(57)【要約】【課題】酵素によらない化学的ライゲーション反応のための方法および組成物を提供する。  【解決手段】  本発明は、試料中に存在する１または複数の核酸標的を検出するための組成物、装置、および方法を提供する。本発明の方法は、互いに近接する形で、標的核酸に可逆的に結合し、かつ、相補的な反応性ライゲーション部分を有する、２つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを用いる工程を含む。このようなプローブが、適正な方向で標的に結合した場合、それらは、自発的な化学的ライゲーション反応を経過し、これにより、オリゴヌクレオチドライゲーション産物をもたらす。一態様では、ライゲーション産物が、特定の標的と相関する可変的な長さである。化学的ライゲーションの後、プローブは、キャピラリー電気泳動またはマイクロアレイ解析により増幅および検出することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列が異なる複数の試料核酸を含む試料中において、本質的に互いに隣接して位置する第１および第２の標的ドメインを含む、少なくとも１つの特定の標的核酸配列の存在を検出する方法であって、
ａ）前記試料核酸を、複数の異なるプローブセットと接触させる工程であって、各プローブセットが、
ｉ． 
１）前記第１の標的ドメインと実質的に相補的な第１のプローブドメインと；
２）前記標的核酸と本質的に非相補的な第１の非相補的領域と；
３）５’側ライゲーション部分と
を含む第１のライゲーションプローブと；
ｉｉ． 
１）前記第２の標的ドメインと実質的に相補的な第２のプローブドメインと；
２）前記標的核酸と本質的に非相補的な第２の非相補的領域と；
３）３’側ライゲーション部分と
を含む第２のライゲーションプローブと
を含み、前記ライゲーションプローブのうちの少なくとも１つが、可変スペーサー配列を含む工程と；
ｂ）前記第１および第２のライゲーションプローブを、リガーゼ酵素の不在下においてライゲーションして、ライゲーション産物を形成させる工程と；
ｃ）前記ライゲーション産物を増幅する工程と；
ｄ）前記ライゲーション産物の存在を検出する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記標的配列が、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的配列が、未精製ＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が、哺乳動物の体に由来し、血液、尿、唾液、および便からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記検出する工程が、キャピラリー電気泳動による、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記検出する工程が、マイクロアレイ解析による、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記検出する工程が、蛍光解析またはリアルタイム蛍光解析による、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記検出する工程が、質量分析による、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のライゲーションプローブ上の前記５’側ライゲーション部分が、ＤＡＢＳＹＬ部分であり、前記第２のライゲーションプローブ上の前記３’側ライゲーション部分が、３’−ホスホロチオエート部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１および第２のライゲーションプローブの各々が、前記ライゲーション産物を増幅するためのユニバーサルプライマー配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記プライマー配列に結合するユニバーサルプライマーのうちの１つが、検出可能な標識を含有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出可能な標識が、蛍光標識、化学発光標識、電気化学標識、および磁気標識からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標識が、フルオレセインおよびその誘導体、ＴＡＭＲＡ（テトラメチル−６−カルボキシローダミン）、Ａｌｅｘａ色素、Ｑｕａｓａｒ色素、ならびにＣｙａｎｉｎｅ色素（例えば、Cy3およびCy5）から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
配列が異なる複数の試料核酸を含む試料中において、本質的に互いに隣接して位置する第１および第２の標的ドメインを含む、少なくとも１つの特定の標的核酸配列の存在を検出する方法であって、
ａ）前記試料核酸を、複数の異なるプローブセットと接触させる工程であって、各プローブセットが、
ｉ）
１）前記第１の標的ドメインと実質的に相補的な第１のプローブドメインと；
２）前記標的核酸と本質的に非相補的な第１の非相補的領域と；
３）５’側ライゲーション部分と
を含む第１のライゲーションプローブと；
ｉｉ）
１）前記第２の標的ドメインと実質的に相補的な第２のプローブドメインと；
２）前記標的核酸と本質的に非相補的な第２の非相補的領域と；
３）３’側ライゲーション部分と
を含む第２のライゲーションプローブと
を含み、前記第１および第２のライゲーションプローブのうちの少なくとも１つが、アンカー配列を含む工程と；
ｂ）前記アンカー配列と実質的に相補的な捕捉プローブを含むマイクロアレイ基板上において、前記ライゲーション産物を捕捉する工程と；
ｃ）前記ライゲーション産物の存在を検出する工程と
を含む方法。
【請求項１５】
前記第１および第２のライゲーションプローブの各々が、前記ライゲーション産物を増幅するためのユニバーサルプライマー配列をさらに含み、前記プライマー配列に結合するユニバーサルプライマーのうちの１つが、検出可能な標識を含有し、前記検出可能な標識が、蛍光標識、電気化学標識、および磁気標識からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
配列が異なる複数の試料核酸を含む試料中において、本質的に互いに隣接して位置する第１および第２の標的ドメイン、ならびに第１のドメインと第２のドメインとの間に位置する第３のドメインを含む、少なくとも１つの特定の標的核酸配列の存在を検出する方法であって、
ｂ）前記試料核酸を、複数の異なるプローブセットと接触させる工程であって、各プローブセットが、
ｉ． 
１）前記第１の標的ドメインと実質的に相補的な第１のプローブドメインと；
２）前記標的核酸と本質的に非相補的な第１の非相補的領域と；
３）５’側ライゲーション部分と
を含む第１のライゲーションプローブと；
ｉｉ． 
１）前記第２の標的ドメインと実質的に相補的な第２のプローブドメインと；
２）前記標的核酸と本質的に非相補的な第２の非相補的領域と；
３）３’側ライゲーション部分と
を含む第２のライゲーションプローブと；
ｉｉｉ． 
１）前記第３の標的ドメインと実質的に相補的な第３のプローブドメインと；
２）３’側および５’側のライゲーション部分と
を含む第３のライゲーションプローブと
を含む工程と；
ｂ）前記第１のライゲーションプローブ、前記第２のライゲーションプローブ、および前記第３のライゲーションプローブを、リガーゼ酵素の不在下においてライゲーションして、ライゲーション産物を形成させる工程と；
ｃ）前記ライゲーション産物を増幅する工程と；
ｃ）前記ライゲーション産物の存在を検出する工程と
を含む方法。
【請求項１７】
前記標的配列が、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記試料が、哺乳動物の体に由来し、血液、尿、唾液、および便からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出する工程が、キャピラリー電気泳動による、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記検出する工程が、マイクロアレイ解析による、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出する工程が、蛍光解析またはリアルタイム蛍光解析による、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出する工程が、質量分析による、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１および第２のライゲーションプローブの各々が、前記ライゲーション産物を増幅するためのユニバーサルプライマー配列をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記プライマー配列に結合するユニバーサルプライマーのうちの１つが、検出可能な標識を含有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記検出可能な標識が、蛍光標識、化学発光標識、電気化学標識、および磁気標識からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記標識が、フルオレセインおよびその誘導体、ＴＡＭＲＡ（テトラメチル−６−カルボキシローダミン）、Ａｌｅｘａ色素、Ｑｕａｓａｒ色素、ならびにＣｙａｎｉｎｅ色素（例えば、Cy3およびCy5）から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
対象の一又は複数の核酸配列を検出するための流体デバイスであって、
ｉ）ウェル注入ポートおよびウェル排出ポートを含む、少なくとも１つの試料操作ウェルと；
ｉｉ）前記試料注入ポートと前記試料操作ウェルとの流体連絡を可能とする第１のマイクロチャネルと；
ｉｉｉ）以下のエレメントの一又は複数：流体制御バルブ、流体圧送機構、温度制御エレメント、検出チャンバーまたは検出チャネル、並びに廃液貯留チャンバーと
を含み、請求項１に記載の方法を自動化するのに用いられるデバイス。
【請求項２８】
キャプラリー電気泳動による検出チャネルを有する、請求項２７に記載の流体デバイス。
【請求項２９】
空気圧制御ポンプおよびバルブを有する、請求項２７に記載の流体デバイス。
【請求項３０】
核酸配列を検出するためのキットであって、ライゲーションプローブのセットを含み、前記セットが、
ｉ）
１）第１の標的ドメインと実質的に相補的な第１のプローブドメインと；
２）５’側ライゲーション部分と
を含む第１のライゲーションプローブと；
ｉｉ）
１）第２の標的ドメインと実質的に相補的な第２のプローブドメインと；
２）３’側ライゲーション部分と
を含む第２のライゲーションプローブと
を含み、前記ライゲーションプローブのうちの少なくとも１つが、可変スペーサー配列を含み、前記第１および第２のライゲーションプローブが、前記標的配列に結合し、かつ、外因的に添加されたリガーゼの不在下において自己ライゲーションを経過することが可能であるキット。
【請求項３１】
前記プローブセットが、
ｉ）第１の標的ドメインと第２の標的ドメインとの間に位置する第３の標的ドメインと実質的に相補的な第３のプローブドメインと；
ｉｉ）３’側および５’側のライゲーション部分と
を含む第３のライゲーションプローブをさらに含み、前記第１、第２、および第３のライゲーションプローブが、前記標的配列に結合し、かつ、外因的に添加されたリガーゼの不在下において自己ライゲーションを経過することが可能である、請求項３０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体の開示が完全に示されたと仮定した場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年４月１日に出願された、米国仮出願第６１／１６５，８３９号に由来する優先権を主張する。
【０００２】
[0001]  本発明は、化学的ライゲーションを用いて、試料中における核酸を検出するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0002]  本発明は、試料中に存在する１または複数の核酸標的を検出するための組成物、装置、および方法に関する。特定の核酸を検出することは、診断医学および分子生物学的研究の重要なツールである。
【０００４】
[0003]  遺伝子プローブアッセイは、細菌およびウイルスなどの感染性生物を同定すること；正常な遺伝子および突然変異体遺伝子の発現をプロービングし、かつ、癌遺伝子など、疾患または傷害と関連する遺伝子を同定すること；組織の移植に先立ち、組織を適合性について類別すること；組織試料または血液試料を法医学に適合させること；核物質による事故、または地球規模における流行性感冒の大流行など、緊急の対応を要する状況に対応すること；疾患の予後または原因を判定すること；ならびに異なる種に由来する遺伝子間における相同性を探索することにおいて、現在役割を果たしている。
【０００５】
[0004]  遺伝子プローブアッセイは、高感度で、特異的で、自動化が容易であることが理想的である（総説については、Nickerson、Current Opinion in Biotechnology（1993）、4:48-51を参照されたい）。感度（すなわち、検出限界が低いこと）に対する必要性は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、および、研究者が、解析前に特定の核酸配列を指数関数的に増幅することを可能とする他の増幅法が開発されたことにより大幅に緩和されている（総説については、Abramsonら、Current Opinion in Biotechnology（1993）、4:41-47を参照されたい）。例えば、ＳＮＰ遺伝子座を、マルチプレックスＰＣＲ増幅し、その後オリゴヌクレオチドアレイとハイブリダイズさせる方法は、数百個のＳＮＰの遺伝子型を同時に決定するための正確かつ信頼できる方法であることが示されている（Wangら、Science（1998）、280:1077を参照されたい；また、Schaferら、Nature Biotechnology（1989）、16:33-39も参照されたい）。
【０００６】
[0005]  特異性はまた、現在利用可能な多くの遺伝子プローブアッセイにおいてもなお、問題である。プローブと、標的と、の分子的相補性の程度により、相互作用の特異性が規定される。ハイブリダイゼーション反応物中におけるプローブ、標的、および塩の組成および濃度の変化のほか、反応温度、ならびにプローブの長さもすべて、プローブ／標的間相互作用の特異性を変化させうる。
【０００７】
[0006]  状況によっては、相補性が完全である標的を、ミスマッチを有する標的と識別することも可能でありうるが、反応条件がわずかでも異なれば、ハイブリダイゼーションが変化するので、従来の技法を用いてこれを行うことは、一般に極めて困難である。ミスマッチを検出するのに必要な特異性を有するより新規の技法には、ミスマッチにより、プローブを切断するための部位が作製されるプローブ消化アッセイ、および単一点ミスマッチによりライゲーションが阻止されるＤＮＡライゲーションアッセイが含まれる。
【０００８】
[0007]  配列のばらつきを検出するには、各種の酵素による方法、および酵素によらない方法が利用可能である。酵素ベースの方法の例には、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（OLA）、一塩基伸長法、対立遺伝子ＰＣＲ、および競合的プローブ解析（例えば、ハイブリダイゼーションによる競合的配列決定）が含まれる。酵素的ＤＮＡライゲーション反応は当技術分野においてよく知られており（Landegren、Bioessays（1993）、15（11）:761-5; Pritchardら、Nucleic Acids Res.（1997）、25（17）:3403-7; Wuら、Genomics（1989）、4（4）:560-9）、ＳＮＰの検出、酵素による増幅反応、およびＤＮＡ修復において広範に用いられている。
【０００９】
[0008]  配列のばらつきを検出するのに用いうる、酵素によらない化学的ライゲーション法または鋳型を介する化学的ライゲーション法が数多く開発されている。これらには、Ｎ−シアノイミダゾール、臭化シアン、および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリドなどの結合試薬を用いる化学的ライゲーション法が含まれる。それらの各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｍｅｔｅｌｅｖ，Ｖ．Ｇ．ら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９９９）、１８：２７１１；Ｌｕｅｂｋｅ，Ｋ．Ｊ．およびＤｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８９）、１１１：８７３３；ならびにＳｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．Ａ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）、１９：４２４７を参照されたい。
【００１０】
[0009]  参照によりその全体において本明細書に組み込まれるＫｏｏｌ（米国特許第７，０３３，７５３号）は、化学的ライゲーション、および蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて、遺伝子多型を検出することについて説明している。このプロセスにおけるリードアウトは、溶液相による蛍光強度の変化に基づく。
【００１１】
[0010]  参照によりその全体において本明細書に組み込まれるＴｅｒｂｒｕｅｇｇｅｎ（米国特許出願第６０／７４６，８９７号）は、化学的ライゲーションの方法、組成物、および試薬を用いて、マイクロアレイ検出により核酸を検出することについて説明している。
【００１２】
[0011]  他の化学的ライゲーション法では、５’−トシル酸基または５’−ヨード基を、３’−ホスホロチオエート基と反応させる結果として、ホスホジエステル架橋の酸素原子のうちの１つを硫黄で置き換えたＤＮＡ構造が得られる。それらの各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれるＧｒｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．およびＬｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９３）、２１：１４０３；Ｘｕ，Ｙ．およびＫｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９７）、３８：５５９５；ならびにＸｕ，Ｙ．およびＫｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９）、２７：８７５を参照されたい。
【００１３】
[0012]  核酸標的を検出するのに、酵素によらない手法を用いることの利点の一部には、非天然ＤＮＡ類似体構造に対する感度の低減、ＲＮＡ標的配列を用いる可能性、多様な条件下における費用の軽減および頑健さの増大が含まれる。Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる米国特許第５，７８０，６１３号）は、既に、一方のオリゴヌクレオチドが５’置換可能基を有し、他方のオリゴヌクレオチドが３’チオホスホリル基を有する、隣接し、鋳型に結合するオリゴヌクレオチドを、不可逆的に、酵素によらず、共有結合により自己ライゲーションすることについて説明している。
【００１４】
[0013]  それらのすべてが参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／１５９７１号、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９７６９、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０９７３９、ＰＣＴＵＳ９９／０１７０５、ＷＯ９６／４０７１２、およびＷＯ９８／２０１６２は、核酸ハイブリダイゼーションの新規の検出法を可能とする、電極を含めた、電子移動部分を含有する核酸を含む新規の組成物について説明している。
【００１５】
[0014]  広く関心を集めるようになっている一技法は、とりわけ、多数の核酸標的の同時的な測定を含む適用に、ＤＮＡアレイを用いている（Marshallら、Nat Biotechnol.（1998）、16（1）:27-31）。ＤＮＡアレイは、相対濃度１対１００，０００の核酸標的（mRNA）を同時的に測定する遺伝子発現モニタリングに用いられることが最も多い。ＤＮＡアレイは、作製時において、明確な既知のパターンにより核酸アンカープローブを表面に結合させている（Marshallら、Nat Biotechnol.（1998）、16（1）:27-31）か、またはビーズアレイの場合など、後の時点で正確に解読しうる（Steemersら、Nat Biotechnol.（2000）、18（l）:91-4；およびYangら、Genome Res.（2001）、11（11）:1888-98）小型のデバイスである。一連の上流処理工程の後、対象の試料を、ＤＮＡアレイと接触させると、試料中における核酸標的が、表面上のアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、試料中における標的核酸が同定され、多くの場合その濃度も決定される。
【００１６】
[0015]  現在用いられている核酸検出法の多くは、それらの広範な適用可能性を損なう特徴および／または限界を有する。例えば、ＤＮＡマイクロアレイの場合は、試料をマイクロアレイと接触させる前に、通常、試料に対して一連の処理工程を実施しなければならない。これらの工程は、アレイの製造元および／またはアレイを読み取るのに用いられる技法（蛍光、電気化学、化学発光、磁気抵抗、カンチレバー偏向、表面プラズモン共鳴）に応じて変化するが、これらの処理工程は通常、いくつかの一般的な類型：核酸の単離および精製、酵素による増幅、検出可能な標識の組込み、ならびに増幅後における洗浄に分けられる。他の一般的な工程は、試料の濃縮；核酸標的の平均サイズを低減するため、増幅された核酸をフラグメント化すること；およびエクソヌクレアーゼにより消化して、ＰＣＲ増幅された標的を、単一の標準的な分子種へと転換することである。
【００１７】
[0016]  ＤＮＡアレイを試料と接触させる前に、多くの上流処理工程が必要であると、これらの方法により一又は複数の核酸標的を検出する時間および費用が顕著に増大する可能性がある。それはまた、得られるデータの品質にも顕著な影響を及ぼしうる。例えば、一部の増幅手順は、標的の分解に対する感度が極めて高く、投入される核酸材料の保存が良好でなければ良い結果が得られない（Fossら、Diagn Mol Pathol.（1994）、3（3）:148-55）。上流処理工程の数および／または複雑さを排するかまたは軽減する技法によるならば、費用が大幅に削減され、ＤＮＡアレイ検査から得られる結果の品質も改善されるであろう。上流処理工程を軽減する一方法は、ライゲーション反応を用いて、シグナル強度を増大させ、特異性を向上させることを含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
[0017]  効率的かつ特異的に核酸を検出するための方法および組成物が、なおも必要とされている。したがって、本発明は、極めて迅速に標的を検出し、核酸標的を検出および測定するプロセスを大幅に簡略化する、酵素によらない化学的ライゲーション反応のための方法および組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
[0018]  したがって、一態様では、本発明は、少なくとも第１の標的ドメインおよび第２の標的ドメインを含む標的核酸配列と、第１および第２のライゲーションプローブと、を含む、ライゲーション基質を供給する工程を含む方法に関する。ライゲーションプローブは、長さおよび／または配列が可変的なスタッファー配列を含みうる。第１のライゲーションプローブは、第１の標的ドメインと実質的に相補的な第１のプローブドメインと、５’側ライゲーション部分とを含む。第２のライゲーションプローブは、第２の標的ドメインと実質的に相補的な第２のプローブドメインと、３’側ライゲーション部分とを含む。任意選択により、第１の標的ドメインと、第２の標的ドメインとは、少なくとも１ヌクレオチドだけ隔てられる。任意選択により、第１および前記第２のライゲーションプローブのうちの少なくとも１つは、アンカー配列、および／または、標識プローブ結合配列を含めた標識を含む。第１および第２のライゲーションプローブを、外因的に添加されたリガーゼ酵素の不在下においてライゲーションして、ライゲーション産物を形成させる。該ライゲーション産物を、前記アンカー配列と実質的に相補的な捕捉プローブを含む基板上において任意選択により捕捉し、これを検出することができる。キャピラリー電気泳動、マイクロアレイ解析、または他の任意の適切な方法によりライゲーション産物を増幅および検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】[0019]ＣＬＰＡ−ＣＥアッセイの一実施形態についての概略表示である。
【図２】[0020]ＣＬＰＡ−ＭＤＭアッセイの一実施形態についての概略表示である
【図３】[0021]２つのプローブによるＣＬＰＡ反応、および３つのプローブによるＣＬＰＡ反応についての一実施形態を示す概略表示である。
【図４】[0022]３’−ＤＡＢＳＹＬ脱離基を含むＤＮＡを作製するのに用いうる、ＤＮＡ合成樹脂についての概略表示である。
【図５】[0023]ＣＬＰＡ−ＣＥアッセイの一実施形態のプロセスの流れについての概略表示である。
【図６】[0024]サイズの異なるスタッファー配列が組み込まれる、ＣＬＰＡアッセイ用のプローブデザインを示す概略図である。
【図７】[0025]ＣＬＰＡ−ＣＥにより解析された試料についての電気泳動による分離プロファイルを示す図である。
【図８】[0026]標的濃度と、ＣＬＰＡ−ＣＥ解析におけるピーク高との間の直線関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
[0027]  本発明を実施するには、別段に示さない限り、当技術分野の範囲内にある、有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組換え法を含めた）、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技法および説明を用いることができる。このような従来の技法には、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および、標識を用いるハイブリダイゼーションの検出が含まれる。適切な技法についての具体的な例示については、本明細書下記の実施例を参照することにより知ることができる。しかし、他の同等な従来の手順もまた用いることができる。このような従来の技法および説明は、それらのすべてが参照によりそれらの全体においてすべての目的で本明細書に組み込まれる、「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」（第Ｉ〜ＩＶ巻）；「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」；「Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」；「ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」；および「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（すべて、Cold Spring Harbor Laboratory Pressから出版されている）；Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．（１９９５）、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（第４版）、Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇａｉｔ、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、１９８４、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ；ＮｅｌｓｏｎおよびＣｏｘ（２０００）、「Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第３版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；およびＢｅｒｇら（２００２）、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第５版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．などの標準的な実験マニュアルにおいて見出すことができる。さらに、本出願で引用されるすべての参考文献は、参照によりそれらの全体においてすべての目的で本明細書に組み込まれる。
【００２２】
概観
[0028]  本発明は、ＤＮＡ標的およびＲＮＡ標的を含め、試料中における１または複数の核酸標的を検出するための組成物、装置、および方法を提供する。さらに、試料は、精製されている必要はない。実際、本発明の一態様は、全血液などであるがこれらに限定されない、体内試料を含めた非純粋試料を解析することに関する。本発明は、互いに近接する形で、標的核酸に可逆的に結合し、かつ、相補的な反応性ライゲーション部分（本明細書でさらに説明される通り、本明細書では、反応性部分を、「ライゲーション部分」と称することに注意されたい）を有する、２つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを用いる方法を提供する。プローブが、適正な方向で標的に結合した場合、それらは、自発的な化学的ライゲーション反応を経過し、これにより、オリゴヌクレオチドライゲーション産物をもたらす。ライゲーションの後、新たな産物が生成されると、これを、酵素反応により増幅することもでき、化学反応により増幅することもできる。好ましい実施形態では、化学的ライゲーション反応により、それらの上にＰＣＲプライマー部位を有する２つのプローブ、例えば、ユニバーサルＰＣＲプライマーを連結する。さらに、本発明の一実施形態では、ライゲーションプローブの一方または両方が、プローブセットごとに（すなわち、標的配列ごとに）長さが異なり、この結果、ライゲーション産物の長さが標的特異的となるようにデザインされる、スタッファー配列、または可変スペーサー配列を含有する。ライゲーションの後、規定の長さのオリゴヌクレオチドは今や、ＰＣＲにより指数関数的に増幅することができる。本発明の一態様によれば、プローブは、オリゴヌクレオチドライゲーション産物を同定、精製、定量化、または検出するのに補助となる検出可能な標識（蛍光標識、電気化学標識、磁気ビーズ、ナノ粒子、ビオチン）を有しうる。プローブはまた、それらの構造内に、固体支持体（マイクロアレイ、マイクロビーズ、ナノ粒子）上における後続の捕捉のためにデザインされるアンカリングオリゴヌクレオチド配列、ライゲーション産物の濃縮または操作を促進する分子ハンドル（磁気粒子、オリゴヌクレオチドコード配列）、ならびにＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼなどの酵素によりライゲーション産物がその後副次的に増幅されることを容易にするプロモーター配列も、任意選択により含みうる。本発明のライゲーション反応は、迅速に進行し、一又は複数の対象の標的に特異的であり、一又は複数の標的ごとに複数のライゲーション産物コピーを生成させることが可能であり、結果として、検出可能なシグナルの増幅（本明細書では、場合によって、「産物出来高(product turnover)」と称する）がもたらされる。本発明のライゲーション反応は、外因的に添加されるリガーゼの存在も、さらなる酵素の存在も必要としないが、一部の副次的反応は、下記で説明されるポリメラーゼなど、酵素の使用に依存しうる。ライゲーションの化学的実体は、既に説明されている化学的部分の多くから選択することができる。好ましい化学的実体は、日常的な作製法へと容易に組み込むことができ、保存期間中において安定であり、適正にデザインされたライゲーションプローブセットへと組み込んだ場���に、標的特異的なライゲーションに極めて好ましい化学的実体である。さらに、酵素による後続の増幅を含む実施形態では、酵素により効率的にプロセシングされうるライゲーション産物を結果としてもたらす、ライゲーションの化学的実体およびプローブのデザイン（非天然のヌクレオチド類似体を含めた）が好ましい。標的の増幅はまた、個別のライゲーションプローブが鋳型核酸または標的核酸に対して有するアフィニティー以下のまたは同程度のアフィニティーを鋳型核酸または標的核酸に対して有するライゲーション産物の出来高(turnover)も含みうる。したがって、ハイブリダイズしたプローブがライゲーションされると、ライゲーション産物が標的から放出されて標的は解放され、新たなライゲーション反応の鋳型として用いられる。
【００２３】
[0029]  一実施形態では、本発明のライゲーション反応が、移動反応を含む。この実施形態では、プローブが標的配列にハイブリダイズするが、オリゴヌクレオチドプローブが併せてライゲーションされてライゲーション産物を形成するのではなく、核酸に誘導される形で、分子実体（フルオロフォア、消光剤などのレポーター分子を含めた）が、一方のオリゴヌクレオチドプローブから他方のオリゴヌクレオチドプローブへと移動する。この移動反応は、ライゲーション反応と類似するが、２つ以上のプローブが連結されるのではなく、一方のプローブは移動分子とライゲーションされるが、他方のプローブは化学反応の「脱離基」となる。結果として得られる最終生成物の異なる性質を区別するために、本発明者らは、「移動」反応という用語を用いる。ライゲーション反応と同様に、移動反応も、プローブが、移動反応を生じさせるのに十分な程度に互いに近接する（例えば、隣接部位にある）形で標的核酸にハイブリダイズした場合に限り顕著なシグナルが検出されるように、移動プローブが、近接した形で核酸標的へと結合することにより促進されることが重要である。
【００２４】
試料
[0030]  したがって、一態様では、本発明が、試料中における標的配列の存在または不在を検出するための組成物および方法を提供する。当業者により理解される通り、試料溶液は、体液（事実上任意の生物の血液、尿、血清、リンパ、唾液、肛門および膣の分泌物、汗、ならびに精液が含まれるがこれらに限定されず、哺乳動物試料が好ましく、ヒト試料が特に好ましい）；環境試料（大気試料、農業試料、水試料、および土壌試料が含まれるがこれらに限定されない）；植物物質；生物兵器用薬剤試料；研究試料（例えば、試料は、増幅反応の産物、例えば、ゲノムDNAの一般的な増幅産物でありうる）；精製ゲノムＤＮＡ、精製ＲＮＡ、精製タンパク質などの精製試料；生の試料（細菌、ウイルス、ゲノムDNAなど）が含まれるがこれらに限定されない任意の数の物質を含むことが可能であり；当業者により理解される通り、該試料に対しては、事実上任意の実験操作を行うことができる。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡを標的配列として用いる（それらの各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Zhangら、J Cell Physiol. （2007）、210（2）:279-89; Osadaら、Carcinogenesis.（2007）、28（1）:2-12；およびMattesら、Am J Respir Cell Mol Biol.（2007）、36（1）:8-12）。
【００２５】
[0031]  本発明の一部の実施形態では、保存組織（例えば、冷凍保存組織および／またはアーカイブ保存組織）または新鮮組織に由来する核酸試料を用いる。パラフィン包埋試料は、診断および予後診断など、それらと関連するさらなるデータが存在するために極めて有用でありうるので、多くの実施形態において特に有用である。本明細書で説明される、固定組織試料およびパラフィン包埋組織試料とは、保存可能な組織試料またはアーカイブ用の組織試料を指す。大半の患者に由来する病理学的試料は、組織学的解析およびその後のアーカイブ保存が可能となるように、日常的に固定およびパラフィン包埋される。従来の核酸検出法では、核酸の発現を正確に測定しうるよう、核酸試料の高度な完全性が必要とされるため、このような研究には、このような試料が有用でないことが多い。パラフィン包埋試料による遺伝子発現研究は、免疫組織化学染色を用いて、タンパク質の発現レベルをモニタリングすることによる定性的モニタリングに限定されることが多い。
【００２６】
[0032]  パラフィン内に固定および包埋する過程は、試料の核酸の分解を結果としてもたらすことが多いため、本発明の方法および組成物は、パラフィン包埋試料から核酸を検出するのに有用である。本発明は、パラフィン包埋試料中において見出される試料など、分解された試料もなお増幅および検出することが可能である。
【００２７】
[0033]  その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／１３３７０３において説明される通り、固定されたパラフィン包埋試料から核酸を精製するための多数の技法が存在する。
【００２８】
[0034]  好ましい実施形態では、標的の分析物が、核酸である。本明細書では、「核酸」もしくは「オリゴヌクレオチド」または文法的同等物が、共有結合により併せて連結された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は一般に、ホスホジエステル結合（例えば、標的配列の場合）を含有するが、下記で概観される通り、場合によっては、例えば、ホスホルアミド結合（Beaucageら、Tetrahedron（1993）、49（10）:1925；およびその中の参考文献；Letsinger、J Org. Chem.（1970）、35:3800; Sprinzlら、Eur. J. Biochem.（1977）、81 :579; Letsingerら、Nucl. Acids Res.（1986）、14:3487; Sawaiら、Chem. Lett.（1984）、805; Letsingerら、J. Am. Chem. Soc.（1988）、110:4470；ならびにPauwelsら、Chemica Scripta（1986）、26:141）、ホスホロチオエート結合（Magら、Nucleic Acids Res.（1991）、19:1437；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート結合（Briuら、J. Am. Chem. Soc.（1989）、111:2321）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Eckstein、「Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach」、Oxford University Pressを参照されたい）、ならびにペプチド核酸骨格およびペプチド核酸結合（それらのすべてが参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Egholm、J. Am. Chem. Soc.（1992）、114:1895; Meierら、Chem. Int. Ed. Engl.（1992）、31 :1008; Nielsen、Nature（1993）、365:566; Carlssonら、Nature （1996）、380:207を参照されたい）を含む代替的な骨格（特に、ライゲーションプローブと共に用いられる）でありうる核酸類似体も含まれる。他の類似体核酸には、ロックト核酸を含めた、二環式構造を含む類似体核酸（Koshkinら、J Am. Chem. Soc.（1998）、120:13252-3）；正に帯電した骨格（Denpcyら、Proc. Natl. Acad. Sci USA（1995）、92: 6097）；非イオン性骨格（米国特許出願第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号、および同第４，４６９，８６３号; Kiedrowshiら、Angew. Chem. Intl. Ed. English（1991）、30:423; Letsingerら、J. Am. Chem. Soc.（1988）、110:4470; Letsingerら、Nucleoside & Nucleotide（1994）、13:1597; ASC Symposium Series 580、Y. S. SanghuiおよびP. Dan Cook編、第2および3章; Mesmaekerら、Bioorganic & Medicinal Chem. Lett.（1994）、4:395 ; Jeffsら、J. Biomolecular NMR（1994）、34:17; Xuら、Tetrahedron Lett.（1996）、37:743）；ならびに米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号；ならびにＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０、Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編、第６および７章において説明されている、骨格を含めた非リボース骨格が含まれる。１または複数の炭素環糖を含有する核酸もまた、核酸の定義の範囲内に包含される（Jenkinsら、Chem. Soc. Rev.（1995）、169〜176頁を参照されたい）。複数の核酸類似体は、Ｒａｗｌｓ、Ｃ  ＆  Ｅ  Ｎｅｗｓ、１９９７年６月２日、３５頁において説明されている。これらの参考文献のすべては、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。リボース−リン酸骨格にこれらの修飾を行うことにより、標識または他の部分の付加を容易にすることができ、生理学的環境において、このような分子の安定性を増大または減少させ、これらの半減期を延長または短縮することなどが可能である。
【００２９】
[0035]  当業者により理解される通り、これらの核酸類似体のすべては、本発明において用いることができる。加えて、天然の核酸と、類似体との混合物を作製することもできる；例えば、ライゲーション部分の部位には、類似体構造を用いることができる。代替的に、異なる核酸類似体の混合物、ならびに天然の核酸と類似体との混合物を作製することもできる。
【００３０】
[0036]  核酸類似体には、例えば、ペプチド核酸（PNA；参照によりその全体において本明細書に組み込まれるＷＯ９２／２０７０２）およびロックト核酸（LNA；それらの各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれるKoshkin AAら、Tetrahedron（1998）、54:3607-3630; Koshkin AAら、J. Am. Chem. Soc.（1998）、120:13252-13253; Wahlestedt Cら、PNAS（2000）、97:5633-5638）が含まれうる。一部の適用では、この種の類似体骨格は、ハイブリダイゼーション反応速度の向上、熱安定性の改善、およびミスマッチ配列に対する感度の向上を示しうる。
【００３１】
[0037]  核酸は、特定される形に応じて、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、または二本鎖配列両方の一部を含有する場合もあり、一本鎖配列の一部を含有する場合もある。核酸は、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方のＤＮＡの場合もあり、ＲＮＡの場合もあり、ハイブリッド体の場合もあり、ここで、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組合せ、ならびに天然の核酸塩基（ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン）および非天然の核酸塩基（イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン、５−メチルシトシン、シュードイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザグアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザグアニン）、およびＮ８−（７−デアザ−８−アザアデニン）、５−プロピニルウラシル、２−チオ−５−プロピニルウラシル）などを含めた塩基の任意の組合せを含有する。本明細書で用いられる「核酸塩基」という用語は、「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」の両方、ならびに核酸類似体の単量体を包含する。したがって、本明細書では、例えば、各々が塩基を含有するペプチド核酸の個別の単位も、核酸塩基と称する。
【００３２】
[0038]  一態様では、本発明のライゲーションプローブが、配列特異的な形で一又は複数の核酸標的と相互作用することが可能であり、それらが、相補的な化学的部分を有する別のポリマー分子種との自発的な化学的ライゲーション反応を経過することを可能とする、化学的部分を有するポリマー分子種である。一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、前述の修飾形、および／またはこれらの任意のハイブリッド体（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド体、ＤＮＡ／ＬＮＡハイブリッド体、ＤＮＡ／ＰＮＡハイブリッド体）でありうる。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブが、ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドである。
【００３３】
[0039]   一又は複数の標的配列領域内において一本鎖状態で存在しない核酸試料（例えば、標的配列）も、一般に、検出する前、またはハイブリダイゼーションさせる前に、このような一又は複数の領域内において一本鎖とする。一般に、核酸試料は、熱変性を用いて、標的配列領域内において一本鎖とすることができる。増幅により得られるポリヌクレオチドの場合、一本鎖増幅産物を生成させるのに適する方法が好ましい。一本鎖増幅産物であるポリヌクレオチドを生成させるのに適する増幅過程の非限定的な例には、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼランオフ転写、ＲＣＡ、非対称ＰＣＲ（Bachmannら、Nucleic Acid Res.（1990）、18:1309）、および非同期ＰＣＲ（ＷＯ０１／９４６３８）が含まれるがこれらに限定されない。ＰＮＡオープナー（米国特許第６，２６５，１６６号）を用いるなど、二本鎖ポリヌクレオチド領域を一本鎖とするための、一般に知られた方法もまた、ポリヌクレオチド上において一本鎖標的配列を生成させるのに用いることができる。
【００３４】
[0040]  一態様では、本発明が、標的配列を検出する方法を提供する。本明細書では、「標的配列」もしくは「標的核酸」または文法的同等物が、核酸の一本鎖上における核酸配列を意味する。標的配列は、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびｒＲＮＡ、その他を含めた、遺伝子、制御配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡの一部でありうる。本明細書で概観される通り、標的配列は、試料に由来する標的配列の場合もあり、増幅反応などの産物など、二次標的の場合もある。より長い配列がより特異的であることを理解する限りにおいて、標的配列は、任意の長さでありうる。当業者により理解される通り、相補的標的配列は、多くの形態を取りうる。例えば、標的配列は、より大型の核酸配列の内部、すなわち、とりわけ、遺伝子またはｍＲＮＡの全部または一部、プラスミドまたはゲノムＤＮＡの制限フラグメントの内部に含有されうる。
【００３５】
[0041]  一部の実施形態では、標的配列が、異なる種類の標的ドメインを含む。例えば、試料の標的配列の第１の標的ドメインは、第１のライゲーションプローブとハイブリダイズすることが可能であり、標的配列内の第２の標的ドメインは、第２のライゲーションプローブとハイブリダイズすることが可能である。他の標的ドメインは、アレイ、標識プローブなどの基板上における捕捉プローブとハイブリダイズしうる。
【００３６】
[0042]  標的ドメインは、下記でより完全に説明される通り、示される通りに隣接する場合もあり、隔てられる場合もある。検出がライゲーションに基づき、適用がシグナルの増幅を必要とする一部の場合には、ライゲーションプローブ間にリンカーを用い、これらの間を、標的配列の１または複数の核酸塩基だけ隔てて、ライゲーション産物にハイブリダイゼーションの不安定性が付与することができる。他の適用では、例えば、一塩基多型（SNP）の検出、または移動反応では、ライゲーションプローブを、標的配列の隣接する核酸塩基にハイブリダイズさせることができる。特定しない限り、「第１」および「第２」という用語は、標的配列の５’−３’方向に関して、配列方向を付与することを意図しない。例えば、相補的な標的配列が５’−３’方向であると仮定すると、第１の標的ドメインは、第２のドメインに対して５’側に位置する場合もあり、第２のドメインに対して３’側に位置する場合もある。言及を容易にすることを目的とするものであり、限定することを目的とするものではないが、場合によっては、これらのドメインを「上流」および「下流」と称する（通常の習慣では、標的配列を、５’から３’への方向で表示する）。
【００３７】
[0043]  プローブは、それが、空間的に近接する標的ポリヌクレオチドの一部に結合する場合に、その間で化学的ライゲーション反応を生じさせるようにデザインされる。一般に、プローブは、化学的な反応部分（本明細書では一般に、「ライゲーション部分」と称する）を含み、該化学的反応部分が、空間的に近接し、この結果として、自発的にライゲーション反応を生じさせるように、特定の方向にある標的ポリヌクレオチドに結合する。
【００３８】
プローブの構成要素
[0044]  一部の実施形態では、本発明が、通常は第１および第２のライゲーションプローブであるが、本明細書で説明される通り、一部の実施形態では２つ以上のプローブが用いられる、ライゲーションプローブのセットを提供する。加えて、本明細書で言及される通り、場合によっては、ライゲーションではなく、移動反応がなされ；「ライゲーションプローブ」は、「移動プローブ」を含む。各ライゲーションプローブは、本明細書では場合によって「プローブドメイン」と称する、標的ドメインのうちの１つと実質的に相補的な核酸部分を含む。本発明のプローブは、標的配列と、本発明のプローブとのハイブリダイゼーションが生じるよう、標的配列と相補的であるようにデザインされる。本明細書で概観される通り、この相補性は、完全である必要がなく；任意の数の塩基対のミスマッチが、標的配列と本発明のプローブとのハイブリダイゼーションに干渉する場合がある。しかし、厳密性が最小限であるハイブリダイゼーション条件下でもなおハイブリダイゼーションが生じ得ない程度に突然変異の数が多い場合、その配列は、相補的配列ではない。したがって、本明細書において、「実質的に相補的」とは、プローブが、通常の反応条件下においてハイブリダイズするのに十分な程度に標的配列と相補的であることを意味する。「同一」配列とは、核酸塩基のより短い長さにわたり、完全な相補性が存在する配列である。
【００３９】
[0045]  本発明の一態様では、プローブの長さが、標的配列の長さ、必要とされる特異性、反応（例えば、ライゲーション反応または移動反応）、ならびにハイブリダイゼーション条件および洗浄条件と共に変化するようにデザインされる。一般に、この態様では、ライゲーションプローブが、約５〜約１５０核酸塩基の範囲内にあり、約１５〜約１００核酸塩基が好ましく、約２５〜約７５核酸塩基がとりわけ好ましい。一般に、これらの長さは、ライゲーションプローブおよび移動プローブに同等に適用される。
【００４０】
[0046]  本明細書では「ＣＬＰＡ−ＣＥ」と称する、下記でより完全に説明される本発明の別の実施形態では、プローブ長を、対象の各標的に応じて変化させ、これにより、長さのばらつきに基づいて同定および解析されうるライゲーション産物を生成させる。
【００４１】
[0047]  本発明では、高度な厳密性条件、中程度の厳密性条件、および低度な厳密性条件を含め、各種のハイブリダイゼーション条件を用いることができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら、「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」を参照されたい。当技術分野で知られる通り、非イオン性骨格、例えば、ＰＮＡを用いる場合もまた、ハイブリダイゼーション条件を変化させることができる。
【００４２】
ライゲーション部分
[0048]  ライゲーションドメインに加えて、本発明のライゲーションプローブは、ライゲーション部分も有する。したがって、一態様では、本発明が、第１および第２のライゲーションプローブのライゲーション部分が自発的に反応して、外因的なリガーゼの不在下において、すなわち、外因的なリガーゼを反応物に添加せずに、該プローブを併せてライゲーションすることが可能であるような条件下において、少なくとも第１および第２のライゲーションプローブを、標的核酸に結合させて「ライゲーション基質」を形成させる工程を含む、化学的ライゲーションの方法に関する。移動反応の場合は、これを、「ライゲーション基質」または「移動基質」と称することができる。本明細書において、「ライゲーション基質」とは、少なくとも１つの標的核酸配列と、２つ以上のライゲーションプローブとを含む、化学的ライゲーションのための基質を意味する。同様に、少なくとも１つの標的核酸配列と、２つ以上の移動プローブとを含む「移動基質」も、「ライゲーション基質」の定義の範囲内に包含される。
【００４３】
[0049]  本発明の一部の実施形態では、例えば、さらなる特異性が所望される場合には、２つ以上のライゲーションプローブを用いることができる。この実施形態でもまた、「中間」の一又は複数のライゲーションプローブを、隣接させることもでき、標的配列の１または複数の核酸塩基だけ隔てることもできる。好ましい実施形態では、ライゲーション反応が、リガーゼ酵素の存在を必要とせず、さらなる（例えば、外因的な）リガーゼの不在下において、結合したプローブ間において自発的に生じる。
【００４４】
[0050]  本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、ポリヌクレオチド標的に特異的であるようにデザインされる。これらのプローブは、互いに空間的に近接する形で標的に結合し、化学的な反応部分が、空間的に近接するような形で方向づけられる。一態様では、２つ以上のプローブを、標的ポリヌクレオチド上における隣接部位の近傍で結合するようにデザインする。好ましい実施形態では、１つのオリゴヌクレオチドプローブの５’端におけるライゲーション部分が、他のプローブの３’端におけるライゲーション部分と相互作用することが可能であるように、２つのプローブが標的に結合する。
【００４５】
[0051]  化学的ライゲーションは、さらなる活性化試薬を添加するか、またはさらなる刺激を加えることなしに、適切な条件下で自発的に生じうる。代替的に、「活性化」剤または外部刺激を用いて、化学的ライゲーション反応を促進することができる。活性化剤の例には、カルボジイミド、臭化シアン（ＢｒＣＮ）、イミダゾール、１−メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、Ｎ−シアノイミダゾール、ジチオトレイトール（DTT）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）、および他の還元剤のほか、紫外光、熱、および／または圧力変化などの外部刺激が含まれるがこれらに限定されない。
【００４６】
[0052]  本明細書で概観される通り、本発明のライゲーション部分は、多数の因子に応じて、各種の立体構造を取りうる。本明細書で示される化学的実体の大半は、３’から５’への方向で一般に進行するホスホルアミダイト反応において用いられる。すなわち、樹脂は、該分子の５’端においてホスホルアミダイト結合を可能にする化学的実体を含有する。しかし、当技術分野で知られる通り、ホスホルアミダイトは、５’から３’への方向に進行するようにも用いることができ；したがって、本発明は、本明細書で概観される方向とは逆の方向を有する部分も包含する。
【００４７】
[0053]  ライゲーションプローブ（または移動プローブ）の各セットは、第１のライゲーション部分および第２のライゲーション部分のセットを含有する。これらのライゲーション部分対の同定は、用いられるライゲーションの化学的実体に依存する。加えて、本明細書で説明される通り、リンカー（不安定化リンカーが含まれるがこれらに限定されない）を、一方または両方のライゲーションプローブのプローブドメインと、ライゲーション部分との間に挿入することもできる。一般に議論を容易にする目的で、本明細書では、「上流」および「下流」のライゲーションプローブという用語を用いる場合があるが、これは限定を意図するものではない。
【００４８】
ハロ脱離基による化学反応
[0054]  本発明の一実施形態では、化学反応が、それらのすべてが参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｇｒｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．およびＬｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．、（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２１：１４０３；Ｘｕ，Ｙ．およびＫｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．、（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３８：５５９５；Ｘｕ，Ｙ．およびＫｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．、（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７：８７５；Ａｒａｒら（１９９５）、ＢｉｏＣｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．、６：５７３；Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．ら（２００１）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９：１４８；Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．ら（１９９５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２３（１７）：３５４７；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、米国特許第５，４７６，９３０号；Ｓｈｏｕｔｅｎら、米国特許第６，９５５，９０１号；Ａｎｄｅｒｓｅｎら、米国特許第７，１５３，６５８号において一般的に説明される技法など、５’ハロゲン脱離基法に基づく。この実施形態では、第１のライゲーションプローブは、その５’端において、５’ 脱離基を有するヌクレオシドを含み、第２のライゲーションプローブは、その３’端において、３’チオホスホリルなどの３’求核基を有するヌクレオシドを含む。５’ 脱離基には、例えば、ハロ分子種（Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ）、ならびに参照によりその全体において本明細書に組み込まれるＡｂｅおよびＫｏｏｌ、Ｊ  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００４）、１２６：１３９８０−１３９８６により説明される基などの基を含め、当業者に知られる多くの一般的な脱離基が含まれうる。本発明のこの態様のより好ましい実施形態では、第１のライゲーションプローブが、フレキシブルなリンカーを介して連結される５’ 脱離基と、３’チオホスホリル基を有する下流オリゴヌクレオチドとを有する。この立体構造は、反応速度を著明に増大させ、結果として、標的ごとに多数のライゲーション産物コピーを生成させる。
【００４９】
[0055]  鋳型の「上流」側（すなわち、左側または５’側）において結合するオリゴヌクレオチドとして、ポリヌクレオチド鋳型の５’側から３’側への方向との関連で定義される「上流」オリゴヌクレオチドは、その５’端として、５’ 脱離基を含む。求核試薬として硫黄、セレニウム、またはテルルを含む、ＳＮ２反応に関与することが可能な任意の脱離基を用いることができる。脱離基とは、修飾ホスホリル基の求核試薬（硫黄、セレニウム、またはテルル）が炭素原子に対して求核攻撃すると、それが陰イオンとして脱離するように炭素に結合した原子または基である。適切な脱離基には、ヨウ化物、臭化物、または塩化物などのハロゲン化物、トシレート、ベンゼンスルホネート、またはｐ−ニトロフェニルエステルのほか、ＲＳＯ３［式中、Ｒは、フェニル、またはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）、ニトロ、シアノ、スルホニル、およびカルボニルを含む１〜５個の原子もしくは基により置換されたフェニルであるか、あるいはＲは、１〜６個の炭素を含むアルキルである］などが含まれるがこれらに限定されない。脱離基は、ヨウ化物であることが好ましく、ＤＮＡの場合、上流オリゴヌクレオチドの５’端におけるヌクレオシドは、５’−デオキシ−５’−ヨード−２’デオキシヌクレオシドであることが好ましい。適切な５’−デオキシ−５’−ヨード−２’デオキシヌクレオシドの例には、５’−デオキシ−５’−ヨードチミジン（５’−１−Ｔ）、５’−デオキシ−５’−ヨード−２’−デオキシシチジン（５’−Ｉ−ｄＣ）、５’−デオキシ−５’−ヨード−２’−デオキシアデノシン（５’−Ｉ−ｄＡ）、５’−デオキシ−５’−ヨード−３−デアザ−２’−デオキシアデノシン（５’−Ｉ−３−デアザ−ｄＡ）、５’−デオキシ−５’−ヨード−２’−デオキシグアノシン（５’−Ｉ−ｄＧ）および５’−デオキシ−５’−ヨード−３−デアザ−２’−デオキシグアノシン（５’−Ｉ−３−デアザ−ｄＧ）、ならびにこれらのホスホルアミダイト誘導体が含まれるがこれらに限定されない（図２を参照されたい）。ＲＮＡオリゴヌクレオチドの場合、同様の適切な５’−デオキシ−５’−ヨードヌクレオシドの例には、５’−デオキシ−５’−ヨードウラシル（５’−１−Ｕ）、５’−デオキシ−５’−ヨードシチジン（５’−１−Ｃ）、５’−デオキシ−５’−ヨードアデノシン（５’−１−Ａ）、５’−デオキシ−５’−ヨード−３−デアザアデノシン（５’−Ｉ−３−デアザ−Ａ）、５’−デオキシ−５’−ヨードグアノシン（５’−１−Ｇ）および５’−デオキシ−５’−ヨード−３−デアザグアノシン（５’−Ｉ−３−デアザ−Ｇ）、ならびにこれらのホスホルアミダイト誘導体が含まれるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、５’ 脱離基を含む、５’端における修飾ヌクレオチドが、リボヌクレオチドである場合を除き、上流ライゲーションプローブが、２’−デオキシリボヌクレオチドを含有する。末端から２番目の２’−デオキシリボヌクレオチドと、末端の５’リボヌクレオチドとの結合は、塩基を用いて切断しやすいため、上流ヌクレオチドのこの実施形態は有利である。これは、例えば、下記においてより詳細に説明される通り、固体支持体に結合さ��るオリゴヌクレオチドプローブの潜在的な再利用を可能とする。下記でより完全に説明されるＣＬＰＡアッセイを参照すると、「上流」プローブの５’ 脱離基は、ＤＡＢＳＹＬであることが最も好ましい。
【００５０】
[0056]  上流オリゴヌクレオチドの「下流」にある、すなわち、その３’側にあるポリヌクレオチド鋳型に結合する「下流」のオリゴヌクレオチドは、その３’端として、その３’ヒドロキシルにホスホロチオエート基（すなわち、「３’−ホスホロチオエート基」）、ホスホロセレノエート基（すなわち、「３’−ホスホロセレノエート基」）、またはホスホロテルロエート基（すなわち、「３’−ホスホロテルロエート基」）を連結したヌクレオシドを含む。したがって、自己ライゲーションに用いられる化学反応は、硫黄を介する反応、セレニウムを介する反応、またはテルルを介する反応である。自己ライゲーションは、下流オリゴヌクレオチドの３’端を含む基により決定される通り、５’架橋ホスホロチオエステル（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）−Ｓ−）、５’架橋ホスホロチセレノエステル（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）−Ｓｅ−）、５’架橋ホスホロテルロエステル（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）−Ｔｅ−）を含有するライゲーション産物をもたらす。この非天然のアキラル架橋ジエステルは、隣接するヌクレオチド間に配置され、天然の５’架橋ホスホジエステルに代用される。セレニウムを介するライゲーションが、硫黄を介するライゲーションより３〜４倍速く、かつ、セレニウムを含有するライゲーション産物が、Ｓｅ−Ｐ間結合の結合強度が低度であるにもかかわらず、極めて安定であったことは、驚くべきことである。さらに、架橋ホスホロセレノエステル、ならびに架橋ホスホロテルロエステルは、極めて低厳密度の条件下において、銀イオンまたは水銀イオンにより選択的に切断可能であることが予測される（Magら、Nucleic Acids Res.（1991）、19:1437-1441）。
【００５１】
[0057]  一実施形態では、３’ホスホロチオエート、３’ホスホロセレノエート、または３’ホスホロテルロエートを含む３’端における修飾ヌクレオチドがリボヌクレオチドである場合を除き、下流オリゴヌクレオチドが、２’−デオキシリボヌクレオチドを含有する。末端から２番目の２’−デオキシリボヌクレオチドと末端のリボヌクレオチドとの結合は、塩基を用いて切断しやすいため、上流ヌクレオチドのこの実施形態は有利であり、これは、例えば、固体支持体に結合されるオリゴヌクレオチドプローブの潜在的な再利用を可能とする。下記でより完全に説明されるＣＬＰＡアッセイを参照すると、「下流」プローブは、その３’端において、３’ホスホロチオエートを含むことが最も好ましい。
【００５２】
[0058]  「上流」オリゴヌクレオチドおよび「下流」オリゴヌクレオチドは、任意選択により、単一のオリゴヌクレオチドの２つの末端を構成することが可能であり、この場合は、ライゲーションにより、環状ライゲーション産物がもたらされる。直鎖状の前駆体オリゴヌクレオチドの５’端および３’端における結合領域は、５’端および３’端における結合領域をポリヌクレオチド標的に結合させるのに十分な数の介在ヌクレオチドにより連結しなければならない。
【００５３】
[0059]  本発明により提供される組成物には、５’−デオキシ−５’−ヨード−２’デオキシヌクレオシド、例えば、５’−デオキシ−５’−ヨードチミジン（５’−１−Ｔ）、５’−デオキシ−５’−ヨード−２’−デオキシシチジン（５’−Ｉ−ｄＣ）、５’−デオキシ−５’−ヨード−２’−デオキシアデノシン（５’−Ｉ−ｄＡ）、５’−デオキシ−５’−ヨード−３−デアザ−２’−デオキシアデノシン（５’−Ｉ−３−デアザ−ｄＡ）、５’−デオキシ−５’−ヨード−２’−デオキシグアノシン（５’−Ｉ−ｄＧ）および５’−デオキシ−５’−ヨード−３−デアザ−２’−デオキシグアノシン（５’−Ｉ−３−デアザ−ｄＧ）、ならびにこれらのホスホルアミダイト誘導体のほか、その５’端として、本発明の５’−デオキシ−５’−ヨード−２’デオキシヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明により提供される組成物には、５’−デオキシ−５’−ヨードウラシル（５’−１−Ｕ）、５’−デオキシ−５’−ヨードシチジン（５’−１−Ｃ）、５’−デオキシ−５’−ヨードアデノシン（５’−１−Ａ）、５’−デオキシ−５’−ヨード−３−デアザアデノシン（５’−Ｉ−３−デアザ−Ａ）、５’−デオキシ−５’−ヨードグアノシン（５’−１−Ｇ）および５’−デオキシ−５’−ヨード−３−デアザグアノシン（５’−Ｉ−３−デアザ−Ｇ）、ならびにこれらのホスホルアミダイト誘導体のほか、その５’端として、本発明の５’−デオキシ−５’−ヨードヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドなど、５’−デオキシ−５’−ヨードヌクレオシドがさらに含まれる。本発明にはまた、３’−ホスホロセレノエート基または３’−ホスホロテルロエート基を含むヌクレオシド、ならびに、その３’端として、３’−ホスホロセレノエート基または３’−ホスホロテルロエート基を含むヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドも包含される。各種のヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチドを作製する方法と同様に、修飾ヌクレオシドのこれらのクラスのうちの一方または両方を含有するオリゴヌクレオチドもまた、本発明に包含される。本発明による、５’端または３’端のうちの一方または両方において修飾されているオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識、好ましくは放射性標識、蛍光エネルギーのドナー基もしくはアクセプター基、エキシマー標識、またはこれらの任意の組合せを含むのは、任意選択によるものであり、その必要はない。
【００５４】
[0060]  加えて、場合によっては、置換基はまた、保護基（本明細書では、場合によって、「PG」と称する）でもありうる。適切な保護基は、保護される原子、ならびに該部分が曝露される条件に依存する。多種多様な保護基が知られており、例えば、ホスホルアミダイト化学反応における保護基としては、ＤＭＴを用いることが多い（図中に示す；しかし、これらの実施形態においても、DMTを他の保護基で代用することができる）。多種態様な保護基が適切であり；例えば、保護基および関連する化学反応については、参照により本明細書に組み込まれる、「Greene's Protective Groups in Organic Synthesis」を参照されたい。
【００５５】
[0061]  本明細書では、「アルキル基」または文法的同等物は、直鎖状または分枝状のアルキル基を意味し、直鎖状のアルキル基が好ましい。分枝している場合、アルキル基は、１または複数の位置において分枝していることが可能であり、特定しない限り、任意の位置において分枝していることが可能である。アルキル基は、約１〜約３０炭素原子（Ｃ１〜Ｃ３０）の範囲にあることが可能であり、約１〜約２０炭素原子（Ｃ１〜Ｃ２０）を用いる実施形態が好ましく、約Ｃ１〜約Ｃ１２〜約Ｃ１５が好ましく、Ｃ１〜Ｃ５が特に好ましいが、一部の実施形態では、はるかに大きなアルキル基も可能である。また、Ｃ５環またはＣ６環などのシクロアルキル基、ならびに窒素、酸素、硫黄、またはリンを含むヘテロ環も、アルキル基の定義の範囲内に包含される。アルキルはまた、ヘテロアルキルも包含し、ヘテロ原子が硫黄、酸素、窒素、およびケイ素であることが好ましい。アルキルは、置換アルキル基も包含する。本明細書において、「置換アルキル基」とは、上記で定義した１または複数の置換部分「Ｒ」をさらに含むアルキル基を意味する。
【００５６】
[0062]  本明細書では、「アミノ基」または文法的同等物は、ＮＨ２基、−ＮＨＲ基、および−ＮＲ２基［式中、Ｒは、本明細書で定義されている］を意味する。一部の実施形態では、例えば、ペプチドライゲーション反応の場合には、一級アミンおよび二級アミンが特に用いられ、一般には、一級アミンの反応速度がより速い。
【００５７】
[0063]  本明細書において、「ニトロ基」とは、−ＮＯ２基を意味する。
【００５８】
[0064]  本明細書において、「硫黄含有部分」とは、チア化合物、チオ化合物、およびスルホ化合物、チオール（−ＳＨおよび−ＳＲ）、ならびにスルフィド（−ＲＳＲ−）が含まれるがこれらに限定されない、硫黄原子を含有する化合物を意味する。硫黄含有部分の特定の種類は、通常、置換チオエステル（−（ＣＯ）−ＳＲ）として見出される、チオエステル（−（ＣＯ）−Ｓ−）である。本明細書において「リン含有部分」とは、ホスフィンおよびリン酸が含まれるがこれらに限定されない、リンを含有する化合物を意味する。本明細書において、「ケイ素含有部分」とは、ケイ素を含有する化合物を意味する。
【００５９】
[0065]  本明細書において、「エーテル」とは、−Ｏ−Ｒ基を意味する。好ましいエーテルには、アルコキシ基が含まれ、−Ｏ−（ＣＨ２）２ＣＨ３および−Ｏ−（ＣＨ２）４ＣＨ３が好ましい。
【００６０】
[0066]  本明細書において、「エステル」とは、−ＣＯＯＲ基を意味する。
【００６１】
[0067]  本明細書において、「ハロゲン」とは、臭素、ヨウ素、塩素、またはフッ素を意味する。好ましい置換アルキルは、ＣＦ３など、部分的または完全にハロゲン化されたアルキルである。
【００６２】
[0068]  本明細書において、「アルデヒド」とは、−ＲＣＯＨ基を指す。
【００６３】
[0069]  本明細書において、「アルコール」とは、−ＯＨ基、およびアルキルアルコールである−ＲＯＨを意味する。
【００６４】
[0070]  本明細書において、「アミド」とは、−ＲＣＯＮＨ−基またはＲＣＯＮＲ−基を意味する。
【００６５】
[0071]  本明細書において、「エチレングリコール」とは、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−基を意味するが、エチレン基の各炭素原子はまた、単独に置換される場合もあり、二重に置換される場合もある、すなわち、−（Ｏ−ＣＲ２−ＣＲ２）ｎ−である［式中、Ｒは、上記で説明した通りである］。酸素の代わりに他のヘテロ原子を含むエチレングリコール誘導体（すなわち、−（Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−もしくは−（Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−、または置換基を含む誘導体）もまた好ましい。
【００６６】
[0072]  加えて、一部の実施形態では、Ｒ基が、消光剤、不安定化部分、およびフルオロフォア（上記で定義した）を含めた官能基でありうる。この実施形態で特に用いられるフルオロフォアには、フルオレセインおよびその誘導体、ＴＡＭＲＡ（テトラメチル−６−カルボキシローダミン）、Ａｌｅｘａ色素、ならびにＣｙａｎｉｎｅ色素（例えば、Cy3およびCy5）が含まれるがこれらに限定されない。
【００６７】
[0073]  消光剤部分または消光剤分子は、当技術分野で知られており、一般に、別の分子の励起状態を脱活性化しうる芳香環化合物、多環式化合物である。当技術分野では、フルオロフォア−消光剤の対がよく知られている。適切な消光剤部分には、Ｄａｂｓｙｌ（ジメチルアミノ（アゾベンゼン）スルホニル）、Ｄａｂｃｙｌ（ジメチルアミノ（アゾベンゼン）カルボニル）、Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（Glen Research社製）、ならびにＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＢｌａｃｋｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（BHQ-1、BHQ-2、およびBHQ-3）が含まれるがこれらに限定されない。
【００６８】
[0074]  適切な不安定化部分については下記で論じるが、これらには、その標的部位に対するオリゴヌクレオチドの全体的な結合エネルギーの低下を結果としてもたらす分子実体が含まれるがこれらに限定されない。潜在的な例には、アルキル鎖、荷電複合体、および環構造が含まれるがこれらに限定されない。
【００６９】
求核試薬によるライゲーション部分
[0075]  この実施形態では、他のライゲーションプローブが、アミンなどの求核試薬を含むライゲーション部分を含む。チオールおよびアミンの両方を含むライゲーション部分が、特定の反応において特に用いられる。一般に、求核試薬によるライゲーション部分が、一級アミンまたは二級アミンに近接するチオール基を含有し、その相対的な位置が、ＳアシルからＮアシルへのシフトが生じる際に、少なくとも５員環または６員環の遷移状態を達成しうるような位置である限りにおいて、求核試薬によるライゲーション部分には、多種多様な潜在的アミノ化合物、チオール化合物が含まれうる。
【００７０】
[0076]  したがって、１，２アミノチオール基または１，３アミノチオール基を含む求核試薬によるライゲーション分子が、特に用いられる。二級アミンより一級アミンの方が一般に反応時間が速いので、反応時間が重要である一部の実施形態では、一級アミンが用いられるが、下記で論じる不安定化に寄与するアシルトランスフェラーゼ反応では、二級アミンが用いられる。アミノ基とチオール基との間の炭素は、水素以外のＲ基で置換しうるが、一般に、用いられる水素以外のＲ基は、炭素１個当たり１個に限られる。加えて、隣接するＲ基（図＊ＣＣでは、Ｒ’およびＲ’ ’として示される）は、併せて連結して、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリール、ならびにこれらの置換誘導体および非置換誘導体を含め、置換および非置換のシクロアルキル基およびアリール基を含めた環構造を形成することもできる。１，２アミノチオール基を用い、かつ、隣接するＲ基を結合させる場合は一般に、隣接するＲ基が、アリール基ではなく、シクロアルキル基（ヘテロシクロアルキル、ならびにその置換誘導体を含めた）を形成することが好ましい。
【００７１】
[0077]  ４つのシグマ結合により鎖を収縮させて不安定化を生じさせるこの実施形態では、置換ライゲーション部分が、アシルトランスフェラーゼ反応に依拠する。
【００７２】
リンカー
[0078]  多くの実施形態では、一又は複数のライゲーションプローブ内の様々な位置に、リンカー（本明細書では、場合によって、「Ｌ」または「−（リンカー）ｎ−」として示す）（式中、ｎは０または１である）を、任意選択で含むことができる。適切なリンカーには、ヘテロアルキルおよびヘテロアリールを含めたアルキル基およびアリール基、ならびにこれらの置換誘導体が含まれる。場合によって、例えば、天然ペプチドライゲーション反応を行う場合は、リンカーがアミノ酸ベースであることが可能であり、および／またはアミド結合を含有しうる。本明細書で説明する通り、一部のリンカーは、ライゲーションプローブを、１または複数の核酸塩基だけ隔てて、ライゲーション産物内に脱塩基部位を形成させ、これを、下記で説明する不安定化部分として用いる。
【００７３】
不安定化部分
[0079]  本発明の一態様によれば、酵素の補助なしに、標的分子ごとに、多数のライゲーション産物コピーを作製することが望ましい。この目標を達成するための一方法は、化学的ライゲーション反応の後に、ライゲーション産物を標的から解離させ、新たなプローブセットを標的に結合させる工程を含む。ライゲーション産物出来高(product turnover)を増大させるには、標的分子からの産物の解離を増大させる、プローブデザイン、装置構成、および化学的ライゲーション反応のための化学的実体が望ましい。
【００７４】
[0080]  既存の研究は、産物の解離を達成し、産物出来高(product turnover)を増大させる一方法が、反応混合物を「熱サイクリング」させることであると示している。熱サイクリングとは、所望の結果を促進するように、反応物の温度を変化させるプロセスである。熱サイクリングは、ライゲーション産物を標的から解離させる短い時間にわたり、反応温度が該産物の溶融温度を超えるように、反応混合物の温度を短い時間にわたり上昇させる形態を取ることが最も多い。冷却すると、新たなプローブセットが標的に結合し、別のライゲーション反応を経過することが可能となる。この熱サイクリング手順は、ＰＣＲのような酵素反応について広く実施されている。
【００７５】
[0081]  熱サイクリングは、産物出来高(product turnover)を達成する一方法であるが、熱サイクリングなしに、顕著な産物出来高(product turnover)が生じるようにプローブをデザインすることも可能である。ライゲーション産物の溶融温度を低下させる一助となる、プローブデザインおよびライゲーション化学反応は、産物による反応サイクルの阻害を軽減することを介して、産物出来高(product turnover)を増大させる。
【００７６】
[0082]  したがって、一態様では、プローブがライゲーションされると、標的配列のライゲーション産物のハイブリダイゼーションを不安定化するのに用いられるエレメント（例えば、不安定化部分）を含むように、プローブをデザインする。結果として、ライゲーションの後、ライゲーションされた基質は解離し、その結果、ライゲーション産物の出来高(turnover)がもたらされる、例えば、２つのライゲーションプローブを含むライゲーション産物が標的配列から脱ハイブリダイズし、標的配列を解放して、別のプローブセットとハイブリダイズする。
【００７７】
[0083]  加えて、解放（例えば、ハイブリダイズしていない）ライゲーションプローブの濃度を増大させることによってもまた、平衡を、標的配列からライゲーション産物（または移動産物）が放出される方向へと駆動する一助とすることができる。したがって、本発明の一部の実施形態では、標的の濃度より１，０００，０００倍高いプローブ濃度を用いるのに対し、他の実施形態では、プローブ濃度が、標的濃度より１０，０００〜１００倍高い。当業者により理解される通り、解放プローブ濃度を増大させることは、それ自体で用いることもでき、本明細書で概観される、産物出来高(product turnover)（例えば、増幅）を達成するための任意の実施形態と共に用いることもできる。プローブ濃度を増大させることにより、結果として産物出来高(product turnover)を増大させうる一方、また、これにより、プローブの加水分解、および標的を介さないライゲーションなど、顕著な標的外反応ももたらされうる。
【００７８】
[0084]  一態様では、プローブエレメントが、ライゲーション産物の溶融温度を低下させる構造を含む。一部の実施形態では、隣接しない標的核酸塩基にハイブリダイズするようにプローブエレメントをデザインする、例えば、ハイブリダイズしてはいるがライゲーションはしていない２つのプローブ間には「ギャップ」が存在する。一般に、これは、プローブドメインとライゲーション部分との間に、１つまたは２つのリンカーを用いることによりなされる。すなわち、第１のプローブドメインと第１のライゲーション部分との間にリンカーが存在する場合もあり、第２のプローブドメインと第２のライゲーション部分との間にリンカーが存在する場合もあり、これらの両方の場合もある。一部の実施形態では、ギャップが、単一の核酸塩基を含むが、所望に応じて、より多くの核酸塩基もまた用いることができる。当業者により理解される通り、反応速度とリンカーの長さとの間にはトレードオフが存在する場合があり；一又は複数のリンカーの長さがあまりに長いために、接触の結果、ライゲーションの反応速度が不利となる場合は、より短いリンカーが望ましい。しかし、反応速度が重要とならない一部の場合には、ギャップの長さ、および結果として得られるリンカーを長くして、１〜１０核酸塩基の範囲のギャップを可能とすることができる。一般に、この実施形態で重要なことは、一又は複数のリンカーの長さが、ギャップ内における核酸塩基の数におおよそ対応することである。
【００７９】
[0085]  本発明のこの実施形態の別の態様では、ライゲーション産物内に、標的配列と比較した脱塩基部位が形成されることを用いて、二重鎖を不安定化させる。例えば、ＡｂｅおよびＫｏｏｌ（J Am. Chem. Soc.（2004）、126:13980-13986）は、２つの異なる８マーのオリゴヌクレオチドプローブ（Bu42およびDT40）を、同じ７マーのプローブ（Thio 4）とライゲーションした場合の出来高(turnover)を比較した。Ｔｈｉｏ４をＤＴ４０とライゲーションすると、ほぼ天然のＤＮＡ構造を有し、ＤＮＡ標的と完全にマッチする、連続する１５マーのオリゴヌクレオチドプローブが形成される。しかし、Ｔｈｉｏ４をＢｕ４２とライゲーションすると、１５マーのオリゴヌクレオチドプローブが形成されるが、該プローブを標的と結合させる場合、それは、アルカンリンカーの範囲である中央部において、脱塩基部位を有する。標的と結合させたときのこれら２つのプローブの溶融温度（Tm）を比較したところ、約１２℃の溶融温度差が示された（Bu42の58.5度に対して、DT40の70.7℃）。この溶融温度における１２℃の差により、プローブセット（10,000倍の過剰; 10μMの濃度）を、標的（1nM）と比較して大幅に過剰するように存在させたところ、２５℃で、産物出来高(product turnover)がおおよそ１０倍増大した（Bu42の91.6に対して、DT40の8.2）。同様に、Ｄｏｓｅら（Dose 2006）は、２つの同一の配列である、化学的ライゲーションされたＰＮＡプローブについて、Ｔｍを４℃低下（57℃に対して53℃）させると、結果として、産物出来高(product turnover)が約４倍増大することを示した。
【００８０】
[0086]  近年の研究は、化学的ライゲーションベースのＱｕｅｎｃｈｅｄ  ＡｕｔｏＬｉｇａｔｉｏｎ（ＱＵＡＬ）プローブを用いて、ＲＮＡの発現についてモニタリングし、細菌細胞およびヒト細胞内における単一の塩基ミスマッチを検出することについて示している（参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００４／０１０１０１１）。
【００８１】
[0087]  一実施形態では、不安定化部分が、安定化部分を除去することに基づいている。すなわち、ライゲーションプローブが、それが標的にハイブリダイズすることを安定化させる部分を含有する場合、ライゲーションが生じ、該安定化部分が放出されると、ライゲーション産物の安定性が低下する。したがって、産物による阻害を軽減するための１つの一般的なスキームは、初期の化学的ライゲーション反応の経過時において、またはライゲーション後における副次的反応後において、副溝結合分子などの分子実体を放出するプローブを開発することである。オリゴヌクレオチド配列に応じて、Ｋｕｔｙａｖｉｎ（Kutyavin 1997；およびKutyavin 2000）により説明されている、ジヒドロピロロインドールトリペプチド（ＤＰＩ３）などの副溝結合剤は、オリゴヌクレオチドプローブの末端にコンジュゲートすると、二重鎖核酸のＴｍを最大で４０℃上昇させることができる。これに対し、ＤＰＩ３の非結合形は、同じ二重鎖のＴｍを２℃ほど上昇させるに過ぎない。したがって、副溝結合剤を用いて、結合強度が増強されたプローブセットを作製しうるが、反応の経過中において副溝結合剤が放出されれば、結合の増強は失われ、ライゲーション産物は、該副溝結合剤がなおも結合しているプローブと比べて、Ｔｍが低下する。
【００８２】
[0088]  適切な副溝結合分子には、ジヒドロピロロインドールトリペプチド（ＤＰＩ３）、ジスタマイシンＡ、およびピロールイミダゾールポリアミド（Gottesfeld, J.M.ら、J. Mol. Biol.（2001）、309:615-629）が含まれるがこれらに限定されない。
【００８３】
[0089]  副溝結合分子に加えて、テザリング型挿入剤および類縁分子もまた、オリゴヌクレオチド二重鎖の溶融温度を著明に上昇させ、この安定化は、非テザリング状態では著明に低下する（Doganら、J. Am. Chem Soc.（2004）、126:4762-4763；およびNarayananら、Nucleic Acids Research （2004）、32:2901-2911）。
【００８４】
[0090]  同様に、当業者により理解される通り、三重らせんを形成することが可能なオリゴヌクレオチドフラグメント（DNA、PNA、LNAなど）を結合させたプローブも、放出されると、標的配列に対するライゲーション産物の安定化を結果として低下させる安定化部分として用いることができる（Pooga, Mら、Biomolecular Engineering（2001）、17:183-192）。
【００８５】
[0091]  ライゲーション産物の結合強度を低下させることにより、産物による阻害を軽減するための別の一般的なスキームは、ライゲーション地点に脱塩基部位を組み込むことである。この手法は、Ａｂｅ（J. Am. Chem. Soc.（2004）、126:13980-13986）により既に示されているが、また、副次的なプローブ再編成をデザインしてライゲーションされたプローブと標的とのアライメントを乱すことにより、Ｔｍの低下をさらに増幅することも可能である。例えば、Ｄｏｓｅら（Org. Letters（2005）、7:20、4365-4368）は、ＰＮＡ塩基間の間隔を、理想的な１２個のシグマ結合から１３個のシグマ結合へと変更する、ライゲーション後における再編成の結果、Ｔｍが４℃低下することを示した。標的に対する産物の結合に干渉するか、またはオリゴヌクレオチド塩基の喪失を結果としてもたらす、より大規模な再編成および副次的反応により、Ｔｍをさらに低下させることができる。
【００８６】
[0092]  本発明は、再編成時において最大４個のシグマ結合による鎖収縮を結果としてもたらし、これにより、Ｄｏｓｅにより説明されている化学反応を用いる、１塩基の拡張と比較して、再編成後におけるＴｍに対して顕著な影響を及ぼす、ライゲーション反応のための方法および組成物を提供する。この化学反応は、既に説明されている（Offerら、J Am Chem Soc.（2002）、124（17）:4642-6）アシル転移補助剤に基づく。鎖収縮が完了すると、別個の分子との、またはそれ自体との別の反応を経過することが可能な遊離チオールが生成される。例えば、このチオールであれば、内部のチオエステルと反応し、オリゴヌクレオチドを大きくキンクさせ、これにより、ライゲーション産物が標的に結合する能力をさらに低下させることが可能であろう。
【００８７】
[0093]  したがって、この実施形態では、官能基を放出するライゲーション反応で、ライゲーション産物との副次的反応を経過する反応により、ライゲーション産物と標的配列とのハイブリッド体を不安定化させることができる。
【００８８】
ライゲーションプローブのさらなる機能性
[0094]  標的ドメイン、ライゲーション部分、および任意選択のリンカーに加えて、本発明のライゲーションプローブのうちの１または複数は、プロモーター配列およびプライマー配列（または、アッセイに応じて、これらの相補体）、標識プローブ結合配列およびアンカー配列を含めた標識が含まれるがこれらに限定されない、さらなる機能性を有しうる。各種のスペーサー配列（また、スタッファー配列とも称する）を含めたさらなる機能性については、ＣＬＰＡアッセイとの関連で、本明細書の下記で説明する。
【００８９】
[0095]  本発明の一態様では、上流オリゴヌクレオチドプローブが、酵素による後続の増幅反応のためのプロモーター部位またはプライマー結合部位を有しうる。一実施形態では、上流プローブが、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列、例えば、Ｔ７、ＳＰ６、またはＴ３を含有する。別の実施形態では、上流および下流両方のオリゴヌクレオチドが、プライマー結合配列を含有する。プロモーター配列およびプライマー結合配列は、核酸標的と感知可能な程度には相互作用しないようにデザインされる。好ましい実施形態では、複数の標的を同時に検出する場合、ライゲーションおよび精製後において、必要に応じ、すべてのライゲーション産物が、同じ酵素および／または同じプライマーを用いて同時に増幅されうるように、反応物中におけるすべてのオリゴヌクレオチドプローブのセットが、同一のプロモーターまたはプライマー対の結合部位を含有するようデザインされる。
【００９０】
[0096]  一実施形態では、ライゲーションプローブのうちの１または複数が、プロモーター配列を含む。プロモーター配列を用いる実施形態では、プロモーター配列またはその相補体が、適切なポリメラーゼがそれと相互反応することを可能とするのに十分な長さである。ポリメラーゼ相互作用に十分な長さの配列についての詳細な説明は、とりわけ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌにおいて見出すことができる。特定の実施形態では、増幅法が、例えば、ポリメラーゼをプロモーターと相互作用させ；ポリメラーゼを用いて鋳型依存的な形でヌクレオチド鎖を合成し；新たに形成された核酸二重鎖を変性させて鎖を分離する連鎖的な手順であるがこれらに限定されない、少なくとも１サイクルの増幅を含む。
【００９１】
[0097]  別の実施形態では、ライゲーションプローブのうちの一方または両方が、プライマー配列を含む。下記で概観する通り、本発明のライゲーション産物は、酵素による増幅反応など、さらなる反応において用いることができる。一実施形態では、ライゲーションプローブが、さらなるレベルの増幅を可能とするようにデザインされたプライマー配列を含む。本明細書で用いられる「プライマー」という用語は、純粋な制限消化を受ける天然の場合であれ、合成により作製される場合であれ、核酸鎖と相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれた場合に、すなわち、適切な緩衝液（「緩衝液」には、ｐＨ、イオン強度、共因子などが含まれる）中で適切な温度下にある、異なるヌクレオチド三リン酸と、ポリメラーゼとの存在下に置かれた場合に、核酸配列合成の開始点として作用することが可能なヌクレオチド配列を指す。プライマーの１または複数のヌクレオチドは、例えば、メチル基、ビオチン部分またはジゴキシゲニン部分、蛍光タグを付加することにより、または放射性ヌクレオチドを用いることにより修飾することができる。プライマー配列は、鋳型の正確な配列を反映する必要がない。例えば、非相補的なヌクレオチドフラグメントを、プライマーの５’端に結合させて、プライマー配列の残りは、標的鎖と実質的に相補的とすることができる。
【００９２】
[0098]  複数のプライミング配列およびプライマーを用いることにより、第１のライゲーション産物を、さらなるライゲーション産物の鋳型として用いることができる。これらのプライマー配列は、ＰＣＲ反応のプライミング部位として用いることができ、これを用いて、ライゲーション産物を増幅することができる。ＰＣＲ反応に加えて、他の増幅法においても、リガーゼ鎖反応、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）、ニック翻訳による位置指定増幅（NICK）、プライマー伸長／ニック翻訳、および当技術分野で知られる他の方法が含まれるがこれらに限定されないプライミング配列を用いることができる。本明細書で用いられる「増幅」とは、特定の核酸のコピー数の増大を指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの増幅反応において作製される特定の核酸コピーを、「アンプリコン」または「増幅産物」と称する。
【００９３】
[0099]  増幅はまた、プライマー部位を、元のライゲーション産物を生成させた、第１のライゲーションプローブのセットと同一の配列を含む場合もあり、含まない場合もある、新たなライゲーションプローブのセットのためのハイブリダイゼーション部位として用いる、第２のライゲーション反応を介しても行うことができる。このようにして、後続の増幅サイクルにおけるライゲーション産物の増幅を介して、標的配列を指数関数的に増幅する。
【００９４】
[00100]  本発明のこの態様の別の実施形態では、プライマー配列を、ネスト化ライゲーション反応に用いる。このようなネスト化ライゲーション反応では、例えば、所望の鎖に対するビオチニル化プライマーと、ストレプトアビジンでコーティングしたビーズ（特に、磁気ビーズ）上における捕捉を用いることにより、ライゲーション産物を捕捉するように、本明細書で説明される方法を用いて第１のライゲーション反応を達成する。ライゲーション産物を捕捉した後、捕捉ビーズ、プローブなどに結合しているライゲーション産物の末端から空間的に離れた（すなわち、該末端の下流における）ライゲーション産物の区画内において、ライゲーションプローブをプライマー配列とハイブリダイズさせることにより、第２のライゲーション反応を達成する。第２のライゲーション反応のためのプライマー配列のうちの少なくとも１つを、アンカー配列または捕捉配列を含め、ライゲーションプローブではない、ライゲーションプローブと相補的なライゲーション産物の領域内に配置する。したがって、この第２のライゲーション反応に由来するライゲーション産物は、必然的に、第１の化学的ライゲーションからの形成に成功した配列だけから結果として得られるものであり、これにより、増幅反応から「偽陽性」が除去される。別の実施形態では、第２の反応において用いられるプライマー配列は、ＰＣＲなど、他の種類の増幅反応のためのプライマー部位となりうる。
【００９５】
[00101]  一実施形態では、ライゲーションプローブのうちの１または複数が、アンカー配列を含む。本明細書において、「アンカー配列」とは、検出を目的として、ライゲーション産物が支持体に結合することを可能とするライゲーションプローブの構成要素を意味する。適切な検出手段には、それに適切な捕捉部分を結合させた支持体が含まれる。一般に、このような結合は、アンカー配列が、それと実質的に相補的な捕捉プローブとハイブリダイズすることにより生じる。
【００９６】
[00102]  本発明のこの態様の一実施形態では、対象の標的には結合しないが、その後、適切な固体支持体またはある種のデバイス上におけるライゲーション産物を捕捉するのに用いられる、さらなるヌクレオチドセグメントを有するように、上流オリゴヌクレオチドをデザインする。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、ライゲーション後、結果として得られる産物が、その３’端における固体支持体のための捕捉配列と、その５’端における検出可能な標識とを含有し、ライゲーション産物だけが、捕捉配列および標識の両方を含有するように、下流オリゴヌクレオチドが、検出可能な標識をそれに結合させている。
【００９７】
[00103]  多重標的の検出に適する、本発明の別の実施形態では、プローブセットの各上流プローブを、その３’端において、ＤＮＡアレイ上における異なる位置に対応する固有の配列を有するようにデザインすることができる。プローブセットの各下流プローブは、他の下流プローブと同一であるが、また、その各々の標的に対応する、固有の標的結合配列も含む、検出可能な標識を任意選択により含有しうる。ＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーション後には、アドレス配列（上流のプローブ）および標識（下流プローブ）の両方を有する、ライゲーションされたプローブだけが観察可能である。
【００９８】
[00104]  本発明の別の態様では、ライゲーション産物が、そのより３’端側に検出可能な標識を有し、そのより５’端側に捕捉配列を有するように、検出可能な標識を上流プローブに結合させ、捕捉配列を下流プローブの一部とすることができる。正確な立体構造は、合成が容易であることのほか、その後ライゲーション反応の産物を検出するのに用いられるデバイスの特徴も考慮することにより、最もよく判定される。
【００９９】
[00105]  アンカー配列は、核酸部分および非核酸部分の両方を有しうる。したがって、例えば、ポリエチレングリコールリンカーを含めた、アルキル基などのフレキシブルなリンカーを用いて、アンカー配列の核酸部分と、支持体表面との間にスペースをもたらすことができる。ライゲーション産物が大型である場合、これは特に有用である。
【０１００】
[00106]  加えて、場合によっては、「ユニバーサルアレイ」の捕捉プローブに対応するアンカー配列のセットも用いることができる。当技術分野で知られる通り、アレイは、解析される試料の標的配列とは非相補的であるが、ライゲーションプローブセットのアレイ結合配列とは相補的であるようにデザインされる捕捉プローブとして、合成による一般配列により作製することができる。プローブの同じアレイ結合配列は、異なる標的認識配列と共に再利用する／これらと対合させうるため、これらの「ユニバーサルアレイ」は、複数種類の試料および診断検査に用いることができる。
【０１０１】
[00107]  一実施形態では、ライゲーションプローブのうちの１または複数が標識を含む。本明細書において、「標識」または「標識された」とは、化合物が、その検出を可能とする目的で結合させた少なくとも１つの元素、同位体、または化合物を有すること、例えば、ライゲーションプローブ、またはライゲーション産物もしくは移動産物を、既知の検出法を用いて、例えば電子的方法、分光分析法、光化学法、または電気化学発光法を用いて検出可能とすることを意味する。一般に、標識は、３つのクラス：ａ）放射性の場合もあり、原子量の大きな同位体の場合もある、同位体標識；ｂ）磁気標識、電子標識、熱標識；ならびにｃ）着色標識または発光色素に分類されるが；標識には、酵素ならびに磁気粒子などの粒子もまた含まれる。色素は、発色団の場合もあり、リン光体の場合もあるが、それらの強力なシグナルにより、良好なシグナル対ノイズ比をもたらす蛍光色素が好ましい。本発明で用いるのに適する色素には、ユーロピウムおよびテルビウムによる複合体を含めた蛍光ランタニド複合体、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、カルボキシフルオレセイン（FAM）、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、ウンベリフェロン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー（商標）、テキサスレッド、アレクサ色素、ダンシルクロリド、フィコエリチン、緑色蛍光タンパク質およびその波長シフト型変異体、ボディビー、およびＨａｕｇｌａｎｄ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」（Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）、第６版；「Ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ  ｃａｔａｌｏｇ」（Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘ．）；Ｌａｋｏｗｉｃｚ、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」、第２版、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）において説明される色素など、当技術分野で知られる他の色素、ならびに参照により本明細書に明示的に組み込まれるＲｉｃｈａｒｄ  Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」の第６版において説明される他の色素が含まれるがこれらに限定されない。さらなる標識には、参照により本明細書に明示的に組み込まれる米国出願第０９／３１５，５８４号において説明されている、ナノ結晶またはＱドットが含まれる。
【０１０２】
[00108]  好ましい実施形態では、標識が、結合パートナー対の一部に結合する第２の標識である。例えば、標識は、その結合パートナーに結合するハプテンまたは抗原でありうる。好ましい実施形態では、結合パートナーを、固体支持体に結合させて、伸長したプライマーと、伸長しなかったプライマーとを分離させることができる。例えば、適切な結合パートナー対には、抗原（タンパク質（ペプチドを含めた））および抗体（それらのフラグメント（Ｆａｂなど）を含めた）；ビオチン／ストレプトアビジンを含めた、タンパク質および低分子；酵素および基質または阻害剤；他のタンパク質間相互作用対；受容体−リガンド；ならびに炭水化物およびそれらの結合パートナーが含まれるがこれらに限定されない。核酸間結合タンパク質対もまた、有用である。一般に、対のうちの小型の分子が、ＮＴＰに結合して、プライマー内へと組み込まれる。好ましい結合パートナー対には、ビオチン（イミノビオチン）およびストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、およびＡｂ、ならびにＰｒｏｌｉｎｘ（商標）試薬が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０３】
好ましい実施形態では、結合パートナー対が、ビオチンまたはイミノビオチンと、ストレプトアビジンとを含む。イミノビオチンが、ストレプトアビジンから、ｐＨ４．０の緩衝液中で解離するのに対し、ビオチンは、強力な変性剤（例えば、９５℃における６Ｍ  ＨＣｌグアニジニウム、ｐＨ１．５または９０％ホルムアミド）を必要とするので、イミノビオチンが特に好ましい。
【０１０４】
[00109]  好ましい実施形態では、結合パートナー対が、一次検出標識（例えば、ライゲーションプローブに結合させる）と、該一次検出標識に特異的に結合する抗体とを含む。本明細書において、「特異的に結合する」とは、パートナーが、該対と、系の他の成分または夾雑物とを差別化するのに十分な特異性で結合することを意味する。結合は、非特異的結合を除去する洗浄工程を含めた、アッセイ条件下において結合を維持するのに十分であるものとする。一部の実施形態では、対の解離定数が、約１０−４〜１０−６Ｍ−１未満であり、約１０−５〜１０−９Ｍ−１未満であることが好ましく、１０−９Ｍ−１であることが特に好ましい。
【０１０５】
[00110]  好ましい実施形態では、二次標識が、化学修飾可能部分である。この実施形態では、反応性官能基を含む標識が核酸内に組み込まれる。次いで、官能基を、一次標識により続いて標識することができる。適切な官能基には、アミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、オキソ基、およびチオール基が含まれるがこれらに限定されないが、アミノ基およびチオール基が特に好ましい。例えば、当技術分野で知られるリンカーを用いて、例えば、よく知られるホモ二官能性またはヘテロ二官能性のリンカー（参照により本明細書に組み込まれる、1994年版Pierce Chemical社カタログ、架橋リンカーについての技法の節、155〜200頁を参照されたい）を用いて、例えば、アミノ基を含有する一次標識を、アミノ基を含む二次標識に結合させることができる。
【０１０６】
[00111]  この実施形態では、標識がまた、標識プローブ結合配列またはその相補体でもありうる。本明細書において、「標識プローブ」とは、結合配列と実質的に相補的であり、一般には直接に標識される核酸を意味する。
【０１０７】
合成法
[00112]  本発明の組成物は一般に、既知の合成法を用いて作製される。一般に、標準的なホスホルアミダイト化学反応に基づく方法が、本発明の一態様では特に用いられるが、当業者により理解される通り、多種多様な核酸合成反応が知られている。
【０１０８】
[00113]  当技術分野では、ハロ脱離基を有するプローブを作製する方法が知られており；例えば、それらの各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ａｂｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００６）、１０３（２）：２６３−８；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００５）、３３（１５）：４９７８−８６；Ｃｕｐｐｏｌｌｅｔｔｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．（２００５）、１６（３）：５２８−３４；Ｓａｎｄｏら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．（２００４）、４；１２６（４）：１０８１−７；Ｓａｎｄｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｕｐｐｌ．（２００２）、２：１２１−２；Ｓａｎｄｏら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．（２００２）、１２４（１０）：２０９６−７；Ｘｕら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００１）、１９（２）：１４８−５２；Ｘｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９８）、２６（１３）：３１５９−６４；Ｍｏｒａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９７）、９４（２０）：１０５０６−１１；Ｋｏｏｌ、米国特許第７，０３３，７５３号；Ｋｏｏｌ、米国特許第６，６７０，１９３号；Ｋｏｏｌ、米国特許第６，４７９，６５０号；Ｋｏｏｌ、米国特許第６，２１８，１０８号；Ｋｏｏｌ、米国特許第６，１４０，４８０号；Ｋｏｏｌ、米国特許第６，０７７，６６８号；Ｋｏｏｌ、米国特許第５，８０８，０３６号；Ｋｏｏｌ、米国特許第５，７１４，３２０号；Ｋｏｏｌ、米国特許第５，６８３，８７４号；Ｋｏｏｌ、米国特許第５，６７４，６８３号；およびＫｏｏｌ、米国特許第５，５１４，５４６号を参照されたい。
【０１０９】
[00114]  当技術分野で知られる通り、標識、プライマー配列、プロモーター配列などのさらなる構成要素も、一般に組み込まれる。フルオロフォアおよび消光剤を付加する場合のスペース形成もまた、よく知られている。
【０１１０】
副次的反応
[00116]  ライゲーション反応産物または移動反応産物を検出する前に、さらなる増幅反応を行う場合がある。副次的増幅反応を用いて、例えば、標的の１コピー当たりに作製されるライゲーション産物数を増大させることにより、標的配列を検出するためのシグナルを増大させることができる。一実施形態では、鎖置換増幅（SDA）、核酸配列ベースの増幅（NASBA）、ライゲーションによる増幅、およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が含まれるがこれらに限定されず；とりわけ、「定量的競合ＰＣＲ」または「ＱＣ−ＰＣＲ」、「任意プライムＰＣＲ」または「ＡＰ−ＰＣＲ」、「イムノＰＣＲ」、「Ａｌｕ−ＰＣＲ」、「一本鎖立体配座多形ＰＣＲ」または「ＰＣＲ−ＳＳＣＰ」、「逆転写酵素ＰＣＲ」または「ＲＴ−ＰＣＲ」、「ビオチン捕捉ＰＣＲ」、「ベクトレットＰＣＲ」、「パンハンドルＰＣＲ」、ならびに「ＰＣＲセレクトｃＤＮＡサブトラクション」を含め、多数のＰＣＲ変化形を含めた、任意の回数の標準的な増幅反応を、ライゲーション産物に対して実施することができる。一実施形態では、増幅法が、ＰＣＲではない。特定の実施形態によれば、ギャップ充填ＯＬＡおよびＬＣＲ、架橋オリゴヌクレオチドによるライゲーション、ＦＥＮ−ＬＣＲ、および補正ライゲーションが含まれるがこれらに限定されない、ギャップ充填ライゲーションなどのライゲーション法を用いることができる。これらの技法についての説明は、とりわけ、米国特許第５，１８５，２４３号；欧州特許出願公開第ＥＰ３２０３０８号、同第ＥＰ４３９１８２号；ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ９０／０１０６９号およびＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ０２／０２８２３号；ならびに米国特許出願第０９／８９８，３２３号において見出すことができる。
【０１１１】
[00117]  標準的な酵素による増幅反応に加えて、初期に生成されるライゲーション産物が、それ自体、副次的な化学ライゲーション反応の標的となりうるプローブスキームをデザインすることも可能である。
【０１１２】
[00118]  さらに、出発試料核酸に対して、「前増幅反応」を行い、化学反応によるライゲーションの標的配列をより多く生成させることもできる。例えば、全ゲノム増幅を行うことができる。
【０１１３】
アッセイ
[00119]  当業者により理解される通り、本発明の方法および組成物を用いるアッセイは、所望の適用に応じて多種多様な構成を取ることが可能であり、これらには、ｉｎ  ｓｉｔｕにおけるアッセイ（FISHと同様のアッセイ）、溶液ベースのアッセイ（例えば、フルオロフォアおよび／または消光剤の移動／除去）、および異種アッセイ（例えば、高密度アレイを用いるなど、操作、除去、および／または検出のために固体支持体を用いるアッセイ）が含まれうる。加えて、本明細書で概観される通り、標的配列の前増幅、およびライゲーションを行った後における副次的増幅反応など、さらなる反応が含まれうる。
【０１１４】
[00120]  本明細書で説明される、本発明のこの態様に適するアッセイは、シグナルの増大、例えば、蛍光または化学発光の発生の増大に依拠しうる。しかし、当業者により理解される通り、このようなシグナルの減少に依拠するアッセイもまた可能である。
【０１１５】
[00121]  一実施形態では、ＦＩＳＨ反応と同様、アッセイ反応は、「ｉｎ  ｓｉｔｕ」において実施される（また、試料に応じ、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」および／または「ｅｘ  ｖｉｖｏ」など各種のアッセイフォーマットにおいても言及される）。外因的な酵素を添加する必要がないので、標的配列、特に、疾患状態または他の病態と関連する標的配列の存在を決定するための組織学的試料など、細胞（生細胞、電気穿孔細胞、固定細胞など）に試薬を添加することができる。
【０１１６】
[00122]  加えて、試料から標的細胞を抽出する場合には、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」アッセイを行うことができる。当技術分野で行われる通り、試料を加工し（例えば、パラフィン包埋試料の場合、試料を調製することができる）、試薬を添加し、反応を進行させた後で、検出を行うことができる。
【０１１７】
[00123]  一実施形態では、固体支持体を用いてライゲーション産物を検出する。例えば、アンカープローブ／捕捉プローブとのハイブリダイゼーション、または結合パートナー対（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン）を用いるなど、他の結合法を用いて、ライゲーション産物をビーズに結合させる。一実施形態では、転移反応の結果、ビオチン部分が、第１のライゲーションプローブから、標識を含む第２のライゲーションプローブへと転移する。ストレプトアビジンを含むビーズを試料と接触させ、該ビーズを、例えば、ＦＡＣＳ法を用いて、標識の存在について調べる。
【０１１８】
[00124]  他の実施形態では、異種アッセイを用いて、ライゲーション産物を検出する。すなわち、溶液中において反応を行い、生成物を、アレイまたはビーズなどの固体支持体へと添加する。一般に、一方のライゲーションプローブは、アンカー配列または結合対パートナー（例えば、ビオチン、ハプテンなど）を含み、他方のライゲーションプローブは、標識（例えば、フルオロフォア、標識プローブ結合配列など）を含む。ライゲーション産物を固体支持体へと添加し、該支持体を任意選択により洗浄する。この実施形態では、ライゲーション産物だけが捕捉され、標識される。
【０１１９】
[00125]  本発明の別の態様では、オリゴヌクレオチドプローブのうちの１つを、ライゲーション産物の容易な操作を可能とする磁気ビーズまたは他の何らかの標識（ビオチン）に結合させる。この磁気ビーズまたは標識は、本明細書で概観される任意の数の構成を用いて、上流プローブまたは下流プローブに結合させる。
【０１２０】
[00126]  本明細書で説明される通り、さらなる機能的部分（例えば、アンカー配列、プライマー、標識など）を付加する場合は、副次的反応もまた行うことができる。同様に、本明細書で説明される通り、副次的増幅反応も行うことができる。
【０１２１】
[00127]  検出系は当技術分野で知られており、これらには、光学アッセイ（蛍光アッセイおよび化学発光アッセイが含まれる）、酵素アッセイ、放射性標識化、表面プラズモン共鳴、磁気抵抗、カンチレバー偏向、表面プラズモン共鳴などが含まれる。一部の実施形態では、ライゲーション産物を、例えば、参照により本明細書に組み込まれる２００６／００６８３７８において説明されている、さらなるアッセイ法において用いることができ、ライゲーション産物を、コロイドなどの光散乱粒子間におけるリンカーとして用いることにより、ライゲーション産物の存在下において、色の変化を結果としてもたらすことができる。
【０１２２】
[00128]  一部の実施形態では、検出系を試料採取用試験管内に含むことができ；例えば、アッセイを血液採取デバイスの試験管またはデバイス内へと組み込んで、病原体または疾患の検出を可能とすることができる。
【０１２３】
固体支持体
[00129]  上記で概観した通り、アッセイは、各種の方法で行うことができる。固体支持体上における検出を用いるアッセイでは、アレイを含めた各種の固体支持体が本発明で用いられる。
【０１２４】
[00130]  本発明の一部の実施形態では、ビーズなどの固体支持体を用いる。例えば、上記で概観した通り、結合パートナー対（一方がライゲーション産物上にあり、もう一方がビーズ上にある）を用いて、ライゲーションされなかった反応物質を除去することができる。この実施形態では、磁気ビーズが特に好ましい。
【０１２５】
[00131]  本発明の一部の実施形態では、捕捉プローブを固体支持体に結合させて検出する。例えば、捕捉プローブをビーズに結合させて、任意の適切な技法、例えば、ＦＡＣＳ法を用いる後続の解析を行うことができる。同様に、下記で説明されるビーズアレイも用いることができる。
【０１２６】
[00132]  一実施形態では、本発明が、各アレイの位置が、一般に「捕捉プローブ」と称する、共有結合させた核酸プローブを最小限で含むアレイを提供する。本明細書において、「アレイ」とは、アレイフォーマットにおける複数の核酸プローブを意味し；アレイのサイズは、その組成および使用目的に依存する。約２〜数千個の異なる捕捉リガンドを含有するアレイを作製することができる。一般に、電極ベースのアッセイでは、電極のサイズ、およびその使用目的に応じて、アレイが、２〜１００，０００個以上の捕捉リガンドを含む。好ましい範囲は、捕捉リガンド約２〜約１０，０００個であり、約５〜約１０００個が好ましく、約１０〜約１００個が特に好ましい。一部の実施形態では、本発明の組成物が、アレイフォーマットでない場合もある；すなわち、一部の実施形態では、単一の捕捉プローブを含む組成物もまた作製することができる。加えて、一部のアレイでは、組成が異なる場合であれ、同一の場合であれ、複数の基板を用いることができる。したがって、例えば、大型のアレイが、複数の小型の基板を含みうる。核酸アレイは、当技術分野で知られており、多くの方法でこれを分類することができ；序列化アレイ（例えば、化学的実体を異なる部位に分解することができる）、および無作為化アレイ（例えば、ビーズアレイ）の両方が含まれる。序列化アレイには、光リソグラフィー法を用いたアレイ（例えば、Affymetrix GeneChip（登録商標））、スポッティング法を用いたアレイ（Synteniら）、プリント法を用いたアレイ（Hewlett Packard and Rosetta社製）、電極アレイ、三次元「ゲルパッド」アレイ、および液体アレイが含まれるがこれらに限定されない。
【０１２７】
[00133]  好ましい実施形態では、アレイを基板上に置く。本明細書では、「基板」もしくは「固体支持体」または他の文法的同等物は、核酸の結合または会合に適する異なる個別の部位を含有するように改変されうる任意の材料を意味する。基板は、当業者により理解される通り、ガラス、プラスチック、ポリマー、金属、メタロイド、セラミック、および有機物が含まれるがこれらに限定されない、多種多様な材料を含みうる。固体支持体がビーズである場合、磁気材料、ガラス、ケイ素、デキストラン、およびプラスチックが含まれるがこれらに限定されない多種多様な基板が可能である。
【０１２８】
ハードウェア
マイクロ流体装置
[00134]  本発明の別の態様では、Ｌｉｕ（２００６）により説明されている流体デバイスと類似の流体デバイスを用いて、本明細書で説明される方法を自動化することができる。カートリッジ、デバイス、ポンプ、ウェル、反応チャンバー、および検出チャンバーが含まれるがこれらに限定されない構成要素については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９４２，７７１号を参照されたい。流体デバイスはまた、磁気粒子の捕捉ゾーン、細胞分離用の膜（すなわち、Pall社製のLeukotrap（商標））を含めた分離フィルターおよび分離樹脂も含みうる。デバイスは、リアルタイムＰＣＲ増幅時において生成される蛍光シグナルをインカートリッジで画像化するための検出チャンバー（すなわち、SYBR green、Taqman、およびMolecular Beacons）、ならびに反応生成物（アンプリコンおよびライゲーション産物）をオンデバイスで分離および検出するためのキャピラリー電気泳動チャネルを含みうる。好ましい実施形態では、キャピラリー電気泳動チャネルを、プラスチック製の基板により成形し、篩分け用ポリマーマトリックス（Applied Biosystems社製のPOP-7（商標））を充填することができる。篩分け用以外のマトリックスを含有するチャネルもまた、適正にデザインされたプローブセットと共に用いることができる。
【０１２９】
[00135]  好ましい実施形態では、本発明のデバイスが、各ステーションまたはステーションのセットにおいて流体を投入および排出するための構成要素を含めた、液体操作用の構成要素を含む。液体操作システムは、任意の数の構成要素を含むロボットシステムを含みうる。加えて、本明細書で概観される工程のうちのいずれかまたはすべては、自動化することができ；したがって、例えば、システムを、完全にまたは部分的に自動化することができる。
【０１３０】
[00136]  当業者により理解される通り、１または複数のロボットアーム；マイクロプレートを配置するためのプレート操作具；カートリッジおよび／またはキャップを有するホルダー；交差汚染除去型プレート上に置かれるウェル用の覆いを取り外したり置き換えたりするための自動式の覆い操作具またはキャップ操作具；ディスポーザブルのチップにより試料を分配するためのチップアセンブリー；試料を分配するための洗浄式チップアセンブリー；９６ウェルローディングブロック；保冷型試薬ラック；マイクロ滴定プレート用のピペット設置個所（任意選択により保冷型）；プレートおよびチップを積み重ねるためのタワー；ならびにコンピュータシステムが含まれるがこれらに限定されない、多種多様な構成要素を用いることができる。
【０１３１】
[00137]  完全ロボット式システムまたは完全マイクロ流体システムは、スクリーニングに適用する場合のすべての工程を実施するハイスループットピペッティングを含めた、自動式液体操作システム、自動式粒子操作システム、自動式細胞操作システム、および自動式生物操作システムを包含する。これは、吸引、分注、混合、希釈、洗浄、正確な容量移動など、液体、粒子、細胞、および生物の操作；ピペットチップの回収および廃棄；ならびに単回の試料吸引から多数回の送液を行うための、同一容量の反復的なピペッティングを含む。これらの操作は、交差汚染を伴わない、液体、粒子、細胞、および生物の移動である。この装置は、マイクロプレート試料を、フィルター、膜、および／または娘プレートへと自動的に多連化し、高密度で移動させ、全プレートによる希釈系列を作製し、作業を高速で実施する。
【０１３２】
[00138]  好ましい実施形態では、アッセイ成分に対して特異性を有する、化学的に誘導体化した、粒子、プレート、カートリッジ、試験管、磁気粒子、または他の固相マトリックスを用いる。マイクロプレート、試験管、または任意の固相マトリックスによる結合表面には、非極性表面、高度の極性表面、共有結合を促進する修飾デキストランコーティング、抗体コーティング、融合タンパク質または融合ペプチドに結合するアフィニティー媒体、組換えプロテインＡまたは組換えプロテインＧなどの表面固定化タンパク質、ヌクレオチド樹脂またはヌクレオチドコーティングが含まれるが、本発明では、他のアフィニティーマトリックスも有用である。
【０１３３】
[00139]  好ましい実施形態では、マルチウェルプレート、マルチ試験管、ホルダー、カートリッジ、ミニ試験管、深底ウェルプレート、マイクロ遠心管、極低温用バイアル、角型ウェルプレート、フィルター、チップ、光ファイバー、ビーズ、または各容量の他の固相マトリックス用のプラットフォーム、および様々な容量を有するプラットフォームを、グレードアップしてさらなる性能を得ることが可能なモジュール型プラットフォーム上に収納する。このモジュール型プラットフォームは、速度可変型オービタルシェーカー、ならびに試料供給源、試料希釈液および試薬希釈液、アッセイプレート、試料容器および試薬容器、ピペットチップ用のマルチポジション型作業台、ならびに可動型洗浄ステーションを含む。
【０１３４】
[00140]  好ましい実施形態では、熱サイクラーおよび熱制御システムを用いて、制御型ブロックまたは制御型プラットフォームなど、熱交換器の温度を安定化させ、試料をインキュベートするときの温度を、摂氏０度〜摂氏１００度に正確に制御するが；これは、ステーションの熱制御装置に加えてであるか、またはその代わりである。
【０１３５】
[00141]  好ましい実施形態では、単一または複数の磁気プローブ、アフィニティープローブを有する交換型のピペットヘッド、またはピペッターにより、液体、粒子、細胞、および生物をロボット式で操作する。マルチウェル、またはマルチチューブ磁気分離機、またはプラットフォームが、単一または複数の試料形態である液体、粒子、細胞、および生物を操作する。
【０１３６】
[00142]  一部の実施形態では、装置構成が、標識およびアッセイに応じて、多種多様な異なる検出器でありうる検出器を含む。好ましい実施形態では、有用な検出器に、多重チャネルの一又は複数の蛍光顕微鏡；蛍光解析器、電気化学解析器、および／または電気的インピーダンス解析器をもたらすプレートリーダー、単一波長および二重波長のエンドポイントならびに反応速度の性能を有する紫外光および可視光の分光光度検出、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）、発光、消光、２光子励起、ならびに強度再分配；データおよび画像を捕捉し、定量化可能なフォーマットへと変換するＣＣＤカメラ；キャピラリー電気泳動システム、質量分析器、およびコンピュータワークステーションが含まれる。
【０１３７】
[00143]  これらの装置は、滅菌多層型のドラフト内に適合させうるか、またはマルチウェルプレートもしくは試験管内において培養物を増殖および形質転換させるため、ならびに危険な作業を行うための、封入型システム、自己収納型システムである。生細胞は、生細胞アッセイの時系列に応じた、温度、湿度、およびガスの制御を伴う、制御された増殖条件下において増殖させることができる。細胞の自動式形質転換、ならびに自動式コロニーピッカーにより、所望の細胞の迅速なスクリーニングを促進することができる。
【０１３８】
[00144]  フローサイトメトリーフォーマットまたはキャピラリー電気泳動フォーマットを用いて、磁気ビーズおよび他のビーズ、粒子、細胞、ならびに生物を個別に捕捉することができる。
【０１３９】
[00145]  フレキシブルなハードウェアおよびソフトウェアにより、多数の適用に対する装置の適合性が可能となる。ソフトウェアプログラムのモジュールにより、方法の創出、改変、および実行が可能となる。システム診断モジュールは、装置の配線、適正な接続、およびモーターの作動を可能とする。カスタマイズ型ツール、ラブウェア、ならびに液体、粒子、細胞、および生物の移動パターンにより、異なる適用を実施することが可能となる。データベースは、方法およびパラメータの保存を可能とする。ロボットおよびコンピュータによるインターフェースは、装置間の通信を可能とする。
【０１４０】
[00146]  好ましい実施形態では、ロボット式装置が、バスを介して、メモリーならびに一連の入力／出力デバイス（例えば、キーボード、マウス、モニター、プリンターなど）と通信する中央処理ユニットを含む。ここでもまた、下記で概観される通り、これは、本発明のマルチプレックス型デバイス用のＣＰＵに加えての場合もあり、これに代わる場合もある。中央処理ユニット、メモリー、入力／出力デバイス、およびバスの間における一般的な相互作用は、当技術分野で知られている。したがって、行われる実験に応じて、各種の異なる手順がＣＰＵメモリー内に保存される。
【０１４１】
[00147]  これらのロボット式流体操作システムでは、緩衝液、試薬、試料、洗浄剤、標識プローブなどのアッセイ構成要素などを含めた、任意の数の異なる試薬を用いることができる。
【０１４２】
キット
[00148]  本発明の別の態様では、本明細書で説明されるプローブ、技法、方法、および化学的ライゲーション反応を用いる、所定の核酸標的セットを日常的に検出するためのキットを、検出プロセスの一部として作製する。キットは、プローブ、標的配列、指示書、緩衝液、および／または他のアッセイ構成要素を含みうる。
【０１４３】
化学的ライゲーション依存型プローブ増幅（CLPA）
[00149]  別の実施形態では、本発明が、化学的ライゲーション依存型プローブ増幅（CLPA）法に関する。ＣＬＰＡは、標的特異的なオリゴヌクレオチドプローブを化学的ライゲーションすることにより、ライゲーション産物を形成させることに基づく。このライゲーション産物を、その後、酵素による増幅反応の鋳型として用いてアンプリコンを生成させ、その後、任意の適切な手段を用いてこれを解析する。ＣＬＰＡは、複雑な遺伝子署名パターンの解析が含まれるがこれらに限定されない、各種の目的に用いることができる。酵素によるライゲーション反応を用いるＤＡＳＬ（Bibikova, M.ら、American Journal of Pathology（2004）、165:5、1799-1807）およびＭＬＰＡ（Schouten、米国特許第６，９５５，９０１号）など、他の技法とは異なり、ＣＬＰＡでは、化学的ライゲーション反応を用いる。
【０１４４】
[00150]  一実施形態では、ＣＬＰＡアッセイが、標的配列上に適正に配置された場合に自己ライゲーションしうる反応性部分を組み込むオリゴヌクレオチドプローブ対の使用を含む。好ましい実施形態では、一方のプローブ上の３’−ホスホロチオエート部分が、他方のプローブ上の５’−ＤＡＢＳＹＬ脱離基と反応する（スキーム１および図６を参照されたい）。
【０１４５】
【化１】
2012531887.tif 000003
スキーム１：３'ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（Sプローブ）と、５'ＤＡＢＳＹＬ修飾オリゴヌクレオチド（Lプローブ）との化学的ライゲーション反応
【０１４６】
[00151]  ５’−ＤＡＢＳＹＬ基は、他の部分、例えば、ヨウ素より約４倍速く反応し、また、合成時におけるプローブの精製も簡略化する。
【０１４７】
[00152]  ＣＬＰＡは、他の配列ベースのハイブリダイゼーション法を上回る、複数の顕著な利点を有する。第１に、ＣＬＰＡは、あらかじめＤＮＡのコピーを作製する必要なしに、直接ＲＮＡ解析に適用することができる。第２に、ＣＬＰＡは、試料中の夾雑物に対して比較的低感度であり、血液、尿、唾液、および便などの体内試料を含めた不純試料に直接適用することができる。第３に、ＣＬＰＡは、伴う工程が他の既知の方法より少なく、このため、結果を得るのに必要とされる時間が短縮される。さらに、ＣＬＰＡプローブは、乾燥保存が可能であり、相補的な標的配列の存在下において、適正にデザインした系を自発的に反応させて、２つ以上のオリゴヌクレオチドを連結することもできる。化学的ライゲーション反応は、優れた配列選択性を示し、一塩基多型を識別するのに用いることができる。
【０１４８】
[00153]  酵素によるライゲーション法と異なり、ＣＬＰＡは、ＤＮＡ標的およびＲＮＡ標的に対してほぼ同一の反応性を示すことが重要であり、下記でより完全に説明する通り、このことが、ＣＬＰＡを他の既知の系より効率的とし、ＣＬＰＡを用いうる適用の範囲を広いものにしている。
【０１４９】
[00154]  ＣＬＰＡアッセイは、結果を達成するのに必要とされる工程の数を削減し、これにより、大幅な短時間内で結果を達成する可能性をもたらしている。例えば、標準的な逆転写酵素（RT）マルチプレクスリガーゼ依存型プローブライゲーション（MLPA）の一般的な工程の流れは、以下の通りである：
１．全ＲＮＡを単離する工程。
２．逆転写酵素を用いてｃＤＮＡコピーを作製する工程。
３．一晩にわたり、ＭＬＰＡプローブセットを、ｃＤＮＡ標的とハイブリダイズさせる工程。
４．ＤＮＡリガーゼを添加して、標的に結合したプローブを連結する工程。
５．ライゲーションされたプローブを増幅する工程、例えば、Ｔａｑポリメラーゼおよび蛍光標識したＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ増幅工程。
６．例えば、ＣＥにより試料を解析する工程。
【０１５０】
[00155]  標準的なＲＴ−ＭＬＰＡと異なり、ＣＬＰＡは、細胞および血液の溶解物に対して、ならびにＲＮＡ標的に対して直接解析を行うことを可能とする。したがって、ＲＴ−ＭＬＰＡと異なり、ＣＬＰＡは、ＲＮＡを単離し、次いで、逆転写を実施してｃＤＮＡコピーを作製した後にライゲーションを実施する必要を回避する。これにより、結果を達成するための時間が短縮され、より迅速な解析を達成するための手段がもたらされる。
【０１５１】
[00156]  ＣＬＰＡのさらなる利点は、ビオチン標識プローブについて下記で説明する通り、一方のプローブ上に捕捉部分を組み込むことにより、結果として得られるライゲーション産物を、粗試料から、あらゆる不純物および標的以外の核酸材料を含まない形で精製するための迅速で特異的な方法を可能とすることである。この能力は、感染性作用物質（細菌、真菌、ウイルス）を検出する場合など、標的以外の核酸が大幅に過剰する存在下で標的核酸を見出す適用において、特に有利である。この場合、宿主核酸が大量に存在すると、高性能の抽出法を用いることが必要となり、この結果、標的以外の核酸および／または妨害的な夾雑物のキャリーオーバーが大量であるために、標的核酸の増幅が非効率的となりうる。
【０１５２】
[00157]  本発明のこの態様の別の実施形態では、より高いプローブ濃度でハイブリダイゼーション反応を駆動することにより、反応時間の短縮がさらに促進される。したがって、例えば、投入されるプローブセットを、例えば、ＭＬＰＡ反応で典型的に用いられる濃度より約１００倍高い、比較的高濃度のＣＬＰＡ反応に組み込むことができる。プローブ濃度を著明に上昇させることにより、ハイブリダイゼーション工程に必要とされる時間を、典型的には、一晩から、約１５分間〜約１時間へと短縮する。
【０１５３】
[00158]  より高いプローブ濃度を用いる場合、とりわけ、高度なマルチプレックス解析（例えば、約５種類を超える標的）の場合は一般に、増幅の前に精製工程を組み込むことが好ましい。本発明のこの態様の一実施形態では、膜による捕捉、磁気ビーズによる捕捉、および／または粒子による捕捉を含めた、固相支持体ベースの捕捉法を用いることができる。好ましい実施形態では、ライゲーションの後で、かつ、酵素による増幅の前に、ビオチン／ストレプトアビジンを有する磁気ビーズによる精製プロトコールを用いる。ある場合には、後続の増幅反応に干渉することなく、磁気粒子を、増幅マスター混合物に直接添加することができる。他の場合には、捕捉されたオリゴヌクレオチドをビーズから放出させ、その後、放出されたオリゴヌクレオチド溶液を、捕捉粒子または捕捉表面を存在させることなしに増幅することが好ましい。
【０１５４】
[00159]  好ましい実施形態では、プローブが、リガーゼを添加することなしに自己ライゲーションしうるように、ＣＬＰＡが、プローブセットを核酸標的配列とハイブリダイズさせることを含む。ライゲーション産物が生成された後は、該産物の検出および解析を容易にする増幅が一般に好ましい。この目的で、例えば、ユニバーサルＰＣＲプライマーなどのＰＣＲプライマーを組み込むようにプローブをデザインすることが好ましい。好ましい実施形態では、反応のライゲーション部分が完了した後まではユニバーサルプライマーを添加せず、該プライマーは、表面捕捉による精製の後、多くはＰＣＲマスター混合物の一部として、ポリメラーゼと共に添加される。
【０１５５】
[00160]  ＣＬＰＡプローブは、それが核酸標的に結合すると、空間的に近接して配向し、酵素を添加することなしにライゲーション反応を経過しうるように配置された反応性部分を有する。好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼであることが多い増幅酵素により効率的に増幅されうる、ライゲーション反応産物がもたらされるように、化学的ライゲーション部分が選択される。理論に拘束されずに述べるなら、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼにより増幅することが可能であると知られている基質により酷似する反応産物を生成させる化学的ライゲーション反応およびプローブセットデザインによれば、ＣＬＰＡアッセイにおいて用いうる効率的なプローブセットがもたらされる可能性が高まる。とりわけ好ましい反応のための化学的実体は、３’−ホスホロチオエートと５’−ＤＡＢＳＹＬ脱離基との反応を含むスキーム１に示される生成物など、天然のＤＮＡに酷似する反応生成物をもたらす化学的部分である。別の好ましい実施形態では、プローブセットが、３’−ジホスホロチオエート（Miller, G.P.ら、Bioorganic and Medicinal Chemistry（2008）、16:56-64）および５’−ＤＡＢＳＹＬ脱離基を含む。
【０１５６】
[00161]  ＣＬＰＡプローブはまた、ライゲーション産物の長さを調整するのに、スタッファー配列（本明細書ではまた、可変スペーサー配列とも称する）も組み込む。下記でさらに説明する通り、長さのばらつきにより、一又は複数のライゲーション産物の解析を容易とするのに便利な手段がもたらされる。スタッファーは、いずれのプローブ上に配置することもできるが、一般には、Ｓプローブ（３’−ホスホロチオエートプローブ）上に組み込むことが便利である。
【０１５７】
[00162]  本発明のこの態様の一実施形態であるＣＬＰＡ−ＣＥでは、長さのばらつきに基づき、特定の標的配列を検出および同定するための基盤をもたらす、１または複数の可変長ライゲーション産物を生成させるために、スタッファー配列の長さを変化させる。好ましい実施形態では、キャピラリー電気泳動（CE）により、可変長ライゲーション産物を解析する。一般には、異なるライゲーション産物の長さが、少なくとも１塩基対〜約１０塩基対；好ましくは、１塩基対〜４塩基対の範囲内で変化するように、スタッファー配列を組み入れる。好ましい実施形態では、異なるライゲーション産物の長さが、約８０ｂｐ〜約４００ｂｐ；好ましくは約１００ｂｐ〜約３００ｂｐの範囲内；より好ましくは、約１００ｂｐ〜約２００ｂｐの範囲内で変化する。
【０１５８】
[00163]  別の実施形態では、ＣＬＰＡプローブがまた、ライゲーション産物の解析および検出を容易とする他の任意選択による一又は複数のエレメントも含有しうる。例えば、本明細書でＣＬＰＡ−ＭＤＭと称する実施形態において用いられるプローブのうちの１つには、マイクロアレイプラットフォーム上における適切な捕捉配列に結合する、アレイ結合配列を組み込むことが好ましい。ＣＬＰＡ−ＭＤＭの場合、異なるＣＬＰＡ反応産物は、サイズの差違により分離されるのではなく、アレイ結合配列の差違により分離される。この実施形態では、各ＣＬＰＡプローブが、ＤＮＡマイクロアレイ上における固有の部位に結合するように、アレイ結合配列の配列を変化させる。ＣＬＰＡ−ＭＤＭにおけるアレイ結合配列の長さは通常、１５〜１５０塩基、より特定すれば、２０〜８０塩基、および最も特定すれば、２５〜５０塩基で変化する。一部の実施形態では、ＣＬＰＡプローブが、一又は複数のライゲーション産物を精製または検出するために、蛍光標識などの標識、ならびに、例えば、ビオチンなどのハプテン部分が含まれるがこれらに限定されない、精製および／または解析を容易とする他のエレメントも含むことが好ましい。例えば、ビオチンを組み込んだプローブおよび／または一あるいは複数のライゲーション産物は、ビーズを含めた、任意の適切なアビジン／ストレプトアビジンプラットフォーム上で精製することができる。ビオチン／アビジン捕捉系が好ましいが、ハイブリダイゼーション／オリゴヌクレオチドによる捕捉を用いうるのと同様、他のハプテン系（例えば、ジゴキシゲニン（DIG）による標識化）も用いることができる。後続の段階でビーズから捕捉産物を放出させることが望ましい場合は、ハイブリダイゼーション／オリゴヌクレオチドによる捕捉が、好ましい方法である。磁気ビーズに加えて、抗ハプテン標識支持体（濾紙、多孔性フィルター、表面捕捉支持体）も用いることができる。
【０１５９】
[00164]  ＣＬＰＡプローブによる標識化は、いずれのプローブ上でも用いることができ、末端でも内部でも用いることができる。ホスホロチオエート（Sプローブ）の５’端にビオチンを組み込むことが好ましい。
【０１６０】
[00165]  ＣＬＰＡプローブは一般に、各プローブにつき、２５０ナノモル（nM）〜０．０１ｐＭ（ピコモル）の濃度で、反応に組み込まれる。一般に、濃度は、約１ｎＭ〜約１ｐＭである。プローブ濃度を選択する場合に考慮すべき因子には、具体的なアッセイと、解析される標的とが含まれる。Ｓプローブまたはホスホロチオエートプローブまたは求核プローブ、ならびにＬプローブまたは脱離基プローブまたはＤＡＢＳＹＬ含有プローブは、標的の濃度以上の濃度で組み込まれる。ＳプローブおよびＬプローブの全濃度は、最高で１０マイクロモル（uM）に達しうる。非限定的な例として述べると、ＳプローブおよびＬプローブの各々につき１ｎＭずつで２５０対のＣＬＰＡプローブ対であれば、５００ｎＭ（１プローブ当たり１ｎＭ×１対当たり２プローブ×標的２５０個）と等濃度となり、各プローブにつき１０ｎＭずつであれば、５ｕＭの全濃度を意味するであろう。
【０１６１】
[00166]  標的の濃度は通常、全ＲＮＡ約１０マイクログラム〜約１０ナノグラムの範囲であるが、最低で遺伝子の単一コピーの場合もある。
【０１６２】
[00167]  ＣＬＰＡ法の好ましい実施形態では、ＣＬＰＡプローブセットが、相補的な反応基を含む２つのオリゴヌクレオチドプローブからなる（図１および２）。別の実施形態では、ＣＬＰＡプローブセットが、互いに隣接して標的に結合する３つ以上のプローブからなることが可能である。３つのプローブによるＣＬＰＡ反応の好ましい実施形態では、酵素による増幅のプライマー結合部位を含有するように外側プローブをデザインし、他のプローブの間にある標的領域に及ぶように内側プローブをデザインする。より好ましい実施形態では、内側（中央）プローブの不在下では、それらが互いに反応することが不可能であるように、外側プローブが、非相補的な反応基を有する（図３）。場合によっては、一方の基が一方のプローブの５’端に位置し、他方の基が他方のプローブの３’端に位置することを除き、両方の外側プローブが類似の反応部分を有することが可能であり、Ｌプローブの化学的実体もまた、その上における配置を除き、互いに類似しうる。当業者に知られている通り、２つのプローブによるＣＬＰＡ系のためのプローブと比較して、３つのプローブによるＣＬＰＡ反応のためのプローブを作製するには、異なる化学反応試薬および化学反応プロセスが必要とされうる。
【０１６３】
[00168]  ３つのプローブによるＣＬＰＡ系の好ましい実施形態では、一方の外側プローブが３’−ホスホロチオエート（3'-Sプローブ）を含有し、他方の外側プローブが５’−ホスホロチオエート（5'-Sプローブ）を含有し、中央プローブが３’−ＤＡＢＳＹＬ脱離基および５’−ＤＡＢＳＹＬ脱離基の両方を含有する。５’−ＤＡＢＳＹＬ脱離基によるプローブの作製については、既に報告されている（Sandoら、J Am Chem Soc.（2002）、124（10）:2096-7）。本発明者らは近年、３’−ＤＡＢＳＹＬ脱離基を日常的に組み込むことを可能とする、新規のＤＮＡ合成試薬を開発した（図４）。
【０１６４】
ＣＬＰＡ−ＣＥ
[00169]  一実施形態では、一又は複数のＣＬＰＡライゲーション産物が、篩分け用マトリックス上におけるサイズ差別化キャピラリー電気泳動（CE）により、またはスラブゲル電気泳動により検出される。ＣＬＰＡ−ＣＥの概略表示を、図１に示す。この例では、化学的手段、機械的手段、または浸透圧的手段を含めた任意の適切な手段により細胞を溶解し、適切にデザインされたプローブを添加した後に、血液試料に対して直接に解析を実施する。好ましい実施形態では、細胞の化学的溶解を用いる。図６は、ＣＬＰＡ−ＣＥ解析のためのプローブセットのデザインについての一般的な概略表示を示す。この例では、その後に一又は複数のライゲーション産物を増幅するためのユニバーサルＰＣＲプライマーを含むようにＳプローブをデザインし；長さが特定の標的と相関するスタッファー配列をデザインし；標的結合配列をデザインする。同様に、Ｌプローブも、標的結合配列およびユニバーサルプライマーを含む。プローブは通常、フルオロフォア（FAM、Cy3、Cy5など）により標識するが、それらはまた、蛍光標識なしに検出することもできる。標識化は、蛍光標識されたＰＣＲプライマーを用いることにより行う。
【０１６５】
[00170]  ＣＬＰＡ−ＣＥプローブのこの実施例では、Ｓプローブがまた、ライゲーションされなかったプローブの精製および除去を容易とするように、５’端にビオチン部分も含む。各々が固有の長さを有する一又は複数のライゲーション産物を増幅した後で、ＣＥにより、または他の適切なサイズ分離法により、反応混合物を分離する。各生成物のピークの高さまたは強度は、標的配列の発現、すなわち、試料中における標的レベルを反映する（図１および図７）。
【０１６６】
ＣＬＰＡ−ＭＤＭ
[00171]  本発明のこの態様の別の実施形態では、ＣＬＰＡライゲーション産物を、マイクロアレイ解析により解析／検出する（CLPA-MDM）。ＣＬＰＡ−ＭＤＭの概略表示を、図２に示す。ＣＬＰＡ−ＭＤＭは、ＣＬＰＡ−ＣＥと、少なくとも以下の点において異なる。第１に、プローブセットのデザインが異なる。例えば、ＣＬＰＡ−ＭＤＭプローブセットの一般的表示を、図２に示す。ＣＬＰＡ−ＣＥプローブと同様に、ＣＬＰＡ−ＭＤＭプローブセットも、一又は複数のライゲーション産物を増幅するためのユニバーサルプライマーを含みうる。ＣＬＰＡ−ＭＤＭプローブもまた、標的特異的配列のほか、酵素に依存しないライゲーションのためのライゲーション部分を含む。加えて、ＣＬＰＡ−ＭＤＭプローブもまた、スタッファー配列を含みうるが、このスタッファー配列の目的は、酵素による増幅の効率を標準化しようと努める中で、ＣＬＰＡ−ＭＤＭのサイズを同じ長さに調整することである。アンプリコンのサイズを標準化することは、要件ではないが、好ましい実施形態である。ＣＬＰＡ−ＣＥプローブセットのデザインとＣＬＰＡ−ＭＤＭプローブセットのデザインとの第２の差違は、後者が、適切なマイクロアレイプラットフォームと共に用いるための、固有のアレイ結合配列を含むことである。
【０１６７】
[00172]  本発明のＣＬＰＡ−ＭＤＭによる態様に関して述べると、検出のための「ユニバーサル」マイクロアレイプラットフォームと共に用いられるプローブデザインには、マイクロアレイ結合部位（ABS配列）が組み込まれる。ＣＬＰＡ−ＣＥ系と同様に、例えば、蛍光標識されたＰＣＲプライマーを用いることにより、プローブを、フルオロフォアで標識することが好ましい。代替的に、例えば、サンドイッチアッセイ標識法を、最終的なリードアウトに用いることもできる。サンドイッチアッセイは、スタッファー配列の代わりに、またはこれに加えて、共通の（一般的な）標識結合部位（LBS）を含むプローブをデザインする工程、およびアレイハイブリダイゼーション工程中に該部位と結合する副次的なプローブを用いる工程を含む。この方法は、アレイを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識オリゴヌクレオチドなどの化学発光系により、または電気化学的検出系により標識することが望ましい場合、特に有用である。一般に、リードアウトには、平面状マイクロアレイ（例えば、スライドガラスまたはプリント基板上にスポットしたマイクロアレイ）を用いる。しかし、Ｌｕｍｉｎｅｘ社およびＩｌｌｕｍｉｎａ社から市販されているマイクロアレイなど、ビーズ型マイクロアレイ（例えば、Luminex社製、xMAP/xタグ）もまた、用いることができる。
【実施例１】
【０１６８】
５つの標的に対する定量的マルチプレックス検出
それらの各々に対するＣＬＰＡプローブ（表１）（各々１ｎＭずつのSプローブおよびLプローブ）の存在下において１つの反応物中に混合した、５つのＤＮＡ標的模倣体（MOAP1遺伝子の部分（配列番号５）、PCNA遺伝子の部分（配列番号９）、DDB2遺伝子の部分（配列番号１２）、BBC3遺伝子の部分（配列番号１６）、およびBAX遺伝子の部分（配列番号１９）に対応する）を用いて、マルチプレックスＣＬＰＡ反応を実施した。標的模倣体は、表２に示す異なる濃度でプールした。標的模倣体、Ｓプローブ、およびＬプローブを、５０℃で１時間、ＰＣＲ緩衝液（１×のPCR緩衝液を、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．３とする）中においてインキュベートした。各反応混合物の１ｕｌアリコートを、ユニバーサルプライマー（配列番号１および２；３００ｎＭ）の存在下においてＤｙｎａｍｏ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍｉｘを用いるＰＣＲ増幅のための鋳型として用いた。２７サイクル（９５℃で１５分間の後、９５℃（１０秒間）、６０℃（２４秒間）、７２℃（１０秒間）による２７サイクル）にわたり、試料をＰＣＲサイクルにかけた。ＰＣＲ増幅の後、試料を変性させ、ＡＢＩ  ３１３０型ＤＮＡシークエンサー（キャピラリー電気泳動装置）内へと注入した。３つの試料についてＡＢＩから得られたＣＥトレース、ならびにＰＣＮＡのピーク対標的模倣体濃度のプロットを図７に示し、注入物濃度に対する関数としてのＰＣＮＡシグナルの直線的応答についてのプロットを図８に示す。
【０１６９】
【表１】
2012531887.tif 000004
【０１７０】
【表２】
2012531887.tif 000005
【０１７１】
【表３】
2012531887.tif 000006
【実施例２】
【０１７２】
ＭＯＡＰ１  ＤＮＡ標的模倣体およびＤＤＢ２  ＤＮＡ標的模倣体ならびにＲＮＡ標的模倣体を用いるＣＬＰＡ反応
表３に示す通り、ＭＯＡＰ１遺伝子およびＤＤＢ２遺伝子のＤＮＡ標的模倣体またはＲＮＡ標的模倣体、ならびに該配列を標的とするように設計したＣＬＰＡプローブセットを用いて反応物を２連で調製した。プローブ番号は、表１の配列番号を指す。試薬は、表４に示す濃度および容量で添加した。Ｓプローブ、Ｌプローブ、および標的模倣体をそれぞれ、０．２ｍＬのＰＣＲ用試験管内において、６０分間５０℃まで加熱し、その後、４０サイクルで増幅するリアルタイムＰＣＲ反応における鋳型として、２．５μｌのＣＬＰＡ反応物を用いた。リアルタイムＰＣＲデータを２連の試料について平均したが、これを表３（Ct値の欄）に示す。ＲＮＡ標的模倣体とＤＮＡ標的模倣体との間で観察されたＣｔ値の差は最小限であり、これにより、ＲＮＡ基質およびＤＮＡ基質に対するプローブライゲーションの効率が同様であることが示される。
【０１７３】
【表４】
2012531887.tif 000007
【０１７４】
【表５】
2012531887.tif 000008
【実施例３】
【０１７５】
溶解緩衝液および溶解された血液中におけるＤＤＢ２  ＲＮＡ転写物についての直接的な解析
Ａｍｂｉｏｎ社製のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写キット、およびＯｒｉｇｅｎｅ社製のｃＤＮＡ用ベクタープラスミド（sc122547）を用いて、ＤＤＢ２メッセンジャーＲＮＡ（mRNA）を調製した。ｍＲＮＡの濃度は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡアッセイキットを用いて決定した。異なる濃度のＤＤＢ２  ｍＲＮＡ転写物を水または全血液中でスパイクすることにより、ＤＤＢ２プローブセット（表５）を調べた。反応混合物の成分を、表５に列挙する。試料１〜４は、水中に１０ｎｇ、１ｎｇ、０．１ｎｇ、および０．０１ｎｇのＤＤＢ２転写物からなり、試料５〜８は、全血液中にスパイクした同じ濃度範囲からなった。タンパク質の凝固を軽減するように、血液試料にプロテイナーゼＫを添加することを除き、同様の反応プロトコールに従った。手順は以下の通りである。表５の濃度および容量で、試薬を添加した。Ｓプローブ、ｍＲＮＡ転写物、グアニジンヒドロクロリド溶解緩衝液、ならびに水（試料１〜４）または全血液（試料５〜８）を、５分間８０℃まで加熱し、次いで、これらを、５５℃の加熱ブロックへと移した。Ｌプローブ、洗浄緩衝液、ストレプトアビジンビーズ、およびプロテイナーゼＫを添加し、５５℃で６０分間反応物をインキュベートした。加熱ブロックから試料を取り出し、Ｄｙｎａｌ社製ＭＰＣ  ９６Ｓ磁気捕捉プレートを用いて磁気ビーズを捕捉した。上清を除去し、洗浄用緩衝液により３回ビーズを洗浄した。ＤｙＮａｍｏ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（２５ｕｌ、１×）、およびユニバーサルプライマー（配列番号１および２；３００ｎＭ）をビーズに添加し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ＭＸ４０００リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、３０サイクル（９５℃で１５分間、９５℃（１０秒間）、６０℃（２４秒間）、７２℃（１０秒間）による３０サイクル）にわたり、試料を熱サイクルにかけた。Ｃｔ値を記録し、アンプリコンの長さを検証するために、増幅された試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ社製Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００内へと注入した。すべてのアンプリコンは適正なサイズ（約９６ｂｐ）を示し、血液試料および水試料について結果が同等であったことから、溶解させた血液中においてＲＮＡを直接解析する可能性が裏付けられた。結果を、以下の表７にまとめる。
【０１７６】
【表６】
2012531887.tif 000009
【０１７７】
【表７】
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【０１７８】
【表８】
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【実施例４】
【０１７９】
３つのプローブによるＣＬＰＡ−ＣＥアッセイ
表８に示す通り、ＤＮＡ標的模倣体プローブである配列番号２３、ならびに３つのプローブによるＣＬＰＡプローブセット（配列番号２０、２１、および２２）を用いて、反応物を２連で調製した。プローブ番号は、表１の配列番号を指す。試薬は、表９に示す濃度および容量で添加した。Ｓプローブ、Ｌプローブ、および標的模倣体を、０．２ｍＬのＰＣＲ用試験管内において、６０分間５０℃まで加熱し、その後、２５サイクルで増幅するＤｙＮａｍｏ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎによるＰＣＲ反応における鋳型として、２．５μｌのＣＬＰＡ反応物を用いた。リアルタイムＰＣＲデータを２連の試料について平均したが、これを表８（Ct値の欄）に示す。次いで、Ａｇｉｌｅｎｔ社製Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００により、各反応物のうち１μｌずつの試料を解析し、反応産物のサイズを決定した。
【０１８０】
【表９】
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【０１８１】
【表１０】
2012531887.tif 000013
【実施例５】
【０１８２】
マルチプレックスリアルタイムＣＬＰＡによるｍＲＮＡの検出
０．２ｍｌのＰＣＲ用試験管に、色の異なる二重標識プローブに対して固有の結合部位を有するように操作された４セットのＣＬＰＡ試薬を添加した。反応物は、表１０および表１１に示す通りに調製した。ＣＬＰＡプローブセットおよび二重標識プローブは、表１の配列番号２５〜３６に対応する。Ｓプローブおよびランオフ転写物であるｍＲＮＡ（GAPDH mRNA、PCNA mRNA、およびDDB2 mRNA）を、２×の溶解緩衝液（ＧｕＨＣｌ溶解緩衝液（１×）を、３Ｍ  ＧｕＨＣｌ、２０ｍＭ  EDTA、５ｍＭ  DTT、１．５％  Triton、３０ｍＭトリス  ｐＨ７．２とする）に添加し、５分間８０℃まで加熱した。氷上において試料を冷却し、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ（DYNAL社製M-270）およびＬプローブを添加した。５０℃で１時間試料を加熱した。ＤＹＮＡＬ社製ＭＰＣプレート上において磁気ビーズを捕捉し、洗浄緩衝液により２回洗浄した。ビーズを再度捕捉し、４種類の異なる二重標識プローブおよびユニバーサルＰＣＲプライマー（全容量２５ｕｌ）と共に、１×のＤｙＮａｍｏ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘを添加した。ＦＡＭチャネル、Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ  ｏｒａｎｇｅ  ５６０チャネル、Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０チャネル、およびＱｕａｓａｒ  ６７０チャネルにおける蛍光発光をモニタリングするのに適正なフィルターと共にＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ＭＸ４０００リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、３０サイクル（９５℃で１５分間、９５℃（１０秒間）、６０℃（２４秒間）、７２℃（１０秒間）による３０サイクル）にわたり、試料を熱サイクルにかけた。各チャネルについて観察されたＣｔ値を記録したが、これを表１０に示す。
【０１８３】
【表１１】
2012531887.tif 000014
【０１８４】
【表１２】
2012531887.tif 000015
【図１】
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【図２】
2012531887.tif 000017
【図３】
2012531887.tif 000018
【図４】
2012531887.tif 000019
【図５】
2012531887.tif 000020
【図６】
2012531887.tif 000021
【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年12月1日(2011.12.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の複数の異なる標的核酸であって、各標的核酸配列が隣接する第１及び第２の標的ドメインを含む標的核酸を検出する方法であって、
ａ）ｉ）前記異なる標的核酸の一つと、
ｉｉ）１）前記一つの標的核酸の第１の標的ドメインと相補的な第１のプローブドメイン；
２）第１のプライマー配列；及び
３）５’側ライゲーション部分；
を備える第１の核酸ライゲーションプローブと、
ｉｉｉ）１）前記一つの標的核酸の第２の標的ドメインと相補的な第２のプローブドメイン；
２）第２のプライマー配列；及び
３）３’側ライゲーション部分；
を備える第２の核酸ライゲーションプローブと、
をそれぞれが備える、複数のライゲーション基質を用意するステップであって、前記核酸ライゲーションプローブの１つが、可変スペーサー配列を備えるステップと、
ｂ）前記第１及び第２の核酸ライゲーションプローブを、リガーゼ酵素の不在下においてライゲーションして、複数の異なるライゲーション産物を形成させるステップであって、前記異なるライゲーション産物が異なる標的特異的長さを有するステップと、
ｃ）前記ライゲーション産物を増幅するステップと、
ｄ）前記異なる標的長さに基づいて、前記異なるライゲーション産物の存在を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記標的核酸配列がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸配列がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が血液由来である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記試料がパラフィン包埋試料由来である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記検出することが、キャピラリー電気泳動による、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記検出することが、質量分析による、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のプライマー配列がそれぞれ同じであり、前記第２のプライマー配列がそれぞれ同じである、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
標的核酸配列であって、隣接する第１及び第２の標的ドメインを含む標的核酸配列を検出するためのキットであって、
ａ）６ＭのＧｕＨＣｌを含む２×の溶解緩衝液と、
ｂ）ｉ）前記第１の標的ドメインと相補的な第１のプローブドメイン；
ｉｉ）第１のプライマー配列；及び
ｉｉｉ）５’側ライゲーション部分；
を備える第１の核酸ライゲーションプローブと、
ｃ）ｉ）前記第２の標的ドメインと相補的な第２のプローブドメイン；
ｉｉ）第２のプライマー配列；及び
ｉｉｉ）３’側ライゲーション部分；
を備える第２の核酸ライゲーションプローブと、
を備える、キット。
【請求項１０】
前記核酸ライゲーションプローブの１つが、可変スペーサー配列を更に備える、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
試料中の複数の異なる標的核酸であって、各標的核酸配列が隣接する第１及び第２の標的ドメインを含む標的核酸を検出する方法であって、
ａ）ｉ）血液を含む標的試料；及び
ｉｉ）３ＭのＧｕＨＣｌを含む１×の溶解緩衝液；
を含む反応溶液を用意するステップと、
ｂ）前記反応溶液を複数の異なるプローブセットと接触させるステップであって、各プローブセットが、
ｉ）１）前記標的核酸の１つの第１の標的ドメインと相補的な第１のプローブドメイン；
２）第１のプライマー配列；及び
３）５’側ライゲーション部分；
を備える第１の核酸ライゲーションプローブと、
ｉｉ）１）前記標的核酸の１つの第２の標的ドメインと相補的な第２のプローブドメイン；
２）第２のプライマー配列；及び
３）３’側ライゲーション部分；
を備える第２の核酸ライゲーションプローブと、
を備えるステップと、
ｃ）前記第１及び第２の核酸ライゲーションプローブを、リガーゼ酵素の不在下においてライゲーションして、複数の異なるライゲーション産物を形成させるステップと、
ｄ) 前記異なるライゲーション産物を増幅するステップと、
ｅ) 前記ライゲーション産物の存在を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項１２】
前記核酸ライゲーションプローブの１つが、可変スペーサー配列を更に備える、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的核酸がＲＮＡである、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１及び第２の核酸ライゲーションプローブの１つが結合パートナー対の１つを更に備え、前記増幅の前に、前記結合パートナー対の他の１つを備えるビーズが、前記ライゲーション産物を捕捉するために加えられる、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出が、前記可変スペーサー配列を用いてなされる、請求項１２乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成24年9月4日(2012.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2012531887000001.app
【国際調査報告】
2012531887.tif 000024