(57)【要約】  本発明は、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法であって、イヌのゲノムにおける、（ａ）肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子における多型および／または（ｂ）前記多型（ａ）との連鎖不平衡にある多型の有無を検出することを含む方法を提供する。本発明は、イヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性を決定する方法であって、イヌのゲノムにおける、（ａ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および（ｂ）（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む方法も提供する。
2012504410.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法であって、イヌのゲノムにおける、（ａ）肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子における多型および／または（ｂ）前記多型（ａ）との連鎖不平衡にある多型の有無を検出することを含む方法。
【請求項２】
少なくとも１つの多型（ａ）および少なくとも１つの多型（ｂ）の有無を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多型が一塩基多型（ＳＮＰ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５（配列番号１）、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５（配列番号２）、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７（配列番号３）、ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８（配列番号４）、ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２（配列番号５）、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ４＿Ｆ＿９（配列番号１３１）、ＵＢＬ５＿Ｒｅｇ１Ｆ＿１６（配列番号１３２）、ｇｏｌｇａ５＿Ｒｅｇ１＿２４（配列番号１３３）、ｇｏｌｇａ５＿２６（配列番号１３４）、ｇｏｌｇａ５＿２７（配列番号１３５）、ｇｏｌｇａ５＿２８（配列番号１３６）、ｇｏｌｇａ５＿２９（配列番号１３７）、ｇｏｌｇａ５＿３０（配列番号１３８）、ｇｏｌｇａ５＿３１（配列番号１３９）、ａｔｐ７ａｒｅｇ１７＿３２（配列番号１４０）、ａｔｐ７ａｒｅｇ１７＿３３（配列番号１４１）およびそれらと連鎖不平衡にある１つまたは複数のＳＮＰから選択される１つまたは複数のＳＮＰの有無を検出することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５（配列番号１）、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５（配列番号２）、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７（配列番号３）、ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８（配列番号４）、およびＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２（配列番号５）のＳＮＰの有無を検出することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
イヌがラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承している、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子における１つもしくは複数の多型および／またはそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型、ならびに前記多型と肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性との関連性に関する情報を含むデータベース。
【請求項８】
肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法であって、
（ａ）コンピュータシステムに、請求項１から５までのいずれか一項に記載の多型のイヌのゲノムにおける有無に関するデータを入力することと、
（ｂ）前記データを、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子における１つもしくは複数の多型および／またはそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型、ならびに前記多型と肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性との関連性に関する情報を含むコンピュータデータベースと比較することと、
（ｃ）前記比較に基づいて肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定することと
を含む方法。
【請求項９】
コンピュータシステムにおいて実行される場合、コンピュータシステムに請求項８に記載の全てのステップを実施するように指示するプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム。
【請求項１０】
請求項９に記載のコンピュータプログラムおよび請求項７に記載のデータベースを含むコンピュータ記憶媒体。
【請求項１１】
請求項８に記載の方法を実施するように構成されているコンピュータシステムであって、
（ａ）請求項１から５までのいずれか一項に記載の多型のイヌのゲノムにおける有無に関するデータを受け取る手段と、
（ｂ）ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子における１つもしくは複数の多型および／またはそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型、ならびに前記多型と肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性との関連性に関する情報を含むデータベースと、
（ｃ）前記データを前記データベースと比較するためのモジュールと、
（ｄ）前記比較に基づいて肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定するための手段と
を含むコンピュータシステム。
【請求項１２】
イヌを肝臓の銅蓄積に対する感受性について検査する方法であって、試料において、イヌのゲノムにおける、（ａ）肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子における多型および／または（ｂ）前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある多型の有無を検出することを含む方法。
【請求項１３】
肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定するための、（ａ）肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す、イヌのＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子における多型および／または（ｂ）前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある多型の使用。
【請求項１４】
肝臓の銅蓄積から保護される可能性が高い子孫を作出することについてイヌを選択する方法であって、
・請求項１から６、８および１２のいずれか一項に記載の方法に従って、候補の第１のイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定し、それにより候補の第１のイヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性が高い子孫を作出するのに適するかどうかを決定することと、
・場合により、請求項１から６、８および１２のいずれか一項に記載の方法に従って、第１のイヌと反対の性の第２のイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定することと、
・場合により、第１のイヌと第２のイヌとを交配して、肝臓の銅蓄積から保護される可能性が高い子孫を作出することと
を含む方法。
【請求項１５】
イヌがラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承している、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承し、請求項１から６、８および１２のいずれか一項に記載の方法により肝臓の銅蓄積に対して感受性であると決定されたイヌにおいて肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患の予防に使用するための、銅を２１ｍｇ／ｋｇ（乾物）未満の濃度で含む食材。
【請求項１７】
銅を１７ｍｇ／ｋｇ（乾物）未満または１２ｍｇ／ｋｇ（乾物）未満の濃度で含む、請求項１６に記載の食材。
【請求項１８】
亜鉛を少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇ（乾物）の濃度でさらに含む、請求項１６または１７に記載の食材。
【請求項１９】
少なくとも一方の親が純粋種のラブラドールレトリーバーであるイヌにおいて肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患の予防に使用するための、請求項１６から１８までのいずれか一項に記載の食材。
【請求項２０】
肝臓の銅蓄積と関連する臨床症状を有しないイヌにおいて肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患の予防に使用するための、請求項１６から１９までのいずれか一項に記載の食材。
【請求項２１】
４００ｍｇ／ｋｇ（乾燥肝臓重量）未満の肝臓銅濃度を有するイヌにおいて肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患の予防に使用するための、請求項１６から２０までのいずれか一項に記載の食材。
【請求項２２】
検出可能な肝疾患を有しないイヌにおいて使用するための、請求項１６から２１までのいずれか一項に記載の食材。
【請求項２３】
銅関連慢性肝炎の予防に使用するための、請求項１６から２２までのいずれか一項に記載の食材。
【請求項２４】
ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承し、請求項１から６、８および１２のいずれか一項に記載の方法により肝臓の銅蓄積に対して感受性であると決定されたイヌにおいて肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患を予防する方法であって、請求項１６から２３までのいずれか一項に記載の食材をイヌに給餌することを含む方法。
【請求項２５】
亜鉛を少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇの濃度で含む食材またはサプリメントをイヌに給餌することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
４００ｍｇ／ｋｇ（乾燥肝臓重量）未満の肝臓銅濃度を有し、かつ／または検出可能な肝疾患を有しないイヌにおいて肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患を予防するための、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承し、請求項１から６、８および１２のいずれか一項に記載の方法により肝臓の銅蓄積に対して感受性であると決定されたイヌ用の食材の製造における銅の使用であって、前記食材が、銅を２１ｍｇ／ｋｇ（乾物）未満の濃度で含み、前記イヌにおいて肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患の予防に使用するためのものである使用。
【請求項２８】
ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承し、請求項１から６、８および１２のいずれか一項に記載の方法により肝臓の銅蓄積に対して感受性であると決定されたイヌにおける肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患の予防に同時に、別々にまたは順次に使用するための、銅を２１ｍｇ／ｋｇ（乾物）未満の濃度で有する食材と少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇ（乾物）の濃度を提供するための亜鉛サプリメントとを含むパック。
【請求項２９】
請求項１６から２３までのいずれか一項に記載のラベルを付けた食材または請求項２８に記載のラベルを付けたパック。
【請求項３０】
イヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性を決定する方法であって、イヌのゲノムにおける、（ａ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および（ｂ）（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む方法。
【請求項３１】
多型（ａ）および少なくとも１つの多型（ｂ）の有無を検出することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）の有無を検出することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
イヌがラブラドールレトリーバー、ゴールデンレトリーバーまたはトイプードルの血統を遺伝的に継承している、請求項３０から３２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
イヌがラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および／またはそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型ならびに前記多型と肝臓の銅蓄積からのイヌの保護との関連性に関する情報を含むデータベース。
【請求項３６】
イヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性を決定する方法であって、
（ａ）コンピュータシステムに、請求項３０に記載の多型のイヌのゲノムにおける有無に関するデータを入力することと、
（ｂ）前記データを、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および／またはそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型、ならびに前記多型と肝臓の銅蓄積からのイヌの保護との関連性に関する情報を含むコンピュータデータベースと比較することと、
（ｃ）前記比較に基づいてイヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性を決定することと
を含む方法。
【請求項３７】
コンピュータシステムにおいて実行される場合、コンピュータシステムに請求項３６に記載の全てのステップを実施するように指示するプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム。
【請求項３８】
請求項３７に記載のコンピュータプログラムおよび請求項３５に記載のデータベースを含むコンピュータ記憶媒体。
【請求項３９】
請求項３６に記載の方法を実施するように構成されているコンピュータシステムであって、
（ａ）請求項３０に記載の多型のイヌのゲノムにおける有無に関するデータを受け取る手段と、
（ｂ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および／またはそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型、ならびに前記多型と肝臓の銅蓄積からのイヌの保護との関連性に関する情報を含むデータベースと、
（ｃ）前記データを前記データベースと比較するためのモジュールと、
（ｄ）前記比較に基づいてイヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性を決定するための手段と
を含むコンピュータシステム。
【請求項４０】
イヌを検査してイヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性を決定する方法であって、試料において、イヌのゲノムにおける、（ａ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および（ｂ）（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む方法。
【請求項４１】
イヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性を決定するための、（ａ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および／または（ｂ）前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある多型の使用。
【請求項４２】
肝臓の銅蓄積から保護される可能性が高い子孫を作出することについてイヌを選択する方法であって、
・請求項３０から３４、３６および４０のいずれか一項に記載の方法に従って、候補の第１のイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定し、それにより候補の第１のイヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性が高い子孫を作出するのに適するかどうかを決定することと、
・場合により、請求項３０から３４、３６および４０のいずれか一項に従って、第１のイヌと性が反対の第２のイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定することと、
・場合により、第１のイヌと第２のイヌとを交配して、肝臓の銅蓄積から保護される可能性が高い子孫を作出することと
を含む方法。
【請求項４３】
イヌがラブラドールレトリーバー、ゴールデンレトリーバーまたはトイプードルの血統を遺伝的に継承している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
イヌがラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承している、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓の銅蓄積および銅関連肝疾患に対するイヌの感受性を決定する方法に関する。本発明は、イヌにおける肝臓の銅蓄積および銅関連肝疾患の予防に使用するためのイヌ用の食材、ならびに該食材を作製する方法に関する。本発明は、イヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性を決定する方法にも関する。
【０００２】
肝疾患はイヌには普通見られないが、その最も普通の形態の１つは慢性肝炎（ＣＨ）である。ＣＨは組織学的診断により、線維症、炎症、ならびに肝細胞アポトーシスおよび壊死の存在を特徴とする。肝硬変は、疾患の最終段階として生じ得る。ＣＨの原因の１つは、肝臓の銅蓄積である。肝臓の銅蓄積は、銅取り込みの増大、肝臓の銅代謝における原発性の代謝欠陥、または銅の胆汁排泄の変化の結果として生じ得る。肝臓の銅蓄積の遺伝的な根拠は未知である。これは、銅は多くの異なった生物学的経路に関与しており、その各々には非常に複雑で多数の遺伝子が関与しているという事実により難しくなっている。過剰な肝臓の銅蓄積を有するイヌは、強力な銅キレート化剤であるＤ−ペニシラミンを用いて通常は治療される。
【発明の概要】
【０００３】
本発明者らは、イヌのＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａおよびＵＢＬ５遺伝子におけるまたはその領域における多型が、イヌにおける肝臓の銅蓄積に対する感受性または保護を示すことを見出した。ゲノムのこれら３つの領域における多型が肝臓の銅蓄積の危険性または可能性と関連するという発見は、多型をスクリーニングすることにより、イヌが、肝臓の銅蓄積に対して感受性であるかまたはそれから保護されるかどうかを予測する検査の根拠を提供する。検査の予測性能は、１つまたは複数の定義された多型を検出する結果を組み合わせることを包含するモデルを使用して高めることができる。
【０００４】
イヌの肝臓における銅の蓄積は、高い肝臓銅に起因し得る肝臓の１つまたは複数の疾患または状態に至り得る。例えば、高い肝臓銅は、慢性肝炎、肝硬変および最終的には肝不全に至り得る。したがって、本発明は、高銅と関連するそのような肝疾患または状態に対して感受性であるイヌを識別することを可能にする。肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性が確認されれば、肝臓の銅レベルを低いまたは正常なレベルに維持する目的で、本発明の食材を投与するなどによる、そのイヌのための適当な予防手段を明らかにすることができる。さらに、肝臓の銅蓄積に対する感受性と関連する変異を有しないと確認されたイヌは、肝疾患または他の高銅と関連する状態を罹患する可能性が低いイヌを作出する目的を有する繁殖プログラムに使用するのに理想的である。
【０００５】
したがって、本発明は、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法であって、イヌのゲノムにおける、（ａ）肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子の多型および／または（ｂ）前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある多型の有無を検出することを含む方法を提供する。
【０００６】
本発明は、
・ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子における１つもしくは複数の多型および／またはそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型、ならびに前記多型と肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性との関連性に関する情報を含むデータベース；
・肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法であって、
（ａ）コンピュータシステムに、本明細書において定義した多型のイヌのゲノムにおける有無に関するデータを入力することと、
（ｂ）該データを、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子における１つもしくは複数の多型および／またはそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型、ならびに前記多型と肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性との関連性に関する情報を含むコンピュータデータベースと比較することと、
（ｃ）前記比較に基づいて肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定することと
を含む方法；
・コンピュータシステムにおいて実行される場合、コンピュータシステムに本発明の方法を実施するように指示するプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム；
・本発明のコンピュータプログラムおよび本発明のデータベースを含むコンピュータ記憶媒体；
・本発明の方法を実施するように構成されているコンピュータシステムであって、
（ａ）本明細書において定義した多型のイヌのゲノムにおける有無に関するデータを受け取る手段と、
（ｂ）ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子における１つもしくは複数の多型および／またはそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型、ならびに前記多型と肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性との関連性に関する情報を含むデータベースと、
（ｃ）該データを該データベースと比較するためのモジュールと、
前記比較に基づいて肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定するための手段と
を含むコンピュータシステム；
・イヌを肝臓の銅蓄積に対する感受性について検査する方法であって、試料において、イヌのゲノムにおける、（ａ）肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子における多型および／または（ｂ）前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある多型の有無を検出することを含む方法；ならびに
・肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定するための、（ａ）肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す、イヌのＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子における多型および／または（ｂ）前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある多型の使用；ならびに
・肝臓の銅蓄積から保護される可能性が高い子孫を作出することについてイヌを選択する方法であって、
・本発明に従って、候補の第１のイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定し、それにより候補の第１のイヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性が高い子孫を作出するのに適するかどうかを決定することと、
・場合により、本発明に従って、第１のイヌと反対の性の第２のイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定することと、
・場合により、第１のイヌと第２のイヌとを交配して、肝臓の銅蓄積から保護される可能性が高い子孫を作出することと
を含む方法
も提供する。
【０００７】
さらに、および驚くべきことに、本発明者らは、ラブラドールレトリーバーにおける肝銅濃度を減少させることにペニシラミンという薬剤の使用よりも効果的である食材をこのたび発見した。この食材は、したがって、ラブラドールレトリーバーの血統のイヌにおける肝臓の銅蓄積を予防するのに有用であり、且つ慢性肝炎、肝硬変および肝不全などの、高い肝臓銅と関連する疾患または病態を予防するために使用することができる。
【０００８】
したがって、本発明は、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承し、好ましくは、本発明の方法により肝臓の銅蓄積に対して感受性であると決定されたイヌにおいて肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患の予防に使用するための、銅を２１ｍｇ／ｋｇ（乾物）未満の濃度で含む食材も提供する。
【０００９】
本発明は、
・ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承し、好ましくは、本発明の方法により肝臓の銅蓄積に対して感受性であると決定されたイヌにおいて肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患を予防する方法であって、本発明の食材をイヌに給餌することを含む方法；
・ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承し、好ましくは、本発明の方法により肝臓の銅蓄積に対して感受性であると決定されたイヌ用の食材の製造における銅の使用であって、該食材が、銅を２１ｍｇ／ｋｇ（乾物）未満の濃度で含み、前記イヌにおいて肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患の予防に使用するためのものである使用；
・ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承し、好ましくは、本発明の方法により肝臓の銅蓄積に対して感受性であると決定されたイヌにおける肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患の予防に同時、別々または順次に使用するための、銅を２１ｍｇ／ｋｇ（乾物）未満の濃度で有する食材と少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇ（乾物）の濃度を提供するための亜鉛サプリメントとを含むパック；ならびに
・本発明のラベルを付けた食材または本発明のラベルを付けたパック
をさらに提供する。
【００１０】
肝臓の銅蓄積からのイヌの保護と関連する多型の同定は、肝臓の銅蓄積から保護されており、したがって肝疾患または他の高銅と関連する状態を罹患する可能性が低いイヌを作出する目的を有する繁殖プログラムにおいて使用するための、これらの変異を有するイヌを選択する機会を提供する。
【００１１】
したがって、本発明は、イヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性を決定する方法であって、イヌのゲノムにおける、（ａ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および（ｂ）（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む方法を提供する。
【００１２】
本発明は、
・ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および／またはそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型、ならびに前記多型と肝臓の銅蓄積からのイヌの保護との関連性に関する情報を含むデータベース；
・イヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性を決定する方法であって、
（ａ）コンピュータシステムに、本明細書において定義した多型のイヌのゲノムにおける有無に関するデータを入力することと、
（ｂ）該データを、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および／またはそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型、ならびに前記多型と肝臓の銅蓄積からのイヌの保護との関連性に関する情報を含むコンピュータデータベースと比較することと、
（ｃ）前記比較に基づいてイヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性を決定することと
を含む方法；
・コンピュータシステムにおいて実行される場合、コンピュータシステムに本発明の方法を実施するように指示するプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム；
・本発明のコンピュータプログラムおよび本発明のデータベースを含むコンピュータ記憶媒体；
・本発明の方法を実施するように構成されているコンピュータシステムであって、
（ａ）本明細書において定義した多型のイヌのゲノムにおける有無に関するデータを受け取る手段と、
（ｂ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および／またはそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型、ならびに前記多型と肝臓の銅蓄積からのイヌの保護との関連性に関する情報を含むデータベースと、
（ｃ）該データを該データベースと比較するためのモジュールと、
前記比較に基づいてイヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性を決定するための手段と
を含むコンピュータシステム；
・イヌを検査してイヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性を決定する方法であって、試料において、イヌのゲノムにおける、（ａ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および／または（ｂ）（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型から選択される１つまたは複数の多型を検出することを含む方法；ならびに
・肝臓の銅蓄積からのイヌの保護を決定するための、（ａ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および／または（ｂ）前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある多型の使用；ならびに
・肝臓の銅蓄積から保護される可能性が高い子孫を作出することについてイヌを選択する方法であって、
・本発明に従って、候補の第１のイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定し、それにより候補の第１のイヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性が高い子孫を作出するのに適するかどうかを決定することと、
・場合により、本発明に従って、第１のイヌと性が反対の第２のイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定することと、
・場合により、第１のイヌと第２のイヌとを交配して、肝臓の銅蓄積から保護される可能性が高い子孫を作出することと
を含む方法
も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】無治療における肝臓の銅蓄積の進行を例示する図である。図は、任意の治療に先立つ８．７ヵ月（範囲６〜１５ヵ月）隔てた２回の検査における１１頭のラブラドールレトリーバーの肝銅濃度（ｍｇ／ｋｇ（乾燥重量））を示す。この期間中、全ての動物はそれらの通常の維持食事を給餌され、それは、製造業者により、乾物を基準にして１２〜２５ｍｇ／ｋｇの間の食餌銅濃度および乾物を基準にして８０〜２７０ｍｇ／ｋｇの間の亜鉛濃度を含んだ。菱形印は外れ値を表す。
【図２】試験開始時の２４頭のラブラドールレトリーバーおよび食事管理中の２頭の対照検査における肝銅濃度（ｍｇ／ｋｇ（乾燥重量））を例示する図である。イヌは以下のように２群に分けた：第１群＝食餌＋グルコン酸亜鉛錠剤、第２群＝食餌＋プラセボ。ｘ軸の数字に対するキーは以下の通りである：１＋２＝治療前、３＋４＝再チェック１（８ヵ月（範囲５〜１３ヵ月）後の最初の対照検査）、５＋６＝再チェック２（１６ヵ月（範囲１２〜２５ヵ月）後の２度目の対照検査）。検査したイヌの数は以下の通りである：１：Ｎ＝第１群中の１２頭のイヌ、２：Ｎ＝第２群中の１２頭のイヌ、３：Ｎ＝第１群中の９頭のイヌ、４：Ｎ＝第２群中の１２頭のイヌ、５：Ｎ＝第１群中の６頭のイヌ、６：Ｎ＝第２群中の１０頭のイヌ。菱形印は外れ値を表す。点線は成犬に対する肝銅の正常レベルを表す。
【図３】本発明の食餌の１８頭のラブラドールレトリーバーにおける肝銅濃度（ｍｇ／ｋｇ（乾燥重量））に対する有効性を、ペニシラミン単独の効果と比較して例示する図である。ｘ軸の数字に対するキーは以下の通りである：１＝ペニシラミン前、２＝ペニシラミン後／食物前、３＝食物後。ｘ軸に沿って１から２へ進むとペニシラミン効果が示され、一方２から３へと進むと食物効果が示される。点線は、成犬に対する肝銅の正常レベルを表す。
【図４】本発明を実施するように調整された機能要素を図式的に例示する図である。
【図５】性別およびＡＴＰ７ａ遺伝子型によるラブラドールレトリーバーにおける平均銅レベル（表ＶＩＩのデータ）を図示する図である。ｙ軸は乾燥重量による肝臓銅（ｍｇ／ｋｇ）である。ｘ軸はＡＴＰ７ａ遺伝子型である：左から右へ、最初の３つは試験した雌イヌについてであり、最後の２つは試験した雄イヌについてである。誤差バーは標準誤差である。
【図６】ラブラドールレトリーバーにおける性別およびＡＴＰ７ａ遺伝子型による組織学的銅スコア（表ＶＩＩのデータ）のボックスプロットを示す図である。ｙ軸は銅組織学的スコアの値である。ｘ軸はＡＴＰ７ａ遺伝子型であり：左から右へ、最初の３つは試験した雌イヌについてであり、最後の２つは試験した雄イヌについてである。クラスカル・ワリスｐ−値は０．０００３９６である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
配列の簡単な説明
配列番号１から１４２は本発明のＳＮＰを含むポリヌクレオチド配列を示す。
【００１５】
肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護の識別
肝臓における銅の蓄積は、ラブラドールレトリーバー、ドーベルマン・ピンシェル、ジャーマンシェパード、キースハウンド、コッカースパニエル、ウェストハイランド・ホワイトテリア、ベッドリントンテリア、およびスカイテリアを含む多数のイヌの血統における肝疾患をもたらす。任意の血統の正常イヌの肝臓における平均銅濃度は、乾燥重量を基準にして２００から４００ｍｇ／ｋｇであるが、新生児のイヌは一般にそれより高い肝臓銅濃度を有する。
【００１６】
肝臓の銅蓄積に対して感受性であるイヌは、銅を蓄積する傾向を有し、その結果その肝臓銅濃度は、４００ｍｇ／ｋｇを超え、例えば５００ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、１５００ｍｇ／ｋｇ、２０００ｍｇ／ｋｇ、５０００ｍｇ／ｋｇを超え、または１００００ｍｇ／ｋｇを超えるレベルに達する。他方、肝臓の銅蓄積から保護されるイヌは、そのようなレベルにまで銅を蓄積する傾向を有しない。イヌが肝臓の銅蓄積に対して感受性である危険性または可能性を本発明により決定することは、イヌが４００ｍｇ／ｋｇを超えるレベルにまで肝臓銅を蓄積する危険性または可能性を決定することを含む。
【００１７】
肝臓の銅蓄積から保護されるイヌは、肝臓銅を蓄積する危険性または可能性が低く、その結果その肝臓銅濃度が６００ｍｇ／ｋｇを超えるに至る可能性は低い。肝臓の銅蓄積から保護されるイヌの肝臓銅濃度は、６００ｍｇ／ｋｇ未満、例えば５５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、４５０ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、３５０ｍｇ／ｋｇ未満、または３００ｍｇ／ｋｇ未満であろう。イヌが肝臓の銅蓄積から保護される危険性または可能性を本発明により決定することは、イヌが肝臓銅を６００ｍｇ／ｋｇを超えるレベルにまで蓄積する危険性または可能性を決定することを含む。
【００１８】
感受性または保護の危険性または可能性は、例えば、危険性因子、パーセンテージまたは確率として表現することができる。イヌが銅を上記のレベルにまで蓄積するかどうかを決定することは可能であり得る。
【００１９】
肝臓銅の４００ｍｇ／ｋｇを超えるレベルまでの蓄積は、肝疾患を伴い、最終的に肝不全に至り得る。イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定することは、したがって、肝臓の銅蓄積に起因し得る慢性肝炎、肝硬変および肝不全などの疾患または病態に対するイヌの感受性を決定する方法も提供する。逆に、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定することは、イヌがそのような疾患または病態を発する可能性が低いことを示す。したがって、本発明は、慢性肝炎、肝硬変および肝不全などの肝臓の銅蓄積と関連する疾患に対するイヌの感受性またはそれからの保護の可能性を検査する方法を提供する。
【００２０】
遺伝形質に連関する多型を解明する方法
本発明者らは、個体の群における遺伝形質と関連する多型を決定する方法、すなわち「パーティションマッピング」（「２Ｄマッピング」としても知られる）を開発した。該方法は、現状では２元状態（症例／対照試験）に限定されている。
【００２１】
遺伝的連関のある複合疾患は、一般的に２つ以上の遺伝子により起こされる。これらの遺伝子は、非線形な様式で相互作用することができて、在来の方法を使用してマップを作成することをより困難にする。一対の個体について作業することにより、遺伝子座はその個体の対における表現型に寄与するか否かであるから、複数の遺伝子の影響を排除することが可能である。このプロセスの作業全体は、下で説明する。この分析を進めた後、各領域中の危険性対立遺伝子を抽出してモデルを構築し、他の方法を使用して表現型を予測することが可能である。
【００２２】
「パーティションマッピング」アルゴリズムは、５０キロベースごとに止めてゲノム全体を通して走査する。これらの各点で、個体の対をことごとく分析する。各対について、３つの可能なシナリオのもとに遺伝子型の可能性を比較して、染色体全体の遺伝子型を分析する。第１のシナリオは、個体のこの対中に表現型を起こさせる劣性変異があるというものである。第２のシナリオは、個体のこの対中に表現型を起こさせる優性変異があるというものである。第３のシナリオは、この遺伝子座にはイヌの対中の表現型に対する重要な変異はないというものである。下記のように、隠れマルコフモデルを使用して、可能性を計算する。これらの可能性を比較することにより、この個体の対についてのベイズ因子を、劣性または優性表現型を起こさせる変異のこの点における存在の方向にまたは反対に向かわせることが可能である。これらの値の対数を取ると、その場合、正の値は、劣性または優性の突然変異のシナリオの方がより重要なことを表し、負の値は、ここには重要な変異はないという方向のより多くの証拠を表す。
【００２３】
個体の対は、その遺伝子座におけるベイズ因子対数の順序で分類される。次に、対のベイズ因子対数は、データの各百分位で証拠の積算重みの記録を取り下降順に合計する。大部分の場合、幾つかのベイズ因子対数が正であり、幾つかが負であろう。これは、データのパーセンテージに対して記録値が上昇し、次に下降する効果を生じるであろう。この値の最大値は、劣性または優性いずれかのモデルに対する証拠の重みの尺度を与える。これは「ピーク値」と称される。
【００２４】
幾つかの場合に、アルゴリズムは特にゲノムのホモ接合性の領域または多型が高密度にある領域に対してバイアスを有する。この効果は、４通りの可能な症例／対照の状態（症例−症例、症例−対照、対照−症例、対照−対照）を通して順序を変えた対について一つ残らずプロセスを実行することにより定量化される。任意の遺伝子座について、順序を変えたモデルにおけるピーク値を正常ピーク値から差し引くと、これは補正ピーク値を与える。対象となる領域を与えるゲノム全体にわたって補正ピーク値を比較することができる。
【００２５】
隠れマルコフモデル
パーティションマッピングの最も重要な要素は、それが遺伝子型データに直接作用しないことである。イヌの対の間の関連度をモデル化する分析の層が使用され、この分析は２つの個体がそれらのゲノム中の遺伝子座に同じ祖先の対立遺伝子をいつ有するかについての情報を与える。
【００２６】
１対のイヌにおける染色体間に９通りの可能な関係があり、最も関係するのは同じハロタイプの全ての４つの染色体であり、最も関係しないのはこの点において異なった４つのハロタイプである。これらの９通りの状態の可能性は隠れマルコフモデルを使用して計算される。
【００２７】
問題にする個体の対に遺伝子座が作用しているならば、これらの状態の幾つかは、症例−対照表現型の幾つかの並べ替えのもとでは不可能である。この理由で、相対的可能性から、劣性または優性対立遺伝子の存在についてのベイズ因子を計算することができる。
【００２８】
銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護の多型および徴候
上記の方法を使用して、本発明者らは、イヌのＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａおよびＵＢＬ５遺伝子におけるまたはその領域における多型は、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示すことを見出した。本発明は、したがって、イヌのゲノムがこれらのゲノムの遺伝子座に、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定する方法に関する。
【００２９】
本発明は、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法であって、イヌのゲノムにおける、（ａ）肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す、イヌのＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子における多型および／または（ｂ）前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある多型の有無を検出することを含む方法を提供する。
【００３０】
本発明者らは、肝臓の銅蓄積からの保護を示すＡＴＰ７ａのタンパク質配列に影響する多型も発見した。該多型は、タンパク質配列を、遺伝子ＡＴＰ７の、タンパク質の機能に大きい効果を有する可能性のあるアミノ酸３２８位でトレオニンからイソロイシンに変化させる。本発明は、したがって、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定に関する。
【００３１】
本発明は、イヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性を決定する方法であって、イヌのゲノムにおける、（ａ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）から選択される１つまたは複数の多型および（ｂ）（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む方法を提供する。
【００３２】
「多型の有無を検出すること」という語句は、典型的には、多型がイヌのゲノム中に存在するかどうかを決定することを意味する。多型は、一塩基多型（ＳＮＰ）、マイクロサテライト多型、挿入多型および欠失多型を含む。好ましくは、多型はＳＮＰである。ＳＮＰの有無を検出することは、ＳＮＰの遺伝子型を同定することまたはイヌのゲノムに存在するヌクレオチド（単数または複数）をＳＮＰについてタイピングすることを意味する。典型的には、両方の相同性の染色体上の同じ位置に存在するヌクレオチドが決定されるであろう。イヌは、したがって、ＳＮＰの第１の対立遺伝子に対してホモ接合性、第２の対立遺伝子に対してヘテロ接合性またはホモ接合性であると決定され得る。
【００３３】
疾患または病態に対する個体の感受性またはそれからの個体の保護などの個体の表現型を決定することは、疾患または病態の原因となる多型の検出に限定されない。遺伝子マッピングの試験においては、個体の試料中の一連のマーカー遺伝子座における遺伝子変化が、所与の表現型との関連について検査される。そのような関連が特定のマーカー遺伝子座と表現型との間で見出されれば、それは、そのマーカー遺伝子座における変化が対象となる表現型に影響するか、またはそのマーカー遺伝子座における変化は遺伝子型が決定されていない、真の表現型に関係した遺伝子座と連鎖不平衡にあるかのいずれかであることを示唆する。互いに連鎖不平衡にある多型の群の場合には、特定の個体における全てのそのような多型の存在の知識は一般的には余剰な情報を提供する。したがって、イヌのゲノムが、肝臓の銅蓄積または銅関連肝疾患に対する感受性またはそれからの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定するとき、多型のそのような群のただ一つの多型だけを検出することが必要である。
【００３４】
連鎖不平衡の結果として、機能的感受性／保護的多型ではないが、機能的多型と連鎖不平衡にある多型は、機能的多型の存在を示すマーカーとして作用し得る。本発明の多型と連鎖不平衡にある多型は、肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護を示す。
【００３５】
したがって、本明細書において定義した多型の位置の任意の１つは、直接的に、換言すれば、その位置に存在するヌクレオチドを決定することにより、または間接的に、例えば前記多型の位置と連鎖不平衡にある他の多型の位置に存在するヌクレオチドを決定することにより、タイピングすることができる。
【００３６】
連鎖不平衡は、集団中の異なった遺伝子座における対立遺伝子の非ランダムの配偶子関連性である。ランダムな組合せにより独立に遺伝されるのではなく一緒に遺伝される傾向を有する多型は、連鎖不平衡にある。２つの多型が一緒の頻度が、２つの多型の個々の頻度の積であれば、多型は互いにランダムに組み合わされまたは独立に遺伝される。例えば、異なった多型部位における２つの多型が集団中の染色体の５０％に存在する場合に、２つの対立遺伝子が集団中の染色体の２５％に一緒に存在すれば、そのとき、それらはランダムに組み合わされていると言われる。より高いパーセンテージは２つの対立遺伝子が連関していることを意味するであろう。２つの多型の頻度が、集団中で個々に、同時に２つの多型の頻度の積より大きければ、第１の多型は第２の多型と連鎖不平衡にあることになる。集団中において、２つの多型が一緒の頻度が、好ましくは、１０％を超え、例えば３０％を超え、５０％を超え、または７０％を超え、２つの多型の個々の頻度の積を超えるならば、第１の多型は第２の多型と連鎖不平衡にあることになる。
【００３７】
連鎖不平衡にある多型は、物理的に近接していることが多く、それは、それらが共遺伝されるからである。本明細書において言及した多型と連鎖不平衡にある多型は、同じ染色体上に位置する。研究により、連鎖不平衡がイヌには大量にあることを示された（Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ａｎｄ  ｂｒｅｅｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｉｎ  Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、  Ｓｕｔｔｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４：２３８８〜２３９６）。イヌで連鎖不平衡にある多型は、典型的には５ｍｂ以内、好ましくは２ｍｂ以内、１ｍｂ以内、７００ｋｂ以内、６００ｋｂ以内、５００ｋｂ以内、４００ｋｂ以内、２００ｋｂ以内、１００ｋｂ以内、５０ｋｂ以内、１０ｋｂ以内、５ｋｂ以内、１ｋｂ以内、５００ｂｐ以内、１００ｂｐ以内、５０ｂｐ以内または１０ｂｐ以内の多型である。
【００３８】
本明細書において定義した多型の位置のいずれか１つと連鎖不平衡にある多型を、日常的技法を使用して同定することは、当業者の能力の内であろう。可能性のある多型が選択されれば、当業者は、この多型とどの多型の型または対立遺伝子とが、本明細書において定義した多型のどれと有意に相関しているかを、容易に決定することができる。
【００３９】
より詳細には、多型が本明細書において定義した多型のどの１つと連鎖不平衡にあるかどうかを決定するために、当業者は、イヌのパネルで、候補の多型および１つまたは複数の本明細書において定義した多型の遺伝子型を決定すべきである。パネルのサイズは、統計的に有意な結果を達成するのに十分であるべきである。典型的には、少なくとも１００、好ましくは少なくとも１５０、または少なくとも２００頭の、異なったイヌからの試料が遺伝子型を決定されるべきである。パネル中のイヌは任意の血統であってよいが、典型的には同じかまたは類似の遺伝的血統背景を有するであろう。イヌのパネルで多型が遺伝子型を決定されれば、多型の１つまたは複数の対の間の連鎖不平衡は、多数の容易に入手できる統計用パッケージのいずれか１つを使用して測定することができる。フリーソフトウェアパッケージの例は、Ｈａｐｌｏｖｉｅｗ（Ｈａｐｌｏｖｉｅｗ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｖｉｓｕａｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＬＤ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｍａｐｓ、Ｂａｒｒｅｔｔら、２００５、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２１（２）：２６３〜２６５）であり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｈａｐｌｏｖｉｅｗ／ｈａｐｌｏｖｉｅｗでダウンロードできる。
【００４０】
連鎖不平衡の尺度はＤ’である。Ｄ’の０．５から１の範囲は、多型の対が連鎖不平衡にあることを示し、１は最も有意の連鎖不平衡を示す。したがって、候補の多型と特定の本明細書において定義した多型とについて、Ｄ’が、０．５から１、好ましくは０．６から１、０．７から１、０．８から１、０．８５から１、０．９から１、０．９５から１または最も好ましくは１であることがわかれば、候補の多型は、本明細書において定義した多型を予測するということができ、それ故、肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護を示すであろう。本発明の好ましい方法において、本明細書において定義した多型と連鎖不平衡にあるにある多型は、６８０ｋｂ以内であり且つ本明細書において定義した多型と同じ染色体上にあり、多型の対間の連鎖不平衡の計算された尺度Ｄ’は、０．９５以上である。
【００４１】
連鎖不平衡の他の尺度はＲの２乗であり、ここで、Ｒは補正係数である。「決定係数」としても知られるＲの２乗は、第１の多型の遺伝子型における分散の第２の多型の遺伝子型に占める分率である。したがって、候補の多型と特定の本明細書において定義した多型とに対して０．５というＲの２乗は、候補の多型が特異的多型における分散の５０％を占めることを意味するであろう。Ｒの２乗はＨａｐｌｏｖｉｅｗなどの標準的パッケージから出せる。典型的には、０．２５以上のＲの２乗（Ｒ＞０．５または＜−０．５）は大きい相関とみなされる。したがって候補の多型と特定の本明細書において定義した多型とについて、Ｒの２乗が０．５以上、好ましくは０．７５、０．８、０．９または０．９５以上であると見出されれば、候補の多型は本明細書において定義した多型を予測するということができ、肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護を示すであろう。本発明の好ましい方法において、本明細書において定義した多型と連鎖不平衡にあるにある多型は、６８０ｋｂ以内で且つ本明細書において定義した多型と同じ染色体上にあり、多型の対の間の連鎖不平衡の計算された尺度、Ｒの２乗は０．９５以上である。
【００４２】
多型が本明細書において定義した多型と連鎖不平衡にあり、したがって相関していると確認されれば、当業者は、どの型の多型、すなわちどの対立遺伝子が、肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護と関連するかを容易に決定することができる。これは、イヌのパネルを肝臓の銅蓄積について表現型解析し、イヌを肝臓の銅蓄積のレベルに関して分類することにより達成することができる。次に、イヌのパネルは、対象となる多型について遺伝子型を決定される。次に、遺伝子型は、遺伝子型と肝臓の銅レベルとの関連を決定し、それによりどの対立遺伝子が肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護と関連するかどうかを決定するために、肝臓銅のレベルと相関づけされる。
【００４３】
肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す本発明の多型は、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子のいずれか１つに存在しても、これらの遺伝子のいずれか１つの中に存在しなくてもよいが、これらの遺伝子のいずれか１つの中の多型と連鎖不平衡にある。したがって本発明は、（ａ）肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す、イヌのＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子における多型および／または（ｂ）前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある多型の有無を検出することを包含する。本発明を実施するために、任意の数および任意の組合せの多型を検出することができる。少なくとも２つの多型が検出されることが好ましい。２から５、３から８または５から１０個の多型が検出されることが好ましい。
【００４４】
イヌのＤＮＡは、
（ｉ）２つ以上の多型（ａ）；
（ｉｉ）２つ以上の多型（ｂ）；または
（ｉｉｉ）１つまたは複数の多型（ａ）および１つまたは複数の多型（ｂ）
のそれぞれの位置でタイピングすることができる。
【００４５】
２つの多型（ａ）があるとき、各多型は、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａおよびＵＢＬ５遺伝子の別々の１つでもあってよく、またはこれらの遺伝子のただ１つだけであってもよい。３つ以上の多型（ａ）、例えば３から１０個のそのような多型があるとき、多型は、同じ遺伝子中に、２つの遺伝子中にまたは３つの全ての遺伝子中にあってもよい。
【００４６】
同様に、２つの多型（ｂ）があるとき、各多型は、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａおよびＵＢＬ５遺伝子の別々の１つの中に、またはこれらの遺伝子のただ１つだけの中にある多型と連鎖不平衡にあってよい。３つ以上の、例えば３から１０個のそのような多型（ｂ）があるとき、多型は、同じ遺伝子中の、２つの遺伝子中にまたは３つの全ての遺伝子中にある多型と連鎖不平衡にあってよい。
【００４７】
好ましい方法は、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を示す、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａまたはＵＢＬ５遺伝子中の少なくとも１つの多型（ａ）および前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある少なくとも１つの多型（ｂ）の有無を検出することを含む。
【００４８】
本発明の好ましい方法において、多型はＳＮＰである。ＳＮＰは、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を示す、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子中のまたはその領域中の任意のＳＮＰおよび／またはそれらと連鎖不平衡にあるＳＮＰであってよい。
【００４９】
前記方法が、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定することである場合、好ましくは、ＳＮＰは表ＩＩＩ、表ＩＶおよび表Ｖにおいて特定されたＳＮＰから選択される。表ＩＩＩおよびＩＶにおいて、各ＳＮＰは、配列中の位置６１に位置する。第１のおよび第２の対立遺伝子は、各ＳＮＰに対してその遺伝子座（［第１の／第２の］）で提供される。表Ｖには、各ＳＮＰに対する第１のおよび第２の対立遺伝子も示されている。任意の数のＳＮＰが、表ＩＩＩ、ＩＶおよびＶから任意の組合せで使用することができる。ＳＮＰは異なったタイプの多型と組み合わせることもできる。
【００５０】
イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定する方法は、表ＩＩＩおよび表Ｖ中のＳＮＰから選択される１つまたは複数のＳＮＰ、および／またはそれらと連鎖不平衡にある１つまたは複数のＳＮＰの有無を検出することを含むことが好ましい。したがって、１つまたは複数のＳＮＰが、ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５（配列番号１）、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５（配列番号２）、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７（配列番号３）、ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８（配列番号４）、ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２（配列番号５）、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ４＿Ｆ＿９（配列番号１３１）、ＵＢＬ５＿Ｒｅｇ１Ｆ＿１６（配列番号１３２）、ｇｏｌｇａ５＿Ｒｅｇ１＿２４（配列番号１３３）、ｇｏｌｇａ５＿２６（配列番号１３４）、ｇｏｌｇａ５＿２７（配列番号１３５）、ｇｏｌｇａ５＿２８（配列番号１３６）、ｇｏｌｇａ５＿２９（配列番号１３７）、ｇｏｌｇａ５＿３０（配列番号１３８）、ｇｏｌｇａ５＿３１（配列番号１３９）、ａｔｐ７ａｒｅｇ１７＿３２（配列番号１４０）、ａｔｐ７ａｒｅｇ１７＿３３（配列番号１４１）およびそれらと連鎖不平衡にある１つまたは複数のＳＮＰから選択されることが好ましい。したがって、これらの１６個のＳＮＰのいずれかまたはこれらの１６個のＳＮＰのいずれかと連鎖不平衡にある任意のＳＮＰはタイピングすることができる。これら１６個のＳＮＰの少なくとも２つまたは連鎖不平衡にあるＳＮＰがタイピングされることが好ましい。
【００５１】
イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定する方法は、表ＩＩＩ中のＳＮＰから選択される１つまたは複数のＳＮＰの有無を検出することを含むことがより好ましい。したがって、これらの５個のＳＮＰのいずれかまたはこれらの５個のＳＮＰのいずれかと連鎖不平衡にある任意のＳＮＰをタイピングすることができる。好ましくは、これらの５個のＳＮＰの少なくとも２個または連鎖不平衡にあるＳＮＰがタイピングされる。より好ましくは、全ての５個の位置がタイピングされる。したがって、タイピングされるヌクレオチド（単数または複数）は、
・配列番号１（ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５、ＳＮＰ１）の位置６１；
・配列番号２（ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５、ＳＮＰ２）の位置６１；
・配列番号３（ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７、ＳＮＰ３）の位置６１；
・配列番号４（ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８、ＳＮＰ４）の位置６１；
・配列番号５（ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２、ＳＮＰ５）の位置６１；または
・これらの位置のいずれか１つと連鎖不平衡にある任意の位置と同等の位置から選択されることが好ましい。好ましくは、該方法は、ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５のＳＮＰ（配列番号１）、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５（配列番号２）、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７（配列番号３）、ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８（配列番号４）、およびＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２（配列番号５）の有無を検出することを含む。
【００５２】
ＳＮＰ１はＧＯＬＧＡ５遺伝子のイントロンの中に位置する。ＳＮＰ２、３および４はＵＢＬ５遺伝子の領域中に位置する。ＳＮＰ５は、ＡＴＰ７ａ遺伝子の領域中に位置する。したがって本発明の検出方法は、１つまたは複数のこれらの遺伝子の内部にまたは領域中に（コード領域中にまたはそれ以外に）ある任意のＳＮＰ、または連鎖不平衡にある任意の他のＳＮＰに関する。
【００５３】
実施例１は、銅蓄積に対する感受性のＢｏｏｌｅａｎモデルを確立するためのこれらのＳＮＰの使用を示す。表Ｉは、３つのゲノムの遺伝子座における対立遺伝子の２元状態を示す。２元値は、イヌが銅蓄積に対する感受性を示す対立遺伝子（「悪い」対立遺伝子）を有することを示す。例えば、０００は、３種の悪い対立遺伝子のいずれも有しないことを表す。１１１は、３種の悪い対立遺伝子を全て有することを表す。Ｘはその遺伝子で使用されない対立遺伝子である。線１ｘｘおよび０ｘｘは、ＧＯＬＧＡ５遺伝子中のＳＮＰのみを使用する１回の遺伝子検査が有する検出力を示す。
【００５４】
ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５のＳＮＰ（ＳＮＰ１）に対するＡ対立遺伝子は、本発明者らにより、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示すことが決定された。Ａ対立遺伝子に対してホモ接合性のイヌは、肝臓の銅蓄積に対して感受性である。したがって、本発明の好ましい方法は、ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５のＳＮＰに対するＡ対立遺伝子の有無を決定すること、およびそれにより、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す多型を含むかどうかを決定することを含む。より好ましい方法は、ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５のＳＮＰに対するＡＡ遺伝子型の有無を検出することを含む。
【００５５】
ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５のＳＮＰ（ＳＮＰ２）に対するＧ対立遺伝子は、本発明者らにより、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示すことが決定された。Ｇ対立遺伝子に対してホモ接合性のイヌは、肝臓の銅蓄積に対して感受性である。したがって、本発明の好ましい方法は、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５のＳＮＰに対するＧ対立遺伝子の有無を決定すること、およびそれにより、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す多型を含むかどうかを決定することを含む。より好ましい方法は、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５のＳＮＰに対するＧＧ遺伝子型の有無を検出することを含む。
【００５６】
ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７のＳＮＰ（ＳＮＰ３）に対するＣ対立遺伝子は、本発明者らにより、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示すことが決定された。Ｃ対立遺伝子に対してホモ接合性のイヌは肝臓の銅蓄積に対して感受性である。したがって、本発明の好ましい方法は、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７のＳＮＰに対するＣ対立遺伝子の有無を決定すること、およびそれにより、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す多型を含むかどうかを決定することを含む。より好ましい方法は、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７のＳＮＰに対するＣＣ遺伝子型の有無を検出することを含む。
【００５７】
ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８のＳＮＰ（ＳＮＰ４）に対するＧ対立遺伝子は、本発明者らにより、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示すことが決定された。Ｇ対立遺伝子に対してホモ接合性のイヌは、肝臓の銅蓄積に対して感受性である。したがって、本発明の好ましい方法は、ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８のＳＮＰに対するＧ対立遺伝子の有無を決定し、それによりイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す多型を含むかどうかを決定することを含む。より好ましい方法は、ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８のＳＮＰに対するＧＧ遺伝子型の有無を検出することを含む。
【００５８】
ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２のＳＮＰ（ＳＮＰ５）に対するＡ対立遺伝子は、本発明者らにより、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示すことが決定された。Ａ対立遺伝子に対してホモ接合性またはヘテロ接合性のイヌは、肝臓の銅蓄積に対して感受性である。したがって、本発明の好ましい方法は、ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２のＳＮＰに対するＡ対立遺伝子の有無を決定すること、およびそれにより、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す多型を含むかどうかを決定することを含む。より好ましい方法は、ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２のＳＮＰに対するＡＡまたはＡＧ遺伝子型の有無を検出することを含む。
【００５９】
したがって、本発明のより好ましい方法は、
（ｉ）ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５のＳＮＰ（ＳＮＰ１）に対するＡＡ遺伝子型；
（ｉｉ）ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５のＳＮＰ（ＳＮＰ２）に対するＧＧ遺伝子型；
（ｉｉｉ）ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７のＳＮＰ（ＳＮＰ３）に対するＣＣ遺伝子型；
（ｉｖ）ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８のＳＮＰ（ＳＮＰ４）に対するＧＧ遺伝子型；および／または
（ｖ）ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２のＳＮＰ（ＳＮＰ５）に対するＡＡまたはＡＧ遺伝子型；
の有無を検出することと、
それによりイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定することとを含む。より好ましい方法は、遺伝子型（ｉ）；遺伝子型（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；または遺伝子型（ｖ）の有無を検出することを含む。さらにより好ましい方法は、全ての５つの遺伝子型（ｉ）から（ｖ）の全ての有無を検出することを含む。
【００６０】
肝臓の銅蓄積からの保護を示す本発明の多型は、表ＶＩにおいて特定されたＳＮＰ（ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６（配列番号１４２））およびこのＳＮＰと連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型である。したがって、本発明の方法が、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定することであるとき、該方法は、（ａ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）または（ｂ）（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む。本発明を実施するために、任意の数および任意の組合せの多型を検出することができる。少なくとも２つの多型を検出することが好ましい。２から５、３から８または５から１０個の多型を検出することが好ましい。
【００６１】
イヌのＤＮＡは、
（ｉ）多型（ａ）；
（ｉｉ）１つまたは複数の多型（ｂ）；または
（ｉｉｉ）多型（ａ）および１つまたは複数の多型（ｂ）。
のそれぞれの位置でタイピングすることができる。
【００６２】
好ましい方法は、（ａ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある少なくとも１つの多型（ｂ）の有無を検出することを含む。
【００６３】
本発明の好ましい方法において、前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある多型はＳＮＰである。好ましくは、該ＳＮＰは、肝臓の銅蓄積からの保護を示すイヌのＡＴＰ７ａ遺伝子中のまたはその領域中の任意のＳＮＰである。
【００６４】
より好ましくは、該方法は、表ＶＩにおいて特定されたＳＮＰ（ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６（配列番号１４２））の有無を決定することを含む。
【００６５】
表ＶＩにおいて特定されたＡＴＰ７ａ  ＳＮＰに対するＴ対立遺伝子は、本発明者らにより、銅蓄積からの保護を示すことが決定された。このＳＮＰはＸ染色体上に位置する。Ｔ対立遺伝子に対してホモ接合性のイヌ（雌イヌの場合に）またはヘミ接合性のイヌ（雄イヌの場合に）は銅蓄積から保護される。Ｃ対立遺伝子を有するイヌは、銅蓄積から保護されていないように思われる。したがって、本発明の好ましい方法は、表ＶＩにおいて特定されたＳＮＰ（ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６（配列番号１４２））に対するＴ対立遺伝子の有無を決定することを含む。したがって、本発明の好ましい方法は、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６（ＳＮＰ１４２）におけるＴＴまたはＴＣ遺伝子型の有無を検出することおよびそれによりイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す多型を含むかどうかを決定することを含む。
【００６６】
表ＶＩにおいて特定されたＡＴＰ７ａ  ＳＮＰはＸ染色体上に位置し、保護効果は劣性であるという事実に照らして、雄イヌは、保護表現型を有する可能性が高い。したがって、本発明の方法は、イヌの性を決定することを含み得る。雄イヌが雌イヌに比較して一般的に、銅蓄積に対して感受性ではないとすれば、ＡＴＰ７ａ  ＳＮＰ（（ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６（配列番号１４２））は、血統不明または混血（雑種）のイヌを含む全ての血統のイヌにとって特に有用である。実施例３は、本発明の方法が全ての血統のおよび全ての地理的位置にいるイヌに対して適用できることの証拠も提供する。したがって本発明の方法は、混血のもしくは交雑種のイヌ、または雑種のもしくは異系交配されたイヌのゲノムが、肝臓の銅蓄積からの保護を示すＡＴＰ７ａ遺伝子中の１つまたは複数の多型またはそれらと連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定することを含む。
【００６７】
本発明の方法は、肝臓の銅蓄積に対する感受性および保護を示すＳＮＰの組合せの有無を決定することを含むことができる。イヌのＤＮＡは、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数のＳＮＰでタイピングされ、肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数のＳＮＰでタイピングすることができる。１つまたは複数の「保護」ＳＮＰの非存在と組み合わせた１つまたは複数の「感受性」ＳＮＰの存在は、イヌが肝臓の銅蓄積に対して感受性であることを示す。１つまたは複数の「感受性」ＳＮＰの非存在と組み合わせた１つまたは複数の「保護」ＳＮＰの存在は、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されることを示す。
【００６８】
イヌのＤＮＡは、
（ｉ）（ａ）表ＩＩＩ、ＩＶおよびＶにおいて特定されたＳＮＰから選択される１つまたは複数のＳＮＰ、ならびに（ｂ）前記ＳＮＰ（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数のＳＮＰ；ならびに
（ｉｉ）（ａ）表ＶＩにおいて特定されたＳＮＰ（ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６（配列番号１４２））から選択される１つまたは複数のＳＮＰならびに（ｂ）前記ＳＮＰ（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数のＳＮＰ
で、タイピングすることができる。
【００６９】
イヌのゲノム中に存在するヌクレオチド（単数または複数）を、表ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩのいずれかで特定された位置でタイピングすることは、表ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩにおいて特定された配列と厳密に対応する配列中のこの位置に存在するヌクレオチドがタイピングされることを意味し得る。しかしながら、表ＩＩＩにおいて特定された配列番号１から５、表ＩＶ中の配列番号６から１３０、表Ｖ中の配列番号１３１から１４１および表ＶＩ中の配列番号１４２において提示された厳密な配列は、検査されるイヌに必ず存在するわけではないことは理解されるであろう。したがって、存在するヌクレオチドのタイピングは、表ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩにおいて特定された位置において、または該配列中の同等のまたは対応する位置においてであり得る。したがって、ここで使用された同等という用語は、表ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩにおいて特定された位置においてまたは対応する位置においてを意味する。ＳＮＰの配列およびそれに伴って位置は、例えば、イヌのゲノム中におけるヌクレオチドの欠失または付加のために変化し得る。当業者は、配列番号１から１４２の各々における関連ある位置に対応するまたは同等の位置を、例えばＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＣＯＭＰＡＲＥ、ＡＬＩＧＮ、ＰＩＬＥＵＰまたはＢＬＡＳＴなどのコンピュータプログラムを使用して、決定することができるであろう。ＵＷＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅは、相同性またはラインアップ配列を計算するために使用することができる（例えばそれらの初期設定で使用）ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＣＯＭＰＡＲＥ、ＡＬＩＧＮ、およびＰＩＬＥＵＰを含むプログラムを提供する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムも、通常はその初期設定で、２つの配列を比較またはラインアップするために使用することができる。２つの配列のＢＬＡＳＴ比較を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから公的に入手できる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。このアルゴリズムは、下でさらに説明する。配列のアラインメントおよび比較のための同様に公的に入手できるツールは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ）で見出すことができ、例えばＡＬＩＧＮおよびＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムがある。
【００７０】
多型が肝臓の銅蓄積に対する感受性または保護を示すかどうかを決定するために使用することができる種々の異なった方法がある。典型的には、候補の多型を多型のデータベースおよび肝臓の銅蓄積に対する感受性または保護とのそれらの関連と比較する。そのようなデータベースは、イヌのパネルを、肝臓の銅蓄積について、例えば肝生検材料により表現型解析することにより発生させて、イヌを銅蓄積のレベルに関して分類する。パネル中のイヌは、多型のパネルに対して遺伝子型も決定する。そのようにして、各遺伝子型と肝臓銅のレベルとの関連を決定することが可能である。したがって、多型が、肝臓銅に対する感受性またはそれからの保護のどちらを示すかを決定することは、データベース中における多型の位置を突き止めることにより達成される。
【００７１】
対象の多型の位置が、上記のようにしてデータベース中で突き止められなくても、それでもなお、多型が、肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護のどちらを示すかを決定することは可能である。これは、イヌのパネルを肝臓の銅蓄積について表現型解析して、イヌを肝臓の銅蓄積レベルに関して分類することにより達成することができる。次に、イヌのパネルは、対象となる多型について遺伝子型を決定する。次に、遺伝子型は、遺伝子型と肝臓の銅レベルとの関連を決定するために、肝臓銅のレベルと相関づけされる。
【００７２】
本発明の１つまたは複数の多型の有無がイヌのゲノム中で検出されると、イヌが肝臓の銅蓄積に対して感受性であるかそれから保護されるかがそれにより決定される。各多型は、単独でまたは他の多型との組合せで、イヌの肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護を示す。例として、表Ｉは、ＧＯＬＧＡ５、ＵＢＬ５およびＡＴＰ７ａ遺伝子の領域における５つのＳＮＰの組合せの異なった可能な遺伝子型および高銅（６００ｍｇ／ｋｇを超える肝臓レベル）を有するこれらの遺伝子型のイヌのパーセンテージを並べる。この例において、イヌの肝臓の銅蓄積に対する感受性を決定するために、イヌからのＤＮＡ試料を使用して、イヌのゲノム中における５つのＳＮＰの遺伝子型を決定することができる。ＳＮＰの遺伝子型が決定されれば、これらは、実施例１で提供されるキーに基づいて、すなわち遺伝子型と高銅との関連の程度に基づいて、２元値に変換することができる。次に、表Ｉは、２元値を、その遺伝子型パターンおよび高銅を有するイヌのパーセンテージに基づく危険性因子に変換するのに使用される。
【００７３】
同様に、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されるかどうかを決定するために、イヌからのＤＮＡ試料を使用して、表ＶＩにおいて特定されたイヌのゲノム中のＳＮＰの遺伝子型を決定することができる。この機能的変異はＡＴＰ７ａ（Ｘ染色体上の）中に位置して、ホモ接合性（ＴＴ）であるとき、保護的であるように思われる。これで、雌の慢性肝炎のバイアスを説明することができる。なぜなら、雄のみが１コピーのＸ染色体を有し、そのためＡＴＰ７ａ遺伝子座においてヘミ接合性であるからである。Ｘ連関劣性遺伝子効果は、雄のＸ染色体のヘミ接合性状態のために、雌より雄で見られる可能性が高い。この場合、保護効果は劣性であり、そのため雌集団において、より多くの症例が見られる（実施例２、表ＶＩＩおよび図５を参照されたい）。ＳＮＰの遺伝子型が決定されれば、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されるかどうかを決定することは可能である。代替の対立遺伝子（Ｔ）の存在は肝臓の銅蓄積からの保護を示す。代替の対立遺伝子（ＴＴ）に対してホモ接合性のイヌは、肝臓の銅蓄積から保護される可能性が最も高い。したがって、本発明の好ましい方法は、イヌのゲノム中におけるＡＴＰ７ａ  ＳＮＰのＴ対立遺伝子の有無を決定することを含む。該方法は、イヌがＡＴＰ７ａ  ＳＮＰのＴ対立遺伝子に対してホモ接合性（雌イヌの場合）であるかまたはヘミ接合性（雄イヌの場合）であるかを決定することを含むことができる。
【００７４】
イヌは、本発明の方法により、任意の年齢、例えば０から１２歳、０から６歳、０から５歳、０から４歳、０から３歳、０から２歳または０から１歳で検査することができる。好ましくは、イヌはできるだけ若い年齢で、例えば生後１年、生後６ヵ月または生後３ヵ月以内に検査される。イヌは、好ましくは、銅蓄積が起こる前に検査される。イヌの履歴はわかってもわからなくてもよい。例えば、イヌは、知られた両親の子であってもよく、および銅蓄積に関する両親の履歴が知られていてもよい。あるいは、イヌは、親子関係および履歴の知られていない迷子または救助されたイヌであってもよい。
【００７５】
本発明の任意の方法により検査されるイヌは、いかなる血統のものでもよい。本発明は、混血または交雑種のイヌ、または雑種のまたは異系交配されたイヌのゲノムが、肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定する方法を提供する。
【００７６】
方法が、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定することである場合、イヌは、肝臓の銅蓄積に対して感受性であると疑われるものであってよい。これは、例えば、イヌが肝臓の銅蓄積に対して感受性であることが知られている血統を遺伝的に継承しているからであり得る。したがって、好ましくは、検査されるイヌは、肝臓の銅蓄積に対して感受性であることが知られている血統を遺伝的に継承しているものであってよい。より好ましくは、検査されるイヌは、ラブラドールレトリーバー、ドーベルマン・ピンシェル、ジャーマンシェパード、キースハウンド、コッカースパニエル、ウェストハイランド・ホワイトテリア、ベッドリントンテリア、およびスカイテリアから選択される血統を遺伝的に継承している。イヌは、混血のもしくは交雑種のイヌ、または雑種のもしくは異系交配されたイヌであってよい。イヌは、そのゲノムの少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％が、いずれかの純粋な血統またはより好ましくは、ラブラドールレトリーバー、ドーベルマン・ピンシェル、ジャーマンシェパード、キースハウンド、コッカースパニエル、ウェストハイランド・ホワイトテリア、ベッドリントンテリア、およびスカイテリアから選択される任意の血統から継承されていてよい。イヌは、純粋種であってよい。本発明の一実施形態において、検査されるイヌの一方または両方の親が純粋種のイヌであるか、またはそうであった。他の実施形態において、１頭または複数の祖父母が純粋種のイヌであるか、またはそうであった。検査されるイヌの祖父母の１、２、３または４頭全部が純粋種のイヌであってよく、またはそうであったとしてもよい。
【００７７】
イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定する方法において、イヌはラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承していることが好ましい。イヌは、純粋種のラブラドールレトリーバーであってよい。あるいは、イヌは混血のもしくは交雑種のイヌ、または異系交配のイヌ（雑種）であってもよい。イヌの両親の一方または両方が純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってよい。イヌの祖父母の１、２、３または４頭が純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってよい。イヌは、その遺伝的背景においてラブラドールレトリーバーの血統の少なくとも５０％または少なくとも７５％を有していてよい。したがって、イヌのゲノムの少なくとも５０％または少なくとも７５％は、ラブラドールレトリーバーの血統に由来してよい。
【００７８】
前記方法が、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定することである場合、イヌは、肝臓の銅蓄積から保護されると推測されるイヌであってよい。本発明の好ましい方法において、イヌは、ラブラドールレトリーバー、ゴールデンレトリーバーまたはトイプードルの血統を遺伝的に継承している。イヌは、混血のもしくは交雑種のイヌ、または雑種のもしくは異系交配されたイヌであってよい。イヌは、任意の純粋な血統から、またはより好ましくはラブラドールレトリーバー、ゴールデンレトリーバーもしくはトイプードルから選択される任意の血統から継承したそのゲノムの少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％を有することができる。イヌは、純粋種であってよい。本発明の一実施形態において、検査されるイヌの一方または両方の親は純粋種のイヌであってもよくまたはあったとしてもよい。他の実施形態において、祖父母の１頭または複数が、純粋種のイヌであってもよくまたはあったとしてもよい。検査されるイヌの祖父母の１、２、３または４頭が純粋種のイヌであってもよくまたはあったとしてもよい。
【００７９】
イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定する方法において、イヌはラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承していることが好ましい。イヌは純粋種のラブラドールレトリーバーであってよい。あるいは、イヌは、混血のもしくは交雑種のイヌ、または異系交配されたイヌ（雑種）であってもよい。イヌの両親の一方または両方が純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってよい。イヌの祖父母の１、２、３または４頭が純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってもよい。イヌは、その遺伝的背景においてラブラドールレトリーバーの血統の少なくとも５０％または少なくとも７５％を有することができる。したがって、イヌのゲノムの少なくとも５０％または少なくとも７５％は、ラブラドールレトリーバーの血統に由来することができる。
【００８０】
イヌの遺伝的血統背景は、遺伝的マーカーの、例えばＳＮＰまたはマイクロサテライトの対立遺伝子の頻度を評価することにより決定することができる。イヌにおける異なったＳＮＰまたはマイクロサテライトの対立遺伝子の頻度の組合せは、イヌの血統または混血血統のイヌを作り出す血統が決定されることを可能にする特色を提供する。そのような遺伝子検査は商業的に利用できる検査である。あるいは、イヌは、例えばイヌの飼い主または獣医によりそれが特定の血統を継承すると推定されるという理由で、特定の血統の遺伝的継承について検査する必要がないこともある。これは、例えば、イヌの祖先の知識のため、またはその外観のためであり得る。
【００８１】
本発明の予測検査は、イヌの遺伝的血統の背景／継承または１種または複数種の他の疾患に対する感受性の決定などの１つまたは複数の他の予測または診断検査と併せて実施してもよい。
【００８２】
多型の検出
本発明による多型の検出は、イヌからの試料中のポリヌクレオチドまたはタンパク質と多型に対して特異的な結合剤とを接触させて、該結合剤がポリヌクレオチドまたはタンパク質に結合するどうかを決定することを含むことができ、この場合、結合剤の結合は多型の存在を示し、結合剤の結合の欠如は、多型の存在しないことを示す。
【００８３】
該方法は、試料がイヌのＤＮＡを含有する場合に、イヌからの試料について、一般にインビトロで実施される。試料は、典型的には、イヌの体液および／または細胞を含み、例えば、口腔スワブなどのスワブを使用して得ることができる。試料は、血液、尿、唾液、皮膚、頬細胞または毛根試料であってよい。試料は、通常、方法が実施される前に処理され、例えばＤＮＡ抽出を実施することができる。試料中のポリヌクレオチドまたはタンパク質は、物理的または化学的のいずれかで、例えば適当な酵素を使用して、切断することができる。一実施形態においては、多型の検出に先立って、試料中のポリヌクレオチドの一部が、例えば、クローニングにより、またはＰＣＲに基づく方法を使用して、コピーされまたは増幅される。
【００８４】
本発明において、任意の１つまたは複数の方法は、イヌにおける１つまたは複数の多型の有無を決定することを含むことができる。多型は、典型的には、イヌのポリヌクレオチドまたはタンパク質中における多型の配列の存在を直接決定することにより検出される。そのようなポリヌクレオチドは、典型的には、ゲノムのＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである。多型は、下記の方法など任意の適当な方法により検出することができる。
【００８５】
特異的な結合剤は、優先的なまたは高い親和性をもって多型を有するタンパク質またはポリペプチドに結合するが、他のポリペプチドまたはタンパク質には結合しないかまたは低い親和性でのみ結合する作用剤である。特異的な結合剤は、プローブまたはプライマーであってよい。プローブは、タンパク質（抗体など）またはオリゴヌクレオチドであり得る。プローブは標識することができ、または間接的に標識することが可能であってもよい。プローブのポリヌクレオチドまたはタンパク質に対する結合は、プローブまたはポリヌクレオチドもしくはタンパク質のいずれかを不動化するために使用することができる。
【００８６】
該方法においては一般に、多型は、イヌの多型のポリヌクレオチドまたはタンパク質に対する作用剤の結合を決定することにより検出することができる。しかしながら、一実施形態において、作用剤は、例えば、変異位置に隣接するヌクレオチドまたはアミノ酸に結合することにより、対応する野生型配列に結合することもできるとはいえ、野生型配列に対する結合様式は、多型を含むポリヌクレオチドまたはタンパク質の結合とは検出可能な程度に異なるであろう。
【００８７】
該方法は、２つのオリゴヌクレオチドプローブが使用される、オリゴヌクレオチド連結アッセイに基づくことができる。これらのプローブは、多型を含むポリヌクレオチドの隣接する領域に結合し、結合後に適当なリガーゼ酵素により２つのプローブが連結されて一緒になることが可能になる。しかしながら、プローブの一方の中に単一のミスマッチが存在すると、結合および連結が妨げられ得る。したがって連結したプローブは、多型を含むポリヌクレオチドでのみ生じ、したがって連結された生成物の検出は、多型の存在を決定するために使用することができる。
【００８８】
一実施形態において、プローブは、ヘテロ二重鎖分析に基づくシステムにおいて使用される。そのようなシステムでは、プローブが多型を含むポリヌクレオチド配列に結合したとき、それは多型が生じる部位でヘテロデュプレックスを形成し、それ故、二本鎖構造を形成しない。そのようなヘテロデュプレックス構造は、一本鎖または二本鎖特異的酵素の使用により検出することができる。典型的には、プローブはＲＮＡプローブであり、ヘテロ二重鎖領域はリボヌクレアーゼＨを使用して切断され、多型は切断生成物を検出することにより検出される。
【００８９】
前記方法は、例えば、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ３、２６８〜７１（１９９４）およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５、４３９７〜４４０１（１９９８）に記載されている蛍光性化学的切断ミスマッチ分析に基づくことができる。
【００９０】
一実施形態においては、それが多型を含むポリヌクレオチドに結合する場合にのみ、ＰＣＲ反応を開始させるＰＣＲプライマー、例えば配列特異的ＰＣＲシステムが使用され、多型の存在はＰＣＲ生成物を検出することにより決定することができる。好ましくは、プライマーの多型に相補性の領域はプライマーの３’末端にまたはその付近にある。多型の存在は、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲ検出システムなどの、蛍光性染料および消光剤に基づくＰＣＲアッセイを使用して決定することができる。
【００９１】
特異的な結合剤は、多型の配列によりコードされたアミノ酸配列に特異的に結合することができる。例えば、作用剤は、抗体または抗体のフラグメントであってもよい。検出方法は、ＥＬＩＳＡシステムに基づくことができる。前記方法は、ＲＦＬＰに基づくシステムであってよい。これは、ポリヌクレオチド中における多型の存在が、制限酵素により認識される制限部位を作り出すかまたは破壊する場合に使用することができる。
【００９２】
多型の存在は、多型の存在がゲル電気泳動中のポリヌクレオチドまたはタンパク質の移動度に生じさせる変化に基づいて決定することができる。ポリヌクレオチドの場合には、一本鎖配座の遺伝子座の多型（ＳＳＣＰ）または変性グラジエントゲル電気泳動（ＤＤＧＥ）分析を使用することができる。多型を検出する他の方法においては、多型領域を含むポリヌクレオチドを、多型を含む領域を通して配列を決定して多型の存在を決定する。
【００９３】
多型の存在は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって検出することもできる。特に、多型は、二重ハイブリッド形成プローブシステムによって検出することができる。この方法は、互いに近接に位置し、且つ対象となる標的ポリヌクレオチドの内部セグメントに相補性の２つのオリゴヌクレオチドプローブの使用を含み、この場合２つのプローブの各々は蛍光団で標識されている。任意の適当な蛍光性標識または染料を、蛍光団として使用することができ、その結果１つのプローブ（供与体）の蛍光団の発光波長が第２のプローブ（受容体）の蛍光団の励起波長と重なる。代表的供与体蛍光団はフルオレセイン（ＦＡＭ）であり、および代表的受容体蛍光団は、テキサスレッド、ローダミン、ＬＣ−６４０、ＬＣ−７０５およびシアニン５（Ｃｙ５）を含む。
【００９４】
蛍光共鳴エネルギー移動が起こるためには、２つの蛍光団は、両プローブの標的に対するハイブリッド形成時に、密接して近づくことが必要である。供与体蛍光団が適当な波長の光で励起されたとき、発光スペクトルのエネルギーが受容体プローブの蛍光団に移動してその蛍光を生じる。したがって、供与体蛍光団にとって適当な波長における励起中の、この波長の光の検出はハイブリッド形成、および２つのプローブの蛍光団の密接な関連を示す。各プローブは、蛍光団を用いて１つの末端で標識することができ、その結果上流（５’）に位置するプローブはその３’末端で標識され、下流（３’）に位置するプローブはその５’末端で標識される。標的配列に結合したときの２つのプローブの間のギャップは、１から２０ヌクレオチド、好ましくは１から１７ヌクレオチド、より好ましくは１から１０ヌクレオチド、例えば１、２、４、６、８または１０ヌクレオチドのギャップであることができる。
【００９５】
２つのプローブの第１のものは、多型に隣接する遺伝子の保存配列に結合するようにデザインすることができ、第２のプローブは、１つまたは複数の多型を含む領域に結合するようにデザインすることができる。第２のプローブにより標的とされる遺伝子の配列内の多型は、生じる塩基ミスマッチが原因の溶融温度変化を測定することにより検出することができる。溶融温度における変化の程度は、ヌクレオチド多型に関与する数および塩基のタイプに依存するであろう。
【００９６】
多型タイピングも、プライマー伸張技法を使用して実施することができる。この技法では、多型の部位周囲の標的領域がコピーされ、または例えばＰＣＲを使用して増幅される。次に単一塩基シークエンシング反応を、多型の部位から１塩基離れてアニールするプライマーを使用して実施する（対立遺伝子特異的ヌクレオチド組み込み）。次に、プライマー伸張生成物を検出して、多型の部位に存在するヌクレオチドを決定する。伸張生成物を検出することができる数通りの方法がある。１検出方法においては、例えば、蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドターミネーターが、伸張反応を多型の部位で停止するために使用される。あるいは、質量改変されたジデオキシヌクレオチドターミネーターが使用されて、プライマー伸張生成物が質量分析法を使用して検出される。１種または複数種のターミネーターを特異的に標識することにより、伸張されたプライマーの配列を、およびそれ故に、多型の部位に存在するヌクレオチドを推測することができる。２種以上の反応生成物を反応ごとに分析することができて、その結果、２つ以上のターミネーターが特異的に標識されていれば、両方の相同性染色体に存在するヌクレオチドを決定することができる。
【００９７】
本発明は、銅蓄積に対する感受性の予測に使用するための、本明細書において定義したＳＮＰの任意のもの検出に使用できるプライマーまたはプローブをさらに提供する。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書において定義したＳＮＰを検出するためのプライマー伸張反応のためのプライマーとしても使用することができる。
【００９８】
そのようなプライマー、プローブおよび他のポリヌクレオチドフラグメントの長さは、好ましくは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５または少なくとも２０、例えば少なくとも２５、少なくとも３０または少なくとも４０ヌクレオチドであろう。それらの長さは、典型的には４０、５０、６０、７０、１００または１５０ヌクレオチドまでであろう。プローブおよびフラグメントの長さは、本発明の全長のポリヌクレオチド配列を除いて、１５０ヌクレオチドを超えてもよく、例えば２００、３００、４００、５００、６００、７００ヌクレオチドまで、またはさらに５または１０ヌクレオチドなど数ヌクレオチドまでであってよい。
【００９９】
本発明のＳＮＰの遺伝子型同定のためのプライマーおよびプローブは、表ＩＩＩおよびＩＶ中のＳＮＰ配列を使用し、当技術分野において知られる任意の適当なデザインソフトウェアを使用して、デザインすることができる。これらのポリヌクレオチド配列の相同体は、プライマーおよびプローブをデザインするのにも適しているであろう。そのような相同体は、典型的には、少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を、例えば少なくとも１５、２０、３０、１００またはそれを超える隣接したヌクレオチドの領域にわたって有する。相同性は、ヌクレオチドの同一性（「硬い相同性」と称されることもある）に基づいて計算することができる。
【０１００】
例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するために使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えばその初期設定で使用）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、（１９８４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２、ｐ３８７〜３９５）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０〜３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３〜１０に記載されたように、相同性またはラインアップ配列（相等のまたは対応する配列の同定など）を計算するのに使用することができる（典型的にはそれらの初期設定で）。
【０１０１】
ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公的に入手できる。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードで整列化したとき、ある正の値の閾値スコアＴとマッチするか、またはそれを充足するかのいずれかである、検索配列における長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記参照）と呼ばれる。これらの最初の近隣ワードのヒットが、それらを含有するより長いＨＳＰの検索を開始するための種として作用する。このワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加することができる限り、それぞれの配列に沿って両方向に延長される。それぞれの方向でのワードのヒットの延長は、累積アラインメントスコアがその到達した最大値から数量Ｘだけ低下したとき；累積スコアが１つまたは複数の負のスコアリング残基のアラインメントの累積によってゼロもしくはそれ以下になったとき；または、いずれかの配列の末端に達したときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸはアラインメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、初期設定として、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５〜１０９１９を参照されたい）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を使用する。
【０１０２】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計学的分析も実施する；例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３〜５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つ尺度は、２つのポリヌクレオチド配列の間でマッチが偶然に起こるであろう確率の指標を提供する、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、第１の配列と第２の配列との比較における最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満であるとき、および最も好ましくは約０．００１未満であるなら、配列は他の配列と類似であると考えられる。
【０１０３】
相同性配列は、典型的には、少なくとも１、２、５、１０、２０以上の変異により相違し、変異はヌクレオチドの置換、欠失または挿入であってよい。
【０１０４】
プライマーまたはプローブなどの本発明のポリヌクレオチドは、単離されたまたは実質的に精製された形態で存在し得る。本発明のポリヌクレオチドは、その使用目的に干渉しない担体または希釈剤と混合し、それでもなお実質的に単離されたとみなすことができる。それらは、実質的に精製された形態であってもよく、その場合、一般に、製剤のポリヌクレオチドの少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、９８％または９９％を占めることになる。
【０１０５】
検出抗体
検出抗体は、１つの多型に対して特異的であるが、本明細書において記載した任意の他の多型には結合しない抗体である。検出抗体は、例えば、免疫沈殿技法を含む精製、単離またはスクリーニングの方法において有用である。
【０１０６】
抗体は、本発明のポリペプチドの特異的エピトープに対するものであってもよい。抗体、または他の化合物は、それが特異的であるタンパク質に対して優先的なまたは高い親和性をもって結合するが、他のポリペプチドには実質的に結合しないかまたは低い親和性でしか結合しないとき、ポリペプチドに「特異的に結合する」。抗体の特異的結合能力を決定するための競争的結合または放射免疫アッセイに対する種々のプロトコルが当技術分野において周知である（例えばＭａｄｄｏｘら、Ｊ  ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８、１２１１〜１２２６、１９９３を参照されたい）。そのような免疫測定は、典型的には、特異的タンパク質とその抗体との間のコンプレックスの形成およびコンプレックス形成の測定を包含する。
【０１０７】
この発明の目的のために、用語「抗体」は、特に断らない限り、本発明のポリペプチドに結合するフラグメントを含む。そのようなフラグメントは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびに一本鎖抗体を含む。さらに、抗体およびそれらのフラグメントは、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体またはヒト化抗体であってもよい。
【０１０８】
抗体は、生物学的試料（本明細書において言及した任意のそのような試料など）中の本発明のポリペプチドを検出するための方法において使用することができ、その方法は
Ｉ．本発明の抗体を提供することと、
ＩＩ．抗体抗原コンプレックスの形成が可能な条件下で、生物学的試料を前記抗体と共にインキュベートすることと、
ＩＩＩ．前記抗体を含む抗体抗原コンプレックスが形成されているかどうかを決定することと
を含む。
【０１０９】
本発明の抗体は、任意の適当な方法により生成させることができる。抗体を調製し特徴づけるための手段は当技術分野において周知である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．を参照されたい。例えば、抗体は、宿主動物中で全ポリペプチドまたはそれらのフラグメント、例えばそれらの抗原性エピトープ、（今後「免疫原」と称する）に対して抗体を生じさせることにより生成させることができる。フラグメントは、本明細書において言及したフラグメント（典型的には少なくとも１０個または少なくとも１５個のアミノ酸の長さ）の任意のものであってよい。
【０１１０】
ポリクローナル抗体を生成させる方法は、適当な宿主動物、例えば実験動物を免疫原で免役して、イムノグロブリンを動物の血清から単離することを含む。したがって、動物に免疫原を接種し、続いて動物から血液を取り出して、ＩｇＧ分画を精製することができる。モノクローナル抗体を生成させるための方法は、所望の抗体を生成する細胞を不死化することを含む。ハイブリドーマ細胞は、接種された実験動物からの脾臓細胞と腫瘍細胞とを融合することにより生成させることができる（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６、４９５〜４９７）。
【０１１１】
所望の抗体を生成する不死化された細胞は、従来の手順により選択することができる。ハイブリドーマは、培養で増殖させるかまたは腹水の形成のために腹腔内に注入するかまたは同種異系の宿主または免疫不全の宿主の血液ストリーム中に注入することができる。ヒト抗体は、ヒトリンパ球のインビトロでの免疫化に続く、エプスタインバールウイルスを用いるリンパ球の形質転換により調製することができる。
【０１１２】
モノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方の生成のために、実験動物は、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ニワトリ、ヒツジまたはウマであることが適当である。所望であれば、免疫原は、免疫原が、例えばアミノ酸残基の１つの側鎖を通して、適当な担体に結合された複合体として投与することができる。担体分子は、通常、生理学的に許容される担体である。得られた抗体は単離して、所望であれば精製することができる。
【０１１３】
検出キット
本発明は、本明細書において定義した１つまたは複数の多型をタイピングするための手段を含むキットも提供する。特に、そのような手段は、本明細書において定義した多型を検出するかまたは検出に役立つことができる、本明細書において定義した特異的な結合剤、プローブ、プライマー、プライマーのペアまたは組合せ、または、抗体フラグメントを含む抗体を含むことができる。プライマーまたはペアまたはプライマーの組合せは、本明細書において論じた検出されるべき多型を含むポリヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅のみを起こす配列特異的プライマーであることができる。プライマーまたはプライマーのペアは、多型のヌクレオチドに対して二者択一的に特異的ではなくてもよいが、上流（５’）および／または下流（３’）領域に対して特異的であり得る。これらのプライマーは、領域がコピーされるべき多型のヌクレオチドを包含することを可能にする。プライマー伸張技法で使用するのに適したキットは、標識されたジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を特異的に含むことができる。これらは、伸張生成物の検出およびそれに続く多型の位置に存在するヌクレオチドの決定を可能にするために、例えば蛍光標識または質量改変され得る。
【０１１４】
キットは、多型が存在しないことを検出することができる特異的な結合剤、プローブ、プライマー、プライマーのペアまたは組合せ、または抗体を含むこともできる。キットは、緩衝剤または水溶液を含むことができる。
【０１１５】
キットは、上記の方法の実施形態の任意のものが実施されることを可能にする１種または複数種の他の試薬または器具を追加して含むことができる。そのような試薬または器具は、以下の１つまたは複数を含むことができる：作用剤の多型に対する結合を検出する手段、蛍光性標識などの検出可能な標識、ポリヌクレオチドに作用し得る酵素、典型的にはポリメラーゼ、制限酵素、リガーゼ、リボヌクレアーゼＨもしくは標識をポリヌクレオチドに付けることができる酵素、酵素試薬のための適当な緩衝剤（単数または複数）もしくは水溶液、本明細書において論じた多型に隣接する領域に結合するＰＣＲプライマー、陽性および／もしくは陰性対照、ゲル電気泳動装置、試料からＤＮＡを単離する手段、個体から試料を得る手段例えばスワブもしくは針を含む器具など、または検出反応をその上で実施することができるウェルを含む指示具。キットは、本発明の特異的な結合剤、好ましくはプローブを含むポリヌクレオチドアレイなどのアレイであることができ、またはそれを含むことができる。キットは、通常、キットを使用するための説明書のセットを含む。
【０１１６】
バイオインフォマティクス
多型の配列は、電子書式で、例えばコンピュータデータベースで貯蔵することができる。したがって、本発明は、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子における１つもしくは複数の多型および／またはそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型、ならびにイヌの肝臓の銅蓄積に対する感受性とのそれらの関連に関する情報を含むデータベースを提供する。本発明は、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および／またはそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型ならびに前記多型と肝臓の銅蓄積からのイヌの保護との関連性に関する情報を含むデータベースも提供する。データベースは、多型についての情報、例えば多型と、肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護との関連性をさらに含むことができる。
【０１１７】
本明細書に記載したデータベースは、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定するために使用することができる。そのような決定は、電子的手段により、例えば  コンピュータシステム（ＰＣなど）を使用することにより実施することができる。
【０１１８】
典型的には、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかの決定は、コンピュータシステムにイヌからの遺伝的データをコンピュータシステムに入力することと、遺伝的データを、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子における１つもしくは複数の多型および／またはそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型、ならびに前記多型と肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性との関連性に関する情報を含むデータベースと比較することと、この比較に基づいて、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定することとにより実施されるであろう。この情報は、次に、イヌの肝臓の銅レベルの管理の指針として使用することができる。
【０１１９】
典型的には、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかの決定は、コンピュータシステムにイヌの遺伝的データをコンピュータシステムに入力することと、該遺伝的データとＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および／またはそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型ならびに前記多型と肝臓の銅蓄積からのイヌの保護との関連性に関する情報を含むデータベースとを比較することと、この比較に基づいて、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定こととにより実施されるであろう。
【０１２０】
本発明は、前記プログラムをコンピュータ上で走らせるときに本発明の方法の全てのステップを実施するためのプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムも提供する。前記プログラムをコンピュータ上で走らせるときに本発明の方法を実施するための、コンピュータで可読の媒体上に貯蔵したプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム製品も提供される。コンピュータシステムにおいて実行される場合、コンピュータシステムに本発明の方法を実施するように指示する搬送波上のプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム製品も、追加で提供される。
【０１２１】
図４に例示したように、本発明は、本発明による方法を実施するために整えられた装置も提供する。装置は、典型的には、ＰＣなどのコンピュータシステムを含む。一実施形態において、該コンピュータシステムは、イヌの遺伝的データを受け取る手段２０；データを多型に関する情報を含むデータベース１０と比較するためのモジュール３０；および前記比較に基づいて、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性または保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定するための手段４０を備える。
【０１２２】
品種改良手段
育種価は個体の親としての価値と定義され、農業において家畜の望ましい特色を改良するために普通に使用される。イヌの全体的銅処理能力を改良して慢性肝炎などの銅関連疾患の発生を減少させるためには、肝臓の銅蓄積から保護される血統についてイヌを選択するのが有利であろう。この問題は、血統を知らせるために、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されるかどうかを決定するために使用することができる多型を使用することにより解決される。
【０１２３】
例えば、２頭のイヌの子孫の銅処理能力は、ＡＴＰ７ａ遺伝子座における両親の遺伝子型により影響され得る。この遺伝子座における特定の変異の移動は、子孫にとって利益であり得る。遺伝子座における遺伝子型を決定することにより、将来の親の育種価を評価して、それにより所与の血統対が適当であるかどうかに関する決定をすることが可能であろう。
【０１２４】
したがって、本発明は、肝臓の銅蓄積から保護される子孫を作出することについてイヌを選択する方法であって、本発明の方法により、候補の第１のイヌで、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定し、それにより候補の第１のイヌが肝臓の銅蓄積から保護される子孫を作出するのに適するかどうかを決定することを含む方法を提供する。該方法は、本発明の方法により、第１のイヌと性が反対の第２のイヌで、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定することをさらに含むことができる。結果が第１のおよび／または第２のイヌが肝臓の銅蓄積からの保護を示す遺伝子型を有するということであれば、その場合、肝臓の銅蓄積から保護される子孫を産するために、第１のイヌを第２のイヌと交配させることができる。
【０１２５】
例えば、該方法は、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）から選択される１つまたは複数の多型およびそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型の有無を、候補の第１のイヌのゲノムで決定することを含むことができる。より好ましくは、該方法はＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）の有無を決定することを含むことができる。本発明の方法は、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６（配列番号１４２）のＴ対立遺伝子の有無を決定することを含むことができる。さらにより好ましくは、方法は、イヌが、ＡＴＰ７ａのＳＮＰのＴ対立遺伝子に対してホモ接合性か（雌イヌの場合）またはヘミ接合性か（雄イヌの場合）を決定することを含むことができる。該ＳＮＰの存在は、第１のイヌが肝臓の銅蓄積から保護されており、したがって第２のイヌと交配させるのによい候補であることを示す。第１のおよび第２のイヌは、該ＳＮＰのＴ対立遺伝子についてホモ接合性またはヘミ接合性であることが好ましい。第１のおよび／または第２のイヌのいずれかにおけるホモ接合は、このことにより子孫がホモ接合性であり、それにより肝臓の銅蓄積から選択される可能性が増大するので、最も好ましい。
【０１２６】
候補の第１のイヌおよび／または第２のイヌは、任意血統のものであってよい。候補の第１のイヌおよび／または第２のイヌは、ラブラドールレトリーバー、ゴールデンレトリーバーまたはトイプードルから選択される血統を遺伝的に継承していることが好ましい。候補の第１のイヌおよび／または第２のイヌはラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的継承していることがより好ましい。イヌは、純粋種のラブラドールレトリーバーであってよい。あるいは、イヌは、混血のもしくは交雑種のイヌ、または異系交配のイヌ（雑種）であってもよい。イヌの両親の一方または両方が、純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってもよい。イヌの祖父母の１、２、３または４頭が純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってもよい。イヌは、その遺伝的背景に少なくとも５０％または少なくとも７５％のラブラドールレトリーバーの血統を有してよい。したがって、イヌのゲノムの少なくとも５０％または少なくとも７５％は、ラブラドールレトリーバーの血統に由来してよい。
【０１２７】
本発明は、銅蓄積に対する感受性を示す本発明の多型を使用することにより、肝臓の銅蓄積から保護される子孫を産するためのイヌを選択する方法も提供する。イヌのゲノム中のそのような多型が存在しないことは、そのイヌが交配のためのよい候補であることを示す。前記方法は、候補の第１のイヌでイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを本発明の方法により決定すること；およびそれにより候補の第１のイヌが肝臓の銅蓄積から保護される子孫を産するのに適するかどうかを決定することを含む。前記方法は、第１のイヌと性が反対の第２のイヌで、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを本発明の方法により決定することをさらに含むことができる。結果が第１のおよび／または第２のイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す遺伝子型を含まないということであれば、その場合第１のイヌを、肝臓の銅蓄積に感受性でない子孫を産するために、第２のイヌと交配させることができる。
【０１２８】
前記方法は、候補の第１のイヌのゲノムで、表ＩＩＩ、ＩＶおよびＶにおいて特定されたＳＮＰから選択される１つまたは複数の多型およびそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型の有無を決定することを含むことができる。これらの多型の１つまたは複数の存在は、第１のイヌが肝臓の銅蓄積に対して感受性であり、したがって肝臓の銅蓄積から保護される子孫を産するために第２のイヌと交配させるべきよい候補ではないことを示す。
【０１２９】
候補の第１のイヌおよび／または第２のイヌは、任意の血統のものであってよい。候補の第１のイヌおよび／または第２のイヌは、ラブラドールレトリーバー、ドーベルマン・ピンシェル、ジャーマンシェパード、キースハウンド、コッカースパニエル、ウェストハイランド・ホワイトテリア、ベッドリントンテリアおよびスカイテリアから選択される血統を遺伝的に継承していることが好ましい。候補の第１のイヌおよび／または第２のイヌは、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承していることがより好ましい。イヌは、純粋種のラブラドールレトリーバーであってよい。あるいは、イヌは混血のもしくは交雑種のイヌ、または異系交配のイヌ（雑種）であってもよい。イヌの両親の一方または両方が純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってもよい。イヌの祖父母の１、２、３または４頭が純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってもよい。イヌは、その遺伝的背景において、少なくとも５０％または少なくとも７５％のラブラドールレトリーバーの血統を有することができる。したがって、イヌのゲノムの少なくとも５０％または少なくとも７５％は、ラブラドールレトリーバーの血統に由来してよい。
【０１３０】
イヌの遺伝的血統の継承は、遺伝的マーカーの、例えばＳＮＰまたはマイクロサテライトの対立遺伝子の頻度を評価することにより決定することができる。イヌにおける異なったＳＮＰまたはマイクロサテライトの対立遺伝子の頻度の組合せは、イヌの血統または混血血統のイヌを作り出す血統が決定されることを可能にする特色を提供する。そのような遺伝子検査は商業的に利用できる検査である。あるいは、イヌは、それがラブラドールレトリーバーの血統を継承すると、例えばイヌの飼い主または獣医により推定されるという理由で、ラブラドールレトリーバーの血統継承について検査される必要がないこともある。これは、例えばイヌの祖先の知識のため、またはその外観のためであり得る。
【０１３１】
オールブリードクラブ登録により認められた血統の最も純粋種のイヌは「非公開の血統台帳」により管理される。血統台帳は、典型的には、例えば、血統協会またはケンネルクラブにより保持される、与えられた血統の承認されたイヌの公式登録である。それは、イヌがそれらの両親の両方とも登録されている場合にのみ追加され得るなら、一般に「非公開」血統台帳と称される。大部分の血統は非公開の血統台帳を有し、その結果、遺伝的多様性は既存集団の外側から導入され得ないので近親交配が生じる。ケンネルクラブにより認められた多くの血統において、これは、遺伝的疾患または障害ならびに同腹子の数の減少、短命および自然受胎不能などの他の問題の高い発生率を生じている。
【０１３２】
近親交配に関連する問題を回避するためには、血縁的により密接なイヌに比較して血縁的に互いにより隔たった特定の血統の中で、血統についてイヌを選択するのが有利であろう。したがって本発明の一態様において、候補の第１のイヌおよび候補の第２のイヌの遺伝的血統の継承が、２頭のイヌの縁続きの程度を決定するために決定される。本発明のこの態様において、用語「遺伝的血統の継承」は、特定の血統内のイヌの遺伝的祖先の系統に関する。イヌの遺伝的血統の継承は本明細書に記載したようにして決定することができる。イヌの遺伝的継承を決定することにより、彼らがいかに密接に関係しているかを決定するために、単一血統内でイヌの間を区別することは可能である。
【０１３３】
したがって、本発明の一態様において、候補の第１のイヌと候補の第２のイヌとの縁続きの程度が決定され、それは候補の第１のイヌの遺伝的血統の継承を同じ血統の候補の第２のイヌと比較することを含む。好ましくは、イヌは純粋種のイヌである。各イヌの遺伝的血統の継承は、例えば、前記イヌにおいて、１つまたは複数の血統特異的多型の有無を確認することにより決定することができる。
【０１３４】
縁続きの程度は、イヌが共通して有する血統特異的多型の数から決定することができる。例えば、同じ血統の２頭のイヌは、０から１００％の、例えば１０から９０％、２０から８０％、３０から７０％または４０から６０％の検査済み血統特異的多型を共通して有することができる。したがって２頭のイヌは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の検査済み血統特異的多型を共通して有することができる。２頭のイヌの間に共通の検査済み血統特異的多型のパーセンテージは、それらの縁続きの程度の尺度として使用することができる。本発明のこの態様において、２頭のイヌは、彼らが遺伝的に十分無関係である場合にのみ、一緒に交配させるであろう。例えば、彼らは、６０％、５０％、４０％、３０％または２０％未満の検査済み血統特異的多型を共通して有する場合にのみ、一緒に交配させることができる。
【０１３５】
本発明は、被験対象のイヌと交配させることについて１頭または複数のイヌを選択する方法であって、
（ａ）被験対象のイヌおよび被験対象のイヌと性が反対の２頭以上のイヌの検査群中の各イヌについて、ゲノムが肝臓の銅蓄積に対して感受性またはそれからの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定することと、
（ｂ）被験対象のイヌと交配させることについて検査群から１頭または複数のイヌを選択することと
を含む方法も提供する。
【０１３６】
検査群は、少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、７５、１００または２００頭の異なったイヌ、例えば２から１００、５から７０または１０から５０頭のイヌからなってよい。イヌは、通常、肝臓の銅蓄積から保護されるという根拠で検査群から選択される。検査群から選択される１頭または複数のイヌは、被験対象のイヌと同じかまたは類似の血統を遺伝的に継承していてよい。
【０１３７】
被験対象のイヌおよび検査群中の各イヌの血統は任意でよい。被験対象のイヌおよび／または検査群中の各イヌは、ラブラドールレトリーバー、ドーベルマン・ピンシェル、ジャーマンシェパード、キースハウンド、コッカースパニエル、ウェストハイランド・ホワイトテリア、ベッドリントンテリア、スカイテリア、ゴールデンレトリーバーまたはトイプードルから選択される血統を遺伝的に継承していることが好ましい。イヌは、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承していることがより好ましい。イヌは純粋種のラブラドールレトリーバーであってよい。あるいは、イヌは、混血のもしくは交雑種のイヌ、または異系交配のイヌ（雑種）であってもよい。イヌの両親の一方または両方が、純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってもよい。イヌの祖父母の１、２、３または４頭が純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってもよい。イヌは、その遺伝的背景において、少なくとも５０％または少なくとも７５％のラブラドールレトリーバーの血統を有することができる。したがって、イヌのゲノムの少なくとも５０％または少なくとも７５％は、ラブラドールレトリーバーの血統に由来してよい。本発明の一実施形態においては、肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護に関する多型の有無に基づいて、検査群内の肝臓の銅蓄積から保護される可能性が最も高いイヌが、被験対象のイヌと交配させるために選択される。他の実施形態においては、検査群内の肝臓の銅蓄積から保護される可能性が高い多数のイヌが、被験対象のイヌと交配させるために選択される。例えば、検査群中の少なくとも２、３、４、５、１０、１５または２０頭のイヌを選択することができる。その上、他の因子、例えば地理的位置、年齢、品種改良状態、既往歴、疾患感受性または身体的特性に基づいて選択されたイヌの群から、さらに選択することもできる。
【０１３８】
上で説明したように、遺伝的に最も無関係の同じ血統内でイヌを交配させることが好ましい。これは、遺伝的多様性を血統内で増加または維持し、且つ子孫に生じる近親交配に関係する問題の可能性を減少させるためである。したがって、検査群からのイヌのさらなる選択は、被験対象のイヌとの遺伝的関係に基づくことができる。したがって、本発明の一態様において、方法は、
（ａ）被験対象のイヌの遺伝的血統の継承を、同じ血統の且つ被験対象のイヌと性が反対の２頭以上のイヌの検査群中の各イヌの遺伝的血統の継承と比較することと、
（ｂ）この比較から、被験対象のイヌと検査群中の各イヌとの間の縁続きの程度を決定することと、
（ｃ）被験対象のイヌと交配させることについて検査群から１頭または複数のイヌを選択することと、
を含むことができる。
【０１３９】
イヌは、被験対象のイヌ（すなわち、精液をとるべきイヌ）とのそれらの関係に基づいて検査群から選択することができる。検査群から選択された１頭または複数のイヌは、イヌの検査群内で最も隔たった関係にある（すなわち最低の縁続きの程度を有する）ことが好ましい。被験対象のイヌおよび検査群中のイヌの遺伝的血統の継承は、すでに知られていてよく、または例えば市販の血統検査により決定してもよい。
【０１４０】
したがって、本発明は、１頭または複数の適当なイヌを被験対象のイヌと交配させるために推薦する方法を提供する。推薦は、被験対象のイヌの飼い主または世話人、獣医、イヌ飼育者、ケンネルクラブまたは血統登録に対して行うことができる。
【０１４１】
本発明は、肝臓の銅蓄積に対する、性が反対の少なくとも２頭のイヌの感受性またはそれからの保護が、場合により同じ血統内で、彼らを一緒に交配させる前に決定される、イヌを交配させる方法にも関する。
【０１４２】
肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性またはそれからの保護は、電子書式中、例えばコンピュータデータベース中に貯蔵することができる。したがって、本発明は、肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護、および１頭または複数のイヌの性に関する情報を含むデータベースを提供する。データベースは、イヌについてのさらなる情報、例えば、イヌの血統を遺伝的に継承している品種改良状態、年齢、地理的位置、既往歴、疾患感受性または身体的特性を含むことができる。データベースは、通常、各イヌについての固有の識別名、例えばイヌの登録名をさらに含む。データベースは、遠隔で、例えばインターネットを使用して評価することができる。
【０１４３】
本発明の食材
本発明は、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承しているイヌのための食材に関する。本発明者らは、市販の食餌中に見出される銅のレベルがラブラドールレトリーバーにおける肝臓の銅蓄積と関連していること、および食餌中の銅のレベルを減少させることが、驚くべきことに、薬剤のペニシラミンより効果的に、肝臓の銅レベルが正常レベルにもたらされることを可能にすることを発見した。本発明の食材は、低い銅濃度、具体的には２１ｍｇ／ｋｇ（乾物）未満の銅濃度を有する。食材は、ラブラドールレトリーバーの肝臓における銅の蓄積を予防するために使用される。したがって、それは、肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患または病態を予防するために有用である。したがって、本発明の食材は、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むと本発明の方法により決定されているイヌに与えることができる。本明細書において使用される「食材」という用語は、食材、食餌、食料品またはサプリメントを包含する。これらの形態のいずれも、固体、半固体または液体であってよい。
【０１４４】
より詳細には、本発明の食材は、銅を２１ｍｇ／ｋｇ（乾物）未満の濃度で含む。好ましくは、銅濃度は、２０ｍｇ／ｋｇ未満、１７ｍｇ／ｋｇ未満、１５ｍｇ／ｋｇ未満、１２または１０ｍｇ／ｋｇ（乾物）未満である。好ましくは、銅濃度は、少なくとも４．５、少なくとも４．７５、少なくとも５または少なくとも８ｍｇ／ｋｇ（乾物）である。典型的には、銅濃度は、４．５から２１ｍｇ／ｋｇ、５から１７ｍｇ／ｋｇまたは１０から１５ｍｇ／ｋｇ（乾物）の範囲内である。銅は、任意の生理学的に許容される形態で食材中に存在してよい。したがって、銅は、硫酸銅などの任意の生理学的に許容される塩で提供することができる。
【０１４５】
食材は、亜鉛を少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇ（乾物）の濃度でさらに含むことができる。好ましくは、亜鉛濃度は、少なくとも１５０、少なくとも１８０または少なくとも２００ｍｇ／ｋｇ（乾物）である。亜鉛濃度は、食品規制当局により許容される最大値を超えないことが好ましい。典型的には、亜鉛濃度は２５０ｍｇ／ｋｇ未満、２４０ｍｇ／ｋｇ未満、２３０ｍｇ／ｋｇ未満または２２０ｍｇ／ｋｇ（乾物）未満である。通常、亜鉛濃度は、１２０から２５０、１５０から２５０または２００から２５０ｍｇ／ｋｇ（乾物）の範囲内であろう。
【０１４６】
食材中の亜鉛の量は銅の量を超えることが好ましい。イヌにより摂取される食材中の亜鉛および／または銅の効果的な濃度は、非消化性物質の有無により影響されることは理解されるであろう。好ましくは、食材中における亜鉛の銅に対する比は、食材の質量により５以上、例えば６、７、８、９、１０以上である。
【０１４７】
亜鉛は、本発明の銅のレベルを提供する同じ食材中で提供することができる。あるいは、亜鉛は、本発明の食材に添加することができるサプリメントの形態で提供することもできる。サプリメントは、錠剤、粉末または液剤の形態であることができる。亜鉛は、食材中に存在するかまたは任意の生理学的に許容される形態にあるサプリメントとして提供することができる。したがって、亜鉛は、酢酸亜鉛、硫酸亜鉛、グルコン酸亜鉛、炭酸亜鉛、塩化亜鉛または酸化亜鉛などの任意の生理学的に許容される塩の中であってよい。
【０１４８】
食材中の銅または亜鉛の濃度は、本明細書に記載した乾物を基準にする。すなわち、異なった含水率を有し得る異なった食材間での直接比較を可能にするために、水を除いた食材を基準にする。湿潤したまたは半湿潤の食材中の銅または亜鉛の濃度を測定するために、食材の試料は、例えばオーブンを使用して最初に乾燥して水を除去する。その後、任意の適当な技法を使用して乾燥食材試料中の銅または亜鉛の濃度を測定することができる。当技術分野において周知のそのような技法の例は炎光原子吸収分光法である。
【０１４９】
本発明の食材は、例えば、湿潤ペットフード、半湿潤ペットフードまたは乾燥ペットフードの形態であることができる。湿潤ペットフードは、一般に６５重量％を超える含水率を有する。半湿潤ペットフードは、通常、２０〜６５重量％の間の含水率を有しており、および微生物の増殖を防止するために吸湿剤および他の成分を含むことができる。キブルとも呼ばれる乾燥ペットフードは、一般に２０重量％未満の含水率を有し、その加工は典型的には、押し出し、乾燥および／または加熱ベーキングを含む。
【０１５０】
食材は、湿潤および乾燥食物の混合物として提供することができる。そのような組合せは、予め混合して提供することができ、または別々に、同時にまたは順番に提供される２つ以上の別の食材としてイヌに与えることもできる。
【０１５１】
食材は、イヌがその食餌中で消費する任意の製品を包含する。本発明は、標準的食品ならびにペットフードスナックを含む。食材は、好ましくは調理された製品である。それは食肉または動物由来の材料（牛肉、鶏肉、七面鳥、ラム、魚その他など）を組み込むことができる。あるいは、製品は食肉を含まなくてもよい（好ましくは、タンパク質供給源を提供するための食肉代替物、例えば、ダイズ、トウモロコシ、グルテンまたはダイズ製品などを含む）。製品は１種または複数種の穀物（例えば、トウモロコシ、米、燕麦、大麦その他）などのデンプン供給源を含有してもよく、またはデンプンを含まなくてもよい。
【０１５２】
乾燥ペットフードの成分は、シリアル、穀物、食肉、家禽、脂肪、ビタミンおよびミネラルから選択することができる。成分は、通常、混合されて押し出し機／調理器を通して整えられる。次に、製品は、典型的には成形されて乾燥され、乾燥後、乾燥製品上に着香剤および脂肪がコートまたはスプレーされることもある。
【０１５３】
全てのペットフードは、一定レベルの栄養分を提供することを求められている。例えば、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｅｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｏｆｆｉｃｉａｌｓ（ＡＡＦＣＯ）およびＰＥＴ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅは共通して使用される成分に基づいて、ドッグフードのための栄養分プロファイルを制定した。これらの制定されたプロファイルは、「ＡＡＦＣＯドッグフード栄養分プロファイル」と呼ばれる。これらの規制の下で、ドッグフードは、ＡＡＦＣＯにより決定されたように最低レベルを満たし且つ最高レベルを超えない栄養分の濃度を含有するように作られなければならない。
【０１５４】
ドッグフード調合物は、イヌのカロリー、タンパク質、脂肪、炭水化物、繊維、ビタミンまたはミネラルの必要性にしたがって作ることができる。例えば、ドッグフード調合物は、ω−６およびω−３脂肪酸などの必須脂肪酸の正しい量または比を提供するように特注生産することができる。ω−６脂肪酸の主要な供給源は、ヒマワリ、ダイズ油、ベニバナおよびオオマツヨイグサ油などの植物であるが、それに対してω−３脂肪酸はアマニおよび海洋性供給源中に主として見出される。銅分が高く且つ食材の製造中に避けることができる食物成分には、貝、肝臓、腎臓、心臓、筋肉、ナッツ、キノコ、シリアル、ココア、莢果および軟水（銅管）が含まれる。亜鉛に富み且つ調合時に含めることができる食物成分には、ミルク、ゼラチン、卵黄、米および馬鈴薯が含まれる。
【０１５５】
食材は好ましくは梱包される。梱包は、金属（通常、スズまたは柔軟なフォイルの形態で）、プラスチック（通常、小袋または瓶の形態で）、紙または厚紙であってよい。どのような製品中の水分量も、使用することができるまたは要求される梱包のタイプに影響し得る。
【０１５６】
本発明の食材は、亜鉛の供給源と一緒に梱包することができる。亜鉛は、任意の形態で提供することができる。亜鉛は、１種または複数種の食材中でまたは本発明の最高の銅のレベルを含む食材と共に梱包される別のサプリメントの形態で提供することができる。亜鉛が食材中で提供されるときには、それは、本発明の特定の銅のレベルを含有する同じ食材中で提供することができ、またはそれは、１つもしくは複数の別の食材もしくは両方の食材中で提供することができる。したがって本発明は、銅を２１ｍｇ／ｋｇ（乾物）未満の濃度で有する食材および亜鉛サプリメントを含むパックを提供する。亜鉛サプリメントは、食材に添加されるときは、少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇ（乾物）の濃度を提供する。食材および亜鉛サプリメントは、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承しているイヌにおける肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患の予防に、同時に、別々にまたは順次に使用するためのものである。
【０１５７】
本発明は、本明細書において論じたラベルを付けた食材も提供する。ラベルは、例えば、食材がラブラドールレトリーバーの血統のイヌに適することを示すことができる。他の指示書または使用説明書も提供することができる。例えば、食餌または食材が、他の成分に加えて含有する銅および／または亜鉛の量を示すことができる。さらに、給餌説明書を提供することができる。
【０１５８】
ラブラドールレトリーバー
本発明の食材は、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承しているイヌにおける肝臓の銅蓄積を予防するのに適する。イヌは、典型的には伴侶犬またはペットである。イヌは、純粋種のラブラドールレトリーバーであってよい。あるいは、イヌは、混血のもしくは交雑種のイヌ、または異系交配されたイヌ（雑種）であってもよい。イヌの両親の一方または両方が純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってもよい。イヌの祖父母の１、２、３または４頭が純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってもよい。イヌは、その遺伝的背景において少なくとも５０％または少なくとも７５％のラブラドールレトリーバーの血統を有することができる。したがって、イヌのゲノムの少なくとも５０％または少なくとも７５％は、ラブラドールレトリーバーの血統に由来してよい。
【０１５９】
イヌの遺伝的血統背景は、遺伝マーカーの、例えばＳＮＰまたはマイクロサテライトの対立遺伝子の頻度を評価することにより決定することができる。イヌにおける異なったＳＮＰまたはマイクロサテライトの対立遺伝子の頻度の組合せは、イヌの血統または混血血統のイヌを作り出す血統が決定されることを可能にする特色を提供する。そのような遺伝子検査は商業的に利用できる検査である。あるいは、イヌは、それがラブラドールレトリーバーの血統を継承すると、例えばイヌの飼い主または獣医により推定されるという理由で、ラブラドールレトリーバーの血統継承について検査される必要がないこともある。これは、例えば、イヌの祖先の知識のため、またはその外観のためであり得る。
【０１６０】
該食物は、任意の年齢のイヌに適する。食物は、０から１２歳、例えば１から５歳、２から７歳または３から９歳の年齢を有するイヌに適し得る。
【０１６１】
一般的に、該食材は、健康なイヌに適する。それは、検出し得る肝銅の蓄積を有しないイヌに適する。食材は、予防的使用、すなわちイヌの肝臓における銅の蓄積を予防することを意図される。食材は、銅蓄積の危険性を最小化して、それによりイヌが慢性肝炎、肝硬変または肝不全などの肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患または病態を発生する確率を減少させるために意図されている。典型的には、食材は、異常な肝銅濃度を有せず、したがって銅関連肝炎に罹る危険性の低いイヌにおける銅蓄積の予防に使用するためのものである。イヌは、銅を蓄積する履歴を有しなくてもよい。したがって、イヌは、好ましくは、約４００ｍｇ／ｋｇ（乾燥肝臓重量）未満の範囲内の肝銅の正常レベルを有する。しかしながら、新生のイヌにおいて、肝銅の正常レベルは約６００ｍｇ／ｋｇ（乾燥肝臓重量）未満であると考えることができる。食材をイヌに与える目的は、肝銅濃度を正常レベルより有意に高いレベルに達することから予防することである。イヌの肝臓における銅の濃度を決定するために使用することができる方法は、当技術分野において周知である。適当な方法は実施例４で記載される。
【０１６２】
食材は、銅関連慢性肝炎を予防するために使用することができる。食材は、好ましくは、上記の肝疾患を予防する目的で、検出可能な肝疾患を有しないイヌにおける銅蓄積の予防に使用するためのものである。食材は、慢性肝炎、肝硬変または肝不全などの肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患または病態を治療するために使用することもできる。肝疾患の証拠または症状には、嗜眠、下痢および黄疸などの臨床的指標が含まれる。肝疾患の生化学的指標には、血清ビリルビンおよびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびガンマグルタミルトランスペプチダーゼなどの血清肝臓酵素活性の異常な上昇が含まれる。そのような肝疾患指標の生化学的測定は、当技術分野において周知である。
【０１６３】
食物が意図されるイヌは、いかなる臨床的問題も有しないことが好ましい。
【０１６４】
食物の製造
本発明の食材は、適当な成分を一緒にして混合することにより作製することができる。製造は、食材が要求される銅濃度を有するように制御される。銅の濃度は、食材製造工程中にモニターすることができる。したがって本発明は、本発明の食材を作製する方法であって、食材が２１ｍｇ／ｋｇ（乾物）未満の銅濃度を有するように、食材用の成分を一緒にして混合することを含む方法を提供する。食材中に組み込まれるべき１種または複数種の構成要素は、銅の供給源を提供し得る。しかしながら、銅に富みそうな構成要素の使用を避けることは重要である。銅分が高く且つ食材の製造中に避けることができる食物成分には、貝、肝臓、腎臓、心臓、筋肉、ナッツ、キノコ、シリアル、ココア、莢果および軟水（銅管）が含まれる。場合により、構成要素の１種または複数種は本発明の食材のために亜鉛の供給源を提供するであろう。亜鉛に富み且つ調合時に含めることができる食物成分には、ミルク、ゼラチン、卵黄、米および馬鈴薯が含まれる。構成要素／成分は、食材の製造／加工中の任意の時に添加することができる。
【０１６５】
食材中に存在する銅の濃度を、それが本発明による限界未満であるかどうかを決定するために、測定することは重要である。亜鉛の濃度も、本発明により好ましい最小レベルを超えていることを確認するために測定することができる。食材の製造方法におけるステップの１つは、食材の試料中の銅濃度の測定を含むことができる。銅濃度の少なくとも１回の測定は、食材が調製された後で食材の試料から行うことができる。測定は、さらなる成分の添加により蓄積される銅および／または亜鉛のレベルをモニターするために、食材の調製中にも行うことができる。例えば、測定は、１種または複数種の成分の添加後に試料について行うことができる。銅、亜鉛および他の元素の測定は、炎光原子吸収分光法などの当技術分野において知られる任意の適当な方法を使用して、試料について行うことができる。
【０１６６】
典型的には、本発明の食材を作製する方法は、成分を一緒にして、場合により任意の原料成分の調理と共に混合することと、食材の試料中の銅、および場合により亜鉛の濃度を測定することと、食材を梱包することとを含む。食材を作製する方法は、イヌの飼い主、イヌの給餌の担当者または獣医に食材を提供することおよび／または食材をイヌに与えることをさらに含み得る。
【０１６７】
食材が銅を少しも含まないということは普通ではないが、銅は、イヌの食餌における銅の毎日の最低必要量を達成するために、食材にサプリメントとして添加することができる（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｅｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ（ＡＡＦＣＯ））により推奨されるように）が、一方それでも銅濃度を本発明によりその下と要求されるレベルに保つ。したがって本発明は、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承しているイヌのための食材の製造における銅の使用も提供し、この場合、食材は銅を２１ｍｇ／ｋｇ未満の濃度で含み、前記イヌにおける銅蓄積の予防に使用するためのものである。銅は、任意の適当な形態で食材に添加することができる。銅サプリメントの例として、塩化銅および硫酸銅５水和物が挙げられる。本発明において使用される食品製造装置は、典型的には、以下の構成要素の１つまたは複数を備える：乾燥ペットフード成分のための容器；液体のための容器；混合機；成形具および／または押し出し機；切断デバイス；調理器（例えばオーブン）；クーラー；梱包手段；およびラベルを付ける手段。乾燥成分容器は、典型的には、底部に開口部を有する。この開口部は、ロータリー・ロックなどの容量調節要素により覆うことができる。容量調節要素は、乾燥成分のペットフードへの添加を調節するために、電子製造指示により開閉することができる。ペットフードの製造において通常使用される乾燥成分には、トウモロコシ、小麦、食肉および／または家禽の肉が含まれる。ペットフードにおいて通常使用される液体成分には、脂肪、獣脂、および水が含まれる。液体容器は、例えば電子製造指示により、測定された量の液体をペットフードに添加するように制御され得るポンプを含むことができる。
【０１６８】
一実施形態において、乾燥成分容器（単数または複数）および液体容器（単数または複数）は混合機に接続され、特定された量の乾燥成分および液体を混合機に送達する。混合機は、電子製造指示により制御することができる。例えば、混合の持続時間または速度を制御することができる。次に、混合された成分は、典型的には成形具または押し出し機に送達される。成形具／押し出し機は、混合された成分を要求される形状に成形するために使用することができる、当技術分野において知られた任意の成形具または押し出し機であってもよい。典型的には、混合された成分は加圧下で限定された開口部を通して押し出され連続した紐の形状になる。紐が押し出されると、それは、ナイフなどの切断デバイスにより断片（キブル）に切ることができる。キブルは、通常、例えばオーブン中で調理される。調理時間および温度は、電子製造指示により制御することができる。調理時間は、食物を所望の含水率にするように変更することができる。次に、調理されたキブルは、クーラー、例えば１つまたは複数のファンを備えたチェンバーに移すことができる。
【０１６９】
ペットフード製造装置は、梱包装置を備えることができる。梱包装置は、通常、ペットフードをプラスチックまたは紙の袋または箱などの容器中に梱包する。装置は、ペットフードにラベルを、通常は、食物が梱包された後で付ける手段も備えることができる。ラベルは、食材が適するイヌの種類（すなわちラブラドールレトリーバー）、および／または食物の成分を表示することができる。
【０１７０】
食材の使用
本発明の食材は、イヌにおける肝臓の銅蓄積を予防するために使用することができる。したがって、銅関連慢性肝炎、肝硬変または肝不全などの高い肝臓銅と関連する疾患または病態を予防するために使用することができる。したがって、本発明は、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承しているイヌにおける肝臓の銅蓄積および肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患を予防する方法であって、イヌに本明細書に記載した食材を給餌することを含む方法を提供する。本発明は、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承しているイヌにおける銅関連慢性肝炎を予防する方法であって、本発明の食材をイヌに与えることを含む方法も提供する。本発明の食材は、典型的には、ラブラドールレトリーバーにおける銅の蓄積の予防における、予防的使用のためのものである。それはまた、典型的には、ラブラドールレトリーバーにおける銅関連慢性肝炎を予防するためのものである。
【０１７１】
本発明の食材は、好ましくは、そのイヌのゲノムが、本明細書に記載した遺伝子検査により、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むと決定されたイヌにおける肝臓銅の蓄積の予防に使用するためのものである。
【０１７２】
本発明の食材の使用は、亜鉛の供給源をイヌに与えることを含むことができる。本明細書に記載したように、亜鉛は、イヌに適した任意の形態で提供することができる。本発明の低レベルの銅を含有する食材は、亜鉛を、例えば、少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇ（乾物）の濃度でさらに含むことができる。あるいは、亜鉛は、１つまたは複数の別々の食材またはサプリメントの形態で提供することもできる。本発明の食材の使用は、亜鉛サプリメントをイヌに与えることを含むことができる。亜鉛サプリメントは、任意の時に、すなわち、別々に、同時にまたは順次に本発明の食材に提供することができる。亜鉛サプリメントは、例えば、それがイヌに与えられるかまたはそれをイヌの飲用水中に入れることができる前に、本発明の食材と混合することができる。
【０１７３】
本発明の食材は、イヌに１日当たり１回または複数回与えることができる。食材は、好ましくは、イヌの従来の食物の代わりに与えられる。銅蓄積を予防するまたは慢性肝炎を予防する方法は、無期限で、すなわちイヌの一生を通して使用することができる。
【０１７４】
本発明を以下の実施例により例示する。
【実施例１】
【０１７５】
銅蓄積に対する感受性と関連するＳＮＰの解明
１２０頭のラブラドールのＤＮＡ試料を、２２０００を超えるＳＮＰにわたって遺伝子型決定した。高銅のイヌ（肝臓銅のレベルが６００ｍｇ／ｋｇを超える）から７２頭のイヌの試料および正常銅肝臓レベル（４００ｍｇ／ｋｇ未満）から４８頭のイヌの試料があった。データは、可能なイヌの対全ての間の相互比較を使用して分析した。データは、疾患を支持する情報を与える遺伝子座により配列した。高銅レベルに連関する最良のフィッティングマーカーを見出すために、Ｂｏｏｌｅａｎオペレータを使用して、最良の３つのゲノムの遺伝子座からのデータを使用した。３つの遺伝子座を使用する簡単なＢｏｏｌｅａｎモデルの結果を下に示す：
【０１７６】
【表１】
2012504410.tif 000003
表Ｉの２進値に対するキーは以下の通りである。
ゲノムの遺伝子座ＣＦＡ８（ＧＯＬＧＡ５遺伝子）
１＝ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５のＳＮＰにＡＡ遺伝子型がある場合
０＝ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５のＳＮＰの任意の他の遺伝子型がある場合
ゲノムの遺伝子座ＣＦＡ３２（ＵＢＬ５遺伝子領域）
１＝ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５にＧＧ、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７にＣＣおよびＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８にＧＧがある場合
０＝これらのＳＮＰのいずれかが異なった遺伝子型を示す場合
ゲノムの遺伝子座ＣＦＡＸ（ＡＴＰ７ａ遺伝子領域）
１＝ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２にＡＡまたはＡＧがある場合
０＝ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２にＧＧがある場合
全ての遺伝子座において、Ｘ＝使用されない対立遺伝子。
【０１７７】
表Ｉは、３つのゲノムの遺伝子座における対立遺伝子の２元状態を表す。ゲノムの遺伝子座ＣＦＡ８において、１つのＳＮＰが使用された（ＳＮＰ１）。ゲノムの遺伝子座ＣＦＡ３２において３つのＳＮＰが使用された（ＳＮＰ２、３および４）。ゲノムの遺伝子座ＣＦＡＸにおいて１つのＳＮＰが使用された（ＳＮＰ５）。２元値は、銅蓄積に対する感受性を示す対立遺伝子（「悪い」対立遺伝子）を有するイヌを示す。例えば０００は、３つの悪い対立遺伝子のいずれも有しないことを表す。１１１は、３つの悪い対立遺伝子の全てを有することを表す。Ｘはその遺伝子における使用されない対立遺伝子である。１ｘｘのおよび０ｘｘのラインは、ＧＯＬＧＡ５遺伝子中のＳＮＰのみを使用する１つの遺伝子検査が有する力を示す。
【０１７８】
表ＩＩは、より多くの標示対立遺伝子を有するイヌほど、平均でより高い銅濃度を有することを示す。各パターンを有するイヌの数を見ることもできる。
【０１７９】
【表２】
2012504410.tif 000004
【０１８０】
表ＩＩＩは、表ＩおよびＩＩ中の結果のために使用されたＳＮＰの位置および配列を示す。
【０１８１】
結果は、３つのゲノムの遺伝子座（ＧＯＬＧＡ５、ＵＢＬ５およびＡＴＰ７ａ遺伝子の中および周辺にある）は銅蓄積に対する感受性と関連することを示す。さらに、銅蓄積に対する感受性を示すこれらの領域中のＳＮＰを表ＩＶに示す。
【０１８２】
【表３】
2012504410.tif 000005
【０１８３】
【表４−Ａ】
2012504410.tif 000006
【表４−Ｂ】
2012504410.tif 000007
【表４−Ｃ】
2012504410.tif 000008
【表４−Ｄ】
2012504410.tif 000009
【表４−Ｅ】
2012504410.tif 000010
【表４−Ｆ】
2012504410.tif 000011
【表４−Ｇ】
2012504410.tif 000012
【表４−Ｈ】
2012504410.tif 000013
【表４−Ｉ】
2012504410.tif 000014
【表４−Ｊ】
2012504410.tif 000015
【表４−Ｋ】
2012504410.tif 000016
【表４−Ｌ】
2012504410.tif 000017
【表４−Ｍ】
2012504410.tif 000018
【表４−Ｎ】
2012504410.tif 000019
【実施例２】
【０１８４】
実施例１で同定された３つの遺伝子を調べて肝臓の銅蓄積に対する感受性と関連するさらなるＳＮＰを同定した。３つの同定された遺伝子のエクソンを残らず網羅する３３個の単位複製配列を選んだ。これらは、ラブラドールレトリーバーの血統のイヌからのゲノムのＤＮＡの７２個の試料中で増幅されていた。試料は、高銅（６００ｍｇ／ｋｇを超える肝臓銅のレベル）または正常銅肝臓レベル（４００ｍｇ／ｋｇ未満）のいずれかのイヌから採取した。増幅された生成物は、サンガー法により両方向で配列を決定した。ＤＮＡＳＴＡＲにより供給されるソフトウェア「Ｓｅｑｍａｎ４．０」を各単位複製配列中の配列のアセンブルに使用した。次にアセンブリーを検査して一塩基変異（ＳＮＰ）を見出した。次に、これらの変異は、両方向からの配列におけるＳＮＰで、基準強度（ｂａｓｅ−ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を検査することにより遺伝子型を決定される。２つの方向からのＳＮＰの遺伝子型が１０個を超える試料中で不一致であれば、ＳＮＰはアーチファクトと分類されておよび無視される。同定された感受性ＳＮＰを表Ｖに提示する。
【０１８５】
驚くべきことに、保護ＳＮＰも発見された。これは表ＶＩに示す。このＳＮＰは、ＡＴＰ７ａ遺伝子（Ｘ染色体連関遺伝子）のコード領域中にあり、コード配列中に変化を生じさせる。性別およびＡＴＰ７ａ遺伝子型による肝臓銅の平均レベルの試験を実施した（表ＶＩＩ）。図５は、表ＶＩＩのデータをグラフで図示する。図６は、同じデータを銅の組織学的スコアとして図示する。ｐ値（０．０００３９６）は、群として、組織学的なスコアと性別遺伝子型とに対するクラスカル・ワリス検定により決定した。Ｔ対立遺伝子の存在はイヌが高い肝臓銅から保護されることを示すことがデータから明らかである。
【０１８６】
結果は、慢性肝炎の雌のバイアスを説明することができる。雄イヌは、１コピーのＸ染色体を有するだけなので、ＡＴＰ７ａ遺伝子座でヘミ接合性である。Ｘ連関劣性遺伝子の効果は、雄のＸ染色体のヘミ接合性状態のために、雌よりも雄において見られる可能性が高い。この場合、保護効果は劣性であるので、雌集団における方が多くの症例が見られる。
【０１８７】
保護ＳＮＰは、ＡＴＰ７ａのアミノ酸３２８位におけるトレオニンのイソロイシンへの変化を生じさせ、可能な水素結合の数の３から０への減少および疎水性の増大、可能性としてタンパク質の形状の変化をもたらす。この位置におけるトレオニンは、ウマ、ヒト、チンパンジーおよびイルカを含む多くの哺乳動物を通じて保存され、タンパク質の機能におけるこのアミノ酸の重要性を示す。
【実施例３】
【０１８８】
表ＶＩ中のＡＴＰ７ａのＳＮＰは、該ＳＮＰが他の血統においても存在するかどうかを決定するために、ラブラドールレトリーバーに加えて他の血統のイヌからのＤＮＡ試料においても遺伝子型を決定された。表ＶＩＩＩは、各遺伝子型のイヌの数について、結果を示す。「Ｔ」の縦欄はホモ接合体の雌（ＴＴ）およびヘミ接合体の雄（Ｔ）を示す。結果は、ＳＮＰは多様なイヌの血統に存在し、したがって種々の異なった血統、混血のイヌおよび雑種における銅蓄積からの保護の指標として使用することができることを示す。該ＳＮＰのＴ対立遺伝子は、米国および日本のラブラドール集団にも見出され、イヌの地理的位置はＳＮＰの効用の障害ではないことを示す。
【０１８９】
【表５−Ａ】
2012504410.tif 000020
【表５−Ｂ】
2012504410.tif 000021
【表５−Ｃ】
2012504410.tif 000022
【０１９０】
【表６】
2012504410.tif 000023
【０１９１】
【表７】
2012504410.tif 000024
【０１９２】
【表８】
2012504410.tif 000025
【実施例４】
【０１９３】
まとめ
試験の目的は、食事管理がペニシラミンによる治療後のラブラドールにおいて肝銅濃度に影響するのに有効であるかどうか、および亜鉛による追加の治療が役に立つかどうかを調べることであった。
【０１９４】
試験は、１２頭の雌および１２頭の雄の純粋種ラブラドールからなる２４頭のイヌの群に対して実施した。イヌは、以前の銅関連慢性肝炎患者犬の家族の構成員であった。食餌試行の開始時に、イヌは、臨床的には健康であったが、２０頭のイヌの肝銅濃度は、４００ｍｇ／ｋｇ（乾燥重量）という基準範囲を超えていた（平均値：８９４、範囲：７０〜２８１０ｍｇ／ｋｇ（乾燥重量））。これらの濃度はペニシラミンによる治療の完了後に測定した。
【０１９５】
全てのイヌは同じ食餌を給餌された。追加の治療は、グルコン酸亜鉛（７．５ｍｇ／ｋｇＰＯ  ＢＩＤ、第１群）またはプラセボ（第２群）からなった。試験完了まで、薬剤師以外は群の割り付けを知り得なかった。平均８ヵ月（範囲５〜１３ヵ月）、および１６ヵ月（範囲１２〜２５ヵ月）間の治療前および後に、臨床検査および血液検査と併行して肝銅濃度および組織病理学を評価した。血漿亜鉛濃度を治療中の追加時点で測定した。
【０１９６】
２１頭のラブラドール犬が試験を完了した。試験開始時に、第１群におけるイヌの平均年齢は４．１歳（範囲２．７〜８．３歳）であった。６頭のイヌは雌（５頭は卵巣を除去、１頭は除去せず）であり、および６頭は雄（２頭は去勢、４頭は去勢せず）であった。第２群におけるイヌの平均年齢は４．８歳（範囲３．６〜１１．２歳）であった。６頭のイヌは雌（４頭は卵巣を除去、２頭は除去せず）であり、および６頭のイヌは雄（２頭は去勢、４頭は去勢せず）であった。嘔吐、食欲不振、および下痢が、グルコン酸亜鉛サプリメントを与えた群の３頭のイヌに副作用として観察された。
【０１９７】
食事管理をした両群における肝銅濃度は経時的に有意の差があった（８ヵ月：第１群ｐ＜０．００１、第２群ｐ＝０．００１、および１６ヵ月：第１群ｐ＝０．０３、第２群ｐ＝０．０４）。しかしながら、治療前（ｐ＝０．６５）、１度目の再チェック（ｐ＝０．５２）、および２度目の再チェック（ｐ＝０．７９）で、群間に肝銅濃度の差はなく、さらなる亜鉛補給の肝臓の銅蓄積に対する利益はないことを示唆した。
【０１９８】
この試験の結果は、食事管理は、ラブラドールにおいて肝銅濃度を減少させることに有効であり得ることを示す。亜鉛を用いる補助的治療は脱銅効果を増幅しなかった。
【０１９９】
ここで、試験をより詳細に説明する。
【０２００】
材料および方法
ラブラドールレトリーバー
試験集団は、以前にＣＡＣＨと記述されたイヌの家族構成員であった２４頭の純粋種のラブラドールレトリーバーからなる。全てのイヌは、オランダのラブラドールレトリーバーの血統クラブで登録された。
【０２０１】
全てのイヌは、この試験の開始前にペニシラミンによるそれらの治療を完了していた。既往歴を全てのイヌから得て、身体検査を実施した。クエン酸Ｎａ添加血液試料を、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）およびフィブリノーゲンを含む凝血プロファイルの分析のために採取した。ヘパリン−およびＥＤＴＡ−血液を肝胆道酵素、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、胆汁酸（ＢＡ）の分析、ならびに血小板数、および血漿亜鉛濃度の測定のためにサンプリングした。肝生検材料はＲｏｔｈｕｉｚｅｎ（Ｒｏｔｈｕｉｚｅｎ  Ｊ，Ｉ．Ｔ．（１９９８）  Ｔｉｊｄｓｃｈｒ  Ｄｉｅｒｇｅｎｅｅｓｋｄ  １２３：２４６〜２５２）により与えられたＭｅｎｇｈｉｎｉ技法にしたがって採取した。少なくとも３個の肝生検材料を各イヌから採取した。２個の生検材料は１０パーセントの中性緩衝ホルマリンで固定し、１個の生検材料は銅を含まない容器中に銅定量のために貯蔵した。
【０２０２】
全ての生検材料は組織学的に評価した。肝組織は、銅の分布および半定量評価のために、以前に記載されたようにして（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｉｎｇｈ  Ｔ．Ｓ．Ｇ．Ａ．Ｍ．Ｒ．Ｊ．、Ｃｕｐｅｒｙ  Ｒ．（１９８８）  Ｖｅｔ  Ｑ１０：８４〜８９）、ルベアン酸染色で染色した。適用された等級づけシステムにしたがって、２を超える銅スコアは異常である（０：銅なし、１：若干の銅陽性顆粒を含む孤立性肝細胞および／または細網組織球系（ＲＨＳ）細胞、２：少量から中程度の量の銅陽性顆粒を含む肝細胞および／またはＲＨＳ細胞の小群、３：中程度の量の銅陽性顆粒を含む肝細胞および／またはＲＨＳ細胞の比較的大きい群または領域、４：多くの銅陽性顆粒を含む肝細胞および／またはＲＨＳ細胞の大きい領域、５：多くの銅陽性顆粒を含む肝細胞および／またはＲＨＳ細胞の散在性存在）。
【０２０３】
肝臓組織中の銅の定量的アッセイは、中性子活性化分析により、Ｔｅｓｋｅらにより記載されたプロトコルにしたがって、Ｂｏｄｅにより記載された施設を使用して（Ｂｏｄｅ，Ｐ．（１９９０）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｃｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８  １３９；Ｔｅｓｋら（１９９２）  Ｖｅｔ  Ｒｅｃ  １３１：３０〜３２）実施した。定量的銅濃度は、凍結乾燥された肝生検材料で測定してｍｇ／ｋｇ（乾燥肝臓重量）で報告した。
【０２０４】
銅含有率とは別に、さらに組織学的な変化を、統計的検定を可能にするために０と５の間の尺度で等級づけした（０＝炎症の組織学的徴候なし、１＝反応性肝炎、２＝軽症の慢性肝炎、３＝中程度の慢性肝炎、４＝重症の慢性肝炎、５＝肝硬変）。
【０２０５】
試験はＵｔｒｅｃｈｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。飼い主のインフォームドコンセントを全てのイヌについて得た。
【０２０６】
無治療における肝臓の銅蓄積の進行
１１頭のイヌで、何らかの治療に先立って、肝銅濃度の測定を、平均８．７ヵ月（範囲６〜１５ヵ月）をおいて繰り返した。この期間中、全ての動物は、食物由来の１２〜２５ｍｇ／ｋｇ（乾物）の間の銅濃度および８０〜２７０ｍｇ／ｋｇ（乾物）の間の亜鉛濃度を含有する、それらの通常の維持食餌を製造業者により給餌された。
【０２０７】
食餌
全てのイヌの飼い主は、同じ特製の食餌を提供された。給餌された食餌の近似分析：水分５７．９％、粗タンパク質６．１％、粗脂肪５．９％、ミネラル１．７％。給餌された代謝性エネルギー（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｅｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｏｆｆｉｃｉａｌｓのプロトコルに従って測定した）：１６５０ｋｃａｌ／ｋｇ）。食餌は、銅を４．７５ｍｇ／ｋｇ（乾物）の濃度で、および亜鉛を１０２ｍｇ／ｋｇ（乾物）の濃度で含有した。イヌは、さらなる栄養補助食品およびご馳走はなしに食餌を給餌された。この試験のラブラドールは、４２０ｇ食餌／日と８４０ｇ食餌／日との間を与えられた。
【０２０８】
薬物動態試験
２頭の縁続きでない９歳の健康なラブラドールレトリーバー（１頭は雌および１頭は雄）を薬物動態試験で使用した。食物は、亜鉛の経口投与前の１２時間の間、および検査期間初期の６時間の間許さなかった。水は自由に利用できた。経口グルコン酸亜鉛は、第１のイヌには１０ｍｇ／ｋｇの用量で、および第２のイヌには５ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。ヘパリン化血液試料（４ｍｌ）を頚静脈から服用前（０時間）および薬剤適用後１５、３０、４５、６０、９０、１２０分、および４、８、１２および２４時間に捕集した。血漿は、原子吸収分光法を使用する亜鉛の分析まで−２０℃で貯蔵した。
【０２０９】
薬剤調製、無作為化、および盲検化
グルコン酸亜鉛の選択は、該薬剤が、酢酸塩または硫酸塩のような他の塩より副作用が少ないという臨床的観察に基づいてなされた。錠剤が、ユトレヒト大学獣医学部の獣医学薬剤部により提供された。亜鉛錠剤は２５ｍｇの元素亜鉛をグルコン酸亜鉛塩として（Ｔｏｐｐｈａｒｍ  Ｚｉｎｋ  ２５  ｇｌｕｃｏｎａａｔ、Ｐａｒｍａｌｕｘ  ＢＶ、Ｕｉｔｇｅｅｓｔ、ＮＬ）含有した。プラセボ錠剤は、１６０ｍｇのラクトース（Ａｌｂｏｃｈｉｎ、Ｐｈａｒｍａｃｈｅｍｉｅ  ＢＶ、Ｈａａｒｌｅｍ、ＮＬ）を含有した。両群の錠剤の外見は同一であった。
【０２１０】
薬剤師は、コインを弾くことによりプロスペクティブに（ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）に６頭のイヌの組の群割り付けを無作為化した。３頭のイヌは、プラセボを与えられ、および３頭のイヌは亜鉛で治療された。臨床医の処方に当たって、錠剤（プラセボまたは亜鉛）は無作為化表にしたがって分配された。
【０２１１】
処方の用量は以下のスキームによった：
【０２１２】
【表９】
2012504410.tif 000026
【０２１３】
飼い主は、給餌の３０分前に、彼らの少量の食餌と混合された錠剤を与えるように指示された。飼い主も臨床医も、どの治療が各イヌに与えられるかについて知らされなかった。無作為化表は試行の間薬剤部が保持し続けて、試行が完了したときにのみ明かされた。
【０２１４】
統計分析
薬物動態学的パラメーター（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  ４．０．１．（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、８００  Ｗｅｓｔ  Ｅｌ  Ｃａｍｉｎｏ  Ｒｅａｌ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）および統計分析（ｗｉｎｄｏｗｓ用のＳＰＳＳ１１．０、２００１、ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、ＵＳＡ）は市販のソフトウェアパッケージの使用により計算した。小さい群サイズのため、ノンパラメトリック統計検定を群間の比較のために使用した。食餌およびグルコン酸亜鉛（第１群）を用いる治療の前および後の２回の対照検査時（１度目の再チェックおよび２度目の再チェック）、ならびに食餌およびプラセボ（第２群）を用いる治療後の両検査時の肝銅濃度の間の差を検出するために、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用した。それに加えて該検定を、試験前、１度目の再チェック時、および２度目の再チェック時における第１群と第２群との間の差を検出するために使用した（有意性レベルｐ≦０．０５）。
【０２１５】
結果
無治療における肝臓の銅蓄積の進行
１１頭のラブラドール犬で、何らかの治療が与えられる前、イヌがそれらの通常の維持食餌を与えられていた間に、肝銅濃度の測定を繰り返した。１頭を除く全てのイヌで、肝銅濃度は、８．７ヵ月の間隔の期間中に、両方の測定の間で、平均１０００ｍｇ／ｋｇ（乾燥重量）（範囲２９０〜２３７０）から平均１６２６ｍｇ／ｋｇ（乾燥重量）（範囲６３０〜３６１０）にまで上昇した。患者犬の体重（平均：３３．９ｋｇ、範囲２５〜３９．５ｋｇ）に関して、これは、８．７ヵ月の間に体重１ｋｇ当たり銅１８ｍｇの上昇であった。結果を図１に示す。
【０２１６】
薬物動態学的試験
２頭のイヌで１０ｍｇ／ｋｇ（イヌ１）および５ｍｇ／ｋｇ（イヌ２）の元素亜鉛の経口適用後に測定された血漿亜鉛濃度から計算された薬物動態学的パラメーターは：
【０２１７】
イヌ１（１０ｍｇ／ｋｇ）：Ｖ＿Ｆ：分布容積＝２９３７．８７２ｍｌ／ｋｇ体重、Ｋ０１：吸収速度定数＝０．５６７２１２  １／時間、Ｋ１０：脱離速度定数＝０．０５３７２８１／時間、ＡＵＣ：曲線下面積＝６３．３５２７２ｈｒ＊μｇ／ｍｌ、Ｃｌ＿Ｆ：バイオアベイラビリティに関するクレアランス＝１５７．８４６４ｍｌ／ｈｒ／ｋｇ、Ｔｍａｘ：最大濃度時間＝４．５８９８１３時間、Ｃｍａｘ：最大クレアランス＝２．６５９９２４μｇ／ｍｌ）
【０２１８】
イヌ２（５ｍｇ／ｋｇ）：Ｖ＿Ｆ：分布容積＝２５３８．６８９ｍｌ／ｋｇ体重、Ｋ０１：吸収速度定数＝１．１６０６４７１／時間、Ｋ１０：脱離速度定数＝０．０３７８８６  １／時間、ＡＵＣ：曲線下面積＝５１．９８５１３ｈｒ＊μｇ／ｍｌ、Ｃｌ＿Ｆ：バイオアベイラビリティに関するクレアランス＝９６．１８１３５ｍｌ／ｈｒ／ｋｇ、Ｔｍａｘ：最大濃度時間＝３．０４７９７４時間、Ｃｍａｘ：最大クレアランス＝１．７５４７２８μｇ／ｍｌ）。
【０２１９】
亜鉛の計算された半減期は、ｔ１／２＝１５．１時間であった。
【０２２０】
Ｒ＝１／（１−ｅｘｐ（−ｋ１０＊２４）から計算された蓄積速度Ｒは１．５２であった。投与間隔は１２時間であるように選ばれた。両方のイヌのＣＬ＿Ｆの平均から計算された推定用量は１２７．０１３９ｍｌ／ｈｒ／ｋｇであった。
【０２２１】
適当な用量の推定値は、意図された５μｇ／ｍｌという最大亜鉛血漿濃度に基づいた。用量＝Ｃｌ＿Ｆ×意図する血液濃度×投与間隔＝７．６２ｍｇ／ｋｇ／１２時間
【０２２２】
食餌試行および無作為化されたプラセボを対照とする亜鉛適用
食餌試行の開始時に、２０頭のイヌの肝銅濃度は、４００ｍｇ／ｋｇ（乾燥重量）という基準範囲を超えていた（平均：８９４、範囲：７０〜２８１０）。銅の半定量的評価の結果は、０から４．５の範囲であった。１７頭のイヌの肝生検材料の組織学的検査は上昇した肝銅含有率を示し（２を超えた）、それは小葉中心の肝細胞に局在化した。銅に対する染色は５頭のイヌで正常であり、高い正常染色結果が、定量的分析から上昇した肝銅を有する２頭のイヌの生検材料から得られた。７頭のイヌに慢性肝炎が存在した。ＣＨは、肝細胞のアポトーシスおよび壊死、単核性炎症、再生および線維症の変化する程度により特徴づけた。肝炎症の活性は炎症の程度ならびに肝細胞アポトーシスおよび壊死の程度により決定した。疾患のステージは線維症の程度およびパターンならびに肝硬変の存在により決定した。肝炎は４頭の患者犬で軽症、２頭のイヌで中程度であり、１頭のイヌにおいては肝硬変が診断された。１３頭のイヌにおいて、肝臓に存在する炎症の組織学的な徴候はなく、４頭のイヌの生検材料で病理組織検査は反応性変化を示した。
【０２２３】
試験開始時に、第１群におけるイヌの平均年齢は、４．１歳（範囲２．７〜８．３）であった。６頭のイヌは卵巣を除去された雌であり、６頭は雄（２頭は去勢され、４頭は去勢せず）であった。平均体重は３３ｋｇ（範囲２６．２〜３７．５）であった。第１群中のイヌの平均肝銅濃度は、９６１ｍｇ／ｋｇ（乾燥重量）（範囲３４０〜２８１０）であった。組織染色による銅の半定量的評価の平均は２〜３＋（範囲０〜４．５）であった。
【０２２４】
第２群におけるイヌの平均年齢は、４．８歳（範囲３．６〜１１．２）であった。６頭のイヌは雌（４頭は卵巣を除去、２頭は除去せず）であり、および６頭のイヌは雄（２頭は去勢、４頭は去勢せず）であった。平均体重は３２．３ｋｇ（範囲２５〜４１．９）であった。第２群におけるイヌの平均肝銅濃度は８６１ｍｇ／ｋｇ（乾燥重量）（範囲７０〜１６８０）であった。治療前の両群間の肝銅濃度に差はなかった（ｐ＝０．７３）。組織染色による銅の平均の半定量的評価は２〜３＋（範囲０．５〜３）であった。
【０２２５】
第１群の３頭のイヌは試験を完了しなかった。中断の理由は３頭全てのイヌにおいて治療に無関係であった（１名の飼い主は彼のイヌが老いすぎつつあると感じ、１名の飼い主には個人的理由があり、および１頭のイヌは肥満細胞腫瘍を発症した）。２１頭のイヌは、少なくとも１回の対照検査（１度目の再チェック）と共に試験を完了した。１６頭のイヌにおいて、肝生検材料はそれより後の追加時点（２度目の再チェック）で得た。
【０２２６】
嘔吐および食欲不振が、第１群の３頭のイヌにおいて観察された副作用であった。これらのイヌの１頭には一過性の小腸下痢もあった。副作用は錠剤適用後に中程度で起こり、錠剤が食餌と混合されたときに解決した。
【０２２７】
血液検査
胆汁酸の濃度は、平均１４μｍｏｌ／ｌ（範囲：３〜１０１）から、１度目の再チェックで平均７．８μｍｏｌ／ｌ（範囲：１〜３９）に、および２度目の再チェックで７．１μｍｏｌ／ｌ（範囲：０〜２１）に低下した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の平均濃度は、全ての検査で正常範囲内にとどまった。治療前の平均ＡＬＰ濃度は、４１Ｕ／ｌ（範囲：８〜１１１）であり、１度目の再チェックで平均ＡＬＰ＝３７Ｕ／ｌ（範囲１２〜１４３）、２度目の再チェックで平均ＡＬＰ＝３７Ｕ／ｌ（範囲：１９〜１５２）であった。治療前の平均ＡＬＴ濃度は２８Ｕ／ｌ（範囲：１０〜２３４）であり、１度目の再チェックで平均ＡＬＴ＝４７Ｕ／ｌ（範囲：１１〜７８）、２度目の再チェックで平均ＡＬＴ＝５１Ｕ／ｌ（２６〜６８）であった。
【０２２８】
試験開始時に、平均の血漿亜鉛濃度は、第１群および第２群においてそれぞれ９５μｇ／ｄｌおよび９６μｇ／ｄｌであった。１度目の再チェックおよび２度目の再チェックで、いずれの群の血漿亜鉛濃度にも差はなかった（ｐ値は０．１１と０．７９との間）。３回の検査のいずれにおいても第１群と第２群との間で血漿亜鉛濃度に差は見出されなかった（ｐ値は０．３４と０．５との間）。血漿亜鉛濃度における差を見出し得た唯一の時点は、第１群における亜鉛を用いる治療の最初の１ヵ月後の血液検査であった。血液サンプリングは亜鉛適用の２〜６時間に実施された。この対照検査で平均血漿亜鉛濃度は１６５μｇ／ｄｌ（範囲１１７〜２４９、ｐ＝０．０２）に上昇していた。
【０２２９】
肝銅測定
肝銅の定量的測定は両群において治療中に改善された。１度目の再チェック、および２度目の再チェックで、肝銅濃度は、両群のイヌにおいて開始時点に比較して有意に低下していた（第１群の１度目の再チェック：平均２８６ｍｇ／ｋｇ、範囲８４〜７００、ｐ＜０．００１；第１群の２度目の再チェック：平均４２１ｍｇ／ｋｇ、範囲２２０〜７９０、ｐ＝０．０３、第２群の１度目の再チェック：平均２７７ｍｇ／ｋｇ、範囲８０〜４５０、ｐ＝０．００１、第２群の２度目の再チェック：平均４０１ｍｇ／ｋｇ、範囲１１８〜８５０、ｐ＝０．０４）。１度目の再チェックで両群における肝銅濃度に差はなく（ｐ＝０．５２）、２度目の再チェックでも群間の差はなかった（ｐ＝０．７９）。それに加えて、１度目の再チェックと２度目の再チェックとの間で肝銅濃度のさらなる低下はなかった（第１群ｐ＝０．４４、第２群ｐ＝０．２５）。結果は図２に示す。
【０２３０】
組織検査
銅についての組織染色は治療で改善された。銅の半定量的評価の組織検査スコアは、第１群および第２群において１度目の再チェックおよび２度目の再チェックで開始時点に比較して減少した（第１群  １度目の再チェックで：ｐ＝０．０３１、第１群  ２度目の再チェックで：ｐ＝０．０１、第２群  １度目の再チェックで：ｐ＝０．０１、第２群  ２度目の再チェックで：ｐ＝０．００１）。どの時点においても両群間に差はなかった（ｐ＝０．１６〜０．７５）。
【０２３１】
肝臓の炎症の重症度に対する組織検査スコアは、両群のイヌの全ての検査を通じて不変のままであった（ｐ＝０．２５〜０．４５）。
【０２３２】
結論
ＣＡＣＨを有する患者犬に肝銅濃度のよりバランスのとれた長期の制御を提供するために、この試験の目的は、食事管理がペニシラミンを用いる治療後のラブラドールにおける肝銅濃度に影響するのに有効かどうか、および亜鉛を用いる追加治療が有用かどうかを調べることであった。この試験の結果は、食事管理は肝銅濃度を低下させるのに有効であり得ることを示す。亜鉛を用いる補助的治療は脱銅効果を増幅しなかった。
【実施例５】
【０２３３】
肝銅濃度に対する亜鉛の効果の検討中に、肝銅濃度を１８頭の純粋種のラブラドールレトリーバーで測定した。イヌの半分は亜鉛のサプリメントを与えられ、他の半分はプラセボを与えられた。全てのイヌは実施例２の食餌を給餌された。肝銅濃度は、実施例２の方法を使用して３つの時点で測定した：（１）ペニシラミンによる治療前、（２）ペニシラミンによる治療後であるが実施例２の食餌による治療前、および（３）食餌治療後。実施例２におけるように、亜鉛で治療されたイヌとプラセボで治療されたイヌの銅レベルの間に有意の差はなかった（データ掲載せず）。しかしながら、食餌の使用は銅レベルに対して有意の効果を有した。亜鉛で治療されたイヌとプラセボで治療されたイヌの組み合わされた結果は、図３に示され、低銅食餌は、肝臓の銅レベルを低下させることに対してペニシラミン単独よりも大きい有意の効果を有することを示す。
【実施例６】
【０２３４】
本発明の食材の例を下で述べる：
【０２３５】
【表１０】
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【０２３６】
この食材中のミネラルおよび微量元素の量の典型的分析を、使用された方法と一緒にして下に示す：
【０２３７】
【表１１】
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【実施例７】
【０２３８】
本発明の食材のさらなる例は以下の通りである：
【０２３９】
【表１２】
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【０２４０】
この食材中のミネラルおよび微量元素の量の典型的分析を、使用された方法と一緒にして下に示す：
【０２４１】
【表１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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