(57)【要約】本発明は、以下の工程を含む、サンプル中の1以上の標的リボ核酸の定量方法に関する：(i)  前記の1以上の標的リボ核酸を含むサンプルを提供する工程；(ii)  前記のサンプルを、リボ核酸特異的蛍光染料に、前記のサンプル中の1以上のリボ核酸への前記の染料の結合を可能にする条件下で接触させる工程；(iii)  前記のサンプル中の、前記のRNAに結合した染料の蛍光を測定する工程；(iv)  前記の測定した蛍光をサンプル中のRNAの総量に対して相関させる工程；(v)  前記の1以上のリボ核酸を逆転写し、それによって二重鎖核酸を作り出す工程；(vi)  前記の1以上の作り出された二重鎖核酸を増幅させる工程であって、前記の1以上の増幅産物に特異的な1以上の蛍光プローブが、サンプル中の前記の1以上の作り出された二重鎖のデオキシリボ核酸への前記の1以上の蛍光プローブの結合を可能にする条件下での増幅の間および／または増幅後に存在する；(vii)  増幅反応の間および／または増幅反応後に、前記の1以上の増幅産物に結合した前記の1以上のプローブの蛍光を測定し、前記の測定された蛍光を、サンプル中の標的RNA配列の量に対して相関させる工程；(viii)  サンプル中の標的RNA配列の量をサンプル中のRNAの総量に対して正規化する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、サンプル中の1以上の標的リボ核酸の定量方法：
(i)  前記の1以上の標的リボ核酸を含むサンプルを提供する工程；
(ii)  前記のサンプルを、リボ核酸特異的蛍光染料に、前記のサンプル中の1以上のリボ核酸への前記の染料の結合を可能にする条件下で接触させる工程；
(iii)  前記のサンプル中の、前記のRNAに結合した染料の蛍光を測定する工程；
(iv)  前記の測定した蛍光をサンプル中のRNAの総量に対して相関させる工程；
(v)  前記の1以上のリボ核酸を逆転写し、それによって二重鎖核酸を作り出す工程；
(vi)  前記の1以上の作り出された二重鎖核酸を増幅させる工程であって、前記の1以上の増幅産物に特異的な1以上の蛍光プローブが、サンプル中の前記の1以上の作り出された二重鎖のデオキシリボ核酸への前記の1以上の蛍光プローブの結合を可能にする条件下での増幅の間および／または増幅後に存在する；
(vii)  増幅反応の間および／または増幅反応後に、前記の1以上の増幅産物に結合した前記の1以上のプローブの蛍光を測定し、前記の測定された蛍光を、サンプル中の標的RNA配列の量に対して相関させる工程；
(viii)  サンプル中の標的RNA配列の量をサンプル中のRNAの総量に対して正規化する工程。
【請求項２】
１つの反応槽で反応が起こる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプルが総RNA調製品である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
RNA特異的蛍光染料がQuant-iTTM-RNA試薬である先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
DNAに特異的な蛍光プローブが、二重鎖DNAに特異的な蛍光染料である先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
蛍光染料が、SYBRグリーンI、SYTO-9、SYTO-13、SYTO-16、SYTO-64、SYTO-82、YO-PRO-1、SYTO-60、SYTO-62、SYTOXオレンジ、SYBRグリーンI、TO-PRO-3、TOTO-3、POPO-3、およびBOBO-3を含む群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
DNAに特異的な蛍光プローブが蛍光染料で標識されたオリゴヌクレオチドプローブであって、オリゴヌクレオチドプローブが標的RNA配列から作り出されたDNA上の配列に、実質的に相補的である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
サンプル中で2以上の標的リボ核酸が定量され、様々な蛍光染料で標識されるオリゴヌクレオチドプローブが定量される個々の標的RNAに用いられる請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ポリメラーゼ連鎖反応が定量的リアルタイムPCRである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
サンプル中の標的RNAを定量するためのキットであって、
(i)RNAに特異的に結合する蛍光染料、
(ii)１つ以上のDNA増幅産物に特異的な1つ以上の蛍光プローブ。
【請求項１２】
サンプル中のRNAの総量に対するサンプル中の標的RNA配列の量の正規化におけるRNA特異的蛍光染料の使用。
【請求項１３】
サンプル中のRNAの総量に対するサンプル中の標的RNA配列の量の正規化のための請求項１０に記載のキットの使用。
【請求項１４】
遺伝子発現解析のための請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法または請求項１０に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学および化学分野におけるものである。特に、本発明は、分子生物学の分野におけるものである。より具体的には、本発明は、核酸の定量およびリアルタイムPCRの分野におけるものである。さらに、本発明は、標的リボ核酸の正規化定量に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸混合物中の特異的標的リボ核酸（本書では、特異的RNAともいう）の定量（計量）は、遺伝子発現解析等の分子生物学や、核酸混合物からの特異的RNAの精製の間における、多くの応用において重要である。定量法では、サンプル中の特異的RNAの濃度および／または相対または絶対量を定量する。特に、遺伝子発現の分析、例えば生物学的サンプル中のmRNAレベルを測定するためには、再現可能な比較方法が望まれる。例えば、相当容量、核酸の量、細胞物質等を有する生物学的サンプルを得ることは、常に可能とは限らない。
【０００３】
加えて、生物学的サンプル中の核酸の検出および定量の感度および選択性は重要である。2以上の異なる（生物学的）サンプル中の特異的RNA量のより優れた比較、またはサンプル中の2以上の異なる特異的RNAの量の比較のためには、投入した核酸または特定の分類の投入した核酸に対する特異的RNAの量の正規化を行わなければならない。特異的RNAの量は、例えば、これらの量を、サンプルの内部標準、または、核酸の全体量、即ち総量、または、サンプル中の特定の分類の核酸の量と関連付けることによって、正規化し得る。
【０００４】
従来の（生物学的）サンプル中の核酸の定量法では、定量的（リアルタイム）PCR（qPCR）が広く使用されている。この分野において、RNA、特にmRNAについては、定量的リアルタイム逆転写PCR（RT-qPCR）が使用されている。定量的PCR法で得られたデータの正規化のため、種々のアプローチが適用されてきた。それらの中で、例えば、β-アクチン、グリセルアルデヒド-3-リン酸ジヒドロゲナーゼ（GAPDH）、ハイポキサンタン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）、または28Sまたは18SリボソームRNA等のハウスキーピング遺伝子またはメインテナンス遺伝子などの種々の参照遺伝子の1以上のmRNAの量に対する特異的mRNAの量の正規化がある。しかし、このようなノーマライザー遺伝子の発現レベルは、実験条件、製造方法およびサンプルの起源（例えば組織または細胞型）によって変わることが示されていることから、それらは投入した核酸について正確な指標とならない。従って、通常は、試験中、サンプル間で変わらないものを同定するために、面倒でエラーを起こし易い手順で、さまざまな異なるハウスキーピング遺伝子を試験することが要求される。
【０００５】
他のアプローチは、例えば、DNAおよび／またはRNAの総含量または例えばリボソームRNA（rRNA）の総含量に対する正規化に依存する。生体細胞およびサンプル中のリボソームRNAの含量もまた、種々のファクターによって変わる場合があるので、rRNAの正規化もあまり好ましくない。例えば総核酸含量、総RNA含量またはゲノムDNAの総含有量に対する正規化に依存する最先端の方法もまた、例えば核酸サンプルのこれらの含量または品質の変化によって制限される。例えばインビトロ転写産物等の、サンプル（例えば細胞抽出物または組織由来のサンプル）中に取り込まれている外来分子または人工分子に対する正規化もまた、それら分子が細胞中の核酸（例えばゲノムDNA、RNA、mRNA）の量を表さないので、全ての場合において適当な手順というわけではない。
【０００６】
さらに、正規化されたデータの比較および実験手順の再現性のため、適用した実験条件の綿密な文書化が求められる。このことは、着目した核酸およびノーマライザー核酸の量が、別々にまたは種々の方法を用いて定量される場合、特に関連がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の根底にある技術的問題は、標的リボ核酸の量を正規化するための、改良された方法、特により簡便でエラーを起こしにくい方法を開発および提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の工程を含む、サンプル中の1以上の標的リボ核酸の定量方法に関する：
(i)  前記の1以上の標的リボ核酸を含むサンプルを提供する工程；
(ii)  前記のサンプルを、リボ核酸特異的蛍光染料に、前記のサンプル中の1以上のリボ核酸への前記の染料の結合を可能にする条件下で接触させる工程；
(iii)  前記のサンプル中の、前記のRNAに結合した染料の蛍光を測定する工程；
(iv)  前記の測定した蛍光をサンプル中のRNAの総量に対して相関させる工程；
(v)  前記の1以上のリボ核酸を逆転写し、それによって二重鎖核酸を作り出す工程；
(vi)  前記の1以上の作り出された二重鎖核酸を増幅させる工程であって、前記の1以上の増幅産物に特異的な1以上の蛍光プローブが、サンプル中の前記の1以上の作り出された二重鎖核酸への前記の1以上の蛍光プローブの結合を可能にする条件下での増幅の間および／または増幅後に存在する；
(vii)  増幅反応の間および／または増幅反応後に、前記の1以上の増幅産物に結合した前記の1以上のプローブの蛍光を測定し、前記の測定された蛍光を、サンプル中の標的RNA配列の量に対して相関させる工程；
(viii)  サンプル中の標的RNA配列の量をサンプル中のRNAの総量に対して正規化する工程。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】SYBRグリーンによる検出を用いるワンステップRT-PCR反応中に存在するRNAの定量を可能にするため、以下の2つの要件を満たす、あらゆる蛍光染料を使用し得る：(i) スペクトル特性は、着目した遺伝子(Gene of Interest)（GoI）の検出に使用されるスペクトル特性を妨げない。GoIは、蛍光染料SYBRグリーンを使用して、大部分は検出される。SYBRグリーンは、二重らせんDNAに結合し、得られるDNA-染料複合体は、励起極大が488 nmであり、発光極大が522 nmであり、(ii) ワンステップRT-PCRに使用される反応混合物は、RNAの測定を妨げ得る種々の物質を含有する：ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質、塩。従って、選択された蛍光染料は、定量を邪魔するような等級の物質によって影響されてはならず、RNAに高感度である必要がある。このような蛍光染料の例は、インビトロジェン(Invitrogen)より販売されているQuant-IT RNAである。これは、RNAに結合している場合、最大励起/発光が644/673 nmであるため、SYBRグリーン測定を妨げない。これはRNA特異性が高く、ワンステップRT-PCR反応において通常存在する物質によって阻害されない。
【図２】図は、RT-PCR反応中に混合されるRNA量の増加に伴って、蛍光が増加することを示す。Quant-IT RNA濃度の増加により、絶対蛍光が増加するが、ノイズ比率に対するシグナルも増加する。
【図３】図３では、同様のPCR実施においてSYBRグリーン蛍光値から得られるcT値を、RNA量に対してプロットする。
【図４】再度、RNA量の増加に伴って、Quant-IT RNA蛍光の増加が見られた。SYBRグリーンcTは、Quant-It RNA染料の存在下、RNA量の増加に伴って、減少した。このことから、特異的蛍光染料を使用するPCR反応中に混合したRNAの量を定量し、同一の機器（PCR Cycler）を使用して、同一の反応においてSYBRグリーンによる増幅および特異的RNA標的の検出を行うことが可能であることが示される。
【図５】再度、RNA量の増加に伴って、Quant-IT RNA蛍光の増加が見られた。SYBRグリーンcTは、Quant-It RNA染料の存在下、RNA量の増加に伴って、減少した。このことから、特異的蛍光染料を使用するPCR反応中に混合したRNAの量を定量し、同一の機器（PCR Cycler）を使用して、同一の反応においてSYBRグリーンによる増幅および特異的RNA標的の検出を行うことが可能であることが示される。
【図６】このより狭い希釈系列においても、PCR反応あたりのRNAの量を定量することが可能であった。同一の多重反応で得られるSYBRグリーンcT値は、RNA濃度の増加に伴って、対応するcTが減少することを示した。この実験においてｘ軸は均等目盛りであるため、cT曲線は対数様の特徴を示す。
【図７】このより狭い希釈系列においても、PCR反応あたりのRNAの量を定量することが可能であった。同一の多重反応で得られるSYBRグリーンcT値は、RNA濃度の増加に伴って、対応するcTが減少することを示した。この実験においてｘ軸は均等目盛りであるため、cT曲線は対数様の特徴を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
サンプルは、少なくとも、定量されるリボ核酸を含む核酸分子を含有する。核酸は、細胞または器官中に組み込まれ得るが、無細胞系にも存在し得る。サンプルは、液体、溶解物、固体マトリックスまたは核酸分子を含有する他のあらゆるものであってもよい。本発明の文意におけるサンプルは、全ての生物組織および、リンパ液、尿、脳脊髄液等の全ての液体であり得る。組織は、例えば、上皮組織、骨または血液等の結合組織、内臓または平滑筋および骨格筋等の筋肉組織および、神経組織であってもよい。1つの態様において、サンプルは細胞培養物または細胞培養物からの抽出物である。
【００１１】
本書では、標的リボ核酸は、例えばウイルス、細菌、古細菌、真菌、リボソーム、真核生物または原核生物などのあらゆる起源のものであってもよい。また、あらゆる生物サンプルおよびあらゆる器官、組織、細胞または副細胞内コンパートメント由来のRNAであってもよい。また、例えば、植物、真菌、動物由来の核酸、および特にヒト核酸であってもよい。RNAは、定量の前に、例えば単離、精製または修飾によって前処理してもよい。また人工RNAを定量してもよい。RNAの長さは変化してもよい。RNAは修飾されてもよく、例えば、1以上の修飾された核酸塩基または修飾された糖部分（例えばメトキシ基を含む）を含んでもよい。RNAの骨格は、ペプチド核酸（PNA）などの場合、1以上のペプチド結合を含んでもよい。RNAは、非プリンまたは非ピリミジンアナログ等の塩基アナログまたはヌクレオチドアナログを含んでもよい。また、タンパク質、ペプチドおよび／またはアミノ酸等のさらなる結合部を含んでもよい。
【００１２】
本書では、「プライマー」は、転写される核酸（「テンプレート」）に実質的に相補的である配列を含むオリゴヌクレオチドを言う。複製の間、ポリメラーゼは、テンプレートの各ヌクレオチドに実質的に相補的なプライマーの3'末端でヌクレオチドに結合する。
【００１３】
本書では「RNA特異的染料」は、以下の通り定義される：
「RNA特異的染料」のスペクトルの特性は、標的RNAの検出に使用されるスペクトル特性と相互作用してはならず、従って同時の検出が可能になる。標的RNAの検出に使用される反応混合物は、RNAの測定に相互作用し得る種々の物質、例えば、DNA、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質、洗浄剤、塩等の物質を含有する。従って、RNA特異的染料の選択は、このような物質によって、RNAの定量を阻害する程度まで影響されてはならない。上記の物質の存在下、RNA濃度と蛍光との間に相関関係があることが必要である。
【００１４】
「RNA特異的染料」は、RNAに特異的に結合し、DNAまたはサンプル中に典型的に存在する他の成分等の、他の核酸に実質的に結合しない染料であってもよい。結合の際、RNA特異的染料は、例えば蛍光の増加等、そのスペクトル特性が変化してもよい。
あるいは、「RNA特異的染料」は、サンプル中の核酸に非特異的に結合するが、蛍光等のスペクトル特性の有意な変化がRNAへの結合の際のみに観察される、染料であってもよい。従って、「RNA特異的染料」は、他の核酸またはタンパク質、洗浄剤、塩またはサンプル中に典型的に存在する他の成分によって有意に妨げられることのない、RNAの選択的検出を可能にする。
【００１５】
本書では「DNA特異的染料」は、以下の通り規定される：
「DNA特異的染料」のスペクトルの特性は、全RNAの検出に使用される染料のスペクトルの特性を妨げてはならず、従って同時の検出が可能になる。「DNA特異的染料」は、二重らせんDNAに選択的な染料を選択するか、増幅産物の配列に選択的なプローブを選択することによって、増幅産物に特異的であることが必要である。
【００１６】
本書では「蛍光プローブ」は、DNA特異的染料であるか、または、蛍光染料で標識された核酸プローブである。本発明による核酸プローブは、オリゴヌクレオチド、核酸またはその断片であり、特定の核酸配列に実質的に相補的である。
【００１７】
RNA特異的染料は、DNA特異的染料またはRNAとDNAの両者が検出されるような蛍光染料とは、スペクトルの特性が異なる。
【００１８】
また、本発明は、(i)RNAに特異的に結合する蛍光染料および(ii)1以上のDNA増幅産物に特異的な1以上の蛍光プローブを含む、サンプル中の標的RNAの定量キットに関する。
【００１９】
本書で使用される場合、キットはパッケージ化された組み合わせであって、任意に、組み合わせの使用指示書および／またはそのような使用のための他の反応および成分を含む。
【００２０】
また、本発明は、サンプル中のRNAの総量に対するサンプル中の標的RNA配列の量の正規化における、Quant-iTTM-RNA等のRNA特異的蛍光染料の使用に関する。
【００２１】
本発明者らは、ある染料がRNAの正規化を可能にすることを発見した。本発明は、以下の工程を含む、サンプル中の1以上の標的リボ核酸の定量方法に関する：
(i)  前記の1以上の標的リボ核酸を含むサンプルを提供する工程；
(ii)  前記のサンプルを、リボ核酸特異的蛍光染料に、前記のサンプル中の1以上のリボ核酸への前記の染料の結合を可能にする条件下で接触させる工程；
(iii)  前記のサンプル中の、前記のRNAに結合した染料の蛍光を測定する工程
(iv)  前記の測定した蛍光をサンプル中のRNAの総量に対して相関させる工程；
(v)  前記の1以上のリボ核酸を逆転写し、それによって二重鎖核酸を作り出す工程；
(vi)  前記の1以上の作り出された二重鎖核酸を増幅させる工程であって、前記の1以上の増幅産物に特異的な1以上の蛍光プローブが、サンプル中の前記の1以上の作り出された二重鎖核酸への前記の1以上の蛍光プローブの結合を可能にする条件下での増幅の間および／または増幅後に存在する；
(vii)  増幅反応の間および／または増幅反応後に、前記の1以上の増幅産物に結合した前記の1以上のプローブの蛍光を測定し、前記の測定された蛍光を、サンプル中の標的RNA配列の量に対して相関させる工程；
(viii)  サンプル中の標的RNA配列の量をサンプル中のRNAの総量に対して正規化する工程。
【００２２】
この方法の1つの態様において、サンプルは総RNA調製品である。別の特別な態様において、定量される標的RNAは、mRNA、rRNA、tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、microRNA、dsRNA、リボザイム、リボスイッチおよびウイルスRNAよりなる群から選択されるRNAであり、RNAの総量は、RNAの総量、mRNAの総量、rRNAの総量、tRNAの総量、nRNAの総量、siRNAの総量、snRNAの総量、snoRNAの総量、scaRNAの総量、microRNAの総量、dsRNAの総量、リボザイムの総量、リボスイッチの総量、ウイルスRNAの総量よりなる群から選択される。
【００２３】
好ましくは、定量される標的RNAはmRNAである。
【００２４】
好ましい態様において、RNA特異的蛍光染料は、以下の化合物よりなる群から選択される：
【００２５】
【化１】
2012506246.tif 000002
【００２６】
【化２】
2012506246.tif 000003
【００２７】
【化３】
2012506246.tif 000004
【００２８】
【化４】
2012506246.tif 000005
【００２９】
【化５】
2012506246.tif 000006
【００３０】
上述の化合物は、米国特許US 2008/0199875 A1号の14〜16頁に公開されている。（化合物6、11、19、20および23を参照のこと）。
【００３１】
特に好ましい態様において、本発明におけるRNA特異的蛍光染料は、化合物11である。
【００３２】
さらに特に好ましい態様において、本発明におけるRNA特異的蛍光染料は、Quant-iTTM-RNA試薬である（米国特許US 2008/0199875 A1号参照）。
【００３３】
DNAに特異的な蛍光プローブは、好ましくは、二重らせんDNAに特異的な蛍光染料である。本書においてこのような染料は、SYTO-9、SYTO-13、SYTO-16、SYTO-64、SYTO-82、YO-PRO-1、SYTO-60、SYTO-62、SYTOXオレンジ、SYBRグリーンI、TO-PRO-3、TOTO-3、POPO-3、臭化エチジウムおよびBOBO-3の群から選択してもよい。Toto族染料は他の染料ほど好適ではない。
【００３４】
理想的には、DNA用蛍光染料はSYBRグリーンI（2-[2-[(3-ジメチルアミノプロピル)-プロピルアミノ]-1-フェニル-1H-キノリン-4-イリデンメチル]-3-メチル-ベンゾチアゾール-3-イウムカチオン）である。
【００３５】
さらなる態様において、DNAに特異的な蛍光プローブは、蛍光染料で標識したオリオヌクレオチドプローブであって、このオリゴヌクレオチドプローブは、標的リボ核酸分子から作り出されたDNA上の配列に、実質的に相補的である。
特に、蛍光標識したプローブは、FAM、VIC、NED、フルオレセイン、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPY TMR、オレゴングリーン(Oregon Green)、ローダミングリーン(Rhodamine Green)、ローダミンレッド(Rhodamine Red)、テキサスレッド(Texas Red)、ヤキマイエロー(Yakima Yellow)、アレキサフロア(Alexa Fluor)およびPETよりなる群から選択される染料で標識される。
【００３６】
1つの態様において、2以上の標的リボ核酸がサンプル中で定量され、異なる蛍光染料で標識したオリゴヌクレオチドプローブを、定量される各標的RNAについて使用する。理想的には、このプローブはその標的配列に相補的である。しかし、いくつかの場合において、ミスマッチが求められる場合もある。このようなプローブは、標的配列に結合しない、テールまたはエンド配列も有する。
【００３７】
当業者には、延長反応の反応温度、使用される特定の酵素（例えば熱安定性ポリメラーゼ、逆転写酵素）および各結合パートナーの配列によって、プローブおよびプライマーの長さおよび配列の選択方法が知られている。特に、ハイブリダイゼーションプローブは、ライトサイクラー(LightCycler)プローブ（ロシュ）であるか、または、加水分解プローブは、タクマン(TaqMan)プローブ（ロシュ）である。他の態様において、ヘアピンプローブは、分子指標、スコルピオン(Scorpion)プライマー、サンライズ(Sunrise)プライマー、LUXプライマーおよびアンプリフロア(Amplifluor)プライマーよりなる群から選択される。
【００３８】
本発明のいくつかの態様において、定量は、非等温増幅反応であるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、特に定量的リアルタイムPCR、または、NASBA（核酸配列ベース増幅）、TMA（転写媒介増幅）、3SR（自家持続配列増幅）、SDA（DNA鎖置換増幅）、HDA（易熱性または熱安定性酵素を用いる、ヘリカーゼ依存性増幅）、RPA（リコンビナーゼ・ポリメラーゼ増幅）、LAMP（ループ媒介増幅(Loop-mediated amplification)）、またはSMAP（スマート増幅法(SMart Amplification Process)）等の等温増幅反応などの、核酸増幅反応を含む。これらの技術は、2、3の異なる酵素、タンパク質、プライマーおよび当業者によく知られているアクセサリー分子を利用する。ポリメラーゼとしては、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)(Tth) DNAポリメラーゼ、サーマス・アクアティカス(Thermus acquaticus)(Taq)DNAポリメラーゼ、サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)(Tma)DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)(Tli)DNAポリメラーゼ、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)(Pfu)DNAポリメラーゼ、ピロコッカス・ウォエセイ(Pyrococcus woesei)(Pwo)DNAポリメラーゼ、ピロコッカス・コダカラエンシス(Pyrococcus kodakaraensis)KOD DNAポリメラーゼ、サーマス・フィリフォルミス(Thermus filiformis ) (Tfi)DNAポリメラーゼ、サルフォロバス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)Dpo4 DNAポリメラーゼ、サーマス・パシフィカス(Thermus pacificus)(Tpac)DNAポリメラーゼ、サーマス・エジェルトソニ(Thermus eggertsonii)(Teg)DNAポリメラーゼおよびサーマス・フラバス(Thermus flavus)(Tfl)DNAポリメラーゼ、ならびに、例えば、Phi-29ファージ、Cp-1、PRD-1、Phi 15、Phi 21、PZE、PZA、Nf、M2Y、B103、SF5、GA-1、Cp-5、Cp-7、PR4、PR5、PR722、またはL 17等のPhi-29様ファージなどのファージのポリメラーゼを含む群から選択されるポリメラーゼが挙げられる。また、ポリメラーゼとして、大腸菌、T4、T7等の他の生物由来のポリメラーゼも挙げられる。他の付加的なタンパク質、例えば、ヘリカーゼ、一本鎖結合タンパク質、または他のDNA結合タンパク質、およびリコンビナーゼ等は、方法を改善する場合がある。
【００３９】
標的RNAの逆転写および作り出されたDNAの増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応において実施されることが好ましい。
本発明のいくつかの態様において、逆転写および定量は、同一の反応容器において実施される。
逆転写酵素は、定量工程の間、増幅にも使用されるポリメラーゼであってもよい。
【００４０】
本発明の文脈において、逆転写酵素活性を有する酵素は、ウイルス、細菌、古細菌および真核生物起源を含む、種々の起源のものであってもよく、特に熱安定生物に由来してもよい。このものとしては、イントロン、レトロトランスポゾンまたはレトロウイルスに由来する酵素が挙げられる。本発明の文脈における逆転写酵素活性を有する酵素は、デスオキシリボ核酸またはリボ核酸の3'末端に加わる能力がある酵素であり、相補的デスオキシリボ核酸またはリボ核酸にハイブリダイゼーションするか、またはその逆であり、または、例えば緩衝条件等、好適な反応条件で、前記のデスオキシリボ核酸またはリボ核酸に相補的な1以上のデスオキシリボヌクレオチドにハイブリダイゼーションする。この酵素は、本質的に逆転写酵素を有する酵素を含むが、その遺伝子配列中で進化し突然変異して、このような機能を増すか、緩衝液または他の反応パラメータを調節することによってこのような機能を増す酵素も含む。
【００４１】
好ましくは、本発明の文脈において逆転写酵素活性を有する酵素は、HIV逆転写酵素、M-MLV逆転写酵素、EAIV逆転写酵素、AMV逆転写酵素、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)DNAポリメラーゼI、M-MLV RNase H、スーパースクリプト(Superscript)、スーパースクリプトII、スーパースクリプトIII、モンスタースリプト(Monstersript)（エピセンター(Epicentre)）、オムニスクリプト(Omniscript)、センシスクリプト(Sensiscript)逆転写酵素（キアゲン(Qiagen)）、サーモスクリプト(ThermoScript)およびサーモ-X(Thermo-X)（両者ともインビトロジェン(Invitrogen)）を含む群から選択される。また、酵素は、例えばアックスクリプト(AccuScript)逆転写酵素（ストラタジーン(Stratagene)）のように、忠実度が高くてもよい。当業者には、逆転写酵素活性を有する1以上の酵素を混合して、最適な条件または新規な特徴を得ることができることが知られている。このものとして、他のものの中でも、例えば中温性酵素と好熱性酵素の混合物、またはRNase H活性を有する酵素とRNase H陰性の酵素の混合物、またはRNase H活性を有する酵素とRNase H陰性の酵素の混合物、または忠実度が高い酵素と好熱性酵素の混合物が挙げられる。本発明の範囲における、逆転写酵素活性を有する好ましい酵素のリストに基づき、幾多の他の組み合わせが可能である。
【００４２】
本書で上記した通り、遺伝子発現の分析のために、サンプル中のmRNAの定量は、定量的リアルタイム逆転写PCR（RT-qPCR）を用いて実施し得る。RT-qPCR法は、3工程の組み合わせを用いる：(i) RNA依存性DNAポリメラーゼ（即ち逆転写酵素）を用いた、mRNAのcDNAへの逆転写、(ii) PCRを用いたcDNAの増幅、および(iii) リアルタイムにおける増幅産物の検出および定量。逆転写およびPCR法による増幅のため、dNTP（「ヌクレオチド混合物」）は、反応緩衝液中に存在している必要がある。本発明によるヌクレオチド混合物は、dNTPの混合物であり、即ち、PCRにおける使用に好適なdATP、dCTP、dGTPおよびdTTP/dUTPの混合物である。本発明の特定の態様のため、これらのdNTPの相対量を、テンプレート核酸の特定のヌクレオチド含量によって適合させてもよい。RT-qPCR工程は、1段階法または2段階法で実施し得る。第一の場合、逆転写酵素およびPCRに基づく増幅は、同一の反応容器中、例えば、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)（Tth）ポリメラーゼのような、固有の逆転写機能性を有するDNAポリメラーゼを利用することにより実施される。2段階設定において、RNAを逆転写する工程およびDNAを増幅する工程は、例えば異なる反応容器中で、別々に実施される。本発明による方法の工程は、例えばマグネシウムイオン等の塩を含む、好適な反応緩衝液中で実施してもよい。既に述べたとおり、同一の緩衝液および反応容器中で、異なる工程を実施してもよく、しなくてもよい。RT-qPCRと対照的に、qPCRにおいて逆転写は行われず、従って、qPCRは、RNAよりはむしろ、DNAのための定量方法である。
【００４３】
RT-qPCRにおける(m)RNAの逆転写およびqPCRおよびRT-qPCRにおける(c)DNAの増幅は、オリゴヌクレオチド（「プライマー」）によって刺激する必要がある。RT-qPCRを用いるmRNAの定量の場合、mRNA特異的オリゴヌクレオチド、例えばmRNAのポリAテールにハイブリダイゼーションするオリゴdTプライマーを使用し得る。しかし、さまざまな長さのランダムプライマーも利用し得る。
【００４４】
いくつかの態様において、定量工程は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、続いての検出測定を伴う標識反応および定量的リアルタイムPCRよりなる群から選択される方法を含む。好ましくは、定量は、定量的リアルタイムPCRまたは定量的リアルタイム逆転写PCRを含む。本発明の好ましい態様において、定量工程は、(i) RNA依存性DNAポリメラーゼ（即ち逆転写酵素）を使用する、RNA（例えばmRNA）のDNA（例えばcDNA）中への逆転写、(ii) PCRを使用する逆転写によって製造されるDNAの増幅、および(iii) リアルタイムの増幅産物の検出および定量を含む。ポリメラーゼ連鎖反応が定量的リアルタイムPCRである場合が特に好ましい。定量的リアルタイムPCRにおいて、選択的プライマーを用いて、標的RNAを定量する。
【００４５】
本発明のいくつかの態様において、標的RNA配列の定量は、定量的リアルタイムPCRの間、1以上の蛍光染料および／または消光剤を用いて標識したオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む。蛍光標識した核酸プローブは、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、加水分解プローブおよびヘアピンプローブよりなる群から選択してもよい。
【００４６】
さらに、本発明による手段および方法のため、標準的な定量的リアルタイムPCRプロトコルおよびキットを適合または修正し得る。
【００４７】
上述のとおり、リアルタイムPCR（また、本書では、定量的PCRまたは定量的リアルタイムPCR（qPCR）と表す）は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用する核酸の同時増幅および定量方法である。定量的リアルタイム逆転写PCR（RT-qPCR）は、例えばmRNAをcDNA中へなど、RNAのDNA中への逆転写をさらに含む、定量的リアルタイムPCR法である。qPCRおよびRT-qPCR法において、増幅された核酸は、蓄積するにつれて定量される。典型的には、二重らせんDNAを挿入する蛍光染料（例えば、臭化エチジウムまたはSYBR（登録商標）グリーンI）または相補的核酸（例えば蓄積したDNA）とハイブリダイゼーションしたときに蛍光を発する修飾した核酸プローブ（「レポータープローブ」）が、qPCRによる方法における定量に使用される。特に、レポータープローブとして、蛍光プライマー、ハイブリダイゼーションプローブ（例えばライトサイクラー(LightCycler)プローブ（ロシュ(Roche)））、加水分解プローブ（例えばタクマン(TaqMan)プローブ（ロシュ））、または、分子指標、スコルピオン(Scorpion)プライマー（DxS）、サンライズ(Sunrise)プライマー（オンコア(Oncor)）、LUXプライマー（インビトロジェン(Invitrogen)）、アンプリフロア(Amplifluor)プライマー（インタージェン(Intergen)）等のヘアピンプローブなどを使用し得る。本発明に従って、蛍光プライマーまたはプローブは、例えば、蛍光染料が、例えば共有結合で結合しているプライマーまたはプローブであってもよい。このような蛍光染料は、例えば、FAM（5-または6-カルボキシフルオレセイン）、VIC、NED、フルオレセイン、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPY TMR、オレゴングリーン(Oregon Green)、ローダミングリーン(Rhodamine Green)、ローダミンレッド(Rhodamine Red)、テキサスレッド(Texas Red)、ヤキマイエロー(Yakima Yellow)、アレキサフロール(Alexa Fluor)、PET等であってもよい。特別なレポータープローブは、付加的に蛍光消光剤を含んでもよい。
【００４８】
また、本発明は、(i) RNAに特異的に結合する蛍光染料および(ii) 1以上のDNA増幅産物に特異的な1以上の蛍光プローブを含む、サンプル中の標的RNAの定量のためのキットに関する。本発明の好ましい態様において、キットは、さらに、ポリメラーゼを含む。このキットは、さらに、核酸混合物および(a)反応緩衝液も含んでもよい。いくつかの態様において、キットはさらに逆転写酵素を含む。
【００４９】
本発明の好ましいRNA特異的染料は、特に、米国特許US2008/0199875 A1号に開示されている。上記で概説したとおり、本発明との関係では、特に好ましいRNA特異的染料は、米国特許US2008/0199875 A1号の14〜16頁に記載されたとおりの化合物6、11、19、20および23である。
特に好ましい態様において、本発明におけるRNA特異的蛍光染料は化合物11である。
さらに特に好ましい態様において、本発明におけるRNA特異的染料は、Quant-iTTM-RNA試薬（米国特許US 2008/0199875 A1号参照）である。
【００５０】
本発明は、サンプル中のRNAの総量に対するサンプル中の標的RNA量の正規化において、制限されないがQuant-iTTM-RNA試薬等の、RNA特異的蛍光染料の使用に関する。
【００５１】
また本発明は、サンプル中のRNAの総量に対するサンプル中の標的RNA量の正規化のための、本発明によるキットの使用に関する。
【００５２】
また、本発明は、本発明による方法または遺伝子発現解析のための本発明によるキットの使用に関する。
【００５３】
いくつかの態様において、本発明による手段および方法は遺伝子発現レベルの正規化に使用される。
【００５４】
好ましくは、定量される2以上の核酸の量は、一斉に、即ち同時に正規化される。
【００５５】
いくつかの態様において、1以上の成分は、同一の反応容器中で予め混合する。
【実施例】
【００５６】
実施例１：染料濃度の影響
MTPによる蛍光光度計を用いるRNAの定量のため、Quant-IT RNAを通常1:200に希釈する。PCRサイクラーにおいて対応する蛍光を測定することによってRNAの検出に使用される場合の、染料濃度の影響を試験するため、種々のQuant-IT RNA濃度を試験した。RNeasy Mini Spinカラムを使用して、総RNAをMCF7細胞から単離した。種々の量のこのRNAを、キアゲン(QIAGEN)のQuantiTect SYBRグリーンRT-PCRキットを用いるSYBRグリーンによるワンステップRT-PCRに、テンプレートとして使用した。RT-PCRマスターミックス(Mastermix)にQuant-IT RNA染料を補充し、示したとおり、最終希釈物を得た。ERK mRNAを標的とするプライマーを増幅のために使用した。96穴PCRプレートおよびストラタジーン(Stratagene)MX3005P熱循環装置においてワンステップRT-PCR反応を行った。反応は二重に実施した。RNAを用いない対照反応の蛍光をブランクとして差し引いたが、各Quant-IT RNA希釈について別々のブランクを用いた；図２を参照のこと。試験したQuant-IT RNA濃度の全てを用いて、RNA濃度の対数とcT値との間に直線関係が見られた。最高の染料濃度（1:25）を用いた場合、cTは〜1まで増加した。しかし、PCR増幅効率のインジケーターである勾配は、Quant-IT RNAの添加によって変化しない。このことは、SYBRグリーンによる検出および定量が、さらに高い濃度のQuant-IT RNAの存在下で可能であることを示す。
【００５７】
実施例２：染料の希釈
実施例１と同様の実験を、以下の変更を伴って実施した：最終希釈1:25においてのみ、Quant-IT RNAを使用した。それぞれの量のRNAを12倍の複製において試験し、アッセイの変動性を試験した。RNAを含有しないブランクの平均蛍光を差し引いた。図３および４は、Quant-IT RNA測定およびSYBRグリーンによる検出の結果を示す。
【００５８】
実施例３：RNA濃度10〜100 ng
これまでの実施例で、2桁にわたるRNA濃度を使用したが、図６および７は、反応当たり10〜100 ngのRNA濃度を10 ng間隔で使用した場合の実験結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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