(57)【要約】本出願は、グルコース調節タンパク質７８（Ｇｒｐ７８）、脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、アポリポタンパク質Ｂ１００（ａｐｏＢ１００）、およびグリコシル化もしくは脱グリコシル化されたリポタンパク質ＶＬＤＬおよびＬＤＬの１つまたは複数に結合するＳＡＭ−６抗体の変異体および機能性断片に関する。新生物、腫瘍、癌、およびＬＤＬもしくは酸化型ＬＤＬの過剰レベルに関連する障害または疾患の治療および診断における変異体および機能性断片の使用も記載されている。
2012517216.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇｒｐ７８に特異的に結合する単離または精製された抗体であって、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される、またはＧｒｐ７８に結合するための軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含むＳＡＭ−６と競合する、抗体。
【請求項２】
ａｐｏＢ１００に特異的に結合する単離または精製された抗体であって、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される、またはａｐｏＢ１００に結合するための軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含むＳＡＭ−６抗体と競合する、抗体。
【請求項３】
ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、または酸化型ＬＤＬに特異的に結合する単離または精製された抗体であって、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される、またはＬＤＬ、ＶＬＤＬ、もしくは酸化型ＬＤＬに結合するための重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含むＳＡＭ−６抗体と競合する、抗体。
【請求項４】
脱グルコシル化されたＧｒｐ７８または脱グルコシル化されたＬＤＬに特異的に結合する単離または精製された抗体であって、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される、または脱グルコシル化されたＧｒｐ７８もしくは脱グルコシル化されたＬＤＬに結合するための軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含むＳＡＭ−６抗体と競合する、抗体。
【請求項５】
前記Ｇｒｐ７８が約６５５アミノ酸の配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
Ｇｒｐ７８の細胞外ドメインまたは細胞内ドメインに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記細胞内ドメインが約４１１アミノ酸を含み、前記細胞外ドメインが約２２０アミノ酸を含む、請求項６に記載の糖タンパク質。
【請求項８】
糖タンパク質をグリコシダーゼ酵素で処理すると、ＳＡＭ−６抗体の前記Ｇｒｐ７８への結合が低下する、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
前記グリコシダーゼ酵素がＯ−グリコシダーゼを含む、請求項８に記載の糖タンパク質。
【請求項１０】
エンドグリコシダーゼＨまたはエンドグリコシダーゼＦで処理すると、前記Ｇｒｐ７８の見かけの分子量が低下する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、酸化型ＬＤＬ、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８または脱グルコシル化されたＬＤＬの１つまたは複数に結合する、請求項１〜４に記載の抗体の部分配列。
【請求項１２】
前記重鎖可変領域または前記軽鎖可変領域が、本明細書に記載のＳＡＭ−６  ＶＨ配列またはＳＡＭ−６  ＶＬ配列を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体。
【請求項１３】
Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、酸化型ＬＤＬ、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８または脱グルコシル化されたＬＤＬに対する前記抗体の結合親和性が、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される、またはＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、酸化型ＬＤＬ、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８もしくは脱グルコシル化されたＬＤＬに結合するための軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含むＳＡＭ−６抗体の結合親和性よりも高い、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体。
【請求項１４】
前記Ｇｒｐ７８が、配列番号１またはその部分配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれを超える同一性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
前記Ｇｒｐ７８が、新生細胞、癌細胞もしくは腫瘍細胞、またはそれぞれＢＸＰＣ−３（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６８７）もしくはＡ５４９（ＤＳＭＺ寄託番号ＣＣＬ１８５）と表わされる膵癌細胞系もしくは肺癌細胞系によって発現または分泌されると特徴付けられる、請求項１に記載の抗体。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれかに記載の抗体をコードする核酸配列。
【請求項１７】
請求項１２に記載の抗体部分配列をコードする核酸配列。
【請求項１８】
請求項１〜４のいずれかに記載の抗体またはその部分配列をコードする核酸配列と少なくとも７５〜９０％またはそれを超えて相補的または相同である核酸配列であって、約１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００ヌクレオチドの長さを有する、核酸配列。
【請求項１９】
請求項１６から１８までのいずれかに記載の核酸配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列。
【請求項２０】
発現制御配列をさらに含む、請求項１６または１７に記載の核酸。
【請求項２１】
請求項１〜４のいずれかに記載の抗体または請求項１２に記載の抗体部分配列をコードする核酸を含むベクター。
【請求項２２】
ウイルスベクター、細菌ベクター、真菌ベクターまたは哺乳動物ベクターを含む、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
請求項１６もしくは１７に記載の核酸または請求項２１に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２４】
真核細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
安定に、または一過性に形質転換された、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される、または軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含むＳＡＭ−６抗体が結合する、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、酸化型ＬＤＬ、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８または脱グルコシル化されたＬＤＬの抗原またはエピトープに特異的に結合する、単離または精製された抗体。
【請求項２７】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される、または軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含むＳＡＭ−６抗体が結合する、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、酸化型ＬＤＬ、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８または脱グルコシル化されたＬＤＬの配列に特異的に結合する、単離または精製された抗体。
【請求項２８】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される、または軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含むＳＡＭ−６抗体の、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、酸化型ＬＤＬ、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８または脱グルコシル化されたＬＤＬへの結合を抑制または遮断する抗体。
【請求項２９】
ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロットまたは免疫沈降アッセイで決定される、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される、または軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含むＳＡＭ−６抗体の、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、酸化型ＬＤＬ、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８または脱グルコシル化されたＬＤＬへの結合を抑制または妨害する抗体。
【請求項３０】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される、または軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含むＳＡＭ−６抗体の、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、酸化型ＬＤＬ、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８または脱グルコシル化されたＬＤＬへの結合を少なくとも５０％抑制する抗体。
【請求項３１】
低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）または酸化型ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）に結合する、請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の単離または精製された抗体。
【請求項３２】
Ａ５４９細胞馴化培地中に存在する成分に結合する、請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の単離または精製された抗体。
【請求項３３】
前記Ｇｒｐ７８を発現する細胞に前記抗体が結合することにより、細胞の死、溶解またはアポトーシスが刺激または誘導される、請求項１または２６のいずれかに記載の単離または精製された抗体。
【請求項３４】
前記Ｇｒｐ７８を発現する新生細胞、癌細胞または腫瘍細胞に前記抗体が結合することにより、細胞の死、溶解またはアポトーシスが刺激または誘導される、請求項１または２６のいずれかに記載の単離または精製された抗体。
【請求項３５】
ＢＸＰＣ−３細胞またはＡ５４９細胞に前記抗体が結合することにより、ＢＸＰＣ−３細胞もしくはＡ５４９細胞の成長もしくは増殖が抑制される、またはＢＸＰＣ−３細胞もしくはＡ５４９細胞の死、溶解もしくはアポトーシスが刺激もしくは誘導される、請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の単離または精製された抗体。
【請求項３６】
Ｇｒｐ７８を発現する細胞に前記抗体が結合することにより、カスパーゼの活性化が引き起こされる、請求項１または２６のいずれかに記載の単離または精製された抗体。
【請求項３７】
前記カスパーゼが、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８またはカスパーゼ−９を含む、請求項３６に記載の単離または精製された抗体。
【請求項３８】
Ｎ結合炭水化物部分またはＯ結合炭水化物部分を含むエピトープまたは配列に結合しない、請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の単離または精製された抗体。
【請求項３９】
配列番号１３、配列番号１５もしくは配列番号１８、またはＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体と同一の重鎖可変配列または軽鎖可変配列を有さない、請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の単離または精製された抗体。
【請求項４０】
本明細書に記載の重鎖ＣＤＲ３または軽鎖ＣＤＲ３と少なくとも１００％の同一性を有する重鎖ＣＤＲ３または軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の単離または精製された抗体。
【請求項４１】
配列番号１８に記載の重鎖可変領域アミノ酸配列のＣＤＲ３（ＡＲＤＲＬＡＶＡＧＲＰＦＤＹ；配列番号１７）と１００％の同一性を有するＣＤＲまたはＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体の重鎖可変領域を有する重鎖可変配列を含む、請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の単離または精製された抗体。
【請求項４２】
本明細書に記載の重鎖可変領域アミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３と１００％の同一性を有する重鎖可変配列を含む、請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の単離または精製された抗体。
【請求項４３】
本明細書に記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３と１００％の同一性を有する軽鎖可変配列を含む、請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の単離または精製された抗体。
【請求項４４】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である、請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の単離または精製された抗体。
【請求項４５】
ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＤから選択される、請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の単離または精製された抗体。
【請求項４６】
前記ＩｇＧがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、請求項４５に記載の抗体。
【請求項４７】
Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、または酸化型ＬＤＬ、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８または脱グルコシル化されたＬＤＬに対する前記抗体の結合親和性が、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される、または軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含むＳＡＭ−６抗体の結合親和性の約１〜５０００倍の範囲内にある、請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の単離または精製された抗体。
【請求項４８】
Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、酸化型ＬＤＬ、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８または脱グルコシル化されたＬＤＬに対する前記抗体の結合親和性が、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される、または軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含むＳＡＭ−６抗体のＫＤ約１０−５Ｍ〜ＫＤ約１０−１３Ｍの範囲内にある、請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の抗体。
【請求項４９】
Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、酸化型ＬＤＬ、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８または脱グルコシル化されたＬＤＬの１つまたは複数、またはその抗原性断片に結合する抗体部分配列を含む、請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の抗体。
【請求項５０】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合したＦｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ、ＶＨ、三重特異性（Ｆａｂ３）、二重特異性（Ｆａｂ２）、ダイアボディ（（ＶＬ−ＶＨ）２または（ＶＨ−ＶＬ）２）、トリアボディ（三価）、テトラボディ（四価）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（（ｓｃＦＶ−ＣＨ３）２）、二重特異性単鎖Ｆｖ（Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ）、ＩｇＧデルタＣＨ２、ｓｃＦｖ−Ｆｃおよび（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃから選択される、請求項４９に記載の抗体部分配列。
【請求項５１】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される、または軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含むＳＡＭ−６抗体の重鎖可変領域配列または軽鎖可変領域配列と少なくとも８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える同一性を有する、請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の抗体。
【請求項５２】
異種ドメインをさらに含む、請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の抗体。
【請求項５３】
前記異種ドメインが、検出可能な標識、タグまたは細胞毒性剤を含む、請求項５２に記載の抗体。
【請求項５４】
前記検出可能な標識またはタグが、酵素；酵素の基質；リガンド；受容体；放射性核種；Ｔ７タグ、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはＦＬＡＧタグ；高電子密度試薬；エネルギー伝達分子；常磁性の標識；フルオロフォア；発色団；化学発光剤；および生物発光剤を含む、請求項５３に記載の抗体。
【請求項５５】
請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の抗体、およびＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、酸化型ＬＤＬ、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８または脱グルコシル化されたＬＤＬの１つまたは複数を検出するための説明書を含むキット。
【請求項５６】
請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の抗体、および望ましくない細胞増殖または過剰増殖を治療するための説明書を含むキット。
【請求項５７】
前記説明書が、新生物、腫瘍または癌を治療するための説明書である、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
抗細胞増殖性または免疫増強性の治療剤（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｇｅｎｔ）または療法剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）をさらに含む、請求項５６に記載のキット。
【請求項５９】
抗新生物剤、抗癌剤または抗腫瘍剤をさらに含む、請求項５６に記載のキット。
【請求項６０】
前記説明書がラベルまたは添付文書に載っている、請求項５６に記載のキット。
【請求項６１】
製造品をさらに含む、請求項５６に記載のキット。
【請求項６２】
前記製造品が、前記抗体、抗細胞増殖性または免疫増強性の治療または療法を、局所的、局部的または全身的に被験体に送達するための製造品である、請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の抗体、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項６４】
治療を必要とする被験体における細胞過剰増殖性障害を治療するための方法であって、前記被験体に、請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の抗体を、前記被験体における前記細胞過剰増殖性障害を治療するのに有効な量で投与するステップを含む、方法。
【請求項６５】
前記細胞過剰増殖性障害が、脳、頭部または頸部、乳房、食道、口、鼻咽頭、鼻もしくは洞、胃、十二指腸、回腸、空腸、肺、肝臓、膵臓、腎臓、副腎、甲状腺、膀胱、結腸、直腸、前立腺、子宮、子宮頸部、卵巣、骨髄、リンパ、血液、骨、精巣、皮膚または筋肉、または造血系に影響を及ぼす、またはそこに少なくとも部分的に存在する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞過剰増殖性障害が新生物、腫瘍または癌を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記新生物、腫瘍または癌が、転移性または非転移性である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記新生物、腫瘍または癌が、乳房、肺、甲状腺、頭頸部、鼻咽頭、鼻もしくは洞、脳、脊柱、副腎、甲状腺、リンパ、胃腸管、口、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸、小腸、結腸、直腸、尿生殖路、子宮、卵巣、子宮頸部、膀胱、睾丸、陰茎、前立腺、腎臓、膵臓、副腎、肝臓、骨、骨髄、リンパ、血液、筋肉または皮膚に影響を及ぼす、またはそこに少なくとも部分的に存在する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記新生物、腫瘍または癌が造血性である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記新生物、腫瘍または癌が、肉腫、癌腫、腺癌、メラノーマ、骨髄腫、芽細胞腫、神経膠腫、リンパ腫または白血病を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記新生物、腫瘍または癌が、肺腺癌、肺癌、びまん性または間質性の胃癌、結腸腺癌、前立腺腺癌、食道癌、乳癌、膵臓腺癌、卵巣腺癌、または子宮腺癌を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７２】
前記新生物、腫瘍または癌が、病期が第Ｉ期、第ＩＩ期、第ＩＩＩ期、第ＩＶ期または第Ｖ期である転移性または非転移性の腫瘍または癌を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７３】
前記新生物、腫瘍または癌が進行的に悪化している、請求項６６に記載の方法。
【請求項７４】
前記新生物、腫瘍または癌が寛解期にある、請求項６６に記載の方法。
【請求項７５】
前記新生物、腫瘍または癌が固形または液性である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７６】
前記抗体が、局所的、局部的または全身的に前記被験体に投与される、請求項６６に記載の方法。
【請求項７７】
前記治療の結果、前記細胞過剰増殖性障害、または前記新生物、腫瘍もしくは癌に関連する１つまたは複数の有害な身体的症状が緩和または回復する、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項７８】
前記治療により、新生物、腫瘍もしくは癌の体積が低下もしくは減少し、新生物、腫瘍もしくは癌の体積の増加が抑制もしくは妨害され、新生物、腫瘍もしくは癌の進行または悪化が抑制され、新生物、腫瘍もしくは癌細胞の溶解もしくはアポトーシスが刺激され、または新生物、腫瘍もしくは癌の増殖もしくは転移が抑制される、低下または減少する、請求項６６に記載の方法。
【請求項７９】
前記治療により、前記被験体の寿命が引き延ばされるまたは延長される、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項８０】
前記治療により、前記被験体の生活の質が向上する、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項８１】
前記被験体が、抗新生物性、抗腫瘍性、抗癌性、または免疫増強性の治療または療法の候補である、それを受けている、またはそれを受けた被験体である、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項８２】
抗細胞増殖性または免疫増強性の治療または療法を前記被験体に施与するステップをさらに含む、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項８３】
前記治療または療法が、外科的切除、放射線療法（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）、放射線療法（ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）、化学療法、免疫療法、または加温療法を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記抗細胞増殖性の治療または療法が、アルキル化剤、代謝拮抗薬、植物抽出物、植物アルカロイド、ニトロソ尿素、ホルモン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記抗細胞増殖性の治療または療法が、シクロホスファミド、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、プレドニゾロン、メルファラン、クロラムブシル、メクロレタミン、ブスルファン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、チオグアニン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、ＡＺＴ、５−アザシチジン（５−ＡＺＣ）および５−アザシチジン関連化合物、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾトシン、ヒドロキシ尿素、シスプラチン、ミトタン、プロカルバジン、ダカルバジン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシンおよびジブロモマンニトールから選択される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
前記免疫増強性の治療または療法が、リンパ球、形質細胞、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞またはＢ細胞を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８７】
前記免疫増強性の治療または療法が、抗体、細胞増殖因子、細胞生存因子、細胞分化因子、サイトカインまたはケモカインを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８８】
前記免疫増強性の治療または療法が、ＩＬ−２、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＴＮＦβ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９／ＴＣＡ３、ＡＴＡＣ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−２、ＨＣＣ−３、ＬＡＲＣ／ＭＩＰ−３α、ＰＡＲＣ、ＴＡＲＣ、ＣＫβ、ＣＫβ６、ＣＫβ７、ＣＫβ８、ＣＫβ９、ＣＫβ１１、ＣＫβ１２、Ｃ１０、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＥＮＡ−７８、ＧＣＰ−２、ＰＢＰ／ＣＴＡＰＩＩＩβ−ＴＧ／ＮＡＰ−２、Ｍｉｇ、ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１、およびリンホタクチンから選択される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８９】
前記抗体が、前記抗細胞増殖性または免疫増強性の治療または療法を施与する前に、それと実質的に同時に、またはその後に投与される、請求項８２に記載の方法。
【請求項９０】
前記被験体が哺乳動物である、請求項６４〜８９のいずれかに記載の方法。
【請求項９１】
前記被験体がヒトである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記被験体が、細胞過剰増殖性障害の治療または療法を受けている、または受けた被験体である、請求項６４〜８９のいずれかに記載の方法。
【請求項９３】
望ましくないまたは過剰なＬＤＬレベルまたはｏｘＬＤＬレベルに関連するまたはそれによって引き起こされる障害または疾患を治療するための方法であって、被験体に、請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の抗体を、前記被験体における望ましくないまたは過剰なＬＤＬレベルまたはｏｘＬＤＬレベルに関連するまたはそれによって引き起こされる前記障害または疾患を治療するのに有効な量で投与するステップを含む、方法。
【請求項９４】
新生物、腫瘍または癌を有する、またはそれらを有する危険性が高い被験体を診断する方法であって、
ａ）被験体由来の生物学的材料または試料を提供するステップと、
ｂ）前記生物学的材料または試料を、細胞または抗原に結合する請求項１〜４または請求項２６〜３０のいずれかに記載の抗体と接触させるステップと、
ｃ）前記抗体の結合についてアッセイするステップであって、前記抗体が前記細胞または抗原に結合することにより、前記被験体が新生物、腫瘍または癌を有する、またはそれらを有する危険性が高いと診断されるステップと
を含む方法。
【請求項９５】
前記生物学的材料または試料がヒトから得られる、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記生物学的材料または試料が生検材料を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記生物学的材料または試料が、肺、膵臓、胃、乳房、食道、卵巣または子宮の生検材料を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
前記生物学的材料または試料が、血清、血漿、尿、唾液、月経血（ｎｍｅｎｓｔｒｕａｔｅ）、または糞便を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９９】
前記抗体が、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表されるＳＡＭ−６抗体、または軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）とは異なる、請求項９４に記載の方法。
【請求項１００】
ａｐｏＢ１００タンパク質およびｇｒｐ７８タンパク質の両方に存在する抗原に結合する、単離または精製された抗体またはその部分配列。
【請求項１０１】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表されるＳＡＭ−６抗体、または軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）の、ａｐｏＢ１００タンパク質またはｇｒｐ７８タンパク質への結合と競合する、請求項１００に記載の抗体。
【請求項１０２】
前記抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）が単独で、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＬＤＬ、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＶＬＤＬ、またはグリコシル化もしくは脱グリコシル化された酸化型ＬＤＬに結合することができる、請求項１〜４または請求項２６〜３０および請求項１００のいずれかに記載の抗体またはその部分配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００９年２月９日に出願された米国仮出願第６１／１５１，１４９号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、抗体の変異体およびＳＡＭ−６として公知の抗体に結合する標的ペプチドに関する。ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ標的と表わされる糖タンパク質は、Ｇｒｐ７８（グルコース調節タンパク質７８）およびａｐｏＢ１００ポリペプチド配列との見かけの構造相同性を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
新生物、腫瘍および癌を含めた細胞過剰増殖性障害などの望ましくないまたは異常な細胞増殖を治療する化合物および方法が必要とされている。本発明はこの必要性に取り組み、関連する利益を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質と表わされる単離および精製された糖タンパク質を提供する。一実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、変性ゲル電気泳動によって決定された、約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の見かけの分子量、少なくとも１つのＧｒｐ７８とは異なる窒素（Ｎ）結合炭水化物部分または酸素（Ｏ）結合炭水化物部分を有し、ＳＡＭ−６と表わされる抗体が、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質に特異的に結合する。別の実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、変性ゲル電気泳動によって決定された、約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の見かけの分子量、Ｇｒｐ７８の炭水化物部分とは異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）結合炭水化物部分または酸素（Ｏ）結合炭水化物部分、および配列番号１に記載のＧｒｐ７８と相同なポリペプチド配列（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の同一性）を有する。
【０００５】
種々の態様では、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質と表わされる単離および精製された糖タンパク質は、約６５５アミノ酸の配列を含む、約１７アミノ酸の膜貫通ドメインを有する、約２２０アミノ酸の細胞外ドメインを有する、または約４１１アミノ酸の細胞内ドメインを有する。種々の付加的な態様では、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、新生細胞、癌細胞または腫瘍細胞、例えば、それぞれＢＸＰＣ−３（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６８７）およびＡ５４９（ＤＳＭＺ寄託番号ＣＣＬ１８５）と表わされる膵癌細胞系または肺癌細胞系において発現される、またはその細胞により分泌されると特徴付けられる。
【０００６】
別の態様では、細胞表面Ｇｒｐ７８または分泌Ｇｒｐ７８は、別の抗原と関連する、例えば、シャペロン、ヒトプラスミノーゲン（ｐｌａｍｉｎｏｇｅｎ）クリングル５（内皮細胞増殖の抑制因子）または別の抗原として機能することができる。
【０００７】
別の態様では、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質と表わされる単離および精製された糖タンパク質の結合炭水化物部分は、アスパラギン残基、セリン残基またはトレオニン残基（例えば配列番号１の）に結合している。別の態様では、ＳＡＭ−６抗体は、Ｎ結合炭水化物部分もしくはＯ結合炭水化物部分を含む糖タンパク質の一部分に結合する、またはＮ結合炭水化物部分もしくはＯ結合炭水化物部分に結合する。付加的な態様では、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をグリコシダーゼ酵素（例えば、エンドグリコシダーゼＨまたはエンドグリコシダーゼＦなどのＯ−グリコシダーゼまたはＮ−グリコシダーゼ）で処理すると、糖タンパク質の見かけの分子量が約１〜５キロダルトン（ｋＤａ）低下する、またはＳＡＭ−６抗体のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質への結合が低下する。さらに別の態様では、Ｎ結合炭水化物部分またはＯ結合炭水化物部分は、ガラクトース、アセチルガラクトース、マンノース、フコース、グルコース、アセチルグルコース、シアル酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン、またはＮ−アセチルグルコサミンの１つまたは複数を含む。
【０００８】
本発明は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）も提供する。一実施形態では、部分配列は、Ｎ結合炭水化物部分またはＯ結合炭水化物部分を有する糖タンパク質の一部分を含む。
【０００９】
本発明は、さらに、糖タンパク質ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をコードする核酸配列を提供する。一実施形態では、核酸配列は、配列番号１をコードする核酸配列またはその部分配列と少なくとも７５〜９０％またはそれを超えて相補的または相同である。別の実施形態では、核酸配列は、Ｇｒｐ７８の炭水化物部分とは異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）結合炭水化物部分または酸素（Ｏ）結合炭水化物部分が結合することができるＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をコードする。特定の態様では、核酸は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の部分配列をコードする。他の態様では、核酸配列は、約１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００ヌクレオチドの長さを有する。付加的な態様では、核酸配列は、配列番号１をコードする核酸、もしくはその部分配列と特異的にハイブリダイズする、または配列番号１をコードする核酸と相補的な核酸配列、もしくはその部分配列と特異的にハイブリダイズする。別の態様では、核酸は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をコードする核酸配列と特異的にハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡまたはリボザイム核酸であり、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の発現を低下させる。アンチセンスポリヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡおよびリボザイムポリヌクレオチドは、約１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００ヌクレオチドの長さを有してよく、配列番号１をコードする核酸配列、またはその部分配列と少なくとも９０％相補的または相同であってよい。さらに別の態様では、核酸配列は、発現制御配列またはベクター（例えば、ウイルスベクター、細菌ベクター、真菌ベクターまたは哺乳動物ベクター）を含んでよい。
【００１０】
本発明は、そのうえ、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質またはその部分配列をコードする核酸で形質転換された宿主細胞を提供する。宿主細胞としては、核酸またはベクターで安定にまたは一過性に形質転換することができる真核生物細胞（例えば、過剰増殖性細胞、不死化細胞、新生細胞、腫瘍細胞または癌細胞）および非真核生物細胞が挙げられる。
【００１１】
本発明は、さらに、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数、またはその部分配列に特異的に結合する、単離および精製されたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。一実施形態では、抗体は、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数、またはその部分配列のエピトープまたは配列に特異的に結合する。別の実施形態では、抗体は、Ｎ結合炭水化物部分またはＯ結合炭水化物部分を含むエピトープに結合しない。別の実施形態では、抗体は、ａｐｏＢ１００およびＧｒｐ７８の１つまたは複数に結合する。さらに別の実施形態では、抗体は、グルコシル化された型または脱グルコシル化された型のＬＤＬ（例えば、酸化型ＬＤＬ、「ｏｘＬＤＬ」）、ＶＬＤＬの１つまたは複数に結合する。
【００１２】
付加的な実施形態では、抗体は、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される、または軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含むＳＡＭ−６抗体の、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数、またはその部分配列への結合と競合する、またはＳＡＭ−６抗体の、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数、またはその部分配列への結合を抑制もしくは遮断する（例えば、ＳＡＭ−６抗体の結合の少なくとも５０％）（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて決定された通り）、またはＳＡＭ−６抗体の、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数への結合と競合する、またはＳＡＭ−６抗体の、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数への結合を抑制もしくは遮断する（例えば、ＳＡＭ−６抗体の結合の少なくとも５０％）（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて決定された通り）。さらに付加的な実施形態では、抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質を発現する細胞（例えば、ＢＸＰＣ−３細胞またはＡ５４９細胞などの新生物、癌または腫瘍の細胞または細胞系）に結合し、細胞の死、溶解もしくはアポトーシス、またはカスパーゼ（例えばカスパーゼ−３、カスパーゼ（ｃａｐａｓｅ）−７、カスパーゼ−８もしくはカスパーゼ−９）の活性化を刺激または誘導する。さらに別の実施形態では、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をＯ−グリコシダーゼで処理すると、抗体の、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、またはＬＤＬまたはｏｘＬＤＬへの結合が低下する。
【００１３】
さらに付加的な実施形態では、抗体は、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数に対する結合親和性が、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される、または軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含むＳＡＭ−６の結合親和性の約１〜５０００倍の範囲内にある、またはグルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数に対する結合親和性が、ＳＡＭ−６のＫＤ約１０−５Ｍ〜ＫＤ約１０−１３Ｍの範囲内にある。さらに別の実施形態では、抗体は、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬに対する結合親和性が、ＳＡＭ−６の結合親和性の約１〜５０００倍の範囲内にある、またはグルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬに対する結合親和性が、ＳＡＭ−６（例えば、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される、または軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含む）のＫＤ約１０−５Ｍ〜ＫＤ約１０−１３Ｍの範囲内にある。
【００１４】
本発明の抗体は、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される、または軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含むＳＡＭ−６抗体とは異なる抗体を含む。一実施形態では、抗体は、ＳＡＭ−６の重鎖配列および軽鎖配列と同一の重鎖配列および軽鎖配列を有さない。別の実施形態では、抗体は、ＳＡＭ−６の重鎖可変配列または軽鎖可変配列と同一の重鎖可変配列または軽鎖可変配列を有さない。別の実施形態では、抗体は、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される、または軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含むＳＡＭ−６抗体の重鎖可変領域配列または軽鎖可変領域配列と９０％〜９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える同一性を有さない。特定の実施形態では、ＳＡＭ−６抗体とは異なる抗体は、重鎖可変領域配列または配列番号１８に記載の重鎖可変領域アミノ酸配列内のＣＤＲ（ＣＤＲ３；ＡＲＤＲＬＡＶＡＧＲＰＦＤＹ；配列番号１７）、またはＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域のＣＤＲ３、または軽鎖可変領域配列（配列番号１３）または重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）と１００％の同一性を有する重鎖配列を有する。
【００１５】
さらに別の実施形態では、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）が単独で標的抗原に結合することができる。特定の態様では、重鎖可変領域（ＶＨ）が単独で、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＬＤＬ、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＶＬＤＬまたはグリコシル化もしくは脱グリコシル化された酸化型ＬＤＬの１つまたは複数に結合することができる。
【００１６】
本発明の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＤを含む。種々の態様では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。
【００１７】
本発明の抗体は、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数、またはその部分配列（例えば、免疫原性断片）に結合する部分配列などの、本明細書に記載の抗体の抗体部分配列も含む。種々の態様では、部分配列は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合したＦｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ、ＶＨ、三重特異性（Ｆａｂ３）、二重特異性（Ｆａｂ２）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）（（ＶＬ−ＶＨ）２または（ＶＨ−ＶＬ）２）、トリアボディ（三価）、テトラボディ（四価）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（（ｓｃＦＶ−ＣＨ３）２）、二重特異性単鎖Ｆｖ（Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ）、ＩｇＧｄｅｌｔａＣＨ２、ｓｃＦｖ−Ｆｃまたは（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃである。
【００１８】
本発明は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質およびその部分配列、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数に結合する、異種ドメインを含む抗体および部分配列も提供する。一実施形態では、異種ドメインは検出可能な標識、タグまたは細胞毒性剤（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔ）を含む。特定の態様では、検出可能な標識またはタグは、酵素、酵素の基質、リガンド、受容体、放射性核種、Ｔ７タグ、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはＦＬＡＧタグ、高電子密度試薬、エネルギー伝達分子、常磁性の標識、フルオロフォア、発色団、化学発光剤、または生物発光剤（ｂｉｏ−ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ａｇｅｎｔ）である。
【００１９】
本発明は、さらにキットを提供する。一実施形態では、キットは、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数に結合する抗体、およびグルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数を検出するための説明書を含む。別の実施形態では、キットは、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数に結合する抗体、およびグルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数に結合する抗体で治療可能な状態を治療するための説明書を含む。付加的な実施形態では、キットは、抗細胞増殖性または免疫増強性の治療剤もしくは治療薬、または抗新生物剤、抗癌剤もしくは抗腫瘍剤、または製造品（例えば、抗体、抗細胞増殖性または免疫増強性の治療または療法を、局所的、局部的または全身的に被験体に送達するための製造品）も含む。特定の態様では、説明書は、望ましくない細胞増殖または細胞過剰増殖を治療するための説明書、または新生物、腫瘍もしくは癌を治療するための説明書である。付加的な態様では、説明書は、ラベルまたは添付文書に載っている。
【００２０】
本発明は、さらに、医薬組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８または脱グルコシル化されたＬＤＬ、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。別の実施形態では、組成物は、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数に特異的に結合する抗体またはその部分配列、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
【００２１】
本発明は、さらに、治療を必要とする被験体における傷害を治療するための方法を提供する。一実施形態では、方法は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、またはグルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数に特異的に結合する抗体を、被験体における細胞過剰増殖性障害（例えば、病期が第Ｉ期、第ＩＩ期、第ＩＩＩ期、第ＩＶ期または第Ｖ期、転移性または非転移性、固形または液性の新生物、腫瘍または癌）を治療するのに有効な量で投与するステップを含む。種々の態様では、細胞過剰増殖性障害は、脳、頭部もしくは頸部、乳房、食道、口、鼻咽頭、鼻もしくは洞、胃、十二指腸、回腸、空腸、肺、肝臓、膵臓、腎臓、副腎、甲状腺、膀胱、結腸、直腸、前立腺、子宮、子宮頸部（ｃｅｒｖｉｘ）、卵巣、骨髄、リンパ、血液、骨、精巣、皮膚もしくは筋肉、または造血系に影響を及ぼす、またはそこに少なくとも部分的に存在する。付加的な態様では、細胞過剰増殖性障害は、乳房、肺、甲状腺、頭頸部、鼻咽頭、鼻もしくは洞、脳、脊柱、副腎、甲状腺、リンパ、胃腸管、口、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸、小腸、結腸、直腸、尿生殖路、子宮、卵巣、子宮頸部、膀胱、睾丸、陰茎、前立腺、腎臓、膵臓、副腎、肝臓、骨、骨髄、リンパ、血液、筋肉、皮膚に影響を及ぼす、もしくはそこに少なくとも部分的に存在する、または造血性の新生物、腫瘍または癌を含む。特定の態様では、新生物、腫瘍または癌は、肉腫、癌腫、腺癌、メラノーマ、骨髄腫、芽細胞腫、神経膠腫、リンパ腫または白血病である。付加的な特定の態様では、新生物、腫瘍または癌は、肺腺癌、肺癌、びまん性もしくは間質性の胃癌、結腸腺癌、前立腺腺癌、食道癌、乳癌、膵臓腺癌、卵巣腺癌、または子宮腺癌である。別の特定の態様では、新生物、腫瘍または癌は、進行的に悪化しているまたは寛解期にある。さらに付加的な態様では、治療の結果、細胞過剰増殖性障害、または新生物、腫瘍もしくは癌に関連する１つまたは複数の有害な身体的症状が緩和もしくは回復する、または新生物、腫瘍もしくは癌の体積が低下もしくは減少する、新生物、腫瘍もしくは癌の体積の増加が抑制もしくは妨害される、新生物、腫瘍もしくは癌の進行もしくは悪化が抑制される、新生物、腫瘍もしくは癌細胞の溶解もしくはアポトーシスが刺激される、または新生物、腫瘍もしくは癌の増殖もしくは転移が抑制される、低下もしくは減少する、または被験体の寿命が引き延ばされるもしくは延長する、または被験体の生活の質が向上する。
【００２２】
方法は、被験体に、局所的、局部的または全身的に投与するステップを含む。代表的な被験体（例えばヒトなどの哺乳動物）は、抗細胞増殖性障害または抗細胞過剰増殖性障害（例えば、抗新生物、抗腫瘍、抗癌もしくは抗転移）の、または免疫増強性の治療もしくは療法の候補、およびそれを受けている被験体、またはそれを受けた被験体を含む。
【００２３】
本発明は、さらに、治療を必要とする被験体における障害を治療するための組み合わせた方法も提供する。一実施形態では、方法は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、またはグルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数に特異的に結合する抗体と、抗細胞増殖性または免疫増強性の治療または療法とを被験体に施与するステップを含む（例えば、互いの前、互いと実質的に同時、または互いの後に）。種々の態様では、抗細胞増殖性の、または免疫増強性の治療または療法は、外科的切除、放射線療法（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）、放射線療法（ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）、化学療法、免疫療法、加温療法、アルキル化剤、代謝拮抗薬、植物抽出物、植物アルカロイド、ニトロソ尿素、ホルモン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体、リンパ球、形質細胞、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞またはＢ細胞、抗体、細胞増殖因子、細胞生存因子、細胞分化因子、サイトカインまたはケモカインを含む。
【００２４】
本発明は、さらに、望ましくないまたは過剰なＶＬＤＬレベル、ＬＤＬレベルまたはｏｘＬＤＬレベルに関連するまたはそれによって引き起こされる障害または疾患を治療するための方法を提供する。一実施形態では、方法は、被験体に、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質に特異的に結合する抗体を、被験体における望ましくないまたは過剰なＶＬＤＬレベル、ＬＤＬレベルまたはｏｘＬＤＬレベルに関連するまたはそれによって引き起こされる障害または疾患を治療するのに有効な量で投与するステップを含む。種々の態様では、望ましくないまたは過剰なＶＬＤＬレベル、ＬＤＬレベルまたはｏｘＬＤＬレベルに関連するまたはそれによって引き起こされる障害または疾患は、高脂血症、高コレステロール血症、動脈硬化症、心臓血管疾患、冠動脈心疾患（ＣＨＤ）、脳卒中、糸球体壊死、高血圧または糖尿病である。
【００２５】
本発明は、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬを検出またはスクリーニングするための方法を提供する。一実施形態では、方法は、生物学的材料または試料を、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８または脱グルコシル化されたＬＤＬに特異的に結合する抗体と、抗体がグルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬに結合することができる条件下で接触させるステップと、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬへの抗体の結合についてアッセイするステップとを含む。抗体がグルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬに結合することにより、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの存在が検出される。一態様では、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬは、細胞または組織に存在する。別の態様では、生物学的材料または試料は哺乳動物の被験体から得られる。
【００２６】
本発明は、さらに、細胞過剰増殖性障害（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）を有する、またはそれらを有する危険性が高い被験体を診断するための方法を提供する。一実施形態では、方法は、被験体由来の生物学的材料または試料を提供するステップと、生物学的材料または試料を、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数に特異的に結合する抗体と、抗体がグルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬに結合することができる条件下で接触させるステップと、抗体の、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質への結合についてアッセイするステップとを含む。上記の１つまたは複数に抗体が結合することにより、被験体が、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移を有する、またはそれらを有する危険性が高いと診断される。一態様では、生物学的材料または試料はヒトから得られる。付加的な態様では、生物学的材料または試料は、肺、膵臓、胃、乳房、食道、卵巣または子宮の生検材料などの生検材料を含む。別の態様では、生物学的材料または試料は、血清、血漿、尿、唾液、月経血（ｍｅｎｓｔｒｕａｔｅ）、または糞便を含む。
【００２７】
本発明は、そのうえ、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数に特異的に結合する抗体を作製するための方法を提供する。一実施形態では、方法は、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬまたはその断片を動物に投与するステップと、その動物を、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数に結合する抗体、またはその断片の発現についてスクリーニングするステップと、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその断片に結合する抗体を産生する動物を選択するステップと、選択された動物から抗体を単離するステップとを含む。別の実施形態では、方法は、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその断片を、ヒト免疫グロブリンを発現することができる動物に投与するステップと、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその断片に結合する抗体を産生する動物から脾臓細胞を単離するステップと、その脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを作製するステップと、そのハイブリドーマを、ポリペプチドまたはその断片に結合するヒト抗体の発現についてスクリーニングするステップとを含む。特定の態様では、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の断片は、Ｎ結合炭水化物部分またはＯ結合炭水化物部分を有するポリペプチド配列の一部分、例えば、ＳＡＭ−６抗体が結合するＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８または脱グルコシル化されたＬＤＬの抗原、エピトープまたは構造を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、ＳＡＭ−６リポトーシス経路（ｌｉｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ）の図である。
【図２】図２は、ＳＡＭ−６標的の図である。
【図３】図３は、膜抽出物におけるＳＡＭ−６および無関連ＩｇＭ対照の代表的なウエスタンブロットの図である。
【図４】図４は、サイズ排除クロマトグラフィー後のクロマトグラムの図である。
【図５】図５は、サイズ排除クロマトグラフィー後のＳＡＭ−６陽性画分の、ウエスタンブロット分析の図である。
【図６】図６は、サイズ排除クロマトグラフィー後のＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルの、クーマシー染色の図である。
【図７】図７は、イオン交換クロマトグラフィー後のクロマトグラムの図である。
【図８】図８は、イオン交換クロマトグラフィー後の、ＳＡＭ−６陽性画分のウエスタンブロット分析の図である。
【図９】図９は、イオン交換クロマトグラフィー後のクーマシーブルー染色の図である。
【図１０】図１０は、ＭＡＬＤＩ質量分析によって得た単離８０ｋＤａタンパク質のペプチド質量マップの図である。
【図１１】図１１は、ヒトＧｒｐ７８に割り当てられた実験によって決定したペプチド配列およびヒトＧｒｐ７８／ＢｉＰ［ＮＰ＿００５３３８］のタンパク質配列のアラインメントの図である。
【図１２】図１２は、Ｇｒｐ７８−ｓｉＲＮＡトランスフェクトＢＸＰＣ−３細胞におけるＳＡＭ−６結合のＦＡＣＳ分析の図である。
【図１３】図１３は、Ｇｒｐ７８−ｓｉＲＮＡトランスフェクトＢＸＰＣ−３細胞におけるＳＡＭ−６結合の分析の図である。ＳＡＭ−６表面抗原に陽性な細胞ならびに対照（Ｇｒｐ７８およびＣＤ５５）の割合を示す。
【図１４】図１４は、Ｇｒｐ７８−ｓｉＲＮＡトランスフェクトＢＸＰＣ−３細胞に関する細胞死ＥＬＩＳＡの図である。
【図１５】図１５は、ウエスタンブロット分析：膵臓癌細胞系ＢＸＰＣ−３の膜抽出物におけるＳＡＭ−６抗体の結合の図である。
【図１６】図１６は、グリコシダーゼを用いた処理後の膵臓癌細胞におけるＳＡＭ−６結合の図である。
【図１７】図１７は、ＳＡＭ−６のエンドサイトーシスの免疫蛍光の図である。
【図１８】図１８は、抗体誘導性膵臓癌細胞（ＢＸＰＣ−３）のスダンＩＩＩ染色の図である。
【図１９】図１９は、シトクロムＣ放出の測定によるＳＡＭ−６誘導性アポトーシスの分析の図である。
【図２０】図２０は、カスパーゼ−８、−９、−３および−６の活性化の測定によるＳＡＭ−６誘導性アポトーシスの分析の図である。
【図２１】図２１は、胃癌腫瘍異種移植片増殖のＳＡＭ−６用量依存性阻害の図である。
【図２２−１】図２２は、ハイブリドーマ細胞系によって産生されたＳＡＭ−６抗体の重鎖可変領域に関する配列カバレッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）のダイアグラムを示す図である。
【図２２−２】図２２は、ハイブリドーマ細胞系によって産生されたＳＡＭ−６抗体の重鎖可変領域に関する配列カバレッジのダイアグラムを示す図である。
【図２２−３】図２２は、ハイブリドーマ細胞系によって産生されたＳＡＭ−６抗体の重鎖可変領域に関する配列カバレッジのダイアグラムを示す図である。
【図２３】図２３は、ハイブリドーマ細胞系によって産生されたＳＡＭ−６抗体の軽鎖可変領域に関する配列カバレッジのダイアグラムを示す図である。
【図２４】図２４は、Ａ５４９細胞の馴化培地中に存在するＬＤＬおよび標的抗原との、１．１Ａおよび１．１Ｂ  ＳＡＭ−６ダイアボディの結合のＥＬＩＳＡを示す図である。
【図２５】図２５は、機能性細胞結合および細胞死ＥＬＩＳＡを示す図である。
【図２６】図２６は、ＳＡＭ−６ダイアボディを用いたＡ５４９馴化培地の免疫沈降を示す図である。このダイアボディは、６０〜１００ｋＤａの範囲の分子量で標的抗原と結合する。
【図２７】図２７は、特定ＳＡＭ−６変異体のＬＤＬのＥＬＩＳＡを示す図である。
【図２８Ａ】図２８は、ＳＡＭ−６  ＶＨ単独とＨｅｌａ細胞の結合を示す図である。
【図２８Ｂ】図２８は、ＳＡＭ−６  ＶＨ単独とＨｅｌａ細胞の結合を示す図である。
【図２９】図２９は、ＳＡＭ−６  ２．７の結合の分析を示す図である。ＳＡＭ−６  Ｏｐｔｉ（ｋａｐｐａ軽鎖）、およびＳＡＭ−６  ＶＨの単鎖抗体と組換え体発現Ｇｒｐ７８（グリコシル化）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、少なくとも一部は、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質と称される糖タンパク質に基づく。ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、変性ゲル電気泳動によって決定された、約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の見かけの分子量を有する。ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の非限定的な代表的特徴は、Ｇｒｐ７８とは異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）結合炭水化物部分または酸素（Ｏ）結合炭水化物部分の結合である。ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の別の非限定的な代表的特徴は、ＳＡＭ−６と表わされる、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマ（２００８年４月３日にＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙに寄託された）によって産生される抗体が、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質に特異的に結合することである。
【００３０】
本発明によると、変性ゲル電気泳動によって決定された、約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の見かけの分子量を有する、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質と表わされる単離または精製された糖タンパク質が提供される。一実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、Ｇｒｐ７８とは異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）結合炭水化物部分または酸素（Ｏ）結合炭水化物部分を有する。別の実施形態では、ＳＡＭ−６と表わされる抗体が、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質に特異的に結合する。
【００３１】
ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質を配列解析により、ＢｉＰ、ＨｓｐＡ５、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５およびＨｓｃｅ７０としても公知でそのように称されるグルコース調節（または調節された）タンパク質７８（Ｇｒｐ７８）との配列同一性が明らかになった。ヒトＧｒｐ７８／ＢｉＰ配列を図１１に示す（配列番号１）。Ｇｒｐ７８／ＢｉＰ配列と同一だと考えられるＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の配列を太字で示している。したがって、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の別の非限定的な代表的特徴は、少なくとも部分的にＧｒｐ７８と配列が相同／同一であることである。
【００３２】
本発明によると、変性ゲル電気泳動によって決定された、約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の見かけの分子量を有する、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質と表わされる単離または精製された糖タンパク質が提供される。一実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、配列番号１に記載のＧｒｐ７８と相同なポリペプチド配列を有する。
【００３３】
種々の非限定的な態様では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、約６５５アミノ酸の配列を含む；約１７アミノ酸の膜貫通ドメインを有する；約２２０アミノ酸の細胞外ドメインを有する；または約４１１アミノ酸の細胞内ドメインを有する。他の非限定的な態様では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、（例えば、配列番号１）のアミノ酸、例えば、アスパラギン残基、セリン残基またはトレオニン残基に結合した炭水化物部分を有する。ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の可能性のあるＯ−グルコシル化された部位を、配列番号１の下線を付したトレオニン（Ｔ）残基によって示している。
【００３４】
本明細書で使用する、「糖タンパク質」という用語は、少なくとも１つの、タンパク質を構成しているアミノ酸に共有結合した糖部分を有するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを指す。「炭水化物部分」は、２つ以上の糖残基、例えば、単糖、二糖、三糖などを指す。オリゴ糖および多糖という用語は炭水化物という用語と同義である。グルコシル化されたタンパク質は、糖タンパク質と同義で使用される。脱グルコシル化されたタンパク質は、比較タンパク質と比較して、１つまたは複数の（または全ての）糖／炭水化物残基が除去されているタンパク質を指す。
【００３５】
糖、炭水化物、オリゴ糖および多糖は、一般にはグリコシド結合によってアミノ酸残基に結合する。真核生物に関して、一連の糖付加および糖除去が翻訳後に起こって、糖タンパク質の炭水化物部分が形成される。代表的な糖としては、ガラクトース、アセチルガラクトース、マンノース、フコース、グルコース、アセチルグルコース、シアル酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびノイラミン酸（ｎｅｕｒａｍｉｃ  ａｃｉｄ）の１つまたは複数が挙げられる。ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、場合によって、例えば、Ｎ結合またはＯ結合を介してセリン残基、トレオニン残基またはアスパラギン残基に結合した１つまたは複数のそのような特定の糖を有する。
【００３６】
ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をグリコシダーゼ酵素と接触させることにより、炭水化物部分を含む１つまたは複数の糖残基が除去されるので、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の見かけの分子量を低下させることができる。一実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をグリコシダーゼ酵素と接触させることにより、見かけの分子量が約１〜１０キロダルトン（ｋＤａ）、例えば、約８２ｋＤａから７２ｋＤａまで低下する。別の実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をＯ−グリコシダーゼと接触させることにより、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の見かけの分子量が低下する。当然ながら、当業者は、もしあれば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質から除去することができる炭水化物の量および種類が、特定のグリコシダーゼ酵素の選択に左右され、それが今度は、もしあれば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の見かけの分子量の低下に影響を及ぼすことを理解するであろう。
【００３７】
炭水化物部分の１つまたは複数の糖または炭水化物構造全体を除去することができるグリコシダーゼとしては、一般的にはセリン残基またはトレオニン残基の酸素（Ｏ）に結合した炭水化物部分を含む糖を切断するＯ−グリコシダーゼ、および一般にはアスパラギン残基の窒素（Ｎ）に結合した炭水化物部分を含む糖を切断するＮ−グリコシダーゼが挙げられる。そのようなグリコシダーゼの特定の例は、Ｏ−グリコシダーゼ、Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＨ（ｅｎｄｏ  Ｈ）、ノイラミニダーゼおよびフコシダーゼである。Ｏ−グリコシダーゼは、セリン結合オリゴ糖またはトレオニン結合オリゴ糖を切断する。Ｎ−グリコシダーゼＦは、オリゴ糖が最小長のキトビオースコア単位を有する場合にアスパラギン結合Ｎ−グリカンを切断する。ｅｎｄｏ  Ｈは、高マンノースのキトビオースコアとＮ結合糖タンパク質からの一部のハイブリッドオリゴ糖の内部を切断するグリコシダーゼである。ノイラミニダーゼは、末端のアシルノイラミン酸残基を除去する。フコシダーゼは、フコースを、例えば、ラクトースおよび複合体炭水化物から除去する。そのようなグリコシダーゼは、一般には、切断される糖結合、および炭水化物部分がＯ結合であるかＮ結合であるかに関して少なくとも一部の特異性を有し、したがって、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の炭水化物部分（単数または複数）の組成および構造を特徴付けるために使用することができる。
【００３８】
炭水化物のパネルを、ＳＡＭ−６抗体の結合についてスクリーニングした。具体的には、（ＧｌｃＮＡｃ）２、Ｍａｎ３、ｓＴｎ、ＧＭ４、Ｌａｃ−ｄｉ−Ｎａｃ、β−Ｄ−ガラクトース−３−硫酸、Ｈ３型、Ｎｅｕ５Ａｃ６Ｇａｌ、ＧｌｃＮａｃβ３Ｇａｌ、α−Ｎ−アセチルノイラミン酸、３’−ＳＬ、Ａｔｒｉ、Ｔｋ、３’ＳＬＮ、ｓＬｅａ、Ｂｔｒｉ、ＧＡ１  Ｐｋ、Ｇｂ３、ｓＬｅｘ、Ａｄｉ、Ａ２型、Ｔαβ、６’−ＳＬ、Ｂｄｉ、Ｂ２型、Ｇａｌβ３Ｇａｌ、Ｔββ、Ｈ２型、Ｇａｌａ１−３’Ｌａｃ、Ｌｅａ  ３’−Ｏ−ｓｕ−Ｌｅａ、６’−Ｏ−ｓｕ−ＬａｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１−２’ＴＦ、Ｌｅｂ、３’−Ｏ−ｓｕ−Ｌｅｘ、Ｈｄｉ、Ｇａｌα４ＧｌｃＮＡｃ、Ｌｅｄ（Ｈ１型）、３’−ｓｕ−ＬａｃＮＡｃ、３’−Ｏ−ｓｕ−ＴＦ、β−Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＬｅＣ、３’−ｓｕ−Ｌｅｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１−３’ＬａｃＮＡｃ、マルトース、Ｌｅｘ、メリビオース、ｄｉ−ＧａｌＮＡｃβ、α−Ｄ−グルコース、Ｌｅｙ、Ｇａｌα１−３’ＬａｃＮＡｃ、３’−ＳｉａＴＦ、β−Ｄ−グルコース、Ｌａｃ、ＧｌｃＮＡｃα１−３’ＴＦ、コア３、α−Ｄ−ガラクトース、ＬａｃＮＡｃ、（Ｓｉａ）２、コア６、β−Ｄ−ガラクトース、ＴＦ、（Ｓｉａ）３、コア４、α−Ｄ−マンノース、Ｆｕｃα３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１−３’ＴＦ、３，６−ＳｉａＴＦ、α−Ｄ−マンノース−６−リン酸、Ｆｕｃα４ＧｌｃＮＡｃ  Ｌｅ、Ｇａｌ２βＧａｌ、６−ＳｉａＴＦ、α−Ｌ−フコース、Ｆｓ−２、６−Ｏ−ｓｕ−ＬａｃＮＡｃ、ＹＤＳ、β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、コア５、コア２、９−ＯＳ、α−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（Ｔｎ）、Ｔαα、Ｈ４型、７−ＯＳ、β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、３’−ＳｉａＬｅｃ、ＬＮＴ、３，６−ＳｉａＴｎ、β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−６−硫酸、Ｇａｌα２Ｇａｌ、ＬＮｎＴおよび３−ＳｉａＴｎを全て、ＳＡＭ−６抗体への結合についてスクリーニングした。ＳＡＭ−６抗体はこれらの炭水化物のいずれにも検出可能に結合しなかった。したがって、本発明のＳＡＭ−６抗体は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質に結合するが、上記炭水化物の１つまたは複数には結合しない抗体を含む。
【００３９】
ＳＡＭ−６と表わされる抗体がＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質に特異的に結合する実施形態では、ＳＡＭ−６抗体は、炭水化物部分（例えば、Ｎ結合炭水化物部分またはＯ結合炭水化物部分）を含むＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の一領域に結合することができる。ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をＯ−グリコシダーゼ酵素で処理すると、おそらくＳＡＭ−６抗体結合エピトープの近くの１つ、いくつか、または全ての糖が除去されるので、ＳＡＭ−６抗体の糖タンパク質への結合が低下する（図１６）。ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をＮ−グリコシダーゼＦ酵素で処理すると、ＳＡＭ−６抗体の糖タンパク質への結合は破壊されない（図１６）。したがって、ＳＡＭ−６のＳＡＭ−６／Ｒへの結合は、Ｏ結合炭水化物部分を含む１つまたは複数の糖に近接している可能性がある。
【００４０】
実施例１２に記載の通り、ＳＡＭ−６抗体は、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８に結合する。したがって、Ｏ結合炭水化物部分は、ＳＡＭ−６抗体のＳＡＭ−６標的／Ｇｒｐ７８への結合に必要であると思われない。したがって、ＳＡＭ−６抗体は、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８またはグルコシル化されたＧｒｐ７８に結合する抗体を含む。
【００４１】
ＳＡＭ−６は、ａｐｏＢ１００にも検出可能に結合する。さらに、ＳＡＭ−６は、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、および脱グルコシル化されたＬＤＬに検出可能に結合する。したがって、これらのＳＡＭ−６標的のそれぞれは、ＳＡＭ−６が認識／結合する共通した構造のエピトープを共有すると考えられる。したがって、本発明は、Ｇｒｐ７８、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、そのグルコシル化または脱グルコシル化された型を含めた１つまたは複数に結合する抗体およびその部分配列を提供する。
【００４２】
「ＳＡＭ−６」または「ＳＡＭ−６抗体」という用語は、一般には、本明細書に開示されている任意の軽鎖可変領域配列または重鎖可変領域配列を有する抗体およびその部分配列を指す。「ＳＡＭ−６抗体」は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、または脱グルコシル化されたＬＤＬの１つまたは複数に特異的に結合する。ＳＡＭ−６抗体という用語は、他の抗体、例えば、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される、または軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含む抗体を除外することができる。
【００４３】
ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパクをＯ−グリコシダーゼで処理した後に観察されるＳＡＭ−６のＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質への結合が低下するので、ＳＡＭ−６は、Ｏ結合炭水化物部分を含む、またはそれに近接するＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の一領域に結合する可能性がある。ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をＮ−グリコシダーゼＦで処理した後、ＳＡＭ−６のＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質への結合が維持されることに示されるように、ＳＡＭ−６は、Ｎ結合炭水化物部分を含むＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の一領域には結合しないと思われる。
【００４４】
示した相補鎖決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を有するＳＡＭ−６の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の代表的なアミノ酸および核酸配列は以下の通りである。
【００４５】
抗体ＳＡＭ−６の軽鎖の可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号１３）：
【００４６】
【化１】
2012517216.tif 000003
抗体ＳＡＭ−６の軽鎖の可変領域（ＶＬ）のヌクレオチド配列（配列番号１４）：
【００４７】
【化２】
2012517216.tif 000004
抗体ＳＡＭ−６の重鎖の可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号１５）：
【００４８】
【化３】
2012517216.tif 000005
抗体ＳＡＭ−６の重鎖の可変領域（ＶＨ）のヌクレオチド配列（配列番号１６）：
【００４９】
【化４】
2012517216.tif 000006
ある特定の実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、新生細胞、癌細胞または腫瘍細胞などの過剰増殖性細胞で発現されると特徴付けられる。ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質が検出されている新生細胞、癌細胞および腫瘍細胞の非限定的な例としては、例えば、食道、胃、乳房、肺、結腸、膵臓、前立腺、子宮および卵巣の新生細胞、癌細胞および腫瘍細胞が挙げられる。さらに特定の態様では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、ＢＸＰＣ−３（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６８７；Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９  Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、２０１０８、ＵＳＡ）およびＡ５４９（ＤＳＭＺ寄託番号ＣＣＬ１８５；Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｅ  ７  Ｂ  ３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と表わされる腫瘍細胞系で発現されていると特徴付けられる。
【００５０】
本発明によると、変性ゲル電気泳動によって決定された、約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の見かけの分子量を有し、場合によって、配列番号１と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上、またはそのような百分率の値を超えない、もしくはそれを包含する任意の数値もしくは範囲の同一性を有する、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）もしくはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質と表わされる単離または精製された糖タンパク質が提供される。一実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、配列番号１に記載のＧｒｐ７８配列の全体または一部と同一のポリペプチド配列を有する。特定の態様では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、以下のアミノ酸配列の１つまたは複数の全体または一部と同一のポリペプチド配列を有する（配列番号２〜１２）：
【００５１】
【化５】
2012517216.tif 000007
である。別の実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質には、Ｇｒｐ７８炭水化物部分とは異なる炭水化物部分が結合している。特定の態様では、炭水化物部分は、Ｎ結合部分またはＯ結合部分である。
【００５２】
「と同一の」または「同一性」という用語は、２つ以上の参照実体が同じであることを意味する。したがって、２つのタンパク質配列が同一である場合、それらは、少なくとも参照領域または参照部分内で、同じアミノ酸配列を有する。２つの核酸配列が同一である場合、それらは、少なくとも参照領域または参照部分内で、同じポリヌクレオチド配列を有する。「同一領域」は、２つ以上の参照実体の、同じである一部分を指す。したがって、２つのタンパク質または核酸配列が、１つまたは複数の配列領域にわたって同一である場合、それらはその領域内で同一性を共有する。
【００５３】
「相同の」または「相同性」という用語は、２つ以上の参照実体が、所与の領域または部分にわたって少なくとも部分的な同一性を共有することを意味する。「実質的に相同」は、分子が、相同性を共有する参照分子または参照分子の関連／対応領域または部分の１つまたは複数の構造または機能（例えば、生物学的機能）の少なくとも部分的な構造または機能を有する、または有することが予想されるように、構造的または機能的に保存されていることを意味する。代表的な相同性は、参照ポリペプチドに５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。実質的に相同なポリペプチドは、少なくとも部分的な参照ポリペプチドと同様の活性を有する、または有することが予想される。例えば、特定の実施形態では、ＳＡＭ−６への少なくとも部分的な結合を保持する、１つまたは複数の修飾（例えば、炭水化物部分またはアミノ酸の置換、欠失または付加）を有するＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質と実質的な相同性を有すると考えられる。
【００５４】
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、本明細書では、アミド結合または等価物によって共有結合している２つ以上のアミノ酸、または「残基」を指すために互換的に使用される。ポリペプチドは、種々の長さであってよく、アミノ酸は、例えば、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、またはＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）で形成される化学結合を含めた、非天然かつ非アミド化学結合によって結合してよい。非アミド結合としては、例えば、ケトメチレン、アミノメチレン、オレフィン、エーテル、チオエーテルなどが挙げられる（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、７巻、２６７〜３５７頁（１９８３年）、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ、ＮＹを参照されたい）。
【００５５】
「単離された」という用語は、組成物の修飾語として使用され、組成物が人の手によって作出される、またはその組成物が天然に存在するｉｎ  ｖｉｖｏ環境中の１つまたは複数の他の組成物から分離されることを意味する。一般に、そのように分離された組成物は、天然で通常付随する１つまたは複数の物質、例えば、１つまたは複数のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜を実質的に含まない。したがって、単離された組成物は、その組成物が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的成分から、またはその組成物を作製した（例えば合成的にまたは細胞培養によって）人工培地から実質的に分離されている。例えば、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチドおよび核酸から実質的に分離されていて、何百万ものポリペプチド配列または核酸配列の中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドのライブラリー、例えばポリペプチドライブラリー、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーなどを含まない。単離された核酸は、他のポリペプチドおよび核酸から実質的に分離されていて、何百万ものポリペプチド配列または核酸配列の中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドのライブラリー、例えばポリペプチドライブラリー、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーなどを含まない。「単離された」という用語は、組成物の代替的な物理的形態を除外せず、例えば、単離されたタンパク質は、タンパク質の多量体、翻訳後修飾体（例えば、グルコシル化、リン酸化）または誘導体化された形態を含む。
【００５６】
「精製された」という用語は、組成物の修飾語として使用され、天然で一般に付随する物質のほとんどまたは全てを含まない組成物を指す。したがって、細胞から分離されたタンパク質は、標準の方法で細胞成分から分離されたときに実質的に精製されたと見なされ、一方、化学的に合成された核酸配列は、その化学的前駆体から分離されたときに実質的に精製されたと見なされる。したがって、精製されたというのは絶対的な純度を必要としない。さらに、「精製された」組成物は、１つまたは複数の他の分子と組み合わせることができる。したがって、「精製された」という用語は、組成物の組合せを除外しない。
【００５７】
「精製された」タンパク質および核酸は、標準の精製方法によって作製されたタンパク質および核酸を含む。この用語は、宿主細胞における組換え発現ならびに化学合成によって作製されたタンパク質および核酸も含む。「精製された」は、混入物のレベルが、ヒトまたは非ヒト動物に投与することについて規制当局、例えば食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）に容認されるレベルを下回る組成物を指す場合もある。
【００５８】
実質的な純度は質量で少なくとも約６０％以上の分子であってよい。純度は、約７０％または８０％またはそれ以上でもあってよく、例えば、９０％以上を超えてよい。純度は、それより少なくてよく、例えば、医薬担体では、分子の量は重量％で６０％未満であってよいが、通常付随する他の組成物と比較してその分子の相対的な比率が大きい。純度は、例えば、ＵＶ分光測定、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、気相）、ゲル電気泳動（例えば、銀染色またはクーマシー染色）および配列解析（ペプチドおよび核酸）を含めた任意の適切な方法によって決定することができる。
【００５９】
ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、悪性のおよび非悪性の新生細胞、腫瘍細胞および癌細胞で発現される。例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、悪性のおよび非悪性の胃組織細胞、肺扁平上皮癌細胞、肺腺癌細胞、メラノーマ細胞および鼻腔癌細胞で発現される。
【００６０】
ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、腫瘍細胞、癌細胞または新生細胞からも分泌される。例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、Ａ５４９細胞から分泌される。
【００６１】
ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、種々の病期および悪性度の腫瘍でも発現される。例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、肺扁平上皮癌および腺癌の病期第ＩＡ期、第ＩＢ期、第ＩＩＡ期、第ＩＩＢ期、第ＩＩＩＡ期、第ＩＩＩＢ期および第ＩＶ期、ならびに悪性度Ｇ１、Ｇ２およびＧ３の全てで検出された。
【００６２】
ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、さらに、転移腫瘍でも発現される。例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、リンパ節および脳に転移した肺扁平上皮癌および肺扁平上皮腺癌で検出された；ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、リンパ節に転移した乳癌（浸潤性、腺管）で検出された；ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、肝臓およびリンパ節に転移した結腸腺癌で検出された；ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、リンパ節に転移した胃腺癌（腸管内およびびまん性）で検出された；ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、リンパ節に転移した膵臓腺癌で検出された；ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、リンパ節に転移した頭頸部扁平上皮癌で検出された；ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、直腸、食道、皮膚、耳下腺、結腸、副腎および鼻粘膜上皮に転移したメラノーマで検出された。
【００６３】
ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、さらに腫瘍細胞系で発現される。例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、ＢＸＰＣ−３（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６８７；Ｐ．Ｏ．  Ｂｏｘ  １５４９  Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、２０１０８、ＵＳＡ）、Ａ５４９（ＤＳＭＺ寄託番号ＣＣＬ１８５；Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｅ  ７  Ｂ  ３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と表わされる腫瘍細胞系、メラノーマ細胞系ＣＲＬ１４２４およびＨＴＢ−６９、および鼻腔癌の細胞（ＲＰＭＩ２６５０）で発現される。単離または精製されたＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、本明細書に開示されているまたは当技術分野で公知の精製方法を用いてこれらの腫瘍、転移、細胞系および他の細胞（初代単離物または継代細胞系または不死化細胞系）から得ることができる。
【００６４】
本発明によると、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＶＬＤＬの１つまたは複数、その免疫原性部分配列、ならびに上記を発現する細胞に特異的に結合する抗体が提供される。そのような抗体は、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＶＬＤＬの１つまたは複数に特異的に結合する抗体、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をグリコシダーゼで処理するとその親和性が低下する抗体、ならびにＧｒｐ７８およびａｐｏＢ１００に特異的に結合する抗体を含む。
【００６５】
ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、一般には、非癌細胞では発現しない。例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、副腎、小脳、大脳、下垂体、乳房、結腸、食道、心臓、腎臓、肝臓、肺、骨格筋、中皮、末梢神経、坐骨神経、三叉神経、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、扁桃腺、子宮、子宮頸部、または骨髄由来の新鮮凍結（ＦＤＡ標準）正常ヒト組織では検出されなかった。ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、リンパ球、顆粒球、ヒト線維芽細胞および正常な鼻の細胞（ＨＮＥＰＣ）でも検出されなかった。したがって、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＶＬＤＬの１つまたは複数に特異的に結合する抗体は、上記の正常なヒト組織型、派生細胞またはそのような正常なヒト組織型を表わすと考えられる細胞にも、リンパ球、顆粒球、ヒト線維芽細胞または正常な鼻の細胞（ＨＮＥＰＣ）の１つまたは複数にも結合しないことが予想される。
【００６６】
グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＶＬＤＬの１つまたは複数に特異的に結合する抗体は、単離された抗体、精製された抗体および抗体部分配列を含む。一実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質細胞外ドメインに結合する抗体が提供される。別の実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質のＮ結合炭水化物部分またはＯ結合炭水化物部分の糖が除去されると、その結合が低下する抗体が提供される。別の実施形態では、Ｇｒｐ７８とは異なるＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質に結合する抗体が提供される。付加的な実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質特異的に結合するが、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をグリコシダーゼと接触させた後に結合の低下を示す抗体が提供される。一態様では、Ｏ−グリコシダーゼでＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質を処理すると、抗体のＳＡＭ−６／Ｒへの結合が低下する、または破壊される。別の態様では、Ｎ−グリコシダーゼＦでＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質を処理すると、抗体のＳＡＭ−６／Ｒへの結合は低下しない、または破壊されない。さらに別の実施形態では、抗体は、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＶＬＤＬの１つまたは複数に結合する。さらに別の実施形態では、抗体は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質のＮ結合炭水化物部分またはＯ結合炭水化物部分を含むエピトープに結合しない抗体が提供される。
【００６７】
グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＶＬＤＬの１つまたは複数に特異的に結合する発明の抗体は、ＳＡＭ−６抗体（例えば、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される、または軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含む）とは異なる抗体を含む。発明の抗体は、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される、または軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含むＳＡＭ−６抗体の重鎖可変配列または軽鎖可変配列と同一の重鎖可変配列または軽鎖可変配列を有さない抗体も含む。
【００６８】
抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）は単独で標的抗原に結合することができる。特定の実施形態では、重鎖可変領域（ＶＨ）が単独でグリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＬＤＬ、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＶＬＤＬまたはグリコシル化もしくは脱グリコシル化された酸化型ＬＤＬの１つまたは複数に結合することができる。
【００６９】
特定の実施形態では、本明細書で定義されたＳＡＭ−６抗体は、以下に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１８）内の重鎖可変領域配列または第３のＣＤＲ（ＣＤＲ３；ＡＲＤＲＬＡＶＡＧＲＰＦＤＹ；配列番号１７）と１００％の同一性を有する重鎖配列を有する。
【００７０】
【化６】
2012517216.tif 000008
本発明の抗体は、ＳＡＭ−６抗体の１つまたは複数の活性または機能を有する抗体を含む。一実施形態では、抗体は、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＶＬＤＬの１つまたは複数に特異的に結合する。別の実施形態では、抗体は、新生細胞、腫瘍細胞または癌細胞または転移細胞に対する結合が、対応する非新生細胞、非腫瘍細胞または非癌細胞または非転移細胞を超える。別の実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質抗体がＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質を発現する細胞に結合することにより、細胞の成長もしくは増殖が抑制される、減少もしくは低下する、または細胞の死、溶解もしくはアポトーシスが刺激もしくは誘導される。
【００７１】
抗体が結合するＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質を発現する非限定的な細胞としては、任意の病期（例えば、病期第ＩＡ期、第ＩＢ期、第ＩＩＡ期、第ＩＩＢ期、第ＩＩＩＡ期、第ＩＩＩＢ期および第ＩＶ期）または悪性度（例えば、悪性度Ｇ１、Ｇ２またはＧ３）の悪性のおよび非悪性の胃組織細胞、肺扁平上皮癌、肺腺癌細胞、メラノーマならびに鼻腔癌の細胞が挙げられる。抗体が結合するＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質を発現する追加的な非限定的な細胞としては、リンパ節および脳に転移した肺扁平上皮癌および扁平上皮腺癌；リンパ節に転移した乳癌（浸潤性、腺管）；肝臓およびリンパ節に転移した結腸腺癌；ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質がリンパ節に転移した胃腺癌（腸管内およびびまん性）で検出された；リンパ節に転移した脾臓腺癌；リンパ節に転移した頭頸部扁平上皮癌；および直腸、食道、皮膚、耳下腺、結腸、副腎および鼻粘膜上皮に転移したメラノーマなどの転移腫瘍の細胞を含む。
【００７２】
抗体が結合するＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質を発現する別の非限定的な細胞としては、ＢＸＰＣ−３（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６８７；Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９  Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、２０１０８、ＵＳＡ）、Ａ５４９（ＤＳＭＺ寄託番号ＣＣＬ１８５；  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｅ  ７  Ｂ  ３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、メラノーマ細胞のＣＲＬ１４２４およびＨＴＢ−６９ならびに鼻腔癌の細胞ＲＰＭＩ２６５０などの腫瘍細胞系が挙げられる。
【００７３】
したがって、付加的な実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質抗体がＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質を発現する新生細胞、腫瘍細胞もしくは癌細胞もしくは転移細胞に結合すると、細胞の成長もしくは増殖が抑制される、減少もしくは低下する、または細胞の死、溶解もしくはアポトーシスが刺激もしくは誘導される。さらに別の実施形態では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質抗体がＢＸＰＣ−３細胞、Ａ５４９細胞、ＣＲＬ１４２４細胞、ＨＴＢ−６９細胞、もしくはＲＰＭＩ２６５０細胞に結合すると、ＢＸＰＣ−３細胞、Ａ５４９細胞、ＣＲＬ１４２４細胞、ＨＴＢ−６９細胞、もしくはＲＰＭＩ２６５細胞の成長もしくは増殖が抑制される、減少もしくは低下する、またはＢＸＰＣ−３細胞、Ａ５４９細胞、ＣＲＬ１４２４細胞、ＨＴＢ−６９細胞、もしくはＲＰＭＩ２６５細胞の死、溶解もしくはアポトーシスが刺激もしくは誘導される。特定の態様では、細胞の成長もしくは増殖は、対照（未処理）細胞と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、またはそれ以上またはそのような百分率の値を超えない、もしくはそれを包含する任意の数値もしくは範囲で抑制される、減少または低下する。別の特定の態様では、細胞の死、溶解もしくはアポトーシスは、対照（未処理）細胞と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、またはそれ以上、またはそのような百分率の値を超えない、もしくはそれを包含する任意の数値もしくは範囲である。さらに別の実施形態では、抗体が糖タンパク質を発現する細胞に結合すると、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８またはカスパーゼ−９）の活性化が引き起こされる。
【００７４】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。抗体に関して使用される場合、「モノクローナル」という用語は、任意の真核生物クローン、原核生物クローンまたはファージクローンを含めた単一のクローンに基づく、そのクローンから得られた、またはそのクローンに由来する抗体を指す。したがって、「モノクローナル」抗体は、本明細書では、それを作製した方法ではなく、構造的に定義される。
【００７５】
本発明の抗体は、抗体の任意のクラス、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはサブクラスに属してよい。ＩｇＧについての代表的なサブクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。
【００７６】
本発明の抗体は、カッパ軽鎖配列またはラムダ軽鎖配列を、天然に存在する抗体の全長、その混合物（すなわち、カッパ鎖配列とラムダ鎖配列の融合物）、およびその部分配列／断片のいずれかで有してよい。天然に存在する抗体分子は、２つのカッパ軽鎖または２つのラムダ軽鎖を含有する。カッパ軽鎖とラムダ軽鎖との間の主要な差異は、定常領域の配列である。
【００７７】
本発明によると、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＶＬＤＬの１つまたは複数に特異的に結合し、ＳＡＭ−６の、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＶＬＤＬ、またはその部分配列への結合と部分的または完全に競合する抗体が提供される。一実施形態では、１つまたは複数のＳＡＭ−６の、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＶＬＤＬ、またはその部分配列への結合を抑制する抗体が提供される。種々の態様では、抗体は、ＳＡＭ−６の、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＶＬＤＬの１つまたは複数、またはその部分配列への結合を、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上、またはそのような百分率の値を超えない、もしくはそれを包含する任意の数値もしくは範囲で競合的に抑制する。別の実施形態では、ＳＡＭ−６の、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＶＬＤＬの１つまたは複数、またはその部分配列への結合を妨害または遮断する抗体が提供される。
【００７８】
ＳＡＭ−６抗体の、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＶＬＤＬの１つまたは複数、またはその部分配列への結合と競合する発明の抗体は、ＳＡＭ−６抗体の結合特異性を有し得る。したがって、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＶＬＤＬの１つまたは複数、またはその部分配列への結合に対してＳＡＭ−６抗体と競合するＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質抗体は、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＶＬＤＬの１つまたは複数、またはその部分配列のエピトープ（例えば、構造）に特異的に結合することができる。ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質抗体は、グリコシル化または脱グリコシル化されたＬＤＬまたはｏｘＬＤＬへの結合に対してＳＡＭ−６抗体と競合することもでき得る。したがって、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＶＬＤＬ、またはその部分配列に特異的に結合し、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＶＬＤＬ、またはその部分配列の、ＳＡＭ−６抗体が結合するのと同じエピトープ、同じエピトープの一部または配列もしくは構造に結合する抗体を含めた、ＳＡＭ−６抗体の、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＶＬＤＬ、またはその部分配列への結合と部分的または完全に競合する抗体が提供される。
【００７９】
ＳＡＭ−６抗体の、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはグルコシル化もしくは脱グルコシル化された型の１つまたは複数、またはその部分配列への結合と競合する抗体は、従来の競合結合アッセイを用いてスクリーニングし、同定することができる。スクリーニングされた抗体は、ＳＡＭ−６抗体の、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはグルコシル化された型または脱グルコシル化された型、またはその部分配列への結合と競合する能力に基づいて選択される。ＳＡＭ−６の、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその部分配列への結合と競合する、またはその結合を抑制、妨害もしくは遮断する抗体の能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、ウエスタンブロットなどを含めた当技術分野で公知の種々のアッセイによって決定することができる。
【００８０】
発明の抗体は、ＳＡＭ−６抗体の結合親和性を有する抗体を含む。そのような抗体の結合親和性は、ＳＡＭ−６抗体とは異なる可能性があり（すなわち、グルコシル化もしくは脱グルコシル化された型のＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数、またはその部分配列に対する親和性が高いまたは低い）、したがって、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数、またはその部分配列への結合に対して競合する抗体の能力は変動し得る。したがって、発明の抗体は、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数、またはその部分配列に対する親和性が、ＳＡＭ−６抗体よりも高いまたは低い抗体を含む。例えば、本発明のＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質抗体の親和性は、参照抗体（例えば、ＳＡＭ−６抗体）の２〜５倍、５〜１０倍、１０〜１００倍、１００〜１０００倍または１０００〜１０，０００倍またはそのような値を超えない、もしくはそれを包含する任意の数値もしくは範囲より高いまたは低くてよい。特異的な非限定的なＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質抗体は、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその部分配列に対する結合親和性が、ＳＡＭ−６の結合親和性の約１〜５，０００倍の範囲内にある。追加的な特異的な非限定的な抗体は、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその部分配列に対する結合親和性が、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその部分配列に対するＳＡＭ−６のＫｄ約１０−２Ｍ〜Ｋｄ約１０−１５Ｍの範囲内、またはＫｄ約１０−５Ｍ〜Ｋｄ約１０−１２Ｍの範囲内にある、またはそのような値を超えない、もしくはそれを包含する任意の数値もしくは範囲である。さらなる特定の実施形態では、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその部分配列に対する結合親和性は、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満、および１０−１５Ｍ未満、またはそのような値を��えない、もしくはそれを包含する任意の数値もしくは範囲の解離定数（ＫＤ）を有する。
【００８１】
結合親和性は、会合速度（Ｋａ）および解離速度（Ｋｄ）によって決定することができる。平衡親和性定数、ＫＤは、Ｋａ／Ｋｄ比である。会合速度（Ｋａ）および解離速度（Ｋｄ）は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＲｉｃｈおよびＭｙｓｚｋａ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１巻：５４頁（２０００年）；Ｅｎｇｌｅｂｉｅｎｎｅ、Ａｎａｌｙｓｔ．１２３巻：１５９９頁（１９９８年））を用いて測定することができる。結合速度をリアルタイムで検出し、モニタリングするための器具類および方法は公知であり、市販されている（ＢｉａＣｏｒｅ２０００、ＢｉａｃｏｒｅＡＢ、Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ；およびＭａｌｍｑｖｉｓｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．２７巻：３３５頁（１９９９年））。ＫＤ値は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の結合部位の２分の１（５０％）が飽和するために必要な抗体濃度として定義される。
【００８２】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は、当技術分野で公知である。例えば、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその部分配列、またはその免疫原性断片は、場合によって、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）もしくはオボアルブミン（例えば、ＢＳＡ）などの担体にコンジュゲートされ、またはフロイント完全アジュバントもしくはフロイント不完全アジュバントなどのアジュバントと混合され、動物を免疫化するために使用される。従来のハイブリドーマ技術を使用して、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質に応答する免疫化された動物から脾細胞を単離し、骨髄腫細胞と融合することができる。ハイブリドーマから産生されたモノクローナル抗体を、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質またはその免疫原性断片との反応性についてスクリーニングすることができる。
【００８３】
免疫化することができる動物として、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシもしくは去勢ウシ、モルモットまたは霊長類が挙げられる。最初の免疫化および任意選択のその後の免疫化のいずれも、静脈内、腹腔内、筋肉内、または皮下の経路を経由させることができる。後の免疫化は、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその部分配列、調製物が同じ濃度または異なる濃度であってよく、また間隔が規則的または不規則であってよい。
【００８４】
動物は、ヒトのＩｇＧ遺伝子座を含むように遺伝子改変し、したがってヒト抗体を作製するために使用することができる動物を含む。内因性免疫グロブリンを発現しない、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニック動物が、例えば米国特許第５，９３９，５９８号に記載されている。ヒトポリクローナル抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するための追加的な方法が記載されている（例えば、Ｋｕｒｏｉｗａら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０巻：８８９頁（２００２年）；ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；および同第５，９３９，５９８号を参照されたい）。ヒト抗体を作製するための技術の概要はＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３巻：６５頁（１９９５年））に記載されている。
【００８５】
抗体は、ハイブリドーマ、組換えおよびファージ提示の技法、またはそれらの組合せを含めた他の技法を用いて生成することもできる（米国特許第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号および同第４，４１１，９９３号を参照されたい；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｋｅｎｎｅｔｔ、ＭｃＫｅａｒｎおよびＢｅｃｈｔｏｌ（編集）、１９８０年、およびＨａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８年も参照されたい）。
【００８６】
抗体は、例えば、ＣＤＲ移植（ＥＰ２３９，４００；Ｗ０９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；および同第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８巻：４８９頁（１９９１年）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ７巻：８０５頁（１９９４年）；Ｒｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ９１巻：９６９頁（１９９４年））、および鎖シャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）を含めた当技術分野で公知の種々の技法を用いてヒト化することができる。ヒトコンセンサス配列（Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１巻：１６９頁（１９９４年）；およびＰａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８巻：４８９頁（１９９１年））は、ヒト化抗体を作製するために以前使用されていた（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８９巻：４２８５頁（１９９２年）；およびＰｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１巻：２６２３頁（１９９３年））。
【００８７】
キメラ抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９巻：１２０２頁（１９８５年）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４巻：２１４頁（１９８６年）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ１２５巻：１９１頁（１９８９年）；および米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７号）。一方の種の抗体由来の可変ドメインで他方の種の可変ドメインが置換されているキメラ抗体が、例えば、Ｍｕｎｒｏ、Ｎａｔｕｒｅ３１２巻：５９７頁（１９８４年）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３１２巻：６０４頁（１９８４年）；Ｓｈａｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ３０９巻：３６４頁（１９８４年）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８１巻：６８５１頁（１９８４年）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ３１２巻：６４３頁（１９８４年）；Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ３３７巻：５２５頁（１９８９年）；およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３３９巻：６８頁（１９８９年）に記載されている。
【００８８】
抗体の方法において追加的に利用することができる適切な技法としては、親和性精製、非変性ゲル精製、ＨＰＬＣもしくはＲＰ−ＨＰＬＣ、サイズ排除、プロテインＡカラムでの精製、またはこれらの技法の任意の組合せが挙げられる。抗体のアイソタイプは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定することができ、例えば、マウスＩｇ吸収抗ヒトＩｇを用いてヒトＩｇを同定することができる。
【００８９】
抗体を生成するために適切な、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその部分配列は、当技術分野で公知の種々の標準のタンパク質の精製または組換え発現の技法のいずれかによって作製することができる。例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、ＢＸＰＣ−３細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６８７；Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９  Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、２０１０８、ＵＳＡ）またはＡ５４９細胞（ＤＳＭＺ寄託番号ＣＣＬ１８５；Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ  （Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｅ  ７  Ｂ  ３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）などの細胞から得ることができる。
【００９０】
免疫応答を生成するために適切なタンパク質の形態は、免疫原性断片などの全長タンパク質のペプチド部分配列を含む。追加的なタンパク質の形態としては、調製物または細胞抽出物または画分、部分的に精製された、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその部分配列、ならびにグリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその部分配列を発現する細胞全体、またはグリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその部分配列を発現する細胞の調製物が挙げられる。
【００９１】
本発明によると、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数に特異的に結合する抗体を作製する方法がさらに提供される。一実施形態では、方法は、変性ゲル電気泳動によって決定された約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の分子量を有し、場合によって少なくとも１つのＯ結合炭水化物部分を有し、Ｇｒｐ７８またはその断片との少なくとも部分的な配列相同性を有するポリペプチドを動物に投与するステップと、その動物を、そのポリペプチド、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬに結合する抗体の発現についてスクリーニングするステップと、そのポリペプチド、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬに結合する抗体を産生する動物を選択するステップと、選択された動物から抗体を単離するステップとを含む。別の実施形態では、方法は、変性ゲル電気泳動によって決定された、約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の見かけの分子量を有し、場合によって少なくとも１つのＮ結合炭水化物部分またはＯ結合炭水化物部分を有し、Ｇｒｐ７８またはその断片との少なくとも部分的な配列相同性を有するポリペプチドを動物に投与するステップと、その動物を、そのポリペプチド、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬに結合する抗体の発現についてスクリーニングするステップと、そのポリペプチド、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＧｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬに結合する抗体を産生する動物を選択するステップと、選択された動物から抗体を単離するステップとを含む。別の実施形態では、方法は、変性ゲル電気泳動によって決定された、約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の見かけの分子量を有し、少なくとも１つのＮ結合炭水化物部分またはＯ結合炭水化物部分を有し、Ｇｒｐ７８またはその断片との少なくとも部分的な配列相同性を有するポリペプチドを、ヒト免疫グロブリンを発現することができる動物に投与するステップと、そのポリペプチドまたはその断片に結合する抗体を産生する動物から脾臓細胞を単離するステップと、その脾臓細を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを作製するステップと、そのハイブリドーマを、変性ゲル電気泳動によって決定された、約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の見かけの分子量を有し、少なくとも１つのＮ結合炭水化物部分またはＯ結合炭水化物部分を有し、Ｇｒｐ７８またはその断片との少なくとも部分的な配列相同性を有するポリペプチドに結合する抗体の発現についてスクリーニングするステップとを含む。種々の態様では、ポリペプチド断片は、Ｎ結合炭水化物部分またはＯ結合炭水化物部分を有するポリペプチドの一部分を含む。
【００９２】
発明の方法は、１つまたは複数のＳＡＭ−６抗体の機能または活性を有する、ＳＡＭ−６抗体とは異なる抗体を作製するステップを含む。代表的な機能または活性としては、例えば、グリコシル化もしくは脱グリコシル化されたＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質（例えば、細胞外ドメイン）、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその部分配列への結合；ＳＡＭ−６／Ｒ、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８または脱グルコシル化されたＬＤＬ、またはその免疫原性断片を含むエピトープへの結合；ＳＡＭ−６抗体の、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその部分配列への結合と競合すること；ＳＡＭ−６抗体の、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその部分配列への結合と競合すること；ＳＡＭ−６抗体の結合親和性（例えば、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその部分配列に対する高いもしくは低い親和性）を有し、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその部分配列のいずれかを発現する細胞に結合すること；ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質を発現する細胞に結合し、細胞の成長もしくは増殖を減少もしくは低下させること、または細胞（例えば、新生細胞、腫瘍細胞または癌細胞または転移細胞）の死、溶解もしくはアポトーシスを刺激もしくは誘導すること；ＢＸＰＣ−３細胞もしくはＡ５４９細胞に結合し、ＢＸＰＣ−３細胞もしくはＡ５４９細胞の成長もしくは増殖を抑制すること、またはＢＸＰＣ−３細胞もしくはＡ５４９細胞の死、溶解もしくはアポトーシスを刺激もしくは誘導すること；カスパーゼ（例えば、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８またはカスパーゼ−９）の活性化を引き起こすことが挙げられる。代表的な機能または活性としては、グリコシダーゼに対するＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の結合の感受性または非感受性、例えば、Ｏ−グリコシダーゼ酵素でＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質を処理すると、抗体のＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質への結合が低下するまたは破壊されること、およびＮ−グリコシダーゼＦ酵素でＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質を処理すると抗体のＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質への結合が低下しないまたは破壊されないことも挙げられる。
【００９３】
本発明によると、タンパク質、抗体、核酸および他の組成物の修飾型も、修飾型が、修飾されていないもしくは参照のタンパク質、核酸、または抗体の機能または活性の少なくとも一部を保持しているという条件で提供される。例えば、修飾されたＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質（例えば、部分配列または断片）を、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質に特異的に結合する抗体を作製するための免疫源として使用することができる。修飾されたＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質抗体（例えば、部分配列または断片）を本発明の治療方法、診断方法、スクリーニング方法および検出方法において使用することができる。
【００９４】
本明細書で使用される、「修飾する」という用語、およびその文法的変異形は、組成物が参照組成物から外れることを意味する。そのような修飾されたタンパク質、核酸および他の組成物は、参照の修飾されていないタンパク質、核酸、または組成物よりも高い活性または低い活性、またはそれとは異なる機能を有し得る。
【００９５】
修飾体は、「変異」と称することができるアミノ酸および炭水化物部分の置換、付加および欠失を含む。アミノ酸修飾体の特定の非限定的な例としては、タンパク質の部分配列および断片が挙げられる。代表的なＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の部分配列および断片としては、場合によってＧｒｐ７８の炭水化物部分とは異なるＮ結合炭水化物部分またはＯ結合炭水化物部分を含むＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の一部分が挙げられる。代表的なＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の部分配列および断片としては、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の免疫原性部分、例えば、１つまたは複数のＮ結合炭水化物部分またはＯ結合炭水化物部分を含むＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の一部分も挙げられる。代表的なＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の部分配列および断片はとしてはさらに、ＳＡＭ−６抗体に結合するＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の一部分も挙げられる。炭水化物部分修飾の特定の非限定的な例としては、ＳＡＭ−６抗体への結合が低下するもしくは破壊される１つまたは複数の糖残基の欠失（Ｏ結合部分もしくはその糖）、またはＳＡＭ−６抗体への結合が低下しないもしくは破壊されない１つまたは複数の糖残基の欠失（Ｎ結合部分もしくはその糖）を有するＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質が挙げられる。
【００９６】
本明細書で使用される、「部分配列」または「断片」という用語は、全長分子の一部分を意味する。ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の部分配列は、全長ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質よりもアミノ酸が１つまたは複数少ない（例えば、１つまたは複数の、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかからの内部または末端のアミノ酸欠失）を有する。抗体の部分配列は、全長抗体よりもアミノ酸が１つまたは複数少ない。核酸部分配列は、全長比較核酸配列よりもヌクレオチドが少なくとも１つ少ない。したがって、部分配列は、全長のネイティブな分子より短い任意の長さであってよい。
【００９７】
本発明の代表的な抗体部分配列および抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合したＦｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ、ＶＨ、三重特異性（Ｆａｂ３）、二重特異性（Ｆａｂ２）、ダイアボディ（（ＶＬ−ＶＨ）２または（ＶＨ−ＶＬ）２）、トリアボディ（三価）、テトラボディ（四価）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（（ｓｃＦＶ−ＣＨ３）２）、二重特異性単鎖Ｆｖ（Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ）、ＩｇＧｄｅｌｔａＣＨ２、ｓｃＦｖ−Ｆｃおよび（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃが挙げられる。そのような部分配列および断片は、全長抗体と同様の結合親和性、全長抗体と同様の結合特異性、または１つまたは複数の全長抗体と同様の活性または機能、例えば、ＳＡＭ−６抗体の機能または活性を有し得る。「機能性部分配列」および「機能性断片」という用語は、抗体に関する場合、少なくとも一部の、インタクトな参照抗体の１つまたは複数の機能または活性、例えば、ＳＡＭ−６抗体の機能または活性を保持する抗体の一部分を指す。例えば、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数、またはその免疫原性断片に結合する抗体部分配列が機能性部分配列と見なされる。
【００９８】
抗体部分配列および抗体断片を組み合わせることができる。例えば、ＶＬ部分配列またはＶＨ部分配列を、リンカー配列によって連結し、それによってＶＬ−ＶＨキメラを形成することができる。単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）部分配列の組合せをリンカー配列によって連結し、それによってｓｃＦｖ−ｓｃＦｖキメラを形成することができる。抗体部分配列および抗体断片は、単鎖抗体または可変領域（単数または複数）を単独で、または他の部分配列の全てまたは一部分を組み合わせて含む。
【００９９】
抗体部分配列および抗体断片は、抗体をタンパク質分解性の加水分解することによって、例えば、抗体全体をペプシンまたはパパインで消化することによって調製することができる。ペプシンを用いた酵素的切断によって作製された抗体部分配列および抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２と表わされる５Ｓ断片をもたらす。この断片をチオール還元剤を使用してさらに切断して３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価断片を作製することができる。あるいは、ペプシンを使用して酵素的切断することにより、２つの一価Ｆａｂ’断片およびＦｃ断片が直接作製される（例えば、米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３３１，６４７号；およびＥｄｅｌｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｙｍｏｌ．１巻：４２２頁（１９６７年）を参照されたい）。一価の軽鎖−重鎖断片からの重鎖の分離、断片のさらなる切断、または他の酵素的切断または化学的切断などの、抗体を切断する他の方法も使用することができる。
【０１００】
タンパク質および抗体、ならびにその部分配列および断片は、遺伝子的な方法体系によって作製することができる。そのような技法としては、タンパク質または抗体をコードする遺伝子の全てまたは一部を、Ｃｏｓ細胞またはＥ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞で発現させることが挙げられる。組換え宿主細胞により、全長配列または部分配列、例えば、ｓｃＦｖが合成される（例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２巻：９７頁（１９９１年）、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２巻：４２３頁（１９８８年）；および米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい）。単鎖Ｆｖｓおよび抗体は、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３巻：４６頁（１９９１年）；Ｓｈｕら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ９０巻：７９９５頁（１９９３年）；およびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０巻：１０３８頁（１９８８年））に記載の通り作製することができる。
【０１０１】
修飾されたタンパク質は、Ｌ−アミノ酸を置換したＤ−アミノ酸（およびそれらの混合物）、構造的類似体および機能的類似体、例えば、合成または非天然のアミノ酸またはアミノ酸類似体を有するペプチド模倣薬、ならびに誘導体化された形態の１つまたは複数も含む。修飾は、分子のアミノ末端とカルボキシ末端との間の端々アミド結合などの環状構造、または分子内もしくは分子間のジスルフィド結合を含む。
【０１０２】
修飾されたタンパク質は、アミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態では、修飾されたタンパク質は、１つまたはいくつかの保存的または非保存的な置換を有する。アミノ酸置換を含むタンパク質は、核酸によってコードすることができる。したがって、アミノ酸置換を含むタンパク質をコードする核酸配列も提供される。
【０１０３】
「保存的置換」は、１つのアミノ酸を、生物学的に、化学的にまたは構造的に類似した残基で置き換えることである。生物学的に類似したとは、置換により生物活性、例えば、ＳＡＭ−６、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８または脱グルコシル化されたＬＤＬの結合活性が破壊されないことを意味する。構造的に類似したとは、アミノ酸が、アラニン、グリシンおよびセリンなどの長さが類似した側鎖、または類似したサイズを有することを意味する。化学的類似性とは、残基が同じ電荷を有する、または両方が親水性または疎水性であることを意味する。特定の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンなどの１つの疎水性残基が別の残基に置換されること、またはリシンからアルギニン、アスパラギン酸からグルタミン酸、またはアスパラギンからグルタミン、トレオニンからセリンに置換されることなど、１つの極性残基が別の残基に置換されることが挙げられる。
【０１０４】
修飾型は、誘導体化された配列、例えば、遊離のアミノ基がアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基を形成し；遊離のカルボキシ基が塩、メチルエステルおよびエチルエステルを形成し；遊離のヒドロキシル基がＯ−アシル誘導体またはＯ−アルキル誘導体を形成するアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸誘導体、例えば、プロリンに対する４−ヒドロキシプロリン、リシンに対する５−ヒドロキシリシン、セリンに対するホモセリン、リシンに対するオルニチンなどを含む。修飾は、当技術分野で公知の方法（例えば、ＰＣＲに基づく部位特異的な欠失および挿入突然変異誘導、化学修飾および突然変異誘導、架橋、など）を用いて引き起こすことができる。
【０１０５】
タンパク質（例えば、抗体）、核酸および他の組成物の修飾型は、付加および挿入を含む。例えば、付加は、タンパク質（例えば、抗体）、核酸または他の組成物に任意の種類の分子が共有結合または非共有結合することであってよい。一般には、付加および挿入により、異なる機能または活性が付与される。
【０１０６】
付加物および挿入物は、融合（キメラ）ポリペプチドまたは核酸配列を含み、それは配列に共有結合した参照のネイティブな（野生型）配列には通常存在しない１つまたは複数の分子を有する配列である。特定の例は、多機能性タンパク質（例えば、多特異的な抗体）を作製するための別のタンパク質（例えば、抗体）のアミノ酸配列である。
【０１０７】
本発明によると、異種ドメインを含むタンパク質、抗体、核酸および他の組成物が提供される。異種ドメインは、アミノ酸の付加物または挿入物であってよいが、アミノ酸残基に限定されない。したがって、異種ドメインは、種々の異なる種類の、小さなまたは大きな機能性部分のいずれからなってもよい。そのような部分としては、核酸、ペプチド、炭水化物、脂質、または薬物（例えば、細胞増殖剤）などの小さな有機化合物、金属（金、銀）などが挙げられる。
【０１０８】
異種ドメインの特定の非限定的な例としては、例えば、タグ、検出可能な標識および細胞毒性剤が挙げられる。タグおよび検出可能な標識の特異的な例としては、酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）；酵素の基質；リガンド（例えば、ビオチン）；受容体（アビジン）；放射性核種（例えば、Ｃ１４、Ｓ３５、Ｐ３２、Ｐ３３、Ｈ３、Ｉ１２５、Ｉ１３１、ガリウム−６７およびガリウム−６８、スカンジウム（ｓｃａｎｔｉｕｍ）−４７、インジウム−１１１、ラジウム−２２３）；Ｔ７タグ、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグおよびＦＬＡＧタグ；高電子密度試薬；エネルギー伝達分子；常磁性の標識；フルオロフォア（フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｔｈｒｉｎ）；発色団；化学発光（イミダゾール、ルシフェラーゼ）；および生物発光剤が挙げられる。細胞毒性剤の特異的な例としては、ジフテリア、毒素、コレラ毒素およびヒマ毒が挙げられる。
【０１０９】
異種ドメインの追加的な例としては、例えば、抗細胞増殖性剤（例えば、抗新生物剤、抗腫瘍剤もしくは抗癌剤、または抗転移剤）が挙げられる。抗細胞増殖性剤の特定の非限定的な例は、本明細書に開示されており、当技術分野で公知である。
【０１１０】
タンパク質（例えば、抗体）、核酸、または他の組成物と付加物または挿入物（例えば、異種ドメイン）との間にリンカー配列を挿入して、その２つの実体が、異なる機能または活性を少なくとも部分的に維持するようにすることができる。リンカー配列は、可動性の構造、規則正しい二次構造を形成できないこと、またはいずれかのドメインを促進するもしくはそれと相互作用することができる疎水性特性もしくは電荷特性を含む１つまたは複数の性質を有してよい。可動性タンパク質領域において一般に見出されるアミノ酸としては、グリシン、アスパラギンおよびセリンが挙げられる。トレオニンおよびアラニンなどの他の中性に近いアミノ酸も、リンカー配列に使用することができる。リンカー配列の長さは変動してよい（例えば、米国特許第６，０８７，３２９号を参照されたい）。リンカーは、スルホスクシンイミジル誘導体（スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＰＢ）、スベリン酸ジサクシンイミジル（ＤＳＳ）、グルタル酸ジサクシンイミジル（ＤＳＧ）および酒石酸ジサクシンイミジル（ＤＳＴ）などの化学的架橋剤およびコンジュゲート剤をさらに含む。
【０１１１】
付加の別の例としては、グルコシル化、脂肪酸、脂質、アセチル化、リン酸化、アミド化、ホルミル化、ユビキチン化、および保護／遮断基による誘導体化、および多数の化学修飾のいずれかが挙げられる。他の変更および可能性が当業者に容易に明らかになり、本発明の範囲内であると見なされる。
【０１１２】
そのような修飾された配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて、細胞発現またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける翻訳によって作出することができる。ポリペプチドおよび核酸配列は、当技術分野で公知の方法、例えば、自動ペプチド合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡを参照されたい）を使用した化学合成によっても作製することができる。
【０１１３】
本発明によると、変性ゲル電気泳動によって決定された、約８０〜８２キロダルトン（ｋＤａ）の範囲の見かけの分子量を有する、ＳＡＭ−６受容体（ＳＡＭ−６／Ｒ）またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質と表わされる糖タンパク質をコードする単離または精製された核酸が提供される。一実施形態では、核酸配列は、配列番号１に記載のＧｒｐ７８と相同なポリペプチド配列を有するＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をコードする。別の実施形態では、核酸配列は、少なくとも１つのＧｒｐ７８とは異なる窒素（Ｎ）結合炭水化物部分または酸素（Ｏ）結合炭水化物部分が結合することができるＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をコードする。別の実施形態では、核酸配列は、ＳＡＭ−６抗体が特異的に結合するエピトープまたはエピトープの一部である少なくとも１つの窒素（Ｎ）結合炭水化物部分または酸素（Ｏ）結合炭水化物部分が結合することができるＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をコードする。したがって、本発明による核酸は、１）配列番号１に記載のＧｒｐ７８と同一であるポリペプチド配列を有するＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質；２）ＳＡＭ−６が特異的に結合できるＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質配列（例えば、少なくとも１つの窒素（Ｎ）結合炭水化物部分または酸素（Ｏ）結合炭水化物部分が結合することができる）；および３）ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の部分配列および断片（例えば、配列番号２〜１２）をコードする配列を含む。
【０１１４】
本発明によると、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の部分配列および断片をコードする単離または精製された核酸も提供される。一実施形態では、核酸配列は、場合によってはＧｒｐ７８の炭水化物部分とは異なる、少なくとも１つの窒素（Ｎ）結合炭水化物部分または酸素（Ｏ）結合炭水化物部分が結合することができるＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質配列をコードする。特定の態様では、核酸配列は、約１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００ヌクレオチドの長さ、またはそのような長さを超えないまたはそれを包含する任意の数値または範囲の長さを有し、場合によっては、Ｇｒｐ７８の炭水化物部分とは異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）結合炭水化物部分または酸素（Ｏ）結合炭水化物部分が結合することができるＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をコードする。
【０１１５】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」などの用語は、少なくとも２つ以上の、リン酸エステル結合または等価物によって結合しているリボ核酸塩基対またはデオキシリボ核酸塩基対（ヌクレオチド）を指す。核酸は、ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオシドを含む。核酸は、一重、二重または三重の環状または直線状の分子を含む。代表的な核酸としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノム核酸、天然に存在する核酸および天然に存在しない核酸、例えば合成核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
核酸は、種々の長さであってよい。核酸の長さは、一般には長さ約２０ヌクレオチド〜２０Ｋｂ、またはそのような長さを超えない、もしくはそれを包含する任意の数値もしくは範囲、１０ヌクレオチド〜１０Ｋｂ、１〜５Ｋｂ以下、１０００〜約５００ヌクレオチド以下にわたる。核酸はそれより短くてもよく、例えば、長さ１００〜約５００ヌクレオチド、または約１２〜２５、２５〜５０、５０〜１００、１００〜２５０、または約２５０〜５００ヌクレオチドまたはそのような長さを超えない、もしくはそれを包含する任意の数値もしくは範囲または値であってよい。短いポリヌクレオチドは、一般に一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの「オリゴヌクレオチド」または「プローブ」と称される。しかし、そのようなオリゴヌクレオチドの長さに上限はない。
【０１１７】
ポリヌクレオチドは、Ｌ−型またはＤ型およびそれらの混合物を含み、被験体に投与された際に分解に抵抗性であるようにさらに修飾することができる。特定の例としては、被験体の種々の組織または体液に存在するエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼに対して抵抗性の５’結合または３’結合が挙げられる。
【０１１８】
別の実施形態では、本発明は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質配列の全てまたは部分配列または断片をコードする核酸とハイブリダイズする、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質配列の全てまたは部分配列または断片をコードする核酸配列と少なくとも７５〜９０％相補的または相同である核酸を提供する。一実施形態では、核酸配列は、約１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００ヌクレオチド、またはそのような長さを超えない、もしくはそれを包含する任意の数値もしくは範囲の長さを有する。特定の態様では、核酸配列は、Ｇｒｐ７８とは異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）結合炭水化物部分または酸素（Ｏ）結合炭水化物部分が結合することができるＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をコードする核酸配列とハイブリダイズする。
【０１１９】
「ハイブリダイズする」という用語およびその文法的変異形は、核酸配列間の結合を指す。ハイブリダイズしている配列は、一般には参照（例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質）配列もしくは参照（例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質）配列のアミノ酸配列をコードする核酸に相補的なアミノ酸配列をコードする核酸と約５０％の相同性（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える同一性）を有する。参照配列、例えば、参照（例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質）配列のアミノ酸配列をコードする核酸と１００％または完全と相補的な、ハイブリダイズしている配列は、ミスマッチなしで１００％の塩基対合を示す。ハイブリダイズしている配列間のハイブリダイゼーション領域は、一般には少なくとも約１２〜１５ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、２０〜３０ヌクレオチド、３０〜５０ヌクレオチド、５０〜１００ヌクレオチド、１００〜２００ヌクレオチドまたはそれ以上、またはそのような長さを超えない、もしくはそれを包含する任意の数値もしくは範囲である。
【０１２０】
本発明によると、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその一部分をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ、およびリボザイム核酸、またはグリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその一部分をコードする核酸と相補的な配列がさらに提供される。アンチセンスポリヌクレオチドは、約１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００ヌクレオチド、またはそのような長さを超えない、もしくはそれを包含する任意の数値もしくは範囲の長さを有してよい。一実施形態では、核酸配列は、Ｇｒｐ７８の炭水化物部分とは異なるＮ結合炭水化物部分またはＯ結合炭水化物部分が結合することができるＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をコードする核酸配列と特異的にハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドを含む。特定の態様では、アンチセンスは、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をコードする核酸配列、またはＧｒｐ７８の炭水化物部分とは異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）結合炭水化物部分または酸素（Ｏ）結合炭水化物部分が結合することができるＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をコードする核酸配列、またはＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をコードする核酸と相補的な配列、またはＧｒｐ７８の炭水化物部分とは異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）結合炭水化物部分または酸素（Ｏ）結合炭水化物部分が結合することができるＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をコードする核酸配列と少なくとも９０％相補的または相同である。
【０１２１】
本明細書で使用される、「アンチセンス」という用語は、特異的なＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列に結合することができるポリヌクレオチドまたはペプチド核酸を指す。アンチセンスは、ＲＮＡ転写物またはＤＮＡに結合する一本鎖、二本鎖、三本鎖またはそれ以上の鎖のＲＮＡポリヌクレオチドおよびＤＮＡポリヌクレオチドおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。特定の例としては、センスＲＮＡに結合するアンチセンスＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡが挙げられる。例えば、一本鎖核酸は、細胞からのグリコーゲンの代謝、異化作用、除去または分解に関与するタンパク質転写物（例えば、ｍＲＮＡ）を標的とすることができる。アンチセンス分子は、一般にはセンス鎖と９５〜１００％相補的であるが、「部分的に」相補的であってよく、その場合一部のヌクレオチドのみがセンス分子に結合する（１００％未満相補的、例えば、９５％、９０％、８０％、７０％および時にはそれ未満）、またはそのような百分率の値を超えない、もしくはそれを包含する任意の数値もしくは範囲であってよい。
【０１２２】
三重形成アンチセンスは、二本鎖ＤＮＡに結合し、それによって遺伝子の転写を抑制することができる。遺伝子の転写開始部位由来のオリゴヌクレオチド、例えば、開始部位から−１０〜＋１０位が１つの特定の例である。
【０１２３】
遺伝子発現を抑制する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉと称される）は当技術分野で公知である（例えば、Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌら、Ｃｅｌｌ９５巻：１０１７頁（１９９８年）；Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３９１巻：８０６頁（１９９８年）；ＷＯ０２／４４３２１；ＷＯ０１／６８８３６；ＷＯ００／４４８９５、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ０１／７５１６４、ＷＯ０１／９２５１３、ＷＯ０１／２９０５８、ＷＯ０１／８９３０４、ＷＯ０２／１６６２０；およびＷＯ０２／２９８５８を参照されたい）。ＲＮＡｉサイレンシングは、「ヘアピン」構造を形成するＲＮＡをコードする核酸によって、またはコードする核酸のそれぞれの端からＲＮＡを発現させ、ハイブリダイズする２つのＲＮＡ分子を作出することによって誘導することができる。
【０１２４】
ＲＮＡの特異的な切断を触媒する酵素的なＲＮＡ分子であるリボザイムを使用して、コードされるタンパク質の発現を抑制することができる。リボザイムは、その後切断される相補的な標的ＲＮＡと、配列特異的なハイブリッドを形成する。特異的な例としては、例えばグリコーゲンの代謝、異化作用、除去または分解に関与するタンパク質をコードする配列のヌクレオチド鎖切断を特異的かつ効率的に触媒することができる遺伝子工学で作られたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子が挙げられる。
【０１２５】
アンチセンス、リボザイム、ＲＮＡｉおよび三重鎖形成核酸は、本明細書ではひとまとめにして「抑制性核酸」または「抑制性ポリヌクレオチド」と称される。そのような抑制性核酸または抑制性ポリヌクレオチドにより、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の発現を抑制または妨害することができる。
【０１２６】
抑制性ポリヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで機能するために発現制御エレメントを必要としない。抑制性ポリヌクレオチドは、細胞に吸収させる、または受動拡散によって細胞内に進入させることができる。抑制性ポリヌクレオチドは、場合によって、ベクターを用いて細胞内に導入することができる。抑制性ポリヌクレオチドは、転写されるように核酸にコードさせることができる。さらに、細胞内またはｉｎ  ｖｉｖｏでコードされているアンチセンスの発現を持続または増加させるために、抑制性ポリヌクレオチドをコードする核酸を発現制御エレメントに作動可能に連結することができる。抑制性核酸は、本明細書に開示されているまたはデータベースで入手可能なタンパク質配列および核酸配列に基づいて設計することができる。
【０１２７】
核酸配列は、ヌクレオチドおよびヌクレオシドの置換、付加および欠失、ならびに誘導体化された形態および融合／キメラ配列（例えば、組換えポリペプチドをコードする）をさらに含む。例えば、遺伝コードが縮重しているので、核酸は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質および部分配列または断片（例えば、Ｇｒｐ７８とは異なる少なくとも１つの窒素（Ｎ）結合炭水化物部分または酸素（Ｏ）結合炭水化物部分が結合することができるＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質断片）またはその変異体をコードする核酸について、配列および部分配列の縮重を含む。他の例は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質およびその部分配列または断片のアミノ酸配列をコードする配列と相補的な核酸である。
【０１２８】
核酸欠失物（部分配列および断片）は、約１０〜２５、２５〜５０または５０〜１００ヌクレオチドを有し得る。そのような核酸は、細胞、培地、生物試料（例えば、組織、器官、血液または血清）において、または被験体において、ポリペプチド部分配列を発現させるため、遺伝子操作するため（ＰＣＲ増幅用のプライマーおよび鋳型として）、およびタンパク質をコードする配列の存在または量を検出するための（例えば、ハイブリダイゼーションによって）プローブとして有用である。
【０１２９】
核酸は、種々の標準のクローニング技法および化学合成技法を用いて作製することができる。技法としては、核酸増幅、例えば、抗体をコードする配列にアニーリングすることができるプライマー（例えば、縮重プライマー混合物）を使用した、ゲノムＤＮＡ標的またはｃＤＮＡ標的を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられるが、これに限定されない。核酸は、化学合成（例えば、固相ホスホラミダイト合成）または遺伝子からの転写によって作製することができる。次いで、作製された配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳することができる、またはプラスミドにクローニングして増幅させ、次いで細胞（例えば、酵母または細菌などの宿主細胞、動物細胞もしくは哺乳動物細胞などの真核細胞または植物内）で発現させることができる。
【０１３０】
本発明によると、本発明の核酸配列を含むベクターがさらに提供される。一実施形態では、ベクターは、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、ベクターは、ＳＡＭ−６抗体が特異的に結合することができる少なくとも１つの窒素（Ｎ）結合炭水化物部分または酸素（Ｏ）結合炭水化物部分が結合することができる、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の部分配列または断片をコードする核酸配列を含む。
【０１３１】
ベクターとしては、ウイルスベクター、原核生物の（細菌性）ベクターおよび真核生物（植物、真菌、哺乳動物）ベクターが挙げられる。ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで核酸を発現させるために使用することができる。そのようなベクターは「発現ベクター」と称され、細胞においてまたは被験体においてｉｎ  ｖｉｖｏで、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、その部分配列および断片をコードする核酸、抑制性核酸をコードする核酸を含めた核酸を導入するため、およびコードされるタンパク質または抑制性核酸を発現させるため（例えば、溶液中または固相で）に有用である。
【０１３２】
ベクターは、核酸を操作するためにも使用することができる。遺伝子操作のために、「クローニングベクター」を利用することができ、挿入された核酸を転写または翻訳するためにも利用することができる。
【０１３３】
ベクターは、一般には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて細胞内で増幅するための複製開始点を含有する。必要に応じて、転写および翻訳を容易にするために、ベクター内に存在する、発現制御エレメントを含めた制御エレメントを含めることができる。
【０１３４】
ベクターは、選択マーカーを含んでよい。「選択マーカー」は、その遺伝子を含有する細胞の選択を可能にする遺伝子である。「正の選択」は、選択マーカーを含有する細胞が正の選択への曝露に際して生存するプロセスを指す。薬物耐性は正の選択マーカーの一例であり、マーカーを含有する細胞が選択薬を含有する培地内で生存し、マーカーを欠く細胞は死ぬ。選択マーカーとしては、Ｇ４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ；ハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒ；およびピューロマイシンに対する耐性を付与するｐｕｒｏなどの、薬物耐性遺伝子が挙げられる。他の正の選択マーカー遺伝子としては、マーカーを含有する細胞の同定およびスクリーニングを可能にする遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子としては、とりわけ、蛍光タンパク質（ＧＦＰおよびＧＦＰ様発色団、ルシフェラーゼ）の遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、およびＣＤ８などの表面マーカーが挙げられる。「負の選択」は、負の選択マーカーを含有する細胞が、適切な負の選択剤への曝露に際して死滅するプロセスを指す。例えば、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ１１巻：２２３頁（１９７７年））を含有する細胞は薬物ガンシクロビル（ＧＡＮＣ）に対して感受性である。同様に、ｇｐｔ遺伝子は細胞に６−チオキサンチンへの感受性を与える。
【０１３５】
ウイルスベクターとしては、レトロウイルス（分裂細胞だけでなく非分裂細胞にも感染するレンチウイルス）、泡沫状ウイルス（米国特許第５，６２４，８２０号、同第５，６９３，５０８号、同第５，６６５，５７７号、同第６，０１３，５１６号および同第５，６７４，７０３号；ＷＯ９２／０５２６６およびＷＯ９２／１４８２９）、アデノウイルス（米国特許第５，７００，４７０号、同第５，７３１，１７２号および同第５，９２８，９４４号）、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）（米国特許第５，６０４，０９０号）、単純ヘルペスウイルスベクター（米国特許第５，５０１，９７９号）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に基づくベクター（米国特許第５，５６１，０６３号）、レオウイルス、ロタウイルスゲノム、サルウイルス４０（ＳＶ４０）またはパピローマウイルス（Ｃｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８１巻：６３４９頁（１９８４年）；Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｇｌｕｚｍａｎ編、１９８２年；Ｓａｒｖｅｒら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．１巻：４８６頁（１９８１年）；米国特許第５，７１９，０５４号）に基づくウイルスベクターが挙げられる。アデノウイルスは、ゆっくり複製している細胞および／または高分化した細胞に効率的に感染し、ゆっくり複製している細胞および／または高分化した細胞を標的とするために使用することができる。発現させるために有用な追加的なウイルスベクターとしては、パルボウイルス、ノーウォークウイルス、コロナウイルス、パラミクソウイルスおよびラブドウイルス、トガウイルス（例えば、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林熱ウイルス）および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）が挙げられる。
【０１３６】
核酸を含むベクターは、核酸が発現制御エレメントに作動可能に連結されている場合に発現させることができる。本明細書で使用される、「作動可能に連結された」という用語は、エレメントが、意図された様式で作動することを可能にすると見なされるエレメント間の物理的または機能的な関係を指す。したがって、発現制御エレメントが核酸に「作動可能に連結された」とは、制御エレメントにより核酸の転写、および必要に応じて転写物の翻訳が調節されることを意味する。
【０１３７】
「発現制御エレメント」という用語は、作動可能に連結された核酸の発現に影響を及ぼす核酸を指す。プロモーターおよびエンハンサーは、発現制御エレメントの特定の非限定的な例である。「プロモーター配列」は、下流（３’方向）の配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。プロモーター配列は、転写の開始を容易にするヌクレオチドを含む。エンハンサーも、遺伝子発現を調節するが、それが作動可能に連結された遺伝子の転写開始部位から離れたところでも機能することができる。エンハンサーは、遺伝子の５’末端または３’末端のいずれか、ならびに遺伝子の内部（例えば、イントロンまたはコード配列内）で機能する。追加的な発現制御エレメントとしては、リーダー配列および融合パートナー配列、多重遺伝子または多シストロン性、メッセージ、イントロンに対するスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳を可能にするための遺伝子の正確な読み枠の維持、対象とする転写物の適切なポリアデニル化をもたらすためのポリアデニル化シグナルをもたらすための配列内リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）エレメントおよび終止コドンが挙げられる。
【０１３８】
発現制御エレメントは、作動可能に連結された核酸の転写がシグナルまたは刺激の存在なしで起こる「構成的な」エレメントを含む。シグナルまたは刺激に応答して発現をもたらす発現制御エレメントは、作動可能に連結された核酸の発現を増加または減少させ、「調節可能」である。作動可能に連結された核酸の発現を、シグナルまたは刺激に応答して増加させる調節可能なエレメントは、「誘導性エレメント」と称される。作動可能に連結された核酸の発現を、シグナルまたは刺激に応答して減少させる調節可能なエレメントは、「抑圧可能なエレメント」と称される（すなわち、シグナルにより発現が減少する；シグナルが除去された、または存在しない場合に発現が増加する）。
【０１３９】
発現制御エレメントは、「組織特異的な発現制御エレメント」と称される、特定の組織または細胞型において活性なエレメントを含む。組織特異的な発現制御エレメントは、一般には、他の細胞型または組織型と比較して、転写活性化タンパク質、または特異的な細胞型もしくは組織型において活性な他の転写調節因子によって認識されるので、特異的な細胞型または組織型において活性が強い。
【０１４０】
組織特異的な発現制御エレメントは、新生物、腫瘍および癌ならびに転移を含めた細胞増殖性障害などの過剰増殖性細胞において活性なプロモーターおよびエンハンサーを含む。そのようなプロモーターの特定の非限定的な例は、ヘキソキナーゼＩＩ、ＣＯＸ−２、アルファ−フェトタンパク質、癌胎児性抗原、ＤＥ３／ＭＵＣ１、前立腺に特異的な抗原、Ｃ−ｅｒＢ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ逆転写酵素および低酸素応答性プロモーターである。
【０１４１】
細菌で発現させるために、構成的なプロモーターは、Ｔ７、ならびにバクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）などの誘導性プロモーターを含む。昆虫の細胞系では、構成的または誘導性のプロモーター（例えば、エクジソン）を使用することができる。酵母では、構成的なプロモーターとして、例えば、ＡＤＨまたはＬＥＵ２およびＧＡＬなどの誘導性プロモーターが挙げられる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２巻、１３章、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ａｓｓｏｃ．  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ編、１９８８年；Ｇｒａｎｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３巻：５１６〜５４４頁（１９８７年）、Ｗｕ  ＆  Ｇｒｏｓｓｍａｎ編、１９８７年、Ａｃａｄ．  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．；Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＩＩ巻、３章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈ．、Ｄ．Ｃ．、１９８６年；Ｂｉｔｔｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５２巻：６７３〜６８４頁（１９８７年）、Ｂｅｒｇｅｒ  ＆  Ｋｉｍｍｅｌ編、Ａｃａｄ．  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．；および、Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ編、Ｉ巻およびＩＩ巻（１９８２年）を参照されたい）。
【０１４２】
哺乳動物で発現させるために、ウイルスまたは他起源の構成的なプロモーターを使用することができる。例えば、ＳＶ４０、またはウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）など、または哺乳動物細胞のゲノム由来の誘導性プロモーター（例えば、メタロチオネインＩＩＡプロモーター；熱ショックプロモーター、ステロイド／甲状腺ホルモン／レチノイン酸応答エレメント）または哺乳動物ウイルス由来の誘導性プロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；マウス乳房腫瘍ウイルスＬＴＲ）が使用される。
【０１４３】
本発明によると、本発明の核酸またはベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。宿主細胞としては、細菌、真菌（酵母）、植物、昆虫、および動物（例えば、霊長類およびヒトを含めた哺乳動物）の細胞などの原核細胞および真核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、組換えバクテリオファージ核酸、プラスミド核酸またはコスミド核酸の発現ベクターで形質転換された細菌；組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた植物細胞系または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；および組換えウイルス発現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）を感染させた動物細胞系、または安定に発現するように遺伝子工学で作られた形質転換された動物細胞系が提供される。
【０１４４】
細胞は、初代細胞単離物、細胞培養物（例えば、継代細胞系、樹立細胞系または不死化細胞系）、または多数の細胞の一部、またはｅｘ  ｖｉｖｏにおける組織または器官または被験体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）であってよい。特定の実施形態では、細胞は、過剰増殖性細胞、細胞過剰増殖性障害を成す細胞、不死化細胞、新生細胞、腫瘍細胞もしくは癌細胞、または転移細胞である。
【０１４５】
「形質転換された」または「トランスフェクトされた」という用語は、細胞（例えば、宿主細胞）または生物体に関して使用される場合、細胞内に外因性分子、例えば、タンパク質または核酸（例えば、導入遺伝子）を導入した後の細胞内の遺伝子変化を意味する。したがって、「トランスフェクトされた」または「形質転換された」細胞は、人の手で、例えば、組換えＤＮＡ技法によって外因性分子が導入された細胞またはその後代である。
【０１４６】
細胞およびその後代において、核酸またはタンパク質を安定にまたは一過性にトランスフェクトまたは形質転換（発現）することができる。細胞（単数または複数）を増幅させて導入されたタンパク質を発現させる、または核酸を転写させることができる。トランスフェクトまたは形質転換された細胞の後代は、複製中に突然変異が起こり得るので、親細胞と同一ではない可能性がある。
【０１４７】
一般には、細胞のトランスフェクションまたは形質転換には、核酸を挿入または導入することによって操作できる、プラスミド、ウイルスベクターなどのウイルスまたは他の当技術分野で公知のビヒクルを指す「ベクター」を利用する。
【０１４８】
表面に標的細胞のリガンドまたは受容体に結合するタンパク質を封入することによって、特定の細胞型（例えば、過剰増殖している細胞）を標的とするようにウイルスの粒子またはベシクルを設計することができる。あるいは、標的細胞において核酸を発現させるために、細胞型特異的なプロモーターおよび／またはエンハンサーをベクター中に含めることができる。したがって、ウイルスの粒子またはベシクルそれ自体、ウイルスベクター、またはウイルス表面上のタンパク質を作出して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてトランスフェクトまたは形質転換するために細胞を標的とすることができる。
【０１４９】
組成物（例えば、タンパク質および核酸）の標的細胞（例えば、宿主細胞）への導入は、例えば浸透圧ショック（例えば、リン酸カルシウム）、電気穿孔、微量注入、細胞融合など当技術分野で公知の方法によっても行うことができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける核酸およびポリペプチドの導入は、他の技法を使用しても実現することができる。例えば、ポリエステル、ポリアミン酸、ヒドロゲル、ポリビニルピロリドン、エチレン酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン、またはラクチド／グリコリド共重合体、ポリラクチド／グリコリド共重合体、またはエチレン酢酸ビニル共重合体などのポリマー物質。核酸は、コアセルベーション技法によって、または界面重合によって、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、またはポリ（メタクリル酸メチル（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｏｌａｔｅ））マイクロカプセルを使用して調製されたマイクロカプセル中、またはコロイド系に封入することができる。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含めた脂質に基づく系が挙げられる。
【０１５０】
種々の組成物を細胞内に導入するためのリポソームは、当技術分野で公知であり、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、リポフェクチンおよびＤＯＴＡＰ（例えば、米国特許第４，８４４，９０４号、同第５，０００，９５９号、同第４，８６３，７４０号、および同第４，９７５，２８２号；およびＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ）が挙げられる。遺伝子治療に有用なピペラジンに基づく両親媒性陽イオン性脂質も公知である（例えば、米国特許第５，８６１，３９７号を参照されたい）。陽イオン性脂質系も公知である（例えば、米国特許第５，４５９，１２７号を参照されたい）。ポリマー物質、マイクロカプセルおよびリポソームなどのコロイド分散系は、本明細書ではひとまとめにして「ベシクル」と称される。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏにおいて細胞、組織または器官に送達する手段であるウイルスベクターおよび非ウイルスベクターが含まれる。
【０１５１】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける方法を含む。例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質を発現する過剰増殖性細胞または細胞過剰増殖性障害などの細胞は、哺乳動物などの被験体（例えば、ヒト被験体）に存在し得る。したがって、細胞増殖性障害または細胞過剰増殖性障害を成す細胞を、例えば、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数、またはその部分配列、またはその抑制性核酸に特異的に結合する抗体またはその部分配列または断片を投与することによって治療することができる。細胞増殖性障害または細胞過剰増殖性障害を成す細胞は、例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質に対する免疫応答を誘発することができ、それによってワクチンとして機能するＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質またはその部分配列を投与することによっても治療することができる。さらに、望ましくないまたは過剰なレベルのグリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬに関連するまたはそれによって引き起こされる障害および疾患を、本発明に従って、例えば、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその部分配列に特異的に結合する、ＶＬＤＬ、ＬＤＬまたはｏｘＬＤＬを減少させる抗体またはその部分配列または断片を投与することによって治療することができる。
【０１５２】
本発明によると、被験体における細胞増殖または細胞増殖性障害もしくは細胞過剰増殖性障害を治療する方法が提供される。一実施形態では、方法は、被験体に、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数に特異的に結合する抗体を、被験体における細胞増殖または細胞増殖性障害もしくは細胞過剰増殖性障害を治療するのに有効な量で投与するステップを含む。別の実施形態では、方法は、被験体に、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、またはその部分配列を、被験体における細胞増殖または細胞増殖性障害もしくは細胞過剰増殖性障害を治療するのに有効な量で投与するステップを含む。
【０１５３】
本明細書で使用される、「細胞増殖性障害」および「細胞過剰増殖性障害」という用語およびその文法的変異形は、細胞、組織または器官に関して使用される場合、任意の望ましくない、過剰または異常な細胞、組織または器官の成長、増殖、分化または生存を指す。過剰増殖性細胞は、その成長、増殖、もしくは生存が、所望の、参照の正常細胞、例えば、同じ組織または器官の細胞であるが、過剰増殖性細胞ではない細胞などを超える細胞、または正常に分化できない細胞を示す。細胞の増殖性障害および過剰増殖性障害は、どちらも被験体における望ましくない、過剰または異常な細胞数、細胞成長、細胞増殖、細胞の生存または分化に特徴付けられる良性の過形成の状態である、疾患および生理的状態を含む。そのような障害の特定の例としては、転移性および非転移性の新生物、腫瘍および癌（悪性）が挙げられる。
【０１５４】
種々の実施形態では、方法は、被験体に、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数、またはその部分配列に特異的に結合する抗体またはその部分配列を、被験体における細胞増殖性障害または細胞過剰増殖性障害を治療するのに有効な量で投与するステップを含む。特定の態様では、障害は、新生物、腫瘍または転移性もしくは非転移性の癌（悪性）である。付加的な態様では、障害は、少なくとも乳房、肺、甲状腺、頭頸部、鼻咽頭、鼻もしくは洞、脳、脊柱、副腎、甲状腺、リンパ、胃腸管系（口、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸  （小腸）、結腸、直腸）、尿生殖路（子宮、卵巣、子宮頸部、膀胱、睾丸、陰茎、前立腺）、腎臓、膵臓、副腎、肝臓、骨、骨髄、リンパ、血液、筋肉、皮膚、または造血系に影響を及ぼすまたはそこに部分的に存在する。
【０１５５】
「新生物」および「腫瘍」という用語は、本明細書では互換的に使用され、その成長、増殖または生存が正常な対応する細胞の成長、増殖または生存を超える、任意の細胞、組織または器官由来の細胞または細胞集団を指す。「癌」は、悪性の新生物または腫瘍であり、一般には他の領域、組織または器官に浸潤し、血液またはリンパの輸送を介して他の部位に転移する可能性を有する。
【０１５６】
新生物、腫瘍および癌としては、肉腫、癌腫、腺癌、メラノーマ、骨髄腫、芽細胞腫、神経膠腫、リンパ腫または白血病が挙げられる。代表的な癌としては、例えば、癌腫、肉腫、腺癌、メラノーマ、神経性（芽細胞腫、神経膠腫）、中皮腫および細網内皮性新生物障害、リンパ性新生物障害または造血性新生物障害（例えば、骨髄腫、リンパ腫または白血病）が挙げられる。特定の態様では、新生物、腫瘍または癌は、肺腺癌、肺癌、びまん性または間質性の胃癌、結腸腺癌、前立腺腺癌、食道癌、乳癌、膵臓腺癌、卵巣腺癌、または子宮腺癌を含む。
【０１５７】
新生物、腫瘍および癌は、良性、悪性、転移性および非転移性の型を含み、任意の病期（第Ｉ期、第ＩＩ期、第ＩＩＩ期、第ＩＶ期または第Ｖ期）または悪性度（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３など）の新生物、腫瘍または癌、または進行している、悪化している、安定化した、または寛解期にある新生物、腫瘍、癌または転移を含む。
【０１５８】
新生物、腫瘍および癌は、これらに限定されないが、乳房、肺、甲状腺、頭頸部、鼻咽頭、鼻もしくは洞、脳、脊柱、副腎、甲状腺、リンパ、胃腸系（口、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸  （小腸）、結腸、直腸）、尿生殖路  （子宮、卵巣、子宮頸部、膀胱、睾丸、陰茎、前立腺）、腎臓、膵臓、副腎、肝臓、骨、骨髄、リンパ、血液、筋肉、皮膚、造血系を含めた多数の原発腫瘍型から生じる可能性があり、続発部位に転移する可能性がある。
【０１５９】
「固形新生物、固形腫瘍または固形癌」は、一般に一緒に凝集し塊を形成する新生物、腫瘍または癌（例えば、転移）を指す。特定の例としては、メラノーマ、乳癌、膵癌、子宮癌および卵巣癌、精上皮腫を含めた精巣癌、胃癌または結腸癌、肝細胞癌、副腎癌、腎癌および膀胱癌、肺癌、頭頸部癌および脳腫瘍／癌などの内臓の腫瘍が挙げられる。
【０１６０】
癌腫は、悪性の上皮組織または内分泌組織を指し、呼吸器系の癌、胃腸系の癌腫、尿生殖器系の癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌腫、内分泌系の癌、およびメラノーマを含む。この用語は、例えば、癌性組織および肉腫様組織で構成される悪性腫瘍を含む癌肉腫も含む。腺癌は、腺組織の癌または腫瘍が腺様構造を形成する癌を含む。メラノーマは、皮膚、眼（網膜を含む）または体の他の領域に生じる可能性がある、メラニン形成細胞および色素細胞由来の他の細胞の悪性腫瘍を指す。追加的な癌は、子宮／子宮頸部、肺、頭部／頸部、結腸、膵臓、精巣、副腎、腎臓、食道、胃、肝臓および卵巣から形成され得る。
【０１６１】
肉腫は、間葉系細胞由来の悪性腫瘍を指す。代表的な肉腫としては、例えば、リンパ肉腫、脂肪肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫および線維肉腫が挙げられる。
【０１６２】
神経系の新生物としては、神経膠腫、神経膠芽腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、乏突起膠細胞腫が挙げられる。
【０１６３】
治療の影響を受けやすい新生物、腫瘍および癌の特定の非限定的な例は、悪性のおよび非悪性の新生物、腫瘍および癌、ならびに転移を含む。具体的には、任意の病期（例えば、病期第ＩＡ期、第ＩＢ期、第ＩＩＡ期、第ＩＩＢ期、第ＩＩＩＡ期、第ＩＩＩＢ期または第ＩＶ期）または悪性度（例えば、悪性度Ｇ１、Ｇ２またはＧ３）のメラノーマ、胃組織、肺扁平上皮癌、肺腺癌細胞および鼻腔癌の細胞。転移の特定の非限定的な例としては、リンパ節および脳に転移した肺扁平上皮癌および腺癌；リンパ節に転移した乳癌（浸潤性、腺管）；肝臓およびリンパ節に転移した結腸腺癌；ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質がリンパ節に転移した胃腺癌（腸管内およびびまん性）で検出された；リンパ節に転移した脾臓腺癌；リンパ節に転移した頭頸部扁平上皮癌；および直腸、食道、皮膚、耳下腺、結腸、副腎および鼻粘膜上皮に転移したメラノーマが挙げられる。
【０１６４】
「液性新生物、液性腫瘍または液性癌」は、本質的にびまん性である、リンパ腫、骨髄腫、または白血病、または新生物などの細網内皮系または造血系の新生物、腫瘍または癌を指す。白血病の特定の例としては、急性および慢性のリンパ芽球性白血病、骨髄芽球性（ｍｙｅｏｌｂｌａｓｔｉｃ）白血病および多発性骨髄腫が挙げられる。一般には、そのような疾患は、低分化球性白血病、例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病から生じる。特異的な骨髄障害としては、急性前骨髄細胞白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。リンパ系腫瘍としては、Ｂ系統ＡＬＬおよびＴ系統ＡＬＬを含む急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＬＬ）およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。特異的な悪性リンパ腫としては、非ホジキンリンパ腫および変異形、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病およびリード・シュテルンベルク病が挙げられる。
【０１６５】
本発明によると、ＶＬＤＬ、ＬＤＬまたはｏｘＬＤＬを低下させる方法ならびに望ましくないまたは過剰なＶＬＤＬレベル、ＬＤＬレベルまたはｏｘＬＤＬレベルに関連するまたはそれによって引き起こされる障害および疾患を治療する方法が提供される。一実施形態では、方法は、被験体に、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８または脱グルコシル化されたＬＤＬの１つまたは複数に特異的に結合する抗体を、被験体における、望ましくないまたは過剰なＶＬＤＬレベル、ＬＤＬレベルまたはｏｘＬＤＬレベル（例えば、血漿レベル）に関連するまたはそれによって引き起こされる障害または疾患を治療するのに有効な量で投与するステップを含む。
【０１６６】
望ましくないまたは過剰なＶＬＤＬレベル、ＬＤＬレベルまたはｏｘＬＤＬレベルに関連する非限定的な代表的障害および疾患としては、高脂血症、高コレステロール血症、動脈硬化症、心臓血管疾患、冠動脈心疾患（ＣＨＤ）、脳卒中、糸球体壊死、高血圧および糖尿病が挙げられる。したがって、付加的な実施形態では、方法は、被験体に、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数に特異的に結合する抗体を、高脂血症、高コレステロール血症、動脈硬化症、心臓血管疾患、冠動脈心疾患（ＣＨＤ）、脳卒中、糸球体壊死、高血圧または糖尿病を治療するのに有効な量で投与するステップを含む。
【０１６７】
本明細書で使用される、「治療する」「治療すること」「治療」という用語およびその文法的変異形は、個々の患者を、その患者において生理的な応答または結果を得ることが望まれるプロトコール、レジメン、プロセスまたは治療法に供することを意味する。治療された患者の全てが特定の治療プロトコール、レジメン、プロセスまたは治療法に応答するのではない可能性があるので、治療は、患者または患者集団のそれぞれ全部において所望の生理的な応答または結果が実現されることを必要としていない。したがって、所与の患者または患者集団は、治療に対して応答しない、または不適切な応答をする可能性がある。
【０１６８】
本発明の方法は、任意の投与方式によって、または任意の経路、全身的、局部的および局所的に投与することによって実行することができる。代表的な投与経路としては、静脈内、動脈内、皮内、筋肉内、皮下、腹膜内、経皮（局所）、経粘膜、頭蓋内、脊髄内、眼内、直腸、経口（食事性）および粘膜が挙げられる。
【０１６９】
本発明の方法は、とりわけ、細胞増殖性障害もしくは細胞過剰増殖性障害、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移の存在に関連する１つまたは複数の有害な（身体的）症状または事象を、緩和または回復するなど所与の被験体の状態における検出可能または測定可能な改善、すなわち治療効果または有益な効果をもたらす方法を含む。
【０１７０】
治療効果または有益な効果は、状態もしくは病状が、他覚的もしくは自覚的、一過性、一時的、もしくは長期のいずれかでも改善されること、または新生物、腫瘍もしくは癌、もしくは転移などの細胞増殖もしくは細胞過剰増殖性障害に関連するもしくはそれによって引き起こされる有害な症状の発症、重症度、持続期間もしくは頻度が低下することである。本発明による治療方法の良好な臨床エンドポイントは、例えば、１つまたは複数の関連する病状、有害な症状もしくは合併症の重症度、持続期間もしくは頻度に増加性もしくは部分的な低下がある場合、または１つまたは複数の生理的、生化学的もしくは細胞性の兆候、または新生物、腫瘍もしくは癌、もしくは転移などの細胞増殖もしくは細胞過剰増殖性障害の特性の抑制または反転がある場合に実現される。したがって、治療効果または改善は、標的の増殖性細胞（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、もしくは転移）が破壊されること、または新生物、腫瘍もしくは癌、もしくは転移などの細胞増殖もしくは細胞過剰増殖性障害に関連するもしくはそれによって引き起こされる１つまたは複数の病状、有害な症状もしくは合併症のほとんど、もしくは全てが消失することなどの治癒である。しかし、治療効果または改善は、標的増殖性細胞（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、もしくは転移）全てが治癒することもしくは完全に破壊されること、または新生物、腫瘍もしくは癌、もしくは転移などの細胞増殖もしくは細胞過剰増殖性障害に関連するもしくはそれによって引き起こされる病状、有害な症状もしくは合併症が全て消失することを必要としない。例えば、腫瘍もしくは癌の進行もしくは悪化を抑制することにより、腫瘍細胞もしくは癌細胞の質量が部分的に破壊されること、または腫瘍もしくは癌の質量、サイズもしくは細胞数が安定化することによって、腫瘍もしくは癌の質量、サイズもしくは細胞が一部もしくは大量に残存するが、例え数日、数週間または数カ月のみであっても、死亡率が低下し、寿命が引き延ばされる可能性がある。
【０１７１】
治療効果の特定の非限定的な例としては、新生物、腫瘍もしくは癌、もしくは転移の量（サイズもしくは細胞の質量）もしくは細胞数が低下すること、新生物、腫瘍もしくは癌の体積の増加が抑制もしくは妨害されること（例えば、安定化）、新生物、腫瘍もしくは癌の進行、悪化もしくは転移が遅くなる、もしくは抑制されること、新生物、腫瘍もしくは癌細胞の溶解もしくはアポトーシスが刺激、誘導されるもしくは増加すること、または新生物、腫瘍もしくは癌の増殖、成長もしくは転移が抑制されることが挙げられる。発明の方法は、即座に効かない場合がある。例えば、治療後に新生物、腫瘍または癌細胞の数または質量が増加する場合があるが、時が経つにつれて、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移の細胞の溶解もしくはアポトーシスの後に、引き続いて所与の被験体における腫瘍細胞の質量、サイズまたは細胞数の最終的な安定化または低下が起こり得る。ＶＬＤＬレベル、ＬＤＬレベルまたはｏｘＬＤＬレベルの低下には、治療後数日、数週間または  数カ月さえかかる可能性がある。
【０１７２】
追加的な利点としては、被験体におけるＶＬＤＬ、ＬＤＬまたはｏｘＬＤＬが低下すること、動脈または静脈の狭窄が低下または反転することが挙げられる。脂質プロファイルの改善およびＨＤＬレベルの上昇も、治療効果の非限定的な例である。
【０１７３】
追加的な、抑制すること、低下させること、減少させること、遅延させること、または妨害することができる新生物、腫瘍、癌および転移に関連する有害な症状および合併症としては、例えば、悪心、食欲不振、嗜眠、痛みおよび不快感が挙げられる。したがって、細胞過剰増殖性障害に関連するまたはそれによって引き起こされる有害な症状または合併症の重症度、持続期間または頻度を部分的または完全に減少または低下させること、被験体の、力の増進、食欲の増進、心理的な健康などの健康を改善することは、全て治療効果の特定の非限定的な例である。したがって、治療効果または改善は、治療された被験体の生活の質に関する自覚的改善も含んでよい。
【０１７４】
種々の実施形態では、方法により、新生物、腫瘍もしくは癌、もしくは転移の量が低下もしくは減少する、新生物、腫瘍もしくは癌の体積の増加が抑制もしくは妨害される、新生物、腫瘍もしくは癌の進行もしくは悪化が抑制されるもしくは遅延する、新生物、腫瘍もしくは癌、もしくは転移の細胞の溶解もしくはアポトーシスが刺激される、または新生物、腫瘍もしくは癌の増殖もしくは転移が抑制される、低下、減少するもしくは遅延する。付加的な実施形態では、方法により、被験体の寿命が引き延ばされるまたは延長される。別の実施形態では、方法により、被験体の生活の質が向上する。
【０１７５】
新生物、腫瘍もしくは癌、もしくは転移を含有する生検試料（例えば、血液または組織の試料）を検査することにより、新生細胞、腫瘍細胞もしくは癌細胞の量もしくは細胞数、したがって、新生細胞、腫瘍細胞もしくは癌細胞の質量もしくは数が低下もしくは安定化したかどうか、または新生物、腫瘍もしくは癌の細胞増殖、成長もしくは生存の抑制（アポトーシス）が起こったかどうかを確証することができる。固形の新生物、腫瘍または癌については、侵襲的なイメージング方法および非侵襲的なイメージング方法により、新生物、腫瘍または癌のサイズまたは量を確認することができる。例えば、細胞の集団、数および型についての（例えば、造血性細胞過剰増殖性障害）血液または血清を検査することにより、新生細胞、腫瘍細胞もしくは癌細胞の質量もしくは数の低下もしくは安定化、または新生物、腫瘍もしくは癌の増殖、成長もしくは生存の抑制（アポトーシス）が起こったかどうかを確証することができる。
【０１７６】
発明の組成物および方法は、所望の作用をもたらす任意の他の治療または療法と組み合わせることができる。とりわけ、抗細胞増殖性の活性または機能を有すると特徴付けられている治療および療法が適用可能である。代表的な治療および療法としては、抗細胞増殖性または免疫増強性の作用剤または薬物が挙げられる。ＶＬＤＬレベル、ＬＤＬレベルまたはｏｘＬＤＬレベルの場合、追加的な治療および療法は、スタチンなどの、ＶＬＤＬ、ＬＤＬまたはｏｘＬＤＬを低下させる作用剤および薬物を含む。治療および療法は、任意の他の本発明の方法、例えば、抗細胞増殖性細胞過剰増殖性障害（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）の、またはＬＤＬを低下させる治療または療法の前に、それと実質的に同時に行うことができる。
【０１７７】
したがって、本発明は、本発明の方法が、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の抗細胞増殖性の、またはＶＬＤＬもしくはＬＤＬを低下させるプロトコール、作用剤または薬物などの任意の治療レジメン、治療プロトコールまたは組成物と組み合わせて使用される、組み合わせた方法を提供する。一実施形態では、方法は、抗体または抑制性核酸と、抗細胞増殖性または免疫増強性の治療、作用剤または薬物とを施与するステップを含む。抗細胞増殖性または免疫増強性の治療、作用剤または薬物は、抗体または抑制性核酸を投与する前に、それと実質的に同時に、またはその後に施与することができる。別の実施形態では、方法は、ＶＬＤＬ、ＬＤＬまたはｏｘＬＤＬを低下させる治療、作用剤または薬物を施与するステップを含む。
【０１７８】
本明細書で使用される、「抗細胞増殖性」、「抗新生物」、「抗腫瘍」または「抗癌」の治療、療法、活性または作用は、異常な、または望ましくない細胞増殖（細胞過剰増殖）、細胞過剰増殖性障害、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移に関連するまたはそれによって引き起こされる病状、有害な症状または合併症の治療において有用な任意の療法、治療レジメン、作用剤、薬物、プロトコールまたはプロセスを意味する。特定の療法、治療レジメン、作用剤、薬物、プロトコールまたはプロセスにより、細胞増殖、細胞成長、細胞性の過剰増殖、新生物、腫瘍または癌（悪性）の成長、増殖、生存または転移を抑制すること、減少させること、遅らせること、低下させること、遅延させること、または妨害することができる。そのような治療、療法、レジメン、プロトコール、作用剤および薬物は、細胞周期の進行または細胞の増殖もしくは成長を撹乱すること、低下させること、抑制すること、もしくは遅延させること；細胞のアポトーシス、溶解または死を増加させること、刺激すること、もしくは増大させること；核酸またはタンパク質の合成または代謝を抑制すること；細胞分裂を低下させること、減少させること、抑制すること、もしくは遅延させること；または、細胞の生存、または細胞生存因子、増殖因子もしくはシグナル伝達経路（細胞外または細胞内）の産生または利用を減少させること、低下させること、抑制すること、もしくは遅延させることによって作動することができる。
【０１７９】
抗細胞増殖性の治療および療法の例としては、化学療法、免疫療法、放射線療法（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）（イオン化または化学的）、局所的または局部的な加温療法（加温療法（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ））および外科的切除が挙げられる。
【０１８０】
抗細胞増殖性の作用剤および薬物の特異的な非限定的なクラスとしては、アルキル化剤、代謝拮抗薬、植物抽出物、植物アルカロイド、ニトロソ尿素、ホルモン（ステロイド）、ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体が挙げられる。細菌毒素の特定の非限定的な例としては、細菌のコレラ毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、ジフテリア毒素、および植物毒素のヒマ毒が挙げられる。薬物の特定の例としては、シクロホスファミド、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、メルファラン、クロラムブシル、メクロレタミン、ブスルファン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、チオグアニン、５−フルオロウラシル、５−フルオロウリジン、シトシンアラビノシド、ＡＺＴ、５−アザシチジン（５−ＡＺＣ）および５−アザシチジン関連化合物、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、カルムスチン、カリケアマイシン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾトシン、テニポシド、エトポシド、ヒドロキシ尿素、シスプラチン、カルボプラチン、レバミソール、ミトタン、プロカルバジン、ダカルバジン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ドキソルビジン、ダウノマイシンおよびジブロモマンニトールが挙げられる。ホルモンの特定の非限定的な例としては、プレドニゾン、プレドニゾロン、ジエチルスチルベストロール（ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｅｒｏｌ）、フルタミド、リュープロリド、およびゴナドトルピン（ｇｏｎａｔｒｏｐｈｉｎ）放出ホルモンアンタゴニストが挙げられる。
【０１８１】
放射線療法（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）は、被験体の内部または外部への送達を含む。例えば、アルファ線、ベータ線、ガンマ線およびＸ線を、放射性同位元素が被験体内部へ移行することなく、またはその反対で身体的に接触することなく外部から被験体に施すことができる。Ｘ線用量の特定の例は、長期間（３〜５／週）に対する１日当たり５０〜２００レントゲンの用量から、２０００〜６０００レントゲンの単回用量までにわたる。用量は大幅に変動し、曝露の持続時間、アイソトープの半減期、照射される放射線の種類、処置される細胞型および部位、ならびに疾患の進行病期に左右される。放射性核種の特定の非限定的な例としては、例えば、４７Ｓｃ６７Ｃｕ、７２Ｓｅ、８８Ｙ、９０Ｓｒ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１０５Ｒｈ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４９Ｔｂ、１５３Ｓｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９４Ｏｓ、２０３Ｐｂ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、２２７Ａｃおよび２２８Ｔｈが挙げられる。
【０１８２】
腫瘍細胞に結合する抗体は、抗細胞増殖性の治療または療法の特定の例である。抗腫瘍抗体としては、例えば、白血病細胞ＣＤ３３抗原に結合するＭ１９５抗体（米国特許第６，５９９，５０５号）；卵巣癌ＣＡ６の腫瘍関連抗原に結合するモノクローナル抗体ＤＳ６（米国特許第６，５９６，５０３号）；上皮細胞表面Ｈ抗原に結合するヒトＩＢＤ１２モノクローナル抗体（米国特許第４，８１４，２７５号）；および結腸癌、乳癌、卵巣癌および肺癌で発現されるＬｅｘ炭水化物エピトープに結合するＢＲ９６抗体が挙げられる。利用することができる追加的な抗腫瘍抗体としては、例えば、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（抗Ｈｅｒ−２ｎｅｕ抗体）、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（登録商標）、ゼヴァリン（Ｚｅｖａｌｉｎ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ））、ベキサール（Ｂｅｘｘａｒ）、キャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）（登録商標）、オンコリム（Ｏｎｃｏｌｙｍ）、１７−１Ａ（エドレコロマブ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ））、３Ｆ８（抗神経芽細胞腫抗体）、ＭＤＸ−ＣＴＬＡ４、ＩＭＣ−Ｃ２２５（セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ））およびマイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）が挙げられる。
【０１８３】
本明細書で使用する「免疫増強性」という用語は、治療、療法、作用剤または薬物に関して使用される場合、治療、療法、作用剤または薬物により、体液性または細胞媒介性の免疫応答の増加、刺激、誘導または促進がもたらされることを意味する。そのような療法により、一般的に免疫応答を増強する、または特定の標的、例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移などの細胞増殖性障害または細胞過剰増殖性障害に対する免疫応答を増強することができる。
【０１８４】
免疫増強剤の特定の非限定的な例としては、抗体、細胞増殖因子、細胞生存因子、細胞分化因子、サイトカインおよびケモカインが挙げられる。免疫増強剤および治療の追加的な例としては、細胞増殖性障害に対する抗体を発現する、またはそうでなければ細胞増殖性障害に対する免疫応答をマウントする可能性がある、リンパ球、形質細胞、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞などの免疫細胞が挙げられる。免疫原性を増強または刺激するサイトカインとしては、免疫増強剤の非限定的な例でもあるＩＬ−２、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦβが挙げられる。ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９／ＴＣＡ３、ＡＴＡＣ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−２、ＨＣＣ−３、ＰＡＲＣ、ＴＡＲＣ、ＬＡＲＣ／ＭＩＰ−３α、ＣＫβ、ＣＫβ６、ＣＫβ７、ＣＫβ８、ＣＫβ９、ＣＫβ１１、ＣＫβ１２、Ｃ１０、ＩＬ−８、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＣＰ−２、ＰＢＰ／ＣＴＡＰＩＩＩβ−ＴＧ／ＮＡＰ−２、Ｍｉｇ、ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１、およびリンホタクチンを含めたケモカインが、免疫増強剤の別の非限定的な例である。
【０１８５】
本発明の方法は、とりわけ、別の治療プロトコールまたは治療レジメン、プロセスまたは治療法の必要性またはその使用を低下させる方法も含む。例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移に対して、本発明の方法は、所与の被験体において、それにより化学療法薬、放射線療法（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）、免疫療法、または新生物、腫瘍もしくは癌に対する外科手術、または転移の治療もしくは療法などの抗細胞増殖性（例えば、抗新生物、抗腫瘍または抗癌）または免疫増強性の治療もしくは療法の頻度が少なくなる、またはその用量が低下する、またはそれが排除される場合に、治療効果を有する。
【０１８６】
本発明によると、抗細胞増殖性（例えば、抗新生物、抗腫瘍、抗癌または抗転移）の治療または療法の必要性またはその使用を低下させる方法が提供される。一実施形態では、方法は、被験体に、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質に結合する抗体を、細胞過剰増殖性障害（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）を治療するため、および抗細胞増殖性（抗新生物、抗腫瘍または抗癌、または抗転移）または免疫増強性の療法の必要性を低下させるまたは排除するのに有効な量で投与するステップを含む。方法は、抗新生物、抗腫瘍、抗癌もしくは抗転移、または免疫増強性の療法を施与する前に、それと実質的に同時に、またはその後に行うことができる。
【０１８７】
治療効果または改善を実現することが望まれる治療または療法の方法における用量または「有効量」または「十分量」としては、例えば、標的（例えば、細胞過剰増殖性障害）の病状、有害な症状または合併症の進行または悪化を妨害、抑制するまたは遅延させることが、良好な結果であるが、標的（例えば、細胞過剰増殖性障害）に関連するまたはそれによって引き起こされる１つ、いくつか、または全ての病状、有害な症状または合併症が、いくらかでも測定可能または検出可能な程度に他覚的または自覚的に緩和または回復することが挙げられる。したがって、細胞過剰増殖性障害の場合、この量は、所与の被験体に治療効果をもたらすため、または所与の被験体における障害の病状、有害な症状または合併症を緩和または回復させるために十分な量になる。用量は、治療または治療の標的（例えば、細胞過剰増殖性障害）または治療もしくは療法の任意の副作用（単数または複数）の状態によって示されるように比例的に増加または低下させることができる。
【０１８８】
代表的な非限定的な量（用量）は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、および任意の数値もしくは範囲またはそのような範囲内の数値にわたる。それを超える量（用量）またはそれ未満の（用量）、例えば、０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ、および任意の数値もしくは範囲またはそのような範囲内の数値の量（用量）を投与することができる。追加的な代表的な非限定的な量（用量）は、約０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、１．０〜２５ｍｇ／ｋｇ、１．０〜１０ｍｇ／ｋｇ、および任意の数値もしくは範囲またはそのような範囲内の数値にわたる。
【０１８９】
本発明の方法は、１日当たり、１週間当たり、１ヵ月当たり、または１年当たり、１回または複数回（例えば、１〜１０回、１〜５回または１〜３回）行うことができる。いつ投与を遅延させるまたは中止するのが適切であるかは、当業者には分かる。代表的な非限定的な投薬スケジュールは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０週間またはそれ以上または任意の数値もしくは範囲またはそのような範囲内の数値の間、１週間当たり１〜７回である。
【０１９０】
当然のことながら、治療または療法のいずれに対しても一般的に、異なる被験体は治療に対して異なる応答を示し、一部は特定の治療プロトコール、治療レジメンまたは治療プロセスに対して応答しない、または不適切に応答する可能性がある。したがって、有効または十分な量は、少なくとも部分的に、治療される障害（例えば、細胞増殖、良性の過形成もしくは新生物、腫瘍もしくは癌、種類または病期、例えば、腫瘍もしくは癌の悪性度、およびそれが進行性、後期もしくは初期であるか）、所望の治療効果ならびに個々の被験体（例えば、被験体での生物学的利用率、性別、年齢など）および遺伝的変異性および後成的変異性（例えば薬理ゲノミクス）に基づいた、治療に対する被験体の応答に左右される。
【０１９１】
細胞の毒性および生存率（細胞のアポトーシス、溶解、成長増殖など）は、当技術分野で公知の、比色分析的、発光的、放射測定的、または蛍光定量的なアッセイに基づいた種々のやり方で測定することができる。細胞の生存率を決定するための比色分析技法としては、例えば、トリパンブルー排除（例えば、実施例１および２を参照されたい）が挙げられる。簡単に述べると、細胞をトリパンブルーで染色し、血球計数器を使用して係数する。生存可能な細胞はこの染料を排除するが、死細胞および瀕死細胞は青色染料を吸収し、光学顕微鏡の下で容易に識別される。ニュートラルレッドは生存可能な細胞に吸着し、細胞のリソソーム内に濃縮される；光学顕微鏡を用い、ニュートラルレッドで染色された細胞の数を定量化することによって生存可能な細胞を決定することができる。
【０１９２】
細胞の生存率を決定するための蛍光定量的な技法としては、例えば、蛍光ＤＮＡ挿入剤であるヨウ化プロピジウムが挙げられる。ヨウ化プロピジウムは、生存可能な細胞からは排除されるが、死細胞の核を染色する。次いで、ヨウ化プロピジウム標識された細胞のフローサイトメトリーを用いて生存可能な細胞および死細胞を定量化することができる。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）が放出されることにより、細胞の構造的な損傷および死が示され、それを分光光度的な酵素アッセイによって測定することができる。ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）は、新たに合成されたＤＮＡに導入され、それを蛍光色素標識された抗体を用いて検出することができる。蛍光染料であるＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８はＤＮＡを標識し、細胞の増殖を定量化するために使用することができる（例えば、フローサイトメトリー）。蛍光染料であるカルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥまたはＣＦＤＡ−ＳＥ）を定量的に導入することにより、細胞分裂分析がもたらされる（例えば、フローサイトメトリー）。この技法はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで用いることができる。７−アミノアクチノマイシン  Ｄ（７−ＡＡＤ）は、ＤＮＡと結合するとスペクトルシフトを受け、細胞分裂分析をもたらすことができる蛍光挿入剤である（例えば、フローサイトメトリー）。
【０１９３】
細胞増殖を決定するための放射測定技法としては、例えば、生細胞の新たに合成されたＤＮＡに導入され、細胞の増殖を決定するために頻繁に使用される［３Ｈ］−チミジンが挙げられる。細胞の生存率を定量化するために、死細胞から放出されるクロム（５１Ｃｒ）をシンチレーション測定によって定量化することができる。
【０１９４】
細胞の生存率を決定するための発光技法としては、例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）が挙げられる。この技法では、生存可能な細胞の数を決定するために、存在するＡＴＰの量が定量化される。
【０１９５】
細胞の生存率および細胞増殖を決定するための市販のキットとしては、例えば、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｒａｋ  ＥＬＩＳＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）；蛍光試薬の示差的な吸収に基づいて迅速な細胞の計数および生存率決定をもたらすＧｕａｖａ  ＶｉａＣｏｕｎｔ（商標）Ａｓｓａｙ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）；ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）；およびＣｙｔｏＬｕｘ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）が挙げられる。ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）では、時間分解蛍光定量的な方法を用いて細胞の増殖および生存率を決定することができる。Ｑｕａｎｔｏｓ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙは、溶解した細胞からのＤＮＡ−染料複合体の蛍光を測定する、蛍光に基づくアッセイである（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞の生存率アッセイは、細胞の生存率を測定するための発光アッセイである（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）。
【０１９６】
「被験体」および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、動物、一般的にはヒト、非ヒト霊長類（ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、マカク、テナガザル）、家畜動物（イヌおよびネコ）、農場および飼育場の動物（ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、試験動物および実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）などの哺乳動物を指す。被験体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性を試験するための疾患モデル動物（例えば、マウス、ラットおよび非ヒト霊長類など）を含む（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移の動物モデル）。ヒト被験体は、例えば１歳〜５歳、５歳〜１０歳、１０歳〜１８歳の新生児、乳児、幼児および十代の子供、１８歳〜６０歳の成人、および例えば６０歳〜６５歳、６５歳〜７０歳および７０歳〜１００歳の高齢者を含む。
【０１９７】
被験体は、治療を必要とする、すなわち、望ましくないまたは異常な細胞増殖（細胞過剰増殖）または細胞過剰増殖性障害を有する哺乳動物（例えば、ヒト）を含む。被験体は、細胞過剰増殖性障害を有する危険性がある（例えば、細胞過剰増殖性障害の素因になる望ましくない細胞増殖を示す）被験体、抗細胞増殖性または免疫増強性の治療または療法を保証する検査診断または臨床診断の結果、そのような治療の候補である被験体またはそれを必要とする被験体、抗細胞増殖性または免疫増強性の療法を受けている被験体、および抗細胞増殖性または免疫増強性の療法を受けて、再燃または再発する危険性がある被験体を含む。
【０１９８】
危険性がある被験体は、家族歴、遺伝的素因がある被験体、または細胞増殖性障害または細胞過剰増殖性障害（例えば、良性の過形成、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）で以前苦痛を受けた被験体、および再燃または再発する危険性がある被験体を含む。危険性がある被験体は、さらに喫煙者などの発癌物質または突然変異原への環境的な曝露、または職業上（工業、化学、農業）の環境にある被験体を含む。新生物、腫瘍または癌などの細胞増殖性障害または細胞過剰増殖性障害を発症する危険性があるそのような被験体は、腫瘍関連遺伝子、遺伝子欠失または遺伝子突然変異についての遺伝子スクリーニングによって同定することができる。例えば、Ｂｒｃａｌを欠く被験体は、乳癌を発症する危険性がある。例えば、結腸癌を発症する危険性がある被験体は、大腸腺腫症遺伝子（ＡＰＣ）などの腫瘍抑制遺伝子の欠失または突然変異を有する。細胞増殖性障害に対して特定の遺伝的素因を有する、危険性がある被験体は公知である（例えば、Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ第２版、Ｂｅｒｔ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（編集者）、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｗ．  Ｋｉｎｚｌｅｒ（編集者）（２００２年）ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ；Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ、ＷＢ  ＣｏｌｅｍａｎおよびＧＪ  Ｔｓｏｎｇａｌｉｓ編（２００１年）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎら、ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ（１９９５年）を参照されたい）。
【０１９９】
したがって、危険性がある被験体を、細胞増殖性障害および細胞過剰増殖性障害を発症する、または細胞増殖性障害が治癒した後に、同じまたは異なる細胞増殖性障害および細胞過剰増殖性障害が再燃または再発する可能性を抑制するまたは低下させるために治療することができる。そのような治療の結果は、細胞増殖性障害および細胞過剰増殖性障害が発症する危険性が低下すること、または細胞増殖性障害および細胞過剰増殖性障害、もしくは治療される、危険性がある被験体におけるその病状、有害な症状または合併症が予防されることであり得る。
【０２００】
本発明は、さらに、タンパク質（例えば、抗体）、核酸、作用剤、薬物および製剤を、適切な包装材料中に、場合によってキットの成分を使用するための説明書、例えば、本発明の方法を実施するための説明書と組み合わせて包装して含むキットを提供する。一実施形態では、キットは、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数またはその部分配列に結合する抗体、および、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数、またはその部分配列を検出するための説明書を含む。別の実施形態では、キットは、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数に結合する抗体または抑制性核酸、およびグリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数、またはその部分配列に結合する抗体または抑制性核酸を用いて治療可能な状態を治療するための説明書を含む。一態様では、説明書は、望ましくない細胞増殖もしくは細胞過剰増殖、または細胞過剰増殖性障害を治療するための説明書である。別の態様では、説明書は、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移を治療するための説明書である。別の実施形態では、キットは、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数、またはその部分配列に結合する抗体、望ましくない細胞増殖または細胞過剰増殖、または細胞過剰増殖性障害を治療するための説明書、および抗細胞増殖性または免疫増強性の治療剤、作用剤または薬物を含む。種々の態様では、キットは、抗新生物剤、抗癌剤または抗腫瘍剤を含む。さらに別の態様では、キットは、製造品、例えば、抗体または核酸、抗細胞増殖性または免疫増強性の治療剤、作用剤または薬物を、被験体に局所的、局部的または全身的に送達するための製造品を含む。
【０２０１】
「包装材料」という用語は、キットの成分を収容している物理的構造を指す。包装材料により、成分を滅菌状態に維持することができ、包装材料はそのような目的のために一般に使用される材料製であってよい（例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプルなど）。ラベルまたは添付文書は、適切な説明書、例えば、本発明の方法を実施すること、例えば、細胞増殖性障害および細胞過剰増殖性障害の治療、グリコシル化もしくは脱グリコシル化された、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬの１つまたは複数、またはその部分配列、または核酸などをスクリーニング、検出または同定するためのアッセイなどの説明書を含んでよい。したがって、付加的な実施形態では、キットは、本発明の方法を溶液中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏで実施するための説明書を含むラベルまたは添付文書を含む。
【０２０２】
したがって、説明書は、本明細書に記載の本発明の方法のいずれかを実施するための説明書を含んでよい。例えば、発明の医薬組成物は、容器、包み、またはディスペンサーに、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移などの細胞増殖性障害および細胞過剰増殖性障害を治療するために被験体に投与するための説明書と一緒に含めることができる。説明書は、良好な臨床エンドポイントもしくは発生する可能性がある任意の有害な症状もしくは合併症、保管情報、有効期限またはヒト被験体において使用するために食品医薬品局などの規制当局に要求される任意の情報の表示をさらに含んでよい。
【０２０３】
説明書は、「印刷物」上、例えば、キット内の紙またはボード紙上、キットまたは包装材料に添付されたラベル上にあってよく、またはキットの成分を含有するガラス瓶またはチューブに貼付してよい。説明書は、音声テープまたはビデオテープで構成されてよく、さらにディスク（ハードディスク）などのコンピュータで読込み可能な媒体、ＣＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭまたはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭなどの光学ＣＤ、ＦＬＡＳＨ、ＲＡＭおよびＲＯＭなどの電気的な記憶媒体、および磁気／光学記憶媒体などのこれらのハイブリッドに含めることができる。
【０２０４】
発明のキットは、緩衝剤、保存料、またはタンパク質／核酸安定化剤をさらに含んでよい。キットは、活性についてアッセイするための対照成分、例えば、対照試料または標準物質も含んでよい。キットの成分のそれぞれは、個々の容器に、または混合物で同封することができ、種々の容器は全て単一または複数の包装物の内部にあってよい。
【０２０５】
タンパク質（例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質）、抗体（例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質抗体）、核酸、および他の組成物ならびに本発明の方法は、製剤中に含めることができる、または製剤を利用することができる。そのような製剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、被験体を治療する、または被験体に投与または送達するために有用である。
【０２０６】
製剤は、「薬学的に許容される」および「生理的に許容される」担体、希釈剤または賦形剤を含む。本明細書で使用される「薬学的に許容される」および「生理的に許容される」という用語は、薬剤投与に適合性のある溶媒（水性または非水性）、溶液、エマルション、分散媒、被覆材、等張化剤、吸収促進剤または吸収遅延剤を含む。そのような処方は、液体；エマルション、懸濁液、シロップもしくはエリキシル剤、または固形剤；錠剤（被覆されたまたは被覆されていない）、カプセル（ハードまたはソフト）、粉末、顆粒、結晶またはマイクロビーズに含有させることができる。補充の化合物（例えば、保存料、抗細菌剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤）も、処方に組み込むことができる。
【０２０７】
製剤は、特定の局所的、局部的または全身的な投与経路または送達経路と適合するように製造することができる。したがって、製剤は、特定の経路で投与するために適切な担体、希釈剤、または賦形剤を含む。本発明の組成物の投与経路の特定の非限定的な例は、非経口的投与、例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹膜内投与、経皮（局所）投与、経粘膜投与、頭蓋内投与、脊髄内投与、眼内投与、直腸投与、経口（食事性）投与、粘膜投与、および治療方法または投与プロトコールに適した任意の他の処方である。
【０２０８】
非経口投与するために使用される溶液または懸濁液としては、注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸、クエン酸またはリン酸などの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの等張化剤が挙げられる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整することができる。
【０２０９】
注射用製剤は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または滅菌懸濁液と、滅菌注射溶液または滅菌注射懸濁液を即時調製するための滅菌粉末を含む。静脈内投与するための適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、クレモフォール  ＥＬ（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ）（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）および適切なその混合物を含有する溶媒または分散媒であってよい。例えば、レシチンなどの被覆剤を使用することにより、分散の場合は必要な粒子サイズを維持することにより、また界面活性剤を使用することにより、流動性を維持することができる。抗細菌剤および抗真菌剤としては、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸およびチメロサールが挙げられる。等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物に含めることができる。吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを含めることにより、注射用組成物の吸収を引き延ばすことができる。
【０２１０】
滅菌注射製剤は、必要量の活性組成物を、上記成分の１つ、またはその組合せと一緒に適切な溶媒に組み込むことによって調製することができる。一般に、分散は、活性組成物を、基本的な分散媒および任意の他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製方法としては、例えば、真空乾燥および凍結乾燥が挙げられ、それにより、予め調製された溶液から、活性成分に任意の追加的な所望の成分が加わった粉末がもたらされる。
【０２１１】
経粘膜または経皮投与するために、関門を浸透させるために適切な浸透剤が処方に使用される。そのような浸透剤は、当技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与用に、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、スプレー式点鼻薬、吸入装置（例えばアスピレーター）または坐薬を使用することによって実現することができる。経皮投与するために、活性化合物を軟膏、膏薬、ゲル、クリームまたは貼付剤に処方する。
【０２１２】
製剤は、制御放出処方など、体内から急速に排出されることから保護する担体、またはモノステアリン酸グリセリンまたはステアリン酸グリセリンなどの時間遅延物質と一緒に調製することができる。処方は、局所的、局部的もしくは全身的な送達または制御放出または持続放出を実現するための移植装置およびマイクロカプセル化送達系などの製造物を使用して送達することもできる。
【０２１３】
エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生物分解性、生体適合性のポリマーを使用することができる。そのような処方を調製するための方法は、当業者に公知である。材料は、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から購入することもできる。リポソーム懸濁液（抗体またはウイルス被覆タンパク質を使用して細胞または組織にターゲティングさせたリポソームを含む）も、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、公知の方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の方法に従って調製することができる。
【０２１４】
投与に適した追加的な製剤は、当技術分野で公知である（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０００年）；Ａｎｓｅｌら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９年）；Ｋｉｂｂｅ（編）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、第３版（２０００年）；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、Ｐａ．、（１９９３年）を参照されたい）。
【０２１５】
タンパク質（抗体）、核酸（抑制性）、治療、療法、作用剤、薬物および製剤を含めた本発明に従って使用される組成物は、容易に投与するためおよび均一に投薬するために単位剤形に包装することができる。本明細書で使用される「単位剤形」は、単位投薬治療に適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の治療または治療的（例えば、有益な）効果がもたらされるように算出した担体、賦形剤、希釈剤、またはビヒクルと一緒にある量の組成物を含有する。単位剤形は、必ずしもこれらに限定されないが、利用される特定の組成物、得ようとする効果、および治療される被験体についての薬力学および薬理ゲノミクスを含む種々の因子に左右される。
【０２１６】
本発明は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、脱グルコシル化されたＧｒｐ７８または脱グルコシル化されたＬＤＬの１つまたは複数をスクリーニング、検出および同定する、無細胞の方法（例えば、溶液中、固相中）および細胞に基づいた方法（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）を提供する。方法は、溶液中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生物学的材料または試料を使用して、およびｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、動物からの新生細胞、腫瘍細胞もしくは癌細胞、もしくは転移細胞、組織または器官（例えば、生検材料）を使用して行うことができる。
【０２１７】
本発明によると、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、それらのグルコシル化された型または脱グルコシル化された型の１つまたは複数を同定、検出またはスクリーニングする方法、およびＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、そのグルコシル化された型または脱グルコシル化された型、配列をコードする核酸またはその部分を同定、検出またはスクリーニングする方法が提供される。一実施形態では、方法は、生物学的材料または試料を、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、そのグルコシル化された型または脱グルコシル化された型の１つまたは複数に結合する抗体と、抗体が結合可能な条件下で接触させるステップと、抗体の、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、そのグルコシル化された型または脱グルコシル化された型の１つまたは複数への結合についてアッセイするステップとを含む。抗体が結合することにより、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、そのグルコシル化された型または脱グルコシル化された型の１つまたは複数の存在が検出される。別の実施形態では、方法は、生物学的材料または試料を、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質配列をコードする核酸またはその部分とハイブリダイズするポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドが核酸に結合可能な条件下で接触させるステップと、抗体のＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質への結合についてアッセイするステップとを含む。ポリヌクレオチドが核酸に結合することにより、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の存在が検出される。一態様では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質は、細胞または組織に存在する。別の態様では、生物学的材料または試料は、哺乳動物被験体から得られる。別の態様では、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、そのグルコシル化された型または脱グルコシル化された型の１つまたは複数に結合する抗体は、例えば、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９０３として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体に代表される、または軽鎖可変領域配列（配列番号１３）および重鎖可変領域配列（配列番号１５または配列番号１８）を含むＳＡＭ−６抗体とは異なる。
【０２１８】
本発明は、望ましくないまたは異常な細胞増殖または細胞過剰増殖性障害（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）を有する、またはそれらを有する危険性が高い被験体を診断する、無細胞の方法（例えば、溶液中、固相中）および細胞に基づく方法（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）も提供する。方法は、溶液中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、生物学的材料または試料、例えば、新生細胞、腫瘍細胞もしくは癌細胞、もしくは転移細胞を含むまたはそれを示している疑いがある細胞、組織または器官の生検材料、または血清、血漿、尿、唾液、月経血、もしくは糞便を用いて行うことができる。方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば、動物においても行うことができる。
【０２１９】
本発明によると、望ましくないまたは異常な細胞増殖または細胞過剰増殖性障害（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）を有する、またはそれらを有する危険性が高い被験体を診断する方法が提供される。一実施形態では、方法は、被験体由来の生物学的材料または試料を、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、そのグルコシル化された型または脱グルコシル化された型の１つまたは複数に結合する抗体と、抗体が結合可能な条件下で接触させるステップと、抗体の、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、そのグルコシル化された型または脱グルコシル化された型の１つまたは複数、またはその部分配列への結合についてアッセイするステップとを含む。ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質、Ｇｒｐ７８、ａｐｏＢ１００、ＬＤＬ（例えば、ｏｘＬＤＬ）、ＶＬＤＬ、そのグルコシル化された型または脱グルコシル化された型、またはその部分配列に抗体が結合することにより、被験体が、望ましくないまたは異常な細胞増殖または細胞過剰増殖性障害（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）を有する、またはそれらを有する危険性が高いと診断される。一態様では、生物学的材料または試料はヒトから得られる。別の態様では、生物学的材料または試料は、生検材料（例えば、肺、膵臓、胃、乳房、食道、卵巣または子宮の生検材料）を含む。別の態様では、生物学的材料または試料は、血清、血漿、尿、唾液、月経血、または糞便を含む。
【０２２０】
本発明の同定、検出、スクリーニングおよび診断アッセイは、過剰増殖していることが疑われる細胞、例えば、細胞過剰増殖性障害の細胞の分析によって実施することができる。細胞は、過剰増殖している細胞系、不死化細胞系、新生細胞系、腫瘍細胞系および癌細胞系、ならびに乳房、肺、甲状腺、頭頸部、鼻咽頭、鼻もしくは洞、脳、脊柱、副腎、甲状腺、リンパ、胃腸系（口、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸（小腸）、結腸、直腸）、尿生殖路  （子宮、卵巣、子宮頸部、膀胱、睾丸、陰茎、前立腺）、腎臓、膵臓、副腎、肝臓、骨、骨髄、リンパ、血液、筋肉、皮膚および造血系由来の初代単離物、ならびに転移部位または続発部位を含む。
【０２２１】
タンパク質（例えば、抗体）などの組成物、材料、試料、または治療に関して使用される「接触させる」という用語は、組成物（例えば、抗体などのタンパク質）と他の参照実体との間の直接的または間接的な相互作用を意味する。直接的な相互作用の特定の例は結合である。間接的な相互作用の特定の例は、組成物が中間分子に作用し、今度はその中間分子が参照実体に作用する場合である。したがって、例えば、細胞（例えば、細胞過剰増殖性障害を成す細胞）を抗体と接触させることは、抗体が細胞に結合できるようにすること（例えば、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質に結合することによって）、または抗体が中間体に作用し、それが今度は細胞に作用できるようにすることを含む。
【０２２２】
「アッセイすること」および「測定すること」という用語およびその文法的変異形は、本明細書では互換的に使用され、定性的な決定または定量的な決定のいずれか、または定性的な決定と定量的な決定の両方を指す。この用語が結合に関して使用される場合、本明細書に記載のおよび当技術分野で公知の種々の方法を含めた、結合の相対量、親和性または特異性を評価する任意の手段が意図されている。例えば、抗体の結合は、ＥＬＩＳＡアッセイによって評価または測定することができる。
【０２２３】
他に定義されていなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が関する技術分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書に記載の方法および材料に類似または等価の方法および材料を使用することができるが、適切な方法および材料が本明細書に記載されている。
【０２２４】
米国特許仮出願第６１／１５１，１４９号、および国際出願ＰＣＴ／ＥＰ／２００４／０１２９７０（公開ＷＯ  ２００５／０４７３３２  Ａ１）およびＰＣＴ／ＤＥ／２００４／００２５０３（公開ＷＯ  ２００５／０４９６３５  Ａ２）は、参照によりその全体が明白に本明細書に組み込まれている。他の刊行物、特許、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号および本明細書で引用した他の参照は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。矛盾する場合は、定義を含めた本明細書に支配される。
【０２２５】
本明細書で使用される、単数形「ａ（１つの）」、「および（ａｎｄ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「糖タンパク質」または「抗体」と言及することは、複数の糖タンパク質または抗体を含み、「治療または療法」と言及することは、多数または連続的な治療または療法を含む、などである。
【０２２６】
本明細書で使用される全ての数値または数的な範囲は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、そのような範囲内を超えない、もしくはそれを包含する整数、および範囲を超えないもしくは範囲を包含する値もしくは整数の部分を全て含む。したがって、例えば、９０〜１００％の範囲に言及することは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％などだけでなく、９１．１％、９１．２％、９１．３％、９１．４％、９１．５％など、９２．１％、９２．２％、９２．３％、９２．４％、９２．５％なども含む、などである。例えば、１〜５，０００倍の範囲に言及することは、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍などだけでなく、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍など、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍なども含む、などである。範囲に言及することは、その範囲の部分的な範囲に言及することを含む。したがって、例えば、９０〜１００の範囲に言及することは、９１〜９９、９２〜９８、９３〜９５、９４〜９６の範囲だけでなく、９２〜９４、９３〜９５、９３〜９６、９５〜９７、９５〜９８、９５〜９９、９５〜１００などを含む。ひと続きの範囲は、これらの範囲の下端と上端の両方を組み合わせた範囲を含む。したがって、例えば、５０〜１００、１００〜２００および２００〜３００などのひと続きの範囲に言及することは、５０〜２００、５０〜３００、１００〜３００などの範囲を含む。
【０２２７】
本発明は、本明細書において、概して、多数の実施形態を記載するために肯定的な言語を使用して開示されている。本発明は、物質または材料、方法のステップおよび条件、プロトコール、手順、アッセイまたは分析などの特定の対象事項が全てまたは部分的に排除された実施形態も具体的に含む。したがって、本発明は、概して、本明細書において本発明が何を含まないかに関して表現されていないが、それにもかかわらず本発明に明白に含まれていない態様が開示されている。
【０２２８】
以下は、炭水化物構造およびそれらの構造の略称の表である。
【０２２９】
【表１−１】
2012517216.tif 000009
【０２３０】
【表１−２】
2012517216.tif 000010
【０２３１】
【表１−３】
2012517216.tif 000011
本発明のいくつもの実施形態が記載されている。それにもかかわらず、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく種々の改変を行うことができることを理解されたい。したがって、以下の実施例は、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を例示することを企図し、限定するものではない。
【実施例】
【０２３２】
（実施例１）
この実施例は様々な例示的な材料および方法を記載する。
【０２３３】
細胞培養
ヒト膵臓癌細胞系ＢＸＰＣ−３およびヒト胃腺癌細胞系２３１３２／８７を、１０％の熱失活ＦＣＳ（ＰＡＡ、ウィーン、オーストリア）、２ｍＭのＬ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシン（いずれも１％、ＰＡＡ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（ＰＡＡ、ウィーン、オーストリア）中で培養した。ＳＡＭ−６抗体産生ハイブリドーマ細胞は、細胞培養フラスコ（１７５ｃｍ２）中ＡＩＭ／Ｖ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）中で増殖させた。全ての細胞は、３７℃において加湿、７％ＣＯ２雰囲気中でインキュベートした。
【０２３４】
ＳＡＭ−６抗体の精製
ＳＡＭ−６抗体の精製用に、細胞培養上清を回収し、高速液体クロマトグラフィーシステム（ＦＰＬＣ）を使用して、カチオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＦＦカラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）によって精製した。開始バッファー（２０ｍＭリン酸バッファーｐＨ５．９）でのカラム平衡化後、細胞培養上清（同じｐＨ）をカラムに施した。非結合タンパク質は開始バッファーで溶出し、一方で結合抗体は、７５％溶出バッファー（２０ｍＭのリン酸バッファー、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を用いて塩濃度を増大することによって置換した。抗体含有画分は０．９％塩化ナトリウムに希釈し、滅菌濾過し、使用するまで−７０℃で保存した。抗体の純度はＳＤＳゲル電気泳動によって決定し、活性は免疫組織化学および機能アッセイによって確認した。
【０２３５】
（抗原精製用の）腫瘍細胞膜抽出物の精製
ＳＡＭ−６抗原（ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質）の精製用に、膜タンパク質を、ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ（商標）天然膜タンパク質抽出キット（Ｍ−ＰＥＫ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を使用してヒト胃腺癌細胞系２３１３２／８７から単離した。内在性および膜結合タンパク質の原型２ステップ抽出の全手順は、４℃または氷上で実施した。全ての必要なバッファー溶液および試薬はＭ−ＰＥＫで与えられた。
【０２３６】
３〜５×１０６個の腫瘍細胞（凍結細胞ペレット）を２ｍｌの氷冷洗浄バッファーで二回洗浄した。３００×ｇおよび４℃での１０分間の遠心分離後、上清はペレットを破壊せずに除去し、廃棄した。このペレットは、１０μｌのプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する２ｍｌ氷冷抽出バッファーＩ中に注意深く再縣濁した。ロータリーシェーカーにおける軽い攪拌下での、４℃での１０分間のインキュベーション後、１５分間１６，０００×ｇおよび４℃での遠心分離によって不溶性物質を沈殿させた。対照の目的で、可溶性タンパク質が豊富な上清のアリコートを、細胞層を破壊せずに試験管に移した。残りの画分は廃棄した。第２の抽出ステップでは、５μｌのタンパク質阻害剤カクテルを含有する１ｍｌの抽出バッファーＩＩをステップＩのペレットに加え、ピペットを使用することによって注意深く混合し、軽い攪拌下において４℃で３０分間インキュベートした。不溶性物質は１６，０００×ｇおよび４℃で１５分間遠心分離した。ここで内在性膜および膜結合タンパク質が豊富な上清を、残骸ペレットを破壊せずに新たな試験管に完全に移した。標準としてウシ血清アルブミンを使用したＢＣＡ法によるタンパク質含有量の決定後、アリコートを−２０℃で保存した。
【０２３７】
ウエスタンブロット分析
還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル（８％）および膜タンパク質のウエスタンブロッティングを、標準的なプロトコールを使用して実施した。要約すると、ブロット０．２μｍニトロセルロース膜を０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０および５％（ｗ／ｖ）低脂肪乳粉末を含有するＰＢＳでブロッキングし、次に２０μｇ／ｍｌのＳＡＭ−６ヒトＩｇＭ抗体または無関連ヒト対照ＩｇＭ（ＣｈｒｏｍｐｕｒｅＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）と共に１時間インキュベートした。二次抗体（ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体１：１，０００；Ｄｉａｎｏｖａ）は、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ、Ｂｏｎｎ、ドイツ）からのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ化学発光キットを用いて検出した。
【０２３８】
ＳＡＭ−６受容体の精製
Ｍ−ＰＥＫを用いた抽出後に腫瘍細胞系２３１３２／８７から得た膜画分を使用して、ＳＡＭ−６抗体の抗原を精製した。第１の精製ステップに、サイズ排除クロマトグラフィーを使用した。１０ｍｌのＭ−ＰＥＫ抽出物（１ｍｇ／ｍｌ）を、スーパーループシステムおよび高速タンパク質液体クロマトグラフィー単位（ＦＰＬＣ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）を使用して１ｍｌ／分の流速で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＸＫ１６／６０；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）に注入した。カラムはバッファーＡ（１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、４０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を用いて事前に平衡状態にし、２ｍｌ／分の流速で同じバッファーを用いて溶出した。それぞれ２ｍｌの画分を回収し、ＳＡＭ−６受容体活性のピークに相当する画分を組み合わせ、平衡状態のアニオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＳｅｐｈａｒｏｓｅＱＸＬ、５ｍｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）に施した。非結合成分はバッファーＡを用いて溶出し、一方で結合タンパク質は、バッファーＢ（１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を使用して直線ステップ勾配により塩濃度を増大することによって放出した。
【０２３９】
再度２ｍｌ／分の流速を使用し、２ｍｌの画分を回収し、２８０ｎｍでモニタリングした。一晩−２０℃でアセトン沈殿によって溶出物を濃縮した後、タンパク質ペレットを１×ＳＤＳバッファーに溶かし、ＳＡＭ−６抗体との反応に関してＳＤＳ−Ｐａｇｅおよびウエスタンブロット分析によって調べた。陽性バンドをクーマシー染色ゲルから切除し、配列決定した。
【０２４０】
ペプチド質量マッピングによるタンパク質の同定
タンパク質の配列決定はＴｏｐＬａｂ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、ドイツ）によって実施された。一次元ＳＤＳ−Ｐａｇｅおよびクーマシー染色後、８０ｋＤａの推定分子量を有するタンパク質バンドを切除し、ヨードアセトアミドによる還元およびアルキル化後、バンドはトリプシンでゲル内消化した。トリプシンペプチドのプールはＺｉｐＴｉｐＣ１８によって脱塩し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）次にデータベース検索（Ｐｒｏｆｏｕｎｄ  ａｎｄ  Ｍａｓｃｏｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ＮＣＢＩ）によって分析した。最適タンパク質候補（１．００の確率）に関するヒットを、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌを使用して比較した。
【０２４１】
Ｇｒｐ７８の低分子干渉ＲＮＡを用いたトランスフェクション試験
細胞系ＢＸＰＣ−３を、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いたトランスフェクション後にＳＡＭ−６受容体結合試験に使用した。ヒトＨＳＰＡ５に対するＳｉＧＥＮＯＭＥ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ試薬、標的分子Ｇｒｐ７８の抑制用に予め設計および確認したｓｉＲＮＡはＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ、ＵＳＡ）から購入した。ｓｉＲＮＡ導入によって引き起こされる遺伝子発現に対する非特異的効果の対照としてのＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）陰性対照はＡｍｂｉｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）から購入した。
【０２４２】
さらなる対照として、擬似トランスフェクト（ｓｉＲＮＡなし）および未処理細胞（完全ＲＰＭＩ−１６４０中で増殖、非トランスフェクト）が働いた。ｓｉＲＮＡのトランスフェクション用に、ｓｉＬｅｎｔＦｅｃｔ（商標）Ｌｉｐｉｄ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した。さらに、細胞へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションを制御するために、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ＣＹ３  ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）をトランスフェクトし、共焦点顕微鏡を使用して確認した。
【０２４３】
トランスフェクション前日に、２４ウエルプレートに、ウエル当たり１ｍｌ完全増殖培地中１×１０４個の細胞を接種した（翌日５０％の集合状態）。プレートはトランスフェクション前に３０分間３７℃および７％ＣＯ２で一晩インキュベートし、培地はウエル当たり０．４ｍｌの新鮮および完全培地に注意深く交換した。それぞれのウエル用に、１００μｌのトランスフェクション混合物を調製し、細胞に加えた。この混合物は、室温で２０分間のインキュベーション後、５０μｌのｓｉＲＮＡと組み合わせた、４９μｌの無血清ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）、１μｌのｓｉＬｅｎｔＦｅｃｔ（商標）Ｌｉｐｉｄからなっていた。ＳｉＧＥＮＯＭＥ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌの最終濃度は対照ｓｉＲＮＡｓの１００ｎＭおよび２５ｎＭであった。トランスフェクト細胞は３７℃および７％ＣＯ２雰囲気で２４、４８および７２時間にわたりインキュベートした。示した時間後のＧｒｐ７８のノックダウンはＦＡＣＳ分析によってモニタリングした。
【０２４４】
ＦＡＣＳ分析によるＧｒｐ７８タンパク質ノックダウンの検出
腫瘍細胞系ＢＸＰＣ−３をヒトＧＲＰ７８に対するｓｉＧＥＮＯＭＥｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。トリプシン／ＥＤＴＡ（ＰＡＡ、ウィーン、オーストリア）で軽く脱着することによって、１日および３日後に細胞を採取した。１日および３日後に、ＧＲＰ７８のタンパク質レベルをＦＡＣＳ分析によってモニタリングした。それぞれ２×１０５個の細胞を３０分間ＳＡＭ−６抗体（１００μｇ／ｍｌ）、抗ＧＲＰ７８抗体（１００μｇ／ｍｌ；クローンＥＴ−２１、Ｓｉｇｍａ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）または抗ＣＤ５５抗体（１：５０；クローン１４３−３０、ＤＰＣ  Ｂｉｅｒｍａｎｎ、Ｂａｄ  Ｎａｕｎｈｅｉｍ、ドイツ）と共に氷上でインキュベートした。無関連ヒトＩｇＭ（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）およびウサギ／マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）は陰性対照として働いた。１５分間のＦＩＴＣ標識二次抗体（ウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体、Ｄａｋｏ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ；ヤギ抗ウサギＩｇＧまたはヤギ抗マウスＩｇＧ、いずれもＡｃｒｉｓ、Ｈｉｄｄｅｎｈａｕｓｅｎ、ドイツ）とのインキュベーションを続けた。細胞はＷｉｎＭＤＩソフトウェアを使用してフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって分析した。
【０２４５】
トランスフェクト腫瘍細胞におけるＳＡＭ−６でのアポトーシスアッセイ
ＧＲＰ７８  ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクション前後のＢＸＰＣ−３細胞における抗体誘導性アポトーシスの程度を、製造者のプロトコールに従い細胞死検出ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）によって検出した。トランスフェクション後４８時間で、１×１０４個の細胞を９６ウエルプレート上に平板培養し、加湿雰囲気において３７℃および７％ＣＯ２で４時間、１００μｇ／ｍｌのＳＡＭ−６抗体または無関連ＩｇＭ対照（ＣｈｒｏｍｐｕｒｅヒトＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）の存在下でインキュベートした。正常な増殖を実証するために、細胞に完全増殖培地を補充した。
【０２４６】
（グリコシダーゼアッセイ用の）腫瘍細胞膜抽出物の精製
細胞系ＢＸＰＣ−３を１００ｍｍ細胞培養プレート上で８０％の集合状態まで増殖させた。培養プレートはリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４（ＰＢＳ）で二回洗浄し、接着細胞はＰＢＳ中に採取し、次に１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞は氷冷低張バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２）中に再縣濁し、１５分間インキュベートし、次に５分間超音波振盪処理した。核および細胞骨格は１０，０００×ｇでの１０分間の遠心分離によってペレット状にした。上清はＳＷ２８ローターにおいて１００，０００×ｇで３０分間遠心分離しミクロソームペレットを得て、最終的には改変型溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１５０ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ；１％のＮｏｎｉｄｅｔ  ＮＰ−４０および０．２５％のデオキシコール酸ナトリウム）中に注意深く再縣濁した。不溶性物質は１６，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって除去した。上清は残骸ペレットを破壊せずに新たな試験管に完全に移した。標準としてウシ血清アルブミンを使用したＢＣＡ法によるタンパク質含有量の決定後、アリコートを−２０℃で保存した。全ての手順は４℃または氷上で実施した。完全プロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を全ての溶液に加えた。
【０２４７】
グリコシダーゼアッセイ
示差的遠心分離によって調製したＢＸＰＣ−３細胞の膜抽出物をグリコシル化試験に使用した。全型のＮ−およびＯ−結合炭水化物鎖を切断するために、９５℃で３分間、１％のドデシル硫酸ナトリウムおよび１％のβ−メルカプトエタノールを含有するバッファー中で膜抽出物を変性させた。変性抽出物は、反応バッファー（ＰＢＳ  ｐＨ７．４、１％のｎｏｎｉｄｅｔ  ＮＰ−４０、１％のβ−メルカプトエタノール）で、０．５ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度まで希釈した。Ｏ−およびＮ−結合炭水化物の脱グリコシル化用に、１００μｌのアリコートを、３７℃で一晩、１０ＵのＮ−グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）または５ｍＵのＯ−グリコシダーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）のいずれかと共にインキュベートした。反応バッファー中の未処理抽出物は対照として働いた。脱グリコシル化の程度はＳＤＳ−Ｐａｇｅおよびウエスタンブロッティング手順によって分析した。
【０２４８】
サイトスピンにおけるグリコシダーゼアッセイ
４×１０５個のヒト膵臓癌細胞（ＢＸＰＣ−３）を洗浄し、１ｍｌのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．２（Ｓｉｇｍａ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）中に再縣濁した。５Ｕ／ｍｌのＮ−グリコシダーゼまたは２０ｍＵ／ｍｌのＯ−グリコシダーゼ（いずれもＲｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）と共に３７℃で４時間のインキュベーションを続けた。リン酸バッファー中の未処理細胞は対照として働いた。１００μｌの対応するアリコートを洗浄し、２分間５００ｒｐｍでカバーガラスにおいて回転させた。乾燥サイトスピンをアセトンで固定し、免疫組織化学法で染色した。
【０２４９】
サイトスピンの免疫組織化学的染色
乾燥サイトスピンをアセトンで固定し（１０分間）、低脂肪乳粉末／ＰＢＳ（４％）で３０分間ブロッキングした。Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌで洗浄した後、カバーガラスは抗体ＳＡＭ−６（５０μｇ／ｍｌ）または対照抗体と共に３０分間インキュベートした。陰性対照として、同じ濃度の無関連ヒトＩｇＭ（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）、および陽性対照として抗ＣＤ５５抗体（１：３０；クローン１４３−３０、ＤＰＣ  Ｂｉｅｒｍａｎｎ、Ｂａｄ  Ｎａｕｎｈｅｉｍ、ドイツ）が働いた。Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌで洗浄した後、二次抗体とのインキュベーションを３０分間続けた（ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトまたはウサギ抗マウスコンジュゲート１：５０）。Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌでの最終洗浄およびＰＢＳ中での１０分間のインキュベーションの後、室温で１０分間、ジアミノベンジジン（０．０５％）−過酸化水素（０．０２％）を用いて染色を実施した。反応は水道水を流しながら停止させ、カバーガラスをヘマトキシリンで対比染色した。グリセロール−ゼラチンで固定した後、脱グリコシル化の程度を光学顕微鏡を使用して視覚的に分析した。
【０２５０】
フルオレセインイソチオシアネートを用いたＳＡＭ−６抗体の標識
ＳＡＭ−６抗体のエンドサイトーシスをヒト膵臓癌細胞系ＢＸＰＣ−３において決定した。免疫蛍光試験用に、モノクローナル抗体ＳＡＭ−６とアイソタイプ対照ＩｇＭ（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）の結合を、製造者のプロトコールに従いＦｌｕｏｒｏ  Ｔａｇ  ＦＩＴＣ結合キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）を用いて実施した。精製抗体ＳＡＭ−６またはＩｇＭアイソタイプ対照は、２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウムバッファーｐＨ９．０に溶かした。したがって、構成バッファーはＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−２５カラムで炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウムバッファーｐＨ９．０と交換した。抗体の最終濃度は約１．７ｍｇ／ｍｌ（希釈係数１．５）であった。２ｍｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウムバッファー（ＦＩＴＣバイアル当たり）に溶かしたフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の溶液を、抗体に加える直前に調製した。５０μｌのＦＩＴＣ溶液を０．２ｍｌの各抗体溶液に一滴ずつ加え、軽く攪拌しながら暗所において室温で２時間インキュベートした。最後に、ＦＩＴＣ（ＭＷ３８９）とＩｇＭ（ＭＷ９００）の２０：１のモル比を反応混合物において使用し、３〜６のＦ／Ｐ比を有するフルオレセイン−抗体コンジュゲートを予想した。細胞はトリプシン処理し、氷上に１時間放置した。
【０２５１】
ＦＩＴＣ標識抗体は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−２５カラムにおいてゲル濾過によって遊離ＦＩＴＣから分離した。少なくとも３０ｍｌのＰＢＳを用いたカラム平衡化後、反応混合物をカラムゲルベッドの上部に施した。カラム溶出は１０ｍｌのＰＢＳで開始し、０．２５ｍｌ画分を回収した。溶出中、第１の２つの出現ピークはこのコンジュゲートを含有していた。標準としてウシ血清アルブミン（Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）を使用したＢＣＡ法により、タンパク質含有量を決定した。
【０２５２】
ＳＡＭ−６のエンドサイトーシス
ヒト膵臓癌細胞系ＢＸＰＣ−３においてＳＡＭ−６抗体に関するエンドサイトーシスを測定した。モノクローナル抗体ＳＡＭ−６（精製）アイソタイプ対照（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）を、前に記載したようにＦｌｕｏｒｏ  Ｔａｇ  ＦＩＴＣ結合キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）を用いて結合させた。４０μｇ／ｍｌの最終濃度で結合抗体を１×１０６個の細胞に直接与え、３７℃で３０、６０、１２０分間インキュベートした。細胞を採取し、すすぎ、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４（ＰＢＳ）中に再縣濁した。１００μｌの各細胞縣濁液はスライド上に固定した。最後にスライドに蛍光染色用封入剤（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＵＳＡ）を封入し、共焦点顕微鏡を使用して分析した。
【０２５３】
スダンＩＩＩを用いた脂質染色
細胞内脂質染色用に、膵臓癌細胞ＢＸＰＣ−３をガラススライド上で増殖させた。接着細胞は、１００μｇ／ｍｌのＳＡＭ−６抗体、抗Ｇｒｐ７８（クローンＥＴ−２１、Ｓｉｇｍａ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）または無関連対照（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）と共に４８時間インキュベートした。ＰＢＳを用いた２回の洗浄ステップ後に、６０％イソプロパノールで５分間細胞を固定した。使用前に、スダンＩＩＩストック（１００％イソプロパノール中に０．５％スダンＩＩＩ）の６０％溶液を一晩熟成させ、濾過し固定した細胞に加えた。４０分後、細胞を蒸留水で洗浄し、６０％イソプロパノールにおいて分化させ、再度洗浄し、ヘマトキシリンで６分間対比染色した。最後に細胞を水で１０分間すすぎ、グリセロールゼラチンで固定した。脂質含有の程度は光学顕微鏡を使用して目に見える状態にした。
【０２５４】
シトクロムＣアッセイ
ＳＡＭ−６によって誘導されたアポトーシス中にシトクロムｃが放出されたかどうかスクリーニングするために、シトクロムＣＥＬＩＳＡキット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＬａＪｏｌｌａ、ＵＳＡ）を施用した。要約すると、１．５×１０６個の胃癌細胞（２３１３２／８７）を、それぞれ１時間および４時間、２００μｇ／ｍｌの精製ＳＡＭ−６または無関連ＩｇＭ抗体と共にインキュベートした。トリプシン処理後、細胞を氷冷ＰＢＳで三回洗浄し、溶解バッファー中に再縣濁し、軽く混合しながらＲＴで１時間インキュベートした。氷冷ＰＢＳでの三回の洗浄ステップおよび１５分間１，０００×ｇでの遠心分離後、上清を新たな試験管に移し、Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  ＲＤ５Ｐ（１×）で希釈した（１：１０）。次いでＣａｌｉｂｒａｔｏｒ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  ＲＤ５Ｐ（１×）と希釈試料それぞれの混合物（１：１）を、キットに与えられたマイクロタイタープレートに加えた。ＲＴで２時間のインキュベーション、および次いで０．４％の洗浄バッファーによる洗浄を続けた。次いでシトクロムＣコンジュゲートをそれぞれのウエルに加えた。インキュベーションおよび洗浄ステップを前の形式で反復した。それぞれのウエルに基質溶液（着色試薬ＡとＢの１：１混合物）を加えた後、プレートをＲＴで３０分間インキュベートした。４１５ｎｍでの測定（参照波長５４０ｎｍ）は停止溶液を加えた後に実施した。
【０２５５】
カスパーゼアッセイ
カスパーゼ−２、−３、−６、−８、および−９活性に関して抗体処理細胞をスクリーニングするために、Ａｐｏ  Ｔａｒｇｅｔ（商標）比色定量プロテアーゼアッセイサンプラーキット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＬａＪｏｌｌａ、ＵＳＡ）を供給者のマニュアルに従い使用した。要約すると、３×１０６個の胃癌細胞（２３１３２／８７）を、それぞれ１時間および４時間、２００μｇ／ｍｌの精製ＳＡＭ−６または無関連ＩｇＭ抗体と共にインキュベートした。トリプシン処理後、細胞を氷冷溶解バッファー中に再縣濁した。それらは氷上で１０分間インキュベートし、１０，０００×ｇで１分間遠心分離した。細胞溶解物中のタンパク質の量を決定するため、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを施用した。それぞれのサイトゾル抽出物を４μｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈した。次いで、ＤＴＴおよび様々な結合プロテアーゼ基質を含有する反応バッファーを、９６ウエルのマイクロタイタープレート中の試料に加えた。溶解バッファーと反応バッファーの混合物（１：１）はブランクとして働いた。加湿ＣＯ２インキュベーターにおける３７℃および７％ＣＯ２で２時間のインキュベーション後、吸光度、およびしたがってカスパーゼ活性の程度を、４１５ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーにおいて測定した。カスパーゼ−３−阻害剤を用いた実験用に、カスパーゼ−３細胞活性アッセイキット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＬａＪｏｌｌａ、ＵＳＡ）を、前に記載したのと同様の条件を使用して、供給者のマニュアルに従い使用した。
【０２５６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍細胞増殖に対するＳＡＭ−６抗体の影響を決定するために、ヌードマウス／ヒト胃癌細胞系を使用した。簡単に言うと、２×１０６個の胃癌細胞（２３１３２／８７）を、６〜７週齢のＮＭＲＩ−ｎｕ／ｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ  ＧｍｂＨ、Ｂｏｒｃｈｅｎ、ドイツ）に皮下（ｓ．ｃ．）注射し、次に腫瘍が目に見える大きさに達したときに抗体ＳＡＭ−６抗体を注射した。５０、２５０、５００または７５０μｇの抗体を、癌細胞腹腔注射後第９、１１、１４、１６および１７日にそれぞれ与えた。対照マウスには７５０μｇの無関連ヒトＩｇＭ（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）を注射した。目に見える腫瘍増殖を実験中肉眼によって測定した。腫瘍が最大許容サイズに達したとき（第１８日）に試験を終了し、このときマウスを屠殺し、腫瘍体積、それぞれの腫瘍重量を決定し、臓器および組織を腫瘍の広がりおよび他の変化に関して調べた。
【０２５７】
ＬＤＬとＳＡＭ−６  ｓｃＦｖの結合のＥＬＩＳＡ
材料：プレート洗浄器（ＢＩＯＲＡＤ１５７５洗浄器）。ＮｕｎｃからのＭＡＸＩＳＯＲＰ９６ウエルイムノプレート。ＥｐｐｅｎｄｏｒｆからのＳｅｃｕｒｅＳｅａｌ（商標）熱接着性シーリングフィルム。プレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ６８０リーダー）。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆからのピペット（１０〜１００μｌ）。
【０２５８】
マイクロプレートへの抗原のコーティング：１×ＰＢＳ、ｐＨ６．５バッファー中に１０μｇ／ｍｌの最終濃度まで抗原を希釈する（例えば、１．８ｍｌの１×ＰＢＳ、ｐＨ６．５中に１００μｇ／ｍｌＬＤＬの２００μｌ）。各ウエルへの５０μｌの希釈抗原のピペッティング（０．５μｇ／ウエル）によってＭＡＸＩＳＯＲＰ  Ｎｕｎｃイムノプレートの９６ウエルをコーティングする。純粋な抗原を含有する試験試料を２μｇ／ｍｌ未満でプレートに通常ピペッティングする。純粋な溶液は必要ではないが、ガイドラインとして、試験試料中の３％を超えるタンパク質が標的タンパク質（抗原）でなければならない。抗原タンパク質濃度は２０μｇ／ｍｌを超えてはならない。これはマイクロタイタープレート上の大部分の利用可能な部位を飽和状態にするからである。試料が抗体の検出範囲内である濃度で抗原を含有することを確実にする。次に、接着性プラスチックでプレートを覆い、室温で２時間、または４０℃で一晩インキュベートする。コーティングインキュベーション時間はある程度の最適化を必要とし得る。次いで、コーティング溶液を除去し、２００μｌの１×ＰＢＳ、ｐＨ６．５をウエルに充填することにより３回、１×ＰＢＳ−Ｔ、ｐＨ６．５で３回、および１×ＰＢＳ、ｐＨ６．５で３回プレートを洗浄する。溶液または洗浄液はシンクでプレートを軽打することによって除去する。残りの滴はペーパータオル上でプレートを叩くことによって除去し、またはシンクでプレートを軽打することによって溶液を除去する。プレート洗浄器を使用して、１×ＰＢＳ、ｐＨ６．５で３回、１×ＰＢＳ−Ｔ、ｐＨ６．５で３回、および１×ＰＢＳ、ｐＨ６．５で３回プレートを洗浄する。残りの滴はペーパータオル上でプレートを叩くことによって除去する。
【０２５９】
ブロッキング：ウエル当たり２５０μｌのブロッキングバッファー、１０％スキムミルク、１×ＰＢＳ、ｐＨ６．５中を加えることによって、コーティングウエル中の残りのタンパク質結合部位をブロッキングする。接着性プラスチックでプレートを覆い、室温で１時間、またはさらに好都合な場合４０Ｃで一晩インキュベートする。プレートを洗浄する。
【０２６０】
共焦点顕微鏡による癌細胞との結合の試験
１２ウエルプレート内の各ウエル上に１枚のカバーガラスを置く。２×１０４個の細胞／カバーガラス（５００〜１０００μｌの細胞培養物／ウエル）の密度で平板培養したカバーガラス上の細胞を増殖させる。５％ＣＯ２中、空気中３７℃でプレートをインキュベートし、次いで細胞を一晩増殖させる（７０〜８０％の集合状態）。
【０２６１】
細胞を固定するために、約５００μｌの１×ＰＢＳ、ｐＨ７．５中で一回細胞を洗浄し、３００〜４００μｌの４％ＰＦＡ中で１５分間細胞を固定し、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．５中で二回細胞を洗浄し、約５００μｌの５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌ／ＰＢＳ中で１０分間遊離アルデヒドをクエンチし、次いで１×ＰＢＳ、ｐＨ７．５中で二回洗浄する。１×ＰＢＳ、ｐＨ７．５中で５分間放置する。プレートおよびカバーガラスは、数週間１×ＰＢＳ、ｐＨ７．５および０．０２％Ｎａアジド中に４℃で保存することができる。必要な場合、４分間のみ約５００μｌの０．１％ＴＸ−１００中で細胞を浸透処理し、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．５中で３回洗浄し、次いで約５００μｌのｌ５％ＦＣＳ／１×ＰＢＳ、ｐＨ７．５中で２０分間ブロッキングする。
【０２６２】
細胞を染色するために、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．５中で１回洗浄し、次いでカバーガラス当たり約３００〜４００μｌの希釈一次抗体（５％ＦＣＳ／１×ＰＢＳ高塩ｐＨ６．５中に希釈、１：１００または非希釈）を加え、ＲＴで４５分〜１時間インキュベートする。その後、３０分間１×ＰＢＳ、ｐＨ７．５中で６回洗浄し、二次コンジュゲートを５％ＦＣＳ／１×ＰＢＳ、ｐＨ７．５中に希釈し（ＦＩＴＣに関して１：１００、およびＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８に関して１：５００）、１０分間４℃において微量遠心機中約１４，０００ｇで浄化する。約３００〜４００μｌの二次コンジュゲートをそれぞれのカバーガラスに加え、ＲＴで３０分〜４５分インキュベートする（アルミニウム箔でプレートを覆う）。３０分間１×ＰＢＳ、ｐＨ７．５中で６回洗浄する。５分間約３００μｌで（５ｍｇ／ｍｌストックの）ＤＡＰＩ１／１０，０００を用いて核を染色する（使用前に試験管を攪拌する）。１×ＰＢＳ、ｐＨ７．５中で３回洗浄し、（塩を除去するために）Ｈ２Ｏ中ですすぎ、（細胞を含む表面に触れずに端から）カバーガラスをブロット用に乾燥させ、クリーンな顕微鏡用スライドにおいて１０μｌの封入液中に封入する（ＲＴで解凍）。観察の準備ができるまでアルミニウム箔を用いて冷蔵庫に保存する。
【０２６３】
（実施例２）
この実施例は、ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の精製および分析の記載を含む。
【０２６４】
膜抽出物におけるウエスタンブロット分析
ＳＡＭ−６抗原の単離および特徴付けを腫瘍細胞系２３１３２／８７およびＢＸＰＣ−３に実施した。ＳＡＭ−６抗体は、約８０ｋＤａの相対分子量を有する抗原と結合した（図３）。両方の細胞系で、ウエスタンブロットは出現バンドのパターンにおいて比較可能な結果を示した。さらに、試料を調製するために本発明者らが差次的遠心分離またはＭＰＥＫ法を使用しようと、有意な差は存在しなかった。それにもかかわらず、低分子量でのさらなる増大およびわずかな非特異的バンドのため、抗原の精製用に、本発明者らは天然膜タンパク質抽出キットの方法を利用した。ＩｇＭ抗体の非特異的結合を発見するために、無関連ヒトＩｇＭを対照に使用した。非特異的結合は約５０ｋＤａで観察することができた。約６０および１００ｋＤａの分子量での他の顕著なタンパク質バンドは、調製中の膜分画物からの不純物として形成された。
【０２６５】
ペプチド質量マッピングによるヒトＳＡＭ−６受容体の精製および同定
ウエスタンブロットでＳＡＭ−６抗体と８０−ｋＤａタンパク質の結合を同定するため、２ステップのカラムクロマトグラフィーを精製するために使用し、タンパク質を同定するためにＭＡＬＤＩ質量分析を使用した。図４は、第１ステップ（サイズ排除クロマトグラフィー）後の代表的なクロマトグラムを示す。ＳＡＭ−６抗体と結合するタンパク質を含有する画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次にウエスタンブロットおよびクーマシー染色によって分析した。陽性画分は図５および６中に示す。アニオン交換クロマトグラフィーを使用して第２ステップを続けた（図７のクロマトグラム参照）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる後の分析は図８および９中に示す。矢印は８０ｋＤａタンパク質を表すバンドを示し、それを最終的に切除し配列決定した。タンパク質の配列決定はＴｏｐＬａｂ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、ドイツ）によって実施された。
【０２６６】
一致した組のトリプシンペプチド質量を用いた配列データベース検索によって、最高ランク候補としてヒトＧｒｐ７８（受託番号ＮＰ＿００５３３８．１）を計算した。合計２１のトリプシンペプチド質量を最小３５％のアミノ酸配列カバレッジに相当するＧｒｐ７８タンパク質に割り当てた（図１０および１１）。ペプチド質量の誤差は５０ｐｐｍ未満であった。多数の割り当てたペプチドおよび高い配列カバレッジのため、Ｇｒｐ７８タンパク質をデータベースから同定した。実験によって誘導したペプチド配列およびヒトＧｒｐ７８／ＢｉＰのタンパク質データベース配列のアラインメントを図１１中に示す。太字はＭＡＬＤＩペプチド質量フィンガープリンティングによって得た質量を示す配列であり、ペプチド質量マップにおいて星印によって示される（図１０）。
【０２６７】
構造分析
潜在的膜貫通領域およびグリコシル化部位に関する構造分析を、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）のＥｘＰＡＳｙ（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）プロテオミクスサーバーの配列分析ツールを使用して実施した。アミノ酸１〜１７および６５０〜６５４におけるシグナル領域以外に、Ｇｒｐ７８はアミノ酸２２０〜２３７における考えられる膜貫通領域、およびアミノ酸残基１６６および１８４における潜在的細胞外Ｏ−グリコシル化部位を示す。Ｎ−グリコシル化部位を決定することはできなかった（図１１）。
【０２６８】
（実施例３）
この実施例は、ｓｉＲＮＡによるＧｒｐ７８の発現阻害試験の記載を含む。
【０２６９】
Ｇｒｐ７８のノックダウン
Ｇｒｐ７８のノックダウンと結びついたＧｒｐ７８遺伝子の抑制が、ＢＸＰＣ−３腫瘍細胞におけるＳＡＭ−６抗体の結合を低減するかどうか調べるために試験を実施した。
【０２７０】
Ｇｒｐ７８  ｓｉＲＮＡによる腫瘍細胞系ＢＸＰＣ−３のトランスフェクションは、タンパク質発現およびＳＡＭ−６抗体の結合を低減した。Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｉｌｅｎｃｅｒ（商標）ｓｉＲＮＡ（無関連ｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトした細胞において、ＳＡＭ−６と対照抗体の強い結合が全インキュベーション時間中に検出可能であり、Ｇｒｐ７８発現の有意な影響は示さなかった。Ｇｒｐ７８  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞は、抗Ｇｒｐ７８（７６％低減）およびＳＡＭ−６（７０％低減）の低減した結合を示す。抑制が他の細胞表面膜分子の発現に影響を与えることはなかった。トランスフェクション後の抗ＣＤ５５の結合は前と同程度に強力であった（図１２および１３）。表面に位置するＧｒｐ７８のノックダウンは、標的タンパク質の発現およびＳＡＭ−６抗体の結合を低減する（図１２および１３）。
【０２７１】
アポトーシスアッセイ
アポトーシス活性を細胞死検出ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ）により測定して、トランスフェクト腫瘍細胞の抗体誘導性アポトーシスの程度を実証した。
【０２７２】
トランスフェクト細胞は１００μｇ／ｍｌのＳＡＭ−６抗体と共に４時間インキュベートした。同じ濃度の無関連ヒトＩｇＭは陰性対照であった。ヒトＧｒｐ７８に対するｓｉＲＮＡでトランスフェクトした腫瘍細胞は、未処理細胞および無関連ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞と比較して、ＳＡＭ−６抗体によって誘導されるアポトーシス活性の明らかな低減を示す（図１４）。アポトーシス細胞含有量の計算値は完全培地中で増殖した細胞の含有量と関係があった。
【０２７３】
（実施例４）
この実施例は、ＳＡＭ−６抗体結合に対するＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質の、グリコシダーゼ処理の影響の試験の記載を含む。
【０２７４】
グリコシダーゼアッセイ
Ｏ−結合炭水化物におけるＳＡＭ−６抗体の結合を確認するために、腫瘍細胞系ＢＸＰＣ−３の膜抽出物の脱グリコシル化の影響を試験した。膜抽出物は一晩Ｏ−およびＮ−グリコシダーゼを用いて還元条件下で脱グリコシル化し、その後ＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分離し、ウエスタンブロッティングによって分析した。グリコシダーゼとのインキュベーション後、顕著な８０ｋＤａタンパク質の分子量は明らかに低下し、ＳＡＭ−６の結合活性も低下する（図１５）。
【０２７５】
サイトスピンにおけるグリコシダーゼアッセイ
腫瘍細胞表面上のＯ−結合炭水化物部分におけるＳＡＭ−６抗体の結合を確認するために、グリコシダーゼアッセイをサイトスピンにおいて行った。ヒト膵臓癌細胞（ＢＸＰＣ−３）をＮ−グリコシダーゼまたはＯ−グリコシダーゼとインキュベートした。サイトスピンの調製後、ＳＡＭ−６抗体および抗ＣＤ５５を用いて染色を実施した。
【０２７６】
ＳＡＭ−６抗体を用いた免疫組織化学染色は、Ｏ−グリコシダーゼで処理したとき表面結合の有意な低減を示す。Ｎ−グリコシダーゼを用いた処理は、ＳＡＭ−６抗体の結合に対して検出可能な影響はなかった（図１６）。細胞表面分子ＣＤ５５は膜完全性の対照として働き、グリコシダーゼを用いた処理後に結合の変化は示さなかった。このデータはＯ−グリコシダーゼ処理細胞とＳＡＭ−６の結合が有意に低減したことを示し、ＳＡＭ−６抗体が結合するエピトープにおける炭水化物部分の考えられる関与を示唆するが、実施例１２および１３中に記載する後のデータは、ＳＡＭ−６は無細胞小麦胚芽翻訳ｇｒｐ７８および脱グリコシル化ＬＤＬと結合することを示し、炭水化物は抗原とＳＡＭ−６の結合に必要とされない可能性があることを意味する。
【０２７７】
（実施例５）
この実施例は、細胞上に存在するＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質とＳＡＭ−６抗体の結合の試験の記載を含む。
【０２７８】
ＳＡＭ−６のエンドサイトーシス
ＳＡＭ−６抗体は細胞膜ＳＡＭ−６／Ｒ糖タンパク質と結合する。この抗体／受容体の結合は脂質の蓄積およびアポトーシスカスケードを開始させる。ＳＡＭ−６抗体はｏｘＬＤＬとも結合し、これを癌細胞に運ぶ。リポタンパク質は通常受容体仲介エンドサイトーシスによって内在化される。
【０２７９】
ＳＡＭ−６抗体が癌細胞膜と結合した後に何が起こるかを調べるために、ＳＡＭ−６抗体とアイソタイプ対照をＦＩＴＣで結合させた。ＬＤＬの存在下で結合抗体をヒト膵臓癌細胞系ＢＸＰＣ−３に直接与え、３０、６０、１２０分間インキュベートした。細胞は最終的に共焦点顕微鏡によって分析した。ＳＡＭ−６抗体との３０分のインキュベーション後、細胞表面との結合を観察することができた（図１７Ａ）。６０分後、ＳＡＭ−６抗体が膜において濃縮され、典型的な「キャッピング」の形成として見られる（図１７Ｂ）。１時間後、ＳＡＭ−６抗体は細胞内に完全に内在化される（図１７Ｃ）。比較すると、標識対照抗体は同様の事象を示さなかった（図１７Ｄ、Ｅ、Ｆ）。ｏｘＬＤＬは抗体と一緒に細胞に運ばれると仮定することができる。
【０２８０】
スダンＩＩＩを用いた脂質染色
ＳＡＭ−６抗体誘導性の細胞内脂質蓄積を調べるために、本発明者らはスダンＩＩＩを用いた染色を実施した。この色素は、中性脂質および脂肪酸の検出に特異的である。図１８は、膵臓癌細胞系ＢＸＰＣ−３におけるＳＡＭ−６抗体、抗Ｇｒｐ７８または無関連ヒト対照ＩｇＭとの４８時間のインキュベーション後に得たデータを示す。ＳＡＭ−６抗体で処理すると、腫瘍細胞は中性脂質滴の抗体誘導性蓄積を明らかに示す（図１８）。対照的に、それぞれ抗Ｇｒｐ７８および無関連対照抗体で処理した細胞は、脂質の有意な蓄積を示さない。これらのデータは、脂質の細胞内蓄積はＳＡＭ−６抗体によって仲介される直接の影響であることを示す。
【０２８１】
ＳＡＭ−６のアポトーシス
ＳＡＭ−６誘導性アポトーシスは乱れた脂質の恒常性の結果である可能性がある。しかしながらこれまで、抗体結合、脂質蓄積および最終的な細胞死の間の経路、またはカスパーゼが活性化されるかどうかに関して全く知られていなかった。ＳＡＭ−６により活性化されるシグナル伝達経路の一層の理解は、癌に対して闘うための革新的療法にさらに貢献し得る。したがってカスパーゼは、ＳＡＭ−６誘導性のアポトーシスプロセス中の活性化に関して試験した。
【０２８２】
それぞれＳＡＭ−６抗体および対照ＩｇＭとのインキュベーション後に、胃癌細胞においてシトクロムＣが遊離状態であったかどうか調べるために、シトクロムＣＥＬＩＳＡキットを施用した。サンドウィッチ酵素イムノアッセイ技法は、１時間後に、無関連なヒトＩｇＭで処理した細胞より、ＳＡＭ−６抗体で処理した細胞において高レベルでシトクロムＣが放出されたことを示した。さらに、両試料中のポリペプチドの量は４時間のインキュベーション以降に異なった。４時間後ＳＡＭ−６試料の減少も観察可能である（図１９）。これは、ＳＡＭ−６誘導性経路中、ミトコンドリアの混乱が起こり、外膜の破壊をもたらし、シトクロムＣの放出につながることを明らかに示す。ＳＡＭ−６抗体処理細胞中のシトクロムＣレベルは４時間のインキュベーション後に対照のそれに近づき、ミトコンドリア分解は経路の初期段階のみで起こったことを示した。
【０２８３】
カスパーゼ、およびどのカスパーゼがＳＡＭ−６抗体により誘導されるかどうか決定するために、Ａｐｏ  Ｔａｒｇｅｔ（商標）比色定量プロテアーゼアッセイサンプラーキットを使用した。抗体との１時間のインキュベーション後、カスパーゼ−２、−３、−６、−８、および−９の活性を測定した。−２ではなくイニシエーターカスパーゼ−８および−９が、１時間後で既に、無関連ヒトＩｇＭ対照で処理した細胞と比較してＳＡＭ−６抗体で処理した細胞中で活性化された（図２０Ａ）。さらに、４時間後、エフェクターカスパーゼ−３および−６の活性化を検出することができた。
【０２８４】
人工産物を除外するために、カスパーゼ−３阻害剤を使用する試験を一例としてさらに調製した。図２０Ｂは、阻害剤を加えたときに抑制されたカスパーゼ−３活性を示す。カスパーゼ−３阻害剤の不在下において、カスパーゼ−３の明らかな活性化をＳＡＭ−６処理腫瘍細胞において観察することができた。
【０２８５】
（実施例６）
この実施例は、悪性メラノーマのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の記載を含む。
【０２８６】
メラノーマ細胞に対するＳＡＭ−６抗体の影響を決定するために、ＳＡＭ−６抗体に対する悪性メラノーマ細胞ＨＴＢ−６９およびＣＲＬ１４２４の感度を決定した。簡単に言うと、細胞をトリプシン処理し、２×１０５個の細胞／ｍｌの濃度まで２％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩで希釈した。ウエル当たり５０μｌの細胞縣濁液を９６ウエルプレートに平板培養した。抗体はＲＰＭＩで１００μｇ／ｍｌまで希釈した（ウエル当たり１％ＦＣＳの最終濃度をもたらした）。ＩｇＭ、ＲＰＭＩおよびバッファーは対照として使用した。細胞は２、５、２４または４８時間３７℃においてインキュベーター内でインキュベートし、上清は廃棄し、３０μｌのトリプシンをウエル当たりに加え、数分間インキュベートし、細胞はウエルの底部から除去し、顕微鏡で観察した。反応はウエル当たり６μｌのＦＣＳで停止させ、３２４μｌのＧｕａｖａ  ＶｉａＣｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＵＳＡ）をウエル当たりに加え、軽く混合し、室温で５分間インキュベートし、データはＧｕａｖａ  ＰＣＡ−９６で分析した。
【０２８７】
このデータは、ＳＡＭ−６抗体が両方のメラノーマ細胞型を殺傷することができたことを示す。細胞の殺傷は、４８時間インキュベートしたＨＴＢ−６９細胞に関して最大であった。
【０２８８】
（実施例７）
この実施例は、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験の記載を含む。
【０２８９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍細胞増殖に対するＳＡＭ−６抗体の影響を決定するために、ヌードマウス−ヒト胃癌細胞系を使用した。ヒト胃癌細胞系２３１３２／８７由来の２×１０６の濃度の細胞を、ＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウスに腹膜内（ｉ．ｐ．）注射した。腫瘍細胞の接種後第９日で、異なる用量のＳＡＭ−６抗体を腹膜内注射した。無関連ヒト対照ＩｇＭおよびＮａＣｌ溶液（０．９％）は陰性対照として働いた。癌細胞移植後第１１、１４、１６および１７日で抗体を再度与えた。対照マウスには、７５０μｇの無関連ヒトＩｇＭ（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）を注射した。
【０２９０】
試験を通じて、腫瘍増殖は肉眼によって調節した。１８日後にマウスを屠殺し、腫瘍体積を決定し、スチューデントのｔ検定を使用して、処理群と対照群の間の腫瘍の大きさを比較した。試験の行程中に発達した腫瘍は、ＳＡＭ−６抗体で処理すると体積の有意な低減を示した（図２１）。さらに、ＳＡＭ−６抗体で処理したマウスにおける腫瘍体積の低減は用量依存性である。５０μｇのＳＡＭ−６抗体で既に処理したマウスは、対照群と比較して明らかに低減した腫瘍体積を示す。それぞれ２５０μｇ、５００μｇのＳＡＭ−６抗体で処理した動物は、ＩｇＭ対照と比較したとき、統計上有意に小さい腫瘍体積を有していた（ｔ検定、両濃度に関してｐ＜０．０５）。しかしながら、７５０μｇのＳＡＭ−６抗体で処理した動物は腫瘍体積の有意な低減を示さない。
【０２９１】
（実施例８）
この実施例は、ハイブリドーマ産生ＳＡＭ−６抗体の重鎖および軽鎖可変領域の配列決定の記載を含む。
【０２９２】
ハイブリドーマ（６ｕｇ）由来のＳＡＭ−６抗体の試料を４〜１２％のビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において還元条件下で電気泳動し、クーマシーブルーＲ−２５０で染色した。抗体の重鎖および軽鎖に対応するバンドをゲルから切除し、脱色し、試料当たり１００ｎｇのトリプシンで消化した。遠心分離蒸発による濃縮後、抽出物は１％ギ酸で１０ｕｌにした。
【０２９３】
溶液内トリプシン消化を以下のように実施した。ＳＡＭ−６（２ｕｌ中に２ｕｇ）を１０Ｍ尿素で１０ｕｌに希釈し、０．５ｍＭの濃度までＤＴＴ（ジチオスレイトール）を加えることによって還元した。１０分後２０Ｃにおいて、ヨードアセトアミドを２．５ｍＭまで加え、２０Ｃにおいて４分間インキュベートした。試料は５０ｍＭの重炭酸アンモニウムおよび１００ｎｇのトリプシンを含有する８０ｕｌの体積に希釈した。消化は２０Ｃにおいて７時間進行した。
【０２９４】
ＭＡＬＤＩ質量分析（ＭＳおよびタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）
液体クロマトグラフィー／画分回収：ＳＡＭ−６抗体の５ｕｌの消化重鎖または軽鎖を、冷却オートサンプラー、溶存ガス除去装置およびキャピラリーポンプを備えるＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズ、ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して分離した。このシステムはＨｙｓｔａｒソフトウェア、バージョン３．２（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｅｍｅｎ、ドイツ）によって制御し、溶媒Ａは水および０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）であり、および溶媒Ｂは１００％ＡＣＮ（アセトニトリル）および０．１％ＴＦＡであった。試料はインラインカラム（１８０ｕｍ×１５ｕｍ×３ｕｍ、１００オングストローム、Ａｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ  Ｃ１８、ＬＣ  Ｐａｃｋｉｎｇｓ、Ｄｉｏｎｅｘ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、オランダ）に注入し、１ｕＬ／分において５％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡで平衡化した。試料はＡＣＮ勾配で解像した（５％〜１７％で２分間、１７％〜４５％で３６分間）。このＬＣシステムを、Ｐｒｏｔｅｉｎｅｅｒｆｃスポッティングロボット（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｅｍｅｎ、ドイツ）と直接連結させた。注入後８分で開始して、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）溶出物は１５秒間６００または８００ｕｍのＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐＴＭ標的に沈積させた。０．５ｕｌの０．１％ＴＦＡの同時沈積をさらに実施してピークテーリングを最小にした。全てのスポットを乾燥させた後、０．８（６００ｕｍ用）または１ｕｌ（８００ｕｍ用の）０．５ｕｇ／ｕｌアルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を、０．５％ＴＦＡを使用して洗浄せずに、Ｚｈａｎｇら（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ７：２３４０〜２３４９頁（２００７年））の方法に従いラスタースポットに沈積させた。ペプチドはマトリックスを加える前のキャリブレーションスポットを示した。次いで標的を、質量分析計への挿入前に空気乾燥させた。
【０２９５】
データ取得−ＭＡＬＤＩ質量分析（ＭＳ）
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ（飛行時間型）質量スペクトルを、ｆｌｅｘＣｏｎｔｒｏｌソフトウェア（バージョン３．０  Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）の制御下においてリフレクトロンモードで作動する、Ｂｒｕｋｅｒ  ｕｌｔｒａｆｌｅｘ  ＩＩＩ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を使用して取得した。ＭＡＬＤＩ標的形状、スポット取得の順序、外部校正およびデータ取得法はＷＡＲＰ−ＬＣソフトウェア（バージョン１．１  Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）で定義した。それぞれの試料位置において、質量スペクトルを１００ショットの増分から得て、ヘキサゴンラスタームーブメントを使用して４００ショットまで合計した。レーザー繰り返し速度は２００Ｈｚであり、レーザー出力は実験を通して不変状態であった。外部校正スポットを使用した装置の質量精度は典型的には＜５０ｐｐｍであった。ＭＳスペクトルは、ｆｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ（バージョン３．０、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を使用して、スムージング、バックグラウンド除去法およびピーク検出を施した。それぞれの画分において検出したペプチドイオンは、ＷＡＲＰ−ＬＣ  Ｓｕｒｖｅｙ  Ｖｉｅｗｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を使用して視覚化した。さらに、選択基準を超える親前駆体の完全な一覧はプログラムＷＡＲＰ−ＬＣを使用して作製した。
【０２９６】
データ取得−ＭＡＬＤＩタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）
ＭＳ／ＭＳをレーザー誘導解離（ＬＩＤ）を使用して実施した。データ取得は、ｆｌｅｘＣｏｎｔｒｏｌおよびＷＡＲＰ−ＬＣソフトウェアを使用して完全自動式ＬＩＦＴモードで実施した。得られたＭＳ／ＭＳスペクトルは、ｆｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓを使用して、スムージング、バックグラウンド除去法およびピーク検出を後に施した。
【０２９７】
データ分析。スペクトルおよび質量リストをＢｉｏＴｏｏｌｓ（バージョン３．１、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）にエクスポートした。ここで、ＭＳスペクトルとＭＳ／ＭＳスペクトルの両方を、配列エディターモジュールを使用して作製したＳＡＭ−６軽鎖および重鎖のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ消化物に対して検索した。カルバミドメチル−Ｃｙｓの固定修飾およびＭｅｔまたはＴｒｐ残基の任意選択的酸化を、５０ｐｐｍのＭＳ質量許容値および０．８ＤａのＭＳ／ＭＳ許容値でトリプシンを使用した理論的消化の前に選択した。ＬＣ−ＥＳＩ−イオントラップＭＳ（下記参照）によって考えられる配列変異体として同定したいくつかのイオンに、これらの可能性を確認または否定するためにｄｅ  ｎｏｖｏ配列解釈を施した。
【０２９８】
液体クロマトグラフィーＥＳＩ質量分析（ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ）
試料調製。１マイクロリットルの各ゲル内消化物を、オートサンプラーバイアル中に１％ギ酸（ＦＡ）を用いて５．５ｕＬに希釈し、５ｕＬを分析した。
【０２９９】
データ取得。ＨＣＴウルトラ３Ｄ−イオントラップ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃ）と接続したＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  Ｃｈｉｐ  Ｃｕｂｅ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ中に収容されたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤチップカラムアセンブリー（４０ｎＬトラップカラム、および０．０７５×４３ｍｍＣ−１８分析カラム）を使用して、試料をクロマトグラフィー処理した。カラムは０．５ｕＬ／分において４％ＡＣＮ／０．１％ＦＡで平衡化し、ＡＣＮ勾配（４％〜３１％、３２分間）で試料を溶出した。イオン化種（３００＜ｍ／ｚ＜１２００）を捕捉し、このときに溶出した２つの最強イオンの１つを、衝突誘導解離（ＣＩＤ）および電子移動解離（ＥＴＤ）によって断片化した。
【０３００】
データ分析。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルにＤａｔａＡｎａｙｌｓｉｓ（バージョン３．４  Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃ）を使用したピーク検出を施し、次いでＢｉｏＴｏｏｌｓ（バージョン３．１、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃ）にインポートした。ここで、ＭＳ／ＭＳスペクトルは、０．３ＤａのＭＳ許容値および０．４ＤａのＭＳ／ＭＳ許容値で、ＳＡＭ−６ハイブリドーマから得たｃＤＮＡ配列に基づくＳＡＭ−６抗体重鎖および軽鎖の予想アミノ酸配列と一致した。配列エディターモジュールを使用して、ＭｅｔおよびＴｒｐ残基、Ｎ末端ピログルタミン酸および１欠損切断部位の酸化などの任意選択の修飾を含めて、トリプシン消化からの概念上ペプチドを計算した。大抵の場合、補足的証拠をこれらのペプチドのＥＴＤから得た。配列の割り当ては手作業で確認した。実証した配列と一致しなかったいくつかの強イオンに、ｄｅ  ｎｏｖｏ配列解釈を施した。
【０３０１】
結果：質量分析によって同定した部分的アミノ酸配列の概要を図２２および２３中に示す。データは配列カバレッジのダイアグラムとして示し、グレーのボックスは配列決定したペプチドを示し、赤色のボックスはこれらのペプチドのＣＩＤにおいて観察したｂ−イオン（上部）およびｙ−イオン（下部）を示す。
【０３０２】
ＳＡＭ−６重鎖：ＳＡＭ−６ハイブリドーマから単離したｃＤＮＡのＤＮＡ配列と比較して、重鎖がＮ末端ピログルタミン酸残基を有する可能性があった。［Ｍ＋Ｈ］＋＝１５９２・８のイオンをＣＩＤスペクトルで実測し、この修飾を有する予想配列と一致した。したがって、このＮ末端修飾は配列エディターにおける固定修飾として含めた。配列カバレッジのダイアグラムは図２２として示す。
【０３０３】
ＣＤＲ−Ｈ１を包含するペプチドを観察した。これは位置２２（３４、オリジナルナンバリング中）にＡｒｇではなくＣｙｓを含有する。したがって、この配列は２０−ＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲ−３８である。
【０３０４】
２つの重複ペプチド、配列；４４−ＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫ−５８；および４４−ＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫ−６５の一部分として、大部分のＣＤＲ−Ｈ２を観察し、ＣＤＲ−Ｈ２に相当する領域に下線を引く。ＣＤＲ−Ｈ２に関して観察した配列は５０−ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫ−６５であったが、ＳＶＫトリペプチドは正式に割り当てなかった。ＣＤＲ、Ｇｌｙ−６６のＣ末端残基は別の（ジ−）ペプチドに存在した可能性があり、観察しなかった。位置７１（８３、オリジナルナンバリング中）においてＴ対Ａを観察しなかった。このペプチドは、小さすぎて容易に検出できなかったからである。
【０３０５】
ＣＤＲ−Ｈ３に関して、この配列カバレッジは見られなかった。トリプシンとトリプシン／Ｖ８消化の両方共、イオントラップ質量分析計の作動範囲の範疇の質量電荷比のペプチドをもたらすと予想されなかった。ＬＣ−ＭＡＬＤＩ  ＭＳ試験はイオントラップＭＳより大きなＭＷ範囲に対処したが、目的の予想トリプシンペプチドは６．６ｋＤａより大きく、容易に発見されると予想した質量ではなかった。ＭＡＬＤＩ  ＭＳスペクトルの手作業の調査は、このペプチドまたは類似ＭＷの任意の他のペプチドを同定しなかった。同様に、トリプシン／Ｖ８二重消化のＬＣ−ＭＡＬＤＩ  ＭＳを使用してＣＤＲ−Ｈ３に相当するペプチドは発見されなかった。
【０３０６】
ＳＡＭ−６軽鎖：ＳＡＭ−６軽鎖のトリプシン消化をゲル内および溶液内で実施し、ＬＣ−ＥＳＩ−イオントラップＭＳによって、およびＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって分析した。予想Ｎ末端に相当するペプチドは同定しなかった（Ｓ［１−２６］Ｋに関する［Ｍ＋Ｈ］＋＝２６６６．３、およびＳ［１−３０］Ｋに関して＝３０７９．５）代わりに、［Ｍ＋Ｈ］＋＝３０２２．６のペプチドを観察し、それをＮ末端領域と一致させる配列タグをもたらした。１−ＳＹＶ−３の代わりに１−ＹＥ−２の最初の配列割り当てを推定した。全体的配列カバレッジは図２３中に示す。これは以下に記載するＶ１２６Ａ置換を含む。
【０３０７】
Ｎ末端トリプシンペプチドは１−ＹＥＬＴＱＰＰＳＶＳＶＳＰＧＱＴＡＳＩＴＣＳＧＤＫ−２５であると推定した。配列１−ＹＥＬ−３は、これらの残基の順列またはＬｅｕとＩｌｅの置換ではなく抗体配列中で一般に見られる。ＣＤＲ−Ｌ１のＮ末端部分を形成する残基Ｓ［２２−２５］Ｋは予想と一致した。より長いペプチド、Ｙ［１−２９］Ｋは、ＣＤＲ−Ｌ１内の残基Ｌ［２６−２９］Ｋに関する予想配列と一致する質量およびＣＩＤスペクトルを有していた。
【０３０８】
ゲル内トリプシン消化から、推定配列
【０３０９】
【化６ａ】
2012517216.tif 000012
を有するペプチドを発見した。下線を引いた配列はＣＤＲ−Ｌ１のＣ末端部分に相当し、一方で二重下線を引いた配列はＣＤＲ−Ｌ２のＮ末端部分に相当する。ＣＤＲ−Ｌ２の予想配列に関するさらなる支持は、予想配列３０−ＹＡＣＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＶＬＶＩＹＱＤＳＫＲＰＳＧＩＰＥＲ−５９を有する長いペプチドから得たが、Ｃ末端に関するＣＩＤスペクトルは明らかでなかった。ＬＣ−ＥＳＩ−イオントラップＭＳはＣＤＲ−Ｌ２のＣ末端部分を同定しなかったが、図２３中に示したＭＳ／ＭＳによる限られた配列カバレッジにもかかわらず、ＬＣ−ＭＡＬＤＩ  ＭＳは同定した。
【０３１０】
ＣＤＲ−Ｌ３を含有するトリプシンペプチドは、おそらく４．３ｋＤａより大きいその大きさのため観察しなかった。トリプシン／Ｖ８二重消化は、ＣＤＲ−Ｌ３の配列に関するさらなる情報は与えなかった。ＭｅｔまたはＴｒｐの酸化およびＣｙｓのＳ−アミドメチル化などの標準的修飾のみを考慮したとき、軽鎖の配列が一致しないいくつか他のペプチドを同定した。［Ｍ＋Ｈ］＋＝１７０３・０の１イオンが、Ｓ［１８９−２０３］Ｋと一致するがＳ−アミドメチル化ペプチドに関して予想したより９Ｄａ軽い配列タグを有していた。ＣＩＤスペクトルの調査は、Ｃｙｓ残基がＳ−アミドメチルＣｙｓよりシステイン酸として存在したことを示唆し（図８ａ）、これは質量差を説明し得る。しかしながら、Ｓ−アミドメチルＣｙｓとしてＣｙｓを含有するペプチドも発見した。したがって、このＣｙｓの一部分のみが酸化された。
【０３１１】
［Ｍ＋Ｈ］＋＝１９８６・１のイオンが、Ａ［１１０−１２８］Ｋと一致するが予想より２８Ｄａ軽い配列タグを有していた。ＥＴＤおよびＬＩＤスペクトルから、このペプチドがＣ末端付近で置換され、Ｖ１２６Ａ置換が割り当てられたことは明らかであった。この置換は配列カバレッジのダイアグラム中に含まれる（図２３）。
【０３１２】
（実施例９）
この実施例は、どのようにしてアミノ酸残基を、重鎖可変領域中の３個のＣＤＲ、およびＳＡＭ−６の軽鎖可変領域に関する３個のＣＤＲ、およびいくつかの代表的な変異重鎖および軽鎖可変領域配列に割り当てるかの記載を含む。以下に述べる割り当ておよびカバットに従う残基の番号処理に基づいて、ＣＤＲ位置を予想する。
【０３１３】
重鎖Ｖ−ドメイン。カバットナンバリングに従い、定義は以下の通りである：
ＣＤＲ−Ｈ１
開始部分：おおよそ残基２６（Ｃｙｓ後に常に４）
前の残基：常にＣｙｓ−ｘｘｘ−ｘｘｘ−ｘｘｘ−
後の残基：常にＴｒｐ、典型的にはＷＶまたはＷＩまたはＷＡ
長さ：１０〜１２残基
ＣＤＲ−Ｈ２
開始部分：ＣＤＲ−Ｈ１の末端後に常に１５残基
前の残基：典型的にはＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（ＬＥＷＩＧ）
後の残基：Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａ（ＲＦＴ）
長さ：１６〜１９残基
ＣＤＲ−Ｈ３
およその開始部分：ＣＤＲ−Ｈ２の末端後に常に残基３３（Ｃｙｓ後に常に２）
前の残基：常にＣｙｓ−ｘｘｘ−ｘｘｘ−ｘｘｘ（典型的にはＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ）
後の残基：常にＴｒｐ−Ｇｌｙ−ｘｘｘ−Ｇｌｙ
長さ：３〜２５残基
したがって、ＳＡＭ−６  ＶＨに関して：ＣＤＲ  Ｈ１  Ｓ２５−Ｈ３５；ＣＤＲ  Ｈ２  Ｖ５０−Ｇ６６；およびＣＤＲ  Ｈ３  Ｒ９８−Ｙ１１０を、以下に星印（＊）によって示す。ＦはＣＤＲ中のフレームワーク突然変異を示し、ＢはＣＤＲ中の突然変異を示す。
【０３１４】
ＳＡＭ−６  ＶＨおよび代表的な変異体（下線）の配列
【０３１５】
【化７】
2012517216.tif 000013
軽鎖Ｖ−ドメイン。カバットナンバリングに従い、定義は以下の通りである：
ＣＤＲ−Ｌ１
開始部分：おおよそ残基２４
前の残基：常にＣｙｓ
後の残基：常にＴｒｐ、典型的にはＷＹＱまたはＷＬＱまたはＷＦＱまたはＷＹＬ
長さ：１０〜１７残基
ＣＤＲ−Ｌ２
開始部分：Ｌ１の末端後に常に１６残基
前の残基：一般にＩｌｅ−ＴｙｒまたはＶＹまたはＩＬまたはＩＦ
長さ：常に７残基（７ＦＡＢ以外）
ＣＤＲ−Ｌ３
およその開始部分：Ｌ２の末端後に常に残基３３
前の残基：常にＣｙｓ
後の残基：常にＰｈｅ−Ｇｌｙ−ｘｘｘ−Ｇｌｙ
長さ：７〜１１残基
したがって、ＳＡＭ−６  ＶＬに関して：ＣＤＲ  Ｌ１  Ｓ２３−Ｃ３３；ＣＤＲ  Ｌ２  Ｑ４９−Ｓ５５；およびＣＤＲ  Ｌ３  Ｑ８８−Ｖ９６を、以下に星印（＊）によって示す。ＦはＣＤＲ中のフレームワーク突然変異を示し、ＢはＣＤＲ中の突然変異を示す。
【０３１６】
ＳＡＭ−６  ＶＬおよび代表的な変異体（下線）の配列
【０３１７】
【化８】
2012517216.tif 000014
「Ｐｅｒｃｅｖｉａ」は、ＰｅｒＣ６細胞系（Ｐｅｒｃｉｖｉａ）ＰＡＴ−ＳＡＭ−６による組換えＩｇＭ抗体発現に使用した配列を指す。「タンパク質」は、実施例８中に記載されたように、ハイブリドーマ細胞系（ＨＡＢ）によって産生された抗体のペプチド配列分析によって決定したアミノ酸配列を指す。「ＳＡＭ−６原型」は、本明細書において配列番号１５として述べる重鎖可変領域の配列である。
【０３１８】
ＳＡＭ−６の他のアミノ酸およびヌクレオチド配列ならびに代表的な変異体配列は以下の通りである：
ＳＡＭ−６に関して定義した完全長Ｖドメイン配列（変異体の位置に下線）
【０３１９】
【化９−１】
2012517216.tif 000015
【０３２０】
【化９−２】
2012517216.tif 000016
【０３２１】
【化９−３】
2012517216.tif 000017
【０３２２】
【化９−４】
2012517216.tif 000018
（実施例１０）
この実施例は、ＳＡＭ−６抗体重鎖および軽鎖可変領域、および代表的な変異体重鎖および軽鎖可変領域配列の単鎖可変領域断片の生成、ならびにこの変異体のＬＤＬ結合および発現試験の記載を含む。
【０３２３】
構築は２部分、ＳＭ−６  ＶＨドメイン（１ＢＴＡ１．１−１．６）および次いでＳＭ−６  ＶＬドメイン（１ＢＴＡ１．６）で行い、次いでこれらを１つに接合し、ｐＰＯＷ発現ベクターにＳｆｉ−ＢｇｌＩＩ断片としてクローニングすることができる。両部分は同時に開始することができる。
【０３２４】
配列決定によって、アミノ酸の変化をもたらす、異なるＳＡＭ−６  ＶＨドメインが存在することが明らかになった。したがって、異なる配列を有するいくつかのｓｃＦｖ構築物を作製した。クローン１ＢＴＡ１．３はＶＨドメインの開始部分に２つの変化を有するが、それらは構築中の誤差である可能性が最も高い。したがって、このクローンはｓｃＦｖ構築において使用しなかった。
【０３２５】
ＳＡＭ−６  ＶＨ（部分Ａ）（１ＢＴＡ１．１、１ＢＴＡ１．２、１ＢＴＡ１．５を使用）に関して、以下の構成要素：ＤＮＡ鋳型、ＳＡＭ−６  ＶＨ  ＳｆｉＩフォワードプライマー（５６５８９７）、ＳＡＭ−６  ＶＨ  ＢａｍＨＩリバースプライマー（５６５３５２）、１０×反応バッファー、ｄＮＴＰ、２０ｕｌまでの水、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼで２０ｕｌのＰＣＲ反応混合物を構築する。サイクル９５℃×１分、６８℃×３０秒、７２℃×４５秒。１％アガロースゲル上に５ｕｌを載せる。約４００ｂｐのバンドが見られるはずである。残りを保存しＶＬドメインとの接合によってＳｃＦｖを構築する。
【０３２６】
ＳＡＭ−６  ＶＬ（部分Ｂ）（１ＢＴＡ１．６を使用）に関して、以下の構成要素：１ＢＴＡ１．６  ＤＮＡ鋳型、ＳＡＭ−６  ＶＬ  ＢａｍＨＩフォワードプライマー（５６５３５４）、ＳＡＭ−６  ＶＬ  Ｂｋ  ＢｇｌＩＩプライマー（５６５５６５）、１０×反応バッファー、ｄＮＴＰ、２０ｕｌまでの水、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼで２０ｕｌのＰＣＲ反応混合物を構築する。１％アガロースゲル上に５ｕｌを載せる。約４００ｂｐのバンドが見られるはずである。残りを保存しＶＨドメインとの接合によってＳｃＦｖを構築する。
【０３２７】
ＳＡＭ−６  ＳｃＦｖ（ＶＬと連結したＶＨ）に関して、以下の構成要素：部分Ａ、ＰＣＲ産物（５ｕｌ）、部分Ｂ、ＰＣＲ産物（５ｕｌ）、ＳＡＭ−６  ＶＨ  ＳｆｉＩフォワードプライマー（５６５８９７）、ＳＡＭ−６  ＶＬ  Ｂｋ  ＢｇｌＩＩプライマー（５６５５６５）、１０×反応バッファー、ｄＮＴＰ、５０ｕｌまでの水、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼで２０ｕｌのＰＣＲ反応混合物を構築する。１／１０体積の酢酸ナトリウム（３Ｍの酢酸ナトリウム、ｐｈ４．５）および２体積の１００％エタノールでＤＮＡを沈殿させる。１４，０００ｒｐｍで６０分間攪拌する。上清を廃棄し、１０ｕｌの滅菌水にペレットを再縣濁する。
【０３２８】
サブクローニング用にＰＣＲ産物のＤＮＡ消化物、１０ｕｌのＳｃＦｖ  ＤＮＡ、滅菌水中、１ｕｌの１０×ＮＥバッファー２、１ｕｌのＢＳＡ、１ｕｌのＳｆｉＩ酵素を設定し、１時間５０℃でインキュベートする。反応混合物を３７℃に冷却し、次いで１．５ｕｌの１０×ＮＥバッファー３、５ｕｌの滅菌水、１ｕｌのＢｇｌＩＩ酵素を加え、１時間３７℃でインキュベートする。１％アガロースゲル上に全ての消化物を載せる。約８００ｂｐのバンドが見られるはずである。バンドを切断し、Ｑｉａｇｅｎキットを使用してＤＮＡを抽出する。
【０３２９】
ＳＡＭ−６（ＶＨ−５−ＶＬ）ｓｃＦｖ
【０３３０】
【化１０】
2012517216.tif 000019
ＳＭ−６ＰＣＲ産物（ｓｃＦｖ−ダイマー）の作製および配列決定用のプライマー：
【０３３１】
【化１１−１】
2012517216.tif 000020
【０３３２】
【化１１−２】
2012517216.tif 000021
【０３３３】
【化１１−３】
2012517216.tif 000022
ｐＰＯＷベクターを使用して細菌から生成および発現した９個のｓｃＦｖ変異体、ならびにそれらが含有する重鎖および軽鎖可変領域配列の概要を以下に列挙する：
ＳＡＭ−６  １．１Ａ  ｓｃＦｖ：１．１Ａ  ｓｃＦｖ構築物は、ＰＡＴ−ＳＡＭ−６ＩｇＭ（Ｐｅｒｃｉｖｉａ）遺伝子構築物と同じＶドメイン遺伝子配列を有する。
【０３３４】
ＳＡＭ−６  １．２Ａは、ＶＨ  ＣＲＤ２中に１個のアミノ酸変化、および１．１Ａと同じＶＬドメインを有する。
【０３３５】
ＳＡＭ−６  １．４Ａは、１個のフレームワークおよび１個のＶＨ  ＣＲＤ３変化、および１．１Ａと同じＶＬドメインを有する。
【０３３６】
ＳＡＭ−６  １．５Ａは、１個のＶＨ  ＣＤＲ１アミノ酸変化、および１．１Ａと同じＶＬドメインを有する。
【０３３７】
ＳＡＭ−６  ２．２Ａは、２個のフレームワークおよび１個のＶＨ  ＣＲＤ２変化、および１．１Ａと同じＶＬドメインを有する。
【０３３８】
ＳＡＭ−６  ２．７Ａは、１個のフレームワークアミノ酸変化、および１．１Ａと同じＶＬドメインを有する。
【０３３９】
ＳＡＭ−６  ＫＴＡ：ＫＴＡ  ｓｃＦｖ構築物と１．１Ａの間の主な違いは、それがＶＨ  ＣＤＲ３結合ループ中に２個のアミノ酸変化を有することである。この結合ループは抗体の最も重要な領域であると考えられる。大部分の結合反応が起こるのは、この領域内であるからである。抗原特異性はこの領域に原因がある。ＫＴＡ構築物中のアミノ酸配列は、初期のＳＡＭ−６の特許出願中で最初に報告されたのと同じである。重鎖可変領域アミノ酸配列、配列番号１５をさらに使用するのはＳＡＭ−６「ファミリー」内のタンパク質である。
【０３４０】
ＰＡＴ−ＳＡＭ−６（Ｐｅｒｃｉｖｉａ）ＩｇＭ：ＰｅｒＣ６細胞（Ｐｅｒｃｉｖｉａ）において産生した組換え抗体。ＶＬドメインフレームワーク中にアミノ酸変化がある。Ｖ（バリン）からＥ（グルタミン酸）へのこの変化は、細胞によるタンパク質発現レベルを改善するようである。ＳＡＭ−６ＨＡＢＩｇＭ：ヒトハイブリドーマ産生タンパク質（Ｐａｔｒｙｓ  ＧｍＢＨ、ドイツ）。質量分析によるタンパク質配列に基づくと、このタンパク質の遺伝子配列はＶＬドメイン中のＰＡＴ−ＳＭ−６ＩｇＭと異なる。
【０３４１】
ＳＡＭ−６  １．１Ｂ  ｓｃＦｖは、１．１Ａと同じＶＨ配列、ただしＶＬドメイン中に１個のアミノ酸変化を有する。
【０３４２】
ＳＡＭ−６  ２．２Ｂ  ｓｃＦｖは、２個のフレームワークおよび１個のＶＨ  ＣＲＤ２変化、およびＶＬドメイン中に１個のアミノ酸変化を有する。
【０３４３】
ＬＤＬとの結合を使用して、細菌による様々なｓｃＦｖ配列のタンパク質発現を測定した。このデータは、最強のシグナルはＳＡＭ−６  ＫＴＡおよびＳＡＭ−６  ２．７に関して観察されることを明らかにし、この２個の変異体が多量に生成されたことを示す。各々における変異体残基を組み合わせて、ＳＡＭ−６のＩｇＧ変異体中のこれらのアミノ酸変化を取り込む。
【０３４４】
（実施例１１）
この実施例は、ＳＡＭ−６ダイアボディは馴化培地中でＡ５４９細胞由来の抗原と結合し、かつＬＤＬ（低比重リポタンパク質）と結合することを示す、結合試験の記載を含む。この実施例は、細胞中での発現時に特定のＳＡＭ−６変異体が多量に生成されることを示すデータも含む。
【０３４５】
ＥＬＩＳＡ（図２４）中、右側の２本のバーはＬＤＬとｓｃＦｖ  １．１Ａおよび１．１Ｂの結合を示す。簡単に言うと、ＬＤＬをプレートにコーティングし、次いでプレートをブロッキングする。（Ｃ末端にＦＬＡＧタグを有する）ＳＡＭ−６ダイアボディを加え（インキュベートし）、次いで非結合タンパク質を洗浄除去する。ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）とも結合するＦＬＡＧタグと結合する別の抗体を加える。ＥＬＩＳＡプレートリーダーによって記録される着色反応において、この結合を検出することができる。１．０周辺の吸光度読取り値は、これらのタンパク質が結合していることを示す。
【０３４６】
ＳＡＭ−６は癌細胞系Ａ５４９と結合し、したがってこれらの細胞は、細胞表面において最も高い確率で抗体が結合するアクセス可能な形で標的を生成する。Ａ５４９細胞を増殖させ、第３日までに、細胞は組織培養フラスコの底部に集合層を形成した。使用済み培養培地（ここでそれは、その中にウシ胎児血清、および分泌標的タンパク質を含めたＡ５４９細胞増殖副産物を有するが、遠心分離によって除去したのでＡ５４９細胞を含まないので、ここでは馴化培地と呼ぶ）を回収し、ＥＬＩＳＡウエルにコーティングした。隣接する（対照）ウエルは、その中で増殖したいかなる細胞も含まなかった増殖培地を有していた。ブロッキング後、ＳＡＭ−６ダイアボディを加え結合させた。非結合タンパク質を洗浄除去し、ＦＬＡＧタグ検出用に二次抗体を加える。
【０３４７】
２本の馴化培地のバーは、Ａ５４９細胞が培地内でＳＡＭ−６抗体が結合する物質を生成することを示す（図２４）。Ａ５４９細胞は、培養培地に明らかに分泌される抗原標的を生成した。このデータは、Ａ５４９馴化培地中に多量の標的（抗原）タンパク質が存在することを示す。
【０３４８】
ＬＤＬとの結合データは、ＣＤＲ３中に２個の残基変化を有するｓｃＦｖ  ＫＴＡ（ＳＡＭ−６原型）は、他のＳＡＭ−６変異体より高度なＬＤＬとの相対的結合を有していたことを示す。このデータは、ｓｃＦｖ  ２．７Ａ中のフレームワーク領域の変化には、他のＳＡＭ−６変異体より高度なＬＤＬに対する相対的結合親和性もあったことをさらに明らかにする。ｓｃＦｖ変異体に関するＬＤＬとの結合に関する順位序列の概要は以下の通りであった：
ＫＴＡ（ＳＡＭ−６原型）、１．１Ａを超える（Ｂ、ＣＤＲ３）
２．７Ａ、１．１Ａを超える（Ｆ）
１．１Ａ＝発現されたＰｅｒｃｉｖｉａ（ＰＡＴ−ＳＡＭ−６）
１．１Ｂ、１．１Ａより低い結合（Ｆ）
２．２Ｂ、１．１Ａ未満（Ｆ、Ｂ）
１．５Ａ、１．１Ａ未満（Ｂ）
１．４Ａ、１．１Ａ未満（Ｆ、Ｂ、ＣＤＲ３）
１．２Ａ、１．１Ａ未満（Ｂ）
２．２Ａ、１．１Ａ未満（Ｆ、Ｂ）
（Ｆ）＝フレームワークの変化、および（Ｂ）＝結合領域の変化
したがって、ＫＴＡ（ＳＡＭ−６原型）と２．７Ａフレームワークの組合せは、ＬＤＬに対する改善された結合親和性をもたらすはずである。
【０３４９】
（実施例１２）
この実施例は、ＳＡＭ−６ダイアボディは馴化培地中でＡ５４９細胞由来の抗原と結合し、無細胞翻訳非グリコシル化ｇｒｐ７８タンパク質（小麦胚芽を使用）と結合することを示す試験の記載を含む。
【０３５０】
ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。抗原は５０μｌ／ウエルの体積で０．５μｇ／ウエルにおいてコーティングした。一次抗体は１２μｇ／ｍｌ（０．６μｇ／ウエル）で使用した。バッファーはｐＨ６．５であり、使用した希釈バッファーは高塩ｐＨ６．５であった。Ｇｒｐ７８タンパク質は１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４で希釈した。
【０３５１】
ＥＬＩＳＡによって、（細胞を３日間増殖させた後の）Ａ５４９癌細胞培養培地の構成要素との結合を実証した。（細胞を除去した）Ａ５４９馴化培地をプレート全体にコーティングした。ＳＡＭ−６ダイアボディを加えた（１．１およびＫＴＡおよび最適化）。他の対照抗体、ＬＭ１ダイアボディ、ＣＭ１ダイアボディ、実際はモノマーである対照ＶＨダイマー、ＢＡＲＢ３−ダイアボディ、ＢＡＲＢ４ダイアボディ、組換えＰＡＴ−ＳＡＭ６  ４５０−ＩｇＭ（ＰｅｒＣ６細胞によって生成された、Ｐｅｒｃｉｖｉａ）、組換えＬＭ１  ４１Ｂ１−ＩｇＭ、およびＳＡＭ６  Ｃ８／９ハイブリドーマＩｇＭを含めた。陰性対照は、一次抗体なし二次抗体ありで、Ａ５４９細胞がその中で増殖していた馴化培地である。データは、全てのＳＡＭ−６ダイアボディがＡ５４９培養上清中に存在する抗原と結合することを示し、それは組換えＳＡＭ−６  ＩｇＭクローン４５０（ＰｅｒＣ６細胞によって生成された、Ｐｅｒｃｉｖｉａ）によっても検出される。ＳＡＭ−６ハイブリドーマＣ８／９は非常に弱いシグナルを与えるが、これはタンパク質分解またはハイブリドーマ細胞死に原因がある可能性がある。このＥＬＩＳＡは、試験した他の抗体は、Ａ５４９馴化培地中のいかなる分泌産物とも結合しないことも示す。ＳＡＭ−６のみが、Ａ５４９馴化培地と検出可能に結合する。このＥＬＩＳＡは、ＳＡＭ−６がＡ５４９細胞馴化培地中の標的と結合することを示す。
【０３５２】
ＳＡＭ−６抗体との細胞表面結合を示さないことが以前に示された、第２の細胞系ＨＤＦａ由来の馴化培地をＳＡＭ−６抗体との結合に関して試験した。結合は検出されず、この細胞系が良い陰性対照であることが示された。
【０３５３】
別のＥＬＩＳＡを、Ｇｒｐ７８タンパク質でコーティングしたプレートに実施した（Ａｂｎｏｖａから−無細胞タンパク質翻訳−小麦胚芽−非グリコシル化を使用）。組換えＰＡＴ−ＳＡＭ−６  ＩｇＭ抗体（ＰｅｒＣ６細胞、Ｐｅｒｃｉｖｉａによって生成されたクローン４５０および５２８）および組換えＳＡＭ−６  １．１Ａダイアボディと純粋な非グリコシル化Ｇｒｐ７８タンパク質の結合を検出した。全ての結合は、純粋な（非グリコシル化）標的Ｇｒｐ７８タンパク質に対してであった。このデータは、ＳＡＭ−６抗体および変異体は炭水化物部分がないｇｒｐ７８と結合することを示す。プレートの第２半分で、Ａ５４９細胞由来の馴化培地との結合を検出したが、一方で陰性対照ＬＭ１抗体は馴化培地と結合しなかった。検出したシグナルの強度の変化はあったが、標的タンパク質は試料全体に均一に分散していない可能性がある。
【０３５４】
（実施例１３）
この実施例は、ＳＡＭ−６  ｓｃＦｖ、ＳＡＭ−６変異体および軽鎖可変領域（ＶＬ）なしでＳＡＭ−６重鎖可変領域（ＶＨ）のみを含む様々な型のＳＡＭ−６が、アポＢ１００、タンパク質、ＬＤＬ、ＶＬＤＬおよび脱グリコシル化ＬＤＬと結合することを示す試験の記載を含む。
【０３５５】
抗原特異性：組換えタンパク質の新たなバッチを作製し、一群のタンパク質に対して試験しＬＤＬに対する特異性を決定した。ＥＬＩＳＡは数回繰り返した。プレート上の抗原の位置はランダムに処理して位置による影響を排除した。
【０３５６】
ＳＡＭ−６  ＫＴＡ  ｓｃＦｖ用に、抗原は０．５μｇ／ウエル、５０μｌ／ウエルの体積でコーティングした。バッファー１×ＰＢＳ、ｐＨ６．５一次抗体ＳＡＭ−６  ＫＴＡ  ｓｃＦｖ親和性精製（抗ＨＩＳ変性）可溶性Ｃ画分を透析し、非希釈で加えた（５０ｕｌ／ウエル）（２ＢＴＡ４６）。これらのタンパク質試料において、可溶性Ｂ画分を除去し、残りの可溶性Ｃ画分のみを試験することに留意されたい。第３回目の読取り値が高い。それらは尿素可溶化抽出物からの組合せタンパク質レベル（１ＣＨＯ４．８）を含有するからである。陽性対照抗体抗ルイスＹは抗ＦＬＡＧ精製であり、非希釈で加えた（５０ｕｌ／ウエル）（２ＢＴＡ４９）。ウエルは、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）と結合した抗原、ルイスＹ四糖を含有する。陽性対照（抗ルイスＹ）は、その炭水化物抗原ルイスＹと結合したとき、１つのＥＬＩＳＡで０．９８および他のＥＬＩＳＡで０．９０の吸光度読取り値をＡ６５５ｎｍで与えた。
【０３５７】
ＳＡＭ−６  ＫＴＡ  ｓｃＦｖの最も強い結合はアポリポタンパク質Ｂ１００との結合である。ＶＬＤＬ、ＬＤＬおよび脱グリコシル化ＬＤＬとの結合も検出した。
【０３５８】
ＳＡＭ−６  １．１Ａ  ｓｃＦｖを尿素可溶化するために、抗原は０．５μｇ／ウエル、５０μｌ／ウエルの体積でコーティングした。バッファー１×ＰＢＳ、ｐＨ６．５一次抗体ＳＡＭ−６  １．１Ａ  ｓｃＦｖ親和性精製（抗ＨＩＳ変性）可溶性Ｃ画分を透析し、非希釈で加えた（５０ｕｌ／ウエル）（２ＢＴＡ４６）。第３回目の読取り値は、尿素可溶化抽出物からの組合せタンパク質レベル（１ＣＨＯ４．７）を含有する。陽性対照抗体抗ルイスＹは抗ＦＬＡＧ精製であり、非希釈で加え（５０ｕｌ／ウエル）（２ＢＴＡ４９）、１．２および１．０の吸光度読取り値をＡ６５５ｎｍで得た。
【０３５９】
アポリポタンパク質Ｂ１００、ＶＬＤＬ、ＬＤＬおよび脱グリコシル化ＬＤＬとのＳＡＭ−６  １．１Ａの強い結合を検出した。
【０３６０】
ＳＡＭ−６（Ｐｅｒｃｉｖｉａ）に関して、アポリポタンパク質Ｂ１００、ＶＬＤＬ、ＬＤＬおよび脱グリコシル化ＬＤＬとの強い結合を検出した。
【０３６１】
ヒトハイブリドーマによって産生されたＳＡＭ−６  ＨＡＢに関して（Ｐａｔｒｙｓ  ＧｍＢＨ、ドイツ）、ＶＬＤＬ、ＬＤＬおよび脱グリコシル化ＬＤＬとの強い結合を検出したが、アポリポタンパク質Ｂ１００との結合は弱かった。ＳＡＭ−６  ＨＡＢはこのアッセイにおいて様々な結果を与えた。
【０３６２】
前述の試験において、様々な異なる形式で産生したいくつかの異なるＳＡＭ−６タンパク質を、ＬＤＬ（低比重リポタンパク質）、ＶＬＤＬ、脱グリコシル化ＬＤＬおよびアポＢ１００タンパク質などの、様々な標的抗原と結合するそれらの能力に関して比較した。ＳＡＭ−６  ＫＴＡ  ｓｃＦｖ、１．１ｓｃＦｖ、ＰＡＴ−ＳＡＭ−６（Ｐｅｒｃｉｖｉａ）およびＳＡＭ−６  ＨＡＢは、ＨＤＬ（高比重リポタンパク質）ではなく、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、脱グリコシル化ＬＤＬおよびアポＢ１００タンパク質に対して様々な程度の結合親和性を示した。このようにして、配列の変化を機能と関連付けることができる。
【０３６３】
アポＢ１００とのさらなる結合試験をＥＬＩＳＡ分析によって実施した。簡単に言うと、（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した）低比重ＬＤＬから単離した２５０ｕｌのアポリポタンパク質Ｂ１００（１０ｕｇ／ｍｌ）をＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。プレートをブロッキングし、一次単鎖抗体（ＳＡＭ−６．２．７およびＳＡＭ−６．ｏｐｔｉ）およびＳＡＭ−６重鎖可変領域（ＶＨ）単独）とインキュベートし、次いで２５０ｕｌの合計体積で抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ二次抗体とインキュベートし、３個の陰性対照（陰性対照１：コーティングなし（ブロッキング）、一次抗体なし、次いで抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ二次抗体；陰性対照２：コーティングなし（ブロッキング）、次いで一次抗体、次いで抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ二次抗体；および陰性対照３：１０ｕｇ／ｍｌのアポＢ１００でコーティング（ブロッキング）、一次抗体なし、次いで抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ二次抗体）と比較した。
【０３６４】
これらの結果は、ＳＡＭ−６．２．７、ＳＡＭ−６．ｏｐｔｉおよびＳＡＭ−６重鎖可変領域（ＶＨ）単独）はアポＢ１００タンパク質と結合することを示した。
【０３６５】
（実施例１４）
この実施例は、ＳＡＭ−６変異体が、癌細胞系Ａ５４９、ＢｘＰＣ３およびＣＲＬ１４２４とも結合することができることを示す試験の記載を含む。
【０３６６】
以下の変異体：ＳＡＭ−６  １．１ＡｓｃＦｖ、ＳＡＭ−６  ＫＴＡ  ｓｃＦｖ、ＳＡＭ−６  ＶＨＶＬ  ｏｐｔ  ｓｃＦｖ、ＳＡＭ−６  ＨＡＢ、およびＰＡＴ−ＳＡＭ−６（Ｐｅｒｃｉｖｉａ）を試験した。ＳＡＭ−６  ＶＨＶＬ  ｏｐｔ  ｓｃＦｖは、ヌクレオチドレベルでの２５％の変化を含めて、ＶＨドメイン中に４アミノ酸変化を有する最適化フレームワークを有する。ＣＤＲ−Ｈ１中にはさらに１つの変化がある。ＳＡＭ−６  ＶＨＶＬ  ｏｐｔ  ｓｃＦｖのＶＬドメインは、ヌクレオチドレベルでの３８％の変化を含めた４０アミノ酸変化を有するラムダからｋａｐｐａ軽鎖のクラス変更である。遊離Ｃｙｓ残基はＶＬＣＤＲ１から除去した。
【０３６７】
ＦＡＣＳ分析によって、全てのｓｃＦｖ構築物は試験した３個の癌細胞系（Ａ５４９、ＢｘＰＣ３およびＣＲＬ１４２４）と結合するが、陰性細胞系ＨＤＦａとは結合しないことが明らかになった。
【０３６８】
Ａ５４９、ＢｘＰＣ３、ＣＲＬ１４２４、ＨＴ−２９、ＨｅＬａ、およびＭＣＦ−７癌細胞系との結合に関するさらなる試験を、共焦点顕微鏡による分析を使用して実施した。試験したＳＡＭ−６抗体は、ＳＡＭ−６  １．１Ａ  ｓｃＦｖ、ＳＡＭ−６  ＫＴＡ  ｓｃＦｖ、ＳＡＭ−６  ＶＨＶＬ  ｏｐｔ  ｓｃＦｖ、ＳＡＭ−６  ＨＡＢ、およびＰＡＴ−ＳＡＭ−６（Ｐｅｒｃｉｖｉａ）を含んでいた。
【０３６９】
簡単に言うと、細胞を固定し、一次抗体を加え、次いでＦＩＴＣ標識を有する二次抗体を用いて検出した。青色に見えるＤＡＰＩ染色液で細胞核を染色し、６００〜６５０波長範囲で測定した。このＤＡＰＩイメージを捕捉し記録した。ＤＡＰＩ核染色のレベルが一定レベルに保たれた場合、異なる試験を「標準化」することができる。細胞は一次（試験）抗体とインキュベートし、適切に標識した二次抗体を加えた。これらの実験中、本発明者らはＦＩＴＣ標識を使用して、それを５００〜５５０波長範囲で観察した最大強度で測定した。ＦＩＴＣイメージを記録した。これらのイメージはＤＡＰＩイメージとＦＩＴＣイメージのオーバーレイであった。
【０３７０】
別組の試験では、２個の活性結合部位を示すタンパク質の能力を試験した。肯定的な結果を得るために、タンパク質は１個の結合アームで癌細胞系上の細胞表面標的抗原と結合することを必要とし、したがって第２のアームがＡｌｅｘａ４８８で標識したヒトＬＤＬと結合するのに必要とされ得る。この２個の事象が起こり得るときのみ、結合事象が検出される。Ａｌｅｘａ４８８のイメージは色あせず、より安定状態であり、本発明者らはそれがより強い染色イメージをもたらしたことを発見した。
【０３７１】
これらの結果は、５個全てのＳＡＭ−６抗体に関してＡ５４９（肺）、ＢｘＰＣ−３（膵臓）、ＨＴ−２９（結腸）、ＨｅＬａ（頸部）、ＭＣＦ−７（乳）およびＣＲＬ１４２４（メラノーマ）細胞で結合を検出したことを明らかにした。ＳＡＭ−６結合の差を観察した。いくつかの細胞系において、ＳＭ−６タンパク質が細胞核に進入したようであり、オーバーレイを行うとき細胞核は淡いが鮮明な青色に見える。５個のＳＡＭ−６抗体はいずれも胃癌細胞系２３１３２／９３と検出可能に結合しない。
【０３７２】
（実施例１５）
この実施例は、癌細胞系Ａ５４９とも結合することができるＩｇＧ１  ＳＡＭ−６変異体を用いた他の試験の記載を含む。
【０３７３】
ＳＡＭ−６  ｓｃＦｖを、ラムダ軽鎖および哺乳動物細胞ＨＥＫ２９３Ｆにおいて発現されるＩｇＧタンパク質を使用してＩｇＧ１に変換した。今日まで、ＩｇＧ１形式で産生される３個の異なるＳＡＭ−６タンパク質は、現在１．１ｉｍｐと呼ばれる、発現を改善するための１個のアミノ酸変化を有する１．１ＡＶＨドメインを含有するＳＡＭ−６  １．１ｉｍｐ  ＩｇＧである。それはＩｇＧ１のＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３も含有する。この軽鎖は、組換えＩｇＭ構築物中で使用したのと同じラムダ軽鎖である。発現を改善するための１個のアミノ酸変化を有するＫＴＡ  ＶＨドメインおよびＩｇＧ１のＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含有するＳＡＭ−６  ＫＴ  ｉｍｐ  ＩｇＧ。この軽鎖は、組換えＩｇＭ構築物中で使用したのと同じラムダ軽鎖である。発現を改善するための４個のアミノ酸変化およびコドン最適化を有するＳ６最適化ＶＨドメインならびにＩｇＧ１のＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含有するＳＡＭ−６  ｏｐｔ  ＩｇＧ。この軽鎖は、組換えＩｇＭ構築物中で使用したのと同じラムダ軽鎖である。ＫＴＡは、ＫＴ  ＶＨがｓｃＦｖ構築物中で１ＢＴＡ１．６ＶＬドメインと対形成することを意味する。
【０３７４】
培養上清をＨＥＫ２９３Ｆ細胞の一過性トランスフェクション後に単離した。第５日に、適切なＩｇＧ１を含む細胞上清。Ａ５４９細胞とＳＡＭ−６  １．１ｉｍｐ  ＩｇＧ１、ＳＡＭ−６  ＫＴ  ＩｇＧ１およびＳＡＭ−６  ｏｐｔ  ＩｇＧ１の結合を検出した。
【０３７５】
さらなるＦＡＣＳ試験を、ＨｅＬａ細胞ならびにＳＡＭ−６  １．１ｉｍｐ  ＩｇＧ１およびＳＡＭ−６  Ｋｏｐｔｉ  ＩｇＧ１を用いて実施した。ＨｅＬａ細胞とＳＡＭ−６  １．１ｉｍｐ  ＩｇＧ１およびＳＡＭ−６  Ｋｏｐｔｉ  ＩｇＧ１の結合を検出した。
【０３７６】
（実施例１６）
この実施例は、ＳＡＭ−６  ｓｃＦｖｓ中のアミノ酸残基の変化は、タンパク質の溶解性を増大する可能性があることを示す試験の記載を含む。
【０３７７】
そのＦｖ配列が親ＰＡＴ−ＳＡＭ−６  ＩｇＭから変化していないＳＡＭ−６  １．１Ａに関して見られる、ｓｃＦｖの抗体の限られた溶解性には、経時的に抗体の試験中で限られた保存性および低い有効性がある。しかしながら、以下の表中に示すように、ＳＡＭ−６最適化（ｓｃＦｖダイマー）およびＳＡＭ−６  ｏｐｔ．ｓｃＦｖモノマーに関して、ＶＨドメインおよび新たなＶＬドメインフレームワーク中の標的残基の変化と組み合わせたコドン使用最適化は、いずれも改善されたタンパク質の溶解性に貢献する。
【０３７８】
【表２】
2012517216.tif 000023
表中のデータは、ＳＡＭ６最適化（ダイアボディ）およびＳＭ−６  ｏｐｔ（最適化）モノマーはＳＡＭ−６  １．１Ａより高い収率を有することを示す。
【０３７９】
（実施例１７）
この実施例は、ＳＡＭ６−ＩｇＭとリポタンパク質（ＬＤＬ）のＥＬＩＳＡ結合試験およびアポトーシスアッセイを示す試験の記載を含む。
【０３８０】
ＰＡＴ−ＳＡＭ６−ＩｇＭは、アイソタイプ適合ヒトＩｇＭ抗体と比較したＬＤＬとの結合を示す（図２５Ａ）。さらに、ＰＡＴ−ＳＡＭ６−ＩｇＭの結合はＬＤＬのＣｕ２＋酸化後に増大する（図２５Ａ）。異なるＣｕ酸化ＬＤＬの存在下での腫瘍細胞の抗体誘導性リポトーシスを、細胞死検出ＥＬＩＳＡＰＬＵＳによって測定した。膵臓癌細胞系ＢＸＰＣ−３は、ＰＡＴ−ＳＡＭ６−ＩｇＭおよび無関連ヒトＩｇＭアイソタイプ対照とインキュベートした。アポトーシス細胞の量は、４１５ｎｍ（参照λ４９０ｎｍ）で分光光度計によって測定した。リポトーシス／アポトーシスを誘導するＰＡＴ−ＳＡＭ６−ＩｇＭの能力は、多量のＣｕ２＋酸化ＬＤＬの存在下で増大する（図２５Ｂ）。
【０３８１】
（実施例１８）
この実施例は、Ａ５４９細胞によって生成した馴化培地由来の標的抗原、およびおそらく標的抗原と結合する抗原のＳＡＭ−６免疫沈降を示す試験の記載を含む。
【０３８２】
ＳＡＭ−６ダイアボディを用いてＡ５４９細胞由来の馴化培地の免疫沈降試験を実施した。免疫沈降部分は１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に分画化し、後に銀染色した。図２６中に示すように、ＳＡＭ−６ダイアボディは、Ａ５４９細胞馴化培地中に存在する、１１０〜５０ｋＤａ周辺のいくつかのタンパク質、および低分子量タンパク質と結合する。これらのタンパク質は、ＳＡＭ−６標的、標的断片、またはＳＡＭ−６標的と結合するタンパク質である可能性がある。３０ｋＤａがＳＡＭ−６ダイアボディであると推定される。
【０３８３】
（実施例１９）
この実施例は、ＳＡＭ−６  １．１Ａ  ｓｃＦｖおよびＳＡＭ−６最適化ｓｃＦｖモノマーと比較した、ＬＤＬに対する特定のＳＡＭ−６変異体（最適化ｓｃＦｖダイマー）の高い親和性を示す、さらなる試験の記載を含む。
【０３８４】
ＰＡＴ−ＳＡＭ−６−ＩｇＭは、癌細胞においてＬＤＬと結合しリポトーシスを誘導することが以前に示されている。ＬＤＬと他のＰＡＴ−ＳＡＭ−６ｓｃＦｖ変異体の親和性はＥＬＩＳＡによって評価した。全ての変異体がＬＤＬと明らかに結合し、最適化ＰＡＴ−ＳＡＭ−６  ｓｃＦｖダイアボディは最大の親和性を有する。
【０３８５】
（実施例２０）
この実施例は、さらなるＳＡＭ−６結合試験、およびＳＡＭ−６がＣＤ５５抗原と結合しないことの記載を含む。
【０３８６】
簡単に言うと、ＣＤ５５抗原（０．５μｇ／ウエル）を５０μｌ／ウエルの体積でコーティングした。一次抗体は１２μｇ／ｍｌ（０．６μｇ／ウエル）でインキュベートした。バッファーはｐＨ６．５であり、使用した希釈用バッファーは高塩ｐＨ８．０であった。これらのＥＬＩＳＡ試験は、ＳＡＭ−６がＣＤ５５抗原と結合しないことを明らかにした。
【０３８７】
（実施例２１）
この実施例は、さらなるＳＡＭ−６結合試験、およびＳＡＭ−６重鎖可変領域（ＶＨ）単独で、軽鎖可変領域（ＶＬ）なしで標的に結合することの記載を含む。結合試験中で使用したＳＡＭ−６重鎖可変領域（ＶＨ）単独のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ以下の通りである：
【０３８８】
【化１２】
2012517216.tif 000024
ＳＡＭ−６重鎖可変領域（ＶＨ）単独を以下の材料および方法を使用して調製した：１Ｌの培養フラスコ、５０ｍｌのファルコンチューブ、ペトリ皿、エッペンドルフバイオフォトメーターまたはＯＤ６００および２８０ｎｍを読み取るための同等品、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ、ＬＢａｍｐ寒天プレート、Ｂｉｏ−Ｒａｄの１ｍｌのスピンカラム、真空マニホールド、懸濁ミキサー。
【０３８９】
ＳＡＭ−６重鎖可変領域（ＶＨ）タンパク質の発現用に、核酸の新たな形質転換体をＪＭ１０９に調製し、１０ｍｌのスーパーブロス（ＳＢ）ａｍｐ培地に単コロニーを接種し、一晩約１５０ｒｐｍで攪拌しながら３３℃で増殖させ、次いで一晩でＳＢ中に１：１０に希釈した。ＯＤ６００で培養物を記録し（対照ＳＢとして１ｍｌ）、次いで１００μｌの培養物および９００μｌのＳＢを希釈した。それが約４．０００のＯＤ６００に達するまで培養物を増殖させる。０時間試料として１ｍｌのアリコートを得て、後の分析用に４℃で保存する。培養物を４２℃に設定した別のインキュベーターシェーカーに移し、４時間約１５０ｒｐｍで攪拌し続ける。３時間後定期的に誘導の進行を調べ、ＯＤが安定化し誘導が終了した後、ＯＤ６００で培養物を記録し（対照として１ｍｌ）、次いで１００μｌの培養物および９００μｌのテリフィックブロスを希釈した。誘導後４時間で１ｍｌのアリコートを得て、５０ｍｌのポリカーボネートファルコンチューブ（ＢＤ）に培養物を移す。ペレットを沈殿させ（４０００ｇ、４℃で２０分間スピン処理）、誘導培養物はタンパク質抽出および精製用に残し、全細胞溶解物アリコートおよび精製タンパク質にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー）およびα−ＦＬＡＧウエスタンを実施する。
【０３９０】
次いでＳＡＭ−６重鎖可変領域（ＶＨ）タンパク質を、２ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒマスター混合物（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に細胞ペレットを溶かし、２０分間懸濁ミキサーで混合することによって抽出した。次いで溶液を６Ｍ尿素にし、さらに１０分間軽く混合し、次に６００μｌのＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）を加え、６０分間懸濁ミキサーで溶液を混合した。次いでタンパク質樹脂溶液を真空下（１０  ｉｎ  Ｈｇ）で１．０ｍｌの使い捨てスピンカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に回収し、カラム中の樹脂および結合ＨｉｓタグｓｃＦｖｓを捕捉し、１０ｍｌのＩＭＡＣ洗浄バッファーで洗浄し、次いで結合タンパク質を５ｍｌのＩＭＡＣ溶出バッファーで溶出した。
【０３９１】
溶出タンパク質を含むバッファーの交換を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５デバイスを用いて以下のように実施した：デバイスをバッファーで洗浄して、膜上の防腐剤、（必須ではないが奨励される）通常グリセロールを除去した。試料をフィルター区画に置き、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）、ｐＨ７．３で１５ｍｌにし、３０分間４０００ｒｐｍ（４℃）で遠心分離した（４℃での試料の遠心分離はＲＴでの試料の遠心分離より時間を要する）。試料が約１．０ｍｌになった後、濾液を廃棄し、さらに１４ｍｌのＨＢＳ、ｐＨ７．３をフィルター区画に加え、再度遠心分離した。タンパク質試料を回収し、ＢＳＡ標準曲線を使用しエッペンドルフバイオフォトメーターを用いて２８０ｎｍでの濃度を測定した。以下の表中に試薬を列挙する：
【０３９２】
【表３】
2012517216.tif 000025
ＳＡＭ−６重鎖可変領域（ＶＨ）タンパク質のＦＡＣＳ分析を以下のように実施した：２×１０５個の細胞／ｍｌ（試料当たり）を１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中の氷冷ＦＡＣＳバッファー中に使用し、それを氷上に３０分間放置し、対照細胞に関してのみ、４×１０５個の細胞／ｍｌで使用した。４℃において５００ｇで５分間、細胞を含有するチューブを遠心分離し、上清を廃棄し、非希釈濃度で一次抗体を加え（合計体積５０μｌ）、暗所で氷上に３０分間放置した。１ｍｌの氷冷ＦＡＣＳバッファーを加え（３０ＦＡＣＳバッファーは、１２０μｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ（ストック５００ｍＭ）、３００μｌの１％ＦＢＳＨＩ、および１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、３０ｍｌを有する）、４℃において５００ｇで５分間遠心分離し、氷冷ＦＡＣＳバッファー（合計体積５０μｌ）中に１／２０希釈した２０抗体２μｌを加え、暗所で氷上に３０分間放置した。１ｍｌの氷冷ＦＡＣＳバッファーを加え、４℃において５００ｇで５分間遠心分離し、２００μｌの氷冷ＦＡＣＳバッファー中に細胞を再縣濁した（対照細胞に関してのみ、チューブ中の４００μｌに再縣濁した）。ナイロンフィルターを介して濾過し、５ｍｌの丸底ＦＡＣＳチューブに細胞を移し（何らかの細胞塊が存在するかどうか調べる）、分析の直前に１μｌのヨウ化プロピジウム（１ｍｇ／ｍｌ）を加えた。ボルテックスミキサーで試料を混合し、ＦＡＣＳ機器において試料を分析した。データはＷｉｎ  ＭＤＩプログラムで分析した。
【０３９３】
試験中で使用したＳＡＭ−６抗体および変異体は、ＳＡＭ−６．２．７．ＳｃＦｖ（２ＣＨＯ４３．１）、ＳＡＭ−６．Ｏｐｔｉ．ＳｃＦｖ（２ＣＨＯ４３．２）およびＳＡＭ−６．ＶＨ単独（２ＣＨＯ４３．３）であった。使用した細胞系はＨｅＬａおよびＨＤＦａ細胞系であった。
【０３９４】
ＦＡＣＳバッファーを氷上に保存した。ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ、１ｍｇ／ｍｌ）、ポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＭ／ＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ、ロット番号：０００５１５０４）、抗ＦｌａｇＭ２モノクローナルＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ、ロット番号：１０５Ｋ６２０９１）、Ｐｅｒｃｉｖｉａ  ＳＭ−６（＋Ｊ鎖）クローン４５０を全て４℃で保存した。
【０３９５】
結果は図２８中、上列中、第１図−ｓｃＦｖ陰性対照、第２図−ＳＭ６  ２．７Ａ  ｓｃＦｖ（黒線）、および第３図−ＳＭ６  ｏｐｔｉ  ｓｃＦｖ（黒線）に示す。下列中、第１図−ＳＭ６  ＶＨ単独（黒線）、第２図−抗ＩｇＭ陰性対照、および第３図−ＳＭ６  ＩｇＭ４５０（黒線）。
【０３９６】
図２８中、第１列（上部）に２例のＳＡＭ−６単鎖（ＶＨ＋ＶＬ）が存在する。ＳＡＭ−６  ２．７はラムダ軽鎖を使用してＶＨおよびＶＬを含有する。ＳＡＭ−６  ｏｐｔｉはｋａｐｐａ軽鎖を使用してＶＨおよびＶＬを含有する。次（底部）列はＶＨドメインのみを有し、同様の結合を示す。最終図（右）にはＳＡＭ−６  ＩｇＭ結合がある。第２列上の第１（左）図はＳＡＭ−６  ＶＨ単独とＨｅｌａ細胞の結合を示す。したがって、ＳＡＭ−６標的との結合はＳＡＭ−６のＶＨのみによって与えられる可能性がある。
【０３９７】
（実施例２２）
この実施例は、ＳＡＭ−６変異体は、哺乳動物２９３Ｆ細胞によって発現される分泌組換えＧｒｐ７８（グリコシル化）と結合することを示す試験の記載を含む。
【０３９８】
タンパク質を分泌するためにＫＤＥＬＣ末端配列を有する（哺乳動物分泌、グリコシル化、完全長およびＨｉｓ×６尾部）組換えＧｒｐ７８を、哺乳動物２９３Ｆ発現系から産生した。
【０３９９】
ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。簡単に言うと、組換えＧｒｐ７８を１０μｇ／ｍｌ（バッチ番号：ＴＣ０９０３−１８）、および１００μｇ／ｍｌにおいて一次抗体でコーティングした。二次抗体は、ＳｃＦｖ  ＳＡＭ−６に対して抗Ｆｌａｇ−Ｍ２モノクローナルＨＲＰ抗体、およびＳＡＭ−６に対してポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＭ／ＨＲＰであった。陰性対照は、１）１０μｇ／ｍｌのＧｒｐ７８でコーティング、一次抗体なし、および抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体、２）１０μｇ／ｍｌのＧｒｐ７８でコーティング、一次抗体なし、およびポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＭ／ＨＲＰ二次抗体、３）コーティングなし、一次抗体なし、ポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＭ／ＨＲＰ二次抗体のみ、４）コーティングなし、一次抗体なし、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体のみ、５）コーティングなし、ＳＡＭ−６クローン４５０およびポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＭ／ＨＲＰ二次抗体、６）コーティングなし、ＬＭ１クローン１７０およびポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＭ／ＨＲＰ二次抗体、および７）コーティングなし、ＰＡＴ  ＳＭ６  ２．７  ｓｃＦＶおよび抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体であった。体積は２５０μｌであった。抗体試験は、ＳＡＭ−６  ２．７Ｆｌａｇの単鎖抗体、ＳＡＭ−６  Ｏｐｔｉの単鎖抗体（ｋａｐｐａ軽鎖）、ＳＡＭ−６  ＶＨ単独Ｆｌａｇ；Ｆｌａｇ  ＳＡＭ−６  ＩｇＭ４５０およびＬＭ１  ＩｇＭクローン１７０であった。
【０４００】
図２９中に示す試験は、ＳＡＭ−６  ２．７、ＳＡＭ−６  Ｏｐｔｉの単鎖抗体（ｋａｐｐａ軽鎖）、およびＳＡＭ−６  ＶＨ単独は、哺乳動物細胞によって発現される組換えＧｒｐ７８（グリコシル化）と結合することを実証する。
【図１】
2012517216.tif 000026
【図２】
2012517216.tif 000027
【図４】
2012517216.tif 000028
【図７】
2012517216.tif 000029
【図１２】
2012517216.tif 000030
【図１３】
2012517216.tif 000031
【図１４】
2012517216.tif 000032
【図１５】
2012517216.tif 000033
【図２４】
2012517216.tif 000034
【図２５】
2012517216.tif 000035
【図２７】
2012517216.tif 000036
【図２９】
2012517216.tif 000037
【図３】
2012517216.tif 000038
【図５】
2012517216.tif 000039
【図６】
2012517216.tif 000040
【図８】
2012517216.tif 000041
【図９】
2012517216.tif 000042
【図１０】
2012517216.tif 000043
【図１１】
2012517216.tif 000044
【図１６】
2012517216.tif 000045
【図１７】
2012517216.tif 000046
【図１８】
2012517216.tif 000047
【図１９】
2012517216.tif 000048
【図２０】
2012517216.tif 000049
【図２１】
2012517216.tif 000050
【図２２−１】
2012517216.tif 000051
【図２２−２】
2012517216.tif 000052
【図２２−３】
2012517216.tif 000053
【図２３】
2012517216.tif 000054
【図２６】
2012517216.tif 000055
【図２８Ａ】
2012517216.tif 000056
【図２８Ｂ】
2012517216.tif 000057
【配列表】
2012517216000001.app
【国際調査報告】
2012517216.tif 000058
2012517216.tif 000059