(57)【要約】  本発明は、ＤＮＡ損傷を誘導または増強すると推定される物質の存在を検出するための方法であって、（ヒトＧＡＤＤ４５α遺伝子プロモーターと、ＤＮＡ損傷に応答してＤＮＡ配列の発現を活性化するために配列されたヒトＧＡＤＤ４５α遺伝子調節エレメントとに機能的に結合したガウシア・ルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）レポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有する）細胞を物質に曝露させるステップと、前記細胞からの前記ＧＬｕｃレポータータンパク質の発現を測定するステップとを含む方法に関する。本発明はさらに、当該方法によって使用できる発現カセット、ベクターおよび細胞ならびに本発明の方法のアッセイおよび好ましい実施形態において使用できる改変培地にも関する。
2012524523.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガウシア・ルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）レポータータンパク質およびその誘導体をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットであって、前記ＤＮＡ配列は、ゲノム損傷に応答してガウシア・ルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）レポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列の発現を活性化するように配列されたヒトＧＡＤＤ４５α遺伝子調節エレメントと、ヒトＧＡＤＤ４５α遺伝子プロモーターとに機能的に連結している発現カセット。
【請求項２】
前記調節エレメントは、前記ＧＡＤＤ４５α遺伝子のエクソン１、エクソン２、エクソン３、および／もしくはエクソン４、もしくはそれらの少なくとも１つの領域、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項３】
前記調節エレメントは、前記ＧＡＤＤ４５α遺伝子のエクソン１の少なくとも１つの領域、前記ＧＡＤＤ４５α遺伝子のエクソン３の少なくとも１つの領域と、前記ＧＡＤＤ４５α遺伝子のエクソン４の少なくとも１つの領域とを含む、請求項２に記載の発現カセット。
【請求項４】
前記調節エレメントは、前記ＧＡＤＤ４５α遺伝子のイントロン１、イントロン２、および／もしくはイントロン３、もしくはそれらの少なくとも１つの領域、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の発現カセット。
【請求項５】
前記調節エレメントは、前記ＧＡＤＤ４５α遺伝子のイントロン３の少なくとも１つの領域を含む、請求項４に記載の発現カセット。
【請求項６】
前記調節エレメントは、推定ｐ５３結合モチーフを含む、請求項５に記載の発現カセット。
【請求項７】
前記調節エレメントは、推定ＡＰ−１モチーフを含む、請求項５または６に記載の発現カセット。
【請求項８】
前記ゲノム損傷はＤＮＡ損傷である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の発現カセット。
【請求項９】
ガウシア・ルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＤＮＡ配列は配列番号１の位置２６４１〜３１９８に示されたものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の発現カセット。
【請求項１０】
実質的に図２に示され、配列番号２により提供されている、発現カセットＧＤ５３２−ＧＬｕｃ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の発現カセットを含む組換えベクター。
【請求項１２】
実質的に図２に示され、配列番号１により提供されている、組換えベクターｐＥＰ−ＧＤ５３２−ＧＬｕｃ。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の発現カセットまたは請求項１１もしくは１２のいずれか１項に記載の組換えベクターを含有する細胞。
【請求項１４】
前記細胞は、ヒト細胞である、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
前記細胞は、完全に機能的なｐ５３を有するヒト細胞である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
前記細胞は、ＴＫ６ヒト細胞株である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
ゲノム損傷を誘導または増強する物質の存在について検出する方法であって、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の細胞を物質に曝露させるステップと、前記細胞からのＧＬｕｃレポータータンパク質の発現を測定するステップとを含む方法。
【請求項１８】
前記物質は、生体を前記物質に曝露させることが安全かどうかを評価するためにさらにスクリーニングされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記物質は、候補薬剤、食品添加物または化粧品である、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１３〜１６に記載の細胞の集団、または請求項１１もしくは１２に記載の組換えベクターによりトランスフェクトされた細胞を調製するステップと、前記細胞を規定時間にわたり前記物質とともにインキュベートするステップと、前記ＧＬｕｃレポータータンパク質の発現を前記細胞のサンプルから直接測定するステップとを含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法は、Ｓ９肝抽出物の存在下で実施される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記集団内の細胞密度は、細胞染色を使用して決定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞染色は、シアニン色素である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記シアニン色素は、チアゾールオレンジである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＧＬｕｃレポータータンパク質の発現は、前記試験化合物への曝露の４６〜５０時間後に測定される、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノム損傷を誘導または増強する物質を検出するための方法、ならびに当該方法において使用できる分子およびトランスフェクト細胞株に関する。詳細には、本発明は、ヒト細胞培養およびその他の哺乳動物細胞株におけるゲノム損傷を検出するためのバイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム損傷は、様々な物質、例えば紫外線、Ｘ線、フリーラジカル、メチル化剤およびその他の突然変異誘発化合物によって誘導されるＤＮＡ損傷を通して発生する可能性がある。ゲノム内の染色体の数は、異数性誘発物質（ａｎｅｕｇｅｎｓ）として公知の化合物によって変化させられることがある。ＤＮＡ損傷および／または異数性誘発性は、さらにまたＤＮＡ（ポリメラーゼおよびトポイソメラーゼを包含する）と相互作用する酵素およびタンパク質に影響を及ぼす物質または原変異原（変異原性になるように代謝され得る物質）のいずれかによって間接的に誘導される可能性もある。これらの物質のいずれかは、微生物の遺伝コードを含むＤＮＡに対する損傷を引き起こし、遺伝子内の突然変異を引き起こす可能性がある。動物では、当該の突然変異または染色体数の変化は発がん現象を引き起こすことがある、または配偶子を損傷させて子孫における先天性欠陥を生じさせることがある。当該のＤＮＡ損傷物質は、集合的に遺伝毒性物質として公知の可能性がある。
【０００３】
これらのＤＮＡ損傷物質は、ＤＮＡを含むヌクレオチドを化学的に修飾し、ヌクレオチドを結合するホスホジエステル結合を破壊する、または塩基間の結び付き（Ｔ−ＡまたはＣ−Ｇ）を崩壊させる可能性がある。その他のゲノム損傷物質は、ＤＮＡの構造的成分（例、ヒストン）、核および細胞分割の機序（例、スピンドル形成）、または例えばトポイソメラーゼおよびポリメラーゼなどのゲノム維持系に影響を及ぼす可能性がある。これらのＤＮＡ損傷物質の作用に対抗するために、細胞は、多数の機序を進化させてきた。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＳＯＳ応答は、損傷したＤＮＡを修復するＤＮＡ修復酵素を包含する一連のタンパク質が発現する、ＤＮＡ損傷によって誘導されることが明確に特徴付けられた細胞応答である。哺乳動物では、例えばヌクレオチド除去修復および塩基除去修復機序などの系はＤＮＡ損傷修復において顕著な役割を果たし、そして巨大なＤＮＡ付加物および修飾塩基を除去するための一次機序であるが、他方では非均質な末端結合および均質な組換えは鎖分解の修復において重要である。これらの系の大多数は、細胞分割を通して進行する前に細胞が修復するのを許容するために細胞周期の停止もまた生じさせる。
【０００４】
どの物質がゲノム損傷を誘導または増強するのかを同定することが重要である極めて多数の状況がある。ヒトをこれらの物質に曝露させるのが安全であるかどうかを判定する場合には、ゲノム損傷を誘導する物質を検出することが特に重要である。例えば、これらの物質を検出する方法は、当該の化合物がゲノム損傷を誘導するか否かを判定するための候補の医薬品、食品添加物または化粧品である化合物をスクリーニングするための遺伝毒性アッセイとして使用できる。または、ゲノム損傷物質を検出する方法は、変異原化合物を含有する汚染物質による上水道の汚染について監視するために使用できる。
【０００５】
物質の遺伝毒性を決定するために、様々な方法、例えばエームズ（Ａｍｅｓ）試験、インビトロ小核試験およびマウスリンパ腫アッセイ（ＭＬＡ）が公知であるが、多数の理由から不十分である。例えば、サンプルのインキュベーションには数週間を要し、もっと短い時間枠で遺伝毒性データを入手するのが望ましいことが多い。さらに、ＤＮＡ損傷を検出する多数の公知の方法（エームズ試験および関連方法を包含する）は、誤修復ＤＮＡ（突然変異および組換え）形態またはフラグメント化ＤＮＡの形態にある未修復損傷のいずれかでのエンドポイントとして持続性ＤＮＡ損傷をアッセイする。しかし、大多数のＤＮＡ損傷は、当該のエンドポイントを測定できる前に修復され、持続性ＤＮＡ損傷は、修復機序が満たされる条件が極めて厳しい場合にのみ発生する。ＤＮＡ損傷は、正しく修復される、または突然変異が生じるように不正確に修復されることがある。この突然変異エンドポイントは、ＤＮＡ修復後に測定できる。例えばＤＮＡ二本鎖切断などの持続性ＤＮＡ損傷は、致死性である。
【０００６】
改良された遺伝毒性試験は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの発光レポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列に機能的に結合した、ＤＮＡ損傷に応答して遺伝子発現を活性化する酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｉｅ）調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子に関連する国際特許出願公開第９８／４４１４９号明細書に開示されている。当該のＤＮＡ分子は、ＤＮＡ損傷を誘導または増強する物質の存在について検出するための遺伝毒性試験において使用するために、酵母細胞を形質転換させるために使用できる。細胞を物質に曝露させることができ、該細胞由来の発光レポータータンパク質（ＧＦＰ）の発現は、該物質がＤＮＡ損傷を誘導することを示す。国際特許出願公開第９８／４４１４９号明細書に記載された遺伝毒性試験は、エンドポイントに到達することを防止できる修復活性の誘導を検出する。このため国際特許出願公開第９８／４４１４９号明細書に記載した方法は、ＤＮＡ損傷物質の存在を検出するために使用できる。
【０００７】
米国特許第６，３４４，３２４号明細書は、ＧＦＰをコードするＤＮＡ配列に結合した、広範囲の細胞ストレス条件に応答して遺伝子発現を活性化するハムスターＧＡＤＤ１５３上流プロモーター領域の調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子について開示している。このレポーター系は、ヒト頭頸部扁平細胞癌細胞株内で実施される。しかし、このレポーター系に関連する問題は、続くフローサイトメトリーによる蛍光の分析のためには、１０％未満の細胞生存率を生じさせる試験物質濃度において、少なくとも４日間の処置期間を必要とすることである。さらに、この毒性レベルにある物質で試験した場合には、あらゆる遺伝子誘導の生物学的関連性が検出される。さらに、この開発は、ＤＮＡ損傷を誘導または増強する可能性がある物質の存在について詳細に監視する手段は開示しておらず、ＧＡＤＤ１５３誘導の機序は依然として不明である。そこで、この系は、ヒトＤＮＡ損傷バイオセンサーとしての使用は極めて限定されている。
【０００８】
国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００１９１３号明細書は、発光タンパク質に結合したヒトＧＡＤＤ４５α遺伝子の調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子について開示している。このレポーター系は、遺伝毒性アッセイについての毒性の通常範囲内での遺伝毒性物質の高速ハイスループット検出を可能にする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の実施形態の１つの目的は、先行技術に関連する問題を解決すること、およびヒト細胞培養内のゲノム損傷を検出するための改良されたバイオセンサーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１態様によると、ガウシア・ルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ＧＬｕｃ））レポータータンパク質およびその誘導体をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットであって、該ＤＮＡ配列は、ヒトＧＡＤＤ４５α遺伝子プロモーターおよびゲノム損傷に応答してガウシア・ルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）レポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列の発現を活性化するように配列されたヒトＧＡＤＤ４５α遺伝子調節エレメントに機能的に連結している発現カセットが提供される。
【００１１】
用語「調節エレメント」は、それが結び付いている遺伝子、つまりガウシア・ルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）レポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列、の転写を調節するＤＮＡ配列を意味する。
【００１２】
用語「機能的に結合した」は、調節エレメントがＧＬｕｃレポータータンパク質の発現を誘導できることを意味する。
【００１３】
本発明の第２態様によると、第１態様による発現カセットを含む組換えベクターが提供される。
【００１４】
本発明の第３態様によると、本発明の第２態様による組換えベクターを含有する細胞が提供される。
【００１５】
本発明の第４態様によると、ゲノム損傷を誘導または増強する物質の存在について検出する方法であって、本発明の第３態様によって細胞を１つの物質に曝露させるステップと、該細胞からのＧＬｕｃレポータータンパク質の発現を監視するステップとを含む方法が提供される。
【００１６】
本発明の第４態様の方法は、製薬産業および有意な数の物質または化合物を試験する必要がある他の用途において使用するための事前規制スクリーニングアッセイを提供するために使用できる、新規の費用効果的な遺伝毒性スクリーニングを提示する。本方法は、現行のインビトロおよびインビボの哺乳動物遺伝毒性アッセイより高速のスループットおよび少ない化合物消費量を提供し、広範囲の遺伝毒性物質に対して感受性である。
【００１７】
本発明の第４態様の方法は、物質がゲノム損傷を誘導する可能性があるか否かを判定するために適している。「ゲノム損傷」には、本発明者らは、ヒストン脱アセチル化阻害剤を包含するＤＮＡの構造的成分（例、ヒストン）、核および細胞分割の機序（例、スピンドル形成）、または例えばトポイソメラーゼおよびポリメラーゼなどのゲノム維持系ならびにＤＮＡ修復系に影響を及ぼす物質を包含している。本発明者らはさらに、ＤＮＡ損傷、例えばヌクレオチドの化学修飾またはヌクレオチドの挿入／欠失／置換；ならびに染色体数の変化、およびＤＮＡ合成を包含している。好ましくは、本発明者らは、「ゲノム損傷」がＤＮＡ損傷を意味すると考える。
【００１８】
ヒトをゲノム損傷物質に曝露させるのが安全であるかどうかを判定する場合にゲノム損傷を誘導する物質を検出することは特に有用である。例えば、本方法は、公知の物質、例えば候補の医薬品、製薬用および工業用化学物質、殺虫剤、殺菌剤、食料品または化粧品がゲノム損傷を誘導するか否かをスクリーニングするための遺伝毒性アッセイとして使用できる。または、本発明の方法は、ゲノム損傷物質を含有する汚染物質で上水道、浸出液および廃液の汚染について監視するために使用できる。
【００１９】
国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００１９１３号明細書に記載された現行の遺伝毒性アッセイは、発光タンパク質であるＧＦＰに結合したヒトＧＡＤＤ４５α遺伝子の調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子を使用する。その系は、蛍光分光法を使用する遺伝毒性アッセイについての毒性の通常範囲内での遺伝毒性物質の高速ハイスループット検出を可能にする。
【００２０】
本発明者らは、レポータータンパク質を生物発光によって検出できるまた別の遺伝毒性アッセイを開発することを決意した。レポータータンパク質の発現をアッセイするために蛍光ではなく生物発光を使用することは、数多くの利点を有する。第１に、それ自体が蛍光性である試験化合物は、蛍光レポータータンパク質の発現の検出に影響を及ぼす可能性がある。これは、生物発光レポータータンパク質が使用される場合は、試験化合物が発光性であることはたとえあっても極めてまれであるので、問題とはならないと思われる。そこで、生物発光の使用は、アッセイにおいて蛍光化合物および試薬によって誘導される干渉を制限するので、これはより広い範囲の試験化合物をアッセイできることを意味する。さらに、本アッセイにおいて使用される試験化合物が発光性であることは極めてまれであるので、これは発光性レポータータンパク質を使用する遺伝毒性アッセイにコントロール反応を包含する必要が低いことを意味する。そこで、極めて多数の試験化合物を並行してアッセイすることができる。さらに、破壊または変異した発光レポータータンパク質を使用するコントロール反応を包含することも不必要である。
【００２１】
ルシフェラーゼ類は、生体において光生成化学反応を触媒する一連の酵素である。ルシフェラーゼ類は、生物発光レポータータンパク質の一例である。それらの発現は、発光読取りが可能な適切なマイクロプレートリーダーを使用して監視することができる。マイクロプレートリーダーは、生物発光に基づくアッセイにおいて使用できる。
【００２２】
生物発光は、様々な微生物において進化した化学発光の形態である。別個の進化史を通して引き出される多数の別個のクラスの生物発光が存在する。これらのクラスは、それらの化学的特性において広汎に相違するが、それでもそれらは類似の化学反応、つまりジオキセタン構造の形成および破壊に曝される。これらのクラスは全部が、酵素ルシフェラーゼの発光基質ルシフェリンとの相互作用に基づいている。
【００２３】
ルシフェラーゼ遺伝子は、細菌、昆虫（例、ホタルおよびコメツキムシ）、Ｒｅｎｉｌｌａ（ウミシイタケ）、Ａｅｑｕｏｒｅａ（オワンクラゲ）、Ｖａｒｇｕｌａ（ウミホタル）およびＧｏｎｙａｕｌａｘ（渦鞭毛藻類）、ならびに甲殻類を包含する極めて広範囲の様々な生物からクローン化されてきた。現在では、生物発光アッセイにおいて使用するために利用できる極めて多様なルシフェラーゼ酵素が存在する。
【００２４】
本発明者らは、遺伝毒性アッセイにおいてＧＦＰに対する２つの相違するルシフェラーゼの特性を比較することを決定した。本発明者らは、いずれのルシフェラーゼが遺伝毒性アッセイにおいて生物発光レポータータンパク質として使用するために最も適合するかを決定しようと考えた。本発明者らは、これまで最も一般的に使用される生物発光レポータータンパク質であるホタル（Ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）を用いて研究することを選択した。さらに、カラヌス目カイアシ（ｃａｌａｎｏｉｄ  ｃｏｐｅｐｏｄ）であり、生物発光アッセイにおけるレポータータンパク質として一般には使用されないＧａｕｓｓｉａから単離されたガウシア・ルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ＧＬｕｃ））の特性について試験することも選択した。
【００２５】
驚くべきことに、本発明者らは、遺伝毒性アッセイにおいて使用した場合のガウシア・ルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）の多数の有益な特性を確認した。ＧＡＤＤ４５α遺伝エレメントと結合すると、ＧＬｕｃは細胞内のゲノム修復活性のシグナルとして蓄積し、細胞が死滅した後でさえ存続する。さらにＧＬｕｃは、ゲノム修復が完了すると測定可能なレポータータンパク質として存続する。これとは対照的に、ＦＬｕｃは、レポーターシグナルとしてはＧＬｕｃほど長くは存続しない。これらの相違は、ＧＬｕｃを使用する遺伝毒性アッセイは試験化合物の遺伝毒性を測定するために単一サンプリング時点を用いて実施できるが、これはＦＬｕｃを用いると可能ではないことを意味している。これらの利点は、主として、ＦＬｕｃが短い半減期を備える不安定タンパク質であると言う事実に起因する。遺伝毒性アッセイにおいてレポータータンパク質としてＦＬｕｃではなくむしろＧＬｕｃを使用するというこれらの利点は公知ではなく、本発明者らによって実施された研究の前には予測することができなかった。実際に、本発明までは、ＧＬｕｃは遺伝毒性アッセイのためのレポータータンパク質としては使用されていなかった。
【００２６】
さらに、ＧＬｕｃタンパク質は、細胞から分泌されるが、ＦＬｕｃタンパク質は分泌されない。そこでＦＬｕｃが遺伝毒性アッセイにおいてレポータータンパク質として使用される場合は、ＦＬｕｃを備える細胞は、ＦＬｕｃ発現レベルを正確に測定するためには溶解させられなければならない。これとは対照的に、ＧＬｕｃタンパク質は細胞から分泌されるが、これは、以下の遺伝毒性アッセイ法においてレポータータンパク質として使用される場合、ＧＬｕｃを備える細胞は通常はＧＬｕｃ発現レベルをアッセイするために溶解させる必要がないことを意味する。このため、レポータータンパク質としてのＦＬｕｃではなくむしろＧＬｕｃの使用は、試薬添加ステップおよびインキュベーションステップを該アッセイ法から省いて、細胞を溶解させる必要がないことを意味する。
【００２７】
これらの所見に基づいて、本発明者らは、ガウシア・ルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）発現がＧＡＤＤ４５α遺伝エレメントによって調節される遺伝毒性アッセイを開発した。本アッセイは、ＦＬｕｃに基づく現行の遺伝毒性アッセイおよび生物発光アッセイより優れた改良点を有する。本アッセイは、蛍光性試験化合物の遺伝毒性を測定するために使用できる。本アッセイにおいては蛍光化合物および試薬によって干渉はほとんど誘導されない。ＧＬｕｃの使用は、本アッセイが、試験化合物の遺伝毒性の尺度を得るために単一サンプリング時点を用いて実施できることを意味する。
【００２８】
さらに、本発明の方法の遺伝毒性アッセイにおいて使用した場合、ＧＬｕｃ媒介性生物発光は、添付の実施例において証明したように、予想外に高い「シグナル対ノイズ」比を有する。この改良された比率によって、本発明者らは、蛍光に基づくアッセイよりも容易に使用できる、より少ない量のアッセイ液を使用する生物発光に基づく遺伝毒性アッセイを開発することができた。直接的な結果として、ＧＬｕｃ媒介性生物発光を使用する遺伝毒性アッセイは、３８４ウェルマイクロタイタープレートを使用して実施できる。これとは対照的に、類似の蛍光に基づくレポーターアッセイのために３８４ウェルマイクロタイタープレートを使用するのは困難であるが、それはアッセイ液の量の減少は細胞数の減少を意味し、その結果として不良な「シグナル対ノイズ」比を意味するからである。
【００２９】
このため、本発明の方法の生物発光に基づく遺伝毒性アッセイは、蛍光に基づくアッセイを用いた場合より高速のスループットスクリーニング系において容易に使用することができる。これは、本アッセイをより少数の試験化合物を用いて実施することを可能にすることができ、そしてアッセイマイクロプレート１枚に付きより多くの化合物を試験することを可能にすることができる。
【００３０】
用語「ガウシア・ルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）レポータータンパク質およびその誘導体」には、発現した場合にルシフェラーゼアッセイによって検出可能な海洋カイアシであるガウシア・プリンケプス（Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ）由来のタンパク質が包含される。ＧＬｕｃタンパク質をコードする核酸配列は、多数の相違する会社、例えば、Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ社（ｗｗ．ｎａｎｏｌｉｇｈｔ．ｃｏｍ）から市販で入手できる。それらの核酸配列は、現在はアッセイ法におけるレポータータンパク質としては広汎には使用されていない。
【００３１】
好ましくは、ガウシア・ルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）レポータータンパク質は、発光反応：
セレンテラジン＋Ｏ２  →  セレンテラミド＋光線
におけるセレンテラジンの酸化を触媒し、実質的および測定可能な発光の放出を誘導する。
【００３２】
当該タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、多数の様々な入手源、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ０１５９９３から入手できる。
【００３３】
ＧＬｕｃの誘導体には、発光活性を保持するＧＬｕｃのポリペプチドアナログまたはポリペプチドフラグメントをコードするＤＮＡ配列が包含される。
【００３４】
「ヒト化」ガウシア・ルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）レポータータンパク質をコードする核酸は、Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ社（ｗｗｗ．ｎａｎｏｌｉｇｈｔ．ｃｏｍ）から入手できるプラスミドから入手することができる。「ヒト化」ＧＬｕｃ遺伝子の核酸配列は、ヒト細胞株において発現のために最適化されてきた。ガウシア・ルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＤＮＡ配列の例は、本明細書の実施例の項の最後で配列番号１の２６４１〜３１９８の位置に示されている。そこで本発明の好ましい実施形態は、ガウシア・ルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）レポータータンパク質が配列番号１の２６４１〜３１９８の位置に示したヌクレオチド配列によってコードされる実施形態である。
【００３５】
ＧＬｕｃは、高い光線量子収率を生成し、ＡＴＰを必要とせず、市販で入手可能な照度計によって容易に検出することができる。本発明の第３態様による細胞は、ＧＬｕｃレポータータンパク質をコードするＤＮＡ分子を含有していて、本発明の第４態様の方法によって使用できる。
【００３６】
驚くべきことに、本発明の第１態様による発現カセット内でのヒトＧＡＤＤ４５α遺伝子プロモーターに加えたヒトＧＡＤＤ４５α遺伝子調節エレメントの使用は、該カセットの遺伝毒性ストレスへの応答、および第３態様による細胞内でのゲノム損傷を根本的に増強する。有益にも、該カセットは、試験培養中のレポータータンパク質の活性についてアッセイすることによって、わずか４８時間以内または４８時間後に該レポータータンパク質の発現について分析することができる。細胞は、試験物質または化合物に曝露させることができ、該細胞内のレポータータンパク質の発現は、該試験物質がゲノム損傷を誘導するかどうかを示す。
【００３７】
本発明者らは、ヒトＧＡＤＤ４５α遺伝子プロモーターおよびヒトＧＡＤＤ４５α遺伝子調節エレメントをコードするＤＮＡは、本発明の第１態様によるカセットを形成するためにレポータータンパク質と機能的に結合させることができること、そして次に本発明による第４態様による遺伝毒性試験において有益にも使用できることを見いだした。当該のカセットは、ＧＬｕｃレポータータンパク質をコードするＤＮＡに機能的に結合していることを前提にＧＡＤＤ４５α遺伝子（コーディング配列を包含する）全体を含むことができる。例えば、本発明の第１態様によって、ＧＡＤＤ４５α遺伝子（調節エレメントおよびプロモーターを含む）の全部、または実質的に全部を、ＧＡＤＤ４５αプロモーターの３’（例えば、ＧＡＤＤ４５αコーディング配列内またはコーディング配列の３’）末端に挿入され、ゲノム損傷に応答してＧＬｕｃレポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列の発現を活性化するように配列されたＧＬｕｃレポーターをコードするＤＮＡとともに含むカセットを作製することができる。
【００３８】
好ましくは、ヒトＧＡＤＤ４５α遺伝子プロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡ分子に結合し、ＧＬｕｃレポータータンパク質をコードするＤＮＡの転写を開始することを誘導する。プロモーター配列がヒトＧＡＤＤ４５α遺伝子プロモーター配列および５’未翻訳領域を含むことが好ましい。プロモーター配列は、図１に例示されたｐＨＧ４５−ＨＣプラスミドから入手することができる。ＧＡＤＤ４５α遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列は、実施例の項の最後に配列番号１のヌクレオチド９７〜２６４０として示した。プロモーターは塩基９７〜２６４０の各々を含むことができる、またはそれらの機能的誘導体もしくは機能的フラグメントであってよいと理解されている。機能的誘導体または機能的フラグメントは、トランスクリプターゼが推定プロモーター領域に結合し、その後にマーカータンパク質の転写を引き起こすか否かを判定して、容易に同定することができる。または当該の機能的誘導体もしくは機能的フラグメントは、ＧＡＤＤ４５α遺伝子と自然に関連している場合はＧＡＤＤ４５αプロモーター上で突然変異生成を実施するステップと、ＧＡＤＤ４５α発現が発生する可能性があるか否かを評価するステップとによって試験することができる。
【００３９】
本発明による発現カセット内の調節エレメントは、ＧＡＤＤ４５α遺伝子プロモーター配列の下流で配列を含むことができる。調節エレメントは、機能的ＤＮＡ配列、例えばリボソーム結合のための翻訳開始配列またはゲノム損傷後の遺伝子発現を促進する転写因子に結合するＤＮＡ配列を含むことができる。
【００４０】
好ましくは、用語「調節エレメント」は、ＧＡＤＤ４５α遺伝子のプロモーター配列を包含しない。用語「調節エレメント」には、ＧＡＤＤ４５α遺伝子の遺伝子内配列が包含され
【００４１】
本発明による発現カセット内の調節エレメントは、ＧＡＤＤ４５α遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含むことができる。例えば、調節エレメントは、ＧＡＤＤ４５αのエクソン１、エクソン２、エクソン３、および／もしくはエクソン４、もしくはそれらの少なくとも１つの領域、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。そこで、調節エレメントは、ＧＡＤＤ４５α遺伝子の４つのエクソン、またはそれらの少なくとも１つの領域の任意の組み合わせを含むことができる。
【００４２】
好ましい実施形態では、調節エレメントは、ＧＡＤＤ４５α遺伝子のエクソン１の少なくとも１つの領域、および好ましくはＧＡＤＤ４５α遺伝子のエクソン３の少なくとも１つの領域、およびより好ましくは、ＧＡＤＤ４５α遺伝子のエクソン４の少なくとも１つの領域を含んでいる。特に好ましいのは、調節エレメントが、ＧＡＤＤ４５α遺伝子のエクソン１の全部、および好ましくはＧＡＤＤ４５α遺伝子のエクソン３の少なくとも１つの領域、およびより好ましくは、ＧＡＤＤ４５α遺伝子のエクソン４の全部を含んでいることである。
【００４３】
ＧＡＤＤ４５α遺伝子のエクソン３のヌクレオチド配列は、配列番号１の塩基３３２５〜３５６２として示されている。ＧＡＤＤ４５α遺伝子のエクソン４のヌクレオチド配列は、配列表において配列番号１の塩基４６３６〜５３１１として示されている。
【００４４】
または、もしくは追加して、調節エレメントは、非コーディングＤＮＡ配列、例えばＧＡＤＤ４５α遺伝子の少なくとも１つのイントロンを含むことができる。例えば、調節エレメントは、ＧＡＤＤ４５α遺伝子のイントロン１、イントロン２、および／もしくはイントロン３、もしくはそれらの少なくとも１つの領域、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。そこで、調節エレメントは、ＧＡＤＤ４５α遺伝子の３つのイントロン、またはそれらの少なくとも１つの領域の任意の組み合わせを含むことができる。
【００４５】
好ましい実施形態では、本発明による発現カセット内の調節エレメントは、ＧＡＤＤ４５α遺伝子のイントロン３の少なくとも１つの領域を含んでいる。ＧＡＤＤ４５α遺伝子のイントロン３のヌクレオチド配列は、配列表において配列番号１の塩基３５６３〜４６３５として示されている。
【００４６】
好ましい実施形態では、本発明による発現カセットは、ＧＡＤＤ４５α遺伝子のプロモーター配列と、さらにゲノムＧＡＤＤ４５α遺伝子配列自体のイントロン３内で見いだされる遺伝子調節エレメントもまた含んでいる。本発明者らは任意の仮説によって拘束しようとは望まないが、ＧＡＤＤ４５α遺伝子のイントロン３は、推定ｐ５３結合モチーフを含有する、および驚くべきことに発現カセットの遺伝毒性ストレスへの応答を増強するのがこのｐ５３モチーフであると考えている。推定ｐ５３結合モチーフは、配列表内の配列番号１にヌクレオチド塩基３７４６〜３７６５として示されている。
【００４７】
本発明者らは、ＧＡＤＤ４５α遺伝子のイントロン３がＡＰ−１結合部位をコードする可能性がある推定ＴＲＥモチーフを含有する可能性があるとさらに考えている。推定ＴＲＥモチーフは、配列表内の配列番号１にヌクレオチド塩基３７９５〜３８０１として示されている。そこで、本発明者らは任意の仮説によって拘束しようとは考えないが、この推定ＡＰ−１結合部位が遺伝毒性物質に対する改良された応答にも貢献できる可能性があると推定している。
【００４８】
発現カセットは、少なくともＧＡＤＤ４５α遺伝子のイントロン３由来のｐ５３結合モチーフおよび／またはＡＰ−１結合モチーフを含むのが好ましい。
【００４９】
調節エレメントは、配列番号１の塩基４７５０〜５３１１として示されているヌクレオチド配列であるＧＡＤＤ４５α遺伝子の３’未翻訳（ＵＴＲ）領域を含むことができる。本発明者らは、任意の仮説によって拘束しようとは思わないが、この３’ＵＴＲがｍＲＮＡカセットの安定化に関係する可能性があること、およびそこで例えばイントロン３などの調節エレメントの残りと一緒に使用されると驚くべきことに重要な可能性があると考えている。
【００５０】
そこで本発明の第１態様による好ましい発現カセットは、ヒトＧＡＤＤ４５α遺伝子調節エレメントおよびガウシア・ルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）レポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列に機能的に連結したヒトＧＡＤＤ４５α遺伝子プロモーターを含んでいる。最も好ましい発現カセットは、ガウシア・ルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＤＮＡ配列に機能的に結合したヒトＧＡＤＤ４５α遺伝子プロモーター、およびＧＡＤＤ４５α遺伝子のイントロン３を含んでいる。
【００５１】
また別の実施形態では、第１態様による発現カセットは、好ましくは図２に示したＧＤ５３２−ＧＬｕｃである。発現カセットＧＤ５３２−ＧＬｕｃのヌクレオチド配列は、配列番号２に与えられ、配列番号１のヌクレオチド位置９７〜５３１１に対応する。
【００５２】
本発明の第２態様による組換えベクターは、例えば、プラスミド、コスミドまたはファージであってよい。当該の組換えベクターは、発現カセットを複製する場合に極めて有用である。さらに、組換えベクターは、発現カセットを用いて細胞をトランスフェクトするために高度に有用であり、さらにまたレポータータンパク質の発現を促進することもできる。
【００５３】
組換えベクターは、該ベクターが細胞の細胞質ゾル内で自律的に複製するように、またはゲノム内に統合するために使用できるように設計できる。この場合には、ＤＮＡ複製を誘導するエレメントが組換えベクター内に必要とされることがある。適切なエレメントは当技術分野において周知であり、例えば、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、３  Ｆｏｕｎｔａｉｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｉｎｃｈｉｎｎａｎ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐａｒｋ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＰＡ４  ９ＲＦ、英国）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＵＫ社、２１  Ｉｎ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｔｏｗｎｓ  Ｒｏａｄ，Ｃｏｗｌｅｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＯＸ４  ＬＹ、英国）、またはｐＣＩおよびｐＳＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＵＫ社、Ｄｅｌｔａ  ｈｏｕｓｅ，ｃｈｉｌｗｏｒｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ  ＳＯ１６  ７ＮＳ、英国）に由来してよい。
【００５４】
当該複製ベクターは、形質転換体内でＤＮＡ分子の複数のコピーを生じさせることができ、このためＧＬｕｃレポータータンパク質の過剰発現（およびそれにより増加した発光）が必要とされる場合に有用である。さらに、該ベクターはヒト、霊長類および／またはイヌ細胞内で複製できることが好ましい。該ベクターは、複製起源、および好ましくは少なくとも１つの選択可能なマーカーを含むことが好ましい。選択可能なマーカーは、抗生物質、例えばハイグロマイシンまたはネオマイシンに耐性を付与することができる。適切なエレメントは、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、３  Ｆｏｕｎｔａｉｎ  Ｄｒｉｖｅ，ｌｎｃｈｉｎｎａｎ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐａｒｋ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＰＡ４  ９ＲＦ、英国）に由来する。
【００５５】
第１実施形態では、第２態様による組換えベクターは、図２に例示されたように、および配列番号１に提供されたように、好ましくはｐＥＰ−ＧＤ５３２−ＧＬｕｃである。
【００５６】
本発明の第３態様によると、本発明の発現カセットまたは組換えベクターは、細胞内に組み込まれる。細胞は真核細胞であるのが好ましい。当該の宿主細胞は、哺乳動物由来細胞および細胞株であってよい。好ましい哺乳動物細胞には、ヒト、霊長類、マウスまたはイヌ細胞が包含される。宿主細胞は、リンパ腫細胞または細胞株、例えばマウスリンパ腫細胞であってよい。宿主細胞は、不死化された、例えばリンパ球であってよい。
【００５７】
好ましい宿主細胞は、ヒト細胞株である。好ましくは、宿主細胞は、完全に機能的なｐ５３を有するヒト株、例えばＭＬ−１（野生型ｐ５３を備えるヒト骨髄性白血病細胞株；ＥＣＡＣＣアクセッション番号８８１１３００７）、ＴＫ６（野生型ｐ５３を備えるヒトリンパ芽球様細胞株；ＥＣＡＣＣアクセッション番号９５１１１７２５）である。しかし、ＷＩ−Ｌ２−ＮＳ（ＥＣＡＣＣアクセッション番号９０１１２１２１）およびＷＴＫ１（そのどちらもＴＫ６の姉妹株であり、変異ｐ５３タンパク質を有する）の宿主細胞株もまた想定される。どちらもヒト肝細胞癌由来細胞株であるＨｅｐ  Ｇ２（ＥＣＡＣＣアクセッション番号８５０１１４３０）およびＨｅｐａＲＧ（ＢｉｏＰｒｅｄｉｃ社；ｈｔｔｐ：／／ｐａｇｅｓｐｅｒｓｏ−ｏｒａｎｇｅ．ｆｒ／ｂｉｏｐｒｅｄｉｃ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）もまた使用できる（ＥＣＡＣＣ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｏｆｆｉｃｅ，ＣＡＭＲ，Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＳＰ４  ＯＪＧ、英国）。
【００５８】
本発明者らは、ＴＫ６ヒト細胞が本発明の方法によって使用するための特に好ましい細胞株であることを見いだした。本発明者らは任意の仮説によって拘束しようとは望まないが、ＴＫ６細胞は完全に機能的なｐ５３を有するために最も有用であると考える。
【００５９】
ＤＮＡ分子によってコードされたタンパク質の発現のために使用される宿主細胞は、理想的には安定性にトランスフェクトされるが、不安定性（一過性）にトランスフェクトされた細胞の使用は除外される。
【００６０】
本発明の第３態様によるトランスフェクト細胞は、以下の実施例に記載した方法によって形成することができる。細胞は、理想的にはヒト細胞、例えばＴＫ６である。当該のトランスフェクト細胞は、本発明の第４態様の方法によって物質がＤＮＡ損傷を誘導または増強するか否かを評価するために使用できる。ＧＬｕｃ発現はＤＮＡ損傷に応答して誘導され、ＧＬｕｃによる発光は公知の適切な技術を使用して容易に測定することができる。
【００６１】
本発明の第３態様によって最も好ましい細胞は、ベクターｐＥＰ−ＧＤ５３２−ＧＬｕｃを用いて形質転換されたＴＫ６細胞である。これらの細胞は、本明細書ではＧＬｕｃ−ＴＯ１と呼ぶ。
【００６２】
本発明による発現カセットは、宿主細胞のゲノム内に統合できることもまた想定されている。当業者であれば、該カセットをゲノム内に統合するための適切な方法を認識できる。例えば、発現カセットは、パッケージング細胞株と組み合わせてヘルパーフリー組換えレトロウイルスを生成でき、次に宿主細胞内に導入することのできるレトロウイルスベクター上に提供することができる。該カセットは、次にゲノム内に自ら統合することができる。適切なヘルパーフリーのレトロウイルスベクター系の例には、ＢＩＮＧレトロウイルスパッケージング細胞株を備えるｐＢａｂｅＰｕｒｏプラスミドが包含される［Ｋｉｎｓｅｌｌａ  ａｎｄ  Ｎｏｌａｎ，１９９６．Ｅｐｉｓｏｍａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｒａｐｉｄｌｙ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｌｙ  Ｐｒｏｄｕｃｅ  Ｈｉｇｈ−Ｔｉｔｅｒ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．７：１４０５−１４１３．］。
【００６３】
本発明の第４態様の方法は、ゲノム、特別にはＤＮＡ損傷を誘導する物質を低濃度で検出するために特に有用である。本方法は、化合物、例えば候補の医薬品、食品添加物または化粧品を、それが生体、特にヒトを当該化合物に曝露させることが安全であるかどうかを判定するためにスクリーニングするために使用できる。または、本発明の第４態様の方法は、上水道がゲノム損傷物質またはゲノム損傷を増強する物質によって汚染されているか否かを検出するために使用できる。例えば、本方法は、汚染に曝露させられた人々または他の生物における増加したゲノム損傷を引き起こす可能性がある汚染物質の存在について工場廃水を監視するために使用できる。
【００６４】
本発明の方法は、好ましくは本発明の第２態様による組換えベクター（例えば、ｐＥＰ−ＧＤ５３２−ＧＬｕｃなど）を用いて形質転換された細胞を増殖させるステップと、規定時間にわたってゲノム損傷を誘導すると推定される物質とともに該細胞をインキュベートするステップと、および該細胞のサンプルからのＧＬｕｃレポータータンパク質の発現を直接的に監視するステップとによって実施される。
【００６５】
発光を検出および定量する適切な方法は、当業者には公知であり、１つの方法を実施例の項に記載する。
【００６６】
本発明の方法の好ましい実施形態によると、発光の示度は、例えばマイクロプレートのウェルから、ｐＥＰ−ＧＤ５３２−ＧＬｕｃを用いてトランスフェクトされたＴＫ６細胞から記録することができる。適切なマイクロプレートの例は、９６ウェルの白色、透明底面、無菌マイクロプレートである（最適性能のためには、Ｍａｔｒｉｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＳｃｒｅｅｎＭａｔｅｓ：製品番号４９２５が推奨される）。
【００６７】
さらに、予想外にも高い「シグナル対ノイズ」比に起因して上記で考察したように、本発明の発光に基づく遺伝毒性アッセイ法は、蛍光に基づくアッセイのために容易に使用できるより少ないアッセイ液（およびそこでより少数の細胞およびより少ない試験化合物）を使用して実施することができる。直接的な結果として、本発明の方法は、３８４ウェルのマイクロタイタープレートを使用して実施できる。そこで、適切なマイクロプレートのまた別の例は、３８４ウェル、黒色、無菌マイクロプレートである。適切なプレートは、またＭａｔｒｉｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳｃｒｅｅｎＭａｔｅｓからも入手できる。
【００６８】
発光および吸光度測定値は、適切なマイクロプレートリーダー、例えばインジェクターを備えるＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５００を使用して記録できる。
【００６９】
本発明の第４態様の方法を実施するための最も好ましいプロトコールは、添付の実施例の項に記載されている。
【００７０】
ＧＡＤＤ４５α−ＧＬｕｃ構築物由来のＧＬｕｃのバックグラウンド（「構成的」）発現が生じる可能性があり、すなわち細胞密度が高いほど、培養の発光が多くなる。増殖の結果として生じる何らかの発光の増加を補正するためには、「輝度単位」、すなわち細胞１個当たりの平均発光の測定結果を得るために、発光データを吸光度データ（細胞密度）で割る。これは、培養密度とは無関係である。したがって、吸光度の測定は、試験物質の遺伝毒性の測定よりむしろ主として発光シグナルの正規化のために使用できる。したがって、細胞生存性およびアポトーシスによって毒性を決定するために吸光度測定と結び付けて二次アッセイを使用できることが想定されている。例えば、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ生物発光細胞毒性アッセイ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社、２４５５−Ｄ  Ｏｌｄ  Ｍｉｄｄｌｅｆｉｅｌｄ  Ｗａｙ、米国カリフォルニア州９４０４３、マウンテンビュー）、またはＶｙｂｒａｎｔ（登録商標）アポトーシスアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、米国オレゴン州９７４０２、２９８５１  Ｗｉｌｌｏｗ  Ｃｒｅｅｋ  Ｒｏａｄ）を使用する。
【００７１】
本発明の第４態様による好ましい方法は、本発明の第３態様による細胞（例、ＧＬｕｃ−ＴＯ１）を利用する。
【００７２】
一部の非遺伝毒性化合物が細胞代謝によって化学的に変化させられることは理解されると思われる。哺乳動物では、このプロセスは、代謝活性化（ＭＡ）と呼ばれることが多い。ＭＡは、所定の非遺伝毒性化合物（例えば、プロ変異誘起物質）を遺伝毒性化合物に変換させることができる。最も頻回には、ＭＡは、肝臓内で発生する。このために、遺伝毒性試験は、試験化合物のアッセイが、あたかもインビボで代謝されたかのように化合物を代謝することのできる肝抽出物の存在下および非存在下で実施されるように適応させられるのが好ましいことが多い。実施例４は、Ｓ９と呼ばれる（当業者には公知の）肝抽出物を利用する、本発明の第４態様による好ましい方法を例示している。当該の抽出物を包含すると、アッセイは肝臓の通過後にのみ遺伝毒性になる化合物を検出することができる。
【００７３】
Ｓ９肝抽出物が本発明の方法において使用される場合は、集団内の細胞の密度は細胞染色を使用して決定されるのが好ましい。これは、実施例４において詳細に記載したように、本発明者らが、細胞密度を推定するために使用される吸光度測定の相対不感受性はＳ９代謝活性化試験におけるプロ遺伝毒性物質についてのアッセイの低下した感受性を生じさせることが見いだされたと決定したからである。
【００７４】
以下の実施例２でより詳細に考察するように、ルーチンアッセイからの陽性および陰性の結果の明確な定義を有することは有用であり、当該の定義は、遺伝毒性および作用機序に関する明白な合意がある場合の化学薬品からのシステムおよびデータ内の最大雑音を考慮に入れて引き出されてきた。
【００７５】
本アッセイがＳ９肝抽出物を包含する場合は、遺伝毒性閾値は１．５の相対ＧＬｕｃ誘導率（すなわち、５０％増加）で設定する。そこで、陽性遺伝毒性結果（＋）は、試験化合物が１．５閾値より大きな相対ＧＬｕｃ誘導率を生じさせる場合に結論される。
【００７６】
本アッセイがＳ９肝抽出物を包含しない場合は、遺伝毒性閾値は１．８の相対ＧＬｕｃ誘導率（すなわち、８０％増加）で設定する。そこで、陽性遺伝毒性結果（＋）は、試験化合物が１．８閾値より大きな相対ＧＬｕｃ誘導率を生じさせる場合に結論される。
【００７７】
同様に、遺伝毒物学の分野の範囲内では、相違する化合物間の遺伝毒性作用の力価における変動を認識する方法でアッセイ結果を評価することが時には望ましいことがある。そこで、ＧＬｕｃ誘導はまた以下の基準を使用して判定することもできる：陽性（＋）遺伝毒性結果は、１つ以上の試験化合物濃度が１．５または１．８閾値より大きな発光誘導率を生じさせる場合に結論づけられる。陰性遺伝毒性結果（−）は、いずれの化合物希釈液も１．５または１．８閾値より大きな相対ＧＬｕｃ誘導率を生じさせない場合に結論づけられる。
【００７８】
本発明者らは、引き続いて、吸光度測定値と置換するために蛍光細胞染色を使用できることを見いだした。これは、２つの方法が同一物を推定する効果的に相違する方法であるためである。驚くべきことに、本発明者らが細胞染色を使用した方法は、細胞数推定の感受性およびこのためプロ遺伝毒性物質の検出を改良した。
【００７９】
好ましくは、適応させられたプロトコールにおいて使用された細胞染色は、シアニン色素、より好ましくはＤＮＡおよびＲＮＡに結合するシアニン色素であるチアゾールオレンジ（ＴＯ）である。ＴＯのＤＮＡへの結合は、その蛍光強度を大きく増強し、バックグラウンドの未結合ＴＯを洗い流す必要を伴わずにその検出を許容する。
【００８０】
好ましくは、本発明の第４態様の方法では、ＧＬｕｃレポータータンパク質の発現は、試験化合物への曝露の４６〜５０時間後に、最も好ましくは４８時間後に監視される。
【００８１】
本発明の第４態様の一部の実施形態では、ゲノム損傷を誘導または増強する物質の存在を検出する方法は、細胞からのＧＬｕｃレポータータンパク質の発現を監視するステップを包含する。ＧＬｕｃレポータータンパク質は、発光反応における基質セレンテラジンの酸化を触媒する。本発明者らは、一部の反応条件（特に多数の反応が連続的に実施される場合）においては、セレンテラジンは、ある程度の変動をアッセイの感受性および信頼性に影響し得る発光シグナルを生じ得るような不安定な場合があることを決定した。
【００８２】
また別の調査では、本発明者らは、アスコルビン酸（ビタミンＣ）などの酸化剤の存在によってセレンテラジンを安定化できることを決定した。または、セレンテラジンは、好ましくはｐＨ７．４および１００ｍＭの最終濃度でのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）の存在によって安定化させることができる。さらに、セレンテラジンは、β−シクロデキストリンの存在によってさらに安定化させることができる。
【００８３】
そこで本発明の好ましい方法は、セレンテラジンが酸性化メタノール中の５ｍＭストック液として調製される方法である。発光バッファー（４００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；５ｍＭのβ−シクロデキストリン；脱イオン水；１０ＮのＮａＯＨを用いてｐＨ７．４へ緩衝）を調製する。セレンテラジンストック液を次に発光バッファー中で２，０００倍に希釈すると、２．５μＭセレンテラジン溶液が得られた（ＴＲＩＳによってｐＨを７．４に緩衝した）。これは反応アッセイに加えられる注入溶液である（さらにセレンテラジンの４倍希釈液を生じさせる）。
【００８４】
本明細書に記載した特徴の全部（任意の添付の請求項、要約書および図面）、および／または本明細書に開示した任意の方法またはプロセスのステップの全部は、当該の特徴および／またはステップの少なくとも一部が相互に排他的である場合の組み合わせを除いて、任意の組み合わせにおいて上記の態様のいずれかと組み合わせることができる。
【００８５】
以下では、本発明の実施形態について、下記の実施例および図面を参照しながら、一例としてのみ詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】ベクター（Ａ）ｐＥＰ−ＧＤ５３２；（Ｂ）ｐＨＧ４５−ＨＣプラスミド；および（Ｃ）ｐＣＭＶ−ＧＬｕｃ−１の制限地図を示す図である。
【図２】ベクター（Ａ）ｐＥＰ−ＧＤ５３２−ＧＬｕｃのプラスミド地図および（Ｂ）発現カセットＧＤ５３２−ＧＬｕｃの図である。
【図３】ＦＬｕｃ、ＧＬｕｃおよびＧＦＰレポータータンパク質活性のメチルニトロソ尿素（ＭＮＵ）誘導を示す図である。
【図４】エンドポイント時間経過実験からのＧＡＤＤ４５α−ＦＬｕｃ発現カセットを有する細胞上の４種の試験化合物についての典型的データを示す図である。
【図５】ＧＤ５３２−ＧＬｕｃ発現カセットを有する２種の試験化合物；（Ａ）非遺伝毒性物質；（Ｂ）遺伝毒性物質についての典型的データを示す図である。
【図６】ＧＦＰレポータータンパク質を使用して高蛍光性試験化合物を使用するアッセイからのデータを示す図である；（Ａ）アクリジンオレンジを用いたＧＦＰデータ；（Ｂ）アクリジンオレンジを用いたＧＬｕｃデータ。
【図７】Ｓ９抽出物の存在下でのＧＬｕｃレポータータンパク質を用いた原遺伝毒性物質のアッセイからの結果を示す図である；（Ａ）細胞数を用いたチアゾールオレンジ（ＴＯ）の校正；（Ｂ）ＴＯ細胞数が本アッセイに組み込まれた場合の６−アミノクリセンを用いたＳ９アッセイからのデータ。Ｓ９抽出物を加えた場合の陽性決定閾値は１．５であるが、Ｓ９抽出物を加えていない場合の陽性決定閾値は１．８である；どちらもグラフ上に示されている。
【図８】遺伝毒性物質である４−ニトロキノリン−１−オキシド（ＮＱＯ）についての３８４−ウェルマイクロタイタープレートを使用したＧＬｕｃに基づく遺伝毒性アッセイからのデータを示す図である；（Ａ）実施例４に記載した蛍光細胞染色（ＴＯ）法を使用して測定したＮＱＯについての相対毒性曲線；（Ｂ）ＮＱＯについての相対ＧＬｕｃ発光誘導率。
【実施例１】
【００８７】
［ｐＥＰ−ＧＤ５３２−ＧＬｕｃのクローン化］
＜要約＞
ＧＡＤＤ４５αレポーター構築体内でＧＦＰ  ＯＲＦをガウシア・ルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）ＯＲＦと置換すること。
【００８８】
＜プロトコール＞
ガウシア・ルシフェラーゼＯＲＦは、ＰＣＲを使用してプラスミドｐＣＭＶ−ＧＬｕｃ−１（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ社）からクローン化した。ｐＣＭＶ−ＧＬｕｃ−１プラスミドは、ＮＥＢ社によってｐＣＭＶ−ＧＬｕｃとして市販されている。ｐＣＭＶ−ＧＬｕｃ−１のプラスミド地図は、図１に提供した。ＰＷＯ高忠実度ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社）を使用して、ＰＣＲ誘導突然変異の生成を最小限に抑えた。フォワードおよびリバースプライマーは、制限エンドヌクレアーゼのＸｈｏＩおよびＮｏｔＩについての認識配列を各々コードする８つの追加の（非相補的）ヌクレオチドを含有していた。ＰＣＲ反応についてのプロトコールを以下に示す。
【００８９】
【表１】
2012524523.tif 000003
【００９０】
【表２】
2012524523.tif 000004
【００９１】
【表３】
2012524523.tif 000005
【００９２】
ＰＣＲ産物を清浄化し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）を使用して５’末端をリン酸化した。プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）は、ＥｃｏＲＩ部位を使用して線状化し、鈍端ＰＣＲ産物をプラスミド内にライゲートした。
【００９３】
ｐＥＰ−ＧＤ５３２プラスミド（図１）を切断し、ＡｓｃＩを用いて線状化し、結果として生じた５’オーバーハングはマングビーンヌクレアーゼ酵素を用いて除去した。次にＧＦＰのＯＲＦはＮｏｔＩ消化物を用いて線形化プラスミドから除去し、ｐＥＰ−ＧＤ５３２プラスミド主鎖は、アガロースゲル電気泳動法およびゲル抽出法を使用して分離および清浄化した。ｐＥＰ−ＧＤ５３２プラスミドのクローン化および配列は、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００１９１３号明細書に完全に記載されている。
【００９４】
ＧＬｕｃのＰＣＲ産物を含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）プラスミドはＸｈｏＩを用いて切断し、結果として生じた５’オーバーハングはマングビーンヌクレアーゼ酵素を用いて除去し、結果として生じたＤＮＡ産物を清浄化した。次にＤＮＡはＮｏｔＩを用いた消化にかけ、遊離したＧＬｕｃのＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動法によって分離および清浄化した。
【００９５】
精製されたＧＬｕｃのＯＲＦは次に、ＮｏｔＩ消化によって生成された付着末端ならびにＸｈｏＩおよびＡｓｃＩ消化によって生成され、その後にマングビーンヌクレアーゼ処理を受けた鈍端を使用してｐＥＰ−ＧＤ５３２主鎖内にクローン化した。これは、図２に示したように、ＧＡＤＤ４５αレポーターベクターｐＥＰ−ＧＤ５３２−ＧＬｕｃを生成した。
【００９６】
＜ｐＥＰ−ＧＤ５３２−ＧＬｕｃについての配列情報＞
ｐＥＰ−ＧＤ５３２−ＧＬｕｃプラスミドの核酸配列（配列番号１）は、添付の実施例の最後の付属書１に提供した。ｐＥＰ−ＧＤ５３２−ＧＬｕｃプラスミド内の重要な核酸配列を下記に列挙した。
【００９７】
【表４】
2012524523.tif 000006
【００９８】
＜ｐＥＰ−ＧＤ５３２−ＧＬｕｃプラスミドを有する細胞株＞
ＴＫ６細胞は、Ｘｉａ  ａｎｄ  Ｌｉｂｅｒ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４８：Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１９９５．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊ．Ａ．Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ，Ｐａｇｅｓ  １５１−１６０］から適応させられた方法を用いたエレクトロポレーションによってｐＥＰ−ＧＤ５３２−ＧＬｕｃを用いてトランスフェクトし、該レポータープラスミドを有するクローンを選択する。その後の研究のために選択した細胞株は、ＧＬｕｃ−ＴＯ１と呼ばれる。
【実施例２】
【００９９】
［ＧＬｕｃを使用した遺伝毒性および細胞毒性アッセイのためのプロトコール］
本発明者らは、ｐＥＰ−ＧＤ５３２−ＧＬｕｃプラスミドを有する細胞株ＧＬｕｃ−ＴＯ１を使用して試験化合物の遺伝毒性および細胞毒性を測定するための好ましいアッセイを開発した。
【０１００】
本アッセイは、以下に詳述するような下記のステップ：（１）アッセイにおいて使用するためのマイクロプレートを調製するステップと、（２）該マイクロプレート内でアッセイを実施するステップと、（３）データを収集および分析するステップと、（４）ゲノム損傷に関する判定および結論を下すステップとを有する。
【０１０１】
本アッセイは、単一ウェルへの添加が可能なインジェクターが装備された、発光および吸光度読取りが可能なマイクロプレートリーダーを使用して実施する。
【０１０２】
＜２．１  マイクロプレート＞
アッセイは、白色、透明底面、９６ウェル、無菌マイクロプレート（最適性能のためにはＭａｔｒｉｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＳｃｒｅｅｎＭａｔｅｓ：製品番号４９２５が推奨される）内で実施する。黒色、透明底面、９６ウェル、無菌マイクロプレート（Ｍａｔｒｉｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＳｃｒｅｅｎＭａｔｅｓ：製品番号４９２９）もまた使用できる。
【０１０３】
＜２．２  アッセイ＞
本明細書に記載した標準希釈プロトコールを使用すると、７５μＬのサンプル量と７５μＬの細胞培養とが合わされた場合に、マイクロプレート内において全濃度が半分にされる。全標準物質ならびに試験化学薬品および試薬類は、本アッセイを実施する直前に新しく調製しなければならない。
希釈液−２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯの無菌水
【０１０４】
２．２．１  試験化合物の調製
各試験化合物の最終濃度は、使用される希釈剤に適合する溶液中において、希釈溶媒自体がプレート全体にわたって希釈されないように、典型的には無菌水中で２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯでなければならない。
【０１０５】
２ｍＭまたは１ｍｇ／ｍＬ（いずれか低い方）の初期濃度（マイクロプレート上の１ｍＭまたは５００μｇ／ｍＬの試験化合物と同等）が推奨される。試験化合物は、試験される最高濃度で完全に可溶性であることが望ましい。１プレート当たり最少２５０μＬの試験化合物が必要とされる。試験化合物の溶液を調製するための推奨方法は、以下のとおりである：
・高水溶性を備える化合物に対して−水性希釈剤（すなわち、２％ＤＭＳＯ）中に直接的に溶解させ、必要に応じて希釈剤を用いて希釈する。
・難水溶性の化合物に対して−１００％ＤＭＳＯ中に溶解させ、必要に応じて１００％ＤＭＳＯ中で希釈し、次に２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含有する試験化合物を生成するために９８０μＬの無菌水に２０μＬのＤＭＳＯストック標準溶液を加える。ＤＭＳＯ標準溶液を水に加えた場合に化合物が溶液から沈殿したら、最初のＤＭＳＯストック標準溶液をさらに１００％ＤＭＳＯを用いて希釈することができる。次に、新鮮試験標準液を生成するために、２０μＬ＋水９８０μＬの希釈ステップを繰り返す。
【０１０６】
２．２．２  コントロール化合物の調製
４−ニトロキノリン−１−オキシド（ＮＱＯ：例、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、製品番号：Ｎ８１４１−２５０ＭＧ）をコントロール化合物として使用する。
【０１０７】
コントロール化合物溶液は、希釈剤中で以下の濃度に調製する。
・  標準物質１  −  ＮＱＯ  ＨＩＧＨ＝１μｇ／ｍＬ
・  標準物質２  −  ＮＱＯ  ＬＯＷ＝０．２５μｇ／ｍＬ
【０１０８】
１００％ＤＭＳＯ中のＮＱＯのアリコートを調製し、５０倍の試験濃度で２０μＬの容量に冷凍し、次に使用直前に解凍し、２％ＤＭＳＯ中の正確な試験濃度を達成するために９８０μＬの水を加える。
【０１０９】
２．２．３  細胞の調製
標準細胞培養法を使用して、本アッセイに使用するためのＧＬｕｃ−ＴＯ１細胞を調製する。本アッセイは、細胞が対数増殖期となることを必要とする。このため、培養は本アッセイに使用できるようになる前に５×１０５個／ｍＬおよび１．２×１０６個／ｍＬの間の密度を達成しなければならない。細胞は、所定の培養培地中で増殖させる。
【０１１０】
【表５】
2012524523.tif 000007
【０１１１】
使用する時点に、アッセイ培地（ＧＳ−ＨＣ−ＡＭ）中において２×１０６個／ｍＬの密度でＧＬｕｃ−ＴＯ１細胞の１０ｍＬ懸濁液を調製する。
【０１１２】
アッセイ培地
本アッセイ培地の構成成分の作業濃度は、以下に規定した。
【０１１３】
【表６】
2012524523.tif 000008
【０１１４】
２．２．４  アッセイの調製
以下の標準プロトコールに従うことができる。試験化学物質のストック、またはＤＮＡ損傷を誘導することが推定される物質を含有するサンプルを上述したように２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ水溶液中で調製し、９６ウェルマイクロプレート全体にわたる一連の希釈液および「コントロール」を作製するために使用する（下記参照）。これを達成するために１５０μＬの試験化学物質溶液をマイクロプレートウェル内に注入する。各サンプルは、７５μＬを７５μＬの２％ＤＭＳＯ中に移し、混合し、次に７５μＬを取り出して隣のウェルに入れることによって連続的に希釈する。これは各７５μＬの９つの連続希釈液を作製する。試験化学物質／サンプルの最終最大濃度は、マイクロプレート上で１ｍＭまたは５００μｇ／ｍＬである。
【０１１５】
上述したアッセイ培地（ＧＳ−ＨＣ−ＡＭ）中の７５μＬのＧＬｕｃ−ＴＯ１細胞は、次に適切に各ウェルに加える。
【０１１６】
以下のコントロールをマイクロプレート内に包含する。
ａ．ブランクウェル
ｂ．試験化合物／サンプル単独
ｃ．アッセイ培地単独
ｄ．細胞を含むコントロール化合物
【０１１７】
「ブランクウェル」は、コントロールが試験化合物のための担体として使用される溶媒、典型的には２％ＤＭＳＯを含有することを意味する。
【０１１８】
終了したら、マイクロプレートを通気性のある膜で被覆する。プレートを１０〜１５秒間にわたりマイクロプレートシェーカー上で（各ウェルの内容物を完全に混合するために）緩徐に振とうし、次に振とうせずに４８時間にわたり３７℃、５％ＣＯ２、９５％湿度でインキュベートする。プレートをインキュベートして４８時間±２時間後に分析しなければならない。
【０１１９】
＜２．３  データの収集および分析＞
プレートは最初に、約６２０ｎｍの波長で、各ウェル内の吸光度について読み取る。発光を読み取る場合は、各ウェルに５０μＬのインジェクター溶液を加え、リーダー設備を使用してプレートを振とうし、次に３秒間の発光の積分時間後に読み取る。適切なリーダーおよびインジェクターシステムの例は、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｆ５００である。
【０１２０】
２．３．１  インジェクター溶液
酸性化メタノール（１０ｍｌ）＝９．９ｍＬメタノールおよび１００μＬの３７％ＨＣｌ
５ｍＭセレンテラジンストック液（４．７２ｍＬ）＝４．７２ｍＬの酸性化メタノール中に溶解させた１０ｍｇセレンテラジン（天然、ＭＷ４２３．４８、ＣＡＳ＃５５７７９−４８−１）。２０μＬのアリコートを微量遠心チューブ内にピペットで移し、暗所において−８０℃で保管する。
５０ｍＭのβ−シクロデキストリン（１００ｍＬ）＝７．３ｇの２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（０．８モル置換、ＭＷ１４６０、ＣＡＳ＃１２８４４６−３５−５）および蒸留水を１００ｍＬまで。フィルターを滅菌し、４℃で保管する。
セレンテラジン担体溶液＝２０ｍＬのＧｅｎｔｒｏｎｉｘアッセイ培地、５ｍＬの５０ｍＭβ−シクロデキストリンおよび２５ｍＬの無菌蒸留水。全構成成分が無菌であれば、溶液は２週間にわたり４℃で保管できる。
【０１２１】
酸性化メタノール中の５ｍＭのセレンテラジンストック液は、最初のプレート読取りのおよそ３０分前に担体溶液に加えなければならない。少量の担体溶液は、プレートリーダー・インジェクターシステムをプライミングするために使用されるとともに、実際の発光の読み取りにおいて使用される死容積となる。以下の量の担体溶液＋セレンテラジンを調製しなければならない。
【０１２２】
【表７】
2012524523.tif 000009
【０１２３】
調製後、インジェクター溶液は、光線への曝露を最小限に抑え、室温で保持しなければならない。
【０１２４】
上記で言及したように、本アッセイは、ｐＨ７．４に緩衝したセレンテラジン溶液を使用して実施することもできる。この場合は、セレンテラジンは、酸性化メタノール中の５ｍＭストック溶液として調製する。発光バッファーを調製する（４００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；５ｍＭのβ−シクロデキストリン；脱イオン水；１０ＮのＮａＯＨを用いてｐＨ７．４に緩衝した）。セレンテラジンストック液を次に発光バッファー中で２，０００倍に希釈すると、２．５μＭセレンテラジン溶液が得られた（ＴＲＩＳによってｐＨを７．４に緩衝した）。これは、反応アッセイに加えられる注入溶液である（さらにセレンテラジンの４倍希釈液を生じさせる）。
【０１２５】
２．３．２  インジェクター溶液の添加
シリンジのインジェクション速度は、セレンテラジン溶液がウェル内に注入された場合に迅速に混合されることを保証する程度に高速に設定しなければならない。シリンジの再充填速度は、シリンジバレル内で気泡が作り出されないことを保証する程度に低く設定しなければならない。
【０１２６】
２．３．３  データの分析
４８時間のインキュベーション後、発光および吸光度のデータをマイクロプレートから収集する。発光および吸光度の機能性を結合したマイクロプレートリーダーを使用する。例として、このリーダーはＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５００（Ｔｅｃａｎ  ＵＫ社）であってよい。発光データは、基質の注入およびマイクロプレートの振とう（リーダー内で）後の３秒間の積分時間で収集する。吸光度は、６００ｎｍまたは６２０ｎｍフィルターを通して測定する。これらの発光および吸光度のデータは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌスプレッドシートにトランスポートし、グラフィックデータに変換する。データ処理は最小限である。吸光度データは、増殖能の減少の指標を与え、これらのデータはビヒクル処理コントロール（＝１００％増殖）に正規化する。発光データを吸光度データで割ると、細胞１個当たり平均ＧＬｕｃ誘導の測定結果である「輝度単位」が生じる。これらのデータをビヒクル処理コントロール（＝１）に正規化する。この方法で、少数の高発光細胞と多数の弱発光細胞とを識別することができる。化合物が遺伝毒性であると分類されるか否かに関する決定（以下を参照）は、ソフトウエアを用いて自動で行われる。
【０１２７】
ルーチンアッセイからの陽性および陰性の結果の明確な定義を有することは有用であり、当該の定義は、遺伝毒性および作用機序に関する明白な統一見解がある場合の化学薬品からのシステムおよびデータ内の最大ノイズを考慮に入れて引き出されてきた。当然ながら、ユーザーが数的およびグラフ的データを査察し、独自の結論を出すこともまた可能にする。例えば、閾値と交差しなかった遺伝毒性データにおける上昇傾向はそれでもまだ２種の化合物を識別することができる。決定閾値は、以下のように規定した。
【０１２８】
細胞毒性閾値は、未処理コントロール細胞が達した細胞密度の８０％に設定する。これは、バックグラウンドの標準偏差の３倍高い。陽性細胞毒性結果（＋）は、１または２つの化合物希釈液が８０％閾値より低い最終細胞密度を生成した場合に結論される。強陽性細胞毒性結果陽性（＋＋）は、（ｉ）３つ以上の化合物希釈液が８０％閾値より低い最終細胞密度を生じさせた場合、または（ｉｉ）少なくとも１つの化合物希釈液が６０％閾値より低い最終細胞密度を生じさせた場合のいずれかに結論される。陰性結果（−）は、いずれの化合物希釈液も８０％閾値より低い最終細胞密度を生成しなかった場合に結論される。最低有効濃度（ＬＥＣ）は、８０％閾値より低い最終細胞密度を生じさせる最低試験化合物濃度である。
【０１２９】
化合物吸光度コントロールは、試験化合物が有意に吸収性である場合には警告を出すことを可能にする。化合物コントロールウェル対培地単独が充填されたウェルの吸光度の比率が＞２である場合は、解釈への干渉の危険性が存在する。細胞毒性コントロールは、細胞株が正常に挙動していることを示す。「高」ＭＭＳ標準物質は最終細胞密度を８０％閾値未満に減少させなければならず、「低」標準物質より低い数値でなければならない。
【０１３０】
遺伝毒性閾値は、１．８の相対ＧＬｕｃ誘導率（すなわち、８０％の増加）に設定する。この決定閾値は、バックグラウンドの標準偏差の３倍高く設定する。陽性遺伝毒性結果（＋）は、化合物希釈液が１．８閾値より大きな相対ＧＬｕｃ誘導率を生じさせる場合に結論される。遺伝毒物学の分野の範囲内では、相違する化合物間の遺伝毒性作用の力価における変動を認識する方法でアッセイ結果を評価することが時には望ましいことがある。そこで、ＧＬｕｃ誘導率は、以下の基準を使用して判定することもできる。強陽性遺伝毒性結果（＋＋）は、３つ以上の化合物希釈液が１．８閾値より大きな相対ＧＬｕｃ誘導率を生じさせる場合に結論される。陰性遺伝毒性結果（−）は、いずれの化合物希釈液も１．８閾値より大きな相対ＧＬｕｃ誘導率を生じさせない場合に結論される。ＬＥＣは、１．８閾値より大きな相対ＧＬｕｃ誘導率を生じさせる最低試験化合物濃度である。遺伝毒性コントロールは、細胞株がＤＮＡ損傷に正常に応答することを証明する。「高」コントロールは＞２の発光誘導率を生成しなければならず、「低」コントロールより高い数値でなければならない。異常な輝度データは、毒性がブランクの細胞密度の３０％より低い最終細胞密度をもたらした場合に生成される。遺伝毒性データは、この毒性閾値より上方では計算されない。遺伝毒性について陰性の試験結果が出た化合物は、１０ｍＭもしくは５，０００μｇ／ｍＬまで、または溶解度もしくは細胞毒性の限界まで再試験された。
【０１３１】
化合物発光コントロールは、化合物が高度に自己発光性である場合に警告を出すことを可能にする。化合物コントロールウェルの発光対ビヒクル処理ＧＬｕｃ−ＴＯ１細胞が充填されたウェルからの平均発光の比率が＞０．０５である場合は、解釈への干渉の危険性が存在する。
【実施例３】
【０１３２】
［ｐＥＰ−ＧＤ５３２−ＧＬｕｃデータ］
＜はじめに＞
ＧＦＰは、ＧｒｅｅｎＳｃｒｅｅｎＨＣ遺伝毒性アッセイのための極めて良好なレポーターであることが証明されている。しかしＧＦＰは、多数の限界を有するので、代替レポーターについての探索が推進されてきた。
【０１３３】
この背景に対して、本発明者らは、レポータータンパク質としてルシフェラーゼを使用する遺伝毒性アッセイを開発しようと考えた。ルシフェラーゼ類は、光生成化学反応を触媒する酵素である。生成された光は、１つのアッセイを使用して測定することができ、そして（正確なアッセイ条件下では）存在するルシフェラーゼの量の直接的測定であると見なすことができる。このため、「ＧＡＤＤ４５α−ルシフェラーゼ」発現カセットを有する細胞によって生成された光の量は、試験化合物の遺伝毒性の測定であるところのＧＡＤＤ４５αレポーターエレメントの活性の測定である。
【０１３４】
＜どのルシフェラーゼ＞
本発明者らは、本アッセイに組み込むために利用できるルシフェラーゼ類の中からホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）およびガウシア・ルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）を試験することを選択した。ＦＬｕｃを選択したのは、ＦＬｕｃに基づくアッセイを設計するために利用できる広汎な文献とともに全ルシフェラーゼ類の中で最も明確に記載されているためであった。ＧＬｕｃは、ＦＬｕｃとは相違して細胞から分泌されるので選択した。
【０１３５】
ＦＬｕｃは、最初にホタルであるフォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）からクローン化した。ＦＬｕｃは、光を生成する化学反応においてルシフェリンの酸化を触媒する。反応における補因子としてマグネシウムが必要とされる。
ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ２→オキシルシフェリン＋ＡＭＰ＋光
【０１３６】
ＦＬｕｃは、記載された全ルシフェラーゼ類の最高量子収率（＞８８％）を有する。反応の光出力は、スペクトルの黄色−緑色部分内にある５６２ｎｍでピークに達する。ＦＬｕｃ反応の半減期は＜１０分間であるが、ルシフェラーゼタンパク質の半減期は他のより高い数値が報告されているが一般には約３時間であると認められている。反応の半減期を延長させるためには、例えばコエンザイムＡおよび所定のシチジンヌクレオチドなどの多数の様々な試薬をＦＬｕｃ反応に加えることができる。天然ＦＬｕｃタンパク質は、細胞のペルオキシソーム内に隔離されるが、細胞質に局在できる突然変異体が生成されている。ルシフェリンがＦＬｕｃを発現する細胞に加えられると、細胞が溶解した場合に比較して生細胞内では極めてわずかな光出力しか観察されない。
【０１３７】
ガウシア・ルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）は、海洋カイアシであるガウシア・プリンケプスからクローン化されている。ＧＬｕｃは、発光反応においてセレンテラジンの酸化を触媒する。
セレンテラジン＋Ｏ２  →  セレンテラミド＋光
【０１３８】
反応の光出力は、スペクトルの青色部分内にある約４７０ｎｍでピークに達するが、ＧＬｕｃ反応の半減期は３０秒間未満である。ＧＬｕｃタンパク質は、自然に分泌され、ＧＬｕｃを発現する細胞内では、このタンパク質の大部分は細胞外環境内で見いだされる。ＧＬｕｃタンパク質は、ｐＨおよび温度誘導性分解に対して安定性および抵抗性であると報告されている。
【０１３９】
＜ＦＬｕｃ試薬およびアッセイ法＞
ＦＬｕｃアッセイのための試薬は、最初は論文Ｗｅｔｔｅｙ  ＦＲ，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＡＰ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ．Ｉｎ：Ｒｅｖｉｅｗｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ＤＴ４０  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，２００６，ｐｐ．４２３−４２５から取り出された。これらの試薬およびそれらの濃度を以下に列挙する。両方のミックスのｐＨは、ルシフェラーゼからの光出力を最大化するためにｐＨ７．８へ調整する。
【０１４０】
細胞をペレット化して洗浄することをプロトコールに追加のステップとして加えると、このためデータ内への変動性を増加させるので、ＧｒｅｅｎＳｃｒｅｅｎ  ＨＣアッセイ培地中でＴＫ６細胞を直接的に溶解させることを決定した。実験によって、溶解およびアッセイミックスを結合して同時に細胞に添加できることが決定された。溶解が即時のＦＬｕｃ定量のために十分に高速で発生することは明白であった。この結合溶解およびアッセイミックスの溶液（Ｌ＆Ａバッファー）を以下に示す。
【０１４１】
【表８】
2012524523.tif 000010
【０１４２】
上記に列挙した最終濃度は、Ｌ＆ＡバッファーがＧｒｅｅｎＳｃｒｅｅｎ  ＨＣアッセイ培地と混合された後の試薬類の濃度である。試薬類の最終濃度は一定であり、Ｗｅｔｔｅｙ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎプロトコールからの情報に基づいている。現在実施されているＦＬｕｃアッセイは、４０μＬのＬ＆Ａバッファーの１２０μＬのＧｒｅｅｎＳｃｒｅｅｎ  ＨＣアッセイバッファーへの添加に依存している。このため、Ｌ＆Ａバッファー内の試薬類の初期濃度は、所望の最終濃度より４倍以上高くなければならない。Ｌ＆Ａバッファーは、Ｌ＆ＡバッファーがＧｒｅｅｎＳｃｒｅｅｎ  ＨＣアッセイ培地（ｐＨ７．２）と結合されると約７．８の最終ｐＨを生じさせるので、ｐＨ８．０でなければならない。
【０１４３】
＜ＧＬｕｃ試薬およびアッセイ法＞
ＧＬｕｃアッセイバッファーの調製を以下に示す。完全アッセイバッファーは、室温の暗所で２０分間にわたりインキュベートし、その後に等量のＧＬｕｃサンプルと混合する。セレンテラジンは自然に崩壊し、水溶液中において長期間おくには不安定性である。セレンテラジンを室温へ２０分間にわたり馴化させると、サンプル間でのこの自然崩壊における変動性を最小限に抑える。
【０１４４】
【表９】
2012524523.tif 000011
【０１４５】
上述したように、本アッセイは、ｐＨ７．４に緩衝したセレンテラジン溶液を使用して実施することもできる。この場合は、セレンテラジンは、酸性化メタノール中の５ｍＭストック溶液として調製する。発光バッファーを調製する（４００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；５ｍＭのβ−シクロデキストリン；脱イオン水；１０ＮのＮａＯＨを用いてｐＨ７．４へ緩衝した）。セレンテラジンストック液を次に発光バッファー中で２，０００倍に希釈すると、２．５μＭセレンテラジン溶液が得られた（ＴＲＩＳによってｐＨを７．４に緩衝した）。これは、反応アッセイに加えられる注入溶液である（さらにセレンテラジンの４倍希釈液を生じさせる）。
【０１４６】
＜結果  −  ＧＬｕｃとＦＬｕｃおよびＧＦＰとの比較＞
ｐＥＰ−ＧＤ５３２−ＧＬｕｃの調製については、添付の実施例において記載されている。本発明者らは、類似の戦略を使用してプラスミドｐＥＰ−ＧＤ５３２−Ｌもまた調製したが、このときＦＬｕｃをレポータータンパク質として使用した。ＴＫ６細胞は、ＧＤ５３２−ＬまたはＧＤ５３２−ＧＬｕｃ発現カセットを有するプラスミドを用いてエレクトロポレーションによってトランスフェクトし、該レポータープラスミドを有するクローンを選択する。
【０１４７】
本発明者らは、ＧＬｕｃおよびＦＬｕｃレポータータンパク質のいずれが遺伝毒性アッセイにおいて使用するために最も適合するかを決定したいと考えた。これを決定するために、本発明者らは、ＧＤ５３２−ＬまたはＧＤ５３２−ＧＬｕｃ発現カセットを有する細胞を試験化合物に曝露させ、ＧＬｕｃおよびＦＬｕｃの活性を測定し、標準ＧＡＤＤ４５α−ＧＦＰ発現カセットと比較する一連の実験を実施した。
【０１４８】
（ＭＮＵの作用）
図３に提示したデータは、メチル−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）がＧＦＰ、ＦＬｕｃおよびＧＬｕｃによって報告されたように、ＧＡＤＤ４５α誘導を引き起こす方法を示している。図３を精査すると、レポータータンパク質の安定性およびこれがＧｒｅｅｎＳｃｒｅｅｎ  ＨＣアッセイに影響を及ぼす方法に関する多数の仮説の構築が可能になる。ＦＬｕｃタンパク質は、細胞内で約３時間の半減期を有すると報告されてきた。これと比較して、ＧＦＰは、細胞内で約２６時間の半減期を有すると報告されてきた。これに関連して、ＧＦＰはＧＡＤＤ４５α誘導のより累積的測定結果を生じさせると見なすことができるが、他方ＦＬｕｃは最近のＧＡＤＤ４５α誘導しかレポートしない。
【０１４９】
ＧＡＤＤ４５α誘導は、この濃度でのＧＦＰシグナルにおけるピークによって証明されたように、少なくとも２５８μｇ／ｍＬのＭＮＵとなるまでピークには達しない。３２μｇ／ｍＬより大きなＭＮＵ濃度は、有意な細胞死を引き起こし、これはより高い濃度のＭＮＵでのＦＬｕｃシグナルの減少を説明する。ＭＮＵの２つの最高濃度では、全細胞が実験時間経過の早期に死滅し、生成された任意のタンパク質がそれ以後は分解されているので、検出可能なＦＬｕｃシグナルはほとんどない。これとは対照的に、ＭＮＵの２つの最高濃度ではＧＦＰおよびＧＬｕｃ両方の明白に検出可能なレベルが存在していて、これら２種のタンパク質がＦＬｕｃより高い安定性を有することを証明している。ＧＬｕｃは、このタンパク質が細胞から分泌されるという点で、ＦＬｕｃおよびＧＦＰとは相違することに留意すべきである。これは、本アッセイを設定した時点に、ＧＬｕｃタンパク質の大部分がＴＫ６細胞から分離されることを意味しているが、それはＴＫ６細胞がＰＢＳおよびＧｒｅｅｎＳｃｒｅｅｎ  ＨＣアッセイ培地中で洗浄されるからである。ＧＦＰおよびＦＬｕｃタンパク質は細胞質性であり、このため本アッセイの開始時には有意な量で存在する。図３はさらに、最高相対誘導が見られる相違する化合物試験濃度を示しており、これはＦＬｕｃについては最低であり（３２μｇ／ｍＬ）、死滅および瀕死細胞内でのＦＬｕｃシグナルの消失を反映している。さらに、測定可能なＧＡＤＤ４５α応答の大きさは、ＧＦＰおよびＦＬｕｃと比較した場合に、ＭＮＵ処理細胞に対してＧＬｕｃについての方が明白にはるかに大きい。
【０１５０】
全体としてみると、図３に提示したデータは、ＧＦＰおよびＧＬｕｃはどちらも蓄積するが、他方ＦＬｕｃは蓄積しないことを示している。ＦＬｕｃの誘導ピークは低い試験化合物濃度にあると思われ、シグナルは高濃度では急に減少する（これらの高濃度では、試験化合物は本アッセイの２４時間の時間枠内では極めて毒性である）。事実上、細胞が毒性を経験する／死滅するにつれて、ＦＬｕｃシグナルはそれらとともに消失する。これはＦＬｕｃがエネルギー要件もまた有する短い半減期を備える不安定タンパク質であるためである。ＧＦＰはＦＬｕｃよりはるかに長い半減期を有するので、このため細胞が毒性条件下にあって瀕死である場合でさえ蓄積して遺残し、そこで誘導のピークははるかに高い濃度で生じる可能性がある。重要にも、ＧＬｕｃはさらにまた相対的に安定性のタンパク質であり、さらにＧＦＰと類似する蓄積を示す。これは、ＦＬｕｃではなくＧＬｕｃをルシフェラーゼレポータータンパク質として使用するための重要な利点である。ＦＬｕｃが使用された場合は、ルシフェラーゼシグナルがＧＡＤＤ４５α活性、したがってレポータータンパク質の分解および試験物質の細胞毒性作用によって有意に影響を受ける応答ではなくむしろ試験化合物の遺伝毒性の測定結果であることを確証するために、多数の時点でデータを測定することが必要になる可能性がある。
【０１５１】
（４種の試験化合物がＦＬｕｃ活性に及ぼす作用）
ＦＬｕｃ細胞を数種の公知の遺伝毒性物質および非遺伝毒性物質と組み合わせた。ＦＬｕｃの発現を処理８、１６、２４、３２、４０および４８時間後に測定した。示した結果は、試験した４種の化合物について、処理１６、２４または４８時間後のいずれかの時点に最大誘導率が観察されたことを明らかにした。図４は、３種の遺伝毒性物質（コルヒチン、５−フルオロウラシルおよび硫酸ビンブラスチン）ならびに１種の非毒性非遺伝毒性物質（エチレングリコール）についての経時的な最大誘導値を示している。図４は、最大ＧＬｕｃ誘導率は様々な試験化合物について様々な時点に達成されたことを示している。コルヒチンおよびおそらく５−フルオロウラシルは、ＧｒｅｅｎＳｃｒｅｅｎ  ＨＣアッセイにおける好ましい４８時間のエンドポイントを使用して遺伝毒性であるとは検出されない可能性がある。これは、全部の公知の遺伝毒性物質を検出するためには多数の時点が必要とされることを意味し、使用可能なアッセイを動力学的に実施する必要があることを示唆している。しかし、この結果は、ＦＬｕｃ誘導率決定には細胞の溶解を必要とし、個別細胞における多数の時点を排除するので、問題が多い。さらに、図４に示した同一化合物は、ＧＬｕｃを用いた４８時間のエンドポイントを使用するアッセイにおいてレポータータンパク質であると（３種の遺伝毒性物質および１種の非遺伝毒性物質）正確に同定された。
【０１５２】
このため、図４は、タンパク質不安定性および蓄積の欠如に起因するＦＬｕｃについての測定時点の問題を証明している。
【０１５３】
＜要約＞
ＦＬｕｃの半減期が短いという不利点は、ＦＬｕｃを使用した遺伝毒性アッセイが、ピークＦＬｕｃ誘導が記録されることを保証するために多数の時点（３回以上）を必要とする点である。これは、ＦＬｕｃ濃度を決定するためには細胞溶解が必要とされるので重大な問題であり、各時点に対してパラレルアッセイ・マイクロプレートがセットアップされなければならない。ＧＬｕｃは、ＦＬｕｃに比して少なくとも２つの利点を提供する。第１に、ＧＬｕｃは分泌されるので、細胞溶解を行わずにその存在を決定することができる。第２に、ＧＬｕｃはＦＬｕｃより安定性であり、このため２回以上の時点の必要を排除する。
【０１５４】
このデータから、本発明者らは、ＧＬｕｃは、遺伝毒性アッセイにおけるルシフェラーゼレポータータンパク質として使用するためにＦＬｕｃより優れた特性を有すると結論した。
【０１５５】
＜結果  −  ｐＥＰ−ＧＤ５３２−ＧＬｕｃを使用した遺伝毒性試験データ＞
一連の遺伝毒性アッセイは、ＧＤ５３２−ＧＬｕｃ発現カセット（「ＧＬｕｃアッセイ」）を有するＴＫ６細胞株を使用して実施した。これらのアッセイは、後述する実施例に提供する実験プロトコールを使用して実施した。
【０１５６】
アッセイからの典型的データは、図５に提供した。この場合には、パネルＡから、非遺伝毒性物質であるクロラムフェニコールがＧＬｕｃアッセイにおいて予想されたように陰性として検出されたことが明らかである。これとは対照的に、パネルＢでは、遺伝毒性物質であるエトポシドは、ＧＬｕｃアッセイにおいて予想されたように陽性であると検出された。
【０１５７】
本発明者らは、ＧＤ５３２−ＧＬｕｃレポーター系を用いて試験された様々なクラスの遺伝毒性物質についての典型的な遺伝毒性試験結果の一覧も以下に包含している。
【０１５８】
【表１０】
2012524523.tif 000012
【０１５９】
各「＋」は、個別アッセイにおける転帰を表している。すなわち、試験化合物は全部を３回ずつ試験した。列挙した全試験化合物は、ＧＤ５３２−ＧＬｕｃレポーター系によって遺伝毒性物質として陽性であると同定された。
【０１６０】
＜結果  −  高い信号対雑音比および発光出力は蛍光干渉の衝撃を減少させる＞
ＧＬｕｃレポータータンパク質を使用する遺伝毒性アッセイを詳細に特徴付けるために、本発明者らは、ＧＬｕｃおよびＧＦＰレポータータンパク質を使用した高蛍光性試験化合物のアッセイの「シグナル対ノイズ比」を評価した。生成されたデータは、図６に明らかである。パネル（Ａ）において、蛍光菌株（下方の線）および非蛍光菌株（上方の線）との間にはほとんど、または全く区別がないことに留意されたい。これは、ＧＦＰレポータータンパク質から蛍光を効果的に遮蔽する化合物からの自家蛍光のためである。これとは対照的に、ＧＬｕｃ系からは干渉を伴わずに明白な陽性シグナルが生じる。
【０１６１】
ここで、レポータータンパク質としてＧＬｕｃを使用するアッセイは、ほぼゼロのバックグラウンドを伴って高強度の光出力を生成することを見て取ることができる。レポーターアッセイとして発光を使用する利点は、蛍光に基づくアッセイにおいて使用されるように、入射光線の必要がないことである。これは、ＧＦＰレポータータンパク質からのシグナルを遮蔽する可能性がある望ましくない蛍光の励起が生じないことを意味する。ＧＦＰではなくＧＬｕｃを使用することによって、高度に蛍光性の化合物さえＧＬｕｃ出力に対する問題を引き起こさずに試験することができる。結果として、ルシフェラーゼ測定は、着色または蛍光性試験材料からの干渉に悩まされる可能性が低い。
【０１６２】
さらに、高い「シグナル対ノイズ比」は、ＧＬｕｃ媒介性生物発光を使用した遺伝毒性アッセイを、図８に提示したデータから明らかなように、３８４ウェル・マイクロタイタープレートを使用して実施することを可能にする。
【実施例４】
【０１６３】
［代謝活性化試験のためのＧＬｕｃを使用した適応させた遺伝毒性アッセイ］
本発明者らは、Ｓ９肝抽出物をアッセイに使用できるように上述した、および添付の実施例に記載した遺伝毒性アッセイを適応させた。Ｓ９抽出物を使用することによって、本アッセイは、それらの天然形では本質的に遺伝毒性ではないが、代謝反応に起因して遺伝毒性になるプロ変異誘起物質またはプロ遺伝毒性物質化合物の検出を許容する。
【０１６４】
Ｓ９は、それらの天然形では非遺伝毒性であるが、（主として肝臓内での）代謝によって化学的に変化させられてインビボで遺伝毒性化合物を生成する化合物を検出することを許容する（当業者には公知の）肝抽出物である。
【０１６５】
Ｓ９抽出物は、実施例２の方法への並行アッセイまたは独立アッセイのいずれかとして、上記の実施例２に記載したアッセイ方法の適応化に組み込むことができる。Ｓ９組み込みアッセイでは、ＧＬｕｃ−ＴＯ１細胞は酵素補因子（例えば、グルコース−６−ホスフェート（２．５ｍＭ）およびβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（０．５ｍＭ））との混合物中においてＳ９抽出物の存在下で試験化合物に曝露させられる。Ｓ９抽出物は、通常はアッセイマイクロプレート内において１％（ｖ／ｖ）の最終濃度で使用される。試験化合物およびＳ９ミックスとのインキュベーション時間は、一般には３時間であり、その後にＳ９および試験化合物は除去され、細胞はＰＢＳ中で洗浄され、次にインキュベーションの残り４５時間にわたり新鮮アッセイ培地中で再懸濁させられる。Ｓ９組み込みアッセイの条件（例えば、曝露時間およびＳ９のタイプ、動物種、肝酵素の化学的誘導など）は、実験要件にしたがって変動してよい。
【０１６６】
＜適応させたプロトコール＞
プレートリーダー測定値の使用は、結果としてＳ９代謝活性化試験におけるプロ遺伝毒性物質についてのアッセイの感受性低下を生じさせることが見いだされた。これは予想外であった。本発明者らは、この事態をさらに詳細に調査し、これが細胞密度を推定するため、およびレポーター出力の正規化のために使用された吸光度測定値の相対非感受性に起因することを見いだした。相対非感受性は、典型的な標準のプロ遺伝毒性化合物の一部が遺伝毒性であると確実には検出されないことを意味した。
【０１６７】
本発明者らは、引き続いて、吸光度測定値と取り換えて蛍光細胞染色を使用できることを見いだした。これは、２つの方法が同一物を推定する効果的に相違する方法であるためである。驚くべきことに、細胞染色を使用した方法は、細胞数推定の感受性およびこのためプロ遺伝毒性物質の検出を改善した。
【０１６８】
適応させたプロトコールにおいて使用した細胞染色は、核酸に結合するシアニン色素であるチアゾールオレンジ（ＴＯ）である。ＴＯのＤＮＡおよびＲＮＡへの結合は、その蛍光強度を大きく増強し、バックグラウンドの未結合ＴＯを洗い流す必要を伴わずにその検出を許容する。
【０１６９】
この方法は、マイクロプレートウェル内に存在するＤＮＡまたは全細胞に接近することを可能にするために、ＧＬｕｃ−ＴＯ１細胞を溶解させることを必要とする。存在する核酸の量は細胞数に比例し、このためＤＮＡ結合ＴＯからの蛍光強度もまた細胞数に比例している。
【０１７０】
ＴＯは、ストック溶液を２５ｍＭで形成するために１００％ＤＭＳＯ中に溶解させる。これをＰＢＳおよびＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００からなる細胞溶解溶液と混合する。各マイクロプレートウェルに５０μＬのＴＯ／溶解ミックスを加え、５〜２０分間にわたりインキュベートし、その後に蛍光測定値を獲得する（励起：４８５ｎｍおよび発光：５３５ｎｍ）。マイクロプレート内では、ＴＯの最終濃度は１５μＭであり、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００については１％（ｖ／ｖ）である。
【０１７１】
図７は、細胞数を用いた（アッセイに関連する最適化条件および細胞密度を使用する）ＴＯ蛍光の検量線（Ａ）およびＴＯ細胞数推定値を組み込んだＳ９代謝活性化ＧＬｕｃアッセイを使用して検出された標準プロ遺伝毒性物質（６−アミノクリセン）についての典型的データ（Ｂ）を示している。
【０１７２】
上記の実施例２で考察したように、ルーチンアッセイからの陽性および陰性の結果の明確な定義を有することは有用であり、当該の定義は、遺伝毒性および作用機序に関する明白な合意がある場合の化学薬品からのシステムおよびデータ内の最大雑音を考慮に入れて引き出されてきた。
【０１７３】
本アッセイがＳ９肝抽出物を包含する場合は、遺伝毒性閾値は１．５の相対ＧＬｕｃ誘導率（すなわち、５０％増加）で設定する。そこで、陽性遺伝毒性結果（＋）は、試験化合物が１．５閾値より大きな相対ＧＬｕｃ誘導率を生じさせる場合に結論される。
【０１７４】
付属書１：ｐＥＰ−ＧＤ５３２  ＧＬｕｃの配列（配列番号１）
【表１１Ａ】
2012524523.tif 000013
【表１１Ｂ】
2012524523.tif 000014
【表１１Ｃ】
2012524523.tif 000015
【表１１Ｄ】
2012524523.tif 000016
【表１１Ｅ】
2012524523.tif 000017
【表１１Ｆ】
2012524523.tif 000018
【表１１Ｇ】
2012524523.tif 000019
【表１１Ｈ】
2012524523.tif 000020
【０１７５】
付属書２：発現カセットＧＤ５３２−ＧＬｕｃの配列（配列番号２）
【表１２Ａ】
2012524523.tif 000021
【表１２Ｂ】
2012524523.tif 000022
【表１２Ｃ】
2012524523.tif 000023
【図１Ａ】
2012524523.tif 000024
【図１Ｂ】
2012524523.tif 000025
【図２Ａ】
2012524523.tif 000026
【図２Ｂ】
2012524523.tif 000027
【図３】
2012524523.tif 000028
【図４】
2012524523.tif 000029
【図５】
2012524523.tif 000030
【図６】
2012524523.tif 000031
【図７】
2012524523.tif 000032
【図８】
2012524523.tif 000033
【配列表】
2012524523000001.xml
【国際調査報告】
2012524523.tif 000045
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