(57)【要約】  本発明は、４７以下のアミノ酸からなり、そして配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むエピトープ配列との選択的相互作用が可能な親和性リガンドに関する。さらに、本発明は、エピトープ配列からなるポリペプチドならびに親和性リガンドおよびポリペプチドの使用に関する。
2012504408.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
４７以下のアミノ酸からなり、そして配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むエピトープ配列との選択的相互作用が可能な親和性リガンド。
【請求項２】
前記エピトープ配列は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の親和性リガンド。
【請求項３】
前記エピトープ配列は、配列番号３および／または配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の親和性リガンド。
【請求項４】
前記エピトープ配列は、配列番号６〜１４および３１〜３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２および３のいずれか一項に記載の親和性リガンド。
【請求項５】
前記エピトープ配列は、配列番号６〜１４および３１〜３７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項４に記載の親和性リガンド。
【請求項６】
前記エピトープ配列は、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の親和性リガンド。
【請求項７】
前記エピトープ配列は、配列番号５２〜５９および７８〜８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１または６に記載の親和性リガンド。
【請求項８】
前記エピトープ配列は、配列番号５２〜５９および７８〜８２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項７に記載の親和性リガンド。
【請求項９】
前記エピトープ配列は、３４以下のアミノ酸残基からなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の親和性リガンド。
【請求項１０】
前記エピトープ配列は、１７以下のアミノ酸残基からなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の親和性リガンド。
【請求項１１】
抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の親和性リガンド。
【請求項１２】
前記抗体はポリクローナルである、請求項１１に記載の親和性リガンド。
【請求項１３】
前記抗体はモノクローナルである、請求項１１に記載の親和性リガンド。
【請求項１４】
ブドウ球菌プロテインＡおよびそのドメイン、リポカリン、アンキリンリピートドメイン、セルロース結合ドメイン、γクリスタリン、緑色蛍光タンパク質、ヒト細胞障害性Ｔリンパ球関連抗原４、プロテアーゼ阻害剤、ＰＤＺドメイン、ペプチドアプタマー、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、テンダミスタット、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインおよびジンクフィンガーからなる群から選択される足場から誘導されるタンパク質リガンドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の親和性リガンド。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチド分子である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の親和性リガンド。
【請求項１６】
大腸癌を有する哺乳動物被験体の予後を確立するためのインビボ方法に使用するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の親和性リガンド。
【請求項１７】
予後作用剤としての請求項１〜１６のいずれか一項に記載の親和性リガンドの使用。
【請求項１８】
大腸癌を有する哺乳動物被験体の予後を確立するための、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
大腸癌を有する哺乳動物被験体の予後が、対照予後より不良であるかもしくはそれに匹敵するかどうかを決定するための方法であって、以下の工程：
ａ）前記被験体からより早期に得られたサンプルを提供する工程；
ｂ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の親和性リガンドを使用して、前記サンプルの少なくとも一部に存在する配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質の量を評価し、そして前記評価した量に対応するサンプル値を決定する工程；
ｃ）工程ｄ）において得られた前記サンプル値と前記対照予後に関連する対照値とを比較する工程；ならびに
前記サンプル値が前記対照値以下である場合、
ｄ）前記被験体の前記予後は、前記対照予後より不良であるかもしくはそれに匹敵すると結論付ける工程、
を含む、方法。
【請求項２０】
処置を必要とする被験体の処置の方法であって、ここで、前記被験体は大腸癌を有し、以下の工程：
ａ）前記被験体由来のサンプルを提供する工程；
ｂ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の親和性リガンドを使用して、前記サンプルの少なくとも一部に存在する配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質の量を評価し、そして前記評価した量に対応するサンプル値を決定する工程；
ｃ）工程ｄ）において得られた前記サンプル値と前記対照予後に関連する対照値とを比較する工程；ならびに
前記サンプル値が前記対照値以下である場合、
ｄ）アジュバント大腸癌処置レジメンにより前記被験体を処置する工程
を含む、方法。
【請求項２１】
工程ｃ）の前記対照値は対照の予後に関連し、そして工程ｄ）の前記アジュバント大腸癌処置レジメンは、前記対照の予後より不良であるかもしくはそれに匹敵する前記被験体の予後に応用される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記アジュバント大腸癌処置レジメンは、化学療法、術前アジュバント療法およびそれらの組み合わせから選択される、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アジュバント大腸癌処置レジメンは術前アジュバント療法である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記術前アジュバント療法は、ｉ）放射線療法のみおよびｉｉ）化学療法と組み合わせた放射線療法から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程ｂ）のタンパク質は配列番号１を含む、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
工程ｂ）は、前記サンプル中のタンパク質に対する前記親和性リガンドの結合を可能にする条件下で前記親和性リガンドを前記サンプルに応用する工程を含み、そして前記評価した量は、前記サンプルの前記少なくとも一部に関連する前記親和性リガンドの量を評価することによって得られる、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
工程ｂ）は：
ｂ１）前記サンプル中のタンパク質に対する前記親和性リガンドの結合を可能にする前記条件において、前記親和性リガンドを前記サンプルに応用する工程；
ｂ２）前記サンプルから非結合親和性リガンドを取り出す工程；および
ｂ３）前記サンプルの前記少なくとも一部に関連して残留している親和性リガンドの量を評価して、前記評価した量を入手する工程
を含む、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記親和性リガンドは、蛍光染料および金属、発色団染料、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性同位元素、粒子および量子ドットからなる群から選択される標識を含む、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記親和性リガンドは、前記親和性リガンドを認識することが可能な２次親和性リガンドを使用して、検出される、請求項１９〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記２次親和性リガンドは、蛍光染料および金属、発色団染料、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性同位元素、粒子および量子ドットからなる群から選択される標識を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記大腸癌はＤｕｋｅｓ分類でＡまたはＢである、請求項１９〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記大腸癌は大腸腺腫である、請求項１９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記大腸癌は大腸癌腫である、請求項１９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記大腸癌は転移性である、請求項１９〜３０および３２〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記大腸癌はＤｕｋｅｓ分類でＣまたはＤである、請求項１９〜３０および３２〜から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記予後は、全生存率のような生存の確率であり、そして前記対照予後は、全生存率のような生存の対照確率であって、ここで、両方の生存率とも同じタイプの生存率である、請求項１９および２１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記生存の確率は、５年、１０年または１５年生存の確率である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記被験体はヒトである、請求項１９〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記サンプルは体液サンプルである、請求項１９〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記体液は、血液、リンパ、血漿、血清、脳脊髄液、尿、精液および滲出物からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記サンプルは細胞学的サンプルである、請求項１９〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記サンプルは糞便サンプルである、請求項１９〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記サンプルは、前記被験体由来の細胞を含む、請求項１９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記サンプルは、前記被験体由来の腫瘍細胞を含む、請求項１９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記サンプルは組織サンプルである、請求項１９〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記組織サンプルは大腸組織サンプルである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記大腸組織サンプルは大腸癌組織サンプルである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記組織サンプルはＳ状結腸から誘導される、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
工程ｂ）の前記評価は、前記サンプルの細胞の核に限定される、請求項１９〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記サンプルの前記細胞は、前記サンプルの腫瘍細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記対照値は、対照サンプルにおける配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質の量に対応する値である、請求項１９〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
工程ｂ）の前記サンプル値は、前記サンプルにおいて配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含む検出可能なタンパク質に対応する１、あるいは前記サンプルにおいて配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含む検出可能なタンパク質が認められないことに対応する０のいずれかとして決定される、請求項１９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
工程ｃ）の前記対照値は、配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含む検出可能なタンパク質が認められない対照サンプルに対応する、請求項１９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
工程ｃ）の前記対照値は０である、請求項１９〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記対照値は、細胞質画分、細胞質強度、細胞質画分および細胞質強度の関数、核画分、核強度ならびに核画分および核強度の関数からなる群から選択される、請求項１９〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記対照値は、核画分、核強度ならびに核画分および核強度の関数からなる群から選択される、請求項１９〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記対照値は核画分である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記対照値は、２５％以下の核画分である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記対照値は核強度である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記対照値は弱以下の核強度である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記対照値は不在の核強度である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記サンプル値が前記対照値以上である場合、以下の工程：
ｅ）前記被験体の前記予後は、前記対照予後より良好であると結論付ける工程
をさらに含む、請求項１９および２５〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
ａ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の親和性リガンド；および
ｂ）前記親和性リガンドの量を定量するのに必要な試薬
を含む、請求項１９〜６２のいずれか一項に記載の方法を行うためのキット。
【請求項６４】
前記親和性リガンドは、蛍光染料および金属、発色団染料、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性同位元素、粒子および量子ドットからなる群から選択される標識を含む、請求項６３に記載のキット。
【請求項６５】
前記親和性リガンドの前記量を定量するのに必要な前記試薬は、前記親和性リガンドを認識することが可能な２次親和性リガンドを含む、請求項６３〜６４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６６】
前記２次親和性リガンドは、蛍光染料または金属、発色団染料、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性同位元素、粒子および量子ドットからなる群から選択される標識を含む、請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
対照値の供給のための少なくとも１つの対照サンプルをさらに含む、請求項６３〜６６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６８】
少なくとも１つの対照サンプルは、配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含む検出可能なタンパク質が認められない組織サンプルである、請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
少なくとも１つの対照サンプルは、配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む、請求項６７〜６８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７０】
少なくとも１つの対照サンプルは、２５％以下の核画分に対応する量の、配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む、請求項６７〜６９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７１】
少なくとも１つの対照サンプルは、弱以下の核強度に対応する量の、配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む、請求項６７〜７０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７２】
少なくとも１つの対照サンプルは、不在の核強度に対応する量の、配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む、請求項６７〜７１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７３】
少なくとも１つの対照サンプルは、前記方法の前記対照値より高い値に対応する量の、配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む、請求項６７〜７２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７４】
少なくとも１つの対照サンプルは、強い核強度に対応する量の、配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む、請求項７３に記載のキット。
【請求項７５】
少なくとも１つの対照サンプルは、７５％以上の核画分に対応する量の、配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む、請求項７３に記載のキット。
【請求項７６】
前記方法の前記対照値より高い値（陽性対照値）に対応する量の、配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む第１の対照サンプル；ならびに
前記方法の前記対照値より低い値（陰性対照値）に対応する量の、配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むある量のタンパク質を含む第２の対照サンプル
を含む、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７７】
前記対照サンプルは組織サンプルである、請求項６７〜７６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７８】
４７以下の酸残基（ａｃｉｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）からなり、そして配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項７９】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項７８に記載のポリペプチド。
【請求項８０】
配列番号３および／または配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項７９に記載のポリペプチド。
【請求項８１】
配列番号６〜１４および３１〜３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７９および８０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８２】
配列番号６〜１４および３１〜３７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項８１に記載のポリペプチド。
【請求項８３】
配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項７８に記載のポリペプチド。
【請求項８４】
配列番号５２〜５９および７８〜８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７８または８３に記載のポリペプチド。
【請求項８５】
配列番号５２〜５９および７８〜８２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項７８または８３に記載のポリペプチド。
【請求項８６】
３４以下のアミノ酸残基からなる、請求項７８〜８５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８７】
１７以下のアミノ酸残基からなる、請求項８６に記載のポリペプチド。
【請求項８８】
免疫化における抗原として使用するための、請求項７８〜８７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８９】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造に使用するための、請求項７８〜８８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９０】
抗原としての、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項９１】
免疫化のための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項９２】
前記免疫化は、非ヒト哺乳動物の免疫化である、請求項９１に記載の使用。
【請求項９３】
抗体の製造における請求項７８〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項９４】
前記抗体はモノクローナルまたはポリクローナルである、請求項９３に記載の使用。
【請求項９５】
親和性リガンドの選択または精製における請求項７８〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項９６】
前記親和性リガンドは、大腸癌を有する哺乳動物被験体の予後を確立するためのものである、請求項９５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示物は、エピトープおよびそれに結合する親和性リガンドの分野に関する。さらに、本開示物のいくつかの態様は、例えば、大腸癌予後のために、親和性リガンドを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌
癌は、西洋における最も多い疾患および死亡の原因である。一般に、罹患率は、ほとんどの形態の癌について、年齢と共に増加している。一般的健康状態の増加によりヒト集団の寿命が続伸しているため、癌が影響を及ぼす個体数が増加している。最も多い癌タイプの原因はなお、大部分が不明であるが、環境因子（食事、喫煙、ＵＶ照射など）および遺伝的因子（ｐ５３、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＸＰなどのような「癌遺伝子」における生殖細胞系列変異）と癌の発達の危険性との間の関連を提供する知識体系が増大している。
【０００３】
癌は、本質的に細胞の疾患であり、そして正味の細胞増殖および秩序に反する（ａｎｔｉ−ｓｏｃｉａｌ）挙動を伴う形質転換された細胞集団として定義されているという事実にもかかわらず、細胞生物学的観点から見ると、癌の定義は、完全には満足できるものではない。悪性形質転換は、不可逆的な遺伝的変更に基づく悪性表現型への転移を表す。このことは正式には証明されていないが、悪性形質転換は、１個の細胞から生じ、その細胞を起源として、その後、腫瘍が発達する（「癌の形成」ドグマ）と考えられている。発癌は、癌が発生するプロセスであり、究極的に悪性腫瘍の増殖をもたらす多数の事象を含むことが一般的に認められている。この多段階プロセスは、変異の付加およびおそらくはまたエピジネティックな事象のようないくらかの律速段階を含み、前癌増殖のステージ後に癌の形成をもたらす。段階的変化は、細胞分裂、反秩序的な（ａｓｏｃｉａｌ）挙動および細胞死を決定する生命の規則的経路におけるエラー（変異）の累積に関係する。これらの変化のそれぞれは、周囲の細胞と比較して、選択的なダーウィン（Ｄａｒｗｉｎｉａｎ）増殖の利点を提供し得、腫瘍細胞集団の正味の増殖を生じる。悪性腫瘍は、形質転換された腫瘍細胞自体だけではなく、また、支持間質として作用する周囲の正常細胞からも構成されることを強調することは重要である。この補充された癌間質は、結合組織、血管および他の様々な正常細胞から、例えば、腫瘍増殖の継続に必要なシグナルを形質転換された腫瘍細胞に、供給するために共同で作用する炎症細胞からなる。
【０００４】
最も多い癌の形態は、体細胞において生じ、そして主に、上皮、例えば、前立腺上皮、乳腺上皮、結腸上皮、尿路上皮および皮膚上皮由来であり、その次に多い形態として、造血系統を起源とする癌、例えば、白血病およびリンパ腫、神経外胚葉、例えば、悪性神経膠腫、ならびに軟部組織腫瘍、例えば、肉腫が続く。
【０００５】
癌診断および予後
腫瘍から採取した組織切片の顕微鏡的評価は、依然として、癌の診断を決定するための絶対的基準のままである。顕微鏡的診断では、疑わしい腫瘍由来の生検材料を回収し、そして顕微鏡下で調べる。確定診断を得るためには、腫瘍組織をホルマリン中で固定し、組織学的に処理（ｈｉｓｔｏ−ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）し、そしてパラフィン包埋する。得られるパラフィンブロックから、組織切片を生成し、そして組織化学的、即ち、ヘマトキシリン−エオシン染色、および免疫組織化学的方法の両方を使用して、染色する。次いで、外科的標本を、目視および顕微鏡分析を含む病理学的技術により評価する。この分析は、特異的診断、即ち、腫瘍タイプを分類し、そして腫瘍の悪性度を階層化（ｇｒａｄｉｎｇ）するための基礎を形成する。
【０００６】
悪性腫瘍は、各癌タイプに特異的な分類スキームに従って、いくらかのステージに分類することができる。固形腫瘍の最も一般的な分類システムは、腫瘍−リンパ節−転移（ＴＮＭ）分類である。Ｔの病期分類は、原発腫瘍の局所進展度、即ち、腫瘍がどれだけ広範に周囲の正常組織に浸潤し、そして増殖したかについて説明し、Ｎの病期分類およびＭの病期分類は、腫瘍がどれくらいの転移に進展しているかを説明しており、Ｎの病期分類は、腫瘍のリンパ節への拡大を説明し、そしてＭの病期分類は、他の離れた器官における腫瘍の増殖について説明している。初期のステージとして：Ｔ０〜１、Ｎ０、Ｍ０が挙げられ、リンパ節転移陰性の局在性の腫瘍を表す。より進行期のステージとして：より広範な増殖を伴う局在性の腫瘍を表すＴ１〜４、Ｎ０〜４、Ｍ０が挙げられ、そしてリンパ節に転移した腫瘍を表すＴ１〜４、Ｎ１〜４、Ｍ０が挙げられ、そして離れた器官において転移が検出された腫瘍を表すＴ１〜４、Ｎ１〜４、Ｍ１が挙げられる。腫瘍の分類は、しばしば、外科的、放射線学的および病理組織学的分析を含むいくらかの形態の検査に基づく。分類に加えて、ほとんどの腫瘍タイプの悪性度のレベルを階層化するための分類システムも存在する。階層化システムは、腫瘍組織サンプルの形態学的評価に依存し、そして所与の腫瘍において見出される顕微鏡的特徴に基づく。これらの階層化システムは、腫瘍細胞の分化、増殖および異形の程度に基づき得る。一般的に用いられる階層化システムの例として、前立腺癌を階層化するＧｌｅａｓｏｎおよび乳癌を階層化するＥｌｓｔｏｎ−Ｅｌｌｉｓが挙げられる。
【０００７】
的確な分類および階層化は、正確な診断に極めて重要であり、そして予後を予測するための道具を提供する。続いて、特定の腫瘍の診断および予後情報は、所与の癌患者の適切な治療計画を決定する。組織切片の組織化学染色に加えて、腫瘍に関する更なる情報を得るための最も一般に用いられる方法は、免疫組織化学染色（ＩＨＣ）である。ＩＨＣは、特異的抗体を使用する組織および細胞におけるタンパク質発現パターンの検出を可能にする。臨床診断においてＩＨＣを使用すると、組織化学的に染色した腫瘍組織切片から評価される組織構造および細胞形態学に関する情報に加えて、異なる細胞集団における免疫反応性を検出することが可能になる。ＩＨＣは、原発腫瘍の分類および階層化を含む的確な診断を支持すること、ならびに起源が不明な転移の診断において重要であり得る。今日の臨床診療において最も一般に使用される抗体として、細胞タイプ「特異的」タンパク質、例えば、ＰＳＡ（前立腺）、ＭｅｌａｎＡ（メラノサイト）、サイログロブリン（甲状腺）に対する抗体、ならびに中間径フィラメント（上皮細胞、間葉細胞、グリア細胞）、白血球分化（ＣＤ）抗原（造血（ｈｅｍａｔｏｐｏｅｔｉｃ）細胞、リンパ系（ｌｙｍｐｏｉｄ）細胞の下位分類）および悪性度のマーカー、例えば、Ｋｉ６７（増殖）、ｐ５３（通例、変異した腫瘍抑制因子遺伝子）およびＨＥＲ−２（増殖因子受容体）を認識する抗体が挙げられる。
【０００８】
ＩＨＣの他に、遺伝子増幅を検出するためのインサイチュハイブリダイゼーションおよび変異分析の遺伝子配列決定の使用も、癌診断分野での発展している技術である。加えて、転写物、タンパク質または代謝物の網羅的分析もすべて、重要な情報を追加する。しかし、これらの分析のほとんどはなお、基礎研究を想定しており、そして臨床医学における使用のための評価および標準化は未だ行われていない。
【０００９】
結腸および直腸由来の腺癌（大腸癌）
大腸癌、腺癌として存在する悪性上皮腫瘍は、世界的に、ヒト癌の最も一般的な形態の１つである。Ｐａｒｋｉｎらによって提示されたＧＬＯＢＯＣＡＮ２００２データベースのデータから、年間約１００万人の大腸癌の新たな症例が示されている（非特許文献１）。さらに、世界における大腸癌の発症率は、すべての癌の約９．４％であり、そして大腸癌は、西洋において２番目に多い死亡原因である。大腸癌の５年生存率は、西洋において約６０％であるが、東欧およびインドでは３０％と低い。
【００１０】
早期検出および腫瘍の摘出による手術は、現在、成功的治療に極めて重要である。局在する腫瘍、即ち、転移性疾患に発展していない腫瘍では、腫瘍ならびに周辺の腸および組織の根治的切除による外科的介入が実施される。大腸腫瘍は、Ｄｕｋｅｓ分類Ａ〜Ｄに従って、またはより最近では、ＴＮＭ分類に従って、いくらかのステージに分類される。最も小さな悪性腫瘍（Ｄｕｋｅｓ分類ＡおよびＢ）は、一般的に、比較的好適な結果に関連するが、転移を伴う高度に悪性の腫瘍（Ｄｕｋｅｓ分類ＣおよびＤ）は、低い生存率を有する。不運にも、大腸癌は、しばしば、検出前に相当なサイズにまで増大し、それ故、転移も珍しくない。腫瘍は、典型的に、領域リンパ節に転移するが、肝臓および肺への遠隔転移もまた、一般的である。
【００１１】
症状は、腫瘍が遠位消化管のどの場所に局在するかに依存し、そして腸窮迫、下痢、便秘、疼痛、および（腫瘍から腸への出血に付随する）貧血を含む。現行の診断は、患者病歴、臨床および内視鏡検査（直腸鏡検査および大腸内視鏡検査）、場合により、それに続く、腫瘍増殖の広がりを決定するための放射線マッピングに基づく。内視鏡検査と共同して、疑わしい病巣から組織生検が実施される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Parkin DM et al (2005) CA Cancer J Clin 55, 74-108
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
鑑別診断では、サイトケラチン２０（ＣＫ２０）、消化管の腺細胞に豊富な中間径フィラメントマーカーは、一般的に、大腸癌を含む消化管における原発腫瘍を診断するために使用される。他のいくつかの腺癌もまたＣＫ２０抗体に対して陽性であり得るが、すべての大腸癌が陽性ではないため、ＣＫ２０マーカーは理想的ではない。更なる予後データを提供する認められた階層化システムまたはタンパク質マーカーは存在しないため、予後情報は、主に、腫瘍ステージ分類から得られる。今日、悪性度が低くかつ転移性疾患に発達する危険性が低い腫瘍と生存の可能性が低減した高度に悪性の腫瘍とを区別することができる利用可能なマーカーは存在しない。それ故、患者の結果を推定し、そして治療介入を含む患者管理の指針を提示するために使用することができる分子マーカーが緊急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本開示物のいくつかの態様の目的は、新規のエピトープおよびそれに結合する親和性リガンドを提供することである。さらに、いくつかの態様の目的は、大腸癌を有する哺乳動物被験体の予後の確立に有用な手段および方法を提供することである。
【００１５】
本発明は、添付の特許請求の範囲によって定義される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１は、モノクローナル抗体５Ｅ２を使用して大腸Ｓ状結腸癌腫と診断された３０５例の被験体の免疫組織化学染色に基づく全生存分析（ＯＳ）の結果を示す。実線は、核画分≧２％（ＮＦ＞０）を表し、そして破線は、核画分＜２％（ＮＦ＝０）を表す。図１Ａは、すべての患者の結果を示す。
【図１Ｂ】図１は、モノクローナル抗体５Ｅ２を使用して大腸Ｓ状結腸癌腫と診断された３０５例の被験体の免疫組織化学染色に基づく全生存分析（ＯＳ）の結果を示す。実線は、核画分≧２％（ＮＦ＞０）を表し、そして破線は、核画分＜２％（ＮＦ＝０）を表す。図１Ｂでは、Ｄｕｋｅの分類ＣまたはＤの大腸癌を伴う被験体のみを分析した。
【図２Ａ】図２は、モノクローナル抗体５Ｅ２を使用して大腸Ｓ状結腸癌腫と診断された３０５例の被験体の免疫組織化学染色に基づく全生存分析（ＯＳ）の結果を示す。実線は、弱い、中等度のまたは強い核強度（ＮＩ＞０）を表し、そして破線は、不在の核強度（ＮＩ＝０）を表す。図２Ａは、すべての患者の結果を示す。
【図２Ｂ】図２は、モノクローナル抗体５Ｅ２を使用して大腸Ｓ状結腸癌腫と診断された３０５例の被験体の免疫組織化学染色に基づく全生存分析（ＯＳ）の結果を示す。実線は、弱い、中等度のまたは強い核強度（ＮＩ＞０）を表し、そして破線は、不在の核強度（ＮＩ＝０）を表す。図２Ｂでは、Ｄｕｋｅの分類ＣまたはＤの大腸癌を伴う被験体のみを分析した。
【図３Ａ】図３は、モノクローナル抗体８Ｆ１１を使用して大腸Ｓ状結腸癌腫と診断された３０５例の被験体の免疫組織化学染色に基づく全生存分析（ＯＳ）の結果を示す。実線は、核画分≧７５％（ＮＦ＝１）を表し、そして破線は、核画分＜７５％（ＮＦ＜１）を表す。図３Ａは、すべての患者の結果を示す。
【図３Ｂ】図３は、モノクローナル抗体８Ｆ１１を使用して大腸Ｓ状結腸癌腫と診断された３０５例の被験体の免疫組織化学染色に基づく全生存分析（ＯＳ）の結果を示す。実線は、核画分≧７５％（ＮＦ＝１）を表し、そして破線は、核画分＜７５％（ＮＦ＜１）を表す。図３Ｂでは、Ｄｕｋｅの分類ＣまたはＤの大腸癌を伴う被験体のみを分析した。
【図４Ａ】図４は、モノクローナル抗体８Ｆ１１を使用して大腸Ｓ状結腸癌腫と診断された３０５例の被験体の免疫組織化学染色に基づく全生存分析（ＯＳ）の結果を示す。実線は、強い核強度（ＮＩ＝１）を表し、そして破線は、不在、弱いおよび中等度の核強度（ＮＩ＜１）を表す。図４Ａは、すべての患者の結果を示す。
【図４Ｂ】図４は、モノクローナル抗体８Ｆ１１を使用して大腸Ｓ状結腸癌腫と診断された３０５例の被験体の免疫組織化学染色に基づく全生存分析（ＯＳ）の結果を示す。実線は、強い核強度（ＮＩ＝１）を表し、そして破線は、不在、弱いおよび中等度の核強度（ＮＩ＜１）を表す。図４Ｂでは、Ｄｕｋｅの分類ＣまたはＤの大腸癌を伴う被験体のみを分析した。
【図５】図５は、モノクローナル抗体５Ｅ２と８Ｆ１１との間のクロス集計を示す。
【図６Ａ】図６は、大腸癌腫の２つのサンプルの免疫組織化学染色を示す。下の画像は、より高い倍率で示したものである。図６Ａは、ポリクローナル抗体ＨＰＡ００１０４２（ＨＰＡ  ｍｓＡＢ）を使用した染色結果を示す。
【図６Ｂ】図６は、大腸癌腫の２つのサンプルの免疫組織化学染色を示す。下の画像は、より高い倍率で示したものである。図６Ｂは、モノクローナル抗体５Ｅ２の結果を示す。
【図７Ａ】図７は、大腸癌腫の２つのサンプルの免疫組織化学染色を示す。下の画像は、より高い倍率で示したものである。図７Ａは、ポリクローナル抗体ＨＰＡ００１０４２（ＨＰＡ  ｍｓＡＢ）を使用した染色結果を示す。
【図７Ｂ】図７は、大腸癌腫の２つのサンプルの免疫組織化学染色を示す。下の画像は、より高い倍率で示したものである。図７Ｂは、モノクローナル抗体８Ｆ１１の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
本開示物の第１の態様として、４７以下のアミノ酸からなり、そして配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むエピトープ配列との選択的相互作用が可能な親和性リガンドを提供する。
【００１８】
本開示物に関して、「エピトープ配列との選択的相互作用」は、エピトープ配列に含有されるアミノ酸残基との選択的相互作用を指す。例えば、エピトープ配列との選択的相互作用が可能な親和性リガンドは、エピトープ配列のアミノ酸残基からなるフラグメントとの選択的相互作用が可能であり得、このフラグメントは、溶液中に遊離して存在してもよく、または固定化されている、例えば、ビーズに結合していてもよい。また、そのようなフラグメントは、相互作用の検出のためのレポーター部分に結合されていてもよい。もう１つの例として、「エピトープ配列との選択的相互作用が可能な親和性リガンド」は、エピトープ配列が、より長いポリペプチドに含まれる場合を指し得るが、但し、親和性リガンドが、エピトープ配列のアミノ酸残基と相互作用し、かつ周囲の、例えば、フランキングしているアミノ酸残基とは相互作用しないことが確立されている場合に限られる。
【００１９】
本開示物に関して、例えば、親和性リガンドとその標的もしくは抗原との「特異的」または「選択的」相互作用は、特異的相互作用と非特異的相互作用との間、または選択的相互作用と非選択的相互作用との間の区別に意義が生じるような相互作用を意味する。２つのタンパク質間の相互作用は、時々、解離定数によって測定される。解離定数は、２つの分子間の結合の強さ（または親和性）を説明する。典型的に、抗体のような親和性リガンドとその抗原との間の解離定数は、１０−７〜１０−１１Ｍである。しかし、高い特異性には、必ずしも高い親和性が必要であるわけではない。対応物に対する（モル範囲で）低い親和性を有する分子は、かなり高い親和性を有する分子と同じ程度に特異的であることが示されている。本開示物の場合、特異的または選択的相互作用は、特定の方法を使用して、天然に存在するかまたは処理された生物学的液体の組織サンプルもしくは液体サンプルにおいて他のタンパク質が存在する所与の条件下で、特異的エピトープ配列を含むタンパク質の存在ならびに／あるいは量を決定することができる程度を指す。言い換えれば、特異性または選択性は、関連するポリペプチド配列を区別する能力である。特異的および選択的は、時々、本明細書において交換可能に使用される。特異性および選択性の決定はまた、Nilsson P et al. (2005) Proteomics 5:4327-4337にも記載されている。
【００２０】
本開示物のこの第１の態様は、本発明者らが所定のエピトープ（即ち、配列番号１および２）を同定し、そしてこれらのエピトープに結合する親和性リガンドを開発したことに基づく。また、本発明者らは、配列番号１および／または２のアミノ酸配列を含むタンパク質に結合する親和性リガンドが大腸癌を有する被験体の予後を確立するのに有用であり得ることを見出した。大腸癌患者における配列番号１および／または２を含むタンパク質の発現は、本明細書において、そのような患者の生存と相関することが示されている。それ故、第１の態様の親和性リガンドは、例えば、大腸癌を有する被験体の予後を確立するための様々な分析、方法、アッセイまたは設定において使用することができる。一般に、そのようなアプリケーションでは、全長タンパク質またはより長いそのフラグメント（例えば、抗原）に単に特異的であるポリクローナル抗体のような親和性リガンドより、所定のエピトープに特異的である親和性リガンドを有する方が、より望ましい。第１の態様に従う親和性リガンドのアプリケーションの例を、以下の態様３として提供する。
【００２１】
配列番号１の配列を有するエピトープと相互作用する抗体は、大腸癌を有する被験体の予後を確立するのに特に適切であることを見出した。
【００２２】
結果的に、第１の態様の実施形態では、問題のエピトープ配列は、配列番号１を含み得る。例えば、本発明者らは、そのような実施形態に従うモノクローナル抗体のほうが、そのようなタンパク質にも結合するが、配列番号１を含むエピトープ配列に対して選択的ではないポリクローナル抗体よりも、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む組織サンプルとのより強く、かつより明瞭な免疫反応性を提示することを見出した（図６〜７も参照のこと）。
【００２３】
異なる２つのモノクローナル抗体を使用するエピトープマッピングによって、本発明者らは、両方ともが配列番号１を含む異なる２つのアミノ酸配列（配列番号３および配列番号４）を同定した。結果的に、第１の態様の実施形態では、問題のエピトープ配列は、配列番号３および／または配列番号４を含み得る。
【００２４】
配列番号３を同定するために使用されるモノクローナル抗体は、本明細書において、大腸癌を有する被験体の予後を確立することに関連することが示されている（図３および４を参照のこと）。結果的に、第１の態様の実施形態では、問題のエピトープ配列は、配列番号３を含み得る。
【００２５】
すべてが配列番号３を含む、定義された長さを有する多くのポリペプチドフラグメント、即ち、配列番号３１〜３７は、本明細書において、そのモノクローナル抗体と相互作用することが示されている。結果的に、第１の態様の実施形態では、問題のエピトープ配列は、配列番号３１〜３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得るかまたはそのアミノ酸配列からなり得る。
【００２６】
配列番号４を同定するために使用されるモノクローナル抗体は、本明細書において、大腸癌を有する被験体の予後を確立することに特に関連することが示されている（図１および２を参照のこと）。結果的に、第１の態様の実施形態では、問題のエピトープ配列は、配列番号４を含み得る。
【００２７】
すべてが配列番号４を含む、定義された長さを有する多くのポリペプチドフラグメント、即ち、配列番号６〜１４は、本明細書において、特に関連するモノクローナル抗体と相互作用することが示されている。結果的に、第１の態様の実施形態では、問題のエピトープ配列は、配列番号６〜１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得るかまたはそのアミノ酸配列からなり得る。
【００２８】
異なる２つのモノクローナル抗体を使用するエピトープマッピングによって、本発明者らは、両方ともが配列番号２を含む異なる２つのアミノ酸配列（配列番号２および配列番号５）を同定した。
【００２９】
結果的に、第１の態様の実施形態では、問題のエピトープ配列は、配列番号５を含み得る。
【００３０】
定義された長さを有する多くのポリペプチドフラグメント、即ち、配列番号５２〜５９および７８〜８２を、配列番号２の同定に使用した。結果的に、第１の態様の実施形態では、問題のエピトープ配列は、配列番号５２〜５９および７８〜８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得るかまたはそのアミノ酸配列からなり得る。
【００３１】
配列番号３を含む上記のフラグメントは、それぞれ、３３、３８、３９、４２、４３、４５および４７アミノ酸長である。さらに、配列番号４を含む上記のフラグメントは、それぞれ、３１、３４、３７、３８、４１、４２、４３、４５、および４７アミノ酸長である。
【００３２】
結果的に、第１の態様の実施形態では、問題のエピトープ配列は、４５以下のアミノ酸残基、例えば、４３以下のアミノ酸残基、例えば、４２以下のアミノ酸残基、例えば、４１以下のアミノ酸残基、例えば、３９以下のアミノ酸残基、例えば、３８以下のアミノ酸残基、例えば、３７以下のアミノ酸残基、例えば、３４以下のアミノ酸残基、例えば、３３以下のアミノ酸残基、例えば、３１以下のアミノ酸残基からなる。
【００３３】
しかし、エピトープ配列は、配列番号１または２を含む限り、第１の態様の親和性リガンドとの相互作用を可能にするほど長い（＞３０アミノ酸）必要はないかもしれない。結果的に、第１態様の実施形態では、エピトープ配列は、２５以下のアミノ酸、例えば、２０以下のアミノ酸、例えば、１７以下のアミノ酸、例えば、１４以下のアミノ酸、例えば、１２以下のアミノ酸からなり得る。エピトープ配列では、配列番号１または配列番号２にフランキングするアミノ酸は、例えば、タンパク質ＳＡＴＢ２においてそれらにフランキングしているアミノ酸であってもよい。
【００３４】
一旦、本明細書において開示される本エピトープ情報が提供されれば、第１の態様に従う親和性リガンドを選択または製造することは当業者の能力の範囲内にあるものとみなされる。それでも敢えて、有用性を証明し得る親和性リガンドの例、ならびに検出および／または定量化の形式および条件の例を、例示目的のために以下に示すことにする。
【００３５】
それ故、第１の態様の実施形態では、親和性リガンドは、抗体、そのフラグメントおよびその誘導体、即ち、免疫グロブリン足場に基づく親和性リガンドからなる群から選択され得る。例えば、抗体は、単離されたおよび／または単一特異的であり得る。例えば、抗体は、マウス、ウサギ、ヒトおよび他の抗体を含む任意の起源のモノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびに部分的にヒト化された抗体、例えば、部分的にヒト化されたマウス抗体のような異なる種由来の配列を含むキメラ抗体を含む。ポリクローナル抗体は、好適な抗原による動物の免疫化によって産生される。定義された特異性を有するモノクローナル抗体は、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Koehler G and Milstein C (1976） Eur. J. Immunol. 6:511-519）によって開発されたハイブリドーマ技術を使用して、産生させることができる。本明細書において、大腸癌を有する被験体の予後を確立することに特に関連することが示された親和性リガンドは、モノクローナル抗体である。それ故、第１の態様の実施形態では、親和性リガンドは、モノクローナル抗体であってもよい。
【００３６】
本開示物に関して、「単一特異的抗体」は、それ自体の抗原に対してアフィニティー精製されているポリクローナル抗体の集団の１つであり、それによって、他の抗血清タンパク質および非特異的抗体からそのような単一特異的抗体を分離している。このアフィニティー精製は、その抗原に選択的に結合する抗体を生じる。本発明の場合、ポリクローナル抗血清は、標的タンパク質に選択的な単一特異的抗体を得るための２工程の免疫アフィニティーに基づくプロトコルによって、精製される。捕捉因子として固定化されたタグタンパク質を使用する１次枯渇工程において、抗原フラグメントの包括的親和性タグに対する抗体を取り出す。第１の枯渇工程後、抗原に特異的な抗体を富化するために、捕捉因子として抗原を伴う第２のアフィニティーカラム上で、血清を単離する（Nilsson P et al. (2005) Proteomics 5:4327-4337も参照のこと）。
【００３７】
抗体フラグメントおよび誘導体は、無傷（ｉｎｔａｃｔ）な免疫グロブリンタンパク質の重鎖（ＣＨ１）の第１の定常ドメイン、軽鎖（ＣＬ）の定常ドメイン、重鎖（ＶＨ）の可変ドメインおよび軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインからなるＦａｂフラグメント；２つの可変抗体ドメインＶＨおよびＶＬからなるＦｖフラグメント（Skerra A and Plueckthun A (1988） Science 240:1038-1041）；可撓性ペプチドリンカーによって共に連結された２つのＶＨおよびＶＬドメインからなる一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）（Bird RE and Walker BW (1991) Trends Biotechnol. 9:132-137）；Ｂｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓダイマー（Stevens FJ et al. (1991) Biochemistry 30:6803-6805）；ラクダ科重鎖ダイマー（Hamers-Casterman C et al. (1993） Nature 363:446-448）および単一可変ドメイン（Cai X and Garen A (1996） Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:6280-6285；Masat L et al. (1994） Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:893-896）、ならびに例えば、コモリザメ由来のＮｅｗ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＡＲ）のような単一ドメイン足場（Dooley H et al. (2003） Mol. Immunol. 40:25-33）および可変重鎖ドメインに基づくミニボディ（Skerra A and Plueckthun A (1988） Science 240:1038-1041）を含む。
【００３８】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびにそれらのフラグメントおよび誘導体は、下記の方法態様に従う標的タンパク質の検出および／または定量化におけるような選択的生体分子認識を必要とするアプリケーションにおいて、親和性リガンドを従来どおり選択する。しかし、当業者は、選択的結合リガンドのハイスループット作製および低コスト生産システムの需要が増加しているため、新たな生体分子多様性技術が、最近１０年間の間に開発されてきたことを知っている。これは、生体分子認識アプリケーションにおいて結合リガンドとして有用であることが同様に証明されており、そして免疫グロブリンの代わりに、または免疫グロブリンと共に使用することができる免疫グロブリンならびに非免疫グロブリン起源の両方の新規のタイプの親和性リガンドの作製を可能にした。
【００３９】
第１の態様に従う親和性リガンドの選択に必要な生体分子多様性は、複数の可能な足場分子のうちの１つのコンビナトリアル操作によって作製することができ、次いで、親和性リガンドが、適切な選択プラットホームを使用して、選択される。足場分子は、免疫グロブリンタンパク質由来（Bradbury AR and Marks JD (2004） J. Immunol. Meths. 290:29-49）、非免疫グロブリンタンパク質由来（Nygren PA and Skerra A (2004） J. Immunol. Meths. 290:3-28）、またはオリゴヌクレオチド由来（Gold L et al. (1995) Annu. Rev. Biochem. 64:763-797）であってもよい。
【００４０】
多数の非免疫グロブリンタンパク質足場が、新規の結合タンパク質の開発において支持構造として使用されている。第１の態様に従って使用するための親和性リガンドを作製するのに有用なそのような構造の非制限的例には、ブドウ球菌プロテインＡおよびそのドメインならびにこれらのドメインの誘導体、例えば、プロテインＺ（Nord K et al. (1997） Nat. Biotechnol. 15:772-777）；リポカリン（Beste G et al. (1999） Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:1898-1903）；アンキリンリピートドメイン（Binz HK et al. (2003） J. Mol. Biol. 332:489-503）；セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）（Smith GP et al. (1998) J. Mol. Biol. 277:317-332；Lehtioe J et al. (2000) Proteins 41:316-322）；γクリスタリン（Fiedler U and Rudolph R、WO01/04144）；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Peelle B et al. (2001） Chem. Biol. 8:521-534）；ヒト細胞障害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）（Hufton SE et al. (2000） FEBS Lett. 475:225-231；Irving RA et al. (2001） J. Immunol. Meth. 248:31-45）；プロテアーゼ阻害剤、例えば、Ｋｎｏｔｔｉｎタンパク質（Wentzel A et al. (2001） J. Bacteriol. 183:7273-7284；Baggio R et al. (2002） J. Mol. Recognit. 15:126-134）およびＫｕｎｉｔｚドメイン（Roberts BL et al. (1992） Gene 121:9-15；Dennis MS and Lazarus RA (1994） J. Biol. Chem. 269:22137-22144）；ＰＤＺドメイン（Schneider S et al. (1999） Nat. Biotechnol. 17:170-175）；ペプチドアプタマー、例えば、チオレドキシン（Lu Z et al. (1995） Biotechnology 13:366-372；Klevenz B et al. (2002） Cell. Mol. Life Sci. 59:1993-1998）；ブドウ球菌ヌクレアーゼ（Norman TC et al. (1999） Science 285:591-595）；テンダミスタット（McConell SJ and Hoess RH (1995) J. Mol. Biol. 250:460-479；Li R et al. (2003) Protein Eng. 16:65-72）；フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに基づくトリネクチン（Koide A et al. (1998） J. Mol. Biol. 284:1141-1151；Xu L et al. (2002） Chem. Biol. 9:933-942）；ならびにジンクフィンガー（Bianchi E et al. (1995） J. Mol. Biol. 247:154-160；Klug A (1999） J. Mol. Biol. 293:215-218；Segal DJ et al. (2003） Biochemistry 42:2137-2148）がある。
【００４１】
非免疫グロブリンタンパク質足場の上記の例として、新規の結合特異性の作製に使用される単一の無作為化ループを提示する足場タンパク質、堅牢な２次構造を伴うタンパク質足場が挙げられ、ここで、タンパク質表面から突出している側鎖が、新規の結合特異性の作製、および新規の結合特異性の作製に使用される非連続的超可変ループ領域を示す足場のために無作為化される。
【００４２】
非免疫グロブリンタンパク質に加えて、オリゴヌクレオチドもまた、第１の態様に従う親和性リガンドとして使用してもよい。一本鎖核酸は、アプタマーまたはデコイと呼ばれ、良好に定義された３次元構造に折り畳まれ、そして高い親和性および特異性でそれらの標的に結合する。（Ellington AD and Szostak JW (1990) Nature 346:818-822；Brody EN and Gold L (2000) J. Biotechnol. 74:5-13；Mayer G and Jenne A (2004) BioDrugs 18:351-359）。オリゴヌクレオチドリガンドは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得、そして広範な標的分子クラスに結合することができる。
【００４３】
上記の足場構造のいずれかの変異体のプールから第１の態様に従う親和性リガンドを選択するために、多くの選択プラットホームが、好適な標的タンパク質に対する新規の特異的なリガンドの単離に利用可能である。選択プラットホームとして、ファージディスプレイ（Smith GP (1985） Science 228:1315-1317）、リボソームディスプレイ（Hanes J and Plueckthun A (1997） Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4937-4942）、酵母ツーハイブリッドシステム（Fields S and Song O (1989） Nature 340:245-246）、酵母ディスプレイ（Gai SA and Wittrup KD (2007） Curr Opin Struct Biol 17:467-473）、ｍＲＮＡディスプレイ（Roberts RW and Szostak JW (1997） Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:12297-12302）、細菌ディスプレイ（Daugherty PS (2007) Curr Opin Struct Biol 17:474-480、Kronqvist N et al. (2008) Protein Eng Des Sel 1-9、Harvey BR et al. (2004) PNAS 101(25):913-9198）、マイクロビーズディスプレイ（Nord O et al. (2003） J Biotechnol 106:1-13、WO01/05808）、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（Tuerk C and Gold L (1990) Science 249:505-510）およびタンパク質フラグメント相補性アッセイ（ＰＣＡ）（Remy I and Michnick SW (1999） Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:5394-5399）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
それ故、第１の態様の実施形態では、親和性リガンドは、上記で列挙したタンパク質足場のうちのいずれかから誘導された非免疫グロブリン親和性リガンドであってもよく、またはオリゴヌクレオチド分子であってもよい。
【００４５】
親和性リガンドは、様々な分析、アッセイ、方法および設定に使用するために標識してもよい。第１の態様に従う標識された親和性リガンドの実施形態については、第３および４の態様に関連して以下に考察する。
【００４６】
第１の態様に従うリガンドは、インビボでの画像のようなインビボ診断に使用され得る。
【００４７】
本発明者らは、Ｓ状結腸における標的タンパク質発現が大腸癌の予後の確立に特に関連することを認識した。それ故、親和性リガンドは、標的タンパク質の発現を検出するのにインビボで使用され得る（以下の定義を参照のこと）。
【００４８】
それ故、第１の態様の実施形態では、親和性リガンドは、例えば、大腸癌を有する哺乳動物被験体の予後を確立するために、標的タンパク質の発現を検出するためのインビボ方法（以下の定義を参照のこと）に使用され得る。
【００４９】
インビボでの実施形態では、親和性リガンドは、例えば、即ち、放射性同位元素のような検出可能な標識で標識された画像を可能にするために標識され得る。抗体のような親和性リガンドを標識するための適切な標識は、当業者に周知である。大腸癌を有する哺乳動物被験体の予後を確立するためのインビボ方法は、例えば、インビボでの腫瘍における標的タンパク質の発現を示し得、次いで、処置決定の基礎を形成し得る。
【００５０】
本明細書に示すように、第１の態様に従う親和性リガンドは、大腸癌を有する被験体の予後の確立に関連する様々なアプリケーションを有し得る。結果的に、本開示物の第２の態様として、予後作用剤として第１の態様に従う親和性リガンドの使用が提供される。
【００５１】
本開示物に関して、「予後作用剤」は、予後の確立において価値のある少なくとも１つの特性を指す。例えば、「予後作用剤」は、マーカータンパク質のような予後マーカーとの選択的相互作用が可能であり得る。
【００５２】
さらに、本開示物に関して、「予後マーカー」は、存在することで予後の確立において価値を有する何らかの材料を指す。例えば、予後マーカーは、以下に定義するような標的タンパク質であってもよい。
【００５３】
第２の態様の実施形態では、使用は、大腸癌のような癌を有する哺乳動物被験体の予後を確立するためのものであってもよい。
【００５４】
本開示物の第３の態様として、以下の工程を含む、大腸癌を有する哺乳動物被験体の予後が対照予後より不良であるかもしくはそれに匹敵するかどうかを決定するための方法が提供される：
ａ）前記被験体からより早期に得られたサンプルを提供する工程；
ｂ）第１の態様に従う親和性リガンドを使用して、前記サンプルの少なくとも一部に存在する標的タンパク質の量を評価し、そして前記評価された量に対応するサンプル値を決定する工程；
ｃ）工程ｄ）において得られた前記サンプル値と前記対照予後に関連する対照値とを比較する工程；ならびに
前記サンプル値が前記対照値以下である場合、
ｄ）前記被験体の前記予後は、前記対照予後より不良であるかもしくはそれに匹敵すると結論付ける工程。
【００５５】
本開示物の態様１〜７に関して、「標的タンパク質」は、配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質を指す。ＳＡＴＢ１タンパク質およびＳＡＴＢ２タンパク質は、配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質の例である。実施形態では、標的タンパク質は、配列番号１を含むＳＡＴＢ２であってもよい。
【００５６】
第３の態様の第１の構成に従えば、以下の工程を含む、大腸癌を有する哺乳動物被験体の予後を決定するための方法が提供される：
ａ）前記被験体からより早期に得られたサンプルを提供する工程；
ｂ）第１の態様に従う親和性リガンドを使用して、前記サンプルの少なくとも一部に存在する標的タンパク質の量を評価し、そして前記評価された量に対応するサンプル値を決定する工程；
ｃ）工程ｄ）において得られた前記サンプル値と対照予後に関連する対照値とを比較する工程；ならびに
前記サンプル値が前記対照値以下である場合、
ｄ）前記被験体の前記予後は、前記対照予後より不良であるかもしくはそれに匹敵すると結論付ける工程。
【００５７】
実施形態では、上記の方法のいずれか１つは、更なる工程を含み得る：
サンプル値が対照値より高い場合、
ｅ）被験体の予後は、対照予後より良好であると結論付ける工程。
【００５８】
第３の態様の第２の構成に従えば、大腸癌を有する哺乳動物被験体の予後が対照予後より不良であるかもしくはそれに匹敵するかどうか、または予後が前記対照予後より良好であるかどうかを決定するための方法が提供され、前記方法は以下の工程を含む：
ａ）前記被験体からより早期に得られたサンプルを提供する工程；
ｂ）第１の態様に従う親和性リガンドを使用して、前記サンプルの少なくとも一部に存在する標的タンパク質の量を評価し、そして前記評価された量に対応するサンプル値を決定する工程；
ｃ）工程ｄ）において得られた前記サンプル値と対照予後に関連する対照値とを比較する工程；ならびに
前記サンプル値が前記対照値以下である場合、
ｄ１）前記被験体の予後は、前記対照予後に匹敵するかもしくはそれより不良であると結論付ける工程、または
前記サンプル値が前記対照値より高い場合、
ｄ２）前記被験体の前記予後は、前記対照予後より良好であると結論付ける工程。
【００５９】
しかし、同じ概念に密接に関連および包含される第３の態様の第２の構成のｄ１）およびｄ２）は、２つの別の結論への選択肢を提供する。従って、第３の態様の第２の構成の方法は、前記被験体の予後が前記対照予後に匹敵するかもしくはそれより不良であるかという問題、または前記被験体の予後が前記対照予後より良好であるかどうかという問題に答え得る。しかし、第３の態様の第２の構成の方法は、適合条件（語句「〜である場合」の部分）を随伴する工程ｄ１）、および適合条件（語句「〜である場合」の部分）を随伴する工程ｄ２）の両方を含んでもよいが、必ずしも含む必要はない。
【００６０】
結果的に、第３の態様は、第１の態様に従う親和性リガンドの使用、即ち、本開示物のエピトープの認識に限定される。例えば、第３の態様は、侵攻性の形態の大腸癌の同定のためのツールを提供し得、次いで、侵攻性の形態の大腸癌を早期に同定することは、医師が、適切な治療計画を選択するのに役立つため、極めて重要である。また、早期のステージにおいてそれほど侵攻性ではない形態を同定することによって、過度の治療を回避することができる。
【００６１】
本開示物では、様々な予後に対応する異なるタンパク質の発現の値（サンプル値）を提示する。典型的に、低いサンプル値は、高いサンプル値より不良な予後に関連する。上記の方法では、サンプル値を対照値と比較し、そしてサンプル値が対照値以下である場合、被験体の予後は対照値に関連する対照予後に匹敵するかもしくはそれより不良であると結論付けられる。
【００６２】
結果的に、上記の方法は、対照値に応用することができる。そのような場合、所定の環境下で関連すると考えられる所与のサンプル値から開始して、所与のサンプル値以上の対照値を選択することができる。続いて、その対照値に関連する対照予後を確立することができる。本開示物を指針として、当業者は、所与の対照値に対応する対照予後を確立する仕方について理解している。例えば、タンパク質発現値と癌患者のグループにおける生存率のデータとの間の関係を、下記の実施例、セクション４にあるように調べてもよく、そして本明細書に記載の手順を、所与の対照値に応用してもよい。次いで、所与の対照値に対応する予後を、対照予後として選択してもよい。
【００６３】
また、上記の方法は、所与の対照予後に応用することができる。そのような場合、所定の環境下で関連すると考えられる所与の対照予後から開始して、例えば、適切な治療を選択するために、対応する対照値を確立することができる。本開示物を指針として、当業者は、所与の対照予後に対応する対照値を確立する仕方について理解している。例えば、サンプル値と癌患者のグループにおける生存率のデータとの間の関係を、下記の実施例、セクション４にあるように調べてもよいが、但し、本明細書に記載の手順を適用して、所与の対照予後に対応する対照値を確立する。例えば、所与の対照予後と相関する対照値が見出されるまで、異なる対照値を試験してもよい。例えば、本開示物は、適切な開始値を提示して、試験の必要量を減少することができるため、当業者は、過度の負担を伴わずに、そのような試験を行うことができる。
【００６４】
従って、上記の態様の方法の実施形態では、対照予後は、例えば、同じ被験体または被験体の集団の検査によって得られる予め確立された予後に基づき得る。また、対照予後は、一般集団におけるバックグランドの危険率、統計的予後／危険率または被験体の検査に基づく仮定に応用することができる。そのような試験では、被験体の年齢、全身状態、性別、人種および／または医学的状態および既往歴、例えば、癌の既往歴または大腸癌の状態を考慮してもよい。例えば、医師は、対照予後を、被験体の癌の既往歴、腫瘍の分類、腫瘍の形態学、腫瘍の位置、転移の存在および広がりならびに／あるいは更なる癌の特徴に応用することができる。
【００６５】
第３の態様の第３の構成に従えば、大腸癌を有する哺乳動物被験体の予後を確立するための方法が提供される：
ａ）被験体由来のサンプルを提供する工程；
ｂ）第１の態様に従う親和性リガンドを使用して、前記サンプルの少なくとも一部に存在する標的タンパク質の量を評価し、そして前記評価された量に対応するサンプル値を決定する工程；
ｃ）工程ｂ）のサンプル値を、被験体の予後に相関させる工程。
【００６６】
本開示物に関して、「予後を確立すること」とは、特定の予後または予後の期間を確立することを指す。
【００６７】
上記の方法の実施形態では、サンプルは、早期に得られたサンプルであってもよい。
【００６８】
工程ｃ）の相関させる工程は、被験体の予後を確立するように、生存率のデータを、得られたサンプル値に関連付ける任意の方法を指す。
【００６９】
第１の態様に従う親和性リガンドの結合活性と大腸癌予後との間の同定された相関はまた、処置決定のための基礎を形成し得る。例えば、そのような相関に基づく方法は、相関に基づかなければ考慮しなかったであろう処置レジメンを示唆し得る。それ故、本開示物の第４の態様に従えば、以下の工程を含む、処置を必要とする被験体の処置の方法が提供され、ここで、被験体は大腸癌を有している：
ａ）前記被験体由来のサンプルを提供する工程；
ｂ）第１の態様に従う親和性リガンドを使用して、前記サンプルの少なくとも一部に存在する標的タンパク質の量を評価し、そして前記評価された量に対応するサンプル値を決定する工程；
ｃ）工程ｂ）において得られた前記サンプル値と対照値とを比較する工程；および
前記サンプル値が前記対照値以下である場合、
ｄ）アジュバント大腸癌処置レジメンにより前記被験体を処置する工程。
【００７０】
第２の態様の一実施形態では、方法は、以下の更なる工程を含み得る：
および、前記サンプル値が前記対照値より高い場合、
ｄ）アジュバント大腸癌処置レジメンにより前記被験体を処置する工程。
【００７１】
第４の態様の１つの実施形態では、工程ｃ）の対照値は対照予後に関連し得、そして工程ｄ）の前記大腸癌処置レジメンは、対照予後より不良であるかもしくはそれに匹敵する予後に応用され得る。そのような実施形態では、方法は、次の更なる工程を含み得る：ｅ）および前記サンプル値が対照値より高い場合、前記被験体を、対照予後より良好である予後に応用させる処置レジメンで治療する工程。
【００７２】
例えば、第２の態様の処置レジメンは、化学療法、術前アジュバント療法およびそれらの組み合わせから選択することができる。
【００７３】
それ故、処置レジメンは、術前アジュバント療法であってもよい。そのような術前アジュバント療法は、放射線療法のみまたは化学療法と組み合わされた放射線療法からなり得る。
【００７４】
一般に、大腸癌を有する患者に適切な治療計画を決定する場合、処置を担当する医師は、免疫組織化学的評価の結果、患者の年齢、全身状態、腫瘍のステージ、血管侵襲および分化度のようないくつかのパラメータを考慮することができる。そのような決定において指針とするために、医師は、上記で提示した方法態様のいずれかの実施形態に従って、試験を実施するか、または試験の実施を指令することができる。
【００７５】
本開示物に関して、「予後」は、疾患の経過もしくは結果の予測およびその処置または疾患を患う被験体の生存率を指す。例えば、予後は、疾患からの生存または回復の可能性の決定、ならびに被験体の予想される生存期間の予測を指し得る。それはまた、疾患の再発、例えば、局部、局所または遠位での事象の可能性でもあり得る。さらに、予後は、３年間、５年間、１０年間、１５年間または他の任意の期間のような将来に至るある期間中の被験体の生存の可能性を確立することに関与し得る。結果的に、被験体の予後は、例えば、認識された生存測定値である「全生存率」のような生存の確率であってもよい。
【００７６】
予後および対照予後に関与する上記の方法では、これらの２つの予後は、同じタイプの予後である。例として、対照予後が全生存率の対照確率である場合、結論は、対照確率全生存率（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｏｖｅｒ−ａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）に関係する被験体の全生存率の確率であると言える。
【００７７】
それ故、第３および適用可能であれば第４の態様の方法の実施形態では、予後は、生存の確率であってもよく、これは、被験体の予後が生存の確率であり、そして対照予後が生存の確率であることを伴う。例えば、生存の確率は、５年生存、１０年生存または１５年生存の確率であってもよい。
【００７８】
さらに、本開示物に関して、「大腸癌を有する哺乳動物被験体」は、原発性もしくは続発性大腸腫瘍を有する哺乳動物被験体、あるいは結腸および／または直腸から腫瘍が摘出された哺乳動物被験体を指し、ここで、腫瘍の摘出は、任意の適切なタイプの手術または治療によって腫瘍を殺すか、もしくは摘出することを指す。例えば、被験体から腫瘍が摘出されていた場合、腫瘍は摘出されてから、５年未満、例えば、１年または６箇月未満である可能性がある。本開示物の方法および使用態様では、「大腸癌を有する哺乳動物被験体」はまた、哺乳動物被験体が、この使用または方法の実施時に大腸癌を有することが疑われており、そして後に大腸癌診断が確定される場合を含む。
【００７９】
本開示物の方法態様に関して、「早期に得られた」は、方法が実施される前に得られたことを指す。結果的に、被験体から早期に得られたサンプルが、ある方法で提供される場合、方法は、サンプルを被験体から得る工程を必要としない、即ち、サンプルは、この方法とは個別の工程で被験体から予め得られた。
【００８０】
従って、本開示物のすべての方法および使用は、全体をインビトロで実施することができる。
【００８１】
本開示物の上記の方法態様の工程ｂ）は、サンプルの少なくとも一部に存在するタンパク質の量を評価し、そして対応するサンプル値を決定することを必要とする。「サンプルの少なくとも一部」は、予後を確立するか、または適切な処置に関する結論を導き出すためのサンプルの関連する部分を指す。当業者は、方法を実施する場合に存在する状況下で関連する部分について理解している。例えば、サンプルが腫瘍および非腫瘍細胞を含む場合、当業者は、サンプルの腫瘍細胞のみ、および腫瘍細胞の核のみを考慮すればよい。
【００８２】
さらに、工程ｂ）では、量を評価し、そして量に対応するサンプル値を決定する。結果的に、サンプル値を得るために、タンパク質の量の正確な測定値は必要ではない。例えば、タンパク質の量は、染色された組織サンプルの目視検査によって評価してもよく、次いで、サンプル値は、評価された量に基づいて、例えば、高いかまたは低いかに分類してもよい。当業者は、そのような評価および決定を実施するための仕方を理解している。
【００８３】
また、上記の態様に従う方法の工程ｂ）に関して、タンパク質の量が増加すると、典型的に、サンプル値も増加する。しかし、いくつかの実施形態では、評価された量は、予め決定した数の個別のサンプル値のいずれかに対応し得る。そのような実施形態では、第１の量および第２の増加した量は、同じサンプル値に対応し得る。いずれにせよ、上記の態様に従う方法に関して、タンパク質の量が増加しても、サンプル値は減少しない。
【００８４】
しかし、不便ではあるが、等価な様式では、工程ｃ）とｄ）との間の定性化が「サンプル値が対照値以上である場合」に行われる場合、評価される量は、サンプル値に反比例するかもしれない。
【００８５】
なおさらに、本開示物に関して、「対照値」は、被験体の予後もしくは処置に関して、決定を行うこと、または結論を導き出すことに関連する予め決定された値を指す。
【００８６】
また、本開示物に関して、対照値に「関連」する対照予後は、エンピリカルデータおよび／または臨床的に意味のある仮定に基づいて対照予後に割り当てられている参照値を指す。例えば、第３の態様の方法の工程ｃ）、および第４の態様の所定の実施形態を参照のこと。対照値は、対照値を示す被験体のグループの予後データから直接誘導される対照予後に割り当てる必要はない。対照予後は、例えば、対照値以下の値を示す被験体の予後に対応してもよい。即ち、対照値が０〜３の尺度で１である場合、対照予後は、０または１の値を示す被験体の予後であってもよい。結果的に、対照予後はまた、入手可能なデータの性質に応用することができる。上記でさらに考察したように、対照予後は、他のパラメータにも適用することができる。
【００８７】
前記サンプル値を得るための工程ｂ）における評価には、様々な条件を使用することができる。態様３および４の方法の実施形態では、工程ｂ）は、前記サンプル中のタンパク質に対する前記親和性リガンドの結合を可能にする条件下で前記親和性リガンドを前記サンプルに応用することを含み得、そして前記評価した量は、前記サンプルの前記少なくとも一部に関連する前記親和性リガンドの量を評価することによって、得られる。ここで、「関連」は、親和性リガンドと成分、例えば、サンプル中のタンパク質との間の特異的および／または選択的相互作用を指す。
【００８８】
態様３および４の方法の実施形態では、工程ｂ）は、以下の工程を含み得る：
ｂ１）前記サンプル中のタンパク質に対する前記親和性リガンドの結合を可能にする前記条件において、前記親和性リガンドを前記サンプルに応用する工程；
ｂ２）前記サンプルから非結合親和性リガンドを取り出す工程；および
ｂ３）前記サンプルの前記少なくとも一部に関連して残留している親和性リガンドの量を評価して、前記評価した量を入手する工程。
【００８９】
ここで、「サンプルとの関連において残留する親和性リガンド」は、工程ｂ２）において取り出されなかった親和性リガンド、例えば、サンプルに結合した親和性リガンドを指す。結合は、例えば、抗体とサンプル中に存在する抗原との間の特異的および／または選択的相互作用であってもよい。さらに、そのような実施形態では、工程ｂ２）は、洗浄緩衝液による洗浄であってもよい。洗浄緩衝液の例は、当業者に周知である。また、そのような実施形態におけるサンプルは、組織サンプルであってもよく、そしてそのような場合、工程ｂ１）〜ｂ３）は、染色手順に反映する。例えば、そのような手順における洗浄は、当該技術分野内において標準的な操作である。
【００９０】
態様３および４の方法のいくつかの実施形態では、親和性リガンドは、検出可能および／または定量可能であり得る。そのような親和性リガンドの検出および／または定量化は、生物学的相互作用に基づくアッセイにおいて結合試薬の検出および／または定量化について当業者に公知の任意の方法で達成することができる。それ故、上記の任意の親和性リガンドを、定量的または定性的に使用して、標的タンパク質の存在を検出することができる。これらの「１次」親和性リガンドは、それら自体が、様々なマーカーによって標識され得、あるいは次いで、２次標識親和性リガンドによって検出されて、検出、可視化および／または定量化を可能にし得る。これは、当業者に公知であり、そして過度の実験に関係しない多数の技術のいずれか１つ以上を使用して、標的タンパク質との相互作用が可能な親和性リガンドまたは任意の２次親和性リガンドにコンジュゲートすることができる多数の標識のいずれか１つ以上を使用して、達成することができる。
【００９１】
１次および／または２次親和性リガンドにコンジュゲートすることができる標識の非制限的例として、蛍光染料または金属（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フルオレスカミン）、発色団染料（例えば、ロドプシン）、化学発光化合物（例えば、ルミナール、イミダゾール）および生物発光タンパク質（例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ）、ハプテン（例えば、ビオチン）が挙げられる。多様な他の有用な蛍光物質および発色団については、Stryer L (1968） Science 162:526-533およびBrand L and Gohlke JR (1972） Annu. Rev. Biochem. 41:843-868に記載されている。親和性リガンドは、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ラクタマーゼ）、放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉ）および粒子（例えば、金）で標識することができる。本開示物に関して、「粒子」は、分子を標識するのに適切な粒子、例えば、金属粒子を指す。さらに、親和性リガンドはまた、蛍光半導体ナノ結晶（量子ドット）で標識することができる。量子ドットは、より優れた量子収量を有し、そして有機蛍光団と比較してより光安定性であり、従って、より容易に検出される（Chan et al. (2002） Curr Opi Biotech. 13: 40-46）。様々な化学、例えば、アミン反応またはチオール反応を使用して、異なるタイプの標識を、親和性リガンドにコンジュゲートすることができる。しかし、アミンおよびチオール以外の他の反応基、例えば、アルデヒド、カルボン酸およびグルタミンを使用することもできる。
【００９２】
本開示物の方法態様は、いくらかの既知の形式および設定のいずれかで利用することができ、その非制限的選択について以下で考察する。
【００９３】
組織学に基づく設定では、その標的タンパク質に結合した標識親和性リガンドの検出、局在および／または定量化は、可視化技術、例えば、光学顕微鏡または免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ）顕微鏡に関係し得る。他の方法は、フローサイトメトリーまたはルミノメトリーを介する検出に関係し得る。
【００９４】
例えば、被験体から取り出した大腸組織由来の腫瘍組織サンプル（生検）のような生物学的サンプルは、標的タンパク質の検出および／または定量化に使用することができる。生検のような生物学的サンプルは、早期に得られたサンプルであってもよい。ある方法において早期に得られたサンプルを使用する場合、ヒトまたは動物身体に対して実践される方法の工程はない。親和性リガンドを、標的タンパク質の検出および／または定量化のために、生物学的サンプルに適用してもよい。この手順は、標的タンパク質の検出を可能にするではなく、加えて、その発現の分布および相対的レベルを示すことができる。
【００９５】
親和性リガンド上の標識の可視化の方法として、フルオロメトリー、ルミノメトリーおよび／または酵素的技術を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光は、蛍光標識を特定の波長の光に暴露し、その後、特定の波長領域において放射された光を検出および／または定量することによって、検出および／または定量される。発光タグ化親和性リガンドの存在は、化学反応中に発生する発光によって、検出および／または定量することができる。酵素反応の検出は、化学反応から生じるサンプルの色のシフトによるものである。当業者は、適切な検出および／または定量化のために、異なる多様なプロトコルを改変することができることを知っている。
【００９６】
態様３および４の方法の実施形態では、生物学的サンプルを、ニトロセルロースもしくは適用される生物学的サンプルに存在する標的タンパク質を固定化することが可能な他の任意の固相支持体マトリックスのような固相支持体またはキャリアに固定化することができる。本発明において有用ないくつかの周知の固体状態支持材料として、ガラス、炭水化物（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、ナイロン、プラスチック、ウール、ポリスチレン、ポリエテン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｎｅ）、ポリプロピレン、デキストラン、アミラーゼ、フィルム、樹脂、セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、アルミナ、ガブロおよびマグネタイトが挙げられる。生物学的サンプルの固定化後、第１の態様に従う１次親和性リガンドは、例えば、本開示物の実施例、セクション４または５に記載のように適用することができる。１次親和性リガンドがそれ自体で標識されない場合、支持マトリックスを、当該分野において公知の１つ以上の適切な緩衝液で洗浄することができ、続いて、２次標識親和性リガンドに暴露し、もう１回、緩衝液で洗浄して、結合していない親和性リガンドを取り出すことができる。その後、従来の方法で、選択的親和性リガンドを検出および／または定量することができる。親和性リガンドの結合特性は、固体状態支持体によって変動し得るが、当業者は、日常的な実験によって、それぞれの決定のための作動条件および至適アッセイ条件を決定することが可能であるべきである。
【００９７】
結果的に、態様３および４の方法の実施形態では、ｂ１）において適用される親和性リガンド（１次親和性リガンド）は、定量可能な親和性リガンドを認識することが可能な２次親和性リガンドを使用して検出することができる。それ故、ｂ３）の定量化は、１次親和性リガンドに対して親和性を有する２次親和性リガンドによって行うことができる。例として、２次親和性リガンドは、抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体であり得る。
【００９８】
例として、標的タンパク質の検出および／または定量化の１つの利用可能な方法は、後に酵素イムノアッセイ（例えば、ＥＩＡもしくはＥＬＩＳＡ）で検出および／または定量することができる酵素に第１の態様に従う親和性リガンドを連結させることによる。そのような技術は、良好に確立されており、そしてそれらは、当業者にとって過度の困難を伴わずに実現される。そのような方法では、生物学的サンプルは、固体材料、または親和性リガンドにコンジュゲートされた固体材料と接触され、次いで、酵素標識された２次親和性リガンドで検出および／または定量される。この後、適切な基質を、酵素標識を伴う適切な緩衝液と反応させて、例えば、分光光度計、蛍光光度計、発光測定装置を使用して、または目視手段によって、検出および／または定量される化学部分を生成させる。
【００９９】
上記で述べたように、１次および２次親和性リガンドは、検出および／または定量化を可能にする放射性同位元素で標識することができる。本開示物における適切な放射性標識の非制限的例は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉである。標識された親和性リガンドの比活性は、放射性標識の半減期、同位体の純度、および標識がどのようにして親和性リガンドに組み入れられたかに依存する。親和性リガンドは、好ましくは、周知の技術（Wensel TG and Meares CF (1983） in: Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy (Burchiel SW and Rhodes BA eds.） Elsevier, New York, pp 185-196）を使用して標識される。そのような放射性標識された親和性リガンドを使用して、インビボまたはインビトロでの放射能の検出により、標的タンパク質を可視化することができる。例えば、γカメラ、磁気共鳴分光法または放射トモグラフィーによる放射性核種スキャニングは、インビボおよびインビトロでの検出に機能し、γ／βカウンター、シンチレーションカウンターおよびラジオグラフィーもまた、インビトロで使用される。
【０１００】
態様３および４の方法の実施形態では、被験体は、異なる形態および／またはステージの大腸癌を有し得る。
【０１０１】
これらの態様のいくつかの実施形態では、問題の大腸癌は、リンパ節転移陰性の大腸癌、即ち、リンパ節転移のステージにまで進行していない大腸癌である。他の類似の実施形態では、問題の大腸癌は、Ｄｕｋｅｓ分類ＡまたはＢのいずれか一方であると特徴付けられる。なお他の実施形態では、問題の大腸癌は、大腸腺腫または大腸癌腫である。これらの実施形態では、被験体が低い標的タンパク質発現を示すことを決定する工程は、疾患の将来の進行の予後の値が大きくあり得、それ故、将来の疾患管理に関する十分な情報に基づいた決定の基礎を形成する。そのような比較的早期のステージの疾患を患う被験体のグループのうち、低い標的タンパク質発現を伴う被験体は、おそらく、より侵攻性の疾患を生じる危険性が比較的高い。従って、リンパ節転移陰性大腸癌またはＤｕｋｅｓ分類ＡもしくはＢの大腸癌を有する被験体の中での低い標的タンパク質発現は、これらの被験体を、より厳密にモニターすべきであり、および／または低い標的タンパク質発現を示さない被験体とは異なる処置を行うべきであることを示し得る。従って、本発明に従う方法は、第１の態様に従う親和性リガンドを使用する方法によって更なる予後情報を与え、このため、そのような被験体に一定期間にわたる生存へのより大きな機会および／またはより長い生存期間の可能性を付与する。Ｄｕｋｅｓ分類Ａの大腸癌を有する被験体は、従来、アジュバント化学療法による処置を受けない。しかし、本開示物の教示内容を指針として、医師は、標的タンパク質発現の低い、または不在の被験体にそのようなアジュバント化学療法を施すように決定することができる。
【０１０２】
結果的に、態様３および４の方法の実施形態では、大腸癌はＤｕｋｅｓ分類Ａである。代替的または相補的実施形態では、前記大腸癌は、上記のＴＮＭ分類に従えば、Ｔ１〜２、Ｎ０およびＭ０である。
【０１０３】
さらに、本明細書に示すように、標的タンパク質発現解析は、Ｄｕｋｅｓ分類ＣまたはＤの大腸癌を有する被験体の予後を確立することに関連する（図１Ｂ、２Ｂ、３Ｂおよび４Ｂを参照のこと）。そのような進行期の大腸癌を有する被験体は、重度の副作用を有するレジメンで頻繁に処置されている。例として、そのような被験体の標的タンパク質が、比較的高発現であると診断される場合、その被験体らには、副作用の頻度がより低いかまたは重度が低い、それ程広範ではない処置が施され得る。
【０１０４】
態様３および４の方法の実施形態では、サンプルは、体液サンプルであってもよい。例えば、体液サンプルは、血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、精液および滲出物からなる群から選択されていてもよい。あるいは、サンプルは、細胞学的サンプルであってもよく、または糞便サンプルであってもよい。
【０１０５】
態様３および４の方法の更なる実施形態では、サンプルは、大腸組織サンプル、例えば、結腸または直腸から誘導されるサンプルのような組織サンプルであってもよい。例えば、組織サンプルは、Ｓ状結腸から誘導され得る。本発明者らは、結腸／直腸のこの部分における標的タンパク質発現が大腸癌の予後の確立に特に関連することを認識した。当該技術分野において、Ｓ状結腸はまた、時々、骨盤結腸（ｐｅｌｖｉｃ  ｃｏｌｏｎ）またはＳ字状屈曲部とも称される。
【０１０６】
態様３および４の方法の相補的実施形態では、サンプルは、腫瘍組織サンプルであってもよい。
【０１０７】
態様３および４の方法の実施形態では、サンプルは、前記被験体由来の腺細胞を含み得る。結果的に、組織サンプルに加えて、例えば、糞便サンプルまたは血液サンプルもまた、第１の態様に従う親和性リガンドを使用して、標的タンパク質の発現を評価することができるような細胞を含み得る。
【０１０８】
本発明者らは、標的タンパク質が、関連する細胞の核において発現されることを見出した。結果的に、サンプル中の標的タンパク質発現の評価は、サンプル、例えば、大腸癌の外科的切除によって早期に得られた腫瘍組織生検材料または標本中に存在する腫瘍細胞における核発現に限定され得る。例として、上記の方法の工程ｂ）の評価は、上皮細胞、例えば、前記サンプルの腺細胞を起源とする腫瘍細胞のような腫瘍細胞の核における標的タンパク質の量を評価する工程に限定され得る。評価を核に限定する場合、親和性リガンドと核との相互作用のような特徴のみが、評価において考慮される。そのような評価は、例えば、免疫組織化学染色であってもよい。さらに、本発明者らは、標的タンパク質の核での発現が、予後に関連し得ることを見出した。
【０１０９】
対照値より高い標的タンパク質のサンプル値、またはそのようなサンプル値が得られる被験体を、時々、本明細書において「標的タンパク質が高い」と称する。さらに、対照値以下の標的タンパク質のサンプル値、またはそのようなサンプル値が得られる被験体を、時々、本明細書において「標的タンパク質が低い」と称する。
【０１１０】
本開示物に関して、用語「サンプル値」および「対照値」は、広範に解釈すべきである。これらの値を得るための標的タンパク質の定量化は、第１の態様に従う抗体が用いられる限り、自動化手段を介するか、サンプルの目視もしくは顕微鏡検査に基づく評価システムを介するか、またはそれらの組み合わせを介して行うことができる。しかしまた、組織病理学の当業者のような熟練者は、例えば、問題の親和性リガンド使用して、標的タンパク質発現に対して染色されている組織スライドの検査だけで、サンプル値および対照値を決定することが可能である。それ故、対照値より高いサンプル値の決定は、目視または顕微鏡検査時に、サンプル組織スライドがより濃染されている、および／または対照組織スライドの場合、より大きな画分の染色細胞を示している、という決定に対応し得る。サンプル値はまた、文言で記載された対照値のような文字の参照によって示された対照値と比較してもよい。結果的に、サンプル値および／または対照値は、検査および比較時に当業者が決定する心証に基づく値として考えられ得る。
【０１１１】
例えば、当業者は、サンプルを標的タンパク質が高いまたは低いとして分類してもよく、ここで、サンプルが、先に検査した対照サンプルより多くの標的タンパク質を含有する場合、サンプルは高いに分類され、そしてサンプルが対照サンプル以下である場合、低いに分類される。そのような評価は、サンプル、および必要であれば、第１の態様に従う抗体を含む染色溶液で対照サンプルを染色することによって、補助され得る。
【０１１２】
大腸癌を有する被験体の予後の提供のため、または被験体由来のサンプル値との比較として使用するためのそのような被験体に関する処置の決定を行うために関連することが見出されている対照値は、様々な方法で提供することができる。当業者は、本開示物の教示内容の知識を用いて、過度の負担を伴うことなく、態様３および４の方法を実施するための関連する対照値を提供することができる。
【０１１３】
態様３および４の方法を実施する者は、例えば、対照値を所望の予後情報に応用してもよい。例えば、対照値を応用して、重要な予後情報、例えば、高い生存率曲線と低い生存率曲線との間の最も大きな隔たりを得ることができる（図を参照のこと）。
【０１１４】
あるいは、対照値を適用して、予め決定された予後を有する被験体のグループ、例えば、予め決定された百分率より低い５年全生存率の確率を有する被験体のグループを同定してもよい。
【０１１５】
態様３および４の方法の実施形態では、対照値は、方法の被験体の健康な乳腺または間質組織のような健康な組織における標的タンパク質発現の量に対応し得る。もう１つの例として、対照値は、比較可能な他の被験体由来の正常組織の標準サンプルにおいて測定した標的タンパク質発現の量によって提供され得る。もう１つの例として、対照値は、腫瘍組織、例えば、大腸癌の対照サンプルのような腫瘍細胞を含む対照サンプルにおいて測定した標的タンパク質発現の量によって提供され得る。対照サンプルの標的タンパク質発現の量は、好ましくは、予め確立され得る。結果的に、対照値は、予め決定された量の標的タンパク質を発現する細胞を含む対照サンプルにおいて測定した標的タンパク質の量によって提供され得る。
【０１１６】
さらに、対照値は、例えば、予め決定されたか、または制御された量の標的タンパク質を発現する癌細胞系統のような細胞系統を含む対照サンプルにおいて測定した標的タンパク質発現の量によって提供され得る。当業者は、例えば、Rhodes et al. (2006) The biomedical scientist, p 515-520の開示内容を指針として、そのような細胞系統を提供する仕方について理解している。
【０１１７】
結果的に、態様３および４の方法の実施形態では、対照値は、対照サンプルにおける標的タンパク質発現の量に対応する予め決定された値であってもよい。
【０１１８】
しかし、さらに以下において考察されるように、対照サンプル中の標的タンパク質の量は、必ずしも対照値に直接対応する必要はない。対照サンプルはまた、方法の実施者が様々な対照値を評価するのを援助する標的タンパク質の量を提供し得る。例えば、対照サンプルは、「陽性」（高い）および／または「陰性」（低い）を提供することによって、対照値の心的イメージを作成するのに役立ち得る。
【０１１９】
本発明者らは、本明細書において、大腸癌を患い、そして標的タンパク質発現を本質的に有さない被験体が、一般的に比較的不良な予後を有することを示している（例えば、図１を参照のこと）。それ故、態様３および４の方法の実施形態では、工程ｂ）のサンプル値は、検出可能な標的タンパク質がサンプルに認められたことに対応する１、または検出可能な標的タンパク質がサンプルに認められないことに対応する０のいずれかであり得る。結果的に、そのような実施形態では、サンプルの評価はデジタルである：標的タンパク質は、存在するかまたは存在しないかのいずれかとみなされる。本開示物に関して、「検出可能な標的タンパク質が認められない」は、通常の操作状況中に、態様３および４のいずれか１つに従って方法を操作する人または装置による検出が可能ではないほどに少ない標的タンパク質の量を指す。「通常の操作状況」とは、当業者が本発明を実施するのに適切であることを見出す検査方法および技術を指す。
【０１２０】
従って、態様３および４の方法の実施形態では、工程ｃ）の対照値は、０であってもよい。そして、態様３および４の方法の更なる実施形態では、当然、工程ｃ）の対照値は、検出可能な標的タンパク質が認められない対照サンプルに対応し得ることになる。これは、対照値が、標的タンパク質を含まない対照サンプルの分析によって得ることができることを意味する。
【０１２１】
被験体からより早期に得られたサンプルまたは対照サンプルのようなサンプルにおける標的タンパク質発現の定量化のための１つの別法は、所定のレベルを超える標的タンパク質発現を示すサンプルにおける細胞の画分の決定である。画分は、例えば、次のものであり得る：細胞全体の標的タンパク質発現を考慮する「細胞画分」；細胞の細胞質のみの標的タンパク質発現を考慮する「細胞質画分」；または細胞の核のみの標的タンパク質発現を考慮する「核画分」。核画分は、例えば、関連する細胞集団の＜２％、２〜２５％、＞２５〜７５％または＞７５％の免疫反応性細胞として分類することができる。代替的に、または相補物として、核画分は、≦１０％もしくは＞１０〜１００％、または≦１％もしくは＞１〜１００％として分類することができる。「核画分」は、核において陽性染色を示すサンプル中の関連する細胞の百分率に対応し、ここで、核における中等度のまたは明瞭かつ強力な免疫反応性は陽性とみなされ、そして核における認められないまたは軽度の免疫反応性は陰性とみなされる。病理学の当業者は、方法を実施する場合に存在する条件下でどの細胞が関連するかを理解しており、そして当業者の一般的知識および本開示物の教示内容に基づく核画分を決定することができる。関連する細胞は、例えば、腫瘍細胞であってもよい。さらに、当業者は、「細胞画分」または「細胞質画分」を用いて対応する測定を実施する仕方について理解している。
【０１２２】
被験体からより早期に得られたサンプルまたは対照サンプルのようなサンプルにおける標的タンパク質発現の定量化のためのもう１つの別法は、サンプルの全体的染色強度を決定することである。強度は、例えば、次のものであり得る：細胞全体の標的タンパク質発現を考慮する「細胞強度」；細胞の細胞質のみの標的タンパク質発現を考慮する「細胞質強度」；または細胞の核のみの標的タンパク質発現を考慮する「核強度」。核強度は、臨床病理組織学的診断において使用される基準に従って、主観的に評価される。核強度決定の結果は、次のように分類することができる：不在＝サンプルの関連する細胞の核において全体的な免疫反応性が認められない、弱＝サンプルの関連する細胞の核において全体的な免疫反応性が軽度である、中＝サンプルの関連する細胞の核において全体的な免疫反応性が中等度である、または強＝サンプルの関連する細胞の核において全体的な免疫反応性が明瞭かつ強力である。病理学の当業者は、方法を実施する場合に存在する条件下でどの細胞が関連するかを理解しており、そして当業者の一般的知識および本開示物の教示内容に基づく核強度を決定することができる。関連する細胞は、例えば、腫瘍細胞であってもよい。さらに、当業者は、「細胞強度」または「細胞質強度」を用いて対応する測定を実施する仕方について理解している。
【０１２３】
本発明者らは、標的タンパク質の核発現が、予後を確立するのに特に関連することを見出した。それ故、態様３および４の方法の実施形態では、対照値は、核画分、核強度またはそれらの組み合わせであってもよい。従って、サンプル値は、核画分、核強度またはそれらの組み合わせであってもよい。
【０１２４】
好ましくは、サンプル値および対照値は、両方とも、同じタイプの値である。従って、態様３および４の方法の実施形態では、サンプル値および対照値は、それぞれ、核画分、核強度またはそれらの組み合わせであってもよい。
【０１２５】
態様３および４の方法の実施形態では、工程ｄ）における結論のための基準は、標的タンパク質陽性細胞の核画分に対するサンプル値、即ち、９０％である対照値以下である、例えば、８０％以下、例えば、７０％以下、例えば、６０％以下、例えば、５０％以下、例えば、４０％以下、例えば、３５％以下、例えば、３０％以下、例えば、２５％以下、例えば、２０％以下、例えば、１５％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下、例えば、２％以下、例えば、１％以下、例えば、０％に等しい「核画分」であってもよい。
【０１２６】
上記の態様の方法の代替的または相補的な実施形態では、工程ｃ）の対照値は、９０％以下、例えば、８０％以下、例えば、７０％以下、例えば、６０％以下、例えば、５０％以下、例えば、４０％以下、例えば、３５％以下、例えば、３０％以下、例えば、２５％以下、例えば、２０％以下、例えば、１５％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下、例えば、２％以下、例えば、１％以下、例えば、０％の核画分である。
【０１２７】
さらに、態様３および４の方法の実施形態では、工程ｄ）における結論の基準は、サンプルの染色強度に対するサンプル値、即ち、中等度以下の核強度、例えば、弱以下の核強度、例えば、不在の核強度であってもよい。態様３および４の方法の代替的または相補的な実施形態では、工程ｃ）の対照値は、中等度の核強度以下の標的タンパク質発現であってもよく、例えば、弱い核強度以下の標的タンパク質発現であってもよく、例えば、標的タンパク質発現の核強度が不在であってもよい。
【０１２８】
さらに、態様３および４の方法の実施形態では、対照値は、２つの値から構成され得、ここで、工程ｄ）における結論の基準は、これらの２つの値より高いサンプル値である。
【０１２９】
あるいは、態様３および４の方法の実施形態では、対照値は、画分値と強度値、例えば、核画分値と核強度値との組み合わせであってもよい。
【０１３０】
また、態様３および４の方法の実施形態では、対照値は、核画分値および核強度値の関数であってもよい。例えば、そのような関数は、染色スコアであり得る。「染色スコア」は、以下の実施例、セクション３および表１に記載のように計算される。例えば、対照値は、０、１または２の染色スコアであってもよい。
【０１３１】
当業者は、強度値または画分値である他の対照値もまた、本発明の範囲内に当てはまることを理解している。同様に、当業者は、画分と強度との他の組み合わせもまた、本発明の範囲内に当てはまることを理解している。結果的に、対照値は、２つ、そしておそらくは、なおそれを超える基準に関係し得る。
【０１３２】
一般に、対照値としての核強度値および／または核画分値の選択は、染色手順、例えば、用いられる第１の発明に従う適用された抗体の性質および染色試薬に依存し得る。
【０１３３】
本開示物を指針として、当業者、例えば、病理学者は、細胞、細胞質もしくは核画分のような画分、または細胞、細胞質もしくは核強度のような強度をもたらす評価を実施する仕方について理解している。例えば、当業者は、所定の画分または強度の出現を確立するための予め決定された量の標的タンパク質を含む対照サンプルを使用することができる。
【０１３４】
しかし、対照サンプルは、実際の対照値を供給するためだけではなく、対照値に対応する量より高い標的タンパク質の量を伴うサンプルの例を供給するために使用することができる。例として、免疫組織化学染色のような組織化学染色では、当業者は、高量の標的タンパク質を有する染色されたサンプル、例えば、陽性対照の出現を確立するための対照サンプルを使用することができる。続いて、当業者は、対照値に対応する量の標的タンパク質を伴うサンプルの出現のような、より低量の標的タンパク質を有するサンプルの出現を評価することができる。言い換えれば、当業者は、対照サンプルを使用して、対照サンプルより低い標的タンパク質の量に対応する対照値の心的イメージを作成することができる。代替的に、または相補物として、そのような評価では、当業者は、例えば、「陰性対照」としてのそのようなサンプルの出現を確立するための低量の標的タンパク質を有するか、または標的タンパク質を本質的に含まないもう１つの対照サンプルを使用することができる。
【０１３５】
例えば、１０％の核画分の対照値を使用する場合、検出可能な標的タンパク質が認められず、それ故、０の核画分に対応する、対照値より低い第１の対照サンプルを、７５％以上の核画分に対応する標的タンパク質の量を有する、対照値より高い第２の対照サンプルと共に使用してもよい。
【０１３６】
結果的に、評価では、当業者は、高量の標的タンパク質を伴うサンプルの出現を確立するための対照サンプルを使用することができる。そのような対照サンプルは、高量の標的タンパク質を発現する組織を含むサンプル、例えば、予め確立された高発現の標的タンパク質を有する大腸腫瘍組織を含むサンプルであってもよい。
【０１３７】
従って、対照サンプルは、強い核強度（ＮＩ）の例を提供し得る。次いで、強いＮＩを伴うサンプルの出現の知識を用いて、当業者は、サンプルを次のＮＩカテゴリー、例えば、上記の不在、弱、中および強に分割することができる。この分割は、検出可能な標的タンパク質（陰性対照）を含まない対照サンプル、即ち、核強度が不在である対照サンプルによって、さらに援助され得る。また、対照サンプルは、７５％以上の核画分（ＮＦ）を伴うサンプルの例を提供し得る。次いで、７５％を超える陽性細胞を伴うサンプルの出現の知識を用いて、当業者は、例えば、より低い百分率の陽性細胞を有する他のサンプルの核画分を評価することができる。この分割は、標的タンパク質を本質的に含まない対照サンプル（陰性対照）、即ち、低いＮＦ（例えば、＜２％）、または０のＮＦを提供する対照サンプルによって、さらに援助され得る。
【０１３８】
上記のように、制御された量の標的タンパク質を発現する細胞系統は、対照、特に、陽性対照として使用することができる。
【０１３９】
上記で考察したように、第３および第４の態様の方法を、選択された対照値、例えば、上記で提示した対照値のうちの１つに応用してもよく、そしてそのような場合、対照予後は、選択された対照値の結果である。非制限的例として、＜２％の核画分（ｎｆ＜２％）を対照値として使用する場合、関連する対照予後は、「低い」曲線（破線）を調べることによって、図１Ａ（全生存率を分析したすべてのステージの腫瘍）から誘導することができる。診断からの所与の時間において、「低い」曲線に対応する累積生存率を、図から読み取ることができ、例えば、５年（６０箇月）後の２５％は、２５％の５年全生存率の確率である対照予後を生じる。結果的に、ＮＦ＜２％の対照値に等しいサンプル値を有する被験体は、２５％の５年全生存率の確率を有する。
【０１４０】
しかし、上記の対照予後は、例示的な例としてのみ提供するものであって、そして当業者は、上記の態様に従う方法の有用性が、任意の特定の対照予後または予後の測定値に限定されるわけではないことを理解している。
【０１４１】
本開示物の第５の態様として、以下を含む、態様３および４の実施形態に従う方法を行うためのキットが提供される：
ａ）第１の態様に従う親和性リガンド；および
ｂ）前記親和性リガンドの量を定量するのに必要な試薬。
【０１４２】
第６の態様に従うキットの様々な成分は、本開示物の方法態様に関連して上記のように選択および指定することができる。結果的に、試薬は、例えば、上記の２次親和性リガンドを含み得る。さらに、キットは、対照値の供給のための１つ以上の対照サンプルを含み得る。語句「対照値の供給のための対照サンプル」は、本開示物に関して、広範に解釈すべきである。対照サンプルは、実際に対照値に対応する標的タンパク質の量を含み得るが、それはまた、対照値より高い値に対応する標的タンパク質の量を含み得る。後者の場合、「高い」値は、例えば、「高い」値より低い対照値の出現を評価するための上位対照（陽性対照）として方法を実施する者によって、使用され得る。免疫組織化学の当業者は、そのような評価をする仕方について理解している。さらに、代替的または相補的な例として、当業者は、例えば、陰性対照として、そのような評価における「低い」値の供給のための低い量の標的タンパク質を含むもう１つの対照サンプルを使用することができる。これについては、さらに、方法態様に関連して上記で考察している。キット態様の実施形態では、対照サンプルは、組織サンプル、例えば、肉眼または顕微鏡的評価に応用される組織サンプルであってもよい。例として、組織対照サンプルは、パラフィンもしくは緩衝ホルマリン中に固定化され得る、および／または顕微鏡ガラススライド上にマウントされるμｍ薄切片に組織処理され得る。組織対照サンプルは、さらに、第１の態様に従う親和性リガンドのような親和性リガンドによる染色に応用され得る。
【０１４３】
それ故、本開示物に従うキットは、第１の態様に従う親和性リガンド、ならびにそれが特異的および／または選択的に標的タンパク質に結合した後、親和性リガンドを定量するのに役立つ他の手段を含む。例えば、キットは、標的タンパク質および問題の親和性リガンドによって形成される複合体を検出および／または定量するための２次親和性リガンドを含有することができる。キットはまた、キットを容易かつ効率的に使用することを可能にするための親和性リガンド以外の様々な補助物質を含有することができる。補助物質の例として、キットの凍結乾燥タンパク質成分を溶解または再構成するための溶媒、洗浄緩衝液、酵素を標識として使用する場合、酵素活性を測定するための基質、パラフィンまたはホルマリン固定された組織サンプルを使用する場合、抗原へのアクセス可能性を増大するための抗原賦活液（ｔａｒｇｅｔ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、および反応抑止剤（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｒｒｅｓｔｅｒ）のような物質、例えば、イムノアッセイ試薬キットにおいて一般に使用されるバックグランド染色を減少するための内因性酵素ブロック溶液および／または染色の対比を増加するための対比染色溶液が挙げられる。
【０１４４】
本発明の第６の態様として、４７以下の酸残基（ａｃｉｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）からなり、そして配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【０１４５】
本開示物のこの第６の態様は、所定のエピトープは、例えば、様々な文脈において標的タンパク質の発現を検出するのに特に興味深いこと、およびそれらのエピトープを含むフラグメントが診断もしくは予後手段の産生、選択または精製に利用することができることの本発明者らの洞察に基づくが、それに限定されるものではない。
【０１４６】
下記の第６の態様の異なる実施形態については、第１の態様に関連して上記で考察している。
【０１４７】
第６の態様の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなり得る。さらに、そのような実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３および／または配列番号４のアミノ酸配列を含む。なおさらに、ポリペプチドが配列番号３の配列を含む実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３１〜３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得るかまたはそのアミノ酸配列からなり得る。そして、ポリペプチドが配列番号４の配列を含む実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６〜１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得るかまたはそのアミノ酸配列からなり得る。
【０１４８】
また、第６の態様の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列からなり得る。そのような実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５２〜５９および７８〜８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得るかまたはそのアミノ酸配列からなり得る。
【０１４９】
第６の態様の実施形態では、ポリペプチドは、４５以下のアミノ酸残基、例えば、４３以下のアミノ酸残基、例えば、４２以下のアミノ酸残基、例えば、４１以下のアミノ酸残基、例えば、３９以下のアミノ酸残基、例えば、３８以下のアミノ酸残基、例えば、３７以下のアミノ酸残基、例えば、３４以下のアミノ酸残基、例えば、３３以下のアミノ酸残基、例えば、３１以下のアミノ酸残基からなる。
【０１５０】
さらに、第６態様の実施形態では、ポリペプチドは、２５以下のアミノ酸残基、例えば、２０以下のアミノ酸残基、例えば、１７以下のアミノ酸残基、例えば、１４以下のアミノ酸残基からなり得る。
【０１５１】
例えば、第６の態様のポリペプチドは、免疫化、例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の精製において使用され得る。
【０１５２】
結果的に、第６の態様の実施形態では、ポリペプチドは、免疫化、例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の精製における抗原として使用され得る。
【０１５３】
従って、本開示物の第７の態様として、例えば、免疫化における抗原として第６の態様に従うポリペプチドの使用が提供される。例えば、免疫化は、非ヒト動物であってもよい。同様に、モノクローナルまたはポリクローナル抗体のような抗体の製造における第６の態様に従うポリペプチドの使用が提供される。
【０１５４】
さらに、親和性リガンドの選択または精製における第６の態様に従うポリペプチドの使用が提供される。そのような親和性リガンドは、例えば、大腸癌を有する哺乳動物被験体の予後またはもう１つのタイプの予後手段を確立するためのものであり得る。例えば、そのような使用は、ポリペプチドが固定化されている固相支持体上でのアフィニティー精製を含み得る。固相支持体は、例えば、カラムにおいて配置されていてもよい。さらに、使用は、ポリペプチドが固定化されている固相支持体を使用する、第３の態様に従うポリペプチドに対して特異性を有する親和性リガンドの選択を含み得る。そのような固相支持体は、９６ウェルプレート、磁気ビーズ、アガロースビーズまたはセファロースビーズであってもよい。さらに、使用は、例えば、デキストランマトリックスを使用する可溶性マトリックス上の親和性リガンドの分析、またはＢｉａｃｏｒｅＴＭ装置のような表面プラズモン共鳴装置における使用を含み得、ここで、分析は、例えば、固定化されたポリペプチドおよび多くの潜在的な親和性リガンドに対する親和性をモニターすることを含み得る。
【０１５５】
本開示物の第８の態様として、２６以下のアミノ酸からなり、そして配列番号８７、配列番号１０５および／または配列番号１０６のアミノ酸配列を含むエピトープ配列との選択的相互作用が可能な親和性リガンドが提供される。
【０１５６】
本開示物のこの第８の態様は、本発明者らが、ＳＡＴＢ２抗原（配列番号１１１）に対して作製されたポリクローナル抗体と相互作用する所定のエピトープ（即ち、配列番号８７、配列番号１０５および／または配列番号１０６）を同定したことに基づく。そのようなエピトープと相互作用する親和性リガンドは、例えば、大腸癌を有する被験体の予後を確立するための様々な分析、方法、アッセイまたは設定において使用することができる。一般に、そのようなアプリケーションでは、所定のエピトープに特異的である親和性リガンドを有する方が、単に全長タンパク質またはより長いそのフラグメント（例えば、抗原）にのみ特異的であるポリクローナル抗体のような親和性リガンドよりも、より望ましい。さらに、全長ＳＡＴＢ２タンパク質およびその抗原フラグメント（配列番号１１１）は、ＳＡＴＢ１タンパク質およびＳＡＴＢ２タンパク質が共有するいくらかの配列部分を含む。場合によって、例えば、それらが両方とも発現される場合、２つのタンパク質を区別することが所望され得る。配列番号８７、配列番号１０５および／または配列番号１０６は、すべて、ＳＡＴＢ２に対して固有であり、従ってこれらのいずれかとの選択的相互作用が可能な親和性リガンドは、そのような要件を満たす。
【０１５７】
定義された長さを有する多くのポリペプチドフラグメント、即ち、配列番号８８〜９１を、配列番号８７の同定に使用した。結果的に、第８の態様の実施形態では、問題のエピトープ配列は、配列番号８８〜９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得るか、またはそのアミノ酸配列からなり得る。
【０１５８】
さらに、定義された長さを有する他の多くのポリペプチドフラグメント、即ち、配列番号１０８〜１１０を、配列番号１０５の同定に使用した。結果的に、第８の態様の実施形態では、問題のエピトープ配列は、配列番号１０８〜１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得るか、またはそのアミノ酸配列からなり得る。
【０１５９】
上記のフラグメントは、それぞれ、２５、２６、２２、２４および１４アミノ酸長である。
【０１６０】
結果的に、第８態様の実施形態では、問題のエピトープ配列は、２５以下のアミノ酸残基、例えば、２４以下のアミノ酸残基、例えば、２２以下のアミノ酸残基、例えば、１４以下のアミノ酸残基からなり得る。第８の態様に従うエピトープ配列では、配列番号８７、配列番号１０５または配列番号１０６にフランキングするアミノ酸は、例えば、タンパク質ＳＡＴＢ２においてそれらにフランキングしているアミノ酸であってもよい。
【０１６１】
第１の態様に従う親和性リガンドの様々な実施形態、例えば、それらのタイプおよび製造が、必要な変更を加えて、第８の態様の親和性リガンドに当てはまる。
【０１６２】
第２の態様の使用もまた、同様である。それ故、第８の態様に従う親和性リガンドの使用は、本開示物の第９の態様を構成する。
【０１６３】
さらに、第８の態様に従う親和性リガンドは、第３の態様に対応する方法において使用してもよい。それ故、本開示物の第１０の態様として、以下の工程を含む、大腸癌を有する哺乳動物被験体の予後が対照予後より不良であるかもしくはそれに匹敵するかどうかを決定するための方法が提供される：
ａ）前記被験体からより早期に得られたサンプルを提供する工程；
ｂ）第８の態様に従う親和性リガンドを使用して、前記サンプルの少なくとも一部に存在するＳＡＴＢ２タンパク質の量を評価し、そして前記評価された量に対応するサンプル値を決定する工程；
ｃ）工程ｄ）において得られた前記サンプル値と前記対照予後に関連する対照値とを比較する工程；ならびに
前記サンプル値が前記対照値より低いかまたはそれに等しい場合、
ｄ）前記被験体の前記予後は、前記対照予後より不良であるかもしくはそれに匹敵すると結論付ける工程。
【０１６４】
結果的に、第１０の態様におけるＳＡＴＢ２タンパク質は、第３における標的タンパク質に対応する。
【０１６５】
また、第８の態様に従う親和性リガンドは、第４の態様に対応する方法において使用してもよい。それ故、本開示物の第１１の態様として、以下の工程を含む、処置を必要とする被験体の処置の方法が提供され、ここで、前記被験体は大腸癌を有している：
ａ）前記被験体由来のサンプルを提供する工程；
ｂ）第８の態様に従う親和性リガンドを使用して、前記サンプルの少なくとも一部に存在するＳＡＴＢ２タンパク質の量を評価し、そして前記評価された量に対応するサンプル値を決定する工程；
ｃ）工程ｄ）において得られた前記サンプル値と前記対照予後に関連する対照値とを比較する工程；ならびに
前記サンプル値が記対照値より低いかまたはそれに等しい場合、
ｄ）アジュバント大腸癌処置レジメンにより前記被験体を処置する工程。
【０１６６】
第３および第４の態様の様々な構成および実施形態は、必要な変更を加えて、それぞれ、第１０および第１１の態様に当てはまる。
【０１６７】
本開示物の第１２の態様として、以下を含む、態様１０および１１の実施形態に従う方法を行うためのキットが提供される：
ａ）第８の態様に従う親和性リガンド；および
ｂ）前記親和性リガンドの量を定量するのに必要な試薬。
【０１６８】
第５の態様の様々な実施形態は、必要な変更を加えて、第１２の態様に当てはまる。
【０１６９】
本開示物の第１３の態様として、２６以下のアミノ酸からなり、そして配列番号８７、配列番号１０５および／または配列番号１０６のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
【０１７０】
上記のように、定義された長さを有する多くのポリペプチドフラグメント、即ち、配列番号８８〜９１を、配列番号８７の同定に使用した。結果的に、第１２の態様の実施形態では、問題のポリペプチドは、配列番号８８〜９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得るか、またはそのアミノ酸配列からなり得る。
【０１７１】
また、上記のように、定義された長さを有する他の多くのポリペプチドフラグメント、即ち、配列番号１０８〜１１０を、配列番号１０５の同定に使用した。結果的に、第１３の態様の実施形態では、問題のポリペプチドは、配列番号１０８〜１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得るか、またはそのアミノ酸配列からなり得る。
【０１７２】
最終的に、上記においてもまた考察したように、上記のフラグメントは、それぞれ、２５、２６、２２、２４および１４アミノ酸長である。
【０１７３】
それ故、第１３態様の実施形態では、問題のポリペプチドは、２５以下のアミノ酸残基、例えば、２４以下のアミノ酸残基、例えば、２２以下のアミノ酸残基、例えば、１４以下のアミノ酸残基からなる。第１３の態様に従うポリペプチドでは、配列番号８７、配列番号１０５または配列番号１０６にフランキングするアミノ酸は、例えば、タンパク質ＳＡＴＢ２においてそれらにフランキングしているアミノ酸であってもよい。
【０１７４】
本開示物の第１４の態様として、第１３の態様に従うポリペプチドの使用が提供される。第７の態様の様々な実施形態は、必要な変更を加えて、第１４の態様に当てはまる。
【実施例】
【０１７５】
１）抗原の作製
ａ．材料および方法
テンプレートとしてヒトゲノム配列を有するバイオインフォマティクスツールを使用して、ＥｎｓＥＭＢＬ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００１１９０４２によってコードされる標的タンパク質の適切なフラグメントを設計した（Lindskog M et al. (2005） Biotechniques 38:723-727, EnsEMBL, www.ensembl.org）。タンパク質ＳＡＴＢ２（ＥｎｓＥＭＢＬ登録番号ＥＮＳＰ０００００２６０９２６）のアミノ酸３７７〜４９９（配列番号１１１）に対応する１２３アミノ酸からなるフラグメントを設計した。標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド（このポリヌクレオチドは、長いＳＡＴＢ２遺伝子転写物（ＥｎｓＥＭＢＬ登録番号ＥＮＳＴ０００００２６０９２６）のヌクレオチド  １５４２〜１９１０を含有した）を、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＯｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ増幅キットおよびテンプレートとしてのヒト全ＲＮＡプールパネル（Ｈｕｍａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｐａｎｅｌ  ＩＶ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によって単離した。フランキング制限部位ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩを、ＰＣＲ増幅プライマーを介してフラグメントに導入して、発現ベクターへのインフレームクローニングを可能にした（順方向プライマー：ＧＴＧＴＣＣＣＡＡＧＣＴＧＴＣＴＴＴＧ、逆方向プライマー：ＣＴＴＧＧＣＣＣＴＴＴＴＣＡＴＣＴＣＣ）。下流プライマーをビオチン化して、先に記載のように、固相クローニングを可能にし、そして得られたビオチン化ＰＣＲ産物を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ２８０Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｏｓｌｏ，  Ｎｏｒｗａｙ）上に固定化した（Larsson M et al. (2000） J. Biotechnol. 80:143-157）。フラグメントを、ＮｏｔＩ−ＡｓｃＩ消化（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によって、固相支持体から遊離させ、固定化金属イオンクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）精製のためのヘキサヒスチジルタグおよび連鎖球菌プロテインＧ由来の免疫増強アルブミン結合タンパク質（ＡＢＰ）からなる二重親和性タグ（Sjoelander A et al. (1997) J. Immunol. Methods 201:115-123；Stahl S et al. (1999) Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation (Fleckinger MC and Drew SW, eds) John Wiley and Sons Inc., New York, pp 49-63）を伴うフレーム内のｐＡｆｆ８ｃベクター（Larsson M et al、上掲）にライゲートし、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。クローンの配列を、製造者の推奨に従って、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ  ＤＮＡ配列決定増幅キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））を使用して増幅したプラスミドＤＮＡのダイターミネーターサイクルシーケンスによって、確認した。
【０１７６】
発現ベクターを所有するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、同じ培養培地の１ｍｌの１晩培養物の添加によって、５ｇ／ｌ酵母抽出物（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）および５０ｍｇ／ｌカナマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｈｃｈ，（Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ））を補充した１００ｍｌの３０ｇ／ｌトリプティックソイブロス（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）に播種した。細胞培養物を、１リットル振盪フラスコ中３７℃および１５０ｒｐｍで、６００ｎｍでの光学密度が０．５〜１．５に到達するまでインキュベートした。次いで、１ｍＭの最終濃度へのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ａｐｏｌｌｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の添加によって、タンパク質発現を誘導し、そしてインキュベーションを、１晩、２５℃および１５０ｒｐｍで継続した。２４００ｇでの遠心分離によって、細胞を回収し、そしてペレットを、５ｍｌ溶解緩衝液（７Ｍ塩酸グアニジン、４７ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２．６５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール；ｐＨ＝８．０）に再懸濁し、そして２時間、３７℃および１５０ｒｐｍでインキュベートした。３５３００ｇでの遠心分離後、変性および可溶化した遺伝子産物を含有する上清を回収した。
【０１７７】
Ｈｉｓ６−タグ化融合タンパク質を、ＡＳＰＥＣ  ＸＬ４ＴＭ（Ｇｉｌｓｏｎ）上の自動化タンパク質精製手順（Steen J et al. (2006) Protein Expr. Purif. 46:173-178）を使用する１ｍｌのＴａｌｏｎ（登録商標）金属（Ｃｏ２＋）アフィニティー樹脂（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を伴うカラム上での固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって、精製した。澄明化した細胞溶解物を充填する前に、樹脂を、２０ｍｌの変性洗浄緩衝液（６Ｍ塩酸グアニジン、４６．６ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、３．４ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０〜８．２）で平衡化した。次いで、２．５ｍｌ溶出緩衝液（６Ｍ尿素、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭ酢酸、７０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ５．０）への溶出前に、樹脂を、最低でも３１．５ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄した。溶出した材料を、３つのプール５００、７００および１３００μｌに分画した。ここで、抗原画分と称する７００μｌ画分、ならびにプールした５００および１３００μｌ画分を、更なる使用のために貯蔵した。
【０１７８】
抗原画分を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；１．９ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１５４ｍＭのＮａＣｌ）で１Ｍ尿素の最終濃度に希釈し、続いて、７５００Ｄａでの分子量カットオフを伴うＶｉｖａｐｏｒｅ１０／２０ｍｌ濃縮装置（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ  ＡＧ）を使用して、タンパク質濃度を増加するための濃縮工程を行った。製造者の推奨に従って、ウシ血清アルブミン標準を伴うビシンコニン酸（ＢＣＡ）マイクロアッセイプロトコル（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、タンパク質濃度を決定した。タンパク質の品質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ５０もしくは２００アッセイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ装置上で分析した。
【０１７９】
ｂ．結果
ＳＡＴＢ２遺伝子の長い転写物のヌクレオチド１５４２〜１９１０に対応し、そしてＳＡＴＢ２タンパク質のアミノ酸３７７〜４９９からなるペプチド（配列番号１１１）をコードする遺伝子フラグメントを、タンパク質フラグメントに特異的なプライマーを使用するヒトＲＮＡプールからのＲＴ−ＰＣＲによって、首尾よく単離した。しかし、ＥｎｓＥＭＢＬ由来のＥＮＳＧ０００００１１９０４２の配列と比較して、配列中に１つの単一のサイレントヌクレオチド変異が存在する。標的タンパク質の１２３アミノ酸フラグメント（配列番号１１１）は、成熟タンパク質において切断除去されるため、膜貫通領域を含まず、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における効率的な発現を確実にし、そしていずれのシグナルペプチドも含まないように設計した。加えて、タンパク質フラグメントを、コンフォメーショナルエピトープの形成を可能にし、そしてなお細菌系における効率的なクローニングおよび発現を可能にするのに適切なサイズであるように設計した。
【０１８０】
正確なアミノ酸配列をコードするクローンを同定し、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現時、正確なサイズの単一のタンパク質を産生させ、続いて、固定化金属イオンクロマトグラフィーを使用して、精製した。抗原画分を１Ｍ尿素の最終濃度に希釈した後、タンパク質フラグメントの濃度を、７，４ｍｇ／ｍｌに決定し、そして純度分析に従って、９８％純度を得た。
【０１８１】
２）モノクローナル抗体の作製
ａ）材料および方法
実施例、セクション１において得られる精製されたフラグメント（配列番号１１１）を、モノクローナル抗体の産生のための抗原として使用した。抗原をＡｂＳｅａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｄｔ（Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）に送付したが、簡単に説明すると、抗原を、３週間間隔で、ＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６週齢、雌性）に皮下注入した。抗原を、最初の注入のために、完全フロイントアジュバントと混合し、そして以降の注入のために、不完全フロイントアジュバントと混合した。融合の３日前に、マウスに対し、静脈内への抗原の最終チャレンジを施した。マウス脾細胞とＳｐ２／０骨髄腫細胞系統との融合によって、ハイブリドーマを作製した。ＥＬＩＳＡを使用していくらかの細胞系統をスクリーニングすることによって、抗原（配列番号１１１）に特異的な抗体を分泌する細胞を同定し、そして将来の特徴付けのために、Ａｔｌａｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＡＢに送達した。ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット（ＷＢ）および免疫組織化学（ＩＨＣ）において陽性の結果を示した細胞系統を、ＡｂＳｅａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｄｔにより実施されるサブクローニングのために選択した。
【０１８２】
加えて、モノクローナル抗体の免疫組織化学染色パターンを、インハウスのモノクローナル抗ＳＡＴＢ２抗体（ＨＰＡ００１０４２、Ａｔｌａｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＡＢ，(Ｓｗｅｄｅｎ)；抗原、配列番号１１１を使用して作製した）のパターンと比較した。この抗体を、時々、本明細書において、「ＨＰＡポリクローナル抗体」または「ＨＰＡｍｓＡｂ」と称する。
【０１８３】
ｂ）結果
細胞系統を、（ＡｂＳｅａにおいて）ＥＬＩＳＡによってスクリーニングして、抗原（配列番号１１１）を認識するが、親和性タグＨｉｓ−ＡＢＰを認識しないモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生する系統を同定した。１３の細胞系統は、ＥＬＩＳＡにおいて抗原配列番号１１１に対する特異的結合を示し、そして将来の試験のために選択された。選択した１３のクローンのそれぞれについて、１５０〜３００μｌの上清を回収し、アジドを添加し、そして上清を、湿性氷上、Ａｔｌａｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＡＢに送達した。上清を、ＡｂＳｅａの指示に従い、到着時に４℃で貯蔵した。さらに、細胞系統の試験により、４つの細胞系統（クローン）（３Ｂ１０、８Ｆ１１、２Ｂ１１および５Ｅ２）が同定され、ウエスタンブロットおよびＩＨＣ分析の両方において陽性の結果を生じた。これらの４つのクローンを、ＡｂＳｅａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｄｔ．において実施されるサブクローニングおよび拡大のために選択した。
【０１８４】
ポリクローナル抗体ＨＰＡ００１０４２およびモノクローナル抗体５Ｅ２および８Ｆ１１を使用する大腸癌腫の免疫組織化学染色により、試験した抗体に対し腫瘍細胞の核染色が示された。モノクローナル抗体５Ｅ２および８Ｆ１１は、ポリクローナル抗体ＨＰＡ００１０４２と比較して、より明瞭かつ強力なパターンを生じた（図６および７）。結果的に、５Ｅ２および８Ｆ１１は、少なくともいくつかの態様では、ポリクローナル抗体ＨＰＡ００１０４２よりも免疫組織化学に適切である。
【０１８５】
３）細菌ディスプレイを使用するエピトープマッピング
ａ）ライブラリーのブドウ球菌ディスプレイベクターへのサブクローニング
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＲＲ１ΔＭ１５（Ruether, U. pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts. Nucleic. Acids Res. 10, 5765- 5772 (1982)）を、プラスミド構築のための宿主株として使用した。新たなブドウ球菌ベクター、ｐＳＣＥＭＩを、新たな制限部位（Ｐｍｅｌ）を含有する遺伝子フラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）で消化した先に記載のブドウ球菌ベクターｐＳＣＸｍ（Wernerus, H. & Stahl, S. Vector engineering to improve a staphylococcal surface display system. FEMS Microbiol Lett 212, 47-54 (2002)）にライゲートすることによって作製した。ＳＡＴＢ２フラグメント遺伝子の増幅のためのテンプレートは、Ａｎｊａ  Ｐｅｒｓｓｏｎ（Ｒｏｙａｌ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ；Ｓｗｅｄｅｎ）より恵与された。遺伝子フラグメントを、ＰＣＲ（９．６ｍｌ、プールされた）によって増幅し、そして無作為のフラグメントを作製するために、氷上での５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ中６０分間、マイクロチップを使用して、音波処理（２１％振幅、一定音波処理）した。その後、サンプルを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ  ２０カラム（ＣＯ  １０ｋＤａ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ））を使用する限外ろ過によって濃縮した。濃縮したフラグメントを平滑末端化し、そして供給者の推奨に従うＴ４  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ポリヌクレオチド  キナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の添加によって、リン酸化した。その後、平滑末端化された遺伝子フラグメントを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して、Ｐｍｅｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化したブドウ球菌ディスプレイベクター、ｐＳＣＥＭＩにライゲートした。ライブラリーを、先に記載（Loefblom, J., Kronqvist, N., Uhlen, M., Stahl, S. & Wernerus, H. Optimization of electroporation-mediated transformation: Staphylococcus carnosus as model organism. J Appl Microbiol 102, 736-747 (2007)）のように、エレクトロコンピテントＳ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）ＴＭ３００（Goetz, F. Staphylococcus carnosus: a new host organism for gene cloning and protein production. Soc. Appl. Bacteriol. Symp. Ser. 19, 49S-53S (1990)）に形質転換し、そして１５％グリセロール中に−８０℃で貯蔵した。
【０１８６】
ｂ）細胞ラベリングおよび蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）
Ｓｃ：ＳＡＴＢ２−ｌｉｂのアリコート（ライブラリーサイズの少なくとも１０倍）を、２０μｇ  ｍｌ−１クロラムフェニコールを伴う１００ｍｌのＴＳＢ＋Ｙ（トリプティックソイブロス＋酵母抽出物）に播種し、そして１晩、３７℃および１５０ｒｐｍで増殖させた。１６時間後、１０７個の細胞を、０．１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８  ＮＦ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ（ＰＢＳＰ；ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，（Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ，ＮＪ））を伴う１ｍｌリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄した。細胞を、遠心分離（３５００×ｇ、４℃、６分間）によりペレット化し、そして抗体（即ち、エピトープマッピングに使用する抗体；典型的に、約１００ｎＭの濃度）を含有する１００μｌのＰＢＳＰに懸濁し、そして１時間、穏やかに撹拌しながら室温でインキュベートして、平衡結合に到達させた。その後、細胞を、１ｍｌの氷冷ＰＢＳＰで洗浄し、続いて、４μｇ  ｍｌ−１Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または４μｇ  ｍｌ−１Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２２５ｎＭのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ＨＳＡコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する１ｍｌのＰＢＳＰにおいて、１時間、氷上、暗所でインキュベーションを行った。１ｍｌの氷冷ＰＢＳＰ中での最後の洗浄工程後、分取前に、細胞を、３００μｌの氷冷ＰＢＳＰに再懸濁した。ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ  ＳＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ））フローサイトメーターを使用して、細胞を分取した。細胞を、０．５ｍｌのＢ２培地（Loefblom, J., Kronqvist, N., Uhlen, M., Stahl, S. & Wernerus, H. Optimization of electroporation-mediated transformation: Staphylococcus carnosus as model organism. J Appl Microbiol 102, 736-747 (2007)）に直接分取し、そして１０μｇ  ｍｌ−１クロラムフェニコールを含有する血液寒天基礎培地（Ｍｅｒｃｋ）プレート上に広げ、そして３７℃で２４時間、インキュベートした。最後のラウンドにおいて、細胞を、半固体培地を含有する９６ウェルプレート中の個々のウェルに分取して、コロニーを形成させた。
【０１８７】
ｃ）ＤＮＡ配列決定およびＢＬＡＳＴアラインメント
各コロニーの部分を、ＰＣＲのために、９６ウェルプレート中の個別の２つのウェルに移した。ブドウ球菌ディスプレイベクターの挿入領域を、別個の２つのプライマー対を使用するＰＣＲによって増幅させ、それぞれ、順方向末端および逆方向末端にビオチン分子を含有する２つのＰＣＲ産物を生じさせた。単一鎖ＤＮＡを、ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０；Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ））上の固定化されたビオチン化ＰＣＲ産物のＮａＯＨ鎖分離によって、作製した。パイロシークエンシングプライマーの鎖分離およびアニーリングを、製造者の指示に従い、Ｍａｇｎａｔｒｉｘ１２００ピペッティングロボット（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ＡＢ，（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ））を使用して、実施した。各挿入物の両末端における１０サイクルのパイロシークエンシングを、製造者の指示に従い、ＰＳＱＴＭ９６ＨＳ装置（Ｂｉｏｔａｇｅ  ＡＢ，（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））を使用して、実施した。リーディングフレーム、ならびに抗原とのＢＬＡＳＴアラインメントの決定を含むパイロシークエンシング出力ファイルの自動分析のための拡張ソフトウェアが、Ｐｅｒｌにおいて作成された。
【０１８８】
ｄ）結果
ＳＡＴＢ２ペプチドライブラリーを、上記のように構築し、そして形質転換により、約６０，０００個の個々のクローンを生じさせ、ブドウ球菌表面上にディスプレイされた推定２，４００（４％）の明瞭な機能的抗原由来のフラグメントを得た。フローサイトメトリー分取を、抗原配列番号１１１（ポリクローナル抗体ＨＰＡ００１０４２）および４つのモノクローナル抗体（３Ｂ１０、８Ｆ１１、２Ｂ１１および５Ｅ２）（すべて、同じ抗原（配列番号１１１）に対して作製した）を使用する免疫化によって先に産生させたポリクローナル抗体のプールを使用して行った。抗体結合性細胞の首尾良い富化後、陽性細胞を、第２のラウンドの分取において単離した。ポリクローナル抗体では、個別の２つのゲートを使用して、僅かに異なる抗体結合特性を伴う細胞集団を回収し、モノクローナル抗体のそれぞれに対して１つのゲートを使用した。各抗体に基づく分取から回収されたクローンの配列決定から、ポリクローナル抗体に対する個別の５つのエピトープが示され、すべてのモノクローナル抗体の結合パターンから、単一の結合エピトープが実証された。モノクローナル抗体の同定されたコンセンサスエピトープ（配列番号１および２）は、ポリクローナル抗体ＨＰＡ００１０４２（配列は含まれない）に対して同定されたエピトープのうちの２つと重複することを見出した。２つのこれらのエピトープを、エピトープ１（配列番号１）および２（配列番号２）として示す。
【０１８９】
モノクローナル抗体８Ｆ１１および５Ｅ２を使用して得られる配列決定情報に基づいて、本発明者らは、エピトープ１（配列番号１、ＱＮＦＬＮＬＰＥ）に対するコンセンサス配列を見出した。８Ｆ１１のマッピングにより、配列番号３１〜５１によって支持される１６アミノ酸長のエピトープ（配列番号３、ＬＲＡＭＱＮＦＬＮＬＰＥＶＥＲＤ）が示された。言い換えれば、フラグメント配列番号３１〜５１は、８Ｆ１１と相互作用することを見出し、そして配列番号３のコンセンサス配列を同定した。モノクローナル抗体５Ｅ２に関して、マッピングにより、配列番号６〜３０によって支持される１３アミノ酸長のエピトープ（配列番号４、ＱＮＦＬＮＬＰＥＶＥＲＤＩ）が示された。言い換えれば、フラグメント配列番号６〜３０は、５Ｅ２と相互作用することを見出し、そして配列番号４のコンセンサス配列を同定した。
【０１９０】
さらに、本発明者らは、モノクローナル抗体３Ｂ１０および２Ｂ１１を使用して得られる配列決定情報に基づいて、エピトープ２（配列番号２、ＧＬＬＳＥＩＬＲＫ）に対するコンセンサス配列を見出した。３Ｂ１０のマッピングにより、配列番号７８〜８６によって支持される１０アミノ酸長のエピトープ（配列番号５、ＱＧＬＬＳＥＩＬＲＫＥ）が示された。モノクローナル抗体２Ｂ１１に関して、マッピングにより、配列番号５２〜７７によって支持される９アミノ酸長のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐ）（配列番号２、ＧＬＬＳＥＩＬＲＫ）が示された。
【０１９１】
また、本発明者らは、ポリクローナル抗体ＨＰＡ００１０４２を使用して、更なる３つのエピトープ、即ち、エピトープ３（配列番号８７）、エピトープ４（配列番号１０５）およびエピトープ５（配列番号１０６）を同定した。１２アミノ酸のエピトープ３（ＫＴＳＴＰＴＴＤＬＰＩＫ）が、本発明者らにより、マッピングを使用して同定されたが、エピトープは、配列番号８８〜１０４からの配列決定情報に基づくコンセンサス配列である。同様に、１２アミノ酸のエピトープ５が、本発明者らにより、マッピングを使用して同定されたが、エピトープは、配列番号１０７〜１１０からの配列決定情報に基づくコンセンサス配列である。さらに、２４アミノ酸のエピトープ４（ＶＳＳＡＳＳＳＰＳＳＳＲＴＰＱＡＫＴＳＴＰＴＴＤ）もまた、本発明者らにより、マッピングを使用して同定された。
【０１９２】
４）結腸癌腫ＴＭＡ（Ｓ字状コホート）
ａ）材料および方法
１９９３年〜２００３年の間にＳ状結腸癌に対して外科的処置を受けた３０５例の患者（１４８例の女性および１５７例の男性）由来のアーカイブホルマリン固定パラフィン包埋組織を、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｍａｌｍｏｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，（Ｓｗｅｄｅｎ）から回収した。患者の年齢の中央値は、７４（３９〜９７）歳であった。４９の腫瘍がＤｕｋｅｓ分類Ａ、１２７がＤｕｋｅｓ分類Ｂ、８９がＤｕｋｅｓ分類Ｃであり、そして４６がＤｕｋｅｓ分類Ｄであった。死亡の日付に関する情報は、すべての患者について地域死因登録から入手した。倫理的許可は、地方倫理委員会（Ｌｏｃａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ）から得た。
【０１９３】
すべての３０５例を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色したスライド上で、組織病理学的に再評価した。次いで、ＴＭＡ：ｓを、Ｓ状結腸癌腫の代表的領域から１症例あたり２×１．０ｍｍのコアを採取することによって、構築した。
【０１９４】
自動化された免疫組織化学を、既に記載のとおりに実施した（Kampf C et al. (2004) Clin. Proteomics 1:285-300）。簡単に述べると、ガラススライドを、６０℃で４５分間インキュベートし、キシレン中で脱パラフィン処理し（２×１５分間）、等級化されたアルコールに水和した。抗原賦活化のために、スライドをＴＲＳ（Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｐＨ６．０，Ｄａｋｏ，（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ））中に浸漬し、そしてＤｅｃｌｏａｋｉｎｇチャンバ（登録商標）（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）内、１２５℃で４分間、煮沸した。スライドを、Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（登録商標）（Ｄａｋｏ）内に置き、そして内因性ペルオキシダーゼを、最初に、Ｈ２Ｏ２（Ｄａｋｏ）でブロックした。スライドを、実施例、セクション２で得た第一抗体５Ｅ２および８Ｆ１１と共に３０分間、室温でインキュベートし、続いて、３０分間、室温で、ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼコンジュゲートＥｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）と共にインキュベーションした。すべての工程の間、スライドを、洗浄緩衝液（Ｄａｋｏ）中で濯いだ。最後に、ジアミノベンジジン（Ｄａｋｏ）を色素原として使用し、そしてＨａｒｒｉｓヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を対比染色に使用した。スライドを、Ｐｅｒｔｅｘ（登録商標）（Ｈｉｓｔｏｌａｂ）でマウントした。
【０１９５】
免疫組織化学的に染色した組織のすべてのサンプルを、顕微鏡下において手動で評価し、そして認定された病理学者によってアノテートした。各サンプルのアノテーションを、ＩＨＣ結果の分類のための簡素化されたスキームを使用して、実施した。各組織における代表性（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｉｔｙ）および免疫反応性について検査した。腫瘍細胞および間質の両方をアノテートした。基本的なアノテーションパラメータは、ｉ）細胞内局在化（核および／または細胞質／膜）、ｉｉ）染色強度（ＳＩ）およびｉｉｉ）染色細胞の画分（ＦＳＣ）の評価を含んだ。染色強度は、臨床組織病理学的診断で使用される基準に従って、主観的に評価し、そして結果を次のように分類する：不在＝免疫反応性なし、弱い＝僅かな免疫反応性、中等度＝中等度の免疫反応性、または強い＝明瞭かつ強い免疫反応性。当業者は、この手順がＡｌｌｒｅｄスコアの計算に類似することを理解するであろう（例えば、Allred et al. (1998） Mod Pathol 11(2）, 155を参照のこと）。
【０１９６】
統計分析のために、核画分（ＮＦ）および核強度（Ｎｌ）レベルを評価した。ＮＦおよびＮＩの両方を、臨床病理組織学的診断において使用される基準に従って、主観的に評価した。「核画分」は、核において陽性染色を示すサンプル中の腫瘍細胞の百分率に対応したが、ここで、核における中等度のまたは明瞭かつ強力な免疫反応性は陽性とみなされ、そして核における認められないまたは軽度の免疫反応性は陰性とみなされる。「核強度」は、サンプルの全体的な染色強度に対応した。しかし、細胞の核の発現のみを考慮した。核強度決定の結果は、次のように分類した：不在＝サンプルの腫瘍細胞の核において全体的な免疫反応性が認められない、弱＝サンプルの腫瘍細胞の核において全体的な免疫反応性が軽度である、中＝サンプルの腫瘍細胞の核において全体的な免疫反応性が中等度である、または強＝サンプルの腫瘍細胞の核において全体的な免疫反応性が明瞭かつ強力である。個々の層に対する生存率の傾向に基づいて、更なる統計分析のために、二分類の変数を構築した。５Ｅ２抗体を使用する分析では、高い核画分（ＮＦ＞０）を、染色した細胞の２〜１００％の画分として定義し、そして低い核画分（ＮＦ＝０）を、染色した細胞の＜２％の画分として定義した。さらに、弱い、中等度および強い核強度（ＮＩ＞０）を、高タンパク質発現レベルとして定義し、そして不在の核強度（ＮＩ＝０）を、低いタンパク質発現レベルとして定義した。８Ｆ１１抗体でより強く染色された、それ故高い核画分（ＮＦ＝１）を、染色した細胞の＞７５％の画分として定義し、そして低い核画分（ＮＦ＜１）を、染色した細胞の０〜７５％の画分として定義した。さらに、強い核強度（ＮＩ＝１）を、高タンパク質発現として定義し、そして不在、弱いおよび中等度の核強度（ＮＩ＜１）を、低いタンパク質発現として定義した。
【０１９７】
サンプルの上記の分類を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ方法に従って、全生存（ＯＳ）分析に使用し、そしてログランク検定を使用して、異なる層における生存率を比較した。すべての統計的検定は、両側検定であり、そして＜０．０５％のｐ値を有意とみなした。すべての計算は、統計パッケージＳＰＳＳ  １６．０（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）により行った。
【０１９８】
ｂ）結果
３０５例のＳ状結腸癌患者の組織マイクロアレイに基づく分析は、モノクローナル抗体５Ｅ２の使用により、強力かつ明瞭な核染色が生じたことが示され、ここで、２６１例の被験体（８６％）は、高発現（ＮＦ＞２％）を示した。全体のコホートの核画分に基づく生存分析は、５Ｅ２が結合するタンパク質の発現が低い腫瘍を有する患者について、有意に（ｐ＝０．００１）より低い５年全生存（ＯＳ）を示した（図１Ａ）。高い発現レベルを有する患者の約６０％は、５年後もなお生存しているが、低い発現レベルを有する患者では、その期間後に約２５％しか生存していない。さらに、Ｄｕｋｅｓ分類のＣおよびＤと診断された被験体について研究する場合、予想される生存率の差異は、なおより顕著であると考えられ得る：このサブグループにおいて高い発現レベルを有する患者の約４０％は、５年後もなお生存しているが、低い発現レベルを有する患者では、同じ期間後に約１０％しか生存していない（ｐ＝０．００１）。図１Ｂを参照のこと。使用したカットオフの結果として、「低い」カテゴリーは、それらの発現が本質的に消失した患者を含有した。それ故、タンパク質発現の消失は、有意に不良な予後と関連するようであり、そしてこれは、Ｄｕｋｅｓ分類ＣおよびＤと診断された患者のような、疾患のより後期において特に顕著であると考えられ得る。核強度について研究する場合にも、同様の結果が得られた（図２Ａおよび２Ｂ）。
【０１９９】
３０５例のＳ状結腸癌患者の組織マイクロアレイに基づく分析は、モノクローナル抗体８Ｆ１１の使用により、強力かつ明瞭な核染色が生じたことが示され、ここで、２７５例の被験体（９０％）は、高発現（ＮＦ＞７５％）を示した。全体のコホートの核画分に基づく生存分析は、タンパク質の発現が低い腫瘍を有する患者について、有意に（ｐ＝０．００４）より短い５年全生存（ＯＳ）を示した（図３Ａ）。高いタンパク質レベルを有する患者の約６０％は、５年後もなお生存しているが、低い発現レベルを有する患者では、同じ期間後に約２７％しか生存していない。さらに、Ｄｕｋｅｓ分類のＣおよびＤと診断された被験体について研究する場合、予想される生存率の差異は、なおより顕著であると考えられ得る：このサブグループにおいて高いタンパク質レベルを有する患者の約４０％は、５年後もなお生存しているが、低いタンパク質発現レベルを有する患者では、同じ期間後に約１２％しか、生存していない。図３Ｂを参照のこと。それ故、低いレベルのタンパク質発現は、有意に不良な予後と関連し、そしてその相関は、Ｄｕｋｅｓ分類ＣおよびＤと診断された患者のような、疾患のより後期においてなおより顕著であると考えられ得る。核強度について研究する場合にも、同様の結果が得られた（図４Ａおよび４Ｂ）。
【０２００】
図５では、５Ｅ２および８Ｆ１１の染色における相関を分析する。染色した腫瘍細胞の核画分を、クロス集計によって比較したところ、２つのモノクローナル抗体の間に有意な（ｐ＝０．００１）相関が認められる。結果的に、これは、２つのモノクローナル抗体が同じエピトープと相互作用することを支持する。
【０２０１】
結論として、大腸癌、例えば、Ｓ状結腸癌腫として診断された患者では、５Ｅ２および８Ｆ１１の使用は、図１〜４に認められ得るように患者の予後を確立するための有意な値、即ち、５年生存率のような生存の確率であってもよい。
【０２０２】
大腸癌患者に対する予後の確立
５．非制限的例
癌患者は、腫瘍増殖由来の症状もしくは徴候、腫瘍が増殖する領域からの疼痛および窮迫を含む病巣症状、または体重減少および疲労のようなより全身的な症状を呈することがあり得る。大腸腫瘍の増殖由来の徴候はまた、排泄物中の血液および／または機能不全、例えば、下痢／便秘を介して明白になり得る。
【０２０３】
以下では、配列番号１のエピトープ配列との選択的相互作用が可能なモノクローナル抗体（ｍＡＢ）が用いられる。そのようなモノクローナル抗体の例は、上記の実施例、セクション２において得られる５Ｅ２である。
【０２０４】
患者における大腸癌診断の確立後、Ｓ状結腸から腫瘍組織サンプルが入手される。腫瘍組織サンプルは、癌の診断中早期に、または腫瘍の早期の外科的切除からの標本から実施された生検から入手することができる。さらに、「陰性対照」の供給では、サンプルは、配列番号１を含むタンパク質（標的タンパク質）の検出可能な発現のない組織を含むアーカイブ材料から採取される。そのようなアーカイブ組織は、例えば、ｍＡＢで染色する場合、発現が認められないことが予め示されている大腸癌組織であってもよい。さらに、「陽性対照」の供給では、サンプルは、予め確立された高い標的タンパク質発現を有する組織を含むアーカイブ材料から採取される。そのようなアーカイブ組織は、例えば、ｍＡＢで染色する場合、高発現、例えば、ＮＦ＞７５％、またはＮＩ＝強い、を呈することが予め示されている大腸癌組織であってもよい。サンプル材料の薄切片（４μｍ）を得るために、サンプル材料を緩衝ホルマリン中で固定化し、そして組織処理を行った。
【０２０５】
免疫組織化学は、実施例、セクション４によって記載のように実施される。各サンプルから１つ以上のサンプル切片をガラススライド上にマウントし、これを、４５分間、６０℃でインキュベートし、キシレン中で脱パラフィン処理し（２×１５分間）、そして等級化されたアルコールに水和する。抗原賦活化のために、スライドをＴＲＳ（Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｐＨ６．０，Ｄａｋｏ）中に浸漬し、そしてＤｅｃｌｏａｋｉｎｇチャンバ（登録商標）（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）内で、１２５℃で４分間、煮沸する。スライドを、Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（登録商標）（Ｄａｋｏ）内に置き、そして内因性ペルオキシダーゼを、最初に、Ｈ２Ｏ２（Ｄａｋｏ）でブロックする。複数のサンプル切片をマウントする理由は、結果の確度を向上させることができるからである。
【０２０６】
ｍＡＢをスライドに添加し、そして３０分間、室温でインキュベートし、続いて、標識した第二抗体；例えば、ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼコンジュゲートＥｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）と共に室温で３０分間のインキュベーションを行う。第二抗体を検出するために、ジアミノベンジジン（Ｄａｋｏ）を色素原として使用し、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）対比染色で対比させる。すべての工程と工程の間で、スライドを、洗浄緩衝液（Ｄａｋｏ）中で濯ぐ。次いで、スライドを、Ｐｅｒｔｅｘ（登録商標）（Ｈｉｓｔｏｌａｂ）でマウントする。
【０２０７】
染色手順を確認するためのツールとして、次の２つのコントロール細胞系統を使用してもよい；例えば、標的タンパク質を発現する細胞（陽性細胞系統）を有する１つのスライドおよび標的タンパク質発現が認められない細胞（陰性細胞系統）を有する１つのスライド。当業者は、例えば、Rhodes et al. (2006） The biomedical scientist, p 515-520の開示内容を指針として、そのような細胞系統を提供する仕方について理解している。コントロール系統のスライドは、大腸癌スライドと同じ手順で同時に染色され得、即ち、同じ第一および第二抗体と共にインキュベートされる。
【０２０８】
例えば、Ｓ状結腸腫瘍組織スライド、染色対照スライド、および場合により、コントロール細胞系統を有するスライドを、ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  Ｔ２自動化スライド走査システム（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を×２０倍率で使用して、光学顕微鏡下で走査してもよい。
【０２０９】
コントロール細胞系統を使用する場合、染色手順を確認するために、これらについて調べる。細胞系統が許容基準外の染色結果を示す、例えば、人工物の染色が当業者によって認識される場合、その生検サンプルの染色は妥当でないとみなされ、そして染色手順全体が、新たなスライドで反復される。陽性細胞系統が強い染色強度、および陰性細胞系統が、不明瞭か、または認められない染色強度をそれぞれを示す場合、その染色は妥当なものとみなされる。
【０２１０】
腫瘍組織生検由来の染色されたサンプルスライドは、臨床病理組織学的診断において使用される基準に従って、手動で目視検査により評価され、そして大腸腫瘍スライドの免疫反応性は、実施例、セクション４に記載のように、階層化される。
【０２１１】
例えば、核画分（ＮＦ）を決定してもよい。即ち、核において陽性染色を示すサンプルスライドにおける腫瘍細胞の百分率が評価される。腫瘍細胞の核において中等度または明瞭かつ強力な免疫反応性は陽性とみなされ、そして核において認められないか、または弱い免疫反応性は陰性とみなされる。例えば、ＮＦ＜２％の対照値を使用してもよく、そしてそのような場合、サンプルは、ＮＦ＜２％であるか、ＮＦ≧２％であるかに分けられる。
【０２１２】
ＮＦの決定では、評価を実施し、そして階層化する者は、染色された対照スライド、即ち、「陽性対照」および「陰性対照」の目視検査によって援助される。
【０２１３】
次いで、サンプル値、即ち、腫瘍組織由来サンプルスライドのＮＦを、対照値と比較する。サンプル値が対照値以下である場合、予後は、対照値に関連する対照予後より不良であるか、もしくはそれに匹敵すると結論付けられる。上記のように、対照値は、ＮＦ＜２％であってもよい。そのような場合、対照値と関連する対照予後は、図１Ａから誘導され得る。図１Ａでは、ＮＦ＜２％（破線）は、２５％の５年全生存の確率に関連する。結果的に、問題の患者のサンプル値がＮＦ＜２％（対照値と同じ）である場合、患者の予後は、２５％の５年全生存の確率（対照予後に匹敵する）である。
【０２１４】
一般論
刊行物、ＤＮＡまたはタンパク質データの入力、および特許を含むが、これらに限定されない本出願において言及した引用したすべての材料は、本明細書において、参考として援用される。
【０２１５】
本発明を上記のように説明してきたが、本発明は、多くの方法で改変することができることは明らかであろう。そのような改変は、本発明の趣旨および範囲から逸脱するものと認識されるべきではなく、そのようなすべての変更は、以下の特許請求の範囲内に含まれることが、当業者には明らかであろう。
【図１】
2012504408.tif 000003
【図２】
2012504408.tif 000004
【図３】
2012504408.tif 000005
【図４】
2012504408.tif 000006
【図５】
2012504408.tif 000007
【図６Ａ】
2012504408.tif 000008
【図６Ｂ】
2012504408.tif 000009
【図７Ａ】
2012504408.tif 000010
【図７Ｂ】
2012504408.tif 000011
【配列表】
2012504408000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成23年4月5日(2011.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2012504408000001.app
【国際調査報告】
2012504408.tif 000048
2012504408.tif 000049
2012504408.tif 000050
2012504408.tif 000051