(57)【要約】本発明は、種々の状態によって引き起こされる急性腎臓損傷を有する患者を予防および／または治療する方法を提供する。その方法は、トロンビンに結合しない可溶性トロンボモジュリン変異体を患者に投与することを含む。標準治療と併用して、トロンビンに結合しない可溶性トロンボモジュリン変異体は、急性腎臓損傷ならびにその後有病率および死亡率を予防または低下させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンビンに結合しないｓＴＭ変異体を患者に投与することを含む、治療を必要とする該患者においてＡＫＩを治療する方法。
【請求項２】
トロンビンに結合しないｓＴＭ変異体を患者に投与することを含む、ＡＫＩに罹りやすい該患者においてＡＫＩを予防する方法。
【請求項３】
該変異体が、実施例３に記載のＢＩＡｃｏｒｅアッセイ条件下におけるトロンビン結合について４３００を超えるＫｄ値を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該ｓＴＭ変異体が、配列番号６または配列番号１１に示されたアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
配列番号１１に示されたアミノ酸配列を含むｓＴＭ変異体。
【請求項６】
請求項５のｓＴＭ変異体および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項７】
ＡＫＩの治療に用いる、トロンビンに結合しないｓＴＭ変異体。
【請求項８】
ＡＫＩの予防に用いる、トロンビンに結合しないｓＴＭ変異体の使用。
【請求項９】
該変異体が、実施例３に記載のＢＩＡｃｏｒｅアッセイ条件下におけるトロンビン結合について４３００を超えるＫｄ値を有する、請求項７または８に記載の使用。
【請求項１０】
前記ｓＴＭ変異体は、配列番号６または配列番号１１に示されたアミノ酸配列を含む、請求項７または８に記載の使用。
【請求項１１】
医薬として使用されるトロンビンに結合しないｓＴＭ変異体であって、配列番号１１に示されたアミノ酸配列を含む、変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医療科学に関し、特に、可溶性トロンボモジュリンの変異体を用いる微小血管機能障害の治療に関する。より具体的には、本発明は、トロンビンに結合しない可溶性トロンボモジュリンの変異体を、治療を必要とする患者に投与することにより、急性腎臓損傷において発生する場合の微小血管機能障害の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
トロンボモジュリン（ＴＭ）は、多臓器（肺、肝臓、および腎臓等）上の内皮細胞の膜表面上で支えられた糖タンパク質であり、損傷に対する血管反応において重要な役割を果たす。ＴＭは、トロンビンに結合し、凝固活性化および炎症活性化の両方を調節する。
【０００３】
ＴＭは、５つのドメイン（すなわち、Ｎ末端レクチン様結合ドメイン、６個のＥＧＦ様リピートを構成する上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）ドメイン、Ｓｅｒ／Ｔｈｒリッチ領域、膜貫通ドメイン、および、細胞質ドメイン）から構成される。可溶性ＴＭ（ｓＴＭ）変異体は細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを欠損することにより構築される。ＴＭ欠損変異体は、トロンビンの結合およびその後のトロンビン−ＴＭ複合体によるプロテインＣの切断を維持する、最小のＴＭフラグメント（ＥＧＦ様リピート４〜６個）を決定するために使用されていた。ＴＭ領域のアラニンスキャンニングは、トロンボモジュリン活性に欠かせない残基を決定するために行われていた（特許文献１）。ＥＧＦ４〜６個からなるポリペプチド内におけるアラニンに対する特定の残基の変化は、トロンビンに対する結合における改善された補因子活性を有するｓＴＭ変異体をもたらした。提案された治療用途は、血管形成の阻害および全身性凝固障害（例えば、播種性血管内凝固症候群）の治療を含んでいた。しかしながら、このような用途は、凝固カスケードの破壊に起因する出血性合併症の固有のリスクを有する。つい最近では、非特許文献１が、実験的糸球体腎炎上のｓＴＭの効果について報告しており、ｓＴＭの抗血栓作用が血栓性糸球体腎炎の損傷を効果的に減衰させたと結論付けた。
【０００４】
急性腎臓損傷（ＡＫＩ）は、腎臓の微小血管系を急に損傷することで生じる状態を意味する一般用語である。この微小血管機能障害は、感染／炎症、虚血性損傷、造影剤、または、化学療法に関連し得る。ＡＫＩは、一般的に、糸球体濾過量おける急激な低下、窒素廃棄物の蓄積、ならびに、電解質および水分平衡を制御する腎臓の不能により特徴付けられる。
【０００５】
ＡＫＩを患う患者のケアにおける技術的な進歩および疾患経過における病態生理学の理解の向上にもかかわらず、この状態に関連する高い有病率および死亡率が依存として見られる。なお、ＡＫＩに対する治療剤における最近の試験は成功していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第９３／２５６７５号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｉｋｅｇｕｃｈｉら，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，６１巻，第４９０〜５０１頁，２００２年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、安全かつ有効なＡＫＩの治療に関するいまだ満たされていない医学的ニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
予想外に、出願人は、トロンビンに結合しない可溶性トロンボモジュリン変異体が、ＡＫＩのインビボ実験モデルにおいて腎臓の損傷を特に効果的に保護することを発見した。トロンビンに結合しない可溶性トロンボモジュリン変異体は、凝固カスケードの調節により起こり得る潜在的な出血性合併症を引き起こすことなく、ＡＫＩを予防および治療するための、潜在的に重要な代替アプローチを提供する。
【００１０】
本発明は、トロンビンに結合しない有効量のｓＴＭ変異体を患者に投与することを含む、治療を必要とする患者においてＡＫＩを治療する方法を提供する。ここで、この変異体は、実施例３に記載のＢＩＡｃｏｒｅアッセイ条件下におけるトロンビン結合について４３００を超えるＫｄ値を有する。この方法の好ましいｓＴＭ変異体は、配列番号６または配列番号１１に示されたアミノ酸配列を含む。
【００１１】
本発明はまた、トロンビンに結合しない有効量のｓＴＭ変異体を患者に投与することを含む、ＡＫＩに罹りやすい患者においてＡＫＩを予防する方法を提供する。ここで、この変異体は、実施例３に記載のＢＩＡｃｏｒｅアッセイ条件下におけるトロンビン結合について４３００を超えるＫｄ値を有する。この方法の好ましいｓＴＭ変異体は、配列番号６または配列番号１１に示されたアミノ酸配列を含む。
【００１２】
本発明は、ＡＫＩの治療に用いる、トロンビンに結合しないｓＴＭ変異体を提供する。
【００１３】
本発明はまた、ＡＫＩの治療に用いる、トロンビンに結合しないｓＴＭ変異体を提供する。ここで、この変異体は、実施例３に記載のＢＩＡｃｏｒｅアッセイ条件下におけるトロンビン結合について４３００を超えるＫｄ値を有する。これに用いられる好ましいｓＴＭ変異体は、配列番号６または配列番号１１に示されたアミノ酸配列を含む。
【００１４】
本発明は更に、ＡＫＩの予防に用いる、トロンビンに結合しないｓＴＭ変異体の使用を提供する。
【００１５】
本発明はまた、ＡＫＩの予防に用いる、トロンビンに結合しないｓＴＭ変異体を提供する。この変異体は、実施例３に記載のＢＩＡｃｏｒｅアッセイ条件下におけるトロンビン結合について４３００を超えるＫｄ値を有する。これに用いられる好ましいｓＴＭ変異体は、配列番号６または配列番号１１に示されたアミノ酸配列を含む。
【００１６】
本発明はまた、配列番号１１に示されたアミノ酸配列を含むｓＴＭ変異体を提供する。
【００１７】
本発明は更に、医薬として使用されるトロンビンに結合しないｓＴＭ変異体を提供する。ここで、この変異体は、配列番号１１に示されたアミノ酸配列を含む。
【００１８】
本発明はまた、医薬として使用されるトロンビンに結合しない配列番号１１に示されたｓＴＭ変異体を提供する。
【００１９】
本発明は、ＡＫＩの治療のための医薬製品に用いる、トロンビンに結合しないｓＴＭ変異体を提供する。本発明は更に、ＡＫＩの予防のための医薬製品に用いる、トロンビンに結合しないｓＴＭ変異体の使用を提供する。これに用いられる好ましいｓＴＭ変異体は、配列番号６または配列番号１１に示されたアミノ酸配列を含む。
【００２０】
本発明はまた、配列番号１１に示されたアミノ酸配列を有するｓＴＭ変異体と、薬学的に受容可能な賦形剤とを含む薬学的組成物を提供する。
【００２１】
本発明は、配列番号６または配列番号１１に示されたアミノ酸配列をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。ここで、このポリヌクレオチドは、配列番号８または配列番号１２の配列を含む。本発明は更に、この単離されたポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクター、および、この組み換え発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２２】
本発明は、配列番号１１に示されたアミノ酸配列を有するｓＴＭ変異体を生成するためのプロセスを提供する。ここで、当該プロセスは、組み換え発現ベクターを用いて安定に形質転換された宿主細胞を培養すること、ポリペプチドを発現させること、および、培養物由来のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドを回収することを含む。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本願明細書において開示されかつ主張される本発明に関して、以下の用語は、以下に示すように定義される。
【００２４】
「ＡＫＩ」は、窒素廃棄物の保持に関連する糸球体濾過量の急激な減少をもたらす１つの症状を有する急性腎臓損傷を意味する。この減少は、ＡＫＩ（例えば、急性腎尿細管壊死または急性間質性腎炎）が原因であり得る。あるいはＡＫＩは急性腎機能障害を意味する場合もある。
【００２５】
「有効量」とは、所望の治療結果を達成するのに必要な量（投与量、時間、投与方法）を意味する。ｓＴＭ変異体の有効量は、例えば、疾患状態、年齢、性別、および、個体の体重等の因子、ならびに、個体における所望の反応を引き起こすｓＴＭ変異体の能力によって変化し得る。
【００２６】
「治療すること」または「治療する」とは、疾患、状態または障害を、除去、低減または調節するために、患者を管理およびケアすることを意味する。
【００２７】
「予防すること」または「予防する」とは、疾患、状態または障害の兆候または合併症の発現を遅延させるために、患者を管理およびケアすることを意味する。
【００２８】
「患者」は、ＡＫＩを有するかまたは発症しやすい動物（好ましくは、ヒト）を意味する。特定の場合、患者は、トロンビンに結合しないｓＴＭ変異体を用いる治療で効果が得られるＡＫＩとともに生じる微小血管機能障害を有する。
【００２９】
可溶性トロンボモジュリン（ｓＴＭ）は、配列番号４または配列番号５の可溶性トロンボモジュリンを意味する。ｓＴＭは可溶性であり、完全長トロンボモジュリン膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインが欠損している、トロンボモジュリンの分泌型変異体である。ヒトのトロンボモジュリン（配列番号１）のアミノ酸一次構造は、欧州特許第０４１２８４１号に記載されるように、当該技術分野において公知である。ヒトＴＭは、１６、１８または２１個の残基長にて報告されるシグナルペプチド部分を含む、５７５個のアミノ酸タンパク質として合成される。このシグナルペプチド部分の後に、ヒトＴＭは、アミノ末端から連続して、以下のドメインまたは領域を含む。（１）約２２２〜２２６個のアミノ酸のアミノ末端ドメイン、（２）合計約２３６〜２４０個のアミノ酸（ＥＧＦドメイン）となる６個のＥＧＦ（「上皮細胞増殖因子」）様構造、（３）いくつかの可能なＯ−糖鎖付加部位を有する、約３４〜３７個のアミノ酸のセリン／トレオニンリッチドメイン（ＳＴドメイン）、（４）約２３〜２４個のアミノ酸の膜貫通領域、および、（５）約３６〜３８個のアミノ酸の細胞質ドメイン。本願明細書において、「アミノ末端ドメイン」、「ＥＧＦドメイン」、「ＳＴドメイン」、「膜貫通領域またはドメイン」、および、「細胞質領域またはドメイン」は、各領域またはドメインについて上述されたアミノ酸残基の隣接した範囲を意味する。さらに、インビボのプロセッシングは、発現形質転換宿主細胞（特に真核宿主細胞と比べて原核宿主細胞）に依存して変化することが見込まれるので、用語「アミノ末端領域またはドメイン」は、必要に応じて、トロンボモジュリンシグナルペプチドまたはその部分を含み得る。例えば、ｓｐＴＭＤ１（配列番号２）は、シグナルペプチド、アミノ末端ドメイン、ＥＧＦドメイン、および、ＳＴドメインを含み、一方で、ｓｐＴＭＤ２（配列番号３）は、シグナルペプチド、アミノ末端ドメイン、および、ＥＧＦドメインを含む。
【００３０】
「ｓＴＭ変異体」は、配列番号４または配列番号５と比べた場合、ＥＧＦ５ドメインにおける１つ以上の置換またはＥＧＦ６ドメインの欠損を含むｓＴＭを意味する。ｓＴＭ変異体は、当該技術分野において公知の手順により生成され得、また、一般的な手順（例えば、実施例３に記載されるＢＩＡＣｏｒｅアッセイ）によりトロンビンと結合する能力の欠如についてアッセイされ得る。これらのアッセイ条件の下で、４３００を超えるＫｄ値は、このアッセイの検出限界を超えるため、ｓＴＭ変異体がトロンビンに結合しないことを示す。
【００３１】
微小血管機能障害は、末梢血管抵抗に対する影響を有し得る血圧およびフローパターンの両方に影響を与え得る、任意の器官（すなわち、腎臓、心臓、肝臓等）における微小循環の機能障害を意味する一般用語である。微小循環は、毛細血管および細静脈に加えて最小動脈および細動脈を含む。
【００３２】
アミノ酸位置の番号付けは、アミノ末端ドメイン、ＥＧＦドメイン、および、ＳＴドメインを含むがシグナルペプチドが欠損している配列番号４（ＴＭＤ１とも表される）を基にしている。配列番号４の最初のアラニンは、アミノ酸の番号付けのために指定された位置１である。ＥＧＦ６の直後に切断されかつシグナルペプチドが欠損している、野生型完全長可溶性ヒトトロンボモジュリンは、配列番号５（ＴＭＤ２とも表される）である。
【００３３】
更に、本発明のｓＴＭ変異体は、置換されたアミノ酸についての１文字表記、アミノ酸位置番号、続いて、置換するアミノ酸残基により、名付けられる。例えば、Ｉ４２４Ａは、位置４２４におけるイソロイシンがアラニンに変更されたｓＴＭ変異体を意味する。
【００３４】
本発明のｓＴＭ変異体は、トロンビンに結合しない。好ましくは、トロンビンに結合しないｓＴＭ変異体は、位置４２４におけるイソロイシンがアラニンで置換されたＴＭＤ２（配列番号５）である。この変異体は、ＴＭＤ２−Ｉ４２４Ａ（配列番号６）としても表され得る。
【００３５】
別の実施形態において、トロンビンに結合しないｓＴＭ変異体は、ＥＦＧ６ドメインが除去され、また、ＴＭ−ＬＥ１５（配列番号１１）として表される、ＴＭＤ２の切断型である。
【００３６】
ヒト組み換えｓＴＭおよびヒトＴＭの変異体を生成する方法は、既に開示されている（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎら，１９９０  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２６０２−１２６１０、および、Ｎａｇａｓｈｉｍａら，１９９３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８８８−２８９２）。本発明において用いられたｓＴＭ変異体は、当該技術分野において公知の種々の方法で達成され得る、分子遺伝学的操作の結果である。ＤＮＡ配列は、当該技術分野において周知の手順により本発明のｓＴＭ変異体のアミノ酸配列から得られる。本発明の好ましいＤＮＡ配列は、ＴＭＤ２（配列番号７）、ＴＭＤ２−Ｉ４２４Ａ（配列番号８）、および、ＴＭ−ＬＥ１５（配列番号１２）をコードするＤＮＡ配列である。加えて、本発明のｓＴＭ変異体をコードするＤＮＡ配列は、プラスミドまたは発現ベクターに組み込まれ、次に、組み換え細胞に形質転換されることで、薬学的に有用な化合物を生成する方法を提供する。ここで、この化合物は、組み換え細胞由来の分泌型であり、ｓＴＭ変異体である。本発明のＤＮＡ配列がリーダー配列（例えば、配列番号１３のリーダー配列）もコードし得ることが理解される。
【００３７】
本発明のｓＴＭ変異体は、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞  ＨＥＫ２９３細胞、またはＣＯＳ細胞）、細菌細胞（例えば、大腸菌）、あるいは、真菌細胞または酵母細胞において、容易に生成され得る。宿主細胞は、ｓＴＭ変異体を含む発現ベクターで形質転換されて、次いで、当該技術分野において周知の技術を用いて培養される。
【００３８】
宿主細胞から発現されたタンパク質は、培地から回収され、精製される。タンパク質精製の様々な方法が利用されてもよく、そのような方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８２：８３−８９（１９９０）およびＳｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第３版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ＮＹ（１９９４）に記載されている。
【００３９】
一般に、本出願に記載される一般的な実験用手順の用語および詳細の定義は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙに見出され得る。そのマニュアルは以下Ｓａｍｂｒｏｏｋと称する。さらに、Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９８７および定期的更新）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋは、本出願に有用な方法を開示している。
【００４０】
ｓＴＭ変異体は、ヒトｓＴＭ配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列を変化させるか、または切断することによって生成される。アミノ酸がタンパク質の配列において除去または置換され得る方法は周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前出；Ａｕｓｕｂｅｌら，前出およびそれらに引用される参考文献を参照のこと。
【００４１】
トロンビン／トロンボモジュリン複合体によってプロテインＣ活性化を測定するアッセイは、本発明のｓＴＭ変異体によるトロンビン結合を測定するために使用される。凝固の間に、ヒトプロテインＣはトロンビンによって活性化される。しかし、この活性化反応は、トロンビンがトロンボモジュリンと複合体化されない限り、ゆっくりである。実施例１に示したアッセイは、ヒトトロンビンおよびｓＴＭの複合体が、ヒトプロテインＣを活性化することを示す。しかし、ヒトプロテインＣ活性化は、ヒトトロンビンおよびｓＴＭ変異体ＴＭＤ２−Ｉ４２４ＡまたはＴＭ−ＬＥ１５の存在下で検出できず、ＴＭＤ２−Ｉ４２４ＡおよびＴＭ−ＬＥ１５がトロンビンに結合せず、従ってプロテインＣを活性化できないことを示す。
【００４２】
本発明のｓＴＭの変異体がトロンビンに結合しないことを実証するさらなる方法は、ヒト臍帯静脈内皮細胞中でトロンビンにより誘発されるＣ＋＋流動のトロンボモジュリン阻害を示すアッセイ（実施例２）ならびにｓＴＭ／トロンビン複合体の結合反応速度および親和性のＢＩＡｃｏｒｅ解析（実施例３）である。
【００４３】
ＡＫＩを低下または予防する本発明のｓＴＭ変異体の有効性の指標となるインビボモデルを実施例４および５に示す。
【００４４】
例えば、Ｋｉｋｅｒｉら，（１９８６  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５０：Ｆ１０９８−Ｆ１１０６）に本質的に記載されるように実施されたＬＰＳにより誘発されたＡＫＩラットモデルを実施例４に表す。ＬＰＳにより誘発されるモデルは一般に、大腸菌ＬＰＳのボーラス注射でＡＫＩを誘発することからなる。ＬＰＳのボーラス注射は内毒血症を引き起こし、糸球体濾過量の機能の減少および血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルの増加を生じる。ｓＴＭ変異体を、内毒血症の誘発前にヒトｓＴＭ変異体でラットを処置することによって、このＡＫＩを低下または予防するそれらの能力について試験する。表４に示すように、トロンビンに結合しないヒトｓＴＭまたはヒトｓＴＭの変異体の投与は、ＢＵＮレベルの減少によって測定されるようにＡＫＩを低下できる。
【００４５】
さらに、ラット両側腎動脈鉗子モデルを実施例５に記載するように行う。このモデルにおいて、両側腎虚血は、腎茎を締めることによって誘発され、クランプが除去されると再潅流障害を生じる。腎障害の測定は、血清中クレアチニン値の増加である。表５に示すように、トロンビンに結合しないヒトｓＴＭの変異体の投与は、血清中クレアチニン値の減少によって示されるようにＡＫＩを低下させる。
【００４６】
本発明の薬学的組成物は、一般にＡＫＩを治療する意図する目的を達成する当該技術分野において公知の任意の手段によって投与され得る。好ましい投与経路は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）、皮下、ならびに関節内注射および注入を含む投与様式として本明細書に定義される、非経口である。より好ましくは、ｓＴＭ変異体は、ＩＶボーラスおよび／または皮下注射のいずれかで投与される。好ましい曝露時間は、１〜２４時間またはそれ以上、限定されないが、４８、７２、９６、もしくは１２０時間もの時間を含む、範囲である。投与される用量は、受容者の年齢、健康、および体重、もしあれば、併用療法の種類、治療の頻度、および望まれる効果の性質に依存する。典型的な用量レベルは、標準的な臨床技術を用いて最適化され得、投与様式および患者の状態に依存する。一般に、用量は、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ；２．５μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ；５μｇ／ｋｇ〜２．５ｍｇ／ｋｇ；または１０μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇの範囲である。
【００４７】
薬学的組成物は、選択される投与様式、および必要に応じて使用される薬学的に許容可能な賦形剤、例えば、緩衝剤、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、等張剤、安定剤、担体などに適切でなければならない。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ。
【００４８】
製剤中のｓＴＭ変異体の濃度は、約０．１％（１ｍｇ／ｍＬ）ほどの低さから１５％または２０％（１５０〜２００ｍｇ／ｍＬ）もの高さであってもよく、選択される特定の投与様式に従って、主に、液量、粘性、安定性などに基づいて選択される。ｓＴＭ変異体の好ましい濃度は一般に、１〜約１００ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００４９】
以下の実施例は例示することを意図するが、本発明を限定しない。
【実施例】
【００５０】
実施例１
ｓＴＭ変異体によるヒトプロテインＣ活性化
反応速度解析を、ヒトｓＴＭ変異体によるヒトプロテインＣの活性化の速度を測定するために行う。各ｓＴＭ変異体について、反応を以下のように設定する。最終的に１００μＬの反応体積において、ヒトプロテインＣを１５０ｎＭの最終濃度に加え、ヒトトロンビンを２ｎＭの最終濃度に加える。ＡＢ／ＢＳＡバッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ；２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５；３ｍＭのＣａＣｌ２；１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）中のｓＴＭコントロールＴＭＤ１およびＴＭＤ２またはｓＴＭ変異体を、０ｎＭ〜２５０ｎＭの種々の最終濃度で反応物に加える。反応混合物を３７℃にて３０分、インキュベートする。２５μＬの各反応物を、１５０μＬのトロンビン停止バッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ中の１ユニット／ｍｌのヒルジン；２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５；３ｍＭのＣａＣｌ２）を含有する９６ウェルプレートに移し、室温にて５分間、インキュベートする。２５μＬのＳ２３６６発色基質（Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン塩酸塩、クロモゲニックス（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ））の４μＭストック溶液を加え、手短に混合する。４０５ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）を、６秒の読み取り間隔で５分の動的読み取りにおいてマイクロプレート分光光度計で読み取る。ミカエリスメンテン速度定数を、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｍｏｄｕｌｅ  １．１を有するＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェアを用いて動的データから計算する。この方法は、Ｇｒｉｎｎｅｌｌら，１９９４  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３０３：９２９−９３３に記載されるプロトコルに一部基づいた。
【００５１】
表１に示すように、ヒトＴＭＤ１（配列番号４）およびヒトＴＭＤ２（配列番号５）はヒトプロテインＣを活性化でき、トロンビンに対する結合についてのＫｄを測定する。解離定数、Ｋｄは、複合体をどのように容易に分離するかの観点からヒトプロテインＣとトロンビンとの間の結合の強度（解離または「オフレート（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）」）を示す。ｓＴＭ変異体Ｉ４２４Ａ（配列番号６）またはＴＭ−ＬＥ１５（配列番号１１）およびトロンビンで得られたヒトプロテインＣ活性化の速度は非常に低く、トロンビン結合に対するＫｄは計算できない（ＴＬＤ＝検出するには低すぎる）。これは、ｓＴＭ変異体Ｉ４２４Ａ（配列番号６）およびＴＭ−ＬＥ１５（配列番号１１）が、トロンビンに結合できず、ヒトプロテインＣを活性化できないことを示す。
【００５２】
【表１】
2012508742.tif 000002
【００５３】
実施例２
ＨＵＶＥＣにおけるトロンビンにより誘発されたＣａ＋＋流動のトロンボモジュリン阻害
トロンビンに結合するｓＴＭなどの化合物は、ＨＵＶＥＣ細胞に対するトロンビンの結合およびその後のＣａ＋＋の誘発を妨げる。インビトロアッセイを、ＨＵＶＥＣ中のトロンビンにより誘発されたＣａ＋＋流動に対するｓＴＭ変異体の効果を評価するために使用する。ブラックウェルの透明底９６ウェルプレートに、１０４のヒト臍静脈内皮細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２にて４８時間インキュベートする。２日のインキュベーション後、ＦＬＩＰＲカルシウム４アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，カタログ番号Ｒ８１４２）からの１００μＬ／ウェルのローディングバッファーを、製造業者のプロトコルに従って加える。次いで、ハンクス平衡塩溶液、２０ｎＭのＨＥＰＥＳおよび０．７５％のウシアルブミン画分Ｖ中の５００ｎＭの可溶性トロンボモジュリン（ＴＭＤ１、ＴＭＤ２またはＴＭＤ２−Ｉ４２４Ａ）を含むか、または含まない５ｎＭのヒトトロンビンを含有する試薬を１００μＬ／ウェルにて加え、室温にて３０分間インキュベートする。トロンビンにより誘発されたＣａ＋＋流動を、蛍光イメージングプレートリーダー−２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で測定した。ＨＵＶＥＣ中のＣａ＋＋流動の誘発によって測定されるように、ｓＴＭ変異体ＴＭＤ１およびＴＭＤ２と比較して、ｓＴＭ変異体ＴＭＤ２−Ｉ４２４Ａがトロンビンに結合しないことは表２から明らかである。
【００５４】
【表２】
2012508742.tif 000003
【００５５】
実施例３
表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）によるトロンビンに結合するｓＴＭ変異体の評価
種々のヒトｓＴＭ変異体のトロンビン結合特性を、ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー２０００機器を用いて測定する。全ての測定は室温で実施する。全ての実験は、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有するＨＢＳ−Ｐ（１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）バッファー中で実施する。全ての結合実験に関して、ビオチン化ｓＴＭ変異体を、２００〜３００反応ユニット（ＲＵ）のレベルでＳＡ（ストレプトアビジンでコーティングされた）センサーチップに固定する。ビオチン化ｓＴＭ変異体を、室温にて２時間、５０μＭのＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンとともに１０μＭのｓＴＭ変異体（０．５ｍＬ）をインキュベートすることによって調製し、その後、一晩、リン酸緩衝生理食塩水に対して透析する。ヒトトロンビン（ＰＰＡＣＫにより阻害された、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マウストロンビン、およびラットトロンビンの結合を試験する。
【００５６】
トロンビンの結合を、複数の解析サイクルを用いて評価する。各サイクルは、１００μＬ／分の流速で実施し、以下の工程からなる：各濃度について２回の注射を用いる種々のトロンビン濃度の２５０μＬの溶液の注射、続いて、解離のために１分遅らせる。解離段階後、バイオセンサーチップ表面を、５ｍＭのＥＤＴＡの５０μＬの注射、続いて、ランニングバッファーの同様の注射を用いて再生成した。トロンビンの濃度は２００ｎＭ〜１．６ｎＭの範囲であり、２００ｎＭのトロンビンで開始する、連続２倍希釈により調製した。急速な会合速度および解離速度のために、平衡結合親和性を、注射段階の最後の３０秒にわたってシグナルを平均化することによって得られる、安定状態シグナルを用いて測定する；次いで得られるシグナル対トロンビン濃度データを、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｕｔａｈ）を用いて１対１平衡結合モデルに適合した。全ての追跡は、１０μＭのビオチンがストレプトアビジン表面にわたって注射されるコントロール表面に対して参照される。ｓＴＭ変異体ＴＭＤ１およびＴＭＤ２と比較して、ｓＴＭ変異体ＴＭＤ２−Ｉ４２４Ａ（配列番号６）およびＴＭ−ＬＥ１５（配列番号１１）が、トロンビンに結合しないことは表３から明白である。上記のアッセイ条件下で、４３００より大きいＫｄ値はアッセイの検出限界を超え、従って配列番号６および配列番号１１のｓＴＭ変異体がトロンビンに結合しないことを示す。
【００５７】
【表３】
2012508742.tif 000004
【００５８】
実施例４
ラットにおけるＬＰＳにより誘発される急性腎不全におけるヒトおよびラットｓＴＭの有効性
ＬＰＳにより誘発されるＡＫＩラットモデルを、Ｋｉｋｅｒｉら（１９８６  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５０：Ｆ１０９８−Ｆ１１０６）によって実質的に記載されたように行った。ＬＰＳにより誘発されたモデルは一般に、大腸菌ＬＰＳのボーラス注射を用いてＡＫＩを誘発することからなる。ＬＰＳのボーラス注射は内毒素血を引き起こし、その結果、糸球体濾過量の機能が低下し、血中尿素窒素（ＢＵＮ）値が増加する。内毒素血の誘発の前に、ヒトｓＴＭ変異体を用いて、ラットを処置することによって、このＡＫＩを低下または予防するそれらの能力についてｓＴＭ変異体を試験できる。
【００５９】
体重２００〜２５０ｇのオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ，ＩＮ，米国）をこの研究において用いた。この動物を（１）生理食塩水で処置したコントロール、および（２）ＬＰＳで処置した動物の２つの群に、外科処置の時点でランダム化する。ＬＰＳで処置した群の動物をさらに下位の群のビヒクル、ＴＭＤ２（配列番号５）またはヒトｓＴＭ変異体ＴＭＤ２−Ｉ４２４Ａ（配列番号：６）に分ける。内毒素血を、大腸菌ＬＰＳ（２０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与により誘発する。コントロール群はピロゲンを含まない生理食塩水を受容する。ＴＭＤ２（５ｍｇ／ｋｇおよび２．５ｍｇ／ｋｇ）またはＴＭＤ２−Ｉ４２４Ａ（５ｍｇ／ｋｇおよび２．５ｍｇ／ｋｇ）を、内毒素血の誘発の１２時間前に皮下投与する。動物を、ＬＰＳ投与の２４時間後に屠殺し、血液サンプルをＢＵＮ分析のために回収する。以下の結果は群毎の４匹のラットの平均である。
【００６０】
表４に示すように、トロンビンに結合しないヒトｓＴＭまたはヒトｓＴＭの変異体の投与が、ＢＵＮ値の低下によって測定されるように、ＡＫＩを低下することができる。ｓＴＭ変異体ＴＭＤ２−Ｉ４２４Ａ（配列番号６）は、比較され得る値でのＴＭＤ２よりも、より効果的にＢＵＮ値を低下する。
【００６１】
【表４】
2012508742.tif 000005
【００６２】
実施例５
ＡＫＩのための両側腎動脈クランプモデル
１８０〜２５０ｇのオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、誘発のために５％のイソフルレンおよび維持のために１．５％を用いて麻酔し、中核体温を３７℃に維持するために恒温テーブルに置く。ＴＭＤ２−Ｉ４２４Ａ（配列番号６）またはＴＭ−ＬＥ１５（配列番号１１）を注入するために、ＰＥ５０カテーテルを用いて頸静脈にカニューレを挿入する。正中切開を行い、腎茎を単離し、両側性腎虚血を、３０分間、腎茎をクランプすることにより誘発する。偽手術コントロールは、腎茎のクランプがないこと以外は同一の手順からなる。化合物を、頸静脈カテーテルを介して虚血の誘発の２時間後に投与する。動物を、虚血の２４時間後に屠殺し、腎機能を、虚血の２４時間後に血清クレアチニンの測定により決定する。実験用のラット、偽ラット、および処置をしなかったコントロールラットの尾静脈から血液を回収する。遠心分離により血清を単離し、プロテアーゼ阻害剤を用いて保存する。血清クレアチニンを測定し、ｍｇ／ｄＬで報告する。変異体ＴＭ−ＬＥ１５およびＴＭＤ２−Ｉ４２４Ａは、腎動脈クランプ（ＲＡＣ）コントロールと比較した場合、虚血の２４時間後でのＳＣｒにおける低減によって証明されるように、腎損傷を抑制するのに効果的である。
【００６３】
【表５】
2012508742.tif 000006
配列番号1
MLGVLVLGALALAGLGFPAPAEPQPGGSQCVEHDCFALYPGPATFLNASQICDGLRGHLMTVRSSVAADVISLLLNGDGGVGRRRLWIGLQLPPGCGDPKRLGPLRGFQWVTGDNNTSYSRWARLDLNGAPLCGPLCVAVSAAEATVPSEIWEEQQCEVKADGFLCEFHFPATCRPLAVEPGAAAAAVSITYGTPFAARGADFQALPVGSSAAVAPLGLQLMCTAPPGAVQGHWAREAPGAWDCSVENGGCEHACNAIPGAPRCQCPAGAALQADGRSCTASATQSCNDLCEHFCVPNPDQPGSYSCMCETGYRLAADQHRCEDVDDCILEPSPCPQRCVNTQGGFECHCYPNYDLVDGECVEPVDPCFRANCEYQCQPLNQTSYLCVCAEGFAPIPHEPHRCQMFCNQTACPADCDPNTQASCECPEGYILDDGFICTDIDNECENGGFCSGVCHNLPGTFECICGPDSALVRHIGTDCDSGKVDGGDSGSGEPPPSPTPGSTLTPPAVGLVHSGLLIGISIASLCLVVALLALLCHLRKKQGAARAKMEYKCAAPSKEVVLQHVRTERTPQRL
配列番号2
MLGVLVLGALALAGLGFPAPAEPQPGGSQCVEHDCFALYPGPATFLNASQICDGLRGHLMTVRSSVAADVISLLLNGDGGVGRRRLWIGLQLPPGCGDPKRLGPLRGFQWVTGDNNTSYSRWARLDLNGAPLCGPLCVAVSAAEATVPSEPIWEEQQCEVKADGFLCEFHFPATCRPLAVEPGAAAAAVSITYGTPFAARGADFQALPVGSSAAVAPLGLQLMCTAPPGAVQGHWAREAPGAWDCSVENGGCEHACNAIPGAPRCQCPAGAALQADGRSCTASATQSCNDLCEHFCVPNPDQPGSYSCMCETGYRLAADQHRCEDVDDCILEPSPCPQRCVNTQGGFECHCYPNYDLVDGECVEPVDPCFRANCEYQCQPLNQTSYLCVCAEGFAPIPHEPHRCQMFCNQTACPADCDPNTQASCECPEGYILDDGFICTDIDECENGGFCSGVCHNLPGTFECICGPDSALARHIGTDCDSGKVDGGDSGSGEPPPSPTPGSTLTPPAVGLVHS
配列番号3
MLGVLVLGALALAGLGFPAPAEPQPGGSQCVEHDCFALYPGPATFLNASQICDGLRGHLMTVRSSVAADVISLLLNGDGGVGRRRLWIGLQLPPGCGDPKRLGPLRGFQWVTGDNNTSYSRWARLDLNGAPLCGPLCVAVSAAEATVPSEPIWEEQQCEVKADGFLCEFHFPATCRPLAVEPGAAAAAVSITYGTPFAARGADFQALPVGSSAAVAPLGLQLMCTAPPGAVQGHWAREAPGAWDCSVENGGCEHACNAIPGAPRCQCPAGAALQADGRSCTASATQSCNDLCEHFCVPNPDQPGSYSCMCETGYRLAADQHRCEDVDDCILEPSPCPQRCVNTQGGFECHCYPNYDLVDGECVEPVDPCFRANCEYQCQPLNQTSYLCVCAEGFAPIPHEPHRCQMFCNQTACPADCDPNTQASCECPEGYILDDGFICTDIDECENGGFCSGVCHNLPGTFECICGPDSALARHIGTDCDSGK
配列番号4
APAEPQPGGSQCVEHDCFALYPGPATFLNASQICDGLRGHLMTVRSSVAADVISLLLNGDGGVGRRRLWIGLQLPPGCGDPKRLGPLRGFQWVTGDNNTSYSRWARLDLNGAPLCGPLCVAVSAAEATVPSEPIWEEQQCEVKADGFLCEFHFPATCRPLAV
EPGAAAAAVSITYGTPFAARGADFQALPVGSSAAVAPLGLQLMCTAPPGAVQGHWAREAPGAWDCSVENGGCEHACNAIPGAPRCQCPAGAALQADGRSCTASATQSCNDLCEHFCVPNPDQPGSYSCMCETGYRLAADQHRCEDVDDCILEPSPCPQRCVNTQGGFECHCYPNYDLVDGECVEPVDPCFRANCEYQCQPLNQTSYLCVCAEGFAPIPHEPHRCQMFCNQTACPADCDPNTQASCECPEGYILDDGFICTDIDECENGGFCSGVCHNLPGTFECICGPDSALARHIGTDCDSGKVDGGDSGSGEPPPSPTPGSTLTPPAVGLVHS
配列番号5
APAEPQPGGSQCVEHDCFALYPGPATFLNASQICDGLRGHLMTVRSSVAADVISLLLNGDGGVGRRRLWIGLQLPPGCGDPKRLGPLRGFQWVTGDNNTSYSRWARLDLNGAPLCGPLCVAVSAAEATVPSEPIWEEQQCEVKADGFLCEFHFPATCRPLAV
EPGAAAAAVSITYGTPFAARGADFQALPVGSSAAVAPLGLQLMCTAPPGAVQGHWAREAPGAWDCSVENGGCEHACNAIPGAPRCQCPAGAALQADGRSCTASATQSCNDLCEHFCVPNPDQPGSYSCMCETGYRLAADQHRCEDVDDCILEPSPCPQRCVNTQGGFECHCYPNYDLVDGECVEPVDPCFRANCEYQCQPLNQTSYLCVCAEGFAPIPHEPHRCQMFCNQTACPADCDPNTQASCECPEGYILDDGFICTDIDECENGGFCSGVCHNLPGTFECICGPDSALARHIGTDCDSGK
配列番号6
APAEPQPGGSQCVEHDCFALYPGPATFLNASQICDGLRGHLMTVRSSVAADVISLLLNGDGGVGRRRLWIGLQLPPGCGDPKRLGPLRGFQWVTGDNNTSYSRWARLDLNGAPLCGPLCVAVSAAEATVPSEPIWEEQQCEVKADGFLCEFHFPATCRPLAVEPGAAAAAVSITYGTPFAARGADFQALPVGSSAAVAPLGLQLMCTAPPGAVQGHWAREAPGAWDCSVENGGCEHACNAIPGAPRCQCPAGAALQADGRSCTASATQSCNDLCEHFCVPNPDQPGSYSCMCETGYRLAADQHRCEDVDDCILEPSPCPQRCVNTQGGFECHCYPNYDLVDGECVEPVDPCFRANCEYQCQPLNQTSYLCVCAEGFAPIPHEPHRCQMFCNQTACPADCDPNTQASCECPEGYILDDGFICTDADECENGGFCSGVCHNLPGTFECICGPDSALARHIGTDCDSGK
配列番号7  
ヒト sTMD2 DNA 配列
GCCCCTGCCGAGCCTCAGCCTGGCGGCAGCCAGTGCGTGGAGCACGACTGCTTCGCCCTGTACCCCGGACCCGCCACCTTCCTGAACGCCAGCCAGATCTGCGACGGCCTGCGGGGCCACCTGATGACCGTGCGGAGCAGCGTGGCCGCCGACGTGATCAGCCTGCTGCTGAACGGCGACGGCGGCGTGGGCAGGCGGAGGCTGTGGATCGGACTGCAGCTGCCCCCTGGCTGCGGCGACCCCAAGAGGCTGGGCCCCCTGCGGGGCTTCCAGTGGGTGACCGGCGACAACAACACCAGCTACAGCAGATGGGCCAGGCTGGACCTGAATGGCGCCCCTCTGTGCGGCCCACTGTGCGTGGCCGTGTCTGCCGCCGAGGCCACCGTGCCCAGCGAGCCCATCTGGGAGGAACAGCAGTGCGAAGTGAAGGCCGACGGCTTCCTGTGCGAGTTCCACTTCCCCGCCACCTGCAGGCCTCTGGCCGTGGAACCTGGAGCCGCTGCTGCCGCCGTGAGCATCACCTACGGCACCCCCTTCGCCGCCAGAGGCGCCGACTTCCAGGCCCTGCCCGTGGGCTCTTCTGCCGCCGTGGCCCCCCTGGGGCTGCAGCTGATGTGCACCGCCCCTCCAGGCGCCGTGCAGGGCCACTGGGCCAGAGAAGCCCCTGGCGCCTGGGACTGCAGCGTGGAGAACGGCGGCTGCGAGCACGCCTGCAACGCCATCCCTGGCGCCCCTAGGTGCCAGTGCCCTGCCGGAGCCGCCCTCCAGGCCGATGGCAGAAGCTGCACCGCCAGCGCCACCCAGAGCTGCAACGACCTGTGCGAGCACTTCTGCGTGCCCAACCCCGACCAGCCCGGCAGCTACAGCTGCATGTGCGAGACCGGCTACCGGCTGGCCGCCGATCAGCACAGATGCGAGGACGTGGACGACTGCATCCTGGAACCCAGCCCCTGCCCCCAGAGATGCGTGAACACCCAGGGCGGCTTCGAGTGCCACTGCTACCCCAACTACGACCTGGTGGACGGCGAGTGTGTGGAGCCCGTGGACCCCTGCTTCCGGGCCAACTGCGAGTACCAGTGCCAGCCCCTGAACCAGACCAGCTACCTGTGCGTGTGCGCCGAAGGCTTCGCCCCCATCCCCCACGAGCCCCACCGGTGCCAGATGTTCTGCAACCAGACCGCCTGCCCTGCCGACTGCGACCCCAATACCCAGGCCAGCTGCGAGTGCCCCGAGGGCTACATCCTGGACGACGGCTTCATCTGCACCGACATCGACGAGTGCGAGAATGGCGGCTTCTGCAGCGGCGTGTGCCACAACCTGCCCGGCACCTTCGAGTGCATCTGCGGCCCTGACAGCGCCCTGGCCCGGCACATCGGCACCGACTGCGATAGCGGCAAG
配列番号8   ヒト sTMD2-I424A DNA 配列
GCCCCTGCCGAGCCTCAGCCTGGCGGCAGCCAGTGCGTGGAGCACGACTGCTTCGCCCTGTACCCCGGACCCGCCACCTTCCTGAACGCCAGCCAGATCTGCGACGGCCTGCGGGGCCACCTGATGACCGTGCGGAGCAGCGTGGCCGCCGACGTGA
TCAGCCTGCTGCTGAACGGCGACGGCGGCGTGGGCAGGCGGAGGCTGTGGATCGGACTGCAGCTGCCCCCTGGCTGCGGCGACCCCAAGAGGCTGGGCCCCCTGCGGGGCTTCCAGTGGGTGACCGGCGACAACAACACCAGCTACAGCAGATGGGCCAGGCTGGACCTGAATGGCGCCCCTCTGTGCGGCCCACTGTGCGTGGCCGTGTCTGCCGCCGAGGCCACCGTGCCCAGCGAGCCCATCTGGGAGGAACAGCAGTGCGAAGTGAAGGCCGACGGCTTCCTGTGCGAGTTCCACTTCCCCGCCACCTGCAGGCCTCTGGCCGTGGAACCTGGAGCCGCTGCTGCCGCCGTGAGCATCACCTACGGCACCCCCTTCGCCGCCAGAGGCGCCGACTTCCAGGCCCTGCCCGTGGGCTCTTCTGCCGCCGTGGCCCCCCTGGGGCTGCAGCTGATGTGCACCGCCCCTCCAGGCGCCGTGCAGGGCCACTGGGCCAGAGAAGCCCCTGGCGCCTGGGACTGCAGCGTGGAGAACGGCGGCTGCGAGCACGCCTGCAACGCCATCCCTGGCGCCCCTAGGTGCCAGTGCCCTGCCGGAGCCGCCCTCCAGGCCGATGGCAGAAGCTGCACCGCCAGCGCCACCCAGAGCTGCAACGACCTGTGCGAGCACTTCTGCGTGCCCAACCCCGACCAGCCCGGCAGCTACAGCTGCATGTGCGAGACCGGCTACCGGCTGGCCGCCGATCAGCACAGATGCGAGGACGTGGACGACTGCATCCTGGAACCCAGCCCCTGCCCCCAGAGATGCGTGAACACCCAGGGCGGCTTCGAGTGCCACTGCTACCCCAACTACGACCTGGTGGACGGCGAGTGTGTGGAGCCCGTGGACCCCTGCTTCCGGGCCAACTGCGAGTACCAGTGCCAGCCCCTGAACCAGACCAGCTACCTGTGCGTGTGCGCCGAAGGCTTCGCCCCCATCCCCCACGAGCCCCACCGGTGCCAGATGTTCTGCAACCAGACCGCCTGCCCTGCCGACTGCGACCCCAATACCCAGGCCAGCTGCGAGTGCCCCGAGGGCTACATCCTGGACGACGGCTTCATCTGCACCGACGCCGACGAGTGCGAGAATGGCGGCTTCTGCAGCGGCGTGTGCCACAACCTGCCCGGCACCTTCGAGTGCATCTGCGGCCCTGACAGCG
CCCTGGCCCGGCACATCGGCACCGACTGCGATAGCGGCAAG
配列番号9   spTMD1 DNA 配列
ATGCTGGGCGTGCTGGTGCTGGGAGCCCTGGCCCTGGCCGGCCTGGGCTTTCCTGCCCCTGCCGAGCCTCAGCCTGGCGGCAGCCAGTGCGTGGAGCACGACTGCTTCGCCCTGTACCCCGGACCCGCCACCTTCCTGAACGCCAGCCAGATCTGCGACGGCCTGCGGGGCCACCTGATGACCGTGCGGAGCAGCGTGGCCGCCGACGTGATCAGCCTGCTGCTGAACGGCGACGGCGGCGTGGGCAGGCGGAGGCTGTGGATCGGACTGCAGCTGCCCCCTGGCTGCGGCGACCCCAAGAGGCTGGGCCCCCTGCGGGGCTTCCAGTGGGTGACCGGCGACAACAACACCAGCTACAGCAGATGGGCCAGGCTGGACCTGAATGGCGCCCCTCTGTGCGGCCCACTGTGCGTGGCCGTGTCTGCCGCCGAGGCCACCGTGCCCAGCGAGCCCATCTGGGAGGAACAGCAGTGCGAAGTGAAGGCCGACGGCTTCCTGTGCGAGTTCCACTTCCCCGCCACCTGCAGGCCTCTGGCCGTGGAACCTGGAGCCGCTGCTGCCGCCGTGAGCATCACCTACGGCACCCCCTTCGCCGCCAGAGGCGCCGACTTCCAGGCCCTGCCCGTGGGCTCTTCTGCCGCCGTGGCCCCCCTGGGGCTGCAGCTGATGTGCACCGCCCCTCCAGGCGCCGTGCAGGGCCACTGGGCCAGAGAAGCCCCTGGCGCCTGGGACTGCAGCGTGGAGAACGGCGGCTGCGAGCACGCCTGCAACGCCATCCCTGGCGCCCCTAGGTGCCAGTGCCCTGCCGGAGCCGCCCTCCAGGCCGATGGCAGAAGCTGCACCGCCAGCGCCACCCAGAGCTGCAACGACCTGTGCGAGCACTTCTGCGTGCCCAACCCCGACCAGCCCGGCAGCTACAGCTGCATGTGCGAGACCGGCTACCGGCTGGCCGCCGATCAGCACAGATGCGAGGACGTGGACGACTGCATCCTGGAACCCAGCCCCTGCCCCCAGAGATGCGTGAACACCCAGGGCGGCTTCGAGTGCCACTGCTACCCCAACTACGACCTGGTGGACGGCGAGTGTGTGGAGCCCGTGGACCCCTGCTTCCGGGCCAACTGCGAGTACCAGTGCCAGCCCCTGAACCAGACCAGCTACCTGTGCGTGTGCGCCGAAGGCTTCGCCCCCATCCCCCACGAGCCCCACCGGTGCCAGATGTTCTGCAACCAGACCGCCTGCCCTGCCGACTGCGACCCCAATACCCAGGCCAGCTGCGAGTGCCCCGAGGGCTACATCCTGGACGACGGCTTCATCTGCACCGACATCGACGAGTGCGAGAATGGCGGCTTCTGCAGCGGCGTGTGCCACAACCTGCCCGGCACCTTCGAGTGCATCTGCGGCCCTGACAGCGCCCTGGCCCGGCACATCGGCACCGACTGCGATAGCGGCAAGGTGGACGGGGGCGACTCCGGCTCCGGCGAGCCCCCTCCCAGCCCTACCCCCGGCAGCACCCTGACCCCTCCCGCCGTGGGCCTGGTGCACAGC
配列番号10 spTMD1-I424A DNA 配列
ATGCTGGGCGTGCTGGTGCTGGGAGCCCTGGCCCTCGCTGGACTGGGCTTTCCTGCCCCTGCCGAGCCTCAGCCTGGCGGCAGCCAGTGCGTGGAGCACGACTGCTTCGCCCTGTACCCCGGACCCGCCACCTTCCTGAACGCCAGCCAGATCTGCGACGGCCTGAGAGGCCACCTGATGACCGTGCGGAGCAGCGTGGCCGCCGACGTGATCAGCCTGCTGCTGAACGGCGACGGCGGCGTGGGCAGGCGGAGACTGTGGATCGGCCTGCAGCTGCCCCCTGGCTGCGGCGACCCCAAGAGACTGGGCCCCCTGCGGGGCTTCCAGTGGGTGACCGGCGACAACAACACCAGCTACAGCAGATGGGCCAGACTGGACCTGAATGGCGCCCCTCTGTGCGGCCCACTGTGCGTGGCCGTGTCTGCTGCCGAGGCCACCGTGCCCAGCGAGCCCATCTGGGAGGAACAGCAGTGCGAAGTGAAGGCCGACGGCTTCCTGTGCGAGTTCCACTTCCCCGCCACCTGCAGACCCCTGGCCGTGGAACCCGGCGCCGCTGCTGCAGCCGTGTCTATCACCTACGGCACCCCCTTCGCCGCCAGAGGCGCCGACTTCCAGGCCCTGCCCGTGGGAAGCTCTGCCGCCGTGGCCCCTCTGGGGCTGCAGCTGATGTGCACCGCCCCTCCAGGCGCCGTGCAGGGCCACTGGGCCAGAGAAGCCCCTGGGGCCTGGGACTGCAGCGTGGAGAACGGCGGCTGCGAGCACGCCTGCAACGCCATCCCTGGCGCCCCTAGATGCCAGTGCCCTGCTGGAGCCGCCCTGCAGGCCGATGGCAGAAGCTGCACCGCCAGCGCCACCCAGAGCTGCAACGACCTGTGCGAGCACTTCTGCGTGCCCAACCCCGACCAGCCTGGAAGCTACAGCTGCATGTGCGAGACAGGCTACCGGCTGGCCGCCGATCAGCACAGATGCGAGGACGTGGACGACTGCATCCTGGAACCCAGCCCCTGCCCCCAGAGATGCGTGAACACCCAGGGCGGCTTCGAGTGCCACTGCTACCCTAACTACGACCTGGTGGACGGCGAGTGTGTGGAGCCCGTGGACCCCTGCTTCCGGGCCAACTGCGAGTACCAGTGCCAGCCCCTGAACCAGACCAGCTACCTGTGCGTGTGCGCCGAAGGCTTCGCCCCCATCCCCCACGAGCCCCACCGGTGCCAGATGTTCTGCAACCAGACCGCCTGTCCTGCCGACTGCGACCCCAATACCCAGGCCAGCTGTGAGTGCCCCGAGGGCTACATCCTGGACGACGGCTTCATCTGCACAGACGCCGACGAGTGCGAGAATGGCGGCTTCTGCAGCGGCGTGTGCCACAACCTGCCCGGCACCTTCGAGTGCATCTGCGGCCCTGACAGCGCCCTGGCCAGACACATCGGCACCGACTGCGATAGCGGCAAGGTGGACGGGGGGGACGCCGGAGCCGGCGAGCCTCCCCCCAGCCCTACCCCCGGCAGCACCCTGACCCCTCCCGCCGTGGGCCTGGTGCACAGC
配列番号11
APAEPQPGGSQCVEHDCFALYPGPATFLNASQICDGLRGHLMTVRSSVAADVISLLLNGDGGVGRRRLWIGLQLPPGCGDPKRLGPLRGFQWVTGDNNTSYSRWARLDLNGAPLCGPLCVAVSAAEATVPSEPIWEEQQCEVKADGFLCEFHFPATCRPLAVEPGAAAAAVSITYGTPFAARGADFQALPVGSSAAVAPLGLQLMCTAPPGAVQGHWAREAPGAWDCSVENGGCEHACNAIPGAPRCQCPAGAALQADGRSCTASATQSCNDLCEHFCVPNPDQPGSYSCMCETGYRLAADQHRCEDVDDCILEPSPCPQRCVNTQGGFECHCYPNYDLVDGECVEPVDPCFRANCEYQCQPLNQTSYLCVCAEGFAPIPHEPHRCQMFCNQTACPADCDPNTQASCECPEGYILDDGFICTDIDE
配列番号12 hsTM-LE15 DNA 配列
GCCCCTGCCGAGCCTCAGCCTGGCGGCAGCCAGTGCGTGGAGCACGACTGCTTCGCCCTGTACCCCGGACCCGCCACCTTCCTGAACGCCAGCCAGATCTGCGACGGCCTGCGGGGCCACCTGATGACCGTGCGGAGCAGCGTGGCCGCCGACGTGATCAGCCTGCTGCTGAACGGCGACGGCGGCGTGGGCAGGCGGAGGCTGTGGATCGGACTGCAGCTGCCCCCTGGCTGCGGCGACCCCAAGAGGCTGGGCCCCCTGCGGGGCTTCCAGTGGGTGACCGGCGACAACAACACCAGCTACAGCAGATGGGCCAGGCTGGACCTGAATGGCGCCCCTCTGTGCGGCCCACTGTGCGTGGCCGTGTCTGCCGCCGAGGCCACCGTGCCCAGCGAGCCCATCTGGGAGGAACAGCAGTGCGAAGTGAAGGCCGACGGCTTCCTGTGCGAGTTCCACTTCCCCGCCACCTGCAGGCCTCTGGCCGTGGAACCTGGAGCCGCTGCTGCCGCCGTGAGCATCACCTACGGCACCCCCTTCGCCGCCAGAGGCGCCGACTTCCAGGCCCTGCCCGTGGGCTCTTCTGCCGCCGTGGCCCCCCTGGGGCTGCAGCTGATGTGCACCGCCCCTCCAGGCGCCGTGCAGGGCCACTGGGCCAGAGAAGCCCCTGGCGCCTGGGACTGCAGCGTGGAGAACGGCGGCTGCGAGCACGCCTGCAACGCCATCCCTGGCGCCCCTAGGTGCCAGTGCCCTGCCGGAGCCGCCCTCCAGGCCGATGGCAGAAGCTGCACCGCCAGCGCCACCCAGAGCTGCAACGACCTGTGCGAGCACTTCTGCGTGCCCAACCCCGACCAGCCCGGCAGCTACAGCTGCATGTGCGAGACCGGCTACCGGCTGGCCGCCGATCAGCACAGATGCGAGGACGTGGACGACTGCATCCTGGAACCCAGCCCCTGCCCCCAGAGATGCGTGAACACCCAGGGCGGCTTCGAGTGCCACTGCTACCCCAACTACGACCTGGTGGACGGCGAGTGTGTGGAGCCCGTGGACCCCTGCTTCCGGGCCAACTGCGAGTACCAGTGCCAGCCCCTGAACCAGACCAGCTACCTGTGCGTGTGCGCCGAAGGCTTCGCCCCCATCCCCCACGAGCCCCACCGGTGCCAGATGTTCTGCAACCAGACCGCCTGCCCTGCCGACTGCGACCCCAATACCCAGGCCAGCTGCGAGTGCCCCGAGGGCTACATCCTGGACGACGGCTTCATCTGCACCGACATCGACGAG
配列番号13 
MLGVLVLGALALAGLGFP
【配列表】
2012508742000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成23年5月12日(2011.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2012508742000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年5月17日(2011.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＫＩの治療または予防に用いる、トロンビンに結合しないｓＴＭ変異体の使用。
【請求項２】
該変異体が、実施例３に記載のＢＩＡｃｏｒｅアッセイ条件下におけるトロンビン結合について４３００を超えるＫｄ値を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ｓＴＭ変異体が、配列番号６または配列番号１１に示されたアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記ｓＴＭ変異体が配列番号６に示されたアミノ酸配列からなる、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記ｓＴＭ変異体が配列番号１１に示されたアミノ酸配列からなる、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
ＡＫＩの治療または予防に用いる、トロンビンに結合しないｓＴＭ変異体。
【請求項７】
該変異体が、実施例３に記載のＢＩＡｃｏｒｅアッセイ条件下におけるトロンビン結合について４３００を超えるＫｄ値を有する、請求項６に記載のｓＴＭ変異体。
【請求項８】
前記ｓＴＭ変異体が、配列番号６または配列番号１１に示されたアミノ酸配列からなる、請求項６に記載のｓＴＭ変異体。
【請求項９】
前記ｓＴＭ変異体が配列番号６に示されたアミノ酸配列からなる、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記ｓＴＭ変異体が配列番号１１に示されたアミノ酸配列からなる、請求項８に記載の使用。
【国際調査報告】
2012508742.tif 000013
2012508742.tif 000014
2012508742.tif 000015
2012508742.tif 000016