(57)【要約】  本発明は、特に、病原体に対する免疫応答を惹起する方法であって、(i)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド；(ii)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含んでなる１つまたはそれ以上のウイルスベクター；および(iii)アジュバント；を投与することを含んでなり、この際、該１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド、該１つまたはそれ以上のウイルスベクター、および該アジュバントを同時投与する方法に関する。また、本発明は、該ポリペプチド、ウイルスベクターおよびアジュバントを使用するワクチン、医薬組成物、キットおよび使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原体に対する免疫応答を惹起する方法であって、
(ｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド；
(ｉｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含んでなる１つまたはそれ以上のウイルスベクター；および
(ｉｉｉ)アジュバント
を投与することを含んでなり、この際、該１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド、該１つまたはそれ以上のウイルスベクター、および該アジュバントを同時投与する、方法。
【請求項２】
病原体に対する免疫応答を惹起する方法であって、
(ｉ)アジュバントと共処方した該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド；および
(ｉｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含んでなる１つまたはそれ以上のウイルスベクター
を投与することを含んでなり、この際、１つまたはそれ以上の免疫原性ポリペプチドとアジュバント、および１つまたはそれ以上のウイルスベクターを同時投与する、方法。
【請求項３】
哺乳動物において病原体特異的なＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞および／または抗体の産生を刺激する方法であって、該哺乳動物に、
(ｉ)病原体に由来する１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド；
(ｉｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含んでなる１つまたはそれ以上のウイルスベクター；および
(ｉｉｉ)アジュバント
を投与することを含んでなり、この際、該１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド、該１つまたはそれ以上のウイルスベクター、および該アジュバントを、例えば、免疫学的有効量の上記組成物の投与によって同時投与する、方法。
【請求項４】
病原体に対する免疫応答を惹起する方法であって、
(ａ)(ｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド；(ｉｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含んでなる１つまたはそれ以上のウイルスベクター；および(ｉｉｉ)アジュバント、を投与し、この際、該１つまたはそれ以上の免疫原性ポリペプチド、該１つまたはそれ以上のウイルスベクター、および該アジュバントを同時投与し；そして
(ｂ)所望により(ａ)の工程を繰り返す
ことからなる、方法。
【請求項５】
病原体に対する免疫応答を惹起する方法であって、
(ｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド；
(ｉｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含んでなる１つまたはそれ以上のウイルスベクター；および
(ｉｉｉ)アジュバント
を投与することを含んでなり、この際、該１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド、該１つまたはそれ以上のウイルスベクター、および該アジュバントを同時投与し、かつ、いずれのプライミング用量の免疫原性ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与も含まない、方法。
【請求項６】
１つまたはそれ以上の免疫原性ポリペプチド、１つまたはそれ以上のウイルスベクター、およびアジュバントを共処方する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
病原体特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞および抗体の産生を刺激する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
(ｉ)病原体に由来する１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド；
(ｉｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含んでなる１つまたはそれ以上のウイルスベクター；および
(ｉｉｉ)アジュバント
を含んでなる、ワクチン組成物。
【請求項９】
該１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチドの１つまたはそれ以上が、該１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドの１つまたはそれ以上と実質的に同一である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法またはワクチン組成物。
【請求項１０】
該１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチドの１つまたはそれ以上が、該１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドの１つまたはそれ以上に含まれる抗原と実質的に同一である少なくとも１つの抗原を含んでいる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法またはワクチン組成物。
【請求項１１】
１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチドが、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法またはワクチン組成物。
【請求項１２】
１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチドが、少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法またはワクチン組成物。
【請求項１３】
該１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチドの１つまたはそれ以上と、該１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドの１つまたはそれ以上とが、１つまたはそれ以上の同一のＢ細胞および／またはＴ細胞エピトープを共有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法またはワクチン組成物。
【請求項１４】
該１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチドの１つまたはそれ以上のいずれもが、該１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドの１つまたはそれ以上と実質的に同一ではないか、またはそれらと共通するいずれの抗原も含んでいない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法またはワクチン組成物。
【請求項１５】
病原体がＨＩＶである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法またはワクチン組成物。
【請求項１６】
免疫原性ポリペプチドが、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、ＧａｇおよびＰｏｌ、ならびにこれらの免疫原性誘導体およびこれらの免疫原性フラグメントから選択されるＨＩＶ由来抗原を含む、請求項１５に記載の方法またはワクチン組成物。
【請求項１７】
第１の免疫原性ポリペプチドが、ｐ２４-ＲＴ-Ｎｅｆ-ｐ１７である、請求項１６に記載の方法またはワクチン組成物。
【請求項１８】
第２の免疫原性ポリペプチドが、Ｇａｇ-ＲＴ-Ｎｅｆである、請求項１６または１７に記載の方法またはワクチン組成物。
【請求項１９】
病原体が、熱帯熱マラリア原虫および／または三日熱マラリア原虫である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法またはワクチン組成物。
【請求項２０】
免疫原性ポリペプチドが、熱帯熱マラリア原虫および／または三日熱マラリア原虫に由来する抗原を含み、該抗原が、スポロゾイト周囲(ＣＳ)タンパク質、ＭＳＰ-１、ＭＳＰ-３、ＡＭＡ-１、ＬＳＡ-１、ＬＳＡ-３、およびこれらの免疫原性誘導体またはこれらの免疫原性フラグメントから選択される、請求項１９に記載の方法またはワクチン組成物。
【請求項２１】
免疫原性ポリペプチドが、ハイブリッドタンパク質ＲＴＳである、請求項２０に記載の方法またはワクチン組成物。
【請求項２２】
ＲＴＳが、ＲＴＳ,Ｓとして知られる混合粒子の形態で供される、請求項２０に記載の方法またはワクチン組成物。
【請求項２３】
ポリヌクレオチドによってコードされる免疫原性ポリペプチドが、熱帯熱マラリア原虫由来のＣＳタンパク質またはその免疫原性フラグメントもしくは誘導体である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法またはワクチン組成物。
【請求項２４】
病原体が結核菌である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法またはワクチン組成物。
【請求項２５】
アジュバントが、Ｔｈ１応答の優先的刺激物質を含んでなる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法またはワクチン組成物。
【請求項２６】
アジュバントが、ＱＳ２１および／または３Ｄ-ＭＰＬおよび／またはＣｐＧを含んでなる、請求項２５に記載の方法またはワクチン組成物。
【請求項２７】
アジュバントが、ＱＳ２１および３Ｄ-ＭＰＬを含んでなる、請求項２６に記載の方法またはワクチン組成物。
【請求項２８】
アジュバントが、水中油型エマルションを含有する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法またはワクチン組成物。
【請求項２９】
アジュバントがリポソームを含有する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法またはワクチン組成物。
【請求項３０】
哺乳動物において免疫応答を刺激する方法であって、対象に、免疫学的有効量の請求項８〜２９のいずれか一項に記載のワクチン組成物を投与することを含んでなる、方法。
【請求項３１】
哺乳動物において免疫応答を刺激するための薬剤の製造における、請求項８〜３１のいずれか一項に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項３２】
哺乳動物において免疫応答を刺激するために用いるための、請求項８〜３１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項３３】
(ｉ)病原体に由来する１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド；
(ｉｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含んでなる１つまたはそれ以上のウイルスベクター；および
(ｉｉｉ)アジュバント
を含んでなる、キット。
【請求項３４】
(ｉ)病原体に由来する１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチドおよびアジュバント；および
(ｉｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の免疫原性ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含んでなる１つまたはそれ以上の第２のウイルスベクター；
を含んでなる、キット。
【請求項３５】
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターではない、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法またはワクチンまたはキットまたは使用。
【請求項３６】
ウイルスベクターが、弱毒化麻疹ウイルスベクター、所望により、弱毒化Schwarz麻疹ウイルスである、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法またはワクチンまたはキットまたは使用。
【請求項３７】
第１の免疫原性ポリペプチドが、ｐ２４-ＲＴ-Ｎｅｆ-ｐ１７を含んでなり、アジュバントが、３Ｄ-ＭＰＬおよびＱＳ２１を含んでなり、ウイルスベクターが、所望によりコドン最適化した免疫原性ポリペプチドＧａｇ-ＲＴ-Ｎｅｆをコードするポリヌクレオチドを含んでなる、弱毒化Schwarz麻疹ウイルスなどのベクターを含んでなる、請求項３６に記載の方法またはワクチンまたはキットまたは使用。
【請求項３８】
ポリペプチド、ウイルスベクターおよびアジュバント成分の１つまたは２つまたは全てを、薬学上許容しうる賦形剤と混合する、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法またはワクチンまたはキットまたは使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、哺乳動物、特にヒトにおいて免疫応答を刺激する際の、特に、病原体による感染の防止および処置のための、新規なワクチン組成物およびその使用に関する。特に、本発明は、後の複雑なプライム・ブースト計画に頼ることなく、対象においてＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞応答ならびに抗体応答を誘導することができる組成物に関する。
【０００２】
背景技術
１９世紀後期から、不活性化した全生物のワクチン接種における使用が成功している。比較的最近になって、抽出物、サブユニット、トキソイドおよび莢膜多糖類の投与を含むワクチンが使用されている。遺伝子工学技術が利用可能になって以来、組換えタンパク質の使用が有利な戦略になっており、天然供給源に由来する精製タンパク質の使用に付随する多くのリスクが除かれている。
【０００３】
初期のワクチンアプローチは、インビボで免疫応答のある種の側面を刺激するタンパク質の投与に基づいていた。その後、宿主によって転写され、免疫原性タンパク質に翻訳されうるＤＮＡの投与によっても免疫応答を惹起しうることが評価されている。
【０００４】
哺乳動物の免疫応答は、２つの重要な要素、即ち、体液性応答および細胞媒介応答を有している。体液性応答には、循環抗体の生成が関与しており、該抗体がその特異的抗原に結合し、それによって抗原を中和し、他の細胞(細胞毒性または食細胞性のいずれかである)が関与する過程による該抗原のその後の浄化を有利にする。Ｂ細胞は、抗体の生成(血漿Ｂ細胞)、ならびに免疫学的な体液性記憶の保持(記憶Ｂ細胞)、即ち、抗原への最初の暴露(例えばワクチン接種による)の後の数年間にわたって抗原を認識する能力の原因である。細胞媒介応答には、数多くの異なる種類の細胞(特にＴ細胞)の相互作用が関与している。Ｔ細胞は、多くの異なるサブセット、主にＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に分けられる。
【０００５】
マクロファージや樹状細胞などの抗原提示細胞(ＡＰＣ)は、免疫系の見張りとして働き、外来抗原に対して身体をスクリーニングする。細胞外の外来抗原がＡＰＣによって検出されたときに、これらの抗原はＡＰＣ内部に取り込まれ(飲み込まれ)、そこで、より小さいペプチドにプロセシングされるであろう。次いで、これらのペプチドは、ＡＰＣ表面の主要組織適合遺伝子複合体クラス  ＩＩ(ＭＨＣ  ＩＩ)分子上に提示され、そこで、ＣＤ４表面分子を発現する抗原特異的なＴリンパ球(ＣＤ４＋Ｔ細胞)によって認識されることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞が、追加の十分な共刺激性シグナルの存在下にＭＨＣ  ＩＩ分子上の抗原(これに該細胞が特異的である)を認識したときに、それらは活性化され、一連のサイトカインを分泌し、次いでこれが免疫系の他のアームを活性化する。通常、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原認識に続いてそれらがもたらす応答の種類に依存して、Ｔヘルパー１(Ｔｈ１)またはＴヘルパー２(Ｔｈ２)サブセットに分類される。ペプチド-ＭＨＣ  ＩＩ複合体を認識したときに、Ｔｈ１ ＣＤ４＋Ｔ細胞は、インターロイキンおよびサイトカイン(インターフェロンガンマなど)を分泌し、それによって、毒性化学物質(酸化窒素および反応性酸素／窒素種など)を放出するようにマクロファージを活性化する。また、ＩＬ-２およびＴＮＦ-αも、通常はＴｈ１サイトカインとして類別される。対照的に、Ｔｈ２ ＣＤ４＋Ｔ細胞は、インターロイキン(ＩＬ-４、ＩＬ-５またはＩＬ-１３など)を分泌するのが普通である。
【０００６】
ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞の他の機能には、抗体を産生および放出するようにＢ細胞を活性化するのを助けることが含まれる。また、これらは、抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞(ＣＤ４＋Ｔ細胞と並ぶ他の主要Ｔ細胞サブセットである)の活性化にも関与することができる。
【０００７】
ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ペプチドが、適当な共刺激性シグナルの存在下に主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ(ＭＨＣ  Ｉ)分子によって宿主細胞の表面に提示されたときに、該ペプチドを認識する(これに該細胞が特異的である)。ＭＨＣ  Ｉ分子上に提示されるためには、外来抗原は、ウイルスまたは細胞内細菌が宿主細胞に直接入り込むとき、またはＤＮＡワクチン接種後のように、細胞の内部(サイトゾルまたは核)に直接入ることを必要とする。細胞内部において、抗原は小さいペプチドにプロセシングされ、これがＭＨＣ  Ｉ分子上に積載され、これが細胞表面に再び向けられる。活性化したときに、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、一連のサイトカイン(インターフェロンガンマなど)を分泌し、これがマクロファージおよび他の細胞を活性化する。特に、これらＣＤ８＋ Ｔ細胞のサブセットは、活性化したときに溶解性および細胞毒性の分子(例えば、グランザイム、パーフォリン)を分泌する。このようなＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞毒性Ｔ細胞と称される。
【０００８】
より最近になって、ＭＨＣ  Ｉ複合体上への細胞外抗原またはそのフラグメントの積載に関与する抗原提示の別経路が記載され、「交差提示」と称されている。
【０００９】
また、Ｔ細胞応答の性質は、ワクチンにおいて使用されるアジュバントの組成によっても影響を受ける。例えば、ＭＰＬおよびＱＳ２１を含むアジュバントは、Ｔｈ１ ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化してＩＦＮ-γを分泌させることが示されている(Stewartら、Vaccine、2006年、24 (42-43)：6483-92)。
【００１０】
アジュバントは、タンパク質抗原に対する免疫応答を増強する際に価値を有することが周知であるが、ＤＮＡまたはＤＮＡに基づくベクターによるワクチン接種と同時に使用することは一般的ではなかった。何故アジュバントがＤＮＡ-ベクターに基づくワクチンと同時に使用されていなかったかについては、いくつかの仮説が存在する。実際のところ、アジュバントとベクターの間の干渉が、それらの安定性に影響を有することもある。さらに、アジュバントを弱毒化ベクターに加えると、そのような生成物によって誘導される反応源性を増大させることもあると予測する者もいる。最後に、ＤＮＡ-ベクターに基づくワクチンの免疫原性を増大させると、ベクターそれ自体に対する増強された中和性の免疫応答を導くことがあり、それによって、同一のベクターに基づくワクチンのその後の注射の強化効果を妨げることがある。実際に、熱帯熱マラリア（P. falciparum）感染に対する保護に向けられたワクチン接種プロトコールにおいて、Jonesら、J Infect Diseases、2001年、183、303-312は、ＤＮＡによるプライムに続いて強化組成物としてＤＮＡ、組換えタンパク質およびアジュバントを組合せた後の不都合な結果を報告している。実際のところ、寄生虫血症のレベルは、強化組成物がタンパク質およびアジュバントのみを含む群において有意に低かった。このプロトコールにおけるＤＮＡ、組換えタンパク質およびアジュバントの組合せの使用は、寄生虫血症ならびに抗体応答の結果に悪影響を及ぼしたと結論された。
【００１１】
他方において、アジュバント-ＤＮＡに基づくベクターワクチンの効力の増強が報告されている(Ganneら、Vaccine、1994年、12 (13)、1190-1196)。特に、油アジュバントの添加による複製欠損アデノウイルス-ベクターワクチンの効力増強が比較的高い抗体レベルと関係付けられたが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答に対する影響は報告されていない。
【００１２】
アジュバントとしての病原性ウイルスの使用が、国際公開第２００７／０１６７１５号パンフレットに開示されている。該ウイルスがいずれかの異種ポリヌクレオチドを含むこともできることは言及されていない。
【００１３】
一般に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の両方の刺激が、最適保護免疫のために、特に、ある種の疾患(ＨＩＶ感染／ＡＩＤＳなど)において必要であると考えられている。予防的または治療的のいずれかで最適免疫応答を誘導するためには、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の両方の刺激が望ましい。これが、「プライム・ブースト」ワクチン接種戦略の主な目的の１つであり、この際、タンパク質に基づくワクチン(主にＣＤ４＋ Ｔ細胞を誘導する)とＤＮＡ-ベクターに基づくワクチン、即ち、裸のＤＮＡ、ウイルスベクターまたは細胞内細菌ベクター、例えばリステリア(主にＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する)との交互投与またはその逆が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の両方を活性化する可能性が最も高い。
【００１４】
しかし、プライム・ブーストワクチン戦略は、一般に比較的大きいかまたは比較的バランスの取れた応答を生じることができるが、１回を超えて、およびほとんど２回を超えてワクチン接種する必要性は、特に、発展途上国のための大規模免疫付与プログラムにおいて、煩わしいかまたは実行不可能であることもある。
【００１５】
さらに、既に上記したように、ベクターそれ自体に対して惹起されることもある免疫のゆえに、ウイルスベクター成分を強化することができないことも多い。
【００１６】
従って、本発明の目的には、以下に挙げるものの１つまたはそれ以上が含まれる：
(ａ)ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞および／または抗体の産生を刺激し、特に、繰り返し免疫付与の必要性を除去または軽減する完全なワクチン接種プロトコールおよびワクチン組成物を提供すること；
(ｂ)免疫原性ポリペプチド単独またはポリヌクレオチド単独を含むワクチン組成物と比較して、あるいは、免疫原性ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの別々の投与を含む通常のプライム・ブーストプロトコールと比較して、ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋細胞および／または抗体の産生の刺激において、同等に良好であるかまたはより良好であるワクチン接種プロトコールおよびワクチン組成物を提供すること；
(ｃ)Ｔｈ１細胞応答を刺激するかまたはより良好に刺激するワクチン組成物を提供すること；
(ｄ)成分、特にウイルスベクターの必要用量が最少化されるワクチン組成物およびワクチン接種プロトコールを提供すること；および
(ｅ)より一般的に、病原体によって引き起こされる疾患の処置または防止に有用なワクチン組成物およびワクチン接種プロトコールを提供すること。
「より良好に刺激する」とは、応答の強さおよび／または持続性および／または広さが増強されることを意味する。
【発明の概要】
【００１７】
即ち、本発明によれば、病原体に対する免疫応答を惹起する方法であって、
(ｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド；
(ｉｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含んでなる１つまたはそれ以上のウイルスベクター；および
(ｉｉｉ)アジュバント
を投与することを含んでなり、この際、該１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド、該１つまたはそれ以上のウイルスベクター、および該アジュバントを同時投与する方法が提供される。
【００１８】
本発明の特定の態様によれば、
(ｉ)病原体に由来する１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド；
(ｉｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含んでなる１つまたはそれ以上のウイルスベクター；および
(ｉｉｉ)アジュバント
を含んでなるワクチン組成物が提供される。
【００１９】
また、
(ｉ)病原体に由来する１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド；
(ｉｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含んでなる１つまたはそれ以上のウイルスベクター；および
(ｉｉｉ)アジュバント
を含んでなる免疫原性組成物も提供される。
【００２０】
これらのワクチンおよび免疫原性組成物は、病原体特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞および／または抗体の産生を適切に刺激する。
【００２１】
「病原体特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞および／または抗体」とは、全病原体またはその一部(例えば、免疫原性サブユニット)を特異的に認識するＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞および／または抗体を意味する。「特異的に認識する」とは、ＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞および／または抗体が、非特異的な様式ではなく免疫特異的な様式で該病原体(またはその一部)を認識することを意味する。
【００２２】
また、哺乳動物において免疫応答を刺激する方法であって、哺乳動物に免疫学的有効量の上記組成物を投与することを含んでなる方法が提供される。
また、哺乳動物において免疫応答を刺激するための薬剤の製造における、上記組成物の使用が提供される。
また、哺乳動物において免疫応答を刺激するのに用いるための上記組成物が提供される。
【００２３】
また、哺乳動物において病原体特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞および／または抗体の産生を刺激する方法であって、該哺乳動物に、
(ｉ)病原体に由来する１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド；
(ｉｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含んでなる１つまたはそれ以上のウイルスベクター；および
(ｉｉｉ)アジュバント
を投与することを含んでなり、この際、該１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド、該１つまたはそれ以上のウイルスベクター、および該アジュバントを、例えば免疫学的有効量の上記組成物の投与によって同時投与する方法が提供される。
【００２４】
また、哺乳動物において病原体特異的なＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞および／または抗体の産生を刺激するための薬剤の製造における上記組成物の使用が提供される。
例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞または抗体の産生を刺激する。
【００２５】
適切には、ＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞および／または抗体の２つ、特に３つの産生を刺激する。
【００２６】
適切には、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の産生を刺激する。適切には、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の産生を刺激する。適切には、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞および抗体の産生を刺激する。
【００２７】
また適切には、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の産生を刺激する。適切には、ＣＤ４＋ Ｔ細胞および抗体の産生を刺激する。
【００２８】
また適切には、抗体の産生を刺激する。
【００２９】
本発明の方法は、免疫応答を惹起するための完全な方法にとって十分な工程を提供することを適切に意図する(所望により、この方法を繰り返すこともあるが)。従って適切には、本方法は、プライミング用量のいずれかの免疫原性ポリペプチドまたはいずれかの免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えば、ウイルスベクターなどのベクターの形態にある)の使用を含まない。
【００３０】
例えば、病原体に対する免疫応答を惹起する方法であって、
(ａ)(ｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド；(ｉｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含んでなる１つまたはそれ以上のウイルスベクター；および(ｉｉｉ)アジュバント、を投与し、この際、該１つまたはそれ以上の免疫原性ポリペプチド、該１つまたはそれ以上のウイルスベクター、および該アジュバントを同時投与し；そして
(ｂ)所望により(ａ)の工程を繰り返す、
ことからなる方法が提供される。
【００３１】
繰り返しによって改善された免疫応答が得られるときには、本方法を繰り返してもよい(例えば１回の繰り返し)。少なくともＴ細胞応答に関する限り、反復を全く必要とすることなく、十分な応答を得ることができる。
【００３２】
また、病原体に対する免疫応答を惹起する方法であって、
(ａ)(ｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド；(ｉｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含んでなる１つまたはそれ以上のウイルスベクター；および(ｉｉｉ)アジュバント、を投与することを含んでなり、この際、該１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド、該１つまたはそれ以上のウイルスベクター、および該アジュバントを同時投与し、かつ、いずれのプライミング用量の免疫原性ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与をも含まない方法が提供される。
【００３３】
また、本発明の方法において使用するためのキットであって、
(ｉ)病原体に由来する１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド；
(ｉｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含んでなる１つまたはそれ以上のウイルスベクター；および
(ｉｉｉ)アジュバント
を含んでなるキット、および特に、
(ｉ)病原体に由来する１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチドおよびアジュバント；および
(ｉｉ)該病原体に由来する１つまたはそれ以上の免疫原性ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含んでなる１つまたはそれ以上の第２のウイルスベクター
を含んでなるキットが提供される。
【００３４】
本発明の組成物および方法は、無経験の対象において病原体による感染を防止するのに、または以前に該病原体に暴露された対象において病原体による感染を防止するのに、または以前に病原体に感染した対象において再感染を防止するのに、または病原体に感染した対象を処置するのに有用であろう。
【００３５】
配列表のまとめ
【表１】
2012508160.tif 000002
【００３６】
上記した配列を、本発明の例示的側面において使用するためのポリペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして使用することができる。これらのポリペプチドは、上記配列からなるか、または上記配列を含んでなることができる。先頭のＭｅｔ残基は任意的である。Ｎ末端のＨｉｓ残基(配列番号１０におけるように、先頭のＭｅｔの直後のＨｉｓ残基を含む)は任意的であるか、または異なる長さのＮ末端Ｈｉｓタグを使用することができる(例えば、通常は６個までのＨｉｓ残基を用いて、該タンパク質の単離を容易にすることができる)。参照配列の全長にわたって大きな配列同一性、例えば８０％を超える、例えば９０％を超える、例えば９５％を超える、例えば９９％を超える配列同一性を有する類似タンパク質を、特に、該類似タンパク質が同様の機能を有するときに、および特に、該類似タンパク質が同様に免疫原性であるときに使用することができる。例えば２０個まで、例えば１０個まで、例えば１〜５個のアミノ酸置換(例えば保存性置換)を許容することができる。同一タンパク質または上記類似タンパク質をコードする上記核酸とは異なる核酸を使用することができる。配列同一性は、通常の手段によって、例えばＢＬＡＳＴを用いて決定することができる。挙げることができる配列番号１６の１つの特定の変異体においては、３９８位のＣｙｓがＳｅｒによって置換されている。
【発明の具体的説明】
【００３７】
本明細書中で使用する場合、用語「同時」は、１つまたはそれ以上の免疫原性ポリペプチド、１つまたはそれ以上のウイルスベクターおよびアジュバントを、１２時間以内に、例えば１時間以内に、通常は１回で投与することを意味する。これは、医療従事者への１回の訪問の最中であってよく、例えば、該１つまたはそれ以上の免疫原性ポリペプチド、該１つまたはそれ以上のウイルスベクターおよび該アジュバントを、同一訪問中に連続してまたは同時に投与する。
【００３８】
本明細書中で使用する場合、用語「エピトープ」は、免疫原性アミノ酸配列を指す。エピトープは、その天然の状況から取り出されたときに、例えば、異種ポリペプチド中に移植されたときに免疫原性である通常は６〜８個のアミノ酸からなる最小アミノ酸配列を指すこともある。また、エピトープは、タンパク質の免疫原性である部分を指すこともあり、この際、該エピトープを含むポリペプチドは、抗原(または、時には「ポリペプチド抗原」)と称される。ポリペプチドまたは抗原は、１つまたはそれ以上(例えば、２つまたは３つまたはそれ以上)の別個のエピトープを含むこともある。用語「エピトープ」は、Ｂ細胞およびＴ細胞エピトープを包含する。用語「Ｔ細胞エピトープ」は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ(時には、ＣＴＬエピトープとも称される)を包含する。
【００３９】
用語「免疫原性ポリペプチド」は、免疫原性であるポリペプチドを指す。即ち、それは、動物において免疫応答を誘導することができ、従って、１つまたはそれ以上のエピトープ(例えば、Ｔ細胞および／またはＢ細胞エピトープ)を含んでいる。免疫原性ポリペプチドは、１つまたはそれ以上のポリペプチド抗原を含むことができる。これらは、天然配置または非天然配置(例えば、融合タンパク質)であることができる。
通常、免疫原性ポリペプチドは、例えば、異種宿主(例えば、細菌宿主)、酵母または培養哺乳動物細胞における発現によって産生された組換えタンパク質であろう。
【００４０】
用語「病原体に由来するポリペプチド」は、病原体において天然に生じる配列またはそれに対して高度の配列同一性(少なくとも１０個、例えば少なくとも２０個のアミノ酸の範囲にわたって、例えば９５％を超える同一性)を保持する配列(即ち、抗原)を、部分的にまたは全体的に含むポリペプチドを意味する。
【００４１】
免疫原性ポリペプチドは、１つまたはそれ以上(例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ)のポリペプチド抗原を含むことができる。
本明細書中におけるポリペプチド、抗原、エピトープおよびポリヌクレオチドへの言及は、そのフラグメントまたは部分への言及を包含する。
他に特記することがなければ、「免疫応答」は、細胞性および／または体液性免疫応答であってよい。
【００４２】
本発明の１つの態様において、該１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチドの１つまたはそれ以上は、該１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドの１つまたはそれ以上と実質的に同一である。例えば、該少なくとも１つの第１の免疫原性ポリペプチドの１つおよび該少なくとも１つの第２の免疫原性ポリペプチドの１つは、１つまたは他の免疫原性ポリペプチドの長さにわたって、９０％またはそれ以上、例えば９５％またはそれ以上、例えば９８％またはそれ以上、あるいは例えば９９％またはそれ以上の全体的な配列同一性を有することができる。
【００４３】
本発明の別の態様において、該１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチドの１つまたはそれ以上は、該１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドの１つまたはそれ以上に含まれる抗原と実質的に同一である少なくとも１つの抗原を含んでいる。例えば、該少なくとも１つの第１の免疫原性ポリペプチドの１つおよび該少なくとも１つの第２の免疫原性ポリペプチドの１つは、２０個のアミノ酸またはそれ以上、例えば４０個のアミノ酸またはそれ以上、例えば６０個のアミノ酸またはそれ以上の範囲にわたって、９０％またはそれ以上、例えば９５％またはそれ以上、例えば９８％またはそれ以上、あるいは例えば９９％またはそれ以上の全体的な配列同一性を有することができる。
【００４４】
適切には、該１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチドは、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなる。
適切には、該１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドは、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなる。
適切には、該１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチドは、少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含んでなる。
適切には、該１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドは、少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含んでなる。
【００４５】
本発明の別の態様において、該１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチドの１つまたはそれ以上および該１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドの１つまたはそれ以上は、１つまたはそれ以上の同一のＢ細胞および／またはＴ細胞エピトープを共有する。適切には、これらは、長さが１０個のアミノ酸またはそれ以上、例えば１５個のアミノ酸またはそれ以上、例えば２５個のアミノ酸またはそれ以上である１つまたはそれ以上の同一のアミノ酸配列を供有する。
【００４６】
本発明の別の態様において、該１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチドの１つまたはそれ以上のいずれもが、該１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドの１つまたはそれ以上と実質的に同一ではないか、またはそれらと共通するいずれの抗原をも含んでいない。例えば、これらは、２０個のアミノ酸またはそれ以上、例えば４０個のアミノ酸またはそれ以上、例えば６０個のアミノ酸またはそれ以上の範囲にわたって、９０％未満の全体的な配列同一性を有することができる。
【００４７】
即ち、これらは、いずれのＢ細胞またはＴ細胞エピトープをも共有しないであろう。例えば、これらは、長さが１０個のアミノ酸またはそれ以上、例えば１５個のアミノ酸またはそれ以上、例えば２５個のアミノ酸またはそれ以上であるいずれの同一アミノ酸配列をも共有しないであろう。
【００４８】
本発明の１つの特定の態様において、第１の免疫原性ポリペプチドおよび第２の免疫原性ポリペプチドは、同一抗原を、同一配置でまたは異なる配置で含んでいる。「異なる配置」とは、これらを異なる順序で配置しうることおよび／またはこれらを分割しうること、例えば、抗原を分離し、別の抗原の両側に配置しうることを意味する。このような例においては、抗原を、その長さに沿って任意の点で分離することができる。本発明の別の特定の態様において、第１の免疫原性ポリペプチドおよび第２の免疫原性ポリペプチドは同一である。
【００４９】
本発明の組成物は、１つの第１の免疫原性ポリペプチドを、組成物中の唯一の免疫原性ポリペプチドとして含むことができる。また、本発明の組成物は、１つを超える第１の免疫原性ポリペプチド、例えば、２つまたは３つまたは４つまたはそれ以上の免疫原性ポリペプチドを含むことができる。
【００５０】
本発明の組成物は、１つのウイルスベクターを含んでなることができる。また、それは、１つを超えるウイルスベクター、例えば、２つまたはそれ以上のウイルスベクターを含んでなることができる。
【００５１】
本発明の組成物において、ウイルスベクターは、１つの第２の免疫原性ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含んでなるか、あるいは、１つを超える第２の免疫原性ポリペプチドを一緒にコードし、同一プロモーターまたは１つを超えるプロモーターの制御下にあってよい１つを超える異種ポリヌクレオチドを含んでなることができる。
【００５２】
予防的ワクチン接種のためだけでなく、本発明の組成物を、既に病原体に感染した個体においても使用することができ、確立された感染の改善された免疫学的制御または浄化を得ることができる。これは、病原体がＨＩＶであるときに特に重要である。ＨＩＶの場合、この制御は、ＨＩＶ感染細胞を特異的に認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞によって達成されると考えられる。このようなＣＤ８陽性Ｔ細胞応答は、ＨＩＶ特異的なＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞の存在によって維持される。従って、両種類の免疫応答の誘導が特に有用であり、これを、異なるワクチン組成物を組合せることによって達成することができる。アジュバント添加(adjuvanted)タンパク質と組換えウイルスの組合せが特に重要である。上記のワクチン接種によって利益を受けるであろうＨＩＶ感染患者は、ワクチン接種の時点でＨＩＶ感染の初感染、潜在相または末期相のいずれかにある。患者は、ワクチン接種の時点において、またはワクチン接種に近接する時点において、病原体に対する他の治療処置介入(ＨＩＶの場合には、例えば高活性の抗レトロウイルス治療)を受けていても受けていなくてもよい。
【００５３】
抗原
本発明に従って使用する抗原は、病原体から誘導される。病原体には、ヒトを含む動物に対して有害であるウイルス、細菌、原生動物および他の寄生生物が含まれる。
【００５４】
本発明によるポリペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして投与する適当なポリペプチド抗原には、以下のものに由来する抗原が含まれる：ＨＩＶ(例えば、ＨＩＶ-１)、ヒトヘルペスウイルス(例えば、ｇＨ、ｇＬ、ｇＭ、ｇＢ、ｇＣ、ｇＫ、ｇＥもしくはｇＤまたはこれらの誘導体、あるいは前初期タンパク質、例えば、ＨＳＶ１またはＨＳＶ２由来のＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３６)、サイトメガロウイルス、特にヒト(例えば、ｇＢまたはその誘導体)、エプスタイン・バーウイルス(例えば、ｇｐ３５０またはその誘導体)、水痘帯状疱疹ウイルス(例えば、ｇｐｌ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＥ６３)、あるいは肝炎ウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス(例えば、Ｂ型肝炎表面抗原、ＰｒｅＳ１、ＰｒｅＳ２および表面ｅｎｖタンパク質、Ｂ型肝炎コア抗原またはｐｏｌ)、Ｃ型肝炎ウイルス(例えば、コア、Ｅ１、Ｅ２、Ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＢ)およびＥ型肝炎ウイルス抗原、あるいは他のウイルス病原体、例えば、パラミクソウイルス：呼吸器合胞体ウイルス(例えば、ＦおよびＧタンパク質またはこれらの誘導体)、あるいはパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス(例えば、ＨＰＶ６、１１、１６、１８、例えば、Ｌ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７)、フラビウイルス(例えば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス)またはインフルエンザウイルス(例えば、ヘマグルチン、核タンパク質、ＮＡ、またはＭタンパク質、またはこれらの組合せ)、あるいは細菌病原体、例えば、ナイセリア(Neisseria)種、これは淋菌(N. gonorrhea)および髄膜菌(N. meningitides)(例えば、トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、ＰｉＩＣ、付着因子)を含む；化膿レンサ球菌(S. pyogenes)(例えば、Ｍタンパク質またはそのフラグメント、Ｃ５Ａプロテアーゼ)、Ｂ群溶連菌( S. agalactiae)、ミュータンス菌(S. mutans)；軟性下疳菌(H. ducreyi)；モラクセラ(Moraxella)種、これはカタル球菌(Branhamella catarrhalis)としても知られるカタル球菌(M. catarrhalis)(例えば、高および低分子量付着因子およびインバシン)を含む；ボルデテラ(Bordetella)種、これは百日咳菌(B. pertussis)(例えば、パータクチン、百日咳毒素またはその誘導体、糸状赤血球凝集素、アデニル酸シクラーゼ、フィムブリエ)、パラ百日咳菌(B. parapertussis)および気管支敗血症菌(B. bronchiseptica)を含む；ミコバクテリウム(Mycobacterium)種、これは結核菌(M. tuberculosis)、ウシ型結核菌(M. bovis)、らい菌(M. leprae)、ヨーネ菌(M. avium)、パラ結核菌(M. paratuberculosis)、スメグマ菌(M. smegmatis)を含む；レジオネラ(Legionella)種、これはレジオネラ属菌(L. pneumophila)を含む；エシェリキア(Escherichia)種、これは腸毒性大腸菌(例えば、定着因子、熱不安定性毒素またはその誘導体、熱安定性毒素またはその誘導体)、腸管出血性大腸菌、腸管病原性大腸菌(例えば、志賀毒素様の毒素またはその誘導体)を含む；ビブリオ(Vibrio)種、これはコレラ菌(V. cholera)(例えば、コレラ毒素またはその誘導体)を含む；シゲラ(Shigella)種、これは赤痢菌(S. sonnei)、志賀赤痢菌(S. dysenteriae)、フレクスナー赤痢菌(S. flexnerii)を含む；エルシニア(Yersinia)種、これは腸��エルシニア菌(Y. enterocolitica)(例えば、Ｙｏｐタンパク質)、ペスト菌(Y. pestis)、偽結核菌(Y. pseudotuberculosis)を含む；カンピロバクター(Campylobacter)種、これはカンピロバクター属細菌(C. jejuni)(例えば、毒素、付着因子およびインバシン)およびC. coliを含む；サルモネラ(Salmonella)種、これはチフス菌(S. typhi)、パラチフス菌(S. paratyphi)、ネズミチフス菌(S. choleraesuis)、ゲルトネル菌(S. enteritidis)を含む；リステリア(Listeria)種、これはリステリア菌(L. monocytogenes)を含む；ヘリコバクター(Helicobacter)種、これは潰瘍原因菌(H. pylori)(例えば、ウレアーゼ、カタラーゼ、空洞化毒素)を含む；シュードモナス(Pseudomonas)種、これは緑膿菌(P. aeruginosa)を含む；スタフィロコッカス(Staphylococcus)種、これは黄色ブドウ球菌(S. aureus)、表皮ブドウ球(S. epidermidis)を含む；エンテロコッカス(Enterococcus)種、これは腸球菌(E. faecalis)、フェシウム菌(E. faecium)を含む；クロストリジウム(Clostridium)種、これは破傷風菌(C. tetani)(例えば、破傷風毒素およびその誘導体)、ボツリヌス菌(C. botulinum)(例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体)、偽膜性腸炎菌(C. difficil)(例えば、クロストリジウム毒素ＡまたはＢおよびこれらの誘導体)を含む；バチルス(Bacillus)種、これは炭疽菌(B. anthracis)(例えば、炭疽毒素およびその誘導体)を含む；コリネバクテリウム(Corynebacterium)種、これはジフテリア菌(C. diphtheriae)(例えば、ジフテリア毒素およびその誘導体)を含む；ボレリア(Borrelia)種、これはライム病ボレリア(B. burgdorferi)(例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ)、ボレリアガリニ(B. garinii)(例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ)、ボレリアアフゼリ(B. afzelii)(例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ)、ボレリアアンダーソニー(B. andersonii)(例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ)、ボレリアヘルムシ(B. hermsii)を含む；エーリキア(Ehrlichia)種、これはウマエーリキア症原因菌(E. equi)およびヒト顆粒球エーリキア症の媒介物質を含む；リケッチア(Rickettsia)種、これは斑点熱リケッチア(R. rickettsii)を含む；クラミジア(Chlamydia)種、これはクラミジア・トラコマチス(C. trachomatis)、クラミジアニューモニエ(C. pneumoniae)、クラミジアシッタシ(C. psittaci)を含む；レプトスピラ(Leptospira)種、これはレプトスピラインタロガンス(L. interrogans)を含む；トレポネーマ(Treponema)種、これは梅毒トレポネーマ(T. pallidum)(例えば、希外膜タンパク質)、トレポネーマデンチコラ(T. denticola)、ブラキスピラヒオディセンテリエ(T. hyodysenteriae)を含む；あるいは寄生生物、例えば、プラスモジウム(Plasmodium)種、これは熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)および3日熱マラリア病原虫(P. vivax)を含む；トキソプラズマ(Toxoplasma)種、これはトキソプラズマ原虫(T. gondii)(例えば、ＳＡＧ２、ＳＡＧ３、Ｔｇ３４)を含む；エントアメーバ(Entamoeba)種、これは赤痢アメーバ(E. histolytica)を含む；バベシア(Babesia)種、これはバベシアミクロチ(B. microti)を含む；トリパノソーマ(Trypanosoma)種、これはクルーズトリパノソーマ(T. cruzi）を含む；ギアルジア(Giardia)種、これはジアルジア(G. lamblia)を含む；リーシュマニア(leishmania)種、これはL. majorを含む；ニューモシスティス(Pneumocystis)種、これはカリニ肺炎(P. carinii)を含む；トリコモナス(Trichomonas)種、これは膣トリコモナス(T. vaginalis)を含む；シゾストマ(Schisostoma)種、これはマンソン住血吸虫(S. mansoni)を含む；あるいは酵母、例えば、カンジダ(Candida)種、これはカンジダ菌(C. albicans)を含む；クリプトコッカス(Cryptococcus)種、これはクリプトコッカス-ネオフォルマンス(C. neoformans)を含む。
【００５５】
さらなる細菌性抗原には、ストレプトコッカス(Streptococcus)種（これは、S. pneumoniae(ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、ストレプトリジン、コリン結合タンパク質)を含む）に由来する抗原、およびタンパク質抗原 肺炎球菌溶血素(Biochem Biophys Acta、1989、67、1007；Rubinsら、Microbial Pathogenesis、25、337-342)、およびその突然変異解毒誘導体(国際公開第９０／０６９５１号；国際公開第９９／０３８８４号)が含まれる。他の細菌性抗原には、ヘモフィリス(Haemophilus)種に由来する抗原、Ｂ型のH. influenzae (例えば、ＰＲＰおよびそのコンジュゲート)、分類できないインフルエンザ菌(H. influenzae)に由来する抗原、例えば、ＯＭＰ２６、高分子量付着因子、Ｐ５、Ｐ６、プロテインＤおよびリポプロテインＤ、ならびにフィンブリンおよびフィンブリン由来ペプチド(米国特許第５８４３４６４号)またはその複数コピー変異体または融合タンパク質が含まれる。
【００５６】
特に、本発明の方法または組成物を用いて、ウイルス疾患、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)、または単純ヘルペスウイルスによって引き起こされる疾患；細菌性疾患、例えば、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）(ＴＢ)またはクラミジア(Chlamydia)種によって引き起こされる疾患；ならびに原生動物感染、例えばマラリア、から保護するか、またはこれらを処置することができる。
【００５７】
これらの特定の疾患状態、病原体および抗原は、例示の目的でのみ言及したものであり、本発明の範囲の限定を意図するものではないことを認識すべきである。
【００５８】
ＴＢ抗原
病原体は、例えば、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)であってよい。
結核菌(M. tuberculosis)由来の例示抗原は、例えば、α-クリスタリン(ＨｓｐＸ)、ＨＢＨＡ、Ｒｖ１７５３、Ｒｖ２３８６、Ｒｖ２７０７、Ｒｖ２５５７、Ｒｖ２５５８、ＲＰＦ：Ｒｖ０８３７ｃ、Ｒｖ１８８４ｃ、Ｒｖ２３８９ｃ、Ｒｖ２４５０、Ｒｖ１００９、ａｃｅＡ(Ｒｖ０４６７)、ＥＳＡＴ６、Ｔｂ３８-１、Ａｇ８５Ａ、-Ｂまたは-Ｃ、ＭＰＴ４４、ＭＰＴ５９、ＭＰＴ４５、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ６５、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７５、ＨＳＰ９０、ＰＰＤ １９ｋＤａ[Ｒｖ３７６３]、ＰＰＤ ３８ｋＤａ[Ｒｖ０９３４]、ＰｓｔＳ１、(Ｒｖ０９３２)、ＳｏｄＡ(Ｒｖ３８４６)、Ｒｖ２０３１ｃ １６ｋＤａ、Ｒａ１２、ＴｂＨ９、Ｒａ３５、Ｔｂ３８-１、Ｅｒｄ１４、ＤＰＶ、ＭＴＩ、ＭＳＬ、ＤＰＰＤ、ｍＴＣＣ１、ｍＴＣＣ２、ｈＴＣＣ１(国際公開第９９／５１７４８号)およびｈＴＣＣ２、特に、Ｍｔｂ３２ａ、Ｒａ３５、Ｒａ１２、ＤＰＶ、ＭＳＬ、ＭＴＩ、Ｔｂ３８-１、ｍＴＣＣ１、ＴｂＨ９(Ｍｔｂ３９ａ)、ｈＴＣＣ１、ｍＴＣＣ２およびＤＰＰＤである。また、結核菌(M. tuberculosis)由来の抗原には、結核菌(M. tuberculosis)の少なくとも２つまたは例えば３つのポリペプチドが、より大きいタンパク質に融合した融合タンパク質およびその変異体も含まれる。このような融合体は、Ｒａ１２-ＴｂＨ９-Ｒａ３５、Ｅｒｄ１４-ＤＰＶ-ＭＴＩ、ＤＰＶ-ＭＴＩ-ＭＳＬ、Ｅｒｄ１４-ＤＰＶ-ＭＴＩ-ＭＳＬ-ｍＴＣＣ２、Ｅｒｄ１４-ＤＰＶ-ＭＴＩ-ＭＳＬ、ＤＰＶ-ＭＴＩ-ＭＳＬ-ｍＴＣＣ２、ＴｂＨ９-ＤＰＶ-ＭＴＩ(国際公開第９９／５１７４８号)、Ｒａ１２-Ｔｂｈ９-Ｒａ３５-Ａｇ８５ＢおよびＲａ１２-Ｔｂｈ９-Ｒａ３５-ｍＴＣＣ２からなるか、またはこれらを含んでなることができる。挙げることができる特定のＲａ１２-Ｔｂｈ９-Ｒａ３５配列は、国際公開第２００６／１１７２４０号の配列番号６により、該配列のＳｅｒ ７０４がセリン以外(例えば、Ａｌａ)に突然変異した変異体、および適当な長さのＮ末端Ｈｉｓタグを導入したその誘導体(例えば、国際公開第２００６／１１７２４０号の配列番号２または４)とともに規定されている。また、所望による開始Ｍおよび所望によるＮ末端Ｈｉｓ-Ｈｉｓタグ(２および３位)を含む配列であり、野生型Ｓｅｒに対して突然変異したＡｌａが７０６位にある配列番号１０をも参照。
【００５９】
クラミジア(Chlamydia)抗原
病原体は、例えばクラミジア(Chlamydia)種、例えばトラコーマクラミジア(C. trachomatis)であってよい。
クラミジア(Chlamydia)種、例えばトラコーマクラミジア(C. trachomatis)由来の例示抗原は、ＣＴ８５８、ＣＴ０８９、ＣＴ８７５、ＭＯＭＰ、ＣＴ６２２、ＰｍｐＤ、ＰｍｐＧおよびこれらのフラグメント、ＳＷＩＢおよびこれらのいずれかの免疫原性フラグメント(例えば、ＰｍｐＤｐｄおよびＰｍｐＧｐｄ)およびこれらの組合せから選択される。抗原の好ましい組合せには、ＣＴ８５８、ＣＴ０８９およびＣＴ８７５が含まれる。使用しうる特定の配列および組合せは、国際公開第２００６／１０４８９０号に記載されている。
【００６０】
マラリア(Plasmodium)抗原
病原体は、例えばマラリアを引き起こす寄生生物、例えばマラリア(Plasmodium)種、例えば熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)または三日熱マラリア原虫(P. vivax)であってよい。
【００６１】
例えば、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)由来の抗原には、スポロゾイト周囲タンパク質(ＣＳタンパク質)、ＰｆＥＭＰ-１、Ｐｆｓ１６抗原、ＭＳＰ-１、ＭＳＰ-３、ＬＳＡ-１、ＬＳＡ-３、ＡＭＡ-１およびＴＲＡＰが含まれる。挙げることができる特定のハイブリッド抗原はＲＴＳである。ＲＴＳは、Ｂ型肝炎ウイルスの表面(Ｓ)抗原に、Ｂ型肝炎表面抗原のｐｒｅＳ２部分の４個のアミノ酸を介して結合した熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)のスポロゾイト周囲(ＣＳ)タンパク質の実質的に全てのＣ末端部分を含んでなるハイブリッドタンパク質である。酵母において発現されるときに、ＲＴＳはリポタンパク質粒子として産生され、ＨＢＶ由来のＳ抗原と同時発現されるときに、それはＲＴＳ,Ｓとして知られる混合粒子を産生する。ＲＴＳおよびＲＴＳ,Ｓの構造は、国際公開第９３／１０１５２号に開示されている。ＴＲＡＰ抗原は、国際公開第９０／０１４９６号に記載されている。他のマラリア(Plasmodium)抗原には、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)のＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、セクエストリン、Ｐｆ３３２、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７／２５、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０および他のマラリア(Plasmodium)種におけるこれらの類似体が含まれる。本発明の１つの態様は、ＲＴＳ,ＳまたはＣＳタンパク質またはこれらのフラグメント、例えば、ＲＴＳ,ＳのＣＳ部分を、１つまたはそれ以上のさらなるマラリア抗原(これは、例えば、ＭＳＰ-１、ＭＳＰ-３、ＡＭＡ-１、Ｐｆｓ１６、ＬＳＡ-１またはＬＳＡ-３からなる群から選択することができる)と組合せて含んでなる組成物である。P. vivax由来の可能な抗原には、スポロゾイト周囲タンパク質(ＣＳタンパク質)およびＤｕｆｆｙ抗原結合タンパク質およびこれらの免疫原性フラグメント、例えばＰｖＲＩＩが含まれる(例えば、国際公開第０２／１２２９２号を参照)。
【００６２】
即ち、本発明の１つの好適な態様において、第１および第２の免疫原性ポリペプチドは、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）および／または三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）由来の抗原から選択される。
例えば、第１および／または第２の免疫原性ポリペプチドは、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）および／または三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）由来の抗原から選択され、また、ＲＴＳ(例えば、ＲＴＳ,Ｓとして)、スポロゾイト周囲(ＣＳ)タンパク質、ＭＳＰ-１、ＭＳＰ-３、ＡＭＡ-１、ＬＳＡ-１、ＬＳＡ-３およびこれらの免疫原性誘導体またはこれらの免疫原性フラグメントから選択される。
【００６３】
挙げることができる１つの特定の誘導体は、ＲＴＳとして知られるハイブリッドタンパク質、特に、ＲＴＳ,Ｓとして知られる混合粒子の形態で供されるときのものである。
例示のＲＴＳ配列を、配列番号１４に示す。
【００６４】
例示のP. falciparum ＣＳタンパク質由来抗原を、配列番号１２に示す。この特定の配列は、P. falciparum(３Ｄ７株)のＣＳＰ配列に対応し、これは、７Ｇ８株由来の１９ａａ挿入(８１〜１００)をも含んでいる。
【００６５】
本発明の１つの特定の態様において、第１の免疫原性ポリペプチドはＲＴＳ,Ｓであり、第２の免疫原性ポリペプチドは、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）由来のＣＳタンパク質またはその免疫原性フラグメントである。
【００６６】
ＨＰＶ抗原
病原体は、例えば、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)であってよい。
即ち、本発明において使用する抗原は、例えば、陰部疣贅の原因であると考えられているヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ６またはＨＰＶ１１など)および／または子宮頸癌の原因であると考えられているＨＰＶウイルス(ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５２など)に由来していてよい。１つの態様において、陰部疣贅の予防または治療組成物の形態は、Ｌ１粒子またはカプソマー、および融合タンパク質(ＨＰＶタンパク質Ｅ１、Ｅ２、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、およびＬ２から選択される１つまたはそれ以上の抗原を含む)を含んでなる。１つの態様において、融合タンパク質の形態は、国際公開第９６／２６２７７号に開示されているＬ２Ｅ７、および国際出願ＰＣＴ／ＥＰ９８／０５２８５に開示されているプロテインＤ(１／３)-Ｅ７である。
【００６７】
好ましいＨＰＶ子宮頸感染または癌の予防または治療組成物は、ＨＰＶ１６または１８抗原を含んでなることができる。例えば、Ｌ１またはＬ２抗原モノマー、あるいはウイルス様粒子(ＶＬＰ)として一緒に供されるＬ１またはＬ２抗原、あるいはＶＬＰまたはカプソマー構造において単独で供されるＬ１タンパク質である。このような抗原、ウイルス様粒子およびカプソマーは自体既知である。例えば、国際公開第９４／００１５２号、国際公開第９４／２０１３７号、国際公開第９４／０５７９２号、および国際公開第９３／０２１８４号を参照。追加の初期タンパク質が、単独でまたは融合タンパク質として含まれていてもよく(例えば、Ｅ７、Ｅ２、または好ましくはＥ５など)、本発明の特に好ましい態様は、Ｌ１Ｅ７融合タンパク質(国際公開第９６／１１２７２号)を含んでなるＶＬＰを含んでいる。１つの態様において、ＨＰＶ１６抗原は、初期タンパク質Ｅ６またはＥ７をプロテインＤ担体と融合して含んでなり、ＨＰＶ１６由来のプロテインＤ-Ｅ６またはＥ７融合、またはその組合せを形成する；あるいはＥ６またはＥ７とＬ２との組合せ(国際公開第９６／２６２７７号)を形成する。また、ＨＰＶ１６または１８初期タンパク質Ｅ６およびＥ７は、単一分子、好ましくはプロテインＤ-Ｅ６／Ｅ７融合において存在することができる。このような組成物は、所望により、ＨＰＶ１８由来のＥ６およびＥ７タンパク質の一方または両方を、好ましくはプロテインＤ-Ｅ６またはプロテインＤ-Ｅ７融合タンパク質またはプロテインＤ-Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質の形態で供することができる。さらに、他のＨＰＶ株由来の抗原、好ましくはＨＰＶ３１または３３株由来の抗原を使用することができる。
【００６８】
ＨＩＶ抗原
病原体は、例えばＨＩＶ、例えばＨＩＶ-１であってよい。
即ち、抗原を、ＨＩＶ由来抗原、特にＨＩＶ-１由来抗原から選択することができる。
ＨＩＶのＴａｔおよびＮｅｆタンパク質が初期タンパク質である。即ち、これらは、感染の初期に、および構造タンパク質の不存在下で発現される。
【００６９】
Ｎｅｆ遺伝子は、いくつかの活性を保持することが示された初期付属ＨＩＶタンパク質をコードする。例えば、Ｎｅｆタンパク質は、細胞表面からのＣＤ４(即ち、ＨＩＶ受容体)の除去を引き起こすことが知られているが、この機能の生物学的重要性は議論されている。また、Ｎｅｆは、Ｔ細胞のシグナル経路と相互作用し、活性状態を誘導し、次いでこれがより効率的な遺伝子発現を促進することができる。一部のＨＩＶ単離体は、この領域において突然変異または欠失を有しており、これが機能的タンパク質をコードしないことをもたらし、インビボにおけるその複製および発症が大きく損なわれる。
【００７０】
Ｇａｇ遺伝子は、完全長ＲＮＡから翻訳されて前駆体ポリタンパク質を与え、次いでこれが３〜５個のカプシドタンパク質；マトリックスタンパク質ｐ１７、カプシドタンパク質ｐ２４および核酸結合タンパク質に切断される(Fundamental Virology、Fields BN、Knipe DMおよびHowley M、1996 2、Fields Virology、vol 2、1996)。
【００７１】
Ｇａｇ遺伝子は、スプライスされていないウイルスｍＲＮＡから発現される５５キロダルトン(Ｋｄ)Ｇａｇ前駆体タンパク質(ｐ５５とも称される)を生じさせる。翻訳中に、ｐ５５のＮ末端はミリストイル化され、それと細胞膜の細胞質側との結合の引き金となる。この膜結合したＧａｇポリタンパク質は、ウイルスゲノムＲＮＡの２つのコピーを、感染細胞表面からのウイルス粒子の出芽の引き金となる他のウイルスおよび細胞タンパク質とともに補充する。出芽の後、ｐ５５は、ウイルスによりコードされたプロテアーゼ(Ｐｏｌ遺伝子の産物)によって、ウイルス成熟の過程中に、ＭＡ(マトリックス[ｐ１７])、ＣＡ(カプシド[ｐ２４])、ＮＣ(ヌクレオカプシド[ｐ９])、およびｐ６と称される４つの比較的小さいタンパク質に切断される。
【００７２】
３つの主要Ｇａｇタンパク質(ｐ１７、ｐ２４およびｐ９)に加えて、全てのＧａｇ前駆体は、いくつかの他の領域を含んでおり、これらは切断され、様々なサイズのペプチドとしてビリオン中に残存する。これらのタンパク質は異なる役割を有しており、例えば、ｐ２タンパク質は、プロテアーゼ活性の調節において提案された役割を有し、タンパク質分解プロセシングの正しいタイミングに寄与する。
【００７３】
ＭＡポリペプチドは、ｐ５５のＮ末端ミリストイル化末端に由来する。大部分のＭＡ分子は、ビリオン脂質二重層の内側表面に結合して残存し、該粒子を安定化する。ＭＡのサブセットは、ビリオンの比較的深い層の内部に補充され、そこで、ウイルスＤＮＡを核に送り届ける複合体の一部になる。これらのＭＡ分子は、ＭＡ上の核親和性シグナルが細胞の核輸入装置によって認識されるので、ウイルスゲノムの核輸送を容易にする。この現象は、ＨＩＶが非分裂細胞に感染することを可能にする(これはレトロウイルスにとっては異常な性質である)。
【００７４】
ｐ２４(ＣＡ)タンパク質は、ウイルス粒子の円錐コアを形成する。シクロフィリンＡは、ｐ５５のｐ２４領域と相互作用して、ＨＩＶ粒子へのその導入を導くことが示されている。ＧａｇとシクロフィリンＡの間の相互作用は必須であるが、これは、シクロスポリンによるこの相互作用の破壊がウイルス複製を阻害するためである。
【００７５】
ＧａｇのＮＣ領域は、いわゆるＨＩＶのパッケージシグナルを特異的に認識するのに関与する。このパッケージシグナルは、ウイルスＲＮＡの５'末端近くに位置する４つのステムループ構造からなり、ＨＩＶ-１ビリオンへの異種ＲＮＡの導入を媒介するのに十分である。ＮＣは、２つの亜鉛フィンガーモチーフによって媒介される相互作用により、パッケージシグナルに結合する。また、ＮＣは逆転写を容易にする。
【００７６】
ｐ６ポリペプチド領域は、ｐ５５ Ｇａｇと付属タンパク質Ｖｐｒの間の相互作用を媒介し、組立て中のビリオンへのＶｐｒの導入を導く。また、ｐ６領域は、感染細胞からの出芽ビリオンの効率的な放出に必要ないわゆる後期ドメインをも含んでいる。
【００７７】
Ｐｏｌ遺伝子は、初期感染においてウイルスによって必要とされる活性を有する３つのタンパク質、逆転写酵素ＲＴ、プロテアーゼ、および細胞ＤＮＡへのウイルスＤＮＡの組込みに必要なインテグラーゼタンパク質をコードする。Ｐｏｌの一次産物は、ビリオンプロテアーゼによって切断されて、ＤＮＡ合成に必要な活性を含むアミノ末端ＲＴペプチド(ＲＮＡおよびＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ)およびカルボキシ末端インテグラーゼタンパク質を生じる。ＨＩＶ ＲＴは、完全長ＲＴ(ｐ６６)および切断産物(ｐ５１)のヘテロダイマーであり、カルボキシ末端ＲＮアーゼＨドメインを欠いている。
【００７８】
ＲＴは、レトロウイルスゲノムによってコードされている最も高度に保存されたタンパク質の１つである。ＲＴの２つの主要な活性は、ＤＮＡ ＰｏｌおよびリボヌクレアーゼＨ活性である。ＲＴのＤＮＡ Ｐｏｌ活性は、ＲＮＡおよびＤＮＡを鋳型として交換可能に使用し、既知の全てのＤＮＡポリメラーゼと同様、ＤＮＡ合成を初めから開始することができず、プライマーとして働く既存の分子(ＲＮＡ)を必要とする。
【００７９】
全てのＲＴタンパク質に固有のＲＮアーゼＨ活性は、ＤＮＡ合成が進行するにつれてＲＮＡゲノムを除去する複製の初期において必須の役割を果たす。それは、全てのＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッド分子からＲＮＡを選択的に分解する。構造的に、ポリメラーゼおよびリボＨは、Ｐｏｌ内の別々の重なり合わないドメインを占め、Ｐｏｌのアミノの３分の２に及ぶ。
【００８０】
ｐ６６触媒サブユニットは、５つの別個のサブドメインに折り畳まれている。これらのアミノ末端の２３はＲＴ活性を有する部分を有する。これらのカルボキシ末端はＲＮアーゼＨドメインである。
【００８１】
宿主細胞の感染後に、レトロウイルスＲＮＡゲノムは、感染粒子中に存在する逆転写酵素によって線状二本鎖ＤＮＡにコピーされる。インテグラーゼ(Skalka AM '99 Adv in Virus Res 52 271-273に概説されている)は、ウイルスＤＮＡの末端を認識し、該末端を整え、該ウイルスＤＮＡを宿主染色体部位まで送り届けて、組込みを触媒する。宿主ＤＮＡ中の多くの部位が、組込みのための標的となりうる。インテグラーゼはインビトロで組込みを触媒するのに十分であるが、インビボでウイルスＤＮＡに随伴する唯一のタンパク質ではない：感染細胞から単離された大きいタンパク質-ウイルスＤＮＡ複合体がプレ組込み複合体と称されている。これは、子孫ウイルスゲノムによる宿主細胞遺伝子の獲得を容易にする。
【００８２】
インテグラーゼは、３つの別個のドメイン、即ち、Ｎ末端ドメイン、触媒コアおよびＣ末端ドメインから構成される。この触媒コアドメインは、ポリヌクレオチジル移動の化学のために必要なものの全てを含んでいる。
【００８３】
即ち、本発明において使用するためのＨＩＶ-１由来抗原は、例えば、Ｇａｇ(例えば、完全長Ｇａｇ)、ｐ１７(Ｇａｇの一部)、ｐ２４(Ｇａｇの別の一部)、ｐ４１、ｐ４０、Ｐｏｌ(例えば、完全長Ｐｏｌ)、ＲＴ(Ｐｏｌの一部)、ｐ５１(ＲＴの一部)、インテグラーゼ(Ｐｏｌの一部)、プロテアーゼ(Ｐｏｌの一部)、Ｅｎｖ、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０またはｇｐ１６０、ｇｐ４１、Ｎｅｆ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、Ｔａｔおよびこれらの免疫原性誘導体およびこれらの免疫原性フラグメント、特に、Ｅｎｖ、Ｇａｇ、ＮｅｆおよびＰｏｌおよびこれらの免疫原性誘導体およびこれらの免疫原性フラグメント(ｐ１７、ｐ２４、ＲＴおよびインテグラーゼを含む)から選択することができる。ＨＩＶワクチンは、複数の異なるＨＩＶ抗原、例えば、２つまたは３つまたは４つまたはそれ以上のＨＩＶ抗原(これらを上記リストから選択することができる)に対応するポリペプチドおよび／またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなることができる。いくつかの異なる抗原を、例えば、単一の融合タンパク質に含ませることができる。それぞれがＨＩＶ抗原であるか、または１つを超える抗原の融合体である１つを超える第１の免疫原性ポリペプチドおよび／または１つを超える第２の免疫原性ポリペプチドを使用することができる。
【００８４】
例えば、抗原は、ＲＴまたはその免疫原性誘導体もしくは免疫原性フラグメントに融合した、Ｎｅｆまたはその免疫原性誘導体もしくは免疫原性フラグメントに融合した、Ｇａｇまたはその免疫原性誘導体もしくは免疫原性フラグメントを含んでなることができる(この融合タンパク質のＧａｇ部分は、ポリペプチドの５'末端に存在する)。
【００８５】
本発明に従って使用するＧａｇ配列は、Ｇａｇ ｐ６ポリペプチドをコードする配列を除外していてよい。本発明において使用するためのＧａｇ配列の特定の例は、ｐ１７および／またはｐ２４をコードする配列を含んでなる。
【００８６】
ＲＴ配列は、あらゆる逆転写酵素活性を実質的に不活性化するために突然変異を含んでいてもよい(国際公開第０３／０２５００３号を参照)。
【００８７】
ＲＴ遺伝子は、ＨＩＶゲノム中の比較的大きいｐｏｌ遺伝子の成分である。本発明に従って使用するＲＴ配列が、Ｐｏｌまたは少なくともＲＴに対応するＰｏｌのフラグメントとの関連で存在しうることは理解されるであろう。このようなＰｏｌのフラグメントは、Ｐｏｌの主要ＣＴＬエピトープを保持している。１つの特定の例において、ＲＴは、ＲＴのまさにｐ５１またはまさにｐ６６フラグメントとして含まれている。
【００８８】
本発明による融合タンパク質または組成物のＲＴ成分は、所望により、原核発現系において内部開始部位として働く部位を除去するための突然変異を含んでなる。
【００８９】
所望により、本発明において使用するためのＮｅｆ配列は、Ｎ末端領域をコードする配列を除去するために先端切除(truncated)されている。即ち、３０〜８５のアミノ酸、例えば６０〜８５のアミノ酸、特にＮ末端の６５アミノ酸が除去されている(後者の先端切除を、本明細書中ではｔｒＮｅｆと称する)。別法としてまたは追加的に、Ｎｅｆを修飾してミリスチル化部位を除去することができる。例えば、Ｇｌｙ２ミリスチル化部位を、欠失または置換によって除去することができる。別法としてまたは追加的に、Ｌｅｕ１７４およびＬｅｕ１７５のジロイシンモチーフを、一方または両方のロイシンの欠失または置換によって変化させるように、Ｎｅｆを修飾することができる。ＣＤ４下方調節におけるジロイシンモチーフの重要性は、例えば、Bresnahan P.Aら、(1998)、Current Biology、8(22)：1235-8に記載されている。
【００９０】
Ｅｎｖ抗原は、ｇｐ１６０としてその完全長で、あるいはｇｐ１４０またはそれより短いものとして先端切除されて存在することができる(所望により、ｇｐ１２０とｇｐ４１の間の切断部位モチーフを破壊するための適当な突然変異を有する)。また、Ｅｎｖ抗原は、その天然のプロセシング形態で、ｇｐ１２０およびｇｐ４１として存在することもできる。ｇｐ１６０のこれら２つの誘導体を、個々にまたは組合せて一緒に使用することができる。さらに、上記したＥｎｖ抗原は、欠失(特に、可変ループの欠失)および先端切除を提示することができる。Ｅｎｖのフラグメントを同様に使用することができる。
【００９１】
例示のｇｐ１２０配列を配列番号８に示す。例示のｇｐ１４０配列を配列番号６に示す。
【００９２】
本発明による免疫原性ポリペプチドは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、ＥｎｖおよびＮｅｆを含んでなることができ、この際、これら天然抗原のＣＴＬエピトープの少なくとも７５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、例えば９６％が存在する。
【００９３】
上で定義したｐ１７／ｐ２４  Ｇａｇ、ｐ６６  ＲＴ、および先端切除Ｎｅｆを含んでなる本発明による免疫原性ポリペプチドにおいては、天然のＧａｇ、ＰｏｌおよびＮｅｆ抗原のＣＴＬエピトープの９６％が適切に存在する。
【００９４】
本発明の１つの態様は、ｐ１７,ｐ２４Ｇａｇ、ｐ６６ＲＴ、先端切除Ｎｅｆ(末端アミノ酸１〜８５をコードするヌクレオチドを欠く：「ｔｒＮｅｆ」)を、Ｇａｇ、ＲＴ、Ｎｅｆの順序で含む免疫原性ポリペプチドを供する。本発明の免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいて、適切には、Ｐ２４ＧａｇおよびＰ６６ＲＴはコドン最適化されている。
【００９５】
本発明による特定のポリヌクレオチド構築物および対応するポリペプチド抗原には、以下のものが含まれる：
１．ｐ１７,ｐ２４(コドン最適化)Ｇａｇ−ｐ６６  ＲＴ(コドン最適化)−先端切除Ｎｅｆ；
２．先端切除Ｎｅｆ−ｐ６６  ＲＴ(コドン最適化)−ｐ１７,ｐ２４(コドン最適化)Ｇａｇ；
３．先端切除Ｎｅｆ−ｐ１７,ｐ２４(コドン最適化)Ｇａｇ−ｐ６６  ＲＴ(コドン最適化)；
４．ｐ６６  ＲＴ(コドン最適化)−ｐ１７,ｐ２４(コドン最適化)Ｇａｇ−先端切除Ｎｅｆ；
５．ｐ６６  ＲＴ(コドン最適化)−先端切除Ｎｅｆ−ｐ１７,ｐ２４(コドン最適化)Ｇａｇ；
６．ｐ１７,ｐ２４(コドン最適化)Ｇａｇ−先端切除Ｎｅｆ−ｐ６６  ＲＴ(コドン最適化)。
【００９６】
例示の融合体は、Ｇａｇ、ＲＴおよびＮｅｆの融合体、特に、Ｇａｇ-ＲＴ-Ｎｅｆの順序の融合体である(例えば、配列番号２を参照)。別の例示融合体は、ｐ１７、ｐ２４、ＲＴおよびＮｅｆの融合体、特に、ｐ２４-ＲＴ-Ｎｅｆ-ｐ１７の順序の融合体である(例えば、配列番号１６を参照；本明細書中の他の場所では「Ｆ４」と称する)。
【００９７】
別の態様において、免疫原性ポリペプチドは、Ｇａｇ、ＲＴ、インテグラーゼおよびＮｅｆを、特に、Ｇａｇ-ＲＴ-インテグラーゼ-Ｎｅｆの順序で含んでいる(例えば、配列番号４を参照)。
【００９８】
他の態様において、ＨＩＶ抗原は、Ｎｅｆまたはその免疫原性誘導体もしくはその免疫原性フラグメント、並びにｐ１７  Ｇａｇおよび／もしくはｐ２４  Ｇａｇまたはその免疫原性誘導体もしくはその免疫原性フラグメントを含んでなる融合ポリペプチドであることができ、この際、ｐ１７およびｐ２４  Ｇａｇの両方が存在するときには、それらの間に少なくとも１つのＨＩＶ抗原または免疫原性フラグメントが存在する。
【００９９】
例えば、Ｎｅｆは、適切には完全長Ｎｅｆである。
例えば、ｐ１７  Ｇａｇおよびｐ２４  Ｇａｇは、適切にはそれぞれ完全長のｐ１７およびｐ２４である。
【０１００】
１つの態様において、免疫原性ポリペプチドは、両方のｐ１７およびｐ２４Ｇａｇまたはこれらの免疫原性フラグメントを含んでなる。このような構築物において、ｐ２４Ｇａｇ成分およびｐ１７Ｇａｇ成分は、少なくとも１つのさらなるＨＩＶ抗原または免疫原性フラグメント、例えば、Ｎｅｆおよび／またはＲＴあるいはこれらの免疫原性誘導体またはこれらの免疫原性フラグメントによって分離されている。さらなる詳細については、国際公開第２００６／０１３１０６号を参照。
【０１０１】
ｐ２４およびＲＴを含んでなる融合タンパク質において、ｐ２４は、構築物においてＲＴの前にあるのが好ましいこともあるが、これは、これらの抗原が大腸菌において単独で発現されるときに、ＲＴの発現よりも良好なｐ２４の発現が観察されるためである。
【０１０２】
本発明によるいくつかの構築物には、以下のものが含まれる：
１．ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７
２．ｐ２４−ＲＴ*−Ｎｅｆ−ｐ１７
３．ｐ２４−ｐ５１ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７
４．ｐ２４−ｐ５１ＲＴ*−Ｎｅｆ−ｐ１７
５．ｐ１７−ｐ５１ＲＴ−Ｎｅｆ
６．ｐ１７−ｐ５１ＲＴ*−Ｎｅｆ
７．Ｎｅｆ−ｐ１７
８．Ｎｅｆ−ｐ１７(リンカーを有する)
９．ｐ１７−Ｎｅｆ
１０．ｐ１７−Ｎｅｆ(リンカーを有する)
*は、ＲＴメチオニン５９２のリジンへの突然変異を示す。
【０１０３】
別の側面において、本発明は、少なくとも４つのＨＩＶ抗原または免疫原性フラグメントを含んでなるＨＩＶ抗原の融合タンパク質であって、該４つの抗原またはフラグメントがＮｅｆ、ＰｏｌおよびＧａｇであるか、またはこれらに由来する融合タンパク質を提供する。好ましくは、Ｇａｇは、融合体において少なくとも１つの他の抗原によって分離された２つの分離した成分として存在する。好ましくは、Ｎｅｆは完全長Ｎｅｆである。好ましくは、Ｐｏｌはｐ６６またはｐ５１ＲＴである。好ましくは、Ｇａｇはｐ１７およびｐ２４Ｇａｇである。本発明のこの側面における融合体の抗原成分の他の好ましい特徴および性質は、本明細書中に記載した通りである。
【０１０４】
本発明のこの側面の好ましい態様は、既に上で挙げた４成分融合体である：
１．ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７
２．ｐ２４−ＲＴ*−Ｎｅｆ−ｐ１７
３．ｐ２４−ｐ５１ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７
４．ｐ２４−ｐ５１ＲＴ*−Ｎｅｆ−ｐ１７
【０１０５】
本発明の免疫原性ポリペプチドは、Ｇａｇ、ＲＴおよびＮｅｆなどの特定の抗原に対応する配列の間に存在するリンカー配列を有することができる。このようなリンカー配列は、例えば、長さが２０個までのアミノ酸であってよい。特定の例において、これらは、１〜１０個のアミノ酸、または１〜６個のアミノ酸、例えば４〜６個のアミノ酸であってよい。
【０１０６】
このような好適なＨＩＶ抗原のさらなる記載を、国際公開第０３／０２５００３号に見ることができる。
【０１０７】
本発明のＨＩＶ抗原は、任意のＨＩＶ分岐群、例えば、分岐群Ａ、分岐群Ｂまたは分岐群Ｃから得ることができる。例えば、ＨＩＶ抗原は、分岐群ＡまたはＢ、特にＢから得ることができる。
【０１０８】
本発明の１つの特定の態様において、第１の免疫原性ポリペプチドは、Ｇａｇおよび／もしくはＰｏｌおよび／もしくはＮｅｆまたはこれらのいずれかのフラグメントもしくは誘導体を含んでなるポリペプチドである(例えば、ｐ２４-ＲＴ-Ｎｅｆ-ｐ１７)。本発明の１つの特定の態様において、第２の免疫原性ポリペプチドは、Ｇａｇおよび／もしくはＰｏｌおよび／もしくはＮｅｆまたはこれらのいずれかのフラグメントもしくは誘導体を含んでなるポリペプチドである(例えば、Ｇａｇ-ＲＴ-ＮｅｆまたはＧａｇ-ＲＴ-インテグラーゼ-Ｎｅｆ)。
【０１０９】
即ち、１つの特定の態様において、Ｇａｇおよび／もしくはＰｏｌおよび／もしくはＮｅｆまたはこれらのいずれかのフラグメントもしくは誘導体を含んでなるポリペプチド(例えば、ｐ２４-ＲＴ-Ｎｅｆ-ｐ１７)が第１の免疫原性ポリペプチドであり、Ｇａｇおよび／もしくはＰｏｌおよび／もしくはＮｅｆまたはこれらのいずれかのフラグメントまたは誘導体を含んでなるポリペプチド(例えば、Ｇａｇ-ＲＴ-ＮｅｆまたはＧａｇ-ＲＴ-インテグラーゼ-Ｎｅｆ)が第２の免疫原性ポリペプチドである。
【０１１０】
本発明の別の特定の態様において、第１の免疫原性ポリペプチドは、Ｅｎｖまたはそのフラグメントもしくは誘導体、例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０またはｇｐ１６０(特にｇｐ１２０)である。本発明の１つの特定の態様において、第２の免疫原性ポリペプチドは、Ｇａｇおよび／もしくはＰｏｌおよび／もしくはＮｅｆまたはこれらのいずれかのフラグメントもしくは誘導体を含んでなるポリペプチド(例えば、ｐ２４-ＲＴ-Ｎｅｆ-ｐ１７)である。
【０１１１】
即ち、１つの特定の態様において、Ｅｎｖまたはそのフラグメントもしくは誘導体、例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０もしくはｇｐ１６０(特にｇｐ１２０)が第１の免疫原性ポリペプチドであり、Ｇａｇおよび／もしくはＰｏｌおよび／もしくはＮｅｆまたはこれらのいずれかのフラグメントもしくは誘導体を含んでなるポリペプチド(例えば、ｐ２４-ＲＴ-Ｎｅｆ-ｐ１７)が第２の免疫原性ポリペプチドである。
【０１１２】
本発明の別の特定の態様において、第１の免疫原性ポリペプチドは、Ｇａｇおよび／もしくはＰｏｌおよび／もしくはＮｅｆまたはこれらのいずれかのフラグメントまたは誘導体を含んでなるポリペプチド(例えば、ｐ２４-ＲＴ-Ｎｅｆ-ｐ１７)である。本発明の１つの特定の態様において、第２の免疫原性ポリペプチドは、Ｅｎｖまたはそのフラグメントもしくは誘導体、例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０またはｇｐ１６０(特にｇｐ１２０)である。
【０１１３】
即ち、１つの特定の態様において、Ｇａｇおよび／もしくはＰｏｌおよび／もしくはＮｅｆまたはこれらのいずれかのフラグメントもしくは誘導体を含んでなるポリペプチド(例えば、ｐ２４-ＲＴ-Ｎｅｆ-ｐ１７)が第１の免疫原性ポリペプチドであり、Ｅｎｖまたはそのフラグメントもしくは誘導体、例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０またはｇｐ１６０(特にｇｐ１２０)が第２の免疫原性ポリペプチドである。
【０１１４】
抗原の免疫原性誘導体および免疫原性フラグメント
上記した抗原を、全抗原よりむしろその免疫原性誘導体または免疫原性フラグメントの形態で使用することができる。
【０１１５】
本明細書中で使用する場合、天然起源の抗原に関連する用語「免疫原性誘導体」は、その天然の対応物に対して限定された様式で修飾されていることもある抗原を指す。それは、例えば、原核生物系における発現の改善によって、または望ましくない活性(例えば、酵素活性)の除去によって、タンパク質の特性を変えうる点突然変異を含むことができる。しかし、免疫原性誘導体は、天然抗原に十分に似ており、従って、その抗原特性を保持し、天然抗原に対する免疫応答を惹起することができる。所与の誘導体がこのような免疫応答を惹起するか否かを、ＥＬＩＳＡなどの適当な免疫学的アッセイ(抗体応答に対して)または細胞マーカーのための適当な染色を用いるフローサイトメトリー(細胞応答に対して)によって測定することができる。
【０１１６】
免疫原性フラグメントは、少なくとも１つのエピトープ、例えばＣＴＬエピトープ、通常は少なくとも８個のアミノ酸のペプチドをコードするフラグメントである。長さが少なくとも８個、例えば８〜１０個のアミノ酸あるいは２０、５０、６０、７０、１００、１５０または２００個までのアミノ酸のフラグメントが、このポリペプチドが抗原性を示す限り、即ち、主要エピトープ(例えばＣＴＬエピトープ)がこのポリペプチドによって保持されている限り、本発明の範囲内にあると考えられる。
【０１１７】
ウイルスベクター
本発明のウイルスベクターは、１つまたはそれ以上の免疫原性ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含んでなる。
【０１１８】
ウイルスベクターは任意のウイルスベクターであってよいが、１つの側面において、アデノウイルスベクターは、本発明の範囲から除外される。
【０１１９】
ウイルスベクターは、任意の適当なウイルス型に由来することができる。ウイルス型には、以下のものが含まれる：
・ｄｓＤＮＡウイルス(例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス)
・ｓｓＤＮＡウイルス(＋)センスＤＮＡ(例えば、パルボウイルス)
・ｄｓＲＮＡウイルス(例えば、レオウイルス)
・(＋)ｓｓＲＮＡウイルス(＋)センスＲＮＡ(例えば、ピコルナウイルス、トガウイルス)
・(−)ｓｓＲＮＡウイルス(−)センスＲＮＡ(例えば、オルソミクソウイルス、ラブドウイルス)
・ｓｓＲＮＡ-ＲＴウイルス(＋)センスＲＮＡ(ライフサイクル中にＤＮＡ中間体を有する)(例えば、レトロウイルス)
・ｄｓＤＮＡ-ＲＴウイルス(例えば、肝炎ウイルス)
【０１２０】
ＤＮＡウイルス型には、以下のものが含まれる：アデノウイルス科；パピローマウイルス科；パルボウイルス科；ヘルペスウイルス科、例えば、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス；ポックスウイルス科、例えば、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス；ヘパドナウイルス科、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス；ポリオーマウイルス科、例えば、ポリオーマウイルス、ＪＣウイルス(進行性多巣性白質脳症)；シルコウイルス科、例えば、輸血伝達性ウイルス。
【０１２１】
ＲＮＡウイルス型には、以下のものが含まれる：レオウイルス科、例えば、レオウイルス、ロタウイルス；ピコルナウイルス科、例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス、カルジオウイルス、アフトウイルス、ポリオウイルス、パレコウイルス、エルボウイルス、コブウイルス、テッショウウイルス、コクサッキー；カリシウイルス科、例えば、ノーウォークウイルス、Ｅ型肝炎；トガウイルス科、例えば、風疹ウイルス；アレナウイルス科、例えば、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス；フラビウイルス科、例えば、デング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス；オルソミクソウイルス科、例えば、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣ、イサウイルス、トゴトウイルス；パラミクソウイルス科、例えば、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス；ブニヤウイルス科、例えば、カリフォルニア脳炎ウイルス、ハンタウイルス；ラブドウイルス科、例えば、狂犬病ウイルス；フィロウイルス科、例えば、エボラウイルス、マルブルグウイルス；コロナウイルス科、例えば、コロナウイルス；アストロウイルス科、例えば、アストロウイルス；ボルナウイルス科、例えば、ボルナ病ウイルス。
【０１２２】
ＲＴウイルス型には、以下のものが含まれる：メタウイルス科；シュードウイルス科；レトロウイルス科、例えば、ＨＩＶ；ヘパドナウイルス科、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス；カリモウイルス科、例えば、カリフラワーモザイクウイルス。
【０１２３】
例示として、ウイルスベクターは、プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、レトロウイルス科、例えば、マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、成人Ｔ細胞白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルスおよび類人猿免疫不全ウイルス；トガウイルス科、例えば、セムリキ森林ウイルス(ＳＦＶ)、シンドビスウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルスを含むアルファウイルス；黄熱病ウイルスおよび風疹ウイルスを含むフラビウイルス；およびピコルナウイルス科、例えばピコルナウイルスであってよい。
【０１２４】
例示として、ウイルスベクターは、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、パラミクソウイルス科、例えば、センダイウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、および特に、麻疹ウイルス；オルソミクソウイルス科、例えば、インフルエンザウイルス；またはラブドウイルス科、例えば、水疱性口炎ウイルスおよび狂犬病ウイルスであってよい。
【０１２５】
例示として、ウイルスベクターは、パルボウイルス科に属する一本鎖ＤＮＡウイルス、例えば、アデノ関連ウイルスであってよい。
【０１２６】
例示として、ウイルスベクターは、ヘルペスウイルス科に属する二本鎖ＤＮＡウイルス、例えば、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)；ポックスウイルス科、例えば、ワクシニアウイルスおよび誘導体、例えば、修飾ワクシニアアンカラ(ＭＶＡ)、カナリア痘および鳩痘であってよい。
【０１２７】
本発明の１つの側面において、ベクターは麻疹ウイルスである。麻疹ウイルス(ＭＶ)は、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス属に属する。ＭＶのエドモンストン株は、１９５４年に単離され、一次ヒト腎臓および羊膜細胞において連続継代され、次いでニワトリ胚線維芽細胞(ＣＥＦ)に順応させて、エドモンストンＡおよびＢ子孫が得られた。エドモンストンＢは、１９６３年に最初のＭＶワクチンとして認可された。ＣＥＦにおけるエドモンストンＡおよびＢのさらなる継代は、より弱毒化されたSchwarzおよびMoratenウイルスを与え、最近になってこれらの配列が同一であることが示された。反応原性であるので、エドモンストンＢワクチンは１９７５年に放棄され、Schwarz/Moratenワクチンに取って代わられた。現在、これが最も普通に使用されている麻疹ワクチンである。現在までに、ＭＶワクチンは、数十億の人々に投与されており、安全かつ有効である。これは、１０４の５０％組織培養感染用量(ＴＣＩＤ５０)の１回注射後に、非常に効率的な長寿命のＣＤ４、ＣＤ８、および体液性免疫を誘導する。その安全性は、ゲノムが非常に安定であること(これが、病原性への逆戻りが決して観察されないことを説明する)、およびウイルス複製が専ら細胞質性であるためそれが宿主染色体に組込まれることができないことによる。
【０１２８】
例示として、麻疹ウイルスベクターは、国際公開第２００８／０７８１９８号、国際公開第２００６／１３６６９７号、国際公開第２００４／００１０５１号および国際公開第２００４／０００８７６号；Journal of Virology、2003年11月、p.11546-11554、Vol.77、No.21、「麻疹ウイルスワクチンの分子クローニングしたSchwarz株はマカクおよびトランスジェニックマウスにおいて強力な免疫応答を誘導する」と題する発表(Chantal Combredetら)に開示されている(これらの全てが参考として本明細書中に完全に組み入れられる)。
【０１２９】
１つの側面において、ウイルスベクターは、例えば上記刊行物に開示されているような弱毒化Schwartz麻疹株である。
【０１３０】
１つの側面において、本発明は、ＨＩＶ抗原と組合せた麻疹ベクター、特に、１つまたはそれ以上のＮｅｆ、Ｅｎｖ、Ｇａｇ、またはＲＴ(完全長またはこれらの免疫原性フラグメントもしくは誘導体のいずれか)を含んでなるＨＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる麻疹ベクターの使用に関する。
【０１３１】
本発明のウイルスベクターは、複製欠損であってよい。これは、野生型ウイルスと比較して、非相補細胞において複製する能力が低下していることを意味する。これは、ウイルスを突然変異させることによって、例えば、複製に関与する遺伝子を欠失させることによって成すことができる。
【０１３２】
ウイルスベクターは、ウイルスが複製可能である任意の好適なセルラインにおいて生成させることができる。ウイルスが、因子を失っていることにより複製を損傷しているときには、ウイルスベクターから失われた因子(これが複製特性の損傷を与える)を供する相補セルラインを使用することができる。
【０１３３】
免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞用にコドン最適化されていてよい。このようなコドン最適化の原理は、国際公開第０５／０２５６１４号に詳しく記載されている。さらに、ある種のＨＩＶ配列のためのコドン最適化が、国際公開第０３／０２５００３号に記載されている。
【０１３４】
本発明の１つの態様において、ポリヌクレオチド構築物は、Ｎ末端リーダー配列を含んでなる。シグナル配列、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、個々に全てが所望により存在するか、または削除されている。本発明の１つの態様において、これら全ての領域が存在するが、修飾されている。
【０１３５】
本発明によるウイルスベクターにおいて使用するためのプロモーターは、ＨＣＭＶ ＩＥ遺伝子由来のプロモーター、例えば、国際公開第０２／３６７９２号に記載されているような、エクソン１を含んでなるＨＣＭＶ ＩＥ遺伝子の５'非翻訳領域は含まれているが、イントロンＡが完全にまたは部分的に除外されているプロモーターであってよい。
【０１３６】
いくつかの抗原が融合タンパク質に融合されているときには、該タンパク質は、単一のプロモーターの制御下にあるポリヌクレオチドによってコードされているであろう。
【０１３７】
本発明の別の態様において、いくつかの抗原は、個々のプロモーター(これらプロモーターのそれぞれは同一または異なっていてよい)によって別々に発現されてよい。本発明のさらに別の態様において、ある種の抗原は、第１のプロモーターに連結して融合体を形成してよく、他の抗原が第２のプロモーター(これは、第１のプロモーターと同一または異なっていてよい)に連結されていてよい。
【０１３８】
即ち、ウイルスベクターは、それぞれが１つのプロモーターの制御下にある１つの抗原をコードする１つまたはそれ以上の発現カセットを含んでなることができる。別法としてまたは追加的に、該ベクターは、それぞれが１つのプロモーターの制御下にある１つを超える抗原をコードする１つまたはそれ以上の発現カセットを含んでなることができる(これにより該抗原は融合体として発現される)。それぞれの発現カセットは、ウイルスベクター中の１つを超える遺伝子座に存在していてよい。
【０１３９】
ポリヌクレオチドまたは発現させるべき免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ウイルスベクターの任意の適する領域に、例えば、削除された領域に挿入することができる。
【０１４０】
２つまたはそれ以上の免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを融合体として連結することができるが、得られるタンパク質は、融合タンパク質として発現させるか、またはそれを別々のタンパク質産物として発現させるか、またはそれを融合タンパク質として発現させ、次いでより小さいサブユニットに分解することができる。
【０１４１】
１つの側面において、ウイルスベクターは、それが供給される宿主生物において適切に複製コンピテントである。
【０１４２】
さらなる側面において、ウイルスベクターは、アジュバントの存在によって影響を受けないか、またはそれによって最小にしか影響を受けない。１つの側面において、アジュバントによって引き起こされるウイルス価のありうる低下は、５０％以下、例えば、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％以下であり、さらなる側面においては、力価の低下は全く存在しない。
【０１４３】
アジュバント
アジュバントは、例えば、「ワクチン設計−サブユニットおよびアジュバントアプローチ」(Powell and Newman、Plenum Press、ニューヨーク、1995)において一般的に記載されている。
【０１４４】
適するアジュバントには、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩が含まれるが、カルシウム、鉄または亜鉛の塩であることもできるか、あるいは不溶性懸濁物のアシル化チロシン、またはアシル化糖、カチオン誘導またはアニオン誘導した多糖、またはポリホスファゼンであることができる。
【０１４５】
本発明の処方物において、アジュバント組成物は、Ｔｈ１応答を優先的に誘導するのが好ましい。しかし、他の体液性応答を含む他の応答が排除されないことは理解されるであろう。
【０１４６】
ある種のワクチンアジュバントが、Ｔｈ１型またはＴｈ２型のいずれかのサイトカイン応答の刺激に特に適していることが知られている。伝統的に、ワクチン接種または感染後の免疫応答のＴｈ１：Ｔｈ２バランスの最良の指標には、抗原による再刺激後のインビトロにおけるＴリンパ球によるＴｈ１またはＴｈ２サイトカインの産生の直接測定、および／または抗原特異的抗体応答のＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比の測定が含まれる。
【０１４７】
即ち、Ｔｈ１型アジュバントは、単離されたＴ細胞集団を刺激して、高レベルのＴｈ１型サイトカインを生体内(血清において測定される)または生体外(細胞がインビトロで抗原により再刺激されたときに測定されるサイトカイン)で産生させ、Ｔｈ１型アイソタイプに付随する抗原特異的な免疫グロブリン応答を誘導するアジュバントである。
【０１４８】
本発明において使用するのに適するアジュバントを与えるように処方する好ましいＴｈ１型免疫刺激物質には、以下のものが含まれるが、これらに限定はされない：
Toll様受容体(ＴＬＲ)４リガンド、特にリピドＡ誘導体などのアゴニスト、特にモノホスホリルリピドＡ、あるいは、特に３-脱アシル化モノホスホリルリピドＡ(３Ｄ-ＭＰＬ)。
【０１４９】
３Ｄ-ＭＰＬは、GlaxoSmithKlineにより商標ＭＰＬＲのもとで販売されており、ＩＦＮ-γの産生によって特徴付けられるＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を主に促進する(Ｔｈ１細胞、即ち、１型表現型を有するＣＤ４ Ｔヘルパー細胞)。これは、英国特許出願公開第２２２０２１１号に開示されている方法に従って得ることができる。化学的には、これは、３、４、５または６アシル化鎖を有する３-脱アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。好ましくは、本発明の組成物において小粒子３Ｄ-ＭＰＬを使用する。小粒子３Ｄ-ＭＰＬは、０.２２μｍフィルターを通って滅菌濾過されうるような粒子サイズを有する。このような調製物は、国際特許出願公開第９４／２１２９２号に記載されている。
【０１５０】
リピドＡの合成誘導体は既知であり、ＴＬＲ４アゴニストであると考えられており、以下のものを含むが、これらに限定はされない：
ＯＭ１７４(２-デオキシ-６-ｏ-[２-デオキシ-２-[(Ｒ)-３-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-４-ｏ-ホスホノ-β-Ｄ-グルコピラノシル]-２-[(Ｒ)-３-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-α-Ｄ-グルコピラノシルリン酸二水素塩)(国際公開第９５／１４０２６号)；
ＯＭ２９４ＤＰ(３Ｓ,９Ｒ)-３-[(Ｒ)-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-４-オキソ-５-アザ-９(Ｒ)-[(Ｒ)-３-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカン-１,１０-ジオール, １,１０-ビス(リン酸二水素塩)(国際公開第９９／６４３０１号および国際公開第００／０４６２号)；
ＯＭ１９７ＭＰ-ＡｃＤＰ(３Ｓ,９Ｒ)-３-[(Ｒ)-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-４-オキソ-５-アザ-９-[(Ｒ)-３-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカン-１,１０-ジオール, １-リン酸二水素塩 １０-(６-アミノヘキサノエート)(国際公開第０１／４６１２７号)。
【０１５１】
使用しうる他のＴＬＲ４リガンドは、アルキルグルコサミニドホスフェート(ＡＧＰ)、例えば国際公開第９８／５０３９９号または米国特許第６３０３３４７号に開示されているもの(ＡＧＰの製造方法も開示されている)、あるいは米国特許第６７６４８４０号に開示されているようなＡＧＰの医薬的に許容しうる塩である。一部のＡＧＰはＴＬＲ４アゴニストであり、一部はＴＬＲ４アンタゴニストである。両方がアジュバントとして有用であると考えられる。
【０１５２】
また、サポニンも本発明において好ましいＴｈ１免疫刺激物質である。サポニンは周知のアジュバントであり、Lacaille-Dubois, MおよびWagner H(サポニンの生物学的および薬理学的活性の概説；Phytomedicine、vol 2、p.363-386、1996)により教示されている。例えば、Ｑｕｉｌ-Ａ(南アメリカの樹木Quillaja Saponaria Molinaの樹皮から得られる)およびその分画が、米国特許第５０５７５４０号および「ワクチンアジュバントとしてのサポニン」(Kensil, C. R.、Crit Rev Ther Drug Carrier Syst、1996、12 (1-2)：1-55)；および欧州特許第０３６２２７９号に記載されている。溶血性サポニンＱＳ２１およびＱＳ１７(Ｑｕｉｌ-ＡのＨＰＬＣ精製した分画)が、強力な全身性アジュバントとして記載されており、その製造方法が、米国特許第５０５７５４０号および欧州特許第０３６２２７９号に開示されている。また、これらの参照文献に記載されているのは、全身性ワクチンのための強力なアジュバントとして働くＱＳ７(Ｑｕｉｌ-Ａの非溶血性分画)の使用である。ＱＳ２１の使用は、Kensilら(1991、J. Immunology、vol 146、431-437)がさらに記載している。また、ＱＳ２１とポリソルベートまたはシクロデキストリンの組合せも知られている(国際公開第９９／１０００８号)。Ｑｕｉｌ-Ａの分画(例えば、ＱＳ２１およびＱＳ７)を含んでなる微粒子アジュバント系が、国際公開第９６／３３７３９号および国際公開第９６／１１７１１号に記載されている。１つのこのような系が、イスコム(Iscom)として知られ、１つまたはそれ以上のサポニンを含むことができる。
【０１５３】
本発明のアジュバントは、特にToll様受容体(ＴＬＲ)４リガンド、特に３Ｄ-ＭＰＬを、サポニンと組合せて含んでなることができる。
【０１５４】
他の適するアジュバントには、ＴＬＲ９リガンド(アゴニスト)が含まれる。即ち、別の好ましい免疫刺激物質は、メチル化されていないＣｐＧジヌクレオチド(「ＣｐＧ」)を含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。ＣｐＧは、ＤＮＡ中に存在するシトシン-グアノシンジヌクレオチドモチーフの省略形である。ＣｐＧは、全身および粘膜の両経路によって投与したときにアジュバントであるとして当分野で知られている(国際公開第９６／０２５５５号、欧州特許第４６８５２０号；Davisら、J.Immunol、1998、160(2)：870-876；McCluskieおよびDavis、J.Immunol.、1998、161(9)：4463-6)。歴史的に、ＢＣＧのＤＮＡ分画は抗腫瘍効果を発揮しうることが観察された。さらなる研究において、ＢＣＧ遺伝子配列に由来する合成オリゴヌクレオチドは、免疫刺激効果を誘導しうることが示された(インビトロおよびインビボの両方において)。これら研究の著者は、ある種の回文配列(中心ＣＧモチーフを含む)がこの活性を担持していると結論した。免疫刺激におけるＣＧモチーフの中心的役割は、後に刊行物において明らかにされた(Krieg、Nature 374、p.546、1995)。詳細な分析は、ＣＧモチーフがある種の配列前後関係になければならないこと、また、このような配列は細菌ＤＮＡにおいては普通であるが脊椎動物ＤＮＡにおいては希であることを示した。免疫刺激性配列は、[プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン](この際、ＣＧモチーフはメチル化されていない)であることが多いが、他のメチル化されていないＣｐＧ配列が免疫刺激性であることが知られており、本発明において使用することができる。
【０１５５】
６個のヌクレオチドのある種の組合せにおいて、回文配列が存在する。これらモチーフのいくつかは、１つのモチーフの繰り返しまたは異なるモチーフの組合せのいずれかとして、同一オリゴヌクレオチド中に存在することができる。１つまたはそれ以上のこれら免疫刺激性配列を含むオリゴヌクレオチドの存在は、天然キラー細胞(これはインターフェロンγを産生し、細胞溶解活性を有する)およびマクロファージを含む様々な免疫サブセットを活性化することができる(Wooldrigeら、Vol.89、No.8、1977)。また現在では、このコンセンサス配列を有していない配列を含む他のメチル化されていないＣｐＧも、免疫調節性であることが示されている。
【０１５６】
通常、ワクチンに配合されるときのＣｐＧは、遊離抗原と一緒に自由溶液中で投与されるか(国際公開第９６／０２５５５号；McCluskieおよびDavis、上記)、または抗原に共有コンジュゲート化されるか(国際公開第９８／１６２４７号)、または水酸化アルミニウムなどの担体と一緒に配合される[(肝炎表面抗原)、Davisら、上記；Brazolot-Millanら、Proc.Natl.Acad.Sci.、米国、1998、95(26)、15553-8]。
【０１５７】
潜在的に重要な他のＴＬＲ９アゴニストには、免疫刺激性ＣｐＲモチーフを含むオリゴヌクレオチドおよびＹｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド(Idera)が含まれる。
【０１５８】
上記したような免疫刺激物質を、担体、例えば、リポソーム、水中油エマルション、および／または金属塩(アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムを含む)などと一緒に処方することができる。例えば、３Ｄ-ＭＰＬは、水酸化アルミニウム(欧州特許第０６８９４５４号)または水中油エマルション(国際公開第９５／１７２１０号)と一緒に処方することができ；ＱＳ２１は、コレステロール含有リポソーム(国際公開第９６／３３７３９号)、水中油エマルション(国際公開第９５／１７２１０号)またはミョウバン(国際公開第９８／１５２８７号)と一緒に有利に処方することができ；ＣｐＧは、ミョウバン(Davisら、上記；Brazolot-Millan、上記)または他のカチオン担体と一緒に処方することができる。
【０１５９】
また、免疫刺激物質の組合せ、特に、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体の組合せ(国際公開第９４／００１５３号；国際公開第９５／１７２１０号；国際公開第９６／３３７３９号；国際公開第９８／５６４１４号；国際公開第９９／１２５６５号；国際公開第９９／１１２４１号)、さらに特に、ＱＳ２１と３Ｄ-ＭＰＬの組合せ(国際公開第９４／００１５３号に開示)も好ましい。別法によれば、ＣｐＧとサポニン(例えばＱＳ２１)の組合せも、本発明において使用するための強力なアジュバントを形成する。別法によれば、サポニンを、リポソーム中またはIscorn中に配合し、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと混合することができる。
【０１６０】
即ち、好適なアジュバント系には、例えば、モノホスホリルリピドＡ(好ましくは３Ｄ-ＭＰＬ)とアルミニウム塩の組合せが含まれる(例えば、国際公開第００／２３１０５号に記載)。
【０１６１】
増強された系には、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体の組合せ、特に、ＱＳ２１と３Ｄ-ＭＰＬの組合せ(国際公開第９４／００１５３号に開示)、またはＱＳ２１がコレステロール含有リポソーム(ＤＱ)中で抑制されている比較的低い反応原性の組成物(国際公開第９６／３３７３９号に開示)が含まれる。この組合せは、さらに免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含んでなることができる。
【０１６２】
即ち、例示のアジュバントは、ＱＳ２１および／またはＭＰＬおよび／またはＣｐＧを含んでなる。
水中油エマルション中にＱＳ２１、３Ｄ-ＭＰＬおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント処方物が、国際公開第９５／１７２１０号に記載されており、本発明において使用するための別の好ましい配合物である。
別の好ましい処方物は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを単独でまたはアルミニウム塩と一緒に含んでなる。
【０１６３】
本発明のさらなる側面において、本明細書中に記載されるワクチン処方物の製造方法であって、本発明による１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチドを適当なアジュバントと混合することを含んでなる方法が提供される。
【０１６４】
本発明の処方物において使用するための特に好ましいアジュバントは、以下の通りである：
(i)３Ｄ-ＭＰＬ＋ＱＳ２１(リポソーム中)(例えば、後記アジュバントＢを参照)
(ii)ミョウバン＋３Ｄ-ＭＰＬ
(iii)ミョウバン＋ＱＳ２１(リポソーム中)＋３Ｄ-ＭＰＬ
(iv)ミョウバン＋ＣｐＧ
(v)３Ｄ-ＭＰＬ＋ＱＳ２１＋水中油エマルション
(vi)ＣｐＧ
(vii)３Ｄ-ＭＰＬ＋ＱＳ２１(例えば、リポソーム中)＋ＣｐＧ
(viii)ＱＳ２１＋ＣｐＧ
【０１６５】
好ましくは、アジュバントは、リポソーム、ＩＳＣＯＭまたは水中油型エマルションの形態で供される。本発明の１つの例示態様において、アジュバントは水中油型エマルションを含んでなる。本発明の別の例示態様において、アジュバントはリポソームを含んでなる。
【０１６６】
適切には、アジュバント成分はウイルスを全く含まない。即ち適切には、本発明において使用するための組成物は、病原体由来の１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含んでなる１つまたはそれ以上のウイルスベクター以外に、ウイルスを全く含まない。
【０１６７】
組成物、用量および投与
本発明の方法において、免疫原性ポリペプチド、ウイルスベクターおよびアジュバントは同時投与される。
通常、アジュバントは、免疫原性ポリペプチドと共処方されるであろう。適切には、アジュバントは、いずれかの他の投与すべき免疫原性ポリペプチドとも共処方されるであろう。
【０１６８】
即ち、本発明の１つの態様において、免疫応答を惹起する方法であって、
(i)アジュバントと共処方した１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド；および
(ii)１つまたはそれ以上の第２の免疫原性ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含んでなる１つまたはそれ以上のウイルスベクター；
を投与することを含んでなり、この際、１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチドとアジュバント、および１つまたはそれ以上のウイルスベクターを同時投与する方法が提供される。
【０１６９】
「共処方(co-formulated)」とは、第１の免疫原性ポリペプチドとアジュバントとが、同一の組成物、例えば医薬組成物中に含まれることを意味する。
通常、ウイルスベクターは、組成物、例えば医薬組成物中に含まれる。
【０１７０】
別法によれば、１つまたはそれ以上の第１の免疫原性ポリペプチド、１つまたはそれ以上のウイルスベクター、およびアジュバントを共処方する。
即ち、１つまたはそれ以上の免疫原性ポリペプチド、１つまたはそれ以上のウイルスベクター、およびアジュバントを含んでなる本発明による組成物が提供される。
【０１７１】
本発明による組成物および方法は、１つを超える免疫原性ポリペプチドおよび／または１つを超えるウイルスベクターの使用を含むことができる。複数抗原の使用は、ある種の病原体、例えば、ＨＩＶ、結核菌(M. tuberculosis)およびマラリア(Plasmodium)種に対する防御免疫応答を惹起する際に特に有利である。本発明による組成物は、１つを超えるアジュバントを含んでなることができる。
【０１７２】
通常、本発明により使用される組成物および方法は、担体、例えば、水性緩衝担体を含んでなることができる。糖などの保護成分が含まれていてよい。
【０１７３】
標的細胞に形質導入し、十分なレベルの遺伝子移送および発現を与え、それによって病原体特異的な免疫応答が現れるのを可能にして、医学分野の専門家によって決定されうる過度の不都合な生理学的効果を伴わないかまたは医学的に許容しうる生理学的効果を伴って予防的または治療的利益を与えるのに十分な量で、組成物を投与すべきである。通常の医薬的に許容しうる投与経路には、網膜への直接供給および他の眼内供給方法、肝臓への直接供給、吸入、鼻内、静脈内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、表皮、直腸、経口および他の非経口投与経路が含まれるが、これらに限定はされない。所望により、遺伝子産物または状態に依存して、投与経路を組合せるかまたは調節することができる。投与経路は、主に、処置される状態の性質に依存するであろう。最も適切には、経路は筋肉内、皮内または表皮である。
【０１７４】
標的にする好ましい組織は、筋肉、皮膚および粘膜である。皮膚および粘膜は、多くの感染性抗原が普通に出会う生理学的部位である。
【０１７５】
第１の免疫原性ポリペプチド、アジュバントおよびウイルスベクターを共処方しないときには、異なる処方物(例えば、ポリペプチド／アジュバントおよびウイルスベクター処方物)を、同じ投与経路または異なる投与経路で投与することができる。
【０１７６】
本方法における組成物の用量は、主に、処置される状態、対象の年齢、体重および健康などの因子に依存し、従って対象の間で変化するであろう。例えば、治療的に有効な成人ヒトまたは獣医学用量は、通常、濃度が約１×１０3〜約１×１０15粒子、例えば、１×１０6〜約１×１０15粒子、約１×１０11〜１×１０13粒子、または約１×１０9〜１×１０12粒子のウイルスを、約１〜１０００ｕｇ、または約２〜１００ｕｇ、例えば約４〜４０ｕｇの免疫原性ポリペプチドと一緒に含む、約１００μＬ〜約１００ｍＬの担体の範囲内である。麻疹ウイルスベクターについては、１×１０3〜１×１０6粒子の用量範囲を使用することができる。用量は、動物の大きさおよび投与経路に依存して変動するであろう。例えば、筋肉内注射のための適するヒトまたは獣医学用量(約８０ｋｇの動物に対して)は、単一部位に対して、１ｍＬあたり約１×１０9〜約５×１０12ウイルス粒子および４〜４０ｕｇタンパク質の範囲内である。当業者なら、投与経路および本組成物を使用する治療またはワクチン用途に依存して、これらの用量を調節することができる。
【０１７７】
アジュバントの量は、アジュバントおよび免疫原性ポリペプチドの性質、処置される状態ならびに対象の年齢、体重および健康に依存するであろう。通常、ヒト投与に対しては、１回用量あたり１〜１００ｕｇ、例えば１０〜５０ｕｇのアジュバント量が適するであろう。
【０１７８】
本発明の方法における本発明の組成物の１回の同時投与によって、十分な免疫応答が適切に達成される。しかし、第２のまたは後の機会(例えば、１ヶ月または２ヶ月後)において、さらなる用量の第１の免疫原性ポリペプチド、アジュバントおよびウイルスベクターの投与によって免疫応答をさらに増強する場合には、そのようなプロトコールが本発明に包含される。
【０１７９】
我々は、本発明の方法における本発明の組成物の１回の同時投与後に、良好な病原体特異的なＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を典型的に惹起しうることを見いだした。しかし、我々は、良好な病原体特異的な抗体応答は、本発明の組成物の第２のまたはさらなる同時投与を必要とすることもあることを見いだした。
【０１８０】
本発明の成分を、任意の適する医薬賦形剤、例えば、水、緩衝液などと混合するか、または処方することができる。
【０１８１】
本発明の１つの側面において、特許請求の範囲に記載される組成物の共処方または同時投与は、例えば本明細書中に開示したアッセイ方法を用いて測定されるように、得られるＣＤ４および／またはＣＤ８応答において付加的効果または相乗的増加を与える。
【０１８２】
本願において言及した全ての参照文献(特許および特許出願を含む)は、可能な限りその最大限で、参考として本明細書中に組み入れられる。
【０１８３】
本明細書および後記の特許請求の範囲の全体にわたり、文脈が他のことを要求しなければ、語句「含んでなる」およびその変形は、言及した整数、工程、整数群または工程群の包含を意味するが、いずれかの他の整数、工程、整数群または工程群の排除を意味するものではないことが理解されるであろう。
【０１８４】
本記載および特許請求の範囲が部分を構成する本願は、いずれかの後の出願に対する優先権の基礎として使用されることもある。そのような後の出願の特許請求の範囲は、本願に記載したいずれかの特徴または特徴の組合せに関するものであろう。それらは、生成物、組成物、方法、または使用に関する特許請求の範囲の形態を採っていてよく、例示の目的で限定されることなく、本願に添付した特許請求の範囲を含んでいることもある。
【実施例】
【０１８５】
以下に挙げる実施例およびデータは、本発明を説明するものであり、本発明を限定するものではない。
【０１８６】
１．アジュバント調製物
１-１．国際公開第９５／１７２１０号に記載されるプロトコールに従う水中油エマルションの調製
このエマルションは、４２.７２ｍｇ／ｍｌのスクアレン、４７.４４ｍｇ／ｍｌのトコフェロール、１９.４ｍｇ／ｍｌのTween 80を含んでいる。得られた油滴は、約１８０ｎｍのサイズを有している。Tween８０をリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)に溶解して、ＰＢＳ中の２％溶液を得た。１００ｍｌの２倍濃縮物を得るために、ＤＬ-α-トコフェロールのエマルション(５ｇ)およびスクアレン(５ｍｌ)を、完全に混合するまで渦撹拌した。ＰＢＳ／Tween溶液(９０ｍｌ)を加え、完全に混合した。次いで、得られたエマルションを注射器に通し、最後にＭ１１０Ｓマイクロ流体機を用いてマイクロ流体化した。得られた油滴は、約１８０ｎｍのサイズを有する。
【０１８７】
１-２．ＱＳ２１およびＭＰＬを含む水中油エマルションの調製
滅菌した大量のエマルションをＰＢＳに加えて、５００μｌエマルション／ｍｌ(ｖ／ｖ)の最終濃度にした。次いで、３Ｄ-ＭＰＬを加えた。次いで、ＱＳ２１を加えた。成分の各添加の間に、中間生成物を５分間撹拌した。１５分後に、ｐＨをチェックし、必要ならＮａＯＨまたはＨＣｌを用いて６.８±０.１に調節した。３Ｄ-ＭＰＬおよびＱＳ２１の最終濃度は、それぞれ１００μｇ／ｍｌであった。
【０１８８】
１-３．リポソームＭＰＬの調製
有機溶媒中の脂質(例えば、卵黄または合成のいずれかに由来するホスファチジルコリン)およびコレステロールおよび３Ｄ-ＭＰＬの混合物を、真空下(または別法によれば不活性ガス流下)に乾燥した。次いで、水性溶液(例えば、リン酸緩衝食塩水)を加え、全ての脂質が懸濁状態になるまで容器を撹拌した。次いで、この懸濁液を、リポソームサイズが約１００ｎｍまで低下するまでマイクロ流体化し、次いで０.２μｍフィルターにより滅菌濾過した。押出または超音波処理によって、この工程を置き換えることもできる。
【０１８９】
通常、コレステロール：ホスファチジルコリンの比は１：４(ｗ／ｗ)であり、水性溶液を加えて１０ｍｇ／ｍｌの最終コレステロール濃度を得た。
ＭＰＬの最終濃度は２ｍｇ／ｍｌである。
リポソームは約１００ｎｍのサイズを有しており、これをＳＵＶと称する(小さい単ラメラ小胞に対して)。リポソームはそれ自体が長期に安定であり、融合能力を有していない。
【０１９０】
１-４．アジュバントＢ(「ａｄｊＢ」)の調製
滅菌した大量のＳＵＶをＰＢＳに加えた。ＰＢＳの組成は、Ｎａ2ＨＰＯ4(９ｍＭ)；ＫＨ2ＰＯ4(４８ｍＭ)；ＮａＣｌ(１００ｍＭ)、ｐＨ６.１であった。水性溶液中のＱＳ２１をＳＵＶに加えた。３Ｄ-ＭＰＬおよびＱＳ２１の最終濃度は、それぞれ１００μｇ／ｍｌであった。この混合物をアジュバントＢと称することもある。成分の各添加の間に、中間生成物を５分間撹拌した。ｐＨをチェックし、必要ならＮａＯＨまたはＨＣｌを用いて６.１±０.１に調節した。
【０１９１】
２．ＨＩＶ抗原の調製
２-１．ｐ２４-ＲＴ-Ｎｅｆ-ｐ１７タンパク質(「Ｆ４」)
Ｆ４は、国際公開第２００６／０１３１０６号、実施例１、コドン最適化法に記載されるように調製した。
【０１９２】
３．麻疹ウイルスベクターの調製
３-１．ＭＶ１-Ｆ４ウイルスのレスキュー
Combredet C、Labrousse V、Mollet L、Lorin C、Delebecque F、Hurtrel B、McClure H、Feinberg MB、Brahic M、およびTangy F、(2003)、「麻疹ウイルスワクチンの分子クローニングしたSchwarz株はマカクおよびトランスジェニックマウスにおいて強力な免疫応答を誘導する」(J Virol、77、11546-11554)に記載されるように、ヘルパーセルラインを用いてＭＶ１-Ｆ４ウイルスをレスキューし、ベラ(Vera)細胞において増幅した。
【０１９３】
４．Ｆ４／ａｄｊＢおよびＭＶ１-Ｆ４の両方を用いる同時投与および共処方戦略
Ｆ４タンパク質は、ａｄｊＢアジュバントと一緒に筋肉内投与したときに、マウス、アカゲザルおよびヒトにおいて強力なＨＩＶ特異的なＣＤ４Ｔ細胞を誘導することが示されている。
このＦ４／ａｄｊＢワクチン候補に加えて、ＭＶ１-Ｆ４が、Ｆ４抗原を用いる別のワクチン候補を構成する。
【０１９４】
マウスモデルにおけるＦ４特異的なＴ細胞応答の性質および強さに対する、同時投与および共処方戦略においてＦ４／ａｄｊＢおよびＭＶ１-Ｆ４の両方を用いることの付加価値を評価した。アジュバントＢを、本明細書中においてはＡＳ０１Ｂと称することもある。
【０１９５】
マウスにおける研究
４-１．マウスおよび免疫
ｈＣＤ４６移入遺伝子に対してヘテロ接合性であるＦＶＢマウス(F. Grosveldからの贈呈品、Erasmus University、ロッテルダム、オランダ国)を、Ｉ型ＩＦＮ受容体を欠く１２９ｓｖ ＩＦＮ-α/α Ｒ −/− マウス(M. Aguetからの贈呈品、Swiss Institute for Experimental Cancer Research、Epalinges、スイス国)と交配した。そのＦ１子孫をＰＣＲによってスクリーニングし、ＣＤ４６ ＋/− 動物を、再び１２９ｓｖ ＩＦＮ-α/α Ｒ −/− マウスと交配した。ＩＦＮ-α/α Ｒ −/− ＣＤ４６ ＋/− を選択し、免疫付与実験に用いた。これらのマウスはＭＶ感染に対して感受性である。マウスを、特定の病原体のない条件下でPasteur Institute動物施設に収容した。１０〜１２週齢の雌性ＣＤ４６ ＋/− ＩＦＮ-α/α Ｒ −/− (ＣＤ４６/ＩＦＮＡＲ)マウスに、腹腔内または筋肉内で様々な用量のＭＶ１-Ｆ４を、そして筋肉内でａｄｊＢ(１００μｌ)に混合した組換えＦ４タンパク質(９または１８μｇ)を接種した。免疫付与の７日後に、マウスを安楽死させ、脾臓細胞を集めた。全ての実験が、“Pasteur InstituteのOffice of Laboratory Animal Care”の指針に従って是認され、そして行われた。
【０１９６】
４-２．細胞媒介の免疫応答の分析
免疫したマウス由来の脾臓細胞を、フローサイトメトリーによる特異的な刺激に対してＩＦＮ-γを分泌する能力について試験した。脾臓細胞を、４８ウエルプレート(Costar)において、Ｆ４配列をカバーするペプチドのプール(１μｇ／ｍｌの各ペプチド最終濃度)を含むかまたは含まない０.４ｍｌ容量の完全培地(５％ウシ胎仔血清、５０ｍＭ ２-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよび抗生物質を追加したＲＰＭＩ１６４０／グルタマックス培地)中、２.１０6細胞／ウエルの濃度で６時間培養した。次いで、ブレフェルジンＡ(１０μｇ／ｍｌ)を一晩加えた。細胞を収穫し、１％ウシ血清アルブミンおよび０.１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝食塩水(ＦＡＣＳ緩衝液)中で洗浄し、Ｆｃブロック化Ａｂと共に１０分間インキュベートし、暗所において４℃で３０分間、ＦＡＣＳ緩衝液中で抗ＣＤ４-ＰＥおよび抗ＣＤ８-ＰｅｒＣＰにより表面染色した。未結合の抗体を洗浄した後、Cytofix/Cytopermキットを製造元の指示(ＢＤ)に従って用いて、細胞内サイトカイン染色のために細胞を固定し、透過性にした。次いで、細胞を、暗所において４５分間、パームウォッシュ(permwash)緩衝液(ＢＤ)中に希釈した抗ＩＦＮγ-ＡＰＣ／抗ＩＬ２-ＦＩＴＣの混合物においてインキュベートした。パームウォッシュ緩衝液およびＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ中の１％ホルムアルデヒドで最終的に固定した。ＣＤ８ゲートにおける２００００回の事象がFACSCaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson)を用いて捕捉された。データを、CELLQuestソフトウエア(Becton Dickinson)を用いて分析し、ＣＤ４またはＣＤ８集団の中でＩＬ-２およびＩＦＮγを発現しているＣＤ４またはＣＤ８細胞の％として表した。以下の抗体を用いた：フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)-コンジュゲート化したラット抗マウスＩＬ２ ｍＡｂ(クローンＪＥＳ６-５Ｈ４)、フィコエリトリン(ＰＥ)-コンジュゲート化したラット抗マウスＣＤ４ ｍＡｂ(クローンＲＭ４-５)、ペリジニンクロロフィルタンパク質(ＰｅｒＣＰ)-コンジュゲート化したラット抗マウスＣＤ８β ｍＡｂ(クローン５３-６.７)、アロフィコシアニン(ＡＰＣ)-コンジュゲート化したラット抗マウスＩＦＮγ(クローンＸＭＧ１.２)およびＦｃブロック化ＣＤ１６／３２(クローン２.４Ｇ２)(これらをPharMingenから購入した)。
【０１９７】
４-３．同時投与プロトコール
Ｆ４特異的なＴ細胞応答に対する、Ｆ４／ａｄｊＢおよびＭＶ１-Ｆ４の両方で同時に免疫することの付加価値を評価するために、両候補を、ＣＤ４６／ＩＦＮＡＲマウスの２つの異なる部位に同時投与した。
【０１９８】
第１組の実験において、マウスに高用量のＦ４／ａｄｊＢ(１８μｇ、ｉｍ)およびＭＶ１-Ｆ４(１０6ＣＣＩＤ50、ｉｐ)の１回注射を行い、Ｆ４特異的なＴ細胞応答を、免疫付与の７日後に分析した(図１Ａ)。
【０１９９】
結果は、Ｆ４／ａｄｊＢ単独が主にＦ４特異的なＣＤ４Ｔ細胞を誘導し、ＭＶ１-Ｆ４単独がＦ４特異的なＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の両方を誘導することを示す。興味深いことに、Ｆ４特異的なＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答の両方の強さは、両候補を同時投与されたマウスにおいて増大する(図１Ｂ)。
【０２００】
第２組の実験において、マウスに１ヶ月間隔で比較的低用量のＦ４／ａｄｊＢ(９μｇ)およびＭＶ１-Ｆ４(１０5ＣＣＩＤ50)の２回注射を行い、両候補を２つの異なる部位に筋肉内注射した。Ｆ４特異的なＴ細胞応答を、第２免疫付与の７日後に分析した(図２Ａ)。
【０２０１】
結果は、Ｆ４特異的なＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答の強さは、Ｆ４／ａｄｊＢおよびＭＶ１-Ｆ４の同時投与を受けたマウスの方が、各候補単独で受けたマウスよりも高いことを示す。
【０２０２】
総合して、これらの結果は、Ｆ４／ａｄｊＢおよびＭＶ１-Ｆ４の両方の同時投与が、Ｆ４特異的なＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答の強さに対して相乗効果を供することを示唆する。しかし、Ｆ４特異的なＴ細胞のサイトカイン産生のプロフィールは、候補が単独注射されるか同時投与で注射されるかを問わず、変化することがないようである。
【０２０３】
４-４．共処方プロトコール
ＭＶ１-Ｆ４を、アジュバントａｄｊＢまたは培地と混合し、室温で様々な時間にわたってインキュベートして、ベクターに対するアジュバントの影響を評価した。次いで、ＭＶ１-Ｆ４をベロ(Vero)細胞において滴定した。結果は、ＭＶ１-Ｆ４をａｄｊＢと一緒にインキュベートしたときに、培地と比較して、感染性のわずかな低下(約０.５対数)が観察されることを示す。
【０２０４】
結果を図３に示す。ＭＶ１-Ｆ４ウイルスを、室温で表示した時間にわたり、aｄｊＢアジュバントまたは培地(ＯｐｔｉＭＥＭ)と一緒にインキュベートした。次いで、ウイルス価を、終点段階希釈アッセイによってベロ細胞において評価した。ウイルス価をＴＣＩＤ50／ｍｌで表す。
【０２０５】
サルにおける研究
４-５．ＮＨＰにおけるワクチン処方の免疫原性
カニクイザル(Cynomolgus macaque)(Ｎ＝１０／群)を、以下のワクチン処方を用いて０日目と２８日目に２回免疫した：(１)１０μｇのＦ４ｃｏ／ＡＳ０１Ｂ(Ｐ)、(２)４.２対数のＣＣＩＤ50 ＭＶ１-Ｆ４(Ｍ)、および(３)両ワクチン候補の同時投与(Ｃｏ-ａｄ)。各ワクチン処方の免疫原性を、最後の注射の３ヵ月後まで長期にわたりモニターした。
【０２０６】
４-５-１．様々なワクチン処方によって誘導されるＦ４特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞応答
Ｆ４ｃｏ／ＡＳ０１Ｂの１回注射は、末梢血において検出したときに、有意レベルのＦ４特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞(Ｉの１４日後における１０動物の中央値：全ＣＤ４＋ Ｔ細胞の０.４８％)を誘導し、第２の注射は、非常に高頻度の特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞(ＩＩの１４日後における中央値が１.０４％である)を誘導した(図４Ａを参照)。全ての動物が、第１用量からＦ４ｃｏ抗原に対して応答性であった(カットオフ＝０.０５％)(図４Ｂを参照)。興味あることに、特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞応答は、最後の免疫付与の３ヵ月後になお検出可能であった(１０動物の中央値：０.１６％)。Ｆ４特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞は、このワクチン処方を用いては観察されなかった(図５Ａおよび５Ｂを参照)。
【０２０７】
４.２対数のＣＣＩＤ50 ＭＶ１-Ｆ４の第１注射は、検出可能なＦ４特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を誘導したが、その強さ(Ｉの１４日後における１０動物の中央値：全ＣＤ４＋ 細胞の０.１８％)は、Ｆ４ｃｏ／ＡＳ０１Ｂ媒介のＦ４特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞応答の強さよりも低かった(図４Ａを参照)。第１免疫付与の１４日後において、１０動物のうち８匹だけがＦ４特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を惹起し、２匹の非応答性サルは、Ｉの２８日後に検出可能であったＦ４特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を惹起した。結果として、全ての動物が、個体間で変化する速度論を伴ってＦ４特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を現した。Ｆ４特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞は、第１注射の１４日後に、１０動物のうち４匹において検出され(カットオフ＝０.０６％)(図５Ｂを参照)、１匹の追加の動物が、Ｉの２８日後に特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を惹起した。４.２対数のＣＣＩＤ50 ＭＶ１-Ｆ４の第２注射は、Ｆ４特異的なＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の頻度を増大させなかった。
【０２０８】
同時投与処方を用いて免疫したサルは、ＩおよびＩＩの免疫付与の１４日後に、Ｆ４ｃｏ／ＡＳ０１Ｂワクチン候補を用いて免疫した動物において惹起されるものと同等のＦ４特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞応答を現した(Ｉの１４日後における１０動物の中央値：全ＣＤ４＋ Ｔ細胞の０.７３％；およびＩＩの１４日後において：０.５５％)(図４Ａを参照)。全ての動物が、第１用量からＦ４ｃｏ抗原に対して応答性であり(図４Ｂを参照)、この特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞応答が、最後の免疫付与の３ヵ月後になお検出可能であった(１０動物の中央値：０.１３％)(図４Ａ)。興味あることに、Ｆ４特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞が、Ｉの注射の１４日後に１０動物のうち７匹において観察され、その頻度は、これら応答動物のうち３匹において高かった(Ｆ４特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の％＝０.８２、１および１.７)(図５Ｂを参照)。同時投与処方を用いて免疫したこれら３匹のサルにおいて検出されたＦ４特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、ＭＶ１-Ｆ４単独を用いて免疫したサルにおいて観察される頻度よりも高かった(Ｉの１４日後における「Ｍ」群の中央値：０.０５２％；およびＩの１４日後における「Ｃｏ-ａｄ」群の中央値：０.１％)(図５Ｂを参照)。同時投与処方を用いる第２の免疫付与は、Ｆ４特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答の強さを増大させなかった。
【０２０９】
まとめると、同時投与処方を用いて免疫したサルは、強さの点でＦ４ｃｏ／ＡＳ０１Ｂ媒介のＣＤ４＋Ｔ細胞応答と同等の強力なＦ４特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞応答を惹起し、この特異的な応答が、第２免疫付与の３ヵ月後までなお検出可能であった。興味深いことに、１０動物のうち７匹がＦ４特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を惹起し、高頻度のＦ４特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞がこれら動物のうち３匹において観察された。同時投与プロトコールを用いる第２の免疫付与は、応答動物の数またはＦ４特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答のレベルを増大させなかった。結果として、同時投与処方は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の両方の誘導に好都合である。
【０２１０】
４-５-２．サイトカイン同時発現プロフィール
Ｆ４特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のサイトカイン同時発現プロフィールを、３種類のワクチン処方について、１回および２回の免疫付与の１４日後に評価した。
【０２１１】
第１用量のＦ４ｃｏ／ＡＳ０１Ｂの後に、Ｆ４特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞は、主にＩＬ-２を単独で、またはＴＮＦ-αと組合せて分泌した(図４Ｃを参照)。第２用量のＦ４ｃｏ／ＡＳ０１Ｂは、少なくとも２つまたは３つのサイトカインを産生する多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を増大させる傾向がある。興味深いことに、少なくとも３つのサイトカインを産生するＦ４特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合は、Ｆ４ｃｏ／ＡＳ０１Ｂの単独を受けた動物において観察される割合(１０動物の平均：Ｉの１４日後において３％、およびＩＩの１４日後において１４％)と比較して、同時投与プロトコールを受けた動物においてより高くなる傾向がある(１０動物の平均：Ｉの１４日後において１３％、およびＩＩの１４日後において２４％)(図４Ｃを参照)。
【０２１２】
ＭＶ１-Ｆ４単独または同時投与プロトコールによって誘導したＦ４特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞は、主にＩＦＮγを単独で、またはＴＮＦ-αと組合せて産生した。第２用量の同時投与プロトコールは、多機能性のＦ４特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を増大させる傾向があるが、全体的なＦ４特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の強さに対する影響は観察されなかった(図５Ａおよび５Ｃを参照)。
【０２１３】
全般的に、それぞれのワクチン処方の第２免疫は、少なくとも３つのサイトカインを分泌するＦ４特異的なＴ細胞の割合を増大させる傾向がある。興味深いことに、多機能性のＦ４特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の割合に対する、Ｆ４ｃｏ／ＡＳ０１Ｂの単独を超える同時投与処方の付加価値が、第１免疫から観察される。
【０２１４】
４-５-３．様々なワクチン処方によって誘導される体液性応答
ＭＶ１-Ｆ４候補単独または同時投与処方を受けた全ての動物が、第１用量後に抗ＭＶ体液性応答を現し、ＭＶ１-Ｆ４ワクチン候補の取込みを示した。第２用量は、両群において抗ＭＶ抗体のレベルを増大させた。ＭＶ１-Ｆ４単独または同時投与処方によって誘導される抗ＭＶ体液性応答の強さは同等であった(図６Ａを参照)。
【０２１５】
Ｆ４特異的な体液性応答に関して、２回用量のＦ４ｃｏ／ＡＳ０１Ｂワクチン候補および同時投与処方を用いて免疫した動物だけが、有意レベルの抗Ｆ４ｃｏ抗体を惹起した。２回免疫付与の２８日後に、抗Ｆ４ｃｏの中間点力価は、両群において同等であった(１０動物の幾何平均は、「Ｐ」群において２０３８４であり、「Ｃｏ-ａｄ」群において２０３６５であった)(図６Ｂを参照)。４.２対数のＣＣＩＤ50 ＭＶ１-Ｆ４を受けた動物において、抗Ｆ４ｃｏ体液性応答は低く、検出不可能であった。
【０２１６】
結論として、本明細書中に記載した前臨床データは、非ヒト霊長類におけるＦ４ｃｏ／ＡＳ０１ＢおよびＭＶ１-Ｆ４候補ワクチンを組合せた同時投与処方の免疫原性を示す。同時投与処方は、良好な持続性およびサイトカイン分泌の多機能性プロフィールを有する非常に高い特異性のＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導した。同時投与プロトコールによって誘導されるＦ４特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞応答の強さは、Ｆ４ｃｏ／ＡＳ０１Ｂの単独によって誘導される強さと同等であったが、多機能性のＦ４特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の割合は、同時投与処方を用いてより高くなる傾向がある。興味深いことに、同時投与処方は、動物のかなりの割合において、Ｆ４特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞応答に加えて、Ｆ４特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞の誘導を誘発する。
【図面の簡単な説明】
【０２１７】
【図１】１回の同時投与の７日後のＦ４特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。  Ａ：筋肉内(ｉｍ)でＦ４ｃｏ／ＡＳ０１Ｂ(１８μｇ)および腹腔内(ｉｐ)でＭＶ１-Ｆ４(１０6 ＴＣＩＤ50)を用いて、マウスを１回免疫した。  Ｂ：免疫付与の７日後に、Ｆ４配列(ｐ２４、ＲＴ、Ｎｅｆおよびｐ１７)をカバーする４プールのペプチドを用いて、脾臓細胞を生体外刺激し(ブレフェルジンの一晩添加の６時間前)、サイトカイン産生をＩＣＳによって測定した。ＨＩＶ特異的応答は、ｐ２４-、ＲＴ-、Ｎｅｆ-およびｐ１７-特異的応答の加算である。ＩＦＮ-γおよび／またはＩＬ-２を分泌するＨＩＶ特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の％を、各マウスについて示す。
【図２】２回の同時投与の７日後のＦ４特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。  Ａ：０日目および２８日目に２つの異なる部位において筋肉内で、Ｆ４ｃｏ／ＡＳ０１Ｂ(９μｇ)およびＭＶ１-Ｆ４(１０5 ＴＣＩＤ50)を用いて、マウスを２回免疫した。  Ｂ：免疫付与の７日後に、Ｆ４配列(ｐ２４、ＲＴ、Ｎｅｆおよびｐ１７)をカバーする４プールのペプチドを用いて、脾臓細胞を生体外刺激し(ブレフェルジンの一晩添加の６時間前)、サイトカイン産生をＩＣＳによって測定した。ＨＩＶ特異的応答は、ｐ２４-、ＲＴ-、Ｎｅｆ-およびｐ１７-特異的応答の加算である。ＩＦＮ-γおよび／またはＩＬ-２を分泌するＨＩＶ特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の％を、各マウスについて示す。
【図３】ＡＳ０１Ｂアジュバントと一緒にインキュベートしたときのＭＶ１-Ｆ４のインビトロ感染性を示す。  ＭＶ１-Ｆ４ウイルスを、室温で表示した時間にわたり、ＡＳ０１Ｂアジュバントまたは培地(ＯｐｔｉＭＥＭ)と一緒にインキュベートした。次いで、ウイルス価を、終点段階希釈アッセイによってベロ細胞において評価した。ウイルス価をＴＣＩＤ50／ｍｌで表す。
【図４】独立してまたは同時投与でＦ４ｃｏ／ＡＳ０１ＢおよびＭＶ１-Ｆ４により、カニクイザルにおいて誘導されたＦ４特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞応答  Ａ：カニクイザルにおいて誘導されたＦ４特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞の速度論および頻度。１０μｇのＦ４ｃｏ／ＡＳ０１Ｂ(Ｐ)、または４.２対数のＣＣＩＤ50 ＭＶ１-Ｆ４(Ｍ)、または両候補の同時投与を用いて、０および２８日目に２回、サルを免疫した。新鮮なＰＢＭＣを、Ｆ４配列をカバーするペプチドのプールを用いて一晩刺激し、サイトカイン産生を、細胞内染色(７色ＩＣＳ)によって測定した。１０匹のサル／群の中央値を、時間に対してプロットした。  Ｂ：１回注射の１４日後におけるそれぞれ個々の動物のＦ４特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度。１回注射の１４日後に各動物において誘導されたＦ４特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を、各ワクチン処方(Ｐ、ＭまたはＣｏ-ａｄ)に対して示す。  Ｃ：第１および第２免疫付与の１４日後におけるＦ４特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカイン同時発現プロフィール。少なくとも１つ、２つまたは３つのサイトカイン(ＩＬ２、ＩＩＦＮ-γおよびＴＮＦ-α)を発現するＦ４特異的なＣＤ４＋ＣＤ４０Ｌ＋Ｔ細胞の頻度を、１回および２回の免疫付与の１４日後にＩＣＳによって評価した。それぞれのパイは１０動物の平均を示す。
【図５】独立してまたは同時投与でＦ４ｃｏ／ＡＳ０１ＢおよびＭＶ１-Ｆ４により、カニクイザルにおいて誘導されたＦ４特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答  Ａ：カニクイザルにおいて誘導されたＦ４特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の速度論および頻度。１０μｇのＦ４ｃｏ／ＡＳ０１Ｂ(Ｐ)、または４.２対数のＣＣＩＤ50 ＭＶ１-Ｆ４(Ｍ)、または両候補の同時投与を用いて、０および２８日目に２回、サルを免疫した。新鮮なＰＢＭＣを、Ｆ４配列をカバーするペプチドのプールを用いて一晩刺激し、サイトカイン産生を、細胞内染色(７色ＩＣＳ)によって測定した。１０匹のサル／群の中央値を、時間に対してプロットした。  Ｂ：１回注射の１４日後におけるそれぞれ個々の動物のＦ４特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度。１回注射の１４日後に各動物において誘導されたＦ４特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を、各ワクチン処方(Ｐ、ＭまたはＣｏ-ａｄ)に対して示す。  Ｃ：第１および第２免疫付与の１４日後におけるＦ４特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞のサイトカイン同時発現プロフィール。少なくとも１つ、２つまたは３つのサイトカイン(ＩＬ２、Ｉ ＩＦＮ-γおよびＴＮＦ-α)を発現するＦ４特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を、１回および２回の免疫付与の１４日後にＩＣＳによって評価した。それぞれのパイは１０動物の平均を示す。
【図６】カニクイザルにおける抗ＭＶおよび抗Ｆ４ｃｏ抗体応答の速度論  Ａ：抗ＭＶ体液性応答。１０μｇのＦ４ｃｏ／ＡＳ０１Ｂ(Ｐ)、または４.２対数のＣＣＩＤ50 ＭＶ１-Ｆ４(Ｍ)、または両候補の同時投与を用いて、０および２８日目に２回、サルを免疫した。非ヒト霊長類血清において抗ＭＶ抗体を測定するために開発したＥＬＩＳＡによって、抗ＭＶ体液性応答を測定した。各動物に対して得られたＯＤ値を、時間に対してプロットした。  Ｂ：抗Ｆ４体液性応答。抗Ｆ４ｃｏ抗体の中間点力価を、時間に対してＥＬＩＳＡにより測定した。各時間点あたりに、１０匹のサル／群の幾何平均が示されている。
【図１】
2012508160.tif 000003
【図２】
2012508160.tif 000004
【図３】
2012508160.tif 000005
【図４】
2012508160.tif 000006
【図５】
2012508160.tif 000007
【図６】
2012508160.tif 000008
【配列表】
2012508160000001.app
【国際調査報告】
2012508160.tif 000009
2012508160.tif 000010
2012508160.tif 000011