(57)【要約】本発明は、形態Ｉの３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸の処方物、その医薬パックまたはキットと、それらを用いた処置方法に関する。この化合物は、薬学的に許容される塩として存在し得、また、形態Ｉと呼ばれ、本明細書中に記載され、特性決定される遊離の形態でも存在し得る。用量単位にはさらに、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、流動促進剤、または粘性剤、および／または潤滑剤が含まれる場合がある。
2012504143.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２５〜４００ｍｇの３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸を含有する用量単位。
【請求項２】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸の量が１００〜３００ｍｇである、請求項１に記載の用量単位。
【請求項３】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸の量が２００ｍｇである、請求項１に記載の用量単位。
【請求項４】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、ＣｕＫα線照射を使用して得られたＸ線粉末回折において１５．２〜１５．６度、１６．１〜１６．５度、および１４．３〜１４．７度での１つまたは複数のピークを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項５】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、約１５．４度、１６．３度、および１４．５度での１つまたは複数のピークを特徴とする、請求項４に記載の用量単位。
【請求項６】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、１４．６〜１５．０度での１つのピークをさらに特徴とする、請求項４または５に記載の用量単位。
【請求項７】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、１４．８度での１つのピークをさらに特徴とする、請求項４〜６のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項８】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、１７．６〜１８．０度での１つのピークをさらに特徴とする、請求項４〜７のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項９】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、１７．８度での１つのピークをさらに特徴とする、請求項４〜８のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項１０】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、１６．４〜１６．８度での１つのピークをさらに特徴とする、請求項４〜９のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項１１】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、１６．６度での１つのピークをさらに特徴とする、請求項４〜１０のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項１２】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、７．６〜８．０度での１つのピークをさらに特徴とする、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項１３】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、７．８度での１つのピークをさらに特徴とする、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項１４】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、２５．８〜２６．２度での１つのピークをさらに特徴とする、請求項４〜１３のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項１５】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、２６．０度での１つのピークをさらに特徴とする、請求項４〜１４のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項１６】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、２１．４〜２１．８度での１つのピークをさらに特徴とする、請求項４〜１５のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項１７】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、２１．６度での１つのピークをさらに特徴とする、請求項４〜１６のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項１８】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、２３．１〜２３．５度での１つのピークをさらに特徴とする、請求項４〜１７のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項１９】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、２３．３度での１つのピークをさらに特徴とする、請求項４〜１８のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項２０】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、単斜晶系、Ｐ２１／ｎ空間群、および以下の格子定数を有する、請求項４〜１９のいずれか１項に記載の用量単位：
ａ＝４．９６２６（７）Å  α＝９０°
ｂ＝１２．２９９４（１８）Å  β＝９３．９３８（９）°
ｃ＝３３．０７５（４）Å  γ＝９０°。
【請求項２１】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、図１の回折パターンと実質的に類似する回折パターンを特徴とする、請求項４〜２０のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項２２】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、図２の回折パターンと実質的に類似する回折パターンを特徴とする、請求項４〜２０のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項２３】
前記用量単位が経口用量単位である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項２４】
前記用量単位が固体の経口用量単位である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項２５】
前記用量単位が錠剤またはカプセル剤の形態である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項２６】
前記用量単位がカプセル剤の形態である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項２７】
前記用量単位に１つより多くのカプセル剤が含まれる、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項２８】
前記用量単位に、各５０ｍｇの３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸のカプセル剤４個が含まれる、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項２９】
増量剤をさらに含有する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項３０】
前記増量剤が以下からなる群より選択される、請求項２９に記載の用量単位：ラクトース、微結晶セルロース、無水リン酸水素カルシウム、リン酸水素カルシウム二水和物、リン酸三カルシウム、セルロース粉末、炭酸マグネシウム、硫酸カルシウム、澱粉、タルク、スクロース、デキストロース、マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、フルクトース、キシリトール、ソルビトール、およびそれらの組み合わせ。
【請求項３１】
前記増量剤がラクトースおよび微結晶セルロースである、請求項２９または３０に記載の用量単位。
【請求項３２】
前記増量剤の量が４０〜８０重量％である、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項３３】
前記増量剤の量が５０〜７０重量％である、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項３４】
前記増量剤の量が６０重量％である、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項３５】
崩壊剤をさらに含有する、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項３６】
崩壊剤が以下からなる群より選択される、請求項３５に記載の用量単位：カルボキシメチルスターチナトリウム、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セルロース粉末、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、キチン、重炭酸塩、ゲランガム、およびそれらの組み合わせ。
【請求項３７】
前記崩壊剤がカルボキシメチルスターチナトリウムである、請求項３５または３６に記載の用量単位。
【請求項３８】
前記崩壊剤の量が１〜２０重量％である、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項３９】
前記崩壊剤の量が５〜１５重量％である、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項４０】
前記崩壊剤の量が１０重量％である、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項４１】
界面活性剤をさらに含有する、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項４２】
前記界面活性剤が、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤である、請求項４１に記載の用量単位。
【請求項４３】
前記界面活性剤が以下からなる群より選択される陰イオン性界面活性剤である、請求項４１または４２に記載の用量単位：ラウリル硫酸塩、ラウレス硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ブタン酸塩、ヘキサン酸塩、オクタン酸塩、デカン酸塩、ラウリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、アラキジン酸塩、ベヘン酸塩、ミリストレイン酸塩、パルミトレイン酸塩、オレイン酸塩、リノール酸塩、α−リノレン酸塩、アラキドン酸塩、エイコサペンタエン酸塩、エルカ酸塩、およびドコサヘキサエン酸塩。
【請求項４４】
前記界面活性剤がラウリル硫酸ナトリウムである、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項４５】
前記界面活性剤が以下からなる群より選択される陽イオン性界面活性剤である、請求項４１または４２に記載の用量単位：臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム、ポリエトキシル化タローアミン（ｐｏｌｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ  ｔａｌｌｏｗ  ａｍｉｎｅ）、塩化ベンザルコニウム、および塩化ベンゼトニウム。
【請求項４６】
前記界面活性剤が以下からなる群より選択される非イオン性界面活性剤である、請求項４１または４２に記載の用量単位：ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、アルキルポリ（エチレンオキサイド）、ポロキサミン、アルキルポリグルコシド、オクチルグルコシド、デシルマルトシド、脂肪族アルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、およびコカミドＴＥＡ。
【請求項４７】
前記界面活性剤の量が０．５〜１５重量％である、請求項４１〜４６のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項４８】
前記界面活性剤の量が１〜１０重量％である、請求項４１〜４６のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項４９】
前記界面活性剤の量が５重量％である、請求項４１〜４６のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項５０】
流動促進剤または粘性剤をさらに含有する、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項５１】
前記流動促進剤または粘性剤が以下からなる群より選択される、請求項５０に記載の用量単位：コロイド状二酸化ケイ素、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、キサンタンゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カラギーナン、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、ポビドン、アカシア、グアーガム、トラガカント、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、カルボマー、およびそれらの組み合わせ。
【請求項５２】
前記流動促進剤がコロイド状二酸化ケイ素である、請求項５０または５１に記載の用量単位。
【請求項５３】
前記流動促進剤または粘性剤の量が０．０５〜２重量％である、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項５４】
前記流動促進剤または粘性剤の量が０．１〜１重量％である、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項５５】
前記流動促進剤または粘性剤の量が０．５重量％である、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項５６】
滑沢剤をさらに含有する、請求項１〜５５のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項５７】
前記滑沢剤が以下からなる群より選択される、請求項５６に記載の用量単位：ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、三ケイ酸マグネシウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、ステアリン酸、ステアリン酸亜鉛、およびそれらの組み合わせ。
【請求項５８】
前記滑沢剤がステアリン酸マグネシウムである、請求項５６または５７に記載の用量単位。
【請求項５９】
前記滑沢剤の量が０．０５〜２重量％である、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項６０】
前記滑沢剤の量が０．１〜１重量％である、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項６１】
前記滑沢剤の量が０．５重量％である、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項６２】
前記用量単位に、５０ｍｇの３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸、４０〜４４重量％のラクトース、１５〜２０重量％の微結晶セルロース、１０重量％のカルボキシメチルスターチナトリウム、５〜６重量％のラウリル硫酸ナトリウム、０．５〜０．６重量％のコロイド状二酸化ケイ素、および０．５重量％のステアリン酸マグネシウムを含有するカプセル剤が１つ含まれる、請求項１〜６１のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項６３】
２５ｍｇの３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸を含有するカプセル剤を１つ含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項６４】
前記用量単位がさらに、４０または４４重量％のラクトース、１５〜２０重量％の微結晶セルロース、１０重量％のカルボキシメチルスターチナトリウム、５〜６重量％のラウリル硫酸ナトリウム、０．５〜０．６重量％のコロイド状二酸化ケイ素、および０．５重量％のステアリン酸マグネシウムを含有する、請求項６３に記載の用量単位。
【請求項６５】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、０．１ミクロン〜５０ミクロンの粒径を有する、請求項１〜６４のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項６６】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、０．１ミクロン〜２０ミクロンの粒径を有する、請求項１〜６４のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項６７】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、０．１ミクロン〜１０ミクロンの粒径を有する、請求項１〜６４のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項６８】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、１．０ミクロン〜５ミクロンの粒径を有する、請求項１〜６４のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項６９】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸が、２．０ミクロンの粒径Ｄ５０を有する、請求項１〜６４のいずれか１項に記載の用量単位。
【請求項７０】
有効量の請求項１〜６９のいずれか１項に記載の用量単位をそれが必要な被験体に投与する工程を含む、被験体の嚢胞性線維症を処置する方法。
【請求項７１】
前記方法が、追加の治療薬を投与する工程を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記追加の治療薬が、粘液溶解薬、気管支拡張薬、抗生物質、抗感染症薬、抗炎症剤、本発明の化合物以外のＣＦＴＲ調節因子、および成分栄養剤からなる群より選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記用量単位が２週間に１回被験体に投与される、請求項７０〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記用量単位が１週間に１回被験体に投与される、請求項７０〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記用量単位が３日に１回被験体に投与される、請求項７０〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記用量単位が１日１回被験体に投与される、請求項７０〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
請求項１〜６９のいずれか１項に記載の用量単位と、その使用のための説明書を含む医薬パックまたはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効量の３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸（化合物１）を含有する用量単位に関する。化合物１は、薬学的に許容される塩として存在し得、また、形態Ｉと呼ばれ、本明細書中に記載され、特性決定される遊離の形態でも存在し得る。用量単位にはさらに、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、流動促進剤、または粘性剤、および／または潤滑剤が含まれる場合がある。本発明はさらに、ＣＦＴＲ媒介疾患（例えば、嚢胞性線維症）を処置する方法、および効果的な処置スケジュールに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＦＴＲは、吸収性および分泌性上皮細胞を含む、様々なタイプの細胞の中で発現されるｃＡＭＰ／ＡＴＰ媒介性陰イオンチャネルであり、これが、膜を通過する陰イオンの流速、ならびに他のイオンチャネルおよびタンパク質の活性を調節する。上皮細胞では、ＣＦＴＲの正常な機能が、呼吸器および消化組織を含む体全体への電解質輸送の維持に非常に重要である。ＣＦＴＲは、それぞれが６個の膜貫通へリックスと１つのヌクレオチド結合ドメインを含む、膜貫通ドメインの縦列反復からなるタンパク質をコードするおよそ１４８０個のアミノ酸により構成される。２つの膜貫通ドメインは、チャネル活性と細胞の輸送を調節する複数のリン酸化部位を持つ大きな極性調節性（Ｒ）ドメインにより結合されている。
【０００３】
ＣＦＴＲをコードする遺伝子は同定され、配列決定されている（非特許文献１；非特許文献２を参照のこと）（非特許文献３）。この遺伝子の欠損がＣＦＴＲにおいて突然変異を誘発し、最も一般的なヒトにとっての致命的遺伝疾患である嚢胞性線維症（「ＣＦ」）を引き起こす。嚢胞性線維症には、米国では幼児２５００人に約１人が罹患する。米国の一般的な集団内では、明らかな病的影響が見られない形で、１０００万人までの人々が１コピーの欠損遺伝子を持っている。対照的に、ＣＦ関連遺伝子を２コピー持つ個体は衰弱し、慢性肺疾患を含む致命的なＣＦの影響に見舞われる。
【０００４】
嚢胞性線維症の患者では、呼吸器上皮内で内因的に発現されるＣＦＴＲの突然変異により、イオンおよび体液の輸送において不均衡を引き起こす頂端側（ａｐｉｃａｌ）の陰イオン分泌の減少が導かれる。生じるこの陰イオン輸送の減少は、肺における粘液蓄積の増大およびそれに付随する微生物感染の一因となり、これは最終的にＣＦ患者の死を招くことになる。呼吸器疾患に加えて、ＣＦ患者は、消化器の問題および膵臓機能不全を患うことが典型的であり、処置しないまま放置した場合、死亡することになる。さらに、嚢胞性線維症の男性の大多数は生殖能力が無く、嚢胞性線維症の女性は生殖能力が低下している。２コピーのＣＦ関連遺伝子の深刻な影響とは対照的に、１コピーのＣＦ関連遺伝子を持つ個体は、コレラおよび下痢による脱水症に対して高い耐性を示し、このことは、この集団における比較的高頻度のＣＦ遺伝子を説明していると考えられる。
【０００５】
ＣＦ染色体のＣＦＴＲ遺伝子の配列分析により、病因となる様々な突然変異が明らかにされている（非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献６；特許文献７）。現在までのところ、ＣＦ遺伝子について１０００を超える病因となる突然変異が同定されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｔ．ｓｉｃｋｋｉｄｓ．ｏｎ．ｃａ／ｃｆｔｒ／）。最も優勢な突然変異は、ＣＦＴＲアミノ酸配列の５０８位のフェニルアラニンの欠失であり、これは、一般的にはΔＦ５０８−ＣＦＴＲと呼ばれている。この突然変異は、嚢胞性線維症の症例のおよそ７０％に存在しており、これは重篤な疾患と関連がある。
【０００６】
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲにおける残基５０８の欠失は、形成されつつあるタンパク質の正確な折りたたみを妨げる。この結果、突然変異タンパク質がＥＲを出て、原形質膜へ輸送されることが不可能となる。結果として、膜に存在するチャネルの数は、野生型ＣＦＴＲを発現する細胞中で観察される数よりはるかに少なくなる。損なわれた輸送機構に加えて、この突然変異はチャネルの開閉にも欠陥をもたらす。まとめて考えると、膜におけるチャネル数の減少と開閉の欠陥により、上皮を通過する陰イオンの輸送は減少し、イオンおよび体液輸送の欠陥を招くことになる。（非特許文献８）。しかしながら、複数の研究により、野生型ＣＦＴＲより少ないが、膜におけるこの少ない数のΔＦ５０８−ＣＦＴＲが機能的であることが示されている（非特許文献９；Ｄｅｎｎｉｎｇら、前出；非特許文献１０）。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲに加えて、輸送、合成、および／またはチャネル開閉の欠陥を生じるＣＦＴＲにおける他の病因となる突然変異は、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされて、陰イオンの分泌を変化させ、疾患の進行および／または重症度を変え得る。
【０００７】
ＣＦＴＲは陰イオンに加えて様々な分子を輸送するが、この役割（陰イオンの輸送）が、上皮を通過してイオンおよび水を輸送する重要な機構における１つの要素を表すことは明らかである。他の要素としては、上皮Ｎａ＋チャネル、ＥＮａＣ、Ｎａ＋／２Ｃｌ−／Ｋ＋共輸送体、Ｎａ＋−Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプ、および側底膜Ｋ＋チャネルが挙げられ、これらは細胞への塩化物の取込に関与している。
【０００８】
これらの要素が一緒に作用して、細胞内でのそれらの選択的発現および局在性により上皮を通過する方向性をもつ輸送を達成する。塩化物の吸収は、頂端側膜上に存在するＥＮａＣとＣＦＴＲの協調活性および細胞の側底膜側表面で発現されるＮａ＋−Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプおよびＣｌ−チャネルにより行われる。管腔側からの塩化物の二次的な能動輸送は細胞内塩化物の蓄積を導き、これが次いで、Ｃｌ−チャネルを介して受動的に細胞から離れることにより、ベクトル輸送が生じ得る。側底膜側表面上にＮａ＋／２Ｃｌ−／Ｋ＋共輸送体、Ｎａ＋−Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプおよび側底膜Ｋ＋チャネルが、そして管腔側上にＣＦＴＲが配置されることにより、管腔側でのＣＦＴＲを介した塩化物の分泌が調和させられる。水はそれ自体能動輸送されないと思われるので、上皮を通過するその流れは、ナトリウムおよび塩化物の大きな流れにより生じた小さな経上皮浸透圧勾配に左右される。
【０００９】
上記で述べたように、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲにおける残基５０８の欠失は形成されつつあるタンパク質の正確な折りたたみを妨げ、その結果、この突然変異タンパク質がＥＲを出て、原形質膜へ輸送されることを不可能にすると考えられる。結果として、原形質膜に存在する成熟タンパク質の量は不十分となり、上皮組織内での塩化物の輸送は著しく減少する。事実、ＥＲ機構によるＡＢＣ輸送体のＥＲプロセッシングの欠陥というこの細胞の現象は、ＣＦ疾患だけでなく、広範囲の他の孤立性疾患（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）および遺伝性疾患の根本要因であることが示されている。ＥＲ機構が機能不全に陥る可能性がある２つの過程は、分解に至るタンパク質のＥＲ排出のためのカップリングが失われること、またはこれらの欠損／誤って折り畳まれたタンパク質のＥＲ蓄積のいずれかによるものである［非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５］。
【００１０】
塩形態の化合物１は、特許文献１（上記刊行物はその全体が引用により本明細書中に組み入れている）に、ＣＦＴＲ活性の調節因子として開示されており、したがって、嚢胞性線維症のようなＣＦＴＲ媒介疾患の処置に有用である。しかし、有効量の化合物１を含有する安定な固体の用量単位が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００７／０５６３４１号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４７：３８２−３８６
【非特許文献２】Ｒｉｃｈ，Ｄ．Ｐ．ら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４７：３５８−３６２
【非特許文献３】Ｒｉｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｒ．ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：１０６６−１０７３
【非特許文献４】Ｃｕｔｔｉｎｇ，Ｇ．Ｒ．ら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：３６６−３６９
【非特許文献５】Ｄｅａｎ，Ｍ．ら（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６１：８６３：８７０
【非特許文献６】Ｋｅｒｅｍ，Ｂ−Ｓ．ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：１０７３−１０８０
【非特許文献７】Ｋｅｒｅｍ，Ｂ−Ｓら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：８４４７−８４５１
【非特許文献８】Ｑｕｉｎｔｏｎ，Ｐ．Ｍ．（１９９０），ＦＡＳＥＢ  Ｊ．４：２７０９−２７２７
【非特許文献９】Ｄａｌｅｍａｎｓら（１９９１），Ｎａｔｕｒｅ  Ｌｏｎｄ．３５４：５２６−５２８
【非特許文献１０】Ｐａｓｙｋ  ａｎｄ  Ｆｏｓｋｅｔｔ（１９９５），Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１２３４７−５０
【非特許文献１１】Ａｒｉｄｏｒ  Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，５（７），ｐｐ．７４５−７５１（１９９９）
【非特許文献１２】Ｓｈａｓｔｒｙ，Ｂ．Ｓ．，ら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，４３，ｐｐ．１−７（２００３）
【非特許文献１３】Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ，Ｊ．ら、Ｓｗｉｓｓ  Ｍｅｄ  Ｗｋｌｙ，１３２，ｐｐ．２１１−２２２（２００２）
【非特許文献１４】Ｍｏｒｅｌｌｏ，ＪＰら、ＴＩＰＳ，２１，ｐｐ．４６６−４６９（２０００）
【非特許文献１５】Ｂｒｏｓｓ  Ｐ．，ら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔ．，１４，ｐｐ．１８６−１９８（１９９９）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、以下の構造を有する３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸の用量単位に関する：
【００１４】
【化１】
2012504143.tif 000003
化合物１は、例えば、ＨＣｌ塩のような薬学的に許容される塩として存在し得る。化合物１はまた、実質的な結晶で存在し得、そして本明細書中に記載され、特性決定される形態Ｉと呼ばれる塩の遊離の形態でも存在し得る。化合物１は、様々なＣＦＴＲ媒介疾患を処置するか、またはその重篤度を下げるために有用である。
【００１５】
１つの態様においては、本発明は、２５〜４００ｍｇの化合物１を含有する用量単位に関する。さらなる実施形態においては、化合物１の量は１００〜３００ｍｇである。さらなる実施形態においては、化合物１の量は２００ｍｇである。
【００１６】
別の実施形態においては、本発明は、化合物１が、ＣｕＫα線照射を使用して得られた粉末Ｘ線回折における１５．２〜１５．６度、１６．１〜１６．５度、および１４．３〜１４．７度での１つまたは複数のピークを特徴とする形態１である、上記実施形態のいずれかの用量単位に関する。
【００１７】
別の実施形態においては、形態１の化合物１は、約１５．４、１６．３、および１４．５度での１つまたは複数のピークを特徴とする。
【００１８】
別の実施形態においては、形態１の化合物１はさらに、１４．６〜１５．０度での１つのピークを特徴とする。別の実施形態においては、形態１の化合物１はさらに、１４．８度での１つのピークを特徴とする。別の実施形態においては、形態１の化合物１はさらに、１７．６〜１８．０度での１つのピークを特徴とする。別の実施形態においては、形態１の化合物１はさらに、１７．８度での１つのピークを特徴とする。別の実施形態においては、形態１の化合物１はさらに、１６．４〜１６．８度での１つのピークを特徴とする。別の実施形態においては、形態１の化合物１はさらに、１６．６度での１つのピークを特徴とする。別の実施形態においては、形態１の化合物１はさらに、７．６〜８．０度での１つのピークを特徴とする。別の実施形態においては、形態１の化合物１はさらに、７．８度での１つのピークを特徴とする。別の実施形態においては、形態１の化合物１はさらに、２５．８〜２６．２度での１つのピークを特徴とする。別の実施形態においては、形態１の化合物１はさらに、２６．０度での１つのピークを特徴とする。別の実施形態においては、形態１の化合物１はさらに、２１．４〜２１．８度での１つのピークを特徴とする。別の実施形態においては、形態１の化合物１はさらに、２１．６度での１つのピークを特徴とする。別の実施形態においては、形態１の化合物１はさらに、２３．１〜２３．５度での１つのピークを特徴とする。別の実施形態においては、形態１の化合物１はさらに、２３．３度での１つのピークを特徴とする。
【００１９】
別の実施形態においては、形態１の化合物１は、単斜晶系、Ｐ２１／ｎ空間群、および以下の格子定数を有する：
ａ＝４．９６２６（７）Å  α＝９０°
ｂ＝１２．２９９４（１８）Å  β＝９３．９３８（９）°
ｃ＝３３．０７５（４）Å  γ＝９０°。
【００２０】
別の実施形態においては、形態１の化合物１は、図１の回折パターンと実質的に類似する回折パターンを特徴とする。
【００２１】
別の実施形態においては、形態１の化合物１は、図２の回折パターンと実質的に類似する回折パターンを特徴とする。
【００２２】
別の実施形態においては、本発明は、用量単位が経口用量単位である、上記実施形態のいずれかの用量単位に関する。別の実施形態においては、用量単位は、固体の経口用量単位である。別の実施形態においては、用量単位は、錠剤またはカプセル剤の形態である。別の実施形態においては、用量単位はカプセル剤の形態である。別の実施形態においては、用量単位には２個以上のカプセル剤が含まれる。別の実施形態においては、用量単位には、それぞれが５０ｍｇの化合物１である４個のカプセル剤が含まれる。別の実施形態においては、用量単位には、それぞれが２５ｍｇの化合物１である１個〜４個のカプセル剤が含まれる。
【００２３】
別の実施形態においては、本発明は、増量剤をさらに含有する、上記実施形態のいずれかの用量単位に関する。別の実施形態においては、増量剤は、ラクトース、微結晶セルロース、無水リン酸水素カルシウム、リン酸水素カルシウム二水和物、リン酸三カルシウム、セルロース粉末、炭酸マグネシウム、硫酸カルシウム、澱粉、タルク、スクロース、デキストロース、マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、フルクトース、キシリトール、ソルビトール、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。別の実施形態においては、増量剤は、ラクトースおよび微結晶セルロースである。別の実施形態においては、増量剤の量は、４０〜８０重量％である。別の実施形態においては、増量剤の量は、５０〜７０重量％である。別の実施形態においては、増量剤の量は６０重量％である。
【００２４】
別の実施形態においては、本発明は、さらに崩壊剤を含有する、上記実施形態のいずれかに関する。別の実施形態においては、崩壊剤は、カルボキシメチルスターチナトリウム、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セルロース粉末、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、キチン、重炭酸塩、ゲランガム、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。別の実施形態においては、崩壊剤は、カルボキシメチルスターチナトリウムである。別の実施形態においては、崩壊剤の量は、１〜２０重量％である。別の実施形態においては、崩壊剤の量は、５〜１５重量％である。別の実施形態においては、崩壊剤の量は１０重量％である。
【００２５】
別の実施形態においては、本発明は、さらに界面活性剤を含有する、上記実施形態のいずれかに関する。別の実施形態においては、界面活性剤は、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤である。別の実施形態においては、界面活性剤は、ラウリル硫酸、ラウレス（ｌａｕｒｅｔｈ）硫酸、アルキルベンゼンスルホン酸、ブタン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、およびドコサヘキサエン酸の塩からなる群より選択される、陰イオン性界面活性剤である。別の実施形態においては、界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウムである。別の実施形態においては、界面活性剤は、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム、ポリエトキシル化タローアミン、塩化ベンザルコニウム、および塩化ベンゼトニウムからなる群より選択される、陽イオン性界面活性剤である。別の実施形態においては、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、アルキルポリ（エチレンオキサイド）、ポロキサミン、アルキルポリグルコシド、オクチルグルコシド、デシルマルトシド、脂肪族アルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、およびコカミドＴＥＡからなる群より選択される非イオン性界面活性剤である。別の実施形態においては、界面活性剤の量は、０．５〜１５重量％である。別の実施形態においては、界面活性剤の量は、１〜１０重量％である。別の実施形態においては、界面活性剤の量は、５重量％である。
【００２６】
別の実施形態においては、本発明は、さらに流動促進剤または粘性剤を含有する、上記実施形態のいずれかに関する。別の実施形態においては、流動促進剤または粘性剤は、コロイド状二酸化ケイ素、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、キサンタンゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カラギーナン、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、ポビドン、アカシア、グアーガム、トラガカント、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、カルボマー、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。別の実施形態においては、流動促進剤はコロイド状二酸化ケイ素である。別の実施形態においては、流動促進剤または粘性剤の量は、０．０５〜２重量％である。別の実施形態においては、流動促進剤または粘性剤の量は、０．１〜１重量％である。別の実施形態においては、流動促進剤または粘性剤の量は０．５重量％である。
【００２７】
別の実施形態においては、本発明は、さらに滑沢剤を含有する、上記実施形態のいずれかに関する。別の実施形態においては、滑沢剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、三ケイ酸マグネシウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、ステアリン酸、ステアリン酸亜鉛、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。別の実施形態においては、滑沢剤はステアリン酸マグネシウムである。別の実施形態においては、滑沢剤の量は、０．０５〜２重量％である。別の実施形態においては、滑沢剤の量は、０．１〜１重量％である。別の実施形態においては、滑沢剤の量は、０．５重量％である。
【００２８】
別の実施形態においては、本発明は、用量単位が、５０ｍｇの化合物１、４０重量％のラクトース、２０重量％の微結晶セルロース、１０重量％のカルボキシメチルスターチナトリウム、５重量％のラウリル硫酸ナトリウム、０．５重量％のコロイド状二酸化ケイ素、および０．５重量％のステアリン酸マグネシウムを含有するカプセル剤を含む、上記実施形態のいずれかに関する。
【００２９】
別の実施形態においては、本発明は、用量単位が、０．１ミクロン〜１０ミクロンの粒径を有している３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸を含む、上記実施形態のいずれかに関する。別の実施形態においては、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸の粒径は、１．０ミクロン〜５ミクロンである。別の実施形態においては、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸は、２．０ミクロンの粒径Ｄ５０を有する。
【００３０】
別の態様においては、本発明は、有効量の上記実施形態のいずれかの用量単位を嚢胞性線維症の処置を必要とする被験体に投与する工程を含む、被験体の嚢胞性線維症を処置する方法に関する。別の実施形態においては、この方法は、追加の治療薬を投与する工程を含む。別の実施形態においては、追加の治療薬は、粘液溶解薬、気管支拡張薬、抗生物質、抗感染症薬、抗炎症剤、本発明の化合物以外のＣＦＴＲ調節因子、および成分栄養剤からなる群より選択される。別の実施形態においては、用量単位は、２週間に１回被験体に投与される。別の実施形態においては、用量単位は、１週間に１回被験体に投与される。別の実施形態においては、用量単位は、３日間に１回被験体に投与される。別の実施形態においては、用量単位は、１日１回被験体に投与される。
【００３１】
別の態様においては、本発明は、上記実施形態のいずれかの用量単位と、その使用についての説明書を含有する、医薬パック（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐａｃｋ）またはキットに関する。
【００３２】
本明細書中に記載されるプロセスは、本発明の組成物を調製するために使用することができる。これらのプロセスにおいて使用される成分の量と特徴は、本明細書中に記載されるとおりであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、形態Ｉの化合物１の単結晶構造から計算したＸ線回折パターンである。
【図２】図２は、形態Ｉの化合物１の実際のＸ線粉末回折パターンである。
【図３】図３は、形態Ｉの化合物１の単結晶から計算したＸ線回折パターンと、形態Ｉの化合物１の実際のＸ線粉末回折パターンの重ね合わせである。
【図４】図４は、形態Ｉの化合物１の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）トレースである。
【図５】図５は、単結晶Ｘ線分析に基づく形態Ｉの化合物１の立体配座の絵である。
【図６】図６は、単結晶Ｘ線分析に基づく、カルボン酸基を介して形成された二量体としての形態Ｉの化合物１の立体配座の絵である。
【図７】図７は、単結晶Ｘ線分析に基づく形態Ｉの化合物１の立体配座の絵であり、複数の分子が互いに積み重なっていることを示している。
【図８】図８は、単結晶Ｘ線分析に基づく形態Ｉの化合物１の立体配座の絵であり、異なる観点を示している（ａの下）。
【図９】図９は、Ｔ（０）での、５０ｍｇ／ｍＬの０．５メチルセルロース−ポリソルベート８０懸濁液中の形態Ｉの化合物１の１ＨＮＭＲ分析である。
【図１０】図１０は、室温で２４時間保存した５０ｍｇ／ｍＬの０．５メチルセルロース−ポリソルベート８０懸濁液中の形態Ｉの化合物１の１ＨＮＭＲ分析である。
【図１１】図１１は、化合物１・ＨＣｌ標準物の１ＨＮＭＲ分析である。
【図１２】図１２は、５％および１０％の崩壊剤であるカルボキシメチルスターチナトリウム（ＳＳＧ）を比較する、化合物１の５０ｍｇのカプセル処方物の溶解率（％）対時間のグラフ（７５ｒｐｍ  ＵＳＰ  Ａｐｐ  ２、２．５％のＣＴＡＢ）である。
【図１３】図１３は、増量剤である微結晶セルロース（ＭＣＣ）をリン酸二カルシウム（Ｄｉｃａｌ）に対して比較する、化合物１の５０ｍｇのカプセル処方物の溶解率（％）対時間のグラフ（７５ｒｐｍ  ＵＳＰ  Ａｐｐ  ２、２．５％のＣＴＡＢ）である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書中で使用される場合は、他に指定のない限りは以下の定義を適用するものとする。
【００３５】
用語「ＣＦＴＲ」は、本明細書中で使用される場合は、嚢胞性線維性経膜コンダクタンス調節因子、または調節活性があるその突然変異体（ΔＦ５０８  ＣＦＴＲおよびＧ５５１Ｄ  ＣＦＴＲを含むがこれらに限定されない）を意味する（例えば、ＣＦＴＲの突然変異体については、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｔ．ｓｉｃｋｋｉｄｓ．ｏｎ．ｃａ／ｃｆｔｒ／を参照のこと）。
【００３６】
「ＣＦＴＲ媒介疾患」は、本明細書中で使用される場合は、以下から選択される疾患である：嚢胞性線維症，遺伝性気腫、遺伝性ヘモクロマトーシス、凝血−線維素溶解欠損症（Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ−Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ）（例えば、プロテインＣ欠乏症、１型遺伝性血管浮腫）、脂質処理欠損症（ｌｉｐｉｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ）（例えば、家族性高コレステロール血症、１型カイロミクロン症、無βリポタンパク質血症）、リソソーム蓄積病（例えば、Ｉ細胞病／偽性ハーラー）、ムコ多糖沈着症、Ｓａｎｄｈｏｆ／Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ、クリグラー−ナジャＩＩ型、多発性内分泌腺症／高インスリン血症、真性糖尿病、ラロン型小人症、ミエロペルオキシダーゼ欠損症（Ｍｙｌｅｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、原発性上皮小体機能低下症、黒色腫、グリカノーシスＣＤＧ１型（ｇｌｙｃａｎｏｓｉｓ  ＣＤＧ  ｔｙｐｅ  １）、遺伝性気腫、先天性甲状腺機能亢進症、骨形成不全症、遺伝性低フィブリノゲン血症、ＡＣＴ欠損症、尿崩症（ＤＩ）、下垂体性ＤＩ、腎性ＤＩ、シャルコー・マリー・トゥース症候群、ペリツェウス・メルツバッハー病、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、ピック病、いくつかのポリグルタミン神経障害（例えば、ハンチントン、脊髄小脳失調症Ｉ型、脊髄および延髄性筋萎縮症（Ｓｐｉｎａｌ  ａｎｄ  ｂｕｌｂａｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（Ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂａｌ  ｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ）、および筋緊張性ジストロフィー）、ならびに海綿状脳症（例えば、遺伝性クロイツフェルト・ヤコブ病）、ファブリー病、およびシュトロイスラー・シャインカー症候群、ＣＯＰＤ、眼球乾燥症候群、およびシェーグレン症候群。
【００３７】
本明細書中で使用される場合は、「結晶」は、構造単位が一定の幾何学的パターンまたは格子に配置され、その結果、結晶性固体が厳格な長距離秩序（ｒｉｇｉｄ  ｌｏｎｇ  ｒａｎｇｅ  ｏｒｄｅｒ）を有する化合物または組成物をいう。結晶構造を構成する構造単位は、原子、分子、またはイオンであり得る。結晶性固体は、明確な融点を示す。
【００３８】
用語「Ｄ５０」は、本明細書中で使用される場合は、半分をその直径より大きく、そして半分をその直径よりも小さい粒径分布に分ける、ミクロンでの大きさをいう。
【００３９】
表現「用量単位」は、本明細書中で使用される場合は、処置される患者に適している、薬剤の物理的に独立した単位をいう。
【００４０】
本発明によれば、化合物１の「有効量」は、上記疾患のいずれかを処置するか、またはそれらの重篤度を下げるために有効なその量である。
【００４１】
用語「調節する」は、本明細書中で使用される場合は、例えば、活性を、測定可能な量だけ増大させるまたは低下させることを意味する。
【００４２】
用語「患者」または「被験体」は、本明細書中で使用される場合は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトを意味する。
【００４３】
本明細書中で使用される場合は、用語「薬学的に許容される塩」は、信頼できる医学的判断の範囲内で、過度の毒性、炎症性刺激、アレルギー応答などを伴わない、ヒトおよび下等動物の組織との接触に使用するのに適しており、合理的な利益／危険度比（ｂｅｎｅｆｉｔ／ｒｉｓｋ  ｒａｔｉｏ）に見合う塩をいう。「薬学的に許容される塩」は、レシピエントに投与すると、本発明の化合物またはその阻害活性代謝物もしくは残留物を直接的または間接的のいずれかで提供できる、本発明の化合物の全ての非毒性の塩またはエステルの塩を意味する。
【００４４】
（化合物１の調製方法）
１つの実施形態においては、化合物１の塩の形態は、スキーム１〜３にしたがって、酸塩化物部分をアミン部分とカップリングさせることによって調製することができる。形態Ｉの化合物１は、１つの実施形態においては、適切な溶媒中に化合物１の塩の形態（例えば、ＨＣｌ塩）を分散または溶解させることにより調製される。別の実施形態においては、化合物１および形態Ｉは、化合物１の安息香酸塩前駆体と適切な酸（例えば、ギ酸）から直接形成させることができる。
【００４５】
スキーム１．酸塩化物部分の合成
【００４６】
【化２】
2012504143.tif 000004
スキーム２．アミン部分の合成
【００４７】
【化３】
2012504143.tif 000005
スキーム３．化合物１の酸塩の形成
【００４８】
【化４】
2012504143.tif 000006
例えば、化合物１のＨＣｌ塩の形態を出発点として使用すると、形態Ｉの化合物１は、適切な溶媒中に有効な時間の間、化合物１・ＨＣｌ塩を分散または溶解させることにより、高い収率で形成させることができる。化合物１の他の塩の形態（例えば、他の鉱酸塩の形態または有機酸塩の形態）を使用することができる。他の塩の形態は、ｔ−ブチルエステルの対応する酸での加水分解によって生じる。他の酸／塩の形態としては、硝酸／硝酸塩、硫酸／硫酸塩、リン酸／リン酸塩、ホウ酸／ホウ酸塩、酢酸／酢酸塩、安息香酸／安息香酸塩、マロン酸／マロン酸塩などが挙げられる。化合物１の塩の形態は、使用される溶媒に応じて可溶性である場合も、また可溶性ではない場合もあるが、溶解度がないことが形態Ｉの化合物１の形成の妨げとなることはない。例えば、１つの実施形態においては、化合物１・ＨＣｌは水にごくわずかしか溶解しないが、適切な溶媒は、水、あるいはアルコール／水混合物（例えば、約５０％のメタノール／水混合物）であり得る。１つの実施形態においては、適切な溶媒は水である。
【００４９】
化合物１の塩の形態からの形態Ｉの化合物１の形成のための有効な時間は、約１〜２４時間の間の任意の時間であり得る。一般的には、高い収率（約９８％）を得るためには２４時間より長い時間は必要ないが、特定の溶媒についてはさらに長い時間が必要であり得る。必要な時間の長さは、一般的には温度に反比例することもまた理解されている。すなわち、温度が高ければ高いほど、形態Ｉの化合物１を形成させるための酸の解離を行うために必要な時間は短くなる。溶媒が水である場合は、分散液を室温でおよそ２４時間撹拌することにより、形態Ｉの化合物１がおよそ９８％の収率で得られる。化合物１の塩の形態の溶液が処理の目的のために所望される場合は、高温および有機溶媒が使用され得る。この溶液を高温で有効な時間の間撹拌した後、冷却して再結晶化させると、形態Ｉの化合物１の実質的に純粋な形態が得られる。１つの実施形態においては、実質的に純粋は、約９０％を上回る純度をいう。別の実施形態においては、実質的に純粋は、約９５％を上回る純度をいう。別の実施形態においては、実質的に純粋は、約９８％を上回る純度をいう。別の実施形態においては、実質的に純粋は、約９９％を上回る純度をいう。選択される温度は、使用される溶媒に部分的に依存し、これは決定を行う当業者の能力の十分に範囲内にある。１つの実施形態においては、温度は、室温から約８０℃の間である。別の実施形態においては、温度は、室温から約４０℃の間である。別の実施形態においては、温度は、約４０℃から約６０℃の間である。別の実施形態においては、温度は、約６０℃から約８０℃の間である。
【００５０】
別の実施形態においては、形態Ｉの化合物１は、安息香酸塩前駆体（例えば、ｔ−ブチル安息香酸塩前駆体）と酸（例えば、ギ酸）から直接形成させることができる。安息香酸塩前駆体とギ酸の高温での反応、その後のこの混合物の水への移動と、高温への再加熱により、形態Ｉの化合物１が酸塩中間体を単離することなく直接形成される。
【００５１】
いくつかの実施形態においては、形態Ｉの化合物１は、有機溶媒からの再結晶化によりさらに精製され得る。有機溶媒の例としては、トルエン、クメン、アニソール、１−ブタノール、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、メチルｔ−ブチルエーテル、メチルイソブチルケトン、または１−プロパノール／水（様々な割合のもの）が挙げられるが、これらに限定されない。上記に記載されたような温度が使用され得る。例えば、１つの実施形態においては、形態Ｉの化合物１は、これが完全に溶解するまで、約７５℃で１−ブタノール中に溶解させられる。この溶液を、約０．２℃／分の速度で約１０℃に冷却することにより、形態Ｉの化合物１の結晶が得られ、これは、濾過により単離することができる。
【００５２】
形態Ｉの化合物１には、化合物１の塩の形態よりも安定であるという利点がある。
【００５３】
（処方物および投与）
したがって、本発明の別の態様においては、薬学的に許容される組成物が提供される。ここでは、これらの組成物には、本明細書中に記載される化合物のいずれかが含まれ、状況に応じて、薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルが含まれる。特定の実施形態においては、これらの組成物には、状況に応じてさらに１種類以上の追加の治療薬が含まれる。
【００５４】
本発明の化合物のうちの特定のものは処置のための遊離の形態で存在することができ、また、適切である場合には、その薬学的に許容される誘導体またはプロドラッグとして存在することができることも理解されるであろう。本発明にしたがうと、薬学的に許容される誘導体またはプロドラッグには、薬学的に許容される塩、エステル、そのようなエステルの塩、あるいは必要な患者に投与されると本明細書中の別の場所に記載される化合物またはその代謝物もしくは残留物を直接的または間接的に提供できる任意の他の付加物または誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
薬学的に許容される塩は当該分野で周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらにより、薬学的に許容される塩がＪ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９７７，６６，１−１９（引用により本明細書中に組み入れられる）に詳細に記載されている。本発明の化合物の薬学的に許容される塩としては、適切な無機および有機の酸および塩基由来のものが挙げられる。薬学的に許容される非毒性の酸付加塩の例は、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸）と、または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、もしくはマロン酸）とともに形成されたアミノ基の塩、あるいは、当技術分野で使用される他の方法（例えば、イオン交換）を使用することにより形成された塩である。他の薬学的に許容される塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、二グルコン酸塩、ラウリル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。適切な塩基由来の塩としては、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、およびＮ＋（Ｃ１−４アルキル）４塩が挙げられる。本発明はまた、本明細書中に開示される化合物の任意の塩基性窒素含有基の四級化を想定している。水溶性もしくは油溶性または水分散性もしくは油分散性の生成物を、そのような四級化により得ることができる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。さらなる薬学的に許容される塩としては、適切である場合は、非毒性アンモニウム、四級アンモニウム、ならびに、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルスルホン酸塩およびアリールスルホン酸塩のような、対イオンを用いて形成されるアミンカチオンが挙げられる。
【００５６】
上記のように、本発明の薬学的に許容される組成物にはさらに、薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルが含まれる。これには、本明細書中で使用される場合は、所望される特定の投薬形態に適している限りは、任意の、およびあらゆる溶媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散補助剤もしくは懸濁補助剤、表面活性剤、等張化剤、増粘剤もしくは乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤などが含まれる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）には、薬学的に許容される組成物の処方に使用される様々な担体と、その調製のための公知の技術が開示されている。任意の従来の担体媒体が本発明の化合物と不適合である（例えば、何らかの望ましくない生物学的作用を生じるか、または、そうでなければ薬学的に許容される組成物の任意の他の成分（単数または複数）と有害な様式で相互作用することによる）場合を除き、その使用は本発明の範囲内に含まれるとする。薬学的に許容される担体とすることができる物質のいくつかの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、リン酸塩）、グリシン、ソルビン酸、またはソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩類または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、蝋、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、羊毛脂、糖類（例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース）、澱粉類（例えば、コーンスターチおよびジャガイモ澱粉）、セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース）、粉末状トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、賦形剤（例えば、ココアバターおよび坐薬ワックス）、油類（例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油）、グリコール類（例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）、エステル類（例えば、エチルオレエートおよびエチルラウレート）、寒天、緩衝剤（例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム）、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張性生理食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、およびリン酸緩衝液。さらに他の適合し得る非毒性滑沢剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、調味料および香料、保存剤および酸化防止剤も、調剤者の判断にしたがって、組成物中に存在させることができる。
【００５７】
１つの実施形態においては、本発明の用量単位には、塩の形態または形態Ｉ、あるいはそれらの両方の化合物１と、以下の薬学的に許容される賦形剤の少なくとも１つが含まれる。
【００５８】
（１．増量剤）
薬学的増量剤は希釈剤としても知られており、これは一般的には不活性であり、用量単位の大部分を占める。１つの実施形態においては、増量剤は以下の群より選択され得る：ラクトース、微結晶セルロース、無水リン酸水素カルシウム、リン酸水素カルシウム二水和物、リン酸三カルシウム、セルロース粉末、炭酸マグネシウム、硫酸カルシウム、澱粉、タルク、スクロース、デキストロース、マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、フルクトース、キシリトール、ソルビトール、およびそれらの組み合わせ。別の実施形態においては、増量剤は、ラクトースおよび微結晶セルロースである。図１３に見ることができるように、全ての増量剤が同じように作用するわけではない。化合物１については、微結晶セルロース（ＭＣＣ）は、リン酸水素カルシウム（Ｄｉｃａｌ）よりもすぐれた溶解プロフィールを生じる。
【００５９】
本発明の用量単位には、一般的には、４０〜８０重量％の増量剤が含まれる。別の実施形態においては、本発明の用量単位には、５０〜７０重量％の増量剤が含まれる。別の実施形態においては、本発明の用量単位には、６０重量％の増量剤が含まれる。
【００６０】
（２．崩壊剤）
崩壊剤は、一般的には、消化器系での用量単位の分散を助ける。１つの実施形態においては、崩壊剤は以下の群より選択され得る：カルボキシメチルスターチナトリウム、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セルロース粉末、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、キチン、重炭酸塩、ゲランガム、およびそれらの組み合わせ。別の実施形態においては、崩壊剤はカルボキシメチルスターチナトリウムである。図１２においては、カルボキシメチルスターチナトリウム（ＳＳＧ）の量は、溶出速度に明らかに影響を及ぼし、１０％のＳＳＧは５％のＳＳＧよりもすぐれた結果を生じる。
【００６１】
本発明の用量単位には、一般的には、１〜２０重量％の崩壊剤が含まれる。別の実施形態においては、本発明の用量単位には、５〜１５重量％の崩壊剤が含まれる。別の実施形態においては、本発明の用量単位には、１０重量％の崩壊剤が含まれる。
【００６２】
（３．界面活性剤）
界面活性剤は、水と有機化合物（例えば、化合物１）との間の表面張力を、水−化合物１界面で吸収することにより低下させる。界面活性剤は、多くの場合は、４つの主要なグループに分類される；陰イオン性、陽イオン性、非イオン性、および双性イオン性（二重電荷）。１つの実施形態においては、界面活性剤は、陰イオン性、陽イオン性、または非イオン性界面活性剤である。
【００６３】
陰イオン性界面活性剤は、ラウリル硫酸、ラウレス硫酸、アルキルベンゼンスルホン酸、ブタン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、またはドコサヘキサエン酸の塩から選択され得る。１つの実施形態においては、本発明の用量単位にはラウリル硫酸ナトリウムが含まれる。
【００６４】
陽イオン性界面活性剤は、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム、ポリエトキシル化タローアミン（ｐｏｌｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ  ｔａｌｌｏｗ  ａｍｉｎｅ）、塩化ベンザルコニウム、および塩化ベンゼトニウムから選択され得る。
【００６５】
非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート、アルキルポリ（エチレンオキサイド）、ポロキサミン、アルキルポリグルコシド、オクチルグルコシド、デシルマルトシド、脂肪族アルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、およびコカミドＴＥＡから選択され得る。
【００６６】
１つの実施形態においては、本発明の用量単位には、０．５〜１５重量％の界面活性剤が含まれる。別の実施形態においては、本発明の用量単位には、１〜１０重量％の界面活性剤が含まれる。別の実施形態においては、本発明の用量単位には、５重量％の界面活性剤が含まれる。
【００６７】
（４．流動促進剤または粘性剤）
１つの実施形態においては、流動促進剤または粘性剤は、薬学的に許容される流動促進剤または粘性剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、キサンタンゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カラギーナン、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、ポビドン、アカシア、グアーガム、トラガカント、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、カルボマー、およびそれらの組み合わせ）から選択される。別の実施形態においては、流動促進剤はコロイド状二酸化ケイ素である。
【００６８】
１つの実施形態においては、本発明の用量単位には、０．０５〜２重量％の流動促進剤または粘性剤が含まれる。別の実施形態においては、本発明の用量単位には、０．１〜１重量％の流動促進剤または粘性剤が含まれる。別の実施形態においては、本発明の用量単位には、０．５重量％の流動促進剤または粘性剤が含まれる。
【００６９】
（５．滑沢剤）
１つの実施形態においては、滑沢剤は、薬学的に許容される滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、三ケイ酸マグネシウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、ステアリン酸、ステアリン酸亜鉛、およびそれらの組み合わせ）から選択される。別の実施形態においては、滑沢剤はステアリン酸マグネシウムである。
【００７０】
１つの実施形態においては、本発明の用量単位には、０．０５〜２重量％の滑沢剤が含まれる。別の実施形態においては、本発明の用量単位には、０．１〜１重量％の滑沢剤が含まれる。別の実施形態においては、本発明の用量単位には、０．５重量％の滑沢剤が含まれる。
【００７１】
別の実施形態においては、本発明には、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸を適切な従来のミル装置の中で、０．１ミクロンから５０ミクロンの間の有意な粒径の画分を有する粒子を生じさせるために適している気圧を使用して、ジェットミルする（ｊｅｔ  ｍｉｌｌｉｎｇ）ことが含まれる。別の実施形態においては、粒径は、０．１ミクロンから２０ミクロンの間である。別の実施形態においては、粒径は、０．１ミクロンから１０ミクロンの間である。別の実施形態においては、粒径は、１．０ミクロンから５ミクロンの間である。なお別の実施形態においては、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸は、２．０ミクロンの粒径Ｄ５０を有する。
【００７２】
（化合物および薬学的に許容される組成物の使用）
なお別の態様においては、本発明は、ＣＦＴＲが関係している症状、疾患、または障害を処置する方法を提供する。特定の実施形態においては、本発明は、ＣＦＴＲ活性の欠損が関係している症状、疾患、または障害を処置する方法を提供する。この方法には、有効量の本明細書中に記載される化合物１を含有する用量単位を、それが必要な被験体（好ましくは、哺乳動物）に投与する工程が含まれる。
【００７３】
特定の実施形態においては、本発明は、哺乳動物のＣＦＴＲ媒介疾患を処置する方法を提供する。この方法には、上記哺乳動物に、有効量の本明細書中に記載される化合物１を含有する用量単位を投与する工程が含まれる。
【００７４】
別の実施形態にしたがうと、本発明は、ヒトの嚢胞性線維症を処置する方法を提供する。この方法には、上記ヒトに、有効量の本明細書中に記載される化合物１を含有する用量単位を投与する工程が含まれる。
【００７５】
特定の実施形態においては、本明細書中に記載される化合物１の用量単位は、呼吸器および非呼吸器上皮の頂端側膜において残留ＣＦＴＲ活性を示している患者において嚢胞性線維症を処置するか、またはその重篤度を下げるために有用である。上皮表面での残留ＣＦＴＲ活性の存在は、当該分野で公知の方法（例えば、標準的な電気生理学的、生化学的、または組織化学的技術）を使用して容易に検出することができる。そのような方法は、インビボもしくはエクスビボでの電気生理学的技術、汗もしくは唾液のＣｌ−濃度の測定、またはエクスビボでの生化学的もしくは組織化学的技術を使用して細胞表面密度をモニタリングすることによりＣＦＴＲ活性を同定する。そのような方法を使用して、残留ＣＦＴＲ活性を、異なる様々な突然変異についてヘテロ接合性またはホモ接合性である患者（最も一般的な突然変異であるΔＦ５０８についてホモ接合性またはヘテロ接合性である患者を含む）において容易に検出することができる。
【００７６】
１つの実施形態においては、本明細書中に記載される化合物１の用量単位は、残留ＣＦＴＲ活性を示している特定の遺伝子型（例えば、クラスＩＩＩ突然変異群（調節または開閉が損なわれている）、クラスＩＶ突然変異群（伝導性が変化している）、またはクラスＶ突然変異群（合成が低下している））の患者において嚢胞性線維症を処置するか、またはその重篤度を下げるために有用である（Ｌｅｅ  Ｒ．Ｃｈｏｏ−Ｋａｎｇ，Ｐａｍｅｌａ  Ｌ．，Ｚｅｉｔｌｉｎ，Ｔｙｐｅ  Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ，ａｎｄ  Ｖ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｔａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｙ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：５２１−５２９，２０００）。残留ＣＦＴＲ活性を示す他の患者の遺伝子型には、これらのクラスのうちの１つについてホモ接合性であるか、あるいは、クラスＩ突然変異群、クラスＩＩ突然変異群、または分類されない突然変異群を含む任意の他のクラスの突然変異群とヘテロ接合性である患者が含まれる。
【００７７】
１つの実施形態においては、本明細書中に記載される化合物１の用量単位は、特定の臨床的表現形（例えば、典型的には上皮の頂端側膜における残留ＣＦＴＲ活性の量と相関関係がある中程度〜軽度の臨床表現形）の患者において嚢胞性線維症を処置するか、またはその重篤度を下げるために有用である。そのような表現形には、膵臓機能不全を示している患者または特発性膵炎および先天性両側精管欠損症、または軽度の肺疾患と診断された患者が含まれる。
【００７８】
必要とされる正確な量は、被験体の種、年齢、および全身状態、感染症の重篤度、特定の薬剤、その投与方法などに応じて、被験体一人ひとりについて異なるであろう。本発明の化合物は、好ましくは、投与し易く、投与量の均一性が保たれる用量単位に処方される。しかし、本発明の化合物および組成物の１日の総投与量は、信頼できる医学的判断の範囲内で、担当医によって決定されることが理解されるであろう。任意の特定の患者または生物に特異的な有効投与量レベルは、処置される障害およびその障害の重篤度；使用される特定の化合物の活性；使用される特定の組成物；患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、および食事；投与時間、投与経路、および使用される特定の化合物の排泄速度；処置の持続時間；使用される特定の化合物と併用または同時使用される薬剤、ならびに、医学の分野で周知の同様の因子を含む様々な因子により変わるであろう。
【００７９】
特定の実施形態においては、本発明の化合物は、所望される治療効果を得るために、１日あたり被験体の体重あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの投与量レベルで、１日に１回以上で経口投与され得る。
【００８０】
化合物１の用量単位は、併用療法において使用することができる、すなわち、化合物１の用量単位を、１つ以上の他の所望される治療薬または医療手法と同時に、その前に、あるいはそれに続いて投与することができることも理解されるであろう。併用レジメンにおいて使用される治療（治療薬または手法）の特定の組み合わせは、所望される治療薬および／または手法との適合性、ならびに達成されるように所望される治療効果が考慮されるであろう。使用される治療により同じ障害について所望される効果が達成され得る（例えば、本発明の化合物が、同じ障害を処置するために使用される別の薬剤と同時に投与され得る）か、または、これらが異なる効果（例えば、あらゆる副作用の制御）を達成し得ることも理解されるであろう。本明細書中で使用される場合は、特定の疾患もしくは症状を処置または予防するために通常投与される追加の治療薬は、「処置される疾患または症状に適している」として知られているものである。
【００８１】
１つの実施形態においては、さらに別の薬剤は、粘液溶解薬、気管支拡張薬、抗生物質、抗感染症薬、抗炎症剤、本発明の化合物以外のＣＦＴＲ調節因子、または成分栄養剤から選択される。
【００８２】
別の実施形態においては、さらに別の薬剤は、ゲンタマイシン、クルクミン、シクロホスファミド、４−フェニルブチラート、ミグルスタット、フェロジピン、ニモジピン、フィロキシンＢ（Ｐｈｉｌｏｘｉｎ  Ｂ）、ゲニステイン（ｇｅｎｉｅｓｔｅｉｎ）、アピゲニン（Ａｐｉｇｅｎｉｎ）、ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ調節因子（例えば、ロリプラム、シルデナフィル、ミルリノン、タダラフィル、アムリノン、イソプロテレノール、アルブテロール、およびアルメテロール）、デオキシスペルグアリン、ＨＳＰ  ９０阻害剤、ＨＳＰ  ７０阻害剤、プロテオソーム阻害剤（例えば、エポキソミシン、ラクタシスチンなどから選択される化合物である。
【００８３】
別の実施形態においては、さらに別の薬剤は、ＷＯ２００４０２８４８０、ＷＯ２００４１１０３５２、ＷＯ２００５０９４３７４、ＷＯ２００５１２０４９７、またはＷＯ２００６１０１７４０に開示されている化合物である。
【００８４】
別の実施形態においては、さらに別の薬剤は、ＣＦＴＲ調節活性を示すベンゾ（ｃ）キノリジニウム誘導体、またはＣＦＴＲ調節活性を示すベンゾピラン誘導体である。
【００８５】
別の実施形態においては、さらに別の薬剤は、ＵＳ７２０２２６２、ＵＳ６９９２０９６、ＵＳ２００６０１４８８６４、ＵＳ２００６０１４８８６３、ＵＳ２００６００３５９４３、ＵＳ２００５０１６４９７３、ＷＯ２００６１１０４８３、ＷＯ２００６０４４４５６、ＷＯ２００６０４４６８２、ＷＯ２００６０４４５０５、ＷＯ２００６０４４５０３、ＷＯ２００６０４４５０２、またはＷＯ２００４０９１５０２に開示されている化合物である。
【００８６】
別の実施形態においては、さらに別の薬剤は、ＷＯ２００４０８０９７２、ＷＯ２００４１１１０１４、ＷＯ２００５０３５５１４、ＷＯ２００５０４９０１８、ＷＯ２００６００２４２１、ＷＯ２００６０９９２５６、ＷＯ２００６１２７５８８、またはＷＯ２００７０４４５６０に開示されている化合物である。
【００８７】
別の実施形態においては、さらに別の薬剤は、２００５年６月２４日に出願された米国特許出願公開番号２００６／００７４０７５として公開された、その全体が引用により本明細書中に組み入れられる米国特許出願番号１１／１６５，８１８の中で開示されている化合物から選択される。別の実施形態においては、さらに別の薬剤は、Ｎ−（５−ヒドロキシ−２，４−ジｔｅｒｔ−ブチル−フェニル）−４−オキソ−１Ｈ−キノリン−３−カルボキサミドである。これらの組み合わせは、嚢胞性線維症を含む本明細書中に記載される疾患を処置するために有用である。これらの組み合わせはまた、本明細書中に記載されるキットにおいても有用である。
【００８８】
本発明の組成物中に存在する追加の治療薬の量は、唯一の有効成分としてその治療薬を含有する組成物において通常投与されるであろう量以下であろう。本明細書中で開示される組成物中の追加の治療薬の量が、唯一の治療有効成分としてその薬剤を含有する組成物中に通常存在する量の約５０％〜１００％の範囲であることが好ましいであろう。
【実施例】
【００８９】
（方法および材料）
（示差走査熱量測定（ＤＳＣ））
化合物１の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）データを、ＤＳＣ  Ｑ１００  Ｖ９．６  Ｂｕｉｌｄ  ２９０（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）を使用して集めた。温度はインジウムで較正し、熱容量はサファイアで較正した。３〜６ｍｇの試料を秤量してアルミニウムパンに入れ、ピンホールが１つあるリッドを使用して両端をかしめた（ｃｒｉｍｐｅｄ）。試料を２５℃から３５０℃まで、１．０℃／分の加熱速度で、そして５０ｍｌ／分の窒素ガスパージを用いて走査した。データをＴｈｅｒｍａｌ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｑ  ＳｅｒｉｅｓＴＭバージョン２．２．０．２４８ソフトウェアにより集め、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアバージョン４．１Ｄ（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）により分析した。記録された数は単分析（ｓｉｎｇｌｅ  ａｎａｌｙｓｅｓ）を表す。
【００９０】
（熱重量分析（ＴＧＡ））
熱重量分析（ＴＧＡ）は、ＴＧＡ測定に使用したＴＧＡ  Ｑ５００  Ｖ６．３  Ｂｕｉｌｄ  １８９（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）を用いて行った。温度はニッケルでキュリー点まで平衡化させた。１０〜２０ｍｇの試料を２５℃から３５０℃まで、１０℃／分の加熱速度で走査した。１０ｍｌ／分の窒素ガスバランスパージおよび９０ｍｌ／分の試料パージを使用した。データをＴｈｅｒｍａｌ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｑ  ＳｅｒｉｅｓＴＭソフトウェアバージョン２．２．０．２４８により集め、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアバージョン４．１Ｄ（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）により分析した。記録された数は単分析を表す。
【００９１】
（ＸＲＰＤ（Ｘ線粉末回折））
化合物１のＸ線回折（ＸＲＤ）データを、ＨＩ−ＳＴＡＲ  ２次元検出装置と平型グラファイト製モノクロメーターを備えたＢｒｕｋｅｒ  Ｄ８  ＤＩＳＣＯＶＥＲ粉末Ｘ線回折装置で収集した。Ｋα線源（Ｋα  ｒａｄｉａｔｉｏｎ）を備えたＣｕシール管を４０ｋＶ、３５ｍＡで使用した。試料を２５℃のゼロバックグラウンドのシリコンウェハー上に置いた。各試料について２つのデータフレームを、各々２種類の２θ角：８°および２６°で、１２０秒で集めた。これらのデータをＧＡＤＤＳソフトウェアにより統合し、ＤＩＦＦＲＡＣＴｐｌｕｓＥＶＡソフトウェアでマージした（ｍｅｒｇｅｄ）。記録されたピーク位置についての不確実さは±０．２度である。
【００９２】
（ジェットミルについての記載）
微粉化していない化合物１は、塊を分解する（ｄｅ−ｌｕｍｐ）ためにこれを篩にかけ、その後、ジェットミルホッパー（ｊｅｔ  ｍｉｌｌ  ｈｏｐｐｅｒ）にこれを投入した。篩は全て使い捨てとし、使用する前に拭き、化合物１を入れた。微粉化していない化合物１を、制御された供給速度で高圧窒素ガスを使用してジェットミルホッパーに添加した。ガスの圧力は、４０〜４５／４５〜７０（Ｖｅｎｔｕｒｉ／Ｍｉｌｌ）ＰＳＩの範囲とし、供給速度は、０．５〜１．６Ｋｇ／時間の範囲とした。化合物１を、粒子同士および粒子と壁との衝突によりミルの中で微粉化し、処理した化合物１を微粉化した生成物の容器の中に流し込んだ。当業者は、上記条件に一部基づいて、ピンミル（ｐｉｎ  ｍｉｌｌｉｎｇ）によってもまた好ましい粒径を持つ化合物１が得ることができると考えられる。
【００９３】
Ｖｉｔｒｉｄｅ（登録商標）（ナトリウムビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムヒドリド［すなわち、ＮａＡｌＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）２］、トルエン中の６５ｗｇｔ％の溶液）は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。
【００９４】
２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−カルボン酸は、Ｓａｌｔｉｇｏ（Ｌａｎｘｅｓｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの系列会社）から購入した。
【００９５】
本出願の全てにおいて、化合物の名称がその化合物の構造を正確に記載できていない場合は、その構造が名称よりも優先され、支配するものとする。
【００９６】
（３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸・ＨＣｌの合成）
（酸塩化物部分）
（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−メタノールの合成
【００９７】
【化５】
2012504143.tif 000007
市販されている２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−カルボン酸（１．０当量）をトルエン（１０倍容量）の中でスラリーにする。Ｖｉｔｒｉｄｅ（登録商標）（２当量）を、滴下漏斗を通じて、１５〜２５℃の温度を維持する速度で添加する。滴下が終了した時点で、温度を２時間かけて４０℃に上昇させ、その後、１０％（ｗ／ｗ）のＮａＯＨ水溶液（４．０当量）を、４０〜５０℃の温度を維持しながら、滴下漏斗を通じて注意深く添加する。さらに３０分間の撹拌の後、４０℃で層を分離させる。有機相を２０℃に冷却し、その後、水で洗浄し（２回×１．５倍容量）、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、そして濃縮して、粗（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−メタノールを得る。これを次の工程に直接使用する。
【００９８】
５−クロロメチル−２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソールの合成
【００９９】
【化６】
2012504143.tif 000008
（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−メタノール（１．０当量）をＭＴＢＥ（５倍容量）に溶解させる。触媒量のＤＭＡＰ（１ｍｏｌ％）を添加し、ＳＯＣｌ２（１．２当量）を滴下漏斗を通じて添加する。ＳＯＣｌ２は、反応器内の温度を１５〜２５℃に維持する速度で添加する。温度を１時間かけて３０℃に上昇させ、その後、２０℃に冷却し、次いで水（４倍容量）を、温度を３０℃未満に維持しながら、滴下漏斗を通じて添加する。さらに３０分間の撹拌の後、層を分離させる。有機層を撹拌し、１０％（ｗ／ｖ）のＮａＯＨ水溶液（４．４倍容量）を添加する。１５〜２０分間の撹拌の後、層を分離させる。次いで、有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮して、粗５−クロロメチル−２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソールを得る。これを次の工程に直接使用する。
【０１００】
（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−アセトニトリルの合成
【０１０１】
【化７】
2012504143.tif 000009
ＤＭＳＯ（１．２５倍容量）中の５−クロロメチル−２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール（１当量）の溶液を、温度を３０〜４０℃に維持しながら、ＤＭＳＯ（３倍容量）中のＮａＣＮ（１．４当量）のスラリーに添加する。この混合物を１時間撹拌し、その後、水（６倍容量）を添加し、続いてＭＴＢＥ（４倍容量）を添加する。３０分間の撹拌の後、層を分離させる。水層をＭＴＢＥ（１．８倍容量）で抽出する。合わせて１つにした有機層を水（１．８倍容量）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮して、粗（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−アセトニトリル（９５％）を得る。これを次の工程に直接使用する。
【０１０２】
（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボニトリルの合成。
【０１０３】
【化８】
2012504143.tif 000010
（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−アセトニトリル（１．０当量）、５０ｗｔ％のＫＯＨ水溶液（５．０当量）、１−ブロモ−２−クロロエタン（１．５当量）、およびＯｃｔ４ＮＢｒ（０．０２当量）の混合物を、７０℃で１時間加熱する。この反応混合物を冷却し、次いで、ＭＴＢＥおよび水で後処理する（ｗｏｒｋｅｄ  ｕｐ）。有機相を水および食塩水で洗浄し、溶媒を除去して、（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボニトリルを得る。
【０１０４】
１−（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボン酸の合成
【０１０５】
【化９】
2012504143.tif 000011
（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボニトリルを、エタノール（５倍容量）中の６ＭのＮａＯＨ（８当量）を使用して、８０℃で一晩加水分解する。この混合物を室温に冷却し、エタノールを減圧下で蒸発させる。残渣を水およびＭＴＢＥ中に採り、１ＭのＨＣｌを添加し、層を分離させる。次いで、ＭＴＢＥ層をジシクロヘキシルアミン（０．９７当量）で処理した。このスラリーを０℃に冷却し、濾過し、ヘプタンで洗浄して、対応するＤＣＨＡ塩を得る。この塩をＭＴＢＥおよび１０％のクエン酸中に採り、全ての固体が溶解するまで撹拌する。層を分離させ、ＭＴＢＥ層を水および食塩水で洗浄した。溶媒をヘプタンに交換し、続いて濾過すると、５０℃で一晩の真空オーブンの中での乾燥後に１−（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボン酸が得られる。
【０１０６】
１−（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボニルクロリドの合成
【０１０７】
【化１０】
2012504143.tif 000012
１−（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−シクロプロパンカルボン酸（１．２当量）をトルエン（２．５倍容量）中でスラリーにし、この混合物を６０℃に加熱する。ＳＯＣｌ２（１．４当量）を滴下漏斗を通じて添加する。３０分後に、トルエンとＳＯＣｌ２をこの反応混合物から蒸留する。さらにトルエン（２．５倍容量）を添加し、再び蒸留する。
【０１０８】
（アミン部分）
ｔｅｒｔ−ブチル−３−（３−メチルピリジン−２−イル）ベンゾエートの合成
【０１０９】
【化１１】
2012504143.tif 000013
２−ブロモ−３−メチルピリジン（１．０当量）をトルエン（１２倍容量）中に溶解させる。Ｋ２ＣＯ３（４．８当量）を添加し、続いて水（３．５倍容量）を添加し、この混合物を、Ｎ２流下で１時間かけて、６５℃に加熱する。その後、３−（ｔ−ブトキシカルボニル）フェニルボロン酸（１．０５当量）とＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２・ＣＨ２Ｃｌ２（０．０１５当量）を添加し、この混合物を８０℃に加熱する。２時間後、加熱を止め、水（３．５倍容量）を添加し、層を分離させる。その後、有機相を水（３．５倍容量）で洗浄し、１０％のメタンスルホン酸水溶液（２当量のＭｓＯＨ、７．７倍容量）で抽出する。水相を５０％のＮａＯＨ水溶液（２当量）で塩基性にし、ＥｔＯＡｃ（８倍容量）で抽出する。有機層を濃縮して、粗ｔｅｒｔ−ブチル−３−（３−メチルピリジン−２−イル）ベンゾエート（８２％）を得る。これを次の工程に直接使用する。
【０１１０】
２−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）フェニル）−３−メチルピリジン−１−オキサイドの合成
【０１１１】
【化１２】
2012504143.tif 000014
ｔｅｒｔ−ブチル−３−（３−メチルピリジン−２−イル）ベンゾエート（１．０当量）をＥｔＯＡｃ（６倍容量）中に溶解させる。水（０．３倍容量）を添加し、続いて、尿素−過酸化水素（３当量）を添加する。無水フタル酸（３当量）を、反応器内の温度を４５℃未満に維持し、固体として何度かに分けて（ｐｏｒｔｉｏｎ−ｗｉｓｅ）添加する。無水フタル酸の添加の完了後、この混合物を４５℃に加熱する。さらに４時間の撹拌の後、加熱を止める。１０％ｗ／ｗのＮａ２ＳＯ３水溶液（１．５当量）を滴下漏斗を通じて添加する。Ｎａ２ＳＯ３の添加の完了後、この混合物をさらに３０分間撹拌し、層分離させる。有機層を撹拌し、１０％ｗ／ｗのＮａ２ＣＯ３水溶液（２当量）を添加する。３０分間の撹拌の後、層を分離させる。有機相を１３％ｗ／ｖのＮａＣｌ水溶液で洗浄する。その後、有機相を濾過し、濃縮して、粗２−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）フェニル）−３−メチルピリジン−１−オキサイド（９５％）を得る。これを次の工程に直接使用する。
【０１１２】
ｔｅｒｔ−ブチル−３−（６−アミノ−３−メチルピリジン−２−イル）ベンゾエートの合成
【０１１３】
【化１３】
2012504143.tif 000015
ＭｅＣＮ（８倍容量）中の２−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）フェニル）−３−メチルピリジン−１−オキサイド（１当量）とピリジン（４当量）の溶液を７０℃に加熱する。ＭｅＣＮ（２倍容量）中のメタンスルホン酸無水物（１．５当量）の溶液を、７５℃未満に温度を維持しながら、滴下漏斗を通じて５０分かけて添加する。添加の完了後、この混合物をさらに０．５時間撹拌する。次いで、この混合物を室温に冷却する。エタノールアミン（１０当量）を滴下漏斗を通じて添加する。２時間の撹拌後、水（６倍容量）を添加し、この混合物を約１０℃に冷却する。少なくとも（ＮＬＴ）３時間の撹拌の後、固体を濾過によって集め、水（３倍容量）、２：１のＭｅＣＮ／水（３倍容量）、およびＭｅＣＮ（２回×１．５倍容量）で洗浄する。わずかなＮ２流を用いて５０℃の真空オーブンの中で、この固体を恒量（＜１％の差）となるまで乾燥させて、ｔｅｒｔ−ブチル−３−（６−アミノ−３−メチルピリジン−２−イル）ベンゾエートを赤−黄色の固体（５３％の収率）として得る。
【０１１４】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）−ｔ−ブチルベンゾエートの合成
【０１１５】
【化１４】
2012504143.tif 000016
粗酸塩化物をトルエン（酸塩化物に基づいて２．５倍容量）中に溶解させ、これを、トルエン（ｔｅｒｔ−ブチル−３−（６−アミノ−３−メチルピリジン−２−イル）ベンゾエートに基づいて４倍容量）中のｔｅｒｔ−ブチル−３−（６−アミノ−３−メチルピリジン−２−イル）ベンゾエート（１当量）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、０．０２当量）、およびトリエチルアミン（３．０当量）の混合物に対して、滴下漏斗を通じて添加する。２時間後、水（ｔｅｒｔ−ブチル−３−（６−アミノ−３−メチルピリジン−２−イル）ベンゾエートに基づいて４倍容量）をこの反応混合物に添加する。３０分間の撹拌の後、層を分離させる。その後、有機相を濾過し、濃縮して、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）−ｔ−ブチルベンゾエートの濃い油（定量的な粗収率）を得る。ＭｅＣＮ（粗生成物に基づいて３倍容量）を添加し、結晶化が起こるまで蒸留させる。水（粗生成物に基づいて２倍容量）を添加し、この混合物を２時間撹拌する。固体を濾過によって集め、１：１（容量で）のＭｅＣＮ／水（２回×粗生成物に基づいて１倍容量）で洗浄し、濾紙上で減圧下で部分的に乾燥させる。わずかなＮ２流を用いて６０℃で真空オーブンの中で、この固体を恒量（＜１％の差）となるまで乾燥させて、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）−ｔ−ブチルベンゾエートを茶色の固体として得る。
【０１１６】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸・ＨＣＬ塩の合成
【０１１７】
【化１５】
2012504143.tif 000017
ＭｅＣＮ（３．０倍容量）中の３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）−ｔ−ブチルベンゾエート（１．０当量）のスラリーに対して水（０．８３倍容量）を添加し、続いて、濃ＨＣｌ水溶液（０．８３倍容量）を添加する。この混合物を４５±５℃に加熱する。２４〜４８時間の撹拌の後に反応が完了し、この混合物を室温に冷却する。水（１．３３倍容量）を添加し、この混合物を撹拌する。固体を濾過によって集め、水（２回×０．３倍容量）で洗浄し、濾紙上で減圧下で部分的に乾燥させる。わずかなＮ２流を用いて６０℃の真空オーブンの中で、この固体を恒量（＜１％の差）となるまで乾燥させて、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸・ＨＣｌを灰白色の固体として得る。
【０１１８】
３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸（形態Ｉの化合物１）の合成．
【０１１９】
【化１６】
2012504143.tif 000018
水（１０倍容量）中の３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸・ＨＣｌ（１当量）のスラリーを室温で撹拌する。試料を、２４時間の撹拌後に採る。この試料を濾過し、固体を水で洗浄する（２回）。この固体試料をＤＳＣ分析に提出する。ＤＳＣ分析が化合物１への変換の完了を示したら、この固体を濾過によって集め、水（２回×１．０倍容量）で洗浄し、濾紙上で減圧下で部分的に乾燥させる。わずかなＮ２流を用いて６０℃の真空オーブンの中で、この固体を恒量（＜１％の差）となるまで乾燥させて、化合物１を灰白色の固体（９８％の収率）として得る。
【０１２０】
水および塩基を使用する３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸（形態Ｉの化合物１）の合成
【０１２１】
【化１７】
2012504143.tif 000019
室温で撹拌した水（１０倍容量）中の３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸・ＨＣｌ（１当量）のスラリーに対して、５０％ｗ／ｗのＮａＯＨ水溶液（２．５当量）を添加する。この混合物を少なくとも（ＮＬＴ）１５分間、または均一な溶液になるまで撹拌する。濃ＨＣｌ（４当量）を添加して化合物１を結晶化させる。ｔ−ブチルベンゾエートエステルのレベルを下げる必要がある場合には、この混合物を６０℃または９０℃に加熱する。この混合物を、ＨＰＬＣ分析が０．８％（ＡＵＣ）以下（ＮＭＴ）のｔ−ブチルベンゾエートエステルを示すまで加熱する。その後、この混合物を室温に冷却し、固体を濾過によって集め、水（３回×３．４倍容量）で洗浄し、濾紙上で減圧下で部分的に乾燥させる。わずかなＮ２流を用いて６０℃の真空オーブンの中で、この固体を恒量（＜１％の差）となるまで乾燥させて、化合物１を灰白色の固体（９７％の収率）として得る。
【０１２２】
ベンゾエートからの直接の３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）安息香酸（形態Ｉの化合物１）の合成
【０１２３】
【化１８】
2012504143.tif 000020
ギ酸（３．０倍容量）中の３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）−ｔ−ブチルベンゾエート（１．０当量）の溶液を７０±１０℃に加熱する。この反応は、反応が完了する（１．０％  ＡＵＣ以下（ＮＭＴ）の３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）−ｔ−ブチルベンゾエート）まで継続するか、または８時間以下（ＮＭＴ）加熱する。この混合物を室温に冷却する。この溶液を、５０℃に加熱した水（６倍容量）に添加し、混合物を撹拌する。その後、この混合物を、３−（６−（１−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボキサミド）−３−メチルピリジン−２−イル）−ｔ−ブチルベンゾエートのレベルが０．８％（ＡＵＣ）未満（ＮＭＴ）となるまで、７０±１０℃に加熱する。固体を濾過によって集め、水（２回×３倍容量）で洗浄し、濾紙上で減圧下で部分的に乾燥させる。わずかなＮ２流を用いて６０℃の真空オーブンの中で、この固体を恒量（＜１％の差）となるまで乾燥させて、形態Ｉの化合物１を灰白色の固体として得る。
【０１２４】
形態Ｉの化合物１の単結晶構造から計算したＸ線回折パターンを図１に示す。表１は図１について計算したピークを列挙する。
【０１２５】
【表１】
2012504143.tif 000021
形態Ｉの化合物１の実際のＸ線粉末回折パターンを図２に示す。表２は、図２についての実際のピークを列挙する。
【０１２６】
【表２】
2012504143.tif 000022
形態Ｉの化合物１の単結晶構造から計算したＸ線回折パターンと形態Ｉの化合物１の実際のＸ線粉末回折パターンの重ね合わせを図３に示す。この重ね合わせは、計算したピーク位置と実際のピーク位置との間での良好な一致を示し、差はわずか約０．１５度である。
【０１２７】
形態Ｉの化合物１のＤＳＣトレースを図４に示す。形態Ｉの化合物１の融解は約２０４℃で起こる。
【０１２８】
単結晶Ｘ線分析に基づく形態Ｉの化合物１の立体配座の絵を図５〜８に示す。図６〜８は、二量体のカルボン酸基の水素結合と、結晶の中に存在するそれによって生じる積み重なりを示す。この結晶構造は、分子の高密度でのパッキングを明らかにする。形態Ｉの化合物１は、以下の格子定数を持つ単斜のＰ２１／ｎである：ａ＝４．９６２６（７）Å、ｂ＝１２．２９９（２）Å、ｃ＝３３．０７５（４）Å、β＝９３．９３８（９）°、Ｖ＝２０１４．０Å３、Ｚ＝４。構造データから計算した形態Ｉの化合物１の密度は、１００Ｋで１．４９２ｇ／ｃｍ３である。
【０１２９】
化合物１の１ＨＮＭＲスペクトルを図９〜１１に示す（図９および１０は、５０ｍｇ／ｍＬの、０．５メチルセルロース−ポリソルベート８０懸濁液中の形態Ｉの化合物１を示し、図１１は、ＨＣｌ塩としての化合物１を示す）。
【０１３０】
以下の表３は、化合物１についてのさらなる分析データを示す。
【０１３１】
【表３】
2012504143.tif 000023
（アッセイ）
（化合物のΔＦ５０８−ＣＦＴＲ矯正特性（Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ）を検出および測定するためのアッセイ）
（化合物のΔＦ５０８−ＣＦＴＲ調節特性をアッセイするための膜電位の光学的測定方法）
上記光学的膜電位アッセイでは、ＧｏｎｚａｌｅｚおよびＴｓｉｅｎによって記載された電圧感受性のＦＲＥＴセンサー（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ  Ｒ．Ｙ．Ｔｓｉｅｎ（１９９５）「Ｖｏｌｔａｇｅ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ」Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ６９（４）：１２７２−８０、およびＧｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ  Ｒ．Ｙ．Ｔｓｉｅｎ（１９９７）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈａｔ  ｕｓｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ」Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ４（４）：２６９−７７を参照のこと）を、電圧／イオンプローブリーダー（ＶＩＰＲ）のような、蛍光変化を測定するための計測器（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．Ｅ．，Ｋ．Ｏａｄｅｓ，ら、（１９９９）「Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｏｎ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｔａｒｇｅｔｓ」Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  ４（９）：４３１−４３９を参照のこと）と組み合わせて利用した。
【０１３２】
これらの電圧感受性アッセイは、膜可溶性の電圧感受性色素であるＤｉＳＢＡＣ２（３）と蛍光性リン脂質であるＣＣ２−ＤＭＰＥとの間での蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）における変化に基づく。ＣＣ２−ＤＭＰＥは、原形質膜の外側のリーフレットに結合され、そしてＦＲＥＴ供与体として働く。膜電位（Ｖｍ）の変化は、負に荷電したＤｉＳＢＡＣ２（３）の原形質膜を横切っての再分布を生じさせ、それにしたがってＣＣ２−ＤＭＰＥからのエネルギー転移の量が変化する。蛍光放射の変化は、ＶＩＰＲ（商標）ＩＩを使用してモニタリングした。ＶＩＰＲ（商標）ＩＩは、９６ウェルマイクロタイタープレートまたは３８４ウェルマイクロタイタープレートの中で細胞をベースとするスクリーニングを行うために設計された、一体型の液体ハンドラー（ｈａｎｄｌｅｒ）および蛍光検出器である。
【０１３３】
（１．矯正化合物の同定）
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲに関連する輸送の欠陥を矯正する低分子を同定するために、１回添加ＨＴＳアッセイ（ｓｉｎｇｌｅ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ＨＴＳ  ａｓｓａｙ）形式を開発した。細胞を、試験化合物の存在下または非存在下（ネガティブコントロール）で、３７℃にて１６時間、無血清培地中でインキュベーションした。ポジティブコントロールとして、３８４ウェルプレートにプレーティングした細胞を、２７℃で１６時間インキュベーションして「温度−矯正」ΔＦ５０８−ＣＦＴＲとした。続いて、上記細胞を、Ｋｒｅｂｓ  Ｒｉｎｇｅｒｓ溶液で３回リンスし、そして電圧感受性色素を充填した。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを活性化させるために、１０μＭのフォルスコリンと、ＣＦＴＲ増強因子であるゲニステイン（２０μＭ）を、Ｃｌ−非含有培地とともに各ウェルに添加した。Ｃｌ−非含有培地の添加は、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲの活性化に応答してＣｌ−流出を促進し、そして生じた膜の脱分極を、ＦＲＥＴをベースとする電圧感知色素（ｖｏｌｔａｇｅ−ｓｅｎｓｏｒ  ｄｙｅ）を使用して光学的にモニタリングした。
【０１３４】
（２．増強因子化合物の同定）
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲの増強因子を同定するために、２回添加ＨＴＳアッセイ形式を開発した。最初の添加の間に、試験化合物を含むＣｌ−非含有培地または試験化合物を含まないＣｌ−非含有培地を、各ウェルに添加した。２２秒後、２〜１０μＭのフォルスコリンを含むＣｌ−非含有培地の２回目の添加を行って、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを活性化させた。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲの活性化に応答してＣｌ−流出を促進した、２回の添加後の細胞外Ｃｌ−濃度は、２８ｍＭであり、そして生じた膜の脱分極を、ＦＲＥＴをベースとする電圧感知色素を使用して光学的にモニタリングした。
【０１３５】
（３．溶液）
バス溶液番号１：（ｍＭ）  ＮａＣｌ  １６０、ＫＣｌ  ４．５、ＣａＣｌ２  ２、ＭｇＣｌ２  １、ＨＥＰＥＳ  １０、ＮａＯＨによってｐＨ７．４。
塩化物非含有バス溶液：バス溶液番号１中の塩化物塩をグルコン酸塩に置き換えた。
ＣＣ２−ＤＭＰＥ：ＤＭＳＯ中の１０ｍＭのストック溶液として調製し、−２０℃で保存した。
ＤｉＳＢＡＣ２（３）：ＤＭＳＯ中の１０ｍＭのストックとして調製し、−２０℃で保存した。
【０１３６】
（４．細胞培養）
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定して発現するＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞を、膜電位の光学的測定に使用した。この細胞を、１７５ｃｍ２の培養フラスコ中の、２ｍＭのグルタミン、１０％のウシ胎仔血清、１×ＮＥＡＡ、β−ＭＥ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、および２５ｍＭのＨＥＰＥＳを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ培地中で、５％のＣＯ２および９０％の湿度で、３７℃で維持した。全ての光学的アッセイについて、これらの細胞を、３８４ウェルのマトリゲルをコーティングしたプレートの中に３０，０００個／ウェルで播種し、増強因子アッセイのためには、３７℃で２時間培養し、その後、２７℃で２４時間培養した。矯正アッセイについては、上記細胞を、２７℃または３７℃で、化合物とともに、および化合物を含めずに、１６〜２４時間培養した。
【０１３７】
（化合物のΔＦ５０８−ＣＦＴＲ調節特性をアッセイするための電気生理学的アッセイ
（１．ウッシングチャンバーアッセイ（ｕｓｉｎｇ  ｃｈａｍｂｅｒ  ａｓｓａｙ））
ウッシングチャンバー（ｕｓｉｎｇ  ｃｈａｍｂｅｒ）実験を、光学的アッセイにおいて同定したΔＦ５０８−ＣＦＴＲ調節因子をさらに特性決定するために、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを発現する分極した上皮細胞について行った。Ｃｏｓｔａｒ  Ｓｎａｐｗｅｌｌ細胞培養挿入物上で増殖させたＦＲＴΔＦ５０８−ＣＦＴＲ上皮細胞を、ウッシングチャンバー（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にマウントし、この単層を、ボルテージクランプシステム（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ，ＩＡ、および、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して連続的に短絡化させた。経上皮抵抗（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を、２ｍＶのパルスを印加することによって測定した。これらの条件下で、このＦＲＴ上皮は、４ＫΩ／ｃｍ２以上の抵抗を示した。この溶液を２７℃で維持し、そして空気で泡立てた。電極オフセット電位と流体抵抗を、細胞を含まない挿入物を使用して補正した。これらの条件下では、電流は、その頂端膜の中で発現されたΔＦ５０８−ＣＦＴＲを通過するＣｌ−の流れを反映する。ＩＳＣは、ＭＰ１００Ａ−ＣＥインターフェースおよびＡｃｑＫｎｏｗｌｅｄｇｅソフトウェア（ν３．２．６；ＢＩＯＰＡＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を使用してデジタル的に取得した。
【０１３８】
（２．矯正化合物の同定）
典型的なプロトコルでは、側底膜から頂端膜にかけてのＣｌ−濃度勾配を利用した。この勾配を設定するために、通常のリンガー液を側底膜上で使用し、一方、頂端膜のＮａＣｌを等モルのグルコン酸ナトリウム（ＮａＯＨでｐＨ７．４に滴定した）によって置き換えて、この上皮を横切る大きなＣｌ−濃度勾配を得た。全ての実験を、インタクトな単層を用いて行った。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを完全に活性化させるために、フォルスコリン（１０μＭ）と、ＰＤＥ阻害剤であるＩＢＭＸ（１００μＭ）を加え、続いて、ＣＦＴＲ増強因子であるゲニステイン（５０μＭ）を添加した。
【０１３９】
他のタイプの細胞において観察されるように、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定して発現するＦＲＴ細胞の低温でのインキュベーションは、その原形質膜中のＣＦＴＲの機能上の密度を増加させる。矯正化合物の活性を決定するために、上記細胞を、１０μＭのこの試験化合物とともに３７℃で２４時間インキュベーションし、続いて記録前に３回洗浄した。化合物で処理した細胞におけるｃＡＭＰ媒介性ＩＳＣおよびゲニステイン媒介性ＩＳＣを、２７℃のコントロールおよび３７℃のコントロールに対して標準化し、そして活性の割合（％）として表わした。細胞の矯正化合物との前インキュベーションにより、３７℃のコントロールと比較して、ｃＡＭＰ媒介性ＩＳＣおよびゲニステイン媒介性ＩＳＣが有意に上昇した。
【０１４０】
（３．増強因子化合物の同定）
典型的なプロトコルでは、側底膜から頂端膜にかけてのＣｌ−濃度勾配を利用した。この勾配を設定するために、通常のリンガー液を側底膜上で使用し、ナイスタチン（３６０μｇ／ｍｌ）で透過性にし、一方、頂端膜のＮａＣｌを、等モルのグルコン酸ナトリウム（ＮａＯＨでｐＨ７．４に滴定した）によって置き換えて、この上皮を横切る大きなＣｌ−濃度勾配を得た。全ての実験は、ナイスタチンによる透過化の３０分後に行った。フォルスコリン（１０μＭ）および全ての試験化合物を、この細胞培養挿入物の両側に添加した。推定のΔＦ５０８−ＣＦＴＲ増強因子の有効性を、公知の増強因子であるゲニステインの有効性と比較した。
【０１４１】
（４．溶液）
側底膜用溶液（ｍＭ）：ＮａＣｌ（１３５）、ＣａＣｌ２（１．２）、ＭｇＣｌ２（１．２）、Ｋ２ＨＰＯ４（２．４）、ＫＨＰＯ４（０．６）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（１０）、およびデキストロース（１０）。この溶液を、ＮａＯＨでｐＨ７．４になるように滴定した。
頂端膜用溶液（ｍＭ）：ＮａＣｌをグルコン酸Ｎａ（１３５）に置き換えた、側底膜用溶液と同じもの。
【０１４２】
（５．細胞培養）
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを発現するＦｉｓｈｅｒラット上皮（ＦＲＴ）細胞（ＦＲＴΔＦ５０８−ＣＦＴＲ）を、本発明者らの光学的アッセイにより同定した推定のΔＦ５０８−ＣＦＴＲ調節因子についてのウッシングチャンバー実験に使用した。これらの細胞を、Ｃｏｓｔａｒ  Ｓｎａｐｗｅｌｌ細胞培養用挿入物上で培養し、５％のウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＣｏｏｎ’ｓ改変Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地中で、３７℃、そして５％のＣＯ２で、５日間培養した。化合物の増強因子活性を特性決定するための使用の前に、これらの細胞を、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを矯正するためには、２７℃にて１６〜４８時間インキュベーションした。矯正化合物の活性を決定するためには、この細胞を、２７℃または３７℃で、化合物とともに、および化合物を含めずに、２４時間インキュベーションした。
【０１４３】
（６．ホールセル記録）
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定して発現する温度で矯正されたＮＩＨ３Ｔ３細胞およびΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定して発現する試験化合物で矯正されたＮＩＨ３Ｔ３細胞の巨視的なΔＦ５０８−ＣＦＴＲ電流（ＩΔＦ５０８）を、穿孔パッチ、ホールセル記録を使用してモニタリングした。簡単に説明すると、ＩΔＦ５０８のボルテージクランプ記録を、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂパッチクランプ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して室温で行った。全ての記録を、１０ｋＨｚのサンプリング周波数で、そして１ｋＨｚのローパスフィルターで取得した。ピペットは、細胞内溶液で満たした場合には、５〜６ＭΩの抵抗を有していた。これらの記録条件下では、室温でＣｌ−について計算した逆転電位（ＥＣｌ）は、−２８ｍＶであった。全ての記録は、２０ＧΩより大きいシール抵抗および１５ＭΩより小さい直列抵抗を有していた。パルスの発生、データの取得、および分析は、Ｃｌａｍｐｅｘ  ８（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）とつないだＤｉｇｉｄａｔａ  １３２０  Ａ／Ｄインターフェースを搭載したＰＣを使用して行った。このバスには、２５０μｌ未満の生理食塩水を含め、そしてこれを、重力による灌流システムを使用して、２ｍｌ／分の速度で連続的に灌流させた。
【０１４４】
（７．矯正化合物の同定）
原形質膜中の機能的ΔＦ５０８−ＣＦＴＲの密度を上昇させるための矯正化合物の活性を決定するために、本発明者らは、上記の穿孔パッチ記録技術を使用して、この矯正化合物で２４時間処理した後の電流密度を測定した。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを完全に活性化させるために、１０μＭのフォルスコリン、および２０μＭのゲニステインを上記細胞に添加した。本発明者らの記録条件下においては、２７℃で２４時間インキュベーションした後の電流密度は、３７℃で２４時間インキュベーションした後に観察された電流密度より高かった。これらの結果は、原形質膜中のΔＦ５０８−ＣＦＴＲの密度に対する低温でのインキュベーションの公知の効果と一致する。ＣＦＴＲ電流密度に対する矯正化合物の効果を決定するために、上記細胞を、１０μＭのこの試験化合物とともに、３７℃で２４時間インキュベーションし、この電流密度を、２７℃のコントロールおよび３７℃のコントロールと比較した（％活性）。記録前に、これらの細胞を、細胞外記録培地で３回洗浄して、残存している試験化合物を全て除去した。１０μＭの矯正化合物とのプレインキュベーションは、３７℃のコントロールと比較して、ｃＡＭＰ依存性の電流およびゲニステイン依存性の電流を、有意に上昇させた。
【０１４５】
（８．増強因子化合物の同定）
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定して発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞における巨視的なΔＦ５０８−ＣＦＴＲによるＣｌ−電流（ＩΔＦ５０８）を上昇させるΔＦ５０８−ＣＦＴＲ増強因子の能力もまた、穿孔パッチ記録技術を使用して調査した。上記光学的アッセイにより同定した増強因子は、その光学的アッセイにおいて観察されたものと同様の効力および有効性で、ＩΔＦ５０８の用量依存的上昇を引き起こした。試験した全ての細胞において、増強因子の添加前および添加の際の逆転電位は、およそ−３０ｍＶであり、これは、計算したＥＣｌ（−２８ｍＶ）である。
【０１４６】
（９．溶液）
細胞内溶液（ｍＭ）：アスパラギン酸Ｃｓ（９０）、ＣｓＣｌ（５０）、ＭｇＣｌ２（１）、ＨＥＰＥＳ（１０）、および２４０μｇ／ｍｌのアンホテリシン−Ｂ（ＣｓＯＨでｐＨを７．３５に調整した）。
細胞外溶液（ｍＭ）：Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＮＭＤＧ）−Ｃｌ（１５０）、ＭｇＣｌ２（２）、ＣａＣｌ２（２）、ＨＥＰＥＳ（１０）（ＨＣｌでｐＨを７．３５に調整した）。
【０１４７】
（１０．細胞培養）
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定して発現するＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞をホールセル記録に使用する。これらの細胞を、１７５ｃｍ２の培養フラスコ中の、２ｍＭのグルタミン、１０％のウシ胎仔血清、１×ＮＥＡＡ、β−ＭＥ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、および２５ｍＭのＨＥＰＥＳを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ培地中で、５％のＣＯ２および９０％の湿度で、３７℃で維持した。ホールセル記録については、２，５００〜５，０００個の細胞を、ポリ−Ｌ−リジンをコーティングしたガラスカバースリップ上に播種し、増強因子の活性を試験するための使用の前に、２７℃で２４〜４８時間培養し、そして矯正化合物の活性を測定するために、３７℃で、矯正化合物とともに、または矯正化合物を含めずにインキュベーションした。
【０１４８】
（１１．単一チャネル（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｎｎｅｌ）記録）
ＮＩＨ３Ｔ３細胞中で安定して発現された温度矯正ΔＦ５０８−ＣＦＴＲの単一チャネル活性および増強因子化合物の活性を、切除したインサイドアウト膜パッチ（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐａｔｃｈ）を使用して観察した。簡単に説明すると、単一チャネル活動のボルテージクランプ記録を、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂパッチクランプ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）を用いて室温で行った。全ての記録を、１０ｋＨｚのサンプリング周波数で、そして４００Ｈｚのローパスフィルターで取得した。パッチピペットは、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｋｏｖａｒ  Ｓｅａｌｉｎｇ番号７０５２ガラス（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）により作製されたものであり、そしてこのピペットは、細胞外溶液で満たした場合には、５〜８ＭΩの抵抗を有していた。このΔＦ５０８−ＣＦＴＲを、切除後に、１ｍＭのＭｇ−ＡＴＰ、および７５ｎＭのｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ、触媒サブユニット（ＰＫＡ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を添加することによって活性化させた。チャネル活性が安定化した後、このパッチを、重力によるマイクロ灌流システムを使用して灌流させた。この流入をこのパッチに隣接させて配置し、それにより、１〜２秒以内に溶液を完全に交換した。速い灌流の間のΔＦ５０８−ＣＦＴＲ活性を維持するために、非特異的ホスファターゼ阻害剤Ｆ−（１０ｍＭのＮａＦ）をバス溶液に添加した。これらの記録条件下では、チャネル活性は、パッチ記録の間を通じて（６０分まで）一定に維持された。その細胞内溶液から細胞外溶液に移動する正電荷（陰イオンは反対の方向に移動する）によって発生した電流を正電流として示す。ピペット電位（Ｖｐ）は８０ｍＶに維持した。
【０１４９】
チャネル活性を、２以下の活性チャネルを含む膜パッチから分析した。同時に開口する最大数から、実験過程の間の活性チャネルの数を決定した。単一チャネルの電流振幅を決定するために、１２０秒間のΔＦ５０８−ＣＦＴＲ活動から記録したデータを、１００Ｈｚにて「オフライン」でフィルターし、次いでＢｉｏ−Ｐａｔｃｈ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｌｏｇｉｃ  Ｃｏｍｐ．Ｆｒａｎｃｅ）を使用して多重ガウス関数（ｍｕｌｔｉｇａｕｓｓｉａｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）に適合した全点振幅ヒストグラムを構築するために使用した。微小電流の合計および開口確率（ＰＯ）を、１２０秒間のチャネル活動から決定した。このＰＯを、Ｂｉｏ−Ｐａｔｃｈソフトウェアを使用して、またはＰＯ＝Ｉ／ｉ（Ｎ）の関係から決定した（ここでは、Ｉ＝平均電流、ｉ＝単一チャネル電流振幅、そしてＮ＝パッチ中の活性チャネルの数）。
【０１５０】
（１２．溶液）
細胞外溶液（ｍＭ）：ＮＭＤＧ（１５０）、アスパラギン酸（１５０）、ＣａＣｌ２（５）、ＭｇＣｌ２（２）、およびＨＥＰＥＳ（１０）（Ｔｒｉｓ塩基でｐＨを７．３５に調整した）。
細胞内溶液（ｍＭ）：ＮＭＤＧ−Ｃｌ（１５０）、ＭｇＣｌ２（２）、ＥＧＴＡ（５）、ＴＥＳ（１０）、およびＴｒｉｓ塩基（１４）（ＨＣｌでｐＨを７．３５に調整した）。
【０１５１】
（１３．細胞培養）
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲを安定して発現するＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞を、切除した膜パッチクランプ記録に使用した。これらの細胞を、１７５ｃｍ２の培養フラスコ中の、２ｍＭのグルタミン、１０％のウシ胎仔血清、１×ＮＥＡＡ、β−ＭＥ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、および２５ｍＭのＨＥＰＥＳを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ培地中で、５％のＣＯ２および９０％の湿度で、３７℃で維持した。単一チャネル記録のために、２，５００〜５，０００個の細胞を、ポリ−Ｌ−リジンをコーティングしたガラスカバースリップ上に播種し、そして使用前に２７℃で２４〜４８時間培養した。
【０１５２】
上記手順を使用して試験して、化合物１の活性、すなわち、ＥＣ５０を測定した。これを表４に示す。
【０１５３】
【表４】
2012504143.tif 000024
（化合物１のカプセル剤の調製）
化合物１を含有するカプセル剤を、表５に列挙する成分および量で調製した。
【０１５４】
【表５】
2012504143.tif 000025
化合物１を含有するカプセル剤をまた、表６に列挙する成分および量でも調製した。
【０１５５】
【表６】
2012504143.tif 000026
（機器／処理）
（機器）
・３０メッシュのハンドスクリーン（ｈａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎ）
・４クォートシェル（ｑｕａｒｔ  ｓｈｅｌｌ）を持つＶ型ブレンダー（Ｖ−ｂｌｅｎｄｅｒ）
・ブレンドのサンプリングのための機器
・Ｉｎ−Ｃａｐカプセル充填機
・Ｃａｐｓｕｇｅｌサイズ１白色不透明ゼラチンＣｏｎｉ−Ｓｎａｐカプセル（Ｃａｐｓｕｇｅｌ  ｓｉｚｅ  １  ｗｈｉｔｅ  ｏｐａｑｕｅ  ｇｅｌａｔｉｎ  Ｃｏｎｉ−Ｓｎａｐ  ｃａｐｓｕｌｅｓ）
・製造工程内試験機器（Ｉｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ）（平衡および重量を選別する機器）
・７５ｃｃのＨＤＰＥボトルおよび蓋
（スクリーニング／秤量）
化合物１は、バッチ秤量前にスクリーニングする。およそ５％の余剰材料（ｅｘｃｅｓｓ  ｍａｔｅｒｉａｌ）を秤量し、この材料の塊をバラバラにする（ｄｅｌｕｍｐ）ために、これらの材料を３０メッシュのハンドスクリーン（ｈａｄ  ｓｃｒｅｅｎ）を通過させる。材料をスクリーニングした後、混合のために必要な量にしたがって再度秤量する。
【０１５６】
バッチ秤量前のスクリーニングは、他のいずれの原材料についても必要はないが、全ての材料を、ブレンドの前に３０メッシュのハンドスクリーンに通過させなければならない。
【０１５７】
（ブレンド）
ブレンド（潤滑化前（Ｐｒｅ−Ｌｕｂｒｉｃａｔｉｏｎ）１）：
４クォートＶ型ブレンダーシェルには、以下の順序で充填する：
１）全量の１／２のラクトース（Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ  ３１６）
２）ジェットミルした（Ｊｅｔ  Ｍｉｌｌｅｄ）化合物１
３）コロイド状二酸化ケイ素
４）ラウリル硫酸ナトリウム
これらの材料を、設定した速度で５分間ブレンドする。
【０１５８】
ブレンド（潤滑化前２）：
以下の賦形剤を、この順序でＶ型ブレンダーに添加する：
１）全量の１／２のラクトース（Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ  ３１６）
２）カルボキシメチルスターチナトリウム（Ｅｘｐｌｏｔａｂ）
３）微結晶セルロース（Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ−１０１）
これらの材料を、設定した速度で２０分間混合する。
【０１５９】
ブレンド（潤滑化後）：
潤滑化前のブレンドが完了した後、ステアリン酸マグネシウムを３０メッシュのハンドスクリーンを使用して塊をバラバラにし、Ｖ型ブレンダーに添加し、他の原材料とともに設定した速度で５分間混合する。
【０１６０】
（カプセル剤の充填）
最終的な混合が完了したら、ブレンドをＩｎ−Ｃａｐカプセル充填機に移す。使用するゼラチンカプセルは、Ｃａｐｓｕｇｅｌサイズ１白色不透明Ｃｏｎｉ−Ｓｎａｐカプセルである。
【０１６１】
これらのカプセルは、カプセル殻の重量を決定する前に１〜３時間、カプセル化の一式（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｓｕｉｔｅ）の中で平衡化させなければならない。カプセル殻の重量は、１０個のカプセル殻のうちの３個のサンプルの平均値をとることによって決定する。サンプルは、バルク容器の異なる領域から採る。目的の充填量は２１０ｍｇであり、したがって、製造工程中の目的の重量は、２１０ｍｇ＋平均のカプセルの重量である。許容される重量の範囲は、±５％である（カプセル殻の重量を７６ｍｇと仮定すると２７２〜３００ｍｇ。実際の殻の重量はカプセル化前に決定する）。
【０１６２】
目的の重量に達したら、カプセルを回収し、平均重量を決定する（プラセボについては１０個のカプセル、有効成分を含むバッチについては５個のカプセル）。少なくとも５個のカプセルについての個々の重量もまた、カプセルごとのばらつきを評価するために決定するべきである。重量を、１０個（プラセボ）または５個（有効成分）のカプセルの平均重量を決定することによって、１５分ごとにチェックする。５個のカプセルについての個々の重量もまた記録するべきである。平均重量が範囲内にない場合には、上記重量の設定手順を繰り返し行う。
【０１６３】
使用に適したカプセル剤を、目的の±５％の重量の範囲を使用して重量選別する。
【図１】
2012504143.tif 000027
【図２】
2012504143.tif 000028
【図３】
2012504143.tif 000029
【図４】
2012504143.tif 000030
【図５】
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【図６】
2012504143.tif 000032
【図７】
2012504143.tif 000033
【図８】
2012504143.tif 000034
【図９】
2012504143.tif 000035
【図１０】
2012504143.tif 000036
【図１１】
2012504143.tif 000037
【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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