(57)【要約】【課題】無血清で、動物由来による汚染がなく、化学成分が明確で高効率にｉＰＳ細胞を取得可能な培養システムを提供する。【解決手段】本発明の培養培地添加物は、ビタミンＣ及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３阻害剤を含む。本発明の培養培地添加物は、ビタミンＣ及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３阻害剤を含む以外に、さらに、ビタミンＢ１２、インスリン、レセプターチロシンキナーゼ及び抗酸化剤を含んでもよい。本発明の培養培地添加物は、上述の２種の培養培地添加物と血清代替細胞成長促進剤との混合物でもよい。本発明は、ＥＳ細胞を誘導する完全培養培地をさらに提供する。完全培養培地は、基礎培養培地、血清及び血清代替添加物の中の少なくとも１つと、上述の数種の培養培地添加物と、からなるか、或いは、基礎培養培地と、上述の数種の培養培地添加物と、からなる。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養培地添加物であって、
前記培養培地添加物は、ビタミンＣ及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３阻害剤を有することを特徴とする培養培地添加物。
【請求項２】
前記グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３阻害剤は、リチウムイオン、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ及びＳＢ２１６７６３の中の少なくとも１つであることを特徴とする請求項１に記載の培養培地添加物。
【請求項３】
前記培養培地添加物は、ビタミンＢ１２、インスリン、レセプターチロシンキナーゼ及び抗酸化剤をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の培養培地添加物。
【請求項４】
前記レセプターチロシンキナーゼは、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）及び肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の中の少なくとも１つであることを特徴とする請求項３に記載の培養培地添加物。
【請求項５】
前記抗酸化剤は、チアミン、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、還元型グルタチオン、ビタミンＥ、アセチル化ビタミンＥ、リノール酸、リノレン酸及び亜セレン酸ナトリウムの中の少なくとも１つであることを特徴とする請求項３に記載の培養培地添加物。
【請求項６】
前記培養培地添加物は、血清代替細胞成長促進剤をさらに有することを特徴とする請求項１又は３に記載の培養培地添加物。
【請求項７】
前記血清代替細胞成長促進剤は、アルブミン加水分解物、トランスフェリン、トリヨードチロニン、アドレナロン、リポ酸、エタノールアミン、プロゲステロン、プトレシン及びビタミンＡの中の少なくとも１つであることを特徴とする請求項６に記載の培養培地添加物。
【請求項８】
完全培養培地であって、
前記完全培養培地は、基礎培養培地、血清及び血清代替添加剤の中の少なくとも１つと、請求項１、３又は６に記載の培養培地添加剤と、から構成されることを特徴とする完全培養培地。
【請求項９】
完全培養培地であって、
前記完全培養培地は、基礎培養培地と、請求項１、３又は６に記載の培養培地添加剤と、から構成されることを特徴とする完全培養培地。
【請求項１０】
前記培養培地添加物又は前記完全培養培地は、ＥＳ細胞への誘導又は真核細胞の培養に応用されることを特徴とする請求項１、３又は６に記載の培養培地添加物、或いは、請求項８又は９に記載の完全培養培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養培地に関し、特に、ｉＰＳ細胞又は哺乳動物細胞の培養に用いることができる培養培地添加物に関する。
【背景技術】
【０００２】
２００８年、日本の科学者である山中らのグループが４つの転写因子（Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ）を用い、マウス線維芽細胞をＥＳ細胞にリプログラミングすることに成功した。この技術は、ｉＰＳ細胞技術と称する。その後、ヒト及び他の動物（大ねずみ、サル、ブタなど）の線維芽細胞もリプログラミングに成功した。この技術は、再生医療において、最も大きな躍進である。現在、マウスのリプログラミング過程において採用されている略全ての培養システムは、血清を含む。
【０００３】
血清を含む培養システムは、以下（１）〜（３）に示す欠点を有する。
【０００４】
（１）プログラミング過程が緩慢である：血清中には、例えば、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）ファミリーなど、リプログラミングを抑制する物質が含まれることが証明されている。また、血清中の他の不明物質がプログラミング過程を緩慢にする可能性が極めて高い。これらの証明済み又は未証明の物質により、リプログラミング効率が低下する。
【０００５】
（２）ロットによって血清成分が異なる：血清の作製過程によって各ロットの血清の成分が異なり、実験の再現性が低下する。
【０００６】
（３）血清成分が不明なことがリプログラミングのメカニズムの研究及び薬剤のスクリーニングの障害となる：血清成分は複雑であり、ｉＰＳ過程に有利な酵素反応も不利な酵素反応も起動される可能性がある。これは、ｉＰＳメカニズムの研究に極めて大きな障害となると共に、薬剤のスクリーニングの感度も低下する。
【０００７】
血清代替物（ＫＯＳＲ）無血清培養培地の発明は、細胞培養技術において、大きな進歩である。このシステムは、血清を一切含まないと共に、システム中の略全ての成分が明確であり、実験の再現性が大幅に高められた。このシステムは、分化因子を殆ど含まないため、幹細胞の自己再生の維持に優れる。また、このシステムに血清を混合したものは、血清を単独で使用したものより、リプログラミング効率が高い。
【０００８】
しかし、このシステムの成分は、完全に明確であるわけではない。例えば、高脂質ウシ血清アルブミン（ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標））中には、多種の不明脂質が含まれる。これらの成分がリプログラミングに与える影響は、未だに分かっていない。また、血清代替物（ＫＯＳＲ）は、リプログラミング前期の細胞成長をサポートすることができない。また、マウスｉＰＳ細胞への誘導過程において、血清を混合しても、リプログラミング効率は高くない。
【０００９】
そこで、無血清であり、成分が完全に明確であり、高効率なリプログラミングシステムは、ｉＰＳメカニズム、薬剤スクリーニング及びｉＰＳの臨床応用にとって非常に重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、無フィーダー細胞の条件においても幹細胞の成長及び増殖を維持することができ、ｉＰＳ進行を加速し、ｉＰＳの作製効率を高めることができる成分が明確で高効率にｉＰＳ細胞を取得することができる培養システムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上述の課題を解決するために、本発明の培養培地添加物は、ビタミンＣ及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３阻害剤を含む。
【００１２】
本発明の培養培地添加物は、ビタミンＣ及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３阻害剤を含む以外に、さらに、ビタミンＢ１２、インスリン、レセプターチロシンキナーゼ及び抗酸化剤を含む。
【００１３】
ビタミンＣは、アスコルビン酸と、アスコルビン酸ナトリウムなど、その誘導体と、を含む。ビタミンＣの安定形は、２リン酸アスコルビン酸である。ビタミンＣは、好ましくは、２リン酸アスコルビン酸である。ビタミンＣの作業濃度は、０〜１００μｇ／ｍｌであり（これに限定されない）、好ましくは、５０μｇ／ｍｌである。ビタミンＢ１２の作業濃度は、０〜２．８μｇ／ｍｌであり（これに限定されない）、好ましくは、１．４μｇ／ｍｌである。
【００１４】
インスリンは、抽出及び人工的に組換え合成された各種起源の生物活性を有するインスリンである。インスリンは、好ましくは、人工的に組換えされたインスリン（ＳＩＧＭＡ社）である。インスリンの作業濃度は、０〜５０μｇ／ｍｌであり（これに限定されない）、好ましくは、２０μｇ／ｍｌである。
【００１５】
グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３阻害剤は、Ｌｉ＋、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ及びＳＢ２１６７６３の中の少なくとも１つを含む。Ｌｉ＋は、好ましくは、ＬｉＣｌである。Ｌｉ＋の作業濃度は、０〜１０μｇ／ｍｌであり（これに限定されない）、好ましくは、５ｍｍｏｌ／ｍｌである。グリコーゲン合成酵素キナーゼは、セリン／トレオニンホスホリラーゼキナーゼであり、多種の信号経路の調整に参与する。その阻害剤は、好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１である。グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３阻害剤の作業濃度は、０〜１２μｍｏｌ／ｍｌであり（これに限定されない）、好ましくは、３μｍｏｌ／ｍｌである。
【００１６】
レセプターチロシンキナーゼは、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）及び肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の中の少なくとも１つを含む。レセプターチロシンキナーゼは、好ましくは、塩基性線維芽細胞成長因子である。レセプターチロシンキナーゼの作業濃度は、０〜１００ｎｇ／ｍｌであり、好ましくは、５ｎｇ／ｍｌである。
【００１７】
抗酸化剤は、チアミン、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、還元型グルタチオン、ビタミンＥ、アセチル化ビタミンＥ、リノール酸、リノレン酸及び亜セレン酸ナトリウムの中の少なくとも１つを含む。チアミンの作業濃度は、０〜３６μｇ／ｍｌであり（これに限定されない）、好ましくは、９μｇ／ｍｌである。スーパーオキシドジスムターゼの作業濃度は、０〜１０μｇ／ｍｌであり（これに限定されない）、好ましくは、２．５μｇ／ｍｌである。還元型グルタチオンの作業濃度は、０〜６μｇ／ｍｌであり（これに限定されない）、好ましくは、１．５μｇ／ｍｌである。ビタミンＥの作業濃度は、０〜１６μｇ／ｍｌであり（これに限定されない）、好ましくは、１μｇ／ｍｌである。アセチル化ビタミンＥの作業濃度は、０〜１６μｇ／ｍｌであり（これに限定されない）、好ましくは、１μｇ／ｍｌである。リノール酸の作業濃度は、０〜４μｇ／ｍｌであり（これに限定されない）、好ましくは、１μｇ／ｍｌである。エタノールアミンの作業濃度は、０〜１６μｇ／ｍｌであり（これに限定されない）、好ましくは、１μｇ／ｍｌである。
【００１８】
本発明の培養培地添加物は、上述の２種の培養培地添加物に血清代替細胞成長促進剤を混合したものでもよい。血清代替細胞成長促進剤は、アルブミン加水分解物、トランスフェリン、トリヨードチロニン、アドレナロン、リポ酸、エタノールアミン、プロゲステロン、プトレシン及びビタミンＡの中の少なくとも１つを含む。
【００１９】
アルブミン加水分解物は、アルブミンを加水分解したものであり、その組成成分は、アミノ酸及びポリペプチドであり、具体的な成分が明確である。アルブミン加水分解物の使用濃度は、０〜１０ｍｇ／ｍｌであり（これに限定されない）、好ましくは、１ｍｇ／ｍｌである。
【００２０】
トランスフェリンは、鉄イオンを含むトランスフェリン及び鉄イオンを含まないトランスフェリンを含み、好ましくは、鉄イオンを含むトランスフェリンである。トランスフェリンの使用濃度は、０〜２００μｇ／ｍｌであり（これに限定されない）、好ましくは、１００μｇ／ｍｌである。
【００２１】
リポ酸の作業濃度は、０〜３．２μｇ／ｍｌであり（これに限定されない）、好ましくは、０．２μｇ／ｍｌである。
【００２２】
ビタミンＡの作業濃度は、０〜１．６μｇ／ｍｌであり（これに限定されない）、好ましくは、０．１μｇ／ｍｌである。
【００２３】
本発明は、完全培養培地をさらに提供する。本発明の完全培養培地は、基礎培養培地、血清及び血清代替添加物中の少なくとも１つと、上述の数種の培養培地添加物と、からなる。或いは、基礎培養培地と、上述の数種の培養培地添加物と、からなる。また、表１に示す材料が基礎培養培地ＤＭＥＭ中に添加されることにより、化学成分が明確な完全培養培地ｉＣＤ１が形成される。表１は、好ましい培養培地添加物の成分及び濃度を示す。
【００２４】
本発明は、ｉＰＳ細胞の完全培養培地をさらに提供する。本発明のｉＰＳ細胞の完全培養培地は、基礎培養培地、血清及び血清代替添加物中の少なくとも１つと、上述の２種の培養培地添加物と、から構成される。
【００２５】
上述の基礎培養培地は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）、Ｆ−１０、Ｆ−１２、ＲＰＭＩ  １６４０、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ‘ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、αＭＥＭ（αＭｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）又はＭ１９９である（これに限定されない）。基礎培養培地は、好ましくは、ＤＭＥＭである。
【００２６】
血清代替添加物は、ＫＯＳＲ（Ｋｎｏｃｋ  Ｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、Ｎ２、Ｂ２７又はＩＴＳ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）である（これに限定されない）。
【００２７】
表１に示す培養培地添加物が基礎培養培地ＤＭＥＭ中に添加されることにより、化学成分が明確な完全培養培地ｉＣＤ１が形成される。表１は、好ましい培養培地添加物の成分及び濃度を示す。表２は、完全培養培地ｉＣＤ１の好ましい成分及び濃度を示す。
【表１】
2012524551.tif 000002
【００２８】
【表２】
2012524551.tif 000003
2012524551.tif 000004
2012524551.tif 000005
【発明の効果】
【００２９】
本発明の培養システムは、無血清である上、成分が明確であり、体細胞からｉＰＳ細胞を高効率に取得する無血清培養システムに用いられ、無フィーダー細胞の条件において、線維芽細胞及び幹細胞の成長及び増殖を維持することができる。また、ｉＰＳ進行を加速させ、ｉＰＳの作製効率を高めることができる。さらに、真核細胞の培養にも用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ａは、ｍＥＳ、ｍＥＳ＋ビタミンＣ、ＫＳＲ−ＢＮ及びＢａｓａｌ３．０の４種の培養条件において、ＳＫＯ（Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＯｃｔ４）ウイルス感染後１０日目の２万個の線維芽細胞から誘導したリプログラミングクローン数を示すグラフである。ｂは、ｍＥＳ、ｍＥＳ＋ビタミンＣ、ＫＳＲ−ＢＮ及びＢａｓａｌ３．０の４種の培養条件において、ＳＫＯ（Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＯｃｔ４）ウイルス感染後１０日目に測定したリプログラミング細胞の比率を示すグラフである。
【図２】ａは、添加物中のコア成分の用量反応実験の結果を示し、塩化リチウムの濃度範囲が０〜１０ｍｍｏｌ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のリプログラミングクローン数を示すグラフである。ｂは、添加物中のコア成分の用量反応実験の結果を示し、塩化リチウムの濃度範囲が０〜１０ｍｍｏｌ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のリプログラミング細胞（緑色蛍光細胞）の比率を示すグラフである。ｃは、添加物中のコア成分の用量反応実験の結果を示し、ビタミンＢ１２の濃度範囲が０〜２．８μｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のリプログラミングクローン数を示すグラフである。ｄは、添加物中のコア成分の用量反応実験の結果を示し、ビタミンＢ１２の濃度範囲が０〜２．８μｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のリプログラミング細胞の比率を示すグラフである。ｅは、添加物中のコア成分の用量反応実験の結果を示し、塩基性線維芽細胞成長因子の濃度範囲が０〜７ｎｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のリプログラミングクローン数を示すグラフである。ｆは、添加物中のコア成分の用量反応実験の結果を示し、塩基性線維芽細胞成長因子の濃度範囲が０〜７ｎｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のリプログラミング細胞の比率を示すグラフである。ｇは、添加物中のコア成分の用量反応実験の結果を示し、ビタミンＣの濃度範囲が０〜１００μｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のリプログラミングクローン数を示すグラフである。ｈは、添加物中のコア成分の用量反応実験の結果を示し、ビタミンＣの濃度範囲が０〜１００μｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のリプログラミング細胞の比率を示すグラフである。ｉは、添加物中のコア成分の用量反応実験の結果を示し、インスリンの濃度範囲が０〜５０μｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のリプログラミングクローン数を示すグラフである。
【図３】ａは、抗酸化剤の用量反応実験の結果を示し、ビタミンＥの濃度範囲が０〜１６μｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のリプログラミングクローン数を示すグラフである。ｂは、抗酸化剤の用量反応実験の結果を示し、ビタミンＥの濃度範囲が０〜１６μｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のフローサイトメトリーによって測定されたＯｃｔ４−ＧＦＰ陽性細胞の比率を示すグラフである。ｃは、抗酸化剤の用量反応実験の結果を示し、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の濃度範囲が０〜１０μｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のリプログラミングクローン数を示すグラフである。ｄは、抗酸化剤の用量反応実験の結果を示し、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の濃度範囲が０〜１０μｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のフローサイトメトリーによって測定されたＯｃｔ４−ＧＦＰ陽性細胞の比率を示すグラフである。ｅは、抗酸化剤の用量反応実験の結果を示し、還元型グルタチオンの濃度範囲が０〜６μｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のリプログラミングクローン数を示すグラフである。ｆは、抗酸化剤の用量反応実験の結果を示し、還元型グルタチオンの濃度範囲が０〜６μｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のフローサイトメトリーによって測定されたＯｃｔ４−ＧＦＰ陽性細胞の比率を示すグラフである。ｇは、抗酸化剤の用量反応実験の結果を示し、チアミンの濃度範囲が０〜３６μｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のリプログラミングクローン数を示すグラフである。ｈは、抗酸化剤の用量反応実験の結果を示し、チアミンの濃度範囲が０〜３６μｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のフローサイトメトリーによって測定されたＯｃｔ４−ＧＦＰ陽性細胞の比率を示すグラフである。
【図４】ａは、成長支持物質の用量反応を示し、ビタミンＡの濃度範囲が０〜１６μｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のリプログラミングクローン数を示すグラフである。ｂは、成長支持物質の用量反応を示し、ビタミンＡの濃度範囲が０〜１６μｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のフローサイトメトリーによって測定されたＯｃｔ４−ＧＦＰ陽性細胞の比率を示すグラフである。ｃは、成長支持物質の用量反応を示し、エタノールアミンの濃度範囲が０〜１６μｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のリプログラミングクローン数を示すグラフである。ｄは、成長支持物質の用量反応を示し、エタノールアミンの濃度範囲が０〜１６μｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のフローサイトメトリーによって測定されたＯｃｔ４−ＧＦＰ陽性細胞の比率を示すグラフである。ｅは、成長支持物質の用量反応を示し、リノール酸の濃度範囲が０〜４μｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のリプログラミングクローン数を示すグラフである。ｆは、成長支持物質の用量反応を示し、リノール酸の濃度範囲が０〜４μｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のフローサイトメトリーによって測定されたＯｃｔ４−ＧＦＰ陽性細胞の比率を示すグラフである。ｇは、成長支持物質の用量反応を示し、リポ酸の濃度範囲が０〜３．２μｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のリプログラミングクローン数を示すグラフである。ｈは、成長支持物質の用量反応を示し、リポ酸の濃度範囲が０〜３．２μｇ／ｍｌの場合における、ＳＫＯ感染後１０日目のフローサイトメトリーによって測定されたＯｃｔ４−ＧＦＰ陽性細胞の比率を示すグラフである。
【図５】ａは、本発明の化学成分が明確な培養培地ｉＣＤ１（Ｂａｓａｌ３．０にグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１を添加）と、従来のリプログラミング培養培地と、のリプログラミング効率の比較を示すグラフである。ｂは、本発明の化学成分が明確な培養培地ｉＣＤ１と、従来のリプログラミング培養培地と、のリプログラミング効率の比較を示し、図5ａに示す複数の培養培地の感染後８日目のリプログラミングクローンを示す写真である。ｃは、本発明の化学成分が明確な培養培地ｉＣＤ１と、従来のリプログラミング培養培地と、のリプログラミング効率の比較を示し、ＫＳＲ−ＢＮ培養方式は、リプログラミング効率を高めることを示すグラフである（成分は後述する）。ｄは、本発明の化学成分が明確な培養培地ｉＣＤ１と、従来のリプログラミング培養培地と、のリプログラミング効率の比較を示し、ｍＥＳ＋ビタミンＣ培養方式は、リプログラミング効率を高めることを示すグラフである。ｅは、本発明の化学成分が明確な培養培地ｉＣＤ１と、従来のリプログラミング培養培地と、のリプログラミング効率の比較を示し、ｍＥＳ→ＫＳＲ培養方式は、リプログラミング効率を高めることを示すグラフである（ｍＥＳ→ＫＳＲ培養方式の具体的な過程は後述する）。
【図６】ａは、本発明の培養培地添加物中の６種の成分（塩基性線維芽細胞成長因子、ビタミンＣ、ＣＨＩＲ９９０２１、塩化リチウム、ビタミンＢ１２及びチアミン）がリプログラミング効率に与える影響を示すグラフである。ｂは、本発明の培養培地添加物中の６種の成分（塩基性線維芽細胞成長因子、ビタミンＣ、ＣＨＩＲ９９０２１、塩化リチウム、ビタミンＢ１２及びチアミン）がリプログラミング効率及び成長に与える影響を示し、感染後８日目の各培養条件におけるリプログラミングの様子を示す写真である。ｃは、本発明の培養培地添加物中の６種の成分（塩基性線維芽細胞成長因子、ビタミンＣ、ＣＨＩＲ９９０２１、塩化リチウム、ビタミンＢ１２及びチアミン）がリプログラミング効率及び成長に与える影響を示し、各培養条件における成長曲線を示すグラフである。
【図７】ａは、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の用量反応を示すグラフである。ｂは、ｂＦＧＦの作用時間実験の結果を示すグラフである。ｃは、ビタミンＣの用量反応を示すグラフである。ｄは、ＣＨＩＲ９９０２１の用量反応を示すグラフである。ｅは、レセプターチロシンキナーゼがリプログラミングに与える効果を示すグラフである。
【図８】ａは、化学成分が明確な培養培地ｉＣＤ１において、ＡＬＫ５（腫瘍壊死因子ＴＧＦ−βの受容体）阻害剤Ａ８３−０１、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）及びウシ胎児血清がＯＫＳが誘導するリプログラミング効率を高めることができないことを証明する実験の結果を示し、マウス線維芽細胞にＳＫＯウイルスを感染させた後、化学成分が明確な培養培地ｉＣＤ１と、Ａ８３−０１（０．５μＭ）が添加されたｉＣＤ１と、バルプロ酸（１ｍＭ）が添加されたｉＣＤ１と、２％のウシ胎児血清が添加されたｉＣＤ１と、において培養し、感染後１０日目のリプログラミングクローン数を示すグラフである。ｂは、図8ａの実験における典型的なリプログラミングクローンを示す写真である。
【図９】初期播種密度がリプログラミング効率に影響を与えることを証明する実験の結果を示すグラフである。
【図１０】ａは、ｉＣＤ１培養条件における内因性多能性分子標識の発現結果を示し、リアルタイムＰＣＲによって検出された内因性多能性分子標識の発現量を示すグラフである。ｂは、ｉＣＤ１培養条件における内因性多能性分子標識の発現結果を示し、細胞培養プレート上に直接固定し、免疫蛍光法によって行った実験の結果を示す写真である。ｃは、ｉＣＤ１培養条件における内因性多能性分子標識の発現結果を示し、イムノブロット法により、発現プロファイルを検出した結果を示す写真である。
【図１１】ｉＣＤ１培養システムにおけるリプログラミングの追跡を示す写真である。
【図１２】ａは、感染後８日目のリプログラミング効率及び関連する分子標識の発現を示し、Ｏｃｔ４−ＧＦＰマウス胎児線維芽細胞にＳＫＯウイルス及び外因性赤色蛍光蛋白ＤｓＲｅｄウイルスを感染させた後、ｍＥＳ培養培地及びｉＣＤ１培養培地中において培養し、感染後８日目の２種の培養条件におけるリプログラミング細胞（緑色蛍光細胞）と未リプログラミング細胞（赤色蛍光細胞）との比率を示す図である。ｂは、感染後８日目のリプログラミング効率及び関連分子標識を示し、リアルタイム定量ＰＣＲにより測定した、ＳＫＯウイルスに感染後、８日培養したｍＥＳと、８日培養したｉＣＤ１と、８日培養したｉＣＤ１から分別した細胞集団と、における多能性分子標識の発現プロファイルを示すグラフである。
【図１３】ａは、キメラマウスを作製する過程に関する結果を示し、胚注射によって検出されたｉＣＤ１培養培地中のＯＳＫによって誘導されたｉＰＳＣ細胞の多能性を示す流れ図である。ｂは、キメラマウスを作製する過程に関する結果を示し、様々な誘導日数において、図13ａに示す実験を行った結果を示す図である。ｃは、キメラマウスを作製する過程に関する結果を示し、８日目に取得したｉＰＳＣ細胞を胞胚に注射することによって作製されたキメラマウスを示す写真である。
【図１４】ａは、ｉＣＤ１培養システムにおいて、ＯＫ及びＯＳを用いて体細胞をリプログラミングする実験の結果を示し、ｉＣＤ１培養条件において、ＯＫ及びＯＳを用いて体細胞をリプログラミングした初代クローン写真及び経過写真である。ｂは、ｉＣＤ１培養システムにおいて、ＯＫ及びＯＳを用いて体細胞をリプログラミングする実験の結果を示し、免疫蛍光法により検出した、幹細胞特異の分子標識の発現プロファイルを示す。ｃは、ｉＣＤ１培養システムにおいて、ＯＫ及びＯＳを用いて体細胞をリプログラミングする実験の結果を示し、ｉＣＤ１培養システムにおいて、ＯＫ及びＯＳを用いてリプログラミングを行う実験の実施状況及び効率を示す図である。ｄは、ｉＣＤ１培養システムにおいて、ＯＫ及びＯＳを用いて体細胞をリプログラミングする実験の結果を示し、奇形腫の切断面を示す写真であり、ＯＫ及びＯＳを用いたリプログラミングによって形成されたｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞の特徴を有することを示す。
【図１５】ａは、ｉＣＤ１条件において、Ｏｃｔ４を用いてマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）をリプログラミングする実験の結果を示し、感染後３３日目にＯｃｔ４によって誘導された初代クローン及び形成された細胞株を示す写真である。ｂは、ｉＣＤ１条件において、Ｏｃｔ４を用いてマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）をリプログラミングする実験の結果を示し、Ｏｃｔ４  ｉＰＳクローンが発現した多能性分子標識を示す写真である。ｃは、ｉＣＤ１条件において、Ｏｃｔ４を用いてマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）をリプログラミングする実験の結果を示し、リアルタイム定量ＰＣＲにより、選出されたクローンが何れも幹細胞特異の多能性分子標識を発現したことを示すグラフである。ｄは、ｉＣＤ１条件において、Ｏｃｔ４を用いてマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）をリプログラミングする実験の結果を示し、リアルタイム定量ＲＣＲ法により、外因子遺伝子の発現プロファイルを分析した結果を示すグラフである。ｅは、ｉＣＤ１条件において、Ｏｃｔ４を用いてマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）をリプログラミングする実験の結果を示し、挿入鑑定分析により、選出されたクローンがＯｃｔ４因子のみにより誘導されたものであり、汚染ではないことが確定されたことを示す図である。ｆは、ｉＣＤ１条件において、Ｏｃｔ４を用いてマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）をリプログラミングする実験の結果を示し、Ｏｃｔ４  ｉＰＳＣ細胞を胞胚に注射することによって作製されたキメラマウスを示す写真である。ｇは、ｉＣＤ１条件において、Ｏｃｔ４を用いてマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）をリプログラミングする実験の結果を示し、作製されたキメラマウスが生殖細胞系モザイク性能力を有することを示す写真である。
【図１６】ａは、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６（ＶＰ１６は、ウイルス由来の遺伝子配列であり、転写因子と接続されることにより、転写因子の活性が増強される）、Ｋｌｆ４及びＳｏｘ２に感染した条件において、ｉＣＤ１がリプログラミング効率を高めることができる実験を示し、Ｏｃｔ４−ＧＦＰマウス胎児繊維芽細胞にＯｃｔ４−ＶＰ１６ＳＫを感染させた後、ｍＥＳ培養培地、ｍＥＳ＋ビタミンＣ培養培地及びｉＣＤ１培養培地において培養し、感染後１０日目に計算した蛍光クローン数を示すグラフである。ｂは、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６、Ｋｌｆ４及びＳｏｘ２に感染した条件において、ｉＣＤ１がリプログラミング効率を高めることができる実験を示し、図16ａの実験中の状態を示す写真である。
【図１７】ａは、ｉＣＤ１培養システムにおいて、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６／Ｋｌｆ４及びＯｃｔ４−ＶＰ１６／Ｓｏｘ２を用いて体細胞をリプログラミングする実験を示し、Ｏｃｔ４−ＧＦＰマウス胎児繊維芽細胞にＯｃｔ４−ＶＰ１６／Ｋｌｆ４及びＯｃｔ４−ＶＰ１６／Ｓｏｘ２を感染させた後、それぞれ、ｉＣＤ１システムにおいて培養し、様々な日数において計算したリプログラミングクローン数を示すグラフである。ｂは、ｉＣＤ１培養システムにおいて、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６／Ｋｌｆ４及びＯｃｔ４−ＶＰ１６／Ｓｏｘ２を用いて体細胞をリプログラミングする実験を示し、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６／Ｋｌｆ４及びＯｃｔ４−ＶＰ１６／Ｓｏｘ２によって誘導されたｉＰＳクローンを示す写真である。ｃは、ｉＣＤ１培養システムにおいて、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６／Ｋｌｆ４及びＯｃｔ４−ＶＰ１６／Ｓｏｘ２を用いて体細胞をリプログラミングする実験を示し、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６／Ｋｌｆ４及びＯｃｔ４−ＶＰ１６／Ｓｏｘ２によって誘導されたｉＰＳ細胞が発現した典型的な多能性分子標識を示す写真である。
【図１８】ａは、ｉＣＤ１培養システムにおいて、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６を用いて体細胞をリプログラミングする実験を示し、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６によって誘導されたｉＰＳクローンを示す写真である。ｂは、ｉＣＤ１培養システムにおいて、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６を用いて体細胞をリプログラミングする実験を示し、Ｏｃｔ４−ＧＦＰマウス胎児線維芽細胞にＯｃｔ４−ＶＰ１６を感染させた後、それぞれ、ｍＥＳ、ｍＥＳ＋ビタミンＣ及びｉＣＤ１培養培地において培養し、様々な培養日数において計算したリプログラミングクローン数を示すグラフである。ｃは、ｉＣＤ１培養システムにおいて、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６を用いて体細胞をリプログラミングする実験を示し、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６によって誘導されたクローンが発現した多能性分子標識を示す写真である。ｄは、ｉＣＤ１培養システムにおいて、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６を用いて体細胞をリプログラミングする実験を示し、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６によって誘導されたｉＰＳクローンを胞胚に注射して作製したキメラマウスを示す写真である。
【図１９】ａは、ｉＣＤ１のコア成分をｍＥＳ培養培地中に添加し、リプログラミングを促進する実験を示し、Ｏｃｔ４−ＧＦＰマウス胎児線維芽細胞にＳＫＯウイルスを感染させた後、ｍＥＳ、ｍＥＳ＋ビタミンＣ、ＳｍＥＳ（ｍＥＳにビタミンＣ、ｂＦＧＦ、ＣＨＩＲ９９０２１、塩化リチウム及びＢ２７を添加したもの）培養培地中において培養し、感染後８日目に計算したリプログラミングクローン数を示すグラフである。ｂは、ｉＣＤ１のコア成分をｍＥＳ培養培地中に添加し、リプログラミングを促進する実験を示し、ＳｍＥＳ培養条件における８日目の典型的な蛍光クローンを示す写真である。ｃは、ｉＣＤ１のコア成分をｍＥＳ培養培地中に添加し、リプログラミングを促進する実験を示し、Ｏｃｔ４−ＧＦＰマウス胎児線維芽細胞にＯｃｔ４ウイルスを感染させた後、ｍＥＳ、ｍＥＳ＋ビタミンＣ及びｉＣＤ１培養培地中において異なる日数培養して観察された蛍光クローン数を示す図である。ｄは、ＳｍＥＳ培養システムにおいて、Ｏｃｔ４を用いて体細胞をリプログラミングした初代クローン及び継代クローンの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の目的、特徴および効果を示す実施形態を図面に沿って詳細に説明する。これらの実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３２】
ここで、本発明の実施形態中、特に説明がない限り、培養培地の用語及び成分は、以下のように定義される。
【００３３】
基礎培養培地：人工的に作製された糖類、アミノ酸、無機塩、ビタミン、脂質などの細胞の成長に必要な栄養物質を含む培養培地。本発明の基礎培養培地は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）、Ｆ−１０、Ｆ−１２、ＲＰＭＩ  １６４０、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ‘ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、αＭＥＭ（αＭｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）又はＭ１９９である（これに限定されない）。基礎培養培地は、好ましくは、高糖度ＤＭＥＭである。
【００３４】
ウシ胎児血清：ウシ胎児の血液から分離抽出された細胞成長を支持する培養物であり、具体的な成分は未知である。ウシ胎児血清は、栄養物質及び成長因子を豊富に含み、様々な種類の細胞の成長を支持することができる。しかし、成分が不明である、ロットによる成分差が大きい、病原体を含むなどの欠点を有する。
【００３５】
血清代替物：血清代替物は、血清の代わりに使用される商品化された培養物添加物であり、一般に、成分が明確である。本発明の血清代替物は、ＫＳＲ（商品化された帯血清培養添加物）、Ｎ２（商品化された血清代替添加物であり、成分は、インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレシン及び亜セレン酸ナトリウムである）、Ｂ２７（神経細胞の培養に用いられる無血清培養添加物）などの血清代替培養添加物である（これに限定されない）。
【００３６】
胚性幹細胞：略称は、ＥＳ細胞又はＥＫ細胞である（以下ＥＳ細胞）。ＥＳ細胞は、早期胞胚（原腸胚期前）又は原始生殖腺から分離した細胞であり、体外培養によって無限増殖し、自己再生能力及び多能性を有する。マウスＥＳ細胞を体外で培養するには、フィーダー層細胞及びマウス白血病抑制因子が必要であり、これにより、多能性が維持される。研究により、体外培養の過程において、グリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤及びＭＡＰキナーゼ阻害剤を合わせて使用することにより、ＥＳ細胞の分化が抑制され、フィーダー層細胞及びマウス白血病抑制因子がない状況においても、ＥＳ細胞の多能性を維持することができることが発見された。
【００３７】
グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３：ＧＳＫ−３）は、多機能のセリン／トレオニンタンパク質キナーゼであり、細胞内の多種の信号伝達経路における重要な成分であり、細胞内の糖代謝、細胞増殖、細胞分化、アポトーシスなどの多種の生理過程に関与する。グリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤は、主に、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、ＳＢ２１６７６３などであり、好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１である。化学式１に、その構造を示す。
【化１】
2012524551.tif 000006
【００３８】
ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌの略称であり、誘導多能性幹細胞とも称す。分化細胞がリプログラミング因子によって処理されることにより、ｉＰＳ細胞の状態に戻る。現在すでに、四倍体胞胚に注射する技術により、ｉＰＳ細胞から完全なマウスを作製することができ、ｉＰＳ細胞が多能性を有することが証明されている。
【００３９】
リプログラミング因子とは、分化細胞を多能性の状態に戻す因子である。リプログラミング因子の多くが核転写因子であり、現在、リプログラミングに用いられる転写因子は、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｓｒｒｂ、Ｔｂｘ３などである。本発明の転写因子は、上述の転写因子を含むがこれに限定されない。
【００４０】
フィーダー層細胞培養培地（ｆｅｅｄｅｒ  ｍｅｄｉｕｍ）の組成成分は、高糖度基礎培養培地（ＤＭＥＭ：本発明の発明者が頭文字から命名した基礎培養培地）に１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）及び非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を添加したものである。
【００４１】
含血清ＥＳ細胞培養培地の成分は、高糖度基礎培養培地、１５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ）、２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノール及びピルビン酸ナトリウムである。
【００４２】
ｍＥＳは、従来の幹細胞培養培地であり、その成分は、高糖度ＤＭＥＭ培養培地に、１５％のウシ胎児血清、非必須アミノ酸、グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノール、ピルビン酸及び白血病抑制因子（マウスの多能性状態を維持させる成長因子）を加えたものである。
【００４３】
ＫＳＲ無血清培養培地：ＫＳＲは、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅの略称であり、商品化された血清代替幹細胞培養添加物である。本発明で使用するＫＳＲ完全培養培地は、２種である。１つは、ｉＰＳの誘導過程に用いられ、その組成成分は、高糖度基礎培養培地（ＤＭＥＭ）、１０％のＫＳＲ添加物、２ｍＭのグルタミン、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノール及びピルビン酸ナトリウムである。もう１つの幹細胞又はｉＰＳクローンの培養に用いられる完全ＫＳＲ無血清培養培地の組成成分は、ＫＮＯＣＫＯＵＴ  ＤＭＥＤ（浸透圧が幹細胞の培養に適する基礎培養培地）、１５％のＫＳＲ添加物、２ｍＭのグルタミン、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ペニシリン／ストレプトマイシン及びβ−メルカプトエタノールムである。全てのｉＰＳ過程及びクローン培養培地には、マウス白血病抑制因子ＬＩＦ（ミリポア社のＥＳＧＲＯ（登録商標）であり、マウス幹細胞の分化を抑制する成長因子）が添加され、添加される終濃度は１０００Ｕ／ｍｌである。
【００４４】
ＫＳＲ−ＢＮとは、上述のｉＰＳ誘導過程に用いられるＫＳＲ完全培養培地に、塩基性線維芽細胞成長因子及びＮ２（商品化された血清代替添加物であり、成分は、インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレシン及び亜セレン酸ナトリウムである）を添加したものである。
【００４５】
Ｂａｓｓａｌ３．０完全培養培地：本発明の培養培地の１種であり、具体的には、高糖度基礎培養培地（ＤＭＥＭ）に、ビタミンＣ、インスリン、塩化リチウム、ビタミンＢ１２、抗酸化剤、レセプターチロシンキナーゼ成長因子、系列の成長支持物質などを添加したものである。具体的な成分は、表２に示し、ＣＨＩＲ９９０２１を含まない。
【００４６】
ｉＣＤ１完全培養培地：本発明の培養培地中の１つである。表１に示す添加物と、高糖度基礎培養培地（ＤＭＥＭ）、グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウムなどと、を混合したものである。表１に示す添加物と他の成分との体積比は１：２４である。具体的な成分及び濃度は、表２に示す。
【００４７】
また、特に説明のない場合、マウス体細胞のリプログラミングは、以下の方式で行われる。
【００４８】
リプログラミングに採用される体細胞は、何れもＯＧ２マウス胎児線維芽細胞であり、継代数は、３代を超えない。ＯＧ２マウスは、幹細胞特異のＯｃｔ４遺伝子のプロモーターが発現された後、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子が連結される遺伝子導入マウスである。リプログラミングの後期、ＯＧ２マウス胎児線維芽細胞の内因性Ｏｃｔ４が起動されたとき、緑色蛍光タンパク質が発現され、蛍光顕微鏡により、細胞又はリプログラミングされたクローンが緑色に見える。蛍光顕微鏡により、リプログラミングクローン（即ち、緑色蛍光クローン）の数を直接計算するか、或いは、フローサイトメトリーにより、ＧＦＰ蛍光細胞の比率を分析する。研究者は、様々な条件におけるリプログラミング効率を比較することができる。
【００４９】
細胞実験及びウイルスの準備過程を以下に示す。細胞播種は、１２孔の壁面に配置された細胞培養プレート内に行われ、播種密度は、２００００細胞／孔である。細胞播種の６〜１８時間後、細胞密度及び状態に応じ、マウスリプログラミング因子を有するウイルスを感染させる。感染は、２回に分けて行う。１回目の感染から２４時間後、２回目の感染を行う。２回目の感染から２４時間後、ウイルス液を各種の被測定培養液に交換する。交換した当日を０日目（Ｄ０）とする。感染後、様々な時間点において、実験の必要に応じ、原孔内のＧＦＰ蛍光クローン数を計算したり、フローサイトメトリーにより、ＧＦＰ蛍光細胞の比率を分析する。
【００５０】
ウイルスの準備過程を以下に示す。ＰＭＸベクターにクローンしたリプログラミング因子プラスミドをウイルスパッケージング細胞（ＰｌａｔＥ）にトランスフェクションする。トランスフェクションから１２〜１６時間後、培養液を新しい培養液に交換する。トランスフェクションから４８時間経過後に収集した培養液を１次感染用ウイルス液とする。新しい培養液を添加し、２４時間経過した後に収集した培養液を２次感染用ウイルス液とする。
【００５１】
また、特に説明のない限り、略称は、以下のように解釈される。
【００５２】
ＳＫＯは、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＯｃｔ４の３つのウイルス又はＳｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＯｃｔ４の３つのウイルスに感染した細胞を指す。また、３つの因子と同一の意味を有する。ＯＫは、Ｏｃｔ４及びＫｌｆ４の２つのウイルス又はＯｃｔ４及びＫｌｆ４の２つのウイルスに感染した細胞を指す。ＯＳは、Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２の２つのウイルス又はＯｃｔ４及びＳｏｘ２の２つのウイルスに感染した細胞を指す。
【００５３】
（実施例１）
Ｂ３．０のリプログラミング効率と他の培養方式のリプログラミング効率との比較と、成分濃度の最適化：
ＳＫＯウイルスを１：１：１で混合（各種０．５ｍｌ）した後、線維芽細胞（１孔に計２万個の線維芽細胞を有し、全部で１２孔）に感染させ、３７℃、５％のＣＯ２の条件において、ｍＥＳ培養培地、ｍＥＳ＋ビタミンＣ培養培地、ＫＳＲ−ＢＮ培養培地及びＢａｓａｌ３．０培養培地中において培養した。次に、感染後１０日目に蛍光顕微鏡により、リプログラミングクローン数を直接計算した。また、フローサイトメトリーにより、リプログラミング細胞の比率を分析した。図1ａは、ｍＥＳ、ｍＥＳ＋ビタミンＣ、ＫＳＲ−ＢＮ及びＢａｓａｌ３．０の４種の培養条件において、感染後１０日目の各２万個のＯｃｔ４−ＧＦＰ遺伝子導入マウス胎児線維芽細胞から誘導したリプログラミングクローン数を示すグラフである。図1ａ中、各実験反復回数ｎ＝３である。エラーバーは、標準偏差を示す。結果から、感染後１０日目、Ｂａｓａｌ３．０培養条件において、１２７８個のリプログラミングクローンが発現した。ＫＳＲ−ＢＮ培養条件においては、１８０個のリプログラミングクローンが発現した。ｍＥＳ＋ビタミンＣ培養条件においては、１１３個のリプログラミングクローンが発現した。また、ｍＥＳ培養条件においては、リプログラミングクローンが略発現しなかった。図1ｂは、ｍＥＳ、ｍＥＳ＋ビタミンＣ、ＫＳＲ−ＢＮ及びＢａｓａｌ３．０の４種の培養条件において、感染後１０日目に、フローサイトメトリーによって測定したＯｃｔ４−ＧＦＰ陽性細胞の比率を示すグラフである。実験反復回数ｎ＝３であり、エラーバーは、標準偏差を示す。結果は、感染後１０日目、Ｂａｓａｌ３．０の培養システムにおいて、３５．２％の細胞にリプログラミングが発生した。ＫＳＲ−ＢＮ条件において、１４．２５％の細胞にリプログラミングが発生した。ｍＥＳ＋ビタミンＣ条件において、３．９％の細胞にリプログラミングが発生した。この２種の実験の結果から、Ｂａｓａｌ３．０は、３つの因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４）のリプログラミングを誘導する非常に優れた培養システムであることが示された。
【００５４】
Ｂａｓａｌ３．０中の物質がリプログラミングに与える影響と、最適な作業濃度範囲を確定させるために、ｉＰＳ効率実験において、Ｂａｓａｌ３．０中の各物質を様々な濃度で使用した。測定物質がリプログラミングに与える影響を正確に判断するために、リプログラミングクローン数又はリプログラミング細胞比率の２種の評価指標を採用した。図2ａ〜図2ｉは、添加物中のコア成分の用量反応実験の結果を示す。図2ａは、塩化リチウムの濃度範囲が０〜１０ｍｍｏｌ／ｍｌの場合における、感染後１０日目のＢａｓａｌ３．０に誘導されて形成されたリプログラミングクローン数を示すグラフである。図2ｂは、図2ａと同一の実験において測定されたリプログラミング細胞の比率を示すグラフである。図2ｃは、ビタミンＢ１２の濃度範囲が０〜２．８μｇ／ｍｌの場合における、感染後１０日目のＢａｓａｌ３．０に誘導されて形成されたリプログラミングクローン数を示すグラフである。図2ｄは、図2ｃと同一の実験において測定されたリプログラミング細胞の比率を示すグラフである。図2ｅは、塩基性線維芽細胞成長因子の濃度範囲が０〜７ｎｇ／ｍｌの場合における、感染後１０日目のＢａｓａｌ３．０に誘導されて形成されたリプログラミングクローン数を示すグラフである。図2ｆは、図2ｅと同一の実験において測定されたリプログラミング細胞の比率を示すグラフである。図2ｇは、ビタミンＣの濃度範囲が０〜１００μｇ／ｍｌの場合における、感染後１０日目のＢａｓａｌ３．０に誘導されて形成されたリプログラミングクローン数を示すグラフである。図2ｈは、図2ｇと同一の実験において測定されたリプログラミング細胞の比率を示すグラフである。図2ｉは、インスリンの濃度範囲が０〜５０μｇ／ｍｌの場合における、感染後１０日目のＢａｓａｌ３．０に誘導されて形成されたリプログラミングクローン数を示すグラフである。以上の実験中、実験反復回数ｎ＝３である。誤差船は、標準偏差を示す。上述の物質は、実験過程においてリプログラミングへの影響が顕著であるため、Ｂａｓａｌ３．０中のリプログラミングに影響を与えるコア物質である。好適な作業濃度は、塩化リチウムが５ｍｍｏｌ／ｍｌ、ビタミンＢ１２が１．４μｇ／ｍｌ、塩基性線維芽細胞成長因子が５ｎｇ／ｍｌ、ビタミンＣが５０μｇ／ｍｌ、インスリンが５０μｇ／ｍｌである（これに限定されない）。
【００５５】
図3ａ〜図3ｈは、抗酸化剤の用量反応実験の結果を示す。図3ａは、ビタミンＥの濃度範囲が０〜１６μｇ／ｍｌの場合における、感染後１０日目のＢａｓａｌ３．０に誘導されて形成されたリプログラミングクローン数を示すグラフである。図3ｂは、図3ａと同一の実験において測定されたリプログラミング細胞の比率を示すグラフである。図3ｃは、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の濃度範囲が０〜１０μｇ／ｍｌの場合における、感染後１０日目のＢａｓａｌ３．０に誘導されて形成されたリプログラミングクローン数を示すグラフである。図3ｄは、図3ｃと同一の実験において測定されたリプログラミング細胞の比率を示すグラフである。図3ｅは、還元型グルタチオンの濃度範囲が０〜６μｇ／ｍｌの場合における、感染後１０日目のＢａｓａｌ３．０に誘導されて形成されたリプログラミングクローン数を示すグラフである。図3ｆは、図3ｃと同一の実験において測定されたリプログラミング細胞の比率を示すグラフである。図3ｇは、チアミンの濃度範囲が０〜３６μｇ／ｍｌの場合における、感染後１０日目のＢａｓａｌ３．０に誘導されて形成されたリプログラミングクローン数を示すグラフである。図3ｈは、図3ｇと同一の実験において測定されたリプログラミング細胞の比率を示すグラフである。以上の実験中、実験反復回数ｎ＝３である。エラーバーは、標準偏差を示す。以上の物質の好適な作業濃度は、ビタミンＥが１μｇ／ｍｌ、スーパーオキシドジスムターゼが２．５μｇ／ｍｌ、還元型グルタチオンが１．５μｇ／ｍｌ、チアミンが９μ／ｍｌである。
【００５６】
図4ａ〜図4ｈは、成長支持物質の用量反応を示す。図4ａは、ビタミンＡの濃度範囲が０〜１６μｇ／ｍｌの場合における、感染後１０日目のＢａｓａｌ３．０に誘導されて形成されたリプログラミングクローン数を示すグラフである。図4ｂは、図4ａと同一の実験において測定されたリプログラミング細胞の比率を示すグラフである。    図4ｃは、エタノールアミンの濃度範囲が０〜１６μｇ／ｍｌの場合における、感染後１０日目のＢａｓａｌ３．０に誘導されて形成されたリプログラミングクローン数を示すグラフである。図4ｄは、図4ｃと同一の実験において測定されたリプログラミング細胞の比率を示すグラフである。図4ｅは、リノール酸の濃度範囲が０〜４μｇ／ｍｌの場合における、感染後１０日目のＢａｓａｌ３．０に誘導されて形成されたリプログラミングクローン数を示すグラフである。図4ｆは、図4ｅと同一の実験において測定されたリプログラミング細胞の比率を示すグラフである。図4ｇは、リポ酸の濃度範囲が０〜３．２μｇ／ｍｌの場合における、感染後１０日目のＢａｓａｌ３．０に誘導されて形成されたリプログラミングクローン数を示すグラフである。図4ｈは、図4ｇと同一の実験において測定されたリプログラミング細胞の比率を示すグラフである。以上の実験中、実験反復回数ｎ＝３である。エラーバーは、標準偏差を示す。以上の物質の好適な作業濃度は、ビタミンＡが０．１μｇ／ｍｌ、エタノールアミンが１μｇ／ｍｌ、リノール酸が１μｇ／ｍｌ、リポ酸が０．２μｇ／ｍｌである。
【００５７】
（実施例２）Ｂａｓａｌ３．０の改良：
Ｂａｓａｌ３．０の濃度測定過程中、塩化リチウムのリプログラミングに対する顕著な影響から、グリコーゲン合成酵素キナーゼの阻害がリプログラミングを促進した原因であることが予測された。従って、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、ＳＢ３１ｘｘｘｘなどの一系列のグリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤を上述のｉＰＳ測定実験（リプログラミングクローン数及びリプログラミング細胞の比率の２種の指標がリプログラミング効率を評価する基準とする）を行うときの候補物質とした。結果、ＧＳＫ３−β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１がＢａｓａｌ３．０のリプログラミング効率を顕著に高めたため、改良されたＢａｓａｌ３．０には、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ３−β）阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１を添加した。即ち、ＣＨ９９０２１（これに限定されない）が添加された培養培地をｉＣＤ１と命名する。
【００５８】
上述のｉＰＳ効率測定実験により、ｉＣＤ１のリプログラミング効率と従来の好適な培養方式のリプログラミング効率とを比較した。従来の好適な培養方式は、ｍＥＳ＋ビタミンＣ、ｍＥＳ→ＫＳＲ（即ち、感染後４日目に、従来のＥＳ細胞培養培地（ｍＥＳ）から、商品化された無血清培養培地（ＫＳＲ）に変換したもの）及びＫＳＲ−ＢＮを含む。図5ａは、本発明の化学成分が明確な培養培地ｉＣＤ１のリプログラミング効率と、従来のリプログラミング培養培地のリプログラミング効率と、の比較を示すグラフである。上述の数種の培養方式において、感染後８日目の各２万個の胎児線維芽細胞から誘導されたリプログラミングクローン数を計算した。図中、各実験反復回数ｎ＝２であり、エラーバーは、標準偏差を示す。結果は、ｉＣＤ１培養条件においては、１４６７．３個のリプログラミングクローンが発現した。ｍＥＳ＋ビタミンＣにおいては、３２．３個のリプログラミングクローンが発現した。ｍＥＳ→ＫＳＲにおいては、２０．７個のリプログラミングクローンが発現した。ＫＳＲ−ＢＮにおいては、６８．３個のリプログラミングクローンが発現した。図5ｂは、図5ａに示す数種の培養培地の感染後８日目のリプログラミングクローンを示す写真である。スケールバーは、２ｍｍである。結果から、ｉＣＤ１培養システムは、他の培養システムより優れることが示された。
【００５９】
数種の培養条件における効率の差異をさらに客観的に比較するために、特許文献又は報道に基づき、ＫＳＲ−ＢＮ、ｍＥＳ＋ビタミンＣ及びｍＥＳ→ＫＳＲの３種の条件の誘導によるリプログラミング効率の実験を反復して行い、様々な日数のリプログラミング効率の統計を行った。図5ｃは、ＫＳＲ−ＢＮ培養培地は、リプログラミング効率が高まることを示すグラフである。Ｏｃｔ４−ＧＦＰマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）
にＳｏｘ２／Ｋｌｆ４／Ｏｃｔ４（ＳＫＯ）ウイルスを感染させた後、ｍＥＳ培養培地及びＫＳＲ−ＢＮ培養培地において培養した。異なる時間点において、フローサイトメトリーによって２種の培養システムにおけるリプログラミング細胞の比率を検出した。実験反復回数ｎ＝２であり、エラーバーは、標準偏差を示す。図5ｄは、ｍＥＳ＋ビタミンＣ培養培地は、リプログラミング効率が高まることを示すグラフである。Ｏｃｔ４−ＧＦＰマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）にＳＫＯウイルスを感染させた後、ｍＥＳ培養培地及びｍＥＳ＋ビタミンＣ培養培地において培養した。異なる時間点において、フローサイトメトリーによって２種の培養システムにおけるリプログラミング細胞の比率を検出した。実験反復回数ｎ＝２であり、エラーバーは、標準偏差を示す。図5ｅは、ｍＥＳ→ＫＳＲ培養培地は、リプログラミング効率が高まることを示すグラフである。Ｏｃｔ４−ＧＦＰマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）にＳＫＯウイルスを感染させた後、ｍＥＳ培養培地及びｍＥＳ→ＫＳＲ培養培地において培養した。ｍＥＳ→ＫＳＲ培養方式は、感染後、前半の４日は、ｍＥＳ培養方式において培養し、４日目からＫＳＲ培養培地に変換する培養方式である。異なる時間点において、フローサイトメトリーによって２種の培養システムにおけるリプログラミング細胞の比率を検出した。実験反復回数ｎ＝２であり、エラーバーは、標準偏差を示す。実験の結果は、何れも特許文献又は報道と符合した。結果から、ｉＣＤ１と他の数種の培養方式との比較結果は、事実であることが示された。
【００６０】
（実施例３）ｉＣＤ１の各成分がリプログラミングに与える影響：
ｉＣＤ１中の主要成分がリプログラミング効率に与える影響を評価するために、ビタミンＣ、塩基性線維芽細胞成長因子、ＣＨＩＲ９９０２１、塩化リチウム、ビタミンＢ１２及びチアミンの中から各１つ又は全てｉＣＤ１中から除去してｉＰＳ効率測定実験を実施した。ｉＣＤ１培養培地を全参照とし、ｍＥＳ培養培地を基本参照とした。感染後、８日目のリプログラミングクローン数を図３３に示す。図6ａは、本発明の培養培地添加物中の６種の成分（塩基性線維芽細胞成長因子、ビタミンＣ、ＣＨＩＲ９９０２１、塩化リチウム、ビタミンＢ１２及びチアミン）がリプログラミング効率及び成長に与える影響を示すグラフである。Ｏｃｔ４−ＧＦＰマウス胎児線維芽細胞にＳＫＯを感染させた後、完全なｉＣＤ１培養培地、ある成分を含まないｉＣＤ１培養培地、コア成分を全て含まないｉＣＤ１培養培地及び従来のｍＥＳ培養培地において培養した。各細胞培地における、感染後８日目の各２万個の細胞から誘導されたリプログラミングクローン数を計算した。図中、各実験反復回数ｎ＝３であり、エラーバーは、標準偏差を示す。図6ｂは、図6ａと同一の実験におけるリプログラミングの様子を示す写真であり、スケールバーは、２ｍｍである。図6ａに示すリプログラミングクローン数と図6ｂに示す写真から、ビタミンＣ、塩基性線維芽細胞成長因子、ＣＨＩＲ９９０２１、塩化リチウム、ビタミンＢ１２及びチアミンは、何れも、リプログラミング効率に一定の影響を与えることが示された。特に、ビタミンＣ、塩基性線維芽細胞成長因子及びＣＨＩＲ９９０２１は、リプログラミングに与える影響が明確である。塩基性線維芽細胞成長因子、ビタミンＣ、ＣＨＩＲ９９０２１、塩化リチウム、ビタミンＢ１２及びチアミンの６種の成分を添加しない場合、リプログラミングクローンは、略発現しなかった。
【００６１】
上述の６種の物質がリプログラミングに与える影響が細胞成長依存性であるか、細胞成長非依存性であるか否かを確定させるために、リプログラミング因子ＳＫＯに感染後の胎児線維芽細胞をｉＣＤ１と、ビタミンＣ除去ｉＣＤ１と、塩基性線維芽細胞成長因子除去ｉＣＤ１と、ＣＨＩＲ９９０２１除去ｉＣＤ１と、塩化リチウム除去ｉＣＤ１と、ビタミンＢ１２除去ｉＣＤ１と、チアミン除去ｉＣＤ１と、塩基性線維芽細胞成長因子、ビタミンＣ、ＣＨＩＲ９９０２１、塩化リチウム、ビタミンＢ１２及びチアミン除去ｉＣＤ１と、ｍＥＳと、の９種の培養条件における成長曲線を記した。２万個の初期Ｏｃｔ４−ＧＦＰマウス胎児線維芽細胞にＳＫＯウイルスを感染させた後、上述の９種の培養培地中において培養した。感染液交換当日（Ｄ０）、感染後３日目及び６日目に細胞を消化し、各孔の細胞数を計算した。各実験反復回数ｎ＝３であり、エラーバーは、標準偏差を示す。図6ｃの結果から、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＧＦＧ）及びＣＨＩＲ９９０２１は、細胞成長にそれぞれ異なる程度の影響を与え、ビタミンＣは、細胞成長に明らかな影響を与えないことが示された。
【００６２】
塩基性線維芽細胞成長因子がリプログラミングに影響を与える最適濃度を確定させるために、様々な添加量の塩基性線維芽細胞成長因子をｉＣＤ１中に添加し、リプログラミングへの作用を検出した。図7ａは、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の用量反応を示すグラフである。１万個のＯｃｔ４−ＧＦＰマウス胎児線維芽細胞にＳＫＯウイルスを感染させた後、０〜１０ｎｇ／ｍｌの様々な添加量のｂＦＧＦを添加したｉＣＤ１培養培地中において培養し、感染後１０日目にリプログラミングクローン数を計算した。実験反復回数ｎ＝３であり、エラーバーは、標準偏差を示す。結果から、終濃度が５ｎｇ／ｍｌ以上の場合、塩基性線維芽細胞成長因子の濃度を上げてもリプログラミング効果が顕著に上がらないことが示された。図7ｂは、ｂＦＧＦの作用時間効果の実験の結果を示すグラフである。１万個のＯｃｔ４−ＧＦＰマウス胎児線維芽細胞にＳＫＯを感染させた後、ｉＣＤ１培養培地で培養し、０〜１０日の異なる時間にｂＦＧＦを添加し、感染後１０日目に蛍光クローン数を計算した。実験反復回数ｎ＝６であり、エラーバーは、標準偏差である。図7ｂは、リプログラミング過程の異なる時間に塩基性線維芽細胞成長因子を添加する実験の結果を示し、結果から、ｉＣＤ１培養条件において、塩基性線維芽細胞成長因子は、リプログラミング過程の０〜８日目まで作用し、それ以降は、リプログラミング効率を高める作用が軽微であることが示された。
【００６３】
同様に、ｉＣＤ１条件におけるビタミンＣ及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１の最適な作用濃度を確定させるために、様々な添加量のビタミンＣ及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１をｉＣＤ１中に添加し、最適濃度を確定させた。図7ｃは、ビタミンＣの用量反応を示すグラフである。２万個のＯｃｔ４−ＧＦＰマウス胎児線維芽細胞にＳＫＯウイルスを感染させた後、０〜１００μｇ／ｍｌの様々な添加量のビタミンＣを添加したｉＣＤ１培養培地中において培養し、感染後１０日目にリプログラミングクローン数を計算した。実験反復回数ｎ＝３であり、エラーバーは、標準偏差を示す。結果から、ビタミンＣ又はリン酸化ビタミンＣ（ビタミンＣの安定形）の濃度が２５μｇ／ｍｌを超えた場合、ビタミンＣの濃度をさらに上げても、リプログラミング効率が顕著に上がらないことが示された。図7ｄは、ＣＨＩＲ９９０２１の用量反応を示すグラフである。１万個のＯｃｔ４−ＧＦＰマウス胎児線維芽細胞にＳＫＯウイルスを感染させた後、０〜１２ｍｍｏｌ／ｍｌの様々な添加量のＣＨＩＲ９９０２１を添加したｉＣＤ１培養培地中において培養し、感染後１０日目にリプログラミングクローン数を計算した。実験反復回数ｎ＝３であり、エラーバーは、標準偏差を示す。結果から、グリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１の最適濃度は、約３ｍｍｏｌ／ｍｌであることが示された。また、高添加量のグリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤は、リプログラミング効率を抑制する作用があることが示された。以上の実験の結果を本発明の関連物質の作業濃度の参考とした。
【００６４】
他のレセプターチロシンキナーゼファミリー成長因子がリプログラミングに影響を与えることを証明するために、上皮成長因子もリプログラミング効率測定実験に用いた。Ｏｃｔ４−ＧＦＰマウス胎児線維芽細胞をＳＫＯ感染させた後、レセプターチロシンキナーゼを添加しないｉＣＤ１培養培地と、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を添加したｉＣＤ１培養培地と、上皮成長因子（ＥＧＦ）を添加したｉＣＤ１培養培地と、において培養した。図7ｅは、レセプターチロシンキナーゼがリプログラミングに与える効果を示すグラフであり、感染後１０日目のリプログラミングクローン数の計算結果を示す。結果から、塩基性線維芽細胞成長因子のほか、他のレセプターチロシンキナーゼもリプログラミングを促進することが示された。
【００６５】
（実施例４）Ａ８３−０１、バルプロ酸及びウシ胎児血清がＯＫＳによって誘導されるリプログラミング効率をさらに高めることができないことを証明する：
ｉＣＤ１のリプログラミング効率をさらに高めるために、リプログラミング効率を高める物質であるとすでに報道されているＡＬＫ５阻害剤Ａ８３−０１と、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（ＶＰＡ）と、従来のマウスＥＳ細胞の培養に使用されるウシ胎児血清と、をｉＣＤ１に添加してリプログラミング効率測定を行った。図8ａは、マウス線維芽細胞にＳＫＯウイルスを感染させた後、化学成分が明確な培養培地であるｉＣＤ１と、Ａ８３−０１（０．５μＭ）が添加されたｉＣＤ１と、バルプロ酸（１ｍＭ）が添加されたｉＣＤ１と、２％のウシ胎児血清が添加されたｉＣＤ１と、において培養し、感染後１０日目にリプログラミングクローン数を計算した結果を示すグラフである。結果から、ＡＬＫ５阻害剤Ａ８３−０１及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（ＶＰＡ）は、何れもｉＣＤ１のリプログラミング効率をさらに高めることができないことが示された。また、ウシ胎児血清は、ｉＣＤ１のリプログラミング効率に一定の抑制効果があることが示された。図8ｂは、図8ａの実験における典型的なリプログラミングクローンを示す写真であり、スケールバーは、２ｍｍである。実験の結果から、ｉＣＤ１は、リプログラミングを誘導する非常に優れた培養システムであることが示された。
【００６６】
（実施例５）初期播種密度がリプログラミング効率に与える影響：
初期播種密度がリプログラミング効率に与える影響を探求するために、Ｏｃｔ４−ＧＦＰ遺伝子導入マウス胎児線維芽細胞をＳＫＯウイルスに２回感染させた後、トリプシンを用いて消化し、様々な細胞密度で９６孔プレート内に播種した。具体的には、５個／ｃｍ２、１０個／ｃｍ２、５０個／ｃｍ２、１００個／ｃｍ２、２００個／ｃｍ２、５００個／ｃｍ２、１０００個／ｃｍ２、２０００個／ｃｍ２、５０００個／ｃｍ２及び１００００個／ｃｍ２である。ｉＣＤ１を用いて８日培養した後、各播種密度におけるリプログラミング効率を計算した。リプログラミング効率の計算方式は、８日目のリプログラミングクローン数と初期細胞播種数との比較によって行った。実験反復数ｎ＝６であり、エラーバーは、標準偏差を示す。図9は、初期播種密度がリプログラミング効率に影響を与えることを証明する実験の結果を示すグラフである。結果から、初期細胞播種密度が２０００個／ｃｍ２〜５０００個／ｃｍ２の場合、リプログラミング効率が高いことが示された。
【００６７】
（実施例６）ｉＣＤ１培養条件においては、内因性多能性分子標識の発現が迅速に起動され、外因性因子が迅速に沈黙する：
分子レベルでｉＣＤ１培養システムが他の培養システムより優れることを証明するために、幹細胞特異に発現される多能性分子標識Ｎａｎｏｇと、内因性Ｏｃｔ４と、の相対発現量により、細胞全体のリプログラミング進行速度を評価した。具体的な実施方法は、Ｏｃｔ４−ＧＦＰ遺伝子導入マウス胎児線維芽細胞にＳＫＯウイルスを２回感染させた後、ｍＥＳ培養培地、ＫＳＲ−ＢＮ培養培地及びｉＣＤ１培養培地において培養した。感染液を交換した当日を０日とし、ｍＥＳ培養培地、ＫＳＲ−ＢＮ培養培地及びｉＣＤ１培養培地の２日目、４日目、６日目及び８日目における培養物サンプルを収集し、各サンプルのリボヌクレオチドを抽出し、リアルタイムＰＣＲにより、Ｎａｎｏｇ及び内因性Ｏｃｔ４の発現量を検出した。実験の結果は、図10ａに示すように、ｉＣＤ１培養条件におけるＮａｎｏｇ及び内因性Ｏｃｔ４の起動は、ｍＥＳ及びＫＳＢ−ＢＮより明らかに速かった。本実験の各実験反復数ｎ＝３であり、エラーバーは、標準偏差を示す。
【００６８】
図10ｂは、タンパク質レベルでの多能性分子標識の発現結果を示す写真である。Ｏｃｔ４−ＧＦＰマウス胎児線維芽細胞にＳＫＯウイルスを感染させた後、ｉＣＤ１中で８日連続培養し、細胞培養プレート上に直接固定し、免疫蛍光法による実験を行った。結果から、８日目の原プレートに発現したリプログラミングクローンには、多能性分子標識Ｃｄｈ１、ＳＳＥＡ−１及びＮａｎｏｇが何れも発現した。図10ｂに示すスケールバーは、１００μｍである。図10ｃは、ｍＥＳ培養条件及びｉＣＤ１培養条件において、４日目及び８日目の培養物から総タンパク質を抽出し、イムノブロット法により、抗体を用いてＮａｎｏｇの発現プロファイルを検出した結果を示す。実験の結果から、感染後８日目のｉＣＤ１培養条件において、Ｎａｎａｏｇが顕著に発現し、参照ｍＥＳ条件においては、Ｎａｎｏｇは、発現しなかった。この結果から、ｉＣＤ１培養条件におけるリプログラミング過程は、顕著に加速されることが証明された。
【００６９】
外因性転写因子の沈黙は、リプログラミングの後期において非常に重要であり、完全なリプログラミングを判断する指標でもある。外因性転写因子の沈黙をさらに直観的に追跡するために、赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄを採用し、外因性転写因子の沈黙のシュミレーションに用いた。具体的な実施方法は、赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄ及びＳＫＯウイルスをＯｃｔ４−ＧＦＰ遺伝子導入マウス胎児線維芽細胞に感染させ、ｉＣＤ１培養培地において培養し、蛍光顕微鏡を用いて細胞の緑光（内因性多能性分子標識Ｏｃｔ４の発現を示す）及び赤色光（外因性ウイルスの発現プロファイルを示す）の発現プロファイルを追跡観察した。図11は、ｉＣＤ１培養システムにおけるリプログラミングの追跡を示す写真である。図11に示すように、感染後３日目、一部細胞から緑色蛍光細胞が発現し始めたが、同時に赤色光も発現し始めた。これは、内因性Ｏｃｔ４遺伝子がすでに起動し始めたが、外因性遺伝子は、まだ沈黙していないことを示す。感染後６日目、緑色蛍光が顕著に強くなり、赤色蛍光が弱くなり始めた。これは、内因性Ｏｃｔの発現が顕著に高くなり、外因性ウイルスが沈黙し始めたことを示し、細胞が完全なリプログラミングの後期段階に入り始めたことを示す。感染後８日目、多くのクローンは、リプログラミングのみを発現し、赤色蛍光を発現しなくなり、リプログラミング過程がすでに基本的に完了したことを示す。
【００７０】
上述の緑色蛍光陽性赤色蛍光陰性の細胞集団が緑色赤色陽性の細胞集団及び緑色蛍光陰性赤色蛍光陽性の細胞集団よりリプログラミング程度が高いことをさらに証明するために、分別式フローサイトメーターにより、ｉＣＤ１培養条件における８日目の培養物中の上述の３種の細胞集団を分別した。図12ａは、フローサイトメトリーにより、２種の培養条件におけるリプログラミング細胞（ＧＦＰ）と赤色蛍光細胞（ＤｓＲｅｄ）との比率を示すグラフである。図12ａから分かるように、ｉＣＤ１培養条件において、リプログラミングに入った細胞集団（緑色蛍光細胞集団）は、５４．３％であった。その中で、リプログラミング陽性赤色蛍光陰性の細胞集団は、３４．８％であった。ｍＥＳ培養システムにおいては、０．３％の細胞のみにリプログラミング陽性が示され、緑色蛍光陽性赤色蛍光陰性の細胞は、検出されなかった。分別した３種の細胞集団からリボヌクレオチドを抽出し、リアルタイム定量ＰＣＲにより、３種の細胞集団中の多能性分子標識である内因性Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｄｐｐａ３、Ｒｅｘ１の発現と、外因性Ｏｃｔ４の沈黙状態と、を検出した。ｍＥＳ及びｉＣＤ１の８日目の未分別培養物を全参照とした。図12ｂ（感染後８日目のリプログラミング効率及び関連分子標識を示し、リアルタイム定量ＰＣＲにより測定した、ＳＫＯウイルスに感染後、８日培養したｍＥＳと、８日培養したｉＣＤ１と、８日培養したｉＣＤ１から分別した細胞集団と、における多能性分子標識の発現プロファイルを示すグラフ）から、３種の細胞集団中、緑色蛍光陽性赤色蛍光陰性の細胞集団の幹細胞特異の分子標識の発現レベルは、他の細胞集団よりも高く、外因子ウイルスの沈黙も完全であった。緑色蛍光赤色蛍光陽性の細胞集団の幹細胞特異の多能性分子の発現レベルは中間状態であり、外因子Ｏｃｔ４も未だ完全に沈黙していなかった。赤色蛍光陽性緑色蛍光陰性の細胞集団の幹細胞特異の多能性分子標識の発現量は極めて低く、外因性Ｏｃｔ４の発現量が極めて高かった。この実験の結果から、外因性の沈黙は、完全なリプログラミングの重要な条件であることが証明された。また、ｉＣＤ１培養条件がリプログラミング過程を加速させることも証明された。
【００７１】
（実施例７）ｉＣＤ１培養条件において、８日目にマウス胎児線維芽細胞を完全にリプログラミングする実験：
キメラマウスを形成できるか否かは、マウスＥＳ細胞の重要な基準である。取得したリプログラミングクローンがＥＳ細胞と差異がないことをさらに厳格に検証するために、様々な方法で選出したリプログラミング細胞からキメラマウスを作製した。具体的な方法は、図13ａに示す。３つの因子（Ｓｏｘ、Ｋｌｆ及びＯｃｔ４）とＤｓＲｅｄとを混合し、Ｏｃｔ４−ＧＦＰ遺伝子導入マウス胎児線維芽細胞に感染させる。感染後、ｉＣＤ１培養培地中において培養する。感染後の８日目、１１日目及び１４日目に、機械又は手動で細胞を選出し、キメラマウスを作製する。機械選出の場合、原孔細胞を消化して遠心脱水した後、フローサイトメトリー法により、ＧＦＰ陽性を分別し、ＤｓＲｅｄ陰性の細胞からキメラマウスを作製する。手動選出の場合、蛍光顕微鏡の下、壁からランダムにクローンを剥離し、クローンを培養培地中に浮遊させる。所定量剥離した後、クローン集団を含む培養培地を１５ｍｌ遠心脱水管中に収集し、遠心脱水してクローン集団を収集する。ＰＢＳで洗浄後、上澄みを遠心脱水し、２００ｕｌの０．２５％のトリプシンを加える。３７℃で３〜５分培養する。血清を終了した後、遠心脱水し、ｍＥＳ培養培地で再び浮遊させる。その後、従来のキメラマウスの作製方法により、キメラマウスを作製する。図13ｂは、様々な誘導日数において、図13ａに示す実験を行った結果を示す図である。図13ｃは、８日目に取得したｉＰＳ細胞を胞胚に注射することによって作製されたキメラマウスを示す写真である。結果から、ｉＣＤ１条件においては、８日目にリプログラミングが完了することが有力に証明された。
【００７２】
（実施例８）本発明の培養培地の因子が少ないことがリプログラミングに与える影響：
ｉＣＤ１培養条件において、ＳＫＯの３つの転写因子が極めて高いリプログラミング効率を有するということは、転写因子がさらに少ない場合でも体細胞をリプログラミングできる可能性があることを示す。この仮定に基づき、様々なウイルスの組合せ（ＯＫ／ＯＳ／ＳＫ）をマウス線維芽細胞に感染させた。具体的な方法は、Ｏｃｔ４とＫｌｆ４とを１：１で混合（各０．５ｍｌ）し、細胞（各孔に２万個の細胞を有し、全部で１２孔のプレート）に感染させた。また、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２とを１：１で混合（各０．５ｍｌ）し、細胞（各孔に３万個の細胞を有し、全部で１２孔のプレート）に感染させた。また、ＫｌｆとＳｏｘ２とを１：１で混合（各０．５ｍｌ）し、細胞（各孔に３万個の細胞を有し、全部で１２孔のプレート）に感染させた。上述の３種の感染した細胞をｉＣＤ１培養培地又は従来のｍＥＳ培養培地中において培養し、連続培養観察を行った。図14ａは、ｉＣＤ１培養条件において、ＯＫ及びＯＳを用いて体細胞をリプログラミングした初代クローン写真及び経過写真である。Ｏｃｔ４及びＫｌｆ４に感染したＭＥＦ中、ｉＣＤ１培養システムにおいて培養した孔には、１２〜１５日内に、各孔に１〜６個の蛍光クローンが出現した。Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２に感染した培養培地においては、１８〜２５日内に、各孔に１〜３個の蛍光クローンが出現した。また、従来のｍＥＳ培養条件においては、如何なるクローンも出現しなかった。また、Ｋｌｆ４及びＳｏｘ２に感染した孔中、ｉＣＤ１培養条件であっても、ｍＥＳ培養条件であっても、２５日内に、リプログラミングクローンが全く出現しなかった。図14ｂは、ＯＫ及びＯＳを用いたリプログラミングによって取得したｉＰＳクローンに、幹細胞特異の分子標識が出現したことを示す写真である。選出したＯＫ及びＯＳクローンをフィーダー層細胞上で継代培養し、免疫蛍光法による検出の結果、選出したクローンが何れもＮａｎｏｇ、Ｒｅｘ１などの多能性分子標識を出現していることを発見した。図14ｃは、Ｏｃｔ４／Ｋｌｆ４及びＯｃｔ４／Ｓｏｘ２を用いたリプログラミング実験の結果を示し、図中、各実験において、リプログラミングクローンを計算した時間及び計算結果を示す。３回の試験結果から、試験は、好適な再現性を有することが示された。図14ｄは、ＯＫ及びＯＳクローンを注射したヌードマウスに発生した奇形腫の切断面を示す写真である。組織切断面中の明らかな３つの胚葉の組織から、ＯＫ及びＯＳクローンは、３つの胚葉細胞に分化する能力を有することが示された。
【００７３】
（実施例９）ｉＣＤ１培養条件において、Ｏｃｔ４は、マウス胎児線維芽細胞をリプログラミングすることができる：
ｉＣＤ１中において、ＯＫ及びＯＳの何れもがリプログラミングクローンを作製することができる事実により、Ｏｃｔ４がリプログラミング過程中において、大きく作用していることが示された。そこで、Ｏｃｔ４単独がｉＣＤ１中において、リプログラミングクローンを作製することができるか否かは、確認する価値がある。そこで、３万個のＯｃｔ４−ＧＦＰ遺伝子導入マウス胎児線維芽細胞にＯｃｔ４ウイルスを２回感染させた後、ｉＣＤ１中で培養した。略３０日連続培養した後、蛍光クローンは、出現しなかった。そこで、培養物をトリプシンで消化し、フィーダー層細胞上で継代培養し、ｉＣＤ１において継続培養した。継代培養後の５日目に、緑色リプログラミングクローンが出現したのを発見した（図15ａ参照）。これらのＯｃｔ４リプログラミングクローンを選出して継代培養し、免疫蛍光法により、抗体を用いて多能性分子標識の発現を検出した。これらのクローンには、何れもＮａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−１及びＲｅｘ１などの多能性分子標識が発現したことが発見された（図15ｂ参照）。リアルタイム定量ＰＣＲにより、Ｏｃｔ４−ＧＦＰマウス胎児線維芽細胞に関連する内因性多能性分子標識Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｄｐｐａ３、Ｒｅｘ１及びＤｎｍｔ３１の発現レベルが検出された。図15ｃの結果からも、これらのクローンの内因性Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ｒｅｘ１、Ｄｐｐａ３及びＤｎｍｔ３１を発現するレベルが標準的なＥＳ細胞Ｒ１と類似することが示された。図15ｄは、リアルタイム定量ＲＣＲ法により、外因子遺伝子の発現プロファイルを分析した結果を示すグラフである。ＳＫＯ感染後４日目のＯｃｔ４−ＧＦＰマウス胎児線維芽細胞を陽性参照とする。結果から、選出されたこれらのリプログラミングクローンは、外因性転写因子が全てすでに沈黙していることが示された。挿入鑑定分析の結果（図15ｅ）から、選出したクローンは、ウイルス汚染によるものではないことが示された。図15ｆは、Ｏｃｔ４リプログラミングクローン細胞を胞胚に注射することによって作製されたキメラマウスを示す写真である。作製されたキメラオスマウスと白色系統マウスとからは、全黒マウスが作製された（図15ｇ参照）。この結果から、Ｏｃｔ４リプログラミングクローンは、生殖系キメラであることが証明された。上述の結果から、Ｏｃｔ４リプログラミング細胞は、ＥＳ細胞と類似することが証明された。従って、ｉＣＤ１培養条件において、Ｏｃｔ４は、マウス胎児線維芽細胞を完全にリプログラミングできることが証明された。
【００７４】
（実施例１０）ｉＣＤ１培養培地をＯｃｔ４−ＶＰ１６リプログラミングで応用：
Ｏｃｔ４−ＶＰ１６は、Ｏｃｔ４遺伝子の後部にＶＰ１６配列が連結されたものである。Ｏｃｔ４−ＶＰ１６の共発現により、Ｏｃｔ４の転写機能が強化される。実験により、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４が体細胞をリプログラミングする能力は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４よりも高いことが証明された。Ｏｃｔ４−ＶＰ１６が参与するリプログラミング過程中、ｉＣＤ１が他の培養条件より優れることを証明するために、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４を２万個のＯｃｔ４−ＧＦＰマウス胎児線維芽細胞に感染させた後、ｍＥＳ、ｍＥＳ＋ビタミンＣ及びｉＣＤ１培養システムにおいて培養し、感染後１０日に、リプログラミングクローン数を計算した。各実験反復回数ｎ＝３であり、エラーバーは、標準偏差を示す。図16ａに示す結果から、ｉＣＤ１培養条件において、１０日目に２５００個のリプログラミングクローンが発現したことが発見された。また、ｍＥＳ＋ビタミンＣの孔中には、６５０個のリプログラミングクローンが発現した。ｍＥＳ条件においては、極めて少数のクローンしか発現しなかった。図16ｂは、３種の培養条件における蛍光クローンを示す写真である。同様に、ｉＣＤ１条件において、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６及びＳｏｘ２と、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６及びＫｌｆ４と、のリプログラミング能力を検出した。具体的な方法は、３万個のマウス胎児線維芽細胞にＯｃｔ４−ＶＰ１６及びＳｏｘ２と、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６及びＫｌｆ４と、を感染させた後、ｉＣＤ１条件において培養し、様々な日数におけるリプログラミングクローン数を計算した。各実験反復回数ｎ＝３であり、エラーバーは、標準偏差を示す。図17ａに示す結果から、ｉＣＤ１培養条件において、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６及びＳｏｘ２と、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６及びＫｌｆ４とは、何れもマウス胎児線維芽細胞をリプログラミングすることができることが示された。感染後１５日目のＯｃｔ４−ＶＰ１６及びＳｏｘ２のリプログラミング効率は、約１％であり、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６及びＫｌｆ４のリプログラミング効率は、約０．１５％であった。図17ｂは、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６／Ｋｌｆ４及びＯｃｔ４−ＶＰ１６／Ｓｏｘ２によって誘導されたｉＰＳクローンを示す写真である。免疫蛍光法により、抗体を用いて多能性分子標識の発現を検出した結果、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１、ＳＳＥＡ−１などの多能性分子標識が何れも発現されたことが発見された（図17ｃ参照）。図17ｃは、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６／Ｋｌｆ４によって誘導されたｉＰＳ細胞が発現した典型的な多能性分子標識と、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６／Ｓｏｘ２によって誘導されたｉＰＳ細胞が発現した典型的な多能性分子標識と、を示す写真である。
【００７５】
Ｏｃｔ４は、ｉＣＤ１条件において、成体幹細胞にリプログラミングすることが可能であるが、効率が極めて低い。また、継代培養が必要である。Ｏｃｔ４−ＶＰ１６単一因子がリプログラミング効率を高めることができるか否かは、その特性と大きく関連性がある。これを検出するために、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６ウイルスを３万個のＯｃｔ４−ＧＦＰ遺伝子導入マウス胎児線維芽細胞に感染させ、ｍＥＳ、ｍＥＳ＋ビタミンＣ及びｉＣＤ１培養培地中において培養した。結果から、感染後約１０日目に、ｉＣＤ１培養培地で培養する孔中から緑色リプログラミングクローンが出現したのが発見された（図18ａ参照）。しかし、ｍＥＳ及びｍＥＳ＋ビタミンＣの孔にはなかった。感染後１７日目、ｉＣＤ１培養の孔内には、各孔に約１０個のリプログラミングクローンが出現した。しかし、ｍＥＳ及びｍＥＳ＋ビタミンＣの孔には、リプログラミングクローンがなかった。計算結果は、図18ｂに示す。選出したクローンを継代培養し、免疫蛍光法により、抗体を用いて多能性分子標識の発現を検出した。結果は、図18ｃに示すように、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６によって誘導されたクローンには、多能性分子標識が発現した。これらの選出したリプログラミングクローンには、何れもＮａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−１などの多能性分子標識が発現した。選出したクローンを胞胚内に注射し、代理妊娠用のマウス子宮に移植した結果、キメラマウスを作製することに成功した（図18ｄ参照）。この結果から、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６を用いてｉＣＤ１から取得されたリプログラミング細胞は、ＥＳ細胞と類似する多能性を有することが証明された。
【００７６】
以上の実験により、Ｏｃｔ４−ＶＰ１６を用いてリプログラミングを行う条件において、ｉＣＤ１培養培地は、他の培養培地よりも明らかに優れることが証明された。
【００７７】
（実施例１１）ｍＥＳ条件におけるｉＣＤ１のコア成分の応用：
ｉＣＤ１中のコア成分の血清中における作用を測定するために、ｉＣＤ１中のコア成分（ビタミンＣ、塩化リチウム、塩基性線維芽細胞成長因子、インスリン及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１）をｍＥＳ中に添加した。この培養培地をＳｍＥＳ（Ｓｕｐｅｒ−ｍＥＳ）と命名した。ＳＫＯ及び普通のＯｃｔ４のＳｍＥＳ中におけるリプログラミング効果を検出した。ｍＥＳ培養培地及びｍＥＳ＋ビタミンＣ培養培地を参照とした。結果は、図19ａに示すように、ＳＫＯ感染後８日目、ＳｍＥＳ培養の孔内から約４００個のクローンが発現した。また、ｍＥＳ＋ビタミンＣの孔内から約２０個のリプログラミングクローンが発現した。図19ｂは、ＳｍＥＳ培養条件において、８日目の原孔内の蛍光クローンを示す写真である。同様に、Ｏｃｔ４単一因子がＳｍＥＳ培養培地のリプログラミング効果に与える影響も測定した（ＳｍＥＳ培養システムの下において、Ｏｃｔ４は、体細胞をリプログラミングすることが可能である。Ｏｃｔ４−ＧＦＰマウス胎児線維芽細胞にＯｃｔ４ウイルスを感染させた後、ｍＥＳ培養培地、ｍＥＳ＋ビタミンＣ培養培地及びｉＣＤ１培養培地において培養し、様々な日数で蛍光クローン数を観察した）。図19ｃに示す３回の独立実験の結果から、ＳｍＥＳ条件において、Ｏｃｔ４は、マウス胎児線維芽細胞をリプログラミングすることが示された。図19ｄは、初代クローン及び継代クローンの写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図９】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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