(57)【要約】  多重欠失株細菌の治療有効量を被験者に投与することを含む、被験者の敗血症の予防または治療方法。
2012517472.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重欠失株細菌の治療的または予防的有効量を含む組成物を、それを必要とする動物に投与することを含む、敗血症の治療および／または予防方法。
【請求項２】
前記多重欠失株細菌が大腸菌多重欠失株である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記多重欠失株細菌が、その野生親株のゲノムよりも少なくとも5%小さいように遺伝子操作されたゲノムを持つ、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記多重欠失株細菌が、その野生親株のゲノムよりも少なくとも7%小さいように遺伝子操作されたゲノムを持つ、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記多重欠失株細菌が、その野生親株のゲノムよりも少なくとも14%小さいように遺伝子操作されたゲノムを持つ、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記多重欠失株細菌がMDS42である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記多重欠失株細菌が、その野生親株のゲノムよりも少なくとも19%小さいように遺伝子操作されたゲノムを持つ、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記多重欠失株細菌がMDS66である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記多重欠失株細菌の治療的有効量が、追加的治療レジメンの前、最中または後に投与される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１０】
前記多重欠失株細菌が生きた多重欠失株細菌である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１１】
前記大腸菌多重欠失株が機能msbB遺伝子を欠いている、請求項2に記載の方法。
【請求項１２】
前記多重欠失株がリポ多糖の生産に関与する1つ以上の遺伝子を欠いている、請求項2に記載の方法。
【請求項１３】
前記1つ以上の遺伝子が、大腸菌染色体のヌクレオチド3792010と3806121の間のrfa遺伝子クラスターに位置している、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記1つ以上の遺伝子が、rfaI、rfaJおよびrfeから成るグループから選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記多重欠失株が腸内一般抗原の生産に関与する1つ以上の遺伝子を欠いている、請求項2または12に記載の方法。
【請求項１６】
前記1つ以上の遺伝子が、大腸菌染色体のヌクレオチド3965939と3980295の間に位置している、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が動物に単回投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が動物に複数回投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が毎週投与される、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記動物が人である、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
前記多重欠失株細菌が、以下から成るグループから選択された1つ以上の遺伝子の削除を含む、請求項2に記載の方法。
大腸菌K-12株MG1655のb2190; b2191; b2192; b3215; b3216; b3217; b3218; b3219; b3504; b3505; b1070; b1071; b1072; b1073; b1074; b1075; b1076; b1077; b1078; b1079; b1080; b1081; b1082; b1083; b1878; b1879; b1880; b1881; b1882; b1883; b1884; b1885; b1886; b1887; b1888; b1889; b1890; b1891; b1892; b1893; b1894; b1917; b1918; b1919; b1920; b1921; b1922; b1923; b1924; b1925; b1926; b1927; b1928; b1929; b1930; b1931; b1932; b1933; b1934; b1935; b1936; b1937; b1938; b1939; b1940; b1941; b1942; b1943; b1944; b1945; b1946; b1947; b1948; b1949; b1950; b4324; b4325; b4326; b4327; b4328; b4329; b4330; b4331; b4332; b4333; b4334; b4335; b4336; b4337; b4338; b4339; b4340; b4341; b4342; b4345; b4346; b4347; b4348; b4349; b4350; b4351; b4352; b4353; b4354; b4355; b4356; b4357; b4358; b4486; b0497; b0498; b0499; b0500; b0501; b0502; b0700; b0701; b0702; b0703; b0704; b0705; b0706; b1456; b1457; b1458; b1459; b1460; b1461; b1462; b3481; b3482; b3483; b3484; b3592; b3593; b3594; b3595; b3596; b0981; b0982; b0983; b0984; b0985; b0986; b0987; b0988; b1021; b1022; b1023; b1024; b1025; b1026; b1027; b1028; b1029; b2080; b2081; b2082; b2083; b2084; b2085; b2086; b2087; b2088; b2089; b2090; b2091; b2092; b2093; b2094; b2095; b2096; b4438; b3440; b3441; b3442; b3443; b3444; b3445; b4451; b3556; b3557; b3558; b4455; b1786; b0150; b0151; b0152; およびb0153。
【請求項２２】
多重欠失株細菌および製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項２３】
前記多重欠失株細菌がMDS42である、請求項22の組成物。
【請求項２４】
前記多重欠失株細菌がMDS66である、請求項22の組成物。
【請求項２５】
動物の敗血症の治療または予防のための請求項22の組成物の使用。
【請求項２６】
動物の敗血症の予防または治療のための、多重欠失株細菌の治療的有効量を含む組成物の薬剤の製造における使用。
【請求項２７】
治療および／または予防されるべき敗血症がグラム陰性細菌への暴露によって起こる、請求項1に記載の方法。
【請求項２８】
グラム陰性細菌が大腸菌である、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記多重欠失株細菌が、MDS66から削除されたDNAセグメントを少なくとも欠失している、請求項7に記載の方法。
【請求項３０】
前記多重欠失株細菌が、MDS66から削除されたDNAセグメントを少なくとも欠失している、請求項22に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は2009年2月12日出願の米国仮出願番号61/152,125の利益を主張し、その内容は参照により本書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、敗血症の治療または予防のための物質および方法を対象とする。本発明は、敗血症の症状の少なくとも1つの治療または予防のための物質および方法も対象とする。より具体的には、本発明は、哺乳動物に非必須要素を欠く縮小ゲノム細菌を導入することを含む、敗血症の治療または予防方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
一般に血液中毒として知られている敗血症は、重度の疾患で、人および他の哺乳動物における罹患率と死亡率の主な原因となっている。敗血症は依然として入院患者の第一の死亡原因である（Martin G.S. et al., N. Engl. J. Med., 348(16):1546-1554 (2003)）。疾病管理予防センターによると、米国では敗血症は非冠動脈内科治療室（ICU）の患者の第二の死亡原因で、全体では十番目に一般的な死亡原因である。世界的に敗血症はICUでの第一の死亡原因で、死亡率は疾患のステージによるが20%から60%に上る。
【０００４】
敗血症は、一般的に初期症状として悪寒、発汗、断続的な発熱、これに続いて、持続的発熱、ショックをもたらす低血圧、好中球減少、白血球減少、播種性血管内凝固症候群、成人呼吸窮迫症候群および多臓器不全を伴う、血液中の病原菌（またはそれらの毒素）に対する急性全身性炎症を特徴とする。敗血症の症状のほとんどは、感染に対する宿主の免疫反応から生じると考えられている。この宿主反応は全身性炎症反応症候群（SIRS）と呼ばれており、血行動態の悪化および結果生じる代謝異常を特徴とする。
【０００５】
病原菌と関連して発見されている敗血症誘発毒素には、敗血症のほとんどの症例の主な病原菌である大腸菌、肺炎桿菌および緑膿菌などのグラム陰性細菌に特有のエンドトキシンまたはリポ多糖類（LPS）がある。LPS分子は、すべてのグラム陰性細菌の細胞表面に見られる重要な外膜糖脂質である。LPSのA領域の宿主による認識は、敗血症の病態生理変化の多くを引き起こす。LPSは、人におけるグラム陰性敗血症の主要な死因であると考えられている。血漿中、LPSは細菌の細胞壁から放出され、さまざまな循環脂質およびタンパク質と複合体を形成する。遊離または複合LPSは、免疫反応で重要な多くの宿主細胞タイプ（樹枝状細胞、腸上皮、マクロファージおよび単球を含む）上にあるトール様受容体を介して働くことにより、炎症を活性化する。これらの受容体を活性化する細菌（主要エンドトキシン／LPS）およびウイルスからの分子は、病原体特異的分子パターン（PAMPS）と呼ばれる。トール様受容体と結合すると、PAMPSは転写因子NF-κBの発現を誘発し、これは次に腫瘍壊死因子α、インターロイキン1およびインターロイキン6などの炎症性サイトカインのカスケードの放出を起こす。これらの因子は炎症の早期関与物質で、正しく制御された場合、限局性炎症および治癒をもたらす発現のパターンに従う。しかし、このシステムの（例えば、PAMPSによる）過剰活性化は、これらのサイトカインの全身性放出を生じ、動物と人の両方において菌血症（すなわち、血液中の細菌）での過剰な炎症反応、細胞傷害および特に末梢血管の血流の変化につながる。LPS暴露のこれらの作用は、肺への炎症細胞の蓄積、およびそれに続く酸素ラジカルの生産につながり、これは肺内皮を損傷し、しばしば死をもたらす急性呼吸窮迫症候群を引き起こす。
【０００６】
ダメージ関連分子パターン（DAMPS）も、わずかに変更された同じ受容体補体を活性化することによってこのシステムを誘発する。細菌性またはウイルス病原体（またはエンドトキシン／LPS）から放出されるPAMPSとは異なり、DAMPSは以下の細胞損傷または疾患から放出される。PAMPSと同様、DAMPSは全身性炎症を誘発し、これもまた外傷患者の主な死亡原因である。
【０００７】
病原菌による血液の感染は、しばしば病因環境で起こり、外科処置、免疫抑制がんまたは移植治療、免疫不全疾患および静脈カテーテルを介した暴露によって生じ得る。また、外傷および熱傷の被害者は敗血症を発症するリスクがある。
【０００８】
敗血症被験者の現在の治療レジメンには、広域スペクトル抗生物質の静脈投与、血圧を上げるための昇圧剤、および活性化タンパク質Cおよび／または炎症を抑制するためのコルチコステロイドが含まれる。しかし、これらの治療レジメンの効果は限定的である。
【０００９】
LPSの敗血症との関連のため、重要な研究は、疾患の早期段階でLPSの成分に対して患者に免疫付与することに焦点を置いてきた（Ziegler E.J. et al., N. Engl. J. Med., 307(20):1225-1230 (1982); Cross A.S. et al., Vaccine, 22(7):812-817 (2004)）。このアプローチの1つの問題は、ワクチンを生産するために使用される大腸菌株が、その使用を厄介にする多くの有害遺伝子およびタンパク質を含むことである。
【００１０】
抗生物質および他の治療の積極的な使用にもかかわらず、敗血症の死亡率は依然として高い。現在の敗血症の治療レジメンの限定的有効性および欠点を考えると、敗血症の治療または予防のための組成物および方法に対するニーズが存在する。
【発明の概要】
【００１１】
1つの実施態様では、本発明は、多重欠失株（MDS）細菌（あるいは本明細書において「縮小ゲノム」または「クリーンゲノム」と呼ばれる）の有効量および随意に1つ以上の担体および／または賦形剤を含む、敗血症の治療または予防のための医薬組成物を提供する。MDS細菌は、選択された遺伝子を細菌の野生親株から削除することによって作られるか、または例えば、敗血症の治療または防止に対して治療薬の役割を果たすのに効果的な細菌を提供するために選択された事前選択遺伝子の集合として完全に合成され得る。本明細書の検討から明らかなように、MDS細菌は、それと比較され、特定の必須遺伝子を共有する野生親株で見られる遺伝子の総数よりも少ない遺伝子を持つ。リポ多糖および／または腸内一般抗原の生産に関与する遺伝子を欠くMDS細菌を含む、敗血症の治療または予防用の組成物もまた提供される。1つの態様では、治療および／または予防されるべき敗血病は、1つ以上のグラム陰性細菌への暴露から起こる。関連する態様では、治療および／または予防されるべき敗血病は、大腸菌細菌への暴露から起こる。
【００１２】
菌血症を持つまたは持つことが疑われる被験者に組成物を投与することを含む、敗血症の治療方法も提供される。関連する実施態様では、本発明の組成物は、敗血症の治療の組み合わせ治療レジメンの1つの成分として投与され得る。その際、本発明の組成物は、敗血症の治療のためのいかなる治療薬の投与の前、最中または後に投与され得る。例えば、本発明の縮小ゲノム細菌は、昇圧剤、活性化タンパク質C、コルチコステロイド、インスリンおよび／または鎮痛剤と組み合わせて使用され得る。
【００１３】
本組成物および方法は、現在の治療レジメンよりも多くの利点を敗血症の治療に提供する。例えば、大腸菌などの他のグラム陰性細菌で見られる有害な遺伝因子の多くが除去される可能性があるため、MDS細菌は、敗血症ワクチンに関連する問題の多くを除外する可能性がある。さらに、エンドトキシン／LPSに寄与する細菌細胞壁の成分が除去され得る。
【００１４】
本発明のこれらおよび他の実施態様を、以下に詳細に記述する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図1は大腸菌の表面での関連LPS構造およびオリゴ糖合成の概略図である。新生オリゴ糖は、内膜中の円として示されているウンデカプレニルリン酸担体上に集合し、次にさらなる処理のために回転してペリプラズム中に入る。LPSは、示されている脂質A、中心核およびオリゴ糖領域とともに示されている。一般の大腸菌株（左）およびO抗原を欠く大腸菌株K-12中のLPSが図示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明はさまざまな形式で具体化できるが、いくつかの実施態様の以下の説明は、本開示が本発明の例証として考慮されるべきであり、例示された特定の実施態様に限定されることを意図するものではないという了解のもとで行われている。見出しは便宜上提供されており、どのような形でも本発明を限定すると解釈されるべきではない。見出しのもとに示されている実施態様は、他のいずれの見出しで示されている実施態様と組み合わせることができる。
【００１７】
本出願で指定されるさまざまな範囲の数値の使用は、他に特に指定のない限り、記載範囲の最小・最大値の両方の前に「約」という言葉がついている場合と同じように、近似として記載されている。その際、記載範囲のわずかに上または下の変化量を使用して、範囲内の値と実質的に同じ結果を達成し得る。本明細書で使用される場合、数値に言及する時の「約」および「およそ」という用語は、問題の関連技術の当業者にとって明白で通常の意味を持つものとする。また、範囲の開示は、記載されている最小値と最大値の間のすべての値およびこのような値によって形成され得るいかなる範囲を含む、連続的範囲を対象とする。これには、有限の上限および／または下限を含むかまたは含まないで形成され得る範囲を含む。これにはまた、いずれの開示数を別の開示数で割ることによって導き出される比率も含まれる。従って、当業者であれば、多くのこのような比率、範囲、および比率の範囲は、本明細書に示されたデータおよび数字から明確に導かれ、すべてが本発明のさまざまな実施態様を説明することを理解する。
【００１８】
本明細書の「多重欠失株（MDS）」という用語は、例えば、約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%または約60%のゲノムが削除されているなど、そのゲノムの約1%〜約75%が削除されている細菌を意味する。1つの実施態様では、本発明の実施に使用されているMDS細菌は、好ましくは、野生親株のゲノムよりも少なくとも2%から最大20%小さくなるように遺伝子操作されたゲノムを持つ。好ましくは、ゲノムは野生親株のゲノムより少なくとも7%小さい。さらに好ましくは、ゲノムは、野生親株のゲノムより8%から14%、20%（その間のいかなる数を含む）またはそれ以上小さい。または、ゲノムは、野生親株のゲノムよりも20%未満小さくなるように操作されていることがある。「野生親株」という用語は、一般的に科学界で理解されているように天然または野生環境で見られ、より小さなゲノムの細菌株を作るためにそのゲノム上で一式の削除を行うことができる細菌株を意味する。野生親株はまた、それに対して組み換え株を比較する株も指し、ここで組み換え株は、野生親株の総数よりも少ない数を持つ。一連の削除の後にゲノムが何パーセント小さくなったかは、「すべての削除後に削除された塩基対の総数」を「すべての削除前のゲノム中の塩基対の総数」で割った後、100を乗じて算出される。同様に、ゲノムが野生親株より何パーセント小さいかは、小さいゲノムを持つ株（それが作られたプロセスにかかわらない）のヌクレオチドの総数を、野生親株のヌクレオチドの総数で割った後、100を乗じて算出される。
【００１９】
1つの実施態様では、「MDS細菌」という用語は、上記の量のゲノムの除去が、最少培地上で微生物が成長する能力に容認し難いほど影響しない細菌を指す。この文脈では、2つ以上の遺伝子の除去が、最少培地上で微生物が成長する能力に「容認し難いほど影響する」かどうかは、特定の用途に依存する。例えば、増殖率の30%の減少は、1つの用途では許容されるかもしれないが、別の用途では許容されないことがある。さらに、ゲノムからDNA配列を削除することの悪影響は、培養条件を変更するなどの措置によって低減され得る。このような措置は、そうでなければ許容できない悪影響を許容できるものに変える可能性がある。1つの実施態様では、増殖率は親株とほぼ同じである。しかし、親株の増殖率よりも約5%、10%、15%、20%、30%、40%から約50%低い範囲の増殖率は、本発明の範囲内である。さらに具体的には、本発明の細菌の倍増時間は、約5分から約3時間の範囲である。適切なMDS細菌および大腸菌などの細菌からDNAを削除する方法の限定されない例は、米国特許番号6,989,265および7,303,906、米国特許公開番号20060270043、2006/0199257および2007/0054358、WIPO公開番号WO 2003/070880に公開されており、これらのそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれる。
【００２０】
大腸菌、サルモネラ、シゲラ・フレックスネリおよび他のグラム陰性菌を含むがこれに限定されないさまざまな細菌株を、本発明の実施態様に使用できる。好ましい実施態様では、多重欠失細菌株は大腸菌である。適切な多重欠失大腸菌株の例には、MDS39、MDS40、MDS41-R13、MDS41E、MDS42、MDS42msbB、MDS42eca、およびMDS66を含むがこれに限定されない。
【００２１】
標的細菌株のDNA配列の少なくとも一部が利用できると考えられる。好ましくは、配列全体が利用できる。このような完全または部分的配列は、GenBankデータベースで容易に入手可能である。GenBankで配列を見つけることのできる一般的に使用される他のいくつかの研究用細菌の配列と同じように、大腸菌のいくつかの株の完全ゲノム配列が公表されている（例えば、Blattner et al, Science, 277:1453-74, 1997 K-12 Strain MG1655、またGenBank受入番号U00096、Perna et al, Nature, 409, 529-533, 2001、Hayashi et al, DNA Res., 8, 11-22, 2001、およびWelch et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA (2002) 99 (26) 17020-17024 およびGenBank 受入番号AE014075も参照）。
【００２２】
さまざまなタンパク質コード遺伝子を削除してMDS細菌を形成し得る。大腸菌および他の細菌では、削除し得るDNA配列のタイプには、一般的に微生物またはその微生物の遺伝子産物の安定性に悪影響を与えるものを含む。不安定性を生じさせるこのような要素には、転移因子、挿入配列、およびゲノムの不安定性の一因となり得る他の「利己的DNA」要素を含むがこれに限定されない。例えば、挿入配列（IS）因子およびその関連転置は細菌ゲノムでしばしば見られ、そのため削除の標的となる。IS配列は大腸菌では一般的であり、そのすべてが削除され得る。この文書では明確性のために、IS因子および転移因子という用語を一般的に、完全か不完全かにかかわらず、ゲノムの一点から他点に移動できるDNA要素を指すために使用する。科学および技術におけるIS因子の悪影響の例として、これらはシークエンシングのための増殖中に宿主大腸菌のゲノムからBACプラスミドに跳ぶことができるという事実が挙げられる。このアーチファクトは、すべてのIS因子を宿主細胞から削除することによって防止され得る。特定の用途に対しては、ゲノムの不安定性に関連している他の特定の遺伝子も削除され得る。
【００２３】
本発明のMDS細菌は、例えば、その細菌の成長および代謝に必要のない特定の遺伝子、偽遺伝子、プロファージ、好ましくない内因性制限修飾遺伝子、病原性遺伝子、毒素遺伝子、線毛遺伝子、ペリプラズムタンパク質遺伝子、インバシン遺伝子、リポ多糖遺伝子、クラスIII分泌系、ファージ毒性決定因子、ファージ受容体、病原性島、RHS因子、未知機能の配列、および細菌の同じ野生親種の2つの株の間で共通ではない配列（これに限定されない）を欠くようにも操作され得る。細胞の生存のために必要のない他のDNA配列も削除または除外され得る。
【００２４】
大腸菌などのグラム陰性細菌は、生存のためにリポ多糖の最小構造要素を少なくとも必要とし、これらの構造の生合成に必要な経路をコードする遺伝子の大規模な削除は致死的である。しかし、LPS合成に関与する一部の遺伝子は必須ではなく、細胞はこれらの特定遺伝子の機能の削除または損失に耐えることができる。
【００２５】
LPSの脂質A成分は、グラム陰性細菌の生存に必要な最小構造である。脂質Aは敗血症で高度に保存され、一対の修飾N-アセチルグルコサミン糖に結合された少なくとも4つの長鎖脂肪アシル基から成る。長鎖脂肪アシル基は、第二級脂肪酸によってアシル化され得る。脂質Aに最も近接しているオリゴ糖は中心核と呼ばれ、既存の脂質Aに連続的に追加される。内部中心核の糖は敗血症に特異的で、外部中心核の糖は一般的にそうではない。外部中心核の糖に結合した追加的オリゴ糖は、ウンデカプレニルリン酸担体に埋め込まれた膜の上で合成され、事前形成反復単位として成熟LPSに追加される。これらの事前形成反復オリゴ糖には、O抗原、M抗原（コラン酸）および腸内一般抗原（ECA）を含む。図1を参照。
【００２６】
1つの実施態様では、MDS細菌はリポ多糖の生産に関与するかまたは必要な遺伝子の1つ以上を欠いている。リポ多糖の生産に関与および／または必要な遺伝子は当技術分野では知られており、例えば、『Reeves, P and Wang, L (2002). Genomic organization of LPS-specific loci. Curr Top Microbiol Immunol 264 (1): 109-35』および『Patil, P et al., (2004). Variation suggestive of horizontal gene transfer at a lipopolysaccharide (lps) biosynthetic locus in Xanthomonas oryzae pv. oryzae, the bacterial leaf blight pathogen of rice. BMC Microbiol 4 (1): 40』に開示されており、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
【００２７】
好ましい実施態様では、削除のための候補遺伝子には、リポ多糖のO抗原および／またはM抗原（コラン酸）の生合成に関与するかまたは必要な遺伝子の1つ以上を含む。大腸菌K-12誘導体は、IS5によるwbbL遺伝子の破壊のために、O抗原を完全に合成できない。しかし、この株は、その遺伝子クラスターがO抗原性合成に関与する多くのものと共局在するM抗原などの他のオリゴ糖を依然として生産できる。大腸菌染色体のヌクレオチド3792010と3806121の間のrfa遺伝子クラスターは削除され得る。rfa遺伝子クラスターの削除は、OおよびM抗原オリゴ糖の両方を削除するように見える。リポ多糖の生産に関与または必要な例示的遺伝子には、rfaI、rfaJ、rfe遺伝子が含まれ、これらは個別にまたは組み合わせて削除できる。
【００２８】
別の好ましい実施態様では、MDS細菌は、腸内一般抗原（ECA）の生産に関連する遺伝子の1つ以上の欠失、すべての腸内細菌科に共通の反復三糖炭水化物成分を含み、この一部はLPSと関連している。ECA遺伝子は一般的に、大腸菌染色体上のヌクレオチド3965939と3980295の間に群がっており、rfeとyifKの間の13個の遺伝子を含む。
【００２９】
特に好ましい実施態様では、MDS細菌は機能msbB遺伝子を欠いている。MsbBは、脂質Aの第一β-ヒドロキシ・ミリストイル成分へのβ-ヒドロキシミリスチン酸のO-アシル結合（すなわち第二のアシル化）を触媒するミリストイル・アシルトランスフェラーゼをコードしている。この遺伝子の削除は、ヒト組織培養細胞でTNFαを刺激する能力が1000〜10,000倍低減少した細胞を作り出す（Sommerville et al., J. Clin. Invest. 1996 97:359）。しかし、MG1655 msbB突然変異体は、カイネティック発色リムルスアメーバ様細胞溶解物（CLAL）分析で測定した場合、エンドトキシンレベルが低下しているようには見えない（未発表の観察）。好ましい実施態様では、MDS細菌は機能msbB遺伝子を欠いている。
【００３０】
別の好ましい実施態様では、MDS細菌は、LPSの外側中心核の生合成に関与する遺伝子の1つ以上を欠いている。LPSの外側中心核の生合成に関与する例示的遺伝子には、waaL、waaV、waaW、waaY およびwaaTを含むがこれに限定されない。
【００３１】
さまざまな実施態様で、本発明は敗血症の予防および／または治療のための方法を提供する。このような治療を必要とする被験者には、細菌病原体（菌血症）またはウイルス病原体などの病原体が血液中に存在するリスクのあるまたはこれを患っている者を含む。本発明から特に恩恵を受けることのできる被験者は、グラム陰性細菌、特に大腸菌による感染のリスクがあるまたはこれを患っている者である。敗血症のリスクがある被験者は、熱傷、銃創、薬物中毒または乱用による腎臓または肝臓不全などを患っている者を含む。
【００３２】
1つの実施態様では、本発明は、多重欠失株細菌の治療的有効量を被験者に投与することを含む敗血症の治療および／または予防のための方法を、このような治療を必要とする被験者に提供する。多重欠失株細菌は生きた細菌として投与でき、また1つ以上の毒性因子の不活化によって弱毒化できる。あるいは、多重欠失株細菌は、死菌として投与され得る。
【００３３】
1つの態様では、本発明は、症状の発現前（例えば予防的）に多重欠失株細菌を含む組成物を被験者に投与することを検討する。特に、本発明は、多重欠失株細菌を含む組成物を、外科患者、化学療法および／または放射線療法を受けているがん患者（特に急性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病、または非ホジキンリンパ腫を持つ患者）、熱傷被害者、外傷患者、および細菌の血流中への導入を引き起こす何らかの病的状態を持つ患者を含むがこれに限定されない、敗血症のリスクの高い被験者に投与することを検討する。敗血症を発症するリスクの高い他の被験者には、以下の状態の1つ以上を持つ患者を含むがこれに限定されず、これらのそれぞれは敗血症の根本原因である可能性がある。先天性微じゅう毛萎縮症、大脳皮質基底核変性症、ディール・バラット・ディロン症候群、熱潰瘍性ムーシャ・ハーベルマン病、野兎病菌感染、連鎖球菌感染、ヒストプラスマ症、リステリア症、水がん、膵臓膿瘍、鎌状赤血球貧血、シンプソン・ゴラビ・ベーメル症候群タイプ2、横隔膜下膿瘍、中毒性表皮剥離症、およびウォーターハウス・フリードリクセン症候群。敗血症を発症するリスクの高いさらなる被験者には、上部尿路感染を持つ被験者、細菌性肺炎を持つ被験者および皮膚感染（例えば蜂巣炎）を持つ被験者が含まれるがこれに限定されない。敗血症を発症するリスクの高いさらなる被験者には、腹膜炎を持つ被験者および炎症性腸疾患（クローン病および／または潰瘍性大腸炎）を持つ被験者が含まれるがこれに限定されない。前述の疾患のいずれかを持つ被験者には、敗血症を予防するために、多重欠失株細菌を含む組成物の予防的に有効な量を投与し得る。
【００３４】
別の態様では、本発明は、病原体（例えば菌血症）が検出され、および／または敗血症が疑われた後に、多重欠失株細菌を含む組成物を被験者に投与することを検討する。菌血症の兆候には（1）中核体温が38°Cより高いまたは35°Cより低い、（2）末梢血白血球数が12x109/Lを超えるまたは3x109/L未満、（3）血液培養からのグラム陰性細菌の成長が見られる、または（4）グラム陰性感染が確認されたまたは疑われる部位が見られる、などがある。
【００３５】
別の態様では、本発明は、多重欠失株細菌を含む組成物を敗血症を持つ被験者に投与することを検討する。全身性敗血症反応は、以下のうちの少なくとも1つによって特徴付けられる。（1）動脈低血圧（収縮期血圧 < 90mm hgまたは30 mm Hgの急激な低下）、（2）代謝性アシドーシス（塩基欠乏 > 5 mEq/L）、（3）全身性血管抵抗減少（全身性血管抵抗 < 800 dynes/s/cm5）、（4）多呼吸（呼吸数 > 20/分または人工呼吸器装着の場合は換気 > 10 L/分）または（5）他の理由では説明できない腎不全（尿量 < 30 ml/時）または肺。好ましくは、本発明の組成物は、可能な場合は全身性感染症の前に被験者に投与される。
【００３６】
関連する実施態様では、本発明は、敗血症の症状の1つ以上を治療および／または予防するための方法を提供し、これにはこのような治療を必要とする被験者に多重欠失株細菌の治療的有効量を投与することを含む。本発明に従って予防または治療することのできる敗血症の症状には、発熱、低血圧、好中球減少、白血球減少、血小板減少、ショック、および多臓器不全を含むがこれに限定されない。
【００３７】
別の実施態様では、本発明は、全身性炎症を治療および／または予防するための方法を提供し、これにはこのような治療を必要とする被験者に多重欠失株細菌の治療的有効量を投与することを含む。本発明の組成物で治療または予防され得る全身性炎症は、細胞損傷または疾患の際に放出されるダメージ関連分子パターン（DAMPS）によって仲介されるか、または細菌（例えば菌血症）またはウイルス病原体などの病原体による感染の際に放出される病原体特異的分子パターン（PAMPS）によって仲介されることがある。理論に束縛されることを望むものではないが、本発明の組成物の投与は、そうでなければ無害のMDS66などの多重欠失株細菌で低レベルのPAMP活性化を誘導することによって、DAMP仲介全身性炎症を予防することが期待される。
【００３８】
別の実施態様では、本発明は、全身性炎症に関連した状態の1つ以上を治療および／または予防するための方法を提供し、これにはこのような治療を必要とする被験者に多重欠失株細菌の治療的有効量を投与することを含む。本発明の組成物で治療または予防され得る全身性炎症は、細胞損傷または疾患の際に放出されるダメージ関連分子パターン（DAMPS）によって仲介されるか、または細菌（例えば菌血症）またはウイルス病原体などの病原体による感染の際に放出される病原体特異的分子パターン（PAMPS）によって仲介されることがある。
【００３９】
別の実施態様では、本発明は、多重欠失株細菌の治療的有効量を投与することを含む治療方法を提供し、ここで前述の多重欠失株細菌は大腸菌多重欠失株である。
【００４０】
関連する実施態様では、本発明は、大腸菌多重欠失株細菌の治療的有効量を投与することを含む治療方法を提供し、ここで前述の大腸菌多重欠失株細菌は、リポ多糖の生産に関与する遺伝子の1つ以上を欠いている。好ましい実施態様では、大腸菌多重欠失株は機能msbB遺伝子を欠いている。別の好ましい実施態様では、大腸菌多重欠失株は、rfaI、rfaJおよびrfeから成るグループから選択された遺伝子の1つ以上を欠いている。
【００４１】
関連する実施態様では、本発明は、大腸菌多重欠失株細菌の治療的有効量を投与することを含む治療方法を提供し、ここで前述の大腸菌多重欠失株細菌は、腸内一般抗原の生産に関与する遺伝子の1つ以上を欠いている。好ましい実施態様では、前述の1つ以上の遺伝子は、大腸菌染色体上のヌクレオチド3965939と3980295の間に位置している。
【００４２】
1つの実施態様では、多重欠失株細菌の治療的有効量は、敗血症の治療の組み合わせ治療レジメンの1つの成分として、被験者に投与される。その際、本発明の組成物は、敗血症の治療のための1つ以上の追加的治療薬の投与の前、最中または後に投与され得る。例えば、本発明の縮小ゲノム細菌は、昇圧剤、活性化タンパク質C、コルチコステロイド、鎮痛剤などと組み合わせて使用され得る。関連する実施態様では、本発明の組成物の被験者への投与に続いて、典型的にはゲンタマイシンなどのアミノグリコシドまたはペニシリン、セファロスポリンなどのベータラクタムなどの抗生物質による治療を行い得る。抗生物質の投与は約24時間以内、約48時間以内、約72時間以内、約96時間以内またはその間のいかなる時間に行ってもよいが、一般的には被験者の敗血症の1つ以上の症状が改善した後に行われる。
【００４３】
タンパク質Cは、肝臓で不活性形として生産されるビタミンK依存セリン・プロテアーゼで、その後血漿中を循環し、内皮細胞の表面でトロンビンによって活性化される。活性化された時、タンパク質Cは凝固を阻害する。活性化タンパク質C製剤は、敗血症患者への投与に対してFDAの承認を得ており、XIGRISTMという商標名でイーライリリーが販売している。
【００４４】
本発明の治療組成物は、多重欠失株細菌の治療的有効量に加えて、製薬上許容可能な担体および／または水、細菌培養液、グリセロール、およびリン酸緩衝生理食塩水などの賦形剤の1つ以上を含む場合がある。
【００４５】
本発明の治療組成物は、他の治療薬と同様の方法で、動物への使用として家畜などの動物に投与される場合があり、また人での臨床使用として投与されることがある。例えば、本発明の治療組成物は、ニワトリ、七面鳥、ブタ、ヒツジ、畜牛、ヤギ、バッファロー、霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、およびマウスに投与され得るがこれに限定されない。1つの実施態様では、本発明の治療組成物は、ニワトリおよび七面鳥、特に若いニワトリと七面鳥などの鳥で一次的または二次的大腸菌感染から生じる敗血症を予防するために投与され得る。大腸菌感染（およびその結果生じる症状）はしばしば大腸菌の株によって引き起こされる。
【００４６】
多重欠失株細菌を含む本発明の組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、経口、経肛門または同様の方法で投与され得る。「単位用量」という用語は、本発明の治療組成物に関連して使用される場合、ヒトに対する単一用量として適切な物理的不連続単位を指し、各単位は、望ましい治療効果をもたらすように算出された多重欠失株細菌の所定量を含む。多重欠失株細菌は、ある期間にわたって望ましい用量を送るように設定されたカテーテルまたは注入ポンプを通して被験者に投与することもできる。
【００４７】
本発明の組成物は、用量製剤に適合性のある方法で、かつ治療的有効量を投与される。投与される量は、治療される被験者により異なる。投与するのに必要な細菌の正確な量は、医師の判断により決められ、各個人に固有な場合がある。しかし、適切な用量範囲は、細菌103〜1015個の次数で、投与経路による。治療用量は一般的に、予防的治療で必要な用量よりもおそらく高いことに留意する。敗血症を阻止または改善するために被験者を治療する場合、被験者の臨床兆候を定期的に測定し、細菌の用量を適宜調整する。例えば、被験者のフィブリン分解生成物およびフィブリノーゲンレベルの頻回な測定がモニターされることがある。バイタルサインおよび白血球数の経時的変化の測定もモニターされ得る。深刻なけがの最初の数時間など、敗血症が臨床的にはまだ明らかになっていないものの、起こる事が予想される状況では、本発明の組成物の投与を始めてもよい。敗血症が臨床的に明らかになった状況では、敗血症の症状の少なくとも1つを低減するように本発明の組成物を投与する。
【００４８】
「治療的有効量」または「予防的有効量」という語句は、本明細書で使用される場合、敗血症に関連する状態の1つ以上を治療または予防するのに十分な量を意味する。
【００４９】
本発明の組成物は、患者に1回投与するか、またはある期間にわたって繰り返し患者に投与できる。例えば、敗血症を発症するリスクのある患者に1回用量を投与し、その後患者の状態をモニターし得る。または、追加期間にわたって、患者に複数用量を投与することがある。追加期間は、1〜約4週間であり得る。例えば、患者に1週間の間に2回用量を投与することがある。患者への本発明の組成物の投与は、毎日、2日に1回、毎週、隔週、毎月、隔月などで行われる場合がある。
【実施例１】
【００５０】
縮小ゲノム大腸菌の生産
縮小ゲノム株MDS39は、国際特許公開番号WO 2003/070880に記述されるように生産され、これは参照により本明細書に組み込まれる。つまり、一連の縮小ゲノム株（MDS01-MDS39）は、親株大腸菌MG1655からの核酸配列に一連の39の累積的削除（前記ゲノムの約14.1%）を行うことによって生産された。
【００５１】
K-12配列およびISデータベースのすべての配列を含むゲノムスキャンチップ（NimbleGen Systems、ウィスコンシン州マジソン）へのハイブリダイゼーションによって、IS因子のすべてを欠くように設計された第一の株MDS39は、予想に反して、生産中に新しい位置に跳んだIS因子の追加的コピーを含んでいることが分かった。これらのIS因子はMDS40を生産するために削除された。fhuACDB（tonA遺伝子座）はMDS41を生産するためにMDS40から削除された。tonA遺伝子座を欠いている株は、実験室の問題の一般的原因であるバクテリオファージT1による感染に耐性を示す。MDS01〜MDS41を生産するために行われた各累積的削除の場所と機能は、米国出願公開番号2007/0054358の表2に示されており、その内容全体は参照によりこの明細書に組み込まれる。endA遺伝子は、MDS42を生産するためにMDS41から削除された。MDS43は、lacオペロンをカバーしている追加的45 kbを親株MDS42から削除することによって生産された。MG1655および関連多重欠失株の一部のゲノム統計が表1に示されている。
【００５２】
MDS22を生産するために、コラン酸の生産に関与する30を超える遺伝子がMDS21から削除された。従って、MDS22、MDS23...MDS66にはコラン酸が欠けている。
【００５３】
大腸菌では、その抗原特性に強く寄与するオリゴ糖の追加により、LPS（エンドトキシン）が修飾されている。MsbBは、脂質Aの第一β-ヒドロキシ・ミリストイル成分へのβ-ヒドロキシミリスチン酸のO-アシル結合を触媒する。この酵素活性の損失により、LPSは免疫原生のより少ないペンタ-アシル形に限定される。中心核脂質Aは外膜の完全性のために必須であるため、LPS全体は除去できない。msbB遺伝子は、MDS42msbBを生産するためにMDS42から削除された。
【００５４】
ECAは、すべてのグラム陰性細菌の外膜に見られる抗原性糖脂質である。MDS42ecaを生産するために、ECA生合成に必要な酵素をコードしている13の連続的遺伝子がMDS42から削除された。
【００５５】
株MDS42msb/ecaは、msbB遺伝子に加えてECA生合成に必要な酵素をコードしている13の連続的遺伝子をMDS42から削除することによって生産された。
【００５６】
MDS66は、MDS42からいくつかの遺伝子を削除することによって生産された。MDS66では、ゲノムの約19.2%が削除されている。MDS66は、完全なmsbB遺伝子に加えてECA生合成に必要な酵素をコードしている13の連続的遺伝子を含む。MDS12からMDS73の各欠失株から削除された遺伝子（Blattner et al., Science, 277:1453-74およびGenBank受入番号400096で設定された記号表示に基づく「b」番号により特定される）は、米国出願公開番号2006/0199257の表8および9に示されている場合があり、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５７】
【表１】
2012517472.tif 000003
【実施例２】
【００５８】
細菌の調製
免疫付与および抗原投与のための培養物（実施例3および4を参照）は同様に調製された。各細菌の冷凍庫ストックからLB中20 mlの培養物を接種し、30°Cで一晩（約17時間）成長させた。集菌時に濁度を測定した（600 nmでの光学密度（OD））。10 mlの培養物を4°C、2500 x gで15分間遠心分離した。次に、結果得られる細菌ペレットを10 ml氷冷滅菌l x PBSで再懸濁し、前述と同様に遠心分離で細菌を集めた。その後、5 ml氷冷滅菌1x PBS、15%グリセロール中に細菌を再懸濁し、濁度を測定した。PBS-グリセロールをさらに加えて、懸濁液をOD600約1.1に調整し、0.3 mlアリコートを0.65 mlマイクロチューブに分配して-80°Cで冷凍した。数時間冷凍した後、各株の1つのチューブを37°Cで2分間解凍し、段階希釈を行った。サンプル0.1 mlをLB寒天培地にのせ、生存能力のあるコロニー形成細菌の力価を測定した。対照免疫付与として、0.3 mlの滅菌PBS-グリセロールを使用した。
【実施例３】
【００５９】
突然変異Stx2Aのクリーンゲノム細菌感染
突然変異Stx2A遺伝子（mStx2A）をコードするプラスミドを持つ縮小ゲノム株MDS42を、細菌ワクチン担体として働く能力について試験した。簡略には、stx2A遺伝子は志賀毒素の活性部位サブユニットをコードする。腸管出血性大腸菌（EHEC）O157:H7株EDL933（ウィスコンシン大学のBlattner研究所で配列決定された）で始めて、活性部位ポケットの反対側に突然変異を生成した。突然変異により、免疫原生に影響することなくタンパク質の毒性グリコシラーゼ活性が除去されたことが示された。mStx2Aは、プラスミドベクター中のCMVプロモーターの支配下に配置され、これは単一コピーおよび誘導性多コピーレプリコン（エルシニア・シュードツベルクローシスからのinvA遺伝子）を含み、MDS42細菌が特定の哺乳類細胞タイプに侵入することを可能にする。
【００６０】
レポーターDNAの送達を分析するために、生後約6〜8週のメスBalb/cマウスに、強制経口投与（栄養チューブ）または腹腔内（IP）注射によって、次のいずれかで初期免疫付与した。（1）mStx2Aの代わりにCMVプロモーターの支配下にあるlacZレポーター遺伝子（B-ガラクトシダーゼをコードしている）を持つプラスミドベクターを持つMDS42、または（2）同じプラスミドを持つ DH10B株。予想に反して、DH10Bを持つIPを注射したマウスすべてが3日以内に死亡したのに対し、MDS42の同様用量を注射したマウスの90%は生き延びた。免疫付与後、1週間ごとに血液試料を採取し、抗β-ガラクトシダーゼ抗体についてELISAで血清を試験した。抗体は検出されなかった（5回の実験、合計で25匹のマウスと対照）。
【００６１】
次に、生後約6〜8週のメスBalb/cマウスに、CMVレポーターの支配下にあるmStx2Aを持つプラスミドを持つ細菌を強制経口投与またはIP注射して免疫付与した。次にマウスに、未治療（未投薬）マウスを死亡させると予想された最低毒素用量で抗原投与した。mStx2Aプラスミドを持つMDS42をIP注射されたマウスは、志賀毒素の抗原投与に対して成功裏に守られた。驚くことに、mStx2AワクチンプラスミドなしのMDS42の対照免疫接種でも、志賀毒素の致死的攻撃から守られた。未免疫マウスの生存率〜20%を考慮に入れても、これらは驚きの結果である。対照的に、強制経口投与されたDNAワクチンは、マウスの約27%（未投薬マウスの生存率20%に対して修正すると57%）を守った。結果を下記の表2に示す。
【００６２】
【表２】
2012517472.tif 000004
1野生型対照では、mStx2AプラスミドはCMVプロモーターの支配下にあるmStx2Aおよびインバシンを含む
【実施例４】
【００６３】
マウスへの腹腔内注射による大腸菌株の毒性
敗血症のマウスモデルを作った。マウスは、実施例2に記述されたように調製された、PBS-グリセロール中の野生型大腸菌株（DH10BまたMG1655）または縮小ゲノム大腸菌株（MDS12、MDS21、MDS22、MDS42、MDS42eca、MDS42msbB、MDS42msbB/eca、またはMDS66）のいずれかを腹腔内注射された。それぞれの株に対する生存細菌／用量およびOD600／用量が表3に示されている。マウス1匹が対照として0.3 ml滅菌PBS／グリセロールを腹腔内注射された。表3に示されるように、未修飾大腸菌株のマウスへの注射では、3日以内の死亡率は85%（MG1655）および90%（DH10B)で、これは敗血症と一致している。縮小ゲノム大腸菌株は、意外にも、MDS42、MDS42msbB、MDS42msbB/ecaおよびMDS66のケースではほとんどまたは全く死亡を引き起こさなかった。しかし、縮小ゲノム株MDS12は、100%の死亡率を生じ、縮小ゲノム株MDS21およびMDS22は90%の死亡率を生じた。
【００６４】
【表３】
2012517472.tif 000005
【実施例５】
【００６５】
縮小ゲノム細菌の投与による敗血症の治療
マウスモデルを使用して、菌血症を伴う敗血症による死亡での多重欠失株の治療可能性を調べた。マウスは2つのグループに分けられた。0日目に、グループ1のマウスは、多重欠失大腸菌株MDS66（OD600 は1.14、6.0 x 108生存細胞）の1回目の腹腔内注射を受け、一方グループ2のマウスはPBS-グリセロールの腹腔内注射を受けた。6日後、グループ1のマウスは同じ株の同じ用量の腹腔内注射を再び受け、一方グループ2のマウスはPBS-グリセロールの注射を再び受けた。14日目に、グループ1のマウス8匹およびグループ2のマウス5匹に、大腸菌株DH10Bからの野生型生細菌の単回注射で抗原投与を行った（OD600は1.12、3.1 x 108生存細胞）。表4に示されるように、生きたDH10Bの腹腔内注射で、グループ2のマウスの80%（実験1）および100%（実験2）が注射投与から4日以内に死亡した。驚くことに、グループ1のマウスはすべて生き延びた。さらに、これらの生存マウスは生き続け健康であった。このように、生きたMDS66細菌の投与によって、株DH10Bからの生菌の致死的攻撃からマウスを守ることができた。これは、縮小ゲノム細菌の注射は、グラム陰性菌血症を持つ哺乳類の敗血症による死亡に対する効果的な治療または予防を提供する。理論に束縛されることを望むものではないが、MDS66などの多重欠失細菌は完全な免疫認識を回避する可能性があるが、敗血症に典型的な広範囲の炎症反応（PAMP-仲介全身性炎症）または広範な組織損傷（DAMP-仲介全身性炎症）を軽減するのに十分なほど効果的である可能性がある。MDS42から削除されたDNAセグメントの削除を少なくとも含む多重欠失株細菌は、グラム陰性菌血症を持つ哺乳類の敗血症死亡に対する効果的な治療および／または予防を提供する。
【００６６】
【表４】
2012517472.tif 000006
【実施例６】
【００６７】
縮小ゲノム
細菌の投与によるヒト被験者における敗血症の治療
ヒトの敗血症を治療するために、多重欠失株細菌を予防的または治療的に使用し得る。敗血症にかかるリスクのある人、特に外傷患者または手術を受ける患者、または敗血症を持つ患者に、疾患を予防するために、または重症度を軽減するために、多重欠失株細菌の治療的または予防的有効量を投与し得る。治療的には、疾患の寛解が明らかになるまで用量を反復投与し得る。投与の望ましい経路は、静脈内投与である。
【図１】
2012517472.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成23年9月1日(2011.9.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の敗血症予防用の多重欠失株大腸菌細菌の有効量を含む組成物であって、前記多重欠失株細菌は、その野生親株のゲノムより約5%〜約30%小さいように遺伝子操作されたゲノムを持つ、組成物。
【請求項２】
前記多重欠失株細菌が、MDS42から削除されたDNAセグメントを少なくとも欠失している、請求項1に記載の用途のための組成物。
【請求項３】
前記多重欠失株細菌がMDS42である、請求項2に記載の用途のための組成物。
【請求項４】
前記多重欠失株細菌がMDS66である、請求項2に記載の用途のための組成物。
【請求項５】
追加的治療レジメンの前、最中、または後に投与するための、請求項1または2に記載の用途のための組成物。
【請求項６】
前記多重欠失株細菌が生きた多重欠失株細菌である、請求項1または2に記載の用途のための組成物。
【請求項７】
前記大腸菌多重欠失株が機能msbB遺伝子を欠いている、請求項1または2に記載の用途のための組成物。
【請求項８】
前記多重欠失株がリポ多糖の生産に関与する1つ以上の遺伝子を欠いており、前記1つ以上の遺伝子が大腸菌染色体のヌクレオチド3792010と3806121の間のrfa遺伝子に位置している、請求項1、2および7のいずれか1つに記載の用途のための組成物。
【請求項９】
前記1つ以上の遺伝子がrfaI、rfaJ、rfeおよびその組み合わせから成るグループから選択される、請求項8に記載の用途のための組成物。
【請求項１０】
前記多重欠失株が腸内一般抗原の生産に関与する1つ以上の遺伝子を欠いており、前記1つ以上の遺伝子が大腸菌染色体のヌクレオチド3965939と3980295の間に位置している、請求項1、2、7および8のいずれか1つに記載の用途のための組成物。
【請求項１１】
動物への単回投与のための、請求項1または2に記載の用途のための組成物。
【請求項１２】
動物への複数回投与のための、請求項1または2に記載の用途のための組成物。
【請求項１３】
毎週投与のための、請求項12に記載の用途のための組成物。
【請求項１４】
前記動物が人である、請求項1または2に記載の用途のための組成物。
【請求項１５】
前記多重欠失株細菌が、以下から成るグループから選択された1つ以上の遺伝子の欠失を含む、請求項1に記載の用途のための組成物。大腸菌K-12株MG1655のb2190; b2191; b2192; b3215; b3216; b3217; b3218; b3219; b3504; b3505; b1070; b1071; b1072; b1073; b1074; b1075; b1076; b1077; b1078; b1079; b1080; b1081; b1082; b1083; b1878; b1879; b1880; b1881; b1882; b1883; b1884; b1885; b1886; b1887; b1888; b1889; b1890; b1891; b1892; b1893; b1894; b1917; b1918; b1919; b1920; b1921; b1922; b1923; b1924; b1925; b1926; b1927; b1928; b1929; b1930; b1931; b1932; b1933; b1934; b1935; b1936; b1937; b1938; b1939; b1940; b1941; b1942; b1943; b1944; b1945; b1946; b1947; b1948; b1949; b1950; b4324; b4325; b4326; b4327; b4328; b4329; b4330; b4331; b4332; b4333; b4334; b4335; b4336; b4337; b4338; b4339; b4340; b4341; b4342; b4345; b4346; b4347; b4348; b4349; b4350; b4351; b4352; b4353; b4354; b4355; b4356; b4357; b4358; b4486; b0497; b0498; b0499; b0500; b0501; b0502; b0700; b0701; b0702; b0703; b0704; b0705; b0706; b1456; b1457; b1458; b1459; b1460; b1461; b1462; b3481; b3482; b3483; b3484; b3592; b3593; b3594; b3595; b3596; b0981; b0982; b0983; b0984; b0985; b0986; b0987; b0988; b1021; b1022; b1023; b1024; b1025; b1026; b1027; b1028; b1029; b2080; b2081; b2082; b2083; b2084; b2085; b2086; b2087; b2088; b2089; b2090; b2091; b2092; b2093; b2094; b2095; b2096; b4438; b3440; b3441; b3442; b3443; b3444; b3445; b4451; b3556; b3557; b3558; b4455; b1786; b0150; b0151; b0152; およびb0153。
【請求項１６】
グラム陰性細菌への暴露によって生じる敗血症を予防するための、請求項1または2に記載の用途のための組成物。
【請求項１７】
グラム陰性細菌が大腸菌である、請求項16に記載の用途のための組成物。
【請求項１８】
多重欠失株大腸菌細菌の治療的有効量及び製薬上許容可能な担体を含む医薬品組成物であって、前記多重欠失株細菌は、その野生親株のゲノムより約5%〜約30%小さいように遺伝子操作されたゲノムを持つ、医薬組成物。
【請求項１９】
前記多重欠失株細菌が、MDS42から削除されたDNAセグメントを少なくとも欠失している、請求項18の組成物。
【請求項２０】
前記多重欠失株細菌がMDS42およびMDS66から成るグループから選択される、請求項18の組成物。
【国際調査報告】
2012517472.tif 000008