(57)【要約】本発明は、ヒト患者又はそのほかの動物宿主における癌、又はウイルス感染、特に、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ノロウイルス、サポロウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、及びＨＢＶによる感染を治療する又は予防するための化合物、組成物、及び方法を指向する。前記化合物は、６−置換されたプリン一リン酸、及び薬学上許容可能なその塩、プロドラッグ又はそのほかの誘導体である。特に、前記化合物は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＣＶ、ノロウイルス、サポロウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、及びＨＢＶに対する強力な抗ウイルス活性を示す。【選択図】図１
2012517443.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物、又は薬学上許容可能なその塩若しくはプロドラッグであって、
【化１】
2012517443.tif 000062
式中、
ｖ）Ｒ１は、親ヌクレオシドとして投与された際、生体内で取り外されてＯＨを形成する原子又は基であり、たとえば、ハロゲン、（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、ＯＲ’、Ｎ（Ｒ’）２、ＳＲ’、ＯＣＯＲ’、ＮＨＣＯＲ’、Ｎ（ＣＯＲ’）ＣＯＲ’、ＳＣＯＲ’、ＯＣＯＯＲ’及びＮＨＣＯＯＲ’であり、
各Ｒ’は独立してＨ、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）、低級ハロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）、低級アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ６）、低級アルケニル（Ｃ２〜Ｃ６）、低級アルキニル（Ｃ２〜Ｃ６）、低級シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ６）アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、又はアリールアルキルであり、その際、基は、上記で定義したような１以上の置換基、たとえば、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル及びアルコキシアルキルによって置換することができ；
ｖｉ）Ｗは独立して、Ｎ、ＣＨ、ＣＦ、ＣＣＮ、ＣＣ≡ＣＨ又はＣＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２であり；
ｘｖ）糖は一般式（ＩＩ）：
【化２】
2012517443.tif 000063
のリボース又は修飾されたリボースであり、
式中、
Ｙは、Ｏ又はＳであり；
Ｚは、ＣＬ２、ＣＬ２ＣＬ２、ＣＬ２ＯＣＬ２、ＣＬ２ＳＣＬ２、ＣＬ２Ｏ、ＯＣＬ２及びＣＬ２ＮＨＣＬ２から成る群から選択され、その際、Ｌは独立して、Ｈ、Ｆ、アルキル、アルケニル及びアルキニルから成る群から選択され、アルキル、アルケニル及びアルキニルは任意で１以上のヘテロ原子を含有してもよく；
Ａは、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、ＣＨＦ、ＣＦ２、Ｃ＝ＣＨ２、Ｃ＝ＣＨＦ又はＣ＝ＣＦ２であり；
Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｒ６’及びＲ７’は独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＯＨ、ＮＨＮＨ２、Ｎ３、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｓ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｒ、ＯＲ、ＳＲ、ＳＳＲ、ＮＨＲ及びＮＲ２から成る群から選択され；
糖が式（ＩＩ）である場合の式（Ｉ）について、ＡがＯである場合、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｒ７’はＨであり、Ｒ６’はＮ３であることができず；
糖が式（ＩＩ）である場合の式（Ｉ）について、ＡがＯ又はＳである場合、Ｒ７’はＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＯＨ、ＮＨＮＨ２、ＯＲ、ＳＲ、ＳＳＲ、ＮＨＲ及びＮＲ２であることができず；
Ｒは独立して、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、低級アルケニル、低級アルキニル、低級シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、アリール、アルキルアリール又はアリールアルキルであり、その際、基は、上記で定義したような１以上の置換基、たとえば、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル及びアルコキシアルキルによって置換することができ；
Ｒ２及びＲ３は、生体内に投与される際、理想的にはヌクレオシド一リン酸、一ホスホン酸、チオ一ホスホン酸、又はチオ一リン酸を提供することが可能であり、代表的なＲ２及びＲ３は独立して以下から選択され、
（ａ）Ｒ８が、Ｈ、Ｃ１−２０アルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、又は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシ、（ＣＨ２）１〜６ＣＯ２Ｒ９ａ、ハロゲン、Ｃ１〜６ハロアルキル−Ｎ（Ｒ９ａ）２、Ｃ１〜６アシルアミノ。−ＮＨＳＯ２Ｃ１〜６アルキル、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ９ａ）２、−ＳＯ２Ｃ１〜６アルキル、ＣＯＲ９ｂ、ニトロ及びシアノから成る群から独立して選択される１〜３の置換基によって任意で置換されるフェニル又はナフチルを含むが、これらに限定されないアリール、又はヘテロアリールであり、Ｒ９ａが独立してＨ又はＣ１−２０アルキルであり、Ｒ９ｂがＯＲ９ａ又は−Ｎ（Ｒ９ａ）２であるＯＲ８；
（ｂ）Ｒ１０ａ及びＲ１０ｂが
（ｉ）独立してＨ、Ｃ１−１０アルキル、−（ＣＨ２）ｒＮＲ９ａ２、Ｃ１〜６ヒドロキシアルキル、−ＣＨ２ＳＨ、−（ＣＨ２）２Ｓ（Ｏ）ｐＭｅ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル、（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル−（ＣＨ２）ｍＣＯＲ９ｂ、アリール及びアリール−Ｃ１−３アルキルから成る群から選択され、前記アリール基が任意で、ヒドロキシル、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、ニトロ及びシアノから成る群から選択される基で置換される；
（ｉｉ）Ｒ１０ａがＨであり、Ｒ１０ｂとＲ１２が一緒に（ＣＨ２）２〜４であり、隣接するＮ原子及びＣ原子を含む環を形成する；
（ｉｉｉ）Ｒ１０ａとＲ１０ｂが一緒に（ＣＨ２）ｎであり、環を形成する；
（ｉｖ）Ｒ１０ａとＲ１０ｂが双方共Ｃ１−６アルキルである；又は
（ｖ）Ｒ１０ａがＨであり、Ｒ１０ｂがＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２Ｐｈ、ＣＨ２−インドール−３−イル、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、ＣＨ２−イミダゾール−４−イル、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２（（４’−ＯＨ）−Ｐｈ）、ＣＨ２ＳＨ、又は低級シクロアルキルであり；ｐが０〜２であり、ｒが１〜６であり、ｎが４又は５であり、ｍが０〜３であり、Ｒ１１が、Ｈ、Ｃ１−１０アルキル、又はたとえば、低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロで置換されるＣ１−１０アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロヘテロアルキル、たとえば、フェニルのようなアリール、たとえば、ピリジニルのようなヘテロアリール、置換アリール、又は置換へテロアリールであり、置換基がＣ１−５アルキル、又は低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロで置換されるＣ１−５アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル又はシクロアルキルであり、Ｒ１２が、Ｈ、Ｃ１−３アルキル若しくはＲ１０ａであり、又はＲ１０ｂとＲ１２が一緒に（ＣＨ２）２〜４であり、隣接するＮ原子及びＣ原子を含む環を形成する、
【化３】
2012517443.tif 000064
（ｃ）Ｏ連結脂質（リン脂質を含む）、Ｎ又はＯ連結のペプチド、Ｏ連結コレステロール又はＯ連結フィトステロール；
（ｄ）Ｒ２とＲ３が一緒になって形成する環、
【化４】
2012517443.tif 000065
その際、Ｗ２が、Ｃ１−６アルキル、ＣＦ３、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ、ＯＲ９ｃ、ＣＯ２Ｒ９ａ、ＣＯＲ９ａ、ハロゲン、Ｃ１−６ハロアルキル、−Ｎ（Ｒ９ａ）２、Ｃ１−６アシルアミノ、ＣＯ２Ｎ（Ｒ９ａ）２、ＳＲ９ａ、−ＮＨＳＯ２Ｃ１−６アルキル、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ９ａ）２、−ＳＯ２Ｃ１−６アルキル、ＣＯＲ９ｂ及びシアノから成る群から独立して選択される１〜３の置換基によって任意で置換されるフェニル又は単環式へテロアリールから成る群から選択され、その際、ａ）２つのへテロ原子があり、一方がＯである場合、他方はＯ又はＳであることができない；及びｂ）２つのへテロ原子があり、一方がＳである場合、他方はＯ又はＳであることができないという条件で、前記単環式へテロアリール及び置換された単環式へテロアリールは、Ｎ、Ｏ及びＳから成る群から独立して選択される１〜２のヘテロ原子を有し、Ｒ９ａは独立してＨ又はＣ１−６アルキルであり、Ｒ９ｂは−ＯＲ９ａ又は−Ｎ（Ｒ９ａ）２であり、Ｒ９ｃはＨ又はＣ１−６アシルである；
（ｅ）Ｒ１３が、Ｈ、Ｃ１−１０アルキル、及び、低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロ、Ｃ３−１０シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロヘテロアルキル、フェニルのようなアリール、ピリジニルのようなヘテロアリール、置換アリール又は置換へテロアリールによって任意で置換されるＣ１−１０アルキルから成る群から選択され、その際、置換基がＣ１−５アルキル、又は低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロ、Ｃ３−１０シクロアルキル、若しくはシクロアルキルで置換されるＣ１−５アルキルである、
【化５】
2012517443.tif 000066
（ｆ）Ｒ２とＲ３が一緒になって形成する環、
【化６】
2012517443.tif 000067
その際、Ｒ１４が、（ｉ）Ｈ、Ｃ１−１０アルキル、−（ＣＨ２）ｒＮＲ２９ａ、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、−ＣＨ２ＳＨ、−（ＣＨ２）２Ｓ（Ｏ）ｐＭｅ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル、（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル、−（ＣＨ２）ｍＣＯＲ９ｂ、アリール及びアリール−Ｃ１−３アルキル又はヘテロアリール及びヘテロアリール−Ｃ１−３アルキルから成る群から独立して選択され、前記アリール基及びヘテロアリール基は、ヒドロキシル、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、ニトロ及びシアノから成る群から選択される基によって任意で置換され、（ｉｉ）Ｒ１４が、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２Ｐｈ、ＣＨ２−インドール−３−イル、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、ＣＨ２−イミダゾール−４−イル、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２（（４’−ＯＨ）−Ｐｈ）、ＣＨ２ＳＨ又は低級シクロアルキルであり；ｐが０〜２であり、ｒが１〜６であり、ｍが０〜３であり、Ｑ１がＮＲ９ａ、Ｏ又はＳであり、Ｑ２が、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、アリール及びアリールＣ１−３アルキル、ヘテロアリール及びヘテロアリールＣ１−３アルキルであり、前記アリール基及びヘテロアリール基がヒドロキシル、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、フルオロ及びクロロから成る群から選択される基によって任意で置換され、Ｒ１１が、Ｈ、Ｃ１−１０アルキル、及び、低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロ、Ｃ３−１０シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロヘテロアルキル、フェニルのようなアリール、ピリジニルのようなヘテロアリール、置換アリール又は置換へテロアリールによって任意で置換されるＣ１−１０アルキルであり、その際、置換基がＣ１−５アルキル、又は低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロ、Ｃ３−１０シクロアルキル、若しくはシクロアルキルで置換されるＣ１−５アルキルであり、Ｒ１２が、Ｈ若しくはＣ１−３アルキルであり、又はＲ１４ｂとＲ１２が一緒になって（ＣＨ２）２〜４であり、隣接するＮ原子及びＣ原子を含む環を形成し；
ｘｖｉ）或いは糖が、一般式（ＩＩＩ）
【化７】
2012517443.tif 000068
の修飾されたリボースであり、
式中、
Ａ、Ｒ２、Ｒ３、Ｙ、Ｚ、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’及びＲ７’は上記と同義であり、その際、糖が式（ＩＩＩ）である場合式（Ｉ）について、ＡはＯ又はＳであり、Ｒ７’はＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＯＨ、ＮＨＮＨ２、ＯＲ、ＳＲ、ＳＳＲ、ＮＨＲ及びＮＲ２であることができず、
Ｒは、独立して、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、低級アルケニル、低級アルキニル、低級シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、アリール、アルキルアリール又はアリールアルキルであり、その際、基は、上記で定義したような１以上の置換基、たとえば、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル及びアルコキシアルキルによって置換することができ；
ｘｖｉｉ）或いは、糖が、一般式（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）：
【化８】
2012517443.tif 000069
のジオキソラン又はオキサチオランであり、
式中、
ＶはＳ又はＳｅであり
Ｒ２、Ｒ３、Ｙ及びＺは上記と同義であり；
ｘｖｉｉｉ）或いは、糖が、一般式（ＶＩＩＩ）
【化９】
2012517443.tif 000070
のホスホニルメトキシアルキルであり、
式中、
Ｒ２、Ｒ３及びＹは上記と同義であり；
Ｒ１５が、アルキル（Ｃ１〜Ｃ６を含むが、これらに限定されない）、アルケニル（Ｃ２〜Ｃ６を含むが、これらに限定されない）及びアルキニル（Ｃ２〜Ｃ６を含むが、これらに限定されない）、シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ８を含むが、これらに限定されない）、アリール（Ｃ６〜Ｃ１０を含むが、これらに限定されない）、ヘテロアリール（Ｃ６〜Ｃ１０を含むが、これらに限定されない）、アリールアルキル及びアルキルアリールから成る群から選択され；
ｘｉｘ）あるいは、糖が、一般式（ＩＸ）又は（Ｘ）
【化１０】
2012517443.tif 000071
のものであり、
式中、
Ｒ２、Ｒ３及びＹは上記と同義であり；
Ｙ２が、Ｏ、Ｓ、ＳｅＮＲであり；
Ｒは、独立して、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、低級アルケニル、低級アルキニル、低級シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、アリール、アルキルアリール又はアリールアルキルであり、その際、基は、上記で定義したような１以上の置換基、たとえば、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル及びアルコキシアルキルによって置換することができ；
Ｒ１６及びＲ１７が、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＲ１８として定義され；
Ｒ１８が、Ｈ又は低級アシル（Ｃ１〜Ｃ６）であり；
ｘｘ）或いは、糖が、一般式（ＸＩ）：
【化１１】
2012517443.tif 000072
の修飾されたリボースであり、
式中、
Ｒ２、Ｒ３及びＹは上記と同義であり；
Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、及びＲ６’は上記と同義であり；
Ｒ１９が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｓ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｒであり、
Ｒは、独立して、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、低級アルケニル、低級アルキニル、低級シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、アリール、アルキルアリール又はアリールアルキルであり、その際、基は、上記で定義したような１以上の置換基、たとえば、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル及びアルコキシアルキルによって置換することができ、
前記化合物は、β−Ｌ又はβ−Ｄの立体配置、又はそのラセミ混合物を含むその混合物の形態であることができる化合物、又は薬学上許容可能なその塩若しくはプロドラッグ。
【請求項２】
Ｒ６’が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＯＨ、ＮＨＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｓ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｒ、ＯＲ、ＳＲ、ＳＳＲ、ＮＨＲ及びＮＲ２から成る群から選択される請求項１の化合物。
【請求項３】
式（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）又は（ＸＩＶ）の化合物、又は薬学上許容可能なその塩若しくはプロドラッグであって、
【化１２】
2012517443.tif 000073
式中
Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｙ、Ａ及びＲ７’は請求項１と同義であり；
Ｒ２０は、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり、
Ｍは、Ｏ、Ｓ又はＮＲであり、
Ｒは、独立して、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、低級アルケニル、低級アルキニル、低級シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、アリール、アルキルアリール又はアリールアルキルであり、その際、基は、上記で定義したような１以上の置換基、たとえば、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル及びアルコキシアルキルによって置換することができ、
塩基は以下から選択され、
【化１３】
2012517443.tif 000074
前記化合物は、β−Ｌ又はβ−Ｄの立体配置、又はそのラセミ混合物を含むその混合物の形態であることができる化合物、又は薬学上許容可能なその塩若しくはプロドラッグ。
【請求項４】
式（ＸＶ）又は（ＸＶＩ）の化合物、又は薬学上許容可能なその塩若しくはプロドラッグであって、
【化１４】
2012517443.tif 000075
式中
Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｙ、Ａ、Ｒ７’及びＲ２０は請求項１と同義であり；
Ｒ２１は、Ｈ、Ｃ１−１０アルキル、又はたとえば、低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロ、Ｃ３−１０シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロヘテロアルキル、たとえば、フェニルのようなアリール、たとえば、ピリジニルのようなヘテロアリール、置換アリール、又は置換へテロアリールによって任意で置換されるＣ１−１０アルキルであり、置換基がＣ１−５アルキル、又は低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロで置換されるＣ１−５アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル又はシクロアルキルであり、
Ｒ２２は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２Ｐｈ、ＣＨ２−インドール−３−イル、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、ＣＨ２−イミダゾール−４−イル、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２（（４’−ＯＨ）−Ｐｈ）、ＣＨ２ＳＨ又は低級シクロアルキルであり、
前記化合物は、β−Ｌ又はβ−Ｄの立体配置、又はそのラセミ混合物を含むその混合物の形態であることができる化合物、又は薬学上許容可能なその塩若しくはプロドラッグ。
【請求項５】
式（ＸＶＩＩ）又は（ＸＶＩＩＩ）の化合物、又は薬学上許容可能なその塩若しくはプロドラッグであって、
【化１５】
2012517443.tif 000076
式中、
Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｙ、Ｍ、Ｒ７’、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、及び塩基は請求項１と同義であり、
前記化合物は、β−Ｌ又はβ−Ｄの立体配置、又はそのラセミ混合物を含むその混合物の形態であることができる化合物、又は薬学上許容可能なその塩若しくはプロドラッグ。
【請求項６】
Ｒ５が、ＮＨ２、ジメチルアミン、メチル−アリル−アミン、メトキシ、クロロ、シクロプロピルアミン、５−ヒドロキシ−ペンチルアミン、１，１−ジメチル−エタノールアミン及び２−メトキシ−エチルアミンから成る群から選択される請求項１の化合物。
【請求項７】
化合物が、−Ｌ又はβ−Ｄの立体配置、又はそのラセミ混合物である請求項１の化合物。
【請求項８】
その治療を必要とする患者に有効量の請求項１〜７のいずれかの化合物を投与することを含むＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２に感染した宿主を治療する方法。
【請求項９】
その予防を必要とする患者に予防上有効量の請求項１〜７のいずれかの化合物を投与することを含むＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２感染を予防する方法。
【請求項１０】
その治療を必要とする患者に有効量の請求項１〜７のいずれかの化合物を投与することを含む宿主におけるＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２感染の生物活性を低減する方法。
【請求項１１】
ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の感染が、ＴＡＭ変異及びＭ１８４Ｖ変異から成る群から選択される変異を含むウイルスによって引き起こされる請求項８の方法。
【請求項１２】
別の抗ＨＩＶ剤との併用で薬学上許容可能なキャリアにおける有効量の請求項１〜７のいずれかの化合物を投与することを含むＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２に感染した宿主を治療する方法。
【請求項１３】
ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の感染が、ＴＡＭ変異及びＭ１８４Ｖ変異から成る群から選択される変異を含むウイルスによって引き起こされる請求項１２の方法。
【請求項１４】
その予防を必要とする患者に、別の抗ＨＩＶ剤との併用で薬学上許容可能なキャリアにおける、予防上有効量の請求項１〜６のいずれかの化合物を投与することを含むＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２感染を予防する方法。
【請求項１５】
その治療を必要とする患者に有効量の請求項１〜７のいずれかの化合物を投与することを含むＨＢＶに感染した宿主を治療する方法。
【請求項１６】
その予防を必要とする患者に予防上有効量の請求項１〜７のいずれかの化合物を投与することを含むＨＢＶ感染を予防する方法。
【請求項１７】
その治療を必要とする患者に有効量の請求項１〜７のいずれかの化合物を投与することを含む宿主におけるＨＢＶ感染の生物活性を低減する方法。
【請求項１８】
別の抗ＨＢＶ剤との併用で薬学上許容可能なキャリアにおける有効量の請求項１〜７のいずれかの化合物を投与することを含むＨＢＶに感染した宿主を治療する方法。
【請求項１９】
その予防を必要とする患者に、別の抗ＨＢＶ剤との併用で薬学上許容可能なキャリアにおける、予防上有効量の請求項１〜６のいずれかの化合物を投与することを含むＨＢＶ感染を予防する方法。
【請求項２０】
その治療を必要とする患者に有効量の請求項１〜７のいずれかの化合物を投与することを含むノロウイルス又はサポロウイルスに感染した宿主を治療する方法。
【請求項２１】
その予防を必要とする患者に予防上有効量の請求項１〜７のいずれかの化合物を投与することを含むノロウイルス又はサポロウイルス感染を予防する方法。
【請求項２２】
その治療を必要とする患者に有効量の請求項１〜７のいずれかの化合物を投与することを含む宿主におけるノロウイルス又はサポロウイルス感染の生物活性を低減する方法。
【請求項２３】
別の抗ノロウイルス又はサポロウイルス剤との併用で薬学上許容可能なキャリアにおける有効量の請求項１〜７のいずれかの化合物を投与することを含むノロウイルス又はサポロウイルスに感染した宿主を治療する方法。
【請求項２４】
その予防を必要とする患者に、別の抗ノロウイルス又はサポロウイルス剤との併用で薬学上許容可能なキャリアにおける、予防上有効量の請求項１〜６のいずれかの化合物を投与することを含むノロウイルス又はサポロウイルス感染を予防する方法。
【請求項２５】
その治療を必要とする患者に有効量の請求項１〜７のいずれかの化合物を投与することを含む、ＨＣＶ、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス及び西ナイルウイルスを含むＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスに感染した宿主を治療する方法。
【請求項２６】
その予防を必要とする患者に予防上有効量の請求項１〜７のいずれかの化合物を投与することを含むＨＣＶ、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス及び西ナイルウイルスを含むＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス感染を予防する方法。
【請求項２７】
その治療を必要とする患者に有効量の請求項１〜７のいずれかの化合物を投与することを含む宿主におけるＨＣＶ、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス及び西ナイルウイルスを含むＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス感染の生物活性を低減する方法。
【請求項２８】
別の抗ノロウイルス又はサポロウイルス剤との併用で薬学上許容可能なキャリアにおける有効量の請求項１〜７のいずれかの化合物を投与することを含むＨＣＶ、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス及び西ナイルウイルスを含むＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスに感染した宿主を治療する方法。
【請求項２９】
その予防を必要とする患者に、別の抗ノロウイルス又はサポロウイルス剤との併用で薬学上許容可能なキャリアにおける、予防上有効量の請求項１〜６のいずれかの化合物を投与することを含むＨＣＶ、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス及び西ナイルウイルスを含むＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス感染を予防する方法。
【請求項３０】
その治療を必要とする患者に有効量の請求項１〜７のいずれかの化合物を投与することを含むＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２に感染した宿主を治療する方法。
【請求項３１】
その予防を必要とする患者に予防上有効量の請求項１〜７のいずれかの化合物を投与することを含むＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２感染を予防する方法。
【請求項３２】
その治療を必要とする患者に有効量の請求項１〜７のいずれかの化合物を投与することを含む宿主におけるＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２感染の生物活性を低減する方法。
【請求項３３】
別の抗ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２剤との併用で薬学上許容可能なキャリアにおける有効量の請求項１〜７のいずれかの化合物を投与することを含むＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２に感染した宿主を治療する方法。
【請求項３４】
その予防を必要とする患者に、別の抗ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２剤との併用で薬学上許容可能なキャリアにおける、予防上有効量の請求項１〜６のいずれかの化合物を投与することを含むＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２感染を予防する方法。
【請求項３５】
ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２に感染した宿主を治療するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物の使用。
【請求項３６】
ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の感染を予防するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物の使用。
【請求項３７】
ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の感染の生物活性を低減するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物の使用。
【請求項３８】
ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の感染が、ＴＡＭ変異及びＭ１８４Ｖ変異から成る群から選択される変異を含むウイルスによって引き起こされる請求項３５の使用。
【請求項３９】
ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２に感染した宿主を治療するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物及び別の抗ＨＩＶ剤の使用。
【請求項４０】
ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の感染が、ＴＡＭ変異及びＭ１８４Ｖ変異から成る群から選択される変異を含むウイルスによって引き起こされる請求項３９の使用。
【請求項４１】
ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の感染を予防するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物及び別の抗ＨＩＶ剤の使用。
【請求項４２】
ＨＢＶに感染した宿主を治療するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物の使用。
【請求項４３】
ＨＢＶの感染を予防するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物の使用。
【請求項４４】
宿主におけるＨＢＶ感染の生物活性を低減するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物の使用。
【請求項４５】
ＨＢＶに感染した宿主を治療するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物及び別の抗ＨＢＶ剤の使用。
【請求項４６】
ＨＢＶの感染を予防するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物及び別の抗ＨＢＶ剤の使用。
【請求項４７】
ノロウイルス又はサポロウイルスに感染した宿主を治療するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物の使用。
【請求項４８】
ノロウイルス又はサポロウイルスの感染を予防するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物の使用。
【請求項４９】
宿主におけるノロウイルス又はサポロウイルス感染の生物活性を低減するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物の使用。
【請求項５０】
ノロウイルス又はサポロウイルスに感染した宿主を治療するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物及び別の抗ノロウイルス又はサポロウイルス剤の使用。
【請求項５１】
ノロウイルス又はサポロウイルスの感染を予防するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物及び別の抗ノロウイルス又はサポロウイルス剤の使用。
【請求項５２】
ＨＣＶ、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス及び西ナイルウイルスを含むＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスに感染した宿主を治療するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物の使用。
【請求項５３】
ＨＣＶ、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス及び西ナイルウイルスを含むＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスの感染を予防するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物の使用。
【請求項５４】
宿主におけるＨＣＶ、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス及び西ナイルウイルスを含むＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス感染の生物活性を低減するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物の使用。
【請求項５５】
ＨＣＶ、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス及び西ナイルウイルスを含むＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスに感染した宿主を治療するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物及び別の抗ノロウイルス又はサポロウイルス剤の使用。
【請求項５６】
ＨＣＶ、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス及び西ナイルウイルスを含むＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスの感染を予防するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物及び別の抗ロウイルス又はサポロウイルス剤の使用。
【請求項５７】
ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２の感染を予防するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物の使用。
【請求項５８】
ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２の感染を予防するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物の使用。
【請求項５９】
宿主におけるＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２感染の生物活性を低減するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物の使用。
【請求項６０】
ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２に感染した宿主を治療するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物及び別の抗ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２剤の使用。
【請求項６１】
ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２の感染を予防するために薬物を調製するための請求項１〜７のいずれかの化合物及び別の抗ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレオチド類似体を用いてウイルス感染を治療する又は予防するための化合物、方法及び組成物を指向する。さらに具体的には、本発明は、６−置換−２−アミノプリンヌクレオシド一リン酸プロドラッグ及び一ホスホン酸プロドラッグ及び修飾プロドラッグ類似体、薬学上許容可能なその塩、又はそのほかのその誘導体を記載し、並びに癌又はウイルス感染、特に、１）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）；２）Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス及び黄熱病ウイルスを含むＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス；３）ノロウイルス及びサポロウイルスを含むＣａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ感染；及び４）Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療におけるその使用を記載する。本発明は、特定の６−置換−アミノ−プリンヌクレオシドの代謝経路を改変する方法、及びこれまで得られなかった治療上関連する濃度にてヌクレオチド三リン酸を逆転写酵素及びポリメラーゼに送達する方法を教示する。
【背景技術】
【０００２】
分野としてのヌクレオシド類似体は、揺るぎない調節性の経歴を有し、現在１０を超えるものが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）又はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を治療するために米国食品医薬品局（ＵＳＦＤＡ）によって認可されている。抗ウイルス療法を開発する上での難題は、宿主細胞を損傷することなくウイルスの複製を阻害することである。ＨＩＶでは、薬剤開発の重要な標的は逆転写酵素（ＨＩＶ−ＲＴ）、独特のウイルスポリメラーゼである。この酵素は、ウイルスの複製サイクルの早期に活性があり、ウイルスの遺伝情報をＲＮＡからＤＮＡに変換し、それは、連続するウイルス複製に必要な過程である。ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）は天然のヌクレオシドを模倣する。三リン酸の形態で、各ＮＲＴＩは、ＨＩＶ−１ＲＴの活性部位の近傍での結合及びＮＤＡ鎖の伸張について、４つの天然に存在する２'−デオキシヌクレオシド−５’−三リン酸（ｄＮＴＰ）、すなわち、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ又はｄＧＴＰの１つと競合する。
【０００３】
逆転写は、ＨＩＶ−１の複製サイクルで必須の事象であり、抗レトロウイルス剤の開発の主な標的であるParniak MA, Sluis-Cremer N. Inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase. Adv. Pharmacol. 2000, 49, 67-109; Painter GR, Almond MR, Mao S, Liotta DC. Biochemical and mechanistic basis for the activity of nucleoside analogue inhibitors of HIV reverse transcriptase. Curr. Top. Med. Chem. 2004, 4, 1035-44; Sharma PL, Nurpeisov V, Hernandez-Santiago B, Beltran T, Schinazi RF. Nucleoside inhibitors of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Curr. Top. Med. Chem. 2004, 4 895-919を参照）。ＨＩＶ−１ＲＴを阻害する２つの異なった群の化合物が特定されている。これらはヌクレオシド又はヌクレオチドのＲＴ阻害剤（ＮＲＴＩ）及び非ヌクレオシドのＲＴ阻害剤（ＮＮＲＴＩ）である。
【０００４】
ＮＲＴＩは、リボース糖における３’−ＯＨ基を欠くデオキシリボヌクレオシドの類似体である。それらは、ＨＩＶ−１感染を治療するのに使用された最初の薬剤であり、ほぼすべての抗レトロウイルス治療計画の不可欠の成分となっている。
【０００５】
１９８５年、代表的なＮＲＴＩの１つである合成ヌクレオシド、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ジドブジン、ＡＺＴ）はＨＩＶの複製を阻害することが報告された。それ以来、２’，３’−ジデオキシイノシン（ジダノシン、ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシシチジン（ザルシタビン、ｄｄＣ）、２’，３’−ジデオキシ−２’，３’−ジデヒドロチミジン（スタブジン、ｄ４Ｔ）、（−）−２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（ラミブジン、３ＴＣ）、（−）−２’，３’−ジデオキシ−５−フルオロ−３’−チアシチジン（エムトリシタビン、ＦＴＣ）、（１Ｓ，４Ｒ）−４−［２−アミノ−６−（シクロプロピル−アミノ）−９Ｈ−プリン−９−イル］−２−シクロペンテン−１−メタノールコハク酸（アバカビル、ＡＢＣ）、（Ｒ）−９−（２−ホスホニルメトキシプロピル）アデニン（ＰＭＰＡ、テノフォビルジソプロキシルフマレート）（ＴＤＦ）及び（−）カルボン酸２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシグアノシン（カルボビル）及びそのプロドラッグ、アバカビルを含むが、これらに限定されない幾つかのそのほかのＮＲＴＩが、ＨＩＶに対して有効であることが判明している。細胞性キナーゼによる５’−三リン酸へのリン酸化の後、これらＮＲＴＩは、３’−ヒドロキシル基を欠くために、ウイルスＤＮＡの増殖中の鎖に導入され、連鎖停止の原因となる。
【０００６】
一般に、抗ウイルス活性を呈するには、ＮＲＴＩは宿主細胞のキナーゼによって相当する三リン酸の形態（ＮＲＴＩ−ＴＰ）に代謝的に変換されなければならない。ＮＲＴＩ−ＴＰは、ＤＮＡ合成の連鎖停止剤として作用することによってＨＩＶ−１ＲＴのＤＮＡ合成を阻害する（Goody RS, Muller B, Restle T. Factors contributing to the inhibition of HIV reverse transcriptase by chain terminating nucleotides in vitro and in vivo. FEBS Lett. 1991, 291, 1-5を参照）。１以上のＮＲＴＩを含有する併用療法は、ＡＩＤＳに関連する罹患率及び死亡率を顕著に下げたが、認可されたＮＲＴＩは有意な限界を有し得る。これらには、急性及び慢性の毒性、ほかの抗レトロウイルス剤との薬物動態上の相互作用、及びほかのＮＲＴＩに対して交差耐性を示すＨＩＶ−１の薬剤耐性変異体の選抜が挙げられる。
【０００７】
個体内におけるＨＩＶ−１の薬剤耐性は、ウイルス集団の遺伝的多様性及び治療による耐性変異体の選抜から生じる（Chen R, Quinones-Mateu ME, Mansky LM. Drug resistance, virus fitness and HIV-1 mutagenesis. Curr. Pharm. Des. 2004, 10, 4065-70を参照）。ＨＩＶ−１の遺伝的多様性は、複製の間に、ＨＩＶ−１ＲＴがヌクレオチド配列を校正できないことによる。この多様性は、ＨＩＶ−１複製の速い速度、ＨＩＶ−１感染過程におけるプロウイルス変異体の蓄積、及び異なった配列のウイルスが同一細胞に感染する際の遺伝子組換えによって高められる。その結果、最初の感染後何年も経った個体の中で数え切れない遺伝的変異体（擬似種と呼ぶ）が進化する。薬剤耐性の進展は、薬物療法の間にウイルス複製が継続する程度、特定の突然変異（又は一連の突然変異）の獲得の容易さ、及び薬剤の感受性とウイルスの適合性に対する薬剤耐性突然変異の効果に左右される。一般に、ＮＲＴＩ療法は、ＲＴで変異を有するウイルスを選択する。選択されたＮＲＴＩ耐性変異によって、変異ウイルスは通常、ＮＲＴＩの一部に、又は場合によってはＮＲＴＩすべてに低下した感受性を示す。臨床的視点から、薬剤耐性ＨＩＶ−１の進展は、耐性ウイルスに対して能力を保持する利用可能な薬剤の数を効果的に減らすことによって将来の治療の選択肢を限定する。このことは、強烈な投薬計画及び薬物毒性による重度の副作用の大きなリスクを含むさらに複雑な薬物治療計画を必要とすることが多い。これらの因子は薬物治療計画に対する不完全な順守に寄与することが多い。従って、優れた活性と安全な特性を持ち、現在利用可能な薬剤との限定的な交差耐性を持つ、又は交差耐性を持たない新規のＮＲＴＩの開発は、ＨＩＶ−１感染の有効な治療に決定的である。
【０００８】
薬剤耐性ＨＩＶ−１に対して活性のあるヌクレオシド類似体の開発は、この種の化合物への耐性に関与する分子メカニズムの詳細な理解を必要とする。従って、ＮＲＴＩに耐性のＨＩＶ−１の突然変異と分子メカニズムの手短な概説を提供する。ＮＲＴＩに耐性のＨＩＶ−１について２つの動力学的に異なる分子メカニズムが提案されている（Sluis-Cremer N, Arion D, Parniak MA. Molecular mechanisms of HIV-1 resistance to nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTIs). Cell Mol. Life Sci. 2000; 57, 1408-22を参照）。一方のメカニズムには、ウイルスＤＮＡの合成の間に取り込まれる通常のｄＮＴＰに対するＮＲＴＩ−ＴＰの選択的低下が関与する。この耐性メカニズムは区別と呼ばれている。第２のメカニズムには、時期尚早に停止するＤＮＡ鎖からの連鎖停止ＮＲＴＩ一リン酸（ＮＲＴＩ−ＭＰ）の選択的取り外しが関与する（Arion D, Kaushik N, McCormick S, Borkow G, Parniak MA. Phenotypic mechanism of HIV-1 resistance to 3'-azido-3'-deoxythymidine (AZT): increased polymerization processivity and enhanced sensitivity to pyrophosphate of the mutant viral reverse transcriptase. Biochemistry. 1998, 37, 15908-17; Meyer PR, Matsuura SE, Mian AM, So AG, Scott WA. A mechanism of AZT resistance: an increase in nucleotide-dependent primer unblocking by mutant HIV-1 reverse transcriptase. Mol. Cell. 1999, 4, 35-43を参照）。このメカニズムは切り取りと呼ばれている。
【０００９】
区別メカニズムには、天然のｄＮＴＰ基質とＮＲＴＩ−ＴＰの間で区別する酵素の能力を改善するＲＴにおける１以上の耐性変異の獲得が関与する。この点で、耐性は通常、ＮＲＴＩ−ＴＰ取り込みの触媒効率の低下と関連する。ＮＲＴＩ−ＴＰ（及びｄＮＴＰ）の触媒効率は、２つのパラメータ（ｉ）ＲＴポリメラーゼの活性部位（Ｋｄ）についてのヌクレオチドの親和性と（ｉｉ）ヌクレオチド取り込みの最高速度によって駆動され、双方共、前定常状態動態解析によって測定することができる（Kati WM, Johnson KA, Jerva LF, Anderson KS. Mechanism and fidelity of HIV reverse transcriptase. J. Biol. Chem. 1992, 26: 25988-97を参照）。
【００１０】
ＮＲＴＩ耐性の切り取りメカニズムについては、ヌクレオチド取り込み工程で変異ＨＩＶ−１ＲＴは天然のｄＮＴＰ基質とＮＲＴＩ−ＴＰの間で区別しない（Kerr SG, Anderson KS. Pre-steady-state kinetic characterization of wild type and 3'-azido-3'- deoxythymidine (AZT) resistant human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase: implication of RNA directed DNA polymerization in the mechanism of AZT resistance. Biochemistry. 1997, 36, 14064-70を参照）。代わりに、「切り取り」変異を含有するＲＴは、生理的濃度のＡＴＰ（通常、０．８〜４ｍＭの範囲内）又はピロリン酸（ＰＰｉ）の存在下でＮＲＴＩ−ＭＰ停止プライマーを解除する高い能力を示す（Arion D, Kaushik N, McCormick S, Borkow G, Parniak MA. Phenotypic mechanism of HIV-1 resistance to 3'-azido-3'-deoxythymidine (AZT): increased polymerization processivity and enhanced sensitivity to pyrophosphate of the mutant viral reverse transcriptase. Biochemistry. 1998, 37, 15908-17; Meyer PR, Matsuura SE, Mian AM, So AG, Scott WA. A mechanism of AZT resistance: an increase in nucleotide-dependent primer unblocking by mutant HIV-1 reverse transcriptase. Mol. Cell. 1999, 4, 35-43を参照）。切り取りメカニズムに関連するＮＲＴＩ耐性変異には、チミジン類似体変異（ＴＡＭＳ）
及びＴ６９Ｓ挿入変異が挙げられる。
【００１１】
ヒトの深刻な健康問題の原因となる別のウイルスはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）である。ＨＢＶは、ヒトの癌の原因でタバコに唯一次ぐ。ＨＢＶが癌を誘導するメカニズムは分かっていない。それは直接、腫瘍の発生を誘発するか、又は間接的に、慢性炎症、肝硬変、及び感染に関連する細胞の再生を介して腫瘍の発生を誘発することが仮定されている。
【００１２】
２〜６ヵ月の潜伏期間の後、宿主が通常感染に気付かない間に、ＨＢＶ感染は急性の肝炎や肝臓障害をもたらし、その結果、腹痛、黄疸及び特定の酵素の血中濃度の上昇を生じ得る。ＨＢＶは、急激に進行し、肝臓の大きな部分が破壊される疾患のために致死性であることが多い劇症肝炎の原因となり得る。
【００１３】
患者は通常、ＨＢＶ感染の急性期から回復する。しかしながら、一部の患者では、長い間、又は無限にウイルスが複製を続け、慢性感染を引き起こす。慢性感染は、慢性の持続性肝炎をもたらし得る。慢性の持続性ＨＢＶに感染した患者は開発途上国では最も一般的である。１９９１年半ばまでに、アジアだけでおよそ２２５００万人の慢性ＨＢＶキャリアが存在し、世界中ではほぼ３億人のキャリアが存在した。慢性の持続性肝炎は、疲労、肝硬変、及び原発肝癌である肝細胞癌の原因となり得る。
【００１４】
先進国では、ＨＢＶ感染の高リスク群には、ＨＢＶキャリア又はその血液試料と接触したヒトが含まれる。ＨＢＶの疫学は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳと類似しており、それは、ＨＢＶ感染がＨＩＶに感染した患者又はＡＩＤＳに罹っている患者で一般的である理由である。しかしながら、ＨＢＶはＨＩＶよりも広がり易い。
【００１５】
３ＴＣ（ラミブジン）、インターフェロンα−２ｂ、ペギインターフェロンα−２ｂ、ヘプセラ（アデフォビル、ジピボキシル）、バラクルード（エンテカビル）及びチゼカ（テルビブジン）は、ＨＢＶ感染を治療するために現在ＦＤＡに認可されている薬剤である。しかしながら、薬剤の一部は、重度の副作用を有し、これらの薬剤で治療された患者ではウイルス耐性が急速に進展する。
【００１６】
ノロウイルスは、エンベロープを持たないプラス鎖ＲＮＡのＣａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ科で見い出される４種のウイルス属の１つである。Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅのほかの３つの種は、ラゴウイルス、ベシウイルス及びサポウイルスである。サポウイルスは、ヒトを宿主として利用するノロウイルス以外の属の唯一のメンバーである。ノロウイルスのゲノムは、３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を持つおよそ７．５６ｋｂである。最初のＯＲＦは、ヘリカーゼ、プロテアーゼ及びＲＮＡを指向するＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）を含む非構造タンパク質をコードし、そのすべてはウイルスの複製に必要とされる。残りの２つのＯＲＦはカプシドタンパク質をコードする（Jiang, X. (1993) Virology 195(1):5１〜６1）。ノロウイルスの多数の株は５つの属内群に分類されており、そのうちのＩ、ＩＶ及びＶがヒトに感染し（Zheng, D.P., et al. (2006) Virology 346(2):312-323）、米国における毎年の食物関連疾患の４０％に相当するおよそ２３００万人の胃腸炎の原因となるとＣＤＣによって推定されている（Mead P.S. (1999) Emerg. Infect. Dis. 5(5):607-625）。
【００１７】
共通する症状は、嘔吐、下痢及び腸痙攣である。嘔吐は小児で最も一般的な症状である一方で。下痢は、感染した成人で一般的である。脱水は重要な懸念である。このウイルスによる失命は、米国では毎年約３００人の患者であり、これらの死亡は免疫系の弱い患者の間で普通である（Centers for Disease Control and Prevention. “Norwalk-like viruses:” public health consequences and outbreak management. MMWR 2001;50 (No. RR-9):3）。暴露から完全な感染までの潜伏期間は通常２４〜４８時間であり、感染個体の約３０％は症状を示さない。症状は一般に２４〜６０時間持続する（Adler, J.L. and Zickl, R., J. (1969) Infect. Dis. 119:668-673）。ウイルスの排出は、感染後２週間まで続く可能性があるが、このウイルスが感染性なのかどうかは明らかではない。
【００１８】
ノロウイルスは、汚染した食物又は水を介した糞便−経口の経路、ヒトからヒトへの接触、嘔吐又は糞便の試料の噴霧によって一義的に伝染する。糞便試料におけるウイルス力価は、ｍＬ当たり１０６〜１０７粒子に達することができ、粒子は０℃（３２°Ｆ）〜６０℃（１４０°Ｆ）の温度で安定である（Duizer, E. et al., (2004) Appl. Environ. Microbiol. 70(8); 4538-4543）。ウイルスは高度に感染性であり、種々の供給源によって感染は１０〜１００ほどの少ないウイルス粒子の接種を必要とし得ることが示唆されている（Centers for Disease Control and Prevention. “Norwalk-like viruses:” public health consequences and outbreak management. MMR 2001; 50(No. RR-9):3-6）。このことは、学校、介護施設、観光船、病院、又は人々が集まるそのほかの場所で流行をもたらす。
【００１９】
ノロウイルスは、Ｎｏｒｗａｌｋウイルスと名付けられ、名称は１９６８年オハイオ州、Ｎｏｒｗａｌｋの学校での発生に由来する。Ｎｏｒｗａｌｋ病に関与するウイルス粒子は、３人のヒト志願者を介した直腸塗抹標本フィルターの継代後、免疫電子顕微鏡によって１９７２年に特定された（Kapikian, A.Z. et al. (1972) J. Virol. 10:1075-1081）。その後、ウイルスは、その電子顕微鏡像のために小型球形ウイルス、カリシウイルスと呼ばれ、それ以来、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ科のメンバー及び／又は元々単離された株以降おそらく最も一般的なＮｏｒｗａｌｋ様ウイルスとなった。ウイルスの一般名には、冬嘔吐ウイルス、胃インフル、食中毒、及びウイルス性胃腸炎が挙げられる。感染の転帰が一般に命にかかわりないものである一方で、施設の使用の損失コスト及び生産性の損失は大きく、その結果、ヒトにおけるノロウイルス感染の治療のための治療法は非常に価値あるものである。
【００２０】
現在、ノロウイルス感染の認可された医薬治療はなく（http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/revb/gastro/norovirus-qa.htm）、これはおそらく少なくとも部分的には細胞培養系の利用性の欠如のためである。最近、元々のＮｏｒｗａｌｋＧ−Ｉ株についてレプリコン系が開発された（Chang, K. O., et al. (2006) Virology 353:463-473）。ノロウイルスのレプリコン及びＣ型肝炎レプリコンの双方は、レプリコンの複製が生じるようにウイルスのヘリカーゼ、プロテアーゼ及びポリメラーゼを必要とする。つい最近、ノロウイルス属内群Ｉ及びＩＩの植菌体を利用した試験管内細胞培養感染性アッセイが報告された（Straub, T. M. et al. (2007) Emerg. Infect. Dis. 13(3):396-403）。このアッセイは、マイクロキャリアビーズ上での小腸上皮細胞を利用して回転する壁の生物反応器にて行われるが、少なくとも当初、この方式で意味ある多数の化合物をスクリーニングするのは困難であったかのように思われる。最終的に、感染性アッセイは、侵入阻害剤をスクリーニングするのに有用であり得る。たとえば、Ｌｉｇｏｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社 (http://www.ligocyte.com/)のようなそのほかのグループは、ノロウイルスに対するワクチンを開発するために型決定に着目したが、その尽力は未だに成功しておらず、低いレプリカーゼの忠実性が進化上の利益であるウイルス系ではよくあるように困難であることが判明するかも知れない。
【００２１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、世界中で１．８億人を超える人々に感染している。毎年３〜４００万人の人々が新しく感染し、その７０％が慢性肝炎を発症する。ＨＣＶは、肝臓癌全症例の５０〜７６％に関与し、開発途上国の肝臓移植すべての３分の２に関与する。標準的な治療法［ペグ化したインターフェロンαにリバビリン（ヌクレオシド類似体）を加えたもの］は、患者の５０〜６０％に有効であるにすぎず、重大な副作用を伴う。従って、新しいＨＣＶ薬剤の差し迫ったニーズがある。
【００２２】
Ｃ型肝炎ウイルスは、ヌクレオカプシドに内包されたプラス鎖ＲＮＡと脂質エンベロープを含み、９．６ｋｂのリボヌクレオチドから成り、それは、約３０００アミノ酸の大きなポリペプチドをコードする（Dymock et al. Antiviral Chemistry & Chemotherapy 2000, 11, 79）。成熟後、このポリペプチドは少なくとも１０のタンパク質に切断される。これらのタンパク質の１つ、ＮＳ５Ｂは、ポリメラーゼ活性を持ち、鋳型として役立つ単鎖ウイルスＲＮＡゲノムからの二本鎖ＲＮＡの合成に関与する。ＨＣＶの複製を選択的に阻害する新規の抗ウイルス戦略の発見は、ＨＣＶの増殖のための好都合な細胞培養モデルの欠如によって長い間妨げられてきた。１９９９年のＨＣＶのレプリコン系の確立によってこのハードルが初めて克服され（Bartenschlager, R., Nat. Rev. Drug Discov. 2002, 1, 911−916 and Bartenschlager, R., J. Hepatol. 2005, 43, 210−216）、２００５年、堅牢なＨＣＶ細胞培養モデルが開発された（Wakita, T., et al., Nat. Med. 2005, 11, 79１〜６; Zhong, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2005, 102, 9294-9; Lindenbach, B.D., et al., Science 2005, 309, 623-6）。
【００２３】
ＨＣＶの複製は、ＮＳ５Ｂタンパク質の競合阻害を介したＮＳ５Ｂ’のポリメラーゼ活性の操作を通して妨害してもよい。或いは、連鎖停止剤ヌクレオシド類似体を、伸張しているＲＮＡ鎖に組み入れてもよい。最近、幾つかの特許出願（ＷＯ９９／４３６９１、ＷＯ０１／３２１５３、ＷＯ０１１６０３１５、ＷＯ０１１７９２４６、ＷＯ０１／９０１２１、ＷＯ０１／９２２８２、ＷＯ０２／４８１６５、ＷＯ０２／１８４０４、ＷＯ０２／０９４２８９、ＷＯ０２／０５７２８７、ＷＯ０２／１００４１５（Ａ２）、ＵＳ０６／０４０８９０、ＷＯ０２／０５７４２５、ＥＰ１６７４１０４（Ａ１）、ＥＰ１７０６４０５（Ａ１）、ＵＳ０６／１９９７８３、ＷＯ０２／３２９２０、ＵＳ０４／６７８４１６６、ＷＯ０５／０００８６４、ＷＯ０５／０２１５６８）が、抗ＨＣＶ剤としてヌクレオシド類似体を記載している。
【００２４】
増殖性障害は、命を脅かす主な疾患の１つであり、数十年間、広範に研究されてきた。癌は今や米国では第２位の死因であり、毎年５００，０００を超える人々がこの増殖性障害で死亡している。腫瘍は、細胞増殖の調節されない、組織されない増殖である。腫瘍は、侵襲性及び転移の特性を有するならば、悪性又は癌性である。侵襲性は、周辺組織に侵入し、組織の境界を規定する基底膜を突破し、それによって生体の循環系に侵入する腫瘍の傾向を指す。転移は、生体のほかの領域に移動し、最初の出現部位から離れた増殖領域を確立する腫瘍の傾向を指す。
【００２５】
癌は分子レベルでは完全には理解されていない。たとえば、特定のウイルス、特定の化学物質又は放射線への細胞の暴露が、「抑制」遺伝子を不活化し、又は「癌遺伝子」を活性化するＤＮＡの変化をもたらすことが知られている。抑制遺伝子は増殖調節遺伝子であり、変異するともはや細胞増殖を制御することができない。癌遺伝子は、当初正常な遺伝子（癌原遺伝子と呼ばれる）であり、変異又は発現の背景の変化によって形質転換遺伝子になる。形質転換遺伝子の産物は不適当な細胞増殖を引き起こす。２０を超える異なった正常の細胞性遺伝子が遺伝子変化によって癌遺伝子になることができる。形質転換された細胞は、細胞の形態、細胞と細胞の相互作用、膜の含量、細胞骨格の構造、タンパク質の分泌、遺伝子発現、及び死すべき運命（形質転換された細胞は無限に増殖することができる）を含む多数の点で正常細胞と異なる。
【００２６】
生体の種々の細胞型のすべては、良性の又は悪性の腫瘍細胞に形質転換され得る。最も頻繁な腫瘍部位は肺であり、直腸結腸、乳腺、前立腺、膀胱、膵臓及び次いで卵巣が続く。癌のそのほかの蔓延する型には、白血病、脳腫瘍を含む中枢神経系の癌、黒色腫、リンパ腫、赤白血病、子宮癌、及び頭頚部の癌が挙げられる。
【００２７】
癌は今や３つの治療手段、手術、放射線及び化学療法の１つ又は併用によって主として治療される。手術は冒された組織の全体的な除去を含む。手術は、特定の部位、たとえば、乳腺、結腸及び皮膚に位置する腫瘍を取り除くのに有効である一方で、背骨のようなほかの領域に位置する腫瘍の治療、又は白血病のような播種された新生物状態の治療にはそれを使用することはできない。
【００２８】
化学療法は、細胞の複製又は細胞の代謝の崩壊を含む。それは、乳癌、肺癌及び睾丸癌と同様に白血病の治療に最もよく使用される。癌の治療に現在使用されている化学療法剤には５つの主な部類：天然産物及びその誘導体；アントラサイクリン類；アルキル化剤；増殖抑制剤（代謝抑制剤とも呼ぶ）；及びホルモン剤がある。化学療法剤は抗癌剤とも呼ばれることが多い。
【００２９】
抗癌活性を示す５−フルオロウラシルのような幾つかの合成ヌクレオシドが特定されている。５−フルオロウラシルは、たとえば、癌腫、肉腫、皮膚癌、消化器癌及び乳癌を含む悪性腫瘍の治療に臨床的に使用されている。しかしながら、５−フルオロウラシルは、たとえば、吐き気、脱毛、下痢、胃痛、白血球血小板減少、食欲不振、色素沈着及び浮腫のような深刻な有害反応を引き起こす。
【００３０】
ワクチンの利用性にもかかわらず（Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2004, 41, 391-427）、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）は、深刻なヒトの健康懸念であり続け、毎年およそ３０，０００人の死亡の原因となっている。ＹＦＶはヒトの最も致死性の感染の１つである（Expert Rev. Vaccines 2005, 4, 553-574）。感染した個体のおよそ１５％が重篤な疾患を発症し、それらの個体の間で死亡率は２０〜５０％である。ＹＦＶの治療に特異的な認可された治療法はない。治療は、徴候性の休息、流体であり、イブプロフェン、ナプロキセン、アセタミノフェン又はパラセタモールは発熱及び疼痛の症状を緩和する可能性がある。アスピリンは回避すべきである。ウイルスは、アフリカ及び南アメリカに特有であるが、これらの領域外でのＹＦＶの発生の可能性があり、そのような輸入症例が報告されている（J. Travel Med. 2005, 12(Suppl. 1), S3−S11）。
【００３１】
西ナイルウイルス（ＷＮＶ）はＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科に由来し、大部分、蚊が媒介する疾患である。それは１９３７年ウガンダの西ナイル地区で発見された。米国疾病対策予防センターの報告によれば、ＷＮＶは、アフリカ、中近東、ヨーロッパ、オセアニア西及び中央アジア、及び北アメリカで見つかっている。北アメリカでの最初の出現は、１９９９年ニューヨーク大都市圏に始まった。それは、北アメリカでは、夏に発疹し、秋まで続く季節流行性であり、環境的健康に脅威を呈する。その天然のサイクルは、鳥−蚊−鳥及び哺乳類である。蚊、特に種、Ｃｕｌｅｘ  ｐｉｐｉｅｎｓは、感染した鳥を刺した場合、感染性になる。次いで感染した蚊が刺した場合、ほかの鳥やヒトを含む哺乳類にＷＮＶを広げる。ヒトやウマでは、致死的な脳炎が、ＷＮＶ感染の最も深刻な徴候である。ＷＮＶは一部の鳥でも致死性となり得る。ＷＮＶ感染に特異的な治療はない。軽い症状の場合、健康な人々でさえ数週間の病を得るが、人々は自身を伝播する発熱や疼痛のような症状を経験する。さらに重度の場合、人々は普通、支援治療を得ることができる病院に行く必要がある。
【００３２】
デング熱感染もＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科に由来し、シンガポールでは最も重要な節足動物由来の感染症である（Epidemiol News Bull 2006, 32,62-6）。世界的には、デング熱（ＤＦ）の症例は年当たり５０００万〜１億と推定され、デング出血熱（ＤＨＦ）症例は数１０万と推定されており、平均死亡率は５％である。多数の患者は、最少限の後遺症で又は後遺症なしでデング熱感染から回復する。デング熱感染は普通、無症候性であるが、古典的なデング熱、デング出血熱、又はデング熱ショック症候群を呈し得る。外来患者でさえ、適当な水分補給を維持する必要性は非常に重要である。デング熱感染は、静脈内輸液交換療法によって効果的に管理することができ、早期に診断されれば、死亡率を１％より低く保持することができる。疼痛や発熱を管理するには、デング熱感染が疑われる患者にはアセタミノフェン製剤を与えるべきである。アスピリン及び非ステロイド性抗炎症剤はデング熱感染の一部に併発する出血傾向を悪化させる可能性がある。しかしながら、以前記載されたデング熱感染の徴候の一部には、肝不全（Dig Dis Sci 2005, 50, 1146-7）、脳症（J Trop Med Public Health 1987, 18, 398-406）及びギラン・バレー症候群（Intern Med 2006, 45, 563-4）が挙げられる。
【００３３】
細胞培養のインキュベートの際、又は生体内への投与の際、多種多様の６−置換−３’−アジド−２’，３’−ジデオキシプリンヌクレオシドが相当する６−ヒドロキシ−３’−アジド−２’，３’−ジデオキシプリンヌクレオシドに変換されることが発見されている。我々は、種々のそのほかの６−置換プリンヌクレオシドについてこれが真実であることも見い出している。プロドラッグ、アバカビルと相当するＧ類似体、カルボビル（（−）カルボン酸２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシグアノシン）への生体内変換の場合のように、これらの化合物はＧ類似体又はＩ類似体のプロドラッグとして作用する。この変換は、生体内で潜在的な抗ウイルス剤として形成され得る６−置換−プリンヌクレオシド三リン酸の多様性を深刻に限定する。
【００３４】
後天性免疫不全症候群、ＡＩＤＳ−関連複合体、ＨＣＶ、ノロウイルス、サポロウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、癌及びＨＢＶが世界中で警告レベルに達しており、関係する患者に重大な、場合によっては悲劇的な影響を有するという事実の観点から、これらの疾患を治療する、宿主に対して毒性の低い新しい有効な医薬剤を提供する強いニーズが依然として存在する。
【００３５】
新しい抗ウイルス剤又は化学療法剤、これらの剤を含む組成物、及び特に薬剤耐性の癌又は変異ウイルスを治療するためにこれらの剤を用いた治療法を提供することは有利である。本発明は、そのような剤、組成物及び方法を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３６】
本発明は、宿主における癌、又はＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＣＶ、ノロウイルス、サポロウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、若しくはＨＢＶの感染を治療する又は予防するための化合物、方法及び組成物を提供する。方法には、癌、又はＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＣＶ、ノロウイルス、サポロウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、若しくはＨＢＶによる感染を治療する又は予防するために本明細書で記載されるような化合物の少なくとも１つの治療上若しくは予防上有効な量、又は癌、又はＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＣＶ、ノロウイルス、サポロウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、若しくはＨＢＶの感染の生物活性を低下させるのに十分な量を投与することが関与する。医薬組成物は、癌に罹った宿主、又はＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＣＶ、ノロウイルス、サポロウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、若しくはＨＢＶに感染した宿主を治療するために、薬学上許容可能なキャリア又は賦形剤と併用で、本明細書で記載されるような１以上の化合物を含む。製剤はさらに少なくとも１つのさらなる治療剤をさらに含むことができる。加えて、本発明は、そのような化合物を調製する方法を含む。
【００３７】
Ｃ型肝炎ウイルスのレプリコンと同様に、ノロウイルスのレプリコンは、レプリコンの複製が生じるように機能的であるウイルスのヘリカーゼ、プロテアーゼ及びポリメラーゼを必要とする。高処理能力アッセイにおいてレプリコンを使用することができ、それは、レプリコンの複製阻害によって証拠付けられるように、活性についてスクリーニングされる化合物が、ノロウイルスのヘリカーゼ、プロテアーゼ及び／又はポリメラーゼの機能する能力を阻害するかどうかを評価する。
【００３８】
化合物は、種々の６−置換−２−アミノプリンヌクレオシドの一リン酸又は一ホスホン酸の形態、又は一リン酸の形態の類似体であり、生体内に投与された場合、三リン酸化される。我々は、全く驚くべきことに、これらヌクレオシドの一リン酸プロドラッグ形態の調製がＧ類似体への変換から６位の置換を保護することを発見した。一リン酸プロドラッグを調製することによって、我々は、ヌクレオチド三リン酸をポリメラーゼ又は逆転写酵素に送達する方法を開発したが、それは、本発明の前には可能ではなかった、又は少なくとも治療に関連する濃度では可能ではなかった。本発明は、新しい及び新規の一連のヌクレオチド三リン酸が生体内で調製され、抗ウイルス剤又は抗癌剤として得られることを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００３９】
本明細書に記載される化合物には、β−Ｄ−及びβ−Ｌ−６−置換−２−アミノプリンヌクレオシドの一リン酸、ホスホン酸及びそのほかの類似体が含まれる。一実施形態では、活性化合物は、式（Ｉ）
【化１】
2012517443.tif 000003
（Ｉ）
のもの、又は薬学上許容可能なその塩、若しくはプロドラッグであり、
式中、
ｉ）Ｒ１は、親ヌクレオシドとして投与された際、生体内で取り外されてＯＨを形成する原子又は基であり、たとえば、ハロゲン、（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、ＯＲ’、Ｎ（Ｒ’）２、ＳＲ’、ＯＣＯＲ’、ＮＨＣＯＲ’、Ｎ（ＣＯＲ’）ＣＯＲ’、ＳＣＯＲ’、ＯＣＯＯＲ’及びＮＨＣＯＯＲ’であり、
各Ｒ’は独立してＨ、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）、低級ハロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）、低級アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ６）、低級アルケニル（Ｃ２〜Ｃ６）、低級アルキニル（Ｃ２〜Ｃ６）、低級シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ６）アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、又はアリールアルキルであり、その際、基は、上記で定義したような１以上の置換基、たとえば、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル及びアルコキシアルキルによって置換することができ；
ｉｉ）Ｗは独立して、Ｎ、ＣＨ、ＣＦ、ＣＣＮ、ＣＣ≡ＣＨ又はＣＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２であり；
ｉｉｉ）糖は一般式（ＩＩ）：
【化２】
2012517443.tif 000004
のリボース又は修飾されたリボースであり、
式中、
Ｙは、Ｏ又はＳであり；
Ｚは、ＣＬ２、ＣＬ２ＣＬ２、ＣＬ２ＯＣＬ２、ＣＬ２ＳＣＬ２、ＣＬ２Ｏ、ＯＣＬ２及びＣＬ２ＮＨＣＬ２から成る群から選択され、その際、Ｌは独立して、Ｈ、Ｆ、アルキル、アルケニル及びアルキニルから成る群から選択され、アルキル、アルケニル及びアルキニルは任意で１以上のヘテロ原子を含有してもよく；
Ａは、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、ＣＨＦ、ＣＦ２、Ｃ＝ＣＨ２、Ｃ＝ＣＨＦ又はＣ＝ＣＦ２であり；
Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｒ６’及びＲ７’は独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＯＨ、ＮＨＮＨ２、Ｎ３、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｓ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｒ、ＯＲ、ＳＲ、ＳＳＲ、ＮＨＲ及びＮＲ２から成る群から選択され；
糖が式（ＩＩ）である場合の式（Ｉ）について、ＡがＯである場合、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｒ７’はＨであり、Ｒ６’はＮ３であることができず；
糖が式（ＩＩ）である場合の式（Ｉ）について、ＡがＯ又はＳである場合、Ｒ７’はＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＯＨ、ＮＨＮＨ２、ＯＲ、ＳＲ、ＳＳＲ、ＮＨＲ及びＮＲ２であることができず；
Ｒは独立して、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、低級アルケニル、低級アルキニル、低級シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、アリール、アルキルアリール又はアリールアルキルであり、その際、基は、上記で定義したような１以上の置換基、たとえば、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル及びアルコキシアルキルによって置換することができ；
Ｒ２及びＲ３は、生体内に投与される際、理想的にはヌクレオシド一リン酸、一ホスホン酸、チオ一ホスホン酸、又はチオ一リン酸を提供することが可能であり、代表的なＲ２及びＲ３は独立して以下から選択され、
（ａ）Ｒ８が、Ｈ、Ｃ１−２０アルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、又は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシ、（ＣＨ２）１〜６ＣＯ２Ｒ９ａ、ハロゲン、Ｃ１〜６ハロアルキル−Ｎ（Ｒ９ａ）２、Ｃ１〜６アシルアミノ。−ＮＨＳＯ２Ｃ１〜６アルキル、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ９ａ）２、−ＳＯ２Ｃ１〜６アルキル、ＣＯＲ９ｂ、ニトロ及びシアノから成る群から独立して選択される１〜３の置換基によって任意で置換されるフェニル又はナフチルを含むが、これらに限定されないアリール、又はヘテロアリールであり、Ｒ９ａが独立してＨ又はＣ１−２０アルキルであり、Ｒ９ｂがＯＲ９ａ又は−Ｎ（Ｒ９ａ）２であるＯＲ８；
（ｂ）Ｒ１０ａ及びＲ１０ｂが
（ｉ）独立してＨ、Ｃ１−１０アルキル、−（ＣＨ２）ｒＮＲ９ａ２、Ｃ１〜６ヒドロキシアルキル、−ＣＨ２ＳＨ、−（ＣＨ２）２Ｓ（Ｏ）ｐＭｅ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル、（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル−（ＣＨ２）ｍＣＯＲ９ｂ、アリール及びアリール−Ｃ１−３アルキルから成る群から選択され、前記アリール基が任意で、ヒドロキシル、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、ニトロ及びシアノから成る群から選択される基で置換される；
（ｉｉ）Ｒ１０ａがＨであり、Ｒ１０ｂとＲ１２が一緒に（ＣＨ２）２〜４であり、隣接するＮ原子及びＣ原子を含む環を形成する；
（ｉｉｉ）Ｒ１０ａとＲ１０ｂが一緒に（ＣＨ２）ｎであり、環を形成する；
（ｉｖ）Ｒ１０ａとＲ１０ｂが双方共Ｃ１−６アルキルである；又は
（ｖ）Ｒ１０ａがＨであり、Ｒ１０ｂがＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２Ｐｈ、ＣＨ２−インドール−３−イル、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、ＣＨ２−イミダゾール−４−イル、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２（（４’−ＯＨ）−Ｐｈ）、ＣＨ２ＳＨ、又は低級シクロアルキルであり；ｐが０〜２であり、ｒが１〜６であり、ｎが４又は５であり、ｍが０〜３であり、Ｒ１１が、Ｈ、Ｃ１−１０アルキル、又はたとえば、低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロ、Ｃ３−１０シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロヘテロアルキル、たとえば、フェニルのようなアリール、たとえば、ピリジニルのようなヘテロアリール、置換アリール、又は置換へテロアリールで置換されるＣ１−１０アルキルであり、置換基がＣ１−５アルキル、又は低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロで置換されるＣ１−５アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル又はシクロアルキルであり、Ｒ１２が、Ｈ、Ｃ１−３アルキル若しくはＲ１０ａであり、又はＲ１０ｂとＲ１２が一緒に（ＣＨ２）２〜４であり、隣接するＮ原子及びＣ原子を含む環を形成する、
【化３】
2012517443.tif 000005
（ｃ）Ｏ連結脂質（リン脂質を含む）、Ｎ又はＯ連結のペプチド、Ｏ連結コレステロール又はＯ連結フィトステロール；
（ｄ）Ｒ２とＲ３が一緒になって形成する環、
【化４】
2012517443.tif 000006
その際、Ｗ２が、Ｃ１−６アルキル、ＣＦ３、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ、ＯＲ９ｃ、ＣＯ２Ｒ９ａ、ＣＯＲ９ａ、ハロゲン、Ｃ１−６ハロアルキル、−Ｎ（Ｒ９ａ）２、Ｃ１−６アシルアミノ、ＣＯ２Ｎ（Ｒ９ａ）２、ＳＲ９ａ、−ＮＨＳＯ２Ｃ１−６アルキル、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ９ａ）２、−ＳＯ２Ｃ１−６アルキル、ＣＯＲ９ｂ及びシアノから成る群から独立して選択される１〜３の置換基によって任意で置換されるフェニル又は単環式へテロアリールから成る群から選択され、その際、ａ）２つのへテロ原子があり、一方がＯである場合、他方はＯ又はＳであることができない；及びｂ）２つのへテロ原子があり、一方がＳである場合、他方はＯ又はＳであることができないという条件で、前記単環式へテロアリール及び置換された単環式へテロアリールは、Ｎ、Ｏ及びＳから成る群から独立して選択される１〜２のヘテロ原子を有し、Ｒ９ａは独立してＨ又はＣ１−６アルキルであり、Ｒ９ｂは−ＯＲ９ａ又は−Ｎ（Ｒ９ａ）２であり、Ｒ９ｃはＨ又はＣ１−６アシルである；
（ｅ）Ｒ１３が、Ｈ、Ｃ１−１０アルキル、及び、低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロ、Ｃ３−１０シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロヘテロアルキル、フェニルのようなアリール、ピリジニルのようなヘテロアリール、置換アリール又は置換へテロアリールによって任意で置換されるＣ１−１０アルキルから成る群から選択され、その際、置換基がＣ１−５アルキル、又は低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロ、Ｃ３−１０シクロアルキル、若しくはシクロアルキルで置換されるＣ１−５アルキルである、
【化５】
2012517443.tif 000007
（ｆ）Ｒ２とＲ３が一緒になって形成する環、
【化６】
2012517443.tif 000008
その際、Ｒ１４が、（ｉ）Ｈ、Ｃ１−１０アルキル、−（ＣＨ２）ｒＮＲ２９ａ、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、−ＣＨ２ＳＨ、−（ＣＨ２）２Ｓ（Ｏ）ｐＭｅ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル、（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル、−（ＣＨ２）ｍＣＯＲ９ｂ、アリール及びアリール−Ｃ１−３アルキル又はヘテロアリール及びヘテロアリール−Ｃ１−３アルキルから成る群から独立して選択され、前記アリール基及びヘテロアリール基は、ヒドロキシル、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、ニトロ及びシアノから成る群から選択される基によって任意で置換され、（ｉｉ）Ｒ１４が、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２Ｐｈ、ＣＨ２−インドール−３−イル、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、ＣＨ２−イミダゾール−４−イル、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２（（４’−ＯＨ）−Ｐｈ）、ＣＨ２ＳＨ又は低級シクロアルキルであり；ｐが０〜２であり、ｒが１〜６であり、ｍが０〜３であり、Ｑ１がＮＲ９ａ、Ｏ又はＳであり、Ｑ２が、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、アリール及びアリールＣ１−３アルキル、ヘテロアリール及びヘテロアリールＣ１−３アルキルであり、前記アリール基及びヘテロアリール基がヒドロキシル、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、フルオロ及びクロロから成る群から選択される基によって任意で置換され、Ｒ１１が、Ｈ、Ｃ１−１０アルキル、及び、低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロ、Ｃ３−１０シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロヘテロアルキル、フェニルのようなアリール、ピリジニルのようなヘテロアリール、置換アリール又は置換へテロアリールによって任意で置換されるＣ１−１０アルキルであり、その際、置換基がＣ１−５アルキル、又は低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロ、Ｃ３−１０シクロアルキル、若しくはシクロアルキルで置換されるＣ１−５アルキルであり、Ｒ１２が、Ｈ若しくはＣ１−３アルキルであり、又はＲ１４ｂとＲ１２が一緒になって（ＣＨ２）２〜４であり、隣接するＮ原子及びＣ原子を含む環を形成し；
ｉｖ）或いは糖が、一般式（ＩＩＩ）
【化７】
2012517443.tif 000009
（ＩＩＩ）
の修飾されたリボースであり、
式中、
Ａ、Ｒ２、Ｒ３、Ｙ、Ｚ、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’及びＲ７’は上記と同義であり、その際、糖が式（ＩＩＩ）である場合式（Ｉ）について、ＡはＯ又はＳであり、Ｒ７’はＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＯＨ、ＮＨＮＨ２、ＯＲ、ＳＲ、ＳＳＲ、ＮＨＲ及びＮＲ２であることができず、
Ｒは、独立して、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、低級アルケニル、低級アルキニル、低級シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、アリール、アルキルアリール又はアリールアルキルであり、その際、基は、上記で定義したような１以上の置換基、たとえば、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル及びアルコキシアルキルによって置換することができ；
ｖ）或いは、糖が、一般式（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）：
【化８】
2012517443.tif 000010
のジオキソラン又はオキサチオランであり、
式中、
ＶはＳ又はＳｅであり
Ｒ２、Ｒ３、Ｙ及びＺは上記と同義であり；
ｖｉ）或いは、糖が、一般式（ＶＩＩＩ）
【化９】
2012517443.tif 000011
のホスホニルメトキシアルキルであり、
式中、
Ｒ２、Ｒ３及びＹは上記と同義であり；
Ｒ１５が、アルキル（Ｃ１〜Ｃ６を含むが、これらに限定されない）、アルケニル（Ｃ２〜Ｃ６を含むが、これらに限定されない）及びアルキニル（Ｃ２〜Ｃ６を含むが、これらに限定されない）、シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ８を含むが、これらに限定されない）、アリール（Ｃ６〜Ｃ１０を含むが、これらに限定されない）、ヘテロアリール（Ｃ６〜Ｃ１０を含むが、これらに限定されない）、アリールアルキル及びアルキルアリールから成る群から選択され；
ｖｉｉ）あるいは、糖が、一般式（ＩＸ）又は（Ｘ）
【化１０】
2012517443.tif 000012
のものであり、
式中、
Ｒ２、Ｒ３及びＹは上記と同義であり；
Ｙ２が、Ｏ、Ｓ、ＳｅＮＲであり；
Ｒは、独立して、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、低級アルケニル、低級アルキニル、低級シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、アリール、アルキルアリール又はアリールアルキルであり、その際、基は、上記で定義したような１以上の置換基、たとえば、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル及びアルコキシアルキルによって置換することができ；
Ｒ１６及びＲ１７が、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＲ１８として定義され；
Ｒ１８が、Ｈ又は低級アシル（Ｃ１〜Ｃ６）であり；
ｖｉｉｉ）或いは、糖が、一般式（ＸＩ）：
【化１１】
2012517443.tif 000013
の修飾されたリボースであり、
式中、
Ｒ２、Ｒ３及びＹは上記と同義であり；
Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、及びＲ６’は上記と同義であり；
Ｒ１９が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｓ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｒであり、
Ｒは、独立して、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、低級アルケニル、低級アルキニル、低級シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、アリール、アルキルアリール又はアリールアルキルであり、その際、基は、上記で定義したような１以上の置換基、たとえば、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル及びアルコキシアルキルによって置換することができる。
【００４０】
本発明の一実施形態では、活性化合物は、式（Ｉ）のものであり、式中Ｒ６’は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＯＨ、ＮＨＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｓ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｒ、ＯＲ、ＳＲ、ＳＳＲ、ＮＨＲ及びＮＲ２から成る群から選択される。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、活性化合物は、式（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）又は（ＸＩＶ）：
【化１２】
2012517443.tif 000014
のもの、又は薬学上許容可能なその塩若しくはプロドラッグであり、
式中
Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｙ、Ａ及びＲ７’は上記と同義であり；
Ｒ２０は、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり、
Ｍは、Ｏ、Ｓ又はＮＲであり、
Ｒは、独立して、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、低級アルケニル、低級アルキニル、低級シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、アリール、アルキルアリール又はアリールアルキルであり、その際、基は、上記で定義したような１以上の置換基、たとえば、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル及びアルコキシアルキルによって置換することができ、
塩基は以下から選択される。
【化１３】
2012517443.tif 000015
【００４２】
本発明の別の実施形態では、活性化合物は、式（ＸＶ）又は（ＸＶＩ）：
【化１４】
2012517443.tif 000016
のもの、又は薬学上許容可能なその塩若しくはプロドラッグであり、
式中
Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｙ、Ａ、Ｒ７’及びＲ２０は上記と同義であり；
Ｒ２１は、Ｈ、Ｃ１−１０アルキル、又はたとえば、低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロ、Ｃ３−１０シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロヘテロアルキル、たとえば、フェニルのようなアリール、たとえば、ピリジニルのようなヘテロアリール、置換アリール、又は置換へテロアリールによって任意で置換されるＣ１−１０アルキルであり、置換基がＣ１−５アルキル、又は低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロで置換されるＣ１−５アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル又はシクロアルキルであり、
Ｒ２２は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２Ｐｈ、ＣＨ２−インドール−３−イル、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、ＣＨ２−イミダゾール−４−イル、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２（（４’−ＯＨ）−Ｐｈ）、ＣＨ２ＳＨ又は低級シクロアルキルである。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、活性化合物は、式（ＸＶＩＩ）又は（ＸＶＩＩＩ）：
【化１５】
2012517443.tif 000017
のものであり、式中、
Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｙ、Ｍ、Ｒ７’、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、及び塩基は上記と同義である。
【００４４】
本明細書で記載される化合物は、β−Ｌ又はβ−Ｄの立体配置、又はそのラセミ混合物を含むその混合物の形態であることができる。
【００４５】
５’−ＯＨ類似体を調製し、次いでこれらを一リン酸、一ホスホン酸又はそのほかの類似体に変換することによって化合物を調製することができる。
【００４６】
加えて、本明細書で記載される化合物は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＣＶ、ノロウイルス、サポロウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、癌及び／又はＨＢＶの阻害剤である。従って、これらの化合物は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＣＶ、ノロウイルス、サポロウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、癌及び／又はＨＢＶに同時感染している患者を治療するのに使用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ヒト末梢血単核（ＰＢＭ）細胞にて５０μＭのＲＳ−４５７の４時間のインキュベート後に形成されたヌクレオチドのＬＣ／ＭＳ解析を示す図である。
【図２】ＰＢＭ細胞にて５０μＭのＲＳ−５２７の４時間のインキュベート後に形成されたヌクレオチドのＬＣ／ＭＳ解析を示す図である。
【図３】ＰＢＭ細胞にて５０μＭのＲＳ−４６４の４時間のインキュベート後に形成されたヌクレオチドのＬＣ／ＭＳ解析を示す図である。
【図４】ＰＢＭ細胞にて５０μＭのＲＳ−５１２の４時間のインキュベート後に形成されたヌクレオチドのＬＣ／ＭＳ解析を示す図である。
【図５】ＰＢＭ細胞にて５０μＭのＲＳ−５０６の４時間のインキュベート後に形成されたヌクレオチドのＬＣ／ＭＳ解析を示す図である。
【図６】ＰＢＭ細胞にて５０μＭのＲＳ−６６７の４時間のインキュベート後に形成されたヌクレオチドのＬＣ／ＭＳ解析を示す図である。
【図７】５０μＭにて４時間、薬剤（化合物６４１５又はＡＺＧとも呼ばれるＲＦＳ−４５７のいずれか）と共にインキュベートした後のＭＴ−２細胞とＰＢＭ細胞におけるＡＺＧ−ＴＰのレベルを示す図である。
【図８】ＰＢＭ細胞にて５０μＭのＲＳ−７８８の４時間のインキュベート後に形成されたヌクレオチドのＬＣ／ＭＳ解析を示す図である。
【図９】ＰＢＭ細胞にて、デオキシコンフォルマイシン（ＤＣＦ）によって予備処理した５０μＭのＲＳ−７８８の４時間のインキュベート後に形成されたヌクレオチドのＬＣ／ＭＳ解析を示す図である。
【図１０】ＰＢＭ細胞にて５０μＭの（−）−β−Ｄ−２，６−ジアミノプリンジオキソラン（ＤＡＰＤ）の４時間のインキュベート後に形成されたヌクレオチドのＬＣ／ＭＳ解析を示す図である。
【図１１】ＰＢＭ細胞にて５０μＭのＲＳ−８６４の４時間のインキュベート後に形成されたヌクレオチドのＬＣ／ＭＳ解析を示す図である。
【図１２】ｘｘＬＡＩウイルスの遺伝子型の図式的な説明を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本明細書に記載される６−置換−２−アミノプリンヌクレオチド一リン酸プロドラッグは、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ノロウイルス、サポロウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、癌及び／又はＨＢＶに対して阻害活性を示す。従って、化合物を使用して宿主におけるウイルス感染を治療する若しくは予防することができ、又はウイルスの生物活性を低減することができる。宿主は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＣＶ、ノロウイルス、サポロウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、癌及び／又はＨＢＶに感染した哺乳類、特にヒトであり得る。方法には、本明細書で記載される１以上の６−置換−２−アミノプリンヌクレオチド一リン酸プロドラッグの有効量を投与することが関与する。
【００４９】
薬学上許容可能なキャリア又は賦形剤との併用で、本明細書で記載される１以上の化合物を含む医薬製剤も開示される。一実施形態では、製剤は、本明細書で記載される少なくとも１つの化合物と、少なくとも１つのさらなる治療剤を含む。
【００５０】
以下の定義を参照して本発明がさらによく理解されるであろう。
Ｉ．定義
【００５１】
用語「独立して」は、出願から出願へと独立して適用される、独立して変化する変数を示すために本明細書で使用される。従って、Ｒ”が「独立して炭素又は窒素」であるＲ”ＸＹＲ”のような化合物では、双方のＲ”は炭素であることができ、双方のＲ”は窒素であることができ、又は一方のＲ”が炭素であり、他方のＲ”が窒素であることができる。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、用語「エナンチオマーとして純粋」は、少なくともおよそ９５％、好ましくはおよそ９７％、９８％、９９％又は１００％のそのヌクレオチドの単一のエナンチオマーを含むヌクレオチド組成物を指す。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、用語「実質的に含まない」又は「実質的に非存在下で」は、そのヌクレオチドの指定されたエナンチオマーの少なくとも８５〜９０重量％、好ましくは９５〜９８重量％、一層さらに好ましくは９９〜１００重量％を含むヌクレオチド組成物を指す。好ましい実施形態では、本明細書で記載される化合物は実質的にエナンチオマーを含まない。
【００５４】
同様に用語「単離された」は、少なくとも８５〜９０重量％、好ましくは９５〜９８重量％、一層さらに好ましくは９９〜１００重量％のヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を指し、残りはそのほかの化学種又はエナンチオマーを含む。
【００５５】
用語「アルキル」は本明細書で使用されるとき、特定されない限り、飽和した直鎖、分枝鎖又は環状の１級、２級、又は３級の炭化水素を指し、置換されたアルキル基及び非置換のアルキル基の双方を含む。たとえば、参照によって本明細書に組み入れられるＧｒｅｅｎｅら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１で教示されるように、当業者に既知であるように、必要に応じて非保護である又は保護されている、たとえば、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アシル、アリール、アシルオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル誘導体、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、チオール、イミン、スルホニル、スルファニル、スルフィニル、スルファモニル、エステル、カルボン酸、アミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホリル、ホスフィン、チオエステル、チオエーテル、酸ハロゲン化合物、無水物、オキシム、ヒドラジン、カルバメート、リン酸、ホスホネートを含むが、これらに限定されない反応を妨害せず、又は工程に改善を提供する部分によってアルキル基を任意で置換することができる。具体的に含まれるのは、ＣＦ３及びＣＨ２ＣＦ３である。
【００５６】
本文では、用語Ｃ（アルキル範囲）が使用される場合はいつでも、その用語は、具体的に且つ別々に設定されるかのように、そのクラスの各数を独立して含む。用語「アルキル」は、Ｃ１〜２２のアルキル部分を含み、用語「低級アルキル」はＣ１〜６アルキル部分を含む。関連するアルキルラジカルが、接尾辞「−ａｎｅ」を接尾辞「−ｙｌ」で置き換えることによって名付けられることが当業者に理解される。
【００５７】
用語「アルケニル」は、１以上の二重結合を含んで、直鎖又は分枝鎖の不飽和炭化水素ラジカルを指す。本明細書で開示されるアルケニル基は、アルキル部分における置換基について記載されるものを含むが、これらに限定されない、反応工程に有害に影響を及ぼさない任意の部分によって任意で置換することができる。アルケニル基の非限定例には、エチレン、メチルエチレン、イソプロピリデン、１，２−エタン−ジイル、１，１−エタン−ジイル、１，３−プロパン−ジイル、１，２−プロパン−ジイル、１，３−ブタン−ジイル、及び１，４−ブタン−ジイルが挙げられる。
【００５８】
用語「アルキニル」は、１以上の三重結合を含んで、直鎖又は分枝鎖の不飽和の非環状炭化水素ラジカルを指す。アルキニル基は、アルキル部分における置換基について記載されるものを含むが、これらに限定されない、反応工程に有害に影響を及ぼさない任意の部分によって任意で置換することができる。アルキニル基の非限定例には、エチニル、プロピニル、ヒドロキシプロピニル、ブチン−１−イル、ブチン−２−イル、ペンチン−１−イル、ペンチン−２−イル、４−メトキシペンチン−２−イル、３−メチルブチン−１−イル、ヘキシン−１−イル、ヘキシン−２−イル、及びヘキシン−３−イル、３，３−ジメチルブチン−１−イルのラジカルが挙げられる。
【００５９】
用語「アルキルアミノ」又は「アリールアミノ」は、それぞれ１又は２のアルキル又はアリールの置換基を有するアミノ基を指す。
【００６０】
用語「保護された」は、本明細書で使用されるとき、特に定義されない限り、酸素原子、窒素原子又はリン原子に添加されてさらなる反応又はそのほかの目的を妨げる基を指す。多種多様な酸素及び窒素を保護する基が有機合成の当業者に既知であり、たとえば、Ｇｒｅｅｎｅらの上記Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓに記載されている。
【００６１】
用語「アリール」は単独で、又は組み合わせにて、環がペンダントの形式で一緒に連結され得る又は縮合され得る、１、２、又は３の環を含有する炭素環式の芳香族系を意味する。アリールの非限定例には、フェニル、ビフェニル若しくはナフチル、又は芳香族環から水素を取り外した後、残るそのほかの芳香族基が挙げられる。用語アリールは、置換された部分及び非置換の部分の双方を含む。アリール基は、アルキル基について上述されたものを含むが、これらに限定されない、反応工程に有害に影響を及ぼさない任意の部分によって任意で置換することができる。置換されたアリールの非限定例には、ヘテロアリールアミノ、Ｎ−アリール−Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ−ヘテロアリールアミノ−Ｎ−アルキルアミノ、ヘテロアラルコキシ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アリールチオ、モノアリールアミノスルホニル、アリールスルホンアミド、ジアリールアミノスルホニル、モノアリール、アミドスルホニル、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールチオ、ヘテロアリールスルフィニル、ヘテロアリールスルホニル、アロイル、ヘテロアロイル、アラルカノイル、ヘテロアラルカノイル、ヒドロキシアラルキル、ヒドロキシへテロアラルキル、ハロアルコキシアルキル、アリール、アラルキル、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールオキシアルキル、飽和へテロシクリル、部分飽和へテロシクリル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールオキシアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルケニル、及びヘテロアリールアルケニル、カルボアラルコキシが挙げられる。
【００６２】
用語「アルカリル」又は「アルキルアリール」は、アリール置換基を持つアルキル基を指す。用語「アラルキル」又は「アリールアルキル」はアルキル置換基を持つアリール基を指す。
【００６３】
用語「ハロ」は本明細書で使用されるとき、クロロ、ブロモ、ヨード及びフルオロを含む。
【００６４】
用語「アシル」は、エステル基の非カルボニル部分が、直鎖、分枝鎖若しくは環状のアルキル若しくは低級アルキル、メトキシメチルを含むが、これに限定されないアルコキシアルキル、ベンジルを含むが、これに限定されないアラルキル、フェノキシメチルのようなアリールオキシアルキル、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、アルキル（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３及びＣ４を含むが、これに限定されない）又はアルコキシ（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３及びＣ４を含むが、これに限定されない）によって任意で置換されるフェニルを含むが、これに限定されないアリール、メタンスルホニルを含むが、これに限定されないアルキル若しくはアラルキルスルホニルのようなスルホン酸エステル、モノ、ジ若しくはトリ−リン酸エステル、トリチル若しくはモノメトキシトリチル、置換ベンジル、トリアルキルシリル（たとえば、ジメチル−ｔ−ブチルシリル）若しくはジフェニルメチルシリルから選択されるカルボン酸エステルを指す。エステルにおけるアシル基は任意でフェニル基を含む。用語「低級アシル」は、非カルボニル部分が低級アルキルであるアシル基を指す。
【００６５】
用語「アルコキシ」及び「アルコキシアルキル」は、たとえば、メトキシラジカルのような、直鎖又は分枝鎖のオキシを含有する、アルキル部分を有するラジカルを包含する。用語「アルコキシアルキル」もまた、アルキルラジカルに連結する１以上のアルコキシラジカルを有する、すなわち、モノアルコキシアルキル及びジアルコキシアルキルのラジカルを形成するアルキルラジカルを包含する。「アルコキシ」ラジカルはさらに、１以上のハロ原子、たとえば、フルオロ、クロロ、又はブロモによって置換されて「ハロアルコキシ」ラジカルを提供することができる。そのようなラジカルの例には、フルオロメトキシ、クロロメトキシ、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、フルオロエトキシ、テトラフルオロエトキシ、ペンタフルオロエトキシ、及びフルオロプロポキシが挙げられる。
【００６６】
用語「アルキルアミノ」は、それぞれアミノラジカルに連結される１又は２のアルキルラジカルを含有する「モノアルキルアミノ」又は「ジアルキルアミノ」を示す。用語アリールアミノは、それぞれアミノラジカルに連結される１又は２のアリールラジカルを含有するモノアリールアミノ又はジアリールアミノを示す。用語「アラルキルアミノ」はアミノラジカルに連結されるアラルキルラジカルを包含する。用語アラルキルアミノは、それぞれアミノラジカルに連結される１又は２のアラルキルラジカルを含有するモノアラルキルアミノ又はジアラルキルアミノを示す。用語アラルキルアミノはさらに、アミノラジカルに連結されたアラルキルラジカル１つとアルキルラジカル１つを含有する「モノアラルキルモノアルキルラジカル」を示す。
【００６７】
用語「ヘテロ原子」は、本明細書で使用されるとき、酸素、イオウ、窒素及びリンを指す。
【００６８】
用語「ヘテロアリール」又は「ヘテロ芳香族」は、本明細書で使用されるとき、芳香族環に少なくとも１つのイオウ、酸素、窒素又はリンを含む芳香族を指す。
【００６９】
用語「複素環」「ヘテロシクリル」及び「シクロヘテロアルキル」は、たとえば、環に３〜１０の原子を含み、環に少なくとも１つのヘテロ原子、たとえば、酸素、イオウ、窒素又はリンがある非芳香族の環状基を指す。
【００７０】
ヘテロアリール基及び複素環基の非限定例には、フリル、フラニル、ピリジル、ピリミジル、チエニル、イソチアゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、ピラジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、キノリル、イソキノリル、ベンゾチエニル、イソベンゾフリル、ピラゾリル、インドリル、イソインドリル、ベンズイミダゾリル、プリニル、カルバゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、イソオキサゾリル、ピロリル、キナゾリニル、シンノリニル、フタラジニル、キサンチニル、ヒポキサンチニル、チオフェン、フラン、ピロール、イソピロール、ピラゾール、イミダゾール、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリミジン又はピリダジン、及びプテリジニル、アジリジン、チアゾール、イソチアゾール、１，２，３−オキサジアゾール、チアジン、ピリジン、ピラジン、ピペラジン、ピロリジン、オキサジラン、フェナジン、フェノチアジン、モルフォリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピラジニル、キノキサリニル、キサンチニル、ヒポキサンチニル、プテリジニル、５−アザシチジニル、５−アザウラシリル、トリアゾロピリジニル、イミダゾロピリジニル、ピロロピリミジニル、ピラゾロピリミジニル、アデニン、Ｎ６−アルキルプリン、Ｎ６−ベンジルプリン、Ｎ６−ハロプリン、Ｎ６−ビニルプリン、Ｎ６−アセチレン性プリン、Ｎ６−アシルプリン、Ｎ６−ヒドロキシアルキルプリン、Ｎ６−チオアルキルプリン、チミン、シトシン、６−アザピリミジン、２−メルカプトピリミジン、ウラシル、Ｎ５−アルキルピリミジン、Ｎ５−ベンジルピリミジン、Ｎ５−ハロピリミジン、Ｎ５−ビニルピリミジン、Ｎ５−アセチレン性ピリミジン、Ｎ５−アシルピリミジン、Ｎ５−ヒドロキシアルキルプリン、及びＮ６−チオアルキルプリン、及びイソキサゾリルが挙げられる。ヘテロ芳香族基は、アリールについて上述されたように任意で置換することができる、複素環基又はヘテロ芳香族基は、ハロゲン、ハロアルキル、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシル誘導体、アミド、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノから選択される１以上の置換基によって任意で置換することができる。所望であれば、ヘテロ芳香族は、部分的に又は全体的に水素化することができる。非限定例として、ピリジンの代わりにジヒドロキシピリジンを使用することができる。複素環基又はヘテロアリール基における官能的な酸素気及び窒素基は、必要に応じて又は所望であれば保護することができる。好適な保護基は当業者に周知であり、トリメチルシリル、ジメチルヘキシルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、及びｔ−ブチルジフェニルシリル、トリチル又は置換トリチル、アルキル基、アセチルとプロピオニルのようなアシル基、メタンスルホニル、及びｐ−トルエンスルホニルが挙げられる。複素環基又はヘテロ芳香族基は、アリールについて上述されたものを含むが、これらに限定されない、反応に有害に影響を及ぼさない任意の部分によって置換することができる。
【００７１】
用語「宿主」は本明細書で使用されるとき、細胞株、及び動物、好ましくはヒトを含むが、これらに限定されない、ウイルスが複製できる単細胞生物又は多細胞生物を指す。或いは、宿主は、ウイルスのゲノムの一部を運びつつあることができ、その複製又は機能は、本発明の化合物によって改変することができる。用語、宿主は具体的には、感染細胞、ウイルスゲノムのすべて又は一部によって形質転換された細胞、動物、特に霊長類（チンパンジーを含むが、これらに限定されない）及びヒトを指す。本発明の動物適用のほとんどでは、宿主はヒト患者である。しかしながら、特定の適応では、獣医領域の適用が本発明によって明瞭に企図される（たとえば、チンパンジーを治療することにおける使用のために）。
【００７２】
用語「ペプチド」は、一方のアミノ酸のカルボキシル基によって別のアミノ酸のアミノ基に連結された２〜１００のアミノ酸を含有する種々の天然の又は合成の化合物を指す。
【００７３】
用語「薬学上許容可能な塩又はプロドラッグ」は明細書全体を通して使用され、患者に投与する際、ヌクレオチド一リン酸化合物を提供する、ヌクレオチド化合物の薬学上許容可能な形態（たとえば、エステル、リン酸エステル、エステル又は関連する基の塩）を記載する。薬学上許容可能な塩には、薬学上許容可能な無機又は有機の塩基及び酸に由来するものが挙げられる。好適な塩には、薬学技術で周知である多数のそのほかの酸の中で、たとえば、カリウム及びナトリウムのようなアルカリ金属、たとえば、カルシウム及びマグネシウムのようなアルカリ土類金属に由来するものが挙げられる。薬学上許容可能なプロドラッグは、宿主において代謝されて、たとえば、加水分解又は酸化されて本発明の化合物を形成する化合物を指す。プロドラッグの典型的な例には、活性化合物の官能部分において生物学的に不安定な保護基を有する化合物が挙げられる。プロドラッグには、酸化されて、還元されて、アミノ化されて、脱アミノ化されて、水酸化されて、脱水酸化されて、加水分解されて、脱加水分解されて、アルキル化されて、脱アルキル化されて、アシル化されて、脱アシル化されて、リン酸化されて又は脱リン酸化されて活性化合物を産出する化合物が挙げられる。本発明の化合物のプロドラッグ形態は、抗ウイルス活性を持つことができ、代謝されてそのような活性を示す化合物を形成することができ、又はその双方であることができる。
【００７４】
プロドラッグにはまた、開示されたヌクレオシドのアミノ酸エステルも挙げられる（たとえば、その本文が参照によって組み入れられ、アシクロビル自体と比べて改善された水溶解度を示すアシクロビルのアミノ酸エステル、特にグリシン及びアラニンのエステルを記載する欧州特許明細書第９９４９３号、及びα−炭素原子に隣接して分岐する側鎖を特徴とし、アラニン及びグリシンのエステルに比べて経口投与後、改善された生体利用効率を示すアシクロビルのバリンエステルを開示している米国特許第４，９５７，９２４号（Ｂｅａｕｃｈａｍｐ）を参照のこと）。そのようなアミノ酸エステルを調製する方法は、米国特許第４，９５７，９２４号（Ｂｅａｕｃｈａｍｐ）に開示されており、その本文は参照によって組み入れられる。バリン自体の使用に代えて、アミノ酸の機能的同等物を使用することができる（たとえば、酸塩化物のような酸ハロゲン化合物、又は酸無水物）。そのような場合、望ましくない副反応を回避するには、アミノ保護の誘導体を使用することが有利であってもよい。
ＩＩ．活性化合物
【００７５】
本発明の一実施形態では、活性化合物は、式（Ｉ）のもの
【化１６】
2012517443.tif 000018
又は、薬学上許容可能なその塩若しくはプロドラッグであり、式中、
ｉｉｉ）Ｒ１は、親ヌクレオシドとして投与された際、生体内で取り外されてＯＨを形成する原子又は基であり、たとえば、ハロゲン、（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、ＯＲ’、Ｎ（Ｒ’）２、ＳＲ’、ＯＣＯＲ’、ＮＨＣＯＲ’、Ｎ（ＣＯＲ’）ＣＯＲ’、ＳＣＯＲ’、ＯＣＯＯＲ’及びＮＨＣＯＯＲ’であり、
各Ｒ’は独立してＨ、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）、低級ハロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）、低級アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ６）、低級アルケニル（Ｃ２〜Ｃ６）、低級アルキニル（Ｃ２〜Ｃ６）、低級シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ６）アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、又はアリールアルキルであり、その際、基は、上記で定義したような１以上の置換基、たとえば、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル及びアルコキシアルキルによって置換することができ；
ｉｖ）Ｗは独立して、Ｎ、ＣＨ、ＣＦ、ＣＣＮ、ＣＣ≡ＣＨ又はＣＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２であり；
ｉｘ）糖は一般式（ＩＩ）：
【化１７】
2012517443.tif 000019
のリボース又は修飾されたリボースであり、
式中、
Ｙは、Ｏ又はＳであり；
Ｚは、ＣＬ２、ＣＬ２ＣＬ２、ＣＬ２ＯＣＬ２、ＣＬ２ＳＣＬ２、ＣＬ２Ｏ、ＯＣＬ２及びＣＬ２ＮＨＣＬ２から成る群から選択され、その際、Ｌは独立して、Ｈ、Ｆ、アルキル、アルケニル及びアルキニルから成る群から選択され、アルキル、アルケニル及びアルキニルは任意で１以上のヘテロ原子を含有してもよく；
Ａは、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、ＣＨＦ、ＣＦ２、Ｃ＝ＣＨ２、Ｃ＝ＣＨＦ又はＣ＝ＣＦ２であり；
Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｒ６’及びＲ７’は独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＯＨ、ＮＨＮＨ２、Ｎ３、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｓ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｒ、ＯＲ、ＳＲ、ＳＳＲ、ＮＨＲ及びＮＲ２から成る群から選択され；
糖が式（ＩＩ）である場合の式（Ｉ）について、ＡがＯである場合、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｒ７’はＨであり、Ｒ６’はＮ３であることができず；
糖が式（ＩＩ）である場合の式（Ｉ）について、ＡがＯ又はＳである場合、Ｒ７’はＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＯＨ、ＮＨＮＨ２、ＯＲ、ＳＲ、ＳＳＲ、ＮＨＲ及びＮＲ２であることができず；
Ｒは独立して、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、低級アルケニル、低級アルキニル、低級シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、アリール、アルキルアリール又はアリールアルキルであり、その際、基は、上記で定義したような１以上の置換基、たとえば、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル及びアルコキシアルキルによって置換することができ；
Ｒ２及びＲ３は、生体内に投与される際、理想的にはヌクレオシド一リン酸、一ホスホン酸、チオ一ホスホン酸、又はチオ一リン酸を提供することが可能であり、代表的なＲ２及びＲ３は独立して以下から選択され、
（ａ）Ｒ８が、Ｈ、Ｃ１−２０アルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、又は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシ、（ＣＨ２）１〜６ＣＯ２Ｒ９ａ、ハロゲン、Ｃ１〜６ハロアルキル−Ｎ（Ｒ９ａ）２、Ｃ１〜６アシルアミノ。−ＮＨＳＯ２Ｃ１〜６アルキル、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ９ａ）２、−ＳＯ２Ｃ１〜６アルキル、ＣＯＲ９ｂ、ニトロ及びシアノから成る群から独立して選択される１〜３の置換基によって任意で置換されるフェニル又はナフチルを含むが、これらに限定されないアリール、又はヘテロアリールであり、Ｒ９ａが独立してＨ又はＣ１−２０アルキルであり、Ｒ９ｂがＯＲ９ａ又は−Ｎ（Ｒ９ａ）２であるＯＲ８；
（ｂ）Ｒ１０ａ及びＲ１０ｂが
（ｉ）独立してＨ、Ｃ１−１０アルキル、−（ＣＨ２）ｒＮＲ９ａ２、Ｃ１〜６ヒドロキシアルキル、−ＣＨ２ＳＨ、−（ＣＨ２）２Ｓ（Ｏ）ｐＭｅ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル、（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル−（ＣＨ２）ｍＣＯＲ９ｂ、アリール及びアリール−Ｃ１−３アルキルから成る群から選択され、前記アリール基が任意で、ヒドロキシル、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、ニトロ及びシアノから成る群から選択される基で置換される；
（ｉｉ）Ｒ１０ａがＨであり、Ｒ１０ｂとＲ１２が一緒に（ＣＨ２）２〜４であり、隣接するＮ原子及びＣ原子を含む環を形成する；
（ｉｉｉ）Ｒ１０ａとＲ１０ｂが一緒に（ＣＨ２）ｎであり、環を形成する；
（ｉｖ）Ｒ１０ａとＲ１０ｂが双方共Ｃ１−６アルキルである；又は
（ｖ）Ｒ１０ａがＨであり、Ｒ１０ｂがＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２Ｐｈ、ＣＨ２−インドール−３−イル、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、ＣＨ２−イミダゾール−４−イル、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２（（４’−ＯＨ）−Ｐｈ）、ＣＨ２ＳＨ、又は低級シクロアルキルであり；ｐが０〜２であり、ｒが１〜６であり、ｎが４又は５であり、ｍが０〜３であり、Ｒ１１が、Ｈ、Ｃ１−１０アルキル、又はたとえば、低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロで置換されるＣ１−１０アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロヘテロアルキル、たとえば、フェニルのようなアリール、たとえば、ピリジニルのようなヘテロアリール、置換アリール、又は置換へテロアリールであり、置換基がＣ１−５アルキル、又は低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロで置換されるＣ１−５アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル又はシクロアルキルであり、Ｒ１２が、Ｈ、Ｃ１−３アルキル若しくはＲ１０ａであり、又はＲ１０ｂとＲ１２が一緒に（ＣＨ２）２〜４であり、隣接するＮ原子及びＣ原子を含む環を形成する、
【化１８】
2012517443.tif 000020
（ｃ）Ｏ連結脂質（リン脂質を含む）、Ｎ又はＯ連結のペプチド、Ｏ連結コレステロール又はＯ連結フィトステロール；
（ｄ）Ｒ２とＲ３が一緒になって形成する環、
【化１９】
2012517443.tif 000021
その際、Ｗ２が、Ｃ１−６アルキル、ＣＦ３、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ、ＯＲ９ｃ、ＣＯ２Ｒ９ａ、ＣＯＲ９ａ、ハロゲン、Ｃ１−６ハロアルキル、−Ｎ（Ｒ９ａ）２、Ｃ１−６アシルアミノ、ＣＯ２Ｎ（Ｒ９ａ）２、ＳＲ９ａ、−ＮＨＳＯ２Ｃ１−６アルキル、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ９ａ）２、−ＳＯ２Ｃ１−６アルキル、ＣＯＲ９ｂ及びシアノから成る群から独立して選択される１〜３の置換基によって任意で置換されるフェニル又は単環式へテロアリールから成る群から選択され、その際、ａ）２つのへテロ原子があり、一方がＯである場合、他方はＯ又はＳであることができない；及びｂ）２つのへテロ原子があり、一方がＳである場合、他方はＯ又はＳであることができないという条件で、前記単環式へテロアリール及び置換された単環式へテロアリールは、Ｎ、Ｏ及びＳから成る群から独立して選択される１〜２のヘテロ原子を有し、Ｒ９ａは独立してＨ又はＣ１−６アルキルであり、Ｒ９ｂは−ＯＲ９ａ又は−Ｎ（Ｒ９ａ）２であり、Ｒ９ｃはＨ又はＣ１−６アシルである；
（ｅ）Ｒ１３が、Ｈ、Ｃ１−１０アルキル、及び、低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロ、Ｃ３−１０シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロヘテロアルキル、フェニルのようなアリール、ピリジニルのようなヘテロアリール、置換アリール又は置換へテロアリールによって任意で置換されるＣ１−１０アルキルから成る群から選択され、その際、置換基がＣ１−５アルキル、又は低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロ、Ｃ３−１０シクロアルキル、若しくはシクロアルキルで置換されるＣ１−５アルキルである、
【化２０】
2012517443.tif 000022
（ｆ）Ｒ２とＲ３が一緒になって形成する環、
【化２１】
2012517443.tif 000023
その際、Ｒ１４が、（ｉ）Ｈ、Ｃ１−１０アルキル、−（ＣＨ２）ｒＮＲ２９ａ、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、−ＣＨ２ＳＨ、−（ＣＨ２）２Ｓ（Ｏ）ｐＭｅ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル、（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル、−（ＣＨ２）ｍＣＯＲ９ｂ、アリール及びアリール−Ｃ１−３アルキル又はヘテロアリール及びヘテロアリール−Ｃ１−３アルキルから成る群から独立して選択され、前記アリール基及びヘテロアリール基は、ヒドロキシル、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、ニトロ及びシアノから成る群から選択される基によって任意で置換され、（ｉｉ）Ｒ１４が、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２Ｐｈ、ＣＨ２−インドール−３−イル、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、ＣＨ２−イミダゾール−４−イル、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２（（４’−ＯＨ）−Ｐｈ）、ＣＨ２ＳＨ又は低級シクロアルキルであり；ｐが０〜２であり、ｒが１〜６であり、ｍが０〜３であり、Ｑ１がＮＲ９ａ、Ｏ又はＳであり、Ｑ２が、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、アリール及びアリールＣ１−３アルキル、ヘテロアリール及びヘテロアリールＣ１−３アルキルであり、前記アリール基及びヘテロアリール基がヒドロキシル、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、フルオロ及びクロロから成る群から選択される基によって任意で置換され、Ｒ１１が、Ｈ、Ｃ１−１０アルキル、及び、低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロ、Ｃ３−１０シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロヘテロアルキル、フェニルのようなアリール、ピリジニルのようなヘテロアリール、置換アリール又は置換へテロアリールによって任意で置換されるＣ１−１０アルキルであり、その際、置換基がＣ１−５アルキル、又は低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロ、Ｃ３−１０シクロアルキル、若しくはシクロアルキルで置換されるＣ１−５アルキルであり、Ｒ１２が、Ｈ若しくはＣ１−３アルキルであり、又はＲ１４ｂとＲ１２が一緒になって（ＣＨ２）２〜４であり、隣接するＮ原子及びＣ原子を含む環を形成し；
ｘ）或いは糖が、一般式（ＩＩＩ）
【化２２】
2012517443.tif 000024
の修飾されたリボースであり、
式中、
Ａ、Ｒ２、Ｒ３、Ｙ、Ｚ、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ６’及びＲ７’は上記と同義であり、その際、糖が式（ＩＩＩ）である場合式（Ｉ）について、ＡはＯ又はＳであり、Ｒ７’はＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＯＨ、ＮＨＮＨ２、ＯＲ、ＳＲ、ＳＳＲ、ＮＨＲ及びＮＲ２であることができず、
Ｒは、独立して、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、低級アルケニル、低級アルキニル、低級シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、アリール、アルキルアリール又はアリールアルキルであり、その際、基は、上記で定義したような１以上の置換基、たとえば、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル及びアルコキシアルキルによって置換することができ；
ｘｉ）或いは、糖が、一般式（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）：
【化２３】
2012517443.tif 000025
のジオキソラン又はオキサチオランであり、
式中、
ＶはＳ又はＳｅであり
Ｒ２、Ｒ３、Ｙ及びＺは上記と同義であり；
ｘｉｉ）或いは、糖が、一般式（ＶＩＩＩ）
【化２４】
2012517443.tif 000026
のホスホニルメトキシアルキルであり、
式中、
Ｒ２、Ｒ３及びＹは上記と同義であり；
Ｒ１５が、アルキル（Ｃ１〜Ｃ６を含むが、これらに限定されない）、アルケニル（Ｃ２〜Ｃ６を含むが、これらに限定されない）及びアルキニル（Ｃ２〜Ｃ６を含むが、これらに限定されない）、シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ８を含むが、これらに限定されない）、アリール（Ｃ６〜Ｃ１０を含むが、これらに限定されない）、ヘテロアリール（Ｃ６〜Ｃ１０を含むが、これらに限定されない）、アリールアルキル及びアルキルアリールから成る群から選択され；
ｘｉｉｉ）あるいは、糖が、一般式（ＩＸ）又は（Ｘ）
【化２５】
2012517443.tif 000027
のものであり、
式中、
Ｒ２、Ｒ３及びＹは上記と同義であり；
Ｙ２が、Ｏ、Ｓ、ＳｅＮＲであり；
Ｒは、独立して、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、低級アルケニル、低級アルキニル、低級シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、アリール、アルキルアリール又はアリールアルキルであり、その際、基は、上記で定義したような１以上の置換基、たとえば、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル及びアルコキシアルキルによって置換することができ；
Ｒ１６及びＲ１７が、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＲ１８として定義され；
Ｒ１８が、Ｈ又は低級アシル（Ｃ１〜Ｃ６）であり；
ｘｉｖ）或いは、糖が、一般式（ＸＩ）：
【化２６】
2012517443.tif 000028
の修飾されたリボースであり、
式中、
Ｒ２、Ｒ３及びＹは上記と同義であり；
Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、及びＲ６’は上記と同義であり；
Ｒ１９が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｓ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｒであり、
Ｒは、独立して、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、低級アルケニル、低級アルキニル、低級シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、アリール、アルキルアリール又はアリールアルキルであり、その際、基は、上記で定義したような１以上の置換基、たとえば、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル及びアルコキシアルキルによって置換することができる。
【００７６】
本発明の一実施形態では、活性化合物は、式（Ｉ）のものであり、式中Ｒ６’は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＯＨ、ＮＨＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｓ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｒ、ＯＲ、ＳＲ、ＳＳＲ、ＮＨＲ及びＮＲ２から成る群から選択される。
【００７７】
本発明の別の実施形態では、活性化合物は、式（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）又は（ＸＩＶ）：
【化２７】
2012517443.tif 000029
のもの、又は薬学上許容可能なその塩若しくはプロドラッグであり、
式中
Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｙ、Ａ及びＲ７’は上記と同義であり；
Ｒ２０は、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり、
Ｍは、Ｏ、Ｓ又はＮＲであり、
Ｒは、独立して、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、低級アルケニル、低級アルキニル、低級シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、アリール、アルキルアリール又はアリールアルキルであり、その際、基は、上記で定義したような１以上の置換基、たとえば、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル及びアルコキシアルキルによって置換することができ、
塩基は以下から選択される。
【化２８】
2012517443.tif 000030
【００７８】
本発明の別の実施形態では、活性化合物は、式（ＸＶ）又は（ＸＶＩ）：
【化２９】
2012517443.tif 000031
のもの、又は薬学上許容可能なその塩若しくはプロドラッグであり、
式中
Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｙ、Ａ、Ｒ７’及びＲ２０は上記と同義であり；
Ｒ２１は、Ｈ、Ｃ１−１０アルキル、又はたとえば、低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロ、Ｃ３−１０シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロヘテロアルキル、たとえば、フェニルのようなアリール、たとえば、ピリジニルのようなヘテロアリール、置換アリール、又は置換へテロアリールによって任意で置換されるＣ１−１０アルキルであり、置換基がＣ１−５アルキル、又は低級アルキル、アルコキシ、ジ（低級アルキル）−アミノ、フルオロで置換されるＣ１−５アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル又はシクロアルキルであり、
Ｒ２２は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２Ｐｈ、ＣＨ２−インドール−３−イル、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、ＣＨ２−イミダゾール−４−イル、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２（（４’−ＯＨ）−Ｐｈ）、ＣＨ２ＳＨ又は低級シクロアルキルである。
【００７９】
本発明の別の実施形態では、活性化合物は、式（ＸＶＩＩ）又は（ＸＶＩＩＩ）：
【化３０】
2012517443.tif 000032
のものであり、式中、
Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｙ、Ｍ、Ｒ７’、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、及び塩基は上記と同義である。
【００８０】
本明細書で記載される化合物は、β−Ｌ又はβ−Ｄの立体配置、又はそのラセミ混合物を含むその混合物の形態であることができる。
ＩＩＩ．立体異性及び多型性
【００８１】
本明細書で記載される化合物は、不斉中心を有してもよく、ラセミ体、ラセミ混合物、個々のジアステレオマー又はエナンチオマーとして存在してもよく、異性体形態はすべて本発明に包含される。キラル中心を有する本発明の化合物は、光学活性のある形態及びラセミ形態で存在することができ、単離することができる。一部の化合物は多型性を呈することができる。本発明は、本明細書に記載される有用な特性を持つ、本発明の化合物のラセミ形態、光学活性のある形態、多型性の形態又は立体異性体の形態を包含する。光学活性のある形態は、たとえば、再結晶化法によるラセミ形態の分割によって、又は光学活性のある出発物質からの合成によって、又はキラル合成によって、又はキラル固定相若しくは酵素分割によるクロマトグラフィ分離によって調製することができる。各ヌクレオシドを精製し、次いでヌクレオシドを誘導体化して本明細書に記載される化合物を形成することができ、又はヌクレオチド自体を精製することができる。
【００８２】
化合物の光学活性のある形態は、再結晶化法によるラセミ形態の分割による、又は光学活性のある出発物質からの合成による、又はキラル合成による、又はキラル固定相若を用いたクロマトグラフィ分離によるものを含むが、これらに限定されない当該技術で既知の方法を用いて調製することができる。
【００８３】
光学活性のある物質を得る方法の例には少なくとも以下が挙げられる。
ｉ）結晶の物理的分離：個々のエナンチオマーの巨視的結晶を手動で分離する技法。この技法は、別々のエナンチオマーの結晶が存在する、すなわち、物質が集塊であり、結晶が視覚的に区別可能である場合に使用することができる。
ｉｉ）同時結晶化：ラセミ体の溶液から個々のエナンチオマーを別々に結晶化させる技法、後者が固体状態で集塊である場合にのみ可能。
ｉｉｉ）酵素分割：酵素とのエナンチオマーの反応の異なった速度によるラセミ体の部分的な又は完全な分離の技法。
ｉｖ）酵素的不斉合成：合成の少なくとも一工程が、酵素反応を用いて所望のエナンチオマーのエナンチオマーとして純粋な又は濃縮された合成前駆体を得る合成法。
ｖ）化学不斉合成：生成物に不斉性（すなわち、キラル性）を生成する条件下でアキラル前駆体から所望のエナンチオマーを合成する合成法であり、キラル触媒又はキラル補助剤を用いて達成することができる。
ｖｉ）ジアステレオマー分離：個々のエナンチオマーをジアステレオマーに変換するエナンチオマーとして純粋な試薬（キラル補助剤）とラセミ化合物を反応させる技法。今やさらに識別可能な構造的差異及び後で取り除いて所望のエナンチオマーを得るキラル補助剤によるクロマトグラフィ又は結晶化によって、次いでジアステレオマーを分離する。
ｖｉｉ）一次及び二次の不斉変換：ラセミ体からのジアステレオマーが平衡化して所望のエナンチオマーからジアステレオマーの溶液で優越を得る、又は所望のエナンチオマーからのジアステレオマーの優先的な結晶化が、最終的に原則として物質すべてを所望のエナンチオマーから結晶性のジアステレオマーに変換するように平衡を乱す技法。次いで所望のエナンチオマーがジアステレオマーから放出される。
ｖｉｉｉ）動的分割：この技法は、動的条件下でキラル非ラセミの試薬又は触媒によるエナンチオマーの非均等な反応速度によってラセミ体の部分的な若しくは完全な分割（又は部分的に分割された化合物のさらなる分割）の達成を指す。
ｉｘ）非ラセミ前駆体からのエナンチオ選択的合成：所望のエナンチオマーが非キラル性出発物質から得られ、立体化学的完全性が合成の過程にわたって妥協されないか、又は最小限に妥協される合成法。
ｘ）キラル液体クロマトグラフィ：固定相との異なった相互作用によってラセミ体のエナンチオマーが液体移動相で分離される（キラルＨＰＬＣを介することを含むが、これに限定されない）技法。固定相はキラル物質で構成することができ、又は移動相は追加のキラル物質を含有して異なっている相互作用を誘発することができる。
ｘｉ）キラルガスクロマトグラフィ：気体移動相における異なった相互作用によってラセミ体を気化させ、エナンチオマーを分離し、カラムは固定された非ラセミキラル吸収相を含有する技法。
ｘｉｉ）キラル溶媒による抽出：特にキラル溶媒への一方のエナンチオマーの優先的な溶解によってエナンチオマーが分離される技法。
ｘｉｉｉ）キラル膜を横切る輸送：薄い膜バリアと接触させてラセミ体を置く技法。バリアは通常、混和性の２つの流体を分離し、一方はラセミ体を含有し、たとえば、濃度又は圧の格差のような駆動力が膜バリアを横切る優先的な輸送を引き起こす。ラセミ体の一方のエナンチオマーのみを通過させることができる膜の非ラセミキラルの性質の結果、分離が生じる。
【００８４】
模倣移動床クロマトグラフィを含むが、これに限定されないキラルクロマトグラフィが一実施形態で使用される。多種多様なキラル固定相が市販されている。
ＩＶ．ヌクレオチドの塩又はプロドラッグの処方
【００８５】
化合物が、安定な非毒性の酸塩又は塩基塩を形成するのに十分に塩基性又は酸性である場合、薬学上許容可能な塩としての化合物の投与が適当であってもよい。薬学上許容可能な塩の例は、生理的に許容可能なアニオンを形成する、酸と共に形成された有機酸付加塩であり、たとえば、トシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸、である。好適な無機塩を形成することができ、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩及びカルボン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
薬学上許容可能な塩は、当該技術で周知の標準的な手順を用いて、たとえば、アミンのような十分に塩基性の化合物を好適な酸と反応させ、生理的に許容可能なアニオンを得ることによって得ることができる。カルボン酸のアルカリ金属（たとえば、ナトリウム、カリウム又はリチウム）又はアルカリ土類金属（たとえば、カルシウム）の塩も作製することができる。
【００８７】
本明細書で記載されるヌクレオチドプロドラッグを投与して、活性、生体利用効率、安定性をさらに高め、又はヌクレオチド一リン酸の特性を改変することができる。
【００８８】
多数のヌクレオチドプロドラッグのリガンドが知られている。一般に、一リン酸のアルキル化、アシル化若しくはそのほかの親油性の修飾、又はヌクレオシドのそのほかの類似体はヌクレオチドの安定性を高める。
【００８９】
一リン酸部分における１以上の水素を置き換えることができる置換基の例は、アルキル、アリール、ステロイド、糖、１，２−ジアシルグリセロール及びアルコールを含むが、これらに限定されない炭水化物である。多数は、Ｒ．Ｊｏｎｅｓ及びＮ．Ｂｉｓｃｈｏｆｂｅｒｇｅｒ，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９５，２７，１−１７、並びにＳ．Ｊ．Ｈｅｃｋｅｒ及びＭ．Ｄ．Ｅｒｉｏｎ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００８，５１，２３２８−２３４５に記載されている。これらのいずれも、開示されたヌクレオチドと併用して所望の効果を達成することができる。
【００９０】
活性のあるヌクレオチドは、参照によって組み入れられる、以下の参考文献で開示されたように５’−ホスホエステル脂質としても提供され得る。Ｋｕｃｅｒａ，Ｌ．Ｓ．，Ｎ．Ｉｙｅｒ，Ｅ．Ｌｅａｋｅ，Ａ．Ｒａｂｅｎ，Ｍｏｄｅｓｔ，Ｅ．Ｋ．，Ｄ．Ｌ．Ｗ．及びＣ．Ｐｉａｎｔａｄｏｓｉ，“Ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ-ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｅｔｈｅｒ  ｌｉｐｉｄ  ａｎａｌｏｇｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ＨＩＶ−１  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｖｉｒｕｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，”ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１９９０，６，４９１−５０１；Ｐｉａｎｔａｄｏｓｉ，Ｃ．，Ｊ．Ｍａｒａｓｃｏ，Ｃ．Ｊ．，Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓ−Ｎａｔｓｃｈｋｅ，Ｋ．Ｌ．Ｍｅｙｅｒ，Ｆ．Ｇｕｍｕｓ，Ｊ．Ｒ．Ｓｕｒｌｅｓ，Ｋ．Ｓ．Ｉｓｈａｑ，Ｌ．Ｓ．Ｋｕｃｅｒａ，Ｎ．Ｉｙｅｒ，Ｃ．Ａ．Ｗａｌｌｅｎ，Ｓ．Ｐｉａｎｔａｄｏｓｉ，及びＥ．Ｊ．Ｍｏｄｅｓｔ，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｅｔｈｅｒ  ｌｉｐｉｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ＨＩＶ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，３４，１４０８−１４；Ｈｏｓｔｅｌｌｅｒ，Ｋ．Ｙ．，Ｄ．Ｄ．Ｒｉｃｈｍａｎ，Ｄ．Ａ．Ｃａｒｓｏｎ，Ｌ．Ｍ．Ｓｔｕｈｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｍ．Ｔ．ｖａｎ  Ｗｉｊｋ，及びＨ．ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｓｃｈ，“Ｇｒｅａｔｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＣＥＭ  ａｎｄ  ＨＴ４−６Ｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ３’−ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ，  ａ  ｌｉｐｉｄ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｏｆ  ３，−ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ，”Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，１９９２，３６，２０２５−２９；Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒ，Ｋ．Ｙ．，Ｌ．Ｍ．Ｓｔｕｈｍｉｌｌｅｒ，Ｈ．Ｂ．Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｈ．ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｓｃｈ，及びＤ．Ｄ．Ｒｉｃｈｍａｎ，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  ａｚｉｄｏｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，２６５，６１１２７。
【００９１】
ヌクレオシド、好ましくは、本明細書で記載されるヌクレオチドのＲ２及び／又はＲ３の位置に共有結合で組み入れられる得る好適な親油性の置換基、又は親油性調製物を開示している米国特許の非限定例には、そのすべてが参照によって組み入れられる、米国特許第５，１４９，７９４号（Ｙａｔｖｉｎら）；同第５，１９４，６５４号（Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら）同第５，２２３，２６３号（Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら）；同第５，２５６，６４１号（Ｙａｔｖｉｎら）；同第５，４１１，９４７号（Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら）；同第５，４６３，０９２号（Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら）；同第５，５４３，３８９号（Ｙａｔｖｉｎら）；同第５，５４３，３９０号（Ｙａｔｖｉｎら）；同第５，５４３，３９１号（Ｙａｔｖｉｎら）；及び同第５，５５４，７２８号（Ｂａｓａｖａら）が挙げられる。本発明のヌクレオシドに連結することができる親油性の置換基、又は親油性の調製物を開示している外国の特許出願には、ＷＯ８９／０２７３３、ＷＯ９０／００５５５、ＷＯ９１／１６９２０、ＷＯ９１／１８９１４、ＷＯ９３／００９１０、ＷＯ９４／２６２７３、ＷＯ９６／１５１３２、ＥＰ０３５０２８７、ＥＰ９３９１７０５４．４，及びＷＯ９１／１９７２１が挙げられる。
Ｖ．治療の方法
【００９２】
ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ノロウイルス、サポロウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス又はその遺伝子断片が感染しているヒトを含むが、これらに限定されない宿主は、薬学上許容可能なキャリア又は希釈剤の存在下で有効量の活性化合物又は薬学上許容可能なそのプロドラッグ若しくは塩を患者に投与することによって治療することができる。適当な経路、たとえば、経口、非経口、静脈内、皮内、皮下、又は局所にて液体又は固体の形態で活性物質を投与することができる。
【００９３】
癌を治療するのにも化合物を使用することができる。本明細書で記載される化合物、及びこれら化合物の薬学上許容可能な塩及びプロドラッグによって本発明の方法に従って治療することができる患者には、たとえば、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頚部の癌、皮膚又は眼内の黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌若しくは肛門領域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、婦人科の腫瘍（たとえば、子宮肉腫、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、頚部の癌腫、膣の癌腫又は膣前庭の癌腫）、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌（たとえば、甲状腺、副甲状腺、副腎の癌）、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、慢性又は急性の白血病、小児の固形腫瘍、リンパ系のリンパ腫、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌（たとえば、腎臓細胞癌、腎盂の癌腫）、又は中枢神経系の新生物（たとえば、原発ＣＮＳリンパ腫、脊髄の軸の腫瘍、脳幹グリオーマ又は下垂体のアデノーマ）であると診断されている患者が挙げられる。
【００９４】
本発明は、ある量の本明細書で記載される化合物、又は薬学上許容可能なその塩若しくはプロドラッグと、抗血管新生剤、シグナル伝達阻害剤及び増殖抑制剤から選択されるある量の、１以上の物質を含む、患者において異常な細胞増殖を阻害する方法及び医薬組成物にも関する。
【００９５】
本明細書で記載される式Ｉの化合物及び医薬組成物と併せて、たとえば、ＭＭＰ−２（マトリクスメタロプロテアーゼ２）阻害剤、ＭＭＰ−９（マトリクスメタロプロテアーゼ９）阻害剤、及びＣＯＸＩＩ（シクロオキシゲナーゼＩＩ）阻害剤のような抗血管新生剤を使用することができる。有用なＣＯＸＩＩ阻害剤には、セレブレックスＴＭ（アレコキシブ）、バルデコキシブ及びロフェコキシブが挙げられる。有用なマトリクスメタロプロテアーゼ阻害剤の例は、ＷＯ９６／３３１７２（１９９６年１０月２４日公開）、ＷＯ９６／２７５８３（１９９６年３月７日公開）、欧州特許出願第９７３０４９７１．１号（１９９７年７月８日出願）、欧州特許出願第９９３０８６１７．２号（１９９９年１０月２９日出願）、ＷＯ９８／０７６９７（１９９８年２月２６日公開）、ＷＯ９８／０３５１６（１９９８年１月２９日公開）、ＷＯ９８／３４９１８（１９９８年８月１３日公開）、ＷＯ９８／３４９１５（１９９８年８月１３日公開）、ＷＯ９８／３３７６８（１９９８年８月６日公開）、ＷＯ９８／３０５６６（１９９８年７月１６日公開）、欧州特許公開６０６，０４６号（１９９４年７月１３日公開）、欧州特許公開９３１，７８８号（１９９９年７月２８日公開）、ＷＯ９０／０５７１９（１９９０年５月３１日公開）、ＷＯ９９／５２９１０（１９９９年１０月２１日公開）、ＷＯ９９／５２８８９（１９９９年１０月２１日公開）、ＷＯ９９／２９６６７（１９９９年６月１７日公開）、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＩＢ９８／０１１１３号（１９９８年７月２１日出願）、欧州特許出願第９９３０２２３２．１号（１９９９年３月２５日出願）、英国特許出願第９９１２９６１．１号（１９９９年６月３日出願）、米国特許仮出願第６０／１４８，４６４号（１９９９年８月１２日出願）、米国特許第５，８６３，９４９号（１９９９年１月２６日発行）、米国特許第５，８６１，５１０号（１９９９年１月１９日発行）及び欧州特許公開７８０，３８６号（１９９７年６月２５日公開）に記載されており、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる。好ましいＭＭＰ阻害剤は、関節痛を示さないものである。さらに好ましいのは、ほかのマトリクスメタロプロテアーゼ（すなわち、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−４、ＭＭＰ−５、ＭＭＰ−６、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２及びＭＭＰ−１３）に比べてＭＭＰ−２及び／又はＭＭＰ−９を選択的に阻害するものである。
【００９６】
本明細書で記載される化合物は、シグナル伝達阻害剤、たとえば、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）反応を阻害することができる剤、たとえば、ＥＧＦＲ抗体、ＥＧＦ抗体及びＥＧＦＲ阻害剤である分子；ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）阻害剤、たとえば、ＶＥＧＦ受容体及びＶＥＧＦを阻害する分子；並びにｅｒｂＢ２受容体阻害剤、たとえば、ｅｒｂＢ２受容体に結合する有機分子、たとえば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）（米国カリフォルニア州、サウスサンフランシスコのＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社）と共に使用することができる。
【００９７】
ＥＧＦＲ阻害剤は、たとえば、ＷＯ９５／１９９７０（１９９５年７月２７日公開）、ＷＯ９８／１４４５１（１９９８年４月９日公開）、ＷＯ９８／０２４３４（１９９８年１月２２日公開）、及び米国特許第５，７４７，４９８号（１９９８年５月５日発行）に記載されており、そのような物質は本明細書で記載されるように本発明で使用することができる。ＥＧＦＲ阻害剤には、モノクローナル抗体Ｃ２２５及び抗−ＥＧＦＲ  ２２Ｍａｂ（米国ニューヨーク州、ニューヨークのＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＡＢＸ−ＥＧＦ（Ａｂｇｅｎｉｘ／Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｓｙｓ）、ＥＭＤ−７２００（Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ）、ＥＭＤ−５５９０（Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ）、ＭＤＸ−４４７／Ｈ−４７７（米国ニュージャージー州、アナンデールのＭｅｄａｒｅｘ社、及びＭｅｒｃｋ  ＫｇａＡ）、及び化合物、ＺＤ−１８３４、ＺＤ−１８３８及びＺＤ−１８３９（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＰＫＩ−１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＫＩ−１６６／ＣＧＰ−７５１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＴＫ  ７８７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＣＰ  ７０１（Ｃｅｐｈａｌｏｎ）、ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／Ｓｕｇｅｎ）、ＣＩ−１０３３（Ｗａｒｎｅｒ  Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｐａｒｋｅ  Ｄａｖｉｓ）、ＣＩ−１０３３／ＰＤ  １８３，８０５（Ｗａｒｎｅｒ  Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｐａｒｋｅ  Ｄａｖｉｓ）、ＣＬ−３８７，７８５（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）、ＢＢＲ−１６１１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ／Ｒｏｃｈｅ）、Ｎａａｍｉｄｉｎｅ  Ａ  （Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ＲＣ−３９４０−ＩＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＢＩＢＸ−１３８２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＯＬＸ−１０３（米国ニュージャージー州、ホワイトハウスステーションのＭｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．）、ＶＲＣＴＣ−３１０（Ｖｅｎｔｅｃｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ＥＧＦ融合毒素（マサチューセッツ州、ホプキントンのＳｅｒａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、ＤＡＢ−３８９（Ｓｅｒａｇｅｎ／Ｌｉｌｇａｎｄ）、ＺＭ−２５２８０８（Ｉｍｐｅｒｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｕｎｄ）、ＲＧ−５０８６４（ＩＮＳＥＲＭ）、ＬＦＭ−Ａ１２（Ｐａｒｋｅｒ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）、ＷＨＩ−Ｐ９７（Ｐａｒｋｅｒ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）、ＧＷ−２８２９７４（Ｇｌａｘｏ）、ＫＴ−８３９１（協和発酵）及びＥＧＦＲ  Ｖａｃｃｉｎｅ（Ｙｏｒｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ／Ｃｅｎｔｒｏ  ｄｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（ＣＩＭ））が挙げられるが、これらに限定されない。これらの及びそのほかのＥＧＦＲ阻害剤は本発明で使用することができる。
【００９８】
ＶＥＧＦ阻害剤、たとえば、ＣＰ−５４７，６３２（ニューヨーク州のＰｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）、ＡＧ−１３７３６（Ａｇｏｕｒｏｎ  Ｐｈａｒｍｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．ａ  Ｐｆｉｚｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ＳＵ−５４１６及びＳＵ−６６６８（米国カリフォルニア州、サウスサンフランシスコもＳｕｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、及びＳＨ−２６８（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）は、本発明の化合物と併用することができる。ＶＥＧＦ阻害剤は、たとえば、ＷＯ９９／２４４４０（１９９９年５月２０日公開）、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＩＢ９９／００７９７号（１９９９年５月３日出願）、ＷＯ９５／２１６１３（１９９５年８月１７日公開）、ＷＯ９９／６１４２２（１９９９年１２月２日公開）、米国特許第５，８３４，５０４号（１９９８年１１月１０日発行）、ＷＯ９８／５０３５６（１９９８年１１月１２日公開）、米国特許第５，８８３，１１３号（１９９９年３月１６日発行）、米国特許第５，８８６，０２０号（１９９９年３月２３日発行）、米国特許第５，７９２，７８３号（１９９８年８月１１日発行）、ＷＯ９９／１０３４９（１９９９年３月４日公開）、ＷＯ９７／３２８５６（１９９７年９月１２日公開）、ＷＯ９７／２２５９６（１９９７年６月２６日公開）、ＷＯ９８／５４０９３（１９９８年１２月３日公開）、ＷＯ９８／０２４３８（１９９８年１月２２日公開）、ＷＯ９９／１６７５５（１９９９年４月８日公開）、及びＷＯ９８／０２４３７（１９９８年１月２２日公開）に記載されており、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる。本発明で有用な一部の特異的なＶＥＧＦ阻害剤のほかの例は、ＩＭ８６２（米国ワシントン州、カークランドのＣｙｔｒａｎ  Ｉｎｃ．）；カリフォルニア州、サウスサンフランシスコのＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の抗−ＶＥＧＦモノクローナル抗体；及びＲｉｂｏｚｙｍｅからの合成リボザイムであるアンギオザイム（コロラド州のＢｏｕｌｄｅｒ）及びＣｈｉｒｏｎ（カリフォルニア州のＥｍｅｒｙｖｉｌｌｅ）である。これらの及びそのほかのＶＥＧＦ阻害剤は本明細書で記載されるように、本発明で使用することができる。
【００９９】
たとえば、ＣＰ−３５８，７７４（ＯＳＩ−７７４）（Ｔａｒｃｅｖａ）（ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、ＧＷ−２８２９７４（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  ｐｌｃ）、及びモノクローナル抗体、ＡＲ−２０９（米国テキサス州、ウッドランドのＡｒｏｎｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）及び２Ｂ−１（Ｃｈｉｒｏｎ）のようなｅｒｂＢ２受容体阻害剤、たとえば、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ９８／０２４３４（１９９８年１月２２日公開）、ＷＯ９９／３５１４６（１９９９年７月１５日公開）、ＷＯ９９／３５１３２（１９９９年７月１５日公開）、ＷＯ９８／０２４３７（１９９８年１月２２日公開）、ＷＯ９７／１３７６０（１９９７年４月１７日公開）、ＷＯ９５／１９９７０（１９９５年７月２７日公開）、米国特許第５，５８７，４５８号（１９９６年１２月２４日発行）、及び米国特許第５，８７７，３０５号（１９９９年３月２日発行）に示されたものは、本発明の化合物とさらに併用することができる。本発明で有用なｅｒｂＢ２受容体阻害剤はまた、双方共その全体が参照によって本明細書に組み入れられる１９９９年１月２７日に出願された米国特許仮出願第６０／１１７，３４１号及び１９９９年１月２７日に出願された米国特許仮出願第６０／１１７，３４６号にも記載されている。前述のＰＣＴ出願、米国特許、及び米国特許出願に記載されたｅｒｂＢ２受容体阻害剤の化合物及び物質、並びにｅｒｂＢ２受容体を阻害するそのほかの化合物及び物質は、本発明に従って本明細書で記載される化合物と共に使用することができる。
【０１００】
化合物は、抗腫瘍免疫応答を高めることが可能である剤、たとえば、ＣＴＬＡ４（細胞傷害性リンパ球抗原４）抗体、及びＣＴＬＡ４を遮断することが可能であるそのほかの剤、及びファルネシルタンパク質トランスフェラーゼのような増殖阻害剤、などを含むが、これらに限定されない、異常な細胞増殖又は癌を治療するのに有用なそのほかの剤と共に使用することができる。本発明で使用することができる具体的なＣＴＬＡ４抗体には、その全体が参照によって組み入れられる米国特許仮出願６０／１１３，６４７号（１９９８年１２月２３日出願）に記載されたものが挙げられるが、ほかのＣＴＬＡ４抗体も本発明で使用することができる。
【０１０１】
そのほかのＣＯＸ−ＩＩ阻害剤、そのほかのＭＭＰ阻害剤、そのほかの抗ＶＥＧＦ抗体又は血管形成のそのほかのエフェクターの阻害剤を含むが、これらに限定されないそのほかの抗血管新生剤も使用することができる。
【０１０２】
１以上のノロウイルス、並びにＣａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅの分類上の科におけるそのほかのウイルスによる感染を治療する又は予防するのに、本明細書で記載される化合物及び医薬組成物を使用することができる。
【０１０３】
ノロウイルス感染を治療するための治療上の使用では、治療利益を達成するのに好適な投与量レベルでノロウイルス感染と診断された患者に化合物及び／又は組成物を投与することができる。「治療利益」又は文法上の同等によって、化合物の投与が時間をかけて患者に有益な効果をもたらすことを意味する。たとえば、患者におけるノロウイルスの力価又はウイルスの負荷が低下する又は増大を止める場合、治療利益を達成することができる。
【０１０４】
患者におけるロウイルスの力価又はウイルスの負荷にかかわりなく、化合物の投与が、通常ノロウイルス感染に伴う有害症状の発症を遅らす又は完全に止めれば、治療利益も達成することができる。本明細書で記載される化合物及び／又は組成物は、ノロウイルス感染を発症するリスクにある患者、又はノロウイルスに暴露されている患者においてノロウイルス感染の発症を防ぐために予防的に投与されてもよい。たとえば、化合物及び／又はその組成物は、ノロウイルスに暴露されている可能性がある患者に投与されてもよい。
【０１０５】
ノロウイルス疾患の発生は、たとえば、いったんウイルスが導入されると、ヒトからヒトへの伝染、又は汚染された食物を介して感染が非常に迅速に広がる長期療養施設、病院、刑務所及び観光船のような閉鎖された又は半閉鎖された共同体で生じることが多い。多数のノロウイルスの発生は、１人の感染したヒトによって取り扱われる食物にその跡を辿ってきた。従って、ノロウイルス又はそのほかのＣａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅと接触する可能性があるこれらの施設の個体に本明細書で記載される化合物の予防的用量を提供することが有利であってもよい。
ＶＩ．併用療法又は代替療法
【０１０６】
一実施形態では、本発明の化合物は、侵入阻害剤、逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、及び免疫に基づいた治療剤から選択される少なくとも１つのそのほかの抗ウイルス剤と一緒に採用されることができる。
【０１０７】
たとえば、ＨＩＶ又はＨＢＶの感染を治療する又は予防するのに使用する場合、活性化合物又はそのプロドラッグ又は薬学上許容可能な塩は、別の抗ウイルス剤、たとえば、上記式のものを含むが、これらに限定されない、たとえば、抗−ＨＩＶ、抗−ＨＢＶ又は抗−ＨＣＶのような別の抗ウイルス剤との併用で、又はその代わりに投与することができる。一般に、併用療法では、有効量の２以上の剤が一緒に投与されるが、代替療法の間、有効量の各剤は連続して投与される。投与量は、薬剤の吸収、相互作用及び排泄率、並びに当業者に既知のほかの因子に左右される。投与量の値は、緩和される条件の重症度によっても異なることに留意されるべきである。任意の特定の対象について、特定の投与計画及びスケジュールは、個体の必要性、及び組成物の投与を管理する又は監督するヒトの専門的な判断に従って時間をかけて調整されるべきであることがさらに理解されるべきである。
【０１０８】
本明細書で開示される化合物と併用して使用することができる抗ウイルス剤の非限定例には、以下の表にあるものが挙げられる。
【表１】
2012517443.tif 000033
【表２】
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【０１０９】
【表３】
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【０１１０】
【表４】
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【表５】
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【０１１１】
【表６】
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【０１１２】
【表７】
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【表８】
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【表９】
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【０１１３】
【表１０】
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【０１１４】
【表１１】
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【表１２】
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ＶＩＩ．増殖性症状の治療のための併用療法
【０１１５】
別の実施形態では、化合物は、増殖抑制剤として使用される場合、抗葉酸、５−フルオロピリミジン（５−フルオロウラシルを含む）、シチジン類似体、たとえば、β−Ｌ−１，３−ジオキソラニルシチジン若しくはβ−Ｌ−１，３−ジオキソラニル５−フルオロシチジン、代謝抑制剤（プリン代謝抑制剤、シタラビン、フダラビン、フロクスリジン、６−メルカプトプリン、メソトレキセート、及び６−チオグアニンを含む）、ヒドロキシ尿素、有糸分裂阻害剤（ＣＰＴ−１１、エトポシド（ＶＰ−２１）、タキソール、及びビンカアルカロイド、たとえば、ビンクリスチン及びビンブラスチンを含む）、アルキル化剤（ブスルファン、クロラムブシル、サイクロホスファミド、イフォファミド、メクロレタミン、メルファラン及びチオテパを含むが、これらに限定されない）、非古典的なアルキル化剤、白金含有化合物、ブレオマイシン、抗腫瘍抗生剤、アントラサイクリン、たとえば、ドキソルビシン及びダンノマイシン、アントラセネジオン、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ホルモン剤（コルチコステロイド（デキサメタゾン、プレドニゾロン及びメチルプレドニゾロン）、アンドロゲン、たとえば、フルオキシメステロン及びメチルテストステロン、エストロゲン、たとえば、ジエチルスチルベステロール、抗エストロゲン、たとえば、タモキシフェン、ＬＨＲＨ類似体、たとえば、リュープロリド、抗アンドロゲン、たとえば、フルタミド、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール、及びメドロキシプロゲステロンを含むが、これらに限定されない）、アスパラギナーゼ、カルムスチン、ロムスチン、ヘキサメチルメラミン、ダカルバジン、ミトタン、ストレプトゾシン、シスプラチン、カルボプラチン、レバマソール、及びリューコボリンを含むが、これらに限定されない、治療の有効性を高める別の化合物と併用して投与することができる。本発明の化合物はまた、酵素療法剤及び免疫系調節剤、たとえば、インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、マクロファージコロニー刺激因子及びコロニー刺激因子と併用して使用することができる。一実施形態では、本明細書で記載される化合物は、逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、融合阻害剤、侵入阻害剤及びポリメラーゼ阻害剤から選択される少なくとも１つのそのほかの抗ウイルス剤と一緒に採用され得る。
【０１１６】
加えて、本発明に係る化合物は、本発明のほかの化合物を含むが、これらに限定されない１以上の抗レトロウイルス剤、抗ＨＢＶ剤、インターフェロン、抗癌剤又は抗菌剤と併用して又はその代わりに投与することができる。本明細書で記載される特定の化合物は、この意図された効果のために同時投与されるように、ほかの化合物の代謝、異化又は不活化を低下させることによって本発明に係る特定の剤の生物活性を高めるのに有効であってもよい。
ＶＩＩＩ．ノロウイルス感染を治療するための併用療法
【０１１７】
本明細書で記載される抗ウイルス性化合物に加えて、そのほかの化合物も存在し得る。たとえば、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）は、ノロウイルスの複製を阻害することが知られている。特定のビタミン、特にビタミンＣは特定のウイルス感染を治療するのに有効であると考えられている。試験の１つは、ビタミンＡの補完が、ノロウイルスＧＩＩの感染の流行を減らし、ノロウイルスＧＩ及びＧＩＩ双方の排出の長さを高め、ＮｏＶに関連した下痢の流行を減らしたことを示している（1: J Infect Dis. 2007 Oct 1;196(7):978-85. Epub 2007 Aug 22）。リジンは抗ウイルス剤として知られている。属内群ＩＩ（ＧＩＩ）のノロウイルスに由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）が細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカン及びそのほかの負に荷電したグリコサミノグリカンに結合することも知られている。感染の症状を治療するのに、制吐剤、下痢止め剤及び／又は鎮痛剤を投与することもできる。
ＩＸ．医薬組成物
【０１１８】
ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス又はＣａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス、又はそれらの遺伝子断片に感染した、又は癌に罹った、ヒトを含むが、これらに限定されない宿主は、薬学上許容可能なキャリア又は希釈剤の存在下で有効量の活性化合物又は薬学上許容可能なそのプロドラッグ若しくは塩を患者に投与することによって治療することができる。活性物質は、当な経路、たとえば、経口、非経口、静脈内、皮内、皮下、又は局所にて液体又は固体の形態で投与することができる。
【０１１９】
化合物の好ましい用量は、１日当たり、受入者の体重の約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、さらに一般的には約１〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１〜約２０ｍｇ／ｋｇの間の範囲である。薬学上許容可能な塩及びプロドラッグの有効投与量の範囲は、送達される親ヌクレオシドの重量に基づいて算出することができる。塩又はプロドラッグが自体活性を呈するのであれば、有効投与量は、塩若しくはプロドラッグの重量を用いて、又は当業者に既知のほかの手段によって上記のように概算することができる。
【０１２０】
単位投与形態当たり７〜３０００ｍｇ、好ましくは７０〜１４００ｍｇの有効成分を含有するものを含むが、これらに限定されない好適な投与形態の単位にて化合物を好都合に投与する。５０〜１０００ｍｇの経口投与量が普通好都合である。
【０１２１】
理想的には、約０．２〜７０μＭ、好ましくは約１．０〜１５μＭの活性化合物のピーク血漿濃度を達成するように有効成分が投与されるべきである。たとえば、任意で生理食塩水にて０．１〜５％の有効成分の溶液の静脈内注射によってこれを達成することができ、又は有効成分のボーラスとしてこれを投与することができる。
【０１２２】
薬剤組成物における活性化合物の濃度は、当業者に既知のそのほかの因子と同様に、薬剤の吸収速度、不活化速度及び排泄速度に左右される。投与量の値は、緩和されるべき症状の重症度によっても変化することが言及されるべきである。特定の対象について、個々の必要性と組成物の投与を管理する又は監督する人の専門的判断に従って具体的な投与計画が時間をかけて調整されるべきであり、本明細書で言及される濃度範囲は請求される組成物の範囲又は実践を限定することを意図しないことがさらに理解されるべきである。有効成分は一度に投与することができ、又は種々の時間間隔で投与される多数のさらに小さな用量に分割することができる。
【０１２３】
活性化合物の投与の好ましい方式は経口である。経口組成物は一般に不活性の希釈剤又は食用のキャリアを含む。それらは、ゼラチンカプセルに内包する、又は錠剤に圧縮することができる。経口の治療投与の目的で、活性化合物を賦形剤と共に組み入れて、錠剤、トローチ又はカプセルの形態で使用することができる。薬学上相溶性の結合剤及び／又はアジュバント物質を組成物の一部として含めることができる。
【０１２４】
錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分又は類似の性質の化合物：微細結晶性セルロース、ゴムトラガカント又はゼラチンのような結合剤；デンプン若しくはラクトースのような賦形剤、アルギン酸のような崩壊剤、プリモゲル若しくはコーンスターチ；ステアリン酸マグネシウム若しくはステロートのような潤滑剤；コロイド状二酸化シリコンのような流動促進剤；又はペパーミント、サリチル酸メチル若しくはオレンジ風味のような風味剤のいずれかを含有することができる。投与単位形態がカプセルである場合、それは、上記の種類の物質に加えて、脂肪油のような液体キャリアを含有することができる。さらに、単位投与量形態は、投与単位の物理的形態を改変する種々のそのほかの物質、たとえば、糖衣、セラック又はそのほかの腸溶剤を含有することができる。
【０１２５】
エリキシル、懸濁剤、シロップ、ウエハー、チューインガムなどの成分として化合物を投与することができる。シロップは、活性化合物に加えて、甘味剤としてのスクロース及び特定の保存剤、染料及び着色剤及び風味剤を含有することができる。
【０１２６】
化合物又は薬学上許容可能なそのプロドラッグ若しくは塩は、所望の作用を損なわないそのほかの活性物質と共に、又は、たとえば、そのほかのヌクレオシド化合物を含むが、これらに限定されない抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤又は抗ウイルス剤のような所望の作用を補完する物質と共に混合することもできる。非経口の、皮内の、皮下の又は局所の適用に使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分：注射用の水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又はそのほかの合成溶媒のような無菌の希釈剤；ベンジルアルコール若しくはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸若しくは重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；索酸塩、クエン酸塩若しくはリン酸塩のような緩衝液；及び塩化ナトリウム若しくはデキストロースのような等張化調整剤を含むことができる。親調製物は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ又は複数回用量のバイアルの中に入れることができる。
【０１２７】
静脈内に投与するのであれば、好ましいキャリアは生理食塩水又はリン酸緩衝の生理食塩水（ＰＢＳ）である。
【０１２８】
好ましい実施形態では、生体からの迅速な排除に対して化合物を保護するキャリア、たとえば、インプラント及び微細内包送達系を含むが、これらに限定されない制御放出製剤と共に活性化合物を調製する。たとえば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル及びポリ乳酸のような生分解性、生体適合性のポリマーを使用することができる。たとえば、腸溶化合物を用いて胃酸による切断を防御することができる。そのような製剤を調製する方法は当業者に明らかである。好適な物質は市販で得ることもできる。
【０１２９】
リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体によって感染細胞を標的とするリポソームを含むが、これらに限定されない）も薬学上許容可能なキャリアとして好ましい。当業者に既知の方法、たとえば、米国特許第４，５２２，８１１号（参照によって組み入れられる）に従ってこれらを調製することができる。たとえば、その後蒸発して容器表面に乾燥した脂質の薄膜を残す無機溶媒にて、適当な脂質（たとえば、ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、及びコレステロール）を溶解することによってリポソーム製剤を調製することができる。活性化合物又はその一リン酸、二リン酸及び／又は三リン酸誘導体の水溶液を次いで容器に導入する。次いで手で容器を回転させ、容器側面から脂質物質を解放し、脂質凝集物を分散し、それによってリポソーム懸濁液を形成する。
【０１３０】
本発明を記載するのに使用される用語は、一般に使用され、当業者に既知である。本明細書で使用されるとき、以下の略語は示された意味を有する：
ａｑ：水性
ＣＤＩ：カルボニルジイミダゾール
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
ｈ：時間（単数）／（複数）
ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
Ｍ：モル
ｍｉｎ：分
ｒｔ又はＲＴ：室温
ＴＢＡＴ：テトラブチルアンモニウムトリフェニルジフルオロ珪酸
ＴＢＴＵ：Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｘ．活性化合物を調製するための一般的なスキーム
【０１３１】
６−置換−２−アミノプリンヌクレオシド一リン酸及びホスホン酸のプロドラッグの手軽な調製方法も提供される。本明細書で開示される６−置換−２−アミノプリンヌクレオシド一リン酸及びホスホン酸のプロドラッグは、以下で詳細に記載されるように、又は当業者に既知のそのほかの方法によって調製することができる。これらのスキームは決して限定的ではなく、本発明の精神と範囲から逸脱することなく詳細の変異を為すことができることが当業者によって理解されるであろう。
【０１３２】
一般に、式Ｉ〜ＸＶＩＩＩのヌクレオチドは、先ず、相当するヌクレオシドを調製し、次いで、化合物の活性のある三リン酸の形態に生体内で容易に変換され得る、本明細書で記載されたような一リン酸又はそのほかの類似体として５’−ヒドロキシ基にキャッピングを行うことによって調製される。
【０１３３】
種々の反応スキームを以下に要約する。
【０１３４】
スキーム１は、本発明の活性化合物の合成、特に一リン酸プロドラッグＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶの合成法の非限定例である。
【０１３５】
スキーム２は、本発明の活性化合物の合成、特に一リン酸プロドラッグＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶの代わりの合成法の非限定例である。
【０１３６】
スキーム３は、本発明の活性化合物の合成、特に一リン酸プロドラッグＸＶの合成法の非限定例である。
【０１３７】
スキーム４は、本発明の活性化合物の合成、特に一リン酸プロドラッグＸＶＩの合成法の非限定例である。
【０１３８】
スキーム５は、本発明の活性化合物の合成、特に一リン酸プロドラッグＸＶＩＩの合成法の非限定例である。
【０１３９】
スキーム６は、本発明の活性化合物の合成、特に一リン酸プロドラッグＸＶＩＩの代わりの合成法の非限定例である。
【０１４０】
スキーム７は、本発明の活性化合物の合成、特に一リン酸プロドラッグＸＶＩＩＩの合成法の非限定例である。
【０１４１】
スキーム８は、本発明の活性化合物の合成、特に一リン酸プロドラッグＸＶＩＩＩの代わりの合成法の非限定例である。
【０１４２】
スキーム９は、本発明の活性化合物の合成、特にヌクレオシドＩの合成法の非限定例である。
【０１４３】
スキーム１０は、本発明の活性化合物の合成、特にヌクレオシドＩの代わりの合成法の非限定例である。
【０１４４】
一実施形態では、式ＸＩＩ、ＸＩＩＩ又はＸＩＶのヌクレオシドは、ＴＩＰＳのような基により化合物１を保護して糖の３’位にて遊離のα−ヒドロキシル基を提供することによって調製される（スキーム１）。化合物１の調製は、（ａ）Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ，Ｐ．；Ｂｏｕｄｉｎｏｔ，Ｆ．Ｄ；Ｃｈｕ，Ｃ．Ｋ．；Ｔｅｎｎａｎｔ，Ｂ．Ｃ．；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｂ．Ｈ．；Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ：Ｃｈｉｒａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｈｙ：Ｃｈｕ，Ｃ．Ｋ．；Ｅｄｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：２００３；ｂ）Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ：  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｃｈｕ，Ｃ．Ｋ．；Ｅｄｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：２００２；ｃ）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２００４，Ｅｄｓ．Ｒ．Ｆ．Ｓｃｈｉｎａｚｉ及びＤ．Ｃ．Ｌｉｏｔｔａ，ＩＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｕｃｋｅｒ，ＧＡ，ＵＳＡ，ｐｐ：３１９−３７；ｄ）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｖｏｒｂｒｕｇｇｅｎ  Ｈ．及びＲｕｈ−Ｐｏｈｌｅｎｚ  Ｃ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  ｓｏｎｓ  ２００１）に概説される方法、並びに一般的スキーム９〜１０によって、当業者により達成される。酸３又は４との２のカップリングは、ＥＤＣ、ＥＤＣ／ＨＯＢｔ、ＴＢＴＵ又はＣＤＩのような剤によって達成されてエステル５又は６を得ることができる。保護基を取り除いた後、オキシ塩化リン又は三塩化ホスホロチオイル（ＰＯＣｌ３又はＰＳＣｌ３）への暴露によって、得られたアミノアルコールを一リン酸プロドラッグＸＩＩ又はＸＩＩＩに変換することができ、又は代わりに、オキシ塩化リン又は三塩化ホスホロチオイルの反応の水後処理の後、ＤＣＣのようなカップリング剤をＸＩＩ又はＸＩＩＩの形成に利用することができる。オキシ塩化リン又は三塩化ホスホロチオイルの反応の水後処理の後、化合物７を得ることができ、ホスゲン又はＣＤＩのようなホスゲン同等物又はトリホスゲンへのその後の暴露によって一リン酸プロドラッグＸＩＶが得られる。
【０１４５】
スキーム１．一リン酸プロドラッグＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶの合成法（塩基は天然又は非天然のヌクレオシド塩基：Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｙ、Ｍ、Ｒ２０及びＲ７’は活性化合物の項と同義である）。
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【０１４６】
或いは、一リン酸プロドラッグＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶはスキーム２で概説されるように合成することができ、すなわち、ヌクレオシド１は、リン酸トリメチルにおけるオキシ塩化リン又は三塩化ホスホロチオイルの作用によって直接、一リン酸８に変換することができる。アミノエステル９又は１０へのカップリングは、ＤＣＣのような標準のカップリング剤によって達成されてホスホルアミデート７及び１１を得ることができる。脱保護及びその後のＥＤＣ、ＥＤＣ／ＨＯＢｔ、ＴＢＹＵ又はＣＤＩのような剤との７又は１１のカップリングによって一リン酸プロドラッグＸＩＩ及びＸＩＩＩが提供される。一リン酸プロドラッグＸＩＶは、スキーム１に記載されたように７から得ることができる。
2012517443.tif 000046
スキーム２．一リン酸プロドラッグＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶの代わりの合成法（塩基は天然又は非天然のヌクレオシド塩基：Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｙ、Ｍ、Ｒ２０及びＲ７’は活性化合物の項と同義である）。
【０１４７】
一リン酸プロドラッグＸＶは、フェノール１２（スキーム３）から出発してスキーム３で概説されるように調製することができる。オキシ塩化リン又は三塩化ホスホロチオイルへの１２の暴露によって１３が提供され、それがその後アミノエステル１４と反応することができ、ホスホルアミデート１５を生じる。次にヌクレオシド１が、クロロホスホリルアミノプロパノエート１５との５’−ヒドロキシル基の反応によって一リン酸類似体１６に変換され得る。脱保護及びその後のＥＤＣ、ＥＤＣ／ＨＯＢｔ、ＴＢＹＵ又はＣＤＩのような剤との１６のカップリングによって一リン酸プロドラッグＸＶが提供される。
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スキーム３．一リン酸プロドラッグＸＶの合成法（塩基は天然又は非天然のヌクレオシド塩基：Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｙ、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ７’は活性化合物の項と同義である）。
【０１４８】
オキシ塩化リン又は三塩化ホスホロチオイルとのフェノール１２の反応によってジフェニルホスホロクロリデート１７（スキーム４）が提供されることによって一リン酸プロドラッグＸＶＩが調製され得る。次にジフェニルホスホロクロリデート１７との５’−ヒドロキシル基の反応によってヌクレオシド１が中間体一リン酸類似体に変換され得る。脱保護及びその後のＥＤＣ、ＥＤＣ／ＨＯＢｔ、ＴＢＹＵ又はＣＤＩのような剤との３’−ヒドロキシル基のエステル形成、その後のＲ２１ＯＨによる再エステル化によって一リン酸プロドラッグＸＶＩが提供される。
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スキーム４．一リン酸プロドラッグＸＶＩの合成法（塩基は天然又は非天然のヌクレオシド塩基：Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｙ、Ｒ２１及びＲ７’は活性化合物の項と同義である）。
【０１４９】
ジペプチド２０を生じる保護されたトリプトファン１８と保護されたアミノ酸１９とＥＤＣ、ＥＤＣ／ＨＯＢｔ、ＴＢＹＵ又はＣＤＩのようなカップリング剤の初期反応によって一リン酸プロドラッグＸＶＩＩを調製することができる（スキーム５）。アミン保護の取り外しによって次いでジアミン２１を生じ、それがオキシ塩化リン又は三塩化ホスホロチオイルと反応して環状の塩化ホスホロジアミド２２を得ることができる。次に環状の塩化ホスホロジアミド２２との５’−ヒドロキシル基の反応によってヌクレオシド１を一リン酸類似体に変換することができる。脱保護及びその後のＥＤＣ、ＥＤＣ／ＨＯＢｔ、ＴＢＹＵ又はＣＤＩのような剤との２２のカップリングによって一リン酸プロドラッグＸＶＩＩが提供される。
2012517443.tif 000049
スキーム５．一リン酸プロドラッグＸＶＩＩの合成法（塩基は天然又は非天然のヌクレオシド塩基：Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｙ、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ７’は活性化合物の項と同義である）。
【０１５０】
或いは、一リン酸プロドラッグＸＶＩＩは、その後にジペプチド２０とのカップリングが続く一リン酸類似体８から調製することができる（スキーム６）。
2012517443.tif 000050
スキーム６．一リン酸プロドラッグＸＶＩＩの代わりの合成法（塩基は天然又は非天然のヌクレオシド塩基：Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｙ、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ７’は活性化合物の項と同義である）。
及び塩基は好適な保護を含有してもよい
【０１５１】
二塩化ホスホルアミド２３のヌクレオシド１との初期反応によって一リン酸プロドラッグＸＶＩＩＩを調製することができる（スキーム７）。生成された中間体と水、硫化水素又はアミンとのその後の反応は一リン酸類似体２４を提供する（スキーム７）。ホスゲン又はＣＤＩのようなホスゲン同等物へのビス求核試薬の暴露は、一リン酸プロドラッグＸＶＩＩＩを提供する。
2012517443.tif 000051
スキーム７．一リン酸プロドラッグＸＶＩＩＩの合成法（塩基は天然又は非天然のヌクレオシド塩基：Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｙ、Ｍ、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ７’は活性化合物の項と同義である）。
１）１との２３の反応
又はホスゲン／ホスゲン同等物
及び塩基は好適な保護を含有してもよい
【０１５２】
或いは、スキーム８に示されるように、ヌクレオシド１のオキシ塩化リン又は三塩化ホスホロチオイルとの初期反応によって一リン酸プロドラッグＸＶＩＩＩ（ＭがＮＲではない）を調製することができる。生成された中間体と水又は硫化水素とのその後の反応、それに続くホスゲン又はＣＤＩのようなホスゲン同等物との反応によって一リン酸プロドラッグＸＶＩＩＩが提供される（スキーム８）。
2012517443.tif 000052
スキーム８．一リン酸プロドラッグＸＶＩＩＩの代わりの合成法（塩基は天然又は非天然のヌクレオシド塩基：Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｙ、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ７’は活性化合物の項と同義である）。
ＣＤＩ又はホスゲン／ホスゲン同等物
及び塩基は好適な保護を含有してもよい
【０１５３】
ＴＭＳＯＴｆのようなルイス酸の存在下で糖２６を保護された又はシリル化されたプリン塩基とカップリングさせることによってヌクレオシド１を調製することができる。３’−及び５’−ヒドロキシルの脱保護によってヌクレオシド１を得る。
2012517443.tif 000053
スキーム９．ヌクレオシド１の合成法（塩基は天然又は非天然のヌクレオシド塩基：Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｙ、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ７’は活性化合物の項と同義である）。
保護された又はシリル化されたプリン塩基
【０１５４】
或いは、１’−ハロ又は１’−ヒドロキシ化合物２７からヌクレオシド１を調製することができる。１’−ハロの場合については、トリエチルアミン又は水素化ナトリウムのような塩基の存在下で保護された又は遊離のプリン塩基が、その後の脱保護で、ヌクレオシド１を生じる。１'−ヒドロキシの場合については、アゾジカルボン酸ジイソプロピルのようなミツノブカップリング剤の存在下、保護された又は遊離のプリン塩基が、その後の脱保護で、ヌクレオシド１を生じる。
2012517443.tif 000054
スキーム１０．ヌクレオシド１の代わりの合成法（塩基は天然又は非天然のヌクレオシド塩基：Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｙ、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ７’は活性化合物の項と同義である）。
保護された又はシリル化されたプリン塩基
１）塩基又はミツノブ
２）脱保護
及び塩基は好適な保護を含有してもよい；Ｐｒ＝保護
ハロゲン
【０１５５】
以下の実施例において本発明をさらに説明する。スキーム１１〜１４及び実施例１〜６は、６−置換プリンヌクレオチドプロドラッグを合成するための調製方法を示し、実施例７〜３５は、６−置換プリンのヌクレオシド、ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体の生物学的評価のための方法を示す。これらの実施例は決して限定ではなく、本発明の精神と範囲から逸脱することなく詳細の変異を為すことができることが当業者によって理解されるであろう。
具体的な実施例
【０１５６】
本発明の代表的なものである具体的な化合物は、以下の実施例及び反応順序のように調製され；反応順序を描く実施例及び図面は、本発明の理解を助ける説明目的で提供され、以下に続く特許請求の範囲で言及される本発明を決して限定するように解釈されるべきではない。本化合物は、本発明の追加の化合物を製造するその後の実施例で中間体としても使用することができる。反応のいずれにおいても得られる収率を最適化する試みは必ずしも為されていない。当業者は、反応時間、温度、溶媒及び／又は試薬における日常の変異を介してそのような収率を高める方法を知るであろう。
【０１５７】
無水溶媒は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（ミルウォーキー）から購入した。試薬は市販品を購入した。特に言及しない限り、実施例で使用した物質は、容易に入手できる業者から得たか、又は化学合成の当業者に既知の常法によって合成した。融点（ｍｐ）は、電熱数字融点装置で測定し、補正されていない。１Ｈ及び１３ＣのＮＭＲスペクトルは、室温にてＶａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ  Ｐｌｕｓ４００分光計で取り込み、内部テトラメチルシランからのｐｐｍダウンフィールドで記録した。重水素交換、脱カップリング実験又は２Ｄ−ＣＯＳＹを行ってプロトンの割り振りを確認した。シグナル多重性は、ｓ（一重項）、ｄ（二重項）、ｄｄ（二重項の二重項）、ｔ（三重項）、ｑ（四重項）、ｂｒ（広い）ｍ（多重）によって表す。Ｊ値はすべてＨｚである。質量スペクトルは、電気スプレーを用いたＭｉｃｒｏｍａｓｓプラットフォームＬＣ分光計で決定した。元素分析は、Ａｔｌａｎｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｌａｂ社（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）によって行われた。分析用ＴＬＣはワットマンＬＫ６Ｆシリカゲルプレートで行い、調製用ＴＬＣはワットマンＰＫ５Ｆシリカゲルプレートで行った。カラムクロマトグラフィは、シリカゲルにて又は逆相高速液体クロマトグラフィを介して実施した。
【０１５８】
2012517443.tif 000055
スキーム１１．２，６−ジアミノプリン２’−Ｃ−Ｍｅ一リン酸プロドラッグの合成
実施例１：（２Ｓ）−エチル２−（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２，６−ジアミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシ−４−メチルテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエート（７５）
ＴＨＦ（１ｍＬ）とＤＭＦ（１ｍＬ）における（７４）（３０ｍｇ、０．１ミリモル）の溶液に０℃にて、（２Ｒ）−エチル２−（クロロ（フェノキシ（ホスホリルアミノ）プロパノエート１（０．４ｍＬ、０．４ミリモル）を加え、次いでｔ−ＢｕＭｇＣｌ（０．４ｍｇ、０．４ｍＬ）を少しずつ加えた。室温にて一晩撹拌した後、濃塩化アンモニウムで反応混合物を中和し、次いでジクロロメタン：メタノール＝７：１〜７：２によるフラッシュカラムクロマトグラフィによって精製し、７５（１ｍｇ、１．８％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ：Ｃ２２Ｈ３０Ｎ７Ｏ８Ｐについての計算値５５１．１，観察値：５５２．１（Ｍ＋１）。
【０１５９】
参考文献：
１．（ａ）Ｐｅｒｒｏｎｅ，Ｐ．；Ｄａｖｅｒｉｏ，Ｆ．；Ｖａｌｅｎｔｅ，Ｒ．；Ｒａｊｙａｇｕｒｕ，Ｓ．；Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ａ．；Ｌｅｖｅｑｕｅ，Ｖ．；Ｐｏｇａｍ，Ｓ．Ｌ．；Ｎａｊｅｒａ，Ｉ．；Ｋｌｕｍｐｐ，Ｋ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．；Ｂ．及びＭｃＧｕｉｇａｎ，Ｃ．Ｆｉｒｓｔ  Ｅｘａｍｐｌｅ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  ａ  ４’−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｐｕｒｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  （４’−Ａｚｉｄｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ）：Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｔｏ  ａ  Ｓｕｂｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｖｅｒｓｕｓ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００７，５０，５４６３−５４７０．（ｂ）Ｕｃｈｉｙａｍａ，Ｍ．；Ａｓｏ，Ｙ．；Ｎｏｙｏｒｉ，Ｒ．；Ｈａｙａｋａｗａ，Ｙ．Ｏ−Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｎ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９３，５８，３７３−３７９。
【０１６０】
2012517443.tif 000056
スキーム１２．２，６−ジアミノプリンジオキソラン一リン酸プロドラッグの合成
実施例２：
（２Ｒ）−エチル−２−（（（（４Ｒ）−４−（２，６−ジアミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−１，３−ジオキソラン−２−イル）メトキシ）フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエート（７７）
化合物７６（３０ｍｇ、０．１２ミリモル）のＴＨＦ（５ｍＬ）溶液に、ｔ−ＢｕＭｇＣｌ（０．３６ｍＬ、０．３６ミリモル）の１Ｍ溶液を加え、３０分間撹拌した。反応混合物に室温にて、ＴＨＦ中の（２Ｒ）−エチル−２−（クロロ（フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエート（０．３６ｍＬ、０．３６ミリモル）を加え、一晩撹拌し、塩化アンモニウムの濃い水溶液で中和し、粗混合物を、酢酸エチル：メタノール＝５：１によるフラッシュカラムクロマトグラフィによって精製して７７（２８ｍｇ、４６％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，３００ＭＨｚ）δ：７．８０−７．７９（ｓ，１Ｈ），７．２６−７．０９（ｍ，５Ｈ），６．２７（ｍ，１Ｈ），６．１２（ｂｒｓ，２Ｈ），５．２５（ｍ，３Ｈ），４．４７（ｍ，２Ｈ），４．２２（ｍ，２Ｈ），４．０３（ｍ，２Ｈ），３．８３（ｍ，１Ｈ），１．３３−１．１５（ｍ，６Ｈ）
ＬＣ／ＭＳ：Ｃ２０Ｈ２７Ｎ７Ｏ７Ｐについての計算値：５０８．２，観察値：５０８．３（Ｍ＋１）
【０１６１】
2012517443.tif 000057
スキーム１３．３’−アジド−２’，３’−ジデオキシグアノシン一リン酸プロドラッグの合成
実施例３：
（２Ｒ）−エチル２（（（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ）−３−アジド−５−（２，６−ジアミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）テトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）−（フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエート（７９）
ＴＨＦ（５ｍＬ）中の化合物７８（３４ｍｇ、０．１１ミリモル）の懸濁液にｔ−ＢｕＭａＣｌ（０．２２ｍＬ、０．２２ミリモル）を加えた。反応混合物を３０分間撹拌し、次いで０℃に冷却し、ＴＨＦ中の（２Ｒ）−エチル−２−（クロロ（フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエート（０．２２ｍＬ、０．２２ミリモル）を加えた。反応混合物を室温にて一晩撹拌し、塩化アンモニウムの濃い水溶液で中和し、粗混合物を、酢酸エチル：メタノール＝５：１によるフラッシュカラムクロマトグラフィによって精製して７９（１２ｍｇ、１９％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，３００ＭＨｚ）δ：７．８５，７．８９（２ｓ，１Ｈ），７．１２（ｍ，５Ｈ），６．１７（ｍ，１Ｈ），４．６０（ｍ，１Ｈ），４．３７（ｍ，１Ｈ），４．２２（ｍ，２Ｈ），４．０３（ｍ，３Ｈ），３．８３（ｍ，１Ｈ），２．８５（ｍ，１Ｈ），２．４６（ｍ，１Ｈ），１．２２（ｍ，３Ｈ），１．１５（ｍ，３Ｈ）
ＬＣ／ＭＳ：Ｃ２１Ｈ２８Ｎ１０Ｏ６Ｐについての計算値：５４７．２，観察値：５４７．３（Ｍ＋１）
【０１６２】
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スキーム１４．３’−アジド−２’，３’−ジデオキシグアノシン類似体（８３）の合成
実施例４：
メチル３−（２−（ジクロロホスホリルオキシ）フェニル）プロパノエート（８１）２
−７８℃にて窒素のもとで、オキシ塩化リン（０．２５ｍＬ、２．８ミリモル）を含有する無水エーテルの溶液に、無水エーテル（９．２ｍＬ）中の無水トリエチルアミン（０．３８ｍＬ、２．８ミリモル）とメチル３−（２−ヒドロキシフェニル）プロパノエート８０（０．５ｇ、２．７７ミリモル）を一滴ずつ加えた。添加に続いて、反応混合物をゆっくり室温に温め、１時間撹拌した。減圧下で溶媒を取り除き、有意な量の固形物を含有する油として粗生成物を得た。
【０１６３】
参考文献
２．Ｌｅｍｍｅｎｓ，Ｒ．ＷＯ２００３／０７０９４４，Ｍｅｔｈｏｄ  Ｏｆ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ  Ｌｉｇａｎｄｓ．
【０１６４】
実施例５：
（２Ｒ）−エチル２−（クロロ（２−（３−メトキシ−３−オキソプロピル）フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエート（８２）
メチル３−（２−（ジクロロホスホリルオキシ）フェニル）プロパノエート８１（２．７７ミリモル）と塩酸Ｌ−アラニンメチルエステル（０．４２ｇ、２．７７ミリモル）を無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）に懸濁した。−７８℃にて窒素のもとで、無水トリエチルアミン（０．３７ｍＬ、２．７７ミリモル）とジクロロメタン（５ｍＬ）を一滴ずつ加えた。添加に続いて、反応混合物をゆっくり室温に温め、一晩撹拌した。減圧下で溶媒を取り除き、固形物を無水エーテル（２０ｍＬで２回）で洗浄し、濾過した。濾液を残留物に濃縮し、油として粗生成物を得た。ＴＨＦ（２．７７ｍＬ）による希釈によって１Ｍ溶液を得、さらに精製することなくその後の工程にそれを用いた。
【０１６５】
実施例６：
（２Ｒ）−エチル２−（（（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ）−３−アジド−５−（２，６−ジアミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）テトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）−（２−（３−メトキシ−３−オキソプロピル）フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエート（８３）
この化合物は、実施例３における化合物７９で記載された方法にて調製した。
【０１６６】
実施例７：
６−置換−２−アミノプリンヌクレオシドの６−ヒドロキシ−２−アミノプリンヌクレオシドへの変換
ヒドロキシ基以外の６’位で官能性を持つ、上述のように調製された種々のヌクレオシドは、５’−ＯＨ基が一リン酸プロドラッグに変換されない場合、生体内で容易に６’−ヒドロキシの形態に変換される。
【０１６７】
以下に示すのは、５０μＭの６−置換−２−アミノプリンヌクレオシドをＰＢＭ細胞にて４時間インキュベートした後に形成されたヌクレオチドのＬＣ／ＭＳ定性分析の複数の例である。末梢血単核（ＰＢＭ）細胞における５０μＭでの３’−アジド（ＲＳ−５２７）のインキュベート及びその後の質量分光検出を伴った液体クロマトグラフィによる解析は、ＲＳ−５２７一リン酸（ＭＰ）についてのシグナルが検出レベルに近かった一方で、ＲＳ−５２７二リン酸（ＤＰ）及びＲＳ−５２７三リン酸（ＴＰ）についての強いシグナルを生じた（図１）。
【０１６８】
ＰＢＭ細胞における６−Ｎ−アリル基を含有するＲＦＳ−４２７のインキュベートは、ＲＦＳ−４５７−ＤＰ及びＲＦＳ−４５７−ＴＰの検出を生じた。ＲＦＳ−４２７、ＲＦＳ−４２７−ＭＰ、ＲＦＳ−４２７−ＤＰ又はＲＦＳ−４２７−ＴＰは検出されなかった（図２）。
【０１６９】
ＰＢＭ細胞における６−Ｎ−アリル、６Ｎ−Ｍｅ基を含有するＲＦＳ−４６４のインキュベートは、ＲＦＳ−４５７−ＴＰの検出を生じた。ＲＦＳ−４６４、ＲＦＳ−４６４−ＭＰ、ＲＦＳ−４６４−ＤＰ又はＲＦＳ−４６４−ＴＰは検出されなかった（図３）。
【０１７０】
ＰＢＭ細胞における６−Ｎ−シクロプロピル基を含有するＲＦＳ−５１２のインキュベートは、ＲＦＳ−４５７−ＤＰ及びＲＦＳ−４５７−ＴＰの検出を生じた。ＲＦＳ−５１２、ＲＦＳ−５１２−ＭＰ、ＲＦＳ−５１２−ＤＰ又はＲＦＳ−５１２−ＴＰは検出されなかった（図４）。
【０１７１】
ＰＢＭ細胞における６−メトキシ基を含有するＲＦＳ−５０６のインキュベートは、ＲＦＳ−５０６−ＤＰ、ＲＦＳ−４５７−ＤＰ及びＲＦＳ−４５７−ＴＰの検出を生じた。ＲＦＳ−５０６、ＲＦＳ−５０６−ＭＰ又はＲＦＳ−５０６−ＴＰは検出されなかった（図５）。
【０１７２】
ＰＢＭ細胞における６−アミノ基を含有するＲＦＳ−６６７のインキュベートは、ＲＦＳ−４５７、ＲＦＳ−４５７−ＭＰ、ＲＦＳ−４５７−ＤＰ、ＲＦＳ−４５７−ＴＰ、ＲＦＳ−６６７−ＤＰ及びＲＦＳ−６６７−ＴＰを生じた。ＲＦＳ−６６７又はＲＦＳ−６６７−ＭＰは検出されなかった（図６）。
【０１７３】
６−クロロ基を含有する化合物６４１５のＰＢＭ細胞及びＭＴ−２細胞双方におけるインキュベート、及び形成された細胞性三リン酸のその後の解析は、ＲＦＳ−４５７−ＴＰの検出を生じた。化合物６４１５はＰＢＭ細胞及びＭＴ−２細胞においてＡＺＧ及びＡＺＧ−ＴＰに変換された。薬剤によって３０分間処理したＭＴ−２細胞にて無視できるレベルの化合物６４１５が検出された。化合物６４１５もそのリン酸化合物もＰＢＭ細胞では検出されなかった（図７）。
【０１７４】
化合物６４１５で処理された場合、ＰＢＭ細胞及びＭＴ−２細胞双方におけるＡＺＧ−ＴＰのレベルがさらに高かったことは、三リン酸形態への変換が化合物６４１５を用いた場合、さらに早く生じたことを示唆している。４つの異なった濃度でのＡＺＧのインキュベートはＭＴ−２においてリン酸化は３０μＭで定常状態に達することを示唆していた。ＡＺＧ−ＴＰ／ｄＧＴＰの比は、ＰＢＭ細胞よりもＭＴ−２細胞で５倍高かった。ＡＺＧ又は６４１５のいずれかとの４８時間の処理後、ｄＮＴＰのレベルはすべて高められた（〜倍加した）が、ｄＧＴＰのレベルはそうではなかったということは、ＡＺＧとのリン酸化についての競合を示唆していた。
【０１７５】
これら６−置換の化合物が、酵素アデノシンデアミナーゼによってＧ類似体に変換されるかどうかを判定するために、一連の酵素動態実験を企てた。表１に示されるように、代表的な数の６−置換ヌクレオシドがアデノシンデアミナーゼによってＧ類似体に変換されることが分かった。化合物６９、６−Ｎ，Ｎ−ジメチル類似体は、調べた条件下ではアデノシンデアミナーゼに対して安定であることが分かった。
【表１３】
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【０１７６】
２’−デオキシアデノシンは本明細書ではＲＦＳ−６６７とも呼ぶ。化合物７２は本明細書ではＲＦＳ−５１２と呼ぶ。化合物６２は本明細書ではＲＦＳ−４２７とも呼ぶ。化合物７０は本明細書ではＲＦＳ−５０６と呼ぶ。
【０１７７】
表２に示されるのは、ＭＰプロドラッグＲＳ−７８８と親ヌクレオシドＲＳ−６６７についてのＨＩＶ及び毒性のデータである。この場合、ＲＳ−７８８についてＥＣ５０及びＥＣ９０での高い抗ＨＩＶ活性が言及されるが、親ヌクレオシドＲＳ−６６７に比べて毒性も上昇している。この化合物は、ＨＩＶに対するＥＣ５０及びＰＢＭ細胞とＣＥＭ細胞に対するＩＣ５０でそれぞれ、４３００倍及び３４００倍の差異を示す。
【表１４】
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表２．ＭＰプロドラッグＲＳ−７８８と親ヌクレオシドＲＳ−６６７についてのＨＩＶ及び毒性のデータ
【０１７８】
６−アミノ基と５’−ＭＰプロドラッグを含有するＲＳ−７８８のＰＢＭ細胞におけるインキュベートは、ＲＦＳ−４５７−ＭＰ、ＲＦＳ−４５７−ＤＰ及びＲＦＳ−４５７−ＴＰの検出を生じた。しかしながら、ＲＳ−６６７のインキュベートとは対照的に、非常に高いレベルのＲＳ−６６７ＭＰ、ＲＳ−６６７ＤＰ及びＲＳ−６６７ＴＰが検出された（図８）。ＭＰプロドラッグＲＳ−７８８のインキュベートの際に生成された高いレベルの細胞内ＲＳ−６６７−ＴＰは、ＭＰプロドラッグが、６−アミノ基の６−ＯＨへの変換を効率的に制限した又は止めたことを示している。
【０１７９】
既知のアデノシンデアミナーゼ阻害剤であるデオキシコフォルマイシンによって予備処理したＰＢＭ細胞における６−アミノ基と５’−ＭＰプロドラッグを含有するＲＳ−７８８のインキュベートは、低レベルのＲＦＳ−４５７−ＭＰ、ＲＦＳ−４５７−ＤＰ及びＲＦＳ−４５７−ＴＰの検出を生じた。しかしながら、再び、ＲＳ−６６７のインキュベートとは対照的に、非常に高いレベルのＲＳ−６６７ＭＰ、ＲＳ−６６７ＤＰ及びＲＳ−６６７ＴＰが検出された（図９）。
【０１８０】
ＰＨＡで刺激したヒトのＰＢＭ細胞及びＣＥＭ細胞における（−）−β−Ｄ−２，６−ジアミノプリンジオキソラン（ＤＡＰＤ）の代謝は、以前評価された（Antimicrob. Agents Chemother. 2001, 45, 158-165）。この以前の研究では、ＤＡＰＤは（−）−β−Ｄ−ジオキソラングアニン（ＤＸＧ）に容易に脱アミノすることが分かった。ＤＸＧ及びＤＡＰＤ双方が検出されたが、ＰＢＭＣにおけるＤＡＰＤのレベルは、ＣＥＭ細胞において測定されたＤＡＰＤのレベルよりも２７倍高かった；ＤＸＧのレベルは双方の細胞種でおおまかに同じだった。ＤＡＰＤ及びＤＸＧ及びそれらのリン酸化された誘導体の細胞内レベルは同じ以前の研究で定量された。いずれの細胞種でもＤＡＰＤの相当する一リン酸、二リン酸又は三リン酸の形態へのリン酸化は検出されなかった。ＤＡＰＤはＤＸＧに脱アミノ化され、その後ＤＸＧ−ＴＰにリン酸化されることが示された。
【０１８１】
６−アミノ基を含有するＤＡＰＤのＰＢＭ細胞における５０μＭにて３７℃での４時間の細胞内代謝の再検査は、ＤＸＧとＤＸＧ−ＭＰに加えて高いレベルのＤＸＧ−ＴＰの検出を生じた。低レベルのＤＡＰＤが検出されたが、ＤＡＰＤのリン酸化形態は検出されなかった（図１０）。
【０１８２】
表３で示されるのは、ＤＡＰＤ−ＭＰプロドラッグＲＳ−８６４と親ヌクレオシドＤＡＰＤについてのＨＩＶ及び毒性のデータである。この場合、ＲＳ−８６４についてＥＣ５０及びＥＣ９０双方での高い抗ＨＩＶ活性が言及されるが、親ヌクレオシドＤＡＰＤに比べてやや高い毒性もある。
【表１５】
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表３．ＤＡＰＤ−ＭＰプロドラッグＲＳ−８６４と親ヌクレオシドＤＡＰＤについてのＨＩＶ及び毒性のデータ
【０１８３】
６−アミノ基と５’−ＭＰプロドラッグを含有するＲＳ−８６４のＰＢＭ細胞におけるインキュベートは、低レベルのＤＸＧ、ＤＸＧ−ＭＰ及びＤＸＧ−ＴＰの検出を生じた。しかしながら、ＤＡＰＤのインキュベートとは対照的に、非常に高いレベルのＤＡＰＤ−ＴＰを検出した。加えて、低レベルのＤＡＰＤ，ＤＡＰＤ−ＭＰ、ＤＡＰＤ−ＤＰも認められた。ＤＡＰＤ−ＭＰのインキュベートの際生成された高いレベルのＤＡＰＤ−ＴＰは、ＭＰプロドラッグが６−アミノ基の６−ＯＨへの変換を効率的に制限した又は止めたことを示している。
【０１８４】
実施例８．
抗ＨＩＶ（ＰＢＭ細胞にて）アッセイ
化合物のヌクレオシド類似体が６−ヒドロキシ類似体に変換され、ヌクレオシドの一リン酸類似体がこの変換に抵抗することを立証したので、今や、本明細書で記載される化合物の生物活性を議論することが関係する。
【０１８５】
以前記載された（Schinazi R.F., McMillan A., Cannon D., Mathis R., Lloyd R.M. Jr., Peck A., Sommadossi J.-P., St. Clair M., Wilson J., Furman P.A., Painter G., Choi W.-B., Liotta D.C. Antimicrob. Agents Chemother. 1992, 36, 2423; Schinazi R.F., Sommadossi J.-P., Saalmann V., Cannon D., Xie M.-Y., Hart G., Smith G., Hahn E. Antimicrob. Agents Chemother. 1990, 34, 1061を参照）ように、ヒトの末梢血単核（ＰＢＭ）細胞にて化合物の抗ＨＩＶ−１活性を測定した。無菌ＤＭＳＯで化合物のストック溶液（２０〜４０ｍＭ）を調製し、次いで増殖培地で所望の濃度に希釈した。感染多重度０．０１にて原型ＨＩＶ−１ＬＡＩによって細胞を感染させた。（ｒＡ）ｎ’（ｄＴ）１２−１８を鋳型−プライマーとして用いた逆転写酵素アッセイによって感染６日後に細胞上清から得られたウイルスを定量した。希釈した溶液に存在するＤＭＳＯ（＜０．１％）はウイルスの収率に影響を有さなかった。ＡＺＴを陽性対照として含めた。以前記載された半有効法（Chou T.-C. & Talalay P. Adv. Enzyme Regul. 1984, 22, 27-55; Belen’kii M.S. & Schinazi R.F. Antiviral Res. 1994, 25, 1-11を参照）を用いた濃度反応曲線から抗ウイルスＥＣ５０及びＥＣ９０を得た。
【０１８６】
実施例９．
ＨＩＶ−１ＲＴによるヌクレオシド−ＴＰの取り込みを評価する
ｉ）タンパク質の発現と精製：ｐ６ＨＲＴ−ＰＲＯＴ発現ベクターを用いて、ＨＩＶ−１ＲＴ（ｘｘＬＡＩの背景）（Shi C, Mellors JW. A recombinant retroviral system for rapid in vivo analysis of human immunodeficiency virus type 1 susceptibility to reverse transcriptase inhibitors. Antimicrob Agents Chemother. 1997; 41:2781-5を参照）を細菌にて過剰発現させ、以前記載された（Le Grice SF, Gruninger-Leitch F. Rapid purification of homodimer and heterodimer HIV-1 reverse transcriptase by metal chelate affinity chromatography. Eur J Biochem. 1990; 187: 307-14; Le Grice SF, Cameron CE, Benkovic SJ. Purification and characterization of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Methods Enzymol. 1995; 262:130-44を参照）ように均質に精製した。２６０４５０Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数（ε２８０）を用いて２８０ｎｍにて分光光度計で、精製した酵素のタンパク濃度を測定した。ＲＴの活性部位濃度は、以前記載された（Kati WM, Johnson KA, Jerva LF, Anderson KS. Mechanism and fidelity of HIV reverse transcriptase. J Biol. Chem. 1992; 267: 25988-97を参照）ように前定常状態バースト実験から算出した。以下に記載される反応はすべて活性部位濃度を用いて実施した。
ｉｉ）前定常状態動態解析：５７ヌクレオチドのＤＮＡ鋳型（５’−ＣＴＣＡＧＡＣＣＣＴＴＴＴＡＧＴＣＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＮＴＣＴＣＴＡＧＣＡＧＴＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＧＧＧＡＣＡ−３’）にアニーリングされた、［γ３２Ｐ］−ＡＴＰで５’末端標識した２０ヌクレオチドのＤＮＡプライマー（５’−ＴＣＧＧＧＣＧＣＣＡＣＴＧＣＴＡＧＡＧＡ−３’）をすべての実験で使用した。ＤＮＡ鋳型は３０位（Ｎ）にＴ又はＣのいずれかを含有したが、それによって同一の２０ヌクレオチドのプライマーを用いた単一ヌクレオチド取り込みの動態の評価を可能にした。Ｋｉｎｔｅｋ  ＲＱＦ−３機器（Ｋｉｎｔｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｃｌａｒｅｎｃｅ，  ＰＡ）を用いて迅速クエンチ実験を行った。実験のすべてにおいて、２０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する同一の反応緩衝液で相当する容積のヌクレオチドと混合するのに先立って、３００ｎＭのＲＴと６０ｎＭのＤＮＡ鋳型／プライマー（Ｔ／Ｐ）を反応緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＫＣｌ）にて予備インキュベートした。０．５ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０によるクエンチによって１０ミリ秒〜３０分に及ぶ時間で反応を終了させた。反応を終了した試料は、等容量のゲル負荷緩衝液（９８％脱イオン化ホルムアミド、１０ｍＭのＥＤＴＡ及び１ｍｇのそれぞれブロモフェノールブルーとキシレンシアノール）と混合し、８５℃にて５分間変性させ、７Ｍ尿素−１６％ポリアクリルアミドゲル上で生成物を基質から分離した。生成物の形成は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＧＳ５２５  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて解析した。
ｉｉｉ）データの解析：適当な方程式（Johnson KA. Rapid quench kinetic analysis of polymerases, adenosinetriphosphatases, and enzyme intermediates. Methods Enzymol. 1995; 249:38-61を参照）を伴ったシグマプロットソフトウエア（Jandel Scientific）を用いた非線形回帰によって、動態解析から得られたデータを適合させた。生成物の形成の時間経過を、Ａがバーストの振幅を表す方程式：［生成物］＝Ａ［１−ｅｘｐ（−ｋｏｂｓｔ］に適合させることによってｄＮＴＰの各特定濃度についての見かけのバースト率定数（ｋｏｂｓ）を決定した。ｄＮＴＰの濃度に対して見かけの触媒速度、ｋｏｂｓをプロットし、以下の双曲線方程式ｋｏｂｓ＝（ｋｐｏｌ［ｄＮＴＰ］）／（［ｄＮＴＰ］＋Ｋｄ）にデータを適合させることによって代謝回転数（ｋｐｏｌ）及びｄＮＴＰの見かけの解離定数（Ｋｄ）を得た。
【０１８７】
実施例１０．
６−置換−２−アミノプリンヌクレオシド一リン酸プロドラッグの抗ＨＩＶ活性と細胞毒性を評価する
ｉ）ウイルス：１．３×１０７個のＭＴ−２細胞に５〜１０μｇのプラスミドＤＮＡをエレクトロポレーション（Gene Pulser; Bio-Rad）により入れることのよってｘｘＨＩＶ−ＩＬＡＩクローン７５を用いてストックのウイルスを調製した。形質転換の７日目に、無細胞上清を回収し、−８０℃で保存した。ビリオンからのＲＮＡの抽出、ＤＮａｓｅＩのよる抽出物の処理、ＲＴ−ＰＣＲによるＲＴの完全長コーディング領域（アミノ酸１〜５６０）の増幅、ＰＣＲ産物の精製、及びＡＢＩ３１００自動ＤＮＡシーケンサー（Applied Biosystems, Foster City, Calif.）におけるＢｉｇＤｙｅターミネータキット（ｖ．３．１）を用いたＰＣＲ産物の配列決定によってストックのウイルスの遺伝子型を確認した。３倍終点希釈アッセイ（希釈当たり６ウェル）によってウイルスのストックについて５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）をＭＴ−２細胞、Ｐ４／Ｒ５細胞又はＰＢＭ細胞について測定し、ＲｅｅｄとＭｕｅｎｃｈの方程式（Reed LJ, Muench H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. Am. J. Hyg. 1938; 27:493-497を参照）を用いて算出した。
【０１８８】
ｉｉ）単一複製サイクル薬剤感受性アッセイ：９６穴プレートにて、３つ組にて阻害剤の２倍又は３倍の連続希釈をＰ４／Ｒ５細胞に加えた。薬剤のないウイルス感染対照ウェルにおいて１００の相対的な光単位値を生じるウイルスの量で細胞を感染させた。感染後４８時間で、細胞溶解緩衝液と発光基質（Gal-Screen; Tropix/Applied Biosystems）を各ウェルに加え、照度計（ThermoLabSystems, Waltham, Mass）を用いて相対的な光単位値を測定した。ウイルス複製の阻害は、５０％のウイルス複製を阻害する（ＥＣ５０）のに必要とされる化合物の濃度として算出した。
【０１８９】
ｉｉｉ）多重複製サイクル薬剤感受性アッセイ：９６穴プレートにて、３つ組にて阻害剤の３倍連続希釈をＭＴ−２細胞に加えた。ＭＴ−２細胞における終点希釈によって決定されるように、細胞を０．０１の感染多重度で感染させた。感染後７日目で、培養上清を回収し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理した。市販の酵素連結免疫吸収アッセイ（DuPont, NEN Products, Wilmington, Del.）を用いて上清におけるｐ２４抗原の濃度を決定した。上述のようにＥＣ５０値を算出した。
【０１９０】
ｉｖ）ＰＢＭ細胞における薬剤感受性アッセイ：以前記載された（Schinazi RF, Cannon DL, Arnold BH, Martino-Saltzman D. Combinations of isoprinosine and 3'-azido-3'-deoxythymidine in lymphocytes infected with human immunodeficiency virus type 1. Antimicrob. Agents Chemother. 1988; 32:1784-1787; Schinazi RF, Sommadossi JP, Saalmann V, Cannon DL, Xie MY, Hart GC, Smith GA. Hahn E.F. Activities of 3'-azido-3'-deoxythymidine nucleotide dimers in primary lymphocytes infected with human immunodeficiency virus type 1. Antimicrob. Agents Chemother. 1990; 34:1061-1067）ように、健常な血清陰性供血者からＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ不連続勾配遠心によってＰＢＭ細胞を単離した。使用に先立って、植物凝集素Ａ（ＰＨＡ、Ｄｉｆｃｏ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）によって２〜３日間細胞を刺激した。フラスコ（Ｔ２５）アッセイには１００ＴＣＩＤ５０／１×１０７個の細胞によって、又は２４穴プレートアッセイには２００１００ＴＣＩＤ５０／６×１０７個の細胞によって、感染はまとめて１時間行った。１０倍連続希釈の試験化合物を含有するプレート又はフラスコに細胞を加えた。感染後５日目に、培養上清を回収し、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で処理した。上清におけるｐ２４の濃度を上述のように測定した。ＥＣ５０及び集約耐性値を上述のように算出した。
【０１９１】
ｖ）細胞毒性アッセイ：Ｐ４／Ｒ５細胞、ＭＴ−２細胞及び非感染のＰＨＡ刺激ヒトＰＢＭ細胞にてその潜在的な毒性効果について６−置換−２−アミノプリンヌクレオシド一リン酸プロドラッグを評価した。１０倍連続希釈の試験化合物を含有する９６穴細胞培養プレートにて５×１０３〜５×１０４個の細胞／ウェルで対数相のＰ４／Ｒ５細胞、ＭＴ−２細胞及びＰＨＡ刺激ヒトＰＢＭ細胞を播いた。培養物を２〜４日間インキュベートし、その後、臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）色素溶液（Promega, Madison, WI）を各ウェルに加え、一晩インキュベートした。停止可溶化溶液（Promega, Madison, WI）によって反応を止め、５７０ｎｍの波長にてプレートを読み取った。半有効法を用いた濃度−反応曲線から平均５０％細胞傷害性濃度（ＣＣ５０）を決定した。
【０１９２】
実施例１１．
薬剤耐性ＨＩＶに対する６−置換−２−アミノプリンヌクレオシド一リン酸プロドラッグの活性を評価する
親類似体と比べて改善された活性を有し、細胞毒性が少ないと確認された類似体をさらに、薬剤耐性ウイルスのパネルに対する活性について評価した。この試験に使用した薬剤耐性ウイルスには、ＨＩＶ−１Ｋ６５Ｒ、ＨＩＶ−１Ｋ７０Ｅ、ＨＩＶ−１Ｌ７４Ｖ、ＨＩＶ−１Ｍ１８４Ｖ、ＨＩＶ−１ＡＺＴ２、ＨＩＶ−１ＡＺＴ３、ＨＩＶ−１ＡＺＴ７、ＨＩＶ−１ＡＺＴ９、ＨＩＶ−１Ｑ１５１Ｍ及びＨＩＶ−１６９Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎが挙げられた。これらのウイルス及びＨＩＶ−ＲＴにおける変異の遺伝子型は図１２に記載されている。これら変異体ウイルスはすべて我々のＨＩＶ−１ｘｘＬＡＩクローンから生成された。
【０１９３】
実施例１２．
薬剤耐性ＨＩＶに対する６−置換−２−アミノプリンヌクレオシド一リン酸プロドラッグの活性を評価する
ｉ）ウイルス及び薬剤感受性アッセイ：上述のようにウイルスのストックを調製した。上述の単一及び複数の複製サイクルアッセイを用いて薬剤感受性アッセイを行った。ウイルスの複製を５０％阻害する（ＥＣ５０）のに必要とされる濃度としてウイルス複製の阻害を算出した。変異体ＨＩＶ−１のＥＣ５０をＷＴＨＩＶ−１のＥＣ５０で割ることによって集約耐性値を決定した。
ｉｉ）統計的解析：集約耐性値が統計学的に有意であるかどうかを判定するために、少なくとも３回の独立した実験からのＥＣ５０値をｌｏｇ１０変換し、ＳｉｇｍａＳｔａｔソフトウエア（）による２試料スチューデントｔ検定を用いて比較した。０．０５より低いｐ値を統計学的に有意であるとみなした。
【０１９４】
実施例１３．
変異体ＨＩＶ−１ＲＴによるヌクレオチドの取り込みと切り取りを評価する
ｉ）酵素：この試験には以下の変異体ＨＩＶ−１ＲＴ酵素を用いた：Ｋ６５Ｒ  ＲＴ、Ｋ７０Ｅ  ＲＴ、Ｌ７４Ｖ  ＲＴ、Ｍ１８４Ｖ  ＲＴ、ＡＺＴ２  ＲＴ、ＡＺＴ３  ＲＴ、Ｑ１５１Ｍ  ＲＴ及び６９Ｉｎｓｅｒｔ  ＲＴ。これら変異体ＲＴのそれぞれについて大腸菌のタンパク質発現ベクターを開発することができ、以前記載されたようにタンパク質の発現及び精製を行うことができる。タンパク質濃度及び活性部位濃度は上述のように決定した。
ｉｉ）ヌクレオチド取り込みの動態解析：Ｋ６５Ｒ、Ｋ７０Ｅ  ＲＴ、Ｌ７４Ｖ  ＲＴ、Ｍ１８４Ｖ  ＲＴ及びＱ１５１Ｍ  ＲＴの新規ヌクレオシド−ＴＰのそれぞれについての動態パラメータＫｄ及びｋｐｏｌを決定するのに前定常状態動態アッセイを使用することができる。実験設定とデータ解析は上述のように行うことができる。
【０１９５】
ｉｉｉ）切り取りアッセイ：連鎖停止鋳型／プライマーからの新規類似体のＡＴＰが介在する加リン酸分解切り取りは、ＷＴ  ＲＴ、ＡＺＴ２  ＲＴ  ＡＺＴ３  ＲＴ及び６９ＩｎｓｅｒｔＲＴを用いて実施することができる。上述の２０ヌクレオチドのＤＮＡプライマーの末端を［γ３２Ｐ］−ＡＴＰで標識し、次いで適当な５７ヌクレオチドにアニーリングすることができる。ＷＴ  ＲＴ及び１００μＭの適当な修飾ヌクレオチド類似体と共に３７℃にて３０分間インキュベートすることによってプライマーの３’末端を連鎖停止することができる。７Ｍ尿素−１６％アクリルアミド変性ゲル電気泳動の後、適当なバンドの切り取りによって３２Ｐ−標識した連鎖停止の２１ヌクレオチドプライマーをさらに精製することができる。加リン酸分解実験に使用するために、精製した連鎖停止プライマーを次いで適当なＤＮＡ鋳型にアニーリングすることができる。５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭのＫＣｌにて３００ｎＭの（活性部位）ＷＴ又は変異体のＲＴを当該の連鎖停止Ｔ／Ｐ複合体と共にインキュベートすることによってヌクレオシド−ＭＰの加リン酸分解除去を達成することができる。３．０ｍＭのＡＴＰと１０ｍＭのＭｇＣｌ２の添加によって反応を開始することができる。反応の全体を通して無機ピロホスファターゼ（０．０１Ｕ）が存在することができる。規定したインキュベート時間の後、反応チューブからアリコートを取り出し、等容量のゲル負荷色素（９８％脱イオン化ホルムアミド、１０ｍＭのＥＤＴＡ及び１ｍｇのそれぞれブロモフェノールブルーとキシレンシアノール）によって反応を止めることができる。変性ゲル電気泳動によって生成物を分離することができ、生成物の形成と一致する基質の消失は、Ｂｉｏ−ＲａｄＧＳ５２５ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｅｒを用いて解析することができる。データを以下の単純指数方程式：Ａが生成物形成の振幅を表す、［生成物］＝Ａ［ｅｘｐ（−ｋＡＴＰｔ）］に適合させてＡＴＰが介在する切り取りの見かけの速度（ｋＡＴＰ）を決定した。端末複合体形成は、以前記載された（Meyer PR, Matsuura SE, Mian AM, So AG, Scott WA. A mechanism of AZT resistance: an increase in nucleotide-dependent primer unblocking by mutant HIV-1 reverse transcriptase. Mol Cell. 1999;4:35-43; Sluis-Cremer N, Arion D, Parikh U, Koontz D, Schinazi RF, Mellors JW, Parniak MA. The 3'-azido group is not the primary determinant of 3'-azido-3'-deoxythymidine (AZT) responsible for the excision phenotype of AZT-resistant HIV-1. J Biol Chem. 2005; 280: 29047-52を参照）ように測定することができる。
【０１９６】
実施例１４．
ＨｅｐＧ２細胞におけるミトコンドリア毒性のアッセイ
ｉ）細胞増殖及び乳酸産生に対する６−置換−２−アミノプリンヌクレオシド一リン酸プロドラッグの効果：０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、及び１００μＭの薬剤の存在下で細胞をインキュベートすることによってＨｅｐＧ２細胞の増殖に対する効果を測定した。１０％ウシ胎児血清、１％ピルビン酸ナトリウム及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補完した非必須アミノ酸を伴った最低必須培地における１２穴細胞培養クラスターに細胞（ウェル当たり５×１０４個）を入れ、３７℃にて４日間インキュベートした。インキュベート期間の終了時、血球計算盤を用いて細胞数を決定した。また、Ｐａｎ−Ｚｈｏｕ，Ｘ−Ｒ，Ｃｕｉ，Ｌ，Ｚｈｏｕ，Ｘ−Ｊ，Ｓｏｍｍａｄｏｓｓｉ，Ｊ−Ｐ，Ｄａｒｌｅｙ−Ｕｓｍｅｒ，ＶＭ．“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＨｅｐＧ２  ｃｅｌｌｓ”Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０００；４４：４９６−５０３によっても教示された。乳酸産生に対するヌクレオシド類似体の効果を測定するために、ストック培養のＨｅｐＧ２細胞を希釈し、ウェル当たり２．５×１０４個にて１２穴培養プレートに入れた。種々の濃度（０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、及び１００μＭ）のヌクレオシド類似体を加え、５％ＣＯ２の湿潤雰囲気にて３７℃で培養物を４日間インキュベートした。４日目に各ウェルの細胞数を決定し、培養培地を回収した。培養培地を濾過し、比色乳酸アッセイ（Sigma-Aldrich）を用いて培地における乳酸含量を測定した。乳酸の産生は損傷したミトコンドリア機能のマーカーとみなされるので、６−置換−２−アミノプリンヌクレオシド一リン酸プロドラッグの存在下での細胞増殖で検出される乳酸産生の高いレベルは、薬剤が誘導する細胞傷害性効果を示す。
【０１９７】
ｉｉ）ミトコンドリアのＤＮＡ合成に対する６−置換−２−アミノプリンヌクレオシド一リン酸プロドラッグの効果：ミトコンドリアのＤＮＡ含量を正確に定量するリアルタイムＰＣＲが開発されている（Stuyver LJ, Lostia S, Adams M, Mathew JS, Pai BS, Grier J, Tharnish PM, Choi Y, Chong Y, Choo H, Chu CK, Otto MJ, Schinazi RF. Antiviral activities and cellular toxicities of modified 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrocytidine analogs. Antimicrob. Agents Chemother. 2002; 46: 3854-60を参照）。ミトコンドリアのＤＮＡ含量に対するヌクレオシド類似体の効果を決定するこのアッセイを、本出願で記載される試験すべてで用いた。このアッセイでは、コラーゲンを被覆した９６穴プレートに、継代の少ないＨｅｐＧ２細胞を５，０００個／ウェルで播いた。ヌクレオシド一リン酸類似体を加えて最終濃度、０μＭ、０．１μＭ、１０μＭ、及び１００μＭを得た。培養７日目に、市販のカラム（RNeasy 96 kit; Qiagen）を用いて細胞の核酸を調製した。これらのキットはＲＮＡ及びＤＮＡを同時に精製するので、合計の核酸がカラムから溶出される。双方の標的及び参照の増幅のための好適なプライマー及びプローブと共にマルチプレックスＱ−ＰＣＲプロトコールを用いて、５μＬの溶出核酸から、ミトコンドリアのチトクロームｃオキシダーゼサブユニットＩＩ（ＣＯＸＩＩ）遺伝子とβアクチン又はｒＲＮＡの遺伝子を増幅した。ＣＯＸＩＩについては、以下のセンス、プローブ及びアンチセンスプライマーをそれぞれ用いる：５’−ＴＧＣＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＡ−３’、５’−テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン−ＴＣＣＴＣＡＴＣＧＣＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＣ−ＴＡＭＲＡ−３’及び５’−ＣＧＴＣＴＧＴＴＡＴＧＴＡＡＡＧＧＡＴＧＣＧＴ−３’。β−アクチン遺伝子（GenBank accession number E01094）のエクソン３については、センス、プローブ及びアンチセンスプライマーはそれぞれ、５’−ＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＡ−３’、５’−６−ＦＡＭＣＡＣＣＡＣＧＧＣＣＧＡＧＣＧＧＧＡＴＡＭＲＡ−３’及び５’−ＴＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴ−３’である。ｒＲＮＡ遺伝子のプライマー及びプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。遺伝子すべてについて等しい増幅効率が得られたので、比較ＣＴ法を用いて、ミトコンドリアＤＮＡ合成の阻害の可能性を検討した。比較ＣＴ法は、標的（ＣＯＸＩＩ遺伝子）の量を内因性の参照（β−アクチン又はｒＲＮＡ遺伝子）の量に標準化し、校正値（７日目での薬剤を含まない対照）と比較する算術式を用いる。この方式の算術式は、２−ΔΔＣＴによって与えられ、式中、ΔΔＣＴは、（平均の標的試験試料のＣＴ−標的対照のＣＴ）−（平均の参照試験のＣＴ−平均の対照のＣＴ）である（Johnson MR, K Wang, JB Smith, MJ Heslin, RB Diasio. Quantitation of dihydropyrimidine dehydrogenase expression by real-time reverse transcription polymerase chain reaction. Anal. Biochem. 2000; 278:175-184を参照）。薬剤の存在下での細胞増殖におけるミトコンドリアＤＮＡ含量の低下は、ミトコンドリア毒性を示す。
【０１９８】
ｉｉｉ）電子顕微鏡での形態評価：ＮＲＴＩ誘導の毒性は、透過型電子顕微鏡を用いた超構造の解析で観察することができるミトコンドリアの形態変化（たとえば、クリスタの喪失、マトリクスの溶解及び膨張、並びに脂質滴の形成）を引き起こすことが示されている。（Cui L, Schinazi RF, Gosselin G, Imbach JL. Chu CK, Rando RF, Revankar GR, Sommadossi JP. Effect of enantiomeric and racemic nucleoside analogs on mitochondrial functions in HepG2 cells. Biochem. Pharmacol. 1996, 52, 1577-1584; Lewis W, Levine ES, Griniuviene B, Tankersley KO, Colacino JM, Sommadossi JP, Watanabe KA, Perrino FW. Fialuridine and its metabolites inhibit DNA polymerase gamma at sites of multiple adjacent analog incorporation, decrease mtDNA abundance, and cause mitochondrial structural defects in cultured hepatoblasts. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996; 93: 3592-7; Pan-Zhou XR, L Cui, XJ Zhou, JP Sommadossi, VM Darley-Usmar. Differential effects of antiretroviral nucleoside analogs on mitochondrial function in HepG2 cells. Antimicrob. Agents Chemother. 2000, 44, 496-503を参照）。たとえば、１０μＭのフィアルリジン（ＦＩＡＵ：１，２’−デオキシ−２’−フルオロ−１−Ｄ−アラビノフラノシル−５−ヨード−ウラシル）と共にインキュベートしたＨｅｐＧ
２細胞は、ミトコンドリアの機能不全と一致する形態変化を伴った拡張したミトコンドリアの存在を示した。６−置換−２−アミノプリンヌクレオシド一リン酸プロドラッグがミトコンドリアにおける形態変化を促進するかどうかを判定するために、０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、及び１００μＭのヌクレオシド類似体の存在下で、細胞培養皿（３５×１０ｍｍ）にＨｅｐＧ２細胞（２．５×１０４個／ｍＬ）を播いた。８日目に細胞を固定し、脱水し、以前記載されたようにＥｐｏｎａｓに包埋した。薄い切片を調製し、酢酸ウラシルとクエン酸鉛で染色し、次いで透過型電子顕微鏡を用いて調べた。
【０１９９】
実施例１５．
Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞におけるミトコンドリア毒性アッセイ
ニューロン毒性を起こすヌクレオシド類似体の可能性を推定するために、マウスのＮｅｕｒｏ２Ａ細胞（American Type Culture Collection 131）をモデル系として用いることができる（Ray AS, Hernandez-Santiago BI, Mathew JS, Murakami E, Bozeman C, Xie MY, Dutschman GE, Gullen E, Yang Z, Hurwitz S, Cheng YC, Chu CK, McClure H, Schinazi RF, Anderson KS. Mechanism of anti-human immunodeficiency virus activity of beta-D-6-cyclopropylamino-2',3'-didehydro-2',3'-dideoxyguanosine. Antimicrob. Agents Chemother. 2005, 49, 1994-2001を参照）。記載されたように、臭化３−（４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム色素に基づいたアッセイを用いて、細胞増殖を５０％阻害ずる（ＣＣ５０）のに必要な濃度を測定することができる。薬剤の規定された濃度での細胞性乳酸及びミトコンドリアのＤＮＡレベルにおける撹乱を上述のように行った。実験すべてにおいて、対照のヌクレオシド類似体としてｄｄＣ及びＡＺＴを使用することができる。
【０２００】
実施例１６．
ミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼγのＤＮＡポリメラーゼ活性及びエンドヌクレアーゼ活性に対するヌクレオチド類似体の効果
ｉ）ヒトのポリメラーゼγの精製：以前記載された（Graves SW, Johnson AA, Johnson KA. Expression, purification, and initial kinetic characterization of the large subunit of the human mitochondrial DNA polymerase. Biochemistry. 1998, 37, 6050-8; Johnson AA, Tsai Y, Graves SW, Johnson KA. Human mitochondrial DNA polymerase holoenzyme: reconstitution and characterization. Biochemistry 2000; 39: 1702-8を参照）ように、ポリメラーゼγの組換え大型及び小型のサブユニットを精製することができる。ポリメラーゼγの大型及び小型のサブユニットについて、２３４，４２０及び７１，８９４Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数によって２８０ｎｍにて分光光度計でタンパク質濃度を決定することができる。
【０２０１】
ｉｉ）ヌクレオチド取り込みの動態解析：ヌクレオシド−ＴＰと天然のｄＮＴＰの基質に対するＤＮＡポリメラーゼγの取り込み（ｋ／Ｋ）の触媒効率を決定するために前定常状態動態解析を行うことができる。これによって、修飾された類似体を取り込み、毒性を予測するこの酵素の相対的能力を決定することができる。ＤＮＡポリメラーゼγによるヌクレオチド類似体の取り込みの前定常状態動態解析は、原則として以前記載された（Murakami E, Ray AS, Schinazi RF, Anderson KS. Investigating the effects of stereochemistry on incorporation and removal of 5-fluorocytidine analogs by mitochondrial DNA polymerase gamma: comparison of D- and L-D4FC-TP. Antiviral Res. 2004, 62, 57-64; Feng JY, Murakami E, Zorca SM, Johnson AA, Johnson KA, Schinazi RF, Furman PA, Anderson KS. Relationship between antiviral activity and host toxicity: comparison of the incorporation efficiencies of 2',3'-dideoxy-5-fluoro-3'-thiacytidine-triphosphate analogs by human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase and human mitochondrial DNA polymerase. Antimicrob Agents Chemother. 2004, 48, 1300-6を参照）ように実施することができる。手短には、ＭｇＣｌ２（２．５ｍＭ）と種々の濃度のヌクレオチド類似体を含有する溶液に、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８におけるポリメラーゼγの大型サブユニット（２５０ｎＭ）と小型サブユニット（１．２５ｍＭ）及び６ｎＭのＤＮＡ鋳型／プライマーの予備インキュベートした混合物を加えることができる。以前記載されたように反応を止め、分析することができる。上述の同様の方程式にデータを適合させることができる。
【０２０２】
ｉｉｉ）ヒトのポリメラーゼγの３’５’エンドヌクレアーゼ活性についてのアッセイ：ｄＮＴＰの非存在下での切断産物の形成の速度を測定することによってヒトのポリメラーゼγのエンドヌクレアーゼ活性を検討することができる。５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８におけるポリメラーゼγの大型サブユニット（４０ｎＭ）と小型サブユニット（２７０ｎＭ）及び１５００ｎＭの連鎖停止鋳型／プライマーの予備インキュベートした混合物にＭｇＣｌ２（２．５ｍＭ）を加えることによって反応を開始することができ、指定した時点で０．３ＭのＥＤＴＡによって反応を止めることができる。反応混合物はすべて、２０％変性ポリアクリルアミド配列決定ゲル（８Ｍ尿素）上で解析し、Ｂｉｏ−ＲａｄＧＳ−５２５分子画像システムで画像化し、分子アナリスト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって定量することができる。早い時点から形成される生成物を時間の関数としてプロットすることができる。ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（Jandel Scientific）による線形回帰によってデータを適合させた。線の傾きを反応中の活性酵素の濃度で割ってエクソヌクレアーゼ活性についてのｋｅｘｏを算出することができる（Murakami E, Ray AS, Schinazi RF, Anderson KS. Investigating the effects of stereochemistry on incorporation and removal of 5-fluorocytidine analogs by mitochondrial DNA polymerase gamma: comparison of D- and L-D4FC-TP. Antiviral Res. 2004; 62: 57-64; Feng JY, Murakami E, Zorca SM, Johnson AA, Johnson KA, Schinazi RF, Furman PA, Anderson KS. Relationship between antiviral activity and host toxicity: comparison of the incorporation efficiencies of 2',3'-dideoxy-5-fluoro-3'-thiacytidine-triphosphate analogs by human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase and human mitochondrial DNA polymerase. Antimicrob Agents Chemother. 2004; 48: 1300-6を参照）。
【０２０３】
実施例１７．
骨髄毒性についてのアッセイ
一次ヒト骨髄単核細胞は、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ (Walkersville, MD)から商業的に得た。５０単位／ｍＬのヒト組換え顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子の存在下で二重層軟寒天を用いてＣＦＵ−ＧＭアッセイを行ったが、ＢＦＵ−Ｅアッセイは、１単位／ｍＬのエリスロポイエチンを含有するメチルセルロースマトリクスを用いた（ommadossi JP, Carlisle R. Toxicity of 3’-azido-3’-deoxythymidine and 9-(1,3-dihydroxy-2-propoxymethyl) guanine for normal human hepatopoietic progenitor cells in vitro. Antimicrob. Agents Chemother. 1987; 31: 452-454; Sommadossi, JP, Schinazi, RF, Chu, CK, and Xie, MY. Comparison of Cytotoxicity of the (-) and (+) enantiomer of 2’,3’-dideoxy-3’-thiacytidine in normal human bone marrow progenitor cells. Biochem. Pharmacol. 1992; 44:1921-1925を参照）。各実験は、３人の異なった提供者からの細胞で２つ組にて行った。ＡＺＴを陽性対照として用いた。５％のＣＯ２と共に３７℃にて化合物の存在下で細胞を１４〜１８日間インキュベートし、倒立顕微鏡を用いて５０個の細胞を超えるコロニーを計数してＩＣ５０を決定する。ＢＦＵ−Ｅ生き残り機能に対する対数の薬剤濃度の最小２乗線形回帰によって５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を得た。独立非対応の試料についてスチューデントのｔ検定によって統計的解析を行った。
【０２０４】
実施例１８．
抗ＨＢＶアッセイ
テトラサイクリンの制御のもとで野生型」ＨＢＶを運ぶＡＤ−３８細胞株を処理することによって化合物の抗ＨＢＶ活性を決定した（Ladner S.K., Otto M.J., Barker C.S., Zaifert K., Wang G.H., Guo J.T., Seeger C. & King R.W. Antimicrob. Agents Chemother. 1997, 41, 1715-20を参照）。培地からのテトラサイクリンの除去［ｔｅｔ（−）］によってＨＢＶの産生を生じる。化合物で処理した細胞からの培養上清流体におけるＨＢＶのレベルを未処理の対照のそれと比較した。テトラサイクリンを伴った［ｔｅｔ（＋）］対照の培養も維持してＨＢＶ発現の基準レベルを決定した。３ＴＣを陽性対照として含めた。
【０２０５】
実施例１９．
細胞傷害性アッセイ
以前記載された（Schinazi R.F., Sommadossi J.-P., Saalmann V., Cannon D.L., Xie M.-Y., Hart G.C., Smith G.A. & Hahn E.F. Antimicrob. Agents Chemother. 1990, 34, 1061-67を参照）ように、Ｖｅｒｏ、ヒトＰＢＭ、ＣＥＭ（ヒトリンパ芽球）、ＭＴ−２及びＨｅｐＧ２の細胞にて化合物の細胞傷害性を評価することができる。サイクロヘキシミドを陽性の細胞傷害性対照として含めることができ、溶媒に暴露した未処理の細胞を陰性対照として含めることができる。以前記載された（Chou T.-C. & Talalay P. Adv. Enzyme Regul. 1984, 22, 27-55; Belen’kii M.S. & Schinazi R.F. Antiviral Res. 1994, 25, 1-11）半有効法を用いた濃度−反応曲線から細胞傷害性ＩＣ５０を得ることができる。
【０２０６】
実施例２０．
アデノシンデアミナーゼ活性
アデノシンデアミナーゼによる６−置換−２−アミノプリンヌクレオシド一リン酸プロドラッグの脱アミノ化の性向を決定するために、ヌクレオシド化合物を市販の精製酵素と共にインキュベートし、分光光度法で反応を続けた。反応条件は、２５℃にて０．５ｍＬ中５０μＭのヌクレオシド類似体を伴った５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．４であった。反応時間は、０．００２単位の酵素では７分であり、０．２単位の酵素では１２０分であった（アデノシンデアミナーゼの単位の規定は、２５℃、ｐＨ７．５にて１．０マイクロモルのアデノシンをイノシンに脱アミノ化する１単位である）。デオキシアデノシンを陽性対照としたが、それは、０．００２単位の酵素で７分間にて所与の条件下で５９％脱アミノ化された。デオキシグアノシンを陰性対照とした。光学密度は２６５ｎｍと２８５ｎｍで測定した。実験の開始と終了の間の光学密度の差異を吸光係数で割り、次いで反応の容積を乗じて生成物に変換された基質のモル数を決定した。生成物のモルを１００％完全な反応に相当する基質のモルで割り、次いで１００を乗じてパーセント脱アミノ化を得た。検出限界は、０．００１光学密度単位であった。
【０２０７】
実施例２１．
ヌクレオチド一リン酸プロドラッグに耐性のウイルスの選択
１つは対照（未処理）でもう１つは薬剤処理する２つのＴ２５フラスコにて、１００ｍＬの熱非働化したウシ胎児血清（Hyclone, Logan, Utah）、８３．３ＩＵ／ｍＬのペニシリン、８３．３μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Mediatech Inc., Herndon, VA）、１．６ｍＭのＬ−グルタミン（Mediatech Inc., Herndon, VA）、０．０００８％のＤＥＡＥ−デキストラン（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）、０．０４７％の重炭酸ナトリウム、及び２６ＩＵ／ｍＬの組換えインターロイキン−２（Chiron Corporation, Emeryville, CA）を含有する合計５ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０（Mediatech Inc., Herndon, VA)に末梢血単核（ＰＢＭ）細胞１を１×１０７個播くことができる。
１米国赤十字（Atlanta, GA）から得たバフィコートからファイコール／ハイパック（Histopaque 1077; Sigma）密度勾配遠心分離によってＰＢＭ細胞を分離することができる。健常な血清陰性の供血者からバフィコートを得ることができる。細胞は、使用に先立って２〜３日間、１００ｍＬの熱非働化したウシ胎児血清（Hyclone, Logan, Utah）、８３．３ＩＵ／ｍＬのペニシリン、８３．３μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１．６ｍＭのＬ−グルタミン（Mediatech Inc., Herndon, VA）を含有する５００ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０（Mediatech Inc., Herndon, VA)にて３μｇ／ｍＬの植物凝集素Ａ（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）によって活性化することができる。
【０２０８】
未処理のＰＢＭ細胞を０．１μＭのヌクレオチド一リン酸プロドラッグで１時間処理し、その後、１００×ＴＣＩＤ５０でのＨＩＶ−１ＬＡＩ２を植菌することができる。処理したＰＢＭ細胞群及び未処理の対照ＰＢＭ細胞群に、たとえば、１時間感染させることができる。追加の５ｍＬのＲＴＵ培地を各フラスコに加え、たとえば、３７℃にて６日間、細胞をインキュベートすることができる。
２ＨＩＶ−１ＬＡＩは、米国疾病対策予防センターから入手することができ、耐性プール用のウイルスとして使用でき、ＰＢＭ細胞における限界希釈法によって決定されるような０．１の感染多重度（ＭＯＩ）を選択して感染プールを開始することができる。
【０２０９】
６日目に、各フラスコから１ｍＬの上清を取り出し、４℃にて２時間、９，７４０ｇで遠心することができる。次いで得られたウイルス沈殿物をＲＴ分析用のウイルス可溶化緩衝液に再懸濁することができる。市販のＱＩＡｍｐウイルスＲＮＡミニキット（Quiagen）を用いて培養上清から全ＲＮＡを単離することができる。対照ウイルスとヌクレオチド一リン酸プロドラッグで処理したウイルスの間で並行して配列決定を行って、ウイルスが耐性であると思われる、数週間適用された薬剤圧によって創られた変異があるかどうかを判定することができる。
【０２１０】
未処理のウイルスプールに比べた処理されたウイルスプールのパーセント阻害を算出することができ、処理に先立って毎週、密接にモニターすることができる。ウイルスプールに対する選択圧は、４７週間以上にもわたって０．１μＭから３．５μＭ（ＥＣ５０値の４０倍）に増大し得る。
【０２１１】
実施例２２．
ヌクレオシド類似体三リン酸の合成
Ｌｕｄｗｉｇ及びＥｃｋｓｔｅｉｎの方法(Ludwig J, Eckstein F. “Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-O-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one” J. Org. Chem. 1989, 54 631-5) を用いて相当するヌクレオシドからヌクレオシド類似体三リン酸の合成を合成した。粗精製のヌクレオシド類似体三リン酸の合成は、たとえば、ＨｉＬｏａｄ  ２６／１０  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｐｈａｒｍａｃｉａカラムを用いたＦＰＬＣ及びＴＥＡＢ緩衝液（ｐＨ７．０）によって精製することができる。ＵＶ分光法、プロトン及びリンのＮＭＲ、質量分光法、並びにＨＰＬＣによって生成物を性状分析する。
【０２１２】
得られる三リン酸は、上述の細胞性薬理学アッセイの対照として、及びＨＩＶ−ＲＴ（たとえば、ＨＩＶ−ＲＴを伴った６−置換−２−アミノプリンヌクレオシド三リン酸）による動態ワークの対照として使用することができる。
【０２１３】
実施例２３．
ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に対する活性のためのスクリーニングアッセイ
ＣＰＥ阻害アッセイにおいて、薬剤を感染の１時間前に添加することができるので、アッセイ系は、最大の感受性を有し、後期の事象と同様に、たとえば、吸収又は貫通のような早期複製段階の阻害剤も検出する。細胞に結合するウイルスの非特異的な阻害を除外するために、薬剤を感染の１時間後に添加する従来のプラーク減少アッセイを用いて、ＣＰＥアッセイにて理に適った活性を示す化合物すべてを確認することができる。化合物が連結を阻止する場合、ＣＰＥアッセイでは陽性に見えるが、プラークアッセイでは陰性であってもよい。有効性：１００ｍｇ／ｍＬ〜０．０３ｍｇ／ｍＬの範囲を網羅するのに５倍増分にて最低６つの薬剤濃度を使用する。これらのデータから、ウイルスの複製を５０％阻害ずる用量（有効濃度５０；ＥＣ５０）を算出することができる。毒性：有効性を決定するのに用いた同一の薬剤濃度を各アッセイでの未感染細胞に用いて各実験化合物の毒性を判定する。ウイルス株を取り込むことの失敗によって判定されるような細胞に対して細胞傷害性である薬剤濃度、中性赤。
【０２１４】
ＨＳＶ−１の薬剤感受性アッセイは、Ｓｃｈｉｎａｚｉ，Ｒ．Ｆ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ｊ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃ．Ｃ．，Ｃｈａｎｃｅ，Ｄ．，Ｎａｈｍｉａｓ，Ａ．Ｊ．“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｃｙｃｌｏｖｉｒ  ｗｉｔｈ  ｖｉｄａｒａｂｉｎｅ  ｏｒ  ｉｔｓ  ５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｏｎ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．”Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９８２，２２，４９９−５０７で以前記載されたように実施することもできる。
【０２１５】
ＨＣＶ複製アッセイ１
ＨＣＶ複製ＲＮＡを含有するＨｕｈ７クローンＢ細胞を５０００個／ウェルにて９６穴プレートに播き、播いた直後に３つ組にて１０μＭで試験化合物を加えた。５日間のインキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）に続いて、ＧｅｎｔｒａのｖｅｒｓａＧｅｎｅＲＮＡ精製キットを用いて細胞の全ＲＮＡを単離した。一段階マルチプレックスリアルタイムＲＴ−ＰＣＴアッセイにてレプリコンＲＮＡと内部対照（ＴａｑＭａｎ  ｒＲＮＡ対照試薬、Applied Biosystems）を増幅した。薬剤なしの対照の閾値ＲＴ−ＰＣＲサイクルから試験化合物の閾値ＲＴ−ＰＣＲサイクルを差し引く（ΔＣｔＨＣＶ）ことによって化合物の抗ウイルス有効性を算出した。３．３のΔＣｔは、レプリコンＲＮＡレベルにおける１ログ低下（出発物質の９０％低下に等しい）に等しい。化合物の細胞傷害性はまた、ΔＣｔ  ｒＲＮＡ値を用いても算出された。（２’−Ｍｅ−Ｃ）を対照として用いた。ＥＣ９０及びＩＣ５０値２を決定するために、ΔＣｔ：値を先ず、出発物質３の分画に変換し、次いでそれを用いて％阻害を算出した。
【０２１６】
参考文献
１．Ｓｔｕｙｖｅｒ，Ｌら、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｔｈａｔ  ｂｌｏｃｋｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００３，４７，２４４−２５４．
２．Ｒｅｅｄ，ＩＪ及びＭｕｅｎｃｈ，Ｈ，Ａ．ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｒ  ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｆｉｆｔｙ  ｐｅｒｃｅｎｔ  ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．２７：４９７，１９３８
３．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ
【０２１７】
実施例２５．
西ナイルウイルスの薬剤の感受性アッセイも、Ｓｏｎｇ，Ｇ．Ｙ．，Ｐａｕｌ，Ｖ．，Ｃｈｏｏ，Ｈ．，Ｍｏｒｒｅｙ，Ｊ．，Ｓｉｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｗ．，Ｓｃｈｉｎａｚｉ，Ｒ．Ｆ．，Ｃｈｕ，Ｃ．Ｋ．Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄ−  ａｎｄ  Ｌ−ｃｙｃｌｏｐｅｎｔｅｎｙｌ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＩＶ  ａｎｄ  Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００１，４４，３９８５−３９９３にて以前記載されたように実施することができる。
【０２１８】
実施例２６．
黄熱病の薬剤の感受性アッセイも、Ｊｕｌａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｇ．，Ｆｕｒｕｔａ，Ｙ．，Ｓｈａｆｅｒ，Ｋ．，Ｓｉｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｗ．Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｔ−１１０６  ｉｎ  ａ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｅｖｅｒ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００７，５１，１９６２−１９６６にて以前記載されたように実施することができる。
【０２１９】
実施例２７．
デング熱を治療するのに有用な化合物を特定するための高処理能力アッセイの代表的な１つは、Ｌｉｍら、Ａ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ＮＳ５  ２′−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｅｓ，  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ  ８０，Ｉｓｓｕｅ  ３，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００８，Ｐａｇｅｓ３６０−３６９に記載されている。
【０２２０】
デング熱ウイルス（ＤＥＮＶ）は、そのＮ末端アミノ酸配列にメチルトランスフェラーゼ（ＭＴａｓｅ）活性を持ち、ウイルスのゲノムＥＮＡで１型のキャップ構造ｍ７ＧｐｐｐＡｍ２′−Ｏの形成に関与する。精製した組換えタンパク質と短いビオチン化ＧＴＰキャップしたＲＮＡ鋳型を用いてＤＥＮＶ２  ２′−Ｏ−ＭＴａｓｅ活性の最適な試験管内条件を特徴付けることができる。初速に由来する定常状態動態パラメータを用いて、化合物試験のための頑強なシンチレーション近接アッセイを確立することができる。ＬｉｍらのＡｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ  ８０，Ｉｓｓｕｅ  ３，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００８，Ｐａｇｅｓ３６０−３６９による予備インキュベート試験は、ＭＴａｓｅ−ＡｄｏＭｅｔとＭＴａｓｅ−ＲＮＡの複合体が、同等に触媒として有能であり、酵素が無作為なｂｉ  ｂｉ動態メカニズムを支えることを示した。Ｌｉｍは、競合阻害剤、Ｓ−アデノシルホモシステイン、及び２つの相同体、シネフンギン及びデヒドロシネフンギンによるアッセイを検証した。ＤＥＮＶ２ＭＴａｓｅのＮ末端に存在するＧＴＰ結合ポケットは以前、キャップ結合部位であるとみなされていた。このアッセイによって２’−Ｏ−ＭＴａｓｅ活性の迅速で高い感度の検出が可能になり、阻害性化合物についての高処理能力スクリーニングに容易にそれを適合させることができる。多種多様なＲＮＡキャッピングＭＴａｓｅの酵素活性を決定するのにそれは好適である。
【０２２１】
実施例２８．
抗ノロウイルス活性
ノロウイルスのポリメラーゼ及び／又はヘリカーゼを阻害することによって、複製サイクル又はそのほかの経路に必要とされる酵素を阻害することによって、化合物は抗ノロウイルス活性を示すことができる。
【０２２２】
現在のところ、ノロウイルス感染のための認可された医薬治療はなく（http://www.cdc.
gov/ncidod/dvrd/revb/gastro/norovirus-qa.htm)）、これは多分、少なくとも部分的には細胞培養系の利用性の欠如による。最近、元々のＮｏｒｗａｌｋＧ−Ｉ株についてのレプリコン系が開発された（Chang, K. O., et al. (2006) Virology 353:463-473）。
【０２２３】
ノロウイルスのレプリコン及びＣ型肝炎のレプリコンの双方は、レプリコンの複製が生じるために機能的であるウイルスのヘリカーゼ、プロテアーゼ及びポリメラーゼを必要とする。つい最近、ノロウイルスの属内群Ｉ及びＩＩの植菌材を利用した試験管内の細胞培養感染性アッセイが報告された（Straub, T. M. et al. (2007) Emerg. Infect. Dis. 13(3):396-403）。このアッセイは、微量キャリアビーズ上での小腸上皮細胞を利用した回転壁生物反応器にて行われる。感染性アッセイは、侵入阻害剤のスクリーニングに有用であってもよい。
【０２２４】
実施例２９．
ＨｅｐＧ２細胞におけるヌクレオシドの活性三リン酸へのリン酸化アッセイ
化合物の細胞での代謝を測定するために、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Rockville, MD）からＨｅｐＧ２細胞を入手し、非必須アミノ酸、１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補完した最小必須培地にて２２５ｃｍ２のフラスコで増殖させることができる。培地を３日に一度交換し、１週間に１回細胞を継代する。３０ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡへの１０分間の暴露、及び培地による３回の連続的な洗浄によって付着細胞を剥離した後、６穴プレートにてウェル当たり２．５×１０６個の密度にて集密なＨｅｐＧ２細胞を播き、特定の時間、１０μＭの［３Ｈ］標識した活性化合物（５００ｄｐｍ／ピコモル）に暴露することができる。
【０２２５】
５％ＣＯ２の雰囲気下で３７℃にて細胞を維持する。選択した時点で、氷冷したリン酸緩衝の生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を３回洗浄する。
【０２２６】
細胞沈殿物を６０％メタノールと共に−２０℃にて一晩インキュベートし、次いで氷槽にて１時間、追加の２０ｐａｌの冷メタノールによる抽出によって細胞内の活性化合物とその各代謝産物を抽出する。次いで抽出物を合わせて、穏やかに濾過する気流のもとで乾燥させ、ＨＰＬＣ分析まで−２０℃で保存する。
【０２２７】
実施例３０．
カニクイザルにおける生体利用効率
以下の手順を用いて化合物が生体利用可能かどうかを判定することができる。試験の開始前１週間以内に、カニクイザルに長期静脈カテーテルと皮下静脈アクセスポート（ＶＡＰ）を外科的に埋め込んで採血を円滑にし、血液学及び血清化学評価を含む身体検査及び体重の記録を受けさせることができる。各サル（合計６匹）は、静脈内ボーラス（３匹、ＩＶ）又は経口強制投与（３匹、ＰＯ）を介して、およそ２５０μＣｉの３Ｈ活性の用量濃度５ｍｇ／ｍＬでの用量レベル１０ｍｇ／ｋｇの活性化合物を受け取る。各投与シリンジを投与前に秤量して投与された製剤の量を重量測定として決定する。指定した間隔（投与前およそ１８〜０時間、投与後０〜４、４〜８及び８〜１２時間）で受け皿を介して尿試料を採取し、処理する。長期静脈カテーテル及びＶＡＰを介して、又は長期静脈カテーテルが可能でない場合、末梢血管から血液試料を同様に（投与前、投与後０．２５、０．５、１、２、３、６、８、１２及び２４時間）採取する。血液試料及び尿試料を最大濃度（Ｃｍａｘ）、時間について分析し、最大濃度が達成される場合（Ｔｍａｘ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、投与量濃度の半減期（ＴＶ）、クリアランス（ＣＬ）、定常状態の容積及び分布（Ｖｓｓ）、並びに生体利用効率（Ｆ）。
【０２２８】
実施例３１．
細胞保護アッセイ（ＣＰＡ）
アッセイは原則としてＢａｇｉｎｓｋｉ，Ｓ．Ｇ．；Ｐｅｖｅａｒ，Ｄ．Ｃ．；Ｓｅｉｐｅｌ，Ｍ．；Ｓｕｎ，Ｓ．Ｃ．Ｃ．；Ｂｅｎｅｔａｔｏｓ，Ｃ．Ａ．；Ｃｈｕｎｄｕｒｕ，Ｓ．Ｋ．；Ｒｉｃｅ，Ｃ．  Ｍ及びＭ．Ｓ．Ｃｏｌｌｅｔｔ
“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ”ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，２０００，９７（１４），７９８１−７９８６によって記載されたように行われる。９６穴培養プレート（ウェル当たり４，０００個）にて使用前２４時間にＭＤＢＫ細胞（ＡＴＣＣ）を播く。細胞当たり０．０２プラーク形成単位（ＰＦＵ）の感染多重度（ＭＯＩ）にてＢＶＤＶ（株ＮＡＤＬ、ＡＴＣＣ）によって感染させた後、増殖培地における０．５％ＤＭＳＯの最終濃度にて、感染細胞及び未感染細胞の双方に連続希釈した試験化合物を加える。各希釈は４つ組で調べる。
【０２２９】
細胞の密度とウイルスの植菌を調整して実験全体を通して継続した細胞増殖を確保し、感染４日後の未処理対照にて９０％を超えるウイルスが誘導する細胞の破壊を達成する。４日後、５０％のＴＣＡでプレートを固定し、スルホローダミンＢによって染色する。細胞の光学密度を５５０ｎｍにてマイクロプレートリーダーで読み取る。
【０２３０】
ウイルスの細胞変性効果の５０％低減を達成する化合物の濃度として５０％有効濃度（ＥＣ５０）値が定義される。
【０２３１】
実施例３２．
プラーク減少アッセイ
化合物について、プラーク減少アッセイによって２４ウェルプレートにて有効濃度を決定する。１００ＰＦＣ／ウェルのウイルスを細胞の単層に感染させる。次いで２％の非働化血清と０．７５％のメチルセルロースで補完したＭＥＭにおける試験化合物の連続希釈を単層に加える。細胞をさらに３７℃で３日間インキュベートし、次いで５０％のエタノールと０．８％のクリスタルバイオレットで固定し、洗浄して風乾する。次いでプラークを計数して９０％のウイルス抑制を得る濃度を決定する。
【０２３２】
実施例３３．
収率低下アッセイ
化合物について、収率低下アッセイによって２つ組の２４穴プレートにてウイルス負荷の６−ログ減少を得る濃度を決定する。アッセイは、少しの改変を伴って、Ｂａｇｉｎｓｋｉ，Ｓ．Ｇ．；Ｐｅｖｅａｒ，Ｄ．Ｃ．；Ｓｅｉｐｅｌ，Ｍ．；Ｓｕｎ，Ｓ．Ｃ．Ｃ．；Ｂｅｎｅｔａｔｏｓ，Ｃ．Ａ．；Ｃｈｕｎｄｕｒｕ，Ｓ．Ｋ．；Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．ａｎｄＭ．Ｓ．Ｃｏｌｌｅｔｔ“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ”ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，２０００，９７（１４），７９８１−７９８６によって記載されるように実施する。
【０２３３】
手短には、細胞当たり０．１ＰＦＵの感染多重性（ＭＯＩ）にてＢＶＤＶ（ＮＡＤＬ株）に感染させる２４時間前に、２４穴プレート（ウェル当たり２×１０５個の細胞）にＭＤＢＫ細胞を播いた。増殖培地における０．５％ＤＭＳＯの最終濃度にて、連続希釈の試験化合物を細胞に加える。各希釈は３つ組で調べる。３日後、３回の凍結融解によって細胞培養物（細胞の単層及び上清）を溶解し、プラークアッセイによってウイルスの収率を定量する。手短には、使用前２４時間にＭＤＢＫ細胞を６穴プレート（ウェル当たり５×１０５個）に播く。細胞に０．２ｍＬの試験溶解物を１時間植菌し、洗浄し、増殖培地での０．５％アガロースによって重層する。３日後、細胞の単層を３．５％のホルムアルデヒドと１％のクリスタル紫（５０％エタノールにてｗ／ｖ）で固定し、プラークを可視化する。プラークを計数してウイルス負荷にて６−ログ低下を得るように濃度を決定した。
【０２３４】
実施例３４．
ノロウイルス感染の診断
逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、罹患患者の糞便でウイルスＲＮＡを検出することによってノロウイルス感染を診断することができる。症状の発症後７日もの時間をかけて試料でのＲＴ−ＰＣＲを用いて満足の行く結果を得ることができるが、ウイルスは、症状の発症後４８〜７２時間以内に糞便試料から特定することができる。ほかの診断法には、電子顕微鏡法、及び少なくとも３週間離して採取した対合血清における力価の上昇についての血清アッセイが挙げられる。市販の酵素結合免疫アッセイも利用可能ではあるが、これらは相対的に低い感度を有する傾向があり、発生の病因を診断するのに使用するには限定されている。特に胃腸炎のほかの原因因子が除外されている場合、ノロウイルスの臨床的診断が使用されることが多い。
【０２３５】
実施例３５．
試験管内の抗ウイルス活性
試験管内の抗ウイルス活性は以下の細胞株で評価することができる：
ＮｏｒｗａｌｋＧ−Ｉ株（Chang, K. O., et al. (2006) Virology 353:463-473）、ＧＩＩ−４株のレプリコン、並びにそのほかのノロウイルスのレプリコンをアッセイに用いて、本明細書で記載される化合物、又はほかの化合物又は化合物ライブラリの試験管内の抗ウイルス活性を測定することができる。
【０２３６】
一部の実施形態では、レプリコン系は、サブゲノムであり、それ故、非構造タンパク質の小分子阻害剤を評価することが可能になる。これは、Ｃ型肝炎のレプリコンがそのウイルスの治療に有用な治療剤の発見に寄与したというノロウイルス薬剤の発見に同様の利益を提供する（Stuyver, L. J., et al. (2006) Antimicrob. Agents Chemother. 47:244-254）。ノロウイルスのレプリコン及びＣ型肝炎のレプリコンは双方共、レプリコンの複製が生じるために機能的であるウイルスのヘリカーゼ、プロテアーゼ及びポリメラーゼを必要とする。本明細書で記載される化合物は、ウイルスのポリメラーゼ及び／又はウイルスのヘリカーゼを阻害すると考えられている。
【０２３７】
ノロウイルスの属内群Ｉ及びＩＩの植菌体を用いて報告された試験管内の細胞培養感染性アッセイ（Straub, T. M. et al. (2007) Emerg. Infect. Dis. 13(3):396-403）も使用することができる。このアッセイは、マイクロキャリアビーズ上での小腸上皮細胞を利用して回転する壁の生物反応器にて行うことができる。所望のウイルスを阻害する能力について化合物をスクリーニングするのに感染性アッセイを使用することができる。
【０２３８】
実施例３６
抗癌化合物を特定するためのスクリーニング法
抗癌化合物を特定するための代表的なスクリーニング法は、Ｓｋｅｈａｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｖｏｌ．８２，Ｎｏ．１３，１１０７−１１１２，Ｊｕｌｙ，４，１９９０に記載されている。
【０２３９】
Ｓｋｅｈａｎの方法は、９６穴マイクロタイタープレートにおける付着培養及び浮遊培養の細胞性タンパク質の含量を測定し、普通の研究目的及び非常に大きな規模の適用に好適である。
【０２４０】
トリクロロ酢酸で培養物を固定し、１％酢酸に溶解した０．４％（ｗ／ｖ）スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）で３０分間染色する。１％酢酸で４回洗浄することによって未結合の色素を取り除き、コンピュータに接続した９６穴マイクロタイタープレートリーダーにて光学密度を測定するために、１０ｍＭの非緩衝トリス塩基［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］によってタンパク質結合の色素を抽出する。
【０２４１】
ＳＲＢアッセイの結果は、細胞数、及びまばらな集密以下から多層の集密を超えた範囲に及ぶ密度でＬｏｗｒｙ法及びＢｒａｄｆｏｒｄ法の双方で測定された細胞性タンパク質の値について線形である。
【０２４２】
５６４ｎｍにおけるシグナル対ノイズの比は、ウェル当たり１，０００個の細胞でおよそ１．５である。ＳＲＢアッセイの感度は、幾つかの蛍光アッセイの感度に比べて遜色がなく、称するところによれば、Ｌｏｗｒｙ法及びＢｒａｄｆｏｒｄ法及び２０のそのほかの可視性色素の感度より優れている。ＳＲＢアッセイは、非破壊的で、無限に安定で、裸眼で見える比色結果を提供する。それは、薬剤誘導の細胞傷害性の敏感な測定を提供し、クローン形成能を定量するのに有用であり、高容量の自動薬剤スクリーニングによく適合する。ＳＲＢは４８８ｎｍのレーザー励起で強く蛍光を発し、静電蛍光サイトメトリーによって単一細胞レベルで定量的に測定することができる。
【０２４３】
前述の明細書が、説明目的で提供された実施例と共に本発明の原理を教示しているが、本発明の実践は、以下の特許請求の範囲及びその同等物の範囲内で生じるような変異、適応及び／又は改変のすべてを包含することが理解されるであろう。
【図１−１】
2012517443.tif 000077
【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2012517443.tif 000089
【図１２】
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【国際調査報告】
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