(57)【要約】  Ｎ末端ネオ−エピトープ及びＣ末端ネオ−エピトープ（各々がタンパク質のプロテアーゼによる切断により生成される）を含有するタンパク質の断片を生物学的試料において測定するアッセイの方法が、前記Ｎ末端ネオ−エピトープを第１の特異的抗体と結合させる、かつ、前記Ｃ末端ネオ−エピトープを第２の特異的抗体と結合させるステップと、前記抗体の双方の結合の程度を検出するステップとを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端ネオ−エピトープと、Ｃ末端ネオ−エピトープとを含有するタンパク質の断片を生物学的試料において測定するステップを含むアッセイの方法であって、前記ネオ−エピトープは、各々前記タンパク質のプロテアーゼによる切断により生成されるアミノ酸配列であり、前記方法は、前記Ｎ末端ネオ−エピトープを該Ｎ末端ネオ−エピトープの存在に対して特異的な第１の免疫学的結合パートナーと結合させ、かつ、前記Ｃ末端ネオ−エピトープを該Ｃ末端ネオ−エピトープの存在に対して特異的な第２の免疫学的結合パートナーと結合させるステップと、並びに前記結合パートナーの双方の結合の程度を検出するステップとを含む方法。
【請求項２】
前記免疫学的結合パートナーの一方を固体支持体に固定化し、前記断片を前記固定化した抗体と結合させ、前記断片に対する前記免疫学的結合パートナーのもう一方の結合を検出するサンドイッチアッセイとして前記アッセイを行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アッセイを均一系サンドイッチアッセイとして行う、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の免疫学的結合パートナーも前記第２の免疫学的結合パートナーもいずれも、前記断片の基となるインタクトなタンパク質と特異的に結合しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の免疫学的結合パートナーも前記第２の免疫学的結合パートナーもいずれも、前記プロテアーゼの切断部位を越えて伸長した、各ネオ−エピトープのアミノ酸配列を含有する前記タンパク質の断片と特異的に結合しない、請求項５に記載の方法。
【請求項６】
前記ネオ−エピトープがＩＩ型コラーゲン由来のものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ネオ−エピトープが、ＭＭＰによる又はカテプシンＫによるＩＩ型コラーゲンの切断により産生される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の免疫学的結合パートナーが、以下のＩＩ型コラーゲン切断アミノ酸配列：
↓ＤＱＧＶＰＧ．．．．（配列番号５４）；↓ＲＥＧＳＰＧ．．．．（配列番号５５）；＊ＬＡＧＰＫＧ．．．．（配列番号５６）；及び＊↓ＬＴＧＰＡＧ．．．．（配列番号５７）
のうちの１つにより規定されるエピトープに対して特異的である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の免疫学的結合パートナーが、以下のＩＩ型コラーゲン切断アミノ酸配列：
．．．．ＰＫＧＡＲＧ↓（配列番号５８）；．．．．ＧＱＰＧＰＡ↓（配列番号５９）；．．．ＥＰＧＧＶＧ↓（配列番号６０）；及び．．．．ＲＤＧＡＡＧ↓（配列番号６１）
のうちの１つにより規定されるエピトープに対して特異的である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の免疫学的結合パートナーと前記第２の免疫学的結合パートナーとを併用すると、以下の配列：
ＬＴＧＰＡＧＥＰＧＲＥＧＳＰＧＡＤＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧ（配列番号６２）
又は
ＲＥＧＳＰＧＡＤＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧ（配列番号６３）
のＩＩ型コラーゲンペプチド断片と特異的に反応性を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
指定された切断部位を過ぎて伸びている場合、前記免疫学的結合パートナーが請求項７において規定されるような配列と特異的に結合しない、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
異性化アミノ酸残基を含有するエピトープに対して特異的な第１の免疫学的結合パートナーと、プロテアーゼにより生成されるネオ−エピトープに対して特異的な第２の免疫学的結合パートナーとを含む、免疫学的アッセイキット。
【請求項１３】
前記キットが、前記結合パートナーとの免疫反応性を有する少なくとも１つの校正基準、洗浄試薬、緩衝剤、前記第１の免疫学的結合パートナー又は前記第２の免疫学的結合パートナーと試料の成分との間の結合を明らかにするための二次的な免疫学的結合パートナー、酵素標識、酵素標識基質、停止試薬、及び前記キットを使用してアッセイを実施するための取扱説明書をさらに含む、請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節軟骨の分解の定量的評価のための、ＩＩ型コラーゲンのタンパク質分解による切断により生成される、体液中の或る特定のペプチド断片の測定であって、上記ペプチド断片上に位置するネオ−エピトープを各々認識する２つの抗体を使用する測定に関する。
【背景技術】
【０００２】
変形性関節症（Osteoarthrtis）は、世界中における身体障害の主要な原因の１つであり、高齢者人口の１０％超が症候性疾患を有する（非特許文献１）。発症率は年齢とともに増大し、６５歳までに８０％がＸ線検査によるＯＡの兆候を有する（非特許文献２）。したがって変形性関節症は、蔓延しており、かつ患者及び社会にとって重度の負担である。しかしながら現在のところ、罹患した個体に対し、該疾患の予防又は初期段階での治療が提供されることはほとんどない。多くの患者にとって、人工股関節置換術又は人工膝関節置換術が、最終的には唯一の治療の選択肢である。
【０００３】
現在のところ変形性関節症の病原性は十分には理解されていないが、この緩慢な慢性疾患における中心となる特徴が、骨、軟骨及び滑膜からなる関節における進行性の破壊であることは明らかである。特に軟骨は大きな注目を集めており、ＯＡＲＳＩのワーキンググループにより、ＯＡ軟骨組織病理学の種々のグレード及び段階が近年詳細に記載されている（非特許文献３）。このシステムは、より進行したＯＡ疾患におけるより深い軟骨層の病変による７つのグレード（又は重症度レベル）を包含しており、５段階で表現される軟骨の病変の程度と組み合わせると、０〜２４の半定量的なスコア化システムがもたらされる。
【０００４】
しかしながら、関節軟骨における重要な代謝プロセス及び組織の構造に対する該プロセスの影響を評価する、高感度、特異的かつ高速の分析法がないことが、ＯＡにおける効果的な薬剤開発に対する主たる障壁である。
【０００５】
特に、主たる努力は、軟骨のターンオーバーに関する新たなより良い生化学的マーカーの開発に割り当てられている。
【０００６】
軟骨（関節軟骨を含む）は、大部分がＩＩ型コラーゲン（乾燥重量の６０％〜７０％）及びプロテオグリカン（乾燥重量の１０％）から構成される。軟骨の分解は、ＭＭＰ及び密接に関連するＡＤＡＭ−ＴＳ（トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ）により主に仲介されるが、ＩＩ型コラーゲンがＭＭＰ活性に対して最も感受性が高い（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。これらのプロテアーゼの作用は、様々な細胞外の断片放出をもたらし、これは、軟骨の分解のバイオマーカーとしての候補であり得ると考えられる。
【０００７】
ＩＩ型コラーゲンのタンパク質分解による切断が多数の研究において報告されており、ＩＩ型コラーゲンの複数の種々の分解断片が、軟骨の変性疾患をモニタリングするのに有用であるとして示されている（非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。
【０００８】
ＩＩ型コラーゲンのＣ−テロペプチド断片、すなわちＣＴＸ−ＩＩは、ＭＭＰ活性により生成され（非特許文献１０、非特許文献１１）、ＣＴＸ−ＩＩの測定が、軟骨の分解を評価する実験的な設定（非特許文献７）及びヒト（非特許文献１２）において、ＩＩ型コラーゲンの分解のモニタリングに関して報告されている。
【０００９】
しかしながら、ＩＩ型コラーゲン断片を検出する抗体の使用に関する最初の報告はBillinghurst及び共同研究者（非特許文献１３）によって行われ、彼らはコラゲナーゼによる切断後のＩＩ型コラーゲンのより短い断片上におけるアミノ末端のネオエピトープの検出を記載した。
【００１０】
長さが４分の３の断片のＣ末端におけるＣ２Ｃネオエピトープが、文献においてより十分に記載されている（非特許文献１４、非特許文献１５）。この試験は、アミノ酸配列ＥＧＰＰ（ＯＨ）ＧＰＱＧ（配列番号１）に対するモノクローナル抗体の結合に依存する（非特許文献１５）。
【００１１】
ＩＩ型コラーゲン断片に関する他の試験はＣ１，２Ｃを含むが、これはＩ型及びＩＩ型の両方に見出されるアミノ酸配列ＧＰＰ（ＯＨ）ＧＰＱＧ（配列番号２）に基づいている（非特許文献１３（Billinghurts et al., 1997））。また、コラゲナーゼの作用により生成される別の断片はＴＩＩＮＥ断片であり（非特許文献１６）、ネオエピトープＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＯＯＨ（配列番号３）を認識するモノクローナル抗体９Ａ４を使用して検出することができる。捕捉抗体としてモノクローナル抗体５１０９（非特許文献１７）と組み合わせると、サンドイッチ試験は、ＩＩ型コラーゲン断片に対して特異的であると言える。モノクローナル抗体５１０９は内部アミノ酸配列ＧＥＰＧＤＤＡＰＳ（配列番号２０）と結合し、サンドイッチ試験はモノクローナル抗体５１０９の結合配列のＮ末端において可変長のコラーゲン断片を検出する。
【００１２】
Zhen及び共同研究者（非特許文献１８）は、ＩＩ型コラーゲン断片を含む、ヒト関節軟骨のタンパク質分解によるペプチド生成物の同定及び特徴付けを開示している。
【００１３】
ＩＩ型コラーゲンのカテプシンＫによる切断が幾つかの研究において報告されている。カテプシンＫをＩＩ型コラーゲンの切断と関連付ける最初の研究は、非特許文献１９により報告された。Kafienah及び共同研究者は、カテプシンＫによるＩＩ型コラーゲンのヘリックス状の切断部位を記載し、１つの切断部位に関するアミノ酸配列、すなわち
ＰＧＤＤＧＥＡＧＫＰＧ↓ＫＳＧＥＲＧＰＰＧ（ウシの配列）（配列番号５）
を提示した。
【００１４】
１０年後、Kefienah（非特許文献２０）により報告されたカテプシンＫ切断部位、すなわち
ＰＧＤＤＧＥＡＧＫＰＧ↓ＫＡＧＥＲＧＰＰＧ（配列番号６）
のＣ末端ネオエピトープ（Ｃ２Ｋ）に対するポリクローナル抗体に基づく酵素結合免疫吸着アッセイの開発が報告された。
【００１５】
このエピトープのＣ末端の７アミノ酸、すなわちＧＥＡＧＫＰＧ（配列番号２０）はＩ型コラーゲンにおいても同様に見出すことができるため、この試験は、カテプシンＫの活性により生成されるＩ型コラーゲン断片とＩＩ型コラーゲンの断片とを識別しない。これに対し、本発明によれば、ＩＩ型コラーゲン断片に対する特異性を増大させるために、このような配列は除外される。
【００１６】
特許文献１（Saltarelli）は、ＩＩ型コラーゲンが他のコラーゲン断片から識別されるように、捕捉抗体及び検出抗体の組み合わせを使用してＩＩ型コラーゲン断片に関して尿をモニタリングする方法を開示している。
【００１７】
特許文献２（Otterness）は、コラゲナーゼによる切断により得られるＩＩ型コラーゲン断片を検出する抗体を開示している。特に、以下の配列が開示されている。
・  GPPGPQG（配列番号７）
・  GEPGDDGPSG（配列番号８）
・  APGEDGRPGPPGP（配列番号９）
・  GKVGPSGAPGEDGRPG（配列番号１０）
・  AEGPPGPQG（配列番号１１）
・  GPPGPQGLAG（配列番号１２）
・  GEPGDDGPS（配列番号１３）
・  GEPGDDGPSGAEGPPG（配列番号１４）
・  EKGEPGDDAPSGAEGPPGPQG（配列番号１５）
・  GPPGPPGKPGDDGEAGKPGKA（配列番号１６）
・  GPPGPRGRSGETGPAGPPGNP（配列番号１７）
・  GAPGPQGFQGNPGEPGEPGVSY（配列番号１８）
・  GEPGDDAGPSGAEGPPGPQG（配列番号１９）
【００１８】
一連の特許（特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５）（Eyre）は、ＩＩ型コラーゲンのテロペプチド中のエピトープと結合する抗体を利用する軟骨再吸収アッセイのためのペプチド及び方法に関する。
【００１９】
特許文献１６（Robins）は、リジルピリジノリン又はヒドロキシリジルピリジノリンで架橋したコラーゲン断片を検出する方法を記載している。
【００２０】
特許文献１７（Reginster）は、ＩＩ型コラーゲンのヘリックス領域に位置するアミノ酸配列ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ（配列番号２３）中のエピトープと結合する抗体を使用してコラゲナーゼにより生成されるＩＩ型コラーゲンの断片を検出する方法を開示した。
【００２１】
特許文献１８（Poole）は、折りたたまれていない（未変性の（native））ＩＩ型コラーゲン断片と結合せずコラゲナーゼによる切断により生成される断片のみと結合する抗体を使用して軟骨の分解を検出する方法を開示している。特に、ＩＩ型コラーゲン由来の以下のアミノ酸配列が含まれる。
・  CGKVGPSGAPGEDGRPGPPGPQY（配列番号２１）
・  APGEDGRPGPPGP（配列番号２２）
・  GQPG（配列番号２４）
・  GPPGPQG（配列番号７）
・  CGGEGPPGPQG（配列番号２５）
・  GAEGPPGPQGLAGQRGIVG（配列番号２６）
・  GAPGTPGPQGIAGQRGVVG（配列番号２７）
・  GPPGTPGPQGLLGAPGILG（配列番号２８）
・  GPPGAPGPLGIAGITGARG（配列番号２９）
・  CGGEGPPGPQGL（配列番号３０）
・  CGGEGPPGPQGLA（配列番号３１）
・  CGGEGPPGPQ（配列番号３２）
・  CGGEGPPGP（配列番号３３）
・  CGPPGPQG（配列番号３４）
【００２２】
特許文献１９（Welsch）は、ＩＩ型コラーゲンの酵素による切断により得られるペプチドを同定及び定量化する質量分析の使用を記載している。該技法は、変形性関節症及び関節リウマチにおけるタンパク質分解酵素の活性を評価するための、生物学的試料におけるペプチドの同定及び定量化のために使用される。特に、ヒト由来の以下の配列が開示されている。
・  GPPGPQG（配列番号７）
・  LQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGPQG（配列番号３５）
・  PQG
・  PGPQG（配列番号３６）
・  PPGPQG（配列番号３７）
・  VLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGPQG（配列番号３８）
・  KGARGDSGPPGRAGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGPQG（配列番号３９）
・  ARGDSGPPGRAGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGPQG（配列番号４０）
・  GPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGPQG（配列番号４１）
・  GPIGPPGERGAPGNRGFPGQDGLAGPKGAPGERGPSGLAGPKGANGDPGRPGEPGLPGARGLTGRPGDAGPQGKVGPSGAPGEDGRPGPPGPQGARGQPGVMGFPGPKGANGEPGKAGEKGLPGAPGLGLPGKDGETGAEGPPPA．．．．．．（配列番号４２）
【００２３】
特許文献２０（Cook）は、哺乳動物のＩＩ型コラーゲンのＣＢペプチド、特にＣＢ１０を使用するコラーゲンに対する抗体の検出を記載している。臭化シアンは、メチオニン残基のカルボキシル末端を切断することにより、ＣＢペプチドを産生する。ＣＢ１０ペプチドは以下の配列を有する。
・  MPGERGAAGIAGPKGDRGDVGEKGPEGAPGKDGGRGLTGPIGPPGPAGANGEKGEVGPPGPAGSAGARGAPGERGETGPPGTSGIAGPPGADGQPGAKGEQGEAGQKGDAGAPGPQGPSGAPGPQGPTGVTGPKGARGAQGPPGATGFPGAAGRVGPPGSNGNPGPPGPPGPSGKDGPKGARGDSGPPGRAGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGPQGLAGQRGIVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGQQGAPGASGDRGPPGPVGPPGLTGPAGEPGREGSPGADGPPGRDGAAGVKGDRGETGAVGAPGAPGPPGSPGPAGPTGKQGDRGEAGAQGPM（配列番号４３）
【００２４】
特許文献２１（Rosenquist）は、アミノ酸配列ＥＫＧＰＤＰ（配列番号４４）に対して特異的な単一の抗体を使用してＩＩ型コラーゲンのテロペプチド断片を検出するサンドイッチイムノアッセイを開示している。
【００２５】
特許文献２２及び特許文献２３（Fledelius）は、イソアスパラギン酸残基を含有するＩＩ型コラーゲンのアミノ酸配列と結合する抗体を使用してコラーゲンの分解の速度（rate）を測定する方法を開示している。また、イソアスパラギン酸残基を含有するＩＩ型コラーゲンのアミノ酸配列を有する合成ペプチドの使用も記載されている。特に、ＩＩ型コラーゲン由来の以下の配列が記載されている。
・  ＧＤＩＫ＊ＤＩＶ（配列番号４５）
・  ＥＫＧＰ＊Ｄ（配列番号４６）
ここで（＊）は、異性化ペプチド結合を示す。
【００２６】
特許文献２４（Fledelius）は、Ｄ−アミノ酸を含有する断片とそのＬ−アミノ酸を含有する類似体とを区別することが可能な抗体を使用する、体液中のタンパク質のＤ−アミノ酸を含有する断片の量の決定を記載している。特に、その応用は、ＩＩ型コラーゲン由来の以下のペプチド配列を含む。
・  GDIKDIV（配列番号４７）
・  EKGPD（配列番号４８）
【００２７】
特許文献２５及び特許文献２６（Bonde）は、ＩＩ型コラーゲンの分解を特徴付ける方法を記載している。異なる免疫学的結合パートナーを各々使用する少なくとも２つの相異なる免疫学的アッセイを使用し、アッセイの結果の差異を表す数値的指標を形成する。特に、以下のＩＩ型コラーゲン配列が開示されている。
・  EKGPDP（配列番号４４）
・  EKGPD（配列番号４８）
・  GVK
・  PGVKG（配列番号４９）
・  PGPKGE（配列番号５０）
・  GQKGEP（配列番号５１）
・  GDIKDIV（配列番号４７）
【００２８】
特許文献２７、特許文献２８、特許文献２９及び特許文献３０（Qvist）は、コラーゲン断片を検出するための、合成ペプチドを認識する抗体の使用を記載している。特に、以下のアミノ酸配列が含まれる。
・  PGPKGE（配列番号５０）
・  GQKGEP（配列番号５１）
・  GDIKDIV（配列番号４７）
・  EKGPD（配列番号４８）
・  GVK
・  PGVKG（配列番号４９）
【００２９】
特許文献３１（Te Koppele）は、コラーゲンテロペプチド架橋部位からの距離が最大１６５アミノ酸のコラーゲン分子上に存在するエピトープを対象とする第１の抗体と、架橋されたコラーゲン分子の別のエピトープを対象とする第２の抗体とを使用する、コラーゲンの分解を検出するサンドイッチイムノアッセイの使用を開示している。
【００３０】
特許文献３２（Barrach）は、ＩＩ型コラーゲンと特異的に結合するがそのペプチドとは結合しない（又はその逆の）モノクローナル抗体を開示している。特に、以下のＩＩ型コラーゲン配列が含まれる。
・  GFQGL-Xaa-G-Xaa-Xaa-G-Xaa-Xaa-G（配列番号５２）
・  GLQGL-Xaa-G-Xaa-Xaa-G-Xaa-SG（配列番号５３）
【００３１】
上で言及された特許のいずれも、各々が同じＩＩ型コラーゲン断片上のネオ−エピトープと結合する２つの抗体の使用を開示していない。
【００３２】
特許文献１（Saltarelli）はサンドイッチ法において２つの抗体を使用しているが、該抗体のいずれもネオ−エピトープと特異的に結合することは必要とされていない。捕捉抗体はＩ型又はＩＩＩ型のコラーゲン断片とのいかなる結合も実質的に排除されるようにＩＩ型コラーゲン断片と結合することが要求され、他の抗体（すなわち検出抗体）はコラゲナーゼにより生成されるコラーゲン断片と特異的に結合する必要がある。しかしながら、切断部位におけるアミノ酸配列、すなわちネオ−エピトープに対する特異性は必要とされていない。
【００３３】
また、特許文献２１（Rosenquist）はＩＩ型コラーゲンに対するサンドイッチイムノアッセイを開示しているが、それは単一の抗体を使用するものである。本発明によれば、異なるエピトープ特異性、すなわち各ネオ−エピトープに対する特異性を有する２つの抗体が必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３４】
【特許文献１】米国特許第６，６４２，００７号
【特許文献２】米国特許第６，０３０，７９２号
【特許文献３】米国特許第６，６０２，９８０号
【特許文献４】米国特許第６，５６６，４９２号
【特許文献５】米国特許第６，３４８，３２０号
【特許文献６】米国特許第６，２５５，０５６号
【特許文献７】米国特許第６，１５３，７３２号
【特許文献８】米国特許第６，１４３，５１１号
【特許文献９】米国特許第６，１００，３７９号
【特許文献１０】米国特許第５，９１９，６３４号
【特許文献１１】米国特許第５，７０２，９０９号
【特許文献１２】米国特許第５，６８８，６５２号
【特許文献１３】米国特許第５，６４１，８３７号
【特許文献１４】米国特許第５，６４１，６８７号
【特許文献１５】米国特許第５，５３２，１６９号
【特許文献１６】米国特許第５，２８３，１９７号
【特許文献１７】米国特許第７，４１０，７７０号
【特許文献１８】米国特許第６，１３２，９７６号
【特許文献１９】米国特許第７，１１５，３７８号
【特許文献２０】米国特許第６，７０６，４９０号
【特許文献２１】米国特許第７，１９５，８８３号
【特許文献２２】米国特許第６，４２０，１２５号
【特許文献２３】米国特許第６，１０７，０４７号
【特許文献２４】米国特許第６，３００，０８３号
【特許文献２５】米国特許第６，３７２，４４２号
【特許文献２６】米国特許第６，２１０，９０２号
【特許文献２７】米国特許第６，３５５，４４２号
【特許文献２８】米国特許第６，３４２，３６１号
【特許文献２９】米国特許第６，３２３，３１４号
【特許文献３０】米国特許第６，１１０，６８９号
【特許文献３１】米国特許第６，０１０，８６３号
【特許文献３２】米国特許第５，５４１，２９５号
【非特許文献】
【００３５】
【非特許文献１】Woolf & Pfleger, 2003
【非特許文献２】Lawrence et al., 1998
【非特許文献３】Pritzker et al., 2006
【非特許文献４】Dean et al., 1989
【非特許文献５】Reboul et al., 1996
【非特許文献６】Hui et al., 2003
【非特許文献７】Schaller et al., 2005
【非特許文献８】Sumer et al., 2006
【非特許文献９】Birmingham et al., 2006
【非特許文献１０】Christgau et al., 2001
【非特許文献１１】Mouritzen et al., 2003
【非特許文献１２】Reijman et al., 2004
【非特許文献１３】Billinghurst et al., 1997
【非特許文献１４】Fraser et al., 2003
【非特許文献１５】Poole et al., 2004
【非特許文献１６】Otterness et al., 1997
【非特許文献１７】Downs et al., 2001
【非特許文献１８】Zhen et al., 2008
【非特許文献１９】Kafienah et al. (1998)
【非特許文献２０】Dejica et al. (2008)
【発明の概要】
【００３６】
ここで本発明は、Ｎ末端ネオ−エピトープとＣ末端ネオ−エピトープとを含有するタンパク質断片を、生物学的試料において測定するステップを含むアッセイの方法であって、前記ネオ−エピトープは、各々前記タンパク質のプロテアーゼによる切断により生成されるアミノ酸配列であり、前記方法は、前記Ｎ末端ネオ−エピトープを該Ｎ末端ネオ−エピトープの存在に対して特異的な第１の免疫学的結合パートナーと結合させ、かつ、前記Ｃ末端ネオ−エピトープを該Ｃ末端ネオ−エピトープの存在に対して特異的な第２の免疫学的結合パートナーと結合させるステップと、前記結合パートナーの双方の（dual）結合の程度を検出するステップとを含む方法を提供する。
【００３７】
生物学的試料は、特に体液試料であってもよく、血液、血清、血漿又は尿であってもよい。
【００３８】
前記アッセイを、前記免疫学的結合パートナーの一方を固体支持体に固定化し、前記断片を前記固定化した抗体と結合させ、前記断片に対する前記免疫学的結合パートナーのもう一方の結合を検出するサンドイッチアッセイとして行うことができる。前記サンドイッチアッセイを、均一系サンドイッチアッセイとして、又は不均一系サンドイッチアッセイとして行うことができる。
【００３９】
好ましくは、前記第１の免疫学的結合パートナーも前記第２の免疫学的結合パートナーも、前記断片が得られるインタクトなタンパク質と特異的に結合せず、好ましくは、前記第１の免疫学的結合パートナーも前記第２の免疫学的結合パートナーも、前記プロテアーゼの切断部位を越えて伸長した、そのそれぞれの前記ネオ−エピトープのアミノ酸配列を含有する前記タンパク質の断片と特異的に結合しない。
【００４０】
好ましくは、前記ネオ−エピトープがＩＩ型コラーゲン由来のものであり、それにより前記アッセイが軟骨の変性の診断に関するものであってもよく、関節炎に関して診断用指標を提供するものであってもよい。
【００４１】
前記ネオ−エピトープが、ＭＭＰによる又はカテプシンＫによるＩＩ型コラーゲンの切断により産生され得る。
【００４２】
好ましくは、前記第１の免疫学的結合パートナーが、以下のＩＩ型コラーゲン切断アミノ酸配列：
↓ＤＱＧＶＰＧ．．．．（配列番号５４）；↓ＲＥＧＳＰＧ．．．．（配列番号５５）；＊ＬＡＧＰＫＧ．．．．（配列番号５６）；及び＊↓ＬＴＧＰＡＧ．．．．（配列番号５７）
のうちの１つにより規定されるエピトープに対して特異的である。
【００４３】
好ましくは、前記第２の免疫学的結合パートナーが、以下のＩＩ型コラーゲン切断アミノ酸配列：
．．．．ＰＫＧＡＲＧ↓（配列番号５８）；．．．．ＧＱＰＧＰＡ↓（配列番号５９）；．．．ＥＰＧＧＶＧ↓（配列番号６０）；及び．．．．ＲＤＧＡＡＧ↓（配列番号６１）
のうちの１つにより規定されるエピトープに対して特異的である。
【００４４】
好ましくは、前記第１の免疫学的結合パートナー及び前記第２の免疫学的結合パートナーが、組み合わせると、以下の配列：
LTGPAGEPGREGSPGADGPPGRDGAAG（配列番号６２）
又は
REGSPGADGPPGRDGAAG（配列番号６３）
のＩＩ型コラーゲンペプチド断片と特異的に反応性を有する。
【００４５】
必要に応じて、被験体における関節炎進行の重症度が、健康な被験体において及び／又は病的な関節炎の活性を有する被験体において、上記アッセイにおいて測定される結合のレベルを過去に設定されたレベルと比較することにより評価される。
【００４６】
本発明は、異性化アミノ酸残基を含有するエピトープに対して特異的な第１の免疫学的結合パートナーと、プロテアーゼにより生成されるネオ−エピトープに対して特異的な第２の免疫学的結合パートナーとを含む、免疫学的アッセイキットを含む。前記キットは、前記結合パートナーとの免疫反応性を有する少なくとも１つの校正基準、洗浄試薬、緩衝剤、前記第１の免疫学的結合パートナー又は前記第２の免疫学的結合パートナーと試料の成分との結合を明らかにするための二次的な免疫学的結合パートナー、酵素標識、酵素標識基質、停止試薬、及び前記キットを使用してアッセイを実施するための取扱説明書をさらに含んでいてもよい。
【００４７】
本発明により有用なアッセイ形式は、不均一系サンドイッチアッセイ形式及び均一系サンドイッチアッセイ形式の両方を含む。
【００４８】
均一系アッセイ形式は、それぞれのビーズと結合させた２つの異なる免疫学的結合パートナーの使用であって、該ビーズが、そのそれぞれの結合パートナー（両方が単一の断片分子上の部位と結合する）が該ビーズに接近すると活性化される検出可能な近接（proximity）シグナルを組み込む使用を含む。
【００４９】
不均一系アッセイ形式は、前記免疫学的結合パートナーの一方を固体支持体に固定化し、前記断片を前記固定化した抗体と結合させ、前記断片に対する前記免疫学的結合パートナーのもう一方の結合を検出する形式を含む。
【００５０】
本発明において使用する免疫学的結合パートナーは、抗体、特にモノクローナル抗体、及び特異的な結合親和性を有する抗体断片を含む。これらはＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２等の結合断片を含む。
【００５１】
本発明によるアッセイは、上記アッセイにおいて検出可能な断片の放出をもたらす病態に関する診断又は疾患の進行のモニタリングに有用である。示される疾患は、測定される断片に応じて異なる。変形性関節症の診断又はモニタリングに関して特別に関心が持たれるものは、ＩＩ型コラーゲンである。軟骨の破壊を伴う他の疾患を、本発明による試験を用いて診断及びモニタリングすることもできると考えられる。このような疾患は、関節リウマチを含む。
【００５２】
ＩＩ型コラーゲンのタンパク質分解による切断により生じるネオエピトープの例は、カテプシンＫにより生成されるネオエピトープ、及びＭＭＰにより生成されるネオエピトープを含む。また、アグリカナーゼ、例えばＡＤＡＭ−ＴＳ４及びＡＤＡＭ−ＴＳ５によるＩＩ型コラーゲンのタンパク質分解による切断により生成される断片が含まれる。カテプシンＫネオエピトープ及びＭＭＰ９ネオエピトープ（neopitopes）を保有するＩＩ型コラーゲン配列の同定を、以下に記載するように行うことができると考えられる。同様に、他のＭＭＰ又はアグリカナーゼにより生成されるネオエピトープを保有するＩＩ型コラーゲン配列を同定することもできると考えられ、又はＭＭＰにより生成されるネオエピトープはヒト関節軟骨のＭＭＰにより生成されるペプチド生成物に関する公的に利用可能な情報に基づき得ると考えられる（非特許文献１８）。タンパク質及びプロテアーゼの特異性を確認するために、好ましい切断部位によるバイオマーカーネオエピトープを、以下のように選択することができる。
【００５３】
ヒトＩＩ型コラーゲン（BIOCOL、ＢＣ−３００１）を、１０ｍＭの酢酸中に溶解した（１ｍｇのＩＩ型コラーゲンに４００μｌを添加した）。１０μｇのプロカテプシンＫ（Calbiochem、３４２００１）を、１０ｍＭ  ＤＴＴ及び５ｍＭのＥＤＴＡを含有する２００μｌの１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．９）を室温で４０分間添加することにより活性化した。１０μｇのＭＭＰ９（Calbiochem、４４４２３１）を、１ｍＭのＡＰＭＡ／ＤＭＳＯ溶液２００μｌを３７℃で２時間添加することにより活性化した。カテプシンＫによる切断のために、６０μｌのＩＩ型コラーゲンを、２０ｍＭのＬ−システインを含有する１２０μｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）及び２４μｌの活性化カテプシンＫに、３７℃で４時間添加した。ＭＭＰ９による切断のために、６０μｌのＩＩ型コラーゲンを、１２０μｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化カルシウム、２ｍＭ  塩化亜鉛（ｐＨ８．０）及び２０μｌのＭＭＰ９に、３７℃で３日間添加した。得られたタンパク質分解による切断により生じる断片を、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）−タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）分析により特徴付けた。ＭＳ／ＭＳスペクトルを、Ｓｅｑｕｅｓｔ及びＸ！Ｔａｎｄｅｍデータベース検索アルゴリズムを使用してタンパク質データベースに対して検索した。カテプシンＫにより切断されたＩＩ型コラーゲンに関して、以下の断片の配列ヒットが見出された。
AQGPPGATGFPGAAGR（配列番号６４）
ASGDRGPPGPV（配列番号６５）
ASGDRGPPGPVGPPG（配列番号６６）
GANGEKGEVGPPGPA（配列番号６７）
GAPGEDGRPGPPGPQ（配列番号６８）
GARGAPGERGETGPPGPA（配列番号６９）
GDRGPPGPV（配列番号７０）
GERGFPG（配列番号７１）
GERGFPGER（配列番号７２）
GESGSPGENGSPGPM（配列番号７３）
GLPGPPGPPGEGGKPG（配列番号７４）
GPIGPPGPA（配列番号７５）
GPPGPPGKPGDDGEAGKPG（配列番号７６）
GPPGPV（配列番号７７）
GPPGPVGPA（配列番号７８）
LPGPPGPPGEGGKPG（配列番号７９）
NPGPPGPPGPPGPG（配列番号８０）
PIGPP（配列番号８１）
REGSPGADGPPGRDGAAGVK（配列番号８２）
SNGNPGPPGPPGPS（配列番号８３）
【００５４】
同定されたカテプシンＫにより生成された断片を、ヒトＩＩ型コラーゲンに関する配列（ｓｐ｜Ｐ０２４５８｜ＣＯ２Ａ１＿ＨＵＡＮ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｌｐｈａ−１（ＩＩ）ｃｈａｉｎ）と整列させ、矢印により示すように切断部位を位置決めした。
QMAGGFDEKAGGAQLGVMQGPMGPMGPRGPPGPAGAPGPQGFQGNPGEPGEPGVSGPMGPR↓GPPGPPGKPGDDGEAGKPG↓KAGERGPPGPQGARGFPGTPGLPGVKGHRGYPGLDGAKGEAGAPGVK↓GESGSPGENGSPGPM↓GPRGLPGERGRTGPAGAAGARGNDGQPGPA↓GPPGPV↓GPA↓GGPGFPGAPGAKGEAGPTGARGPEGAQGPRGEPGTPGSPGPAGASGNPGTDGIPGAKGSAGAPGIAGAPGFPGPRGPPGPQGATGPLGPKGQTGEPGIAGFKGEQGPKGEPGPAGPQGAPGPAGEEGKRGARGEPGGVG↓PIGPP↓GERGAPGNRGFPGQDGLAGPKGAPGERGPSGLAGPKGANGDPGRPGEPGLPGARGLTGRPGDAGPQGKVGPS↓GAPGEDGRPGPPGPQ↓GARGQPGVMGFPGPKGANGEPGKAGEKGLPGAPGLRGLPGKDGETGAAGPPGPAGPAGERGEQGAPGPSGFQ↓G↓LPGPPGPPGEGGKPG↓DQGVPGEAGAPGLVGPR↓GERGFPG↓ER↓GSPGAQGLQGPRGLPGTPGTDGPKGASGPAGPPGAQGPPGLQGMPGERGAAGIAGPKGDRGDVGEKGPEGAPGKDGGRGLT↓GPIGPPGPA↓GANGEKGEVGPPGPA↓GSA↓GARGAPGERGETGPPGPA↓GFAGPPGADGQPGAKGEQGEAGQKGDAGAPGPQGPSGAPGPQGPTGVTGPKGARG↓AQGPPGATGFPGAAGR↓VGPPG↓SNGNPGPPGPPGPS↓GKDGPKGARGDSGPPGRAGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGPQGLAGQRGIVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGAPG↓AS↓GDRGPPGPV↓GPPG↓LTGPAGEPG↓REGSPGADGPPGRDGAAGVK↓GDRGETGAVGAPGAPGPPGSPGPAGPTGKQGDRGEAGAQGPMGPSGPAGARGIQGPQGPRGDKGEAGEPGERGLKGHRGFTGLQGLPGPPGPSGDQGASGPAGPSGPRGPPGPVGPSGKDGANGIPGPIGPPGPRGRSGETGPAGPPG↓NPGPPGPPGPPGPG↓IDMSAFAGLGPREKGPDPLQYMRA（配列番号８４）
【００５５】
ＭＭＰ９により切断されたＩＩ型コラーゲンに関して、以下の断片の配列ヒットが見出された：
AAGARGNDGQPGPAGPPGPVGPA（配列番号８５）
AQGPRGEPGTPGSPGPAG（配列番号８６）
ARGAPGERGETGPPGPAG（配列番号８７）
ASGDRGPPGPV（配列番号８８）
ASGDRGPPGPVG（配列番号８９）
ATGPLGPKG（配列番号９０）
DRGPPGPVGPPG（配列番号９１）
ERGAPGNRGFPGQDGLAGPKGAPGERGPSG（配列番号９２）
FQGLPGPPGPPGEGGKPGDQGVPGEAGAPGLVGPR（配列番号９３）
FQGLPGPPGPPGEGGKPGDQGVPGEAGAPGLVGPRG（配列番号９４）
FTGLQGLPGPPGPSG（配列番号９５）
FTGLQGLPGPPGPSGDQGASGPAGPSGPRGPPGPVGPSG（配列番号９６）
GANGEKGEVGPPGPA（配列番号９７）
GAPGEDGRPGPPGPQ（配列番号９８）
GAPGEDGRPGPPGPQG（配列番号９９）
GAPGERGETGPPGPA（配列番号１００）
GESGSPGENGSPGPM（配列番号１０１）
GPIGPPGPA（配列番号１０２）
GPPGPV（配列番号１０３）
GPPGPVGPPG（配列番号１０４）
GPRGPPGPAGAPGPQG（配列番号１０５）
GVMQGPMGPMGPRGPPGPAGAPGPQG（配列番号１０６）
IVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGK（配列番号１０７）
KQGDRGEAGAQGPMGPSGPAG（配列番号１０８）
KVGPSGAPGEDGRPGPPGPQG（配列番号１０９）
LPGKDGETGAAGPPGPAGPAG（配列番号１１０）
LPGKDGETGAAGPPGPAGPAGERGEQGAPGPSG（配列番号１１１）
LQGLPGPPGPSGDQGASGPAGPSGPRGPPGPVGPSG（配列番号１１２）
LTGPAGEPGREGSPGAD（配列番号１１３）
LTGPAGEPGREGSPGADGPPGRDGAAG（配列番号６２）
LTGPIGPPGPAG（配列番号１１５）
LTGRPGDAGPQGKVGPSGAPGEDGRPGPPGPQG（配列番号１１６）
QGPMGPMGPRGPPGPAGAPGPQG（配列番号１１７）
QGPRGLPGTPGTDGPKGASGPAGPPGAQGPP（配列番号１１８）
RSGETGPAGPPGNPGPPGPPGPPGPGID（配列番号１１９）
RVGPPGSNGNPGPPGPPGPSG（配列番号１２０）
SNGNPGPPGPPGPS（配列番号１２１）
SPGPMGPRG（配列番号１２２）
VKGESGSPGENGSPGPMGPRG（配列番号１２３）
【００５６】
同定されたＭＭＰ９により生成された断片を、ヒトＩＩ型コラーゲンに関する配列（ｓｐ｜Ｐ０２４５８｜ＣＯ２Ａ１＿ＨＵＡＮ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｌｐｈａ−１（ＩＩ）ｃｈａｉｎ）と整列させ、星印により示すように切断部位を位置決めした。
QMAGGFDEKAGGAQL＊GVM＊QGPMGPM＊GPRGPPGPAGAPGPQG＊FQGNPGEPGEPGVSGPMGPRGPPGPPGKPGDDGEAGKPGKAGERGPPGPQGARGFPGTPGLPGVKGHRGYPGLDGAKGEAGAPG＊VK＊GESGSPGENG＊SPGPM＊GPRG＊LPGERGRTGPAG＊AAGARGNDGQPGPAGPPGPVGPA＊GGPGFPGAPGAKGEAGPTGARGPEG＊AQGPRGEPGTPGSPGPAG＊ASGNPGTDGIPGAKGSAGAPGIAGAPGFPGPRGPPGPQG＊ATGPLGPKG＊QTGEPGIAGFKGEQGPKGEPGPAGPQGAPGPAGEEGKRGARGEPGGVGPIGPPG＊ERGAPGNRGFPGQDGLAGPKGAPGERGPSG＊LAGPKGANGDPGRPGEPGLPGARG＊LTGRPGDAGPQG＊KVGPS＊GAPGEDGRPGPPGPQ＊G＊ARGQPGVMGFPGPKGANGEPGKAGEKGLPGAPGLRG＊LPGKDGETGAAGPPGPAGPAG＊ERGEQGAPGPSG＊FQGLPGPPGPPGEGGKPGDQGVPGEAGAPGLVGPR＊G＊ERGFPGERGSPGAQGL＊QGPRGLPGTPGTDGPKGASGPAGPPGAQGPP＊GLQGMPGERGAAGIAGPKGDRGDVGEKGPEGAPGKDGGRG＊LT＊GPIGPPGPA＊G＊ANGEKGEVGPPGPA＊GSAG＊AR＊GAPGERGETGPPGPA＊G＊FAGPPGADGQPGAKGEQGEAGQKGDAGAPGPQGPSGAPGPQGPTGVTGPKGARGAQGPPGATGFPGAAG＊RVGPPG＊SNGNPGPPGPPGPS＊G＊KDGPKGARGDSGPPGRAGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGPQGLAGQRG＊IVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGK＊QGAPG＊ASG＊DR＊GPPGPV＊G＊PPG＊LTGPAGEPGREGSPGAD＊GPPGRDGAAG＊VKGDRGETGAVGAPGAPGPPGSPGPAGPTG＊KQGDRGEAGAQGPMGPSGPAG＊ARGIQGPQGPRGDKGEAGEPGERGLKGHRG＊FTG＊LQGLPGPPGPSG＊DQGASGPAGPSGPRGPPGPVGPSG＊KDGANGIPGPIGPPGPRG＊RSGETGPAGPPGNPGPPGPPGPPGPGID＊MSAFAGLGPREKGPDPLQYMRA（配列番号８４）
【００５７】
カテプシンＫにより生成される部位に関して矢印により、及びＭＭＰ９により生成される部位に関して星印により示すように、切断部位を位置決めした。
QMAGGFDEKAGGAQL＊GVM＊QGPMGPM＊GPRGPPGPAGAPGPQG＊FQGNPGEPGEPGVSGPMGPR↓GPPGPPGKPGDDGEAGKPG↓KAGERGPPGPQGARGFPGTPGLPGVKGHRGYPGLDGAKGEAGAPG＊VK＊↓GESGSPGENG＊SPGPM＊↓GPRG＊LPGERGRTGPAG＊AAGARGNDGQPGPA↓GPPGPV↓GPA＊↓GGPGFPGAPGAKGEAGPTGARGPEG＊AQGPRGEPGTPGSPGPAG＊ASGNPGTDGIPGAKGSAGAPGIAGAPGFPGPRGPPGPQG＊ATGPLGPKG＊QTGEPGIAGFKGEQGPKGEPGPAGPQGAPGPAGEEGKRGARGEPGGVG↓PIGPP↓G＊ERGAPGNRGFPGQDGLAGPKGAPGERGPSG＊LAGPKGANGDPGRPGEPGLPGARG＊LTGRPGDAGPQG＊KVGPS＊↓GAPGEDGRPGPPGPQ＊↓G＊ARGQPGVMGFPGPKGANGEPGKAGEKGLPGAPGLRG＊LPGKDGETGAAGPPGPAGPAG＊ERGEQGAPGPSG＊FQ↓G↓LPGPPGPPGEGGKPG↓DQGVPGEAGAPGLVGPR＊↓G＊ERGFPG↓ER↓GSPGAQGL＊QGPRGLPGTPGTDGPKGASGPAGPPGAQGPP＊GLQGMPGERGAAGIAGPKGDRGDVGEKGPEGAPGKDGGRG＊LT＊↓GPIGPPGPA＊↓G＊ANGEKGEVGPPGPA＊↓GSA↓G＊AR＊GAPGERGETGPPGPA＊↓G＊FAGPPGADGQPGAKGEQGEAGQKGDAGAPGPQGPSGAPGPQGPTGVTGPKGARG↓AQGPPGATGFPGAAG＊R↓VGPPG＊↓SNGNPGPPGPPGPS＊↓G＊KDGPKGARGDSGPPGRAGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGPQGLAGQRG＊IVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGK＊QGAPG＊↓AS↓G＊DR＊GPPGPV＊↓G＊PPG＊↓LTGPAGEPG↓REGSPGAD＊GPPGRDGAAG＊VK↓GDRGETGAVGAPGAPGPPGSPGPAGPTG＊KQGDRGEAGAQGPMGPSGPAG＊ARGIQGPQGPRGDKGEAGEPGERGLKGHRG＊FTG＊LQGLPGPPGPSG＊DQGASGPAGPSGPRGPPGPVGPSG＊KDGANGIPGPIGPPGPRG＊RSGETGPAGPPG↓NPGPPGPPGPPGPG↓ID＊MSAFAGLGPREKGPDPLQYMRA（配列番号８４）
【００５８】
ＩＩ型コラーゲンのタンパク質分解による切断により生じるさらなるネオエピトープは、ヒト関節軟骨のプロテアーゼにより生成されるペプチド生成物に関する公的に利用可能な情報に基づき得ると考えられる（非特許文献１８）。
【００５９】
考え得る生成される断片のいずれもが、バイオマーカーを構成することができると考えられる。バイオマーカーは、断片のＮ末端及びＣ末端に切断部位を有しかつ中間には他の切断部位を有していなくてもよいと考えられ、又はバイオマーカーは、Ｎ末端及びＣ末端に切断部位を有し、かつ、中間に１つ又は複数の考え得る切断部位を有していてもよいと考えられる。
【００６０】
２つのネオエピトープを保有する好ましいＩＩ型コラーゲン配列は、以下のように選択された。
【００６１】
好ましいバイオマーカーネオエピトープを、タンパク質特異性に基づき選択した。切断部位のタンパク質特異性を、切断部位のいずれかの部位上における６アミノ末端残基又は６カルボキシ末端残基の同一性検索により評価した。公的に利用可能なプログラム「Ｐａｔｔｉｎｐｒｏｔ」を、ＵＮＩＰＲＯＴ／ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータバンクの検索に使用した。カテプシンＫ切断部位（矢印）及び／又はＭＭＰ切断部位（星印）の好ましいバイオマーカーネオエピトープを、下線を付した配列により示す。
QMAGGFDEKAGGAQLGVMQGPMGPMGPRGPPGPAGAPGPQGFQGNPGEPGEPGVSGPMGPRGPPGPPGKPGDDGEAGKPGKAGERGPPGPQGARGFPGTPGLPGVKGHRGYPGLDGAKGEAGAPGVKGESGSPGENGSPGPMGPRGLPGERGRTGPAGAAGARGNDGQPGPA↓GPPGPVGPAGGPGFPGAPGAKGEAGPTGARGPEGAQGPRGEPGTPGSPGPAGASGNPGTDGIPGAKGSAGAPGIAGAPGFPGPRGPPGPQGATGPLGPKGQTGEPGIAGFKGEQGPKGEPGPAGPQGAPGPAGEEGKRGARGEPGGVG↓PIGPPGERGAPGNRGFPGQDGLAGPKGAPGERGPSG＊LAGPKGANGDPGRPGEPGLPGARGLTGRPGDAGPQGKVGPSGAPGEDGRPGPPGPQGARGQPGVMGFPGPKGANGEPGKAGEKGLPGAPGLRGLPGKDGETGAAGPPGPAGPAGERGEQGAPGPSGFQGLPGPPGPPGEGGKPG↓DQGVPGEAGAPGLVGPRGERGFPGERGSPGAQGLQGPRGLPGTPGTDGPKGASGPAGPPGAQGPPGLQGMPGERGAAGIAGPKGDRGDVGEKGPEGAPGKDGGRGLTGPIGPPGPAGANGEKGEVGPPGPAGSAGARGAPGERGETGPPGPAGFAGPPGADGQPGAKGEQGEAGQKGDAGAPGPQGPSGAPGPQGPTGVTGPKGARG↓AQGPPGATGFPGAAGRVGPPGSNGNPGPPGPPGPSGKDGPKGARGDSGPPGRAGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGPQGLAGQRGIVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGAPGASGDRGPPGPVGPPG＊↓LTGPAGEPG↓REGSPGADGPPGRDGAAG＊VKGDRGETGAVGAPGAPGPPGSPGPAGPTGKQGDRGEAGAQGPMGPSGPAGARGIQGPQGPRGDKGEAGEPGERGLKGHRGFTGLQGLPGPPGPSGDQGASGPAGPSGPRGPPGPVGPSGKDGANGIPGPIGPPGPRGRSGETGPAGPPGNPGPPGPPGPPGPGIDMSAFAGLGPREKGPDPLQYMRA（配列番号８４）
【００６２】
好ましいバイオマーカー断片に関する付加的な要件は切断部位の位置が互いに近接していることであり、すなわち標的断片は、好ましくは最大で、５０アミノ酸残基、より好ましくは４０アミノ酸残基以下、より好ましくは３０アミノ酸残基以下の長さを有する必要がある。好ましいバイオマーカー断片の例は以下の通りである。
１  LTGPAGEPGREGSPGADGPPGRDGAAG（配列番号６２）
２  REGSPGADGPPGRDGAAG（配列番号６３）
【００６３】
断片１に関しては、免疫学的結合パートナーは好ましくは、ＬＴＧＰＡＧ．．．（配列番号５７）のＮ末端ネオエピトープ、及び．．．ＲＤＧＡＡＧ（配列番号６１）のＣ末端ネオエピトープに対する特異的な結合親和性を有する必要がある。
【００６４】
断片２に関しては、免疫学的結合パートナーは好ましくは、ＲＥＧＳＰＧ．．．（配列番号５５）のＮ末端ネオエピトープ、及び．．．ＲＤＧＡＡＧ（配列番号６１）のＣ末端ネオエピトープに対する特異的な結合親和性を有する必要がある。
【００６５】
他のタンパク質の関連する断片を、同様に規定することができる。本発明を、生物学的試料における他のタンパク質の分解生成物の検出に適用することができる。
【００６６】
本発明を、添付の図面を参照して、以下の実施例によりさらに説明及び例示する。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】実施例１において検討された血清における抗体の結合を示す図である。
【図２】実施例１において観察されたモノクローナル抗体の結合を示す図である。
【実施例】
【００６８】
実施例１
＜ネオエピトープを認識するモノクローナル抗体の生成＞
合成ペプチドを、標準的な技法により調製した。免疫原性を増大させるために、ペプチド（ＬＴＧＰＡＧＧＧＧＣ（配列番号１２４））をそのＣ末端で、システインを介する部位特異的結合技術を使用してキャリアタンパク質ＫＬＨと結合させた。免疫化の前に、免疫原をフロイント不完全アジュバントと１：１の比で混合し、混合物をＢａｌｂ／ｃマウスに皮下注射した。免疫化は２週間毎に２ヶ月間繰り返し（４回免疫）、その後各免疫化の間隔を４週間として継続した。免疫化を開始する前及び各免疫化の１週間後に、マウスから血液を取得した。Ｃ末端をビオチン化した合成ペプチド（ＬＴＧＰＡＧＥＰＧＫ−ビオチン（配列番号１２５））に対するマウス免疫血清の結合反応性を試験することにより、免疫応答を評価した。マウス免疫血清の結合反応性に関する試験は、ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレートの表面と結合させたビオチン化合成ペプチドに対する免疫血清の結合に基づくものとした。インキュベーション及び洗浄の後、結合した抗体を、セイヨウワサビペルオキシダーゼと複合体形成した抗マウスＩｇＧとのインキュベーション、洗浄、及び色素原ＴＭＢの添加により実証した（図１）。
【００６９】
上で言及したスクリーニング試験において十分な免疫血清の力価を達成した後、選択したマウスを少なくとも４週間休ませ、アジュバントを含まない免疫原を用いて腹腔内に追加免疫した。３日後脾臓を取り出し、標準的な技法を使用する骨髄腫細胞との融合に使用した。増殖中のハイブリドーマから得た抗体を、上で記載したようなアッセイにおけるビオチン化合成ペプチドに対するその結合反応性により評価した。さらに抗体の切断特異性を、１残基伸長させたコーター（coater）ペプチド（ＧＬＴＧＰＡＧＥＰＧＫ−ビオチン（配列番号１２６））に対する結合反応性が極めて小さいこと、及び非類似のコーターペプチド（ビオチン−ＫＧＡＴＧＰＬＧＰＫ（配列番号１２７））に対して結合しないことにより実証した（図２）。
【００７０】
実施例２
＜２つのネオ−エピトープを保有するコラーゲン断片を検出するイムノアッセイの開発＞
上で記載したようなアミノ酸配列ＬＴＧＰＡＧＧＧＧＣ（配列番号１２４）のＮ末端と結合する１つのモノクローナル抗体を、標準的な手順に従ってビオチン化し、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて捕捉抗体として使用した。アミノ酸配列ＣＧＧＧＲＤＧＡＡＧ（配列番号１２８）のＣ末端と結合する検出抗体を、標準的な技法に従ってセイヨウワサビペルオキシダーゼで標識した。これらの２つの試薬、及びストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレートを使用して、抗体をウシ血清アルブミン（１％）及びＴｗｅｅｎ２０（０．１％）を含む１０ｍＭ  リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（総体積１００μＬ）で予備希釈し、その後マイクロタイタープレート中で５０μＬのヒト血清試料と共にインキュベートした。Ｎ末端ネオ−エピトープ及びＣ末端ネオ−エピトープの両方を含有するアミノ酸配列ＬＴＧＰＡＧＥＰＧＲＥＧＳＰＧＡＤＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧ（配列番号６２）を有する合成ペプチドを、較正物質として使用した。２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、色素原（ＴＭＢ）と共に１５分間インキュベートした。その後、発色反応を０．１８Ｍの硫酸の添加により停止した。
【００７１】
異化条件及び同化条件で培養したヒト関節軟骨からの断片の放出の測定により、アッセイの固有の（native）反応性を試験した。図３は、異化条件が軟骨からの断片の放出を増大させるが、同化条件は断片の放出を減少させることを示す。これにより、この断片が軟骨のターンオーバーのマーカーであることが示される。
【００７２】
上で記載したＥＬＩＳＡにおけるＯＡ患者由来の２０個のヒト尿試料、及び健康な被験体由来の２０個の試料の測定により、疾患を有する被験体におけるＩＩ型コラーゲン断片の濃度の５０％超の増大（ｐ＜０．０５）が実証された（図４）。
【００７３】
実施例３
＜１つのネオ−エピトープを保有するコラーゲン断片を検出するイムノアッセイの開発−当該切断が本来のＭＭＰ切断部位であるか否かに関する試験。＞
上で記載したようなアミノ酸配列ＬＴＧＰＡＧＧＧＧＣ（配列番号１２４）のＮ末端と結合する１つのモノクローナル抗体を、標準的な手順に従ってペルオキシダーゼ標識し、競合ＥＬＩＳＡにおいてビオチン化コーターペプチドと共に使用した。
【００７４】
コーターペプチド（ＬＴＧＰＡＧＧＧＧＣ−ビオチン（配列番号１２４））及び抗体を、ウシ血清アルブミン（１％）及びＴｗｅｅｎ２０（０．１％）を含む１０ｍＭのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（総体積１００μＬ）で予備希釈し、その後マイクロタイタープレート中で２０μＬのヒト血清試料と共にインキュベートした。Ｎ末端ネオ−エピトープ及びＣ末端ネオ−エピトープの両方を含有するアミノ酸配列ＬＴＧＰＡＧＥＰＧＲＥＧＳＰＧＡＤＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧ（配列番号６２）を有する合成ペプチドを、較正物質として使用した。２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、色素原（ＴＭＢ）と共に１５分間インキュベートした。その後、発色反応を０．１８Ｍの硫酸の添加により停止した。
【００７５】
これが実際にＭＭＰ由来のものであるか否かを試験するために、種々の阻害剤を軟骨移植片培養物に添加し、培地への断片（ＬＴＧＰＡＧＧＧＧＣ（配列番号１２４））の放出を測定した。図５は、プロテアーゼ阻害剤を添加したときの断片のレベルに対する効果を示す。使用した阻害剤は以下である：メタロプロテイナーゼ阻害剤（ＧＭ６００１）、システインプロテアーゼ阻害剤（Ｅ６４）、アスパルチルペプチダーゼ阻害剤ペプスタチンＡ（Ｐｅｐ．Ａ）及びセリンプロテアーゼ阻害剤アプロチニン（Aprotenin）（ａｐｒｏ．）。全ての条件に対して異化サイトカインを添加することにより放出を刺激した。ＧＭ６００１のみが断片の放出を阻止することができ、これが真のＭＭＰ由来の断片であることが示されたが、ＭＭＰを間接的に阻害するセリンプロテアーゼ阻害剤も或る程度放出を阻害することができた（図５）。これにより、断片が真にＭＭＰ由来の断片であることが確認される。
【００７６】
実施例４
＜１つのネオ−エピトープを保有するコラーゲン断片を検出するイムノアッセイの開発−当該切断が本来のＭＭＰ切断部位であるか否かに関する試験。＞
上で記載したようなアミノ酸配列ＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧ（配列番号１１４）のＣ末端と結合する１つのモノクローナル抗体を、標準的な手順に従ってペルオキシダーゼ（peroxidise）標識し、競合ＥＬＩＳＡにおいてビオチン化コーターペプチドと共に使用した。
【００７７】
コーターペプチド（ビオチン−ＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧ（配列番号１１４））及び抗体をウシ血清アルブミン（１％）及びＴｗｅｅｎ２０（０．１％）を含む１０ｍＭ  リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（総体積１００μＬ）で予備希釈し、その後マイクロタイタープレート中で２０μＬのヒト血清試料と共にインキュベートした。Ｎ末端ネオ−エピトープ及びＣ末端ネオ−エピトープの両方を含有するアミノ酸配列ＬＴＧＰＡＧＥＰＧＲＥＧＳＰＧＡＤＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧ（配列番号６２）を有する合成ペプチドを、較正物質として使用した。２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、色素原（ＴＭＢ）と共に１５分間インキュベートした。その後、発色反応を０．１８Ｍの硫酸の添加により停止した。
【００７８】
この断片が実際にＭＭＰ由来のものであるか否かを試験するために、種々の阻害剤を軟骨移植片培養物に添加し、培地への断片（ＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧ（配列番号１１４））の放出を測定した。図６は、プロテアーゼ阻害剤を添加したときの断片のレベルに対する効果を示す。使用した阻害剤は以下である：メタロプロテイナーゼ阻害剤（ＧＭ６００１）、システインプロテアーゼ阻害剤（Ｅ６４）、アスパルチルペプチダーゼ阻害剤ペプスタチンＡ（Ｐｅｐ．Ａ）及びセリンプロテアーゼ阻害剤アプロチニン（ａｐｒｏ．）。全ての条件に対して異化サイトカインを添加することにより放出を刺激した。ＧＭ６００１のみが断片の放出を阻止することができ、これが真のＭＭＰ由来の断片であることが示された。ＭＭＰを間接的に阻害するセリンプロテアーゼ阻害剤も、有意にではないが或る程度放出を阻害することができた（図６）。これにより、断片が真にＭＭＰ由来の断片であることが確認される。
【００７９】
本明細書では、他に明示的に示されぬ限り、「又は（or）」という単語は、記載される条件のうちの１つだけが満たされることを要求する「排他的な『又は』（exclusive or）」という作用素（operator：演算子）に対立するものとして、該条件のいずれか又は両方が満たされる場合に真の値を返す作用素の意味で使用される。「を含む（comprising）」という単語は、「からなる（consisting of）」を意味するというよりも「を含む（including）」の意味で使用される。上で確認した全ての過去の教示は、参照により本明細書に援用される。本明細書における過去に公開された文献のいずれについての確認も、その教示がこの日付においてオーストラリア又は他の場所で一般的な周知の知識であったことの承認又は表明であると解釈すべきではない。
【００８０】
＜文献＞
【表１Ａ】
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【表１Ｂ】
2012508872.tif 000003
【表１Ｃ】
2012508872.tif 000004
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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