(57)【要約】  本発明は標的配列を増幅するプライマーを使用してヒトＫ−ＲＡＳのコドン１２及び１３における突然変異に相関する癌及び腫瘍を診断するための組成物、方法及びキットに関する。増幅した標的配列をその後、任意数の質量分析法により分析し、コドン１２及び１３におけるＫ−ＲＡＳ突然変異の塩基組成シグネチャデータベースに対してデータを照会する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験サンプル中のヒトＫ−ＲＡＳのコドン１２又は１３における突然変異の有無の識別方法であって、
試験サンプルを準備する段階と，
セットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ，
前記セットＡは配列番号１の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
前記セットＢは配列番号２の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
前記セットＣは配列番号２の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５の核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
前記セットＤは配列番号３の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
から構成される群から選択されるプライマー対セットを含む反応混合物を形成する段階と，
混合物を増幅条件に付し、増幅産物を生成する段階と，
増幅産物の分子量を測定する段階と，
増幅産物の分子量をデータベース中の標的配列の分子量計算値又は測定値と比較し、ヒトＫ−ＲＡＳのコドン１２又は１３における突然変異の有無を識別する段階を含む前記方法。
【請求項２】
試験サンプル中のヒトＫ−ＲＡＳのコドン１２又は１３における突然変異の有無の識別方法であって、
試験サンプルを準備する段階と，
セットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ，
前記セットＡは配列番号１の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
前記セットＢは配列番号２の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
前記セットＣは配列番号２の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５の核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
前記セットＤは配列番号３の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
から構成される群から選択されるプライマー対セットを含む反応混合物を形成する段階と，
混合物を増幅条件に付し、増幅産物を生成する段階と，
増幅産物の塩基組成を決定する段階と，
増幅産物の塩基組成をデータベース中の標的配列の塩基組成計算値又は測定値と比較し、ヒトＫ−ＲＡＳのコドン１２又は１３における突然変異の有無を識別する段階を含む前記方法。
【請求項３】
標的配列の識別が増幅産物のシーケンシングを含まない請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
質量分析法がフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析法（ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ）、飛行時間型質量分析法（ＴＯＦ−ＭＳ）又はエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析法である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
プライマーセットが少なくとも１種のヌクレオチドアナログを含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
ヌクレオチドアナログがイノシン、ウリジン、２，６−ジアミノプリン、プロピンＣ及びプロピンＴから構成される群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
分子量修飾タグを増幅産物に付加する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
ヒトＫ−ＲＡＳのコドン１２又は１３における突然変異が結腸直腸、非小細胞肺、卵巣、胆管、膵臓、食道、乳房、甲状腺、子宮内膜の癌又は腫瘍及びその存在がコドン１２又は１３における突然変異に相関する他の任意癌又は腫瘍から構成される群から選択される癌に相関する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
増幅産物の分子量を測定する段階の前にＰＣＲ反応体とカチオンを除去する段階を更に含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
試験サンプル中のヒトＫ−ＲＡＳのコドン１２又は１３における突然変異の有無の識別方法であって、
試験サンプルを準備する段階と，
セットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ，
前記セットＡは配列番号１の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
前記セットＢは配列番号２の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
前記セットＣは配列番号２の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
前記セットＤは配列番号３の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
から構成される群から選択されるプライマー対セットを含む反応混合物を形成する段階と，
混合物を増幅条件に付し、増幅産物を生成する段階と，
増幅産物の分子量を測定する段階と，
増幅産物の分子量をデータベース中の標的配列の分子量計算値又は測定値と比較し、ヒトＫ−ＲＡＳのコドン１２又は１３における突然変異の有無を識別する段階を含む前記方法。
【請求項１１】
試験サンプル中のヒトＫ−ＲＡＳのコドン１２又は１３における突然変異の有無の識別方法であって、
試験サンプルを準備する段階と，
セットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ，
前記セットＡは配列番号１の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
前記セットＢは配列番号２の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
前記セットＣは配列番号２の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
前記セットＤは配列番号３の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
から構成される群から選択されるプライマー対セットを含む反応混合物を形成する段階と，
混合物を増幅条件に付し、増幅産物を生成する段階と，
増幅産物の塩基組成を決定する段階と，
増幅産物の塩基組成をデータベース中の標的配列の塩基組成計算値又は測定値と比較し、ヒトＫ−ＲＡＳのコドン１２又は１３における突然変異の有無を識別する段階を含む前記方法。
【請求項１２】
標的配列の識別が増幅産物のシーケンシングを含まない請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
質量分析法がフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析法（ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ）、飛行時間型質量分析法（ＴＯＦ−ＭＳ）又はエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析法である請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１４】
プライマーセットが少なくとも１種のヌクレオチドアナログを含む請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１５】
ヌクレオチドアナログがイノシン、ウリジン、２，６−ジアミノプリン、プロピンＣ及びプロピンＴから構成される群から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
分子量修飾タグを増幅産物に付加する請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１７】
ヒトＫ−ＲＡＳのコドン１２又は１３における突然変異が結腸直腸、非小細胞肺、卵巣、胆管、膵臓、食道、乳房、甲状腺、子宮内膜の癌又は腫瘍及びその存在がコドン１２又は１３における突然変異に相関する他の任意癌又は腫瘍から構成される群から選択される癌に相関する請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１８】
セットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ，
前記セットＡは配列番号１の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
前記セットＢは配列番号２の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
前記セットＣは配列番号２の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
前記セットＤは配列番号３の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
から構成される群から選択されるプライマー対セットと，
増幅試薬
を含むキット。
【請求項１９】
セットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ，
前記セットＡは配列番号１の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
前記セットＢは配列番号２の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
前記セットＣは配列番号２の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５の核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
前記セットＤは配列番号３の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
から構成される群から選択されるプライマー対セットと，
増幅試薬
を含むキット。
【請求項２０】
Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤから構成される群から選択されるプライマー対セットであって、
セットＡが配列番号１の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
セットＢが配列番号２の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
セットＣが配列番号２の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
セットＤが配列番号３の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含む前記プライマー対セット。
【請求項２１】
Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤから構成される群から選択されるプライマー対セットであって、
セットＡが配列番号１の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
セットＢが配列番号２の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
セットＣが配列番号２の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５の核酸配列を含むリバースプライマーを含み，
セットＤが配列番号３の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含む前記プライマー対セット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に分子ツールを使用して各種癌のマーカーであるヒトＫ−ＲＡＳのコドン１２−１３における突然変異を検出することに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｋ−ＲＡＳと癌
Ｋ−ＲＡＳ（「ラット肉腫」ウイルス由来；別称Ｋ−ＲＡＳ２）遺伝子における突然変異は多様な癌に相関する。Ｋ−ＲＡＳ遺伝子はＫｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルスから単離されたトランスフォーミング遺伝子のヒト細胞ホモログをコードする。コドン１２及び１３におけるＫ−ＲＡＳ遺伝子の突然変異はコードされるｐ２１蛋白質の機能的変異につながる。Ｋ−ＲＡＳ突然変異は概数で膵癌の９０％、結腸直腸癌の５０％及び非小細胞肺癌の３０％に存在することが知られており、その突然変異プロファイルによると、突然変異の約８５％はコドン１２及び１３に生じることが判明した（Ｓａｍｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。Ｋ−ＲＡＳ遺伝子突然変異の識別は例えば膵癌、結腸直腸癌及び非小細胞肺癌の癌診断における有用なツールとして使用され、各種腫瘍表現型との相関が報告されている（Ａｎｄｒｅｙｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｓａｍｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０００３】
ＲＡＳ癌遺伝子ファミリーは十分に特性決定されている（Ｂａｒｂａｃｉｄ，１９８７）；（Ｂｏｓ，１９８９）。ＲＡＳ遺伝子ファミリーは分子量２１，０００をもつ免疫学的に近縁の蛋白質（ｐ２１）をコードする（Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）；（Ｐａｐａｇｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）。これらは細胞内シグナルトランスデューサーとして作用するグアノシン二リン酸／グアノシン三リン酸（ＧＤＰ／ＧＴＰ）結合蛋白質である。このファミリーには（１）マウス肉腫ウイルスのＨａｒｖｅｙ株におけるＨ−ＲＡＳ（Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）と、（２）Ｋ−ＲＡＳ及びＫｉｒｓｔｅｎマウス肉腫ウイルス（Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）と、（３）Ｈ−ＲＡＳとの低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションにより同定されたＮ−ＲＡＳ（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）の少なくとも３種のメンバーが含まれる。野生型蛋白質は増殖、分化及び老化を含む正常組織シグナル伝達において重要な役割を果たすが、突然変異ＲＡＳ遺伝子は多数のヒト癌において役割を果たす（Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇ，２００５）。
【０００４】
Ｋ−ＲＡＳは最も一般に活性化される癌遺伝子の１種であると思われ、全ヒト腫瘍の１７〜２５％が活性化Ｋ−ＲＡＳ突然変異を含む（Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇ，２００５）。コドン１２及び１３以外で癌遺伝子活性化に重要な領域としては、コドン５９、６１及び６３が挙げられる（Ｇｒｉｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。突然変異の結果、活性なＧＴＰと結合した状態でＲＡＳが蓄積するが、これは内在ＧＴＰアーゼ活性の低下に起因すると思われ、従って、ＧＴＰアーゼ活性化蛋白質に対する耐性を生じる（Ｚｅｎｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０００５】
コドン１２及び１３におけるＫ−ＲＡＳ突然変異を報告している研究例を表１に示す。
【０００６】
【表１】
2012512665.tif 000002
【０００７】
Ｋ−ＲＡＳコドン１２−１３突然変異の従来の判定方法
ヒトＫ−ＲＡＳ遺伝子のコドン１２−１３における突然変異の典型的な分子アッセイは野生型から多型を検出する段階に依存する。例えば、Ｋ−ＲＡＳのコドン１２又は１３に突然変異を含む疑いのある核酸を含有する試験サンプルを各種技術により分析し、ＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡデュプレクス塩基ミスマッチ検出後にゲル電気泳動する方法や、ゲル上で突然変異体ポリヌクレオチドと野生型ポリヌクレオチドの電気泳動移動度の差を検出する１本鎖コンフォーメーション多型（ＳＳＣＰ）アッセイ等の電気泳動移動度アッセイ、又は同様にＧＣクランプを標的配列に付加する追加段階を含む変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）が挙げられる。他の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的核酸増幅技術、及び選択的プライマー伸長アッセイが挙げられる。分子の中心（従って突然変異毎に異なるプライマーが必要になる）又はプライマーの３’末端（ＡＲＭＳ）等に該当突然変異を含むようにプライマーを設計する選択的ＰＣＲ増幅アプローチも使用される。あるいは、試験サンプルからの配列を野生型Ｋ−ＲＡＳ配列と比較する方法（従って、シーケンシングが必要）や、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）をアッセイする方法（有用なＲＦＬＰの識別が必要であり、制限ヌクレアーゼ消化やフラグメント長検出等の追加段階が必要である）もある。
【０００８】
核酸に基づく分子診断法
核酸の同定には分子診断が主流になっている。標的ポリヌクレオチドをインビトロ増幅した後に検出するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による診断は疾患、病態及び病原体に特異的な多様な核酸について開発に成功している。
【０００９】
ＰＣＲアッセイを臨床面に適用する際の重要な欠点として、バックグラウンドＤＮＡ汚染と競合基質によるＰＣＲ増幅の妨害を回避できない点が挙げられる。著しい進歩にも拘わらず、試験サンプルの汚染は依然として問題であり、外来ＤＮＡ源を除去する方法はアッセイ感度の有意低下を伴うことが多い。ＰＣＲ産物を同定及び特性決定するには単にＤＮＡシーケンシングを実施すればよいが、シーケンシングとその後の分析は手間と時間がかかる。
【００１０】
迅速なＰＣＲ産物検出と特性決定には高分解能エレクトロスプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析法（ＥＳＩ−ＦＴ−ＩＣＲ  ＭＳ）等の質量分析技術を使用することができる。少なくとも１種のヌクレオチドの個数の認知と厳密な質量の正確な測定により、約１００塩基対のＰＣＲデュプレクス産物の合計塩基組成を計算することができる（Ｍｕｄｄｉｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９８）。例えば、Ａａｓｅｒｕｄらは２本の鎖の相補性により加えられる数学的制約を使用して２本鎖合成ＤＮＡ構築物から塩基組成を導くために、高性能質量分析法により得られた正確な質量測定値を使用できることを立証した（Ａａｓｅｒｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。Ｍｕｄｄｉｍａｎらは相補的な１本鎖オリゴヌクレオチドの厳密な質量測定値から明確な塩基組成を導くことが可能なアルゴリズムを開発した（Ｍｕｄｄｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。ＷｕｎｓｃｈｅｌらはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓに由来する１６／２３Ｓ  ｒＤＮＡ中間領域から増幅したＰＣＲ産物において８９ｂｐレベルでＥＳＩ−ＦＴＩＣＲを使用し、１塩基相違する鋳型から増幅したＰＣＲ産物を分解及び同定できることを示した（Ｗｕｎｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。エレクトロスプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＥＳＩ−ＦＴ−ＩＣＲ）ＭＳを使用し、平均分子量により２本鎖５００塩基対ＰＣＲ産物の質量を決定することができる（Ｈｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。ＰＣＲ産物を特性決定するためにマトリックス支援レーザー脱着イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法も利用されている（Ｍｕｄｄｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００１１】
ポリヌクレオチドの質量分析法の例を以下に挙げる。
【００１２】
米国特許第５，９６５，３６３号はこれらの方法の質量分解能と質量精度を改善するための質量分析技術及び手法を使用し、増幅した標的核酸を分析することにより、核酸を多型についてスクリーニングする方法を開示している。
【００１３】
ＷＯ９９／１４３７５は予め選択したＤＮＡタンデムヌクレオチドリピート対立遺伝子を質量分析法により分析するのに使用する方法、ＰＣＲプライマー及びキットについて記載している。
【００１４】
ＷＯ９８／１２３５５は標的核酸を開裂してその長さを短縮し、標的１本鎖を作製し、ＭＳを使用して１本鎖短縮標的の質量を測定することにより、標的核酸の質量を質量分析法により測定する方法を開示している。標的核酸を増幅し、鎖の一方を固体支持体に結合し、第２鎖を遊離させてから第１鎖を遊離させた後にＭＳにより分析する段階を含むＭＳ分析に使用する２本鎖標的核酸の作製方法も開示されている。標的核酸作製用キットも提供されている。
【００１５】
ＰＣＴ  ＷＯ９７／３３０００は標的を１組の１本鎖非ランダム長フラグメントに非ランダムに断片化し、その質量をＭＳにより測定することにより標的核酸中の突然変異を検出する方法を開示している。
【００１６】
米国特許第５，６０５，７９８号は高速高精度質量分析計を使用し、診断目的で生体サンプル中の特定核酸の存在を検出する方法について記載している。
【００１７】
ＷＯ９８／２１０６６は質量分析法により特定標的核酸の配列を決定する方法について記載している。生体サンプル中に存在する標的核酸をＰＣＲ増幅と質量分析検出により検出する方法も開示されており、更に、制限部位とタグを付加したプライマーを使用して標的を増幅し、増幅した核酸を伸長及び開裂し、伸長した産物の存在を検出し、野生型と異なる質量のＤＮＡフラグメントの存在を突然変異の指標とすることにより、サンプル中の標的核酸を検出する方法も開示されている。質量分析法による核酸のシーケンシング方法も記載されている。
【００１８】
ＷＯ９７／３７０４１、ＷＯ９９／３１２７８及び米国特許第５，５４７，８３５号は質量分析法を使用した核酸のシーケンシング方法について記載している。米国特許第５，６２２，８２４号、５，８７２，００３号及び５，６９１，１４１号はエキソヌクレアーゼによる質量分析シーケンシング方法、システム及びキットについて記載している。
【００１９】
米国特許第７，２１７，５１０号、７，１０８，９７４号、７，２５５，９９２号、７，２２６，７３９号及びＵＳ２００４／０２１９５１７は塩基組成シグネチャを利用するための方法と組成物について記載しており、これらの場合には病原体を同定している。塩基組成シグネチャは増幅産物の分子量から決定される厳密な塩基組成であり、先ず増幅産物の分子量を質量分析法により測定した後に、分子量から塩基組成を決定することにより決定される。少なくとも１対のオリゴヌクレオチドはリボソームＲＮＡをコードする核酸の２個の別個の保存領域とハイブリダイズし、２個の別個の保存領域は可変核酸領域を挟み、増幅されると、病原体の特徴である塩基組成「シグネチャ」を形成する。塩基組成シグネチャをデータベースに保存されたシグネチャとマッチさせることにより病原体を決定する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第５，９６５，３６３号明細書
【特許文献２】国際公開第９９／１４３７５号
【特許文献３】国際公開第９８／１２３５５号
【特許文献４】国際公開第９７／３３０００号
【特許文献５】米国特許第５，６０５，７９８号明細書
【特許文献６】国際公開第９８／２１０６６号
【特許文献７】国際公開第９７／３７０４１号
【特許文献８】国際公開第９９／３１２７８号
【特許文献９】米国特許第５，５４７，８３５号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，６２２，８２４号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，８７２，００３号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，６９１，１４１号明細書
【特許文献１３】米国特許第７，２１７，５１０号明細書
【特許文献１４】米国特許第７，１０８，９７４号明細書
【特許文献１５】米国特許第７，２５５，９９２号明細書
【特許文献１６】米国特許第７，２２６，７３９号明細書
【特許文献１７】米国特許出願公開第２００４／０２１９５１７明細書
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｓａｍｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０００
【非特許文献２】Ａｎｄｒｅｙｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００１
【非特許文献３】Ｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００３
【非特許文献４】Ｂａｒｂａｃｉｄ，１９８７
【非特許文献５】Ｂｏｓ，１９８９
【非特許文献６】Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１
【非特許文献７】Ｐａｐａｇｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２
【非特許文献８】Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３
【非特許文献９】Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇ，２００５
【非特許文献１０】Ｇｒｉｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２
【非特許文献１１】Ｚｅｎｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７
【非特許文献１２】Ｒｏｄｅｎｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７
【非特許文献１３】Ｙａｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７
【非特許文献１４】Ａｌｍｏｇｕｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８
【非特許文献１５】Ｈｒｕｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３
【非特許文献１６】Ｓｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８
【非特許文献１７】Ｌａｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２
【非特許文献１８】Ｂｕｒｍｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｅｂ，１９８９
【非特許文献１９】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５
【非特許文献２０】Ｏｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７
【非特許文献２１】Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３
【非特許文献２２】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７
【非特許文献２３】Ｂｅｚｉｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１
【非特許文献２４】Ｍｕｄｄｉｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９８
【非特許文献２５】Ａａｓｅｒｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６
【非特許文献２６】Ｍｕｄｄｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７
【非特許文献２７】Ｗｕｎｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８
【非特許文献２８】Ｈｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６
【非特許文献２９】Ｍｕｄｄｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９
【発明の概要】
【００２２】
第１の側面において、本発明は試験サンプル中のヒトＫ−ＲＡＳのコドン１２又は１３における突然変異の有無の識別方法であって、
試験サンプルを準備する段階と；
セットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ（ここで、
セットＡは配列番号１の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＢは配列番号２の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＣは配列番号２の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５の核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＤは配列番号３の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含む）から構成される群から選択されるプライマー対セットを含む反応混合物を形成する段階と；
混合物を増幅条件に付し、増幅産物を生成する段階と；
増幅産物の分子量を測定する段階と；
増幅産物の分子量をデータベース中の標的配列の分子量計算値又は測定値と比較し、ヒトＫ−ＲＡＳのコドン１２又は１３における突然変異の有無を識別する段階を含む方法に関する。
【００２３】
第２の側面において、本発明は試験サンプル中のヒトＫ−ＲＡＳのコドン１２又は１３における突然変異の有無の識別方法であって、
試験サンプルを準備する段階と；
セットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ（ここで、
セットＡは配列番号１の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＢは配列番号２の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＣは配列番号２の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５の核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＤは配列番号３の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含む）から構成される群から選択されるプライマー対セットを含む反応混合物を形成する段階と；
混合物を増幅条件に付し、増幅産物を生成する段階と；
増幅産物の塩基組成を決定する段階と；
増幅産物の塩基組成をデータベース中の標的配列の塩基組成計算値又は測定値と比較し、ヒトＫ−ＲＡＳのコドン１２又は１３における突然変異の有無を識別する段階を含む方法に関する。
【００２４】
第１及び第２の側面の方法のいずれにおいても、標的配列の識別は増幅産物のシーケンシングを含まず、質量分析法はフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析法（ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ）又はエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析法（ＥＳＩ−ＴＯＦ）等の飛行時間型質量分析法（ＴＯＦ−ＭＳ）とすることができる。更に、第１及び第２の側面のいずれにおいても、プライマーセットは少なくとも１種のヌクレオチドアナログを含むことができ、前記ヌクレオチドアナログは例えばイノシン、ウリジン、２，６−ジアミノプリン、プロピンＣ及びプロピンＴである。どちらの側面の増幅産物も更に炭素同位体（例えば１３Ｃ）等の分子量修飾タグを付加することができる。コドン１２又は１３における突然変異の検出は結腸直腸、非小細胞肺、卵巣、胆管、膵臓、食道、乳房、甲状腺及び子宮内膜癌もしくは腫瘍、又はＫ−ＲＡＳのコドン１２もしくは１３における突然変異に相関する他の任意癌もしくは腫瘍から構成される群から選択される癌に相関する。
【００２５】
第３の側面において、本発明は試験サンプル中のヒトＫ−ＲＡＳのコドン１２又は１３における突然変異の有無の識別方法であって、
試験サンプルを準備する段階と；
セットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ（ここで、
セットＡは配列番号１の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＢは配列番号２の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＣは配列番号２の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＤは配列番号３の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含む）から構成される群から選択されるプライマー対セットを含む反応混合物を形成する段階と；
混合物を増幅条件に付し、増幅産物を生成する段階と；
増幅産物の分子量を測定する段階と；
増幅産物の分子量をデータベース中の標的配列の分子量計算値又は測定値と比較し、ヒトＫ−ＲＡＳのコドン１２又は１３における突然変異の有無を識別する段階を含む方法に関する。
【００２６】
第４の側面において、本発明は試験サンプル中のヒトＫ−ＲＡＳのコドン１２又は１３における突然変異の有無の識別方法であって、
試験サンプルを準備する段階と；
セットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ（ここで、
セットＡは配列番号１の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＢは配列番号２の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＣは配列番号２の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＤは配列番号３の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含む）から構成される群から選択されるプライマー対セットを含む反応混合物を形成する段階と；
混合物を増幅条件に付し、増幅産物を生成する段階と；
増幅産物の塩基組成を決定する段階と；
増幅産物の塩基組成をデータベース中の標的配列の塩基組成計算値又は測定値と比較し、ヒトＫ−ＲＡＳのコドン１２又は１３における突然変異の有無を識別し、Ｋ−ＲＡＳ突然変異を少なくとも１種の癌又は腫瘍に相関させる段階を含む方法に関する。
【００２７】
第３及び第４の側面の方法のいずれにおいても、標的配列の識別は増幅産物のシーケンシングを含まず、質量分析法はフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析法（ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ）又はエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析法等の飛行時間型質量分析法（ＴＯＦ−ＭＳ）とすることができる。更に、第３及び第４の側面のいずれにおいても、プライマーセットは少なくとも１種のヌクレオチドアナログを含むことができ、前記ヌクレオチドアナログは例えばイノシン、ウリジン、２，６−ジアミノプリン、プロピンＣ及びプロピンＴであり、反応混合物は少なくとも２個のプライマーセットを含む。どちらの側面の増幅産物も更に分子量修飾タグを付加することができる。コドン１２又は１３における突然変異の検出は結腸直腸、非小細胞肺、卵巣、胆管、膵臓、食道、乳房、甲状腺及び子宮内膜の癌もしくは腫瘍、又はＫ−ＲＡＳのコドン１２もしくは１３における突然変異に相関する他の任意癌もしくは腫瘍から構成される群から選択される癌に相関する。
【００２８】
第５の側面において、本発明はセットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ（ここで、
セットＡは配列番号１の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＢは配列番号２の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＣは配列番号２の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＤは配列番号３の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含む）から構成される群から選択されるプライマー対セットと；
増幅試薬
を含むキットに関する。
【００２９】
第６の側面において、本発明はセットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ（ここで、
セットＡは配列番号１の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＢは配列番号２の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＣは配列番号２の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５の核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＤは配列番号３の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含む）から構成される群から選択されるプライマー対セットと；
増幅試薬
を含むキットに関する。
【００３０】
第７の側面において、本発明はプライマー対セットに関し、前記プライマー対セットはセットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤから構成される群から選択される１種であり、
セットＡは配列番号１の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＢは配列番号２の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＣは配列番号２の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＤは配列番号３の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列一致度を有する核酸配列を含むリバースプライマーを含む。
【００３１】
第８の側面において、本発明はプライマー対セットに関し、前記プライマー対セットはセットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤから構成される群から選択される１種であり、
セットＡは配列番号１の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＢは配列番号２の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＣは配列番号２の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５の核酸配列を含むリバースプライマーを含み；
セットＤは配列番号３の核酸配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の核酸配列を含むリバースプライマーを含む。
【００３２】
本発明はＫ−ＲＡＳコドン１２及び１３における突然変異の検出を著しく簡単にする。新規プライマー対セットを使用して標的配列の増幅後、得られたフラグメントの塩基組成を質量分析法により分析し、塩基組成中に特定変異がある場合に突然変異が存在すると判定する。
【００３３】
本発明は分光技術を利用することによりその顕著な利点の一部を実現する。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の標的増幅技術により生成されたアンプリコンの厳密な塩基組成を決定するためには、エレクトロスプレーインジェクション飛行時間型質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）を使用することができる。本願に開示する発明はＫ−ＲＡＳのコドン１２−１３を挟むプライマー対セット（セットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ）を利用する。プライマーを表２に示し、これらのプライマーにより増幅される配列を表３に示す。表４はコドン１２及び１３における突然変異の非限定的な例を示し、核酸変異と、得られるアミノ酸変異を示す。表５〜８は増幅後の核酸が表４に示す各種突然変異を含むときに各プライマーセットにより増幅される配列を示す。
【００３４】
本発明は新規プライマー対セットを提供する。これらのプライマー対セットは本発明の各種Ｋ−ＲＡＳ突然変異検出法で使用することができる。１態様において、本発明は配列番号１及び４の新規プライマー対（セットＡ）を提供及び使用する。別の態様において、本発明は配列番号２及び４の新規プライマー対（セットＢ）を提供及び使用する。別の態様において、本発明は配列番号２及び５のプライマー対（セットＣ）を提供及び使用する。更に別の態様において、本発明は配列番号３及び４のプライマー対（セットＤ）を提供及び使用する。
【００３５】
【表２】
2012512665.tif 000003
【００３６】
【表３】
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【００３７】
【表４】
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【００３８】
【表５】
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【００３９】
【表６】
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【００４０】
【表７】
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【００４１】
【表８】
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【００４２】
別の態様では、プライマーセットを増幅条件に付し、第１のサイクルでは反応混合物を少なくとも１種の核酸ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ）と共に９４℃で１０秒間後、５５〜６０℃で２０秒間、次いで７２℃で２０秒間インキュベートする。サイクルを複数回（例えば４０サイクル）反復することができる。反応混合物を４０℃に維持する最終サイクルを加えることができる。これらの条件は必要に応じて当業者が容易に調節することができる。増幅条件については追って詳述する。
【００４３】
増幅後、反応混合物をＥＳＩ−ＭＳ等の分光分析に付す。サンプルを分光計に注入後、任意増幅産物の分子量又は対応する「塩基組成シグネチャ」（ＢＣＳ）を決定し、分子量又はＢＣＳのデータベースにマッチさせる。ＢＣＳはアンプリコンを識別する生体物質の分子量から計算された厳密な塩基組成である。ＢＣＳは核酸の有用な指標を提供する。ＢＣＳは塩基配列ではなく、核酸の核酸塩基組成（例えばＡ，Ｇ，Ｃ，Ｔ）を表すという点が核酸配列と異なる。従って、本願方法は迅速なスループットを提供し、検出と識別に増幅後の標的配列の核酸シーケンシングを必要としない。更に、分離した配列を単なるゲル染色により検出するか、あるいは検出ラベルを含むプローブとのハイブリダイゼーションにより検出するかに関係なく、検出後にゲル電気泳動等の時間のかかる分離技術を実施する必要がなくなる。本発明の方法では、Ｋ−ＲＡＳのコドン１２及び１３における突然変異を単純な検出段階とデータベース照会によりサンプル中で検出することができる。
【００４４】
１態様では、ヒト等の哺乳動物とすることができる対象からサンプルを採取する。サンプルは一般に腫瘍又は腫瘍もしくは癌細胞を含む疑いのある組織から採取される。
【００４５】
定義
「特異的にハイブリダイズする」とは、核酸が第２の核酸と検出可能且つ特異的に結合できることを意味する。ポリヌクレオチドは非特異的核酸との相当量の検出可能な結合を最小限にするハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で標的核酸鎖と特異的にハイブリダイズする。
【００４６】
「標的配列」又は「標的核酸配列」とは、Ｋ−ＲＡＳ遺伝子のコドン１２又は１３を含む核酸配列、あるいはポリヌクレオチドプライマーセットＡ、Ｂ、Ｃ又はＤの１種以上を使用して増幅、検出又は増幅検出されるその相補配列を意味する。更に、標的配列なる用語は２本鎖核酸配列を意味する場合もあるが、標的配列は１本鎖でもよい。標的が２本鎖の場合には、本発明のポリヌクレオチドプライマー配列は標的配列の両方の鎖を増幅することが好ましい。特定生物に多少なりとも特異的な標的配列を選択することができる。例えば、標的配列は属全体、２種以上の属、種もしくは亜種、血清群、栄養要求型、血清型、株、単離株又は生物の他のサブセットに特異的であり得る。
【００４７】
「試験サンプル」とは対象又は体液から採取したサンプルであって、Ｋ−ＲＡＳ標的配列を含んでいる可能性のあるサンプルを意味する。試験サンプルは任意ソース（例えば組織、血液、唾液、喀痰、粘液、汗、尿、尿道スワブ、子宮頸部スワブ、泌尿・生殖器スワブ又は肛門スワブ、結膜スワブ、水晶体液、脳脊髄液等）から採取することができる。試験サンプルは（ｉ）ソースから採取したまま使用してもよいし、（ｉｉ）サンプルの特徴を改変するように前処理後に使用してもよい。従って、例えば、血液から血漿又は血清の調製、細胞又はウイルス粒子の破壊、固体材料から液体の調製、粘液の希釈、液体濾過、試薬添加、核酸精製等により試験サンプルを前処理することができる。
【００４８】
「対象」とは哺乳動物、鳥類又は爬虫類を包含する。対象はウシ、ウマ、イヌ、ネコ又は霊長類とすることができる。対象はヒトが好ましい。対象は生体でも死体でもよい。
【００４９】
「ポリヌクレオチド」とは、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、又はＲＮＡもしくはＤＮＡミメティクス（例えばＰＮＡ）、並びにその誘導体及びそのホモログの核酸ポリマーである。従って、ポリヌクレオチドは天然ヌクレオ塩基、糖及び共有的ヌクレオシド間（主鎖）結合から構成されるポリマーと、同様に機能する非天然部分をもつポリマーを包含する。このような修飾又は置換核酸は当分野で周知であり、本発明の趣旨では「アナログ」と呼ぶ。オリゴヌクレオチドは一般に約１０ヌクレオチドから約１６０又は２００ヌクレオチドまでの短いポリヌクレオチドである。
【００５０】
第１のポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドに対して配列一致度を有すると言う場合には、ポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドに対して少なくとも約６０％の核酸配列一致度、より好ましくは少なくとも約６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％の核酸配列一致度を有することを意味する。
【００５１】
核酸配列に関する「核酸配列一致度百分率（％）」は該当配列を整列させ、必要に応じて最大の配列一致度百分率に達するようにギャップを導入後に該当配列中のヌクレオチドと一致する候補配列中のヌクレオチドの百分率として定義される。核酸配列一致度％を決定する目的での整列は例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公共入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して当業者に公知の各種方法により実施することができる。当業者は比較する配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意アルゴリズムを含めてアラインメントの測定に適したパラメータを決定することができる。
【００５２】
ヌクレオチド配列を整列させる場合には、所定核酸配列Ｄに対する所定核酸配列Ｃの核酸配列一致度％（あるいは所定核酸配列Ｄに対して所定の核酸配列一致度％を有する所定核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算することができる：
核酸配列一致度％＝Ｗ／Ｚ＊１００
（式中、
Ｗは配列アラインメントプログラム又はアルゴリズムによるＣとＤの整列により一致マッチとしてスコアされたヌクレオチド数であり、
ＺはＤにおける合計ヌクレオチド数である）。
【００５３】
核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さに等しくない場合には、Ｄに対するＣの核酸配列一致度％はＣに対するＤの核酸配列一致度％と等しくならない。
【００５４】
「％の配列一致度を有するポリヌクレオチドから本質的に構成される」とは、ポリヌクレオチドの長さは実質的に相違しないが、配列は実質的に相違していてもよいことを意味する。従って、１００ヌクレオチドの既知配列「Ｂ」に対して少なくとも８０％の配列一致度を有するポリヌクレオチドから本質的に構成されるポリヌクレオチド「Ａ」と言う場合には、ポリヌクレオチド「Ａ」が約１００ｎｔ長であるが、２０ｎｔまでは「Ｂ」配列と相違していてもよいことを意味する。目的の二次構造を作製するために実質的に一致しない配列を付加する場合のように、例えば特定型のプローブ、プライマー及び他の分子ツール等を作製するために１〜１５ヌクレオチドを付加する等の末端修飾により、該当ポリヌクレオチド配列を延長又は短縮することができる。配列が「から本質的に構成される」と言う場合には、このような不一致のヌクレオチドは配列一致度の計算に含まない。
【００５５】
相補的フラグメントとハイブリダイズするための１本鎖ＤＮＡの特異性は反応条件のストリンジェンシーにより決定される。ＤＮＡデュプレクスを形成する傾向が減るにつれてハイブリダイゼーションストリンジェンシーは増加する。核酸ハイブリダイゼーション反応において、ストリンジェンシーは特異的ハイブリダイゼーションを助長するように選択することができる（高ストリンジェンシー）。近縁であるが、厳密ではない（相同であるが、一致しない）ＤＮＡ分子又はセグメントを識別するには低特異性ハイブリダイゼーション（低ストリンジェンシー）を使用することができる。
【００５６】
ＤＮＡデュプレクスは（１）相補的塩基対の数、（２）塩基対の種類、（３）反応混合物の塩濃度（イオン強度）、（４）反応温度、及び（５）ＤＮＡデュプレクス安定性を低下させる所定の有機溶媒（例えばホルムアミド）の存在により安定化される。一般的なアプローチは温度を変化させる方法であり、相対温度が高いほど、ストリンジェントな反応条件となる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについては、優れた説明が文献に記載されている（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。
【００５７】
「ストリンジェント条件」下のハイブリダイゼーションとは、相互に少なくとも６０％相同のヌクレオチド配列がハイブリダイズされる状態に保たれるハイブリダイゼーションプロトコルを意味する。
（例えば宿主細胞受容体にインビボ標的するための）ペプチドや、細胞膜通過を助長する物質等の他の付加基をポリヌクレオチドに付加することができる。更に、ハイブリダイゼーション誘導型開裂剤（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）やインターカレーター（Ｚｏｎ，１９８８）でオリゴヌクレオチドを修飾することもできる。オリゴヌクレオチドを別の分子（例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘導型架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘導型開裂剤等）と共役してもよい。
【００５８】
有用なポリヌクレオチドアナログとしては、修飾主鎖又は非天然ヌクレオシド間結合をもつポリマーが挙げられる。修飾主鎖としては、主鎖にリン原子を保持するもの（例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、アミノアルキルホスホロトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート）と、リン原子をもたないもの（例えば短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１個以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合により形成される主鎖）が挙げられる。修飾核酸ポリマー（アナログ）は１個以上の修飾糖部分を含むことができる。
【００５９】
ヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間結合の両方が新規基で置換されたＲＮＡ又はＤＮＡミメティクスであるアナログも有用である。これらのミメティクスでは、塩基単位は標的配列とのハイブリダイゼーションのために維持されている。優れたハイブリダイゼーション特性をもつことが示されているこのようなミメティクスの１例はペプチド核酸（ＰＮＡ）である（Ｂｕｃｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。別の例は２’及び４’グリコシド炭素が２’−Ｏ−メチレン橋により結合されたロックト核酸（ＬＮＡ）である（Ｋａｒｋａｒｅ  ａｎｄ  Ｂｈａｔｎａｇａｒ，２００６）。
【００６０】
核酸の範囲は、核酸分子が置換、化学的手段、酵素的手段又は他の適切な手段により天然ヌクレオチド以外の部分で共有結合的に修飾された誘導体を含む。
【００６１】
従って、本発明のポリヌクレオチドは標的配列（例えば配列番号１〜５の核酸配列のいずれか１種をもつ核酸分子、並びに前記核酸配列のアナログ及び／又は誘導体とそのホモログ）と特異的にハイブリダイズするプライマーを含む。本発明のポリヌクレオチドはＫ−ＲＡＳを含有するポリヌクレオチドを増幅又は検出するためのプライマーとして使用することができる。
【００６２】
配列番号１〜５のポリヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ；ＵＳＡ）、ＤｕＰｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ；ＵＳＡ）、又はＭｉｌｌｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ；ＵＳＡ）から市販されているような市販装置を使用して固相合成等の従来技術により製造することができる。ホスホロチオエートやアルキル化誘導体等の修飾ポリヌクレオチドも当分野で公知の同様の方法により容易に製造することができる（Ｆｉｎｏ，１９９５；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，１９９５；Ｒｕｔｈ，１９９０）。
【００６３】
発明の実施
本発明はＫ−ＲＡＳ核酸のコドン１２又は１３における突然変異の検出方法であって、試験サンプルを採取し；増幅試薬と配列番号１〜５のプライマー等のＫ−ＲＡＳ特異的プライマーを添加し；サンプルを増幅し；増幅した核酸（アンプリコン）がある場合には、質量分析法により分析し；得られたデータを使用してデータベースに照会する方法を含む。ＢＣＳを決定及び使用してもよいし、しなくてもよい。
【００６４】
Ｋ−ＲＡＳ核酸の増幅
サンプル中のＫ−ＲＡＳポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして配列番号１〜５のポリヌクレオチドを使用することができる。ポリヌクレオチドをプライマーとして使用し、プライマー対セットは配列番号１及び４（セットＡ）、配列番号２及び４（セットＢ）、配列番号２及び５（セットＣ）、並びに配列番号３及び４（セットＤ）である。
【００６５】
増幅方法は一般に、（ａ）核酸増幅試薬と、少なくとも１個の本発明のプライマーセットと、少なくとも１個の標的配列を含む疑いのある試験サンプルを含む反応混合物を形成する段階と；（ｂ）混合物を増幅条件に付し、標的配列が存在する場合には標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも１個のコピーを作製する段階を含む。
【００６６】
上記方法の段階（ｂ）は例えば検出段階の前に適切な任意回数反復することができ、例えば反応混合物を１０〜１００回（又はそれ以上）、一般には約２０〜約６０回、より一般には約２５〜約４５回熱サイクルに付す。
【００６７】
核酸増幅試薬としては、ポリメラーゼ活性をもつ酵素、酵素補因子（例えばマグネシウムやマンガン）；塩類；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）；及びデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ），（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ又はリボヌクレオシド三リン酸）が挙げられる。
【００６８】
増幅条件は１個以上の核酸配列のアニーリングと伸長を助長する条件である。このようなアニーリングは温度、イオン強度、配列長、相補性及び配列のＧ：Ｃ含量等の数個のパラメータにかなり予測通りに依存する。例えば、相補的核酸配列の環境内の温度が低下すると、アニーリングが助長される。一般には、診断用途では溶融温度Ｔｍよりも約２℃〜１８℃（例えば約１０℃）低いハイブリダイゼーション温度を使用する。イオン強度もＴｍに影響を与える。典型的な塩濃度はカチオンの種類と原子価に依存するが、当業者に容易に理解される。同様に、Ｇ：Ｃ含量の増加と配列長の増加によりデュプレクス形成は安定化し、Ｔｍは上昇する。
【００６９】
最後に、ハイブリダイゼーション温度はプライマーのＴｍに近似又は一致するように選択される。従って、ＰＣＲ技術の当業者であれば、特定プライマーセットに適切なハイブリダイゼーション条件を得ることできる。
【００７０】
増幅法は当分野で周知であり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、転写による増幅（ＴＭＡ）、ローリングサークル増幅、核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）が挙げられる。当業者に理解される通り、所定増幅技術で使用するには、プライマーを修飾することが必要な場合があり、例えば、ＳＤＡプライマーには一般に制限エンドヌクレアーゼの認識部位を構成する付加ヌクレオチドを５’末端近傍に付加する。ＮＡＳＢＡでは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを構成する付加ヌクレオチドをプライマーの５’末端近傍に付加することができる。こうして修飾したポリヌクレオチドも本発明の範囲に含むものとみなす。
【００７１】
本発明は単一容器フォーマットで試験サンプル中の標的核酸配列を特異的に増幅するための方法における配列番号１〜５のポリヌクレオチドの使用を包含する。
【００７２】
プライマーの化学修飾
例えばハイブリダイゼーションの効率を改善するために、プライマーを化学的に修飾することができる。例えば、ＤＮＡトリプレットの３文字目の位置には種間の保存領域の（３文字目の位置のコドンゆらぎによる）変異が起こることが多いので、この位置に対応するヌクレオチドが２個以上のヌクレオチドと結合することができる「ユニバーサル塩基」となるように配列番号１〜５のプライマーを修飾することができる。例えば、イノシン（Ｉ）はＵ、Ｃ又はＡと結合し、グアニン（Ｇ）はＵ又はＣと結合し、ウリジン（Ｕ）はＡ又はＧと結合する。ユニバーサル塩基の他の例としては、５−ニトロインドールや３−ニトロピロール等のニトロインドール類（Ｌｏａｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、縮重ヌクレオチドｄＰもしくはｄＫ（Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）、５−ニトロインダゾールを含有する非環状ヌクレオシドアナログ（Ｖａｎ  Ａｅｒｓｃｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）又はプリンアナログ１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド（Ｓａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）が挙げられる。
【００７３】
別の態様では、「ゆらぎ」塩基による多少弱い結合を補償するために、各トリプレットの１文字目と２文字目の位置が未修飾ヌクレオチドよりも高い親和性で結合するヌクレオチドアナログにより占有されるようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。これらのアナログの例としては、チミンと結合する２，６−ジアミノプリン、アデニンと結合するプロピンＴ、並びにＧと結合するプロピンＣ及びフェノキサジン（Ｇクランプを含む）が挙げられる。プロピン化ピリミジンは米国特許第５，６４５，９８５号、５，８３０，６５３号及び５，４８４，９０８号に記載されている。フェノキサジンは米国特許第５，５０２，１７７号、５，７６３，５８８号及び６，００５，０９６号に記載されている。Ｇクランプは米国特許第６，００７，９９２号及び６，０２８，１８３号に記載されている。
【００７４】
対照
本発明の方法では、例えば増幅条件が最適になるように確保するために、各種対照を設定することができる。反応には内部標準を含むことができる。このような内部標準は一般に対照標的核酸配列を含む。内部標準は場合により更に別のプライマー対を含むことができる。これらの対照プライマーの一次配列は本発明のポリヌクレオチドと無関係で対照標的核酸配列に特異的なものとすることができる。
【００７５】
本発明の関連で対照標的核酸配列は、
（ａ）特定反応で使用されるプライマーもしくはプライマー対セット又は明白な対照プライマーにより増幅することができ；
（ｂ）質量分析技術により検出される
核酸配列である。
【００７６】
アンプリコンの質量分析特性決定
質量分析法（ＭＳ）によるＰＣＲ産物の検出と特性決定にはいくつかの明白な利点がある。ＭＳは全増幅産物をその分子量により識別するので、元来放射性又は蛍光ラベルを必要としない並列検出スキームである。フェムトモル未満の量の材料しか必要としない。サンプルの分子量の正確な測定を短時間で得ることができる。サンプルを気相に変換するために各種イオン化法の１種を使用して増幅産物からインタクトな分子イオンを生成することができる。これらのイオン化法としては、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳ）、マトリックス支援レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ）及び高速原子衝突（ＦＡＢ）が挙げられる。例えば、ＷＯ９８／５４７５１には核酸のＭＡＬＤＩと、核酸のＭＡＬＤＩで使用されるマトリックスの例が記載されている。
【００７７】
イオン化後、異なる電荷をもつイオンの形成により１個のサンプルから数個のピークが観測される。１個の質量スペクトルから得られる分子量の複数の読み取り値を平均すると、アンプリコンの分子量の推定値が得られる。エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）は有意量の断片化を生じずにサンプルの多荷電分子の分布が得られるため、分子量が１０ｋＤａを上回る蛋白質や核酸等の非常に高分子量のポリマーに特に有用である。
【００７８】
本発明に適切な質量検出器としては、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ）、イオントラップ型分析計、四重極型分析計、磁気セクター型分析計、飛行時間（ＴＯＦ）型分析計、Ｑ−ＴＯＦ型分析計及び三連四重極型分析計が挙げられる。
【００７９】
一般に、本発明で使用することができる有用な質量分析技術としては、タンデム質量分析法、赤外多光子解離法及び熱分解ガスクロマトグラフィー質量分析法（ＰＧＣ−ＭＳ）が挙げられる。
【００８０】
大きなＤＮＡの分子量の正確な測定は各鎖へのＰＣＲ反応からのカチオン付加、天然に存在する１３Ｃ及び１５Ｎ同位体からの同位体ピークの分解、並びに任意イオンの電荷状態の帰属により制限される。カチオンは流れに対して垂直な電場勾配の存在下でＰＣＲ産物を含有する溶液を酢酸アンモニウムを含有する溶液と接触させるフロースルーチップを使用するインライン透析により除去される。後者２つの問題は＞１００，０００の分解能で操作し、同位体を減少させたヌクレオチド三リン酸をＤＮＡに付加することにより対処することができる。機器の分解能も考慮すべきである。１０，０００の分解能では、８４量体ＰＣＲ産物の［Ｍ−１４Ｈ＋］１４−電荷状態からのモデル化シグナルは特性決定が不良であり、電荷状態又は厳密な質量の帰属は不可能である。３３，０００の分解能では、個々の同位体成分からのピークが目に見える。１００，０００の分解能では、同位体ピークは基線まで分解され、イオンの電荷状態の帰属が簡単である。例えば、微生物を欠乏培地で増殖させ、ヌクレオチドを回収することにより、［１３Ｃ，１５Ｎ］を減少させた三リン酸塩が得られる（Ｂａｔｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。
【００８１】
タンデム質量分析法は分子種又は配列に関するより決定的な情報を提供することができる。タンデムＭＳは２段階以上の質量分析を併用するものであり、分離段階と検出段階の両方を質量分析法により実施する。第１段階を使用し、詳細な構造情報を得ることが望まれるサンプルのイオン又は成分を選択する。選択したイオンを次に例えば黒体放射、赤外多光子解離又は衝突活性化により断片化する。例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）により生成されたイオンはＩＲ多光子解離を使用して断片化することができる。この活性化はグリコシド結合とリン酸主鎖の解離をもたらし、（内部開裂後にインタクトな３’末端と５’リン酸をもつ）ｗ系列と（インタクトな５’末端と３’フランをもつ）ａ−Ｂａｓｅ系列と呼ばれる２系列のフラグメントイオンを生じる。
【００８２】
次に第２段階の質量分析を使用し、これらの得られた生成イオンフラグメントの質量を測定する。このようなイオン選択後に断片化ルーチンを複数回実施すると、サンプルの分子配列をほぼ完全に解析することができる。
【００８３】
ＰＣＲアンプリコンをＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析法により分析すると、２本鎖ＤＮＡアンプリコンの各鎖に１つずつ１対の質量が得られる。場合によっては、一方の鎖のみの分子量から明確な識別に十分な情報が得られる。他方、他の場合には、両鎖からの情報を判定することが好ましい。
【００８４】
１本鎖の分子量が２個以上のＢＣＳに一致する場合もある。相補鎖でもこのような場合がある。これらの曖昧さは相補性の付加制約を適用すると解決される。従って、Ａ２８Ｔ２４Ｇ２９Ｃ２５のＢＣＳをもつ鎖をその相補配列Ａ２４Ｔ２８Ｇ２５Ｃ２９と対合させる。一般にアンプリコンの２本の鎖の可能なＢＣＳ解のセットを比較する場合、通常は１対のみの鎖が相互の相補配列である。この対はアンプリコンのＢＣＳの唯一の解に相当し、他の潜在的な解は非相補的であるため、棄却する。
【００８５】
例えば、アンプリコンをＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析法により分析し、第１鎖の第１の質量３２．８８９．４５Ｄａと、第２鎖の第２の質量３３，０７１．４６Ｄａの２つの質量を得る。ＤＮＡ塩基の平均質量は以下の通り：
Ａ＝３１３．０５７６ａｍｕ
Ｇ＝３２８．０５２６ａｍｕ
Ｃ＝２８９．０４６４ａｍｕ；及び
Ｔ＝３０４．０４６１ａｍｕ
であると仮定する。各鎖に５つの解が考えられ、各解から質量測定値が得られる。第１鎖と第２鎖の可能な解の計算値は以下の通りである。
【００８６】
【表９】
2012512665.tif 000010
【００８７】
これらの可能な解を検証すると、相補性の制約を適用した場合に第１鎖が第２鎖の相補配列となる解は１個だけであり、即ち、第１鎖の全Ａの代わりに第２鎖ではＴが存在し、第１鎖の全Ｇの代わりに第２鎖ではＣが存在し、以下同様である。従って、唯一の解は以下の通りとなる：
第１鎖：Ａ２８Ｇ２９Ｃ２５Ｔ２４
第２鎖：Ｔ２８Ｃ２９Ｇ２５Ａ２４。
【００８８】
質量修飾「タグ」も使用することができる。質量の識別を改善するように未修飾塩基と異なる分子量をもつヌクレオチドアナログ又は「タグ」（例えば５−（トリフルオロメチル）デオキシチミジン三リン酸）を増幅中に付加する。このようなタグは例えばＷＯ９７／３３０００に記載されている。こうして任意質量に一致する可能な塩基組成の数を更に制限する。例えば、別の核酸増幅反応でｄＴＴＰの代わりに５−（トリフルオロメチル）デオキシチミジン三リン酸を使用することができる。従来の増幅産物とタグ付き産物の質量シフトの測定を使用し、各１本鎖におけるチミジンヌクレオチド数を定量する。鎖は相補的であるため、各鎖におけるアデノシンヌクレオチド数も決定される。
【００８９】
別の増幅反応では、例えばシチジンアナログである５−メチルシトシン（５−ｍｅＣ）又はプロピンＣを使用して各鎖におけるＧ及びＣ残基の数を測定する。Ａ／Ｔ反応とＧ／Ｃ反応の併用後に分子量を測定すると、唯一の塩基組成が得られる。この方法を表９にまとめる。
【００９０】
【表１０】
2012512665.tif 000011
【００９１】
表９では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓクラスターを識別するために質量タグホスホロチオエートＡ（Ａ＊）を使用した。ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定によると、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ（Ａ１４Ｇ９Ｃ１４Ｔ９）は平均ＭＷ１４０７２．２６であり、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ（Ａ１Ａ＊１３Ｇ９Ｃ１４Ｔ９）は平均分子量１４２８１．１１であり、ホスホロチオエートＡは平均分子量＋１６．０６であった。
【００９２】
別の例では、各鎖の分子量測定値が夫々３０，０００．１１５Ｄａ及び３１，０００．１１５Ｄａであり、ｄＴ及びｄＡ残基数の測定値が（３０，２８）及び（２８，３０）であると仮定する。分子量精度が１００ｐｐｍであるならば、各鎖に７種類のｄＧ＋ｄＣの組合せが考えられる。他方、分子量測定値の精度が１０ｐｐｍであるならば、ｄＧ＋ｄＣの組合せは２種類だけであり、精度が１ｐｐｍならば、各鎖に考えられる塩基組成は１種類だけである。
【００９３】
アンプリコン識別及びデータベース照会の指標としての塩基組成シグネチャ
所定の分析には分子量データから塩基組成シグネチャへの変換が有用である。「塩基組成シグネチャ」（ＢＣＳ）はアンプリコンの分子量から決定した厳密な塩基組成である。ＢＣＳは特定生物における特定遺伝子の指標を提供することができる（例えば、米国特許第７，２１７，５１０号、７，１０８，９７４号、７，２５５，９９２号及び７，２２６，７３９号参照）。
【００９４】
配列と同様に塩基組成も種内の単離株間で多少変動する。各Ｋ−ＲＡＳ突然変異について組成制約の周囲に「塩基組成確率クラウド」を設定することによりこのダイバーシティを管理することが可能である。こうして、配列分析と同様にＫ−ＲＡＳ突然変異を同定することが可能になる。塩基組成確率クラウドの概念を視覚化するために「疑似四次元プロット」を使用することができる。
【００９５】
質量分析から収集したＢＣＳを使用し、既知突然変異（例えばＫ−ＲＡＳのコドン１２及び１３について表１に示し、文献から公知の突然変異であり、突然変異は少なくとも１個の癌又は腫瘍細胞の存在に相関する）の配列からの情報を含むデータベースに照会することができる。この照会に基づき、増幅した標的配列からＫ−ＲＡＳ突然変異の種を識別することができる。
【００９６】
データベース
本発明は多数の癌及び腫瘍で突然変異していることが知られているＫ−ＲＡＳ配列も利用し、本発明のポリヌクレオチドである配列番号１〜５は突然変異領域、特にコドン１２及び１３を挟む配列とハイブリダイズするように設計される。本発明に有用なデータベースは既知Ｋ−ＲＡＳコドン１２及び１３分子量と、（プライマーセットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤにより規定される）標的配列のＢＣＳと、場合により野生型Ｋ−ＲＡＳ配列からのＢＣＳ及び質量を含む。単純なデータベースにまとめることができるデータの１例を表１０に示し、プライマーセットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤからの増幅配列（従って、配列番号６〜３７の配列が得られる；なお、増幅配列はプライマー配列自体を含む）から得られるＢＣＳ、Ｇ＋Ｃ含量及び分子量を示す。
【００９７】
【表１１】
2012512665.tif 000012
2012512665.tif 000013
【００９８】
キット
Ｋ−ＲＡＳ核酸のコドン１２及び１３における突然変異の検出を可能にするキットの一部として配列番号１〜５のポリヌクレオチドを含むことができる。このようなキットは本発明のポリヌクレオチドの１種以上を含む。１態様において、ポリヌクレオチドは試験サンプル中のＫ−ＲＡＳ核酸を特異的に増幅するためのプライマーとして併用するようにキットとして提供される。
【００９９】
Ｋ−ＲＡＳ核酸の検出用キットは更に対照標的核酸を含むことができる。キットは更に対照標的核酸配列の配列を特異的に増幅する対照プライマーを含むことができる。
【０１００】
キットは更に増幅試薬、反応成分及び／又は反応容器を含むことができる。ポリヌクレオチドの１種以上を上記のように修飾することができる。キットの成分の１種以上を凍結乾燥してもよく、キットは更に凍結乾燥物を再構成するのに適した試薬を含むことができる。キットは更に使用説明書を含むことができる。
【０１０１】
別の態様において、キットは更にＢＣＳの識別を可能にするデータベースを含むコンピュータ読取り可能な媒体を含む。場合により、コンピュータ読取り可能な媒体はデータ収集及び／又はデータベース照会を可能にするソフトウェアを含むことができる。キットは更に説明書を備えることができる。説明書は紙もしくは他の基材に印刷してもよいし、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープ等の電子読取り可能な媒体として供給してもよい。
【０１０２】
キットを供給する場合には、組成物の個々の成分を別々の容器に個装し、使用直前に混合することができる。成分のこのような個装により、活性成分の長期保存が可能になる。例えば、ポリヌクレオチドと、対照基質と、増幅酵素を別々の容器で供給する。
【０１０３】
キットに含まれる試薬は各成分が保存され、容器の材料に吸着したり、変性を受けないような任意種類の容器で供給することができる。例えば、密閉ガラスアンプルに窒素等の中性非反応性ガス下で充填した試薬又は緩衝液の１種以上を収容することができる。アンプルはガラス、有機ポリマー（例えばポリカーボネート、ポリエステル等）、セラミック、金属又は同様の試薬を保持するために一般に使用される他の任意材料等の任意の適切な材料から構成することができる。適切な容器の他の例としては、アンプルと同様の物質から製造することができる単純なボトルと、アルミニウムや合金等の箔裏張りを付けることができるエンベロープが挙げられる。他の容器としては、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ等が挙げられる。
【発明を実施するための形態】
【０１０４】
実施例
以下の実施例は単に例証を目的とし、請求項に記載する発明を限定するものと解釈すべきではない。同様に目的の発明を首尾よく実施することが可能な種々の代替技術及び手法が当業者に利用可能である。
【実施例１】
【０１０５】
プライマー設計
本実施例では、ヒトｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２  Ｋｒｉｓｔｅｎラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログのコドン１２及び１３における突然変異の識別を可能にするように質量分析に適した増幅産物を生成するように、ポリメラーゼ連鎖反応及び他のポリヌクレオチド増幅プロトコルで使用するのに適した４組のプライマーセットを設計した。コドン１２及び１３（どちらも野生型配列ではグリシンである）を挟むようにプライマーを設計した。
【０１０６】
ＯＬＩＧＯ  ６ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．；Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ）を使用し、以下の設計パラメータ：
２００ｎＭ  プライマー濃度
５０ｍＭ  一価カチオン
０．７ｍＭ  遊離二価カチオン
を使用して配列番号１〜５のプライマーを設計した。
【０１０７】
表２に示すようなプライマーセットＡ〜Ｄが同定された。
【実施例２】
【０１０８】
標的配列を増加するためのプライマー効力の実証（予言的）
表１に示し、表１１にもう一度示すような４組のプライマーセット、Ａ（配列番号１及び４）、Ｂ（配列番号２及び４）、Ｃ（配列番号２，５）及びＤ（配列番号３，４）をその標的配列増幅能と増幅配列検出について試験する。プライマー自体に更にイノシン、ウリジン、２，６−ジアミノプリン、プロピンＣ又はプロピンＴ等のヌクレオチドアナログを付加することができる。
【０１０９】
【表１２】
2012512665.tif 000014
【０１１０】
ＰＣＲの条件は以下の通りとする。
【０１１１】
【表１３】
2012512665.tif 000015
【０１１２】
あるいは、ＰＣＲの初期ラウンド中の偽プライミングを避けるために「ホットスタート」ポリメラーゼを使用することができる。ＰＣＲサイクリングパラメータの調節としては、標準ＰＣＲサイクリング前の熱活性化段階が挙げられる。
【０１１３】
【表１４】
2012512665.tif 000016
【０１１４】
予測される増幅産物を質量分析に付し、そのＢＣＳを決定し、各標的配列の質量及び／又はＢＣＳを含めてＫ−ＲＡＳのコドン１２及び１３における突然変異からの突然変異情報を含むデータベースに照会する。
【実施例３】
【０１１５】
質量分析法（予言的）
フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）質量分析法
機器：ＦＴ−ＩＣＲ機器は７テスラアクティブシールド磁石と、改造型Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ａｐｅｘ  ＩＩ  ７０ｅイオンオプティクス（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ；ＭＡ）と、真空チャンバーをベースとする。分光計をＬＥＡＰ  ＰＡＬオートサンプラー（ＬＥＡＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｒｂｏｒｏ，ＮＣ）及び高スループットスクリーニング用カスタム流体制御システムとインターフェースする。サンプルを約１個／分の速度で９６ウェル及び３８４ウェルマイクロタイタープレートから直接分析する。オートサンプラーを制御し、タンデムＭＳ実験用複合ｒｆ励起波形（周波数スイープ，ノイズフィルター，蓄積波形逆フーリエ変換（ＳＷＩＦＴ）等）を生成することが可能な任意波形発生器を搭載する補助データステーションを実験室で設定し、Ｂｒｕｋｅｒデータ獲得プラットフォームに追加する。典型的な性能特性としては、１００，０００（ＦＷＨＭ）を超える質量分解能、低ｐｐｍ質量測定誤差、及び５０〜５０００ｍ／ｚの動作可能なｍ／ｚ範囲が挙げられる。
【０１１６】
改造型ＥＳＩ源：サンプル限定分析では、３Ｄマイクロマニピュレータに搭載した内径３０ｍｍ溶融シリカＥＳＩエミッターに検体溶液を１５０ｎＬ／分で供給する。ＥＳＩイオンオプティクスは加熱金属毛管と、ｒｆ専用六重極と、スキマーコーンと、補助ゲート電極から構成される。６．２ｃｍ  ｒｆ専用六重極は直径１ｍｍのロッドから構成され、電圧３８０Ｖｐｐ、周波数５ＭＨｚで動作する。データステーションからのＴＴＬパルスを介して「開」位置に駆動されない限り、エレクトロスプレー流が入口毛管に流入しないようにするために、電気機械的シャッターを使用することができる。「閉」位置にあるときには、ＥＳＩエミッターとシャッターの面の間に安定なエレクトロスプレー流が維持される。シャッターアームの裏面には、入口毛管と共に真空シールを形成するように配置することが可能なエラストマーシールを設ける。シールを外すと、シャッターが開閉いずれの位置にあるかに関係なく、シャッターブレードと毛管入口の間の１ｍｍのギャップにより、外部イオンレザバーに一定の圧力が得られる。シャッターを駆動すると、イオンの「タイムスライス」が入口毛管に導入された後に、外部イオンレザバーに蓄積される。イオンシャッターの応答時間が短い（＜２５ｍｓ）ため、ユーザーにより決定される再現可能な間隔でイオンを外部イオンレザバーに注入及び蓄積することができる。
【０１１７】
赤外多光子解離用装置：タンデムＭＳ用赤外多光子解離（ＩＲＭＰＤ）を可能にするように、１０．６μｍで動作する２５ワットＣＷ  ＣＯ２レーザーを分光計とインターフェースする。レーザービームを磁石の中心軸と整列させるようにアクティブシールド超伝導磁石から約１．５ｍの位置にアルミニウム光学ベンチを配置する。赤外線に適合可能な標準ミラーとキネマティックミラーマウントを使用し、収束していない３ｍｍレーザービームがＦＴ−ＩＣＲでトラップされたイオンセルのトラッピング電極の３．５ｍｍホールを直接通過し、外部イオンガイドの六重極領域を長手方向に通過し、最終的にスキマーコーンに達するように前記レーザービームを調整する。このスキームにより、（例えば該当種のＳＷＩＦＴ単離後に）トラップされたイオンセル内でｍ／ｚ選択的に赤外多光子解離（ＩＲＭＰＤ）を実施することが可能になり、あるいは外部イオンレザバーの高圧領域において広帯域モードで実施することが可能になり、ＩＲＭＰＤにより生成される準安定フラグメントイオンは中性分子との衝突により安定化され、その結果、フラグメントイオン収率と配列対応範囲が増加する。
【実施例４】
【０１１８】
試験サンプルからのコドン１２及び１３Ｋ−ＲＡＳ突然変異の存在のアッセイ（予言的）
ヒトＫ−ＲＡＳ，コドン１２及び／又は１３に突然変異をもつ疑いのある生物又は対象からのサンプルを周知方法により処理し、実施例２に示した方法等の標準方法を使用するＰＣＲによりプライマーセットＡ、Ｂ、Ｃ及び／又はＤを使用してアッセイする。実施例３に記載した装置を使用して増幅産物を質量分析法によりアッセイする。
【０１１９】
必要に応じて、例えば細胞溶解、遠心及びエタノール沈殿又は当分野で周知の他の任意技術によりサンプルから核酸を単離する。
【０１２０】
ＰＣＲ産物のＥＳＩ−ＭＳ試験で内部質量標準を使用して質量測定精度をアッセイすることができる。プライマーセットＡ、Ｂ、Ｃ及び／又はＤ  ＰＣＲ産物を含有する溶液に２０量体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド等の質量標準を添加して使用することができる。
【０１２１】
ＰＣＲ反応体及び混在する金属カチオンを除去するための段階にＰＣＲ産物を付す。ＰＣＲ産物を固体支持体に固定し、１〜５回洗浄後、ＰＣＲ産物を固体支持体から溶出させる。
【０１２２】
増幅産物を質量分析し、各標的配列の質量及び／又はＢＣＳ（例えば表９に示すデータ）を含めてプライマーセットＡ（配列番号１，４）、Ｂ（配列番号２，４）、Ｃ（配列番号２，５）及びＤ（配列番号３，４）により標的される領域からの情報を含むデータベースに照会する。
【０１２３】
【表１５】
2012512665.tif 000017
2012512665.tif 000018
2012512665.tif 000019
2012512665.tif 000020
【配列表】
2012512665000001.app
【国際調査報告】
2012512665.tif 000021
2012512665.tif 000022
2012512665.tif 000023