(57)【要約】  異なる発生ステージでの赤血球細胞及び赤血球細胞前駆細胞の分離、同定、及び定量のための方法が、本明細書において開示される。赤血球細胞及び赤血球細胞前駆細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖及び分化をモニターする方法もまた開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）赤血球細胞（ＲＢＣｓ）又はＲＢＣ前駆細胞の複数の成熟ステージを含むサンプルを得る工程と、
（ｂ）細胞表面マーカーＣＤ４４を発現する細胞を分離する工程と、
を含む、異なる発生ステージでのＲＢＣｓ又はＲＢＣ前駆細胞を分離する方法。
【請求項２】
ＲＢＣｓ又はＲＢＣ前駆細胞のサイズを決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＢＣｓ又はＲＢＣ前駆細胞の分化ステージは、ＣＤ４４発現及び細胞サイズにより決定される、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記発生ステージにおいてＲＢＣｓ又はＲＢＣ前駆細胞の数を定量する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＲＢＣｓの障害におけるＲＢＣ成熟ステージを同定する方法。
【請求項６】
ＲＢＣｓの障害は、サラセミア、ＲＢＣ成熟の障害、及び骨髄不全症候群からなる群より選択される、
ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＲＢＣ成熟の障害は、骨髄異形成症候群である、
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
サラセミアは、クーリー貧血症である、
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＢＣｓの障害の前記ＲＢＣ成熟ステージにおいてＲＢＣｓ又はＲＢＣ前駆細胞の数を定量する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の工程を含む、幹細胞の、造血前駆細胞及び成熟赤血球細胞へのｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖及び分化をモニターする方法。
【請求項１２】
前記造血前駆細胞は、赤血球細胞前駆細胞である、
ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＲＢＣ成熟又は分化ステージにおいて造血前駆細胞、ＲＢＣ前駆細胞又は成熟ＲＢＣｓの数を定量する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記幹細胞は、末梢血、骨髄、臍帯血、及び胎盤からなる群より選択されるソース由来である、
ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
幹細胞は、胎児幹細胞である、
ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤血球細胞前駆細胞の同定及び分離、並びにこれらの方法及び組成の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
前赤芽球から成熟した機能的な赤血球細胞（ＲＢＣ）への、赤血球の成熟の試験は、形態学的及び細胞の変化の試験に大きく限定されてきた。成熟プロセスに関するこの理解不足は、サラセミア（クーリー貧血）、ＲＢＣ成熟に影響を及ぼす疾患（骨髄異形成症候群〔ＭＤＳ〕）、マラリア貧血、及び骨髄不全症候群といった、先天的及び後天的なＲＢＣ疾患を理解する努力を台無しにしてきた。フローサイトメトリーの使用は、ＲＢＣ成熟の６つのステージの各々を特定するより良い一助となってきたが、標準的技術を用いた場合、ステージ間の明確な分化のさらなるオーバーラップ及び欠落が存在する。
【０００３】
赤血球産生は、多能性造血幹細胞が、成熟した無核の赤血球を産生するように終末期の赤血球分化をその後に経験する、増殖性赤血球前駆細胞を産生するプロセスである。２つの区別し得る赤血球前駆細胞は、コロニーアッセイにおいて機能的に特定されきており、すなわち、早期ステージではバースト形成ユニット赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）前駆細胞、及び後期ステージではコロニー形成ユニット赤血球（ＣＦＵ−Ｅ）前駆細胞である。造血組織における最も早くに形態学的に認識可能な赤芽球は、前赤芽球であり、それは、網赤血球を作るように３から４の有糸分裂を経験する。赤芽球の形態学的に区別し得る集団は、各々の連続する有糸分裂により作られ、それは赤芽球から始まり、その後、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、及び正染性赤芽球へと続く。最後に、正染性赤芽球は、網赤血球を産生するように、核を排出する。網赤血球は、最初は骨髄において、その後循環において、さらに成熟赤血球細胞へと成熟する。この規則性分化プロセスには、細胞サイズの減少、亢進されたクロマチン凝縮、漸増的なヘモグロビン産生（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｉｚａｔｉｏｎ）、及び膜組織における顕著な変化を伴う。
【０００４】
最近１０年の間、タンパク質組成の特性及び成熟赤血球細胞膜の組織構造の詳細は、その機能への洞察を導いてきた。良く研究されている膜貫通タンパク質は、バンド３、ＧＰＡ、ＧＰＣ、ＲｈＡＧ、Ｒｈ、ＣＤ４７、Ｄｕｆｆｙ、ＸＫ、Ｋｅｌｌ、ＣＤ４４、Ｌｕ及びＬＷを含み、それらすべては血液型抗原を有する。α−及びβ−スペクトリン、短アクチンフィラメント、アンキリン、タンパク質４．１Ｒ、アデュシン、デマチン、トロポミオシン、トロポモジュリン、タンパク質４．２並びにｐ５５からなる、二次元のスペクトリンベースの骨格ネットワークは、膜の弾性及び安定性を調節することが示されてきた。これらのタンパク質のいくつかにおける変異は、機械的完全性の欠陥及び溶血性貧血をもたらす。骨格ネットワークは、２つの主要なリンケージを介して脂質二重層に結合される。第一はアンキリンを介しており、それ自体でバンド３、グリコフォリンＡ、ＲｈＡＧ、ＣＤ４７、及びＩＣＡＭ−４の複合体の一部を形成する。一方、第二は、Ｄｕｆｆｙ、ＸＫ、及びＲｈタンパク質に関与するタンパク質４．１Ｒ、グリコフォリンＣ、及びタンパク質５５を含む。アンキリン又はバンド３の変異に起因する、アンキリン依存的リンケージの欠損は、二重層と骨格ネットワークとの間の結合の欠陥をもたらし、小水疱形成による膜欠損を引き起こす。表面領域におけるこの減退は、赤血球細胞の寿命を短くし、結果として貧血を引き起こす。ＣＤ４４及びＬｕを含む、いくつかの付加的な膜貫通タンパク質の特性が、それらの膜における組織構造は完全には特定されてはいないが、明らかにされてきた。
【０００５】
いくつかの膜貫通タンパク質は、多様な機能を示す。バンド３は、陰イオン交換体として機能し；Ｒｈ／ＲｈＡＧはおそらくガス輸送体であり；Ｄｕｆｆｙはケモカイン受容体として機能する。Ｌｕ、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ−４並びにインテグリンα４β１及びα５β１を含む、他のグループの膜貫通タンパク質は、細胞−細胞間及び細胞−細胞外マトリクックス間相互作用を介在する。ＣＤ４７は、抑制性受容体ＳＩＰＲαと結合する、外側表面における“自己”のマーカーとしての機能により、循環からの時期尚早の除去を防ぐ。Ｋｅｌｌは、酵素活性を変換するエンドセリン−３を保有する。
【０００６】
成熟赤血球細胞の膜の構造及び機能の我々の広い知見とは対照的に、早期ステージにおける赤芽球膜タンパク質組成及び機構の我々の知識は、希薄である。過去の試験は、赤血球分化の間の膜タンパク質、具体的にはα−及びβ−スペクトリン、アンキリン、及びバンド３の非同期性産生及び集合に対するエビデンスを与えてきた。いくつかの試験は、終末期の赤血球分化の間、α４β１インテグリン、α５β１インテグリン、及びＬｕといった、接着分子の発現レベルの減少を明らかにした。最後に、分化のすべてのステージで赤芽球において高いレベルで発現される、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）は、成熟赤血球細胞においては存在しない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の試験は、ウェスタンブロットによりフレンド白血病ウイルス誘発貧血（ＦＶＡ）を示す細胞由来の赤芽球の種々のステージにおける赤血球細胞の膜タンパク質の発現、及びフローサイトメトリーにより膜貫通タンパク質の表面発現を評価した。種々のタンパク質の区別し得る変化が、赤血球産生の間観察された。
【０００８】
赤血球細胞の膜は、赤血球産生の間劇的なリモデリングを経験する。しかしながら、このプロセスの間の分子変化は、多くは知られていないままである。赤芽球の種々の発生ステージにおける２４のタンパク質は、フレンド白血病ウイルス（ＦＶＡ）誘発貧血の脾臓から得られた。赤血球産生の間減少するアクチンを除いて、すべての細胞骨格タンパク質は増加した。主要な赤血球細胞の膜貫通タンパク質であるバンド３、ＧＰＡ、ＧＰＣ、Ｒｈ、ＲｈＡＧ、ＣＤ４７、及びＤｕｆｆｙは、前赤芽球のおいてのみ弱く発現されたが、分化において顕著に増加した。対照的に、ＣＤ４４、β１インテグリン、Ｌｕ、及びＬＷといった接着分子は、前赤芽球において高く発現されたが、後期のステージの赤芽球においては無くなり又は顕著に減少した。注目すべきことに、ＣＤ４４の表面発現の減少は、進行的な態様であり、赤芽球のサイズ変化に同期した。ＴＥＲ１１９と結合したＣＤ４４を用いたフローサイトメトリー及び前方散乱による骨髄細胞の分析は、選別された細胞の特性により確認されたように、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球、網赤血球、及び成熟赤血球細胞に対応する、６つの区別し得る集団を明らかにした。さらに、サイズ変化に伴うＣＤ４４発現レベルに基づく骨髄細胞の選別は、異なる赤芽球のほぼ純粋な集団を生み出す。したがって、成熟赤血球細胞の機能に重要であるタンパク質のレベルの増加、及び望まれない又は成熟赤血球細胞の機能に害をも及ぼすタンパク質のレベルの減少を伴う膜タンパク質の規則性集合が開示される。さらに、ＴＥＲ１１９と結合したＣＤ４４及び前方散乱の使用は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける赤血球産生を検証するための信頼性の高い方法の開発を可能にした。
【０００９】
本明細書において、ヒトを含む哺乳動物由来の異なる発生ステージでの赤血球細胞の分離、同定、及び定量のための方法が開示される。
【００１０】
一実施態様において、異なる発生ステージでの赤血球細胞（ＲＢＣｓ）又はＲＢＣ前駆細胞の分離のための方法が本明細書に開示され、該方法は、（ａ）ＲＢＣｓ又はＲＢＣ前駆細胞の複数の成熟ステージを含むサンプルを得る工程；及び（ｂ）細胞表面マーカーＣＤ４４を発現する細胞を分離する工程を含む。他の実施態様において、該方法はさらに、ＲＢＣｓ又はＲＢＣ前駆細胞のサイズを決定することを含む。
【００１１】
他の実施態様において、ＲＢＣ又はＲＢＣ前駆細胞の分化ステージは、ＣＤ４４発現及び細胞サイズにより決定される。他の実施態様において、該方法はさらに、前記発生ステージにおけるＲＢＣｓ又はＲＢＣ前駆細胞の数を定量する工程を含む。
【００１２】
一実施態様において、ＲＢＣｓの障害におけるＲＢＣ成熟ステージを同定するための方法が本明細書に開示され、該方法は、（ａ）ＲＢＣｓ又はＲＢＣ前駆細胞の複数の成熟ステージを含むサンプルを得る工程；及び（ｂ）細胞表面マーカーＣＤ４４を発現する細胞を分離する工程を含む。他の実施態様において、ＲＢＣｓの障害は、サラセミア、ＲＢＣ成熟の障害、及び骨髄不全症候群からなる群より選択される。他の実施態様において、ＲＢＣ成熟の障害は、骨髄異形成である。さらなる他の実施態様において、サラセミアは、クーリー貧血である。他の実施態様において、該方法はさらに、ＲＢＣｓの前記障害における前記ＲＢＣ成熟ステージでのＲＢＣｓ又はＲＢＣ前駆細胞の数を定量する工程を含む。
【００１３】
一実施態様において、造血前駆細胞及び成熟赤血球細胞への幹細胞の増殖及び分化をｅｘ  ｖｉｖｏでモニターする方法が本明細書に開示され、該方法は、（ａ）ＲＢＣｓ又はＲＢＣ前駆細胞の複数の成熟ステージを含むサンプルを得る工程；及び（ｂ）細胞表面マーカーＣＤ４４を発現する細胞を分離する工程を含む。他の実施態様において、造血前駆細胞は、赤血球細胞前駆細胞である。他の実施態様において、該方法はさらに、ＲＢＣ成熟又は分化ステージにおける造血前駆細胞、ＲＢＣ前駆細胞、又は成熟ＲＢＣｓの数を定量する工程を含む。
【００１４】
他の実施態様において、前記幹細胞は、末梢血、骨髄、臍帯血、及び胎盤からなる群より選択されるソース由来である。さらなる他の実施態様において、前記幹細胞は、胎児幹細胞である。
【００１５】
以下の図は、本明細書の一部を形成し、本明細書に開示される実施例のある側面をさらに説明するために含まれる。本開示は、本明細書に記載の特定の実施態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図の１又は２以上を参照することによってより良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるフレンド白血病ウイルス誘発貧血（ＦＶＡ）細胞の分化を示す図である。ＦＶＡ細胞は、示されるように異なる時間ポイントで収集され、染色された。
【図２Ａ】赤芽球の種々のステージにおける膜タンパク質の免疫ブロットを示す図である。膜貫通タンパク質：トータル膜タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥのブロットは、示されるタンパク質に対して抗体で調べられた。
【図２Ｂ】赤芽球の種々のステージにおける膜タンパク質の免疫ブロットを示す図である。Ｎ−グルコシダーゼ処理後のＫｅｌｌ及びβ１インテグリン：０時間又は４４時間のＦＶＡ細胞は、Ｎ−グルコシダーゼ処理されず（−）又はＮ−グルコシダーゼ処理（＋）され、抗Ｋｅｌｌ抗体又は抗β１インテグリン抗体で調べられた。
【図２Ｃ】赤芽球の種々のステージにおける膜タンパク質の免疫ブロットを示す図である。細胞骨格タンパク質：トータル膜タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥのブロットが、示されるタンパク質に対する抗体で調べられた。
【図３】ＦＶＡ細胞の異なるステージの膜貫通タンパク質のフローサイトメトリー分析を示す図である。異なるステージのＦＶＡ細胞を、示される通りの分子に対する抗体で染色した。縦座標は、横座標により与えられる蛍光強度を示す細胞の数を表す。
【図４Ａ】骨髄細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。ＴＥＲ１１９及びＣＤ４４に対する抗体でラベルされた骨髄細胞である。ＴＥＲ１１９に対するＣＤ４４のプロットである。
【図４Ｂ】骨髄細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。ＴＥＲ１１９及びＣＤ４４に対する抗体でラベルされた骨髄細胞である。ＦＳＣのすべてのＴＥＲ陽性細胞に対するＣＤ４４のプロットである。
【図４Ｃ】骨髄細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。ＴＥＲ１１９及びＣＤ４４に対する抗体でラベルされた骨髄細胞である。ゲートされた細胞集団におけるＣＤ４４発現レベルである。
【図４Ｄ】骨髄細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。ＴＥＲ１１９及びＣＤ７１に対する抗体でラベルされた骨髄細胞である。
【図４Ｅ】骨髄細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。ＴＥＲ１１９及びＣＤ７１に対する抗体でラベルされた骨髄細胞である。
【図４Ｆ】骨髄細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。ＴＥＲ１１９及びＣＤ７１に対する抗体でラベルされた骨髄細胞である。
【図５Ａ】マーカーとしてＣＤ４４、ＴＥＲ１１９、及びＦＳＣを用いた選別による、異なるステージの赤芽球の分離を示す図である。図４Ａ及び４Ｂで示されたように、区別し得る領域から選別された細胞のサイトスピン調製物を示す図である。
【図５Ｂ】マーカーとしてＣＤ４４、ＴＥＲ１１９、及びＦＳＣを用いた選別による、異なるステージの赤芽球の分離を示す図である。ＣＤ４４を用いて選別された種々の集団における成熟の異なるステージでの赤芽球の純度の定量を示す図である。
【図６Ａ】二重染色された骨髄細胞におけるＣＤ４４発現の比較を示す図である。ＦＳＣのすべてのＴＥＲ陽性細胞に対するＣＤ４４のプロットを示す図である。
【図６Ｂ】二重染色された骨髄細胞におけるＣＤ４４発現の比較を示す図である。ゲートされた細胞集団におけるＣＤ４４発現レベルを示す図である。
【図６Ｃ】二重染色された骨髄細胞におけるＣＤ７１発現の比較を示す図である。同様にゲートされた細胞集団におけるＣＤ７１発現レベルを示す図である。
【図６Ｄ】二重染色された骨髄細胞におけるＣＤ４４及びＣＤ７１発現の比較を示す図である。すべてのＴＥＲ陽性細胞のＣＤ７１に対するＣＤ４４のプロットを示す図である。
【図７Ａ】マーカーとしてＣＤ７１、ＴＥＲ１１９、及びＦＳＣを用いた選別による異なるステージの赤芽球の分離を示す図である。図４Ａ及び４Ｂで示されるように、区別し得る領域から選別された細胞のサイトスピン調製物を示す図である。
【図７Ｂ】マーカーとしてＣＤ７１、ＴＥＲ１１９、及びＦＳＣを用いた選別による異なるステージの赤芽球の分離を示す図である。ＣＤ７１を用いて選別された種々の集団における成熟の異なるステージでの赤芽球の純度の定量を示す図である。
【図８Ａ】フローサイトメトリーに対するゲーティングの進展を示す図である。すべてのイベントを示す図である。
【図８Ｂ】フローサイトメトリーに対するゲーティングの進展を示す図である。Ｐ１としてゲートされた生存細胞（７ＡＡＤ−細胞）を示す図である。
【図８Ｃ】フローサイトメトリーに対するゲーティングの進展を示す図である。ＣＤ４５−ＣＤ１１ｂ−Ｇｒ１−（Ｐ２）である、図８Ｂの生存細胞内の細胞集団を示す図である。
【図８Ｄ】フローサイトメトリーに対するゲーティングの進展を示す図である。Ｐ２細胞（Ｐ３）におけるＴＥＲ１１９の発現を示す図である。
【図８Ｅ】フローサイトメトリーに対するゲーティングの進展を示す図である。Ｐ３由来のＴＥＲ１１９＋細胞に対するＣＤ４４＋のプロットを示す図である。
【図８Ｆ】フローサイトメトリーに対するゲーティングの進展を示す図である。Ｐ３由来のＦＳＣ細胞に対するＣＤ４４＋のプロットを示す図である。
【図８Ｇ】フローサイトメトリーに対するゲーティングの進展を示す図である。ＣＤ４４及びＴＥＲ１１９発現に基づきゲートされたフラクションＩ細胞を示す図である。
【図８Ｈ】フローサイトメトリーに対するゲーティングの進展を示す図である。図８Ｆにおいて示されたクラスターに基づきゲートされたフラクションＩＩ−ＩＶを示す図である。
【図８Ｉ】フローサイトメトリーに対するゲーティングの進展を示す図である。骨髄細胞から選別された、区別し得るステージの赤芽球を示す図である。
【図９Ａ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒトの赤血球産生の間のＣＤ４４、ＧＬＵＴ１、及びＣＤ７１の免疫ブロット分析を示す図である。
【図９Ｂ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒトの赤血球産生の間のＣＤ４４、ＧＬＵＴ１、及びＣＤ７１のフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図９Ｃ】７日目から１１日目のＣＤ４４及びＧＬＵＴ１の定量的分析を示す図である。
【図９Ｄ】ＣＤ４４及びＧＬＵＴ１の発現レベルに基づき選別された赤芽球を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
赤血球産生は、有核赤血球前駆細胞が、特有の円盤形状及び膜マテリアル特性を有する多数の無核赤血球細胞を産生するように、増殖し分化するプロセスである。マウスの赤血球産生の間個々の膜タンパク質成分の様相の経時変化は、赤血球細胞膜の独特な特性の展開の理解に新しい光を投じる。成熟赤血球細胞の全ての主要な膜貫通タンパク質及び骨格タンパク質（アクチンのみを除く）の集積は、終末期の赤血球分化の間漸増的に増加する。同時に、及び対照的に、種々の接着分子の集積は減少する。具体的には、接着分子であるＣＤ４４は、前赤芽球から網赤血球へ、進行的かつ劇的な減少を示す；これは、一連の発生ステージでの赤芽球間を明確に区別するためのシステムの開発を可能とした。これらの発見は、赤芽球分化の間の赤血球細胞膜の機能の発生に新たな見識を提供し、また、先天的及び後天的な赤血球細胞障害における並びに骨髄不全症候群における、赤血球成熟でのステージ特異的な異常を特定する手段を提供する。
【００１８】
終末期の赤血球分化の間、前赤芽球（造血組織において最も早期に形態学的に認識可能な有核赤血球細胞）は、ヒトにおいて、毎秒２００万の無核網赤血球を産生するように、３から４の有糸分裂を経験する。はじめは骨髄において、その後は血液循環における、網赤血球の広範なリモデリングは、特有の円盤状形状及び膜マテリアル特性を有する成熟循環赤血球細胞の産生をもたらす。本試験において、マウスの赤血球産生の間、異なる膜タンパク質成分の蓄積における一時的な変化が試験された。成熟赤血球細胞のすべての主要な膜貫通タンパク質及びすべての骨格タンパク質（アクチンを除く）の蓄積は、前赤芽球ステージから正染性赤芽球ステージへの分化の間、進行的に増大した。対照的に、一連の接着分子の蓄積は、前赤芽球において最も高くなり、正染性赤芽球における非常に低レベルの発現を伴う赤血球分化の間、減少した。従来可能であったものに比して、信頼性及び精度のより高い、赤血球分化における一連のステージの分離を可能にする方法が、本明細書に開示される。
【００１９】
いくつかの早期の試験は、スペクトリン、アンキリン、４．１Ｒ、及びバンド３を含む、限定された数の主要な膜タンパク質をもたらす赤血球産生の間の膜タンパク質の合成及び集合を調査した。ニワトリ赤芽球症ウイルス又はＳ１３ウイルスで形質転換されたニワトリの赤芽球において、バンド３の発現は、末梢タンパク質、スペクトリン、アンキリン、及び４．１Ｒのそれよりも遅く生じる。スペクトリン、アンキリン、４．１Ｒ、及びバンド３の蓄積における同様の結果はまた、マウス及びヒトの赤血球産生においても見出された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養システムにおけるヒト血液型抗原をコードするタンパク質の様相の規則性の試験において、Ｋｅｌｌ抗原は最初に発現するタンパク質であった。
【００２０】
赤血球細胞膜のタンパク質の範囲のステージ特異的な発現パターンを特定する、高く同期的な赤芽球集団のタンパク質発現プロファイルが本明細書に開示される。骨格タンパク質ネットワーク（バンド３、ＲｈＡＧ、アンキリン、及び４．１Ｒ）への脂質二重層の結合に関わるタンパク質の蓄積の後に、膜骨格（α−及びβ−スペクトリン、アデュシン、並びにトロポモジュリン）の成分の蓄積が続く。したがって、完全に機能的なスペクトリンベースのネットワークの集合（膜のマテリアル特性を決定する）は、赤血球産生において遅い頃のイベントである。この背景において、興味深いことに、スペクトリンベースのネットワーク、α−及びβ−スペクトリン、アデュシン、及びトロポモジュリンの成分は、タンパク質の結合よりも早期に合成され、前赤芽球ステージでスタートし、分化の後期ステージで漸増的に増加する。通常のパターンの例外は、アクチンであり（膜骨格の他の主要成分である）、その発現は前赤芽球において最も高く、最終的な赤血球分化が進むと下降する。アクチンは赤芽球において付加的な機能を有するようであり、それはおそらく細胞質においてフィラメント状に運動しており、小さな集団のみが骨格格子の短いプロトフィラメントを形成するために必要とされる。
【００２１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの赤血球産生は、もっぱら赤血球ニッチにおいて生じ、それは“赤芽球島”と称され、それは発生中の赤芽球に取り囲まれたセントラルマクロファージからなる。セントラルマクロファージと赤芽球との間のこの特化した構造における接着性相互作用は、赤芽球と細胞外マトリックスタンパク質との間と同様に、終末期の赤血球分化の調節において重要な役割を果たす。β１インテグリン、ＣＤ４４、Ｌｕ及びＩＣＡＭ−４を含む、赤芽球で発現するいくつかのタンパク質は、種々の接着性相互作用に関与する。β１インテグリンの５つのスプライス変異体（細胞質ドメインの設計された選択的スプライシングより生じる）であるβ１Ａ、β１Ｂ、β１Ｃ−１、β１Ｃ−２、及びβ１Ｄは従来、種々の細胞において同定され、５つの既知のアイソフォームのうち２つが、赤血球分化の間発現している。接着分子が、前赤芽球において最も強く発現しており、正染性赤芽球においては非常に低いレベルで発現しているか又はまったく発現していないという発見は、接着性相互作用が終末期の赤血球分化の間劇的に調節されていることを示唆する。
【００２２】
本明細書に開示される試験は、成熟の異なるステージでの赤芽球間を識別する細胞表面マーカーの同定をもたらした。ＣＤ４４の表面発現は、前赤芽球から正染性赤芽球への経過において段階的な態様で３０倍減少した。主要な骨髄細胞から、成熟のすべてのステージでの赤芽球の高度に精製された集団を細胞選別により得る能力は、マーカーの選択の有効性を立証した。対照的に、この目的のために表面マーカーとして常用されてきたＣＤ７１は、ＣＤ７１の発現が４倍しか変化せず終末期の赤血球分化の間進行的な態様がみられず、有効ではないことが証明された。このＣＤ７１の顕著な減少がみられないことは、生理学的に意味を有する。トランスフェリン結合鉄の取り込みは、ヘモグロビン合成の高いレベルを維持するために赤血球分化のすべてのステージでヘム合成に必要とされるからであり、その発現についてはわずかな変化しか期待できないからである。
【００２３】
本明細書で用いられるように、“実質的に純粋である”という用語は、わずか１０％しか望まない細胞を含まず、９０％純粋であるとされ得る細胞の集団をいう。例えば、正染性赤芽球の実質的に純粋な集団は、本明細書に開示される基準により少なくとも９０％の正染性赤芽球、及び１０％未満の他のタイプの細胞を有するだろう。付加的な実施態様において、本明細書に開示される細胞の実質的に純粋な集団は、８％未満、又は５％未満の望まない細胞を含む。それゆえ、これらの細胞集団は、各々、９２％純粋、又は９５％純粋とされ得る。
【００２４】
赤血球及び赤芽球の成熟のステージを同定するのに有用な方法が本明細書に開示される。本明細書で用いられるように、“赤血球細胞”という用語は、赤血球、赤芽球、及び網赤血球を意味し得る。本発明者らは驚くべきことに、細胞表面マーカーＣＤ４４（任意に細胞サイズの決定と組み合わされる）が赤血球細胞の分化又は成熟のステージを決定するために用いられ得ることを見出した。
【００２５】
一実施態様において、本明細書に開示される方法は、赤血球系統幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖及び分化をモニターするのに適する。他の実施態様において、本明細書に開示される方法は、赤血球系統幹細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖及び分化をモニターするのに適する。
【００２６】
他の実施態様において、本明細書に開示される方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び正常又は疾患の状態での赤血球細胞の分化ステージを決定するのに適する。
【００２７】
本明細書に開示される方法に用いられ得る生物学的サンプルに制限はない。一つの限定されない例において、サンプルは、血液、骨髄、臍帯血、胎盤、又は脾臓由来である。さらにサンプルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞培養物由来であり得る。他の実施態様において、サンプルは、末梢血から成人幹細胞を収集するためにアフェレーシスが行われた血液ドナーから得られ得、及び／又は幹細胞が赤血球に成熟するように誘導される処理方法から得られ得る。
【実施例】
【００２８】
（実施例１）
（赤芽球の分化の間の膜タンパク質の規則的集合）
赤血球産生の間の膜貫通タンパク質の発現
【００２９】
赤芽球の分化は、タンパク質組成及び細胞膜の特性の変化を伴うであろうことが予想される。しかしながら、包括的試験は報告されてこなかった。ＦＶＡシステム（Ｋｏｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２１：５２６−６３，１９８４）を用いて、赤芽球のほぼ均質な集団が、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球ステージで得られ（図１に示される）、ウェスタンブロッティングにより１３の膜貫通タンパク質の発現が試験された。このシステムの培養の４４時間の間、前赤芽球（０ｈｒ）は進行的に、好塩基性赤芽球（１２ｈｒ）、多染性赤芽球（２４ｈｒ）、並びに正染性赤芽球及び網赤血球（４４ｈｒ）に分化した。図２Ａは、ウェスタンブロッティングにより評価されたこれらのタンパク質の相対的濃度を示す。下記の変化が明らかとなった：１）主要な赤血球細胞タンパク質（バンド３、ＧＰＡ、ＧＰＣ、Ｒｈ、ＲｈＡＧ、Ｄｕｆｆｙ及びＣＤ４７）が前赤芽球において低いレベルで発現していたが、後期ステージの赤芽球において顕著に増加した；２）反対に、接着分子（β１インテグリン、ＣＤ４４、Ｌｕ及びＩＣＡＭ−４）は前赤芽球において最も高いレベルで発現していたが、後期ステージの赤芽球において減少した；３）トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）及びＸＫは、前赤芽球から好塩基性赤芽球への進行においてわずかに増加した。
【００３０】
２つの区別し得る免疫反応タンパク質のバンドがＫｅｌｌ及びβ１インテグリンに対して観察され（図２Ａ）、２つのバンドがグリコシル化における差異又は異なるアイソフォームの発現を反映するかについて検討するためにＮ−グルコシダーゼ処理を行った（図２Ｂ）。これは、前赤芽球における（０ｈｒ）Ｋｅｌｌのより低い９４ｋＤａのバンドの泳動を変化させなかった一方で、正染性赤芽球において（４４ｈｒ）発現したより高いバンド（１３０ｋＤａ）は、見掛けサイズにおいて減少した。これは、グリコシル化されていない９４ｋＤａの成分が前赤芽球において発現している一方で、グリコシル化された１３０ｋＤａの成分が赤血球分化の後期ステージにおいて発現していたことを示す。２つのβ１インテグリンのバンドは、前赤芽球において（０ｈｒ）見られ、両方がＮ−グルコシダーゼ処理後にシフトしていた。これは、両方がこのステージで発現し、グリコシル化されることを示す。グリコシル化されたより高い分子量のアイソフォームのみが、正染性赤芽球において（４４ｈｒ）低いレベルで発現した。
【００３１】
赤血球産生の間の細胞骨格タンパク質の発現
【００３２】
赤血球産生の間の膜タンパク質の分子変化を良く理解するために、細胞骨格タンパク質組成もまた、赤芽球の種々のステージにおいて比較された。ウェスタンブロッティングにより評価された、終末期の赤血球分化の間の１０の骨格タンパク質の発現レベルが、図２Ｃに示される。膜貫通タンパク質の発現の３つの異なるパターンとは対照的に、アクチンを除くすべての骨格タンパク質は、単一のパターンの発現を示した。α−スペクトリン、β−スペクトリン、アンキリン、４．１Ｒ、４．２、ｐ５５、トロポモジュリン、デマチン、及びアデュシンの発現は、終末期の分化の間増加し、一方でアクチンのそれは、前赤芽球に比べて後期ステージの赤芽球において減少した。
【００３３】
赤血球産生の間の膜貫通タンパク質の表面暴露
【００３４】
ウェスタンブロッティング分析はトータルタンパク質含量を提供するため、ＣＤ７１、ＧＰＡ、Ｋｅｌｌ、β１インテグリン、及びＣＤ４４を含むいくつかの膜貫通タンパク質の表面発現がフローサイトメトリーによりさらに試験された。図３及び表１に示されるように、ＣＤ７１の表面発現は、前赤芽球から好塩基性及び多染性赤芽球へ、３−４倍増加した。しかしながら、後期ステージの正染性赤芽球では、前赤芽球と同様のレベルの表面ＣＤ７１が発現した。ＧＰＡは、前赤芽球と比較すると、正染性赤芽球において４倍多い、進行的増加を示した。Ｋｅｌｌの表面発現には著しい変化は観察されなかった。β１インテグリンに関しては、ウェスタンブロッティングの結果（前赤芽球から好塩基性赤芽球へと増加を示し、その後、後期ステージにおいて進行的な減少を示した）とは対照的に、β１インテグリンの表面発現は、正染性赤芽球においてのみ顕著に減少した。最も劇的な変化は、ＣＤ４４の表面発現において生じ、前赤芽球から正染性赤芽球へと３０倍以上減少した。二次抗体で染色された細胞同様に、染色されなかった細胞の平均蛍光強度は、１００未満であった。
【表１】
2012531203.tif 000002
【００３５】
骨髄赤芽球における膜貫通タンパク質の免疫蛍光染色
【００３６】
ＧＰＡ、バンド３、ＲｈＡＧ、ＣＤ７１、及びＣＤ４４の発現がその後、免疫蛍光顕微鏡検査法により初期マウス骨髄赤芽球において試験された。赤芽球は、ＧＰＡ及びＤＡＰＩのポジティブ染色により同定された。早期及び後期ステージの赤芽球を、細胞サイズをベースに区別した。大きな細胞は早期ステージの赤芽球を、小さな細胞は後期ステージの赤芽球を表す。図１に示されるように、早期ステージの赤芽球から後期ステージの赤芽球へのＧＰＡ、バンド３、及びＲｈＡＧの細胞表面発現の増加が、容易に明らかとなった。対照的に、ＣＤ４４の表面発現において劇的な減少が見られた。特筆すべきことに、早期ステージの赤芽球と後期ステージの赤芽球との間のＣＤ７１の表面発現の変化はわずかであった。これらの知見は、培養された赤芽球の結果と一致する。
【００３７】
赤芽球サイズとＣＤ４４及びＣＤ７１の発現レベルとの関係
【００３８】
ＴＥＲ１１９と結合したＣＤ７１は、ＣＤ７１が赤血球産生の間顕著に減少するとの仮定に基づき、ｉｎ  ｖｉｖｏでの赤芽球の異なるステージを見分けるために、表面マーカーとして用いられてきた。しかしながら、本発明者らは、ＣＤ７１のトータル及び表面発現は赤血球産生の間顕著に変化しないことを示した。代わりに、ＣＤ４４のトータル同様表面発現は、ステージ間で進行的な減少を示し、前赤芽球から正染性赤芽球へと３０倍以上減少した。これらの知見は、ＣＤ４４は、ＣＤ７１よりも、赤血球分化の異なるステージ間の識別のためのより信頼性の高い表面マーカーであることを示唆する。この観察を確かめるために、骨髄細胞を、ＣＤ４４及び赤血球特異的グリコフォリンＡ抗体、ＴＥＲ１９９の両方で染色した。図４Ａは、ＴＥＲ１１９に対するＣＤ４４のプロットを示す。ＴＥＲ１１９染色強度に基づき、２つの区別し得る集団、ＴＥＲｌｏｗ及びＴＥＲｈｉが見られた。“ｌｏｗ”及び“ｈｉ”の用語は、タンパク質の細胞表面発現に関して用いられる場合、発現の相対レベルを意味する。さらに赤芽球亜集団を区別するために、前方散乱（ＦＳＣ）強度が用いられた。ＦＳＣは細胞サイズの関数であり、赤芽球は成熟とともにサイズが小さくなるからである。図４Ｂは、すべてのＴＥＲ１１９陽性細胞に対するＦＳＣに応じたＣＤ４４の発現レベルを示す。５つの区別し得るクラスターが見られ得る。５つのゲートされた細胞集団におけるＣＤ４４発現レベルの描写（図４Ｃ）は、細胞サイズの減少とともにＣＤ４４の表面発現が次第に減少することを示す。
【００３９】
同時に、骨髄細胞もまたＴＥＲ１１９及びＣＤ７１で染色され、同じ方法でデータを分析した（図４Ｄ−４Ｆ）。ＴＥＲ１１９染色強度に基づき、２つの区別し得る集団、ＴＥＲｌｏｗ及びＴＥＲｈｉが再度見られた（図４Ｄ）。しかしながら、ＣＤ７１発現レベルがすべてのＴＥＲ陽性細胞に対するＦＳＣに応じて分析される場合（図４Ｅ）、ゲートされたクラスターＩからＩＩＩの間ＣＤ７１のヒストグラムプロファイルにおいて著しいオーバーラップが存在した。それはＣＤ７１の同様のレベルを暗示する（図４Ｆ）。
【００４０】
ＣＤ４４又はＣＤ７１を用いた選別による赤芽球集団の解析
【００４１】
異なる赤芽球集団を同定するために、初期骨髄赤血球細胞をＣＤ４４又はＣＤ７１の発現レベル及び細胞サイズに基づき、選別した。図５Ａは、５つのＣＤ４４染色集団の各々からの代表的なイメージを示す。領域Ｉ由来の細胞は、前赤芽球の形態特性、すなわち大きなサイズ、非常に高い核／細胞質比、及び高度に好塩基性の細胞質を有する。領域ＩＩ由来の細胞は、サイズがより小さく、核凝縮が増大しており、好塩基性赤芽球の形態学的特性を有する。領域ＩＩＩ由来の細胞は、多染性赤芽球であり、細胞サイズ及び付加的な核凝縮のさらなる低減を示す。領域ＩＶ集団の初期の選別は、正染性赤芽球及び未成熟網赤血球の混合された集団を示した。したがって領域ＩＶの細胞は、ＣＤ４４の発現レベルに基づき２つの区別し得る集団（ＩＶ−Ａ（より高いＣＤ４４発現、領域ＩＶの上半分）及びＩＶ−Ｂ（より低いＣＤ４４発現、領域ＩＶの下半分）と称される）にゲートされた。図５Ａに示されるように、領域ＩＶ−Ａ由来の細胞は、正染性赤芽球の細胞特性を有し、一方、領域ＩＶ−Ｂ由来の細胞は、無核網赤血球である。最後に、領域Ｖ由来の細胞は、優性的な成熟赤血球細胞であった。種々の選別集団の純度を定量化するために、発生の異なるステージでの赤芽球の割合算出を１０００細胞を検証することにより行った。図５Ｂに示されるように、種々の選別集団は、８５％から９０％の純度で、前赤芽球から網赤血球の範囲で、特定された発生のステージでの細胞を含んでいた。
【００４２】
５つのＣＤ７１染色集団の各々の染色されたサイトスピンにおける赤芽球形態の代表的イメージを図７Ａに示す。ＣＤ４４と同様に、領域Ｉ由来の細胞の９０％以上が前赤芽球である一方で、すべての他の領域において、大きな程度の不均一性が見られた（図７Ｂ）。発生のすべての後期ステージでの赤芽球の純度は、異なるフラクションにおいて４０％から６０％の範囲であった。
【００４３】
ＣＤ７１よりもＣＤ４４が赤血球分化の異なるステージでの赤芽球を区別するためのより効果的な表面マーカーであることをさらに実証するために、ＣＤ４４及びＣＤ７１の発現レベルを同じ細胞で比較し、抗体及びＴＥＲ１１９の両方で初期骨髄細胞を二重染色することで測定した。図６Ａ及び６Ｂで示されるように、二重染色された細胞の５つの区別し得る前方散乱ゲートにおけるゲーティングは、ＣＤ４４発現の５つの区別し得るレベルで赤芽球を同定し、ＣＤ４４のみの染色と一致した。対照的に、同じ５つのゲートされた集団におけるＣＤ７１発現レベルで著しいオーバーラップが存在した（図６Ｃ）。さらに、図６Ｄに示されるように、ＣＤ４４に比していくつかの成熟ステージで広い範囲のＣＤ７１発現レベルが存在し、ＣＤ７１が終末期の赤血球分化の間進行的及び区別し得るように変化しないことを確証した。
【００４４】
マテリアル及び方法
【００４５】
抗体
ウェスタンブロットに対して、ほとんどの抗体は、過去に記載されたように作られ、特徴づけられる（Ｓａｌｏｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：８０２６−３１，２００８）。抗ＴＥＲ１１９、抗β１インテグリン、及び抗ＣＤ４４は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社より得た。抗ＣＤ７１は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より得た。フローサイトメトリー及び選別のために、用いられた抗体は、下記の通りである：ＦＩＴＣ−コンジュゲート抗ＴＥＲ１１９、ＡＰＣ−コンジュゲート抗ＣＤ４４、ＰＥ−コンジュゲート抗ＣＤ７１、ＡＰＣ−Ｃｙ（登録商標）７−コンジュゲートＣＤ１１ｂ、これらすべてはＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社より得た。ＦＩＴＣ−コンジュゲート抗β１−インテグリンはＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社より得、モノクローナル抗Ｋｅｌｌは、内部で作製した。
【００４６】
赤血球培養
前赤血球を、過去に確立された方法を用いて単離及び培養した（Ｋｏｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  ＰＨｙｓｉｏｌ．１２１：５２６−３２，１９８４；Ｂｏｎｄｕｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ６１：７５１−８，１９８３）。端的に言うと、雌ＣＤＦ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社）を、フレンド白血病ウイルスの貧血誘発性型（ＦＶＡ）の１０４個の脾臓フォーカス形成ユニット注入２週間後に屠殺し、脾臓の前赤芽球を単位重量での速度沈降により精製した。前赤芽球を、３０％非働化ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１％脱イオン化ウシ血清アルブミン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、１００ユニット／ｍＬペニシリンＧ（ＡＴＣＣ社）、１００ｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＡＴＣＣ社）、０．１ｍＭ  α−チオグリセロール（Ｓｉｇｍａ社）、及び０．２ユニット／ｍＬヒトリコンビナントエリスロポエチン（ＥＰＯ；Ｒ＆Ｄ社）を含有するイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）において、１×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度で、空気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で、３７℃で培養した。異なるステージの赤芽球を１２時間、２４時間、及び４４時間で収集した。
【００４７】
ウェスタンブロット分析
赤血球細胞の全細胞溶解液を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ社）の存在下で、ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．５％  デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０）で調製した。タンパク質濃度を、ＤＣタンパク質アッセイキット（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて測定した。Ｎ−グルコシダーゼ処理のために、５０μＬの溶解緩衝液中に希釈した４０μｇのトータルタンパク質を、３７℃で１６時間、５ユニットのＮ−グルコシダーゼＦ（ＮｇｌｙＦ、Ｓｉｇｍａ社）存在下又は非存在下で消化した。３０マイクログラムのタンパク質を１０％ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルに載せ、６０Ｖで２時間、ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ社）に移した。膜を５％無脂肪ドライミルク、及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中で１時間ブロッキングし、その後、５％無脂肪ドライミルク及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中に希釈した一次抗体で２時間プローブした。数回洗浄した後、ブロットを、５％無脂肪ドライミルク及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で希釈された、ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂａ社）に結合された二次抗体でインキュベートし、ｔｈｅ  ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてＫｏｄａｋ  ＢｉｏＭａｘ  ＭＲ  ｆｉｌｍ（Ｓｉｇｍａ社）に展開した。
【００４８】
免疫蛍光顕微鏡検査法
骨髄細胞をＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ中で遠心分離により３回洗浄し、Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）でコートされたスライドに１時間、接着させた。細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し；１０分間室温で、１０分間、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で固定し；さらに３分間、ＰＢＳ中の１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理し；その後ＰＢＳでリンスした。非特異的タンパク質結合をブロックするために、１時間、ＰＢＳ中の１０％ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）及び１０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ社）においてインキュベートした後、固定された細胞を室温で１時間、１０ｍｇ／ｍＬ  ＰＢＳ／ＢＳＡ中に希釈された一次抗体で処理した。細胞を穏やかな振盪により６回５分間隔で洗浄し、１０ｍｇ／ｍＬ  ＰＢＳ／ＢＳＡ中の１：７００での二次抗体で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、その後ＤＡＰＩ入りＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いてマウントした。免疫蛍光を、６３×／１．２５油浸対物レンズを有しＣＣＤカメラを備えるＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １３５顕微鏡を用いて画像化した。
【００４９】
培養細胞及び初期骨髄細胞のフローサイトメトリー分析
培養した赤芽球（１×１０６）を、４℃で、２０分間、ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ中のＰＥ−コンジュゲートＣＤ７１、ＡＰＣ−コンジュゲートＣＤ４４、ＦＩＴＣ−コンジュゲートＴＥＲ１１９、ＦＩＴＣ−コンジュゲートβ１インテグリン又は非コンジュゲート抗Ｋｅｌｌで染色した。その後、細胞をＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで２回洗浄した。Ｋｅｌｌに対して、細胞をその後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で、２０分間インキュベートし、細胞をＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで２回洗浄し、これらのタンパク質の表面抗原発現を分析した。骨髄細胞を、マウス（３月齢）の脛骨及び大腿骨から採取した。フローサイトメトリーによる表現型分析のために、２×１０６細胞を８０μＬのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡに再懸濁した。細胞を１５分間、ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（５μｇ／１０６細胞）でブロックした。その後、サンプルを、暗所にて、２０−３０分間、氷上で、ＦＩＴＣラット抗マウスＴＥＲ１１９（１μｇ／１０６細胞）、ＡＰＣラット抗マウスＣＤ４４（１μｇ／１０６細胞）、及びＡＰＣ−Ｃｙ（登録商標）７ラット抗マウスＣＤ１１ｂ（０．３μｇ／１０６細胞）で染色した。細胞を７００μＬのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで２回洗浄した。最後に、細胞を１００μＬのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡに再懸濁させ、暗所にて、１０分間、氷上で、生存マーカー７−ＡＡＤ（０．２５μｇ／１０６細胞）で染色した。細胞をその後、０．４ｍＬのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡに懸濁し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）フローサイトメ−ターにおけるＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ（登録商標）ソフトウェアを用いて、染色後１時間以内に分析した。染色されていない細胞又は二次抗体のみで染色された細胞（Ｋｅｌｌ染色の場合）を、ネガティブコントロールとして用いた。平均蛍光強度（ＦＬＩ）を抗体結合の測定値として用いた。
【００５０】
蛍光活性化細胞選別
細胞選別により成熟の異なるステージでの赤芽球を分離するために、２００×１０６細胞を５０ｍＬチューブにおいて８ｍＬ  ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡに再懸濁させた。細胞を１５分間、ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（５μｇ／１０６細胞）でブロッキングした。その後、サンプルを、ＦＩＴＣラット抗マウスＴＥＲ１１９（１μｇ／１０６細胞）、ＡＰＣ−Ｃｙ（登録商標）７ラット抗マウスＣＤ１１ｂ（０．３μｇ／１０６細胞）、及びＡＰＣラット抗マウスＣＤ４４（１μｇ／１０６細胞）、又はＣＤ４４の代わりにＰＥラット抗マウスＣＤ７１（１μｇ／１０６細胞）で染色し、暗所で２０−３０分間、氷上でインキュベートした。細胞を４０ｍＬ  ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで２回洗浄し、１０ｍＬ  ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡに再懸濁し、暗所で１０分間、氷上で、生存マーカー７−ＡＡＤ（０．２５μｇ／１０６細胞）で染色した。選別は、ＭＯＦＬＯ高速細胞選別機（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で行った。
【００５１】
サイトスピン
細胞の形態を決定するために、選別された細胞を１０５含有する１００μＬの細胞懸濁液を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｈａｎｄｏｎ  ４  Ｃｙｔｏｓｐｉｎを用いてコートされたスライドにおいてサイトスピン調製液を調製するために用いた。スライドを５分間、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ（Ｓｉｇｍａ社）溶液で染色し、９０秒間、ｐＨ７．２のＴｒｉｓ緩衝液でリンスし、その後Ｇｉｅｍｓａ溶液（Ｓｉｇｍａ社）で染色した。
【００５２】
（実施例２）
マウス骨髄における赤血球産生の定量的分析
２つの区別し得る赤血球前駆細胞は、コロニーアッセイにおいて機能的に特定された。すなわち、早期ステージではバースト形成ユニット赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）前駆細胞、及び後期ステージではコロニー形成ユニット赤血球（ＣＦＵ−Ｅ）前駆細胞である。造血組織における最も早く形態学的に認識可能な赤芽球は、前赤芽球であり、それは、網赤血球を作るように３から４の有糸分裂を経験する。赤芽球の形態学的に区別し得る集団は、各々の連続する有糸分裂により作られ、それは前赤芽球から始まり、その後、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、及び正染性赤芽球へと続く。ＣＤ４４、ＧＰＡの発現レベル及び細胞サイズの変化に基づき、該方法は、トランスフェリン受容体であるＣＤ７１の発現レベルに依存して、過去に成し遂げられたよりもより均質の状態において、発生の各ステージでの赤芽球の集団を分離するために開発された。この試験において、前赤芽球：好塩基性赤芽球：多染性赤芽球：正染性赤芽球の比率は、１：２：４：８の態様であり、各有糸分裂における細胞の倍加を示す。赤血球産生の進行は、４．１Ｒ−ノックアウトマウス（溶血性貧血モデル）においては正常であるが、サラセミアマウスにおいて、前赤芽球から好塩基性赤芽球への進行は、変化している（表２）。したがって、開示された方法は、マウス骨髄のｉｎ  ｖｉｖｏでの赤血球産生の定量を可能とし、先天的な赤血球細胞障害における赤血球成熟でのステージ特異的な異常を特定することができる。マウス骨髄細胞のフローサイトメトリーは、図８Ａ−８Ｉに示される。
【表２】
2012531203.tif 000003
【００５３】
マテリアル及び方法
【００５４】
細胞採取
骨髄細胞を３月齢のマウスの脛骨及び大腿骨より採取した。
【００５５】
ＣＤ４５陽性細胞減少
細胞数を決定し、その後細胞を１０分間、３００×ｇで遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを１０７トータル細胞毎に９０μＬの緩衝液に再懸濁した。次に、１０μＬのＣＤ４５マイクロビーズを１０７トータル細胞毎に加え、細胞懸濁液を良く混合し、４−８℃で１５分間インキュベートした。細胞をその後、１０７細胞毎に１−２ｍＬの緩衝液を加えることにより洗浄し、１０分間、３００×ｇで遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを５００μＬの緩衝液に１０８細胞で再懸濁した。この細胞集団をその後、磁気分離のために用いた。
【００５６】
ＭＳ又はＬＳカラムによる磁気分離
磁気分離を、カラムの使用説明書に従って行った。カラムを通過する細胞を透明な１５ｍＬチューブに収集し、１ｍＬの緩衝液で２回洗浄し、トータルの廃液を収集した。
【００５７】
染色
２×１０６細胞を８０μＬのＤＰＢＳ／０．５％ＢＳＡに再懸濁し、細胞を１５分間、ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（１μｇ／１０６細胞）でブロッキングした。サンプルをその後、暗所にて、２０−３０分間、氷上で、ＦＩＴＣラット抗マウスＴＥＲ１１９（１μｇ／１０６細胞）、ＡＰＣラット抗マウスＣＤ４４（０．５μｇ／１０６細胞）、及びＡＰＣ−Ｃｙ（登録商標）７ラット抗マウスＣＤ１１ｂ（０．２μｇ／１０６細胞）で染色した。細胞を７００μＬのＤＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで２回洗浄した。最後に、細胞を１００μＬのＤＰＢＳ／０．５％ＢＳＡに再懸濁し、暗所にて、１０分間、氷上で、生存マーカー７−ＡＡＤ（０．２５μｇ／１０６細胞）で染色した。細胞をその後、０．４ｍＬのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡに懸濁し、染色から１時間以内にフローサイトメトリーにより分析した。染色されない細胞を、ネガティブコントロールとして用いた。
【００５８】
（実施例３）
ヒト赤血球産生のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析
赤血球産生は、有核赤血球前駆細胞が、独特な円盤状形状及び膜マテリアル特性を有する多量の無核赤血球細胞を刻々と産生するように、増殖し分化するプロセスである。マウス赤血球産生の間の個々の膜タンパク質成分の経時的な様相が検討され、個々のタンパク質の区別し得る変化が、終末期の赤血球分化の間見出され、具体的には、前赤芽球から網赤血球へのＣＤ４４の進行的及び劇的な減少が見られた。これらの知見は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける赤血球産生を定量するための、及びマウスにおける赤血球成熟のステージ特異的な障害を特定するための、新しいストラテジーの開発を可能にしてきた。同様のストラテジーがヒトの赤血球産生を試験するために適用可能か否かを検討するために、種々の赤血球細胞膜タンパク質の発現を、ヒト単一継代赤血球培養システムを用いて、ヒト赤血球前駆細胞の終末期の分化の間試験した。同様のパターンの膜タンパク質発現が見られた。具体的には、ＣＤ４４が減少し、ＧＬＵＴ１及びバンド３が増加し、ＣＤ７１（図９Ａ及び９Ｂ）は明確な変化を示さなかった。表面マーカーとしてＣＤ４４及びＧＬＵＴ１（又はバンド３）を用いて、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）によりｉｎ  ｖｉｖｏで培養された赤芽球から区別し得るステージの赤芽球を分離することが可能であった（図９Ｂ及び９Ｄ）。これらの知見は、ＧＬＵＴ１又はバンド３と結合したＣＤ４４が、ヒトの赤血球産生の間連続する発生ステージでの赤芽球を区別するために用いられ得ることを強く示唆し、それは、先天的及び後天的な赤血球細胞障害における、及び骨髄不全症候群における赤血球成熟のステージ特異的障害を特定する手段を提供する。
【００５９】
マテリアル及び方法
【００６０】
フィコール−パックを用いる単核細胞の分離
臍帯血を緩衝液で２−４倍に希釈し、単核細胞を密度勾配遠心分離によりフィコール分離で分離した。間期積層細胞を新しい５０ｍＬ円錐チューブに移し、緩衝液で４回洗浄し、磁気分離の前に適量の緩衝液に再懸濁した。
【００６１】
ＣＤ３４＋磁気ラベリング
分離された細胞を４℃で３−５分間、２００×ｇでスピンダウンした。１×１０８細胞毎に対して、細胞を３００μＬ緩衝液に再懸濁し、１００μＬのＦｃＲブロッキング試薬及び１００μＬのＣＤ３４マイクロビーズを加えた。細胞をよく混合し、３０分間４℃でインキュベートした。細胞をその後、２−５ｍＬの緩衝液で洗浄し、１−２ｍＬの緩衝液に再懸濁した。
【００６２】
ＬＳカラムによる磁気分離
磁気分離を、カラムの使用説明書に従って行った。端的に言うと、カラムを適量の緩衝液でリンスすることで調製し、細胞懸濁液をカラムに載せた。カラムを３×３ｍＬの緩衝液で洗浄した。その後、カラムをセパレーターで除去し、適切な収集チューブに置き、磁気的にラベルされた細胞を、プランジャーをカラムにしっかりと押すことでカラムからフラッシュした。細胞をカウントし、４℃で３−５分間、２００×ｇでスピンダウンした。
【００６３】
細胞培養
細胞を２つの工程のプロトコールにより培養した。第一工程（０日−６日）において、１０５／ｍＬのＣＤ３４＋細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、５０ｎｇ／ｍＬ幹細胞因子（ＳＣＦ）、１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−３、１Ｕ／ｍＬエリスロポエチン（ＥＰＯ）、α−チオグリセロール（１：００希釈後、０．６μＬ／ｍＬ培地）、及びペニシリン−ストレプトマイシン  １００×を含有する無血清増殖培地（ＳＦＥＭ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で培養した（０日）。培養４日後、細胞を新鮮な培地を用いて１０５／ｍＬに希釈し、３日間培養を続けた。第二工程（７日−１３日）において、細胞を３０％ＦＢＳ、同濃度のＥＰＯ、α−チオグリセロール、及びペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＳＦＥＭ培地中１０５／ｍＬで培養した。
【００６４】
細胞染色及び選別
５×１０６細胞を４００μＬのＤＰＢＳ／０．５％ＢＳＡに再懸濁した。サンプルを暗所にて２０−３０分間、氷上で、ＡＰＣラット抗マウスＣＤ４４（０．５μｇ／１０６細胞）で染色した。細胞を７００μＬのＤＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで２回洗浄した。その後、細胞を４００μＬのＤＰＢＳ／０．５％ＢＳＡに再懸濁し、暗所にて３０分間、３７℃で、ＧＦＰ−ＧＬＵＴ１抗体で染色した。洗浄後、細胞を４００ｍＬのＤＰＢＳ／０．５％ＢＳＡに再懸濁し、暗所にて１０分間、氷上で、生存マーカー７−ＡＡＤ（０．２５μｇ／１０６細胞）で染色した。染色されなかった細胞をネガティブコントロールとして用いた。単色での染色サンプルを補正（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）として用いた。サンプルをその後、染色から１時間以内にフローサイトメトリーにより分析した。
【００６５】
他に示唆のない限り、本明細書及び特許請求の範囲において用いられた成分の量、分子量といった特性、反応条件等を表現するすべての数字は、すべての場合において、用語“約”により変形されるように理解されるべきである。したがって、反対に示唆されない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられた数字のパラメータは、本発明により得られようとされる所望の特性に基づき変化し得る近似値である。少なくとも及び特許請求の範囲の範囲への均等物の適用を制限しようとすることなく、各々の数字のパラメータは少なくとも、報告される有効数字の数字を考慮して、及び通常の四捨五入の技術を適用することにより、理解されるべきである。本発明の広い範囲に記載された数字の範囲及びパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例において記載された数値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、いかなる数値も本質的には、各々の試験測定において見出される標準偏差に起因する誤差を必然的に含む。
【００６６】
本発明を記述する文脈において（特に、特許請求の範囲の文脈において）用いられる“ひとつの（ａ）”、“ひとつの（ａｎ）”、“該（ｔｈｅ）”、及び同様の指示語は、本明細書において他に示唆のない限り、又は文脈により明確に否定されない限り、単数及び複数をカバーするように理解されるべきである。本明細書における値の範囲の記述は、単に範囲に含まれる各々の独立した値を個別に参照する省略方法として提供されるように意図されたにすぎない。本明細書において他に示唆のない限り、各々の個々の値は、それがまるで本明細書において個々に列挙されるように、本明細書に包含される。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書において他に示唆のない限り、又は文脈により明確に否定されない限り、適切ないかなる方法においても行われ得る。本明細書において提供されるいずれかの及びすべての実施例、又は典型的な言語（例えば、“といった（ｓｕｃｈ  ａｓ）”）の使用は、単に本発明の理解を容易にするようにしたにすぎず、他にクレームされた本発明の範囲における限定をもたらさない。本明細書におけるいかなる言語も、本発明の実施に本質的であるクレームされていないいかなる要素をも示唆するように理解されるべきではない。
【００６７】
本明細書に開示される本発明の代替要素又は態様の集団は、限定されて理解されるべきではない。各々の集団要素は、個々に又は該集団の他の要素若しくは本明細書においてみられる他の要素との組み合わせにて言及され及びクレームされ得る。集団の１若しくは２以上の要素は、利便性及び／若しくは特許性を理由に集団に包含され得、又は集団から削除され得ることが予測される。こうした包含又は削除が生じる場合、本明細書は、変形された集団を含むと考えられ、その結果、添付された特許請求の範囲において用いられるすべてのマーカッシュの集団の明細書を充足する。
【００６８】
本発明のある態様は、本発明を実施するために本発明者らに知られたベストモードを含んで本明細書に記載される。むろん、これらの記載された態様における変形は、前述の記載を読むことにおいて本技術分野の当業者に明白となるだろう。本発明者らは、当業者が必要に応じてこのような変形を用いることを期待し、本発明者らは、本発明に対して本明細書に具体的に記載されたものよりもむしろ他の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法律により許容されるように本明細書に添付された特許請求の範囲において列挙される対象物のすべての変形物及び均等物を含む。さらに、すべての可能性のある変形における上述の要素のいかなる組み合わせも、本明細書において他に示唆のない限り、又は文脈により明確に否定されない限り、本発明により包含される。
【００６９】
本明細書に開示される特定の態様は、言語からなる又は本質的に言語からなる特許請求の範囲においてさらに限定され得る。特許請求の範囲において用いられる場合、補正ごとにファイルされ又は加えられるとしても、推移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）の表現である“〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）”は、特許請求の範囲に特定されていない要素、工程、又は成分を排除する。推移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）の表現である“本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）”は、特許請求の範囲の範囲を、特定されたマテリアル又は工程及び基本的かつ新しい特徴に実質的に影響を与えないものに限定する。クレームされた本発明の態様は、本明細書において本質的に又は明確に記載され及び可能にされる。
【００７０】
さらに、この明細書の至るところに特許及び刊行物が多数参照されてきた。上述の参照及び刊行物の各々は、それらの全体において本明細書に個々に包含される。
【００７１】
終わりに、本明細書において開示される本発明の態様は、本発明の原理の実例となるということが理解されるべきである。用いられ得る他の変形は、本発明の範囲内にある。このように、実施例により、限定されることなく、本発明の他の構成が、本明細書における教示に従って用いられ得る。したがって、本発明は、正確に示され及び記載されるものに限定されない。
【００７２】
（関連する出願）
本出願は、米国仮特許出願６１／２１９，７００（出願日２００９年６月２３日）に基づき、３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）に基づく優先権主張の利益を有し、その全体の内容は、本明細書に参照により取り込まれる。
【００７３】
（連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載）
本発明は、国立衛生研究所により与えられた付与番号ＤＫ２６２６３、ＤＫ３２０９４及びＨＬ３１５７９の合衆国政府の支援によりなされた。合衆国政府は、本発明において一定の権利を保有し得る。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【国際調査報告】
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