(57)【要約】本発明は骨軟骨欠損を治療するための組成物およびを提供する。１つの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスおよび血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含み、二相性生体適合性マトリクスは足場材料を含み、足場材料は骨相および軟骨相を含む多孔質構造を形成する、組成物が提供される。別の実施形態では、個体において骨軟骨欠損を治療するための方法であって、個体に、有効量の、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物を少なくとも１つの骨軟骨欠損部位に投与することを含み、二相性生体適合性マトリクスは足場材料を含み、足場材料は骨相および軟骨相を含む多孔質構造を形成する方法も提供される。
2012519556.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二相性生体適合性マトリクスおよび血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含む骨軟骨欠損治療のための組成物であって、前記二相性生体適合性マトリクスが足場材料を含み、さらに前記足場材料が骨相および軟骨相を含む多孔質構造を形成する組成物。
【請求項２】
前記骨軟骨欠損が軟骨および軟骨に隣接した硬骨中にあり、前記軟骨が関節軟骨、線維軟骨、または弾性軟骨を含む請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記骨軟骨欠損が軟骨および軟骨に隣接した硬骨中にあり、前記軟骨に隣接した硬骨が軟骨下骨または海綿骨を含む請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記骨相がカルシウムリン酸塩およびコラーゲンを含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記骨相がカルシウムリン酸塩および同種移植物質を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記骨相がカルシウムリン酸塩、コラーゲン、および同種移植物質を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記骨相がコラーゲンおよび同種移植物質を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記軟骨相がグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）およびコラーゲンを含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記軟骨相がグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）および同種移植物質を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記軟骨相がグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、同種移植物質、およびコラーゲンを含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記二相性生体適合性マトリクスがさらに生体適合性バインダーを追加して含む請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＰＤＧＦが溶液中に在り、ＰＤＧＦ溶液中のＰＤＧＦ濃度が約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの範囲にある請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＰＤＧＦ溶液中のＰＤＧＦ濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲にある請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
哺乳動物の骨軟骨欠損を治療する方法であって、前記哺乳動物に骨軟骨欠損の少なくとも１つの部位に対する二相性生体適合性マトリクスおよび血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含む有効量の組成物を投与することを含み、前記二相性生体適合性マトリクスが足場材料を含み、前記足場材料が骨相および軟骨相を含む多孔質構造を形成する方法。
【請求項１５】
前記骨軟骨欠損が軟骨および軟骨に隣接した硬骨中にあり、軟骨が関節軟骨を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記骨軟骨欠損が軟骨および軟骨に隣接した硬骨中にあり、前記軟骨に隣接した硬骨が軟骨下骨または海綿骨を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記骨相がカルシウムリン酸塩およびコラーゲンを含む請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記骨相がカルシウムリン酸塩および同種移植物質を含む請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記骨相がカルシウムリン酸、同種移植物質、およびコラーゲンを含む請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記骨相が同種移植物質およびコラーゲンを含む請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記軟骨相がグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）およびコラーゲンを含む請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記軟骨相がグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）および同種移植物質を含む請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記軟骨相がグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、同種移植物質、およびコラーゲンを含む請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記二相性生体適合性マトリクスがさらに生体適合性バインダーを追加して含む請求項１４〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＤＧＦが溶液中に在り、ＰＤＧＦ溶液中のＰＤＧＦ濃度が約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの範囲にある請求項１４〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＰＤＧＦ溶液中のＰＤＧＦ濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲にある請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記骨軟骨欠損の少なくとも１つの部位が、軟骨に隣接した硬骨、軟骨、軟骨と軟骨に隣接した硬骨の間の界面、またはこれらの組み合わせを含む請求項１４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年３月５日に出願された米国特許仮出願第６１／２０９，５２０号、および２００９年３月２７日に出願された米国特許仮出願第６１／１６４，２５９号（それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる）の米国特許法１１９条に基づく恩典を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、軟骨および骨における損傷または欠損を治療するための組成物および方法、特に、個体に二相性生体適合性マトリクスを血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）と共に含む組成物を、少なくとも１つの骨軟骨欠損部位に投与することによる、個体における軟骨および軟骨に隣接する骨における骨軟骨欠損の治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
軟骨は軟骨細胞から構成される特定化された結合組織である。一般に、３つの主な軟骨の型、すなわち関節（硝子）軟骨、線維軟骨、および弾性軟骨が存在し、それは全て構造および機能が異なる。
【０００４】
関節軟骨は、コラーゲン線維（ＩＩ型コラーゲン）のネットワークおよび軟骨細胞を含むプロテオグリカンマトリクスを有する。その原理機能は、ほとんど摩擦のない関節表面を提供すること、ならびに圧迫、張力、およびずり応力に耐えることができる衝撃吸収構造を提供すること、負荷を消散させることである。関節軟骨組成は関節表面上の解剖学的位置、年齢および表面からの深さに伴い、変化する。Lipshitz H. et al., J. Bone Joint Surg., 57(4):527-34 (1975)を参照されたい。関節軟骨は、他の筋骨格組織と、外傷性または病的攻撃後に再生する能力を有しないという点で異なる。いったん疾患または外傷が関節軟骨の健康に影響を与えると、不可避な変性過程が起こる可能性がある。F.R. et al., Clin. Orthop., 82:253-62 (1972)を参照されたい。
【０００５】
線維軟骨はＩ型コラーゲンの高密度ネットワークにより特徴づけられる。これは、関節軟骨よりも多くのコラーゲンおよびより少ないプロテオグリカンを含む。これは、頻繁な応力を最も受けやすい領域、例えば椎間板、半月板、恥骨結合、およびある腱と靱帯の付着部に存在する。
【０００６】
弾性軟骨はマトリクス全体にわたって大量のエラスチンを含む。これは、管状構造が崩壊するのを阻止するように機能し、耳介および管状構造、例えば、耳管および喉頭蓋内で見出すことができる。
【０００７】
軟骨の損傷または外傷は、ますます、患者における疼痛および機能的問題の原因として認識されている。一般に軟骨は制限された修復能力を有し、というのも、軟骨細胞はラクナ内に結合され、損傷領域に移動することができないからである。さらに、関節軟骨損傷の場合、神経支配がなく、血管およびリンパ系により侵入されず、主に滑液を介し、ある程度は隣接する骨から栄養が誘導されるため、関節軟骨への損傷または外傷は、治癒が非常に困難であり、特に、ほとんど無血管で５％のみが細胞である成人関節軟骨の場合がそうである。Bora F.W. Jr. and Miller G., Hand Clin., 3(3):325-36 (1987)を参照され
たい。
【０００８】
軟骨で認識される２つの型の損傷または欠損がある：軟骨欠損（または表層欠損）およ
び骨軟骨欠損（または全層欠損）。軟骨欠損における損傷または外傷は、軟骨自体に制限されているにすぎず、軟骨下骨構造に影響しないが、骨軟骨欠損における損傷または外傷は、軟骨およびその下にある骨の両方に影響し、治療が非常に困難である。骨軟骨欠損（または局所性骨軟骨欠損）は、軟骨表面で維持され、軟骨における細胞死のカスケードを開始し、例えば、重篤な変形性関節症の場合に見られるように、骨に伝達する外傷性損傷として生じると考えられる。圧迫力はさらに、下の骨に影響し、血液供給への損傷、および最終的な壊死を引き起こす。骨軟骨欠損に対する現在の治療としては、骨関節移植システム（ＯＡＴＳ）／モザイクプラスティ、同種移植片、自家軟骨細胞移植（ＡＣＩ）／マトリクス−ＡＣＩ（ＭＡＣＩ）、およびマイクロフラクチャーが挙げられる。しかしながら、これらの治療は各々、様々な欠点を有する。
【０００９】
骨関節移植システム（ＯＡＴＳ）／モザイクプラスティは、健康な免荷軟骨の円筒形プラグの損傷軟骨領域への移植を必要とする。この治療は、最適プラグ配置の技術的問題および組織を回収するために必要とされる力による組織壊死により複雑化される。さらに、患者はしばしば、回収部位の合併症に苦しみ、より長期にわたり外科的領域にとどまらなければならない。
【００１０】
第２の治療選択、同種移植片は、ひざの処置において日常的に使用される。しかしながら、感染症伝播の危険および新たな自家組織移植に比べ結果がよくないという主な欠点を有する。
【００１１】
自家軟骨細胞移植（ＡＣＩ）／マトリクス−ＡＣＩ（ＭＡＣＩ）は、膝の免荷領域（例えば、大腿顆）から取り出した軟骨外植片（２００ｍｇ〜３００ｍｇ）を必要とする。組織試料中の軟骨細胞は、その後周囲の軟骨から分離され、４〜５週間培養される。欠損領域は、死んだ軟骨を除去し、下にある周囲の生存軟骨を滑らかにすることにより準備する。骨を被覆する膜である骨膜の一片を患者の脛骨から取り、準備した欠損上で縫合し、その下に、外科医が、培養させた軟骨細胞を注入する。ＡＣＩはコストが高い（すなわち、１処置あたり＄２０，０００を超える）、軟骨細胞を回収し移植する２つの手術が必要である、手術時間の増加、回収部位での局所的な罹患率、およびマイクロフラクチャー単独の場合に比べ良好な結果を得ることができないために、広くは使用されていない。
【００１２】
マイクロフラクチャー外科手術は、関節鏡下アプローチにより実施される。外科医は、最初に、鋭匙またはバールを用いて病変部から全ての石灰化軟骨を除去する。その後微小破壊を、突錐を使用して隣接する骨内で生成させる。血液および骨髄（幹細胞を含む）が破壊部から漏れ、血餅を形成し、これは軟骨生成細胞を放出する。微小破壊は、身体により損傷として治療され、外科手術により新たに置換された軟骨が得られる。処置は、高齢患者または体重超過患者、または２．５ｃｍを超える軟骨損傷では効果が低い。約１２０，０００マイクロフラクチャー処置（グレード３および４病変を含む）が１年に起こる。マイクロフラクチャーはまた、骨軟骨損傷に対しては不完全な修復となる、というのも、１）軟骨を再生するには不十分な血餅および細胞量が欠損部に引き込まれ、２）形成後に血餅の剥離／移動が起こり、３）望ましいＩＩ型硝子軟骨ではなく、線維軟骨で見られるＩ型コラーゲンが生成されるからである。
【００１３】
したがって、軟骨およびその下の骨、特に、関節軟骨、線維軟骨、または弾性軟骨、およびその下の骨における骨軟骨欠損のためのより効果的、効率的、および経済的な治療のための新規組成物および方法を提供する必要がある。
【００１４】
特許、特許出願および科学文献を含むがそれらに限定されない、本明細書で引用される参考文献は全て、その全体が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、骨軟骨欠損を治療するための組成物および方法を提供する。本発明の１つの態様では二相性生体適合性マトリクスおよび血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含み、二相性生体適合性マトリクスは足場材料を含み、足場材料は骨相および軟骨相を含む多孔質構造を形成する、組成物が提供される。
【００１６】
本発明の別の態様では、個体において骨軟骨欠損を治療するための方法であって、前記個体に、有効量の、二相性生体適合性マトリクスおよび血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含む組成物を少なくとも１つの骨軟骨欠損部位に投与することを含み、二相性生体適合性マトリクスは足場材料を含み、足場材料は骨相および軟骨相を含む多孔質構造を形成する方法が提供される。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態では、骨軟骨欠損は軟骨および軟骨に隣接する骨において生じ、軟骨は関節軟骨、線維軟骨、または弾性軟骨を含む。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態では、骨軟骨欠損は軟骨および軟骨に隣接する骨において生じ、軟骨に隣接する骨は軟骨下骨または海綿骨を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの骨軟骨欠損部位は、軟骨に隣接する骨、軟骨、軟骨と軟骨に隣接する骨の間の界面、またはそれらに組み合わせを含む。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態では、骨相はリン酸カルシウムおよびコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムはリン酸トリカルシウムである。いくつかの実施形態では、骨相は硫酸カルシウムおよびコラーゲンを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、リン酸カルシウム約１００μｍ〜約５０００μｍの範囲のサイズの粒子から構成される。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは約１００μｍ〜約３０００μｍの範囲のサイズの粒子から構成される。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは約２５０μｍ〜約１０００μｍの範囲のサイズの粒子から構成される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、骨相で使用されるリン酸カルシウムは、二相性生体適合性マトリクスの総容積に比べ、より低い容積％を有する。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは、二相性生体適合性マトリクスの総容積の約５％未満〜約５０％未満の範囲の容積％を有する。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは、二相性生体適合性マトリクスの総容積の約５％未満の容積％を有する。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは、二相性生体適合性マトリクスの総容積の約１０％未満の容積％を有する。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは、二相性生体適合性マトリクスの総容積の約１５％未満の容積％を有する。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは、二相性生体適合性マトリクスの総容積の約２０％未満の容積％を有する。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは、二相性生体適合性マトリクスの総容積の約３０％未満の容積％を有する。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは、二相性生体適合性マトリクスの総容積の約３５％未満の容積％を有する。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは、二相性生体適合性マトリクスの総容積の約４０％未満の容積％を有する。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは、二相性生体適合性マトリクスの総容積の約４５％未満の容積％を有する。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは、二相性生体適合性マトリクスの総容積の約５０％未満の容積％を有する。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態では、骨相はリン酸カルシウムおよび同種移植片材料を含む。いくつかの実施形態では、骨相は硫酸カルシウムおよび同種移植片材料を含む。いくつかの実施形態では、同種移植片材料は脱灰骨マトリクスである。
【００２４】
いくつかの実施形態では、骨相はリン酸カルシウム、同種移植片材料、およびコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、骨相はβ−リン酸トリカルシウム、同種移植片材料、およびコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、骨相はリン酸カルシウム、脱灰骨マトリクス、およびコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、骨相はβ−リン酸トリカルシウム、脱灰骨マトリクス、およびコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、骨相は硫酸カルシウム、同種移植片材料、およびコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、骨相は硫酸カルシウム、脱灰骨マトリクス、およびコラーゲンを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、骨相は同種移植片材料およびコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、骨相は脱灰骨マトリクスおよびコラーゲンを含む。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態では、骨相は多孔質構造を形成し、約４０％を超える多孔度を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、骨相は約５０％を超える多孔度を有する。いくつかの実施形態では、骨相は約７５％を超える多孔度を有する。いくつかの実施形態では、骨相は約８５％を超える多孔度を有する。いくつかの実施形態では、骨相は約９０％を超える多孔度を有する。いくつかの実施形態では、骨相は約９５％を超える多孔度を有する。いくつかの実施形態では、骨相は相互接続された細孔を有する多孔質構造を含む。いくつかの実施形態では、骨相中のリン酸カルシウムは相互接続された細孔を有する。いくつかの実施形態では、多孔度はマクロ多孔度である。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態では、骨相は、多孔質構造を形成し、約４５００μｍ2〜
約２００００μｍ2の範囲の細孔面積サイズおよび約２００μｍ〜約５００μｍの範囲の
細孔周囲長サイズを有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、骨相は、多孔質構造を形成し、約６０００μｍ2〜約１５０００μｍ2の範囲の細孔面積サイズを有する細孔を含む。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態では、骨相の多孔質構造は、細胞の骨相の細孔内への浸潤を可能にする。いくつかの実施形態では、骨相は細胞の付着を可能にする。いくつかの実施形態では、浸潤または付着細胞は、間葉系幹細胞（または骨髄間質細胞）である。いくつかの実施形態では、浸潤または付着細胞は、骨芽細胞である。いくつかの実施形態では、浸潤または付着細胞は、軟骨細胞である。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態では、骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約１００％〜約１０００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約１００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約２００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約３００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約４００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約６００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約８００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に
比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約１０００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態では、骨梁数は、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物で処置した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物で処置した個体において、約１００％〜約１０００％（マトリクスの投与後１２週で測定）増加する。いくつかの実施形態では、骨梁数は、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物で処置した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物で処置した個体において、約１００％（マトリクスの投与後１２週で測定）増加する。いくつかの実施形態では、骨梁数は、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物で処置した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物で処置した個体において、約２００％（マトリクスの投与後１２週で測定）増加する。いくつかの実施形態では、骨梁数は、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物で処置した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物で処置した個体において、約２５０％〜約１０００％（マトリクスの投与後１２週で測定）増加する。いくつかの実施形態では、骨梁数は、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物で処置した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物で処置した個体において、約３００％（マトリクスの投与後１２週で測定）増加する。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態では、軟骨相はグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）およびコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、軟骨相はＧＡＧおよび同種移植片材料を含む。いくつかの実施形態では、同種移植片材料は脱灰骨マトリクスではない。いくつかの実施形態では、同種移植片材料は石灰化骨マトリクスである。
【００３２】
いくつかの実施形態では、軟骨相はＧＡＧ、同種移植片材料、およびコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、軟骨相はコンドロイチン硫酸、同種移植片材料、およびコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、軟骨相はＧＡＧ、石灰化骨マトリクス、およびコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、軟骨相はコンドロイチン硫酸、石灰化骨マトリクス、およびコラーゲンを含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、軟骨相はコラーゲンおよびプロテオグリカンを含む。いくつかの実施形態では、軟骨相は同種移植片材料およびプロテオグリカンを含む。いくつかの実施形態では、軟骨相は石灰化骨マトリクスおよびプロテオグリカンを含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、軟骨相はコラーゲン、プロテオグリカン、および同種移植片材料を含む。いくつかの実施形態では、軟骨相は石灰化骨マトリクス、プロテオグリカン、およびコラーゲンを含む。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態では、軟骨相は多孔質構造を形成し、約４０％を超える多孔度を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、軟骨相は約５０％を超える多孔度を有する。いくつかの実施形態では、軟骨相は約７５％を超える多孔度を有する。いくつかの実施形態では、軟骨相は約８５％を超える多孔度を有する。いくつかの実施形態では、軟骨相は約９０％を超える多孔度を有する。いくつかの実施形態では、軟骨相は約９５％を超える多孔度を有する。いくつかの実施形態では、軟骨相は相互接続された細孔を有する多孔質構造を含む。いくつかの実施形態では、多孔度はマクロ多孔度である。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態では、軟骨相は多孔質構造を形成し、４５００μｍ2〜約
２００００μｍ2の範囲の細孔面積サイズおよび約２００μｍ〜約５００μｍの範囲の細
孔周囲長サイズを有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、軟骨相は、多孔質構造を形成し、約６０００μｍ2〜約１５０００μｍ2の範囲の細孔面積サイズを有する細孔を含
む。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態では、軟骨相の多孔質構造は、細胞の軟骨相の細孔内への浸潤を可能にする。いくつかの実施形態では、軟骨相は細胞の付着を可能にする。いくつかの実施形態では、浸潤または付着細胞は、間葉系幹細胞（または骨髄間質細胞）である。いくつかの実施形態では、浸潤または付着細胞は、骨芽細胞である。いくつかの実施形態では、浸潤または付着細胞は、軟骨細胞である。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態では、軟骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約１００％〜約１０００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、軟骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約１００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、軟骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約２００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、軟骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約３００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、軟骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約４００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、軟骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約６００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、軟骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約８００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、軟骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約１０００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態では、骨相および軟骨相は両方とも、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約１００％〜約１０００％（細胞播種後約２日で測定）両方の相における細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相および軟骨相は両方とも、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約１００％（細胞播種後約２日で測定）両方の相における細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相および軟骨相は両方とも、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約２００％（細胞播種後約２日で測定）両方の相における細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相および軟骨相は両方とも、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約３００％（細胞播種後約２日で測定）両方の相における細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相および軟骨相は両方とも、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約４００％（細胞播種後約２日で測定）両方の相における細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相および軟骨相は両方とも、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約６００％（細胞播種後約２日で測定）両方の相における細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相および軟骨相は両方とも、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約８００％（細胞播種後約２日で測定）両方の相における細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相および軟骨相は両方とも、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約１０００％（細胞播種後約２日で測定）両方の相における細胞数または細胞増殖を増加させること
ができる。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスはさらに、骨および／または軟骨相中に生体適合性結合剤を含む。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは生体吸収性である。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは、インビボ投与約１年以内に吸収され得る。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスはインビボ投与約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１ヶ月以内に吸収され得る。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスはインビボ投与約３０日以内に吸収され得る。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスはインビボ投与約１０〜１４日以内に吸収され得る。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスはインビボ投与約１０日以内に吸収され得る。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは、マトリクスの少なくとも約７０％〜約９５％が吸収されるように吸収される。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスはマトリクスの少なくとも約８０％が吸収されるように吸収される。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは、マトリクスからのＰＤＧＦの放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約７０％のＰＤＧＦの放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約７１％のＰＤＧＦの放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約７２％のＰＤＧＦの放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約７３％のＰＤＧＦの放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約７４％のＰＤＧＦの放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約７５％のＰＤＧＦの放出を可能にする。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態では、面積による最高肉眼的スコアは、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物を用いて治療した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物を用いて治療した個体では、約１００％〜約５００％（マトリクスの投与後１２週間で測定）増加する。いくつかの実施形態では、面積による最高肉眼的スコアは、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物を用いて治療した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物を用いて治療した個体では、約１００％（マトリクスの投与後１２週間で測定）増加する。いくつかの実施形態では、面積による最高肉眼的スコアは、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物を用いて治療した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物を用いて治療した個体では、約２００％（マトリクスの投与後１２週間で測定）増加する。いくつかの実施形態では、面積による最高肉眼的スコアは、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物を用いて治療した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物を用いて治療した個体では、約３００％（マトリクスの投与後１２週間で測定）増加する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは二相性生体適合性マトリクスの約２５重量％〜約２０００重量％の範囲であるＰＤＧＦを含むある量の溶液を吸収することができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは二相性生体適合性マトリクスの約１００重量％〜約１６００重量％の範囲であるＰＤＧＦを含むある量の溶液を吸収することができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは二相性生体適合性マトリクスの少なくとも約２５重量％に等しいＰＤＧＦを含むある量の溶液を吸収することができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは
二相性生体適合性マトリクスの少なくとも約１００重量％に等しいＰＤＧＦを含むある量の溶液を吸収することができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは二相性生体適合性マトリクスの少なくとも約５００重量％に等しいＰＤＧＦを含むある量の溶液を吸収することができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは二相性生体適合性マトリクスの少なくとも約１０００重量％に等しいＰＤＧＦを含むある量の溶液を吸収することができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは二相性生体適合性マトリクスの少なくとも約１５５０重量％に等しいＰＤＧＦを含むある量の溶液を吸収することができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは二相性生体適合性マトリクスの少なくとも約１６００重量％に等しいＰＤＧＦを含むある量の溶液を吸収することができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは二相性生体適合性マトリクスの少なくとも約２０００重量％に等しいＰＤＧＦを含むある量の溶液を吸収することができる。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態では、変形性関節症を治療するための組成物および方法が提供される。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは溶液中に存在し、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１０．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは溶液中に存在し、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは溶液中に存在し、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約２．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは溶液中に存在し、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約３．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは溶液中に存在し、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約５．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは溶液中に存在し、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは溶液中に存在し、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約３．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、約０．０３ｍｇ／ｍＬ、約０．１５ｍｇ／ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬ、または約１．０ｍｇ／ｍＬの濃度である。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは溶液中に存在し、約１μｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約１０ｍｇ、約１μｇ〜約１ｍｇ、約１μｇ〜約５００μｇ、約１０μｇ〜約２５ｍｇ、約１０μｇ〜約５００μｇ、約１００μｇ〜約１０ｍｇ、または約２５０μｇ〜約５ｍｇの範囲の量である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは約１５μｇ、約７５μｇ、約１５０μｇ、または約５００μｇの量である。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態では、方法は、開放性または微小開放性関節鏡技術、内視鏡技術、腹腔鏡技術、または任意の他の好適な低侵襲技術を用いて実施し得る。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦホモ二量体である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦはヘテロ二量体である。ＰＤＧＦの例としては、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤ、ならびにそれらの混合物および誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは組換えヒト（ｒｈ）ＰＤＧＦ、例えば組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）を含む。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ断片である。いくつかの実施形態では、ｒｈＰＤＧＦ−Ｂは下記断片を含む：全Ｂ鎖のアミノ酸配列１−３１、１−３２、３３−１０８、３３−１０９、および／または１−１０８。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載される様々な実施形態の特性の１つ、いくつかまたは全てが組み合わされて、本発明のいくつかの実施形態を形成し得ることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１Ａ】走査型電子顕微鏡による二相性マトリクスプラグ（Ｃｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ，Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃ（登録商標），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）の物理特性を示す図である：図１Ａ−１Ｆ（プラグ材料の上面）。
【図１Ｂ】走査型電子顕微鏡による二相性マトリクスプラグ（Ｃｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ，Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃ（登録商標），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）の物理特性を示す図である：図１Ａ−１Ｆ（プラグ材料の上面）。
【図１Ｃ】走査型電子顕微鏡による二相性マトリクスプラグ（Ｃｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ，Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃ（登録商標），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）の物理特性を示す図である：図１Ａ−１Ｆ（プラグ材料の上面）。
【図１Ｄ】走査型電子顕微鏡による二相性マトリクスプラグ（Ｃｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ，Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃ（登録商標），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）の物理特性を示す図である：図１Ａ−１Ｆ（プラグ材料の上面。
【図１Ｅ】走査型電子顕微鏡による二相性マトリクスプラグ（Ｃｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ，Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃ（登録商標），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）の物理特性を示す図である：図１Ａ−１Ｆ（プラグ材料の上面）。
【図１Ｆ】走査型電子顕微鏡による二相性マトリクスプラグ（Ｃｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ，Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃ（登録商標），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）の物理特性を示す図である：図１Ａ−１Ｆ（プラグ材料の上面）。
【図１Ｇ】走査型電子顕微鏡による二相性マトリクスプラグ（Ｃｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ，Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃ（登録商標），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）の物理特性を示す図である：図１Ｇ−１Ｉ（プラグ材料の最上相）。
【図１Ｈ】走査型電子顕微鏡による二相性マトリクスプラグ（Ｃｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ，Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃ（登録商標），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）の物理特性を示す図である：図１Ｇ−１Ｉ（プラグ材料の最上相）。
【図１Ｉ】走査型電子顕微鏡による二相性マトリクスプラグ（Ｃｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ，Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃ（登録商標），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）の物理特性を示す図である：図１Ｇ−１Ｉ（プラグ材料の最上相）。
【図１Ｊ】走査型電子顕微鏡による二相性マトリクスプラグ（Ｃｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ，Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃ（登録商標），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）の物理特性を示す図である：図１Ｊ−１Ｋ（左側最上相／右側底部相−プラグ材料を通る垂直切断、内面）。
【図１Ｋ】走査型電子顕微鏡による二相性マトリクスプラグ（Ｃｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ，Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃ（登録商標），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）の物理特性を示す図である：図１Ｊ−１Ｋ（左側最上相／右側底部相−プラグ材料を通る垂直切断、内面）。
【図１Ｌ】走査型電子顕微鏡による二相性マトリクスプラグ（Ｃｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ，Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃ（登録商標），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）の物理特性を示す図である：図１Ｌ−１Ｏ（底部相）。
【図１Ｍ】走査型電子顕微鏡による二相性マトリクスプラグ（Ｃｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ，Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃ（登録商標），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）の物理特性を示す図である：図１Ｌ−１Ｏ（底部相）。
【図１Ｎ】走査型電子顕微鏡による二相性マトリクスプラグ（Ｃｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ，Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃ（登録商標），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）の物理特性を示す図である：図１Ｌ−１Ｏ（底部相）。
【図１Ｏ】走査型電子顕微鏡による二相性マトリクスプラグ（Ｃｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ，Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃ（登録商標），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）の物理特性を示す図である：図１Ｌ−１Ｏ（底部相）。
【図２】９６時間にわたるプラグ材料のサイズ変化を示す図である。
【図３】二相性マトリクスディスク上でのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの投入の工程を示す図である。
【図４Ａ】対照ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ試料と比較した、３７℃での２４時間にわたるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢと組み合わせたＣｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ二相性マトリクスプラグからのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの累積放出（ｎｇまたは％放出）プロファイルを示す図である。
【図４Ｂ】対照ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ試料と比較した、３７℃での２４時間にわたるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢと組み合わせたＣｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ二相性マトリクスプラグからのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの累積放出（ｎｇまたは％放出）プロファイルを示す図である。
【図５Ａ】異なる塩濃度での二相性マトリクスプラグからの溶出物中のｒｈＰＤＧＦの回収を示す図である。２つの実験の平均を示す。
【図５Ｂ】異なる塩濃度での二相性マトリクスプラグからの溶出されたｒｈＰＤＧＦの結合曲線を示す図である。ＥＬＩＳＡアッセイを、８つの異なる濃度のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで２度ずつ実施した。陰性対照（プレートにコートされた受容体なし）を減算した。
【図６】二相性マトリクスディスク上への細胞（ヒト骨髄間質細胞（ｈＭＳＣ））播種の段階を示す図である。
【図７】図７Ａ−７Ｆは走査型電子顕微鏡による細胞播種あり、またはなしの二相性マトリクスディスクの物理特性を示す図である。図７Ａ−７Ｃは、ｈＭＳＣ細胞なし（図７Ａ−７Ｂ）またはｈＭＳＣ細胞あり（図７Ｃ）のリン酸カルシウムコーティングを有する架橋線維を含む二相性マトリクスの下部相を示す図である。最上層平行線維整列を、ｈＭＳ細胞なし（図７Ｄ−７Ｅ）またはｈＭＳＣ細胞あり（図７Ｆ）で示す。
【図８】発光細胞生存率ＡＴＰアッセイの結果を示す図である。エラーバーは、標準偏差を表す。最上相および下部相に対するｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処理群と対照群との間の統計的有意性（Ｐ＜０．０５）が示される。
【図９Ａ】各処置群内の各標本に対する面積による最高肉眼的スコアを示す：９Ａ：空欠損処置群；９Ｂ：０μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群；９Ｃ：１５μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群；９Ｄ：７５μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群；９Ｅ：５００μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群。
【図９Ｂ】各処置群内の各標本に対する面積による最高肉眼的スコアを示す：９Ａ：空欠損処置群；９Ｂ：０μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群；９Ｃ：１５μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群；９Ｄ：７５μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群；９Ｅ：５００μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群。
【図９Ｃ】各処置群内の各標本に対する面積による最高肉眼的スコアを示す：９Ａ：空欠損処置群；９Ｂ：０μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群；９Ｃ：１５μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群；９Ｄ：７５μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群；９Ｅ：５００μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群。
【図９Ｄ】各処置群内の各標本に対する面積による最高肉眼的スコアを示す：９Ａ：空欠損処置群；９Ｂ：０μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群；９Ｃ：１５μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群；９Ｄ：７５μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群；９Ｅ：５００μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群。
【図９Ｅ】各処置群内の各標本に対する面積による最高肉眼的スコアを示す：９Ａ：空欠損処置群；９Ｂ：０μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群；９Ｃ：１５μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群；９Ｄ：７５μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群；９Ｅ：５００μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群。
【図１０】図１０はｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群の肉眼的関節軟骨修復評価、面積による最高スコアを示す図である。＊：空欠損処置群と比較した有意の差（ｐ＜０．０５）を示す。‡：空欠損、０μｇｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、および１５μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群と比較した有意の差を示す。
【図１１Ａ】顕微鏡（ｍｉｃｒｏＣＴ）によるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群の骨梁数（１／ｍｍ）、骨梁厚（ｍｍ）、または骨量（ｍｍ3）を示す。図１１ＡはｍｉｃｒｏＣＴによる、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群の８ｍｍｘ６．２５ｍｍ輪郭の骨梁数（１／ｍｍ）を示す。＊：有意差ｐ＜０．０５を示す。
【図１１Ｂ】顕微鏡（ｍｉｃｒｏＣＴ）によるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群の骨梁数（１／ｍｍ）、骨梁厚（ｍｍ）、または骨量（ｍｍ3）を示す。図１１Ｂは、ｍｉｃｒｏＣＴによる、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群の８ｍｍｘ６．２５ｍｍ輪郭の骨量（ｍｍ3）を示す。＊：有意差ｐ＜０．０５を示す。
【図１１Ｃ】顕微鏡（ｍｉｃｒｏＣＴ）によるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群の骨梁数（１／ｍｍ）、骨梁厚（ｍｍ）、または骨量（ｍｍ3）を示す。図１１Ｃは、ｍｉｃｒｏＣＴによる、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群の８ｍｍｘ７．５ｍｍ輪郭の骨梁数（１／ｍｍ）を示す。＊：有意差ｐ＜０．０５を示す。
【図１１Ｄ】顕微鏡（ｍｉｃｒｏＣＴ）によるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群の骨梁数（１／ｍｍ）、骨梁厚（ｍｍ）、または骨量（ｍｍ3）を示す。図１１ＤはｍｉｃｒｏＣＴによる、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群の４ｍｍｘ６．２５ｍｍ深さ輪郭の骨梁厚（ｍｍ）を示す。＊：有意差ｐ＜０．０５を示す。
【図１１Ｅ】顕微鏡（ｍｉｃｒｏＣＴ）によるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群の骨梁数（１／ｍｍ）、骨梁厚（ｍｍ）、または骨量（ｍｍ3）を示す。図１１Ｅは、ｍｉｃｒｏＣＴによる、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群の４ｍｍ直径ｘ６．２５ｍｍ深さ輪郭の骨量（ｍｍ3）を示す。＊：有意差ｐ＜０．０５を示す。
【図１１Ｆ】顕微鏡（ｍｉｃｒｏＣＴ）によるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群の骨梁数（１／ｍｍ）、骨梁厚（ｍｍ）、または骨量（ｍｍ3）を示す。図１１Ｆは、ｍｉｃｒｏＣＴによる、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群の６ｍｍ直径ｘ６．２５ｍｍ深さ輪郭の骨量（ｍｍ3）を示す。＊：有意差ｐ＜０．０５を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
発明者らは、骨相および軟骨相を有する二相性生体適合性マトリクスを、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）と共に含む組成物は、軟骨下骨および軟骨修復を増大または増強させることを発見した。いくつかの実施形態では、組成物は組成物なしで治療された被験体に比べ、被験体において骨梁数を著しく増加させ、および／または骨架橋を増強させることができる。いくつかの実施形態では、組成物は、例えば、そのような組成物で治療された被験体において面積による最高肉眼的スコアの増加により証明されるように、肉眼的関節軟骨修復を増強させることができる。いくつかの実施形態では、組成物は、ＰＤＧＦの放出の増加を可能にする。いくつかの実施形態では、骨相および軟骨相はどちらも、ＰＤＧＦで処理されていない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理された細胞において、細胞数または細胞増殖を増加させることができる。
【００５４】
理論に縛られることを望まないが、骨相および軟骨相を有する二相性生体適合性マトリクスを血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）と共に含む組成物は骨軟骨欠損において、例えば、幹細胞の動員、適当なコラーゲンサブタイプの合成の増加および骨内部成長により、および／または新規組織内部成長および軟骨再生のためのフレームワークまたは足場を提供することにより軟骨および骨の形成を増加させることができる。
【００５５】
本発明は、軟骨および／または軟骨に隣接する骨における骨軟骨欠損を治療するための組成物および方法を提供する。本発明の１つの態様では二相性生体適合性マトリクスおよび血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含み、二相性生体適合性マトリクスは足場材料を含み、足場材料は骨相および軟骨相を含む多孔質構造を形成する、組成物が提供される。
【００５６】
本発明の別の態様では、個体において軟骨および／または 軟骨に隣接する骨における
骨軟骨欠損を治療するための方法であって、前記個体に、有効量の、二相性生体適合性マトリクスおよび血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含む組成物を少なくとも１つの骨軟骨欠損部位に投与することを含み、二相性生体適合性マトリクスは足場材料を含み、足場材料は骨相および軟骨相を含む多孔質構造を形成する方法が提供される。
【００５７】
本明細書を説明する目的で、下記定義が適用され、適切である場合はいつでも、単数形で使用される用語はまた、複数形を含み、およびその逆もある。下記で説明されるいずれかの定義が参照により本明細書に組み込まれるいずれかの文書と対立する場合には、下記で説明される定義が優先する。
【００５８】
本明細書では、本発明の組成物および方法により治療され得る「骨」または「軟骨に隣接する骨」という用語は、軟骨下骨または海綿骨(骨梁としても知られている)を含む。
【００５９】
「個体」は、ヒト、飼育動物および家畜、ならびに動物園、スポーツまたはペット動物を含む哺乳類、例えばチンパンジーならびに他の類人猿およびサル種、イヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、スナネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコなどを示す。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。この用語は、特定の年齢または性別を意味しない。
【００６０】
「有効量」は、所望の治療または臨床結果を達成するのに必要とされるある用量での、ある期間の間の、少なくとも有効なある量を示す。有効量は１回または複数回の投与で提供することができる。
【００６１】
「生体吸収性」は、生体適合性マトリクスのインビボで吸収され、または再構築される能力を示す。吸収過程は、元の材料の、体液、酵素または細胞の作用による分解および排除を含む。吸収された材料は、宿主により、新規組織の形成において使用され得、またはそうでなければ、宿主により再利用され得、あるいは排泄され得る。
【００６２】
本明細書で記述されるように、コラーゲンはジェル、粒子、粉末、シート、パッチ、パッド、プラグまたはスポンジの形態の材料である。コラーゲンは、例えば、ウシ真皮またはウシアキレス腱のコラーゲン抽出物から製造され得る。コラーゲンはまた、コラーゲンスラリーから製造され得、ここで、スラリー中のコラーゲン濃度は、骨相および軟骨相の各型に対し異なっている。例えば、コラーゲンは約４．５％、約５％、約６％、または約７％のコラーゲン濃度を有するスラリーから製造することができる。いずれの二相性生体適合性マトリクスに対しても、開始スラリー中で使用されるコラーゲンのパーセンテージは、二相性生体適合性マトリクス中の最終骨相または軟骨相中のコラーゲンのパーセンテージを反映しない。
【００６３】
本明細書では、別記されない限り、「治療」または「治療する」という用語は、個体に二相性生体適合性マトリクスおよび血小板由来増殖因子を含む組成物を投与し、治療される被験体に対し有利な、または所望の臨床結果が得られることを示す。本発明の目的のために、有利な、または所望の臨床結果としては、検出可能か、検出不可能かに関係なく、骨軟骨損傷または欠損に関連する１つ以上の症状の軽減、骨軟骨損傷または欠損の程度の減少、骨軟骨損傷または欠損に関連する１つ以上の症状の安定化(すなわち、悪化なし)、骨軟骨損傷または欠損進行の遅延または鈍化、骨軟骨損傷または欠損状態の寛解または緩和、骨軟骨損傷または欠損の治癒過程速度の増加、ならびに部分または完全緩解が挙げられるが、それらに限定されない。骨軟骨損傷または欠損の例は、変形性関節症である。骨軟骨欠損の治療は、軟骨、軟骨に隣接する骨、またはその両方の治療を含み得、有利な、または所望の臨床結果としては、軟骨、軟骨に隣接する骨、または両方における有利な、
または所望の臨床結果が挙げられる。「治療」はまた、治療を受けない場合に予測される生存期間と比べて、長くなった生存期間を意味することができる。いくつかの実施形態では、骨軟骨損傷または欠損の「治療」は疾患の治癒を含むことができる。いくつかの実施形態では、病状に対する有利な、または所望の結果としては、病状の改善、病状の治癒、病状の重篤度の軽減、病状の進行の遅延、病状に関連する１つ以上の症状の軽減、病状に苦しむものの生活の質の増加、および／または生存期間の延長が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６４】
本明細書では、「同種移植片材料」という用語は、同じ種の遺伝的に同一でないメンバーに由来する移植組織または細胞を示す。同種移植片材料は、天然状態または修飾状態で使用することができる。例えば、同種移植片材料は、石灰化骨マトリクス、脱灰骨マトリクス、または部分脱灰骨マトリクス（例えば、スポンジまたはシート）とすることができる。本明細書では、脱灰骨マトリクスは、骨内のミネラル分の除去のために処理された石灰化骨材料を示す。本明細書では、単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は別記されない限り、複数形を含む。
【００６５】
本明細書で「約」１つの値またはパラメータの言及は、その値またはパラメータ自体に向けられる実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に関する記載は、「Ｘ」ならびに「約Ｘ」の記載を含む。
【００６６】
本明細書で記載される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「を含む」、「から構成される」および「から本質的に構成される」ことを含むことは理解される。
【００６７】
本発明の組成物および方法
本明細書では、軟骨および骨における骨軟骨欠損を治療するための組成物および方法が記載される。本発明の１つの態様では、二相性生体適合性マトリクスおよび血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含み、二相性生体適合性マトリクスは足場材料を含み、足場材料は骨相および軟骨相を含む多孔質構造を形成する、組成物が提供される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含み、二相性生体適合性マトリクスは足場材料を含み、足場材料は骨相および軟骨相を含む多孔質構造を形成し、ＰＤＧＦは溶液であり、ＰＤＧＦ溶液は約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの範囲のＰＤＧＦ濃度を有する、軟骨および／または軟骨に隣接する骨における骨軟骨欠損を治療するための組成物が提供される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ溶液は約１．０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスの足場マトリクス中の骨相と軟骨相の間の重量／重量比は、約６５：３５〜約９９：１である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦから構成され、二相性生体適合性マトリクスは足場材料から構成され、足場材料は骨相および軟骨相から構成される多孔質構造を形成し、ＰＤＧＦは溶液であり、ＰＤＧＦ溶液は約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの範囲のＰＤＧＦ濃度を有する、軟骨および／または軟骨に隣接する骨における骨軟骨欠損を治療するための組成物が提供される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ溶液は約１．０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスの足場マトリクス中の骨相と軟骨相の間の重量／重量比は、約６５：３５〜約９９：１である。
【００７０】
本発明の別の態様では、個体において軟骨および軟骨に隣接する骨における骨軟骨欠損を治療するための方法であって、前記個体に、有効量の、二相性生体適合性マトリクスおよび血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含む組成物を少なくとも１つの骨軟骨欠損部位に
投与することを含み、二相性生体適合性マトリクスは足場材料を含み、足場材料は骨相および軟骨相を含む多孔質構造を形成する方法が提供される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、個体において軟骨および軟骨に隣接する骨における骨軟骨欠損を治療するための方法であって、個体に、有効量の、二相性生体適合性マトリクスおよび血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含む組成物を少なくとも１つの骨軟骨欠損部位に投与することを含み、二相性生体適合性マトリクスは足場材料を含み、足場材料は骨相および軟骨相を含む多孔質構造を形成し、ＰＤＧＦは溶液であり、ＰＤＧＦ溶液は約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの範囲のＰＤＧＦ濃度を有する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ溶液は約１．０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスの足場マトリクス中の骨相と軟骨相の間の重量／重量比は、約６５：３５〜約９９：１である。
【００７２】
いくつかの実施形態では、個体において軟骨および軟骨に隣接する骨における骨軟骨欠損を治療するための方法であって、個体に、有効量の、二相性生体適合性マトリクスおよび血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含む組成物を少なくとも１つの骨軟骨欠損部位に投与することを含み、二相性生体適合性マトリクスは足場材料から構成され、足場材料は骨相および軟骨相から構成される多孔質構造を形成し、ＰＤＧＦは溶液であり、ＰＤＧＦ溶液は約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの範囲のＰＤＧＦ濃度を有する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ溶液は約１．０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスの足場マトリクス中の骨相と軟骨相の間の重量／重量比は、約６５：３５〜約９９：１である。
【００７３】
二相性生体適合性マトリクス
本発明の実施形態によれば、二相性生体適合性マトリクスは二重層または二相性足場材料を含む。いくつかの実施形態では、足場材料は骨相および軟骨相を含む多孔質構造を形成する。骨相および軟骨相は、それぞれ、新しい骨組織内部成長および軟骨再生のためのフレームワークまたは足場を提供する。軟骨再生は関節軟骨、線維軟骨、または弾性軟骨内での軟骨組織成長を含む。骨内部成長は、軟骨下骨または海綿骨（骨梁としても知られている）中での骨成長を含む。
【００７４】
本発明の実施形態によれば、軟骨は関節軟骨、線維軟骨、または弾性軟骨を含む。関節軟骨（または硝子軟骨）は、膝関節（例えば、大腿骨、脛骨、大腿顆）、肩関節および肘関節、橈尺関節、指節間関節、距骨（例えば、足および足首）、および臀部が挙げられるが、それらに限定されない可動関節の全ての表面を覆う滑らかなギラギラひかる白色組織である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、骨相は少なくとも１つのリン酸カルシウムを含む。いくつかの実施形態では、骨相は複数のリン酸カルシウムを含む。いくつかの実施形態では、骨相で使用されるリン酸カルシウムは、約０．５〜約２．０の範囲のカルシウム対リン原子比を有する。いくつかの実施形態では、骨相で使用されるリン酸カルシウムは、約１００μｍ〜約５０００μｍの範囲のサイズの粒子から構成される。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは約１００μｍ〜約３０００μｍの範囲のサイズの粒子から構成される。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは約２５０μｍ〜約１０００μｍの範囲のサイズの粒子から構成される。
【００７６】
いくつかの実施形態では、骨相で使用されるリン酸カルシウムは、二相性生体適合性マトリクスの総容積に比べ、より低い容積％を有する。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは、二相性生体適合性マトリクスの総容積の約５％未満〜約５０％未満の範囲の容積％を有する。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは、二相性生体適合性マト
リクスの総容積の約５％未満の容積％を有する。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは、二相性生体適合性マトリクスの総容積の約１０％未満の容積％を有する。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは、二相性生体適合性マトリクスの総容積の約１５％未満の容積％を有する。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは、二相性生体適合性マトリクスの総容積の約２０％未満の容積％を有する。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは、二相性生体適合性マトリクスの総容積の約３０％未満の容積％を有する。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは、二相性生体適合性マトリクスの総容積の約３５％未満の容積％を有する。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは、二相性生体適合性マトリクスの総容積の約４０％未満の容積％を有する。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは、二相性生体適合性マトリクスの総容積の約４５％未満の容積％を有する。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムは、二相性生体適合性マトリクスの総容積の約５０％未満の容積％を有する。
【００７７】
骨相において使用するのに好適なリン酸カルシウムとしては、アモルファスリン酸カルシウム、リン酸一カルシウム一水和物（ＭＣＰＭ）、リン酸一カルシウム無水物（ＭＣＰＡ）、リン酸二カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）、リン酸二カルシウム無水物（ＤＣＰＡ）、リン酸八カルシウム（ＯＣＰ）、α−リン酸トリカルシウム（α−ＴＣＰ）、β−リン酸トリカルシウム（β−ＴＣＰ）、ヒドロキシアパタイト（ＯＨＡｐ）、あまり結晶化していないヒドロキシアパタイト、リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）、ヘプタカルシウムデカホスフェート、メタリン酸カルシウム、無水ピロリン酸カルシウム、炭酸化リン酸カルシウム、およびピロリン酸カルシウムが挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムはβ−ＴＣＰである。
【００７８】
いくつかの実施形態では、骨相は少なくとも１つの硫酸カルシウムを含む。いくつかの実施形態では、骨相は複数の硫酸カルシウムを含む。
【００７９】
骨相中で使用するのに好適な硫酸カルシウムとしては、γ−無水石膏、半水和物（α−半水和物、およびβ−半水和物）、石膏（無水物）、β−無水石膏、ならびに硫酸カルシウム無水物が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８０】
いくつかの実施形態では、骨相はコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、コラーゲンはＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶ型コラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、コラーゲンはコラーゲン混合物、例えば、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲンの混合物を含む。いくつかの実施形態では、コラーゲンはＩＩ型コラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、コラーゲンは、例えば、線維状コラーゲン、例えば可溶性ＩＩ型ウシ真皮−誘導または腱−誘導コラーゲンを含む。コラーゲンは線維状コラーゲン、例えば可溶性ＩＩ型線維状コラーゲンをコラーゲンジェル、粒子、粉末、パッチ、パッド、シート、プラグ、またはスポンジ中に含むことができ、いくつかの実施形態では、断裂なしで、縫合に耐え、縫合を保持するために十分な機械的特性、例えば濡れ引張強さを証明することができる。いくつかの実施形態では、コラーゲン約０．７５ｇ／ｃｍ3〜約１．５ｇ／ｃｍ3の範囲の密度を有する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、コラーゲンは生理的条件下で可溶性である。いくつかの実施形態では、コラーゲンは生理的条件下で可溶性であり、架橋される。いくつかの実施形態では、コラーゲンはウシ皮膚組織またはウシアキレス組織から誘導される線維状および酸可溶性コラーゲンを含む。例えば、線維状コラーゲンは、約０．７５ポンド〜約５ポンドの範囲の濡れ引裂き強さを有することができる。骨または筋骨格組織中に存在する他の型のコラーゲンを使用してもよい。組換え、合成、および天然形態のコラーゲンを、本発明で使用してもよい。
【００８２】
いくつかの実施形態では、コラーゲンは商業的供給源から入手され、ウシ真皮またはウシ腱由来の精製コラーゲン抽出物から製造される。いくつかの実施形態では、コラーゲンはＩＩ型ウシコラーゲンである。いくつかの実施形態では、コラーゲンは下記濃度のコラーゲン（ｗ／ｖ）：約４．５％、約５％、約６％または約７％のいずれか１つを有するコラーゲンスラリーから製造される。
【００８３】
いくつかの実施形態では、骨相は同種移植片材料を含む。理論に縛られることを望まないが、同種移植片材料は、形成した血栓および未熟組織の剥離を阻止し、細胞を動員し、軟骨（例えば、関節軟骨、線維軟骨、または弾性軟骨）およびその下の骨の合成を誘導するように機能し得る。同種移植片材料は、石灰化骨マトリクス、脱灰骨マトリクス、または部分脱灰骨マトリクスとすることができる。いくつかの実施形態では、骨相のための同種移植片材料は脱灰骨マトリクスである。いくつかの実施形態では、骨相のための同種移植片材料は部分脱灰骨マトリクスである。
【００８４】
いくつかの実施形態では、骨相はリン酸カルシウムおよびコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、骨相はβ-リン酸トリカルシウムおよびコラーゲンを含む。いくつかの
実施形態では、骨相は硫酸カルシウムおよびコラーゲンを含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、骨相はリン酸カルシウムおよび同種移植片材料を含む。いくつかの実施形態では、骨相はβ-リン酸トリカルシウムおよび同種移植片材料を含む。い
くつかの実施形態では、骨相はリン酸カルシウムおよび脱灰骨マトリクスを含む。いくつかの実施形態では、骨相はβ-リン酸トリカルシウムおよび脱灰骨マトリクスを含む。い
くつかの実施形態では、骨相は硫酸カルシウムおよび同種移植片材料を含む。いくつかの実施形態では、骨相は硫酸カルシウムおよび脱灰骨マトリクスを含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、骨相はリン酸カルシウム、同種移植片材料、およびコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、骨相はβ-リン酸トリカルシウム、同種移植片材料
、およびコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、骨相はリン酸カルシウム、脱灰骨マトリクス、およびコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、骨相はβ-リン酸トリ
カルシウム、脱灰骨マトリクス、およびコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、骨相は硫酸カルシウム、同種移植片材料、およびコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、骨相は硫酸カルシウム、脱灰骨マトリクス、およびコラーゲンを含む。
【００８７】
いくつかの実施形態では、骨相は同種移植片材料、およびコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、骨相は脱灰骨マトリクス、およびコラーゲンを含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、骨相は多孔質構造を形成する。いくつかの実施形態では、骨相は多孔質構造を形成し、約４５００μｍ2〜約２００００μｍ2の範囲の細孔面積サイズおよび約２００μｍ〜約５００μｍの範囲の細孔周囲長サイズを有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、骨相は多孔質構造を形成し、約６０００μｍ2〜約１５０００μｍ2の範囲の細孔面積サイズを有する細孔を含む。（ＵＳ６１／１９１，６４１号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【００８９】
いくつかの実施形態では、骨相は多孔質構造を形成し、約４０％を超える多孔度を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、骨相は約５０％を超える多孔度を有する。いくつかの実施形態では、骨相は約７５％を超える多孔度を有する。いくつかの実施形態では、骨相は約８０％を超える多孔度を有する。いくつかの実施形態では、骨相は約８５％を超える多孔度を有する。いくつかの実施形態では、骨相は約９０％を超える多孔度を有する。いくつかの実施形態では、骨相は約９５％を超える多孔度を有する。
【００９０】
本発明のいくつかの実施形態では、骨相の多孔質構造は、細胞の骨相の細孔内への浸潤を可能にする。いくつかの実施形態では、骨相は細胞の付着を可能にする。いくつかの実施形態では、浸潤または付着細胞は、間葉系幹細胞（または骨髄間質細胞）である。いくつかの実施形態では、浸潤または付着細胞は、骨芽細胞である。いくつかの実施形態では、浸潤または付着細胞は、軟骨細胞である。
【００９１】
本発明のいくつかの実施形態では、骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約１００％〜約１０００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約１００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約２００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約３００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約４００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約６００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約８００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約１０００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。
【００９２】
本発明のいくつかの実施形態では、骨梁数は、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物で処置した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物で処置した個体において、約１００％〜約１０００％（マトリクスの投与後１２週で測定）増加する。いくつかの実施形態では、骨梁数は、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物で処置した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物で処置した個体において、約１００％（マトリクスの投与後１２週で測定）増加する。いくつかの実施形態では、骨梁数は、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物で処置した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物で処置した個体において、約２００％（マトリクスの投与後１２週で測定）増加する。いくつかの実施形態では、骨梁数は、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物で処置した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物で処置した個体において、約２５０％〜約１０００％（マトリクスの投与後１２週で測定）増加する。いくつかの実施形態では、骨梁数は、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物で処置した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物で処置した個体において、約３００％（マトリクスの投与後１２週で測定）増加する。いくつかの実施形態では、骨梁数は、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物で処置した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物で処置した個体において、約４００％（マトリクスの投与後１２週で測定）増加する。いくつかの実施形態では、骨梁数は、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物で処置した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物で処置した個体において、約５００％（マトリクスの投与後１２週で測定）増加する。いくつかの実施形態では、骨梁数は、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物で処置した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物で処置した個体において、約６００％（マトリクスの投与後１２週で測定）増加する。いくつかの実施形態では、骨梁数は、二相性生体適合性マトリク
スのみを含む組成物で処置した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物で処置した個体において、約７５０％（マトリクスの投与後１２週で測定）増加する。いくつかの実施形態では、骨梁数は、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物で処置した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物で処置した個体において、約１０００％（マトリクスの投与後１２週で測定）増加する。
【００９３】
いくつかの実施形態では、軟骨相はコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、コラーゲンはＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶ型コラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、コラーゲンはコラーゲン混合物、例えば、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲンの混合物を含む。いくつかの実施形態では、コラーゲンはＩＩ型コラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、コラーゲンは、線維状コラーゲン、例えば可溶性ＩＩ型ウシ真皮−誘導または腱−誘導コラーゲンを含む。コラーゲンは例えば、線維状コラーゲン、例えばコラーゲンジェル、粒子、粉末、パッチ、パッド、シート、プラグ、またはスポンジ中で使用するのに好適な可溶性ＩＩ型線維状コラーゲンを含むことができ、いくつかの実施形態では、断裂なしで、縫合に耐え、縫合を保持するために十分な機械的特性、例えば濡れ引張強さを証明することができる。いくつかの実施形態では、コラーゲンは約０．７５ｇ／ｃｍ3〜約１．
５ｇ／ｃｍ3の範囲の密度を有する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、軟骨相はグリコサミノグリカン（ＧＡＧまたはムコ多糖類）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＧはコンドロイチン硫酸である。本発明において使用するのに好適な他のＧＡＧとしては、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヒアルロナン、およびそれらに組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、軟骨相中のコラーゲン対ＧＡＧの重量／重量比は、約７０：３０〜約９５：５である。いくつかの実施形態では、軟骨相中のコラーゲン対ＧＡＧの重量／重量比は、約９０：１０である。いくつかの実施形態では、軟骨相中のコラーゲン対ＧＡＧの重量／重量比は、約９５：５である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、軟骨相はプロテオグリカンを含む。いくつかの実施形態では、プロテオグリカンはアグリカンである。いくつかの実施形態では、軟骨相中のコラーゲン対プロテオグリカンの重量／重量比は、約７０：３０〜約９５：５である。いくつかの実施形態では、軟骨相中のコラーゲン対プロテオグリカンの重量／重量比は、約９０：１０である。いくつかの実施形態では、軟骨相中のコラーゲン対プロテオグリカンの重量／重量比は、約９５：５である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、軟骨相は同種移植片材料を含む。理論に縛られることを望まないが、同種移植片は、形成した血栓および未熟組織の剥離を阻止し、細胞を動員し、軟骨（例えば、関節軟骨、線維軟骨、または弾性軟骨）およびその下の骨の合成を誘導するように機能し得る。同種移植片材料は、例えば、石灰化骨マトリクス、脱灰骨マトリクス、または部分脱灰骨マトリクスを含む。いくつかの実施形態では、軟骨相のための同種移植片材料は石灰化骨マトリクスである。
【００９７】
いくつかの実施形態では、軟骨相はＧＡＧおよびコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、軟骨相はコンドロイチン硫酸およびコラーゲンを含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、軟骨相はＧＡＧおよび同種移植片材料を含む。いくつかの実施形態では、軟骨相はコンドロイチン硫酸および同種移植片材料を含む。いくつかの実施形態では、軟骨相はＧＡＧおよび石灰化骨マトリクスを含む。いくつかの実施形態では、軟骨相はコンドロイチン硫酸および石灰化骨マトリクスを含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、軟骨相はＧＡＧ、同種移植片材料、およびコラーゲンを含む
。いくつかの実施形態では、軟骨相はコンドロイチン硫酸、同種移植片材料、およびコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、軟骨相はＧＡＧ、石灰化骨マトリクス、およびコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、軟骨相はコンドロイチン硫酸、石灰化骨マトリクス、およびコラーゲンを含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、軟骨相はコラーゲンおよびプロテオグリカンを含む。いくつかの実施形態では、軟骨相は同種移植片材料およびプロテオグリカンを含む。いくつかの実施形態では、軟骨相は石灰化骨マトリクスおよびプロテオグリカンを含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、軟骨相はコラーゲン、プロテオグリカン、および同種移植片材料を含む。いくつかの実施形態では、軟骨相は石灰化骨マトリクス、プロテオグリカン、およびコラーゲンを含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、軟骨相は多孔質構造を形成する。いくつかの実施形態では、軟骨相は多孔質構造を形成し、約４５００μｍ2〜約２００００μｍ2の範囲の細孔面積サイズおよび約２００μｍ〜約５００μｍの範囲の細孔周囲長サイズを有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、軟骨相は、多孔質構造を形成し、約６０００μｍ2〜約１５０
００μｍ2の範囲の細孔面積サイズを有する細孔を含む。（ＵＳ６１／１９１，６４１号
（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、軟骨相は多孔質構造を形成し、約４０％を超える多孔度を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、軟骨相は約５０％を超える多孔度を有する。いくつかの実施形態では、軟骨相は約７５％を超える多孔度を有する。いくつかの実施形態では、軟骨相は約８０％を超える多孔度を有する。いくつかの実施形態では、軟骨相は約８５％を超える多孔度を有する。いくつかの実施形態では、軟骨相は約９０％を超える多孔度を有する。いくつかの実施形態では、軟骨相は約９５％を超える多孔度を有する。
【０１０４】
本発明のいくつかの実施形態では、軟骨相の多孔質構造は、細胞の軟骨相の細孔内への浸潤を可能にする。いくつかの実施形態では、軟骨相は細胞の付着を可能にする。いくつかの実施形態では、浸潤または付着細胞は、間葉系幹細胞（または骨髄間質細胞）である。いくつかの実施形態では、浸潤または付着細胞は、骨芽細胞である。いくつかの実施形態では、浸潤または付着細胞は、軟骨細胞である。
【０１０５】
本発明のいくつかの実施形態では、軟骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約１００％〜約１０００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、軟骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約１００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、軟骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約２００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、軟骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約３００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、軟骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約４００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、軟骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約６００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、軟骨相は、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約８００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、軟骨相は、ＰＤＧＦで処理
していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約１０００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。
【０１０６】
本発明のいくつかの実施形態では、骨相および軟骨相はどちらも、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約１００％〜約１０００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相および軟骨相はどちらも、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約１００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相および軟骨相はどちらも、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約２００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相および軟骨相はどちらも、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約３００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相および軟骨相はどちらも、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約４００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相および軟骨相はどちらも、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約６００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相および軟骨相はどちらも、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約８００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。いくつかの実施形態では、骨相および軟骨相はどちらも、ＰＤＧＦで処理していない細胞に比べ、ＰＤＧＦで処理した細胞において、約１０００％（細胞播種後約２日で測定）細胞数または細胞増殖を増加させることができる。
【０１０７】
様々な実施形態では、二相性生体適合性マトリクスの足場マトリクス中の骨相と軟骨相の間の重量／重量比は約６５：３５〜約９９：１である。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスの足場マトリクス中の骨相と軟骨相の間の重量／重量比は約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約９６：４、約９７：３、約９８：２、または約９９：１である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、骨相は二相性生体適合性マトリクスの底面にあり、軟骨相は二相性生体適合性マトリクスの上面にある。
【０１０９】
いくつかの実施形態によれば、二相性生体適合性マトリクスは、移植に好適な形状（例えば、球、円柱、またはブロック）で提供することができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスはジェル、粒子、粉末、パッチ、パッド、シート、プラグまたはスポンジとすることができる。例えば、プラグ形態の骨相および軟骨相を有する足場マトリクスを含む二相性生体適合性マトリクスが、少なくとも１つの骨軟骨欠損部位（例えば、軟骨に隣接する骨、軟骨、軟骨と軟骨に隣接する骨の間の界面、またはそれらの組み合わせ）に導入される場合、二相性生体適合性マトリクスプラグは細胞適合性であり、軟骨（例えば、関節軟骨、線維軟骨、または弾性軟骨）および骨（例えば、軟骨下骨または海綿骨）の両方の再生を支援する移植可能なプラグが得られる製品の製剤化を可能にする。市販の二相性生体適合性マトリクスは、様々な供給源から入手でき、例えば、Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃｓ（例えば、ＣｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃまたはＲＩＶＥＲＳＩＤＥ（登録商標）；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｎｅｐｈｅｗ（Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）、およびＫｅｎｓｅｙ  Ｎａｓｈ（ＯＳＳＥＯＦＩＴ（商標）、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスはＣｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃである。他の実施形態では、二相性生体適合性マトリクスはＣｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃではない。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性
マトリクスはＯＳＳＥＯＦＩＴ（商標）である。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスはＯＳＳＥＯＦＩＴ（商標）ではない。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは成形可能、押出可能、および／または注射可能である。成形可能二相性生体適合性マトリクスは、軟骨（例えば、関節軟骨、線維軟骨、および弾性軟骨）および骨（例えば、軟骨下骨または海綿骨）中およびその周囲での本発明の組成物の効率的な配置を促進することができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは、スパチュラまたは等価の装置を用いて軟骨に隣接する骨、軟骨、および骨と軟骨の間の界面に適用される。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは流動性である。流動性二相性生体適合性マトリクスは、いくつかの実施形態では、シリンジおよび針またはカニューレを介して、少なくとも１つの骨軟骨欠損部位（例えば、軟骨に隣接する骨、軟骨、軟骨と軟骨に隣接する骨の間の界面、またはそれらの組み合わせ）に適用することができる。いくつかの実施形態では、流動性二相性生体適合性マトリクスは、少なくとも１つの骨軟骨欠損部位（例えば、軟骨に隣接する骨、軟骨、軟骨と軟骨に隣接する骨の間の界面、またはそれらの組み合わせ）の外科的処置により露出させた部位に適用することができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスはプラグ形態であり、骨軟骨病変部位内に「圧入」させることができる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは足場材料を含む。足場材料は、骨相および軟骨相を含む多孔質構造を形成し、これはＰＤＧＦを二相性生体適合性マトリクスから放出させる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは骨相および軟骨相の両方で５％コラーゲンを含み、６％コラーゲンまたは７％コラーゲンと比較して、より高いパーセンテージのＰＤＧＦを放出させる。いくつかの実施形態では、約８５％を超える多孔度を有する細孔を含む二相性生体適合性マトリクスは、約８５％より低い  多孔度を有する二相性生体適合性マトリクスに比べ、より高いパーセンテージのＰＤＧＦを放出させる。いくつかの実施形態では、約９０％を超える多孔度を有する細孔を含む二相性生体適合性マトリクスは、約９０％より低い多孔度を有する二相性生体適合性マトリクスに比べ、より高いパーセンテージのＰＤＧＦを放出させる。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間でＰＤＧＦの放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約５０％のＰＤＧＦの放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約５５％のＰＤＧＦの放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約６０％のＰＤＧＦの放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約６５％のＰＤＧＦの放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約７０％のＰＤＧＦの放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約７１％のＰＤＧＦの放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約７２％のＰＤＧＦの放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約７３％のＰＤＧＦの放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約７４％のＰＤＧＦの放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約７５％のＰＤＧＦの放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約８０％のＰＤＧＦの放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約８５％のＰＤＧＦの放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約９０％のＰＤＧＦの放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約９５
％のＰＤＧＦの放出を可能にする。足場材料から放出または溶出されたＰＤＧＦは生物化学的に安定である。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約７５，０００ｎｇのＰＤＧＦ放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約８０，０００ｎｇのＰＤＧＦ放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約８１，０００ｎｇのＰＤＧＦ放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約８２，０００ｎｇのＰＤＧＦ放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約８３，０００ｎｇのＰＤＧＦ放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約８４，０００ｎｇのＰＤＧＦ放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約８５，０００ｎｇのＰＤＧＦ放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約８６，０００ｎｇのＰＤＧＦ放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約８７，０００ｎｇのＰＤＧＦ放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約８８，０００ｎｇのＰＤＧＦ放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約８９，０００ｎｇのＰＤＧＦ放出を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは２４時間で少なくとも約９０，０００ｎｇのＰＤＧＦ放出を可能にする。足場材料から放出または溶出されたＰＤＧＦは生物化学的に安定である。
【０１１４】
本発明のいくつかの実施形態では、面積による最高肉眼的スコアは、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物を用いて治療した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物を用いて治療した個体では、約１００％〜約５００％（マトリクスの投与後１２週間で測定）増加する。いくつかの実施形態では、面積による最高肉眼的スコアは、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物を用いて治療した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物を用いて治療した個体では、約１００％（マトリクスの投与後１２週間で測定）増加する。いくつかの実施形態では、面積による最高肉眼的スコアは、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物を用いて治療した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物を用いて治療した個体では、約２００％（マトリクスの投与後１２週間で測定）増加する。いくつかの実施形態では、面積による最高肉眼的スコアは、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物を用いて治療した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物を用いて治療した個体では、約３００％（マトリクスの投与後１２週間で測定）増加する。いくつかの実施形態では、面積による最高肉眼的スコアは、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物を用いて治療した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物を用いて治療した個体では、約４００％（マトリクスの投与後１２週間で測定）増加する。いくつかの実施形態では、面積による最高肉眼的スコアは、二相性生体適合性マトリクスのみを含む組成物を用いて治療した個体に比べ、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物を用いて治療した個体では、約５００％（マトリクスの投与後１２週間で測定）増加する。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは、細胞のマトリクスの細孔内への浸潤を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクス中で骨相および軟骨相を含む足場材料は、細胞のマトリクスの細孔内への浸潤を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは細胞の付着を可能にする。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクス中で骨相および軟骨相を含む足場材料は、細胞の付着を可能にする。いくつかの実施形態では、浸潤または付着細胞は、軟骨細胞で
ある。いくつかの実施形態では、浸潤または付着細胞は、間葉系幹細胞（または骨髄間質細胞）である。いくつかの実施形態では、浸潤細胞は、骨芽細胞である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは多孔質であり、水または他の流体を吸収するように動作可能である。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクス中で骨相および軟骨相を含む足場材料は多孔質であり、二相性生体適合性マトリクスの量の約１×〜約１５×の範囲の量の水または他の流体を吸収するように動作可能である。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスの完全吸収は、約３００μＬ〜約１，０００μＬの水、緩衝液、または他の流体で達成することができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスの完全吸収は、約３００μＬ、約３５０μＬ、約４００μＬ、約４５０μＬ、約５００μＬ、約５５０μＬ、約６００μＬ、約６５０μＬ、約７００μＬ、約７５０μＬ、約８００μＬ、約８５０μＬ、約９００μＬ、約９５０μＬ、または約１，０００μＬの水、緩衝液、または他の流体で達成することができる。緩衝液は例えば、様々な塩濃度の溶出緩衝液とすることができる。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは多方向のおよび／または相互接続された細孔を有する多孔質構造を含む。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクス中で骨相および軟骨相を含む足場材料は多方向のおよび／または相互接続された細孔を有する多孔質構造を含む。多孔質構造は、いくつかの実施形態によれば、約１μｍ〜約１ｍｍの範囲の直径を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは約１００μｍ〜約１ｍｍの範囲の直径を有するマクロ孔を含む。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは約１０μｍ〜約１００μｍの範囲の直径を有するメソ細孔を含む。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは約１０μｍ未満の直径を有する微細孔を含む。本発明の様々な実施形態は、マクロ孔、メソ細孔、微細孔または任意のそれらの組み合わせを含む二相性生体適合性マトリクスを企図する。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクス中で骨相および軟骨相を含む足場材料は、相互接続されていない細孔を有する多孔質構造を含む。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクス中で骨相および軟骨相を含む足場材料は相互接続された細孔を有する多孔質構造を含む。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクス中で骨相および軟骨相を含む足場材料は相互接続された細孔および相互接続されていない細孔の混合物を有する多孔質構造を含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、足場材料中の骨相は、相互接続されていない細孔を有する多孔質構造を含む。いくつかの実施形態では、足場材料中の骨相は、相互接続された細孔を有する多孔質構造を含む。いくつかの実施形態では、足場材料中の骨相は、相互接続された細孔および相互接続されていない細孔の混合物を有する多孔質構造を含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、足場材料中の軟骨相は、相互接続されていない細孔を有する多孔質構造を含む。いくつかの実施形態では、足場材料中の軟骨相は、相互接続された細孔を有する多孔質構造を含む。いくつかの実施形態では、足場材料中の軟骨相は、相互接続された細孔および相互接続されていない細孔の混合物を有する多孔質構造を含む。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスはインビボ投与約１年以内に吸収され得る。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスはインビボ投与約約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１ヶ月以内に吸収され得る。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスはインビボ投与約３０日以内に吸収され得る。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスはインビボ投与約１０〜１４日以内に吸収され得る。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスはイ
ンビボ投与約１０日以内に吸収され得る。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスはマトリクスの少なくとも約７０％〜約９５％が吸収されるように吸収される。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスはマトリクスの少なくとも８０％が吸収されるように吸収される。生体内吸収性は下記に依存する：（１）二相性生体適合性マトリクス材料の性質（すなわち、その化学的組成、物理的構造およびサイズ）；（２）二相性生体適合性マトリクスが配置される体内の位置；（３）使用される二相性生体適合性マトリクス材料の量；（４）患者の代謝状態（糖尿病／非糖尿病、骨粗鬆症、喫煙者、老齢、ステロイド使用、など）；（５）治療される損傷の程度および／または型；ならびに（６）二相性生体適合性マトリクスに加えて他の材料、例えば他の骨同化、異化および抗異化因子の使用。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクス中で骨相および軟骨相を含む足場材料はインビボ投与約１年以内に吸収され得る。いくつかの実施形態では、足場材料はインビボ投与約約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１ヶ月以内に吸収され得る。いくつかの実施形態では、足場材料はインビボ投与約３０日以内に吸収され得る。いくつかの実施形態では、足場材料はインビボ投与約１０〜１４日以内に吸収され得る。いくつかの実施形態では、足場材料はインビボ投与約１０日以内に吸収され得る。いくつかの実施形態では、足場材料は材料の少なくとも約７０％〜約９５％が吸収されるように吸収される。いくつかの実施形態では、足場材料はマトリクスの少なくとも８０％が吸収されるように吸収される。
【０１２３】
生体適合性結合剤
いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは足場マトリクスおよび生体適合性結合剤を含む。生体適合性結合剤は、１つ以上の物質間の接着を促進するように動作可能な１つ以上の材料を含むことができる。生体適合性結合剤は、例えば、二相性生体適合性マトリクスの形成において足場材料の粒子間の接着を促進することができる。ある実施形態では、そのような材料が物質間の接着を促進するように作用し、新しい軟骨および骨の成長が起きるためのフレームワークを提供する場合、同じ材料が足場材料および結合剤の両方として作用することができる。ＷＯ２００８／００５４２７号および米国特許出願第１１／７７２，６４６号（米国特許公開第２００８／００２７４４７０号）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１２４】
生体適合性結合剤は、いくつかの実施形態では、下記のうちの１つ以上を含むことができる：コラーゲン、エラスチン、多糖、核酸、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ポリ（ａ−ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリウレタン、ポリ（オルトエステル）、ポリ（アンヒドリド−コ−イミド）、ポリ（オルトカーボネート）、ポリ（ａ−ヒドロキシアルカノエート）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（リン酸エステル）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）  （ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコリドまたはポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−トリメチレンカーボネート）、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）、ポリ（ｅ−カプロラクトン）、ポリ（ｄ−バレロラクトン）、ポリ（γ−ブチロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアクリル酸、ポリカルボン酸、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリプロピレンフマレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、炭素繊維、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマ、ポリ（エチレンテレフタレート）ポリアミド、コポリマ、およびそれらの混合物。
【０１２５】
生体適合性結合剤は、いくつかの実施形態では、下記のうちの１つ以上を含むことができる：アルギン酸、アラビアゴム、グアーガム、キサンタンガム、ゼラチン、キチン、キトサン、キトサンアセテート、キトサンラクテート、コンドロイチン硫酸、Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサン、デキストラン（例えば、ａ−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、またはデキストラン硫酸ナトリウム）、フィブリンのり、レシチン、ホスファチジルコリン誘導体、グリセロール、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、セルロース（例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはヒドロキシエチルセルロース）、グルコサミン、プロテオグリカン、デンプン（例えば、ヒドロキシエチルデンプンまたは可溶性デンプン）、乳酸、プルロニック酸、グリセロリン酸ナトリウム、グリコーゲン、ケラチン、絹、ならびにそれらの誘導体および混合物。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、生体適合性結合剤は水溶性である。水溶性結合剤は、二相性生体適合性マトリクスの移植後すぐにそれから溶解することができ、これにより、生体適合性マトリクスにマクロ多孔度が導入される。本明細書では、マクロ多孔度は、移植片部位での破骨細胞および骨芽細胞のアクセス、その結果として再構築活性を増強することにより、移植片材料の骨伝導性を増加させることができる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、生体適合性結合剤は、二相性生体適合性マトリクス中に、マトリクスの約５重量％〜約５０重量％の範囲の量で存在することができる。いくつかの実施形態では、生体適合性結合剤は、二相性生体適合性マトリクスの約１０重量％〜約４０重量％の範囲の量で存在することができる。いくつかの実施形態では、生体適合性結合剤は、二相性生体適合性マトリクスの約１５重量％〜約３５重量％の範囲の量で存在することができる。いくつかの実施形態では、生体適合性結合剤は、二相性生体適合性マトリクスの約２０重量％の量で存在することができる。いくつかの実施形態では、生体適合性結合剤は、二相性生体適合性マトリクスの約５０重量％未満の量で存在することができる。いくつかの実施形態では、生体適合性結合剤は、二相性生体適合性マトリクスの約４０重量％未満の量で存在することができる。いくつかの実施形態では、生体適合性結合剤は、二相性生体適合性マトリクスの約３０重量％未満の量で存在することができる。いくつかの実施形態では、生体適合性結合剤は、二相性生体適合性マトリクスの約２０重量％未満の量で存在することができる。いくつかの実施形態では、生体適合性結合剤は、二相性生体適合性マトリクスの約１０重量％未満の量で存在することができる。いくつかの実施形態では、生体適合性結合剤は、二相性生体適合性マトリクスの約５重量％未満の量で存在することができる。
【０１２８】
いくつかの実施形態によれば、足場材料および任意で生体適合性結合剤を含む二相性生体適合性マトリクスは、流動性、成形可能、および／または押出可能とすることができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは、ペーストまたはパテの形態とすることができる。いくつかの実施形態では、ペーストまたはパテの形態の生体適合性マトリクスは、生体適合性結合剤により互いに接着された足場材料の粒子を含むことができる。
【０１２９】
ペーストまたはパテの形態の二相性生体適合性マトリクスは、所望の移植片形状に成形することができ、あるいは移植部位の輪郭に合わせて成形することができる。いくつかの実施形態では、ペーストまたはパテの形態の二相性生体適合性マトリクスは、シリンジまたはカニューレを用いて移植部位に注入することができる。いくつかの実施形態では、成形可能および／または流動性足場材料は、軟骨に隣接する骨内の少なくとも１つの骨軟骨欠損部位（例えば、軟骨に隣接する骨、軟骨、軟骨と軟骨に隣接する骨の間の界面、またはそれらの組み合わせ）に適用することができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、ペーストまたはパテの形態の二相性生体適合性マトリクスは、移植後、硬化せず、流動性および成形可能形態を保持する。いくつかの実施形態では、ペーストまたはパテは移植後に硬化することができ、これにより、マトリクス流動性および成形性が減少する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、足場材料および任意で生体適合性結合剤を含む二相性生体適合性マトリクスはまた、ブロック、球、もしく円柱または任意の所望の形状、例えば、鋳型または適用部位により規定される形状を含む予め決められた形状で提供することができる。いくつかの実施形態では、足場材料および任意で生体適合性結合剤を含む二相性生体適合性マトリクスは、ジェル、粒子、粉末、シート、パッチ、パッド、プラグまたはスポンジの形態で提供することができる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、足場材料および任意で生体適合性結合剤を含む二相性生体適合性マトリクスは生体吸収性である。二相性生体適合性マトリクスは、いくつかの実施形態では、インビボ移植約１年以内に吸収され得る。いくつかの実施形態では、足場材料および任意で生体適合性結合剤を含む二相性生体適合性マトリクスはインビボ移植約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１ヶ月以内に吸収され得る。いくつかの実施形態では、足場材料および任意で生体適合性結合剤を含む二相性生体適合性マトリクスはインビボ投与約３０日以内に吸収され得る。いくつかの実施形態では、足場材料および任意で生体適合性結合剤を含む二相性生体適合性マトリクスはインビボ投与約１０〜１４日以内に吸収され得る。いくつかの実施形態では、足場材料および任意で生体適合性結合剤を含む二相性生体適合性マトリクスはインビボ投与約１０日以内に吸収され得る。いくつかの実施形態では、足場材料および任意で生体適合性結合剤を含む二相性生体適合性マトリクスはマトリクスの少なくとも約７０％〜約９５％が吸収されるように吸収される。いくつかの実施形態では、足場材料および任意で生体適合性結合剤を含む二相性生体適合性マトリクスはマトリクスの少なくとも約８０％が吸収されるように吸収される。
【０１３３】
血小板由来増殖因子
本発明は軟骨および骨における骨軟骨欠損を治療するための組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態では、個体において軟骨および軟骨に隣接する骨における骨軟骨欠損を治療するための組成物および方法が提供される。いくつかの実施形態では、軟骨は、関節軟骨、線維軟骨、または弾性軟骨を含む。いくつかの実施形態では、骨は軟骨下骨または海綿骨を含む。
【０１３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、二相性生体適合性マトリクスは足場材料およびＰＤＧＦを含む。足場材料は、さらに骨相および軟骨相を含み得る。ＰＤＧＦは損傷部位で血小板から放出される増殖因子である。ＰＤＧＦは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と相乗作用し、血管新生（血行再建）を促進し、テノサイト、骨芽細胞、軟骨細胞、および血管平滑筋細胞を含む間葉系細胞の走化性および増殖を刺激する。その場合、二相性生体適合性マトリクスと共に、少なくとも１つの骨軟骨欠損部位（例えば、軟骨に隣接する骨、軟骨、軟骨と軟骨に隣接する骨の間の界面、またはそれらの組み合わせ）に導入される。ＰＤＧＦはＩＩ型コラーゲン（硝子軟骨の主コラーゲンサブタイプ）の合成を誘起し、十分な数の幹細胞の動員を増加させ、骨軟骨欠損において骨の内部成長および軟骨再生の両方を増強させる。
【０１３５】
１つの態様では、本発明により提供される組成物および方法は二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦ溶液を含むことができ、溶液は生体適合性マトリクス中に分散される。様々な実施形態では、ＰＤＧＦは溶液中に存在し、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１０．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは溶液中に存在し、
約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは溶液中に存在し、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約２．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは溶液中に存在し、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約３．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは溶液中に存在し、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約５．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは溶液中に存在し、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは溶液中に存在し、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約３．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、約０．０３ｍｇ／ｍＬ、約０．１５ｍｇ／ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬ、または約１．０ｍｇ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは溶液中に下記濃度のいずれか１つで存在する：約０．０５ｍｇ／ｍＬ；約０．１ｍｇ／ｍＬ；約０．２ｍｇ／ｍＬ；約０．２５ｍｇ／ｍＬ；約０．３５ｍｇ／ｍＬ；約０．４ｍｇ／ｍＬ；約０．４５ｍｇ／ｍＬ；約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．５５ｍｇ／ｍＬ、約０．６ｍｇ／ｍＬ、約０．６５ｍｇ／ｍＬ、約０．７ｍｇ／ｍＬ；約０．７５ｍｇ／ｍＬ；約０．８ｍｇ／ｍＬ；約０．８５ｍｇ／ｍＬ；約０．９ｍｇ／ｍＬ；約０．９５ｍｇ／ｍＬ；約１．５ｍｇ／ｍＬ、または約２．０ｍｇ／ｍＬ。これらの濃度は、特定の実施形態の単なる例であること、ＰＤＧＦの濃度は、上記濃度範囲のいずれか内にある得ることが理解されるべきである。
【０１３６】
１つの変形では、本発明により提供される組成物および方法は二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦ溶液を含むことができ、ＰＤＧＦ溶液は凍結乾燥され、またはフリーズドライされ、二相性生体適合性マトリクス内に入れられる。組成物は、本明細書で記載される方法において使用するために再構成され得る。
【０１３７】
様々な量のＰＤＧＦが本発明の組成物において使用され得る。使用され得るＰＤＧＦの量の例としては、下記範囲の量が挙げられる：約１μｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約１０ｍｇ、約１μｇ〜約１ｍｇ、約１μｇ〜約５００μｇ、約１０μｇ〜約２５ｍｇ、約１０μｇ〜約５００μｇ、約１００μｇ〜約１０ｍｇ、または約２５０μｇ〜約５ｍｇ。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは約１５μｇ、約７５μｇ、約１５０μｇ、または約５００μｇの量である。
【０１３８】
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ（または他の増殖因子）の濃度は、米国特許第６，２２１，６２５号；同第５，７４７，２７３号；および同第５，２９０，７０８号において記載されている酵素結合免疫測定法、またはＰＤＧＦ濃度を決定するための当技術分野において知られている任意の他のアッセイを使用することにより決定することができる。本明細書で提供される場合、ＰＤＧＦのモル濃度は、ＰＤＧＦ二量体の分子量に基づき決定される（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＭＷ約２５ｋＤａ）。
【０１３９】
ＰＤＧＦはＰＤＧＦホモ二量体および／またヘテロ二量体、例えば、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤ、ならびにそれらの混合物および誘導体を含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは組換えヒトＰＤＧＦ、例えばｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは自然源から入手することができる。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは組換えＤＮＡ技術により生成させることができる。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦまたはその断片は、当業者に知られたペプチド合成技術、例えば、固相ペプチド合成を用いて生成させることができる。
【０１４１】
自然源から入手される場合、ＰＤＧＦは生体液から誘導することができる。いくつかの実施形態によれば、生体液は生物と関連する任意の処置された、または未処置の流体、例えば血液を含むことができる。生体液はまた、血液成分、例えば血小板濃縮液、アフェレーシスされた血小板、多血小板血漿、血漿、血清、新鮮凍結血漿、およびバフィーコートを含むことができる。生体液は血漿から分離され、生理液に再懸濁された血小板を含むことができる。
【０１４２】
組換えＤＮＡ技術により生成される場合単一単量体（例えば、ＰＤＧＦ  Ｂ鎖またはＡ鎖）をコードするＤＮＡ配列は、培養させた原核または真核細胞に挿入することができ、発現してその後にホモ二量体（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＡ）が生成される。いくつかの実施形態では、組換え技術により生成されるホモ二量体ＰＤＧＦを使用することができる。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦヘテロ二量体は、ヘテロ二量体の単量体ユニットの両方をコードするＤＮＡ配列を培養させた原核または真核細胞中に挿入し、翻訳された単量体ユニットを細胞により処理させ、ヘテロ二量体（例えば、ＰＤＧＦ−ＡＢ）を生成させることにより、生成させることができる。市販の組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢは様々な供給源から入手することができ、例えば、Ｃｈｉｒｏｎ／Ｎｏｒｖａｒｔｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）製のｃＧＡＭＰ組換えＰＤＧＦ−ＢＢ、リサーチグレードｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、およびＣｈｅｍｉｃｏｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ））が挙げられる。
【０１４３】
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは１つ以上のＰＤＧＦ断片を含む。いくつかの実施形態では、ｒｈＰＤＧＦ−Ｂは１つ以上の下記断片を含む：全Ｂ鎖のアミノ酸配列１−３１、１−３２、３３−１０８、３３−１０９、および／または１−１０８。ＰＤＧＦのＢ鎖の完全アミノ酸配列（ＡＡ１−１０９）が米国特許第５，５１６，８９６号の図１５で提供される。本発明のｒｈＰＤＧＦ組成物は、無傷のｒｈＰＤＧＦ−Ｂ（ＡＡ１−１０９）およびその断片の組み合わせを含み得ることが理解されるべきである。米国特許第５，５１６，８９６号で開示されるものなどのＰＤＧＦの他の断片が使用され得る。いくつかの実施形態によれば、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは少なくとも６５％の無傷のｒｈＰＤＧＦ−Ｂ（ＡＡ１−１０９）を含む。いくつかの実施形態によれば、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の無傷のｒｈＰＤＧＦ−Ｂ（ＡＡ１−１０９）を含む。
【０１４４】
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは精製形態とすることができる。本明細書では、精製ＰＤＧＦは、本発明の溶液に組み込む前、約９５重量％を超えるＰＤＧＦを有する組成物を含む。溶液は、任意の薬学的に許容される緩衝液または希釈剤を用いて調製され得る。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは実質的に精製することができる。本明細書では、実質的に精製されたＰＤＧＦは、本発明の溶液に組み込む前、約５％〜約９５重量％のＰＤＧＦを有する組成物を含む。１つの実施形態では、実質的に精製されたＰＤＧＦは、本発明の溶液に組み込む前、約６５％〜約９５重量％のＰＤＧＦを有する組成物を含む。いくつかの実施形態では、実質的に精製されたＰＤＧＦは本発明の溶液に組み込む前、約７０％〜約９５％、約７５％〜９５％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９５％、または約９０％〜約９５重量％のＰＤＧＦを有する組成物を含む。精製ＰＤＧＦおよび実質的に精製されたＰＤＧＦは足場マトリクスに組み込まれ得る。
【０１４５】
さらなる実施形態では、ＰＤＧＦは部分的に精製することができる。本明細書では、部分的に精製されたＰＤＧＦは、多血小板血漿、新鮮凍結血漿、またはＰＤＧＦを生成させるのに回収および分離を必要とする任意の他の血液製剤との関連でＰＤＧＦを有する組成物を含む。本発明の実施形態は、ホモ二量体およびヘテロ二量体を含む、本明細書で提供
されるＰＤＧＦアイソフォームのいずれも精製することができ、または部分的に精製することができることを企図する。ＰＤＧＦ混合物を含む本発明の組成物はＰＤＧＦアイソフォームまたはＰＤＧＦ断片を部分的に精製された割合で含むことができる。いくつかの実施形態では、部分的に精製された、および精製ＰＤＧＦは米国特許出願第１１／１５９，５３３号（米国特許公開番号第２００６００８４６０２号）において記載されているように調製することができる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦを含む溶液は、１つ以上の緩衝液中にＰＤＧＦを可溶化することにより形成される。本発明のＰＤＧＦ溶液で使用するのに好適な緩衝液は、炭酸塩、リン酸塩（例えば、リン酸緩衝食塩水）、ヒスチジン、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、酸性緩衝液、例えば酢酸およびＨＣｌ、および有機緩衝液、例えばリシン、Ｔｒｉｓ緩衝液（例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、および３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）を含むことができるが、それらに限定されない。緩衝液は、ＰＤＧＦとの生体適合性および緩衝液の望ましくないタンパク質修飾を妨げる能力に基づいて選択することができる。緩衝液はさらに、宿主組織との適合性に基づいて選択することができる。１つの実施形態では、酢酸ナトリウム緩衝液が使用される。緩衝液は異なるモル濃度、例えば、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、または約１５ｍＭ〜約２５ｍＭ、またはこれらの範囲内の任意のモル濃度で使用され得る。いくつかの実施形態では、酢酸緩衝液が約２０ｍＭのモル濃度で使用される。
【０１４７】
別の実施形態では、ＰＤＧＦを含む溶液は、水中で凍結乾燥ＰＤＧＦを可溶化することにより形成され得、ここで、可溶化前に、ＰＤＧＦは、適当な緩衝液から凍結乾燥される。
【０１４８】
本発明の実施形態によれば、ＰＤＧＦを含む溶液は、約３．０〜約８．０の範囲のｐＨを有することができる。１つの実施形態では、ＰＤＧＦを含む溶液は約５．０〜約８．０、より好ましくは約５．５〜約７．０、最も好ましくは約５．５〜約６．５の範囲のｐＨ、またはこれらの範囲の任意の値を有する。ＰＤＧＦを含む溶液のｐＨは、いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦまたは任意の他の所望の生理活性物質の長期安定性および有効性と適合し得る。ＰＤＧＦは一般に酸性環境でより安定である。そのため、いくつかの実施形態によれば、本発明はＰＤＧＦ溶液の酸性貯蔵製剤を含む。いくつかの実施形態によれば、ＰＤＧＦ溶液は好ましくは約３．０〜約７．０、より好ましくは約４．０〜約６．５のｐＨを有する。しかしながら、ＰＤＧＦの生物活性は、中性ｐＨ範囲を有する溶液中で最適化させることができる。そのため、いくつかの実施形態では、本発明はＰＤＧＦ溶液の中性ｐＨ製剤を含む。この実施形態によれば、ＰＤＧＦ溶液は好ましくは、約５．０〜約８．０、より好ましくは約５．５〜約７．０、最も好ましくは約５．５〜約６．５のｐＨを有する。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ含有溶液のｐＨを変化させて、ＰＤＧＦのマトリクス基質への結合動力学を最適化することができる。所望であれば、材料のｐＨが隣接する材料と平衡化されるので、結合ＰＤＧＦは不安定になる可能性がある。
【０１５０】
ＰＤＧＦを含む溶液のｐＨは、いくつかの実施形態では、本明細書で列挙される緩衝液により制御することができる。様々なタンパク質は、それらが安定である異なるｐＨ範囲を証明している。タンパク質安定性は主に、等電点およびタンパク質上の電荷により反映される。ｐＨ範囲は、タンパク質の立体配座構造ならびにタンパク質のタンパク質分解、加水分解、酸化、およびタンパク質の構造および／または生物活性への変更を引き起こし得る他のプロセスへの感受性に影響を与え得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦを含む溶液はさらに、追加の成分、例えば他の生理活性物質を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦを含む溶液はさらに、細胞培地、他の安定化タンパク質、例えばアルブミン、抗菌剤、プロテアーゼ阻害剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、アプロチニン、Ｅ−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、など）および／または他の増殖因子、例えば線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＥ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、または他のＰＤＧＦ、例えばＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣおよび／またはＰＤＧＦ−ＤＤの組成物を含むことができる。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは、二相性生体適合性マトリクスの約２５％〜約２０００重量％の範囲にある、ある量のＰＤＧＦを含む溶液を吸収することができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは、二相性生体適合性マトリクスの約１００％〜約１６００重量％の範囲にある、ある量のＰＤＧＦを含む溶液を吸収することができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは、二相性生体適合性マトリクスの少なくとも約２５重量％に等しい、ある量のＰＤＧＦを含む溶液を吸収することができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは、二相性生体適合性マトリクスの少なくとも約１００重量％に等しい、ある量のＰＤＧＦを含む溶液を吸収することができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは、二相性生体適合性マトリクスの少なくとも約５００重量％に等しい、ある量のＰＤＧＦを含む溶液を吸収することができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは、二相性生体適合性マトリクスの少なくとも約１０００重量％に等しい、ある量のＰＤＧＦを含む溶液を吸収することができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは、二相性生体適合性マトリクスの少なくとも約１５５０重量％に等しい、ある量のＰＤＧＦを含む溶液を吸収することができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは、二相性生体適合性マトリクスの少なくとも約１６００重量％に等しい、ある量のＰＤＧＦを含む溶液を吸収することができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは、二相性生体適合性マトリクスの少なくとも約２０００重量％に等しい、ある量のＰＤＧＦを含む溶液を吸収することができる。
【０１５３】
さらに生理活性物質を含む組成物
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物および方法はさらに、ＰＤＧＦに加えて１つ以上の生理活性物質を含むことができる。本発明の組成物に、ＰＤＧＦに加えて組み込むことができる生理活性物質は、例えば、有機分子、無機材料、タンパク質、ペプチド、核酸（例えば、遺伝子、遺伝子断片、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、遺伝子制御配列、核転写因子およびアンチセンス分子）、核タンパク質、多糖（例えば、ヘパリン）、糖タンパク質、およびリポタンパク質を含むことができる。例えば、抗癌剤、抗生物質、鎮痛薬、抗炎症薬、免疫抑制剤、酵素阻害薬、抗ヒスタミン薬、ホルモン、筋弛緩薬、プロスタグランジン、栄養素、骨誘導タンパク質、増殖因子、およびワクチンを含む、本発明の組成物に組み込むことができる生理活性化合物の非制限的例は、米国特許出願第１１／１５９，５３３号（米国特許公開番号第２００６００８４６０２号）に開示されている。いくつかの実施形態では、本発明の組成物に組み込むことができる生理活性化合物としては、骨誘導因子、例えばインスリン様増殖因子、線維芽細胞増殖因子、または他のＰＤＧＦが挙げられる。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物に組み込むことができる生理活性化合物としては、好ましくは、骨誘導および骨刺激因子、例えば骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ模倣薬、カルシトニン、カルシトニン模倣薬、スタチン、スタチン誘導体、線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、増殖分化因子、および／または副甲状腺ホルモンが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物に組み込む
ための追加の因子としては、プロテアーゼ阻害剤、ならびに骨吸収を減少させる骨粗鬆症治療薬、例えば、ビスホスホネート、およびＮＦ−ｋＢ（ＲＡＮＫ）リガンドに対する抗体が挙げられる。
【０１５４】
追加の生理活性物質を送達させるための標準プロトコルおよびレジメンは当技術分野において公知である。追加の生理活性物質は本発明の組成物中に、少なくとも１つの骨軟骨欠損部位（例えば、軟骨に隣接する骨、軟骨、軟骨と軟骨に隣接する骨の間の界面、またはそれらの組み合わせ）に適当な用量の作用物質を送達させる量で導入することができる。ほとんどの場合、用量は、実行者に知られており、問題になっている特定の作用物質に適用可能なガイドラインを用いて決定される。本発明の組成物に含有される追加の生理活性物質の量は、病状の型および程度、特定の患者の全体的な健康状態、生理活性物質製剤、放出動力学、および生体適合性マトリクスの生体内吸収性などの変数に依存し得る。
【０１５５】
軟骨の欠損および／または損傷を治療するための方法
本発明は、軟骨および骨における骨軟骨欠損を治療するための方法を提供する。１つの態様では、軟骨および骨における骨軟骨欠損を治療するための方法は、二相性生体適合性マトリクス中に配置されたＰＤＧＦ溶液を含む組成物を提供すること、組成物を少なくとも１つの骨軟骨欠損部位に適用することを含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ溶液は骨相および／または軟骨相（複数可）内に配置される。
【０１５６】
別の態様では、軟骨および骨における骨軟骨欠損を治療するための方法は、二相性生体適合性マトリクス中の、予め決められた濃度で、ＰＤＧＦ溶液から凍結乾燥され、またはフリーズドライされたＰＤＧＦを含む組成物を提供すること、組成物を少なくとも１つの骨軟骨欠損部位に対し標準の生理食塩水または水で水和させること、および組成物を同じ部位（複数可）に適用することを含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、個体において軟骨および骨における骨軟骨欠損を治療するための方法は、個体に有効量の、二相性生体適合性マトリクスおよびＰＤＧＦを含む組成物を少なくとも１つの骨軟骨欠損部位に投与することを含み、二相性生体適合性マトリクスは足場材料を含み、足場材料は骨相および軟骨相を含む多孔質構造を形成する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、骨は軟骨下骨または海綿骨を含む。いくつかの実施形態では、軟骨は関節軟骨、線維軟骨、または弾性軟骨を含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、関節軟骨は膝の関節軟骨、例えば、大腿骨および／または脛骨のそれを含む。いくつかの実施形態では、関節軟骨は大腿顆または滑車を含む。いくつかの実施形態では、関節軟骨は、肩関節、肘および橈尺関節、指節間関節、距骨（例えば、足および足首）、および／または臀部の関節軟骨を含む
【０１６０】
いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクス中に配置されたＰＤＧＦ溶液を含む組成物は、ステープル、タック、およびフィブリンのりの組み合わせを有孔軟骨下骨表面に貼付し、関節軟骨および軟骨下骨または海綿骨の両方に組成物を挿入することにより、適用することができる。
【０１６１】
本発明のいくつかの実施形態では、方法は、開放性または微小開放性関節鏡技術、内視鏡技術、腹腔鏡技術、または任意の他の好適な低侵襲技術を用いて実施し得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスに配置されたＰＤＧＦ溶液を含む組成物は送達装置を用いて適用することができる。例えば、送達装置は外側スリーブを備え、これは、組成物を軟骨および軟骨に隣接する骨における骨軟骨欠損部位に中に投入
するために使用することができる。いくつかの実施形態では、骨軟骨欠損部位は、軟骨に隣接する骨、軟骨、軟骨と軟骨に隣接する骨の間の界面、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１６３】
本発明の方法の実施形態によれば、組成物中で使用するのに好適なＰＤＧＦ溶液および生体適合性マトリクスは、上記で提供されるものと一致する。
【０１６４】
本発明のキット
１つの態様では、本発明はＰＤＧＦ溶液を含む第１の容器および二相性生体適合性マトリクスを含む第２の容器を備えるキットを提供する。いくつかの実施形態では、溶液は予め決められた濃度のＰＤＧＦを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦの濃度は、治療される損傷あるいは欠損軟骨または軟骨の性質に従い予め決定することができる。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは、治療される軟骨および骨の型に従い、予め決められた量を含む。いくつかの実施形態では、二相性生体適合性マトリクスは足場マトリクスを含み、足場マトリクスは骨相および軟骨相を含む。いくつかの実施形態では、シリンジは、外科的処置部位、例えば少なくとも１つの骨軟骨欠損部位に適用するために、二相性生体適合性マトリクス中でのＰＤＧＦ溶液の分散を促進することができる。
【０１６５】
キットはまた、軟骨および骨における骨軟骨欠損を治療するために使用するための説明書を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＤＧＦ溶液を含む第１の容器、および二相性生体適合性マトリクスを含む第２の容器、ならびに軟骨および骨における骨軟骨欠損を治療するためにＰＤＧＦ溶液および二相性生体適合性マトリクスを混合するための説明書を備えるキットを提供する。
【０１６６】
別の態様では、本発明は、凍結乾燥され、またはフリーズドライされたＰＤＧＦおよび二相性生体適合性マトリクスならびに凍結乾燥され、またはフリーズドライされたＰＤＧＦおよび二相性生体適合性マトリクスを標準の生理食塩水または他の溶液（例えば、水）で少なくとも１つの骨軟骨欠損部位に対し水和させるため、および得られた混合物を軟骨および／または骨における骨軟骨欠損を治療するために使用するための説明書を含むキットを提供する。凍結乾燥され、またはフリーズドライされたＰＤＧＦは生体適合性マトリクスとは別個に提供され得る、例えば、ＰＤＧＦは、様々な溶液、例えば酢酸ナトリウム緩衝液）を用いて再水和させることができ、あるいは、二相性生体適合性マトリクス内に（例えば、ＰＤＧＦ溶液を二相性生体適合性マトリクス中に組み込み、続いて凍結乾燥およびフリーズドライすることにより）含有させることができる。
【実施例】
【０１６７】
下記実施例は、例示目的のためだけに提供されたものであり、いかなる意味においても本発明の範囲を制限することを意図しない。
実施例
実施例１
骨軟骨欠損の治療に適用するための２相プラグの物理特性評価
【０１６８】
この調査では走査電子顕微鏡を使って、Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃのコンドロミメティック（Ｃｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ）２相プラグ材料の表面トポグラフィー、組成、および可視化空隙率を評価した。
【０１６９】
調製に際し、プラグ（８．５ｍｍｘ８ｍｍ）を液体窒素中に入れ、垂直方向に２つに分割した。プラグを液体窒素中に置きプラグの構造の健全性を維持した。
【０１７０】
半分割した後、 次にプラグを両面粘着テープで２６ｍｍ円形試料台に取り付けた。次
に、試料台をスパッタ被覆装置中に置いた。スパッタ被覆工程では、試料にスパッタして金粒子のコーティングをすることにより試料の電気伝導度増加を確実にする。スパッタ被覆 工程の完了後すぐに試料を黒鉛接着剤と「アースを取って」電子顕微鏡の観察中にチ
ャージするのを防止する。
【０１７１】
次に試料を走査電子顕微鏡に移し、画像を記録した（図１Ａ〜１Ｑ）。
【０１７２】
実施例２
２相プラグの取扱い性
この調査では、緩衝液溶液中のプラグ材料水和の進行を評価し、またプラグ材料への溶出緩衝液長時間飽和状態の時間に対する影響を測定するという２つの目的のために、２相プラグ（Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃのコンドロミメティックプラグ）の取扱い性を評価した。メチレンブルー染料を使って可視化しプラグ材料の水和を実証した。
【０１７３】
水和と飽和状態の調査の一環として、寸法（上下相）、重量、テクスチャ、剛性、および写真記録を含む最初の観察結果を記録した。
【０１７４】
水和調査のために、Ｐ２００ピペットを使ってメチレンブルー染色酢酸ナトリウム緩衝液をプラグ材料に５０μＬきざみで添加した。２０μＬメチレンブルーおよび５ｍＬ酢酸ナトリウム緩衝液を使って１％ｘ／ｖ（容積／容積）メチレンブルー濃度のメチレンブルー水溶液を作った。５．４４ｇ酢酸ナトリウム（シグマ１３５０５ＰＬ）および１．８Ｌ
ＭＱｄｄＨ２Ｏを用いて酢酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．９９）を作った。２００μＬの１７．４Ｍ酢酸（シグマ０６９１１ＭＥ）でｐＨを６．０に調整し、次に２Ｌに調整した。次にこの酢酸ナトリウム緩衝液を０．２２μｍの滅菌フィルターで濾過した。
【０１７５】
プラグが目視で飽和状態に達するとすぐ、プラグを完全な飽和状態のまま１０分維持し、次いでメスで垂直に切断して、プラグ材料全体の完全な水和を確実にした。観察を行って写真を撮った。必要容積の水和が得られるとすぐ、次の水和ステップをシリンジと針を使って、またさらにシリンジの真空を利用して、繰り返した。
【０１７６】
飽和状態の状況調査のために、プラグを２４ウエルプレートに入れ、溶出緩衝液に完全に浸漬し、３７°Ｃ、ＣＯ２のインキュベーターに挿入した。このプレートを取り出し、３０分；６０分；１２０分；１８０分；２４０分；２４時間；９６時間の間隔で観察した。全ての取扱は、無菌試験環境で行った。
【０１７７】
水和の調査のため、１つのプラグを検量したピペットを使って水和し、１つのプラグをシリンジと針を使って水和し、また１つをシリンジの真空を使って水和した。
【０１７８】
飽和状態の調査では、前記工程を３回繰り返して行った。
【表１】
2012519556.tif 000003
【表２】
2012519556.tif 000004
【表３】
2012519556.tif 000005
【０１７９】
吸収の調査で、プラグ材料の完全吸収は４５０μＬ添加緩衝液で得られることが明らかになった。この容量でプラグ材料全体への完全飽和状態が保障された。真空シリンジによるプラグ材料の添加では、プラグを厳密に水和することがより困難であり、シリンジ中でプラグを緩衝液で十分に水和するには追加の操作が必要になることがわかった。一旦完全に水和されてしまえば、プラグ材料は、緩衝液溶液を保持し、まさにテクスチャと剛性を有するスポンジのように作動した。
【０１８０】
飽和状態の調査で、３７℃で緩衝液溶液に浸漬下の９６時間までのインキュベーション
では、プラグ材料に物理的観点からの大きな収縮または変化は認められないことが明確になった。溶出緩衝液中に入れると横向きの状態からすぐに上部が上を向くというプラグ再配向から明らかように、プラグの先端相は、底部相に比べより大きな浮力を示した。プラグ材料は、全ての時点で優れた形状記憶を示した。実験全体を通して、いかなる微粒子状物質も溶出緩衝液の曇りも記録されなかった。
【０１８１】
実施例３
２相プラグ材料からのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（組換えヒト血小板由来増殖因子−ＢＢ）放出の評価
この調査では、２相基質プラグ（コンドロミメティック（Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃｓ））からの経時的ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ放出速度を評価した。
【０１８２】
無菌条件で、各プラグを、２７Ｇ１／２インチ針およびシリンジ（プランジャーはシリンジから取り外してある）付きのザルスタット１５ｍＬポリプロピレンコニカルチューブを使って安定化した。各Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃのコンドロミメティック基質プラグ（ｘ３；８．５ｍｍｘ８ｍｍ）に４５０μＬ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（例えば、０．３ｍｇ／ｍＬまたは１．０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、次に室温で１０分間コニカルチューブ内に飽和状態で置いた（図３参照）。
【０１８３】
インキュベーションの後で、９ｍＬ溶出緩衝液（１％Ｌ−グルタミン、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、２％ＦＢＳ（熱不活化、ガンマ線照射）、２．５％ヘペス）を１５ｍＬコニカルチューブ（１〜６の番号を付与）に入れた。４５０μＬ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを直接に溶出緩衝液（１％Ｌ−グルタミン、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、２％ＦＢＳ（熱不活化、ガンマ線照射）、および２．５％ヘペス）に添加し、１〜３の番号を付与したコニカルチューブには、これらを含んだ試料プラグを入れ、４〜６の番号を付与したチューブはプラグのない対照として使った（表４参照）。次いで、コニカルチューブを、３７℃のインキュベーター内にある振盪台にのせた。
【０１８４】
１０分、１時間、８時間、２４時間の各時点で、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）で使用するため、コニカルチューブを振盪台から取り外し、無菌層流フードに戻して全ての溶出緩衝液捕集物を完全に洗い流した。
【０１８５】
全洗浄物の無菌コニカルチューブへの採取が完了したらすぐ、９ｍＬの新しい溶出液を各試料のコニカルチューブに入れ、振盪台に戻した。集めた洗浄物試料は２〜４℃の保冷容器に入れた。
【０１８６】
全試料を集めた後、ＥＬＩＳＡを行って各時点での洗浄物中のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ濃度を測定した。
【表４】
2012519556.tif 000006
【０１８７】
Ａ．ＥＬＩＳＡアッセイ工程
１００μＬの希釈した捕集試薬を９６−ウエルプレート（コーニング３５９０）の各ウエルに添加した。接着性プレートカバーで覆い、希釈した捕集試薬を室温でオービタルシェーカーを使って一晩コートした。
【０１８８】
次に、各ウエルを吸引し、３００μＬのＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ２０を含む１Ｘ燐酸塩緩衝食塩水）で洗浄した。
【０１８９】
２００μＬの試料希釈剤（溶出緩衝液）を添加して、室温で少なくとも２時間プレート振盪装置にかけてブロックした。
【０１９０】
次に各ウエルを吸引して、３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。
【０１９１】
試験試料で使われたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢのロットを使ってｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの検量線を作成した。次いでｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを希釈剤として溶出緩衝液を使って１０ｎｇ／ｍＬに希釈した。２倍希釈系列を０．１５６２５ｎｇ／ｍＬまで作成した。
【０１９２】
希釈剤として溶出緩衝液を使って試料１〜７をアッセイ用に希釈した（表５参照）。
【表５】
2012519556.tif 000007
【０１９３】
アッセイテンプレートに続いて１００μＬの各試料と標準の二組をプレートに分注した。プレートを接着膜でカバーし、振盪しながら１〜２時間室温でインキュベートした。
【０１９４】
次に、各ウエルを吸引して３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。
【０１９５】
１００μＬの検出抗体を各ウエルに添加し、接着膜でカバーした後、１〜１．５時間振盪した。
【０１９６】
さらに、各ウエルを吸引し３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。
【０１９７】
試薬希釈剤を使ってストレプトアビジン−ＨＲＰを１：２００に希釈し、１００μＬを各ウエルに添加して、アルミニウムフォイルでカバーし、室温で２０分間インキュベートした。
【０１９８】
次に、各ウエルを吸引し３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。
【０１９９】
ＫＰＬ（ＫＰＬ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）から入手した１００μＬのＳｕｒｅ  Ｂｌｕｅを添加し、アルミニウムフォイルでカバーて、室温で２０分インキュベートした。ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を光から常に防御した。時間と共に青色が現れた。
【０２００】
５０μＬのＨＣＬ（１Ｎ）を各ウエルに添加して反応を停止させた。青色のウエルに黄色が出現した。
【０２０１】
各ウエル光学密度を停止液添加後３０分以内に５４０ｎｍで波長補正し４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダで測定した。光学密度の読みをマイクロソフトエクセルに出力して分析した。
【表６】
2012519556.tif 000008
【表７】
2012519556.tif 000009
【０２０２】
１０分後に、５１％のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの初期大量放出があり、次いで残りの２３時間の調査期間にわたるさらに緩慢な相の放出があった。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの２４時間後の基質材料からの累積放出は、対照に比較して７０〜７５％（平均値７３．５％）であった（表６〜７と図４Ａ〜４Ｂ参照）。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの完全回収は、このインビトロ実験計画を使っては、達成されなかった。添加したタンパク質の一部は共有結合により材料に交差結合することが可能であり、この調査の測定時間枠では放出されない。調査計画の一部として行った陽性対照実験により、このアッセイがｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ検出に対し正常に機能したことが示された。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢと２相基質の組み合わせは、ＰＤＧＦ−ＢＢの生化学的安定性に負の影響を与えなかった。非線形回帰により求めた放出ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢのＰＤＧＦ受容体結合効率は、対照ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢと同等であった。
【０２０３】
実施例４
Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃｓの２相（ＲＩＶＥＲＳＩＤＥ（登録商標））プラグが組換えヒト血小板由来増殖因子ＢＢ（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）特性に与える影響
この調査では、サイズ排除および逆相ＨＰＬＣならびにＥＬＩＳＡで決定されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ受容体に対する結合親和性により、ＯｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃｓのＲＩＶＥＲＳＩＤＥ（登録商標）プラグと組み合わせた後の、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの構造と機能の健全性を評価した。
【０２０４】
Ａ．試験方法
２つのＲＩＶＥＲＳＩＤＥ（登録商標）プラグを４分割した。プラグを１００μＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（例えば、１．０ｍｇ／ｍＬを２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に溶解）に浸漬し４分割プラグのそれぞれに試料１〜６のラベルを付けるか、または同じ容積の酢酸
ナトリウム（ＮａＡｃ）緩衝液に浸漬し（対照７、８）、室温で１０分間インキュベートした。
【０２０５】
微量遠心機チューブを表８に示す異なる塩濃度の溶出緩衝液３００μＬで満たした。
【表８】
2012519556.tif 000010
【０２０６】
チューブを３７℃のインキュベーター中の振盪装置上に置き１時間振盪した。
【０２０７】
１時間後、チューブをインキュベーターから取り出し、溶出緩衝液を各チューブからマイクロチューブに移した。
【０２０８】
試料を２０℃、１４、０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次に、各試料の１５０μＬをサイズ排除ＨＰＬＣ用ガラスバイアルに、９０μＬを逆相ＨＰＬＣ用マイクロチューブに、そして１０μＬをＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡを使ったＰＤＧＦ検出アッセイ用に移した。
【０２０９】
サイズ排除ＨＰＬＣ
自動注入装置を使って１００μＬの試料を自動サンプラーからサイズ排除カラムに注入し、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム中の０．４Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０と平衡したカラムで流速０．８ｍＬ／分、室温で溶出した。クロマトグラフィーの時間中、試料を４℃に保持した。
【０２１０】
逆相ＨＰＬＣ
試験手順ＱＣＴ００４に従って、各９０μＬの試料を、最初、２００ｍＭジチオトレイトールと４Ｍグアニジン塩酸塩で５０℃、５分間変性し、次にＣ18逆相カラムに注入し０．０６％トリフルオロ酢酸中の２４〜４５％アセトニトリル勾配、１．２ｍＬ／分で溶出した。２１４ｎｍの吸光度を使ってデータ収集した。
【０２１１】
ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
溶出緩衝液を使って４倍希釈の試料を１０ｎｇ／ｍＬに希釈し、２倍希釈系列により合計７希釈液を２組調整した。次に、このアッセイのためにＲ＆Ｄ  Ｌａｂから入手した標準プロトコルに従い、ＤｕｏＳｅｔアッセイを使ってＰＤＧＦ検出アッセイを行った。
【０２１２】
本調査に関して、いかなる逸脱データも記録されなかった。
【０２１３】
Ｂ．結果
ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）から得られたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢプロファイル
はその元の構造の変化および／またはプラグから溶出した可溶性成分の存在を反映していた。全塩濃度でプラグ材料から溶出した多少の低分子量物のバックグラウンドがあった。しかし、溶出緩衝液中に塩が存在するときのみ、材料からｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが放出され、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢがイオン相互作用によってプラグに付着していることを示した。低塩濃度（例えば、０．２８Ｍ  ＮａＣｌ）では、溶出時間約８分で小さな高分子量ピークが現れ（ブランク溶出では認められない）、おそらく一部のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの凝集が起こっていることを示すと思われた。この現象は高塩濃度（例えば、０．５６Ｍ  ＮａＣｌ）では認められない。
【０２１４】
ＳＥＣプロファイル中のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの積分により、２相の生体適合性基質から溶出した増殖因子の定量のためのベースが得られた。試料セットがアッセイ（Ｒ2＝１．
０）の校正に使われる前後で、異なる濃度のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの６種類の基準セットから得た検量線をＳＥＣに適用した。図５ＡのデータからＰＤＧＦの回収は溶出緩衝液中の塩化ナトリウムの濃度に依存したことがわかる。
【０２１５】
プラグから溶出したｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＨＰＬＣ）プロファイルは、それの二相性生体適合性マトリクスとの相互作用により生じた増殖因子の変性した構造に対して、いかなる変化／修飾も無かったことを示した。溶出緩衝液中に塩が存在しない場合は二相性生体適合性マトリクスからのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの溶出がなかったことも確認された。
【０２１６】
プレートにコートした受容体を使ったＥＬＩＳＡアッセイにより、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの受容体への結合効率を評価した。図５Ｂは、８つの異なる濃度のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで得られた結合曲線について、大きな変化は認められなかったことを示している。関連した解離定数を表９に示す。
【表９】
2012519556.tif 000011
【０２１７】
これらの実験結果によると、ＲＩＶＥＲＳＩＤＥ（登録商標）プラグからのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの溶出は塩依存性である。低塩濃度では、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは溶出後凝集物を形成する可能性がある。さらに、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの変性した構造に変化（酸化、開裂、または他の化学的修飾）は認められなかった。結局のところ、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは二相性生体適合性マトリクスとの相互作用の影響をほとんど受けない。
【０２１８】
実施例５
二相性生体適合性マトリクスおよびｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを使った骨軟骨欠損治療調査
Ａ．調査Ｉ
この調査には、３つの群のボーア交配種去勢雄ヤギが含まれる。第一群（群１）は、二相性生体適合性マトリクスプラグ（コンドロミメティック（Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃｓ））だけを与えた６〜８匹のヤギで構成される。また、第２の群（群２）および第３群（群３）も、６〜８匹のヤギからなり、二相性生体適合性マトリクスプラグに含まれる２種類
８のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの濃度（０．３ｍｇ／ｍＬまたは１．０ｍｇ／ｍＬ）のうちの一種類をそれぞれに割り付けた。調査開始日に、全てのヤギの左右両方の大腿内側にグレード３の顆状突起内の欠損（直径８〜１０ｍｍ、深さ６〜８ｍｍ）を導入した。群２と３に対しては、二相性生体適合性マトリクスプラグを１つの顆状突起の欠損に埋入した。欠損は、顆状突起を貫通して顆状突起に隣接する（あるいは、その下層の硬骨）硬骨に達する孔である。そのため、その孔は、顆状突起中の孔、顆状突起に隣接した硬骨、および顆状突起に隣接した顆状突起と硬骨間の界面も含む。同じ動物の反対側の欠損を二相性生体適合性マトリクスプラグおよび酢酸ナトリウム緩衝液で治療した。あるいは、二相性生体適合性マトリクスプラグを、群２と群３の同じ動物の両方の顆状突起中の欠損に埋入した。ヤギは２週間、１２週間、または２６週間維持し、その時間時点で安楽死させて、埋入した領域を、組織学的調査、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）、肉眼による評価、写真記録、滑液検査（時間ゼロおよび嚢中で）、機械剛性試験（全て同じ試料で実施）用に試料調製した。
【０２１９】
二相性生体適合性マトリクス中に保持されたＰＤＧＦ溶液を含む組成物で治療された大腿内側顆状突起の関節軟骨中および顆状突起に隣接する硬骨中の欠損により、大腿内側顆状突起およびその下層の硬骨の形成と成長を含む治癒および修復促進が実証されている。
【０２２０】
Ｂ．調査ＩＩ
この調査は、４つの群のボーア交配種去勢雄ヤギが含まれる。第一群（群１）は、関節軟骨のグレード３の欠損を含まず、治療を施さない４匹のヤギから構成される。第２の群（群２）は、関節軟骨のグレード３の欠損を有し、二相性生体適合性マトリクスプラグ（コンドロミメティック（Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃｓ））のみの治療を受けた８匹のヤギからなる。また、第３群（群３）および第４群（群４）は、８匹のヤギからなり、二相性生体適合性マトリクスプラグに含まれる２種類８のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの濃度（０．３ｍｇ／ｍＬまたは１．０ｍｇ／ｍＬ）のうちの一種類をそれぞれに割り付けた。調査開始日に、群２〜４のヤギに、左右両方の大腿内側顆状突起および近くの滑車溝内に欠損（直径８〜１０ｍｍ）を導入した。群２〜４に対しては、二相性生体適合性マトリクスプラグを１つの顆状突起および滑車溝中の欠損に埋入した。欠損は、軟骨を貫通して硬骨に達する孔であるため、プラグをその欠損中に置くことが可能である。その孔は、大腿内側顆状突起中の孔または近くの滑車溝中の孔、大腿内側顆状突起または近くの滑車溝に隣接した硬骨、および顆状突起に隣接した顆状突起または近くの滑車溝と大腿内側顆状突起または近くの滑車溝に隣接した硬骨間の界面、も含む。同じ動物の反対側の欠損を二相性生体適合性マトリクスプラグおよび酢酸ナトリウム緩衝液で治療した。あるいは、二相性生体適合性マトリクスプラグを、群２〜４の同じ動物の両方の顆状突起中または近くの滑車溝中の欠損に埋入した。ヤギは２５週間、５２週間維持し、その時間時点で安楽死させて、埋入した領域を、組織学的調査、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）、肉眼による評価、写真記録、滑液検査（時間ゼロおよび嚢中で）、機械剛性試験（全て同じ試料で実施）用に試料調製した。
【０２２１】
二相性生体適合性マトリクス中のＰＤＧＦ溶液を含む組成物で治療された大腿内側顆状突起または近くの滑車溝の関節軟骨の欠損および大腿内側顆状突起または近くの滑車溝に隣接する硬骨の欠損により、大腿内側顆状突起または近くの滑車溝およびその下層の硬骨の形成と成長を含む治癒および修復促進が実証されている。
【０２２２】
実施例６
インビトロ細胞適合性調査：二相性生体適合性マトリクスディスクへの細胞播種
２相基質ディスクに、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ不含２０μＬの完全成長培地中で、ヒト骨髄間質（ｈＭＳＣ）細胞を５ｘ１０4ｈＭＳＣ細胞播種した。または２相基質ディスクに、ｒ
ｈＰＤＧＦ−ＢＢ（５０ｎｇ／ｍＬ）を加えた場合と加えない場合の２０μＬの飢餓培地（０．３％ＦＢＳ）中で、１ｘ１０4ｈＭＳＣ細胞を播種した。２相基質ディスクを、３
７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターで４８時間インキュベートした後、発光細胞生存率
アッセイ（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ）、組織観察、および走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察（図６）を行うため取り外した。
【０２２３】
２相基質ディスクのＳＥＭ像により足場材料の２重層状構造が明らかになった（図７Ａ〜７Ｆ）。２相基質ディスクの下部相は、カルシウムリン酸塩コーティングを施した交差した、細胞の無い繊維（図７Ａおよび７Ｂ）またはｈＭＳＣ細胞を伴った繊維（図７Ｃ）から構成される。上部層平行繊維部には、細胞の無い部分（図７Ｄおよび７Ｅ）、またはｈＭＣ細胞のある部分（図７Ｆ）が認められた。組織学データにより基質全体に分布した細胞の存在が確認された。
【０２２４】
発光細胞生存率ＡＴＰアッセイのために、２日目の時点でｈＭＳＣ播種２相基質ディスクを単独で、またはｒｈＰＤＧＦ−ＢＢと一緒に細胞懸濁液に加えた。２相の基質ディスクの上下両相にｈＭＳＣ細胞が直ちに付着していることが観察された。発光信号は存在するＡＴＰの量に比例し、残存する生存細胞の数に直接比例した。このアッセイでは、上下両相のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療と対照群の間で統計的有意差（Ｐ＜０．０５）があることが示された（図８）。２相基質ディスクの上下両相に関し、培地のみの細胞に比較してｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療の細胞数が２日間で大きく増加した。
【０２２５】
実施例７
ヤギのモデルの骨軟骨欠損修復のために二相性生体適合性マトリクスと組み合わせたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの評価
この調査の目的は、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢと組み合わせた二相性生体適合性マトリクスプラグ／インプラント（例えば、コンドロミメティック（Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃｓ））を使って骨軟骨欠損修復強化の影響を測定することであった。
【０２２６】
材料と方法
次の材料を使用した：１）１．０ｍｇ／ｍＬｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０（ロット／バッチ(：ＱＣＰＤＧＦ−０９０２０９−１．０）中溶
液；２）０．１５ｍｇ／ｍＬ（±１０％）ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０ロット／バッチ(：ＱＣＰＤＧＦ−０９０２０９−０．１５）中溶液
；および３）コンドロミメティックインプラント（ＯｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃｓＬｔｄ、ケンブリッジ、英国）、多孔性コラーゲンインプラント、８．５ｍｍ直径ｘ８ｍｍ高さ（ロット／バッチ(：ＣＭ０１９、使用期限：０２／２０１０））、および４）２０ｍＭ酢
酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０＋／−０．５（ロット／バッチ(：ＱＣＡＢ０４０７０
９）。
【０２２７】
０．１５および１．０ｍｇ／ｍＬの濃度のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの保留および回収した試料について、ＵＶで濃度を、またｒｐＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）で安定性を試験した。全回収試料は、保留試料に匹敵する濃度と安定性プロファイルを有していた。
【０２２８】
この調査では、総計３２匹の骨格成熟去勢雄のボーア交配種ヌビアンヤギを使った。これらのヤギは、認可された米国農務省ソース（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｍｏｒｒｉｓ、Ｉｎｃ．）から得た。全動物は、調査開始時３〜４才であった。大きな後膝関節寸法、取扱の容易さ、および他の軟骨修復調査に使用の理由でこのヤギを選択した。Ｓｈａｈｇａｌｄｉ
ＢＦ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ、７３（１）：５７−６４（１９９１）を参照。
【０２２９】
調査計画
この調査は、用量範囲決定と有効性調査として計画され、５つの外科的群を含む。すなわ
ち、軟骨欠損に対し治療をしない対照群、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（緩衝液）で飽和したコンドロミメティックＩ型コラーゲンインプラントを含む対照群、０．０３０ｍｇ／ｍＬ
ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの緩衝液中溶液の０．５ｃｃで飽和したコンドロミメティックＩ型コラーゲンインプラントを含む実験群、０．１５ｍｇ／ｍＬ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの緩衝液中溶液の０．５ｃｃで飽和したコンドロミメティックＩ型コラーゲンインプラントを含む実験群、および１．０ｍｇ／ｍＬ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの緩衝液中溶液の０．５ｃｃで飽和したコンドロミメティックＩ型コラーゲンインプラントを含む実験群である。これらの群の動物への割り付けを下の表１０に示す。
【表１０】
2012519556.tif 000012
【０２３０】
表１１に記載したように治療をエクセルの乱数発生器を使って無作為化した。
【表１１】
2012519556.tif 000013
【０２３１】
外科的プロトコル
１）動物麻酔と手術準備
１つの（１）右大腿内側顆状突起中に骨軟骨欠損を導入した。基本的な外科手術は全動物に対し同じとした。全手術は厳密な無菌状態下で行った。全動物で手術１２時間前に食物と水を断った。
【０２３２】
ジアゼパム０．２２ｍｇ／ｋｇとケタミン１０ｍｇ／ｋｇのＩＶ注入により全身麻酔を誘導した。カフ付き気管内チューブを入れて、再呼吸システムで送達されるイソフルラン０．５〜５％により全身麻酔を維持した。手術直前に尾部に５０μｇフェンタニールパッチ１個を適用し、約７２時間の術後痛に対処した。キシラジンを使って痛みの激しい術後時間の鎮痛を支援した。各膝の身体検査をして、関節引出し可動域（関節角度計）、スウェリング、温度、捻髪音、膝蓋骨追従、および外反／内反を調べた。各動物の身体検査記録は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓから手術時間に提供された。
【０２３３】
次に、動物を手術室に移動し、背臥位にした。気管内チューブを麻酔機械に取り付けて、酸素、室内空気およびイソフルランを送り込んだ。手術領域を剪毛して準備した。クロルヘキシジン洗剤による標準的手術時手洗い、続いて７０％アルコール洗浄、ベタダインの塗布による洗浄を行った。各動物は、予防のため、手術前後に抗生物質の投与を受けることになっている。イソフルラン（動物により０．５〜５．０％の範囲）および酸素（１．５Ｌ／分）を使った吸入麻酔により、麻酔の外科平面の維持を行った。動物が麻酔をかけられている間、心拍数、呼吸数および粘膜を少なくとも１５分毎にモニターした。
【０２３４】
２）血液収集
手術前および死体解剖前の健康状態選別用の血液収集に加えて、追加の１つの血液チューブを手術の日と安楽死の日にクロットチューブに集め、血清を集めて少なくとも血清の２ｍＬを、調査番号、動物番号、および収集日付のラベルのついたクライオバイアル中にいれ、−７０〜−８０℃で保存した。
【０２３５】
３）関節液収集
全動物に対して、手術時間中に関節液の色と粘度の目視評価を記録した。採取可能な十分な量がある場合は、関節液試料を集め、調査番号、動物番号、収集者のイニシャル、および収集日付を記したラベルを貼ったクライオバイアル中に入れ、−７０〜−８０℃で保存した。
【０２３６】
死体解剖の時間に、関節液の色と粘度の目視評価を記録した。全動物に対して、関節液の色と粘度の目視評価を記録した。採取可能な十分な量がある場合は、５００μＬまでの関節液試料を採取し、調査番号、動物番号、および収集日付のラベルを貼ったクリオバイアルにいれ、−７０〜−８０℃で保存した。
【０２３７】
４）外科移植
この手術法は、遠位の右大腿の１／３から脛骨プラトーのレベルまでの、脛骨脊椎を横切った曲線状側部皮膚切開で構成された。この方法を使って、皮膚を明確に切開し、口を開いて後膝関節への外側膝蓋骨経由アプローチを可能とした。膝蓋骨と膝蓋靭帯の外側境界に平衡に切開を行った。これを大腿筋膜の外側から大腿二頭筋の頭蓋境界に沿って後膝関節の外側筋膜へと拡張した。大腿二頭筋および付随の外側筋膜を後退させ、切開を関節襄まで到達可能とした。関節を拡張し、膝蓋骨をはずして内部の後膝関節を曝した。
【０２３８】
膝関節を自由に曲がるようにして、脂肪パッドを焼灼法により部分的に切開して、大腿内側顆状突起を見えるようにした。大腿内側顆状突起用の穿孔点を、顆状突起溝接合部の
１９ｍｍ遠位で滑車溝の内側陵に整列した位置と確定した。提供された手術器具を使って、直径８ｍｍＸ深さ８ｍｍの骨軟骨欠損を導入した。欠損部を大量の無菌食塩水で洗い流した。いずれの試験物質を置く前にも、関節の残存部分を注意深く洗い流し、関節を紙で吸い取り乾燥した。
【０２３９】
大腿内側顆状突起欠損を、未充填のまま（群１）、または、対照の２０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（群２）もしくは３種類の用量のうちの１つのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（群３〜５）で飽和させたコンドロミメティックインプラントを埋入した。
【０２４０】
次に膝蓋骨を元の位置に戻した。次いで１Ｖｉｃｒｙｌ縫合材料とサージカルスキンステープラーを使って３層になっている関節のルーチン的閉創を行った。外科的切開の閉創後、改良トーマス副木を脚に適用し体重負荷と運動を制限した。ガラス繊維ギプスおよび副木を術後１４日間継続した。副木除去に際し、動物に、ジアゼパム０．２２ｍｇ／ｋｇおよびケタミン１０ｍｇ／ｋｇのＩＶ注入を行い、短期間の全身麻酔を誘導した。麻酔の間に、副木を取り外した。脚は、全関節可動域の全領域では動かなかった。
【０２４１】
各動物の試験片または対照片移植後の各手術位置のデジタル写真を撮った。動物番号および日付をデジタル写真に含めた。
【０２４２】
５）材料調製
２相基質インプラント／ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ：移植の前に、３種類の用量の内の１つのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（０．０３０ｍｇ／ｍＬ、０．１５ｍｇ／ｍＬ、または１．０ｍｇ／ｍＬｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの緩衝液中溶液）または２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を、２相コラーゲンインプラントと組み合わせた。これは、ステンレス鋼ボウル中で前述の適切な試験物質の０．５ｃｃを無菌のコラーゲンインプラントに添加することにより達成した。水和コラーゲンインプラントを室温で５〜１５分間置き、次に、外科用鉗子で静かに欠損位置に移した。過剰のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液は全てシリンジで吸い出し欠損部位に絞り出した。
【０２４３】
生存中の観察および測定
手術後の不快感の兆しのあるどの動物に対しても少なくとも毎日２回の手術後チェックを行った。動物に不快感による苦悩の兆しが少しでもあるようなら、追加の手術後鎮痛薬を与えた。全ての処置は適切な調査ドキュメンテーションに記録された。安楽死のときまで、毎日の臨床的観察を行い、各動物について記録を取った。ルーチン臨床観察の一環として全動物に対し術後チェックを行った。
【０２４４】
手術に先立ち（０日目）、および調査の後で（１２±０．５週目）全動物の体重測定を行った。摂食量は定性的とした。動物を毎日モニターし、食欲の度合いを記録した。
【０２４５】
死体解剖
動物は術後８４±３日目（１２週目）人道的に屠殺された。屠殺直前に体重を記録した。ジアゼパム０．２２ｍｇ／ｋｇとケタミン１０ｍｇ／ｋｇのＩＶ注入により全身麻酔を誘導した。この後、心拍停止が確認されるまで、麻酔下の動物に濃塩化カリウム（ＫＣｌ）ＩＶ過量投与を行った。
【０２４６】
安楽死のとき、各動物から血液を採取した。引き出し、関節可動域（関節角度計）、スウェリング、温度、捻髪音、膝蓋骨トラッキング、および外反／内反に関して、各膝を身体検査した。死体解剖の時点での各動物の身体検査記録は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓから提供された。
【０２４７】
後膝関節を目視評価し、関節液色と粘度の目視評価を行い、表１２に記載のように試料を収集した。関節を開いて、写真を撮り、骨軟骨欠損位置の表面を表１３に示したようにスコアリングした。欠損位置の反対側の関節表面についてなんらかの異常関節表面がないか調べた。
【０２４８】
対照および手術した膝関節に対し目視評価を行った。目視評価には、元々の軟骨との関連での新生修復組織のエッジの一体化に対するスコアリング、修復表面のなめらかさ、充填度、および修復組織の色が含まれた。
【０２４９】
膝窩リンパ節および滑膜を、リンパ節腫脹と炎症がないかそれぞれ調べた。
【表１２】
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【表１３】
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【０２５０】
組織分析
目視評価の直後、左および右膝窩リンパ節と一緒に、試料を１０％リン酸塩で緩衝化した
ホルマリン（少なくとも１０倍容積）中に置いた。ホルマリンで固定した試料を目視でトリミングして余分な組織を除去した。膝窩リンパ節を当業者には既知の標準的組織学的手法を使い処理し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。これらの柔組織を、炎症、線維形成、または他の変化の観点から下記の分類システムにより等級に分けた：
０＝変化なし
１＝微少変化
２＝軽度の変化
３＝中程度の変化
４＝顕著な変化
【０２５１】
次に完全に脱灰されるまで、１０％ＥＤＴＡまたはギ酸で大腿骨試料を脱灰した。脱灰前に密着Ｘ線写真を撮って試料の完全脱灰を確認した。完全脱灰の後に、一連の濃度増加エタノール置換により試料を脱水した。必要ならキシレンまたは他の適切な化学交換を行い試料中の過剰の脂肪を除去し試料への浸透を改善して、試料をパラフィン包埋した。４つの５〜１０μｍ厚さの切片を作成した。その内の１つの切片をヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。２つ目の切片をサフラニンＯで染色し、ファストグリーンで対比染色した。３番目と４番目の切片を作成したが、これらは、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲン検出用免疫組織化学染色を行う。追加の２つのスライドも作成し非染色で残した。
【０２５２】
関節液評価
関節液の色と粘度の目視評価を記録した。関節液試料を各膝関節から取り出した。関節液をラベル付けしたクリオバイアルに入れ−７０〜−８０℃で保存した。
【０２５３】
マイクロＣＴ分析
ｍｉｃｒｏＣＴ８０システム（ＳＣＡＮＣＯ  ＵＳＡ、サウスイースタン、ペンシルベニア州）とメーカーの分析ソフトウェアを使ってマイクロＣＴを走査し、分析を行った。マイクロＣＴ分析の評価項目には、肋軟骨下ゾーン全体の骨充填および中心窩洞の骨体積／全体積（ＢＶ／ＴＶ）の評価が含まれる。
【０２５４】
各特性スコアおよび全体スコアに基づいて骨軟骨欠損部位の目視形態評価を各治療群毎にまとめた。ノンパラメトリック検定を使ってｐ≦０．０５の有意水準でのデータ適合に関して治療群間の比較を行った。組織変化スコアも同様に評価した。
【０２５５】
結果
目視剖検
屠殺まで動物を毎日２回観察した。全動物を術後２週間で屠殺し、マイクロＣＴと組織分析用試料を採取した。
【０２５６】
特に断りのない限り、全動物は、欠損部位で中程度の治癒を示した：
３３７９は、欠損の充填が不完全であった。
３７４３は、欠損内に明白な血斑あり、治癒部位は平坦でなく周囲に軟骨が存在した。
３７４３は、欠損部に血斑、右後膝関節に窩の血管新生、右と左膝蓋大腿部溝に欠損、が観察された。
３３８２は、欠損内に明白な血斑があった。
３３８８は、明白な血斑、暗い組織色、および欠損部位内の修復組織の不規則表面、が観察された。
３７３３は、明白な血斑、および内側顆状突起（欠損位置に対して内側）に少量の骨増殖体、が観察された。
３３８３は、明白な血斑、欠損部位に良好な治癒、および右後膝関節の後方内側顆状突起
に石灰沈着、が観察された。
３３７５は、欠損部の低充填、ごくわずかの軟組織形成、修復組織の鈍く暗い外観、欠損部位で崩壊、右後膝関節の内側および外側顆状突起に骨増殖体形成、左後膝関節の外側顆状突起に小さい骨増殖体形成、および右後膝関節の脂肪パッドに線維形成、が観察された。
３３８７は、不規則欠陥表面が観察された。
３７２８は、欠損部位の低充填、極わずかの表面軟組織形成（色は鈍く暗い）、左と右の両後膝関節の内側顆状突起の後方側面（欠損から約２０ｍｍ）上の局所的欠損、および右と左の両後膝関節の膝蓋大腿部溝中の軟骨傷害、が観察された。
３７３５は、明白な血斑、治癒部位のわずかな窪み、および近くの右後膝関節内側脛骨の内側側面に骨増殖体形成、が観察された。
３７４６は、修復組織中の明白な血斑、および欠損内側および外側に少々の骨増殖体形成、が観察された。
３７４９は、修復組織中の明白な血斑、膝蓋溝上の骨増殖体形成、左後膝関節の顆状突起および膝蓋大腿部溝、および右後膝関節脂肪パッド中の充血、が観察された。
３３９３は、修復組織中の明白な血斑が観察された。
３７３７は、修復組織中の明白な血斑、修復組織中の窪み、および欠損内側の小さい骨増殖体形成、が観察された。
３７３１は、修復組織中に明白な血斑、修復組織表面のわずかの窪み、および欠損近傍の軟骨表面の多少の粗さ、が観察された。
３３８４は、良好な治癒、軟骨表面を伴った修復組織の平坦さ、および修復組織中の明白な血斑、が観察された。
３７４２は、欠損部の低充填、極わずかの軟組織形成（外観は鈍く暗い色）、が観察された。
３３７６は、修復組織中に明白な血斑が観察された。
３７４７は、修復組織中に明白な血斑、欠損の良好な治癒、欠損直径の３〜４ｍｍへの減少、および右後膝関節大腿内側顆状突起の内側および外側の側面に小さな骨増殖体形成、が観察された。
３７４８は、修復組織中に明白な血斑、周辺軟骨に比べ治癒部位に窪み、右後膝関節関節液の濁り、右後膝関節の弛緩（前十字靱帯が伸びているが断裂していない状態）、右後膝関節の脂肪パッドに充血、左後膝関節の関節液の透明さ、および内側顆状突起もしくは右と左後膝関節の脛骨プラトーの近傍側面上の軟骨摩耗、が観察された。
３７３４は、修復組織中に大きな明白な血斑、修復部位にわずかな窪み、および右後膝関節の大腿内側顆状突起の外側の側面上に小さな骨増殖体形成、が観察された。
３７３２は、修復組織中に明白な血斑、および周辺軟骨に比べ修復部位がわずかに窪み、が観察された。
３３９０は、修復組織中に大きな明白な血斑が観察された。
３７３９は、修復組織中に明白な血斑、および修復組織の不規則表面、が観察された。
３７３８は、修復組織中に明白な血斑、欠損部位の平滑さ（縁の欠陥あり）、欠損部位の内側および外側の骨増殖体形成、および右後膝関節の内側のメニスカスに明白な血管変化、が観察された。
３７３６は、修復組織中に明白な血斑が観察された。
３７３０は、修復組織中に明白な血斑が観察され、修復組織は平滑で周辺に軟骨表面があった。
３７４５は、極わずかな表面の軟組織形成が観察され、硬骨崩壊はなく、および欠損内の修復組織はピンク色であった。
３３８９は、不規則表面の修復組織が観察された。
３３８０は、欠損部位の低充填、極わずかな軟組織形成（鈍く暗い外観色）、欠損部位の修復部の崩壊、および右と左の両後膝関節の脂肪パッド中に充血が観察された。
【０２５７】
目視評価
各治療群内の各試料のエリア別最大目視スコアを図９Ａ〜９Ｅに示した。スコアリング基準については、目視形態評価のスコアリング基準（表１３）を参照されたい。グラフパッドプリズム５によりチューキーポストホック検定と一元配置分散分析を行い治療群が定量値に与える影響を測定した。優位性はｐ＜０．０５で決定した。
【０２５８】
欠損未充填治療群に比べ、５００μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、７５μ  ｇｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、または１５μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群でエリア別最大目視スコアが有意に増加した（図１０）。さらに、５００μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群が１５μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢおよび０μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群に比較して面積による最大目視スコアが有意に増加した。
【０２５９】
マイクロＣＴ
動物を人道的に安楽死させ、手術した（右）後膝関節を採取し、マイクロＣＴ分析のため１０％中性緩衝ホルマリン中に入れた。手術した後膝関節に加えて、手術していない、反対側の（左）後膝関節もマイクロＣＴ分析用に採取した。マイクロＣＴについては、実施例８に記載されている。
【０２６０】
動物を人道的に安楽死させ、手術した後膝関節を採取し、マイクロＣＴ分析のため１０％中性緩衝ホルマリン中に入れた。マイクロＣＴ分析に続いて、全試料の１０％中性緩衝ホルマリンを入れ替えて新しくし、組織調査用準備が完了した。全試料を処理しパラフィン包埋して、非脱灰組織分析用とした。脱灰組織観察用に冠状側面を処理し、パラフィン包埋した。試料を固定、脱灰、脱水、清浄化、含浸を行い、パラフィン組織観察技術と装置を使って包埋した。６つの切片を３〜５μｍステップで採取し：２つの非染色切片は試験せず、２つの切片は、Ｉ型とＩＩ型コラーゲンのＩＨＣ（免疫組織化学的）分析用に調製し、１つの切片は、サフラニンＯとファストグリーンで染色し、また最後の切片はＨ＆Ｅで染色した。両染色切片とＩＨＣ用調製切片は病理組織学的調査用の準備を完了した。
【表１４】
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【０２６１】
全脱灰組織切片を改良Ｓｅｌｌｅｒｓスコアリングシステムに従い等級付けした。評価項目には、支配的な組織特性、構造的特性、変性による細胞変化がないこと、変性による隣接軟骨組織の変化のないこと、軟骨下骨の再構成、およびサフラニンＯ染色の強度が含まれる。切片は、最初、相互比較により全体治癒状況を査定、評価され、治癒スコアが与えられる。軟骨と骨修復の組織スコアリングの尺度を下の表１５に挙げた。
【表１５】
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【０２６２】
結果は次のようになる：１）全治療群で最小の炎症反応；２）０μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群または欠損未充填治療群に比較して、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群で組織修復合
計スコアの用量依存的増加；３）０μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群または欠損未充填治療群に比較して、ＰＤＧＦ治療群で軟骨下骨の再構成の用量依存的増加；４）０μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群または欠損未充填治療群に比較して、ＰＤＧＦ治療群で欠損空隙内の発生期の骨梁の数および／または骨梁幅の用量依存的増加；５）欠損空隙でのブリッジングが認められる５００μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群に属する多くの試料を除いて、主に欠損部の底部およびエッジに局在化した新規に形成された骨梁；６）欠損の不完全充填、および／または欠損未充填治療群で欠損中への周辺の元の軟骨の崩壊；７）０μｇ
ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群または欠損未充填治療群に比較して、ＰＤＧＦ治療群で修復組織の隣接する元の軟骨との用量依存的統合；８）全治療群で、主に線維軟骨からなる修復組織；９）欠損未充填治療群を除く全治療群について、欠損の軟骨ゾーンの中央部でヒアリン様軟骨の存在。これは、ＩＩ型コラーゲンのための免疫組織化学染色の陽性により示され、またサフラニンＯ染色により測定されたグリコサミノグリカン含量により示された。；および１０）コラーゲンインプラント含有全治療群で、欠損空隙内の少量の残留コラーゲンインプラント。
【０２６３】
さらに、定量的組織形態計測的分析を行い欠損充填組織を評価した。修復組織の全面積および存在する具体的組織（ガラス軟骨、線維軟骨、線維組織、骨組織）の割合を評価した。結果は次の事項を含む：１）０μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群または欠損未充填治療群に比較して、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群で、石灰化組織（新硬骨）による肋軟骨下空隙の再構成割合の増加；２）０μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群または欠損未充填治療群に比較して、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群で、全組織による欠損に対する全充填の用量依存的増加；３）０μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群または欠損未充填治療群に比較して、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群で、欠損空隙の軟骨領域内のヒアリン様軟骨割合の用量依存的増加；４）０μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群または欠損未充填治療群に比較して、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群で、欠損空隙の軟骨領域内の線維軟骨割合の用量依存的増加；５）欠損未充填治療群に比較して、コラーゲンインプラントを含む全治療群（０、１５、７５、５００μｇｒ  ｈＰＤＧＦ−ＢＢ）で、元の軟骨組織の欠損空隙内への崩壊の減少。
【０２６４】
実施例８
ヤギモデルにおける骨軟骨欠損修復のための軟骨下骨再構成のマイクロＣＴ評価
調査の目的は、骨軟骨欠損モデルにおけるヤギの大腿顆状突起の軟骨下骨修復角度を評価することであった。定量的因子（例えば、骨体積、骨梁幅、等）を測定し形成された硬骨の量と質を評価した。この調査で用いた治療群は実施例７のものと同じであった。
【０２６５】
材料と方法
大腿内側顆状突起用マイクロＣＴ走査手順
各大腿内側顆状突起を５１．２ｍｍの褐色樹脂試料ホルダーに入れ装填した。各顆状突起を気泡ゴムで固く包み試料ホルダー中で安定化させた。包んだ顆状突起を試料チューブに挿入し欠損側を上に向け、チューブの長軸と平行にした。顆状突起の安定性をチューブ内の回転と横方向の移動によりチェックした。装填と各顆状突起の安定性チェック後、１０％中性緩衝化ホルマリンを添加し試料を完全に浸漬したが、チューブの先端に２〜３ｍｍの空気層を残した。試料チューブをプラスチックチューブキャップでシールした。マイクロＣＴ中で、シールした試料チューブの方向マーカーをユーザー側に向けた。
【０２６６】
これで顆状突起の走査が可能となり、次に評価ソフトウェア立ち上げた。顆状突起全体の外表面を厳密に近似した反時計方向の動きで手描きして関心領域の試料スライスを描画した。
【０２６７】
次に、試料の定量分析を行った。元の欠損の輪郭全体を描く１回目の全スライスからはじめて、顆状突起領域の５６０スライスに対し、２５０スライス（６．２５ｍｍ深さ）ま
たは３００スライス（７．５ｍｍ深さ）を描画した。再構築した欠損部位を、各分析に対し次の寸法の環状輪郭を描画して輪郭に合わせた：元の欠損の中心管を中心として、１６０ピクセルｘ１６０ピクセル（０．１２６６ｃｍ2、４ｍｍ径）、２４０ピクセルｘ２４
０ピクセル（０．２８４２ｃｍ2、６ｍｍ径）、３２０ピクセルｘ３２０ピクセル（０．
５０４６ｃｍ2、８ｍｍ径）、４００ピクセルｘ４００ピクセル（０．７８５ｃｍ2、１０ｍｍ径）。
【０２６８】
チューキーポストホック検定と一元配置分散分析をグラフパッドプリズム５を使って実行し、治療群の定量測定値に与える影響を求めた。優位性はｐ＜０．０５で決定した。
【０２６９】
結果
全体積、骨体積、材料平均密度、連結密度、骨梁数、骨梁肉厚、および骨梁間隔の定量的測定値を、Ｓｃａｎｃｏ  ｍｉｃｒｏＣＴ８０  ｍａｃｈｉｎｅ（サウスイースタン、ペンシルベニア州）の分析プログラムを使って評価した。治療群と群当たりの動物の数は実施例７と同じで、表１６に概要を示した。定量分析を多重分析基準を使って元の欠損の中心管上で行った。この基準には、直径８ｍｍＸ深さ６．２５ｍｍのシリンダー、直径６ｍｍＸ深さ６．２５ｍｍのシリンダー、直径４ｍｍＸ深さ６．２５ｍｍのシリンダー、直径８ｍｍＸ深さ７．５ｍｍのシリンダー、および直径１０ｍｍＸ深さ６．２５ｍｍのシリンダーが含まれる。各分析基準では、全容積（輪郭に合わせたシリンダーの容積）を一定に保持した。連結密度または骨梁間隔に有意差は観察されなかった。全分析基準に対し、治療群間の骨体積に有意差は認められなかったが、５００μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群７試料のうち４試料に欠損空隙の全幅に架かる実質的な骨ブリッジングが認められた。このタイプのブリッジングは、残りの治療群では観察されなかった。厚さ８ｍｍＸ深さ６．２５ｍｍ輪郭に対し、５００μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで治療した試料の骨梁数（図１０Ａ）は０μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群に比較して、有意に増加した。直径８ｍｍＸ深さ７．５ｍｍ輪郭に対し、０μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、１５μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、および欠損未充填治療群に比較して、５００μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群で骨梁数（図１０Ｃ）は、有意に増加した。厚さ４ｍｍＸ深さ６．２５ｍｍ輪郭に対し、０μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群に比較して、７５μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで治療した試料で、骨梁幅（図１０Ｄ）が、有意に増加した。また、０μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、７５μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、および５００μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（直径１０ｍｍＸ深さ６．２５ｍｍ輪郭）および０μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、１５μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、および７５μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群（直径８ｍｍＸ深さ７．５ｍｍ輪郭）に比較して、欠損未充填治療群で骨梁幅が有意に増加した。
【表１６】
2012519556.tif 000018
【０２７０】
結論
数点の分析により、残りの治療群に比較して、欠損未充填治療群で骨梁幅の有意な増加が明らかになった。この差は、欠損未充填治療群において、周囲にある内在性硬骨の欠損空隙への崩壊に起因する。この場合、欠損プロファイルの崩壊のない残りの治療群での新生硬骨に比較して内在性硬骨が輪郭内で見つかっている。多重輪郭解析により、他の治療群に比較して、５００μｇ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療群で認められた有意な骨梁数の増加、および、１２週目の早い時点での骨ブリッジングの促進の存在は、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが骨新形成に対し有意な影響を与えることを示しているものと考えられる。この軟骨下骨再構成促進は、修復促進を生じ、コラーゲン基質と組み合わせた場合、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが骨軟骨欠損修復治療に有望である可能性があることを示唆している。
【０２７１】
実施例９
膝骨軟骨欠損の外科的修復を目的とした二相性生体適合性マトリクスとｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの使用に関する安全性評価のためのパイロットヒト臨床試験
この調査の主目的は、高荷重負荷と低荷重負荷膝骨軟骨欠損の治療のために、ｈＰＤＧＦ−ＢＢおよび二相性生体適合性マトリクス（例えば、コンドロミメティック（Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃｓ））の安全性を確認し、性能調査を行うことである。この調査の２つ目の目的は、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢと二相性生体適合性マトリクスの移植に対する外科手術および臨床成績の測定値（ＩＣＲＳ−国際軟骨修復学会フォーラム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｆｏｒｍ）、ＶＡＳ−視覚的アナログスケール（Ｖｉｓｕａｌ  Ａｎａｌｏｇｕｅ  Ｓｃａｌｅ）、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ  Ｒａｔｉｎｇ、ＫＯＯＳ−膝関節損傷と変形性関節症転帰スコア（Ｋｎｅｅ  Ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｏｕｔｃｏｍｅ  Ｓｃｏｒｅ））を評価することである。
【０２７２】
この調査は３臨床センターで行われた。各臨床センターでの調査には、３つの適格被験者群が含まれる。適格患者（ヒト）は表１７の選択基準を満たす。１番目の群（群１（対
照））は、外傷（例えば、スポーツ損傷）による硬骨および／または軟骨欠損がなく、または早期骨軟骨欠損がなく、また、治療を受けていない６人の適格被験者から構成される。また、対照群は、当業者には既知の、過去の対照データや既報論文をベースにしても良い。２含目の群（群２）は、最小侵襲手技か、解放手術による外科治療が必要な、少なくとも１つの膝骨軟骨欠損（＜１２ｍｍ）を有する７人の適格被験者からなる。この群は、適格被験者１人当たり最大で６欠損とし、１欠損当たり二相性生体適合性マトリクスプラグ（例えば、コンドロミメティック（Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃｓ））および５００μｇ
ｒｈＰＤＧＦ（０．５ｃｃ  １．０ｍｇ／ｍＬ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）を膝の低加重負荷領域中へ挿入された。３番目の群（群３）は、最小侵襲手技か、解放手術による外科治療が必要な、少なくとも１つの膝骨軟骨欠損（＜１２ｍｍ）を有する７人の適格被験者からなる。この群は、１欠損当たり二相性生体適合性マトリクスプラグ（例えば、コンドロミメティック（Ｏｒｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃｓ））および５００μｇ  ｒｈＰＤＧＦ（０．５ｃｃ  １．０ｍｇ／ｍＬ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）を膝の高加重負荷領域中へ挿入された。
【表１７】
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【０２７３】
手術前１２週前以内に罹患膝のＭＲＩ（磁気共鳴画像法）走査を行う。ＭＲ
Ｉは下記に概説したように行い、独立した放射線科医が評価して埋め戻しの有
効性と有害事象の存在を判定する。治療後の処置毎にフォローアップＭＲＩ走
査を行う：１）術後１２週目（＋／−３日）；および２）術後２４週目（＋／
−３日）。
【０２７４】
被験者は治療前、および４、１２、２４週間隔で任命査定者による機能評価
を受ける。被験者は、４週、１２週および２４週に臨床、ＭＲＩ（１２および
２４週のみ）、ならびに合併症および／または機器関連有害事象および同時薬
剤使用について評価を受ける。
【０２７５】
被験者は、ＩＣＲＳ基準により手術時のみに、ＶＡＳによりベースラインレベルおよび１、３、および６ヶ月時点で、ＫＯＯＳによりベースラインレベルおよび１、３、および６ヶ月時点で、改良Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ  Ｒａｔｉｎｇシステムによりベースラインレベルおよび１、３、および６ヶ月時点で、それぞれ評価される。
【０２７６】
膝の高加重負荷領域の骨軟骨欠損中に外科的に移植されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢと二相性生体適合性マトリクスプラグの両方を挿入されている３群は、ＭＲＩ、ＩＣＲＳ、ＶＡＳ、ＫＯＯＳ、改良Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ  Ｒａｔｉｎｇシステム、および関節鏡検査で測定して、欠損部位での治癒が加速されたと報告されている。
【０２７７】
他に定義されていない限り、本明細書に使われた全ての技術科学用語の意味は、本発明の分野に属する当業者により通常理解される意味を有する。本発明は、記載された特定の方法、手順、および試薬に限定されるものではなく、これらは変化しても良いということは、理解されるべきである。また、当業者なら、本明細書の記載と類似または同等のいずれの方法や材料も、本発明を実施またはテストする目的に使用可能であることを認めるであろう。
【０２７８】
総じて、本明細書に提供された今までの記載は、本明細書の参照により実施されうる本発明の様々な態様や実施形態に対する制限を意味するものではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図１Ｌ】
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【図１Ｍ】
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【図１Ｎ】
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【図１Ｏ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【国際調査報告】
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