(57)【要約】本発明は、液体培地中での病原菌の同定方法であって、病原菌に感染した宿主の成分、すなわち、細胞外環境からの細胞成分およびタンパク質を含有する液体培地に膜洗浄剤を加えて、それらを分解することなくこれらの成分から病原菌を遊離させる工程を含み、液体培地中で増殖した病原菌は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析される、方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体培地中の病原菌の同定方法であって、
病原菌に感染した宿主の成分、すなわち、細胞外環境からの細胞成分およびタンパク質を含有する液体培地に膜洗浄剤を加えて、これらの成分を劣化させることなくこれらの成分から病原菌を遊離させる工程を含み、
液体培地において増殖した病原菌は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析される、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
−  液体培地に、原核生物の細胞壁に損傷を与えない穏やかな膜洗浄剤を加えて、感染宿主の成分から病原菌を分離し、特に、細胞内の病原菌を遊離させ、バックグランドノイズが低減したスペクトルを得て、それにより、病原菌の容易な同定を可能にする、工程と、
−  分画遠心分離により液体培地から病原菌を回収する工程と、
−  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより病原菌ペレットを分析し、次いで、その結果を病原菌データベースと比較する工程と
を含む、方法。
【請求項３】
穏やかな洗浄剤は、液体培地に、最大５％、より好ましくは０．５〜５％、最も好ましくは１％の最終濃度まで加えられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
穏やかな洗浄剤の膜洗浄剤は、サポニン、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシル−グルコシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
分析されるべき病原菌を含む液体と洗浄剤との接触時間は、最大８分、より好ましくは１〜８分、より具体的には約５分である、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
混合物は、最大１５分間、好ましくは約１〜１５分間、より具体的には約２分間にわたって、最大２０，０００ｒｐｍ、特に１０，０００〜１５，０００ｒｐｍの遠心分離にかけられる、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
上清は捨てられ、ペレットは、蒸留水に溶解させられ、請求項６に記載の条件下に遠心分離にかけられる、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
用いられる液体は、特定の病原菌に陽性である患者からの血液培養物、液体培地中に接種されたまたはされなかった関節液、尿、または、液体培地中に接種されたまたはされていない任意の他の生物流体、例えば、髄液、ドレーン管または膿瘍からのドレナージ流体であるが、ただし、感染は、単一菌であると疑われる、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体培地中の病原菌の同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物流体中で培養された病原菌を同定するためには２４〜４８時間の期間が必要である。
【０００３】
実際に、液体培地中における病原菌の培養は固形培地上で継代培養されなければならない。
【０００４】
この期間は、適切な経験的抗生物質治療を開始して手元に耐性記録の結果を出す要求に弊害をもたらす。
【０００５】
血液培養ブイヨンに直接適用される分子生物学技術（ＰＣＲ）はより速く；それでもやはり最低およそ３時間かかり、適切な設備と、ある程度の技術的専門知識とを必要とする。
【０００６】
特許文献１（Large Scale Proteomics Corp. et all）は、２Ｄ遠心分離により混合物から微生物を分離することを含む、微生物の検出及び特徴付けに関する。
【０００７】
Chenらの論文である非特許文献１および２には、プロテオミクスに有用な質量分析のための張力活性剤（tension-active agents）が開示されている。
【０００８】
本発明者らの研究は、従来技術の欠点を克服するための手段を求めることに焦点を合わせていた。発明者らは、病原菌学および質量分析による微生物の分析の両方における彼らの専門知識の多くを用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight Mass Spectrometry：マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析）技術を、液体培地中の病原菌の同定に適合させるように努めた。
【０００９】
固形培地上で増殖した細菌は、現在、コロニーから直接的に得られた種の特定のプロファイルのお陰で、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって同定され得ることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第０２／２１１０８号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Chenら著、「Anal.Chem.」、２００８年、第８０巻、ｐ．８６９４−８７０１
【非特許文献２】Chenら著、「J. Proteome Res」、２００７年７月、第６巻（第７号）、ｐ．２５２９−２５３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、この技術は、液体サンプルまたは生物学的サンプル中に含まれる病原菌を、このサンプルが液体培地中に濃縮されたかどうかに拘わらず、適切に処理することによって用いられ得ることを見出した。
【００１３】
従って、本発明の目的は、新規な液体培地中の病原菌の同定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の方法は、病原菌に感染した宿主の成分、すなわち、細胞外環境からの成分およびタンパク質を含有する液体培地に膜洗浄剤が加えられ、その結果、それらを品質低下させることなく病原菌をこれらの成分から放出することおよび液体培地において増殖した病原菌は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析されることを特徴とする。
【００１５】
より具体的には、本発明の方法は、
−  液体培地に、原核生物の細胞壁に損傷を与えない穏やかな膜洗浄剤を加え、感染宿主の成分から病原菌を分離し、特に、細胞内の病原菌を放出させ、バックグラウンドノイズが減少したスペクトルを得て、それ故に、病原菌の容易な同定を可能にする工程；
−  分画遠心分離により液体培地から病原菌を回収する工程；及び
−  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより病原菌ペレットを分析し、次いで、その結果を適切な病原菌データベースと比較する工程
を含む。
【００１６】
この技術は迅速であるという利点を有し：それは、固形培地上での継体培養を回避することによって、同定方法において少なくとも２４時間の時間の利益を生じさせ、その結果、時間の喪失なしで適切な抗生物質治療が開始され得る。更に、この技術は実施容易である。
【００１７】
穏やかな膜洗浄剤は、最終濃度が５％以下、更に好ましくは０．５〜５％、最も好ましくは１％になるように液体培地に加えられる。
【００１８】
他の条件によれば、洗浄剤は、最終濃度１〜５％、好ましくは２％で加えられる。
【００１９】
適切な化合物には、サポニン、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシル−グルコシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドが含まれる。
【００２０】
サポニンが好ましい洗浄剤である。
【００２１】
有利には、分析されるべき病原菌を含む液体と洗浄剤との接触時間は、８分以下、更に好ましくは１〜８分、より具体的には約５分である。
【００２２】
混合物は、遠心分離にかけられ、有利には、蒸留水を加えた後である。
【００２３】
適切な遠心分離条件は、２０，０００ｒｐｍ以下、特に１０，０００〜１５，０００ｒｐｍで、１５分以下、好ましくは約１〜１５分間、より具体的には約２分間である。
【００２４】
他の条件によれば、遠心分離は、８０００ｔ／分以下、好ましくは３０００〜５０００ｔ／分で、１５分以下、好ましくは約５〜１５分間、より具体的には約５分間実施される。
【００２５】
次いで、上清が捨てられ、ペレットが蒸留水に溶解させられ、遠心分離にかけられる（有利には上記条件下）。ペレットは、回収され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析に用いられる。得られた結果は、データベースと比較される。
【００２６】
本発明による方法に用いられる液体には、例えば、特定の病原菌について陽性である患者からの血液培養物、手術室内で血液培養バイアルにおいて接種されたまたはされなかった、特定の病原菌について陽性である培養物を産生する関節液（joint fluid）、又は任意の他の生物流体、例えば、尿、髄液、ドレーン管または膿瘍からのドレナージ流体（感染は、単一微生物性であることが疑われるという条件とされる）が含まれる。これは、生物流体から直接、又は接種材料が薄い時には液体培地中に濃縮した後のいずれかで検出され得る。
【００２７】
スペクトルは、有利には、２００８年１月８日に出願された、国際出願WO2008/084409「Means for identifying a germ isolated from a clinical sample」に記載された技術によって分析される。
【００２８】
細菌、酵母、真菌又は適切な場合には糸状菌のような種々のタイプの病原菌が同定され得る。
【００２９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の実施例において説明され、図１Ａおよび１Ｂに参照がなされる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１Ａは、血液培養物から単離された病原菌について得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳのグラフであり、図１Ｂは、コロニーから単離された血液培養物から単離された病原菌について得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳのグラフであり、２つのスペクトルの間の共通のピークは、“＊”によってマークされている。これらのピークは、大腸菌種に特有である（ａ．ｕ：任意の単位（吸収））。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（材料及び方法）
（血液及び流体の培養物）
予備的試験は、活性炭なしの陰性血液培養フラスコ（bioMerieux,Marcy l’Etoile,France）を用いた。それらは、通常に分離される病原体（表１）の１０４個の細胞により人為的に汚染され、次いで、自動化血液培養装置Bact/Alert(bioMerieux,Marcy-l’Etoile,France)内に置かれた。更に、患者由来の種々の病理学流体（pathological fluid）：陽性血液培養物（表２及び３）、又は血液培養フラスコ内にスパイクされた種々の流体（表４）が試験された。
【００３２】
血液培養瓶からの２つの一定分量が取得された。最初の一定分量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ処理のために取得された。第二の一定分量は、グラム染色、抗生物質感受性試験、及び従来の微生物学的技術を用いた微生物学的同定のための適切な継代培養のために用いられた。
【００３３】
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）
２００マイクロリットルの陽性血液培養ブイヨン（又は濃縮液１ｍＬ）を、５％サポニン溶液４０μＬ（又は濃縮液２００μＬ）を含むプラスチックチューブに移して、細胞内細菌を遊離させた。５分のインキュベーションの後、蒸留水を１．５ｍＬまで加え、１６６００ｇで１分間にわたる、２回の連続的な蒸留水洗浄を実施した。上清を捨て、５μＬの１０％トリフルオロ酢酸をペレットに加えた。この混合物１μＬを、ＭＡＬＤＩサンプルターゲット（Bruker Daltonics, Bremen, Germany）上にスポットし（２ウェル／試料）、室温で乾燥させた。次いで、無水エタノール１マイクロリットルを各ウェルに加え、混合物を乾燥させた。次いで、１μＬのマトリクス溶液ＤＨＢ（２，５−ジヒドロキシ安息香酸、８０ｍｇ／ｍＬ、３０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）を加え、サンプルと共結晶化させた。Flex Controlソフトウェア（Bruker Daltonics）を備えたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分光計（Microflex,Bruker Daltonics）でサンプルを処理した。線形モードにおいて２０ｋＶの加速電圧で陽イオンを抽出した。各スペクトルは、同じウェルの異なる領域で自動的に実施された、４００個のレーザーショットから得られたイオンの合計である。スペクトルは、３６４０〜２０００のｍ／ｚ範囲において分析され、基準データベース（Andromas@SAS, Paris, France）のものと比較された。このデータベースは、前述のようにして設計され、人体病理学において遭遇される病原体を含む（１，２）。試験される株の同定は、データベース中の最も適合する基準株の種に対応する。分析は、基準データベースと最も適合する最初の２つの種との間の相違をも考慮に入れる。２個のサンプル沈着物のうちの１個について、適合ピークの割合（％）が、Andromas@ソフトウェア（Andromas SAS）による分析後にデータベースにおいて提案される第１の種のものの少なくとも６０％である場合、および、データにおいて最も適合する最初の２つの種の間の相違が少なくとも１０％である場合、種の同定は有効であると考えられた。後者の条件が満たされない場合、最初の２つの適合が細菌の同じ群／属／科に属していたならば、同定は、群／属／科のレベルで正しいと考えられた。他の全ての場合において、結果は不適切であると考えられた。最も信頼できない同定は、質の悪いスペクトルによるものであることが指摘されるべきである。血液培養物がグラム染色により見られるように数種の細菌種を含んでいた場合、グラム陰性桿菌及び／又はグラム陽性球菌に特有のデータベースが用いられた。
【００３４】
（結果）
１）血液培養フラスコ内にスパイクされた病原菌の同定
病原体の正確な同定が、液体培地中で増殖した細菌から得られ得るかどうかを決定するために、通常に単離された病原体でスパイクされた血液培養瓶を用いてパイロット実験が最初に実施された。図１Ａ及び１Ｂは、血液培養瓶中で増殖した大腸菌を用いて得られたスペクトルの例を、単離コロニーから得られた同じ株のものと比較して示す。合計２９２種の細菌株及び２０種のカンジダ（Candida）種が血液培養瓶中にスパイクされた。結果は、表１に示される。
【００３５】
表１．種々の種でスパイクされた血液培養物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる微生物学的同定
【００３６】
【表１】
2012519479.tif 000002
【００３７】
ａＣＮＳ群：コアグラーゼ陰性ブドウ球菌属
ｂ口腔ストレプトコッカス群：ストレプトコッカス・ミレリ群を除く、ストレプトコッカスの全ての口腔種を含む群
【００３８】
説明可能な３０７個のスペクトルのうち（９８％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳは、それぞれ、事例の８９％、６％、０．４％及び２．６％で、種、群、属及び科のレベルにおける同定を可能にした。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳは、事例の１００％において、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌属（coagulase negative Staphylococci：ＣＮＳ）と黄色ブドウ球菌の区別を可能にしたことを指摘されるべきである。
【００３９】
２）患者由来の陽性血液培養物の同定
本試験に含まれる３８８個の陽性血液培養物のうち、３７３個は単一菌であった（表２）。
【００４０】
表２．患者由来の単一菌血液培養物における、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる直接的細菌同定
【００４１】
【表２】
2012519479.tif 000003
【００４２】
ａＣＮＳ群：コアグラーゼ陰性ブドウ球菌属
ｂ化膿性連鎖球菌／ディスガラクティエ群：化膿性連鎖球菌とストレプトコッカス・ディスガラクティエとの間に差異はない。
【００４３】
ｃ口腔ストレプトコッカス群：ストレプトコッカス・ミレリ群を除く、ストレプトコッカスの全ての口腔細菌を含む群
【００４４】
材料及び方法の項に記載されたようなＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて、９８％の事例において、説明可能な同定が得られた。これらの結果は、種、群、属／科のレベルにおいて、古典的な方法により得られた結果と、それぞれ９１％、５％及び２％の事例で一致していた。
【００４５】
更に、混合細菌を含む患者由来の１５個の血液培養物が試験された（表３）。
【００４６】
表３：２種以上の病原菌を含む血液培養物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる直接的同定
【００４７】
【表３】
2012519479.tif 000004
【００４８】
データベースを用いて、混合物に存在する病原体のうちの１種のみが検出されるか、または、２種の病原体が同じスコアで検出された。グラム陽性球菌及びグラム陰性桿菌がグラム染色で検出された場合、それぞれ、グラム陽性球菌又はグラム陰性桿菌の種に特異的なスペクトルを含むデータベースを用いることにより、９個の事例のうちの６個で同定が改善された。
【００４９】
３）血液培養フラスコからの陽性濃縮液（positive enrichment fluid）の同定：血液培養ブイヨン中に増殖した４６種の流体が含まれていた。結果は、下記（表４）に与えられる。
【００５０】
表４：患者由来の濃い培養物中における、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる直接的細菌同定
【００５１】
【表４】
2012519479.tif 000005
【００５２】
全てのスペクトルが説明可能であり、得られた同定は、古典的な方法により得られた結果と、種、群及び属のレベルにおいて、それぞれ９６％、２％及び２％の事例で一致していた。
【００５３】
４）尿における結果
１０の尿が試験され、９の事例において大腸菌が同定され、１の事例において腐性ブドウ球菌（S.saprophyticus）株が同定された。
【００５４】
同定は正しかった。
【００５５】
本発明の方法は、病原菌の濃度が十分であり、かつ感染が微生物感染であるならば、生物学的試料において直接的に用いられ得る。
【００５６】
５）診断のための時間
各陽性血液培養物は、陽性であると検出されたとすぐに、処理されたことも指摘されるべきである。Bact/Alertアラームと、洗浄剤のインキュベーションの際に実施されるグラム染色を含む病原菌同定との間に必要とされる時間は２０分であった。
【００５７】
（考察）
Bact-Alert瓶から直接的に適用されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる病原菌検出の感度及び正確度が評価された。この試験は、血液又は液体培養物内で単離された微生物の大部分の迅速（２０分）かつ確実な同定を可能にする。迅速かつ正確な診断は、不適当かつ広域スペクトラムの抗生物質の使用を減らし、それにより、結果が改善され、耐性及び可能な副作用の潜在的な発生を減少させる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる血液培養物内の微生物の同定は、臨床管理におけるグラム染色の結果の影響を劇的に拡張する。特に、グラム陰性桿菌のうち、シュードモナスまたはアシネトバクターからの腸内細菌（Enterobacteriae）の識別は、血液培養増殖のわずか２０分後に、感受性試験の結果が出るまで、より適切な処理を可能にするであろう。同様に、黄色ブドウ球菌の即時診断を得る可能性は、主要な臨床的帰結である。ＣＮＳと黄色ブドウ球菌との速い識別は、臨床医が可能な汚染から重篤な感染を識別するのに役立つであろう。
【００５８】
（参照）
1.Carbonnelle, E., J. L. Beretti, S. Cottyn, G. Quesne, P. Berche, X. Nassif, and A. Ferroni. 2007. Rapid identification of Staphylococci isolated in clinical microbiology laboratories by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol 45:2156-2161.
２．Degand, N., E. Carbonnelle, B. Dauphin, J. L. Beretti, M. Le Bourgeois, I. Sermet-Gaudelus, C. Segonds, P. Berche, X. Nassif, and A. Ferroni. 2008. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for identification of nonfermenting gram-negative bacilli isolated from cystic fibrosis patients. J Clin Microbiol 46:3361-3367.
【図１】
2012519479.tif 000006
【国際調査報告】
2012519479.tif 000007
2012519479.tif 000008
2012519479.tif 000009
2012519479.tif 000010