５個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、５〜１０個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、１５〜２０個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、２０〜２５個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、２５〜３０個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。
【００６２】
一実施形態では、アンチセンス鎖が、１〜２個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約２〜４個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約４〜６個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約６〜８個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約８〜１０個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約１０〜１２個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約１２〜１４個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約１４〜１６個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約１６〜１８個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約１８〜２０個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約２２〜２４個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖が、約２４〜２６個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。
【００６３】
一実施形態では、センス鎖が、１〜２個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約２〜４個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約４〜６個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約６〜８個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約８〜１０個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約１０〜１２個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約１２〜１４個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約１４〜１６個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約１６〜１８個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約１８〜２０個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約２２〜２４個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖が、約２４〜２６個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。
【００６４】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡの二重鎖領域が、１〜５個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡの二重鎖領域が、５〜１０個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡの二重鎖領域が、１５〜２０個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡの二重鎖領域が、２０〜２５個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡの二重鎖領域が、２５〜３０個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。
【００６５】
一実施形態では、アンチセンス二重鎖領域が、１〜２個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス二重鎖領域が、約２〜４個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス二重鎖領域が、約４〜６個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス二重鎖領域が、約６〜８個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス二重鎖領域が、約８〜１０個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス二重鎖領域が、約１０〜１２個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス二重鎖領域が、約１２〜１４個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス二重鎖領域が、約１４〜１６個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス二重鎖領域が、約１６〜１８個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス二重鎖領域が、約１８〜２０個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス二重鎖領域が、約２２〜２４個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス二重鎖領域が、約２４〜２６個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。
【００６６】
一実施形態では、センス二重鎖領域が、１〜２個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、センス二重鎖領域が、約２〜４個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、センス二重鎖領域が、約４〜６個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、センス二重鎖領域が、約６〜８個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、センス二重鎖領域が、約８〜１０個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、センス二重鎖領域が、約１０〜１２個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、センス二重鎖領域が、約１２〜１４個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、センス二重鎖領域が、約１４〜１６個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、センス二重鎖領域が、約１６〜１８個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、センス二重鎖領域が、約１８〜２０個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、センス二重鎖領域が、約２２〜２４個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、センス二重鎖領域が、約２４〜２６個の２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。
【００６７】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡが、１９ヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖と、１９ヌクレオチドの長さのセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖が、ヌクレオチド２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記アンチセンス鎖が５’から３’に番号付けされ、前記センス鎖が３’から５’に番号付けされる。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、２０ヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖と、２０ヌクレオチドの長さのセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖が、ヌクレオチド２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記アンチセンス鎖が５’から３’に番号付けされ、前記センス鎖が３’から５’に番号付けされる。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、２１ヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖と、２１ヌクレオチドの長さのセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、および２１において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖が、ヌクレオチド２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記アンチセンス鎖が５’から３’に番号付けされ、前記センス鎖が３’から５’に番号付けされる。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、２２ヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖と、２２ヌクレオチドの長さのセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、および２１において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖が、ヌクレオチド２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、および２２において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記アンチセンス鎖が５’から３’に番号付けされ、前記センス鎖が３’から５’に番号付けされる。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、２３ヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖と、２３ヌクレオチドの長さのセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、および２３において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖が、ヌクレオチド２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、および２２において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記アンチセンス鎖が５’から３’に番号付けされ、前記センス鎖が３’から５’に番号付けされる。
【００６８】
別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、１８〜２３ヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖と、１８〜２３ヌクレオチドの長さのセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド３、５、７、９、１１、１３、１５、および１７において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖が、ヌクレオチド４、６、８、１０、１２、１４、および１６において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記アンチセンス鎖が５’から３’に番号付けされ、前記センス鎖が３’から５’に番号付けされる。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、１８〜２３ヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖と、１８〜２３ヌクレオチドの長さのセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド５、７、９、１１、１３、および１５において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖が、ヌクレオチド６、８、１０、１２、および１４において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記アンチセンス鎖が５’から ３’に番号付けされ、前記センス鎖が３’から５’に番号付けされる。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、１８〜２３ヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖と、１８〜２３ヌクレオチドの長さのセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド７、９、１１、および１３において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖が、ヌクレオチド８、１０、および１２において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記アンチセンス鎖が５’から３’に番号付けされ、前記センス鎖が３’から ５’に番号付けされる。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、１８〜２３ヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖と、１８〜２３ヌクレオチドの長さのセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド７、９、および１１において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖が、ヌクレオチド８、１０、および１２において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記アンチセンス鎖が５’から３’に番号付けされ、前記センス鎖が３’から５’に番号付けされる。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、１８〜２３ヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖と、１８〜２３ヌクレオチドの長さのセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド７、および９において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖が、ヌクレオチド８、および１０において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記アンチセンス鎖が５’から３’に番号付けされ、前記センス鎖が３’から５’に番号付けされる。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡが、１８〜２３ヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖と、１８〜２３ヌクレオチドの長さのセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド９、および１１において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖が、ヌクレオチド８、および１０において２’−ＯＣＨ３修飾を含み、前記アンチセンス鎖が５’に３’に番号付けされ、前記センス鎖が３’から５’に番号付けされる。
【００６９】
さらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡが、以下のヌクレオチド配列を含み、該配列が、大文字で示されたヌクレオチド上において２’−ＯＣＨ３修飾を含む。
【００７０】
別の実施形態では、アンチセンス鎖が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の２’−デオキシヌクレオチドを含む。
【００７１】
別の実施形態では、センス鎖が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の２’−デオキシヌクレオチドを含む。
【００７２】
別の実施形態では、アンチセンス鎖が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の２’−フルオロヌクレオチドを含む。
【００７３】
別の実施形態では、センス鎖が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の２’−フルオロヌクレオチドを含む。
【００７４】
別の実施形態では、アンチセンス鎖内のピリミジンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである。
【００７５】
別の実施形態では、アンチセンス鎖内のプリンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。
【００７６】
別の実施形態では、アンチセンス鎖内のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシピリミジンヌクレオチドである。
【００７７】
別の実施形態では、アンチセンス鎖内のプリンヌクレオチドが、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。
【００７８】
別の実施形態では、アンチセンス鎖内のピリミジンヌクレオチドが、２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。
【００７９】
別の実施形態では、アンチセンス鎖内のプリンヌクレオチドが、２’−フルオロプリンヌクレオチドである。
【００８０】
別の実施形態では、センス鎖内のピリミジンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである。
【００８１】
別の実施形態では、センス鎖内のプリンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。
【００８２】
別の実施形態では、センス鎖内のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシピリミジンヌクレオチドである。
【００８３】
別の実施形態では、センス鎖内のプリンヌクレオチドが、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。
【００８４】
別の実施形態では、センス鎖内のピリミジンヌクレオチドが、２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。
【００８５】
別の実施形態では、センス鎖内のプリンヌクレオチドが、２’−フルオロプリンヌクレオチドである。
【００８６】
別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域内のピリミジンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである。
【００８７】
別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域内のプリンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。
【００８８】
別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域内のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシピリミジンヌクレオチドである。
【００８９】
別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域内のプリンヌクレオチドが、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。
【００９０】
別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域内のピリミジンヌクレオチドが、２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。
【００９１】
別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域内のプリンヌクレオチドが、２’−フルオロプリンヌクレオチドである。
【００９２】
別の実施形態では、センス二重鎖領域内のピリミジンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである。
【００９３】
別の実施形態では、センス二重鎖領域内のプリンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。
【００９４】
別の実施形態では、センス二重鎖領域内のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシピリミジンヌクレオチドである。
【００９５】
別の実施形態では、センス二重鎖領域内のプリンヌクレオチドが、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。
【００９６】
別の実施形態では、センス二重鎖領域内のピリミジンヌクレオチドが、２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。
【００９７】
別の実施形態では、センス二重鎖領域内のプリンヌクレオチドが、２’−フルオロプリンヌクレオチドである。
【００９８】
別の実施形態では、アンチセンス二重鎖隣接領域内のピリミジンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである。
【００９９】
別の実施形態では、アンチセンス二重鎖隣接領域内のプリンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。
【０１００】
別の実施形態では、アンチセンス二重鎖隣接領域内のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシピリミジンヌクレオチドである。
【０１０１】
別の実施形態では、アンチセンス二重鎖隣接領域内のプリンヌクレオチドが、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。
【０１０２】
別の実施形態では、アンチセンス二重鎖隣接領域内のピリミジンヌクレオチドが、２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。
【０１０３】
別の実施形態では、アンチセンス二重鎖隣接領域内のプリンヌクレオチドが、２’−フルオロプリンヌクレオチドである。
【０１０４】
別の実施形態では、センス二重鎖隣接領域内のピリミジンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである。
【０１０５】
別の実施形態では、センス二重鎖隣接領域内のプリンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。
【０１０６】
別の実施形態では、センス二重鎖隣接領域内のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシピリミジンヌクレオチドである。
【０１０７】
別の実施形態では、センス二重鎖隣接領域内のプリンヌクレオチドが、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。
【０１０８】
別の実施形態では、センス二重鎖隣接領域内のピリミジンヌクレオチドが、２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。
【０１０９】
別の実施形態では、センス二重鎖隣接領域内のプリンヌクレオチドが、２’−フルオロプリンヌクレオチドである。
【０１１０】
パターン：一態様では、アンチセンス二重鎖領域が、本明細書で「修飾群」と称する複数の修飾ヌクレオチド群を含み、各修飾群が、同一の形で修飾された１個以上の修飾ヌクレオチドからなり、各修飾群が、片側または両側において、本明細書で「隣接群」と称する第２のヌクレオチド群により挟まれ、前記各隣接群が、非修飾であるかまたは前記修飾群のヌクレオチドとは異なる形で修飾されている１個以上のヌクレオチドからなる。一実施形態では、アンチセンス二重鎖領域内における各修飾群が同一である、すなわち、各修飾群が、同一の形で修飾された同等数のヌクレオチドからなる。別の実施形態では、各隣接群が、同等数のヌクレオチドを有する。別の実施形態では、各隣接群が同一である。別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域内における前記修飾群のヌクレオチドが、修飾塩基を含む。別の実施形態では、前記修飾群のヌクレオチドが、修飾リン酸骨格を含む。別の実施形態では、前記修飾群のヌクレオチドが、修飾２’位を含む。
【０１１１】
別の態様では、センス二重鎖領域が、複数の修飾群を含み、各修飾群が、同一の形で修飾された１個以上の修飾ヌクレオチドからなり、各修飾群が、片側または両側において、隣接群により挟まれ、前記各隣接群が、非修飾であるかまたは前記修飾群のヌクレオチドとは異なる形で修飾されている１個以上のヌクレオチドからなる。一実施形態では、センス二重鎖領域内における各修飾群が同一である。別の実施形態では、各隣接群が、同等数のヌクレオチドを有する。別の実施形態では、各隣接群が同一である。別の実施形態では、センス二重鎖領域内における前記修飾群のヌクレオチドが、修飾塩基を含む。別の実施形態では、前記修飾群のヌクレオチドが、修飾リン酸骨格を含む。別の実施形態では、前記修飾群のヌクレオチドが、修飾２’位を含む。
【０１１２】
別の態様では、アンチセンス二重鎖領域およびセンス二重鎖領域の各々が、複数の修飾群を含み、各修飾群が、同一の形で修飾された１個以上の修飾ヌクレオチドからなり、各修飾群が、片側または両側において、隣接群により挟まれ、前記各隣接群が、非修飾であるかまたは前記修飾群のヌクレオチドとは異なる形で修飾されている１個以上のヌクレオチドからなる。一実施形態では、アンチセンス二重鎖領域およびセンス二重鎖領域内における各修飾群が同一である。別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域およびセンス二重鎖領域内における各隣接群が、同等数のヌクレオチドを有する。別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域およびセンス二重鎖領域における各隣接群が同一である。別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域およびセンス二重鎖領域内における前記修飾群の複数のヌクレオチドの各々が、同じ修飾群および同じ隣接群を含む。別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域およびセンス二重鎖領域における前記修飾群の複数のヌクレオチドの各々が、修飾塩基を含む。別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域およびセンス二重鎖領域における前記修飾群の複数のヌクレオチドの各々が、修飾リン酸骨格を含む。別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域およびセンス二重鎖領域における前記修飾群の複数のヌクレオチドの各々が、修飾２’位を含む。
【０１１３】
一態様では、アンチセンス鎖が、本明細書で「修飾群」と称する複数の修飾ヌクレオチド群を含み、各修飾群が、同一の形で修飾された１個以上の修飾ヌクレオチドからなり、各修飾群が、片側または両側において、本明細書で「隣接群」と称する第２のヌクレオチド群により挟まれ、前記各隣接群が、非修飾であるかまたは前記修飾群のヌクレオチドとは異なる形で修飾されている１個以上のヌクレオチドからなる。一実施形態では、アンチセンス鎖内における各修飾群が同一である、すなわち、各修飾群が、同一の形で修飾された同等数のヌクレオチドからなる。別の実施形態では、各隣接群が、同等数のヌクレオチドを有する。別の実施形態では、各隣接群が同一である。別の実施形態では、アンチセンス鎖内における前記修飾群のヌクレオチドが、修飾塩基を含む。別の実施形態では、前記修飾群のヌクレオチドが、修飾リン酸骨格を含む。別の実施形態では、前記修飾群のヌクレオチドが、修飾２’位を含む。
【０１１４】
別の態様では、センス鎖が、複数の修飾群を含み、各修飾群が、同一の形で修飾された１個以上の修飾ヌクレオチドからなり、各修飾群が、片側または両側において、隣接群により挟まれ、前記各隣接群が、非修飾であるかまたは前記修飾群のヌクレオチドとは異なる形で修飾されている１個以上のヌクレオチドからなる。一実施形態では、センス鎖内における各修飾群が同一である。別の実施形態では、各隣接群が、同等数のヌクレオチドを有する。別の実施形態では、各隣接群が同一である。別の実施形態では、センス鎖内における前記修飾群のヌクレオチドが、修飾塩基を含む。別の実施形態では、前記修飾群のヌクレオチドが、修飾リン酸骨格を含む。別の実施形態では、前記修飾群のヌクレオチドが、修飾２’位を含む。
【０１１５】
別の態様では、アンチセンス鎖およびセンス鎖の各々が、複数の修飾群を含み、各修飾群が、同一の形で修飾された１個以上の修飾ヌクレオチドからなり、各修飾群が、片側または両側において、隣接群により挟まれ、前記各隣接群が、非修飾であるかまたは前記修飾群のヌクレオチドとは異なる形で修飾されている、１個以上のヌクレオチドからなる。一実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖内における各修飾群が同一である。別の実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖内における各隣接群が、同等数のヌクレオチドを有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖内における各隣接群が同一である。別の実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖内における前記修飾群のヌクレオチドの各々が、同じ修飾群および同じ隣接群を含む。別の実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖内における前記修飾群のヌクレオチドの各々が、修飾塩基を含む。別の実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖内における前記修飾群のヌクレオチドの各々が、修飾リン酸骨格を含む。別の実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖内における前記修飾群のヌクレオチドの各々が、修飾２’位を含む。
【０１１６】
別の態様では、修飾群および隣接群が、アンチセンス鎖上において、規則的なパターンを形成する。別の態様では、修飾群および隣接群が、センス鎖上において、規則的なパターンを形成する。一実施形態では、修飾群および隣接群が、アンチセンス鎖上およびセンス鎖上の両方において、規則的なパターンを形成する。別の実施形態では、修飾群および隣接群が、アンチセンス二重鎖領域上において、規則的なパターンを形成する。別の態様では、修飾群および隣接群が、センス二重鎖領域上において、規則的なパターンを形成する。一実施形態では、修飾群および隣接群が、アンチセンス二重鎖領域上およびセンス二重鎖領域上の両方において、規則的なパターンを形成する。
【０１１７】
別の態様では、パターンが、空間パターンまたは位置パターンである。空間パターンまたは位置パターンとは、ヌクレオチド（複数可）が、二本鎖部分のヌクレオチド配列内におけるそれらの位置に応じて修飾されていることを意味する。したがって、修飾されるヌクレオチドが、ピリミジンまたはプリンのいずれであるかは問題とならない。むしろ、修飾ヌクレオチドの位置は、（ａ）核酸鎖上においてそれが番号付けされた位置（該鎖の５’末端のヌクレオチドを１位として、５’末端から３’末端へとヌクレオチドを番号付けする（アンチセンス鎖およびセンス鎖のいずれも、それら各々の５’末端のヌクレオチドから番号付けする））、または（ｂ）隣接群に対する修飾群の位置に依存する。したがって、この実施形態によれば、修飾パターンは、修飾される配列に関わらず常に同じである。
【０１１８】
別の実施形態では、アンチセンス鎖上における修飾群の数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。別の実施形態では、センス鎖上における修飾群の数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。別の実施形態では、核酸のアンチセンス鎖上における隣接群の数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。別の実施形態では、核酸のセンス鎖上における隣接群の数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。一実施形態では、アンチセンス鎖上およびセンス鎖上の一方または両方における修飾群の数および隣接群の数が同じである。
【０１１９】
別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域上における修飾群の数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。別の実施形態では、センス二重鎖領域上における修飾群の数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。別の実施形態では、核酸のアンチセンス二重鎖領域上における隣接群の数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。別の実施形態では、核酸のセンス二重鎖領域上における隣接群の数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。一実施形態では、アンチセンス二重鎖領域上およびセンス二重鎖領域上の一方または両方における修飾群の数および隣接群の数が同じである。
【０１２０】
一実施形態では、鎖上または二重鎖領域上における修飾群の数および隣接群の数が同じである。別の実施形態では、鎖上または二重鎖領域上における修飾群の数および隣接群の数が同じであり、その数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。
【０１２１】
別の実施形態では、修飾群内におけるヌクレオチド数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。別の実施形態では、隣接群内におけるヌクレオチド数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。
【０１２２】
一実施形態では、アンチセンス鎖上およびセンス鎖上の両方における各修飾群が同一である。一実施形態では、アンチセンス二重鎖領域上およびセンス二重鎖領域上の両方における各修飾群が同一である。別の実施形態では、アンチセンス鎖上およびセンス鎖上の両方における各修飾群および各隣接群が同一である。別の実施形態では、アンチセンス二重鎖上およびセンス二重鎖上の両方における各修飾群および各隣接群が同一である。
【０１２３】
一実施形態では、アンチセンス鎖上およびセンス鎖上の両方における各修飾群、各修飾群の位置、各隣接群、および各隣接群の位置が同一である。一実施形態では、アンチセンス二重鎖上およびセンス二重鎖上の両方における各修飾群、各修飾群の位置、各隣接群、および各隣接群の位置が同一である。別の実施形態では、アンチセンス鎖上における修飾群が、センス鎖上における修飾群と相補的である（アンチセンス鎖およびセンス鎖上における修飾群が、互いに全体にわたり完全に整列される）。別の実施形態では、アンチセンス鎖上における各修飾群が、センス鎖上における各修飾群と塩基対合するように、修飾群においてミスマッチが見られない。別の実施形態では、センス鎖上における各修飾群が、アンチセンス鎖上における修飾群に対して、１、２、３、４、または５ヌクレオチドシフトしている。例えば、センス鎖上における各修飾群が、１ヌクレオチドシフトし、アンチセンス鎖上における修飾群が、１位で始まったとした場合、センス鎖上における修飾群は、２位で始まるであろう。別の実施形態では、アンチセンス鎖の修飾群がセンス鎖の修飾群と重複しない、すなわち、アンチセンス鎖上における修飾群のヌクレオチドが、センス鎖上における修飾群のヌクレオチドと塩基対合しない。
【０１２４】
一実施形態では、核酸鎖の末端におけるデオキシリボヌクレオチドが、修飾群の位置を決定する場合に考慮されない、すなわち、位置の番号付けが、第１のリボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドで始まる。別の実施形態では、核酸鎖の末端における脱塩基ヌクレオチドが、修飾群の位置を決定する場合に考慮されない。
【０１２５】
一態様では、修飾群が、アンチセンス鎖およびセンス鎖の一方または両方の５’末端のヌクレオチドを含む。別の実施形態では、隣接群が、アンチセンス鎖およびセンス鎖の一方または両方の５’末端のヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖の一方または両方の５’末端のヌクレオチドが、非修飾である。別の実施形態では、修飾群が、アンチセンス二重鎖領域およびセンス二重鎖領域の一方または両方の最も５’側のヌクレオチドを含む。別の実施形態では、隣接群が、アンチセンス二重鎖領域およびセンス二重鎖領域の一方または両方の最も５’側のヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域およびセンス二重鎖領域の一方または両方の最も５’側のヌクレオチドが、非修飾である。別の実施形態では、アンチセンス鎖の１０位におけるヌクレオチドが、非修飾である。別の実施形態では、センス鎖の１０位におけるヌクレオチドが、非修飾である。別の実施形態では、修飾群が、センス鎖の１０位におけるヌクレオチドを含む。
【０１２６】
一実施形態では、２’位における修飾が、アミノ、フルオロ、メトキシ、アルコキシ、およびＣ１〜Ｃ３のアルキルを含む群から選択される。別の実施形態では、修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾である。
【０１２７】
別の実施形態では、各修飾群が１つのヌクレオチドからなり、各隣接群が１つのヌクレオチドからなる。一実施形態では、アンチセンス鎖上における各修飾群が、センス鎖上における隣接群により整列される。
【０１２８】
別の態様では、各修飾群が、１つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドからなり、各隣接群が、１つのヌクレオチドからなる。一実施形態では、各隣接群が、１つの非修飾ヌクレオチドからなる。一実施形態では、各隣接群が、１つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドからなる。別の実施形態では、アンチセンス鎖上およびセンス鎖上の両方における各修飾群が、１つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖上およびセンス鎖上の両方における各隣接群が１つのヌクレオチドからなり、１つの鎖上における修飾群が、他の鎖上における別の修飾群により整列されることがないか、またはこれにより整列されることがなく、かつ、これと共に塩基対合することがなく、１つの鎖上における隣接群が、他の鎖上における隣接群により整列されることがないか、またはこれにより整列されることがなく、かつ、これと共に塩基対合することがない。別の実施形態では、任意選択的な突出を除外すれば、各鎖上における各修飾群が、他の鎖上における隣接群により整列されることがないか、またはこれにより整列されることがなく、かつ、これと共に塩基対合することがない。一実施形態では、隣接群が非修飾である。別の実施形態では、アンチセンス鎖上における１位のヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾されている。別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域の最も５’側のヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾されている。
【０１２９】
位置修飾のスキームについては、参照することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする国際特許出願第ＷＯ２００４／０１５１０７号において説明されている。
【０１３０】
リン酸骨格に対する修飾：別の二次的な態様は、リン酸骨格に対する修飾に関する。本発明のｓｉＲＮＡのヌクレオチドの全部または一部は、非修飾核酸において見出される通り、ホスホジエステル結合を介して連結されうる。しかし、本発明のｓｉＲＮＡは、修飾ホスホジエステル結合を含みうる。アンチセンス鎖またはセンス鎖のホスホジエステル結合を修飾して、窒素および硫黄からなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を独立して包含させることができる。一実施形態では、リボヌクレオチドを、隣接するリボヌクレオチドに連結するホスホエステル基を、修飾基により置換する。一実施形態では、ホスホエステル基を置換する修飾基が、ホスホロチオエート基、メチルホスホネート基、またはホスホルアミデート基からなる群から選択される。
【０１３１】
一実施形態では、アンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが、ホスホジエステル結合を介して連結される。別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域のすべてのヌクレオチドが、ホスホジエステル結合を介して連結される。別の実施形態では、センス鎖のすべてのヌクレオチドが、ホスホジエステル結合を介して連結される。別の実施形態では、センス二重鎖領域のすべてのヌクレオチドが、ホスホジエステル結合を介して連結される。別の実施形態では、アンチセンス鎖が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０から選択される数の修飾ホスホエステル基を含む。別の実施形態では、アンチセンス二重鎖領域が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０から選択される数の修飾ホスホエステル基を含む。別の実施形態では、センス鎖が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０から選択される数の修飾ホスホエステル基を含む。別の実施形態では、センス二重鎖領域が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０から選択される数の修飾ホスホエステル基を含む。
【０１３２】
５’末端および３’末端における修飾：別の二次的な態様は、５’修飾および３’修飾に関する。本発明のｓｉＲＮＡは、センス鎖上およびアンチセンス鎖上の一方または両方の５’末端または３’末端における１個以上の修飾ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、非環式リボヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチドを含む核酸分子を包含しうる。一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の５’末端および３’末端のヌクレオチドが、非修飾である。別の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドが、修飾されている。別の実施形態では、センス鎖の５’末端のヌクレオチドが、修飾されている。別の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端のヌクレオチドが、修飾されている。別の実施形態では、センス鎖の３’末端のヌクレオチドが、修飾されている。別の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドおよびセンス鎖の５’末端のヌクレオチドが、修飾されている。別の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端のヌクレオチドおよびセンス鎖の３’末端のヌクレオチドが、修飾されている。別の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドおよびセンス鎖の３’末端のヌクレオチドが、修飾されている。別の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端のヌクレオチドおよびセンス鎖の５’末端のヌクレオチドが、修飾されている。別の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端のヌクレオチドならびにセンス鎖の５’末端および３’末端両方のヌクレオチドが、修飾されている。別の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端および３’末端両方のヌクレオチドが、修飾されている。別の実施形態では、センス鎖の５’末端および３’末端両方のヌクレオチドが、修飾されている。
【０１３３】
別の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドが、リン酸化されている。別の実施形態では、センス鎖の５’末端のヌクレオチドが、リン酸化されている。別の実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖両方の５’末端のヌクレオチドが、リン酸化されている。別の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドが、リン酸化されており、センス鎖の５’末端のヌクレオチドが、遊離ヒドロキシル基（５’−ＯＨ）を有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドが、リン酸化されており、センス鎖の５’末端のヌクレオチドが、修飾されている。
【０１３４】
５’末端および３’末端のヌクレオチドに対する修飾は、これらの末端ヌクレオチドにおける５’位および３’位に限定されない。末端ヌクレオチドに対する修飾の例には、とりわけ、例えば、参照することによりそれらの全体が本明細書の一部をなすものとするＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／５４４５９、欧州特許ＥＰ０５８６５２０Ｂ１、またはＥＰ０６１８９２５Ｂ１において説明される、ビオチン、反転（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）（デオキシ）脱塩基、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＣＮ、ＣＦ、メトキシ、イミダゾール、カルボキシレート、チオエート、Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリルまたはアラルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、またはＮ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２、Ｎ３；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ、または置換シリルが含まれるがこれらに限定されない。本明細書で用いられる「アルキル」とは、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルを意味し、「低級アルキル」とは、Ｃ１アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、およびＣ６アルキルを含めたＣ１〜Ｃ６アルキルを意味する。
【０１３５】
別の態様では、アンチセンス鎖の５’末端、センス鎖の５’末端、アンチセンス鎖の３’末端、またはセンス鎖の３’末端が、共有結合を介してプロドラッグ部分に連結される。一実施形態では、該部分が、エンドソーム内において切断される。別の実施形態では、該部分が、細胞質内において切断される。
【０１３６】
異なる種類の末端修飾（複数可）を有する、本発明のｓｉＲＮＡの各種の可能な非限定的実施形態を、以下の表に示す。
【０１３７】
【表１】
2012517815.tif 000002
別の実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖の一方または両方の３’末端の１つのヌクレオチド、または３’末端の２つのヌクレオチドが、２’−デオキシヌクレオチドである。別の実施形態では、該２’−デオキシヌクレオチドが、２’−デオキシピリミジンである。別の実施形態では、該２’−デオキシヌクレオチドが、２’−デオキシチミジンである。
【０１３８】
ｓｈＲＮＡおよび連結ｓｉＲＮＡ：別の態様は、ｓｈＲＮＡおよび連結ｓｉＲＮＡに関する。二本鎖構造が、２つの個別の鎖、すなわち、アンチセンス鎖およびセンス鎖により形成されることは、本発明の範囲内にある。しかし、また、アンチセンス鎖およびセンス鎖を、互いに対して共有結合させることも、本発明の範囲内にある。このような連結は、アンチセンス鎖およびセンス鎖をそれぞれ形成する任意のヌクレオチド間において生じうる。このような連結は、共有結合により形成される場合もあり、非共有結合により形成される場合もある。共有結合は、メチレンブルーおよび二官能性基を含む群から好ましくは選択される化合物により、両方の鎖を、それぞれ、１回以上にわたり、１以上の位置において連結することにより形成することができる。このような二官能性基は、ビス（２−クロロエチル）アミン、Ｎ−アセチル−Ｎ’−（ｐ−グリオキシル−ベンゾイル）シスタミン、４−チオウラシル、およびソラーレンを含む群から選択されることが好ましい。
【０１３９】
一態様では、アンチセンス鎖およびセンス鎖が、ループ構造により連結される。別の実施形態では、ループ構造が、非核酸ポリマーを含む。別の実施形態では、非核酸ポリマーが、ポリエチレングリコールである。別の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端が、センス鎖の３’末端へと連結される。別の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端が、センス鎖の５’末端へと連結される。
【０１４０】
別の態様では、ループが、核酸からなる。本明細書で用いられるロックされた核酸（ＬＮＡ）（ＥｌａｙａｄｉおよびＣｏｒｅｙ（２００１）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ．２（４）：５５８〜６１）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｆａｓｅｂ  Ｊ．（２０００）、１４：１０４１〜１０６０に掲載）は、核酸としてみなされ、これらもまた、ループ形成ポリマーとして用いることができる。一実施形態では、核酸が、リボ核酸である。一実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端が、センス鎖の３’末端に連結される。別の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端が、センス鎖の５’末端に連結される。ループは、最小で４ヌクレオチドまたは４ヌクレオチド類似体の長さからなる。一実施形態では、ループが、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５から選択される長さのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体からなる。一実施形態では、ループの長さが、ループ構造または類似の構造を介してバックフォールディングが生じる形で２本の鎖を結合させるのに十分である。リボ核酸構築物は、適切なベクター系へと組み込むことができる。ベクターは、ＲＮＡｉを発現させるためのプロモーターを含むことが好ましい。好ましくは、各プロモーターが、ｐｏｌ  ＩＩＩであり、より好ましくは、該プロモーターが、Ｇｏｏｄら（１９９７）、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、４、４５〜５４において説明されるＵ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、７ＳＫプロモーターである。
【０１４１】
別の実施形態では、本発明による核酸が、ヌクレオチド間におけるホスホロチオエート結合を含む。一実施形態では、ヌクレオチド間におけるホスホロチオエート結合が、アンチセンス鎖およびセンス鎖の一方または両方の３’末端または５’末端から５ヌクレオチドの範囲内にある。アンチセンス鎖は、ヌクレオチド間における約１〜約５個のホスホロチオエート結合を含みうる。
【０１４２】
実施形態の組合せ：
一実施形態では、センス鎖の３’末端における突出が、１、２、３、４、および５ヌクレオチドの長さからなる群から選択される。一実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端における突出が、１、２、３、４、および５ヌクレオチドの長さからなる群から選択される。一実施形態では、センス鎖の５’末端における突出が、１、２、３、４、および５ヌクレオチドの長さからなる群から選択される。
【０１４３】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子が、両方の末端において平滑末端であり、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９個の連続ヌクレオチドからなる群から選択される長さである。
【０１４４】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子が、一方の末端において平滑末端であり、ｓｉＲＮＡ分子の二本鎖部分が、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９個の連続ヌクレオチドからなる群から選択される長さである。
【０１４５】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子が、両方の末端において突出を有し、ｓｉＲＮＡ分子の二本鎖部分が、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９個の連続ヌクレオチドからなる群から選択される長さである。
【０１４６】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子が突出を含み、前記突出が、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子が突出を含み、前記突出が、２つのデオキシリボヌクレオチドを含む。
【０１４７】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子が、アンチセンス鎖の３’末端およびセンス鎖の３’末端において突出を有し、前記突出が、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子が、アンチセンス鎖の３’末端およびセンス鎖の３’末端において突出を有し、前記突出が、２つのデオキシリボヌクレオチドを含む。
【０１４８】
突出を形成するヌクレオチド（複数可）は、デオキシリボヌクレオチド（複数可）、リボヌクレオチド（複数可）、またはこれらの組合せでありうる。一実施形態では、アンチセンス鎖および／またはセンス鎖が、３’末端において、ＴＴジヌクレオチドを含む。
【０１４９】
作製の方法：本発明の核酸は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、ランオフ転写）またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける核酸の化学合成または発現を含め、当技術分野におけるルーチンの方法を用いて作製することができる。一実施形態では、ｓｉＲＮＡが、固相化学合成を用いて作製される。別の実施形態では、核酸が、発現ベクターを用いて作製される。一実施形態では、発現ベクターにより、標的細胞内において、本発明の核酸が作製される。したがって、このようなベクターを、薬剤の製造に用いることができる。本明細書で説明される核酸分子を合成する方法は、当業者に知られている。このような方法は、とりわけ、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、１９９２、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１、３〜１９、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、国際ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４４５９、Ｗｉｎｃｏｔｔら、１９９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３、２６７７〜２６８４、Ｗｉｎｃｏｔｔら、１９９７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．、７４、５９、Ｂｒｅｎｎａｎら、１９９８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．、６１、３３〜４５、およびＢｒｅｎｎａｎ、米国特許第６，００１，３１１号（各々が、参照することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする）において説明されている。
【０１５０】
驚くべきことに、以下のＡＮＧ２の配列を標的とするｓｉＲＮＡは、ＡＮＧ２の発現を低減することに関し、驚くべき程度に高い活性を示す。肺炎球菌に感染すると（肺炎に罹患すると）、ＡＮＧ２の発現が上方制御されることが示された。同時に、受容体を活性化するリガンドであるＡＮＧ１（ＡＮＧ２の対応物）およびＴＩＥ２の発現が驚くべき程度に下方制御されたことは、刺激を受けたときに、遺伝子発現のパターンが協調されることを示唆する。現在のところ、誘導下ならびに非誘導下における空間的な発現パターン、特に、細胞レベル（肺胞および気管支における上皮細胞レベルまたは内皮細胞レベル）における分布は明確ではない。
【０１５１】
強力なｓｉＲＮＡ分子についての初期のスクリーニングは、８つの被験分子のうち２つ（配列番号１４および１６）が、ＡＮＧ２をサイレンシングする有効性において同様に高度であることを示した。アンチセンス鎖である配列番号１４および１６の３’末端、ならびにセンス鎖（配列番号１５および１７）の５’末端の対応する相補的配列上における、４つの付加ヌクレオチドを介する伸長により、トランスフェクション実験後にＡＮＧ２をサイレンシングする有効性において差違を示す２３マーの分子（配列番号４８および５０（アンチセンス鎖）ならびに配列番号４９および５１（センス鎖））がもたらされたことは驚くべきことである。さらに驚くべきことに、マウスＡＮＧ２  ｍＲＮＡ内のセンス鎖に対しては１００％の相同性を反映するが、ヒト相同ｍＲＮＡに対しては１００％の相同性を反映しない（１つのミスマッチ）新規に生成された２３マーの配列（９番のｓｉＲＮＡ）が、ヒトに由来する内皮細胞株（ＨＵＶＥＣおよびＨＭＶＥＣ−Ｌ）におけるＡＮＧ２発現をやはりサイレンシングすることが可能であった。これに対し、ヒトＡＮＧ２に対して完全な相同性を示す配列（７番のｓｉＲＮＡ）が、サイレンシングの有効性を示さなかったことは、予測外である（図１４）。
【０１５２】
血管のバリア機能（血管透過性）の制御は、肺炎の進行、またはより一般的に、急性肺傷害（ＡＬＩ）、ならびに血管漏出により維持される他の炎症性疾患症候群に対して、目覚ましい影響を及ぼす。これに対し、他の科学的報告は、肺上皮細胞におけるＡＮＧ２の上方制御が、急性肺傷害の発症／進行に寄与すること（Ｂｈａｎｄａｒｉら、２００６）、または、誘導されたＡＮＧ２に対しては、推測されるアンタゴニスト活性ではなく、自己分泌性の、保護的／アゴニスト作用が存在すること（Ｄａｌｙら、２００６）を示唆している。これに照らして考えると、本発明者らが、リポソームにより製剤化したｓｉＲＮＡ（ＡｔｕＰＬＥＸ、Ｓａｎｔｅｌら、２００６）を静脈内投与する結果として、肺組織において、最も可能性が高い場合としては肺血管内皮細胞において、ＡＮＧ２の発現がある程度まで下方制御され、血管のバリア機能が改善されることを見出したことは、予測外である。これは、非製剤化ｓｉＲＮＡを吸入することにより、低酸素症により誘導される急性肺傷害の進行が阻害された報告とは大きく異なる。原則としては、本発明に従って、ＡＮＧ２をコードするｍＲＮＡの任意の部分を用いて、それぞれ、このようなｓｉＲＮＡ分子およびＲＮＡｉ分子をデザインすることができるが、本発明者らは、驚くべきことに、以下の表に示されるヌクレオチド位置で始まる配列が、ＡＮＧ２  ｍＲＮＡの発現を低減するのに適するｓｉＲＮＡ分子をもたらすことを見出した。
【０１５３】
【表２】
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【０１５４】
送達／製剤：
ｓｉＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのいずれにおいても、細胞と直接的に接触させるか（「裸の（ｎａｋｅｄ）」ｓｉＲＮＡ）、または細胞を標的化するか、もしくは細胞内へと送達することを容易にする１種以上の作用物質と組み合わせることを含め、当業者に知られる各種の方法により、細胞へと送達することができる。このような作用物質および方法には、リポプレックス、リポソーム、イオントフォレーシス、ハイドロゲル、シクロデキストリン、ナノカプセル、マイクロスフェアおよびナノスフェア、ならびにタンパク質性ベクター（例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．（１９９９）、１０：１０６８〜１０７４およびＷＯ００／５３７２２）が含まれる。核酸／媒体の組合せは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、直接的な注射によって局所到達することもでき、注入ポンプを用いることにより局所送達することもできる。本発明のｓｉＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、静脈内、皮下、筋肉内、もしくは皮内の注射、または吸入を含め、各種の手段により送達することができる。本発明の分子は、薬剤として用いることができる。薬剤は、対象における疾患状態の発生を防止、調節するか、またはこれを治療する（症状をある程度まで緩和し、好ましくは、すべての症状を緩和する）ことが好ましい。
【０１５５】
また、ポリ（エチレングリコール）脂質を含有する表面修飾リポソーム（ＰＥＧ修飾リポソーム、または長時間循環型リポソームもしくはステルスリポソーム）を含む組成物の使用も提供される。これらの製剤は、その凝集および融合を防止することにより、リポソーム溶液またはリポプレックス溶液の安定性を増大させる方法をもたらす。製剤にはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、単核食作用細胞系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン作用および除去に抵抗する利益も付加されており、それにより、血液循環時間を長くすること、およびカプセル製剤に対する組織暴露を増強することが可能である。このようなリポソームは、おそらく、新血管形成された標的組織内における溢出および捕捉により、腫瘍内に選択的に蓄積されることが示されている（Ｌａｓｉｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５、２６７、１２７５〜１２７６；Ｏｋｕら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１２３８、８６〜９０）。長時間循環型リポソームは、特に、ＭＰＳ組織内において蓄積することが知られる、従来の陽イオン性リポソームと比較して、ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態特性および薬力学特性を増強する（Ｌｉｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５、４２、２４８６４〜２４７８０；Ｃｈｏｉら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０３９１号；Ａｎｓｅｌｌら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０３９０号；Ｈｏｌｌａｎｄら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０３９２号）。長時間循環型リポソームはまた、ヌクレアーゼによる分解からもｓｉＲＮＡを保護する。
【０１５６】
本発明のｓｉＲＮＡは、医薬組成物として調合することができる。医薬組成物は、単独の、または他の薬剤と組み合わせた医薬として、または診断剤として用いることができる。例えば、本発明の１つ以上のｓｉＲＮＡを、担体、希釈剤などの送達媒体（例えば、リポソーム）および賦形剤と組み合わせることができる。防腐剤および安定化剤など、他の薬剤もまた添加することができる。核酸分子を送達する方法は当技術分野で知られており、例えば、Ａｋｈｔａｒら、１９９２、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．、２、１３９；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ａｋｈｔａｒ編、１９９５、Ｍａｕｒｅｒら、１９９９、Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂ．Ｂｉｏｌ．、１６、１２９〜１４０；ＨｏｆｌａｎｄおよびＨｕａｎｇ、１９９９、Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１３７、１６５〜１９２；ならびにＬｅｅら、２０００、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．、７５２、１８４〜１９２、米国特許第６，３９５，７１３号およびＰＣＴ  ＷＯ９４／０２５９５号（これらの各々が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる）において説明されている。本発明のｓｉＲＮＡはまた、他の治療化合物と組み合わせて投与することもでき、その投与は個別の場合もあり、同時、例えば、組合せ単位用量としての場合もある。一実施形態では、本発明が、安定化剤、防腐剤、希釈剤、緩衝剤など、生理学的／薬学的に許容される賦形剤中に、本発明による１つ以上のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物を包含する。
【０１５７】
本発明の医薬および医薬組成物の用量レベルは、ルーチンな実験によって当業者により決定されうる。一実施形態では、単位用量が、約０．０１ｍｇ／体重ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重ｋｇのｓｉＲＮＡを含有する。一実施形態では、ｓｉＲＮＡの用量が、約１０ｍｇ／体重ｋｇ〜約２５ｍｇ／体重ｋｇである。一実施形態では、ｓｉＲＮＡの用量が、約１ｍｇ／体重ｋｇ〜約１０ｍｇ／体重ｋｇである。一実施形態では、ｓｉＲＮＡの用量が、約０．０５ｍｇ／体重ｋｇ〜約５ｍｇ／体重ｋｇである。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡの用量が、約０．１ｍｇ／体重ｋｇ〜約５ｍｇ／体重ｋｇである。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡの用量が、約０．１ｍｇ／体重ｋｇ〜約１ｍｇ／体重ｋｇである。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡの用量が、約０．１ｍｇ／体重ｋｇ〜約０．５ｍｇ／体重ｋｇである。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡの用量が、約０．５ｍｇ／体重ｋｇ〜約１ｍｇ／体重ｋｇである。
【０１５８】
一態様では、医薬組成物が、注射用の滅菌水性懸濁液または滅菌水溶液である。一態様では、医薬組成物が、乾燥凍結形態である。一実施形態では、医薬組成物が、本発明のｓｉＲＮＡを含む乾燥凍結リポプレックスを含む。別の実施形態では、医薬組成物が、本発明のｓｉＲＮＡを含むリポプレックスの水性懸濁液を含む。
【０１５９】
本発明の医薬組成物および医薬は、開示される治療法において、対象（哺乳動物）に投与することができる。一実施形態では、哺乳動物が、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットからなる群から選択される。一実施形態では、哺乳動物がヒトである。別の実施形態では、哺乳動物が非ヒト哺乳動物である。
【０１６０】
一実施形態では、本発明は、本発明によるｓｉＲＮＡを含むリポプレックスに関する。このようなリポプレックスは、ｓｉＲＮＡおよびリポソームからなる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、このようなリポプレックスを用いて、本発明のｓｉＲＮＡを標的細胞へと送達することができる。
【０１６１】
一態様では、リポプレックスが、約４０〜５５ｍＶ、好ましくは、約４５〜５０ｍＶのゼータポテンシャルを有する。本発明によるリポプレックスのサイズは、例えば、製造元の推奨に従い、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製のＮ５型ミクロン未満粒子サイズ解析器を用いることなどによる、動的光散乱（ＱＥＬＳ）により決定される通り、約８０〜２００ｎｍ、約１００〜１４０ｎｍ、または約１１０ｎｍ〜１３０ｎｍである。
【０１６２】
一実施形態では、リポプレックスを形成する部分としてのリポソームは、
ａ）約５０モル％のβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド、好ましくは、β−（Ｌ−アルギニル）−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドと、
ｂ）約４８〜４９モル％の１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）と、
ｃ）約１〜２モル％の１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリエチレングリコール、好ましくは、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩と
からなる正に帯電したリポソームである。
【０１６３】
リポプレックス、およびリポソームを形成する脂質組成物は、担体中にあることが好ましいが、リポプレックスはまた、乾燥凍結形態でも存在しうる。担体中に含有される脂質組成物は通常、分散液を形成する。担体は、本明細書でもさらに特徴付けられる通り、水性媒体または水溶液であることがより好ましい。脂質組成物は、典型的には担体中においてリポソームを形成し、このようなリポソームは内部にも担体を含有することが好ましい。
【０１６４】
担体中に含有される脂質組成物、および担体は、それぞれ、約５０〜６００ミリオスモル／ｋｇ、好ましくは約２５０〜３５０ミリオスモル／ｋｇ、ならびにより好ましくは約２８０〜３２０ミリオスモル／ｋｇの浸透圧を有することが好ましい。
【０１６５】
リポソームは、第１の脂質成分と、任意選択的に、好ましくは該第１の脂質成分と組み合わせた第１のヘルパー脂質とによって形成されることが好ましく、約２０〜２００ｎｍ、好ましくは約３０〜１００ｎｍ、より好ましくは約４０〜８０ｎｍの粒子サイズを示すことが好ましい。粒子のサイズは、特定の統計学的分布に従うことが注目される。
【０１６６】
本発明による脂質組成物についての、さらなる任意選択的な特徴は、担体のｐＨが、好ましくは約４．０〜６．０であることである。しかし、４．５〜８．０、好ましくは約５．５〜７．５、より好ましくは約６．０〜７．０など、他のｐＨ範囲もまた、本発明の範囲内にある。
【０１６７】
これらの特定の特徴を認識するために、各種の測定を行うことができる。例えば、浸透圧を調整するには、糖または糖の組合せが特に有用である。これまでのところ、本発明の脂質組成物は、以下の糖、すなわちスクロース、トレハロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、マルトース、ラクツロース、イヌリン、およびラフィノースのうちの１種以上を含むことが可能であり、スクロース、トレハロース、イヌリン、およびラフィノースが特に好ましい。特に好ましい実施形態では、多くの場合、糖を添加することにより調整される浸透圧は、約３００ミリオスモル／ｋｇであり、これは、２７０ｍＭのスクロース溶液または２８０ｍＭのグルコース溶液に対応する。担体は、このような脂質組成物が投与される体液と等張性であることが好ましい。本明細書で用いられる、多くの場合、糖を添加することにより浸透圧が調整されるという表現は、浸透圧の少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％が、前記糖または前記糖の組合せによりもたらされることを意味する。
【０１６８】
本発明の脂質組成物のｐＨを調整する場合、調整は、緩衝液物質を用いることによりなされ、緩衝液物質自体は当業者に基本的に知られている。陽イオン性脂質、より具体的には、陽イオン性頭部基のアンモニウム基の塩基性性質を補完するのに適する塩基性物質を用いることが好ましい。塩基性アミノ酸および弱塩基などの塩基性物質を添加する場合は、それぞれ、上記の浸透圧を考慮に入れる。このような脂質組成物、ならびにこのような脂質組成物により形成されるリポソームの粒子サイズは、製造元の推奨に従い、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製のＮ５型サブミクロン粒子サイズ分析器を用いることなどによる、動的光散乱により決定することが好ましい。
【０１６９】
脂質組成物が、１以上の核酸（複数可）を含有する場合、このような脂質組成物は通常、リポプレックス（リポソーム−核酸複合体）を形成する。好ましくは、等張性の２７０ｍＭスクロースまたは２８０ｍＭグルコース中のリポプレックス内におけるより好ましい全脂質内容物の濃度は、約０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜４０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０１〜２５ｍｇ／ｍｌである。十分量のストックを調製するには、この濃度を、典型的には２〜３倍増大させうることを認めるものとする。これに基づき、浸透圧が上記で特定した範囲内にあるようにすることが典型的である希釈液を調製することもまた、本発明の範囲内にある。より好ましくは、希釈液は、機能に関して同一であり、より具体的に述べると、脂質組成物と組み合わせて用いられる担体と浸透圧が同様である担体、またはその中に脂質組成物が含有される担体中において調製される。核酸、好ましくは、ｓｉＲＮＡなどであるがこれに限定されない機能的核酸もまた含む本発明の脂質組成物の実施形態では、脂質組成物中における機能的核酸、好ましくはｓｉＲＮＡの濃度が、約０．２〜０．４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２８ｍｇ／ｍｌであり、全脂質濃度が、約１．５〜２．７ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２．１７ｍｇ／ｍｌである。核酸画分と脂質画分とのこの質量比はまた、これにより認識される電荷比との関連でも特に好ましいことを認めるものとする。本発明の脂質組成物の任意のさらなる濃縮液または希釈液との関連では、この特定の実施形態で認識される質量比および電荷比がそれぞれ、このような濃縮液または希釈液に関わらず維持されることが好ましい。
【０１７０】
例えば、医薬組成物において用いられるこのような濃縮液は、適量の媒体、好ましくは生理学的に許容される緩衝液、もしくは本明細書で説明される任意の担体中において脂質を分散させることにより得ることもでき、適切な手段により濃縮することもできる。このような適切な手段は、例えば、十字流限外濾過を含めた限外濾過法である。フィルター膜は、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）が１，０００〜３００，０００Ｄａであるか、または５ｎｍ〜１μｍの小孔径を示しうる。約１０，０００〜１００，０００Ｄａ  ＭＷＣＯの小孔径が好ましい。本発明による脂質組成物、より具体的には、リポプレックスが、乾燥凍結形態で存在しうることもまた、当業者により認められる。このような乾燥凍結形態は、リポプレックスの保管寿命を延長するのに適することが典型的である。とりわけ、適切な浸透圧をもたらすのに添加される糖は、それらと関連して、凍結保護剤として用いられる。これと関連して、浸透圧、ｐＨ、ならびにリポプレックス濃度について前述した特徴は、担体中における脂質組成物の溶解形態、懸濁形態、または分散形態を指し、このような担体は、原則として、本明細書で説明される任意の担体であり、水または生理学的に許容される緩衝液、好ましくは等張性緩衝液または等張性溶液などの水性担体であることが典型的である。
【０１７１】
疾患：本発明の一態様は、ＡＮＧ２の発現を低減し、ヒト疾患およびヒトの病理学的状態を治療するのに有用なｓｉＲＮＡ分子を提供する。ｓｉＲＮＡ分子を他の治療剤と組み合わせて用いて、所与の治療法の治療効果を増強することができる。別の態様では、本発明が、細胞内において、望ましくないかまたは異常なレベルのＡＮＧ２活性を特徴とする疾患および状態を治療するのに有用な試薬および方法を提供する。
【０１７２】
本発明の別の態様は、皮膚の過剰増殖性状態（例えば、乾癬および／または接触性皮膚炎）、または他の過剰増殖性疾患を治療するための材料および方法を用いている。本発明の別の態様は、各種の網膜症、子宮内膜症、子宮筋腫、ならびに子宮内膜における微小血管増殖など、機能不全性血管増殖と関連する他のこのような状態の治療を包含し、本明細書で開示されるｓｉＲＮＡ分子を対象に投与することを含む。本発明のさらに別の態様は、炎症（例えば、関節炎、関節リウマチなど）を治療する方法であって、本明細書で開示されるｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１７３】
本明細書で開示される、治療されうるヒト疾患およびヒトの病理学的状態の非限定的な例には、急性肺傷害（ＡＬＩ）、急性呼吸促窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、アテローム性動脈硬化、遺伝性出血性毛細血管拡張症、海綿状血管腫、血管新生誘導性肥満、移植後動脈症、乾癬、糖尿病性網膜症、炎症性腸疾患、および歯周病、腹水、子宮内膜症、月経過多、関節炎、肺高血圧、肺炎、子癇前症、肺線維症、肺気腫、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、膵炎、敗血症、血栓症、虚血性心疾患、炎症、多発性硬化症、脳卒中、および黄斑変性が含まれる。
【実施例１】
【０１７４】
［材料と方法］
（細胞株）
マウスＢ１６Ｖ黒色腫細胞およびマウス内皮ＭＳ−１細胞を、ＡＴＣＣ／ＬＧＣ  Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ社から得て、製造元の推奨に従い培養した。ＥＢＭ２＋  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ増殖用補充物質を含有するＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ培地中において、ＨＵＶＥＣ（Ｌｏｎｚａ社製）を培養した。
【０１７５】
（培養細胞のトランスフェクションおよびｍＲＮＡレベルの定量）
既に説明した通り（Ｓａｎｔｅｌら、２００６）、表示の細胞数およびｓｉＲＮＡ濃度で、マウスＢ１６Ｖ黒色腫細胞およびマウス内皮ＭＳ−１細胞に、リポプレックス化させたｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に細胞を溶解させ、全ＲＮＡを調製した（Ｉｎｖｉｔｅｋ社製、Ｉｎｖｉｓｏｒｂ  Ｓｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  ＲＮＡ単離キット）。その後、全ＲＮＡを、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法（ＡＢＩ社製、ＴａｑＭａｎ）を用いるｍＲＮＡ定量アッセイに用いた。表示されるｍＲＮＡの標準化レベルは、標的遺伝子および基準遺伝子の両方についての発現レベルを示す２−（ΔΔＣｔ）法により決定した。
【０１７６】
（ｓｉＲＮＡを含有するリポプレックスの全身送達）
４日間連続で、２００μｌ溶液を、尾静脈に静脈内ボーラス注射することにより、ｓｉＲＮＡリポプレックスを、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスに全身投与した。既に説明した通り（Ｓａｎｔｅｌら、２００６）、リポプレックス溶液は、２１．７ｍｇ／ｋｇの全脂質（ＡｔｕＦＥＣＴ０１、ＤＰｈｙＰＥ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）と共に複合体化させた、２．８ｍｇ／ｋｇの最終用量でｓｉＲＮＡを含有した。
【０１７７】
（マウスの肺炎球菌肺炎における肺微小血管漏出）
動物に対するすべての手順は、現地の規制当局による承認を受けた。既に説明した通り（Ｓｃｈｍｅｃｋら、２００４；Ｏｐｉｔｚら、２００４）、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスに、５×１０６コロニー形成単位の肺炎球菌（ＮＣＴＣ  ７９７８）を経鼻感染させた。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を静脈内適用し、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った後で、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定アッセイ）（テキサス州、モンゴメリー、Ｂｅｔｈｙｌ社製）（Ｍａｔｕｔｅ−Ｂｅｌｌｏら、２００１）により、ＢＡＬおよび血清中におけるＨＳＡ濃度を測定し、ＨＳＡのＢＡＬ／血清比を計算した。
【０１７８】
（単離灌流マウス肺（ＩＰＭＬ））
既に説明した通りに、ＢＡＬＢ／ｃマウスの肺を調製した。略述すると、麻酔をかけたマウスを気管切開および換気した。胸骨切開し、左心房および肺動脈にカニューレ挿入し、３７℃のクレブス−ヘンゼルライトの滅菌ヒドロキシエチルアミロペクチン緩衝液（ドイツ、Ｓｅｒａｇ社製、１ｍＬ／分）により肺を灌流し、陰圧（−４．５〜−９．０ｃｍ  Ｈ２Ｏ）により換気した。圧力トランスデューサーにより肺動脈圧（Ｐｐａ）および肺静脈圧を持続的にモニタリングし、デジタルデータ化した。Ｇｒａｐｈ−Ｐａｄ−４ソフトウェア（米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）により、Ｐｐａ曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。説明される通り（Ｐａｔｏｎら、１９９３）に組換えＰＬＹ（ニューモリシン）を調製し、肺動脈内へと注入するか、またはマイクロスプレー装置（ペンシルベニア州、フィラデルフィア、Ｐｅｎｎ−Ｃｅｎｔｕｒｙ社製）を用いて気管内エアゾール投与した。肺胞毛細血管の透過性を測定するため、ＰＬＹを適用する前に、灌流物にＨＳＡを混合した（０．０４％）。ＰＬＹ接種の３０分後、ＢＡＬを実施し、ＢＡＬ上清中においてＨＳＡ濃度を測定した。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるデータを、平均＋／−ＳＥＭとして表した。一元分散分析の後、ステューデント・ニューマン・クールズ検定により、差違を解析した。
【実施例２】
【０１７９】
［ＡＮＧ−２特異的なｓｉＲＮＡ分子］
アンジオポエチン２（Ａｎｇ−２）をコードするｍＲＮＡを指向するｓｉＲＮＡ分子（ＡｔｕＲＮＡｉ、表１および２を参照されたい）、ならびにルシフェラーゼを指向し、本明細書で説明される実験および実施例と関連して用いられた各種のｓｉＲＮＡ分子は、ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ社（ドイツ、フランクフルトアムマイン）により合成されたものであり、これらを、本発明の二本鎖核酸分子を形成する第１の鎖および第２の鎖両方の配列に関して、表１に示す。
【０１８０】
【表３】
2012517815.tif 000004
【０１８１】
【表４】
2012517815.tif 000005
【０１８２】
【表５】
2012517815.tif 000006
【０１８３】
【表６】
2012517815.tif 000007
【０１８４】
「Ａ」は、本明細書で第１の鎖とも称するアンチセンス鎖を表し、「Ｂ」は、本明細書で第２の鎖とも称するセンス鎖を表す。これに反する指示が明示的になされるのでない限り、本出願で示される任意の配列は、５’→３’方向で示されることに注意されたい。
【０１８５】
特定の実施形態では、１個以上の奇数番号を付したヌクレオチド（または各奇数番号を付したヌクレオチド）の２’位において（例えば、２’−Ｏ−メチル基により）アンチセンス鎖（上記の表中に示される）を修飾することができ、１個以上の偶数番号を付したヌクレオチドは、非修飾のままとする（例えば、各非修飾ヌクレオチドの２’位にＯＨ基が存在し、例えば、各非修飾ヌクレオチドは修飾されない）。１個以上の偶数番号を付したヌクレオチド（または各偶数番号を付したヌクレオチド）の２’位において（例えば、２’−Ｏ−メチル基により）センス鎖を修飾することができ、１個以上の奇数番号を付したヌクレオチドは、非修飾のままとすることができる（例えば、各非修飾ヌクレオチドの２’位にＯＨ基が存在し、例えば、各奇数番号を付したヌクレオチドは修飾されない）。
【０１８６】
代替的な実施形態は、１個以上の偶数番号を付したヌクレオチド（または各偶数番号を付したヌクレオチド）の２’位において（例えば、２’−Ｏ−メチル基により）修飾されたアンチセンス鎖（上記で示した）を提供し、センス鎖は、１個以上の奇数番号を付したヌクレオチド（または各奇数番号を付したヌクレオチド）の２’位において（例えば、２’−Ｏ−メチル基により）修飾される。これらの代替的な実施形態では、１個以上の非修飾ヌクレオチドが、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方において存在する（例えば、これらの代替的な実施形態の各々では、非修飾ヌクレオチドが、２’位においてＯＨ基を有する）。特定の実施形態では、各奇数番号を付したヌクレオチドが、アンチセンス鎖において非修飾であり、本段落で論じた代替的な実施形態では、各偶数番号を付したヌクレオチドが、センス鎖において非修飾である。
【実施例３】
【０１８７】
［Ａｎｇ２特異的なｓｉＲＮＡ分子のリポプレックス製剤］
本明細書ではまた、Ａｎｇ２特異的なｓｉＲＮＡ分子を含有するリポプレックス製剤を、ｓｉＲＮＡリポプレックスまたはｓｉＲＮＡＡｎｇ２リポプレックスとも称する。脂質膜を、３００ｍＭのＲＮａｓｅを含まない滅菌スクロース溶液中に、４．３４ｍｇ／ｍｌの全脂質濃度まで再水和することにより、５０／４９／１のモル比で、特許で保護された陽イオン性脂質であるＡｔｕＦＥＣＴ０１（β−（Ｌ−アルギニル）−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド、Ｓｉｌｅｎｃｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ＡＧ社製）、中性リン脂質である１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）（アラバマ州、アラバスター、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製）、およびＰＥＧ化脂質であるＮ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）（ドイツ、ルートヴィッヒシャーフェン、Ｌｉｐｏｉｄ  ＧｍｂＨ社製）を混合した。ＩＰＭＬおよび肺炎球菌感染についての実験の場合、このような製剤は、２１．７ｍｇ／ｋｇの全脂質と共に複合体化させた、２．８ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡであり、これを、４日間連続で静脈内ボーラスにより注射した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の場合は、１μｇ／ｍｌでＡｔｕＦＥＣＴ０１−ＤＰｈｙＰＥを混合することにより、リポプレックスを作製した。
【実施例４】
【０１８８】
［ｓｉＲＮＡＡｎｇ２リポプレックスの特徴付け］
実施例３に従ってリポプレックスとして製剤化された実施例２のＡｎｇ２特異的ｓｉＲＮＡ分子を、それらが、Ｂ１６Ｖ細胞、ＭＳ−１細胞、およびＨＵＶＥＣ細胞のそれぞれにおいてＡｎｇ２  ｍＲＭＡ発現を阻害する能力について調べた。このような目的で、４８時間にわたり、２０ｎＭの最終濃度で、表１Ａ、Ｂで列挙するｓｉＲＮＡＡｎｇ２リポプレックス、または対照を、培養細胞にトランスフェクトした。細胞を回収し、対応する全ＲＮＡを、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ解析にかけた。さらなる詳細は、実施例１から理解することができる。対照としては、鎖ＬＵＣ−ＢおよびＬＵＣ−Ａからなる、ルシフェラーゼ特異的なｓｉＲＮＡ分子を含有するリポプレックスを用いた。ローディング対照としては、ＰＴＥＮを用いた。ＴａｑＭａｎ解析の結果を、図３、６、７、１０、１２、１３に示す。
【０１８９】
図３から理解されうる通り、配列番号４および５、配列番号１４および１５、配列番号１６および１７、配列番号１８および１９、ならびに配列番号２２および２３により形成される任意のｓｉＲＮＡ分子を含有するリポプレックスが、Ｂ１６Ｖ細胞およびＭＳ−１細胞の両方において、Ａｎｇ−２の発現を阻害するのに特に有効であったのに対し、配列番号６および７、配列番号８および９、ならびに配列番号１０および１１により形成される任意のｓｉＲＮＡ分子を含有するＡｎｇ−２特異的リポプレックスは、被験細胞株のうちの１つにおいて、活性でないか、またはある程度活性であるに過ぎなかった（図３）。
【０１９０】
配列番号１４および１５、または配列番号１６および１７により形成されたｓｉＲＮＡは、いずれの細胞株においても極めて強力であった。アンチセンス鎖の３’末端において、これらのｓｉＲＮＡ構築物を伸長させることにより、２３マーの有効なｓｉＲＮＡ分子（配列番号４８および４９、ならびに配列番号５０および５１により形成される）がもたらされた。このアッセイにおいて、およびヒト細胞株で調べた場合（図１４）のいずれにおいても、（（６４番および６５番のｓｉＲＮＡとは対照的に）アンチセンス鎖の配列が、ヒトＡＮＧ２  ｍＲＮＡと完全に相補性ではないものの）配列番号４８および４９により形成されるｓｉＲＮＡが、最も強力であることが分かった（図７）。他のｓｉＲＮＡ配列も、既に公表されているｓｉＲＮＡ配列と比較した（図９、Ａｎｇ２−Ｂｈａｎｄａｒｉ＿Ａ＋Ｂは３’−ＴＴ突出を有する１９マーの配列、Ｂｈａｎｄａｒｉら、２００６）。３’末端および５’末端それぞれにおいて４つの相補的な塩基を付加することによって、ＡＮＧ２  ｍＲＮＡに相補的な１９マーの配列を伸長することにより、デオキシ−ＴＴ突出を包含する１９マーのｄｓＲＮＡと、その２つの２３マーの平滑末端変異体として、公表配列を合成した（図９）。結果として得られる２つの２３マーの平滑末端変異体（Ａｎｇ２−Ｂｈａｎｄａｒｉ＿Ａ＋Ｂ、およびＡｎｇ２−Ｂｈａｎｄａｒｉ＿Ａｔｕ２３＿Ａ＋Ｂ、図９）を、前述の通りに２’−Ｏ−メチル修飾により化学的に安定化させ、合成し、配列番号４８および４９を介して形成されるｓｉＲＮＡ分子によるトランスフェクション実験において並行して調べた。ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲを介するｍＲＮＡレベルの決定により明らかとなる通り、配列番号４８および４９により形成されるｓｉＲＮＡ分子は、公表配列（１９マーのＴＴを有する「Ｂｈａｎｄａｒｉ」）、またはその誘導体（平滑末端、修飾、伸長させた２３マー、図９）より、なおより強力ではないにせよ、同等に強力であった（図１０）。マウスＡｎｇ２を標的とする、新規にデザインされたさらに８つの２３マー（ＡＮＧＴ２分子、図１１）により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける別のスクリーニングを実施したところ、９番のＡＮＧ２  ｓｉＲＮＡ分子を含めた他の２３マーのｓｉＲＮＡと比較して、より強力な別のｓｉＲＮＡがもたらされたことは驚くべきことである（図１１および１２を参照されたい）。対照比較による力価決定実験では、より良好な効力を示すことが強調された（図１２）。この実施例からは、Ａｎｇ−２  ｍＲＮＡの異なる領域を標的とする異なるｓｉＲＮＡ分子が、標的ｍＲＮＡをノックダウンすることに関して異なる活性を示すことが理解されうる。
【実施例５】
【０１９１】
［ＰＬＹ感染または肺炎球菌感染により刺激された肺における、静脈内ｓｉＲＮＡＡｎｇ２リポプレックスによる肺血管バリア機能の改善］
肺の微小血管透過性の増大は、ＡＬＩ（急性肺傷害）またはそのより重篤な形態であるＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）の発症および進行における主要な事象である（Ａｉｒｄ、２００３；Ｗａｒｅ  ２００６、ＭａｎｉａｔｉｓおよびＯｒｆａｎｏｓ、２００８）。マウスを、４日間連続で、１９マーのｓｉＲＮＡＡｎｇ２リポプレックスにより静脈内処置（尾静脈への低圧ボーラス注射）した。対照として、ｓｉＲＮＡＬｕｃリポプレックスおよび関連のないｓｉＲＮＡ標的２リポプレックスを並行して適用した。その後、単離ニューモリシン（ＰＬＹ）により刺激した肺（ｅｘ  ｖｉｖｏにおける単離灌流マウス肺系、図４〜５）において、肺血管透過性を測定した。対照試料と異なり、ＰＬＹは、ＨＳＡの微小血管透過性を劇的に増大させた。しかし、ｓｉＲＮＡＬｕｃリポプレックスまたはｓｉＲＮＡ標的２リポプレックスにより処置した対照動物とは異なり、ｓｉＲＮＡＡｎｇ２で処置した動物に由来する肺における平均血管透過性が著明に低かったことは、ＰＬＹによる侵襲から血管系が防御されたことを示唆する（図５）。肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の肺感染（＝病原性肺炎球菌の吸入後における、肺炎）によりマウスを接種し、Ａｎｇ２  ｓｉＲＮＡリポプレックスにより処置した後においても、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて同様の結果が得られた（図５、６）。ここでも、対照群に由来する動物とは異なり、Ａｎｇ２リポプレックス処置により、血管漏出に対する防御がなされた。肺炎球菌感染したときに、ｓｉＲＮＡＡｎｇ２リポプレックスによる静脈内処置が、関連のないｓｉＲＮＡＬｕｃリポプレックス／ｓｉＲＮＡ標的２リポプレックス対照と比較して、血管透過性に対する防御効果を及ぼすさらなる実験においても、この知見は裏付けられた（図６Ａ）。ＲＮＡｉを介してＡｎｇ２発現の下方制御を誘発するのにリポプレックスが果たす機能性は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける実験を実施する前に、細胞培養物中において確認された（図６Ｂ）。加えて、ｓｉＲＮＡＡｎｇ２リポプレックスで処置したマウスに由来する肺においてバリア機能が改善されること、対応する試料中においてＡｎｇ２  ｍＲＮＡの発現が標的特異的にノックダウンされることも観察された（図６Ｃ）。７番のｓｉＲＮＡ分子（図２を参照されたい）の３’側伸長変異体、すなわち、９番のｓｉＲＮＡ分子（図１１を参照されたい）も、上記で説明したｅｘ  ｖｉｖｏにおける別のＩＰＭＬ実験において、同じ防御効果を示した（図８）。
【実施例６】
【０１９２】
［１９マーのｓｉＲＮＡおよびそれらの対応する３’側伸長２３マー変異体の特徴付け］
１９マーの初期リードｓｉＲＮＡ分子である７番および８番のｓｉＲＮＡ（また、図２を参照されたい）、ならびにそれらの対応する３’側伸長２３マー変異体を、ＨＵＶＥＣにおけるトランスフェクション実験による力価決定によりさらに特徴付けた。図１５に示す通り、（上記で説明した通り）いずれの１９マー分子（マウスｍＲＮＡおよびヒトｍＲＮＡの両方に対して完全にマッチする）も、非処置試料と比較して、明確に用量依存的なサイレンシング活性を示すのに対し、対応する２３マー（図１５に示す）は、培養ヒト細胞において、効力の明確な差違を示した。ヒトＡｎｇ−２  ｍＲＮＡに対して１つのミスマッチを保有する９番の２３マーのｓｉＲＮＡは、２３マーのｓｉＲＮＡより強力であった。
【実施例７】
【０１９３】
［ヒトＡｎｇ−２のｍＲＮＡを標的とする２３マーのｓｉＲＮＡ分子の特徴付け］
ヒトＡｎｇ−２のｍＲＮＡ配列を標的とする１６個の２３マーｓｉＲＮＡ分子の別のセット（１１〜２６番のＡｔｕＲＮＡｉ分子）をデザインおよび合成した（図１６、配列番号７３〜１０４）。２６番のｓｉＲＮＡ分子は、９番のマウスｓｉＲＮＡ分子（配列番号６８、６９）のヒト変異体であり、マウスｓｉＲＮＡ変異体に対して１つのミスマッチを保有する。表示の条件（図１７）でヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）にトランスフェクトすることにより、これらのｓｉＲＮＡを、ＲＮＡｉの有効性について調べ、ｑＲＴ−ＰＣＲによりＡｎｇ２  ｍＲＮＡレベルを評価した。新規のヒトリードｓｉＲＮＡを同定し（１３、１９、２１、２３、２４、２５番、図１８）、さらなるトランスフェクション実験においてさらに特徴付けし、既に同定したヒトおよびマウスのｓｉＲＮＡリード分子（４番は配列番号８、９）、マウス特異的なｓｉＲＮＡ（５番は陰性対照）のほか、７番の１９マー初期リードｓｉＲＮＡの変異体、ならびにそのマウスおよびヒトの２３マー変異体と比較した。結論として述べると、ヒトｓｉＲＮＡをスクリーニングしたところ、トランスフェクション実験において、新規の２３マーのｓｉＲＮＡ分子が、ｍＲＮＡを抑制するのに同様の有効性を示すことが明らかとなった。
【実施例８】
【０１９４】
［肺炎球菌による感染後のマウスにおいて肺炎が発達するときの、Ｔｉｅ２−Ａｎｇ系構成要素の発現レベル］
図１９Ａに示す通り、肺炎球菌による感染後のマウスにおいて肺炎が発達するときの、Ｔｉｅ２−Ａｎｇ系構成要素の発現レベルの変化を観察した。この実験では、吸入により細菌を施し、４８時間にわたり、肺炎の進行についてモニタリングした。表示される各時点の後、感染マウスおよび非感染マウスに由来する動物ｎ＝６匹のコホートを屠殺し、肺組織を分析した。対応する試料中におけるＴｉｅ２、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、およびＰＴＥＮのｍＲＮＡレベルを決定するため、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲにより、各試料に由来する全ＲＮＡを単離および解析した。各群の平均値を経時的にプロットしたところ、感染マウスにおいては、Ａｎｇ１およびＴｉｅ２のｍＲＮＡレベルが、非感染マウスと比較して経時的に低下することが示された。Ａｎｇ２のｍＲＮＡレベルが、非感染対照と比較して経時的に上昇したことは、驚くべきことである。
【０１９５】
それに対して抗体が得られるＴｉｅ−２タンパク質レベルは、表示のマウスに由来するタンパク質抽出物についてのウェスタンブロットにより示される通り、経時的に低下した（図１９Ｂ）。
【０１９６】
参考文献
【表７】
2012517815.tif 000008
【０１９７】
本明細書、特許請求の範囲、配列表、および／または図面において開示される本発明の特徴は、個別に、かつ、それらの任意の組合せにおいて、その各種の形態における本発明を実現するための材料でありうる。
【図１】
2012517815.tif 000009
【図２】
2012517815.tif 000010
【図３】
2012517815.tif 000011
【図４】
2012517815.tif 000012
【図５】
2012517815.tif 000013
【図６】
2012517815.tif 000014
【図７】
2012517815.tif 000015
【図８】
2012517815.tif 000016
【図９】
2012517815.tif 000017
【図１０】
2012517815.tif 000018
【図１１】
2012517815.tif 000019
【図１２】
2012517815.tif 000020
【図１３】
2012517815.tif 000021
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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