(57)【要約】  本発明は、オーファン核内受容体ＲＯＲガンマのモジュレーター、並びにＲＯＲガンマ活性の新規モジュレーターの同定及びスクリーニング方法のほか、このような方法により同定された新規ＲＯＲガンマモジュレーターによるＲＯＲガンマ媒介性疾患の治療方法に関する。【選択図】  図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＯＲガンマ受容体の抑制又は活性化に関連した疾患又は障害の治療又は予防に使用するためのＲＯＲガンマモジュレーター。
【請求項２】
ＲＯＲガンマ受容体の抑制又は活性化に関連した疾患又は障害を治療又は予防する医薬品を調製するためのＲＯＲガンマモジュレーターの使用。
【請求項３】
ＲＯＲガンマ受容体活性が低減される、請求項１若しくは２に記載の使用のためのＲＯＲガンマモジュレーター又は請求項１若しくは２に記載の使用。
【請求項４】
Ｔｈ１７細胞の分化及び活性並びにこれらの細胞からのＩＬ−１７の分泌が低減される、請求項３に記載の使用のためのＲＯＲガンマモジュレーター又は請求項３に記載の使用。
【請求項５】
疾患又は障害が、Ｔｈ１７媒介性組織炎症、又は疼痛、掻痒、若しくは表皮剥脱などの、自己免疫疾患若しくは皮膚疾患に関連した症状である、請求項４に記載の使用のためのＲＯＲガンマモジュレーター又は請求項４に記載の使用。
【請求項６】
疾患又は障害が、自己免疫疾患、炎症性皮膚疾患、及び多発性硬化症から成る群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のためのＲＯＲガンマモジュレーター又は請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
自己免疫疾患が関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（クローン病）、潰瘍性大腸炎及び１型糖尿病から選択される、請求項６に記載の使用のためのＲＯＲガンマモジュレーター又は請求項６に記載の使用。
【請求項８】
自己免疫疾患が関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（クローン病）、及び潰瘍性大腸炎から選択される、請求項６に記載の使用のためのＲＯＲガンマモジュレーター又は請求項６に記載の使用。
【請求項９】
炎症性皮膚疾患がアトピー性湿疹及び乾癬から選択される、請求項６に記載の使用のためのＲＯＲガンマモジュレーター又は請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
式（Ｉ）
【化１】
2012506998.tif 000007
の化合物又は溶媒和物又は薬学的に許容可能なこの塩
（式中
Ｒ５はＣＯＮＨＲ８、ＮＨＣＯＲ８、Ｃ（Ｏ）Ｒ８、ＣＨ＝ＣＨＲ８、Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨＲ８、Ｃ≡ＣＲ８、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ＝ＣＨＲ８、Ｃ（Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＲ８、５〜６員環ヘテロシクリル−Ｒ８であり、
Ｒ６は水素であり、
Ｒ５及びＲ６は共に
【化２】
2012506998.tif 000008
も形成することができ、
Ｒ７は水素、フッ素、塩素又はヒドロキシであり、
Ｒ８は４−イル−安息香酸又は６−イル−２−ナフトエ酸であり、
Ｒ９及びＲ１０は水素であり、又はＲ９及びＲ１０はこれらが付着する結合と共に融合５〜１０員のへテロ芳香族環又は芳香族環で、単環又は二環を形成する）
を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のためのＲＯＲガンマモジュレーター又は請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
ＲＯＲガンマ受容体の抑制又は活性化に関連した疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、ＲＯＲガンマモジュレーターの有効量をこのような治療を必要とする被験者に投与するステップを含む方法。
【請求項１２】
ＲＯＲガンマモジュレーターとしての化合物（Ｚ）−４−（１０，１０，１３，１３，１５−ペンタメチル−１１，１２，１３，１５−テトラヒドロ−１０Ｈ−ジナフト［２，３−ｂ：１’，２’−ｅ］［１，４］ジアゼピン−７−イル）安息香酸（ＬＥ５４０）、（Ｚ）−４−（５，７，７，１０，１０−ペンタメチル−７，８，９，１０−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｅ］ナフト［２，３−ｂ］［１，４］ジアゼピン−１３−イル）安息香酸（ＬＥ１３５）、（Ｅ）−４−（２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）プロプ−１−エニル）安息香酸（ＴＴＮＢＰ）、（Ｅ）−４−（３−（３，５−ジ−テルト−ブチルフェニル）−３−オキソプロプ−１−エニル）安息香酸（Ｃｈ５５）。
【請求項１３】
生化学無細胞インビトロアッセイ系でＲＯＲガンマ活性のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）このような細胞培養系又は生化学アッセイ系でＲＯＲガンマ活性の計測値を誘導又は低減するのに十分な、請求項１０又は１２に記載のＲＯＲガンマモジュレーターの有効量をこのようなアッセイ系に投与するステップと、
（ｂ）測定された活性を参照ＲＯＲガンマモジュレーターの活性と比較するステップ
とを含む方法。
【請求項１４】
生化学アッセイ系が、配列ＳＥＱ１の組換え発現ＲＯＲガンマタンパク質及びＳＥＱ２又は３の配列を有するコアクチベーターペプチドと併用する、均一時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＨＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイ、放射性リガンド結合及び置換アッセイから選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
参照ＲＯＲガンマモジュレーターが、請求項１０又は１２に記載の１つ又は複数の化合物であり、新たに同定されるモジュレーターの活性をモニターするための対照として使用される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、オーファン核内受容体ＲＯＲガンマ（ＲＯＲｇａｍｍａ）のモジュレーター、並びにＲＯＲガンマ活性の新規モジュレーターの同定及びスクリーニングの方法のほか、このような方法により同定された新規ＲＯＲガンマモジュレーターによるＲＯＲガンマ媒介性疾患の治療方法を提供する。
【０００２】
レチノイド受容体関連オーファン受容体は、３つのファミリーメンバー、すなわち、ＲＯＲα（Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９３年、１９４：１３７１〜１３７９頁）、ＲＯＲβ（Ａｎｄｒｅら、Ｇｅｎｅ  １９９８年、５１６：２７７〜２８３頁）及びＲＯＲγ（Ｈｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９８年、９：７９７〜８０６頁）から成り、核内受容体スーパーファミリーのＮＲ１Ｆ（ＲＯＲ／ＲＺＲ）サブグループを構成する（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、Ｃｅｌｌ  １９９５年、８３：８３５〜８３９頁）。
【０００３】
核内受容体スーパーファミリーは、超可変Ｎ末端ドメイン、保存ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、ヒンジ領域、及び保存リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）から成る共通のモジュール構造ドメインを共有する。ＤＢＤは特定のＤＮＡ配列（核ホルモン応答エレメント、すなわちＮＲＥ）に対する受容体をターゲットとし、ＬＢＤは内因性又は外因性化学リガンドの認識において機能する。構成的転写活性化ドメインはＮ末端（ＡＦ１）で見出され、リガンド調節転写活性化ドメインは、典型的なＮＲではＣ末端ＬＢＤ内に埋め込まれている。核内受容体は、核内受容体の標的ＮＲＥに結合した際に、転写活性化状態又は抑制状態で存在し得る。遺伝子活性化の基本的機構は、共調節タンパク質、すなわちコアクチベーター及びコリプレッサーのリガンド依存的交換を伴う（ＭｃＫｅｎｎａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．１９９９年、２０：３２１〜３４４頁）。抑制状態でのＮＲは、そのＤＮＡ認識エレメントに結合しており、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣＳ）を動員するコリプレッサータンパク質と結合している。アゴニストの存在下では、コリプレッサーはコアクチベーターと交換され、コアクチベーターはクロマチンリモデリング複合体の構築に寄与する転写因子を動員する。クロマチンリモデリング複合体は、ヒストンアセチル化を介して転写抑制を緩和し、転写開始を刺激する。ＬＢＤのＡＦ−２ドメインは、コリプレッサー又はコアクチベータータンパク質の相互作用面を提示する、及び核内受容体スーパーファミリーのメンバーにより共有される遺伝子活性化又は抑制の保存された機構を提供する、リガンド依存性分子スイッチとして作用する。
【０００４】
核内受容体のＮＲ１Ｆファミリーのメンバー（ＲＯＲガンマなど）は、既知のリガンドの非存在下では、構成的活性型転写因子と考えられ、エストロゲン関連受容体アルファと類似する（Ｖａｎａｃｋｅｒら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９９９年、１３：７６４〜７７３頁）。ＥＲＲアルファについては、ＥＲＲアルファ／ＰＧＣ１アルファシグナル伝達を妨害することによりＥＲＲアルファ転写活性を低減する合成インバースアゴニストが記載されている（Ｗｉｌｌｙら、ＰＮＡＳ  ２００４年、１０１：８９１２〜８９１７頁）。ＲＯＲガンマのインバースアゴニストは、例えば、ＲＯＲガンマの転写活性を低減し、ＲＯＲガンマにより制御される生物学的経路に機能的にマイナスの影響を及ぼすことが予期され得る。
【０００５】
ＲＯＲは、選択的スプライシング又は選択的転写開始部位から生じるアイソフォームとして発現される。これまで、アイソフォームは、Ｎ末端ドメイン（Ａ／Ｂドメイン）のみが異なると記載されてきた。ヒトでは、４つの異なるＲＯＲαアイソフォームが同定されたが（ＲＯＲα１〜４）、ＲＯＲβ（１及び２）及びＲＯＲγ（１及び２）の両方については２つのアイソフォームのみが知られている（Ａｎｄｒｅら、Ｇｅｎｅ  １９９８年、２１６：２７７〜２８３頁；Ｖｉｌｌｅｙら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９年、２９：４０７２〜４０８０頁）。ＲＯＲガンマは、ＲＯＲγ１及び／又はＲＯＲγ２の両方を記載する用語として使用される。
【０００６】
ＲＯＲアイソフォームは、異なる組織発現パターンを示し、異なる標的遺伝子及び生理学的経路を調節する。例えば、ＲＯＲγ２（ＲＯＲγ−ｔとも呼ばれる）はＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺細胞に高度に限定されるのに対し、他の組織はＲＯＲγ１を発現する（Ｅｂｅｒｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４年、３０５：２４８〜２５１頁）。
【０００７】
ＲＯＲは、核内受容体に特有の構造的構成を示す。ＲＯＲは、４つの主要な機能ドメイン、すなわち、アミノ末端（Ａ／Ｂ）ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、ヒンジドメイン、及びリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含有する（Ｅｖａｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８８年、２４０：８８９〜８９５頁）。ＤＢＤは、ＡＴリッチ配列に先行されるコンセンサスモチーフＡＧＧＴＣＡから成るＲＯＲ応答エレメント（ＲＯＲＥ）の認識に関与する、２つの高度に保存されたジンクフィンガーモチーフから成る（Ａｎｄｒｅら、Ｇｅｎｅ  １９９８年、２１６：２７７〜２８３頁）。該コンセンサスモチーフは、核内受容体Ｒｅｖ−ＥｒｂＡα及びＲｅｖ−Ｅｒｂβ（それぞれ、ＮＲ１Ｄ１及びＤ２）のコンセンサスモチーフと類似している（Ｇｉｇｕｅｒｅら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９９５年、２８：５９６〜５９８年）。これらの認識エレメントはまた、エストロゲン関連受容体、及び特にＥＲＲα（ＥＲＲ、ＮＲ３Ｂ１、−２、−３）（Ｖａｎａｃｋｅｒら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９９９年、１３：７６４〜７７３頁）、ステロイド合成因子１（ＳＦ−１、ＮＲ５Ａ）及びＮＧＦＩ−Ｂ（ＮＲ４Ａ１、−２、−３）（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９３年、１３：５７９４〜５８０４頁）について同定された認識エレメントとも高度な類似性を示している。
【０００８】
Ｒｅｖ−Ｅｒｂ受容体は構成的転写抑制因子として作用し、及び類似のＤＮＡ認識配列に結合することから、Ｒｅｖ−Ｅｒｂ受容体は、まさに同じＤＮＡ応答エレメントをＲＯＲと奪い合うことによりＲＯＲ媒介転写活性化を抑制することができる（Ｆｏｒｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９９４年、８：１２５３〜１２６１頁）。このような相互作用の生理学的意義は、体内時計の制御に重要な役割を果たす概日リズムの制御において明らかであり、概日リズムにおいて、Ｒｅｖ−Ｅｒｂ及びＲＯＲαが、それぞれＢｍａｌ１転写因子の転写を抑制及び活性化する（Ａｋａｓｈｉ及びＴａｋｕｍｉ、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００５年、１２：４４１〜４４８頁）。ＲＯＲのファミリーメンバーと、類似の認識エレメントに結合するＥＲＲαのような他の核内受容体との間のこのようなクロストークは、他の生理学的経路の制御でも同様に作用する可能性がある。
【０００９】
ＲＯＲαは、異なる脳領域で高度に発現され、小脳及び視床で最も高度に発現される。ＲＯＲαノックアウトマウスは、いわゆるスタゲラー（ｓｔａｇｇｅｒｅｒ）突然変異体マウス（ＲＯＲαｓｇ／ｓｇ）で示される症状に高度に類似した、強度の小脳萎縮を有する運動失調を示す。スタゲラー突然変異体マウスはＲＯＲαに突然変異を保有し、これがＬＢＤを含有しない切断ＲＯＲαをもたらす（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６年、３７９：７３６〜７３９頁）。
【００１０】
ＲＯＲαｓｇ／ｓｇスタゲラー−マウスの分析はさらに、脂質代謝に対する強い影響、すなわち血清及び肝臓トリグリセリドの著しい減少、血清ＨＤＬコレステロールレベルの低下及び肥満減少を明らかにした。ＳＲＥＢＰ１ｃ並びにコレステロールトランスポーターＡＢＣＡ１及びＡＢＣＧ１は、スタゲラーマウスの肝臓で減少し、ＣＨＩＰ分析は、ＲＯＲαが直接動員されＳＲＥＢＰ１ｃプロモーターを調節することを示唆している。さらに、ＰＧＣ１α、ＰＧＣ１β、リピン１及びβ２アドレナリン作動性受容体は、肝臓又は白色及び褐色脂肪組織などの組織で増加することが見出され、スタゲラーマウスでの食餌性肥満に対する観察された抵抗性を説明するのに役立つ可能性がある（Ｌａｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００８年、２８３：１８４１１〜１８４２１頁）。
【００１１】
ＲＯＲβは、より特異的に、すなわち脳の特定の領域及び網膜で発現される。ＲＯＲβノックアウトマウスは、アヒルのような歩き及び失明に至る網膜変性を示す（Ａｎｄｒｅら、ＥＭＢＯ．Ｊ．１９９８年、１７：３８６７〜３８７７頁）。この網膜変性の背後にある分子機構は、依然としてあまり理解されていない。
【００１２】
ＲＯＲγ（特にＲＯＲγ２）ヌル突然変異体マウスは、リンパ節及びパイエル板が欠如し（Ｅｂｅｒｌ及びＬｉｔｔｍａｎｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２００３年、１９５：８１〜９０頁）、リンパ組織誘導（ＬＴｉ）細胞が脾臓腸間膜及び腸から完全に欠落している。さらに、胸腺の大きさ及び胸腺細胞の数は、ダブルポジティブＣＤ４＋ＣＤ８＋及びシングルポジティブＣＤ４−ＣＤ８＋又はＣＤ４＋ＣＤ８−細胞の減少により、ＲＯＲγヌルマウスで大幅に減少し（Ｓｕｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００年、２８８：２３６９〜２３７３頁）、胸腺細胞の発生におけるＲＯＲγ２の極めて重要な役割を示唆している。
【００１３】
胸腺細胞の発生は、それらの微環境により捧げられる（ｄｅｄｉｃａｔｅｄ）細胞集団における増殖、分化、細胞死及び遺伝子組換えという協調したサイクルを伴う複雑なプログラムをたどる。胎児の肝臓又は成人の骨髄から胸腺に移動する多能性リンパ球前駆細胞は、Ｔ細胞系列にコミットメントしている。多能性リンパ球前駆細胞は、ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブ細胞からＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞への一連のステップを通じて成熟し、自己ＭＨＣペプチドに対し親和性の低いものは負の選択により排除される。これらは、ＣＤ４−ＣＤ８＋（キラー）又はＣＤ４＋ＣＤ８−（ヘルパー）Ｔ細胞系列へと成熟する。ＲＯＲγ２はダブルネガティブでは発現されず、未熟なシングルネガティブ胸腺細胞ではほとんど発現されない（Ｈｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００年、１６４：５６６８〜５６７４頁）が、ダブルポジティブ胸腺細胞では高度にアップレギュレートされ、シングルポジティブ胸腺細胞では分化中にダウンレギュレートされる。ＲＯＲγ欠損は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞でのアポトーシスの増加をもたらし、抹消血胸腺細胞の数は６倍減少する（１０倍（ＣＤ４＋胸腺細胞）及び３倍（ＣＤ８＋胸腺細胞））。
【００１４】
アレルギー性気道疾患モデルとしての、マウスにおけるオボアルブミン（ＯＶＡ）誘発炎症モデルでの最近の実験は、ＲＯＲγ  ＫＯマウスにおけるアレルギー性表現型の重度の発達障害を示し、ＯＶＡに曝露後の肺におけるＣＤ４＋細胞数の減少並びにＴｈ２サイトカイン／ケモカインタンパク質及びｍＲＮＡ発現の減少を示した（Ｔｉｌｌｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７年、１７８：３２０８〜３２１８頁）。ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０産生は、ｗｔ脾細胞と比べてＯＶＡ抗原で再刺激後に脾細胞で増加し、Ｔｈ２型応答の減少と引き換えにＴｈ１型免疫応答へ移行することを示唆した。これは、リガンドによるＲＯＲγ転写活性の下方調節が、Ｔｈ２型応答への免疫応答の同様の移行をもたらし得、特定のアレルギー性炎症疾患（ｉｎｆｒａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）の治療に有益となり得ることを示唆している。
【００１５】
ヘルパーＴ細胞は、以前はＴｈ１及びＴｈ２細胞から成ると考えられていた。しかし、Ｔｈ細胞の新たなクラスである、ＩＬ−１７を産生するＴｈ１７細胞が、炎症促進性であると考えられるヘルパーＴ細胞の１つの固有のクラスとして同定された。ＩＬ−１７発現が、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、及びクローン病などの炎症性腸疾患又は潰瘍性大腸炎など、自己免疫病因の可能性のある多くの炎症性疾患に関連していることから、Ｔｈ１７細胞は自己免疫及び炎症性疾患における中心的存在として認識されている（Ｉｖａｎｏｖら、Ｃｅｌｌ  ２００６年、１２６：１１２１〜１１３３頁；Ｔｅｓｍｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２００８年、２２３：８７〜１１３頁）。強力な自己免疫病因要素を有する別の疾患は、１型糖尿病である。最近、Ｔｈ１７細胞の活性増加と１型糖尿病との関連が導き出された（Ｂｒａｄｓｈａｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９年、１８３：４４３２〜４４３９頁；Ｅｍａｍａｕｌｌｅｅら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２００９年  ５８：１３０２〜１３１１頁）。乾癬、神経皮膚炎及びアトピー性湿疹など自己免疫要素を有する炎症性皮膚疾患も、Ｔｈ１７細胞の活性増加と関連していると考えられる（Ｍｉｏｓｓｅｃ、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．２００９年、１１：６２５〜６３０頁）。
【００１６】
ＲＯＲγ２は、免疫系細胞でもっぱら発現され、及びＴｈ１７細胞分化のマスター調節因子として同定されている。ＲＯＲγ２発現はＴＧＦ−ベータ又はＩＬ−６により誘導され、ＲＯＲγ２の過剰発現はＴｈ１７細胞系列及びＩＬ−１７発現の増加をもたらす。ＲＯＲγ２  ＫＯマウスは、腸固有層でＴｈ１７細胞をほとんど示さないが、Ｔｈ１７細胞は依然として検出できる。最近Ｙａｎｇら（２００８年）は、ＳＴＡＴ３依存的様式でＴＧＦ−ベータ及びＩＬ−６により調節される、Ｔｈ１７細胞でのＲＯＲαの発現を報告した。ＲＯＲα及びＲＯＲγ２における二重突然変異は、インビトロ及びインビボでＴｈ１７の分化を完全に抑制し、及びＥＡＥ（実験的自己免疫性脳炎）モデルでの症状の出現を完全に阻害した（Ｙａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００８年、２８：２９〜３９頁）。これは、ＲＯＲγ２及びＲＯＲαがＴｈ１７の発生を相乗的に制御することを示唆している。ＲＯＲγ２及びＲＯＲαの両方の阻害剤は、炎症性疾患においてＴｈ１７細胞の発生及び炎症促進性ＩＬ−１７の発現を抑制することができる。Ｔｈ１７細胞発生の抑制によるＩＬ−１７産生の抑制はまた、ＩＬ−１７が深く関与するアトピー性皮膚炎及び乾癬でも有利になり得る。興味深いことに、ＩＬ−１０は、マクロファージ及びＴ細胞の両方に分泌されるＩＬ−１７の発現を抑制するという最近の証拠が示された。さらに、Ｔｈ１７転写因子ＲＯＲγ２の発現が抑制された（Ｇｕら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８年、３８：１８０７〜１８１３頁）。さらに、ＩＬ−１０欠損マウスは、Ｔｈ１型炎症反応への移行がしばしば観察される、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の優れたモデルを提供する。経口ＩＬ−１０送達は、ＩＢＤの治療選択肢の可能性を有する。
【００１７】
ＲＯＲγ１は、筋肉並びに膵臓、胸腺、前立腺、肝臓及び精巣を含むいくつかの他の組織で発現される。ＲＯＲγ１のドミナントアクティブ及びドミナントネガティブバージョンの異所性過剰発現は、この受容体が、脂質代謝（ＦＡＢＰ４、ＣＤ３６、ＬＰＬ及びＵＣＰ３）、コレステロール流出（ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１）（炭水化物代謝（ＧＬＵＴ５、アディポネクチン受容体２及びＩＬ−１５）及び筋肉量（ミオスタチン及びＩＬ−１５）に関与する遺伝子を制御することを示した。
【００１８】
ＲＯＲα１及びＲＯＲγ１は肝臓で発現され、及び２４時間周期で変動する。ダブルＫＯマウスは、これらの遺伝子が、３−ベータ−ヒドロキシステロイド脱水素酵素、Ｃｙｐ４５０酵素及び硫酸転移酵素を含む第Ｉ相及び第ＩＩ相代謝酵素の調節に関与することを示し、ステロイド、胆汁酸及び異物代謝における重要な役割を示唆している（Ｋａｎｇら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２００７年、３１：２８１〜２９４頁）。調節される遺伝子の１つは、コレステロール代謝に重要な役割を果たすＣｙｐ７ｂ１であることが示され、ＲＯＲαがＣｙｐ７ｂ１の調節に必要及び十分であることが示された。ＲＯＲα及びＬＸＲα  ＫＯマウスにおける標的遺伝子の分析は、両方の受容体が、それぞれの標的遺伝子により相互に抑制されているという仮説を提起した（Ｗａｄａら、Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２００８年、２３３：１１９１〜１２０１頁）。
【００１９】
ＲＯＲに対するリガンド：
コレステロール及びその硫酸化誘導体は、ＲＯＲαリガンドとして機能する可能性があること、及び特にコレステロール硫酸は、コレステロール除去細胞においてＲＯＲαの転写活性を回復させ得ることが報告された（Ｋａｌｌｅｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２００２年、１０：１６９７〜１７０７頁）。以前、メラトニン（Ｍｉｓｓｂａｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８年、２７１：１３５１５〜１３５２２頁）及びチアゾリジンジオンは、ＲＯＲαに結合することが示唆された（Ｗｉｅｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９９５年、２３：３２７〜３３３頁）。しかし、これらのいずれも、ＲＯＲα又はいずれかの他のＲＯＲの機能的リガンドであることは示されていない。オールトランスレチノイド酸を含む特定のレチノイドは、ＲＯＲβに結合し、及びＲＯＲβの部分アンタゴニストとして機能することが示されたが、ＲＯＲαでは示されていない（Ｓｔｅｈｌｉｎ−Ｇａｏｎら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２００３年、１０：８２０〜８２５頁）。しかし、ＲＯＲガンマ調節化合物を求めて物質ライブラリーをスクリーニングする方法を生み出す潜在的基盤として、マウス及びヒトＲＯＲガンマ  ｃＤＮＡのクローニング（Ｍｅｄｖｅｄｅｖら、Ｇｅｎｅ  １９９６年、１８１：１９９〜２０６頁、国際公開第２０００／２４７５７号）が記載されているのにもかかわらず、これらのリガンド又はいずれか他のリガンドはどれもまだ、ＲＯＲγ１又はＲＯＲγ２に結合及び／又はＲＯＲγ１又はＲＯＲγ２の転写活性を調節することが記載されていない。
【００２０】
したがって、オーファン核内受容体ＲＯＲγ１及び／又はＲＯＲγ２に結合する化合物を提供すること、並びに故に、自己免疫疾患、炎症性皮膚疾患又は多発性硬化症など、ＲＯＲガンマの調節に関連した疾患の新規の治療方法を公開することが本発明の目的である。
【００２１】
さらに、ＲＯＲガンマのリガンドを同定及び前記リガンドの活性を測定するためのスクリーニング方法を提供することが本発明の目的である。
【００２２】
この目的は、ヒトＲＯＲガンマに対する低分子リガンドの驚くべき発見により解決される。これらのリガンドにはレチノイドがあるが、レキシノイドもある。
【００２３】
故に、本発明は、ＲＯＲガンマ受容体の不活性化又は活性化に関連した疾患又は障害の治療又は予防に使用することができるＲＯＲガンマモジュレーターを提供する。
【００２４】
本発明は、細胞培養系又は生化学無細胞インビトロアッセイ系においてＲＯＲガンマ活性の計測値を誘導又は低減するのに十分な、本明細書に記載されたようなＲＯＲガンマモジュレーターの有効量をこのような細胞培養系又はアッセイ系に投与するステップを含む、このような細胞培養系又は生化学アッセイ系におけるＲＯＲガンマ活性の調節方法をさらに提供する。
【００２５】
さらに、本発明は、本明細書に記載された方法により同定された化合物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＲＯＲガンマ−リガンド結合ドメイン（ＲＯＲγ−ＬＢＤ）に結合した放射性Ｈ３−２５−ヒドロキシコレステロールの、本明細書に記載の化合物による置換が測定された、放射性リガンド置換アッセイの結果を示す図である。
【図２Ａ】本発明で使用される化合物の構造式を示す図である。
【図２Ｂ】本発明で使用される化合物の構造式を示す図である。
【図３】用量反応様式での、抹消血ヒト単核細胞（ＰＢＭＣ）における化合物ＬＥ１３５によるＩＬ−１７レベルの低下を示す図である。
【００２７】
本発明は、ＲＯＲガンマ受容体の抑制又は活性化に関連した疾患又は障害の治療又は予防に使用するためのＲＯＲガンマモジュレーターに関する。
【００２８】
本発明はまた、ＲＯＲガンマ受容体の抑制又は活性化に関連した疾患又は障害を治療又は予防する医薬品を調製するためのＲＯＲガンマモジュレーターの使用にも関する。
【００２９】
本発明はまた、ＲＯＲガンマ受容体の抑制又は活性化に関連した疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、ＲＯＲガンマモジュレーターの有効量をこのような治療を必要とする被験者に投与することを含む方法にも関する。
【００３０】
ＲＯＲガンマ受容体の調節に関連した疾患又は障害を治療する場合、前記受容体の活性は好ましくは低減される。
【００３１】
好ましくは、疾患又は障害は、自己免疫疾患、炎症性皮膚疾患及び多発性硬化症から成る、Ｔｈ１７関連組織炎症を有する疾患群から選択される。
【００３２】
本発明で使用されるＲＯＲガンマモジュレーターは、以下の構造を有する式（Ｉ）
【００３３】
【化１】
2012506998.tif 000002
の化合物又は溶媒和物又は薬学的に許容可能なこの塩（式中
Ｒ５はＣＯＮＨＲ８、ＮＨＣＯＲ８、Ｃ（Ｏ）Ｒ８、ＣＨ＝ＣＨＲ８、Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨＲ８、Ｃ≡ＣＲ８、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ＝ＣＨＲ８、Ｃ（Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＲ８、５〜６員環ヘテロシクリル−Ｒ８であり、
Ｒ６は水素であり、
Ｒ５及びＲ６は共に
【００３４】
【化２】
2012506998.tif 000003
も形成することができ
Ｒ７は水素、フッ素、塩素又はヒドロキシであり、
Ｒ８は４−イル−安息香酸又は６−イル−２−ナフトエ酸であり、
Ｒ９及びＲ１０は水素であり、又はＲ９及びＲ１０はこれらが付着する結合と共に融合５〜１０員のへテロ芳香族環又は芳香族環で、単環又は二環を形成する）
を好ましくは含む。
【００３５】
上記及び以下では、使用される用語は、下記の通り独立に意味を有する。
【００３６】
５〜１０員の芳香族単環又は二環部分は、好ましくはフェニル、ビフェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、フルオレニル、インデニル及びフェナントレニル、より好ましくはフェニル及びナフチルから選択される。
【００３７】
５〜１０員のへテロ芳香族単環又は二環は、４〜９個の炭素原子並びにＯ、Ｎ及び／又はＳから選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有する少なくとも１個の環を有する環系である。好ましくは、ヘテロアリルは、Ｏ及び／又はＮから選択される１、２、３又は４個、より好ましくは１、２又は３個のヘテロ原子を含有し、並びにピリジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、シンノリニル、インダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、イソインドリル、プテリジニル、プリニル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチアゾリル、ベンズオキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル及びフロピリジニルから好ましくは選択される。スピロ部分もこの定義の範囲内に含まれる。好ましいヘテロアリールには、ピリジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、イソキサゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル及びトリアゾリルが含まれる。
【００３８】
ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ及び／又はＳから選択される少なくとも１個のヘテロ原子並びに１、２、３、４、又は５個の炭素原子を含有する５〜６員の飽和環又は不飽和環である。好ましくは、ヘテロシクリルは、Ｏ及び／又はＮから選択される１、２、３又は４個、より好ましくは１、２又は３個のヘテロ原子を含有する。ヘテロシクリルには、単環系及び二環系が含まれ、並びにピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、チオキサニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ホモピペリジニル、オキセパニル、チエパニル、オキサゼピニル、ジアゼピニル、チアゼピニル、１，２，３，６−テトラヒドロピリジニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、インドリニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、ピラゾリニル、ジチアニル、ジチオラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロフラニル、ピラゾリジニルイミダゾリニル、イミダゾリジニル、アゼチジン−２−オン−１−イル、ピロリジン−２−オン−１−イル、ピペリド−２−オン−１−イル、アゼパン−２−オン−１−イル、３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサニル、３−アザビシクロ［４．１．０］ヘプタニル、アザビシクロ［２．２．２］ヘキサニル、３Ｈ−インドリル及びキノリジニルから好ましくは選択される。スピロ部分もこの定義の範囲内に含まれる。
【００３９】
本発明で使用される化合物の好ましい実施形態は、図２に示されている。
【００４０】
本発明で使用される化合物は、薬学的に許容可能な塩又は溶媒和物の形態であってもよい。用語「薬学的に許容可能な塩」は、無機塩基又は酸及び有機塩基又は酸を含む、薬学的に許容可能な非毒性塩基又は酸から調製される塩をいう。本発明の化合物が１つ又は複数の酸性基又は塩基性基を含有する場合、本発明は、これらの対応する薬学的に又は毒性学的に許容可能な塩、特にこれらの薬学的に利用可能な塩も含む。故に、酸性基を含有する本発明の化合物は、これらの基に存在することができ、及び例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩又はアンモニウム塩として、本発明により使用することができる。このような塩のより正確な例には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、又はアンモニア若しくは、例えば、エチルアミン、エタノールアミン、トリエタノールアミン若しくはアミノ酸などの有機アミンとの塩が含まれる。１つ又は複数の塩基性基（すなわちプロトン化することができる基）を含有する本発明の化合物は、無機又は有機酸との付加塩の形態で存在することができ、及び無機又は有機酸との付加塩の形態で本発明により使用することができる。適切な酸の例には、塩化水素、臭化水素、リン酸、硫酸、硝酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、シュウ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、サリチル酸、安息香酸、ギ酸、プロピオン酸、ピバル酸、ジエチル酢酸、マロン酸、コハク酸、ピメリン酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、スルファミン酸、フェニルプロピオン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、イソニコチン酸、クエン酸、アジピン酸、及び当業者に既知の他の酸が含まれる。本発明の化合物が分子中に酸性及び塩基性基を同時に含有する場合、本発明には、言及された塩形態に加えて、分子内塩又はベタイン（双性イオン）も含まれる。各塩は、当業者に既知の慣習的方法により、例えば、溶媒若しくは分散剤中で有機若しくは無機酸若しくは塩基とこれらを接触させることにより、又は他の塩とのアニオン交換若しくはカチオン交換により得ることができる。本発明は、低い生理的適合性のために、医薬品での使用には直接適さないが、例えば、化学反応用又は薬学的に許容可能な塩の調製用の中間体として使用することができる本発明の化合物の全ての塩も含む。
【００４１】
実用において、本発明に使用される化合物は、従来の薬学的配合技術により医薬担体との緊密な混合における活性成分として組み合わせることができる。担体は、投与（例えば、経口又は非経口（静脈内を含む））に望ましい製剤の形態に応じて多種多様な形態をとることができる。経口剤形のための組成物の調製では、例えば、懸濁液、エリキシル剤及び溶液などの経口液体製剤の場合、例えば、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存料、着色剤等などの通常の医薬媒体のいずれかを、又は例えば、粉末、硬及び軟カプセル並びに錠剤などの経口固体製剤の場合、デンプン、糖、微結晶性セルロース、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等などの担体を使用することができ、固体経口製剤は液体製剤よりも好ましい。
【００４２】
投与の容易さのために、錠剤及びカプセルは最も有利な経口投与単位形態であり、この場合明らかに固体医薬担体が使用される。所望の場合、錠剤は、標準の水性又は非水性法により被覆することができる。このような組成物及び製剤は、少なくとも０．１パーセントの活性化合物を含有するべきである。これらの組成物中の活性化合物のパーセンテージは、当然変えることができ、及び好都合には、単位の重量の約２パーセント〜約６０パーセントであってよい。このような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、有効用量が得られるような量である。活性化合物は、例えば、液滴又はスプレーとして鼻腔内投与することもできる。
【００４３】
錠剤、ピル、カプセル等は、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ又はゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；及びショ糖、乳糖又はサッカリンなどの甘味剤も含有することができる。投与単位形態がカプセルである場合、上記のタイプの材料に加えて、脂肪油などの液体担体を含有してもよい。
【００４４】
さまざまな他の材料が、コーティングとして、又は投与単位の物理的形態を修飾するために存在してもよい。例えば、錠剤は、セラック、糖又は両方で被覆することができる。シロップ又はエリキシル剤は、活性成分に加えて、甘味料としてのショ糖、保存料としてのメチル及びプロピルパラベン、色素並びにサクランボ又はオレンジ風味などの香料を含有してもよい。
【００４５】
本発明で使用される化合物は、非経口投与することもできる。これらの活性化合物の溶液又は懸濁液は、ヒドロキシ−プロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散液も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及び油中のこれらの混合物中で調製することができる。貯蔵及び使用の通常の条件下では、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するための保存料を含有する。
【００４６】
注射用途に適した医薬品形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、該形態は、滅菌されていなければならず、及び容易に注射できる程度に流動性でなければならない。該形態は、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、並びに細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール）、これらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。
【００４７】
ここから
任意の適切な投与経路が、哺乳動物、特にヒトに本発明の化合物の有効用量を提供するのに使用され得る。例えば、経口、直腸、局所、非経口、眼内、肺内、鼻腔内等が使用され得る。剤形には、錠剤、トローチ、分散液、懸濁液、溶液、カプセル、クリーム、軟膏、エアロゾル等が含まれる。好ましくは、本発明の化合物は経口投与される。
【００４８】
使用される活性成分の有効用量は、使用される特定の化合物、投与様式、治療される疾患及び治療される疾患の重症度に応じて変わり得る。このような用量は、当業者に容易に確認され得る。
【００４９】
式（Ｉ）の化合物が適応されるＲＯＲガンマ媒介性疾患を治療又は予防する場合、化合物が、動物の体重１キログラム当たり約０．１ミリグラム〜約１００ミリグラムの日用量で投与、好ましくは１日１回投与として若しくは１日２〜６回の分割投与で、又は持続放出形態で与えられる場合に、概ね満足な結果が得られる。大部分の大型哺乳動物について、合計日用量は約１ミリグラム〜約１，０００ミリグラム、好ましくは約１ミリグラム〜約５０ミリグラムである。７０ｋｇの成人の場合では、合計日用量は一般に約７ミリグラム〜約３５０ミリグラムとなろう。この投与レジメンは、最適な治療反応を得るように調節することができる。
【００５０】
初めて、本発明は、ＲＯＲガンマ受容体に結合するモジュレーター（以下ではリガンドとも呼ばれる）を記載する。驚くべきことに、式（Ｉ）の化合物などの特定の合成レチノイドは、ＲＯＲガンマ受容体のモジュレーターとして作用することが見出された。
【００５１】
式（Ｉ）の化合物は、ＳＲＣ−１又はＴＩＦ−２などのコアクチベーター由来ペプチドとのＲＯＲγリガンド結合ドメインの構成的相互作用を用量依存的に調節する点で、拮抗活性を示す。
【００５２】
ＲＯＲγリガンド結合ドメインと該ペプチドとの間の相互作用は、均一ＦＲＥＴベースのリガンド検出アッセイにより判定することができることが驚くべきことに見出された。
【００５３】
飽和濃度（５００ｎＭ）で３Ｈ−２５−ヒドロキシコレステロールを用いる特定の放射性置換アッセイでは、非標識２５−ヒドロキシコレステロール、ＬＥ５４０、ＴＴＮＰＢ又はＣＨ５５による用量依存的競合置換が起こった（図１参照）。
【００５４】
受容体活性調節特性を有する、ＲＯＲγに対する高親和性リガンドの同定は、該分野に精通した専門家が低分子ライブラリーから新規の作動性及び拮抗性ＲＯＲγリガンドを同定するアッセイを確立できるようにするための土台である。ＲＯＲγ１及びＲＯＲγ２に結合する並びにＲＯＲγ１及びＲＯＲγ２の活性を調節するリガンドの同定は、ＲＯＲγ１又はＲＯＲγ２の活性により直接又は間接的に制御される疾患の治療のため開発される可能性を有する、新規の低分子ベースの薬剤を開発するための第一必須ステップである。このような疾患には、炎症性疾患、関節リウマチ、自己免疫疾患又は全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（クローン病）、潰瘍性大腸炎、１型糖尿病などの自己免疫要素を有する疾患、及びアトピー性湿疹又は乾癬などの炎症性皮膚疾患、多発性硬化症又は類似の疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
故に、本発明はまた、ＲＯＲガンマ受容体の新規のリガンドを同定する方法にも関する。
【００５６】
一般に、さまざまなアッセイ系を核内受容体リガンドの新たな同定に使用することができる。このようなアッセイ系は、天然の細胞環境由来の精製受容体、若しくは好ましくは、研究中の核内受容体の精製組換えバージョンを使用するどちらかの生化学、無細胞アッセイであり、又はこれらは、細胞ベースのアッセイ系である。研究中の核内受容体は、通常、完全長受容体として、又は核内受容体のリガンド結合ドメインを構成するようなアミノ酸残基を少なくともカバーする、この部分として使用される。リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）は、ＤＮＡ結合ドメインを含有する高度に保存されたジンクフィンガーから遠位又はＣ末端に、及びより保存度の低いヒンジ領域から核内受容体のＣ末端まで伸展するような、核内受容体のタンパク質ドメインとして定義される。
【００５７】
生化学アッセイでは、核内受容体又はこのＬＢＤ含有部分は、大腸菌、酵母、バキュロウイルス誘導昆虫細胞又は哺乳動物細胞培養系などの通常の発現系の１つにおいて組換え発現される。核内受容体発現コンストラクトは、天然、すなわち自然発生アミノ酸配列に完全に類似していてもよく、又は、好ましくは、該コンストラクトは、精製を容易にするため親和性タグに似た特定の人工アミノ酸ストレッチを含有してもよい。或いは、ＮＲコンストラクトは、親和性タグ（すなわち局在化タグ）として、又はフォールディング及び安定化の補助として作用する別のタンパク質又はタンパク質ドメインに融合されてもよい。
【００５８】
組換え発現されたＮＲタンパク質は、次いでタンパク質発現及び精製の、当業者に利用可能な標準的な方法を用いて、リガンド結合活性の特徴付けを可能にする程度まで精製される。リガンドスクリーニングの目的のため、組換えＮＲタンパク質はこれ自体として使用されてもよく、又は該タンパク質は標識試薬でさらに標識若しくは装飾されてもよい。非修飾タンパク質は、放射性標識又は蛍光標識された本物のリガンドが参照リガンドとして利用可能な、放射性リガンド又は蛍光リガンド置換アッセイにおいて使用することができる。ＦＲＥＴ又はアルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）（登録商標）型アッセイでの使用では、組換えＮＲタンパク質は、親和性タグに対するユーロピウム−キレートフルオロフォア含有抗体などのさらなる試薬で装飾されなければならない。このような装飾試薬は、第２試薬によりさらに転移、増強又は補足され得る１次シグナルを発する。ＦＲＥＴアッセイの場合では、第２試薬は、ＮＲタンパク質に付加される第１試薬により発せさられる波長光を吸収することができる発色団である。Ｅｕ−キレートが、ＮＲ装飾された試薬から生じる第１蛍光源である場合は、すなわちアロフィコシアニン（ＡＰＣ）が第２蛍光吸収体となり得る。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）効果は、発光体及び吸収体が近接近する状態になる場合に生じるのみである。
【００５９】
したがって、ほとんどの非放射性標識生化学核内受容体アッセイは、核内受容体のタンパク質動員機能を利用する。核内受容体は、一般に、クロマチン及び転写活性修飾タンパク質複合体に核内受容体をつなぎ止める特定のアダプタータンパク質を動員する傾向がある。リガンドの非存在下では、ほとんどのＮＲは、ヒストン脱アセチル化活性を含有するか、又はさらに動員し、故に転写的にサイレントなＮＲ応答エレメントの周りのクロマチン領域を維持する、いわゆるコリプレッサーを動員する。アゴニストである活性化リガンドが核内受容体に結合すると、コリプレッサーは、ヒストンアセチラーゼ活性を有する他のタンパク質を動員するアダプタータンパク質、コアクチベーターに取って代わられる。得られるクロマチング（ｃｈｒｏｍａｔｉｎｇ）オープニングは、次いでこれらのプロモーター領域から始まる転写活性の増加をもたらすことができる。
【００６０】
故に、コアクチベーターの動員は、アゴニストリガンドにより開始される活性化カスケードに必須のステップである。したがって生化学アッセイ系は、コアクチベーターの動員の検出によりリガンド結合を検出することができる。このコアクチベーター動員は、同様に、コアクチベーターがこのアッセイタイプに必要な第２試薬により標識される場合に検出することができる。核内受容体リガンドは、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）を利用する核内受容体−ペプチド相互作用アッセイを用いて同定することができる。このアッセイは、リガンドが、核内受容体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）内で結合するとコンフォメーション変化を誘導することができ、コンフォメーション変化が、コアクチベーター又はコリプレッサータンパク質との相互作用を変え、これが今度は転写活性の変化を媒介するという原理の発見に基づく。ＴＲ−ＦＲＥＴでは、蛍光ドナー分子は双極子−双極子相互作用を介して、（通常は蛍光）アクセプター分子にエネルギーを転移させる。この手法は、１０〜７０Å範囲の距離及び距離の変化を測定するための標準的な分光法であり、ドナー分子とアクセプター分子の間の距離Ｒ−６に依存する。９０Åの極めて大きなＲ０との相互作用は、発色団アロフィコシアニンに結合したユーロピウムクリプテートを用いて達成することができる（Ｍａｔｈｉｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９３年、３９：１９５３〜１９５９頁）。
【００６１】
核内受容体リガンド感受性ＦＲＥＴアッセイの目的のため、既知のコアクチベータータンパク質の１つ、好ましくはコアクチベーターに由来するペプチドにアクセプター標識を付加することができる。通常は、物理的なＮＲ−補因子相互作用に関与する明確に定義されたＬＸＸＬＬモチーフの１つに似た、２０〜３０ｍｅｒペプチドで十分である。フルオロフォア標識は、ペプチドのビオチン化及び例えばストレプトアビジン−ＡＰＣ複合体によるビオチンの捕捉を含むさまざまな手段により、このようなペプチドに付加することができる。
【００６２】
ＲＯＲガンマの場合では、このような生化学アッセイ系における特定の構成的活性を観察することができる。これはまさに、補因子ペプチド及び全ての必要な試薬と共に、ＮＲが既にシグナルを生成していることを意味する。このような構成的に活性なＮＲの場合では、活性なＮＲコンフォメーションをさらに安定化又は増強するアゴニスト化合物により、このようなシグナルをさらに刺激することが可能であり得る。しかし、このような構成的に活性な受容体の場合に用量依存的シグナルの減少をもたらす化合物は、インバースアゴニストと呼ばれる。
【００６３】
ＲＯＲガンマ媒介性免疫疾患の寛解と関連して炎症促進性Ｔｈ１７細胞数を低減する目的のため、このようなインバースアゴニストの同定が求められる。
【００６４】
細胞ベースの核内受容体アッセイでは、研究中の核内受容体の大部分が組換え発現されたバージョンが使用され、一過性のトランスフェクション、又はトランスフェクション及びこれに続く安定核内受容体コンストラクト発現細胞株の選択のどちらかにより細胞に導入される。核内受容体又はこのＬＢＤ含有部分を一過性又は安定発現するこのような細胞株は、これらが、レポータープロモーター中の核内受容体コンストラクト特異的ＤＮＡ応答エレメントの制御下で、前記核内受容体が特定のレポーター遺伝子の転写を開始できるプラスミドを保有しているか、又はトランスフェクトされる核内受容体コンストラクトが特定の天然標的遺伝子の転写を制御するプラスミドを保有しているかどちらかの場合に、リガンドスクリーニングに使用することができる。このような標的遺伝子に対するＮＲの転写制御を調節する特定のリガンドによりもたらされる内因性又は天然標的遺伝子発現の変化は、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）インコーポレーション又は類似の手法のような定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）ベースの方法などの任意の標的遺伝子ｍＲＮＡ特異的検出系でモニターすることができる。コードされたレポーター酵素の活性をモニターして、発現レベルを直接モニターすることができるレポーター遺伝子の例は、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ又は類似の明確に定義されたレポーター酵素である。
【００６５】
このようなＲＯＲガンマ細胞ベースのレポーターアッセイでのアゴニストリガンドは、構成的レポーターシグナルをさらに刺激し、インバースアゴニストリガンドはレポーターシグナルを用量依存的に低減するであろう。
【００６６】
例でより詳細に記載される通り、ＧＳＴ−ＲＯＲガンマ−ＬＢＤ融合タンパク質は、大腸菌から発現され及び精製される。ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイは、ＧＳＴに融合した２０〜６０ｎｇ／ウェルの組換え発現ＲＯＲγ−ＬＢＤ、２００〜６００ｎＭのＮ末端ビオチン化ペプチド（例えばＳＲＣ−１又はＴＩＦ−２由来の）、５０〜５００ｎｇ／ウェルのストレプトアビジン−ｘｌＡＰＣ複合体（Ｐｒｏｚｙｍｅ社）及び２〜２０ｎｇ／ウェルのＥｕ  Ｗ１０２４−抗ＧＳＴ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を含有するＴｒｉｓベースの緩衝系：１０〜５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９；５０〜１００ｍＭ  ＫＣｌ、１〜１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；２０〜１００ｎｇ／μｌ  ＢＳＡ）を用いて、３８４ウェルプレートの個々のウェルにおける最終容積２５μｌで実施された。ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルは、６６５ｎｍ及び６１５ｎｍで放射光を検出してＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＶＩＣＴＯＲ２Ｖ（商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて検出され、結果は６６５／６１５ｎｍの比としてプロットされた。
【００６７】
ＧＳＴ融合タンパク質中のＲＯＲガンマ−ＬＢＤ部分が、より小さい又はより大きい（例えば完全長のＲＯＲγ１又はＲＯＲγ２）タンパク質フラグメントを含有するＲＯＲガンマにより交換できることは当業者の共通の理解である。また、ＧＳＴ部分は、他の親和性タグ（例えばＨｉｓ−タグ、ｍｙｃ−タグ、ＨＡ−タグ）により、使用した親和性タグを検出するそれぞれのユーロピウム標識抗体と併用して交換することもできる。さらに、コアクチベータータンパク質（例えばＳＲＣ−１及びＴＩＦ−２）の核内受容体相互作用ドメイン由来のビオチン化ペプチドは、真核細胞系の原核細胞系で組換え発現され、及びインビトロ又はインビボでビオチン化される、前記コアクチベーターのより大きなフラグメント又はさらには完全長のコアクチベーターにより交換され得る。本明細書に記載された核内受容体−ペプチド相互作用アッセイは、蛍光偏光（ＦＰ（国際公開第１９９９／０２７３６５号パンフレット）核内ホルモン受容体薬スクリーニング）及びＦｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社により市販）を用いるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎなどの代替検出方法を用いて実施することもできる。当業者には、蛍光標識ペプチド及び蛍光標識リガンドの両方を、ＲＯＲガンマとのリガンド相互作用又は補因子由来ペプチドとＲＯＲガンマとのリガンド媒介相互作用の検出に使用することができる。
【００６８】
ＲＯＲガンマは、Ｔｈ１７細胞の主要な分化因子、及び分化したＴｈ１７細胞においてインターロイキン１７（ＩＬ−１７）遺伝子の転写を刺激する直接転写因子（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８年、９：１２９７〜１３０６頁）であると考えられている。故にＴ細胞又はより一般的には、白血球由来の細胞培養上清中のＩＬ−１７を測定することは、Ｔｈ１７細胞分化及びこの活性に対するＲＯＲガンマ及びＲＯＲガンマ調節の影響を判定するための適切な手段になる可能性がある。このような白血球は、ヒト又は動物血液の低速遠心分離後の赤血球と血漿上清との境界面である、「バッフィーコート」として分離することができる。これらの「バッフィーコート」は、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）と血小板の混合物を含有し、このＴ細胞部分は、ＩＬ−１７を分泌するよう十分に刺激することができる。このようなＰＢＭＣ細胞培養は、既知の又は潜在的な免疫調節及び免疫抑制化合物の効果を確かめる優れたシステムである（Ｚｈａｎｇら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２００８年、４２：３４５〜３５２頁）。
【００６９】
以下の例は、本発明をより詳細に記載する。しかし、これらの例は、いかなる方法によっても本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【００７０】
タンパク質発現及び精製
核内受容体レチノイド酸受容体関連オーファン受容体ガンマ（ＲＯＲγ）とのリガンド相互作用を定量化するためのリガンド媒介補因子ペプチド相互作用の判定では、ＲＯＲガンマのそれぞれのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を大腸菌で発現させ、下記の通り精製した。
【００７１】
ヒトＲＯＲγリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）は、Ｎ末端グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）標識融合タンパク質として大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた。ＲＯＲγリガンド結合ドメインをコードするＤＮＡを、ベクターｐＤＥＳＴ１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。リガンド結合ドメインのアミノ酸境界は、データベースエントリＮＭ＿００５０６０（ＲｅｆＳｅｑ）のアミノ酸２６７〜５１８であった。ｐＤＥＳＴ１５での発現はＩＰＴＧ誘導Ｔ７プロモーターにより制御し、大腸菌のクローニング及び形質転換は、基本的に、当業者に既知であって、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により提供された標準プロトコルに従って行った。
【００７２】
ＲＯＲγ−ＬＢＤの発現及び精製：ｐＤＥＳＴ１５−ｈｕＲＯＲγ−ＬＢＤで形質転換した大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の一晩の前培養物を、ＬＢ−アンピシリン培地で１：２０に希釈し、ＯＤ６００＝０．６の至適密度まで３０℃で増殖させた。遺伝子発現を次いで、最終濃度０．５ｍＭまでＩＰＴＧを添加して誘導した。細胞はさらに１６時間、１６℃、１８０ｒｐｍでインキュベートした。細胞を遠心分離（７，０００ｘｇ、１０分、室温）により回収した。細胞を、湿ペレット重量１グラム当たり１０ｍｌ溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び４ｍｇ／ｍｌリゾチーム）で再懸濁し、及び３０分間室温で放置した。続いて、１ｍｌ溶液当たり１μｌ  ＤＮａｓｅＩ溶液（２ｍｇ／ｍｌ）を添加し、ＭｇＣｌ２を２０ｍＭ最終濃度まで添加し、得られた溶液を氷上で１５分間インキュベートする。細胞は次いで超音波処理にかけ、細胞残屑を遠心分離（１４，０００ｘｇ、６０分、４℃）により除去した。オリジナル細胞培養物１ｌ当たり０．５ｍｌの予洗いしたグルタチオン４Ｂセファローススラリー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を添加し、懸濁液を１時間、４℃でゆっくり回転させ続けた。グルタチオン４Ｂセファロースビーズは遠心分離（１，０００ｘｇ、１分、４℃）によりペレット化し、及び洗浄緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び１Ｍ  ＮａＣｌ）で３回洗浄した。ペレットを、湿ペレット重量１グラム当たり５００μｌ溶出緩衝液で再懸濁した（溶出緩衝液：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、６０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び粉末として使用する直前に添加した１０ｍＭグルタチオン）。懸濁液は１５分間、４℃で回転させ、ビーズをペレット化し、及び溶出緩衝液で５０ｍＭグルタチオンにより再び溶出した。この後のＴＲ  ＦＲＥＴアッセイのため、グリセロールをこのタンパク質溶液に１０％（ｖ／ｖ）まで添加した。
【００７３】
放射性リガンド置換アッセイ（実施例３）のため、溶出液を６０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析し、及びアッセイで直接使用した。
【００７４】
ヒトＲＯＲガンマリガンド結合ドメインとのリガンドの相互作用の判定は、時間分解蛍光エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）に基づきリガンド感受性アッセイを用いて行った。
【００７５】
ＴＲ−ＦＲＥＴ活性アッセイ
この方法は、精製細菌発現ＲＯＲγリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）と、ＳＲＣ１（ＮｃｏＡ１）、ＳＲＣ２（ＮｃｏＡ２、ＴＩＦ２）、ＳＲＣ３（ＮｃｏＡ３）、ＰＧＣ１α、ＰＧＣ１β、ＣＢＰ、ＧＲＩＰ１、ＴＲＡＰ２２０、ＲＩＰ１４０など（但しこれらに限定されない）の核内受容体コアクチベータータンパク質に由来する合成Ｎ末端ビオチン化ペプチドとの間の相互作用を調節する推定リガンドの能力を測定する。実施例１及び実施例２用に使用したペプチドを、下の表１に列挙する。
【００７６】
【表１】
2012506998.tif 000004
【００７７】
ＲＯＲγのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）は、ベクターｐＤＥＳＴ１５を用いてＢＬ−２１（ＢＬ３）細胞においてＧＳＴとの融合タンパク質として発現させた。細胞をリゾチーム処理及び超音波処理により溶解し、融合タンパク質を、メーカーの指示に従いグルタチオンセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）上で精製した。ＲＯＲγ−ペプチド相互作用に対する影響について化合物をスクリーニングするため、ＬＡＮＣＥ技術（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を適用した。この方法は、ドナーフルオロフォアから目的の結合パートナーに付加したアクセプターフルオロフォアへの結合依存性エネルギー転移に依存する。取り扱いの容易さ及び化合物蛍光発光からのバックグラウンドの低下のため、ＬＡＮＣＥ技術は、一般的なフルオロフォア標識を利用し、時間分解検出アッセイは、ＧＳＴに融合した２０〜６０ｎｇ／ウェルの組換え発現ＲＯＲγ−ＬＢＤ、２００〜６００ｎＭのＮ末端ビオチン化ペプチド、２００ｎｇ／ウェルのストレプトアビジン−ｘｌＡＰＣ複合体（Ｐｒｏｚｙｍｅ社）及び６〜１０ｎｇ／ウェルのＥｕ  Ｗ１０２４−抗ＧＳＴ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を含有するＴｒｉｓベースの緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９；６０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；３５ｎｇ／μｌ  ＢＳＡ）中で、３８４ウェルプレートにおける最終容積２５μｌで行った。試料のＤＭＳＯ含有量は１％に保った。アッセイミックスの生成後、潜在的なＲＯＲγ調節リガンドを希釈した。このステップ後、アッセイを、ＦＩＡプレートブラック３８４ウェル（Ｇｒｅｉｎｅｒ社）で、室温、暗所で１時間平衡させた。ＬＡＮＣＥシグナルは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＶＩＣＴＯＲ２Ｖ（商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒにより検出した。結果は、６６５ｎｍ及び６１５ｎｍでの放射光間の比をプロットして視覚化した。ＲＯＲγ−ペプチド形成の基礎レベルは、添加リガンドの非存在下で観測する。複合体形成を促進するリガンドは、時間分解蛍光シグナルの濃度依存的増加を誘導する。単量体ＲＯＲγ及びＲＯＲγ−ペプチド複合体の両方に等しく十分に結合する化合物は、シグナルに変化を与えないことが予想されるのに対し、単量体受容体に優先的に結合するリガンドは、観測されるシグナルの濃度依存的減少を誘導すると予想される。
【００７８】
実施例１：
化合物の作動可能性及び拮抗可能性を評価するため、ＥＣ５０又はＩＣ５０値を、上記の通り、時間分解蛍光エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）に基づきリガンド感受性アッセイを用いて判定した。正規化したＴＲ  ＦＲＥＴアッセイ値（以下の方程式：１０００＊６５５ｎｍ測定値／６１５ｎｍ測定値による）をプログラムＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍに移して以下の方程式によりグラフ及び用量反応曲線を生成した：
方程式：シグモイド用量反応（可変勾配）
Ｙ＝下限＋（上限−下限）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＥＣ５０−Ｘ）＊Ｈｉｌｌ係数））
Ｘは濃度の対数である。Ｙは反応である。
Ｙは下限で始まり、シグモイドの形を有する上限に達する。
【００７９】
これは、「４つのパラメータロジスティック方程式」と同じである。ＥＣ５０又はＩＣ５０値はこの方程式により計算する。
【００８０】
選択した化合物の例を、下の表２に列挙する：
【００８１】
【表２】
2012506998.tif 000005
【００８２】
レチノイド構造を有する、上に列挙した全ての化合物（ＬＥ５４０、ＬＥ１３５、Ａｍ５８０、Ｃｈ５５、ＴＴＮＰＢ、９ｃｉｓＲＡ及びＡＴＲＡ）は、ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイにおいてシグナルを用量依存的様式で減少させ、ＩＣ５０値は相互作用ペプチドにＳＲＣ１を用いたＬＥ５４０での３，６００ｎＭから、相互作用ペプチドにＳＲＣ１を用いたＡｍ５８０での２３，４００ｎＭまで及ぶ。
【００８３】
対照的に、オキシステロール化合物２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、（２５Ｒ）−２６−ヒドロキシコレステロール、コレン酸メチルエステル及びＤＭＨＣＡは、高度に強力な様式で作動性に作用し、ＥＣ５０値はＴＩＦ２を相互作用ペプチドとするＤＭＨＣＡでの１０．７ｎＭから、ＴＩＦ２を相互作用ペプチドとするコレン酸メチルエステルでの２７．７ｎＭまで及ぶ。
【００８４】
実施例２：
上記のアッセイのバリエーションでは、拮抗性化合物を飽和濃度（４μＭ）でアッセイミックスに添加した。次いで作動性化合物を希釈し、アッセイを暗所で１時間平衡化させた。飽和アンタゴニスト濃度に加えたアゴニストの滴定は、アゴニストに関する用量反応曲線を依然として生成したが、アンタゴニストの非存在下で得られたデータと比べてアゴニストのＥＣ５０値はより高度に明白であった（表２参照）。これは、アンタゴニストがアゴニストに取って代わられ得ることを示している。明白なＥＣ５０値は、下の表３に列挙されている通りであった：
【００８５】
【表３】
2012506998.tif 000006
【００８６】
ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイのこのバリエーションでは、オキシステロール型化合物が、用量依存的様式で、飽和濃度（４μＭ）の拮抗性化合物を置換し、計算されたＥＣ５０値は、相互作用ペプチドにＴＩＦ２を用いたＤＭＨＣＡでの８５ｎＭから、及び相互作用ペプチドにＴＩＦ２を用いた２５−ヒドロキシコレステロールでの３６３ｎＭに及ぶ。
【００８７】
実施例３：
放射性リガンド置換アッセイ
この方法は、ＲＯＲガンマリガンド結合ドメインに結合した放射活性標識化合物を置換する推定リガンドの能力を測定する。
【００８８】
ＲＯＲγのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）は、ベクターｐＤＥＳＴ１５を用いてＢＬ−２１細胞においてＧＳＴとの融合タンパク質として発現させた。細胞をリゾチーム処理及び超音波処理により溶解し、融合タンパク質を、メーカーの指示に従いグルタチオンセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）上で精製した。ＲＯＲγに結合する能力について化合物をスクリーニングするため、市販の２５−［２６，２７−３Ｈ］−ヒドロキシコレステロール（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、ＮＥＴ６７４２５０ＵＣ）をタンパク質に結合させ、非放射活性リガンドによる置換を観察した。アッセイは、９６−ウェルのグルタチオン及びシンチラント被覆マイクロプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、ＳＭＰ１０９００１ＰＫ）で、最終容積１００μｌで行った。ＧＳＴに融合した５０〜２００ｎｇ／ウェルの組換え発現ＲＯＲγ−ＬＢＤを、Ｔｒｉｓベースの緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９；６０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；４５ｎｇ／μｌ  ＢＳＡ）中で、１００ｎＭ  ２５−［２６，２７−３Ｈ］−ヒドロキシコレステロール及び４００ｎＭ  ２５−ヒドロキシコレステロールと共にインキュベートした。試験化合物を滴定し、タンパク質−放射性リガンドミックスに添加した。試料のＤＭＳＯ含有量は１％に保った。化合物の添加後、アッセイを、室温で３０分間平衡化させた。このインキュベーション後、アッセイプレートウェルをＴｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５；６０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で２回洗浄し、続いてＬＵＭＩｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡ（ＢＭＧ社）で１ウェル当たり５００秒間測定した。
【００８９】
アッセイの結果は図１に示されている。レチノイド様構造物、ＬＥ５４０、ＴＴＮＢＰ及びＣｈ５５（但しオキシステロール２５−ヒドロキシコレステロールも）は、ＲＯＲガンマリガンド結合ドメインに事前に結合された２５−［２６，２７−３Ｈ］−ヒドロキシコレステロールを、用量依存的様式で置換することができる。置換の明らかな強度及び有効性は、ＬＥ５４０及び２５−ヒドロキシコレステロールで最も高い。ＴＴＮＢＰは、強度は低いがどちらかといえば有効であるように思われるのに対し、Ｃｈ５５は、ＲＯＲガンマ相互作用リガンドの識別を可能にするこの置換アッセイにおいて最も低い強度及び有効性を示す。
【００９０】
実施例４：
抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）刺激及びＩＬ−１７分泌アッセイ
凍結保存抹消血ヒト単核細胞（ＰＢＭＣ）を実験に使用した。細胞をＣＴＬ−Ａｎｔｉ−Ａｇｇｒｅｇａｔｅ−Ｗａｓｈ（商標）溶液で解凍し、及びベンゾナーゼを含むＣＴＬ  Ｗａｓｈ（商標）培地で１回洗浄した。ＣＴＬ無血清試験培地（ＣＴＬ−Ｔｅｓｔ（商標）培地）で懸濁したＰＢＭＣを、９６ウェルＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ抗ヒトＣＤ３Ｔ細胞活性化プレートに、合計１×１０５細胞／ウェルで３通りに播種した。細胞は、異なる濃度でのＬＥ５４０、ＬＥ１３５及びＡｍ５８０の存在下又は非存在下、７２時間、３７℃、５％ＣＯ２で抗ＣＤ２８（２μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。化合物は時間０で添加した。上清を回収し、及び対応するＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）からのプロトコルに従いＩＬ−１７についてアッセイした。検出範囲は１５．６〜１，０００．０ｐｇ／ｍｌであった。データを平均±標準偏差値で表す。
【００９１】
対照実験では、ＰＢＭＣを０．１％ＤＭＳＯの存在下、抗ＣＤ３（プレート）及び抗ＣＤ２８で刺激した。ＩＬ−１７の平均濃度は１，００３．３６±４５．１８ｐｇ／ｍｌであった。一方、非刺激細胞でのＩＬ−１７の濃度は検出範囲より下であった（＜１５．６ｐｇ／ｍｌ）。ＬＥ５４０、ＬＥ１３５、及びＡｍ５８０は全て、ヒトＰＢＭＣによるＩＬ−１７の産生を抑制する。化合物は、時間０で抗ＣＤ２８ｍＡｂと共に細胞に添加した。結果は、濃度０．３μＭで添加したＬＥ５４０がＩＬ−１７の産生を強力に抑制することを示した（平均＝２８９．６９ｐｇ／ｍｌ；７１．１３％の低減）。より低い濃度のＬＥ５４０（０．１μＭ）もＰＢＭＣで極めて強力であった。ＩＬ−１７抑制のパーセンテージは、それぞれ３４．２８％（平均＝６５９．３９ｐｇ／ｍｌ）であった。これらの結果と比べて、ＬＥ１３５は、ＰＢＭＣでのＩＬ−１７タンパク質産生に対する抑制効果は低い。図３に示された結果は、ＬＥ１３５がＰＢＭＣにおけるＩＬ−１７レベルを用量反応様式で低減することを示した。ＩＬ−１７タンパク質の量は、３、１、及び０．３μＭのＬＥ１３５で細胞を処理後にダウンレギュレートされた（図３）。抑制のパーセンテージは、それぞれ７５．９１、６１．８５、及び３５．７８％であった。１０、５、及び１μＭのＡｍ５８０で刺激した細胞のインキュベーションは、１０μＭの投与群でのみＩＬ−１７タンパク質の低減をもたらした（６９．７３％の抑制）。５及び１μＭのＡｍ５８０の存在下では、ＩＬ−１７レベルは対照範囲内であった。
【図１】
2012506998.tif 000009
【図２Ａ】
2012506998.tif 000010
【図２Ｂ】
2012506998.tif 000011
【図３】
2012506998.tif 000012
【配列表】
2012506998000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年6月13日(2011.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生化学無細胞インビトロアッセイ系でＲＯＲガンマ活性のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）式（Ｉ）のＲＯＲガンマモジュレーター
【化１】
2012506998.tif 000013
（式中
Ｒ５はＣＯＮＨＲ８、ＮＨＣＯＲ８、Ｃ（Ｏ）Ｒ８、ＣＨ＝ＣＨＲ８、Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨＲ８、Ｃ≡ＣＲ８、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ＝ＣＨＲ８、Ｃ（Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＲ８、５〜６員環ヘテロシクリル−Ｒ８であり、
Ｒ６は水素であり、
Ｒ５及びＲ６は共に
【化２】
2012506998.tif 000014
も形成することができ、
Ｒ７は水素、フッ素、塩素又はヒドロキシであり、
Ｒ８は４−イル−安息香酸又は６−イル−２−ナフトエ酸であり、
Ｒ９及びＲ１０は水素であり、又はＲ９及びＲ１０はこれらが付着する結合と共に融合５〜１０員のへテロ芳香族環又は芳香族環で、単環又は二環を形成する）の有効量又は下記ＲＯＲガンマモジュレーター、（Ｚ）−４−（１０，１０，１３，１３，１５−ペンタメチル−１１，１２，１３，１５−テトラヒドロ−１０Ｈ−ジナフト［２，３−ｂ：１’，２’−ｅ］［１，４］ジアゼピン−７−イル）安息香酸（ＬＥ５４０）、（Ｚ）−４−（５，７，７，１０，１０−ペンタメチル−７，８，９，１０−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｅ］ナフト［２，３−ｂ］［１，４］ジアゼピン−１３−イル）安息香酸（ＬＥ１３５）、（Ｅ）−４−（２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）プロプ−１−エニル）安息香酸（ＴＴＮＢＰ）、（Ｅ）−４−（３−（３，５−ジ−テルト−ブチルフェニル）−３−オキソプロプ−１−エニル）安息香酸（Ｃｈ５５）の有効量をこのようなアッセイ系に投与し、前記有効量はこのような細胞培養系又は生化学アッセイ系でＲＯＲガンマ活性の計測値を誘導又は低減するのに十分な量であるステップと、
（ｂ）測定された活性を参照ＲＯＲガンマモジュレーターの活性と比較するステップ
とを含む方法。
【請求項２】
生化学アッセイ系が、配列ＳＥＱ１の組換え発現ＲＯＲガンマタンパク質及びＳＥＱ２又は３の配列を有するコアクチベーターペプチドと併用する、均一時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＨＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイ、放射性リガンド結合及び置換アッセイから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
参照ＲＯＲガンマモジュレーターが、請求項１に記載の１つ又は複数の化合物であり、新たに同定されるモジュレーターの活性をモニターするための対照として使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
ＲＯＲγ（特にＲＯＲγ２）ヌル突然変異体マウスは、リンパ節及びパイエル板が欠如し（Ｅｂｅｒｌ及びＬｉｔｔｍａｎｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２００３年、１９５：８１〜９０頁）、リンパ組織誘導（ＬＴｉ）細胞が脾臓、腸間膜及び腸から完全に欠落している。さらに、胸腺の大きさ及び胸腺細胞の数は、ダブルポジティブＣＤ４＋ＣＤ８＋及びシングルポジティブＣＤ４−ＣＤ８＋又はＣＤ４＋ＣＤ８−細胞の減少により、ＲＯＲγヌルマウスで大幅に減少し（Ｓｕｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００年、２８８：２３６９〜２３７３頁）、胸腺細胞の発生におけるＲＯＲγ２の極めて重要な役割を示唆している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
胸腺細胞の発生は、それらの微環境により決定される細胞集団における増殖、分化、細胞死及び遺伝子組換えという協調したサイクルを伴う複雑なプログラムをたどる。胎児の肝臓又は成人の骨髄から胸腺に移動する多能性リンパ球前駆細胞は、Ｔ細胞系列にコミットメントしている。多能性リンパ球前駆細胞は、ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブ細胞からＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞への一連のステップを通じて成熟し、自己ＭＨＣペプチドに対し親和性の低いものは負の選択により排除される。これらは、ＣＤ４−ＣＤ８＋（キラー）又はＣＤ４＋ＣＤ８−（ヘルパー）Ｔ細胞系列へと成熟する。ＲＯＲγ２はダブルネガティブでは発現されず、未熟なシングルネガティブ胸腺細胞ではほとんど発現されない（Ｈｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００年、１６４：５６６８〜５６７４頁）が、ダブルポジティブ胸腺細胞では高度にアップレギュレートされ、シングルポジティブ胸腺細胞では分化中にダウンレギュレートされる。ＲＯＲγ欠損は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞でのアポトーシスの増加をもたらし、抹消血胸腺細胞の数は６倍減少する（１０倍（ＣＤ４＋胸腺細胞）及び３倍（ＣＤ８＋胸腺細胞））。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
ＲＯＲγ１は、筋肉並びに膵臓、胸腺、前立腺、肝臓及び精巣を含むいくつかの他の組織で発現される。ＲＯＲγ１のドミナントアクティブ及びドミナントネガティブバージョンの異所性過剰発現は、この受容体が、脂質代謝（ＦＡＢＰ４、ＣＤ３６、ＬＰＬ及びＵＣＰ３）、コレステロール流出（ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１）炭水化物代謝（ＧＬＵＴ５、アディポネクチン受容体２及びＩＬ−１５）及び筋肉量（ミオスタチン及びＩＬ−１５）に関与する遺伝子を制御することを示した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
５〜１０員のへテロ芳香族単環又は二環は、４〜９個の炭素原子並びにＯ、Ｎ及び／又はＳから選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有する少なくとも１個の環を有する環系である。好ましくは、ヘテロアリルは、Ｏ及び／又はＮから選択される１、２、３又は４個、より好ましくは１、２又は３個のヘテロ原子を含有し、並びにピリジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、シンノリニル、インダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、イソインドリル、プテリジニル、プリニル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチアゾリル、ベンズオキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル及びフロピリジニルから好ましくは選択される。スピロ部分もこの定義の範囲内に含まれる。好ましいヘテロアリールには、ピリジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、イソキサゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル及びトリアゾリルが含まれる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ及び／又はＳから選択される少なくとも１個のヘテロ原子並びに１、２、３、４、又は５個の炭素原子を含有する５〜６員の飽和環又は不飽和環である。好ましくは、ヘテロシクリルは、Ｏ及び／又はＮから選択される１、２、３又は４個、より好ましくは１、２又は３個のヘテロ原子を含有する。ヘテロシクリルには、単環系及び二環系が含まれ、並びにピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、チオキサニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ホモピペリジニル、オキセパニル、チエパニル、オキサゼピニル、ジアゼピニル、チアゼピニル、１，２，３，６−テトラヒドロピリジニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、インドリニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、ピラゾリニル、ジチアニル、ジチオラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロフラニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、アゼチジン−２−オン−１−イル、ピロリジン−２−オン−１−イル、ピペリド−２−オン−１−イル、アゼパン−２−オン−１−イル、３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサニル、３−アザビシクロ［４．１．０］ヘプタニル、アザビシクロ［２．２．２］ヘキサニル、３Ｈ−インドリル及びキノリジニルから好ましくは選択される。スピロ部分もこの定義の範囲内に含まれる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
したがって、ほとんどの非放射性標識生化学核内受容体アッセイは、核内受容体のタンパク質動員機能を利用する。核内受容体は、一般に、クロマチン及び転写活性修飾タンパク質複合体に核内受容体をつなぎ止める特定のアダプタータンパク質を動員する傾向がある。リガンドの非存在下では、ほとんどのＮＲは、ヒストン脱アセチル化活性を含有するか、又はさらに動員し、故に転写的にサイレントなＮＲ応答エレメントの周りのクロマチン領域を維持する、いわゆるコリプレッサーを動員する。アゴニストである活性化リガンドが核内受容体に結合すると、コリプレッサーは、ヒストンアセチラーゼ活性を有する他のタンパク質を動員するアダプタータンパク質、コアクチベーターに取って代わられる。得られるクロマチンオープニングは、次いでこれらのプロモーター領域から始まる転写活性の増加をもたらすことができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
例でより詳細に記載される通り、ＧＳＴ−ＲＯＲガンマ−ＬＢＤ融合タンパク質は、大腸菌から発現され及び精製される。ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイは、ＧＳＴに融合した２０〜６０ｎｇ／ウェルの組換え発現ＲＯＲγ−ＬＢＤ、２００〜６００ｎＭのＮ末端ビオチン化ペプチド（例えばＳＲＣ−１又はＴＩＦ−２由来の）、５０〜５００ｎｇ／ウェルのストレプトアビジン−ｘｌＡＰＣ複合体（Ｐｒｏｚｙｍｅ社）及び２〜２０ｎｇ／ウェルのＥｕ  Ｗ１０２４−抗ＧＳＴ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を含有するＴｒｉｓベースの緩衝系（１０〜５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９；５０〜１００ｍＭ  ＫＣｌ、１〜１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；２０〜１００ｎｇ／μｌ  ＢＳＡ）を用いて、３８４ウェルプレートの個々のウェルにおける最終容積２５μｌで実施された。ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルは、６６５ｎｍ及び６１５ｎｍで放射光を検出してＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＶＩＣＴＯＲ２Ｖ（商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて検出され、結果は６６５／６１５ｎｍの比としてプロットされた。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
ＧＳＴ融合タンパク質中のＲＯＲガンマ−ＬＢＤ部分が、より小さい又はより大きい（例えば完全長のＲＯＲγ１又はＲＯＲγ２）タンパク質フラグメントを含有するＲＯＲガンマにより交換できることは当業者の共通の理解である。また、ＧＳＴ部分は、他の親和性タグ（例えばＨｉｓ−タグ、ｍｙｃ−タグ、ＨＡ−タグ）により、使用した親和性タグを検出するそれぞれのユーロピウム標識抗体と併用して交換することもできる。さらに、コアクチベータータンパク質（例えばＳＲＣ−１及びＴＩＦ−２）の核内受容体相互作用ドメイン由来のビオチン化ペプチドは、真核細胞系又は原核細胞系で組換え発現され、及びインビトロ又はインビボでビオチン化される、前記コアクチベーターのより大きなフラグメント又はさらには完全長のコアクチベーターにより交換され得る。本明細書に記載された核内受容体−ペプチド相互作用アッセイは、蛍光偏光（ＦＰ（国際公開第１９９９／０２７３６５号パンフレット）核内ホルモン受容体薬スクリーニング）及びＦｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社により市販）を用いるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎなどの代替検出方法を用いて実施することもできる。当業者には、蛍光標識ペプチド及び蛍光標識リガンドの両方を、ＲＯＲガンマとのリガンド相互作用又は補因子由来ペプチドとＲＯＲガンマとのリガンド媒介相互作用の検出に使用することができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイのこのバリエーションでは、オキシステロール型化合物が、用量依存的様式で、飽和濃度（４μＭ）の拮抗性化合物を置換し、計算されたＥＣ５０値は、相互作用ペプチドにＴＩＦ２を用いたＤＭＨＣＡでの８５ｎＭから、相互作用ペプチドにＴＩＦ２を用いた２５−ヒドロキシコレステロールでの３６３ｎＭまで及ぶ。
【国際調査報告】
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