(57)【要約】  本発明は、発現ライブラリーからｓｃＦｖ抗体分子の確実な発現および選別を可能にする、改良インビトロＲＮＡディスプレイライブラリーを特徴とする。本発明のｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、発現ｓｃＦｖ抗体の発現を改善する、最適化され短縮されたドメイン間リンカーを含む。ｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、個々のライブラリークローン、ライブラリーまたはそのサブセットの同定を可能にする短い核酸バーコードも含む。本発明のｓｃＦｖ抗体ライブラリーを作製、増幅およびスペクトラタイプ解析するためのプライマーも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１−１４、１９−４２および５８−２１０の内いずれか１つに記載されている核酸配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１４−１６および４３−５７の内いずれか１つに記載されている核酸配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１７または１８に記載されている核酸配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
ライブラリー増幅、ライブラリー逆転写および／またはライブラリースペクトラタイプ解析のための、請求項１から３における配列の内いずれかの使用。
【請求項５】
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）発現のための核酸ライブラリーであって、前記ライブラリーは前記Ｈ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域をコードした配列のレパートリーを含み、ライブラリーの各構成員がＨ鎖可変領域、Ｌ鎖可変領域およびリンカー領域を含むオープンリーディングフレームを含有し、ならびに前記ライブラリーは請求項１の１つ以上のオリゴヌクレオチドを用いて作製される、ライブラリー。
【請求項６】
リンカー領域が２０アミノ酸未満をコードする、請求項５のライブラリー。
【請求項７】
リンカー領域が１５アミノ酸をコードする、請求項５のライブラリー。
【請求項８】
ライブラリーの各構成員が、オープンリーディングフレームと作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項５のライブラリー。
【請求項９】
前記プロモーターが、Ｔ７、ＳＰ６およびＴ３からなる群から選択されたプロモーターである、請求項８のライブラリー。
【請求項１０】
前記プロモーターがＴ７プロモーターである、請求項９のライブラリー。
【請求項１１】
ライブラリーの各構成員が、そこに作動可能に連結した遺伝子の転写を促進することのできる５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）をさらに含む、請求項５のライブラリー。
【請求項１２】
前記５’ＵＴＲがタバコモザイクウイルス５’ＵＴＲまたはその活性断片である、請求項１１のライブラリー。
【請求項１３】
ライブラリーの各構成員がポリアデニン配列をさらに含む、請求項５のライブラリー。
【請求項１４】
ライブラリーの各構成員が核酸バーコードをさらに含む、請求項５のライブラリー。
【請求項１５】
前記核酸バーコードが８ヌクレオチドを含む、請求項１４のライブラリー。
【請求項１６】
ライブラリーの各構成員がエピトープタグをコードした核酸配列をさらに含む、請求項５のライブラリー。
【請求項１７】
エピトープタグがＦＬＡＧタグである、請求項１６のライブラリー。
【請求項１８】
前記核酸配列がｓｃＦｖのリンカー領域の一部である、請求項１６のライブラリー。
【請求項１９】
ライブラリーの各構成員が、抗体定常部またはその断片をコードした核酸配列をさらに含む、請求項５のライブラリー。
【請求項２０】
ライブラリーの各構成員がリボソーム休止配列をさらに含む、請求項５のライブラリー。
【請求項２１】
ライブラリーの各構成員がペプチドアクセプターをさらに含む、請求項５のライブラリー。
【請求項２２】
ペプチドアクセプターがソラレンＣ６分子を含むリンカーを介して共有結合する、請求項２１のライブラリー。
【請求項２３】
リンカーが、５’（ソラレンＣ６）２’Ｏｍｅ（Ｕ  ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＵＧＣ）ＸＸＸＸＸＸＣＣ（ピューロマイシン）（式中、ＸはトリエチレングリコールリンカーまたはＰＥＧ−１５０であり、ＣＣはＤＮＡ骨格である）である、請求項２２のライブラリー。
【請求項２４】
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を発現するための核酸ライブラリーを作製する方法であって、
核酸組成物を提供するステップであって、前記組成物における核酸の少なくとも一部が抗体可変領域をコードした少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む、ステップ、および
請求項１の１つ以上のオリゴヌクレオチドを用いて複数の抗体可変領域を増幅するステップ、
を含む、方法。
【請求項２５】
抗体可変領域をコードした少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む核酸をスペクトラタイプ解析する方法であって、
核酸組成物を提供するステップであって、前記組成物における核酸の少なくとも一部が抗体可変領域をコードした少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む、ステップ、および
請求項２の１つ以上のオリゴヌクレオチドを用いて前記可変領域のＣＤＲ３領域を増幅するステップ、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、これによりその内容が参照によって本明細書に組み込まれている、２００８年９月３０日に出願された米国仮出願第６１／１０１，４８３号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、改良抗体ライブラリー、ならびに改良抗体ライブラリーを作製する方法および材料に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ほぼどのような構造的エピトープでもそれと高い特異性および親和性で結合する抗体は、リサーチツールとして、またＦＤＡに認可された治療薬として日常的に使用される。その結果、治療用および診断用モノクローナル抗体は、世界中で数十億ドル規模のマーケットを構成している。
【０００４】
動物を免疫して抗体を得る古典的手法は、時間がかかり煩雑である。その結果、合成抗体ライブラリーを用いた、所望の標的分子に対する抗体をエキソビボ選別するための多くの方法が開発された。一部の方法において、抗体またはその断片のライブラリーは、生物（例えば、酵母細胞、細菌細胞もしくは哺乳類細胞）または超顕微鏡的因子（例えば、バクテリオファージもしくはウイルス）表面に提示され、生物または超顕微鏡的因子は所望の抗体の発現に対して選別される。他の方法において、抗体ライブラリーは、無細胞インビトロシステムにおいて発現、選別される。現在のインビトロ発現システムは、単一の抗体可変領域の発現に優れているが、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）分子等、多ドメイン抗体の発現には十分でない。これは、現在のｓｃＦｖ抗体ライブラリーの構造と、現在のインビトロ発現システムの反応条件の両方に起因する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本技術分野において、所望の標的に対するｓｃＦｖ抗体を選別するための改良抗体ライブラリーの必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、ｓｃＦｖ抗体分子の確実な発現および選別を可能にする、改良インビトロディスプレイＲＮＡライブラリーを提供することによって上述の課題を解決する。
【０００７】
本発明は、次の記述を含む多くの利点を有するが、これらに限定されるものではない。
・発現改善のために最適化された領域間リンカーを含む、改良インビトロディスプレイｓｃＦｖ抗体ライブラリーの提供、
・短い核酸バーコードを含む改良インビトロディスプレイｓｃＦｖ抗体ライブラリーの提供、
・改良インビトロディスプレイｓｃＦｖ抗体ライブラリーを作製するためのプライマーの提供、
・本発明のライブラリーにおけるｓｃＦｖ抗体分子Ｈ鎖可変領域のＣＤＲ３領域をスペクトラタイプ解析するためのプライマーの提供、および
・改良インビトロディスプレイライブラリーを作製する方法。
【０００８】
本発明はその一態様において、配列番号１−１４、１９−４２および５８−２１０の内いずれか一配列に記載されている核酸配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。別の一態様において、本発明は、配列番号１−１４、１９−４２および５８−２１０の内いずれか一配列に記載されている核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【０００９】
別の一態様において、本発明は、配列番号１４−１６および４３−５７の内いずれか一配列に記載されている核酸配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。別の一態様において、本発明は、配列番号１４−１６および４３−５７の内いずれか一配列に記載されている核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１０】
さらに別の一態様において、本発明は、配列番号１７または１８に記載されている核酸配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。別の一態様において、本発明は、配列番号１７または１８に記載されている核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１１】
本発明はその一実施形態において、ライブラリー増幅、ライブラリー逆転写および／またはライブラリースペクトラタイプ解析のための、配列番号１−２１０に記載されている配列の内いずれかの使用を提供する。
【００１２】
別の一態様において、本発明は、ライブラリーの各構成員がＨ鎖可変領域、Ｌ鎖可変領域およびリンカー領域からなるオープンリーディングフレームを含有し、配列番号１−２１０に記載されている１つ以上のオリゴヌクレオチドを用いて作製され、Ｈ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域をコードした配列のレパートリーを含む、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を発現するための核酸ライブラリーを提供する。
【００１３】
一実施形態において、ライブラリーは、２０アミノ酸未満をコードしたリンカー領域をさらに含む。別の一実施形態において、ライブラリーは、１５アミノ酸をコードしたリンカー領域をさらに含む。
【００１４】
一実施形態において、ライブラリーの各構成員は、オープンリーディングフレームと作動可能に連結したプロモーターをさらに含む。別の一実施形態において、プロモーターは、Ｔ７、ＳＰ６およびＴ３からなる群から選択される。さらに別の一実施形態において、プロモーターはＴ７プロモーターである。
【００１５】
一実施形態において、ライブラリーの各構成員は、そこに作動可能に連結した遺伝子の転写を促進することのできる５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）をさらに含む。別の一実施形態において、５’ＵＴＲは、タバコモザイクウイルス５’ＵＴＲまたはその活性断片である。別の一実施形態において、ライブラリーの各構成員はポリアデニン配列をさらに含む。
【００１６】
さらに別の一実施形態において、ライブラリーは核酸バーコードをさらに含む。別の一実施形態において、核酸バーコードは８ヌクレオチドを含む。
【００１７】
別の一実施形態において、ライブラリーの各構成員はエピトープタグをコードした核酸配列をさらに含む。さらに別の一実施形態において、エピトープタグはＦＬＡＧタグである。さらに別の一実施形態において、核酸配列はｓｃＦｖのリンカー領域の一部である。別の一実施形態において、ライブラリーは抗体定常部またはその断片をコードした核酸配列をさらに含む。
【００１８】
一実施形態において、ライブラリーはリボソーム休止配列をさらに含む。
【００１９】
一実施形態において、ライブラリーはペプチドアクセプターをさらに含む。別の一実施形態において、ペプチドアクセプターはソラレンＣ６分子を含むリンカーを介して共有結合する。さらに別の一実施形態において、リンカーは、５’（ソラレンＣ６）２’Ｏｍｅ（Ｕ  ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＵＧＣ）ＸＸＸＸＸＸＣＣ（ピューロマイシン）（式中、ＸはトリエチレングリコールリンカーまたはＰＥＧ−１５０であり、ＣＣはＤＮＡ骨格である）である。
【００２０】
別の一態様において、本発明は、（ａ）核酸組成物を提供するステップ、および（ｂ）配列番号１−２１０に記載されている１つ以上のオリゴヌクレオチドを用いて複数の抗体可変領域を増幅するステップを含み、前記組成物における核酸の少なくとも一部が抗体可変領域をコードした少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を発現するための核酸ライブラリーを作製する方法を提供する。
【００２１】
別の一態様において、本発明は、（ａ）核酸組成物を提供するステップ、および（ｂ）配列番号１−２１０に記載されている１つ以上のオリゴヌクレオチドを用いて前記可変領域のＣＤＲ３領域を増幅するステップを含み、前記組成物における核酸の少なくとも一部が抗体可変領域をコードした少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む、抗体可変領域をコードした少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む核酸をスペクトラタイプ解析する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の一部の実施形態におけるｍＲＮＡ−ｓｃＦｖディスプレイ技術の概略図を示す図である。
【図２】本発明の他の実施形態におけるｍＲＮＡ−ｓｃＦｖディスプレイ技術の概略図を示す図である。
【図３】ライブラリーＤＮＡコンストラクトの概要描写を示す図である。
【図４】ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子として生じ得る機能的ｓｃＦｖを示す図である。
【図５】ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子フォーマットにおいて結合しているｓｃＦｖが遊離ｓｃＦｖ分子と機能的に同等であることを表す結果を示す図である。
【図６】１７／９ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖコンストラクトのＴＭＶ−ＵＴＲとコザック共通配列との間に挿入された４種類の８ｂｐタグを示す図である。
【図７】例示的なコンストラクトおよび調節配列を示す図である。
【図８】３ラウンドの選別で同定されたランダムタグ配列を示す図である。
【図９】１ラウンドのｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ選別の前と後に１７／９ｓｃＦｖを定量した結果を示す図である。
【図１０】Ｄ２Ｅ７と２ＳＤ４との間のキメラを示す図である。
【図１１】異なるＴＮＦαバインダーのＫＤ曲線を示す図である。
【図１２】ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の耐熱性を示す図である。
【図１３】ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の高温処理後にＲＮＡが回収されたことを表す結果を示す図である。
【図１４】未処理ヒトＰＢＭＣκ  ｓｃＦｖ  ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーにおけるＰＢＭＣドナーの年齢、民族および性別分布を示す図である。
【図１５】構築された未処理ヒトＰＢＭＣκ  ｓｃＦｖ  ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーにおけるＶＨファミリー特異的ＰＣＲ断片を示す図である。
【図１６】構築された未処理ヒトＰＢＭＣκ  ｓｃＦｖ  ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーにおけるＶκファミリー特異的ＰＣＲ断片を示す図である。
【図１７】構築された未処理ヒトＰＢＭＣκ  ｓｃＦｖ  ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーにおけるＶＨ−Ｖκ  ｓｃＦｖ  ＰＣＲ産物を示す図である。
【図１８】構築された未処理ヒトＰＢＭＣκ  ｓｃＦｖ  ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーにおけるＶＨおよびＶκファミリー分布を示す図である。
【図１９】未処理ヒトＰＢＭＣ抗体ＣＤＲ３サイズのスペクトラタイプ解析を示す図である。
【図２０】スペクトラタイプ解析によるＶＨ／Ｖκライブラリーの品質管理を示す図である。
【図２１】未処理ヒトＰＢＭＣλ  ｓｃＦｖ  ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーにおけるＶλファミリー特異的ＰＣＲ断片を示す図である。
【図２２】構築された未処理ヒトＰＢＭＣλ  ｓｃＦｖ  ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーにおけるＶＨ−Ｖλ  ｓｃＦｖ  ＰＣＲ産物を示す図である。
【図２３】構築された未処理ヒトＰＢＭＣλ  ｓｃＦｖ  ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーにおけるＶＨおよびＶλファミリー分布を示す図である。
【図２４】未処理ヒトリンパ節κおよびλ  ｓｃＦｖ  ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーにおけるＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリー構築の概要を示す図である。
【図２５】構築された未処理ヒトリンパ節κおよびλ  ｓｃＦｖ  ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーにおけるＶＨファミリー特異的ＰＣＲ断片を示す図である。
【図２６】構築された未処理ヒトリンパ節κおよびλ  ｓｃＦｖ  ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーにおけるＶκファミリー特異的ＰＣＲ断片を示す図である。
【図２７】構築された未処理ヒトリンパ節κおよびλ  ｓｃＦｖ  ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーにおけるＶλファミリー特異的ＰＣＲ断片を示す図である。
【図２８】構築された未処理ヒトリンパ節κおよびλ  ｓｃＦｖ  ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーにおけるＶＨ−ＶκおよびＶＨ−Ｖλ  ｓｃＦｖ  ＰＣＲ産物を示す図である。
【図２９】構築されたＶＨ−Ｖκ  ｓｃＦｖライブラリーにおけるＶＨおよびＶκファミリー分布を示す図である。
【図３０】構築されたＶＨ−Ｖλ  ｓｃＦｖライブラリーにおけるＶＨおよびＶλファミリー分布を示す図である。
【図３１】構築されたＶＨ−Ｖλ  ｓｃＦｖライブラリーにおけるスペクトラタイプ解析によるＶＨ−ＶκおよびＶＨ−Ｖλライブラリーの品質管理を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（発明の詳細な記述）
本発明をより容易に理解できるように、特定の用語を先ず定義する。
【００２４】
Ｉ．定義
用語「抗体」は、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体等）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、マウス抗体およびそれらの断片、例えば、抗体Ｌ鎖（ＶＬ）、抗体Ｈ鎖（ＶＨ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメントおよび単領域抗体フラグメント（ＤＡｂ）を含む。
【００２５】
用語「抗体ライブラリー」は、抗体またはその断片をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する複数のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味する。これはまた、前記ＤＮＡまたはＲＮＡ分子から発現した複数の抗体タンパク質および核酸／抗体融合分子も含む。
【００２６】
用語「Ｈ鎖可変領域」は、抗体Ｈ鎖可変領域をコードする核酸および該核酸のタンパク質産物を意味する。
【００２７】
用語「Ｌ鎖可変領域」は、抗体Ｌ鎖可変領域をコードする核酸および該核酸のタンパク質産物を意味する。
【００２８】
用語「スペクトラタイプ解析」は、抗体をコードした遺伝子配列をＣＤＲ３長に基づいて分離する、ＰＣＲに基づいた方法を意味する。ＣＤＲ３長分布の変化は、抗体レパートリーの変化と相関する（Ｊａｎｅｗａｙら「Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ」、５ｔｈ  ｅｄ．Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ、（２００１））。
【００２９】
用語「エピトープタグ」は、抗体によって特異的に認識される短いアミノ酸配列であって、分子に化学的または遺伝学的に結合して、前記抗体によるその検出を可能にするアミノ酸配列、例えば、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ＭｙｃタグまたはＴ７タグを意味する。
【００３０】
用語「核酸バーコード」は、本発明のライブラリーの非翻訳領域に含まれる短い核酸を意味する。バーコードは、個々のクローンまたは複数のライブラリー構成員に特有の識別子を提供するよう働くランダムまたは所定の配列である。
【００３１】
用語「非抗体配列」は、本発明の抗体ライブラリーに出現する、本来の抗体配列の一部ではない任意の核酸またはアミノ酸配列を意味する。このような配列は、例えばエピトープタグまたは核酸バーコードを含む。
【００３２】
用語「調節配列」は、特定の宿主生物、超顕微鏡的因子またはインビトロ発現システムにおける、作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な核酸配列または遺伝要素を意味する。このような配列は、本技術分野においてよく知られている。原核生物に適した調節配列は、例えばプロモーター、場合によってオペレーター配列、そしてリボソーム結合部位を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係になるよう配置されている場合「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に作用する場合コード配列に作動可能に連結されており、またリボソーム結合部位は、転写を促進できるよう配置されている場合コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結」は、連結された核酸配列同士が隣接していることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも隣接している必要はない。連結は、例えば、都合のよい制限酵素認識部位におけるライゲーションによってなされる。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣例的手法に従って用いられる。
【００３３】
用語「特異的結合」または「と特異的に結合する」は、少なくとも約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ以上の親和性で標的と結合する、および／またはその非特異的抗原との親和性より少なくとも２倍強い親和性で標的と結合する、結合分子の能力を意味する。
【００３４】
用語「標的」は、抗体によって認識される抗原またはエピトープを意味する。標的は、例えば、任意のペプチド、タンパク質、糖類、核酸、脂質およびそれに対して特異抗体を作製する小分子を含む。一実施形態において、抗体は、ヒトタンパク質、例えばＴＮＦα、ＩＬ−１２またはＩＬ−１αに対するものである。
【００３５】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、本技術分野において定義されている。
【００３６】
用語「ＲＮＡディスプレイ」または「ｍＲＮＡディスプレイ」は、発現したタンパク質またはペプチドがそのコード化ｍＲＮＡと共有結合してまたは緊密な非共有結合的相互作用によって、「ＲＮＡ／タンパク質融合」分子を形成するインビトロ技術を意味する。ＲＮＡ／タンパク質融合体におけるタンパク質またはペプチド成分は、所望の標的との結合および結合しているコード化ｍＲＮＡ成分の配列決定によって決定されたタンパク質またはペプチドの同一性について選別される。このような方法は、本技術分野においてよく知られており、例えば、米国特許第７，１９５，８８０号、６，９５１，７２５号、７，０７８，１９７号、７，０２２，４７９号、６，５１８，０１８号、７，１２５，６６９号、６，８４６，６５５号、６，２８１，３４４号、６，２０７，４４６号、６，２１４，５５３号、６，２５８，５５８号、６，２６１，８０４号、６，４２９，３００号、６，４８９，１１６号、６，４３６，６６５号、６，５３７，７４９号、６，６０２，６８５号、６，６２３，９２６号、６，４１６，９５０号、６，６６０，４７３号、６，３１２，９２７号、５，９２２，５４５号および６，３４８，３１５号に記載されている。
【００３７】
用語「単鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」は、ＶＬおよびＶＨ領域が組み合わされて一価分子を形成しそれらが単一のタンパク質鎖として生成されることを可能にする合成リンカーによる、組換え法を用いて接続されたＬ鎖可変領域の抗原結合部分とＨ鎖可変領域の抗原結合部分を意味する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる。例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ８５：５８７９−５８８３を参照）。
【００３８】
用語「機能性部分」は、それが結合した分子に追加的な機能性を付与する任意の生物学的または化学的物質を意味する。
【００３９】
用語「選別」は、ある分子を集団内の他の分子から実質的に区分化することを意味する。本明細書において、「選別」ステップは、選別ステップの後に集団における望ましくない分子に対する所望の分子の、少なくとも２倍、好ましくは３０倍、さらに好ましくは１００倍、最も好ましくは１０００倍濃縮を提供する。本明細書に示されているように、選別ステップは任意の回数繰り返すことができ、また異なる種類の選別ステップを特定のアプローチと組み合わせることもできる。
【００４０】
用語「休止配列」は、リボソームの翻訳速度を減速または停止させる核酸配列を意味する。
【００４１】
用語「固体支持体」は、アフィニティー複合体が直接的または間接的（例えば、他の抗体やプロテインＡ等、他の結合パートナーの介在によって）のいずれかで結合することのできる、またはアフィニティー複合体を包埋できる（例えば、レセプターまたはチャネルによって）、任意のカラム（またはカラム材料）、ビーズ、試験管、マイクロタイター皿、固体粒子（例えば、アガロースまたはセファロース）、マイクロチップ（例えば、シリコン、シリコンガラスまたはゴールドチップ）または膜（例えば、リポソームや小胞の膜）を意味するが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
用語「リンカー領域」は、ｓｃＦｖ抗体遺伝子における抗体ＶＨおよびＶＬ領域をコードする核酸配列を接続する核酸領域を意味する。リンカー領域は、ＶＨ、ＶＬおよびリンカー領域を含む連続的なオープンリーディングフレームが形成されるように、抗体ＶＨおよびＶＬをコードする核酸配列とフレーム内に存在する。この用語はまた、ｓｃＦｖタンパク質においてＶＨとＶＬを接続する領域も意味する。
【００４３】
用語「ペプチドアクセプター」は、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼの触媒活性によって、成長中のタンパク質鎖のＣ末端に付加され得る任意の分子を意味する。通常、このような分子は、（ｉ）ヌクレオチドまたはヌクレオチド様部分（例えば、ピューロマイシンおよびそのアナログ）、（ｉｉ）アミノ酸またはアミノ酸様部分（例えば、２０種類のＤ−もしくはＬ−アミノ酸の内のいずれかまたはその任意のアミノ酸アナログ（例えば、Ｏ−メチルチロシンまたはＥｌｌｍａｎら（１９９１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０２：３０１によって記載されたアナログの内のいずれか））および（ｉｉｉ）両者の間の結合（例えば、３’位置、より好ましくないが２’位置におけるエステル、アミドまたはケトン結合）を含むが、この結合は好ましくは天然のリボヌクレオチド構造由来の環状構造を顕著に乱さない。さらにこの用語は、タンパク質コード配列に（核酸配列に介在することによって直接的または間接的に）共有結合したペプチドアクセプター分子と共に、一部の非共有結合的手段、例えばタンパク質コード配列の３’末端に、またはその近傍に結合する第二の核酸配列を用いたハイブリダイゼーションによってタンパク質コード配列と接続した分子や、それ自身がペプチドアクセプター分子と結合する分子を包含するが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
ＩＩ．概観
本発明は、発現ライブラリーからｓｃＦｖ抗体分子の確実な発現および選別を可能にするための、改良インビトロＲＮＡディスプレイライブラリーを特徴とする。ＲＮＡディスプレイ法は、発現したタンパク質またはペプチドが共有結合または緊密な非共有結合的相互作用によってそのコード化ｍＲＮＡと結合してＲＮＡ／タンパク質融合分子を形成する、タンパク質またはペプチドライブラリーの発現を一般に含む。ＲＮＡ／タンパク質融合体におけるタンパク質またはペプチド成分は、所望の標的との結合および結合しているコード化ｍＲＮＡ成分の配列決定によって決定されるタンパク質またはペプチドの同一性に対して選別される。
【００４５】
本発明のｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、発現ｓｃＦｖ抗体の発現を改善する、最適化され短縮された領域間リンカーを含む。ｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、個々のライブラリークローン、ライブラリーまたはそのサブセットの同定を可能にする短い核酸バーコードも含む。
【００４６】
本発明はまた、本発明のｓｃＦｖ抗体ライブラリーを作製、増幅およびスペクトラタイプ解析するための新規プライマーも提供する。
【００４７】
ＩＩＩ．ライブラリー構築
モノクローナル抗体医薬候補を作製するための抗体技術開発として、本発明は、２種の組換え抗体作製アプローチ、すなわちＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（ｍＲＮＡディスプレイ）および酵母表面ディスプレイの開発を開示する。ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ  ｍＲＮＡディスプレイ技術は、ヒト抗体ライブラリーをスクリーニングするためのアブイニシオ方法である。酵母表面ディスプレイ技術は、酵母表面に特異的に提示されているモノクローナル抗体をスクリーニングするための細胞を利用した方法である。
【００４８】
本発明はその一態様において、抗体分子を発現することのできる新規抗体ライブラリーを特徴とする。本発明のライブラリーは、標的に結合できる任意の抗体断片から作製される。一実施形態において、抗体可変領域のライブラリーが作製される。一実施形態において、これは、ＶＨおよび／またはＶＬ領域である。別の一実施形態において、ｓｃＦｖライブラリーが作製される。
【００４９】
本発明のライブラリーは、可変部の外側の領域、例えば定常部もしくはその断片またはヒンジ部をコードする抗体核酸配列を含むこともできる。
【００５０】
本発明の核酸ライブラリーは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両要素を含むことができる。
【００５１】
１）核酸インプット多様性の生成
本発明の抗体ライブラリー作製に用いられている核酸配列は、あらゆるソースから得られる。一実施形態において、本発明のライブラリーは、齧歯類（ｒｏｄｅｎｔ）、霊長類（ｐｒｉｍａｔｅ）、ラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）、サメまたはヒト免疫グロブリン遺伝子のレパートリーを含む任意の遺伝子組換え動物を含むあらゆる動物の抗体レパートリーから得られるが、これらに限定されない。生物の抗体補体の可変領域をコードした核酸を単離およびクローニングするための技法は、本技術分野においてよく知られている。実際に、抗体可変領域をコードした核酸を含む多くのｃＤＮＡライブラリー、例えばさまざまな免疫細胞、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、脾臓またはリンパ節から作製されたヒト抗体可変領域のライブラリーが市販されている。別の一実施形態において、本発明のライブラリーは、１つ以上の抗体をコードした核酸のアブイニシオ合成によって得られる。
【００５２】
本発明のライブラリーは、発現した抗体分子における１つ以上のアミノ酸置換および／または欠失をもたらす核酸置換および／または欠失を導入することによる、追加的な多様性の導入を必要とし得る。技術分野で認識されている任意の突然変異誘発方法、例えばランダム突然変異誘発、「ウォークスルー（ｗａｌｋ  ｔｈｒｏｕｇｈ）」突然変異誘発および「ルックスルー（ｌｏｏｋ  ｔｈｒｏｕｇｈ）」突然変異誘発が企図される。このような抗体突然変異誘発は、例えばエラープローンＰＣＲ、酵母もしくは細菌の「ミューテーター」株または抗体の全体もしくは一部のアブイニシオ合成における、ランダムまたは確定的な核酸変化の取込みを用いて達成できる。一実施形態において、１つ以上のアミノ酸がランダムに突然変異した抗体分子のライブラリーが作製され得る。別の一実施形態において、１つ以上のアミノ酸が１つ以上の所定のアミノ酸に突然変異した抗体分子のライブラリーが作製され得る。
【００５３】
２）調節配列
本発明の核酸ライブラリーは、コードされた抗体のインビトロでの発現およびスクリーニングを促進するための追加的な調節配列を含むことができる。
【００５４】
このような調節配列の一型は、ｍＲＮＡ合成のための所望のＲＮＡポリメラーゼと併せて用いられるプロモーターとなることができる。本明細書に記載されている通り、直鎖状二本鎖ＤＮＡから行われる合成を導くことのできる任意のプロモーター、例えばＴ７、ＳＰ６またはＴ３ファージプロモーターが用いられてよい。
【００５５】
第二の調節配列は、５’非翻訳領域（すなわち５’ＵＴＲ）と言うことができ、これは翻訳開始部位のＲＮＡ上流に相当する。その他適切な５’ＵＴＲが利用され得る（例えば、Ｋｏｚａｋ（１９８３）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４７：１を参照）。一実施形態において、５’ＵＴＲ（「ＴＥ」と言う）は、タバコモザイクウイルス５’非翻訳領域の欠失変異体となることができ、特に、ＴＭＶ翻訳開始の直接５’側の塩基に相当する。このＵＴＲの配列は次の通りである。ｒＧｒＧｒＧ  ｒＡｒＣｒＡ  ｒＡｒＵｒＵ  ｒＡｒＣｒＵ  ｒＡｒＵｒＵ  ｒＵｒＡｒＣ  ｒＡｒＡｒＵ  ｒＵｒＡｒＣ  ｒＡ（式中、転写を増加させるため最初の３個のＧヌクレオチドが挿入される）。
【００５６】
第三のエレメントは、翻訳開始部位となることができる。一般に、これはＡＵＧコドンである。なお、ＡＵＧ以外のコドンが天然のコード配列で利用されている例があり、これらのコドンが本発明の選別スキームにおいて用いられてもよい。この翻訳開始部位は、好ましくは「コザック」配列と言う翻訳の適切な前後関係に置かれる（例えば、Ｋｏｚａｋ（１９８３）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４７：１を参照）。
【００５７】
第四のエレメントは、５’終止コドンを含むポリアデニル化（ポリＡ）配列となることができる。ポリＡ配列は、核酸ライブラリーコンストラクト内の抗体コード配列の後に配置され得る。このような、本技術分野においてよく知られている配列が企図される。
【００５８】
３）追加的な核酸配列エレメント
本発明の核酸ライブラリーは、抗体をコードしたｍＲＮＡ転写産物に組み込まれた追加的な配列エレメントを含むこともできる。これは、非抗体配列を含むことができる。
【００５９】
一実施形態において、短い核酸配列、すなわち「核酸バーコード」は、抗体ｍＲＮＡ転写産物の非翻訳部分に組み込まれることができる。このバーコード配列は、核酸ライブラリーの個々の構成員を識別、または異なるライブラリー間を識別するための特有の識別子となることができる。短い核酸配列は、好ましくは５０塩基未満、２０塩基未満または１０塩基未満を含む。一実施形態において、短い核酸配列は８塩基を含む。
【００６０】
他の一実施形態において、特定の非抗体アミノ酸配列をコードした核酸配列エレメントは、コードされたアミノ酸配列が発現抗体に組み込まれるように、本発明の核酸ライブラリーのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に組み込まれることができる。一実施形態において、非抗体核酸配列エレメントは、ｓｃＦｖのＶＨ領域とＶＬ領域との間のＯＲＦに組み込まれてリンカー領域となることができる。終止コドンを持たない、連続的なアミノ酸配列をコードした任意の核酸配列が、リンカー領域のために企図され得る。リンカー領域の長さは、５０アミノ酸未満、２０アミノ酸未満または１６アミノ酸未満である。
【００６１】
別の一実施形態において、１つ以上のエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧタグ）をコードした核酸配列エレメントは、抗体コード配列に組み込まれることができる。この配列は、任意の位置、例えばｓｃＦｖ抗体分子のＮ末端、Ｃ末端またはＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカー領域に存在するエピトープタグを備える抗体の産生をもたらすことができる。一実施形態において、抗体定常部またはその断片をコードした配列が、本発明の核酸ライブラリーＯＲＦの３’部分に含まれてよい。この抗体定常部またはその断片は、特定のライブラリーの全構成員において同一である。
【００６２】
他の実施形態において、特定の非抗体アミノ酸配列をコードした核酸配列エレメントは、本発明における核酸ライブラリーを酵母細胞表面に特異的に発現するために利用されるベクターに組み込まれていてよい。このエレメントは、本技術分野で公知の膜貫通領域を含むことができるが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、このエレメントは、コードされたアミノ酸配列が発現抗体に組み込まれるように、本発明の核酸ライブラリーのＯＲＦに組み込まれることができる。別の一実施形態において、このエレメントは、ベクター配列に組み込まれることができるが、本発明の核酸ライブラリーのＯＲＦには組み込まれない。このエレメントは、本発明および上述の核酸ライブラリーの発現、安定性、フォールディングおよびエピトープ提示、または他の特徴に有用となることができる。
【００６３】
４）オリゴヌクレオチドプライマー
本発明はその一態様において、本発明の抗体ライブラリーの合成および／または増幅に適した核酸オリゴヌクレオチドプライマーを特徴とする。例示的なプライマーは、配列番号１−１３（表６）を含む。
【００６４】
別の一態様において、本発明は、本発明のライブラリーから産生されたｍＲＮＡの逆転写に適した核酸オリゴヌクレオチドプライマーを特徴とする（表３）。例示的なプライマーは、配列番号１４−１６（表３）を含む。
【００６５】
別の一態様において、本発明は、ライブラリーまたはその選別アウトプットにおけるＶＨ  ＣＤＲ３サイズ分布のスペクトラタイプＰＣＲ解析に適したオリゴヌクレオチドプライマーを特徴とする（表４）。スペクトラタイプ解析は、抗体ライブラリーの多様性および選別の進行を評価するための有用なツールとなることができる。例示的なスペクトラタイプＰＣＲプライマーは、配列番号１７−１８を含む。
【００６６】
５）核酸のペプチドアクセプターとの連結
一実施形態において、本発明の抗体核酸ライブラリーは、ペプチドアクセプター部分を含むよう修飾され得る。この操作は、核酸発現ライブラリーの個々のメンバーとその同系タンパク質産物との共有結合を容易にする。技術分野で認識されているペプチドアクセプターを核酸に結合する任意の手段が企図される。
【００６７】
本発明はその一態様において、ペプチドアクセプターを核酸ライブラリーへと結合するための新しい方法および組成物を特徴とする。一実施形態において、ソラレンＣ６分子およびペプチドアクセプター分子が核酸ライブラリーの３’末端配列と相補的であり得る核酸配列と融合し得る、ソラレンＣ６分子およびペプチドアクセプター分子を含む連結分子が合成され得る。このような連結分子は、相補的塩基対合を介して核酸ライブラリークローンの３’末端と結合することができる。ソラレンＣ６は、紫外線（ＵＶ）光感受性であり、リンカーを核酸ライブラリークローンに架橋し、これによりペプチドアクセプターを核酸ライブラリークローンに共有結合させる。別の一実施形態において、リンカー分子の核酸部分は、修飾されたヌクレオチド、例えば２プライムメトキシ（２’ＯＭｅ）リボヌクレオチドを含むことができる。別の一実施形態において、リンカー分子は、ソラレンＣ６分子とペプチドアクセプター分子を含む核酸領域を隔てるトリエチレングリコールまたはＰＥＧ−１５０リンカーをさらに含むことができる。一実施形態において、リンカーは、５’（ソラレンＣ６）２’ＯＭｅ（Ｕ  ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＵＧＣ）ＸＸＸＸＸＸＣＣ（ピューロマイシン）３’（式中、ＸはトリエチレングリコールまたはＰＥＧ−１５０であり、ＣＣは標準ＤＮＡ骨格である）となることができる。一実施形態において、このようなリンカーは、例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ（サンディエゴ、カリフォルニア州）によってオーダーメイド合成される。
【００６８】
ＩＶ．スペクトラタイプ解析法
スペクトラタイプ解析は、機能の多様性の代わりに抗原レセプター長の多様性を評価する、臨床および基礎免疫学的状況において用いられる方法である（例えば、Ｃｏｃｈｅｔ、Ｍ．ら（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２２：２６３９−２６４７；Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ、Ｃ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：４３１９−４３２３；Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ、Ｃ．ら（１９９７）Ｉｎ  Ａｕｓｔｉｎ、Ｏ．Ｊ．Ｒ．（Ｅｄ．）Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＴＸ  Ｌａｎｄｅｓ、２８７−３２５頁を参照）。スペクトラタイプアッセイは、例えば被験者の末梢血サンプルから単離されたＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞を用いることができるが、一方、他のケースでは全ＣＤ３またはＰＢＭＣ細胞が用いられる。
【００６９】
本発明において、ＰＣＲは、抗体をコードした遺伝子配列をＣＤＲ３長に基づいて分析するための可変長領域（ＣＤＲ３）を特異的に複製するために用いられ得る。ＣＤＲ３長分布の変化は、抗体レパートリーの変化と相関する。一部の実施形態において、本発明の実施において構築された個々のライブラリーに特異的なプライマーは、各ライブラリーに独立したスペクトラタイプを提供するために用いられ得る。好ましい一実施形態において、それぞれＶＨのフレームワーク３領域およびＪ領域とアニーリングする、蛍光色素標識５’フォワードプライマー（６−ＦＡＭ−ＰａｎＶＨＦＲ３−Ｆｗｄ、５’−ＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴ−３’、配列番号１７）およびリバースプライマー（ＰａｎＪＨ−Ｒｅｖ、５’−ＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣ−３’、配列番号１８）は、ＰＣＲによってＶＨ領域のＣＤＲ３領域にわたって増幅するために用いられ得る。他の実施形態において、抗体ライブラリーをコードしたポリヌクレオチド配列における同一の領域または他の領域と特異的にアニーリングする、本技術分野で公知の他のプライマーが用いられ得る。好ましい一実施形態において、その結果生じるＣＤＲ３レプリコンの混合物は、電気泳動によってサイズに従って分離され、デンシメトリーによって定量化されることができる。他の実施形態において、本技術分野で公知の他の方法は、その結果生じるＣＤＲ３レプリコンを特徴付けるために用いられ得る。
【００７０】
好ましい一実施形態において、異なるＶＨファミリー間のＣＤＲ３サイズ分布のスペクトラタイプ解析は、ＶＨ  ｃＤＮＡ断片において行われ得る。一実施形態において、例示的なＶＨファミリーは単一の生殖系列またはＶＨ１−４６、ＶＨ２、ＶＨ５およびＶＨ６等、異なるＶＨファミリーから得られる。好ましい一実施形態において、スペクトラタイプ解析のためのテンプレートは、例えばヒトリンパ節ライブラリー、酵母脾臓ライブラリー、未処理ヒトλライブラリー、ヒトＰＢＭＣκライブラリー、ＶＨ−Ｖλ  ｓｃＦｖライブラリー、ＶＨ−Ｖκ  ｓｃＦｖライブラリーから選択され得る。他の実施形態において、スペクトラタイプ解析のためのテンプレートは、他のライブラリーから選択され得る。
【００７１】
Ｖ．一般スクリーニング法
本発明はその一態様において、本発明の発現ライブラリーをスクリーニングして所望の抗原と結合できる抗体を同定する方法を特徴とする。抗体の標的分子への結合に基づいて発現ライブラリーから抗体の選別を可能にする任意のインビトロまたはインビボスクリーニング法が企図される。
【００７２】
一実施形態において、本発明の発現ライブラリーは、技術分野で認識されているインビトロ無細胞表現型−遺伝子型連関ディスプレイを用いてスクリーニングされ得る。このような方法は、本技術分野でよく知られており、例えば米国特許第７，１９５，８８０号、６，９５１，７２５号、７，０７８，１９７号、７，０２２，４７９号、６，５１８，０１８号、７，１２５，６６９号、６，８４６，６５５号、６，２８１，３４４号、６，２０７，４４６号、６，２１４，５５３号、６，２５８，５５８号、６，２６１，８０４号，６，４２９，３００号、６，４８９，１１６号、６，４３６，６６５号、６，５３７，７４９号、６，６０２，６８５号、６，６２３，９２６号、６，４１６，９５０号、６，６６０，４７３号、６，３１２，９２７号、５，９２２，５４５号および６，３４８，３１５号に記載されている。これらの方法は、タンパク質がその起源である核酸と物理的に関連または結合するような仕方で、核酸からインビトロでタンパク質を転写することを含む。発現したタンパク質を標的分子で選別することによって、タンパク質をコードする核酸もまた選別され得る。
【００７３】
ｓｃＦｖタンパク質の発現を改善するため、上述において参照されたインビトロスクリーニングアッセイは特定の試薬の添加または除去を必要とし得る。一実施形態において、機能的ｓｃＦｖ分子の産生を改善するために、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ酵素がインビトロ発現システムに添加されてよい。別の一実施形態において、弱い酸化剤（例えば、ＧＳＳＧ（酸化型グルタチオン）／ＧＳＨ（還元型グルタチオン）、例えば、１００ｍＭ  ＧＳＳＧ／１０ｍＭ  ＧＳＨ）がｓｃＦｖタンパク質のインビトロ翻訳反応混合液に添加されて、ｓｃＦｖ分子のＶＨおよびＶＬ領域における鎖内ジスルフィド結合を形成させることができる。別の一実施形態において、還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ））が、ｓｃＦｖのインビトロ翻訳反応混合物から除去されてよい。
【００７４】
別の一実施形態において、１種類または数種類の標識アミノ酸またはその誘導体は、標識アミノ酸がその結果生じる抗体に取り込まれるように、インビトロ翻訳システムに添加されてよい。技術分野で認識されている任意の標識アミノ酸、例えば放射性標識アミノ酸、例えば３５Ｓ標識メチオニンまたはシステインが企図される。
【００７５】
一実施形態において、本発明のインビトロスクリーニングアッセイは、単数または複数の抗体のインビトロ選別後に、単数または複数の抗体と物理的に関連したｍＲＮＡが逆転写されて前記単数または複数の抗体をコードするｃＤＮＡを生成できることを必要とする。任意の適切な逆転写方法、例えば、酵素を介した、例えばモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素が企図される。
【００７６】
本発明で用いられているスクリーニング法は、所望の標的に特異的に結合する抗体をコードする核酸の増幅を必要とし得る。一実施形態において、単数または複数の抗体と物理的に関連したｍＲＮＡは、増幅されてさらにｍＲＮＡを生成することができる。技術分野で認識されている任意のＲＮＡ複製方法、例えばＲＮＡレプリカーゼ酵素を用いた方法が企図される。別の一実施形態において、単数または複数の抗体と物理的に関連したｍＲＮＡは、ＰＣＲで増幅される前に先ずｃＤＮＡに逆転写される。一実施形態において、ＰＣＲ増幅は、高忠実度プルーフリーディングポリメラーゼ、例えばサーモコッカス・コダカラエンシス由来のＫＯＤ１耐熱性ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いて行われる。別の一実施形態において、ＰＣＲ増幅は、増幅されたＤＮＡに突然変異の導入をもたらす条件下、すなわちエラープローンＰＣＲを用いて行われてもよい。
【００７７】
本発明で用いられているスクリーニング法は、改善された標的親和性を備える抗体の選別のため、標的結合スクリーニングアッセイのストリンジェンシーが強まることも必要とし得る。抗体−標的相互作用アッセイのストリンジェンシー増強するための、技術分野で認識されている任意の方法が企図される。一実施形態において、単数または複数のアッセイ条件（例えば、アッセイバッファーの塩濃度）が変化され、抗体分子の所望の標的に対する親和性を低減させることができる。別の一実施形態において、抗体が所望の標的と結合できる時間の長さが短縮され得る。別の一実施形態において、抗体−標的相互作用アッセイに競合結合ステップが加えられてよい。例えば、抗体は所望の固定化標的と先ず結合できる。次に、抗原に対して最も低い親和性を有する抗体が固定化標的から溶出され、その結果、抗原結合親和性の向上した抗体が濃縮されるよう、固定化標的との結合と競合するよう作用する特定の濃度の非固定化標的が添加され得る。一実施形態において、アッセイ条件のストリンジェンシーは、アッセイに添加される非固定化標的濃度を増加することによってさらに強くなることができる。
【００７８】
本発明のスクリーニング法はまた、標的結合の向上した１種類または数種類の抗体を濃縮するために複数ラウンドの選別も必要とし得る。一実施形態において、選別の各ラウンドにおいて、技術分野で認識されている方法を用いてさらなるアミノ酸突然変異が抗体に導入され得る。別の一実施形態において、選別の各ラウンドにおける所望の標的に対する結合のストリンジェンシーは、所望の標的に対して向上した親和性を有する抗体を選別するために強くなることができる。
【００７９】
本発明のスクリーニング法は、インビトロ翻訳システムの成分からＲＮＡ−抗体融合タンパク質の精製を必要とし得る。この操作は、技術分野で認識されている任意の分離方法を用いて行われてよい。一実施形態において、ＲＮＡ−抗体融合タンパク質は、ポリデオキシチミジン（ポリｄＴ）レジンを用いたクロマトグラフィーによって分離されてよい。別の一実施形態において、ＲＮＡ−抗体融合タンパク質は、ＲＮＡ−抗体融合タンパク質の抗体成分に存在するエピトープに特異的な抗体を用いたクロマトグラフィーによって分離されてよい。一実施形態において、エピトープは、アミノ酸配列タグ、例えばＲＮＡ−抗体融合タンパク質の抗体成分のアミノ酸配列の、例えばＮ末端、Ｃ末端または可変領域間リンカーに取り込まれたＦＬＡＧまたはＨＡタグとなることができる。
【００８０】
本発明のライブラリーの抗体選別は、固定化標的分子の使用を必要とし得る。一実施形態において、標的分子は固体基質、例えばアガロースビーズに直接連結され得る。別の一実施形態において、標的分子は先ず修飾、例えばビオチン化されてよく、修飾された標的分子は修飾を介して固体支持体、例えばストレプトアビジン−Ｍ２８０、ニュートラアビジン−Ｍ２８０、ＳＡ−Ｍ２７０、ＮＡ−Ｍ２７０、ＳＡ−ＭｙＯｎｅ、ＮＡ−ＭｙＯｎｅ、ＳＡ−アガロースおよびＮＡ−アガロースと結合することができる。
【００８１】
本発明を、限定するものであると理解するべきでない、次の実施例によってさらに説明する。
【実施例】
【００８２】
発明の具体例
他に記載がなければ、実施例を通じて次の材料と方法が用いられた。
【００８３】
材料と方法
一般に、他に断りがなければ、本発明の実施において、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば免疫グロブリン技術）および畜産業における従来の技法が用いられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５１０、Ｐａｕｌ、Ｓ．、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ、１６９）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ、Ｅｄ．、Ｉｒｌ  Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗら、Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ、Ｐｕｂ．（１９９９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９２）を参照。
【００８４】
（実施例１）
ｓｃＦｖ分子用のｍＲＮＡディスプレイプロトコール
【００８５】
ｍＲＮＡディスプレイは、図２に示されている方法に従って行うことができる。この方法の特定の実施形態はより詳細に後述される。これら実施形態は、本発明の方法を説明することを目的としており、限定するものであると理解するべきでない。
【００８６】
１．抗体ライブラリーテンプレートの設計
ライブラリーＤＮＡコンストラクトは、図３に示されている図式に従って設計される。二本鎖ＤＮＡコンストラクトは、次の機能エレメントを５’末端から３’末端方向へと一般に含む。Ｔ７プロモーターは、インビトロのＲＮＡ転写に有用となり得る。ＴＭＶ−ＵＴＲ（タバコモザイクウイルス非翻訳領域）は、インビトロのタンパク質翻訳に有用となり得る。場合によるタグは、所定のライブラリーに属するコンストラクトの同定に有用となり得る、各ライブラリーに特有の８塩基対配列を含む。コザック共通配列は、タンパク質翻訳開始を促進する。対象抗体ライブラリーは、ｓｃＦｖ、ＶＨまたはＶＬをコードした配列を含むことができる。好ましい一実施形態において、抗体ライブラリーはｓｃＦｖをコードする。一実施形態において、あらゆる抗体ライブラリーの３’末端の非可変領域である部分的抗体定常部配列も含まれる。一部の実施形態において、コンストラクトは、アフィニティー精製に有用なＦＬＡＧタグを追加的に含む。他の実施形態において、コンストラクトは、ソラレンおよびピューロマイシン修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドリンカーがプロトコールの次のステップにおいてコンストラクトと架橋することのできるアニーリング部位からなる、リンカーアニーリング配列を含む。一実施形態において、５’終止コドンを備えるポリアデニル化配列は、ｍＲＮＡの安定性およびオリゴｄＴセルロースバッチ精製による精製に有用となり得る。
【００８７】
２．標的抗原の調製
一般に、ｍＲＮＡディスプレイ抗体ライブラリーは、ビオチン化抗原に対して選別することができる。各標的に対する最良の抗原は、ケースバイケースの原則に従って決定するべきであるが、次の記載は一般的ガイドラインとして用いることができる。標的抗原は、通常十分に特徴付けられ、多型（ＳＮＰおよびハプロタイプ）および／または薬理遺伝学的解析によって決定されるような、関連または優性遺伝アイソタイプである。標的抗原はさらに適切な生物活性（天然の抗原と同等の）、十分な溶解度ならびに化学的および物理的特性を有することができ、ライブラリー選別すなわちスクリーニングおよび下流のバイオアッセイに十分な量を調製することができる。ライブラリー選別に有用な例示的な標的抗原量を下の表１に記す。
【００８８】
【表１】
2012504416.tif 000002
【００８９】
３．ライブラリーＤＮＡの調製
ライブラリーＤＮＡおよびその選別アウトプットは、ＰＣＲによって増幅できる。ライブラリー増幅の例示的なプライマーを表２に示す。
【００９０】
【表２】
2012504416.tif 000003
【００９１】
ＰＣＲ増幅は、本技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。ＰＣＲ反応液は通常、ＤＮＡテンプレート、反応バッファー、ｄＮＴＰ、増幅用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよび水を含む。複数の反応チューブをマスターミックスから一度に調製し、増幅ＤＮＡ収量を増加する。２５サイクルのＰＣＲによって通常十分な増幅がもたらされるが、より多くの産物を得るために３５サイクルもの回数を用いてもよい。
【００９２】
４．ライブラリーＤＮＡの精製
上述のＰＣＲから得られた産物が正確なサイズ（ｓｃＦｖはほぼ８５０ｂｐ、ＶＨまたはＶＬライブラリーはほぼ５００ｂｐ）であり、最小限の非特異的産物が含まれている場合、産物は転写反応に直接用いることができる。あるいは、産物はゲル精製してもよい。ＰＣＲ産物をゲル精製する場合、産物を調製用アガロースゲルで分離して、ＰＣＲ産物を含む特異的バンドを切り出すことができる。続いてＤＮＡは、本技術分野で公知の標準的方法を用いたゲル抽出によってバンドから精製することができ、その濃度は分光計で測定することができる。
【００９３】
５．ＲＮＡの転写
ライブラリーＤＮＡからＲＮＡの転写は、本技術分野で公知の標準的な方法を用いて行うことができる。大量の反応容量を用いて、全ライブラリー多様性を標本抽出するのに十分なＤＮＡテンプレートを転写することができる。例示的な一実施形態において、１×１０１３コピーのライブラリーテンプレートをＲＮＡ転写反応に用いることができる。ＲＮＡ転写反応液は、通常５−１０μｇのＰＣＲ産物、反応バッファー、プラスＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含む。ＲＮＡ転写反応は３７℃で２時間から一晩の間行うことができる。選別の最初のラウンドの後、より短い時間を用いてもよい。ＲＮＡ転写の後、ＤＮＡテンプレートはＤＮａｓｅＩを用いて反応混合液から除去できる。
【００９４】
６．ＮＡＰカラムクロマトグラフィーによるＲＮＡ精製
ＲＮＡ転写後、ＲＮＡはＮＡＰ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を用いて分画することができる。最大１ｍＬの転写反応液が、ＲＮＡ精製のためＮＡＰ−１０カラムに装填できる。カラムは、分画前にジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理ｄＨ２Ｏを用いて平衡化することができる。全溶出容量は、転写反応液の容量の１５０％未満となるべきである。さらに、またはあるいは、ＲＮＡはＮＡＰ−２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を用いて分画できる。
【００９５】
７．ＲＮＡの品質管理と定量
ＲＮＡサンプルのサイズおよび収量は、ゲル電気泳動を用いてモニターできる。ＲＮＡ収量は、通常、ほぼ２０ｎｍｏｌ／ｍＬの転写反応液の最高値に達する。
【００９６】
８．リンカーへのＲＮＡライゲーション
ペプチドアクセプター分子をその３’末端に備えるＤＮＡリンカーは、各ＲＮＡ分子の３’末端と共有結合的ライゲーションを行う。リボソームＡ部位に入り込んで未完成ポリペプチド鎖のカルボキシル末端に共有結合できるペプチドアクセプターは、ｍＲＮＡ（遺伝子型）の、該ｍＲＮＡによってコードされたタンパク質（表現型）との共有結合的関連を最終的に可能にできる。例示的なＰＥＧ６／１０リンカーは、次式を有することができる。
５’（ソラレンＣ６）２’ＯＭｅ（ＵＡＧＣＧＧＡＵＧＣ）ＸＸＸＸＸＸＣＣ（ピューロマイシン）３’
【００９７】
ソラレンＣ６の５’修飾は光感受性であり、ＵＶ架橋によってリンカーとｍＲＮＡとの間の共有結合を形成するよう機能する。２’ＯＭｅ（ＵＡＧＣＧＧＡＵＧＣ）骨格領域は、ｍＲＮＡにおけるＦＬＡＧ配列に対して３’のリンカーアニーリング部位とアニーリングする（図１参照）。上述の配列において、Ｘは「スペーサー９」、あるいはトリエチレングリコールまたはＰＥＧ−１５０として知られている物質を示す。このスペーサーは、ピューロマイシンの真核生物リボソームＡ部位への挿入に対する柔軟性を提供するよう最適化されている。ＣＣは標準的なＤＮＡ骨格を含む。ピューロマイシンの３’修飾は、リボソームＡ部位に挿入してリンカーと未完成ポリペプチドとの間に安定的な結合を形成する。本明細書に記載されているリンカーの減衰係数は、約１４７．７ＯＤ２６０／μモルである。このリンカーは光感受性であるため、このリンカーを含む溶液は、光から保護しなくてはならない。
【００９８】
ライブラリーの全多様性を標本抽出するため、ライブラリー選別の最初のラウンドのためにラージスケールのライゲーション反応（３．１×１０１５転写ＲＮＡ分子）が推奨される。このＲＮＡ量は、十分なテンプレートが翻訳反応に入れられて、ほぼ１０ｐｍｏｌの機能的ｍＲＮＡディスプレイ分子が産生されることを保証するために設定し得る。後期ラウンドでは、ＲＮＡインプットは選別当たり０．５ｎｍｏｌへと減少できる。例示的な一実施形態において、ＲＮＡライゲーション反応液は、次の成分、すなわちＲＮＡ、水、化学ライゲーションバッファーおよびＰＥＧ６／ピューロマイシンリンカー（１ｍＭ）を含むことができる。例示的な一実施形態において、全反応容量は１００μＬである。好ましい一実施形態において、リンカー／ＲＮＡ分子比は、１．５より大きくなることができる。一実施形態において、反応液における最終リンカー濃度は約１５μＭであってよく、反応液におけるＲＮＡ濃度は約３−１０μＭ（＝０．３−１ｎｍｏｌのＲＮＡインプット）の範囲に及ぶ。参考までに、１ｍｇ／ｍＬの８５０ｎｔのｓｃＦｖ  ＲＮＡ＝３．５６μＭであり、達成可能な最大ライゲーション濃度は、３．１６μＭ（＝０．３２ｎｍｏｌ）である。
【００９９】
アニーリング反応（リンカーと転写されたＲＮＡとのアニールにおける）は、サーマルサイクラーにおいて行うことができる。好ましい一実施形態において、アニーリング反応は、サンプルを約８５℃で３０秒間、続いて１秒当たり約０．３℃のランプ速度を用いて約４℃で温置することによって行うことができる。次に、反応液は４℃で維持することができる。
【０１００】
アニーリングしたリンカー／ＲＮＡのライゲーションは、ＵＶ架橋によって行うことができる。この操作は当業者に知られた任意の方法を用いて行うことができる。一実施形態において、反応チューブは手持ち式ＵＶランプ（長波長、約３６５ｎｍ）の中央の上に置き、約１５分間架橋することができる。フリーザーパックはランプの上に置き、紫外線照射中に発生した熱が消散するのに有用とすることができる。通常のライゲーション効率は約５０−９０％であり、普通は精製は必要とされない。ライゲーション産物は−８０℃で保存することができる。
【０１０１】
９．翻訳反応
例示的な一実施形態において、全反応および精製の後、ほぼ約０．１％のインプットＲＮＡをｍＲＮＡディスプレイ分子へと作製することができる。インビトロ翻訳は、当業者に知られた方法と試薬を用いて行われ得る。一実施形態において、ｓｃＦｖライブラリーを用いた翻訳反応は、約１５ｍＬの反応容量における約５ｎｍｏｌのＲＮＡテンプレートと約１０ｍＬの網状赤血球ライセートを用いることができる。
【０１０２】
翻訳反応液の調製において、ＧＳＳＧ／ＧＳＨ（酸化型グルタチオン／還元型グルタチオン）溶液は、最終濃度約１００ｍＭ  ＧＳＳＧ／１０ｍＭ  ＧＳＨに調製できる。ＰＤＩ（タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ）は、ＰＤＩ粉末をｄＨ２Ｏに溶解して約１ユニット／μＬ濃度になるよう調製されてもよい。ＰＤＩ溶液は−２０℃で保存できる。
【０１０３】
例示的な翻訳反応液は、次の通り設定することができる：
【０１０４】
【表３】
2012504416.tif 000004
【０１０５】
翻訳反応液は、３０℃のウォーターバスで１−２時間温置する。翻訳容量が１．５ｍＬを超えた場合、ＲＮＡ／タンパク質融合体収量の顕著な減少が観察できた。従って、小さなアリコートに分注する前に、反応容量が１．５ｍＬより多い場合、翻訳反応液のマスターミックスを調製してよい。
【０１０６】
１０．ＲＮＡ／タンパク質融合体形成
翻訳反応後、３００μＬの翻訳反応混合液につき約１００μＬの２Ｍ  ＫＣｌおよび約２０μＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ２を添加し、１時間室温で温置することができる。この操作は、ｍＲＮＡテンプレート末端における休止リボソームを安定化し、ＤＮＡリンカー末端のピューロマイシンを休止リボソームのＡ部位に挿入し、これにより翻訳されたｓｃＦｖタンパク質とそのｍＲＮＡテンプレートとを永続的に接続する。反応液が−２０℃で一晩保存される場合、室温の温置は短縮できる。反応は、５０μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを加えてリボソームを停止することによって終了できる。反応液は−２０℃で保存できる。５μＬアリコートを後のシンチレーション計数のため取り分けることができる。
【０１０７】
１１．オリゴｄＴセルロースによるＲＮＡ／タンパク質融合体の精製
このステップは、ｍＲＮＡディスプレイ分子および残存ＲＮＡテンプレートを翻訳／融合反応液から精製する。オリゴｄＴ結合のため、全ＲＮＡテンプレートを捕集するのに必要な、前洗浄したオリゴｄＴセルロース量を概算することができる。十分量のオリゴｄＴ結合バッファーは、約１×最終濃度となるよう融合反応液に加えることができる。次に、前洗浄したオリゴｄＴセルロースが加えられ、反応液は１時間、４℃で行うことができる。反応液は、場合によって約１５００ｒｐｍ、５分間、４℃でスピンダウンすることができ、上清は廃棄される。オリゴｄＴセルロースビーズを移し、スピンカラムを用いて１×オリゴｄＴ結合バッファーで約６回洗浄することができ、バッファーは通常、カラムを約１０００ｒｐｍ、１０秒間スピンすることによって除去され得る。貫流液は廃棄してよいが、最後の洗浄液はシンチレーション計数のため取っておくことができる。ｍＲＮＡディスプレイ分子（および遊離ＲＮＡテンプレート）は、ビーズにｄＨ２Ｏを加えて５分間室温で温置することによって溶出できる。溶出液は、約４０００ｒｐｍで２０秒間スピンすることによって収集することができる。溶出は通常１回繰り返し、溶出液を合わせることができる。５μＬの溶出液をシンチレーション計数のため取り分けることができる。オリゴｄＴ精製効率は、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光装置（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ウィルミントン、デラウェア州）の２６０ｎｍのＯＤ（ＯＤ２６０）によって評価することもできる。理論的に、全残存ＲＮＡテンプレートおよびｍＲＮＡディスプレイ分子がオリゴｄＴビーズによって回収される。５×ＦＬＡＧ結合バッファーが、約１×最終濃度になるよう溶出液に加えられ得る。サンプルは、次のＦＬＡＧ精製ステップに進まない場合、−８０℃で保存することができる。
【０１０８】
オリゴｄＴ回収は、次の通りに計算される。約５μＬのインプット（融合反応液由来）、最後の洗浄液由来の１００μＬおよび５μＬのアウトプット（オリゴｄＴ精製由来の溶出液）が計数される。最後の洗浄液は、洗浄の程度を評価するために用いられ、他の２種の計数は、元来のＲＮＡテンプレートインプットからＲＮＡ／タンパク質融合体回収を計算するために用いられる。ＲＮＡ／タンパク質融合体収量（ｐｍｏｌ）＝（ＣＰＭアウトプット×容量アウトプット×５μＭ×容量ライセート）／［ＣＰＭインプット×容量インプット×（産物におけるメチオニンの＃）］。この式は網状赤血球ライセートにおける５μＭのメチオニン濃度を推測し、計算に用いられているあらゆる容量はμＬで表されている。選別の初期のラウンドのｍＲＮＡディスプレイ分子収量は、通常０．５−２％であるが、後期ラウンドでは１０％に増加する。
【０１０９】
１２．抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースによるＲＮＡ／タンパク質融合体精製
このステップは、残存ＲＮＡテンプレートからｍＲＮＡディスプレイ分子を精製する。全ｍＲＮＡディスプレイ分子の捕集に必要とされる、前洗浄された抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースビーズの量を概算することができる。一実施形態において、ビーズの結合能力は、５０％スラリー１ｍＬ当たり約６ｎｍｏｌ融合タンパク質である。結合と洗浄における操作に十分なビーズ容量を有するために、２００μＬ未満の前洗浄されたビーズを用いることは推奨されない。後述の例は、最初の翻訳反応液３００μＬに対するものである。
【０１１０】
ＦＬＡＧ精製では、大口径ピペットチップを用いて３００μＬの前洗浄した抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースをオリゴｄＴ精製されたアウトプットに移すことができる。混合物は、回転によって１時間４℃で混合および温置することができる。抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースとの温置は一晩続けてよい。抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースは、場合によって遠心分離機で約１５００ｒｐｍ、１分間４℃でスピンして、上清を捨てることができる。抗ＦＬＡＧビーズは、スピンカラムを用いて１×ＦＬＡＧ結合バッファーで約５回洗浄し、各洗浄につき約１０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離することができる。貫流液は廃棄することができる。ビーズは約１０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離することによって、７００μＬの選別バッファー（後述を参照）で追加的に２回洗浄することができる。最後の洗浄は、シンチレーション計数のため取っておくことができる。ｍＲＮＡディスプレイ分子は、約４００μＬの１００μｇ／ｍＬ  ＦＬＡＧペプチド（選別バッファーに溶解）を添加して５分間室温で温置することによって溶出できる。溶出液は、約３０００ｒｐｍで２０秒間スピンすることによって収集することができ、約４００μＬの１００μｇ／ｍＬ  ＦＬＡＧペプチドを加えることによって、もう１回溶出することができる。両方の溶出液は合わされて、５μＬの合わされた溶出液をシンチレーション計数のために取り分けることができる。この容量のＦＬＡＧペプチドは、最大約１ｍＬの５０％スラリーからの溶出に通常十分であり、より少量のスラリーが用いられていたおよび／またはより高いＲＮＡ／タンパク質融合体濃度が望ましい場合、半量（２００μＬ）に縮小することができる。保存や抗原選別におけるＲＮＡ分解を防ぐため、適量の本技術分野で公知のＲＮａｓｅインヒビター（すなわち、１−２Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅＯＵＴおよび０．０２μｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡ）が、精製されたｍＲＮＡディスプレイライブラリーに添加されてよい。次の抗原選別ステップに進まない場合、サンプルを−８０℃で保存する。
【０１１１】
ＦＬＡＧ回収を定量するため、約５μＬの溶出アウトプットおよび最後の洗浄由来の約１００μＬをベータカウンターで計数することができる。１０−３０％以上の回収を予想でき、次式に従って計算することができる。
ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子回収％＝（ＣＰＭアウトプット×容量アウトプット）／（ＣＰＭインプット×容量インプット）
【０１１２】
１３．ビオチン化抗原によるライブラリー選別
選別は、目的の標的に特異的に結合する分子を濃縮するように設計される。ネガティブ選別（プレクリア）は、非特異的およびマトリックスバインダーを除去するのに必要となり得る。標的フォーマットに依存して選別プロトコールは異なる。次に、ビオチン化標的を用いた使用のための例示的な選別プロトコールを記載する。このプロトコールは、他のフォーマットの標的抗原に適合するよう修正することができ、所望のアウトプットに応じてスケールアップまたはスケールダウンすることができる。
【０１１３】
Ａ．選別前の調製
ストレプトアビジン（ＳＡ）磁気ビーズは、捕集のため用いることができ、通常使用前にプレブロッキングすることができる。ＳＡビーズは、原瓶から１．５または２ｍＬチューブに移して２ｍＬの１×ＦＬＡＧ結合バッファーで２回洗浄することができる。次にビーズは２ｍＬの選別バッファーで２時間から一晩、４℃で回転しながらブロッキングすることができる。プレクリアと選別捕集の両方に十分なビーズを調製するべきである。プレブロッキングされたビーズは４℃で保存する。１０ｐｍｏｌのビオチン化抗原につき約１００μＬのビーズが通常用いられる。
【０１１４】
１．５ｍＬまたは２ｍＬ微量遠心チューブは、１×ＦＬＡＧ結合バッファーで約１時間から一晩、プレブロッキングする。プレブロッキングされたチューブは、全プレクリアおよび選別ステップに用いることができる。通常、各サンプルにつき４本のチューブが必要とされる。２本はプレクリア用、１本はビーズ用、そして１本は選別用である。
【０１１５】
最適な結果は、ライブラリーをプレクリアすることによって得ることができる。ＦＬＡＧ精製したｍＲＮＡディスプレイライブラリーは、ＳＡビーズ（バッファーから分離）に加えることができる。ＳＡビーズの容量は、捕集容量の半量に相当し得る。プレクリアしたｍＲＮＡディスプレイライブラリーを磁石を用いてＳＡビーズから分離する前に、全混合物は、３０℃で約３０分間回転しながら温置することができる。このプレクリアステップはもう１回繰り返し、第二のプレクリアＳＡビーズは、上述の通りに洗浄、計数して、バックグラウンドが高いか判断することができる。これは、「抗原無し」ネガティブコントロールとすることもできる。
【０１１６】
Ｂ．ライブラリー選別：結合
選別の第一ラウンドのため、ビオチン化標的（１００ｎＭ）をプレクリアしたライブラリー全体に添加して、３０℃で１時間回転しながら温置することができる。後期選別ラウンドのため、抗原結合分子の回収が１％を超えることが予想される場合、プレクリアしたライブラリーは、２個の等量アリコートに分注することができる。ビオチン化抗原は一方のアリコートに加えることができ、他方のアリコートは「抗原無し」ネガティブコントロールとなることができる。あるいは、上述の通り、洗浄した第二のプレクリアビーズは、より「プレクリア」手順でないことになるが、「抗原無し」コントロールであると考えることができる。後期ラウンドにおける抗原濃度は、抗原結合分子の回収が５％を超える場合減少させることができる。
【０１１７】
Ｃ．ライブラリー選別：捕集
プレブロッキングされたＳＡビーズ（バッファーから分離）は、結合反応液に添加して、３０℃で５−１０分間回転しながら温置することができる。捕集用ＳＡビーズ量は、結合能力および選別に用いられている標的の濃度（上述を参照）に基づいて計算するべきである。ＳＡビーズ量は、ＳＡビーズバインダーを抑制するため標的濃度を下げる場合少なくするべきであるが、通常５０μＬ以上のビーズが用いられる。
【０１１８】
Ｄ．ライブラリー選別：洗浄
磁石を用いてＳＡビーズを捕集し、１ｍＬの選別バッファーで１分間洗浄することができる。磁石を用いてビーズを再度捕集し、約５回洗浄する（合計約６回）。洗浄回数を後期ラウンドで増やして、オフレート選別戦略を一部の標的に取り込むことができる。ビーズは、最後の１回は１ｍＬの逆転写に適切な１×バッファーで洗浄することができる。ビーズを磁石で捕集し、水（上で計算された捕集ビーズ容量の４分の１）に再懸濁する。
【０１１９】
Ｅ．ライブラリー選別：計数および回収計算
ラウンド３から始めて、最後の洗浄液およびビーズの約１０−２０％を計数する。より多くのビーズが計数を抑えることができるため、１００μＬ未満のビーズのみを通常計数する。ライブラリー選別回収は次式に従って計算する。
選別回収％＝１００×ＣＰＭ全ビーズ／ＣＰＭ全インプット
【０１２０】
１４．ＲＴ−ＰＣＲによるライブラリーＤＮＡの再増幅
逆転写は、ライブラリーから捕集した材料を用いて行うことができる。本技術分野で公知の試薬およびプロトコールが、逆転写反応の実施に適切である。選別後のビーズ容量に応じて、反応液の容量はスケールアップまたはダウンすることができる。
【０１２１】
逆転写に有用な例示的なプライマーを表３に示すが、本技術分野で公知の方法を用いて追加的なプライマーを設計することができる。Ｃκリバースプライマーはκライブラリーに用いられ、ＣＪＬリバースプライマーはλライブラリーに用いられ、Ｌｉｂ−ＧＳ−ＲｅｖはヒトＰＢＭＣ  ＶＨライブラリーに用いられる。
【０１２２】
【表４】
2012504416.tif 000005
【０１２３】
例示的な逆転写反応液は、ライブラリー選別由来のビーズ（水に懸濁）、約１０μＭのリバースプライマーおよび約１０ｍＭのｄＮＴＰを含むことができる。反応液を６５℃で５分間温置し、氷上で冷却する。次に、通常Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ合成バッファー、０．１Ｍ  ＤＴＴおよびＲＮａｓｅインヒビターを反応液に添加する。逆転写酵素の添加前に、逆転写反応液を４２℃で２分間温置する。次に反応液は、時々攪拌しつつ４２℃で５０分間温置し、９５℃で５分間さらに温置する。続いてビーズを磁石によって収集し、上清を新しいチューブに移し、同一の選別アウトプット由来であればプールしてもよい。ビーズを水（ＲＴ容量の半量）に再懸濁し、チューブにおいて９５℃で５分間温置する。磁石を用いてビーズを再度収集し、上清を、前に移しておいた上清と共にプールする。これは選別アウトプットのＰＣＲ増幅のためのｃＤＮＡテンプレートを含む。
【０１２４】
スペクトラタイプＰＣＲは、ライブラリーまたはその選別アウトプットにおけるＶＨ  ＣＤＲ３サイズ分布を解析するために用いることができる。これは、ライブラリーの多様性および選別の進行を評価するのに有用なツールである。最初の数ラウンドのライブラリー選別アウトプットおよび選別前のライブラリーは、高度に多様でなければならず、ＣＤＲ３サイズ分布はガウス分布に近似する。例示的なスペクトラタイプＰＣＲプライマーを表４に示す。
【０１２５】
【表５】
2012504416.tif 000006
【０１２６】
例示的なスペクトラタイプＰＣＲ反応液を下の表５に示すが、反応液成分は本技術分野で公知の類似試薬で代用することができ、反応容量は選別反応のスケールと適合するよう調整することができる。
【０１２７】
表５：例示的なスペクトラタイプＰＣＲ反応液
ｃＤＮＡテンプレート                          ２．０μＬ
ｄＨ２Ｏ                                    １８．１μＬ
５×耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー    ６．０μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                          １．８μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ                            ０．６μＬ
５’フォワードプライマー（１０μＭ）          ０．６μＬ
３’リバースプライマー（１０μＭ）            ０．６μＬ
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ                      ０．３μＬ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
全容量                                      ３０．０μＬ
【０１２８】
本技術分野で公知の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがこの反応に適している。例示的な一実施形態において、最終Ｍｇ２＋濃度は１．５ｍＭである。例示的なサーマルサイクルプログラムとして、反応液を９４℃で２分間温置し、続いて３０回のサーマルサイクルに付してＤＮＡを伸長させる。反応液は、各サイクルにおいて９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、次に７２℃で３０秒間温置する。３０サイクルの後、反応液を７２℃で５分間さらに温置し、続いて４℃で保存する。ＰＣＲ後、１０μＬのＰＣＲ産物を２％アガロースゲルにアプライし、反応が成功したことを確認する。反応液および残りの産物をスペクトラタイプ電気泳動によって解析する。
【０１２９】
増幅ＤＮＡ産物は次の構成を有する。
５’−ＦＲ３（２７ｂｐ）−ＶＨ  ＣＤＲ３−ＦＲ４（３５ｂｐ）−３’
【０１３０】
ＶＨ  ＣＤＲ３サイズは、見かけ上のＤＮＡ産物サイズから推測することができる。これは、Ｒｏｘ染色サイズマーカーにより次の計算を用いて決定することができる。
サイズＶＨ  ＣＤＲ３＝（サイズ見かけ上のＤＮＡ産物サイズ−６０）／３
式中、６０＝（６２両末端のフレームワーク−１３’突出＋３ＤＮＡマーカー過小評価）
【０１３１】
１５．ライブラリーＤＮＡテンプレート増幅のためのＰＣＲ
第一および第二ラウンドの選別アウトプットのため、ｃＤＮＡ（ＲＴ反応由来の上清）は８ｋＤａカットオフを用いて水に対して透析することができ、ｃＤＮＡ全量をＰＣＲテンプレートとして用いることができる。後期ラウンドの選別アウトプットのため、ｃＤＮＡの１０％をＰＣＲテンプレートとして用い、通常透析は必要とされない。例示的な増幅プライマーを表６に示す。
【０１３２】
【表６】
2012504416.tif 000007
2012504416.tif 000008
【０１３３】
ライブラリーＤＮＡテンプレート増幅のための例示的なＰＣＲ反応液を下の表７に示す。
【０１３４】
表７：ライブラリーｃＤＮＡテンプレート増幅のための例示的なＰＣＲ反応液
ｃＤＮＡテンプレート                                          Ｘ  μＬ
ｄＨ２Ｏ                                                ９０μＬとする
１０×Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー
１００  μＬ
ＭｇＳＯ４（５０ｍＭ）                                      ４０  μＬ
１０ｍＭｄＮＴＰ                                            ２０  μＬ
５’フォワードプライマー（１０μＭ）                        ２０  μＬ
３’リバースプライマー（１０μＭ）                          ２０  μＬ
Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ      １０  μＬ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
全容量                                                  １０００  μＬ
【０１３５】
例示的な一実施形態において、ラウンド１および２のアウトプットには１ｍＬのＰＣＲ反応液が用いられ、後期ラウンド由来のアウトプットには０．５ｍＬの反応液が用いられる。１００μＬ反応液のアリコートはマスターミックスから作製するべきである。ライブラリーＤＮＡテンプレートの増幅のための例示的なサーマルサイクル条件を下の表８に示す。
【０１３６】
表８：ライブラリーＤＮＡテンプレート増幅のためのサーマルサイクル条件
９４℃  ２分間
９４℃  ２０秒間
５５℃  ２０秒間    ２５サイクル＊
６８℃  １分間
６８℃  ５分間
４℃  永続的に維持する
＊注記：通常、２５サイクルで十分な増幅が得られるが、３５サイクルもの回数に増やしてより多くの産物を得ることもできる。追加的な増幅サイクルによってさまざまなサイズの非特異的産物がより顕著となる可能性が有り、産物はゲル精製が必要となり得る。可能であれば、増幅サイクル数よりもＤＮＡテンプレートインプットを増やす方が有用となり得る。
【０１３７】
ＰＣＲ後、５−１０μＬの産物を適切なＤＮＡサイズマーカーと共に１．２％アガロースゲルにアプライし、結果を確認する。産物が正確なサイズ（ｓｃＦｖはほぼ８５０ｂｐ、ＶＨまたはＶＬライブラリーはほぼ５００ｂｐ）であり、最小限の非特異的産物を有する場合、産物は次のラウンドの転写反応に直接用いることができる。産物はゲル精製を必要とし得る。ゲル精製がＰＣＲ産物に対して行われる場合、残りの全産物を調製的アガロースゲルで分離して、産物を含む特異的バンドをゲル抽出のために切り出すことができる。ＤＮＡにおける残存ＥｔＢｒはＵＶ吸光度に干渉する傾向があるため、ゲル精製したＤＮＡは定量を誤らせる可能性がある。ゲル抽出におけるより広範な洗浄ステップはこの干渉を低減するのに有用となり得る。ＵＶ走査トレースは純粋なＤＮＡサンプルと残存ＥｔＢｒを有するＤＮＡとの間で非常に異なるため、可能であればＤＮＡ濃度は分光計で測定するべきである。続いてこのプロトコールは繰り返され、複数ラウンドの選別を行う。
【０１３８】
１６．例示的な試薬およびバッファーの組成
１０×化学ライゲーションバッファー
Ｔｒｉｓ、ｐＨ７  ２５０ｍＭ
ＮａＣｌ  １Ｍ
【０１３９】
【表７】
2012504416.tif 000009
【０１４０】
選別バッファー
リン酸塩ベースバッファー
ＰＢＳ  １×
ＢＳＡ  １ｍｇ／ｍＬ
サケ精子ＤＮＡ  ０．１ｍｇ／ｍＬ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ０．０２５％
酵母ｔＲＮＡ（場合による、使用前に添加）  ２０ｎｇ／ｍＬ
【０１４１】
代替的なＨＥＰＥＳベースバッファー
ＨＥＰＥＳ  ５０ｍＭ
ＮａＣｌ  １５０ｍＭ
ＢＳＡ  １ｍｇ／ｍＬ
サケ精子ＤＮＡ  ０．１ｍｇ／ｍＬ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ０．０２５％
酵母ｔＲＮＡ（場合による、使用前に添加）  ２０ｎｇ／ｍＬ
【０１４２】
Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄバッファー
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３  ２５０ｍＭ
ＫＣｌ  ３７５ｍＭ
ＭｇＣｌ２  １５ｍＭ
【０１４３】
５０×ＦＬＡＧストック溶液
ＦＬＡＧペプチド  ２５ｍｇ
選別バッファー  ５ｍＬ
１ｍＬのアリコートを作製し、−２０℃で保存する。
【０１４４】
ＦＬＡＧ溶出溶液
５０×ＦＬＡＧストック溶液  １ｍＬ
選別バッファー  ４９ｍＬ
１ｍＬのアリコートを作製し、−２０℃で保存する。
【０１４５】
オリゴｄＴセルロースの調製
２．５ｇのオリゴｄＴセルロースを５０ｍＬチューブに移して、２５ｍＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨと混合することができる。混合液は１５００ｒｐｍで３分間スピンダウンして、上清を捨てることができる。次にオリゴｄＴセルロースは２５ｍＬの１×オリゴｄＴ結合バッファーで洗浄し、１５００ｒｐｍで３分間スピンダウンすることができる。上清は捨ててよい。洗浄ステップはさらに３回繰り返すことができ、上清のｐＨを測定する。ｐＨは洗浄バッファーと同じでなければならない（ほぼｐＨ８．５）。オリゴｄＴセルロースは、１×オリゴｄＴ結合バッファーを加えて最終容量２５ｍＬになるよう再懸濁して約５０％スラリーを作製し、４℃で保存する。最終濃度＝１００ｍｇ／ｍＬ＝１ナ
ノモルＲＮＡ結合能力
【０１４６】
抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースの調製
２５ｍＬのＭ２アガロースビーズを５０ｍＬチューブに移して、Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、フラートン、カリフォルニア州）において５分間１０００ｒｐｍでスピンダウンすることができる。上清はアスピレーションによって除去してよい。その結果得られたビーズを等量の１０ｍＭグリシン（ｐＨ３．５）で再懸濁、洗浄し、５分間１０００ｒｐｍでスピンダウンすることができる。上清を再度アスピレーションによって除去する。ビーズを１カラム容量の１×ＦＬＡＧ結合バッファーで再懸濁し、５分間１０００ｒｐｍでスピンダウンする。上清はアスピレーションによって除去する。この洗浄ステップは３回繰り返すことができ、ビーズを１カラム容量の１×結合バッファー（１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡおよび１００ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡを含む）に再懸濁することができる。混合液は１時間または一晩４℃で回転し、必要に応じて２ｍＬ画分のアリコートに分注し、４℃で維持する。
【０１４７】
（実施例２）
機能的ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の証明
【０１４８】
４種の抗体を用いて、機能的ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子が提示され、それらそれぞれの抗原と結合できることを証明した。Ｄ２Ｅ７（ヒト抗ｈＴＮＦ）、Ｙ６１（ヒト抗ｈＩＬ−１２）、１７／９（マウス抗−ＨＡ）およびＭＡＫ１９５（マウス抗ｈＴＮＦ）。次の表９のプライマーを用いたＰＣＲによって、ＭＡＫ−１９５ｓｃＦｖを作製する。
【０１４９】
【表８】
2012504416.tif 000010
【０１５０】
ＮＣＢＩデータベースからダウンロードしたタンパク質配列Ａ３１７９０およびＢ３１７９０に基づく次のプライマー（下の表１０を参照）を用いたＰＣＲによって、抗ＨＡ１７／９ｓｃＦｖ（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｇａｈｍｅｎら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４（４）：１０９８−１１８を参照）を作製する。
【０１５１】
【表９】
2012504416.tif 000011
2012504416.tif 000012
2012504416.tif 000013
【０１５２】
これらｓｃＦｖのＤＮＡコンストラクトは、インビトロで転写され、次にウサギ網状赤血球ライセートにおいてｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ（タンパク質はピューロマイシン修飾を有するリンカーを介してｍＲＮＡに結合している）として、または遊離ｓｃＦｖ（タンパク質はｍＲＮＡに結合していない）として翻訳される。両方のタイプの分子を精製し、対応するビオチン化抗原によるプルダウンアッセイに付す（図４を参照）。
【０１５３】
図４のデータは、機能的ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ（ビオチン化抗原と結合）分子は、遊離ｓｃＦｖ分子よりも低い回収率であったがストレプトアビジン−磁気ビーズによってプルダウンすることを示す。さらに別の実験によって、この差が単にｓｃＦｖに繋がった大きなＲＮＡ分子によるものであることが示される。ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子におけるＲＮＡ部分をＲＮａｓｅによって分解することにより、ｓｃＦｖの抗原による回収を遊離ｓｃＦｖ分子の回収と同一のレベルにまで回復させた（図５を参照）。
【０１５４】
（実施例３）
ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖライブラリーの構築
【０１５５】
１８人のドナー由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＳｅｒａＣａｒｅから入手する。下の表１１は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）法によるＰＢＭＣ分析を示す。次にライブラリー構築のため、ポリＡ  ＲＮＡを抽出する。
【０１５６】
【表１０】
2012504416.tif 000014
【０１５７】
（実施例４）
ライブラリータグ選別
４種類の８塩基対タグ（配列番号３９−４２）を選択し、１７／９ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖコンストラクトのＴＭＶ−ＵＴＲとコザック共通配列との間に挿入する（図６を参照）。タグ配列はアデノシンを含まないよう設計し、３ラウンドの選別後に同定する。図６から分かるように、第一の位置にはＧが好ましく、第二の位置にはＴが好ましい。ランダム配列タグは、５’ＵＴＲのＴＭＶとコザック共通配列との間に８個のランダム（Ｂ＝Ｇ、Ｃ、Ｔ）ヌクレオチド挿入を備える５’プライマーを設計することによって作製される（図７を参照）。次に１７／９ｓｃＦｖを増幅して２−３ラウンドの選別によって選別し、その次のラウンドでは５’プライマーで再増幅する。続いて配列アウトプットは、選別プロセスを経たタグを同定するよう処理される。各ラウンド由来の異なるアウトプットタグを図８に示す。一部の反復配列が各ラウンド内に観察されるが、複数ラウンドではタグ配列は観察されない。ＡＴＧ配列はタグ配列に利用可能でないため、ラウンド２において１個の可能な突然変異がタグに存在することに留意するべきである。
【０１５８】
（実施例５）
１７／９ｓｃＦｖのライブラリー選別
【０１５９】
本明細書に記載されているｍＲＮＡディスプレイ法を用いた数ラウンドの選別によってｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子を濃縮できることを証明するため、重複ＰＣＲ法によって２５の多様性を有するｓｃＦｖライブラリーを構築する。ｓｃＦｖライブラリーを作製するため、１７／９、Ｄ２Ｅ７、２ＳＤ４、Ｙ６１およびＭＡＫ１９５のＶＨおよびＶＬ断片を、上述の通りに用いる。次にこのライブラリーからビオチン化ＨＡタグによって１７／９ｓｃＦｖを選別する。選別後、クローニングおよびコロニーＰＣＲによって１７／９の濃縮を検査する。１ラウンドのｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ選別の前と後で１７／９ｓｃＦｖを定量した結果を、図９に示す。
【０１６０】
（実施例６）
ｍＲＮＡディスプレイ技術は、異なる親和性を有するｓｃＦｖバインダーを識別するために用いる
【０１６１】
ｍＲＮＡディスプレイ技術、すなわち上述の技術が、異なる親和性を有するｓｃＦｖバインダーを識別するために用いるか決定するため、Ｄ２Ｅ７と２ＳＤ４のキメラを作製する。２ＳＤ４は、ＴＮＦαに対して低い親和性（遊離タンパク質としてＫＤほぼ２００ｎＭ）を示す、Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖの前駆体である。図１０はキメラを示す。
【０１６２】
遊離タンパク質に対して滴定を行う。図１１は、異なるキメラの間の抗原結合後の回収率と共に、抗原選別後の正規化回収率を示す。上述の結果から、本明細書に記載されているｍＲＮＡディスプレイ技術は、異なる親和性を有するバインダーを識別するために用いることができることが示される。
【０１６３】
（実施例７）
ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の耐熱性
【０１６４】
ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の耐熱性を決定するため、本明細書に記載されているようにＤ２Ｅ７−ｓｃＣｋおよびＹ６１−ｓｃＣｋを翻訳して、ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖフォーマットに精製する。次に、ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子を抗原選別前にさまざまな温度で３０分間温置する。抗原選別後の正規化回収率を図１２に示す。
【０１６５】
図１３は、ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の高温処理後にＲＮＡを回収できることを示す。そこで、回収されたＹ６１−ｓｃＣｌのｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子を有するビーズにおいてＲＴ−ＰＣＲを行う。
【０１６６】
（実施例８）
ヒトＰＢＭＣ  ＲＮＡから未処理κ  ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ  ｓｃＦｖライブラリーの構築
【０１６７】
次の例は、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ技術を用いた選別に適したヒト未処理κ  ｓｃＦｖライブラリーの作製を説明する。
【０１６８】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＳｅｒａＣａｒｅ（ミルフォード、マサチューセッツ州、ｃａｔ．＃７２０００）から購入する。異なるドナー由来の細胞は、抗ヒトＣＤ２０−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州、ｃａｔ．＃５５６６３２）および抗ヒトＣＤ２７−ＰＥ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｃａｔ．＃５５５４４１）抗体による染色によって特徴付けられる。全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉキット（ＱＩＡＧＥＮ、バレンシア、カリフォルニア州、ｃａｔ．＃７５１４４）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってＰＢＭＣから単離する。すなわち、凍結した細胞を３７℃で素早く解凍し、グアニジンイソチオシアネートを含むバッファーに再懸濁し、２１Ｇ注射針に複数回通すことによってホモジナイズする。エタノールを添加し、ライセートをＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉカラム（合計１８カラム）にアプライする。カラムを洗浄し、全ＲＮＡをＲＮａｓｅフリー水で溶出する。ＲＮＡ濃度および収量は、ＯＤ２６０ｎｍ吸光度を測定することによって決定する。次に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｆａｓｔｒａｃｋ  ＭＡＧ  Ｍａｘｉ  ｍＲＮＡ単離キット（ｃａｔ＃Ｋ１５８０−０２）を用いて、キットのマニュアルに従って全ＲＮＡからｍＲＮＡを単離する。この手順においてＲＮａｓｅインヒビター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州、ｃａｔ＃１０７７７−０１９）を添加し、ＲＮＡ分解を最小限に抑える。全ＲＮＡを先ずＤＮａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃１８−６８−０１５）で処理し、ゲノムＤＮＡの混入を最小限に抑える。すなわち、先ずオリゴｄＴ−磁気ビーズを洗浄し、次に全ＲＮＡに加え、６５℃で１０分間温置し、続いて室温で３０分間結合させる。ビーズを数回洗浄し、結合したｍＲＮＡをＲＮＡｓｅフリー水で溶出する。ＯＤ２６０ｎｍ吸光度を測定することによってｍＲＮＡを定量する。
【０１６９】
逆転写
次に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州、ｃａｔ．＃１８０６４−０１４）および１５種類のプライマーの混合物（合計濃度１００ｎＭ）（表１２）を用いて、メーカーのプロトコールに従って３７μｇのｍＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成する。反応は、各０．９ｍｌの２個のアリコートで行われる。ＲＴ反応液（全容量１．８ｍｌ）を３６本のＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｓ−２００ＨＲカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州、ｃａｔ．＃２７−５１２０−０１）に通すことによって精製する（カラム当たり５０μｌ）。カラム溶出液は、ＲＮａｓｅＨで２０分間３７℃温置する。
【０１７０】
【表１１】
2012504416.tif 000015
【０１７１】
ＶＨ  ｃＤＮＡ増幅
上述のＲＴ反応液の３分の１は、ＶＨリーダー配列（ＬＳ）特異的フォワードプライマーの混合物（合計濃度２００ｎＭ）およびＪＨ特異的リバースプライマーの混合物（合計濃度２００ｎＭ）（表１３）を含む反応液においてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．＃１１３０４−１０２）による限定増幅に付す。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、１０サイクルの９４℃（３０秒間）、５５℃（３０秒間）および６８℃（６０秒間）、続いて３分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。次に、ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、バレンシア、カリフォルニア州、ｃａｔ．＃２８１０６）を用いて、メーカーのプロトコールに従って精製する。スモールスケールのパイロット実験により、少なくとも１００倍のｃＤＮＡ増幅を確認する。
【０１７２】
【表１２】
2012504416.tif 000016
【０１７３】
精製したＰＣＲ産物の１／１００は、各ＶＨファミリー特異的ｃＤＮＡ増幅のためのテンプレートとして用いる。増幅は、個々のＶＨ  ＬＳ特異的フォワードプライマー（２００ｎＭ）およびＪＨ特異的リバースプライマーの混合物（合計濃度２００ｎＭ）（表１３）を含む反応液においてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いたＰＣＲにより行われる。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、２５サイクルの９４℃（３０秒間）、５５℃（３０秒間）および６８℃（４０秒間）、続いて３分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。
【０１７４】
上述のＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、バレンシア、カリフォルニア州）により、メーカーのプロトコールに従って精製する。続いて各ＰＣＲ産物は、対応するＶＨ特異的ネステッドフォワードプライマー（２００ｎＭ）およびＪＨ特異的リバースプライマーの混合物（合計濃度２００ｎＭ）（表１４）を含むＰＣＲ反応液においてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）により増幅する。各反応におけるフォワードプライマーは、続くライブラリー増幅における特異性を高めるために導入された８ヌクレオチド「タグ」（下線部）を有する。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、２５サイクルの９４℃（３０秒間）、５５℃（３０秒間）および６８℃（４０秒間）、続いて３分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。
【０１７５】
【表１３】
2012504416.tif 000017
【０１７６】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動に付し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、バレンシア、カリフォルニア州、ｃａｔ．＃２８７０４）によって精製する。これらＰＣＲ産物のアリコートは、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）および２００ｎＭの次のユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲ反応においてラージスケールでさらに増幅する。
Ｔ７ＴＭＶＴａｇ２（配列番号８０）：
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＡＣＡＧＴＧＴＴＧＣＧＡＣ
Ｌｉｂｒａｒｙ−ＧＳ−Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号１６）：ＣＧＣＴＡＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＧＡＣ
【０１７７】
これらのプライマーは、ＰＣＲ産物の５’末端にＴ７プロモーターおよびＴＭＶ−ＵＴＲ配列を、ＰＣＲ産物の３’末端に部分グリシン−セリン（Ｇ４Ｓ）−リンカーを付加する。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、２６サイクルの９４℃（３０秒間）、５５℃（３０秒間）および６８℃（４０秒間）、続いて３分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。
【０１７８】
ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、バレンシア、カリフォルニア州）で精製し、２６０ｎｍのＵＶ吸光度で定量化し、これら産物のアリコートを１％アガロースゲル電気泳動で可視化して純度を確認する。ＶＨファミリー特異的ｃＤＮＡ断片のアリコートをＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．＃４５−０６４１）を用いてクローニングし、個々のクローンを配列決定により分析する。
【０１７９】
Ｖκ  ｃＤＮＡ増幅
上述のＲＴ反応から作製したｃＤＮＡの３分の１は、Ｖκリーダー配列（ＬＳ）特異的フォワードプライマーの混合物（合計濃度２００ｎＭ）およびＣκ特異的リバースプライマー（２００ｎＭ）（表１５）を含む反応液においてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）による限定増幅に付す。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、１０サイクルの９４℃（３０秒間）、５５℃（３０秒間）および６８℃（６０秒間）、続いて３分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。別のスモールスケール実験によって、このようなＰＣＲによるｃＤＮＡの１０−１００倍増幅を確認する。
【０１８０】
ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、バレンシア、カリフォルニア州）を用いて、メーカーのプロトコールに従って精製する。精製したＰＣＲ産物の１／５００を、各Ｖκファミリー特異的ｃＤＮＡの増幅のためのテンプレートとして用いる。増幅は、個々のＶκ  ＬＳ特異的フォワードプライマー（２００ｎＭ）およびＣκ特異的リバースプライマー（２００ｎＭ）（表１６）を含む反応液においてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いたＰＣＲによって行われる。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、２５サイクルの９４℃（３０秒間）、５５℃（３０秒間）および６８℃（４０秒間）、続いて３分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。
【０１８１】
【表１４】
2012504416.tif 000018
【０１８２】
【表１５】
2012504416.tif 000019
【０１８３】
ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、メーカーのプロトコールに従って精製する。続いて各ＰＣＲ産物を、対応するＶκ特異的ネステッドフォワードプライマー（２００ｎＭ）およびＣκ特異的リバースプライマー（２００ｎＭ）（表１３）を含むＰＣＲ反応液においてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）により増幅する。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、２５サイクルの９４℃（３０秒間）、５５℃（３０秒間）および６８℃（４０秒間）、続いて３分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。
【０１８４】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動に付し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、バレンシア、カリフォルニア州）により精製する。Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）および次のユニバーサルプライマー（２００ｎＭ）を含むＰＣＲ反応液において、これらＰＣＲ産物のアリコートをラージスケールでさらに増幅する。
Ｌｉｂｒａｒｙ−ＧＳ−Ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号９４）：ＧＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＡＧＣＧ
ＦｌａｇＡ２０Ｒｅｖ（配列番号９５）：
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＴＡＧＣＧＧＡＴＧＣＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣ
【０１８５】
これらプライマーは、ＰＣＲ産物の５’末端に部分的Ｇ４Ｓ−リンカーを、その結果生じるＰＣＲ産物の３’末端にＦＬＡＧタグ、リンカーアニーリング部位およびポリＡテールを付加する。
【０１８６】
ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、２６サイクルの９４℃（３０秒間）、５５℃（３０秒間）および６８℃（３０秒間）、続いて３分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、バレンシア、カリフォルニア州）で精製し、２６０ｎｍのＵＶ吸光度によって定量化し、これら産物のアリコートを１％アガロースゲル電気泳動により可視化して純度を確認する。得られたＶκファミリー特異的ｃＤＮＡ断片の一部をＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．＃４５−０６４１）を用いてクローニングし、個々のクローンを配列決定により分析する。
【０１８７】
ＶＨ−Ｖκ  ｓｃＦｖ構築
ＶＨおよびＶκ  ｃＤＮＡ断片を各ファミリーにおける生殖系列の数に応じて混合する（表１７および１８）。
【０１８８】
【表１６】
2012504416.tif 000020
【０１８９】
【表１７】
2012504416.tif 000021
【０１９０】
合計１０μｇのＶＨ  ｃＤＮＡ断片（２×１０１３分子）および合計１０μｇのＶκ  ｃＤＮＡ断片（２×１０１３分子）は、重複ＰＣＲのテンプレートとして用いる。Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  ＦｉｄｅｌｉｔｙならびにプライマーＴ７ＴＭＶＴａｇ２（２００ｎＭ）およびＦｌａｇＡ２０Ｒｅｖ（２００ｎＭ）を用いて、３０ｍｌ容量でＰＣＲを行う。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、１７サイクルの９４℃（３０秒間）、５５℃（３０秒間）および６８℃（６０秒間）、続いて３分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。ＰＣＲ産物のアリコートをＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．＃４５−０６４１）を用いてクローニングし、個々のクローンを配列決定により分析する。
【０１９１】
スペクトラタイプ解析
それぞれＶＨのフレームワーク３領域およびＪ領域とアニーリングする蛍光色素標識５’フォワードプライマー（６−ＦＡＭ−ＰａｎＶＨＦＲ３−Ｆｗｄ、５’−ＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴ−３’、配列番号１７）およびリバースプライマー（ＰａｎＪＨ−Ｒｅｖ、５’−ＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣ−３’、配列番号１８）は、ＰＣＲによりＶＨ領域のＣＤＲ３領域にわたって増幅するため用いる。２００ｎＭ  ６−ＦＡＭ−ＰａｎＶＨＦＲ３−Ｆｗｄプライマー、２００ｎＭ  ＰａｎＪＨ−Ｒｅｖプライマー、２００μＭ  ｄＮＴＰ、１×ＧｏＴａｑバッファーおよび１．５ＵのＧｏＴａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州）を含む３０μｌ反応容量で、５０ｎｇのｓｃＦｖライブラリーＤＮＡテンプレートを用いる。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、３０サイクルの９４℃（２０秒間）、５５℃（２０秒間）および７２℃（３０秒間）、続いて５分間７２℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。ＰＣＲ後、１０μｌの産物を２％アガロースゲルにアプライして反応の成功を確認し、残りの産物をＡＢＩシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いたスペクトラタイプ電気泳動に付す。ＲＯＸ色素標識ＤＮＡマーカーにより決定した産物長から６０ｂｐフランキングフレームワーク配列を引くことによってＣＤＲ３長を計算する。
【０１９２】
結果
【０１９３】
ヒトＰＢＭＣの評価
２０人のドナーから得られたＰＢＭＣサンプルのフローサイトメトリーによるＢ細胞（ＣＤ２０＋）およびメモリーＢ細胞（ＣＤ２７＋）のためのプレスクリーニングは、１０人のドナー（ＰＭＢＣにおける＞９％Ｂ細胞、全Ｂ細胞における＜３５％メモリーＢ細胞）の選別をもたらし、ドナーの年齢、性別、民族分布をドナー利用可能性の最良の範囲に最適化できる（図１４）。
【０１９４】
ＲＮＡ精製
ライブラリー構築のための抗体ｃＤＮＡレパートリーを得るため、１．９ｍｇの全ＲＮＡを推定２．６×１０８個のＢ細胞を含む２．３×１０９個のヒトＰＢＭＣから得る。続いて全ＲＮＡからポリＡ  ｍＲＮＡを精製することによって、４２．２μｇのｍＲＮＡが得られる。
【０１９５】
ＶＨ  ｃＤＮＡ断片の増幅
ＶＨユニバーサルプライマー（Ｔ７ＴＭＶＴａｇ２、配列番号８０およびｌｉｂｒａｒｙ−ＧＳ−Ｒｅｖ、配列番号１６）により増幅されたほぼ５００ｂｐのＶＨファミリー特異的ｃＤＮＡ断片のアリコートを、アガロースゲル電気泳動によって可視化する（図１５）。
【０１９６】
個々のＶＨクローンの配列解析を表１９に示す。クローニングされたＶＨ配列と公知のＶＨ生殖系列配列との比較は、ＶＨファミリー特異的プライマーによる高度に特異的な増幅を裏付ける。
【０１９７】
Ｖκ断片の増幅
ユニバーサルプライマー（Ｌｉｂｒａｒｙ−ＧＳ−Ｆｗｄ、配列番号９４およびＦｌａｇＡ２０Ｒｅｖ、配列番号９５）を用いて増幅したＶκファミリー特異的ｃＤＮＡ断片のアリコートは、アガロースゲル電気泳動により可視化する（図１６）。個々のＶκクローンの配列解析を表２０に示す。このデータは、Ｖκ生殖系列ファミリーのそれぞれに対するプライマーの特異性を裏付ける。
【０１９８】
【表１８】
2012504416.tif 000022
【０１９９】
ＶＨ−Ｖκ  ｓｃＦｖ構築
重複ＰＣＲを行ってＶＨ−Ｖκ  ｓｃＦｖ  ｃＤＮＡ断片を構築する。得られた産物の一部をアガロースゲル電気泳動により可視化する（図１７）。作製したＶＨ−Ｖκ  ｓｃＦｖ断片は、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ  ｍＲＮＡディスプレイ技術による選別に必要なあらゆる要素を備える（図１７）。個々のＶＨ−Ｖκ  ｓｃＦｖクローンの配列解析により、機能的介在Ｇ４Ｓリンカーとの大部分での正確なＶＨ−Ｖκ組換えを確認する。構築したｓｃＦｖライブラリーにおけるさまざまなＶＨおよびＶκファミリーの分布は、以前の文献報告と一致する（図１８、さらに、Ｔｓｕｉｊｉら（２００６）Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．；Ｖ．２０３（２）、３９３−４００頁およびＡｒｏｎｓら（２００６）Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｖ．１３３、５０４−５１２頁も参照）。
【０２００】
【表１９】
2012504416.tif 000023
【０２０１】
スペクトラタイプ解析
異なるＶＨファミリー間のＣＤＲ３サイズ分布のスペクトラタイプ解析は、ｓｃＦｖライブラリーへと組み立てる直前にＶＨ  ｃＤＮＡ断片において行われる（図１９）。高度な多様性を有するｃＤＮＡライブラリーで予想されるように、観察されたＣＤＲ３サイズは、解析した全ファミリーで大きく異なる。異なるＣＤＲ３サイズの観察されたピーク高は、正規分布に一般的な釣鐘曲線を想定し、非常に大きな集団サイズを示唆する。これは特に、単一の生殖系列から、またはＶＨ１−４６、ＶＨ２、ＶＨ５およびＶＨ６等、非常に小さいＶＨファミリーから得られた結果において明らかである。異なるＶＨファミリーにおけるＣＤＲ３サイズの僅かな差に留意しても興味深い。例えば、ＶＨ１およびＶＨ２は、１５−１６残基のＣＤＲ３をより多く有する傾向があり、一方ＶＨ３は、１３残基のＣＤＲ３をより多く有する傾向がある。全体的に考えると、個々のＶＨファミリーのスペクトラタイプ解析は、ｃＤＮＡライブラリーにおける高度な多様性および非常に大きなＶＨ配列を裏付ける。
【０２０２】
８種類のｓｃＦｖライブラリーテンプレートをランダムに標本抽出し、前述の通りスペクトラタイプ解析に付す。全８サンプルから得られた結果は区別がつかず、各アリコートにおけるライブラリーテンプレートが再現可能な程類似していることを示唆する（図２０）。ライブラリーＶＨ  ＣＤＲ３サイズは正規分布し、大部分は６−２４残基の間に収まり、中央は１３−１６残基の間である。この分布は予想されたように、個々のＶＨファミリーのスペクトラタイプ結果と一致する。
【０２０３】
結論
高品質ヒト抗体リードの選別は、治療用抗体医薬開発の成功のための必要条件である。確固とした選別技術に加え、抗体ライブラリーの品質（ソース、多様性および構築）は、良質のリード産生におけるその有用性を大きく左右する。ドナーコレクションにおける全多様性が得られるよう、多くのヒトドナーはより高度な多様性のためにプレスクリーニングされ、ＰＣＲプライマーはあらゆる抗体生殖系列配列をカバーできるよう非常に高い特異性を備えるよう設計される。構築された抗体ｓｃＦｖライブラリーは、２×１０８個より多いＢ細胞から得られた２×１０１２より大きい理論上の多様性を有するが、これは複数のクローンを配列決定し、スペクトラタイプ解析することにより実証されている。
【０２０４】
（実施例９）
ヒトＰＢＭＣ  ＲＮＡ由来の未処理λＰＲＯｆｕｓｉｏｎ  ｓｃＦｖライブラリーの構築
【０２０５】
全ＲＮＡおよびｍＲＮＡ精製、ｍＲＮＡ逆転写ならびにＰＣＲによるＶＨ  ｃＤＮＡ増幅は、実施例１に記載されている。
【０２０６】
Ｖλ  ｃＤＮＡ増幅
上述のＲＴ反応によって作製されたｃＤＮＡの３分の１は、Ｖλリーダー配列（ＬＳ）特異的フォワードプライマーの混合物（合計濃度２００ｎＭ）およびＣλ特異的リバースプライマー（２００ｎＭ）（表２１）を含む反応液においてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）による限定増幅に付す。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、１０サイクルの９４℃（３０秒間）、５５℃（３０秒間）および６８℃（６０秒間）、続いて５分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。別のスモールスケール実験によって、このようなＰＣＲによるｃＤＮＡの１０−１００倍増幅を確認する。
【０２０７】
【表２０】
2012504416.tif 000024
【０２０８】
ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、メーカーのプロトコールに従って精製する。精製したＰＣＲ産物の１／２５０は、各Ｖλファミリー特異的ｃＤＮＡ増幅のためのテンプレートとして用いる。個々のＶλ  ＬＳ特異的フォワードプライマー（２００ｎＭ）およびＣλ特異的リバースプライマー（２００ｎＭ）（表２２）を含む反応液においてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いたＰＣＲによって、増幅を行う。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、３５サイクルの９４℃（３０秒間）、５５℃（３０秒間）および６８℃（６０秒間）、続いて５分間６８℃伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。
【０２０９】
【表２１】
2012504416.tif 000025
【０２１０】
ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで泳動し、ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ  ＦｒｅｅｚｅＮＳｑｕｅｅｚｅカラム（Ｂｉｏｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を用いて、メーカーのプロトコールに従って精製する。次に各ＰＣＲ産物は、対応するＶλ特異的ネステッドフォワードプライマー（２００ｎＭ）およびＣλ特異的リバースプライマー（２００ｎＭ）（表１３）を含むＰＣＲ反応液においてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）により増幅する。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、３５サイクルの９４℃（３０秒間）、５５℃（３０秒間）および６８℃（６０秒間）、続いて５分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。
【０２１１】
ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで泳動し、ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ  ＦｒｅｅｚｅＮＳｑｕｅｅｚｅカラム（Ｂｉｏｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を用いて精製する。これらＰＣＲ産物のアリコートは、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）および次のユニバーサルプライマー（２００ｎＭ）を含むＰＣＲ反応液においてラージスケールでさらに増幅する。
Ｌｉｂｒａｒｙ−ＧＳ−Ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号９４）：ＧＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＡＧＣＧ
ＦｌａｇＡ２０Ｒｅｖ（配列番号９５）：
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＴＡＧＣＧＧＡＴＧＣＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣ
【０２１２】
これらプライマーは、ＰＣＲ産物の５’末端に部分Ｇ４Ｓ−リンカーを、その結果生じたＰＣＲ産物の３’末端にＦＬＡＧタグ、リンカーアニーリング部位およびポリＡテールを付加する。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、３５サイクルの９４℃（３０秒間）、５５℃（３０秒間）および６８℃（３０秒間）、続いて５分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。ＰＣＲ産物をＰｕｒｅｌｉｎｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いて精製し、２６０ｎｍのＵＶ吸光度により定量化し、これら産物のアリコートを２％アガロースゲル電気泳動により可視化して純度を確認する。
【０２１３】
得られたＶλファミリー特異的ｃＤＮＡ断片の一部をＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．＃４５−０６４１）を用いてクローニングし、個々のクローンを配列決定により解析する。
【０２１４】
ＶＨ−Ｖλ  ｓｃＦｖ構築
各ＰＣＲ産物により示された生殖系列の多様性に従い、ＶＨおよびＶλ  ｃＤＮＡ断片を混合する（表２３および２４）。
【０２１５】
【表２２】
2012504416.tif 000026
【０２１６】
【表２３】
2012504416.tif 000027
【０２１７】
合計１０μｇのＶＨ  ｃＤＮＡ断片（２×１０１３分子）および１０μｇのＶλ  ｃＤＮＡ断片（２×１０１３分子）を重複ＰＣＲのテンプレートとして用いる。Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  ＦｉｄｅｌｉｔｙならびにプライマーＴ７ＴＭＶＴａｇ２（２００ｎＭ）およびＦｌａｇＡ２０Ｒｅｖ（２００ｎＭ）を用いて、３０ｍｌ容量でＰＣＲを行う。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、１７サイクルの９４℃（３０秒間）、５５℃（３０秒間）および６８℃（６０秒間）、続いて５分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．＃４５−０６４１）を用いてＰＣＲ産物のアリコートをクローニングし、個々のクローンを配列決定により解析する。
【０２１８】
結果
【０２１９】
Ｖλ断片の増幅
ユニバーサルプライマー（Ｌｉｂｒａｒｙ−ＧＳ−ＦｗｄおよびＦｌａｇＡ２０Ｒｅｖ）で増幅したＶλファミリー特異的ｃＤＮＡ断片のアリコートをアガロースゲル電気泳動により可視化する（図２１）。
【０２２０】
個々のＶλクローンの配列解析を表２５に示す。データは、１個のミスマッチを太字で強調表示してＶλ生殖系列ファミリーのそれぞれに対するプライマー特異性を裏付ける（ＶＬ１  ＬＳ３、生殖系列Ｖ１−３）。
【０２２１】
【表２４】
2012504416.tif 000028
【０２２２】
ＶＨ−Ｖλ  ｓｃＦｖ構築
重複ＰＣＲを行ってＶＨ−Ｖλ  ｓｃＦｖ  ｃＤＮＡ断片を構築する。得られた産物の一部をアガロースゲル電気泳動により可視化する（図２２）。作製したＶＨ−Ｖλ  ｓｃＦｖ断片は、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ  ｍＲＮＡディスプレイ技術による選別に必要なあらゆる要素を有する（図２３）。
【０２２３】
個々のＶＨ−Ｖλ  ｓｃＦｖクローンの配列解析により、機能的介在Ｇ４Ｓリンカーとの大部分での正確なＶＨ−Ｖλ組換えを確認する。
【０２２４】
（実施例１０）
ヒトリンパ節ｍＲＮＡから未処理κおよびλＰＲＯｆｕｓｉｏｎ  ｓｃＦｖライブラリーの構築
【０２２５】
本実施例は、リンパ節ｍＲＮＡからＰＲＯｆｕｓｉｏｎヒト未処理ｓｃＦｖライブラリー（ＰＢＭＣκおよびＰＢＭＣλ）の作製を説明する。
１０．１  逆転写
【０２２６】
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．＃１８０６４−０１４）および１５種類のプライマー混合物（合計濃度１００ｎＭ）（表１２）を用いて、メーカーのプロトコールに従って４０μｇのｍＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成する。各０．１ｍｌの１６個のアリコートで反応を行う。ＲＴ反応液をプールし（合計容量１．６ｍｌ）、２０μｌのＲＮａｓｅＨと２０分間３７℃で温置し、次に水に対して透析する。
【０２２７】
１０．２  ＰＣＲ
【０２２８】
１０．２．１  ＶＨ  ｃＤＮＡ増幅
ＶＨリーダー配列（ＬＳ）特異的フォワードプライマーの混合物（合計濃度２００ｎＭ）およびＪＨ特異的リバースプライマーの混合物（合計濃度２００ｎＭ）（表１３）を含む反応液においてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．＃１１３０４−１０２）により上述のＲＴ反応液の３分の１を限定増幅に付す。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、１０サイクルの９４℃（２０秒間）、５５℃（２０秒間）および６８℃（６０秒間）、続いて３分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。次にＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、ｃａｔ．＃２８１０６）により、メーカーのプロトコールに従って精製する。スモールスケールのパイロット実験により、ｃＤＮＡの少なくとも１０倍増幅を確認する。
【０２２９】
精製したＰＣＲ産物の半量を７個の等量アリコートに分注し、各アリコートをＶＨファミリー特異的ｃＤＮＡの内の１種類を増幅するためのテンプレートとして用いる。個々のＶＨ  ＬＳ特異的フォワードプライマー（２００ｎＭ）およびＪＨ特異的リバースプライマーの混合物（合計濃度２００ｎＭ）（表１３）を含む反応液においてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いたＰＣＲにより増幅を行う。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、２５サイクルの９４℃（２０秒間）、５５℃（２０秒間）および６８℃（４０秒間）、続いて３分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。
【０２３０】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）により、メーカーのプロトコールに従って上述のＰＣＲ産物を精製する。続いて、対応するＶＨ特異的ネステッドフォワードプライマー（２００ｎＭ）およびＪＨ特異的リバースプライマーの混合物（合計濃度２００ｎＭ）（表２６）を含むＰＣＲ反応液においてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）により各ＰＣＲ産物を増幅する。各反応液におけるフォワードプライマーは、次のライブラリー増幅における特異性を高めるために導入された８ヌクレオチド「タグ」（下線部）を有する。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、２５サイクルの９４℃（２０秒間）、５５℃（２０秒間）および６８℃（４０秒間）、続いて３分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。
【０２３１】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動に付し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、ｃａｔ．＃２８７０４）で精製する。これらＰＣＲ産物のアリコートを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）ならびに２００ｎＭのユニバーサルプライマー（Ｔ７ＴＭＶＴａｇ４ｓおよびＬｉｂ−ＧＳｖ２−Ｒｅｖ）を用いたＰＣＲ反応によりラージスケールでさらに増幅する。これらのプライマーは、ＰＣＲ産物の５’末端にＴ７プロモーターおよびＴＭＶ−ＵＴＲ配列を、ＰＣＲ産物の３’末端に部分グリシン−セリン（Ｇ４Ｓ）−リンカーを付加する。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、２５サイクルの９４℃（２０秒間）、５５℃（２０秒間）および６８℃（４０秒間）、続いて３分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、２６０ｎｍのＵＶ吸光度で定量化し、これら産物のアリコートを１％アガロースゲル電気泳動により可視化して純度を確認する。ＶＨファミリー特異的ｃＤＮＡ断片のアリコートをＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．＃４５−０６４１）を用いてクローニングし、個々のクローンを配列決定により解析する。
【０２３２】
【表２５】
2012504416.tif 000029
【０２３３】
１０．２．２  Ｖκ  ｃＤＮＡ増幅
上述のＲＴ反応により作製したｃＤＮＡの３分の１は、Ｖκリーダー配列（ＬＳ）特異的フォワードプライマーの混合物（合計濃度２００ｎＭ）およびＣκ特異的リバースプライマー（２００ｎＭ）（表１５）を含む反応液においてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）による限定増幅に付す。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、１０サイクルの９４℃（２０秒間）、５５℃（２０秒間）および６８℃（６０秒間）、続いて３分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。別のスモールスケール実験により、このようなＰＣＲにより最大１０倍のｃＤＮＡ増幅を確認する。
【０２３４】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってＰＣＲ産物を精製する。精製したＰＣＲ産物の半量を６個の等量アリコートに分注し、各アリコートは個々のＶκファミリー特異的ｃＤＮＡ増幅のためのテンプレートとして用いる。個々のＶκ  ＬＳ特異的フォワードプライマー（２００ｎＭ）およびＣκ特異的リバースプライマー（２００ｎＭ）（表１５）を含む反応液においてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いたＰＣＲにより増幅を行う。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、２５サイクルの９４℃（２０秒間）、５５℃（２０秒間）および６８℃（４０秒間）、続いて３分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。
【０２３５】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動に付し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてメーカーのプロトコールに従って精製する。続いて対応するＶκ特異的ネステッドフォワードプライマー（２００ｎＭ）およびＣκ特異的リバースプライマー（２００ｎＭ）（表２７）を含むＰＣＲ反応液においてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）により各ＰＣＲ産物を増幅する。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、２５サイクルの９４℃（２０秒間）、５５℃（２０秒間）および６８℃（４０秒間）、続いて３分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。
【０２３６】
Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）ならびに２００ｎＭユニバーサルプライマー（Ｌｉｂ−ＧＳｖ２−ＦｗｄおよびＣＫＲｅｖｅｒｓｅ）を含むＰＣＲ反応液において、ラージスケールでこれらＰＣＲ産物のアリコートをさらに増幅する。
【０２３７】
プライマーＬｉｂ−ＧＳｖ２−Ｆｗｄは、Ｖκ上流の部分Ｇ４Ｓ−リンカーを付加する。Ｇ４Ｓリンカーをコードしたユニバーサルプライマー配列（Ｌｉｂ−ＧＳｖ２−ＦｗｄおよびＬｉｂ−ＧＳｖ２−Ｒｅｖ）は、ヒトＰＢＭＣライブラリー構築のために使用されるプライマー配列（Ｌｉｂｒａｒｙ−ＧＳ−ＦｏｒｗａｒｄおよびＬｉｂｒａｒｙ−ＧＳ−Ｒｅｖｅｒｓｅ）から改変する。この改変は、プライマーＬｉｂｒａｒｙ−ＧＳ−ＲｅｖｅｒｓｅがＶＨ３ファミリー生殖系列のフレームワーク１とアニーリングして切断ＶＨ配列を生成する、クロスプライミング問題を防ぐため行われる。
【０２３８】
【表２６】
2012504416.tif 000030
【０２３９】
ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、２５サイクルの９４℃（２０秒間）、５５℃（２０秒間）および６８℃（４０秒間）、続いて３分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＰＣＲ産物を精製し、２６０ｎｍのＵＶ吸光度で定量化し、これら産物のアリコートを１％アガロースゲル電気泳動により可視化して純度を確認する。得られたＶκファミリー特異的ｃＤＮＡ断片のアリコートは、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．＃４５−０６４１）を用いてクローニングし、個々のクローンを配列決定により解析する。
【０２４０】
１０．２．３  Ｖλ  ｃＤＮＡ増幅
上述のＲＴ反応から作製されたｃＤＮＡの３分の１は、Ｖλリーダー配列（ＬＳ）特異的フォワードプライマーの混合物（合計濃度２００ｎＭ）およびＣλ特異的リバースプライマー（２００ｎＭ）（表２１）を含む反応液においてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）による限定増幅に付す。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、１０サイクルの９４℃（２０秒間）、５５℃（２０秒間）および６８℃（４０秒間）、続いて３分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。別のスモールスケール実験により、このようなＰＣＲによる最大１０倍のｃＤＮＡ増幅を確認する。
【０２４１】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってＰＣＲ産物を精製する。精製したＰＣＲ産物の半量を１６個の等量アリコートに分注し、各アリコートを個々のＶλファミリー特異的ｃＤＮＡ増幅のためのテンプレートとして用いる。個々のＶλ  ＬＳ特異的フォワードプライマー（２００ｎＭ）およびＣλ特異的リバースプライマー（２００ｎＭ）（表２１）を含む反応液においてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いたＰＣＲにより増幅を行う。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、３０サイクルの９４℃（２０秒間）、５５℃（２０秒間）および６８℃（４０秒間）、続いて３分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。
【０２４２】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）で、メーカーのプロトコールに従ってＰＣＲ産物を精製する。続く増幅の前に、次の断片をプールする。ＶＬ−１  ＬＳ−１およびＶＬ１  ＬＳ−３断片はＶＬ１  ＬＳ混成断片に３：２の比率でプールし、ＶＬ−２  ＬＳ−３およびＶＬ２  ＬＳ−４断片は３：２の比率でＶＬ２  ＬＳ混成断片にプールし、ＶＬ３  ＬＳ−２、ＶＬ３  ＬＳ−３、ＶＬ３  ＬＳ−４およびＶＬ３  ＬＳ−５断片は１：６：１：１の比率でＶＬ３  ＬＳ混成断片にプールする。次に、対応するＶλ特異的ネステッドフォワードプライマー（２００ｎＭ）およびＣλ特異的リバースプライマー（２００ｎＭ）（表２２）を含むＰＣＲ反応液においてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）により、個々のファミリーに対応するＰＣＲ産物を増幅する。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、２５サイクルの９４℃（２０秒間）、５５℃（２０秒間）および６８℃（４０秒間）、続いて３分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。
【０２４３】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動に付し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）により精製する。Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）ならびに２００ｎＭユニバーサルプライマー（Ｌｉｂ−ＧＳｖ２−ＦｗｄおよびＣＪＬＲｅｖｅｒｓｅ）を含むＰＣＲ反応液において、これらＰＣＲ産物のアリコートをラージスケールでさらに増幅する。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、２５サイクルの９４℃（３０秒間）、５５℃（３０秒間）および６８℃（３０秒間）、続いて５分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。
【０２４４】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＰＣＲ産物を精製し、２６０ｎｍのＵＶ吸光度で定量化し、これら産物のアリコートを１％アガロースゲル電気泳動により可視化して純度を確認する。ＶＬファミリー特異的プライマーの特異性は以前に確認されている。
【０２４５】
１０．２．４  ＶＨ−Ｖκ  ｓｃＦｖ構築
各ファミリーの生殖系列の数（ＮＣＢＩに基づく）に応じて、ＶＨおよびＶκ  ｃＤＮＡ断片を混合する（表１７および１８）。
【０２４６】
合計１０μｇのＶＨ  ｃＤＮＡ断片（２×１０１３分子）および合計１０μｇのＶκ  ｃＤＮＡ断片（２×１０１３分子）を重複ＰＣＲ用テンプレートとして用いる。Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  ＦｉｄｅｌｉｔｙならびにプライマーＴ７ＴＭＶＵＴＲ（２００ｎＭ）およびＣκ５−ＦｌａｇＡ２０Ｒｅｖ（２００ｎＭ）を用いて３０ｍｌ容量で、次のステップによりＰＣＲを行う。最初に２分間９４℃の変性ステップ、１２サイクルの９４℃（２０秒間）、５５℃（２０秒間）および６８℃（６０秒間）、続いて３分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．＃４５−０６４１）を用いてＰＣＲ産物のアリコートをクローニングし、個々のクローンを配列決定により解析する。
【０２４７】
【化１】
2012504416.tif 000031
【０２４８】
プライマーＣｋ５−ＦｌａｇＡ２０Ｒｅｖは、ＰＣＲ産物の３’末端にポリＡテールを付加する。従って、この配列はＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子のオリゴｄＴ精製のために用いられる。
【０２４９】
１０．２．５  ＶＨ−Ｖλ  ｓｃＦｖ構築
各ＰＣＲ産物により示された生殖系列の多様性に応じて、ＶＨおよびＶλ  ｃＤＮＡ断片を混合する（表１８および２８）。合計１０μｇのＶＨ  ｃＤＮＡ断片（２×１０１３分子）および１０μｇのＶλ  ｃＤＮＡ断片（２×１０１３分子）を重複ＰＣＲ用テンプレートとして用いる。Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  ＦｉｄｅｌｉｔｙならびにプライマーＴ７ＴＭＶＵＴＲ（２００ｎＭ）およびＣＬ５ＦｌａｇＡ２０（２００ｎＭ）を用いて３０ｍｌ容量でＰＣＲを行う。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、１０サイクルの９４℃（２０秒間）、５５℃（２０秒間）および６８℃（６０秒間）、続いて５分間６８℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．＃４５−０６４１）を用いてＰＣＲ産物のアリコートをクローニングし、個々のクローンを配列決定により解析する。
【０２５０】
【表２７】
2012504416.tif 000032
【０２５１】
【化２】
2012504416.tif 000033
【０２５２】
プライマーＣＬ５−ＦｌａｇＡ２０は、ＰＣＲ産物の３’末端にポリＡテールを付加する。従って、この配列はＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子のオリゴｄＴ精製のために用いられる。
【０２５３】
１０．３  スペクトラタイプ解析
それぞれＶＨのフレームワーク３領域およびＪ領域とアニーリングする蛍光色素標識５’フォワードプライマー（６−ＦＡＭ−ＰａｎＶＨＦＲ３−Ｆｗｄ、５’−ＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴ−３’、配列番号１７）およびリバースプライマー（ＰａｎＪＨ−Ｒｅｖ、５’−ＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣ−３’、配列番号１８）を用いて、ＰＣＲによりＶＨ領域のＣＤＲ３領域にわたって増幅する。５０ｎｇのｓｃＦｖライブラリーＤＮＡテンプレートは、２００ｎＭ  ６−ＦＡＭ−ＰａｎＶＨＦＲ３−Ｆｗｄプライマー、２００ｎＭ  ＰａｎＪＨ−Ｒｅｖプライマー、２００μＭ  ｄＮＴＰ、１×ＧｏＴａｑバッファーおよび１．５ＵのＧｏＴａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州）を含む３０μｌ反応容量に用いる。ＰＣＲ条件は次の通りである。最初に２分間９４℃の変性ステップ、３０サイクルの９４℃（２０秒間）、５５℃（２０秒間）および７２℃（３０秒間）、続いて５分間７２℃の伸長ステップならびに４℃の保存ステップ。ＰＣＲ後、１０μｌの産物を２％アガロースゲルにアプライして反応が成功したことを確認し、ＡＢＩシーケンサーを用いて残りの産物をスペクトラタイプ電気泳動に付す。ＲＯＸ色素標識ＤＮＡマーカーによって決定した産物長から６０ｂｐフランキングフレームワーク配列を引くことにより、ＣＤＲ３長を計算する。
【０２５４】
結果
【０２５５】
ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ  ＳｃＦｖライブラリー構築の概略
ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリー構築における異なるステップを表すフローチャートを図２４に示す。
【０２５６】
ＶＨ  ｃＤＮＡ断片の増幅
ＶＨユニバーサルプライマー（Ｔ７ＴＭＶＵＴＲおよびＬｉｂ−ＧＳｖ２−Ｒｅｖ）で増幅したＶＨファミリー特異的ｃＤＮＡ断片（ほぼ５００ｂｐ）のアリコートをアガロースゲル電気泳動により可視化する（図２５）。ＶＨファミリー特異的プライマーの特異性は、以前に試験したが、多数の生殖系列を有するファミリーを増幅するプライマーであることを再度確認する（表２９）。
【０２５７】
Ｖκ断片の増幅
ユニバーサルプライマー（Ｌｉｂ−ＧＳｖ２−ＦｗｄおよびＣＫ  Ｒｅｖｅｒｓｅ）で増幅したＶκファミリー特異的ｃＤＮＡ断片のアリコートをアガロースゲル電気泳動により可視化する（図２６）。Ｖκファミリー特異的プライマーの特異性は前に試験したが、多数の生殖系列を有するファミリーを増幅するプライマーであることを再度確認する（表３０）。
【０２５８】
【表２８】
2012504416.tif 000034
【０２５９】
【表２９】
2012504416.tif 000035
【０２６０】
Ｖλ断片の増幅
ユニバーサルプライマー（Ｌｉｂ−ＧＳｖ２−Ｆｗｄ、配列番号１４０およびＣＪＬ  Ｒｅｖｅｒｓｅ、配列番号１５）で増幅したＶλファミリー特異的ｃＤＮＡ断片のアリコートをアガロースゲル電気泳動により可視化する（図２７）。Ｖλファミリー特異的プライマーの特異性は前に試験した。
【０２６１】
ＶＨ−ＶκおよびＶＨ−Ｖλ  ｓｃＦｖの構築
重複ＰＣＲを行って、ＶＨ−ＶκおよびＶＨ−Ｖλ  ｓｃＦｖ  ｃＤＮＡ断片を構築する。得られた産物の一部をアガロースゲル電気泳動により可視化する（図２７）。作製したＶＨ−ＶκおよびＶＨ−Ｖλ  ｓｃＦｖ断片は、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ  ｍＲＮＡディスプレイ技術による選別に必要なあらゆる要素を有する（図２８）。
【０２６２】
個々のＶＨ−ＶκおよびＶＨ−Ｖλ  ｓｃＦｖクローンの配列解析により、大部分のクローンにおけるＶＨ−ＶκおよびＶＨ−Ｖλと機能的介在Ｇ４Ｓリンカーとの正確な組換えを確認する。構築されたｓｃＦｖライブラリーにおけるさまざまなＶＨ、ＶκおよびＶλファミリーの分布は、以前の文献報告と一致する（図２９、図３０、さらにＴｓｕｉｊｉら（２００６）．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．；Ｖ．２０３（２）、３９３−４００頁およびＡｒｏｎｓら（２００６）Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｖ．１３３、５０４−５１２頁も参照）。
【０２６３】
スペクトラタイプ解析
ＶＨ  ＣＤＲ３サイズ分布のスペクトラタイプ解析は、リバースプライマーの混合物を用いた逆転写によりリンパ節ＲＮＡから得られたｃＤＮＡ（１０．１を参照）、ｓｃＦｖライブラリーに組み立てられる直前のＶＨ  ＤＮＡ断片の混合物、ならびに最終ＶＨ−ＶκおよびＶＨ−Ｖλ  ｓｃＦｖ断片において行う（図３１）。高度な多様性を有するｃＤＮＡライブラリーで予想されるように、観察されたＣＤＲ３サイズは正規分布し、その多くは６−２２残基の間に収まり、中央は１１−１４残基である。
【０２６４】
結論
高品質ヒト抗体リードの選別は、治療用抗体医薬開発の成功のための必要条件である。確固とした選別技術に加えて、抗体ライブラリーの品質（ソース、多様性および構築）は、良質のリード生産におけるその有用性を大きく左右する。本発明において、ドナーコレクションにおける全多様性が得られるよう、ライブラリーの多様性を高めるため複数ドナー由来のｍＲＮＡが用いられ、あらゆる抗体生殖系列配列をカバーするため高度に特異的なＰＣＲプライマーが設計される。ＶＨ−ＶκおよびＶＨ−Ｖλ  ＳｃＦｖライブラリーを別々に構築し、同一のＲＮＡソースから複数の抗体リードを選別する機会を増やす。両ライブラリーの高度な多様性は、複数クローンのスペクトラタイプ解析および配列決定により確認される。両ライブラリーは、異なる標的に対するＰＲＯｆｕｓｉｏｎ  ｍＲＮＡディスプレイ選別のために用いる。
【０２６５】
（実施例１１）
ＰＲＯｆｕｓｉｏｎコンストラクトのための配列決定用プライマー
本実施例は、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎコンストラクトに用いられる配列決定用プライマーを提供する。
【０２６６】
【化３】
2012504416.tif 000036
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【０２６７】
参照による援用
本願を通じて引用されている可能性のあるあらゆる引用文献（参考文献、特許、特許出願およびウエブサイト）の内容は、そこに引用されている参考文献のように、これによりその内容全体が参照によって本明細書に特に組み込まれている。本発明の実施において、他に断りがない限り、本技術分野においてよく知られている従来の免疫学と分子生物学および細胞生物学の技法が用いられる。
【０２６８】
均等
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態に具体化することができる。従って上述の実施形態は、本明細書の記載に本発明を限定するものではなくむしろ説明のためのものであることをあらゆる点で考慮するべきである。従って本発明の範囲は、上述の説明によってではなくむしろ添付の特許請求の範囲によって示され、従って特許請求の範囲における均等の意義および範囲内のあらゆる変更を本明細書に包含することを目的とする。
【図１】
2012504416.tif 000050
【図２】
2012504416.tif 000051
【図３】
2012504416.tif 000052
【図４】
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【図５】
2012504416.tif 000054
【図６】
2012504416.tif 000055
【図７】
2012504416.tif 000056
【図８】
2012504416.tif 000057
【図９】
2012504416.tif 000058
【図１０】
2012504416.tif 000059
【図１１】
2012504416.tif 000060
【図１２】
2012504416.tif 000061
【図１３】
2012504416.tif 000062
【図１４】
2012504416.tif 000063
【図１５】
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【図１６】
2012504416.tif 000065
【図１７】
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【図１８】
2012504416.tif 000067
【図１９】
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【図２０】
2012504416.tif 000069
【図２１】
2012504416.tif 000070
【図２２】
2012504416.tif 000071
【図２３】
2012504416.tif 000072
【図２４】
2012504416.tif 000073
【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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