(57)【要約】本発明は、抗癌処置に対する対象の感受性を評価するため、癌を処置するために有用である化合物をスクリーニングするため、及び対象における転移再発の可能性を決定するための方法に関する。前記方法は、被験者における非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路が処置に耐性を示す知見に基づいている。本発明は、さらに、癌を処置するため及び癌処置に対する対象の感受性を回復するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の化学療法又は放射線療法の処置に対する対象の感受性を評価するインビトロでの方法であって、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態を決定することを含み、非機能的経路が前記処置に対する耐性を示す方法。
【請求項２】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態が、前記経路に関与する遺伝子における機能喪失突然変異の検出により評価され、前記突然変異の存在が非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を示す、請求項１記載の方法。
【請求項３】
突然変異が、ｒｓ２８３６０４５７、ｒｓ１６５３６２４、ｒｓ３７５１１４３、ｒｓ２２３０９１１、及びｒｓ５０１１９２からなる群より選択されるＳＮＰである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＳＮＰがｒｓ３７５１１４３である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態が、前記経路に関与するタンパク質の突然変異ポリペプチド配列又は損なわれた発現の検出により評価され、突然変異配列又は発現が非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を示す、請求項１記載の方法。
【請求項６】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態が、化学療法又は放射線療法の処置前後で対象の血液サンプル中でのＩＬ−１βレベルを比較することにより評価され、前記処置後での前記レベルの有意な増加が機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を示す、請求項１記載の方法。
【請求項７】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態が、死にかけている腫瘍細胞の存在においてＩＬ−１βを分泌する対象の樹状細胞の能力を測定することにより評価され、標準レベルと比較して低下した能力が、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路と相関する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態が、ＨＭＧＢ１及びＡＴＰの存在においてＩＬ−１βを分泌する対象の樹状細胞の能力を測定することにより評価され、標準レベルと比較して低下した能力が、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路と相関する、請求項１記載の方法。
【請求項９】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態が、リポポリサッカリド及びＡＴＰの存在においてＩＬ−１βを分泌する対象の単球の能力を測定することにより評価され、標準レベルと比較して低下した能力が、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路と相関する、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態が、前記経路の構成成分の機能分析により評価され、前記経路の少なくとも１つの構成成分の機能喪失が、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を示す、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態が、Ｐ２Ｘ７受容体の機能分析により評価される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態が、ＩＬ−１βの機能分析により評価される、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態が、カスパーゼ１の機能分析により評価される、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
癌の化学療法の処置が、アントラサイクリン、オキサリプラチン、及びシスプラチンからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
放射線療法の処置がＸ線又はガンマ線である、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
癌が、乳房、結腸、卵巣、胃、肉腫、子宮粘膜、膀胱、子宮頸部、前立腺、直腸、肺、ＯＲＬ癌、小児腫瘍（神経芽細胞腫、多形性膠芽腫）、リンパ腫、白血病、ミエローマ、セミノーマ、ホジキン及び悪性血液病からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を有する対象において癌の化学療法又は放射線療法の処置に対する感受性を増加又は回復するために有用である化合物をスクリーニングするためのインビトロでの方法であって、前記対象において死にかけている腫瘍細胞の存在における樹状細胞によるＩＬ−１β分泌を誘導又は増加する試験化合物の能力を決定することを含む方法。
【請求項１８】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を有する対象において癌を処置するために有用である化合物をスクリーニングするためのインビトロでの方法であって、前記対象において死にかけている腫瘍細胞の存在における樹状細胞によるＩＬ−１β分泌を誘導又は増加する試験化合物の能力を決定することを含む方法。
【請求項１９】
非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する対象において癌の化学療法又は放射線療法の処置に対する感受性を増加又は回復するために有用である化合物をスクリーニングするための方法であって、（ｉ）癌の化学療法又は放射線療法の処置との組み合わせで、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有し、腫瘍を用いて接種された非ヒトトランスジェニック動物に試験化合物を投与すること、及び（ｉｉ）前記処置に対する前記動物の感受性を評価することを含む方法。
【請求項２０】
対象における癌再発の可能性を決定するためのインビトロでの方法であって、前記対象においてＰ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態を決定することを含み、非機能的経路が再発の可能性の増加を示す方法。
【請求項２１】
癌再発が転移再発である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態が、前記経路に関与する遺伝子における機能喪失突然変異の検出により評価され、前記突然変異の存在が非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を示す、請求項２０又は２１記載の方法。
【請求項２３】
突然変異が、ｒｓ２８３６０４５７、ｒｓ１６５３６２４、ｒｓ３７５１１４３、ｒｓ２２３０９１１、及びｒｓ５０１１９２からなる群より選択されるＳＮＰであり、好ましくは、ＳＮＰ  ｒｓ３７５１１４３である、請求項２０〜２２のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
それを必要とする対象のために適した化学療法又は放射線療法の処置を選択するためのインビトロでの方法であって、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態を決定することを含み、非機能的経路が、免疫原性腫瘍細胞死を誘導する抗癌処置についての禁忌と考えられている方法。
【請求項２５】
化学療法薬剤及びＰ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を補うことができる化合物を含む医薬的組成物。
【請求項２６】
化学療法薬剤が、アントラサイクリン、オキサリプラチン、及びシスプラチンからなる群より選択される、請求項２５記載の医薬的組成物。
【請求項２７】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を補うことができる化合物が、ＩＬ−１β；ＩＬ−１２；ナチュラルキラー細胞及びナチュラルキラーＴ細胞アクチベーター、例えばＣＤ１ｄアゴニスト、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、又はＩＦＮαなど；Ｐ２Ｘ７受容体アクチベーター、例えばカテリシジン由来ペプチドＬＬ３７、ポリミキシンＢ、ＳＴＡＴ３阻害剤、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、ＴＧＦｂ阻害ペプチド、ＩＬ−１０阻害ペプチド、抗ＩＬ−１０モノクローナル抗体、抗ＩＬ−１３モノクローナル抗体、抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体、及びＩＬ−３３などからなる群より選択される、請求項２５記載の医薬的組成物。
【請求項２８】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を補うことができる化合物が、組換えＩＬ−１βである、請求項２７記載の医薬的組成物。
【請求項２９】
化学療法薬剤及びＰ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を補うことができる化合物を、癌の処置における同時、別々、又は連続使用のための組み合わせ調製物として含む産物。
【請求項３０】
化学療法薬剤が、アントラサイクリン、オキサリプラチン、及びシスプラチンからなる群より選択される、請求項２９記載の産物。
【請求項３１】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を補うことができる化合物が、ＩＬ−１β；ＩＬ−１２；ナチュラルキラー細胞及びナチュラルキラーＴ細胞アクチベーター、例えばＣＤ１ｄアゴニスト、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、又はＩＦＮαなど；Ｐ２Ｘ７受容体アクチベーター、例えばカテリシジン由来ペプチドＬＬ３７、ポリミキシンＢ、ＳＴＡＴ３阻害剤、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、ＴＧＦｂ阻害ペプチド、ＩＬ−１０阻害ペプチド、抗ＩＬ−１０モノクローナル抗体、抗ＩＬ−１３モノクローナル抗体、抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体、及びＩＬ−３３などからなる群より選択される、請求項２９記載の産物。
【請求項３２】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を補うことができる化合物が、組換えＩＬ−１βである、請求項３１記載の産物。
【請求項３３】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を有する対象における、化学療法薬剤又は放射線療法の処置と組み合わせた癌の処置における使用のためのＰ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を補うことができる化合物。
【請求項３４】
化合物が、ＩＬ−１β；ＩＬ−１２；ナチュラルキラー細胞及びナチュラルキラーＴ細胞アクチベーター、例えばＣＤ１ｄアゴニスト、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、又はＩＦＮαなど；Ｐ２Ｘ７受容体アクチベーター、例えばカテリシジン由来ペプチドＬＬ３７、ポリミキシンＢ、ＳＴＡＴ３阻害剤、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、ＴＧＦｂ阻害ペプチド、ＩＬ−１０阻害ペプチド、抗ＩＬ−１３モノクローナル抗体、及びＩＬ−３３などからなる群より選択される、請求項３３記載の化合物。
【請求項３５】
化合物が組換えＩＬ−１βである、請求項３４記載の化合物。
【請求項３６】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を有する対象において癌を処置するための医薬の製造のためのＰ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を補うことができる化合物の使用。
【請求項３７】
癌を患い、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する対象において化学療法又は放射線療法の処置の効力を増加させるための方法であって、治療的有効量の請求項３０記載の化合物と組み合わせて化学療法又は放射線療法の処置を施すことを含む方法。
【請求項３８】
癌を患い、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を有する対象を処置するための方法であって、請求項３０記載の化合物と組み合わせて化学療法又は放射線療法の処置を施すことを含む方法。
【請求項３９】
アントラサイクリン、オキサリプラチン、シスプラチン、及びＸ線からなる群より選択される処置を、組換えＩＬ−１βとの組み合わせで施すことを含む、請求項３８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般的に、遺伝学、免疫学、及び医薬の分野に関する。本発明者らは、特に、癌の処置に対する対象の感受性を予測又は評価するために使用される経路の同定を開示する。この経路は、また、治療的に活性な薬物のスクリーニングのために、及び感受性を回復させるために使用することができる。
【０００２】
発明の背景
癌は、細胞分裂の制御が失われた場合に生じ、ＤＮＡ修復経路の障害、癌遺伝子への正常遺伝子の形質転換、又は腫瘍抑制遺伝子の機能障害に起因する。
【０００３】
外科手術と共に、化学療法及び放射線療法を、多くの型の癌を処置するために使用する。多種多様の化学療法薬剤（種々の機構で関与する）が開発されており、癌患者の生存は、多くの型の癌について大幅に改善されてきた。しかし、癌処置において、同じ組織像を有する個々の対象が、所与の薬剤又は所与の治療プロトコールに同様の反応を示さないという最も重要な問題の１つが残る。
【０００４】
最近まで、癌疾患における免疫系の役割は、その腫瘍促進性局面について考えられただけであった。しかし、放射線療法及び一部の化学療法薬剤も特定の免疫応答を誘導し、免疫原性の癌細胞死又は免疫賦活性の副作用を招きうる（Koebel et al., 2007; Zitvogel et al., 2008）。免疫応答に対する抗癌治療の影響は、異なる機構を含みうる：（ｉ）免疫抑制細胞、例えば調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）（例、シクロホスファミド）又は骨髄系抑制細胞（例、ゲムシタビン、ＡＴＲＡ）などの除去、（ｉｉ）免疫エフェクターの活性化（例、メシル酸イマチニブ、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤）、及び（ｉｉｉ）免疫原性癌細胞死の誘導（例、アントラサイクリン、オキサリプラチン、及びＸ線）。
【０００５】
処置が免疫原性癌細胞死を誘導する薬剤を含む場合、効率的な応答は、死にかけている癌細胞から抗原を提示し、腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）をプライムする樹状細胞（ＤＣ）の能力に依存する。ＣＴＬ応答を高めるために、ＤＣは、ストレスを受けた又は死にかけている細胞から抗原を取り込み、成熟段階において抗原プロセシングの能力を獲得し、特定ＣＴＬの分化／活性化を刺激する共刺激シグナル及びサイトカインに関連してＭＨＣ分子に結合した抗原ペプチドを提示しなければならない（Figdor et al., 2004; Steinman et al., 2007）。樹状細胞による処理された腫瘍細胞の食作用は、腫瘍細胞表面へのカルレチクリンのアポトーシス前転位により促進される（Obeid et al., 2007）。腫瘍抗原特異的なＴ細胞免疫の活性化は、死にかけている腫瘍細胞による高移動度群ボックス１アラーミンタンパク質（ＨＭＧＢ１）の分泌及び樹状細胞により発現されるＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）上でのこのタンパク質の作用を含む（Apetoh et al., 2007）。これらの観察に基づき、異常なＴＬＲ４タンパク質の発現又は活性が、以前に、抗癌処置に対する耐性を示していると記載された（ＷＯ  ０８／００９６９３）。
【０００６】
アントラサイクリン、オキサリプラチン、及びＸ線は、抗癌処置の大半の基礎となるため、これらの処置に対する低下した応答の予測は、患者管理のために必須である。さらに、抗癌処置の大半が重度の副作用を起こすだけでなく、一般的に、患者を身体的に消耗させ、しばしば、高コストとなることを考えると、適切な化学療法及び／又は放射線療法プロトコールの選択が極めて重要である。結果的に、特定の処置の実際の開始前に処置に対する患者の応答を予測するための方法が強く求められている。この予測に基づいて、治療プロトコールを次にこの患者のために適応することができる。
【０００７】
発明の概要
驚くべきことに、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路が、抗癌処置に対する対象の応答ひいてはそのような処置に対する前記対象の感受性に関与することが本発明者らにより、見いだされてきた。
【０００８】
したがって、第１の局面において、本発明は、癌の化学療法又は放射線療法の処置に対する対象の感受性を評価するインビトロでの方法に関し、前記方法は、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態を決定することを含み、非機能的経路は前記処置に対する耐性を示す。
【０００９】
第２の局面において、本発明は、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を有する対象において癌の化学療法又は放射線療法の処置に対する感受性を増加又は回復するために有用である化合物をスクリーニングするためのインビトロでの方法に関し、前記方法は、前記対象において死にかけている腫瘍細胞の存在における樹状細胞によるＩＬ−１β分泌を誘導又は増加する試験化合物の能力を決定することを含む。
【００１０】
さらなる局面において、本発明は、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を有する対象において癌を処置するために有用である化合物をスクリーニングするためのインビトロでの方法に関し、前記方法は、前記対象において死にかけている腫瘍細胞の存在における樹状細胞によるＩＬ−１β分泌を誘導又は増加する試験化合物の能力を決定することを含む。
【００１１】
別の局面において、本発明は、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する対象において癌の化学療法又は放射線療法の処置に対する感受性を増加又は回復するために有用である化合物をスクリーニングするための方法に関し、前記方法は、（ｉ）非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有し、腫瘍を接種した非ヒトトランスジェニック動物に対して癌の化学療法又は放射線療法の処置と組み合わせて試験化合物を投与すること、及び（ｉｉ）前記処置に対する前記動物の感受性を評価することを含む。
【００１２】
別の局面において、本発明は、対象において癌再発の可能性を決定するためのインビトロでの方法に関し、前記方法は、前記対象においてＰ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態を決定することを含み、非機能的経路は、癌再発の可能性の増加を示す。好ましくは、癌再発は転移再発である。あるいは、癌再発は原発腫瘍の再発である。好ましくは、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態は、前記経路に関与する遺伝子の機能喪失突然変異の検出により評価され、前記突然変異の存在は非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を示す。特に、突然変異は、ｒｓ２８３６０４５７、ｒｓ１６５３６２４、ｒｓ３７５１１４３、ｒｓ２２３０９１１、及びｒｓ５０１１９２からなる群より選択されるＳＮＰであり、好ましくＳＮＰ  ｒｓ３７５１１４３である。
【００１３】
別の局面において、本発明は、それを必要とする対象のために適した化学療法又は放射線療法の処置を選択するためのインビトロでの方法に関し、前記方法は、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態を決定することを含み、非機能的経路は、免疫原性腫瘍細胞死を誘導する抗癌処置についての禁忌と考えられている。
【００１４】
さらなる局面において、本発明は、化学療法薬剤及びＰ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を補うことができる化合物を含む医薬的組成物に関する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、化学療法薬剤及びＰ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を補うことができる化合物を、癌の処置における同時、別々、又は連続使用のための組み合わせ調製物として含む産物に関する。
【００１６】
別の局面において、本発明は、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を有する対象において、化学療法薬剤又は放射線療法の処置と組み合わせた癌の処置における使用のためのＰ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を補うことができる化合物に関する。
【００１７】
別の局面において、本発明は、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を有する対象において、癌を処置するための医薬の製造のためのＰ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を補うことができる化合物の使用に関する。
【００１８】
本発明は、また、癌を患い、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する対象における化学療法又は放射線療法の処置の効力を増加させるための方法に関し、前記方法は、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を補うことができる治療的有効量の化合物と組み合わせて化学療法又は放射線療法の処置を施すことを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１ａ】死にかけている腫瘍細胞によるＡＴＰ放出は、細胞死の免疫原性を指示する。図１ａ：化学療法への腫瘍細胞の暴露後の細胞外空間におけるＡＴＰの蓄積。ＥＧ７を、オキサリプラチンを用いて処理し、上清中へのＡＴＰ放出をモニターした。図１ｂ：アンチマイシンＡ及びデオキシグルコースを使用したオキサリプラチン処理時での細胞内ＡＴＰの減少及び細胞内プールのＡＴＰの枯渇。ＥＧ７をオキサリプラチンを用いて２４時間にわたり処理し、続いてアンチマイシンＡ及びデオキシグルコース（Ａ／Ｄ）を用いて２０分間処理した。３つの内の１つの代表的な実験でのデータ（３通りでの平均±ＳＥＭ）を示す。図１ｃ：ＡＴＰが枯渇した死にかけている腫瘍細胞でのＯＶＡ特異的免疫応答誘発の不全。生きた又はオキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞をＣ５７Ｂｌ／６マウスの足蹠中に注射した。５日後、膝窩リンパ節細胞を回収し、ＩＦＮγ分泌の定量化前に７２時間にわたりＯＶＡホロタンパク質を用いて再刺激した。ＡＴＰ枯渇又は非枯渇ＥＧ７を用いて免疫化されたマウスの間でのＩＦＮγ分泌のレベルを、３つの独立した実験において比較した。図１ｄ：酸化ＡＴＰ（ｏｘｉＡＴＰ）を用いたプリン受容体の阻害によって、オキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞によるＴ細胞のプライミングが無効になる。オキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞を、ｏｘｉＡＴＰと混合し又は混合せず、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの足蹠中に注射し、ＯＶＡ特異的免疫応答をｃの通りに検討し、ｏｘｉＡＴＰの存在又は非存在においてＴＬＲ３／９リガンド（ポリＩ：Ｃ＋ＣｐＧ（Ｃ／Ｐ））と共に注射されたＯＶＡタンパク質を用いて達成されたものと比較した。図１ｅ：死にかけている腫瘍細胞に対する免疫応答を媒介するためのＤＣ上でのＰ２Ｘ７発現の要件。ＷＴ又はＰ２Ｘ７−／−マウスからのＤＣを最初に抗原（Ｃ／Ｐアジュバントを併せたＯＶＡホロタンパク質、生きた又はオキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞）を用いて負荷し、次にＰ２Ｘ７−／−レシピエントの足蹠中に注射した。５日後、局所免疫応答を（ａ）の通りに測定した。実験は３〜４匹マウス／群を含み、３回繰り返し、同様の結果を得た（＊ｐ＜０．０５）。図１ｆ：ＡＴＰ枯渇の前又は後でのオキサリプラチン処理されたＥＧ７の表現型。オキサリプラチンを用いて２０時間にわたり処理され、洗浄され、アンチマイシンＡ／デオキシグルコース（Ａ／Ｄ）を用いて２０分間インキュベートされ（図１ｂを参照のこと）、ヨウ化プロピジウム及びアネキシンＶ−ＦＩＴＣを用いて染色されたＥＧ７腫瘍細胞でのフローサイトメトリー分析。
【図１ｂ】死にかけている腫瘍細胞によるＡＴＰ放出は、細胞死の免疫原性を指示する。図１ａ：化学療法への腫瘍細胞の暴露後の細胞外空間におけるＡＴＰの蓄積。ＥＧ７を、オキサリプラチンを用いて処理し、上清中へのＡＴＰ放出をモニターした。図１ｂ：アンチマイシンＡ及びデオキシグルコースを使用したオキサリプラチン処理時での細胞内ＡＴＰの減少及び細胞内プールのＡＴＰの枯渇。ＥＧ７をオキサリプラチンを用いて２４時間にわたり処理し、続いてアンチマイシンＡ及びデオキシグルコース（Ａ／Ｄ）を用いて２０分間処理した。３つの内の１つの代表的な実験でのデータ（３通りでの平均±ＳＥＭ）を示す。図１ｃ：ＡＴＰが枯渇した死にかけている腫瘍細胞でのＯＶＡ特異的免疫応答誘発の不全。生きた又はオキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞をＣ５７Ｂｌ／６マウスの足蹠中に注射した。５日後、膝窩リンパ節細胞を回収し、ＩＦＮγ分泌の定量化前に７２時間にわたりＯＶＡホロタンパク質を用いて再刺激した。ＡＴＰ枯渇又は非枯渇ＥＧ７を用いて免疫化されたマウスの間でのＩＦＮγ分泌のレベルを、３つの独立した実験において比較した。図１ｄ：酸化ＡＴＰ（ｏｘｉＡＴＰ）を用いたプリン受容体の阻害によって、オキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞によるＴ細胞のプライミングが無効になる。オキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞を、ｏｘｉＡＴＰと混合し又は混合せず、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの足蹠中に注射し、ＯＶＡ特異的免疫応答をｃの通りに検討し、ｏｘｉＡＴＰの存在又は非存在においてＴＬＲ３／９リガンド（ポリＩ：Ｃ＋ＣｐＧ（Ｃ／Ｐ））と共に注射されたＯＶＡタンパク質を用いて達成されたものと比較した。図１ｅ：死にかけている腫瘍細胞に対する免疫応答を媒介するためのＤＣ上でのＰ２Ｘ７発現の要件。ＷＴ又はＰ２Ｘ７−／−マウスからのＤＣを最初に抗原（Ｃ／Ｐアジュバントを併せたＯＶＡホロタンパク質、生きた又はオキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞）を用いて負荷し、次にＰ２Ｘ７−／−レシピエントの足蹠中に注射した。５日後、局所免疫応答を（ａ）の通りに測定した。実験は３〜４匹マウス／群を含み、３回繰り返し、同様の結果を得た（＊ｐ＜０．０５）。図１ｆ：ＡＴＰ枯渇の前又は後でのオキサリプラチン処理されたＥＧ７の表現型。オキサリプラチンを用いて２０時間にわたり処理され、洗浄され、アンチマイシンＡ／デオキシグルコース（Ａ／Ｄ）を用いて２０分間インキュベートされ（図１ｂを参照のこと）、ヨウ化プロピジウム及びアネキシンＶ−ＦＩＴＣを用いて染色されたＥＧ７腫瘍細胞でのフローサイトメトリー分析。
【図１ｃ】死にかけている腫瘍細胞によるＡＴＰ放出は、細胞死の免疫原性を指示する。図１ａ：化学療法への腫瘍細胞の暴露後の細胞外空間におけるＡＴＰの蓄積。ＥＧ７を、オキサリプラチンを用いて処理し、上清中へのＡＴＰ放出をモニターした。図１ｂ：アンチマイシンＡ及びデオキシグルコースを使用したオキサリプラチン処理時での細胞内ＡＴＰの減少及び細胞内プールのＡＴＰの枯渇。ＥＧ７を、オキサリプラチンを用いて２４時間にわたり処理し、続いてアンチマイシンＡ及びデオキシグルコース（Ａ／Ｄ）を用いて２０分間処理した。３つの内の１つの代表的な実験でのデータ（３通りでの平均±ＳＥＭ）を示す。図１ｃ：ＡＴＰが枯渇した死にかけている腫瘍細胞でのＯＶＡ特異的免疫応答誘発の不全。生きた又はオキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞をＣ５７Ｂｌ／６マウスの足蹠中に注射した。５日後、膝窩リンパ節細胞を回収し、ＩＦＮγ分泌の定量化前に７２時間にわたりＯＶＡホロタンパク質を用いて再刺激した。ＡＴＰ枯渇又は非枯渇ＥＧ７を用いて免疫化されたマウスの間でのＩＦＮγ分泌のレベルを、３つの独立した実験において比較した。図１ｄ：酸化ＡＴＰ（ｏｘｉＡＴＰ）を用いたプリン受容体の阻害によって、オキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞によるＴ細胞のプライミングが無効になる。オキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞を、ｏｘｉＡＴＰと混合し又は混合せず、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの足蹠中に注射し、ＯＶＡ特異的免疫応答をｃの通りに検討し、ｏｘｉＡＴＰの存在又は非存在においてＴＬＲ３／９リガンド（ポリＩ：Ｃ＋ＣｐＧ（Ｃ／Ｐ））と共に注射されたＯＶＡタンパク質を用いて達成されたものと比較した。図１ｅ：死にかけている腫瘍細胞に対する免疫応答を媒介するためのＤＣ上でのＰ２Ｘ７発現の要件。ＷＴ又はＰ２Ｘ７−／−マウスからのＤＣを最初に抗原（Ｃ／Ｐアジュバントを併せたＯＶＡホロタンパク質、生きた又はオキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞）を用いて負荷し、次にＰ２Ｘ７−／−レシピエントの足蹠中に注射した。５日後、局所免疫応答を（ａ）の通りに測定した。実験は３〜４匹マウス／群を含み、３回繰り返し、同様の結果を得た（＊ｐ＜０．０５）。図１ｆ：ＡＴＰ枯渇の前又は後でのオキサリプラチン処理されたＥＧ７の表現型。オキサリプラチンを用いて２０時間にわたり処理され、洗浄され、アンチマイシンＡ／デオキシグルコース（Ａ／Ｄ）を用いて２０分間インキュベートされ（図１ｂを参照のこと）、ヨウ化プロピジウム及びアネキシンＶ−ＦＩＴＣを用いて染色されたＥＧ７腫瘍細胞でのフローサイトメトリー分析。
【図１ｄ】死にかけている腫瘍細胞によるＡＴＰ放出は、細胞死の免疫原性を指示する。図１ａ：化学療法への腫瘍細胞の暴露後の細胞外空間におけるＡＴＰの蓄積。ＥＧ７を、オキサリプラチンを用いて処理し、上清中へのＡＴＰ放出をモニターした。図１ｂ：アンチマイシンＡ及びデオキシグルコースを使用したオキサリプラチン処理時での細胞内ＡＴＰの減少及び細胞内プールのＡＴＰの枯渇。ＥＧ７を、オキサリプラチンを用いて２４時間にわたり処理し、続いてアンチマイシンＡ及びデオキシグルコース（Ａ／Ｄ）を用いて２０分間処理した。３つの内の１つの代表的な実験でのデータ（３通りでの平均±ＳＥＭ）を示す。図１ｃ：ＡＴＰが枯渇した死にかけている腫瘍細胞でのＯＶＡ特異的免疫応答誘発の不全。生きた又はオキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞をＣ５７Ｂｌ／６マウスの足蹠中に注射した。５日後、膝窩リンパ節細胞を回収し、ＩＦＮγ分泌の定量化前に７２時間にわたりＯＶＡホロタンパク質を用いて再刺激した。ＡＴＰ枯渇又は非枯渇ＥＧ７を用いて免疫化されたマウスの間でのＩＦＮγ分泌のレベルを、３つの独立した実験において比較した。図１ｄ：酸化ＡＴＰ（ｏｘｉＡＴＰ）を用いたプリン受容体の阻害によって、オキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞によるＴ細胞のプライミングが無効になる。オキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞を、ｏｘｉＡＴＰと混合し又は混合せず、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの足蹠中に注射し、ＯＶＡ特異的免疫応答をｃの通りに検討し、ｏｘｉＡＴＰの存在又は非存在においてＴＬＲ３／９リガンド（ポリＩ：Ｃ＋ＣｐＧ（Ｃ／Ｐ））と共に注射されたＯＶＡタンパク質を用いて達成されたものと比較した。図１ｅ：死にかけている腫瘍細胞に対する免疫応答を媒介するためのＤＣ上でのＰ２Ｘ７発現の要件。ＷＴ又はＰ２Ｘ７−／−マウスからのＤＣを最初に抗原（Ｃ／Ｐアジュバントを併せたＯＶＡホロタンパク質、生きた又はオキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞）を用いて負荷し、次にＰ２Ｘ７−／−レシピエントの足蹠中に注射した。５日後、局所免疫応答を（ａ）の通りに測定した。実験は３〜４匹マウス／群を含み、３回繰り返し、同様の結果を得た（＊ｐ＜０．０５）。図１ｆ：ＡＴＰ枯渇の前又は後でのオキサリプラチン処理されたＥＧ７の表現型。オキサリプラチンを用いて２０時間にわたり処理され、洗浄され、アンチマイシンＡ／デオキシグルコース（Ａ／Ｄ）を用いて２０分間インキュベートされ（図１ｂを参照のこと）、ヨウ化プロピジウム及びアネキシンＶ−ＦＩＴＣを用いて染色されたＥＧ７腫瘍細胞でのフローサイトメトリー分析。
【図１ｅ】死にかけている腫瘍細胞によるＡＴＰ放出は、細胞死の免疫原性を指示する。図１ａ：化学療法への腫瘍細胞の暴露後の細胞外空間におけるＡＴＰの蓄積。ＥＧ７を、オキサリプラチンを用いて処理し、上清中へのＡＴＰ放出をモニターした。図１ｂ：アンチマイシンＡ及びデオキシグルコースを使用したオキサリプラチン処理時での細胞内ＡＴＰの減少及び細胞内プールのＡＴＰの枯渇。ＥＧ７を、オキサリプラチンを用いて２４時間にわたり処理し、続いてアンチマイシンＡ及びデオキシグルコース（Ａ／Ｄ）を用いて２０分間処理した。３つの内の１つの代表的な実験でのデータ（３通りでの平均±ＳＥＭ）を示す。図１ｃ：ＡＴＰが枯渇した死にかけている腫瘍細胞でのＯＶＡ特異的免疫応答誘発の不全。生きた又はオキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞をＣ５７Ｂｌ／６マウスの足蹠中に注射した。５日後、膝窩リンパ節細胞を回収し、ＩＦＮγ分泌の定量化前に７２時間にわたりＯＶＡホロタンパク質を用いて再刺激した。ＡＴＰ枯渇又は非枯渇ＥＧ７を用いて免疫化されたマウスの間でのＩＦＮγ分泌のレベルを、３つの独立した実験において比較した。図１ｄ：酸化ＡＴＰ（ｏｘｉＡＴＰ）を用いたプリン受容体の阻害によって、オキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞によるＴ細胞のプライミングが無効になる。オキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞を、ｏｘｉＡＴＰと混合し又は混合せず、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの足蹠中に注射し、ＯＶＡ特異的免疫応答をｃの通りに検討し、ｏｘｉＡＴＰの存在又は非存在においてＴＬＲ３／９リガンド（ポリＩ：Ｃ＋ＣｐＧ（Ｃ／Ｐ））と共に注射されたＯＶＡタンパク質を用いて達成されたものと比較した。図１ｅ：死にかけている腫瘍細胞に対する免疫応答を媒介するためのＤＣ上でのＰ２Ｘ７発現の要件。ＷＴ又はＰ２Ｘ７−／−マウスからのＤＣを最初に抗原（Ｃ／Ｐアジュバントを併せたＯＶＡホロタンパク質、生きた又はオキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞）を用いて負荷し、次にＰ２Ｘ７−／−レシピエントの足蹠中に注射した。５日後、局所免疫応答を（ａ）の通りに測定した。実験は３〜４匹マウス／群を含み、３回繰り返し、同様の結果を得た（＊ｐ＜０．０５）。図１ｆ：ＡＴＰ枯渇の前又は後でのオキサリプラチン処理されたＥＧ７の表現型。オキサリプラチンを用いて２０時間にわたり処理され、洗浄され、アンチマイシンＡ／デオキシグルコース（Ａ／Ｄ）を用いて２０分間インキュベートされ（図１ｂを参照のこと）、ヨウ化プロピジウム及びアネキシンＶ−ＦＩＴＣを用いて染色されたＥＧ７腫瘍細胞でのフローサイトメトリー分析。
【図２】ＡＴＰ枯渇の前又は後でのオキサリプラチン処理されたＥＧ７の表現型。オキサリプラチンを用いて２０時間にわたり処理され、洗浄され、アンチマイシンＡ／デオキシグルコース（Ａ／Ｄ）を用いて２０分間インキュベートされ（図１ｂを参照のこと）、ヨウ化プロピジウム及びアネキシンＶ−ＦＩＴＣを用いて染色されたＥＧ７腫瘍細胞でのフローサイトメトリー分析。
【図３ａ】死にかけているＣＴ２６細胞による抗癌ワクチン接種の限定因子としてのＡＴＰ放出の同定。図３ａ〜ｂ：図１ａ及びｂと同じであるが、しかし、ドキソルビシンに暴露されたマウス結腸癌ＣＴ２６を使用。３つ内の１つの代表的な実験でのデータを示す。図３ｃ−ｄ：ＡＴＰの枯渇（ｃ）又はプリン受容体の遮断（ｄ）によって、死にかけている腫瘍細胞を用いたワクチン接種の効力が防止される。マウスをＰＢＳ又は死にかけているＣＴ２６腫瘍細胞を用いて免疫化した。死にかけているＣＴ２６を最初にドキソルビシンを用いて２４時間にわたり処理し、次にアンチマイシンＡ／デオキシグルコース（Ａ／Ｄ）を用いて２０分間にわたりインキュベートした。細胞をＡ／Ｄ暴露後及び皮下接種前に洗浄した（ｃ）。あるいは、死にかけているＣＴ２６を単独で又はｏｘｉＡＴＰと一緒に接種した（ｄ）。７日後、マウス（合計３つの異なる実験において１５匹／群）を、生きた同系腫瘍細胞を用いて接種し、腫瘍成長をモニターした（＊ｐ＜０．０５）。
【図３ｂ】死にかけているＣＴ２６細胞による抗癌ワクチン接種の限定因子としてのＡＴＰ放出の同定。図３ａ〜ｂ：図１ａ及びｂと同じであるが、しかし、ドキソルビシンに暴露されたマウス結腸癌ＣＴ２６を使用。３つ内の１つの代表的な実験でのデータを示す。図３ｃ−ｄ：ＡＴＰの枯渇（ｃ）又はプリン受容体の遮断（ｄ）によって、死にかけている腫瘍細胞を用いたワクチン接種の効力が防止される。マウスをＰＢＳ又は死にかけているＣＴ２６腫瘍細胞を用いて免疫化した。死にかけているＣＴ２６を最初にドキソルビシンを用いて２４時間にわたり処理し、次にアンチマイシンＡ／デオキシグルコース（Ａ／Ｄ）を用いて２０分間にわたりインキュベートした。細胞をＡ／Ｄ暴露後及び皮下接種前に洗浄した（ｃ）。あるいは、死にかけているＣＴ２６を単独で又はｏｘｉＡＴＰと一緒に接種した（ｄ）。７日後、マウス（合計３つの異なる実験において１５匹／群）を、生きた同系腫瘍細胞を用いて接種し、腫瘍成長をモニターした（＊ｐ＜０．０５）。
【図３ｃ】死にかけているＣＴ２６細胞による抗癌ワクチン接種の限定因子としてのＡＴＰ放出の同定。図３ａ〜ｂ：図１ａ及びｂと同じであるが、しかし、ドキソルビシンに暴露されたマウス結腸癌ＣＴ２６を使用。３つ内の１つの代表的な実験でのデータを示す。図３ｃ−ｄ：ＡＴＰの枯渇（ｃ）又はプリン受容体の遮断（ｄ）によって、死にかけている腫瘍細胞を用いたワクチン接種の効力が防止される。マウスをＰＢＳ又は死にかけているＣＴ２６腫瘍細胞を用いて免疫化した。死にかけているＣＴ２６を最初にドキソルビシンを用いて２４時間にわたり処理し、次にアンチマイシンＡ／デオキシグルコース（Ａ／Ｄ）を用いて２０分間にわたりインキュベートした。細胞をＡ／Ｄ暴露後及び皮下接種前に洗浄した（ｃ）。あるいは、死にかけているＣＴ２６を単独で又はｏｘｉＡＴＰと一緒に接種した（ｄ）。７日後、マウス（合計３つの異なる実験において１５匹／群）を、生きた同系腫瘍細胞を用いて接種し、腫瘍成長をモニターした（＊ｐ＜０．０５）。
【図３ｄ】死にかけているＣＴ２６細胞による抗癌ワクチン接種の限定因子としてのＡＴＰ放出の同定。図３ａ〜ｂ：図１ａ及びｂと同じであるが、しかし、ドキソルビシンに暴露されたマウス結腸癌ＣＴ２６を使用。３つ内の１つの代表的な実験でのデータを示す。図３ｃ−ｄ：ＡＴＰの枯渇（ｃ）又はプリン受容体の遮断（ｄ）によって、死にかけている腫瘍細胞を用いたワクチン接種の効力が防止される。マウスをＰＢＳ又は死にかけているＣＴ２６腫瘍細胞を用いて免疫化した。死にかけているＣＴ２６を最初にドキソルビシンを用いて２４時間にわたり処理し、次にアンチマイシンＡ／デオキシグルコース（Ａ／Ｄ）を用いて２０分間にわたりインキュベートした。細胞をＡ／Ｄ暴露後及び皮下接種前に洗浄した（ｃ）。あるいは、死にかけているＣＴ２６を単独で又はｏｘｉＡＴＰと一緒に接種した（ｄ）。７日後、マウス（合計３つの異なる実験において１５匹／群）を、生きた同系腫瘍細胞を用いて接種し、腫瘍成長をモニターした（＊ｐ＜０．０５）。
【図４】プリンＰ２Ｘ７受容体は、細胞死の免疫原性のために必須である。死にかけている腫瘍細胞でのＰ２Ｘ７−／−マウスにおけるＯＶＡ特異的免疫応答誘発の不全。生きた又はオキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞をＣ５７Ｂｌ／６マウス（ＷＴ又はＰ２Ｘ７−／−）の足蹠中に注射した。５日後、膝窩リンパ節細胞を回収し、ＩＦＮγ分泌の定量化前に７２時間にわたりＯＶＡホロタンパク質を用いて再刺激した。抗原提示のポジティブコントロールとして、マウスに、１mgのＯＶＡタンパク質＋１０μgのＣｐＧ  ２８及び５μgのポリＩ：Ｃ（Ｃ／Ｐ）（アジュバントとして）を用いて注射した。
【図５ａ】死にかけている腫瘍細胞によるＩＦＮγ産生のためのＴ細胞のクロス−プライミングに対するＮａｌｐ３インフラマソーム依存的ＩＬ−１β産生の本質的寄与。図５ａ〜ｂ：骨髄由来ＤＣにおける活性カスパーゼ１の免疫蛍光染色。ＤＣ（ＷＴ又はＰ２Ｘ７−／−、ＮＡＬＰ３−／−、もしくはＡｓｃ−／−マウス由来）を、オキサリプラチン又は生きたＥＧ７腫瘍細胞もしくは酸化ＡＴＰの存在又は非存在においてオキサリプラチン処理されたＥＧ７腫瘍細胞に暴露させ、抗ＣＤ１１ｃ、抗カスパーゼ１  ｐ２０又はアイソタイプコントロール抗体（示さず）及びＤＡＰＩ（ａ、ｂ）を用いて標識し、培養中で２４時間にわたり放置した（ｃ）。ポジティブコントロールは、ＬＰＳ（５０ng/ml）に１６時間にわたり、次にＡＴＰ（２mM）に２０分間にわたり暴露されたＤＣとした。代表的な顕微鏡写真又はヒストグラムを（ａ）に示す。活性カスパーゼ１を含むＤＣの定量化を（ｂ）に示す。
【図５ｂ】死にかけている腫瘍細胞によるＩＦＮγ産生のためのＴ細胞のクロス−プライミングに対するＮａｌｐ３インフラマソーム依存的ＩＬ−１β産生の本質的寄与。図５ａ〜ｂ：骨髄由来ＤＣにおける活性カスパーゼ１の免疫蛍光染色。ＤＣ（ＷＴ又はＰ２Ｘ７−／−、ＮＡＬＰ３−／−、もしくはＡｓｃ−／−マウス由来）を、オキサリプラチン又は生きたＥＧ７腫瘍細胞もしくは酸化ＡＴＰの存在又は非存在においてオキサリプラチン処理されたＥＧ７腫瘍細胞に暴露させ、抗ＣＤ１１ｃ、抗カスパーゼ１  ｐ２０又はアイソタイプコントロール抗体（示さず）及びＤＡＰＩ（ａ、ｂ）を用いて標識し、培養中で２４時間にわたり放置した（ｃ）。ポジティブコントロールは、ＬＰＳ（５０ng/ml）に１６時間にわたり、次にＡＴＰ（２mM）に２０分間にわたり暴露されたＤＣとした。代表的な顕微鏡写真又はヒストグラムを（ａ）に示す。活性カスパーゼ１を含むＤＣの定量化を（ｂ）に示す。
【図５ｃ】死にかけている腫瘍細胞を認識するＤＣによるＩＬ−１β分泌は、ＮＡＬＰ３インフラマソームに依存的である。ＩＬ−１βレベルを、市販のＥＬＩＳＡにより、ＤＣの上清中で測定した（ｎ．ｄ．：決定せず）。実験を３回実施し、同様の結果を得た。代表的な顕微鏡写真又はヒストグラムを示す。平均±ＳＥＭを３連ウェルについて示す。
【図５ｄ】死にかけている腫瘍細胞でのＮＡＬＰ３−／−、Ｃａｓｐ１−／−、及びＩＬ−１Ｒ１−／−マウスにおけるＯＶＡ特異的免疫応答誘発の不全。生きた又はオキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞をＣ５７Ｂｌ／６マウス（ＷＴ、ＮＡＬＰ３−／−、Ｃａｓｐ１−／−、又はＩＬ−１Ｒ１−／−）の足蹠中に注射した。５日後、膝窩リンパ節細胞を回収し、ＩＦＮγ分泌の定量化前に７２時間にわたりＯＶＡホロタンパク質を用いて再刺激した。抗原提示のポジティブコントロールとして、マウスに、１mgのＯＶＡタンパク質＋Ｃ／Ｐアジュバントを用いて注射した。
【図５ｅ】Ｈ−２ｂ＋マウスにおける死にかけているＨ−２ｄ＋ＴＳ／ＡによるＣＤ８−Ｔ細胞のクロス−プライミング。Ｘ線処理された乳癌細胞ＴＳ／Ａを、ＷＴ又はＣａｓｐ１−／−遺伝子型を持つＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３匹マウス／群）において注射した。流入領域リンパ節細胞を５日目に回収し、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド又はＯＶＡホロタンパク質を用いて７２時間にわたりエクスビボで再刺激し、ＩＦＮγ分泌をＥＬＩＳＡにより上清で測定した（＊ｐ＜０．０５）。
【図６】死にかけている腫瘍細胞に応答したＤＣの成熟は、カスパーゼ１に非依存的である。１：１の比率でオキサリプラチン処置された腫瘍細胞を用いて２４時間にわたり負荷されたＢＭ−ＤＣ（ＷＴ又はｃａｓｐ−１もしくはＮａｌｐ３欠損宿主由来）の細胞蛍光測定分析。表現型の特徴付けは、３色染色（抗ＣＤ１１ｃ、Ｉ−Ａｂ、及びＣＤ８０又はＣＤ８６又はＣＤ４０  ｍＡｂ）により達成した。縦列は、ＣＤ１１ｃ＋集団中でのＩ−Ａｂ＋、ＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋、又はＣＤ４０＋細胞のパーセンテージを表す。これらの実験を２回実施し、同様の結果を得た（＊ｐ＜０．０５）。
【図７】死にかけている腫瘍細胞を認識するＤＣによるＩＬ−１２ｐ４０分泌は、ＮＡＬＰ３インフラマソームに非依存的である。ＩＬ−１２ｐ４０レベルを、市販のＥＬＩＳＡにより、図５ｃに記載するものと同じＤＣの上清で測定した（ｎ．ｄ．：決定せず）。実験を３回実施し、同様の結果を得た。代表的な顕微鏡写真又はヒストグラムを示す。平均±ＳＥＭを３連ウェルについて示す。
【図８】ＤＣによる腫瘍細胞関連抗原の抗原プロセシングは、Ｃａｓｐ−１非依存的である。ＷＴ、Ｃａｓｐ−１、及びＮａｌｐ３欠損マウス由来のＢＭ−ＤＣを、オキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞を用いて（１：１の比率で）インキュベートし、Ｂ３Ｚハイブリドーマに（１：２  ＤＣ／Ｔ細胞比率で）暴露させた。コントロールは生きたＥＧ７細胞及びＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドとした。ＩＬ−２レベルを、市販のＥＬＩＳＡを用いて、４８時間目に測定した。実験を２回実施し、同程度の結果を得た。グラフは３連での平均±ＳＥＭを描写する（＊ｐ＜０．０５）。
【図９】ＤＣは、オキサリプラチン処理された腫瘍細胞の免疫原性を媒介するためにＮＡＬＰ３及びＣａｓｐ１を発現しなければならない。ＷＴ、Ｎａｌｐ３−／−、又はＣａｓｐ１−／−マウスからのＤＣを最初に抗原（ＣｐＧ  ＯＤＮ（１０μg/ml）及びポリＩ：Ｃ（５μg/ml）（Ｃ／Ｐ）の混合物（アジュバントとして）を併せた組換えＯＶＡタンパク質、生きた又はオキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞）を用いて負荷し、次にＷＴレシピエントの足蹠中に注射した。５日後、局所免疫応答を、図５ｄに記載する通りに、インビトロで再刺激されたリンパ節Ｔ細胞からのＩＦＮγ分泌として測定した。
【図１０ａ】死にかけている腫瘍細胞を用いてインビボでプライムされたＴ細胞による異なるサイトカインの産生に対するカスパーゼ１ノックアウトの効果。ＷＴ又はcａｓｐ１−／−マウスにおいて、オキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞を用いて足蹠中に注射し、５日後に、流入領域リンパ節細胞を、ＯＶＡタンパク質を用いて再刺激し、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、及びＩＬ−１７のインビトロ産生（４８時間後）を評価した。ＩＬ−４、ＩＬ−１７が全ての場合において検出不可能であり（示さず）、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３が、全ての示した遺伝子バックグラウンドで同様のレベルで産生された。このように、カスパーゼ１の非存在によって、ＩＦＮγ（ＩＬ−１０又はＩＬ−１３ではない）の産生が選択的に損なわれる。２つの内の１つの代表的な実験（３連での平均±ＳＥＭ）を示す（＊ｐ＜０．０５）。
【図１０ｂ】死にかけている腫瘍細胞を用いてインビボでプライムされたＴ細胞による異なるサイトカインの産生に対するカスパーゼ１ノックアウトの効果。ＷＴ又はcａｓｐ１−／−マウスにおいて、オキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞を用いて足蹠中に注射し、５日後に、流入領域リンパ節細胞を、ＯＶＡタンパク質を用いて再刺激し、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、及びＩＬ−１７のインビトロ産生（４８時間後）を評価した。ＩＬ−４、ＩＬ−１７が全ての場合において検出不可能であり（示さず）、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３が、全ての示した遺伝子バックグラウンドで同様のレベルで産生された。このように、カスパーゼ１の非存在によって、ＩＦＮγ（ＩＬ−１０又はＩＬ−１３ではない）の産生が選択的に損なわれる。２つの内の１つの代表的な実験（３連での平均±ＳＥＭ）を示す（＊ｐ＜０．０５）。
【図１１ａ】死にかけている細胞を用いて負荷されたＤＣにより提示される細胞関連抗原に対するＴ細胞のクロス−プライミングは、ＣＡＳＰ−１に依存する。図１１ａ：Ｋｂ又はＥＧ７の膜貫通ドメインに融合されたＯＶＡをコードするｃＤＮＡを用いてトランスフェクトされたマウス胎仔繊維芽細胞（ＭＥＦ）を、ＷＴ又はＣａｓｐ１−／−マウスの足蹠中への注射前に、オキサリプラチン（５μg/ml、２４時間）を用いて処理した。膝窩リンパ節細胞を５日後に得て、ＭＥＦ、ＥＬ４ライセート、又はオボアルブミンを用いて再刺激した。ＩＦＮγレベルを４８時間目にＥＬＩＳＡによりモニターした。図１１ｂ：死にかけているＭＥＦは、インビトロでＤＣによるＩＬ−１β産生を誘導することができる。図５ｃと同様の方法。図１１ｃ：オキサリプラチンを用いて処理されたＯＶＡ負荷マクロファージはcａｓｐ１−／−依存的Ｔ細胞応答を誘導する。腹腔マクロファージを、ＯＶＡタンパク質を用いて負荷し、オキサリプラチンを用いて１８時間かけて殺し、ＷＴとＣａｓｐ１−／−マウス中に接種した。免疫応答を次に、ＩＦＮγを産生する流入領域リンパ節細胞の能力を評価することにより測定した。ａ及びｃについて、５匹マウス／群を使用した。３連での平均±ＳＥＭを示す３つの内の１つの代表的な実験を表す（＊ｐ＜０．０５）。
【図１１ｂ】死にかけている細胞を用いて負荷されたＤＣにより提示される細胞関連抗原に対するＴ細胞のクロス−プライミングは、ＣＡＳＰ−１に依存する。図１１ａ：Ｋｂ又はＥＧ７の膜貫通ドメインに融合されたＯＶＡをコードするｃＤＮＡを用いてトランスフェクトされたマウス胎仔繊維芽細胞（ＭＥＦ）を、ＷＴ又はＣａｓｐ１−／−マウスの足蹠中への注射前に、オキサリプラチン（５μg/ml、２４時間）を用いて処理した。膝窩リンパ節細胞を５日後に得て、ＭＥＦ、ＥＬ４ライセート、又はオボアルブミンを用いて再刺激した。ＩＦＮγレベルを４８時間目にＥＬＩＳＡによりモニターした。図１１ｂ：死にかけているＭＥＦは、インビトロでＤＣによるＩＬ−１β産生を誘導することができる。図５ｃと同様の方法。図１１ｃ：オキサリプラチンを用いて処理されたＯＶＡ負荷マクロファージはcａｓｐ１−／−依存的Ｔ細胞応答を誘導する。腹腔マクロファージを、ＯＶＡタンパク質を用いて負荷し、オキサリプラチンを用いて１８時間かけて殺し、ＷＴとＣａｓｐ１−／−マウス中に接種した。免疫応答を次に、ＩＦＮγを産生する流入領域リンパ節細胞の能力を評価することにより測定した。ａ及びｃについて、５匹マウス／群を使用した。３連での平均±ＳＥＭを示す３つの内の１つの代表的な実験を表す（＊ｐ＜０．０５）。
【図１１ｃ】死にかけている細胞を用いて負荷されたＤＣにより提示される細胞関連抗原に対するＴ細胞のクロス−プライミングは、ＣＡＳＰ−１に依存する。図１１ａ：Ｋｂ又はＥＧ７の膜貫通ドメインに融合されたＯＶＡをコードするｃＤＮＡを用いてトランスフェクトされたマウス胎仔繊維芽細胞（ＭＥＦ）を、ＷＴ又はＣａｓｐ１−／−マウスの足蹠中への注射前に、オキサリプラチン（５μg/ml、２４時間）を用いて処理した。膝窩リンパ節細胞を５日後に得て、ＭＥＦ、ＥＬ４ライセート、又はオボアルブミンを用いて再刺激した。ＩＦＮγレベルを４８時間目にＥＬＩＳＡによりモニターした。図１１ｂ：死にかけているＭＥＦは、インビトロでＤＣによるＩＬ−１β産生を誘導することができる。図５ｃと同様の方法。図１１ｃ：オキサリプラチンを用いて処理されたＯＶＡ負荷マクロファージはcａｓｐ１−／−依存的Ｔ細胞応答を誘導する。腹腔マクロファージを、ＯＶＡタンパク質を用いて負荷し、オキサリプラチンを用いて１８時間かけて殺し、ＷＴとＣａｓｐ１−／−マウス中に接種した。免疫応答を次に、ＩＦＮγを産生する流入領域リンパ節細胞の能力を評価することにより測定した。ａ及びｃについて、５匹マウス／群を使用した。３連での平均±ＳＥＭを示す３つの内の１つの代表的な実験を表す（＊ｐ＜０．０５）。
【図１２】死にかけている腫瘍細胞中に含まれる天然腫瘍抗原に対するＴ細胞応答は、カスパーゼ１に依存する。図５ｄと同じ設定であるが、しかし、オキサリプラチンを用いて処理されたＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を使用し、ＷＴ又はＣａｓｐ−１欠損マウスを免疫した。５〜７日後、マウス（ｎ＝５匹マウス／群）を屠殺し、ｇｐ１００由来ペプチド（ＱＶＰＲＮＱＤＷＬ）を用いたインビトロでの再刺激及びＩＦＮγ産生の評価のために膝窩リンパ節を回収した（＊ｐ＜０．０５）。
【図１３】死にかけている腫瘍細胞の保護的な抗腫瘍効果は、Ｐ２Ｘ７／ＮＡＬＰ３／Ｃａｓｐ１軸に決定的に依存する。ミトキサントロン（ＭＴＸ）を用いてインビトロで処理されたＭＣＡ２０５細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群）の示した遺伝子バックグラウンドにおいて皮下接種した。７〜１０日後、マウスを、生きたＭＣＡ２０５細胞を用いて再曝露した。無腫瘍マウスのパーセンテージを、３つの独立した実験からプールする（＊ｐ＜０．０５）。
【図１４】細胞死の免疫原性は、活性ＩＬ−１βを必要とする。マウスを、ＰＢＳ又はドキソルビシンもしくは凍結融解及びＬＰＳを用いて処理された死にかけているＣＴ２６腫瘍細胞を用いて免疫した。死にかけているＣＴ２６を、ＷＴマウスの側腹部中にＩＬ−１Ｒａ（１００μg）と一緒に同時接種した。５日後、マウス（ｎ＝５匹マウス／群）を屠殺し、ＣＴ２６又はＭＣＡ２０５腫瘍ライセートを用いたインビトロでの再刺激及びＩＦＮγ産生の評価のために膝窩リンパ節を回収した（＊ｐ＜０．０５）。
【図１５ａ】インビトロ及びインビボでの死にかけている腫瘍細胞によるＩＬ−１β依存的ＣＴＬプライミング。図１５ａ：ＭｙＤ８８が、宿主のレベルで要求される（しかし、ＡＰＣのレベルではない）。ＷＴマウスからのＤＣを最初に抗原（Ｃ／Ｐアジュバントを併せたＯＶＡホロタンパク質、生きた又はオキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞）を用いて負荷し、次にＷＴ又はＭｙＤ８８−／−レシピエントの足蹠中に注射した（ｎ＝６匹マウス／群）。５日後、局所免疫応答を図２ｄ、ｅの通りに測定した。３つの内の１つの典型的な実験での結果を示す。図１５ｂ：インビトロでのＣａｓｐ−１及びＩＬ−１β依存的ＯＴ−Ｉプライミング。ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋  ＯＴ−１細胞の分化を、天然ＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックＯＴ−１リンパ球を、インビトロで２日間にわたりオキサリプラチン処理されたＥＧ７を用いて負荷された同系ＢＭ−ＤＣ（ＷＴ又はＣａｓｐ１−／−マウス由来）とインキュベートすることにより誘導した。ＩＬ−１βの抗体媒介性中和によって、２日間の同時培養物の上清中でのＥＬＩＳＡにより測定されたＩＦＮγのレベルが顕著に低下した（アイソタイプコントロール抗体ではそうならなかった）。死にかけている腫瘍細胞を用いて負荷し、ＯＴ１とインキュベートされたＣａｓｐ１−／−  ＤＣの同時培養物へのｒＩＬ−１β（１００ng/ml）又はＩＬ−１２（１０ng/ml）の外因性の添加は、Ｔ細胞プライミングを回復させた。挿入図は、ＴＬＲアゴニストの存在におけるＯＶＡホロタンパク質を用いたプライミングが、Ｃａｓｐ−１に非依存的であることを示す。図１５ｃ：インビトロでのＴリンパ球に対するＩＬ−１βの特異的かつ直接的な極性化効果。天然ＷＴマウスに由来する精製ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８  ｍＡｂを用いて５日間にわたり、示したサイトカイン（ＩＬ−１２ｐ７０については１０ng/ml、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦαについては１００ng/ml）の存在において刺激し、ＩＦＮγ産生を図３ｂの通りに測定した。図１５ｄ：オキサリプラチン処理されたＥＧ７により誘発された適応性Ｔ細胞免疫応答が、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストにより抑止された。図５ａと同じ設定であるが、しかし、ワクチンにＩＬ−１Ｒアンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）を加えた。図１５ｅ：組換えＩＬ−１β又はＩＬ−１２（しかしＩＬ−６ではない）の外因性の供給は、Ｐ２Ｘ７／ＮＡＬＰ３／Ｃａｓｐ−１経路が欠損したマウスにおいてＴ細胞プライミングを回復させた。図２ｄと同じ設定であるが、しかし、ｒＩＬ−１β（２５０ng/足蹠）、ｒＩＬ−１２（５０ng/足蹠）、又はｒＩＬ−６（２５０ng/足蹠）を、死にかけている腫瘍細胞と同時注射した。インビトロ実験（ａ、ｂ）を２回行い、１つの代表的な実験を示す。３連のウェルでの平均±ＳＥＭを示す。各実験群は、２つの独立した実験において４〜８匹のマウスとした（＊ｐ＜０．０５）。
【図１５ｂ】インビトロ及びインビボでの死にかけている腫瘍細胞によるＩＬ−１β依存的ＣＴＬプライミング。図１５ａ：ＭｙＤ８８が、宿主のレベルで要求される（しかし、ＡＰＣのレベルではない）。ＷＴマウスからのＤＣを最初に抗原（Ｃ／Ｐアジュバントを併せたＯＶＡホロタンパク質、生きた又はオキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞）を用いて負荷し、次にＷＴ又はＭｙＤ８８−／−レシピエントの足蹠中に注射した（ｎ＝６匹マウス／群）。５日後、局所免疫応答を図２ｄ、ｅの通りに測定した。３つの内の１つの典型的な実験での結果を示す。図１５ｂ：インビトロでのＣａｓｐ−１及びＩＬ−１β依存的ＯＴ−Ｉプライミング。ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋  ＯＴ−１細胞の分化を、天然ＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックＯＴ−１リンパ球を、インビトロで２日間にわたりオキサリプラチン処理されたＥＧ７を用いて負荷された同系ＢＭ−ＤＣ（ＷＴ又はＣａｓｐ１−／−マウス由来）とインキュベートすることにより誘導した。ＩＬ−１βの抗体媒介性中和によって、２日間の同時培養物の上清中でのＥＬＩＳＡにより測定されたＩＦＮγのレベルが顕著に低下した（アイソタイプコントロール抗体ではそうならなかった）。死にかけている腫瘍細胞を用いて負荷し、ＯＴ１とインキュベートされたＣａｓｐ１−／−  ＤＣの同時培養物へのｒＩＬ−１β（１００ng/ml）又はＩＬ−１２（１０ng/ml）の外因性の添加は、Ｔ細胞プライミングを回復させた。挿入図は、ＴＬＲアゴニストの存在におけるＯＶＡホロタンパク質を用いたプライミングが、Ｃａｓｐ−１に非依存的であることを示す。図１５ｃ：インビトロでのＴリンパ球に対するＩＬ−１βの特異的かつ直接的な極性化効果。天然ＷＴマウスに由来する精製ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８  ｍＡｂを用いて５日間にわたり、示したサイトカイン（ＩＬ−１２ｐ７０については１０ng/ml、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦαについては１００ng/ml）の存在において刺激し、ＩＦＮγ産生を図３ｂの通りに測定した。図１５ｄ：オキサリプラチン処理されたＥＧ７により誘発された適応性Ｔ細胞免疫応答が、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストにより抑止された。図５ａと同じ設定であるが、しかし、ワクチンにＩＬ−１Ｒアンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）を加えた。図１５ｅ：組換えＩＬ−１β又はＩＬ−１２（しかしＩＬ−６ではない）の外因性の供給は、Ｐ２Ｘ７／ＮＡＬＰ３／Ｃａｓｐ−１経路が欠損したマウスにおいてＴ細胞プライミングを回復させた。図２ｄと同じ設定であるが、しかし、ｒＩＬ−１β（２５０ng/足蹠）、ｒＩＬ−１２（５０ng/足蹠）、又はｒＩＬ−６（２５０ng/足蹠）を、死にかけている腫瘍細胞と同時注射した。インビトロ実験（ａ、ｂ）を２回行い、１つの代表的な実験を示す。３連のウェルでの平均±ＳＥＭを示す。各実験群は、２つの独立した実験において４〜８匹のマウスとした（＊ｐ＜０．０５）。
【図１５ｃ】インビトロ及びインビボでの死にかけている腫瘍細胞によるＩＬ−１β依存的ＣＴＬプライミング。図１５ａ：ＭｙＤ８８が、宿主のレベルで要求される（しかし、ＡＰＣのレベルではない）。ＷＴマウスからのＤＣを最初に抗原（Ｃ／Ｐアジュバントを伴うＯＶＡホロタンパク質、生きた又はオキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞）を用いて負荷し、次にＷＴ又はＭｙＤ８８−／−レシピエントの足蹠中に注射した（ｎ＝６匹マウス／群）。５日後、局所免疫応答を図２ｄ、ｅの通りに測定した。３つの内の１つの典型的な実験での結果を示す。図１５ｂ：インビトロでのＣａｓｐ−１及びＩＬ−１β依存的ＯＴ−Ｉプライミング。ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋  ＯＴ−１細胞の分化を、天然ＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックＯＴ−１リンパ球を、インビトロで２日間にわたりオキサリプラチン処理されたＥＧ７を用いて負荷された同系ＢＭ−ＤＣ（ＷＴ又はＣａｓｐ１−／−マウス由来）とインキュベートすることにより誘導した。ＩＬ−１βの抗体媒介性中和によって、２日間の同時培養物の上清中でのＥＬＩＳＡにより測定されたＩＦＮγのレベルが顕著に低下した（アイソタイプコントロール抗体ではそうならなかった）。死にかけている腫瘍細胞を用いて負荷し、ＯＴ１とインキュベートされたＣａｓｐ１−／−  ＤＣの同時培養物へのｒＩＬ−１β（１００ng/ml）又はＩＬ−１２（１０ng/ml）の外因性の添加は、Ｔ細胞プライミングを回復させた。挿入図は、ＴＬＲアゴニストの存在におけるＯＶＡホロタンパク質を用いたプライミングが、Ｃａｓｐ−１に非依存的であることを示す。図１５ｃ：インビトロでのＴリンパ球に対するＩＬ−１βの特異的かつ直接的な極性化効果。天然ＷＴマウスに由来する精製ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８  ｍＡｂを用いて５日間にわたり、示したサイトカイン（ＩＬ−１２ｐ７０については１０ng/ml、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦαについては１００ng/ml）の存在において刺激し、ＩＦＮγ産生を図３ｂの通りに測定した。図１５ｄ：オキサリプラチン処理されたＥＧ７により誘発された適応性Ｔ細胞免疫応答が、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストにより抑止された。図５ａと同じ設定であるが、しかし、ワクチンにＩＬ−１Ｒアンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）を加えた。図１５ｅ：組換えＩＬ−１β又はＩＬ−１２（しかしＩＬ−６ではない）の外因性の供給は、Ｐ２Ｘ７／ＮＡＬＰ３／Ｃａｓｐ−１経路が欠損したマウスにおいてＴ細胞プライミングを回復させた。図２ｄと同じ設定であるが、しかし、ｒＩＬ−１β（２５０ng/足蹠）、ｒＩＬ−１２（５０ng/足蹠）、又はｒＩＬ−６（２５０ng/足蹠）を、死にかけている腫瘍細胞と同時注射した。インビトロ実験（ａ、ｂ）を２回行い、１つの代表的な実験を示す。３連のウェルでの平均±ＳＥＭを示す。各実験群は、２つの独立した実験において４〜８匹のマウスとした（＊ｐ＜０．０５）。
【図１５ｄ】インビトロ及びインビボでの死にかけている腫瘍細胞によるＩＬ−１β依存的ＣＴＬプライミング。図１５ａ：ＭｙＤ８８が、宿主のレベルで要求される（しかし、ＡＰＣのレベルではない）。ＷＴマウスからのＤＣを最初に抗原（Ｃ／Ｐアジュバントを併せたＯＶＡホロタンパク質、生きた又はオキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞）を用いて負荷し、次にＷＴ又はＭｙＤ８８−／−レシピエントの足蹠中に注射した（ｎ＝６匹マウス／群）。５日後、局所免疫応答を図２ｄ、ｅの通りに測定した。３つの内の１つの典型的な実験での結果を示す。図１５ｂ：インビトロでのＣａｓｐ−１及びＩＬ−１β依存的ＯＴ−Ｉプライミング。ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋  ＯＴ−１細胞の分化を、天然ＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックＯＴ−１リンパ球を、インビトロで２日間にわたりオキサリプラチン処理されたＥＧ７を用いて負荷された同系ＢＭ−ＤＣ（ＷＴ又はＣａｓｐ１−／−マウス由来）とインキュベートすることにより誘導した。ＩＬ−１βの抗体媒介性中和によって、２日間の同時培養物の上清中でのＥＬＩＳＡにより測定されたＩＦＮγのレベルが顕著に低下した（アイソタイプコントロール抗体ではそうならなかった）。死にかけている腫瘍細胞を用いて負荷し、ＯＴ１とインキュベートされたＣａｓｐ１−／−  ＤＣの同時培養物へのｒＩＬ−１β（１００ng/ml）又はＩＬ−１２（１０ng/ml）の外因性の添加は、Ｔ細胞プライミングを回復させた。挿入図は、ＴＬＲアゴニストの存在におけるＯＶＡホロタンパク質を用いたプライミングが、Ｃａｓｐ−１に非依存的であることを示す。図１５ｃ：インビトロでのＴリンパ球に対するＩＬ−１βの特異的かつ直接的な極性化効果。天然ＷＴマウスに由来する精製ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８  ｍＡｂを用いて５日間にわたり、示したサイトカイン（ＩＬ−１２ｐ７０については１０ng/ml、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦαについては１００ng/ml）の存在において刺激し、ＩＦＮγ産生を図３ｂの通りに測定した。図１５ｄ：オキサリプラチン処理されたＥＧ７により誘発された適応性Ｔ細胞免疫応答が、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストにより抑止された。図５ａと同じ設定であるが、しかし、ワクチンにＩＬ−１Ｒアンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）を加えた。図１５ｅ：組換えＩＬ−１β又はＩＬ−１２（しかしＩＬ−６ではない）の外因性の供給は、Ｐ２Ｘ７／ＮＡＬＰ３／Ｃａｓｐ−１経路が欠損したマウスにおいてＴ細胞プライミングを回復させた。図２ｄと同じ設定であるが、しかし、ｒＩＬ−１β（２５０ng/足蹠）、ｒＩＬ−１２（５０ng/足蹠）、又はｒＩＬ−６（２５０ng/足蹠）を、死にかけている腫瘍細胞と同時注射した。インビトロ実験（ａ、ｂ）を２回行い、１つの代表的な実験を示す。３連のウェルでの平均±ＳＥＭを示す。各実験群は、２つの独立した実験において４〜８匹のマウスとした（＊ｐ＜０．０５）。
【図１５ｅ】インビトロ及びインビボでの死にかけている腫瘍細胞によるＩＬ−１β依存的ＣＴＬプライミング。図１５ａ：ＭｙＤ８８が、宿主のレベルで要求される（しかし、ＡＰＣのレベルではない）。ＷＴマウスからのＤＣを最初に抗原（Ｃ／Ｐアジュバントを併せたＯＶＡホロタンパク質、生きた又はオキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞）を用いて負荷し、次にＷＴ又はＭｙＤ８８−／−レシピエントの足蹠中に注射した（ｎ＝６匹マウス／群）。５日後、局所免疫応答を図２ｄ、ｅの通りに測定した。３つの内の１つの典型的な実験での結果を示す。図１５ｂ：インビトロでのＣａｓｐ−１及びＩＬ−１β依存的ＯＴ−Ｉプライミング。ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋  ＯＴ−１細胞の分化を、天然ＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックＯＴ−１リンパ球を、インビトロで２日間にわたりオキサリプラチン処理されたＥＧ７を用いて負荷された同系ＢＭ−ＤＣ（ＷＴ又はＣａｓｐ１−／−マウス由来）とインキュベートすることにより誘導した。ＩＬ−１βの抗体媒介性中和によって、２日間の同時培養物の上清中でのＥＬＩＳＡにより測定されたＩＦＮγのレベルが顕著に低下した（アイソタイプコントロール抗体ではそうならなかった）。死にかけている腫瘍細胞を用いて負荷し、ＯＴ１とインキュベートされたＣａｓｐ１−／−  ＤＣの同時培養物へのｒＩＬ−１β（１００ng/ml）又はＩＬ−１２（１０ng/ml）の外因性の添加は、Ｔ細胞プライミングを回復させた。挿入図は、ＴＬＲアゴニストの存在におけるＯＶＡホロタンパク質を用いたプライミングが、Ｃａｓｐ−１に非依存的であることを示す。図１５ｃ．インビトロでのＴリンパ球に対するＩＬ−１βの特異的かつ直接的な極性化効果。天然ＷＴマウスに由来する精製ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８  ｍＡｂを用いて５日間にわたり、示したサイトカイン（ＩＬ−１２ｐ７０については１０ng/ml、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦαについては１００ng/ml）の存在において刺激し、ＩＦＮγ産生を図３ｂの通りに測定した。図１５ｄ：オキサリプラチン処理されたＥＧ７により誘発された適応性Ｔ細胞免疫応答が、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストにより抑止された。図５ａと同じ設定であるが、しかし、ワクチンにＩＬ−１Ｒアンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）を加えた。図１５ｅ：組換えＩＬ−１β又はＩＬ−１２（しかしＩＬ−６ではない）の外因性の供給は、Ｐ２Ｘ７／ＮＡＬＰ３／Ｃａｓｐ−１経路が欠損したマウスにおいてＴ細胞プライミングを回復させた。図２ｄと同じ設定であるが、しかし、ｒＩＬ−１β（２５０ng/足蹠）、ｒＩＬ−１２（５０ng/足蹠）、又はｒＩＬ−６（２５０ng/足蹠）を、死にかけている腫瘍細胞と同時注射した。インビトロ実験（ａ、ｂ）を２回行い、１つの代表的な実験を示す。３連のウェルでの平均±ＳＥＭを示す。各実験群は、２つの独立した実験において４〜８匹のマウスとした（＊ｐ＜０．０５）。
【図１６ａ】ＩＬ−１Ｒアンタゴニストは、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生を刺激する死にかけている腫瘍細胞の能力を抑止する。ＩＬ−１Ｒアゴニストの存在又は非存在においてオキサリプラチン処理された腫瘍細胞を使用したインビボでのプライミングから５日後の、インビトロでのＰＭＡ−イオノマイシンを用いた再刺激に続く、ＩＦＮγを産生するＣＤ３＋ＣＤ８−Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。図１６ａ：ＩＦＮγを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞の代表的なドットプロット。図１６ｂ：ＩＦＮγを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞の定量化（＊ｐ＜０．０５）。
【図１６ｂ】ＩＬ−１Ｒアンタゴニストは、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生を刺激する死にかけている腫瘍細胞の能力を抑止する。ＩＬ−１Ｒアゴニストの存在又は非存在においてオキサリプラチン処理された腫瘍細胞を使用したインビボでのプライミングから５日後の、インビトロでのＰＭＡ−イオノマイシンを用いた再刺激に続く、ＩＦＮγを産生するＣＤ３＋ＣＤ８−Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。図１６ａ：ＩＦＮγを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞の代表的なドットプロット。図１６ｂ：ＩＦＮγを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞の定量化（＊ｐ＜０．０５）。
【図１７ａ】オキサリプラチンの抗癌活性は、Ｐ２Ｘ７及びＮＡＬＰ３インフラマソームに依存する。図１７ａ、ｂ、ｃ：樹立された腫瘍に対するオキサリプラチンの治療効力は、Ｐ２Ｘ７／ＮＡＬＰ３／ｃａｓｐ−１軸上の免疫系の完全性に依存する。ＥＬ４胸腺腫を、示した遺伝子型（ａ〜ｃ）を持つ又は抗ＣＤ８抗体を用いて注射された（ａ）同系マウスにおいて樹立した。腫瘍が７０−９０mm２のサイズに達した場合、マウスを未処置で放置又はオキサリプラチンを用いて処置した。各処置群が５〜６匹のマウスを含み（Ｘ±ＳＥＭ）、各実験が３回繰り返され、同様の結果を得た（＊ｐ＜０．０５）。ｄ：カスパーゼ１が、オキサリプラチン化学療法により促進される免疫応答のために要求される。大腿部に樹立されたＥＧ７腫瘍を、オキサリプラチンの１回の全身注射により処置した。鼠径リンパ節細胞を５日後に回収し、神経節細胞をインビトロで再刺激した。ＩＦＮγ分泌をＥＬＩＳＡにより評価した。結果（３連での平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）は、３つの内の１つの典型的な実験を代表する（＊Ｐ＜０．０１）。図１７ｄ：樹立された結腸癌に対するアントラサイクリンの効力は、ＩＬ−１βに依存的である。ＷＴマウスにおいて１０日間にわたり樹立されたＣＴ２６腫瘍を、ドキソルビシンの１回の局所注射を用いて、中和抗ＩＬ−１βＡｂの非存在又は存在において処置した（ｎ＝１０／群、＊ｐ＜０．０５）。図１７ｅ：Ｐ２Ｘ７中の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）（ｒｓ３７５１１４３）は、乳癌患者における従来の抗癌治療の長期効力に影響を及ぼす。正常（Ｇｌｕ４９６Ｇｌｕ）又は機能喪失（Ｇｌｕ４９６Ａｌａ）Ｐ２Ｘ７対立遺伝子を持つ患者の２群における転移までの時間の比較カプラン・マイヤー推定値。転移進行までの時間を、アントラサイクリンを用いたアジュバント化学療法を受けた非転移性乳癌を有する２２５人の女性において分析した。
【図１７ｂ】オキサリプラチンの抗癌活性は、Ｐ２Ｘ７及びＮＡＬＰ３インフラマソームに依存する。図１７ａ、ｂ、ｃ：樹立された腫瘍に対するオキサリプラチンの治療効力は、Ｐ２Ｘ７／ＮＡＬＰ３／ｃａｓｐ−１軸上の免疫系の完全性に依存する。ＥＬ４胸腺腫を、示した遺伝子型（ａ〜ｃ）を持つ又は抗ＣＤ８抗体を用いて注射された（ａ）同系マウスにおいて樹立した。腫瘍が７０−９０mm２のサイズに達した場合、マウスを未処置で放置又はオキサリプラチンを用いて処置した。各処置群が５〜６匹のマウスを含み（Ｘ±ＳＥＭ）、各実験が３回繰り返され、同様の結果を得た（＊ｐ＜０．０５）。ｄ：カスパーゼ１が、オキサリプラチン化学療法により促進される免疫応答のために要求される。大腿部に樹立されたＥＧ７腫瘍を、オキサリプラチンの１回の全身注射により処置した。鼠径リンパ節細胞を５日後に回収し、神経節細胞をインビトロで再刺激した。ＩＦＮγ分泌をＥＬＩＳＡにより評価した。結果（３連での平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）は、３つの内の１つの典型的な実験を代表する（＊Ｐ＜０．０１）。図１７ｄ：樹立された結腸癌に対するアントラサイクリンの効力は、ＩＬ−１βに依存的である。ＷＴマウスにおいて１０日間にわたり樹立されたＣＴ２６腫瘍を、ドキソルビシンの１回の局所注射を用いて、中和抗ＩＬ−１βＡｂの非存在又は存在において処置した（ｎ＝１０／群、＊ｐ＜０．０５）。図１７ｅ：Ｐ２Ｘ７中の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）（ｒｓ３７５１１４３）は、乳癌患者における従来の抗癌治療の長期効力に影響を及ぼす。正常（Ｇｌｕ４９６Ｇｌｕ）又は機能喪失（Ｇｌｕ４９６Ａｌａ）Ｐ２Ｘ７対立遺伝子を持つ患者の２群における転移までの時間の比較カプラン・マイヤー推定値。転移進行までの時間を、アントラサイクリンを用いたアジュバント化学療法を受けた非転移性乳癌を有する２２５人の女性において分析した。
【図１７ｃ】オキサリプラチンの抗癌活性は、Ｐ２Ｘ７及びＮＡＬＰ３インフラマソームに依存する。図１７ａ、ｂ、ｃ：樹立された腫瘍に対するオキサリプラチンの治療効力は、Ｐ２Ｘ７／ＮＡＬＰ３／ｃａｓｐ−１軸上の免疫系の完全性に依存する。ＥＬ４胸腺腫を、示した遺伝子型（ａ〜ｃ）を持つ又は抗ＣＤ８抗体を用いて注射された（ａ）同系マウスにおいて樹立した。腫瘍が７０−９０mm２のサイズに達した場合、マウスを未処置で放置又はオキサリプラチンを用いて処置した。各処置群が５〜６匹のマウスを含み（Ｘ±ＳＥＭ）、各実験が３回繰り返され、同様の結果を得た（＊ｐ＜０．０５）。ｄ：カスパーゼ１が、オキサリプラチン化学療法により促進される免疫応答のために要求される。大腿部に樹立されたＥＧ７腫瘍を、オキサリプラチンの１回の全身注射により処置した。鼠径リンパ節細胞を５日後に回収し、神経節細胞をインビトロで再刺激した。ＩＦＮγ分泌をＥＬＩＳＡにより評価した。結果（３連での平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）は、３つの内の１つの典型的な実験を代表する（＊Ｐ＜０．０１）。図１７ｄ：樹立された結腸癌に対するアントラサイクリンの効力は、ＩＬ−１βに依存的である。ＷＴマウスにおいて１０日間にわたり樹立されたＣＴ２６腫瘍を、ドキソルビシンの１回の局所注射を用いて、中和抗ＩＬ−１βＡｂの非存在又は存在において処置した（ｎ＝１０／群、＊ｐ＜０．０５）。図１７ｅ：Ｐ２Ｘ７中の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）（ｒｓ３７５１１４３）は、乳癌患者における従来の抗癌治療の長期効力に影響を及ぼす。正常（Ｇｌｕ４９６Ｇｌｕ）又は機能喪失（Ｇｌｕ４９６Ａｌａ）Ｐ２Ｘ７対立遺伝子を持つ患者の２群における転移までの時間の比較カプラン・マイヤー推定値。転移進行までの時間を、アントラサイクリンを用いたアジュバント化学療法を受けた非転移性乳癌を有する２２５人の女性において分析した。
【図１７ｄ】オキサリプラチンの抗癌活性は、Ｐ２Ｘ７及びＮＡＬＰ３インフラマソームに依存する。図１７ａ、ｂ、ｃ：樹立された腫瘍に対するオキサリプラチンの治療効力は、Ｐ２Ｘ７／ＮＡＬＰ３／ｃａｓｐ−１軸上の免疫系の完全性に依存する。ＥＬ４胸腺腫を、示した遺伝子型（ａ〜ｃ）を持つ又は抗ＣＤ８抗体を用いて注射された（ａ）同系マウスにおいて樹立した。腫瘍が７０−９０mm２のサイズに達した場合、マウスを未処置で放置又はオキサリプラチンを用いて処置した。各処置群が５〜６匹のマウスを含み（Ｘ±ＳＥＭ）、各実験が３回繰り返され、同様の結果を得た（＊ｐ＜０．０５）。ｄ：カスパーゼ１が、オキサリプラチン化学療法により促進される免疫応答のために要求される。大腿部に樹立されたＥＧ７腫瘍を、オキサリプラチンの１回の全身注射により処置した。鼠径リンパ節細胞を５日後に回収し、神経節細胞をインビトロで再刺激した。ＩＦＮγ分泌をＥＬＩＳＡにより評価した。結果（３連での平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）は、３つの内の１つの典型的な実験を代表する（＊Ｐ＜０．０１）。図１７ｄ：樹立された結腸癌に対するアントラサイクリンの効力は、ＩＬ−１βに依存的である。ＷＴマウスにおいて１０日間にわたり樹立されたＣＴ２６腫瘍を、ドキソルビシンの１回の局所注射を用いて、中和抗ＩＬ−１βＡｂの非存在又は存在において処置した（ｎ＝１０／群、＊ｐ＜０．０５）。図１７ｅ：Ｐ２Ｘ７中の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）（ｒｓ３７５１１４３）は、乳癌患者における従来の抗癌治療の長期効力に影響を及ぼす。正常（Ｇｌｕ４９６Ｇｌｕ）又は機能喪失（Ｇｌｕ４９６Ａｌａ）Ｐ２Ｘ７対立遺伝子を持つ患者の２群における転移までの時間の比較カプラン・マイヤー推定値。転移進行までの時間を、アントラサイクリンを用いたアジュバント化学療法を受けた非転移性乳癌を有する２２５人の女性において分析した。
【図１７ｅ】オキサリプラチンの抗癌活性は、Ｐ２Ｘ７及びＮＡＬＰ３インフラマソームに依存する。図１７ａ、ｂ、ｃ：樹立された腫瘍に対するオキサリプラチンの治療効力は、Ｐ２Ｘ７／ＮＡＬＰ３／ｃａｓｐ−１軸上の免疫系の完全性に依存する。ＥＬ４胸腺腫を、示した遺伝子型（ａ〜ｃ）を持つ又は抗ＣＤ８抗体を用いて注射された（ａ）同系マウスにおいて樹立した。腫瘍が７０−９０mm２のサイズに達した場合、マウスを未処置で放置又はオキサリプラチンを用いて処置した。各処置群が５〜６匹のマウスを含み（Ｘ±ＳＥＭ）、各実験が３回繰り返され、同様の結果を得た（＊ｐ＜０．０５）。ｄ：カスパーゼ１が、オキサリプラチン化学療法により促進される免疫応答のために要求される。大腿部に樹立されたＥＧ７腫瘍を、オキサリプラチンの１回の全身注射により処置した。鼠径リンパ節細胞を５日後に回収し、神経節細胞をインビトロで再刺激した。ＩＦＮγ分泌をＥＬＩＳＡにより評価した。結果（３連での平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）は、３つの内の１つの典型的な実験を代表する（＊Ｐ＜０．０１）。図１７ｄ：樹立された結腸癌に対するアントラサイクリンの効力は、ＩＬ−１βに依存的である。ＷＴマウスにおいて１０日間にわたり樹立されたＣＴ２６腫瘍を、ドキソルビシンの１回の局所注射を用いて、中和抗ＩＬ−１βＡｂの非存在又は存在において処置した（ｎ＝１０／群、＊ｐ＜０．０５）。図１７ｅ：Ｐ２Ｘ７中の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）（ｒｓ３７５１１４３）は、乳癌患者における従来の抗癌治療の長期効力に影響を及ぼす。正常（Ｇｌｕ４９６Ｇｌｕ）又は機能喪失（Ｇｌｕ４９６Ａｌａ）Ｐ２Ｘ７対立遺伝子を持つ患者の２群における転移までの時間の比較カプラン・マイヤー推定値。転移進行までの時間を、アントラサイクリンを用いたアジュバント化学療法を受けた非転移性乳癌を有する２２５人の女性において分析した。
【図１８Ａ】Ｐ２Ｘ７中の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）（ｒｓ３７５１１４３）は、乳癌患者（ｎ＝４７）でのネオアジュバント設定における従来の抗癌治療の効力に影響を与える。図１８Ａ）ケースコントロール試験に登録された患者の数及びパーセンテージを、主要評価項目（病理学的な完全寛解）及びＰ２Ｘ７−ｒｓ３７５１１４３  ＳＮＰの遺伝子型に基づく分割表に表示する。図１８Ｂ）病理学的な完全寛解の割合を、野生型群と突然変異群の患者において比較した。フィッシャー直接確率検定を使用し、主要評価項目とＰ２Ｘ７−ｒｓ３７５１１４３  ＳＮＰの間での関連性をテストした。
【図１８Ｂ】Ｐ２Ｘ７中の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）（ｒｓ３７５１１４３）は、乳癌患者（ｎ＝４７）でのネオアジュバント設定における従来の抗癌治療の効力に影響を与える。図１８Ａ）ケースコントロール試験に登録された患者の数及びパーセンテージを、主要評価項目（病理学的な完全寛解）及びＰ２Ｘ７−ｒｓ３７５１１４３  ＳＮＰの遺伝子型に基づく分割表に表示する。図１８Ｂ）病理学的な完全寛解の割合を、野生型群と突然変異群の患者において比較した。フィッシャー直接確率検定を使用し、主要評価項目とＰ２Ｘ７−ｒｓ３７５１１４３  ＳＮＰの間での関連性をテストした。
【００２０】
発明の詳細な説明
例えば、アントラサイクリン、オキサリプラチン、又はＸ線により誘発される免疫原性細胞死は、細胞膜上でのカルレチクリンのアポトーシス前暴露（ＤＣによる死にかけている細胞の取り込みを促進する）及びＤＣ上に存在するＴＬＲ４に作用するＨＭＧＢ１のアポトーシス後放出（抗原のプロセシングを刺激する）により特徴付けられる。しかし、生きた腫瘍細胞への組換えカルレチクリン又はＨＭＧＢ１の添加は、ＤＣによるそれらの抗原の提示を誘発するために十分ではなく、追加シグナルが死にかけている細胞とＤＣの間で交換されなければならないことを意味する。
【００２１】
本発明は、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソームが死にかけている腫瘍細胞に対する免疫応答を制御するとの観察に基づく。実際に、死にかけている腫瘍細胞はＡＴＰを放出し、それは次にＤＣからのＰ２Ｘ７プリン受容体に作用し、ＮＡＬＰ３カスパーゼ１活性化複合体を引き起こし、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）の分泌を可能にする。
【００２２】
ＩＬ−１受容体１の非存在において又はＩＬ−１受容体アンタゴニストの存在において、死にかけている腫瘍細胞は、癌特異的なインターフェロンγ産生ＣＴＬをプライミングしない。本発明者らは、このように、ＩＦＮγ産生に向けたＣＴＬ極性化の重要な要因としてＮＡＬＰ３インフラマソーム依存的ＩＬ−１β産生を特定している。今までに、ＩＬ−１β／ＩＬ−１βＲシステムの過剰活性化（Krelin et al., 2007）を含む慢性炎症が、腫瘍を促進する条件として考えられており、腫瘍の防止又は治療のためのＩＬ−１β阻害を支持して議論されている（Hagemann et al., 2007; Greten et al., 2004; Naugler et al., 2007; Balkwill et al., 2005）。
【００２３】
本発明者らは、本明細書において、また、免疫正常宿主において成功した抗癌化学療法が、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を有する対象において樹立された腫瘍に対して非効果的であることが判明したことを実証する。本発明者らは、機能的なＰ２Ｘ７／ＮＡＬＰ３／Ｃａｓｐ−１／ＩＬ−１β軸の非存在によってＩＦＮγ産生を阻止すること、及び、死にかけている腫瘍細胞によるＣＴＬ刺激が、外因性ＩＬ−１βが与えられない場合、そのような対象において失敗することを観察した。
【００２４】
さらに、本明細書に記載する臨床試験において、本発明者のデータによって、免疫原性腫瘍細胞死を誘導する化学療法後、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を有する癌患者の無転移生存率が、正常経路を有する患者でのそれより短いことが明らかになる。また、本発明者らは、また、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を有する癌患者が、病理学的な完全寛解を有するより低い確率を有することを示す。
【００２５】
定義
「癌」という用語は、本明細書で使用される通り、癌を起こす細胞に典型的な特徴（例えば無制御な増殖、不死、転移能、急速な成長及び増殖速度、ならびに特定の特徴的な形態学的特性など）を保持する細胞の存在を示す。この用語は、悪性腫瘍の任意の型（原発性又は転移性）を指す。典型的な癌は、Ｘ線、アントラサイクリン、シスプラチン、及び／又はオキサリプラチン感受性の癌、例えば乳房、胃、肉腫、卵巣、子宮粘膜、膀胱、子宮頸部、直腸、結腸、肺、ＯＲＬ癌、小児腫瘍（神経芽細胞腫、多形性膠芽腫）、リンパ腫、白血病、ミエローマ、セミノーマ、ホジキン及び悪性血液病などである。
【００２６】
「癌再発」という用語は、本明細書で使用される通り、改善の期間、特に寛解期間後での癌の徴候及び症状の戻りを指す。「癌再発」という用語は、転移性再発又は同じ部位での原発性腫瘍からの腫瘍発生を指しうる。「癌再発」の代わりに、「転移又は疾患と関連する死」という用語も本願を通して使用してもよい。
【００２７】
「転移性再発」という用語は、本明細書で使用される通り、最初は以前の治療に応答したが、しかし、治療的応答が維持されなかった患者における原発性腫瘍から他の１つ又は複数の部位への癌性細胞の伝播を指す。転移性再発は寛解期間後に出現する。
【００２８】
本明細書で使用する「処置」、「処理する」、又は「処理している」という用語は、患者の健康状態を改善することが意図された任意の行為、例えば疾患の治療、防止、予防、及び遅延などを指す。特定の実施態様において、そのような用語は、疾患又は疾患と関連する症状の改善又は根絶を指す。他の実施態様において、この用語は、疾患を有する対象に対する１つ又は複数の治療用薬剤の投与に起因する疾患の広まり又は悪化を最小限にすることを指す。この用語は、疾患の任意の段階での処置を指す。特に、それは、アジュバント治療（外科手術後の化学療法又は放射線療法）又はネオアジュバント治療（外科手術前の化学療法又は放射線療法）でありうる。
【００２９】
特に、「癌を処置するために」又は「癌を処置する」という用語は、患者において腫瘍の成長、腫瘍転移、又は他の癌を起こす細胞もしくは新生物細胞の進行を逆転する、軽減する、阻害する、又は部分的にもしくは完全に防止することを意味する。
【００３０】
本明細書で使用する「化学療法の処置」又は「化学療法」という用語は、化学的又は生化学的物質を使用した、特に１つ又はいくつかの抗新生物薬剤を使用した癌の治療的処置を指す。好ましくは、化学療法は免疫原性腫瘍細胞死を促進する。「抗新生物薬剤」及び「化学療法薬剤」という用語は互換的に使用され、癌の処置において使用される化合物又は薬物を指す。好ましくは、化学療法は、アントラサイクリン、例えばアクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アムルビシン、ピラルビシン、バルルビシン、ゾルビシン、カルミノマイシン、及びデトルビシン（Ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）など；白金ベースの化学療法薬物、例えばカルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、四硝酸トリプラチン、及びサトラプラチンなど；アントラセンジオン、例えばミトキサントロン及びピクサントロンなど；ストレプトマイセス属の種から単離された抗腫瘍薬剤、例えばアクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン及びプリカマイシン、ならびにその誘導体などからなる群より選択される少なくとも１つの抗新生物薬剤の使用を含む。より好ましくは、化学療法は、アントラサイクリン、オキサリプラチン、及びシスプラチンからなる群より選択される。
【００３１】
「放射線療法の処置」又は「放射線療法」という用語は、複数の型の放射線治療（内部及び外部放射線治療を含む）、放射免疫療法、及び種々の型の放射線（Ｘ線、ガンマ線、アルファ粒子、ベータ粒子、光子、電子、中性子、ラジオアイソトープ、及び電離放射線の他の形態を含む）の使用を指し、当技術分野において一般的に使用される用語である。好ましくは、放射線療法は、Ｘ線又はガンマ線の使用を含む。
【００３２】
化学療法及び放射線療法は、単独で又は組み合わせで使用することができる。
【００３３】
「免疫原性細胞死を誘導する抗癌処置」という用語は、任意のアジュバントの非存在において、アポトーシス形態の細胞死の様相を誘導し、免疫応答を誘発する際に非常に効果的である化学療法又は放射線療法の処置を指す。免疫原性細胞死を誘導する抗癌処置は、限定はされないが、アントラサイクリン、オキサリプラチン、シスプラチン、及びＸ線でありうる。
【００３４】
「処置に対する感受性」という用語は、処置に対する対象の応答レベル（限定はされないが、治療用化合物を代謝する能力を含む）、プロドラッグを活性薬物に変換する能力、個体における薬物の薬物動態（吸収、分布、除去）及び薬力学（受容体に関連する）を指す。
【００３５】
「処置に対する耐性」という用語は、対象が処置に応答しない先天性又は後天性の状態を指す。耐性が後天的に得られる場合、対象は、最初は処置に応答するが、しかし、癌は、最初の処置が完了する６ヶ月以内に再発する。
【００３６】
本明細書で使用する「対象」という用語は、好ましくは、癌を処置するための処置を必要とするヒト（成人、小児、出生前段階を含む）を指す。しかし、「対象」という用語は、また、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物（例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジなど）及び、とりわけ、処置を必要とする非ヒト霊長類を指しうる。
【００３７】
本明細書で使用する「Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路」という用語は、Ｐ２Ｘ７受容体（ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．５０７１０２）、ＮＡＬＰ３タンパク質（ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．１５９４８３）、アダプタータンパク質ＡＳＣ（ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．４９９０９４）、カスパーゼ１（ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．２４９０）、及びＩＬ−１β（ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．１２６２５６）を含む代謝軸を指す。
【００３８】
Ｐ２Ｘ７受容体は、細胞外アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）の結合に応答して開く陽イオン透過性リガンド開閉イオンチャネルのファミリーである。それらは、プリン受容体として公知である受容体のより大きなファミリーに属する。
【００３９】
ＮＡＬＰ３インフラマソームは、カスパーゼ１の活性化に関与する多タンパク質複合体であり、サイトカインＩＬ−１β及びＩＬ−１８のプロセシング及び分泌に導く。ＮＡＬＰ３インフラマソームは、細胞質タンパク質のＮＬＲファミリーに属するＮＡＬＰ３タンパク質、カスパーゼ１、及びＮＡＬＰタンパク質をカスパーゼ１に連結するアダプタータンパク質ＡＳＣで構成される。
【００４０】
本明細書で使用する経路の「機能的状態」という用語は、経路の機能を満たす能力又は不能を指す。Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態は、この経路に含まれる全てのタンパク質（即ち、Ｐ２Ｘ７、ＮＡＬＰ３、ＡＳＣ、カスパーゼ１、及びＩＬ−１β）の発現及び活性に依存する。Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路は、対象の樹状細胞がＩＬ−１βを分泌しない又は標準的レベルと比較して低い分泌量である場合、非機能的である。
【００４１】
経路の構成成分の「機能喪失」という用語は、本明細書で使用される通り、この構成成分の活性の低下又は活性がないことを指す。
【００４２】
タンパク質の「機能分析」という用語は、本明細書で使用される通り、その活性を評価することによるタンパク質の機能の分析を指す。
【００４３】
本明細書で使用する「突然変異」という用語は、遺伝子座中のコード及び／又は非コード領域における点突然変異、欠失、再配列、及び／又は挿入を、単独で又は種々の組み合わせで包含する。欠失は、遺伝子座のコード又は非コード部分において１、２、又はそれ以上の残基の任意の領域（例えば２つの残基から遺伝子又は遺伝子座全体までなど）を包含しうる。典型的な欠失は、より小さな領域（例えば約５０未満の連続塩基対のドメイン（イントロン）又は反復配列又はフラグメントなど）に影響を与えるが、より大きな欠失も生じうる。挿入は、遺伝子座のコード又は非コード部分における１つ又はいくつかの残基の付加を包含しうる。挿入は、典型的には、遺伝子座における１〜５０の間の塩基対の付加を含みうる。再配列は、配列の逆位を含む。突然変異は、終止コドンの作製、フレームシフト突然変異、アミノ酸置換、特定のＲＮＡスプライシング又はプロセシング、産物不安定性、切断ポリペプチド産生などをもたらしうる。突然変異は、変化した機能、安定性、標的化、又は構造を有するポリペプチドの産生をもたらしうる。それは、また、タンパク質発現における低下又は、代わりに、前記産生における増加を起こしうる。
【００４４】
「機能喪失突然変異」という用語は、突然変異遺伝子によりコードされるタンパク質の活性に影響を与える突然変異を指す。タンパク質は、低活性又は完全に不活性でありうる。
【００４５】
「Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失」という用語は、上で定義するＰ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路に含まれるタンパク質をコードする遺伝子が機能喪失突然変異を保有すること、あるいは経路のタンパク質が低活性又は完全に不活性であること、あるいは経路のタンパク質が低発現である又は発現されないことを意味する。この機能喪失は、ＩＬ−１βを分泌する樹状細胞の能力低下又は不能力をもたらす。
【００４６】
「ＳＮＰ」という用語は、「単一ヌクレオチド多型」を意味する。ＳＮＰは、多型（例、Ａｒｇ３０７Ｇｌｎ）のために改変されるアミノ酸残基の位置により又はＮＣＢＩ  ＳＮＰデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP）の参照ＳＮＰ番号（例、ｒｓ２８３６０４５７）により参照することができる。
【００４７】
「治療的有効量」とは、研究者、獣医、医師、又は他の臨床医が対象とする組織、系、動物、又はヒトの生物学的又は医学的な応答を誘発するのに十分である、対象に投与される量を意図する。
【００４８】
「標準レベル」又は「標準値」という用語は、本明細書で使用される通り、機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する個体の集合から又はこれらの個体により提供される細胞から得られるレベル又は値を指す。
【００４９】
効率的な抗癌応答は、死にかけている癌細胞からの抗原を提示し、腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）をプライムする樹状細胞の能力に依存する。実験セクションに記載される通り、本発明者らは、ＮＡＬＰ３インフラマソーム依存的ＩＬ−１β産生が、ＩＦＮγ産生に向かうＣＴＬ極性化、ひいては効果的な抗癌応答の重要な要素であることを実証している。
【００５０】
第１の局面において、本発明は、癌の化学療法又は放射線療法の処置に対する対象の感受性を評価するインビトロでの方法を提供し、前記方法は、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態を決定することを含み、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路は、前記処置に対する耐性を示す。場合により、化学療法又は放射線療法の処置は、アジュバント又はネオアジュバント治療でありうる。
【００５１】
第１の実施態様において、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態は、前記経路に関与する遺伝子における機能喪失突然変異の検出により評価され、前記突然変異の存在は非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を示す。この突然変異は、Ｐ２Ｘ７、ＮＡＬＰ３、ＡＳＣ、カスパーゼ１、又はＩＬ−１βをコードする遺伝子において、又は発現調節エレメント（例えばプロモーターなど）において含まれうる。
【００５２】
機能喪失突然変異は、当業者により公知の任意の手段により、例えば、Ｐ２Ｘ７、ＮＡＬＰ３、ＡＳＣ、カスパーゼ１、又はＩＬ−１β遺伝子の全部又は部分を配列決定することにより、これらの遺伝子の全部又は部分の選択的ハイブリダイゼーション及び／又は増幅あるいは制限消化を使用して検出することができる。より好ましくは、遺伝子の特異的増幅を、突然変異の同定段階前に行う。配列決定は、特定のドメインで、典型的には、有害な突然変異を保有することが公知である又は疑われるドメインで実施してもよい。
【００５３】
機能喪失突然変異は、また、例えば、ＲＮＡ突然変異配列又は異常なＲＮＡスプライシングもしくはプロセシングもしくは発現レベルを検出することにより、ＲＮＡレベルで検出することができる。これは、当技術分野において公知の種々の技術（制限消化、目的のＲＮＡの全部又は部分の配列決定、前記ＲＮＡの全部又は部分の選択的ハイブリダイゼーション又は選択的増幅を含む）により行ってもよい。
【００５４】
好ましくは、検出される機能喪失突然変異は、Ｐ２Ｘ７、ＮＡＬＰ３、ＡＳＣ、カスパーゼ１、又はＩＬ−１βをコードする遺伝子において、又はこれらの遺伝子の発現調節エレメントにおいて含まれる単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）である。
【００５５】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態は、Ｐ２Ｘ７をコードする遺伝子において機能喪失ＳＮＰを検出することにより評価されうる。好ましくは、ＳＮＰは、Ａｒｇ３０７Ｇｌｎ（ｒｓ２８３６０４５７；配列番号２）、Ｉｌｅｕ５６８Ａｓｎ（ｒｓ１６５３６２４；配列番号３）、Ｇｌｕ４９６Ａｌａ（ｒｓ３７５１１４３；配列番号１）、及びＴｈｒ３５７Ｓｅｒ（ｒｓ２２３０９１１；配列番号４）からなる群より選択される。より好ましくは、ＳＮＰはＧｌｕ４９６Ａｌａ（ｒｓ３７５１１４３）である。
【００５６】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態は、また、カスパーゼ１をコードする遺伝子において機能喪失ＳＮＰを検出することにより評価されうる。好ましくは、ＳＮＰはｒｓ５０１１９２（配列番号５）である。
【００５７】
増幅は、当技術分野において公知の種々の技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、及び制限断片長多型（ＲＦＬＰ）などに従って実施されうる。好ましくは、対立遺伝子特異的ＰＣＲ又はＰＣＲ−ＳＳＣＰが使用される。これらの増幅反応を実施するための適したプライマーは、データベース（例えばＧｅｎｂａｎｋなど）において見出される配列情報に基づき、当業者により簡単に設計される。
【００５８】
制限消化、配列決定反応、選択的ハイブリダイゼーション、及び選択的増幅は、周知のプロトコール、例えばSambrook et al.（Sambrook et al.Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000)及びAusubel et al.(In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1998）に記載されるものなどに従って行ってもよい。
【００５９】
別の実施態様において、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態は、前記経路に含まれるタンパク質の突然変異ポリペプチド配列又は損なわれた発現の検出により評価され、突然変異配列又は発現は非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を示す。Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路に関与するタンパク質は、Ｐ２Ｘ７、ＮＡＬＰ３、ＡＳＣ、カスパーゼ１、及びＩＬ−１βからなる群より選択されうる。
【００６０】
突然変異ポリペプチド配列は、当技術分野において公知の種々の技術、例えば、ポリペプチド配列決定及び／又は特定リガンド（例えば抗体など）への結合などにより検出することができる。
【００６１】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路に関与するタンパク質の損なわれた発現は、また、当技術分野において公知の種々の技術、例えば、ウエスタンプロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、又は免疫酵素アッセイなどにより検出することができる。タンパク質の発現は、また、ノーザンブロット又は定量的ＲＴ−ＰＣＲ、あるいは当技術分野において公知の任意の他の方法を使用することによりその特定ＲＮＡ発現を検出することにより評価することができる。
【００６２】
他の適した方法を使用し、突然変異ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列を検出する又はタンパク質発現又はＲＮＡを定量化してもよい。それらは、限定なく、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、対立遺伝子特異的増幅、サザンブロット、一本鎖立体構造解析、ＰＦＧＥ、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ゲル移動、クランプ変性ゲル電気泳動、ヘテロデュプレックス分析、ＲＮアーゼ保護、及び化学ミスマッチ切断を含む。
【００６３】
別の実施態様において、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態は、化学療法又は放射線療法の処置前後で対象の血液サンプル中でのＩＬ−１βレベルを比較することにより評価され、前記処置後での前記レベルの有意な増加は、機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を示す。好ましくは、処置は、アントラサイクリン、オキサリプラチン、シスプラチン、及びＸ線からなる群より選択される。
【００６４】
本明細書で使用する「有意な増加」という用語は、機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する対象において同じ条件において得られたものと統計的に同程度である増加を指す。
【００６５】
対象に施される処置は、死にかけている腫瘍細胞を生成し、それらは、機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する対象において、樹状細胞によるＩＬ−１β分泌の増加、ひいては血液中のＩＬ−１βレベルの増加を誘導する。対象が機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有さない場合、ＩＬ−１β血液レベルにおける増加は観察されない、又はそのレベルがより低い。ＩＬ−１βは、当業者により公知の任意の方法、例えばＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定してもよい。
【００６６】
好ましい実施態様において、ＩＬ−１βレベルを、対象の血清サンプル中で、化学療法又は放射線療法の処置の前ならびに２４及び／又は７２時間後に測定する。
【００６７】
結果的に、この方法を用いて、抗癌処置に対する対象の感受性を、この対象の血液サンプル中のＩＬ−１β濃度を測定するだけで、最初の投与後に評価してもよい。
【００６８】
さらなる実施態様において、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態は、死にかけている腫瘍細胞の存在においてＩＬ−１βを分泌する対象の樹状細胞（ＤＣ）の能力を測定することにより評価され、それにおいて標準レベルと比較して低下した能力は、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路と相関する。
【００６９】
この分泌能力は、例えば、以下の工程を含む方法を用いて評価してもよい：（ｉ）対象のサンプルからＤＣを得ること、（ｉｉ）前記細胞を、抗新生物薬剤を用いて処理された腫瘍細胞と同時培養すること、（ｉｉｉ）細胞培養上清中のＩＬ−１βを評価すること（それにおいて標準レベルと比較したＩＬ−１βの減少レベルは、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路と相関する）。
【００７０】
標準レベルは、機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する対象からの樹状細胞を同じプロトコールに供することにより得られる。
【００７１】
ネガティブコントロールとして、ＤＣを、単独又は生きている腫瘍細胞とインキュベートしてもよい。
【００７２】
好ましくは、自己ＤＣは、対象の血液サンプルから得られる。最初に、ＣＤ１４＋単球を、抗ＣＤ１４抗体を使用した陽性細胞選別又はプラスチックディッシュ上での付着工程後、あるいは当技術分野において公知の任意の他の方法により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から回収する。次に、ＣＤ１４＋単球を、樹状細胞分化を刺激する化合物（例えばＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮα２ｂなど）を用いて４日間インキュベートする。
【００７３】
この方法において使用される腫瘍細胞は、抗新生物薬剤に感受性でなければならず、当業者により簡単に選ばれうる。例えば、オキサリプラチンを用いて処理されたＨＣＴ１１６細胞（結腸癌）を使用してもよい。これらの細胞を、任意の洗液工程なしにＤＣ培養に加える。
【００７４】
好ましくは、抗新生物薬剤は、アントラサイクリン、オキサリプラチン、シスプラチン、及びＸ線からなる群より選択される。
【００７５】
この方法の実施態様の例を、実験セクションに提示する。
【００７６】
別の実施態様において、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態は、ＨＭＧＢ１及びＡＴＰの存在においてＩＬ−１βを分泌する対象の樹状細胞（ＤＣ）の能力を測定することにより評価され、それにおいて標準レベルと比較して低下した能力は、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路と相関する。
【００７７】
本明細書で使用する「ＨＭＧＢ１」という用語は、抗新生物薬剤（例えばドキソルビシン又はオキサリプラチンなど）を用いて処理された死にかけている腫瘍細胞により放出されたＴＬＲ４アゴニストである高移動度群ボックス１タンパク質を指す（Apetoh et al., 2007）。
【００７８】
この方法は、以下の工程を含む：（ｉ）対象のサンプルからＤＣを得ること、（ｉｉ）前記細胞をＨＭＧＢ１及びＡＴＰと培養すること、（ｉｉｉ）細胞培養上清中のＩＬ−１βを評価すること（それにおいて標準レベルと比較したＩＬ−１βの減少レベルは、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路と相関する）。
【００７９】
標準レベルは、機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する対象からの樹状細胞を同じプロトコールに供することにより得られる。
【００８０】
ネガティブコントロールとして、ＤＣを、ＨＭＧＢ１もＡＴＰも添加せずインキュベートしてもよい。
【００８１】
好ましくは、自己ＤＣは、上に記載する通りに、ＰＢＭＣ由来単球から得られる。
【００８２】
さらなる実施態様において、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態は、リポポリサッカリド及びＡＴＰの存在においてＩＬ−１βを分泌する対象の単球の能力を測定することにより評価され、それにおいて標準レベルと比較して低下した能力は、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路と相関する。
【００８３】
この能力は、例えば、以下の工程を含む方法を用いて評価してもよい：（ｉ）対象のサンプルからＣＤ１４＋単球を得ること、（ｉｉ）前記細胞をリポポリサッカリド及びＡＴＰと培養すること、（ｉｉｉ）細胞培養上清中のＩＬ−１βを評価すること（それにおいて標準レベルと比較したＩＬ−１βの減少レベルは、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路と相関する）。
【００８４】
好ましくは、自己ＣＤ１４＋単球は、上に記載する通りに、被験者の末梢血単核細胞から回収される。
【００８５】
標準レベルは、機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する対象からの単球を同じプロトコールに供することにより得られる。
【００８６】
ネガティブコントロールとして、単球を、ＬＰＳもＡＴＰも添加せずインキュベートしてもよい。
【００８７】
ＩＬ−１βを、細胞培養上清中で、当技術分野において公知の任意の方法により、好ましくはＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価してもよい。ＩＬ−１βを、また、下で記載する通り、前駆体又は成熟形態のＩＬ−１β及び／又はカスパーゼ１を認識する特異的抗体を使用したウエスタンブロット解析を用いて評価してもよい。
【００８８】
さらなる実施態様において、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態は、前記経路の構成成分の機能分析により評価され、前記経路の少なくとも１つの構成成分の機能喪失は、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を示す。
【００８９】
Ｐ２Ｘ７、ＮＡＬＰ３、ＡＳＣ、カスパーゼ１、及び／又はＩＬ−１βの活性を評価し、これらのタンパク質の１つに影響を与える任意の機能喪失を検出する。Ｐ２Ｘ７、ＮＡＬＰ３、ＡＳＣ、カスパーゼ１、又はＩＬ−１βの活性は、当業者により公知の任意の方法により評価されうる。
【００９０】
好ましくは、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態は、Ｐ２Ｘ７受容体の機能分析により評価される。例として、Ｐ２Ｘ７受容体の機能分析は、Sluyter et al.（Sluyter et al., 2004）により記載される通り、赤血球においてＡＴＰ誘導性８６Ｒｂ＋流出を測定することにより行われうる。このＰ２Ｘ７受容体の分析は、対象の血液サンプルで実施されうる。得られた値を、コントロール対象（即ち、機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する）を用いて得られた値と比較する。損なわれたＡＴＰ誘導性８６Ｒｂ＋流出は、対象が非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有し、ひいては抗癌処置に対する感受性が低下したことを示すことを意味する。さらなる例として、Ｐ２Ｘ７受容体の機能分析は、Jursik et al.（Jursik et al., 2007）の論文において記載される通りに、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋、又はエチジウムの取り込み又は流入について単球、リンパ球、又はマクロファージをテストすることにより行われうる。
【００９１】
ＩＬ−１β及びカスパーゼ１の活性は、それらの成熟プロセスを研究することにより評価されうる。
【００９２】
ＩＬ−１βが、生物学的に不活性な前駆体（即ち、プロＩＬ−１β）として産生され、それは、カスパーゼ１（ＩＬ−１β変換酵素（ＩＣＥ）とも呼ばれる）により行われるタンパク質分解的プロセシングにより活性形態（即ち、ＩＬ−１β  ｐ１７）に変換される。
【００９３】
カスパーゼ１はプロ酵素（４５kDa）として合成され、それはタンパク質分解的切断を受け、成熟産物（即ち、ｐ２０及びｐ１０サブユニット）を生産し、それはヘテロ二量体化し、活性プロテアーゼを形成する。
【００９４】
前駆体及び成熟形態のカスパーゼ１及びＩＬ−１βは、ＡＴＰとＬＰＳを用いて刺激されたＰＢＭＣ由来単球又は死にかけている腫瘍細胞（例、オキサリプラチンとインキュベートされ、ＤＣを用いたインキュベーション前に洗浄されていないＨＣＴ１１６細胞）とインキュベートされたＤＣ（上に記載する通りに、ＰＢＭＣ由来単球から生成した）又はＨＭＧＢ１及びＡＴＰとインキュベートされたＤＣの上清及びライセート中でこれらのタンパク質を認識する特異的抗体を使用したウエスタンブロットにより検出されうる。
【００９５】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路が機能的である場合、カスパーゼ１  ｐ２０は細胞ライセート中で検出され、ＩＬ−１β  ｐ１７は細胞培養上清中で検出される。
【００９６】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路が機能的ではない場合、ＩＬ−１β  ｐ１７は細胞培養上清中で検出されない。これは、カスパーゼ１及び／又はＩＬ−１β前駆体発現の非存在又はこれらの前駆体の異常成熟を誘導する突然変異に起因しうる。
【００９７】
インフラマソーム活性化に続いて産生されるＩＬ−１βの特異性は、カスパーゼ１のアンタゴニストを伴う又は伴わない上に記載する実験（例えば高濃度のＫＣｌ（例、１３０mM）又はｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋなど）を実行することによりアッセイされうる。カスパーゼ１アンタゴニストの存在において、刺激された単球又はＤＣによるＩＬ−１β産生は、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路が機能的である場合でも無効になる。
【００９８】
第２の局面において、本発明は、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する対象において癌の化学療法又は放射線療法の処置に対する感受性を増加又は回復させるために有用である化合物をスクリーニングするためのインビトロでの方法を提供し、前記方法は、前記対象において死にかけている腫瘍細胞の存在における樹状細胞によるＩＬ−１β分泌を誘導又は増加させる試験化合物の能力を決定することを含む。
【００９９】
本発明は、さらに、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する対象において癌を処置するために有用である化合物をスクリーニングするためのインビトロでの方法を提供し、前記方法は、前記対象において死にかけている腫瘍細胞の存在における樹状細胞によるＩＬ−１β分泌を誘導又は増加させる試験化合物の能力を決定することを含む。
【０１００】
死にかけている腫瘍細胞の存在における樹状細胞によるＩＬ−１β分泌を誘導又は増加させることができる化合物によって、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球のプライミングを回復又は増加させることができる。この化合物をこのように使用し、対象における抗癌処置に対する感受性を増加又は回復させ、ひいては前記対象において癌を処置しうる。好ましくは、抗癌処置は、アントラサイクリン、オキサリプラチン、シスプラチン、及びＸ線からなる群より選択される。
【０１０１】
実施態様において、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する対象においてＩＬ−１β産生を誘導又は増加させる試験化合物の能力を、対象のサンプルからＤＣを得て、前記細胞を、試験化合物の存在において死にかけている腫瘍細胞と接触させ、細胞培養上清中に分泌されたＩＬ−１βの量を測定することにより評価され、それにおいて標準レベルと比較したＩＬ−１βの低下量は、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路と相関する。
【０１０２】
標準レベルのＩＬ−１β分泌は、機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する対象のＤＣを、試験化合物の存在において、死にかけている腫瘍細胞と接触させ、細胞培養上清中に分泌されたＩＬ−１βの量を測定することにより得られる。
【０１０３】
ネガティブコントロールとして、前記ＤＣを、試験化合物の非存在において、死にかけている腫瘍細胞と接触させることを使用してもよい。
【０１０４】
上に記載する通りに、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路は、前記経路の異なる構成成分の機能喪失に起因しうる。このように、非機能的経路を有する異なる対象から提供されるＤＣは、機能喪失の障害を示す経路の構成成分に従い、試験化合物に対して異なる応答を示しうる。結果的に、このスクリーニング方法において使用される樹状細胞は、好ましくは、処置される対象から提供される。
【０１０５】
本発明は、さらに、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する対象において癌の化学療法又は放射線療法の処置に対する感受性を増加又は回復するために有用である化合物をスクリーニングするための方法を提供し、前記方法は、（ｉ）非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有し、腫瘍を用いて接種された非ヒトトランスジェニック動物に癌の化学療法又は放射線療法の処置との組み合わせで、試験化合物を投与すること、及び（ｉｉ）前記処置に対する前記動物の感受性を評価することを含む。
【０１０６】
好ましくは、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する非ヒトトランスジェニック動物は、Ｃａｓｐ１−／−、Ａｓｃ−／−、ＮＡＬＰ３−／−、ＩＬ−１β−／−、又はＰ２Ｘ７−／−遺伝子型を示すＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスからなる群より選択される。例として、Ｃ５７ＢＬ／６Ｃａｓｐ１−／−、Ａｓｃ−／−、ＮＡＬＰ３−／−、Ｐ２Ｘ７−／−マウスが、それぞれLi et al., 1995；Srinivasula et al., 2002；Kanneganti et al., 2006；Solle et al., 2001に記載された。
【０１０７】
非ヒトトランスジェニック動物に腫瘍を接種するために使用される腫瘍細胞は、好ましくは、ＣＴ２６結腸癌細胞、ＥＬ４胸腺腫細胞、ＥＧ７細胞、ＭＣＡ２０５繊維肉腫細胞、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞、及びＴＳ／Ａ乳腺腺癌細胞からなる群より選択される。
【０１０８】
施された処置に対する非ヒトトランスジェニック動物の感受性は、当技術分野において公知の任意の方法（例えば動物の腫瘍サイズの経過観察又は無転移生存率など）により評価してもよい。
【０１０９】
実験セクションに提示された本発明者らのデータは、再発、特に転移再発の確率が、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を有する対象において増加することを実証する。
【０１１０】
本発明は、このように、対象における再発の可能性を決定するためのインビトロでの方法を提供し、前記方法は、前記対象においてＰ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態を決定することを含み、非機能的経路は再発の可能性の増加を示す。好ましくは、癌再発は転移再発である。あるいは、癌再発は原発性腫瘍の再発である。好ましくは、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態は、前記経路に関与する遺伝子における機能喪失突然変異の検出により評価され、前記突然変異の存在は非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を示す。特に、突然変異は、ｒｓ２８３６０４５７、ｒｓ１６５３６２４、ｒｓ３７５１１４３、ｒｓ２２３０９１１、及びｒｓ５０１１９２からなる群より選択されるＳＮＰであって、好ましくはＳＮＰは、ｒｓ３７５１１４３である。
【０１１１】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態は、上に記載する通りに、任意の方法により評価されうる。
【０１１２】
さらなる局面において、本発明は、それを必要とする対象のために適した化学療法又は放射線療法の処置を選択するためのインビトロでの方法を提供し、前記方法は、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態を決定することを含み、非機能的経路は免疫原性腫瘍細胞死を誘導する抗癌処置について禁忌と考えられる。
【０１１３】
「禁忌」という用語は、本明細書で使用される通り、治療的処置の副作用と前記処置に対する患者の応答の間での不均衡を指す。この場合において、処置は、有益な効果よりも多くの有害な効果を誘導する。
【０１１４】
対象が機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する場合、被験者は、免疫原性腫瘍細胞死を誘導する抗癌処置（例えばアントラサイクリン、オキサリプラチン、シスプラチン、又はＸ線など）に対して感受性でありうる。
【０１１５】
反対に、対象が非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する場合、免疫原性腫瘍細胞死を誘導する抗癌処置では治療効果が低下するであろう。
【０１１６】
結果的に、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態を決定することによって、施術者が、免疫原性腫瘍細胞死を誘導する抗癌処置が対象を処置するために適しているか否か、又は他の処置が考慮されなければならないか否かを決定する；あるいは、施術者が、何が適切な処置であるかを決めることを可能にする情報を提供することが可能になる。
【０１１７】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態は、上に記載する通りに、任意の方法により評価されうる。
【０１１８】
本発明は、また、化学療法薬剤及び非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を補うことができる化合物を含む医薬的組成物に関する。
【０１１９】
特定の実施態様において、化学療法薬剤は、アントラサイクリン、オキサリプラチン、及びシスプラチンからなる群より選択される。
【０１２０】
非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を補うことができる化合物は、本発明のスクリーニング方法によりスクリーニングされうる。
【０１２１】
実施態様において、この化合物は、ＩＬ−１β；ＩＬ−１２；ナチュラルキラー細胞及びナチュラルキラーＴ細胞アクチベーター、例えばＣＤ１ｄアゴニスト、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、又はＩＦＮαなど；Ｐ２Ｘ７受容体アクチベーター、例えばカテリシジン由来ペプチドＬＬ３７、ポリミキシンＢ、ＳＴＡＴ３阻害剤、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、ＴＧＦｂ阻害ペプチド、ＩＬ−１０阻害ペプチド、抗ＩＬ−１０モノクローナル抗体、抗ＩＬ−１３モノクローナル抗体、抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体、及びＩＬ−３３などからなる群より選択される。抗体は中和又は遮断しうる。分子は、好ましくは、それらの活性形態（例えばＩＬ−１βについてはＩＬ−１β  ｐ１７及びＩＬ−１２についてはＩＬ−１２  ｐ７０など）で提供される。
【０１２２】
好ましい実施態様において、化合物は組換えＩＬ−１βである。
【０１２３】
化学療法薬剤及び非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を補うことができる化合物を含む医薬的化合物を、当業者により公知の標準的な薬務（例、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000及びEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New Yorkを参照のこと）に従い製剤化する。
【０１２４】
可能な医薬的組成物は、経口、直腸、局所（経皮、口腔、及び舌下を含む）、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、及び皮内を含む）、又は腫瘍内（例、超音波誘導腫瘍内注射）投与のために適したものを含む。腫瘍内投与は、限局性の非転移性腫瘍に検討されている。これらの製剤のために、従来の賦形剤を、当業者により周知の技術に従って使用することができる。
【０１２５】
非経口投与のための組成物は、一般的に、生理学的に適合する無菌溶液、あるいは、場合により使用直前に固形又は凍結乾燥形態から調製することができる懸濁剤である。アジュバント（例えば局所麻酔剤、保存剤、及び緩衝剤など）は溶剤に溶解することができ、界面活性剤又は湿潤剤は組成物中に添加し、活性成分の均一な分布を促進することができる。
【０１２６】
経口投与のために、組成物を、従来の経口投与形態、例えば錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、及び液体調製物（例えばシロップ、エリキシル、及び濃縮滴剤など）などに製剤化することができる。非毒性固形担体又は希釈剤を使用してもよく、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、マグネシウム、炭酸塩などを含む。圧縮錠剤のために、結合剤（粉末物質に粘着性を与える薬剤である）も必要である。例えば、デンプン、ゼラチン、糖（例えばラクトース又はデキストロースなど）、及び天然又は合成ゴムを結合剤として使用することができる。崩壊剤も、錠剤の分解を促進するために錠剤中に必要である。崩壊剤は、デンプン、粘土、セルロース、アルギン、ゴム、及び架橋ポリマーを含む。さらに、潤滑剤及び滑剤も錠剤中に含め、製造プロセスにおける表面への錠剤材料の付着を防止し、製造の間での粉末材料の流動特性を改善する。コロイド状二酸化ケイ素が滑剤として最も一般的に使用される。化合物、例えばタルク又はステアリン酸などが潤滑剤として最も一般的に使用される。
【０１２７】
経皮投与のために、組成物を、軟膏、クリーム、又はゲル形態に製剤化することができ、適切な浸透剤又は界面活性剤を使用し、浸透を促進することができうる（例えばジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、及びジメチルホルムアミドなど）。
【０１２８】
経粘膜投与のために、鼻内スプレー、直腸又は膣坐剤を使用することができる。活性化合物を、当技術分野において公知の方法により、公知の坐剤基剤のいずれかに加えることができる。そのような基剤の例は、ココアバター、ポリエチレングリコール（カーボワックス）、ポリエチレンソルビタンモノステアレート、及び、これらと、融点又は溶解速度を改変する他の適合性する材料との混合物を含む。
【０１２９】
好ましい実施態様において、本発明の医薬的組成物は非経口又は経口投与に適する。
【０１３０】
本発明の医薬的組成物を、投与後実質的に直ぐに又は投与後の任意の所定の時間もしくは期間に活性薬物を放出するように製剤化してもよい。
【０１３１】
本発明の医薬的組成物は、１つ又は複数の化学療法薬剤及び、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を補うことができる１つ又は複数の化合物を、医薬的に許容可能な賦形剤及び／又は担体と併せて含むことができる。これらの賦形剤及び／又は担体は、上に記載する通りに、投与形態に従って選ばれる。
【０１３２】
本発明は、また、化学療法薬剤及び非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を補うことができる化合物を、癌の処置における、特に非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する対象における同時、別々、又は連続使用のための組み合わせ調製物として含む産物に関する。
【０１３３】
化学療法薬剤及び非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を補うことができる化合物の量を、当業者により周知である標準的手順により決定しなければならない。患者の生理学的データ（例、年齢、サイズ、及び体重）及び投与経路を考慮に入れて、適切な投与量を決定しなければならない。
【０１３４】
好ましい実施態様において、医薬的組成物は、治療的有効量の化学療法薬剤及び非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を補うことができる治療的有効量の化合物を含む。
【０１３５】
治療的有効量を決定するための適した手段及び測定は、当業者に利用可能である。
【０１３６】
本発明は、さらに、特に非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する対象において、化学療法薬剤又は放射線療法の処置と組み合わせた癌の処置における使用のための非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を補うことができる化合物を提供する。
【０１３７】
この化合物を、上に記載する通りに、本発明のスクリーニング方法に従ってスクリーニングしてもよい。
【０１３８】
特定の実施態様において、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を補うことができる化合物は、ＩＬ−１β；ＩＬ−１２；ナチュラルキラー細胞及びナチュラルキラーＴ細胞アクチベーター、例えばＣＤ１ｄアゴニスト、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、又はＩＦＮαなど；Ｐ２Ｘ７受容体アクチベーター、例えばカテリシジン由来ペプチドＬＬ３７、ポリミキシンＢ、ＳＴＡＴ３阻害剤、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、ＴＧＦｂ阻害ペプチド、ＩＬ−１０阻害ペプチド、抗ＩＬ−１０モノクローナル抗体、抗ＩＬ−１３モノクローナル抗体、抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体、及びＩＬ−３３などからなる群より選択される。抗体は中和又は遮断しうる。分子は、好ましくは、それらの活性形態（例えばＩＬ−１βについてはＩＬ−１β  ｐ１７及びＩＬ−１２についてはＩＬ−１２  ｐ７０など）で提供される。
【０１３９】
好ましい実施態様において、この化合物は組換えＩＬ−１βである。
【０１４０】
別の局面において、本発明は、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を有する対象において癌を処置するための医薬の製造のための、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を補うことができる化合物に関する。この化合物は、上に記載する通りに、本発明の方法によりスクリーニングされうる。
【０１４１】
特定の実施態様において、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を補うことができる化合物は、ＩＬ−１β；ＩＬ−１２；ナチュラルキラー細胞及びナチュラルキラーＴ細胞アクチベーター、例えばＣＤ１ｄアゴニスト、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、又はＩＦＮαなど；Ｐ２Ｘ７受容体アクチベーター、例えばカテリシジン由来ペプチドＬＬ３７、ポリミキシンＢ、ＳＴＡＴ３阻害剤、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、ＴＧＦｂ阻害ペプチド、ＩＬ−１０阻害ペプチド、抗ＩＬ−１０モノクローナル抗体、抗ＩＬ−１３モノクローナル抗体、抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体、及びＩＬ−３３などからなる群より選択される。抗体は中和又は遮断しうる。分子は、好ましくは、それらの活性形態（例えばＩＬ−１βについてはＩＬ−１β  ｐ１７及びＩＬ−１２についてはＩＬ−１２  ｐ７０など）で提供される。
【０１４２】
好ましい実施態様において、この化合物は組換えＩＬ−１βである。
【０１４３】
本発明は、また、癌を患い、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する対象において化学療法又は放射線療法の処置の効力を増加させるための方法に関し、前記方法は、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を補うことができる治療的有効量の化合物との組み合わせで化学療法又は放射線療法の処置を施すことを含む。
【０１４４】
非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を補うことができる化合物、及び化学療法又は放射線療法の処置を同時に、別々に、又は連続的に施してもよい。
【０１４５】
特定の実施態様において、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を補うことができる化合物は、ＩＬ−１β；ＩＬ−１２；ナチュラルキラー細胞及びナチュラルキラーＴ細胞アクチベーター、例えばＣＤ１ｄアゴニスト、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、又はＩＦＮαなど；Ｐ２Ｘ７受容体アクチベーター、例えばカテリシジン由来ペプチドＬＬ３７、ポリミキシンＢ、ＳＴＡＴ３阻害剤、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、ＴＧＦｂ阻害ペプチド、ＩＬ−１０阻害ペプチド、抗ＩＬ−１０モノクローナル抗体、抗ＩＬ−１３モノクローナル抗体、抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体、及びＩＬ−３３などからなる群より選択される。抗体は中和又は遮断しうる。分子は、好ましくは、それらの活性形態（例えばＩＬ−１βについてはＩＬ−１β  ｐ１７及びＩＬ−１２についてはＩＬ−１２  ｐ７０など）で提供される。
【０１４６】
好ましくは、この化合物は組換えＩＬ−１βである。
【０１４７】
好ましい実施態様において、前記方法は、アントラサイクリン、オキサリプラチン、シスプラチン、及びＸ線からなる群より選択される抗癌処置を、組換えＩＬ−１βとの組み合わせで施すことを含む。
【０１４８】
本発明は、さらに、癌を患い、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する対象を処置するための方法を提供し、前記方法は、化学療法又は放射線療法の処置を、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を補うことができる化合物との組み合わせで施すことを含む。
【０１４９】
化合物及び抗癌処置、化学療法又は放射線療法は、同時に、別々に、又は連続的に施されうる。好ましくは、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を補うことができる化合物は、化学療法又は放射線療法の処置と同じ日に、そしてこの処置後の数日間（例、約２、３、４日、又は１週間）施される。このプロトコールは、処置の各サイクルで繰り返される。
【０１５０】
特定の実施態様において、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を補うことができる化合物は、ＩＬ−１β；ＩＬ−１２；ナチュラルキラー細胞及びナチュラルキラーＴ細胞アクチベーター、例えばＣＤ１ｄアゴニスト、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、又はＩＦＮαなど；Ｐ２Ｘ７受容体アクチベーター、例えばカテリシジン由来ペプチドＬＬ３７、ポリミキシンＢ、ＳＴＡＴ３阻害剤、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、ＴＧＦｂ阻害ペプチド、ＩＬ−１０阻害ペプチド、抗ＩＬ−１０モノクローナル抗体、抗ＩＬ−１３モノクローナル抗体、抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体、及びＩＬ−３３などからなる群より選択される。抗体は中和又は遮断しうる。分子は、好ましくは、それらの活性形態（例えばＩＬ−１βについてはＩＬ−１β  ｐ１７及びＩＬ−１２についてはＩＬ−１２  ｐ７０など）で提供される。好ましくは、この化合物は組換えＩＬ−１βである。
【０１５１】
好ましい実施態様において、方法は、アントラサイクリン、オキサリプラチン、シスプラチン、及びＸ線からなる群より選択される抗癌処置を、組換えＩＬ−１βとの組み合わせで施すことを含む。
【０１５２】
以下の実施例は、例示の目的のために与えられ、限定のためではない。
【０１５３】
実施例
材料及び方法
マウス系統
ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）、ｎｕ／ｎｕ、及びＲａｇ２−／−Ｃ５７ＢＬ／６マウスをCentre d'elevage Janvier（Le Genest St Isle, France）から及びCharles River Laboratories（L'Arbresle, France）から、ならびにTaconic（Denmark）から得た。
【０１５４】
Ｃ５７ＢＬ／６  Ｉｆｎγｒ１−／−、Ｃａｓｐ１−／−、Ａｓｃ−／−、ＮＡＬＰ３−／−、Ｐ２Ｘ７−／−、及びＩＬ−１２Ｒβ２−／−マウスは、Huang et al, 1993；Li et al., 1995；Srinivasula et al., 2002；Kanneganti et al., 2006；Solle et al., 2001；及びWu et al., 2000にそれぞれ記載された。マウスを無菌条件において飼育した。６〜２０週齢の動物を使用した。全ての動物を、FELASAガイドライン及びAnimal Experimental Ethics Committee Guidelines（Val de Marne, France）に従って維持した。
【０１５５】
試薬及び材料
細胞死を、ドキソルビシン、ミトキサントロン（Sigma Aldrich, St Quentin Fallavier, France）、又はオキサリプラチン（Sanofi-Aventis, France）のいずれかを用いて誘導した。オボアルブミンタンパク質をCalbiochem（Darmstadt, Germany）から、イオノマイシン、ホルボール１２ミリステート１３アセテート（ＰＭＡ）、アンチマイシンＡ、２−デオキシグルコース、ＡＴＰ、及び酸化ＡＴＰ（ＯｘｉＡＴＰ）をSigma Aldrichから購入した。組換えヒトＨＭＧＢ１、マウスＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２及びＴＮＦα、ならびに抗ＩＬ−１β中和抗体をR&D Systems（Lille, France）から得た。一部の実験において、ＨＭＧＢ１活性を、Huan Yang（Lexington, MA)(Huston et al., 2008）により提供された抗ＨＭＧＢ１抗体を用いて中和した。ＩＬ−１Ｒａ、Kineret Anakinra（Amgen）が、厚意で、CNRS（Orleans, France）により及びCochin University Hospital（Paris, France）（Fleischmann et al., 2004）により提供された。モノクローナル蛍光色素結合抗マウスＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＦＮγ、ＣＤ１１ｃ、Ｉ−Ａｂ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、コントロールアイソタイプ抗体、Cytofix/Cytoperm、ブレフェルジンＡ、及びQuantikine ELISAキット（ＩＦＮγ、ＩＬ−１２ｐ４０、及びＩＬ−１０用）をBD Pharmingen（Le Pont de Claix, France）から購入した。ＩＬ−１β  ＥＬＩＳＡキットをClinisciences（Montrouge, France）から購入した。ＩＬ−１７及びＩＬ−４  ＥＬＩＳＡキットをOzyme（Paris, France）から購入した。ＩＬ−１３  ＥＬＩＳＡキットをPeprotech（Neuilly sur-Seine, France）から購入した。免疫蛍光顕微鏡検査法用のウサギ抗カスパーゼ１  ｐ２０ポリクローナル抗体をSanta Cruz Biotechnology（Santa Cruz, USA）から得た。マウス抗ＣＤ１１ｃ  Alexa Fluor 488をBiolegend（San Diego, USA）から購入した。ＳＩＩＮＦＥＫＬ及びｇｐ１００（ＫＶＰＲＮＱＤＷＬ）ペプチドをEurogentec（Seraing, Belgium）から得た。ＣｐＧ  ＯＤＮ  ２８が、厚意で、Pitie Salpetriere University Hospital（Paris, France）（Carpentier et al., 2006）により提供された。ポリＩ：ＣをAmersham（Buckinghamshire, UK）から購入した。ＬＰＳをInvivogen（San Diego, CA）から得た。ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇のために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０．３mg/マウスの精製ＩｇＧラット抗マウス抗ＣＤ８ｍＡｂ（２．４３ハイブリドーマから調製）を含む０．２ｍｌのＰＢＳを用いて腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＣＤ４＋細胞の枯渇は、ＧＫ１．５ハイブリドーマから調製されたラット抗マウス抗ＣＤ４  ｍＡｂ（０．２mg/マウス）を用いてマウスに腹腔内注射することにより達成した。ＮＫ細胞活性を除去するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、化学療法の開始から−３日後、０日後、及び３日後にWakoから購入した３０μlの抗アシアロＧＭ１抗体（Neuss, Germany；抗体力価１：１０００）を用いて腹腔内注射した。
【０１５６】
腫瘍細胞株及び移植可能な腫瘍
ＣＴ２６結腸癌細胞（ＢＡＬＢ／ｃから）、ＥＬ４胸腺腫細胞（Ｃ５７ＢＬ／６から）、ＥＧ７細胞（ＯＶＡトランスフェクトＥＬ４細胞）、ＭＣＡ２０５繊維肉腫細胞（Ｃ５７ＢＬ／６から）、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞（Ｃ５７ＢＬ／６から）、ＴＳ／Ａ乳腺腺癌細胞（ＢＡＬＢ／ｃから）、及びＴＳ／Ａ−ＯＶＡ細胞（ＯＶＡトランスフェクトＴＳ／Ａ細胞）を、１０%ＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、１mMピルビン酸、及び１０mMＨｅｐｅｓを添加したエンドトキシンフリーＲＰＭＩ  １６４０培地中で、３７℃で５%ＣＯ２下で培養した。マウス胎仔繊維芽細胞（ＭＥＦ）及びＯＶＡトランスフェクトＭＥＦを、１０%ＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、１mMピルビン酸、及び１０mMＨｅｐｅｓを添加したエンドトキシンフリーＤＭＥＭ培地中で培養した。Ｂ３ＺクローンがKarttunen et al., 1992に記載された。
【０１５７】
骨髄由来ＤＣ及びＴ細胞ハイブリドーマアッセイ
骨髄由来樹状細胞（ＤＣ）を、ペニシリン（１００U/ml  Gibco）、ストレプトマイシン（１００μg/ml  Gibco）、Ｌ−グルタミン（Gibco）、２−メルカプトエタノール（５０μM、Sigma）、１０%の熱不活化され、ろ過されたエンドトキシンフリーＦＣＳ（Gibco）、及び３０%のＪ５５８上清が添加されたＩｓｃｏｖｅｓ培地（Sigma Aldrich）中で、以前に記載された通りに（Lutz et al., 1999）増殖させた。ＤＣを１０〜１２日目に使用した。この時、培養物内でのＤＣの割合は８０%を上回った（ＣＤ１１ｃ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原の同時免疫蛍光検出により決定）。ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的な、Ｈ−２Ｋｂ拘束性ハイブリドーマＢ３Ｚ（２．１０４個細胞／ウェル、２００μl培養培地を含む）を、生きた又はオキサリプラチン処置されたＥＧ７細胞（オキサリプラチン処置から２４時間後に使用した。１×１０４個細胞／ウェル）とＷＴ又は機能喪失ＤＣ（１．１０４個細胞／ウェル）（Apetoh et al., 2007）の存在において培養した。上清を４８時間後に回収し、ＩＬ−２分泌をＥＬＩＳＡにより評価した。ポジティブコントロールとして、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（２μg/ml）を使用した。
【０１５８】
プライミングアッセイ
１．１０６個のＣＴ２６、ＥＧ７、又はＢ１６Ｆ１０細胞を、未処理のままで放置、又はドキソルビシン（２０μM）もしくはオキサリプラチン（５μg/ml）を用いて２４時間にわたり処理した。細胞を、次に、同系マウスの足蹠中に注射した。一部の実験において、２０もしくは１００μgのＩＬ−１Ｒａ（Anakinra）又は２５０ngの組換えマウスＩＬ−１β（又は２５０ngのＩＬ−６もしくは５０ngのＩＬ−１２）を、死にかけている腫瘍細胞と共にマウスの足蹠に注射した。代わりに、ＤＣを、ＥＧ７細胞と２時間にわたり同時培養し、その後磁気ビーズに結合された抗ＣＤ１１ｃ  ｍＡｂ（Miltenyi Biotec, Paris, France）を用いたＣＤ１１ｃ＋細胞の精製及び足蹠中へのこれらの精製ＤＣの注射を行った。５日後に、膝窩リンパ節からの神経節細胞を回収し、９６Ｕウェルプレート中に播種し（３．１０５個細胞／ウェル）、１mg/ml  ＯＶＡタンパク質を用いて再刺激した。ＭＣＡ２０５又はＣＴ２６細胞を用いた再刺激を、４２℃で５分間の加温により殺された３×１０４個の腫瘍細胞を使用して実施し、その後液体窒素中での１サイクルの凍結／解凍を行った。Ｂ１６Ｆ１０について、再刺激を、以前に記載された通りに（Overwijk et al., 1998）、ｇｐ１００ペプチドを使用して達成した。Ｔ細胞予備刺激のポジティブコントロールとして、マウスを、ＯＶＡタンパク質（１mg）（又はＢ１６Ｆ１０についてはｇｐ１００）及びＣｐＧ（１０μg）とポリＩ：Ｃ（５μg）の会合を用いて注射した。ＣＴ２６予備刺激実験のために、細胞ライセートとＬＰＳ（２５０ng）をポジティブコントロールとして使用した。上清を７２時間後に回収し、ＩＦＮγ分泌をＥＬＩＳＡにより評価した。代わりに、細胞を、ＰＭＡ（１０ng/ml）及びイオノマイシン（１μg/ml）を用いて１時間にわたり刺激し、ブレフェルジンＡ（１０μg/ml、３７℃で６時間にわたる）（Apetoh et al., 2007）の添加後、ＣＤ３、ＣＤ４、又はＣＤ８に特異的なＡｂを用いた表面染色、固定、及び透過処理（Cytofix/cytopermキット）を行い、次にＩＦＮγに特異的な抗体を用いて標識した。免疫蛍光を、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（BD Biosciences）でFACSDivaソフトウェアを用いて分析した。
【０１５９】
クロス−プライミングアッセイのために、３．１０５個のＸ線照射（１０Gy）されたＴＳ／Ａ  ＯＶＡ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの足蹠中に注射した。５日後に、膝窩リンパ節からの神経節細胞を回収し、９６Ｕウェルプレート中に播種し（３．１０５個細胞／ウェル）、１mg/mlのＯＶＡタンパク質又は２μg/mlのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを用いて再刺激した。上清を７２時間後に回収し、ＩＦＮγ分泌をＥＬＩＳＡにより評価した。マクロファージを用いた予備刺激アッセイのために、Ｃａｓｐ１−／−マウスからの５×１０６個の腹腔マクロファージを未処理又はオキサリプラチン（５μg/ml）を用いて２４時間にわたり処理した。細胞を次にマウスの足蹠中に注射した。５日後に、膝窩リンパ節からの神経節細胞を回収し、９６Ｕウェルプレート中に播種し（３．１０５個細胞／ウェル）、１mg/mlのＯＶＡタンパク質を用いて再刺激した。上清を７２時間後に回収し、ＩＦＮγ分泌をＥＬＩＳＡにより評価した。
【０１６０】
ＡＴＰアッセイ
１×１０５個のＥＧ７又はＣＴ２６細胞をオキサリプラチン（５μg/ml）又はドキソルビシン（２０μM）を用いてそれぞれ処理し、細胞内及び細胞外ＡＴＰを０、４、８、１２、１６、２０、及び２４時間目に測定した。簡単に述べると、上清を回収し、細胞外ＡＴＰを、ルシフェリンベースのENLITEN ATP Assay（Promega, Madison, USA）を使用して評価した。１００μlのルシフェリン−ルシフェラーゼ溶液を上清に加え、発光を記録した。ルシフェリン−ルシフェラーゼ溶液の添加によって、ほぼ瞬間的に蛍光の放出が起こった。発光を、製造者の標準サンプルを使用することにより較正した。細胞内ＡＴＰを、市販のATP Assayキット（Calbiochem, Darmstadt, Germany）を使用して測定した。細胞を、１%トリクロロ酢酸を含む溶解溶液を用いて１分間にわたり処理した。ルシフェリン−ルシフェラーゼ溶液を次に加え、ＡＴＰを測定した。ＡＴＰ枯渇のために、細胞を最初にオキサリプラチン又はドキソルビシンのいずれかを用いて２４時間にわたり処理し、次にアンチマイシンＡ（２μg/ml）及び２−デオキシグルコース（３０mM）を用いて２０分間にわたりインキュベートし、ＡＴＰを、続いて、以前に記載された通りに（Holmsen et al., 1974）測定した。プレートをFluostarルミノメーター（BMG Labtech）で計測した。
【０１６１】
マウスにおいて樹立された腫瘍の化学療法及び放射線療法
野生型又は機能喪失Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１０６個のＥＬ４細胞を用いて右側腹部中に皮下注射した。代わりに、野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスを、５．１０５個のＣＴ２６細胞を用いて右側腹部中に注射した。マウスを、次に、各々４〜６匹のマウスの処置群に無作為に割り当てた。腫瘍表面を、キャリパーを使用してモニターした。腫瘍サイズがＥＬ４について７０〜９０mm2（注射から９〜１２日後）又はＣＴ２６について６０〜８０mm2（注射から８〜１０日後）に達した際、マウスに化学療法を行った（Apetoh et al., 2007）。ＥＬ４腫瘍を持つマウスを、オキサリプラチン（５mg/kg  ｉ．ｐ）を用いて注射し、ＣＴ２６腫瘍を持つマウスを、ドキソルビシン（５０μl、４mM  ｉ．ｔ）を用いて注射した。一部の実験において、ＣＴ２６腫瘍を持つマウスに、ＩＬ−１Ｒａ（McIntyre et al., 1991）（１００μg）、抗ＩＬ−１抗体（１００μg）、又はハムスター血清（コントロールとして）の２回の注射（化学療法の処置の開始後０日目及び２日目）を行った。
【０１６２】
インビボでの予備刺激アッセイ
ＷＴ又はＣａｓｐ１−／−マウスにおいて、１０６個のＥＧ７細胞を用いて脚の大腿部に注射した。腫瘍サイズが７０〜９０mm2に達した際、マウスを、オキサリプラチン（５mg/kg体重ｉ．ｐ）を用いて処置した。５日後、鼠径リンパ節からの神経節細胞を回収し、１mg/mlのＯＶＡタンパク質を用いて再刺激した。上清を７２時間後に回収し、ＩＦＮγ分泌をＥＬＩＳＡにより評価した。
【０１６３】
抗癌ワクチン接種
抗癌ワクチン接種を、以前に記載された設定を使用して評価した（Casares et al., 2005; Obeid et al., 2007）。ＣＴ２６細胞を、ＰＢＳ又は２０μMドキソルビシンのいずれかを用いて、ＭＣＡ２０５を、ＰＢＳ又は１μMミトキサントロンのいずれかを用いて２４時間にわたり培養した。全てのこれらの処理は、〜５０%のアネキシンＶ＋ＤＡＰＩ＋細胞をもたらした（２４時間目にＦＡＣＳ分析により評価）。注意深い洗浄後、細胞を無菌ＰＢＳ中に再懸濁させた。ＣＴ２６細胞を、アンチマイシンＡ及びデオキシグルコース（それぞれ２μg/ml及び３０mM）の存在又は非存在において２０分間にわたり、あるいはＯｘｉ−ＡＴＰ（１００mM）の存在又は非存在においてインキュベートした。３回の洗浄後、３×１０６個の死にかけているＣＴ２６細胞（又は３×１０５個のＭＣＡ２０５細胞）を、マウスの左側腹部中に皮下注射した。一部の実験において、１００μgのＩＬ−１Ｒａ（Anakinra）を死にかけている細胞と共に注射した。７日後、マウスを、右の側腹部中に、５×１０５個の生きたＣＴ２６細胞（又は、代わりに、３．１０４個の生きたＭＣＡ２０５細胞）を用いて再曝露した。次に腫瘍成長を週１回モニターした。
【０１６４】
免疫蛍光
ＥＧ７細胞をＰＢＳ又はオキサリプラチンを用いて２４時間にわたり培養し、次に、ＰＢＳ、ＯｘｉＡＴＰ（Lowe et al., 1982; Murgia et al., 1993）（１００mM）、又はアンチマイシンＡ及びデオキシグルコース（それぞれ２μg/ml及び３０mM、２０分間）のいずれかを用いて処理した。腫瘍細胞を次に注意深く洗浄し、野生型又は機能喪失マウスから得られたＢＭＤＣを用いて２４時間にわたり同時培養した。同時培養上清をＥＬＩＳＡアッセイのために保持し、一方、ＤＣを回収し、洗浄し、ポリリジンスライド上に３０分間にわたり播種した。ＤＣを次に固定し、BD Cytofix/cytoperm（Beckton Dickinson）を用いて、製造者の指示に従い透過処理した。細胞を、次に、免疫蛍光顕微鏡検査法のために、ウサギポリクローナルカスパーゼ１ｐ２０抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, USA）、CD11c Alexa Fluor 488（Biolegend, San Diego, USA）、及びＤＡＰＩを用いて染色した。
【０１６５】
ＯＴ−１細胞のインビトロでの刺激
ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＯＴ−１脾臓から、CD8+T Cell Isolation Kit（Miltenyi Biotec, Paris, France）を用いて精製した。これらの応答細胞（２×１０４個）を、生きている又はオキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞（１×１０４個）を用いて負荷したＷＴ又はＣａｓｐ１欠損マウスからの骨髄由来ＤＣ（１×１０４個）と、コントロール又は抗ＩＬ−１β抗体（１０μg/ml）の存在において、丸底９６ウェルプレート中で同時培養した。代わりに、ＯＴ−１細胞及びＢＭ−ＤＣを、ＯＶＡタンパク質単独と又はＣｐＧ（１０μg/ml）及びポリＩ：Ｃ（５μg/ml）とインキュベートした。上清を４８時間後に回収し、ＩＦＮγについてＥＬＩＳＡにより分析した。
【０１６６】
ＣＤ８＋Ｔ細胞のインビトロでの刺激
二重陽性ＣＤ３＋及びＣＤ８＋細胞を、マウス脾臓から、MoFloサイトフルオロメーター（Dako Colorado Inc）で細胞選別により単離し、これらの細胞を、種々の量のサイトカインを添加し、抗ＣＤ３ε  ｍＡｂ（１μg/ml）及び抗ＣＤ２８  ｍＡｂ（０．５μg/ml）を用いて事前にコーティングされた平底９６ウェル培養プレート中でインキュベートした。上清を４８時間後に回収し、ＩＦＮγについてＥＬＩＳＡにより分析した。
【０１６７】
実験データの統計分析
実験データの分析のために、必要に応じて連続データの比較をマンホイットニーＵ検定により、カテゴリーデータの比較を、カイ二乗又はフィッシャー直接確率検定より達成した。ログランク検定を、カプラン・マイヤー生存曲線の分析のために使用した。統計的計算を、JMP 5.1ソフトウェア（SAS Institute, Cary, NC）を用いて実施した。全てのｐ値が両側であった。ｐ値＜０．０５が、全ての実験について統計的に有意であると考えられた。
【０１６８】
臨床試験計画
本発明者らは、Institut Gustave Roussy及びCentre Rene Huguenin（France）から得られたデータを使用して患者データベースを遡及的に構築した。全ての患者が、試験における登録のための書面のインフォームドコンセントを提供し、同意が、地元の治験審査委員会「CCPPRB du Val de Marne」から得られた。適格患者は、組織学的に確認された腋窩リンパ節陽性の散発性乳癌を有した。患者が選択され、一次外科手術により処置された（外科手術手順及び地元のガイドラインに従った＋／−放線治療）。全ての患者が、外科手術後にアジュバントアントラサイクリンベースの化学療法を受けた（ＦＥＣプロトコール）。アジュバント設定におけるタキサンの性能は、除外基準ではなかった。診断時に転移の証拠を示す患者又は原発性腫瘍の不完全な外科切除を有する患者を試験から除外した。アジュバント内分泌療法が、ホルモン受容体陽性腫瘍を有する全ての患者に推奨された。診断時の年齢、病理学的な腫瘍サイズ、リンパ節の関与、腫瘍の悪性度、ホルモン受容体、内分泌処置、事象の発生、及び経過観察を、医学的ファイルから抽出し、データベースに記録した（下の表１）。試験の主要評価項目は、無転移生存（診断から転移の発生までの時間と定義される）であった。転移事象が依然としてなかった患者についてのデータを、１０年目（フランスの推奨事項に従った最後の診察日）で打ち切った。なぜなら、１０年後での真性再発が異例であったからである（Brewster et al., 2008）。患者データベースの生成及びゲノムＤＮＡサンプルの回収後、遺伝子型決定及び統計分析を盲検様式で実施した。合計２３０人の患者が、参加基準を満たした。それらの内の５人をリンパ節転移陰性疾患のために除外した。カイ二乗検定を使用し、２つの遺伝子型群に対して臨床特徴の分布を比較した。生存率を、カプラン・マイヤー法を使用して推定した。単変量非階層化Ｃｏｘモデルを次に使用した。単変量非階層化Ｃｏｘ分析によりフィルターされた有意なデータを使用し、多変量Ｃｏｘモデルを生成した。全ての分析を、ＳＡＳソフトウェア、バージョン８．２（SAS Institute Inc., Cary, NC）を使用して行った。
【０１６９】
【表１】
2012509685.tif 000002
【０１７０】
また、本発明者らは、Institut Gustave Roussy（France）から得られたデータを使用して第２の患者データベースを遡及的に構築した。全ての患者が、ケースコントロール試験における登録のための書面のインフォームドコンセントを提供した。適格患者は、組織学的に確認された腋窩リンパ節陽性の散発性乳癌を有した。全ての患者が、外科手術（ネオアジュバント設定におけるＦＥＣプロトコール）前にアントラサイクリンベースの化学療法を受けた。この試験では、年齢、腫瘍の悪性度、及びホルモン受容体について一致させた。試験の主要評価項目は、病理学的な完全寛解（即ち、もはや腫瘍細胞なく、完全な回復）であった。患者データベースの生成及びゲノムＤＮＡサンプルの回収後、遺伝子型決定及び統計分析を盲検様式で実施した。合計４７人の患者が、参加基準を満たした。フィッシャー直接確率検定を使用し、２つの遺伝子型群に対して臨床特徴の分布を比較した。全ての分析を、ＳＡＳソフトウェア、バージョン８．２（SAS Institute Inc., Cary, NC）を使用して行った。
【０１７１】
Ｐ２Ｘ７単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の遺伝子型決定
ＤＮＡを、対象からの冷凍血液の白血球から単離した。ＰＣＲプライマー（Applied Biosystems）を使用し、Ｐ２Ｘ７  Ｇｌｕ４９６Ａｌａ  ＳＮＰ（ｒｓ３７５１１４３）を含むフラグメントを増幅した。ＰＣＲ増幅後、遺伝子型を、２つの蛍光プローブ（ＦＡＭ及びＶＩＣ）からのシグナルを比較し、各データポイントについて−ｌｏｇ（ＦＡＭ／ＶＩＣ）比を計算することにより各対象に割り当てた。
【０１７２】
結果
本発明者らは、オキサリプラチンが、複数の細胞株（ＥＬ４胸腺腫及びＥＧ７細胞（オボアルブミン（ＯＶＡ）トランスフェクトＥＬ４細胞である）を含む）からＡＴＰの放出を誘導することを観察した（図１ａ）。デオキシグルコースとアンチマイシンＡを用いた短時間の処理によるＡＴＰの枯渇（図１ｂ）、壊死を誘導しなかった処置（図２）によって、オキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞の免疫原性が無効になった。足蹠中への注射後、ＡＴＰを含む（ＡＴＰは枯渇していない）、オキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞が、膝窩リンパ節からのＴ細胞を予備刺激し、ＯＶＡを用いた再刺激に応答してＩＦＮγを分泌した（図１ｃ）。ＡＴＰ（「ｏｘｉＡＴＰ」）の２’，３’−ジアルデヒド誘導体を用いたプリン受容体の遮断によって、オキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞によるＴ細胞予備刺激が無効になり、しかし、ＯＶＡタンパク質とアジュバントにより引き起こされたＴ細胞予備刺激に影響を与えなかった（図１ｄ）。同様の結果がＣＴ２６結腸癌細胞について得られ、それらはドキソルビシンに応答してＡＴＰを放出し、ＡＴＰが枯渇した場合又はプリン受容体が遮断された場合、抗癌ワクチンとして作用するそれらの潜在力を喪失した（図３）。オキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞は、それらがプリン受容体Ｐ２Ｘ７（ＡＴＰに対して最も高い親和性を有する）を欠くマウス中に接種された場合、ＩＦＮγ産生のためにＴ細胞を予備刺激しなかった（図４）。ＷＴマウスからの（Ｐ２Ｘ７−／−からではない）骨髄由来ＤＣ（ＢＭ−ＤＣ）は、それらが死にかけているＥＧ７細胞を用いて事前にインキュベートされ、次にＰ２Ｘ７−／−マウス中に接種された場合に、ＩＦＮγ産生のためにＴ細胞を予備刺激し（図１ｅ）、それが、死にかけている腫瘍細胞からのＡＴＰを感知するＤＣ（他の細胞型とは対照的に）上のＰ２Ｘ７であることを示す。
【０１７３】
Ｐ２Ｘ７受容体を介して、ＡＴＰは、カスパーゼ１のＮＡＬＰ３依存的なタンパク質分解活性化を誘導することができる。死にかけているＥＧ７細胞とインキュベートされた単離ＷＴ  ＢＭ−ＤＣ（Ｐ２Ｘ７−／−、Ａｓｃ−／−、又はＮＡＬＰ３−／−ＤＣではない）は、カスパーゼ１を活性化した（図５ａ、ｂ）。ＤＣ内でのカスパーゼ１活性化は、ＩＬ−１βの分泌をもたらしたが（図５ｃ）、ＩＬ−１８は分泌されなかった（依然として検出不可能であった）。死にかけている腫瘍細胞を用いて刺激されたＤＣによるＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットの分泌及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＣＤ４０、ＣＤ８０、又はＣＤ８６の表面発現は、Ｐ２Ｘ７、Ｎａｌｐ３、又はＡｓｃに非依存的であり（図６、７）、インフラマソームの活性化の障害は、ＤＣに対する特異的な（広範囲ではなく）効果を有することを示す。したがって、死にかけているＥＧ７細胞を用いて負荷されたＮＡＬＰ３−／−又はＣａｓｐ１−／−ＤＣは、ＷＴ  ＤＣと同じくらい効果的にＯＶＡ由来ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドをＴ細胞ハイブリドーマ細胞に提示した（図８）。ＷＴ  ＤＣとは対照的に、死にかけている腫瘍細胞を用いてパルスされたＮＡＬＰ３−／−又はＣａｓｐ１−／−ＤＣは、インビボでのＩＦＮγ産生のためにＴ細胞を予備刺激できなかった（図９）。同系の死にかけている腫瘍細胞によるＩＦＮγ産生のためのＴ細胞予備刺激は、ＮＡＬＰ３−／−、Ｃａｓｐ１−／−、又はＩＬ−１Ｒ１−／−マウスにおいて抑制された（しかし、ＩＬ−１２Ｒβ２−／−及びＩＬ−１８Ｒ−／−マウスにおいては正常であった）（図５ｄ）。機能的Ｐ２Ｘ７／ＮＡＬＰ３／Ｃａｓｐ−１／ＩＬ−１Ｒ１軸の非存在によって、Ｔ細胞予備刺激はそれ自体無効にならなかったが、しかし、むしろ、異なるサイトカインパターンに向かった逸脱を起こし、今までに抗原特異的Ｔ細胞が正常にＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生したが（図１０）、ＩＦＮγは産生しなかった（図５ｄ）。
【０１７４】
同種（ＭＨＣ不適合）系におけるＭＨＣクラスＩ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞の交差予備刺激もカスパーゼ１に依存した。死にかけているＯＶＡ発現乳癌細胞（ＴＳ／Ａ、Ｈ−２ｄ）は、Ｃａｓｐ１−／−マウスに注射された場合、ＯＶＡ由来のＨ−２ｂ拘束性ＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープに特異的なＣＴＬを予備刺激できなかった（図５ｅ）。同様に、細胞関連ＯＶＡ（Ｋｂタンパク質の膜貫通ドメインに融合）を発現する死にかけているマウス胎仔繊維芽細胞（ＭＥＦ）は、ＷＴに注射された場合、ＩＦＮγ産生のためにＴ細胞を予備刺激したが、Ｃａｓｐ１−／−マウスではしなかった（図１１ａ、ｂ）。Ｃａｓｐ−１欠損によって、また、オキサリプラチン処理されたＯＶＡ負荷腹腔マクロファージ（図１１ｃ）及びオキサリプラチン処理されたＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞（図１２）によるＴ細胞予備刺激が損なわれた。ミトキサントロン処理されたＭＣＡ２０５繊維肉腫細胞は、免疫応答を誘発し、それはＷＴマウスにおいて生きた腫瘍細胞の成長を防止したが、しかし、Ｐ２Ｘ７−／−、ＮＡＬＰ３−／−、又はＣａｓｐ１−／−マウスにおいてはしなかった（図１３）。死にかけているＣＴ２６細胞は、自己ＣＴ２６ライセートに応答したＩＦＮγ産生のためにＴ細胞を予備刺激した（しかし、異なる腫瘍からのコントロールライセートではしなかった）。この腫瘍特異的な応答は、組換えＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）の注射により無効になった（図１４）。これらの結果によって、ＮＡＬＰ３インフラマソーム依存的なＩＬ１β産生が、ＩＦＮγ産生へのＣＴＬ極性化／予備刺激の重要な要素として特定される。
【０１７５】
ＷＴ  ＤＣは、Ｔ細胞においてＩＬ−１Ｒ媒介シグナルを伝達するために不可欠であるアダプター分子ＭｙＤ８８を欠損した宿主においてＴ細胞を活性化できず（図１５ａ）、ＩＬ−１βシグナル伝達が宿主細胞にとって重要であることを示す（ＯＶＡ提示ＤＣのレベルだけではなく）。Ｔ細胞予備刺激に対するＩＬ−１βの寄与を直接的に評価するために、本発明者らはインビトロでのアッセイを実施し、それにおいてＷＴ又はＣａｓｐ１−／−  ＢＭ−ＤＣを、死にかけている腫瘍細胞を用いてパルスし、次にＩＬ−１Ｒａ又はＩＬ−１β中和抗体の存在において天然Ｔ細胞と同時培養し、その後分泌されたＩＦＮγの検出を行った。Ｃａｓｐ１−／−マウスからのＨ−２ｂ発現ＤＣを、死にかけているＥＧ７細胞を用いてパルスした場合、それらは、Ｈ−２ｂクラスＩ分子により提示されるＯＶＡ由来ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを認識するトランスジェニックＴＣＲを発現するＯＴ−１マウスからの天然Ｔ細胞を予備刺激できなかった（図１５ｂ）。同様の条件において、ＷＴ  ＤＣはＯＶＡ特異的ＯＴ−１細胞を刺激し、ＩＦＮγを産生する（ＩＬ−１β特異的抗体を系に加えない場合）。外因性ＩＬ−１β又はｒＩＬ−１２は、インビトロでＣａｓｐ１−／−  ＤＣの予備刺激能力を回復した（図１５ｂ）。注目すべきは、ＷＴ及びＣａｓｐ１−／−  ＤＣは、同様の効力でＯＴ−１活性化を促進した（それらが、死にかけているＯＶＡ発現細胞の代わりに、可溶性ＯＶＡタンパク質とアジュバントを用いてパルスされた場合）（挿入図、図１５ｂ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＩＬ−１βの直接効果を実証するために、本発明者らは、ＩＬ−１βの非存在又は存在において、ＣＤ３＋とＣＤ２８を架橋することにより、ＣＤ３＋ＣＤ８＋脾臓Ｔ細胞を準最適に刺激した。天然ＣＴＬはＩＦＮγを産生できなかった（ＩＬ−１β（又はポジティブコントロールとしてのＩＬ−１２、しかしネガティブコントロールとしてのＴＮＦα又はＩＬ−６ではない）を加えなかった場合）。
【０１７６】
オキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞は、インビボでＴ細胞を予備刺激できなかった（それらを足蹠中にＩＬ−Ｒａと同時注射した場合）。これらの条件において、流入領域リンパ節からのＴ細胞は、ＯＶＡを用いた再刺激後に、インビトロでＩＦＮγを分泌できなかった（図１５ｄ）。より具体的には、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、細胞質ＩＦＮγについて陽性染色されなかった（図１６）。反対に、組換えＩＬ−１βタンパク質（又はＩＬ−１２、しかしＩＬ−６ではない）とオキサリプラチン処理されたＥＧ７細胞との局所注射は、ＮＡＬＰ３−／−又はＣａｓｐ１−／−マウスにおける欠損したＴ細胞予備刺激を回復させた（図１５ｅ）。このように、ＩＬ−１βは、癌細胞死のＮＡＬＰ３依存的な免疫原性を決定するサイトカインである。
【０１７７】
オキサリプラチンは、免疫正常ＷＴマウスにおけるＥＬ４腫瘍成長を制御する際に効果的である。オキサリプラチンは、Ｔ及びＢ細胞欠損ｒａｇ−２-/-マウス、Ｔ細胞欠損ｎｕ／ｎｕマウス、ＣＤ８＋Ｔ細胞が枯渇しているマウス（図１７ａ）、及びＩｆｎγＲ１-/-マウスにおいて樹立された腫瘍に対する治療効力を喪失していたが、しかし、ＷＴ及びＩＬ−１２Ｒβ２-/-マウスにおいては依然として効果的であった（図１７ｂ）。同様に、Ｐ２Ｘ７-/-、ＮＡＬＰ３−／−、又はＣａｓｐ１−／−マウスに移植されたＥＬ４腫瘍は、ＷＴコントロールにおいて成長している腫瘍ほどオキサリプラチンに効果的に応答しなかった（図１７ｃ）。ＩＬ−１Ｒａ又は抗ＩＬ−１βは、また、インビボでのオキサリプラチンに対するＥＬ４腫瘍の応答（示さず）及びアントラサイクリンに対するＣＴ２６腫瘍の応答を鈍くした（図１７ｄ）。全てのこれらのモデルにおいて、ならびに、アントラサイクリンを用いて処置された非転移性乳癌患者において、ＴＬＲ４の欠損又は機能喪失対立遺伝子によって化学療法の効力が損なわれることから、免疫系が化学療法の応答に寄与していることが裏付けられる。本発明者らは、従って、Ｐ２Ｘ７に影響を与える機能喪失対立遺伝子（Ｇｌｕ４９６Ａｌａ）（ＡＴＰについてのその親和性ひいてはＡＴＰ誘導性ＩＬ−１β放出を低下させる）が、アントラサイクリン処置された乳癌患者において治療の失敗を加速させうるか否かを追求した（上の表１）。Ｐ２Ｘ７機能喪失対立遺伝子は、診断後１０年以内に転移再発の確率を増大させ（Ｇｌｕ４９６Ａｌａ対立遺伝子を保有する患者の５２%対正常対立遺伝子を有する患者の３６%；カイ２乗分析によるｐ＝０．０２）、無転移生存に対する有意にネガティブな予後影響を示し（ログランク検定；ｐ＝０．０２）、ハザード比は１．６であった（９５%信頼区間１．１−２．４；単変量Ｃｏｘ比例ハザード分析においてｐ＝０．０２）（図１７ｅ）。第２の試験において、本発明者らは、外科手術（ネオアジュバント治療）前にアントラサイクリンベースの化学療法を有する乳癌患者の集団において、病理学的な完全寛解の割合が、Ｐ２Ｘ７機能喪失対立遺伝子を提示しない集団では、Ｐ２Ｘ７機能喪失対立遺伝子を有する集団よりも高いことを観察した（Ｇｌｕ４９６Ａｌａ対立遺伝子を保有する患者の２３%対正常対立遺伝子を有する患者の５６%；カイ２乗分析によるｐ＝０．０５）（図１８Ａ及びＢ）。したがって、Ｐ２Ｘ７機能喪失対立遺伝子は、病理学的な完全寛解に対して有意なネガティブな予後影響を有する。これらの結果は、Ｐ２Ｘ７／インフラマソーム経路が臨床的関連性を示すことを裏付ける。
【０１７８】
本結果によって、癌細胞死が免疫原性であるために要求される新たなシグナル、即ち、ＡＴＰの放出が特定される。細胞外ＡＴＰは、重度の組織損傷（心筋梗塞と肝毒性損傷を含む）において強力な炎症性効果を媒介することが以前に示されている。本データは以下のシナリオに適合する：ＡＴＰがＤＣ上のＰ２Ｘ７受容体を活性化し、それによりＮＡＬＰ３／ＡＳＣ／Ｃａｓｐ−１インフラマソームの連続凝集、カスパーゼ１のタンパク質分解的な成熟／活性化、及びＩＬ−１βの成熟／分泌が刺激される。ＩＬ−１βが、次に、ＩＦＮγを産生する腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球の予備刺激に関与する。この線形カスケードにおける個々の段階のいずれかを実行できなければ、死にかけている腫瘍細胞に対する免疫応答が損なわれ、ひいては抗癌化学療法の治療効力が低下しうる。
【０１７９】
抗癌処置に対する対象の感受性を、死にかけている腫瘍細胞の存在におけるその樹状細胞のＩＬ−１β分泌能力を測定することにより評価するためのプロトコールの例
ＭＤ−ＤＣを得て、濃度２．１０６/mlで、６ウェルプレートで、ＧＭ−ＣＳＦ（８００IU/ml）及びＩＦＮアルファ（１０００IU/ml）と一緒にＡＩＭＶ培地中で２日間にわたり培養した。ＨＣＴ１１６細胞を、オキサリプラチン（１０μg/ml）を用いて１６時間にわたり処理した。死にかけているＨＣＴ１１６を次に回収し、ＭＤＤＣと比率１：１で、９６ウェルプレート中で２０時間にわたり同時培養した。ポジティブコントロールとして、ＤＣを、ＬＰＳ（５ng/ml）と２０時間にわたり、及びＡＴＰ（２mM）と最後に１５分間インキュベートした。ネガティブコントロールとして、ＤＣを、単独で、又は生きた腫瘍細胞とインキュベートした。２０時間後、上清を回収し、ＩＬ−１βを、異なる条件においてＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価した。
【０１８０】
【表２】
2012509685.tif 000003
2012509685.tif 000004
2012509685.tif 000005
【図１ａ】
2012509685.tif 000006
【図１ｂ】
2012509685.tif 000007
【図１ｃ】
2012509685.tif 000008
【図１ｄ】
2012509685.tif 000009
【図１ｅ】
2012509685.tif 000010
【図２】
2012509685.tif 000011
【図３ａ】
2012509685.tif 000012
【図３ｂ】
2012509685.tif 000013
【図３ｃ】
2012509685.tif 000014
【図３ｄ】
2012509685.tif 000015
【図４】
2012509685.tif 000016
【図５ａ】
2012509685.tif 000017
【図５ｂ】
2012509685.tif 000018
【図５ｃ】
2012509685.tif 000019
【図５ｄ】
2012509685.tif 000020
【図５ｅ】
2012509685.tif 000021
【図６】
2012509685.tif 000022
【図７】
2012509685.tif 000023
【図８】
2012509685.tif 000024
【図９】
2012509685.tif 000025
【図１０ａ】
2012509685.tif 000026
【図１０ｂ】
2012509685.tif 000027
【図１１ａ】
2012509685.tif 000028
【図１１ｂ】
2012509685.tif 000029
【図１１ｃ】
2012509685.tif 000030
【図１２】
2012509685.tif 000031
【図１３】
2012509685.tif 000032
【図１４】
2012509685.tif 000033
【図１５ａ】
2012509685.tif 000034
【図１５ｂ】
2012509685.tif 000035
【図１５ｃ】
2012509685.tif 000036
【図１５ｄ】
2012509685.tif 000037
【図１５ｅ】
2012509685.tif 000038
【図１６ａ】
2012509685.tif 000039
【図１６ｂ】
2012509685.tif 000040
【図１７ａ】
2012509685.tif 000041
【図１７ｂ】
2012509685.tif 000042
【図１７ｃ】
2012509685.tif 000043
【図１７ｄ】
2012509685.tif 000044
【図１７ｅ】
2012509685.tif 000045
【図１８Ａ】
2012509685.tif 000046
【図１８Ｂ】
2012509685.tif 000047
【配列表】
2012509685000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年7月28日(2011.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の化学療法又は放射線療法の処置に対する対象の感受性を評価するインビトロでの方法であって、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態を決定することを含み、非機能的経路が前記処置に対する耐性を示す方法。
【請求項２】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態が以下：
（ａ）前記経路に関与する遺伝子における機能喪失突然変異、好ましくはｒｓ２８３６０４５７、ｒｓ１６５３６２４、ｒｓ３７５１１４３、ｒｓ２２３０９１１、及びｒｓ５０１１９２からなる群より選択されるＳＮＰ、より好ましくはＳＮＰ  ｒｓ３７５１１４３の検出であって、前記突然変異の存在が非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を示す状態；又は
（ｂ）前記経路に関与するタンパク質の突然変異ポリペプチド配列又は発現の検出であって、突然変異配列又は発現が非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を示す状態；又は
（ｃ）化学療法又は放射線療法の処置前後で対象の血液サンプル中でのＩＬ−１βレベルを比較することであって、前記処置後での前記レベルの有意な増加が機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を示す状態；又は
（ｄ）死にかけている腫瘍細胞の存在においてＩＬ−１βを分泌する対象の樹状細胞の能力を測定することであって、標準レベルと比較して低下した能力が、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路と相関する状態；又は
（ｅ）ＨＭＧＢ１及びＡＴＰの存在においてＩＬ−１βを分泌する対象の樹状細胞の能力を測定することであって、標準レベルと比較して低下した能力が、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路と相関する状態；又は
（ｆ）リポポリサッカリド及びＡＴＰの存在においてＩＬ−１βを分泌する対象の単球の能力を測定することであって、標準レベルと比較して低下した能力は、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路と相関する状態；又は
（ｇ）前記経路の構成成分の機能分析であって、前記経路の少なくとも１つの構成成分の機能喪失が、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を示し、好ましくはＰ２Ｘ７受容体、ＩＬ−１β、又はカスパーゼ１の機能分析による状態
により評価される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
癌の化学療法の処置が、アントラサイクリン、オキサリプラチン、及びシスプラチンからなる群より選択され、又は放射線療法の処置がＸ線又はガンマ線である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
癌が、乳房、結腸、卵巣、胃、肉腫、子宮粘膜、膀胱、子宮頸部、前立腺、直腸、肺、ＯＲＬ癌、小児腫瘍（神経芽細胞腫、多形性膠芽腫）、リンパ腫、白血病、ミエローマ、セミノーマ、ホジキン及び悪性血液病からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を有する対象において癌の化学療法又は放射線療法の処置に対する感受性を増加又は回復するために有用である化合物をスクリーニングするためのインビトロでの方法であって、前記対象において死にかけている腫瘍細胞の存在における樹状細胞によるＩＬ−１β分泌を誘導又は増加する試験化合物の能力を決定することを含む方法。
【請求項６】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を有する対象において癌を処置するために有用である化合物をスクリーニングするためのインビトロでの方法であって、前記対象において死にかけている腫瘍細胞の存在における樹状細胞によるＩＬ−１β分泌を誘導又は増加する試験化合物の能力を決定することを含む方法。
【請求項７】
非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有する対象において癌の化学療法又は放射線療法の処置に対する感受性を増加又は回復するために有用である化合物をスクリーニングするためのインビトロでの方法であって、（ｉ）癌の化学療法又は放射線療法の処置との組み合わせで、非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を有し、腫瘍を用いて接種された非ヒトトランスジェニック動物に試験化合物を投与すること、及び（ｉｉ）前記処置に対する前記動物の感受性を評価することを含む方法。
【請求項８】
対象における癌再発の可能性を決定するためのインビトロでの方法であって、前記対象においてＰ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態を決定することを含み、非機能的経路が再発の可能性の増加を示し、好ましくは、癌再発が転移再発である方法。
【請求項９】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態が、前記経路に関与する遺伝子における機能喪失突然変異、好ましくはｒｓ２８３６０４５７、ｒｓ１６５３６２４、ｒｓ３７５１１４３、ｒｓ２２３０９１１、及びｒｓ５０１１９２からなる群より選択されるＳＮＰ、より好ましくはＳＮＰ  ｒｓ３７５１１４３の検出により評価され、前記突然変異の存在が非機能的Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路を示す、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
それを必要とする対象のために適した化学療法又は放射線療法の処置を選択するためのインビトロでの方法であって、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路の機能的状態を決定することを含み、非機能的経路が、免疫原性腫瘍細胞死を誘導する抗癌処置についての禁忌と考えられている方法。
【請求項１１】
化学療法薬剤及びＰ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を補うことができる化合物を含む医薬的組成物。
【請求項１２】
化学療法薬剤が、アントラサイクリン、オキサリプラチン、及びシスプラチンからなる群より選択される、請求項１１記載の医薬的組成物。
【請求項１３】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を補うことができる化合物が、ＩＬ−１β；ＩＬ−１２；ナチュラルキラー細胞及びナチュラルキラーＴ細胞アクチベーター、例えばＣＤ１ｄアゴニスト、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、又はＩＦＮαなど；Ｐ２Ｘ７受容体アクチベーター、例えばカテリシジン由来ペプチドＬＬ３７、ポリミキシンＢ、ＳＴＡＴ３阻害剤、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、ＴＧＦｂ阻害ペプチド、ＩＬ−１０阻害ペプチド、抗ＩＬ−１０モノクローナル抗体、抗ＩＬ−１３モノクローナル抗体、抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体、及びＩＬ−３３などからなる群より選択され、好ましくは組換えＩＬ−１βである、請求項１１記載の医薬的組成物。
【請求項１４】
好ましくは、アントラサイクリン、オキサリプラチン、及びシスプラチンからなる群より選択される化学療法薬剤、及び、好ましくは、ＩＬ−１β；ＩＬ−１２；ナチュラルキラー細胞及びナチュラルキラーＴ細胞アクチベーター、例えばＣＤ１ｄアゴニスト、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、又はＩＦＮαなど；Ｐ２Ｘ７受容体アクチベーター、例えばカテリシジン由来ペプチドＬＬ３７、ポリミキシンＢ、ＳＴＡＴ３阻害剤、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、ＴＧＦｂ阻害ペプチド、ＩＬ−１０阻害ペプチド、抗ＩＬ−１０モノクローナル抗体、抗ＩＬ−１３モノクローナル抗体、抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体、及びＩＬ−３３などからなる群より選択される、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を補うことができる化合物、より好ましくは組換えＩＬ−１βを、癌の処置における同時、別々、又は連続使用のための組み合わせ調製物として含む産物。
【請求項１５】
Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を有する対象において癌を処置するための医薬の製造のための、化学療法薬剤又は放射線療法の処置との組み合わせでの、Ｐ２Ｘ７誘発性ＮＡＬＰ３インフラマソーム経路における機能喪失を補うことができる化合物の使用であって、好ましくは、該化合物が、ＩＬ−１β；ＩＬ−１２；ナチュラルキラー細胞及びナチュラルキラーＴ細胞アクチベーター、例えばＣＤ１ｄアゴニスト、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、又はＩＦＮαなど；Ｐ２Ｘ７受容体アクチベーター、例えばカテリシジン由来ペプチドＬＬ３７、ポリミキシンＢ、ＳＴＡＴ３阻害剤、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、ＴＧＦｂ阻害ペプチド、ＩＬ−１０阻害ペプチド、抗ＩＬ−１３モノクローナル抗体、及びＩＬ−３３などからなる群より選択され、より好ましくは、該化合物は組換えＩＬ−１βである使用。
【国際調査報告】
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