(57)【要約】本発明は、患者における鉱質コルチコイドレセプター（ＭＲ）活性化のバイオマーカーとしての好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）および／またはＳＥＲＰＩＮＡ３の使用に関する。さらに特定すれば、本発明は、ＭＲアンタゴニストまたはアルドステロンシンターゼ阻害剤を用いた処置に対する患者の反応性を予測するための方法であって、該患者から得られた生物学的試料中の、ＮＧＡＬ遺伝子および／またはＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子の発現レベルを決定することを含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から得られた生物学的試料中の、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）遺伝子およびＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子から成る群より選択される一つまたは二つのバイオマーカーの発現レベルを決定することを含む、該患者における鉱質コルチコイドレセプター（ＭＲ）の活性化を評価するための方法。
【請求項２】
患者から得られた生物学的試料中の、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）遺伝子およびＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子から成る群より選択される一つまたは二つのバイオマーカーの発現レベルを決定することを含む、ＭＲアンタゴニストまたはアルドステロンシンターゼ阻害剤を用いた処置に対する該患者の反応性を予測するための方法。
【請求項３】
一つまたは二つのバイオマーカーの発現レベルが、該一つまたは二つのバイオマーカーのｍＲＮＡの量を決定することによって決定され、生物学的試料が、細胞または組織試料である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
細胞試料が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料または内皮細胞試料である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
一つまたは二つのバイオマーカーの発現レベルが、ＲＴ−ＰＣＲによって決定される、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
一つまたは二つのバイオマーカーの発現レベルが、患者から得られた生物学的試料中の該一つまたは二つのバイオマーカータンパク質の濃度を測定することによって決定される、請求項１または２記載の方法。
【請求項７】
生物学的試料が、血液試料、血清試料、血漿試料または尿試料である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
患者が、心血管疾患を患う、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
患者が、うっ血性心不全または高血圧を患う、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
患者が、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、利尿薬、血管拡張薬、β遮断薬、ジギタリス、および抗凝固薬から成る群より選択される標準的な処置で既に処置されている、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
患者が、肥満、糖尿病、または代謝症候群を患う、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
患者が、一般集団または健康被験者から得られた予備決定値よりも高い、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）遺伝子およびＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子から成る群より選択される一つまたは二つのバイオマーカーの発現レベルを有する、心血管疾患、糖尿病、肥満または代謝症候群を患う該患者の処置に使用するためのＭＲアンタゴニストまたはアルドステロンシンターゼ阻害剤。
【請求項１３】
患者が、一般集団または健康被験者から得られた予備決定値よりも高い、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）遺伝子およびＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子から成る群より選択される一つまたは二つのバイオマーカーの発現レベルを有する、心血管疾患、糖尿病、肥満または代謝症候群を患う該患者を処置するための医薬を調製するためのＭＲアンタゴニストまたはアルドステロンシンターゼ阻害剤の使用。
【請求項１４】
ａ）ＮＧＡＬタンパク質を検出するための手段；および
ｂ）ＳＥＲＰＩＮＡ３タンパク質を検出するための手段
を含むキット。
【請求項１５】
ａ）ＮＧＡＬタンパク質の結合パートナー；および
ｂ）ＳＥＲＰＩＮＡ３タンパク質の結合パートナー
を含む、請求項１４記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、患者における鉱質コルチコイドレセプター（ＭＲ）の活性化のバイオマーカーに関する。
【０００２】
発明の背景
鉱質コルチコイドレセプター（ＭＲ）は、糖質コルチコイドレセプター（ＧＲ）、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）、プロゲステロンレセプター（ＰＲ）、およびエストロゲンレセプター（ＥＲ）を含めた古典的ステロイドホルモンレセプターの１種である（Funder, 1997）。これらのレセプターは、器官の発生および分化から気分のコントロールおよびストレス反応におよぶ多種多様な生理学的過程をレギュレーションするホルモン活性化転写因子である（Beato et al., 1995）。ＭＲに対する生理学的ホルモンは、副腎によって分泌されるステロイドホルモンである、アルドステロンである。
【０００３】
ＭＲは、血管、脳、および心臓の非上皮部位に位置している（Bonvalet JP. et al. 1995; Lombes M, et al. 1992; Tanaka J. et al. 1997）。過去１０年にわたる数多くの研究から、鉱質コルチコイドの非上皮作用がそれらの血管および心筋の線維化効果および栄養効果を担うことが示唆されている（Brilla CG. et al. 1992, Ullian ME. et al. 1992; Young M. et al. 1994）。加えて、ＭＲは、動物研究においてヒト上皮細胞および血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）（Hatakeyama H. et al. 1994)および心筋細胞から見出されている（Silvestre JS.et al. 1988）。いくつかの研究（Brilla CG et al. 1992; Young M. et al. 1994）では、鉱質コルチコイドが、心筋細胞におけるコラーゲン形成の刺激を介した心筋線維症と関連づけられた。
【０００４】
Farquharson CA.ら（2000）は、アルドステロンが、慢性心不全における内皮障害に役割を果たすおそれがあることを間接的に示した。したがって、ＭＲは、特に高血圧および心不全を処置するための重要な薬物ターゲットである。
【０００５】
例えば、アルドステロンのアンタゴニストであるスピロノラクトン（PFIZER製ALDACTONE（登録商標）としても知られている）は、鉱質コルチコイドレセプターに結合し、アルドステロンの結合を遮断する。このステロイド化合物は、一般にうっ血性心不全の処置に使用される。実際に、スピロノラクトンは、薬理学的に有効かつ認容性良好であって、死亡、進行性心不全による死亡、および心臓に起因する突然死の全般的なリスク、ならびに心臓に起因する入院のリスクを軽減することが示されている。無作為アルダクトン評価試験（ＲＡＬＥＳ）で重症心不全患者へのスピロノラクトンの投与が評価された。ＲＡＬＥＳは、重症心不全および３５％以下の左室駆出分画を有する参加者であって、典型的にはアンジオテンシン変換酵素阻害剤、ループ利尿薬、および場合によりジゴキシンを含めた標準的治療を受けている参加者を登録した無作為二重盲検プラセボ対照試験であった。スピロノラクトンで処置されたＲＡＬＥＳ被験者は、プラセボで処置された被験者に比べて死亡率および入院頻度が統計的に有意に低下した（Pitt B. et al. 1999）。
【０００６】
同様に、エプレレノンは、鉱質コルチコイドレセプターにおけるアルドステロン結合の別の遮断剤の一例である。エプレレノンが、ヒト−リコンビナント糖質コルチコイドレセプター、プロゲステロンレセプターおよびアンドロゲンレセプターよりもヒト−リコンビナント鉱質コルチコイドレセプターに選好的に結合する点で、その作用は選択的である。エプレレノンの投与に関連する治療効果は、複数の臨床試験で実証されている。６６００人を超える被験者が参加しているそのような一試験［急性心筋梗塞後心不全に対するエプレレノンの有効性および生存率の研究（ＥＰＨＥＳＵＳ）］において、エプレレノンは、心臓に起因する死亡リスクおよび心血管イベントに関する入院リスクを有意に低下させることが分かった（Pitt B. et al. 2003）。心臓に起因する突然死の率の低下もまた観察された。
【０００７】
しかし、アルドステロンは、ＭＲを活性化することが知られている唯一の内因性ホルモンではない。例えば、内因性糖質コルチコイドもまた、ＭＲを活性化することができる。実際に、糖質コルチコイドは、心線維症の初期の発生段階で酸化ストレスおよび血管の炎症を生じさせることが示されている。このように、心血管系におけるＭＲ活性化の有害作用は、高アルドステロン症の不在下でさえも起こるおそれがあり（Funder JW, 2006）アルドステロンの血漿中濃度は、心血管系におけるＭＲ活性化に関する指標とならない。さらに、心不全、心筋梗塞または高血圧に関連する末端器官障害では、心臓または血管でＭＲの発現が増加する（Nagata K, et al.  2006; Takeda M. et al., 2007）。
【０００８】
したがって、心血管系におけるＭＲ活性化を評価するための正確で特異的な方法を開発する技術的必要性が、当技術分野においてまだ存在する。
【０００９】
さらに、患者におけるＭＲアンタゴニストの投与は、高カリウム血症などの重篤な有害副作用を併発するおそれがある。実際に、ＲＡＬＥＳ試験の公表後に、重篤な高カリウム血症の報告がいくつもあった。そのような一報告で、緊急治療室で処置しなければならなかったスピロノラクトン関連高カリウム血症の患者のエピソードが２５件以上記載された（Schepkens H. et al. 2001）。２５人の患者のうち４人は、心血管蘇生術を必要とし、２５人の患者のうち２人は死亡した。臨床的に有意な高カリウム血症の発生率がこのＭＲアンタゴニストを投与されている患者の約１０％にのぼることを、数人の著者が評価している。
【００１０】
したがって、そのような処置の有害副作用を予防または限定するために、ＭＲアンタゴニストを用いた処置に対する心不全の患者の反応性を予測するための正確かつ特異的な方法を開発する目下の必要性も、当技術分野において存在する。
【００１１】
発明の概要
本発明は、患者から得られた生物学的試料中の、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）遺伝子およびＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子から成る群より選択される一つまたは二つのバイオマーカーの発現レベルを決定することを含む、該患者における鉱質コルチコイドレセプター（ＭＲ）の活性化を評価する方法方法に関する。
【００１２】
本発明は、また、ＭＲアンタゴニストまたはアルドステロンシンターゼ阻害剤を用いた処置に対する患者の反応性を予測するための方法であって、該患者から得られた生物学的試料中の、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）遺伝子およびＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子から成る群より選択される一つまたは二つのバイオマーカーの発現レベルを決定することを含む方法に関する。
【００１３】
本発明は、また、心血管疾患、糖尿病、肥満または代謝症候群の患者であって、本発明の方法によるレスポンダーとして分類される患者を処置するためのＭＲアンタゴニストまたはアルドステロンシンターゼ阻害剤の使用に関する。
【００１４】
発明の詳細な説明
定義：
「ＭＲ」という用語は、鉱質コルチコイドレセプターを表す。本明細書に使用されるような「ＭＲ活性化」という用語は、鉱質コルチコイド（すなわちアルドステロン）または糖質コルチコイドによる鉱質コルチコイドレセプターの活性化を表す。
【００１５】
「ＭＲアンタゴニスト」という用語は、ＭＲの生物学的活性化を（部分的または完全に）阻害する能力をもつ、天然または天然でない化合物を表す。スピロノラクトン、エポキシメキスレノン（epoxymexrenone）およびエプレレノンを含めたいくつかのＭＲアンタゴニストが公知である。本発明の範囲には、公知ではない全てのＭＲアンタゴニストおよび将来発見されるＭＲアンタゴニストが含まれる。アルドステロンアンタゴニストは、スピロノラクトン型化合物（スピロノラクトン、スピロノラクトンの活性代謝物（カンレノンまたはカンレノ酸カリウムのようなその塩など））でありうる。アルドステロンアンタゴニストは、また、エポキシ−ステロイド系アルドステロンアンタゴニストでありうる。別の系列のステロイド型ＭＲアンタゴニストの一例は、エポキシ含有スピロノラクトン誘導体である。例えば、米国特許第４，５５９，３３２号は、ＭＲアンタゴニストとしてスピロノラクトン誘導体を記載している。さらなるＭＲアンタゴニストは、スピロノラクトンのアナログのドロスピレノン（ＤＲＳＰ）でありうる。
【００１６】
「アルドステロンシンターゼ阻害剤」という用語は、コルチコステロンをヒドロキシル化して１８−ＯＨ−コルチコステロンを形成させ、１８−ＯＨ−コルチコステロンをアルドステロンにすることによってコルチコステロンをアルドステロンに変換するアルドステロンシンターゼ酵素を阻害する化合物または薬剤を含むことが意図される。いくつかのアルドステロンシンターゼ阻害剤が、当技術分野において周知である。本発明の範囲には、現在公知の全てのアルドステロンシンターゼ阻害剤および将来発見されるアルドステロンシンターゼ阻害剤が含まれる。該アルドステロンシンターゼ阻害剤は、ステロイド系または非ステロイド系アルドステロンシンターゼ阻害剤でありうる。アルドステロンシンターゼ阻害剤は、非ステロイド系またはステロイド系アロマターゼ阻害剤でありうる。非ステロイド系アロマターゼ阻害剤には、アナストロゾールおよびファドロゾール（その（＋）−鏡像異性体を含む）が含まれうる。ステロイド系アロマターゼ阻害剤の一例は、エキセメスタンである。別の非ステロイド系アルドステロンシンターゼ阻害剤は、Fiebeler A.ら（2005）にも記載されているようなファドロゾール塩酸塩の（＋）−鏡像異性体である（米国特許第４６１７３０７号および第４８８９８６１号）。
【００１７】
「リポカリン２」または「ＮＧＡＬ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味をもち、Schmidt-Ott KM.ら（2007）に記載されているような好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンを表す。ＮＧＡＬは、任意の起源でありうるが、典型的には哺乳動物（例えばヒトおよび非ヒト霊長類）ＮＧＡＬ、特にヒトＮＧＡＬである。「ＮＧＡＬ遺伝子」という用語は、ＮＧＡＬのｍＲＮＡおよびタンパク質をコードする、例えばゲノムＤＮＡ配列および任意の天然ＮＧＡＬならびにその変異体および改変形をコードする、任意のヌクレオチド配列を表す。それは、また、ＮＧＡＬのｍＲＮＡおよびタンパク質をコードするｃＤＮＡなどの人工配列を包含しうる。ネイティブなヒトＮＧＡＬヌクレオチド配列の一例は、GenBankデータベースにアクセッションナンバーＮＭ＿００５５６４で提供されている。「ＮＧＡＬ ｍＲＮＡ」という用語は、当技術分野において一般的な意味をもち、ＮＧＡＬ遺伝子が発現したときに合成されるメッセンジャーＲＮＡを表す。「ＮＧＡＬタンパク質」という用語は、ＮＧＡＬ遺伝子の発現に起因するアミノ酸配列、ならびに任意の天然ＮＧＡＬおよびその変異体および改変形を表す。ネイティブなヒトＮＧＡＬアミノ酸配列の一例は、GenPeptデータベースにアクセッションナンバーＮＰ＿００５５５５で提供されている。本明細書に使用されるような「ＮＧＡＬタンパク質」という用語は、また、ＮＧＡＬおよびメタロプロテイナーゼＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ、９２kDa ＩＶ型コラゲナーゼ、９２kDaゼラチナーゼおよびＶ型コラゲナーゼとしても知られている）から形成されるヘテロ二量体複合体を包含する（Kjeldsen et a., 1993）。
【００１８】
「抗ＮＧＡＬ抗体」という用語は、ＮＧＡＬを認識する抗体またはそのフラグメントを表す。
【００１９】
「ＳＥＲＰＩＮＡ３」遺伝子という用語は、当技術分野においてその一般的な意味をもち、ＣＴ；ＡＡＣＴ；ＧＩＧ２４；ＧＩＧ２５；ＭＧＣ８８２５４としても知られている。この遺伝子の公式な正式名称は、セルピンペプチダーゼインヒビター、クレードＡ（α−１アンチプロテイナーゼ、アンチトリプシン）、メンバー３である。ＳＥＲＰＩＮＡ３は、任意の起源であってもよいが、典型的には哺乳動物（例えばヒトおよび非ヒト霊長類）ＳＥＲＰＩＮＡ３、特にヒトＳＥＲＰＩＮＡ３である。「ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子」という用語は、ＳＥＲＰＩＮＡ３のｍＲＮＡおよびタンパク質、例えばゲノムＤＮＡ配列および任意の天然ＳＥＲＰＩＮＡ３ならびにその変異体および改変形をコードする任意のヌクレオチド配列を表す。それは、また、ＳＥＲＰＩＮＡ３のｍＲＮＡおよびタンパク質をコードするｃＤＮＡなどの人工配列を包含しうる。「ＳＥＲＰＩＮＡ３ ｍＲＮＡ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味をもち、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子が発現したときに合成されるメッセンジャーＲＮＡを表す。「ＳＥＲＰＩＮＡ３タンパク質」という用語は、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子の発現に起因するアミノ酸配列、ならびに任意の天然ＳＥＲＰＩＮＡ３およびその変異体および改変形を表す。
【００２０】
「ＳＥＲＰＩＮＡ３抗体」という用語は、ＳＥＲＰＩＮＡ３タンパク質を認識する抗体またはそのフラグメントを表す。
【００２１】
「心血管系」という用語は、当技術分野においてその一般的な意味をもち、心臓、血管、または血管系、ならびに血管を構成する細胞および血漿から成り立つ系を意味する。
【００２２】
「心血管疾患」という用語は、当技術分野においてその一般的な意味をもち、身体の心臓、心臓弁、血液、および血管系に影響を与える数多くの状態を分類するために使用される。心血管疾患には、内皮障害、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、うっ血性心不全、高血圧、脳血管疾患、卒中、一過性脳虚血発作、深部静脈血栓症、末梢動脈疾患、心筋症、不整脈、大動脈狭窄症、および動脈瘤が挙げられる。
【００２３】
本明細書に使用されるように、「バイオマーカーの予備決定値」は、一般集団または選択された被験者集団から得られた生物学的試料中のバイオマーカーの量を表わす。例えば、選択された集団は、心血管疾患の存在を示す徴候も症状も以前に全く示していない個体などの、健康と見受けられる被験者から成ってもよい。別の例では、予備決定値は、確立した心血管疾患を有する被験者から得られたバイオマーカーの量の予備決定値であってもよい。予備決定値は、しきい値または範囲でありうる。予備決定値は、外見上健康な被験者と、確立した心血管疾患を有する被験者の間の比較測定に基づいて確立することができる。
【００２４】
本明細書に使用されるように「患者」という用語は、齧歯類、ネコ、イヌおよび霊長類などの哺乳動物を意味する。好ましくは、本発明による患者は、ヒトである。
【００２５】
ＭＲアンタゴニストまたはアルドステロンシンターゼ阻害剤を用いた処置への「レスポンダー」または処置に「反応性の」患者または患者群は、それぞれＭＲアンタゴニストまたはアルドステロンシンターゼ阻害剤を用いて処置した場合に、心血管疾患に臨床的に有意な軽減を示すかまたは示すであろう患者または患者群を表す。本発明の方法によると、患者における好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）遺伝子およびＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子から成る群より選択される一つまたは二つのバイオマーカーの発現が、一般集団または健康被験者から得られた予備決定値と有意に異なるならば、その患者は処置へのレスポンダーとして分類される。好ましくは、患者における好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）遺伝子およびＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子から成る群より選択される一つまたは二つのバイオマーカーの発現レベルが、一般集団または健康被験者から得られた予備決定値よりも高いならば、その患者はレスポンダーである。
【００２６】
典型的には、患者における該一つまたは二つのバイオマーカーの発現レベルの比が予備決定値に対して１．２、好ましくは１．５、なおさらに好ましくは２、なおさらに好ましくは５、１０または２０よりも高い場合に、該患者における該一つまたは二つのバイオマーカーの発現レベルが、一般集団または健康被験者から得られた該予備決定値よりも高いと見なされる。
【００２７】
本明細書に使用されるように「健康被験者」という用語は、任意の公知の状態を患わない、特に心血管疾患も、糖尿病も、肥満も、代謝症候群も全く患わない、被験者集団を表す。
【００２８】
「生物学的試料」という用語は、患者由来の任意の生物学的試料を意味する。そのような試料の例には、体液、組織、細胞試料、器官、生検材料などが挙げられる。好ましい生物学的試料は、細胞または組織試料である。好ましい生物学的試料は、全血、血清、血漿または尿である。
【００２９】
本明細書に使用されるように「バイオマーカー」という用語は、一般に、患者由来の生物学的試料における発現が、当技術分野で標準的な方法によって検出することができ、それが得られた患者の状態を予測または明示する分子、すなわち遺伝子（または該遺伝子をコードする核酸）、タンパク質を表す。
【００３０】
本発明の予測法：
本発明は、患者から得られた生物学的試料中の、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）遺伝子およびＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子から成る群より選択される一つまたは二つのバイオマーカーの発現レベルを決定することを含む、該患者におけるＭＲ活性化を評価するための方法に関する。
【００３１】
特定の態様では、本発明は、該患者から得られた生物学的試料中の、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）遺伝子およびＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子から成る群より選択される一つまたは二つのバイオマーカーの発現レベルを決定することを含む、該患者の心血管系におけるＭＲ活性化を評価するための方法に関する。
【００３２】
本発明は、また、ＭＲアンタゴニストまたはアルドステロンシンターゼ阻害剤を用いた処置に対する患者の反応性を予測するための方法であって、該患者から得られた生物学的試料中の、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）遺伝子およびＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子から成る群より選択される一つまたは二つのバイオマーカーの発現レベルを決定することを含む方法に関する。
【００３３】
特定の態様では、患者は心血管疾患を患う。さらに特定すれば、該患者は、内皮障害、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、うっ血性心不全、高血圧、脳血管疾患、卒中、一過性脳虚血発作、深部静脈血栓症、末梢動脈疾患、心筋症、不整脈、大動脈狭窄症、または動脈瘤を患う。特定の態様では、該患者は、うっ血性心不全または高血圧を患う。
【００３４】
特定の態様では、心血管疾患の患者は、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、利尿薬、血管拡張薬、β遮断薬、ジギタリス、および抗凝固薬から成る群より選択される標準的な処置ですでに処置されている。
【００３５】
別の特定の態様では、患者は、肥満、糖尿病または代謝症候群を患う。実際に、ＭＲの活性化が肥満および代謝症候群の病態生理学的発生に関連したことが示されている（Caprio M. et al. 2007; Lamounier-Zepter V. et al. 2005）。
【００３６】
一態様では、本発明は、患者から得られた細胞または組織試料中の一つまたは二つのバイオマーカーのｍＲＮＡの量を決定することを含む、該患者におけるＭＲ活性化を評価するための方法に関する。
【００３７】
本発明は、また、ＭＲアンタゴニストまたはアルドステロンシンターゼ阻害剤を用いた処置に対する患者の反応性を予測するための方法であって、該患者から得られた細胞または組織試料中の一つまたは二つのバイオマーカーのｍＲＮＡの量を決定することを含む方法に関する。
【００３８】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、マクロファージ、多核細胞、および内皮細胞および内皮プロモーター細胞（ＥＰＣ）が、好ましい細胞である。なおさらに好ましくは、本発明による細胞は、ＰＢＭＣまたは内皮細胞である。総ＲＮＡは、それから容易に抽出することができる。例えば核酸を入手可能にするために、細胞または組織試料を使用する前にそれを処理してもよい。細胞またはタンパク質の溶解のための技法、核酸の濃度または希釈は、技術者に公知である。
【００３９】
遺伝子の発現レベルの決定は、多様な技術により行うことができる。一般に、決定されるような発現レベルは、相対発現レベルである。
【００４０】
さらに好ましくは、決定は、プローブ、プライマーもしくはリガンドなどの選択試薬と試料を接触させることによってその存在を検出すること、または本来試料中の、関心がもたれる核酸の量を測定することを含む。
【００４１】
好ましい態様では、ｍＲＮＡの量を決定することによって、発現レベルを決定してもよい。
【００４２】
ｍＲＮＡの量を決定するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、試料（例えば患者から調製された細胞または組織）中に含有される核酸を、標準法により、例えば溶解酵素もしくは化学溶液を使用して最初に抽出するか、または製造業者の説明書に従って核酸結合樹脂によって抽出する。次に、抽出されたｍＲＮＡをハイブリダイゼーション（例えばノーザンブロット分析）および／または増幅（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によって検出する。好ましい態様では、一つまたは二つのバイオマーカーの発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲ、好ましくは定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲ、なおさらに好ましくはリアルタイム定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定する。好ましい態様では、ＮＧＡＬ遺伝子の発現レベルを、フォワードプライマー５’−ＧＧＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＴＣＧＣＴＡＣＴ−３’（配列番号１）およびリバースプライマー５’−ＧＧＴＧＧＣＣＡＣＴＴＧＣＡＣＡＴＴＧＴ−３’（配列番号２）、またはフォワードプライマー５’−ＴＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＧＧＡＡＧＡＡＣＣ−３’（配列番号３）およびリバースプライマー５’−ＧＧＴＧＧＧＡＡＣＡＧＡＧＡＡＡＡＣＧＡ−３’（配列番号４）を使用する、定量ＰＣＲによって評価する。
【００４３】
増幅の他の方法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（strand displacement amplification）（ＳＤＡ）および核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。
【００４４】
少なくとも１０個のヌクレオチドを有し、本明細書において関心がもたれるｍＲＮＡに相補的または相同な配列を示す核酸には、ハイブリダイゼーションプローブまたは増幅プライマーとしての有用性が見つかる。そのような核酸は、同一である必要はないが、典型的には匹敵するサイズの相同領域と少なくとも約８０％同一、さらに好ましくは８５％同一、なおさらに好ましくは９０〜９５％同一であることが了解されている。ある態様では、ハイブリダイゼーションを検出するための検出可能なラベルなどの適切な手段と共に核酸を使用することが、有利であろう。蛍光、放射性、酵素または他のリガンド（例えばアビジン／ビオチン）を含めた豊富な種類の適切な指標が、当技術分野において公知である。
【００４５】
プローブは、典型的には１０〜１０００、例えば１０〜８００、さらに好ましくは１５〜７００、典型的には２０〜５００ヌクレオチド長の一本鎖核酸を含む。プライマーは、典型的には、増幅される、関心がもたれる核酸と完全またはほぼ完全にマッチするように設計された、１０〜２５ヌクレオチド長の比較的短い一本鎖核酸である。プローブおよびプライマーは、ハイブリダイゼーションする核酸に「特異的」であり、すなわちそれらは、好ましくは高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（最高の融解温度Ｔｍ、例えば５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣに対応する。ＳＣＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａである）でハイブリダイゼーションする。
【００４６】
上記増幅および検出法に使用される核酸プライマーまたはプローブは、キットとして集合させてもよい。そのようなキットは、コンセンサスプライマーおよび分子プローブを包含する。好ましいキットには、また、増幅が起こったかどうかを決定するために必要な構成要素を包含する。キットは、また、例えばＰＣＲ緩衝液および酵素；陽性対照配列、反応対照プライマー；および特異的配列を増幅および検出するための説明書を包含してもよい。
【００４７】
別の態様では、本発明は、患者から得られた生物学的試料中の一つまたは二つのバイオマーカータンパク質の濃度を測定することを含む、該患者のＭＲ活性化を評価するための方法に関する。
【００４８】
別の態様では、本発明は、患者から得られた生物学的試料中の一つまたは二つのバイオマーカータンパク質の濃度を測定することを含む、ＭＲアンタゴニストまたはアルドステロンシンターゼ阻害剤を用いた処置に対する該患者の反応性を予測するための方法に関する。
【００４９】
好ましい態様では、一つまたは二つのバイオマーカータンパク質の濃度は、該患者から得られた血液試料、血漿試料、血清試料または尿試料から測定される。
【００５０】
特定の態様では、本発明の方法は、生物学的試料を、その生物学的試料中に存在する一つまたは二つのバイオマーカータンパク質と選択的に相互作用できる結合パートナーと接触させることを含む。結合パートナーは、ポリクローナルまたはモノクローナル、好ましくはモノクローナルでありうる抗体であってもよい。別の態様では、結合パートナーはアプタマーであってもよい。
【００５１】
本発明のポリクローナル抗体またはそのフラグメントは、例えば数ある中でブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、およびマウスより選択されるホスト動物に、適切な抗原またはエピトープを投与することによって、公知の方法により産生させることができる。抗体産生を高めるために、当技術分野で公知の様々なアジュバントを使用することができる。本発明の実施に有用な抗体はポリクローナルであってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。
【００５２】
本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、培養継代細胞系による抗体分子の産生に対応する任意の技法を用いて調製および単離することができる。産生および単離のための技法には、非限定的にKohlerおよびMilstein（1975）によって本来記載されたハイブリドーマ技法；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Cote et al., 1983）；およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Cole et al. 1985）が挙げられる。
【００５３】
または、一本鎖抗体の産生のために記載された技法（例えば米国特許第４，９４６，７７８号参照）を、抗ＮＧＡＬまたは抗ＳＥＲＰＩＮＡ３一本鎖抗体を産生させるために適用してもよい。本発明の実施に有用な抗体には、また、抗ＮＧＡＬまたは抗ＳＥＲＰＩＮＡ３フラグメントが挙げられ、それらには、非限定的にＦ（ａｂ’）２フラグメント（インタクトな抗体分子のペプシン消化によって産生しうる）、およびＦａｂフラグメント（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって産生しうる）が挙げられる。または、Ｆａｂおよび／またはｓｃＦｖ発現ライブラリーを構築して、ＮＧＡＬまたはＳＥＲＰＩＮＡ３に対して所望の特異性を有するフラグメントを迅速に同定させることができる。例えば、抗体のファージディスプレイを使用してもよい。そのような方法では、適切なバクテリオファージ、例えばＭ１３の表面に一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）またはＦａｂフラグメントを発現させる。簡潔には、タンパク質を免疫処置した適切なホスト、例えばマウスの脾臓細胞を取り出す。そのタンパク質に対する所望の抗体を産生している細胞から、ＶＬおよびＶＨ鎖のコード領域を得る。次に、ファージ配列の末端にこれらのコード領域を融合させる。いったんファージが適切な担体、例えば細菌に挿入されたならば、そのファージは抗体フラグメントを提示する。抗体のファージディスプレイは、また、当業者に公知のコンビナトリアル法によって提供してもよい。次に、ファージによって提示される抗体フラグメントを、イムノアッセイの一部として使用してもよい。
【００５４】
ＮＧＡＬに対するモノクローナル抗体は、例えばKjeldsenら（1996）に記載されている。ＮＧＡＬに対する市販のモノクローナル抗体の例には、ＨＹＢ−２１１−０１、ＨＹＢ−２１１−０２、およびＮＹＢ−２１１−０５のような、Antibody Shop, Copenhagen, Denmarkから得られる抗体が挙げられる。典型的には、ＨＹＢ−２１１−０１およびＨＹＢ−２１１−０２は、その還元型および非還元型のＮＧＡＬと共に使用することができる。ＮＧＡＬ抗体は、また、R&D Systemsから参照番号ＡＦ１８５７で購入することができる。
【００５５】
ＳＥＲＰＩＮＡ３に対する市販のモノクローナル抗体の例には、Abgent, Inc. San DiegoおよびSigma-Aldrich Coから得られる抗体が挙げられる。
【００５６】
別の態様では、結合パートナーはアプタマーであってもよい。アプタマーは、分子認識に関して抗体の代替となる種類の分子である。アプタマーは、高い親和性および特異性で事実上任意の種類のターゲット分子を認識する能力をもつオリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチド配列である。そのようなリガンドは、Tuerk C. 1997に記載されたように、ランダム配列ライブラリーの試験管内進化法（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）（ＳＥＬＥＸ）により単離することができる。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって入手可能である。このライブラリーでは、各構成配列は、ユニーク配列の直鎖オリゴマー（場合により化学的に改変されているもの）である。この種の分子の可能な改変、使用および利点は、Jayasena S.D., 1999に総説されている。ペプチドアプタマーは、E. coli チオレドキシンＡなどのプラットフォームタンパク質により提示される、コンホメーションが束縛された抗体可変領域から成り、その抗体可変領域は、ツーハイブリッド法によりコンビナトリアルライブラリーより選択される（Colas et al., 1996）。
【００５７】
抗体またはアプタマーなどの本発明の結合パートナーに、蛍光分子、放射性分子または当技術分野において公知の任意の他のラベルなどの検出可能な分子または物質をラベルしてもよい。ラベルは、一般にシグナルを（直接的または間接的のいずれかで）与えることが当技術分野において公知である。
【００５８】
本明細書に使用されるように、抗体に関して「ラベルされた」という用語は、抗体またはアプタマーに放射性薬剤またはフルオロフォア（例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）またはインドシアニン（Ｃｙ５））などの検出可能な物質をカップリング（例えば物理的に結合）させることによるその抗体またはアプタマーの直接的ラベルと同様に、検出可能な物質との反応性によるそのプローブまたは抗体の間接的ラベルを包含することが意図される。本発明の抗体またはアプタマーに、当技術分野で公知の任意の方法によって放射性分子をラベルしてもよい。例えば放射性分子には、非限定的にＩ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８などのシンチグラフィー研究のための放射性原子が挙げられる。
【００５９】
上記アッセイは、一般に固体支持体に結合パートナー（すなわち抗体またはアプタマー）を結合させることを伴う。本発明の実施に使用することができる固体支持体には、ニトロセルロース（例えばメンブレンまたはマイクロタイターウェルの形態のもの）；ポリ塩化ビニル（例えばシートまたはマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えばビーズまたはマイクロタイタープレート）；ポリフッ化ビニリデン；ジアゾ化紙；ナイロンメンブレン；活性化ビーズ、磁気反応性ビーズなどのような基材が挙げられる。
【００６０】
一つまたは二つのバイオマーカータンパク質の濃度は、競合アッセイ、直接反応アッセイ、またはサンドイッチ型アッセイなどのイムノアッセイを含めた、標準的な免疫診断技法を用いることによって測定してもよい。そのようなアッセイには、非限定的に凝集検査；ＥＬＩＳＡなどの酵素ラベル介在イムノアッセイ；ビオチン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動；免疫沈降が挙げられる。
【００６１】
さらに特定すれば、該一つまたは二つのバイオマーカータンパク質を認識する抗体セットでマイクロタイタープレートのウェルをコーティングするＥＬＩＳＡ法を用いることができる。次に、コーティングされたウェルに、該一つまたは二つのバイオマーカータンパク質を含有するか、または含有する疑いのある生物学的試料を加える。抗体−抗原複合体を形成させるのに十分な時間インキュベーションした後に、プレートを洗浄して未結合成分を除去し、そして検出可能にラベルされた二次結合分子を添加することができる。捕捉された任意の試料マーカータンパク質と二次結合分子を反応させ、プレートを洗浄し、二次結合分子の存在を当技術分野で周知の方法を用いて検出する。
【００６２】
ＮＧＡＬの検出に適したＥＬＩＳＡ法は、Kjeldsen ら（1996）、 Mishra J.ら（2005）およびWangら（2007）に記載された。ＮＧＡＬを検出するためのサンドイッチ酵素イムノアッセイは、Blaser J.ら（1995）によって記載された。ＮＧＡＬを検出するためのラジオイムノアッセイは、Xu SY.ら（1994）によって記載された。
【００６３】
ＮＧＡＬを検出するためのＥＬＩＳＡキットは、AntibodyShop（Grusbakken 8 DK-2820 Gentofte - Denmark）から参照番号ＫＩＴ０３６またはＫＩＴ０３７で、R&D Systems Europe（Lille - France）から参照番号ＤＬＣＮ２０で、MBL International（Woburn, MA 01801, USA）から参照番号ＣＹ−８０７０で市販されている。ＮＧＡＬ／ＭＭＰ９複合体濃度を定量するためのイムノアッセイは、R&D Systems Europe（Lille - France）から参照番号ＤＭ９Ｌ２０で市販されている。
【００６４】
（イムノアッセイに基づく方法を用いたまたは用いない）一つまたは二つのバイオマーカータンパク質の濃度測定は、また、化合物の分離：化合物の分子量に基づく遠心分離；質量および電荷に基づく電気泳動；疎水性に基づくＨＰＬＣ；サイズに基づくサイズ排除クロマトグラフィー；および使用される特定の固相に対する化合物の親和性に基づく固相親和性を含んでもよい。いったん分離されると、該一つまたは二つのバイオマーカータンパク質は、標準的な技法を用いて測定された、その化合物に対する公知の「分離プロファイル」、例えば保持時間に基づいて同定してもよい。
【００６５】
または、分離された化合物は、例えば質量分析機により検出および測定してもよい。
【００６６】
一態様では、本発明の方法は、さらに、該一つまたは二つのバイオマーカータンパク質の濃度を予備決定されたしきい値と比較する段階を含んでもよい。該比較は、患者におけるＭＲ活性化またはＭＲアンタゴニストを用いた処置に対する患者の反応性を示す。典型的には、処置前のＮＧＡＬタンパク質の血中濃度が７０μg/lよりも高い、好ましくは８０μg/lよりも高い、なおさらに好ましくは８５μg/l、９０μg/l、９５μg/l、１００μg/l、１２５μg/l、１５０μg/lまたは２００μg/lよりも高い場合に、ヒト患者は、処置に対してレスポンダーであると見なすことができる。
【００６７】
本発明のキット
本発明のさらなる態様は、患者におけるＭＲ活性化を評価するための方法およびＭＲアンタゴニストまたはアルドステロンシンターゼ阻害剤を用いた処置に対する患者の反応性を予測するための方法を実施するために有用な材料を備えるキットを提供する。これらの方法を、診断検査室、実験研究室または専門家が行うことができる。本発明は、これらの異なる設定で使用されうるキットを提供する。
【００６８】
生物学的試料中のＮＧＡＬおよび／またはＳＥＲＰＩＮＡ３を検出するための材料および試薬を、キットの中に一緒にまとめてもよい。
【００６９】
本発明の一態様は、
ａ）ＮＧＡＬタンパク質を検出するための手段；および
ｂ）ＳＥＲＰＩＮＡ３タンパク質を検出するための手段
を含むキットに関する。
【００７０】
典型的には、該キットは、
ａ）ＮＧＡＬタンパク質の結合パートナー；および
ｂ）ＳＥＲＰＩＮＡ３タンパク質の結合パートナー
を含む。
【００７１】
典型的には、該結合パートナーは抗体である。
【００７２】
結合パートナーは、より容易な検出のためにタグ付けすることができる。それは、支持体（例えばビーズ、アレイなどの）表面に固定化してもよいか、または固定化しなくてもよい。典型的には、支持体表面（例えばメンブレン）は、（例えばゲル電気泳動およびメンブレンへの移行による）結合パートナーの固定化のためにキットに包含されていてもよい。
【００７３】
加えて、本発明のキットは、一般にまた、キットに含まれる結合パートナーと本発明のバイオマーカーとの間の複合体を検出するための、少なくとも一つの試薬を含む。
【００７４】
手順に応じて、キットは、さらに、抽出緩衝液および／または試薬、ウエスタンブロッティング緩衝液および／または試薬、ならびに検出手段のうち一つまたは複数を含んでもよい。異なる段階の手順を行うためにこれらの緩衝液および試薬を使用するためのプロトコールが、キットに包含されていてもよい。
【００７５】
本発明のキットに包含される、異なる試薬は、固体（例えば凍結乾燥）または液体状態で供給してもよい。本発明のキットは、場合により個別の緩衝液および／または試薬毎に異なる容器（例えばバイアル、アンプル、試験管、フラスコまたはボトル）を備えてもよい。各構成要素は、一般にそのそれぞれの容器に小分けするときに適するか、または濃縮形で提供される。ある段階の開示された方法を実施するために適する他の容器もまた提供してもよい。キットの個別の容器は、好ましくは、販売のために密閉して維持される。
【００７６】
ある態様では、キットは、本発明の方法により被験者における心不全リスクを予測するためにその構成要素を使用するための説明書を備える。本発明の方法によりキットを使用するための説明書は、その被験者から得られた生物学的試料を処理するためおよび／もしくはその検査を行うための説明書または結果を解釈するための説明書を備えてもよい。キットは、また、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により指示された形式の通知を含んでもよい。
【００７７】
本発明の治療法：
本発明の方法は、心血管疾患の患者を分類するために有用でありうることから、該患者に的確な処置を選択するために使用してもよい。このように例えば、レスポンダーまたは非レスポンダーとして分類される患者に、ＭＲアンタゴニストまたはアルドステロンシンターゼ阻害剤の適切な量を投与してもよい。それゆえに、そのような方法は、医師が治療的処置を選択することを助けることができる。したがって、処置のコストを患者のリスクに適合させることができる。
【００７８】
このように、本発明の別の局面は、疾患のある患者を治療するため、および／または疾患のリスクのある患者において予防するための方法であって、
ａ）該患者における該一つまたは二つのバイオマーカーの発現レベルが一般集団または健康被験者から得られた予備決定値よりも高いならば、その患者をレスポンダーとして分類する、本発明により該患者の反応性を予測するためのインビトロ法を行うことによって、該患者がＭＲアンタゴニストまたはアルドステロンシンターゼ阻害剤を用いた処置に対してレスポンダーまたは非レスポンダーであるかどうかを決定すること、および
ｂ）該患者が段階ａ）でレスポンダーとして決定されたならば、ＭＲアンタゴニストまたはアルドステロンシンターゼ阻害剤を該患者に投与すること
にある工程を含む方法に関する。
【００７９】
好ましい態様では、該疾患は心血管疾患である。
【００８０】
別の態様では、該疾患は、代謝症候群、肥満または糖尿病である。
【００８１】
ＭＲアンタゴニストまたはアルドステロンシンターゼ阻害剤は、薬学的組成物の形で投与してもよい。好ましくは、該アンタゴニストまたは阻害剤は、治療有効量で投与される。
【００８２】
「治療有効量」によって、任意の医学的処置に適用可能な,妥当な利益／リスク比で心血管疾患を治療および／または予防するために十分な量のＭＲアンタゴニストまたは阻害剤を意味する。
【００８３】
本発明の化合物および組成物の合計１日使用量は、健全な医学的判断の範囲内で担当の医師によって決定されることが理解されよう。任意の特定の患者についての特異的治療有効用量レベルは、処置されている障害および障害の重症度；採用される特異的化合物の活性；採用される特異的組成物、患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事；採用される特異的化合物の投与時間、投与経路、および排泄速度；処置期間；採用される特異的ポリペプチドと組合せてまたは同時に使用される薬物などの、医学分野で周知の要因を含めた多様な要因に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するために、そして所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させるために必要な用量よりも低いレベルで、化合物の用量を開始することは、十分に当該分野の技術の範囲内である。しかし、製品の１日投薬量は、大人１人につき１日に０．０１〜１０００mgの広い範囲を変動しうる。好ましくは、組成物は、処置される患者への投薬量を症状に応じて調整するために０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０および５００mgの活性成分を含有する。医薬は、典型的には約０．０１mg〜約５００mgの活性成分、好ましくは１mg〜約１００mgの活性成分を含有する。薬物の有効量は、通常、１日あたり０．０００２mg/kg体重〜約２０mg/kg体重、特に１日あたり約０．００１mg/kg体重〜７mg/kg体重の投薬レベルで供給される。
【００８４】
本発明のさらなる目的は、心血管疾患、糖尿病、肥満または代謝症候群の患者であって、上記方法によりレスポンダーとして分類される患者を処置するための医薬を調製するための、ＭＲアンタゴニストまたはアルドステロンシンターゼ阻害剤の使用である。
【００８５】
本発明のさらなる目的は、心血管疾患、糖尿病、肥満または代謝症候群の患者であって、本発明の方法によりレスポンダーとして分類される患者を処置するためのＭＲアンタゴニストまたはアルドステロンシンターゼ阻害剤に関する。
【００８６】
したがって、本発明のさらなる目的は、心血管疾患、糖尿病、肥満または代謝症候群の患者であって、一般集団または健康被験者から得られた予備決定値よりも高い、一つまたは二つのバイオマーカーの発現レベルを有する患者を処置するためのＭＲアンタゴニストまたはアルドステロンシンターゼ阻害剤に関する。
【００８７】
好ましい態様では、該患者は、心血管疾患を患う。
【００８８】
好ましい態様では、該患者は、肥満を患う。
【００８９】
好ましい態様では、該患者は、糖尿病を患う。
【００９０】
好ましい態様では、該患者は、代謝症候群を患う。
【００９１】
本発明の別の目的は、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）遺伝子およびＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子から成る群より選択される一つまたは二つのバイオマーカーを、患者におけるＭＲ活性化のバイオマーカーとして使用することである。
【００９２】
本発明の別の目的は、ＭＲアンタゴニストまたはアルドステロンシンターゼ阻害剤を用いた患者の処置をモニタリングするための方法であって、本発明の方法によりＭＲ活性化を評価すること、および場合により該一つまたは二つのバイオマーカーの発現レベルを、予備決定された段階のＭＲ活性化を表す予備決定値と比較することを含む方法であるが、予備決定値に対する該一つまたは二つのバイオマーカーの発現レベルは、ＭＲ活性化の漸進的変化、すなわち処置の有効度を示す。
【００９３】
本発明を図および実施例の点からさらに例示する。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１Ａ】コンディショナルなＭＲの心臓過剰発現のモデルにおけるＮＧＡＬ発現の経時変化を示す図である。Ｌｃｎ２は、リポカリン２（ＮＧＡＬ）を意味する。ＨＰＲＴは、対照ハウスキーピング遺伝子を意味する。Ｃｎｔは、対照同腹仔マウスを意味する。ＤＴは、ｈＭＲをコンディショナルに過剰発現しているダブルトランスジェニックマウスを意味する。
【図１Ｂ】ＭＲの心臓におけるＮＧＡＬタンパク質の発現を示す図である。Ｌｃｎ２は、リポカリン２（ＮＧＡＬ）を意味する。ＧＡＰＤＨは、対照ハウスキーピングタンパク質を意味する。Ｃｎｔは、対照同腹仔マウスを意味する。ＤＴは、ｈＭＲをコンディショナルに過剰発現しているダブルトランスジェニックマウスを意味する。
【図２】ＧＲを過剰発現しているマウスに比べた、ＭＲを過剰発現しているマウスの心臓におけるＮＧＡＬ発現を示す図である。Ｌｃｎ２は、リポカリン２（ＮＧＡＬ）を意味する。ＨＰＲＴは、対照ハウスキーピング遺伝子を意味する。Ｃｎｔは、対照同腹仔マウスを意味する。ＤＴは、ｈＭＲまたはｈＧＲをコンディショナルに過剰発現しているダブルトランスジェニックマウスを意味する。
【図３】様々なモデルにおけるＮＧＡＬの発現を示す図である。ＡおよびＢ：定量ＰＣＲ；ＣおよびＤ：ＥＬＩＳＡ。Ｃｎｔは、対照同腹仔マウスを意味する。ＤＴは、ｈＭＲをコンディショナルに過剰発現しているダブルトランスジェニックマウスを意味する。Ａｌｄｏ−塩は、 アルドステロン注入処置され、１％ ＮａＣｌを飲用している一側性腎摘出マウスを意味する。内皮特異的なＭＲ発現は、内皮のみにターゲティングされたコンディショナルなＭＲの発現によって得られる。
【図４Ａ】ラットＭＲを安定発現しているラット心筋細胞（Ｈ９Ｃ２細胞）の細胞モデルにおけるＮＧＡＬの発現を示す図である。Ｃｎｔは、対照（希釈剤）を意味する。ａｌｄｏおよびｃｏｒｔｉｃｏは、それぞれアルドステロンおよびコルチコステロンを意味する。ＲＵ２８３１８は、ＭＲアンタゴニストであり、ＲＵ４８６は、ＧＲアンタゴニストである。βアクチンは、標準化のために使用されるハウスキーピング遺伝子である。
【図４Ｂ】ラットＭＲを安定発現しているラット心筋細胞（Ｈ９Ｃ２細胞）の細胞モデルにおけるＮＧＡＬの発現を示す図である。Ｃｎｔは、対照（希釈剤）を意味する。ａｌｄｏおよびｃｏｒｔｉｃｏは、それぞれアルドステロンおよびコルチコステロンを意味する。ＲＵ２８３１８は、ＭＲアンタゴニストであり、ＲＵ４８６は、ＧＲアンタゴニストである。βアクチンは、標準化のために使用されるハウスキーピング遺伝子である。
【図４Ｃ】ラットＭＲを安定発現しているラット心筋細胞（Ｈ９Ｃ２細胞）の細胞モデルにおけるＮＧＡＬの発現を示す図である。Ｃｎｔは、対照（希釈剤）を意味する。ａｌｄｏおよびｃｏｒｔｉｃｏは、それぞれアルドステロンおよびコルチコステロンを意味する。ＲＵ２８３１８は、ＭＲアンタゴニストであり、ＲＵ４８６は、ＧＲアンタゴニストである。βアクチンは、標準化のために使用されるハウスキーピング遺伝子である。
【図４Ｄ】ラットＭＲを安定発現しているラット心筋細胞（Ｈ９Ｃ２細胞）の細胞モデルにおけるＮＧＡＬの発現を示す図である。Ｃｎｔは、対照（希釈剤）を意味する。ａｌｄｏおよびｃｏｒｔｉｃｏは、それぞれアルドステロンおよびコルチコステロンを意味する。ＲＵ２８３１８は、ＭＲアンタゴニストであり、ＲＵ４８６は、ＧＲアンタゴニストである。βアクチンは、標準化のために使用されるハウスキーピング遺伝子である。
【図５Ａ】ＩＩ型糖尿病のマウスモデルにおけるＮＧＡＬの発現を示す図である。Ｌｃｎ２は、リポカリン２（ＮＧＡＬ）を意味する。Ｃｎｔは、対照同腹仔マウスを意味する。ｄｂ／ｄｂは、糖尿病マウスを意味する。
【図５Ｂ】リポカリン２／ＮＧＡＬの血漿中濃度の進展を示す図である。カンレノ酸塩で１７週間処置されたかまたは処置されていない対照およびｄｂ／ｄｂマウスにおける血漿中ｌｃｎ２。
【図６】心不全ラットの心臓および血漿におけるリポカリン２／ＮＧＡＬのＭＲ依存性誘導を示す図である。リポカリン２／ＮＧＡＬの発現は、悪液質誘導性心不全を有するラットの左心室で２倍に増加する。誘導は、有効用量のスピロノラクトン（５０mg/Kg/日、心不全の症状を予防できる）により完全に阻止される。Ｂ．心不全を有するラットの血漿においてリポカリン２／ＮＧＡＬの血漿中濃度もまた増加する（図６Ｂ）。動物を５０mg/Kg/jのｓｐｉｒｏで処置すると増加は阻止される（ＨＦ＋ｓｐｉｒｏ ５０mg/Kg/jとＨＦを比較）。
【図７】ＭＲの心臓過剰発現のマウスモデルに関するマイクロアレイ解析で同定されたディファレンシャルな遺伝子の検証を示す図である。Ｓｅｒｐｉｎａ３の発現は、ＭＲを過剰発現しているマウス（ＤＴ−ＭＲ）の心臓で有意に増加しているが、ＧＲを過剰発現しているマウス（ＤＴ−ＧＲ）の心臓では改変されない。ｍＲＮＡレベルの値を各試料中のｕｂｃ ｍＲＮＡレベルに対して標準化した。対照におけるこれらの値を各遺伝子について１に設定し、図に変化倍率を示す。Mann-WhitneyのＵ検定を用いたときに対照に対して、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１。
【図８】Ｈ９Ｃ２／ＭＲ細胞におけるｓｅｒｐｉｎａ３の発現のＭＲ特異性を示す図である。ｓｅｒｐｉｎａ３の発現は、特異的ＭＲアンタゴニストであるＲＵ２８３１８を用いて示されるようなＭＲ依存性メカニズムを介して、２４時間の１nMアルドステロン（ａｌｄｏ）および１０nMコルチコステロン（ｃｏｒｔｉｃｏ）によって増加する。ｍＲＮＡレベルの値を各試料中のβ−アクチンｍＲＮＡレベルに対して標準化した。対照（未処理細胞）におけるこれらの値を各遺伝子について１に設定し、図に変化倍率を示す。ＡＮＯＶＡ分析を用いたとき対照（ステロイドなし）に対して、＊＊：ｐ＜０．０１。
【図９Ａ】１０nMアルドステロンで処理されたＨ９Ｃ２／ＭＲ細胞におけるＳｅｒｐｉｎａ３誘導の経時変化を示す図である。Ｓｅｒｐｉｎａ３の発現は、アルドステロンに２４時間曝露後に高度に誘導される。ｍＲＮＡレベルの値を各試料中のβ−アクチンのｍＲＮＡレベルに対して標準化した。対照（未処理細胞）におけるこれらの値を各遺伝子について１に設定し、図に変化倍率を示す。ＡＮＯＶＡ分析を用いたとき対照（ステロイドなし）に対して、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１。
【図９Ｂ】アルドステロンを用いたＳｅｒｐｉｎａ３誘導の用量反応関係を示す図である。アルドステロンによるＳｅｒｐｉｎａ３の発現誘導は用量依存性である。ｍＲＮＡレベルの値を各試料中のβ−アクチンのｍＲＮＡレベルに対して標準化した。対照（未処理細胞）におけるこれらの値を各遺伝子について１に設定し、図に変化倍率を示す。ＡＮＯＶＡ分析を用いたとき対照（ステロイドなし）に対して、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１。
【図１０】心不全を有するラットの心臓におけるＳｅｒｐｉｎａ３のＭＲ依存性誘導を示す図である。Ｓｅｒｐｉｎａ３の発現は悪液質誘導性心不全を有するラットの左心室で高度に増加している。有効用量のスピロノラクトン（５０mg/Kg/日、心不全の症状を予防できる）によって誘導は阻止される。ＡＮＯＶＡ分析を用いたとき疑似処置に対して、＊＊：ｐ＜０．０１、プラセボ（心不全、プラセボ投与）に対して、＃：ｐ＜０．０５。
【００９５】
実施例１
ＭＲおよびＧＲトランスジェニックマウス：鉱質コルチコイドレセプター（ＭＲ）トランスジェニックマウスおよび糖質コルチコイドレセプター（ＧＲ）トランスジェニックマウスは、それぞれヒトＭＲまたはＧＲのコンディショナルな発現が可能であった。ＭＲおよびＧＲトランスジェニックマウスは、適切なトランスアクチベーターマウスと交配したときにｈＭＲまたはｈＧＲをコンディショナルに誘導性発現可能となる、施設内で作出したアクセプターマウスの繁殖によって得られた。これらのコンディショナル-トランスジェニックモデルは、Ouvrard-Pascaudら（2005）およびSainte-Marieら（2007）に記載されている。心臓においてＭＲにより選択的にモデュレーションされる遺伝子を同定するために、ＭＲおよびＧＲアクセプターマウスを、G. Fishman（Columbia University, NY, USA）により提供されたＭＨＣ−ｔＴＡトランスアクチベーターマウスと交配させ（Yu et al. 1996）、それぞれｈＭＲおよびｈＧＲを心筋細胞特異的に発現可能にした。この結果として、それぞれＭＲまたはＧＲコンディショナルマウスの心臓でのＭＲが対照同腹仔に比べて４倍に過剰発現するか、または糖質コルチコイドの結合が３倍に増加した。初期胚の死滅を避けるために、ＭＲ後代を妊娠から出生までＤｏｘで処置し、生後７日までだけを発現可能にした。
【００９６】
試料、ＲＮＡ単離、ラベルおよびハイブリダイゼーション：５匹の１か月齢ＭＲトランスジェニックマウス、５匹の１か月齢ＧＲトランスジェニックマウスの全心臓からTRIZOL（登録商標）試薬（Life technologies）を用いて総ＲＮＡを単離した。ＭＲトランスジェニックマウスについての参照試料は、ＭＲトランスジェニックマウスの５匹の対照同腹仔（同齢、同系統）から抽出した全心臓の総ＲＮＡから成った。ＧＲトランスジェニックマウスについての参照試料は、ＧＲトランスジェニックマウスの５匹の対照同腹仔（同齢、同系統）から抽出した全心臓の総ＲＮＡから成った。Oligotex mRNAキット（Qiagen）を用いてｍＲＮＡを単離した。Agilent 2100バイオアナライザーを用いてＲＮＡおよびｍＲＮＡの品質を評価した。ＭＲトランスジェニックマウスからのｍＲＮＡをプールし、３回の別々の反応でそれにＣｙ５をラベルした。ＭＲトランスジェニックマウスについての参照からのｍＲＮＡをプールし、３回の別々の反応でそれにＣｙ３をラベルした。ＧＲトランスジェニックマウスからのｍＲＮＡを３個のプールになるように合わせ、２回の別々の反応でそれらにそれぞれＣｙ５をラベルした。ＧＲトランスジェニックマウスについての参照からのｍＲＮＡをプールし、６回の別々の反応でそれにＣｙ３をラベルした。CyScribe cDNA Post Labeling Kit（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて、Ｃｙ３−およびＣｙ５−ラベルｃＤＮＡを調製した。各マイクロアレイについて別々にラベル反応を行った。ＭＲトランスジェニックマウスについて３回およびＧＲトランスジェニックマウスについて６回のマイクロアレイハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション混合物をヒトCot-I DNA（Gibco-BRL）、酵母ｔＲＮＡおよびポリＡ ＲＮＡと共に予備インキュベーションし、マイクロアレイとハイブリダイゼーションさせた。
【００９７】
マイクロアレイ：マイクロアレイは、５０塩基長オリゴヌクレオチドプローブ（MWG Biotech（登録商標））を用いて施設内で調製した。エポキシシランをコーティングしたガラススライドに、Amersham製Lucidea Array Spotterを用いてプローブをスポットした。マイクロアレイに提示された５４１９個の遺伝子は、心血管および／または骨格筋の正常および病的機能への関与について選択された。選択は、１）サブトラクティブハイブリダイゼーション実験（Steenman et al. 2005）、２）全ゲノムマイクロアレイハイブリダイゼーション（Steenman et al. 2003）および３）文献データに基づいた。マイクロアレイは、マウス特異的オリゴヌクレオチドと、対応するマウス配列と少なくとも８０％相同なヒトオリゴヌクレオチドとの両方を含んだ。各遺伝子プローブを３回の繰り返しでスポットした。
【００９８】
生データの抽出および統合化（consolidation）：ハイブリダイゼーションされたアレイを蛍光共焦点顕微鏡法（Scanarray 4000XL, GSI-Lumonics）により走査した。蛍光シグナルの測定値を、各蛍光色素について１０μm/画素の分解能で別々に得た。ハイブリダイゼーションおよびバックグラウンドシグナルの強度、ならびに品質管理のパラメーターをGenePix Pro 5.0（Axon（登録商標））を用いて測定した。Lowessの標準化手順（Yang et al. 2002）を行って、技術的なバイアスを補正した。以前に記載されたように、その手順をチャンネル毎に適用した（Workman et al. 2002）。各マイクロアレイについて、全てのＣｙ３−またはＣｙ５−シグナル強度の中央値プロファイルとして定義されたプロトタイプに対してＣｙ３−およびＣｙ５−シグナル強度を個別に標準化した。
【００９９】
マイクロアレイの統計解析：マイクロアレイ有意性解析（Significance Analysis of Microarray）（ＳＡＭ）（Tusher et al. 2001）およびマイクロアレイデータに関する線形モデル（Linear Models for MicroArray data）（Ｌｉｍｍａ）（Smyth 2004）を用いて、統計的に有意な、ディファレンシャルな発現を示す遺伝子を同定した。１クラスの解析を利用して、トランスジェニックマウスと参照マウスとの間でディファレンシャルに発現する遺伝子を同定し、２クラスの解析を利用して、両方のトランスジェニックマウスモデルの間でディファレンシャルに発現する遺伝子を同定した。ＭＲトランスジェニックマウスの１クラスの解析の結果として、５２０個の遺伝子が同定され、それらは、ＳＡＭ（ＦＤＲ（誤検出率＝０．０５％）およびＬｉｍｍａ（「ＦＤＲ」−補正、ｐ＜０．０１）の両方により同定された。ＧＲトランスジェニックマウスの１クラス解析の結果として、１２３２個の遺伝子が同定され、それらは、ＳＡＭ（ＦＤＲ＝０．０３％）およびＬｉｍｍａ（「ＦＤＲ」−補正、ｐ＜０．０１）の両方により同定された。２クラスの解析の結果として、５２９個の遺伝子が同定され、それらは、ＳＡＭ（ＦＤＲ＝０．０９％）およびＬｉｍｍａ（「ＦＤＲ」−補正、ｐ＜０．０１）の両方により同定された。
【０１００】
ＭＲが活性化した様々なトランスジェニックマウスモデルまたは薬理学的マウスモデルにおけるＮＧＡＬの発現：１、２および３か月齢のＭＲトランスジェニックマウスの心臓から抽出した２μgのＤＮＡ不含総ＲＮＡを使用して調製した２５μlのＲＴ−ＰＣＲ液（Eurogentec製Sybr Green I用qPCR Coreキット使用）に関してフォワードプライマー５’−ＧＧＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＴＣＧＣＴＡＣＴ−３’（配列番号１）およびリバースプライマー５’−ＧＧＴＧＧＣＣＡＣＴＴＧＣＡＣＡＴＴＧＴ−３’（配列番号２）を使用した定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ、Light Cycler, Biorad）によりＮＧＡＬ ｍＲＮＡの定量的発現を分析し、マッチした同腹仔および２か月齢のＧＲトランスジェニックマウス（およびそれぞれの対照同腹仔）と比較した。特異的ＮＧＡＬ抗体（ＡＦ１８５７、R&D Systems）を使用して、２か月齢のＭＲマウスからの心臓タンパク質抽出物中のＮＧＡＬタンパク質の発現を分析した。マウスＮＧＡＬ特異的ＥＬＩＳＡアッセイ（A. Xu, Hong-Kongが提供）を使用してＮＧＡＬの血漿中濃度を推定した(Wang et al., 2007）。
【０１０１】
（一側性腎摘出のみの対照マウスに比べて）アルドステロン注入（６０μg/kg/j、0.25μl/h ALZETミニポンプ）および飲料水中の１％塩で３週間処置された一側性腎摘出マウスの心臓における、および上記ＭＲトランスジェニックマウスを内皮特異的トランスアクチベーターマウス（L. E. Benjamine, Harvard, USAが提供）と適切に交配（内皮のみにｈＭＲをコンディショナルに発現可能）（Sun et al., 2005）後に得られた、内皮のみにヒトＭＲをコンディショナルに過剰発現する９か月齢のマウスの胸部大動脈における、ＮＧＡＬ ｍＲＮＡの定量的発現もまた、Ｑ−ＰＣＲによって分析した。
【０１０２】
（一側性腎摘出のみの対照マウスに比べて）アルドステロン注入（６０μg/kg/j、０．２５μl/h ALZETミニポンプ）および飲料水中の１％塩で３週間処置された３か月齢の一側性腎摘出マウスならびに（対照同腹仔に比べて）内皮特異的にＭＲを過剰発現している９か月齢のマウスの血漿中でも、ＮＧＡＬの血漿中濃度を測定した。
【０１０３】
ラットＭＲを安定的に過剰発現しているラット心筋細胞の細胞モデル（Ｈ９Ｃ２細胞）におけるＮＧＡＬの発現（Fejes-toth, Endocrinology, 2007）
様々な濃度のアルドステロンまたは１０−８Ｍコルチコステロンまたは１０−６Ｍ ＭＲアンタゴニストＲＵ２８３１８またはＧＲアンタゴニストＲＵ４８６により単独でまたは組合せて処理したラットＨ９−Ｃ２／ＭＲ細胞から抽出した２μgのＤＮＡ不含総ＲＮＡを用いて調製した２５μlのＲＴ−ＰＣＲ液（Eurogentec製Sybr Green I用qPCR Coreキット使用）に関してフォワードプライマー５’−ＴＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＧＧＡＡＧＡＡＣＣ−３’（配列番号３）およびリバースプライマー５’−ＧＧＴＧＧＧＡＡＣＡＧＡＧＡＡＡＡＣＧＡ−３’（配列番号４）を用いた定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ、Light Cycler, Biorad）によりＮＧＡＬ ｍＲＮＡの定量的発現を分析した。
【０１０４】
ＩＩ型糖尿病のマウスモデル（レプチンレセプター遺伝子に自然突然変異をもつｄｂ／ｄｂマウス）におけるＮＧＡＬの発現
薬理学的ＭＲアンタゴニストであるカンレノ酸塩（カンレノ酸塩、Sigma-Alderich、飲料水中に１００mg/Kg/日、４５日間）で処置前後のｄｂ／ｄｂマウスにおけるマウスＮＧＡＬ特異的ＥＬＩＳＡアッセイ（A. Xu, Hong-Kong提供）（Wang et al., 2007）を用いてＮＧＡＬの血漿濃度を推定した。
【０１０５】
結果：
ヒトＭＲをコンディショナルに過剰発現しているマウス（ＤＴ）の心臓では、対照同腹仔（Ｃｎｔ）に比べて１、１．５または３か月齢でリポカリン２／ＮＧＡＬ ｍＲＮＡが強く発現される（×６０〜２００）（図１Ａ）。ヒトＭＲをコンディショナルに過剰発現している１．５か月齢マウス（ＤＴ）の心臓では、対照同腹仔（Ｃｎｔ）に比べてリポカリン２／ＮＧＡＬタンパク質もまた強く誘導される（図１Ｂ）。対照同腹仔におけるリポカリン２／ＮＧＡＬの発現誘導が決して×１．３を超えないことから、これは高感度である。ＧＲを過剰発現している２か月齢のマウスの心臓におけるリポカリン／ＮＧＡＬの発現を分析することによって、近縁ＧＲに対する特異性を評価した（図２）。ＮＧＡＬの発現は、ＧＲを過剰発現しているマウスよりもＭＲを過剰発現しているマウスの心臓で７５倍大きく誘導された。
【０１０６】
リポカリン２／ＮＧＡＬの発現は、ＭＲを薬理学的に３週間刺激されたマウス（ａｌｄｏ／塩モデル）の心臓と同様に内皮にターゲティングされたＭＲをコンディショナルに過剰発現する９か月齢のマウス（ＤＴ、同腹仔Ｃｎｔに比べて）の大動脈で増加している（図３Ａ〜Ｃ）。興味深いことに、リポカリン２／ＮＧＡＬの血漿中濃度もまた、これら二つのマウスモデルで増加し、これは、内皮壁からの分泌を示唆している（図３Ｂ〜Ｄ）。
【０１０７】
リポカリン２／ＮＧＡＬの発現は、１０−８Ｍアルドステロンで２４時間処理されたＨ９Ｃ２／ＭＲ細胞中で増加している（図４Ａ）。リポカリン２／ＮＧＡＬの発現のこの増加は、１０−８Ｍアルドステロンに、ＧＲアンタゴニストＲＵ４８６ではなくＭＲアンタゴニストＲＵ２８３１８を添加することによって阻止される（図４Ａ）。１０−８Ｍコルチコステロン（糖質コルチコイドホルモン）もまた、Ｈ９Ｃ２／ＭＲ細胞におけるリポカリン２／ＮＧＡＬ発現を刺激した（図４Ｂ）。この増加もまた、ＧＲアンタゴニストＲＵ４８６ではなくＭＲアンタゴニストＲＵ２８３１８によって阻止され（図４Ｂ）、これは、コルチコステロンもまた、ＭＲを介してリポカリン２／ＮＧＡＬの発現を刺激したことを示している。経時変化研究により、リポカリン２／ＮＧＡＬの発現が１０−８Ｍアルドステロンの２４時間後に誘導され、４８時間の刺激後に持続したままであったことが示された（図４Ｃ）。リポカリン２／ＮＧＡＬの発現は、アルドステロンの濃度を増加させることによって刺激され、これは、特異的ＭＲ介在性作用を示している（図４Ｄ）。
【０１０８】
リポカリン２／ＮＧＡＬの血漿中濃度は、ＩＩ型糖尿病マウスモデル（ｄｂ／ｄｂ）の血漿中でも増加する（図５Ａおよび図５Ｂ、対照に比べたｄｂ／ｄｂ）。これらのマウスにおいて、１７週間の薬理学的ＭＲ拮抗の作用もまた分析する。図５Ｂは、カンレノ酸塩で処置されたか、または処置されていない対照およびｄｂ／ｄｂマウスマウスにおけるリポカリン２／ＮＧＡＬの血漿中濃度を表す。ｄｂ／ｄｂマウスにおけるリポカリン２／ＮＧＡＬの血漿中濃度の増加は、ｄｂ／ｄｂマウスをＭＲアンタゴニストであるカンレノ酸塩で１７週間インビボ処置することによって阻止される（図５Ｂ、ｄｂ／ｄｂ＋カンレノ酸塩）。カンレノ酸塩は、対照マウスにおけるリポカリン２／ＮＧＡＬの血漿中濃度に作用を有さない（対照＋カンレノ酸塩）。このことから、ＩＩ型糖尿病におけるＭＲアンタゴニストの有効性を追跡するためにリポカリン２／ＮＧＡＬの血漿中濃度を使用することができることが実証される。
【０１０９】
悪液質に関連する心不全ラットモデル（ＨＦ）においてリアルタイムＰＣＲにより推定されるような心臓リポカリン２／ＮＧＡＬ ｍＲＮＡの発現は、最大２倍誘導される（疑似処置に比べたＭＩ）（図６Ａ）。心不全の症状の発生を予防するために有効な濃度までスピロノラクトンを投与すると（ＨＦ＋ｓｐｉｒｏ ５０ｍg/Kg/jをＨＦと比較）、リポカリン２／ＮＧＡＬ ｍＲＮＡの誘導は完全に阻止される（図６Ａ）。リポカリン２／ＮＧＡＬの血漿中濃度は、また、心不全ラットの血漿中で増加する（図６Ｂ）。その増加は、動物をｓｐｉｒｏ ５０mg/Kg/jで処置した場合に阻止される（ＨＦ＋ｓｐｉｒｏ ５０mg/Kg/jをＨＦと比較）。
【０１１０】
したがって、ＭＲ活性化は、ＮＧＡＬ遺伝子の発現レベルを決定することによって特異的かつ効率的に評価することができる。ＭＲアンタゴニストまたはアルドステロンシンターゼ阻害剤を用いた処置に対する患者の反応性は、該患者から得られた生物学的試料中のＮＧＡＬ遺伝子の発現レベルを決定することにより予測することができる。
【０１１１】
実施例２
健康被験者集団におけるＬｃｎ２／ＮＧＡＬの血漿中濃度を測定した。
【０１１２】
過去７日間に急性病状を示さず、心血管処置を全く受けなかったという条件で、年齢１８〜８５歳の男女を研究に含めた。健康対照についてのさらなる排除基準は：既知の高血圧（１４０／９０mmHgよりも高い、または６５歳を超える場合は１６０mmHgよりも高い）；既知の腎不全、既知の糖尿病、妊娠、過去５年以内に診断されたガンまたは進行性腫瘍（evolutive neoplasia）、慢性肝臓病変、結合組織炎（connectivitis）、クローン病、進行性結核（evolutive tuberculosis）、労作性狭心症、急性冠動脈症候群（acute coronarien syndrome）、冠動脈症（coronopathy）の病歴、頚動脈内膜摘除および既知の腹部大動脈瘤であった。
【０１１３】
健康被験者のＬｃｎ２／ＮＧＡＬの血漿中濃度は、一般に４０〜８０μg/mlの範囲に含まれた。
【０１１４】
心血管疾患、糖尿病、肥満または代謝症候群の患者のＬｃｎ２／ＮＧＡＬの血漿中濃度も測定する。それは、健康被験者の血漿中濃度よりも高い。
【０１１５】
実施例３
心筋細胞におけるＭＲまたはＧＲの慢性過剰発現は、短期コルチコステロイド処理により誘導されるものとは異なる、細胞の順応を表す、変化したシグナル伝達経路を導くおそれがある。心臓におけるインビボ慢性ＭＲ活性化の分子的影響を分析するために、本発明者らは、Cardiochips（登録商標）、すなわち心血管および／または骨格筋の正常および病的機能への関与について選択された５４１９個の遺伝子を含むマイクロアレイを用いて、ＭＲ−心臓マウスの心臓遺伝子発現を検討した。６週間にわたる心筋細胞のＭＲ過剰発現は、約２４個のアップレギュレーションされる遺伝子および２３個のダウンレギュレーションされる遺伝子という結果となった。興味深いことに、それらの大部分は、ＧＲ−心臓マウスで平行して決定されたＧＲにより調節される遺伝子（約７４個のＧＲによりアップレギュレーションされる遺伝子および７０個のＧＲでダウンレギュレーションされる遺伝子）とは異なった。さらに、ＭＲによりレギュレーションされる遺伝子の大部分は、ＧＲ−心臓マウスモデルでは変化しなかったことから、各ステロイドレセプターが、心筋細胞において別個の遺伝子発現パターンをコントロールしていることが示される。
【０１１６】
ＭＲおよびＧＲトランスジェニックマウス：鉱質コルチコイドレセプター（ＭＲ）トランスジェニックマウスおよび糖質コルチコイドレセプター（ＧＲ）トランスジェニックマウスは、それぞれヒトＭＲまたはＧＲのコンディショナルな発現が可能であった。ＭＲおよびＧＲトランスジェニックマウスは、適切なトランスアクチベーターマウスと交配したときにｈＭＲまたはｈＧＲをコンディショナルに誘導性発現可能となる、施設内で作出したアクセプターマウスの繁殖によって得られた。これらのコンディショナル-トランスジェニックモデルは、Ouvrard-Pascaudら（2005）およびSainte-Marieら（2007）に記載されている。心臓においてＭＲにより選択的にモデュレーションされる遺伝子を同定するために、ＭＲおよびＧＲアクセプターマウスを、G. Fishman（Columbia University, NY, USA）により提供されたＭＨＣ−ｔＴＡトランスアクチベーターマウスと交配させ（Yu et al. 1996）、それぞれｈＭＲおよびｈＧＲを心筋細胞特異的に発現可能にした。この結果として、それぞれＭＲまたはＧＲコンディショナルマウスの心臓でのＭＲが対照同腹仔に比べて４倍に過剰発現するか、または糖質コルチコイドの結合が３倍に増加した。初期胚の死滅を避けるために、ＭＲ後代を妊娠から出生までＤｏｘで処置し、生後７日までだけ発現可能にした。
【０１１７】
試料、ＲＮＡ単離、ラベルおよびハイブリダイゼーション：５匹の１か月齢ＭＲトランスジェニックマウス、５匹の１か月齢ＧＲトランスジェニックマウスの全心臓からTRIZOL（登録商標）試薬（Life technologies）を用いて総ＲＮＡを単離した。ＭＲトランスジェニックマウスについての参照試料は、ＭＲトランスジェニックマウスの５匹の対照同腹仔（同齢、同系統）から抽出した全心臓の総ＲＮＡから成った。ＧＲトランスジェニックマウスについての参照試料は、ＧＲトランスジェニックマウスの５匹の対照同腹仔（同齢、同系統）から抽出した全心臓の総ＲＮＡから成った。Oligotex mRNAキット（Qiagen）を用いてｍＲＮＡを単離した。Agilent 2100バイオアナライザーを用いてＲＮＡおよびｍＲＮＡの品質を評価した。ＭＲトランスジェニックマウスからのｍＲＮＡをプールし、３回の別々の反応でそれにＣｙ５をラベルした。ＭＲトランスジェニックマウスについての参照からのｍＲＮＡをプールし、３回の別々の反応でそれにＣｙ３をラベルした。ＧＲトランスジェニックマウスからのｍＲＮＡを３個のプールになるように合わせ、２回の別々の反応でそれらにそれぞれＣｙ５をラベルした。ＧＲトランスジェニックマウスについての参照からのｍＲＮＡをプールし、６回の別々の反応でそれにＣｙ３をラベルした。CyScribe cDNA Post Labeling Kit（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて、Ｃｙ３−およびＣｙ５−ラベルｃＤＮＡを調製した。各マイクロアレイについて別々にラベル反応を行った。ＭＲトランスジェニックマウスについて３回およびＧＲトランスジェニックマウスについて６回のマイクロアレイハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション混合物をヒトＣｏｔ−Ｉ ＤＮＡ（Gibco-BRL）、酵母ｔＲＮＡおよびポリＡ ＲＮＡと共に予備インキュベーションし、マイクロアレイにハイブリダイゼーションさせた。
【０１１８】
マイクロアレイ：マイクロアレイは、５０塩基長オリゴヌクレオチドプローブ（MWG Biotech（登録商標））を用いて施設内で調製した。エポキシシランをコーティングしたガラススライドに、Amersham製Lucidea Array Spotterを用いてプローブをスポットした。マイクロアレイ上に提示された５４１９個の遺伝子は、心血管および／または骨格筋の正常および病的機能への関与について選択した。選択は、１）サブトラクティブハイブリダイゼーション実験（Steenman et al. 2005）、２）全ゲノムマイクロアレイハイブリダイゼーション（Steenman et al. 2003）および３）文献データに基づいた。マイクロアレイは、マウス特異的オリゴヌクレオチドと、対応するマウス配列と少なくとも８０％相同なヒトオリゴヌクレオチドの両方を含んでいた。各遺伝子プローブを３回の繰り返しでスポットした。
【０１１９】
生データの抽出および統合化：ハイブリダイゼーションされたアレイを蛍光共焦点顕微鏡法（Scanarray 4000XL, GSI-Lumonics）により走査した。蛍光シグナルの測定値を、各蛍光色素について１０μm/画素の分解能で別々に得た。ハイブリダイゼーションおよびバックグラウンドシグナルの強度、ならびに品質管理のパラメーターをGenePix Pro 5.0（Axon（登録商標））を用いて測定した。Lowessの標準化手順（Yang et al. 2002）を行って、技術的なバイアスを補正した。以前に記載したように、その手順をチャンネル毎に適用した（Workman et al. 2002）。各マイクロアレイについて、全てのＣｙ３−またはＣｙ５−シグナル強度の中央値プロファイルとして定義されたプロトタイプに対してＣｙ３−およびＣｙ５−シグナル強度を個別に標準化した。
【０１２０】
マイクロアレイの統計解析：マイクロアレイ有意性解析（ＳＡＭ）（Tusher et al. 2001）およびマイクロアレイデータに関する線形モデル（Ｌｉｍｍａ）（Smyth 2004）を用いて、統計的に有意な、ディファレンシャルな発現を示す遺伝子を同定した。１クラスの解析を利用して、トランスジェニックマウスと参照マウスとの間でディファレンシャルに発現する遺伝子を同定し、２クラスの解析を利用して、両方のトランスジェニックマウスモデルの間でディファレンシャルに発現する遺伝子を同定した。ＭＲトランスジェニックマウスの１クラスの解析の結果として、５２０個の遺伝子が同定され、それらは、ＳＡＭ（ＦＤＲ（誤検出率＝０．０５％）およびＬｉｍｍａ（「ＦＤＲ」−補正、ｐ＜０．０１）の両方により同定された。ＧＲトランスジェニックマウスの１クラスの解析の結果として、１２３２個の遺伝子が同定され、それらは、ＳＡＭ（ＦＤＲ＝０．０３％）およびＬｉｍｍａ（「ＦＤＲ」−補正、ｐ＜０．０１）の両方により同定された。２クラスの解析の結果として、５２９個の遺伝子が同定され、それらをＳＡＭ（ＦＤＲ＝０．０９％）およびＬｉｍｍａ（「ＦＤＲ」−補正、ｐ＜０．０１）の両方により同定された。
【０１２１】
ＭＲまたはＧＲが活性化したトランスジェニックマウスモデルにおけるｓｅｒｐｉｎａ３の発現：１、２および３か月齢のＭＲトランスジェニックマウスの心臓から抽出した２μgのＤＮＡ不含総ＲＮＡを使用して調製した２５μlのＲＴ−ＰＣＲ液（Eurogentec製Sybr Green I用qPCR Coreキット使用）に関してフォワードプライマー５’−ＣＡＴＣＣＣＴＧＴＧＧＧＡＡＧＴＣＡＧＴ−３’（配列番号５）およびリバースプライマー５’−ＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＧＡＴＡ−３’（配列番号６）を用いた定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ、Light Cycler, Biorad）によってｓｅｒｐｉｎａ３ ｍＲＮＡの定量的発現を分析し、マッチした同腹仔と同様に２か月齢のＧＲトランスジェニックマウス（およびそれぞれの対照同腹仔）と比較した。
【０１２２】
ラットＭＲを安定的に過剰発現しているラット心筋細胞の細胞モデル（Ｈ９Ｃ２細胞）におけるＳｅｒｐｉｎａ３の発現（Fejes-toth, Endocrinology, 2007）
様々な濃度のアルドステロンまたは１０−８Ｍコルチコステロンまたは１０−６Ｍ ＭＲアンタゴニストＲＵ２８３１８で、単独でまたは組合せて処理したラットＨ９−Ｃ２／ＭＲ細胞から抽出した２μｇのＤＮＡ不含総ＲＮＡを使用して調製した２５μｌのＲＴ−ＰＣＲ液（Eurogentec製Sybr Green I用qPCR Coreキット使用）に関してフォワードプライマー５’−ＡＧＡＣＡＡＧＧＧＧＡＣＡＣＡＡＣＴＧＧ−３’（配列番号７）およびリバースプライマー５’−ＴＧＡＧＡＴＧＣＴＡＡＧＴＧＧＧＧＡＧＡＡ−３’（配列番号８）を使用した定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ、Light Cycler, Biorad）によってＳｅｒｐｉｎａ３ ｍＲＮＡの定量的発現を分析した。
【０１２３】
悪液質により誘導される心不全のラットモデルにおけるＳｅｒｐｉｎａ３の発現。
スピロノラクトンとの薬理学的ＭＲ拮抗の作用
左室から抽出した２μgのＤＮＡ不含総ＲＮＡを使用して調製した２５μlのＲＴ−ＰＣＲ（Eurogentec製Sybr Green I用qPCR Coreキット使用）に関してフォワードプライマー５’−ＡＧＡＣＡＡＧＧＧＧＡＣＡＣＡＡＣＴＧＧ−３’（配列番号７）およびリバースプライマー５’−ＴＧＡＧＡＴＧＣＴＡＡＧＴＧＧＧＧＡＧＡＡ−３’（配列番号８）を使用した定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ、Light Cycler, Biorad）によってＳｅｒｐｉｎａ３ ｍＲＮＡの定量的発現を分析した。
【０１２４】
結果：
セリンプロテアーゼ阻害剤ＳＥＲＰＩＮＡ３（またはα１−アンチキモトリプシン）のｍＲＮＡ発現は、ＭＲ−心臓マウスの心臓で２５倍にアップレギュレーションされたが、リアルタイムＰＣＲにより決定されたように、ＧＲ−心臓マウスでは有意差が見られなかった。（図７）
【０１２５】
ＭＲの慢性作用と初期に起こる作用の間の可能な結びつきを検討するために、ＭＲ−心臓マウスで同定された、ＭＲによりインビボで調節される遺伝子のいくつかをＨ９Ｃ２／ＭＲ＋細胞系で検査した。２４時間の低用量アルドステロン（１nM）の存在下で、ＳＥＲＰＩＮＡ３ ｍＲＮＡは約８倍だけ誘導された（図８）。ＭＲアンタゴニストＲＵ２８３１８の存在下で誘導は抑制され、これは、それがＭＲとの特異的相互作用を伴うことを実証している。注目すべきことに、１０nMコルチコステロンは、アルドステロンに類似の効果を有し、それはＭＲアンタゴニストで阻止された（図８）。経時実験（図９Ａ）から、ｓｅｒｐｉｎａ３がアルドステロン１０nMにより１０時間後に誘導され、２４時間後強く（×１５）誘導されることが示された。１nMのアルドステロンから濃度依存的な誘導が観察される（図９Ｂ）。
【０１２６】
悪液質に関連する心不全のラットモデル（ＨＦ）において、リアルタイムＰＣＲによって推定されたように心臓Ｓｅｒｐｉｎａ３ ｍＲＮＡの発現は、最大６倍に誘導される（疑似処置に比べたＨＦ）（図１０）。心不全の症状の発生を予防するために有効な濃度までスピロノラクトンを投与する場合（ＨＦ＋ｓｐｉｒｏ ５０mg/Kg/jをＨＦと比較）、Ｓｅｒｐｉｎａ３ ｍＲＮＡの誘導は完全に阻止される（図１０）。
【０１２７】
ＭＲを過剰発現しているマウスで見られるように、これらのデータは、ＳＥＲＰＩＮＡ３が心筋細胞におけるアルドステロンに対する初期反応と同様に、強化したＭＲシグナル伝達への慢性順応に関与することを示している。ｓｅｒｐｉｎａ３は分泌型酵素であることから、ＭＲ活性化に結びついた心損傷のマーカーとして使用することができる。
【０１２８】
参考文献：
本出願全体で、本発明が属する技術の現状を様々な参考文献が説明している。これらの参考文献の開示は、この参照により本開示に組み入れられる。
【０１２９】
【表１】
2012506245.tif 000002
2012506245.tif 000003
2012506245.tif 000004
2012506245.tif 000005
2012506245.tif 000006
【図１Ａ】
2012506245.tif 000007
【図１Ｂ】
2012506245.tif 000008
【図２】
2012506245.tif 000009
【図３】
2012506245.tif 000010
【図４Ａ】
2012506245.tif 000011
【図４Ｂ】
2012506245.tif 000012
【図４Ｃ】
2012506245.tif 000013
【図４Ｄ】
2012506245.tif 000014
【図５Ａ】
2012506245.tif 000015
【図５Ｂ】
2012506245.tif 000016
【図６】
2012506245.tif 000017
【図７】
2012506245.tif 000018
【図８】
2012506245.tif 000019
【図９Ａ】
2012506245.tif 000020
【図９Ｂ】
2012506245.tif 000021
【図１０】
2012506245.tif 000022
【配列表】
2012506245000001.app
【国際調査報告】
2012506245.tif 000023
2012506245.tif 000024
2012506245.tif 000025
2012506245.tif 000026
2012506245.tif 000027
2012506245.tif 000028
2012506245.tif 000029
2012506245.tif 000030