(57)【要約】  本発明は、冷菓組成物および乳製品に類似する冷菓組成物、並びに冷菓組成物の製造方法を提供する。特に、冷菓は、各カルボニル末端に主としてアルギニン残基またはリシン残基のいずれかを有するポリペプチド断片から概ね構成されるタンパク質加水分解組成物を含む。
2012502666.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）各カルボキシル末端に主としてアルギニン残基またはリシン残基のいずれかを有するポリペプチド断片の混合物を含むタンパク質加水分解組成物であって、少なくとも約０．２％の加水分解度と、約６．０よりも高いｐＨで少なくとも約８０％の可溶性固形分指数を有する組成物、および
（ｂ）可食材料、
を含む、冷菓。
【請求項２】
前記タンパク質加水分解組成物が、大豆、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ジャガイモ、米、小麦、動物、卵、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質に由来する、請求項１に記載の冷菓。
【請求項３】
前記タンパク質加水分解組成物が、大豆と、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ジャガイモ、米、小麦、動物、乳製品、および卵からなる群から選択される少なくとも１種類のタンパク質との組み合わせに由来する、請求項１に記載の冷菓。
【請求項４】
前記タンパク質加水分解組成物が大豆に由来し、加水分解度が約０．２％〜約１４％である、請求項１に記載の冷菓。
【請求項５】
前記可食材料が、脱脂乳、全乳、クリーム、粉乳、脱脂粉乳、カゼイン酸塩、大豆タンパク質濃縮物、大豆タンパク質単離物、乳清タンパク質濃縮物、乳清タンパク質単離物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の冷菓。
【請求項６】
前記食品が、甘味剤、乳化剤、増粘剤、安定剤、脂質材料、保存料、香味剤、着色剤、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される成分を更に含む、請求項１に記載の冷菓。
【請求項７】
冷菓組成物の製造方法であって、
（ａ）各カルボキシル末端に主としてアルギニン残基またはリシン残基のいずれかを有するポリペプチド断片の混合物を含むタンパク質加水分解組成物であって、少なくとも約０．２％の加水分解度と、約６より高いｐＨで少なくとも約８０％の可溶性固形分指数を有する組成物を、少なくとも１種類の可食材料と混合し、菓子を製造する工程、および
（ｂ）前記菓子組成物を凍結し、冷菓を製造する工程、
を含む、方法。
【請求項８】
前記菓子を（ａ）の後、約１５５°Ｆ〜約２７０°Ｆの温度、約０．１気圧〜約１０気圧の圧力で、約３秒〜約４５分の時間、低温殺菌する工程を更に含む、請求項７に記載の冷菓組成物の製造方法。
【請求項９】
前記温度が約１７５°Ｆ〜約１９５°Ｆであり、圧力約１気圧〜約１．５気圧、時間約４秒〜約２５秒である、請求項８に記載の冷菓組成物の製造方法。
【請求項１０】
前記菓子を（ａ）の後、１平方インチ当たり約１０００ポンド〜１平方インチ当たり約４０００ポンドで均質化する工程を更に含む、請求項７に記載の冷菓組成物の製造方法。
【請求項１１】
前記均質化が一段均質化である、請求項１０に記載の冷菓組成物の製造方法。
【請求項１２】
前記均質化が多段均質化である、請求項１０に記載の冷菓組成物の製造方法。
【請求項１３】
前記多段均質化が二段均質化であり、第１段階が１平方インチ当たり約２０００ポンド〜１平方インチ当たり約３０００ポンドであり、第２段階が１平方インチ当たり約２５０ポンド〜１平方インチ当たり約７５０ポンドである、請求項１２に記載の冷菓組成物の製造方法。
【請求項１４】
前記菓子を（ａ）の後、低温殺菌する工程と均質化する工程を更に含み、低温殺菌工程が約１５５°Ｆ〜約２７０°Ｆの温度、約０．１気圧〜約１０気圧の圧力で約４秒〜約４５分の時間であり、均質化工程が１平方インチ当たり約１０００ポンド〜１平方インチ当たり約４０００ポンドである、請求項７に記載の冷菓組成物の製造方法。
【請求項１５】
前記均質化工程が一段または多段である、請求項１４に記載の冷菓組成物の製造方法。
【請求項１６】
前記多段均質化が二段均質化であり、第１段階が１平方インチ当たり約２０００ポンド〜１平方インチ当たり約３０００ポンドであり、第２段階が１平方インチ当たり約２５０ポンド〜１平方インチ当たり約７５０ポンドである、請求項１５に記載の冷菓組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般に、可食材料とタンパク質加水分解組成物を含む冷菓（乳タンパク質を含んでいてもよい）、および冷菓の製造方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
アイスクリーム、ウォーターアイス、およびシャーベットなどの冷菓は、長年にわたってあらゆる年齢の人に楽しまれてきた。乳製品ベースの冷菓は、典型的には、全乳、乳脂肪、および／またはヘビークリーム、および糖で製造されるが、非乳製品ベースの冷菓は、栄養学的に健全であることを犠牲にして（例えば、繊維やタンパク質を全く含まず）、高レベルの糖とカロリーを含むことがある。多くの人は、冷菓を楽しむことができるが、これらの楽しみは様々な理由で回避される傾向がある。第１に、冷菓は、それらが典型的に含む高レベルの脂肪とカロリーのため、栄養価の高い製品ではない。第２に、人口の大部分は、乳製品中に見出される糖である乳糖を代謝できないため、乳製品をベースにする冷菓を摂取できない。第３に、乳製品の摂取に関わる宗教上のまたは個人的な信条のため乳製品をベースにする冷菓を食べないことを選択する人もいる。これらの全ての要因に鑑みて、栄養価も高い低乳製品または非乳製品の冷菓が必要とされている。
【０００３】
乳製品ベースの冷菓は、ミルキーな風味とクリーミーなテクスチャーのため、好まれている。様々な製品に乳製品の代わりに日常的に使用される製品の１つは、大豆タンパク質である。現在、大豆を含有する冷菓が市販されていることは周知である。これらの製品は、乳製品含有量が低減されているかまたはなくされており、栄養学的に健全な可能性がある。冷菓中の成分として市場で使用されている現在の大豆タンパク質により、冷菓は、不快であるまたは口に合わないと感じられる「草のような」または「豆のような」香味を有する傾向がある。これらの「健康的な」冷菓の選択肢が出現したにもかかわらず、消費者は、健康的であるためにまたは乳製品を避けるために、好物の味やテクスチャーを犠牲にすることに意欲的ではないことが明らかであるように思われる。従って、大豆タンパク質製品を含有することによって健康または信条の制限に対処しようと努力するが、人々が知り好むようになった味とテクスチャーを依然として保つ非乳製品または低乳製品の冷菓が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の一態様は、各カルボキシル末端に主としてアルギニン残基またはリシン残基のいずれかを有するポリペプチド断片の混合物を有するタンパク質加水分解物を含む冷菓組成物を提供する。これらの製品は、乳タンパク質を含んでいてもよい。更に、タンパク質加水分解組成物は、少なくとも約０．２％の加水分解度と、約６．０より高いｐＨで少なくとも約８０％の可溶性固形分指数（ＳＳＩ）を有する。
【０００５】
本発明の他の態様および特徴を以下により詳細に説明する。
【０００６】
本願は、カラーで撮影された少なくとも１枚の写真を含む。カラー写真を有する本特許出願公報のコピーは、請求と必要料金の支払いがあり次第、官庁により提供されることになっている。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）トリプシン様エンドペプチダーゼ（ＴＬ１）による単離大豆タンパク質の加水分解を示す図である。クーマシー染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの画像を示している。レーン３（Ｌ３）は、非加水分解単離大豆タンパク質（ＳＵＰＲＯ（登録商標）５００Ｅ）を含有する。レーン４（Ｌ４）、レーン５（Ｌ５）、レーン６（Ｌ６）、レーン７（Ｌ７）、およびレーン８（Ｌ８）は、それぞれ０．３％、２．２％、３．１％、４．０％および５．０％の加水分解度（ＤＨ）を有するＴＬ１加水分解物を含有する。レーン９（Ｌ９）は、ゲルの右側に示すサイズ（単位：キロダルトン（ＫＤ））を有するタンパク質ＭＷ標準物質を含有する。
【図２】訓練された官能試験員によって評価された固形分５．０％でのＴＬ１加水分解物とＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）加水分解物の診断スコアを示す図である。各加水分解物の識別と加水分解度（％ＤＨ）を各プロットの下に示す。正のスコアは、加水分解物が対照サンプルより高い官能特性を有したことを示し、負のスコアは、加水分解物が対照サンプルより低い官能特性を有することを示す。対照サンプルは、非加水分解単離大豆タンパク質であった。（Ａ）は、約２．５％ＤＨ未満の加水分解度を有するＴＬ１加水分解物とＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）（ＡＬＣ）加水分解物のスコアを示す。（Ｂ）は、３％ＤＨより大きい加水分解度を有するＴＬ１加水分解物とＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）（ＡＬＣ）加水分解物のスコアを示す。
【図３】ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）加水分解物とＴＬ１加水分解物の溶解性を比較する図である。それぞれの酵素と加水分解度（％ＤＨ）を各管の下に示す。（Ａ）は、ｐＨ７．０、４℃で２週間貯蔵したＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）（ＡＬＣ）加水分解物とＴＬ１加水分解物（固形分２．５％）の管を示す。（Ｂ）は、ｐＨ８．２、４℃で３週間貯蔵したＴＬ１加水分解物とＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）（ＡＬＣ）加水分解物（固形分２．５％）を示す。
【図４】ＴＬ１加水分解物とＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）加水分解物の溶解性のプロットを示す図である。各加水分解物（固形分２．５％）の可溶性固形分のパーセント（即ち、可溶性固形分指数）をｐＨの関数としてプロットしている。各加水分解物の識別と加水分解度（％ＤＨ）を各プロットの下に示す。（Ａ）は、ＴＬ１加水分解物の溶解性曲線を示す。（Ｂ）は、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）（ＡＬＣ）加水分解物の溶解性曲線を示す。（Ｃ）は、選択されたＴＬ１加水分解物とＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）（ＡＬＣ）加水分解物の溶解性の直接比較を示す。
【図５】パイロットプラントスケールでのＴＬ１による大豆タンパク質材料の加水分解を示す図である。ＴＬＡ加水分解物および対照サンプルを分離したクーマシー染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの画像を示す。レーン１（Ｌ１）およびレーン３（Ｌ３）は、非加水分解大豆タンパク質を含有する；レーン２（Ｌ２）は、２．７％ＤＨ  ＴＬ１加水分解物を含有する；レーン４（Ｌ４）は、加水分解対照サンプル（酵素の混合物で２．８％まで加水分解されたＳＵＰＲＯ（登録商標）ＸＴ２１９）を含有する；レーン５〜１１（Ｌ５〜Ｌ１１）は、それぞれ１．３％ＤＨ、２．０％ＤＨ、３．８％ＤＨ、０．３％ＤＨ、０．９％ＤＨ、１．６％ＤＨ、および５．２％ＤＨを有するＴＬ１加水分解物を含有する。レーン１２（Ｌ１２）は、ゲルの右側に示すサイズ（単位：キロダルトン（ＫＤ））を有する分子量標準物質を含有する。
【図６】パイロットプラントＴＬ１加水分解物と対照サンプルの溶解性プロットを示す図である。各加水分解物の加水分解度（％ＤＨ）をプロットの下に示す。
【図７】パイロットプラントＴＬ１加水分解物と対照サンプルの粘度のプロットを示す図である。各加水分解物の加水分解度（％ＤＨ）をプロットの下に示す。
【図８】パイロットプラントＴＬ１加水分解物の粘度と溶解性［即ち、可溶性固形分指数（ＳＳＩ）および窒素可溶性指数（ＮＳＩ）］を加水分解度の関数としてプロットした図である。
【図９】対照サンプルと比較してＴＬ１加水分解物中には香味揮発性物質のレベルが低いことを示す図である。（Ａ）は、対照サンプル中と、異なる加水分解度（％ＤＨ）を有するＴＬ１加水分解物中の全活性揮発性物質とヘキサナール（ｈｅｘａｎａｌ）のレベルを示す。（Ｂ）は、対照サンプル中と、異なる加水分解度（％ＤＨ）を有するＴＬ１加水分解物中の表示された香味揮発性物質のレベルを示す。
【図１０】パイロットプラントＴＬ１加水分解物と対照サンプルの診断スコアのプロットを示す図である。対照サンプルは、非加水分解単離大豆タンパク質であった。正のスコアは、加水分解物が対照サンプルより高い官能特性を有したことを示し、負のスコアは、加水分解物が対照サンプルより低い官能特性を有することを示す。（Ａ）は、対照サンプル、０．３％ＤＨサンプル、および１．６％ＤＨサンプルのスコアを示す。（Ｂ）は、対照サンプル、１．３％ＤＨサンプル、および５．２％ＤＨサンプルのスコアを示す。（Ｃ）は、対照サンプル、２．７％ＤＨサンプル、および０．９％ＤＨサンプルのスコアを示す。（Ｄ）は、対照サンプル、２．０％ＤＨサンプル、および３．８％ＤＨサンプルのスコアを示す。
【図１１】ＴＬ１加水分解物の官能スコアを加水分解度（ＤＨ）の関数として要約してプロットした図である。上に全体的な好みのスコアを示し、下に苦味のスコアを示す。菱形は、予測スコアを示し、正方形は実際のスコアを示す。
【図１２】幾つかの異なるトリプシン様プロテアーゼによる単離大豆タンパク質の加水分解を示す図である。非加水分解大豆タンパク質サンプルおよび酵素処理大豆タンパク質サンプルを分離したクーマシー染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの画像を示す。レーン１は、ゲルの左側に示すサイズを有する分子量マーカーを含有する。レーン３およびレーン９は、未処理の単離大豆タンパク質を含有する。レーン２およびレーン４〜８は、それぞれ、ＴＬ１、ＳＰ３、ＴＬ５、ＴＬ６、ブタトリプシンおよびウシトリプシンで処理した大豆を含有する。
【図１３】大豆タンパク質と乳製品タンパク質の組み合わせのＴＬ１加水分解物の溶解性をｐＨの関数として示す図である。
【図１４】ＴＬ１による他の植物性タンパク質材料の加水分解を示す図である。未処理および処理済のタンパク質サンプルを分離したクーマシー染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの画像を示す。レーン１（Ｌ１）は、分子量マーカー（ゲルの左側にＫＤで示す）を含有する。レーン２（Ｌ２）、レーン４（Ｌ４）、およびレーン６（Ｌ６）は、それぞれ、非加水分解コーン胚芽、非加水分解キャノーラおよび非加水分解小麦胚芽のサンプルを含有する。レーン３（Ｌ３）、レーン５（Ｌ５）、およびレーン７（Ｌ７）は、それぞれ、コーン胚芽、キャノーラおよび小麦胚芽のＴＬ１加水分解物を含有する。
【図１５】Ｓｕｐｒｏ（登録商標）ＸＦ８０２０で乳製品を１０％置換したもの、乳製品を２０％置換したもの、乳製品を３０％置換したもの、乳製品を４０％置換したもの、および乳製品を５０％置換したものを含むバニラアイスクリームの香味特性を、全部乳製品の（ａｌｌ−ｄａｉｒｙ）対照アイスクリームと比較して示す棒グラフである。
【図１６】Ｓｕｐｒｏ（登録商標）１２０で乳製品を１０％置換したもの、乳製品を２０％置換したもの、乳製品を３０％置換したもの、乳製品を４０％置換したもの、および乳製品を５０％置換したものを含むバニラアイスクリームの香味特性を、全部乳製品の対照アイスクリームと比較して示す棒グラフである。
【図１７】Ｓｕｐｒｏ（登録商標）７６０で乳製品を１０％置換したもの、乳製品を２０％置換したもの、乳製品を３０％置換したもの、乳製品を４０％置換したもの、および乳製品を５０％置換したものを含むバニラアイスクリームの香味特性を、全部乳製品の対照アイスクリームと比較して示す棒グラフである。
【図１８】Ｓｕｐｒｏ（登録商標）ＸＦ８０２０で乳製品を１０％置換したもの、乳製品を２０％置換したもの、および乳製品を４０％置換したものを含むバニラアイスクリームの受容性を、全部乳製品の対照アイスクリームと比較して示す棒グラフである。
【図１９】Ｓｕｐｒｏ（登録商標）１２０で乳製品を１０％置換したもの、乳製品を２０％置換したもの、および乳製品を４０％置換したものを含むバニラアイスクリームの受容性を、全部乳製品の対照アイスクリームと比較して示す棒グラフである。
【図２０】Ｓｕｐｒｏ（登録商標）７６０で乳製品を１０％置換したもの、乳製品を２０％置換したもの、および乳製品を４０％置換したものを含むバニラフレーバーの冷菓の受容性を、全部乳製品の対照アイスクリームと比較して示す棒グラフである。
【図２１】Ｓｕｐｒｏ（登録商標）１２０、Ｓｕｐｒｏ（登録商標）ＸＦ８０２０で乳製品を１００％置換したものを、市販の全植物性の冷菓であるＳｏｙ  Ｄｅｌｉｃｉｏｕｓと比較して示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、タンパク質加水分解組成物を含む冷菓および冷菓の製造方法を提供する。冷菓に使用されるタンパク質加水分解組成物は、各カルボキシル末端に主としてアルギニン残基またはリシン残基のいずれかを有するポリペプチド断片の混合物を含む。本発明の冷菓製品は、タンパク質加水分解組成物の他に乳タンパク質を含んでいてもよい。有利には、実施例に示すように、本明細書に記載のタンパク質加水分解組成物を含有する本発明の冷菓組成物は、異なる大豆タンパク質を含有する冷菓製品と比較して、改善された香味、テクスチャー、口当たり、および芳香を有する。
【０００９】
（Ｉ）冷菓組成物
本発明の一態様は、乳タンパク質と大豆タンパク質加水分解組成物の、大豆加水分解物１００％以下（大豆加水分解物１００％を含む）の様々な比率での混合物を含む冷菓組成物を提供する。本発明の別の態様は、タンパク質加水分解組成物だけを含み乳タンパク質を含まない冷菓組成物を提供する。タンパク質加水分解物の組成および特性を下記の（Ｉ）Ａの項で詳述する。１００％乳製品を含有する冷菓を標準として使用した場合、タンパク質加水分解組成物を様々な比率で含む本発明の冷菓組成物は、概して、他の大豆タンパク質を含む冷菓と比較して改善された香味特性とテクスチャー特性を有する。
【００１０】
本発明のタンパク質加水分解物は、製品を凍結するとき、１００％乳タンパク質を含有する冷菓製品と比較して異なる氷結晶を形成する。更に、タンパク質加水分解組成物を含有する冷菓はまた、凍結前、製品に添加するタンパク質加水分解物が多いほど、高い粘度を示す。混合粘度が高いほど、空気の混入効率が高くなる可能性があり、凍結時間が短縮される。
【００１１】
Ａ．タンパク質加水分解組成物
タンパク質加水分解組成物は、タンパク質出発材料と比較して、様々な長さと分子量を有するポリペプチド断片の混合物を含む。ペプチド断片はそれぞれ、典型的には、そのカルボキシル末端にアルギニン残基またはリシン残基のいずれかを有する（実施例３、４、１３および１８に示すように）。ポリペプチド断片のサイズは、約７５ダルトン〜約５０，０００ダルトン、または、より好ましくは約１５０ダルトン〜約２０，０００ダルトンの範囲であってもよい。幾つかの実施形態では、ポリペプチド断片の平均分子サイズは、約２０，０００未満であってもよい。他の実施形態では、ポリペプチド断片の平均分子サイズは、約１５，０００未満であってもよい。更に他の実施形態では、ポリペプチド断片の平均分子サイズは、約１０，０００未満であってもよい。追加の実施形態では、ポリペプチド断片の平均分子サイズは、約５０００未満であってもよい。
【００１２】
本発明のタンパク質加水分解組成物の加水分解度は、タンパク質材料源、使用するエンドペプチダーゼ、および加水分解反応の完了度に応じて変わる可能性があり、変わるものである。加水分解度（ＤＨ）は、出発ペプチド結合数に対する切断されたペプチド結合のパーセンテージを指す。例えば、ペプチド結合を５００個含む出発タンパク質をペプチド結合が５０個切断されるまで加水分解すると、得られる加水分解物のＤＨは１０％である。加水分解度は、実施例で詳述するように、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）比色法またはｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）法を使用して求めてもよい。加水分解度が高いほど、タンパク質加水分解の程度が大きい。典型的には、タンパク質が更に加水分解されるにつれ（即ち、ＤＨが高いほど）、ペプチド断片の分子量が低下し、それに応じてペプチドのプロファイルが変化し、混合物の粘度が低下する。ＤＨは、全加水分解物（即ち、全画分）で測定してもよく、または、ＤＨは加水分解物の可溶性画分（即ち、加水分解物を約５００〜１０００×ｇで約５〜１０分間遠心分離した後の上清画分）で測定してもよい。
【００１３】
タンパク質加水分解物の加水分解度は、概して、少なくとも約０．２％となる。一実施形態では、タンパク質加水分解物の加水分解度は、約０．２％〜約２％の範囲であってもよい。別の実施形態では、タンパク質加水分解物の加水分解度は、約２％〜約８％の範囲であってもよい。更に別の実施形態では、タンパク質加水分解物の加水分解度は、約８％〜約１４％の範囲であってもよい。代替の実施形態では、タンパク質加水分解物の加水分解度は、約１４％〜約２０％の範囲であってもよい。追加の実施形態では、タンパク質加水分解物の加水分解度は、約２０％より大きくてもよい。
【００１４】
タンパク質加水分解組成物の溶解性は、出発タンパク質材料源、使用するエンドペプチダーゼ、および組成物のｐＨによって変わる可能性があり、変わるものである。可溶性固形分指数（ＳＳＩ）は、タンパク質加水分解組成物を含む固形分（即ち、ポリペプチド断片）の溶解性の尺度である。可溶性固形分の量は、遠心分離（例えば、約５００〜１０００×ｇで約５〜１０分間）の前後に溶液中の固形分の量を測定することによって推定してもよい。あるいは、可溶性固形分の量は、当該技術分野で周知の方法（例えば、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質比色定量法など）を使用して遠心分離の前後の組成物中のタンパク質の量を推定することにより求めてもよい。
【００１５】
本発明のタンパク質加水分解組成物は、概して、その加水分解度にかかわらず、ｐＨ約６．０より高いｐＨで少なくとも約８０％の可溶性固形分指数を有する。一実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、ｐＨ約６．０より高いｐＨで約８０％〜約８５％の範囲の可溶性固形分指数を有してもよい。別の実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、ｐＨ約６．０より高いｐＨで約８５％〜約９０％の範囲の可溶性固形分指数を有してもよい。また別の実施形態では、約６．０より高いｐＨで約９０％〜約９５％の範囲の可溶性固形分指数を有してもよい。別の代替の実施形態では、約６．０より高いｐＨで約９５％〜約９９％の範囲の可溶性固形分指数を有してもよい。
【００１６】
更に、本発明のタンパク質加水分解組成物の溶解性は、ｐＨ約４．０〜ｐＨ約５．０で加水分解度の関数として変化してもよい。例えば、約３％より大きい加水分解度を有する大豆タンパク質加水分解組成物は、約３％未満の加水分解度を有するものより、ｐＨ約４．０〜ｐＨ約５．０で溶解性が高い傾向がある。
【００１７】
一般的に言えば、約１％〜約６％の加水分解度を有する大豆タンパク質加水分解組成物は、ｐＨ約７．０〜ｐＨ約８．０のｐＨで安定である。安定とは、経時で沈殿の生成がないことを指す。タンパク質加水分解組成物は、室温（即ち、約２３℃）または冷蔵温度（即ち、約４℃）で貯蔵されてもよい。一実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、約１週間〜約４週間安定であってもよい。別の実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、約１ヶ月間〜約６ヶ月間、安定であってもよい。また別の実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、約６ヶ月より長期間安定であってもよい。
【００１８】
タンパク質加水分解組成物は乾燥されてもよい。例えば、タンパク質加水分解組成物は噴霧乾燥されてもよい。スプレードライヤーの入口温度は約５００°Ｆ〜約６００°Ｆの範囲であってもよく、排気温度は約１８０°Ｆ〜約１００°Ｆの範囲であってもよい。あるいは、タンパク質加水分解組成物は真空乾燥、凍結乾燥、または当該技術分野で既知の他の方法を使用して乾燥されてもよい。
【００１９】
タンパク質加水分解物が大豆タンパク質に由来する実施形態では、加水分解度は、約０．２％〜約１４％、より好ましくは約１％〜約６％の範囲であってもよい。実施例で示すように、加水分解度は、生成するポリペプチド断片の数の他に、典型的には、得られる大豆タンパク質加水分解組成物の他の物理的特性および官能特性に影響を及ぼす。典型的には、加水分解度が約１％から約６％に高くなると、大豆タンパク質加水分解組成物は、透明性または半透明性が増加し、穀物臭および大豆/豆臭の官能特性が低下する。更に、大豆タンパク質加水分解組成物は、加水分解度が約２％未満のときは、加水分解度が約２％より大きいときと比較して、苦味官能特性がかなり低い。換言すれば、加水分解度が高いほど、穀物臭および大豆/豆臭の官能特性が低下し、加水分解度が低いほど、苦味官能特性が低下する。官能特性およびその測定方法は実施例に詳述する。
【００２０】
更に、タンパク質加水分解物が大豆に由来する実施形態では、大豆タンパク質加水分解組成物は、配列番号５〜１７７および２７０〜２７４からなる群から選択されるポリペプチドを含んでもよい。一実施形態では、大豆タンパク質加水分解物は、配列番号５〜１７７および２７０〜２７４からなる群に対応するまたはそれに由来するアミノ酸配列を有する少なくとも１種類のポリペプチドを含んでもよい。代替の実施形態では、大豆タンパク質加水分解物は、配列番号５〜１７７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約１０種類のポリペプチドまたはその断片を含んでもよい。別の実施形態では、大豆タンパク質加水分解物は、配列番号５〜１７７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約２０種類のポリペプチドまたはその断片を含んでもよい。また別の実施形態では、大豆タンパク質加水分解物は、配列番号５〜１７７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約４０種類のポリペプチドまたはその断片を含んでもよい。更に別の実施形態では、大豆タンパク質加水分解物は、配列番号５〜１７７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約８０種類のポリペプチドまたはその断片を含んでもよい。更に別の実施形態では、大豆タンパク質加水分解物は、配列番号５〜１７７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約１２０種類のポリペプチドまたはその断片を含んでもよい。また別の実施形態では、大豆タンパク質加水分解物は、配列番号５〜１７７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約１７８種類のポリペプチドまたはその断片を含んでもよい。
【００２１】
タンパク質加水分解物が大豆タンパク質と乳製品の組み合わせに由来する実施形態では、大豆／乳製品複合タンパク質加水分解組成物は、配列番号５〜１９７および２７０〜２７４からなる群から選択されるポリペプチドを含んでもよい。一実施形態では、大豆／乳製品複合加水分解物は、配列番号５〜１９７および２７０〜２７４からなる群に対応するまたはそれに由来するアミノ酸配列を有する少なくとも１種類のポリペプチドを含んでもよい。代替の実施形態では、大豆／乳製品複合加水分解物は、配列番号５〜１９７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約１０種類のポリペプチドまたはその断片を含んでもよい。別の実施形態では、大豆／乳製品複合加水分解物は、配列番号５〜１９７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約５０種類のポリペプチドまたはその断片を含んでもよい。別の代替の実施形態では、大豆／乳製品複合加水分解物は、配列番号５〜１９７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約１００種類のポリペプチドまたはその断片を含んでもよい。別の実施形態では、大豆／乳製品加水分解物は、配列番号５〜１９７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約１５０種類のポリペプチドまたはその断片を含んでもよい。更に別の代替の実施形態では、大豆／乳製品複合加水分解物は、配列番号５〜１９７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約１９８種類のポリペプチドまたはその断片を含んでもよい。
【００２２】
タンパク質加水分解物がキャノーラに由来する追加の実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、配列番号１９８〜２３７からなる群から選択されるポリペプチドを含んでもよい。一実施形態では、キャノーラ加水分解物は、配列番号１９８〜２３７からなる群に対応するまたはそれに由来するアミノ酸配列を有する少なくとも１種類のポリペプチドを含んでもよい。代替の実施形態では、キャノーラ加水分解物は、配列番号１９８〜２３７からなる群から選択される少なくとも約１０種類のポリペプチドまたはその断片を含んでもよい。別の実施形態では、キャノーラ加水分解物は、配列番号１９８〜２３７からなる群から選択される少なくとも約２０種類のポリペプチドまたはその断片を含んでもよい。更に別の代替の実施形態では、キャノーラ加水分解物は、配列番号１９８〜２３７からなる群に対応するまたはそれに由来するアミノ酸配列を有する少なくとも３９種類のポリペプチドを含んでもよい。
【００２３】
タンパク質加水分解物がトウモロコシに由来する他の追加の実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、配列番号２３８〜２６１からなる群から選択されるポリペプチドを含んでもよい。一実施形態では、トウモロコシ加水分解物は、配列番号２３８〜２６１からなる群に対応するまたはそれに由来するアミノ酸配列を有する少なくとも１種類のポリペプチドを含んでもよい。別の実施形態では、トウモロコシ加水分解物は、配列番号２３８〜２６１からなる群に対応するまたはそれに由来するアミノ酸配列を有する少なくとも１０種類のポリペプチドを含んでもよい。また別の実施形態では、トウモロコシ加水分解物は、配列番号２３８〜２６１からなる群に対応するまたはそれに由来するアミノ酸配列を有する少なくとも２４種類のポリペプチドを含んでもよい。
【００２４】
更に、タンパク質加水分解物が小麦に由来する実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、配列番号２６２〜２６９からなる群から選択されるポリペプチドを含んでもよい。一実施形態では、小麦加水分解物は、配列番号２６２〜２６９からなる群に対応するまたはそれに由来するアミノ酸配列を有する少なくとも１種類のポリペプチドを含んでもよい。別の実施形態では、小麦加水分解物は、配列番号２６２〜２６９からなる群に対応するまたはそれに由来するアミノ酸配列を有する少なくとも８種類のポリペプチドを含んでもよい。
【００２５】
本発明は、また、本発明の大豆タンパク質加水分解組成物、大豆／乳製品タンパク質加水分解組成物、キャノーラタンパク質加水分解組成物、トウモロコシタンパク質加水分解組成物、または小麦タンパク質加水分解組成物から精製され得るポリペプチドまたはその断片のいずれかを含んでもよい。典型的には、純粋なポリペプチド断片は、所与の精製サンプル中の全ポリペプチドの少なくとも約８０重量％、好ましくは９０重量％、更により好ましくは少なくとも約９５重量％を構成する。ポリペプチド断片は、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および逆相クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法で精製されてもよい。例えば、ポリペプチド断片は、配列番号５〜２７４からなる群から選択されてもよい。更に、本発明は、また、配列番号５〜２７４からなる群から選択されるものに配列がかなり類似しているポリペプチド断片も含む。一実施形態では、ポリペプチド断片は、配列番号５〜２７４からなる群から選択されるポリペプチド断片に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％の配列同一性を有してもよい。別の実施形態では、ポリペプチド断片は、配列番号５〜２７４からなる群から選択されるポリペプチド断片に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有してもよい。ポリペプチド断片が本発明の配列と特定のパーセンテージの配列同一性を有するかどうかを判定する方法は、上記に示している。
【００２６】
また、本発明のタンパク質加水分解組成物が更に非加水分解（即ち、インタクトな）タンパク質を更に含み得ることも考えられる。非加水分解タンパク質は、本質的にインタクトな調製物（例えば、大豆カード、コーンミール、牛乳など）中に存在する可能性がある。更に、非加水分解タンパク質は、植物由来のタンパク質源（例えば、アマランス、クズウコン、大麦、ソバ、キャノーラ、キャッサバ、ヒヨコマメ（ガルバンゾー）、豆類、レンズマメ、ルピナス、トウモロコシ、アワ・キビ類、オート麦、エンドウ豆、ジャガイモ、米、ライ麦、モロコシ、ヒマワリ、タピオカ、ライ小麦、および小麦などのタンパク質源）から単離されても、または、動物性タンパク質材料（適した単離動物性タンパク質の例としては、酸カゼイン、カゼイン酸塩、乳清、アルブミン、およびゼラチンなどが挙げられる）から単離されてもよい。好ましい実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、更に、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ジャガイモ、米、大豆、小麦、動物、乳製品、卵、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される非加水分解タンパク質を含む。タンパク質加水分解物と非加水分解タンパク質の相対的割合は、含まれるタンパク質および組成物の所望の用途によって変わる可能性があり、変わるものである。
【００２７】
Ｂ．タンパク質加水分解物の調製方法
各カルボキシル末端に主としてアルギニン残基またはリシン残基のいずれかを有するポリペプチド断片の混合物を含むタンパク質加水分解物の調製方法は、タンパク質材料を、タンパク質材料のペプチド結合をアルギニン残基またはリシン残基のカルボキシル末端側で特異的に切断するエンドペプチダーゼと接触させて、タンパク質加水分解物を製造する工程を含む。タンパク質加水分解物の調製に使用されるタンパク質材料またはタンパク質材料の組み合わせは変わる可能性があり、変わるものである。適したタンパク質材料の例を下記に詳述する。
【００２８】
（ａ）大豆タンパク質材料
幾つかの実施形態では、タンパク質材料は、大豆タンパク質材料であってもよい。本発明の方法に様々な大豆タンパク質材料を使用して、タンパク質加水分解物を生成してもよい。一般に、大豆タンパク質材料は、当該技術分野で既知の方法に従って丸大豆から得てもよい。全大豆は標準的な大豆（即ち、非遺伝子組換え大豆）、遺伝子組換え大豆（例えば、組換え油を有する大豆、組換え炭水化物を有する大豆、組換えタンパク質サブユニットを有する大豆など）、またはこれらの組み合わせであってもよい。適した大豆タンパク質材料の例としては、大豆抽出物、豆乳、豆乳粉末、大豆カード、大豆粉、大豆タンパク質単離物、大豆タンパク質濃縮物、およびこれらの混合物が挙げられる。
【００２９】
一実施形態では、本方法に使用される大豆タンパク質材料は、大豆タンパク質単離物（単離大豆タンパク質またはＩＳＰとも称される）であってもよい。大豆タンパク質単離物は、概ね、無水ベースで大豆タンパク質少なくとも約９０％のタンパク質含有量を有してもよい。大豆タンパク質単離物はインタクトな大豆タンパク質を含んでも、または大豆タンパク質単離物は部分加水分解大豆タンパク質を含んでもよい。大豆タンパク質単離物は、７Ｓ、１１Ｓ、２Ｓなどの貯蔵タンパク質サブユニットを高含有率で有してもよい。本発明に出発材料として使用され得る大豆タンパク質単離物の非限定例は、例えば、Ｓｏｌａｅ，ＬＬＣ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から市販されており、その中で、ＡＬＰＨＡ（商標）５８００、ＳＵＰＲＯ（登録商標）１２０、ＳＵＰＲＯ（登録商標）５００Ｅ、ＳＵＰＲＯ（登録商標）５４５、ＳＵＰＲＯ（登録商標）６２０、ＳＵＰＲＯ（登録商標）６７０、ＳＵＰＲＯ（登録商標）７６０、ＳＵＰＲＯ（登録商標）ＥＸ３３、ＳＵＰＲＯ（登録商標）ＰＬＵＳ  ２６００Ｆ、ＳＵＰＲＯ（登録商標）ＰＬＵＳ  ２６４０ＤＳ、ＳＵＰＲＯ（登録商標）ＰＬＵＳ  ２８００、ＳＵＰＲＯ（登録商標）ＰＬＵＳ  ３０００、ＳＵＰＲＯ（登録商標）ＸＦ  ８０２０、ＳＵＰＲＯ（登録商標）  ＸＦ  ８０２１、および、これらの組み合わせが挙げられる。
【００３０】
別の実施形態では、大豆タンパク質材料は、無水ベースで約６５％〜約９０％未満のタンパク質含有量を有する大豆タンパク質濃縮物であってもよい。本発明に有用な、適した大豆タンパク質濃縮物の例としては、ＰＲＯＣＯＮ（商標）製品ライン、ＡＬＰＨＡ（商標）１２およびＡＬＰＨＡ（商標）５８００（これらは全て、Ｓｏｌａｅ．ＬＬＣから市販されている）が挙げられる。あるいは、大豆タンパク質濃縮物を大豆タンパク質単離物とブレンドし、大豆タンパク質材料源として大豆タンパク質単離物の一部を代替してもよい。典型的には、大豆タンパク質濃縮物で大豆タンパク質単離物の一部を代替する場合、大豆タンパク質濃縮物で大豆タンパク質単離物の約４０重量％以下を代替し、より好ましくは大豆タンパク質単離物の約３０重量％以下を代替する。
【００３１】
更に別の実施形態では、大豆タンパク質材料は、無水ベースで約４９％〜約６５％のタンパク質含有率を有する大豆粉であってもよい。大豆粉は、脱脂大豆粉、部分脱脂大豆粉、または全脂大豆粉であってもよい。大豆粉を大豆タンパク質単離物または大豆タンパク質濃縮物とブレンドしてもよい。
【００３２】
代替の実施形態では、大豆タンパク質材料は、遠心分離の沈殿に基づいて、４つの主要な貯蔵タンパク質画分またはサブユニット（１５Ｓ、１１Ｓ、７Ｓおよび２Ｓ）に分離された材料であってもよい。一般に、１１Ｓ画分にはグリシンが非常に多く含まれており、７Ｓ画分にはβ−コングリシニンが非常に多く含まれている。更にまた別の実施形態では、大豆タンパク質材料は、高オレイン酸大豆由来のタンパク質であってもよい。
【００３３】
（ｂ）他のタンパク質材料
別の実施形態では、タンパク質材料は、大豆以外の植物に由来してもよい。非限定例として、適した植物には、アマランス、クズウコン、大麦、ソバ、キャノーラ、キャッサバ、ヒヨコマメ（ガルバンゾー）、豆類、レンズマメ、ルピナス、トウモロコシ、アワ・キビ類、オート麦、エンドウ豆、ジャガイモ、米、ライ麦、モロコシ、ヒマワリ、タピオカ、ライ小麦、小麦、およびこれらの混合物が挙げられる。とりわけ好ましい植物性タンパク質としては、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ジャガイモ、米、小麦、およびこれらの組み合わせが挙げられる。一実施形態では、植物性タンパク質材料は、キャノーラミール、キャノーラタンパク質単離物、キャノーラタンパク質濃縮物、またはこれらの組み合わせであってもよい。別の実施形態では、植物性タンパク質材料は、トウモロコシもしくはコーンのタンパク質粉末、トウモロコシもしくはコーンのタンパク質濃縮物、トウモロコシもしくはコーンのタンパク質単離物、トウモロコシもしくはコーンの胚芽、トウモロコシもしくはコーンのグルテン、トウモロコシもしくはコーンのグルテンミール、トウモロコシ粉またはコーン粉、ゼインタンパク質、またはこれらの組み合わせであってもよい。更に別の実施形態では、植物性タンパク質材料は、大麦粉末、大麦タンパク質濃縮物、大麦タンパク質単離物、大麦ミール、大麦粉、またはこれらの組み合わせであってもよい。代替の実施形態では、植物性タンパク質材料は、ルピナス粉、ルピナスタンパク質単離物、ルピナスタンパク質濃縮物、またはこれらの組み合わせであってもよい。別の代替の実施形態では、植物性タンパク質材料はオートミール、オート麦粉、オート麦タンパク質粉、オート麦タンパク質単離物、オート麦タンパク質濃縮物、またはこれらの組み合わせであってもよい。更に別の実施形態では、植物性タンパク質材料は、エンドウ豆粉、エンドウ豆タンパク質単離物、エンドウ豆タンパク質濃縮物、またはこれらの組み合わせであってもよい。更に別の実施形態では、植物性タンパク質材料は、ジャガイモタンパク質粉末、ジャガイモタンパク質単離物、ジャガイモタンパク質濃縮物、ジャガイモ粉、またはこれらの組み合わせであってもよい。また別の実施形態では、植物性タンパク質材料は、米粉、ライスミール、米タンパク質粉末、米タンパク質単離物、米タンパク質濃縮物、またはこれらの組み合わせであってもよい。別の代替の実施形態では、植物性タンパク質材料は、小麦タンパク質麦粉末、小麦グルテン、小麦胚芽、小麦粉、小麦タンパク質単離物、小麦タンパク質濃縮物、可溶化小麦タンパク質、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【００３４】
他の実施形態では、タンパク質材料は動物源に由来してもよい。一実施形態では、動物性タンパク質材料は卵に由来してもよい。適した卵タンパク質の非限定例としては、粉末状卵、乾燥卵固形分、乾燥卵白タンパク質、液体卵白タンパク質、卵白タンパク質粉末、単離オボアルブミンタンパク質、および、これらの組み合わせが挙げられる。卵タンパク質は、鶏、アヒル、ガチョウ、ウズラ、または他の鳥の卵に由来してもよい。代替の実施形態では、タンパク質材料は乳製品源に由来してもよい。適した乳製品タンパク質としては、脱脂粉乳、乳タンパク質単離物、乳タンパク質濃縮物、酸カゼイン、カゼイン酸塩（例えば、カゼイン酸ナトリウム、およびカゼイン酸カルシウムなど）、乳清タンパク質単離物、乳清タンパク質濃縮物、およびこれらの組み合わせが挙げられる。乳タンパク質材料は、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ラクダ、ラクダ科の動物、ヤク、水牛などに由来してもよい。別の実施形態では、タンパク質は、陸上動物または水生動物の筋肉、臓器、結合組織、または骨格に由来してもよい。一例として、動物性タンパク質は、畜牛または他の動物の骨、結合組織、臓器などから抽出されたコラーゲンの部分加水分解により製造されるゼラチンであってもよい。
【００３５】
また、大豆タンパク質材料と少なくとも１種類の他のタンパク質材料との組み合わせも本発明の方法に使用し得ることが考えられる。即ち、タンパク質加水分解組成物は、大豆タンパク質材料と少なくとも１種類の他のタンパク質材料との組み合わせから調製されてもよい。一実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、大豆タンパク質材料と、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ジャガイモ、米、小麦、動物性材料、乳製品および卵からなる群から選択される他の１種類のタンパク質材料との組み合わせから調製されてもよい。別の実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、大豆タンパク質材料と、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ジャガイモ、米、小麦、動物性材料、乳製品および卵からなる群から選択される他の２種類のタンパク質材料との組み合わせから調製されてもよい。また別の実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、大豆タンパク質材料と、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ジャガイモ、米、小麦、動物性材料、乳製品および卵からなる群から選択される他の３種類以上のタンパク質材料との組み合わせから調製されてもよい。
【００３６】
組み合わせて使用される大豆タンパク質材料と他のタンパク質材料の濃度は、変わる可能性があり、変わるものである。大豆タンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約１％〜約９９％の範囲であってもよい。一実施形態では、大豆タンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約１％〜約２０％の範囲であってもよい。別の実施形態では、大豆タンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約２０％〜約４０％の範囲であってもよい。更に別の実施形態では、大豆タンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約４０％〜約８０％の範囲であってもよい。また別の実施形態では、大豆タンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約８０％〜約９９％の範囲であってもよい。同様に、（少なくとも１種類の）他のタンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約１％〜約９９％の範囲であってもよい。一実施形態では、他のタンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約１％〜約２０％の範囲であってもよい。別の実施形態では、他のタンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約２０％〜約４０％の範囲であってもよい。更に別の実施形態では、他のタンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約４０％〜約８０％の範囲であってもよい。また別の実施形態では、他のタンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約８０％〜約９９％の範囲であってもよい。
【００３７】
（ｃ）タンパク質スラリー
本発明の方法では、タンパク質材料は、典型的には水に混合または分散され、タンパク質を約１重量％〜約２０重量％（「現状」ベースで）含むスラリーを形成する。一実施形態では、スラリーはタンパク質を約１重量％〜約５重量％（現状）含んでもよい。別の実施形態では、スラリーはタンパク質を約６重量％〜約１０重量％（現状）含んでもよい。また別の実施形態では、スラリーはタンパク質を約１１重量％〜約１５重量％（現状）含んでもよい。更に別の実施形態では、スラリーはタンパク質を約１６重量％〜約２０重量％（現状）含んでもよい。
【００３８】
タンパク質材料を水に分散させた後、タンパク質材料のスラリーを約７０℃〜約９０℃で約２分間〜約２０分間加熱し、内在すると思われるプロテアーゼインヒビターを失活させてもよい。加水分解物反応を最適化するために、特に、加水分解物反応に使用されるエンドペプチダーゼがその最適活性レベル付近で機能することを確実にするために、典型的にはタンパク質スラリーのｐＨおよび温度を調整する。当該技術分野で一般に知られている方法に従って、タンパク質スラリーのｐＨを調整し、監視してもよい。タンパク質スラリーのｐＨをｐＨ約５．０〜ｐＨ約１０．０に調整し、維持してもよい。一実施形態では、タンパク質スラリーのｐＨをｐＨ約７．０〜ｐＨ約８．０に調整し、維持してもよい。別の実施形態では、タンパク質スラリーのｐＨをｐＨ約８．０〜約ｐＨ９．０に調整し、維持してもよい。好ましい実施形態では、タンパク質スラリーのｐＨをｐＨ約８．０に調整し、維持してもよい。好ましくは、当該技術分野で既知の方法に従って、加水分解反応中、タンパク質スラリーの温度を約４０℃〜約７０℃に調整し、維持する。好ましい実施形態では、加水分解反応中、タンパク質スラリーの温度を約５０℃〜約６０℃に調整し、維持してもよい。一般に、この範囲より高温では、エンドペプチダーゼが最終的に失活する可能性があり、この範囲より低温または高温では、エンドペプチダーゼの活性が低下する傾向がある。
【００３９】
（ｄ）エンドペプチダーゼ
加水分解物反応は、一般に、タンパク質材料のスラリーにエンドペプチダーゼを添加することによって開始される。幾つかのエンドペプチダーゼは、本発明の方法に使用するのに適している。好ましくは、エンドペプチダーゼは食品用酵素である。エンドペプチダーゼは、ｐＨ約６．０〜ｐＨ約１１．０、より好ましくはｐＨ約７．０〜ｐＨ約９．０の加水分解条件下で、且つ約４０℃〜約７０℃、より好ましくは約４５℃〜約６０℃の温度で最適な活性を有する可能性がある。
【００４０】
一般に、エンドペプチダーゼは、Ｓ１セリンプロテアーゼ系（ＭＥＲＯＰＳ  Ｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，ｒｅｌｅａｓｅ  ８．００Ａ；／／ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）の１種である。好ましくは、エンドペプチダーゼは、アルギニン残基、リシン残基、またはこの両方の残基のカルボキシル末端側のペプチド結合を切断するものである。従って、エンドペプチダーゼは、アルギニン、リシン、またはこの両方のカルボキシル末端側のペプチド結合を切断するトリプシン様エンドペプチダーゼであってもよい。本発明の文脈におけるトリプシン様エンドペプチダーゼは、１００より大きいトリプシン比（実施例１６参照）を有するエンドペプチダーゼと定義してもよい。トリプシン様エンドペプチダーゼは、リシン残基のカルボキシル末端側のペプチド結合を切断するリシルエンドペプチダーゼであってもよい。好ましい実施形態では、エンドペプチダーゼは、微生物起源、より好ましくは真菌類起源のものであってもよい。トリプシンおよびトリプシン様エンドペプチダーゼは、他の供給源（例えば、動物源）から入手可能であるが、動物源由来のトリプシンは、実施例１４に示すように、出発タンパク質材料を切断できない可能性がある。
【００４１】
一実施形態では、エンドペプチダーゼは、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来のトリプシン様プロテアーゼ（米国特許第５，２８８，６２７号明細書；米国特許第５，６９３，５２０号明細書、これらはそれぞれ参照によりその内容全体が本明細書に援用される）であってもよい。このエンドペプチダーゼは「ＴＬ１」と称され、そのタンパク質配列（配列番号１）を表Ａに示す。ＴＬ１のアクセッション番号は、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ  Ｎｏ．Ｐ３５０４９であり、そのＭＥＲＯＰＳ  ＩＤはＳ０１．１０３である。別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）由来のトリプシン様プロテアーゼ（国際特許出願国際公開第２００５／０４０３７２−Ａ１号パンフレット、その内容全体が本明細書に援用される）であってもよい。このエンドペプチダーゼは「ＴＬ５」と称され、そのタンパク質配列（配列番号２）を表Ａに示す。ＴＬ５のアクセッション番号は、ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＤＺ８０５７７である。更に別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、フザリウムｃｆ．ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｆ．  ｓｏｌａｎｉ）由来のトリプシン様プロテアーゼであってもよい。このエンドペプチダーゼは「ＴＬ６」と称され、そのタンパク質配列（配列番号３）を表Ａに示す。また別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、アクロモバクター・リティカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓ）由来のリシルエンドペプチダーゼであってもよい。このエンドペプチダーゼは「ＳＰ３」と称され、そのタンパク質配列（配列番号４）を表Ａに示す。ＳＰ３のアクセッション番号は、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ  Ｎｏ．Ｐ１５６３６であり、ＳＰ３のＭＥＲＯＰＳ  ＩＤはＳ０１．２８０である。例示的な実施形態では、エンドペプチダーゼはＴＬ１であってもよい。
【００４２】
表Ａ．例示的なトリプシン様プロテアーゼ
2012502666.tif 000003
【００４３】
別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、４またはその断片と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％または８５％同一のアミノ酸配列を含んでもよい。また別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、４またはその断片と少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％または９２％同一のアミノ酸配列を含んでもよい。更に別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、４またはその断片と少なくとも９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含んでもよい。プロテアーゼ活性を有するこれらの配列のいずれかを有する断片は、例えば、処理後（いずれかのシグナルペプチドおよび／またはプロペプチドを切断した後など）の活性酵素のアミノ酸配列であってもよい。好ましい断片には、配列番号１のアミノ酸２５〜２４８；配列番号２のアミノ酸２６〜２５１；配列番号３のアミノ酸１８〜２５０；または配列番号４のアミノ酸２１〜６５３が含まれる。
【００４４】
本発明の目的では、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．ａｎｄ  Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．（２０００）ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，（６）ｐｐ２７６−２７７；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）バージョン２．８．０を使用することによって、２つのアミノ酸配列のアライメントを決定してもよい。Ｎｅｅｄｌｅプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３に記載のグローバルアライメントアルゴリズムを実行する。使用する置換マトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２であり、ギャップオープニングペナルティは１０であり、ギャップエクステンションペナルティは０．５である。一般に、配列同一性のパーセンテージは、比較ウィンドウ上で最適に整列された２つの配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウ内のアミノ酸配列部分は、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（即ち、ギャップ）を含む可能性がある。このパーセンテージは、同一のアミノ酸がどちらの配列にも認められる位置の数を求めてマッチ位置の数を得、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の２つの配列のうち最短のものの総位置数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより、算出される。
【００４５】
当業者には、ポリペプチドの機能に影響を及ぼすことなく、アミノ酸残基を類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置換し得ることが分かるであろう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンがあり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群には、セリンおよびスレオニンがあり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群にはアスパラギンおよびグルタミンがあり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群にはフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンがあり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群にはリシン、アルギニン、およびヒスチジンがあり；イオウ含有側鎖を有するアミノ酸の群にはシステインおよびメチオニンがある。好ましい保存的アミノ酸置換群としては、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンが挙げられる。従って、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、または４に関して少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有してもよい。一実施形態では、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、または４に関して約５０の保存的アミノ酸置換を有してもよい。別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、または４に関して約４０の保存的アミノ酸置換を有してもよい。更に別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、または４に関して約３０の保存的アミノ酸置換を有してもよい。別の代替の実施形態では、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、または４に関して約２０の保存的アミノ酸置換を有してもよい。更に別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、または４に関して約１０の保存的アミノ酸置換を有してもよい。更に別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、または４に関して、約５の保存的アミノ酸置換を有してもよい。また別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、または４に関して、約１つの保存的アミノ酸置換を有してもよい。
【００４６】
タンパク質材料とエンドペプチダーゼの様々な組み合わせを表Ｂに示す。
【００４７】
表Ｂ．好ましい組み合わせ
2012502666.tif 000004
【００４８】
（表Ｂ続き）
2012502666.tif 000005
【００４９】
（表Ｂ続き）
2012502666.tif 000006
【００５０】
（表Ｂ続き）
2012502666.tif 000007
【００５１】
タンパク質材料に添加されるエンドペプチダーゼの量は、タンパク質材料源、所望の加水分解度、および加水分解反応の持続時間によって変わる可能性があり、変わるものである。エンドペプチダーゼの量は、タンパク質材料１キログラム当たり酵素タンパク質約１ｍｇ〜酵素タンパク質約５０００ｍｇの範囲であってもよい。別の実施形態では、エンドペプチダーゼの量は、タンパク質材料１キログラム当たり酵素タンパク質１０ｍｇ〜酵素タンパク質約２０００ｍｇの範囲であってもよい。更に別の実施形態では、エンドペプチダーゼの量は、タンパク質材料１キログラム当たり酵素タンパク質約５０ｍｇ〜酵素タンパク質約１０００ｍｇの範囲であってもよい。
【００５２】
当業者には分かるように、加水分解反応の持続時間は変わる可能性があり、変わるものである。一般的に言えば、加水分解反応の持続時間は、数分〜長時間（例えば、約３０分〜約４８時間）の範囲であってもよい。加水分解反応を終了させるために、エンドペプチダーゼを失活させるのに十分高い温度に組成物を加熱してもよい。例えば、組成物を約９０℃の温度に加熱すると、エンドペプチダーゼは実質的に熱失活する。
【００５３】
（ＩＩ）タンパク質加水分解物を含有する冷菓の調製
上記の（Ｉ）に詳述した冷菓は、（Ｉ）Ａに詳述したタンパク質加水分解組成物のいずれかと、いずれかの可食材料を含む。あるいは、冷菓は乳製品の代わりにタンパク質加水分解組成物のいずれかを含んでもよい。あるいは、冷菓は、可食材料と、本明細書に記載の単離ポリペプチド断片のいずれかを含んでもよい。
【００５４】
Ａ．タンパク質加水分解組成物の含有（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）
冷菓中のタンパク質加水分解物の濃度は、製造される製品によって変わる可能性があり、変わるものである。乳タンパク質を高いパーセンテージで含む実施形態では、タンパク質加水分解物のパーセンテージは低くなる。一方、乳タンパク質を添加しない実施形態では、様々な冷菓中のタンパク質加水分解物のパーセンテージは高くなる。従って、様々な冷菓中のタンパク質成分のタンパク質加水分解物の濃度は、約１重量％、２重量％、５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、９５重量％、１００重量％未満であってもよい。
【００５５】
可食材料と組み合わせる特定のタンパク質加水分解組成物の選択は、所望の冷菓製品によって変わる可能性があり、変わるものである。幾つかの実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ジャガイモ、米、小麦、動物、卵、またはこれらの組み合わせに由来してもよい。更に他の実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、大豆と、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ジャガイモ、米、小麦、動物、乳製品、および卵からなる群から選択される少なくとも１種類の他のタンパク質源との組み合わせに由来してもよい。代替の実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、異なるタンパク質加水分解物の組み合わせを含んでもよい。追加の実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、配列番号５〜２７４からなるアミノ酸配列の群から選択される単離ポリペプチドまたは合成ポリペプチドを含んでもよい。
【００５６】
タンパク質加水分解組成物の加水分解度は、また、加水分解物の製造に使用される出発材料および所望の冷菓によって変わるものである。例えば、ある一定の量の大豆含有タンパク質加水分解組成物を含むアイスクリームに類似する冷菓に関して、苦味官能特性を最小限にすることが望ましい可能性がある特定の実施形態では、６％ではなく１％により近いまたは１％未満の加水分解度を有する大豆タンパク質加水分解組成物を選択してもよい。更に、代替の実施形態では、冷菓中の穀物臭および大豆/豆臭の官能特性を最小限にすることが望ましい可能性がある場合、１％ではなく６％により近いまたは６％より大きい加水分解度を有する大豆タンパク質加水分解組成物を選択してもよい。
【００５７】
Ｂ．乳製品との任意のブレンド
タンパク質加水分解組成物は、乳製品とブレンドされていてもよい。幾つかの実施形態では、乳製品の濃度は、約９５重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％または５０重量％であってもよく、タンパク質加水分解物の濃度は、約５重量％、１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、または５０重量％であってもよい。他の実施形態では、乳製品の濃度は、約４０重量％、３０重量％、２０重量％、１０重量％、５重量％または０重量％であってもよく、タンパク質加水分解物の濃度は、約６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、または１００重量％であってもよい。他の実施形態では、乳製品の濃度は、約５０重量％〜約９５重量％の範囲であってもよく、タンパク質加水分解物の濃度は、約５重量％〜約５０重量％の範囲であってもよい。別の実施形態では、乳製品の濃度は、約０重量％〜約５０重量％の範囲であってもよく、タンパク質加水分解物の濃度は、約５０重量％〜約１００重量％の範囲であってもよい。
【００５８】
Ｃ．冷菓製品への加工
タンパク質加水分解物を含有する冷菓製品の製造に使用される方法は、１００％乳製品の冷菓の製造に使用される方法に類似している。
【００５９】
タンパク質加水分解物を含有する冷菓は、様々な形状を有する様々な冷菓製品に加工されることになる。製造される冷菓は、当業界で既知のいずれかの冷菓製品であってもよい。好ましい実施形態では、冷菓はアイスクリームであってもよく、またはアイスクリームに類似していてもよい。冷菓の非限定例としては、シャーベット、ウォーターアイス、メロリン、フローズンヨーグルト、フローズンカスタード、ポプシクル、ソルベ、ジェラート、またはこれらの組み合わせが挙げられる。冷菓は、アイスクリームサンドイッチもしくはアイスクリームコーンなどのようにウエハース、クッキー、もしくはコーンなどの他の可食成分と組み合わせられても、または、サンデーのように適切なソース（カラメル、チョコレートソース、フルーツソースなど）と組み合わせられてもよい。更に、冷菓に可食性含有物（チョコレートチップ、フルーツ片、キャンディー、ケーキ片、ブラウニー片、クッキー生地、クッキー片、ナッツなど）または非可食性含有物（ポプシクルの棒など）が入っていてもよい。冷菓は、また、押出形状に形成されてもよい。
【００６０】
一般に、冷菓中の可食材料は、脱脂乳、低脂肪乳、２％牛乳、全乳、クリーム、無糖練乳、ヨーグルト、バターミルク、粉乳、脱脂粉乳、乳タンパク質、酸カゼイン、カゼイン酸塩（例えば、カゼイン酸ナトリウム、カゼイン酸カルシウムなど）、乳清タンパク質濃縮物、乳清タンパク質単離物、大豆タンパク質単離物、大豆タンパク質加水分解物、乳清加水分解物、チョコレート、ココアパウダー、コーヒー、茶、果実ジュース、野菜ジュース、および、当業界で既知であり使用される他の任意の成分を含む。冷菓は、更に、甘味剤（ブドウ糖、ショ糖、果糖、マルトデキストリン、スクラロース、コーンシロップ（液状または固形）、蜂蜜、メープルシロップなど）、香味剤（例えば、チョコレート、チョコレート抽出物、ココア、バニラ抽出物、純バニラ、バニリン、バニラフレーバー、麦芽粉末、フルーツフレーバー、ミント、カラメル、緑茶、ヘーゼルナッツ、生姜、ココナッツ、ピスタチオ、塩など）、乳化剤または増粘剤（例えば、レシチン、カラギナン、セルロースガム、セルロースゲル、デンプン、アラビアガム、キサンタンガム、および当業界で既知であり使用される他の任意の増粘剤）；安定剤、脂質材料（例えば、キャノーラ油、ヒマワリ油、高オレイン酸ヒマワリ油、脂肪粉末など）、保存料（例えば、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、および当業界で既知であり使用される他の任意の保存料）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウムなど）、着色剤、ビタミン、ミネラル、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。
【００６１】
好ましい実施形態では、冷菓製品は、アイスクリームに類似していてもよい。「アイスクリーム」製品は、成分のブレンド、低温殺菌、均質化、冷却、エージング、凍結、包装、および硬化を含む、全てのアイスクリーム製品に共通する方法で製造されてもよい。低温殺菌工程後、フレーバータンクに香味剤を添加してもよい。成分は、液状であっても、乾燥していても、または両方の組み合わせであってもよい。製品は、バッチ法で製造されても、または連続法で製造されてもよい。ブレンド温度は成分の性質によって決まるが、ブレンド温度はどの脂肪の融点より高温でなければならず、安定剤として使用されるガム類を水和させるのに十分でなければならない。低温殺菌は、一般に、高温で短時間行われ、とりわけＦＤＡ’ｓ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ（参照により本明細書に援用される）に記載されているように、ホモジナイザーが低温殺菌装置に組み込まれている。この方法を完了し、０°Ｆ以下の貯蔵安定温度に維持される製品を製造するための典型的な業界標準に基づいた凍結工程および包装工程を使用してもよい。
【００６２】
本発明の冷菓組成物の製造方法は、更に、冷菓組成物を低温殺菌または滅菌するための熱処理を含んでもよい。低温殺菌は、冷菓組成物を凍結する前に実施される。低温殺菌は、一般に、約１５５°Ｆ〜約２７０°Ｆ、より典型的には約１７５°Ｆ〜約１９５°Ｆ、の温度で、約０．１〜約１０気圧、より典型的には約１気圧〜約１．５気圧の圧力で、約３秒〜約３０分、より典型的には約４秒〜約２５秒の時間で加熱する工程を含む。加熱パラメータ、圧力パラメータ、および時間パラメータは互いに独立している。
【００６３】
本発明の冷菓組成物の製造方法は、更に、冷菓組成物中にタンパク質を均一に分散させることを助けるために、冷菓組成物を凍結する前に冷菓組成物を均質化する工程を含んでもよい。冷菓組成物は、通常、１４５°Ｆ〜１７０°Ｆの温度範囲で均質化される。特に、この均質化により、冷菓組成物は、脂肪液滴のサイズを非常に小さい直径または粒子サイズに減少させることによって、より均一な脂肪懸濁液を有することができる。好適には、一段均質化法を使用し、１平方インチ当たり約１０００ポンド〜１平方インチ当たり約４０００ポンドの高速・高剪断の混合により、凍結前の冷菓組成物を均質化することができる。あるいは、全段階の合計圧力が１平方インチ当たり約１０００ポンド〜１平方インチ当たり約４０００ポンドとなる多段均質化法を使用してもよい。例えば、二段法では、第１の均質化段階は１平方インチ当たり約２０００ポンド〜１平方インチ当たり約３０００ポンドであり、第２の均質化段階は１平方インチ当たり約２５０ポンド〜１平方インチ当たり約７５０ポンドである。
【００６４】
低温殺菌法と均質化法は互いに独立して実施されてもよく、または逐次的に実施されてもよい、即ち、低温殺菌法と均質化法の両方を使用し、最初に低温殺菌を行った後、均質化を行ってもよい。単独で使用する場合の低温殺菌と均質化のパラメータは、両方を使用する場合のパラメータと同じである。
【００６５】
冷菓製品中の他のタンパク質源の代わりに本明細書に記載のタンパク質加水分解組成物を使用する場合、好ましいタンパク質置換量は１００％以下である。冷菓中の乳製品タンパク質の一部の代わりに本明細書に記載のタンパク質加水分解組成物を使用する場合、好ましいタンパク質置換量は２０〜３５％であり、最も好ましいタンパク質置換量は３０％である。
【００６６】
定義
本発明を理解し易くするために、幾つかの用語を下記に定義する。
【００６７】
「冷菓」という用語は、広義に、牛乳、甘味料、安定剤、乳化剤、着色料および香味料を含む安全且つ適した成分の組み合わせの凍結混合物を指すが、それらに限定されるものではない。また、卵製品およびデンプン加水分解物などの他の成分を含んでもよい。具体的な冷菓としては、アイスクリームおよびその低脂肪の種類のもの、フローズンカスタード、メロリン（植物性脂肪含有冷菓）、シャーベット、およびウォーターアイスが挙げられる。これらの製品の中には、柔らかい凍結形態で供せられるものもあれば、硬い凍結形態で供されるものもある。また、冷菓としてペアレバイン（ｐａｒｅｖｉｎｅ）タイプの製品（非乳製品冷菓）も含まれ、これらは、乳製品の代わりに安全且つ適した成分が使用されていること以外、アイスクリームおよびその様々な形態に類似している。
【００６８】
「加水分解度」という用語は、切断される全ペプチド結合のパーセンテージを指す。
【００６９】
「エンドペプチダーゼ」という用語は、オリゴペプチド鎖またはポリペプチド鎖中の内部ペプチド結合を加水分解する酵素を指す。エンドペプチダーゼの群は、酵素サブクラスＥＣ  ３．４．２１〜２５（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙの酵素分類体系）を含む。
【００７０】
「食品用酵素」は、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）と認可されており、ヒトなどの生物体が摂取しても安全な酵素である。典型的には、酵素および酵素が由来し得る製品は、適用可能な法的規制ガイドラインに従って製造される。
【００７１】
「加水分解物」は、化合物が水の作用によって切断されるときに得られる反応生成物である。タンパク質加水分解物は、熱分解、化学分解、または酵素分解の後に生じる。反応中、大きい分子は、より小さいタンパク質、可溶性タンパク質、ペプチド断片、および遊離アミノ酸に分解される。
【００７２】
例えば、「穀物臭」、「大豆/豆臭」、または「苦味」のような用語を説明するために使用される「官能特性」という用語は、実施例６で具体的に記載するようなＳＱＳ採点システムに従って決定される。
【００７３】
「可溶性固形分指数」という用語は、可溶性タンパク質または可溶性固形分のパーセンテージを指す。
【００７４】
本明細書で使用される「大豆タンパク質単離物」または「単離大豆タンパク質」という用語は、無水ベースで大豆タンパク質少なくとも約９０％のタンパク質含有量を有する大豆材料を指す。大豆タンパク質単離物は、子葉から大豆の種皮および胚を除去し、子葉をフレーク状にしてまたは粉砕してフレーク状のまたは粉砕された子葉から油を除去し、子葉繊維から子葉の大豆タンパク質と炭水化物を分離した後、炭水化物から大豆タンパク質を分離することによって、大豆から調製される。
【００７５】
本明細書で使用される「大豆タンパク質濃縮物」という用語は、無水ベースで大豆タンパク質約６５％〜約９０％未満のタンパク質含有量を有する大豆材料である。大豆タンパク質濃縮物は大豆子葉繊維も含有し、典型的には無水ベースで大豆子葉繊維を約３．５重量％〜約２０重量％含有する。大豆タンパク質濃縮物は、大豆の種皮および胚を除去し、子葉をフレーク状にしてまたは粉砕してフレーク状のまたは粉砕された子葉から油を除去し、子葉の可溶性炭水化物から大豆タンパク質および大豆子葉繊維を分離することによって、大豆から調製される。
【００７６】
本明細書で使用される「大豆粉」という用語は、粒子が１００番メッシュ（米国規格）スクリーンを通過できるようなサイズを有する脱脂、部分脱脂、または全脂大豆材料の粉砕された形態を指す。従来の大豆粉砕法を使用して、大豆ケーキ、チップ、フレーク、ミール、または材料の混合物を大豆粉に粉砕する。大豆粉は、無水ベースで約４９％〜約６５％の大豆タンパク質含有量を有する。好ましくは、粉は非常に細かく粉砕されており、最も好ましくは、３００メッシュ（米国規格）スクリーン上に保持される粉が約１％未満となるように粉砕されている。
【００７７】
本明細書で使用される「大豆子葉繊維」という用語は、食物繊維を少なくとも約７０％含有する大豆子葉の多糖類部分を指す。大豆子葉繊維は、典型的には幾らかの少量の大豆タンパク質を含有するが、１００％繊維であってもよい。本明細書で使用される大豆子葉繊維は、大豆種皮繊維を指さないまたは含まない。一般に、大豆子葉繊維は、大豆の種皮および胚芽を除去し、子葉をフレーク状にしてまたは粉砕してフレーク状のまたは粉砕された子葉から油を除去し、大豆材料および子葉の炭水化物から大豆子葉繊維を分離することによって、大豆から調製される。
【００７８】
「トリプシン様セリンプロテアーゼ」は、アルギニン残基またはリシン残基のカルボキシル末端側のペプチド結合を優先的に切断する酵素である。
【００７９】
本発明またはその好ましい実施形態の要素を導入するとき、冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」および「前記（ｓａｉｄ）」は、その要素が１つ以上存在することを意味するものとする。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は包括的であり、記載する要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味するものとする。
【００８０】
本発明の範囲から逸脱することなく、上記の化合物、製品および方法には様々な変更がなされ得るため、上記説明および後述の実施例に含まれる全ての内容は例示として解釈されるべきであり、限定の意味で解釈されるべきではないものとする。
【実施例】
【００８１】
以下の実施例は、本発明の実施形態を説明する。
【００８２】
実施例１．トリプシン様エンドペプチダーゼ、ＴＬ１による単離大豆タンパク質の加水分解
溶解性を高め、官能特性を改善するために、単離大豆タンパク質をより小さいペプチド断片に加水分解した。フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来の真菌類トリプシン様ペプチダーゼ、ＴＬ１（その配列は本願の配列番号１として示される）を選択したが、その理由は、ＴＬ１はアルギニン残基またはリシン残基のＣ末端側のペプチド結合を切断するが、他のペプチダーゼは大豆タンパク質中のペプチド結合をランダムに切断することが示されているからである。
【００８３】
発泡を低減するために穏やかに混合して、ＳＵＰＲＯ（登録商標）５００Ｅ（Ｓｏｌａｅ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））３２０ｇを水３６８０ｇに分散させることによって、単離大豆タンパク質（ＩＳＰ）の８％スラリーを作製した。必要に応じて、消泡剤を２滴添加した。溶液を８０℃に５分間加熱し、存在した可能性のあるセリンプロテアーゼインヒビターを失活させた。混合物を５０℃に冷却し、食品用ＫＯＨ（５０％ｗ／ｗ溶液）でｐＨを８．０に調整した。０ｍｇ、７５ｍｇ、３５０ｍｇ、６５０ｍｇ、または９５０ｍｇのＴＬ１／ｋｇ大豆タンパク質の存在下で、８％大豆タンパク質スラリーのアリコート（８００ｍＬ）を５０℃で６０分間インキュベートした。サンプルを８５℃に５分間加熱して、酵素を失活させた。サンプルを氷で冷却し、４℃で貯蔵した。
【００８４】
加水分解度（％ＤＨ）は、加水分解された特定のペプチド結合のパーセント（即ち、出発タンパク質中に存在するペプチド結合の総数のうち切断されたものの数）を指す。％ＤＨは、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）法を使用して推定した。この方法は正確で再現性があり、食品タンパク質加水分解物の加水分解度を求めるために一般に適用可能な方法である。このために、大豆タンパク質加水分解物０．１ｇを０．０２５ＮのＮａＯＨ、１００ｍＬ中に溶解させた。加水分解物溶液のアリコート（２．０ｍＬ）を０．０５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）８ｍＬと混合した。緩衝加水分解物溶液２ｍＬを１０％トリニトロベンゼンスルホン酸０．２０ｍＬで処理した後、暗所で１５分間、室温でインキュベートした。０．１Ｍ亜硫酸ナトリウム−０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液（１：９９の比）４ｍＬを添加することにより反応を終了させ、４２０ｎｍで吸光度を読み取った。０．１ｍＭのグリシン溶液を標準液として用いた。以下の計算を使用してグリシン標準溶液の回収率を求めた：［（４２０ｎｍにおけるグリシンの吸光度−４２０ｎｍにおけるブランクの吸光度）×（１００／０．７１０）］。９４％以上の値は許容可能であると見なされた。
【００８５】
表１は、各サンプルの平均ＴＮＢＳ値および％ＤＨを示す。加水分解は６％ＤＨ付近でプラトーに達し始めたが、これは、切断に容易に利用できるアルギニン部位とリシン部位の数を反映した可能性があると思われる。この実験から、３５０ｍｇ／ｋｇのＴＬ１で１時間消化することにより、十分な加水分解生成物が製造されたことが示唆される。
【００８６】
表１．大豆タンパク質加水分解物の加水分解度
2012502666.tif 000008
【００８７】
実施例２．ＴＬ１加水分解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
０．３％ＤＨ、２．２％ＤＨ、３．１％ＤＨ、４．０％ＤＨ、および５．０％ＤＨを有するＴＬ１加水分解物を、本質的に実施例１に記載のように調製した。各加水分解物と非加水分解単離大豆タンパク質のアリコートを、標準的な方法を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。この分析により、大豆加水分解物中のポリペプチドの分子サイズを、出発大豆タンパク質の分子サイズと比較することができた。図１は、クーマシー染色ゲルの画像を示す。非加水分解単離大豆タンパク質は、サイズが約５ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲のポリペプチドを含む。０．３％ＤＨ加水分解物中のポリペプチドのサイズ範囲は出発材料のものと類似していたが、この加水分解物は追加の小さいポリペプチド断片を含有した。比較的高い％ＤＨを有する加水分解物は、約２０〜３０ｋＤａより大きいポリペプチドを本質的に含まず、全て、追加の小さい（＜５ｋＤａ）ポリペプチドを有した。２．２％ＤＨ、３．１％ＤＨ、および４．０％ＤＨ加水分解物のポリペプチドパターンはかなり類似していた。しかし、５．０％ＤＨ加水分解物は、他の加水分解物より狭いポリペプチドサイズ範囲（約０．１〜２０ｋＤａ）を有した。特に、５．０％ＤＨ加水分解物には７Ｓおよび１１Ｓサブユニットバンドが存在しなかった。（図１、レーン８参照）。
【００８８】
実施例３．ＬＣ−ＭＳによるＴＬ１加水分解物中のペプチド断片の分析
実施例１で調製したＴＬ１加水分解物中のペプチド断片を、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）で同定した。各ＴＬ１加水分解物２ｍｇを含有するアリコートを０．１％ギ酸（１ｍＬ）とガラスバイアル中で混合し１〜２分間ボルテックスすることによってＬＣ−ＭＳ分析用のサンプルを調製した。混合物を１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＨＰ−１１００（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ））ＨＰＬＣ装置で、Ｃ１８分析ＨＰＬＣカラム（１５ｃｍ×２．１ｍｍ内径、５μｍ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｂｉｏ  Ｗｉｄｅ  Ｐｏｒｅ，Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））に、上清のアリコート（２５μＬ）を注入した。溶出プロファイルを表２に示す；溶媒Ａは０．１％ギ酸であり；溶媒Ｂはアセトニトリル中０．１％のギ酸であり、流速は０．１９ｍＬ／分であり、カラムのサーモスタット温度は２５℃であった。
【００８９】
表２．ＨＰＬＣ溶媒溶出プロファイル
2012502666.tif 000009
【００９０】
ＭＳ分析用のスプリッターシステムを使用してＬＣ溶離液のアリコート（１０μＬ）をＥＳＩ−ＭＳ源に供給した。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  Ｄｅｃａイオントラップ質量分析計を使用して、データ依存型ＭＳ／ＭＳおよび動的排除走査事象（ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｓｃａｎ  ｅｖｅｎｔ）を有するデータ依存型ＭＳ／ＭＳによりペプチドを分析した。ＥＳＩ−ＭＳはキャピラリー温度２２５℃の正イオンモードで測定を行い、エレクトロスプレーニードルは電圧５．０ｋＶに設定し、走査範囲はｍ／ｚ４００〜２０００であった。酵素検索パラメータのないＳｅｑｕｅｓｔ検索エンジン（ＢＩＯＷＯＲＫＳ（商標）ソフトウェア、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ））でＭＳ／ＭＳ生データをデコンボリューションした。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、またはＳｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓからのＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの標準データベースを検索することによってペプチドを同定した。
【００９１】
表３にペプチドを示す。ほぼ全てのペプチド断片が、カルボキシル末端にアルギニンまたはリシンを有した（３つの断片はカルボキシル末端にグルタミンを有した）。末端にアルギニン残基を有する断片の方が、末端にリシン残基を有する断片よりも約２倍多かった。
【００９２】
ペプチド断片の同定により、各ＴＬ１加水分解物中にβ−コングリシニンのα−サブユニット、β−コングリシニンのβ−サブユニット、グリシニンサブユニットＧ１、グリシニンサブユニットＧ３、およびグリシニンＧｙ４の加水分解生成物が存在することが明らかになった。同じペプチド断片の多くが各加水分解物中に検出された。５．８％ＤＨの加水分解物および６．１％ＤＨの加水分解物は、Ｐ２４オレオシンアイソフォームＡ由来の断片も含有した。６．１％ＤＨの加水分解物は、追加のタンパク質であるトリプシンインヒビターＫｔｉ３由来の断片の存在を明らかにした。
【００９３】
表３．異なる加水分解度（ＤＨ）を有する加水分解物中のペプチド断片
2012502666.tif 000010
【００９４】
（表３続き）
2012502666.tif 000011
【００９５】
（表３続き）
2012502666.tif 000012
【００９６】
実施例４．ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる、高い加水分解度を有するＴＬ１加水分解物中のペプチド断片の分析
実施例１で調製した６．１％ＤＨ大豆加水分解物中のペプチド断片を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ−ＭＳ）でも分析した。最終溶出工程を約５０分に延長し、Ｂｉｏ−Ｒａｄフラクションコレクターで１分間隔で画分を分取したことを除いて、実施例３に記載のようにサンプルをＨＰＬＣ用に調製し、ＨＰＬＣで分析した。画分番号４〜４８をＧｅｎｅｖａｃエバポレータで３０℃より低い温度で完全に蒸発させた。
【００９７】
このために、乾燥サンプルを５０％アセトニトリル中１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液２００μＬに溶解させた。各サンプルのアリコート（１．５μＬ）をＭＡＬＤＩマトリックス溶液（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸６．２ｍｇ／ｍｌ［メタノール３６％（ｖ／ｖ）、アセトニトリル５６％（ｖ／ｖ）および水８％］）１．５μＬと混合した。サンプルをボルテックスし、遠心分離し、１μＬをＭＡＬＤＩステンレス鋼ターゲットプレートにスポットした。更に精製しＭＳ／ＭＳ分析を行うために、高品質ＭＳスペクトルを有する１３つのサンプルを選択した。各画分を乾燥させ、ＰＣＲ管内で１％アセトニトリル中０．１％のギ酸溶液１０μＬ中に再懸濁させ、３０秒間ボルテックスし、２０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離した。ボルテックスおよび回転を５回繰り返した。ＮｕＴｉｐ（１０μＬの多孔質黒鉛炭素ＳＰＥチップ）を使用してペプチド混合物を精製した。予め濡らした（６０％アセトニトリル中０．１％のギ酸、続いて０．１％ギ酸で平衡化した）チップを使用して、サンプルの入ったＰＣＲ管からペプチドを抽出した。合計５０回、サンプル溶液を全部チップに吸い込み、管に排出して戻した。次いで、サンプルを入れたチップを０．１％ギ酸（１０μＬ）で５回洗浄（吸込みおよび排出）した。最後に、６０％アセトニトリル中０．１％のギ酸１０μＬでチップからペプチドを溶出させた。同じ溶媒混合物（１０μＬ）を使用して、溶出プロセスを１０回繰り返した。貯留した溶出サンプル溶液をスピードバキュームで乾燥させ、５０％アセトニトリル中１％のＴＦＡ溶液１．５μＬおよびＭＡＬＤＩマトリックス溶液１．５μＬ中に再懸濁させた。混合物を３０秒間ボルテックスし、２０００ｒｐｍで５秒間遠心分離し、１μＬをＭＡＬＤＩターゲットプレートにスポットした。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ装置（ＡＢＩ−４７００）でＭＳ分析を行った。装置はＮＤ：ＹＡＧ（３３５ｎｍ）を備え、ＭＳとＭＳ／ＭＳの両方のモードで２００Ｈｚの繰り返し周波数で作動した。第１のＴＯＦでは２０ＫｅＶの加速エネルギーでデータを記録し、電圧ｍアインツェルレンズを６ＫｅＶに設定した。酵素検索パラメータのないＭＡＳＣＯＴ検索エンジン（ＭＡＴＲＩＸ  ＳＣＩＥＮＣＥ）で、ＭＳ／ＭＳデータをデコンボリューションした。ＮＣＢＩまたはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの標準データベースを検索することによってペプチドを同定した。
【００９８】
表４にＭＡＬＤＩ−ＭＳで同定したペプチドを示す。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）で同定したのと同じペプチド断片の幾つかをこの分析で同定した。例えば、β−コングリシニンのα−サブユニット、β−コングリシニンのβ−サブユニット、グリシニンサブユニットＧ１、およびグリシニンＧｙ４の断片はどちらの分析でも検出された。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析により、β−コングリシニンのアルファプライムサブユニット、グリシニンサブユニットＧ２、および６２Ｋショ糖結合タンパク質前駆体および種子成熟タンパク質ＬＥＡ４などの追加のポリペプチドの断片が検出された。
【００９９】
表４．６．１％ＤＨ加水分解物中のペプチド断片−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ
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【０１００】
実施例５．ＴＬ１またはＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）による単離大豆タンパク質の加水分解
異なる加水分解物の官能特性および機能性を比較できるように、ＴＬ１またはＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）２．４Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手可能な微生物サブチリシンプロテアーゼのいずれかで単離大豆タンパク質を加水分解した。５分間穏やかに混合して、ＳＵＰＲＯ（登録商標）５００Ｅ、７２ｇを水道水８２８ｇ中にブレンドすることにより、８％単離大豆タンパク質のスラリーを調製した。消泡剤を２滴添加した。２ＮのＫＯＨでスラリーのｐＨを８．０に調整した。スラリーのアリコート（８００ｇ）を混合しながら５０℃に加熱した。様々な量のＴＬ１ペプチダーゼまたはＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）（ＡＬＣ）プロテアーゼを添加して、０％、１％、２％、４％、および６％の目標加水分解度を達成した。自動滴定装置を使用して、反応ｐＨをｐＨ８．０に一定に保った。５０℃である一定の時間インキュベートして所望の加水分解度を得た後、サンプルを８５℃に５分間加熱して酵素を失活させ、溶液をｐＨ７．０に調整した。サンプルを氷で冷却し、４℃で貯蔵した。ＴＮＢＳ法（実施例１に記載）を使用して加水分解度（％ＤＨ）を求めた。表５は、添加した酵素の量、反応時間、反応中にｐＨを調整するために添加したＫＯＨの容積、平均ＴＮＢＳ値、および％ＤＨを示す。
【０１０１】
表５．ＴＬ１加水分解物およびＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）加水分解物
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【０１０２】
実施例６．ＴＬ１加水分解物とＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）加水分解物の官能分析
自社開発の官能スクリーニング法であるＳｏｌａｅ  Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（ＳＱＳ）法を使用して、実施例５で調製したＴＬ１加水分解物とＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）加水分解物の香味特性を評価した。この方法は試験サンプルと対照サンプルの直接比較に基づくものであり、定性的差と定量的傾向（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）差の両方を提供する。７人の訓練された官能試験員のパネルに、各サンプル（希釈して５％スラリーとした）と対照サンプル（非加水分解単離大豆タンパク質の５％スラリーであった）のアリコートを提供した。食品用リン酸で各溶液のｐＨを７．０に調整した。
【０１０３】
評価手順は、カップの底をテーブルに付けたまま、カップを３回かき混ぜることを含んだ。サンプルを２秒間放置した後、各官能試験員は約１０ｍＬ（小さじ２杯）をすすり、口の中で１０秒間音を立てるようにした後、吐き出した。その後、官能試験員は表６に示すスケールに従って試験サンプルと対照サンプルとの差を評価した。
【０１０４】
表６．ＳＱＳ採点法
2012502666.tif 000015
【０１０５】
表７は、各サンプルの平均ＳＱＳスコアを示す。ＴＬ１加水分解物は、概して、対照サンプル（未処理の単離大豆タンパク質であった）と中程度の差があると評価された。ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）（ＡＬＣ）加水分解物は、対照と僅かな差〜極度の差があると評価された。
【０１０６】
表７．ＴＬ１加水分解物とＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）加水分解物のＳＱＳスコア
2012502666.tif 000016
【０１０７】
試験サンプルが対照サンプルと差がある（即ち、ＳＱＳスコアが２、３、または４である）と評価された場合、試験サンプルは対照サンプルとどのような差があるかについての診断情報を提供するために、試験サンプルを更に評価した。従って、試験サンプルの特性（表８を参照）が対照サンプルよりわずかに高い、中程度に高い、または極度に高い場合、それぞれ＋１、＋２、＋３のスコアを割り当てた。同様に、試験サンプルの特性が対照サンプルよりわずかに低い、中程度に低い、または極度に低い場合、それぞれ−１、−２、−３のスコアを割り当てた。この分析は、試験サンプルと対照サンプルとの間の定量的傾向差についての評価を提供する。
【０１０８】
表８．ＳＱＳ用語集
2012502666.tif 000017
【０１０９】
図２Ａおよび図２Ｂに、類似のＤＨレベルを有する加水分解物に関する９つの香味特性の傾向差を示す。全てのＤＨレベルで、ＴＬ１加水分解物は、ＡＬＣ加水分解物より穀物臭および大豆/豆臭の特性の低下が大きく、渋味および苦味の増加が小さかった。％ＤＨの最も高いＡＬＣ加水分解物は、対照と比較して苦味の増加が特に大きかった。
【０１１０】
実施例７．ＴＬ１加水分解物とＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）加水分解物の溶解性
加水分解物を固形分２．５％に希釈し、それを４℃、ｐＨ７．０で１週間貯蔵することによって、実施例５で調製したＴＬ１加水分解物とＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）加水分解物のそれぞれの溶解性を推定した。サンプルを視覚的に評価した；図３Ａに写真画像を示す。ＴＬ１加水分解物は全て沈殿がほとんどなかったが、５．１％ＤＨのＴＬ１加水分解物は、より低い％ＤＨを有するものと比較して透明性も高かった。対照的に、％ＤＨが最も高いＡＬＣ加水分解物は、かなりの量の沈殿があった。図３Ｂは、６．１％ＤＨのＴＬ１加水分解物と１３．８％ＤＨのＡＬＣ加水分解物を固形分２．５％に希釈し、ｐＨ８．２、４℃で３週間貯蔵したものの管の画像を示す。ＴＬ１加水分解物は沈殿がなく、ｐＨ８．２、４℃で長期間安定であることが分かったが、ＡＬＣ加水分解物は沈殿があった。
【０１１１】
実施例５で調製したＴＬ１加水分解物とＡＬＣ加水分解物のそれぞれで、溶解性に対するｐＨの影響を試験した。それぞれのアリコートをｐＨ２、ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８、またはｐＨ９に調整し、サンプルを５００×ｇで１０分間遠心分離した。遠心分離前の溶液中の固形分の量を遠心分離後の溶液中の固形分の量と比較して、可溶性固形分指数（ＳＳＩ）を得た。図４Ａおよび４ＢにそれぞれＴＬ１加水分解物とＡＬＣ加水分解物の％可溶性固形分をｐＨの関数として示す。溶液は全て、ｐＨ約４〜ｐＨ約５（すなわち、大豆タンパク質の等電点）のｐＨレベルで溶解性が低く、それより低いｐＨ値で溶解性が幾分高かった。しかし、それより高いｐＨ値では、ＴＬ１加水分解物は全て、ｐＨ６．０より高いレベルで溶解性に優れていた（図４Ａ）が、ＡＬＣ加水分解物の中にはｐＨ６．０より高いｐＨレベルで溶解性の低いものもあった（図４Ｂ）。図４Ｃは、低い％ＤＨと高い％ＤＨのＴＬ１加水分解物とＡＬＣ加水分解物の溶解性の直接比較をｐＨの関数として示す。
【０１１２】
実施例８．ＴＬ１加水分解物の光透過率
実施例５で調製したＴＬ１加水分解物の幾つかの透過率を測定した。このために、異なる固形分率（即ち、０．５％、１．０％、１．５％、２．０％、および２．５％）を有する１％ＤＨおよび５．１％ＤＨのＴＬ１加水分解物を調製した。各タンパク質スラリーのアリコートをＴＵＲＢＩＳＣＡＮ（登録商標）Ｌａｂ  Ｅｘｐｅｒｔ装置（Ｆｏｒｍｕｌａｃｔｉｏｎ（Ｉ’Ｕｎｉｏｎ,Ｆｒａｎｃｅ））に入れ、毎秒、合計６０秒間、透過率を記録した。表９は、各サンプルの平均透過率を示す。５．１％ＤＨのＴＬ１加水分解物は固形分０．５％で透過率が３７．４％であり、それに対して１．０％ＤＨの加水分解物は固形分０．５％で透過度が１．３％であった。これらのデータから、視覚的に観察されたもの（図３Ａを参照）が裏付けられる。
【０１１３】
表９．ＴＬ１加水分解物の透過率
2012502666.tif 000018
【０１１４】
実施例９．ＴＬ１または他のエンドペプチダーゼを用いて調製した大豆加水分解物の苦味分析
ＴＬ１、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）（ＡＬＣ）、またはアクロモバクター・リティカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓ）由来のリシルエンドペプチダーゼ（ＳＰ３、配列番号４）で、本質的に実施例１および５に記載のように、単離大豆タンパク質を加水分解した。実施例１に記載のＴＮＢＳ法で求めるとき％ＤＨ値が約５〜６％となるように、酵素濃度と反応条件を選択した。実施例６に記載のＳＱＳ法を使用して苦味に焦点を合わせた評価を行うために、加水分解物を５人の官能試験員のパネルに提供した。
【０１１５】
表１０に平均ＳＱＳスコアと苦味診断スコアを示す。ＴＬ１加水分解物およびＳＰ３加水分解物は、対照サンプル（非加水分解単離大豆タンパク質）とわずかな差があると評価された。同様に、ＴＬ１加水分解物およびＳＰ３加水分解物は、対照サンプルより僅かだけ苦味が少ないと評価された。対照的に、ＡＬＣ加水分解物は、対照サンプルと極度の差があり、対照サンプルより極めて苦味が強いと評価された。
【０１１６】
表１０．加水分解物のＳＱＳ分析
2012502666.tif 000019
【０１１７】
実施例１０．パイロットプラントＴＬ１加水分解物の物理的特性
大豆のＴＬ１加水分解物の製造をベンチスケールからより大きいパイロットプラントスケールに拡大し、加水分解物の官能特性および機能特性を分析した。このために、出発材料は大豆タンパク質カードであった。大豆タンパク質カード材料を製造するために、大豆フレーク、大豆粉、または大豆グリットをｐＨ約６．５〜ｐＨ約１０の水溶液で連続的に抽出して、フレーク／粉／グリット中のタンパク質を繊維などの不溶物から分離した。亜硫酸塩を、フレーク重量に基づいて０．０５〜０．１５％の低レベルで抽出媒体に添加した。フレーク、粉、またはグリットを、１回目の抽出ではｐＨ約６．５〜７．０の水酸化ナトリウム水溶液で抽出し、その後、２回目の抽出ではｐＨ約８．５〜１０の溶液で抽出した。水対大豆フレーク／粉／グリット材料の重量比は、約８：１〜約１６：１であった。
【０１１８】
抽出後、ろ過または遠心分離により不溶物から抽出物を分離した。次いで、大豆タンパク質を大豆可溶分（鼓腸誘発性のオリゴ糖および他の水溶性炭水化物を含む）から分離できるように、分離した抽出物のｐＨを適した酸で大豆タンパク質の等電点付近（ｐＨ約４〜５、または好ましくはｐＨ４．４〜４．６）に調整して大豆タンパク質カードを沈殿させた。適した食用酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、または酢酸が挙げられる。沈殿したタンパク質材料（カード）を遠心分離により抽出物（大豆乳清）から分離して、大豆タンパク質カード材料を製造した。分離した大豆タンパク質カード材料を水で、水対タンパク質材料の重量比約５：１〜約１２：１で洗浄し、残留する可溶分を除去した。
【０１１９】
まず、大豆タンパク質カード材料を水酸化ナトリウム溶液または水酸化カリウム溶液などのアルカリ金属水酸化物水溶液またはアルカリ土類金属水酸化物水溶液で中和して、ｐＨ約８．０〜ｐＨ約９．０、好ましくはｐＨ約８．０〜８．５にした。好ましくは、ジェット調理およびフラッシュ冷却により、中和した大豆タンパク質カードを加熱および冷却した。次いで、大豆タンパク質加水分解物のＴＮＢＳ値が約３５〜５５となるように大豆タンパク質材料を加水分解するのに有効な温度と時間で、大豆タンパク質材料をＴＬ１酵素で処理した。タンパク質カードの重量ベースに基づいて０．００５％〜０．０２％の酵素タンパク質濃度で、酵素を大豆タンパク質材料に添加した。４０℃〜６０℃、好ましくは約５０℃の温度で３０分間〜１２０分間、好ましくは５０分間〜７０分間、酵素を大豆タンパク質カード材料と接触させて、タンパク質を加水分解した。酵素を失活させるのに有効な温度に加水分解大豆タンパク質材料を加熱することによって、加水分解を終了させた。最も好ましくは、加水分解大豆タンパク質カード材料をジェット調理して酵素を失活させ、フラッシュ冷却した後、前述のように噴霧乾燥した。
【０１２０】
表１１は、典型的な１組の加水分解物の反応パラメータを示す。本質的に実施例１に記載のようにＴＮＢＳ法を使用して加水分解度を求めた。表１１に各サンプルのＴＮＢＳ値および％ＤＨも示す。対照サンプルは、非加水分解単離大豆タンパク質（即ち、ＳＵＰＲＯ（登録商標）５００Ｅ）および本質的に市販の大豆タンパク質加水分解物（即ち、酵素の混合物で２．８％ＤＨに加水分解されたＳＵＰＲＯ（登録商標）ＸＴ２１９）を含んだ。
【０１２１】
表１１．パイロットプラントＴＬ１加水分解物
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【０１２２】
標準的方法を使用してＳＤＳ  ＰＡＧＥにより、ＴＬ１加水分解物と対照サンプルを分析したが、図５はゲルの画像を示す。この分析から、主要な大豆貯蔵タンパク質サブユニットは全て、ＴＬ１により切断されることが明らかになった。
【０１２３】
実施例１１．パイロットプラントＴＬ１加水分解物の溶解性および粘度
実施例１０で調製したパイロットプラントＴＬ１加水分解物および対照サンプルの溶解性も調べた。各サンプルのアリコートをｐＨ２、ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８、およびｐＨ９に調整し、本質的に実施例７に記載のように可溶性固形分指数（ＳＳＩ）を求めた。図６に示すように、ＴＬ１加水分解物サンプルは全て、ｐＨ６以上のｐＨレベルでほぼ１００％溶解したが、加水分解対照サンプルはｐＨ６で約４０％しか溶解しなかった。さらに、加水分解度が高くなるにつれ、等電点（即ち、ｐＨ４〜５付近）における溶解性が高くなる。
【０１２４】
様々な固形分率（即ち、固形分１２〜２０％）におけるＴＬ１加水分解物の幾つかと対照サンプルの粘度を求めた。小型のワーリングブレンダーを使用して、７０グラムの全スラリー含有量でサンプルを分散させた。発泡を低減するために最小限の剪断を使用してサンプルを合計４分間ブレンドした。次いで、小型サンプルアダプターおよびスピンドル１８を有するＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度計を使用して室温でサンプルを分析した。各サンプルをデュプリケートで調製し、分析した。図７に、異なる調製物の粘度測定値をセンチポアズ（ｃｐｓ）でプロットする。単離品は、固形分１２％のとき１０，０００ｃｐｓより大きかったが、これはＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄには粘度が高過ぎた。この分析から、加水分解度が高くなるにつれ、粘度が低下し、固形分率が高くなるにつれ、粘度が上昇することが明らかになった。図８に、粘度および溶解性のデータを要約する。溶解性は、可溶性固形分指数（ＳＳＩ）および窒素可溶性指数（ＮＳＩ、全窒素の関数としての水溶性窒素のパーセントである）で表される。図８に示すように、加水分解度が高くなるにつれ、粘度は低下し、溶解性が高くなる。
【０１２５】
ＴＬ１加水分解物の幾つかに存在する香味揮発性物質の量を、非加水分解単離大豆タンパク質中に存在する香味揮発性物質の量と比較した。香味揮発性物質は、標準的なＧＣ法を使用して測定した。非加水分解大豆タンパク質と比較して、ＴＬ１加水分解物中では、ヘキサナール、ヘプタナール、ペンタナール、３−オクテン−２−オン、および１−オクテン−３−オールのレベルが低かった（図９Ａおよび９Ｂ）。
【０１２６】
実施例１２．パイロットプラントＴＬ１加水分解物の官能分析
本質的に実施例６に記載のＳＱＳ法を使用して、実施例１０で調製したパイロットプラントＴＬ１加水分解物の香味特性を分析した。１１人または１２人の訓練された官能試験員のパネルが加水分解物を対照サンプル（即ち、非加水分解単離大豆タンパク質）と比較して評価した。表１２は平均ＳＱＳスコアを示し、図１０Ａ〜図１０Ｄは診断スコアのプロットを示す。概して、ＴＬ１加水分解物は、対照サンプルと比較して穀物臭および大豆/豆臭の特性が僅かに低く、粘度が低かったが、特に、比較的高い加水分解度（％ＤＨ）では苦味特性が高かった。加水分解対照サンプル（即ち、サンプル５−３）は穀物臭の特性が僅かに低かったが、苦味および渋味特性が中程度に高かった。従って、ＴＬ１加水分解物は、概して、加水分解対照サンプルよりも苦味が少ないと評価された。
【０１２７】
表１２．パイロットプラントＴＬ１加水分解物のＳＱＳスコア  
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【０１２８】
図１１はＴＬ１加水分解物の官能分析の要約を示し、重要な官能特性を加水分解度の関数としてプロットしている。加水分解度が高くなるにつれ加水分解物の全体的な官能スコアは低くなり、加水分解度が高くなるにつれ苦味スコアは高くなる。約２％未満のＤＨを有する加水分解物は最良の香味を有し、苦味が最も少なかったと思われる。
【０１２９】
実施例１３．大豆のＴＬ１加水分解物中のペプチド断片の分析
Ｑ−ＳＴＡＲ（登録商標）ＸＬ  ＭＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（ＡＢＩ）（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））およびＬＣＱ−Ｄｅｃａ  ＭＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ（Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ））を使用したＬＣ−ＭＳ分析により異なる加水分解度を有するＴＬ１加水分解物中のペプチドを同定した。
【０１３０】
各サンプル約（０．５〜２．０ｍｇ）を５０ｍＭの重炭酸アンモニウム０．５ｍＬ中に溶解した。データ依存型の取得を使用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行うために、内径７５ｕｍのカラムに５μＬを注入した（ＬＣ流速は１８０ｎＬ／分であった）。Ｃ１８  ＰｅｐＭａｐ１００カラム（Ｄｉｏｎｅｘ）を使用するＬＣ  Ｐａｃｋｉｎｇｓ  Ｕｌｔｉｍａｔｅナノ−ＬＣ／Ｃ１８  ＰｅｐＭａｐ１００カラム（Ｄｉｏｎｅｘ）を使用するＥｋｓｉｇｅｎｔ  ２Ｄナノ−ＬＣでナノＬＣを実施した。溶出プロファイルを表１３に示す。溶媒ＡはＭｉｌｌｉＱ水中５％のアセトニトリル、０．１％のギ酸であり、溶媒ＢはＭｉｌｌｉＱ水中９５％のアセトニトリル、０．０７５％のギ酸であった。
【０１３１】
表１３．ＬＣ−ポンプ勾配
2012502666.tif 000022
【０１３２】
ナノエレクトロスプレー源（Ｐｒｏｔａｎａ  ＸＹＺマニピュレータ）を備えたＡＢＩ  ＱＳＴＡＲ（登録商標）ＸＬ  ｈｙｂｒｉｄ  ＱＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳ質量分析計を用いて、サンプル分析を進めた。２．５ｋＶでホウケイ酸塩ナノエレクトロスプレーニードルからポジティブモードのナノエレクトロスプレーを発生させた。製造業者からの標準物質を用いて装置のｍ／ｚ応答を毎日較正した。Ａｎａｌｙｓｔ  ＱＳソフトウェア中の情報依存型データ取得（ＩＤＡ）機構を使用し、次のパラメータを用いて、ＴＯＦ質量スペクトルおよび生成イオンスペクトルを取得した：ＴＯＦ  ＭＳおよびＭＳ／ＭＳの質量範囲はそれぞれ、ｍ／ｚ３００〜２０００および７０〜２０００であった。毎秒、ＴＯＦ  ＭＳ前駆体イオンスペクトルを蓄積した後、３つの生成イオンスペクトルをそれぞれ３秒間蓄積した。ＴＯＦ  ＭＳからＭＳ／ＭＳへの切換えは、ペプチドの質量範囲（ｍ／ｚ  ３００〜２０００）、前駆体の荷電状態（２〜４）およびイオン強度（＞５０カウント）で行った。ＤＰ、ＤＰ２、およびＦＰの設定はそれぞれ６０、１０、および２３０であり、回転衝突エネルギーを使用した。
【０１３３】
Ａｎａｌｙｓｔ  ＱＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してペプチドエレクトロスプレータンデム質量スペクトルを処理した。ＭＡＳＣＯＴバージョン１．９を使用し、次の制約を用いて、ＮＣＢＩまたはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの標準データベースを検索することによりペプチドを同定した：切断し損なった部位が１箇所以下の酵素はなく；ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ断片イオンの質量許容差はそれぞれ０．８／２．０および０．８Ｄａである。選択される前駆体イオンの電荷状態は１〜３であった。
【０１３４】
ＬＣＱ−Ｄｅｃａ  ＭＳを使用してＬＣ−ＭＳ分析を行うために、１）ガラスバイアル内で各ＴＬ１加水分解物２ｍｇを含有するアリコートを０．１％ギ酸（１ｍＬ）と混合し、１〜２分間分間ボルテックスし、混合物をマイクロ遠心分離機で１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、または２）マイクロ遠心管内で各ＴＬ１加水分解物３ｍｇを含有するアルコートと０．１％ギ酸（３００ｕＬ）を混合し、混合物を１〜２分間ボルテックスすることにより、サンプルを調製した。次いで、ペプチドを単離するために、予め清浄にしたＣ１８チップ（Ｇｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ））に混合物を全部移した。Ｃ１８チップを６０％アセトニトリル中０．１％のギ酸（３００μＬ）で溶出することによって清浄にし、０．１％ギ酸（６００μＬ）で平衡化した。０．１％ギ酸で溶出した材料画分を廃棄し、ペプチドを６０％アセトニトリル中０．１％のギ酸（６００μＬ）で溶出した。Ｇｅｎｅｖａｃエバポレータで３００℃で１０分間、溶媒混合物を蒸発させることにより、ペプチド溶液の全容積を２００μＬに減少させた。本質的に実施例３に記載のようにＬＣ−ＭＳ分析を行った。
【０１３５】
表１４は、大豆タンパク質のＴＬ１加水分解物中の同定されたペプチドを全て示す。
【０１３６】
表１４．大豆のＴＬ１加水分解物中のペプチド
2012502666.tif 000023
【０１３７】
（表１４続き）
2012502666.tif 000024
【０１３８】
（表１４続き）
2012502666.tif 000025
【０１３９】
（表１４続き）
2012502666.tif 000026
【０１４０】
実施例１４．他のエンドペプチダーゼによる大豆タンパク質の加水分解
異なるエンドペプチダーゼ（例えば、ＳＰ３、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）由来のトリプシン様プロテアーゼ（ＴＬ５、配列番号２）、フザリウムｃｆ．ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｆ．  ｓｏｌａｎｉ）由来のトリプシン様プロテアーゼ（ＴＬ６、配列番号３）、ブタトリプシン、またはウシトリプシンで単離大豆タンパク質を処理し、別の供給源からのトリプシンまたはトリプシン様プロテアーゼを大豆タンパク質の加水分解に使用できるかどうかを判定した。
【０１４１】
単離大豆タンパク質（即ち、ＳＵＰＲＯ（登録商標）５００Ｅ）の８％スラリーを調製し、ｐＨ８に調整し、１００ｍｇプロテアーゼ／ｋｇ大豆タンパク質の最終濃度が得られるようにエンドペプチダーゼの１つと混合した。プロテアーゼ非含有対照サンプルも含まれた。スラリーを混合しながら５０℃の水浴中で２時間インキュベートした後、プロテアーゼを熱失活させた（８０℃で３０分間）。最終的な大豆タンパク質濃度が５％となるように各サンプルに脱イオン水を添加した。
【０１４２】
加水分解度を推定するために、各サンプルのアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより４〜２０％トリス−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ  Ｉｎｃ．（Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ、ＯＨ））で分離した。図１２に示すように、ＴＬ１、ＳＰ３、ＴＬ５、およびＴＬ６は、大豆タンパク質をより小さいポリペプチド断片に加水分解したが、ブタトリプシンまたはウシトリプシンのいずれかで処理した後、大豆タンパク質はほとんどまたは全く加水分解されていなかった（レーン７および８を参照）。ブタトリプシンとウシトリプシンは大豆タンパク質を切断できないということが、３７℃と５０℃（ｐＨ８）の両方で観察された。
【０１４３】
実施例１５．Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋインヒビターによるトリプシン様プロテアーゼの阻害
大豆は、大豆材料製造中の熱処理に耐える活性プロテアーゼインヒビターを含有するため、ブタトリプシンとウシトリプシンが大豆タンパク質材料を加水分解できなかった可能性がある。この仮説を試験するために、プロテアーゼを様々な濃度の市販のＢｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋインヒビター調製物と一緒にインキュベートし、残留酵素活性を測定した。
【０１４４】
プロテアーゼをアッセイ緩衝液（０．１Ｍのトリス、０．０２％のＢｒｉｊ  ３５、ｐＨ８．０）で０．００１ｍｇ／ｍｌに希釈し、マイクロタイタープレートのウェル内で様々な濃度のＢｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋインヒビター（カタログ番号Ｔ−９７７７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合した。プレートを室温で１時間、攪拌しながらインキュベートした。０．６ｍｇ／ｍｌの基質、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｌ−１２０５；Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ））を添加することにより、残留活性を測定した。４０５ｎｍにおける吸光度を室温で１０秒ごとに３分間測定した。測定された４０５ｎｍにおける吸光度の初期勾配から活性を計算した。残留活性は、インヒビターを含まないウェル内の活性に対する、インヒビターを有するウェル内の活性として計算した。
【０１４５】
表１５に示すように、ブタトリプシンとウシトリプシンは、微生物プロテアーゼより低濃度のＢｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋインヒビターによって阻害された。従って、大豆材料は、動物由来のトリプシンの活性を阻害する化合物を含有すると思われる。
【０１４６】
表１５．動物由来のプロテアーゼの阻害  
2012502666.tif 000027
【０１４７】
実施例１６．トリプシン様プロテアーゼのトリプシン比および同定
トリプシン様活性を有する酵素を同定するためのアッセイを開発した。このために、一般式Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−ｐＮＡ（式中、Ｘｘｘは２０種類の天然アミノ酸残基のうちの１つの３文字略号であり、ｐＮＡはｐ−ニトロアニリドである）を有する色素生産性の基質（Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してトリプシン様活性を測定した。エンドペプチダーゼがＸｘｘのカルボキシル末端側のペプチド結合を切断した場合、ｐ−ニトロアニリンが放出され、黄色を呈し、本質的に実施例１５に記載のように測定した。ＸｘｘがＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、ＰｈｅまたはＶａｌである１０種類のｐＮＡ基質を使用した。
【０１４８】
次のエンドペプチダーゼ：ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＰ３、ＴＬ１、およびブタトリプシンを試験した。酵素は全てクロマトグラフィーで高純度に精製された、即ち、各ペプチダーゼについてクーマシー染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にバンドが１つしか見られなかった。活性がＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−ｐＮＡ基質での最適ｐＨにおける活性の少なくとも半分となるｐＨ値で、各酵素の活性を測定した。これらの基質に関して、ＡＬＣの最適ｐＨはｐＨ９であり、他の３つのペプチダーゼの最適ｐＨはｐＨ１０であった。アッセイ緩衝液は、１００ｍＭのコハク酸、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＣＨＥＳ、１００ｍＭのＣＡＢＳ、１ｍＭのＣａＣｌ2、１５０ｍＭのＫＣｌ、および０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ９．０であった。各ペプチダーゼ希釈液（０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中に希釈）２０μＬをマイクロタイタープレートの１０個のウェルに入れた。各ウェルに１０種類のｐＮＡ基質（５０ｍｇをＤＭＳＯ１．０ｍｌ中に溶解し、更にアッセイ緩衝液で９０倍に希釈した）の１つを２００μＬ添加することによりアッセイを開始した。ＯＤ405の初期増加をペプチダーゼ活性の尺度として監視した。４分の測定時間内に直線的なプロットが達成されなかった場合、ペプチダーゼを更に希釈してアッセイを繰り返した。
【０１４９】
トリプシン比は、ＡｒｇまたはＬｙｓのいずれかを含有する基質での最大活性を、他の８種類の基質のいずれかでの最大活性で割ったものとして計算した。トリプシン様エンドペプチダーゼは、トリプシン比が１００より大きいエンドペプチダーゼと定義した。
【０１５０】
表１６に、活性レベルを、最高活性を有するＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−ｐＮＡ基質での活性に対する活性として示し、更にトリプシン比も示す。アッセイはｐＨ９で行い、試験したペプチダーゼのうちの３つは最適ｐＨがｐＨ９より高いが、ｐＨ９におけるこれらの３つのペプチダーゼの活性は、最適ｐＨにおける活性の半分より高かった。従って、この分析から、アクロモバクター・リティカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓ）プロテアーゼ（ＳＰ３）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（ＴＬ１）、およびブタトリプシンはトリプシン様エンドペプチダーゼであるが、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）（ＡＬＣ）はトリプシン様エンドペプチダーゼでないことが明らかになった。
【０１５１】
表１６．様々なペプチダーゼの活性およびトリプシン比
2012502666.tif 000028
【０１５２】
実施例１７．大豆タンパク質と乳製品タンパク質の組み合わせに由来するＴＬ１加水分解物
単離大豆タンパク質と単離乳製品タンパク質の組み合わせをＴＬ１で異なる加水分解度に加水分解し、その組み合わせの機能特性および官能特性を評価できるようにした。
【０１５３】
単離大豆タンパク質（ＳＵＰＲＯ（登録商標）５００Ｅ）とカゼイン酸ナトリウム（Ａｌａｎａｔｅ１８０、ＮＺＭＰ  Ｉｎｃ．／Ｆｏｎｔｅｒｒａ  Ｃｏ−ｏｐ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．，（Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ））との５０／５０混合物を、穏やかに混合しながら水に分散させることによって、大豆タンパク質と乳製品タンパク質の５％スラリーを作製した。混合物を８０℃に加熱して、５分間保持し、５０℃に冷却し、１ＭのＮａＯＨを使用してｐＨを８．０に調整した。スラリーのアリコートを中速で（ｍｅｄｉｕｍ）混合しながら５０℃に加熱し、様々な量のＴＬ１（インタクトなタンパク質１ｋｇ当たり約１７〜６００ｍｇの酵素タンパク質）を添加して、０％、２％、４％、および６％の目標の％ＤＨ値を達成した。５０℃で、ある一定の時間（約６０分間）インキュベートして所望の加水分解度を得た後、サンプルを９０℃に３分間加熱して、酵素を失活させた。サンプルを氷で冷却し、４℃で貯蔵した。ＴＮＢＳ法（実施例１に記載）を使用して加水分解度（％ＤＨ）を求めた。
【０１５４】
大豆／乳製品ＴＬ１加水分解物のうちの２つ（即ち、４．３％ＤＨおよび６．７％ＤＨ）で、溶解性に対するｐＨの影響を試験した。それぞれのアリコートをｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７、またはｐＨ８に調整し、サンプルを５００×ｇで１０分間遠心分離した。遠心分離前の溶液中の固形分の量を遠心分離後の溶液中の固形分の量と比較して、可溶性固形分指数（ＳＳＩ）を得たが、図１３に％可溶性固形分をｐＨの関数としてプロットしたものを示す。溶液は両方とも、ｐＨ約５（即ち、大豆タンパク質の等電点付近）のｐＨレベルで溶解性が低かった。しかし、大豆／乳製品ＴＬ１加水分解物は両方とも、ｐＨ約６．０以上のレベルで溶解性に優れていた。
【０１５５】
実施例１８．大豆／乳製品のＴＬ１加水分解物中のペプチド断片の分析
実施例１７で調製した大豆／乳製品ＴＬ１加水分解物中のペプチド断片を、上記に詳述した方法（実施例３、４、および１３を参照）を使用して液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により同定した。この分析で同定したペプチド断片の配列を表１７に記載する。４つの新たな大豆由来のペプチドを同定した（即ち、配列番号１７４、１７５、１７６、および１７７）。乳製品由来の配列は配列番号：１７８〜１９７である。
【０１５６】
表１７．大豆／乳製品のＴＬ１加水分解物中のペプチド断片*
2012502666.tif 000029
【０１５７】
（表１７続き）
2012502666.tif 000030
【０１５８】
実施例１９．他のタンパク質材料に由来するＴＬ１加水分解物
他の様々な植物由来のタンパク質材料をＴＬ１で処理し、追加の加水分解物を生成した。これらの加水分解物は小スケール（すなわち、ベンチトップ）で製造された。このために、キャノーラタンパク質、小麦グルテンタンパク質、またはコーン胚芽タンパク質のいずれかの５％スラリーを８０℃より高い温度で５分間変性させた。タンパク質スラリーを水酸化ナトリウム溶液または水酸化カリウム溶液などのアルカリ水溶液またはアルカリ土類水溶液で中和して、ｐＨ約８．０〜８．５にした。次いで、タンパク質材料を加水分解するのに十分な温度と時間で、各タンパク質スラリーをＴＬ１酵素で処理した。タンパク質カードの重量ベースに基づいて０．０１％〜０．０８％の酵素タンパク質濃度でＴＬ１酵素をタンパク質スラリーに添加した。約５０℃の温度で５０分間〜７０分間、酵素をタンパク質カード材料と接触させてタンパク質を加水分解した。加水分解大豆タンパク質材料を、酵素を有効に失活させる温度に加熱することによって加水分解反応を終了させた。
【０１５９】
表１８は、典型的な１組の加水分解物を得るための反応パラメータを示す。ＴＬ１酵素の活性は、アミノ基のモル数に基づいて測定した。ＴＮＢＳ値の増加は酵素活性を示す。酵素活性は各タンパク質に最適化されていないが、酵素活性はタンパク質材料の懸濁または溶解性の影響を受けるように見られた。
【０１６０】
表１８．反応パラメータ
2012502666.tif 000031
【０１６１】
標準的な方法を使用してＳＤＳ  ＰＡＧＥにより、ＴＬ１キャノーラ加水分解物、ＴＬ１コーン加水分解物、またはＴＬ１小麦加水分解物、および非加水分解対照サンプルを分析した。図１４はゲルの画像を示す。この分析から、各タンパク質材料の主要なタンパク質サブユニットは全て、ＴＬ１によって切断されることが明らかになった。
【０１６２】
上記に詳述した方法を使用してキャノーラＴＬ１加水分解物、コーンＴＬ１加水分解物、または小麦ＴＬ１加水分解物中の代表的なペプチドを同定した。表１９、表２０、および表２１はそれぞれ、キャノーラ、コーン、および小麦のＴＬ１加水分解物中の同定された代表的なペプチドを示す。
【０１６３】
表１９．キャノーラのＴＬ１加水分解物中のペプチド
2012502666.tif 000032
【０１６４】
（表１９続き）
2012502666.tif 000033
【０１６５】
表２０．コーン（トウモロコシ）のＴＬ１加水分解物中のペプチド
2012502666.tif 000034
【０１６６】
表２１．小麦のＴＬ１加水分解物中のペプチド
2012502666.tif 000035
【０１６７】
実施例２０．大豆加水分解物とインタクトな乳製品タンパク質の組み合わせの官能分析
大豆のＴＬ１加水分解物をインタクトな乳製品タンパク質（すなわち、カゼイン酸塩または乳清）と混合した。上記の実施例６で詳述したＳＱＳ法を使用して、これらの大豆加水分解物とインタクトな乳製品タンパク質との組み合わせの官能特性を、非加水分解（インタクトな）大豆とインタクトな乳製品タンパク質との組み合わせと比較した。約２．１％ＤＨの加水分解度を有するＴＬ１大豆加水分解物を希釈して５％スラリーとした。非加水分解大豆タンパク質も希釈して５％スラリーとした。１つの試験では、ＴＬ１加水分解物をカゼイン酸ナトリウムと（１：１）混合し、非加水分解大豆タンパク質をカゼインナトリウム塩と（１：１）混合したものである対照サンプルと比較して評価した。第２の試験では、ＴＬ１加水分解物を甘味乳製品乳清（４：１）と混合し、非加水分解大豆タンパク質を甘味乳製品乳清と（４：１）混合したものである対照サンプルと比較して評価した。
【０１６８】
表２２は、各サンプルの平均ＳＱＳスコアおよび診断評価を示す。ＴＬ１加水分解物を含む組み合わせは、概ね、対照サンプルと僅かな差があると評価された。診断スコアから、ＴＬ１加水分解物とインタクトな乳製品タンパク質との組み合わせは、対照サンプル（即ち、非加水分解大豆とインタクトな乳製品タンパク質との組み合わせ）と比較して改善された官能特性を有することが分かった。
【０１６９】
表２２．ＳＱＳ分析
2012502666.tif 000036
【０１７０】
実施例２１．タンパク質加水分解物（Ｓｕｐｒｏ（登録商標）ＸＦ８０２０）を含む冷菓の分析
ＴＬ１大豆加水分解物、Ｓｕｐｒｏ（登録商標）ＸＦ８０２０を様々な置換レベルで使用して、アイスクリームに類似する冷菓製品を調製した。まず、ステンレス鋼製の容器内で水にリン酸塩を添加し、１００°Ｆに加熱することによって、各「アイスクリーム」サンプルを作製した。望ましい量のタンパク質加水分解物（Ｓｕｐｒｏ（登録商標）ＸＦ８０２０）を添加し、タンパク質を分散および水和させるために、プロペラタイプのミキサーを使用して中速で５〜１０分間成分を混合した。タンパク質を完全に分散させた後、スラリー温度を１８０°Ｆに上昇させ、スラリーを低速で５分間混合した。タンパク質スラリーに糖と固形コーンシロップを添加して、中速で更に３分間混合し続けた。次いで、ヘビークリームとポリソルベート６０を添加し、合わせた成分を中速で３〜５分間、成分が完全に分散するまで混合した。次いで、混合物を１８０°Ｆで、保持時間３０秒で低温殺菌した。低温殺菌後、２段式シングルピストンホモジナーザーを、２段目を５００ｐｓｉに、１段目を２５００ｐｓｉに設定して使用し、混合物を均質化した。均質化した後、予め滅菌したＮａｌｇｅｎｅ（登録商標）ボトルに混合物を捕集し、直ぐに氷浴に入れ、その中で３０分間保持した。冷却したボトルを３５°Ｆのウォークイン型冷蔵庫に入れ、一晩貯蔵した。凍結前に、バニラフレーバーを冷却した混合物とブレンドした。次いで、香味を付けた混合物をＴａｙｌｏｒ  Ｂａｔｃｈ  Ｉｃｅ  Ｃｒｅａｍ  Ｆｒｅｅｚｅｒに投入し、混合物の凍結を７分間にわたって行い、２４°Ｆ〜２６°Ｆの温度に達した。フリーザーから混合物を排出し、適切なラベルの付いた１パイントのＳｗｅｅｔｈｅａｒｔ  Ｋ１６Ａカップに充填包装する。サンプルカップをプラスチックトレー上に底部を上にして置き、−２０°Ｆのブラストフリーザーに一晩入れ、０°Ｆのフリーザーに移して評価するまで貯蔵した。
【０１７１】
表２３〜表２７は、タンパク質加水分解物で１０％、２０％、３０％、４０％、および５０％置換した場合のサンプルの配合を示す。
【０１７２】
表２３．１０％タンパク質加水分解物（Ｓｕｐｒｏ（登録商標）ＸＦ８０２０）を有する冷菓の配合
2012502666.tif 000037
【０１７３】
表２４．２０％タンパク質加水分解物（Ｓｕｐｒｏ（登録商標）ＸＦ８０２０）を有する冷菓製品の配合
2012502666.tif 000038
【０１７４】
表２５．３０％タンパク質加水分解物（Ｓｕｐｒｏ（登録商標）ＸＦ８０２０）を有する冷菓製品の配合
2012502666.tif 000039
【０１７５】
表２６．４０％タンパク質加水分解物（Ｓｕｐｒｏ（登録商標）ＸＦ８０２０）を有する冷菓製品の配合
2012502666.tif 000040
【０１７６】
表２７．５０％タンパク質加水分解物（Ｓｕｐｒｏ（登録商標）ＸＦ８０２０）を有する冷菓製品の配合
2012502666.tif 000041
【０１７７】
官能スペクトル記述的プロファイル（Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）法で訓練された７人のパネリストがサンプルをトリプリケートで評価した。評価の目的は、本発明に従って配合および製造された大豆タンパク質「アイスクリーム」製品の香味特性を、１００％乳製品を用いて調製されたバニラアイスクリームの香味特性と比較して定量化することであった。各サンプルで１９の香味特性を１５点強度スケールで評価したが、０は、なし／該当せずを表し、１５は非常に強い／高いを表す。サンプルで調べた香味特性、香味特性の定義、および使用した香味強度スケール基準サンプルを表２８に記載する。
【０１７８】
表２８．バニラフレーバーの冷菓の用語集
2012502666.tif 000042
【０１７９】
（表２８続き）
2012502666.tif 000043
【０１８０】
表２９は、対照（１００％乳製品）と比較した５つのサンプル（１０％、２０％、３０％、４０％、および５０％）に関するパネリストの平均強度スコアを示す。
【０１８１】
表２９．Ｓｕｐｒｏ（登録商標）ＸＦ８０２０を含有するサンプルの香味特性の平均スコア
2012502666.tif 000044
【０１８２】
図１５と表２９の両方に示すように、置換レベルが２０％以上になるまで、サンプル中に大豆タンパク質の存在は検出されなかった。サンプルが５０％大豆タンパク質を含んだ場合でも、大豆の香味の強さは１５点スケールで２．０の強度レベル以下にとどまった。実際、ミルク臭、乳脂肪臭、カラメル化臭、およびバニラ複合臭の芳香は全て、大豆/豆臭と比較して強かった。更に、大豆で１０％置換した場合、１００％乳製品と比較して、ミルク臭の芳香が僅かだけ弱くなり、一方、バニラ複合臭およびバニラ/バニリン臭の香味は、大豆で１０％置換した場合、僅かに強くなったが、大豆での置換レベルが２０％以上に上昇すると、弱くなった。
【０１８３】
図１７は、バニラフレーバーの冷菓を試食する意欲があるものとして採用された３５〜５４歳の７４人の消費者の別々のパネルによって評価された、１０％、２０％、および４０％の大豆タンパク質含有レベルにおける大豆タンパク質サンプルの受容性を示す。サンプルは、均衡のとれた逐次的１点方式で各消費者に提供され、各サンプルは個々に出され、次のサンプルを評価する前に片付けられた。標準的官能試験手順と一致するように、出す順番の影響による偏りを最小限にするため、出す順番を交代して均衡させた。
【０１８４】
図１７のグラフに示すように、サンプル製品に対する平均の全体的な好み、外観の好み、香味の好み、口当たりの好み、および後味の好みの反応は、１０％および２０％大豆タンパク質を含有する場合、全部乳製品のアイスクリーム対照サンプルのものと同等であったが、４０％含有する場合、平均の好みのスコアは僅かに低下した。
【０１８５】
この実施例から、乳製品の代わりにある一定の量の大豆タンパク質加水分解物を含むアイスクリームに類似する冷菓製品は、１００％乳製品を含有する冷菓製品の代替の冷菓として好ましく受け入れられる可能性があることが分かる。
【０１８６】
実施例２２．Ｓｕｐｒｏ（登録商標）１２０を含む冷菓の分析
Ｓｕｐｒｏ（登録商標）１２０を様々な置換レベル−１０％、２０％、３０％、４０％、および５０％で使用して、アイスクリームに類似する冷菓製品を調製した。まず、ステンレス鋼製の容器内で水にリン酸塩を添加し、１００°Ｆに加熱することによって、各「アイスクリーム」サンプルを作製した。望ましい量のＳｕｐｒｏ（登録商標）１２０を添加し、タンパク質を分散および水和させるために、プロペラタイプのミキサーを使用して中速で５〜１０分間成分を混合した。タンパク質を完全に分散させた後、スラリー温度を１８０°Ｆに上昇させ、スラリーを低速で５分間混合した。タンパク質スラリーに糖と固形コーンシロップを添加して、中速で更に３分間混合し続けた。混合物にヘビークリームとポリソルベート６０を添加し、合わせた成分を中速で３〜５分間、成分が完全に分散するまで混合した。次いで、混合物を１８０°Ｆで、保持時間３０秒で低温殺菌した。低温殺菌後、２段式シングルピストンホモジナーザーを、２段目を５００ｐｓｉに、１段目を２５００ｐｓｉに設定して使用し、混合物を均質化した。均質化した後、予め滅菌したＮａｌｇｅｎｅ（登録商標）ボトルに混合物を捕集し、直ぐに氷浴に入れ、３０分間保持した。冷却したボトルを３５°Ｆのウォークイン型冷蔵庫に入れ、一晩貯蔵した。凍結前に、バニラフレーバーを冷却した混合物とブレンドした。次いで、香味を付けた混合物をＴａｙｌｏｒ  Ｂａｔｃｈ  Ｉｃｅ  Ｃｒｅａｍ  Ｆｒｅｅｚｅｒに投入し、混合物の凍結を７分間にわたって行い、２４°Ｆ〜２６°Ｆの温度に達した。フリーザーから混合物を排出し、適切なラベルの付いた１パイントのＳｗｅｅｔｈｅａｒｔ  Ｋ１６Ａカップに充填包装する。サンプルカップをプラスチックトレー上に底部を上にして置き、−２０°Ｆのブラストフリーザーに一晩入れ、０°Ｆのフリーザーに移して評価するまで貯蔵した。
【０１８７】
表３０〜表３４は、タンパク質単離物で１０％、２０％、３０％、４０％、および５０％置換した場合のサンプルの配合を示す。
【０１８８】
表３０．１０％Ｓｕｐｒｏ（登録商標）１２０を有する冷菓製品の配合
2012502666.tif 000045
【０１８９】
表３１．２０％Ｓｕｐｒｏ（登録商標）１２０を有する冷菓製品の配合
2012502666.tif 000046
【０１９０】
表３２．３０％Ｓｕｐｒｏ（登録商標）１２０を有する冷菓製品の配合
2012502666.tif 000047
【０１９１】
表３３．４０％Ｓｕｐｒｏ（登録商標）１２０を有する冷菓製品の配合
2012502666.tif 000048
【０１９２】
表３４．５０％Ｓｕｐｒｏ（登録商標）１２０を有する冷菓製品の配合
2012502666.tif 000049
【０１９３】
官能スペクトル記述的プロファイル法で訓練された７人のパネリストがサンプルをトリプリケートで評価した。評価の目的は、本発明に従って配合および製造されたアイスクリームに類似する大豆タンパク質製品の香味特性を、１００％乳製品を用いて調製されたバニラアイスクリームの香味特性と比較して定量化することであった。各サンプルで１９の香味特性を１５点強度スケールで評価したが、０は、なし／該当せずを表し、１５は非常に強い／高いを表す。サンプルで調べた香味特性、香味特性の定義、および使用した香味強度スケール基準サンプルは上記の表２８に記載している。
【０１９４】
図１６に示すように、置換レベルが３０％以上になるまで、サンプル中にＳｕｐｒｏ（登録商標）１２０の存在は検出されなかった。サンプルが５０％大豆タンパク質を含んだ場合でも、大豆の香味の強さは１５点スケールで２．５以下にとどまった。実際、５０％大豆を含有する場合でも、ミルク臭、カラメル化臭、およびバニラ複合臭の芳香は全て、大豆/豆臭と比較して強かった。更に、大豆で２０％置換した場合、１００％乳製品と比較して、ミルク臭およびカラメル化臭の芳香は僅かだけ弱かった。
【０１９５】
図１８は、バニラフレーバーの冷菓を試食する意欲があるものとして採用された３５〜５４歳の７４人の消費者の別々のパネルによって評価された、１０％、２０％、および４０％のＳｕｐｒｏ（登録商標）１２０含有レベルにおける大豆タンパク質サンプルの受容性を示す。サンプルは、均衡のとれた逐次的１点方式で各消費者に提供され、各サンプルは個々に出され、次のサンプルを評価する前に片付けられた。標準的官能試験手順と一致するように、出す順番の影響による偏りを最小限にするため、出す順番を交代して均衡させた。
【０１９６】
図１８のグラフに示すように、サンプルに対する平均の全体的な好み、色の好み、香味の好み、口当たりの好み、および後味の好みの反応は、全部乳製品の対照サンプルのものと同等であるか、またはそれより高かった。例えば、１０％大豆タンパク質を含有する場合、全体的な好み、外観の好み、香味の好み、口当たりの好み、および後味の好みの平均スコアは全て、全部乳製品の対照サンプルのものと同等であるか、またはそれより高かった。２０％大豆タンパク質を含有する場合、外観の好みのスコアは、全部乳製品の対照サンプルのものより高かったが、全体的な好み、香味の好み、口当たりの好み、および後味の好みの平均スコアはほんの僅かだけ低かった。４０％大豆タンパク質を含有する場合、外観の好みと口当たりの好みのスコアは、全部乳製品の対照サンプルのものより僅かだけ低かった。
【０１９７】
この実施例から、乳製品の代わりにある一定の量のＳｕｐｒｏ（登録商標）１２０を含むアイスクリームに類似する冷菓製品は、１００％乳製品を含有する冷菓製品の代替の冷菓として好ましく受け入れられる可能性があることが分かる。
【０１９８】
実施例２３．Ｓｕｐｒｏ（登録商標）７６０を含む冷菓の分析
Ｓｕｐｒｏ（登録商標）７６０を様々な置換レベル−１０％、２０％、３０％、４０％、および５０％で使用して、アイスクリームに類似する冷菓製品を調製した。まず、ステンレス鋼製の容器内で水にリン酸塩を添加し、１００°Ｆに加熱することによって、各サンプルを作製した。望ましい量のＳｕｐｒｏ（登録商標）７６０を添加し、タンパク質を分散および水和させるために、プロペラタイプのミキサーを使用して中速で５〜１０分間成分を混合した。タンパク質を完全に分散させた後、スラリー温度を１８０°Ｆに上昇させ、スラリーを低速で５分間混合した。タンパク質スラリーに糖と固形コーンシロップを添加して、中速で更に３分間混合し続けた。次いで、ヘビークリームとポリソルベート６０を添加し、合わせた成分を中速で３〜５分間、成分が完全に分散するまで混合した。次いで、混合物を１８０°Ｆで、保持時間３０秒で低温殺菌した。低温殺菌後、２段式シングルピストンホモジナーザーを、２段目を５００ｐｓｉに、１段目を２５００ｐｓｉに設定して使用し、混合物を均質化した。均質化した後、予め滅菌したＮａｌｇｅｎｅ（登録商標）ボトルに混合物を捕集し、直ぐに氷浴に入れ、３０分間保持した。冷却したボトルを３５°Ｆのウォークイン型冷蔵庫に入れ、一晩貯蔵した。凍結前に、バニラフレーバーを冷却した混合物とブレンドした。次いで、香味を付けた混合物をＴａｙｌｏｒ  Ｂａｔｃｈ  Ｉｃｅ  Ｃｒｅａｍ  Ｆｒｅｅｚｅｒに投入し、混合物の凍結を７分間にわたって行い、２４°Ｆ〜２６°Ｆの温度に達した。フリーザーから混合物を排出し、適切なラベルの付いた１パイントのＳｗｅｅｔｈｅａｒｔ  Ｋ１６Ａカップに充填包装する。サンプルカップをプラスチックトレー上に底部を上にして置き、−２０°Ｆのブラストフリーザーに一晩入れ、０°Ｆのフリーザーに移して評価するまで貯蔵した。
【０１９９】
表３５〜表３９は、タンパク質単離物で１０％、２０％、３０％、４０％、および５０％置換した場合のサンプルの配合を示す。
【０２００】
表３５．１０％Ｓｕｐｒｏ（登録商標）７６０を有する冷菓製品の配合
2012502666.tif 000050
【０２０１】
表３６．２０％Ｓｕｐｒｏ（登録商標）７６０を有する冷菓製品の配合
2012502666.tif 000051
【０２０２】
表３７．３０％Ｓｕｐｒｏ（登録商標）７６０を有する冷菓製品の配合
2012502666.tif 000052
【０２０３】
表３８．４０％Ｓｕｐｒｏ（登録商標）７６０を有する冷菓製品の配合
2012502666.tif 000053
【０２０４】
表３９．５０％Ｓｕｐｒｏ（登録商標）７６０を有する冷菓製品の配合
2012502666.tif 000054
【０２０５】
官能スペクトル記述的プロファイル法で訓練された７人のパネリストがサンプルをトリプリケートで評価した。評価の目的は、本発明に従って配合および製造された大豆タンパク質「アイスクリーム」製品の受容レベルを、１００％乳製品を用いて調製されたバニラアイスクリームの受容レベルと比較して判定することであった。各サンプルで１９の香味特性を１５点強度スケールで評価したが、０は、なし／該当せずを表し、１５は非常に強い／高いを表す。サンプルで調べた香味特性、香味特性の定義、および使用した香味強度スケール基準サンプルは上記の表２８に記載している。
【０２０６】
表４０は、対照（１００％乳製品）と比較した５つのサンプル（１０％、２０％、３０％、４０％、および５０％）に関するパネリストの平均強度スコアを示す。
【０２０７】
表４０．Ｓｕｐｒｏ（登録商標）７６０を含有するサンプルの香味特性の平均スコア
2012502666.tif 000055
【０２０８】
図１７と表４０の両方に示すように、置換レベルが５０％になるまで、サンプル中にＳｕｐｒｏ（登録商標）７６０の存在は検出されなかった。サンプルが５０％大豆タンパク質を含んだ場合でも、大豆香味の強さは１５点スケールで２．０以下にとどまった。実際、ミルク臭、カラメル化臭、およびバニラ複合臭の芳香は全て、５０％大豆を含有する場合でも、大豆/豆臭と比較して強かった。更に、大豆で２０％置換した場合、１００％乳製品と比較してミルク臭の芳香はわずか僅かだけ弱かった。
【０２０９】
図２０は、バニラフレーバーの冷菓を試食する意欲があるものとして採用された３５〜５４歳の７４人の消費者の別々のパネルによって評価された、１０％、２０％、および４０％のＳｕｐｒｏ（登録商標）７６０含有レベルにおける大豆タンパク質サンプルの受容性を示す。サンプルは、均衡のとれた逐次的１点方式で各消費者に提供され、各サンプルは個々に出され、次のサンプルを評価する前に片付けられた。標準的官能試験手順と一致するように、出す順番の影響による偏りを最小限にするため、出す順番を交代して均衡させた。
【０２１０】
図２０のグラフに示すように、大豆タンパク質製品を含むサンプルに対する全体的な好み、外観、香味、口当たり、および後味の好みの反応は、全部乳製品の対照サンプルのものと同等であった。例えば、１０％大豆タンパク質を含有する場合、全体的な好み、外観の好み、香味の好み、口当たりの好み、および後味の好みの平均スコアは全て、全部乳製品の対照サンプルのものと同等であるか、またはそれより僅かだけ低かった。２０％大豆タンパク質を含有する場合、外観の好み、全体的な好み、香味の好み、口当たりの好み、および後味の好みの平均スコアは、９５％の信頼度で統計学的に全部乳製品の対照サンプルのものより低かった。４０％大豆タンパク質を含有する場合、外観の好みおよび口当たりの好みのスコアは、同様に、９５％の信頼度で統計学的に全部乳製品の対照サンプルのものより低かった。
【０２１１】
この実施例から、乳製品の代わりにある一定の量のＳｕｐｒｏ（登録商標）７６０を含む冷菓製品は、１００％乳製品を含有する冷菓製品の代替の冷菓として好ましく受け入れられる可能性があることが分かる。
【０２１２】
実施例２４および２５.  大豆タンパク質スラリーを含む冷菓の分析
大豆タンパク質スラリーを１００％の乳製品置換レベルで使用して、アイスクリームに類似する冷菓製品を調製した。まず、ステンレス鋼製の容器内で水にリン酸塩を添加し、１００°Ｆに加熱することによって、各サンプルを作製した。望ましい量の大豆タンパク質スラリーを添加し、タンパク質を分散および水和させるために、プロペラタイプのミキサーを使用して中速で５〜１０分間成分を混合した。タンパク質を完全に分散させた後、スラリー温度を１８０°Ｆに上昇させ、スラリーを低速で５分間混合した。タンパク質スラリーに糖と固形コーンシロップを添加して、中速で更に３分間混合し続けた。次いで、ヤシ油、モノグリセリドおよびジグリセリド、並びにポリソルベート６０を添加し、合わせた成分を中速で３〜５分間、成分が完全に分散するまで混合した。次いで、混合物を１８０°Ｆで、保持時間３０秒で低温殺菌した。低温殺菌後、２段式シングルピストンホモジナーザーを、２段目を３０００ｐｓｉに、１段目を２５００ｐｓｉに設定して使用し、混合物を均質化した。均質化した後、予め滅菌したＮａｌｇｅｎｅ（登録商標）ボトルに混合物を捕集し、直ぐに氷浴に入れ、３０分間保持した。冷却したボトルを３５°Ｆのウォークイン型冷蔵庫に入れ、一晩貯蔵した。凍結前に、バニラフレーバーを冷却した混合物とブレンドした。次いで、香味を付けた混合物をＴａｙｌｏｒ  Ｂａｔｃｈ  Ｉｃｅ  Ｃｒｅａｍ  Ｆｒｅｅｚｅｒに投入し、混合物の凍結を７分間にわたって行い、２４°Ｆ〜２６°Ｆの温度に達した。フリーザーから混合物を排出し、適切なラベルの付いた１パイントのＳｗｅｅｔｈｅａｒｔ  Ｋ１６Ａカップに充填包装する。サンプルカップをプラスチックトレー上に底部を上にして置き、−２０°Ｆのブラストフリーザーに一晩入れ、０°Ｆのフリーザーに移して評価するまで貯蔵した。
【０２１３】
表４１は、タンパク質スラリーで１００％置換したサンプルの配合を示す。
【０２１４】
表４１．１００％タンパク質スラリーを有する冷菓製品の配合
2012502666.tif 000056
【０２１５】
官能スペクトル記述的プロファイル法で訓練された６人のパネリストがサンプルをトリプリケートで評価した。香味特性の定義は表２８に記載している。平均の香味特性強度を下記の表４２に要約する。
【０２１６】
図２１は、Ｓｕｐｒｏ（登録商標）１２０、Ｓｕｐｒｏ（登録商標）ＸＦ８０２０で乳製品を１００％置換したものであり、市販の全植物性の冷菓であるＳｏｙ  Ｄｅｌｉｃｉｏｕｓと比較している。
【０２１７】
表４２は、図２１に示すパネリストの平均強度スコアを示す。
2012502666.tif 000057
【０２１８】
消費者受容性データの結果から、Ｓｕｐｒｏ  ＸＦ（実施例２４）で製造したバニラ冷菓の平均スコアは、試験したどの嗜好（Ｈｅｄｎｉｃ）に関しても、即ち、全体的な好み、外観の好み、香味の好み、テクスチャーの好み、および後味の好みに関しても、Ｓｏｙ  Ｄｅｌｉｃｉｏｕｓバニラ冷菓より著しく高い（より好まれる）ことが分かる。
【０２１９】
Ｓｕｐｒｏ  １２０（実施例２５）で製造したバニラ冷菓と比較して、Ｓｕｐｒｏ  ＸＦ（実施例２４）の平均スコアは、全体的な好み、香味の好み、および後味の好みに関して著しく高い。
【０２２０】
本発明を例示的な実施形態に関連して説明してきたが、説明を読めば当業者には本発明の様々な変更が明らかとなることを理解すべきである。従って、本明細書に開示される本発明は、添付の特許請求の範囲に入るこのような変更を包含するものとすることを理解すべきである。
【図１】
2012502666.tif 000058
【図２Ａ】
2012502666.tif 000059
【図２Ｂ】
2012502666.tif 000060
【図３Ａ】
2012502666.tif 000061
【図３Ｂ】
2012502666.tif 000062
【図４Ａ】
2012502666.tif 000063
【図４Ｂ】
2012502666.tif 000064
【図４Ｃ】
2012502666.tif 000065
【図５】
2012502666.tif 000066
【図６】
2012502666.tif 000067
【図７】
2012502666.tif 000068
【図８】
2012502666.tif 000069
【図９】
2012502666.tif 000070
【図１０Ａ】
2012502666.tif 000071
【図１０Ｂ】
2012502666.tif 000072
【図１０Ｃ】
2012502666.tif 000073
【図１０Ｄ】
2012502666.tif 000074
【図１１】
2012502666.tif 000075
【図１２】
2012502666.tif 000076
【図１３】
2012502666.tif 000077
【図１４】
2012502666.tif 000078
【図１５】
2012502666.tif 000079
【図１６】
2012502666.tif 000080
【図１７】
2012502666.tif 000081
【図１８】
2012502666.tif 000082
【図１９】
2012502666.tif 000083
【図２０】
2012502666.tif 000084
【図２１】
2012502666.tif 000085
【国際調査報告】
2012502666.tif 000086
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2012502666.tif 000088