(57)【要約】  本発明は、突然変異ペスチウイルス、および該ウイルスを含有するワクチンに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性コアタンパク質を発現し得ないウイルスを与える、コアタンパク質をコードする遺伝子における突然変異を有する突然変異ペスチウイルスであって、該ウイルスが、それがＮＳ３のヘリカーゼドメインのＣ末端ドメインに１以上の突然変異を含有することにより更に特徴づけられる、突然変異ペスチウイルス。
【請求項２】
該ペスチウイルスが古典的ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）である、請求項１に記載の突然変異ペスチウイルス。
【請求項３】
ＮＳ３のヘリカーゼドメインのＣ末端ドメイン内の突然変異が、Ａｓｎ２１７７Ｔｙｒ、Ｇｌｕ２１６０Ｇｌｙ、Ｐｒｏ２１８５Ｔｈｒ／Ａｌａ、Ｇｌｎ２１８９Ｌｙｓ、Ｐｒｏ２２００ＴｈｒおよびＡｓｎ２２５６Ａｓｐよりなる群から選択される、請求項２に記載の突然変異ＣＳＦＶ。
【請求項４】
ＮＳ３のヘリカーゼドメインのＣ末端ドメイン内の突然変異がＡｓｎ２１７７Ｔｙｒ突然変異を含む、請求項２または３に記載の突然変異ＣＳＦＶ。
【請求項５】
該ペスチウイルスがウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）である、請求項１に記載の突然変異ペスチウイルス。
【請求項６】
ＮＳ３のヘリカーゼドメインのＣ末端ドメイン内の突然変異が、Ｇｌｕ２１８９Ｌｙｓ、Ｌｅｕ２１９０Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２１９１Ａｌａ、Ａｓｐ２１９２Ｇｌｕ、Ｐｒｏ２１９４Ｌｅｕ、Ｔｙｒ２２０４Ｈｉｓ、Ａｓｎ２２６５Ｔｙｒ、Ａｓｎ２２６５Ａｓｐよりなる群から選択される、請求項５に記載の突然変異ＢＶＤＶ。
【請求項７】
ＮＳ３のヘリカーゼドメインのＣ末端ドメイン内の突然変異がＡｓｐ２１９２Ｇｌｕ、Ｔｙｒ２２０４Ｈｉｓ、Ａｓｎ２２６５ＴｙｒまたはＡｓｎ２２６５Ａｓｐ突然変異を含む、請求項５または６に記載の突然変異ＢＶＤＶ。
【請求項８】
請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の突然変異ペスチウイルスおよび製薬上許容される担体を含むことを特徴とするワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、突然変異ペスチウイルス、および該ウイルスを含有するワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ペスチウイルス（Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ；ペスチウイルス属）は世界中で動物における経済的に重要な疾患を引き起こす。ペスチウイルスはフラビウイルス科に含まれ、少なくとも３つの種、すなわち、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、古典的ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）およびヒツジボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）を含む。ウシおよびヒツジから分離体を含むペスチウイルスの第４の独立群の存在が記載されており、この追加的な種をＢＶＤＶ−２と称することが現在では一般に受け入れられており、したがって、古典的ＢＶＤＶ株はＢＶＤＶ−１と称される。
【０００３】
ＣＳＦＶはブタにおいて古典的ブタコレラを引き起こす。古典的ブタコレラは高伝染性であり、時にはブタにおける致死的な疾患であり、相当な経済的損失を引き起こしうる。動物はワクチン接種によりＣＳＦＶに対して防御されうるが、通常の不活化または修飾生ワクチンは安全性および効力に関する欠点を有する。したがって、新規の改良されたタイプのワクチンが開発されるべきである。
【０００４】
ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）は、多種多様な臨床症状を示す先天性腸疾患の一因である。該疾患は、高い罹患率および低い死亡率を伴う、ウシの伝染性疾患として最初に記載された。罹患したウシは発熱、下痢および咳を示した。該病態はウシウイルス性下痢と称された。今日、ＢＶＤＶは、世界的な経済的影響を及ぼす、ウシの主要病原体だとみなされている。動物群におけるＢＶＤＶ感染の臨床パターンおよびその結果としてそれが生産に及ぼす影響は、ウイルスの株、ウシの年齢、動物群における免疫およびストレス因子の相互作用を含む幾つかの要因に左右される。ＢＶＤＶ−１およびＢＶＤＶ−２は共に、ウシにおける急性感染症（下痢、発熱、出血症候群）ならびに（妊娠中に感染が生じた場合には）流産、胎児の奇形および子ウシの持続的感染を引き起こす。
【０００５】
ペスチウイルスのゲノムは（＋）ＲＮＡの一本鎖からなり、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲに隣接した単一の大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。該ＯＲＦは、１１〜１２個の切断産物を与える大きな前駆体ポリタンパク質をコードしている。該ＯＲＦはそれらの種々のウイルスタンパク質へと細胞プロテアーゼおよびウイルスプロテアーゼによりプロセッシングされる。該ＯＲＦ内のウイルスタンパク質は以下の順序で配置されている：ＮＨ２−Ｎｐｒｏ−Ｃ−Ｅｒｎｓ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ−ＣＯＯＨ。ペスチウイルスビリオンは４つの構造タンパク質、小さな正荷電コア（Ｃ）タンパク質（これはＲＮＡゲノムと一緒になってヌクレオカプシド構造を形成すると考えられている）および３つのグリコシル化エンベロープタンパク質（Ｅｒｎｓ、Ｅ１、Ｅ２）からなる。中和活性は主にＥ２特異的抗体に関して示された。
【０００６】
ペスチウイルスの複製のための最小要件が、例えば、構造タンパク質の遺伝子配列を欠く欠損ペスチウイルスゲノムを作製することにより調べられた。欠損ＣＳＦＶゲノムは尚も複製され、ＳＫ−６細胞内に導入される際にヘルパーＡ１８７−ＣＡＴ  ＲＮＡと共にウイルス粒子内にパッケージングされうることが判明した（Ｍｏｓｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７８７−７７９４，１９９９）。Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７およびＮＳ２をコードする自律複製性であるが欠損性であるＢＶＤＶゲノムは既に記載されていた（Ｂｅｈｒｅｎｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，２３６４−２３７２，１９９８）。もう１つのペスチウイルスのトランス相補ＣおよびＥ１欠失突然変異体におけるＢＶＤＶがＢｅｅｒらによりＷＯ０４／０１６７９４に記載されている。
【０００７】
ＣＳＦＶに関しては、ウイルス弱毒化を示す突然変異体が開示されている。例えば、Ｒｉｓａｔｔｉら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３６４，３７１−３８２，２００７は、弱毒化表現型を示したＥ２領域における置換を有するＣＳＦＶ突然変異体を記載している。Ｍａｕｒｅｒら，ｖａｃｃｉｎｅ，２３（２５），３３１８−２８，２００５も、強毒性ＣＳＦＶでの致死的チャレンジに対して部分的防御を示したＥ２遺伝子の全部または一部を欠くＣＳＦＶ  Ｅ２突然変異体を記載している。Ｍｅｙｅｒｓら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７３（１２），１０２２４−１０２３５，１９９９は、突然変異を招くＥｒｎｓタンパク質をコードする遺伝子における突然変異を有するＣＳＦＶ突然変異体を記載している。トランス相補Ｅｒｎｓ欠失においては、ＣＳＦＶの突然変異体がＷｉｌｄｊｏｊｏａｔｍｏｄｊｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４（７），２９７３−８０，２０００に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第０４／０１６７９４号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｏｓｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７８７−７７９４，１９９９
【非特許文献２】Ｂｅｈｒｅｎｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，２３６４−２３７２，１９９８
【非特許文献３】Ｒｉｓａｔｔｉら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３６４，３７１−３８２，２００７
【非特許文献４】Ｍａｕｒｅｒら，ｖａｃｃｉｎｅ，２３（２５），３３１８−２８，２００５
【非特許文献５】Ｍｅｙｅｒｓら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７３（１２），１０２２４−１０２３５，１９９９
【非特許文献６】Ｗｉｌｄｊｏｊｏａｔｍｏｄｊｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４（７），２９７３−８０，２０００
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、機能性コアタンパク質を発現し得ないウイルスを与える、コアタンパク質をコードする遺伝子における欠失を有する突然変異ペスチウイルスであって、該ウイルスが、それがＮＳ３のヘリカーゼドメインのＣ末端ドメインに１以上の突然変異を含有することにより更に特徴づけられる、突然変異ペスチウイルスを提供する。
【００１１】
好ましくは、本発明の突然変異ペスチウイルスは、古典的ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）またはウシウイルス下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）である。
【００１２】
該コアタンパク質をコードする遺伝子領域における突然変異は、機能性コアタンパク質が発現され得ないものであるべきである。これは、全体的または部分的に該コアタンパク質をコードする遺伝子を欠失させることにより達成されうる。該コアタンパク質のＣ末端におけるシグナル配列は下流のポリタンパク質の更なるプロセッシングに必須である。したがって、該コア遺伝子の（一部）を欠失させる際には、Ｅｒｎｓに関するトランスロケーションシグナル配列が保有されるように注意すべきである。
【００１３】
該トランスロケーション配列は、ＣＳＦＶ  Ｅｒｎｓタンパク質のＮ末端の前の切断部位（Ａｌａ−２６７／Ｇｌｕ−２６８）の前のアミノ酸２５０−２６７に位置する１８アミノ酸の伸長である（Ｒｕｍｅｎａｐｆら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５（２），５８９−５９７，１９９１；Ｒｕｍｅｎａｐｆら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７（６），３２８８−３２９４，１９９３）。ＢＶＤＶに関しては、Ｅｒｎｓタンパク質のＮ末端の前の切断部位はＧｌｙ−２７０／Ｇｌｕ−２７１である。
【００１４】
下流プロセッシングに必要な配列の厳密な長さは株または細胞型によって異なりうる。例えば、ＣＳＦＶに関しては、コアコード配列をアミノ酸１６９−２４８（ｐ６１９）から欠失させて、Ｅｒｎｓのトランスロケーションシグナル（ＣＰＬＷＶＴＳＣ１６８／ＬＥＫＡＬＬＡＷＡＶＩＴＩＬＬＹＱＰＶＡＡ２６７／ＥＮＩＴ）を構成するコアタンパク質のＣ末端アミノ酸にＮｐｒｏのＣ末端を融合させることが可能である。ＢＶＤＶに関しては、コアコード配列をアミノ酸１６９−２５１から欠失させて、ＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓのトランスロケーションシグナル（ＣＰＬＷＶＳＳＣ１６８／ＬＥＫＡＬＬＡＷＡＩＩＡＬＶＦＦＱＶＴＭＧ２７０／ＥＮＩＴ）を構成するコアタンパク質のＣ末端アミノ酸にＮｐｒｏのＣ末端を融合させることが可能である。該コア遺伝子の大部分の欠失はトランスフェクション後のＲＮＡの複製を可能にしたが、感染性ウイルス後代は産生されなかった。
【００１５】
本発明において、機能性コアタンパク質をコードする遺伝子の非存在は該ウイルスゲノムのＮＳ３領域における突然変異により補償されうることが判明した。該コア遺伝子が（前記のとおりに）欠失しているペスチウイルスのｃＤＮＡコピー内へのこれらの突然変異の導入は感染性ウイルスの回収を可能にした。ＮＳ３領域内の突然変異はＮＳ３のヘリカーゼドメインのＣ末端ドメイン内、より詳しくは、該Ｃ末端ドメインの１００アミノ酸内に密集している。ＣＳＦＶに関しては、ＮＳ３領域のヘリカーゼドメインのＣ末端ドメイン（アミノ酸２１６０−２２６０）内の７つの独立した突然変異を特定した。本発明の好ましい突然変異ＣＳＦウイルスは、Ａｓｎ２１７７Ｔｙｒ、Ｇｌｕ２１６０Ｇｌｙ、Ｐｒｏ２１８５Ｔｈｒ／Ａｌａ、Ｇｌｎ２１８９Ｌｙｓ、Ｐｒｏ２２００ＴｈｒおよびＡｓｎ２２５６Ａｓｐよりなる群から選択される、ＮＳ３のヘリカーゼドメインのＣ末端ドメイン内に１以上の突然変異を有する。
【００１６】
ＣＳＦＶコアΔ（ｐ６１９）内への突然変異Ａｓｎ２１７７Ｔｙｒ  ｉｎｔｏ  の導入および該ｃＲＮＡのエレクトロポレーションは生存可能な感染性ウイルス粒子の驚くべき放出を招いた。該ゲノムＲＮＡはノーザンブロット分析におけるサイズにおいて若干減少したようであり、濃縮ウイルス粒子はコアタンパク質を含有していなかった。ウイルス力価はＳＫ６細胞において５×１０５  ｆｆｕ／ｍｌに達し、したがってｐ４４７  ｗｔ力価より約１０倍低かった。次に、残りの突然変異Ｇｌｕ２１６０Ｇｌｙ、Ｐｒｏ２１８５Ａｌａ、Ｇｌｎ２１８９Ｌｙｓ、Ｐｒｏ２２００ＴｈｒおよびＡｓｎ２２５６ＡｓｐをＣＳＦＶコアΔ（ｐ６１９）内に導入して、ｐ１０３３（Ａｌａ２１８５）、ｐ１０３４（Ｔｈｒ２２００）、ｐ１０３５（Ｌｙｓ２１８９）、ｐ１０３６（Ａｓｐ２２５６）、ｐ１０３７（Ｇｌｙ２１６０）およびｐ１０３８（Ａｓｐ２２５６）を得た。全ての場合において、それぞれのＳＰ６転写産物のエレクトロポレーションの後でウイルスが回収されたが、生存性は有意に異なっていた（成長曲線分析）。Ａｓｎ２１７７Ｔｙｒ置換を含有するゲノムが最高の生存性を示した。
【００１７】
したがって、最も好ましいのは、ＮＳ３のヘリカーゼドメインのＣ末端ドメイン内の突然変異がＡｓｎ２１７７Ｔｙｒ突然変異を含む、本発明の突然変異ＣＳＦＶである。
【００１８】
これらの突然変異が相加効果を及ぼすかどうかを調べるために、最強補償性突然変異体を組合せた。二重突然変異のために、Ａｓｎ２１７７ＴｙｒをＧｌｕ２１６０Ｇｌｙ、Ｐｒｏ２１８５Ａｌａ、Ｇｌｎ２１８９Ｌｙｓ、Ｐｒｏ２２００ＴｈｒおよびＡｓｎ２２５６Ａｓｐと組合せた。三重突然変異は、Ｐｒｏ２１８５ＡｌａおよびＰｒｏ２２００Ｔｈｒ、Ｐｒｏ２１８５ＡｌａおよびＧｌｎ２１８９Ｌｙｓ、Ｇｌｎ２１８９ＬｙｓおよびＰｒｏ２２００Ｔｈｒ、ならびにＧｌｕ２１６０ＧｌｙおよびＧｌｎ２１８９Ｌｙｓと共に、Ａｓｎ２１７７Ｔｙｒを含有していた。全ての試験された組合せは、単一突然変異と比較して低下した生存性を示し、このことは、可能な突然変異の付加がコアの補償におけるＮＳ３を改善することを示している。
【００１９】
親ＣＳＦＶ  ｗｔに対する物理的または表現型的相違は明らかでなかったが、ＣＳＦＶコアΔは天然宿主において高度に弱毒化された。したがって、本発明の突然変異ウイルスは、ＣＳＦＶによる感染に対してブタを防御するためのワクチンにおける使用に適している。
【００２０】
ＢＶＤＶに関しては、ＮＳ３領域のヘリカーゼドメインのＣ末端ドメイン（アミノ酸２１６９−２２６９）における８つの独立した突然変異を特定した。本発明の好ましい突然変異ＢＶＤウイルスは、Ｇｌｕ２１８９Ｌｙｓ、Ｌｅｕ２１９０Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２１９１Ａｌａ、Ａｓｐ２１９２Ｇｌｕ、Ｐｒｏ２１９４Ｌｅｕ、Ｔｙｒ２２０４Ｈｉｓ、Ａｓｎ２２６５Ｔｙｒ、Ａｓｎ２２６５Ａｓｐよりなる群から選択される、ＮＳ３のヘリカーゼドメインのＣ末端ドメイン内に１以上の突然変異を有する。
【００２１】
最も好ましいのは、ＮＳ３のヘリカーゼドメインのＣ末端ドメイン内の突然変異がＡｓｐ２１９２Ｇｌｕ、Ｔｙｒ２２０４Ｈｉｓ、Ａｓｎ２２６５ＴｙｒまたはＡｓｎ２２６５Ａｓｐ突然変異を含む、本発明の突然変異ＢＶＤＶである。
【００２２】
コアタンパク質は感染性粒子の形成に必須ではないらしい。Ｃはペスチウイルスの構築には要求されないようであるが、他の機能をもたらす。その機能はＮＳ３のヘリカーゼドメインにおける突然変異により補償される。ＣＳＦＶ  ＥｒｎｓまたはＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓに関するトランスロケーションシグナル（それぞれＬＥＫＡＬＬＡＷＡＶＩＴＩＬＬＹＱＰＶＡＡ２６８またはＬＥＫＡＬＬＡＷＡＩＩＡＬＶＦＦＱＶＴＭＧ２７０）を含むコアタンパク質の残りのアミノ酸（ＮｐｒｏのＣ末端とＥｒｎｓのＮ末端との間の距離にわたる配列）の厳密な配列は、Ｅｒｎｓのトランスロケーションが維持される限り、感染性ウイルス粒子の形成に要求されない。無関係な糖タンパク質のシグナル配列により真正配列が機能的に置換されうる。コアの残りのアミノ酸がＮ末端ＣＤ４６トランスロケーションシグナルにより完全に置換された構築物は生存可能である（ＣＤ４６はトランスロケーション細胞タンパク質の単なる一例である）。ウシＣＤ４６の膜貫通ドメイン（ＳＳＧＲＳＰＧＷＬＬＬＡＰＬＬＬＬＰＴＳＳＤＡ）を導入した場合、生存可能なウイルスが回収され、２×１０４  ｆｆｕ／ｍｌの力価に達した。
【００２３】
コアの非存在下のペスチウイルスの増殖はペスチウイルスマーカーワクチンへの可能性を切り開くものである。ペスチウイルスによる感染に打ち勝った動物の血清中にはコアタンパク質に対する抗体が存在すると予想されうる。コアは免疫原性であり、有意な量で発現される。
【００２４】
同様に、本発明の感染性ウイルス粒子を製薬上許容される担体と共に含有するワクチンは本発明の一部である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】臨床徴候および体温の図である。４０℃を超える体温が発熱として記録されている。
【図２】白血球数の図である。１０Ｇ／ｌ未満の値が白血球減少症として記録された。この値は濃い黄色の線により大まかに示されている。
【実施例】
【００２６】
（実施例１）
コア欠失構築物
ＮＳ３における置換が欠損コアタンパク質を補償するという仮定を試験するために、コアコード配列（ａａ１６９−２４８（ＳＤＤＧＡＳＧ−ＫＰＰＥＳＲＫＫＬ））が欠失した感染性ＣＳＦＶ  ｃＤＮＡ（ｐ６１９）内に該ヌクレオチド変化を導入した。したがって、ＮｐｒｏのＣ末端は、Ｅｒｎｓのトランスロケーションシグナル（ＣＰＬＷＶＴＳＣ１６８／ＬＥＫＡＬＬＡＷＡＶＩＴＩＬＬＹＱＰＶＡＡ２６７／ＥＮＩＴ）を構成するコアのＣ末端アミノ酸に融合されている。コア遺伝子の大部分の欠失はトランスフェクション後の該ＲＮＡの複製を可能にしたが、感染性ウイルス後代は産生されなかった。ＣＳＦＶコアΔ内への突然変異Ａｓｎ２１７７Ｔｙｒの導入および該ｃＲＮＡのエレクトロポレーションは生存可能な感染性ウイルス粒子の驚くべき放出を招いた。該ゲノムＲＮＡはノーザンブロット分析におけるサイズにおいて若干減少したようであり、濃縮ウイルス粒子はコアタンパク質を含有していなかった。ウイルス力価はＳＫ６細胞において５×１０５  ｆｆｕ／ｍｌに達し、したがってｐ４４７  ｗｔ力価より約１０倍低かった。次に、残りの突然変異Ｇｌｕ２１６０Ｇｌｙ、Ｐｒｏ２１８５Ａｌａ、Ｇｌｎ２１８９Ｌｙｓ、Ｐｒｏ２２００ＴｈｒおよびＡｓｎ２２５６ＡｓｐをＣＳＦＶコアΔ（ｐ６１９）内に導入して、ｐ１０３３（Ａｌａ２１８５）、ｐ１０３４（Ｔｈｒ２２００）、ｐ１０３５（Ｌｙｓ２１８９）、ｐ１０３６（Ａｓｐ２２５６）、ｐ１０３７（Ｇｌｙ２１６０）およびｐ１０３８（Ａｓｐ２２５６）を得た。全ての場合において、それぞれのＳＰ６転写産物のエレクトロポレーションの後でウイルスが回収されたが、生存性は有意に異なっていた。Ａｓｎ２１７７Ｔｙｒ置換を含有するゲノム（突然変異体「ＣＳＦＶ１０１７コアΔ」）が最高の生存性を示した。コアタンパク質は感染性粒子の形成に必須ではないらしい。Ｃはペスチウイルスの構築には要求されないようであるが、他の機能をもたらす。その機能はＮＳ３のヘリカーゼドメインにおける突然変異により補償される。
【００２７】
ＮＳ３における突然変異による存在しないコアの補償がＢＶＤＶにも当てはまるかどうかを評価するために、プライマーＢＶＴ８６（ＧＣＡＧＣＴＴＧＡＡＡＣＣＣＡＴＡＧＧＧＧＧＣＡＧ）およびコア２６８（ＣＴＡＧＡＧＡＡＡＧＣＣＣＴＡＴＴＧＧＣＣＴＧ）を使用する、ＸｈｏＩ／ＢｇｌＩＩ断片（ｎｔ２２２−２３３５）を含有するサブクローン上のＰＣＲにより、ＢＶＤＶ  ｃＤＮＡクローンＮＣＰ７（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２２０２４７）のコアコード配列を除去した。該欠失を配列決定により確認し、ＸｈｏＩ／ＮｃｏＩ断片（ｎｔ２２２−４６７１）の連結により完全長ｃＤＮＡクローン内に導入した。コアを欠く得られた完全長プラスミド（ｐ１０２６）は、ＣＳＦＶコアΔ（ｐ６１９）と同様に、Ｅｒｎｓのシグナル配列の前にＮｐｒｏをコードしていた。ｐ１０２６の転写産物はＭＤＢＫ細胞において複製性であったが、感染性ウイルスは観察されなかった。ＮＣＰ７ΔＣ内への置換Ｐｒｏ２１９４Ａｌａ、Ｐｒｏ２２０９ＴｙｒおよびＡｓｎ２２６５Ａｓｐの導入は、ＭＤＢＫ細胞上で力価測定された場合に約１０３  ｆｆｕ／ｍｌの感染性ウイルス力価のレスキューを可能にした。ブタＳＫ６細胞における増殖のために操作された修飾ＮＣＰ７ΔＣは、コアがＴｙｒ２２０４Ｈｉｓ、Ａｓｎ２２６５Ｔｙｒ、Ａｓｎ２２６５Ａｓｐ、Ｐｒｏ２１９４Ｌｅｕ、Ｇｌｎ２Ｉ９８ＬｙＳおよびＬｅｕ２１９９Ｐｒｏにおいて補償されることを示した。コアタンパク質ウイルスを欠くＮＣＰ７は有意な力価（Ａｓｎ２２６５Ｔｙｒ：３．３×１０５、Ｔｙｒ２２０４Ｈｉｓ：２×１０４およびＡｓｐ２１９２Ｇｌｕ：１．５×１０４  ｆｆｕ／ｍｌ）でＳＫ６細胞からレスキューされた。ＭＤＢＫ細胞において良好に増殖する通常の１型ＢＶＤＶウイルスであるＢＶＤＶ  Ｃ８６の感染性コピーに基づき、前記のとおりにコア欠失突然変異体を作製し、Ａｓｎ２２６５Ａｓｐ（Ａｓｎ２４３３Ａｓｐ）に類似した突然変異を導入した。ＳＫ６細胞におけるトランスフェクションの後、５×１０４  ｆｆｕの力価を有するウイルスが回収された。
【００２８】
コアタンパク質由来膜貫通ドメインは宿主細胞配列により機能的に置換されうる。
【００２９】
Ｅｒｎｓのトランスロケーションシグナル（ＬＥＫＡＬＬＡＷＡＶＩＴＩＬＬＹＱＰＶＡＡ２６８）を含む残存アミノ酸の機能的重要性を排除するために、ＮｐｒｏのＣ末端とＥｒｎｓのＮ末端との間の距離にわたる配列をＣＳＦＶコアΔＮ２１７７Ｙ（ｐ１０１７）においてウシＣＤ４６の膜貫通ドメイン（ＳＳＧＲＳＰＧＷＬＬＬＡＰＬＬＬＬＰＴＳＳＤＡ）により置換した。それぞれのｃＤＮＡ（ｐ１２４６）のＳＰ６転写産物をＳＫ６細胞内にトランスフェクトした。２×１０４  ｆｆｕ／ｍｌの力価に達する生存可能なウイルスが回収された。
【００３０】
材料および方法
細胞およびウイルス
ＳＫ６細胞を、５％  ＣＯ２を含むインキュベーター内で、１０％  ウシ胎児血清と非必須アミノ酸とを含有するＤＭＥＭ内でプラスチックディッシュ上で増殖させた。細胞を３日ごとに分割した。全てのＣＳＦＶウイルスは非ｃｐ  ＣＳＦＶ株Ａｌｆｏｒｔ−ｐ４４７（Ｇａｌｌｅｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７９（４），２４４０−２４４８，２００５）に由来する。
【００３１】
エレクトロポレーション：
２μｇのＳＰ６転写産物を５×１０６個のＳＫ６細胞内にエレクトロポレーションした。この目的のために、ＳＫ６細胞（９０％のコンフルエンシー）をトリプシン処理し、ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋）中で２回洗浄し、３１０μｌの総容量中で該転写産物と混合し、２ｍｍの間隙のキュベット中のエレクトロポレーション（Ｂｉｏｒａｄ  Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ，０．１８ＫＶおよび０．９５μＦｄ）に付した。細胞を該キュベットから回収し、１０％  ウシ胎児血清で補足されたＤＭＥＭ内で３５ｍｍプラスチックディッシュ上でプレーティングした。
【００３２】
ＲＮＡ調製およびｃＤＮＡ合成：
レスキューされたウイルスに感染したＳＫ６細胞を洗浄し、Ｒｎｅａｓｙキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を該製造業者により推奨されているとおりに使用して、該ＲＮＡを調製した。２μｇのＲＮＡを、関心のある実際の位置によって異なるプライマーを使用する逆転写に付した。ＰＣＲを適当なプライマーで行い、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）内にサブクローニングした。
【００３３】
（実施例２）
動物実験
古典的ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）突然変異体「ＣＳＦＶ１０１７コアΔ」の毒性を実験条件下で特徴づけるために、動物実験を行った。
【００３４】
目的
この実験の主要目的は、ＣＳＦＶ突然変異体「ＣＳＦＶ１０１７コアΔ」が、親株「ＣＳＦＶ  Ａｌｆｏｒｔ  ｐ４４７」と比較して弱毒化を示すかどうかを調べることであった。歩哨ブタの使用により、該ウイルスの放出および伝達を大雑把に調べることが可能であった。弱毒化が証明されたため、残りのブタを１月２日に高病原性ＣＳＦＶ株Ｋｏｓｌｏｖでチャレンジした。
【００３５】
動物実験
第１部−感染
６頭の離乳直後のブタを２００６年１０月１６日に商業的養豚場から購入し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙの高収容ユニット内に入れた。動物を各群３頭の２つの群に無作為に分けた。全ての動物を個々に番号および耳標識で識別表示した。それらの２つの群（群１：番号７５〜７７を有する動物；群２：番号７８〜８０を有する動物）を、該実験の全体にわたり互いに接触させることなく別々の畜舎内に高収容条件（１００Ｐａの負の空気圧）下で維持した。動物に１日１回給餌した。水は任意に供給した。動物は実験開始時に臨床的に健康であった。実験の開始前に、血液サンプルを全動物から集め、ペスチウイルス（ＣＳＦＶ、ボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）およびウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ））に対する中和抗体の存在に関して中和アッセイにより検査した。新しい環境に対する順応期間の後、各群の２頭のブタに約１０７  ＴＣＩＤ５０のそれぞれＣＳＦＶ１０１７（群１）およびＣＳＦＶ  Ａｌｆｏｒｔ  ｐ４４７（群２）を筋肉内感染させた。感染後少なくとも１２時間にわたり歩哨ブタ（各群１頭）をそれらの群から取り出した。この期間の後、それらをそれぞれの群に再び加えた。両群の動物を臨床症状および体温に関して毎日モニターした。４０℃を超える体温を発熱として記録した。該実験の経過中、もはや許容できない臨床症状を示す動物を動物愛護上の理由により安楽死させた。全動物の死後検査を行い、記録した。血液サンプル（天然血液およびＥＤＴＡ抗凝血化血液）を感染後第０、２、４、７、１０、１４、２１および２８日に全動物から採取した。安楽死の当日に追加的なサンプルを採取した。天然血液サンプルを１５００ｒｐｍ、室温で１５分間遠心分離（Ｌａｂｏｆｕｇｅ  ４００Ｒ，Ｈｅｒａｅｕｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）して血清を得た。ついで血清を０．５〜２ｍｌの適当なアリコートに分割し、更なる試験まで−８０℃で保存した。
【００３６】
第ＩＩ部−チャレンジ
感染の部（第Ｉ部）の後に生存したブタを感染後第７１日に１０４．５  ＴＣＩＤ５０の高病原性ＣＳＦＶ株Ｋｏｓｌｏｖで鼻腔内にチャレンジした。血液サンプルをチャレンジ後第０、３、６日およびそれぞれのブタの安楽死の当日に採取した。
【００３７】
臨床検査
白血球数
酢酸（２％）での赤血球溶解の後にＮｅｕｂａｕｅｒ（改良型）による計数チャンバーを使用して、ＥＤＴＡ血から白血球を手動で計数した。ＥＤＴＡ血をＴｈｏｍａにより血液希釈ピペット内に０．５指標まで吸入した。ついで酢酸（２％）を１１指標まで加え、該サンプル希釈物を穏やかに約６０秒間振とうした。調製された計数チャンバー内に該希釈物を満たした後、光学顕微鏡下で白血球計数視野内の白血球を計数した。チャンバーの仕様書に従い正確な値を計算した。１０Ｇ／ｌ未満の値を白血球減少症として記録した。白血球の計数は感染後第０、２、４、７、１０、１４、２１および２８日に行った。
【００３８】
中和ペルオキシダーゼ結合抗体アッセイ
Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ（２００２年２月１日付けのＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ２００２／１０６）の“Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍａｎｕａｌ”およびそれに付属のＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｐａｒｔに従い、それぞれＣＳＦＶおよびＢＶＤＶ／ペスチウイルスに対する抗体の検出のために以下のウイルスを使用して中和ペルオキシダーゼ結合抗体アッセイ（ＮＰＬＡ）を行った：
・ＢＶＤＶ  ＮＡＤＬ
・ＣＳＦＶ参照株「Ａｌｆｏｒｔ  １８７」（ＣＳＦ  ９０２）
・ＣＳＦＶ  Ａｌｆｏｒｔ  ｐ４４７（親株）
・ＣＳＦＶ  Ｋｏｓｌｏｖ（チャレンジ株）
・ＣＳＦＶ  Ｄｉｅｐｈｏｌｚ（ＣＳＦ０１０４）。
【００３９】
ＢＶＤＶ抗体の検出のためのＮＰＬＡを初代胎児ウシ腎細胞上で行い、一方、ＣＳＦＶ抗体の検出のためのＮＰＬＡを永久ブタ腎細胞（ＳＫ６）上で行った。抗体価は、２つの重複ウェルの５０％においてウイルス複製を妨げた最高初期血清希釈度の逆数として表される。これらの中和希釈５０％（ＮＤ５０）は、ＫＡＲＢＥＲの方法を用いて計算した。ＣＳＦＶ抗体の検出のためのＮＰＬＡは、感染後（ＣＳＦＶ  Ａｌｆｏｒｔ  ｐ４４７およびＣＳＦ０９０２）第０、１０、１４、２１および２８日に行った。また、チャレンジ後第０、３および６日ならびに安楽死の当日に採取したサンプルを調べた（ＣＳＦＶ  Ａｌｆｏｒｔ  ｐ４４７およびＣＳＦ０９０２）。また、ＣＳＦＶ  ＫｏｓｌｏｖおよびＣＳＦ０１０４を使用して、チャレンジ後に採取したサンプルをＮＰＬＡに付した。ＢＶＤＶに対する中和抗体の検出のためのＮＰＬＡは実験開始前に行った。
【００４０】
抗体酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
感染後第０、１４、２１および２８日ならびに安楽死の当日に集めた血清サンプルを、ＮＰＬＡの他に、ＣＳＦＶに対する抗体の検出のための商業的に入手可能な抗体酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）に付した。全ての試験は、製造業者の説明に記載されているものに厳密に従って行った。以下のＥＬＩＳＡ試験キットを使用した：
・ＨｅｒｄＣｈｅｋ  ＣＳＦＶ，Ｉｄｅｘｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｏｒｒｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ。
【００４１】
ウイルス分離
白血球調製物からのウイルス分離を、ＥＵ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ２００２／１０６／ＥＣ）に従い永久ブタ腎細胞系ＳＫ６およびＲｉｅ５−１上で２継代にわたって行った。ペスチウイルス特異的モノクローナル抗体ＢＶＤ／Ｃ１６（Ｐｅｔｅｒｓら，１９８６）および市販の種特異的ペルオキシダーゼ結合コンジュゲート（ＲＡＭＰＯ，Ｄａｋｏ）で間接免疫標識を行った。
【００４２】
抗原ＥＬＩＳＡ
ウイルス分離の他に、商業的に入手可能な抗原酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を、製造業者の説明書に記載されているものに厳密に従って行った。第０、４、７および１０日に採取したサンプルを分析に付した。以下のＥＬＩＳＡ試験キットを使用した：
・ＣＨＥＫＩＴ  ＨＣＶ−Ａｎｔｉｇｅｎ，ｆｏｒｍｅｒ  Ｄｒ．Ｂｏｍｍｅｌｉ  ＡＧ，Ｌｉｅｂｅｆｅｌｄ−Ｂｅｒｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ。
【００４３】
結果
第Ｉ部−感染
臨床徴候および体温（図１を参照されたい）
該実験の感染の部の間に、動物７６のみが感染後第８日に僅かな発熱（４０．１℃）を示した。動物７５および７６に関しては感染後第１４日に４０．０℃の微熱体温が記録された。これとは対照的に、群２の全動物が発熱を示した。動物７８は感染後第８および９日ならびに感染後第１３日から第２８日の実験終了まで発熱体温を示した。動物７９は感染後第９日および第１４日から実験終了まで発熱を示した。動物８０に関しては感染後第７、９、１０日および第１３日から第２０日まで発熱体温が記録された。第２１日に動物８０は３５．６℃の体温を示した。
群１の動物（７５〜７７）は、該実験の最初の部分においては、ＣＳＦＶ感染を示す臨床徴候を何ら示さなかったが、群２の全動物（７８〜８０）は顕著な臨床症状を示した。臨床徴候の重症度は動物によって様々であった。動物７６は重度の歩行困難のためＣＳＦ感染には無関係に第４４日に安楽死に付された。該実験経過中、動物７８は重度の下痢、結膜炎、食欲不振、皮膚病変および運動失調を示した。該動物は感染後第２８日に安楽死に付された。動物７９は、食欲減退および若干の下痢を含む軽度の特徴的でない症状を示したに過ぎなかった。該動物は感染後第２８日に安楽死に付された。動物８０は、胃腸および呼吸徴候、食欲不振、感情鈍麻ならびに皮膚病変を含む重度の症状を示した。該動物は感染後第２１日に瀕死状態で安楽死に付された。
【００４４】
白血球数（図２を参照されたい）
一般に、群１の動物は白血球減少症を示さなかった。それでも、動物７５および７７は感染後第２０日に１０Ｇ／ｌ未満の値を示した。同じ日に、動物７６は僅か１０．３Ｇ／ｌを示した。群２の全動物はＣＳＦＶ  Ａｌｆｏｒｔ  ｐ４４７による感染後に重度の白血球減少症を示した。動物７８においては、感染後第４日に白血球減少症が発症し、安楽死の日に僅か０．４５Ｇ／ｌが記録された。歩哨ブタ７９は感染後第２１および２８日に白血球減少症値を示し、感染後第１４日に既に１０．６Ｇ／ｌの限界値を示していた。動物８０は感染後第４日から重度の白血球減少症を示した。その末期の値は感染後第２１日に１．４Ｇ／ｌであった。
【００４５】
病理学
群１の動物は該実験の感染の部の間に安楽死に付された。群２の動物は種々の病理学的徴候を示した。動物７８は、びらん性皮膚炎、腸および気道におけるリンパ節の腫張および出血、胸腺萎縮、気管支肺炎、潰瘍性胃炎、カタル性腸炎、腎盂腎炎、ならびに腎皮質における点状出血を示した。動物７９は、軽度の胸腺萎縮、腸および気道におけるリンパ節の軽度腫張、肺炎（前葉）、潰瘍性胃炎、重度のカタル性腸炎および膀胱炎を示した。動物８０は、皮膚および皮下組織（肢端および腹部）の点状出血、リンパ節の顕著な拡大、浮腫および出血（全身性）、重度の胸腺萎縮、髄膜、脾臓、喉頭蓋、気管、胃、腸壁、回盲弁、膀胱、肝臓、胆嚢および腎臓における点状出血を示した。また、動物８０はカタル性化膿性肺炎、心内膜下および心筋内の広範な出血、重度の出血性胃炎、便秘、ならびに重度の間質性腎炎を示した。
【００４６】
抗体検出
中和ペルオキシダーゼ結合抗体アッセイ（ＮＰＬＡ）
全動物が該実験前にＢＶＤＶ／ペスチウイルス抗体に関して陰性結果を示した。第０日に採取された全サンプルが、ＮＰＬＡにおいて使用された両方のＣＳＦＶ株（ＣＳＦ０９０２およびＡｌｆｏｒｔ  ｐ４４７）に関して陰性（＜５  ＮＤ５０）結果を示した。ＣＳＦＶ株Ａｌｆｏｒｔ  ｐ４４７を使用した場合には、群１の動物は感染後第１４日から陽性結果を示した（動物７５）。詳細には、動物７５は感染後第１４日に７．５  ＮＤ５０の抗体価を示し、ついでこれは３１６  ＮＤ５０まで増加した。動物７６は感染後第２１および２８日に陽性結果を示し、抗体価は１５８．５  ＮＤ５０に達した。歩哨動物７７は抗体価を何ら示さなかった。ＣＳＦ０９０２を使用した場合には、動物７６だけが感染後第２８日に７．５  ＮＤ５０の低い抗体価を示した。群２の動物は、該実験の全体にわたって行った全ＮＰＬＡにおいて、ＣＳＦＶ抗体に関して陰性（＜５  ＮＤ５０）のままであった。
【００４７】
抗体酵素結合イムノソルベントアッセイ（Ａｂ−ＥＬＩＳＡ）
動物７５は感染後第２１日に最初の疑わしい結果を示し、感染後第２８日に陽性であり、一方、動物７６は感染後第１４日に疑わしい結果を示し、感染後第２１および２８日に陽性結果を示した。動物７７は陰性のままであった。動物７８および７９は該試験の全体にわたって陰性を示し、一方、動物８０は安楽死の当日（感染後第２１日）に疑わしい結果を示した。
【００４８】
ウイルス分離
群１の動物は該試験の感染の部の全体にわたってＳＫ６およびＲｉｅ５−１細胞の両方において陰性結果を示した。動物７８はそれぞれＳＫ６およびＲｉｅ５−１細胞上で感染後第４、７、１０（ＳＫ６細胞上のみで調べた）および１４日に陽性結果を示した。また、このブタに関してＲｉｅ５−１細胞上で感染後第２日に陽性結果が得られた。歩哨ブタである動物７９は両細胞系上で陰性のままであった。ＳＫ６細胞上では、動物８０は感染後第７、１０および１４日に陽性結果を示した。Ｒｉｅ５−１細胞上でも感染後７および１４日（第１０日にはサンプル物質の欠如のため試験されなかった）に陽性結果が見出された。
【００４９】
抗原酵素結合イムノソルベントアッセイ（Ａｇ−ＥＬＩＳＡ）
Ａｇ−ＥＬＩＳＡは群１の全動物ならびに群２の動物７８および７９に関して陰性のままであった。動物８０だけが感染後第１０日に陽性結果を示した。
【００５０】
第ＩＩ部−チャレンジ
臨床徴候および体温
感染の部の後に生存したブタである動物７５および７７を感染後第７１日に高病原性ＣＳＦＶ株Ｋｏｓｌｏｖでチャレンジした。
【００５１】
動物７５はチャレンジ感染後に発熱体温もいずれの臨床徴候も示さず、チャレンジ後第１６日に安楽死に付された。動物７７はチャレンジ後第３日に発熱を示し、これは安楽死まで続いた。該動物は重度の神経症状を示し、チャレンジ後第８日に瀕死状態で安楽死に付された。
【００５２】
病理学
該チャレンジの前に、動物７６は重度の歩行困難のために安楽死に付された。この動物は、ＣＳＦを示すいずれの病理学的病変をも示さなかった。それは前葉の軽度肺炎を示したに過ぎなかった。前葉の軽度肺炎および軽度潰瘍性胃炎の他には、動物７５は病理学的徴候を示さなかった。動物７７は、腫張した部分的に出血性のリンパ節、カタル性肺炎、腹水、軽度の潰瘍性胃炎、肝充血、胆嚢浮腫および間質性腎炎を示した。
【００５３】
抗体検出
チャレンジ感染後、動物７５は１６０  ＮＤ５０のチャレンジウイルスに対する抗体価（チャレンジ後第１６日）およびＣＳＦ０１０４に対する６４０を超える力価を示した。動物７７は陰性のままであった。
【００５４】
要約および結論
・ＣＳＦＶ突然変異体「ＣＳＦＶ  １０１７コアΔ」は、親株「ＣＳＦＶ  Ａｌｆｏｒｔ  ｐ４４７」と比較して実質的に完全な弱毒化を示した。
・群２の動物とは対照的に、群１の動物では、種々の細胞系上でウイルス分離においてウイルスは検出されなかった。
・歩哨ブタを除き、群１の動物はＣＳＦＶ  １０１７コアΔによる感染後に中和抗体を示した。
・群１の歩哨ブタは抗体および抗原の両方の検出においていずれの陽性結果も示さなかった。したがって、該ウイルス突然変異体の放出および伝達の可能性はほとんど考えられない。
・高病原性ＣＳＦＶ株によるチャレンジ感染後の臨床徴候の非存在は、ＣＳＦＶ１０１７コアΔに既に感染した動物の完全な防御を証明した。
・該歩哨ブタは、ＣＳＦＶ  Ｋｏｓｌｏｖによる感染後に急性致死性ＣＳＦの経過を示した。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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