(57)【要約】  抗体の抗原結合部位を可逆的に覆い隠すためのマスキングリガンドは、抗体のエピトープと切断可能なリンカーとを含む。マスキングリガンドの作製方法は、切断可能なポリペプチドリンカーに抗体のエピトープの少なくとも2つのコピーを連結することを含む。【選択図】  図２
2012511033.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体が特異的に結合する抗原のエピトープの2つのコピーと、該エピトープの各コピーに連結された切断可能なポリペプチドリンカーと、を含む、抗体の抗原結合部位を可逆的に覆い隠すためのマスキングリガンド。
【請求項２】
前記ポリペプチドリンカーが少なくとも1つのタンパク質分解酵素認識部位を含む、請求項１に記載のマスキングリガンド。
【請求項３】
前記タンパク質分解酵素がマトリックスメタロプロテアーゼである、請求項２に記載のマスキングリガンド。
【請求項４】
前記マトリックスメタロプロテアーゼがマトリックスメタロプロテアーゼ9である、請求項３に記載のマスキングリガンド。
【請求項５】
前記ポリペプチドリンカーが配列番号5を含む、請求項１に記載のマスキングリガンド。
【請求項６】
前記エピトープが、前記エピトープに対する前記抗体の親和性を低下させる少なくとも1つのアミノ酸突然変異を有する、請求項１に記載のマスキングリガンド。
【請求項７】
前記抗体が上皮増殖因子に特異的に結合する、請求項１に記載のマスキングリガンド。
【請求項８】
前記エピトープが、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のマスキングリガンド。
【請求項９】
前記抗体の抗原結合部位に非共有結合された請求項１に記載のマスキングリガンドを含む、複合体。
【請求項１０】
前記抗体が、検出可能な標識を含む、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
前記抗体が、少なくとも1つの翻訳後修飾を含む、請求項９に記載の複合体。
【請求項１２】
請求項９に記載の複合体と製薬上許容される担体とを含む、組成物。
【請求項１３】
少なくとも1つのタンパク質分解酵素認識部位を含む切断可能なポリペプチドリンカーに抗体のエピトープの少なくとも2つのコピーを連結することを含む、多価マスキングリガンドの調製方法。
【請求項１４】
前記エピトープの各コピーが、前記切断可能なポリペプチドリンカーに結合可能な部分を含むように、化学修飾される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記切断可能なポリペプチドリンカーが配列番号5のアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
有効量の請求項１２に記載の組成物を被験体中の標的組織に投与することを含み、該標的組織が、前記切断可能なポリペプチドリンカーを切断できるタンパク質分解酵素を発現し、かつ前記マスキングリガンドが、該タンパク質分解酵素が前記切断可能なポリペプチドリンカーを切断した後、該標的組織で前記抗体の抗原結合部位から解離する、治療の必要な被験体の治療方法。
【請求項１７】
前記標的組織が、腫瘍、潰瘍、創傷であるか、または炎症を起こしている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
各抗原結合部位が他の抗原結合部位とは異なる特異性を有する２つ以上の抗原結合部位を有する抗体の各抗原結合部位を可逆的に覆い隠すためのマスキングリガンドであって、該抗体の各抗原結合部位に対するエピトープのコピーと、該エピトープの各コピーに連結された切断可能なポリペプチドリンカーと、を含む、上記マスキングリガンド。
【請求項１９】
前記ポリペプチドリンカーが少なくとも1つのタンパク質分解酵素認識部位を含む、請求項１８に記載のマスキングリガンド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドリンカーが配列番号5を含む、請求項１８に記載のマスキングリガンド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2008年12月8日出願の米国仮特許出願第61/120,657号および2009年1月27日出願の米国仮特許出願第61/147,611号に基づく優先権を主張する。それぞれの内容は、その全体がすべての目的で参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０００２】
発明の分野
本出願は、全体的には、タンパク質工学および治療法の分野に関する。より特定的には、本出願は、切断可能なポリペプチドリンカーに連結された抗体エピトープを含むマスキングリガンドならびにそれを含む複合体および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
特許、公開出願、技術論文、および学術論文をはじめとする種々の出版物が、本明細書全体を通じて引用される。これらの引用された各出版物は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０００４】
治療目的または診断目的のいずれかで投与された生物学的活性化合物により引き起こされる有害事象は、感染症、炎症、自己免疫症候群、および新生物形成をはじめとする多くの疾患状態の薬理学的管理において、依然として重大な問題である。多くの場合、そのような有害事象は、生物学的活性化合物と正常な細胞および組織との相互作用に起因して起こるので、「標的化」療法の目的の妨げになる。タンパク質試薬の場合、有害事象は、細胞関連レセプターと薬理活性リガンドとの相互作用の結果として起こりうる。モノクローナル抗体（mAb）は、そのようなリガンド／レセプター系の重要なクラスである。mAbは、典型的には、特定の疾患状態の病理発生に関与する抗原に結合し、免疫学的機序および非免疫学的機序の両方を介して細胞生存に影響を及ぼしうる。
【０００５】
したがって、薬理活性化合物を疾患部位に特異的に方向付けて、この化合物の正常組織との反応性を低下させることがきわめて望ましい。これまで、この問題は、正常組織と比較して疾患組織中に高レベルで存在する分子体（たとえば抗原）を標的にすることにより取り組まれてきた。関連する標的分子は、疾患部位で過剰発現されない可能性があるか、または発現レベルにかかわらず正常組織および罹患組織の両方で決定的な機能を有する可能性があるので、この取組みには限界がある。たとえば、ErbBファミリーの細胞表面レセプターと反応するmAbは、腫瘍を治療するために頻繁に使用されるが、それらのmAbはまた、コグネイト抗原を発現する正常組織（たとえば、心臓、胃腸系、および皮膚）に影響を及ぼす深刻な有害作用をも引き起こす（Chien, New England J. Med. 354: 789-790, 2006、Lemmens, et al., Circulation 116: 954-960, 2007、Pastore, et al., J. Investigative Dermatology 128: 1365-1374, 2008）。それに加えて、有害な副作用が原因で、mAb治療の不遵守が頻繁に起こっている（Boone, et al., Oncology 72: 152-159, 2007）。さらには、長期間にわたるmAbの全身投与は、治療患者で感染症および／または新生物が発生する危険性の増大を伴う可能性がある（Jones and Loftus, Inflamm. Bowel Dis. 13: 1299-1307, 2007、Williams, Eur. J. Cancer Prevention 17: 169-177, 2008）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、抗体の抗原結合部位を可逆的に覆い隠すためのマスキングリガンドを特徴とする。一般的には、マスキングリガンドは、抗体が特異的に結合する抗原のエピトープの2つのコピーと、該エピトープの各コピーに連結された切断可能なポリペプチドリンカーと、を含む。
【０００７】
いくつかの態様では、マスキングリガンドは、２つ以上の抗原結合部位を有する抗体の各抗原結合部位を可逆的に覆い隠す。抗原結合部位の少なくとも1つは、他の抗原結合部位と対比して異なる抗原特異性を有する。一般的には、そのようなマスキングリガンドは、抗体の各抗原結合部位に対するそれぞれのエピトープのコピーと、エピトープの各コピーに連結された切断可能なポリペプチドリンカーと、を含む。
【０００８】
マスキングリガンドについては、ポリペプチドリンカーは、好ましくは、少なくとも1つのタンパク質分解酵素認識部位を含み、かつそのタンパク質分解酵素は、好ましくは、マトリックスメタロプロテアーゼであり、そのうち、マトリックスメタロプロテアーゼ2およびマトリックスメタロプロテアーゼ9は、きわめて好ましい。ポリペプチドリンカーは、好ましくは、配列番号5を含む。
【０００９】
マスキングリガンドのエピトープは、エピトープに対する抗体の親和性を低下させる少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含みうる。エピトープは、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10のアミノ酸配列を含みうる。
【００１０】
抗体は、上皮増殖因子に特異的に結合可能である。
【００１１】
本発明はまた、抗体の抗原結合部位に非共有結合されたマスキングリガンドを含む複合体を特徴とする。マスキングリガンドは、好ましくは、切断可能なポリペプチドリンカーを含む。抗体は、検出可能な標識および／または少なくとも1つの翻訳後修飾を含みうる。複合体は、製薬上許容される担体を有する組成物の状態で提供可能である。
【００１２】
本発明はまた、多価マスキングリガンドの調製方法を特徴とする。一般的には、この方法は、少なくとも1つのタンパク質分解酵素認識部位を含む切断可能なポリペプチドリンカーに抗体のエピトープの少なくとも2つのコピーを連結することを含む。エピトープの各コピーは、切断可能なポリペプチドリンカーに結合可能な部分を含むように化学修飾可能である。好ましくは、切断可能なポリペプチドリンカーは、配列番号5のアミノ酸配列を有する。
【００１３】
本発明はまた、治療の必要な被験体の治療方法を特徴とする。一般的には、この方法は、抗体に非共有結合されたマスキングリガンドを含む有効量の複合体を被験体の標的組織に投与することを含む。複合体は、製薬上許容される担体を有する組成物の状態で提供可能である。標的組織は、好ましくは、マスキングリガンドの切断可能なポリペプチドリンカーを切断可能なタンパク質分解酵素を発現する組織である。タンパク質分解酵素が切断可能なポリペプチドリンカーを切断した後、マスキングリガンドが標的組織で抗体の抗原結合部位から解離するとき、抗原結合部位は利用可能になる。標的組織は、腫瘍、潰瘍、創傷、または炎症を起こした組織でありうる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1は、二価マスキングリガンドの概略図を示している。図1Aは、同一の連結されたマスクを示している。図1Bは、同一でない連結されたマスクを示している。
【図２】図2は、2つの同一のマスクを有する多価マスキングリガンドにより抗原結合部位が覆い隠されている抗体の概略図を示している。
【図３】図3は、標的組織中のEGFRに対するマスク化mAbのin vivo活性化のモデルを示している。
【図４】図4は、セツキシマブおよび／またはマツズマブ／425と反応する多価マスキングリガンドの配列を示している。図4Aは、MMP-9タンパク質分解部位（太字）を有するリンカー（下線付き）により連結された、EGFRドメインIII中のエピトープに基づく2つのEGFRマスクを示している（配列番号7）。このマスクは、セツキシマブ（C225）またはマツズマブ（ネズミmAb425由来）に高い親和性を有して結合するであろう（実施例1参照）。図4Bは、MMP-9タンパク質分解部位（太字）を有するリンカー（下線付き）により連結され、かつSをPに置き換える2つの突然変異（より大きい太字のフォント）を有する、EGFRドメインIII中のエピトープに基づく2つのEGFRマスクを示している。このマスクは、A中のマスクよりも弱くセツキシマブに結合するであろう（配列番号8）。図4Cは、MMP-9タンパク質分解部位（太字）を有するリンカー（下線付き）により連結され、かつHをEに置き換える2つの突然変異（より大きい太字のフォント）を有する、EGFRドメインIII中のエピトープに基づく2つのEGFRマスクを示している。このマスクは、A中のマスクよりも弱くマツズマブ／425に結合するであろう（配列番号9）。図4Dは、MMP-9タンパク質分解部位（太字）を有するリンカー（下線付き）により連結され、かつ一方のマスクではHをEに置き換える突然変異および他方のマスクではSをPに置き換える突然変異（より大きい太字のフォント）を有する、EGFRドメインIII中のエピトープに基づく2つのEGFRマスクを示している。このマスクは、セツキシマブとマツズマブ／425とを連結するために使用可能である。
【図５】図5は、プロテアーゼ認識配列を含有するリンカーの化学的構築を例示する模式的反応シーケンスを示している。
【図６】図6は、別個のマスクを有する多価マスキングリガンドにより連結された2つの異なる抗体の四量体型複合体の概略図を示している。
【図７】図7は、各抗体に対するマスキングリガンドを架橋することにより形成された2つの抗体の四量体型複合体の概略図を示している。
【図８】図8Aは、抗体の汎用マスキングリガンドおよびダイアボディー阻止抗原結合部位の概略図を示しており、図8Bは、汎用多価マスキングリガンドにより連結された2つの異なる抗体の四量体型複合体の概略図を示している。
【図９】図9は、TGP1マスキング剤の昆虫細胞内産生および検出を示している。Ni-Hisカラムから溶出されてクーマシーブルーで染色されたTGP1のSDSゲル電気泳動が示されている。予測分子量の単一バンドが、媒体ならびにカラムから溶出された画分5および6の両方ではっきりと認められた。レーン(1)−  媒体、レーン(2)−  カラム透過液液、レーン(3)−  洗浄液、レーン(4〜7)−  溶出画分、レーン(8)−  サイズマーカー用として記載されたM。
【図１０】図10は、マウス抗His6 mAbを用いたイムノブロット分析によるマスキング剤（TGP1）の検出を示している。TGP1は、図4Aに示されるようにMMP9感受性切断部位により連結されたタンデムEGFRドメインIII断片よりなる。
【図１１】図11は、セツキシマブ（C225）がNi-Hisビーズ上に固定されたTGP1に結合することを示している。TGP1があらかじめ充填されたNi-Hisカラムを用いてセツキシマブを捕捉し、次に、これを溶出させ、非変性条件下でのゲル電気泳動の後でクーマシーブルー染色により検出した。ヒトLewisYを認識する対照抗体（15-6A）は、捕捉されなかった。
【図１２】図12は、イムノブロット分析により測定されるように、セツキシマブ（C225）が、Ni-Hisビーズ上に固定されたTGP1に結合することを示している。Ig重鎖およびIg軽鎖に分子量が一致するタンパク質種は、C225溶出液中に回収されるが、対照15-6Aの場合、抗体由来のタンパク質種は、はっきりと認められない。
【図１３】図13は、MMP9によるTGP1マスクの切断を示している。SDS-PAGEにより分離したタンパク質種のクーマシーブルー染色が示されている。レーン（1）−  MMP9の不在下での対照TGP1、レーン（2〜4）−  室温で漸増濃度（25、50、150ng）のMMP9で4時間処理されたTGP1、レーン（5〜7）−  37℃で漸増濃度（25、50、150ng）のMMP9で30分間処理されたTGP1。TGP1切断は、高分子量タンパク質バンドの存在量の減少およびより低分子量の種の出現により示唆・実証される。
【図１４】図14は、MMP9によるTGP1/C225複合体の消化を示している。MMP9を添加する前に約5μgのTGPを20μgのC225と共に4℃で20分間インキュベートした。TGP1の完全切断（レーン1中のTGP1と共泳動する）が、はっきりと認められる。
【図１５】図15は、TGP1と共にプレインキュベートした後、FACS分析により測定される、MDA-MB-468標的細胞へのセツキシマブ（C225）の結合の低下を示している。非マスク化抗体と対比してほぼ完全な結合阻害が達成された。上側パネルは、FACSヒストグラムを表し、下側パネルは、ヒストグラム上のピークの平均蛍光強度（MFI）を示している。
【図１６】図16は、TGP1と共にプレインキュベートした後、FACS分析により測定される、MDA-MB-468標的細胞への425の結合の低下を示している。非マスク化抗体と対比してほぼ完全な結合阻害が達成された。説明文は図15の記載と同様。
【図１７】図17は、セツキシマブ/TGP1複合体のMMP9切断がMDA-MB-468細胞へのTGP-1マスク化セツキシマブの結合を回復させることを示している。
【図１８】図18は、セツキシマブ/TGP1複合体のMMP9切断がMDA-MB-468細胞への425の結合を回復させることを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書に記載の方法および組成物は、正常組織内での活性を回避する一方で、治療活性抗体または他の治療用タンパク質分子と疾患部位の標的細胞との分子相互作用を促進する。これを達成するために、治療用分子は、そのエピトープ／リガンド結合部位を可逆的に覆い隠してそれにより正常組織内での抗原認識および会合を阻止することにより「不活性化」される。しかしながら、治療用の抗体またはタンパク質に対して薬理活性を回復してそのコグネイトのエピトープまたはリガンドに自由に結合するようになるように、疾患部位または標的部位で主に起こる分子事象が活用される。
【００１６】
この手法は、本明細書中では、抗体の抗原結合部位のマスキングまたは覆い隠しであると称され、その組換えタンパク質は、「マスク」と称される。抗体の抗原結合部位のマスキングは、疾患組織内のその抗原に結合する抗体の能力を潜在的に阻害する可能性があるので、抗体を活性化する機序が必要とされ、これは、好ましくは、疾患部位またはその近位で行われるであろう。
【００１７】
したがって、本発明は、抗体の抗原結合部位を可逆的に覆い隠すマスキングリガンドを特徴とする。一般的には、そのマスキングリガンドは、抗体が特異的に結合する抗原のエピトープを含み、好ましくは、エピトープの少なくとも2つのコピーを含み、各コピーは、切断可能なポリペプチドリンカーを介して他方に連結される。エピトープの各コピーは、抗体上の抗原結合部位の1つと相互作用する。そのような抗体は、好ましくは二価であり、さもなければ少なくとも2つの抗原結合部位を含む。二価マスクの例は、図1および2に示される。
【００１８】
リンカーは、特定のタンパク質分解酵素、好ましくは、疾患組織内で高度に発現されるような酵素により切断可能なポリペプチド配列を含みうる。そのような酵素のいくつかの好ましい例としては、MMP1〜28のいずれかを含むマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）が挙げられる。他の好適な酵素としては、前立腺特異的抗原（PSA、セリンプロテアーゼ）、ADAMプロテアーゼ（ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ）、およびプラスミノーゲンアクチベーターが挙げられる。一般的には、酵素は、疾患関連プロテアーゼ、たとえば、疾患部位で高レベルで発現されるプロテアーゼであることが好ましい。いくつかの好ましい態様では、プロテアーゼは、前立腺癌をはじめとする癌によって上昇したレベルで発現される。リンカーが切断されると、分離されたマスクに対する抗体の親和性は低下し、マスクは、疾患組織の部位で抗体から解離する。非マスク化(unmasked)抗体は、「活性化」された状態になり、好ましくは、解離したマスクの拡散により支援されて疾患組織内の標的細胞上のそのコグネイト抗原に優先的に結合可能であり、その際、マスクは、血流中に移行可能であり、かつ代謝および／または排泄可能である。
【００１９】
リンカーは、標的組織内に存在する1種以上の酵素により消化されるタンパク質分解切断部位を含みうる。いくつかの好ましい態様では、タンパク質分解酵素は、疾患に罹患した標的組織内でのみ特異的に発現されるであろう。たとえば、前立腺特異的抗原は、前立腺で特異的に見いだされるタンパク質分解酵素であり、これは、特定のアミノ酸配列を認識して切断する（Khan and Denmeade, The Prostate 45: 80-83, 2000、DeFeo-Jones, et al., Mol. Cancer Therap. 1: 451-459, 2002）。いくつかの態様では、正常組織内よりも疾患組織内でより高度に発現され、かつ腫瘍の形成、浸潤、および転移で本質的な機能を担うタンパク質分解酵素、たとえば、レグマインおよびマトリックスメタロプロテイナーゼにより、その切断部位が認識されるであろう（Liu, et al., Cancer Research 63: 2957-2964, 2003、Egeblad and Werb, Nat. Rev. Cancer 2: 161-174, 2002、Overall and Lopez-Otin, Nat. Rev. Cancer 2: 657-672, 2002）。特に、MMP-9およびMMP-2は、腫瘍進行のすべてのステージに関連しており、広範にわたるさまざまな固形腫瘍の浸潤性の一因となる（Kline, et al., Mol. Pharmaceutics 1: 9-22, 2004）。いくつかの好ましい態様では、ポリペプチドリンカーは、配列番号5を含む。
【００２０】
適切な切断部位の選択および設計は、疾患標的部位における対応するタンパク質分解酵素（複数可）の出現度によって誘導されうる。公知のタンパク質分解酵素に対する切断認識配列を列挙し、プロテアーゼおよびその特異的基質を同定するためのデグラドミクスの使用を記述するデータベースたとえばMEROPSおよび文献を、利用可能である（Lopez-Otin and Overall, Nature Reviews Molecular Cell Biology 3: 509-519, 2002、Doucet, et al., Mol. Cell. Proteomics 7: 1925-1951, 2008）。MMP-1およびMMP-9に対する基質の最適化方法もまた、開示されている（McGeehan, et al., J. Biol. Chem. 269: 32814-32820, 1994）。
【００２１】
MMP切断部位を有しかつEGFRに特異的なモノクローナル抗体（mAb）の結合部位を覆い隠すことが可能である二価マスクの例示的モデルを図3に示す。このモデルでは、腫瘍組織内で高度に発現されるMMPは、腫瘍細胞により分泌され、腫瘍微小環境中に放出される。MMPは、治療用mAbに結合されたマスクを連結するリンカー中のタンパク質分解部位を認識して切断する。結果として、切断されて今や一価になったマスクのmAbに対する親和性は、低減され、該マスクは、抗体から解離する。抗体のエピトープ結合部位は、この時点では「非マスク化」されており、腫瘍細胞上の抗原EGFRに結合可能である。
【００２２】
マスキングリガンドは、任意のタイプの抗体ならびに任意のアイソタイプおよびイディオタイプの抗体に対して使用可能である。リガンドは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、抗体フラグメントたとえばFabおよびFv、ファージディスプレイ抗体などに対して使用可能である。このほかに、抗体は、多重特異性を有するように工学操作可能である。たとえば、抗体は、他の抗原結合部位とは異なる抗原に特異的に結合する抗原結合部位をそれぞれ含む異なる重鎖及び軽鎖対を含みうる。したがって、抗体は、２つ以上の抗原に特異的である（２つ以上の抗原と交差反応する反応性抗原結合部位とは別個のものとする）。そのような抗体の例としては、ダイアボディーが挙げられる。同様に、同一抗原の同一または異なるエピトープに結合するmAbを多価マスクにより連結して、標的組織での治療効果を増強することが可能である（図1、6）。罹患組織および正常組織の両方で抗原を認識するmAbが悪性および炎症性状態の治療にますます用いられるようになっているので、正常組織に有害な副作用を生じる危険性がある。
【００２３】
本発明で使用可能である好適な抗体の例としては、上皮増殖因子（EGFR）、erbB2、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、インスリン様増殖因子（IGFR）、血管内皮増殖因子（VEGF）、VEGFレセプター（VEGFR）、CD20、CD11A、CD25、腫瘍壊死因子（TNF）、TNF-α、TNF-αレセプター、および癌胎児性抗原（CEA）に特異的に結合する抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。したがって、本発明のいくつかの態様では、正常組織内の抗原に結合する抗体は、抗体により特異的に認識されるエピトープを含有する個別の組換えタンパク質を抗体に非共有結合させることにより低減される。エピトープという用語は、本明細書中では、抗体が結合する抗原上の部位を意味し、エピトープは、その天然のコンフォメーションのものであってもよいし、またはペプチド模倣体やミモトープなどのように中間体立体構造もしくは線状立体構造をとるものであってもよい。
【００２４】
エピトープは、抗体の抗原結合部位が特異的に結合する完全（全長）抗原を含みうる。エピトープは、抗体の抗原結合部位が特異的に結合する抗原の領域のみを含みうる。たとえば、エピトープは、抗原の断片でありうる。エピトープは、他のアミノ酸、ポリペプチド、またはタンパク質と融合可能である。エピトープは、化学修飾可能であり、かつ化学修飾は、マスク中のエピトープに対する抗体の親和性を低減させうる。ポリペプチドエピトープについては、エピトープは、1つ以上の突然変異を含んでもよく、その突然変異は、マスク中のエピトープに対する抗体の親和性を低減させるかさもなければ減弱させることができ、ひいては解離を促進することができる。該突然変異は、保存的アミノ酸であってよいが、その必要があるわけではない。該突然変異は、付加または欠失でありうる。該突然変異は、エピトープの構造を変化させることによりそのようなアミノ酸の配向に影響を及ぼしうるが、突然変異は、抗原結合部位が特異的に相互作用するアミノ酸である必要はない。
【００２５】
たとえば、セツキシマブおよびマツズマブ／425について、突然変異型マスク配列は、図4B〜Dに示され、図4Aに示される天然のEGFRドメインIIIエピトープよりもこれらのmAbに対して弱い親和性を有する（Kamat, et al., Cancer Biol. And Ther. 7:726-33, 2008）。リンカーが切断されると、マスクは、抗体から解離するであろう。また、腫瘍細胞の標的細胞上で発現された野生型EGFRドメインIII抗原は、比較的高い親和性で優先的に結合されるであろう。
【００２６】
いくつかの好ましい態様では、エピトープは、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10を含む。エピトープはまた、これらの配列から本質的になるものであってよく、あるいはこれらの配列からなる。
【００２７】
上述の概念および技術はまた、他の非抗体治療用タンパク質上のリガンド結合部位に対するマスクを調製するために使用可能である。リガンドとは、他の化学物質に結合して複合体を形成する分子または分子群のことである。いくつかの態様では、標的部位への治療剤の送達の増強のために、2つ以上の同一または別個の治療用タンパク質を多価マスキングリガンドで１つに連結することが可能である。
【００２８】
多価マスキングリガンドは、抗体の抗原結合部位または他の機能部位（すなわち、補体結合部位またはFcレセプター）を非共有結合で可逆的に覆い隠す。マスキングリガンドは、少なくとも2つのマスキング部分と1つの切断可能なリンカーとで構成されうる。
【００２９】
本発明は、天然で非共有結合状態である（すなわち、治療用または診断用の化合物たとえば抗体自体、の分子組成に影響を及ぼさない）マスキング複合体を包含する。したがって、本明細書に記載のマスキング複合体は、既存の薬剤の永久的な修飾や分子改変ではなく標的化遊離成分を示す。この特性により、本発明は、同一の巨大分子内にマスキング部分と標的結合部分とを含有する単一のタンパク質配列のタンパク質分解切断に焦点をあてた分野において類似の手法からは区別される。後者の場合、治療活性成分の分子組成は、永久的に改変される。
【００３０】
本明細書に記載のエピトープマスキング技術は、抗体相補性決定領域（CDR）を介する抗原／抗体境界の構造に関する詳細な知見に依存しうる。この情報は、臨床使用が承認されているかまたは臨床試験中であるほとんどの治療用抗体に関して入手可能である。こうした抗体としては、セツキシマブ、マツズマブ、パニツムマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ゲムツズマブオゾガミシン、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、ナタリズマブ、セルトリズマブペゴール、エタネルセプト、アダリムマブ、インフリキシマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ラニビズマブ、オマリズマブ、アルシツモマブ、イムシロマブペンテテート、カプロマブペンデチド、バシリキシマブ、パリビズマブ、ノフェツモマブ、ダクリズマブ、ファノレソマブ、およびウステキヌマブ（Ustekinemab）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
しかしながら、エピトープ構造が未知である場合でさえも、任意のモノクローナル抗体上の抗原結合部位を可逆的に覆い隠すために、汎用法を適用することも可能である。この方法のいくつかの態様では、特定のアイソタイプのすべての抗体に共通するフレームワーク領域を認識するリガンドを構築することが可能である。たとえば、癌治療で現在使用されているほとんどのモノクローナル抗体は、ヒトIgG1アイソタイプである。これらのmAbはそれぞれ、抗原認識のために特有かつ別個のCDRを有するが、ヒトIgG1分子はすべて、そこにCDRが組み込まれる共通フレームワークを共有する。こうした共有フレームワーク領域に結合してmAbのエピトープ結合部位を覆い隠す切断可能な多価マスキングリガンドは、一方のmAbのCDRが他方のmAbのCDRに並置される四量体型（またはそれより大きい）複合体を形成するために使用される（図8）。このようにして、各mAbのCDRは覆い隠され、標的細胞上の天然の抗原に結合することができなくなる。
【００３２】
汎用(generic)リガンドについては、マスク自体は、特定の免疫グロブリンアイソタイプたとえばヒトIgG1の可変ドメイン内に含有される共通フレームワーク残基を認識するモノクローナル抗体のCDRを含みうる。タンパク質分解切断部位は、以上に記載したように選択されリンカー中に工学的に導入される。また、標的組織内でのタンパク質分解切断により複合体が解離するので、「活性」治療用mAbが放出される。IgG1に対する汎用マスキングリガンドの例を配列番号6に示す。
【００３３】
他の選択肢として、タグたとえばHisまたはFLAG（登録商標）（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を付加することにより、CDRフレームワーク領域のN末端を誘導体化することが可能である。該タグは、タンパク質分解部位を有する汎用マスキングリガンドに可逆的に結合するための部位を提供する。結合されたリガンドは、ダイアボディーに結合するように設計され、その結果、mAbの抗原結合部位がマスキングされる（図8A）。ダイアボディーは、新しいクラスの小さい二価および多重特異性の抗体フラグメントであり、Kortt AA et al. (2001) Dimeric and trimeric antibodies: high avidity scFvs for cancer targeting Biomol. Eng. 18(3):95-108に詳細に記載されている。汎用マスキングリガンドに結合するダイアボディーはまた、図8bに示されるように、マスク化(masked)mAbの複合体を形成するために使用可能である。このタイプの汎用マスキングリガンドの例は、実施例8に記載されている。
【００３４】
マスキングリガンドは、抗体有効性およびエフェクター機能を改変したり、薬剤もしくはヌクレオチドを担持したり、またはプロドラッグを活性化する酵素を担持したりするものなどのようなC末端修飾を有する抗体と共に使用可能である。マスキング成分は、公知のFc（すなわちC末端抗体）の修飾のいずれに対してもそれと無関係に有効である。
【００３５】
本発明のいくつかの態様では、治療用として選択された特定のmAb（複数可）に結合する天然のエピトープ（複数可）を模倣した組換えマスクタンパク質が産生される。たとえば、MMP-9に対するタンパク質分解部位を含有するリンカーにより連結された、EGFRドメインIIIの天然エピトープの配列を有する2つのマスクを含む多価マスキングリガンド（配列番号7）は、図4Aに示される。これらのマスクは、種々の上皮癌を治療するために使用されるErbB1に対する2つの異なるmAbであるセツキシマブおよびマツズマブ／425の両方に結合するエピトープを含有する（Kamat, et al., Cancer Biology and Therapy 7: 726-733, 2008、およびLi, et al., Cancer Cell 7: 301-311, 2005に基づく）。図4Dは、セツキシマブに対する1つの改変マスクとマツズマブ／425に対する1つの改変マスクとを有する多価マスキングリガンド（配列番号10）を示している。このヘテロマスクは、2つの治療用抗体を１つに連結し、標的部位へのそれらの同時送達を可能にする。同一のタンパク質に対する2つの別個のmAbの使用は、腫瘍細胞において細胞増殖およびシグナル伝達を阻害するうえで相乗効果を有することが示されている（Kamat, et al., 2008）。同一の戦略は、公知のエピトープを用いて他の抗体に対して使用可能である。たとえば、ヒトIGF1Rを中和可能な2つのmAbは、米国特許第7,217,796号明細書に記載されている。一方のmAbは、アミノ酸残基309〜591を含むと考えられる構造ドメインに結合する。他方の抗体は、アミノ酸残基191〜309内のドメインに結合する。EGFRに関連して以上に記載したように、マスクは、これらの各抗体上の結合部位を覆い隠しかつ同時送達のために2つの別個の抗体を１つに連結させるように作製可能である。
【００３６】
本発明はまた、コグネイト抗体の抗原結合部位に非共有結合した本明細書に記載のマスキングリガンドを含む複合体を提供する。そのような複合体は、被験体を治療するために使用可能であるか、または標的組織内の特異的バイオマーカーを検出するために診断的に使用可能である。抗体は、第2の治療剤に連結可能であるか、または検出可能なマーカー、たとえば、蛍光タグ、色素、放射性同位体、または酵素に連結可能である。抗体は、翻訳後修飾またはさもなければ化学修飾が可能である。修飾としては、当技術分野で公知であるかそうでなくとも使用されているグリコシル化、アシル化、アルキル化、ビオチン化、アミド化、リン酸化、ペグ化、プレニル化、グリケーションなどが挙げられる。
【００３７】
そのような複合体と製薬上許容される担体および／または賦形剤とを含有する組成物もまた、提供される。そのような組成物は、不活性形態の治療用抗体を標的組織に送達するために使用可能である。組成物は、経口、静脈内、局所、腸内、非経口、および標的部位への直接注射または直接適用などをはじめとする任意の好適な方法により、必要とする哺乳動物被験体に送達可能である。投与量は、当技術分野で公知の方法に従って、使用される1種もしくは複数種の抗体に対しておよび各被験体に対して最適化可能である。担体としては、水、生理食塩水、緩衝溶液などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
抗体-マスク複合体を被験体に投与した後、抗体は、被験体の体内の適切な分子機構を通じて非マスク化されるであろう。そして、好ましくは標的組織内に保持され、そこでそのコグネイト抗原に結合し、利用される検出可能なマーカーのタイプに基づいてそれをその部位で画像化可能である。
【００３９】
本発明はまた、マスキングリガンドの作製方法を特徴とする。一般的には、この方法は、少なくとも1つのタンパク質分解酵素認識部位を含む切断可能なポリペプチドリンカーにエピトープを連結することを含む。マスキングリガンドの作製方法はまた、一般的には、少なくとも2つのエピトープを提供する工程と、切断可能なリンカーを提供する工程と、切断可能なリンカーを介してエピトープを連結する工程と、を含みうる。エピトープは、マスクが使用される治療用途に従って、またはマスクの化学的性質に従って、リンカーに連結可能である。たとえば、連結は、吸着、静電相互作用、電荷複合体化、イオン結合形成、または共有結合形成によるものでありうるか、またはバイオ分子テザー(tether)の使用を含みうる。
【００４０】
切断可能なリンカーを有する、標的エピトープを模倣したマスキングタンパク質またはマスキングペプチドは、遺伝子工学操作および組換えタンパク質の産生を介して、たとえば、標準的技術および実施例1に記載されるような市販のタンパク質発現系を用いて組換え細胞により、産生可能である。タンパク質およびペプチドはまた、t-Boc／Fmoc固相・液相技術のような当技術分野で公知の方法に従って、化学合成可能である。
【００４１】
特定の酵素に特異的な切断部位を含有するフレキシブルリンカーは、たとえば実施例2に記載されるような任意の適切な方法により調製される。好ましいリンカーは、アミノ酸配列(SSGS)n-VPLSLYS-(SSGS)m（たとえば、配列番号5）〔式中、n=1〜3かつm=1〜3、かつVPLSLYSは、MMP-9に対するタンパク質分解部位である〕を有する。しかしながら、マスクの正しいコンフォメーションおよび機能を可能にするリンカー配列はいずれも使用可能である。いくつかの適切なリンカーおよびその調製方法は、米国特許第6,541,219号明細書に記載されている。
【００４２】
いくつかの他の選択肢の態様では、図5に示されかつ実施例2に詳細に記載されるように、ポリエチレングリコールは、マスクとプロテアーゼ部位との間のリンカーになりうる。他の方法、たとえば、Krishnamurthy, et al., J. Am. Chem. Soc. 129:1312-1320, 2005に記載されるような方法を利用することも可能である。
【００４３】
他の選択肢として、完全マスキングリガンド、すなわち、特定の酵素に対する切断部位を含有する1つ以上のフレキシブルリンカーにより連結された2つ以上のマスクペプチド、たとえば、配列番号1〜4または配列番号7〜10をコードする遺伝的構築物を作製することが可能である。次に、この構築物を含む組換え細胞／生物を用いて、マスキングリガンドを作製する。分子生物学の標準的方法を用いて遺伝的構築物を調製し、任意の適切な発現系、たとえば、哺乳動物もしくは昆虫の細胞系、または細菌、酵母、もしくは植物の系を用いて、マスキングリガンドを作製することが可能である。
【００４４】
いくつかの態様では、2つの別個の(同一でない)マスクを連結する二価マスキング構築物が調製される（図1B）。この構築物を用いて2つの異なるmAbをマスキングかつ連結し、非常に安定な四価複合体を形成することが可能である（図6）。四量体複合体がタンパク質分解により破壊される場合、2つの一価のより弱く結合されたmAb-エピトープ複合体が生成される。一価複合体中のマスクと抗体との親和性は、大幅に低減され、マスクは、容易に解離して「活性」抗体を放出する。この現象は、Rao, et al., Science 280: 708-711, 1988により小分子を用いて試験され確認されている。
【００４５】
いくつかの態様では、別個のマスク化抗体は、図7に示されるように、マスクを架橋することにより複合体の状態で連結される。このようにして、2つ以上の抗体を標的部位に同時に送達することが可能である。
【００４６】
本発明はまた、本明細書に記載されるようなマスキングリガンドを少なくとも1つの抗体に接触させることを含む、抗体の抗原結合部位を可逆的に覆い隠す方法を提供する。マスキングリガンドは、そのコグネイト抗原結合部位に結合することによりマスク化抗体複合体を形成するであろう。マスキングリガンドおよび抗体は、適切な緩衝液たとえばリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で適切な化学量論比で組合せ可能である。リンカー長さに依存して、1:1または2:2の抗体:抗原複合体を形成することが可能である。
【００４７】
本発明はまた、治療の必要な被験体の治療方法を提供する。一般的には、この方法は、マスキングリガンドと抗体とを含む有効量の複合体、たとえば、本明細書に記載および／または例示した複合体を、被験体に投与することを含む。その複合体は、製薬上許容される担体中に入れて投与可能である。この方法は、好ましくは、EGFRの発現により特徴付けられる被験体の病的状態を治療すべく適合化される。そのような病的状態の例としては、結腸直腸癌（Frederic Bibeau, F et al. (2006) Assessment of epidermal growth factor receptor (EGFR) expression in primary colorectal carcinomas and their related metastases on tissue sections and tissue microarray. Virchows Arch. 449(3): 281-287）、非小細胞肺癌（Dacic, S et al. (2006) Significance of EGFR Protein Expression and Gene Amplification in Non-Small Cell Lung Carcinoma Am. J. Clin. Pathol.125(6):860-865）、膵臓癌（Dancer J et al. (2007) Coexpression of EGFR and HER-2 in pancreatic ductal adenocarcinoma: a comparative study using immunohistochemistry correlated with gene amplification by fluorescencent in situ hybridization. Oncology Reports 18:151-155、および Chadha KS et al. (2006) Activated Akt and Erk expression and survival after surgery in pancreatic carcinoma. Ann. Surg. Oncol. 13(7) 933-9）、頭頸部扁平上皮癌（Ang et al. (2002) Impact of epidermal growth factor receptor expression on survival and pattern of relapse in patients with advanced head and neck carcinoma. Cancer Research 62:7350-6、 Sok JC et al. (2006) Mutant epidermal growth factor receptor (EGFRvIII) contributes to head and neck cancer growth and resistance to EGFR targeting. Clin. Cancer Res. 12:5064-73、および Dassonville O et al. (1993) Expression of epidermal growth factor receptor and survival in upper aerodigestive tract cancer. J. Clin. Oncol. 11:1873-8）、乳癌（Milanezi et al. (2008) EGFR/HER2 in breast cancer: a biological approach for molecular diagnosis and therapy. Expert Rev. Mol. Diagn. 8(4):417-34）、卵巣癌（Maihle NJ et al. (2002) EGF/ErbB receptor family in ovarian cancer. Cancer Treat. Res. 107:247-58）、膀胱癌、および神経膠腫が挙げられる。
【００４８】
複合体の有効量は、被験体の生物種、血統、大きさ、身長、体重、年齢、全身の健康状態、製剤のタイプ、投与の形態または方法、治療される特定の病的状態のタイプおよび／または重症度（ただし、これらに限定されるものではない）をはじめとする多くの変動要因に依存する可能性があり、病的状態が癌である場合、癌の病期、転移の度合いなどに依存する可能性がある。適切な有効量は、当業者であれば、慣例的な最適化方法ならびに診療医の技量および情報に基づく判断さらには当業者に自明な他の因子を用いて、慣例に従って決定可能である。好ましくは、複合体の治療上有効用量は、被験体に実質的な毒性を引き起こすことなく治療効果を提供するであろう。
【００４９】
複合体の毒性および治療効果は、標準的な薬学的手順により、たとえば、LD50（集団の50%で致死的な用量）およびED50（集団の50%で治療上有効な用量）を決定するための手順により、細胞培養物または実験動物で決定可能である。毒性作用と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、比LD50/ED50として表現可能である。大きい治療指数を呈する作用剤または組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、被験体で使用するための投与量の範囲の策定に使用可能である。そのような作用剤または組成物の投与量は、好ましくは、毒性がわずかであるかまたはまったくないED50を含む循環血中濃度の範囲内にある。投与量は、利用される剤形および利用される投与経路に依存して、この範囲内でさまざまでありうる。
【００５０】
本発明に係る方法で使用される任意のマスク-抗体複合体に対して、治療上有効用量は、細胞培養アッセイのようなin vitroアッセイから最初に推定可能である。たとえば、細胞培養で決定されたようなIC50を含む循環血漿中濃度範囲を達成するように、動物モデルで用量を策定することが可能である。そのような情報を用いて、ヒトのような指定の被験体で有用な用量をより正確に決定することが可能である。治療医であれば、毒性または器官機能不全に基づいて、投与を終了したり、中断したり、または調整したりすることが可能であり、臨床応答が適正ではない場合、応答を改善するために、必要に応じて治療を調整することが可能である。
【００５１】
いくつかの態様では、被験体に投与される複合体の用量はまた、1日あたり投与される薬剤の全量に関して測定可能である。アンギオシジンの最適用量よりも少ないより少量の投与量で治療を開始し、続いて、その状況下で最大の効果が到達されるまで、治療期間全体を通じて投与量を増加させることが可能である。所要により、1日あたりの全投与量を分割し、１日を通じて何回かに分けて投与することが可能である。複合体は、単独でまたは他の活性成分との組合せで投与可能である。
【００５２】
本発明をより詳細に説明するために、以下の実施例を提供する。実施例は、本発明を限定するものではなく例示することを意図したものである。
【実施例１】
【００５３】
セツキシマブ（Cetuximab； C225）およびマツズマブ（Matuzumab）／425の抗原結合部位を覆い隠すように遺伝子工学操作された切断可能な多価マスキングリガンド
これ以降でTGP1と称されている多価マスキングリガンドのすべての構成部分を1つの組換え遺伝子から発現させた（図4A）。セツキシマブ／マツズマブ（425）結合マスク（EGFRドメインIIIエピトープ）、MMP-9切断部位を含有するグリシン-セリンリンカー（GGGSGGGSGGGSVPLSLYSGSTSGSGKSSEGSGSGAQG）（配列番号11）、および第2のセツキシマブ／マツズマブ（425）結合マスクをこの順番で含む単一のタンパク質を自動化学DNA合成により製造した。組換えタンパク質の精製を支援するために、ポリヒスチジン精製タグ（6-His）を組換え遺伝子構築物のC末端に組み込んだ。この実施例ではその2つのマスクは同一であるが、図4に対する説明文に記載されるように、2つの別個の抗体を連結するために別個のものであってもよい。次に、組換え遺伝子をバキュロトランスファー発現ベクター（pVL1392（Invitrogen））中にライゲートし、これをBaculogoldTM線状化バキュロウイルスDNA（Pharmingen）およびCellfectin（登録商標）（Invitrogen）と共にツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）細胞系sf9（BD Biosciences）に添加した。組換えバキュロウイルス（recBV）を含有する上清を収集して4℃で貯蔵した。High FiveTM昆虫細胞（Invitrogen）を用いてウイルスストックの力価を測定した。具体的には、ウイルスストック感染の24時間後、細胞の球状化、剥離、および分裂不全などのような感染の徴候に関して、光学顕微鏡法により細胞を調べた。細胞の100%が感染の徴候を示す場合を最適力価と定義した。1細胞あたり5〜10感染単位で感染させた「High Five」細胞内で組換え多価マスキングリガンドを産生させ、それを分泌させて上清中に蓄積し、それを収集して遠心分離し、細胞片を除去した。清澄化された上清を、250mM NaCl、5mMイミダゾール、プロテアーゼ阻害剤カクテル（セットIII、CalBiochem）を含有する緩衝液で平衡化させ、ポリヒスチジンタグを特異的に結合するアフィニティークロマトグラフィー（Ni-Hisカラム）により組換えタンパク質を精製した。高濃度のイミダゾール（300mM）を含有する緩衝液によりNi-Hisカラムから溶出された材料のゲル電気泳動により、レーン4〜7で予想分子質量の単一バンドが示された（図9）。予想どおり、このバンド中のタンパク質は、ヤギHRPコンジュゲート化抗マウスIgGにより検出されるマウス抗His6抗体（Genscript）を用いたイムノブロット分析における反応性により実証されるように、Hisタグを含有していた（図10）。TGP1を含有する画分を1mM DTTで処理し、50mMトリスpH7.5、150mM NaClで一晩透析した。
【００５４】
Ni-His樹脂に結合された精製TGP1タンパク質を用いてセツキシマブを固定した（図11および12）。約4μgのTGP1を含有する10mLの収集した媒体を150mL Ni-Hisビーズ上にローディングし、これを2つのカラム中に分割導入した。それに加えて対照目的で、TGP1を有しない50μl Ni-Hisビーズを2つのカラムに充填した。50mMトリスpH8.0、250mM NaCl、40mMイミダゾール、20%グリセロールでカラムを洗浄した。以上の緩衝液中の20μg mAb C225またはヒトLewisYを認識する対照抗体（15-6A）を室温で各カラムに10分間適用し、続いて、同一の緩衝液で洗浄した。300mMイミダゾールを含有する100μLの緩衝液を用いて、結合したタンパク質を溶出させた。示された結果は、天然の抗体立体構造を保持すべくDTTを有していないSDS色素緩衝液中の溶出液のクーマシーブルー染色ゲルの結果であり、Mは、分子量マーカーを表す。染色およびニトロセルロースへの転写のために、各溶出液の20μLのアリコートをSDSゲル上で泳動させた。セツキシマブは、TGP1に結合したが、陰性対照抗体15-6Aは、結合しなかった。15-6A抗体は、昆虫細胞で産生された組換えTGP1マスクの一部ではない糖鎖抗原ヒトLewisYを認識する（15-6A; Rodeck et al., Hybridoma 6:389-401, 1987）。
【００５５】
示された結果は、天然の抗体立体構造を保持すべくDTTを有していないSDS色素緩衝液中で電気泳動された溶出液の結果である（図11）。対照抗体（15-6A）はTGP1により保持されなかったので、TGP1へのセツキシマブの結合は、特異的であった。セツキシマブに一致する単一のタンパク質種が、未変性ゲル電気泳動ではっきりと認められる一方、変性条件下では、重鎖および軽鎖に一致するいくつかのタンパク質種は、セツキシマブ溶出液では回収されたが、対照15-6A溶出液では回収されなかった（図12）。サイズが重鎖および軽鎖に対応するこれらのタンパク質種は、ウサギ抗ヒトIgGに続いてペルオキシダーゼコンジュゲート化ヤギ抗ウサギIgGとペルオキシダーゼコンジュゲート化ヤギ抗マウスIgGとの混合物により認識された（図12）。予想どおり、ネズミIgフラグメントは、陰性対照抗体15-6Aの場合、TGP1 Ni-Hisカラムからの溶出液では検出されなかった。分子量マーカー（M）の右側のC225および15-6Aで示されるレーンは、Ni-Hisカラムに通していないストック抗体のレーンである。
【００５６】
MMP9（Calbiochem）曝露を利用したTGP1タンパク質の切断は、室温および37℃の両方で漸増量の組換えMMP9の存在下における予想質量の切断産物の出現により実証された（図13）。TGP1の切断はまた、セツキシマブの存在下でも起こったことから、抗体の存在は、TGP1上のプロテアーゼ標的部位の接近可能性を阻害しなかったことが示唆される（図14）。
【００５７】
TGP1をセツキシマブと混合した場合、標的抗原EGFRを強力に発現する乳癌細胞MDA-MB-468へのセツキシマブの結合は、FACS分析による測定で、セツキシマブCDRの効率的なマスキングに一致して、90%超も低減された（図15）。TGP1を425抗体と前混合した場合、類似の結果が得られたが（図16）、平均蛍光強度により測定した425の結合は、EGFRに対する425の親和性が全体的により弱いことが以前に観察されていることに一致して、セツキシマブの結合よりも弱かった（Donaldson et al., Cancer Biol and Ther. 8:2135-40）。これらの実験は、4℃で行われ、マスク化（masked）抗体および非マスク化（unmasked）抗体は、標的細胞と共に30分間インキュベートされた。逆に、MMP9の添加によりMDA-MB-468標的細胞へのC225および425の結合が回復したこと（図17および18）から、タンパク質分解酵素の存在を条件とする可逆的結合阻害が実証された。後者の実験は、マスク化抗体および非マスク化抗体を標的細胞と共に15℃で2時間インキュベートすることにより行われた。全体として、これらの結果から、TGP1マスクのMMP9切断による効果的なマスキングおよびアンマスキングが実証される。
【００５８】
まとめると、非共有結合された多価抗原エピトープ(マスク)を用いて、治療有用性または診断有用性を有するモノクローナル抗体上の抗原結合部位を可逆的に閉塞可能であることが実証された。疾患関連酵素による多価化合物の切断により一価相互作用に減少させると、一価性への減少によりコグネイト抗体との相互作用が弱まり、複合体の解体につながり、標的（たとえば腫瘍細胞）上でのおそらく二価の抗原の連結が促進されることがさらに示された。これらの実験は、この概念の実現可能性を強調するものである。
【００５９】
すでに行われた研究から、セツキシマブとTGP1との間のおそらく二価相互作用複合体は、ある程度、自然に解離する可能性があることが明らかにされた。これがin vivoで問題を呈するのであれば、たとえば、図4B〜Dに略図で示されるような「ヘテロマスク」よりなる非常に安定な四価複合体を構築することにより、部分的には回避可能である。いくつかの態様では、1つの抗体のみではなく2つの別個の抗体（たとえば、セツキシマブおよびマツズマブ）との相互作用を助ける点突然変異をマスクに工学的に導入することが可能である。いずれの抗体が二価性であっても、第2のFabが第2のヘテロマスクに対するドッキングステーションとして機能して「頭-頭」配向の四価複合体をもたらす分子配置を助けるであろう。四価相互作用の親和性は、二価相互作用の親和性よりもかなり高く、koffの低下により複合体の自然解体を低減させるであろう。しかしながら、二価複合体または四価複合体のいずれをプロテアーゼ切断しても、例外なく、個別のFabを有する所与のマスク断片の一価相互作用への減少をもたらすであろう。この立体構造では、抗体分子と膜結合型細胞結合抗原との二価相互作用が有利である。治療目的と組み合わせて使用可能な異なる治療用抗体に対応するまったく異なるマスクを用いて、類似の四価複合体を構築することが可能である。
【００６０】
マスク-抗体複合体の低すぎる親和性から生じる問題に対処するためのマスク自体のさらなる改変は、Ig分子上のフレームワーク残基を認識する「汎用(generic)」非共有結合リガンドの使用でありうる。これは、プロテアーゼ感受性配列をも含有しうるペプチドリンカーによりマスクに追加可能である。この態様では、切断されていない個別マスクの親和性は、二価相互作用により増大される。しかしながら、疾患部位で一般的なプロテアーゼは、タンデムマスク複合体の破壊をもたらすだけでなく、追加のフレームワーク相互作用部分による各個別マスクの伸長部をも切断するので、マスク親和性を単純な一価相互作用と等価なものに減少させる。
【００６１】
これらを考慮することにより、臨床有用性を有する柔軟な設計を達成すべく非共有結合マスクの基本設計に改変を加えることができることを明確に示す。
【実施例２】
【００６２】
mAbの抗原結合部位を覆い隠すマスクの調製およびリンカーへのマスクの化学結合によるマスキングリガンドの形成
これは予測実施例である。以上に概説した組換えタンパク質発現技術を用いて組換えマスクを産生および精製し、次に、リンカーを介して化学修飾により第2のマスクに連結することが可能である。たとえば、Scheck and Francis, ACS Chemical Biology 2: 247-251, 2007; Scheck, et al., J. Am. Chem. Soc. 130: 11762-11770, 2008に記載されるように、N末端アミノ基転移を介して第1のマスクタンパク質のN末端に反応性基を付加することが可能である。次に、反応性基（ケトンまたはアルデヒド）を用いてリンカータンパク質をマスクタンパク質に化学結合させることが可能である。
【００６３】
配列番号5の配列〔式中、m=1かつn=1〕を有する連結ペプチドは、標準的製造プロトコルに従って化学合成可能である。連結ペプチドは、一方の末端にアルコキシアミンおよび他方の末端に反応性硫黄基を含有可能である。リンカーは、第1のマスク上の反応性基に結合可能であり、非反応性リンカーは、限外濾過により除去可能である。第2のマスクは、N末端システインまたはC末端システインを有するように工学操作可能である。リンカー上の反応性スルフヒドリル基は、二官能性マレイミド反応を介してこのシステイン部分に結合可能である。
【００６４】
ポリエチレングリコールは、マスクとプロテアーゼ部位との間のリンカーとして代用可能である。エチレングリコール単位(1〜10個)をMMP-9切断ペプチドVPLSLYSのN末端およびC末端に化学的に結合させて、NH2-(EG)n-VPLSLYS-(EG)m-NH2〔式中、EGは、エチレングリコールであり、かつnおよびmの値は、1〜10の範囲内である〕を得ることが可能である。次に、標準的化学手順を介して、エチレングリコールから伸びたアミン基をオキシムに変換することが可能である。ピリドキサール-5'-リン酸反応（Scheck and Francis, ACS Chem. Biol. 2: 247-251, 2007に記載）を適用して各抗体上にジアルデヒド基を形成することが可能である。次に、図5に示されるように、修飾型マスクをオキシム-(EG)n-VPLSLYS-(EG)m-オキシムと混合して、完全マスキングリガンド(マスク-(EG)n-VPLSLYS-(EG)m-マスク)、を生成することが可能である。
【００６５】
完全多価マスキングリガンドは、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または分取未変性ゲル電気泳動のような任意の適切な方法により精製可能である。セツキシマブ用として得られる多価マスキングリガンドは、72〜74kDの概略分子量を有するであろう。
【実施例３】
【００６６】
mAb又はmAb群へのマスキングリガンドの結合
これは予測実施例である。実施例2の多価マスキングリガンドは、標準的緩衝液（たとえば、PBS、TBS）中、セツキシマブに対するmAbとほぼ化学量論量で混合して、該抗体に結合させることができる。マスク化抗体複合体の得られる化学量論比は、1:1または2:2のマスキングリガンド:抗体になるであろう。サイズ排除クロマトグラフィーを用いて所望の生成物を精製することが可能である。1:1混合物の分子量は、約225キロダルトンになるであろう（抗体は約150 kDであり、マスキングリガンドは約75 kDである）。2:2混合物の分子量は、約450kDになるであろう。この実施例では、多価マスキングリガンドのマスクは同一である。
【００６７】
ヘテロマスキング（同一でない）リガンドを生成するために、別個の抗体（たとえば、抗Her2および抗IGFR）をヘテロマスキングリガンドと1:1:2の比で混合し、そのリガンドを該抗体に結合させることが可能である。サイズ排除クロマトグラフィーを用いてマスク化抗体複合体を精製することが可能である。
【００６８】
マスク化抗体複合体を約2mg/mLに濃縮し、生理食塩水緩衝液に交換し、そして4℃で貯蔵すべく滅菌濾過することが可能である。複合体の化学量論比は、沈降速度プロトコルまたは沈降平衡プロトコルのいずれかを用いて分析用超遠心分離により検証可能である（Kamat, et al. 2008）。マスキング効率は、表面プラズモン共鳴（SPR）およびFACS分析を介して試験可能である。SPRを用いれば、天然レセプターをチップのような表面基材に物理的に結合させ、天然抗体を用いて較正することが可能である。単離および精製されたマスク化抗体複合体をセンサー上を通過させて結合レベルを検出することが可能である。マスク化抗体複合体を適切なプロテアーゼ（たとえば、市販のMMP-9）で切断して、切断を検証することが可能である。切断されると、マスキングリガンドは、一価になり、治療用抗体は、チップ上の抗原に分配されるであろう。この手順はまた、マスク化抗体の臨床調製物に対する診断手段として使用可能である。SPR法およびFACS法は、当技術分野で公知である。
【００６９】
図7に示されるように、マスク化抗体のマスキングリガンドを架橋することにより、2つ以上の抗体の複合体を作製することが可能である。このようにして、複数の抗体を標的部位に同時に送達して有効性を増大させることが可能である。
【実施例４】
【００７０】
mAbに対してより弱い親和性を有するマスクの調製
これは予測実施例である。非マスク化抗体の解離および標的組織内の抗原への結合を増強するために、抗体に対して弱められた親和性を有するマスクを調製することも可能である。抗体-抗原境界においてマスクペプチド中に点突然変異を発生させることが可能である。ほとんどの治療用抗体は、動物源から単離され、次に、ヒト化されてきた。一般的には、宿主生物（マウス、ラット、ウサギ、ヤギなど）はまた、相同タンパク質をコードする。抗原および宿主由来の相同タンパク質の配列比較により、可能性のあるエピトープの選択が限定される。しかしながら、抗原の溶媒露出表面上での生物間の配列差を比較することにより、選択を促進することが可能である。宿主配列に対する露出配列の相違の復帰は、構造完全性を確保するのに役立つ。Kamat, et al., 2008に記載されるように、結合親和性を1/10〜1/1000に低下させる復帰突然変異体を用いて、治療用抗体に対する隠蔽剤の親和性を弱めることが可能である。
【実施例５】
【００７１】
汎用マスキングリガンドによる抗体のマスキング
これは予測実施例である。図8Aに示されるように、「汎用」マスキングリガンドを用いて、抗原特異性に関係なく抗原結合部位をマスキングすることが可能である。汎用エピトープ（たとえば、FLAG（登録商標）（Sigma-Aldrich）またはHisタグ）に続いて組織特異的プロテアーゼ切断配列（たとえば、MMP9）を治療用抗体のN末端に遺伝的に付加することが可能である。図8Aに示されるように、タグは、ダイアボディーに結合することにより、抗体の抗原結合部位をマスキングする。マスクは、タンパク質分解部位のタンパク質分解切断により除去可能である。また、図8Bに示されるように、こうした汎用マスキングリガンドを用いて2つの抗体分子のフレームワーク領域を連結することにより、それらの抗原結合部位をマスキングし、四量体構造を形成することが可能である。
【実施例６】
【００７２】
被験体における標的組織へのマスク化抗体の送達
これは予測実施例である。マスク化抗体複合体は、生理食塩水緩衝液中に入れて投与の必要な哺乳動物被験体に静脈内投与することが可能である。投与量および投与頻度は、抗体のタイプおよび被験体の生理機能により決定される。投与量は、70〜80kgの被験体に対して約50〜500mgになるであろうと予測される。
【００７３】
投与されると、抗体複合体は、循環系により拡散されて組織により取り込まれる。正常組織では、抗体複合体は、元の状態を維持して保持されない。疾患組織または腫瘍組織では、マスク間のリンカーは、内因性タンパク質分解酵素により切断され、マスクは、抗体から解離し、抗体は、腫瘍細胞上の表面抗原に結合する。未結合マスク化抗体は、最終的には分解されて排泄される。
【００７４】
本発明は、以上に記載および例示された実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲内で変更および修正が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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