(57)【要約】本発明は、イノシン及び／若しくはゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を含むヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物を提供し、ここで、そのオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物は、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソンの少なくとも一部又はジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の非エキソン領域の少なくとも一部と相補的な配列を含み、前記一部は、少なくとも８ヌクレオチドを含む連続したストレッチである。本発明は、ＤＭＤ又はＢＭＤを予防又は治療するための前記オリゴヌクレオチドの使用をさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イノシン、及び／若しくはゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を含むヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物であって、前記オリゴヌクレオチド又はその機能的等価物が、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソンの少なくとも一部又はジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の非エキソン領域の少なくとも一部と相補的な配列を含み、前記一部が、少なくとも８ヌクレオチドを含む連続したストレッチである、オリゴヌクレオチド又はその機能的等価物。
【請求項２】
連続したストレッチが、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソンの１３〜５０ヌクレオチド、好ましくは１４〜２５ヌクレオチドのＲＮＡを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
エキソンが、エキソン５１、４５、５３、４４、４６、５２、５０、４３、６、７、８、５５、２、１１、１７、１９、２１、５７、５９、６２、６３、６５、６６、６９及び／又は７５を含む、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを含み、好ましくは、前記ＲＮＡが、修飾、好ましくは、２’−Ｏ−メチル修飾リボース（ＲＮＡ）若しくはデオキシリボース（ＤＮＡ）修飾を含むか、又は前記オリゴヌクレオチドの機能的等価物が、ペプチド核酸、ロックト核酸、モルホリノホスホロジアミデート又はそれらの任意の組み合わせ、最も好ましくは、モルホリノホスホロジアミデートを含む、請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが、少なくとも２つの部分を含み、第１の部分が、少なくとも２つのエキソンの第１のエキソンと相補的である少なくとも８個、好ましくは１６〜８０個の連続するヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを含み、第２の部分が、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体における第２のエキソンと相補的な少なくとも８個、好ましくは１６〜８０個の連続するヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
第１及び第２のエキソンが、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体において、オリゴヌクレオチドと相補的でない少なくとも１つのエキソンによって分断されている、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
第１及び第２のエキソンが、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体において連続している、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
好ましくは、個体におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーを予防又は治療するための薬物として使用するための、請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
薬物が、個体に機能的ジストロフィンタンパク質を提供し、且つ／又は異常なジストロフィンタンパク質の産生を少なくとも部分的に減少させ、且つ／又は機能的な若しくはより機能的なジストロフィンタンパク質の産生を増加させる、請求項１〜８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
薬物が、個体におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１又は２以上の症状を軽減する、請求項１〜９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかにおいて定義された少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、前記組成物が、好ましくは、薬学的組成物であり、前記薬学的組成物が、薬学的に許容可能な担体、アジュバント、希釈剤及び／又は賦形剤を含む、組成物。
【請求項１２】
使用されるオリゴヌクレオチドの各数又は総数が、０．５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の量で投薬される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
（ａ）炎症を減少させるための補助化合物、好ましくは筋組織の炎症を減少させるための補助化合物、及び／又は
（ｂ）筋繊維の機能、完全性及び／若しくは生存を改善するための補助化合物、及び／又は
（ｃ）リードスルー活性を示す化合物
が存在する、請求項１１若しくは１２に記載の組成物、又は請求項１〜１０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
個体におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーを予防又は治療するための薬物を製造するための、請求項１〜１０のいずれかにおいて定義されるオリゴヌクレオチド、又は請求項１１〜１３のいずれかにおいて定義される組成物の使用。
【請求項１５】
個体におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１又は２以上の症状を軽減するための方法であって、請求項１〜１０のいずれかにおいて定義されるオリゴヌクレオチド、又は請求項１１〜１３のいずれかにおいて定義される組成物を、前記個体に投与する工程を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学及び医学の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋障害は、通常、個体の生命に重大な影響を及ぼす疾患である。筋障害は、遺伝的原因又は非遺伝的原因を有し得る。遺伝的原因を有する筋肉疾患の重要な群は、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）及びデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。これらの障害は、筋肉タンパク質に対する遺伝子の欠陥によって引き起こされる。
【０００３】
ベッカー型筋ジストロフィー及びデュシェンヌ型筋ジストロフィーは、比較的高頻度の遺伝型筋ジストロフィーである。デュシェンヌ型とベッカー型の両方の筋ジストロフィーにおいて、筋肉タンパク質であるジストロフィンが、影響を受けている。デュシェンヌ型では、ジストロフィンは存在せず、一方ベッカー型では、ジストロフィンはいくらか存在するが、その産生は、ほとんどの場合十分でなく、且つ／又は存在するジストロフィンは、異常に形成されている。両方の疾患が、Ｘ連鎖劣性遺伝に関連する。ＤＭＤは、ＤＭＤ遺伝子におけるフレームシフト変異に起因する。ＤＭＤ遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）におけるフレームシフトは、切断型の非機能的なジストロフィンタンパク質を産生させ、進行性の筋消耗及び筋力低下をもたらす。変異が、ＤＭＤ転写産物（ｍＲＮＡ）においてフレームシフトを引き起こさないとき、ＢＭＤが生じる。ＢＭＤでは、ジストロフィンが存在しないＤＭＤとは対照的に、一部から大部分は機能的なジストロフィンがいくらか存在するので、ＢＭＤの症状は一般にＤＭＤよりも重症でない。ＤＭＤの発症は、ＢＭＤよりも早い。ＤＭＤは、通常、小児期早期に現れ、ＢＭＤは、１０歳代又は成人期早期に現れる。ＢＭＤの進行は、ＤＭＤよりも遅く、予測できない。ＢＭＤを有する患者は、成人期の中期から後期まで生存し得る。ＤＭＤを有する患者は、３０歳代を過ぎても生存することは稀である。
【０００４】
ジストロフィンは、細胞外マトリックスと細胞骨格とを接続する筋繊維において構造上の重要な役割を果たす。Ｎ末端領域は、アクチンに結合し、Ｃ末端は、筋細胞膜に広がるジストロフィン糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）の一部である。ジストロフィンの非存在下では、機械的ストレスによって筋細胞膜が断裂し、筋繊維内部へのカルシウム流入が制御できなくなり、それによって、カルシウムによるプロテアーゼの活性化及び線維の壊死が引き起こされる。
【０００５】
ほとんどの遺伝型筋ジストロフィーについては、現在、臨床的に適用できて有効な治療法は利用可能でない。今日では、遺伝型筋ジストロフィーに対抗するためにエキソンスキッピング法が探索されている。最近、ｍｄｘマウス、ＧＲＭＤイヌ（非特許文献１）及びＤＭＤ患者（非特許文献２）、（非特許文献３）、（非特許文献４）、（非特許文献５）、（非特許文献６）、（非特許文献７）、（非特許文献８）、（非特許文献９）、（非特許文献１０）、（非特許文献１１）、（非特許文献１２）由来の細胞におけるジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の読み枠の回復を目指した遺伝的治療において、有望な結果が本発明者ら及び他の研究者らによって報告されている。特定のエキソンを標的にしたスキッピングによって、ＤＭＤ表現型（ジストロフィン欠損）は、より軽症のＢＭＤ表現型（一部から大部分は機能的なジストロフィン）に変換される。エキソンのスキッピングは、好ましくは、スプライス部位の一方若しくは両方又はエキソン内部の配列を標的にするアンチセンスオリゴリボヌクレオチド（ＡＯＮ）の結合によって誘導される。エキソンは、両方のスプライス部位がスプライセオソーム複合体によって認識されるときだけｍＲＮＡの中に含められるので、スプライス部位は、ＡＯＮに対する明らかな標的であると考えられている。より好ましくは、そのエキソンの正しいスプライシングに関与する１又は２以上のエキソン配列の少なくとも一部に対して特異的である１又は２以上のＡＯＮが使用される。本発明者らは以前に、エキソン４５を欠失している異なる２人のＤＭＤ患者に由来する培養筋管において、エキソン４６の配列に特異的なエキソン内部のＡＯＮを用いたとき、スプライシングパターンを調節することができた（非特許文献１２）。ＡＯＮ処理の後、エキソン４６はスキップされ、それによりその細胞の少なくとも７５％において読み枠が回復し、ジストロフィン合成が誘導された。本発明者らは、最近、エキソン内部ＡＯＮを用いることにより、３９個の異なるＤＭＤエキソンに対するエキソンスキッピングも、ヒトのコントロール細胞及び患者筋細胞において効果的に誘導することができることを示した（非特許文献２）、（非特許文献３）、（非特許文献１２）、（非特許文献１３）、（非特許文献１４）、（非特許文献１５）、（非特許文献１６）。
【０００６】
ゆえに、ジストロフィン遺伝子に対して適用されるエキソンスキッピング法は、ＤＭＤ患者において、（たとえ短くても）少なくとも部分的に機能的なジストロフィンタンパク質の産生をもたらす。ＤＭＤは、機能不全のジストロフィンタンパク質によって引き起こされるので、いったんＤＭＤ患者に機能的ジストロフィンタンパク質が提供されると、ＤＭＤの症状が十分に軽減されると期待され得る。しかしながら、本発明は、エキソンスキッピング法がジストロフィン合成を誘導することができるけれども、イノシン及び／又はゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を含むヌクレオチドを前記オリゴヌクレオチドに組み込むことによって、エキソンスキッピング法に使用されるオリゴヌクレオチドをこれ以上改善することができるという見識を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】59.Yokota T. et al., March 13th, 2009, e-publication: Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in duchennes dystrophy dogs.  Ann. Neurol. 2009
【非特許文献２】1. Aartsma-Rus A, Janson AA, Kaman WE, et al. Therapeutic antisense-induced exon skipping in cultured muscle cells from six different DMD patients. Hum Mol Genet 2003;12(8):907-14.
【非特許文献３】2. Aartsma-Rus A, Janson AA, Kaman WE, et al. Antisense-induced multi-exon skipping for Duchenne muscular dystrophy makes more sense. Am J Hum Genet 2004;74(1):83-92.
【非特許文献４】3. Alter J, Lou F, Rabinowitz A, et al. Systemic delivery of morpholino oligonucleotide restores dystrophin expression bodywide and improves dystrophic pathology. Nat Med 2006;12(2):175-7.
【非特許文献５】4. Goyenvalle A, Vulin A, Fougerousse F, et al. Rescue of dystrophic muscle through U7 snRNA-mediated exon skipping. Science 2004;306(5702):1796-9.
【非特許文献６】5. Lu QL, Mann CJ, Lou F, et al. Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse. Nat Med 2003;6:6.
【非特許文献７】6. Lu QL, Rabinowitz A, Chen YC, et al. Systemic delivery of antisense oligoribonucleotide restores dystrophin expression in body-wide skeletal muscles. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102(1):198-203.
【非特許文献８】7. McClorey G, Fall AM, Moulton HM, et al. Induced dystrophin exon skipping in human muscle explants. Neuromuscul Disord 2006;16(9-10):583-90.
【非特許文献９】8. McClorey G, Moulton HM, Iversen PL, et al. Antisense oligonucleotide-induced exon skipping restores dystrophin expression in vitro in a canine model of DMD. Gene Ther 2006;13(19):1373-81.
【非特許文献１０】9. Pramono ZA, Takeshima Y, Alimsardjono H, Ishii A, Takeda S, Matsuo M. Induction of exon skipping of the dystrophin transcript in lymphoblastoid cells by transfecting an antisense oligodeoxynucleotide complementary to an exon recognition sequence. Biochem Biophys Res Commun 1996;226(2):445-9.
【非特許文献１１】10. Takeshima Y, Yagi M, Wada H, et al. Intravenous infusion of an antisense oligonucleotide results in exon skipping in muscle dystrophin mRNA of Duchenne muscular dystrophy. Pediatr Res 2006;59(5):690-4.
【非特許文献１２】11. van Deutekom JC, Bremmer-Bout M, Janson AA, et al. Antisense-induced exon skipping restores dystrophin expression in DMD patient derived muscle cells. Hum Mol Genet 2001;10(15):1547-54.
【非特許文献１３】12. Aartsma-Rus A, Bremmer-Bout M, Janson A, den Dunnen J, van Ommen G, van Deutekom J. Targeted exon skipping as a potential gene correction therapy for Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord 2002;12 Suppl:S71-S77.
【非特許文献１４】13. Aartsma-Rus A, De Winter CL, Janson AA, et al. Functional analysis of 114 exon-internal AONs for targeted DMD exon skipping: indication for steric hindrance of SR protein binding sites. Oligonucleotides 2005;15(4):284-97.
【非特許文献１５】14. Aartsma-Rus A, Janson AA, Heemskerk JA, CL de Winter, GJ Van Ommen, JC Van Deutekom. Therapeutic Modulation of DMD Splicing by Blocking Exonic Splicing Enhancer Sites with Antisense Oligonucleotides. Annals of the New York Academyof Sciences 2006;1082:74-6.
【非特許文献１６】15. Aartsma-Rus A, Kaman WE, Weij R, den Dunnen JT, van Ommen GJ, van Deutekom JC. Exploring the frontiers of therapeutic exon skipping for Duchenne muscular dystrophy by double targeting within one or multiple exons. Mol Ther 2006;14(3):401-7.
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ヒトコントロール筋管において、ＰＳ２２０及びＰＳ３０５（両方ともがエキソン４５内の同一の配列を標的にする）を、相対的なスキッピング効率について比較した。ＰＳ２２０は、最高レベルのエキソン４５スキッピングを再現性よく誘導した（最大７３％）一方、ＰＳ３０５を用いた場合、最大４６％という最大のエキソン４５スキッピングレベルが得られた。非処理細胞ではエキソン４５のスキッピングは観察されなかった（Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー；ＮＴ：非処理細胞）
【図２】ＲＴ−ＰＣＲ解析によって評価された、イノシン含有ＡＯＮの相対的なエキソン４５スキッピングレベルを示しているグラフ。ヒトコントロール筋管では、一連の新しいＡＯＮ（すべてがエキソン４５を標的にしており、１つのグアノシンに対するイノシンの置換を含む）を、ＰＳ２２０及びＰＳ３０５（図１を参照のこと）と比較して、相対的なエキソン４５スキッピング効率について試験した。すべての新しいイノシン含有ＡＯＮが、様々なレベルではあるが（４％〜２５％）効果的であった。ＰＳ２２０は、最高レベルのエキソン４５スキッピング（最大７２％）を誘導した一方、ＰＳ３０５を用いた場合、最大６３％という最大のエキソン４５スキッピングレベルが得られた。非処理細胞ではエキソン４５のスキッピングは観察されなかった（Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー；ＮＴ：非処理細胞）
【発明を実施するための形態】
【０００９】
オリゴヌクレオチド
第１の態様において、イノシン、及び／若しくはゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を含むヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物が提供され、ここで、前記オリゴヌクレオチド又はその機能的等価物は、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソンの少なくとも一部又はジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の非エキソン領域の少なくとも一部と相補的な配列を含み、前記一部は、少なくとも８ヌクレオチドを含む連続したストレッチである。
【００１０】
本発明のオリゴヌクレオチドにおける、イノシン及び／又はゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を含むヌクレオチドの使用は、以下に説明されるように非常に魅力的である。例えば、イノシンは、３種の塩基：ウラシル、アデニン及びシトシンと対形成することができる公知の修飾塩基である。イノシンは、ヒポキサンチンがβ−Ｎ９−グリコシド結合を介してリボース環（リボフラノースとしても知られる）に結合したときに形成されるヌクレオシドである。イノシンは、通常ｔＲＮＡに見られ、ゆらぎ塩基対における遺伝暗号の適切な翻訳にとって不可欠である。ゆらぎ塩基対は、ＲＮＡ二次構造の基本となるＧ−Ｕ及びＩ−Ｕ／Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｃ対である。その熱力学的安定性は、ワトソン−クリック塩基対のそれに匹敵する。ゆらぎ塩基対は、遺伝暗号の適切な翻訳にとって欠かせない。アンチコドンの第１塩基に修飾塩基対を使用することによって、遺伝暗号は、トリプレットコドン（６４）に対するアミノ酸の数（２０）の不一致を埋め合わせる。同様に、ポリメラーゼ連鎖反応のためにプライマーを設計する際、イノシンは、アデニン、チミン又はシトシンと無差別に対形成するという点において有用である。そのような塩基を使用する第１の利点は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）にまたがるプライマーを、その多型がプライマーのアニーリング効率を乱し得るという心配無しに設計することを可能にすることである。ゆえに、本発明では、そのような塩基の使用によって、本発明のオリゴヌクレオチドによって標的にされるジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の範囲内にＳＮＰを有する個体に対しても使用され得るオリゴヌクレオチドを設計することが可能である。
【００１１】
本発明のオリゴヌクレオチドにおいてイノシン及び／又はゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を使用する第２の利点は、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソンの少なくとも一部又はジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の非エキソン領域の少なくとも一部（前記一部は、少なくとも８ヌクレオチドを含む連続したストレッチである）と相補的であるようなオリゴヌクレオチドを設計する場合に、前記オリゴヌクレオチドが正常にＣｐＧを含み得るときに発揮される。オリゴヌクレオチド内のＣｐＧの存在は、通常、前記オリゴヌクレオチドの免疫原性の増強に関連する（Dorn and Kippenberger, Curr Opin Mol Ther 2008 10(1) 10-20）。この免疫原性の増強は、筋繊維の破壊を誘導し得るので、望まれない。前記オリゴヌクレオチドにおける１つ、２つ又はそれ以上のＣｐＧを対応するイノシン及び／又はゆらぎ塩基対を形成することができる塩基によって置き換えることによって、オリゴヌクレオチドに低レベル及び／又は許容可能なレベルの免疫原性が提供されると予想される。免疫原性は、動物モデルにおいて、前記動物の筋生検材料におけるＣＤ４＋及び／若しくはＣＤ８＋細胞の存在並びに／又は炎症性の単核球（mononucleocyte）浸潤を評価することによって評価され得る。免疫原性は、本発明のオリゴヌクレオチドで処置された動物又はヒトの血液においても、当業者に公知の標準的なイムノアッセイを用いて中和抗体の存在及び／又は前記オリゴヌクレオチドを認識する抗体の存在を検出することによって評価され得る。
【００１２】
免疫原性の増強は、好ましくは、処置前の動物又は少なくとも１つのイノシン及び／若しくはゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を有する対応するオリゴヌクレオチドで処置された動物の対応する筋生検材料中の各細胞型の量との比較によるこれらの細胞型の少なくとも１つの検出可能な増強に対応する。或いは、免疫原性の増強は、標準的なイムノアッセイを用いて、中和抗体又は前記オリゴヌクレオチドを認識する抗体が存在すること、又はそれらの量が増加していることを検出することによって評価され得る。
【００１３】
免疫原性の低下は、好ましくは、処置前の動物又はイノシン及び／若しくはゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を有しない対応するオリゴヌクレオチドで処置された動物の対応する筋生検材料中の対応する細胞型の量との比較によるこれらの細胞型の少なくとも１つの検出可能な減少に対応する。或いは、免疫原性の低下は、標準的なイムノアッセイを用いて、前記化合物及び／若しくは中和抗体が存在しないこと、又はそれらの量が減少していることによって評価され得る。
【００１４】
本発明のオリゴヌクレオチドにおいてイノシン及び／又はゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を使用する第３の利点は、オリゴヌクレオチドの潜在的な多量体化又は凝集が回避されること又は減少することである。例えば、Ｇ−カルテットモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、４つの一本鎖オリゴヌクレオチドのフーグスティーン塩基対形成によって形成される四重鎖、多量体又は凝集物を形成する傾向を有することが知られており（Cheng and Van Dyke, Gene. 1997 Sep 15;197(1-2):253-60）、これは当然、望ましくない：結果として、オリゴヌクレオチドの効率は、低下すると予想される。多量体化又は凝集は、好ましくは、当業者に公知の標準的なポリアクリルアミド（polyacrylamid）非変性ゲル電気泳動法によって評価される。好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドの総数の２０％未満又は１５％、１０％、７％、５％若しくはそれ未満が、上で述べたアッセイを用いて評価される、多量体を形成する能力又は凝集する能力を有する。
【００１５】
よって、本発明のオリゴヌクレオチドにおいてイノシン及び／又はゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を使用する第４の利点は、抗血栓活性（Macaya et al., Biochemistry. 1995 4;34(13):4478-92）並びにマクロファージスカベンジャー受容体への結合及びマクロファージスカベンジャー受容体の阻害（Suzuki et al., Eur J Biochem. 1999 , 260(3):855-6）に関連する四重構造を回避することでもある。
【００１６】
本発明のオリゴヌクレオチドにおいてイノシン及び／又はゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を使用する第５の利点は、ＲＮＡ結合動態及び／又は熱力学的特性が改善されたオリゴヌクレオチドの設計を可能にすることである。ＲＮＡ結合動態及び／又は熱力学的特性は、オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ；基本的なＴｍ及び最近接モデル（nearest neighbour model）を用いて一本鎖ＲＮＡに対してオリゴヌクレオチド特性計算機（http://www.unc.edu/~cail/biotool/oligo/index.html）を用いて計算される温度）及び／又はＡＯＮ−標的エキソン複合体の自由エネルギー（ＲＮＡ構造バージョン４．５を用いて）によって少なくとも部分的に測定される。Ｔｍが高すぎる場合、そのオリゴヌクレオチドは、それほど特異的でないと予想される。許容可能なＴｍ及び自由エネルギーは、オリゴヌクレオチドの配列に左右される。ゆえに、これらのパラメータの各々に対して好ましい範囲を与えることは困難である。許容可能なＴｍは、３５〜６５℃の範囲であり得、許容可能な自由エネルギーは、１５〜４５ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲であり得る。
【００１７】
ゆえに、当業者は第１に、潜在的な治療化合物としてオリゴヌクレオチドを選択し得る。第２の工程では、当業者は本発明を使用して、その免疫原性を低下させること、並びに／又は凝集及び／若しくは四重鎖の形成を回避すること、並びに／又はＡＯＮ−標的複合体のＴｍ及び／若しくは自由エネルギーを最適化することによって、前記オリゴヌクレオチドをさらに最適化し得る。当業者は、少なくとも１つのイノシン及び／又はゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を前記オリゴヌクレオチド内の適当な位置に導入することを試み、そして前記イノシン及び／又はゆらぎ塩基対を形成することができる塩基が存在することによりＡＯＮ−標的複合体の免疫原性並びに／又は凝集及び／若しくは四重鎖の形成並びに／又はＴｍ及び／若しくは自由エネルギーがどれくらい変化したかを評価し得る。その変化が、免疫原性並びに／又は凝集及び／若しくは四重鎖の形成並びに／又はＡＯＮ−標的複合体のＴｍ及び／若しくは自由エネルギーの、所望の変化又は減少を提供しない場合、当業者は、前記オリゴヌクレオチド内にイノシン及び／又はゆらぎ塩基対を形成することができる塩基をさらに導入すること、並びに／又は所与のイノシン及び／若しくはゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を前記オリゴヌクレオチド内の異なる適当な位置に導入することを選択し得る。
【００１８】
イノシン及び／又はゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を含むオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチドがイノシン及び／又はゆらぎ塩基対を形成することができる塩基で置換されたオリゴヌクレオチドと定義され得る。当業者は、ヌクレオチドがゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を含んでいるか否かを試験する方法を承知している。例えば、イノシンは、ウラシル、アデニン及び／又はシトシンと塩基対を形成することができるので、上記のことは、ウラシル、アデニン及び／又はシトシンと塩基対を形成することができる少なくとも１つのヌクレオチドがイノシンで置換されていることを意味する。しかしながら、特異性を保護するために、イノシン含有オリゴヌクレオチドの許容可能なレベルの機能活性が、本明細書中の以下で定義されるように保持される限り、前記オリゴヌクレオチドは、好ましくは、ウラシル又はアデニン又はシトシンと塩基対を形成することができる少なくとも１、２、３、４つのヌクレオチドの置換を含む。
【００１９】
イノシン及び／又はゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を含むオリゴヌクレオチドは、好ましくは、イノシン及び／又はゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を含まない対応するオリゴヌクレオチドの許容可能なレベルの機能活性をなおも示すことができるオリゴヌクレオチド（olignucleotide）である。前記オリゴヌクレオチドの機能活性は、好ましくは、機能的なジストロフィンタンパク質及び／若しくはｍＲＮＡを個体に提供し、並びに／又は異常なジストロフィンタンパク質及び／若しくはｍＲＮＡの産生の少なくとも部分的な減少を個体に提供するものである。これらの特徴の各々は、本明細書の後で定義される。そのような許容可能なレベルの機能活性は、好ましくは、イノシン及び／又はゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を含まない対応するオリゴヌクレオチドの機能活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％である。そのような機能活性は、イノシン及び／又はゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を含まない対応するオリゴヌクレオチドの機能活性との比較によって、個体の筋組織若しくは筋細胞において又はインビトロの細胞において測定されるものであり得る。機能性の評価は、ｍＲＮＡレベルで、好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、行われ得る。機能性の評価は、タンパク質レベルで、好ましくは、ウエスタンブロット解析又は切片の免疫蛍光解析を用いて、行われ得る。
【００２０】
本発明の文脈内において、オリゴヌクレオチド内に存在するようなイノシン及び／又はゆらぎ塩基対を形成することができる塩基は、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソンの少なくとも一部又はジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の非エキソン領域の少なくとも一部と相補的な前記オリゴヌクレオチドの一部として存在し、前記一部は、少なくとも８ヌクレオチドを含む連続したストレッチである。ゆえに、好ましい実施形態において、イノシン及び／若しくはゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を含むヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物、ここで、前記オリゴヌクレオチド又はその機能的等価物は、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソンの少なくとも一部又はジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の非エキソン領域の少なくとも一部と相補的な配列を含み、前記一部は、少なくとも８ヌクレオチドを含む連続したストレッチであり、前記イノシン及び／又はできる塩基を含むヌクレオチドは、前の文で定義されたようなジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の少なくとも一部と相補的なオリゴヌクレオチド配列内に存在する。
【００２１】
しかしながら、本明細書の後で定義されるように、そのようなイノシン及び／又はゆらぎ塩基対を形成することができる塩基は、本発明のオリゴヌクレオチドに存在する連結部分にも存在してもよい。好ましい連結部分は、本明細書の後で定義される。
【００２２】
好ましい実施形態において、そのようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは、薬物である。より好ましくは、前記薬物は、個体又は患者におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーを予防するため又は治療するためのものである。本明細書中で定義されるように、ＤＭＤｍＲＮＡ前駆体は、好ましくは、ＤＭＤ患者又はＢＭＤ患者のＤＭＤ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体を意味する。患者は、好ましくは、ＤＭＤ若しくはＢＭＤを有する患者、又は遺伝的背景に起因してＤＭＤ若しくはＢＭＤを発症する可能性のある患者を意味すると意図される。
【００２３】
ＤＭＤ患者の場合、使用されるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、前記患者のＤＭＤ遺伝子に存在するＤＭＤ変異の少なくとも１つを補正し得、ゆえに、好ましくは、ＢＭＤジストロフィンのように見えるジストロフィンを生成し得る：前記ジストロフィン（dystropin）は、好ましくは、本明細書の後で定義されるような機能的ジストロフィンであり得る。
【００２４】
ＢＭＤ患者の場合、使用されるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、前記患者のＤＭＤ遺伝子に存在するＢＭＤ変異の少なくとも１つを補正し得、ゆえに、好ましくは、前記ＢＭＤ患者に元々存在したジストロフィンよりも機能的であり得る１又は２以上のジストロフィンを生成し得る。なおもより好ましくは、前記薬物は、機能的又はより機能的なジストロフィンタンパク質及び／若しくはｍＲＮＡを個体に提供し、且つ／又は異常なジストロフィンタンパク質及び／若しくはｍＲＮＡの産生を少なくとも部分的に減少させる。
【００２５】
好ましくは、１又は２以上の細胞、好ましくは、患者の筋細胞において本明細書中で特定されるようなＤＭＤｍＲＮＡ前駆体の少なくとも１つのエキソンのスキッピングを誘導すること及び／又は促進することによる本発明の方法は、前記患者においてより機能的なジストロフィンタンパク質及び／若しくはｍＲＮＡの産生を増加させ、且つ／又は前記患者において異常な若しくはより機能的でないジストロフィンタンパク質及び／又はｍＲＮＡの産生を減少させる。
【００２６】
より機能的なジストロフィンタンパク質及び／若しくはｍＲＮＡを患者に提供すること、並びに／又は前記患者における異常なジストロフィンタンパク質及び／若しくはｍＲＮＡの産生を減少させることは、典型的には、ＤＭＤ患者に適用される。より機能的な又は機能的なジストロフィン及び／又はｍＲＮＡの産生を増加させることは、典型的には、ＢＭＤ患者に適用される。
【００２７】
ゆえに、好ましい方法は、患者、又は前記患者の１又は２以上の細胞に、より機能的な若しくは機能的なジストロフィンタンパク質及び／若しくはｍＲＮＡの産生の増加を提供する方法、並びに／又は前記患者における異常なジストロフィンタンパク質及び／若しくはｍＲＮＡの産生を減少させる方法であり、ここで、前記異常な又はより機能的なジストロフィンタンパク質及び／又はｍＲＮＡのレベルは、この方法の開始時の前記患者における前記ジストロフィン及び／又はｍＲＮＡのレベルと比較することによって評価される。
【００２８】
本明細書中で定義されるように、機能的なジストロフィンは、好ましくは、配列番号１に特定されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質に対応する野生型ジストロフィンである。機能的なジストロフィンは、好ましくは、Ｎ末端部分におけるアクチン結合ドメイン（Ｎ末端における最初の２４０アミノ酸）、システイン（cystein）リッチドメイン（アミノ酸３３６１〜３６８５）及びＣ末端のドメイン（Ｃ末端における最後の３２５アミノ酸）を有するジストロフィンであり、これらのドメインの各々は、当業者に公知であるような野生型ジストロフィンに存在するものである。本明細書中で示されるアミノ酸は、配列番号１に表されている野生型ジストロフィンのアミノ酸に対応する。別の実施形態では、機能的なジストロフィンは、野生型ジストロフィンの活性を少なくともある程度示すジストロフィンである。「少なくともある程度」とは、好ましくは、野生型の機能的なジストロフィンの対応する活性の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％を意味する。この文脈において、野生型ジストロフィンの活性は、好ましくは、アクチン及びジストロフィン関連糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）への結合である（Aartsma-Rus A et al, (2006), Entries in the leiden Duchenne Muscular Dystrophy mutation database: an overview of mutation types and paradoxical cases that confirm the reading-frame rule, Muscle Nerve, 34: 135-144）。アクチン及びＤＧＣ複合体へのジストロフィンの結合は、当業者に公知であるように、ジストロフィーであると疑われる筋肉の生検材料由来の総タンパク質抽出物を用いた免疫共沈降又はその生検材料由来の切片の免疫蛍光解析によって可視化され得る。
【００２９】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している個体は、典型的には、ジストロフィンをコードする遺伝子に、完全なタンパク質の合成を妨げる変異、すなわち、中途終止によってそのタンパク質のＣ末端の合成を妨げる変異を有する。ベッカー型筋ジストロフィーでは、ジストロフィン遺伝子は、野生型と比べて変異を含むが、その変異は、典型的には中途終止を含まず、そのタンパク質のＣ末端は、典型的には合成される。結果として、必ずしも同じ量の活性ではないが野生型タンパク質と本質的に少なくとも同じ活性を有する機能的なジストロフィンタンパク質が合成される。好ましい実施形態において、機能的なジストロフィンタンパク質は、インフレームのジストロフィン遺伝子を意味する。ＢＭＤ個体のゲノムは、典型的には、Ｎ末端部分（Ｎ末端における最初の２４０アミノ酸）、システインリッチドメイン（アミノ酸３３６１〜３６８５）及びＣ末端ドメイン（Ｃ末端における最後の３２５アミノ酸）を含むジストロフィンタンパク質をコードするが、その中央の桿状のドメインは、野生型ジストロフィンのそれよりも短いことがある（Aartsma-Rus A et al, (2006), Entries in the leiden Duchenne Muscular Dystrophy mutation database: an overview of mutation types and paradoxical cases that confirm the reading-frame rule, Muscle Nerve, 34: 135-144）。ＤＭＤを処置するためのエキソンスキッピングは、好ましくは、読み枠を補正し、そしてＣ末端を含むジストロフィンタンパク質の残りの部分の合成を可能にする（が、そのタンパク質は、より小さい桿状ドメインの結果としていくらか小さい）ために、桿状ドメインの形状のドメインにおけるエキソンをスキップすることによってｍＲＮＡ前駆体における中途終止を克服することに向けられているが、それに限らない。好ましい実施形態において、ＤＭＤを有する個体及び本明細書中に定義されるようなオリゴヌクレオチドを用いて処置されている個体には、野生型ジストロフィンの活性を少なくともある程度示すジストロフィンが提供される。より好ましくは、前記個体が、デュシェンヌ型患者である場合又はデュシェンヌ型患者であると疑われる場合、機能的なジストロフィンは、ＢＭＤを有する個体のジストロフィンである：好ましくは、前記ジストロフィンは、アクチンとＤＧＣの両方と相互作用することができるが、その中央の桿状のドメインは、野生型ジストロフィンのそれよりも短いことがある（Aartsma-Rus A et al, (2006), Entries in the leiden Duchenne Muscular Dystrophy mutation database: an overview of mutation types and paradoxical cases that confirm the reading-frame rule, Muscle Nerve, 34: 135-144）。野生型ジストロフィンの中央の桿状ドメインは、２４個のスペクトリン様リピートを含む（Aartsma-Rus A et al, (2006), Entries in the leiden Duchenne Muscular Dystrophy mutation database: an overview of mutation types and paradoxical cases that confirm the reading-frame rule, Muscle Nerve, 34: 135-144）。例えば、本明細書中に提供されるようなジストロフィンの中央の桿状のドメインは、それがアクチン及びＤＧＣに結合することができる限り、５〜２３、１０〜２２又は１２〜１８個のスペクトリン様リピートを含んでよい。
【００３０】
前記患者又は前記患者の細胞における異常なジストロフィンの産生の減少は、ｍＲＮＡレベルで評価され得、好ましくは、異常なジストロフィンｍＲＮＡの最初の量の９９％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％又はそれ以下が、ＲＴ  ＰＣＲによってなおも検出可能であることを意味する。異常なジストロフィンｍＲＮＡ又はタンパク質は、非機能的、又は低機能的から非機能的、又は半機能的なジストロフィンｍＲＮＡ又はタンパク質とも呼ばれる。非機能的なｍＲＮＡ前駆体ジストロフィンは、好ましくは、ジストロフィンタンパク質が産生されないこと及び／又は検出されないことを意味するフレーム外の（out of frame）ジストロフィンタンパク質をもたらす。非機能的なジストロフィンタンパク質は、好ましくは、アクチン及び／又はＤＧＣタンパク質複合体のメンバーに結合することができないジストロフィンタンパク質である。非機能的なジストロフィンタンパク質又はジストロフィンｍＲＮＡは、典型的には、そのタンパク質のインタクトなＣ末端を有するジストロフィンタンパク質を有しないか、又はコードしない。
【００３１】
前記患者又は前記患者の細胞における機能的なジストロフィンの産生の増加は、ｍＲＮＡレベルで（ＲＴ−ＰＣＲ解析によって）評価され得、好ましくは、検出可能な量の機能的な又はインフレームのジストロフィンｍＲＮＡがＲＴ  ＰＣＲによって検出可能であることを意味する。別の実施形態では、検出可能なジストロフィンｍＲＮＡの１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上が、機能的な又はインフレームのジストロフィンｍＲＮＡである。
【００３２】
前記患者又は前記患者の細胞における機能的なジストロフィンの産生の増加は、タンパク質レベルで（免疫蛍光解析及びウエスタンブロット解析によって）評価され得、好ましくは、検出可能な量の機能的なジストロフィンタンパク質が免疫蛍光解析又はウエスタンブロット解析によって検出可能であることを意味する。別の実施形態では、検出可能なジストロフィンタンパク質の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上が、機能的なジストロフィンタンパク質である。
【００３３】
増加又は減少は、好ましくは、本発明の前記分子又は組成物で処置される前の個体又は患者に存在する量との比較によって、前記個体又は患者の筋組織又は筋細胞においてにおいて評価される。或いは、その比較は、処置が局所的である場合、前記オリゴヌクレオチド又は組成物でまだ処置されていない前記個体又は患者の筋組織又は筋細胞を用いて行うことができる。
【００３４】
好ましい方法において、本発明の分子又は組成物を用いて、ＤＭＤ患者若しくはＢＭＤ患者の１又は２以上の症状が軽減され、そして／又はＤＭＤ患者若しくはＢＭＤ患者由来の筋細胞若しくは筋組織の１又は２以上の特性が軽減される。そのような症状は、患者自身において評価されてもよい。そのような特性は、所与の患者の細胞、組織レベルで評価されてもよい。１又は２以上の特性の軽減は、患者由来の筋原細胞又は筋細胞における以下の分析結果のいずれかによって評価され得る：筋細胞によるカルシウム取り込みの減少、コラーゲン合成の減少、形態の変化、脂質生合成の変化、酸化ストレスの減少、並びに／又は筋繊維の機能、完全性及び／若しくは生存の改善。これらのパラメータは、通常、筋生検材料の切片の免疫蛍光解析及び／又は組織化学的解析を用いて評価される。
【００３５】
本発明の分子又は組成物を用いた個体におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１又は２以上の症状の軽減は、以下の分析結果のいずれかによって評価され得る：歩行できなくなるまでの時間の延長、筋力の改善、重いものを持ち上げる能力の改善、床から起き上がるのに要する時間の改善、９メートルを歩行する時間の改善、４段を上るのに要する時間の改善、脚の機能のグレードの改善、肺機能の改善、心機能の改善、生活の質の改善。これらの分析結果の各々は、当業者に公知である。例として、Manzur AY et al, (2008), Glucocorticoid corticosteroids for Duchenne muscular dystrophy (review), Wiley publishers,  The Cochrane collaboration.の刊行物によって、これらの分析の各々が広範に説明されている。これらの分析の各々について、分析において測定されたパラメータの検出可能な改善又は延長が見出され次第、好ましくは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１又は２以上の症状が、本発明の分子又は組成物を用いて個体において軽減していることを意味する。検出可能な改善又は延長は、好ましくは、Hodgetts S., et al, (2006), Neuromuscular Disorders, 16: 591-602.に記載されているような統計学的に有意な改善又は延長である。或いは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１又は２以上の症状の軽減は、本明細書の後で定義されるような筋繊維の機能、完全性及び／又は生存の改善を測定することによって評価され得る。
【００３６】
本明細書中で使用されるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴリボヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、エキソンスキッピング法が適用される。エキソンスキッピングは、真核細胞内で生じている天然のスプライシングプロセスを干渉する。高等真核生物では、細胞のＤＮＡにおけるタンパク質についての遺伝情報は、イントロン配列によって互いから分断されているエキソンにコードされている。これらのイントロンは、場合によっては非常に長い。真核生物の転写機構は、エキソンとイントロンの両方を含むｍＲＮＡ前駆体を産生する一方、スプライシング機構は、しばしばすでにｍＲＮＡ前駆体の産生中に、ｍＲＮＡ前駆体に存在するエキソンとともに、タンパク質に対する実際のコード領域を、スプライシングによって産生する。
【００３７】
エキソンスキッピングは、少なくとも１つのスキップされたエキソンを欠く成熟ｍＲＮＡをもたらす。よって、前記エキソンがアミノ酸をコードしているとき、エキソンスキッピングは、変更された産物の発現をもたらす。エキソンスキッピングについての技術は、現在、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の使用に向けられている。本研究の多くは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに対するｍｄｘマウスモデルにおいて行われている。ｍｄｘマウスは、エキソン２３にナンセンス変異を保持している。機能的なジストロフィンタンパク質の合成を阻むはずのｍｄｘ変異にもかかわらず、天然に存在する稀なジストロフィン陽性線維が、ｍｄｘ筋組織において観察されている。これらのジストロフィン陽性線維は、体細胞変異に起因するか又は選択的スプライシングを介した見かけ上は天然に存在するエキソンスキッピングのメカニズムから生じていると考えられている。ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体におけるイントロン２２及び２３のそれぞれ３’及び／又は５’スプライス部位に対するＡＯＮが、正常ではイントロン２３の除去に関与する因子を干渉し、その結果、エキソン２３もそのｍＲＮＡから除去されたことが示されている（Alter J, Lou F, Rabinowitz A, et al. Systemic delivery of morpholino oligonucleotide restores dystrophin expression bodywide and improves dystrophic pathology. Nat Med 2006;12(2):175-7.、Lu QL, Mann CJ, Lou F, et al. Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse. Nat Med 2003;6:6.、Lu QL, Rabinowitz A, Chen YC, et al. Systemic delivery of antisense oligoribonucleotide restores dystrophin expression in body-wide skeletal muscles. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102(1):198-203.、Mann CJ, Honeyman K, McClorey G, Fletcher S, Wilton SD. Improved antisense oligonucleotide induced exon skipping in the mdx mouse model of muscular dystrophy. J Gene Med 2002;4(6):644-54.、Graham IR, Hill VJ, Manoharan M, Inamati GB, Dickson G. Towards a therapeutic inhibition of dystrophin exon 23 splicing in mdx mouse muscle induced by antisense oligoribonucleotides (splicomers): target sequence optimisation using oligonucleotide arrays. J Gene Med 2004;6(10):1149-58）。
【００３８】
特定のエキソンを標的にしたスキッピングによって、ＤＭＤ表現型は、より軽症のＢＭＤ表現型に変換される。エキソンのスキッピングは、好ましくは、スプライス部位の一方若しくは両方又はエキソン内部の配列を標的にするＡＯＮの結合によって誘導される。エキソン内部の配列に対するオリゴヌクレオチドは、典型的には、非エキソン配列との重複を示さない。それは、少なくともこれらがイントロンに存在しない限り、好ましくはスプライス部位と重複しない。エキソン内部の配列に対するオリゴヌクレオチドは、好ましくは、隣接するイントロンと相補的な配列を含まない。よって、本発明に記載のオリゴヌクレオチドがさらに提供され、ここで、前記オリゴヌクレオチド又はその機能的等価物は、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソンが前記ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングから生成されるｍＲＮＡに封入されるのを阻害するためのものである。エキソンスキッピング法は、好ましくは、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体から生成されるｍＲＮＡにエキソンが存在しなくなることにより、（より短いが）より機能的なジストロフィンタンパク質に対するコード領域が生成されるように、適用される。この文脈において、エキソンの封入の阻害とは、好ましくは、元の異常なジストロフィンｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の検出が、本明細書の前の部分で定義されたように減少されていることを意味する。
【００３９】
ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソンは、両方のスプライス部位がプライセオソーム複合体によって認識されるときだけ、生じるｍＲＮＡに含められるので、スプライス部位は、ＡＯＮに対する明らかな標的である。ゆえに、１つの実施形態は、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の非エキソン領域と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物を提供する。１つの実施形態において、もっぱらジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の非エキソン領域と相補的なＡＯＮが使用される。しかしながら、これは、必須ではない：イントロン特異的配列並びにエキソン特異的配列を含むＡＯＮを使用することも可能である。そのようなＡＯＮは、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の非エキソン領域と相補的な配列、並びにジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソン領域と相補的な配列を含む。当然のことながら、ＡＯＮは、必ずしもジストロフィンのエキソン又はイントロンの配列全体と相補的ではない。そのようなエキソン又はイントロンの一部と相補的なＡＯＮが、好ましい。ＡＯＮは、好ましくは、ジストロフィン（ｄｙｓｔｒｏｈｉｎ）のエキソン及び／又はイントロンの少なくとも一部と相補的であり、前記一部は、少なくとも８、１０、１３、１５、２０ヌクレオチドを有する。
【００４０】
ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のスプライシングは、２つの連続的なエステル交換反応を介して起きる。第１に、スプライセオソームの集合において定義されるイントロン内の特定のブランチポイントのヌクレオチドの２’ＯＨが、５’スプライス部位におけるイントロンの１番目のヌクレオチドに対して求核攻撃を行い、投縄型の中間体を形成する。第２に、放出された５’エキソンの３’ＯＨが、３’スプライス部位におけるそのイントロンの最後のヌクレオチドにおいて求核攻撃を行い、よって、エキソンが連結され、投縄型のイントロンが放出される。イントロンのブランチポイント及びスプライス部位は、このようにスプライシング事象に関与する。それ故に、そのようなブランチポイント及び／又はスプライス部位と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドは、好ましくは、エキソンスキッピングのために用いられる。ゆえに、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のスプライス部位及び／又はブランチポイントと相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物がさらに提供される。
【００４１】
スプライス部位は、コンセンサス配列を含むので、スプライス部位と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物（本明細書中でＡＯＮとも呼ばれる）の使用は、無差別なハイブリダイゼーションのリスクを含む。スキップされるべきエキソンの部位ではない他のスプライス部位へのＡＯＮのハイブリダイゼーションは、スプライシングプロセスの精度を容易に干渉し得る。イントロン配列と相補的なＡＯＮの使用に関するこれらの問題及び他の潜在的な問題を克服するために、１つの好ましい実施形態は、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソンと相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物を提供する。好ましくは、前記ＡＯＮは、前記ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体における少なくとも１つのエキソンのエキソン封入シグナル（exon inclusion signal）を特異的に阻害することができる。エキソン封入シグナル（ＥＩＳ）の干渉は、そのようなエレメントがそのエキソン内に配置されているという利点を有する。スキップされるべきエキソンの内部にＡＯＮを提供することによって、エキソン封入シグナルを干渉することができ、それにより、スプライシング装置からエキソンが効果的にマスクされる。よって、スプライシング装置がスキップされるべきエキソンを認識できなくなることにより、最終的なｍＲＮＡからそのエキソンが排除される。この実施形態は、スプライシング機構の酵素プロセス（エキソンの接続）を直接干渉しない。これは、本方法をより特異的及び／又は信頼できるものにすると考えられる。ＥＩＳは、スプライス受容体及びスプライス供与体が特定の空間的コンフォメーションをとることを可能にするエキソンの特定の構造であると考えられる。このコンセプトでは、その特定の空間的コンフォメーションこそが、スプライシング機構によるエキソンの認識を可能にする。しかしながら、本発明は、必ずしもこのモデルに限定されない。好ましい実施形態において、エキソンに結合することができ、且つＥＩＳを阻害することができるオリゴヌクレオチドが使用される。ＡＯＮは、任意の点において前記エキソンと特異的に接触し得、なおも前記ＥＩＳを特異的に阻害することができる。
【００４２】
本発明の文脈内で、オリゴヌクレオチドの機能的等価物は、好ましくは、本明細書中に定義されるようなオリゴヌクレオチドを意味し、ここで、１又は２以上のヌクレオチドが置換されており、前記機能的等価物の活性は、少なくともいくらか保持されている。好ましくは、前記機能的等価物の活性は、機能的なジストロフィンタンパク質を提供することである。ゆえに、前記機能的等価物の前記活性は、好ましくは、機能的なジストロフィンタンパク質の量を定量化することによって又は機能的なジストロフィンｍＲＮＡの量を定量化することによって評価される。機能的なジストロフィンタンパク質（又は機能的なジストロフィンｍＲＮＡ）は、本明細書中において好ましくは、アクチン及びＤＧＣタンパク質のメンバーに結合することができるジストロフィンタンパク質（又は前記ｍＲＮＡによってコードされるジストロフィンタンパク質）であると定義される。オリゴヌクレオチドの前記活性の評価は、好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲ（ｍ−ＲＮＡ）又は免疫蛍光解析若しくはウエスタンブロット解析（タンパク質）によって行われる。前記活性が、機能的等価物が由来する前記オリゴヌクレオチドの対応する活性の少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％又はそれ以上を示すとき、前記活性は、好ましくは、少なくともいくらか保持されている。そのような活性は、個体の筋組織若しくは筋細胞又はインビトロの細胞において、機能的等価物が由来する前記オリゴヌクレオチドの対応するオリゴヌクレオチドの活性と比較することによって測定され得る。本願全体を通して、オリゴヌクレオチドという単語が使用されるとき、その単語は、本明細書中に定義されるようなその機能的等価物によって置き換えられてもよい。
【００４３】
それ故に、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソンと相補的な配列を含むか又はそれから成るオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物が、良好なＤＭＤ治療の結果を提供する。１つの好ましい実施形態において、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソン２〜７５の少なくとも一部と相補的な配列を含むか又はそれから成るオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物が使用され、前記一部は、少なくとも１３ヌクレオチドを有するか又は含む。しかしながら、前記一部は、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ヌクレオチドを有してもよい。オリゴヌクレオチドと相補的であるジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の一部は、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の連続したストレッチとも呼ばれることがある。
【００４４】
最も好ましくは、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソン５１、４５、５３、４４、４６、５２、５０、４３、６、７、８、５５、２、１１、１７、１９、２１、５７、５９、６２、６３、６５、６６、６９及び／又は７５の少なくとも一部と相補的な配列を含むか又はその配列から成るＡＯＮが使用され、前記一部は、少なくとも１３ヌクレオチドを有するか又は含む。しかしながら、前記一部は、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ヌクレオチドを有してもよい。より好ましいオリゴヌクレオチドは、以下の配列の配列番号２〜配列番号５３９の各々を含むか又はそれらから成る配列によって表され、ここで、少なくとも１つのイノシン及び／又はゆらぎ塩基対を形成することができる塩基が、前記配列中に存在する。好ましくは、グアノシン、アデニン又はウラシルを置き換えるために、イノシンがこれらの配列のうちの１つに導入されている。したがって、本明細書中で使用されるなおもより好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号２〜配列番号４８６又は配列番号５３９、なおもより好ましくは、配列番号２〜２３７又は配列番号５３９、最も好ましくは、配列番号７６を含むか又はそれらから成る配列によって表され、ここで、少なくとも１つのイノシン及び／又はゆらぎ塩基対を形成することができる塩基が、前記配列中に存在する。好ましくは、グアノシン、アデニン又はウラシルを置き換えるために、イノシンがこれらの配列のうちの１つに導入されている。
【００４５】
したがって、別の好ましい実施形態では、本明細書中で使用されるオリゴヌクレオチドは、配列番号５４０〜配列番号５７６を含むか又はそれらから成る配列によって表される。より好ましくは、本明細書中で使用されるオリゴヌクレオチドは、配列番号５５７を含むか又はそれから成る配列によって表される。
【００４６】
前記エキソンは、患者集団の適応性に関して降順（decreasing order）で列挙されている。それ故に、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソン５１の少なくとも一部と相補的な配列を含むＡＯＮの使用は、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソン４４と相補的な配列を含むＡＯＮなどと比べて、ＤＭＤ患者集団のより多くの部分における使用に適している。
【００４７】
好ましい実施形態において、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の一部と相補的な配列を含む本発明のオリゴヌクレオチドは、その相補的な一部が、本発明のオリゴヌクレオチドの長さの少なくとも５０％、より好ましくは、少なくとも６０％、なおもより好ましくは、少なくとも７０％、なおもより好ましくは、少なくとも８０％、なおもより好ましくは、少なくとも９０％又はなおもより好ましくは、少なくとも９５％又はなおもより好ましくは、９８％又はなおもより好ましくは、少なくとも９９％又はなおもより好ましくは、１００％であるようなオリゴヌクレオチドである。最も好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、本明細書中に定義されるようなジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の一部と相補的な配列から成る。例として、オリゴヌクレオチドは、本明細書中に定義されるようなジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の一部と相補的な配列及び追加の隣接配列を含み得る。より好ましい実施形態において、前記オリゴヌクレオチドの前記相補的な一部の長さは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ヌクレオチドである。好ましくは、追加の隣接配列は、オリゴヌクレオチドへのタンパク質の結合を改変するため、又はオリゴヌクレオチドの熱力学的特性を改変するため、より好ましくは、標的ＲＮＡの結合親和性を改変するために、使用される。
【００４８】
１つの好ましい実施形態は、
−ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソンの別の一部とハイブリダイズされたジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソンの領域（閉じた構造）と相補的な配列、及び
−前記ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体においてハイブリダイズされていないジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソンの領域（開いた構造）と相補的な配列
を含むオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物を提供する。
【００４９】
この実施形態については、ＷＯ２００４／０８３４３２（その全体が参考として援用される）に言及されている。ＲＮＡ分子は、同じＲＮＡ内の相補的な範囲又は部分的に相補的な範囲の塩基対形成に主に起因する、強い二次構造を示す。ＲＮＡの構造は、ＲＮＡの機能に関与すると長く考えられている。理論に拘束されないが、エキソンのＲＮＡの二次構造は、スプライシングプロセスの構築に関与すると考えられる。エキソンの構造は、エキソンをｍＲＮＡに封入するのを指示すると考えられている１つのパラメータである。しかしながら、他のパラメータも、それに関与し得る。本明細書中では、このシグナル伝達機能は、エキソン封入シグナルと称される。この実施形態の相補的なオリゴヌクレオチドは、エキソンの構造を干渉することができ、それにより、エキソンのエキソン封入シグナルを干渉することができる。多くの相補的なオリゴヌクレオチドが、実際にこの能力を備えている（いくつかは他のものよりも効率的である）ことが見出されている。この好ましい実施形態のオリゴヌクレオチド、すなわち、本来のエキソンＲＮＡにおける開いた構造及び閉じた構造に対する前記重複を有するオリゴヌクレオチドは、すべての存在し得るオリゴヌクレオチドから選択されたものである。この選択されたものは、エキソン封入シグナルを効率的に干渉し得るオリゴヌクレオチドを含む。理論に拘束されないが、開いた構造との重複は、オリゴヌクレオチドの侵入効率を改善し、スプライシング因子の結合を妨げる（すなわち、オリゴヌクレオチドがその構造に進入し得る効率を高める）のに対し、閉じた構造との重複は、その後、エキソンのＲＮＡの二次構造を干渉する効率を高め、それにより、エキソン封入シグナルを干渉すると考えられる。閉じた構造と開いた構造の両方に対する部分的な相補性の長さは、極端に制限されないことが見出されている。本発明者らは、いずれかの構造において様々な長さの相補性を有するオリゴヌクレオチドによる高効率を観察した。相補性という用語は、生理学的条件下において別のストレッチの核酸にハイブリダイズすることができるあるストレッチの核酸のことを指すために本明細書中で使用される。よって、相補性の領域内のすべての塩基が、反対の鎖における塩基と対形成できることが絶対必要というわけではない。例えば、オリゴヌクレオチドを設計する際、例えば、相補鎖の塩基と塩基対形成しない残基を組み込みたい場合がある。細胞内の環境下では、ストレッチのヌクレオチドが、相補的な部分と十分にハイブリダイズできる場合、ミスマッチは、ある程度許容され得る。この文脈において、「十分」とは、好ましくは、ＥＰ１６１９２４９の実施例１に記載されているようなゲル移動度シフトアッセイを用いてオリゴヌクレオチドの結合が検出可能であることを意味する。必要に応じて、前記オリゴヌクレオチドは、患者の筋細胞へのトランスフェクションによってさらに試験されてもよい。標的とされるエキソンのスキッピングは、ＲＴ−ＰＣＲ（ＥＰ１６１９２４９に記載されているようなＲＴ−ＰＣＲ）によって評価されてもよい。相補的領域は、好ましくは、それらの相補的領域が組み合わされたときにｍＲＮＡ前駆体内のエキソンに特異的であるように、設計される。そのような特異性は、その系の他のｍＲＮＡ（前駆体）における実際の配列に依存するので、様々な長さの相補的領域によってもたらされ得る。１又は２以上の他のｍＲＮＡ前駆体もそのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができ得るというリスクは、オリゴヌクレオチドのサイズを大きくするほど低下する。相補性の領域内にミスマッチを含むが、ｍＲＮＡ前駆体内の標的とされる領域とハイブリダイズする能力を保持しているオリゴヌクレオチドが、本発明において使用され得ることは明らかである。しかしながら、少なくとも相補的な部分は、典型的には、１又は２以上の相補的領域内にそのようなミスマッチを有するオリゴヌクレオチドよりも高い効率及び高い特異性を有するので、好ましくは、これらは、そのようなミスマッチを含まない。より高いハイブリダイゼーション強度（すなわち、反対鎖との多数の相互作用）は、その系のスプライシング機構を干渉するプロセスの効率を高める際に都合がよいと考えられている。好ましくは、その相補性は、９０〜１００％である。一般に、これは、およそ２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドにおいておよそ１つ又は２つのミスマッチを許容するものである。
【００５０】
二次構造は、エキソンが存在するｍＲＮＡ前駆体に照らして最もよく解析される。そのような構造は、実際のＲＮＡにおいて解析され得る。しかしながら、現在、構造モデリングプログラムを用いてＲＮＡ分子の二次構造をかなりうまく（最低のエネルギーコストで）予測することが可能である。適当なプログラムの非限定的な例は、ＲＮＡ  ｍｆｏｌｄバージョン３．１サーバーである（Mathews DH, Sabina J, Zuker M, Turner DH. Expanded sequence dependence of thermodynamic parameters improves prediction of RNA secondary structure. J Mol Biol 1999;288(5):911-40）。当業者は、ヌクレオチド配列が与えられれば、エキソンのもっともらしい構造を適当な再現性で予測することができるであろう。最善の予測は、そのようなモデリングプログラムにエキソン配列と隣接のイントロン配列の両方を提供するときに得られる。典型的には、ｍＲＮＡ前駆体全体の構造をモデル化することは必要ではない。
【００５１】
オリゴヌクレオチドが向かう開いた構造及び閉じた構造は、好ましくは、互いに隣接する。このように、開いた構造へのオリゴヌクレオチドのアニーリングは、閉じた構造を開くことを誘導し、その結果、アニーリングは、この閉じた構造に進入すると考えられる。この作用を通じて、以前に閉じていた構造は、異なるコンフォメーションをとる。その異なるコンフォメーションは、エキソン封入シグナルを乱す。しかしながら、潜在的な（隠れた）スプライス受容体配列及び／又はスプライス供与体配列が、標的とされるエキソン内に存在するとき、時折、異なる（新）エキソン、すなわち、異なる５’末端、異なる３’末端又はその両方を有するエキソンを定義する新しいエキソン封入シグナルが生成される。標的とされるエキソンがｍＲＮＡから排除されるので、このタイプの活性も本発明の範囲内である。標的とされるエキソンの一部を含む、ｍＲＮＡ内の新しいエキソンの存在は、標的とされるエキソンが同様に排除されるという事実を変化させない。新エキソンの封入は、ほんの時折起こる副作用としてみられる。エキソンスキッピングが、変異の結果として破壊されたジストロフィンのオープンリーディングフレーム（の一部）を回復させるために使用されるとき、２つの可能性がある。一方は、新エキソンが読み枠の回復において機能的である可能性であり、それに対して、他方の場合は、読み枠が回復されない可能性である。エキソンスキッピングを用いてジストロフィンの読み枠を回復させるためのオリゴヌクレオチドを選択する際、これらの条件下において、新エキソンを含むか又は含まない、ジストロフィンオープンリーディングフレームを回復させるエキソンスキッピングを実際にもたらすオリゴヌクレオチドだけが選択されることは、当然明らかである。
【００５２】
ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエキソンのＲＮＡ内のセリン−アルギニン（ＳＲ）タンパク質に対する結合部位と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物がさらに提供される。国際公開第２００６／１１２７０５号パンフレットにおいて、本発明者らは、エキソンスキッピングを誘導する際のエキソン内部のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の有効性と、前記ＡＯＮの標的ｍＲＮＡ前駆体部位における（例えば、ＥＳＥ  ｆｉｎｄｅｒによって）予測されたＳＲ結合部位の存在との間に相関関係が存在することを開示した。ゆえに、１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドが生成されるが、その生成には、ジストロフィンエキソンのＲＮＡにおけるＳＲ（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）タンパク質に対する（推定）結合部位を決定すること、及び前記ＲＮＡと相補的且つ前記（推定）結合部位と少なくとも部分的に重複するオリゴヌクレオチドを生成することが包含される。用語「少なくとも部分的に重複する」は、ＳＲ結合部位のただ１つのヌクレオチド並びに前記結合部位の複数のヌクレオチドの重複、並びに前記結合部位の完全な重複を含むことと本明細書中で定義される。この実施形態は、好ましくは、前記ＲＮＡの二次構造から、前記ＲＮＡの別の部分とハイブリダイズしている領域（閉じた構造）及び前記構造においてハイブリダイズしていない領域（開いた構造）を決定すること、続いて、前記（推定）結合部位と少なくとも部分的に重複するオリゴヌクレオチド並びに前記閉じた構造の少なくとも一部と重複するオリゴヌクレオチド及び前記開いた構造の少なくとも一部と重複するオリゴヌクレオチドを生成することをさらに包含する。このように、本発明者らは、ｍＲＮＡ前駆体からｍＲＮＡへのエキソン封入を干渉することができるオリゴヌクレオチドを得る見込みを高める。第１の選択されたＳＲ結合領域は、要求された開いた−閉じた構造を有しない可能性があり、その場合、別の（第２）ＳＲタンパク質結合部位が選択され、続いてそれは、開いた−閉じた構造の存在について試験される。このプロセスは、ＳＲタンパク質結合部位並びに（部分的に重複する）開いた−閉じた構造を含む配列が同定されるまで、続けられる。次いで、この配列を用いることにより、前記配列と相補的なオリゴヌクレオチドが設計される。
【００５３】
オリゴヌクレオチドを生成するためのそのような方法は、記載された順序を逆転させること、すなわち、第１に、オリゴヌクレオチドを生成すること（ジストロフィンエキソンのＲＮＡの二次構造から、前記ＲＮＡの別の部分にハイブリダイズした構造（閉じた構造）をとる領域、及び前記構造においてハイブリダイズしていない領域（開いた構造）を決定することを含む）、続いて、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が前記閉じた構造と相補的であるオリゴヌクレオチド、及び前記オリゴヌクレオチドの少なくとも別の部分が前記開いた構造と相補的であるオリゴヌクレオチドを生成することによっても行われる。次いで、この後、ＳＲタンパク質結合部位が、前記開いた／閉じた構造と少なくとも重複するか否かが判定される。このように、国際公開第２００４／０８３４３２号パンフレットの方法は、改善される。なおも別の実施形態では、選択は同時に行われる。
【００５４】
いずれの理論にも拘束つもりはないが、ＳＲタンパク質結合部位に対するオリゴヌクレオチドの使用は、ＳＲタンパク質がＳＲタンパク質の結合部位に結合するのを（少なくとも部分的に）損ね、それにより、スプライシングが乱されるか又は損なわれると現在考えられている。
【００５５】
好ましくは、開いた／閉じた構造及びＳＲタンパク質結合部位は、部分的に重複し、なおもより好ましくは、開いた／閉じた構造は、ＳＲタンパク質結合部位と完全に重複するか、又はＳＲタンパク質結合部位は、開いた／閉じた構造と完全に重複する。これにより、エキソン封入が乱されるのが改善される。
【００５６】
コンセンサススプライス部位配列に加えて、多くの（全部ではないが）エキソンは、スプライセオソームによる真のスプライス部位の認識を促進するスプライシング制御配列（例えば、エキソンのスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）配列）を含む（Cartegni L, Chew SL, Krainer AR. Listening to silence and understanding nonsense: exonic mutations that affect splicing. Nat Rev Genet 2002;3(4):285-98.、Cartegni L, Wang J, Zhu Z, Zhang MQ, Krainer AR. ESEfinder: A web resource to identify exonic splicing enhancers. Nucleic Acids Res 2003;31(13):3568-71）。ＳＲタンパク質と呼ばれるスプライシング因子のサブグループは、これらのＥＳＥに結合することができ、他のスプライシング因子（例えば、Ｕ１及びＵ２ＡＦ）を（弱く定義される）スプライス部位に補充することができる。この最も豊富に存在する４つのＳＲタンパク質（ＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５、ＳＲｐ４０及びＳＲｐ５５）の結合部位は、詳細に解析されており、これらの結果は、これらのＳＲタンパク質に対する潜在的な結合部位を予測するウェブソースであるＥＳＥ  ｆｉｎｄｅｒに実装されている（Cartegni L, Chew SL, Krainer AR. Listening to silence and understanding nonsense: exonic mutations that affect splicing. Nat Rev Genet 2002;3(4):285-98.、Cartegni L, Wang J, Zhu Z, Zhang MQ, Krainer AR. ESEfinder: A web resource to identify exonic splicing enhancers. Nucleic Acids Res 2003;31(13):3568-71）。ＡＯＮの有効性と、ＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５及びＳＲｐ４０結合部位の存在／非存在との間には相関関係が存在する。よって、好ましい実施形態において、本発明は、上に記載されたような組み合わせを提供し、ここで、前記ＳＲタンパク質は、ＳＦ２／ＡＳＦ又はＳＣ３５又はＳＲｐ４０である。
【００５７】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチド又はその機能的等価物は、転写産物におけるジストロフィンエキソンの正しいスプライシングに必要とされる調節性ＲＮＡ配列に特異的に結合することができる。いくつかのシス作用性ＲＮＡ配列は、転写産物におけるエキソンの正しいスプライシングに必要とされる。特に、構成的エキソン及び選択的エキソンの特異的且つ効率的なスプライシングを制御する補助的なエレメント（例えば、イントロン又はエキソンのスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ及びＥＳＥ）又はサイレンサー（ＩＳＳ及びＥＳＥ））が同定されている。上記エレメントに結合する配列特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を用いると、ＤＭＤについて示されているように、それらの制御機能が妨害されてエキソンがスキップされる。それ故に、１つの好ましい実施形態において、イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、エキソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）及び／又はエキソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）と相補的なオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物が使用される。本明細書の前の部分にすでに記載したように、ジストロフィンエキソンは、１つの好ましい実施形態において、前記エキソンがｍＲＮＡに含められる必要がある部分としてスプライシング機構によって認識されないように、前記エキソンのエキソン封入シグナルを特異的に阻害することができる薬剤によってスキップされる。結果として、前記エキソンを有しないｍＲＮＡが形成される。
【００５８】
本明細書中で使用されるＡＯＮは、好ましくは、８〜５０ヌクレオチドの、ジストロフィンエキソンＲＮＡ又はジストロフィンイントロンＲＮＡの連続する一部又は連続したストレッチと相補的である。１つの実施形態において、本明細書中で使用されるＡＯＮは、１４〜５０ヌクレオチドの、ジストロフィンエキソンＲＮＡ又はジストロフィンイントロンＲＮＡの連続する一部又は連続したストレッチと相補的である。好ましくは、前記ＡＯＮは、１４〜２５ヌクレオチドの、前記エキソンＲＮＡの連続する一部又は連続したストレッチと相補的である。より好ましくは、２０〜２５ヌクレオチドの、ジストロフィンエキソンＲＮＡ又はジストロフィンイントロンＲＮＡの連続する一部又は連続したストレッチと相補的な配列を含むＡＯＮが使用される。
【００５９】
種々のタイプの核酸が、オリゴヌクレオチドを生成するために使用され得る。ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、非常に安定であるので、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡを含む。エキソンスキッピング法の目標の１つは、被験体においてスプライシングを指示することであるので、オリゴヌクレオチドＲＮＡが追加の特性（例えば、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ及びＲＮａｓｅＨに対する耐性、追加のハイブリダイゼーション強度、高い安定性（例えば、体液中での安定性）、高い又は低い可撓性、低い毒性、高い細胞内輸送、組織特異性など）をＲＮＡに提供する修飾を含むことが好ましい。好ましくは、前記修飾は、２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエートオリゴリボヌクレオチド修飾を含む。好ましくは、前記修飾は、２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチド修飾を含む。よって、１つの実施形態は、修飾、好ましくは、２’−Ｏ−メチル修飾リボース（ＲＮＡ）又はデオキシリボース（ＤＮＡ）修飾を含むＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【００６０】
１つの実施形態において、本発明は、２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエートオリゴ（デオキシ）リボヌクレオチド修飾及びロックト（locked）核酸を含むオリゴヌクレオチドを含むハイブリッドオリゴヌクレオチドを提供する。この特定のオリゴヌクレオチドは、ロックト核酸から成る等価物と比べてより良好な配列特異性を備え、２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエートオリゴ（デオキシ）リボヌクレオチド修飾から成るオリゴヌクレオチドと比較して改善された有効性を備える。
【００６１】
核酸模倣技術の出現で、核酸自体と必ずしも量としてではないが本質的に（in kind not necessarily in amount）同様のハイブリダイゼーション特性、好ましくは、同じハイブリダイゼーション特性を有する分子を生成することが可能になった。そのような機能的等価物もまた、当然、本発明における使用に適している。オリゴヌクレオチドの機能的等価物の好ましい例は、ペプチド核酸及び／又はロックト核酸である。最も好ましくは、モルホリノホスホロジアミデートが使用される。本発明のオリゴヌクレオチドの等価物の適当であるが非限定的な例は、Braasch DA, Corey DR. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol 2001;8(1):1-7.、Braasch DA, Corey DR. Novel antisense and peptide nucleic acid strategies for controlling gene expression. Biochemistry 2002;41(14):4503-10.、Elayadi AN, Corey DR. Application of PNA and LNA oligomers to chemotherapy. Curr Opin Investig Drugs 2001;2(4):558-61.、Larsen HJ, Bentin T, Nielsen PE. Antisense properties of peptide nucleic acid. Biochim Biophys Acta 1999;1489(1):159-66.、Summerton J. Morpholino antisense oligomers: the case for an RNase H-independent structural type. Biochim Biophys Acta 1999;1489(1):141-58.、Summerton J, Weller D. Morpholino antisense oligomers: design, preparation, and properties. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 1997;7(3):187-95.、Wahlestedt C, Salmi P, Good L, et al. Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97(10):5633-8.に見られる。上記等価物の１又は２以上の互いによるハイブリッド及び／又は核酸とのハイブリッドもまた、当然のことながら適当である。好ましい実施形態において、ロックト核酸は、より高い標的親和性及び低い毒性を示すが故に、より高いエキソンスキッピング効率を示すので、ロックト核酸は、オリゴヌクレオチドの機能的等価物として使用される。
【００６２】
１つの実施形態において、ジストロフィンエキソンをジストロフィンｍＲＮＡに封入するのを阻害することができるオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物は、別のジストロフィンエキソンをジストロフィンｍＲＮＡに封入するのを阻害することができる少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物と組み合わされる。このように、このｍＲＮＡ前駆体から生成されるｍＲＮＡにおいてジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の２又は３以上のエキソンの封入が妨げられる。この実施形態は、さらに、二重（ｄｏｕｂｌｅ−）エキソンスキッピング又は多重（ｍｕｌｔｉ−）エキソンスキッピングとも称される（Aartsma-Rus A, Janson AA, Kaman WE, et al. Antisense-induced multi-exon skipping for Duchenne muscular dystrophy makes more sense. Am J Hum Genet 2004;74(1):83-92.、Aartsma-Rus A, Kaman WE, Weij R, den Dunnen JT, van Ommen GJ, van Deutekom JC. Exploring the frontiers of therapeutic exon skipping for Duchenne muscular dystrophy by double targeting within one or multiple exons. Mol Ther 2006;14(3):401-7）。ほとんどの場合、二重エキソンスキッピングは、標的とされる２つのエキソンだけをジストロフィンｍＲＮＡ前駆体から排除する。しかしながら、他の場合では、他のエキソン（介在エキソン）が、標的とされるエキソン及び前記ｍＲＮＡ前駆体における前記エキソン間の領域に存在するときでさえも、そのような領域全体が、生成されたｍＲＮＡに存在しないことが見出された。この多重エキソンスキッピングは、エキソン４５に対する１つのオリゴヌクレオチド及びエキソン５１に対する１つのオリゴヌクレオチドが、ＤＭＤ遺伝子を転写している細胞に加えられたという、ＤＭＤ遺伝子に由来するオリゴヌクレオチドの組み合わせの場合に特にそうであった。このような構成（ｓｅｔ−ｕｐ）は、エキソン４５〜５１を含まないｍＲＮＡを生成した。述べられたオリゴヌクレオチドの存在下でのｍＲＮＡ前駆体の構造は、明らかに、スプライシング機構がエキソン４４及び５２を互いに接続するように刺激されたような構造であった。多重エキソンスキッピングの他の好ましい例は：
−エキソン１７を標的にするオリゴヌクレオチド及びエキソン４８を標的にする第２のオリゴヌクレオチドの使用（これにより、前記両方のエキソンのスキッピング又はエキソン１７とエキソン４８との間のすべての領域のスキッピングが生じ得る）
−エキソン１７を標的にするオリゴヌクレオチド及びエキソン５１を標的にする第２のオリゴヌクレオチドの使用（これにより、前記両方のエキソンのスキッピング又はエキソン１７とエキソン５１との間のすべての領域のスキッピングが生じ得る）
−エキソン４２を標的にするオリゴヌクレオチド及びエキソン５５を標的にする第２のオリゴヌクレオチドの使用（これにより、前記両方のエキソンのスキッピング又はエキソン４２とエキソン５５との間のすべての領域のスキッピングが生じ得る）
−エキソン４３を標的にするオリゴヌクレオチド及びエキソン５１を標的にする第２のオリゴヌクレオチドの使用（これにより、前記両方のエキソンのスキッピング又はエキソン４３とエキソン５１との間のすべての領域のスキッピングが生じ得る）
−エキソン４３を標的にするオリゴヌクレオチド及びエキソン５５を標的にする第２のオリゴヌクレオチドの使用（これにより、前記両方のエキソンのスキッピング又はエキソン４３とエキソン５５との間のすべての領域のスキッピングが生じ得る）
−エキソン４５を標的にするオリゴヌクレオチド及びエキソン５５を標的にする第２のオリゴヌクレオチドの使用（これにより、前記両方のエキソンのスキッピング又はエキソン４５とエキソン５５との間のすべての領域のスキッピングが生じ得る）
−エキソン４５を標的にするオリゴヌクレオチド及びエキソン５９を標的にする第２のオリゴヌクレオチドの使用（これにより、前記両方のエキソンのスキッピング又はエキソン４５とエキソン５９との間のすべての領域のスキッピングが生じ得る）
−エキソン４８を標的にするオリゴヌクレオチド及びエキソン５９を標的にする第２のオリゴヌクレオチドの使用（これにより、前記両方のエキソンのスキッピング又はエキソン４８とエキソン５９との間のすべての領域のスキッピングが生じ得る）
−エキソン５０を標的にするオリゴヌクレオチド及びエキソン５１を標的にする第２のオリゴヌクレオチドの使用（これにより、前記両方のエキソンのスキッピングが生じ得る）
−エキソン５１を標的にするオリゴヌクレオチド及びエキソン５２を標的にする第２のオリゴヌクレオチドの使用（これにより、前記両方のエキソンのスキッピングが生じ得る）
である。
【００６３】
ゆえに、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の第１エキソンと相補的な少なくとも８個、好ましくは、１６〜８０個連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドがさらに提供され、ここで、前記ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の第２エキソンと相補的な少なくとも８個、好ましくは、１６〜８０個連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列が用いられる。前記第１及び前記第２エキソンは、同じであってもよい。
【００６４】
１つの好ましい実施形態において、前記第１及び前記第２エキソンは、前記ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体において、前記オリゴヌクレオチドと相補的でない少なくとも１つのエキソンによって分断されている。或いは、前記第１エキソンと前記第２エキソンは、隣接している。
【００６５】
２つの相補的オリゴヌクレオチドの間に結合を提供することによって、介在するエキソンのスキッピングを特異的に促進することができる。それ故に、１つの実施形態において、少なくとも２つのジストロフィンエキソンと相補的なストレッチのヌクレオチドは、連結部分によって分断される。よって、その少なくとも２つのストレッチのヌクレオチドは、この実施形態において、単一分子を形成するように連結される。ゆえに、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体における少なくとも２つのエキソンと相補的なオリゴヌクレオチド又はその機能的等価物がさらに提供され、前記オリゴヌクレオチド又は機能的等価物は、少なくとも２つの部分を含み、ここで、第１の部分は、前記少なくとも２つのエキソンのうちの第１のエキソンと相補的な少なくとも８個、好ましくは、１６〜８０個連続するヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを含み、第２の部分は、前記ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体における第２のエキソンと相補的な少なくとも８個、好ましくは、１６〜８０個連続するヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを含む。その結合は、任意の手段によるものであり得るが、好ましくは、ヌクレオチド結合によって達成される。後者の場合、一方又は他方の相補的エキソンとの間の重複を含まないヌクレオチドの数は、ゼロであり得るが、好ましくは、４〜４０ヌクレオチドである。その連結部分は、オリゴヌクレオチドを連結することができる任意のタイプの部分であり得る。好ましくは、前記連結部分は、少なくとも４つのウラシルヌクレオチドを含む。現在、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を模倣する多くの異なる化合物が、利用可能である。オリゴヌクレオチドの機能的等価物と本明細書中で呼ばれるそのような化合物も、そのような等価物が、必ずしも量としてではないが本質的に同様のハイブリダイゼーション特性を備える場合、本発明に適している。適当な機能的等価物は、この説明の前の部分で述べられている。述べられたように、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的とされるエキソンへのハイブリダイゼーションに寄与するオリゴヌクレオチドだけから成る必要はない。追加の材料及び／又は付加されるヌクレオチドが存在してもよい。
【００６６】
ＤＭＤ遺伝子は、多くの異なるエキソンを有する大きな遺伝子である。この遺伝子がＸ染色体上に位置することを考慮すると、この疾患の影響を受けるのはたいてい男児であるが、女児も影響を受けることがある。
なぜなら、両方の親からこの遺伝子の不良なコピーを受け継ぐことがあるから、又は筋細胞における特に偏ったＸ染色体の不活性化に起因する機能的な対立遺伝子の特に偏った不活性化を受けるからである。このタンパク質は、少なくとも２．４Ｍｂの範囲にわたる複数のエキソン（７９）によってコードされる。欠陥は、ＤＭＤ遺伝子のいずれの部分においても起き得る。特定の１つのエキソン又は特定の複数のエキソンのスキッピングは、頻繁に、正常よりも短いが少なくとも部分的に機能的なジストロフィンタンパク質をコードするｍＲＮＡの再構築をもたらすことができる。エキソンスキッピング法に基づいて薬物を開発する際の実際の問題は、細胞において機能的なジストロフィンタンパク質の欠損をもたらし得る複数の変異である。すでに説明された複数の異なる変異が単一エキソンのスキッピングによって補正され得るという事実にもかかわらず、種々のエキソンがスキップされる必要がある種々の変異に関しては、この複数の変異は、一連の異なる医薬の生成を必要とする。オリゴヌクレオチドの利点、又は２つ若しくは３以上のエキソンのスキッピングを誘導することができる本明細書の後で定義されるような少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドを含む組成物の利点は、２つ以上のエキソンが、単一の医薬を用いてスキップされ得る点である。この特性は、多くの異なるＤＭＤ変異又は特定の重症のＢＭＤ変異を処置するために生成されるのに必要な医薬の数が単に限られた数で済むという点において現実に非常に有用であるだけではない。当業者に現在開かれている別の選択肢は、特に機能的な再構築されたジストロフィンタンパク質を選択すること、及びこれらの好ましいジストロフィンタンパク質を生成することができる化合物を生成することである。そのような好ましい最終結果は、軽症の表現型のジストロフィンに対してもさらにあてはめられる。
【００６７】
本発明に記載のオリゴヌクレオチドの用量の範囲は、好ましくは、厳格なプロトコルの要件が存在する臨床試験における用量漸増試験（rising dose studies）（インビボ使用）に基づいて設計される。本明細書中に定義されるような分子又はオリゴヌクレオチドは、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．５〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で使用され得る。
【００６８】
好ましい実施形態において、０．１ｎＭ〜１μＭの範囲である本明細書中に定義されるようなオリゴヌクレオチドの濃度が使用される。好ましくは、この範囲は、筋細胞又は筋組織などの細胞モデルにおけるインビトロでの使用のための範囲である。より好ましくは、用いられる濃度は、０．３〜４００ｎＭ、なおもより好ましくは、１〜２００ｎＭの範囲である。いくつかのオリゴヌクレオチドが使用される場合、この濃度又は用量は、オリゴヌクレオチドの全体の濃度若しくは用量又は加えられる各オリゴヌクレオチドの濃度若しくは用量のことを指し得る。
【００６９】
上で与えられたようなオリゴヌクレオチドの濃度又は用量の範囲は、インビトロ又はエキソビボで使用するための好ましい濃度又は用量である。当業者は、使用されるオリゴヌクレオチドに応じて、処置される標的細胞、遺伝子標的及びその発現レベル、使用される培地並びにトランスフェクション条件及びインキュベーション条件、使用されるオリゴヌクレオチドの濃度又は用量が、さらに変動することがあり、さらに最適化される必要があることがあることを理解するであろう。
【００７０】
本発明に従って使用するための本明細書中に定義されるようなオリゴヌクレオチドは、ＤＭＤ又はＢＭＤに冒されているか又はそれらを発症するリスクのある個体の細胞、組織及び／又は器官へのインビボ投与に適していることがあり、インビボ、エキソビボ又はインビトロにおいて投与され得る。前記オリゴヌクレオチドは、ＤＭＤ又はＢＭＤに冒されているか又はそれらを発症するリスクのある個体の細胞、組織及び／又は器官に直接又は間接的にインビボ投与され得、インビボ、エキソビボ又はインビトロにおいて直接又は間接的に投与され得る。デュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィーは、筋細胞において顕著な表現型を有するので、前記細胞が筋細胞であることが好ましく、前記組織が筋組織であることがさらに好ましく、そして／又は前記器官が筋組織を含むか若しくはそれから成ることがさらに好ましい。好ましい器官は、心臓である。好ましくは、前記細胞は、変異ジストロフィンタンパク質をコードする遺伝子を含む。好ましくは、前記細胞は、ＤＭＤ又はＢＭＤに罹患している個体の細胞である。
【００７１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の適当な手段を用いて間接的に投与され得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、個体又は前記個体（indiviual）の細胞、組織若しくは器官に発現ベクターの形態で提供されてもよく、ここで、その発現ベクターは、前記オリゴヌクレオチドを含む転写産物をコードする。その発現ベクターは、好ましくは、遺伝子送達ビヒクルを介して細胞、組織、器官又は個体に導入される。好ましい実施形態において、本明細書中で同定されるような分子の発現又は転写を駆動する発現カセット又は転写カセットを含むウイルスベースの発現ベクターが提供される。好ましい送達ビヒクルは、ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ））又はレトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター（Goyenvalle A, Vulin A, Fougerousse F, et al. Rescue of dystrophic muscle through U7 snRNA-mediated exon skipping. Science 2004;306(5702):1796-9.、De Angelis FG, Sthandier O, Berarducci B, et al. Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Delta 48-50 DMD cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99(14):9456-61.、Denti MA, Rosa A, D'Antona G, et al. Chimeric adeno-associated virus/antisense U1 small nuclear RNA effectively rescues dystrophin synthesis and muscle function by local treatment of mdx mice. Hum Gene Ther 2006;17(5):565-74））などである。また、プラスミド、人工染色体、細胞のヒトゲノムにおける標的相同組換え及び組込みに適したプラスミドが、本明細書中に定義されるようなオリゴヌクレオチドの送達に適切に適用され得る。転写がＰｏｌIIIプロモーターによって駆動され、そして／又は転写産物がＵ１若しくはＵ７転写産物との融合物（小さい転写産物を送達する場合に良好な結果をもたらす）の形態であるベクターが本発明にとって好ましい。適当な転写産物を設計することは、当業者の技術の範囲内である。ＰｏｌIIIによって駆動される転写産物が、好ましい。好ましくは、Ｕ１又はＵ７転写産物との融合転写産物の形態（Goyenvalle A, Vulin A, Fougerousse F, et al. Rescue of dystrophic muscle through U7 snRNA-mediated exon skipping. Science 2004;306(5702):1796-9.、De Angelis FG, Sthandier O, Berarducci B, et al. Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Delta 48-50 DMD cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99(14):9456-61.、Denti MA, Rosa A, D'Antona G, et al. Chimeric adeno-associated virus/antisense U1 small nuclear RNA effectively rescues dystrophin synthesis and muscle function by local treatment of mdx mice. Hum Gene Ther 2006;17(5):565-74）。そのような融合物は、記載されているように（Gorman L, Suter D, Emerick V, Schumperli D, Kole R. Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A 1998;95(9):4929-34.、Suter D, Tomasini R, Reber U, Gorman L, Kole R, Schumperli D. Double-target antisense U7 snRNAs promote efficient skipping of an aberrant exon in three human beta-thalassemic mutations. Hum Mol Genet 1999;8(13):2415-23）生成され得る。そのオリゴヌクレオチドは、そのまま送達され得る。しかしながら、そのオリゴヌクレオチドは、ウイルスベクターによってコードされ得る。典型的には、これは、転写産物の一部にオリゴヌクレオチドの配列を含むＲＮＡ転写産物の形態である。
【００７２】
これまでにすでに達成された進歩を考慮すれば、個体、又は前記個体の細胞、組織、器官にオリゴヌクレオチド及び／又はその等価物を提供するための手段の改善が予測される。そのような将来の改善も、当然のことながら、本発明の方法を用いたｍＲＮＡの再構築に対して、述べられた作用を達成するために組み込まれ得る。オリゴヌクレオチド及び／又はその等価物は、個体、前記個体の細胞、組織又は器官にそのまま送達され得る。オリゴヌクレオチド及び／又はその等価物を投与するとき、オリゴヌクレオチド及び／又はその等価物を、その送達方法に適合した溶液に溶解することが好ましい。静脈内、皮下、筋肉内、鞘内及び／又は心（脳）室内投与に対しては、溶液は生理学的塩溶液であることが好ましい。本明細書中に定義されるような構成物の各々の、細胞への及び／又は細胞内への、好ましくは、筋細胞内への送達を助ける賦形剤の使用が、本発明において特に好ましい。本明細書中に定義されるような各構成物を、細胞膜を通って送達する複合体、ナノ粒子、ミセル、ベシクル及び／若しくはリポソームを形成することができるか、複合体化されるか、又はベシクル内若しくはリポソーム内に捕捉される、賦形剤が好ましい。これらの賦形剤の多くは、当該分野で公知である。適当な賦形剤としては、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）若しくは同様のカチオン性ポリマー（ポリプロピレンイミン又はポリエチレンイミン共重合体（ＰＥＣ）及び誘導体を含む）、合成の両親媒性物質（amphiphil）（ＳＡＩＮＴ−１８）、リポフェクチンＴＭ、ＤＯＴＡＰ、及び／又は本明細書中に定義されるような各構成物（each constitutent）を細胞（好ましくは、筋細胞）に送達することができる粒子に自己組織化することができるウイルスキャプシドタンパク質が挙げられる。そのような賦形剤は、アンチセンス核酸などのオリゴヌクレオチドを、筋細胞をはじめとした多種多様の培養細胞に効率的に送達すると示されている。それらの高いトランスフェクション能力は、細胞生存全体に関する、予想されている低い毒性から中程度の毒性と組み合わされる。構造的な修飾のしやすさを用いることにより、さらなる修飾、並びにさらなる（インビボ）核酸の運搬特性及び毒性の解析が可能になり得る。
【００７３】
リポフェクチンは、リポソームトランスフェクション薬剤の例である。リポフェクチンは、２種の脂質成分、すなわち、カチオン性脂質であるＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）（ｃｐ．硫酸メチル塩であるＤＯＴＡＰ）及び中性脂質であるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から成る。その中性成分は、細胞内の放出を媒介する。送達系の別の群は、高分子ナノ粒子である。
【００７４】
ＤＮＡトランスフェクション試薬として周知のジエチルアミノエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストランのようなポリカチオンは、ブチルシアノアクリレート（ＰＢＣＡ）及びヘキシルシアノアクリレート（ＰＨＣＡ）と組み合わされて、本明細書中に定義されるような各構成物（好ましくは、オリゴヌクレオチド）を、細胞膜を超えて細胞内に送達することができるカチオン性ナノ粒子を製剤化することができる。
【００７５】
これらの通常のナノ粒子材料に加えて、カチオン性ペプチドであるプロタミンは、コロイドを用いてオリゴヌクレオチドを製剤化する代替アプローチを提供する。このコロイド状のナノ粒子系は、いわゆるプロティクル（ｐｒｏｔｉｃｌｅｓ）を形成することができ、これは、オリゴヌクレオチドをパッケージングするため及びオリゴヌクレオチドの細胞内放出を媒介するための単純な自己組織化プロセスによって調製され得る。当業者は、オリゴヌクレオチドをパッケージングし、送達するための上記又は他の商業的に入手可能な代替の賦形剤及び送達系のいずれかを、ヒトにおけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーを治療するためのオリゴヌクレオチドを送達するために本発明において使用するために選択し得、適応させ得る。
【００７６】
さらに、オリゴヌクレオチドは、細胞、細胞質及び／又はその核への取り込みを促進するように特異的に設計された標的化リガンドと共有結合的に又は非共有結合的に連結され得る。そのようなリガンドは、（ｉ）細胞の取り込みを促進する、細胞特異的、組織特異的若しくは器官特異的エレメントを認識する化合物（ペプチド（様）構造が挙げられるがこれに限定されない）、並びに／又は（ii）ベシクル、例えば、エンドソーム又はリソソームからオリゴヌクレオチドの細胞への取り込み及び／若しくは細胞内の放出を促進することができる化学的化合物を含み得る。
【００７７】
ゆえに、好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、組成物又は薬物又は組成物として製剤化され、それは、少なくとも賦形剤、及び／又は送達用の標的化リガンド、及び／又は細胞へのその送達デバイス、及び／又はその細胞内送達を増強するものとともに提供される。したがって、本発明は、オリゴヌクレオチドを含み、さらに、少なくとも１つの賦形剤、及び／又は送達用の標的化リガンド、及び／又は細胞への前記オリゴヌクレオチドの送達デバイス、及び／又はその細胞内送達を増強するものを含む、薬学的に許容可能な組成物も包含する。
【００７８】
組成物が、本明細書の後で定義されるような補助化合物（adjunct compound）などの追加の構成物を含む場合、その組成物の各構成物は、１つの単一の組み合わせ又は組成物若しくは調製物として製剤化されないかもしれないことが理解されるべきである。それらの独自性に応じて、当業者は、どのタイプの製剤が、本明細書中に定義されるような各構成物にとって最も適切であるかを承知している。好ましい実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチド及び本明細書の後で定義されるようなさらなる補助化合物を含むキットの一部の形態である組成物又は調製物を提供する。
【００７９】
好ましいオリゴヌクレオチドは、個体におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）又はベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）を予防又は治療するためのものである。本発明のオリゴヌクレオチドを用いて処置され得る個体は、ＤＭＤ又はＢＭＤを有するとすでに診断されている可能性がある。或いは、本発明のオリゴヌクレオチドを用いて処置され得る個体は、ＤＭＤ又はＢＭＤを有するとまだ診断されていないかもしれないが、遺伝的背景を考慮すると将来ＤＭＤ又はＢＭＤを発症するリスクの高い個体であり得る。好ましい個体は、ヒトである。
【００８０】
組成物
さらなる態様において、本明細書中に定義されるようなオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供される。好ましくは、前記組成物は、本明細書中に定義されたような少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドを含む。より好ましくは、これらの２つの異なるオリゴヌクレオチドは、多重エキソンスキッピングに対して本明細書での前の部分で定義されたように、異なる２又は３以上のエキソンをスキップするように設計される。
【００８１】
好ましい実施形態において、前記組成物は、好ましくは、薬学的組成物であり、前記薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体、アジュバント、希釈剤及び／又は賦形剤を含む。
【００８２】
任意の薬学的に許容可能な担体、充填剤、保存剤、アジュバント、可溶化剤、希釈剤及び／又は賦形剤を含み得るそのような薬学的組成物も提供される。そのような薬学的に許容可能な担体、充填剤、保存剤、アジュバント、可溶化剤、希釈剤及び／又は賦形剤は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition.Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000に見られることがある。前記組成物の各々の特徴は、本明細書の前の部分で定義されている。
【００８３】
いくつかのオリゴヌクレオチドが用いられる場合、本明細書中ですでに定義された濃度又は用量は、使用されるすべてのオリゴヌクレオチドの全体の濃度若しくは用量又は使用される若しくは加えられる各オリゴヌクレオチドの濃度若しくは用量のことを指すことがある。ゆえに、１つの実施形態において、用いられるオリゴヌクレオチドの各量又は総量が０．５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の量で投薬される組成物が提供される。
【００８４】
好ましい組成物は、さらに：
ａ）炎症を減少させるため、好ましくは、筋組織の炎症を減少させるための補助化合物、並びに／又は
ｂ）筋繊維の機能、完全性及び／若しくは生存を改善するための補助化合物、並びに／又は
ｃ）リードスルー活性を示す化合物
を含む。
【００８５】
驚いたことに、ジストロフィンエキソンを含むｍＲＮＡ前駆体からの前記エキソンのスキッピング頻度は、そのエキソン又は前記エキソンの一方若しくは両方方のスプライス部位に対するオリゴヌクレオチドを用いるとき、前記ｍＲＮＡ前駆体を発現する細胞が、炎症を減少させるため、好ましくは、筋組織の炎症を減少させるための補助化合物、並びに／又は筋繊維の機能、完全性及び／若しくは生存を改善するための補助化合物も提供される場合に、増加することが見出された。その増加されたスキッピング頻度は、ＤＭＤ個体又はＢＭＤ個体の筋細胞において産生される機能的なジストロフィンタンパク質のレベルも増加させる。
【００８６】
本発明によると、ジストロフィンタンパク質欠損が、本発明のオリゴヌクレオチドを投与することによってＤＭＤ患者において回復されているときでさえ、組織の炎症及び損傷された筋細胞の存在は、ＤＭＤの症状に関与するようになおも継続する。それ故に、ＤＭＤの原因（すなわち、機能不全のジストロフィンタンパク質）を軽減したとしても、ＤＭＤの処置は、本発明に記載の補助療法をさらに用いることによって、なおもさらに改善される。さらに、本発明は、炎症の減少が、筋細胞によるＡＯＮ取り込みの著しい減少をもたらさないという見識を提供する。通常、炎症は、細胞、血液及び他の化合物の輸送を高めるものであるので、これは、驚くべきことである。結果として、ＡＯＮの取り込み／送達も炎症中に増強される。それ故に、本発明より前は、炎症を打ち消す補助療法は、ＡＯＮ治療に悪影響を及ぼすリスクを伴うと予想されていた。しかしながら、このことは、真実ではないと見られる。
【００８７】
炎症を減少させるための補助化合物は、炎症、好ましくは、損傷された筋細胞によって引き起こされる炎症を少なくとも部分的に減少させることができる任意の治療を含む。前記補助化合物は、最も好ましくは、筋組織の炎症を減少させることができる。炎症は、好ましくは、ジストロフィーであると疑われる筋組織における浸潤免疫細胞（例えば、好中球及び／又はマスト細胞及び／又は樹状細胞及び／又はリンパ球）の数の増加を検出することによって評価される。この評価は、好ましくは、上で特定されたような免疫細胞を特異的に染色した後の、ジストロフィーであると疑われる筋組織の生検材料（Hodgetts S., et al, (2006), Neuromuscular Disorders, 16: 591-602）の切片において行われる。定量化は、好ましくは、顕微鏡下において行われる。ゆえに、炎症の減少は、好ましくは、ジストロフィーであると疑われる筋組織の切片において免疫細胞の数の減少を検出することによって評価される。減少の検出とは、好ましくは、上で特定されたような免疫細胞の少なくとも１種類の数が、処置前の同じ個体における対応する免疫細胞の数と比べて、少なくとも１％、２％、３％、５％、７％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上減少していることを意味する。最も好ましくは、浸潤免疫細胞が存在しないことが、前記生検材料の切片において検出される。
【００８８】
筋繊維の機能、完全性及び／又は生存を改善するための補助化合物は、前記補助化合物が存在しない別の同様の状況と比べて、筋繊維の機能、完全性及び／又は生存を測定可能な程度に増強することができる任意の治療を含む。筋繊維の機能、完全性及び／又は生存の改善は、以下の分析結果のうちの少なくとも１つを用いて評価され得る：血液中のクレアチンキナーゼの検出可能な減少、ジストロフィーであると疑われる筋肉の生検材料の切片における筋繊維の壊死の検出可能な減少、及び／又はジストロフィーであると疑われる筋肉の生検材料の切片における筋繊維の直径の均一性の検出可能な増加。これらの分析結果の各々は、当業者に公知である。
【００８９】
クレアチンキナーゼは、Hodgetts S., et al, (2006), Neuromuscular Disorders, 16: 591-602に記載されているように血液中で検出され得る。クレアチンキナーゼの検出可能な減少とは、処置前の同じ個体におけるクレアチンキナーゼの濃度と比べて、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上の減少のことを意味し得る。
【００９０】
筋繊維の壊死の検出可能な減少は、好ましくは、筋生検材料において、より好ましくは、生検材料切片を用いてHodgetts S., et al, (2006), Neuromuscular Disorders, 16: 591-602に記載されているように、評価される。壊死の検出可能な減少は、生検材料の切片を用いて壊死が特定された面積の５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上の減少であり得る。この減少は、処置前の同じ個体において評価された壊死との比較によって判定される。
【００９１】
筋繊維の直径の均一性の検出可能な増加は、好ましくは、筋生検材料の切片において、より好ましくは、Hodgetts S., et al, (2006), Neuromuscular Disorders, 16: 591-602に記載されているように、評価される。
【００９２】
１つの実施形態において、損傷された筋細胞のターンオーバーを増加させるための補助化合物が使用される。損傷された筋細胞のターンオーバーを増加させるための補助化合物は、損傷された筋細胞のターンオーバーを少なくとも部分的に誘導すること及び／又は増加させることができる任意の治療を含む。損傷された筋細胞は、健常な無傷の筋細胞よりも臨床的に測定可能な機能性を著しく有しない筋細胞である。ジストロフィンの非存在下では、機械的ストレスによって筋細胞膜が断裂し、筋繊維内部へのカルシウム流入が制御できなくなり、それによって、カルシウムによるプロテアーゼの活性化及び線維の壊死が引き起こされ、損傷された筋細胞が生じる。損傷された筋細胞のターンオーバーの増加とは、損傷された筋細胞のターンオーバーが増加されていない状況と比べて、損傷された筋細胞がより迅速に破壊されること及び／又は除去されることを意味する。損傷された筋細胞のターンオーバーは、好ましくは、筋生検材料において、より好ましくは、生検材料の切片を用いてHodgetts S., et al, (2006), Neuromuscular Disorders, 16: 591-602に記載されているように、評価される。ターンオーバーの検出可能な増加は、生検材料の切片を用いてターンオーバーが特定された面積の５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上の増加であり得る。この増加は、処置前の同じ個体において評価されたターンオーバーとの比較によって判定される。
【００９３】
理論に拘束するつもりはないが、筋細胞のターンオーバーの増加は、炎症反応を減少させるので、好ましいと考えられる。
【００９４】
本発明によると、炎症を減少させるため、好ましくは、個体における筋組織の炎症を減少させるための補助療法をさらに含む本発明の組成物は、薬物としての使用に特に適している。そのような組成物は、前記補助化合物を含まない組み合わせと比べて、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１又は２以上の症状をさらによりよく軽減することができる。この実施形態はまた、ジストロフィンエキソン又は前記エキソンの一方若しくは両方方のスプライス部位に対するオリゴヌクレオチドを用いるとき、前記エキソンを含むｍＲＮＡ前駆体からのそのエキソンのスキッピング頻度を増加させる。そのスキッピング頻度の増加は、ＤＭＤ個体又はＢＭＤ個体の筋細胞において産生される機能的なジストロフィンタンパク質のレベルも増加させる。
【００９５】
ゆえに、薬物、好ましくは、ＤＭＤを処置するため又は予防するため、中和するための薬物として使用するための、炎症を減少させるため、好ましくは、前記個体における筋組織の炎症を減少させるための補助化合物をさらに含む組成物が提供される。１つの実施形態において、前記組成物は、十分に機能的でない、非常に短いジストロフィンタンパク質又は改変型若しくは切断型のジストロフィンｍＲＮＡ若しくはタンパク質が形成される重症の形態のＢＭＤの１又は２以上の症状を軽減するために使用される。
【００９６】
炎症を減少させるための好ましい補助化合物としては、ステロイド、ＴＮＦα阻害剤、ｍＩＧＦ−１の起源物質及び／又は抗酸化物質が挙げられる。しかしながら、本明細書中に定義されるような炎症を減少させることができる他の任意の化合物もまた本発明の範囲内に包含される。これらの化合物の各々は、後で広範に提示される。その広範に提示される化合物の各々は、別個に、若しくは互いと組み合わせて、並びに／又は筋繊維の機能、完全性及び／若しくは生存を改善するために使用される補助化合物の１又は２以上と組み合わせて、使用されてもよい。
【００９７】
さらに、個体における筋繊維の機能、完全性及び／又は生存を改善するための補助療法を含む組成物は、薬物として、好ましくは、ＤＭＤを処置するため又は予防するための薬物としての使用に特に適している。そのような組成物は、前記補助化合物を含まない組成物と比べて、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの１又は２以上の症状をなおもよりうまく軽減することができる。
【００９８】
筋繊維の機能、完全性及び／又は生存を改善するための好ましい補助化合物としては、イオンチャネル阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、Ｌ−アルギニン及び／又はＩ型アンギオテンシンII受容体拮抗薬が挙げられる。しかしながら、本明細書中に定義されるような筋繊維の機能、完全性及び／又は生存を改善することができる他の任意の化合物もまた本発明の範囲内に包含される。これらの化合物の各々は、後で広範に提示される。その広範に提示される化合物の各々は、別個に、若しくは互いと組み合わせて、並びに／又は炎症を減少させるために使用される補助化合物の１又は２以上と組み合わせて、使用されてもよい。
【００９９】
特に好ましい実施形態において、組成物は、ステロイドをさらに含む。そのような組成物は、ＤＭＤの症状の著しい軽減をもたらす。この実施形態はまた、ジストロフィンエキソン又は前記エキソンの一方若しくは両方方のスプライス部位に対するオリゴヌクレオチドを用いるとき、そのエキソンを含むｍＲＮＡ前駆体からの前記エキソンのスキッピング頻度も増加させる。その増加されたスキッピング頻度は、ＤＭＤ個体又はＢＭＤ個体の筋細胞において産生される機能的なジストロフィンタンパク質のレベルも増加させる。
【０１００】
１つの実施形態において、前記組成物は、十分に機能しない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症の形態のＢＭＤの１又は２以上の症状を軽減するために使用される。
【０１０１】
ステロイドは、４つの縮合環（通常、６−６−６−５様式で配置される）を有する炭素骨格を特徴とするテルペノイド脂質である。ステロイドは、これらの環に結合される官能基及びそれらの環の酸化状態によって変化する。ステロイドには、腫脹及び炎症を緩和するために通常使用される、ホルモン及び薬（例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン及びビタミンＤ）が含まれる。
【０１０２】
本発明によると、ＤＭＤ患者における補助的なステロイド療法の付加的効果としては、組織の炎症の減少、細胞傷害性細胞の抑制、及びカルシウムホメオスタシスの改善が挙げられる。最も肯定的な結果は、より若年の男児において得られる。好ましくは、ステロイドは、コルチコステロイド、より好ましくは、副腎皮質ステロイドである。好ましくは、プレドニゾンステロイド（例えば、プレドニゾン、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｚｏｌｏｎｅ）又はデフラザコート）が、本発明に従って組み合わせて使用される（Manzur AY, Kuntzer T, Pike M, Swan A. Glucocorticoid corticosteroids for Duchenne muscular dystrophy. Cochrane Database Syst Rev 2004;2）。本明細書中に記載されるような治療への応用に使用されるステロイド又は副腎皮質ステロイドの用量範囲は、厳格なプロトコルの要件が存在する臨床試験における用量漸増試験に基づいて設計される。通常の用量は、プレドニゾン及びプレドニゾロンについては０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、０．７５ｍｇ／ｋｇ／日、並びにデフラザコートについては０．４〜１．４ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、０．９ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０１０３】
１つの実施形態において、ステロイドは、本明細書の前の部分で定義されたような組成物を投与する前に、前記個体に投与される。この実施形態において、前記ステロイドは、前記組成物の投与の少なくとも１日前に投与されることが好ましく、少なくとも１週間前がより好ましく、少なくとも２週間前がより好ましく、少なくとも３週間前がより好ましい。
【０１０４】
別の好ましい実施形態において、組み合わせは、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦα）阻害剤をさらに含む。腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦα）は、炎症反応を刺激する炎症促進性サイトカインである。中和抗体であるインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）によるＴＮＦα活性の薬理学的遮断は、炎症性疾患の症状を減少させる際、臨床上、非常に有効である。ｍｄｘマウスにおいて、インフリキシマブとエタネルセプトの両方が、ジストロフィーの筋肉の壊死を遅延させ、減少させ（Grounds MD, Torrisi J. Anti-TNFalpha (Remicade) therapy protects dystrophic skeletal muscle from necrosis. Faseb J 2004;18(6):676-82.、Hodgetts S, Radley H, Davies M, Grounds MD. Reduced necrosis of dystrophic muscle by depletion of host neutrophils, or blocking TNFalpha function with Etanercept in mdx mice. Neuromuscul Disord 2006;16(9-10):591-602）、筋力、塩素イオンチャネルの機能及びＣＫレベルの低下に対する追加の生理学的利益が、長期間処置され、運動した成体ｍｄｘマウスにおいて証明されている（Pierno S, Nico B, Burdi R, et al. Role of tumour necrosis factor alpha, but not of cyclo-oxygenase-2-derived eicosanoids, on functional and morphological indices of dystrophic progression in mdx mice: a pharmacological approach. Neuropathology and applied neurobiology 2007;33(3):344-59）。他の病態において使用するために設計されたそのような高度に特異的な抗炎症性薬は、ＤＭＤのためにステロイドを使用することの魅力的な代替物である。１つの実施形態において、ＴＮＦα阻害剤の使用は、筋肉の損傷及び変質が特に顕著であるときの男児の集中的な筋成長の期間に限定される。
【０１０５】
薬物として使用するためのＴＮＦα阻害剤をさらに含む組成物も提供される。１つの実施形態において、前記組成物は、十分に機能的でない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症の形態のＢＭＤの１又は２以上の症状を軽減するために使用される。好ましいＴＮＦα阻害剤は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたＴＮＦαのヒトｐ７５受容体の細胞外リガンド結合ドメインから成る二量体融合タンパク質である。より好ましいＴＮＦα阻害剤は、エタネルセプト（ethanercept）（Amgen社製，America）である（Pierno S, Nico B, Burdi R, et al. Role of tumour necrosis factor alpha, but not of cyclo-oxygenase-2-derived eicosanoids, on functional and morphological indices of dystrophic progression in mdx mice: a pharmacological approach. Neuropathology and applied neurobiology 2007;33(3):344-59）。エタネルセプトの通常の用量は、１週間に２回の約０．２ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．５ｍｇ／ｋｇである。その投与は、好ましくは、皮下投与である。
【０１０６】
別の好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ｍＩＧＦ−１の起源物質をさらに含む。本明細書中で定義されるように、ＩＧＦ−１の起源物質は、好ましくは、ｍＩＧＦ−１の発現及び／又は活性を増強することができる化合物であるｍＩＧＦ−１自体を含む。増強は、本明細書中において増加と同義である。ｍＩＧＦ−１の発現は、ｍＩＧＦ−１の量と同義である。ｍＩＧＦ−１は、衛星細胞の活性の増加を通じて筋肉の再生を促進し、炎症及び線維増多を減少させる（Musaro A, McCullagh K, Paul A, et al. Localized Igf-1 transgene expression sustains hypertrophy and regeneration in senescent skeletal muscle. Nat Genet 2001;27(2):195-200）。筋肉の局所的な損傷は、ｍＩＧＦ−１発現を増加させる。追加のＩＧＦ−１遺伝子を有するトランスジェニックマウスにおいて、筋肉肥大及び筋繊維の肥大が観察されている（Musaro A, McCullagh K, Paul A, et al. Localized Igf-1 transgene expression sustains hypertrophy and regeneration in senescent skeletal muscle. Nat Genet 2001;27(2):195-200）。同様に、トランスジェニックｍｄｘマウスは、筋繊維の変性の減少を示す（Barton ER, Morris L, Musaro A, Rosenthal N, Sweeney HL. Muscle-specific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice. J Cell Biol 2002;157(1):137-48）。よって、ｍＩＧＦ−１遺伝子のアップレギュレーション及び／又は余分の量のｍＩＧＦ−１タンパク質若しくはその機能的等価物（特に、ｍＩＧＦ−１Ｅａアイソフォーム［Musaro A, McCullagh K, Paul A, et al. Localized Igf-1 transgene expression sustains hypertrophy and regeneration in senescent skeletal muscle. Nat Genet 2001;27(2):195-200に記載されているようなもの，ヒトホモログＩＧＦ−１アイソフォーム４：配列番号５７７］）の投与は、ＤＭＤに対する他の治療、好ましくは、遺伝療法（アンチセンスに誘導されるエキソンスキッピングを含む）の作用を促進する。上で述べられたトランスジェニックマウスにおける追加のｍＩＧＦ−１レベルは、心臓の問題も誘導しないし、癌も促進せず、また、病理学的副作用も有しない。前に述べたように、ｍＩＧＦ−１の量は、例えば、ｍＩＧＦ−１遺伝子の発現を増強することによって並びに／又はｍＩＧＦ−１タンパク質及び／若しくはその機能的等価物（特に、ｍＩＧＦ−１Ｅａアイソフォーム［Musaro A, McCullagh K, Paul A, et al. Localized Igf-1 transgene expression sustains hypertrophy and regeneration in senescent skeletal muscle. Nat Genet 2001;27(2):195-200に記載されているようなもの，ヒトホモログＩＧＦ−１アイソフォーム４：配列番号５７７］）を投与することによって、増加する。好ましくは、薬物として使用するための、ｍＩＧＦ−１の発現及び／又はｍＩＧＦ−１の活性を増強することができる化合物であるｍＩＧＦ−１をさらに含む本発明の組成物も提供される。前記薬物は、好ましくは、ＤＭＤの１又は２以上の症状を軽減するためのものである。１つの実施形態において、そのような組成物は、十分に機能しない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症の形態のＢＭＤの１又は２以上の症状を軽減するために使用される。
【０１０７】
本発明の文脈内において、ｍＩＧＦ−１の量又は活性の増加は、ＩＧＦ−１遺伝子の遺伝子発現レベルを増加させることによって、対応するＩＧＦ−１タンパク質の量を増加させることによって、及び／又はＩＧＦ１−タンパク質の活性を増加させることによって、達成され得る。好ましいｍＩＧＦ−１タンパク質は、本明細書の前の部分で定義されている。前記タンパク質の活性の増加は、処置されていない個体における前記タンパク質によって発揮される生物学的活性又は前記タンパク質の定常状態レベルと比べたときの前記活性又は定常状態の任意の検出可能な変化のことを意味すると本明細書中で理解される。ｍＩＧＦ−１の量又は活性の増加は、好ましくは、筋肉肥大の生物学的マーカーＧＡＴＡ−２（Musaro A, McCullagh K, Paul A, et al. Localized Igf-1 transgene expression sustains hypertrophy and regeneration in senescent skeletal muscle. Nat Genet 2001;27(2):195-200に記載されているようなもの）の発現の増加の検出によって評価される。
【０１０８】
遺伝子発現レベルは、好ましくは、古典的な分子生物学手法（例えば、（リアルタイム）ＰＣＲ、アレイ又はノーザン解析）を用いて評価される。タンパク質の定常状態レベルは、タンパク質の量を定量化することによって直接測定される。タンパク質の量の定量化は、任意の公知の手法（例えば、タンパク質に対して作製された抗体を用いるウエスタンブロッティング又はイムノアッセイ）によって行われてもよい。対応するタンパク質の基質の定量化、又は対応するタンパク質の機能若しくは活性と関連すると知られている任意の化合物の定量化、或いは、特定のアッセイを用いた対応するタンパク質の前記機能又は活性の定量化を、二者択一的に又は遺伝子発現レベル及び／若しくは対応するタンパク質の定量化と組み合わせて用いることにより、タンパク質の活性又は定常状態レベルの変化を評価してもよいことを当業者は理解するであろう。
【０１０９】
本発明において、前記タンパク質の活性又は定常状態レベルは、例えば、外来性の起源由来の細胞に対してあるタンパク質を提供することによって、そのタンパク質自体のレベルで変化し得る。
【０１１０】
好ましくは、前記遺伝子の発現レベルの増加又はアップレギュレーションは、アレイを用いたときの前記遺伝子の発現レベルの少なくとも５％の増加を意味する。より好ましくは、前記遺伝子の発現レベルの増加は、少なくとも１０％、なおもより好ましくは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１５０％又はそれ以上の増加を意味する。別の好ましい実施形態において、前記タンパク質の発現レベルの増加は、ウエスタンブロッティング及び／若しくはＥＬＩＳＡ又は適当なアッセイを用いたときの、前記タンパク質の発現レベルの少なくとも５％の増加を意味する。より好ましくは、タンパク質の発現レベルの増加は、少なくとも１０％、なおもより好ましくは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１５０％又はそれ以上の増加を意味する。
【０１１１】
別の好ましい実施形態において、ポリペプチド活性の増加は、適当なアッセイを用いたときのポリペプチド活性の少なくとも５％の増加を意味する。より好ましくは、ポリペプチド活性の増加は、少なくとも１０％、なおもより好ましくは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１５０％又はそれ以上の増加を意味する。上記増加は、好ましくは、処置前の個体における対応する活性との比較によって評価される。
【０１１２】
ｍＩＧＦ−１の起源物質を提供する好ましい方法は、ｍＩＧＦ１、好ましくは、ｍＩＧＦ−１Ｅａアイソフォーム（Musaro A, McCullagh K, Paul A, et al. Localized Igf-1 transgene expression sustains hypertrophy and regeneration in senescent skeletal muscle. Nat Genet 2001;27(2):195-200に記載されているようなもの，ヒトホモログＩＧＦ−１アイソフォーム４：配列番号５７７）をコードするトランスジーン、より好ましくは、本明細書の後で定義されるようなＡＡＶベクターにおけるものを導入することである。そのようなｍＩＧＦ１の起源物質は、Musaro A, McCullagh K, Paul A, et al. Localized Igf-1 transgene expression sustains hypertrophy and regeneration in senescent skeletal muscle. Nat Genet 2001;27(2):195-200に記載されているようにマウスの筋組織において特異的に発現される。
【０１１３】
別の好ましい実施形態において、組成物は、抗酸化物質をさらに含む。酸化ストレスは、ＤＭＤの進行において重要な因子であり、慢性炎症及び線維増多を促進する（Disatnik MH, Dhawan J, Yu Y, et al. Evidence of oxidative stress in mdx mouse muscle: studies of the pre-necrotic state. J Neurol Sci 1998;161(1):77-84）。酸化ストレスの最も優勢な産物である過酸化脂質は、デュシェンヌ型男児において平均３５％増加している。高レベルのスーパーオキシドジスムターゼ酵素及びカタラーゼ酵素は、これらの影響を引き起こす過剰量のフリーラジカルを減少させる。実際に、栄養補助食品Ｐｒｏｔａｎｄｉｍ（登録商標）（LifeVantage社製）を臨床的に検査したところ、スーパーオキシドジスムターゼ（最大３０％）及びカタラーゼ（最大５４％）のレベルを増加させることが見出され、これは、実際に２９人の健常人における脂質の過酸化を有意に阻害した（Nelson SK, Bose SK, Grunwald GK, Myhill P, McCord JM. The induction of human superoxide dismutase and catalase in vivo: a fundamentally new approach to antioxidant therapy. Free radical biology & medicine 2006;40(2):341-7）。よって、このような酸化ストレスの効果的な管理によって、筋肉の質が保存され、そしてＤＭＤ治療の正の効果が促進される。イデベノンは、天然のコエンザイムＱ１０に由来する化学構造を有する別の強力な抗酸化物質である。イデベノンは、酸化的リン酸化によってアデノシン三リン酸，ＡＴＰを産生するミトコンドリアを保護する。ＤＭＤにおいてジストロフィンが存在しないことにより、心臓において（おそらく骨格筋においても）このプロセスは悪影響を受ける。イデベノンは、最近、米国及び欧州において臨床試験に適用され、フリードライヒ運動失調症の神経性の局面に対する有効性が証明された（Hart PE, Lodi R, Rajagopalan B, et al. Antioxidant treatment of patients with Friedreich ataxia: four-year follow-up. Archives of neurology 2005;62(4):621-6）。８〜１６歳の２１人のデュシェンヌ型男児が参加する、イデベノンを用いた第IIａ相の二重盲検プラセボ対照ランダム化臨床試験が、ベルギーにおいて最近開始された。この研究の主目的は、心筋機能に対するイデベノンの作用を測定することである。さらに、患者の筋力に対する起き得る機能的な利益を検出するいくつかの異なる試験が、行われることになっている。イデベノンは、有効であるとき、ＤＭＤ治療の治療効果、特に、心臓における治療効果を増強するために本発明に従って併用で使用するための好ましい補助化合物である。薬物として使用するための抗酸化物質をさらに含む組成物も提供される。前記薬物は、好ましくは、ＤＭＤの１又は２以上の症状を軽減するためのものである。１つの実施形態において、前記組成物は、十分に機能しない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症の形態のＢＭＤの１又は２以上の症状を軽減するために使用される。抗酸化物質の独自性に応じて、当業者は、どれくらいの量を使用するのが好ましいかを承知している。抗酸化物質としては、バコシド（bacoside）、シリマリン、クルクミン及び／又はポリフェノールが挙げられ得る。好ましくは、ポリフェノールは、エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）であるか、又はそれを含む。好ましくは、抗酸化物質は、栄養補助食品プロタンディム（Protandim）（登録商標）（LifeVantage社製）の���うな抗酸化物質の混合物である。６７５ｍｇのプロタンディム（登録商標）の１日量のカプセルは、１５０ｍｇのバコパモンニエラ（B.monniera）（４５％バコシド）、２２５ｍｇのマリアアザミ（S.marianum）（７０〜８０％シリマリン）、１５０ｍｇのアシュワガンダ（W.somnifera）粉末、７５ｍｇの緑茶（９８％ポリフェノール、そのうち４５％がＥＧＣＧ）及び７５ｍｇのターメリック（９５％クルクミン）を含む。
【０１１４】
別の好ましい実施形態において、組成物は、イオンチャネル阻害剤をさらに含む。ＤＭＤにおける損傷された筋肉膜の存在は、筋繊維へのカルシウムイオンの通過を妨害し、その結果として、妨害されたカルシウムホメオスタシスは、追加の損傷及び筋肉壊死を引き起こす多くの酵素、例えば、プロテアーゼを活性化する。ジストロフィーの筋肉におけるカルシウムの病的蓄積に直接関与するイオンチャネルは、ＤＭＤを処置する補助化合物に対する潜在的な標的である。ペントキシフィリンなどの一部の薬は、運動感受性カルシウムチャネルを遮断し（Rolland JF, De Luca A, Burdi R, Andreetta F, Confalonieri P, Conte Camerino D. Overactivity of exercise-sensitive cation channels and their impaired modulation by IGF-1 in mdx native muscle fibers: beneficial effect of pentoxifylline. Neurobiol Dis 2006;24(3):466-74）、伸展活性化チャネルを遮断する抗生物質は、ｍｄｘマウスにおける筋繊維の壊死及びＤＭＤ男児におけるＣＫレベルを減少させる（Whitehead NP, Streamer M, Lusambili LI, Sachs F, Allen DG. Streptomycin reduces stretch-induced membrane permeability in muscles from mdx mice. Neuromuscul Disord 2006;16(12):845-54）という証拠が存在する。薬物として使用するためのイオンチャネル阻害剤をさらに含む組成物もまた提供される。前記薬物は、好ましくは、ＤＭＤの１又は２以上の症状を軽減するためのものである。１つの実施形態において、前記組成物は、十分に機能しない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症の形態のＢＭＤの１又は２以上の症状を軽減するために使用される。
【０１１５】
好ましくは、キサンチンのクラスのイオンチャネル阻害剤が使用される。より好ましくは、前記キサンチンは、メチルキサンチンの誘導体であり、最も好ましくは、前記メチルキサンチン誘導体は、ペントキシフィリン、フラフィリン（furafylline）、リソフィリン（lisofylline）、プロペントフィリン、ペンチフィリン、テオフィリン、トルバフィリン（torbafylline）、アルビフィリン（albifylline）、エンプロフィリン（enprofylline）及びそれらの誘導体から成る群から選択される。最も好ましいのは、ペントキシフィリンの使用である。キサンチンのクラスのイオンチャネル阻害剤は、ジストロフィンエキソン又は前記エキソンの一方若しくは両方方のスプライス部位に対するオリゴヌクレオチドを用いるときの、前記エキソンを含むｍＲＮＡ前駆体からのそのエキソンのスキッピング頻度を増加させる。そのスキッピング頻度の増加は、ＤＭＤ個体又はＢＭＤ個体の筋細胞において産生される機能的なジストロフィンタンパク質のレベルも増加させる。
【０１１６】
イオンチャネル阻害剤の独自性に応じて、当業者は、どれくらいの量を使用するのが好ましいかを承知している。ペントキシフィリンの適当な投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日であり、好ましい投薬量は、１０ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日である。ヒトにおいて使用される典型的な投薬量は、２０ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０１１７】
１つの実施形態において、イオンチャネル阻害剤は、オリゴヌクレオチドを含む組成物を投与する前に前記個体に投与される。この実施形態において、前記イオンチャネル阻害剤が、オリゴヌクレオチドを含む組成物の投与の少なくとも１日前に投与されることが好ましく、少なくとも１週間前がより好ましく、少なくとも２週間前がより好ましく、少なくとも３週間前がより好ましい。
【０１１８】
別の好ましい実施形態において、組成物は、プロテアーゼ阻害剤をさらに含む。カルパインは、ジストロフィーの筋肉において増加しており、且つ筋繊維の変性の原因となる、カルシウムによって活性化されるプロテアーゼである。ゆえに、カルパイン阻害剤（例えば、カルパスタチン、ロイペプチン（Badalamente MA, Stracher A. Delay of muscle degeneration and necrosis in mdx mice by calpain inhibition. Muscle Nerve 2000;23(1):106-11）、カルペプチン（ｃａｌｐｅｐｔｉｎ）、カルパイン阻害剤III又はＰＤ１５０６０６）は、変性プロセスを減少させるために適用される。カルパイン阻害剤と抗酸化物質との両方としての二重の作用を有する新しい化合物であるＢＮ８２２７０（Ｉｐｓｅｎ）は、筋力を増加させ、血清ＣＫを減少させ、そしてｍｄｘ横隔膜の線維症を減少させたことから、この新しい化合物による治療効果が示唆された（Burdi R, Didonna MP, Pignol B, et al. First evaluation of the potential effectiveness in muscular dystrophy of a novel chimeric compound, BN 82270, acting as calpain-inhibitor and anti-oxidant. Neuromuscul Disord 2006;16(4):237-48）。ロイペプチン／カルニチンの別の化合物（Myodur）が、最近、ＤＭＤ患者における臨床試験に提案されている。
【０１１９】
ＭＧ１３２は、筋肉膜の損傷を減少させ、且つ筋ジストロフィーの病理組織学的徴候をよくすると示されている別のプロテアソーム阻害剤である（Bonuccelli G, Sotgia F, Schubert W, et al. Proteasome inhibitor (MG-132) treatment of mdx mice rescues the expression and membrane localization of dystrophin and dystrophin-associated proteins. Am J Pathol 2003;163(4):1663-75）。ＭＧ−１３２（ＣＢＺ−ロイシル−ロイシル−ロイシナール）は、ＩカッパーＢの分解を妨げることによってＮＦカッパーＢの活性化を阻害する（ＩＣ５０＝３μＭ）細胞透過性プロテアソーム阻害剤（Ｋｉ＝４ｎＭ）である。さらに、これは、２０Ｓ及び２６Ｓプロテアソームに結合してそれらを不活性化することによってユビキチン媒介性のタンパク質分解を阻害するペプチドアルデヒドである。ＭＧ−１３２は、ジストロフィーのｍｄｘマウスモデルにおいてジストロフィン関連タンパク質のプロテアソーム分解を阻害すると示されている（Bonuccelli G, Sotgia F, Schubert W, et al. Proteasome inhibitor (MG-132) treatment of mdx mice rescues the expression and membrane localization of dystrophin and dystrophin-associated proteins. Am J Pathol 2003;163(4):1663-75）。よって、この化合物は、ＤＭＤに対する補助的な薬理学的化合物としての使用にも適している。薬物として使用するためのプロテアーゼ阻害剤をさらに含む組成物もまた提供される。前記薬物は、好ましくは、ＤＭＤの１又は２以上の症状を軽減するためのものである。１つの実施形態において、前記組み合わせは、十分に機能しない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症の形態のＢＭＤの１又は２以上の症状を軽減するために使用される。プロテアーゼ阻害剤の独自性に応じて、当業者は、どれくらいの量を使用するのが好ましいかを承知している。
【０１２０】
別の好ましい実施形態において、組成物は、Ｌ−アルギニンをさらに含む。ジストロフィン欠損は、神経型一酸化窒素シンターゼ（ｎＮＯＳ）をはじめとした線維膜におけるＤＧＣ複合体の喪失に関連する。ｍｄｘマウスにおけるｎＮＯＳトランスジーンの発現は、筋肉膜の損傷を大きく減少させた。同様に、Ｌ−アルギニン（一酸化窒素シンターゼに対する基質）の投与は、ｍｄｘマウスにおいてＮＯの産生を増加させ、ユートロフィンの発現をアップレギュレートさせた。６週間にわたるＬ−アルギニン処置により、ｍｄｘマウスにおいて筋肉の病理が改善され、血清ＣＫが減少した（Voisin V, Sebrie C, Matecki S, et al. L-arginine improves dystrophic phenotype in mdx mice. Neurobiol Dis 2005;20(1):123-30）。本発明の組成物中のさらなる構成物としてのＬ−アルギニンの使用は、開示されたことがない。
【０１２１】
薬物として使用するためのＬ−アルギニンをさらに含む組成物もまた提供される。前記薬物は、好ましくは、ＤＭＤの１又は２以上の症状を軽減するためのものである。１つの実施形態において、前記組成物は、十分に機能しない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症の形態のＢＭＤの１又は２以上の症状を軽減するために使用される。
【０１２２】
別の好ましい実施形態において、組成物は、ジストロフィン欠損ｍｄｘマウスモデルにおいて示されているように筋肉の構造、修復及び機能を正常化する（Cohn RD, van Erp C, Habashi JP, et al. Angiotensin II type 1 receptor blockade attenuates TGF-beta-induced failure of muscle regeneration in multiple myopathic states. Nat Med 2007;13(2):204-10）１型アンギオテンシンII受容体拮抗薬ロサルタンをさらに含む。薬物として使用するための１型アンギオテンシンII受容体拮抗薬ロサルタンをさらに含む組成物もまた提供される。前記薬物は、好ましくは、ＤＭＤの１又は２以上の症状を軽減するためのものである。１つの実施形態において、前記組成物は、十分に機能しない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症の形態のＢＭＤの１又は２以上の症状を軽減するために使用される。１型アンギオテンシンII受容体拮抗薬の独自性に応じて、当業者は、どれくらいの量を使用するのが好ましいかを承知している。
【０１２３】
別の好ましい実施形態において、組成物は、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、好ましくは、ペリンドプリル（perindopril）をさらに含む。ＡＣＥ阻害剤は、血圧を低下させることができる。ペリンドプリルによる処置の早期開始は、ＤＭＤ患者における低死亡率に関連する（Duboc D, Meune C, Pierre B, et al. Perindopril preventive treatment on mortality in Duchenne muscular dystrophy: 10 years' follow-up. American heart journal 2007;154(3):596-602）。薬物として使用するためのＡＣＥ阻害剤、好ましくは、ペリンドプリルをさらに含む組成物もまた提供される。前記薬物は、好ましくは、ＤＭＤの１又は２以上の症状を軽減するためのものである。１つの実施形態において、前記組成物は、十分に機能しない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症の形態のＢＭＤの１又は２以上の症状を軽減するために使用される。ＡＣＥ阻害剤、好ましくは、ペリンドプリルの通常の用量は、約２〜４ｍｇ／日である（Duboc D, Meune C, Pierre B, et al. Perindopril preventive treatment on mortality in Duchenne muscular dystrophy: 10 years' follow-up. American heart journal 2007;154(3):596-602）。
【０１２４】
より好ましい実施形態において、ＡＣＥ阻害剤は、先に特定された補助化合物の少なくとも１つと組み合わされる。
【０１２５】
別の好ましい実施形態において、組成物は、リードスルー活性を示す化合物をさらに含む。リードスルー活性を示す化合物は、終止コドンを抑制することができる任意の化合物であり得る。ＤＭＤ患者の２０％では、ジストロフィン遺伝子の変異は、点変異を含んでおり、その１３％は、ナンセンス変異である。リードスルー活性を示すか又は終止コドンを抑制することができる化合物は、機能的なジストロフィンｍＲＮＡ若しくはタンパク質の量の増加、及び／又は異常な若しくは切断型のジストロフィンｍＲＮＡ若しくはタンパク質の量の減少を提供することができる化合物である。増加は、好ましくは、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％又はそれ以上の増加を意味する。減少は、好ましくは、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％又はそれ以上の減少を意味する。前記タンパク質の増加又は減少は、好ましくは、前記リードスルー活性を示す化合物で処置される前の個体に存在する量との比較によって、前記個体の筋組織又は筋細胞において評価される。或いは、その比較は、その処置が局所的である場合、前記化合物でまだ処置されていない前記個体の筋組織又は筋細胞を用いて行うことができる。タンパク質レベルでの量の評価は、好ましくは、ウエスタンブロット解析を用いて行われる。
【０１２６】
リードスルー活性を示す好ましい化合物は、アミノグリコシド（ジェネテシン（Ｇ４１８）、パロモマイシン、ゲンタマイシン及び／又は３−（５−（２−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）安息香酸が挙げられるがこれらに限定されない）及びそれらの誘導体を含むか又はそれらから成る（Howard et al., Ann Neurol 2004 55(3): 422-6;、Nudelman et al., 2006, Bioorg Med Chem Lett 16(24), 6310-5）。より好ましいリードスルー活性を示す化合物は、PTC124（商標）及び／又はその機能的等価物を含むか又はそれらから成る。PTC124（商標）は、PTC Therapeutics, Inc.社，Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙの登録商標である。PTC124（商標））としても知られる３−（５−（２−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）安息香酸）（Welch EM, Barton ER, Zhuo J, et al. PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations. Nature 2007;447(7140):87-91.、Hirawat S, Welch EM, Elfring GL, et al. Safety, tolerability, and pharmacokinetics of PTC124, a nonaminoglycoside nonsense mutation suppressor, following single- and multiple-dose administration to healthy male and female adult volunteers. Journal of clinical pharmacology 2007;47(4):430-44）は、ゲンタマイシンのリードスルー活性を低濃度で模倣する小分子の新しいクラスに属する（Wagner KR, Hamed S, Hadley DW, et al. Gentamicin treatment of Duchenne and Becker muscular dystrophy due to nonsense mutations. Ann Neurol 2001;49(6):706-11）。３−（５−（２−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）安息香酸）又はゲンタマイシンの機能的等価物は、本明細書の前の部分で定義されたようなリードスルー活性を示すことができる化合物である。最も好ましくは、リードスルー活性を示す化合物は、ゲンタマイシン及び／又はPTC124（商標）としても知られる３−（５−（２−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）安息香酸）を含むか又はそれらから成る。リードスルー活性を示す化合物をさらに含む組成物、好ましくは、薬物として使用するためのゲンタマイシン及び／又は３−（５−（２−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）安息香酸）を含むか又はそれらから成る組成物もまた提供される。前記薬物は、好ましくは、ＤＭＤの１又は２以上の症状を軽減するためのものである。１つの実施形態において、前記組成物は、十分に機能しない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症の形態のＢＭＤの１又は２以上の症状を軽減するために使用される。リードスルー活性を示す化合物、好ましくは、３−（５−（２−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）安息香酸）又はゲンタマイシンの通常の用量は、３ｍｇ／ｋｇ／日〜２００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり、好ましい投薬量は、１日あたり又は１日に２回の１０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇである。
【０１２７】
より好ましい実施形態において、リードスルー活性を示す化合物は、先に特定された補助化合物の少なくとも１つと組み合わされる。
【０１２８】
別の好ましい実施形態において、組成物は、エキソンスキッピングを増加させること並びに／又はスプライセオソームの集合及び／若しくはスプライシングを阻害することができる化合物をさらに含む。小さい化学的化合物（例えば、特定のインドール誘導体）は、例えば、同族のスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ又はＥＳＥ）へのセリン−及びアルギニン−リッチ（ＳＲ）タンパク質の結合を干渉することによって、並びに／又はサイレンサー配列（ＥＳＳ又はＩＳＳ）へのスプライシング抑制因子の結合を干渉することによって、スプライセオソームの集合及びスプライシングを選択的に阻害することが示されている（Soret J, Bakkour N, Maire S, et al. Selective modification of alternative splicing by indole derivatives that target serine-arginine-rich protein splicing factors. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102(24):8764-9）。ゆえに、これらの化合物は、エキソンスキッピングを増加させる補助化合物としての適用に適している。薬物として使用するための、エキソンスキッピングを増加させるため並びに／又はスプライセオソームの集合及び／若しくはスプライシングを阻害するための化合物をさらに含む組成物もまた提供される。前記薬物は、好ましくは、ＤＭＤの１又は２以上の症状を軽減するためのものである。１つの実施形態において、前記組成物は、十分に機能しない非常に短いジストロフィンタンパク質が形成される重症の形態のＢＭＤの１又は２以上の症状を軽減するために使用される。エキソンスキッピングを増加させること、並びに／又はスプライセオソームの集合及び／若しくはスプライシングを阻害することができる化合物の独自性に応じて、当業者は、どれくらいの量を使用するのが好ましいかを承知している。より好ましい実施形態において、エキソンスキッピングを増加させるため並びに／又はスプライセオソームの集合及び／若しくはスプライシングを阻害するための化合物は、ＡＣＥ阻害剤及び／又は本明細書の前の部分で特定されたような任意の補助化合物と組み合わされる。
【０１２９】
よって、本発明は、補助化合物をさらに含む組成物を提供し、ここで、前記補助化合物は、ステロイド、ＡＣＥ阻害剤（好ましくは、ペリンドプリル）、１型アンギオテンシンII受容体拮抗薬ロサルタン、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦα）阻害剤、ｍＩＧＦ−１の起源物質、好ましくは、ｍＩＧＦ−１、ｍＩＧＦ−１の発現を増加させるための化合物、ｍＩＧＦ−１の活性を増加させるための化合物、抗酸化物質、イオンチャネル阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、Ｌ−アルギニン、リードスルー活性を示す化合物並びに／又はスプライセオソームの集合及び／若しくはスプライシングを阻害する化合物を含む。
【０１３０】
１つの実施形態において、さらに、マイクロ−ミニ−ジストロフィン遺伝子を含むベクター、好ましくは、ウイルスベクターを用いて、機能的なジストロフィンタンパク質を個体に提供する。最も好ましくは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが使用される。ＡＡＶは、非病原性でありヘルパー依存性の生活環を示す一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。ｒＡＡＶベクターは、他のウイルス（アデノウイルス、レトロウイルス及び単純ヘルペスウイルス）とは対照的に、成熟骨格筋を形質導入する際に非常に有効であると証明されている。古典的なＤＭＤ「遺伝子付加」研究におけるｒＡＡＶの適用は、その限られたパッケージング限界（＜５ｋｂ）によって邪魔されている。ゆえに、ｒＡＡＶは、好ましくは、一層小さいマイクロ−又はミニ−ジストロフィン遺伝子の効率的な送達に適用される。そのようなマイクロ−又はミニ−ジストロフィン遺伝子の投与は、少なくとも部分的に機能的なジストロフィンタンパク質の出現をもたらす。Wang B, Li J, Xiao X. Adeno-associated virus vector carrying human minidystrophin genes effectively ameliorates muscular dystrophy in mdx mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97(25):13714-9.、Fabb SA, Wells DJ, Serpente P, Dickson G. Adeno-associated virus vector gene transfer and sarcolemmal expression of a 144 kDa micro-dystrophin effectively restores the dystrophin-associated protein complex and inhibits myofibre degeneration in nude/mdx mice. Hum Mol Genet 2002;11(7):733-41.、Wang Z, Kuhr CS, Allen JM, et al. Sustained AAV-mediated dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy with a brief course of immunosuppression. Mol Ther 2007;15(6):1160-6に言及されている。
【０１３１】
組成物の各構成物は、任意の順序で個体に投与することができる。１つの実施形態において、各構成物は、同時に投与される（これは、各構成物が１０時間以内、好ましくは、１時間以内に投与されることを意味する）。しかしながら、これは必須ではない。１つの実施形態において、少なくとも１つの補助化合物は、それを必要とする個体にオリゴヌクレオチドの投与の前に投与される。或いは、オリゴヌクレオチドは、それを必要とする個体に少なくとも１つの補助化合物の投与の前に投与される。
【０１３２】
使用
さらなる態様において、個体におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーを予防又は治療するための薬物を製造するための、本明細書中に定義されるようなオリゴヌクレオチド（oligoucleotide）又は組成物の使用が提供される。前記使用の各特徴は、本明細書の前の部分で定義されている。
【０１３３】
本発明に記載の使用又は方法における治療は、少なくとも１週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも数ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２、３、４、５、６年又はそれ以上である。本発明に記載の使用のための本明細書中に定義されるような分子若しくはオリゴヌクレオチド又はそれらの等価物の各々は、ＤＭＤ又はＢＭＤに冒されているか又はそれらを発症するリスクのある個体の細胞、組織及び／又は器官へのインビボにおける直接投与に適していてもよいし、インビボ、エキソビボ又はインビトロにおいて直接投与されてもよい。本発明のオリゴヌクレオチド、組成物、化合物又は補助化合物の投与の頻度は、いくつかのパラメータ（例えば、患者の年齢、患者の変異、分子の数（すなわち用量）、前記分子の製剤化）に依存し得る。その頻度は、２週間又は３週間又は４週間又は５週間又はそれ以上の期間に少なくとも１回の範囲であり得る。
【０１３４】
方法
さらなる態様において、個体におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１又は２以上の症状を軽減するため又は前記個体の筋原細胞若しくは筋細胞の１又は２以上の特性を軽減するための方法が提供され、その方法は、本明細書中に定義されるようなオリゴヌクレオチド又は組成物を前記個体に投与する工程を包含する。
【０１３５】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーに罹患している個体においてジストロフィンｍＲＮＡ前駆体を発現している細胞における前記ｍＲＮＡ前駆体からのエキソンのスキッピングを増加させるため、誘導するため又は促進するための方法がさらに提供され、その方法は、本明細書中に定義されるようなオリゴヌクレオチド又は組成物を前記個体に投与する工程を包含する。
【０１３６】
細胞における機能的なジストロフィンタンパク質の産生を増加させるため及び／又は異常なジストロフィンタンパク質の産生を減少させるための方法がさらに提供され、前記細胞は、異常なジストロフィンタンパク質をコードするジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡ前駆体を含んでおり、前記方法は、前記細胞に本発明のオリゴヌクレオチド又は組成物を提供する工程及び前記ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングから生成されるｍＲＮＡの翻訳を可能にする工程を包含する。１つの実施形態において、前記方法は、インビトロにおいて、例えば、細胞培養を用いて、行われる。好ましくは、前記方法は、インビボにおける方法である。
【０１３７】
この文脈において、機能的なジストロフィンタンパク質の産生の増加は、本明細書の前の部分で定義されている。
【０１３８】
別段示されない限り、本明細書中に記載されるような各実施形態は、本明細書中に記載されるような別の実施形態と組み合わされてもよい。
【０１３９】
この書面及びその請求項において、動詞「含む（to comprise）」及びその語形変化は、非限定的な意味において、その単語の前にくるものが含められるが、明確に述べられていないものは除外されないことを意味するために使用される。さらに、動詞「成る(to consist)」は、本明細書中に定義されるような化合物又は補助化合物が、明確に特定されるものの他に追加の成分を含んでもよいことを意味する「本質的に成る(to consist essentially of)」によって置き換えられてもよく、前記追加の成分は、本発明の独特の特性を変化させない。
【０１４０】
さらに、不定冠詞「a」又は「an」によるエレメントに対する言及は、文脈がそのエレメントの１つ及びただ１つが存在することを明らかに要求しない限り、１つより多いそのエレメントが存在する可能性を除外しない。よって、不定冠詞「a」又は「an」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【０１４１】
数値と関連して使用されるときの単語「およそ(approximately)」又は「約(about)」（およそ１０、約１０）は、好ましくは、その値が、１０という所与の値の１％大きい又は小さい値であり得ることを意味する。
【０１４２】
本明細書において引用されたすべての特許及び参照文献は、それらの全体が本明細書によって参考として援用される。本明細書中で特定されるような各実施形態は、別段示されない限り、共に組み合わされてもよい。
【０１４３】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明される。これらの実施例は、本発明の範囲を限定せず、本発明を明らかにするためにだけ役立つものである。
【実施例１】
【０１４４】
材料及び方法
ＡＯＮの設計は、ｍ−ｆｏｌｄプログラムによって予測された標的のエキソンのＲＮＡの（部分的に）重複する開いた二次構造、ＥＳＥ−ｆｉｎｄｅｒソフトウェアによって予測された（部分的に）重複する推定ＳＲ−タンパク質結合部位に基づいた。ＡＯＮは、Prosensa Therapeutics B.V.社（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって合成されたものであり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ及び全長にわたるホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を含む。
【０１４５】
組織培養、トランスフェクション及びＲＴ−ＰＣＲ解析
健常個体（「ヒトコントロール」）（実施例１、３及び４；エキソン４３、５０、５２スキッピング）又はエキソン４５欠失を有するＤＭＤ患者（実施例２；エキソン４６スキッピング）に由来する筋管培養物を、以前に報告されているように（Aartsma-Rus et al., Neuromuscul.Disord. 2002; 12: S71-77及びHum Mol Genet 2003; 12(8): 907-14）処理した。ＡＯＮのスクリーニングのために、筋管培養物を各ＡＯＮ（ＰＳ２２０及びＰＳ３０５）について２００ｎＭでトランスフェクトした。トランスフェクション試薬UNIFectylin（Prosensa Therapeutics BV社製，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、ＡＯＮ１μｇあたり２μｌのUNIFectylinで使用した。標的とされるエキソン４５に隣接するエキソンにおけるプライマーを用いたネステッドＲＴ−ＰＣＲ解析によって、エキソンスキッピング効率を測定した。配列の検証のために、ＰＣＲ断片をアガロースゲルから単離した。定量化のために、DNA1000LabChip Kitを用いてAgilent 2100バイオアナライザー（Agilent Technologies社製，ＵＳＡ）においてＰＣＲ産物を解析した。
【０１４６】
結果
ＤＭＤエキソン４５スキッピング．
エキソン４５内の同一の配列を標的にしている２つのＡＯＮ、ＰＳ２２０（配列番号７６；5’-UUUGCCGCUGCCCAAUGCCAUCCUG-3’）とＰＳ３０５（配列番号５５７；5’-UUUGCCICUGCCCAAUGCCAUCCUG-3’）の両方を、健常コントロール筋管培養物において、相対的なスキッピング効率について直接比較した。単離されたＲＮＡのその後のＲＴ−ＰＣＲ及び配列解析から、両方のＡＯＮが、実際にエキソン４５スキッピングを誘導することができたことが証明された。ＧＣＣＧＣというストレッチから成るＰＳ２２０は、図１に示されるように最高レベルのエキソン４５スキッピング（最大７３％）を再現性よく誘導した。しかしながら、ＰＳ２２０と同一であるがそのストレッチ内の４位のＧに対するイノシンへの置換を含むＰＳ３０５もまた、有効であり、最大４６％のエキソン４５スキッピングのレベルをもたらした。非処理細胞（ＮＴ）では、エキソン４５スキッピングは観察されなかった。
【実施例２】
【０１４７】
材料及び方法
ＡＯＮの設計は、ｍ−ｆｏｌｄプログラムによって予測された標的のエキソン４５のＲＮＡの（部分的に）重複する開いた二次構造、ＥＳＥ−ｆｉｎｄｅｒソフトウェアによって予測された（部分的に）重複する推定ＳＲ−タンパク質結合部位に基づいた。ＡＯＮは、Prosensa Therapeutics B.V.社（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって合成されたものであり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、全長にわたるホスホロチオエート（ＰＳ）骨格及びグアノシンに対する１つのイノシンの置換を含む。
【０１４８】
組織培養、トランスフェクション及びＲＴ−ＰＣＲ解析
健常個体（「ヒトコントロール」）に由来する筋管培養物を、以前に報告されているように（Aartsma-Rus et al., Neuromuscul.Disord. 2002; 12: S71-77及びHum Mol Genet 2003; 12(8): 907-14）処理した。ＡＯＮのスクリーニングのために、筋管培養物を各ＡＯＮについて２００ｎＭでトランスフェクトした。トランスフェクション試薬UNIFectylin（Prosensa Therapeutics BV社製，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、ＡＯＮ１μｇあたり２μｌのUNIFectylinで使用した。標的とされるエキソン４５に隣接するエキソンにおけるプライマーを用いたネステッドＲＴ−ＰＣＲ解析によって、エキソンスキッピング効率を測定した。配列の検証のために、ＰＣＲ断片をアガロースゲルから単離した。定量化のために、DNA1000LabChip Kitを用いてAgilent 2100バイオアナライザー（Agilent Technologies社製，ＵＳＡ）においてＰＣＲ産物を解析した。
【０１４９】
結果
ＤＭＤエキソン４５スキッピング
エキソン４５を標的にし、且つ１つのイノシン置換を含む追加の一連のＡＯＮを、エキソン４５スキッピング効率について健常コントロール筋管培養物において試験し、ＰＳ２２０（イノシンを含まない；配列番号７６））及びＰＳ３０５（ＰＳ２２０と同一配列であるがイノシン置換を含む；配列番号５５７）と直接比較した。単離されたＲＮＡのその後のＲＴ−ＰＣＲ及び配列解析から、すべての新しいＡＯＮ（ＰＳ３０９〜ＰＳ３１６）が、図２に示されるように、４％（ＰＳ３１１）〜２５％（ＰＳ３１０）、エキソン４５スキッピングを誘導することができたことが証明された。ＰＳ２２０及びＰＳ３０５と比較すると、ＰＳ２２０は、最高レベルのエキソン４５スキッピングを誘導した（最大７２％）。新しいイノシン含有ＡＯＮのうち、最大６３％のエキソン４５スキッピングレベルを示すＰＳ３０５が最も有効であった。非処理細胞（ＮＴ）では、エキソン４５スキッピングは観察されなかった。
【０１５０】
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【０１５１】
ＤＭＤ遺伝子アミノ酸配列
配列番号１：
MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDGRRLLDLLEGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIVDGNHKLTLGLIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSWVRQSTRNYPQVNVINFTTSWSDGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAFNIARYQLGIEKLLDPEDVDTTYPDKKSILMYITSLFQVLPQQVSIEAIQEVEMLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYSQQITVSLAQGYERTSSPKPRFKSYAYTQAAYVTTSDPTRSPFPSQHLEAPEDKSFGSSLMESEVNLDRYQTALEEVLSWLLSAEDTLQAQGEISNDVEVVKDQFHTHEGYMMDLTAHQGRVGNILQLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWECLRVASMEKQSNLHRVLMDLQNQKLKELNDWLTKTEERTRKMEEEPLGPDLEDLKRQVQQHKVLQEDLEQEQVRVNSLTHMVVVVDESSGDHATAALEEQLKVLGDRWANICRWTEDRWVLLQDILLKWQRLTEEQCLFSAWLSEKEDAVNKIHTTGFKDQNEMLSSLQKLAVLKADLEKKKQSMGKLYSLKQDLLSTLKNKSVTQKTEAWLDNFARCWDNLVQKLEKSTAQISQAVTTTQPSLTQTTVMETVTTVTTREQILVKHAQEELPPPPPQKKRQITVDSEIRKRLDVDITELHSWITRSEAVLQSPEFAIFRKEGNFSDLKEKVNAIEREKAEKFRKLQDASRSAQALVEQMVNEGVNADSIKQASEQLNSRWIEFCQLLSERLNWLEYQNNIIAFYNQLQQLEQMTTTAENWLKIQPTTPSEPTAIKSQLKICKDEVNRLSGLQPQIERLKIQSIALKEKGQGPMFLDADFVAFTNHFKQVFSDVQAREKELQTIFDTLPPMRYQETMSAIRTWVQQSETKLSIPQLSVTDYEIMEQRLGELQALQSSLQEQQSGLYYLSTTVKEMSKKAPSEISRKYQSEFEEIEGRWKKLSSQLVEHCQKLEEQMNKLRKIQNHIQTLKKWMAEVDVFLKEEWPALGDSEILKKQLKQCRLLVSDIQTIQPSLNSVNEGGQKIKNEAEPEFASRLETELKELNTQWDHMCQQVYARKEALKGGLEKTVSLQKDLSEMHEWMTQAEEEYLERDFEYKTPDELQKAVEEMKRAKEEAQQKEAKVKLLTESVNSVIAQAPPVAQEALKKELETLTTNYQWLCTRLNGKCKTLEEVWACWHELLSYLEKANKWLNEVEFKLKTTENIPGGAEEISEVLDSLENLMRHSEDNPNQIRILAQTLTDGGVMDELINEELETFNSRWRELHEEAVRRQKLLEQSIQSAQETEKSLHLIQESLTFIDKQLAAYIADKVDAAQMPQEAQKIQSDLTSHEISLEEMKKHNQGKEAAQRVLSQIDVAQKKLQDVSMKFRLFQKPANFEQRLQESKMILDEVKMHLPALETKSVEQEVVQSQLNHCVNLYKSLSEVKSEVEMVIKTGRQIVQKKQTENPKELDERVTALKLHYNELGAKVTERKQQLEKCLKLSRKMRKEMNVLTEWLAATDMELTKRSAVEGMPSNLDSEVAWGKATQKEIEKQKVHLKSITEVGEALKTVLGKKETLVEDKLSLLNSNWIAVTSRAEEWLNLLLEYQKHMETFDQNVDHITKWIIQADTLLDESEKKKPQQKEDVLKRLKAELNDIRPKVDSTRDQAANLMANRGDHCRKLVEPQISELNHRFAAISHRIKTGKASIPLKELEQFNSDIQKLLEPLEAEIQQGVNLKEEDFNKDMNEDNEGTVKELLQRGDNLQQRITDERKREEIKIKQQLLQTKHNALKDLRSQRRKKALEISHQWYQYKRQADDLLKCLDDIEKKLASLPEPRDERKIKEIDRELQKKKEELNAVRRQAEGLSEDGAAMAVEPTQIQLSKRWREIESKFAQFRRLNFAQIHTVREETMMVMTEDMPLEISYVPSTYLTEITHVSQALLEVEQLLNAPDLCAKDFEDLFKQEESLKNIKDSLQQSSGRIDIIHSKKTAALQSATPVERVKLQEALSQLDFQWEKVNKMYKDRQGRFDRSVEKWRRFHYDIKIFNQWLTEAEQFLRKTQIPENWEHAKYKWYLKELQDGIGQRQTVVRTLNATGEEIIQQSSKTDASILQEKLGSLNLRWQEVCKQLSDRKKRLEEQKNILSEFQRDLNEFVLWLEEADNIASIPLEPGKEQQLKEKLEQVKLLVEELPLRQGILKQLNETGGPVLVSAPISPEEQDKLENKLKQTNLQWIKVSRALPEKQGEIEAQIKDLGQLEKKLEDLEEQLNHLLLWLSPIRNQLEIYNQPNQEGPFDVQETEIAVQAKQPDVEEILSKGQHLYKEKPATQPVKRKLEDLSSEWKAVNRLLQELRAKQPDLAPGLTTIGASPTQTVTLVTQPVVTKETAISKLEMPSSLMLEVPALADFNRAWTELTDWLSLLDQVIKSQRVMVGDLEDINEMIIKQKATMQDLEQRRPQLEELITAAQNLKNKTSNQEARTIITDRIERIQNQWDEVQEHLQNRRQQLNEMLKDSTQWLEAKEEAEQVLGQARAKLESWKEGPYTVDAIQKKITETKQLAKDLRQWQTNVDVANDLALKLLRDYSADDTRKVHMITENINASWRSIHKRVSEREAALEETHRLLQQFPLDLEKFLAWLTEAETTANVLQDATRKERLLEDSKGVKELMKQWQDLQGEIEAHTDVYHNLDENSQKILRSLEGSDDAVLLQRRLDNMNFKWSELRKKSLNIRSHLEASSDQWKRLHLSLQELLVWLQLKDDELSRQAPIGGDFPAVQKQNDVHRAFKRELKTKEPVIMSTLETVRIFLTEQPLEGLEKLYQEPRELPPEERAQNVTRLLRKQAEEVNTEWEKLNLHSADWQRKIDETLERLQELQEATDELDLKLRQAEVIKGSWQPVGDLLIDSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSHVNDLARQLTTLGIQLSPYNLSTLEDLNTRWKLLQVAVEDRVRQLHEAHRDFGPASQHFLSTSVQGPWERAISPNKVPYYINHETQTTCWDHPKMTELYQSLADLNNVRFSAYRTAMKLRRLQKALCLDLLSLSAACDALDQHNLKQNDQPMDILQIINCLTTIYDRLEQEHNNLVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGRIRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRYLFKQVASSTGFCDQRRLGLLLHDSIQIPRQLGEVASFGGSNIEPSVRSCFQFANNKPEIEAALFLDWMRLEPQSMVWLPVLHRVAAAETAKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYCTPTTSGEDVRDFAKVLKNKFRTKRYFAKHPRMGYLPVQTVLEGDNMETPVTLINFWPVDSAPASSPQLSHDDTHSRIEHYASRLAEMENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQDSPLSQPRSPAQILISLESEERGELERILADLEEENRNLQAEYDRLKQQHEHKGLSPLPSPPEMMPTSPQSPRDAELIAEAKLLRQHKGRLEARMQILEDHNKQLESQLHRLRQLLEQPQAEAKVNGTTVSSPSTSLQRSDSSQPMLLRVVGSQTSDSMGEEDLLSPPQDTSTGLEEVMEQLNNSFPSSRGRNTPGKPMREDTM
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ヒトＩＧＦ−１アイソフォーム４アミノ酸配列
配列番号５７７：
MGKISSLPTQLFKCCFCDFLKVKMHTMSSSHLFYLALCLLTFTSSATAGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSAGNKNYRM
【図１】
2012524540.tif 000035
【図２】
2012524540.tif 000036
【配列表】
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【国際調査報告】
2012524540.tif 000037
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