(57)【要約】本発明はＢＡＣＥ２阻害剤の同定のためのスクリーニングアッセイに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の増殖が、ＢＡＣＥ２を介したＴｍｅｍ２７の切断に依存した、Ｔｍｅｍ２７ポリペプチドを発現する細胞を提供すること、
ＢＡＣＥ２ポリペプチドとＴｍｅｍ２７ポリペプチドを発現する細胞とを含む混合物を候補化合物と接触させること、および
候補化合物が、細胞増殖を調節するか否かを決定すること、ここで細胞増殖の増大が、ＢＡＣＥ２阻害剤の指標である、
を含む、ＢＡＣＥ２阻害剤を同定するための方法。
【請求項２】
細胞が、Ｔｍｅｍ２７ポリペプチドおよびＢＡＣＥ２を発現している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が、β細胞系であり、好ましくはＭＩＮ６  Ｂ１またはＩＳＮ−１ｅ細胞系である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
細胞増殖が、共焦点顕微鏡によって測定される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＢＡＣＥ２阻害剤の同定のための、Ｔｍｅｍ２７ポリペプチドを発現する細胞、およびＢＡＣＥ２を介したＴｍｅｍ２７ポリペプチドの切断に依存した該細胞の増殖の使用。
【請求項６】
ＢＡＣＥ２とＴｍｅｍ２７に由来するＢＡＣＥ２切断部位またはＡＣＥ２に由来するＢＡＣＥ２切断部位を含むペプチドとを候補化合物と接触させること、および
そのペプチドの切断を決定すること
を含む、ＢＡＣＥ２阻害剤を同定するための方法。
【請求項７】
Ｔｍｅｍ２７に由来するペプチドまたはＡＣＥ２に由来するペプチドが、配列番号１に記載されたかまたは配列番号１２に記載された配列を有するペプチドを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｔｍｅｍ２７に由来するペプチドまたはＡＣＥ２に由来するペプチドの切断が、ＦＲＥＴアッセイで決定される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
Ｔｍｅｍ２７に由来するペプチドまたはＡＣＥ２に由来するペプチドが、Ｎ末端はダブシルで、そしてＣ末端は蛍光色素で標識されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
蛍光色素が、ルシファーイエローである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｔｍｅｍ２７に由来するペプチドまたはＡＣＥ２に由来するペプチドの切断が、蛍光消光アッセイによって決定される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１２】
Ｔｍｅｍ２７に由来するペプチドまたはＡＣＥ２に由来するペプチドが、Ｎ末端はＭＲ１２１で、そしてＣ末端はトリプトファンで標識されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＢＡＣＥ２阻害剤の同定のための、ＡＣＥ２ポリペプチドの使用。
【請求項１４】
実質的に本明細書に記載された、特に実施例に関連した、方法および使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢＡＣＥ２阻害剤の同定のためのスクリーニングアッセイに関する。これらの化合物は、代謝異常の処理のために使用し得る。
【０００２】
欠陥のあるグルコース応答性インスリン分泌および低下したβ細胞質量は、２型糖尿病の主原因である。膜貫通型タンパク質Ｔｍｅｍ２７（コレクトリン）は、膵臓のβ細胞に発現しており、そこで膵臓のβ細胞質量、およびインスリンの分泌を制御している。Ｔｍｅｍ２７は、形質膜でタンパク質分解性の切断およびシェディングにより不活性化される。
【０００３】
アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）は、アンジオテンシンIIのアンジオテンシンへの切断を含む生理的役割を伴ったマルチドメイン膜タンパク質である。従って上昇したＡＣＥ２活性は、高血圧を含む代謝疾患に対する防御を与えるポテンシャルを有する
【表１】
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。膵臓では、減少したＡＣＥ２は、グルコース代謝障害と関連している
【表２】
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。それゆえにＡＣＥ２の保存は、糖尿病において有益な効果をも有する可能性がある。ＡＣＥ２およびＴＭＥＭ２７は、細胞外ドメインにおいて近接な配列相同性を有し、そしてそれゆえに両者が、同一のシェディングプロテアーゼを共有することが可能である。
【０００４】
ＢＡＣＥ１は、β−セクレターゼ（ＡＰＰのβ部位切断酵素）であり、アスパラギン酸プロテアーゼのクラスに属し、そしてアルツハイマー病の病因および末梢神経細胞におけるミエリン鞘の形成に関与している。ＢＡＣＥ１は膜貫通型タンパク質であり、その細胞外タンパク質ドメインに二つのアスパラギン酸残基活性部位を含み、二量体として機能することができる。
【０００５】
アルツハイマー病患者の脳内で凝集する、４０または４２アミノ酸長のアミロイドβ−タンパク質の生成は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の二回連続の切断を必要とする。ＢＡＣＥ１によるＡＰＰの細胞外での切断は、可溶性細胞外フラグメントを遊離し、そしてその後にγ−セクレターゼ（プレセニリン）による膜貫通ドメイン内でのＡＰＰの切断が続く。二番目の切断は、ＡＰＰの細胞内ドメインおよびアミロイド−βを遊離する。α−セクレターゼは、ＢＡＣＥ１より細胞膜により近くでＡＰＰを切断するので、アミロイド−βペプチドのフラグメントを取り除く。ＢＡＣＥ１ではなくα−セクレターゼによるＡＰＰの最初の切断は、最終的なアミロイドβの生成を妨げる。
【０００６】
ＡＰＰ、およびγ−セクレターゼで重要なプレセニリンタンパク質とは異なり、ＢＡＣＥ１をコードする遺伝子内で、早発性の、家族性のアルツハイマー病を引き起こす突然変異は、知られていない。しかしながら、この酵素のレベルが、アルツハイマー病患者において上昇していることが示されている。ＢＡＣＥ１によるＡＰＰおよびその他の膜貫通型タンパク質の切断の生理的目的は、知られていない。ＢＡＣＥ２は、ＢＡＣＥ１の近接のホモログである。
【０００７】
本発明の目的は、代謝異常の処理のための化合物の同定のための新規方法を提供することである。
【０００８】
本発明は、ＢＡＣＥ２がＴｍｅｍ２７を切断するプロテアーゼであるという知見に基づく。ＢＡＣＥ２の阻害は、Ｔｍｅｍ２７のシェディングの阻害および全長タンパク質の増加を導く。その増殖が全長Ｔｍｅｍ２７タンパク質の存在に依存している細胞においては、ＢＡＣＥ２を介したＴｍｅｍ２７の切断の阻害は、細胞増殖の増加を導く。
【０００９】
第一の局面において、本発明は、細胞の増殖が、ＢＡＣＥ２を介したＴｍｅｍ２７の切断に依存した、Ｔｍｅｍ２７ポリペプチドを発現する細胞を提供すること、ＢＡＣＥ２ポリペプチドとＴｍｅｍ２７ポリペプチドを発現する細胞とを含む混合物を候補化合物と接触させること、および該候補化合物が細胞増殖を調節するか否かを決定することであって、ここで、細胞増殖の増大が、ＢＡＣＥ２阻害剤の指標である、を含む、ＢＡＣＥ２阻害剤を同定するための方法を提供する。
【００１０】
好ましい態様においては、該細胞が、Ｔｍｅｍ２７ポリペプチドとＢＡＣＥ２とを発現している。
【００１１】
更に好ましい態様においては、該細胞が、β細胞系であり、好ましくはＭＩＮ６  Ｂ１またはＩＳＮ−１ｅ細胞系である。
【００１２】
更に別の好ましい態様においては、細胞増殖が、共焦点顕微鏡によって測定される。
【００１３】
第二の局面において、本発明は、下記：ＢＡＣＥ２とＴｍｅｍ２７に由来するＢＡＣＥ２切断部位またはＡＣＥ２に由来するＢＡＣＥ２切断部位を含むペプチドとを候補化合物と接触させること、およびそのペプチドの切断を決定することを含む、ＢＡＣＥ２阻害剤を同定するための方法を提供する。
【００１４】
好ましい態様においては、Ｔｍｅｍ２７に由来するペプチドが、配列番号１に記載された配列（ＱＴＬＥＦＬＫＩＰＳ）を有するペプチドを含む。
【００１５】
更に好ましい態様においては、ＡＣＥ２に由来するペプチドが、配列番号１４に記載された配列（ＮＳＬＥＦＬＧＩＱＰ）を有するペプチドを含む。
【００１６】
更に好ましい態様においては、Ｔｍｅｍ２７に由来するペプチドまたはＡＣＥ２に由来するペプチドの切断が、フルオロフォア蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイによって決定される。
【００１７】
更に別の態様においては、Ｔｍｅｍ２７に由来するペプチドまたはＡＣＥ２に由来するペプチドが、Ｎ末端はダブシルで、そしてＣ末端は蛍光色素で標識されている。
【００１８】
更に好ましい態様においては、蛍光色素は、ルシファーイエローである。
【００１９】
更に好ましい態様においては、Ｔｍｅｍ２７に由来するペプチドまたはＡＣＥ２に由来するペプチドの切断が、蛍光消光アッセイによって決定される。
【００２０】
更に別の好ましい態様においては、Ｔｍｅｍ２７に由来するペプチドまたはＡＣＥ２に由来するペプチドが、Ｎ末端はＭＲ１２１で、およびＣ末端はトリプトファンで、標識されている。
【００２１】
別の局面においては、本発明は、ＢＡＣＥ２阻害剤の同定のための、ＡＣＥ２ポリペプチドの使用に関する。
【００２２】
更なる局面においては、本発明は、配列番号１および配列番号５〜１８からなる群より選択されるペプチドを提供する。
【００２３】
本発明の方法において用いられるＢＡＣＥ２は、ＢＡＣＥ２を発現している細胞から得られた細胞膜から単離することができるか、またはＢＡＣＥ２を発現している細胞から単離することができる。あるいは、ＢＡＣＥ２は、従来の化学合成および／または組換えＤＮＡ技術によって部分的にまたは完全に合成することができる。
【００２４】
用語「Ｔｍｅｍ２７」は、本明細書中で、いずれの動物、例えばヒトを含む哺乳類からのネイティブＴｍｅｍ２７配列、およびＴｍｅｍ２７バリアントを指すために使用される。Ｔｍｅｍ２７ポリペプチドは、ヒトの組織型を含む、様々な供給源から単離することができるか、または組換えおよび／または合成方法で調製することができる。
【００２５】
「ネイティブ配列Ｔｍｅｍ２７」は、その調製方法に関わらず、自然に存在するＴｍｅｍ２７ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ネイティブ配列Ｔｍｅｍ２７は自然から単離することができるか、または組換えおよび／または合成方法で調製することができる。用語「ネイティブ配列Ｔｍｅｍ２７」は、自然に存在する切断または分泌型、具体的には自然に存在するバリアント型（例えばオルタナティブスプライシング型）、および自然に存在するＴｍｅｍ２７の対立遺伝子多型を包含する。SwissprotデータベースにおけるヒトのＴｍｅｍ２７ポリペプチドの識別子は、Ｑ９ＨＢＪ８（配列番号２）である。
【００２６】
用語「Ｔｍｅｍ２７バリアント」は、ネイティブ配列に一以上のアミノ酸置換および／または欠失および／または挿入を含むネイティブ配列Ｔｍｅｍ２７のアミノ酸配列バリアントを指す。一般的にアミノ酸配列バリアントは、ネイティブ配列Ｔｍｅｍ２７のアミノ酸配列と少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、更に好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列相同性を有する。用語「Ｔｍｅｍ２７バリアント」は、またＢＡＣＥ２によってプロセシングされたＴｍｅｍ２７フラグメント、例えばいまだＢＡＣＥ２の基質である切断されたＴｍｅｍ２７ポリペプチドを指す。
【００２７】
用語「ＢＡＣＥ２」は、本明細書中で、いずれの動物、例えばヒトを含む哺乳類からのネイティブ配列ＢＡＣＥ２、およびＢＡＣＥ２バリアント（下記でさらに定義される）を指すために使用される。ＢＡＣＥ２ポリペプチドは、ヒトの組織型を含む、様々な供給源から単離することができるか、または組換えおよび／または合成方法で調製することができる。
【００２８】
「ネイティブ配列ＢＡＣＥ２」は、その調製方法に関わらず、自然に存在するＢＡＣＥ２ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ネイティブ配列ＢＡＣＥ２は自然から単離することができるか、または組換えおよび／または合成方法で調製することができる。用語「ネイティブ配列ＢＡＣＥ２」は、具体的には自然に存在する切断または分泌型、自然に存在するバリアント型（例えばオルタナティブスプライシング型）、および自然に存在するＢＡＣＥ２の対立遺伝子多型を包含する。SwissprotデータベースにおけるヒトのＢＡＣＥ２ポリペプチドの識別子は、Ｑ９Ｙ５Ｚ０（配列番号３）である。
【００２９】
用語「ＢＡＣＥ２バリアント」は、ネイティブ配列に一以上のアミノ酸置換および／または欠失および／または挿入を含むネイティブ配列ＢＡＣＥ２のアミノ酸配列バリアントを指す。一般的にアミノ酸配列バリアントは、ネイティブ配列Ｔｍｅｍ２７のアミノ酸配列と少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、更に好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列相同性を有する。
【００３０】
用語「化合物」は、本明細書中で、本発明方法に関連して記述される「試験化合物」または「薬剤候補化合物」との関連で使用される。このように、これらの化合物は、合成的に得られたか、または自然供給源からの有機または無機化合物を含む。該化合物は、比較的低分子量を特徴とするポリ核酸、脂質またはホルモン類似物質といった無機または有機化合物を含む。他の生体高分子有機試験化合物は、約２から４０アミノ酸を含むペプチドおよび約４０から約５００アミノ酸を含む、抗体または抗体コンジュゲートといったより大きいポリペプチドを含む。
【００３１】
用語「Ｔｍｅｍ２７由来ペプチド」は、Ｔｍｅｍ２７ポリペプチドおよびＢＡＣＥ２により切断された該ペプチドの少なくとも５アミノ酸の連続したストレッチと少なくとも約８０％の配列相同性を有するペプチドを指す。
【００３２】
用語「用語アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）」は、本明細書中で、いずれの動物、例えばヒトを含む哺乳類からのネイティブ配列ＡＣＥ２、およびＡＣＥ２バリアントを指すために使用される。ＡＣＥ２ポリペプチドは、ヒトの組織型を含む、様々な供給源から単離することができるか、または組換えおよび／または合成方法で調製することができる。
【００３３】
「ネイティブ配列ＡＣＥ２」は、その調製方法に関わらず、自然に存在するＡＣＥ２ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ネイティブ配列ＡＣＥ２は自然から単離することができるか、または組換えおよび／または合成方法で調製することができる。用語「ネイティブ配列ＡＣＥ２」は、自然に存在する切断または分泌型、具体的には自然に存在するバリアント型（例えばオルタナティブスプライシング型）、および自然に存在するＡＣＥ２の対立遺伝子多型を包含する。SwissprotデータベースにおけるヒトのＡＣＥ２ポリペプチドの識別子は、Ｑ９ＢＹＦ１（配列番号４）である。
【００３４】
用語「ＡＣＥ２バリアント」は、ネイティブ配列に一以上のアミノ酸置換および／または欠失および／または挿入を含むネイティブ配列ＡＣＥ２のアミノ酸配列バリアントを指す。一般的にアミノ酸配列バリアントは、ネイティブ配列ＡＣＥ２のアミノ酸配列と少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、更に好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列相同性を有する。用語「ＡＣＥ２バリアント」は、またＢＡＣＥ２によってプロセシングされたＡＣＥ２フラグメント、例えばいまだＢＡＣＥ２の基質である切断されたＡＣＥ２ポリペプチドを指す。
【００３５】
本発明のアッセイによって同定された化合物は、代謝異常、好ましくは２型糖尿病の処理のための医薬の開発のために使用し得る。
【００３６】
本発明方法でＢＡＣＥ２阻害剤を同定するために使用し得るフルオロフォア蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイは、当業者に公知である。適切なＦＲＥＴアッセイは、例えば
【表３】
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中に記載されている。要約すると、ペプチドは、プロテアーゼによって切断される様にデザインされている。該ペプチドは、Ｎ末端は例えばダブシルで、Ｃ末端は例えばルシファーイエローでラベルされていて、その結果インタクトなペプチドではルシファーイエローの蛍光はダブシルによって消光されている。該ペプチドがＢＡＣＥ２によって切断されたとき、消光は、除去され、そして蛍光シグナルが、発生する。
【００３７】
本発明方法でＢＡＣＥ２阻害剤を同定するために使用し得る蛍光消光アッセイは、当業者に公知である。適切な方法は、例えば
【表４】
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中に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、ウェスタンブロット解析の結果を示し、細胞アッセイ（ＩＮＳ−ＴＭＥＭ２７／ＢＡＣＥ２細胞系）での（Ｒ）−２−アミノ−６−［２−（３’−メトキシ−ビフェニル−３−イル）−エチル］-３，６−ジメチル−５，６−ジヒドロ−３Ｈ−ピリミジン−４−オン（阻害剤）による用量依存的な全長ＴＭＥＭ２７の保存を示す。
【図２】図２は、ヒトＴＭＥＭ２７を安定に発現しそしてＢＡＣＥ２阻害剤で処理されたＩＮＳ１ｅ細胞の培養上清からのＴＭＥＭ２７のＥＬＩＳＡ測定値を示す。
【図３】図３は、ウェスタンブロット解析の結果を示し、（Ｒ）−２−アミノ−６−［２−（３’−メトキシ−ビフェニル−３−イル）−エチル］−３，６−ジメチル−５，６−ジヒドロ−３Ｈ−ピリミジン−４−オンによる全長ＴＭＥＭ２７の保存および培養上清へのシェディングの随伴性の阻害を示す。ＣＭＶプロモーター制御下のＴＭＥＭ２７およびＢＡＣＥ２を安定にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞から得られた。
【図４】図４は、細胞アッセイの結果を示し、ＢＡＣＥ２阻害剤（Ｒ）−２−アミノ−６−［２−（３’−メトキシ−ビフェニル−３−イル）−エチル］−３，６−ジメチル−５，６−ジヒドロ−３Ｈ−ピリミジン−４−オンで処理されたヒトの膵島は、全長ＴＭＥＭ２７の保存を示す。１μＭ阻害剤存在下または非存在下で４８時間インキュベーションされた〜２０００膵島（男性；ＢＭＩ＝２３．４；１９歳）。
【図５ａ】図５ａは、Ｍｉｎ６細胞の増殖率の変化の測定によるＢＡＣＥ２阻害剤の細胞アッセイの結果を示す。
【図５ｂ】図５ｂは、図５ａのアッセイで使用された細胞のウェスタンブロットを示す。
【図６】図６は、Ｉｎｓ１ｅ細胞の増殖率の変化の測定によるＢＡＣＥ２阻害剤の細胞アッセイの結果を示す。
【図７】図７は、ＡＰＰ、ＴＭＥＭ２７、および無関係タンパク質に由来するペプチドを用いたＦＲＥＴアッセイの結果を示す。
【図８】図８は、ＴＭＥＭ２７ペプチドおよび参照ＢＡＣＥ２阻害剤を用いたＦＲＥＴアッセイ用量反応曲線を示す。
【図９】図９は、ＦＲＥＴアッセイにおける関連するペプチドに由来するペプチド基質に対するＢＡＣＥ２の活性を示す。
【００３９】
実施例
細胞性ＴＭＥＭ２７切断を測定することによるＢＡＣＥ２阻害についてのアッセイ
【００４０】
１．安定した細胞系：
ＩＮＳ−ＴＭＥＭ２７／ＢＡＣＥ２は、それぞれ、ネオマイシン（Ｇ４１8）、ハイグロマイシン、およびゼオシンによる三工程の連続した安定した選択により樹立された、ｈＴＭＥＭ２７およびｈＢＡＣＥ２の両方をドキシサイクリン依存的な方法における誘導発現（ＴｅｔＯｎシステムを用いて）を可能にする安定した細胞系を意味する。
【００４１】
２．培養、継代、および保存：
ａ）．培養
基本ＩＮＳ−１細胞培養培地：
【表５】
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−完全培地：ＩＮＳ−ＴＭＥＭ２７／ＢＡＣＥ２三種安定細胞系を、選択圧：１００μg/mlＧ４１８；１００μg/mlハイグロマイシン；２５０μg/mlゼオシンを含む基本ＩＮＳ−１培地中で培養する。
−培地を週に２回換える。
ｂ）．継代
週に１度、細胞をトリプシン処理する：細胞を１回ＰＢＳでリンスし、２mlのトリプシンで３分間室温でインキュベーションし、１０mlの完全培養培地を添加し、そして３分割する。
ｃ）保存：
−〜１０ｘ１０６細胞を１mlの１０％ＤＭＳＯ含有ＦＣＳに再懸濁する。
−それらを凍結カプセルに移す。
−細胞を−８０℃に一晩置く。
−細胞を液体窒素に保存する。
【００４２】
３．アッセイ：
ａ）．ｈＴＭＥＭ２７発現の誘導とＢＡＣＥ２によるその切断：
−ＩＮＳ−ＴＭＥＭ２７／ＢＡＣＥ２細胞を９６ウェルプレートに播種する。
−完全培地での２〜３日培養後、ドキシサイクリンを終濃度５００ng/mlで添加する（ドキシサイクリンは新たに調製すべきであり、水で溶解すべきである）。
ｂ）．ＢＡＣＥ２阻害の測定。
−所望の濃度のＢＡＣＥ２化合物をドキシサイクリン投与２時間前に添加する。
−更に４６時間インキュベーションする。
−培地中にシェディングされたｈＴＭＥＭ２７をウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡで検出するか、またはウェスタンブロットによって細胞ライセート中の全長ＴＭＥＭ２７を測定する。
【００４３】
４．ウェスタンブロットの読み出しの結果
図１：細胞アッセイでのＢＡＣＥ２阻害剤（Ｒ）−２−アミノ−６−［２−（３’−メトキシ−ビフェニル−３−イル）−エチル］−３，６−ジメチル−５，６−ジヒドロ−３Ｈ−ピリミジン−４−オンによる用量依存的な全長ＴＭＥＭ２７の保存を示すウェスタンブロット。
【００４４】
５．ＥＬＩＳＡ読み出しの結果
図２：図表は、ヒトＴＭＥＭ２７を安定に発現しそしてプロトコールに記載された様にＢＡＣＥ２阻害剤で処理されたＩＮＳ１ｅ細胞の培養上清からの、ＴＭＥＭ２７のＥＬＩＳＡの読み出しを示す。シェディングされたＴＭＥＭ２７は、より高い濃度のＢＡＣＥ２によって減少し、そして阻害剤のＩＣ５０は、Ｘｌｆｉｔといった標準的な曲線適合プログラムによって推定することができる。今回の場合は１．１１２マイクロモル濃度のＩＣ５０が、決定された。
【００４５】
６．別の細胞システム
図３：同様の結果が、ＣＭＶプロモーター制御下のＴＭＥＭ２７およびＢＡＣＥ２を安定にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞において得られた。ウェスタンブロットは、（Ｒ）−２−アミノ−６−［２−（３’−メトキシ−ビフェニル−３−イル）−エチル］−３，６−ジメチル−５，６−ジヒドロ−３Ｈ−ピリミジン−４−オンによる全長ＴＭＥＭ２７の保存および培養上清へのシェディングの随伴性の阻害を示す。
【００４６】
７．単離されたヒト膵島におけるＴＭＥＭ２７切断の測定によるＢＡＣＥ２阻害の検出。
図４：ＢＡＣＥ２阻害剤（Ｒ）−２−アミノ−６−［２−（３’−メトキシ−ビフェニル−３−イル）−エチル］−３，６−ジメチル−５，６−ジヒドロ−３Ｈ−ピリミジン−４−オンで処理されたヒトの膵島は、全長ＴＭＥＭ２７の保存を示す。１μＭ阻害剤存在下または非存在下で４８時間インキュベーションされた〜２０００膵島（男性；ＢＭＩ＝２３．４；１９歳）。ＴＭＥＭ２７は、上清では検出されないが、溶解細胞への効果は、明らかである。
【００４７】
Ｍｉｎ６細胞の増殖率の変化の測定によるＢＡＣＥ２阻害剤についてのアッセイ
１．細胞培養、継代、および保存
ａ）．培養
ＭＩＮ６  Ｂ１またはＩＮＳ−１ｅを、下表で記載される標準ＭＩＮ６培養培地または前述の基本ＩＮＳ-1培地で各々培養した。
標準完全ＭＩＮ６細胞培養培地：
【表６】
2012508588.tif 000008
培地を、週に２回交換した。
ｂ）．継代：
週に一度、細胞を、トリプシン処理する：細胞を、１回ＰＢＳでリンスし、２mlのトリプシンで３分間室温でインキュベーションし、１０mlの完全培養培地を添加し、そして３分割する。
必要に応じて、細胞を、１０mlの完全培養培地で再懸濁した後、細胞を、ノイバウエルチャンバーを用いて計数し、所望される細胞密度に希釈した。
ｃ）保存：
−〜１０ｘ１０６細胞を１mlの１０％ＤＭＳＯ含有ＦＣＳに再懸濁する。
−それらを凍結カプセルに移す。
−細胞を−８０℃に一晩置く。
−細胞を液体窒素に保存する。
【００４８】
２．細胞準備プロトコール
ウェルあたり５０，０００個のＭＩＮ６  Ｂ１細胞を、標準的なトリプシン処理方法で９６ウェルプレートに播種した。翌日、血清を補充した完全培地（前述）を取り除き、下記のように、化合物を補充された無血清および低グルコース培地（Invitrogen）に交換した：陽性対照として、１０ｎＭのｅｘｅｎｄｉｎ−４（Sigma-Aldrich）を、１２時間毎に細胞に添加し、分解を回避した。１μＭのＲＯ５１９９９６は、実験の開始に添加された。絶対的な陽性対照として、細胞は、ＦＣＳ補充標準培地でも培養した。細胞は、４８時間培養した。
培養後、培地を捨て、１０ｎＭのＥｄＵ（Invitrogen）を含んだ血清を補充した培地に交換し、３７度で１時間インキュベーションした。その後、製造業者の指示に従って、上清を注意深く取り除き、細胞を、固定し、透過処理し、適切な色素により染色した（Invitrogen、Ｃｌｉｃｋ−Ｉｔ ＥｄＵ  ｋｉｔ)。
【００４９】
３．増殖アッセイ：イメージ取得、顕微鏡
９６ウェル用スピニングディスク共焦点顕微鏡は、ハイスループット自動イメージングシステムＯｐｅｒａ（商標）ＱＥＨＳ（PerkinElmer Cellular Technologies、Hamburg、Germany）によって行われる。核染色（ヘキストまたはＤＡＰＩ）を、固体レーザー４０５nm走査によるか、または広視野照明におけるマーキュリーＵＶランプにより励起した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識された増殖マーカーを、４８８nmの固体レーザーで励起した。標識効率の違いがあるので、輝度とコントラストを最適化し、退色を最小化するため、全ての照明光源の励起強度および持続時間を実験毎に調整した（典型的には、５０ｍＷレーザー出力、４０−４００ｍｓ積分時間）。各ウェルにおいて、典型的には１２対の走査像を、ＵＡＰＯ  ２０ｘ  ＮＡ  ０．７水浸対物レンズ（Olympus）と最適化されたフィルターを通して、２つの独立した高量子効率１２ビットＣＣＤカメラ（１．３メガピクセルモノクロ）によって記録した。残差照明の不均一性、画像シフト、またはゆがみのいずれも、別々に取得した検定試料からの画像を用いて補正した。
【００５０】
４．増殖アッセイ：画像解析
共焦点顕微鏡写真を、著作権のあるソフトウェア環境であるPerkinElmer製Ｏｐｅｒａ（Ａｃａｐｅｌｌａ１．８、PerkinElmer Cellular Technologies、Hamburg、Germany）によって解析した。最初に、各細胞の位置を核染色像のセグメンテーションにより同定した。いったん核を位置付けそして輪郭と領域とを決定したら、核の位置のＥｄＵ染色像の強度を各細胞に対して定量化した。このような方法により、いずれの非特異的ＥｄＵ染色をも排除することができる。適切な閾値の適用後、増殖率を、ＥｄＵ陽性細胞の数を識別された細胞の総数で割ることにより算出した。従って増殖率は、レーザー強度、標識効率、またはフルオロフォアの輝度とは独立している。
【００５１】
５．増殖アッセイ：統計解析
実験的に決定された増殖率を、陽性対照（高ＦＣＳ濃度）および陰性対照（飢餓細胞）を含む、種々の処理条件より算出した。条件間の差の有意性を、二つの条件は同一の増殖率をもつという帰無仮説Ｈ０に対して、多重検定用Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を伴う逆正弦変換した増殖率の両側ｔ検定を用いて検定し、対応するｐ値により定量化した。
【００５２】
６．結果：増殖アッセイ
飢餓細胞の基礎増殖率と比較して、試験した三つの条件全て、すなわちＦＣＳ、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４、および（Ｒ）−２−アミノ−６−［２−（３’−メトキシ−ビフェニル−３−イル）−エチル］−３，６−ジメチル−５，６−ジヒドロ−３Ｈ−ピリミジン−４−オン（図５ａ）において、きわめて有意な増殖増加を示した（ｐ＜１０−６）。さらに、該ロシュ化合物は、増殖亢進においてＥｘｅｎｄｉｎ−４すらも有意に上回る。二つの異なる標本（プレートＡ、プレートＢ）は増殖に効果を示さないので（ｐ＝０．２１）、このアッセイの再現性を実証する。
【００５３】
図５ａ：Ｍｉｎ６細胞増殖の誘導。データは、ＴＭＥＭ２７の濃度を調節するために、ＢＡＣＥ２、ＴＭＥＭ２７または対照のｓiＲＮＡを形質転換した飢餓Ｍｉｎ６細胞の三回の独立した調製からである。増殖は、ＴＭＥＭ２７レベルに強く相関する。アッセイをまた、ＢＡＣＥ２阻害レベルと相関する増殖に対するＢＡＣＥ２の活性の読み出しとして用いることができる。
図５ｂは、図５ａのアッセイ中に用いられた細胞のウェスタンブロットを示す。
【００５４】
７．別の細胞システム：  Ｉｎｓ-１ｅ細胞
Ｉｎｓ１ｅアッセイを、細胞培養のために標準Ｉｎｓ１ｅ培地を用いたこと以外はＭｉｎ６細胞のためのと同じプロトコールを用いて行った。増殖を、１０μＭのＢｒｄＵを用いて３０分間のインキュベーションおよび製造業者のプロトコールに従ってＡｌｅｘａ４８８−抗ＢｒｄＵ（Invitrogen）抗体を用いて細胞を染色することにより測定した。
【００５５】
図６：ＢＡＣＥ２の阻害により誘導されるＩｎｓ１ｅ増殖の実証。ＢＡＣＥ２阻害剤（ＢＡＣＥ２  Ｉｎｈ）で処理された細胞は、低グルコース培地上で２日生育後の基底増殖率を伴う対照細胞よりも有意により高い（ｐ＜０．０５）増殖率を有する。
【００５６】
ＴＭＥＭ２７およびＡＣＥ２に由来するペプチドの切断の測定によるＢＡＣＥ２阻害剤のためのアッセイ
１．ＦＲＥＴアッセイの説明
ＦＲＥＴアッセイを、
【表７】
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中に実質的に記載されたように行った。要約すると、ペプチドを、プロテアーゼによって切断されるようにデザインする。該ペプチドを、Ｎ末端はダブシルでそしてＣ末端はルシファーイエローで標識し、そのためにインタクトなペプチドの場合はルシファーイエローの蛍光は、ダブシルによって消光される。該ペプチドが、ＢＡＣＥ２によってカットされると、その消光は、取り除かれ、蛍光シグナルが、発生する。
【００５７】
アッセイを、Grueningerら２００２中に記載されたように基質濃度５μＭを用いてｐＨ４．５でおこなった。全てのＦＲＥＴ‐ペプチドは、記載された形式を有する。
【００５８】
ＴＭＥＭ２７配列を基礎としたＦＲＥＴペプチドを考案した。ダブシル−ＱＴＬＥＦＬＫＩＰＳ−ＬｕｃＹ（配列番号１）。ＢＡＣＥ２は、周知のＡＰＰに基づく基質と関係のない、この配列に対して高い活性を有した。反対に、ＢＡＣＥ１は、このペプチドに対して有意でない活性を有する。
【００５９】
図７：種々のＦＲＥＴペプチドに対するＢＡＣＥ１とＢＡＣＥ２の活性の比較。ダブシルおよびルシファーイエローで標識されたＡＰＰに由来するペプチド、ＴＭＥＭ２７および無関係のタンパク質による、ＦＲＥＴアッセイの結果。該アッセイ中で用いられた該ペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
【表８】
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【００６０】
図８：ダブシルおよびルシファーイエローで標識されたＴＭＥＭ２７ペプチド（配列番号１）ならびに参照ＢＡＣＥ２阻害剤を用いたＦＲＥＴアッセイ用量反応曲線。ＢＡＣＥ２阻害を、同一のアッセイで測定する。この例では、各濃度の（Ｒ）−２−アミノ−６−［２−（３’−メトキシ−ビフェニル−３−イル）−エチル］−３，６−ジメチル−５，６−ジヒドロ−３Ｈ−ピリミジン−４−オンの該アッセイへの添加によってＢＡＣＥ２は、阻害される。ＦＲＥＴ活性は、阻害剤無しで得られた最大に対して正規化される。この化合物に対するＩＣ５０を、ＥｘｃｅｌのＸＬＦｉｔアドインによって計算されたように０．０８４μＭとする。
【００６１】
図９：ＴＭＥＭ２７中のＢＡＣＥ２切断部位に相当する部位でのＡＣＥ２の配列を基礎としたペプチドも、また考案し、そのペプチドはダブシル−ＮＳＬＥＦＬＧＩＱＰ−ルシファーイエロー（配列番号１４）配列を伴った。この基質は、ＴＭＥＭ２７基質に比べてより優れた効率でＢＡＣＥ２によって切断された。ＴＭＥＭ２７、ＡＰＰおよびアミリンの異なる領域に由来する別の基質は、より低い効率で切断された。該アッセイ中で用いられた該ペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
【表９】
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【００６２】
２．ＭＲ１２１アッセイの説明
関連するアッセイ中で、ペプチドを、Ｎ末端はＭＲ１２１でそしてＣ末端はトリプトファンで標識された同一配列を用いて考案した。
【００６３】
ＴＭＥＭ２７に由来する基質ペプチドとＭＲ１２１−ペプチド切断アッセイ中の活性。
【表１０】
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【００６４】
アッセイのためのＢＡＣＥ２の調製
ＢＡＣＥ２酵素外部ドメインを、
【表１１】
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中に記載されたように調製した。
【００６５】
発現システムの調製
ＢＡＣＥ２翻訳後アミノ酸配列中のアミノ酸２０−４６５に対応するＤＮＡ配列を、ＢＡＣＥ２配列が５’ＡＴＧでインフレームでありストップコドンによって終止されるように、ｐＥＴ１７ｂのＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローン化した。該プラスミドを、ｐＥＴ１７ｂ−ＢＡＣＥ２（ｅｃｄ）と名付けた。
【００６６】
ＢＬ２１（ＤＥ３；ｐＬｙｓＳ）細胞を、ｐＥＴ１７ｂ−ＢＡＣＥ２（ｅｃｄ）を用いて形質転換し、ＩＰＴＧ誘導性Ｅ.ｃｏｌｉ発現システムを得た。
【００６７】
これらの細胞を、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを補充した標準ＬＢ発現メディウムをＯＤ６００〜０．５まで生育した。ＩＰＴＧを、最終濃度１ｍＭまで添加する。インキュベーションを３７℃で３時間継続した。細胞を、３０００ｇで１０分間遠心により回収する。
【００６８】
ＩＢ調製
超音波処理またはConstant  Systems細胞粉砕器を用いての細胞の機械的破壊。
５０００ｇで１０分間遠心により封入体を回収する。
沈殿物を５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０で4回洗浄する。
沈殿物を最小量の変性バッファーで再懸濁する。
リフォールディング。
溶解されたタンパク質を変性バッファーで１０から２１mg/mlの間まで希釈する。
変性されたタンパク質を急速希釈により２０倍量のリフォールディングバッファーＩに希釈する。
穏やかに撹拌しながら一晩インキュベーションする。
急速希釈により２０倍量のリフォールディングバッファーＩＩに希釈する。
穏やかに撹拌しながら２〜５日間インキュベーションする。
【００６９】
精製
リフォールドされたタンパク質溶解液のリットル当たり３００mlの飽和硫酸アンモニウム（〜４Ｍ）を添加する。
【００７０】
ＨＩＣバッファーＢで前平衡化後、Ｈｉｐｒｅｐブチルセファロース６  ＦＦ  ＨＩＣカラムにアプライする。３ＣＶ  ＨＩＣバッファーＢで洗浄し、その後勾配でバッファーＡで溶出する。
【００７１】
大部分の活性画分が、プールされ、そして２０倍量の１０ｍＭトリスｐＨ８．０；１５０ｍＭ塩化ナトリウムに対して希釈された。
【００７２】
バッファー：
変性バッファー：５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、８．０Ｍ塩酸グアニジン、３０ｍＭジチオエリトリトール
リフォールディングバッファーＩ：３Ｍ塩酸グアニジン、０．７Ｍアルギニンベース、０．５ｍＭ  ＧＳＳＧ、１．０ｍＭ  ＧＳＨ  塩酸でｐＨ１０．４
リフォールディングバッファーＩＩ：１Ｍ塩化ナトリウム、０．７Ｍアルギニンベース、０．５ｍＭ  ＧＳＳＧ、１．０ｍＭ  ＧＳＨ  塩酸でｐＨ９．４
ＨＩＣバッファーＡ：１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０
ＨＩＣバッファーＢ：１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１Ｍ塩化ナトリウム、１．５Ｍ  ＡｍＳＯ４
アッセイバッファー：１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム
【００７３】
使用された抗体およびそれらの生成の説明。
１．９／２４抗体の産生のための全細胞免疫化
Ｓｗｉｓｓ系アルビノマウスの免疫化を、ｈＴＭＥＭ２７を安定に発現したＩＮＳ−１ｅ細胞を用いて生細胞の反復注入により行った。動物が、ｈＴＭＥＭ２７に対する特異的免疫応答を示すとすぐに、
【表１２】
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に従い脾臓細胞を取り出しＡｇ８細胞と融合した。
【００７４】
２．３／３および１／３３抗体の産生のためのタンパク質免疫化
いくつかのモノクローナル抗体を、精製ｈＴＭＥＭタンパク質（Ｅ．Ｃｏｌｉで産生された）を用いて２〜３週の間隔で動物を皮下免疫化し、その後の記載の通り脾臓細胞の融合により得た。
【００７５】
３．抗体の使用
９／２４抗体を、もっぱらＥＬＩＳＡのために使用した。１／３３を、シェディングされたタンパク質を検出するウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡのために使用した。３／３を、全長タンパク質を検出するウェスタンブロットのために使用した。１／３３および３／３抗体を、プロトコールによって必要なように標準的方法を用いて西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲーションした。
【００７６】
可溶性ＴＭＥＭ２７のためのＥＬＩＳＡアッセイの記載
１．アッセイプロトコール
標準的９６−ウェルイムノアッセイプレート中で
コーティング：ＴＭＥＭ２７−９／２４抗体、ＰＢＳ中で５μg/ml、１００μl/ウェル、４０Ｃで一晩
洗浄：ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２回
ブロッキング：Ｂ−バッファー、２００μl/ウェル、３７０Ｃで１時間
洗浄：ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２回
試料：培養上清、Ｂ−バッファーで希釈、５０μl/ウェル、３７℃で１時間
洗浄：ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回
コンジュゲート：Ｅｃ−１／３３−ＨＲＰＯ、Ｂ−バッファー中で１μg/ml、５０μl/ウェル、室温で１時間
洗浄：ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回
基質：１００μl/ウェル、５分、１００μl/ウェルの１Ｍ硫酸を用いた基質反応の停止
読み出し：４５０ｎｍでのＯＤの測定
【００７７】
本発明の好ましい態様をここに示しそして記載している一方で、本発明がそれに限定されず、しかし以下の請求項の範囲に含まれて他の方法で様々に具体化されそして実践されるであろうことを、明確に理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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