(57)【要約】  血管バリア機能を促進する活性な薬剤および組成物を本明細書に記載する。本明細書に記載の組成物は、血管バリア機能を促進することができる少なくとも一つの活性薬剤を含有し、一の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、血管内皮のバリア機能を促進する活性薬剤を含有する。本明細書に記載の組成物は、急性肺炎症および慢性肺炎症を導くか、生じる状態と関連のある血管透過率を含有する肺炎症と関連のある血管透過率を阻害する活性薬剤を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管バリア機能を対象で促進する方法において、
少なくとも一つのＳｌｉｔポリペプチドの治療効果のある量を対象に投与する工程を含み、
前記少なくとも一つのＳｌｉｔポリペプチドの投与する工程は、内皮バリア機能の促進を生じる方法。
【請求項２】
少なくとも一つのＳｌｉｔポリペプチドはＲｏｂｏ４のリガンドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも一つのＳｌｉｔポリペプチドは、少なくとも一つのＳｌｉｔ２ポリペプチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも一つのＳｌｉｔ２ポリペプチドは、Ｓｌｉｔ２Ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
少なくともＳｌｉｔポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２ならびにそれらの組み合わせ、誘導体、ホモログおよび類似体のポリペプチド配列を含有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
血管バリア機能の促進は、リポ多糖類、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つの炎症のメディエーターの存在下において生じる、前記いずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
内皮バリア機能の促進は、血管内皮カドヘリン（ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）の存在を血管内皮細胞の表面で促進、およびｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を血管内皮細胞の表面で促進の少なくとも一つを含む、前記いずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
血管バリア機能を対象で促進する方法において、
少なくとも一つのＡＲＦ  ＧＴＰ交換因子（ＡＲＦ−ＧＥＦ）の少なくとも一つの阻害剤の治療効果のある量を、対象に投与する工程を含み、
前記少なくとも一つのＡＲＦ−ＧＥＦの調節は、対象において血管透過率の阻害をもたらす方法。
【請求項９】
少なくとも一つのＡＲＦ−ＧＥＦの阻害は、少なくとも一つのＡＤＰリボシル化因子（ＡＲＦ）の阻害を生じる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも一つのＡＲＦは、ＡＲＦ６、ＡＲＦ１およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも一つの阻害剤は、少なくとも一つのＡＲＦ−ＧＥＦの有用性、少なくとも一つのＡＲＦ−ＧＥＦの活性、および少なくとも一つのＡＲＦ−ＧＥＦの活性の少なくとも一つを阻害する低分子化合物である、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも一つのＡＲＦ−ＧＥＦの少なくとも一つの阻害剤は、ＳｅｃｉｎＨ３を含有する、請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも一つのＡＲＦ−ＧＥＦの少なくとも一つの阻害剤は、一般式１に従った化合物および一般式２に従った化合物の少なくとも一つを含む、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも一つのＡＲＦ−ＧＥＦの少なくとも一つの阻害剤は、下記：
【化１】
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および薬学的に受け入れられる塩、その溶媒和物、または水和物から選択される、
請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも一つのＡＲＦ−ＧＥＦの少なくとも一つの阻害剤は、サイトヘシンのＡＲＮＯ群から選択されるサイトヘシンを阻害する、請求項８から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
サイトヘシンはＡＲＮＯである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
対象における血管透過率の阻害は、リポ糖類、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つの炎症メディエーターの存在下で生じる、請求項８から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
対象における血管透過率の阻害は、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を血管内皮細胞の表面で促進、およびｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を血管内皮細胞の表面で促進の少なくとも一つを含む、請求項８から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を、対象の血管内皮細胞表面で促進する方法において、
治療効果のある量の少なくとも一つのＳｌｉｔポリペプチドを対象に投与する工程を含み、
前記少なくとも一つのＳｌｉｔポリペプチドを投与する工程は、対象のＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在下において、血管内皮細胞の表面で促進する方法。
【請求項２０】
少なくとも一つのＳｌｉｔポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ならびにそれらの組み合わせ、誘導体、ホモログおよび類似体の少なくとも一つから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
対象のＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎにおいて、血管内皮細胞の表面で前記存在の促進は、リポ多糖類、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびそれらの組み合わせをからなる群から選択される少なくとも一つの炎症メディエーターの存在下において生じる、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも一つのＳｌｉｔポリペプチドを投与する工程は、ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を、血管内皮細胞の表面において促進する、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
肺血管炎症を伴う対象を治療する方法において、
少なくとも一つのＳｌｉｔポリペプチドの治療効果のある量を対象に投与する工程を含み、
前記少なくとも一つのＳｌｉｔポリペプチドを投与する工程は、対象に肺血管炎症の減少をもたらす方法。
【請求項２４】
少なくとも一つのＳｌｉｔポリペプチドは、少なくとも一つのＳｌｉｔ２ポリペプチドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも一つのＳｌｉｔ２ポリペプチドは、Ｓｌｉｔ２Ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも一つのＳｌｉｔポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ならびにそれらの組み合わせ、誘導体、ホモログおよび類似体の少なくとも一つのポリペプチド配列を含む、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
血管炎症の減少は、リポ多糖類、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つの炎症メディエーターの存在下において生じる、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも一つのＳｌｉｔポリペプチドを投与する工程は、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの対象の存在を血管内皮細胞の表面において促進する、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも一つのＳｌｉｔポリペプチドを投与する工程は、ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの対象の発現を血管内皮細胞の表面において促進する、請求項２３から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
血管炎症の治療する工程は、対象においてｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を血管内皮細胞の表面で促進する工程をさらに含有する少なくとも一つの治療する工程を含む、請求項２３から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
急性肺血管浮腫、慢性肺血管浮腫、急性肺血管炎症、慢性肺血管炎症、特発の肺線維症、細菌性敗血症またはインフルエンザ感染を含有する肺線維症のいずれかと関連のある血管透過率を減少させる方法において、
少なくとも一つのＳｌｉｔポリペプチドの治療効果のある量を対象に投与する工程を含み、
前記少なくとも一つのＳｌｉｔポリペプチドを投与する工程は、対象の病態と関連のある血管透過率を減少させる方法。
【請求項３２】
病態は、突発の肺線維症を含む肺線維症である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも一つのＳｌｉｔポリペプチドを、リポ多糖類、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つの炎症メディエーターの存在下で対象に投与する、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも一つのＳｌｉｔポリペプチドを投与する工程は、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を血管内皮細胞の表面で促進する、請求項３１から請求項３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
肺線維症を患っている対象を治療する方法において、
一般式１に従った化合物および一般式２に従った化合物から選択される化合物の治療効果のある量を対象に投与する工程を含む方法。
【請求項３６】
ＳｅｃｉｎＨ３および薬学的に受け入れられる塩、その溶媒和物、または水和物の治療効果のある量を対象に投与する工程を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
下記から選択される化合物：
【化２】
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および薬学的に受け入れられる塩、その溶媒和物、または水和物の治療効果のある量を対象に投与する工程を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
肺線維症の発生を対象で阻害する方法において、
一般式１に従った化合物および一般式２に従った化合物から選択される化合物の治療効果のある量を対象に投与する工程を含む方法。
【請求項３９】
ＳｅｃｉｎＨ３および薬学的に受け入れられる塩、その溶媒和物、または水和物の治療効果のある量を対象に投与する工程を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
下記から選択される化合物：
【化３】
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および薬学的に受け入れられる塩、その溶媒和物、または水和物治療効果のある量を対象に投与する工程を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
肺線維症を患っている対象を治療する方法において、
Ｓｌｉｔポリペプチドの治療効果のある量を対象に投与する工程を含む方法。
【請求項４２】
Ｓｌｉｔ２ポリペプチドの治療効果のある量を対象に投与する工程を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
Ｓｌｉｔ２ポリペプチドはＳｌｉｔ２Ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
Ｓｌｉｔポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２によって示されるポリペプチド、ならびにそれらの組み合わせ、誘導体、ホモログ、および類似体の一つから選択される、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４５】
肺線維症の発生を対象で阻害する方法において、
Ｓｌｉｔポリペプチドの治療効果のある量を対象に投与する工程を含む方法。
【請求項４６】
Ｓｌｉｔ２ポリペプチドの治療効果のある量を対象に投与する工程を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ＳｌｉｔポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２によって示されるポリペプチド、ならびにそれらの組み合わせ、誘導体、ホモログ、および類似体の一つから選択される、請求項４５または４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）から与えられる政府支援のＧｒａｎｔ  Ｒ０１  ＨＬ０７７６７１によって行った。政府がこの発明に関して特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
急性および慢性の肺血管炎症および漏出は複数の病態と関連する。例えば、インフルエンザ感染および敗血症は急性で、潜在的に致命的な肺血管炎症として特徴付けることができる。さらに、慢性肺血管炎症は肺線維症の発現および進行と関連する。肺線維症は肺に線維状の瘢痕組織の異常な形成があり、瘢痕形成は炎症に先行して関連する。肺線維症は、肺の肺胞および間質組織の腫れおよび瘢痕を引き起こす慢性疾患である。肺線維症の原因は全く断定することができないことが多いが（すなわち特発性肺線維症）、いくつかの場合には、肺線維症の発現および進行は、疾患および感染、例えば結核、全身性紅斑性狼瘡 、全身性硬化症等、一つ以上の環境条件、例えばシリカ粉塵およびアスベストへの曝露、または特定の薬物、例えばニトロフラントイン（ｎｉｔｉｏｆｕｒａｎｔｏｉｎ）、アミオダロンおよびブレオマイシンとさえも関連する。肺線維症は軽度でほとんど症状を引き起こさないけれども、それはまた致命的であるおそれがある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
血管バリア機能を促進する活性薬剤および組成物を、本明細書に記載する。本明細書に記載の組成物は、血管バリア機能を促進することができる少なくとも一つの活性薬剤であり、そのような実施形態において、本明細書に記載の組成物は血管内皮バリア機能を促進する活性薬剤を含む。他の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、肺の血管内皮、腎臓の血管内皮および脾臓の血管内皮の一つから選択される上皮組織において血管バリア機能を促進する活性薬剤を含む。他の実施形態において、本願明細書に記載の組成物は、急性肺炎症および慢性肺炎症に導くか、または結果的に生じる状態と関連する血管透過性を含有する肺炎症と関連する血管透過性を阻害する活性薬剤を含む。本明細書で提供する実験例において示すように、本明細書に従う活性薬剤は、特定の実施形態において、血管バリア機能を、例えばエンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βを含む、炎症性および血管透過性の複数のメディエーターの存在下でさえも促進する。
【０００４】
血管内皮バリア機能を促進する方法をまた本明細書において提供する。一の実施形態において、血管内皮バリア機能を促進する方法は、一以上の血管内皮細胞を本明細書に記載の活性薬剤と治療する工程を含む。そのような実施形態において、一以上の血管内皮細胞の治療過程は、それを必要とする患者に、本明細書に記載のような活性薬剤の治療上効果的な量を投与することによって実施することができる。特定の実施形態において、一つ以上の血管内皮細胞と活性薬剤との治療は以下の一つ以上の結果を生じる：血管内皮バリア機能の予防；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在における内皮バリア機能の促進；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在下における血管漏出の阻害；血管内皮細胞の表面でのＶＥｃａｄｈｅｒｉｎの存在の促進；および血管内皮細胞の表面でのｐ１２０ｃａｔｅｎｉｎの発現の促進。他の実施形態において、一つ以上の血管内皮細胞と活性薬剤との治療は、少なくとも部分的に、血管内皮細胞を一つ以上の炎症メディエーターに曝露後、血管バリア機能を回復させる場合には、一つ以上の炎症のメディエーターはエンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）およびＩＬ−βの一つ以上を含む群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】Ｓｌｉｔ２Ｎは細胞表面でＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの局在化を向上させることによって、内皮性を安定化させる。（Ａ）体外における透過率は、ＭｏｃｋまたはＳｌｉｔ２Ｎの存在下で、ＬＰＳ、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−１βによって刺激してＨＭＶＥＣ−ｌｕｎｇを測定した。（Ｂ）Ｒｏｂｏ４またはコントロールｓｉＲＮＡノックアウトのＨＭＶＥＣ−ｌｕｎｇを、ＭｏｃｋまたはＳｌｉｔ２Ｎの存在下で、ＩＬ−１βで刺激し、体外における透過率を評価した。（Ｃ−Ｅ）ＨＶＭＥＣ−肺をＭｏｃｋまたはＳｌｉｔ２Ｎと処理して、膜分画、その後の（Ｃ）ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、（Ｄ）ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎまたは（Ｅ）β−ｃａｔｅｎｉｎでの免疫ブロット法に曝したものである。（Ｆ）ＨＭＶＥＣ−ｌｕｎｇをＭｏｃｋまたはＳｌｉｔ２Ｎで刺激して、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（緑）により免疫蛍光に曝した。白矢印はＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの細胞表面局在化の向上した領域を示す。全ての実験に関して、Ｎ≧３、＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１で、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図２】Ｓｌｉｔ２ＮはＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ／ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの相互作用を向上させる。（Ａ）ＨＭＶＥＣ−ｌｕｎｇをＭｏｃｋまたはＳｌｉｔ２Ｎの存在下において、ＩＬ−１βで刺激し、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎおよびｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎにより免疫染色をした。白矢印は、Ｍｏｃｋ処理細胞においてＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎまたはｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの欠損する細胞表面部位を示す。黄矢印は、Ｓｌｉｔ２Ｎ処理した細胞においてＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎまたはｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの向上した細胞表面局在の部位を示す。（Ｂ）ＨＭＶＥＣ−ｌｕｎｇは、ＭｏｃｋまたはＳｌｉｔ２Ｎの存在下において、ＩＬ−１βで刺激した。溶解物をＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎで免疫沈降させ、その後ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎおよびＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎで免疫染色をした。（Ｃ）ＨＭＶＥＣ−ｌｕｎｇを、ＭｏｃｋまたはＳｌｉｔ２Ｎの存在下において、ＩＬ−１βで刺激した。ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの内在化（緑）を評価し、内在化の部位を白矢印で示す。（Ｄ）体外における透過率をコントロールのＩｇＧまたはＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの抗体の存在下において測定した。全ての実験に関して、Ｎ≧３、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５で、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図３】Ｓｌｉｔ２Ｎは、ＬＰＳ誘発透過率、タンパク質の浸出液、および細胞浸潤を生体内において阻害する。（Ａ）Ｒｏｂｏ４＋／＋およびＲｏｂｏ４ＡＰ／ＡＰのマウスを、ＭｏｃｋまたはＳｌｉｔ２Ｎの静脈注射して、その後１０μｇの気道内注入を施した。マウスは後にエバンスブルーアルブミン（ＥＢＡ）の静脈注射を投与して、肺の中のＥＢＡの蓄積を使用して内皮透過率を評価した（Ｎ≧４）。（Ｂ−Ｄ）代わりにＬＰＳ投与後２４時間に、気管支肺胞を得て、（Ｂ）タンパク質含有率、（Ｃ）総炎症細胞の蓄積、または（Ｄ）好中球の蓄積（Ｎ≧５）を評価した。ｅＨ＆Ｅ染色を、ＭｏｃｋまたはＳｌｉｔ２Ｎの存在下で、ＬＰＳにさらしたマウスの肺断片において実施した。（Ｆ）タンパク質の浸出液を３．３μｇＬＰＳｇ−ｉで処理したマウスにおいて（Ｎ＝５）測定し、マウスをコントロールまたはＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ阻害抗体で、ＭｏｃｋまたはＳｌｉｔ２Ｎの静脈注射した後、ＬＰＳの気道内注入を施した。気管支肺胞洗浄を得て、（Ｇ）タンパク質含有量、（Ｈ）総炎症細胞の蓄積、または好中球の蓄積を評価した（Ｎ≧５）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１で、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図４】Ｓｌｉｔ２Ｎは盲腸結紮および敗血症の穿刺モデルにおいて、透過率および死亡率を減少した。（Ａ）マウスをＣＬＰまたは見せかけの手術の対象とした。マウスにエバンスブルーアルブミン（ＥＢＡ）の静脈注射して、ＥＢＡの蓄積を腎臓（Ａ）または脾臓（Ｂ）で測定して内皮透過率の評価をした（Ｎ＝５）。（Ｃ）Ｒｏｂｏ４＋／＋マウスはＣＬＰの対象として、ＭｏｃｋまたはＳｌｉｔ２Ｎで処理して、生存率を評価した（Ｍｏｃｋ処理Ｎ＝１５、Ｓｌｉｔ２Ｎ処理Ｎ＝１４）。ＭｏｃｋまたはＳｌｉｔ２Ｎ処理されたＣＬＰマウスの血清中の（Ｄ）サイトカインまたは（Ｅ）ケモカイン（Ｎ＝６）。（Ｆ）Ｒｏｂｏ４ＡＰ／ＡＰマウスはＣＬＰの対象として、ＭｏｃｋまたはＳｌｉｔ２Ｎで処理し、生存率を評価した（Ｍｏｃｋ処理Ｎ＝１３、Ｓｌｉｔ２Ｎ処理Ｎ＝１３）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１で、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図５】Ｓｌｉｔ２ＮはＨ５Ｎ１感染のモデルにおいて死亡率を減少させた。（Ａ）Ｂａｌｂ／ｃマウスを鼻腔内にＨ５Ｎ１ウィルスで感染させた。マウスにエバンスブルーアルブミン（ＥＢＡ）の静脈注射を施し、ＥＢＡの蓄積を肺において測定し、内皮透過率の評価をした（Ｎ＝５）。（Ｂ）Ｈ５Ｎ１感染後のマウスの生存率（Ｍｏｃｋ処理Ｎ＝２０、Ｓｌｉｔ２Ｎ処理＝２０）。（Ｃ）Ｈ＆Ｅ染色を感染後６日にＨ５Ｎ１感染マウスから肺断片において実施した。左上パネルの白矢印は、肺細動脈付近において浮腫液の蓄積を示す。中央上のパネルは過剰な肺胞炎症を示す。右上パネルの黒矢印は泡沫マクロファージの存在を示す。（Ｄ）Ｈ５Ｎ１ウイルス滴定濃度を感染後６日に測定した（Ｎ＝３の統合分析マウス群）。（Ｅ）サイトカインまたは（Ｆ）ケモカインのレベルを肺ホモジェネートにおいて感染後６日に測定した（Ｎ＝３の統合分析マウス群）。
【図６】Ｓｌｉｔは複数の炎症刺激による細胞表面上におけるＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの向上が原因の漏出を減少した。（Ａ）正常状態における肺胞毛細血管は、半透過性バリアを提供する。（Ｂ）炎症刺激はＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの内在化およびバリア機能の途絶を導くサイトカインの大量放出の原因である。これは肺胞腔における内皮漏出およびタンパク質に富んだ浮腫液の蓄積の結果に至る。（Ｃ）ＳｌｉｔはＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎを細胞表面において増強することで、複数のサイトカインに対する内皮バリア機能を向上する。
【図７】Ｓｌｉｔ２−Ｄ１（４０ｋＤ）と同じ大きさの組み換え型Ｓｌｉｔペプチドを活性化した。図７Ａにおいて、Ｓｌｉｔタンパク質の異なった構図を示す図である。４つのロイシンに富んだドメイン（ＬＰＲ）、上皮細胞成長因子のホモロジー領域（ＥＧＦ）およびｃ末端タグ（ＭＹＣ／ＨＩＳ）を示す。異なったＳｌｉｔ構図（２ｎＭ）によるＶＥＧＦ媒介の内皮細胞遊走の阻害を図７Ｂに示す。
【図８】ＳｅｃｔｉｎＨ３はブレオマイシン誘導の線維症を阻害する。６〜８週齢のＢＬ／６マウスに、生理食塩水または０．０５Ｕブレオマイシンの鼻腔内接種を施した。１００μＬの賦形剤または３０μＬのＳｅｃｔｉｎＨ３を、腹腔内投与によって一日２回投与した。肺線維症をＳｉｒｃｏｌコラーゲン分析によって評価した。Ｎ≧７動物毎群、＊Ｐ＜０．０５。
【図９】ＳｅｃｔｉｎＨ３の化学構造を示す図である。
【図１０】Ｒｏｂｏ４シグナル経路の挿絵を示す図である。
【図１１】Ｒｏｂｏ４発現が肺においてＬＰＳ点滴６時間後に増加していたことを示す図である。
【図１２】Ｓｌｉｔ２タンパク質投与のマウスモデルのトリインフルエンザに従ってトリインフルエンザウイルスに感染させたマウスの生存率の効果。
【図１３】（ａ）Ｓｌｉｔ２はブレオマイシン投与１１日後、Ｒｏｂｏ４＋／＋マウスにおいてブレオマイシン誘導ＥＢＡ蓄積を著しく減少した。Ｓｌｉｔ２の効果はＲｏｂｏ４ＡＰ／ＡＰマウスにおいて欠損していて、（ｂ）Ｓｌｉｔ２はまたブレオマイシン誘導による肺線維症を著しく減少した。この効果はＲｏｂｏ４ＡＰ／ＡＰマウスにおいて消失していて、Ｓｌｉｔ２が内皮に直接働き、肺線維症を減少することを示す。（ｃ）三重染色を使用してコラーゲンの蓄積の視覚化を向上させた肺の組織学的検査は、Ｒｏｂｏ−４依存的様式にＳｌｉｔ２の効果をもたらすことを確認した。
【図１４】ＳｌｉｔはＬＰＳ誘導した細胞浸潤を濃度依存的様式で阻害する。（Ａ）Ｒｏｂｏ４またはコントロールｓｉＲＮＡノックダウンのＨＭＶＥＣ−ｌｕｎｇをＲｏｂｏ４発現に関して免疫ブロット法によって評価した。（Ｂ）Ｚ軸の共焦点像を以下に示し、その横に黄色線によって示す。増加した接合部位の厚さ（ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）をＳｌｉｔ２Ｎ処理した細胞において観測した。（Ｃ−Ｄ）マウスをＳｌｉｔ２Ｎの増加したレベルの存在下で、ＬＰＳ誘導したＡＬＩの対象とした。細胞浸潤および好中球を示す。Ｎ＝４、＊Ｐ＜０．０５。
【図１５】Ｓｌｉｔ２Ｎは、定量的組織学による評価において、ＬＰＳ誘導したＡＬＩを減少した。Ｒｏｂｏ４＋／＋およびＲｏｂｏ４ＡＰ／ＡＰのマウスを、Ｓｌｉｔ２ＮのＭｏｃｋの存在下において、ＬＰＳ誘発ＡＬＩの対象とした。これらのマウスからの肺断片をＨ＆Ｅ染色し、定盲検治験の研究者による実施によって量的組織学によって肺外傷の度合いを評価した。Ｎ＝３、＊＊＊Ｐ＜０．００５。
【図１６】Ｓｌｉｔは初代ヒトＰＭＮの遊走を減少しない。（Ａ）細胞を、ＭｏｃｋＳｌｉｔ２の存在下において、白血球走化性因子ｆＭＬＰへの遊走の対象とした。（Ｂ）ＲＮＡをｈＰＭＮから分離し、定量ＰＣＲの対象とした。脳ｃＤＮＡを陽性コントロールとして使用した。Ｎ＝３、＊＊＊Ｐ＜０．００５、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図１７】Ｓｌｉｔ２タンパク質は、肺全体で内皮の近接近において発現している。矢印で示すように、Ｓｌｉｔ２はＲｏｂｏ４アルカリホスファターゼ（ＡＰ）発現で共局在している。
【図１８】著しい肺外傷はＣＬＰ時に存在しなかった。（Ａ−Ｃ）マウスをＣＬＰの対象として、ＭｏｃｋまたはＳｌｉｔ２Ｎで治療した。肺断片を（Ａ）Ｈ＆Ｅ染色し、（Ｂ）定量的組織学をＮ＝３で実施した肺外傷の度合いを評価する。（Ｃ）マウスの肺における透過率をエバンスブルーアルブミン（ＥＢＡ）の使用によって評価した。Ｎ＝５。
【図１９】Ｒｏｂｏ４の欠損は、初期発生中の肺で血管内皮のパターン形成に影響しなかった。Ａ−Ｃ、Ｄ−ＦおよびＧ−Ｉは、Ｒｏｂｏ４＋／＋、Ｒｏｂｏ４＋／ＡＰおよびＲｏｂｏ４ＡＰ／ＡＰである〜Ｅ１２．５の肺を、上皮（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）および脈管構造（ＣＤ３１）で、それぞれ染色した。矢印は左肺動脈のＥＣチューブ遠位部を示す。Ｂ、ＥおよびＨは、第一左の外側の第二気道分岐部の、遠位分岐部の拡大図を、遠位分岐の頂点から直線状に外側に伸びるＣＤ３１＋網状組織部位を示す横棒とともに示す図である。Ｃ、ＦおよびＩは、左肺動脈の遠位のＥＣチューブ部位の拡大図を、ＣＤ３１に対する抗体で染色した拡大図を示す。第一、第二および第三の部位の左背部の第二気道芽をＤ１、Ｄ２、およびＤ３として示す。
【図２０】Ｒｏｂｏ４の欠損は発育中の肺における血管内皮のパターン形成に影響しない。Ａ−Ｂ、Ｃ−ＤおよびＥ−Ｆは、Ｒｏｂｏ４＋／＋、Ｒｏｂｏ４＋／ＡＰおよびＲｏｂｏ４ＡＰ／ＡＰ〜Ｅ１４．５肺を、肺の上皮（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）および脈管発達（ＣＤ３１）でそれぞれ染色した。矢印は左第一気管支の外側に位置する左肺動脈を示す。Ａ、ＣおよびＥの暗い矢印の頭は、右副肺に供給する右肺動脈の分岐部を示し、副肺に対して右第二後部の気道分岐の後部に位置する。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
I. 定義
開示したものは、使用することができるか、組み合わせて使用することができるか、調製に使用することができるか、開示した活性薬剤、組成物および方法の生成物である材料、組成物および成分である。これらおよび他の材料を本明細書で開示し、それはこれらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、基等を開示するとともに、これらの化合物のそれぞれの様々な個々および集合体の組み合わせ、置換の特定の関連を明確に開示した以外は、それぞれを詳細に考慮して、本明細書に記載したことを理解される。例えば、ポリペプチドを開示や考察したり、ポリペプチドを含有する多数の分子を製造することができる数々の修飾を考察する場合には、ポリペプチドのそれぞれおよび全ての組み合わせ、置換並びに可能性のある修飾物は、それとは反対に示さない限り、特に考慮される。従って、分子Ａ、ＢおよびＣは分子Ｄ、ＥおよびＦのクラスを同様に開示して、組み合わせ分子の例Ａ−Ｄを開示した場合には、それぞれを各々に列挙しない場合でも、それぞれが各々および集合的に考慮される。従って、例えば、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆのそれぞれを具体的に考慮し、開示物Ａ、ＢおよびＣ；Ｄ、ＥおよびＦ；Ａ−Ｄの組み合わせの開示から開示したものと考えるべきである。同様にこれらのサブセットまたは組み合わせのいずれかをまた具体的に考慮し、開示する。従って、例えばＡ−Ｅ、Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅのサブグループを具体的に考慮し、Ａ、ＢおよびＣ；Ｄ、ＥおよびＦ；Ａ−Ｄの組み合わせの例の開示から開示したものと考えるべきである。この概念は、開示した組成物の製造および使用の方法の工程を含むが、これに制限されない本願の全ての態様に適用する。従って、実施することができる様々な付加工程がある場合には、これらの付加工程のそれぞれをあらゆる特定の実施形態または開示した方法の実施態様の組み合わせで実施することができ、前記組み合わせのそれぞれを具体的に考慮し、開示したものとして考えるべきである。
【０００７】
当業者は、本明細書に記載の、一連の実験、方法の特定の実施形態の均等物および組成物以外を使用して認識または確認できるだろう。前記均等物は添付の請求項を含むことを意図する。
【０００８】
それはまた本明細書に使用される用語は、特異的な実施形態のみを記載する目的であり、本明細書に記載する発明の範囲を制限する意図はないことを理解される。
【０００９】
他に定義しない場合、本明細書に使用される全ての技術的および化学的用語は、本明細書の文脈において、当業者に一般的に解釈される意味である。
【００１０】
本明細書および添付の請求項に使用されるように、単数形は文脈で明確に他を意図しない限り複数の関連物を含むことを注意するべきである。従って、例えば一つのポリペプチドの関連は、前記ポリペプチドの複数を含み、一つのポリペプチドの関連は一つ以上のポリペプチドおよび当業者に既知の均等物等に対する関連物である。
【００１１】
任意とは、その後記載の事象、状況または材料が生じるもしくは存在することができるかできないこと、および明細書が、事象、状況もしくは材料が生じるか存在する場合、または生じないかまたは存在しない場合を含むこと意味する。
【００１２】
範囲を、一つの特定のおおよその値からおよび／または他の特定のおおよその値で本明細書に示すことができる。このような範囲を示すとき、他の実施形態は一つの特定値からおよび／または他の特定値までを含む。同様に、値を近似値として示すとき、前例に関する使用によって、それは特定値が他の実施形態において構成すると解釈されるであろう。それはさらにそれぞれの範囲の終点が、関連の他の終点および独立の他の終点の両方で重要であると解釈されるであろう。それはまた、本明細書に記載した複数の値があり、それぞれの値をまた、本明細書において、それ自身の値に加えて、特定値として開示することを理解される。例えば、もし値１０を開示したとき、約１０をまた開示する。また二つの特定の単位の間のそれぞれの単位をまた開示することを解釈する。例えば、もし１０および１５を開示する場合、１１、１２、１３および１４をまた開示する。 
【００１３】
アルキル基とは、炭素−炭素単結合によって結合して、炭素原子１から８を共に結合した任意に置換された炭化水素基である。アルキル炭化水素基は直鎖または一つ以上の分岐を含むことができる。これらの基は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第三級ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等を含有する。低級アルキル基とは、炭素原子１から４を有する置換された分岐状または直鎖状のアルキルとする。
【００１４】
アルケニル基とは、炭素原子の間に少なくとも一つの炭素−炭素二重結合を含み、共に結合した炭素原子２から８を含む任意に置換された炭化水素基とする。アルケニル炭化水素基は、分岐または直鎖であることができる。
【００１５】
シクロアルキル基とは、任意に置換された環式のアルキルまたは任意に置換された非芳香環式のアルケニルであり、一環式および複数の縮合環の構造、例えば二環式および三環式を含有する。シクロアルキルは、例えば３から１５の炭素原子を有することができる。一の実施形態において、シクロアルキルは炭素原子５から１２である。適切なシクロアルキル基の例は、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等を含有する。
【００１６】
ヘテロ環とは、少なくとも一つの非炭素原子を含む任意に置換された飽和性または部分的に飽和の、非芳香環の部分とする。複素環部分は、一般的に単一環または複数の縮合環の構造、例えば二環式および三環式を含む。一の実施形態において、（複数の）環は５から６員であり、一般的に非炭素原子１から３を含有する。複素環における非炭素原子は独立して、窒素、酸素および硫黄から選択することができる。
【００１７】
アリールとは、任意に置換された芳香基と共役π電子系を有する少なくとも一つの環であり、単環および複数の縮合環の構造、例えば二環式および三環式を含有する。アリール基は、任意に置換された炭素環式アリール基を含む。適切なアリール基の例は、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、フェナントレニル基等を含む。
【００１８】
複素環アリール基とは、任意に置換された芳香基と、少なくとも一つの非炭素原子を含む共役π電子環系を有する少なくとも一つの環とする。複素環アリール基部分は、一般的に短環または複数の縮合環の構造、例えば二環式および三環式を含む。適切な複素環アリール基は、フラニル基、チエニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピリジニル基等を含有する。
【００１９】
アルコシキルとは、アルキル基に結合した酸素とする。低級アルコキシとは低級アルキル基との結合した酸素とする。一の実施形態において、酸素が非置換性アルキル炭素１から４の長さで結合した。例えば、アルコキシルは、メトキシ、エトキシ等であることができる。
【００２０】
アルキレンとは、炭素原子の間に炭素−炭素単一結合のみを含む任意に置換された炭化水素鎖とする。アルキレン鎖は炭素原子１から６であり、他の官能基または構造部分の二ヶ所の部分に結合している。適切なアルキレン基の例は、メチレン、エチレン等を含む。
【００２１】
本明細書において使用されるように、小分子とは低分子量の化合物とする。例えば、特定の実施形態において、このような低分子の化合物は５０Ｄａから８００Ｄａの間の分子量を示す。代替の実施形態において、本明細書に記載の小分子は、１００Ｄａから５００Ｄａの間、２５０Ｄａから４７５Ｄａの間の範囲から選択される分子量を示す。
【００２２】
本明細書において使用されるように、対象という用語は投与の標的のいずれかを意味する。対象は、脊髄動物、例えば哺乳類であることができる。従って、対象はヒトであることができる。この用語は特定の年齢または性別を示さない。従って、大人および新生児の対象並びに胎児、男性または女性かどうかで適用されることを意図する。患者という用語は、病態を患っている対象とする。患者という用語は、ヒトおよび獣医の対象を含む。
【００２３】
阻害する、阻害することおよび阻害とは、活性、反応、状態、疾患、または他の生物学的パラメーターを抑制、減少、不活性化、または逆転することを意味する。阻害する、阻害することおよび阻害とは、活性、反応、状態、または疾患を完全になくすことを含むが、これに限定されない。阻害する、阻害することおよび阻害とはまた、例えば活性、反応、状態、疾患または他の生物学的パラメーターを正常のレベルと比較して、低下または減少を含むことができ、前記正常のレベルという用語は阻害剤の不存在下における確かなレベルとする。阻害する、阻害することおよび阻害とは、また例えば活性、反応、状態、疾患または他の生物学的パラメーターを通常のレベルと比較して、逆転することを含むことができ、前記通常のレベルという用語は、阻害剤の不存在下における明確なレベルとする。この文脈において、減少は、いずれかの測定における減少であることができる。特定の実施形態において、減少は、正常のレベルと比較して、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または具体的に列挙した比率の間のいずれかの量の減少であることができる。
【００２４】
促進する、促進および促進することとは、活性、反応、状態または他の生物学的パラメーターを維持、復元、または上昇させることとする。促進する、促進および促進することとは、活性、反応、状態、または生物学的パラメーターの開始を含むことができるが、これに限定されない。これ以外に、促進する、促進および促進することとは、活性、反応、状態または他の生物学的パラメーターの維持を含み、特に関連のある活性、反応、状態または他の生物学的パラメーターを分解、減少または取り除く観点で含有することができる。促進する、促進および促進することとはまた、例えば正常もしくはコントロールのレベルと比較して、活性、反応、状態または生物学的要素の上昇を含有することができる。特定の実施形態において、活性、反応、状態または生物学的パラメーターは、正常またはコントロールのレベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれ以上の上昇であることができ、特定の列挙した比率の間における上昇のいずれかの量を含み、前記正常のレベルという用語は促進剤の不存在下における明確なレベルとする。
【００２５】
キャリアという用語は、化合物または組成物を組み合わせたとき、化合物または組成物の調製、保存、投与、送達、効果、選択性、または他の性質を、その意図する使用または目的のために補助または促進する化合物、組成物、物質または構造を意味する。例えば、キャリアを製剤処方に提供して使用することができ、活性薬剤のいずれかの分解を最低限するか、またはいずれかの好ましくない副作用を対象に対して最低限にするから選択することができる。
【００２６】
本明細書において使用されるように、処理する、処理することおよび処理という用語は、治療の利点であり、特定の病態状態、疾患、状態、事象または傷害の有害な効果または進行を防止、減少、中断、逆転または遅延させることである。
【００２７】
治療の有効量は、治療の利点、例えば病態に関する活性、反応、状態、疾患または他のパラメーターを阻害または逆転させることによって達成する化合物の量である。治療への有効量は、対象の病態の一つ以上の症状を少なくともある程度軽減し；病態の関連するまたは原因となる部分的または完全のいずれかで、一つ以上の生理学的なまたは生化学的なパラメーターを、正常に回復し；および／または病態の開始の可能性を減少させる量であることができる。
【００２８】
病的または病態という用語は、健康的、正常または有能な状態からのいずれの偏向における疾患、状態、事象または負傷の結果に至ることができることとする。
【００２９】
用語を本明細書において使用するように、タンパク質およびペプチドとは通常ポリペプチド分子であり、いずれか特定のサイズ、長さ、または分子量のポリペプチド分子として使用されない。タンパク質の変異体および誘導体は、当業者に既知であり、アミノ酸配列の修飾を含むことができる。例えば、アミノ酸配列の修飾は、典型的に３クラス：置換、挿入または欠失体の１つ以上に分類される。挿入とは、アミノおよび／またはカルボキシル末端の融合、並びに単一または複数のアミノ酸残基の内在配列挿入を含む。挿入は通常、アミノまたはカルボキシル末端の融合、例えば約１から４の単位のものより小さい挿入物である。免疫原性融合タンパク質の誘導体、例えば実施例に記載のものを、十分に大きなポリペプチドの融合を作成し、標的配列に免疫原性を、体外における架橋結合、または融合をコードするＤＮＡで、形質転換した組み換え型の細胞培養によって与える。欠失とは、タンパク質配列からの一つ以上のアミノ酸残基の除去として特徴付けられる。通常、約２から６残基以下を、いずれかの一部でタンパク質分子内において欠失している。これらの変異は通常、タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的な突然変異によって調製し、その結果変異体をコードするＤＮＡを生成し、その後組み換え型細胞培養を発現する。置換突然変異体を既知の配列を有するＤＮＡの所定部位で生成する技術、例えばＭ１３プライマー突然変異生成およびＰＣＲ突然変異生成が良く知られている。アミノ酸の置換は、通常単一残基であるが、数々の異なった部位において同時に起こることができ；挿入は通常、約１から１０アミノ酸残基の単位であり；欠失は約１から３０の残基の範囲で分布するであろう。欠失または挿入を、好ましくは隣接した一対、すなわち２残基の欠失または２残基を生成する。置換、欠失、挿入、またはそれらいずれかの組み合わせを組み合わせて、最終構造に至ることができる。突然変異体は、リーディングフレーム外の配列には配置することができず、好ましくは二次ｍＲＮＡ構造を作り出すことができる相補領域を生成しないであろう。置換変異は、技術においてよく理解されており、少なくとも一残基を除去し、異なった残基をその部位に挿入するものである。一般的に、置換変異体の形成において実施される置換は、保存的置換であり、よく知られる技術であり、しばしば置換変異体を、ポリペプチド分子の一つ以上の特性、例えば循環半減期、安定性等を向上させて生成することができる一方、ポリペプチドの生物学的活性を保持または改善する。
【００３０】
機能または免疫学的同定における置換変異を、（ａ）置換領域内のペプチドの骨格の構造、例えばシートまたはらせん形の構造、（ｂ）標的部位で分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さを維持するそれらの効果と異なる代替物から選択することによって製造する。一般的には、最大の変化をタンパク質の性質において生み出すと期待される置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリルまたはトレオニルを、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルに置換；（ｂ）システインまたはプロリンをいずれか他の残基に置換；（ｃ）陽性物質側鎖、例えばリシル、アルギニル、またはヒスチジルを有する残基を、陰性残基、例えばグルタミルまたはアスパルチルに置換；または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンを、側鎖を有さないもの、例えばグリシンに置換、この場合、（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化の部位の数を増加させるものである。 
【００３１】
例えば、一つのアミノ酸残基を、生物学的および／または化学的に同様な他のものへの置換が、同類置換として当業者に既知である。例えば、同類置換は、一つの疎水性残基を他のものへの置換、または一つの極性残基を他のものへの置換である。この置換は、例えばＧｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒ等の組み合わせを含有する。それぞれ明確に開示した配列の前記同類置換体を、本明細書に提供したポリペプチドの範囲内に含む。
【００３２】
置換または欠失の突然変異生成を、Ｎグリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯグリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）の挿入部位に用いることができる。システインまたは他の不安定な残基の欠失がまた望ましい。潜在的なタンパク質分解領域、例えばＡｒｇの欠失または置換は、例えば塩基性残基の欠失、またはグルタミニルまたはヒスチジルの残基で一つを置換することによって達成することができる。
【００３３】
組み換えによって製造したポリペプチドの関連で、特定の翻訳後の誘導体化は、発現したポリペプチドで組み換え宿主細胞の活性の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニルの残基を、対応するグルタミルおよびアスパラギニルの残基に、しばしば翻訳後脱アミド化した。また、これらの残基を、弱酸性条件下において脱アミド化した。他の翻訳後の修飾は、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニルの、残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジンの、側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｐｐ７９−８６〔１９８３〕、本明細書に参照によって組み込む）、Ｎ末端のアセチル化、およびいくつかの場合、Ｃ末端カルボキシのアミド化を含有する。 
【００３４】
本明細書に開示のポリペプチドの誘導体、類似物およびホモログの定義をする一つの方法は、特異的な既知の配列を相同性／同一性に関する誘導体、類似物、およびホモログを規定することによる。当業者は、二つのタンパク質の相同性を決定する方法を容易に理解する。例えば、相同性を、相同性がその比較的に高いレベルになるように、二つの配列を配置した後、算出することができる。 
【００３５】
相同性を算出する他の方法を、公のアルゴリズムによって実行することができる。比較のため、配列の最適な配置を、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．  ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の局所相同性アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：２４４４（１９８８）の類似法に対する検索、これらアルゴリズムのコンピューター化された実行（Ｗｉｎｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または検査によって実施することができる。
【００３６】
本開示のポリペプチドに組み込むことができる多くのアミノ酸およびペプチドの類似体があることを理解される。例えば、多くのＤアミノ酸または異なった機能置換を有するアミノ酸、そして、表１で示すアミノ酸がある。自然に分泌されるペプチドの対称的な立体異性体を、ペプチド類似体の立体異性体と同様に開示する。これらのアミノ酸を、ｔＲＮＡ分子とアミノ酸の選択で満たし、例えばアンバーコドンを利用して、類似体のアミノ酸をペプチド鎖内に、部位特異的な方法によって挿入する遺伝子構造を設計することによって、ポリペプチド鎖内に容易に組み込むことができる（Ｔｈｏｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ７７：４３−７３（１９９１），  Ｚｏｌｌｅｒ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ３：３４８−３５４（１９９２）；  Ｉｂｂａ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３：１９７−２１６（１９９５），  Ｃａｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＴＩＢＳ，  １４（１０）：４００−４０３（１９８９）；  Ｂｅｎｎｅｒ，  ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ，  １２：１５８−１６３  （１９９４）；  Ｉｂｂａ  ａｎｄ  Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，  Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １２：６７８−６８２（１９９４）全てを本明細書に参照によって組み込む）。 
【００３７】
Ｄ−アミノ酸は、Ｄアミノ酸をペプチダーゼ等によって認識されないために、比較的安定したペプチドを生成して使用することができる。同じ種のＤ−アミノ酸との共通配列の一つ以上のアミノ酸の系統的置換（例えば、Ｌリジンの代わりにＤリジン）を使用して、比較的安定なペプチドを生成することができる。システイン残基を使用して、二つ以上のペプチドを共に環化または結合することができる。これは、ペプチドを特定の構造内に拘束する利点がある。（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６１：３８７（１９９２）、本明細書に参照によって組み込む）。
【００３８】
本明細書において使用されるように、血管透過率とは、小分子（例えば、イオン、水、栄養分）、大分子（例えば、タンパク質および核酸）、または全細胞でさえ（炎症部位への途中のリンパ球）が血管壁を通過する能力とする。 
【００３９】
II.  ＲＯＢＯ４シグナル経路
Ｒｏｂｏ４シグナルが病原性血管形成および新血管形成阻害するシグナル経路を、国際公開第２００９／１２９４０８号、国際公開第２００８／０７３４４１号、およびＪｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｃ．Ａ．  Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８．  Ｒｏｂｏ４  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １４：４４８−４５３）に記載する。これらの参考文献に記載するように、Ｒｏｂｏ４の発現は、Ｓｌｉｔ２に反応性を与え、Ｓｌｉｔ２−Ｒｏｂｏ４シグナルは、細胞突起活性を細胞接着によって陰性に制御する。前記陰性制御は、Ｒｏｂｏ４の相互作用を、アダプタータンパク質、パキシリンおよびそのパラログによって媒介され、ＡＲＦ−ＧＡＰ、例えばＧＩＴ１を補充し、ＡＤＰリボース化因子６（ＡＲＦ６）の局所不活性化を導く。それによって、このシグナル経路は（図１０に示す）、粘着媒介Ｒａｃ１活性および細胞突起と相互作用する。図１０に記載のシグナル経路は、Ｒｏｂｏ４シグナル経路を調製するための複数の標的を示し、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、国際公開第２００９／１２９４０８号および国際公開第２００８／０７３４４１号は、Ｒｏｂｏ４シグナル経路を含むＡＲＦ−ＧＡＰおよびＡＲＦ−ＧＥＦの調節がＳｌｉｔ／Ｒｏｂｏ４シグナルによって達成することができることをさらに記載する。Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、国際公開第２００９／１２９４０８号、国際公開第２００８／０７３４４１号のそれぞれの内容を、本明細書に参照として組み込む。
【００４０】
Ｒｏｂｏ４シグナルは作用して、複数の異なる炎症媒介の存在下において、血管保全を維持する。例えば、Ｒｏｂｏ４シグナル経路を利用して、エンドトキシン（例えば、リポ糖類または“ＬＰＳ”）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびインターロイキン１β（ＩＬ−１β）の存在下において、血管保全を維持し、それらのそれぞれは既知の炎症媒介である（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｃ．Ａ．  １９９７．  Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｓ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｐｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ．  Ｃｈｅｓｔ  １１２：３２１Ｓ−３２９Ｓ）。さらに、Ｒｏｂｏ４シグナル経路は、内皮バリア機能を、複数の異なった組織、例えば肺、腎臓、および脾臓等において維持するように機能する。さらにまた、Ｒｏｂｏ４シグナル経路は、急性炎症反応に関する状態で血管保全を維持するだけではなく、Ｒｏｂｏ４シグナル経路を利用して、生体内の急性および慢性の肺炎症における内皮バリア機能を維持することができる。
【００４１】
ＩＩ．  活性薬剤および組成物
本明細書に記載の活性薬剤および組成物は、血管バリア機能の促進をもたらす。それぞれの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、血管バリア機能を促進することができる少なくとも一つの活性薬剤を含み、一の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、血管内皮バリア機能を促進する活性薬剤を含む。他の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、肺の血管内皮、腎臓の血管内皮および脾臓の血管内皮の一つから選択される内皮組織において、血管バリア機能を促進する活性薬剤を含む。他の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、急性肺炎症を導く状態に関連がある血管透過率、並びに慢性肺炎症に関連がある状態、例えば肺線維症の発達および進行を阻害する活性薬剤を含む。本明細書で提供した実施例に示すように、本記載に従った活性薬剤は、特定の実施形態において、例えばエンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βを含有する複数の炎症のメディエーターおよび血管透過率の存在下で、血管バリア機能を促進する。 
【００４２】
特定の実施形態において、本明細書に記載の活性薬剤および組成物は、病態、例えば肺線維症、並びに急性肺血管炎症と関連のある他の状態を患った対象を治療するのに適している。一つの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、肺線維症の発生または進行と関連のある急性肺血管浮腫、急性肺血管炎症および慢性肺血管炎症の一つ以上を阻害する活性薬剤を含む。他の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、微生物のエンドトキシンにさらすか、またはインフルエンザ感染、例えばトリインフルエンザ感染を患うヒトを含む動物において、血管バリア機能を促進する活性薬剤を含有する。さらなる実施形態において、本明細書に記載の組成物は、血管バリア機能を促進し、病態、例えば細菌敗血症またはインフルエンザ感染、例えばトリインフルエンザ感染と関連する血管透過率を阻害する活性薬剤を含有する。 
【００４３】
血管内皮において、重要な安定性のある相互作用は、接着結合タンパク質、血管内皮カドヘリン（ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）によって媒介される（Ｄｅｊａｎａ，  Ｅ．，  Ｆ．  Ｏｒｓｅｎｉｇｏ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｇ．  Ｌａｍｐｕｇｎａｉｎｉ．  ２００８．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｄｈｅｒｅｎｓ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １２１：２１１５−２１２２；  Ｖｅｓｔｗｅｂｅｒ，  Ｄ．  ２００８．  ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ：  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２８：２２３−２３２）。ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの表面における発現は、ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎとＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの関連によって調製され、ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎとＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの関連は、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの内部化を細胞表面から阻害し、血管安定性を促進することが知られる（Ｐｏｔｔｅｒ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｓ．  Ｂａｒｂｅｒｏ，  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．  Ｃｈｅｒｅｓｈ．  ２００５．  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎｇ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｐ１２０−  ａｎｄ  ｂｅｔａ−  ｃａｔｅｎｉｎ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔａｉｎｓ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔａｔｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０：３１９０６−３１９１２；  Ｘｉａｏ，  Ｋ．，  Ｊ．  Ｇａｒｎｅｒ，  Ｋ．Ｍ．  Ｂｕｃｋｌｅｙ，  Ｐ．Ａ．  Ｖｉｎｃｅｎｔ，  Ｃ．Ｍ．  Ｃｈｉａｓｓｏｎ，  Ｅ．  Ｄｅｊａｎａ，  Ｖ．  Ｆａｕｎｄｅｚ，  ａｎｄ  Ａ．Ｐ．  Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ．  ２００５．  ｐ１２０−Ｃａｔｅｎｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １６：５１４１−５１５１）。特定の実施形態において、本明細書に記載の活性薬剤は、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を細胞表面接合で促進する。一つの実施形態において、本開示に従った活性薬剤は、細胞表面におけるｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を促進する。細胞表面のｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現の促進において、特定の理論に束縛されずに、このような実施形態がＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎおよびｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの間の関係を維持し、その結果、例えば他の一を超える炎症メディエーター（例えば、一つ以上のサイトカイン）の存在下において生じることができるようなＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎのエンドサイトーシスを減少することによって、血管保全を促進すると現在考えられている。従って、特定の実施形態において、本明細書に記載の活性薬剤は、ヒトを含む動物において、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を内皮細胞の表面、例えば血管内皮細胞で血管バリア機能を促進、およびｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を内皮細胞の表面、例えば血管内皮細胞で促進の一つまたは��方によって促した。 
【００４４】
本記載に従う活性薬剤は、Ｓｌｉｔポリペプチド、例えばＳｌｉｔ２ポリペプチドを含むことができる。Ｓｌｉｔ２ポリペプチドを本明細書において考慮して述べるとき、Ｓｌｉｔ２タンパク質の全長、並びにＳｌｉｔ２タンパク質の全長の誘導体、類似体、およびホモログを、前記ポリペプチドが内皮バリア機能が、エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症媒介の存在下において促進、エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在下において、血管漏出を阻害、血管内皮細胞の表面でＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を促進、または血管内皮細胞の表面でｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を促進すると考慮した。誘導体ポリペプチド分子とは、天然化合物からの直接的、修飾または部分的な置換のいずれかによって形成によるポリペプチドとする。ホモログポリペプチド分子とは、異なった種から誘導した特定の遺伝子の誘導体とする。類似体ポリペプチド分子は、構造が似ているが、同一ではなく、参考としたポリペプチド配列を含有するアミノ酸の数または性質に関して異なるポリペプチドとする。例えば、所定のポリペプチドに対する類似体は、配列の相同性レベルを示すが、一つ以上のアミノ酸の置換または欠失を含有することができる。 
【００４５】
特定の実施形態において、活性薬剤がＳｌｉｔポリペプチドの場合、活性薬剤を哺乳類Ｓｌｉｔ２ポリペプチド、例えばヒトＳｌｉｔ２ポリペプチドから選択することができる。活性薬剤が哺乳類Ｓｌｉｔ２の場合、活性薬剤を既知の全長、自然に分泌される哺乳類のＳｌｉｔ２ポリペプチド、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示したＳｌｉｔ２ポリペプチド並びにそれらの誘導体、類似体およびホモログから選択することができ、それは以下の一つ以上ができる：エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターを促進；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターを阻害；ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を血管内皮細胞で促進；ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を血管内皮細胞で促進。容易に理解されるように、自然に分泌されるＳｌｉｔ２ポリペプチドを従来知られている技術に従って、分離し、精製することができる（Ｗａｎｇ，  ＫＨ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｌｉｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ａｘｏｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ．  Ｃｅｌｌ  Ｍａｒ  １９；９６（６）：７７１−８４；  Ｃｈｅｄｏｔａｌ，  Ａ．  ２００７．  Ｓｌｉｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ６２１：６５−８０）。
【００４６】
自然に分泌されるＳｌｉｔ２ポリペプチドに加えて、本明細書において考察されるようなＳｌｉｔ２活性薬剤を、従来よく知られている組み換えまたは合成の生成技術によって得ることができる。さらに活性薬剤は、自然に分泌される組み合わせまたは合成の哺乳類Ｓｌｉｔ２ポリペプチドの、誘導体、類似体またはホモログから選択することができる。特定の実施形態において、Ｓｌｉｔ２活性薬剤を自然に分泌されるＳｌｉｔ２タンパク質の断片、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のいずれかに示される断片、並びにその誘導体、類似体およびホモログから選択することができ、以下の一つ以上ができる：エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在で内皮バリア機能を促進；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在で内皮バリア機能を阻害；ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を血管内皮細胞で促進；ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を血管内皮細胞で促進。
【００４７】
さらに他の実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４からＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示されるＳｌｉｔ２ポリペプチドを、活性薬剤として使用することができる。特に、本明細書に記載の活性薬剤を、Ｓｌｉｔ２Ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、Ｓｌｉｔ２ΔＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、Ｓｌｉｔ２Ｄ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、Ｓｌｉｔ２Ｄ１−Ｄ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、Ｓｌｉｔ２Ｄ１−Ｄ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、Ｓｌｉｔ２Ｄ１−Ｄ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、Ｓｌｉｔ２Ｄ１−Ｅ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）およびＳｌｉｔ２Ｄ１−Ｅ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）に示されたＳｌｉｔ２ポリペプチド；並びにその誘導体、類似体およびホモログで、以下の一つ以上ができるものから選択することができる：エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在で内皮バリア機能を促進；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在で血管漏出を阻害；ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を血管内皮細胞で促進；ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を血管内皮細胞で促進。
【００４８】
さらに他の実施形態において、活性薬剤は、本明細書に記載のＳｌｉｔ２ポリペプチドの誘導体、類似体またはホモログの一つから選択される場合、活性薬剤は自然に分泌される哺乳類Ｓｌｉｔ２ポリペプチドまたは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４からＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に記載のＳｌｉｔ２ポリペプチドの一つと、関連した自然に分泌される哺乳類のＳｌｉｔ２ポリペプチドまたはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４からＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のいずれかのものに、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上のポリペプチド配列の相同性を示す前記活性薬剤を選択することができる。それぞれの前記実施形態において、誘導体、類似体またはホモログは、以下の一つ以上のその性能から選択される：エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターで内皮バリア機能を促進；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターで内皮バリア機能を阻害；ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を血管内皮細胞で促進；ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を血管内皮細胞で促進。
【００４９】
他の実施形態において活性薬剤は、自然に分泌される哺乳類Ｓｌｉｔ２ポリペプチドの誘導体、類似体またはアナログ、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４からＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に記載のＳｌｉｔ２ポリペプチドの一つであり、誘導されるポリペプチドに対して低いポリペプチド配列相同性を示し、例えば８０％以下、７０％以下、６０％以下、または５０％以下の一つから選択される相同性であるとともに、以下の一つ以上の能力を保持できる：エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターで内皮バリア機能を促進；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターで内皮バリア機能を阻害；ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を血管内皮細胞で促進；ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を血管内皮細胞で促進。
【００５０】
一の実施形態において、本明細書に記載の活性薬剤は、Ｒｏｂｏ４受容体のリガンドである。このような実施形態において、Ｒｏｂｏ４のリガンドは、Ｒｏｂｏ４によって作用して血管バリア機能を促進するいずれかの分子であることができる。本明細書において使用したように、発現は、Ｒｏｂｏ４受容体の存在を必要とする内皮細胞に影響があるリガンドによって作用する。一の実施形態において、内皮細胞に影響のあるリガンドは、Ｒｏｂｏ４シグナルを生じる方法でＲｏｂｏ４受容体と結合または会合することで、Ｒｏｂｏ４によって作用することができる。特定の理論に制限されないが、本明細書に記載のＳｌｉｔ２ポリペプチドは、Ｒｏｂｏ４受容体によって作用すると現在考えられている。従って、特定の実施形態において、本開示に従った活性薬剤はＲｏｂｏ４受容体のリガンドである場合には、活性薬剤は本明細書に記載のＳｌｉｔポリペプチドから選択することができる。他の実施形態において、Ｒｏｂｏ４のリガンドは、Ｒｏｂｏ４によって作用してＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎを細胞表面分岐において促進するいずれかの分子であることができる。特定の実施形態において、Ｓｌｉｔリガンド、その断片または変異体は、次の一つ以上を生じる方法で、Ｒｏｂｏ４と結合または会合する：エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在下における内皮バリア機能を促進；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症性メディエーターの存在下における血管漏出を阻害；ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎを血管内皮細胞の表面における存在で促進；およびｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎを血管内皮細胞の表面で促進。
【００５１】
また他の実施形態において、本明細書に記載の活性薬剤は、Ｒｏｂｏ４のリガンドである場合には、リガンドはＲｏｂｏ４によって作用して、ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの細胞表面上における発現を促進する。さらなる実施形態において、本明細書に記載の活性薬剤はＲｏｂｏ４受容体のリガンドを含むことができる場合は、リガンドはＲｏｂｏ４からＧＩＴ１のパキシリン活性を開始するために働く。他の実施形態において、本明細書に記載の活性薬剤は、Ｒｏｂｏ４受容体のリガンドを含有する場合には、リガンドはＲｏｂｏ４によって作用して、ＡＲＦ６のＧＩＴ１の害を活性化する。さらなる実施形態において、本明細書に記載の活性薬剤は、Ｒｏｂｏ４受容体のリガンドを含有する場合には、リガンドは次の一つ以上を生じる方法で、Ｒｏｂｏ４によって作用する：エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在下における内皮バリア機能を促進；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症性メディエーター血管漏出で阻害；ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎを血管内皮細胞の表面における存在で促進；およびｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎを血管内皮細胞の表面で促進。本発明の活性薬剤がＲｏｂｏ４のリガンドを含有する場合には、特定の実施形態において、リガンドはＲｏｂｏ４シグナルを導くＲｏｂｏ４の細胞外ドメインを結合する分子であることができる。
【００５２】
所望の構造のポリペプチドは、従来技術でよく知られた方法および材料を用いて生成することができる。例えば、自然に分泌されるポリペプチドを単離または組み換えポリペプチドの生成する様々な方法がよく知られる。さらに、様々な方法が、所望の配列のポリペプチドを合成で生成することが知られている。例えば、ペプチドは現在入手可能な実験器具を用いて、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボノイル）のいずれかの化学を使用して、化学合成することができる（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）。本明細書に記載のＳｌｉｔポリペプチドは当業者によく知られた組み換えおよび合成の技術、本明細書において記載のもの、例えば国際公開第２００９／１２９４０８号および国際公開第２００８／０７３４４１号に記載の方法によって得ることができる。
【００５３】
当業者は、所望のタンパク質に対応するペプチドを標準の化学反応によって合成することができることを、容易に認識することができる。例えば、ペプチドを合成することができ、その合成樹脂は切断されるのに対して、タンパク質の他のペプチド断片を合成することができ、その後樹脂から切断することができ、その結果、他の断片において機能的に遮断される末端基をさらす。ペプチド凝集反応によって、これら二つの断片を、それらのカルボキシルおよびアミノの末端のそれぞれにおいてペプチド結合によって共有結合して、抗体およびその断片の形成することができる。（Ｇｒａｎｔ  ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｎ．Ｙ．  （１９９２）；  Ｂｏｄａｎｓｋｙ  Ｍ  ａｎｄ  Ｔｒｏｓｔ  Ｂ．，  Ｅｄ．  （１９９３）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．，  ＮＹ（本明細書に少なくともペプチド合成に関する材料を参照として組み込むものとする）。また所望のタンパク質またはペプチドは、生体内において標準の組み換え技術を使用して生成することができる。所望のタンパク質を形成するように結合する独立のペプチドは、生体内において独立して生成され、このような独立したペプチドを生成し、分離すると、それらを結合して所望のタンパク質またはその断片を、同様のペプチド凝集反応によって形成することができる。
【００５４】
例えば、クローンまたは合成のペプチド断片の酵素ライゲーションは、比較的短いペプチド断片を結合して、大きいペプチド断片、ポリペプチドまたは全タンパク質ドメインを生成することを可能にする（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３０：４１５１（１９９１））。また合成ペプチドの自然な化学ライゲーションを利用して、比較的短いペプチド断片からの大きいペプチドまたはポリペプチドを合成的に作成することができる。この方法は二段階の化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２６：７７６−７７９（１９９４））。第一工程は、チオエステル結合した中間体を最初の共有結合の生成物として生じるように、保護されていない合成ペプチド―チオエステルとアミノ末端末端Ｃｙｓ残基を含む他の保護されていないペプチド断片の化学選択的な反応である。反応条件で変化することなく、この中間体は自然的、急激な分子内反応を経て、自然なペプチド結合をライゲーション部位で形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３０７：９７−１０１；  Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２６９：１６０７５（１９９４；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３０：３１２８  （１９９１）；  Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６６２３−３０（１９９４））。
【００５５】
また、保護されていないペプチド部分は、化学ライゲーションの結果が不自然な（非ペプチド）結合であるので、結合がペプチド部位の間で形成される場合、化学的に結合する（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５６：２２１（１９９２））。この技術を使用して、タンパク質ドメインの類似体、並びに大量の比較的精製されたタンパク質を十分な生物学的活性で合成した（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎ  ＲＣ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．２５７−２６７（１９９２））。
【００５６】
他の実施形態において、本明細書に記載の活性薬剤は、ＡＲＮＯ系のサイトヘシンから選択されるサイトヘシンの活性を阻害する小分子活性薬剤であることができる。ＡＲＦ−ＧＥＦ、例えばサイトヘシン、ＡＲＮＯ系のサイトヘシンから選択されたサイトヘシン、またはＡＲＮＯの有用性、活性化または活性を阻害する化合物から、ＡＲＦ、例えばＡＲＦ６およびＡＲＦ１の一つ以上の阻害を生じる方法で選択される小分子活性薬剤は、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、国際公開第２００９／１２９４０８号および国際公開第２００８／０７３４４１号に記載される。本明細書に記載の組成物および方法との関連で、ＡＲＦ−ＧＥＦ、例えばサイトヘシン、ＡＲＮＯ系のサイトヘシンから選択されるサイトヘシン、またはＡＲＮＯの有用性、活性化または活性を、ＡＲＦ、例えばＡＲＦ６およびＡＲＦ１の一つ以上の阻害を生じる方法で阻害する小分子活性薬剤は、肺血管透過率および／または炎症、ならびにその結果として成長する肺線維症を阻害することができる。
【００５７】
特定の実施形態において、本明細書に記載の小分子活性薬剤は、サイトヘシンのＡＲＮＯ系から選択されるサイトヘシンの活性を、次の一つ以上を生じる方法で阻害する；ＡＲＦ６の活性または有用性の阻害；ＡＲＦ１の活性または有用性の阻害；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在下における血管内皮バリア機能の促進；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在下における血管漏出の阻害；ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を血管内皮細胞の表面で促進；およびｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を血管内皮細胞の表面で促進。他の実施形態において、小分子活性薬剤はＡＲＮＯの活性を、次の一つ以上を生じる方法で阻害する；ＡＲＦ６の阻害；血管内皮バリア機能の維持；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在下における内皮バリア機能の促進；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在下における血管漏出の阻害；血管内皮細胞の表面でＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在の促進；血管内皮細胞の表面上でｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現の促進。また他の実施形態において、小分子活性薬剤は、ＡＲＦ６の活性または有用性を、次の一つ以上を生じる方法で阻害する：血管内皮バリア機能の維持；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在下における内皮バリア機能の促進；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在下における血管漏出の阻害；ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を血管内皮細胞の表面で促進；およびｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を血管内皮細胞の表面で促進。
【００５８】
特定の実施形態において、本明細書に記載の活性薬剤は、ＳｅｃｉｎＨ３であり、図９で示す構造であることができる。ＳｅｃｉｎＨ３は、サイトヘシンの阻害剤である（例えば、Ｈａｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｈｅｓｉｎｓ  ｂｙ  ＳｅｃｉｎＨ３  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，  Ｎａｔｕｒｅ  （２００６），  ４４４，  ９４１−９４４，  ａｎｄ  国際公開第２００６／０５３９０３号参照、共に本明細書に参照として組み込むものとする）。Ｓｅｃｉｎ−Ｈ３が炎症メディエーターおよび血管透過率の効果を阻害することを見出した。従って、一の実施形態において、ＳｅｃｉｎＨ３はサイトヘシンのＡＲＮＯ系から選択されるサイトヘシンの活性を、ＡＲＦ６およびＡＲＦ１から選択されるＡＲＦの阻害を生じる方法で阻害して、次の一つ以上を提供する小分子活性薬剤として選択することができる：エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在下における内皮バリア機能の促進；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在下における血管漏出の阻害；ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を血管内皮細胞で促進；ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を血管内皮細胞の表面で促進。
【００５９】
他の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、ＡＲＦ−ＧＥＦ、例えばサイトヘシン、ＡＲＮＯ系のサイトヘシンから選択されるサイトヘシンまたはＡＲＮＯの有用性、活性化または活性を、次の一つ以上を生じる方法で阻害する化合物から選択される一つ以上の小分子活性薬剤を含有する：ＡＲＦ６の活性または有用性の阻害；ＡＲＦ１の活性または有用性の阻害；血管内皮バリア機能の維持；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在下における内皮バリア機能の促進；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在下における血管漏出の阻害；ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を血管内皮細胞の表面で促進；およびｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を血管内皮細胞の表面で促進。
【００６０】
本明細書に従った活性薬剤は、小分子活性薬剤を含み、特定の実施形態において、活性薬剤は以下の化学式（一般式Ｉ）を有する一つ以上の化合物：
【００６１】
【化１】
2012512170.tif 000003
【００６２】
式中、Ｒ１およびＲ３は、任意の置換したアリール基、任意の置換したヘテロアリール基、任意の置換したシクロアルキル基、または任意の置換したヘテロ環から独立して選択され； 
Ｒ２は水素、低級アルコキシ基、低級アルキル基、ハロゲンまたは水酸基から選択され； 
ＺはＯ、Ｓ、ＮＨ、アルキレン基または一重結合から選択される；または 
薬学的に受け入れられる塩、その溶媒和物または水和物を含むことができる。
【００６３】
一の実施形態において、一つ以上の化合物は一般式１に記載のような化合物から選択され、式中、Ｒ３はハロゲン、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ヘテロ原子低級アルキル基、水酸基またはメチレンジオキシ基から独立して選択される置換基１〜５と置換し、２つの置換基は共に結合したシクロアルキル基または複素環の構造を形成することができる。他の実施形態において、一つ以上の化合物は一般式１に記載の化合物から選択され、式中、Ｒ１は非置換のアリール基または非置換のヘテロアリール基から選択され；Ｒ２は水素、低級アルコキシまたは低級アルキルから選択され；Ｒ３はアリール基、任意にハロゲン、低級アルキル基、低級アルコキシ基、またはメチレンジオキシ基から独立して選択される置換基１〜５と置換され；およびＺはＯ、Ｓまたは単結合から選択される。
【００６４】
他の実施形態において、本明細書に従った活性薬剤は小分子活性薬剤を含有する場合、活性薬剤は以下の化学式（一般式ＩＩ）を有する化合物：
【００６５】
【化２】
2012512170.tif 000004
【００６６】
式中、Ｒ１は、任意に置換したアリール基、任意に置換したヘテロアリール基、任意に置換したサイクロアルキル基または任意に置換したヘテロ環から選択され； 
Ｒ２は水素、低級アルコキシ基、低級アルキル基、ハロゲンまたは水酸基から選択され； 
ＺはＯ、Ｓ、ＮＨ、アルキレン基または単結合から選択され；
Ｘはハロゲン、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ヘテロ原子低アルキル基、水酸基、またはメチレンジオキシ基から独立して選択されし、２つの置換基は共に結合したサイクロアルキル基またはヘテロ環の環状構造を形成することができ； 
ｍは０〜５である；または 
薬学的に受け入れられる塩、その溶媒和物または水和物の一つ以上のから選択することができる。
【００６７】
一の実施形態において、一つ以上の化合物は以下の化合物：
【００６８】
【化３】
2012512170.tif 000005
【００６９】
または薬学的に受け入れられる塩、その溶媒和物、水和物から選択することができる。
【００７０】
Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．の、国際公開第２００９／１２９４０８号および国際公開第２００８／０７３４４１号に記載されるように、Ｒｏｂｏ４の活性はＲｏｂｏ４の間で相互作用と、アダプタータンパク質、パキシリンおよびそのパラログを生じ、ＡＲＦ−ＧＡＰｓ、例えばＧＩＴ１を、ＡＲＦ６の局所不活性化へと導くように補充すると考えられる。それはさらにＪｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．の、国際公開第２００９／１２９４０８号および国際公開第２００８／０７３４４１号に記載され、ＡＦＲ−ＧＡＰｓおよびＡＲＦ−ＧＥＦｓの調節はＲｏｂｏ４シグナルなく達成することができる。特定の理論に束縛されずに、本明細書に記載の小分子活性薬剤は、少なくとも部分的には、Ｒｏｂｏ４シグナルの利点を達成することによって、例えば本明細書に記載したもの、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．の、国際公開第２００９／１２９４０８号および国際公開第２００８／０７３４４１号において、Ｒｏｂｏ４リガンドまたは直接的なＲｏｂｏ４の活性を要求することなく機能することができると現在考えられている。
【００７１】
本明細書に記載の活性薬剤を含有する組成物もまた提供する。この様な組成物は、本明細書に記載の一つ以上の活性薬剤を含有することができる。一の実施形態において、組成物を製剤処方として調製した。例えば、本明細書に記載の一つ以上の活性薬剤に加えて、製剤処方は薬学的に受け入れられるキャリアおよび／または一つ以上の薬学的に受け入れられる賦形剤を含有し、治療のための投与に適した処方を提供する。本明細書において使用したように、薬学的に受け入れられるとは、生物学的または他の所望でない材料であり、例えば材料は対象に所望の活性薬剤（例えば、本明細書に記載の所望の活性薬剤）で投与が適切であり、含まれる製剤処方の他の成分と相性が良い材料とする。キャリアおよびいずれかの賦形剤とは、活性薬剤の分解または対象への副作用のいずれかを最小にするように自然に選択される。
【００７２】
本記載に従った製剤処方を、投与のためのいずれか適した形態、例示の目的として、錠剤の組成物、カプセル化用の粉末の組成物、直接的な摂取用の溶液の組成物、カプセル化または非経口投与、エマルジョン、ゲル、クリーム、坐薬または懸濁液、例えば微小粒子、マトリックス剤、もしくはリポソームの中に組み込まれたまたは組み込む処方として調整することができる。本明細書に記載の製剤処方は、特定の細胞種に、抗体、受容体、または受容体リガンドによって標的とされる成分を含有することができる。薬学的なキャリア、賦形剤およびそれらの処方を、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．  Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ  １９９５を含む文献に詳細に記載されている。
【００７３】
適切な場合には、薬学的に受け入れられる塩または他の張力の変性剤を製剤処方で使用して、等張の状態にすることができる。液体の薬学的に受け入れられるキャリアの例は、生理食塩水、リンガー溶液およびブドウ糖を含むが、これに限定しない。製剤処方を溶液または懸濁液、特定の非経口投与として提供するとき、処方のｐＨを対象および／もしくは活性薬剤、または他の処方の成分の維持を促進するように所望に調整することができる。製剤処方の調整に適したキャリアおよび賦形剤は、例えば良く知られた種の薬学的に受け入れられるポリマー、サッカライド、塩、脂質、リン脂質、界面活性剤、ゲル、ポリペプチド、およびアミノ酸を含有する。本記載に従った製剤処方は、徐放性の調整剤を含むことができる。特定のキャリアおよび／または賦形剤は、例えば投与経路および投与される組成物の濃度に依存して好ましいことが当業者には明白であろう。本明細書に記載の製剤処方は、増粘剤、香味料、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、抗菌剤、抗炎症薬剤、麻酔剤、表面活性薬剤等の一つ以上を含むことができる。 
【００７４】
活性薬剤および組成物を、薬学的に受け入れられる酸または塩基における付加塩として投与することができる。その場合、所望の塩は無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸、および有機酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸との反応、または無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、および有機塩基、例えばモノ、ジ、トリ−アルキルおよびアリールアミンおよび置換したエタノールアミンとの反応によって形成することができる。 
【００７５】
製剤処方を含む本明細書に開示の組成物は、局所または全身の療法が望ましい、いずれかおよび治療される領域に依存して、数々の手段によって投与することができる。組成物の非経口投与を、使用する場合には、一般的に注射として特徴付けられる。注入物質を従来の形態、液体溶液または懸濁液のいずれか、注射前に液体中に溶解または懸濁した適切な固体の形態、すなわちエマルジョンとして調製することができる。非経口投与での改善した方法は、徐放または持続放出系の使用を、一定の投与量を維持するように含む（例えば、米国特許第３，６１０，７９５号明細書参照、本明細書の参照として取り込むものとする）。
【００７６】
治療効果を達成するために必要な所定の組成物の正確な量は、対象から対象、年齢、重量および対象の一般的な状態、治療される病態の重症度、使用される特定の活性薬剤、その投与の形態等に依存して変化するだろう。組成物の投与する投与量の範囲は、治療効果を生み出すのに十分に大きいものである。投与量を調整して、好ましくない副作用、例えば望まれていない交差反応、アナフィラキシー反応等の発生を避けるかまたは減少することができる。投与量は、年齢、状態、性別、および患者の疾患範囲、投与経路、または他の薬物を投薬計画に含むかどうかによって変化することができる。投与量は個々の医師によっていずれかの逆の適応の事象において調整することができる。投与量を変化することができ、一または数日間、一日一回以上の投与で投与することができる。誘導は所定の種類の医薬品で適切な投薬量の文献において見出すことができる。
【００７７】
III．  方法
血管内皮バリア機能を促進する方法を明細書に提供する。一の実施形態において、血管内皮バリア機能を促進する方法は、一以上の血管内皮細胞を本明細書に記載の活性薬剤と治療する工程を含む。一のそのような実施形態において、一以上の血管内皮細胞を治療する工程は、それを必要とする患者に、本明細書に記載のような活性薬剤の治療上効果的な量を投与することによって実施することができる。所望の場合、活性薬剤を本明細書に記載のような組成物を使用して投与することができる。特定の実施形態において、一つ以上の血管内皮細胞と活性薬剤の治療は次の一つ以上を生じる：血管内皮バリア機能の維持；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在下における内皮バリア機能の促進；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在下における血管漏出の阻害；ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を血管内皮細胞の表面で促進；およびｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を血管内皮細胞の表面で促進。一のこのような実施形態において、一つ以上の血管内皮細胞と活性薬剤の治療は、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を血管内皮細胞の表面で向上させ、ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を血管内皮細胞の表面で促進する。他のこのような実施形態において、一つ以上の血管内皮細胞と活性薬剤との治療は、少なくとも部分的には、血管内皮細胞を、一つ以上の炎症メディエーターを曝した後に回復し、ここで一つ以上の炎症メディエーターはエンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含むものから選択される。活性薬剤を本明細書に記載の活性薬剤から選択することができ、活性薬剤の投与は本明細書に記載の組成物を使用して活性薬剤を投与することによって達成することができる。
【００７８】
本明細書に記載の血管内皮バリア機能を促進する方法は、肺の血管内皮、腎臓の血管内皮および脾臓の血管内皮の一つから選択される内皮組織を含有する様々な種々の内皮組織でバリア機能を促進して利用することができる。従って、特定の実施形態において、一つ以上の内皮細胞と本明細書に記載の活性薬剤との治療は、肺の血管内皮細胞、腎臓の血管内皮細胞、脾臓の血管内皮細胞から選択される血管内皮細胞の治療を含むことができる。
【００７９】
他の実施形態において、本発明の方法は、急性肺血管浮腫、慢性肺血管浮腫、急性肺血管炎症、慢性肺血管炎小、急性肺血管炎症、特発の肺線維症を含有する肺線維症、細菌性敗血症、またはインフルエンザ感染、例えばトリインフルエンザ感染の危険性があるか、または患っている患者の治療を含有する。従って、特定の実施形態において、本発明の方法は、急性肺血管浮腫、慢性肺血管浮腫、急性肺血管炎症、慢性肺血管炎症、特発の肺線維症を含有する肺線維症、細菌性敗血症、またはインフルエンザ感染、例えばトリインフルエンザ感染の危険性があるか、または患っている患者の同定する工程、および本明細書に記載の治療に効果的な量の活性薬剤を患者に投与する工程を含む。所望の場合、活性薬剤を本明細書に記載の組成物を使用して投与することができる。特定の実施形態において、活性薬剤の投与は次の一つ以上を生じる：エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在下における、内皮バリア機能の促進；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在下における、血管漏出の阻害；ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在の血管内皮細胞の表面で促進；およびｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を血管内皮細胞の表面で促進。
【００８０】
他の実施形態において、本発明の方法は、患者における血管内皮バリア機能を回復する工程を含み、患者は、急性肺血管浮腫、慢性肺血管浮腫、急性肺血管炎症、慢性肺血管炎症、特発の肺線維症を含有する肺線維症、細菌性敗血症、またはインフルエンザ感染、例えばトリインフルエンザ感染から選択される病態を患っている。さらに、病態または環境条件を、一つ以上の炎症メディエーター、例えばエンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１β等の一つ以上の存在または発現とさらに関連させることができる。本明細書に記載の血管バリア機能の回復する方法において、本明細書に記載の活性薬剤の治療に効果的な量を患者に投与する。所望の場合、活性薬剤を、本明細書に記載の組成物を使用して投与することができる。特定の実施形態において、活性薬剤の投与は次の一つ以上を生じる：エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在下における、内皮バリア機能の促進；エンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）、およびＩＬ−１βの一つ以上を含有する一つ以上の炎症メディエーターの存在下における、血管漏出の阻害；ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在の血管内皮細胞の表面で促進；およびｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を血管内皮細胞の表面で促進。
【００８１】
またさらなる実施形態において、本発明の方法は、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を血管内皮細胞の表面で促進する方法を含む。特定の実施形態において、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を血管内皮細胞の表面で促進する方法は、一つ以上の血管内皮細胞を本明細書に記載の活性薬剤で治療する工程を含む。一つのそのような実施形態において、一以上の血管内皮細胞の治療する工程は、それを必要とする患者に、本明細書に記載の活性薬剤の治療上効果的な量を投与することによって実施することができる。所望の場合、活性薬剤を、本明細書に記載の組成物を使用して投与することができる。特定の実施形態において、一つ以上の血管内皮細胞を活性薬剤での治療は、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を血管内皮細胞の表面で促進、ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を血管内皮細胞の表面で促進の一つまたは両方を生じる。一のこのような実施形態において、一つ以上の血管内皮細胞を活性薬剤での処理は、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を血管内皮細胞の表面で向上させ、ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を血管内皮細胞の表面で促進する。
【００８２】
血管内皮バリア機能を促進する薬剤のスクリーニングまたは評価の方法をまた、本明細書で提供する。例えば、特定の実施形態において、本記載に従った活性薬剤のスクリーニング法は、本明細書に記載の体外実験および体内モデルを使用して実行することができる。本明細書に記載の活性薬剤のスクリーニング方法の特定の実施形態において、この方法は、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの存在を血管内皮細胞の表面で、本明細書に提供した実験手法を利用して促進する活性薬剤の能力を評価する工程を含むことができる。本明細書に記載の活性薬剤のスクリーニング方法の他の実施形態において、この方法は、本明細書で提供する実験手法を利用して、ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を血管内皮細胞の表面で促進する活性薬剤の性質を含むことができる。またさらなる実施形態において、本明細書に記載の活性薬剤のスクリーニングの方法は、内皮バリア機能を本明細書に提供する実験手法を利用して維持する活性薬剤の性質を評価する工程を含むことができる。またさらなる実施形態において、活性薬剤のスクリーニングの方法は、本明細書に記載のように、ブレオマイシン誘導される線維症の動物モデルで肺線維症の形成を阻害する活性薬剤の能力を評価する工程を含むことができる。
【００８３】
特定の実施形態において、薬剤を同定する方法は、標的のＡＲＦ−ＧＥＦ、例えばサイトヘシン、ＡＲＮＯ系のサイトヘシンから選択されるサイトヘシン、またはＡＲＮＯの活性または有用性を、一つ以上のＡＲＦ、例えばＡＲＦ６およびＡＲＦ１の活性または有用性の阻害を生じる方法で阻害し、例えばＨａｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に記載のアプタマー置換検出を含む（Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂｏｕｎｄ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｓｃｒｅｅｎｅｄ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  （２００８），３，  ５７９−５８７）。特に、この様な方法を使用して、小分子、例えば本明細書に記載のものの活性化を同定および確認することができる。アプタマーとその標的の関連を、蛍光偏光によって検出した。蛍光標識したアプタマーは、低偏光を非結合状態において示す。標的タンパク質に結合したとき、蛍光標識アプタマーの蛍光偏光を上昇させる。小分子がタンパク質からアプタマーを置換する場合、蛍光標識されたアプタマーの蛍光偏光は減少し、その結果、蛍光標識アプタマーに活性類似を示す小分子候補の確認を可能にする。
【実施例１】
【００８４】
IV.実施例
以下に提示する実施例は、例示の目的のみであり、本明細書に記載のいずれかの手段による組成物および方法の範囲を制限する目的ではない。それは、開示の組成物および方法を本明細書に記載の、特定の手段、手法、および薬剤に限定しないことを理解すべきである。それぞれの場合、他に特定しない限り、通常の材料および方法は、提供された実施例で記載される作業を実施することによって使用することができる。本明細書において参考文献として参照した全ての特許および文献は、それらの全てを本明細書に引用したものとする。
【００８５】
本発明の実施は、他に示さない限り、従来の化学、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、遺伝子学、免疫学、細胞生物学、細胞培養および遺伝子組み換えの生物学を使用して、従来技術の範囲内とする。（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．  Ｙ．）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  （Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ）；  Ｇｌｏｖｅｒ，  Ｄ．  （１９８５）  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ  （Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ）；  Ａｎａｎｄ，  Ｒ．  （１９９２）  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；  Ｇｕｔｈｒｉｅ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，  Ｇ．  Ｒ．  （１９９１）  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （１９８８）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）；  Ｊａｋｏｂｙ，  Ｗ．  Ｂ．  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，  Ｉ．  Ｈ．  （ｅｄｓ．）  （１９７９）  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ５８  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ  （ＮＹ）；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  （Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．  １９８４）；  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  （Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．  １９８４）；  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  （Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８７）；  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８６）；  Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （１９８４）；  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎ．  Ｙ．）；  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  （Ｊ．  Ｈ．  Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｐ．  Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，  １９８７，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ＶｏＩｓ．  １５４  ａｎｄ  １５５  （Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．）；  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９８７）；  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ  （Ｄ．  Ｍ．  Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，  ｅｄｓ．，  １９８６）；  Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ）  （１９９４）  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．を参照）。ヒト染色体１のマッピングを含むヒト遺伝子マッピングのための技術および材料における一般的な考察は、例えばＷｈｉｔｅ  ａｎｄ  Ｌａｌｏｕｅｌ  （１９８８）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２２：２５９  ２７９で提供される。本発明の実施は、他に示されない限り、化学、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、遺伝学および免疫学の従来技術を使用する（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２；  Ｇｌｏｖｅｒ，  １９８５；  Ａｎａｎｄ，  １９９２；  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，  １９９１参考）。本明細書に記載のないものは、本明細書で教示した課題が、従来の発明によってこの様な開示を先行する権利がない容認として構成するものとする。いかなる参考文献が従来の発明を構成することを全く容認しない。 
【００８６】
Ｓｌｉｔ−Ｒｏｂｏ４シグナルは複数の炎症メディエーターによって誘導される内皮過透過性を減少させる
Ｓｌｉｔ−Ｒｏｂｏ４シグナルは、エンドトキシン（リポ糖類、ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、およびインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、全ての重要な炎症メディエーターによって誘導される内皮過透過性を減少させる（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，  Ｃ．Ａ．  １９９７．  Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｓ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｐｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ．  Ｃｈｅｓｔ  １１２：３２１Ｓ−３２９Ｓ）。体外におけるバリア機能を研究するために、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の受容体の拡散するバリアとして作用するヒト内皮細胞単層の能力を評価した。Ｎ末端断片（Ｓｌｉｔ２Ｎ）を利用して、それはタンパク質分解的切断によって放出されるＳｌｉｔの活性断片である（Ｃｈｅｄｏｔａｌ，  Ａ．  ２００７．  Ｓｌｉｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ６２１：６５−８０）。図１ａに示すように、Ｓｌｉｔ２Ｎは著しくＬＰＳ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１βに誘導される透過率を減少させた。さらに、Ｓｌｉｔ２Ｎの阻害効果を、Ｒｏｂｏ４に対して向けられるｓｉＲＮＡに曝された細胞で欠損させた（図１Ｂ；図１４Ａ）。 
【実施例２】
【００８７】
Ｓｌｉｔ２−Ｒｏｂｏ４は細胞−細胞間相互作用に原因がある機構を直接向上することによって血管安定性を促進させる
Ｓｌｉｔ２−Ｒｏｂｏ４経路は、細胞細胞間相互作用に原因がある機構を直接向上することによって、血管安定性を促進させる。内皮において、重要な安定性のある相互作用は、接着結合タンパク質、血管内皮ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）によって媒介される（Ｄｅｊａｎａ，  Ｅ．，  Ｆ．  Ｏｒｓｅｎｉｇｏ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｇ．  Ｌａｍｐｕｇｎａｎｉ．  ２００８．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｄ  ｏｆ  ａｄｈｅｒｅｎｓ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １２１：２１１５−２１２２；およびＶｅｓｔｗｅｂｅｒ，  Ｄ．  ２００８．  ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ：ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２８：２２３−２３２）。ヒト微小血管肺内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−ｌｕｎｇ）とＳｌｉｔ２Ｎで処理することは、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎレベルを細胞表面接着で著しく上昇させることを見出した（図１Ｃ，Ｆ；図１４Ｂ）。ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの表面での発現は、ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎとＶｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎの関連性、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの内在化を細胞表面から阻害、血管安定性を促進する既知の関連性によって調整される（Ｐｏｔｔｅｒ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｓ．  Ｂａｒｂｅｒｏ，  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．  Ｃｈｅｒｅｓｈ．  ２００５．  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｐ１２０−  ａｎｄ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔａｉｎｓ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔａｔｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０：３１９０６−３１９１２；およびＸｉａｏ，  Ｋ．，  Ｊ．  Ｇａｒｎｅｒ，  Ｋ．Ｍ．  Ｂｕｃｋｌｅｙ，  Ｐ．Ａ．  Ｖｉｎｃｅｎｔ，  Ｖｉｎｃｅｎｔ，  Ｃ．Ｍ．  Ｃｈｉａｓｓｏｎ，  Ｅ．  Ｄｅｊａｎａ，  Ｖ．  Ｆａｕｎｄｅｚ，  ａｎｄ  Ａ．Ｐ．  Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ．  ２００５．  ｐ１２０−Ｃａｔｅｎｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １６：５１４１−５１５１）。Ｓｌｉｔ２Ｎはまた細胞表面におけるｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの発現を上昇させるが（図１Ｄ）、他の接続またはカテニン系のメンバーで効果が全く観測されなかった（図１Ｅ、データ不掲載）。 
【実施例３】
【００８８】
Ｓｌｉｔ２はＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎをＩＬ−１βに曝した後の細胞表面で向上させる   ＩＬ−１βは、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎレベルを細胞表面で減少し、Ｓｌｉｔ２Ｎはこの効果を無効にした（図２Ａ）。ＩＬ−１β刺激は、ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎを細胞表面において減少し、Ｓｌｉｔ２Ｎはこの効果を逆転した（図２Ａ）。ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎからＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎのＩＬ−１βした分離、およびＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの内在化（図２Ｂ、Ｃ）。Ｓｌｉｔ２Ｎは、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎおよびｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎの関連性を回復させ、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの内在化を阻害した（図２Ｂ、Ｃ）。ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの局在でＳｌｉｔ２Ｎの効果はその能力が血管安定性を向上させるために必要であるかどうかを調査するために、抗ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体がＳｌｉｔ２Ｎの効果を体外における透過性で阻害できるかを観測した。Ｓｌｉｔ２ＮはＩＬ−１β誘導の透過率を体外において非特異的ＩｇＧの存在下で阻害した；しかしながら、Ｓｌｉｔ２Ｎの効果は抗ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体の存在下において欠損していた（図２Ｄ）。共に、これらのデータは、Ｓｌｉｔがｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎとＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの関連性を、ＩＬ−１β刺激にかかわらず維持することを示し、この結果、血管壁統合性を、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎエンドサイトーシスを誘導したサイトカインを減少することによって促進したことを論証する。
【実施例４】
【００８９】
Ｓｌｉｔ２は血管透過率を生体内において高サイトカイン血症の条件下において減少する 
Ｓｌｉｔが血管透過率を生体内において、高サイトカイン血症を生じる状態下で減少することを示すために、肺炎症の細菌エンドトキシンモデルを使用した。このモデルにおいて、リポ糖類（ＬＰＳ）をマウスの肺に気道内注入によって投与し、グラム陰性の感染を刺激した（Ｍａｔｕｔｅ−Ｂｅｌｌｏ，  Ｇ．，  Ｃ．Ｗ．  Ｆｒｅｖｅｒｔ，  ａｎｄ  Ｔ．Ｒ．  Ｍａｒｔｉｎ．  ２００８．  Ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９５：Ｌ３７９−３９９）。肺におけるＬＰＳ点滴は、急性炎症のモデルである。ＬＰＳの投与は、広範囲の炎症反応およびサイトカインの放出を引き起こし、肺胞毛細血管透過率を著しく上昇させる。
【００９０】
エバンスブルーアルブミン（ＥＢＡ）をトレーサーとして使用して、Ｓｌｉｔ２Ｎが血管漏出をＬＰＳ処理したＲｏｂｏ４＋／＋マウスの肺において著しく減少することを見出した（図３Ａ）。Ｓｌｉｔ２Ｎの効果はＲｏｂ４−ｎｕｌｌ（Ｒｏｂｏ４ＡＰ／ＡＰ）マウスにおいて欠損していて、Ｒｏｂｏ４がＳｌｉｔ２Ｎの効果を生体内において必須であることを示した。この結果はまた前記活性が内皮特異的であることを、Ｒｏｂｏ４が内皮のみで検出されたことから示した（Ｈｕｍｉｎｉｅｃｋｉ，  Ｌ．，  Ｍ．  Ｇｏｒｎ，  Ｓ．  Ｓｕｃｈｔｉｎｇ，  Ｒ．  Ｐｏｕｌｓｏｍ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｂｉｃｋｎｅｌｌ．  ２００２．  Ｍａｇｉｃ  ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ  ｉｓ  ａ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｔ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７９：５４７−５５２；  ａｎｄ  Ｐａｒｋ，  Ｋ．Ｗ．，  Ｃ．Ｍ．  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｌ．Ｋ．  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，  Ｃ．Ａ．  Ｊｏｎｅｓ，  Ｙ．  Ｒａｏ，  Ｃ．Ｂ．  Ｃｈｉｅｎ，  Ｊ．Ｙ．  Ｗｕ，  Ｌ．Ｄ．  Ｕｒｎｅｓｓ，  ａｎｄ  Ｄ．Ｙ．  Ｌｉ．  ２００３．  Ｒｏｂｏ４  ｉｓ  ａ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２６１：２５１−２６７）。肺でのＬＰＳ点滴はまた、タンパク質浸出液および白血球の蓄積を肺胞腔内の、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）によって定量化することができる炎症反応を誘導する（Ｍａｔｕｔｅ−Ｂｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。Ｓｌｉｔ２Ｎは、タンパク質浸出液、急性肺外傷の重要なマーカーおよび血管バリアの崩壊の指標（Ｗａｒｅ，  Ｌ．Ｂ．，  ａｎｄ  Ｍ．Ａ．  Ｍａｔｔｈａｙ．  ２０００．  Ｔｈｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４２：１３３４−１３４９）、ならびに炎症細胞の蓄積を、Ｒｏｂｏ４＋／＋マウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）において、容量依存方法で減少した（図３Ｂ−Ｄ；図１４Ｃ、Ｄ）。ＢＡＬＦにおけるタンパク質および白血球の蓄積の阻害は、Ｒｏｂｏ４ＡＰ／ＡＰマウスにおいて欠損していて、またＳｌｉｔ２Ｎが脈管構造に直接作用して、タンパク質浸出液および炎症細胞蓄積を肺胞に減少することを示した（図３Ｂ−Ｄ）。最後に、肺の組織学的検査ではＳｌｉｔ２ＮがＬＰＳ誘導の肺炎症をＲｏｂｏ４ＡＰ／ＡＰマウス以外のＲｏｂｏ４＋／＋マウスにおいて減少することによってＲｏｂｏ４依存的方法で作用することを確認した（図３Ｅ；図１５）。Ｒｏｂｏ４ＡＰ／ＡＰの肺脈管構造は正常に発現し（図１９および２０）、Ｒｏｂｏ４ＡＰ／ＡＰマウスでのＳｌｉｔ２の効果の欠損は脈管構造における構造の違いによるものでないことを示した。 
【００９１】
好中球が細菌性肺炎およびＬＰＳチャレンジモデルにおいて主な細胞種であることから（Ｍａｔｕｔｅ−Ｂｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）、Ｓｌｉｔ２Ｎが好中球遊走に直接の効果があるかを求めた。それはＳｌｉｔ２が好中球遊走に深い効果があることを以前報告した（Ｗｕ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｒｅｐｅｌｌｅｎｔ  Ｓｌｉｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１０，  ９４８−９５２（２００１））。しかしながら、これらの実験を、ＤＭＳＯ処理したＨＬ−６０好中球等の細胞を用いて実施した。ＤＭＳＯ処理したＨＬ−６０好中球類似細胞でＳｌｉｔ２の同様の効果を観測したが、主にヒトＰＭＮはＳｌｉｔ２Ｎに反応せず、それらがＲｏｂｏ受容体を発現しない事実と一致することを見出した（図１６Ａ、Ｂ）。
【００９２】
初期の研究において、急性炎症のＬＰＳモデルにおけるＲｏｂｏ４ＡＰ／ＡＰマウスをＲｏｂｏ４＋／＋マウスと比較しても向上した感度は検出されなかった（図３Ｂ−Ｄ）。しかしながら、定量ＰＣＲを用いて、Ｒｏｂｏ４発現が肺の中でＬＰＳ点滴から６時間後に著しく増加したことを見出した（図１１）。この結果はＲｏｂｏ４がＬＰＳ誘導の炎症を肺の中で阻害または解消することに重要であるおそれがあるあることを示唆した。投与したＬＰＳの濃度が高すぎる場合には、それはこの様な重大な損傷が二つの遺伝子型の間のいずれかの違いを遮蔽することを生じた。従って、マウスを厳密に調べるために使用されるＬＰＳの投与量を減少して、Ｒｏｂｏ４ＡＰ／ＡＰマウスは同腹子のＲｏｂｏ４＋／＋マウスと比較して、ＢＡＬＦ浸出液で著しく高いタンパク質濃度を有することを見出した（図３Ｆ）。この上昇した感度は、内因性Ｓｌｉｔ−Ｒｏｂｏ４シグナルの役割を、サイトカインの血管作用の減少で示した。このモデルと一致していて、Ｓｌｉｔ２タンパク質を肺を通しておよび内皮に近い付近で発現した（図１７）。 
【実施例５】
【００９３】
ＳｌｉｔはＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎに依存した機構によって生体内でシグナルを出す 
ＳｌｉｔがＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎに依存する機構で生体内においてシグナルを出すことを確認するために、同種親和性の相互作用をＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎを発現した隣接の内皮細胞間において防止する特異性のある抗体と、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎを阻害した。Ｓｌｉｔ２Ｎは、タンパク質浸出液および炎症細胞浸潤をコントロールＩｇＧ抗体の存在下において減少するが、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ阻害抗体の存在下では減少しなかった（図３Ｇ−Ｉ）。従って、細胞培養実験の結果と同様に、生体内データはＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの発現を細胞表面で促進し、サイトカイン媒介した内皮過透過性を鈍らせるＳｌｉｔ−Ｒｏｂｏ４のモデルを立証した。
【実施例６】
【００９４】
様々なＳｌｉｔタンパク質がＲｏｂｏ４の活性に作用する
図７は、Ｓｌｉｔ２タンパク質の様々な構造を示す。既に本明細書に記載したように、１５０ｋＤａタンパク質のＳｌｉｔ２Ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）が、Ｍｉｌｅｓアッセイ、網膜の透過性のモデル、管形成および内皮細胞遊走を含む体外および生体内のモデル、ならびに眼疾患のＯＩＲおよびＣＮＶで有効的であることを見出した。図７Ａにおいて、Ｓｌｉｔタンパク質の異なった構造を示す。４つのロイシンに富んだドメイン（ＬＲＰ）、上皮成長因子領域（ＥＧＦ）およびＣ末端タグ（ＭＹＣ／ＨＩＳ）を示す。異なったＳｌｉｔ構造（２ｎＭ）によるＶＥＧＦ媒介の内皮細胞遊走の阻害を図７Ｂに示す。
【実施例７】
【００９５】
Ｒｏｂｏ４ノックアウトマウス
本明細書に詳細に示した実験実施例において使用したＲｏｂｏ４ノックアウトマウスを、通常の技術を使用して作り出した。ノックアウトマウスを作り出すために、Ｒｏｂｏ４を発現する遺伝子上のエキソン１から５までを、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）レポーター遺伝子と相同的組み換えを使用して置換した。この対立遺伝子Ｒｏｂｏ４ＡＰはＲｏｂｏ４細胞外ドメインの免疫グロブリン（ＩｇＧ）リピートをコードするエキソンを欠損していて、Ｓｌｉｔタンパク質と相互作用を必要とされることを予測した。Ｒｏｂｏ４＋／ＡＰ動物を交雑して、同型の標的対立遺伝子のマウスを生み出した。マウスの遺伝子構造の図を図１２に提供する。Ｒｏｂｏ４ＡＰ／ＡＰ動物は生存能力および繁殖力があり、血管系の正常なパターンを示した。これらのデータは、Ｒｏｂｏ４が発育中のマウスにおいて血管新生を成長させるために必要でないことを示し、哺乳類内皮においてＲｏｂｏ４シグナルのための代替機能であることを指摘する。アルカリフォスファターゼ活性を、これらの動物で全ての血管床の内皮にわたって発生中の胚および成長したマウスにおいて検出し、Ｒｏｂｏ４ＡＰ対立遺伝子がＲｏｂｏ４発現の確かなマーカーであることを確認した。
【実施例８】
【００９６】
Ｓｌｉｔ２は血管透過率および肺線維症の発症を生体内において減少した
Ｓｌｉｔ２Ｎは血管透過率を生体内の慢性炎症の設定において減少する（Ｍａｔｕｔｅ−Ｂｅｌｌｏ，  Ｇ．，  Ｆｒｅｖｅｒｔ，  Ｃ．，  ＆ Ｍａｒｔｉｎ，  Ｔ．  Ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９５，  ３７９−３９９  （２００８）；  Ｇａｓｓｅ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＩＬ−１Ｒ１／ＭｙＤ８８  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１７，  ３７８６−３７９９  （２００７）；Ｒｕｓｓｏ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＸＣＲ２  ｉｎ  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  （２００８））。ブレオマイシンは長期に、慢性の透過性を肺で引き起こす化学物質である（Ｔａｇｅｒ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＬＰＡ１  ｌｉｎｋｓ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｏ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ｂｙ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｌｅａｋ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １４，  ４５−５４（２００８））。慢性の透過率および炎症に加えて、ブレオマイシンは肺線維症の原因となる。Ｒｏｂｏ４＋／＋マウスにおいて、Ｓｌｉｔ２Ｎはブレオマイシン誘導のＥＢＡ蓄積を、ブレオマイシン投与から１１日後に肺で著しく減少した（図１３ａ）。Ｓｌｉｔ２Ｎの効果はＲｏｂｏ４ＡＰ／ＡＰマウスにおいて欠損している（図１３ａ）。Ｓｌｉｔ２Ｎはまた、ブレオマイシン誘導の肺線維症を著しく減少した（図１３ｂ）。この効果は、Ｒｏｂｏ４ＡＰ／ＡＰマウスにおいて欠損していて、Ｓｌｉｔ２Ｎが内皮に直接的に作用して肺線維症を減少することを示す（図１３ｂ）。コラーゲン沈着の可視化を向上するトリクロム染色を使用した肺の組織学的検査は、Ｓｌｉｔ２Ｎの効果を、Ｒｏｂｏ４依存的方法で確認した（図１３ｃ）。これらの結果は、血管安定性の値を減少した肺線維症において強調し、内皮が線維症の病態において役割を果たすことを際立たせる。
【実施例９】
【００９７】
ＳｅｃｉｎＨ３はブレオマイシンの誘導の線維症を生体内において阻害する
肺線維症を阻害するＳｅｃｉｎＨ３の能力を、ブレオマイシン誘導の線維症の動物モデルにおいて、実施例８に記載したように評価した。簡潔には、６−８週齢のマウスを麻酔し、ブレオマイシン（４０μＬ食塩水に０．０５Ｕ）を経鼻投与点滴によって与えた。コントロールマウスは、４０μＬ生理的食塩水の経鼻投与点滴を受けた。マウスは腹腔内注射による３０μＭのＳｅｃｉｎＨ３または賦形剤を一日二回与えられた。１１日目に、マウスをＣＯ２窒息によって屠殺し、肺を除去し、０．５Ｍ酢酸とプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）の中で均質化にした。肺コラーゲン含有量をＳｉｒｃｏｌコラーゲン分析を使用して評価した。均質化を一晩４℃で撹拌しながらインキュベートした。その後サンプルを遠心し、Ｓｉｒｃｏｌ染色剤１ｍＬを３０分間、上清１００μＬに加えた。サンプルを再び遠心し、沈殿物を１ｍＬアルカリ試薬と再懸濁し、分光光度計（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ）によって分析した。これらのサンプルを製造業者によって提供されたコラーゲン検量線に対して比較した。データを少なくとも７匹のマウス毎１状態のｓ．ｅ．ｍ．として示す。
【実施例１０】
【００９８】
Ｓｌｉｔは血管安定性を多微生物性敗血症において向上させる 
Ｓｌｉｔ２Ｎは組織的な血管安定性の状態において死亡率を減少させ、Ｓｌｉｔ２Ｎの効果は肺に限定されない。盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）として知られている多微生物性敗血症のモデル（Ｈｕｂｂａｒｄ，  Ｗ．Ｊ．，  Ｍ．  Ｃｈｏｕｄｈｒｙ，  Ｍ．Ｇ．  Ｓｃｈｗａｃｈａ，  Ｊ．Ｄ．  Ｋｅｒｂｙ，  Ｌ．Ｗ．  Ｒｕｅ，  ３ｒｄ，  Ｋ．Ｉ．  Ｂｌａｎｄ，  ａｎｄ  Ｉ．Ｈ．  Ｃｈａｕｄｒｙ．  ２００５．  Ｃｅｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｎｃｔｕｒｅ．  Ｓｈｏｃｋ  ２４  Ｓｕｐｐｌ  １：５２−５７）。Ｓｌｉｔ２Ｎは、腎臓および脾臓において血管透過率を著しく減少させ（図４Ａ、Ｂ）、ＣＬＰ誘導の敗血症に曝したマウスの生存率を、３３％から約８０％にまで改善した（図４Ｃ）。これら実験の条件下において、ＣＬＰは著しい損傷を肺に引き起こさず、Ｓｌｉｔ２Ｎの効果が肺に限定されないさらなる立証を提供した（図１８Ａ−Ｃ）。高炎症性反応は敗血症の病態に寄与するため、Ｓｌｉｔ２Ｎがサイトカインおよびケモカインの濃度を敗血性マウスのプラズマで影響を与えるかどうかを試験した（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，  Ｃ．Ａ．  １９９７．  Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｓ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｐｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ．  Ｃｈｅｓｔ  １１２：３２１Ｓ−３２９Ｓ）。Ｓｌｉｔ２Ｎはサイトカインおよびケモカインのパネルの発現を変えず、Ｓｌｉｔ２Ｎの治療効果が炎症性のサイトカインおよびケモカインの濃度における減少が二次的でないことを示した（図４Ｄ、Ｅ）。最後に、Ｓｌｉｔ２Ｎの効果はＲｏｂｏ４ＡＰ／ＡＰマウスにおいて欠損していて（図４Ｆ）、Ｒｏｂｏ４がＳｌｉｔ２Ｎの活性化に必須であることを示した。これらをもとに、これらのデータは、Ｓｌｉｔが敗血症に誘発される組織的な炎症反応において血管安定性を特異的に向上させることによって生存率を向上させることを示した。
【実施例１１】
【００９９】
Ｓｌｉｔはウイルス感染を生じる血管安定性を向上させる 
Ｓｌｉｔの効果をＨ５Ｎ１インフルエンザのモデルにおいて観測した。汎発性インフルエンザ、例えばトリインフルエンザ（Ｈ５Ｎ１）は、サイトカインの濃度および過度な炎症において広範囲の増加により特徴付けられることが多い直接的な感染による肺外傷の一例である（ｄｅ  Ｊｏｎｇ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｃ．Ｐ．  Ｓｉｍｍｏｎｓ，  Ｔ．Ｔ．  Ｔ半ｈ、Ｖ．Ｍ．  Ｈｉｅｎ，  Ｇ．Ｊ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｔ．Ｎ．  Ｃｈａｕ，  Ｄ．Ｍ．  Ｈｏａｎｇ，  Ｎ．Ｖ．  Ｃｈａｕ，  Ｔ．Ｈ．  Ｋｈａｎｈ，  Ｖ．Ｃ．  Ｄｏｎｇ，  Ｐ．Ｔ．  Ｑｕｉ，  Ｂ．Ｖ．  Ｃａｍ，  Ｑ．  Ｈａ  ｄｏ，  Ｙ．  Ｇｕａｎ，  Ｊ．Ｓ．  Ｐｅｉｒｉｓ，  Ｎ．Ｔ．  Ｃｈｉｎｈ，  Ｔ．Ｔ．  Ｈｉｅｎ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｆａｒｒａｒ．  ２００６．  Ｆａｔａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  （Ｈ５Ｎ１）  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｖｉｒａｌ  ｌｏａｄ  ａｎｄ  ｈｙｐｅｒｃｙｔｏｋｉｎｅｍａ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２：１２０３−１２０７；  Ｋｏｂａｓａ，  Ｄ．，  Ｓ．Ｍ．，  Ｊｏｎｅｓ，  Ｋ．  Ｓｈｉｎｙａ，  Ｊ．Ｃ．  Ｋａｓｈ，  Ｊ．  Ｃｏｐｐｓ，  Ｈ．  Ｅｂｉｈａｒａ，  Ｙ．  Ｈａｔｔａ，  Ｊ．Ｈ．  Ｋｉｍ，  Ｐ．  Ｈａｌｆｍａｎｎ，  Ｍ．  Ｈａｔｔａ，  Ｆ．  Ｆｅｌｄｍａｎｎ，  Ｊ．Ｂ．  Ａｌｉｍｏｎｔｉ，  Ｌ．  Ｆｅｒｎａｎｄｏ，  Ｙ．  Ｌｉ，  Ｍ．Ｇ．  Ｋａｔｚｅ，  Ｈ．  Ｆｅｌｄｍａｎｎ，  ａｎｄ  Ｙ．  Ｋａｗａｏｋａ．  ２００７；  Ａｂｅｒｒａｎｔ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｌｅｔｈａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃａｑｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  １９１８  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４４５：３１９−３２３；  ａｎｄ  Ａｂｄｅｌ−Ｇｈａｆａｒ，  Ａ．Ｎ．，  Ｔ．  Ｃｈｏｔｐｉｔａｙａｓｕｎｏｎｄｈ，  Ｚ．  Ｇａｏ，  Ｆ．Ｇ．  Ｈａｙｄｅｎ，  Ｄ．Ｈ．  Ｎｇｕｙｅｎ，  Ｍ．Ｄ．  ｄｅ  Ｊｏｎｇ，  Ａ．  Ｎａｇｈｄａｌｉｙｅｖ，  Ｊ．Ｓ．  Ｐｅｉｒｉｓ，  Ｎ．  Ｓｈｉｎｄｏ，  Ｓ．  Ｓｏｅｒｏｓｏ，  ａｎｄ  Ｔ．Ｍ．  Ｕｙｅｋｉ．  ２００８．  Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  （Ｈ５Ｎ１）  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５８：２６１−２７３）。 Ｓｌｉｔ２Ｎは肺におけるＨ５Ｎ１感染後３日で内皮過透過性を十分に阻害し（図５Ａ）、死亡率を減少させた（図５Ｂ）。Ｓｌｉｔ２Ｎ処理したマウスの肺病態は、未処理のマウスと比較して重症度が減少していた（図５Ｃ）。Ｓｌｉｔ２Ｎが直接抗ウイルス活性を有する可能性を排除するため、肺ウイルス適定量を測定し、Ｓｌｉｔ２Ｎのウイルス量が変化しないことを見出した（図５Ｄ）；さらに、Ｓｌｉｔ２ＮはＨ５Ｎ１感染後に炎症サイトカイン放出の濃度を十分に減少させない（図５Ｅ、Ｆ）。従って、Ｈ５Ｎ１の結果はＬＰＳおよびＣＬＰの研究で一貫性があり、血管反応を高サイトカイン血症に特異的に限定したことは、重篤感染症の動物モデルにおいて死亡率および疾病率を十分に減少させることを示した。
【０１００】
Ｖ.材料および方法
組み換え型Ｓｌｉｔ２Ｎの調製
ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ）コートしたシャーレ上に播種した２９３Ｔ細胞を、空ベクターのｐＳｅｃＴａｇＢまたはｐＳｅｃＴａｇＢ：：ｈＳｌｉｔ２Ｎで一過性に導入した。１５ｃｍシャーレの細胞のそれぞれに関して、無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ内で６０μｇＤＮＡおよび１００μｇリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。Ｓｌｉｔ２Ｎタンパク質は、Ｊｏｎｅｓ，  Ｃ．Ａ．，  Ｎ．Ｒ．  Ｌｏｎｄｏｎ，  Ｈ．  Ｃｈｅｎ，  Ｋ．Ｗ．  Ｐａｒｋ，  Ｄ．  Ｓａｕｖａｇｅｔ，  Ｒ．Ａ．  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ，  Ｊ．Ｄ．  Ｗｙｔｈｅ，  Ｗ．  Ｓｕｈ，  Ｆ．  Ｌａｒｒｉｅｕ−Ｌａｈａｒｇｕｅ，  Ｙ．Ｓ．  Ｍｕｋｏｕｙａｍａ，  Ｐ．  Ｌｉｎｄｂｌｏｍ，  Ｐ．  Ｓｅｔｈ，  Ａ．  Ｆｒｉａｓ，  Ｎ．  Ｎｉｓｈｉｙａ，  Ｍ．Ｈ．  Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，  Ｈ．  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，  Ｋ．  Ｚｈａｎｇ，  ａｎｄ  Ｄ．Ｙ．  Ｌｉ．  ２００８．  で前に記載されたように抽出した塩である。Ｒｏｂｏ４  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １４：４４８−４５３。このプロトコールを使用して、Ｓｌｉｔ２Ｎ濃度０．５−１．５ｍｇ／ｍＬを常に得た。同様の塩抽出方法を空ベクターｐＳｅｃＴａｇＢを導入した細胞に実施した。前記調整をＭｏｃｋといい、Ｓｌｉｔ２Ｎのコントロールとして全ての実験で使用した。体外研究においてＳｌｉｔ２Ｎ１０ｎＭを使用して実施した。 
【０１０１】
ＬＰＳ誘導の急性肺外傷
８から１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスは、生理的食塩水のみ、生理的食塩水中に３．５μｇＳｌｉｔ２ＮもしくはＭｏｃｋで静脈注射した。あるいは、静脈注射はまた、２０μｇコントロールＩｇＧまたは２０μｇＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ阻害抗体を含む（ｃｌｏｎｅ  ＢＶ１３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。動物を、気管の外科的露出の前にＡｖｅｒｔｉｎで麻酔した。生理的食塩水１００μＬ内のリポ多糖類（ｓｅｒｏｔｙｐｅ０１１１：Ｂ４、Ｓｉｇｍａ）１０μｇまたは生理的食塩水のみを気管内（ＩＴ）に投与した。２４時間後、気管を再度露出し、カテーテルを挿入した。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を、生理的食塩水１ｍＬの注射によって吸引を三回繰り返した後に得た。ＢＡＬＦを３００ｇで５分間遠心して、炎症細胞を回収した。沈殿物をＡＣＫバッファーで３分間処理して、赤血球を除去した。細胞を３００ｇで５分間遠心して、１％ＦＢＳを含むＰＢＳ１ｍＬで再懸濁した。その後細胞数を血球計算板によって検出した。好中球の数を、細胞百分率によって決定した。ＢＡＬＦタンパク質をタンパク質分析によって評価した（ＢｉｏＲａｄ）。データを少なくとも５匹のマウス毎状態のｓ．ｅ．ｍ．として示す。
【０１０２】
ブレオマイシンモデル
ブレオマイシンの実験を（Ｇａｓｓｅ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．  ＩＬ−１Ｒ／ＭｙＤ８８  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１７，３７８６−３７９９（２００７））で記載したように実施した。簡潔には、６〜８週齢のマウスを麻酔し、ブレオマイシン（食塩水４０μＬ内に０．０５Ｕ）を経鼻投与点滴によって与えた。コントロールマウスは、生理的食塩水４０μＬの経鼻投与点滴を受けた。マウスは、Ｓｌｉｔ５μｇまたはＭｏｃｋの腹腔内注射を毎日与えられた。コントロールマウスは、毎日生理的食塩水を受けた。１１日目に、マウスをＣＯ２窒息によって屠殺し、肺を除去し、酢酸０．５Ｍの中でプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）で均質化にした。均等質を一晩４℃で撹拌しながらインキュベートした。その後サンプルを遠心し、Ｓｉｒｃｏｌ染色剤１ｍＬを３０分間、上清１００μＬに加えた。サンプルを再度遠心し、沈殿物をアルカリ試薬１ｍＬで再懸濁し、分光光度計（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ）によって分析した。これらのサンプルを製造業者によって提供されるコラーゲン検量線に対して比較した。データを、少なくとも５匹のマウス毎状態のｓ．ｅ．ｍ．として示す。 
【０１０３】
Ｈ５Ｎ１感染
メス１８〜２０ｇＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を麻酔し、Ｈ５Ｎ１ウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ，  Ｄｕｃｋ／ＭＮ／１５２５／８１）で経鼻投与の点滴によって感染させた。マウスは、１．５６μｇのＳｌｉｔまたはＭｏｃｋの静脈注射を５日間毎日与えられた。Ｈ５Ｎ１肺感染を受けたマウスの生存率を、２１日間２０マウス毎状態において測定した。
【０１０４】
盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）敗血症モデル
７から１１週齢のオスＣ５７ＢＬ／６マウスは、５μｇのＳｌｉｔ２ＮまたはＭｏｃｋの腹腔内投与を与えられた。１時間後、マウスをイソフルレンで麻酔し、Ｇｏｍｅｓ，  Ｒ．Ｎ．，  Ｒ．Ｔ．  Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ，  Ｆ．Ａ．  Ｂｏｚｚａ，  Ｐ．  Ｐａｃｈｅｃｏ，  Ｒ．Ｔ．  Ａｍａｎｃｉｏ，  Ａ．Ｐ．  Ｌａｒａｎｊｅｉｒａ，  Ｈ．Ｃ．  Ｃａｓｔｒｏ−Ｆａｒｉａ−Ｎｅｔｏ，  Ｐ．Ｔ．  Ｂｏｚｚａ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｔ．  Ｂｏｚｚａ．  ２００６．に記載されたようにＣＬＰを実施した。単球化学遊走物質タンパク質において１／ｃｃケモカインリガンド２欠乏マウスにおいて、敗血性およびエンドトキシンショックに対する上昇した感度は、減少したインターロイキン１０、向上したマクロファージ遊走阻害因子の産出に一致したＳｈｏｃｋ２６：４５７−４６３。マウスは継続して５μｇのＳｌｉｔ２ＮまたはＭｏｃｋの腹腔内注射を一日一回受けた。擬似手術群のマウスを、血管結紮、および盲腸穿刺を除く以外、同一の方法の対象とした。ＣＬＰの対象としたマウスの生存率を６日間、Ｓｌｉｔ２Ｎ処理Ｎ＝１４およびＭｏｃｋ処理Ｎ＝１５の、Ｒｏｂｏ４＋／＋マウスにおいて測定した。Ｒｏｂｏ４ＡＰ／ＡＰマウスに関しては、Ｓｌｉｔ２Ｎ処理Ｎ＝１３およびＭｏｃｋ処理＝１３である。
【０１０５】
エバンスブルー透過率
肺における血管透過率をＭｏｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．に記載のようにエバンスブルーアルブミン（ＥＢＡ）を使用して評価した（Ｍｏｒｉｔａ，  Ｊ．，  Ｓ．  Ｓａｍｍａｎｉ，  ａｎｄ  Ｊ．Ｇ．  Ｇａｒｃｉａ．  ２００７．  Ｒｅ−ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ  ｄｙｅ  ａｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ  １５０：２５３−２６５）。ＬＰＳのＩＴ点滴の５時間後、ＣＬＰの４時間後、およびＨ５Ｎ１感染の３日後、マウスはＥＢＡ（２０ｍｇ／ｋｇ）の静脈注射を与えられた。ＥＢＡを１時間循環することを可能にし、マウスを深く麻酔し、生理的食塩水＋５ｍＭＥＤＴＡで潅流した。肺を摘出し、重量を測定し、２ｍＬＰＢＳで均質化した。ホルムアミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）４ｍＬを添加し、サンプルを一晩６０℃でインキュベートしてエバンスブルー染色を抽出した。その後、サンプルを遠心し、上清を６２０および７４０ｎｍの両方で分光光度計によって分析した。ＣＬＰ処理したマウスに関して、マウスを潅流し、腎臓および脾臓を除去し、重量を測定し、４８時間６０℃で、ホルムアミド内で置いた。吸収率をＭｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．に記載されたように標準化し、μｇエバンスブルー染色／肺、腎臓または脾臓の湿重量グラムとしてそれぞれ換算した。データを少なくとも４匹のマウス毎状態のｓ．ｅ．ｍ．として示した。 
【０１０６】
組織学
ＬＰＳ曝すまたはＣＬＰの２４時間後、マウスをＣＯ２窒息によって安楽死させた。胸腔を開けて、肺を１０％ホルマリンで緩衝化したＺｎＳＯ４で膨らませた。ホルマリン固定された組織を通常のように処理して、パラフィンに埋め込み、６ミクロンに切断し、Ｈ＆Ｅ染色した。組織学的な定量化はＧｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．に記載された方法によって修飾した（Ｇｕｐｔａ，  Ｎ．，  Ｘ．  Ｓｕ，  Ｂ．  Ｐｏｐｏｖ，  Ｊ．Ｗ．  Ｌｅｅ，  Ｖ．  Ｓｅｒｉｋｏｖ，  ａｎｄ  Ｍ．Ａ．  Ｍａｔｔｈａｙ．  ２００７．  Ｉｎｔｒａｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７９：１８５５−１８６３）。Ｈ５Ｎ１サンプルに関して、感染６日後に２匹の動物からの肺の右葉を採取し、１０％中性緩衝化のホルマリンで固定した。ホルマリン固定した組織を通常通りに処理して、パラフィンに埋め込み、５ミクロンに切断し、Ｈ＆Ｅ染色し、顕微鏡的病変を有資格の獣医病理学者が評価した。
【０１０７】
Ｒｏｂｏ４のＲＮＡサイレンシング
それぞれの実験に関して、ＨＭＶＥＣ−Ｌ、Ｐ−４（Ｌｏｎｚａ）を７０−８０％融合まで１５０ｃｍフラスコ内のＥＧＭ−２ｍｖ培地（Ｌｏｎｚａ）で培養した。トリプシン処理前に、１２ファイブロネクチンのコートされた６．５ｍｍ、３．０μｍ穴のトランスウェル（Ｃｏｓｔａｒ）は、４８０ｎＭのＲＮＡ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）で希釈した２５μｌ／ウェルのｈｕＲｏｂｏ４ｓｉＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｓ＿ＲＯＢＯ４＿１＿ＨＰ，＃１９１９４３１）を受け、第二セットの１２トランスウェルは２５μｌ／ウェルの等モルＡｌｌＳｔａｒｓ  ＮｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（Ｑｕｉａｇｅｎ、＃１０２７２８０）を受けた。トランスフェクションコンプレックスを形成するために、ｓｉＲＮＡを、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１：１０に希釈した２５μＬ／ウェルのＨｉＰｅｒｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で、室温で１０分間トランスウェル内において事前に混合した。細胞を取り出し、２×１０４細胞／ウェルを含む１５０μＬの完全合成培地をトランスフェクションコンプレックスに播種した。トランスフェクタントを３０分間、３７℃でインキュベートし、８００μＬの完全合成培地をそれぞれのトランスウェルの下部チャンバーに加えた。トランスフェクションされた単層を、体外透過率分析の実施前に、記載されたように、４８時間さらに培養した。Ｒｏｂｏ４遺伝子産物の切除を確認するために、二つの１００ｍｍシャーレを残りのＨＭＶＥＣ−Ｌで、４．５ｍＬＥＧＭ−２ｍｖの１０６細胞／シャーレで播種し、Ｒｏｂｏ４ｓｉ  ＲＮＡ、または２０μｍＲＮＡ＋７０μＬＨｉＰｅｒｆｅｃｔ＋５００μＬＯｐｔｉ  ＭＥＭの１２．５μＬからなるＡｌｌＳｔａｒｓ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌトランスフェクションコンプレックスのいずれかを注ぎ、細胞懸濁液のそれぞれのシャーレの上でピペットした。３７℃で３０分後、６．５ｍＬの完全合成培地を添加し、プレートを４８時間インキュベートし、その後ライセートを回収し、１：１００抗Ｒｏｂｏ４（Ｎ−１７）および１：２００抗βＴｕｂｕｌｌｉｎの抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でウェスタンブロッティングを実施した。
【０１０８】
Ｒｏｂｏ４  ｓｉＲＮＡノックダウン
ｈｕＲｏｂｏ４  ｓｉＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ（Ｈｓ＿ＲＯＢＯ４＿１＿ＨＰ＃１９１９４３１，Ｑｉａｇｅｎ）または等モルＡｌｌＳｔａｒｓ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（＃１０２７２８０，Ｑｉａｇｅｎ）のトランスフェクションコンプレックスを、通常のプロトコールに従って形成し、トランスウェルフィルターの上部チャンバーに加えた。２４時間後、細胞をｈｕＲｏｂｏ４またはコントロールｓｉＲＮＡでと二回トランスフェクションした。さらに２４時間後、体外透過率を上述のように評価した。データを三つ組で実施した少なくとも３つの独立した実験の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．として示す。Ｒｏｂｏ４タンパク質発現の成功したノックダウンを、Ｒｏｂｏ４（Ｎ−１７）またはβ−Ｔｕｂｕｌｉｎ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対する抗体を使用してウェスタンブロットで確認した。 
【０１０９】
体外透過率分析
体外透過率をＪｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．に記載されたように実施した（Ｊｏｎｅｓ，  Ｃ．Ａ．，  Ｎ．Ｒ．  Ｌｏｎｄｏｎ，  Ｈ．Ｃｈｅｎ，  Ｋ．Ｗ．  Ｐａｒｋ，  Ｄ．  Ｓａｕｖａｇｅｔ，  Ｒ．Ａ．  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ，  Ｊ．Ｄ．  Ｗｙｔｈｅ，  Ｗ．  Ｓｕｈ，  Ｆ．  Ｌａｒｒｉｅｕ−Ｌａｈａｒｇｕｅ，  Ｙ．Ｓ．  Ｍｕｋｏｕｙａｍａ，  Ｐ．  Ｌｉｎｄｂｌｏｍ，  Ｐ．  Ｓｅｔｈ，  Ａ．  Ｆｒｉａｓ，  Ｎ．  Ｎｉｓｈｉｙａ，  Ｍ．Ｈ．  Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，  Ｈ．  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，  Ｋ．  Ｚｈａｎｇ，  ａｎｄＤ．Ｙ．  Ｌｉ．  ２００８．  Ｒｏｂｏ４  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １４：４４８−４５３）。分析は１００ｎｇ／ｍＬリポ多糖類（ｓｅｒｏｔｙｐｅ０１１１：Ｂ４，Ｓｉｇｍａ）を３時間、１０ｎｍ／ｍＬ腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を６時間、または１０ｎｇ／ｍＬインターロイキン−１β（ＩＬ−１β，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を２時間使用して実施した。示したように、これを、２５μｇ／ｍＬコントロールラビットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）または２５μｇ／ｍＬ抗ヒトＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＲＤＩ  Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）の抗体の存在下において繰り返した。刺激していない単層の基礎透過率を１００％として定めた。データを、三つ組で実施した少なくとも３つの独立した実験の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．として示す。 
【０１１０】
細胞内分画
ＨＭＶＥＣ−ｌｕｎｇを、Ｓｌｉｔ２ＮまたはＭｏｃｋで、０．１％ＦＢＳ  ＥＢＭ−２内１．５時間処理した。その後細胞を、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含む氷冷したＰＢＳで２回、ＨＬＢバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ＰＨ７．４，５ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で１回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）、フォスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）および１ｍＭ  ＤＴＴを追加したＨＬＢバッファー内に回収した。その後細胞を、加圧型細胞破砕装置で均質化した（２０ストローク）。破砕物を４００ｇ、１０分間、４℃で遠心して細胞片を沈殿させた。生じた上清を再度１６，０００ｇ、３０分間、４℃で遠心した。沈殿物を、ＨＬＢで１回洗浄し、ＲＩＰＡバッファーで３０分間、４℃で再懸濁した。再懸濁した沈殿物を遠心し（１６，０００ｇ／１５ｍｉｎ、４℃）、生じた上清を水溶性膜分画として保存した。全細胞ライセートを得るために、アリコートを加圧型細胞破砕装置で均質化する前に保存した。ＲＩＰＡバッファーをこのアリコートに加えて、１３，０００ｇ、１０分間、４℃で遠心した。上清を保存し、全細胞ライセートとして使用した。ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎへの抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから、ｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎおよびβ−ｃａｔｅｎｉｎはＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た。濃度測定を少なくとも３回独立した実験で実施し、データを平均値±ｓ．ｅ．ｍ．として示す。
【０１１１】
免疫蛍光
免疫蛍光を、Ｊｏｎｅｓ，  Ｃ．Ａ．，  Ｎ．Ｒ．  Ｌｏｎｄｏｎ，  Ｈ．  Ｃｈｅｎ，  Ｋ．Ｗ．  Ｐａｒｋ，Ｄ．  Ｓａｕｖａｇｅｔ，  Ｒ．Ａ．  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ，  Ｊ．Ｄ．  Ｗｙｔｈｅ，  Ｗ．  Ｓｕｈ，  Ｆ．  Ｌａｒｒｉｅｕ−Ｌａｈａｒｇｕｅ，  Ｙ．Ｓ．  Ｍｕｋｏｕｙａｍａ，  Ｐ．  Ｌｉｎｄｂｌｏｍ，  Ｐ．  Ｓｅｔｈ，  Ａ．  Ｆｒｉａｓ，  Ｎ．  Ｎｉｓｈｉｙａ，  Ｍ．Ｈ．  Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，  Ｈ．  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，  Ｋ．  Ｚｈａｎｇ，  ａｎｄ  Ｄ．Ｙ．  Ｌｉ．  ２００８．に記載したように実施した。細胞を、Ｓｌｉｔ２ＮまたはＭｏｃｋと３０分間前処理し、その後１０ｎｇ／ｍＬＩＬ−１βで３時間刺激した。ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはｐ１２０−ｃａｔｅｎｉｎ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）に対する一次抗体を４℃で一晩適応した。画像を三つの独立した実験の代表図とする。 
【０１１２】
免疫沈降
ＨＭＶＥＣ−ｌｕｎｇを、０．１％ＦＢＳ  ＥＢＭ−２内のＳｌｉｔ２ＮまたはＭｏｃｋで３０分間処理した。その後細胞を、ＩＬ−１β１０ｎｇ／ｍＬで１０分間刺激した。その後ＨＭＶＥＣ−ｌｕｎｇを、氷冷したＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤、フォスファターゼ阻害剤および１ｍＭ  ＤＴＴを追加した氷冷した溶解緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％ＮＰ−４０および１０％グリセロール）で溶解した。細胞ライセートを氷上で３０分間インキュベートし、１３，０００ｇ、１５分間遠心して、細胞片を沈殿させた。タンパク質濃度をＢＣＡ分析（ＰＩＥＲＣＥ）で測定し、ライセート０．５ｍｇをＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）８μｇおよびタンパク質Ａ／Ｇセファローズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）と、１時間、４℃でインキュベートした。複合物を溶解緩衝液で３回洗浄した。免疫沈降物をウェスタンブロット分析の対象とした。濃度測定法を３つの独立した実験において実施し、データを平均値±ｓ．ｅ．ｍ．として示す。 
【０１１３】
内在化分析
ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ内在化を、Ｘｉａｏ，Ｋ．，Ｊ．Ｇａｒｎｅｒ，Ｋ．Ｍ．Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｐ．Ａ．Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｃ．Ｍ．Ｃｈｉａｓｓｏｎ，Ｅ．Ｄｅｊａｎａ，Ｖ．Ｆａｕｎｄｅｚ，ａｎｄ  Ａ．Ｐ．Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ．２００５．ｐ１２０−Ｃａｔｅｎｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １６：５１４１−５１５１．に記載されたように実施した。簡潔には、ＨＭＶＥＣ−ｌｕｎｇをチャンバースライド上に播種し、７２時間培養した。その後培地を取り除き、細胞を３０分間４℃、抗ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体（ｃｌｏｎｅ  ＢＶ６，ＲＤＩＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ）でラベルした。その後細胞を、Ｓｌｉｔ２ＮまたはＭｏｃｋで３０分間、前処理した。過剰な抗体を氷の上で氷冷した培地で２回洗浄することによって取り除いた。チャンバースライドを３７℃に移し、ＩＬ−１β１０ｎｇ／ｍＬおよび０．６ｍＭプリマキンと１０ｎＭのＳｌｉｔ２ＮまたはＭｏｃｋの存在下において１時間インキュベートした。細胞を酸洗浄して表面に結合したＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎを取り除いだ。単層を洗浄し、固定し、透過した。内在化したＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体を、Ａｌｅｘａ  ４８８共役ｄｏｎｋｅｙの抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）によって検出した。画像は４つの独立した実験の代表図である。
【０１１４】
肺免疫蛍光
成体Ｒｏｂｏ４＋／ＡＰマウスをＣＯ２窒息で安楽死させた。胸腔を開けて、肺をＯＣＴで膨らませて、ＯＣＴをドライアイスで迅速に凍結した。肺断片は、Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．Ａ．，  Ｎ．Ｒ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｈ．Ｃｈｅｎ，Ｋ．Ｗ．Ｐａｒｋ，Ｄ．Ｓａｕｖａｇｅｔ，Ｒ．Ａ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ，Ｊ．Ｄ．Ｗｙｔｈｅ，Ｗ．Ｓｕｈ，Ｆ．Ｌａｒｒｉｅｕ−Ｌａｈａｒｇｕｅ，Ｙ．Ｓ．Ｍｕｋｏｕｙａｍａ，Ｐ．Ｌｉｎｄｂｌｏｍ，Ｐ．Ｓｅｔｈ，Ａ．Ｆｒｉａｓ，Ｎ．Ｎｉｓｈｉｙａ，Ｍ．Ｈ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｈ．Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｋ．Ｚｈａｎｇ，ａｎｄＤ．Ｙ．Ｌｉ．２００８．Ｒｏｂｏ４  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ１４：４４８−４５３に記載のように、Ｒｏｂｏ４発現のアルカリホスファターゼ活性を示す部位を染色した。その後断片を、Ｓｌｉｔ２（Ｅ−２０，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）またはＣＤ−３１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に対する一次抗体を使用して染色し、その後蛍光二次抗体で染色した。
【０１１５】
サイトカイン／ケモカインのアレイ
ＣＬＰの６時間後、マウスを深く麻酔した。全血をＡＣＤ（〜１：９体積）内に頸動脈から抜いた。血漿は４０００ｇで１０分間、血液を遠心することによって分離した。血漿をＱｕａｎｓｙｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）によって分析して、サイトカインおよびケモカインの濃度を定量した。データを６匹のマウスの平均値±ｓ．ｅ．ｍ．毎状態として示す。Ｈ５Ｎ１サンプルに関しては、感染から６日後の、精製したマウスの肺のホモジネートを調整し、炎症性サイトカインおよびケモカインの分析結果を、マウスのサイトカインおよびケモカインのアレイ（Ｑｕａｎｓｙｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を使用して測定した。データを統合されたマウスの３群の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．として示す。
【０１１６】
肺ウイルス滴定量測定
Ｓｉｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｗ．，Ｋ．Ｗ．Ｂａｉｌｅｙ，Ｍ．Ｈ．Ｗｏｎｇ，Ｄ．Ｌ．Ｂａｒｎａｒｄ，ａｎｄＤ．Ｆ．Ｓｍｅｅ．２００５．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｖｉｒａｍｉｄｉｎｅ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ６８：１０−１７に記載されたように実施した。
【０１１７】
肺の発症
胚を、Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｏ．Ｄ．Ｋｌｅｉｎ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ，ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｋｒａｓｎｏｗ．２００８．Ｔｈｅ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｌｕｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ４５３：７４５−７５０．に記載されたように切除し、固定し、再水和した。肺を抗ＰＥＣＡＭ（ＢＣ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；ｃｌｏｎｅＭＥＣ１３．３）および抗Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（ｃｌｏｎｅＥＣＣＤ−２，Ｚｙｍｅｄ）の一次抗体で、Ｍｅｔｚｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に記載された様々な方法を用いて、連続して免疫染色した。
【０１１８】
好中球の遊走
ＨＬ−６０細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎ／ｓｔｅｐを追加したＲＰＭＩ−１６４０培地で、通常の条件下において培養した。１．２％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）によって誘導された細胞を、成長培地内の３×１０６ＨＬ−６０細胞／ｍＬで播種し、４６日間培養することによって得た（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，Ｆ．Ｗ．Ｒｕｓｃｅｔｔｉ，Ｒ．Ｅ．Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，ａｎｄ  Ｒ．Ｃ．Ｇａｌｌｏ．１９７８．Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｐｏｌａｒ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ７５：２４５８−２４６２）。ｈＰＭＮを、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｇ．Ａ．，Ｔ．Ｍ．ＭｃＩｎｔｙｒｅ，ａｎｄ  Ｓ．Ｍ．Ｐｒｅｓｃｏｔｔ．１９８５．Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  Ｔｈｅ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ７６：２２３５−２２４６．に記載されたような技術を使用して、ＡＣＤの健常な成体ドナーの全血から分離した。トロンビンは好中球の粘性をヒト内皮細胞に体外にて刺激するＪ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ７６：２２３５−２２４６。Ｓｌｉｔ２またはＭｏｃｋと共に白血球の化学誘引物質ｆＭＬＰ（１０μＭ）を、４８ウェル走化性チャンバー（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ）の低ウェルに配置した。ファイブロネクチンのコートした（一晩、４℃）ポリカーボネート膜（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ，５μｍ）を、化学誘引物質と細胞の間に配置した。ＨＬ−６０細胞をＤＭＳＯで誘導するか、またはｈＰＭＮ（５０μｌ，５０，０００細胞）を上部ウェルに加えた。３７℃で２時間インキュベートした後、フィルターの表面上の細胞を取り除き、フィルターによって表面下で遊走した細胞を固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃ染色セット（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）を使用して染色した。５高倍率視野における遊走した細胞を数えて、遊走をＳｌｉｔ２またはＭｏｃｋの不存在下においてｆＭＬＰの方に遊走した細胞と比較して遊走細胞の比率として示した。データを少なくとも３つの独立した実験におけるｓ．ｅ．ｍ．として示す。
【０１１９】
定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）
総ＲＮＡを、生理的食塩水またはＬＰＳ処理した肺から、製造業者が提供するプロトコールに従って抽出した（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡ ＩＩ ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。逆転写後、ｑＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ分析（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で１８ｓ  ｒＲＮＡおよびマウスＲｏｂｏ４に関して実施した。ｈＰＭＮ研究に関して、ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して分離し、ｑＰＣＲをＴａｑＭａｎ分析（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、ヒトＧＡＰＤＨおよびＲＯＢＯ１−４に関して実施した。
【０１２０】
統計分析
事後の試験でＳｔｕｄｅｎｔのｓ  t検定、ｌｏｇ  ｒａｎｋ検定またはＡＮＯＶＡを、必要に応じて、使用して、統計的有意性を評価した。Ｐ値＜０．０５を統計的優位性として考慮した。
【０１２１】
多くの変化が、上記実施形態の詳細で、発明の根本的な原理から離れることなく製造することが当業者には明らかである。従って本発明の範囲は、添付の請求項のみによって決定すべきである。
【図１】
2012512170.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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