(57)【要約】本明細書において、ラミニン−３３２の種々のドメインに対する抗体について論じる。前記抗体は、接着およびラミニン−３３２のマトリックス結合特性を低下させ、インビボでの腫瘍の成長および転移を阻害する。診断、予防、および／または治療の目的のための、医薬組成物および前記抗体を用いる方法を開示する。一実施形態において、本発明は、ラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体を含む組成物を提供し、この抗体は、β３鎖のドメインＩＩＩ〜ＶＩに結合する。
2012530045.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体を含む組成物。
【請求項２】
前記抗体がβ３鎖のドメインＩＩＩ〜ＶＩに結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
γ２鎖に対する前記抗体がγ２鎖のドメインＩＩＩまたはドメインＶに結合する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
Ｇドメインに対する前記抗体がα３鎖のサブドメインＧ１〜Ｇ３に結合する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体およびラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
ラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体に細胞を接触させる工程を含む、転移を示している細胞の細胞移動を減少させる方法。
【請求項９】
前記抗体がβ３鎖のドメインＩＩＩ〜ＶＩに結合する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
γ２鎖に対する前記抗体がγ２鎖のドメインＩＩＩまたはドメインＶに結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
Ｇドメインに対する前記抗体がα３鎖のサブドメインＧ１〜Ｇ３に結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体およびラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
ラミニン−３３２分泌腫瘍を有する対象に有効量のラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体を投与する工程を含む、腫瘍の成長を低下させる方法。
【請求項１６】
前記抗体がβ３鎖のドメインＩＩＩ〜ＶＩに結合する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
Ｇドメインに対する前記抗体がα３鎖のサブドメインＧ１〜Ｇ３に結合する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体およびラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００８年６月１８日に出願された、米国仮特許出願第６１／０７３，６１１号（この全体は、参考として本明細書に完全に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、ラミニン−３３２の鎖上の種々のドメインに選択的に結合しうる抗体、その組成物、および種々の目的のために前記抗体／組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ラミニンは、細胞の接着、増殖、移動、および分化に関与する三量体の基底膜（ＢＭ）糖タンパク質である。ラミニン分子は、１本の重鎖（α）と２本の軽鎖（βおよびγ）とからなる十字の形をしたヘテロ三量体である。前記３本の鎖は、カルボキシル末端側のコイルドコイルドメインを介して会合している。さらに、すべてのα鎖はカルボキシル末端に大きな球状のＧドメインを有している。
【０００４】
哺乳動物において、５種類の遺伝学的に相違するアルファ（α）、３種類のベータ（β）、および３種類のガンマ（γ）鎖は、これらの鎖の少なくとも１４種類の異なる組み合わせを形成しうる（参考文献１、２（非特許文献１、２））。ラミニン−３３２（ＬＮ−３３２とも示され、ラミニン−５、ＬＮ−５、カリニン、ニーシンとしても既知）は、α３：β３：γ２の鎖組成を有し（図８）、上皮細胞の定着に必須であり、かつ上皮ＢＭに特異的に見られる（参考文献３〜５（非特許文献３〜５））。ＬＮ−３３２の欠損は、上皮の剥離および致死性の水疱形成性皮膚疾患である接合部型表皮水疱症を引き起こす（参考文献６〜８（非特許文献６〜８））。ＬＮ−３３２は、回復期創傷のケラチノサイト等における上皮細胞の増殖および動きにも関与する（参考文献９、１０（非特許文献９、１０））。α３鎖の球状ドメイン（Ｇドメイン）は、インテグリン受容体α６β４およびα３β１を介して細胞表面に結合し（参考文献１１）、焦点接着キナーゼを介して抗アポトーシスシグナルを誘起し（参考文献１２、１３）、一方でβ３およびγ２鎖の短腕は間質におけるＶＩＩ型コラーゲンに結合する（参考文献１４）。
【０００５】
ＬＮ−３３２は、結腸癌、胃癌、乳管癌、および扁平上皮癌を含む種々の上皮性癌、ならびに黒色腫において上方制御されているが（参考文献５〜１０（非特許文献５〜１０）、参考文献１１〜１８）、間葉系癌では上方制御されていない（参考文献１５、１６）。ＬＮ−３３２のγ２鎖の高発現は、子宮頸部扁平上皮癌の予後不良と相関することが分かっている（参考文献１９）。ＬＮ−３３２は、インビトロでのいくつかの腫瘍細胞株の浸潤能および転移能を促進する主要な散乱因子でもある（参考文献２０、２１）。前記癌組織において、前記タンパク質は浸潤先進部ならびに微小転移で主に発現している。ＬＮ−３３２の下方制御は、上皮性前立腺癌において（参考文献２２）および乳癌においても（参考文献２３）報告されている。
【０００６】
ＬＮ−３３２の発現は腫瘍形成と関連している。したがって、ラミニンのβ３鎖およびγ２鎖を構成的に発現しているが、α３を発現していないＨＴ１０８０腫瘍細胞にラミニンα３  ｃＤＮＡをトランスフェクションした場合、前記細胞はヌードマウスにおいて未形質転換細胞よりも有意に大きな腫瘍を成長させた（参考文献２４）。さらに、ＬＮ−３３２陰性（ならびに、α４インテグリン陰性）のケラチノサイトは、正常なケラチノサイトとは対照的に、ｒａｓ−ＩκＢαをトランスフェクションしても腫瘍形成性にならなかった（参考文献２５）。
【０００７】
ほとんどの癌は上皮性起源のものであり、かつＬＮ−３３２発現陽性であるため、本出願人らは、このタンパク質が浸潤する癌細胞の接着および移動の過程に一般的役割を有するかどうか、ならびにそれらの作用を妨げると腫瘍の成長および広がりに影響を及ぼすかどうかを調査した。特に、本出願人らは、インビトロでの癌細胞の接着および移動に対するＬＮ−３３２の役割を調べ、このタンパク質の前記細胞への結合を妨げると、これらの作用が阻害され、かつアポトーシスが誘導されることを実証した。さらに、本出願人らは、ＬＮ−３３２の細胞およびマトリックス結合ドメインに対する抗体が、インビボで成長するいくつかのタイプの癌を標的とし、かつマウスにおいて腫瘍の成長および転移を効果的に阻害することを示した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｕｍａｉｌｌｅｙ  Ｍ、Ｂｒｕｃｋｎｅｒ−Ｔｕｄｅｒｍａｎ  Ｌ、Ｃａｒｔｅｒ  ＷＧ、Ｄｅｕｔｚｍａｎｎ  Ｒ、Ｅｄｇａｒ  Ｄ、Ｅｋｂｌｏｍ  Ｐ、Ｅｎｇｅｌ  Ｊ、Ｅｎｇｖａｌｌ  Ｅ、Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅｒ  Ｅ、Ｊｏｎｅｓ  ＪＣ、Ｋｌｅｉｎｍａｎ  ＨＫ、Ｍａｒｉｎｋｏｖｉｃｈ  ＭＰら、Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ（２００５）２４：３２６〜３２
【非特許文献２】Ｍｉｎｅｒ  ＪＨ、Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ  ＰＤ．  Ｌａｍｉｎｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ（２００４）２０：２５５〜８４
【非特許文献３】Ｋａｌｌｕｎｋｉ  Ｐ、Ｓａｉｎｉｏ  Ｋ、Ｅｄｄｙ  Ｒ、Ｂｙｅｒｓ  Ｍ、Ｋａｌｌｕｎｋｉ  Ｔ、Ｓａｒｉｏｌａ  Ｈ、Ｂｅｃｋ  Ｋ、Ｈｉｒｖｏｎｅｎ  Ｈ、Ｓｈｏｗｓ  ＴＢ、Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ  Ｋ．  Ａ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｃｈａｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｂ２  ｃｈａｉｎ：  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｓｐａｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９９２）１１９：６７９〜９３
【非特許文献４】Ｇｅｒｅｃｋｅ  ＤＲ、Ｗａｇｍａｎ  ＤＷ、Ｃｈａｍｐｌｉａｕｄ  ＭＦ、Ｂｕｒｇｅｓｏｎ  ＲＥ．  Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｃｈａｉｎ、ｔｈｅ  ｌａｍｉｎｉｎ  Ｂ１ｋ  ｃｈａｉｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９４）２６９：１１０７３〜８０
【非特許文献５】Ｒｙａｎ  ＭＣ、Ｔｉｚａｒｄ  Ｒ、ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ  ＤＲ、Ｃａｒｔｅｒ  ＷＧ．  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＬａｍＡ３  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ  ３  ｃｈａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｅｐｉｌｉｇｒｉｎ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｗｏｕｎｄ  ｒｅｐａｉｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９４）２６９：２２７７９〜８７
【非特許文献６】Ａｂｅｒｄａｍ  Ｄ、Ｇａｌｌｉａｎｏ  ＭＦ、Ｖａｉｌｌｙ  Ｊ、Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎ  Ｌ、Ｂｏｎｉｆａｓ  Ｊ、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｏ  ＡＭ、Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ  Ｋ、Ｕｉｔｔｏ  Ｊ、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｊｒ  ＥＨ、Ｏｒｔｏｎｎｅ  ＪＰ、Ｍｅｎｅｇｕｚｚｉ  Ｇ．  Ｈｅｒｌｉｔｚ’ｓ  ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ  ｉｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  （ＬＡＭＣ２）  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇａｍｍａ  ２  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｎｉｃｅｉｎ／ｋａｌｉｎｉｎ  （ＬＡＭＩＮＩＮ−５）．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ（１９９４）６：２９９〜３０４
【非特許文献７】Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎ  Ｌ、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｏ  ＡＭ、Ａｉｒｅｎｎｅ  Ｔ、Ｈａａｋａｎａ  Ｈ、Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ  Ｋ、Ｕｉｔｔｏ  Ｊ．  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｍｍａ  ２  ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  （ＬＡＭＣ２）  ｏｆ  ｋａｌｉｎｉｎ／ｌａｍｉｎｉｎ  ５  ｉｎ  ｔｈｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ（１９９４）６：２９３〜７
【非特許文献８】Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎ  Ｌ、Ｕｉｔｔｏ  Ｊ．  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ．  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ（１９９９）１８：２９〜４２
【非特許文献９】Ｓａｌｏ  Ｓ、Ｈａａｋａｎａ  Ｈ、Ｋｏｎｔｕｓａａｒｉ  Ｓ、Ｈｕｊａｎｅｎ  Ｅ、Ｋａｌｌｕｎｋｉ  Ｔ、Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ  Ｋ．  Ｌａｍｉｎｉｎ−５  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｍｍａ２  ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  （ＬＡＭＣ２）  ｗｉｔｈ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ（１９９９）１８：１９７〜２１０
【非特許文献１０】Ｎｇｕｙｅｎ  ＢＰ、Ｇｉｌ  ＳＧ、Ｃａｒｔｅｒ  ＷＧ．  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｍｉｎｉｎ  ５  ｂｙ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２０００）２７５：３１８９６〜９０７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
簡単な説明
様々な態様において、ラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体を含む種々の抗体組成物を開示する。前記抗体は、β３鎖上のドメインＩＩＩ〜ＶＩに特異的に結合しうる。
【００１０】
前記抗体組成物は、ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体をさらに含んでもよい。γ２鎖に対する前記抗体は、γ２鎖上のドメインＩＩＩまたはドメインＶに結合しうる。
【００１１】
あるいは、前記抗体組成物は、ラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含んでもよい。Ｇドメインに対する前記抗体は、α３鎖のサブドメインＧ１〜Ｇ３に結合しうる。
【００１２】
他の態様において、前記抗体組成物は、ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体とラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体との両方をさらに含む。
【００１３】
また、ラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体に細胞を接触させる工程を含む、転移を示している細胞における細胞移動を減少させる方法も開示する。
【００１４】
さらに、ラミニン−３３２分泌腫瘍を有する対象に有効量のラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体を投与する工程を含む、腫瘍の成長を低下させる方法を開示する。
【００１５】
ＬＮ−３３２のα３鎖の細胞結合ドメインに対する抗体は腫瘍の成長を６８％まで阻害し、β３鎖およびγ２鎖のマトリックス結合ドメインに対する抗体は肺転移を有意に減少させた。ＬＮ−３３２抗体は、腫瘍細胞のアノイキスおよびそれに続くプログラム細胞死を誘導すると考えられる。ＬＮ−３３２抗体は、また、腫瘍細胞マトリックス相互作用を妨げることによって移動を減少させ、つまり言い換えると、前記細胞を細胞外マトリックスから解離させることによって転移を減少させる。
【００１６】
本開示のこれらおよび他の制限されない特徴を、以下により具体的に開示する。
【００１７】
本特許または出願の書類は、カラーで作成した少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を含む本特許または特許出願公報の複写物は、要請および必要な料金の支払いがあれば当該庁によって提供されるであろう。
【００１８】
以下は図面の簡単な説明であって、本明細書において開示されている例示的態様を解説する目的のために提示されるものであり、それを制限する目的のためのものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａは、本研究において用いたマウスＫＬＮ−２０５  ＳＣＣ、ならびにヒトＡ４３１  ＳＣＣ、ＳＣＣ−２５、およびＢｘＰＣ３腺癌細胞株における３本すべてのＬＮ−３３２鎖の発現を明示しているＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示している。図１Ｂは、３本すべてのＬＮ−３３２成分鎖が前記４種のＳＣＣ株によって合成されることを示しているウエスタンブロットである。分泌されたγ２鎖は、ＫＬＮ−２０５細胞について示されているように、培地中でより小さな１０５ｋＤａ型に部分的にプロセシングされていた。図１Ｃは、３本のＬＮ−３３２鎖に対するモノクローナル抗体を用いることによって、ヌードマウスにおける腫瘍の浸潤周辺において強いペルオキシダーゼ染色を示す、３つのＡ４３１腫瘍および３つのマウスＫＬＮ−２０５腫瘍を図示している。骨格筋で成長したマウスＫＬＮ−２０５腫瘍も、浸潤先進部において前記３本の鎖に対する抗体を用いた染色が強陽性であり、かつ肺転移も陽性である。倍率２００×。
【図２】図２Ａは、三量体ＬＮ−３３２に対して作られたポリクローナル抗体（Ｐａｂ−ＢＳＴ）、ならびにα３鎖のＧドメインに対するマウスｍＡｂ  ＢＭ１６５および７Ｂ２が、ｒＬＮ−３３２でコーティングしたプラスチック表面へのヒトＡ４３１、ＳＣＣ−２５、およびＢｘＰＣ３癌細胞の接着を有意に阻害したことを示している。γ２鎖の短腕のドメインＩＩＩに対するマウスｍＡｂ−４Ｇ１は、この表面への前記細胞の接着に対して有意な阻害効果を有しなかった。さらに、α３鎖のＧ１〜３サブドメインに対して作られたＰａｂ−ＢＳＴおよびＰａｂ−Ｇ１２３は、マウスＫＬＮ−２０５細胞株の接着を阻害し、一方で、β３（Ｐａｂ−２２６）およびγ２（Ｐａｂ−１４２０、Ｐａｂ−１４２５、Ｐａｂ−２６）の短腕に対するＰａｂは、ｒＬＮ−３３２でコーティングしたプラスチックへの前記細胞の接着に影響を及ぼさなかった。図２Ｂは、ｍＡｂ−７Ｂ２によるＬＮ−３３２でコーティングした表面への細胞接着の阻害が用量依存的であったことを図示しているグラフである。当該図は、ＲＴ−ＣＥＳＴＭ法によって測定された、１ウェルあたり２５，０００個のＳＣＣ−２５細胞を添加した１時間後における細胞指標を示している（各値は２ウェルの平均である）。図２Ｃは、抗α３  ｍＡｂ  ７Ｂ２およびＢＭ１６５の抗接着効果の比較であって、１ウェルあたり２５，０００個のＡ４３１細胞をプレーティングした１時間後の細胞指標の大きさによって表示されているように、ＬＮ−３２２でコーティングした表面への接着を阻害することにおいて、ｍＡｂ−７Ｂ２はＢＭ１６５より２倍強力であることを明示している（ｎ＝３，平均±ＳＥＭ）。図２Ｄは、競合的ＥＬＩＳＡアッセイの結果を図示するものであって、ｍＡｂ−７Ｂ２およびＢＭ１６５がラミニンα３鎖Ｇドメインにある種々のエピトープに結合することを明示している。ビオチン化ｍＡｂ−７Ｂ２は、ｒＬＮ−３３２でコーティングしたプラスチックに効果的に結合する（１００％）。１００倍過剰のｍＡｂ−７Ｂ２の添加により、ビオチン化７Ｂ２抗体の結合は阻害され、一方で同量のＢＭ１６５または抗ラットα３抗体であるＣＭ６は、ｒＬＮ−３３２へのｍＡｂ−７Ｂ２の結合を全く阻害しない。別の抗ヒトα３モノクローナル抗体であるＲＧ１３は、ｒＬＮ−３３２へのビオチン化ｍＡｂ−７Ｂ２の結合を部分的にのみ阻害しうる。
【図３】図３Ａは、コーティングされていない２４ウェルプレート上にプレーティングし、コンフルエントまで成長させ、その後「創傷」を生じさせた、２×１０５個のＳＣＣ−２５またはＢｘＰＣ３腺癌細胞を有するサンプルの画像である。非免疫性ＩｇＧ（図示せず）、非免疫性マウスおよびウサギＩｇＧ、またはγ２鎖の短腕に対するｍＡｂ−４Ｇ１の欠如は、２４時間の時点で観察されるように、いずれの細胞型の移動も阻害しなかった。対照的に、三量体ＬＮ−３３２全体に対して作製されたポリクローナル抗体Ｐａｂ−ＢＳＴ、ならびにα３鎖のＧドメインを標的とするｍＡｂ  ＢＭ１６５および７Ｂ２は、前記細胞の移動を効果的に阻害した。図３Ｂは、コーティングされていないプラスチック上またはＶＩＩ型コラーゲンを含有する線維芽細胞由来のマトリックス上にプレーティングした、２×１０５個のマウスＫＬＮ−２０５細胞を有するサンプルの画像である。非免疫性ウサギＩｇＧまたはＰａｂ−２２６（β３鎖）またはＰａｂ−１４２５（γ２鎖）は、コーティングされていないプラスチック上での移動に影響を及ぼさなかった。しかしながら、マウスＬＮ−３３２と反応するＰａｂ−ＢＳＴは移動を効果的に阻害し、かつ前記細胞のいくらかの解離も引き起こした。しかしながら、前記細胞を線維芽細胞由来のマトリックス上で成長させた場合、抗β３抗体は移動を完全には阻害しなかったものの、β３およびγ２の短腕に対する抗体はすべて移動を阻害した。非免疫性ウサギ血清は、移動に影響をもたらさなかった。以下の材料および方法に記載されるように、すべての移動実験において、細胞の増殖を阻止するためにマイトマイシンを添加し、細胞の位置を０および２４時間の時点で記録した。図３Ｃは、線維芽細胞由来のマトリックス上でのマウスＫＬＮ−２細胞の移動に対する、種々のＬＮ−３３２抗体に関する効果を要約しているグラフである。
【図４】図４Ａは、線維芽細胞由来のマトリックス上でのマウスＫＬＮ−２０５  ＳＣＣ細胞の移動に対する、γ２鎖に対する抗体の効果をコントロールとともに示している２つの画像である。非免疫性の血清の存在下では、前記細胞は移動の方向に広い葉状仮足を生じるが、γ２鎖のドメインＶを標的とするＰａｂ−１４２５抗体の添加により、葉状仮足の形成は完全に阻害される。線維芽細胞由来のマトリックス上で移動するＫＬＮ−２０５細胞の表現型の変化を検出するために、０．００４単位／ｍｌのローダミン−ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒ−４１５）を用いてアクチン線維を染色し、ヘキスト染色で細胞核を染色した。矢印は、葉状仮足が陽性または陰性の細胞の周辺を指し示している。倍率４００×。図４Ｂは、マウスＫＬＮ−２０５  ＳＣＣ細胞の形に対する、γ２鎖に対する抗体の効果を要約しているグラフである。
【図５】図５Ａは、腫瘍を持つマウスに静脈内注射し、その後、腫瘍を切り出し、組織／腫瘍切片を標識二次抗体で染色した、ＬＮ−３３２全体または個々のラミニン鎖に対する抗体を示している一連の画像である。α３鎖に対するｍＡｂ−７Ｂ２はヌードマウスにおけるＡ４３１腫瘍を標的とし、一方で非免疫性マウス血清はインビボで腫瘍細胞を標的としない。ウサギポリクローナル抗ヒト・ラミニンγ２鎖抗体（Ｐａｂ−２６）は、腰筋で成長するマウスＫＬＮ−２０５原発腫瘍またはその肺転移を効果的に標的とする。正常ウサギＩｇＧは、腫瘍または他のマウス組織を標的としない。倍率２００×。図５Ｂは、２×１０５個の細胞を３０匹のヌードマウスの背側頸部領域に皮下注射した実験の結果を図示しているグラフである。３日目から２４日目まで、マウスをＢＭ−１６５、ｍＡｂ−７Ｂ２、またはＰＢＳで週に２回処理し、次いでそれらを殺処分する３８日目までさらに観察し、分析した。腫瘍の成長は、抗α３鎖抗体の注射後に統計的に有意に低下した。腫瘍サイズをｍｍ３で提示し、棒は＋／−ＳＥＭを表す。矢印は、抗体の注射の時間を表示している。図５Ｃは、抗体の処理を腫瘍容積が５０〜１００ｍｍ３である１４日目に最初に開始し、次いでｍＡｂ  ７Ｂ２またはＰＢＳで処理した、確立した腫瘍に関する試験の結果を示している。その他の点では、手順は図５Ｂにおけるもののとおりである。図５Ｄは、腫瘍の移植のために１匹のマウスあたり４×１０５個のＫＬＮ−２０５細胞を３０匹のマウスに皮下注射した、確立したマウスの腫瘍に関する試験の結果を示している。抗体または抗体混合物（Ｐａｂ−ＢＳＴ、Ｐａｂ−１４２５、およびＰａｂ−２２６）の処理を、腫瘍容積が約２０ｍｍ３である７日目に開始し、２４日目まで続けた。試験は２８日目に終了した。
【図６】図６Ａは、マウスにおける浸潤性癌細胞の転移に対する、ＬＮ−３３２抗体の効果を示している６つの画像である。ＫＬＮ−２０５癌細胞を、ＰＢＳのみとともに、あるいはＬＮ−３３２全体またはβ３およびγ２鎖の短腕に対する抗体とともに静脈内注射した。処理期間の後、肺を取り出し、転移についての分析にかけた。ＬＮ−３３２全体（マウス５１および５２）、ならびにβ３およびγ２鎖の短腕（マウス５９および６０）の両方に対する抗体は、媒剤のみ（マウス４８および４９）で処理したマウスと比較して、肺における転移の形成を効果的に阻害する。図６Ｂは、図６Ａの肺葉からの組織切片を示している。ＨＥ対比染色。図６Ｃは、肺サンプルごとの腫瘍組織の形態学的定量化である。
【図７】図７Ａは、ポリクローナル抗Ｋｉ６７を用いた早期原発腫瘍の染色であって、ＴＵＮＥＬ染色は、ＢＭ１６５またはｍＡｂ−７Ｂ２で処理した７日後に、増殖細胞の数の有意な減少および腫瘍細胞のアポトーシスの増加を示した。図７Ｂは、図７Ａで例示されているような未処理および処理した組織サンプルからの、抗Ｋｉ６７およびＴＵＮＥＬ染色の統計解析である。図７Ｃは、アポトーシスに関連したいくつかの差次的に発現した遺伝子のタンパク質−タンパク質相互作用ネットワークを示している。文献によって立証されているタンパク質相互作用のデータを、ヒトタンパク質参照データベース（Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）（ｗｗｗ．ｈｐｒｄ．ｏｒｇ）から抽出した。アポトーシスに関連した遺伝子の数は、線維芽細胞由来のマトリックス上にプレーティングし、かつ抗ＬＮ−３３２抗体で処理したＡ４３１細胞において上方制御されていた（赤）。図７Ｄは、アネキシンＶで細胞を標識した後、フローサイトメトリーによって分析したように、アポトーシス細胞の数が、正常マウスＩｇＧにさらした細胞においてよりも、ｍＡｂ−７Ｂ２で処理した細胞において２．４倍多かったことを示している。
【図８】図８は、ラミニン分子の描写である。α３、β３、および２鎖を示している。Ｃはカルボキシ末端を表し、Ｎはアミノ末端を表す。β３およびγ２鎖の構造ドメインをローマ数字で示し、α３鎖のＧドメインの５つのサブドメインを示す。Ｐａｂ−２２６は、β３鎖のドメインＩＩＩ〜ＶＩと反応した。Ｐａｂ−１４２０はγ２鎖のドメインＩＩＩと反応し、Ｐａｂ−１４２５はγ２鎖のドメインＶと反応した。ｍＡｂ−７Ｂ２はＧ１〜Ｇ３サブドメインと反応し、ｍＡｂ  ＢＭ１６５はＧドメイン全体に対して反応した。Ｐａｂ−ＰＳＴは、三量体組換え型ヒトＬＮ−３３２分子全体に対して調製された。
【図９】図９Ａは、本研究において用いた新規のポリクローナルおよびモノクローナル抗体の免疫ブロットによる特徴づけである。組換え型ＬＮ−３３２（ｒＬＮ−３３２）を６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、免疫ブロットした。三量体ＬＮ−３３２に対して調製したＰａｂ  ＢＳＴは、３本すべての鎖と反応する。α３鎖のＧドメインに対して作製されたＰａｂ−Ｇ１２、Ｐａｂ−Ｇ１２３、およびｍＡｂ−７Ｂ２は、前記鎖のプロセシングされていない型およびプロセシングされた型の両方を認識する。ｍＡｂ−７Ｅ３およびＰａｂ−２２６は、β３鎖に特異的である。γ２鎖のドメインＩＩＩに対して作製されたポリクローナル抗体（Ｐａｂ−１４２０）は、前記鎖のプロセシングされていない型およびプロセシングされた型の両方を認識するが、一方でγ２鎖のドメインＶに対するＰａｂ−１４２５は、プロセシングされていない型のみを認識する。図９Ｂは、新規の組換え型Ｇ１２、Ｇ１２３、およびβ３  ６５ｋＤフラグメントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）による分析である。１ウェルあたり５μｇの各タンパク質をロードした。クマシーブルー染色。
【図１０】図１０は、マウスＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞によるＶＩＩ型コラーゲンα１鎖の発現を示している。ＲＴ−ＰＣＲ解析は、本研究で用いたマウスＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞におけるＶＩＩ型コラーゲンα１鎖（Ｃｏｌ７Ａ１）の発現を明示している。ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子の発現をコントロールとして示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
添付の図を参照することによって、本明細書に開示される組成物および方法のより完全な理解が得られる。これらの図は、本開示を実証する便宜性および容易性に基づいた概略図に過ぎず、したがって、例示的態様の範囲を定義および制限することを意図するものではない。
【００２１】
明確性のために以下の説明には特定の用語が使用されているが、これらの用語は図中の解説のために選択された態様の特定の構造のみを表すことを意図するものであって、本開示の範囲を定義および制限することを意図するものではない。図および以下の説明において、類似した数字表示は類似した作用の要素を表すものであると理解されるべきである。
【００２２】
本開示は、ラミニン−３３２に結合することによって腫瘍の成長および転移を阻害するのに有用な抗体を含む組成物に関する。この結合は、ラミニン−３３２に依存する腫瘍細胞の接着および移動を阻害する。
【００２３】
抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）単量体を表す。各Ｉｇ単量体は、一緒に接合している２本の重鎖と２本の軽鎖とからなり、Ｙの形を形成する。各Ｉｇ単量体は、当該技術分野において既知であるように、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメントに分割することができる。抗体は、機能的に定義づけられたかなりの期間（すなわち、結合と関連した生理学的反応を誘導、促進、増強、または調節するのに十分な時間）、典型的な生理的条件下で所望の抗原に結合する能力を有する。本明細書において用いられる「抗体」という用語は、完全な抗体分子、すなわちＩｇ単量体、およびエピトープに結合しうるそのフラグメントを表すと意図される。
【００２４】
図８はラミニン−３３２分子の略図であり、各鎖上の種々のドメインを意味するラベル付きで３本の鎖を示している。特に、３本すべての鎖のドメインＩおよびＩＩは、コイルドコイルドメイン構造を含むと考えられる。ドメインＩＩおよびＩＩＩのコイルドコイル領域の間には、柔軟性のあるヒンジ領域がある。
【００２５】
態様において、抗体組成物はラミニン−３３２の鎖、特にラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体を含む。特定の態様において、前記抗体は、β３鎖のアミノ末端にあるβ３鎖のドメインＶＩを介してドメインＩＩＩに選択的に結合する。実施例において論じられている例示的抗体には、Ｐａｂ−２２６およびｍＡｂ−７Ｅ３が含まれる。
【００２６】
前記抗体組成物は、ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体をさらに含んでもよい。特に、γ２鎖に対するこれらの抗体は、γ２鎖上のドメインＩＩＩまたはドメインＶに選択的に結合する。実施例において論じられている例示的抗体には、Ｐａｂ−１４２０、Ｐａｂ−１４２５、４Ｇ１、６Ｃ１２、およびＰａｂ−２６が含まれる。
【００２７】
前記抗体組成物は、あるいは、ラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含んでもよい。Ｇドメインに対するこれらの抗体のいくつかは、α３鎖のサブドメインＧ１〜Ｇ３に選択的に結合しうる。実施例において論じられている例示的抗体には、ＢＭ１６５、ＲＧ１３、ｍＡｂ−７Ｂ２、およびＰａｂ−Ｇ１２が含まれる。
【００２８】
ある態様において、前記抗体組成物は、ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体およびラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体のいずれかまたは両方とともに、ラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体を含む。
【００２９】
あるいは、前記抗体組成物は、ラミニン−３３２のγ２鎖に対する単離または精製した抗体等の抗体を含む。
【００３０】
あるいは、前記抗体組成物は、ラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する単離または精製した抗体等の抗体を含む。
【００３１】
「選択的に結合する」という用語は、特定の領域または標的内に包含される１または複数のエピトープに対する抗体の優先的結合を表す。一般的に、前記抗体は他のエピトープに対してほとんど結合性または反応性を有しないものである。
【００３２】
β３鎖、２鎖、および／またはα３鎖のＧドメインに対する抗体は、それぞれモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってよい。それらはキメラ抗体、すなわち、異なる抗体由来の領域を組み合わせることによって形成された抗体であってもよい。それらはヒト化された、すなわち、ある領域がヒトにおける免疫反応を低減または回避するように変異しているヒトでない種に由来するものであってもよい。あるいは、前記抗体は、完全にヒトの、すなわち、ヒトの生殖細胞系に由来するものであってもよい。前記抗体は、単離または精製されていてもよい。
【００３３】
本開示の抗体組成物の実際の投与量レベルおよび投与様式は、特定の患者に対して効果的な治療反応を実現するために多様であってよい。「治療上有効な量」という語句は、任意の医療に適用可能な妥当な効果／リスク比で疾患を治療するための、化合物の十分な量を意味する。しかしながら、本開示の抗体および組成物の１日あたりの総使用量は、適切な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されるであろうことは理解されるであろう。本開示の抗体組成物の１日あたりの総投与量は、約０．０００１〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であってよい。所望の場合には、有効な１日あたりの投与量を投与の目的のために複数回の投与に分けることもでき、その結果として、単回投与の組成物は、１日あたりの投与量を補うような量またはその約数を含有するものであってよい。任意の特定の患者に対する具体的な治療上有効な投与レベルは、治療される疾患および疾患の重症度、患者の病歴、使用される特定化合物の活性、使用される特定化合物、患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別および食事、投与の時間、投与経路、治療期間、排泄率、併用される他の薬剤等を含む様々な要素によって決まるであろう。
【００３４】
本開示の抗体組成物の投与様式は、経口、直腸、静脈内、筋肉内、嚢内、膣内、腹腔内、口腔（ｂｕｃａｌ）、皮下、胸骨内、鼻腔内、または局所的であってよい。前記組成物を、カテーテル、冠動脈内ステント（微細な金網で構成されている管状デバイス）、生分解性ポリマー、または、抗体、ビオチン−アビジン複合体等を含むがそれに制限されない生物学的キャリアを介して標的部位に運ぶこともできる。局所投与のための投薬形態は、粉末、噴霧、軟膏、および吸引を含む。前記抗体を、無菌状態の下で医薬上許容されるキャリアおよび任意の必要とされる防腐剤、緩衝剤、または推進剤と混合する。眼科用（Ｏｐｔｈａｌｍｉｃ）製剤、眼軟膏剤、粉末、および溶液も本開示の範囲内であると見なされる。好ましくは、前記抗体組成物は、静脈内または皮下に投与される。
【００３５】
前記抗体を、固形（顆粒、粉末、または坐薬を含む）あるいは液状（例えば、溶液、懸濁液、または乳濁液）に調製することができる。前記抗体を、様々な溶液の状態で適用することができる。本発明に従った使用のための適切な溶液は、無菌であり、十分量の前記抗体を溶解しており、かつ提案される適用に有害でない。
【００３６】
前記抗体は、滅菌等の従来の製薬工程にかけることができ、かつ／または防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤等の従来のアジュバントを含有してもよい。
【００３７】
投与のために、前記抗体を示された投与経路に適した１または複数の医薬上許容されるキャリアと組み合わせてもよい。前記抗体を、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリジン、ならびに／またはポリビニルアルコールと混合してもよく、かつ従来的な投与のために錠剤またはカプセル化してもよい。あるいは、前記抗体を、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、エタノール、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、トラガカント・ゴム、および／または種々の緩衝剤に溶解させてもよい。他のアジュバントおよび投与様式は、製薬分野において周知である。前記キャリアまたは希釈剤は、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル等の時間減衰物質を単独で、あるいはワックスまたは当該技術分野において周知の他の物質とともに含有してもよい。
【００３８】
本開示の他の局面において、細胞移動を減少させる方法は、ラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体に細胞を接触させることによって提供される。好ましくは、接触させる細胞は腫瘍細胞または癌細胞である。本明細書においてさらに説明されているように、癌腫の浸潤先進部にある細胞は、しばしばＬＮ−３３２発現陽性である。
【００３９】
別の局面において、ラミニン−３３２分泌腫瘍を有する対象に有効量のラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体を投与する工程を含む、腫瘍の成長を低下させる方法が提供される。
【００４０】
以下の実施例は、本開示をさらに解説することを目的とするものである。実施例は実例に過ぎず、本明細書に示した物質、条件、または工程のパラメーターに対する開示に従って作られたデバイスを制限することを意図するものではない。
【実施例】
【００４１】
材料および方法
細胞
ヒト類表皮癌細胞株Ａ４３１（カタログ番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５５５）、ヒト扁平上皮癌（ＳＣＣ）細胞株ＳＣＣ−２５（カタログ番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６２８）、ヒト腺癌細胞株ＢｘＰＣ３（カタログ番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６８７）、ヒトＢＪ線維芽細胞（カタログ番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５２２）、およびマウスＳＣＣ細胞株ＫＬＮ−２０５（カタログ番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４５３）、およびマウス線維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３（カタログ番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手した。すべての細胞はＡＴＣＣによって推奨されている細胞培養培地中で単層培養として維持した。ＶＩＩ型コラーゲンの発現を調べるために用いたマウス線維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３は、１０％ＦＢＳ、抗体、および（＋）−Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム（１００μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ，米国）、コラーゲンに必須の補因子であるプロリルおよびリシルヒドロキシラーゼを補充したＤＭＥＭを用いて培養した。
【００４２】
タンパク質および抗体
組換え型ＬＮ−３３２（ｒＬＮ−３３２）、組換え型ラミニンα３  ＧドメインフラグメントＧ１２（ｒＧ１２）およびＧ１２３（ｒＧ１２３）、ならびに組換え型ラミニンβ３短腕６５ｋＤフラグメント（ｒβ３−６５ｋＤ）は、米国のＢｉｏＳｔｒａｔｕｍ，Ｉｎｃ．から入手した（米国特許第６，７０３，３６３号、補足の材料および方法を参照されたい）。
【００４３】
ポリクローナル抗体をマウスγ２のドメインＩＩＩの一部（Ｐａｂ−１４２０）およびドメインＶの一部（Ｐａｂ−１４２５）に対して生成した（図８を参照されたい）。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）４Ｇ１はデンマークのＤＡＫＯ（Ｍ７２６２）から入手し、モノクローナル抗体６Ｃ１２は以前に特徴づけされている（参考文献２６）。ｍＡｂ  ＢＭ１６５（参考文献２７）はＰａｕｌ  Ｆ．Ｇｏｅｔｉｎｃｋからのご好意により提供されたものであり、ｍＡｂ  ＣＭ６およびＲＧ１３（参考文献２８および２９）はＪｏｎａｔｈａｎ  Ｊｏｎｅｓからののご好意により提供されたものである。ｍＡｂ−７Ｂ２およびｍＡｂ−７Ｅ３を、伝統的なハイブリドーマ技術を用いることによってｒＬＮ−３３２に対して作製した。ハイブリドーマを、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、およびウエスタン解析を用いることによって特徴づけした（図９を参照されたい）。ポリクローナル抗体Ｐａｂ−２６（Ｐａｂ  γ２ＩＩＩ）は以前に特徴づけされている（参考文献１６および１９）。ポリクローナル抗体Ｐａｂ−ＢＳＴはｒＬＮ−３３２に対して、Ｐａｂ−Ｇ１２はＧドメインフラグメントのｒＧ１２に対して、およびＰａｂ−２２６はβ３短腕フラグメントのｒβ３  ６５ｋＤに対してウサギで作り、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、およびウエスタン解析を用いることによって特徴づけした（図９）。
【００４４】
細胞接着アッセイ
９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉ−ＳｏｒｐｔＴＭ，Ｎｕｎｃ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に０．１μｇ／ウェルのｒＬＮ−３３２でコーティングし、可能性のある活性結合部位を２００μｇ／ウェルの１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした。総数２０，０００〜２５，０００個のＡ４３１、ＳＣＣ−２５、またはＢｘＰＣ３細胞を各ウェルに１００μｌでプレーティングし、３７℃で２時間付着させ、次いで４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％クリスタルバイオレットで染色した。すべての抗体およびコントロールを３点のウェルで試験した。
【００４５】
リアルタイム細胞電極センサー（ＲＴ−ＣＥＳＴＭ）技術（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，サンディエゴ，カリフォルニア州）（３０）を用いて、細胞接着および抗体の阻害効果をより正確に評価した。ＡＣＥＡ  Ｅプレートを５μｇ／ｍｌのｒＬＮ−３３２を用いて３７℃で１時間コーティングし、ＰＢＳで洗浄し、可能性のある残留活性部位をＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡでブロッキングした。ウェルをＰＢＳで洗浄し、１ウェルあたり２５０００個の細胞を、種々の濃度のｍＡｂ  ７Ｂ２またはＢＭ１６５とともにまたはなしで添加した。細胞指標（参考文献３１）をそれに続く時間、連続的に測定した。
【００４６】
移動アッセイ
プラスチック上での細胞移動を調べるために、平底の２４ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に２×１０５個／ウェルのＳＣＣ−２５またはＢｘＰＣ３細胞を播種し、一晩培養した。次いで、細胞を１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）で３７℃にて２時間処理し、その後、細胞層をピペットのチップで引っかくことによって細胞層を傷つけた。創傷サイズを顕微鏡下で測定し、最も類似している創傷をアッセイに選択した。細胞移動の阻害アッセイのために、１０％ＦＣＳを含有する培地を抗体およびコントロール（５０μｇ／ｍｌ）とともにまたはなしでウェルに添加した。コントロール抗体で処理したまたは抗体処理なしのすべての細胞は、マイトマイシンＣ処理の後、適切に移動することができ、マイトマイシンＣ自体が細胞移動に影響を与えないことを確認した。細胞を３７℃で２０時間移動させ、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ（Ｄａｄｅ）で染色し、創傷を測定し、写真に撮った（Ｌｅｉｃａ  ＭＺＦＬ１１１）。
【００４７】
線維芽細胞によって産生された細胞外マトリックス上でのＫＬＮ−２０５細胞の移動を調べるために、平底の２４ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に２×１０５個／ウェルのマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞を播種し、コンフルエントまで一晩培養した。細胞外線維芽細胞マトリックスを記載されているように調製し（参考文献３２）、金属棒をウェル中に置いた。次いで、２×１０５個／ウェルのＫＬＮ−２０５細胞を播種し、コンフルエントまで一晩成長させた。細胞を１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）で２時間処理し、その後、細胞を洗浄し、創傷サイズを測定した。細胞移動の阻害をアッセイするために、１０％ＦＣＳを含有する培地を抗体およびコントロール（５０〜１００μｇ／ｍｌ）とともにまたはなしで添加した。細胞を前述のように染色後、３７℃で４６時間移動させ、創傷を測定し、写真に撮った。創傷境界線における葉状仮足構造の定量化のために、線維芽細胞マトリックス上でのＫＬＮ−２０５の細胞移動の典型的な結果を示している５〜６領域を２つの独立した試験から選択した。創傷境界線における第一層の細胞のみを計数した。１領域あたりの葉状仮足を有する細胞の数を、特定の創傷境界線における１領域あたりの細胞の総数と比較した。
【００４８】
Ｃｏｌ７Ａ１発現の解析
全ＲＮＡを、メーカーのプロトコールに従い、ＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ，ドイツ）を用いて、培養したＮＩＨ３Ｔ３細胞から抽出した。一本鎖ｃＤＮＡを、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）で合成した。ＰＣＲ反応を、ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＱＩＡＧＥＮ，ドイツ）を用いて、９５℃３０秒間、５０℃３０秒間、および７２℃４０秒間での３５回の繰り返しサイクルで実施した。Ｃｏｌ７Ａ１  ｃＤＮＡの増幅のためのプライマー配列は以下のとおりであり：Ｃ７Ｆ  ５’ｃａｇｔｃａｇｇａｃｃｃａａｇｇｇｔｇ  ３’（配列番号：１）、Ｃ７Ｒ  ５’ｔａｔｃｃｇｃａｇｃａｔａａｃｃｇｇ  ３’（配列番号：２）、マウスＣｏｌ７Ａ１  ｍＲＮＡの３’末端（４００ｂｐ）を増幅するために設計された。ポジティブコントロールとしてのＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡの一部（３４７ｂｐ）を増幅するためのプライマー配列は、ＧＡＦ  ５’ｔｃａｔｃｔｃｃｇｃｃｃｃｔｔ  ３’（配列番号：３）、ＧＡＲ  ５’ａａｃａｃｇｇａａｇｇｃｃａｔｇ  ３’（配列番号：４）であった。
【００４９】
動物実験
すべての動物実験は、フィンランドおよびデンマークの法律、ならびにデンマークのＮｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓにおける動物の人道的使用に関するガイドラインに従って実施された。前記実験は、フィンランドのオウル大学の動物実験委員会（０６４／０５）およびフィンランドのオウル地方行政局（ＯＬＨ−２００５−０３２６６／Ｙｍ−２３）によって承認された。
【００５０】
ＬＮ−３３２抗体のインビボでの腫瘍への標的を分析するため、ＫＬＮ−２０５腫瘍を持つＤＢＡ／２マウス（Ｐａｂ−２６および正常ウサギＩｇＧ）またはＡ４３１腫瘍を持つヌードマウス（ｍＡｂ−７Ｂ２および正常マウスＩｇＧ）に、マウス１匹あたりＰＢＳ中に２０μｇのＩｇＧを静脈内注射した。注射した抗体およびコントロールＩｇＧを検出するために、注射の２４時間後、腫瘍組織を切り出した。５μｍ厚の低温切開片をアセトンで固定し、非特異的結合に対してＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロッキングし、次いでＦＩＴＣ接合型抗ウサギＩｇＧまたはＦＩＴＣ接合型抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いることによって、注射した抗体の存在を調べた。
【００５１】
異種移植マウスモデルにおける免疫療法試験のために、１０週齢の雌のＮＭＲＩヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）を用いた。０日目に、ヒト類表皮癌細胞（Ａ４３１細胞株、２×１０５個／マウス）を腫瘍の移植のために３０匹の免疫不全マウスに皮下注射し、その後、前記マウスを３つのグループに分けた（１０匹／グループ）。３日目（初回投与）および処理期間の間、グループ１のマウスは、滅菌ＰＢＳ緩衝液（０．０５ｍｌ／１０ｇ）を受けた。グループ２のマウスは、ｍＡｂ  ＢＭ１６５を含むＰＢＳ（初回投与量０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で５０ｍｇ／ｋｇ、処理期間の投与量０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で２５ｍｇ／ｋｇ）を与えられた。グループ３のマウスは、ｍＡｂ−７Ｂ２を含むＰＢＳ（初回投与量０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で５０ｍｇ／ｋｇ、処理期間の投与量０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で２５ｍｇ／ｋｇ）を与えられた。治療の注射（試験アイテムを含むＰＢＳ）は２８日目まで行われた。腫瘍容積を週に２回測定し、調査は３８日目に終了した。腫瘍の最大および最小（長さ／幅）寸法（ｄ１およびｄ２）を測定し、腫瘍のおおよその容積をπ／６×ｄ１２×ｄ２（ｄ１＜ｄ２の場合）の式に従って算出した。
【００５２】
同系マウスモデルにおける免疫療法試験のために、８〜１０週齢の雄のＤＢＡ／２マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）を用いた。０日目に、マウス肺癌細胞（ＫＬＮ−２０５細胞株、４×１０５個／マウス）を腫瘍の移植のために３０匹のマウスに皮下注射し、その後、前記マウスを無作為に３つのグループに分けた（１０匹／グループ）。７日目（初回投与）および処理期間の間、グループ１のマウスは、滅菌ＰＢＳ緩衝液（０．０５ｍｌ／１０ｇ）を受けた。グループ２のマウスは、γ２およびβ３鎖の短腕に対するポリクローナル抗体の混合物を含むＰＢＳ（Ｐａｂ−１４２０、Ｐａｂ−１４２５、およびＰａｂ−２２６、すべての投与量は０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で１つの抗体あたり２５ｍｇ／ｋｇ）を受けた。グループ３のマウスは、ＬＮ−３３２のすべての鎖に対するポリクローナル抗体の混合物を含むＰＢＳ（Ｐａｂ−ＢＳＴ、Ｐａｂ−１４２５、およびＰａｂ−２２６、すべての投与量は０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で１つの抗体あたり２５ｍｇ／ｋｇ）を受けた。治療の注射（試験アイテムを含むＰＢＳ）は６回行われた。試験は２８日目に終了した。腫瘍を週に２回測定し、腫瘍容積を前述のように算出した。
【００５３】
癌転移の溢出工程に対する抗体の潜在的効果を、ＫＬＮ−２０５細胞の静脈内注射によって調べた。０日目に、マウス１匹あたり４×１０５個の細胞を、抗体またはＰＢＳ媒剤のみとともに、雄のＤＢＡ／２マウス（８〜１０週齢）に静脈内注射した。０日目および処理期間のすべての投与量は、０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で１つの抗体あたり２５ｍｇ／ｋｇであった。グループ１のマウス（３匹／グループ）は、滅菌ＰＢＳ緩衝液（０．０５ｍｌ／１０ｇ）を受けた。グループ２のマウス（４匹／グループ）は、ＬＮ−３３２のすべての鎖に対するポリクローナル抗体の混合物を含むＰＢＳ（Ｐａｂ−ＢＳＴ、Ｐａｂ−１４２５、およびＰａｂ−２２６）を受けた。グループ３のマウス（３匹／グループ）は、γ２およびβ３鎖の短腕に対するポリクローナル抗体の混合物を含むＰＢＳ（Ｐａｂ−１４２５およびＰａｂ−２２６）を受けた。治療の注射（試験アイテムを含むＰＢＳの腹腔内注射）は１１日目まで３回行われ、試験は１８日目に終了した。肺を取り出し、典型的な結果を示している肺（２匹／グループ）を転移の量に関する形態学的分析にかけた。いくつかの連続的な５μｍの組織切片（組織の深さ２００〜４００ｎｍ）を調製し、規則的な空間とすべての肺葉の良好な横断面とを有する５つの切片を、３ＣＣＤカラービデオカメラ（Ｓｏｎｙ）およびＭＣＩＤＭ４  ３．０  Ｒｅｖ．１．１ソフトウェア（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）に接続したＮｉｋｏｎ  Ｏｐｔｉｓｈｕｔ  ２顕微鏡を用いて腫瘍組織をスキャンした。肺サンプルごとの腫瘍組織の割合を、スキャンされた肺の総面積に対するスキャンされた腫瘍面積のａ％として算出した。最終的な結果を、５つすべての肺切片からの平均として算出した。
【００５４】
早期原発腫瘍におけるアポトーシスを調べるために、０日目に、ヒトＡ４３１類表皮癌細胞を腫瘍の移植のために１８匹の免疫不全マウスに皮下注射した。３日目（初回投与）および処理期間の間、グループ１のマウス（６匹）は、ＰＢＳ中の正常マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、初回投与量０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で５０ｍｇ／ｋｇ、処理期間の投与量０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で２５ｍｇ／ｋｇ）を受けた。グループ２のマウス（６匹）は、ＢＭ１６５を含むＰＢＳ（初回投与量０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で５０ｍｇ／ｋｇ、処理期間の投与量０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で２５ｍｇ／ｋｇ）を受けた。グループ３のマウス（６匹）は、ｍＡｂ−７Ｂ２を含むＰＢＳ（初回投与量０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で５０ｍｇ／ｋｇ、処理期間の投与量０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で２５ｍｇ／ｋｇ）を受けた。治療の注射（正常マウスＩｇＧまたは試験アイテムを含むＰＢＳの腹腔内注射）は１４日目まで行われた。腫瘍容積を週に２回測定した。動物を腫瘍の成長に応じて７、１０、または１４日目に個別に殺処分した。
【００５５】
マイクロアレイ
線維芽細胞マトリックス上で培養したＡ４３１細胞の発現プロファイルに対する抗体の効果を、ＤＮＡマイクロアレイ（補足の材料および方法を参照されたい）を用いて調べた。アレイデータをＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓデータベースに寄託した。受託番号Ｅ−ＭＥＸＰ−１１４１。審査担当者のアカウント：ユーザー名：Ｒｅｖｉｅｗｅｒ＿ＥＭＥＸＰ−１１４１、パスワード：１１８２８５８８５５１９７。
【００５６】
統計解析
免疫療法試験からのデータをマン・ホイットニーのＵ検定によって、ＴＵＮＥＬアッセイからのものを両側スチューデントのｔ検定によって評価した。
【００５７】
結果
癌細胞におけるＬＮ−３３２  ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現
適当なＬＮ−３３２産生細胞を識別するために、本発明者らは、４種の上皮性癌細胞株、すなわちマウスＫＬＮ−２０５扁平上皮癌（ＳＣＣ）、ヒトＡ４３１、ヒトＳＣＣ−２５、およびヒトＢｘＰＣ３腺癌における前記タンパク質の発現を検証した。ＲＴ−ＰＣＲ解析によって判断されるように、すべてがラミニンα３、β３、およびγ２鎖を発現しており（図１Ａ）、かつウエスタンブロットにより、すべての鎖が予想分子量で合成されていることが明示された（図１Ｂ）。分泌されたγ２鎖は、マウスＫＬＮ−２０５細胞株について示されているように、１５５ｋＤａ型およびプロセシングされた１０５ｋＤａ型の両方で存在していた。
【００５８】
ＬＮ−３３２陽性のマウスおよびヒト腫瘍細胞株を、それぞれＤＢＡ／２マウスの腰筋またはヌードマウスの背側頸部領域に接種した。すべての株がＬＮ−３３２陽性の腫瘍を生成し、さらにＫＬＮ−２０５細胞は肺に転移した。図１Ｃは、ヒトＡ４３１およびマウスＫＬＮ−２０５の腫瘍、周辺間質、または筋組織において、すべてのＬＮ−３３２鎖の発現がそれぞれ陰性であることを示している。前記発現は腫瘍端部で最も強かったが、腫瘍先進部からより中央でも観察された。ＫＬＮ−２０５原発腫瘍の肺転移は、ＬＮ−３３２陽性であった（図１Ｃ）。ヒトＳＳＣ−２５腫瘍は、同様のＬＮ−３３２発現を示した（図示せず）。
【００５９】
ＬＮ−３３２抗体は、インビトロでの腫瘍細胞の接着および移動に影響を与える
上皮細胞の定着は、通常、一方ではＬＮ−３３２のＧドメインのインテグリンへの結合を介して、他方ではβ３およびγ２鎖の短腕のＶＩＩ型コラーゲンのようなマトリックス分子への結合によって媒介される。これらの結合作用は、ドメイン特異的抗体によって妨げることができる。
【００６０】
ヒトＬＮ−３３２分子全体を抗原として用いて生成されたＰａｂ−ＢＳＴは、組換え型ヒトＬＮ−３３２（ｒＬＮ−３３２）でコーティングしたプラスチックへのすべての細胞株の接着を有意に阻害した（図２Ａ）。さらに、ヒトＧドメインに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＢＭ１６５およびｍＡｂ−７Ｂ２も、同様の結果を明示した。対照的に、β３およびγ２鎖の短腕に対する抗体は、このアッセイにおいてｒＬＮ−３３２への接着に影響を与えなかった（図２Ａ）。これらの結果は、ＬＮ−３３２がこれら腫瘍細胞の接着に重要であるということ、ならびに前記タンパク質の前記主要な細胞およびインテグリン結合部位がα３鎖のＧドメインに位置するという見解と一致する。三量体ｒＬＮ−３３２への接着に対するｍＡｂ−７Ｂ２の阻害効果は、用量依存的であった（図２Ｂ）。リアルタイム細胞電極センサー（ＲＴ−ＣＥＳＴＭ）技術により、細胞接着に対してｍＡｂ−７Ｂ２はＢＭ１６５よりもほぼ５０％高い阻害効果を有することが明示されており（図２Ｃ）、また競合的ＥＬＩＳＡの結果により、ｍＡｂ−７Ｂ２は少なくとも部分的にラミニンα３鎖のインテグリン結合ドメイン内の異なるエピトープを認識することが示唆される（図２Ｄ）。
【００６１】
二次元創傷治癒アッセイにおいて調査したように、ＬＮ−３３２抗体はコーティングされていないプラスチック上での前記細胞の移動を阻害した。したがって、ｍＡｂ−７Ｂ２およびＢＭ１６５（抗α３）、ｒＬＮ−３３２に対して作られたＰａｂ−ＢＳＴは、ＳＣＣ−２５、ＢｘＰＣ３、またはＫＬＮ−２０５細胞の移動を阻害したが、コントロールＩｇＧは阻害しなかった（図３Ａおよび３Ｂ）。対照的に、ラミニンγ２鎖のドメインＩＩＩ（短腕）（図３Ａ）およびβ３鎖の短腕（図示せず）に対する抗体は、このアッセイにおいて前記細胞の移動を阻害しなかった。これらの結果は、マトリックス分子が存在しない場合、ＬＮ−３３２がプラスチック上でのヒトおよびマウスの癌細胞の移動に重要であること、ならびにＬＮ−３３２産生細胞のプラスチックへの接着は、α３鎖のインテグリン結合Ｇドメインに依存するが、通常ＬＮ−３３２をコラーゲンまたは間質に存在する他の相互作用タンパク質とつなげているβ３またはγ２鎖の短腕には依存しないことを実証している。
【００６２】
上皮細胞は、通常インビボでは、ＬＮ−３３２の短腕を介してＶＩＩ型コラーゲン等の間質分子に固定されているため、本発明者らは、ＶＩＩ型コラーゲンを含有する線維芽細胞由来のマトリックス上での腫瘍細胞の移動調査を繰り返した。マトリックスの産生に用いたマウス線維芽細胞株ＮＩＨ−３Ｔ３は、ＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いることによってＶＩＩ型コラーゲンを発現することが実証された（材料および方法、図１０）。興味深いことには、前記マトリックス上で成長させたマウスＫＬＮ−２０５細胞の移動は、β３およびγ２両方の短腕に対する抗体（Ｐａｂ−２２６、Ｐ−１４２０、Ｐａｂ−１４２５）、ならびに三量体ＬＮ−３３２全体に対する抗体（Ｐａｂ−ＢＳＴ）によって強力に阻害された（図３Ｂ）。このことは、γ２鎖のドメインＩＩＩおよびＶ、ならびにβ３鎖の短腕が、移動の間、ＬＮ−３３２をマトリックスへ連結させるのに重要であることを実証している。本発明者らは、また、線維芽細胞マトリックス上でのヒトＳＣＣ−２５癌細胞の移動に対するα３、β３、およびγ２鎖に対する抗体の効果を調べ、それらは同様の阻害効果を生じた（データ示さず）。種々の抗体の移動に対する全体的効果を図３Ｃに表した。
【００６３】
ＬＮ−３３２抗体は、線維芽細胞由来のマトリックス上で成長させた細胞において、種々の細胞表現型をもたらした。したがって、インテグリン結合Ｇドメインに対する抗体によって、前記細胞の多くが集まって解離し、一方でβ３およびγ２の短腕に対する抗体（Ｐａｂ−２２６およびＰａｂ−１４２５）は、移動細胞で観察される葉状仮足の形成を阻害した（図４Ａ）。このことは、移動細胞が移動の間間質分子に結合するために前記短腕を使用することを示している。葉状仮足を有する細胞を定量化し、葉状仮足を有する細胞の数を創傷境界線における細胞の総数と比較した。コントロールＩｇＧで処理した細胞の約６５％は、創傷境界線において葉状仮足構造を有する移動表現型を示し、一方で、例えばＰａｂ−１４２５で処理した細胞の７．７％のみで葉状仮足が観察された（図４Ｂ）。
【００６４】
ＬＮ−３３２抗体は、インビボで癌腫を標的とする
ＬＮ−３３２産生腫瘍を持つマウスに、前記腫瘍およびその転移を標的とした抗ＬＮ−３３２抗体を静脈内注射した。本発明者らは、まず、皮下ヒトＡ４３１腫瘍を持つヌードマウスにα３およびγ２鎖抗体を注射した。注射の２４時間後、α３  ｍＡｂ−７Ｂ２抗体は腫瘍を効果的に標的とし（図５Ａ）、染色は主に間質成分に近接する周囲で観察された。β３およびγ２に対する抗体は、同様の腫瘍細胞の染色を示した（図示せず）。さらに、いくつかの不連続な染色が、腫瘍細胞コロニー周辺およびいくつかの単一細胞の周りに検出された。正常マウスＩｇＧは、陽性の染色を示さなかった（図５Ａ）。β３およびγ２鎖はＬＮ−３３２アイソフォームのみで存在するが、α３鎖はＬＮ−３１１（以前は、ラミニン−６）およびＬＮ−３２１（以前は、ラミニン−７）アイソフォームでも存在する（参考文献１）。ｍＡｂ−７Ｂ２は血管において弱い陽性シグナルを生じたのみであり、それがそうしたラミニンとも反応しうることを示している（データ示さず）。ｍＡｂ−７Ｂ２およびＢＭ１６５のいずれもマウスＬＮ−３３２と実際に交差反応しないため、これらの抗体の正常上皮および血管へのインビボでの潜在的ホーミングは、同系マウスモデルにおいて抗マウスα３鎖抗体を用いて今後確認されなければならない。
【００６５】
本発明者らは、次いで、ラミニンγ２鎖に対する精製ポリクローナルウサギＩｇＧまたは正常ＩｇＧを、マウスＫＬＮ−２０５原発腫瘍および肺転移を持つマウスに注射した。注射の６、２４、４８、または７２時間後にマウスを殺処分し、ＦＩＴＣ標識抗ウサギ二次抗体を用いて凍結切片をウサギＩｇＧについて調べた。注射の６時間後、コントロールＩｇＧとは対照的に、抗γ２抗体は原発腫瘍およびその肺転移を効果的に標的としていた（図５Ａ）。ＫＬＮ−２０５腫瘍組織全体にわたって染色が観察され、反応は筋肉−腫瘍接合部で最大であった。さらに、いくつかの不連続な染色が、腫瘍細胞コロニー周辺およびいくつかの個別細胞の周りに検出された。抗γ２鎖抗体の特異的位置は、注射の６時間後にすでに観察でき、それは注射後の少なくとも７日間依然として検出可能であった（データ示さず）。正常ウサギＩｇＧの注射後、腫瘍および他の組織は、標識抗ウサギ二次抗体を用いて陰性であった（図示せず）。
【００６６】
ポリクローナルＬＮ−３３２抗体は、皮膚および腸等における正常上皮ＢＭに対していくらかの標的化を示したが、染色は腫瘍におけるものほど強くなかった。本発明者らは、接合部型表皮水疱症を有する患者で、または抗体処理後４週までの間ＬＮ−３３２ノックアウトマウスで観察される腸管上皮における皮膚疱疹または異常のいかなる兆候にも決して気づかなかった。
【００６７】
抗ラミニン抗体は、インビボでのヒトＡ４３１およびマウスＫＬＮ−２０５  ＳＣＣの成長を阻害する
本発明者らは、ＬＮ−３３２抗体がインビボで腫瘍細胞の成長および広がりに影響を及ぼしうる可能性があるかどうかを調査した。ＬＮ−３３２強陽性のヌードマウスにおけるヒトＡ４３１腫瘍（異種移植モデル）およびＤＢＡ／２マウスにおけるマウスＫＬＮ−２０５腫瘍（同系転移モデル）をモデルとして用いることによって、４つの独立した試験を実施した。ＢＭ１６５およびｍＡｂ−７Ｂ２の両方ともに、Ａ４３１異種移植モデルにおいて原発腫瘍の成長の有意な阻害をもたらし、その全体的阻害は最大で６８％であった（図５Ｂ）。処理した腫瘍の腫瘍生着率は、試験２（１００％）（データ示さず）においてよりも試験１で低く（５５％）（図５Ｂ）、抗腫瘍効果が抗体処理したマウスに対する腫瘍確立の低下に部分的に起因することを示唆した。ＢＭ１６５での腫瘍の成長の阻害は、試験１で６８％（ｐ＝０．０２９）および試験２で４８％（ｐ＝０．１１３）であり、ｍＡｂ−７Ｂ２処理での阻害は、それぞれ６８％（ｐ＝０．０２３）および５１％（ｐ＝０．０２８）であった。
【００６８】
３つ目の試験において、ｍＡｂ−７Ｂ２  抗α３鎖抗体を用いた処理を、腫瘍が確立した（５０〜１００ｍｍ３）１４日目に最初に開始した。３４％（ｐ＜０．００１）のみではあるが、腫瘍の成長に対して有意な阻害効果が依然としてあった（図５Ｃ）。
【００６９】
マウスＫＬＮ−２０５腫瘍モデルを用いた４つ目の試験において、３本すべてのＬＮ−３３２鎖に対するポリクローナル抗体またはβ３およびγ２の短腕に対するもののみを用いた処理を、腫瘍生着率が１００％であり、かつ腫瘍容積が約２０ｍｍ３であった腫瘍接種の７日後に開始した。短腕抗体を用いた腫瘍の成長の阻害は約４３％であり、すべてのＬＮ−３３２鎖に対する抗体混合物を用いた阻害は約５３％であった（図５Ｄ）。
【００７０】
正常な免疫系の潜在的活性化を調べるために、Ａ４３１インビボ試験由来の、およびインビボで腫瘍にも位置するアイソタイプ適合性抗ＬＮ−３３２モノクローナル抗体で処理した正常ヌードマウス由来の血液サンプルを分析した。しかしながら、中和抗体の兆候は検出されなかった（データ示さず）。さらに、インビボで腫瘍に位置することも示されているγ２鎖ドメインＩＩＩに対するアイソタイプ適合性ポリクローナル抗体Ｐａｂ−２６（データ示さず）で処理した場合には、マウスＫＬＮ−２０５腫瘍を持つマウスにおいて、腫瘍の成長に対するわずかな阻害効果しか検出されなかった。したがって、腫瘍の成長の阻害の主なメカニズムは、おそらく例えば補体タンパク質の活性化の結果ではない。
【００７１】
重要な問題は、β３およびγ２鎖の短腕に結合するマトリックスへの結合を介して移動を妨げる抗ＬＮ−３３２抗体が、インビボでの転移の形成に影響を及ぼしうるかどうかであった。重要なことには、このことは事実であることが示された。したがって、一方では３本すべてのＬＮ−３３２鎖に対するポリクローナル抗体混合物、ならびに他方ではβ３およびγ２の短腕に対する抗体は、マウスＫＬＮ２０５細胞の静脈内注射の後、肺転移の数を約７０〜８５％まで減少させた（図６）。
【００７２】
腫瘍の成長の阻害メカニズムを理解するために、本発明者らは、抗体処理の有無での増殖およびアポトーシスのレベルについてＡ４３１腫瘍を調べた。抗体の注射（正常マウスＩｇＧ、ＢＭ１６５、またはｍＡｂ−７Ｂ２を含むＰＢＳ）を、３日目から１４日目まで（３回）与えた。動物を腫瘍の成長に応じて７、１０、および１４日目に個別に殺処分した。ポリクローナル抗Ｋｉ６７を用いた早期原発腫瘍の染色は、ＢＭ１６５またはｍＡｂ−７Ｂ２を用いた処理の７日後に、早期の腫瘍において増殖する細胞の数の有意な減少を示した（図７Ａおよび７Ｂ）。７日目のＴＵＮＥＬ染色は、腫瘍細胞のアポトーシスの増加を示した（図７Ａ）。ＢＭ１６５およびｍＡｂ−７Ｂ２で処理したマウス由来の腫瘍のアポトーシス指数（ＢＭ１６５に対して８．４８％±３．２５％，Ｐ＝０．００２およびｍＡｂ−７Ｂ２に対して８．１８％±８．４６％，Ｐ＝０．０３３）は、コントロールとして用いたマウス正常ＩｇＧで処理したマウスのもの（１．８２％±１．２８％）よりも、７日目に有意に高かった（図７Ｂ）。１４日目についても同様の結果が得られたが、３８日目のインビボ試験の最後には得られなかった（データ示さず）。
【００７３】
ＬＮ−３３２抗体によってもたらされる腫瘍の成長の阻害の分子メカニズムについて解明するために、３本すべてのＬＮ−３３２鎖に対する抗体の混合物を添加する前に、線維芽細胞由来のマトリックス上にヒトＡ４３１細胞を５時間プレーティングし、インキュベーションを１６時間続けた。前記細胞の約３０％が集まり、それらの一部は解離し、一方でコントロール細胞は付着したままであった。抗体処理したものおよびコントロール由来の細胞を、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトゲノムＵ１３３プラス２．０アレイを用いた包括的トランスクリプトーム解析にかけた。結果は、２，１３９個の遺伝子が５％の個別の有意水準で少なくとも１．５倍の変化で差次的に発現していたことを明示した。抗体処理した細胞において、総計１，２９１個の遺伝子が１．５倍またはそれ以上に上方制御されており、８４８個の遺伝子が１．５倍またはそれ以上に下方制御されていた。
【００７４】
興味深いことには、多数のアポトーシス経路の遺伝子が上方制御されていた（図７Ｃおよび補足の表１を参照されたい）。例えば、カスパーゼ３は約１０倍、ＤＮａｓｅＩは６倍、カスパーゼ４は３倍、および細胞死関連タンパク質３は２倍上方制御されていた。
【００７５】
抗ＬＮ−３３２処理後のアポトーシス細胞の割合を、アネキシンＶで細胞を標識した後、フローサイトメトリーによって分析した。図７Ｄに示されているように、アポトーシス細胞の数は、正常ヒトＩｇＧにさらした細胞においてよりも、ｍＡｂ−７Ｂ２で処理した細胞において２．４倍多かった。細胞過程の制御、インテグリン介在性シグナル経路、細胞接着、細胞成長の制御等、有意に変化する他の経路または生物学的過程が存在する。多くのこうした経路が変化するのは、二次的効果であろう。したがって、本発明者らは、観察された表現型に直接関連するアポトーシス経路に重点を置くことを選択した。したがって、当該すべての相互作用は、ヒトタンパク質参照データベース（ｗｗｗ．ｈｐｒｄ．ｏｒｇ）（３３−３５）から入手した、文献によって立証されているタンパク質−タンパク質相互作用である。
【００７６】
考察
ＬＮ−３３２は、皮膚、口腔、消化管、および結腸の扁平上皮癌、ならびに頸癌等のほとんどの上皮性腫瘍において高発現している、上皮特異的な接着および移動関連タンパク質である（参考文献１５、１６、１９、および３６〜４０）。本出願は、ドメイン特異的抗体がインビトロおよびインビボでのＬＮ−３３２の特異的作用およびＬＮ−３３２陽性の腫瘍細胞の挙動に重大な影響を及ぼしうることを示した。第一に、β３およびγ２鎖特異的抗体は間質マトリックス上でのＬＮ−３３２介在性の腫瘍細胞移動を阻害することが初めて示され、ＬＮ−３３２の間質結合作用はマトリックスを介した移動に重要であることが示唆された。第二に、α３鎖のインテグリン結合部位を遮断することによっても、ＬＮ−３３２陽性の腫瘍細胞株の接着および移動は阻害された。第三に、これらの抗体は、インビトロで前記細胞を剥離することによってアポトーシスを誘導した。第四に、重要なことには、前記抗体はインビボでＬＮ−３３２陽性のヒト腫瘍マウスを効果的に標的とした。第五に、ヒトＡ４３１およびマウスＫＬＮ−２０５癌腫を持つマウスをＬＮ３３２抗体で処理することにより、腫瘍の成長の有意な低下がもたらされた。第六に、ＫＬＮ−２０５腫瘍細胞を静脈内投与することによる肺転移の形成は、ＬＮ−３３２に対する抗体で処理することによって有意に低下した。当該結果は、前記抗体が腫瘍の成長および腫瘍の広がりの過程を両方ともに阻害しうる治療法としての可能性を有しうることを示唆している。
【００７７】
接着および移動の阻害
インビボでの腫瘍細胞の抗体介在性ＬＮ−３３２中和作用は、一方では細胞結合ドメインの、他方ではマトリックス結合ドメインの特異的遮断を要件とし、かつ前記抗体が皮膚疱疹等の正常上皮の機能障害および合併症を引き起こさないことを要件とする。本研究により、インテグリン結合Ｇドメインを標的化すると、ｒＬＮ−３３２でコーティングされたプラスチックへのＬＮ−３３２陽性細胞の接着、およびプラスチックまたは線維芽細胞由来のマトリックス上での移動が効果的に阻害されることが実証された。先行研究により、上皮細胞および癌細胞は、インテグリンα３β１およびα６β４を介してＬＮ−３３２に結合することが示されている（参考文献１１）。安定した接着ではα６β４が主要なインテグリンであるが（参考文献１１）、移動の間ではそれは主にα３β１である（参考文献４１および４２）。両方のインテグリンに対する抗体はＬＮ−３３２への結合を阻害するが、前記インテグリンに対する抗体は、種々の細胞型および組織において、多くの他のタンパク質へのそれらの受容体の結合に影響を及ぼすため、インテグリンへのＬＮ−３３２結合の特異的遮断は、ＬＮ−３３２  Ｇドメインに対する抗体を用いておそらくより効果的に達成される。
【００７８】
ＬＮ−３３２のβ３およびγ２鎖の短腕に対する抗体は、ＬＮ−３３２をコーティングしたプラスチック上での結合および移動には影響を与えなかったが、それらは線維芽細胞由来のマトリックス上での移動を遮断した。妥当な説明としては、組織においてＬＮ−３３２はその短腕を介してＶＩＩ型コラーゲンと相互作用するということ、およびこの相互作用は間質内の移動のために利用されるということである。固定フィラメントにおけるこのタイプのラミニン−間質相互作用は、ＬＮ−３３２、β３およびγ２鎖を含有するラミニン型のみに特有のものである。他のラミニンは意図的にＶＩＩ型コラーゲンに結合しない。ＬＮ−３３２はその短腕を介してＶＩＩ型コラーゲンに結合することが示されているが（参考文献１４）、両方の鎖がこの相互作用に関与するかどうかは明らかになっていない。本結果は、β３の短腕全体に対する抗体、あるいはγ２のドメインＩＩＩまたはＶに対する抗体が間質マトリックス上での移動に個別に影響を及ぼすため、両方の鎖が関係していることを強く示唆している。間質タンパク質への結合におけるγ２鎖の役割についてのさらなる証拠は、ドメインＩＩＩおよびＩＶの断片のインフレーム欠失（Ｐａｂ−１４２０抗原）によって、致死性の接合部型表皮水疱症が引き起こされる（参考文献７）ということである。ＶＩＩ型コラーゲンに加えて、γ２の短腕は、少なくともインビトロでファイブリン−２、α２β１インテグリン、ヘパリン／ヘパリン硫酸、またはシンデカン−１に結合することが示唆されているが（参考文献４３〜４６）、こうした結果がインビボで関連性があるかどうかはまだ示されていない。
【００７９】
興味深いことには、ＬＮ−３３２短腕に対する抗体は、通常移動している上皮細胞に伴う葉状仮足の形成を阻害した。葉状仮足の形成は、アクチンの極性化重合と最初の突出の発生によって開始される（参考文献４７および４８）。これはインビトロでは細胞外マトリックス相互作用を必要としないが、突出は接着性基質上に細胞をプレーティングした場合に形成される葉状仮足ほど大きくない（参考文献４９）。葉状仮足の形成および移動におけるＬＮ−３３２／ＶＩＩ型コラーゲン相互作用の役割は解明されていない。しかしながら、安定した接着性表現型から移動性表現型への移行の間、当該細胞は先端部にα３β１インテグリンを発現させた葉状仮足を形成することが示されている（参考文献４１、４２、および５０）。こうした移動は、ラット尾部の変性コラーゲン上で培養したＬＮ−３３２産生細胞によって生じた場合、α３β１およびＲａｃ１の活性化に依存的であり、かつα３インテグリン欠損ケラチノサイトはこのような条件下で葉状仮足を形成しなかった（参考文献４２）。α６β４およびα３β１インテグリンに対する抗体は、ＬＮ−３３２との相互作用を、ゆえにこの移動を遮断する。本結果により、Ｇドメインの遮断が間質マトリックス上での移動を遮断することだけでなく、短腕作用の遮断も葉状仮足形成および移動を阻害することも示された。このことは、葉状仮足の形成には、移動過程の間、インテグリン、ＬＮ−３３２、およびＶＩＩ型コラーゲン、ならびにおそらく他の間質タンパク質の一体となった相互作用が使用されることを示唆している。これは、通常インビボでの上皮および癌細胞の移動の間に生じている過程に相当しうる。
【００８０】
最終的に、本発明者らの結果により、ＬＮ−３３２分子は、細胞結合に対するＧドメインの役割に加えて、移動の間間質タンパク質に結合するためにβ３およびγ２の両方の短腕を使用すること、ならびにこれらの作用は少なくともインビトロではドメイン特異的抗体を用いて遮断されうることが示された。
【００８１】
ＬＮ−３３２抗体は、インビボで癌腫を標的とし、かつアポトーシスを誘導する
いくつかの研究により、癌腫の浸潤先進部における細胞はしばしばＬＮ−３３２発現が陽性であるということがこれまでに示されている（参考文献１５、１６、１９、３６、および３７）。本明細書において、本発明者らは、種々のＬＮ−３３２ドメインに対する抗体がインビボでそのような癌腫を容易に標的とすることを示した。さらに、本発明者らは、前記タンパク質のα３鎖上のインテグリン結合ドメインに対するｍＡｂ  ＢＭ−１６５および７Ｂ２を、腫瘍細胞の接種の３日後に注射した場合、ヌードマウスにおいてヒトＡ４３１  ＳＣＣの成長が有意に阻害されたことを示した。さらに、β３およびγ２鎖の短腕に対するポリクローナル抗体は、早期に処理を開始した場合、ＫＬＮ−２０５マウスにおける腫瘍の成長を阻害することができた。
【００８２】
インビボでＡ４３１腫瘍が成長するにつれて、その中心部は増殖するのを止め、アポトーシスが増加し、中心は壊死する。本発明者らが増殖マーカーを用いて観察したように、最も活発に増殖している細胞は腫瘍巣の周辺に位置する（データ示さず）。最近、ＡｔｓｕｍｉによってＡ４３１腫瘍巣の周辺細胞が癌発症細胞（癌幹細胞）によって濃縮されることが報告されている（参考文献５８）。ＬＮ−３３２発現はＡ４３１腫瘍巣の浸潤周辺において顕著であったため、ならびにｍＡｂ−７Ｂ２も腫瘍巣の周辺を標的とするため、本発明者らの抗体はこうした癌発症細胞を実際に標的とする可能性がある。
【００８３】
本研究および先行研究は、腫瘍形成および浸潤に対するＬＮ−３３２の重要性を実証しており、これにより、ＬＮ−３３２は癌治療のための興味深い標的となっている。Ｄａｊｅｅらは（参考文献２５）、ｒａｓ−ＩκＢαを過剰発現しているＳＣＣ細胞がＬＮ−３３２およびα６β４インテグリンの高い発現を示すこと、ならびにそうした腫瘍の成長をｍＡｂ  ＢＭ１６５またはα６β４インテグリンに対する抗体によって完全に阻害することができること、ならびにｒａｓ−ＩκＢαを過剰発現しているＬＮ−３３２またはα６β４陰性の細胞が腫瘍を形成しなかったことを示した。しかしながら、本発明者らは、本研究においてｍＡｂ  ＢＭ１６５を用いて６８％を上回る腫瘍の成長の阻害を達成しなかった。ＬＮ−３３２−間質相互作用の重要性は、非機能性ＶＩＩ型コラーゲン遺伝子を有する表皮水疱症患者由来のケラチノサイトが腫瘍を形成せず、一方でｒａｓ−ＩκＢαを過剰発現している正常ケラチノサイトが腫瘍形成性であったことを示す研究でも強調された（参考文献５１）。さらに、表皮の腫瘍形成およびＰＩ３Ｋ経路の活性化が、ＬＮ−３３２とＶＩＩ型コラーゲンの相互作用に関連していることが示されている（参考文献５２）。β３鎖のＶＩＩ型コラーゲンとの相互作用は、ＳＣＣの腫瘍形成、腫瘍浸潤の増加、およびアポトーシスからの防御に不可欠であることが示唆されている。
【００８４】
ＬＮ−３３２は、また、腫瘍細胞の悪性度に影響を及ぼし、かつヌードマウスにおけるヒト線維肉腫細胞ＨＴ１０８０の腫瘍原性（ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｃｉｔｙ）を増進させることも示されている。ＬＮ−３３２を発現するＨＴ１０８０細胞の形質転換体は、コントロール細胞よりも早く成長し、かつより大きな腫瘍を形成した（参考文献２４）。しかしながら、矛盾する結果も存在している（参考文献５３）。したがって、非浸潤性の口腔扁平上皮癌細胞ＪＨＵ−０２２−ＳＣＣにおけるＬＮ−３３２発現の抑制は、インビボでの腫瘍原性および浸潤を増進させた。
【００８５】
腫瘍の成長の阻害メカニズムは不明であるが、腫瘍細胞の周辺間質からの解離がアノイキス（参考文献５４）およびそれに続くアポトーシスを引き起こすと考えられる。間質マトリックス上で成長させ、かつインテグリン結合ドメインに対する抗体およびＬＮ−３３２の短腕に対する抗体の組み合わせで処理したＳＣＣ細胞についての本発明者らの発現解析は、これが事実でありうることを示唆した。前記細胞の移動は明らかに阻害され、かつ前記細胞は高頻度で集まり、基質から剥離した。未処理の細胞と比較して、処理した細胞では、カスパーゼ３、カスパーゼ８、ＤＮａｓｅＩ、およびプログラム細胞死タンパク質３等のカスパーゼカスケードのいくつかの成分の有意な上方制御があった。これらの所見はアノイキスに典型的なものであり、不十分または不適切な細胞−マトリックス相互作用によって誘導されるアポトーシスとして定義づけられている（参考文献５４）。インテグリン介在性の細胞接着の欠損は、何らかの形でアポトーシス経路を誘起するが、ＬＮ−３３２への細胞の安定的な結合は、焦点接着キナーゼ、ＰＩ３キナーゼ、およびＭＡＰ経路の作用を介して前記細胞に抗アポトーシスシグナルを誘導する（参考文献５４、５５）。転移性の肺癌細胞にＬＮ−３３２タンパク質をトランスフェクションすると、アノイキスから防御されることが報告されている（参考文献５６）。ＬＮ−３３２のインテグリンからの解離はアポトーシスの主要な誘因に違いないが、ＬＮ−３３２が短腕に対する抗体を用いてＶＩＩ型コラーゲンおよび潜在的には他のいくつかの間質タンパク質からも分離した場合、細胞の解離はより完全である。
【００８６】
ＬＮ−３３２抗体は浸潤性癌細胞の転移を減少させる
本研究の重要な知見は、ＬＮ−３３２抗体が、静脈内投与していたマウスＫＬＮ−２０５細胞の転移病巣の数を有意に減少させることであった。癌細胞の転移過程は、形質転換した上皮細胞のその下部にある基底膜からの解離、複雑なタンパク質分解過程による周辺の細胞外マトリックスの分解、および腫瘍細胞の移動等の多くの個別の分子事象を伴う複雑な過程である（参考文献５７）。前述のように、浸潤性腫瘍先進部におけるＬＮ−３３２陽性腫瘍細胞の移動は、他の事象の中で、ＶＩＩ型コラーゲン等のマトリックス分子への前記腫瘍細胞の結合を伴う。本研究は、ＬＮ−３３２のマトリックス結合領域を標的とする抗体がこの作用を阻害し、それによって転移の減少に寄与しうることを示した。
【００８７】
本研究は、接着および移動に対するＬＮ−３３２の役割、ならびにこのタンパク質の細胞相互作用がＬＮ−３３２依存的な細胞生存にとっていかに重要であるかについての新たな洞察を提供している。このタンパク質の癌細胞からの解離が、インビボでもアポトーシス経路および腫瘍細胞死を誘導することは明らかである。本結果から、ＬＮ−３３２の短腕を標的とすることにより、ＶＩＩ型コラーゲンおよびおそらく他のいくつかの間質成分への結合を介して、実際のインビボでの移動メカニズムを阻害しうることも同様に明らかである。現在のところ、腫瘍細胞の移動メカニズムを標的とする薬剤は臨床的に用いられていない。本調査では、マウスＬＮ−３３２に対するポリクローナル抗体を用いた。
【００８８】
補足の材料および方法
タンパク質および抗体
組換え型ＬＮ−３３２（ｒＬＮ−３３２）を、米国特許第６，７０３，３６３号に記載されているように調製した。組換え型ラミニンα３  ＧドメインフラグメントＧ１２（ｒＧ１２）およびＧ１２３（ｒＧ１２３）を、発現ベクターのｐＲＣｘ３  α３Ｇ１２およびｐＲＣｘ３  α３Ｇ１２３の一過性のトランスフェクションによってＦＳ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において作製した。これらのベクターは、それぞれＤＮＡシークエンシングによって確認されたＧ１２およびＧ１２３ドメインの完全配列を含んでいた。
【００８９】
α３Ｇ１２およびα３Ｇ１２３に対するコード配列を、鋳型としてのＬＮ−３３２  α３鎖用の発現ベクターであるｐＺｅｏアルファ３（米国特許第６，７０３，３６３号）、ならびに以下のプライマー：
α３Ｇ１２３に対して、ｇ１２３Ｆｗｄ：ＧＣＴＡＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＴＴＧＡＡ（配列番号：５）および
ｇ１２３Ｒｅｖ：ＡＴＣＧＡＴＣＡＧＧＧＡＡＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧ（配列番号：６）、ならびに
α３Ｇ１２に対して、ｇ１２３ｆｗｄおよびｇ１２ｒｅｖ：ＡＴＣＧＡＴＣＡＣＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＧＴＣＴＴＣＣ（配列番号：７）を用いることによってＰＣＲ増幅した。
【００９０】
組換え型ラミニンβ３短腕６５ｋＤフラグメント（ｒβ３−６５ｋＤ）を、ＬＮ−３３２  β３発現ベクターであるｐＲｃＸ３ベータ３をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３安定細胞株から精製した（米国特許第６，７０３，３６３号）。
【００９１】
これらすべてのＬＮ−３３２フラグメントを、これら組換えタンパク質に対する１ステップのアフィニティークロマトグラフィー精製手順を可能にするＦｌａｇ配列（Ｓｉｇｍａ）をアミノ末端に保持して発現させた。
【００９２】
マウスラミニンγ２鎖に対するポリクローナル抗体の産生のために、マウスγ２鎖のドメインＩＩＩの一部をＧＳＴ融合タンパク質として発現させた（Ｐａｂ１４２０）。ヌクレオチド１３１２〜１８８８を包含するＤＮＡフラグメント（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ＮＭ＿００８４８５）をＰＣＲによって生成し、ｐＧＥＸ−Ｉ＼Ｔ発現ベクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。ＰＣＲ産物の配列は、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。融合タンパク質を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導して大腸菌ＢＬ２１細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）内で産生し、メーカー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって推奨されるとおりに、グルタチオン−セファロース４Ｂカラムで精製した。ポリクローナル抗体の産生のために、マウスγ２鎖のドメインＶの一部をＧＳＴ融合タンパク質として発現させた（Ｐａｂ−１４２５）。ヌクレオチド６６〜５８５を包含するＤＮＡフラグメント（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ＮＭ−００８４８５）をＰＣＲによって生成し、ｐＧＥＸ−Ｉ＼Ｔ発現ベクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。ＰＣＲ産物の配列は、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。融合タンパク質を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導して大腸菌ＢＬ２１細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）内で産生し、メーカー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって推奨されるとおりに、グルタチオン−セファロース４Ｂカラムで精製した。Ｐａｂ−１４２０およびＰａｂ−１４２５の両方をウサギで作り、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、およびウエスタン解析を用いることによって特徴づけした。
【００９３】
リアルタイムＰＣＲ
ＳＣＣ−２５、Ａ４３１、ＢｘＰＣ３、およびＫＬＮ−２０５細胞からの全ＲＮＡを、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ一本鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてランダム・ヘキサマー・プライマーでｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイムＰＣＲを、ＴａｑＭａｎプローブベースの化学反応を用いてＡＢＩ  ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。プライマーおよびプローブの配列は、以下のとおり：ラミニン−３３２  ５’−-ＧＧＣＴＡＣＴＴＣＧＧＧＧＡＣＣＡＴＴ−３’（配列番号：８）、５’−ＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＧＧＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’（配列番号：９）、および５’−ＣＡＧＡＣＡＡＧＴＧＴＣＧＡＧＣＴＴＧＣＡＡＣＴ−３’（配列番号：１０）（プローブ）；ＶＩＩ型コラーゲン  ５’−ＧＴＧＧＣＴＧＡＣＣＡＴＧＴＣＴＴＣＣＴ−３’（配列番号：１１）、５’−ＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＧＡＣＴＴ−３’（配列番号：１２）、および５’−ＴＧＴＣＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＡ−３’（配列番号：１３）（プローブ）であった。各標的遺伝子の発現についての相対的定量化を、比較サイクル閾値（ＣＴ）法を用いて行った。Ｓ１８  ｍＲＮＡを内在性コントロールとして用いた。
【００９４】
ウエスタンブロッティング
急速に成長しているコンフルエントに満たない細胞培養物からのＡ４３１、ＳＣＣ−２５、およびＢｘＰＣ３細胞を、冷却した溶解バッファー（プロテアーゼ阻害剤カクテルを含んだ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で溶解した。氷上で３０分間時折混合しながらインキュベーションした後、細胞溶解物を４℃で１５分間１０，０００×ｒｐｍで遠心分離した。上清を慎重に回収し、−７０℃で保存した。
【００９５】
ＫＬＮ−２０５細胞の細胞外マトリックスを、Ｌａｎｇｈｏｆｅｒら（１９９３）によって記載されているのと同様に産生した。コンフルエントに満たない細胞培養物をＰＢＳで２回洗浄し、２０ｍＭ  ＮＨ４ＯＨとともに室温で１０分間インキュベーションした。インキュベーション後すぐに、細胞培養ディッシュをＨ２ＯとＰＢＳで洗浄して、壊れた細胞物質を除去した。次いで、細胞外マトリックスを可溶化バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ６．８、８Ｍ尿素、１％  ＳＤＳ、５％  β−メルカプトエタノール）中で可溶化し、−７０℃で保存した。
【００９６】
１レーンにつき５０μｇの全細胞抽出物および５０μｇの細胞外マトリックスのサンプルを、還元条件下で、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上での電気泳動にロードし、ニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｐ  ＰＶＤＦ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に転写した。メンブレンを、まずＰａｂ−Ｇ１２（α３鎖）、Ｐａｂ−２２６（β３鎖）、およびＰａｂ−２６（γ２鎖）に対するポリクローナル抗体で、その後、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ二次抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でプローブし、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって可視化した。抗β−アクチン抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）をローディングコントロールとして用いた。
【００９７】
Ａ４３１腫瘍の組織学的分析
Ａ４３１腫瘍組織におけるラミニンα３、β３、およびγ２鎖の免疫組織学染色のために、ｍＡｂ−７Ｂ２（抗α３）、ｍＡｂ−７Ｂ３（抗β３）、およびｍＡｂ−６Ｃ１２（抗γ２）を用いた。ＫＬＮ−２０５腫瘍組織におけるラミニンα３、β３、およびγ２鎖の免疫組織学染色のために、Ｐａｂ−Ｇ１２（抗α３）、Ｐａｂ−２２６（抗β３）、およびＰａｂ−２６（抗γ２）を用いた。アセトン固定した厚さ５μｍの凍結切片の染色を前記抗体を用いて行い、種関連ＩｇＧをネガティブコントロールとして用いた。非特異的結合に対して前記切片をＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロッキングし、次いでＰＢＳ中に５〜１０μｇ／ｍｌまで希釈した抗体およびコントロールとともに４℃で一晩インキュベーションした。その後、ビオチン化ヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはビオチン化ブタ抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ）を、続いてメーカー（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって推奨されるとおりに希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ−アビジン−ビオチン複合体を適用した。ジアミノベンジジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｔｓａｍｉｄｉｎｅ）（ＤＡＢ）で発色させ、続いてヘマトキシリンを用いてスライドの対比染色を行った。早期腫瘍の増殖についての分析のために、ポリクローナルウサギ抗ヒトＫｉ６７抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，１：５０希釈）を用いた。アセトン固定した厚さ５μｍの凍結切片の染色を前述のように行った。光学顕微鏡検査の切片を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１顕微鏡を用いて可視化し、写真に撮った。免疫蛍光顕微鏡検査の切片を、ＬＳＭ  ５１０レーザーモジュールを備えた共焦点レーザー走査顕微鏡Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡を用いて可視化し、写真に撮った。
【００９８】
競合ＥＬＩＳＡ
競合ＥＬＩＳＡのために、メーカー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）の指示に従い、スルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンキットを用いてｍＡｂ−７Ｂ２をビオチン化した。９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉ−ＳｏｒｐｔＴＭ，Ｎｕｎｃ）を、０．２５μｇ／ウェルのｒＬＭ３３２を用いて４℃でｏ／ｎコーティングした。可能性のある非特異的結合を、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて室温で２時間ブロッキングした（２００μｌ／ウェル）。５ｎｇのビオチン化ｍＡｂ７Ｂ２、ならびに５００ｎｇの競合的抗体および正常マウスＩｇＧを混合し、３点のウェルにピペット注入した。インキュベーションの３０分後、ウェルをＰＢＳおよびメーカー（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって推奨されるとおりに希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ−アビジン−ビオチン複合体で３回洗浄した。室温でのインキュベーションの３０分後、２，２’−アジノ−ビス−３−エチルベンゾチアゾリン（ｅｔｈｙｌｂｅｔｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ）−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ−ペルオキシダーゼ）基質で発色させた。３０分後に、マイクロタイター・プレートリーダーを用いて４０５ｎｍにおける吸光度を読み取った。
【００９９】
アポトーシスアッセイ
ｍＡｂ−７Ｂ２、ＢＭ１６５、および正常マウスＩｇＧで処理したマウスの早期Ａ４３１腫瘍におけるアポトーシスを調査するため、７、１０、および１４日目からの腫瘍サンプルをＴＵＮＥＬ染色用に調製した。５μｍのクリオスタット切片を、１％パラホルムアルデヒド中で室温にて１０分間固定した。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ介在性ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色を、Ａｐｏｐｔａｇペルオキシダーゼキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いて行い、切片をメチルグリーン（Ｒｉｅｄｅｌ  ｄｅ  Ｈａｅｎ）を用いて対比染色した。各切片から総計７〜１０の顕微鏡視野（倍率４００×）を無作為に選択し、写真に撮った。ＴＵＮＥＬ陽性の核を、ａｎａｌｙＳＩＳイメージングソフトウェア（Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＧｍｂＨ）を用いて計数した。
【０１００】
線維芽細胞マトリックス上で成長させたＡ４３１細胞のアポトーシスを誘導するｍＡｂ−７Ｂ２の能力を、メーカー（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の指示に従い、アネキシンＶ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キットによって測定した。ＢＪ線維芽細胞によって産生される細胞外マトリックスの産生のために、平底の１２ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、２．５×１０５個／ウェルのヒトＢＪ細胞を播種した。コンフルエントの細胞培養物に至るまで細胞を一晩培養した。前述のように、２０ｍＭ  ＮＨ４ＯＨを用いて線維芽細胞マトリックスを産生した。細胞培養物をＰＢＳで２回洗浄し、室温で１０分間インキュベーションした。マトリックスの産生後すぐに、２×１０５個／ウェルのヒトＡ４３１細胞を播種した。ｍＡｂ−７Ｂ２およびコントロールＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）の添加前に、前記細胞を５時間付着させた。アポトーシスの分析前に、前記細胞を１６時間培養した。
【０１０１】
マイクロアレイ
２×１０５個／ウェルのヒトＡ４３１細胞を新しく調製した線維芽細胞マトリックス上に播種し、３本すべてのＬＮ−３３２鎖に対する抗体の混合物またはコントロールＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）の添加前に、５時間付着させた。全ＲＮＡ抽出（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏキット，Ｑｉａｇｅｎ）前に、前記細胞を１６時間培養した。
【０１０２】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析のために、発現解析テクニカルマニュアルに従ってＲＮＡを調製した。要するに、鋳型として８μｇの全ＲＮＡを用いて、Ｏｎｅ−ｃｙｃｌｅ  ｃＤＮＡ合成キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）およびＴ７−（ｄＴ）２４プライマーによって二本鎖ＤＮＡを合成した。前記ＤＮＡを、ＧｅｎｅＣｈｉｐサンプル・クリーンアップ・モジュール（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＩＶＴ標識キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、インビトロ転写を行い、ビオチン標識ｃＲＮＡを生成した。ＧｅｎｅＣｈｉｐサンプル・クリーンアップ・モジュール（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてビオチン化ｃＲＮＡから不純物を除去し、３５〜２００ｎｔに断片化し、およそ５５０００のヒト転写物を含有するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトゲノムＵ１３３プラス２アレイにハイブリダイズした。アレイをストレプトアビジン−フィコエリスリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、染色シグナルをビオチン化抗ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびストレプトアビジン−フィコエリスリンを用いた第二染色によって増幅し、次いでＧｅｎｅＣｈｉｐスキャナー３０００でスキャンした。アレイのシグナル強度を、５００の値を標的とするようにスケール調整した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘハイブリダイゼーションオーブン６４０（＋４５℃、６０ｒｐｍ、１６時間）を用いてハイブリダイゼーションを行った。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘフルイディクス（Ｆｌｕｉｄｉｃｓ）ステーション４５０（ＥｕｋＧＥＷＳ２ｖ５＿４５０）を用いて洗浄および染色を行った。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒプロジェクト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）のパッケージを用いてデータ解析を行った。ａｆｆｙパッケージ（バージョン１．１２．２）を用いて生データを処理した。サンプル間の差次的遺伝子発現を検出するために、Ｓスコアパッケージ（バージョン１．６．０）を備えた統計解析を用いた。それは、遺伝子発現における差異を評価するために、プローブレベルのデータを直接用いた。ｈｇｕ１３３ｐｌｕｓ２パッケージ（バージョン１．１４．０）にある遺伝子オントロジーの注釈を用いて、ある生物学的カテゴリーに関連するすべてのプローブセットを抽出した。
【０１０３】
本研究で用いたＬＮ−３３２鎖に対するドメイン特異的抗体
β３鎖の短腕全体（ドメインＩＩＩ〜ＶＩ）（Ｐａｂ−２２６）に対して、ならびにγ２鎖のドメインＩＩＩ（Ｐａｂ−１４２０）およびＶ（Ｐａｂ−１４２５）に対して、ウサギポリクローナル抗体を調製した。三量体ＬＮ−３３２に対して、ｍＡｂ  ７Ｂ２および７Ｅ３を調製した。本研究で調製したすべてのＬＮ−３３２フラグメントに対してｍＡｂ−７Ｂ２を試験し、それはα３鎖のＧ１２およびＧ１２３フラグメントのみを検出した。ｍＡｂ  ＢＭ１６５は、α３鎖のＧドメインに対して作製された、以前に記載されている抗体（参考文献２７）である。さらに、三量体組換え型ヒトＬＮ−３３２分子全体に対して、ポリクローナル抗体Ｐａｂ−ＢＳＴを調製した。
【０１０４】
補足の表１
アポトーシスに関連する差次的に発現した遺伝子
ｈｇｕ１３３ｐｌｕｓ２パッケージにある遺伝子オントロジーの注釈を用いて、アポトーシスに関連するプローブを同定した。リストに記載された割合は、抗ＬＮ−３３２抗体で処理したサンプルとコントロールとの間のｌｏｇ２変換率であった。Ｓスコアパッケージを用いてｐ値を算出した。前記割合に従って、当該遺伝子を分類している。
【０１０５】
【表１−１】
2012530045.tif 000003
【０１０６】
【表１−２】
2012530045.tif 000004
【０１０７】
【表１−３】
2012530045.tif 000005
【０１０８】
【数１】
2012530045.tif 000006
【０１０９】
【数２】
2012530045.tif 000007
【０１１０】
【数３】
2012530045.tif 000008
【０１１１】
【数４】
2012530045.tif 000009
【０１１２】
【数５】
2012530045.tif 000010
【０１１３】
【数６】
2012530045.tif 000011
本開示の組成物および方法は、好ましい態様に関して記載されている。明らかに、前述の詳細な説明を解釈かつ理解すると、他のものに修正および変更が生じるであろう。本開示は、それらが添付の特許請求またはその同等物の範囲内に入る限りにおいて、すべてのそのような修正および変更を含むと見なされることを意図する。
【図２】
2012530045.tif 000012
【図４】
2012530045.tif 000013
【図５】
2012530045.tif 000014
【図８】
2012530045.tif 000015
【図９Ａ】
2012530045.tif 000016
【図９Ｂ】
2012530045.tif 000017
【図１０】
2012530045.tif 000018
【図１】
2012530045.tif 000019
【図３】
2012530045.tif 000020
【図６】
2012530045.tif 000021
【図７】
2012530045.tif 000022
【配列表】
2012530045000001.app
【誤訳訂正書】
【提出日】平成24年4月17日(2012.4.17)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体を含む組成物。
【請求項２】
前記抗体がβ３鎖のドメインＩＩＩ〜ＶＩに結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
γ２鎖に対する前記抗体がγ２鎖のドメインＩＩＩまたはドメインＶに結合する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
Ｇドメインに対する前記抗体がα３鎖のサブドメインＧ１〜Ｇ３に結合する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体およびラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
ラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体を含む、転移を示している細胞の細胞移動を減少させるための組成物。
【請求項９】
前記抗体がβ３鎖のドメインＩＩＩ〜ＶＩに結合する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体をさらに含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
γ２鎖に対する前記抗体がγ２鎖のドメインＩＩＩまたはドメインＶに結合する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｇドメインに対する前記抗体がα３鎖のサブドメインＧ１〜Ｇ３に結合する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体およびラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１５】
有効量のラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体を含む、ラミニン−３３２分泌腫瘍を有する被験体において腫瘍の成長を低下させるための組成物。
【請求項１６】
前記抗体がβ３鎖のドメインＩＩＩ〜ＶＩに結合する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
ラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
Ｇドメインに対する前記抗体がα３鎖のサブドメインＧ１〜Ｇ３に結合する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体およびラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００８年６月１８日に出願された、米国仮特許出願第６１／０７３，６１１号（この全体は、参考として本明細書に完全に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、ラミニン−３３２の鎖上の種々のドメインに選択的に結合しうる抗体、その組成物、および種々の目的のために前記抗体／組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ラミニンは、細胞の接着、増殖、移動、および分化に関与する三量体の基底膜（ＢＭ）糖タンパク質である。ラミニン分子は、１本の重鎖（α）と２本の軽鎖（βおよびγ）とからなる十字の形をしたヘテロ三量体である。前記３本の鎖は、カルボキシル末端側のコイルドコイルドメインを介して会合している。さらに、すべてのα鎖はカルボキシル末端に大きな球状のＧドメインを有している。
【０００４】
哺乳動物において、５種類の遺伝学的に相違するアルファ（α）、３種類のベータ（β）、および３種類のガンマ（γ）鎖は、これらの鎖の少なくとも１４種類の異なる組み合わせを形成しうる（参考文献１、２（非特許文献１、２））。ラミニン−３３２（ＬＮ−３３２とも示され、ラミニン−５、ＬＮ−５、カリニン、ニーシンとしても既知）は、α３：β３：γ２の鎖組成を有し（図８）、上皮細胞の定着に必須であり、かつ上皮ＢＭに特異的に見られる（参考文献３〜５（非特許文献３〜５））。ＬＮ−３３２の欠損は、上皮の剥離および致死性の水疱形成性皮膚疾患である接合部型表皮水疱症を引き起こす（参考文献６〜８（非特許文献６〜８））。ＬＮ−３３２は、回復期創傷のケラチノサイト等における上皮細胞の増殖および動きにも関与する（参考文献９、１０（非特許文献９、１０））。α３鎖の球状ドメイン（Ｇドメイン）は、インテグリン受容体α６β４およびα３β１を介して細胞表面に結合し（参考文献１１）、焦点接着キナーゼを介して抗アポトーシスシグナルを誘起し（参考文献１２、１３）、一方でβ３およびγ２鎖の短腕は間質におけるＶＩＩ型コラーゲンに結合する（参考文献１４）。
【０００５】
ＬＮ−３３２は、結腸癌、胃癌、乳管癌、および扁平上皮癌を含む種々の上皮性癌、ならびに黒色腫において上方制御されているが（参考文献５〜１０（非特許文献５〜１０）、参考文献１１〜１８）、間葉系癌では上方制御されていない（参考文献１５、１６）。ＬＮ−３３２のγ２鎖の高発現は、子宮頸部扁平上皮癌の予後不良と相関することが分かっている（参考文献１９）。ＬＮ−３３２は、インビトロでのいくつかの腫瘍細胞株の浸潤能および転移能を促進する主要な散乱因子でもある（参考文献２０、２１）。前記癌組織において、前記タンパク質は浸潤先進部ならびに微小転移で主に発現している。ＬＮ−３３２の下方制御は、上皮性前立腺癌において（参考文献２２）および乳癌においても（参考文献２３）報告されている。
【０００６】
ＬＮ−３３２の発現は腫瘍形成と関連している。したがって、ラミニンのβ３鎖およびγ２鎖を構成的に発現しているが、α３を発現していないＨＴ１０８０腫瘍細胞にラミニンα３  ｃＤＮＡをトランスフェクションした場合、前記細胞はヌードマウスにおいて未形質転換細胞よりも有意に大きな腫瘍を成長させた（参考文献２４）。さらに、ＬＮ−３３２陰性（ならびに、α４インテグリン陰性）のケラチノサイトは、正常なケラチノサイトとは対照的に、ｒａｓ−ＩκＢαをトランスフェクションしても腫瘍形成性にならなかった（参考文献２５）。
【０００７】
ほとんどの癌は上皮性起源のものであり、かつＬＮ−３３２発現陽性であるため、本出願人らは、このタンパク質が浸潤する癌細胞の接着および移動の過程に一般的役割を有するかどうか、ならびにそれらの作用を妨げると腫瘍の成長および広がりに影響を及ぼすかどうかを調査した。特に、本出願人らは、インビトロでの癌細胞の接着および移動に対するＬＮ−３３２の役割を調べ、このタンパク質の前記細胞への結合を妨げると、これらの作用が阻害され、かつアポトーシスが誘導されることを実証した。さらに、本出願人らは、ＬＮ−３３２の細胞およびマトリックス結合ドメインに対する抗体が、インビボで成長するいくつかのタイプの癌を標的とし、かつマウスにおいて腫瘍の成長および転移を効果的に阻害することを示した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｕｍａｉｌｌｅｙ  Ｍ、Ｂｒｕｃｋｎｅｒ−Ｔｕｄｅｒｍａｎ  Ｌ、Ｃａｒｔｅｒ  ＷＧ、Ｄｅｕｔｚｍａｎｎ  Ｒ、Ｅｄｇａｒ  Ｄ、Ｅｋｂｌｏｍ  Ｐ、Ｅｎｇｅｌ  Ｊ、Ｅｎｇｖａｌｌ  Ｅ、Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅｒ  Ｅ、Ｊｏｎｅｓ  ＪＣ、Ｋｌｅｉｎｍａｎ  ＨＫ、Ｍａｒｉｎｋｏｖｉｃｈ  ＭＰら、Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ（２００５）２４：３２６〜３２
【非特許文献２】Ｍｉｎｅｒ  ＪＨ、Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ  ＰＤ．  Ｌａｍｉｎｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ（２００４）２０：２５５〜８４
【非特許文献３】Ｋａｌｌｕｎｋｉ  Ｐ、Ｓａｉｎｉｏ  Ｋ、Ｅｄｄｙ  Ｒ、Ｂｙｅｒｓ  Ｍ、Ｋａｌｌｕｎｋｉ  Ｔ、Ｓａｒｉｏｌａ  Ｈ、Ｂｅｃｋ  Ｋ、Ｈｉｒｖｏｎｅｎ  Ｈ、Ｓｈｏｗｓ  ＴＢ、Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ  Ｋ．  Ａ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｃｈａｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｂ２  ｃｈａｉｎ：  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｓｐａｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９９２）１１９：６７９〜９３
【非特許文献４】Ｇｅｒｅｃｋｅ  ＤＲ、Ｗａｇｍａｎ  ＤＷ、Ｃｈａｍｐｌｉａｕｄ  ＭＦ、Ｂｕｒｇｅｓｏｎ  ＲＥ．  Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｃｈａｉｎ、ｔｈｅ  ｌａｍｉｎｉｎ  Ｂ１ｋ  ｃｈａｉｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９４）２６９：１１０７３〜８０
【非特許文献５】Ｒｙａｎ  ＭＣ、Ｔｉｚａｒｄ  Ｒ、ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ  ＤＲ、Ｃａｒｔｅｒ  ＷＧ．  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＬａｍＡ３  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ  ３  ｃｈａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｅｐｉｌｉｇｒｉｎ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｗｏｕｎｄ  ｒｅｐａｉｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９４）２６９：２２７７９〜８７
【非特許文献６】Ａｂｅｒｄａｍ  Ｄ、Ｇａｌｌｉａｎｏ  ＭＦ、Ｖａｉｌｌｙ  Ｊ、Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎ  Ｌ、Ｂｏｎｉｆａｓ  Ｊ、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｏ  ＡＭ、Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ  Ｋ、Ｕｉｔｔｏ  Ｊ、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｊｒ  ＥＨ、Ｏｒｔｏｎｎｅ  ＪＰ、Ｍｅｎｅｇｕｚｚｉ  Ｇ．  Ｈｅｒｌｉｔｚ’ｓ  ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ  ｉｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  （ＬＡＭＣ２）  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇａｍｍａ  ２  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｎｉｃｅｉｎ／ｋａｌｉｎｉｎ  （ＬＡＭＩＮＩＮ−５）．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ（１９９４）６：２９９〜３０４
【非特許文献７】Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎ  Ｌ、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｏ  ＡＭ、Ａｉｒｅｎｎｅ  Ｔ、Ｈａａｋａｎａ  Ｈ、Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ  Ｋ、Ｕｉｔｔｏ  Ｊ．  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｍｍａ  ２  ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  （ＬＡＭＣ２）  ｏｆ  ｋａｌｉｎｉｎ／ｌａｍｉｎｉｎ  ５  ｉｎ  ｔｈｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ（１９９４）６：２９３〜７
【非特許文献８】Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎ  Ｌ、Ｕｉｔｔｏ  Ｊ．  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ．  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ（１９９９）１８：２９〜４２
【非特許文献９】Ｓａｌｏ  Ｓ、Ｈａａｋａｎａ  Ｈ、Ｋｏｎｔｕｓａａｒｉ  Ｓ、Ｈｕｊａｎｅｎ  Ｅ、Ｋａｌｌｕｎｋｉ  Ｔ、Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ  Ｋ．  Ｌａｍｉｎｉｎ−５  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｍｍａ２  ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  （ＬＡＭＣ２）  ｗｉｔｈ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ（１９９９）１８：１９７〜２１０
【非特許文献１０】Ｎｇｕｙｅｎ  ＢＰ、Ｇｉｌ  ＳＧ、Ｃａｒｔｅｒ  ＷＧ．  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｍｉｎｉｎ  ５  ｂｙ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２０００）２７５：３１８９６〜９０７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
簡単な説明
様々な態様において、ラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体を含む種々の抗体組成物を開示する。前記抗体は、β３鎖上のドメインＩＩＩ〜ＶＩに特異的に結合しうる。
【００１０】
前記抗体組成物は、ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体をさらに含んでもよい。γ２鎖に対する前記抗体は、γ２鎖上のドメインＩＩＩまたはドメインＶに結合しうる。
【００１１】
あるいは、前記抗体組成物は、ラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含んでもよい。Ｇドメインに対する前記抗体は、α３鎖のサブドメインＧ１〜Ｇ３に結合しうる。
【００１２】
他の態様において、前記抗体組成物は、ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体とラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体との両方をさらに含む。
【００１３】
また、ラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体に細胞を接触させる工程を含む、転移を示している細胞における細胞移動を減少させる方法も開示する。
【００１４】
さらに、ラミニン−３３２分泌腫瘍を有する被験体に有効量のラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体を投与する工程を含む、腫瘍の成長を低下させる方法を開示する。
【００１５】
ＬＮ−３３２のα３鎖の細胞結合ドメインに対する抗体は腫瘍の成長を６８％まで阻害し、β３鎖およびγ２鎖のマトリックス結合ドメインに対する抗体は肺転移を有意に減少させた。ＬＮ−３３２抗体は、腫瘍細胞のアノイキスおよびそれに続くプログラム細胞死を誘導すると考えられる。ＬＮ−３３２抗体は、また、腫瘍細胞マトリックス相互作用を妨げることによって移動を減少させ、つまり言い換えると、前記細胞を細胞外マトリックスから解離させることによって転移を減少させる。
【００１６】
本開示のこれらおよび他の制限されない特徴を、以下により具体的に開示する。
本発明の好ましい実施形態によれば、例えば以下が提供される：
（項目１）
ラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体を含む組成物。
（項目２）
前記抗体がβ３鎖のドメインＩＩＩ〜ＶＩに結合する、項目１に記載の組成物。
（項目３）
ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目４）
γ２鎖に対する前記抗体がγ２鎖のドメインＩＩＩまたはドメインＶに結合する、項目３に記載の組成物。
（項目５）
ラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目６）
Ｇドメインに対する前記抗体がα３鎖のサブドメインＧ１〜Ｇ３に結合する、項目５に記載の組成物。
（項目７）
ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体およびラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目８）
ラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体に細胞を接触させる工程を含む、転移を示している細胞の細胞移動を減少させる方法。
（項目９）
前記抗体がβ３鎖のドメインＩＩＩ〜ＶＩに結合する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体をさらに含む、項目８に記載の方法。
（項目１１）
γ２鎖に対する前記抗体がγ２鎖のドメインＩＩＩまたはドメインＶに結合する、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
ラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含む、項目８に記載の方法。
（項目１３）
Ｇドメインに対する前記抗体がα３鎖のサブドメインＧ１〜Ｇ３に結合する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体およびラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含む、項目８に記載の方法。
（項目１５）
ラミニン−３３２分泌腫瘍を有する被験体に有効量のラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体を投与する工程を含む、腫瘍の成長を低下させる方法。
（項目１６）
前記抗体がβ３鎖のドメインＩＩＩ〜ＶＩに結合する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体をさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
ラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
Ｇドメインに対する前記抗体がα３鎖のサブドメインＧ１〜Ｇ３に結合する、項目１８
に記載の方法。
（項目２０）
ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体およびラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含む、項目１５に記載の方法。
【００１７】
本特許または出願の書類は、カラーで作成した少なくとも１つの図面を含む。カラーの
図面を含む本特許または特許出願公報の複写物は、要請および必要な料金の支払いがあれば当該庁によって提供されるであろう。
【００１８】
以下は図面の簡単な説明であって、本明細書において開示されている例示的態様を解説する目的のために提示されるものであり、それを制限する目的のためのものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａは、本研究において用いたマウスＫＬＮ−２０５  ＳＣＣ、ならびにヒトＡ４３１  ＳＣＣ、ＳＣＣ−２５、およびＢｘＰＣ３腺癌細胞株における３本すべてのＬＮ−３３２鎖の発現を明示しているＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示している。図１Ｂは、３本すべてのＬＮ−３３２成分鎖が前記４種のＳＣＣ株によって合成されることを示しているウエスタンブロットである。分泌されたγ２鎖は、ＫＬＮ−２０５細胞について示されているように、培地中でより小さな１０５ｋＤａ型に部分的にプロセシングされていた。図１Ｃは、３本のＬＮ−３３２鎖に対するモノクローナル抗体を用いることによって、ヌードマウスにおける腫瘍の浸潤周縁部において強いペルオキシダーゼ染色を示す、３つのＡ４３１腫瘍および３つのマウスＫＬＮ−２０５腫瘍を図示している。骨格筋で成長したマウスＫＬＮ−２０５腫瘍も、浸潤先進部において前記３本の鎖に対する抗体を用いた染色が強陽性であり、かつ肺転移も陽性である。倍率２００×。
【図２】図２Ａは、三量体ＬＮ−３３２に対して作られたポリクローナル抗体（Ｐａｂ−ＢＳＴ）、ならびにα３鎖のＧドメインに対するマウスｍＡｂ  ＢＭ１６５および７Ｂ２が、ｒＬＮ−３３２でコーティングしたプラスチック表面へのヒトＡ４３１、ＳＣＣ−２５、およびＢｘＰＣ３癌細胞の接着を有意に阻害したことを示している。γ２鎖の短腕のドメインＩＩＩに対するマウスｍＡｂ−４Ｇ１は、この表面への前記細胞の接着に対して有意な阻害効果を有しなかった。さらに、α３鎖のＧ１〜３サブドメインに対して作られたＰａｂ−ＢＳＴおよびＰａｂ−Ｇ１２３は、マウスＫＬＮ−２０５細胞株の接着を阻害し、一方で、β３の短腕に対するＰａｂ（Ｐａｂ−２２６）およびγ２の短腕に対するＰａｂ（Ｐａｂ−１４２０、Ｐａｂ−１４２５、Ｐａｂ−２６）は、ｒＬＮ−３３２でコーティングしたプラスチックへの前記細胞の接着に影響を及ぼさなかった。図２Ｂは、ｍＡｂ−７Ｂ２によるＬＮ−３３２でコーティングした表面への細胞接着の阻害が用量依存的であったことを図示しているグラフである。当該図は、ＲＴ−ＣＥＳＴＭ法によって測定された、１ウェルあたり２５，０００個のＳＣＣ−２５細胞を添加した１時間後における細胞指数を示している（各値は２ウェルの平均である）。図２Ｃは、抗α３  ｍＡｂ  ７Ｂ２およびＢＭ１６５の抗接着効果の比較であって、１ウェルあたり２５，０００個のＡ４３１細胞をプレーティングした１時間後の細胞指数の大きさによって表示されているように、ＬＮ−３２２でコーティングした表面への接着を阻害することにおいて、ｍＡｂ−７Ｂ２はＢＭ１６５より２倍強力であることを明示している（ｎ＝３，平均±ＳＥＭ）。図２Ｄは、競合的ＥＬＩＳＡアッセイの結果を図示するものであって、ｍＡｂ−７Ｂ２およびＢＭ１６５がラミニンα３鎖Ｇドメインにある種々のエピトープに結合することを明示している。ビオチン化ｍＡｂ−７Ｂ２は、ｒＬＮ−３３２でコーティングしたプラスチックに効果的に結合する（１００％）。１００倍過剰のｍＡｂ−７Ｂ２の添加により、ビオチン化７Ｂ２抗体の結合は阻害され、一方で同量のＢＭ１６５または抗ラットα３抗体であるＣＭ６は、ｒＬＮ−３３２へのｍＡｂ−７Ｂ２の結合を全く阻害しない。別の抗ヒトα３モノクローナル抗体であるＲＧ１３は、ｒＬＮ−３３２へのビオチン化ｍＡｂ−７Ｂ２の結合を部分的にのみ阻害しうる。
【図３】図３Ａは、コーティングされていない２４ウェルプレート上にプレーティングし、コンフルエントまで成長させ、その後「創傷」を生じさせた、２×１０５個のＳＣＣ−２５またはＢｘＰＣ３腺癌細胞を有するサンプルの画像である。非免疫性ＩｇＧ（図示せず）、非免疫性マウスおよびウサギＩｇＧ、またはγ２鎖の短腕に対するｍＡｂ−４Ｇ１の欠如は、２４時間の時点で観察されるように、いずれの細胞型の移動も阻害しなかった。対照的に、三量体ＬＮ−３３２全体に対して作製されたポリクローナル抗体Ｐａｂ−ＢＳＴ、ならびにα３鎖のＧドメインを標的とするｍＡｂ  ＢＭ１６５および７Ｂ２は、前記細胞の移動を効果的に阻害した。図３Ｂは、コーティングされていないプラスチック上またはＶＩＩ型コラーゲンを含有する線維芽細胞由来のマトリックス上にプレーティングした、２×１０５個のマウスＫＬＮ−２０５細胞を有するサンプルの画像である。非免疫性ウサギＩｇＧまたはＰａｂ−２２６（β３鎖）またはＰａｂ−１４２５（γ２鎖）は、コーティングされていないプラスチック上での移動に影響を及ぼさなかった。しかしながら、マウスＬＮ−３３２と反応するＰａｂ−ＢＳＴは移動を効果的に阻害し、かつ前記細胞のいくらかの解離も引き起こした。しかしながら、前記細胞を線維芽細胞由来のマトリックス上で成長させた場合、抗β３抗体は移動を完全には阻害しなかったものの、β３およびγ２の短腕に対する抗体はすべて移動を阻害した。非免疫性ウサギ血清は、移動に影響をもたらさなかった。以下の材料および方法に記載されるように、すべての移動実験において、細胞の増殖を阻止するためにマイトマイシンを添加し、細胞の位置を０および２４時間の時点で記録した。図３Ｃは、線維芽細胞由来のマトリックス上でのマウスＫＬＮ−２細胞の移動に対する、種々のＬＮ−３３２抗体に関する効果を要約しているグラフである。
【図４】図４Ａは、線維芽細胞由来のマトリックス上でのマウスＫＬＮ−２０５  ＳＣＣ細胞の移動に対する、γ２鎖に対する抗体の効果をコントロールとともに示している２つの画像である。非免疫性の血清の存在下では、前記細胞は移動の方向に広い葉状仮足を生じるが、γ２鎖のドメインＶを標的とするＰａｂ−１４２５抗体の添加により、葉状仮足の形成は完全に阻害される。線維芽細胞由来のマトリックス上で移動するＫＬＮ−２０５細胞の表現型の変化を検出するために、０．００４単位／ｍｌのローダミン−ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒ−４１５）を用いてアクチン線維を染色し、ヘキスト染色で細胞核を染色した。矢印は、葉状仮足が陽性または陰性の細胞の周縁部を指し示している。倍率４００×。図４Ｂは、マウスＫＬＮ−２０５  ＳＣＣ細胞の形に対する、γ２鎖に対する抗体の効果を要約しているグラフである。
【図５】図５Ａは、腫瘍を持つマウスに静脈内注射し、その後、腫瘍を切り出し、組織／腫瘍切片を標識二次抗体で染色した、ＬＮ−３３２全体または個々のラミニン鎖に対する抗体を示している一連の画像である。α３鎖に対するｍＡｂ−７Ｂ２はヌードマウスにおけるＡ４３１腫瘍を標的とし、一方で非免疫性マウス血清はインビボで腫瘍細胞を標的としない。ウサギポリクローナル抗ヒト・ラミニンγ２鎖抗体（Ｐａｂ−２６）は、腰筋で成長するマウスＫＬＮ−２０５原発腫瘍またはその肺転移を効果的に標的とする。正常ウサギＩｇＧは、腫瘍または他のマウス組織を標的としない。倍率２００×。図５Ｂは、２×１０５個の細胞を３０匹のヌードマウスの背側頸部領域に皮下注射した実験の結果を図示しているグラフである。３日目から２４日目まで、マウスをＢＭ−１６５、ｍＡｂ−７Ｂ２、またはＰＢＳで週に２回処理し、次いでそれらを殺処分する３８日目までさらに観察し、分析した。腫瘍の成長は、抗α３鎖抗体の注射後に統計的に有意に低下した。腫瘍サイズをｍｍ３で提示し、棒は＋／−ＳＥＭを表す。矢印は、抗体の注射の時間を表示している。図５Ｃは、抗体の処理を腫瘍容積が５０〜１００ｍｍ３である１４日目に最初に開始し、次いでｍＡｂ  ７Ｂ２またはＰＢＳで処理した、確立した腫瘍に関する試験の結果を示している。その他の点では、手順は図５Ｂにおけるもののとおりである。図５Ｄは、腫瘍の移植のために１匹のマウスあたり４×１０５個のＫＬＮ−２０５細胞を３０匹のマウスに皮下注射した、確立したマウスの腫瘍に関する試験の結果を示している。抗体または抗体混合物（Ｐａｂ−ＢＳＴ、Ｐａｂ−１４２５、およびＰａｂ−２２６）の処理を、腫瘍容積が約２０ｍｍ３である７日目に開始し、２４日目まで続けた。試験は２８日目に終了した。
【図６】図６Ａは、マウスにおける浸潤性癌細胞の転移に対する、ＬＮ−３３２抗体の効果を示している６つの画像である。ＫＬＮ−２０５癌細胞を、ＰＢＳのみとともに、あるいはＬＮ−３３２全体またはβ３およびγ２鎖の短腕に対する抗体とともに静脈内注射した。処理期間の後、肺を取り出し、転移についての分析にかけた。ＬＮ−３３２全体に対する抗体（マウス５１および５２）、ならびにβ３の短腕に対する抗体とγ２鎖の短腕に対する抗体（マウス５９および６０）は両方とも、ビヒクルのみで処理したマウス（マウス４８および４９）と比較して、肺における転移の形成を効果的に阻害する。図６Ｂは、図６Ａの肺葉からの組織切片を示している。ＨＥ対比染色。図６Ｃは、肺サンプルごとの腫瘍組織の形態学的定量化である。
【図７】図７Ａは、ポリクローナル抗Ｋｉ６７を用いた早期原発腫瘍の染色であって、ＴＵＮＥＬ染色は、ＢＭ１６５またはｍＡｂ−７Ｂ２で処理した７日後に、増殖細胞の数の有意な減少および腫瘍細胞のアポトーシスの増加を示した。図７Ｂは、図７Ａで例示されているような未処理および処理した組織サンプルからの、抗Ｋｉ６７およびＴＵＮＥＬ染色の統計解析である。図７Ｃは、アポトーシスに関連したいくつかの差次的に発現した遺伝子のタンパク質−タンパク質相互作用ネットワークを示している。文献によって立証されているタンパク質相互作用のデータを、ヒトタンパク質参照データベース（Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）（ｗｗｗ．ｈｐｒｄ．ｏｒｇ）から抽出した。アポトーシスに関連した多くの遺伝子は、線維芽細胞由来のマトリックス上にプレーティングし、かつ抗ＬＮ−３３２抗体で処理したＡ４３１細胞において上方制御されていた（赤）。図７Ｄは、アネキシンＶで細胞を標識した後、フローサイトメトリーによって分析したところ、アポトーシス細胞の数が、正常マウスＩｇＧにさらした細胞においてよりも、ｍＡｂ−７Ｂ２で処理した細胞において２．４倍多かったことを示している。
【図８】図８は、ラミニン分子の描写である。α３、β３、およびγ２鎖を示している。Ｃはカルボキシ末端を表し、Ｎはアミノ末端を表す。β３およびγ２鎖の構造ドメインをローマ数字で示し、α３鎖のＧドメインの５つのサブドメインを示す。Ｐａｂ−２２６は、β３鎖のドメインＩＩＩ〜ＶＩと反応した。Ｐａｂ−１４２０はγ２鎖のドメインＩＩＩと反応し、Ｐａｂ−１４２５はγ２鎖のドメインＶと反応した。ｍＡｂ−７Ｂ２はＧ１〜Ｇ３サブドメインと反応し、ｍＡｂ  ＢＭ１６５はＧドメイン全体に対して反応した。Ｐａｂ−ＰＳＴは、三量体組換え型ヒトＬＮ−３３２分子全体に対して調製された。
【図９】図９Ａは、本研究において用いた新規のポリクローナルおよびモノクローナル抗体の免疫ブロットによる特徴づけである。組換え型ＬＮ−３３２（ｒＬＮ−３３２）を６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、免疫ブロットした。三量体ＬＮ−３３２に対して調製したＰａｂ  ＢＳＴは、３本すべての鎖と反応する。α３鎖のＧドメインに対して作製されたＰａｂ−Ｇ１２、Ｐａｂ−Ｇ１２３、およびｍＡｂ−７Ｂ２は、前記鎖のプロセシングされていない型およびプロセシングされた型の両方を認識する。ｍＡｂ−７Ｅ３およびＰａｂ−２２６は、β３鎖に特異的である。γ２鎖のドメインＩＩＩに対して作製されたポリクローナル抗体（Ｐａｂ−１４２０）は、前記鎖のプロセシングされていない型およびプロセシングされた型の両方を認識するが、一方でγ２鎖のドメインＶに対するＰａｂ−１４２５は、プロセシングされていない型のみを認識する。図９Ｂは、新規の組換え型Ｇ１２、Ｇ１２３、およびβ３  ６５ｋＤフラグメントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）による分析である。１ウェルあたり５μｇの各タンパク質をロードした。クマシーブルー染色。
【図１０】図１０は、マウスＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞によるＶＩＩ型コラーゲンα１鎖の発現を示している。ＲＴ−ＰＣＲ解析は、本研究で用いたマウスＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞におけるＶＩＩ型コラーゲンα１鎖（Ｃｏｌ７Ａ１）の発現を明示している。ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子の発現をコントロールとして示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
添付の図を参照することによって、本明細書に開示される組成物および方法のより完全な理解が得られる。これらの図は、本開示を実証する便宜性および容易性に基づいた概略図に過ぎず、したがって、例示的態様の範囲を定義および制限することを意図するものではない。
【００２１】
明確性のために以下の説明には特定の用語が使用されているが、これらの用語は図中の解説のために選択された態様の特定の構造のみを表すことを意図するものであって、本開示の範囲を定義および制限することを意図するものではない。図および以下の説明において、類似した数字表示は類似した作用の要素を表すものであると理解されるべきである。
【００２２】
本開示は、ラミニン−３３２に結合することによって腫瘍の成長および転移を阻害するのに有用な抗体を含む組成物に関する。この結合は、ラミニン−３３２に依存する腫瘍細胞の接着および移動を阻害する。
【００２３】
抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）単量体を表す。各Ｉｇ単量体は、一緒に接合している２本の重鎖と２本の軽鎖とからなり、Ｙの形を形成する。各Ｉｇ単量体は、当該技術分野において既知であるように、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメントに分割することができる。抗体は、機能的に定義づけられたかなりの期間（すなわち、結合と関連した生理学的反応を誘導、促進、増強、または調節するのに十分な時間）、典型的な生理的条件下で所望の抗原に結合する能力を有する。本明細書において用いられる「抗体」という用語は、完全な抗体分子、すなわちＩｇ単量体、およびエピトープに結合しうるそのフラグメントを表すと意図される。
【００２４】
図８はラミニン−３３２分子の略図であり、各鎖上の種々のドメインを意味するラベル付きで３本の鎖を示している。特に、３本すべての鎖のドメインＩおよびＩＩは、コイルドコイルドメイン構造を含むと考えられる。ドメインＩＩおよびＩＩＩのコイルドコイル領域の間には、柔軟性のあるヒンジ領域がある。
【００２５】
態様において、抗体組成物はラミニン−３３２の鎖、特にラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体を含む。特定の態様において、前記抗体は、β３鎖のアミノ末端にあるβ３鎖のドメインＶＩを介してドメインＩＩＩに選択的に結合する。実施例において論じられている例示的抗体には、Ｐａｂ−２２６およびｍＡｂ−７Ｅ３が含まれる。
【００２６】
前記抗体組成物は、ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体をさらに含んでもよい。特に、γ２鎖に対するこれらの抗体は、γ２鎖上のドメインＩＩＩまたはドメインＶに選択的に結合する。実施例において論じられている例示的抗体には、Ｐａｂ−１４２０、Ｐａｂ−１４２５、４Ｇ１、６Ｃ１２、およびＰａｂ−２６が含まれる。
【００２７】
前記抗体組成物は、あるいは、ラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体をさらに含んでもよい。Ｇドメインに対するこれらの抗体のいくつかは、α３鎖のサブドメインＧ１〜Ｇ３に選択的に結合しうる。実施例において論じられている例示的抗体には、ＢＭ１６５、ＲＧ１３、ｍＡｂ−７Ｂ２、およびＰａｂ−Ｇ１２が含まれる。
【００２８】
ある態様において、前記抗体組成物は、ラミニン−３３２のγ２鎖に対する抗体およびラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する抗体のいずれかまたは両方とともに、ラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体を含む。
【００２９】
あるいは、前記抗体組成物は、ラミニン−３３２のγ２鎖に対する（単離または精製した抗体等の）抗体を含む。
【００３０】
あるいは、前記抗体組成物は、ラミニン−３３２のα３鎖のＧドメインに対する（単離または精製した抗体等の）抗体を含む。
【００３１】
「選択的に結合する」という用語は、特定の領域または標的内に包含される１または複
数のエピトープに対する抗体の優先的結合を表す。一般的に、前記抗体は他のエピトープに対してほとんど結合性または反応性を有しないものである。
【００３２】
β３鎖、２鎖、および／またはα３鎖のＧドメインに対する抗体は、それぞれモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってよい。それらはキメラ抗体、すなわち、異なる抗体由来の領域を組み合わせることによって形成された抗体であってもよい。それらはヒト化された、すなわち、ある領域がヒトにおける免疫反応を低減または回避するように変異しているヒトでない種に由来するものであってもよい。あるいは、前記抗体は、完全にヒトの、すなわち、ヒトの生殖細胞系に由来するものであってもよい。前記抗体は、単離または精製されていてもよい。
【００３３】
本開示の抗体組成物の実際の投与量レベルおよび投与様式は、特定の患者に対して効果的な治療反応を実現するために多様であってよい。「治療上有効な量」という語句は、任意の医療に適用可能な妥当な効果／リスク比で疾患を治療するための、化合物の十分な量を意味する。しかしながら、本開示の抗体および組成物の１日あたりの総使用量は、適切な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されるであろうことは理解されるであろう。本開示の抗体組成物の１日あたりの総投与量は、約０．０００１〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であってよい。所望の場合には、有効な１日あたりの投与量を投与の目的のために複数回の投与に分けることもでき、その結果として、単回投与の組成物は、１日あたりの投与量を構成するような量またはその約数（ｓｕｂｍｕｌｔｉｐｌｅ）を含有するものであってよい。任意の特定の患者に対する具体的な治療上有効な投与レベルは、治療される疾患および疾患の重症度、患者の病歴、使用される特定化合物の活性、使用される特定化合物、患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別および食事、投与の時間、投与経路、治療期間、排泄率、併用される他の薬剤等を含む様々な要素によって決まるであろう。
【００３４】
本開示の抗体組成物の投与様式は、経口、直腸、静脈内、筋肉内、大槽内、膣内、腹腔内、口腔（ｂｕｃａｌ）、皮下、胸骨内、鼻腔内、または局所的であってよい。前記組成物を、カテーテル、冠動脈内ステント（微細な金網で構成されている管状デバイス）、生分解性ポリマー、または、抗体、ビオチン−アビジン複合体等を含むがそれに制限されない生物学的キャリアを介して標的部位に運ぶこともできる。局所投与のための投薬形態は、粉末、噴霧剤、軟膏、および吸引剤を含む。前記抗体を、無菌状態の下で医薬上許容されるキャリアおよび任意の必要とされる防腐剤、緩衝剤、または噴射剤と混合する。眼科用（Ｏｐｔｈａｌｍｉｃ）製剤、眼軟膏剤、粉末、および溶液も本開示の範囲内であると見なされる。好ましくは、前記抗体組成物は、静脈内または皮下に投与される。
【００３５】
前記抗体を、固形（顆粒、粉末、または坐薬を含む）あるいは液状（例えば、溶液、懸濁液、または乳濁液）に調製することができる。前記抗体を、様々な溶液の状態で適用することができる。本発明に従った使用のための適切な溶液は、無菌であり、十分量の前記抗体を溶解しており、かつ提案される適用に有害でない。
【００３６】
前記抗体は、滅菌等の従来の製薬工程にかけることができ、かつ／または防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤等の従来のアジュバントを含有してもよい。
【００３７】
投与のために、前記抗体を示された投与経路に適した１または複数の医薬上許容されるキャリアと組み合わせてもよい。前記抗体を、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリジン、ならびに／またはポリビニルアルコールと混合してもよく、かつ従来的な投与のために錠剤またはカプセル化してもよい。あるいは、前記抗体を、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコー
ル、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、エタノール、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、トラガカント・ゴム、および／または種々の緩衝剤に溶解させてもよい。他のアジュバントおよび投与様式は、製薬分野において周知である。前記キャリアまたは希釈剤は、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル等の時間遅延物質を単独で、あるいはワックスまたは当該技術分野において周知の他の物質とともに含有してもよい。
【００３８】
本開示の他の局面において、細胞移動を減少させる方法は、ラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体に細胞を接触させることによって提供される。好ましくは、接触させる細胞は腫瘍細胞または癌細胞である。本明細書においてさらに説明されているように、癌腫の浸潤先進部にある細胞は、しばしばＬＮ−３３２発現陽性である。
【００３９】
別の局面において、ラミニン−３３２分泌腫瘍を有する被験体に有効量のラミニン−３３２のβ３鎖に対する抗体を投与する工程を含む、腫瘍の成長を低下させる方法が提供される。
【００４０】
以下の実施例は、本開示をさらに解説することを目的とするものである。実施例は実例に過ぎず、本明細書に示した物質、条件、または工程のパラメーターに対する開示に従って作られたデバイスを制限することを意図するものではない。
【実施例】
【００４１】
材料および方法
細胞
ヒト類表皮癌細胞株Ａ４３１（カタログ番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５５５）、ヒト扁平上皮癌（ＳＣＣ）細胞株ＳＣＣ−２５（カタログ番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６２８）、ヒト腺癌細胞株ＢｘＰＣ３（カタログ番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６８７）、ヒトＢＪ線維芽細胞（カタログ番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５２２）、およびマウスＳＣＣ細胞株ＫＬＮ−２０５（カタログ番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４５３）、およびマウス線維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３（カタログ番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手した。すべての細胞はＡＴＣＣによって推奨されている細胞培養培地中で単層培養として維持した。ＶＩＩ型コラーゲンの発現を調べるために用いたマウス線維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３は、１０％ＦＢＳ、抗体、および（コラーゲンプロリルおよびリシルヒドロキシラーゼに必須の補因子である）（＋）−Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム（１００μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ，米国）を補充したＤＭＥＭを用いて培養した。
【００４２】
タンパク質および抗体
組換え型ＬＮ−３３２（ｒＬＮ−３３２）、組換え型ラミニンα３  ＧドメインフラグメントＧ１２（ｒＧ１２）およびＧ１２３（ｒＧ１２３）、ならびに組換え型ラミニンβ３短腕６５ｋＤフラグメント（ｒβ３−６５ｋＤ）は、米国のＢｉｏＳｔｒａｔｕｍ，Ｉｎｃ．から入手した（米国特許第６，７０３，３６３号、補足の材料および方法を参照されたい）。
【００４３】
ポリクローナル抗体をマウスγ２のドメインＩＩＩの一部に対して生成し（Ｐａｂ−１４２０）、およびドメインＶの一部に対して生成した（Ｐａｂ−１４２５）（図８を参照されたい）。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）４Ｇ１はデンマークのＤＡＫＯ（Ｍ７２６２）から入手し、モノクローナル抗体６Ｃ１２は以前に特徴づけされている（参考文献２６）。ｍＡｂ  ＢＭ１６５（参考文献２７）はＰａｕｌ  Ｆ．Ｇｏｅｔｉｎｃｋからのご好意により提供されたものであり、ｍＡｂ  ＣＭ６およびＲＧ１３（参考文献２８および２９）はＪｏｎａｔｈａｎ  Ｊｏｎｅｓからのご好意により提供されたものである。ｍＡｂ−７Ｂ２およびｍＡｂ−７Ｅ３を、伝統的なハイブリドーマ技術を用いることによってｒＬＮ−３３２に対して作製した。ハイブリドーマを、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、およびウエスタン解析を用いることによって特徴づけした（図９を参照されたい）。ポリクローナル抗体Ｐａｂ−２６（Ｐａｂ  γ２ＩＩＩ）は以前に特徴づけされている（参考文献１６および１９）。ポリクローナル抗体Ｐａｂ−ＢＳＴはｒＬＮ−３３２に対して、Ｐａｂ−Ｇ１２はＧドメインフラグメントのｒＧ１２に対して、およびＰａｂ−２２６はβ３短腕フラグメントのｒβ３  ６５ｋＤに対してウサギで作り、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、およびウエスタン解析を用いることによって特徴づけした（図９）。
【００４４】
細胞接着アッセイ
９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉ−ＳｏｒｐｔＴＭ，Ｎｕｎｃ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に０．１μｇ／ウェルのｒＬＮ−３３２でコーティングし、可能性のある活性結合部位を２００μｇ／ウェルの１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした。総数２０，０００〜２５，０００個のＡ４３１、ＳＣＣ−２５、またはＢｘＰＣ３細胞を各ウェルに１００μｌでプレーティングし、３７℃で２時間付着させ、次いで４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％クリスタルバイオレットで染色した。すべての抗体およびコントロールを３連のウェルで試験した。
【００４５】
リアルタイム細胞電極センサー（ＲＴ−ＣＥＳＴＭ）技術（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，サンディエゴ，カリフォルニア州）（３０）を用いて、細胞接着および抗体の阻害効果をより正確に評価した。ＡＣＥＡ  Ｅプレートを５μｇ／ｍｌのｒＬＮ−３３２を用いて３７℃で１時間コーティングし、ＰＢＳで洗浄し、可能性のある残留活性部位をＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡでブロッキングした。ウェルをＰＢＳで洗浄し、１ウェルあたり２５０００個の細胞を、種々の濃度のｍＡｂ  ７Ｂ２またはＢＭ１６５とともにまたはなしで添加した。細胞指数（参考文献３１）をそれに続く時間、連続的に測定した。
【００４６】
移動アッセイ
プラスチック上での細胞移動を調べるために、平底の２４ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に２×１０５個／ウェルのＳＣＣ−２５またはＢｘＰＣ３細胞を播種し、一晩培養した。次いで、細胞を１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）で３７℃にて２時間処理し、その後、細胞層をピペットのチップで引っかくことによって細胞層を傷つけた。創傷サイズを顕微鏡下で測定し、最も類似している創傷をアッセイに選択した。細胞移動の阻害アッセイのために、１０％ＦＣＳを含有する培地を抗体およびコントロール（５０μｇ／ｍｌ）とともにまたはなしでウェルに添加した。コントロール抗体で処理したまたは抗体処理なしのすべての細胞は、マイトマイシンＣ処理の後、適切に移動することができ、マイトマイシンＣ自体が細胞移動に影響を与えないことを確認した。細胞を３７℃で２０時間移動させ、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ（Ｄａｄｅ）で染色し、創傷を測定し、写真に撮った（Ｌｅｉｃａ  ＭＺＦＬ１１１）。
【００４７】
線維芽細胞によって産生された細胞外マトリックス上でのＫＬＮ−２０５細胞の移動を調べるために、平底の２４ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に２×１０５個／ウェルのマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞を播種し、コンフルエントまで一晩培養した。細胞外線維芽細胞マトリックスを記載されているように調製し（参考文献３２）、金属棒をウェル中に置いた。次いで、２×１０５個／ウェルのＫＬＮ−２０５細胞を播種し、コンフルエントまで一晩成長させた。細胞を１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）で２時間処理し、その後、細胞を洗浄し、創傷サイズを測定した。細胞移動の阻害をアッセイするために、１０％ＦＣＳを含有する培地を抗体およびコントロール（５０〜１００μｇ／ｍｌ）とともにまたはなしで添加した。細胞を前述のように染色後、３７℃で４６時間移動させ、創傷を測定し、写真に撮った。創傷境界線における葉状仮足構造の定量化のために、線維芽細胞マトリックス上でのＫＬＮ−２０５の細胞移動の典型的な結果を示し
ている５〜６領域を２つの独立した試験から選択した。創傷境界線における第一層の細胞のみを計数した。１領域あたりの葉状仮足を有する細胞の数を、特定の創傷境界線における１領域あたりの細胞の総数と比較した。
【００４８】
Ｃｏｌ７Ａ１発現の解析
全ＲＮＡを、メーカーのプロトコールに従い、ＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ，ドイツ）を用いて、培養したＮＩＨ３Ｔ３細胞から抽出した。一本鎖ｃＤＮＡを、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）で合成した。ＰＣＲ反応を、ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＱＩＡＧＥＮ，ドイツ）を用いて、９５℃３０秒間、５０℃３０秒間、および７２℃４０秒間での３５回の繰り返しサイクルで実施した。Ｃｏｌ７Ａ１  ｃＤＮＡの増幅のためのプライマー配列は以下のとおりであり：Ｃ７Ｆ  ５’ｃａｇｔｃａｇｇａｃｃｃａａｇｇｇｔｇ  ３’（配列番号：１）、Ｃ７Ｒ  ５’ｔａｔｃｃｇｃａｇｃａｔａａｃｃｇｇ  ３’（配列番号：２）、マウスＣｏｌ７Ａ１  ｍＲＮＡの３’末端（４００ｂｐ）を増幅するために設計された。ポジティブコントロールとしてのＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡの一部（３４７ｂｐ）を増幅するためのプライマー配列は、ＧＡＦ  ５’ｔｃａｔｃｔｃｃｇｃｃｃｃｔｔ  ３’（配列番号：３）、ＧＡＲ  ５’ａａｃａｃｇｇａａｇｇｃｃａｔｇ  ３’（配列番号：４）であった。
【００４９】
動物実験
すべての動物実験は、フィンランドおよびデンマークの法律、ならびにデンマークのＮｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓにおける動物の人道的使用に関するガイドラインに従って実施された。前記実験は、フィンランドのオウル大学の動物実験委員会（０６４／０５）およびフィンランドのオウル地方行政局（ＯＬＨ−２００５−０３２６６／Ｙｍ−２３）によって承認された。
【００５０】
ＬＮ−３３２抗体のインビボでの腫瘍への標的を分析するため、マウス１匹あたりＰＢＳ中に２０μｇのＩｇＧを、ＫＬＮ−２０５腫瘍を持つＤＢＡ／２マウスに（Ｐａｂ−２６および正常ウサギＩｇＧ）またはＡ４３１腫瘍を持つヌードマウスに（ｍＡｂ−７Ｂ２および正常マウスＩｇＧ）静脈内注射した。注射した抗体およびコントロールＩｇＧを検出するために、注射の２４時間後、腫瘍組織を切り出した。５μｍ厚の低温切開片をアセトンで固定し、非特異的結合に対してＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロッキングし、次いでＦＩＴＣ接合型抗ウサギＩｇＧまたはＦＩＴＣ接合型抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いることによって、注射した抗体の存在を調べた。
【００５１】
異種移植マウスモデルにおける免疫療法試験のために、１０週齢の雌のＮＭＲＩヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）を用いた。０日目に、ヒト類表皮癌細胞（Ａ４３１細胞株、２×１０５個／マウス）を腫瘍の移植のために３０匹の免疫不全マウスに皮下注射し、その後、前記マウスを３つのグループに分けた（１０匹／グループ）。３日目（初回投与）および処理期間の間、グループ１のマウスは、滅菌ＰＢＳ緩衝液（０．０５ｍｌ／１０ｇ）を受けた。グループ２のマウスは、ｍＡｂ  ＢＭ１６５を含むＰＢＳ（初回投与量０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で５０ｍｇ／ｋｇ、処理期間の投与量０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で２５ｍｇ／ｋｇ）を与えられた。グループ３のマウスは、ｍＡｂ−７Ｂ２を含むＰＢＳ（初回投与量０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で５０ｍｇ／ｋｇ、処理期間の投与量０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で２５ｍｇ／ｋｇ）を与えられた。治療の注射（試験アイテムを含むＰＢＳ）は２８日目まで行われた。腫瘍容積を週に２回測定し、調査は３８日目に終了した。腫瘍の最大および最小（長さ／幅）寸法（ｄ１およびｄ２）を測定し、腫瘍のおおよその容積をπ／６×ｄ１２×ｄ２（ｄ１＜ｄ２の場合）の式に従って算出した。
【００５２】
同系マウスモデルにおける免疫療法試験のために、８〜１０週齢の雄のＤＢＡ／２マウ
ス（Ｔａｃｏｎｉｃ）を用いた。０日目に、マウス肺癌細胞（ＫＬＮ−２０５細胞株、４×１０５個／マウス）を腫瘍の移植のために３０匹のマウスに皮下注射し、その後、前記マウスを無作為に３つのグループに分けた（１０匹／グループ）。７日目（初回投与）および処理期間の間、グループ１のマウスは、滅菌ＰＢＳ緩衝液（０．０５ｍｌ／１０ｇ）を受けた。グループ２のマウスは、γ２およびβ３鎖の短腕に対するポリクローナル抗体の混合物（Ｐａｂ−１４２０、Ｐａｂ−１４２５、およびＰａｂ−２２６）を含むＰＢＳ（すべての投与量は０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で１つの抗体あたり２５ｍｇ／ｋｇ）を受けた。グループ３のマウスは、ＬＮ−３３２のすべての鎖に対するポリクローナル抗体の混合物（Ｐａｂ−ＢＳＴ、Ｐａｂ−１４２５、およびＰａｂ−２２６）を含むＰＢＳ（すべての投与量は０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で１つの抗体あたり２５ｍｇ／ｋｇ）を受けた。治療の注射（試験アイテムを含むＰＢＳ）は６回行われた。試験は２８日目に終了した。腫瘍を週に２回測定し、腫瘍容積を前述のように算出した。
【００５３】
癌転移の溢出工程に対する抗体の潜在的効果を、ＫＬＮ−２０５細胞の静脈内注射によって調べた。０日目に、マウス１匹あたり４×１０５個の細胞を、抗体またはＰＢＳビヒクルのみとともに、雄のＤＢＡ／２マウス（８〜１０週齢）に静脈内注射した。０日目および処理期間のすべての投与量は、０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で１つの抗体あたり２５ｍｇ／ｋｇであった。グループ１のマウス（３匹／グループ）は、滅菌ＰＢＳ緩衝液（０．０５ｍｌ／１０ｇ）を受けた。グループ２のマウス（４匹／グループ）は、ＬＮ−３３２のすべての鎖に対するポリクローナル抗体の混合物（Ｐａｂ−ＢＳＴ、Ｐａｂ−１４２５、およびＰａｂ−２２６）を含むＰＢＳを受けた。グループ３のマウス（３匹／グループ）は、γ２およびβ３鎖の短腕に対するポリクローナル抗体の混合物（Ｐａｂ−１４２５およびＰａｂ−２２６）を含むＰＢＳを受けた。治療の注射（試験アイテムを含むＰＢＳの腹腔内注射）は１１日目まで３回行われ、試験は１８日目に終了した。肺を取り出し、典型的な結果を示している肺（２匹／グループ）を転移の量に関する形態学的分析にかけた。いくつかの連続的な５μｍの組織切片（組織の深さ２００〜４００ｎｍ）を調製し、規則的な空間とすべての肺葉の良好な横断面とを有する５つの切片を、３ＣＣＤカラービデオカメラ（Ｓｏｎｙ）およびＭＣＩＤＭ４  ３．０  Ｒｅｖ．１．１ソフトウェア（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）に接続したＮｉｋｏｎ  Ｏｐｔｉｓｈｕｔ  ２顕微鏡を用いて腫瘍組織をスキャンした。肺サンプルごとの腫瘍組織の割合を、スキャンされた肺の総面積に対するスキャンされた腫瘍面積のａ％として算出した。最終的な結果を、５つすべての肺切片からの平均として算出した。
【００５４】
早期原発腫瘍におけるアポトーシスを調べるために、０日目に、ヒトＡ４３１類表皮癌細胞を腫瘍の移植のために１８匹の免疫不全マウスに皮下注射した。３日目（初回投与）および処理期間の間、グループ１のマウス（６匹）は、ＰＢＳ中の正常マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、初回投与量０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で５０ｍｇ／ｋｇ、処理期間の投与量０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で２５ｍｇ／ｋｇ）を受けた。グループ２のマウス（６匹）は、ＢＭ１６５を含むＰＢＳ（初回投与量０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で５０ｍｇ／ｋｇ、処理期間の投与量０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で２５ｍｇ／ｋｇ）を受けた。グループ３のマウス（６匹）は、ｍＡｂ−７Ｂ２を含むＰＢＳ（初回投与量０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で５０ｍｇ／ｋｇ、処理期間の投与量０．０５ｍｌ／１０ｇの状態で２５ｍｇ／ｋｇ）を受けた。治療の注射（正常マウスＩｇＧまたは試験アイテムを含むＰＢＳの腹腔内注射）は１４日目まで行われた。腫瘍容積を週に２回測定した。動物を腫瘍の成長に応じて７、１０、または１４日目に個別に殺処分した。
【００５５】
マイクロアレイ
線維芽細胞マトリックス上で培養したＡ４３１細胞の発現プロファイルに対する抗体の効果を、ＤＮＡマイクロアレイ（補足の材料および方法を参照されたい）を用いて調べた。アレイデータをＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓデータベースに寄託した。受託番号Ｅ−ＭＥ
ＸＰ−１１４１。審査担当者のアカウント：ユーザー名：Ｒｅｖｉｅｗｅｒ＿ＥＭＥＸＰ−１１４１、パスワード：１１８２８５８８５５１９７。
【００５６】
統計解析
免疫療法試験からのデータをマン・ホイットニーのＵ検定によって、ＴＵＮＥＬアッセイからのものを両側スチューデントのｔ検定によって評価した。
【００５７】
結果
癌細胞におけるＬＮ−３３２  ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現
適当なＬＮ−３３２産生細胞を識別するために、本発明者らは、４種の上皮性癌細胞株、すなわちマウスＫＬＮ−２０５扁平上皮癌（ＳＣＣ）、ヒトＡ４３１、ヒトＳＣＣ−２５、およびヒトＢｘＰＣ３腺癌における前記タンパク質の発現を検証した。ＲＴ−ＰＣＲ解析によって判断されるように、すべてがラミニンα３、β３、およびγ２鎖を発現しており（図１Ａ）、かつウエスタンブロットにより、すべての鎖が予想分子量で合成されていることが明示された（図１Ｂ）。分泌されたγ２鎖は、マウスＫＬＮ−２０５細胞株について示されているように、１５５ｋＤａ型およびプロセシングされた１０５ｋＤａ型の両方で存在していた。
【００５８】
ＬＮ−３３２陽性のマウスおよびヒト腫瘍細胞株を、それぞれＤＢＡ／２マウスの腰筋またはヌードマウスの背側頸部領域に接種した。すべての株がＬＮ−３３２陽性の腫瘍を生成し、さらにＫＬＮ−２０５細胞は肺に転移した。図１Ｃは、ヒトＡ４３１およびマウスＫＬＮ−２０５の腫瘍、周辺間質、または筋組織において、すべてのＬＮ−３３２鎖の発現がそれぞれ陰性であることを示している。前記発現は腫瘍端部で最も強かったが、腫瘍先進部からより中央でも観察された。ＫＬＮ−２０５原発腫瘍の肺転移は、ＬＮ−３３２陽性であった（図１Ｃ）。ヒトＳＳＣ−２５腫瘍は、同様のＬＮ−３３２発現を示した（図示せず）。
【００５９】
ＬＮ−３３２抗体は、インビトロでの腫瘍細胞の接着および移動に影響を与える
上皮細胞の定着は、通常、一方ではＬＮ−３３２のＧドメインのインテグリンへの結合を介して、他方ではβ３およびγ２鎖の短腕のＶＩＩ型コラーゲンのようなマトリックス分子への結合によって媒介される。これらの結合作用は、ドメイン特異的抗体によって妨げることができる。
【００６０】
ヒトＬＮ−３３２分子全体を抗原として用いて生成されたＰａｂ−ＢＳＴは、組換え型ヒトＬＮ−３３２（ｒＬＮ−３３２）でコーティングしたプラスチックへのすべての細胞株の接着を有意に阻害した（図２Ａ）。さらに、ヒトＧドメインに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＢＭ１６５およびｍＡｂ−７Ｂ２も、同様の結果を明示した。対照的に、β３およびγ２鎖の短腕に対する抗体は、このアッセイにおいてｒＬＮ−３３２への接着に影響を与えなかった（図２Ａ）。これらの結果は、ＬＮ−３３２がこれら腫瘍細胞の接着に重要であるということ、ならびに前記タンパク質の前記主要な細胞およびインテグリン結合部位がα３鎖のＧドメインに位置するという見解と一致する。三量体ｒＬＮ−３３２への接着に対するｍＡｂ−７Ｂ２の阻害効果は、用量依存的であった（図２Ｂ）。リアルタイム細胞電極センサー（ＲＴ−ＣＥＳＴＭ）技術により、細胞接着に対してｍＡｂ−７Ｂ２はＢＭ１６５よりもほぼ５０％高い阻害効果を有することが明示されており（図２Ｃ）、また競合的ＥＬＩＳＡの結果により、ｍＡｂ−７Ｂ２は少なくとも部分的にラミニンα３鎖のインテグリン結合ドメイン内の異なるエピトープを認識することが示唆される（図２Ｄ）。
【００６１】
二次元創傷治癒アッセイにおいて調査したように、ＬＮ−３３２抗体はコーティングされていないプラスチック上での前記細胞の移動を阻害した。したがって、ｍＡｂ−７Ｂ２
およびＢＭ１６５（抗α３）、ｒＬＮ−３３２に対して作られたＰａｂ−ＢＳＴは、ＳＣＣ−２５、ＢｘＰＣ３、またはＫＬＮ−２０５細胞の移動を阻害したが、コントロールＩｇＧは阻害しなかった（図３Ａおよび３Ｂ）。対照的に、ラミニンγ２鎖のドメインＩＩＩ（短腕）（図３Ａ）およびβ３鎖の短腕（図示せず）に対する抗体は、このアッセイにおいて前記細胞の移動を阻害しなかった。これらの結果は、マトリックス分子が存在しない場合、ＬＮ−３３２がプラスチック上でのヒトおよびマウスの癌細胞の移動に重要であること、ならびにＬＮ−３３２産生細胞のプラスチックへの接着は、α３鎖のインテグリン結合Ｇドメインに依存するが、通常ＬＮ−３３２をコラーゲンまたは間質に存在する他の相互作用タンパク質とつなげているβ３またはγ２鎖の短腕には依存しないことを実証している。
【００６２】
上皮細胞は、通常インビボでは、ＬＮ−３３２の短腕を介してＶＩＩ型コラーゲン等の間質分子に固定されているため、本発明者らは、ＶＩＩ型コラーゲンを含有する線維芽細胞由来のマトリックス上での腫瘍細胞の移動調査を繰り返した。マトリックスの産生に用いたマウス線維芽細胞株ＮＩＨ−３Ｔ３は、ＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いることによってＶＩＩ型コラーゲンを発現することが実証された（材料および方法、図１０）。興味深いことには、前記マトリックス上で成長させたマウスＫＬＮ−２０５細胞の移動は、β３の短腕に対する抗体およびγ２の短腕に対する抗体（Ｐａｂ−２２６、Ｐ−１４２０、Ｐａｂ−１４２５）、ならびに三量体ＬＮ−３３２全体に対する抗体（Ｐａｂ−ＢＳＴ）のいずれによっても強力に阻害された（図３Ｂ）。このことは、γ２鎖のドメインＩＩＩおよびＶ、ならびにβ３鎖の短腕が、移動の間、ＬＮ−３３２をマトリックスへ連結させるのに重要であることを実証している。本発明者らは、また、線維芽細胞マトリックス上でのヒトＳＣＣ−２５癌細胞の移動に対するα３、β３、およびγ２鎖に対する抗体の効果を調べ、それらは同様の阻害効果を生じた（データ示さず）。種々の抗体の移動に対する全体的効果を図３Ｃに表した。
【００６３】
ＬＮ−３３２抗体は、線維芽細胞由来のマトリックス上で成長させた細胞において、種々の細胞表現型をもたらした。したがって、インテグリン結合Ｇドメインに対する抗体によって、前記細胞の多くが丸く持ち上がって解離し、一方でβ３の短腕に対する抗体およびγ２の短腕に対する抗体（Ｐａｂ−２２６およびＰａｂ−１４２５）は、移動細胞で観察される葉状仮足の形成を阻害した（図４Ａ）。このことは、移動細胞が移動の間間質分子に結合するために前記短腕を使用することを示している。葉状仮足を有する細胞を定量化し、葉状仮足を有する細胞の数を創傷境界線における細胞の総数と比較した。コントロールＩｇＧで処理した細胞の約６５％は、創傷境界線において葉状仮足構造を有する移動表現型を示し、一方で、例えばＰａｂ−１４２５で処理した細胞の７．７％のみで葉状仮足が観察された（図４Ｂ）。
【００６４】
ＬＮ−３３２抗体は、インビボで癌腫を標的とする
ＬＮ−３３２産生腫瘍を持つマウスに、前記腫瘍およびその転移を標的とした抗ＬＮ−３３２抗体を静脈内注射した。本発明者らは、まず、皮下ヒトＡ４３１腫瘍を持つヌードマウスにα３およびγ２鎖抗体を注射した。注射の２４時間後、α３  ｍＡｂ−７Ｂ２抗体は腫瘍を効果的に標的とし（図５Ａ）、染色は主に間質成分に近接する周囲で観察された。β３およびγ２に対する抗体は、同様の腫瘍細胞の染色を示した（図示せず）。さらに、いくつかの不連続な染色が、腫瘍細胞コロニー周辺およびいくつかの単一細胞の周りに検出された。正常マウスＩｇＧは、陽性の染色を示さなかった（図５Ａ）。β３およびγ２鎖はＬＮ−３３２アイソフォームのみで存在するが、α３鎖はＬＮ−３１１（以前は、ラミニン−６）およびＬＮ−３２１（以前は、ラミニン−７）アイソフォームでも存在する（参考文献１）。ｍＡｂ−７Ｂ２は血管において弱い陽性シグナルを生じたのみであり、それがそうしたラミニンとも反応しうることを示している（データ示さず）。ｍＡｂ−７Ｂ２およびＢＭ１６５のいずれもマウスＬＮ−３３２と実際に交差反応しないため、これらの抗体の正常上皮および血管へのインビボでの潜在的ホーミングは、同系マウスモ
デルにおいて抗マウスα３鎖抗体を用いて今後確認されなければならない。
【００６５】
本発明者らは、次いで、ラミニンγ２鎖に対する精製ポリクローナルウサギＩｇＧまたは正常ＩｇＧを、マウスＫＬＮ−２０５原発腫瘍および肺転移を持つマウスに注射した。注射の６、２４、４８、または７２時間後にマウスを殺処分し、ＦＩＴＣ標識抗ウサギ二次抗体を用いて凍結切片をウサギＩｇＧについて調べた。注射の６時間後、コントロールＩｇＧとは対照的に、抗γ２抗体は原発腫瘍およびその肺転移を効果的に標的としていた（図５Ａ）。ＫＬＮ−２０５腫瘍組織全体にわたって染色が観察され、反応は筋肉−腫瘍接合部で最大であった。さらに、いくつかの不連続な染色が、腫瘍細胞コロニー周辺およびいくつかの個別細胞の周りに検出された。抗γ２鎖抗体の特異的位置は、注射の６時間後にすでに観察でき、それは注射後の少なくとも７日間依然として検出可能であった（データ示さず）。正常ウサギＩｇＧの注射後、腫瘍および他の組織は、標識抗ウサギ二次抗体を用いて陰性であった（図示せず）。
【００６６】
ポリクローナルＬＮ−３３２抗体は、皮膚および腸等における正常上皮ＢＭに対していくらかの標的化を示したが、染色は腫瘍におけるものほど強くなかった。本発明者らは、接合部型表皮水疱症を有する患者で、または抗体処理後４週までの間ＬＮ−３３２ノックアウトマウスで観察される腸管上皮における皮膚疱疹または異常のいかなる兆候にも決して気づかなかった。
【００６７】
抗ラミニン抗体は、インビボでのヒトＡ４３１およびマウスＫＬＮ−２０５  ＳＣＣの成長を阻害する
本発明者らは、ＬＮ−３３２抗体がインビボで腫瘍細胞の成長および広がりに影響を及ぼしうる可能性があるかどうかを調査した。ＬＮ−３３２強陽性のヌードマウスにおけるヒトＡ４３１腫瘍（異種移植モデル）およびＤＢＡ／２マウスにおけるマウスＫＬＮ−２０５腫瘍（同系転移モデル）をモデルとして用いることによって、４つの独立した試験を実施した。ＢＭ１６５およびｍＡｂ−７Ｂ２の両方ともに、Ａ４３１異種移植モデルにおいて原発腫瘍の成長の有意な阻害をもたらし、その全体的阻害は最大で６８％であった（図５Ｂ）。処理した腫瘍の腫瘍生着率は、試験２（１００％）（データ示さず）においてよりも試験１で低く（５５％）（図５Ｂ）、抗腫瘍効果が抗体処理したマウスに対する腫瘍確立の低下に部分的に起因することを示唆した。ＢＭ１６５での腫瘍の成長の阻害は、試験１で６８％（ｐ＝０．０２９）および試験２で４８％（ｐ＝０．１１３）であり、ｍＡｂ−７Ｂ２処理での阻害は、それぞれ６８％（ｐ＝０．０２３）および５１％（ｐ＝０．０２８）であった。
【００６８】
３つ目の試験において、ｍＡｂ−７Ｂ２  抗α３鎖抗体を用いた処理を、腫瘍が確立した（５０〜１００ｍｍ３）１４日目に最初に開始した。３４％（ｐ＜０．００１）のみではあるが、腫瘍の成長に対して有意な阻害効果が依然としてあった（図５Ｃ）。
【００６９】
マウスＫＬＮ−２０５腫瘍モデルを用いた４つ目の試験において、３本すべてのＬＮ−３３２鎖に対するポリクローナル抗体またはβ３およびγ２の短腕に対するもののみを用いた処理を、腫瘍生着率が１００％であり、かつ腫瘍容積が約２０ｍｍ３であった腫瘍接種の７日後に開始した。短腕抗体を用いての腫瘍の成長阻害は約４３％であり、すべてのＬＮ−３３２鎖に対する抗体混合物を用いての腫瘍の成長阻害は約５３％であった（図５Ｄ）。
【００７０】
正常な免疫系の潜在的活性化を調べるために、Ａ４３１インビボ試験由来の、およびインビボで腫瘍にも位置するアイソタイプ適合性抗ＬＮ−３３２モノクローナル抗体で処理した正常ヌードマウス由来の血液サンプルを分析した。しかしながら、中和抗体の兆候は検出されなかった（データ示さず）。さらに、インビボで腫瘍に局在することも示されているγ２鎖ドメインＩＩＩに対するアイソタイプ適合性ポリクローナル抗体Ｐａｂ−２６
（データ示さず）で処理した場合には、マウスＫＬＮ−２０５腫瘍を持つマウスにおいて、腫瘍の成長に対するわずかな阻害効果しか検出されなかった。したがって、腫瘍の成長の阻害の主なメカニズムは、おそらく例えば補体タンパク質の活性化の結果ではない。
【００７１】
重要な問題は、β３およびγ２鎖のうちのマトリックスに結合する短腕への結合を介して移動を妨げる抗ＬＮ−３３２抗体が、インビボでの転移の形成に影響を及ぼしうるかどうかであった。重要なことには、このことは事実であることが示された。したがって、一方では３本すべてのＬＮ−３３２鎖に対するポリクローナル抗体混合物、ならびに他方ではβ３およびγ２の短腕に対する抗体は、マウスＫＬＮ２０５細胞の静脈内注射の後、肺転移の数を約７０〜８５％減少させた（図６）。
【００７２】
腫瘍の成長の阻害メカニズムを理解するために、本発明者らは、抗体処理の有無での増殖およびアポトーシスのレベルについてＡ４３１腫瘍を調べた。抗体の注射（正常マウスＩｇＧ、ＢＭ１６５、またはｍＡｂ−７Ｂ２を含むＰＢＳ）を、３日目から１４日目まで（３回）与えた。動物を腫瘍の成長に応じて７、１０、および１４日目に個別に殺処分した。ポリクローナル抗Ｋｉ６７を用いた早期原発腫瘍の染色は、ＢＭ１６５またはｍＡｂ−７Ｂ２を用いた処理の７日後に、早期の腫瘍において増殖する細胞の数の有意な減少を示した（図７Ａおよび７Ｂ）。７日目のＴＵＮＥＬ染色は、腫瘍細胞のアポトーシスの増加を示した（図７Ａ）。ＢＭ１６５およびｍＡｂ−７Ｂ２で処理したマウス由来の腫瘍のアポトーシス指数（ＢＭ１６５に対して８．４８％±３．２５％，Ｐ＝０．００２およびｍＡｂ−７Ｂ２に対して８．１８％±８．４６％，Ｐ＝０．０３３）は、コントロールとして用いたマウス正常ＩｇＧで処理したマウスのもの（１．８２％±１．２８％）よりも、７日目に有意に高かった（図７Ｂ）。１４日目についても同様の結果が得られたが、３８日目のインビボ試験の最後には得られなかった（データ示さず）。
【００７３】
ＬＮ−３３２抗体によってもたらされる腫瘍の成長の阻害の分子メカニズムについて解明するために、３本すべてのＬＮ−３３２鎖に対する抗体の混合物を添加する前に、線維芽細胞由来のマトリックス上にヒトＡ４３１細胞を５時間プレーティングし、インキュベーションを１６時間続けた。前記細胞の約３０％が丸く持ち上がり、それらの一部は解離し、一方でコントロール細胞は付着したままであった。抗体処理したものおよびコントロール由来の細胞を、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトゲノムＵ１３３プラス２．０アレイを用いた包括的トランスクリプトーム解析にかけた。結果は、２，１３９個の遺伝子が５％の個別の有意水準で少なくとも１．５倍の変化で差次的に発現していたことを明示した。抗体処理した細胞において、総計１，２９１個の遺伝子が１．５倍またはそれ以上に上方制御されており、８４８個の遺伝子が１．５倍またはそれ以上に下方制御されていた。
【００７４】
興味深いことには、アポトーシス経路の多数の遺伝子が上方制御されていた（図７Ｃおよび補足の表１を参照されたい）。例えば、カスパーゼ３は約１０倍、ＤＮａｓｅＩは６倍、カスパーゼ４は３倍、および細胞死関連タンパク質３は２倍上方制御されていた。
【００７５】
抗ＬＮ−３３２処理後のアポトーシス細胞の割合を、アネキシンＶで細胞を標識した後、フローサイトメトリーによって分析した。図７Ｄに示されているように、アポトーシス細胞の数は、正常ヒトＩｇＧにさらした細胞においてよりも、ｍＡｂ−７Ｂ２で処理した細胞において２．４倍多かった。細胞過程の制御、インテグリン介在性シグナル経路、細胞接着、細胞成長の制御等、有意に変化する他の経路または生物学的過程が存在する。多くのこうした経路が変化するのは、二次的効果であろう。したがって、本発明者らは、観察された表現型に直接関連するアポトーシス経路に重点を置くことを選択した。したがって、当該すべての相互作用は、ヒトタンパク質参照データベース（ｗｗｗ．ｈｐｒｄ．ｏｒｇ）（３３−３５）から入手した、文献によって立証されているタンパク質−タンパク質相互作用である。
【００７６】
考察
ＬＮ−３３２は、皮膚、口腔、消化管、および結腸の扁平上皮癌、ならびに頸癌等のほとんどの上皮性腫瘍において高発現している、上皮特異的な接着および移動関連タンパク質である（参考文献１５、１６、１９、および３６〜４０）。本出願は、ドメイン特異的抗体がインビトロおよびインビボでのＬＮ−３３２の特異的作用およびＬＮ−３３２陽性の腫瘍細胞の挙動に重大な影響を及ぼしうることを示した。第一に、β３およびγ２鎖特異的抗体は間質マトリックス上でのＬＮ−３３２介在性の腫瘍細胞移動を阻害することが初めて示され、ＬＮ−３３２の間質結合作用はマトリックスを介した移動に重要であることが示唆された。第二に、α３鎖のインテグリン結合部位を遮断することによっても、ＬＮ−３３２陽性の腫瘍細胞株の接着および移動は阻害された。第三に、これらの抗体は、インビトロで前記細胞を剥離することによってアポトーシスを誘導した。第四に、重要なことには、前記抗体はインビボでＬＮ−３３２陽性のヒト腫瘍マウスを効果的に標的とした。第五に、ヒトＡ４３１およびマウスＫＬＮ−２０５癌腫を持つマウスをＬＮ３３２抗体で処理することにより、腫瘍の成長の有意な低下がもたらされた。第六に、ＫＬＮ−２０５腫瘍細胞を静脈内投与することによる肺転移の形成は、ＬＮ−３３２に対する抗体で処理することによって有意に低下した。当該結果は、前記抗体が腫瘍の成長および腫瘍の広がりの過程を両方ともに阻害しうる治療法としての可能性を有しうることを示唆している。
【００７７】
接着および移動の阻害
インビボでの腫瘍細胞の抗体介在性ＬＮ−３３２中和作用は、一方では細胞結合ドメインの、他方ではマトリックス結合ドメインの特異的遮断を必要とし、かつ前記抗体が皮膚疱疹等の正常上皮の機能障害および合併症を引き起こさないことを必要とする。本研究により、インテグリン結合Ｇドメインを標的化すると、ｒＬＮ−３３２でコーティングされたプラスチックへのＬＮ−３３２陽性細胞の接着、およびプラスチックまたは線維芽細胞由来のマトリックス上での移動が効果的に阻害されることが実証された。先行研究により、上皮細胞および癌細胞は、インテグリンα３β１およびα６β４を介してＬＮ−３３２に結合することが示されている（参考文献１１）。固定された接着ではα６β４が主要なインテグリンであるが（参考文献１１）、移動の間ではそれは主にα３β１である（参考文献４１および４２）。両方のインテグリンに対する抗体はＬＮ−３３２への結合を阻害するが、前記インテグリンに対する抗体は、種々の細胞型および組織において、多くの他のタンパク質へのそれらの受容体の結合に影響を及ぼすため、インテグリンへのＬＮ−３３２結合の特異的遮断は、ＬＮ−３３２  Ｇドメインに対する抗体を用いておそらくより効果的に達成される。
【００７８】
ＬＮ−３３２のβ３およびγ２鎖の短腕に対する抗体は、ＬＮ−３３２をコーティングしたプラスチック上での結合および移動には影響を与えなかったが、それらは線維芽細胞由来のマトリックス上での移動を遮断した。妥当な説明としては、組織においてＬＮ−３３２はその短腕を介してＶＩＩ型コラーゲンと相互作用するということ、およびこの相互作用は間質内の移動のために利用されるということである。固定フィラメントにおけるこのタイプのラミニン−間質相互作用は、ＬＮ−３３２、β３およびγ２鎖を含有するラミニン型のみに特有のものである。他のラミニンは意図的にＶＩＩ型コラーゲンに結合しない。ＬＮ−３３２はその短腕を介してＶＩＩ型コラーゲンに結合することが示されているが（参考文献１４）、両方の鎖がこの相互作用に関与するかどうかは明らかになっていない。本結果は、β３の短腕全体に対する抗体、あるいはγ２のドメインＩＩＩまたはＶに対する抗体が間質マトリックス上での移動に個別に影響を及ぼすため、両方の鎖が関係していることを強く示唆している。間質タンパク質への結合におけるγ２鎖の役割についてのさらなる証拠は、ドメインＩＩＩおよびＩＶの断片のインフレーム欠失（Ｐａｂ−１４２０抗原）によって、致死性の接合部型表皮水疱症が引き起こされる（参考文献７）とい
うことである。ＶＩＩ型コラーゲンに加えて、γ２の短腕は、少なくともインビトロでファイブリン−２（ｆｉｂｕｌｉｎ−２）、α２β１インテグリン、ヘパリン／ヘパリン硫酸、またはシンデカン−１に結合することが示唆されているが（参考文献４３〜４６）、こうした結果がインビボで関連性があるかどうかはまだ示されていない。
【００７９】
興味深いことには、ＬＮ−３３２短腕に対する抗体は、通常移動している上皮細胞に伴う葉状仮足の形成を阻害した。葉状仮足の形成は、アクチンの極性化重合と最初の突出の発生によって開始される（参考文献４７および４８）。これはインビトロでは細胞外マトリックス相互作用を必要としないが、突出は接着性基質上に細胞をプレーティングした場合に形成される葉状仮足ほど大きくない（参考文献４９）。葉状仮足の形成および移動におけるＬＮ−３３２／ＶＩＩ型コラーゲン相互作用の役割は解明されていない。しかしながら、安定した接着性表現型から移動性表現型への移行の間、当該細胞は先端部にα３β１インテグリンを発現させた葉状仮足を形成することが示されている（参考文献４１、４２、および５０）。こうした移動は、ラット尾部の変性コラーゲン上で培養したＬＮ−３３２産生細胞によって生じた場合、α３β１およびＲａｃ１の活性化に依存的であり、かつα３インテグリン欠損ケラチノサイトはこのような条件下で葉状仮足を形成しなかった（参考文献４２）。α６β４およびα３β１インテグリンに対する抗体は、ＬＮ−３３２との相互作用を、ゆえにこの移動を遮断する。本結果により、Ｇドメインの遮断が間質マトリックス上での移動を遮断することだけでなく、短腕作用の遮断も葉状仮足形成および移動を阻害することも示された。このことは、葉状仮足の形成には、移動過程の間、インテグリン、ＬＮ−３３２、およびＶＩＩ型コラーゲン、ならびにおそらく他の間質タンパク質の一体となった相互作用が使用されることを示唆している。これは、通常インビボでの上皮および癌細胞の移動の間に生じている過程に相当しうる。
【００８０】
最終的に、本発明者らの結果により、ＬＮ−３３２分子は、細胞結合に対するＧドメインの役割に加えて、移動の間間質タンパク質に結合するためにβ３およびγ２の両方の短腕を使用すること、ならびにこれらの作用は少なくともインビトロではドメイン特異的抗体を用いて遮断されうることが示された。
【００８１】
ＬＮ−３３２抗体は、インビボで癌腫を標的とし、かつアポトーシスを誘導する
いくつかの研究により、癌腫の浸潤先進部における細胞はしばしばＬＮ−３３２発現が陽性であるということがこれまでに示されている（参考文献１５、１６、１９、３６、および３７）。本明細書において、本発明者らは、種々のＬＮ−３３２ドメインに対する抗体がインビボでそのような癌腫を容易に標的とすることを示した。さらに、本発明者らは、前記タンパク質のα３鎖上のインテグリン結合ドメインに対するｍＡｂ  ＢＭ−１６５および７Ｂ２を、腫瘍細胞の接種の３日後に注射した場合、ヌードマウスにおいてヒトＡ４３１  ＳＣＣの成長が有意に阻害されたことを示した。さらに、β３およびγ２鎖の短腕に対するポリクローナル抗体は、早期に処理を開始した場合、ＫＬＮ−２０５マウスにおける腫瘍の成長を阻害することができた。
【００８２】
インビボでＡ４３１腫瘍が成長するにつれて、その中心部は増殖するのを止め、アポトーシスが増加し、中心は壊死する。本発明者らが増殖マーカーを用いて観察したように、最も活発に増殖している細胞は腫瘍巣の周縁部に位置する（データ示さず）。最近、ＡｔｓｕｍｉによってＡ４３１腫瘍巣の周縁部の細胞が癌発症細胞（癌幹細胞）によって濃縮されることが報告されている（参考文献５８）。ＬＮ−３３２発現はＡ４３１腫瘍巣の浸潤周縁部において顕著であったため、ならびにｍＡｂ−７Ｂ２も腫瘍巣の周縁部を標的とするため、本発明者らの抗体はこうした癌発症細胞を実際に標的とする可能性がある。
【００８３】
本研究および先行研究は、腫瘍形成および浸潤に対するＬＮ−３３２の重要性を実証しており、これにより、ＬＮ−３３２は癌治療のための興味深い標的となっている。Ｄａｊ
ｅｅらは（参考文献２５）、ｒａｓ−ＩκＢαを過剰発現しているＳＣＣ細胞がＬＮ−３３２およびα６β４インテグリンの高い発現を示すこと、ならびにそうした腫瘍の成長をｍＡｂ  ＢＭ１６５またはα６β４インテグリンに対する抗体によって完全に阻害することができること、ならびにｒａｓ−ＩκＢαを過剰発現しているＬＮ−３３２またはα６β４陰性の細胞が腫瘍を形成しなかったことを示した。しかしながら、本発明者らは、本研究においてｍＡｂ  ＢＭ１６５を用いて６８％を上回る腫瘍の成長の阻害を達成しなかった。ＬＮ−３３２−間質相互作用の重要性は、非機能性ＶＩＩ型コラーゲン遺伝子を有する表皮水疱症患者由来のケラチノサイトが腫瘍を形成せず、一方でｒａｓ−ＩκＢαを過剰発現している正常ケラチノサイトが腫瘍形成性であったことを示す研究でも強調された（参考文献５１）。さらに、表皮の腫瘍形成およびＰＩ３Ｋ経路の活性化が、ＬＮ−３３２とＶＩＩ型コラーゲンの相互作用に関連していることが示されている（参考文献５２）。β３鎖のＶＩＩ型コラーゲンとの相互作用は、ＳＣＣの腫瘍形成、腫瘍浸潤の増加、およびアポトーシスからの防御に不可欠であることが示唆されている。
【００８４】
ＬＮ−３３２は、また、腫瘍細胞の悪性度に影響を及ぼし、かつヌードマウスにおけるヒト線維肉腫細胞ＨＴ１０８０の腫瘍原性（ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｃｉｔｙ）を増進させることも示されている。ＬＮ−３３２を発現するＨＴ１０８０細胞の形質転換体は、コントロール細胞よりも早く成長し、かつより大きな腫瘍を形成した（参考文献２４）。しかしながら、矛盾する結果も存在している（参考文献５３）。したがって、非浸潤性の口腔扁平上皮癌細胞ＪＨＵ−０２２−ＳＣＣにおけるＬＮ−３３２発現の抑制は、インビボでの腫瘍原性および浸潤を増進させた。
【００８５】
腫瘍の成長の阻害メカニズムは不明であるが、周縁部間質からの腫瘍細胞の解離がアノイキス（参考文献５４）およびそれに続くアポトーシスを引き起こすと考えられる。間質マトリックス上で成長させ、かつインテグリン結合ドメインに対する抗体およびＬＮ−３３２の短腕に対する抗体の組み合わせで処理したＳＣＣ細胞についての本発明者らの発現解析は、これが事実でありうることを示唆した。前記細胞の移動は明らかに阻害され、かつ前記細胞は高頻度で持ち上がり、基材から剥離した。未処理の細胞と比較して、処理した細胞では、カスパーゼ３、カスパーゼ８、ＤＮａｓｅＩ、およびプログラム細胞死タンパク質３等のカスパーゼカスケードのいくつかの成分の有意な上方制御があった。これらの所見はアノイキスに典型的なものであり、不十分または不適切な細胞−マトリックス相互作用によって誘導されるアポトーシスとして定義づけられている（参考文献５４）。インテグリン介在性の細胞接着の欠損は、何らかの形でアポトーシス経路を誘起するが、ＬＮ−３３２への細胞の安定的な結合は、接着斑キナーゼ、ＰＩ３キナーゼ、およびＭＡＰ経路の作用を介して前記細胞に抗アポトーシスシグナルを誘導する（参考文献５４、５５）。転移性の肺癌細胞にＬＮ−３３２タンパク質をトランスフェクションすると、アノイキスから防御されることが報告されている（参考文献５６）。ＬＮ−３３２のインテグリンからの解離はアポトーシスの主要な誘因に違いないが、ＬＮ−３３２が短腕に対する抗体を用いてＶＩＩ型コラーゲンおよび潜在的には他のいくつかの間質タンパク質からも分離した場合、細胞の解離はより完全である。
【００８６】
ＬＮ−３３２抗体は浸潤性癌細胞の転移を減少させる
本研究の重要な知見は、ＬＮ−３３２抗体が、静脈内投与していたマウスＫＬＮ−２０５細胞の転移病巣の数を有意に減少させることであった。癌細胞の転移過程は、形質転換した上皮細胞のその下部にある基底膜からの解離、複雑なタンパク質分解過程による周縁部の細胞外マトリックスの分解、および腫瘍細胞の移動等の多くの個別の分子事象を伴う複雑な過程である（参考文献５７）。前述のように、浸潤性腫瘍先進部におけるＬＮ−３３２陽性腫瘍細胞の移動は、他の事象の中で、ＶＩＩ型コラーゲン等のマトリックス分子への前記腫瘍細胞の結合を伴う。本研究は、ＬＮ−３３２のマトリックス結合領域を標的とする抗体がこの作用を阻害し、それによって転移の減少に寄与しうることを示した。
【００８７】
本研究は、接着および移動に対するＬＮ−３３２の役割、ならびにこのタンパク質の細胞相互作用がＬＮ−３３２依存的な細胞生存にとっていかに重要であるかについての新たな洞察を提供している。癌細胞からのこのタンパク質の解離が、インビボでもアポトーシス経路および腫瘍細胞死を誘導することは明らかである。本結果から、ＬＮ−３３２の短腕を標的とすることにより、ＶＩＩ型コラーゲンおよびおそらく他のいくつかの間質成分への結合を介して、実際のインビボでの移動メカニズムを阻害しうることも同様に明らかである。現在のところ、腫瘍細胞の移動メカニズムを標的とする薬剤は臨床的に用いられていない。本調査では、マウスＬＮ−３３２に対するポリクローナル抗体を用いた。
【００８８】
補足の材料および方法
タンパク質および抗体
組換え型ＬＮ−３３２（ｒＬＮ−３３２）を、米国特許第６，７０３，３６３号に記載されているように調製した。組換え型ラミニンα３  ＧドメインフラグメントＧ１２（ｒＧ１２）およびＧ１２３（ｒＧ１２３）を、発現ベクターのｐＲＣｘ３  α３Ｇ１２およびｐＲＣｘ３  α３Ｇ１２３の一過性のトランスフェクションによってＦＳ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において作製した。これらのベクターは、それぞれＤＮＡシークエンシングによって確認されたＧ１２およびＧ１２３ドメインの完全配列を含んでいた。
【００８９】
α３Ｇ１２およびα３Ｇ１２３に対するコード配列を、鋳型としてのＬＮ−３３２  α３鎖用の発現ベクターであるｐＺｅｏアルファ３（米国特許第６，７０３，３６３号）、ならびに以下のプライマー：
α３Ｇ１２３に対して、ｇ１２３Ｆｗｄ：ＧＣＴＡＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＴＴＧＡＡ（配列番号：５）および
ｇ１２３Ｒｅｖ：ＡＴＣＧＡＴＣＡＧＧＧＡＡＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧ（配列番号：６）、ならびに
α３Ｇ１２に対して、ｇ１２３ｆｗｄおよびｇ１２ｒｅｖ：ＡＴＣＧＡＴＣＡＣＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＧＴＣＴＴＣＣ（配列番号：７）を用いることによってＰＣＲ増幅した。
【００９０】
組換え型ラミニンβ３短腕６５ｋＤフラグメント（ｒβ３−６５ｋＤ）を、ＬＮ−３３２  β３発現ベクターであるｐＲｃＸ３ベータ３をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３安定細胞株から精製した（米国特許第６，７０３，３６３号）。
【００９１】
これらすべてのＬＮ−３３２フラグメントを、これら組換えタンパク質に対する１ステップのアフィニティークロマトグラフィー精製手順を可能にするＦｌａｇ配列（Ｓｉｇｍａ）をアミノ末端に保持して発現させた。
【００９２】
マウスラミニンγ２鎖に対するポリクローナル抗体の産生のために、マウスγ２鎖のドメインＩＩＩの一部をＧＳＴ融合タンパク質として発現させた（Ｐａｂ１４２０）。ヌクレオチド１３１２〜１８８８を包含するＤＮＡフラグメント（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ＮＭ＿００８４８５）をＰＣＲによって生成し、ｐＧＥＸ−Ｉ＼Ｔ発現ベクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。ＰＣＲ産物の配列は、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。融合タンパク質を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導して大腸菌ＢＬ２１細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）内で産生し、メーカー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって推奨されるとおりに、グルタチオン−セファロース４Ｂカラムで精製した。ポリクローナル抗体の産生のために、マウスγ２鎖のドメインＶの一部をＧＳＴ融合タンパク質として発現させた（Ｐａｂ−１４２５）。ヌクレオチド６６〜５８５を包含するＤＮＡフラグメント（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ＮＭ−００８４８５）をＰＣＲによって生成し、ｐＧＥＸ−Ｉ＼Ｔ発現ベクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。ＰＣＲ産物の配列は、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。融合タンパク質を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導して大腸菌ＢＬ２１細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）内で産生し、メーカー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって推奨されるとおりに、グルタチオン−セファロース４Ｂカラムで精製した。Ｐａｂ−１４２０およびＰａｂ−１４２５の両方をウサギで作り、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、およびウエスタン解析を用いることによって特徴づけした。
【００９３】
リアルタイムＰＣＲ
ＳＣＣ−２５、Ａ４３１、ＢｘＰＣ３、およびＫＬＮ−２０５細胞からの全ＲＮＡを、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ一本鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてランダム・ヘキサマー・プライマーでｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイムＰＣＲを、ＴａｑＭａｎプローブベースの化学反応を用いてＡＢＩ  ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。プライマーおよびプローブの配列は、以下のとおり：ラミニン−３３２  ５’−-ＧＧＣＴ
ＡＣＴＴＣＧＧＧＧＡＣＣＡＴＴ−３’（配列番号：８）、５’−ＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＧＧＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’（配列番号：９）、および５’−ＣＡＧＡＣＡＡＧＴＧＴＣＧＡＧＣＴＴＧＣＡＡＣＴ−３’（配列番号：１０）（プローブ）；ＶＩＩ型コラーゲン  ５’−ＧＴＧＧＣＴＧＡＣＣＡＴＧＴＣＴＴＣＣＴ−３’（配列番号：１１）、５’−ＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＧＡＣＴＴ−３’（配列番号：１２）、および５’−ＴＧＴＣＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＡ−３’（配列番号：１３）（プローブ）であった。各標的遺伝子の発現についての相対的定量化を、比較サイクル閾値（ＣＴ）法を用いて行った。Ｓ１８  ｍＲＮＡを内在性コントロールとして用いた。
【００９４】
ウエスタンブロッティング
急速に成長しているコンフルエントに満たない細胞培養物からのＡ４３１、ＳＣＣ−２５、およびＢｘＰＣ３細胞を、冷却した溶解バッファー（プロテアーゼ阻害剤カクテルを含んだ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で溶解した。氷上で３０分間時折混合しながらインキュベーションした後、細胞溶解物を４℃で１５分間１０，０００×ｒｐｍで遠心分離した。上清を慎重に回収し、−７０℃で保存した。
【００９５】
ＫＬＮ−２０５細胞の細胞外マトリックスを、Ｌａｎｇｈｏｆｅｒら（１９９３）によって記載されているのと同様に産生した。コンフルエントに満たない細胞培養物をＰＢＳで２回洗浄し、２０ｍＭ  ＮＨ４ＯＨとともに室温で１０分間インキュベーションした。インキュベーション後すぐに、細胞培養ディッシュをＨ２ＯとＰＢＳで洗浄して、壊れた細胞物質を除去した。次いで、細胞外マトリックスを可溶化バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ６．８、８Ｍ尿素、１％  ＳＤＳ、５％  β−メルカプトエタノール）中で可溶化し、−７０℃で保存した。
【００９６】
１レーンにつき５０μｇの全細胞抽出物および５０μｇの細胞外マトリックスのサンプルを、還元条件下で、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上での電気泳動にロードし、ニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｐ  ＰＶＤＦ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に転写した。メンブレンを、まずＰａｂ−Ｇ１２（α３鎖）、Ｐａｂ−２２６（β３鎖）、およびＰａｂ−２６（γ２鎖）に対するポリクローナル抗体で、その後、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ二次抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でプローブし、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって可視化した。抗β−アクチン抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）をローディングコントロールとして用いた。
【００９７】
Ａ４３１腫瘍の組織学的分析
Ａ４３１腫瘍組織におけるラミニンα３、β３、およびγ２鎖の免疫組織学染色のため
に、ｍＡｂ−７Ｂ２（抗α３）、ｍＡｂ−７Ｂ３（抗β３）、およびｍＡｂ−６Ｃ１２（抗γ２）を用いた。ＫＬＮ−２０５腫瘍組織におけるラミニンα３、β３、およびγ２鎖の免疫組織学染色のために、Ｐａｂ−Ｇ１２（抗α３）、Ｐａｂ−２２６（抗β３）、およびＰａｂ−２６（抗γ２）を用いた。アセトン固定した厚さ５μｍの凍結切片の染色を前記抗体を用いて行い、種関連ＩｇＧをネガティブコントロールとして用いた。非特異的結合に対して前記切片をＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロッキングし、次いでＰＢＳ中に５〜１０μｇ／ｍｌまで希釈した抗体およびコントロールとともに４℃で一晩インキュベーションした。その後、ビオチン化ヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはビオチン化ブタ抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ）を、続いてメーカー（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって推奨されるとおりに希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ−アビジン−ビオチン複合体を適用した。ジアミノベンジジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｔｓａｍｉｄｉｎｅ）（ＤＡＢ）で発色させ、続いてヘマトキシリンを用いてスライドの対比染色を行った。早期腫瘍の増殖についての分析のために、ポリクローナルウサギ抗ヒトＫｉ６７抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，１：５０希釈）を用いた。アセトン固定した厚さ５μｍの凍結切片の染色を前述のように行った。光学顕微鏡検査の切片を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１顕微鏡を用いて可視化し、写真に撮った。免疫蛍光顕微鏡検査の切片を、ＬＳＭ  ５１０レーザーモジュールを備えた共焦点レーザー走査顕微鏡Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡を用いて可視化し、写真に撮った。
【００９８】
競合ＥＬＩＳＡ
競合ＥＬＩＳＡのために、メーカー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）の指示に従い、スルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンキットを用いてｍＡｂ−７Ｂ２をビオチン化した。９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉ−ＳｏｒｐｔＴＭ，Ｎｕｎｃ）を、０．２５μｇ／ウェルのｒＬＭ３３２を用いて４℃でｏ／ｎコーティングした。可能性のある非特異的結合を、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて室温で２時間ブロッキングした（２００μｌ／ウェル）。５ｎｇのビオチン化ｍＡｂ７Ｂ２、ならびに５００ｎｇの競合的抗体および正常マウスＩｇＧを混合し、３連のウェルにピペット注入した。インキュベーションの３０分後、メーカー（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって推奨されるとおりに希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ−アビジン−ビオチン複合体入りのＰＢＳでウェルを３回洗浄した。室温でのインキュベーションの３０分後、２，２’−アジノ−ビス−３−エチルベンゾチアゾリン（ｅｔｈｙｌｂｅｔｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ）−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ−ペルオキシダーゼ）基質で発色させた。３０分後に、マイクロタイター・プレートリーダーを用いて４０５ｎｍにおける吸光度を読み取った。
【００９９】
アポトーシスアッセイ
ｍＡｂ−７Ｂ２、ＢＭ１６５、および正常マウスＩｇＧで処理したマウスの早期Ａ４３１腫瘍におけるアポトーシスを調査するため、７、１０、および１４日目からの腫瘍サンプルをＴＵＮＥＬ染色用に調製した。５μｍのクリオスタット切片を、１％パラホルムアルデヒド中で室温にて１０分間固定した。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ介在性ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色を、Ａｐｏｐｔａｇペルオキシダーゼキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いて行い、切片をメチルグリーン（Ｒｉｅｄｅｌ  ｄｅ  Ｈａｅｎ）を用いて対比染色した。各切片から総計７〜１０の顕微鏡視野（倍率４００×）を無作為に選択し、写真に撮った。ＴＵＮＥＬ陽性の核を、ａｎａｌｙＳＩＳイメージングソフトウェア（Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＧｍｂＨ）を用いて計数した。
【０１００】
線維芽細胞マトリックス上で成長させたＡ４３１細胞のアポトーシスを誘導するｍＡｂ−７Ｂ２の能力を、メーカー（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の指示に従い、アネキシンＶ−Ｆ
ＩＴＣアポトーシス検出キットによって測定した。ＢＪ線維芽細胞によって産生される細胞外マトリックスの産生のために、平底の１２ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、２．５×１０５個／ウェルのヒトＢＪ細胞を播種した。コンフルエントの細胞培養物に至るまで細胞を一晩培養した。前述のように、２０ｍＭ  ＮＨ４ＯＨを用いて線維芽細胞マトリックスを産生した。細胞培養物をＰＢＳで２回洗浄し、室温で１０分間インキュベーションした。マトリックスの産生後すぐに、２×１０５個／ウェルのヒトＡ４３１細胞を播種した。ｍＡｂ−７Ｂ２およびコントロールＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）の添加前に、前記細胞を５時間付着させた。アポトーシスの分析前に、前記細胞を１６時間培養した。
【０１０１】
マイクロアレイ
２×１０５個／ウェルのヒトＡ４３１細胞を新しく調製した線維芽細胞マトリックス上に播種し、３本すべてのＬＮ−３３２鎖に対する抗体の混合物またはコントロールＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）の添加前に、５時間付着させた。全ＲＮＡ抽出（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏキット，Ｑｉａｇｅｎ）前に、前記細胞を１６時間培養した。
【０１０２】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析のために、発現解析テクニカルマニュアルに従ってＲＮＡを調製した。要するに、鋳型として８μｇの全ＲＮＡを用いて、Ｏｎｅ−ｃｙｃｌｅ  ｃＤＮＡ合成キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）およびＴ７−（ｄＴ）２４プライマーによって二本鎖ＤＮＡを合成した。前記ＤＮＡを、ＧｅｎｅＣｈｉｐサンプル・クリーンアップ・モジュール（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＩＶＴ標識キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、インビトロ転写を行い、ビオチン標識ｃＲＮＡを生成した。ＧｅｎｅＣｈｉｐサンプル・クリーンアップ・モジュール（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてビオチン化ｃＲＮＡから不純物を除去し、３５〜２００ｎｔに断片化し、およそ５５０００のヒト転写物を含有するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトゲノムＵ１３３プラス２アレイにハイブリダイズした。アレイをストレプトアビジン−フィコエリスリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、染色シグナルをビオチン化抗ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびストレプトアビジン−フィコエリスリンを用いた第二染色によって増幅し、次いでＧｅｎｅＣｈｉｐスキャナー３０００でスキャンした。アレイのシグナル強度を、５００の値を標的とするようにスケール調整した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘハイブリダイゼーションオーブン６４０（＋４５℃、６０ｒｐｍ、１６時間）を用いてハイブリダイゼーションを行った。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘフルイディクス（Ｆｌｕｉｄｉｃｓ）ステーション４５０（ＥｕｋＧＥＷＳ２ｖ５＿４５０）を用いて洗浄および染色を行った。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒプロジェクト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）のパッケージを用いてデータ解析を行った。ａｆｆｙパッケージ（バージョン１．１２．２）を用いて生データを処理した。サンプル間の差次的遺伝子発現を検出するために、Ｓスコアパッケージ（バージョン１．６．０）を備えた統計解析を用いた。それは、遺伝子発現における差異を評価するために、プローブレベルのデータを直接用いた。ｈｇｕ１３３ｐｌｕｓ２パッケージ（バージョン１．１４．０）にある遺伝子オントロジーの注釈を用いて、ある生物学的カテゴリーに関連するすべてのプローブセットを抽出した。
【０１０３】
本研究で用いたＬＮ−３３２鎖に対するドメイン特異的抗体
ウサギポリクローナル抗体をβ３鎖の短腕全体（ドメインＩＩＩ〜ＶＩ）に対して（Ｐａｂ−２２６）、ならびにγ２鎖のドメインＩＩＩに対して（Ｐａｂ−１４２０）およびγ２鎖のドメインＶに対して（Ｐａｂ−１４２５）調製した。三量体ＬＮ−３３２に対して、ｍＡｂ  ７Ｂ２および７Ｅ３を調製した。本研究で調製したすべてのＬＮ−３３２フラグメントに対してｍＡｂ−７Ｂ２を試験し、それはα３鎖のＧ１２およびＧ１２３フラグメントのみを検出した。ｍＡｂ  ＢＭ１６５は、α３鎖のＧドメインに対して作製された、以前に記載されている抗体（参考文献２７）である。さらに、三量体組換え型ヒトＬＮ−３３２分子全体に対して、ポリクローナル抗体Ｐａｂ−ＢＳＴを調製した。
【０１０４】
補足の表１
アポトーシスに関連する差次的に発現した遺伝子
ｈｇｕ１３３ｐｌｕｓ２パッケージにある遺伝子オントロジーの注釈を用いて、アポトーシスに関連するプローブを同定した。リストに記載された割合は、抗ＬＮ−３３２抗体で処理したサンプルとコントロールとの間のｌｏｇ２変換率であった。Ｓスコアパッケージを用いてｐ値を算出した。前記割合に従って、当該遺伝子を分類している。
【０１０５】
【表１−１】
2012530045.tif 000023
【０１０６】
【表１−２】
2012530045.tif 000024
【０１０７】
【表１−３】
2012530045.tif 000025
【０１０８】
【数１】
2012530045.tif 000026
【０１０９】
【数２】
2012530045.tif 000027
【０１１０】
【数３】
2012530045.tif 000028
【０１１１】
【数４】
2012530045.tif 000029
【０１１２】
【数５】
2012530045.tif 000030
【０１１３】
【数６】
2012530045.tif 000031
本開示の組成物および方法は、好ましい態様に関して記載されている。明らかに、前述の詳細な説明を解釈かつ理解すると、他のものに修正および変更が生じるであろう。本開示は、それらが添付の特許請求またはその同等物の範囲内に入る限りにおいて、すべてのそのような修正および変更を含むと見なされることを意図する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図２】
2012530045.tif 000032
【国際調査報告】
2012530045.tif 000033
2012530045.tif 000034
2012530045.tif 000035
2012530045.tif 000036