(57)【要約】  植物細胞中でインベルターゼの酵素活性の減少に適している核酸の、植物のサッカロース貯蔵器官の形成のための使用であって、このサッカロース濃度が、比較可能な発育段階にある同じゲノタイプの変更していない対照サッカロース貯蔵器官のサッカロース濃度に対して高められている使用。この場合に、Ｘパーセント点だけのこのサッカロース濃度の向上は変更したか又は変更していないサッカロース貯蔵器官収量を生じることができ、この場合に、サッカロース貯蔵器官収量の低下の場合には、この低下は最大５Ｘパーセントである。さらに、本発明は、サトウダイコン及びサトウキビの農業的栽培の際のサッカロース収量の増加方法であって、遺伝子構成がインベルターゼの酵素活性の減少に指向しているサトウダイコン−又はサトウキビ植物が使用される方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞中でインベルターゼの酵素活性の減少に適している核酸の、植物のサッカロース貯蔵器官の形成のための使用であって、このサッカロース濃度が、比較可能な発育段階にある同じゲノタイプの変更していない対照サッカロース貯蔵器官のサッカロース濃度に対して高められている使用。
【請求項２】
Ｘパーセント点だけのサッカロース濃度の向上が低下したサッカロース貯蔵器官収量を生じ、かつ、このサッカロース貯蔵器官収量の低下が最大で５Ｘパーセントである、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記サッカロース貯蔵器官収量が変更してないか又は高められている、請求項１記載の使用。
【請求項４】
前記サッカロース貯蔵器官のサッカロース濃度が、前記サッカロース貯蔵器官収量と負の相関をしていないことを特徴とする請求項１記載の使用。
【請求項５】
前記核酸が、同種又は異種の核酸であることを特徴とする請求項１記載の使用。
【請求項６】
前記異種の核酸が、インベルターゼの酵素活性を減少させる能力のあるポリペプチドをコードする核酸であり、かつ、これが好ましくはタバコ（Nicotiana tabacum）由来であることを特徴とする請求項５記載の使用。
【請求項７】
前記核酸が、配列番号１に応じた配列、又は配列番号１に応じた配列に対する相補配列又はこの断片とハイブリダイゼーションできる核酸配列を有することを特徴とする請求項５又は６記載の使用。
【請求項８】
前記サッカロース貯蔵器官が、サトウダイコン本体又はサトウキビ茎であることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項記載の使用。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、サトウダイコン−及びサトウキビ細胞中で、液胞に、サイトゾル中に又は細胞壁中に局在化していることを特徴とする請求項６記載の使用。
【請求項１０】
遺伝子構成がインベルターゼの酵素活性の減少に指向している、サトウダイコン−又はサトウキビ植物が使用される、サトウダイコン及びサトウキビの農業的栽培のための方法。
【請求項１１】
前記遺伝子構成が、サッカロース貯蔵器官の形成を可能にし、その際、このサッカロース濃度が、比較可能な発育段階にある同じゲノタイプの変更していない対照サッカロース貯蔵器官のサッカロース濃度に対して高められていることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
Ｘパーセント点だけのサッカロース濃度の向上が、低下したサッカロース貯蔵器官収量を生じ、かつ、このサッカロース貯蔵器官収量の低下が最大で５Ｘパーセントである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記サッカロース貯蔵器官収量が変更してないか又は高められている、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子構成が、サッカロース貯蔵器官の形成を可能にし、その際、このサッカロース濃度が、前記サッカロース貯蔵器官収量と負の相関をしていないことを特徴とする請求項１０から１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
インベルターゼの酵素活性の減少が、同種又は異種の核酸を用いて行われることを特徴とする請求項１０から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記の異種の核酸が、インベルターゼの酵素活性を減少させる能力のあるポリペプチドをコードする核酸であり、かつ、これが好ましくはタバコ（Nicotiana tabacum）由来であることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸が、配列番号１に応じた配列、又は配列番号１に応じた配列に対する相補配列又はこの断片とハイブリダイゼーションできる核酸配列を有することを特徴とする請求項１５又は１６記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸が、配列番号２に応じた配列、又は配列番号２に応じた配列に対する相補配列又はこの断片とハイブリダイゼーションできる核酸配列を有することを特徴とする請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物細胞におけるインベルターゼの酵素活性の減少に適している核酸の使用、並びに、サトウダイコン及びサトウキビの農業的栽培の際のサッカロース収量の増加方法に関する。
【０００２】
サトウダイコンは二年生植物である。この発育の一年目に栄養成長が行われ、その際、この植物は葉ロゼット（Blattrosette）を発育し、一次根、根部（Ruebenkoerper）、を形成する。二年目、生殖相において、花序及び種子が形成される。このサトウダイコンの収量生理学の特殊性は、サッカロースの蓄積及び貯蔵が主として最初の栄養年の間に行われることにある。サッカロース獲得のためには、したがって、サトウダイコンは、栄養的発育段階において収穫される。
【０００３】
サトウダイコン育種における数十年来の努力及び成功は、根部−及びサッカロース収量に関して注目すべき増大をもたらした。但し、この増大は、この根部のサッカロース濃度が今日既に、根部新鮮重の約１５〜２０％であるにもかかわらず、依然として満足のいくものでない。
【０００４】
ＥＰ０９５６３５７Ｂ１からは、インベルターゼの酵素活性を減少させる能力のあるポリペプチドをコードする核酸の、減少した、貯蔵に制限されたサッカロース損失を有するトランスジェニック植物の製造のための使用が知られている。インベルターゼ阻害剤を用いて、このサッカロース濃度を、植物のサッカロース貯蔵器官中で増加させるための手段に関する示唆は、この刊行物には与えられていない。
【０００５】
さらに、ＥＰ１３４６０５４Ｂ１は、植物の液胞のインベルターゼの阻害をもくろむ。この刊行物も、植物の改善された貯蔵安定性だけを記載し、サッカロース濃度の向上は記載しない。
【０００６】
したがって、本発明の課題は、植物のサッカロース貯蔵器官中のサッカロース濃度を更に増加させることである。特に、本発明の課題は、サッカロース収量を増加させることができる、サトウダイコン及びサトウキビの農業的栽培方法を提供することにある。
【０００７】
本発明により、この提示された課題の解決は、植物細胞中でインベルターゼの酵素活性の減少に適している核酸の、植物のサッカロース貯蔵器官の形成のための使用であって、このサッカロース濃度が、比較可能な発育段階にある同じゲノタイプの変更していない対照サッカロース貯蔵器官のサッカロース濃度に対して高められている使用により行われる。
【０００８】
しかし、これまで、サッカロース濃度及び根部収量（Ruebenkoerperertrag）は負に相関しており、すなわち、高いサッカロース濃度を有する品種は、より低いサッカロース濃度を有する品種に比較してより少ない根部収量を提供する。この理由は、高いサッカロース濃度を有するサトウダイコンが、むしろ、小さい根部を形成することにある。
【０００９】
サトウダイコンでの、サッカロース濃度及び根部収量の間の負の関係性のための説明の試みは、既に１９７３年にＭｉｌｆｏｒｄにより行われている。これによれば、根部質量及び柔貯蔵細胞のサイズが相関している。これに応じて、大きな柔細胞は、小さい柔細胞に比較してより低いサッカロース濃度を有する。
【００１０】
サッカロース濃度及び根部収量の間の関係性は、新規品種でも負であり、但し、もはや以前に記載されたほど密接でない（Ｃａｍｐｂｅｌｌ及びＫｅｒｎ  １９８３，Ｈｏｆｆｍａｎｎ及びＭａｅｒｌａｅｎｄｅｒ  ２００２）。この育種進歩は、このようにして、サッカロース濃度及び根部収量の間の負の関係性のシフトを生じたが、しかし、この関係性の根本的変化は生じなかった（図１）。
【００１１】
上でサトウダイコンについて記載した、サッカロース濃度及びサッカロース貯蔵器官収量の間の負の関係性は、基本的に、サトウキビにも該当する。
【００１２】
意外なことに、植物細胞中でのインベルターゼの酵素活性の減少に適している核酸の本発明による使用の際に、サッカロース濃度及びサッカロース貯蔵器官収量（サトウダイコン本体収量又はサトウキビ茎収量）の間の負の相関も減る（zurueckfuehren）か又はなくすことができることが今や見出された。
【００１３】
とりわけ、前記核酸の本発明による使用はＸパーセント点だけのサッカロース濃度の向上の際に、低下したサッカロース貯蔵器官収量を生じることができ、その際、このサッカロース貯蔵器官収量の低下は最大で５Ｘパーセントである。
【００１４】
本発明の特別な一実施態様によれば、植物細胞中でインベルターゼの酵素活性の減少に適している核酸の使用の際に、したがって、このサッカロース貯蔵器官収量は、変更しないか又は高められる。
【００１５】
したがって、例えば２パーセント点だけのサッカロース濃度の向上は、サッカロース貯蔵器官収量の低下の場合に、最大１０パーセントの低下を生じる。通常は、しかし、このサッカロース濃度の向上は、サッカロース貯蔵器官収量の向上も生じ、この結果、このサッカロース貯蔵器官のサッカロース濃度は、このサッカロース貯蔵器官収量と負に相関しない。
【００１６】
サトウダイコンの場合には、このサッカロース濃度は根部新鮮重中のサッカロースの量を示し、すなわち、パーセントにおいてである。根部収量とは、土のない（erdfrei）、最適に頭部をなくした（kopfen）ビートの新鮮重（Frishmasse）が理解される。サッカロース濃度に乗算した根部収量からは、次に、サッカロース収量が算出される。
【００１７】
同様に、サトウダイコンを例にとって、本発明の利点が、以下に挙げられる実施例計算にもとづき詳説される。
【００１８】
インベルターゼの酵素活性の減少に特に適した核酸として、インベルターゼ阻害剤をコードする核酸が用いられる。インベルターゼ阻害剤は、ジャガイモにおいて最初に記載された（Ｓｃｈｗｉｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９６１）。これは、サトウダイコン、トマト及びタバコから知られている（Ｐｒｅｓｓｅｙ  １９６８，Ｐｒｅｓｓｅｙ  １９９４，  Ｗｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４，Ｒａｕｓｃｈ及びＧｒｅｉｎｅｒ  ２００４）。インベルターゼ阻害剤は技術水準に属するものの、これまでには、このポリペプチドを用いてサトウダイコン本体のサッカロース濃度を増加できることは予期できなかった。特に、これにより、サッカロース濃度及びサッカロース貯蔵器官収量の間の負の関係性が減ることも知られていなかった。
【００１９】
他方では、様々なインベルターゼ阻害剤の入手可能性（Verfuegbarkeit）が、この新規の使用のための良好な前提をも提示する。したがって、インベルターゼの酵素活性を減少させる能力のあるポリペプチドをコードする核酸が、問題なく同定されるか又は得られ、かつ、サトウダイコンで及びサトウキビで使用されることができ、しかも、育種的手法において同様に遺伝子工学的方法を用いてである。
【００２０】
インベルターゼの酵素活性の減少のための他の手段は、しかし、インベルターゼの酵素活性を、阻害性ポリペプチドを介してでなく、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＲＮＡ干渉を用いて減少させることによっても達成される。両方の方法は、そうこうしているうちに、一般的に知られている標準技術に属する。アンチセンスＲＮＡの場合には、インベルターゼのｍＲＮＡに対して相補的である単鎖ＲＮＡが使用される。この相補的ＲＮＡｓの引き続くペア形成により、このｍＲＮＡの翻訳の阻害、ひいてはこのインベルターゼの遺伝子発現の抑制が細胞中で生じる。このＲＮＡ干渉の場合には、これに対して、ｃＤＮＡフラグメントの逆転したリピートが利用され、これは転写後に二重鎖ＲＮＡ分子を形成し、これは、植物固有酵素により約２１〜２３ヌクレオチドの長さを有するフラグメントに切断され、これは、前記インベルターゼのｍＲＮＡの翻訳遮断を生じる。
【００２１】
サトウダイコンからのインベルターゼは同様に知られている（Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｇｏｎｚａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）か、又は、知られているインベルターゼ（Ｓｔｕｒｍ及びＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ，１９９０；Ｓｔｕｒｍ，１９９９）に基づいてサトウダイコン及びサトウキビから特別な困難性なしに単離され、この結果、相応するアンチセンス−ＲＮＡ又はＲＮＡ干渉コンストラクトも容易に製造可能である。一般的に知られている植物形質転換方法を用いて、このようなコンストラクトは植物中に良好に移入され、そこで発現する。
【００２２】
本発明の更に好ましい一実施態様によれば、この使用される核酸は、タバコ（Nicotiana tabacum）由来の異種（heterolog）核酸である。
【００２３】
「異種」との概念は、当該核酸が、この宿主細胞に関して他の起源を有するか、又は少なくとも非天然の状態に存在することを意味する。宿主細胞が、異質な種類の生物由来の核酸で形質転換される場合には、この核酸配列は、この宿主細胞に対して、かつ、これら核酸配列を有するこの宿主細胞の子孫に対して、異種である。
【００２４】
意外なことに、トランスジェニックアプローチの場合には、初代形質転換体からの、種子から育成されたトランスジェニック子孫中にさえも高められたサッカロース濃度が根部中で検出されることができた。このビート質量は、非トランスジェニック対照に比較して変更しておらず、このため、高められたサッカロース収量も結果として生じた。不定根、すなわち、根部類似構造物（初代形質転換体から直接的に形成される）においては、このサッカロース濃度の変更は確認できなかった。
【００２５】
本発明の更に好ましい一実施態様によれば、この異種核酸は、配列番号１に応じた配列、又は配列番号１に応じた配列に対する相補配列又はこの断片とハイブリダイゼーションできる核酸配列を有する。
【００２６】
ここで使用される概念「ハイブリダイゼーション」は、通常の条件下、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）に記載されている条件下で、有利にはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は例えば、次のようである：４×ＳＳＣ中で６５℃でハイブリダイゼーション、引き続き６５℃で０．１×ＳＳＣ中で複数回の洗浄、全体として約１時間。あまりストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件は例えば次のとおりである：４×ＳＳＣ中で３７℃でハイブリダイゼーション、引き続き１×ＳＳＣ中で室温で複数回の洗浄。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、次のことも意味できる：０．２５Ｍ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、７％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１％ＢＳＡ中で６８℃で１６時間ハイブリダイゼーション、引き続き２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで６８℃での２回の洗浄。
【００２７】
前記核酸によりコードされるポリペプチド、インベルターゼ阻害剤は、成功した形質転換後にサトウダイコン−又はサトウキビ細胞中で好ましくは液胞に、サイトゾル中又はこの細胞壁中に局在化している。
【００２８】
本発明の更なる一実施態様によれば、この核酸は、同種（homolog）核酸である。「同種」との概念は、この場合に、当該核酸がこの宿主細胞に関して同じ天然の起源に由来することを意味する。「同種」との概念は、同一の天然の起源の細胞種類（この細胞種類に当該核酸は由来する）中に導入される核酸にも関連するが、しかし、例えば、他の、この細胞種類中で又はこの組み合わせにおいて天然に存在しない、調節要素の制御下にある。この場合に、調節要素は、ヌクレオチド配列の発現に支持的に関与する配列である。これは例えば、プロモーター及びターミネーター配列を含む。したがって、宿主細胞は例えば、種が同じ生物からの核酸で形質転換されることができ、これは例えば、この核酸の過剰発現を達成するためである。
【００２９】
他方では、これは、知られた育種的手法により細胞中のこの核酸の発現を高めるか、又は、この核酸によりコードされるポリペプチドの活性がこの細胞中で増加されるように配慮することにより、可能である。したがって、例えば、サトウダイコン又はサトウキビからのインベルターゼ阻害剤の遺伝子座でのアレル変形が分析され、次いで、育種においてこの最良のアレルを用いて更に作業することができる。この基礎となるのは、サトウダイコンでは、配列番号２に応じたインベルターゼ阻害剤BvC/VIF1（テンサイ（Beta vulgaris）細胞壁又はベータ−フルクトシダーゼの液胞阻害剤）の配列、並びに、配列番号２に応じた配列に対して相補的な配列又はこの断片とハイブリダイゼーションできる核酸配列であることができる。
【００３０】
アレル変形の分析は、まずこのインベルターゼ阻害剤の遺伝子座の比較配列決定により集団中に存在するアレルが同定されるように行われる。次に、この様々なアレルは、繰り返された戻し交雑を介して常に同じ遺伝的背景にもたらされる。このようにして発生する準同質遺伝子系統は、このインベルターゼ阻害剤の発現に関して分析される。この分析は、ノーザンブロット法又はＲＴ−ＰＣＲを用いて行われる。
【００３１】
このインベルターゼ阻害剤の様々なアレルの有効性の比較は、さらに、このインベルターゼの酵素活性を介して非直接的に測定されることができる。
【００３２】
準同質サトウダイコン系統は、捕縄試験において栽培される。収穫後に、このビート収量及びサッカロース濃度が測定される。これは、目的指標サッカロース収量に関してこのアレルの比較を可能にする。サッカロース収量に関して最良の効果を有するこのアレルを、次いで、現在の育種材料中へと交配し、品種開発のために使用する。
【００３３】
本発明は、サトウダイコン及びサトウキビの農業的栽培の際のサッカロース収量の増加方法にも関する。ここで、遺伝子構成（genetische Ausstattung）が、インベルターゼの酵素活性の減少に指向しているサトウダイコン−又はサトウキビ植物が使用される。
【００３４】
このサトウダイコン−又はサトウキビ植物の遺伝子構成は、再度、遺伝子工学的方法又は慣用の植物育種方法を用いて行われることができる。この点で、核酸の新規使用のための上述の手段が参照される。
【００３５】
本発明の方法の好ましい一実施態様は、前記遺伝子構成が、サッカロース貯蔵器官の形成を可能にすることを意図し、その際、このサッカロース濃度はサッカロース貯蔵器官収量と負の相関をしない。
【００３６】
以下の計算は、どのようにこの新規方法がサッカロース収量に対して全体的に作用することができるかを、サトウダイコンを例として詳説する。
【００３７】
標準−サトウダイコン品種のサッカロース収量は、ビート収量６０ｔ／ｈａ及びビートのサッカロース濃度１７％の場合に全体として１０．２ｔ／ｈａである。本発明による方法を用いて、これに対して、サッカロース濃度１８％以上が達成される。同じビート収量では、１％の濃度増加が既に、栽培面積１ヘクタールあたりサッカロース６００ｋｇのサッカロース収量増加を生じる。サッカロース濃度及びビート収量の間のこれまでの負の相関を基礎として、例えば１７％から１８％へのこのサッカロース濃度の従来の増加は、不釣り合いに大きく低められたビート収量を生じており、この結果、サッカロース濃度の濃度増加は極めて限定されてのみ有意義であった。
【００３８】
本発明は、以下において図及び好ましい一実施態様を基礎としてより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ２００６に応じたサトウダイコン品種でのビート収量及びサッカロース濃度における育種進歩を示す。この図によれば、高いサッカロース濃度は比較的低い根部収量でだけ達成される。高い根部収量は、比較的低いサッカロース濃度を伴う。確かに、この育種進歩により、回帰曲線の勾配は更に減少するものの、根部収量及びサッカロース濃度の間の関係性は新規品種でも負である。
【図２】図２は、タバコ（Nicotiana tabacum）からのインベルターゼ阻害剤（配列番号１）が組み込まれたベクターを示す（pBINAR-NtVIF）。
【図３】図３は、非トランスジェニック対照Ｋ0ｎ＝４０）と比較した、トランスジェニック系統Ｔ（ｎ＝２５）における相対的サッカロース含量を示す。全植物は、温室中で管中で育成され、この種子の播種２０４日後に収穫された。このトランスジェニック系統は、２４％だけより高いサッカロース含量を伴って、この非トランスジェニック対照とは有意に相違する。
【図４】図４は、図３による植物の根部の相対的質量を示す。トランスジェニック系統の根部の質量は、この場合に、この対照ビートとは異ならない。これにより、このトランスジェニック系統は、非トランスジェニック対照に比較して、有意に変更していない根部質量で、高められたサッカロース含量を示す。サッカロース含量及び根部収量の間の負の相関はこの場合に打ち破られている。
【００４０】
異種核酸の使用のための例
制限切断部位BamHI（１１９４）及びXbaI（２０３１）を介して、この選択された、タバコ（Nicotiana tabacum）からのインベルターゼ阻害剤をコードする、８１１ｂｐの長さを有するｃＤＮＡ（配列番号１）をベクターpBINAR中に組み込み、この結果、プラスミドpBINAR-NtVIFが生じた。
【００４１】
このサトウダイコンの形質転換を、Ｌｉｎｄｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）に応じて行った。この植物の遺伝子導入性（Transgenitaet）を、ＰＣＲにより検証した。再生後に、この形質転換体を、種の獲得のために温室中で育成し、自家受精（selbsten）させた。
【００４２】
この選択されたトランスジェニック系統及び非トランスジェニック対照の、自家受精により得られた種を、３月初めに播種し、この実生を３月半ばに間引いた。この育成を温室中で管（１９×１００ｃｍ）中で〜１６℃の温度及び６Ｋｌｕｘの光強度及び１８時間の光期間で行った。この管は、鉢植え用土ＦＥタイプ３４０（Fruhsdorfer）、移植用土ＬＡＴ  Ｔｅｒｒａ  Ｐ８及び５ｇのＴｒｉａｂｏｎを含有した。毎週、この植物にＫａｍａｓｏｌ３〜４％。を肥料として与え、うどんこ病及びアリマキに対して処理をした。この播種２０４日後に、この根部を収穫し、頭部を切り落とし、洗浄し、秤量し、シングルビートソー（Einzelruebensaege）を介してスラリーにした（verbreien）。このスラリーを直接的に−２０℃で凍結させた。
【００４３】
サッカロース測定
このサトウダイコンスラリー２６ｇを、抽出溶液（１０００ｍｌの超純水中の硫酸アルミニウム３ｇ）１７７ｍｌで５分間室温で撹拌しながら抽出した。この混合物を丸フィルター２４０ｍｍを介して濾過し、引き続き超純粋で１：１０に希釈した。シリンジフィルターを介して、１．５ｍｌの希釈濾過物をガラスバイアル中にＨＰＬＣ分析のために移した。この希釈濾過物１０μｌを、Ｍｅｒｃｋ  ＬｉｃｈｒｏＣａｒｔ  ２５０−３カラム（Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００  ＮＨ2（５μｍ）Ｃａｔ．Ｎｏ．１．５０８３４）を介してＲＩ検出器を備えるＡｇｉｌｅｎｔ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅのＨＰ１１００  ＨＰＬＣ装置中で、７０％アセトニトリルの溶離剤（ｖ／ｖアセトニトリル７０、水３０）中で、そして０．８ｍｌ／ｍｉｎの流速で分析した。この算出されたＨＰＬＣ値は、μｇ／ｍｌでサッカロースを再現し、かつ、希釈比を考慮してビート新鮮重に対する％サッカロースに換算した。校正のために、外部標準溶液１００μｇサッカロース／ｍｌ水、５００μｇサッカロース／ｍｌ水、及び５０００μｇサッカロース／ｍｌ水を使用した。
【００４４】
2012512667.tif 000003
2012512667.tif 000004
【図１】
2012512667.tif 000005
【図２】
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【図３】
2012512667.tif 000007
【図４】
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【配列表】
2012512667000001.app
【国際調査報告】
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