(57)【要約】  本発明は、パーキンソン病を処置するための、炎症誘発性サイトカインに特異的に結合する抗体を提示する繊維状バクテリオファージの、単独におけるまたは哺乳動物細胞内部移行シグナルを提示しない繊維状バクテリオファージと組み合わせてのいずれかにおける使用に関する。
2012509672.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パーキンソン病またはパーキンソン病への易罹患性の処置において使用するための繊維状バクテリオファージであって、前記繊維状バクテリオファージは炎症誘発性サイトカインに対する抗体を提示する、前記繊維状バクテリオファージ。
【請求項２】
パーキンソン病またはパーキンソン病への易罹患性の処置において使用するための繊維状バクテリオファージであって、前記繊維状バクテリオファージは（ｉ）哺乳動物細胞内部移行シグナル；（ｉｉ）α−シヌクレイン抗原もしくはα−シヌクレイン抗体；または（ｉｉｉ）β−アミロイド抗原もしくはβ−アミロイド抗体を提示しない、前記繊維状バクテリオファージ。
【請求項３】
前記バクテリオファージが哺乳動物細胞内部移行シグナルを提示しない、請求項１または２記載の繊維状バクテリオファージ。
【請求項４】
前記バクテリオファージがＷＴファージである、請求項１〜３のいずれか１項記載の繊維状バクテリオファージ。
【請求項５】
前記バクテリオファージがＵＶ照射されたファージである、請求項４記載の繊維状バクテリオファージまたは使用。
【請求項６】
パーキンソン病の処置において使用するための第一および第二の繊維状バクテリオファージであって、
ａ）第一の繊維状バクテリオファージは、炎症誘発性サイトカインに対する抗体を提示し；
ｂ）第二の繊維状バクテリオファージは、（ｉ）哺乳動物細胞内部移行シグナル；（ｉｉ）α−シヌクレイン抗原もしくはα−シヌクレイン抗体；（ｉｉｉ）β−アミロイド抗原もしくはβ−アミロイド抗体；または（ｉｖ）炎症誘発性サイトカインに対する抗体、を提示しない、前記第一および第二の繊維状バクテリオファージ。
【請求項７】
第一のバクテリオファージが、哺乳動物細胞内部移行シグナルを提示しない、請求項６記載の繊維状バクテリオファージ。
【請求項８】
第二のバクテリオファージがＷＴファージである、請求項６または７記載の繊維状バクテリオファージ。
【請求項９】
第二のバクテリオファージがＵＶ照射されたファージである、請求項８記載の繊維状バクテリオファージ。
【請求項１０】
炎症誘発性サイトカインに結合する抗体を提示する繊維状バクテリオファージがさらに、プロテインＡまたはプロテインＧの抗体結合部分を提示し、そして炎症誘発性サイトカインに結合する前記抗体が、プロテインＡまたはプロテインＧの抗体結合部分に結合している、請求項１、３、４および５のいずれか１項記載の繊維状バクテリオファージ。
【請求項１１】
炎症誘発性サイトカインに結合する抗体が、ＩＬ−６に結合する抗体である、請求項
３〜１０のいずれか１項記載の繊維状バクテリオファージ。
【請求項１２】
各バクテリオファージが、鼻腔内投与のために使用される、請求項１〜１１のいずれか１項記載の繊維状バクテリオファージ。
【請求項１３】
各繊維状バクテリオファージが、独立して、Ｍ１３、ｆ１およびｆｄバクテリオファージ、並びにその混合物から選択される、請求項１および３〜１２のいずれか１項記載の繊維状バクテリオファージ。
【請求項１４】
各繊維状バクテリオファージがＭ１３である、請求項１３記載の繊維状バクテリオファージ。
【請求項１５】
ａ）炎症誘発性サイトカインに特異的な抗体を提示する第一の繊維状バクテリオファージ；
ｂ）第二の繊維状バクテリオファージ（前記の第二のバクテリオファージは（ｉ）哺乳動物細胞内部移行シグナル；（ｉｉ）α−シヌクレイン抗原もしくはα−シヌクレイン抗体；（ｉｉｉ）β−アミロイド抗原もしくはβ−アミロイド抗体；または（ｉｖ）炎症誘発性サイトカインに特異的な抗体を提示しない）；および
ｃ）薬学的に許容され得る担体
を含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
鼻腔内投与のために製剤化された請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
第一のバクテリオファージが哺乳動物細胞内部移行シグナルを提示しない、請求項１５または１６記載の組成物。
【請求項１８】
第二のバクテリオファージがＷＴファージである、請求項１５〜１７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１９】
第二のバクテリオファージがＵＶ照射されたバクテリオファージである、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
第一の繊維状バクテリオファージがさらに、プロテインＡまたはプロテインＧの抗体結合部分を提示し、そして炎症誘発性サイトカインに結合する抗体が、プロテインＡまたはプロテインＧの抗体結合部分に結合している、請求項１５〜１９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２１】
炎症誘発性サイトカインに結合する抗体が、ＩＬ−６に結合する抗体である、請求項１５〜２０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２２】
第一および第二の繊維状バクテリオファージの各々が、独立して、Ｍ１３、ｆ１、およびｆｄバクテリオファージ、並びにその混合物から選択される、請求項１５〜２１のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２３】
第一および第二の繊維状バクテリオファージがＭ１３である、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
繊維状バクテリオファージをそれを必要とする患者に投与することによってパーキンソン病に罹患した患者またはパーキンソン病に罹患し易い患者を処置する方法であって、前記バクテリオファージは（ｉ）哺乳動物細胞内部移行シグナル；（ｉｉ）α−シヌクレイン抗原もしくはα−シヌクレイン抗体；または（ｉｉｉ）β−アミロイド抗原もしくはβ−アミロイド抗体を提示しない、前記方法。
【請求項２５】
炎症誘発性サイトカインに対する抗体を提示する繊維状バクテリオファージをそれを必要とする患者に投与することによって、パーキンソン病に罹患した患者またはパーキンソン病に罹患し易い患者を処置する方法。
【請求項２６】
前記バクテリオファージが哺乳動物細胞内部移行シグナルを提示しない、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記バクテリオファージがＷＴファージである、請求項２４または２５記載の方法。
【請求項２８】
前記バクテリオファージがＵＶ照射されたファージである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ａ）炎症誘発性サイトカインに対する抗体を提示する第一の繊維状バクテリオファージ；および
ｂ）第二の繊維状バクテリオファージ（前記の第二のバクテリオファージは（ｉ）哺乳動物細胞内部移行シグナル；（ｉｉ）α−シヌクレイン抗原もしくはα−シヌクレイン抗体；（ｉｉｉ）β−アミロイド抗原もしくはβ−アミロイド抗体；または（ｉｖ）炎症誘発性サイトカインに対する抗体を提示しない）
をそれを必要とする患者に共投与することによってパーキンソン病に罹患した患者またはパーキンソン病に罹患し易い患者を処置する方法。
【請求項３０】
前記の第一のバクテリオファージが、哺乳動物細胞内部移行シグナルを提示しない、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記の第二のバクテリオファージがＷＴファージである、請求項２９または３０記載の方法。
【請求項３２】
前記の第二のバクテリオファージがＵＶ照射されたファージである、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
炎症誘発性サイトカインに結合する抗体を提示する繊維状バクテリオファージがさらに、プロテインＡまたはプロテインＧの抗体結合部分を提示し、そして炎症誘発性サイトカインに結合する抗体が、プロテインＡまたはプロテインＧの抗体結合部分に結合している、請求項２５〜３２のいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
炎症誘発性サイトカインに結合する抗体が、ＩＬ−６に結合する抗体である、請求項２５〜３３のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
各バクテリオファージが鼻腔内に投与される、請求項２４〜３４のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
各繊維状バクテリオファージが、独立して、Ｍ１３、ｆ１およびｆｄバクテリオファージ、並びにその混合物から選択される、請求項２４〜３５のいずれか１項記載の方法。
【請求項３７】
各繊維状バクテリオファージがＭ１３である、請求項３６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、パーキンソン病を処置するための治療薬および方法に関する。
【０００２】
関連分野の記載
パーキンソン病（ＰＤ）は、その主な臨床的特徴として、安静時振戦、動作緩慢および固縮などの運動異常が含まれる進行性の神経変性疾病である(FahnおよびSulzer, 2004)。ＰＤは、黒質緻密部におけるドーパミン神経の減少、並びに同じ領域の生存神経におけるレビー小体およびレビー神経突起と呼ばれる封入体の存在によって特徴付けられる(Forno, 1996)。中脳ドーパミン神経の減少が、主に、主要な運動症状の原因であることが一般的に認められているが、これは、ＰＤ患者において病的変化を示す唯一の領域ではない。レビー病態および細胞の減少は、最初に下位脳幹核に出現し、進行的に中脳に上行し、そして高度に予測可能な様式で最後には皮質領に上行する(Braak et al., 2004)。中脳の外の種々の領域へのレビー病態の進行は、うつ病、痴呆、並びに種々の自律神経機能不全および感覚機能不全などの、ＰＤ患者によく観察される多数の続発性症状を説明し得る。
【０００３】
ＰＤの原因は依然として分かりにくいままであるが、α−シヌクレインのミスフォールディングおよび異常な凝集が、疾病の病態発生の重要な構成要素であることを示唆する多くの証拠が存在する。遺伝子連鎖解析により、遺伝型のパーキンソン症において３つのミスセンス突然変異が同定され(Kruger et al. 1998; Polymeropoulos et al. 1997; Zarranz et al. 2004)、そして全ての突然変異体がオリゴマー化または線維化のいずれかを加速することが示された(Conway et al. 2000; Greenbaum et al. 2005)。野生型α−シヌクレインの蓄積は前記疾病を引き起こすのに十分である。
【０００４】
α−シヌクレインの線維性凝集体が、レビー小体およびレビー神経突起の主要な構成成分であるようであり、そしてこれらは、死後診断のための最も信頼性の高いＰＤマーカーであると現在考えられている(Spillantini et al. 1998)。α−シヌクレインは細胞質タンパク質であるので、前記タンパク質によって誘導される病原性の変化および作用は、細胞質内で起こり、そして単一細胞内に限定されると想定される。しかしながら、細胞外α−シヌクレインの近年の研究は、病原性作用の範囲はその起源である細胞質を超えていることを示唆する(Lee, 2008)。
【０００５】
細胞外液におけるα−シヌクレインおよびその凝集形の存在が、in vivoおよびin vitroの両方において近年実証された。細胞外α−シヌクレインは、小胞内α−シヌクレインの特殊なエキソサイトーシスによって送達されるようであるが、正確な機序は特徴付けられていない。小胞内α−シヌクレインは凝集する傾向があり、そしてこれは細胞外凝集体の可能性ある起源である。
【０００６】
細胞外空間に分泌されたα−シヌクレインの役割は、組織培養系を使用した研究から推測することができる。いくつかの研究が、前記タンパク質を培養培地に加えた場合の、細胞外α−シヌクレインおよびその内部疎水性フラグメント（非アミロイド成分すなわちＮＡＣ（nonamyloid component））の細胞障害作用を報告した(Albani et al. 2004; Bodles et al. 2000; Du et al. 2003; El-Agnaf et al. 1998; Forloni et al. 2000; Lee et al. 2004; Seo et al. 2002; Sung et al. 2001)。線維性凝集体の毒性作用を実証した研究もあり(Bodles et al. 2000; El-Agnaf et al. 1998)、また毒性の原因としてプロトフィブリル性またはオリゴマー性凝集体を同定した研究もあった(Du et al. 2003)。
【０００７】
α−シヌクレインは容易に膜内に取り込まれ得、そしてシナプス小胞内および細胞膜上に見出され得る。毒性の機序に関する十分に構成されたモデルは多くはない。近年の研究は、パーキンソン病の病態発生におけるα−シヌクレインの孔様のプロトフィブリルの可能性ある役割を例証する(Tsigelny et al., 2007; Lee et al., 2002; Volles and Lansbury, 2002)。あるモデルは、オリゴマー性α−シヌクレインが、中心に孔を有する環状構造を形成し得ると提案する(VollesおよびLansbury 2003)。これらの凝集体は膜に結合することができ(Volles et al. 2001)、そしてその膜透過作用は、リン脂質リポソーム(Volles et al. 2001)および平面二重膜(Kayed et al. 2004)などの合成モデル膜において実証されている。細胞膜へのこれらの凝集体の挿入は、細胞質と細胞外空間との間のイオンおよび小さな代謝物の自由な交換に因り、細胞生存度に対して破滅的な作用を及ぼすだろう。この毒性孔モデルは、少なくともいくつかのオリゴマー性凝集体の細胞障害作用を説明するが、孔および孔の活性は、依然として生物学的系においては実証されていない。細胞外α−シヌクレイン、および特にその凝集体形の神経毒性の別の可能性ある機序は、神経炎症応答を含み得る(Zhang et al., 2005; Klegeris et al., 2006)。
【０００８】
ＰＤを処置するための治療薬の開発において今までになされた進歩にも関わらず、依然としてさらなる治療が非常に必要とされる。
【０００９】
本明細書におけるあらゆる文書の引用は、このような文書が関連のある従来技術である、または本出願の任意の請求項の特許性に対する材料であると考える承認とは捉えない。内容に関する任意の記述または任意の文書の日付は、出願時に出願人に利用可能な情報に基づき、そしてこのような記述の正確性に関する承認を構成するものではない。
【００１０】
発明の要約
本発明は、パーキンソン病またはパーキンソン病への易罹患性の処置において使用するための繊維状バクテリオファージ、および、パーキンソン病（ＰＤ）に罹患した患者またはパーキンソン病に罹患し易い患者を処置するための方法を提供する。前記方法は、患者に、哺乳動物細胞内部移行シグナルを提示しない繊維状バクテリオファージを投与することを含む。
【００１１】
本発明はまた、炎症誘発性サイトカインに特異的な抗体を提示する繊維状バクテリオファージ、および（ｉ）哺乳動物細胞内部移行シグナル；（ｉｉ）α−シヌクレイン抗原もしくはα−シヌクレイン抗体；（ｉｉｉ）β−アミロイド抗原もしくはβ−アミロイド抗体；または（ｉｖ）炎症誘発性サイトカインに特異的な抗体、を提示しない第二の繊維状バクテリオファージを含む、薬学的組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、孔のような構造で細胞膜に包埋されたα−シヌクレイン凝集体の前面からの斜視図（図１Ａ）および膜中へのタンパク質挿入の深さを示す膜の横断面図（図１Ｂ）を含む、膜α−シヌクレイン（ＡＳ）凝集体のコンピューターモデルを示す(Tsigelny et al., 2007)。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、孔のような構造で細胞膜に包埋されたα−シヌクレイン凝集体の前面からの斜視図（図１Ａ）および膜中へのタンパク質挿入の深さを示す膜の横断面図（図１Ｂ）を含む、膜α−シヌクレイン（ＡＳ）凝集体のコンピューターモデルを示す(Tsigelny et al., 2007)。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、Ｔｈｔによって測定し（図２Ａ）、そしてＴＥＭによって可視化した（図２Ｂ）、in vitroにおけるＡＳフラグメント凝集体に対するファージの脱凝集活性を示す。
【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、Ｔｈｔによって測定し（図２Ａ）、そしてＴＥＭによって可視化した（図２Ｂ）、in vitroにおけるＡＳフラグメント凝集体に対するファージの脱凝集活性を示す。
【図３】図３は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の生存度に対するファージの効果を示したグラフである。
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂは、α−シヌクレインフィルター遅延アッセイにおいてα−シヌクレインポリクローナル抗体を使用して可視化（図４Ａ）およびＥＬＩＳＡにおいて測定した（図４Ｂ）、ファージ（ヘルパー）によるＡＳ凝集体の減少を示す。
【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、α−シヌクレインフィルター遅延アッセイにおいてα−シヌクレインポリクローナル抗体を使用して可視化（図４Ａ）およびＥＬＩＳＡにおいて測定した（図４Ｂ）、ファージ（ヘルパー）によるＡＳ凝集体の減少を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、種々のα−シヌクレイン（ＡＳ）オリゴマーの存在を実証するＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の膜画分のウエスタンブロット分析を示し、そして図５Ｂは、Ｍ１３処理後のオリゴマーの測定のためのＥＬＩＳＡアッセイを示す。図５Ａでは、ＡＳが、ＡＳに対するポリクローナル抗体（Sigma）を用いて検出されている。図５Ｂでは、膜画分からのＡＳオリゴマーの量が、ＡＳに対するモノクローナル抗体(Sigma, clone Syn 211)で検出されるＡＳオリゴマーに特異的なＥＬＩＳＡにおいて定量された。ＡＳオリゴマーの量の有意な減少が、野生型繊維状ファージで処理されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の膜画分において測定された。＊＝非処理細胞と比較した有意差（ｐ＜０．０５）。
【図５Ｂ】図５Ａは、種々のα−シヌクレイン（ＡＳ）オリゴマーの存在を実証するＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の膜画分のウエスタンブロット分析を示し、そして図５Ｂは、Ｍ１３処理後のオリゴマーの測定のためのＥＬＩＳＡアッセイを示す。図５Ａでは、ＡＳが、ＡＳに対するポリクローナル抗体（Sigma）を用いて検出されている。図５Ｂでは、膜画分からのＡＳオリゴマーの量が、ＡＳに対するモノクローナル抗体(Sigma, clone Syn 211)で検出されるＡＳオリゴマーに特異的なＥＬＩＳＡにおいて定量された。ＡＳオリゴマーの量の有意な減少が、野生型繊維状ファージで処理されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の膜画分において測定された。＊＝非処理細胞と比較した有意差（ｐ＜０．０５）。
【図６】図６は、ビヒクルと比較した、Ｍ１３ファージとの相互作用後のＡＳ反応性における減少を示したグラフである。データは、ＰＢＳビヒクル（＋Ｍ１３）の注入された他方の半球と比較した、Ｍ１３の注入された脳の一方の半球において観察されたＡＳの神経凝集体の平均数の比として表現される。−Ｍ１３対照では、両方の半球にＰＢＳビヒクルが注入された。
【００１３】
発明の詳細な説明
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲の目的のために、以下の定義を適用する。
【００１４】
「患者」、「被験体」および「レシピエント」という用語は同義語として使用される。それらは、治療処置の目的であるヒトおよび他の哺乳動物を含む。
【００１５】
パーキンソン病に関して「処置する」という用語は、パーキンソン病の進行を実質的に阻害、遅延もしくは逆転させること、例えばα−シヌクレインの凝集体の形成を減少もしくは阻害するか、またはα−シヌクレインの予め形成された凝集体を脱凝集させること；パーキンソン病の１つ以上の臨床症状を実質的に寛解させること、例えばパーキンソン病に関連した炎症を減少させること；またはパーキンソン病の臨床症状の出現を実質的に予防することを意味することを意図する。
【００１６】
「共投与」という用語は、同時に、連続的に、または別々に投与される単一の剤形によるまたは複数の剤形による投与を意味することを意図する。好ましくは、共投与は、時刻が重複して、より好ましくは同時に処置される細胞上において各投与の効果の奏功を引き起こす。
【００１７】
本明細書において使用したような「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、二重特異的抗体、ディアボディ、または他の精製された抗体調製物、および組換え抗体を含む。抗体は、例えば任意のアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭなど）の完全抗体であり得るか、または対象の抗原に結合する抗体フラグメントであり得る。本発明において使用する抗体の具体例においては、製剤化しようとする抗体は、ＩｇＧアイソタイプを有する抗体である。抗体を、従来の技術または他の技術を使用してフラグメント化することができ、そして前記フラグメントを対象の抗原への結合についてスクリーニングすることができる。一般に、抗体フラグメントは、インタクトな抗体の抗原結合領域および／または可変領域を含む。
【００１８】
「抗体フラグメント」という用語は、選択されたタンパク質に選択的に結合することができる抗体分子のタンパク質分解的に切断されたまたは組換え調製された部分のセグメントを含む。このようなタンパク質分解的フラグメントおよび／または組換えフラグメントの非制限的な例は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、並びにペプチドリンカーによって接続されたＶＬおよび／またはＶＨドメインを含む一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、ナノバディ（登録商標）（天然に存在する重鎖抗体の独特な構造的で機能的な特性を含む、抗体に由来する生物学的な治療剤）、並びにユニバディ（ヒンジ領域を欠失した抗体）を含む。ｓｃＦｖｓは、共有結合的または非共有結合的に連結して、２つ以上の結合部位を有する抗体を形成し得る。
【００１９】
いくつかの態様において、抗体または抗体フラグメントは、ヒト化モノクローナル抗体または完全なヒト化モノクローナル抗体である。本明細書において使用したような「ヒト化モノクローナル抗体」という用語は、等価なヒトモノクローナル抗体（ドナー）において見出されるアミノ酸残基の少なくとも１つ以上を含むように改変された、非ヒト起源（レシピエント）由来のモノクローナル抗体である。「完全なヒト化モノクローナル抗体」は、等価なヒトモノクローナル抗体の抗原結合領域において見出される全てのアミノ酸残基を含むように改変された、非ヒト起源由来のモノクローナル抗体である。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体またはドナー抗体のいずれにも見られない残基も含み得る。これらの改変を行なって、抗体の機能性をさらに洗練および最適化することができる。ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を場合により含み得る。
【００２０】
「炎症誘発性サイトカイン」という用語は、パーキンソン病に関連した脳炎症に関与する任意の炎症誘発性サイトカインをいい、これは好ましくはＩＬ−６、ＩＬ−１、ＩＬ−１７およびＴＮＦαを含み、そしてこれは最も好ましくはＩＬ−６である。
【００２１】
「哺乳動物細胞内部移行シグナル」という用語は、細胞接着および／または細胞への付着の結果として、内部移行を促進する任意の細胞接着配列をいう。数多くの哺乳動物細胞接着配列が知られており、そしてこれは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）細胞接着配列、ＨＩＶ由来のＴａｔペプチド、並びにArg-Glu-Asp (RED)、Arg-Lys-Lys (RKK)、Leu-Asp-Val（LDV; Humphries, 1992)、Leu-Leu-Gly (LLG; Koivunen et al., 2001)、Asp-Gly-Glu-Ala (DGEA;配列番号２)、Ile-Arg-Val-Val-Met (IRVVM;配列番号３; Kosfeld et al., 1993)、Pro-His-Ser-Arg-Asp (PHSRN;配列番号４)およびRFYVVMWK (配列番号５; Kosfeld et al., 1993)の配列を含むペプチドを含む。例えばラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、トロンボスポンジンなどの細胞接着分子における多くの細胞接着配列（細胞付着モチーフとしても知られる）が知られている。
【００２２】
「α−シヌクレイン抗原」という用語は、ヒトα−シヌクレイン由来の抗原をいい、ヒトα−シヌクレインは、好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列(NCBI遺伝子ID:6622、アクセッショナンバー NP000336; UniProtKB/Swiss-Prot アクセッションナンバー P37840)を有する。「α−シヌクレイン抗体」は、α−シヌクレインの配列番号６またはその変異体もしくは突然変異体を認識しそして結合するものである。
【００２３】
「β−アミロイド抗原」という用語は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質に由来する、斑を形成する「β−アミロイドペプチド」（これは「βＡＰ」、「βＡ」、「Ａβ」または「ＡβＰ」としても知られる）に由来する抗原をいう。「β−アミロイド抗体」は、天然に存在するヒトＡβ１〜４２ペプチド並びにその変異体および突然変異体のβ−アミロイドペプチドを認識しそして結合するものである。
【００２４】
本明細書において使用した「薬学的組成物」は、生理学的に適切な担体および賦形剤などの他の化学成分を含む、本明細書において記載した１つ以上の活性成分の調製物をいう。薬学的組成物の目的は、患者への化合物の投与を容易にすることである。
【００２５】
「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という語句は、同義語として使用され得るが、これらは生物に対して有意な刺激を引き起こさず、そして投与される化合物の生物活性および特性を消失させない、担体または希釈剤をいう。
【００２６】
「賦形剤」という用語は、活性成分の投与をさらに容易にするために薬学的組成物に添加された不活性物質をいう。賦形剤の非制限的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、および一種のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００２７】
本明細書において使用した「野生型繊維状バクテリオファージ」という用語は、典型的には天然においては会合している他の成分から単離されている、天然に存在する繊維状バクテリオファージを意味する。この用語はまた、「野生型」として特徴付けられる市販されている繊維状ファージも含む。
【００２８】
本明細書において使用した「不活性化された野生型繊維状バクテリオファージ」という用語は、組換えＤＮＡ手段によって遺伝子的に改変されていないが、ＵＶ照射などによって複製できなくさせた、野生型繊維状バクテリオファージを意味する。ファージを複製できなくさせるが、バクテリオファージの繊維状構造は妨害しない（嗅覚経路を通して脳へと透過するその能力を保持する）任意の機序が本発明によって考えられる。
【００２９】
「ＷＴファージ」という用語は、野生型繊維状バクテリオファージおよび不活性化された野生型繊維状バクテリオファージの両方をいう。
【００３０】
処置において使用するための繊維状バクテリオファージおよび処置法
１つの態様において、本発明は、パーキンソン病またはパーキンソン病への易罹患性の処置において使用するための繊維状バクテリオファージ、および、患者に繊維状バクテリオファージを投与することによってパーキンソン病に罹患した患者またはパーキンソン病に罹患し易い患者を処置する方法を提供し、前記バクテリオファージは（ｉ）哺乳動物細胞内部移行シグナル；（ｉｉ）α−シヌクレイン抗原もしくはα−シヌクレイン抗体；または（ｉｉｉ）β−アミロイド抗原もしくはβ−アミロイド抗体を提示しない。
【００３１】
この態様の１つの局面において、バクテリオファージは、薬学的に許容され得る担体を追加的に含む薬学的に許容され得る組成物の一部として患者に投与される。
【００３２】
この態様の別の局面において、バクテリオファージはＷＴファージである。
【００３３】
理論に拘るわけではないが、本発明において使用したファージは、膜において細胞外α−シヌクレインまたはα−シヌクレイン凝集体に結合し、そして細胞膜におけるα−シヌクレインの凝集を減少させると提唱されている。本発明者らは、膜におけるα−シヌクレイン凝集体のこの減少はまた、おそらく細胞内から細胞外へとα−シヌクレインの平衡をシフトさせることによって、α−シヌクレインの細胞内凝集体の減少をもたらすと提唱する。それにも関わらず、任意の特定の機序に拘るわけではないが、本発明の繊維状バクテリオファージおよび方法は、パーキンソン病に罹患した患者またはパーキンソン病に罹患し易い患者を処置するのに有用である。
【００３４】
１つの態様において、繊維状バクテリオファージは、鼻腔内投与に有用である。鼻腔内投与は、これらのバクテリオファージが血液脳関門を通過することを可能とする。その後、ファージは、末梢臓器に対して有害な作用を及ぼすことなく、尿および糞便を介して脳および体内から排除される。
【００３５】
炎症誘発性サイトカインは、パーキンソン病の神経炎症症状の原因となる。このような炎症誘発性サイトカインの除去はこのような症状を寛解させるだろう。従って１つの態様において、本発明は、パーキンソン病またはパーキンソン病への易罹患性の処置において使用するための炎症誘発性サイトカインに特異的な抗体を提示する繊維状バクテリオファージ、および、炎症誘発性サイトカインに特異的な抗体を提示する繊維状バクテリオファージを患者に投与することによってパーキンソン病に罹患した患者またはパーキンソン病に罹患し易い患者を処置する方法を提供する。この態様の１つの局面において、バクテリオファージは鼻腔内に投与される。別の局面において、バクテリオファージは、薬学的に許容され得る担体を追加的に含む薬学的に許容され得る組成物の一部として投与される。別の局面において、炎症誘発性サイトカインに特異的な抗体はＩｇＧクラスであり、そしてＦｃ部分を有する。さらに別の局面において、前記抗体はＩＬ−６に特異的な抗体である。さらに別の局面において、炎症誘発性サイトカインを有するバクテリオファージは、哺乳動物細胞内部移行シグナルを含まない。
【００３６】
鼻腔内に投与されると、抗体を有するファージは脳へと送達され、そこで前記ファージはその上に提示される抗体によって炎症誘発性サイトカインへと指向され、これによりこのようなサイトカインを不活性化する。これらのファージ提示抗体のファージ部分は、抗体を血液脳関門を通過させそして直接的にα−シヌクレイン凝集を阻害するという２つの作用を有する。
【００３７】
関連する態様によると、本発明は、（ａ）炎症誘発性サイトカインに特異的な抗体を提示する第一の繊維状バクテリオファージ；および（ｂ）第二の繊維状バクテリオファージ（第二のバクテリオファージは、炎症誘発性サイトカインに特異的な抗体を提示しない）を患者に共投与することによって、パーキンソン病に罹患した患者またはパーキンソン病に罹患し易い患者を処置する際に使用するための第一および第二の繊維状バクテリオファージ、並びに、（ａ）炎症誘発性サイトカインに特異的な抗体を提示する第一の繊維状バクテリオファージ；および（ｂ）第二の繊維状バクテリオファージ（第二のバクテリオファージは、炎症誘発性サイトカインに特異的な抗体を提示しない）を患者に共投与することによって、パーキンソン病に罹患した患者またはパーキンソン病に罹患し易い患者を処置する方法を提供する。１つの局面において、第二の繊維状ファージはさらに、哺乳動物細胞内部移行シグナルを提示しない。別の局面において、第二の繊維状ファージはさらに、（ｉ）α−シヌクレイン抗原もしくはα−シヌクレイン抗体；または（ｉｉ）β−アミロイド抗原もしくはβ−アミロイド抗体を提示しない。さらに別の局面において、第二の繊維状ファージはさらに（ｉ）哺乳動物細胞内部移行シグナル；（ｉｉ）α−シヌクレイン抗原もしくはα−シヌクレイン抗体；または（ｉｉｉ）β−アミロイド抗原もしくはβ−アミロイド抗体を提示しない。
【００３８】
別の局面において、各繊維状バクテリオファージは、薬学的に許容され得る担体を追加的に含む薬学的に許容され得る組成物の一部として投与される。前記に示した任意の組成物の別の局面において、第二の繊維状バクテリオファージはＷＴファージである。さらに別の局面において、第二の繊維状バクテリオファージはＵＶ照射されたバクテリオファージである。
【００３９】
さらに別の局面において、第一および第二のバクテリオファージは各々患者に鼻腔内投与される。別の局面において、炎症誘発性サイトカインに特異的な抗体はＩｇＧクラスであり、そしてＦｃ部分を有する。さらに別の局面において、前記抗体はＩＬ−６に特異的な抗体である。別の局面において、第一のバクテリオファージは哺乳動物細胞内部移行シグナルを含まない。
【００４０】
ファージに、当技術分野において知られている任意の技術によって炎症誘発性サイトカインに対する抗体を提示させるようにすることができる。例えば、前記抗体を、周知の技術によって一本鎖抗体として工学操作することができ、そしてバクテリオファージ表面上にこのような一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を提示するようにファージベクターを改変することができる。
【００４１】
任意の所与の抗体、好ましくはモノクローナル抗体をファージ上に提示させるようにする別の方法は、免疫グロブリンのＦｃ部分に結合するポリペプチドを提示するファージを産生することである。このようなファージは当技術分野において公知であり、そしてＰＣＴ公開公報ＷＯ２００７／０９５６１６に記載されている。このような改変されたファージを使用して、抗体を前記ファージと単に接触させることによって、Ｆｃ部分を含む任意の抗体をそのファージ上に提示させることができる。抗体のＦｃ部分は、ファージによって提示されるＦｃ結合ポリペプチドにより結合する。従って、抗体またはそのフラグメントの結合は促進される。
【００４２】
１つの態様において、免疫グロブリンのＦｃ部分に結合するポリペプチドは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ（すなわち結合ドメインＢ）もしくはプロテインＧの抗体結合部分を含むそのフラグメント、またはプロテインＡもしくはプロテインＧの変異体である。別の態様において、プロテインＡ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する変異体である。Ｆｃ領域を欠失した抗体を使用する場合、それはファージによって直接的に提示されなければならない。
【００４３】
繊維状バクテリオファージは、環状一本鎖ＤＮＡゲノムを含む、一群の構造的に関連したウイルスである。それらは増殖性感染中はその宿主を殺滅しない。Ｆプラスミドを含むEscherichia coliに感染するファージはまとめてＦｆバクテリオファージと呼ばれる。それらは哺乳動物細胞には感染しない。１つの態様において、前記に示した方法に使用される各繊維状バクテリオファージは、独立して、繊維状ファージＭ１３、ｆ１、およびｆｄから選択される。１つの局面において、第一および第二の繊維状ファージを使用する場合、各ファージは同じサブタイプであり、そして繊維状ファージＭ１３、ｆ１およびｆｄから選択される。
【００４４】
炎症誘発性サイトカインに特異的な抗体または免疫グロブリンのＦｃ部分に結合するポリペプチドのいずれかを有するファージを、その表面上にタンパク質を提示するように工学操作する。これは典型的には、ｃＤＮＡクローンのポリペプチドの発現を、ファージコートタンパク質との融合タンパク質として提示させることを含む。ファージコートタンパク質との融合物として外来タンパク質またはペプチドを提示する繊維状バクテリオファージは当業者には周知である。Ｍ１３タンパク質ＩＩＩ、Ｍ１３タンパク質ＶＩＩＩ、Ｍ１３タンパク質ＶＩ、Ｍ１３タンパク質ＩＸおよびｆｄマイナーコートタンパク質ｐＩＩＩを含むがこれらに限定されない、多種多様なファージおよびコートタンパク質を使用し得る(Saggio et al., 1995; UppalaおよびKoivunen, 2000)。このような融合タンパク質を産生するために多くのベクターを利用可能である(Kay et al., 1996; Berdichevsky et al., 1999;およびBenhar, 2001を参照)。外来コード配列をファージ遺伝子に挿入するための方法は周知である（例えば、Sambrook et al., 1989;およびBrent et al., 2003を参照)。
【００４５】
１つの態様において、免疫グロブリンのＦｃ部分に結合するポリペプチドは、繊維状ファージのマイナーコートタンパク質（タンパク質ＩＩＩ）へのその融合によって提示される。
【００４６】
本明細書において説明した方法はまた、特定の記載された処置が必要とされるとして患者が同定されている方法も含む。このような処置の必要な患者の同定は、患者または医療の専門家の判断により得、そして主観的（例えば意見）または客観的（例えば試験または診断法によって測定可能）であり得る。
【００４７】
薬学的組成物
関連する態様において、本発明は、（ａ）炎症誘発性サイトカインに特異的な抗体を提示する第一の繊維状バクテリオファージ；および（ｂ）第二の繊維状バクテリオファージ（第二のバクテリオファージは、炎症誘発性サイトカインに特異的な抗体を提示しない）を含む、薬学的組成物（例えば発熱物質を含まない）を提供する。１つの局面において、第二の繊維状ファージは追加的に哺乳動物細胞内部移行シグナルを提示しない。別の局面において、第二の繊維状ファージはさらに、（ｉ）α−シヌクレイン抗原もしくはα−シヌクレイン抗体；または（ｉｉ）β−アミロイド抗原もしくはβ−アミロイド抗体を提示しない。さらに別の局面において、第二の繊維状ファージはさらに、（ｉ）哺乳動物細胞内部移行シグナル；（ｉｉ）α−シヌクレイン抗原もしくはα−シヌクレイン抗体；または（ｉｉｉ）β−アミロイド抗原もしくはβ−アミロイド抗体を提示しない。
【００４８】
この態様の１つの局面において、第二のバクテリオファージはＷＴファージである。より特定の局面において、第二のバクテリオファージはＵＶ照射されたバクテリオファージである。
【００４９】
別の局面において、炎症誘発性サイトカインに特異的な抗体はＩｇＧクラスであり、そしてＦｃ部分を有する。さらに別の局面において、組成物中の第一のバクテリオファージは、ＩＬ−６に特異的な抗体を提示する。さらに別の局面において、第一のバクテリオファージは哺乳動物細胞内部移行シグナルを含まない。
【００５０】
さらなる局面において、前記組成物は鼻腔内投与のために製剤化される。
【００５１】
薬物の製剤化および投与のための技術は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」 Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版に見出し得、これは参照により本明細書に組み込まれ、そしてこれは当技術分野において周知である。
【００５２】
従って、本発明に従って使用するための薬学的組成物は、薬学的に使用することのできる調製物への活性成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む、１つ以上の生理学的に許容され得る担体を使用して従来の方法で製剤化され得る。
【００５３】
鼻腔内吸入による投与のために、本発明に従って使用するための活性成分は、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタンまたは二酸化炭素などの適切な噴射剤を使用して、加圧包装またはネブライザーからエアゾールスプレー形の形態で簡便に送達される。吸入スプレーのように加圧包装またはネブライザーを必要としない鼻腔スプレーを、鼻腔内投与のために代替的に使用することができる。加圧エアゾールの場合、一定量を送達するためのバルブを施すことによって投与単位を決定し得る。化合物と適切な粉末基剤（ラクトースまたはデンプンなど）との粉末混合物を含む、ディスペンサに使用するための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジを製剤化し得る。
【００５４】
本発明の方法の脈絡において使用するのに適した薬学的組成物は、活性成分（群）が意図する目的を達成するために有効な量で含まれている組成物を含む。より具体的には、有効量とは、パーキンソン病を処置するのに有効な活性成分（群）の量を意味する。
【００５５】
治療的に有効な量の決定は、特に本明細書において提供される詳細な開示に照らして、当業者の能力の十分に範囲内である。
【００５６】
投与量および間隔は、処置をするのに十分な繊維状ウイルス提示ビヒクルの脳内レベルを与えるように個々に調整され得る（最小有効濃度、ＭＥＣ）。ＭＥＣは各調製物によって変動するが、in vitroデータから推測することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、個々の特徴に依存する。
【００５７】
投与の間隔はまた、ＭＥＣ値を使用して決定することもできる。調製物は、処置クール中の時間の１０〜９０％、好ましくは時間の３０〜９０％、最も好ましくは時間の５０〜９０％においてＭＥＣを超える脳内レベルを維持するレジメンを使用して投与されるべきである。
【００５８】
患者の処置しようとするパーキンソン病の重度および応答性に依存して、投与は、１回または複数回の投与であり得、処置クールは、数日間から数週間まで続くか、またはパーキンソン病の状態の減少が達成されるまで続く。
【００５９】
投与しようとする組成物の量は、もちろん、処置される被験体、罹患の重度、処方医の判断などに依存する。
【００６０】
本発明の方法において使用される組成物は、所望であれば、活性成分を含む１つ以上の単位投与形を含み得る、ＦＤＡ承認キットなどの、包装またはディスペンサ装置に提示され得る。前記包装は、例えば、金属またはプラスチック箔を含み得、例えばブリスターパックなどであり得る。包装またはディスペンサ装置は、投与のための説明書を伴い得る。包装またはディスペンサはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式で容器内に付随した注意書きを収容し得、この注意書きは、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の機関による承認を反映している。このような注意書きは、例えば、処方薬のための米国食品医薬品局によって承認されたラベル、または承認された製品の同封説明書であり得る。適合性の薬学的担体中に製剤化された本発明の調製物を含む組成物もまた、さらに上記で詳述したように、調製し、適切な容器中に入れ、そして、適応する容態の処置のためにラベルを付け得る。
【００６１】
１つの特定の態様において、本発明は、別々の容器に、（ａ）炎症誘発性サイトカインに特異的な抗体を提示する第一の繊維状バクテリオファージ；および（ｂ）第二の繊維状バクテリオファージ（第二のバクテリオファージは、（ｉ）哺乳動物細胞内部移行シグナル；（ｉｉ）α−シヌクレイン抗原もしくはα−シヌクレイン抗体；（ｉｉｉ）β−アミロイド抗原もしくはβ−アミロイド抗体；または（ｉｖ）炎症誘発性サイトカインに特異的な抗体、を提示しない）；および（ｃ）パーキンソン病を処置するためにキットを使用する方法を記載した説明書、を含む、パーキンソン病を処置するためのキットを提供する。
【００６２】
今まで一般的に本発明を説明してきたが、本発明は、説明のために提供され本発明を限定するものとは捉えられない以下の実施例を参照してより容易に理解されるであろう。
【００６３】
実施例
本実施例における実験結果は、ＰＤの病態発生に関与するα−シヌクレイン凝集体の脱凝集に対する繊維状ファージの効果を実証する。
【００６４】
繊維状ファージの調製
Ｍ１３繊維状ファージを、５０μg/mlのカナマイシン(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を含む２ＹＴブロス中で、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ(New England Biolabs, Beverly, MA)を用いて感染させたＴＧ１Escherichia coli培養液から調製した。細菌細胞を遠心分離にかけ（８３００×ｇ、１５分間）、そしてファージを、１/５（wt/vol）の１６．７％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加によって上清から沈降させ、そして遠心分離にかけた（１４，０００×ｇ、４℃で１時間）。ペレットを、滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（上清容量の３％）中に再懸濁した。残留細菌を、６，０００×ｇで１５分間の遠心分離によって除去し、そしてその後、ファージをＰＥＧ−ＮａＣｌ沈降にかけた。ペレットを最終的にＰＢＳ（上清容量の２％）中に再懸濁し、そしてファージ溶液を発熱物質を含まない０．４５μmのフィルターを通してろ過して、全ての残留細菌を除去した。等容量のクロロホルムと共にＰＢＳ中で繊維状ファージをインキュベーションすることによって球状のファージを生成した。溶液を室温（ＲＴ）で３分間かけて各１０秒間６回ボルテックスにかけ、そして１８５，０００×ｇで１分間遠心分離にかけた。全てのクロロホルム残渣が蒸発するまで、水溶液およびクロロホルム溶液の両方をフード中で蓋を掛けないで放置し、その後、ＰＢＳ中に再懸濁して最初の容量とした。超音波細胞破壊機(Microson Heat Systems, Farmingdale, NY, USA)を使用して、１５×５秒間の間、氷上でＰＢＳ中で５００μlの１×１０１３個のファージに超音波をかけることによってファージの完全性を破壊した。
【００６５】
in vitroにおけるα−シヌクレイン凝集の調査
レビー小体のコアである、ヒトα−シヌクレインのアミノ酸７１〜８２に対応する１２アミノ酸フラグメント（配列番号７）、および完全な組換えα−シヌクレインタンパク質の両方の凝集レベルを試験しそして分析した。
【００６６】
ペプチドおよび組換えα−シヌクレインの両方を妨げそして脱凝集する繊維状ファージの能力を調べた。α−シヌクレインの凝集レベルを、下記したようにチオフラビンＴ（Ｔｈｔ）およびタンパク質ろ過アッセイで決定した。
【００６７】
α−シヌクレイン原線維および繊維状ファージを電子顕微鏡によって可視化した。
繊維状ファージの抗凝集効果を評価するために、α−シヌクレインのアミノ酸残基７１〜８２におよぶα−シヌクレインフラグメントの９００μlの試料を、３７℃で６週間インキュベーションした。この段階で、繊維状ファージを、１週間の期間、凝集したペプチドと共にインキュベーションした。１０１２/mlおよび１０１１/mlの２つのファージ濃度を調べた。ペプチド試料を０．３μMのＴｈｔ水溶液中に希釈して、２２５μMの最終濃度とした。４８０nmにおける試料の蛍光発光を定量した。４８０nmにおける発光の減少によって観察されたように、１０１２/mlのファージ量を含む試料中において有意な４３％の減少が検出された（図２Ａ）。
【００６８】
試料はまた、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によっても観察された。試料をカーボングリッド上にのせ、そして酢酸ウラニルで被覆した。α−シヌクレインペプチドのみを含む試料では、濃密な形態での有意な量の複雑な原線維が検出された（図２Ｂ、左パネル）。原線維の量および複雑さのかなりの減少が、１０１１個のファージと共にインキュベーションした試料中で観察されたが、一方、１０１２個のファージと共にインキュベーションした試料中では原線維は全く検出されず、そして無定形な凝集体だけが見られた（図２Ｂ、中央および右のパネル）。
【００６９】
細胞モデルとしてのＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞培養液
神経芽細胞腫の細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙは、ＰＤモデルとして使用するのに良好な候補である。なぜなら、それはドーパミン細胞であるからである。細胞を、野生型ヒトα−シヌクレイン遺伝子および突然変異体α−シヌクレインＡ５３Ｔ遺伝子を用いて安定にトランスフェクションさせた。
・α−シヌクレイン発現を、ウェスタンブロットによって決定した。
・細胞を、α−シヌクレイン抗体で染色することによりレビー小体を可視化した。
【００７０】
Ａ５３Ｔα−シヌクレインを過剰発現させるように安定にトランスフェクションされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、１０cmの皿において成長させ、そして５％ＣＯ２を含む加湿インキュベーター中、３７℃で、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡｓ）を含み、ＦＣＳ（１０％）、グルタミン（２mM）、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（１％）(Biological Industries)の補充されたＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（１：１）改変培地中で維持した。
【００７１】
細胞溶解
α−シヌクレインの分離のために、溶解手順を、本発明者らの研究室によって改変されたLee et al. (2004)によって記載された細胞抽出を使用して実施した。簡潔に言うと、細胞をＰＢＳで濯ぎ、１５mlのチューブに収集された１つの皿あたり１．５mlのトリプシンを用いてトリプシン処理し、遠心分離にかけ、そしてＰＢＳで再度洗浄し、その後、エッペンドルフチューブに回収した。細胞を、１００μlの緩衝液Ｔ（２０mMトリスｐＨ７．４、２５mM ＫＣｌ、５mM ＭｇＣｌ２、０．２５Ｍスクロース、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびプロテアーゼ阻害剤混合物を含む）を用いて溶解し、細胞凝集塊が残留しなくなるまでピペッティングし、室温で１０分間インキュベーションし、そして１３，０００×ｇで１０分間遠心分離にかけた。上清を回収し、そして「ｓｕｐ」と印をつけた別々のエッペンドルフチューブに入れた（上清がペレット画分に全く残らないように注意する）。ペレットに、混合することなく穏やかに緩衝液Ｎ（０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１１．５およびタンパク質阻害剤混合物を含む）を被せ、そして４℃で一晩インキュベーションした。このことは、タンパク質が穏やかに緩衝液中に再懸濁されることを可能とした。インキュベーション後、今では曇った緩衝液を、小さなピペット尖端を使用して除去し、そして廃棄した。チューブ中の残りの材料を「ペレット」と印をつけた。上清およびペレット抽出物を−２０℃に保ち、そしてウェスタンブロットによって分析して、可溶性および不溶性α−シヌクレインの量を定量した。
【００７２】
ファージ毒性
ファージと共にインキュベーションした後の分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の生存度を、ＭＴＴ試薬を使用して試験した。細胞を、９６ウェルプレート中で１×１０９および１×１０１１個のファージ/ウェルと共に一晩インキュベーションした。インキュベーション後に細胞死は全く観察されなかった（図３）。
【００７３】
フィルター遅延アッセイ
タンパク質凝集体のろ過のために、市販されているスロットブロット装置(Bio-Rad Laboratories, Munich, Germany)を使用した。試料を、遮断されたニトロセルロース膜(0-.2 μmの孔サイズ、Schleicher & Scheull, Dassel, Germany)を通してろ過した。ろ過後、各スロットを、０．１％ＳＤＳで洗浄した。α−シヌクレイン凝集体を、二次ＨＲＰ結合ヤギ抗マウス抗体と共にモノクローナル抗体ＬＢ５０９（１：１０，０００）を使用して検出し、そして最終的に化学発光によって可視化した。ＰＡＦブロットの濃度測定による定量を、SigmaGel v1.0を用いて実施した。
【００７４】
１つの１０cm皿あたり等しい数の細胞を加え、そして８０％の集密度を到達させた。その時点で、細胞を、種々の量のファージを用いて２４時間および７２時間処理した。その後、細胞を、各プレートから回収し、溶解し、そして下記したように分析した。野生型α−シヌクレインを過剰発現する分化ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、３時間の期間または一晩３７℃で合計１×１０１２個のファージと共にインキュベーションした。可溶性および不溶性画分を抽出し、そして不溶性画分を０．２μmのニトロセルロース膜を通してろ過した。フィルター上に保持されたα−シヌクレイン凝集体の量は非処理細胞中においてより高かった（図４Ａ）。
【００７５】
α−シヌクレインオリゴマーのＥＬＩＳＡ
α−シヌクレインのオリゴマー種を検出するためのＥＬＩＳＡを改変して(El-Agnaf et al., 2000)、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の不溶性画分中のα−シヌクレインオリゴマーの量を測定した。ＡＳのオリゴマーのみを検出するために、被覆のために使用したのと同じモノクローナル抗体（ビオチンにコンジュゲート）を使用した。
【００７６】
ＡＳオリゴマーの４０％〜５０％の減少が、ファージを用いて３時間および一晩のインキュベーションの両方で処理した細胞の不溶性画分において検出された（図４Ｂ）。
【００７７】
細胞モデルにおけるα−シヌクレインとＭ１３ファージとの相互作用
α−シヌクレイン（ＡＳ）は、シナプス前終末に局在する天然ではフォールディングされていないタンパク質である。ＡＳはＮ末端を通して膜中に容易に取り込まれ、従って、細胞中において膜結合形態および無秩序な細胞質形態という２つの形態で存在する。蓄積しているデータは、膜形態のＡＳが細胞毒性において役割を果たしていることを示す。プロトフィブリルは、細胞膜上に包埋された環状構造を形成し得、そして膜透過性を引き起こし得る。ＡＳが脂質の存在下においてより高度な凝集の傾向を有し、そして膜凝集体が細胞質形態のＡＳの凝集を誘導し得ることが近年実証された。
【００７８】
ここで、野生型ＡＳを過剰発現するＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における野生型（Ｍ１３）繊維状ファージを用いて処理後のＡＳオリゴマーのモデュレーションが提示される。細胞の膜画分を、ウェスタンブロット分析によるＡＳ検出のために、膜抽出キット（ＭＢＬ）を使用して抽出した。ＡＳモノマーが検出されただけでなく、ＡＳダイマーおよびトリマーも膜画分において検出され（図５Ａ）、本発明者らの細胞モデルにおける膜区画におけるＡＳオリゴマーの存在が実証された。繊維状ファージと共にインキュベーションした後のＡＳ膜のオリゴマー化に対する繊維状ファージの効果を図５Ａおよび５Ｂに示す。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、レチノイン酸を使用して分化させ、そして１０１１個のファージ/mlの野生型ファージと共に一晩インキュベーションした。膜画分を次の日に抽出し、そして各抽出試料を、ＡＳのオリゴマー種のみを認識するように設計されたＥＬＩＳＡでＡＳオリゴマーの量について測定した（図５Ｂ）。膜画分由来のＡＳオリゴマーの有意な減少が、繊維状ファージと共にインキュベーションした後にＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において測定された。膜画分から抽出されたＡＳ凝集体に対する野生型ファージの効果は、野生型ファージが、おそらく、ＡＳのＮＡＣ領域のアミノ酸７３〜８５に位置する以前に実証された相互作用領域を通してのＡＳとの直接的な相互作用を介して、形質膜上のＡＳに影響を及ぼすことを示唆する。細胞をファージと共に長時間インキュベーションすることに因り、僅かな割合のファージが細胞中に内部移行し、形質膜以外の細胞中の他の膜区画に影響を及ぼすことも可能である。内部移行の可能性を伴う細胞へのファージの結合は、リソソーム分解の活性化を通して、形質膜からのα−シヌクレインの排除を促進し得る。
【００７９】
パーキンソン病のトランスジェニックマウスモデルを使用した、α−シヌクレインとＭ１３との相互作用の研究
７カ月令のＰＤＧＦα−シヌクレイントランスジェニックマウス（Ｄ系）および非トランスジェニックマウスは、１×１０１４個のＭ１３ファージの海馬内注入を受け、そして脳を免疫組織化学によって７日後に、α−シヌクレイン、Ｍ１３およびlba1（ミクログリア活性化のため）に対する抗体を用いて分析した。Ｍ１３を注入されたα−シヌクレインＴｇマウスにおいて、豊富なＭ１３免疫反応性が観察された。Ｍ１３の免疫染色が、新皮質および海馬の神経細胞体において観察された。海馬におけるＭ１３の免疫染色はまた、ニューロピルにおいても豊富であった。α−シヌクレインの神経凝集体の平均数を、一方の半球にはＭ１３を、他方の半球にはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ビヒクルを注入した後に脳の両半球において測定し、そして別々の半球における測定の比を図６に示す。
【００８０】
今まで本発明を完全に説明してきたが、本発明を、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、過度の実験を行なうことなく、多種多様な等価なパラメータ、濃度および条件内で実施することができることが当業者によって認識されるだろう。
【００８１】
本発明を、その具体的な態様と関連させて記載してきたが、さらなる改変も行なうことができることが理解されるだろう。本出願は、一般に本発明の原理に従って、本発明が属する技術分野内の公知または慣用的な実践内に該当し、そして以下のように添付の特許請求の範囲に示された本明細書において前記した本質的な特徴に適用され得るような、本発明の開示からのこのような逸脱を含む、本発明の任意の変法、使用または適応を網羅することを意図する。
【００８２】
公知の方法工程、従来の方法工程、公知の方法または従来の方法への言及は、いずれにしても、本発明の任意の局面、記載または態様が、関連技術分野において開示、教義または示唆されていることを承認するものではない。
【００８３】
以前の具体的な態様の記載は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするので、他者は、当技術分野の技術範囲内の知識（本明細書において引用した参考文献の内容を含む）を適用することによって、過度の実験を行なうことなく、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、種々の適用のためにこのような具体的な態様を容易に改変および／または適応させることができる。それ故、このような適応および改変は、本明細書において提示した教義および指針に基づいて、開示された態様の均等物の意味および範囲内であることを意図する。本明細書における語句または用語は、説明のためであって制限するためのものではないので、本明細書の用語または語句は、当業者によって、本明細書において提示した教義および指針に照らして、当業者の知識と組み合わせて解釈されるものであることを理解されたい。
【００８４】
【表１】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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