(57)【要約】  本発明者らは、野生型チャイニーズハムスター卵巣細胞と比較して、例えば機能的ＧｎＴ１の存在下においてタンパク質を高度にシアル化できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であって、前記ＣＨＯ細胞はＲｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓアグルチニンＩ（ＲＣＡ−Ｉ）を用いた選択によって入手できるＣＨＯ細胞を提供する。
2012502654.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
例えば機能的ＧｎＴ１の存在下において、野生型チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞と比較して、タンパク質をより高シアル化できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であって、前記ＣＨＯ細胞は、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ヒマ）のアグルチニンＩ（ＲＣＡ−Ｉ）を用いた選択によって入手できるＣＨＯ細胞。
【請求項２】
（ｉ）ＧｎＴ１遺伝子における、例えばＧｎＴ１配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ３４３９６３）の特定位置における、
（ａ）１０１５位でのＣからＴへのトランジッション；
（ｂ）１３００位でのＧからＣへのトランスバージョン；
（ｃ）６３８位でのＡからＣへのトランスバージョン；
（ｄ）７８４位でのＣからＧへのトランスバージョン；
（ｅ）８１１位でのＴからＡへのトランスバージョン；
（ｆ）コードされたアミノ酸配列の２３６位からのフレームシフトを生じさせる７０６位での挿入；
（ｇ）１０１５位でのＣからＴへのトランジッション；
（ｈ）２４６位でのＧからＡへのトランジッション；
（ｉ）２５８位でのＧからＡへのトランジッション；
（ｊ）８５９位でのＡからＴへのトランスバージョン
から選択される突然変異を含む、または
（ｉｉ）ＧｎＴ１配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ３４３９６３）の特定位置で以下の：
（ａ）４３４位でＡｌａからＰｒｏへ；
（ｂ）２１３位でＡｓｐ→Ａｌａ；
（ｃ）２６２位でＡｒｇ→Ｇｌｙ；
（ｄ）２７１位でＴｒｐ→Ａｒｇ；
（ｅ）ＧｎＴ１をコードする核酸配列の７０６位での挿入の結果として生じる２３６位からのフレームシフト；
（ｆ）３３９位でのＧｌｎ→ＳＴＯＰ；
（ｇ）８２位でのＴｒｐ→ＳＴＯＰ；
（ｈ）８６位でのＴｒｐ→ＳＴＯＰ；
（ｉ）２８７位でのＬｙｓ→ＳＴＯＰの内の１つ以上の突然変異を含むＧｎＴ１タンパク質を発現する、請求項１に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項３】
前記ＧｎＴ１遺伝子は、配列番号１に示したＧｎＴ１核酸配列を含む、または配列番号２に示したＧｎＴ１タンパク質を発現する、請求項１または２に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項４】
前記ＣＨＯ細胞は：
（ａ）目的のタンパク質、例えば目的の組換えタンパク質、例えばエリスロポエチン（ＥＰＯ）もしくはインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）をコードする核酸配列；
（ｂ）機能的ＧｎＴ１をコードする核酸配列；または
（ｃ）例えばＣＨＯ細胞内に安定的にトランスフェクトされた、１つの発現ベクター内に含まれた目的のタンパク質をコードする核酸配列および機能的ＧｎＴ１をコードする核酸配列を含む、請求項１、２または３に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のＣＨＯ細胞を含むＣＨＯ細胞系。
【請求項６】
ＪＷ１５２細胞系（ＡＴＣＣにブダペスト条約の下でアクセッション番号ＰＴＡ−９６５７として寄託された）、ＪＷ８０細胞系、ＪＷ３６細胞系、ＫＦＣ１５００２細胞系、ＫＦＣ１５０７１細胞系、ＫＦＣ５００８細胞系、ＪＷ１５２細胞系、ＫＦＣ５０２６細胞系、ＫＦＣ２００１１細胞系またはＫＦＣ１５０４７細胞系を含むＣＨＯ細胞系。
【請求項７】
懸濁培養に順応させられている、請求項１〜６のいずれかに記載のＣＨＯ細胞もしくはＣＨＯ細胞系。
【請求項８】
例えばエリスロポエチン（ＥＰＯ）もしくはインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のＣＨＯ細胞もしくはＣＨＯ細胞系によって発現された組換えタンパク質。
【請求項９】
４以下、３．５以下、３以下、２．５以下もしくは２以下のｐＫａまたは１５０より大きい、例えば１６０より大きい、１７０より大きい、１８０より大きい、例えば１９０より大きい、２００より大きい、２１０より大きい、例えば２２０より大きい、もしくは２３０より大きいＺ数、またはその両方を含む、請求項８に記載の組換えタンパク質。
【請求項１０】
組換えタンパク質を発現する方法であって、前記方法は、前記タンパク質をコードする核酸を請求項１〜７のいずれかに記載のＣＨＯ細胞内に導入することと、前記タンパク質を該ＣＨＯ細胞もしくはその子孫から発現することと、前記タンパク質を精製することとを含み、前記方法はさらに、任意で前記タンパク質をコードする核酸配列および機能的ＧｎＴ１をコードする核酸配列を含む発現ベクターの形態にあるなどの前記ＣＨＯ細胞内に機能的ＧｎＴ１をコードする核酸を導入もしくは安定的にトランスフェクトすることを含む方法。
【請求項１１】
配列番号１に示した配列、またはＧｎＴ１配列を含む配列を表Ｄ１の第２列に記載した突然変異と一緒に含む核酸、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメント。
【請求項１２】
配列番号２に示した配列、またはＧｎＴ１配列を含む配列を表Ｄ１の第３列に記載した突然変異と一緒に含むポリペプチド、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメント。
【請求項１３】
ＣＨＯ細胞もしくは細胞系を提供する方法であって、前記方法はＲｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓアグルチニンＩ（ＲＣＡ−Ｉ）の存在下でＣＨＯ細胞を培養することと、該培養を生残する細胞を選択することとを含み、例えば：
（ａ）前記ＣＨＯ細胞は、０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ、例えば５０μｇ／ｍＬまで、または２０μｇ／ｍＬまで、例えば１０μｇ／ｍＬもしくは５μｇ／ｍＬまでの濃度のＲＣＡ−Ｉへ曝露される；または
（ｂ）前記ＣＨＯ細胞は、ＲＣＡ−Ｉへ、１時間、数時間（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２時間）、一晩から数日間、例えば２日間もしくは３日間、例えば一晩までの期間にわたって曝露される方法。
【請求項１４】
凝集試験においてＲＣＡ−Ｉと反応しない細胞を選択することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の方法によって入手可能なＣＨＯ細胞もしくはＣＨＯ細胞系。
【請求項１６】
実質的に添付図面の図１〜１２を参照および図示して上記に記載したＣＨＯ細胞、細胞系、組換えタンパク質、方法、核酸またはポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
２００８年９月１９日に出願された米国特許出願第６１／０９８，２７０号明細書および２００９年６月３日に出願された米国特許出願第６１／１８３，６４７号明細書が参照される。上記特許の発明者Ｓｏｎｇは本願の発明者である。
【０００２】
上記の特許出願、そして本出願および上記の特許出願の各々において上記の特許出願の各々の審査手続き中を含めて引用または参照された各文書（「特許出願および論文が引用した文書」）、ならびに上記の特許出願および論文の各々および特許出願および論文が引用した文書のいずれかにおいて引用または言及された任意の製品についての任意の製造業者の取扱説明書またはカタログは、参照することによって本明細書に組み入れられる。さらに、本明細書において引用した全文書、そして本明細書において引用した文書において引用または参照された全文書、ならびに本明細書、または本明細書に組み入れられた任意の文書において引用または言及された任意の製品についての任意の製造業者の取扱説明書またはカタログは、本明細書に参照することによって組み入れられる。本明細書に参照することによって組み入れられた文書またはその中の任意の教示は、本発明の実施において使用することができる。本明細書に参照することによって組み入れられた文書は、先行技術であると認められるものではない。
【０００３】
［発明の分野］
本発明は、バイオテクノロジーおよび分子生物学の分野に関する。本発明は、特に、チャイニーズハムスター卵巣細胞系および組換えタンパク質発現におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
タンパク質は、様々な診断学、薬理学、農業、栄養、および研究用途において有用である。タンパク質、特には治療用タンパク質の製造には高額の費用を要することを考えると、生産効率またはタンパク質の機能および安定性における小さな増進さえ有益な可能性がある。
【０００５】
タンパク質の機能および安定性、したがってその有用性は、糖タンパク質を形成するためのタンパク質への糖残基の翻訳後付加によって影響を及ぼすことができることである。例えば、糖タンパク質に付着した多糖類への末端シアル酸残基の付加は、一般に血流中のタンパク質の寿命を増加させ、そして特定の場合には、さらに一部の糖タンパク質の溶解性、熱安定性、プロテアーゼ攻撃への耐性、抗原性、および比活性度に影響を及ぼすことができる。例えば、Ｇｕ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ（１９９８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇ．５８（６）：６４２−４８；Ｍｏｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９６８），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３（１）：１５５−５９を参照されたい。
【０００６】
例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの細胞系によって生成された組換え糖タンパク質および薬物は、一般には特異的にシアル化されたアイソフォームからなる。低シアル化のアイソフォームは、循環中半減期が短くなるので、このため有効性が低い。
【０００７】
このため、糖タンパク質、特に薬理学的用途に使用される糖タンパク質のシアル酸含量を増加させることは望ましい。実際に、バイオテクノロジー分野における主要な研究の焦点の１つは、組換えタンパク質薬のシアル化を増加させる方法であった。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の第１の態様によると、本発明者らは、野生型チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞と比較してタンパク質を高シアル化できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を提供するが、該ＣＨＯ細胞は、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ヒマ）のアグルチニンＩ（ＲＣＡ−Ｉ）を用いた選択によって入手することができる。該ＣＨＯ細胞は、機能的ＧｎＴ１の存在下ではより高いシアル化を行ってもよい。
【０００９】
ＣＨＯ細胞は、ＧｎＴ１遺伝子内に突然変異を含んでもよい。
【００１０】
ＧｎＴ１遺伝子における突然変異は、ＧｎＴ１配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ３４３９６３）の特定位置で以下の突然変異、（ａ）１０１５位でのＣからＴへのトランジッション、（ｂ）１３００位でのＧからＣへのトランスバージョン、（ｃ）６３８位でのＡからＣへのトランスバージョン、（ｄ）７８４位でのＣからＧへのトランスバージョン、（ｅ）８１１位でのＴからＡへのトランスバージョン、（ｆ）コードされたアミノ酸配列の２３６位からのフレームシフトを生じさせる７０６位での挿入、（ｇ）１０１５位でのＣからＴへのトランジッション、（ｈ）２４６位でのＧからＡへのトランジッション、（ｉ）２５８位でのＧからＡへのトランジッション、（ｊ）８５９位でのＡからＴへのトランスバージョンの内の１つ以上を含んでもよい。
【００１１】
ＧｎＴ１遺伝子は、配列番号１に示したＧｎＴ１核酸配列を含んでもよい。
【００１２】
ＣＨＯ細胞は、ＧｎＴ１配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ３４３９６３）の特定位置で以下の突然変異：（ａ）４３４位でＡｌａからＰｒｏ、（ｂ）２１３位でＡｓｐ→Ａｌａ、（ｃ）２６２位でＡｒｇ  →Ｇｌｙ、（ｄ）２７１位でＴｒｐ→Ａｒｇ、（ｅ）ＧｎＴ１をコードする核酸配列の７０６位での挿入の結果として生じる２３６位からのフレームシフト、（ｆ）３３９位でのＧｌｎ→ＳＴＯＰ、（ｇ）８２位でのＴｒｐ→ＳＴＯＰ、（ｈ）８６位でのＴｒｐ→ＳＴＯＰ、（ｉ）２８７位でのＬｙｓ→ＳＴＯＰの内の１つ以上を含むＧｎＴ１タンパク質を発現してもよい。
【００１３】
ＣＨＯ細胞は、配列番号２に示したＧｎＴ１タンパク質を発現してもよい。
【００１４】
ＣＨＯ細胞は、例えば当該組換えタンパク質などの当該タンパク質をコードする核酸配列を含んでもよい。目的のタンパク質は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を含んでもよい。
【００１５】
ＣＨＯ細胞は、機能的ＧｎＴ１をコードする核酸配列を含むことができる。目的のタンパク質をコードする核酸配列および機能的ＧｎＴ１をコードする核酸配列は、１つの発現ベクター内に含まれてもよい。
【００１６】
目的のタンパク質をコードする核酸配列および機能的ＧｎＴ１をコードする核酸配列は、ＣＨＯ細胞内に安定的にトランスフェクトしてもよい。
【００１７】
本発明の第２の態様によると、本発明の第１態様によるＣＨＯ細胞を含むＣＨＯ細胞系が提供される。
【００１８】
ＣＨＯ細胞系は、ＪＷ１５２細胞系（ＡＴＣＣにブダペスト条約の下でアクセッション番号ＰＴＡ−９６５７として寄託された）、ＪＷ８０細胞系、ＪＷ３６細胞系、ＫＦＣ１５００２細胞系、ＫＦＣ１５０７１細胞系、ＫＦＣ５００８細胞系、ＪＷ１５２細胞系、ＫＦＣ５０２６細胞系、ＫＦＣ２００１１細胞系またはＫＦＣ１５０４７細胞系を含んでもよい。
【００１９】
ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞系は、懸濁培養に順応させることができる。
【００２０】
本発明者らは、本発明の第３態様によると、本発明の第１または第２態様によるＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞系によって発現された組換えタンパク質を提供する。
【００２１】
組換えタンパク質は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を含むことができる。
【００２２】
組換えタンパク質は、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下もしくは２以下のｐＫａを含むか、または１５０より大きい、例えば１６０より大きい、１７０より大きい、１８０より大きい、例えば１９０より大きい、２００より大きい、２１０より大きい、例えば２２０より大きい、もしくは２３０より大きいＺ数を含むか、またはその両方を含んでもよい。
【００２３】
本発明の第４の態様として、組換えタンパク質を発現させる方法であって、該タンパク質をコードする核酸を上記に記載したようにＣＨＯ細胞内に導入するステップと、該タンパク質を該ＣＨＯ細胞又はその子孫から発現させるステップと、任意選択により該タンパク質を精製するステップとを含む方法が提供される。
【００２４】
本方法は、機能的ＧｎＴ１をコードする核酸をＣＨＯ細胞内に導入することを含んでもよい。
【００２５】
本方法は、該タンパク質をコードする核酸配列および機能的ＧｎＴ１をコードする核酸配列を含む発現ベクターを導入することを含んでもよい。
【００２６】
本方法は、目的のタンパク質をコードする核酸配列および機能的ＧｎＴ１をコードする核酸配列を安定的にトランスフェクトすることを含んでもよい。
【００２７】
本発明者らは、本発明の第５の態様によると、配列番号１に示した配列、または表Ｄ１の第２列に記載した突然変異を有するＧｎＴ１配列を含む配列を含む核酸、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントを提供する。
【００２８】
本発明は、第６の態様では、配列番号２に示した配列、または表Ｄ１の第３列に記載した突然変異を有するＧｎＴ１配列を含む配列を含むポリペプチド、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントを提供する。
【００２９】
本発明の第７の態様では、ＣＨＯ細胞または細胞系を提供する方法であって、該方法は、ＣＨＯ細胞をＲｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓのアグルチニンＩ（ＲＣＡ−Ｉ）の存在下で培養するステップと、該培養を生存する細胞を選択するステップとを含む方法が提供される。
【００３０】
本方法は、ＣＨＯ細胞をＲｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓのアグルチニンＩ（ＲＣＡ−Ｉ）の存在下で培養するステップと、該培養を生存する細胞を選択するステップとを含むことができる。
【００３１】
本方法は、ＣＨＯ細胞を、０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ、例えば５０μｇ／ｍＬまで、または２０μｇ／ｍＬまで、例えば１０μｇ／ｍＬもしくは５μｇ／ｍＬまでの濃度のＲＣＡ−Ｉへ曝露させることを含むことができる。
【００３２】
本方法は、ＣＨＯ細胞をＲＣＡ−Ｉへ、１時間、数時間（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２時間）、一晩から数日間、例えば２日間または３日間、例えば一晩までの期間にわたって曝露させることを含むことができる。
【００３３】
本方法は、凝集試験においてＲＣＡ−Ｉと反応しない細胞を選択することをさらに含むことができる。
【００３４】
本発明の第８の態様によると、本発明者らは、上記に記載した方法によって入手できるＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞系を提供する。
【００３５】
本発明の実施は、他に特に指示しない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技術を使用するが、これらは当業者の能力の範囲内に含まれる。そのような技術は、文献において説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９，１３，ａｎｄ  １６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ  Ａ．Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ  Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ，１９９０，Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ；Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ．Ｉ  ｂｙ  Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（１９９９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５４４−７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｂｙ  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（Ｅｄｉｔｏｒ）（１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３１４−２），１８５５．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ  Ｓｅｅｔｈａｌａ，Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ  Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ（２００１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＩＳＢＮ  ０−８２４７−０５６２−９）；ａｎｄ  Ｌａｂ  Ｒｅｆ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｅｃｉｐｅｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ，ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｂｅｎｃｈ，Ｅｄｉｔｅｄ  Ｊａｎｅ  Ｒｏｓｋａｍｓ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄａ  Ｒｏｄｇｅｒｓ，２００２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−６３０−３を参照されたい。これらの全本文は、各々を参照することによって本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＪＷ１５２細胞系内で一過性に発現されたエリスロポエチン（ＥＰＯ）がエンドグルコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）処理に感受性であることを示している写真である。一過性に発現されたＥＰＯのウエスタンブロット：ＣＨＯ  Ｋ−１細胞から（レーン１）、ＪＷ１５２細胞から（レーン２）、ＣＨＯ−Ｋ１からエンドグルコシダーゼＨ処理されたＥＰＯ（レーン３）、ＪＷ１５２からエンドグルコシダーゼＨ処理されたＥＰＯ（レーン４）。ＪＷ１５２から発現されたＥＰＯはＥｎｄｏ  Ｈ処理に対して感受性であり、これはＥＰＯ分子上で見いだされるグリカン構造が高マンノースタイプであることを示唆している。そこで、グリコシル化経路の初期由来の遺伝子には欠陥があることが疑われる。
【図２】ＪＷ１５２細胞には機能的ＧｎＴＩ遺伝子が欠如することを示している写真である。組換えＥＰＯは、ＩＥＦ／ウエスタンブロットアッセイによって分析される。左端のレーン（ＣＨＯ  ＷＴ）は、コントロールとしての野生型ＣＨＯ細胞によって発現されたＥＰＯを示している。第２レーンは、ＪＷ１５２細胞によって生成されたＥＰＯを示している。ＪＷ１５２細胞における不完全なグリコシル化は、これら２つのレーンを比較することによって明白である。相補性検定のためには、幾つかの（指示した）グリコシル化関連遺伝子はそれぞれ、ＥＰＯ構築物とともにＪＷ１５２細胞内へコトランスフェクトされる。ＧｎＴＩだけがＪＷ１５２細胞内の遺伝的欠陥を補完できるが、これはこれらのＪＷ１５２細胞に機能的ＧｎＴＩ遺伝子が欠如することを示唆している。このＩＥＦ結果からのまた別の極めて重要な観察所見は、ＧｎＴＩの存在下ではＪＷ１５２細胞がＥＰＯを野生型細胞よりはるかに良好にシアル化することである。
【図３】ＧｎＴＩを用いた共トランスフェクション後のシアル化の改善がＪＷ１５２については観察されるがＣＨＯ−Ｋ１については観察されないことを示している写真である。ＣＨＯ−Ｋ１内、ＧｎＴＩの共発現を伴うＣＨＯ−Ｋ１内で生成されたＥＰＯのシアル化パターン。ＪＷ１５２細胞内およびＧｎＴＩの共発現を伴うＪＷ１５２細胞内で生成されたＥＰＯ。ＧｎＴＩの共発現を伴う、および伴わないＣＨＯ−Ｋ１のＥＰＯシアル化パターンは同一であると考えられるので、そこでＧｎＴＩの過剰発現はレーン４において見られるシアル化の改善の原因ではない。試験結果は、ＧｎＴＩの存在下では、ＪＷ１５２細胞が組換えタンパク質を野生型細胞に比べてはるかに良好にシアル化することを示唆している。シアル酸を切断するノイラミニダーゼを用いたサンプルの処理は、シアル酸の切断後には塩基領域に還元させられる酸性領域内でＥＰＯ帯を生じさせるが、これはＥＰＯのより高度のシアル化形が実際にはゲルの酸性領域内に集中することを示している。
【図４】ＧｎＴＩ欠損を有する、以前に公表されたＬｅｃ１変異体の機能的ＧｎＴＩの存在下でのＥＰＯ発現もまた高度にシアル化されることを示している写真である。ＣＨＯ−Ｋ１、Ｌｅｃ  １および機能的ＧｎＴＩの修復を伴うＬｅｃ  １において一過性に発現されたＥＰＯ。Ｌｅｃ１は以前に報告され、Ｐａｍｅｌａ  Ｓｔａｎｌｅｙが主催するまた別のグループによって相違するレクチンを使用して独立して単離されていた。
【図５】ＲＣＡに耐性であり、ＧｎＴＩ遺伝子において別個の突然変異を有する全９個のＣＨＯグリコシル化突然変異体が不完全なシアル化をもたらすことを示している写真である。ＪＷ１５２、ＪＷ３６、ＪＷ８０、ＫＦＣ５００８、ＫＦＣ５０２６、ＫＦＣ１５００２、ＫＦＣ１５０４７、ＫＦＣ１５０７１、ＫＦＣ  ２００１１、ＣＨＯ−Ｋ１において一過性に発現されたＥＰＯ。各々がＧｎＴＩ遺伝子内で相違する突然変異を有する、ＲＣＡレクチンを用いて選択された９個のＣＨＯグリコシル化突然変異体内で生成されたＥＰＯは、ＧｎＴＩ機能の消失をもたらす。これらの細胞系では、ＣＨＯ野生型（右端）と比較して不完全シアル化が観察される。ＥＰＯ臨床標準物質は、左端にある。ＲＣＡレクチンは、主としてＧｎＴＩ欠損突然変異体を産生する。
【図６】全９個のＣＨＯグリコシル化突然変異体がＧｎＴＩ機能の回復後にはＣＨＯ−Ｋ１におけるより良好にシアル化されるＥＰＯを一過性に発現することを示している写真である。
【図７】回復されたＧｎＴＩ機能を備えるＪＷ１５２は、さらにＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質をＣＨＯ−Ｋ１より良好にシアル化することを示している写真である。レスキューの前後にＪＷ１５２内で生成されたものと平行して比較された、ＣＨＯ野生型において生成されたＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質。これらの結果は、レスキューされたＪＷ１５２による優れたシアル化が相違するモデルの糖タンパク質を用いた場合でさえ維持されることを証明している。
【図８】機能的ＧｎＴＩを共発現するＪＷ１５２細胞内で発現されたＥＰＯ−Ｆｃから切断されたより良好にシアル化されたグリカン類を示しているＨＰＡＥＣクロマトグラムを示している写真である。ＣＨＯ−Ｋ１およびＪＷ１５２内で一過性に発現され、ＧｎＴＩとともにコトランスフェクトされたＥＰＯ−Ｆｃは、プロテインＡ結合クロマトグラフィーカラムによるアフィニティ精製を用いて精製される。等量のＥＰＯ−Ｆｃ上のグリカン類は、ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）を用いた処理によって切断され、そしてグリカン類に付着したシアル酸の数にしたがって、高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）を使用して分離される。クロマトグラムは、ＣＨＯ−Ｋ１サンプルと比較した場合に、４Ｓ群におけるＪＷ１５２サンプルについて明確に高いピークおよび１Ｓ群における低いピークを示している。矢印は、内部コントロールのラフィノースを指している。サンプルは図示したように表示されている。
【図９】ＲＣＡ−Ｉによって単離された１０個の無作為に採取されたクローンによって発現された組換えＥＰＯを示している写真である。一番上のゲルは、１０個の相違する突然変異体系において発現されたＥＰＯである。細胞は、ＥＰＯ単独を発現する構築物でトランスフェクトされる。一番下のゲルは、ｐＥＩＧでトランスフェクトされる同一組の細胞系において発現されたＥＰＯである。この構築物は、ＥＰＯおよびＧｎＴＩの両方を発現する。
【図１０】ＥＰＯは、ＥＰＯおよびＧｎＴＩの両方を発現する構築物を用いて安定的にトランスフェクトされる１０個の相違するＪＷ１５２クローンを生成したことを示している写真である。ＪＷ１５２細胞は、ｐＥＩＧと呼ばれる構築物でトランスフェクトされる。ｐＥＩＧでは、ＥＰＯ−ＩＲＥＳ−ＧｎＴＩ（ＥＩＧ）を含有する転写ユニットは、ＣＭＶプロモーターの下流のｐｃＤＮＡ３．１内にクローニングされる。トランスフェクション後、安定的クローンが選択および採取される。１０個のそのような無作為に採取されたクローンによって生成されたＥＰＯのシアル化パターンは、ＩＥＦ／ウエスタンブロットアッセイによって分析される。これらの結果は、相違する安定的クローンによって生成されたＥＰＯサンプル全部が高度にシアル化されることを示している。これは、より良好なシアン化が機能的ＧｎＴＩの存在下において、ＥＰＯの安定的発現で維持されることを意味する。
【図１１】ＣＨＯ−Ｋ１内でのＥＰＯの安定的発現が回復されたＧｎＴＩ機能を備えるＪＷ１５２のプロファイルより劣るシアル化プロファイルを示すことを示している写真である。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ＥＰＯコーディング配列を含有する発現ベクターでトランスフェクトされ、選択下に置かれる。クローンは単離され、９個の無作為に選択された安定的クローン由来のＥＰＯはＩＥＦを用いて分析される。これらの結果は、相違する安定的クローンによって生成された全ＥＰＯサンプルが全シアル化において相違するが、一般には図１０に示したようには良好にシアル化されないことを示している。
【図１２】ＥＰＯが無タンパク質培地中での懸濁液バッチ培養に順応させられている４つのＪＷ１５２安定的細胞系を生じさせたことを示している写真である。付着培養中の安定的ＪＷ１５２細胞系について観察されたシアル化パターンは、懸濁培養中で維持される。
【００３７】
＜配列表＞
配列番号１は、ＣＨＯ  ＪＷ１５２細胞由来のＮ−アセチルグルコアミニルトランスフェラーゼ（ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）Ｉ  ｃＤＮＡの核酸配列である。
【００３８】
配列番号２は、配列番号１によってコードされたＮ−アセチルグルコアミニルトランスフェラーゼ（ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）Ｉのアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
細胞毒性レクチンであるＲＣＡ−Ｉを用いて、本発明者らは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞から新規なＣＨＯ変異細胞系であるＪＷ１５２を単離した。
【００４０】
ＥＰＯおよびＧｎＴＩのｃＤＮＡを用いて安定的にトランスフェクトされたＪＷ１５２細胞によって生成された組換えＥＰＯは、高度にシアル化されたアイソフォームを含有する。これらの安定的にトランスフェクトされた細胞系の幾つかは、懸濁培養中で順応し、無血清培地中で増殖する。これらの細胞によって生成されたＥＰＯは、ＩＥＦアッセイによって分析される。これらの結果は、無血清培地中で生成されたＥＰＯが高シアル化された状態であることを証明した。
【００４１】
これらの結果は、ＪＷ１５２細胞がタンパク質、例えば糖タンパク質薬を含む高シアル化されたタンパク質などを生成するための宿主細胞系になる潜在能力を有することを示唆している。
【００４２】
細胞系ＪＷ１５２は、２００８年１２月１１日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、米合衆国バージニア州マナッサス、ＶＡ  ２０１１０−２２０９）に特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約（ｔｈｅ  Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅｓ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）下の国際寄託番号としてのアクセッション番号ＰＴＡ−９６５７を付けて寄託された。
【００４３】
本発明者らは、このため野生型チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞と比較してタンパク質を高シアル化できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または細胞系を提供する。
【００４４】
より高いシアル化が可能なＣＨＯ細胞は、適切な選択法、例えばＲＣＡ−１選択法によって生成することができる。そのような方法は、以下の「ＣＨＯ細胞およびＣＨＯ細胞系」においてさらに詳細に説明される。このため、ＲＣＡ−Ｉを使用すると、ＧｎＴＩの存在下で高シアル化された組換えタンパク質を生成するＣＨＯグリコシル化変異細胞を単離することができる。
【００４５】
そのような選択法は、それゆえ本明細書に記載した方法および組成物に特に含まれる。
【００４６】
本発明者らはこのため、野生型チャイニーズハムスター卵巣細胞と比較してタンパク質を高シアル化できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または細胞系を提供するが、該ＣＨＯ細胞はＲｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓアグルチニンＩ（ＲＣＡ−Ｉ）を用いた選択によって入手できる。一般に、本発明者らは、ＲＣＡ−Ｉ耐性ＣＨＯ細胞または細胞系、例えばＲＣＡ−Ｉ耐性ＣＨＯ−Ｋ１細胞または細胞系を提供する。
【００４７】
遺伝分析により、ＪＷ１５２細胞内の機能異常のＮ−アセチル−グルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）遺伝子を明らかにした。変異細胞由来のＧｎＴＩのｃＤＮＡの分子クローニングにより、早期の終止コドンを生じさせる点突然変異が同定された。結果として、ＪＷ１５２細胞は、４４７アミノ酸を含有する正常タンパク質ではなく３３８アミノ酸しか備えていないＧｎＴＩタンパク質の短縮（ｔｒａｎｃａｔｅｄ）バージョンしか合成できない。
【００４８】
ＲＣＡ−Ｉを使用して、本発明者らは、さらに多くのＣＨＯ変異系（約１００クローン）を単離している。遺伝分析により、それら全部に機能的ＧｎＴＩ遺伝子が欠如することを証明した。それらの内の多くはＧｎＴＩ遺伝子のコーディング領域において相違する点突然変異を有し、それらが様々のオリジナルクローンに由来することを示唆している。それでも、それらは全部がＧｎＴＩの存在下では組換えタンパク質のシアル化を劇的に改善した。これらのまた別のＣＨＯ細胞系由来のＧｎＴ１遺伝子における突然変異は、以下の表Ｄ１に示した。
【００４９】
したがって、本発明者らは、機能的ＧｎＴ１の存在下では野生型チャイニーズハムスター卵巣細胞と比較してタンパク質を高シアル化できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であって、該ＧｎＴ１遺伝子における突然変異を含むＣＨＯ細胞を提供する。本発明者らはさらに、野生型チャイニーズハムスター卵巣細胞と比較してタンパク質を高シアル化できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または細胞系であって、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓアグルチニンＩ（ＲＣＡ−Ｉ）を用いた選択によって入手でき、ＧｎＴ１遺伝子における突然変異を含むＣＨＯ細胞を提供する。
【００５０】
ＧｎＴ１遺伝子内の突然変異は、任意の点突然変異、欠失、反転などを含んでもよい。ＧｎＴ１遺伝子における突然変異は、部分機能的、または非機能的ＧｎＴ１ポリペプチドをコードしてもよい。ＧｎＴ１遺伝子における突然変異は、短縮ＧｎＴ１ポリペプチドをコードしてもよい。
【００５１】
本発明者らは、これらの変異ＣＨＯ変異系およびクローンの各々を含むＣＨＯ細胞および細胞系を提供する。本発明者らは、ＲＣＡ−Ｉ選択法に由来する、および野生型もしくは天然ＣＨＯ細胞または親細胞と比較して高シアル化できる具体的な細胞系を提供する。本発明者らは、以下でより詳細に説明するように、変異ＣＨＯ核酸およびそのような細胞または細胞系に含まれるポリペプチド配列を提供する。
【００５２】
ＣＨＯ細胞または細胞系は、ＪＷ１５２細胞系を含んでもよい。ＣＨＯ細胞または細胞系は、ＪＷ８０細胞系を含んでもよい。ＣＨＯ細胞または細胞系は、ＪＷ３６細胞系を含んでもよい。ＣＨＯ細胞または細胞系は、ＫＦＣ１５００２細胞系を含んでもよい。ＣＨＯ細胞または細胞系は、ＫＦＣ１５０７１細胞系を含んでもよい。ＣＨＯ細胞または細胞系は、ＫＦＣ５００８細胞系を含んでもよい。ＣＨＯ細胞または細胞系は、ＪＷ１５２細胞系を含んでもよい。ＣＨＯ細胞または細胞系は、ＫＦＣ５０２６細胞系を含んでもよい。ＣＨＯ細胞または細胞系は、ＫＦＣ２００１１細胞系を含んでもよい。ＣＨＯ細胞または細胞系は、ＫＦＣ１５０４７細胞系を含んでもよい。
【００５３】
ＣＨＯ細胞または細胞系は、目的のタンパク質、例えば異種もしくは組換えタンパク質をコードする核酸によりトランスフェクトされてもよい。そのようなタンパク質は、糖タンパク質を含んでもよい。ＣＨＯ細胞または細胞系は、機能的ＧｎＴ１配列、完全長ＧｎＴ１配列または野生型ＧｎＴ１配列をコードする核酸によりトランスフェクトまたは共トランスフェクトされてもよい。
【００５４】
上記で言及したように、本発明者らは、核酸自体、例えば変異ＧｎＴ１遺伝子をコードする核酸、またはそのような核酸のフラグメント、変異体、誘導体もしくはホモログを提供する。変異ＧｎＴ１遺伝子をコードする核酸、フラグメント、変異体、誘導体またはホモログは、それを含むＣＨＯ細胞がそのような核酸を含まないＣＨＯ細胞、例えば野生型ＣＨＯ細胞と比較して、より高いシアル化を行うことができるようにするものでもよい。変異ＧｎＴ１遺伝子をコードする核酸は、配列番号１に示した配列、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントを含んでもよい。
【００５５】
配列番号１
ＣＨＯ  ＪＷ１５２細胞から単離されたＮ−アセチルグルコアミニルトランスフェラーゼ（ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）Ｉ（Ｍｇａｔ１、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ３４３９６３）ｍＲＮＡのコーディング領域。これらの変異細胞では、１０１５位でのＣからＴへの点突然変異が同定された（ボールド体で示した）：
【化１】
2012502654.tif 000003
【００５６】
本発明者らは、変異ＧｎＴ１ポリペプチド、ならびにそれらのフラグメント、変異体、誘導体およびホモログをさらに提供する。変異ＧｎＴ１ポリペプチド、フラグメント、変異体、誘導体またはホモログは、そのようなポリペプチドを含んでいないＣＨＯ細胞、例えば野生型ＣＨＯ細胞と比較して、それを含むＣＨＯ細胞がより高いシアル化を行うことができるようにするものでもよい。変異ＧｎＴ１ポリペプチドは、配列番号２に示した配列、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントを含んでもよい。
【００５７】
配列番号２
ＣＨＯ  ＪＷ１５２細胞内の変異遺伝子によってコードされたＮ−アセチルグルコアミニルトランスフェラーゼ（ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）Ｉ（ＧｎＴＩ）タンパク質。点突然変異（Ｃ１０１５Ｔ）の結果として、ＪＷ１５２細胞は、４４７アミノ酸を含有する正常タンパク質ではなく３３８アミノ酸しか含有していないＧｎＴＩの短縮バージョンしか生成しない。ボールド体のＣ末端部分は、ＪＷ１５２細胞内では翻訳されない。
【化２】
2012502654.tif 000004
【００５８】
図２に示したＪＷ１５２−ｐＥＩＧ安定系の幾つかは、懸濁培養中で順応し、無血清培地中で増殖する。無血清培地中で生成されたＥＰＯは、高シアル化された状態であった。本発明者らはこのため、懸濁培養中で順応した、または無血清培地中で増殖する、ＲＣＡ−Ｉ選択に由来する変異ＣＨＯ細胞および細胞系を提供する。
【００５９】
結論として、本発明者らは、グリコシル化変異細胞をＣＨＯ細胞から単離するための新規な方法を開発した。ＲＣＡ−Ｉ処理を生存する全ＣＨＯ細胞は、極めて類似する特性を有する。第１に、その全ての細胞は、機能的ＧｎＴＩ遺伝子を欠如する。第２に、その全ての細胞が、ＧｎＴＩの存在下で野生型ＣＨＯ細胞よりも良好に、その組換えタンパク質をシアル化する。この特徴は、一過性のトランスフェクトされた細胞、および安定的にトランスフェクトされた細胞の両方において同一のままである。
【００６０】
ＲＣＡ−Ｉ、例えばＪＷ１５２細胞を用いて単離されたＣＨＯグリコシル化変異細胞は、ＧｎＴＩが存在する限り、高くシアル化された組換え糖タンパク質を生成できる。本方法は、シアル酸含量がその有効性のために重要である組換え糖タンパク質を生成するために使用できる。これらのタンパク質には、ＥＰＯ、ＩＥＦ−γ、第ＶＩＩＩ因子などが含まれる。
【００６１】
＜ＣＨＯ細胞および細胞系＞
本明細書に記載したＣＨＯ細胞および細胞系は、任意の適切な手段によって作成されてもよい。例えば、ＣＨＯ細胞および細胞系は、適切な凝集剤、例えばアグルチニンＩを用いる選択によって生成されてもよい。アグルチニンは、任意の適切なアグルチニン、例えばＲｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓアグルチニンＩ（ＲＣＡ−Ｉ）を含んでもよい。
【００６２】
本発明者らはこのため、ＣＨＯ細胞または細胞系を提供する方法であって、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓアグルチニンＩ（ＲＣＡ−Ｉ）の存在下でＣＨＯ細胞を培養するステップと、該培養を生存する細胞を選択するステップとを含む方法を提供する。
【００６３】
本明細書に記載したＣＨＯ細胞および細胞系は、出発もしくは親細胞をＲｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓアグルチニンＩ（ＲＣＡ−Ｉ）で処理するステップと、そのような処理を生存する細胞を選択することとによって作成されてもよい。そのような生存細胞をさらにクローニングし、細胞系を作成してもよい。選択された細胞および細胞系は、本文書に記載したように高いシアル化活性を含んでもよい。選択された細胞および細胞系は、本文書に記載したように、変異ＧｎＴ１遺伝子およびポリペプチドを含んでもよい。
【００６４】
例えば、本文書に記載したＣＨＯ細胞もしくは細胞系は、親細胞系をＲｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓアグルチニンＩ（ＲＣＡ−Ｉ）へ適切な期間にわたって適切な濃度で曝露させることによって選択されてもよい。
【００６５】
ＲＣＡ−１濃度は、０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ、例えば５０μｇ／ｍＬまでまたは２０μｇ／ｍＬまでの範囲に及んでよい。特定濃度の例には、１０μｇ／ｍＬおよび５μｇ／ｍＬが含まれる。
【００６６】
培養またはＲＣＡ−１への曝露の期間は、１時間、数時間（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２時間）、一晩から数日間、例えば２日間もしくは３日間までであってよい。
【００６７】
一般には、この期間および濃度は、多数のＣＨＯ細胞を除去するが、ＲＣＡ−Ｉに耐性である小さな比率の細胞が生存してコロニーを形成することができるように調整することができる。この範囲内で、濃度ならびに曝露および選択の期間は変動してよいが、一般には、ＲＣＡ−Ｉの濃度が高いほど必要な曝露期間は短かくなり、その逆もまた同様である。
【００６８】
選択は、任意の適切な出発細胞または細胞系を対象に実施できるが、これは一般にはＣＨＯ細胞または細胞系であろう。任意の公知のＣＨＯ細胞または細胞系は、出発点またはＣＨＯ−Ｋ１を含む親細胞として使用できよう。その他の適切な出発細胞は、ＣＨＯ（８５０５０３０２）、ＣＨＯ（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＦＲＥＥ）（００１０２３０７）、ＣＨＯ−Ｋ１（８５０５１００５）、ＣＨＯ−Ｋ１／ＳＦ（９３０６１６０７）、ＣＨＯ／ｄｈＦｒ−（９４０６０６０７）、ＣＨＯ／ｄｈＦｒ−ＡＣ−ｆｒｅｅ（０５０１１００２）、ＲＲ−ＣＨＯＫＩ（９２０５２１２９）（括弧内はＥＣＡＣＣアクセッション番号）を含むことができるが、それらに限定されない。
【００６９】
選択後、生存した細胞を増殖させ、コロニーを形成させるが、その後に採取してもよい。このために許容される時間は変動するが、一般にはコロニーを採取可能なサイズへ増殖させるために十分な長さである。そのような時間の例は、５日間、７日間、９日間、１１日間、１３日間、１週間、２週間、３週間またはそれ以上である。
【００７０】
採取することは手作業で行えるが、採取はロボット、例えばＣＬＯＮＥＰＩＸ（Ｇｅｎｅｔｉｘ社、英国ハンプシャー州ニューミルトン）の使用によって自動化することができる。採取されたコロニーを、さらにクローニングし、さらにスクリーニングし、特性解析し、そして培養するなどできる。
【００７１】
選択された細胞を、その後の試験にかけることができる。例えば、選択された細胞は、変異細胞がもはやＲＣＡ−Ｉと反応しないことを確認するためにＲＣＡ−Ｉを用いて凝集試験にかけることができる。
【００７２】
限定されることは意図されない特定の例として、ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、例えば６ウエルプレート内で集密まで培養されてよい。培養培地を、無血清ＤＭＥＭに変更してもよい。Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓアグルチニンＩ（ＲＣＡ−Ｉ、ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を、培地中に添加して１０μｇ／ｇｍＬの最終濃度に達してもよい。ＲＣＡ−Ｉは、細胞とともに一晩インキュベートされてもよい。ＲＣＡ−Ｉを含有する無血清ＤＭＥＭは、例えば１０％  ＦＢＳを備える新鮮ＤＭＥＭと取り替えられてよい。９日後、ＲＣＡ−Ｉ処理を生存するＣＨＯ細胞のコロニーを、採取して、例えば２４ウエルプレート内で培養することができる。
【００７３】
これらの細胞は、変異細胞がもはやＲＣＡ−Ｉと反応しないことを確認するために、また別の試験、例えば凝集試験にかけられてもよい。本発明者らはこのため、ＣＨＯ細胞もしくは細胞系を提供する方法であって、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓアグルチニンＩ（ＲＣＡ−Ｉ）の存在下でＣＨＯ細胞を培養するステップと、該培養から生存し、凝集試験においてＲＣＡ−Ｉと反応しない細胞を選択するステップとを含む方法を提供する。
【００７４】
ＲＣＡ−Ｉで選択したＣＨＯ細胞およびＣＨＯ細胞系は、それらのシアル化挙動について、例えば目的のタンパク質を発現させることと、シアル化度を決定することとによって試験することができる。これは、以下の「シアル化」に記載した方法によって行うことができる。
【００７５】
本発明者らはこのため、ＣＨＯ細胞もしくは細胞系を提供する方法であって、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓアグルチニンＩ（ＲＣＡ−Ｉ）の存在下でＣＨＯ細胞を培養するステップと、該培養を生存する細胞を選択することと、高度のシアル化挙動、例えば発現されたタンパク質の高Ｚ数または低ｐＩを示すそれらの細胞または細胞系を選択するステップとを含む方法を提供する。
【００７６】
そのような選択された細胞内のＧｎＴ１遺伝子は、当分野において公知の方法を用いてクローニングおよび配列決定することができる。ＧｎＴ１遺伝子は、本明細書に記載したように変異ＧｎＴ１遺伝子を含んでもよい。
【００７７】
本発明者らはこのため、ＣＨＯ細胞または細胞系を提供する方法であって、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓアグルチニンＩ（ＲＣＡ−Ｉ）の存在下でＣＨＯ細胞を培養するステップと、該培養を生存する細胞を選択するステップと、本明細書に記載した変異ＧｎＴ１遺伝子を含むそれらの細胞または細胞系を選択するステップとを含む方法を提供する。
【００７８】
＜変異ＣＨＯ細胞および細胞系＞
本発明者らは、上述したように、ＲＣＡ−Ｉ選択に由来するＣＨＯ細胞または細胞系を提供する。そのような細胞系は、ＪＷ１５２細胞系、またはＪＷ８０細胞系、ＪＷ３６細胞系、ＫＦＣ１５００２細胞系、ＫＦＣ１５０７１細胞系、ＫＦＣ５００８細胞系、ＪＷ１５２細胞系、ＫＦＣ５０２６細胞系、ＫＦＣ２００１１細胞系、またはＫＦＣ１５０４７細胞系を含む以下の表Ｄ１に記載した細胞系のいずれかを含むことができよう。
【００７９】
＜タンパク質発現＞
本明細書に記載したＣＨＯ細胞は、目的の任意のタンパク質を発現させるための宿主細胞として使用できる。これは当分野において公知の手段によって行うことができる。
【００８０】
ＣＨＯ細胞および細胞系におけるタンパク質発現は前記文献において明確に記載され、当業者であれば、本明細書に記載したＣＨＯ細胞および細胞系をタンパク質発現のための宿主として使用する際に、ほとんど困難を有しない。そこで例えば、ＣＨＯ細胞および細胞系は、当分野において公知の手段によって目的のタンパク質を発現できる発現ベクターによりトランスフェクトすることができる。
【００８１】
ＣＨＯ細胞および細胞系は、さらに野生型または機能的ＧｎＴ１、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３４３９６３に提示された配列を発現することができる。これは、ＧｎＴ１をコードする発現ベクターによりＣＨＯ細胞および細胞系をトランスフェクトすることによって実施できる。これは、目的のタンパク質をコードする核酸を含有するベクターと同一または相違するベクター上であってよい。
【００８２】
任意の適切なタンパク質は、本明細書に記載したＣＨＯ細胞を宿主細胞として使用して発現させることができる。タンパク質は、異種タンパク質を含むことができる。タンパク質は、組換えタンパク質を含むことができる。タンパク質は、操作されたタンパク質を含むことができる。タンパク質は、糖タンパク質を含むことができる。
【００８３】
例には、治療または薬理学的目的の異種タンパク質が含まれる。発現させることのできるタンパク質には、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ、α−グルコシダーゼ、ラロニダーゼ、Ｉｇ−ＣＴＬＡ４融合、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、黄体化ホルモン、抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ  、第ＶＩＩＩ因子、抗ｌｇＥ  ｍＡｂ、抗ＣＤ１１ａ  ｍＡｂ、α−ガラクトシダーゼ、インターフェロン−β、抗ＴＮＦα  ｍＡｂ、エリスロポエチン、抗ＣＤ５２  ｍＡｂ、第ＶＩＩＩ因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、抗−ＨＥＲ２  ｍＡｂ、ＴＮＦα受容体融合、第ＩＸ因子、卵胞刺激ホルモン、抗ＣＤ２０  ｍＡｂ、インターフェロン−β，β−グルコセレブロシダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩなどが含まれる。
【００８４】
例えば、本発明者らは、本明細書に記載したＣＨＯ細胞および細胞系を用いたエリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロン−γおよび第ＶＩＩＩ因子の発現について記載する。本発明者らはさらに、本明細書に記載したＣＨＯ細胞および細胞系から発現されたエリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロン−γおよび第ＶＩＩＩ因子の高シアル化形またはアイソフォームについても記載する。
【００８５】
＜シアル酸＞
用語「シアル酸」は、１ファミリーの炭素数が９個のカルボキシル化された糖の任意のメンバーを意味すると意図されている。
【００８６】
シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース（ｇａｌａｃｔｏｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓ）−１−オニン酸（ｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡと略記されることが多い）である。該ファミリーの第２メンバーは、Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）であり、このときＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基はヒドロキシル化されている。第３のシアル酸ファミリーメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）である。１７
【００８７】
９−置換シアル酸、例えば９−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６−アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ、例えば９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃもしくは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃも、また、含まれる。シアル酸ファミリーの概説については、例えば、Ｖａｒｋｉ；Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２  １９９２；２５−４０；Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｅｄ．を参照されたい。
【００８８】
＜シアル化＞
タンパク質のシアル化度を、様々な手段、例えばＺ数を使用すること、またはタンパク質の等電点を明示することによって測定することができる。
【００８９】
本発明者らはこのため、本明細書に記載したＣＨＯ細胞および細胞系を用いたタンパク質発現を提供するが、そのようなタンパク質発現は、目的のタンパク質の高シアル化形またはアイソフォームを含む。本明細書に記載したＣＨＯ細胞および細胞系からのタンパク質発現は、糖タンパク質などのタンパク質、例えばエリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロン−γおよび第ＶＩＩＩ因子の生成を可能にするが、これらのタンパク質は高Ｚ数もしくは低ｐＩ、またはその両方を有する。
【００９０】
＜Ｚ数＞
パラメーターのＺ数は、糖タンパク質中の炭水化物成分の内のいくつのアンテナが荷電残基、例えばシアル酸を有するかの尺度を提供する。
【００９１】
Ｚ数を決定するために、炭水化物成分は、上述したようにペプチドから遊離され、所望であれば標識される。この混合物は、次に電荷に基づいて種の分離を許容するイオン交換クロマトグラフィーによって分離される。溶出ピークの可視化は、上記で言及したように標識によるものでもよく、または一部の他の方法、例えば質量分析法によるものでもよい。
【００９２】
クロマトグラムは、次にモノ、ジ、トリおよびテトラ荷電炭水化物種に関連するピークを統合することによって分析される。各種によって表される全炭水化物のパーセンテージは、次に以下の方程式：Ｚ＝Ｐ’モノ＋２Ｐ’ジ＋３Ｐ’トリ＋４Ｐ’テトラ（式中、Ｚは、Ｚ数であり、Ｐ’モノ、Ｐ’ジ、Ｐ’トリ、およびＰ’テトラは、各々モノ、ジ、トリおよびテトラ荷電である全炭水化物のパーセンテージである）にしたがってＺ数を計算するために使用できる。
【００９３】
高Ｚ数は、多数のアンテナが荷電残基を有しているため、糖タンパク質は高く荷電され、そしてシアル酸残基の場合には酸性であることを示している。
【００９４】
本明細書に記載したＣＨＯ細胞は、高くシアル化されたタンパク質を発現することができる。そこで例えば、ＣＨＯ細胞は、例えば１５０より大きい、例えば１６０より大きい、１７０より大きい、１８０より大きい、例えば１９０より大きい、２００より大きい、２１０より大きい、例えば２２０より大きい、例えば２３０より大きいＺ数値を備えるタンパク質を発現することができる。
【００９５】
＜等電点＞
タンパク質の等電点（ｐＩ）は、さらにまたタンパク質のシアル化の尺度として使用できる。シアル化度が高いほど、タンパク質はより酸性となり、ｐＩは小さくなる。
【００９６】
本明細書に記載したＣＨＯ細胞によって発現されたタンパク質は、それらの正常対応物、例えば天然タンパク質、または野生型ＣＨＯ細胞によって発現された対応タンパク質より有意に小さいｐＩプロファイルを有する。例えば、本明細書に記載したＣＨＯ細胞および細胞系によって発現されたタンパク質は、小さいｐＩ、例えば４．５以下、例えば４．３以下、４．１以下、４．０以下、３．８以下、３．６以下、３．４以下、３．２以下、３．０以下、２．８以下、２．６以下などの小さいｐＩ値を有してもよい。これらのｐＩは、個別タンパク質分子、またはそれらのバッチもしくは分画のｐＩでもよい、または発現された多数のタンパク質の平均ｐＩでもよい。
【００９７】
発現されたタンパク質は、当業者には公知である多数の方法を使用してアイソフォームの混合物から単離することができる。例えば、等電点焦点法（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｓｉｎｇ）、クロマト分画法（ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｓｉｎｇ）またはイオン交換クロマトグラフィーを使用すると、ｐＩに基づいてアイソフォームを分離することができる。様々な分画は、シアル酸含量について分析することができ、所望の分画を使用するために選択できる。
【００９８】
＜変異ＧｎＴ１配列＞
本発明者らは、変異ＧｎＴ１アミノ酸配列および変異ＧｎＴ１核酸配列を含む変異ＧｎＴ１配列を開示する。
【００９９】
例示の変異ＧｎＴ１アミノ酸配列には、配列番号２に示した配列、ならびに以下の表Ｄ１の第３列に示した突然変異を含む配列が含まれる。
【０１００】
例示の変異ＧｎＴ１核酸配列には、配列番号１に示した配列、ならびに以下の表Ｄ１の第２列に示した突然変異を含む配列が含まれる。
【０１０１】
表Ｄ１は、以下の実施例に記載したように、ＲＣＡ−Ｉを用いた選択から単離されたクローンのＧｎＴ１配列における突然変異を示している。
【０１０２】
対応する突然変異は、各ヌクレオチドおよびアミノ酸突然変異ならびに二次構造／相互作用における可能性のある破壊場所または終止コドン突然変異の場合に結果として生じるアミノ酸の消失を示すことと平行して表示されている。
【０１０３】
見いだされた突然変異がＰＣＲの誤差に起因しなかったことを確認するために、最少４つの細菌コロニーが配列決定された。
【０１０４】
【表１】
2012502654.tif 000005
【０１０５】
表Ｄ１。ＲＣＡ−Ｉスクリーニングからのクローン由来のＧｎＴ１突然変異体において見いだされた突然変異の表（以下の実施例１０）。ＧｎＴ１遺伝子において相違する突然変異を備える９個のＣＨＯグリコシル化突然変異体。機能消失をもたらす点突然変異は、４つの細胞系（ＪＷ８０、ＪＷ３６、ＫＦＣ１５００２、ＫＦＣ１５０７１）において見いだされた。終止コドンの生成を生じさせる点挿入（ｐｏｉｎｔ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）は、ＫＦＣ  ５００８において見いだされた。早期終止コドンをもたらす突然変異は、別の４つの細胞系（ＪＷ１５２、ＫＦＣ５０２６、ＫＦＣ２００１１、ＫＦＣ１５０４７）においても見いだされた。
【０１０６】
＜変異ＧｎＴ１ポリペプチド＞
ＣＨＯ細胞および細胞系は、変異ＧｎＴ１ポリペプチドを含んでいる。
【０１０７】
本発明者らはこのため、一般に変異ＧｎＴ１ポリペプチドをそれらのフラグメント、ホモログ、変異体および誘導体と一緒に提供する。これらのポリペプチド配列は、本明細書に、および特には配列表に開示したポリペプチド配列を含んでもよい。
【０１０８】
変異ＧｎＴ１ポリペプチドは、野生型ＧｎＴ１配列と比較して１つ以上の変化を含む場合がある。そのような突然変異は、コーディング核酸配列内に導入される終止コドンおよびその結果であるＧｎＴ１のｍＲＮＡの翻訳の早期終結から生じてもよい。
【０１０９】
変異ＧｎＴ１ポリペプチドは、野生型ＧｎＴ１ポリペプチドより短くてもよい。変異ＧｎＴ１ポリペプチドは、野生型ＧｎＴ１ポリペプチドの短縮バージョンでもよい。変異ＧｎＴ１ポリペプチドの長さは、野生型配列の９０％以下、８０％以下、７０％以下などであってよい。
【０１１０】
例えば、変異ＧｎＴ１ポリペプチドは、完全長もしくは野生型ＧｎＴ１ポリペプチドと比較して５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のＣ末端残基が欠如していてもよい。
【０１１１】
変異ＧｎＴ１ポリペプチドは、例えば配列番号２に提示した配列を含んでもよい。これは、細胞系ＪＷ１５２由来の変異ＧｎＴ１ポリペプチド配列である。変異ＧｎＴ１ポリペプチドは、上記の表Ｄ１の第３列に提示した突然変異を含むＧｎＴ１配列を含んでもよい。
【０１１２】
本明細書に開示した変異ＧｎＴ１ポリペプチド配列は、配列表に提示された特定の配列、またはそのフラグメント、もしくは変異ＧｎＴ１タンパク質から入手された配列には限定されず、場合によっては、それらが変異ＧｎＴ１の少なくとも１つの生物学的活性を有することを前提として、任意の起源、例えば関連細胞ホモログ、他の種由来ホモログおよびその変異体もしくは誘導体から入手された相同配列もまた含まれることを理解されたい。
【０１１３】
本開示はこのため、配列表に記述されたアミノ酸配列の変異体、ホモログまたは誘導体、および本明細書に開示したヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の変異体、ホモログまたは誘導体を含んでいる。そのような配列は、一般に「変異ＧｎＴ１配列」と呼ばれる。
【０１１４】
変異ＧｎＴ１ポリペプチドの長さは、対応する野生型配列の９０％以下、８０％以下、７０％以下などであってよい。
【０１１５】
例えば、変異ＧｎＴ１核酸は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のＣ末端残基が欠如する変異ＧｎＴ１ポリペプチドをコードする可能性がある。
【０１１６】
＜生物学的活性＞
一部の実施形態では、これらの配列は、場合によっては変異ＧｎＴ１の少なくとも１つの生物学的活性を含んでいる。生物学的活性は、野生型ＧｎＴ１と比較して、より高くシアル化されたタンパク質を発現する改善された能力を含むことができる。
【０１１７】
＜ホモログ＞
開示されたポリペプチドには、任意の起源、例えば関連ウイルス／細菌タンパク質、細胞ホモログおよび合成ペプチド、ならびにそれらの変異体または誘導体から入手された相同配列が含まれる。
【０１１８】
本文書の状況では、相同配列またはホモログは、場合によっては、例えば本明細書の配列表に示したようにＧｎＴ１とともに少なくとも３０、例えば５０、７０、９０または１００アミノ酸にわたるアミノ酸レベルで少なくとも６０、７０、８０または９０％同一である、例えば少なくとも９５もしくは９８％同一であるアミノ酸配列を含むと理解されている。本文書の状況では、相同配列は、アミノ酸レベルで、ＧｎＴ１の配列とともに少なくとも１５、２５、３５、５０または１００、例えば２００、３００、４００または５００アミノ酸にわたり少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％同一である、例えば少なくとも９５もしくは９８％同一であるアミノ酸配列を含むと理解されている。
【０１１９】
相同性は類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）に関して考察することもできるが、本文書の状況においては、配列同一性に関して相同性を表現することが可能である。一部の実施形態では、配列同一性は、関連配列の長さの全てに比して、すなわち例えば関連遺伝子の全長または完全長配列に比して決定される。
【０１２０】
相同性比較は、目視で、またはより通例では、容易に入手できる配列比較プログラムを用いて実施することができる。これらの市販で入手できるコンピュータープログラムは、２つ以上の配列間の相同性率（％）を計算できる。
【０１２１】
相同性率（％）は、隣接配列と比較して計算することができるが、すなわち１つの配列が他の配列とアラインさせられ、１つの配列内の各アミノ酸が他の配列内の対応するアミノ酸と、一度に１残基ずつ直接的に比較される。これは、「ギャップ無し」アラインメントと呼ばれる。典型的には、ギャップ無しアラインメントは、相当に少ない数の残基（例えば、５０未満の隣接アミノ酸）にわたってのみ実施される。
【０１２２】
これは極めて単純かつ首尾一貫した方法であるが、例えば、他の点で同一対の配列では、１つの挿入もしくは欠失は以下のアミノ酸残基がアラインメントから締め出されることを引き起こすので、そこでグローバルアラインメントが実施される場合は相同性率（％）の大きな減少が生じることを考慮に入れることができない。結果として、大多数の配列比較方法は、全相同性スコアに過度にペナルティを与えることなく可能性のある挿入および欠失を考慮に入れる最適なアラインメントを生じさせるように設計されている。これは、局所相同性を最大化することを試みるために配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【０１２３】
しかし、これらのより複雑な方法はアラインメント内で発生する各ギャップに「ギャップペナルティ」を指定するので、このため同数の同一アミノ酸については、できる限り少ない数のギャップを備える配列アラインメントは、２つの比較された配列間のより高度の関連性を反映して、多数のギャップを備える配列より高いスコアを達成する。典型的には、ギャップの存在に対する相当に高いコストおよび該ギャップ内の各後続残基に対するより小さなペナルティを要求する「アフィンギャップコスト」が使用される。これは、最も一般的に使用されるギャップ・スコアリングシステムである。高ギャップペナルティは、当然ながらより少数のギャップを備える最適化アラインメントを生じさせる。大多数のアラインメントプログラムによって、ギャップペナルティを変更することができる。しかし、配列比較のためにそのようなソフトウェアを使用する場合にはデフォルト値を使用できる。例えばＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（以下を参照されたい）を使用した場合は、アミノ酸配列についてのデフォルト・ギャップ・ペナルティは、１つのギャップについては−１２および各伸長については−４である。
【０１２４】
最高相同性率（％）の計算は、このためギャップペナルティを考慮に入れて、最適アラインメントの生成を最初に必要とする。そのようなアラインメントを実施するための適切なコンピュータープログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７）である。配列比較を実施できる他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  ｉｂｉｄ  -  Ｃｈａｐｔｅｒ  １８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１０）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールセットが含まれるがそれらに限定されない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡはどちらもオフラインおよびオンライン検索のために利用できる（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  ｉｂｉｄ，ｐａｇｅｓ  ７−５８  ｔｏ  ７−６０を参照されたい）。
【０１２５】
最終相同性率（％）は同一性によって測定できるが、アラインメントプロセス自体は、典型的には絶対的対比較法（ａｌｌ−ｏｒ−ｎｏｔｈｉｎｇ  ｐａｉｒ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）には基づいていない。その代りに、化学的類似性または進化距離に基づいて各ペアワイズ比較にスコアを指定する目盛り付き類似性スコアマトリックスが一般に使用される。一般に使用されるそのようなマトリックスの例は、ＢＬＡＳＴプログラムセットのためのデフォルトマトリックスであるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般には公衆デフォルト値または供給された場合はカスタム記号比較表のいずれかを使用する（これ以上の詳細についてはユーザーマニュアルを参照されたい）。ＧＣＧパッケージのための公衆デフォルト値、または他のソフトウェアの場合にはデフォルトマトリックス、例えばＢＬＯＳＵＭ６２を使用できる。
【０１２６】
ソフトウェアが最適なアラインメントを生成すると、相同性率（％）、例えば配列同一性率（％）を計算するのが可能である。ソフトウェアは、典型的にはこれを配列比較の一部として実行し、数値結果を生成する。
【０１２７】
＜変異体および誘導体＞
本明細書に記載したアミノ酸配列に関連する用語「変異体」もしくは「誘導体」には、その配列から、またはその配列への１つ（またはそれ以上）のアミノ酸の任意の置換、変化、修飾、置換、欠失または付加が含まれる。例えば、生じたアミノ酸配列は未修飾配列と実質的に同一活性を維持し、例えば配列表に示した変異ＧｎＴ１ポリペプチドと少なくとも同一の活性を有する。
【０１２８】
実施例に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそれらのフラグメントもしくはホモログは、本明細書に記載した方法および組成物において使用するために修飾されてよい。典型的には、配列の生物学的活性を維持する修飾が行われる。例えば、修飾された配列が未修飾配列の生物学的活性を維持することを前提に、１、２もしくは３〜１０、２０もしくは３０置換のアミノ酸置換が行われてもよい。アミノ酸置換は、例えば治療的に投与されるポリペプチドの血漿中半減期を増加させるために、自然には発生しないアナログの使用を含んでもよい。
【０１２９】
変異ＧｎＴ１の天然変異体は、保存的アミノ酸置換を含む可能性が高い。保存的置換は、例えば以下の表にしたがって規定することができる。第２列の同一ブロック内および第３列の同一線内のアミノ酸は、相互に置換することができる。
【０１３０】
【表２】
2012502654.tif 000006
【０１３１】
＜フラグメント＞
本明細書に開示され、マーカーとして有用なポリペプチドは、配列表に提示した配列のフラグメントを含む、上記で言及した完全長ポリペプチドおよびそれらの変異体もまた含んでいる。
【０１３２】
ポリペプチドは、変異ＧｎＴ１ポリペプチドの完全長配列のフラグメントもまた含んでいる。そのようなフラグメントは、少なくとも１つのエピトープを含んでもよい。エピトープを同定する方法は、当分野において周知である。フラグメントは、典型的には少なくとも６アミノ酸、例えば少なくとも１０、２０、３０、５０または１００アミノ酸を含む。
【０１３３】
変異ＧｎＴ１アミノ酸配列由来の、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５または１５０またはそれ以上の残基からなるフラグメントが含まれる。
【０１３４】
変異ＧｎＴ１タンパク質ならびにそれらの対立遺伝子および種変異系のポリペプチドフラグメントは、保存的置換を含む、１つ以上（例、５、１０、１５、または２０）の置換を含有してもよい。置換、欠失および／または挿入が、例えば相違する種において発生する場合は、配列表に記載された例えば５０％、４０％または２０％未満のアミノ酸残基が変更させられる。
【０１３５】
変異ＧｎＴ１、ならびにフラグメント、ホモログ、変異体および誘導体は、組換え手段によって作成することができる。しかし、それらは例えば固相合成法などの当業者には周知の技術を使用する合成手段によって作成することもできる。タンパク質は、例えば抽出および精製において役立つために、融合タンパク質として生成されてもよい。融合タンパク質パートナーの例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）およびβ−ガラクトシダーゼが含まれる。融合タンパク質パートナーと目的のタンパク質配列との間で融合タンパク質配列の除去を許容するために、タンパク質分解的切断部位を含めることも、また便宜的かもしれない。融合タンパク質は、それが当該配列のタンパク質の機能を妨害しない融合タンパク質であってもよい。タンパク質は、動物細胞由来の細胞抽出物の生成によって入手されてもよい。
【０１３６】
本明細書に開示した変異ＧｎＴ１ポリペプチド、変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体は、実質的に単離された形態にあってよい。そのようなポリペプチドは、該タンパク質の所定の目的を妨害しない担体もしくは希釈液と混合することができ、それでもなお実質的に単離されていると見なせると理解されている。変異ＧｎＴ１変異体、ホモログ、フラグメントもしくは誘導体は、さらに実質的に精製された形態であってよく、その場合には調製物内にタンパク質を一般には含んでおり、該調製物内のタンパク質の９０％超、例えば９５％、９８％または９９％がタンパク質である。
【０１３７】
本明細書に開示した変異ＧｎＴ１ポリペプチド、変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体は、明示的（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ）標識を用いて標識することができる。明示的標識は、ポリペプチドなどの検出を可能にする任意の適切な標識であってよい。適切な標識には、放射性同位体、例えば１２５Ｉ、酵素、抗体、ポリヌクレオチドおよびリンカー、例えばビオチンが含まれる。標識されたポリペプチドは、サンプル中のポリペプチドの量を決定するために、診断方法、例えばイムノアッセイにおいて使用できる。ポリペプチドもしくは標識されたポリペプチドは、さらにまた標準プロトコルを用いて動物およびヒトにおける前記ポリペプチドに対する免疫反応性を検出するための血清学的または細胞媒介性免疫アッセイにおいて使用することができる。
【０１３８】
本明細書に開示した、任意選択的に標識された変異ＧｎＴ１ポリペプチド、変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体は、固相に、例えばイムノアッセイウェルまたはディップスティックの表面に固定することもできる。そのような標識および／または固定化されたポリペプチドは、適切な容器内のキットに適切な試薬、コントロール、取扱説明書などと一緒に包装することができる。そのようなポリペプチドおよびキットは、イムノアッセイによってポリペプチドまたはそれらの対立遺伝子もしくは種変異体に対する抗体の検出方法において使用できる。
【０１３９】
イムノアッセイ法は、当分野において周知であり、一般的には、（ａ）前記タンパク質に対する抗体によって結合可能なエピトープを含むポリペプチドを提供するステップと、（ｂ）抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で生物学的サンプルを前記ポリペプチドとともにインキュベートするステップと、（ｃ）前記ポリペプチドを含む抗体−抗原複合体が形成されるかどうかを決定するステップとを含む。
【０１４０】
本明細書に開示した変異ＧｎＴ１ポリペプチド、変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体は、それらが疾患に及ぼす機能を含む細胞機能における対応する遺伝子およびそれらのホモログの役割を試験するために、インビトロまたはインビボ細胞培養システムにおいて使用できる。例えば、切断もしくは修飾されたポリペプチドは、細胞内で発生する正常機能を破壊するために細胞内に導入することができる。ポリペプチドは、組換え発現ベクターからのポリペプチドのインサイチュー発現によって細胞内に導入することができる（以下を参照されたい）。発現ベクターは、任意選択によりポリペプチドの発現を制御するために誘導性プロモーターを有している。
【０１４１】
適切な宿主細胞、例えば昆虫細胞または哺乳動物細胞の使用は、組換え発現産物に最適な生物学的活性を授けるための必要に応じて、そのような翻訳後修飾（例、ミリストイル化、グリコシル化、切断、ラピデーション（ｌａｐｉｄａｔｉｏｎ）およびチロシン、セリンもしくはトレオニンリン酸化）を提供すると予期される。その中で本明細書に開示した変異ＧｎＴ１ポリペプチド、変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体が発現させられるそのような細胞培養システムは、細胞内のポリペプチドの機能を妨害または増強する候補物質を同定するためのアッセイシステムにおいて使用できる。
【０１４２】
＜変異ＧｎＴ１核酸＞
ＣＨＯ細胞および細胞系は、変異ＧｎＴ１核酸を含む。
【０１４３】
本発明者らはこのため、一般に変異ＧｎＴ１核酸をそれらのフラグメント、ホモログ、変異体および誘導体と一緒に提供する。これらの核酸配列は、本明細書に、および特に配列表に開示したポリペプチド配列をコードする可能性がある。
【０１４４】
ポリペプチドは、変異ＧｎＴ１核酸を含んでもよい。変異ＧｎＴ１核酸は、野生型ＧｎＴ１配列と比較して１つ以上の点突然変異を含んでもよい。そのような突然変異は、アミノ酸配列への対応する変化を生じさせる、または終止コドンおよびＧｎＴ１  ｍＲＮＡの翻訳の早期終結を導入することができる。
【０１４５】
変異ＧｎＴ１核酸は、終止コドンを生じさせる突然変異を含んでもよく、これは野生型ＧｎＴ１ポリペプチドより短い変異ＧｎＴ１ポリペプチドを生じさせる。変異ＧｎＴ１ポリペプチドの長さは、野生型配列の９０％以下、８０％以下、７０％以下などでもよい。
【０１４６】
例えば、変異ＧｎＴ１核酸は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のＣ末端残基が欠如する変異ＧｎＴ１ポリペプチドをコードする可能性がある。
【０１４７】
変異ＧｎＴ１核酸は、例えば配列番号１に提示した配列を含んでもよい。これは、細胞系ＪＷ１５２由来の変異ＧｎＴ１核酸配列である。変異ＧｎＴ１核酸は、上記の表Ｄ１の第２列に提示した突然変異を含むＧｎＴ１配列を含んでもよい。
【０１４８】
詳細には、本発明者らは、本明細書に開示したＧｎＴ１ポリペプチドのいずれかをコードする核酸またはポリヌクレオチドを提供する。そこで、用語「ＧｎＴ１配列」は、それに応じて解釈されなければならない。しかし、そのような核酸またはポリヌクレオチドは、配列番号１に提示した配列、またはそのような核酸の対応するポリペプチド、およびフラグメント、ホモログ、変異体または誘導体をコードする配列を含んでもよい。上記の用語は、このためこれらの配列に関すると解釈されてもよい。
【０１４９】
本文書において使用する用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および核酸は、相互に同義語であることが意図されている。「ポリヌクレオチド」は、一般には、未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチドを意味している。「ポリヌクレオチド」には、制限なく、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、より典型的には二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれる。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。用語「ポリヌクレオチド」には、さらにまた１つ以上の修飾された塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡおよび安定的または他の理由から修飾された骨格を備えるＤＮＡまたはＲＮＡもまた含まれる。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基および例えばイノシンなどの異常塩基が含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡには様々な修飾が行われてきた。そこで「ポリヌクレオチド」は、典型的には実際に見いだされる化学的、酵素的または代謝的修飾形、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態を含んでいる。「ポリヌクレオチド」は、さらにまたオリゴヌクレオチドと呼ばれることが多い相当に短いポリヌクレオチドを含んでいる。
【０１５０】
当業者であれば、多数の相違するポリヌクレオチドおよび核酸は、遺伝コードの縮重の結果として同一ポリペプチドをコードできることを理解できる。さらに、当業者であれば、ルーチン技術を使用して、ポリペプチドがその中で発現させられる任意の特定宿主生物のコドン使用頻度を反映するために本明細書に記載したポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列には影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行えることが理解されるはずである。
【０１５１】
＜変異ＧｎＴ１変異体、誘導体およびホモログ＞
本明細書に記載した変異ＧｎＴ１ポリヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡを含むことができる。それらは、一本鎖または二本鎖であってよい。それらはさらにまた、それらの内部に合成もしくは修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドでもよい。オリゴヌクレオチドへの多数の様々なタイプの修飾は、当分野において公知である。これらは、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端におけるアクリジンもしくはポリリシン鎖の付加を含んでいる。本特許文書のために、本明細書に記載したポリヌクレオチドが当分野において利用できる任意の方法によって修飾できると理解すべきである。そのような修飾は、ポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増強するために実施できる。
【０１５２】
ポリヌクレオチドが二本鎖の場合は、個別または組み合わせのいずれかの二重鎖の両方の鎖は、本明細書に記載した方法および組成物によって含まれる。ポリヌクレオチドが一本鎖である場合は、そのポリヌクレオチドの相補的配列もまた含まれると理解すべきである。
【０１５３】
ヌクレオチド配列に関連する用語「変異体」、「ホモログ」または「誘導体」には、その配列から、またはその配列への１つ（またはそれ以上）のヌクレオチドの任意の置換、変化、修飾、取替え、欠失もしくは付加が含まれる。結果として生じる配列は、ＣＨＯ細胞内のより高いシアル化を媒介できるポリペプチドをコードしてもよい。
【０１５４】
配列同一性に関連して上記で指示したように、「ホモログ」は、例えば、配列表に示した関連配列との少なくとも５％同一性、少なくとも１０％同一性、少なくとも１５％同一性、少なくとも２０％同一性、少なくとも２５％同一性、少なくとも３０％同一性、少なくとも３５％同一性、少なくとも４０％同一性、少なくとも４５％同一性、少なくとも５０％同一性、少なくとも５５％同一性、少なくとも６０％同一性、少なくとも６５％同一性、少なくとも７０％同一性、少なくとも７５％同一性、少なくとも８０％同一性、少なくとも８５％同一性、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一性を有する。
【０１５５】
少なくとも９５％同一性、例えば少なくとも９６％同一性、例えば少なくとも９７％同一性、例えば少なくとも９８％同一性、例えば少なくとも９９％同一性であってよい。ヌクレオチド相同性比較は、上記に記載したように実施できる。使用できる配列比較プログラムは、上記に記載したＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムである。デフォルトのスコアリングマトリックスは、各同一ヌクレオチドに対しては１０および各ミスマッチに対しては−９のマッチ値を有する。各ヌクレオチドに対して、デフォルトのギャップ作成ペナルティは−５０であり、デフォルトのギャップ伸長ペナルティは−３である。
【０１５６】
一部の実施形態では、変異ＧｎＴ１ポリヌクレオチドは、配列番号１に示した配列に対して少なくとも９０％以上の配列同一性を有している。変異ＧｎＴ１ポリヌクレオチドは、配列番号１に示した配列との６０％以上、例えば６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上または９８％以上の配列同一性を有していてよい。
【０１５７】
＜ハイブリダイゼーション＞
本発明者らはさらに、本明細書に提示した配列のいずれか、それらの変異体、フラグメントもしくは誘導体、または上記のいずれかの相補体へ選択的にハイブリダイズすることのできる変異ＧｎＴ１ヌクレオチド配列について記載する。ヌクレオチド配列は、長さが少なくとも１５ヌクレオチドの配列、例えば長さが少なくとも２０、３０、４０もしくは５０ヌクレオチドの配列である。
【０１５８】
本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション」は、「それにより核酸鎖が塩基対合により相補鎖と結合するプロセス」ならびにポリメラーゼ連鎖反応テクノロジーにおいて実施されるような増幅プロセスを含むものとする。
【０１５９】
本明細書に提示したヌクレオチド配列、またはそれらの相補体へ選択的にハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチドは、一般には、少なくとも２０、例えば少なくとも２５もしくは３０、例えば少なくとも４０、６０もしくは１００以上の隣接ヌクレオチドにわたって、本明細書に提示した対応するヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０もしくは９０％、または少なくとも９５％もしくは９８％相同である。
【０１６０】
用語「選択的にハイブリダイズすることができる」は、プローブとして使用されるポリヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドがバックグラウンドより有意に高いレベルでプローブにハイブリダイズすることが見いだされる条件下で使用されることを意味する。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えば存在する他のポリヌクレオチドのために、スクリーニングされるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡライブラリー内で発生する可能性がある。結果的に、バックグラウンドは、プローブとライブラリーの非特異的ＤＮＡメンバーとの間の相互作用によって生成されるシグナルの１０倍未満、例えば標的ＤＮＡを用いて観察される特異的相互作用と同等の強度の１００倍未満などであるレベルを付与する。相互作用の強度は、例えば、プローブを例えば３２Ｐで放射標識することによって測定することができる。
【０１６１】
ハイブリダイゼーション条件は、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，サンディエゴカリフォルニア州）に教示されたように核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、以下で説明するように規定された「ストリンジェンシー（厳密性）」を付与する。
【０１６２】
最高ストリンジェンシーは、典型的には約Ｔｍ−５℃である（プローブのＴｍより５℃低い）。高ストリンジェンシーはＴｍより約５℃〜１０℃低く、中ストリンジェンシーはＴｍより約１０℃〜２０℃低く、低ストリンジェンシーはＴｍより約２０℃〜２５℃低い。当業者であれば理解できるように、最高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを使用すると、同一ポリヌクレオチド配列を同定または検出することができるが、中（もしくは低）ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを使用すると、類似もしくは関連するポリヌクレオチド配列を同定または検出することができる。
【０１６３】
１つの態様では、本発明者らは、変異ＧｎＴ１核酸、またはそのフラグメント、ホモログ、変異体もしくは誘導体に、ストリンジェントな条件（例、６５℃および０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５ＭのＮａ３シトレート（ｐＨ  ７．０）｝）下でハイブリダイズすることのできるヌクレオチド配列を開示する。
【０１６４】
ポリヌクレオチドが二本鎖である場合は、二重鎖の両方の鎖は、個別に、または組み合わせてのいずれかで本開示に含まれる。ポリヌクレオチドが一本鎖の場合は、そのポリヌクレオチドの相補的配列もまた開示されかつ含まれると理解すべきである。
【０１６５】
本明細書に開示された配列と１００％相同ではないが、本開示の範囲内に含まれるポリヌクレオチドは、多数の方法で入手できる。本明細書に記載した配列の他の変異体は、例えば、ある範囲の個体、例えば相違する集団由来の個体から作成されたＤＮＡライブラリーを精査することによって入手することができる。さらに、他のウイルス／細菌、または細胞ホモログ、特には哺乳動物細胞（例、ラット、マウス、ウシおよび霊長類細胞）において見いだされる細胞ホモログを入手してもよく、そのようなホモログおよびそれらのフラグメントは、一般には、本明細書に記載の配列表に示した配列に選択的にハイブリダイズすることができる。そのような配列は、他の動物種から作成されたｃＤＮＡライブラリーまたは他の動物種由来のゲノムＤＮＡライブラリーを精査することと、中から高ストリンジェンシー条件下で配列番号１の全部または一部を含むプローブを用いてそのようなライブラリーを精査することとによって入手してもよい。類似の検討材料は、変異ＧｎＴ１の種ホモログおよび対立遺伝子変異体を入手することにも当てはまる。
【０１６６】
本明細書に記載したポリヌクレオチドは、プライマー、例えばＰＣＲプライマー、代替増幅反応のためのプライマー、例えば放射性もしくは非放射性標識を用いる従来型手段によって明示的標識を用いて標識されたプローブを生成するために使用されてもよく、またはポリヌクレオチドを、ベクター内にクローニングしてもよい。そのようなプライマー、プローブおよびその他のフラグメントは、長さが少なくとも１５、例えば少なくとも２０、例えば少なくとも２５、３０もしくは４０ヌクレオチドであり、さらにまた本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチド」に含まれる。フラグメントは、長さが５００、２００、１００、５０または２０ヌクレオチド未満であってもよい。
【０１６７】
ＤＮＡポリヌクレオチドおよびプローブなどのポリヌクレオチドを、組換え的、合成的、または当業者であれば利用できる任意の手段によって生成することができる。それらを、さらにまた標準技術によってクローニングすることもできる。
【０１６８】
一般に、プライマーは、一度に１つのヌクレオチドが所望の核酸配列の段階的製造を含む合成的手段によって生成される。これを実施するための自動化技術を使用する技術は、当分野において容易に利用できる。
【０１６９】
より長いポリヌクレオチドは、一般には組換え手段を用いて、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を使用して生成される。これは、一対の（例えば、約１５〜３０ヌクレオチドの）プライマーを作成することと、クローニングを所望する１領域の配列をフランキングすることと、該プライマーを動物またはヒト細胞から入手されるｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡと接触させることと、ポリメラーゼ連鎖反応を該所望領域の増幅を発生させる条件下で実施することと、該増幅させたフラグメントを（例えば、アガロースゲル上で該反応混合物を精製することによって）単離することと、該増幅させたＤＮＡを回収することとを含んでいる。プライマーは、適切な制限酵素認識部位を含有するように設計できるので、増幅させたＤＮＡは適切なクローニングベクター内にクローニングすることができる。
〔実施例１〕
【０１７０】
＜細胞培養＞
チャイニーズハムスター卵巣Ｋ１（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞を、最初はＤｒ．Ｄｏｎａｌｄ  Ｋ．ＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｌｌ、ミシガン州アナーバー、ＭＩ）から入手する。
【０１７１】
ＪＷ１５２細胞を含む親および変異ＣＨＯ細胞は、５％のＣＯ２を備える加湿培養器内で３７℃で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補給されたダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉａ：ＤＭＥＭ）中で培養される。
【０１７２】
Ｌｅｃ１．３細胞（Ｌｅｃ１細胞）は、Ｄｒ．Ｐ．Ｓｔａｎｌｅｙ（Ａｌｂｅｒｔ  Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ニューヨーク州）のご厚意で提供され、プロリン（４０  ｍｇ／Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ社）および１０％のＦＢＳが補給されたα−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）中で培養される。
〔実施例２〕
【０１７３】
＜ＲＣＡ−Ｉ耐性ＣＨＯ細胞の単離＞
ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、集密になるまで６ウェルプレート内で培養され、その後に培養培地は無血清ＤＭＥＭに変更される。Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓアグルチニンＩ（ＲＣＡ−Ｉ、ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）は、１０μｇ／ｍＬの最終濃度に達するまで培地に加えられ、細胞とともに一晩インキュベートされる。
【０１７４】
次にＲＣＡ−Ｉを含有する無血清ＤＭＥＭは１０％のＦＢＳを含む新鮮ＤＭＥＭと取り替えられる。９日後、ＲＣＡ−Ｉ処理を生残したＣＨＯ細胞のコロニーが採取され、２４ウェルプレート内で培養される。
【０１７５】
これらの細胞は次に、変異細胞がもはやＲＣＡ−Ｉと反応しないことを確認するために、ＲＣＡ−Ｉを用いて凝集試験にかけられる。
〔実施例３〕
【０１７６】
＜発現構築物＞
ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）に対するコーディング領域および幾つかのグリコシル化関連遺伝子は、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内にクローニングされる。
【０１７７】
その後に脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）およびチャイニーズハムスターＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＥＰＯ−ＩＲＥＳ−ＧｎＴＩ、もしくは略してＥＩＧ）に対するコーディング領域が続くヒトＥＰＯのオープンリーディングフレームを含有していたＤＮＡフラグメントもまたｐｃＤＮＡ３．１内にクローニングされる。結果として生じたＥＰＯおよびＧｎＴＩの両方を発現するベクターは、ｐＥＩＧと呼ばれる。効率的翻訳を保証するために、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（ＧＣＣＡＣＣ）は、各構築物内の翻訳開始コドンＡＴＧの上流に配置される。
〔実施例４〕
【０１７８】
＜親および変異ＣＨＯ細胞系における組換えヒトＥＰＯの一過性発現＞
特に明示しない限り、ＥＰＯを発現する１μｇのＤＮＡ構築物およびＧｎＴＩまたは他のグリコシル化関連遺伝子を発現する１μｇのＤＮＡ構築物は、製造業者のプロトコルにしたがってリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とともに野生型もしくはＪＷ−１５２変異細胞内に共トランスフェクトされる。
【０１７９】
トランスフェクションの２日後、トランスフェクトされた細胞からの馴化培養培地が収集される。各トランスフェクションサンプル中の組換えＥＰＯの濃度は、ＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ社）を使用して標準ＥＬＩＳＡによって決定される。
〔実施例５〕
【０１８０】
＜野生型ＣＨＯ細胞およびＪＷ−１５２ＣＨＯ細胞によって生成されたＥＰＯの等電点焦点（ＩＥＦ）分析＞
様々なサンプルにおけるＥＰＯのシアル化パターンは、ＩＥＦおよびその後に以前に記載されたようなウエスタンブロット法によって分析される（Ｓｃｈｒｉｅｂｌ  ｅｔ  ａｌ．２００７，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２８：２１００−７）。ＩＥＦについてのｐＨ範囲は、３〜１０である。
〔実施例６〕
【０１８１】
＜ＲＣＡ−Ｉ耐性ＣＨＯ細胞内のＧｎＴＩ  ｃＤＮＡの分子クローニングおよび配列決定分析＞
各細胞系について、１×１０７細胞をペレットにし、ＰＢＳ中で洗った。全ＲＮＡは、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓキット（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用してペレットから抽出される。次にｃＤＮＡは、製造業者の推奨にしたがって、モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用した逆転写を通して合成される。
【０１８２】
各細胞系のｃＤＮＡ由来のＧｎＴＩアンプリコンは、ＰＦＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を通して入手される。これは、続いてｐｃＤＮＡ  ３．１発現ベクター内にクローニングされ、そして配列決定される。各変異体系由来の少なくとも４つのクローンが配列決定される。全プラスミド精製は、Ｐｒｏｍｅｇａ社からの少量もしくは中量調製キットを使用して実施される。構築物は、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いたサイクルシーケンシング後にＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００遺伝分析装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して配列決定される。
【０１８３】
これらの結果は、上記の表Ｄ１に示されている。
〔実施例７〕
【０１８４】
＜安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系の単離＞
ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ＥＰＯを単独で発現する構築物によりトランスフェクトされるが、変異ＪＷ１５２細胞はＥＰＯおよびＧｎＴＩの両方を発現するｐＥＩＧによりトランスフェクトされる。トランスフェクトされた細胞は、２週間にわたってＧ４１８（０．８ｍｇ／ｍＬ）を用いて選択される。
【０１８５】
トランスフェクトされたプールから得られる安定的にトランスフェクトされた細胞は、限界希釈法を使用して９６ウェル内で培養される。ＥＰＯを発現した単一トランスフェクトされた細胞由来の安定的細胞系は、ドットブロット分析を使用して選択され、各細胞系によって発現された組換えＥＰＯのシアル化パターンは、等電焦点法を用いて分析される。
〔実施例８〕
【０１８６】
＜結果：ＲＣＡ−Ｉ耐性変異ＣＨＯ細胞系の単離および特性解析＞
ＲＣＡ−Ｉは、糖タンパク質もしくは糖脂質上のβ結合ガラクトース残基に対して特異的であることが知られている植物レクチンであり、ＣＨＯ−Ｋ１細胞由来のグリコシル化突然変異体を選択するために使用される。大多数のＣＨＯ細胞は、一晩のインキュベーション後にＲＣＡ−Ｉによって殺滅される。
【０１８７】
９〜１０日後、ＲＣＡ−Ｉ処理を生存した細胞は単一クローンに増殖させられた。これらのクローンは採取され、２４ウエルプレート内で培養される。クローンの１つはＪＷ１５２と命名されている。
【０１８８】
この細胞系内の遺伝的欠陥を特性解析するために、ＪＷ１５２細胞は、ヒトＥＰＯを発現するために構築物でトランスフェクトされる。ＪＷ１５２細胞によって生成された組換えＥＰＯは、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）を用いて処理される。
【０１８９】
これらの結果は、図１に示されている。図１は、ＪＷ１５２発現ＥＰＯがＥｎｄｏ  Ｈ処理に対して感受性であることを示しているが、これはＥＰＯ分子上で見いだされるグリカン構造（Ｎ−グリカン類）が高マンノースタイプであることを示唆している。そこで、グリコシル化経路の初期由来の遺伝子には欠陥があることが疑われる。
【０１９０】
この観察に基づいて、相補性検定が実施される。この検定では、ＥＰＯ構築物に加えて、ＪＷ１５２細胞は、Ｎ−グリコシル化経路上の幾つかの遺伝子により共トランスフェクトされる。これらの遺伝子には、グルコシダーゼＩ、グルコシダーゼＩＩ、マンノシダーゼＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、マンノシダーゼＩＩ、ＧｎＴＩおよびＧｎＴＩＩが含まれる。これらの共トランスフェクション実験においてＪＷ１５２細胞によって生成されるＥＰＯサンプルは、等電焦点法（ＩＥＦ）によって、およびその後にウエスタンブロット法によって分析される。
【０１９１】
これらの結果は、図２に示されている。左端のレーン（ＣＨＯ  ＷＴ）は、コントロールとしての野生型ＣＨＯ細胞によって発現されたＥＰＯを示している。ＣＨＯ−ＪＷ１５２の下のレーンは、ＪＷ１５２細胞によって生成されたＥＰＯを示し、これはＥＰＯの不完全グリコシル化を証明している。残りのレーンは、指示したように様々のグリコシル化関連遺伝子により共トランスフェクトされるＪＷ１５２細胞系内で生成されたＥＰＯを示している。
【０１９２】
試験された遺伝子間で、ＧｎＴＩだけがＪＷ１５２細胞内で生成されたＥＰＯのシアル化パターンを回復することができる。これらの結果は、ＪＷ１５２細胞には機能的ＧｎＴＩ遺伝子が欠如することを示唆している。
【０１９３】
このＩＥＦ／ウエスタンブロットアッセイから行われたまた別の重要な観察では、ＧｎＴＩの存在下では、ＪＷ１５２細胞は野生型細胞と比較して（野生型細胞によって生成されたＥＰＯを用いた場合と比較して）はるかに良好にＥＰＯをシアル化する。
【０１９４】
この相違がＧｎＴＩを過剰発現することの結果ではなくＪＷ１５２細胞の固有の特徴に起因することを確認するために、３つのＣＨＯ細胞系はＧｎＴＩ構築物により共トランスフェクトすることによって分析される。馴化培地中の組換えＥＰＯが収集され、ＩＥＦによって分析される。
【０１９５】
これらの結果は、図３に示されている。ＧｎＴＩは、野生型ＣＨＯ細胞におけるＥＰＯのシアル化を改善しなかった（ＣＨＯ−ＷＴレーンおよびＣＨＯ−ＷＴ＋ＧｎＴＩレーンを比較する）。ＧｎＴＩの共発現を伴う、および共発現を伴わないＣＨＯ−Ｋ１のＥＰＯシアル化パターンは同一であると思われるので、ＧｎＴＩの過剰発現はＣＨＯ−Ｋ１＋ＧｎＴ１と表示されたレーンにおいて見られるシアル化の改善の原因ではない。
【０１９６】
ＧｎＴＩは、ＪＷ１５２細胞におけるＥＰＯのシアル化を劇的に改善した（ＪＷ１５２＋ＧｎＴＩレーン）。ＧｎＴＩの存在下では、ＪＷ１５２細胞はＥＰＯを野生型ＣＨＯ細胞と比較してはるかに良好にシアル化する（ＣＨＯ−ＷＴレーンおよびＣＨＯ−ＪＷ１５２＋ＧｎＴＩレーンを比較する）。
【０１９７】
図３は、ＧｎＴＩの存在下では、ＪＷ１５２細胞が野生型細胞と比較してはるかに良好に組換えタンパク質をシアル化することを示している。シアル酸を切断するノイラミニダーゼ類を用いたサンプルの処理は、シアル酸の切断後には塩基領域に還元される酸性領域内のＥＰＯ帯を生じさせるが、これはＥＰＯのより高いシアル化形が実際にはゲルの酸性領域内に集中することを証明している。
【０１９８】
Ｌｅｃ１細胞は、以前にＰ．Ｓｔａｎｌｅｙによって単離されているが、それらにはＧｎＴＩ活性が欠如することが知られている。Ｌｅｃ１細胞（Ｌｅｃ１）によって生成されたＥＰＯのＩＥＦパターンは、ＪＷ１５２によって生成されたＥＰＯのＩＥＦパターンと類似である。ＧｎＴＩにより共トランスフェクトされるＬｅｃ１細胞によって生成されたＥＰＯは、野生型ＣＨＯ細胞によって生成されたＥＰＯと類似のシアル化パターンを示す。
【０１９９】
これは、図４に示されている。そこで、図４は、以前に公表されたＧｎＴＩ欠陥を有するＬｅｃ１突然変異体の機能的ＧｎＴＩの存在下では、ＥＰＯの発現もまた高シアル化されることを示している。
〔実施例９〕
【０２００】
＜結果：ＧｎＴＩの存在下でのＪＷ１５２細胞内の組換えＥＰＯの安定的発現＞
図２および図３に提示したデータは、全部が一過性にトランスフェクトされた細胞由来である。安定的にトランスフェクトされた細胞によって生成されたＥＰＯのシアル化パターンを解明するために、ＪＷ１５２細胞はｐＥＩＧによりトランスフェクトされ、Ｇ４１８を用いて選択される。
【０２０１】
選択の２週間後、単一クローンが採取され、Ｇ４１８の選択圧下でさらに２週間にわたり２４ウェルプレート内で培養される。１０個の無作為に採取されたそのような安定的にトランスフェクトされたクローンによって生成されたＥＰＯは、ＩＥＦによって分析される。
【０２０２】
図１０に示したように、様々のクローンによって生成された全ＥＰＯサンプルは高くシアル化されている。シアル化パターンは、図３に示した一過性にトランスフェクトされた細胞によって生成されたＥＰＯのシアル化パターンと極めて類似する。
【０２０３】
図１１に示した結果は、様々の安定的クローンによって生成されたＥＰＯサンプルが全シアル化において相違するが、一般には図１０に示したＥＰＯサンプルほど良好にはシアル化されていないことを証明している。
〔実施例１０〕
【０２０４】
＜結果：ＲＣＡ−Ｉ処理を生存した全ＣＨＯ細胞は、機能異常のＧｎＴＩ遺伝子を有し、それらはＧｎＴＩにより共コトランスフェクトされると全部がそれらのタンパク質をより良好にシアル化する＞
ＲＣＡ−Ｉは、β−Ｇａｌ残基に特異的に結合することが知られている。理論的には、これらの細胞がそれらの表面糖タンパク質上の末端糖としてのβ−Ｇａｌを発現しない限り、それらはＲＣＡ−Ｉ処理を生き残り、変異クローンとして単離されるはずである。
【０２０５】
本発明者らは、ＲＣＡ−Ｉを用いて１００個より多い変異ＣＨＯクローンを単離し、それらが様々の遺伝子内に遺伝突然変異を有すると期待した。驚くべきことに、図２に記載した相補性検定が実施されると、ＲＣＡ−Ｉ処理を生存した全クローンは機能異常ＧｎＴＩ遺伝子を有すると確認される。
【０２０６】
さらに、図９に示したように、これらのクローン内で生成されたＥＰＯは、ＧｎＴＩにより共トランスフェクトされると全部が高シアル化される。ｍＲＮＡは、変異体系の一部から単離され、ｃＤＮＡに逆転写される。ＧｎＴＩについてのコーディング領域は、ｃＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲによって増幅され、ｐｃＤＮＡ３．１内にクローニングされる。
【０２０７】
シーケンシング分析は、これらの変異体系内のＧｎＴＩ遺伝子内で９つの相違する点突然変異を明らかにしたが、これはそれらが様々なオリジナル変異体細胞から達したことを示唆している（上記の表Ｄ１を参照されたい）。ＪＷ１５２のようなそれらの一部は、早期終止コドンを生じさせる点突然変異を有している。その他は、ＧｎＴＩコーディング領域内でアミノ酸残基を変化させる突然変異を有している。ＧｎＴＩ遺伝子内に相違する突然変異を各々が備える９つの変異体系は、ｐＥＩＧによりトランスフェクトされる。全９つの細胞系によって生成されたＥＰＯは、ＩＥＦによって分析されると全部が高シアル化されている（データは示していない）。
〔実施例１０〕
【０２０８】
＜ＪＷ１５２およびその他のＣＨＯ  ＧｎＴ１突然変異体におけるシアル化パターン＞
図５に示したように、ＥＰＯの不完全シアル化は、ＣＨＯ野生型と比較して、各々がＧｎＴ１機能の消失をもたらすＧｎＴ１遺伝子内の相違する突然変異を有する、ＲＣＡレクチンを用いて選択された９個のＣＨＯグリコシル化突然変異体において観察される。
【０２０９】
図６に示したように、各々がＧｎＴ１遺伝子内に相違する突然変異を有する９個のＣＨＯグリコシル化突然変異体は、レスキュー後にＣＨＯ野生型より優れたシアル化パターンを有する。
【０２１０】
図７は、相違する糖タンパク質分子、ＥＰＯ−Ｆｃ、本質的にはエリスロポエチン融合タンパク質の等電焦点法サンプルを用いた実験の結果を示している。この実験は、上記に記載したプロトコルを用いてＥＰＯ発現およびＩＥＦ分析について、相違するコーディング配列を備える発現ベクターだけを用いて実施された。
【０２１１】
左端のレーンは、ＥＰＯ−Ｆｃコーディング配列を含有する発現ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞内でのＥＰＯ−Ｆｃの発現を示している。中央のレーンは、ＥＰＯ−Ｆｃコーディング配列を含有する発現ベクターによりトランスフェクトされたＪＷ１５２細胞内でのＥＰＯ−Ｆｃの発現を示している。右端のレーンは、ＥＰＯ−Ｆｃコーディング配列を含有する発現ベクターおよび機能的ＧｎＴＩコーディング配列を含有する発現ベクターにより共トランスフェクトされたＪＷ１５２細胞内でのＥＰＯ−Ｆｃの発現を示している。図７に示したように、レスキューされたＪＷ１５２細胞による優れたシアル化は、相違するモデルの糖タンパク質を用いた場合さえ維持されている。
【０２１２】
これらの結果は、レスキューされたＪＷ１５２による優れたシアル化が相違するモデルの糖タンパク質を用いた場合でさえ維持されることを証明している。
【０２１３】
図１２は、付着した培養中の安定的ＪＷ１５２細胞系について観察されたシアル化パターンが懸濁培養中で維持されることを示している。
【０２１４】
結論として、本発明者らは、新規なＣＨＯグリコシル化変異細胞を単離するための方法を開発した。ＣＨＯ細胞を処理するためにＲＣＡ−Ｉが使用される限り、生存細胞はそれらのＧｎＴＩ遺伝子内に遺伝的欠陥を有することになる。ＧｎＴＩにより共トランスフェクトされると、これらのＲＣＡ−Ｉ耐性ＣＨＯ細胞は、高シアル化されたＮ−グリカン類を備える組換え糖タンパク質を発現する。
〔実施例１１〕
【０２１５】
＜ＨＰＡＥＣクロマトグラム＞
図８は、機能的ＧｎＴＩを共発現するＪＷ１５２細胞内で発現されたＥＰＯ−Ｆｃから切断されたより良好にシアル化されたグリカン類を示しているＨＰＡＥＣクロマトグラムを示している写真である。ＣＨＯ−Ｋ１およびＪＷ１５２内で一過性に発現され、ＧｎＴＩにより共トランスフェクトされたＥＰＯ−Ｆｃは、プロテインＡ結合クロマトグラフィーカラムによるアフィニティ精製を用いて精製される。等量のＥＰＯ−Ｆｃ上のグリカン類は、ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）を用いた処理によって切断され、そしてグリカン類に付着したシアル酸の数にしたがって、高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）を使用して分離される。
【０２１６】
このクロマトグラムは、ＣＨＯ−Ｋ１サンプルと比較した場合に、４Ｓ群におけるＪＷ１５２サンプルについて明確に高いピークおよび１Ｓ群における低いピークを示している。
【０２１７】
＜参考文献＞
Ｗｅｉｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｍａｘｉｍｉｚｅ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：１１１６．
【０２１８】
本文書に言及した特許出願および特許の各々、そして上記の特許出願および特許の各々において特許出願および特許の各々の審査手続き中を含めて引用もしくは参照された各文書（「特許出願が引用した文書」）、ならびに特許出願および論文の各々および該特許出願が引用した文書のいずれかにおいて引用もしくは言及された任意の製品についての任意の製造業者の取扱説明書もしくはカタログは、これにより参照して本明細書に組み入れられる。さらに、本明細書において引用した全文書、ならびに本明細書において引用した文書の中で引用もしくは参照された全文書、ならびに本明細書において引用もしくは言及された任意の製品についての任意の製造業者の取扱説明書もしくはカタログは、これにより参照して組み入れられる。
【０２１９】
本発明の記載した方法およびシステムの様々な修飾および変形は、当業者には、本発明の範囲および精神から逸脱せずに明白になる。本発明は特定の好ましい実施形態と結び付けて記載してきたが、請求する本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定すべきではないと理解すべきである。実際に、分子生物学または関連分野の当業者には明白である、本発明を実施するための記載した様式の様々な修飾は、請求の範囲内に含まれると意図されている。
【０２２０】
ＡＴＣＣ
ブダペストの制限された寄託証明書
特許手続のための微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約
国際書式
規則７．３に準拠して発行された原寄託のケースの受託書および
規則１０．２に準拠して発行された生存性に関する陳述書
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ（登録商標））は、特許出願に関連する貴殿の種子／株の寄託を受領しました。以下の情報を特許庁の要件を満たすために提供致します。
科学技術研究庁
Ｄｒ．Ｓｏｎｇ  Ｚｈｉｗｅｉ  様
２０  Ｂｉｏｐｏｌｉｓ  ｗａｙ  ＃０６−０１
Ｃｅｎｔｒｏｓ．ＳＧ
シンガポール  １３８６６８
寄託者：科学技術研究庁
ＡＴＣＣ（登録商標）による種子／株の受託日：２００８年１２月１１日
寄託者による識別参照番号：ＡＴＣＣ（登録商標）特許寄託指定番号
チャイニーズハムスター卵巣細胞     ＪＷ１５２  ＰＴＡ−９６５７
ＡＴＣＣ（登録商標）は、以下のように理解しています。
１．これらの種子／株の寄託は、ＡＴＣＣ（登録商標）に、明示的にも黙示的にも、該特許を侵害する許諾を与えるものではなく、これらの種子／株の他者へのＡＴＣＣ（登録商標）からの公開は、明示的にも黙示的にも、前記特許を侵害する許諾を与えるものではありません。
２．前記寄託物が該特許の有効期間中に死滅した、もしくは破損した場合は、それを生存性材料と置換することは貴殿の責任です。さらに、寄託期間中に配布するのに十分な量を供給することもまた貴殿の責任です。ＡＴＣＣ（登録商標）は、本物質を３０年間または前記寄託に対する最新の依頼日より５年間のいずれか長い期間に渡り配布および維持します。アメリカ合衆国および多数の他の国々がブダペスト条約の締約国です。
米国特許の発行に先立ち、ＡＴＣＣ（登録商標）は、１回の手数料を考慮して、寄託者もしくは関連特許庁によって指示される場合を除いて、これらの種子／株またはそれらまたはそれらの寄託に関するあらゆる情報を配布しないことに同意します。関連特許の発行後には、我々は、種子／株を公開することに責任を負い、それらは何の制約も受けずに公衆へ配布するために利用可能になります。我々は、寄託日から３０年間に渡り該種子／株に対する要請について貴殿にお知らせします。
本寄託は、２００９年１月８日に検査され、同日に前記種子／株は生存性でありました。
国際寄託機関：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ（登録商標））、アメリカ合衆国バージニア州マナッサス
ＡＴＣＣ（登録商標）の代表権を有する者の署名
２００９年１月９日
ＡＴＣＣ（登録商標）特許寄託                                          日付
ＣＣ：Ｄｒ．Ｋｈｏｏ  Ｃｈｏｎｇ  Ｙｅｅ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年8月26日(2010.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から目的のタンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）目的のタンパク質をコードする核酸を、ＧｎＴ１機能の消失をもたらすＧｎＴ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３４３９６３）における突然変異を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内に導入するステップと、ここで、前記ＣＨＯ細胞は機能的ＧｎＴＩをコードする導入された核酸配列をさらに含む、
（ｂ）目的のタンパク質を前記ＣＨＯ細胞又はその子孫から発現させるステップと
（ｃ）前記タンパク質を精製するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記目的のタンパク質は、野生型チャイニーズハムスター卵巣細胞によって発現された目的のタンパク質より高いシアル化を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記目的のタンパク質は、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下もしくは２以下のｐＫａを有する、または１５０より大きい、例えば１６０より大きい、１７０より大きい、１８０より大きい、例えば１９０より大きい、２００より大きい、２１０より大きい、例えば２２０より大きい、もしくは２３０より大きいＺ数を有する、またはその両方を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記目的のタンパク質は、糖タンパク質、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）または第ＶＩＩＩ因子を含む、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記目的のタンパク質をコードする前記核酸配列および機能的ＧｎＴＩをコードする前記核酸配列は、好ましくは前記ＣＨＯ細胞内に安定的にトランスフェクトされている、１つの発現ベクター内に含まれる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）前記ＧｎＴＩ遺伝子内の前記突然変異は、ＧｎＴＩ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ３４３９６３）の特定位置における以下の突然変異、（ａ）１０１５位でのＣからＴへのトランジッション、（ｂ）１３００位でのＧからＣへのトランスバージョン、（ｃ）６３８位でのＡからＣへのトランスバージョン、（ｄ）７８４位でのＣからＧへのトランスバージョン、（ｅ）８１１位でのＴからＡへのトランスバージョン、（ｆ）コードされたアミノ酸配列の２３６位からのフレームシフトを生じさせる７０６位での挿入、（ｇ）２４６位でのＧからＡへのトランジッション、（ｈ）２５８位でのＧからＡへのトランジッション、もしくは（ｉ）８５９位でのＡからＴへのトランスバージョンから選択される、または（ｉｉ）前記チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、ＧｎＴＩ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ３４３９６３）の特定位置における以下の突然変異、（ａ）４３４位でＡｌａからＰｒｏ、（ｂ）２１３位でＡｓｐ→Ａｌａ、（ｃ）２６２位でＡｒｇ→Ｇｌｙ、（ｄ）２７１位でＴｒｐ→Ａｒｇ、（ｅ）ＧｎＴＩをコードする核酸配列の７０６位での挿入の結果として生じる２３６位からのフレームシフト、（ｆ）３３９位でのＧｌｎ→ＳＴＯＰ、（ｇ）８２位でのＴｒｐ→ＳＴＯＰ、（ｈ）８６位でのＴｒｐ→ＳＴＯＰ、もしくは（ｉ）２８７位でのＬｙｓ→ＳＴＯＰのうちの１つ以上を含むＧｎＴ１タンパク質を発現する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法
【請求項７】
前記チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、配列番号１に示したＧｎＴＩ核酸配列を含む、または配列番号２に示したＧｎＴＩタンパク質を発現する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＨＯ細胞は、細胞系、例えばＪＷ１５２細胞系（ブダペスト条約の下でアクセッション番号ＰＴＡ−９６５７としてＡＴＣＣに寄託された）に含まれ、好ましくは半固体培地中の懸濁培養または増殖に順応されている、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ＧｎＴ１遺伝子における突然変異を含む前記チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ヒマ）のアグルチニンＩ（ＲＣＡ−Ｉ）を用いた選択によって入手できる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記選択は、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓのアグルチニンＩ（ＲＣＡ−Ｉ）の存在下でＣＨＯ細胞を培養するステップと、前記培養中で生存する細胞を選択するステップとを含み、例えば、（ａ）前記ＣＨＯ細胞は０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ、例えば５０μｇ／ｍＬまで、または２０μｇ／ｍＬまで、例えば１０μｇ／ｍＬもしくは５μｇ／ｍＬまでの濃度のＲＣＡ−Ｉへ曝露される、または（ｂ）前記ＣＨＯ細胞は、１時間、数時間（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２時間）、一晩から数日間、例えば２日間もしくは３日間、例えば一晩までの期間にわたって、ＲＣＡ−Ｉに曝露される、さらに任意選択的に凝集試験においてＲＣＡ−Ｉと反応しない細胞を選択するステップを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＧｎＴＩ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ３４３９６３）の特定位置における以下の突然変異、（ａ）１０１５位でのＣからＴへのトランジッション、（ｂ）１３００位でのＧからＣへのトランスバージョン、（ｃ）６３８位でのＡからＣへのトランスバージョン、（ｄ）７８４位でのＣからＧへのトランスバージョン、（ｅ）８１１位でのＴからＡへのトランスバージョン、（ｆ）コードされたアミノ酸配列の２３６位からのフレームシフトを生じさせる７０６位での挿入、（ｇ）２４６位でのＧからＡへのトランジッション、（ｈ）２５８位でのＧからＡへのトランジッション、または（ｉ）８５９位でのＡからＴへのトランスバージョンから選択される前記ＧｎＴＩ遺伝子内の突然変異を含むＣＨＯ細胞であって、好ましくは１つの発現ベクター内に含まれる、発現ベクター内に糖タンパク質を含む目的のタンパク質をコードする核酸および機能的ＧｎＴＩ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ３４３９６３）をコードする核酸をさらに含むＣＨＯ細胞。
【請求項１２】
前記目的のタンパク質は、糖タンパク質、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）または第ＶＩＩＩ因子を含む、請求項１１に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項１３】
ＪＷ１５２（ブダペスト条約の下でアクセッション番号ＰＴＡ−９６５７としてＡＴＣＣに寄託された）を含む、請求項１１または１２に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項１４】
前記ＧｎＴＩ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ３４３９６３）において突然変異を含むＣＨＯ細胞もしくはＣＨＯ細胞系を提供する方法であって、ＣＨＯ細胞をＲｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓのアグルチニンＩ（ＲＣＡ−Ｉ）の存在下でＣＨＯ細胞を培養することを含み、ここで、機能的なＧｎＴ１をコードする導入された核酸の存在下で前記生じたＣＨＯ細胞もしくはＣＨＯ細胞系によって発現された目的の組換えタンパク質は、野生型チャイニーズハムスター卵巣細胞によって発現された目的のタンパク質より高いシアル化を含む方法。
【請求項１５】
（ａ）前記ＣＨＯ細胞は０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ、例えば５０μｇ／ｍＬまで、または２０μｇ／ｍＬまで、例えば１０μｇ／ｍＬもしくは５μｇ／ｍＬまでの濃度のＲＣＡ−Ｉへ曝露される、または（ｂ）前記ＣＨＯ細胞は、ＲＣＡ−Ｉへ、１時間、数時間（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２時間）、一晩から数日間、例えば２日間もしくは３日間、例えば一晩までの期間にわたって曝露される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
好ましくは１つの発現ベクター内に含まれる、目的のタンパク質をコードする核酸および機能的なＧｎＴＩ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３４３９６３）をコードする核酸配列を導入することをさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【国際調査報告】
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