(57)【要約】  本発明は、とりわけ、鉄キレート剤を使用した、時間の経った赤血球を含む組成物の患者への急性輸血によって引き起こされる患者の副作用を改善するための方法を提供する。そういった副作用を改善するための器具およびキットもまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
時間の経った赤血球を含む組成物の患者への急性輸血によって引き起こされる患者の副作用を改善するための器具であって、前記組成物と無菌状態で接触する内部表面、及び有効量の鉄キレート剤を含んでなる、前記器具。
【請求項２】
前記鉄キレート剤が、前記組成物と無菌状態で接触する前記器具の内部表面に配置される、請求項１に記載の器具。
【請求項３】
前記鉄キレート剤が、前記組成物と無菌状態で接触する前記内部表面によって形成された前記器具の内部空間内に配置される、請求項１に記載の器具。
【請求項４】
輸血を必要としている患者への輸血のための赤血球を保存するためのコンテナである、請求項１に記載の器具。
【請求項５】
前記コンテナが輸血バッグである、請求項４に記載の器具。
【請求項６】
前記器具が血液フィルターである、請求項１に記載の器具。
【請求項７】
前記鉄キレート剤が、アポトランスフェリン、ラクトトランスフェリン、金属結合酵素、ヒドロキサム酸重合体、リン酸化ミオイノシトール重合体、ヘムＢ、ヘムＡ、ヘムＣ、デスフェロキサミン（ＤＦＯ）、デスフェリチオシン（ＤＦＴ）、デスフェリ−エキソケリン（Ｄ−Ｅｘｏ）、（Ｓ）−ＤＭＦＴ、（Ｓ）−ＤＡＤＭＤＦＴ、（Ｓ）−ＤＡＤＦＴ、４’−（ＯＨ）−ＤＡＤＦＴ、４’−（ＯＨ）−ＤＡＤＭＤＦＴまたはその六座誘導体ＢＤＵ、デフェリプロン（Ｌ１）、その代謝がヒドロキシピリジノン類似体を生じるヒドロキシピリジノンエステル・プロドラッグ、ＣＰ９４、ＣＰ５０２、ＣＰ３６５、ＣＰ１０２、ＣＰ４１、ＣＰ３８、ＬｉＮＡＩＩ、Ｐｒ−（Ｍｅ−３，２−ＨＯＰＯ）およびその六座類似体ＴＲＥＮ−（Ｍｅ−３，２−ＨＯＰＯ）、ＣＰ１１７、ＣＰ１６５、タキピリジンアルキル類似体、タキピリジン二級アミン連結類似体、タキピリジンピリジル連結類似体、タキピリジンピリジル連結マレイミド誘導体類似体、ＰＩＨ、ＳＩＨ、ＰＣＩＨ、ＰＫＩＨ、ＰＩＨ類似化合物１０１、ＰＩＨ類似化合物１０２、ＰＩＨ類似化合物１０３、ＰＩＨ類似化合物１０４、ＰＩＨ類似化合物１０５、ＰＩＨ類似化合物１０６、ＰＩＨ類似化合物１０７、ＰＩＨ類似化合物１０８、ＰＩＨ類似化合物１０９、ＰＩＨ類似化合物１１０、ＰＩＨ類似化合物１１２、ＰＩＨ類似化合物１１３、ＰＩＨ類似化合物１１４、ＰＩＨ類似化合物１１５、ＰＩＨ類似化合物２０１、ＰＩＨ類似化合物２０２、ＰＩＨ類似化合物２０４、ＰＩＨ類似化合物２０５、ＰＩＨ類似化合物２０６、ＰＩＨ類似化合物２０７、ＰＩＨ類似化合物２０８、ＰＩＨ類似化合物２０９、ＰＩＨ類似化合物２１２、ＰＩＨ類似化合物２１５、ＰＩＨ類似化合物３０１、ＰＩＨ類似化合物３０２、ＰＩＨ類似化合物３０５、ＰＩＨ類似化合物３０７、ＰＩＨ類似化合物３０８、ＰＩＨ類似化合物３０９、ＰＩＨ類似化合物３１０、ＰＩＨ類似化合物３１２、ＰＩＨ類似化合物３１５、ＰＣＢＨ、ＰＣＨＨ、ＰＣＢＢＨ、ＰＣＡＨ、ＰＣＴＨ、ＰＫＢＨ、ＰＫＡＨ、ＰＫ３ＢＢＨ、ＰＫＨＨ、ＰＫＴＨ、５−ＨＰ、トリアピン（Ｔｒｉａｐｉｎｅ）、ＮＴ、Ｎ２ｍＴ、Ｎ４ｍＴ、Ｎ４４ｍＴ、Ｎ４ｅＴ、Ｎ４ａＴ、Ｎ４ｐＴ、ＤｐＴ、ＤＰ２ｍＴ、Ｄｐ４ｍＴ、Ｄｐ４４ｍＴ、Ｄｐ４ｅＴ、Ｄｐ４ａＴ、Ｄｐ４ｐＴ、デフェラシロクス（ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘ）（Ｅｘｊａｄｅ、ＩＣＬ６７０Ａ）、デフェラシロクスの５，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾール類似体、ＨＢＥＤ、Ｆａｒａｌｅｘ−Ｇ、４−ヒドロキシ−２−ノニルキノリン、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載の器具。
【請求項８】
前記鉄キレート剤が、デスフェロキサミン、デフェラシロクス、およびアポトランスフェリンから成る群から選択される、請求項７に記載の器具。
【請求項９】
時間の経った赤血球を含む組成物の患者への急性輸血によって引き起こされる患者の副作用を改善するためのキットであって、鉄キレート剤を直接的に組成物へ、血液製剤関連器具へ、またはそれを必要としている患者へ投与する方法についての使用説明書が共に包装された、有効量の鉄キレート剤を含んでなるコンテナを含んでなる、前記キット。
【請求項１０】
前記血液製剤関連器具が、血液フィルターまたは血液バッグである、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記鉄キレート剤が、アポトランスフェリン、ラクトトランスフェリン、金属結合酵素、ヒドロキサム酸重合体、リン酸化ミオイノシトール重合体、ヘムＢ、ヘムＡ、ヘムＣ、デスフェロキサミン（ＤＦＯ）、デスフェリチオシン（ＤＦＴ）、デスフェリ−エキソケリン（Ｄ−Ｅｘｏ）、（Ｓ）−ＤＭＦＴ、（Ｓ）−ＤＡＤＭＤＦＴ、（Ｓ）−ＤＡＤＦＴ、４’−（ＯＨ）−ＤＡＤＦＴ、４’−（ＯＨ）−ＤＡＤＭＤＦＴまたはその六座誘導体ＢＤＵ、デフェリプロン（Ｌ１）、その代謝でヒドロキシピリジノン類似体を生じるヒドロキシピリジノンエステル・プロドラッグ、ＣＰ９４、ＣＰ５０２、ＣＰ３６５、ＣＰ１０２、ＣＰ４１、ＣＰ３８、ＬｉＮＡＩＩ、Ｐｒ−（Ｍｅ−３，２−ＨＯＰＯ）およびその六座類似体ＴＲＥＮ−（Ｍｅ−３，２−ＨＯＰＯ）、ＣＰ１１７、ＣＰ１６５、タキピリジンアルキル類似体、タキピリジン二級アミン連結類似体、タキピリジンピリジル連結類似体、タキピリジンピリジル連結マレイミド誘導体類似体、ＰＩＨ、ＳＩＨ、ＰＣＩＨ、ＰＫＩＨ、ＰＩＨ類似化合物１０１、ＰＩＨ類似化合物１０２、ＰＩＨ類似化合物１０３、ＰＩＨ類似化合物１０４、ＰＩＨ類似化合物１０５、ＰＩＨ類似化合物１０６、ＰＩＨ類似化合物１０７、ＰＩＨ類似化合物１０８、ＰＩＨ類似化合物１０９、ＰＩＨ類似化合物１１０、ＰＩＨ類似化合物１１２、ＰＩＨ類似化合物１１３、ＰＩＨ類似化合物１１４、ＰＩＨ類似化合物１１５、ＰＩＨ類似化合物２０１、ＰＩＨ類似化合物２０２、ＰＩＨ類似化合物２０４、ＰＩＨ類似化合物２０５、ＰＩＨ類似化合物２０６、ＰＩＨ類似化合物２０７、ＰＩＨ類似化合物２０８、ＰＩＨ類似化合物２０９、ＰＩＨ類似化合物２１２、ＰＩＨ類似化合物２１５、ＰＩＨ類似化合物３０１、ＰＩＨ類似化合物３０２、ＰＩＨ類似化合物３０５、ＰＩＨ類似化合物３０７、ＰＩＨ類似化合物３０８、ＰＩＨ類似化合物３０９、ＰＩＨ類似化合物３１０、ＰＩＨ類似化合物３１２、ＰＩＨ類似化合物３１５、ＰＣＢＨ、ＰＣＨＨ、ＰＣＢＢＨ、ＰＣＡＨ、ＰＣＴＨ、ＰＫＢＨ、ＰＫＡＨ、ＰＫ３ＢＢＨ、ＰＫＨＨ、ＰＫＴＨ、５−ＨＰ、トリアピン、ＮＴ、Ｎ２ｍＴ、Ｎ４ｍＴ、Ｎ４４ｍＴ、Ｎ４ｅＴ、Ｎ４ａＴ、Ｎ４ｐＴ、ＤｐＴ、ＤＰ２ｍＴ、Ｄｐ４ｍＴ、Ｄｐ４４ｍＴ、Ｄｐ４ｅＴ、Ｄｐ４ａＴ、Ｄｐ４ｐＴ、デフェラシロクス（Ｅｘｊａｄｅ、ＩＣＬ６７０Ａ）、デフェラシロクスの５，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾール類似体、ＨＢＥＤ、Ｆａｒａｌｅｘ−Ｇ、４−ヒドロキシ−２−ノニルキノリン、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
前記鉄キレート剤が、デスフェロキサミン、デフェラシロクス、およびアポトランスフェリンから成る群から選択される、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
時間の経った赤血球を含む組成物の患者への急性輸血によって引き起こされる患者の副作用を改善するための方法であって、前記時間の経った赤血球のマクロファージ食作用によって放出された鉄をキレートすることができる鉄キレート剤を供給することを含み、ここで前記キレート剤は前記患者の副作用を改善する、前記方法。
【請求項１４】
前記副作用がサイトカインストームである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記副作用が、患者における鉄依存性病原菌の増大である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記鉄キレート剤が、ペプチド、重合体、有機または無機小分子、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記鉄キレートペプチドが、アポトランスフェリン、ラクトトランスフェリン、金属結合酵素、かかるタンパク質由来の鉄結合性ドメイン、およびかかるタンパク質の鉄結合性部位を模倣するように設計した合成ペプチドから成る群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記鉄キレート重合体が、ヒドロキサム酸重合体またはリン酸化ミオ−イノシトール重合体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記鉄キレート剤が、ヘムＢ、ヘムＡ、およびヘムＣから成る群から選択されるポルフィリン環である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記鉄キレート剤が、シデロホアまたは合成によって得られたその類似体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記シデロホアが、デスフェロキサミン（ＤＦＯ）、デスフェリチオシン（ＤＦＴ）、およびデスフェリ−エキソケリン（Ｄ−Ｅｘｏ）から成る群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記鉄キレート剤が、（Ｓ）−ＤＭＦＴ、（Ｓ）−ＤＡＤＭＤＦＴ、（Ｓ）ＤＡＤＦＴ、４’−（ＯＨ）−ＤＡＤＦＴ、および４’−（ＯＨ）−ＤＡＤＭＤＦＴまたはその六座誘導体ＢＤＵから成る群から選択されるＤＦＴ類似体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
前記鉄キレート剤がヒドロキシピリジノンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヒドロキシピリジノンが、デフェリプロン（Ｌ１）もしくはその類似体、またはその代謝でヒドロキシピリジノン類似体を生じるヒドロキシピリジノンエステル・プロドラッグから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記デフェリプロン類似体が、ＣＰ９４、ＣＰ５０２、ＣＰ３６５、ＣＰ１０２、ＣＰ４１、ＣＰ３８、ＬｉＮＡＩＩ、Ｐｒ−（Ｍｅ−３，２−ＨＯＰＯ）およびその六座類似体ＴＲＥＮ−（Ｍｅ−３，２−ＨＯＰＯ）から成る群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヒドロキシピリジノンエステル・プロドラッグが、ＣＰ１１７およびＣＰ１６５から成る群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記鉄キレート剤が、タキピリジンまたはその類似体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２８】
前記タキピリジン類似体が、タキピリジンアルキル類似体、タキピリジン二級アミン連結類似体、タキピリジンピリジル連結類似体、およびタキピリジンピリジル連結マレイミド誘導体類似体から成る群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記鉄キレート剤がアロイルヒドラゾンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項３０】
前記アロイルヒドラゾン鉄キレート剤が、ＰＩＨ、ＳＩＨ、３１１シリーズ類似化合物、ＰＣＩＨ、ＰＫＩＨ、およびそれぞれの親化合物の類似体から成る群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＰＩＨ類似体が、１００シリーズ類似化合物１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１２、１１３、１１４および１１５から成る群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＰＩＨ類似体が、２００シリーズ類似化合物２０１、２０２、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１２および２１５から成る群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記３１１シリーズ類似化合物が、化合物３０１、３０２、３０５、３０７、３０８、３０９、３１０、３１２および３１５から成る群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＰＣＩＨ類似体が、ＰＣＢＨ、ＰＣＨＨ、ＰＣＢＢＨ、ＰＣＡＨおよびＰＣＴＨから成る群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＰＫＩＨ類似体が、ＰＫＢＨ、ＰＫＡＨ、ＰＫ３ＢＢＨ、ＰＫＨＨおよびＰＫＴＨから成る群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記鉄キレート剤がチオセミカルバゾンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項３７】
前記チオセミカルバゾンが、５−ＨＰ、トリアピン、ＮＴシリーズのメンバー、およびＤｐＴシリーズのメンバーから成る群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＮＴシリーズが、ＮＴ、Ｎ２ｍＴ、Ｎ４ｍＴ、Ｎ４４ｍＴ、Ｎ４ｅＴ、Ｎ４ａＴ、およびＮ４ｐＴから成る群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＤｐＴシリーズが、ＤｐＴ、ＤＰ２ｍＴ、Ｄｐ４ｍＴ、Ｄｐ４４ｍＴ、Ｄｐ４ｅＴ、Ｄｐ４ａＴ、およびＤｐ４ｐＴから成る群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記鉄キレート剤が、デフェラシロクス（Ｅｘｊａｄｅ、ＩＣＬ６７０Ａ）、デフェラシロクスの５，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾール類似体、ＨＢＥＤ、Ｆａｒａｌｅｘ−Ｇ、および４−ヒドロキシ−２−ノニルキノリンから成る群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項４１】
前記供給ステップが、副作用を改善するのに有効である量の鉄キレート剤を患者に投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項４２】
前記供給ステップが、輸血に先立って、時間の経った赤血球を含む組成物を、副作用を改善するのに有効な量の鉄キレート剤と接触させることを含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
２００９年６月１６日付で出願された米国特許仮出願番号第６１／１８７，６００号および２００９年８月３１日付で出願された米国特許仮出願番号第６１／２７５，５７９号に対する本出願の利益を主張する。前記両出願の内容全体を、すべてが本明細書中に引用されているかのように本明細書中に援用する。
【０００２】
政府による資金提供
本願発明は、米国立衛生研究所によって支給された助成金番号第Ｒ２１  ＨＬ０８７９０６号の下、政府の支援を得て作成された。政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
本発明の分野
本発明は、とりわけ、鉄キレート剤を使用した、時間の経った（ａｇｅｄ）赤血球の急性輸血（ａｃｕｔｅ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ）に伴う副作用を改善するための方法、キット、および組成物に向けられる。
【背景技術】
【０００４】
本発明の背景
合衆国では毎年、約１４００万単位の袋詰めされた赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）（ＲＢＣ）が輸血されている［１］。加えて、集中治療室（ＩＣＵ）は全病床の１０％を占め、毎年４４０万人のアメリカ人が集中治療質に収容され［２］、そして４４％のＩＣＵ患者には彼らの入院中に少なくとも１ＲＢＣ単位（平均４．６単位）が輸血される［３］。これらの単位の輸血前の平均保存期間は１７日間である［１］。いくつかの観察研究［４−９］および大規模無作為前向き臨床研究［１０］は、輸血自体が重症患者の罹患率や死亡率、すなわちＲＢＣの保存期間に伴って増大する影響を高めることを示唆している。観察研究では、死亡率［７、１１−１３］、重篤疾患［７、１２、１４］、多臓器不全［１２、１５］、および入院期間［７、１３］の増加が、重症患者における古い保存ＲＢＣの輸血と相関していた。最近、約６０００人の心臓手術患者の後ろ向き試験では、１４日未満しか保存していないＲＢＣを輸血した患者に対して、１４日超保存したＲＢＣを輸血した患者の院内死亡率、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）／菌血症を伴う敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、および１年死亡率の有意に高い比率を確認した［１２］。異論はあるが［１６］、これらの研究では古い保存ＲＢＣの輸血の有効性について根本的な疑問を投げ掛けている；加えて、高められた罹患率や死亡率に関与する機構は、大部分が分かっていない［１７］。
【０００５】
もっとも、使用する、合衆国で輸血されたＲＢＣ単位の＞７０％が白血球除去されている（すなわち、３−ｌｏｇ10個の白血球の低減を達成するように濾過されている）にもかかわらず［１］、輸血の副作用を記録しているほとんどの研究で、非白血球除去ＲＢＣを使用した。機構（単数又は複数）は分かっていないが、一部の副作用はＲＢＣ単位内への白血球の混入に起因する可能性もある［１８］。しかしながら、Ｋｏｃｈらによる最近の研究［１２］では「より古い」保存ＲＢＣ群の患者の大多数に白血球除去ＲＢＣが与えられていた。加えて、白血球除去ＲＢＣのみが与えられた外傷患者に関する最近のある研究では、より古い保存単位の輸血が死亡率、腎不全、および肺炎の増加に関連した［１９］。よって、白血球除去は保存ＲＢＣの副作用を排除することはないが、そのことが副作用の重症度を低減する可能性はある。
【０００６】
ＲＢＣの機能や生存を低減する、インビトロでの保存中に起こる生物化学的および生体力学的変化は、まとめて「ＲＢＣ保存損傷」として知られている［１７］。これらには、ＡＴＰの減少［２０］、２，３−ジホスホグリセリン酸の減少［２１］、膜胞化［２２］、タンパク質および脂質の酸化［２３、２４］、低いＳ−ニトロソヘモグロビン［２５］、低い表面シアリル化［２６］、低いＣＤ４７発現［２７］、高いホスファチジルセリン露出［２８］、および低い変形能［２９］が含まれる。これらのうちのいくつかは、保存中に白血球が存在しているときに悪化する［３０］。加えて、ＲＢＣ損傷は、長い保存期間が上清中の高い非トランスフェリン結合鉄レベルにつながることによって誘発された［３１］。
【０００７】
そのため、食品医薬品局（ＦＤＡ）は、保存ＲＢＣの最大安全保存期限が細胞の完全性の維持（すなわち、遊離ヘモグロビンがＲＢＣ単位中の総ヘモグロビンの＜１％でなければならない）および輸血後の十分な２４時間ＲＢＣ生存（ｓｕｒｖｉｖａｌ）（７５％）を必要とすることを義務付けたが；しかしながら、これらは治療的有用性の代用マーカーである［１７］。保存料次第で、最大ヒトＲＢＣ保存期間は３５〜４２日間になる。保存損傷は複雑であり、輸血後の低いＲＢＣ生存に関与する機構（単数もしくは複数）に関して不確定要素が残っているが、最終的には保存期間が延びるほど輸血ＲＢＣの２４時間生存が低下している。期限切れ時点で、平均すると輸血ＲＢＣの≧７５％が２４時間生存していなければならないというＦＤＡの要件にもかかわらず、ほとんどの研究において標準偏差が大きく、問題を含んでいる［３２］。実際には、２４時間生存は、多くの輸血に関して＜７５％である［３２、３３］。加えて、ほとんどのＲＢＣクリアランスが輸血後１時間のうちに起こる［３３］。１ヒトＲＢＣ単位には２２０〜２５０ｍｇの鉄が含まれている。よって、単一単位であったとしても最大２５％の急なＲＢＣクリアランスは、単球−マクロファージ系にかなりのヘモグロビン鉄負荷を急激にかける。最後に、ＦＤＡ承認取得のためのＲＢＣ生存試験は健常ボランティアにて通常実施されるが、輸血後２４時間のＲＢＣ生存は重症患者ではなおさら低い［３３、３４］。よって、このことが、除去される約２５％のＲＢＣを正常に機能しない宿主防衛の考えられる原因として研究することに重きを置くべきだと一部の人々に示すに至った［３０］。
【０００８】
インビトロにおけるＲＢＣ保存損傷の正味の影響は、インビボにおける急速なクリアランスである。なかにはＲＢＣ単位の輸血が＞２５％のクリアランスを結果的にもたらし得るものもあるが、当業者はＦＤＡ承認期限切れの時点でＲＢＣの２５％が除去されると考えることもある。平均的な単位には約１．５×１０12個のＲＢＣが含まれているが、このことは、４×１０11個の非生存ＲＢＣが単球−マクロファージ系の約１０11個の貪食細胞によって処理されていることを意味する［３０］。そのため、この状況では、単球−マクロファージ系に加わる鉄負荷の総量は、わずか１時間の期間内に保存ＲＢＣ１単位あたり約６０ｍｇである［３３］。これを総体的に見ると、定常状態の健康成人では、毎日約２５ｍｇの鉄（約２５ｍＬの老化ＲＢＣに由来）が単球−マクロファージ系によって除去されている（すなわち、約１ｍｇ／時間）。よって、古い単位の保存ＲＢＣの輸血は、鉄を１時間あたりの「用量」として最高６０倍増まで急激に供給することがある。約９０％の２４時間生存を有することがある比較的に新しいＲＢＣの輸血でさえ、顕著な鉄負荷を急激に供給することがあり、多くの患者に複数のＲＢＣ単位が与えられている。
【０００９】
マウスおよびヒトでの研究の両方が、マクロファージにおいて細胞内鉄の増加が様々な刺激に対する炎症誘発性サイトカイン反応を増強するという概念を裏付けている。鉄が炎症反応を助長する機構は、（Ｈ2Ｏ2のヒドロキシルラジカル、すなわち強力な酸化剤への変換を触媒する）フェントン（Ｆｅｎｔｏｎ）反応への鉄の関与に起因する反応性酸素分子種の産生の増加によると考えられる［３５−３７］。この変更された酸化還元環境は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、インターロイキン（ＩＬ）−６、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１、および単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−１を含めた炎症誘発性サイトカインの合成と分泌を誘発する［３５、３６、３８、３９］。例えば、遺伝性ヘモクロマトーシス、すなわち、ヒト鉄代謝障害では、マクロファージ鉄レベルは減少する。同様に、マウス・ヘモクロマトーシスモデルのマクロファージは、少ない細胞内鉄しか持っていない；興味深いことに、サルモネラ誘発腸炎症はこれらのマウスでは軽減され［４０］そしてＴＮＦ−αおよびＩＬ−６発現はサルモネラまたはリポポリサッカライド（ＬＰＳ）に対する応答では減少する。サイトカイン産生を阻害する細胞内鉄減少のこの効果は、野生型マクロファージにおいて細胞浸透性鉄キレート剤を使用することで再生した［４０］。対照的に、アルコール性肝疾患のマウス・モデルでは［４１］、クッパー細胞で鉄が増加し、そしてＴＮＦ−αおよびＭＩＰ−１の産生が増加した；これは、鉄キレート化によって止められたが、脾臓摘出によって助長された。後者では、クッパー細胞へのヘモグロビン鉄供給が増加するので、炎症誘発性サイトカイン発現を刺激する鉄の役割を裏付けている。ヒトでもまた、細胞内鉄の減少または増強が、それぞれ関連刺激に対する炎症誘発性サイトカイン発現を減弱または増強する［４２］。例えば、遺伝性ヘモクロマトーシスを患っている患者からの単球は、健常対照者または鉄負荷性貧血を患っている患者と比較して、ＬＰＳに対する応答において少ないＴＮＦ−αしか産生しない［４２］。ここまでで分かるように、サイトカインに対する古い保存ＲＢＣ輸血の影響を調べているヒトでの研究は、全く報告されていない。それにもかかわらず、高いＩＬ−６およびＩＬ−８レベルが手術患者で輸血後に見られた［４３−４５］；サイトカインレベルは、同種ＲＢＣよりむしろ自家ＲＢＣを与えられた患者で高いので、この応答が同種免疫機構によるものではないことを示唆している［４２］。
【００１０】
全身性炎症反応症候群では、過剰炎症反応が敗血性ショックや多臓器不全につながることがあり、それが深刻な罹患率および死亡率を引き起こす［４６］。マクロファージはこの現象の中心的役割を果たす、つまり、この応答を開始し、継続させ、そして調節するサイトカインを産生している［４６］。運命づけられていないマクロファージの運命はサイトカインによって決定される［４７］。古典的経路への分化は１型ヘルパーＴ細胞の応答によるインターフェロン（ＩＦＮ）−γ依存性活性化よるが、選択的経路活性化は（２型ヘルパーＴ細胞のサイトカインである）ＩＬ−４およびＩＬ−１３による［４８、４９］。あるいは、選択的活性化マクロファージは、細胞内病原を殺滅することはなく、代償性抗炎症反応症候群において役割を果たし得る［４９］。この代償性抗炎症反応症候群は全身性炎症反応症候群を調節する［５０］。例えば、（例えば、急性膵炎による）重度の全身性炎症反応症候群を患っているマウスは感染症に感染しやすいが［５１］、これは一部にはＭＣＰ−１［５０］によって在住マクロファージから生み出された選択的活性化マクロファージによる［５１］。それらがエフェクター応答の強さを制御しているので、Ｔ細胞は炎症において主要な制御的役割を担っている；例えば、制御性Ｔ細胞は二次感染と自己免疫応答において重要である［５２］。興味深いことに、二次感染の発生は、古い保存ＲＢＣの輸血と関連づけられ［１２］、そしてＲＢＣ自家抗体形成は輸血に関連づけられる［５３］。よって、古い保存ＲＢＣの輸血によって引き起こされた炎症誘発性発作は、代償性抗炎症応答としてのＴ細胞サブセットを変更し得る。制御性Ｔ細胞もまた選択的活性化マクロファージを誘導するので、それによって、宿主防衛を害する別の経路をもたらす［５４］。
【００１１】
古い保存ＲＢＣの輸血によって供給された細胞外非トランスフェリン結合鉄もまた、病理学的に関連している可能性がある。あるいは、単球−マクロファージ系が大量の鉄を処理する必要によって急に圧倒されれば、非トランスフェリン結合鉄がＲＢＣ貪食に続いて血漿中に「あふれ出す」可能性もある。
【００１２】
血漿鉄がトランスフェリンによって封鎖されていないときには、非トランスフェリン結合鉄は、酸化的損傷、細胞毒性、および接着分子の発現促進につながる酸化還元反応に参加する可能性がある［５５、５６］。例えば、ヒトでは、インビボにおける高い血漿非トランスフェリン結合鉄レベルは、可溶性細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）−１レベル（活性化内皮細胞のマーカー）の上昇と相関する［５７］。加えて、ヒト臍帯静脈内皮細胞と単球を、非トランスフェリン結合鉄を含む培地とインビトロでインキュベートすると、細胞間接着が増加し、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）−１、ＩＣＡＭ−１、およびＥ−セレクチンの内皮細胞発現が増加し、ならびにインテグリンα４β１（ＶＣＡＭ−１のリガンド）およびインテグリンαＬβ２（ＩＣＡＭ−１のためのリガンド）の単球発現が増加した。興味深いことに、これらの接着効果は細胞浸透性鉄キレート剤や抗酸化剤によって妨げられた。同様に、β−サラセミア患者からの血漿における高い非トランスフェリン結合鉄レベルによってインビトロで誘導された酸化促進剤の効果は、鉄キレート剤を用いてインビボで患者を処置することによって急速に（３０分以内に）阻害された［５８］。
【００１３】
鎌状赤血球症は、米国における重要な医学上の問題であり、そして例えば脳卒中などの合併症の多くが、循環内の様々な細胞型（例えば、ＲＢＣ、内皮細胞、血小板、および白血球）の間の細胞間接着の増強のせいにされている；加えて、炎症誘発性サイトカインがこの過程で重要である可能性もある［６１］。慢性的ＲＢＣ輸血はこれらの主要な合併症を予防するのに有効である［６２］。しかしながら、それらの有効性にもかかわらず、ＲＢＣ保存期間、洗浄、および／または冷凍保存に関して、鎌状赤血球症におけるＲＢＣ輸血に対する行為の徴候に基づく基準が存在しない［６３］。よって、ＲＢＣ輸血が高いレベルの炎症誘発性サイトカインを生じる際に担う役割を検討することが重要である。
【００１４】
一部の患者、特に子供は、２〜６週ごとの単純な輸血によって管理できるが、彼らには約３０％のヘマトクリットまでしか輸血しないことが推奨される、さもなければ、高い粘度のために合併症が起こる可能性がある［６４、６５］。この状況において、ヘモグロビンＳレベルは１０〜２０％のままなので、患者は（例えば、高い網状赤血球算定によって証明される）低レベルの継続的な溶血反応を示す。よって、実質的に改善している予後にもかかわらず、彼らは継続的な溶血状態のままである。加えて、鎌状赤血球症には、おそらく継続的な低酸素症再潅流傷害による慢性炎症性障害の顕著な特徴がある［６６−６９］。そのため、鎌状赤血球症の患者はサイトカイン、例えばＩＬ−６などが高いレベルになり得るが［７０、７１］、それらの慢性的な根本的溶血反応と継続的な炎症誘発状況は、逆説的に、正常レベルの他の炎症性メディエーターを伴う可能性があり、おそらく代償性機構、例えばヘム・オキシゲナーゼ−１などの上方制御による［６７、７１］。これらの現象は、その後の鉄媒介性発作に対するいくつかの関連保護を提供し得る。そのような「関連保護」は、マウスのＬＰＳへの暴露前にその後のＬＰＳ暴露に対して「寛容性」を誘導するという知見に類似していることもある［７２、７３］。
【００１５】
鎌状赤血球症と同様に、β−サラセミア患者もまた、慢性的輸血療法の利益を得る［７４］。加えて、彼らは慢性炎症状態の兆候を示すこともあるが［７５］、彼らは通常、低レベルの循環炎症誘発性サイトカインを有している［７１、７６］。これは、慢性的に輸血を受けている個体における低レベルの継続的な溶血反応を反映し得る、および／または疾患の根本的な病態生理学、例えば無効な赤血球産生の増加などに関連し得る。
【００１６】
複数回のＲＢＣ輸血により、これらの患者は、最終的には心臓、肝臓、および内分泌機能不全に至る柔組織の鉄過負荷を患う［７４］。そのため、彼らはキレート剤で処置されて、慢性的な実質鉄過負荷を予防する。鉄キレート化はさらに、ＲＢＣ輸血に続いて起こるこれらの患者の循環非トランスフェリン結合鉄レベルも調節し得るが［７７、７８］、このことは詳細に研究されていない。確かに、継続的なキレート療法にもかかわらず、一部の慢性的に輸血を受けている鎌状赤血球症およびβ−サラセミア患者において循環非トランスフェリン結合鉄レベルが高いままであることは興味深い［７１、７９］；ＲＢＣ輸血はこれらの疾患状況では非トランスフェリン結合鉄をさらに増強する可能性もある。
【００１７】
袋詰めされたＲＢＣ単位の上清には輸血後の有害転帰、例えば（特に非白血球除去状況において）アレルギーや熱性輸血反応などにつながる生物学的に活性な成分が含まれている可能性もあるので、洗浄ＲＢＣが血色素病を患っている患者の処置のために優れた製品を提供すると一部の人々は考えている［６３］。洗浄ＲＢＣ単位は、関連作業やそれらの短い２４時間の期限切れのため、血液バンクにとって提供するのが厄介であるが、密閉系を使用した新しい方法は、洗浄ＲＢＣをかなり長期間保存できるようにする［８０］。しかしながら、後者の場合には、インビトロにおけるＲＢＣ品質に関するパラメーターが洗浄ステップ後の延びた保存に伴って劣化し［８０］、２４時間ＲＢＣ生存もまた影響を受ける可能性があることを示唆している。
【００１８】
慢性的に輸血を受けている血色素病患者は複数の血液型抗原に同種免疫されるようになる可能性があるが、予想される表現型マッチングにより、それは過去に比べて起こる頻繁が低い［８１］。それにもかかわらず、この状況において、患者は、受けることが難しい、少ない単位の輸血を必要とすることもある。その結果、血液センターは、特定の抗原表現型を有する複数の冷凍保存ＲＢＣ単位をストックし、その後、それがこれらの患者の輸血に使用される［６３］。しかしながら、冷凍保存ＲＢＣは、特にそれらがインビトロにおいて４℃にて著しく長い時間保存された後に冷凍されたか、または著しく長い時間インビトロにおいて４℃にて解凍後保存された場合には、輸血後の最適な２４時間生存に比べて低下する可能性がある［２７、８２−８４］。とはいえ、冷凍保存ＲＢＣ単位の脱グリセリン化は大規模な洗浄を伴い、洗浄ＲＢＣに関して先に記載したのと同様に、そのことが上清中の物質による輸血の副作用を改善し得る。
【発明の概要】
【００１９】
前記を考慮すると、輸血、特に急性輸血に時間の経ったＲＢＣを使用することに関して先に述べた不利益を改善するための方法、キット、および組成物を供給することは有益であろう。本発明は、とりわけ、そういった方法、キット、および組成物を供給することに向けられる。
【００２０】
発明の概要
本発明の一実施形態は、時間の経った赤血球を含む組成物の患者への急性輸血によって引き起こされる患者の副作用を改善するための器具（ａｐｐａｒａｔｕｓ）である。その器具は、前記組成物と無菌状態で接触する内部表面および有効量の鉄キレート剤を含んでなる。
【００２１】
本発明の他の実施形態は、時間の経った赤血球を含む組成物の患者への急性輸血によって引き起こされる患者の副作用を改善するためのキットである。そのキットは、鉄キレート剤を直接組成物に、血液製剤関連器具に、またはそれを必要としている患者に投与する方法についての使用説明書が共に包装された、有効量の鉄キレート剤を含むコンテナを含む。
【００２２】
本発明の更なる実施形態は、時間の経った赤血球を含む組成物の患者への急性輸血によって引き起こされる患者の副作用を改善するための方法である。この方法は、時間の経った赤血球のマクロファージ食作用によって放出された鉄をキレートすることができる鉄キレート剤を供給することを含み；ここで、そのキレート剤が患者の副作用を改善する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】保存ＲＢＣの輸血の効果のための本発明による提案機構を示す。
【図２】新しいＲＢＣと保存したＲＢＣ生存を示す。概略すると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、クエン酸リン酸デキストロースアデニン（ＣＰＤＡ−１、５０％のヘマトクリットにて１００μＬ；３〜５匹のマウス／群）中に保存した白血球除去ＲＢＣを、51Ｃｒ標識した新鮮な状態（三角）、２週間目（四角；図２Ａ）、または３週間目（四角；図２Ｂ）で輸血した。眼窩後方の血液を、ミクロヘマトクリット管により輸血の直後、ならびに１、２、および２４時間後に採血した。これらを遠心分離し、そして袋詰めされたＲＢＣ柱の高さを計測した。生存（ｓｕｒｖｉｖａｌ）を、それぞれの時点対直後の時点のＲＢＣ柱の高さ１ｍｍあたりの１分あたりのカウントの比に１００を掛けて算出した。
【図３】保存ＲＢＣの輸血後の用量−血漿炎症誘発性サイトカインレベルの応答増大を示す。概略すると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、低用量（すなわち、２００μＬ：「１単位」）または高用量（４００μＬ：「２単位」）にて新鮮またはＣＰＤＡ−１中に保存した２週間目の白血球除去ＲＢＣを輸血した。２５ｇのマウスには２ｍＬの血液量があるので、ＲＢＣを５０％のヘマトクリットにて輸血したという仮定に基づいて、マウスの２００μＬが、袋詰めされたヒトＲＢＣの１単位に相当すると決定した。マウスを輸血の２時間後に放血させ、そして血漿サイトカインレベルを多重フローサイトメトリーアッセイ（Ｆｌｅｘ  ｋｉｔ、ＢＤ）を使用して計測した。サイトカインレベル（±ＳＥＭ）を示し、そして条件をパネルの下に示す（ＭＣＰ−１（左のパネル）；ＩＬ−６（右のパネル））。*は未処理マウスと比較したｐ＜０．０５を示す。**は無処置マウスおよび低用量の保存ＲＢＣ輸血処置マウスと比較したｐ＜０．０５を示す。
【図４】インビボにおけるクッパー細胞による赤血球貪食を示す。概略すると、Ｃ５７ＢＩ／６マウスに、３週間保存したＲＢＣまたは新鮮なＲＢＣを輸血した。剖検を輸血の２時間後に実施し；肝臓切片をヘマトキシリンおよびエオジンで染色し、次いで光学顕微鏡検査によって調べた。保存ＲＢＣを輸血したマウスの代表的な像において、約４個の貪食されたＲＢＣを持ったクッパー細胞を矢印で示す。
【図５】全鉄が、保存ＲＢＣを輸血したマウスの肝臓、脾臓、および腎臓で有意に増加していることを示す。概略すると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、新鮮なＲＢＣ（４００μＬ−白色の棒）またはＣＰＤＡ−１（５０％のヘマトクリットにて４００μＬ；１群あたり１３匹のマウス）中に保存した２週間目のＲＢＣ（灰色の棒）を輸血した。マウスを輸血の２時間後に屠殺し、そして全鉄を、肝臓、脾臓、および左腎で湿式灰化法を使用して計測した。棒は、対照非輸血マウスと比較した全鉄増加を示す（*は新鮮なＲＢＣと保存ＲＢＣの輸血を比較した両側スチューデントｔ検定におけるｐ＜０．０５を表す）。
【図６】炎症誘発性応答には無傷の保存ＲＢＣの輸血が必要であることを示す。概略すると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２週間保存したＲＢＣ（保存；４００μＬ）、１０倍量の通常の生理的食塩水で３回洗浄した２週間保存したＲＢＣ（ペレット；４００μＬ）、上清（４００μＬ）、または２週間保存したＲＢＣ由来のＲＢＣゴースト（４００μＬ）を輸血した。マウスを輸血の２時間後に屠殺し、そして血漿サイトカインレベルを、多重フローサイトメトリーアッセイを使用して計測した（ＭＣＰ−１（左のパネル）；ＩＬ−６（右のパネル））。平均サイトカインレベルを示し（±ＳＥＭ）、そして条件をパネルの下に示す。*は２週間保存したＲＢＣを輸血したマウスと比較したｐ＜０．０５を示す。
【図７】保存ＲＢＣの輸血が、非トランスフェリン結合鉄を増加させることを示す。概略すると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２週間保存したＲＢＣ（保存；４００μＬ）、１０倍量の通常の生理的食塩水で３回洗浄した２週間保存したＲＢＣ（ペレット；４００μＬ）、または上清（４００μＬ）を輸血した。マウスを輸血の２時間後に屠殺し、そして、［９３］に記載のとおり血漿非トランスフェリン結合鉄を計測した。平均血漿非トランスフェリン結合鉄レベルを示し（±ＳＥＭ）、そして条件をパネルの下に示す。*は非輸血マウス（すべてが検出不能なレベルしか有してない（ｎ＝５；未掲載））と比較したｐ＜０．０５を示す。注意：上清の輸血では、輸血の２時間後の時点で検出可能な非トランスフェリン結合鉄をもたらさなかった。
【図８】ＬＰＳと輸血された保存ＲＢＣがサイトカインストームを悪化させる、および長引かせるのに相乗効果を示す。概略すると、マウスに、ＬＰＳ（１００μｇ／マウスのＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）０１１１：Ｂ４；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）単体、４００μｌの２週間保存したＲＢＣ単体、または同時にＬＰＳ（１００μｇ／マウス）と４００μＬの新鮮なＲＢＣ、２週間保存したＲＢＣ、もしくは保存血由来のＲＢＣゴーストのいずれかを注射した。マウス（５〜１０匹／群）を処置の２４時間後に屠殺し、そしてサイトカインレベルを定量した（ＭＣＰ−１（左のパネル）；ＩＬ−６（右のパネル））。サイトカイン測定結果を示し（平均±ＳＥＭ）、そして条件をパネルの下に示す。*は新鮮なＲＢＣを輸血したマウスと比較したｐ＜０．０５を示す。
【図９】鉄キレート化が、より古い保存ＲＢＣを輸血したマウスにおいて炎症誘発性サイトカイン反応を阻害することを示す。概略すると、Ｃ５７ＢＩ／６マウスに、４００μＬの２週間保存したＲＢＣ単体（ｎ＝１３）を輸血するか、あるいは輸血の５〜１０分前に１２０ｍｇ／ｋｇの静脈内デフェロキサミン（ＤＦＯ）（ｎ＝１０）または輸血の２４および６時間前（ｎ＝６）に経口の経管栄養法によって投与された３０ｍｇ／ｋｇのデフェラシロクス（Ｅｘｊａｄｅ）のいずれかでの前処理後にそれを輸血した。血漿サイトカインレベルを輸血の２時間後に定量した。新鮮なＲＢＣ（４００μＬ）を対照として輸血した（ｎ＝１３）。サイトカインレベル（ＭＣＰ−１（上のパネル）；ＩＬ−６（中央のパネル）；ＫＣ（ＣＸＣＬ１）（下のパネル））を示し（平均±ＳＥＭ）、そして条件をパネルの下に示す。*は保存ＲＢＣを輸血したマウスと比較したｐ＜０．０５を示す。保存ＲＢＣとキレート剤の輸血のすべてで、新鮮なＲＢＣ輸血と比較してサイトカインレベルが有意に上昇した（ｐ＜０．０５）。
【図１０】健常ボランティアの試験中の、自家ＲＢＣ提供、輸血、および血液サンプルのタイミングを示す。参加は、最初の提供から最後の静脈切開まで４５日間に及ぶ。採血は、各輸血前、ならびに輸血の０、１、２、４、２４、および７２時間後に起こる。
【図１１】１人の患者のための本発明による代表的な研究の概略を示す。時系列上の縦線は１カ月を表す。時系列の上側には専任ドナーの参加を表し、そして時系列の下側には受血者の参加を表す。３対の輸血事象を含む６回の輸血が患者ごとに提案されている。
【図１２】本発明による別の代表的な試験の概略を示す。提案された時系列上の各縦線は１カ月を表す。時系列の上側には専任ドナーの参加を表し、そして時系列の下側には受血者の参加を表す。患者ごとに２回の輸血が提案され、そして４対の輸血事象を示している。
【図１３】新鮮なＲＢＣ、保存ＲＢＣ由来上清、または保存ＲＢＣから調製したゴーストの輸血と比較して、保存ＲＢＣの輸血が、高いＲＢＣクリアランス、組織鉄供給、および循環非トランスフェリン結合鉄（ＮＴＢＩ）レベルをもたらすことを示す。すべての輸血受血者が、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８〜１２週齢）であった。結果を、指定したものを除き、平均±平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として示す。図１３ａは、以下のとおり行ったある代表的な実験の結果を示す：白血球除去した新鮮なＦＶＢ／ＮＪマウスＲＢＣ（＜２４時間保存；ｎ＝３）と保存ＲＢＣ（２週間保存；ｎ＝５）を輸血し（１７．０〜１７．５ｇ／ｄＬのヘモグロビンにて４００μＬ）、そして輸血の１０分、３０分、１時間、２時間（保存ＲＢＣについてのみ）、および２４時間後に輸血ＲＢＣ生存を二重標識フローサイトメトリー・トラッキングによって計算した。*Ｐ＝０．０４。図１３ｂは、新鮮なＲＢＣまたは保存ＲＢＣの輸血の２時間後のマウスから得た脾臓の代表的な像を示す。図１３ｃは、新鮮なＲＢＣ（ｎ＝１３）および保存ＲＢＣ（ｎ＝１３）を輸血したマウスの平均脾臓重量を示す。*Ｐ＝０．０２。図１３ｄに示した結果を得るために、新鮮なＲＢＣのアリコート（４００μＬ）（ｎ＝１３）、保存ＲＢＣ（ｎ＝１３）、洗浄した保存ＲＢＣ（ｎ＝１３）、保存ＲＢＣ由来上清（ＳＮ；ｎ＝１２）、および保存ＲＢＣから調製したゴースト（ｎ＝８）を輸血した。全鉄を、輸血の２時間後の剖検で得た臓器で計測した；対照である非輸血マウス（ｎ＝１２）で計測されたものと比較した場合の、鉄の増加を示す。結果を３つの別々の実験から組み合わせる。肝臓（左のパネル）：*Ｐ＝０．０４、**Ｐ＝０．０００２、***Ｐ＝０．０３；脾臓（中央のパネル）：*Ｐ＜０．０００１；腎臓（右のパネル）：*Ｐ＝０．００２、**Ｐ＝０．０００４；新鮮なＲＢＣ輸血と比較した場合。図１３ｅに示した結果を得るために、マウスに、表示のとおり輸血し（１群あたりｎ＝５）、そして血漿ＮＴＢＩを輸血の２時間後に計測した。注意：存在しないエラーバーは検知されないＮＴＢＩレベルを示す。結果は２つの別々の実験を代表するものである。新鮮なＲＢＣ輸血と比較した場合に*Ｐ＝０．００８、**Ｐ＝０．０１。
【図１４】保存ＲＢＣの輸血剤が、マウスにおいて用量反応性の炎症誘発性応答を誘発することを示す。図１４ａに示した結果を得るために、非輸血Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１３）または新鮮なＲＢＣ（＜２４時間保存；１ｕ（すなわち１単位）＝２００μＬ、ｎ＝５；２ｕ＝４００μＬ、ｎ＝１７）、保存ＲＢＣ（２週間保存；１ｕ＝２００μＬ、ｎ＝５；２ｕ＝４００μＬ、ｎ＝１７）、洗浄した保存ＲＢＣ（４００μＬ；ｎ＝１３）、保存ＲＢＣ由来の上清（ＳＮ；４００μＬ；ｎ＝１２）、および保存ＲＢＣから調製したゴースト（４００μＬ；ｎ＝８）を輸血したマウスを、輸血の２時間後に屠殺し、そして血漿サイトカインレベルを計測した（ＩＬ−６（上のパネル）とＭＣＰ−１（下のパネル）を示す）。等価用量の輸血した新鮮なＲＢＣと比較した場合に*Ｐ＜０．０００１、**Ｐ＝０．００３。１４ｂに示した結果は、２つの実験を代表するものである。ＳＡＡ１−ルシフェラーゼレポーターマウスに、２００μＬの新鮮なＲＢＣ（＜２４時間保存）または保存ＲＢＣ（２週間保存）を輸血し、そして最長で輸血の２４時間後までの複数の時点にて非侵襲性生物発光画像法によってルシフェラーゼ活性を計測した（１群あたりｎ＝３）。図１４ｃに示した結果を得るために、生物発光を、新鮮なＲＢＣ（ｎ＝６；灰色の円）または保存ＲＢＣ（ｎ＝６；黒色の四角）を輸血していたＳＡＡ１−ルシフェラーゼレポーターマウスの肝脾領域にわたって定量した。*Ｐ＝０．００２。図１４ｄは、新鮮なＲＢＣまたは保存ＲＢＣ（１群あたりｎ＝６）の輸血の２４時間後のＳＡＡ１−ルシフェラーゼレポーターマウスにおける循環ＳＡＡ１タンパク質レベルを示す。*Ｐ＝０．００２。結果は２つの別々の実験から組み合わせる。
【図１５】保存ＲＢＣの輸血が、炎症反応に対してＬＰＳに相乗効果を与え、そして細菌増殖を助長することを示す。図１５ａに示した結果は、２つの実験を代表するものである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、亜臨床的用量のＬＰＳ（Ｅ．コリ０１１１：Ｂ４；尾静脈注射によって１マウスあたり３０μｇ）を注入し、それに続いて４００μＬの新鮮なＲＢＣまたは保存ＲＢＣを輸血した。マウスを、輸血の２４時間後に屠殺し、そして血漿サイトカインを計測した（１群あたりｎ＝５）。ＬＰＳ＋保存ＲＢＣを輸血したマウスと比較した場合に*Ｐ＝０．００８、**Ｐ＝０．００３。図１５ｂに示した結果を得るために、４００μＬの新鮮なＲＢＣ（ｎ＝１５）、保存ＲＢＣ（ｎ＝２４）、保存ＲＢＣ由来上清（ｎ＝１２））、洗浄した保存ＲＢＣ（ｎ＝１３）、または保存ＲＢＣから調製したゴースト（ｎ＝８）の輸血の２時間後のマウスから血漿（１００μＬ）を得た。血漿をさらに、対照非輸血マウス（ｎ＝１４）または保存ＲＢＣの輸血の２４時間後（ｎ＝８）からも得た。サンプルを、表示のとおり１ｘ１０6ＣＦＵのＥ．コリと一緒に振盪しながら３７℃にてインキュベートした。細菌増殖を、最長５時間まで３０分毎に６００ｎｍの吸収度によって観察した。保存ＲＢＣまたは洗浄した保存ＲＢＣの輸血の２時間後のマウスからの血漿中の細菌増殖は、インビトロにおける２．５時間のインキュベーションで他のすべての群と異なり始め、そして各群の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）（括弧内）が図のように有意に異なった。図１５ｃに示した結果を得るために、４００μＬの新鮮なＲＢＣまたは保存したＲＢＣの輸血の２時間後のマウスからのプール血漿サンプル（１００μＬ）に、クエン酸第二鉄（２０μＭ）、クエン酸ナトリウム（２０μＭ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；８０μＭ）、またはプロトポルフィリンＩＸ（２０μＭ）を補って、次いで〜１×１０6ＣＦＵのＥ．コリと一緒に振盪しながら３７℃にてインキュベートした。細菌増殖を、１群あたり５連で最長５時間まで３０分毎に６００ｎｍの吸収度によって観察した。クエン酸ナトリウム、ＢＳＡ、またはプロトポルフィリンＩＸを補ったもしくは補っていない新鮮なＲＢＣを輸血したマウスからの血漿中の増殖についての濃度曲線下面積（ＡＵＣ）（括弧内）は、他の３つの群と有意差があった。図１５ｄに示した結果を得るために、プール血漿（ｎ＝４）を、鉄キレート剤であるＤＦＯ（２０μＭ）、またはＤＦＯの鉄キレート化形態であるフェリオキサミン（ｆｅｒｒｏｘａｍｉｎｅ）（ＦＯ）（２０μＭ）と一緒にインキュベートし、そして先の実験について示したようにＥ．コリを接種した。ＤＦＯを含む血漿における増殖に関するＡＵＣ（括弧内）は、他のすべての群と有意に異なっていた。図１５ｅに示した結果を得るために、プール血漿（ｎ＝５）を、クエン酸第二鉄（１３３μＭ）を伴ってまたはそれなしに鉄キレート剤である２，２’−ジピリジル（４００μＭ）と一緒にインキュベートし、そして先の実験について示したようにＥ．コリを接種した。２，２’−ジピリジルを含む血漿における増殖に関するＡＵＣ（括弧内）は、他のすべての群と有意に異なっていた。*Ｐ＜．０５。結果は少なくとも２つの実験を代表するものであり、平均（±ＳＥＭ）として示す。エラーバーの不存在は、プール血漿を用いた非常に再現性の高い反復試験を示していることに留意のこと。
【図１６】ＤＦＯ処置が保存ＲＢＣ輸血によって誘発された炎症誘発性応答を軽減することを示す。図１６ａに示した結果を得るために、保存ＲＢＣ（４００μＬ）の輸血の直前に、マウスを、ＰＢＳビヒクル対照（ｎ＝２８）または等モルのクエン酸第二鉄の添加を伴う（ｎ＝１５）またはそれを伴わない（ｎ＝３１）３ｍｇのＤＦＯで前処理した。マウスを輸血の２時間後に屠殺し、そして血漿サイトカインレベルを計測した。ＰＢＳビヒクルを注入し、そして保存ＲＢＣを輸血したマウスと比較して*Ｐ＜．０５；**Ｐ＜．０１；***Ｐ＜．００１。図１６ｂに示されていた結果を得るために、２００μＬの新鮮なＲＢＣ（ｎ＝３；黒丸）、ＰＢＳビヒクル対照および保存ＲＢＣ（ｎ＝３；黒四角）、または３ｍｇのＤＦＯおよび保存ＲＢＣ（ｎ＝６；黒三角）を輸血したＳＡＡ１−ルシフェラーゼレポーターマウスの肝脾領域にわたって輸血後２４時間、生物発光を定量した；ビヒクル処理およびＤＦＯ処理マウスと比較して輸血の４時間後と６時間後の時点でＰ＝．０９５。図１６ｃは、古い保存ＲＢＣの輸血がどのように患者に副作用を引き起こし得るのか説明している提案された機構経路（「鉄仮説」）を示す。保存された、しかし新鮮ではないＲＢＣの輸血は、急激に大量のＲＢＣおよびＲＢＣ由来の鉄を単球／マクロファージ系に供給し、酸化ストレスと炎症性サイトカインの分泌をもたらす。マクロファージ貪食鉄の一部はさらに、酸化的損傷や細菌増殖の助長も引き起こす可能性がある循環中に、鉄が再び放出される（すなわちＮＴＢＩ）。ＳＩＲＳは全身性炎症反応症候群を意味する。
【図１７】保存ＲＢＣの輸血剤が、用量応答性の炎症誘発性応答を誘導することを示す。非輸血Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１３）または新鮮なＲＢＣ（＜２４時間保存；１ｕ＝２００μＬ、ｎ＝５；（すなわち、１換算ヒト単位（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｕｎｉｔｓ）＝２００μＬ）；２ｕ＝４００μＬ、ｎ＝１７）、保存ＲＢＣ（２週間保存；１ｕ＝２００μＬ、ｎ＝５；２ｕ＝４００μＬ、ｎ＝１７）、洗浄した保存ＲＢＣ（４００μＬ；ｎ＝１３）、保存ＲＢＣ由来上清（ＳＮ；４００μＬ；ｎ＝１２）、保存ＲＢＣから調製したゴースト（４００μＬ；ｎ＝８）、および保存ＲＢＣ由来のストローマ不含溶解物（４００μＬ、ｎ＝８）を輸血したマウスを輸血の２時間後に屠殺し、そして血漿サイトカイン／ケモカインレベルを計測した（表示のとおり）；新鮮なＲＢＣと比較して*Ｐ＜．０５、**Ｐ＜．０１、***Ｐ＜．００１。
【図１８】保存ＲＢＣの輸血が、炎症反応に対してＬＰＳに相乗効果を与えることを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、亜臨床的な用量のＬＰＳ（Ｅ．コリ０１１１：Ｂ４；尾静脈注射によってマウスあたり３０μｇ）を注入し、それに続いて４００μＬの新鮮なＲＢＣまたは保存ＲＢＣのいずれかを輸血した。マウスを輸血の２４時間後（または瀕死であればもっと早く）屠殺し、そして血漿サイトカイン／ケモカインを計測した（２つの実験のうち１つの代表的な実験、１群あたりｎ＝５）。ＬＰＳ＋保存ＲＢＣを注入したマウスと比較した場合に*Ｐ＝０．００８、**Ｐ＝０．００３、***Ｐ＝０．０３、****Ｐ＝０．０１、*****Ｐ＝０．００４。
【図１９】ＤＦＯ処置が、保存ＲＢＣ輸血によって引き起こされる炎症誘発応答を阻害することを示す。マウスを、処理しないかまたは保存ＲＢＣ輸血（４００μＬ；１群あたりｎ＝１４）直前に、３ｍｇのＤＦＯで前処理した。マウスを輸血の２時間後に屠殺し、そして血漿サイトカイン／ケモカインレベルを計測した。箱は正中線の２５パーセンタイル値および７５パーセンタイル値を表す。ヒゲは範囲を表す。ＫＣ：Ｐ＝０．０７；ＭＩＰ−１β：Ｐ＝０．１８；ＴＮＦ−α：Ｐ＝０．０９７。
【図２０】「新鮮な」３日目のＲＢＣ輸血または「古い」４２日目のＲＢＣ輸血で輸血された患者の、経時的な、血清中の総ビリルビンレベルを示すグラフである。水平な点線は正常な基準範囲を表す。
【図２１】「新鮮な」３日目のＲＢＣ輸血または「古い」４２日目のＲＢＣ輸血で輸血された患者の、経時的な、血清中の鉄レベルを示すグラフである。水平な点線は正常な基準範囲を表す。
【図２２】「新鮮な」３日目のＲＢＣ輸血または「古い」４２日目のＲＢＣ輸血で輸血された患者の、経時的な、血清中のハプトグロビンレベルを示すグラフである。水平な点線は正常な基準範囲を表す。
【図２３】「新鮮な」３日目のＲＢＣ輸血または「古い」４２日目のＲＢＣ輸血で輸血された患者の、経時的な、血清中のトランスフェリン飽和度を示すグラフである。水平な点線は正常な基準範囲を表す。
【図２４】「新鮮な」３日目のＲＢＣ輸血または「古い」４２日目のＲＢＣ輸血で輸血された患者の、経時的な、血漿中のＮＴＢＩレベルを示すグラフである。水平な点線は正常な基準範囲を表す。
【図２５】「新鮮な」３日目のＲＢＣ輸血または「古い」４２日目のＲＢＣ輸血で輸血された患者の、経時的な、血漿中の絶対好中球数を示すグラフである。水平な点線は正常な基準範囲を表す。
【図２６】「新鮮な」３日目のＲＢＣ輸血または「古い」４２日目のＲＢＣ輸血で輸血された患者の、経時的な、血漿中のＭＣＰ−１レベルを示すグラフである。水平な点線は正常な基準範囲を表す。
【図２７】本発明による代表的な器具の透視図を示す。
【図２８】直線Ａ−Ａに沿った図２７の器具の横断面図を示す。
【図２９】本発明による器具の代替実施形態の透視図を示す。
【図３０】マクロファージが輸血された保存ＲＢＣの除去に関与することを示す。輸血の受血者とドナーのすべてが、同種の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８〜１２週齢）であった。図３０ａに示した結果の実験条件は以下のとおりであった。マウスには、保存ＲＢＣ輸血の４８時間前に、２ｍｇのリポソーム化クロドロネート（ｎ＝９）または対照ＰＢＳ−リポソーム（ｎ＝１０）を腹腔内に注入した。そして、２時間ＲＢＣ生存を計測した。２時間ＲＢＣ生存（黒四角）を各マウスについて示し、そして水平な棒線が平均を示す。結果は２つの別々の実験を代表するものである；ＰＢＳ−リポソームでの処理と比較して***Ｐ＝０．００１。図３０ｂは、表示のとおり、保存ＲＢＣの輸血の４８時間前にリポソーム化クロドロネートまたは対照ＰＢＳ−リポソームで処理し、そして抗マウスＦ４／８０モノクローナル抗体によって染色したマウスからの肝臓および脾臓の組織切片の代表的な像を示す。茶色に染色された細胞の不存在によって証明される、リポソーム化クロドロネート処理マウスにおいて組織マクロファージの不存在に留意のこと。図３０ｃは、新鮮なＲＢＣまたは保存ＲＢＣを輸血したマウスの肝臓からの組織切片の代表的な像を示す。切片を、表示のとおり、ヘマトキシリンおよびエオシンまたは抗マウスＦ４／８０モノクローナル抗体で染色した。矢印は、ＲＢＣを貪食した組織マクロファージを意味する。茶色の染色は、マクロファージのＦ４／８０免疫反応性の結果である；細胞質染色は、貪食されたＲＢＣの蓄積のため、保存ＲＢＣを輸血したマウスの細胞周辺部と置き換えられる。本来の倍率は４００倍であった。５つの剖検から得られた独特な代表例を示す。
【図３１】保存ＲＢＣの輸血が、用量応答性の炎症誘発性サイトカイン反応を誘導することを示す。際立った吸光度によって検出される血色素血症は、保存ＲＢＣ由来のストローマ不含溶解物を輸血したすべてのマウス（ｎ＝８）で観察された。新鮮なＲＢＣ（＜２４時間保存）、保存ＲＢＣ（２週間保存）、または保存ＲＢＣ由来のストローマ不含溶解物の輸血の２時間後にマウスから得た血漿（ＰＢＳで１：４に希釈）の代表的なスペクトルを示す。
【図３２】ヒトにおける古い保存ＲＢＣの輸血が、インターロイキン−６（図３２ａ）およびヘプシジン（図３２ｂ）の循環血清レベルを上げることを示す。分析物（表示のとおり）の循環レベルを、「新鮮」な３日目のＲＢＣ輸血、および「古い」４２日目のＲＢＣ輸血（それぞれ各パネル内の左側と右側のグラフ）について示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明の一実施形態は、時間の経った赤血球を含む組成物の患者への急性輸血により引き起こされる患者の副作用を改善するための器具である。その器具は、前記組成物と無菌状態で接触する内部表面および有効量の鉄キレート剤を含んでなる。
【００２５】
本発明では、器具は、時間の経った赤血球、例えば保存ＲＢＣなどを含む組成物の保存や加工に使用されるあらゆる従来のデバイスであってもよい。例えば器具は、それを必要としている患者への輸血のために赤血球を保存するためのコンテナ、例えば従来の輸血バッグなどであってもよい。
【００２６】
次に図２７を見ると、この実施形態の一態様は従来の血液バッグである。示されているとおり、器具（１０）には、内部表面（２）が含まれ、それが内部空間（１）の輪郭を示している。直線Ａ−Ａに沿った器具（１０）の横断面図が図２８に示されている。内部表面（２’）が示されているが、それが内部空間（１’）の輪郭を示しており、その中に、例えばＲＢＣを含む組成物が保存される。
【００２７】
本発明による鉄キレート剤は、器具（１０’）の内部表面（２’）に配置されてもよい。本発明では、鉄キレート剤は、例えば器具の内部表面へのコーティングとして塗布されても、いずれかの適当な従来の手段を使用して内部表面内に含浸されてもよい。また、器具の内部表面上／内に本発明による鉄キレート剤を適用するための他の従来法もまた企図される。
【００２８】
あるいは、本発明の鉄キレート剤は、組成物と無菌状態で接触する内部表面（２’）によって形成される器具（１０’）の内部空間（１’）内に配置されてもよい。
【００２９】
この実施形態のさらに別の態様では、器具はあらゆる従来の血液フィルターであってもよい。次に図２９を見ると、本発明による代表的な血液フィルタ（１００）が示されている。その血液フィルターは、内部表面（２１）および内部空間（２０）を含んでなる。本発明では、あらゆる従来の血液フィルターを使用できる。鉄キレート剤は、例えばＲＢＣと接触する血液フィルターのあらゆる内部表面に配置することもできる。よって、キレート剤は、血液フィルターの内部表面（２１）上にコーティングされても、その中に含浸されてもよい。あるいは、鉄キレート剤は、血液フィルターのフィルター部分（２２）に配置されてもよい。輸血バッグまたは血液フィルター内に鉄キレート剤を配置する位置や手段は、その鉄キレート剤が時間の経った赤血球を含む組成物と接触し、そしてそこから鉄をキレートできる限り重要ではない。
【００３０】
本明細書中に使用されるとき、「急性（ａｃｕｔｅ）」輸血は、単回の輸血か、または対象の慢性的な病状の処置過程の中で実施される慢性的輸血の投薬計画の一部を構成することのない一連の輸血を意味する。用語「慢性的（ｃｈｒｏｎｉｃ）」輸血には、慢性的な病状を患っている対象に与えられる輸血の通常または頻繁なスケジュールの一部として投与される単回の輸血が含まれる。
【００３１】
本明細書中に使用されるとき、「時間の経った（ａｇｅｄ）赤血球」は、ドナーから取り出され、そしてドナーの体外、通常、冷蔵保存状態で、それらがもはや輸血での使用に最適な状態ではなくなるまでの一定の期間保存した赤血球（ＲＢＣ）を意味する。例えば、細胞が保存された温度または使用される（単数もしくは複数の）保存料により、その後ＲＢＣが「時間の経った」ＲＢＣと見なされる保存の日数にはある程度ばらつきがあり得る。「時間の経った」ＲＢＣには、現在のＦＤＡ規格により「期限切れ」であると見なされるＲＢＣ、例えば約３５〜４２日間冷蔵状態で保存したものなどが含まれるが、これだけに限定されるものではない。しかしながら、約３５日間未満しか体外で保存されていない細胞でも、当業者に輸血での使用に最適でないと見なされることもあるので、それは本発明の目的とする「時間の経った」ものと見なされる。例えば特定の実施形態では、「時間の経った」ＲＢＣという用語は、ドナーの体外で約１４日間以上、約１６日間以上、約１８日間以上、約２０日間以上、約２２日間以上、約２４日間以上、約２６日間以上、約２８日間以上、約３０日間以上、約３２日間以上、または約３４日間以上保存された細胞を指すこともできる。当業者は、例えば使用した保存料（単数もしくは複数）を含めた保存媒質、保存温度、ＲＢＣの生存、対象（例えば被験者または処置対象など）に輸血した後に生き残り、そして循環している細胞の割合、ならびに（これだけに限定されるものではないが、ＲＢＣサンプルの、炎症誘発性サイトカインの量、トランスフェリン不含鉄の量、ＡＴＰの減少［２０］、２，３−ジホスホグリセリン酸の減少［２１］、膜胞化［２２］、タンパク質および脂質の酸化［２３、２４］、Ｓ−ニトロソヘモグロビンの減少［２５］、低い表面シアリル化［２６］、低いＣＤ４７発現［２７］、高いホスファチジルセリン露出［２８］、および低い変形能［２９］、低い血球完全性、および／または、総ヘモグロビンの１％超の遊離ヘモグロビンのレベルを含めた）特定の生化学的または他の試験パラメーターなどの因子を考慮して、そのような細胞が時間の経ったものと見なされるかどうか判断できる。
【００３２】
先に記載したとおり、ＲＢＣが時間の経ったものであるとみなされる時期に関してはある程度ばらつきがある。最も高い頻度で、献血および／または輸血の分野に従事している医師または他の医学専門家が、ＲＢＣが時間の経ったものと見なされるかどうかに関して測定を行うことができるだろう。
【００３３】
本明細書中に使用されるとき、「鉄キレート剤（ｉｒｏｎ  ｃｈｅｌａｔｏｒ）」という用語は、急性輸血から生じる副作用を予防または阻害できる、Ｆｅ（ＩＩ）またはＦｅ（ＩＩＩ）を含めた鉄と相互作用する能力のあるあらゆる物質を意味する。本発明による鉄キレート剤の限定されることのない例には、アポトランスフェリン、ラクトトランスフェリン、金属結合酵素、ヒドロキサム酸重合体（Ｖａｒａｐｒａｓｅｄら［１１０］によって開示されたものを含む）、リン酸化ミオイノシトール重合体（Ｌｅｍｍａら［１１１］によって開示されたものを含む）、ヘムＢ、ヘムＡ、ヘムＣ、デスフェロキサミン（ＤＦＯ）、デスフェリチオシン（ＤＦＴ）、デスフェリ−エキソケリン（ｄｅｓｆｅｒｒｉ−ｅｘｏｃｈｅｌｉｎ）（Ｄ−Ｅｘｏ）、（Ｓ）−ＤＭＦＴ、（Ｓ）−ＤＡＤＭＤＦＴ、（Ｓ）−ＤＡＤＦＴ、４’−（ＯＨ）−ＤＡＤＦＴ、４’−（ＯＨ）−ＤＡＤＭＤＦＴまたはその六座誘導体ＢＤＵ［１１２］、デフェリプロン（Ｌ１）、その代謝でヒドロキシピリジノン類似体を生じるヒドロキシピリジノンエステル・プロドラッグ、ＣＰ９４、ＣＰ５０２、ＣＰ３６５、ＣＰ１０２、ＣＰ４１、ＣＰ３８、ＬｉＮＡＩＩ、Ｐｒ−（Ｍｅ−３，２−ＨＯＰＯ）およびその六座類似体ＴＲＥＮ−（Ｍｅ−３，２−ＨＯＰＯ）、ＣＰ１１７、ＣＰ１６５、タキピリジン（ｔａｃｈｐｙｒｉｄｉｎｅ）アルキル類似体［１１３］、タキピリジン二級アミン連結類似体、タキピリジンピリジル連結類似体、タキピリジンピリジル連結マレイミド誘導体類似体［１１４］、ＰＩＨ、ＳＩＨ、ＰＣＩＨ、ＰＫＩＨ、ＰＩＨ類似化合物１０１、ＰＩＨ類似化合物１０２、ＰＩＨ類似化合物１０３、ＰＩＨ類似化合物１０４、ＰＩＨ類似化合物１０５、ＰＩＨ類似化合物１０６、ＰＩＨ類似化合物１０７、ＰＩＨ類似化合物１０８、ＰＩＨ類似化合物１０９、ＰＩＨ類似化合物１１０、ＰＩＨ類似化合物１１２、ＰＩＨ類似化合物１１３、ＰＩＨ類似化合物１１４、ＰＩＨ類似化合物１１５、ＰＩＨ類似化合物２０１、ＰＩＨ類似化合物２０２、ＰＩＨ類似化合物２０４、ＰＩＨ類似化合物２０５、ＰＩＨ類似化合物２０６、ＰＩＨ類似化合物２０７、ＰＩＨ類似化合物２０８、ＰＩＨ類似化合物２０９、ＰＩＨ類似化合物２１２、ＰＩＨ類似化合物２１５、ＰＩＨ類似化合物３０１、ＰＩＨ類似化合物３０２、ＰＩＨ類似化合物３０５、ＰＩＨ類似化合物３０７、ＰＩＨ類似化合物３０８、ＰＩＨ類似化合物３０９、ＰＩＨ類似化合物３１０、ＰＩＨ類似化合物３１２、ＰＩＨ類似化合物３１５、ＰＣＢＨ、ＰＣＨＨ、ＰＣＢＢＨ、ＰＣＡＨ、ＰＣＴＨ、ＰＫＢＨ、ＰＫＡＨ、ＰＫ３ＢＢＨ、ＰＫＨＨ、ＰＫＴＨ［１１５］、５−ＨＰ、トリアピン（Ｔｒｉａｐｉｎｅ）、ＮＴ、Ｎ２ｍＴ、Ｎ４ｍＴ、Ｎ４４ｍＴ、Ｎ４ｅＴ、Ｎ４ａＴ、Ｎ４ｐＴ、ＤｐＴ、ＤＰ２ｍＴ、Ｄｐ４ｍＴ、Ｄｐ４４ｍＴ、Ｄｐ４ｅＴ、Ｄｐ４ａＴ、Ｄｐ４ｐＴ、デフェラシロクス（ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘ）（Ｅｘｊａｄｅ、ＩＣＬ６７０Ａ）、デフェラシロクスの５，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾール類似体、ＨＢＥＤ、Ｆａｒａｌｅｘ−Ｇ、４−ヒドロキシ−２−ノニルキノリン、およびそれらの組み合わせが含まれる。好ましくは、鉄キ���ート剤は、デスフェロキサミン、デフェラシロクス、およびアポトランスフェリンから成る群から選択される。
【００３４】
本発明の他の実施形態は、時間の経った赤血球を含む組成物の患者への急性輸血によって引き起こされる患者の副作用を改善するためのキットである。そのキットには、有効量の鉄キレート剤を含むコンテナが、どのようしてその鉄キレート剤を直接組成物に、血液製剤関連器具に、またはそれを必要としている患者に投与するかについての使用説明書と一緒に包装されて含まれている。
【００３５】
本明細書中に使用されるとき、「血液製剤（ｂｌｏｏｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）」という用語は、赤血球を含んでなるあらゆる組成物を指す。そのような血液製剤の例には、全血および「袋詰めされた（ｐａｃｋｅｄ）赤血球」またはＰＲＢＣ（当該技術分野では「パックドセル」とも呼ばれる）が含まれるが、これだけに限定されるものではない。ＰＲＢＣは、一般に、全血から血小板と血漿を取り除いて、主に赤血球を含む調製物を残す。ＰＲＢＣではさらに、白血球が除去される、すなわち血液から白血球を取り除く工程を受けることもある。米国において輸血に使用される血液製剤の大部分は、白血球除去ＰＲＢＣである。古い保存血液の輸血によって観察された副作用のうちの、すべてではなく、一部が、血液製剤中の白血球に起因することが、証拠から示唆された。本発明に従って使用される血液製剤は、好ましくは白血球除去されたものである。
【００３６】
この実施形態の一態様では、血液製剤関連器具とは、血液フィルターまたは血液バッグである。
【００３７】
この実施形態の別の態様では、鉄キレート剤は、アポトランスフェリン、ラクトトランスフェリン、金属結合酵素、ヒドロキサム酸重合体、リン酸化ミオイノシトール重合体、ヘムＢ、ヘムＡ、ヘムＣ、デスフェロキサミン（ＤＦＯ）、デスフェリチオシン（ＤＦＴ）、デスフェリ−エキソケリン（Ｄ−Ｅｘｏ）、（Ｓ）−ＤＭＦＴ、（Ｓ）−ＤＡＤＭＤＦＴ、（Ｓ）−ＤＡＤＦＴ、４’−（ＯＨ）−ＤＡＤＦＴ、４’−（ＯＨ）−ＤＡＤＭＤＦＴまたはその六座誘導体ＢＤＵ、デフェリプロン（Ｌ１）、その代謝でヒドロキシピリジノン類似体を生じるヒドロキシピリジノンエステル・プロドラッグ、ＣＰ９４、ＣＰ５０２、ＣＰ３６５、ＣＰ１０２、ＣＰ４１、ＣＰ３８、ＬｉＮＡＩＩ、Ｐｒ−（Ｍｅ−３，２−ＨＯＰＯ）およびその六座類似体ＴＲＥＮ−（Ｍｅ−３，２−ＨＯＰＯ）、ＣＰ１１７、ＣＰ１６５、タキピリジンアルキル類似体、タキピリジン二級アミン連結類似体、タキピリジンピリジル連結類似体、タキピリジンピリジル連結マレイミド誘導体類似体、ＰＩＨ、ＳＩＨ、ＰＣＩＨ、ＰＫＩＨ、ＰＩＨ類似化合物１０１、ＰＩＨ類似化合物１０２、ＰＩＨ類似化合物１０３、ＰＩＨ類似化合物１０４、ＰＩＨ類似化合物１０５、ＰＩＨ類似化合物１０６、ＰＩＨ類似化合物１０７、ＰＩＨ類似化合物１０８、ＰＩＨ類似化合物１０９、ＰＩＨ類似化合物１１０、ＰＩＨ類似化合物１１２、ＰＩＨ類似化合物１１３、ＰＩＨ類似化合物１１４、ＰＩＨ類似化合物１１５、ＰＩＨ類似化合物２０１、ＰＩＨ類似化合物２０２、ＰＩＨ類似化合物２０４、ＰＩＨ類似化合物２０５、ＰＩＨ類似化合物２０６、ＰＩＨ類似化合物２０７、ＰＩＨ類似化合物２０８、ＰＩＨ類似化合物２０９、ＰＩＨ類似化合物２１２、ＰＩＨ類似化合物２１５、ＰＩＨ類似化合物３０１、ＰＩＨ類似化合物３０２、ＰＩＨ類似化合物３０５、ＰＩＨ類似化合物３０７、ＰＩＨ類似化合物３０８、ＰＩＨ類似化合物３０９、ＰＩＨ類似化合物３１０、ＰＩＨ類似化合物３１２、ＰＩＨ類似化合物３１５、ＰＣＢＨ、ＰＣＨＨ、ＰＣＢＢＨ、ＰＣＡＨ、ＰＣＴＨ、ＰＫＢＨ、ＰＫＡＨ、ＰＫ３ＢＢＨ、ＰＫＨＨ、ＰＫＴＨ、５−ＨＰ、トリアピン、ＮＴ、Ｎ２ｍＴ、Ｎ４ｍＴ、Ｎ４４ｍＴ、Ｎ４ｅＴ、Ｎ４ａＴ、Ｎ４ｐＴ、ＤｐＴ、ＤＰ２ｍＴ、Ｄｐ４ｍＴ、Ｄｐ４４ｍＴ、Ｄｐ４ｅＴ、Ｄｐ４ａＴ、Ｄｐ４ｐＴ、デフェラシロクス（Ｅｘｊａｄｅ、ＩＣＬ６７０Ａ）、デフェラシロクスの５，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾール類似体、ＨＢＥＤ、Ｆａｒａｌｅｘ−Ｇ、４−ヒドロキシ−２−ノニルキノリン、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される。好ましくは、鉄キレート剤は、デスフェロキサミン、デフェラシロクス、およびアポトランスフェリンから成る群から選択される。
【００３８】
本発明の更なる実施形態は、時間の経った赤血球を含む組成物の患者への急性輸血によって引き起こされる患者の副作用を改善するための方法である。この方法は、鉄キレート剤を提供することを含むが、前記鉄キレート剤は時間の経った赤血球のマクロファージ食作用によって放出された鉄をキレートする能力を有していて、そのキレート剤が患者で副作用を改善する。
【００３９】
この実施形態の一態様では、副作用はサイトカインストームである。本明細書中に使用されるとき、「サイトカインストーム」は、様々なサイトカイン、例えばＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１０などのレベルの上昇を伴う激しい炎症誘発性サイトカイン応答を意味する。
【００４０】
この実施形態の別の態様では、副作用は、患者の鉄依存性病原菌の増加である。本発明では、「鉄依存性病原菌」はその宿主、特にヒトに疾患または病気を引き起こす、および鉄を利用するかまたは他の方法で加工するあらゆる生物学的因子である。本発明による鉄依存性病原菌の限定されることのない代表的な例には、鉄依存性ウィルス、鉄依存性細菌、鉄依存性真菌、および鉄依存性プリオンが含まれる。
【００４１】
この実施形態の更なる態様では、鉄キレート剤は、ペプチド、重合体、有機または無機小分子、およびその組み合わせから成る群から選択される。
【００４２】
本明細書中に使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、互換的に使用される。本発明では、これらの用語は２個以上アミノ酸の連結した配列を意味し、それは、天然のものであっても、合成のものであっても、または天然のものと合成のものの修飾形態または組み合わせであってもよい。
【００４３】
本明細書中に使用されるとき、「重合体」は、互いに連結して、これだけに限定されるものではないが、長い鎖を含めた高次構造物を形成する２個以上の分子（アミノ酸を除く）を意味する。
【００４４】
本発明では、「小分子」という用語には、鉄キレート剤として機能する、ペプチドおよび重合体以外のあらゆる化学的部分または他の部分が含まれる。小分子には、現在知られている、そして使用されているいくつもの治療薬を含むことができ、それは鉄キレート機能についてスクリーニングする目的のためにそのような分子の研究室で合成されることもできる。小分子は、サイズによって巨大分子と区別される。本発明の小分子は、通常、約５，０００ダルトン（Ｄａ）未満、好ましくは約２，５００Ｄａ未満、より好ましくは１，０００Ｄａ未満、最も好ましくは約５００Ｄａ未満の分子量を持つ。
【００４５】
小分子には、制限されることなしに、有機分子と無機分子が含まれる。本明細書中に使用されるとき、「有機小分子」という用語は、巨大分子、例えば炭素ベースの重合体やポリペプチドなどを除く、炭素ベースの小分子を指し、「無機分子」という用語は、その他の小分子を指す。炭素に加えて、有機小分子は、カルシウム、塩素、フッ素、銅、水素、鉄、カリウム、窒素、酸素、硫黄および他の元素を含有することもできる。有機分子は、芳香族または脂肪族の形態であることもできる。有機小分子の制限されることのない例には、アセトン、アルコール、アニリン、炭水化物、単糖、アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、プロテオグリカン、ケトン、アルデヒド、飽和、不飽和および多価不飽和脂肪、油およびワックス、アルケン、エステル、エーテル、チオール、硫化物、環式化合物、複素環式化合物、イミダゾール、ならびにフェノールが含まれる。本明細書中に使用されるとき、有機小分子にはさらに、ニトロ化有機化合物とハロゲン化（例えば、塩素化）有機化合物も含まれる。
【００４６】
好ましい小分子は、比較的に簡単かつ安い費用で製造され、製剤化され、または調製される。好ましい小分子は、様々な貯蔵条件下で安定している。好ましい小分子は、巨大分子と密な結合の中に配置されて、生物学的に活性であり、かつ、改善された医薬特性を有する分子を形成することもできる。改善された医薬特性には、所望の生物学的活性に好ましい循環時間の変化、分布、代謝、修飾、排泄、分泌、排除、および安定性が含まれる。改善された医薬特性には、化学物質の毒性学および効能特徴の変化が含まれる。
【００４７】
１つの好ましい実施形態では、鉄キレートペプチドは、アポトランスフェリン、ラクトトランスフェリン、金属結合酵素、かかるタンパク質由来の鉄結合性ドメイン、およびかかるタンパク質の鉄結合性部位を模倣するように設計した合成ペプチドから成る群から選択される。
【００４８】
別の好ましい実施形態では、鉄のキレート重合体は、ヒドロキサム酸重合体またはリン酸化ミオイノシトール重合体である。
【００４９】
この実施形態の更なる態様では、鉄キレート剤は、ヘムＢ、ヘムＡ、およびヘムＣから成る群から選択されるポルフィリン環である。本明細書中で使用されるとき、「ポルフィリン環」は、メチン架橋（＝ＣＨ−）を介してそれらのα炭素原子にて相互接続された、修飾された４つのピロール・サブユニットを特徴とする複素環式芳香族分子を意味する。
【００５０】
この実施形態のさらに別の態様では、鉄キレート剤は、シデロホアまたは合成によって得られたその類似体である。本明細書中に使用されるとき、「シデロホア」は、環境内の鉄の不溶性性質に対応して、微生物によって分泌される鉄結合性化合物を意味する。好ましくはシデロホアは、デスフェロキサミン（ＤＦＯ）、デスフェリチオシン（ＤＦＴ）、およびデスフェリ−エキソケリン（Ｄ−Ｅｘｏ）から成る群から選択される。
【００５１】
この実施形態の追加態様では、鉄キレート剤は、（Ｓ）−ＤＭＦＴ、（Ｓ）−ＤＡＤＭＤＦＴ、（Ｓ）−ＤＡＤＦＴ、４’−（ＯＨ）−ＤＡＤＦＴ、および４’−（ＯＨ）−ＤＡＤＭＤＦＴ、またはその六座誘導体ＢＤＵから成る群から選択されるＤＦＴ類似体である。
【００５２】
この実施形態の更なる態様では、鉄キレート剤はヒドロキシピリジノンである。本明細書中に使用されるとき、「ヒドロキシピリジノン」は、複素環式６員環、ケトン基、およびヒドロキシル基を含む有機化合物を意味する。好ましくは、ヒドロキシピリジノンは、デフェリプロン（Ｌ１）もしくはその類似体、またはその代謝でヒドロキシピリジノン類似体を生じるヒドロキシピリジノンエステル・プロドラッグから選択される。より好ましくは、デフェリプロン類似体は、ＣＰ９４、ＣＰ５０２、ＣＰ３６５、ＣＰ１０２、ＣＰ４１、ＣＰ３８、ＬｉＮＡＩＩ、Ｐｒ−（Ｍｅ−３，２−ＨＯＰＯ）およびその六座類似体ＴＲＥＮ−（Ｍｅ−３，２−ＨＯＰＯ）から成る群から選択され、そしてヒドロキシピリジノンエステル・プロドラッグは、ＣＰ１１７およびＣＰ１６５から成る群から選択される。
【００５３】
この実施形態のさらに別の態様では、鉄キレート剤は、タキピリジンまたはその類似体である。本明細書中に使用されるとき、「タキピリジン」は、シス，シス−１，３，５−トリアミノシクロヘキサン骨格ベースの六座鉄キレート剤を意味する。好ましくは、タキピリジン類似体は、タキピリジンアルキル類似体、タキピリジン二級アミン連結類似体、タキピリジンピリジル連結類似体、およびタキピリジンピリジル連結マレイミド誘導体類似体から成る群から選択される。
【００５４】
この実施形態の追加態様では、鉄キレート剤は、アロイルヒドラゾンである。本明細書中に使用されるとき、「アロイルヒドラゾン」は、構造Ｒ1Ｒ2Ｃ＝ＮＮＨＲ3｛式中、Ｒ1、Ｒ2、および／またはＲ3は、芳香族環を含む｝を有する化合物である。好ましくは、アロイルヒドラゾン鉄キレート剤は、ＰＩＨ、ＳＩＨ、３１１シリーズの類似化合物、ＰＣＩＨ、ＰＫＩＨ、およびそれぞれの親化合物の類似体から成る群から選択される。ＰＩＨ類似体の制限されることのない例には、１００シリーズの類似化合物１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１２、１１３、１１４および１１５；または２００シリーズの類似化合物２０１、２０２、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１２および２１５が含まれる（例えばＫａｌｉｎｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．［１１５］を参照のこと）。３１１シリーズの類似化合物の制限されることのない例には、化合物３０１、３０２、３０５、３０７、３０８、３０９、３１０、３１２および３１５が含まれる（例えばＫａｌｉｎｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．［１１５］を参照のこと）。ＰＣＩＨ類似体の制限されることのない例には、ＰＣＢＨ、ＰＣＨＨ、ＰＣＢＢＨ、ＰＣＡＨおよびＰＣＴＨが含まれる。ＰＫＩＨ類似体の制限されることのない例には、ＰＫＢＨ、ＰＫＡＨ、ＰＫ３ＢＢＨ、ＰＫＨＨおよびＰＫＴＨが含まれる。
【００５５】
この実施形態の更なる態様では、鉄キレート剤は、チオセミカルバゾンである。本明細書中に使用されるとき、「チオセミカルバゾン」は、以下の一般構造：
【００５６】
【化１】
2012530133.tif 000002
【００５７】
を有する化合物を意味し、そしてそれは鉄をキレートする能力を有する。好ましくは、チオセミカルバゾンは、５−ＨＰ、トリアピン、ＮＴシリーズのメンバー、およびＤｐＴシリーズのメンバーから成る群から選択される。ＮＴシリーズの制限されることのない例には、ＮＴ、Ｎ２ｍＴ、Ｎ４ｍＴ、Ｎ４４ｍＴ、Ｎ４ｅＴ、Ｎ４ａＴ、およびＮ４ｐＴが含まれる（例えばＫａｌｉｎｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．［１１５］を参照のこと）。ＤｐＴシリーズの制限されることのない例には、ＤｐＴ、ＤＰ２ｍＴ、Ｄｐ４ｍＴ、Ｄｐ４４ｍＴ、Ｄｐ４ｅＴ、Ｄｐ４ａＴ、およびＤｐ４ｐＴが含まれる（例えばＫａｌｉｎｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．［１１５］を参照のこと）。
【００５８】
この実施形態の別の態様では、鉄キレート剤は、デフェラシロクス（ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘ）（Ｅｘｊａｄｅ、ＩＣＬ６７０Ａ）、デフェラシロクスの５，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾール類似体、ＨＢＥＤ、Ｆａｒａｌｅｘ−Ｇ、および４−ヒドロキシ−２−ノニルキノリンから成る群から選択される（例えばＫａｌｉｎｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．［１１５］を参照のこと）。
【００５９】
この実施形態の追加態様では、供給ステップには、副作用を改善するのに有効である量の鉄キレート剤を患者に投与することが含まれる。
【００６０】
この実施形態のさらに別の態様では、供給ステップには、輸血に先立って、時間の経った赤血球を含む組成物を、副作用を改善するのに有効な量の鉄キレート剤と接触させることが含まれる。
【００６１】
本発明では、「有効量」（または「有効である」量）は、有益または所望の結果を達成するのに十分な量である。患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトの処置に関して、鉄キレート剤の「有効量」は、急性輸血によって引き起こされる患者の副作用を改善するのに十分な量である。有効量は、１回分もしくは複数回分の用量で投与され得る。
【００６２】
本発明による鉄キレート剤の投与量の好適な、制限されることのない例は、約１ｎｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇであり、それを患者に投与するのであれば、例えば約５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇを含めた、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇなどである。鉄キレート剤の他の代表的な投与量には、約１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、または１０００ｍｇ／ｋｇが含まれる。好ましくは、投与量は約２０ｍｇ／ｋｇ体重である。代替の好ましいが、しかし代表的な実施形態では、鉄キレート剤は、約３０〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で投与されるが、より低用量、例えば約２５ｍｇ／ｋｇ／日なども可能である。化合物の有効量は、１日を通して適当な間隔で別々に投与される２、３、４、５、６回またはそれ以上の小用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）として投与されてもよい。
【００６３】
有効量は、一般に医師によって個別的に決定され、そしてそれは当業者の技能の範疇である。適当な投与量を決定するとき、通常、いくつかの要因が考慮される。これらの要因には、患者の年齢、性別、および体重、処置中の症状、症状の重症度、ならびに投与中の薬物の形態が含まれる。
【００６４】
有効な剤形、投与様式、および投与量は、実験的に決定することもでき、そしてそういった決定を行うことは当該技術分野の技能の範疇である。投与量が投与経路、排泄速度、処置の持続期間、投与されるその他の薬物の正体、動物の年齢、サイズ、および種、ならびに医学および獣医学の分野で周知の類似した要因によって変化することは、当業者によって理解されている。一般に、本発明による鉄キレート剤の好適な用量は、所望の効果を生じさせるのに有効な最も低い用量であるところの記鉄キレート剤の量になるだろう。鉄キレート剤の有効量は、１日を通して適当な間隔で別々に投与される２、３、４、５、６回またはそれ以上の小用量として投与され得る。
【００６５】
本発明の鉄キレート剤は、あらゆる所望のおよび効果的な様式で：経口摂取または非経口もしくは任意の適当な様式による他の投与、例えば腹腔内投与、皮下投与、局所投与、皮内投与、吸入、肺内投与、直腸投与、腟内投与、舌下投与、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、くも膜下腔内投与、またはリンパ管内投与などのための医薬組成物として、投与され得る。さらに、本発明の鉄キレート剤は、他の処置と併用して投与され得る。本発明の鉄キレート剤は、所望であれば、カプセル化されるかまたはほかの方法で胃または他の分泌物から保護され得る。
【００６６】
本発明の鉄キレート剤は、単体で投与され得るが、鉄キレート剤が医薬製剤（組成物）として投与されることが好ましい。そういった医薬製剤は、通常、１つもしくは複数の医薬的に許容し得る担体および、場合により１つもしくは複数の他の化合物、薬物、成分および／または材料との混合された有効成分として１つもしくは複数のモジュレーターを含む。選択された投与経路にかかわらず、本発明の鉄キレート剤は、当業者に知られている従来の方法によって、医薬的に許容し得る剤形に処方される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．）を参照のこと。
【００６７】
医薬的に許容し得る担体は、当該技術分野において周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）およびＴｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）を参照のこと）、そして糖（例えば、ラクトース、ショ糖、マンニトール、およびソルビトール）、デンプン、セルロース調製物、リン酸カルシウム（例えば、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、およびリン酸水素カルシウム）、クエン酸ナトリウム、水、水溶液（例えば、生理的食塩水、塩化ナトリウム注射、リンゲル液注射、デキストロース注射、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射、乳酸リンゲル液注射）、アルコール（例えば、エチルアルコール、プロピルアルコール、およびベンジルアルコール）、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコール）、有機エスエル（例えば、オレイン酸エチル、およびトリグリセリド）、生分解性高分子（例えば、ポリラクチド−ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）、およびポリ（アンヒドリド））、弾性マトリックス（ｅｌａｓｔｏｍｅｒｉｃ  ｍａｔｒｉｃｅｓ）、リポソーム、マイクロスフィア、油（例えば、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、キャスター、ゴマ、綿実、およびラッカセイ）、ココアバター、ワックス（例えば坐剤ワックス）、パラフィン、シリコーン、タルク、シリシレート（ｓｉｌｉｃｙｌａｔｅ）などが含まれる。本発明の鉄キレート剤を含む医薬組成物に使用される、各々の医薬的に許容し得る担体は、製剤の他の成分と適合性があり、そして対象に対して有害ではないという意味において、「許容し得る」ものでなければならない。選択された剤形および意図された投与経路に好適である担体は、当技術分野において周知であり、そして選択された剤形に関して許容し得る担体および投与方法は、当該技術分野における通常の技術を使用して決定され得る。
【００６８】
本発明の鉄キレート剤を含む医薬組成物には、場合により、医薬組成物において一般的に使用される追加成分、および／または材料を含むこともできる。これらの成分および材料は、当該技術分野において周知であり、そして（１）賦形剤又は増量剤、例えばデンプン、ラクトース、ショ糖、グルコース、マンニトールおよびケイ酸など；（２）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドンン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ショ糖およびアカシアなど；（３）保湿剤、例えばグリセロールなど；（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、デンプングリコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｔａｒｃｈ  ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）、架橋されたカルボキシメチルセルロースナトリウムおよび炭酸ナトリウムなど；（５）溶解遅延剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｔａｒｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）例えばパラフィンなど；（６）吸着加速剤（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ）、例えば四級アンモニウム化合物など；（７）湿潤剤、例えばセチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなど；（８）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイト粘土など；（９）滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、およびラウリル硫酸ナトリウムなど；（１０）懸濁化剤、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、およびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド（ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｍｅｔａｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、ベントナイト、寒天、およびトラガカントなど；（１１）緩衝剤；（１２）賦形剤、例えばラクトース、乳糖、ポリエチレングリコール，動物性および植物性脂肪、オイル、ワックス、パラフィン、ココアバター、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、サリチル酸塩、酸化亜鉛、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド散剤など；（１３）不活性希釈剤、例えば水、又は他の溶媒など；（１４）保存剤；（１５）界面活性剤；（１６）分散剤；（１７）制御放出又は吸収遅延剤、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、生分解性高分子、リポソーム、マイクロスフィア、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、およびワックスなど；（１８）乳白剤；（１９）助剤；（２０）湿潤剤；（２１）乳化剤および懸濁化剤；（２２）可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、キャスター油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルなど；（２３）噴霧剤、例えば、クロロフルオロ炭化水素、および揮発性無置換炭化水素、例えばブタンおよびプロパンなど；（２４）抗酸化剤；（２５）当該製剤を意図した受血者の血液と等張化する薬剤、例えば糖、および塩化ナトリウムなど；（２６）増粘剤；（２７）コーティング材、例えばレシチンなど；ならびに（２８）甘味剤、香味剤、着色剤、香料および保存料が含まれる。そういった成分および材料の各々は、製剤の他の成分と適合性があり、そして対象に対して有害ではないという意味において、「許容し得る」ものでなければならない。
【００６９】
経口投与に好適な医薬組成物は、カプセル、カシェット、丸薬、錠剤、散剤、顆粒、水性もしくは非水性液体の溶液又は懸濁液、水中油型もしくは油中水型エマルジョン、エリキシル剤もしくはシロップ、トローチ、大丸薬、舐剤、又はペースト剤の形態であり得る。これらの製剤は、当技術分野において知られている方法によって、例えば、従来のパン−コーティング、混合、顆粒化、又は凍結乾燥工程によって製造され得る。
【００７０】
経口投与のための固体剤形（カプセル、錠剤、丸薬、糖衣錠、散剤、顆粒など）は、１若しくは２以上の活性成分を、１つもしくは２以上の医薬として許容し得る担体と、および場合により１つもしくは２以上の賦形剤、増量剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、溶解遅延剤、吸着加速剤、湿潤剤、吸収剤、滑沢剤、および／または着色剤と混合することにより製造され得る。類似タイプの固体組成物は、好適な賦形剤を使用した軟質および硬質充填ゼラチンカプセル（ｓｏｆｔ  ａｎｄ  ｈａｒｄ−ｆｉｌｌｅｄ  ｇｅｌａｔｉｎ  ｃａｐｓｕｌｅ）中の充填剤として使用され得る。錠剤は、圧縮または成形により、場合により１つもしくは２以上の補助成分と共に製造され得る。圧縮錠剤は、好適な結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、保存料、崩壊剤、界面活性剤または分散剤を使用して調製され得る。成形錠剤は、好適な機械による成形によって製造され得る。例えば、本発明による鉄キレート剤は、約１２５ｍｇ、２５０ｍｇ、または５００ｍｇの有効成分を持つ錠剤の形態であり得る。錠剤および他の固体剤形、例えば糖衣錠、カプセル、丸薬、および顆粒などは、場合により分割されるか、またはコーティングおよびシェル（ｓｈｅｌｌ）、例えば腸溶コーティングおよび医薬製剤の分野において周知である他のコーティングを用いて調製され得る。それらはまた、その中の活性成分の遅延または制御放出を提供するように製剤化され得る。それらは、例えば細菌保持フィルター（ｂａｃｔｅｒｉａ−ｒｅｔａｉｎｉｎｇ  ｆｉｌｔｅｒ）を通す濾過により無菌化され得る。これらの組成物はまた、場合により乳白剤を含み得、そしてそれらが活性成分のみをまたは優先的に、消化管の特定の部分に、場合により遅延様式で放出するような組成物であり得る。活性成分はまた、マイクロカプセル化された形態でもあり得る。
【００７１】
経口投与用の液体剤形は、医薬として許容し得るエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤を含む。液体剤形は、当技術分野において一般的に使用される好適な不活性希釈剤を含み得る。不活性希釈剤に加えて、経口用組成物はまた、助剤、例えば湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色剤、香料および保存料を含み得る。懸濁液は、懸濁化剤を含み得る。
【００７２】
直腸投与または膣内投与のための医薬組成物は、座薬として提供され得、そしてそれは、室温で固体だが体温で液体であり、したがって直腸腔または膣腔中で溶解し、そして活性成分を放出することとなる、１若しくは２以上の好適な非刺激性担体と共に、１若しくは２以上の活性成分を混合することによって調製され得る。膣内投与に好適である医薬組成物はまた、当技術分野において好適であることが知られている、医薬として許容し得る担体を含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレー製剤も含む。
【００７３】
局所投与または経皮投与のための剤形は、散剤、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、ドロップ、および吸入剤を含む。活性化合物は、滅菌条件下において、好適な医薬として許容し得る担体と混合され得る。軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、賦形剤を含み得る。散剤およびスプレーは、賦形剤および噴霧剤を含み得る。
【００７４】
非経口投与に好適な医薬組成物は、好適な抗酸化剤、緩衝剤、製剤を対象となる受血者の血液と等張化する溶質、または懸濁化剤もしくは増粘剤を含み得る、１もしくは２以上の医薬として許容し得る無菌の等張性水性溶液もしくは非水性溶液、分散剤、懸濁化剤もしくはエマルジョン、または使用直前に無菌の注射溶液もしくは分散液へともどされ得る無菌散剤と組み合わされて１もしくは２以上の鉄キレート剤を含む。適切な流動性が、例えばコーティング材料の使用により、分散剤の場合においては必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。これらの組成物はまた、好適な助剤、例えば湿潤剤、乳化剤および分散剤などを含み得る。等張化剤を含むこともまた好ましい。さらに、注射可能な医薬形態の延長された吸収は、吸収を遅らせる薬剤の封入によりもたらされ得る。
【００７５】
場合によっては、本発明の鉄キレート剤を含む薬剤の効果を延長させるために、皮下注射または筋肉内注射からのその吸収を遅らせることが好ましい。これは、乏しい水溶性しかない結晶質または非晶質の液体懸濁液の使用により達成され得る。
【００７６】
薬剤の吸収速度は、その溶解速度に依存し、同様に、結晶の大きさおよび結晶の形態に依存し得る。代わりに、非経口投与された薬剤の遅延された吸収は、油ビヒクル中に薬剤を溶解または懸濁することによって達成され得る。注射可能な持続性薬剤形態は、生分解性重合体中にマイクロカプセル化マトリックス（ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌｅ  ｍａｔｒｉｃｅｓ）を形成することによって製造され得る。活性成分と重合体との比率に依存して、および使用される特定の重合体の性質に依存して、活性成分放出速度は制御され得る。持続性薬剤の注射可能な製剤はまた、薬剤を生体組織に適合可能なリポソームまたはマイクロエマルジョン中に封入することによって製造される。注射可能材料は、例えば、細菌保持フィルターを通す濾過によって無菌化され得る。
【００７７】
製剤は、単位用量または複数回用量封入コンテナ、例えばアンプルおよびバイアル中で存在し得、そして無菌の液体担体、例えば注射用水を使用の直前に添加することしか必要としない、凍結乾燥状態で保存され得る。即席の注射溶液および懸濁液が、前記のタイプの無菌の散剤、顆粒および錠剤から調製され得る。
【００７８】
以下の実施例は、本発明の組成物および方法をさらに説明するために提供される。これらの実施例は一例にすぎず、そしていかなる場合であっても本発明の範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【００７９】
実施例１
白血球除去されたマウスとヒトのＲＢＣの保存は類似する。
マウス血液を、ヒトに使用する標準的な保存溶液中に心臓穿刺によって無菌的に得た：ＣＰＤＡ−１（Ｂａｘｔｅｒ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，  ＩＬ）。３０〜５０匹のマウスからの全血を、小児用白血球除去フィルター（Ｐｕｒｅｃｅｌｌ  Ｎｅｏ，  Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＮＹ）を使用して白血球除去し、遠心分離し、そして６０〜７５％のヘマトクリットで４℃にて最長２１日間保存した。正常なマウスＲＢＣの寿命がヒトＲＢＣの寿命の約半分なので［８６］、マウスＲＢＣに関しては（ヒトに用いられる≦３５日間より）２１日以下を選択した。マウスＲＢＣの保存前の白血球除去では、白血球の少なくとも３−ｌｏｇ10の低減を実現した（ＬｅｕｃｏＣＯＵＮＴキット、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ；未掲載）。
【００８０】
マウスにおけるＲＢＣ生存試験を、51Ｃｒ−標識を使用して実施した［８７］。保存して２と３週間目のマウスＲＢＣの輸血後２４時間生存は、それぞれ７３％（±５％）と６２％（±６％）であったが、一方で新鮮なＲＢＣのそれは９３％（±８％）であった（平均（±１ＳＤ）（図２）。保存中の無菌性を確保するために、すべての材料が使い捨て、かつ、発熱物質を含まないものであった。加えて、各実験の前に、５００μＬの保存ＲＢＧｓを、Ｐｅｄｓ  Ｐｌｕｓ／Ｆ培養ボトル（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）内に接種し、そして細菌増殖をＢＡＣＴＥＣ（商標）血液培養システム（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で≧５日間にわたって検出した；すべてのサンプルが陰性であった。先に注意したとおり、ＦＤＡは、平均で、≧７５％の保存ＲＢＣの輸血後２４時間生存を義務付けている。よって、ここで開示した方法を使用してＣＰＤＡ−１中に≦２週間保存したマウスＲＢＣは、このＦＤＡ規格の基準を使用しても許容されるであろう。
【００８１】
白血球除去した保存ＲＢＣの輸血は炎症誘発性応答を引き起こす。
ＭＣＰ−１、ＩＬ−６（図３）、ＫＣ（ＩＬ−８のマウス相同体）、ＭＩＰ−１β、およびＴＮＦ−α（未掲載）の血漿レベルの統計的に有意な、かつ、用量応答性の増大が、古い保存ＲＢＣ輸血の２時間後にそれぞれ観察された（１３匹のマウス／群；保存ＲＢＣの輸血からの結果を新鮮なＲＢＣと比較したときｐ＜０．０５（両側スチューデントｔ検定））。対照的に、ＩＬ−１０またはＩＦＮ−γに関して有意差は観察されなかった（未掲載）。
【００８２】
興味深いことに、マウスに古い保存ＲＢＣを輸血したときには、それらには、輸血の２時間後までに炎症誘発性サイトカイン（特にＭＣＰ−１）の急上昇があった（図３）。このことは、古い保存ＲＢＣの輸血によって引き起こされる「早い」炎症誘発性応答の１つの可能性のある結末が、患者をその後の感染にかかりやすくする「遅い」全身的な抗炎症性応答であることを示唆している（図１）。実際に、感染などの炎症誘発性発作を乗り切るには、自身に対する巻き添え被害を限定する制御された免疫応答が必要である［５２］。
【００８３】
保存ＲＢＣはクッパー細胞による貪食を介して除去される。
マウスに３週間保存したＲＢＣを輸血し、屠殺し、そして肝切片を光学顕微鏡検査によって調べた。古い保存ＲＢＣを輸血したマウスにおいて貪食されたＲＢＣを含むクッパー細胞が頻繁に見られたが（＞１／高倍率視野）（図４）、新鮮なＲＢＣを輸血したマウスではめったに見ない（未掲載）。よって、より古い保存ＲＢＣはインビボにおける貪食によって除去される。
【００８４】
保存ＲＢＣの輸血は、肝臓、脾臓、および腎臓の鉄含量を高める。
全鉄を、新鮮または保存ＲＢＣの輸血（４００μＬの用量、１群あたり１３匹のマウス）の後、剖検時に湿式灰化手順［８８］によって様々な臓器において計測した。全鉄は、保存ＲＢＣを輸血したマウスの肝臓、脾臓、および腎臓で有意に増加した（ｐ＜０．０５、両側スチューデントｔ検定）（図５）。よって、相当量の保存ＲＢＣの急速なクリアランスは、肝臓、脾臓、および腎臓における鉄の沈着につながる。典型的な実験では、約１４０μｇの全鉄を各マウスに輸血する。ＲＢＣ生存データ（図２）に基づくと、輸血の２時間後には、２週間保存したＲＢＣの約２５％が除去されている。よって、約３５μｇの鉄が、単球−マクロファージ系に供給される；これは、これらのマウスの脾臓、腎臓、および肝臓から回収された過剰鉄の量とほとんど同じである（図５）。
【００８５】
輸血で誘発される炎症誘発性サイトカイン反応は、無傷のヘモグロビン含有ＲＢＣを必要とする。
保存ＲＢＣの保存媒質または上清中の因子の添加よりむしろ、膜カプセル化ヘモグロビン鉄の急激な供給がサイトカインストームを引き起こすのに必要であるかどうか判断するために、試験を実施した。このために、生理的食塩水で洗浄した２週間保存したＲＢＣ、保存ＲＢＣからの上清、および保存ＲＢＣ由来のＲＢＣゴーストの輸血の効果を比較した。保存ＲＢＣを、１０倍量の標準的な生理的食塩水で３回洗浄し、次いで洗浄していない保存ＲＢＣのそれと同等の最終的なヘモグロビン濃度に生理的食塩水中に再懸濁した。保存ＲＢＣの低浸透圧性溶解によって調製したＲＢＣゴーストを［８９］、白色のペレットを得るまで十分に洗浄した。ゴーストの濃度をＴｒｕｃｏｕｎｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したフローサイトメトリーによって定量して、同数のゴースト、保存ＲＢＣ、および洗浄した保存ＲＢＣが輸血されることを確かめた。加えて、ゴーストは、同数の保存ＲＢＣ中に存在している全鉄の約０．０７％しか含んでいなかった（未掲載）。マウス（１群につき６〜１３匹）に、規準化した量の新鮮なＲＢＣ、保存ＲＢＣ、保存ＲＢＣからの上清、生理的食塩水で洗浄した保存ＲＢＣペレット、または保存ＲＢＣ由来のゴーストを輸血した。炎症誘発性サイトカイン反応は、保存ＲＢＣまたは生理的食塩水で洗浄した保存ＲＢＣペレットのいずれかの輸血後にのみ見られた；ＭＣＰ−１およびＩＬ−６の結果を例として示した（図６）。質的に類似し、かつ、統計的に有意な結果を、ＫＣ、ＭＩＰ−１β、およびＴＮＦ−αについて得た（未掲載）；群間の有意差が見られなかったのは、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γについてであった（未掲載）。ＲＢＣゴーストが炎症誘発性応答を引き起こさなかったので、このことは、十分な量のヘモグロビン鉄の供給がこの現象を生じさせるのに必要であることを示唆している。加えて、生理的食塩水で洗浄したペレット中の無傷のＲＢＣの輸血が同様のサイトカイン反応を誘発したが、上清ではそうならなかった。このことは、炎症誘発性応答が保存中に上清中に蓄積する化合物、例えば、市販の添加物、ＲＢＣ由来のベシクル、サイトカイン、または非トランスフェリン結合鉄などに由来しないことを示唆している。
【００８６】
保存ＲＢＣの輸血は、血漿非トランスフェリン結合鉄レベルを急激に上げる。
血漿非トランスフェリン結合鉄を、新鮮なＲＢＣ、２週間保存したＲＢＣ、洗浄したＲＢＣペレット、または保存ＲＢＣからの上清（４００μＬ、５〜７匹のマウス／群）の輸血後に定量した。血漿非トランスフェリン結合鉄は、保存ＲＢＣまたは洗浄ＲＢＣペレットのいずれかを輸血したマウスでのみ上がった（図７）。非トランスフェリン結合鉄は、その酸化還元電位のため悪影響を引き起こし得るので、このことは、おそらく古い保存ＲＢＣの貪食後の鉄の放出の増加によるものであり、無傷の輸血ＲＢＣがこれらのレベル上昇の原因であることを示唆している。
【００８７】
現在、より古い単位の保存ＲＢＣをヒトに輸血するとき、非トランスフェリン結合鉄の同時注入の重要性を排除することはできなかったが、先に述べたように、より古い保存ＲＢＣをマウスに輸血することで、輸血後に非トランスフェリン結合鉄の血漿レベルが上昇した（図７）。興味深いことに、より古い保存マウスＲＢＣの洗浄では、輸血後の炎症誘発性サイトカイン反応の誘導（図６）または循環非トランスフェリン結合鉄レベルの上昇（図７）のいずれも予防できなかった。加えて、保存マウスＲＢＣ由来の上清の輸血では、輸血の２時間後にサイトカイン反応を引き起こさず（図６）、非トランスフェリン結合鉄レベルも上昇しなかった（図７）。まとめると、このことは、輸血後の非トランスフェリン結合鉄レベルの上昇が、マウスにおいて、より古い保存ＲＢＣの貪食後のマクロファージからの鉄の放出の増加によることを示唆している。
【００８８】
保存ＲＢＣの輸血は、ＬＰＳによって引き起こされるサイトカインストームを悪化させ、そして長引かせる。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５〜１０匹／群）に、新鮮なＲＢＣ、２週間保存したＲＢＣまたは保存ＲＢＣから調製したゴーストのいずれかの同時輸血と共にまたはそれ無しに、亜致死用量のＬＰＳを注射した。マウスを、輸血の２４時間後に屠殺し、そしてサイトカインを計測した（図８）。輸血の２４時間後まで、保存ＲＢＣを輸血したＬＰＳ処理マウスは、ＫＣ、ＭＩＰ−１β、およびＴＮＦ−αを含めた多くの炎症誘発性サイトカインの顕著に高いレベルを維持している；例として、ＭＣＰ−１とＩＬ−６の結果を図８に示す。加えて、保存ＲＢＣを輸血したＬＰＳ処理マウスはすべて、輸血の２４時間後までに瀕死になり、そして自発運動を欠き、鈍い立直り反射しか示さなかった；他の群のマウスはすべて、この時点では健康そうに見えた。最終的に、ヘモグロビン不含ゴーストの輸血は、マウスにおいてＬＰＳ誘発性サイトカインストームを助長しなかった。まとめると、このことは、保存ＲＢＣの急速なクリアランスがＬＰＳに相乗効果を与えて、サイトカインストームを悪化させ、そして長引かせる；そのため、このマウス・モデルが、患者、例えば敗血症を患っている患者などの副作用により古い保存ＲＢＣの輸血が関与することのヒトでの試験を再現していることを示唆している。
【００８９】
実施例２
マウス
野生型Ｃ５７ＢＬ／６およびＦＶＢ／ＮＪマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＭＥ）から購入した。ＳＡＡ１−ルシフェラーゼレポーターマウスを、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，  ＭＡ）から入手した。マウスは、８〜１２週齢の時点で使用した。手順は、適当な施設内動物実験委員会に承認された。
【００９０】
マウスＲＢＣの採取、保存、および派生物
ＦＶＢ／ＮＪおよびＣ５７ＢＬ／６マウスから、ジ−（２−エチルヘキシル）フタラート−可塑化ポリ塩化ビニル製ヒト一次採血パック（製品コード４Ｒ３６１１；Ｂａｘｔｅｒ）から直接得たリン酸クエン酸デキストロースアデニン−１（ＣＰＤＡ−１）中に、心臓穿刺によって無菌的に出血させた。保存に使用される最終的なＣＰＤＡ−１濃度は１４％であった。３０〜５０匹のマウスから採血した全血を、プールし、そしてＮｅｏｎａｔａｌ  Ｈｉｇｈ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ｆｉｌｔｅｒ（Ｐｕｒｅｃｅｌｌ  Ｎｅｏ，  Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．）を使用して白血球除去し、遠心分離し（４００ｇにて１５分間）、そして１７．０〜１７．５ｇ／ｄＬ（保存ＲＢＣ対Ｄｒａｂｋｉｎ’ｓ試薬（Ｒｉｃｃａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，  ＴＸ）の１：２５１希釈にて改変Ｄｒａｂｋｉｎ’ｓアッセイ［１０６］によって測定した場合、吸光度を５４０ｎｍで計測し、そしてＣｏｕｎｔ−ａ−ｐａｒｔ  Ｃｙａｎｍｅｔｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｓｅｔ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．、Ｂｅｌｒｏｓｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）と比較した）の最終ヘモグロビンレベルまで体積を減らした。残留白血球を、フローサイトメトリー（ＬｅｕｃｏＣＯＵＮＴキット、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって数えた。保存ＲＢＣを、１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに入れ、パラフィルムで封をし、そして暗所内で４℃にて最長１４日間保存した。輸血の日に、５００μｌの保存ＲＢＣを、Ｐｅｄｓ  Ｐｌｕｓ／Ｆ培養ボトル（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）内に接種し、そして最長５日間または細菌増殖が検出されるまでＢＡＣＴＥＣ連続観察血液培養システム（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で細菌増殖を検出した（この方法は、９７％の感度で少なくとも１ｍＬあたり１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）にて検出する）［１１６］。洗浄した保存ＲＢＣを、１０倍量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を使用した３回の洗浄と、４００×ｇでの遠心分離によって調製した。最後の洗浄の後に、洗浄した保存ＲＢＣを、輸血のために１７．０〜１７．５ｇ／ｄＬの最終ヘモグロビン濃度に合わせてＰＢＳ中に再懸濁した。保存ＲＢＣの４００×ｇの遠心分離を使用して上清を得、そして４００μＬのこの溶液を希釈せずに輸血した。ＲＢＣゴーストを、ＰＢＳ対蒸留水（１：１５）を用いて２倍量の保存ＲＢＣの低浸透圧性溶解によって得（すなわち、４００μＬのゴーストのために、８００μＬの保存ＲＢＣを溶血させた）、それに続いて白色のペレットを得るまで同じバッファーで複数回洗浄し、そして３０，０００×ｇにて遠心分離した。ＲＢＣゴーストの白色ペレットをＰＢＳ中に再懸濁した。ストローマ不含ＲＢＣ溶解物を、洗浄した保存ＲＢＣを凍結−融解し、続いて１６，０００×ｇにて遠心分離して、ストローマをペレット化し、そして取り除くことによって調製した。
【００９１】
輸血と短期的なＲＢＣ生存。
ＲＢＣ（１７．０〜１７．５ｇ／ｄＬのヘモグロビンにて２００または４００μＬ；それぞれ１または２換算ヒト単位）を、イソフルラン麻酔したマウスの眼窩後方の静脈叢を通して輸血した。輸血の２および２４時間後に循環している輸血ＲＢＧの割合（すなわち、輸血の２および２４時間後の生存）を、二重または単一標識法のいずれかによって計測した（予備試験では、この試験の条件についてこれらの方法で有意差がないことを確認した（未掲載））。二重標識法については、先に記載したように［１０２］、新鮮な、同種同系であるＣ５７ＢＬ／６ＲＢＣのアリコートを、クロロメチルベンズアミド１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン・ペルクロラート（Ｄｉｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）で標識し、そして同種であるＦＶＢ／ＮＪの新鮮なＲＢＣまたは保存したＲＢＣのアリコートを、３，３’−ジヘキサデシルオキサカルボシアニン・ペルクロラート（ＤｉＯ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。輸血後の規定の時点で、１〜２μＬの血液を尾静脈から得、そして蛍光標識したＲＢＣのフローサイトメトリー検出のために５００μＬのＰＢＳに移した。生存を、サンプル中のＤｉｌ標識ＲＢＣ対ＤｉＯ標識ＲＢＣの割合を、自身での輸血における割合と比較することによって計算した。単一標識試験については、新鮮なＲＢＣまたは保存したＲＢＣの１０％のアリコートをＤｉＯで標識した。生存を測定するために、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で得られるＤｉＯ標識性ＲＢＣ対非標識ＲＢＣの比を、輸血の１０分後のサンプルと最終的な終点で得たサンプルの間で比較した。規定した時点（輸血の２時間または２４時間後）では、すべてのマウスをイソフルランで麻酔し、屠殺し、そして血液を心臓穿刺によってヘパリン化シリンジを使用して得た。洗浄した保存ＲＢＣを、１０倍量のＰＢＳを使用して３回洗浄し、そして４００×ｇにて遠心分離することによって調製した。最後の洗浄に続いて、洗浄した保存ＲＢＣを、１７．０〜１７．５ｇ／ｄＬの最終ヘモグロビン濃度に合わせてＰＢＳ中に再懸濁した。保存ＲＢＣの４００×ｇの遠心分離後に上清を得、そしてこの溶液４００μＬを希釈せずに輸血した。ＲＢＣゴーストを、ＰＢＳ：ｄＨ2Ｏ（１：１５）を用いた２倍量の保存ＲＢＣの低浸透圧性溶解（すなわち、４００μＬのゴーストのために、８００μＬの保存ＲＢＣを低浸透圧性溶解した）と、それに続く白色のペレットを得るまでの同じバッファーを用いた複数回の洗浄と３０，０００×ｇでの遠心分離によって得た。ＲＢＣゴーストの白色のペレットをＰＢＳ中に再懸濁した。一部の実験については、１００μＬのＰＢＳ中に溶解したＬＰＳ（Ｅ．コリ０１１１：Ｂ４（Ｓｉｇｍａ）；マウス１匹あたり３０〜１００μｇ）を、輸血直前に尾静脈によってマウスに注射した。ＬＰＳ処理マウスを、屠殺前にＣａｎｏｎ  ＰｏｗｅｒＳｈｏｔ  ＳＤ６００を使用してビデオで記録した。一部の実験では、１００μＬのＰＢＳ中に溶解した３ｍｇのデフェロキサミン（ＤＦＯ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、または等モル濃度のクエン酸第二鉄（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と一緒に１時間プレインキュベートした３ｍｇのＤＦＯを、輸血直前のマウスの尾静脈に注射した。最後に、一部の実験では、２ｍｇのリポソーム化クロドロネートまたはＰＢＳ−リポソーム（ともにＥｎｃａｐｓｕｌａ  ＮａｎｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣ、Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，  Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ製）を、輸血の４８時間前にマウスに腹腔内注射した。
【００９２】
組織学と免疫組織化学
剖検では、肝臓と脾臓を取り出し、１０％の中性緩衝ホルマリンによって一晩固定し、そしてパラフィン内に包埋した。切片を、ヘマトキシリンおよびエオジンによって染色するか、または脱パラフィン処理し、次いで１：５００希釈の抗マウスＦ４／８０モノクローナル抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と、続くビオチン化抗ラット二次抗体（１：２００希釈）、ＡＢＣ試薬（１：５０希釈）によって免疫染色し、そして３，３’−ジアミノベンジジン基質キット（すべてＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ製）を用いて現像した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４０顕微鏡およびＳＰＯＴ  ＩＮＳＩＧＨＴデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）を使用して像を得た。
【００９３】
炎症性タンパク質の測定
インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、単球遊走因子（ＭＣＰ−１）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）、およびケラチン生成細胞由来ケモカイン／ＣＸＣＬ１（ＫＣ／ＣＸＣＬ１）を含めたサイトカイン／ケモカインを、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ  Ｍｏｕｓｅ  Ｆｌｅｘ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して定量した。心臓穿刺によって得られたヘパリン化血漿を、１：４、および／または１：１０希釈にて分析した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で得たフローサイトメトリーデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．、Ａｓｈ  ｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して分析した。血漿血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）レベルを、製造業者の使用説明書に従ってマウスＳＡＡ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）を使用して計測した。
【００９４】
鉄に関連する測定
血漿ＮＴＢＩを、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）限外濾過アッセイ［１０７］によって計測した。概略すると、ヘパリン化血漿（９０μＬ）を、８００ｍＭのＮＴＡ、ｐＨ７．０と一緒に、室温にて３０分間インキュベートした。血漿タンパクを、限外濾過（ＮａｎｏＳｅｐ、３０ｋＤａカットオフ、ポリスルホン型（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；１０，６２０×ｇ、１５℃にて４５分間）によって取り除き、そして限外濾過液中の鉄をフェロジン・アッセイ［９５］によって測定した。総臓器鉄を湿式灰化手順［８８］を用いて計測した。概略すると、剖検で得られた臓器の湿重量を定量し；脾臓全体または肝臓（約１００ｍｇ）もしくは腎臓（約８０ｍｇ）の一部を２ｍＬのガラスバイアルに入れる。６５℃にて２４時間の乾燥後に、２００μｌの酸混合物（７０％の過塩素酸：硝酸、２：１）を加えた。１８２℃にて５〜６時間の乾燥後に、１ｍＬの３Ｍ  ＨＣｌを加え、そして混合した。次いで、酸性化サンプル（５０μＬ）を２００μＬの色素体（１．６ｍＭのバソフェナントロリン、２Ｍの酢酸ナトリウム、および１１．５ｍＭのチオグリコール酸）と一緒に３０分間インキュベートした。５３５ｎｍにてサンプルおよび鉄標準物質の吸収度を二連で計測し、そして平均値を総臓器鉄を計算するのに使用した。血色素血症を、ＰｏｗｅｒＷａｖｅ  ＸＳ分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，Ｖｅｒｍｏｎｔ）を使用して分光光度測定により検出した。
【００９５】
ルシフェラーゼ活性のインビボにおける画像化
雄ＳＡＡ１−ルシフェラーゼ・トランスジェニック・マウス［１０８］に、尾静脈注射によって２００μＬの新鮮なＲＢＣ（＜２４時間保存）または保存ＲＢＣを輸血した。生物発光画像法を、［１０８］に記載のとおり、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。マウスをイソフルランで麻酔し、１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリン（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を腹腔内に注射し、そして１０分後に１〜６０秒間撮像した。特定の領域から放出された光子を、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して定量した；ルシフェラーゼ活性を１秒あたりの光子として表す。
【００９６】
インビトロにおける細菌増殖
尿路感染を患っている匿名の患者から得たＥ．コリの病原性株を使用した。各実験については、このＥ．コリの冷凍ストックからのサンプルを、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に接種し、そして中間対数期（約３時間）まで培養した。次いで、細菌をＰＢＳで２回洗浄し、そして約２００，０００コロニー形成単位（ＣＦＵ）／μＬに合わせて再懸濁した。次いで、５マイクロリットルの細菌懸濁液を、９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレート内で１００μＬのヘパリン化血漿に加えた（Ｃｏｓｔａｒ、Ｓｉｇｍａ）。細菌増殖を６００ｎｍの吸収度によって計測した。一部の実験では、２０μＭのクエン酸第二鉄またはクエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、ウシ血清アルブミン、２，２’−ジピリジル（すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）、プロトポルフィリンＩＸ（Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）、またはＤＦＯを細菌接種前に血漿に加えた。
【００９７】
統計解析
２つの平均の間の有意性を、両側マンホイットニーＵ検定を使用して計算した。インビトロにおける細菌増殖に関する有意性を、各増殖曲線の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）値への変換と、それに続く各群について平均ＡＵＣを比較するための両側マンホイットニーＵ検定によって判断した。０．０５未満のＰの値を有意と見なした。統計解析はＰｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して実施した。
【００９８】
結果
標準的な保存液であるＣＰＤＡ−１中で最長２週間保存した白血球除去Ｃ５７ＢＬ／６マウスＲＢＣの輸血後生存は、期限切れ時点でＦＤＡ基準に見合っている［１０９］。本試験において、ドナーＦＶＢ／ＮＪマウスＲＢＣを、同種血輸血をモデル化するのに使用した。ＲＢＣを保存前に白血球除去したので（＞３ｌｏｇ10白血球除去（未掲載））、アリコートには５日間の血液培地中でのインキュベーション後でも微生物の増殖がなかった。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに輸血した新鮮（すなわち、＜２４時間の保存）および２週保存した同種ＦＶＢ／ＮＪのＲＢＣの２４時間生存は、同種同系輸血の結果と同様であった（図１３ａ）［１０９］。これ以降に示した実験については、新鮮なＲＢＣの平均２時間生存は、保存ＲＢＣの８３．６％（ｓ．ｅ．ｍ．４．７）と比較した場合に、１００．１％（ｓ．ｅ．ｍ．３．８）であった；すべての保存ＲＢＣは２週間の保存後に輸血した。
【００９９】
保存ＲＢＣの輸血後に除去されたヘモグロビン鉄の結末を究明するために、組織鉄レベルを、（ｉ）新鮮なＲＢＣ、（ｉｉ）保存ＲＢＣ、（ｉｉｉ）洗浄した保存ＲＢＣ、（ｉｖ）保存ＲＢＣから調製した上清、および（ｖ）保存ＲＢＣ由来のゴーストの輸血後２時間の剖検で計測した。洗浄した保存ＲＢＣを、輸血されるヘモグロビンの量が新鮮なＲＢＣおよび保存ＲＢＣのヘモグロビンの量（１回の輸血あたり１７．０〜１７．５ｇ／ｄＬのヘモグロビンを含有する２００μＬまたは４００μＬ）と等しくなるように、ＰＢＳ中に再懸濁した。上清と保存ＲＢＣ由来のゴーストは、それぞれ１．１９ｇ／ｄＬ（ｓ．ｅ．ｍ．０．４８）と＜０．０２ｇ／ｄＬの平均ヘモグロビンを含んでいた。新鮮なＲＢＣ輸血と比べた場合に、平均全鉄は、保存ＲＢＣ輸血後に肝臓（１２．１μｇ）、脾臓（１０．１μｇ）、および腎臓（２．８μｇ）で有意に増加していた（図１３ｄ）。典型的な実験では、（１７．５ｇ／ｄＬのヘモグロビンを含む４００μｌのＲＢＣ中の鉄の量として計算して）約２２５μｇの全鉄を１匹のマウスに輸血した。生存データに基づいて、１６．４％の保存ＲＢＣを輸血の２時間後までに除去し、そして循環から除去された約３６μｇの鉄をもたらした；よって、これらのマウスの脾臓、腎臓、および肝臓内に回収された余分な鉄は、あわせて、提供された全鉄の約７０％を占めた。骨髄鉄は計測しなかった。加えて、保存のクリアランスは、剖検時点で脾臓の変色を生じ（図１３ｂ）そして脾臓の重さを重くした（図１３ｃ）。肝臓または腎臓の重量の有意差は検出されなかった（未掲載）。最終的に、保存ＲＢＣおよび洗浄した保存ＲＢＣの輸血だけが、輸血の２時間後に血漿ＮＴＢＩレベルを増強した（図１３ｅ）。血漿ＮＴＢＩのこの急増は短命であった、血漿ＮＴＢＩレベルは保存ＲＢＣの輸血の２４時間後まで検知できなかった。
【０１００】
マクロファージがこのモデルにおける保存ＲＢＣの除去に関与するかどうか判断するために、マウスを、輸血の４８時間前にリポソーム化クロドロネートまたは対照ＰＢＳ−リポソームで処理した。２時間ＲＢＣ生存は、ＰＢＳ−リポソーム化対照と比べて、リポソーム化クロドロネート処理マウスで有意に上昇した（図３０ａ）。Ｆ４／８０マウスマクロファージ・マーカーに関する免疫組織化学によって評価されるように、リポソーム化クロドロネート処置は、肝臓および脾臓（図３０ｂ）のマクロファージを消耗させた。同系保存ＲＢＣを輸血した非クロドロネート処理対照動物では、組織学的検査が肝臓（図３０ｃ）および脾臓（データ未掲載）のマクロファージによる赤血球貪食の増加を示し、そしてそれをマクロファージのＦ４／８０染色によって確認した（図３０ｃ）。
【０１０１】
急速な保存ＲＢＣクリアランスが炎症を引き起こすかどうか、および保存ＲＢＣ上清に蓄積する因子よりむしろ、膜カプセル化ヘモグロビン鉄が必要であるのかどうかを判断するために、受血マウスに、規準化した量の（ｉ）新鮮なＲＢＣ、（ｉｉ）保存ＲＢＣ、（ｉｉｉ）洗浄した保存ＲＢＣ、（ｉｖ）保存ＲＢＣ由来の上清、（ｖ）保存ＲＢＣから調製したゴースト、または（ｖｉ）ストローマ不含保存ＲＢＣ溶解物を輸血した。輸血の２時間後には、ストローマ不含保存ＲＢＣ溶解物を輸血したマウスは、無傷のＲＢＣを輸血したマウスと比較して、劇的な血色素血症（図３１）および血色素尿（データ未掲載）を患っていた。輸血の２時間後までに、保存ＲＢＣまたは洗浄した保存ＲＢＣのいずれかの輸血後にのみ、用量応答性の炎症誘発性サイトカイン反応を検出した。例として、循環インターロイキン（ＩＬ）−６および単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−１レベルを、図１４ａに示す。統計的に有意な増加は、ＣＸＣＬ１（すなわち、ＫＣ）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１β、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αに見られ（図１７）；有意差は、ＩＬ−１０またはインターフェロン（ＩＦＮ）−γで見られなかった（図１７）。質的に同様のサイトカイン結果を、保存同系ＲＢＣの輸血後に得た（すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６ドナーから；データ未掲載）。
【０１０２】
保存ＲＢＣ由来のゴーストの輸血に対する反応の欠如は、炎症を発生させるにはヘモグロビンが必要であることを示唆している。加えて、上清ではなく、無傷の洗浄した保存ＲＢＣがこのサイトカイン反応を引き起こした；そのため、保存中に上清中に蓄積する化合物（例えば、サイトカイン、ＲＢＣ由来のベシクル、無細胞ヘモグロビン、ＮＴＢＩ）は関与していなかった。最後に、誘発されたサイトカインパターンは、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）によって引き起こされたパターン（例えば、ＬＰＳによるＩＬ−１０およびＩＦＮ−γの増加；未掲載）と異なり、そして保存ＲＢＣ上清の輸血はサイトカインを引き起こさなかった；そのため、保存ＲＢＣおよび洗浄した保存ＲＢＣの輸血の結果は、不慮のＬＰＳ夾雑によるものではなく、輸血した保存ＲＢＣ自体によるものである。
【０１０３】
保存ＲＢＣ輸血後の炎症反応をさらに調査するために、雄トランスジェニック血清アミロイドＡ１（ＳＡＡ１）ルシフェラーゼレポーターマウス［１０８］に、２００μＬの新鮮なＲＢＣまたは保存ＲＢＣを輸血した。ＳＡＡ１は、炎症誘発性サイトカインレベルの上昇によって誘発される急性相反応物質である［１０８］。非侵襲性生物発光性画像法によって計測されたとおり、保存ＲＢＣ輸血だけが肝脾領域において強いルシフェラーゼ・シグナルを引き起こした（基準値の＞３００倍超、図１４ｂ、ｃ）。発現は、輸血の４時間後にて検出可能であり、そして輸血の２４時間後までには基準値に戻った。輸血の２４時間後の血漿ＳＡＡ１タンパク質レベルは、画像法の結果（図１４ｄ）と一致している。
【０１０４】
保存ＲＢＣ輸血は有意な炎症誘発性反応を引き起こしたが、どのマウスも臨床的に明らかな症状、例えば、食欲不振、移動性の低下、注意力の低下、または身づくろい行動の欠如などを発症しなかった。それにもかかわらず、保存ＲＢＣ輸血に対する炎症反応が、既存の炎症状態を悪化させ、そして臨床的症状をもたらすこともあり得るので、重症患者と、古い保存ＲＢＣ輸血と、有害転帰の間の相関を説明し得ると考える［１１、１２］。よって、ＬＰＳの亜臨床用量を、同時の新鮮なＲＢＣまたは保存ＲＢＣの輸血を伴ってまたはそれなしに、受血マウスに注射した。輸血の２４時間後の（または瀕死であればそれより早い）屠殺に続いて、サイトカインは計測した。保存ＲＢＣを輸血したＬＰＳ処理マウスは、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１（図１５ａ）、ＫＣ、ＭＩＰ−１β、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１０（図１８）を含めた複数の炎症誘発性サイトカインのレベルの著しい上昇を維持した。加えて、より高いＬＰＳ用量を用いた実験では、保存ＲＢＣを輸血したＬＰＳ処理マウスは、輸血の１８〜２４時間後までに瀕死になり、そして自発運動を欠き、鈍い立直り反射しか示さなかったが、他のすべての群のマウスは、それほど病気のようではなく、そして自発運動と身づくろい行動を示していた（未掲載）。まとめると、これらの結果は、急速な保存ＲＢＣクリアランスが、ＬＰＳに相乗効果を与えて、サイトカインストームを悪化させ、そして長引かせることを示唆している。
【０１０５】
保存ＲＢＣの輸血がインビトロにおける病原菌の増殖を助長するかどうか判断するために、輸血後にマウスから得たヘパリン化血漿サンプルに、Ｅ．コリ病原性株をインビトロにおいて接種し、そして増殖を混濁度によって計測した。保存ＲＢＣまたは洗浄した保存ＲＢＣのいずれかの輸血２時間後のマウスからの血漿は、非輸血マウス、または新鮮なＲＢＣ、保存ＲＢＣ由来の上清、もしくは保存ＲＢＣから調製したゴーストを輸血したマウスからの血漿と比較した場合に、有意に高い細菌増殖を示した（図１５ｂ）。保存ＲＢＣ輸血の２４時間後に採取した血漿が細菌増殖を助長しなかったので、これは急性的な影響であった（図１５ｂ）。新鮮なＲＢＣまたは保存ＲＢＣを輸血後２時間のプール血漿中の全鉄は、それぞれ１７６μｇ／ｄＬまたは２９５μｇ／ｄＬであった（すなわち、保存ＲＢＣ輸血後に約２０μＭだけ増加した）。クエン酸ナトリウム（２０μＭ）、ウシ血清アルブミン（８０μＭ）、またはプロトポルフィリンＩＸ（２０μＭ）ではなく、２０μｍのクエン酸鉄を、新鮮なＲＢＣを輸血したマウスからのプール血漿に加えると、保存ＲＢＣを輸血したマウスからの血漿と同じレベルまで、細菌増殖を助長した（図１５ｃ）。このことは、保存ＲＢＣ輸血によって引き起こされる高い循環鉄が、高い細菌増殖に関与することを示唆している。
【０１０６】
逆に、鉄キレート剤であるＤＦＯ（２０μＭ）を、保存ＲＢＣを輸血したマウスからのプール血漿に加えると、細菌増殖を部分的に阻害した（図１５ｄ）。ＤＦＯの、等モル量のクエン酸第二鉄との（すなわち、フェリオキサミン［ＦＯ］を生じさせる）プレインキュベーションが細菌増殖の阻害を妨げたので、この阻害はＤＦＯの鉄結合能によるものであった。いくつかのタイプの細菌は鉄源としてＦＯを使用できるので［１１７］、より劇的な細菌増殖の阻害はおそらく達成されない。それにもかかわらず、より大規模な細菌増殖の阻害は、高濃度の二座配位子の第一鉄キレート剤である２，２’−ジピリジルを使用することで達成された［１１８］（図１５ｅ）。２，２’−ジピリジルを３分の１のモル比のクエン酸第二鉄と一緒にプレインキュベートしたとき、この阻害効果は同様に無効となった。
【０１０７】
最後に、鉄キレート剤の投与が保存ＲＢＣ輸血に対する炎症誘発性応答を改善するかどうか調べるために、輸血の直前に、マウスに３ｍｇ（約１２０ｍｇ／ｋｇ）のデフェロキサミン（ＤＦＯ）、つまりＦＤＡで承認された鉄キレート剤を静脈内注射した。鉄キレートは、血漿ＩＬ−６レベルの増加を妨げ（２１２．８±３０．８ｐｇ／ｍＬから９８．４±１０．１ｐｇ／ｍＬに；平均±ｓ．ｅ．ｍ．；Ｐ＝０．００５；図１６ａ）、そして、ＭＣＰ−１（図１６ａ）、ＫＣ、およびＴＮＦ−αレベル（図１９）が減少に向かう傾向を示した。よって、ＤＦＯは、炎症誘発性サイトカインレベルの増加を有意に阻害し（図１６ａ）、そしてＳＡＡ１−ルシフェラーゼレポーターマウスにおいてルシフェラーゼシグナルが減少に向かう傾向を示した（図１６ｂ）。しかしながら、ＳＡＡタンパク質レベルは、輸血の２４時間後に有意差はなかった（データ未掲載）。本明細書中に開示した「鉄仮説」モデル（図１６ｃ）は、保存ＲＢＣ輸血の副作用の基礎となる機構を説明するのに使用できる。
【０１０８】
ＤＦＯの効果は、それ自身の鉄キレート能、またはそれが有し得る他の抗酸化特性、例えばヒドロキシルラジカルを除去するその能力など、あるいはその両方の結果と考えることができる［１１９］。よって対照実験を、ＦＯ（すなわち、ＤＦＯとクエン酸第二鉄の等モルの組み合わせ）を注射し、それに続いて保存ＲＢＣの輸血をすることによって実施した（図１６ａ）。この状況では、ＦＯは、サイトカイン反応を改善する点でＤＦＯと同じくらい有効であった。
【０１０９】
マウスを用いた現在の試験から得られた主な結論は、長期貯蔵後のＲＢＣの輸血が炎症誘発性応答を引き起こし、高い循環ＮＴＢＩレベルに関連していて、そして様々な組織における鉄沈着の増加につながるということである。保存ＲＢＣ由来の膜ゴーストまたはストローマ不含溶解物のいずれかの輸血に対する炎症誘発性反応の欠如は、膜カプセル化ヘモグロビンが炎症を発生させるのに必要であることを示唆している。
【０１１０】
ストローマ不含ＲＢＣ溶解物の輸血により観察される劇的な血色素血症（図３１）が炎症性サイトカイン応答をもたらさなかったので、血管内溶血がこの影響に関与していないこと；むしろ、マクロファージが媒介する貪食による血管外溶血反応が関与していることを示唆している。
【０１１１】
加えて、付随する上清ではなく、無傷の洗浄した保存ＲＢＣがこのサイトカイン反応を引き起こした；そのため、保存中に上清中に蓄積する化合物（例えば、サイトカイン、ＲＢＣ由来のベシクル、無細胞ヘモグロビン、生物活性脂質、ＮＴＢＩなど）の輸血は関与していなかった。保存ＲＢＣの輸血はさらに、ＬＰＳに相乗効果を与えて、サイトカインストームを悪化させ、そして長引かせた。最後に、インビトロにおいて細菌増殖の計測は、輸血した保存ＲＢＣのクリアランスによって放出された循環鉄（すなわち、ＮＴＢＩ）の増加が細菌増殖を助長することを示唆している。よって我々は、鉄が保存ＲＢＣ輸血のこれらの副作用の根底にあるという説を出す。
【０１１２】
輸血に使用されるすべてのＲＢＣ単位を保存後に培養し、いずれの細菌増殖も検出されなかったが、それらはＬＰＳ夾雑については試験していなかった。低レベルの細菌夾雑の可能性もまた存在している。しかしながら、保存ＲＢＣ由来の上清またはストローマ不含溶解物の注入は、サイトカイン反応を引き起こさなかった。加えて、ＬＰＳ単独の注射は、異なったサイトカイン・プロファイルを誘発した（図１５ａおよび１７）。そのため、保存ＲＢＣまたは洗浄した保存ＲＢＣの輸血によって得られた結果は、おそらくＲＢＣ採取や加工中の不慮のＬＰＳまたは細菌夾雑によるものではなく；むしろ、結果は輸血した保存ＲＢＣ自体によるものである。
【０１１３】
１９６０年代からの研究［１２０−１２１］は、抗体を媒介したＲＢＣクリアランス、フェニルヒドラジン処置、または異種ＲＢＣのクリアランスのいずれかによるマウスにおける赤血球貪食が、それぞれＥ．コリを含めた様々な細菌種によって引き起こされる敗血症に対する感受性増大に関連することを示唆している。この影響に関する機構は当時解明されなかったが、現在我々のＲＢＣ保存と輸血のモデルで見られるような、これらの生物体のフェロフィリア（ｆｅｒｒｏｐｈｉｌｉａ）［１２２］とＲＢＣクリアランス後の循環ＮＴＢＩレベルの劇的な上昇によって説明できる可能性がある。
【０１１４】
別のマウス輸血モデルを用いた最近の研究では、エンドトキシン血症のマウスへの輸血前のＲＢＣの長期保存が、肺のケモカイン、好中球、および毛細血管透過性の上昇を引き起こした［１２３］。我々の知見と同様に、輸血前の保存ＲＢＣの洗浄がその応答を無効にしなかったので、この応答はＲＢＣ自体に関連していた。このモデル［１２３］で見られた既存の肺炎症の増悪もまた、保存ＲＢＣの輸血後の上昇したＮＴＢＩレベルに関与する可能性がある。例えば、過剰な血漿鉄がトランスフェリンによって捕捉されないとき、ＮＴＢＩは酸化還元反応に加わり、そして酸化的損傷、細胞毒性、および内皮接着分子の発現増強を導く［１２４、１２５］。よって、ＮＴＢＩは、この肺傷害モデルにおいて別の病理学的因子として機能し得る。
【０１１５】
ＤＦＯ、非膜浸透性キレート剤の両方、およびその鉄キレート形態であるＦＯが、保存ＲＢＣの輸血によって誘発されたサイトカイン反応を同程度まで阻害するという知見（図１６）は、ＤＦＯの抗酸化性による可能性もある［１１９］。実際には、ＬＰＳ投与マウスをＤＦＯまたはＦＯで処理すると、同様の効果が見られた；ともに、ＴＮＦ−αレベルを同程度まで低減する［１１９］。反応性酸素分子種は、核因子Ｂなどの転写因子を活性化することによってサイトカイン産生を媒介する［１２６，１２７］；そのため、保存ＲＢＣのクリアランス後に生じた反応性酸素分子種がその炎症誘発性応答に関与すること、ならびにＤＦＯおよびＦＯがこの酸化促進効果を改善することが可能である。貪食されたＲＢＣの処理によって放出される遊離細胞内鉄の役割は、これらの推定される反応性酸素分子種の産生では、明らかにされないままである。ＳＡＡ１レベルに対するＤＦＯの顕著な効果の欠如は、遺伝的背景の差異の結果である可能性もある。ＳＡＡ１−ルシフェラーゼ・トランスジェニックマウスはＢＡＬＢ／ｃバックグラウンド上に存在するが、本試験における他の受血マウスのすべてがＣ５７ＢＬ／６バックグラウンド上に存在する。より古い保存ＲＢＣの輸血への炎症反応に対するマウス系統の影響を評価するために、追加研究が必要である。
【０１１６】
発明者らは以前に、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体媒介性ＲＢＣクリアランスが不適合ＲＢＣ輸血のマウス・モデルにおいてサイトカインストームを引き起こすことを観察した［１０２］。保存ＲＢＣまたは不適合ＲＢＣのいずれかの輸血後に、同じサイトカインパターンが見られた；しかしながら、前者の場合のサイトカイン反応は深刻ではない。そのため、ＩｇＧコートＲＢＣのクリアランスに関与するＦｃγ受容体仲介シグナリングは、不適合輸血モデルにおけるサイトカイン反応を増幅することが可能である［１２８−１３０］。
【０１１７】
概略すると、現在のマウスＲＢＣの保存および輸血モデルは、古い保存ＲＢＣの輸血が肝臓、脾臓、および腎臓における高いレベルの組織鉄およびＮＴＢＩの高い循環レベルに関連する炎症誘発性応答を生じさせる証拠を提供する。このことは、保存ＲＢＣの急激なクリアランス後に放出された鉄の酸化促進効果が長期保存後のＲＢＣ輸血の悪影響の一部に関与し得ることを示している。加えて、高い血漿ＮＴＢＩレベルの存在は、保存ＲＢＣ輸血後のヒトにおける後ろ向き試験によって示唆された細菌感染の増加リスクについて可能性のある理由を提供する［７、１２、１４、１３１−１３２］。輸血された保存ＲＢＣの急速なクリアランスによって供給された鉄の酸化促進効果を予防することが、これらの副作用を軽減し得る。米国だけでも毎年１５００万件を超えるＲＢＣ輸血がある状態で、ヒト輸血療法に関連する場合にこの鉄仮説の重大な臨床的意義がある。
【０１１８】
実施例３
鉄キレート化は、古い保存ＲＢＣの輸血によってマウスで引き起こされる炎症誘発性サイトカイン応答を阻害する。
【０１１９】
このアプローチが古い保存ＲＢＣ輸血の受血者の有害転帰を予防するための革新的な処置につながることを示すために、原理証明の前臨床試験を実施した。よって、ＲＢＣ輸血の２４および６時間前に、マウスに１２０ｍｇ／ｋｇのデフェロキサミン（ＤＦＯ；Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＪ）、つまりＦＤＡの承認した静脈内鉄キレート剤、または３０ｍｇ／ｋｇのデフェラシロクス（Ｅｘｊａｄｅ；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、つまりＦＤＡの承認した細胞浸透性の経口鉄キレート剤を与えた。キレート化は、血漿ＫＣおよびＩＬ−６レベルの上昇を統計的に有意に妨げ、そしてＭＣＰ−１レベルの低下に向かう傾向を実証した（図９）。よって、新しい治療介入は、古い保存ＲＢＣ輸血が副作用を生じさせる機構に関する動物データを確認することによって生じる。
【０１２０】
実施例４
ＡＳ−１中で保存したマウスＲＢＣの輸血は、炎症を引き起こし、かつ、細菌性敗血症を悪化させる。
【０１２１】
ヒトの観察調査は、古い保存ＲＢＣの輸血が細菌性敗血症の高い確率に関連していることを示唆しているが、関連機構は分かっていない。ＲＢＣ保存および輸血のマウス・モデルを使用することで、プラスチック製試験管内でＣＰＤＡ−１中に保存したマウスＲＢＣの輸血が、同種異系免疫を助長し、サイトカインストームを誘発し、そして非トランスフェリン結合鉄の血漿レベルを高める。ＡＳ−１（アドゾル保存料）およびジ（２−エチルヘキシル）フタラート（ＤＥＨＰ）可塑化保存バッグによる新しいマウスＲＢＣ貯蔵システムを使用することで、保存した袋詰めされたＲＢＣの輸血が単−細菌性敗血症を悪化させるかどうかをモデル・フェロフィリック（ｆｅｒｒｏｐｈｉｌｉｃ）病原菌を用いて調べられるであろう。
【０１２２】
Ｃ５７ＢＬ／６ドナーマウスからのＲＢＣを、リン酸クエン酸デキストロース溶液（ＣＰＤ）中に採血し、プールし、フィルターで白血球除去し、強く遠心分離し、血漿除去し、ＡＳ−１で６０％のヘマトクリットに合わせ、そしてＤＥＨＰ可塑化保存バッグ（Ｆｅｎｗａｌ，Ｉｎｃ．、Ｌａｋｅ  Ｚｕｒｉｃｈ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）内に保存した。規定した期間保存したＲＢＣと新たに採取したＲＢＣを、脂溶性色素（ＤｉＯおよびＤｉｌ）で標識し、Ｃ５７ＢＬ／６受血体に輸血し、そして輸血の２４時間後にＲＢＣの回復（ＰＴＲ）を測定した。
【０１２３】
ヘモグロビンを、Ｄｒａｂｋｉｎ’ｓアッセイで定量した。輸血受血体のサイトカインを、多重フローサイトメトリーアッセイで計測した。１０００コロニー形成単位のサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の菌株ＬＴ２（ＡＴＣＣ）を腹腔内に感染させたマウスのコホートに、３５０μｌの新鮮なＲＢＣ、２週間保存したＲＢＣを輸血するか、またはＲＢＣを輸血せず、そしてマウス生存を測定した。
【０１２４】
９日間の保存後に、平均２４時間ＰＴＲは、食品医薬品局（ＦＤＡ）の評価基準の７５％を下回る２４時間ＰＴＲを示した１匹のマウスを除けば８７．８％（ＳＤ９．４％；ｎ＝１０）であった。インビトロにおける溶血反応は、３．４％（すなわち、上清中のヘモグロビン／総ヘモグロビン）であった。複数の炎症誘発性サイトカイン（すなわち、ＫＣ、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−６）の血漿レベルは、９日間保存したＲＢＣの輸血の４時間後のマウスにおいて統計的に有意に上昇した。１４日間保存したＲＢＣは、３２％（ＳＤ４．２％；ｎ＝５）の平均２４時間ＰＴＲを有し、そして輸血受血体は９日目の古いＲＢＣを輸血したものより高い炎症誘発性サイトカインレベルを示した。１４日間保存したＲＢＣを輸血した細菌感染マウス（１群あたりｎ＝５）は中央値で４日間生存したが、それに対し新鮮なＲＢＣを輸血したマウスおよび輸血していないマウスは中央値で＞１４日間生存した（ｐ＜０．０１ログ−ランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定）。死亡時点で、保存ＲＢＣを輸血したマウスは、重度の菌血症（＞１ｘ１０4個の細菌／ｍＬ血液）であった。
【０１２５】
よって、９日間にわたるプラスチック製バッグ内のＡＳ−１中でのマウスＲＢＣの保存は、これまでに公開されたモデルに比べて身体のヒトＲＢＣ保存条件により厳密に近似している。新鮮なＲＢＣではなく、１４日間保存したマウスＲＢＣの輸血は、モデル病原菌による細菌性敗血症を有意に悪化させた。
【０１２６】
実施例５
健常人への古い保存ＲＢＣの輸血は、急性炎症誘発性サイトカイン応答を引き起こす。
【０１２７】
１１人の健常ヒト・ボランティアによる前向き試験を実施するためにコロンビア大学メディカルセンター（ＣＵＭＣ）とニューヨーク血液センター（ＮＹＢＣ）の両方からＩＲＢ承認を得た（サンプルサイズの根拠に関しては以下を参照のこと）。各ボランティアについての試験の図式的概略を図１０に示す。概略すると、各参加者について試験の１日目には、ボランティアはＮＹＢＣにおいてアフェレーシスによって自家の２ＲＢＣ単位の献血をする。ＲＢＣ献血を、保存前に白血球除去し、２つのＲＢＣ保存バッグに二等分し、ＣＵＭＣ血液バンクにおいてＡＳ−１中に保存した。１単位を同じ参加者に輸血し（すなわち、３日目の「新鮮」）；もう一方の単位を最大安全保存期間後に輸血する（すなわち、４２日目の「古い」）。よって、各参加者に、新鮮なＲＢＣおよび古い保存ＲＢＣの自家輸血を与える。血液サンプル（それぞれ約２０ｍＬ）を、以下のとおり様々な時点で採血する：輸血前、輸血直後、および輸血の１、２、４、２４、および７２時間後。表１には、それぞれの時点で計測した分析物のタイプをまとめる；これらは、炎症（例えば、サイトカイン）、溶血反応（例えば、ハプトグロビン）、鉄代謝（例えば、ヘプシジン）、および関連生理系（例えばクレアチニンおよび血中尿素窒素を使用した腎機能の評価）のマーカーに注目している。サイトカインと鉄関連の分析物はさらに、受血者で検出したレベルがインビボにおける内因性産生によるかどうか判断するために、ＲＢＣ単位輸血前にも計測される。
【０１２８】
【表１】
2012530133.tif 000003
【０１２９】
より古い保存ＲＢＣ輸血の影響に対する輸血で誘発された赤血球増多症による干渉を予防し、かつ、ＲＢＣ輸血に対するその後のサイトカイン反応に対する献血の推定される影響を規制するため、ボランティアは、５００ｍＬの全血を採血するために、３９日目（すなわち、最後の輸血の３日前）に静脈切開される。この単位は廃棄される（すなわち、この単位は４２日目に受血者に輸血されない）。これは、「新鮮」および「古い」ＲＢＣ輸血状況の可能な限り多くの規制を確実にする。
【０１３０】
試験施設
自家ＲＢＣ献血を、２倍ＲＢＣ採血アフェレーシス装置（ＡＬＹＸ；Ｂａｘｔｅｒ）を備えたＮＹＢＣ献血施設の立地条件が良い５か所のうちの１か所で実施する。自家ＲＢＣ単位は、現在の適正製造基準（ｃＧＭＰ）品質規準に従ってＮＹＢＣによって処理され、そして保存３日目までの保存のためにＣＵＭＣ血液バンクに輸送される。
【０１３１】
ＣＵＭＣ血液バンクは、１年に約３０，０００の袋詰めされたＲＢＣ単位を支給しているが、完全交差適合性試験後にそれぞれの自家単位を支給し、それに続いてＣＵＭＣ標準作業手順書を支給する。輸血は、ＣＵＭＣ外来患者アフェレーシスおよび輸血施設において実施するが、それは４人の経験豊富な輸血医学の担当医によって監督され、５人の専門アフェレーシス看護婦が配置され、そして＞３０年の経験を有するアフェレーシス看護婦によって指揮される。すべての必要な静脈切開および輸血設備は、８床のベッドを一式備えたこの１，０００平方フィート（約９２．９平方メートル）の中で利用される。すべての輸血は、確立されたＣＵＭＣ標準作業手順書に従う。
【０１３２】
すべての血液サンプルを、先端医学的検査センター（ＣＡＬＭ）に運ぶ。ＣＡＬＭは、ＣＵＭＣでの臨床的試験研究のための検査室検査を統括する。そのため、ＣＡＬＭの技術スタッフは、血液チューブにコード化ラベルを与え、チューブを遠心分離にかけ、そして必要であればサンプルを分割し、そしてサンプルを彼らの検査施設に輸送する。例えば、全血球算定などの標準的な臨床的検査のためのサンプルは、検査のためにＣＵＭＣ臨床的検査室に輸送する；サイトカインレベルなどの研究検査のためのサンプルは、分割され、そして検査まで−８０℃にて保存する。ＣＡＬＭには多目的検査室スペース、結果および保存標本の管理のためのコンピューター、冷蔵庫、−２０℃と−８０℃の冷凍庫、および液体窒素貯蔵設備がある。加えて、すべての鉄およびヘム関連アッセイを、ＣＡＬＭ内の鉄の基準検査室で実施する。サイトカインレベルを計測する。最後に、すべての残留サンプルを、分割し、冷凍し、そして今後の使用のために−８０℃にて保管する。
【０１３３】
対象の選択
ＣＵＭＣの至る所で配布されていた小冊子に応じた健常な男性（１８〜６５歳）を採用する。年齢または性別に関する交絡因子（例えば、女性の月経周期は鉄レベルとサイトカイン反応に影響し得る）を回避するために、初期試験を１８〜６５歳の男性に限定する。この試験への参加は、民族に関して制限されることはない。すべての参加者は、現行の標準的な、ボランティアの２倍ＲＢＣ献血に関するＮＹＢＣ要件（例えば、体重＞１３０ｌｂｓ（約５９ｋｇ）、身長＞５’１”（約１５４．９ｃｍ）；ヘモグロビン＞１３．３ｇ／ｄＬ；例えば心臓病、主要組織疾患、または癌などの献血を不可能にするであろう過去の重大な病歴がない；など）を満足していなければならない。加えて、所定の感染症検査を、各献血に対してＮＹＢＣにおいて実施する。合併感染症がサイトカイン応答を変え得る可能性のために、どんな肯定的な結果も除外に至る。組み入れおよび除外に関する具体的な基準は、以下のとおりである：
【０１３４】
組み入れ基準：（ｉ）男性、１８〜６５歳；（ｉｉ）体重＞１３０ｌｂｓ（約５９ｋｇ）；（ｉｉｉ）身長＞５’１”（約１５４．９ｃｍ）；（ｉｖ）ヘモグロビン＞１３．３ｇ／ｄＬ。
【０１３５】
除外基準：（ｉ）ＮＹＢＣの献血者アンケートに基づく献血の対象外；（ｉｉ）収縮期血圧＞１８０または＜９０ｍｍＨｇ、拡張期血圧＞１００または＜５０ｍｍＨｇ；（ｉｉｉ）心拍数＜５０または＞１００；（ｉｖ）体温が献血前に＞９９．５°Ｆ（３７．５℃）；（ｖ）体温＞１００．４°Ｆ（３８℃）、または輸血前の自覚的な病感（このことは、輸血後のサイトカイン測定に影響する合併症を回避するためである）；（ｖｉ）標準的な献血者感染症検査の陽性の結果。
【０１３６】
サイトカインの測定
以下のもの：ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１０を、血清で、多重フローサイトメトリーアッセイ（ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ  Ｋｉｔ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてそれぞれの時点で計測する。これらのマーカーを、前臨床マウス試験に基づいて選択した（先に開示した実施例を参照のこと）。加えて、将来的な試験のための化合物をそして同定するために、特定のサンプルを、（先に列挙したものを含めた）４６種類の炎症性メディエーターに関してＨｕｍａｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｔｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅ（Ｒｕｌｅｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｉｎｃ．）によってスクリーニングした。４６種類の伝達物質に関する全リストを以下の表２に挙げる。
【０１３７】
【表２】
2012530133.tif 000004
【０１３８】
鉄関連の測定
非トランスフェリン結合鉄を計測するために、血液サンプルを規定した時点にて微量元素不含チューブ内に採血する；（ヒト非トランスフェリン結合鉄レベルはマウスにおける前臨床試験のように輸血後に上昇する（図７を参照のこと）と仮定すると）これで輸血受血者の非トランスフェリン結合鉄の動態学的の測定が可能になる。血清非トランスフェリン結合鉄を計測するために、これまでに公になっている方法［９３］を、わずかな変更を加えて使用する。概略すると、血液サンプルを室温にて２０分間凝固させ、次いで１，０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離する；血清をデカントし、そして分析まで−８０℃にてすぐに冷凍する。トランスフェリン上の空の結合部位によるインビトロにおける鉄の取込みを回避するために、血清サンプルをトリス−カルボナトコバルト酸（ＩＩＩ）三水和物［９４］で処理する。次いで、８００ｍＭのニトリロ三酢酸、ｐＨ７．０溶液（５０μＬ）を各４５０μＬのサンプルに加える。室温にて３０分間のインキュベーションに続いて、超遠心濾過デバイスを使用して血清タンパク質を除去する（ＮａｎｏＳｅｐ、３０ｋＤａカットオフ、ポリスルホン・タイプ；Ｐａｉｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；１０，６２０×ｇ、１０℃にて４５分間）。最後に、限外濾過液中の鉄を、フェロジン・アッセイ［９５］を使用して定量する。
【０１３９】
血清ヘプシジン濃度を、近年開発され、そして正当性が認められた競合酵素結合免疫学的アッセイ［９６］を使用して計測することもできる。このアッセイは、優れたアッセイ内精度とアッセイ間再現性を有しているので、ヘプシジン濃度の想定される生理学的および病理学的変動を正しく検出する。このアッセイで使用するヘプシジン基準範囲は、男性については２９〜２５４ｎｇ／ｍＬそして女性に関しては１７〜２８６ｎｇ／ｍＬであり、それぞれ中央値：１１２対６５ｎｇ／ｍＬと著しく異なっていた。この差は、女性の低い鉄保持に原因がありそうである。ヘプシジンレベルは、正午と晩（すなわち、午後８時）の値が朝（すなわち、午前８時）の値より有意に高い、日変化を示す。よって、「新鮮な」輸血と「古い」輸血の両方がほとんど同じ時刻に予定される。
【０１４０】
血清鉄と全鉄結合能（ＴＩＢＣ）を、ＣＡＬＭ内の鉄の基準検査室において国際血液標準化委員会によって推薦される方法を使用して計測する。トランスフェリン飽和度を：（血清鉄×１００）／ＴＩＢＣとして計算する。
【０１４１】
血漿ヘモグロビンとヘムを、溶血反応の誘発を回避するように注意して得た血液サンプルに対して、［９７］に記載のとおり、酸素ヘモグロビン、メトヘモグロビン、およびヘミクロム濃度として測定する。
【０１４２】
その他の所定の臨床検査室アッセイ
先に述べたように、血液サンプルを、ＣＵＭＣの所定の臨床検査室にＣＡＬＭのスタッフが輸送する。全血球算定（ヘモグロビン、ヘマトクリット、赤血球数、平均赤血球容積、自動化白血球較差を伴う白血球数算定、血小板数、および絶対網状赤血球算定を含む）をＸｅ−５０００  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｙｓｍｅｘ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を用いて測定する。総ビリルビン、直接ビリルビン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アルブミン、総タンパク質、グルコース、血中尿素窒素、クレアチニン、乳酸デヒドロゲナーゼ、およびフェリチンの血清中濃度を、ＡＵ−２７００  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）を用いて計測する。ハプトグロビンを、ＢＮＩＩ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）を用いて計測する。
【０１４３】
統計的考察
健常男性ボランティアのこの前向き試験では、各々に２回のＲＢＣ輸血、つまり、１回が対照（すなわち、３日間の保存後の「新鮮」）、および１回が実験用（すなわち、４２日間の保存後の「古い」）を与える。初期試験の結果は、「新鮮な」ＲＢＣ輸血と「古い」ＲＢＣ輸血を比較する、各対象に関する６種類のサイトカイン（表１）の各々の輸血前レベルと輸血後レベルの間の最大差の一対比較である。「新鮮な」ＲＢＣ輸血と「古い」ＲＢＣ輸血の間で、輸血前と輸血後の血清非トランスフェリン結合鉄およびヘプシジンレベルを比較した２つの重要な副次的結果を調べる。
【０１４４】
サンプルサイズの根拠を提示するために、より古い保存ＲＢＣの輸血によるヘモグロビン鉄の急激な供給が炎症誘発性サイトカイン反応を引き起こすと考えられる。よって、試験の各参加者に、「新鮮な」ものと、３９日間に間に合うように分離した「古い」自家ＲＢＣ輸血との両方を与える。初期試験の結果は、３日目の「新鮮な」輸血と、４２日目の「古い」輸血を比較する、各対象に関する輸血前後のサイトカインレベル（ΔＣmax）の最高血中濃度差の一対比較である。そのため、サンプルサイズを、この初期の結果に関してだけ評価した。副次的な分析を他のいくつかの試験結果に関して行うが、これらの比較はサンプルサイズ算出には加えない。
【０１４５】
マウスにおける前臨床データに基づいて、１単位の新鮮または古い保存ＲＢＣの同等物の輸血は、新鮮なＲＢＣの輸血と古い保存ＲＢＣの輸血によるサイトカインレベルを比較したとき、１３８．３ｐｇ／ｍＬの標準偏差で、３８６．４ｐｇ／ｍＬの血漿ＭＣＰ−１（強い炎症誘発性サイトカイン）の平均ΔＣmaxをもたらした。同様の差がヒトでも見られると仮定すると、３日目の新鮮な輸血と４２日目の古い輸血の間に少なくとも１５０ｐｇ／ｍＬの血漿ＭＣＰ−１レベルのΔＣmaxの差（すなわち、マウスで見られた差の約４０％）を検出するには、０．０５の両側有意水準と０．８０の検定力を有する、対応のある２標本ｔ検定を使用すると、約９人の対象を必要とする：
【数１】
2012530133.tif 000005
この方程式では、ｎが試験群のサンプルサイズを示し、ｚaとｚbが、それぞれ正規分布の上側αパーセント点と下側βパーセント点を意味し、σが期待標準偏差であり、そしてδが４２日目の古い輸血と３日目の新鮮な輸血の間の血漿サイトカインレベルのΔＣmaxの差を意味する。４５日間の試験中に（不十分な血液サンプリング、いずれかの理由による除外または離脱による）ボランティア参加者の約２０％の喪失が許容されるのであれば、その時には１１人の対象を採用する必要がある。
【０１４６】
計画された副次的な分析を試験に必要なサンプルサイズの計算に加えていないが、示したサンプルサイズはさらに、副次的な比較に十分な検定力ももたらすはずである。例えば、マウスの前臨床データは、新鮮なＲＢＣを輸血したマウスとより古い保存ＲＢＣを輸血したマウスを比べて、０．６μＭの標準偏差で１．４μＭの非トランスフェリン結合鉄のΔＣｍａｘを示す。人体試験では、１１人のサンプルサイズが、３日目の新鮮な輸血とより古い４２日目の輸血の間の非トランスフェリン結合鉄の０．５９μＭの差（すなわち、マウスで見られた差の約４０％）を検出するのに８０％の検定力をもたらす。
【０１４７】
これまでの結果
これまでに、１８〜６５歳の年齢の２人の男性ボランティアが試験を完了し、そして（１人の女性を含めた）３人が現在、組み入れられている。２人の対象からの結果を、図２０〜２６および３２に示す。より古い保存ＲＢＣ単位のみの輸血の０〜４時間後に、両ボランティアとも、総ビリルビン、血清鉄、トランスフェリン飽和度、ＮＴＢＩ、および絶対好中球数の劇的な上昇を示した。加えて、血清ヘプシジンレベルおよび炎症誘発性サイトカインであるインターロイキン−６（ＩＬ−６）が、２人のボランティアのうち１人で上昇した（図３２）。「新鮮な」ＲＢＣ輸血後に、これらの分析物の検出可能な増加はない。ハプトグロビンレベルに検出可能な変化がないということは、ＲＢＣが血管外に除去されていることを示唆している。まとめると、このことは、除去されたＲＢＣの処理後に鉄が循環中に解放される証拠を提供する；特に、このクリアランスは血漿ＮＴＢｌのレベルを上げるのに十分なほど多く、血漿ＮＴＢｌは健常ボランティアで通常検知されない。加えて、循環好中球およびＩＬ−６の急激な上昇は、古い保存ＲＢＣ輸血に続く炎症反応の存在を示唆している。
【０１４８】
実施例６
古い保存ＲＢＣの輸血は、鎌状赤血球症またはβ−サラセミアを患っている慢性的に輸血を受けている患者において急性炎症誘発性応答を引き起こす。
【０１４９】
より古い保存血液の輸血は、鎌状赤血球症およびβ−サラセミアを患っている患者において炎症誘発性サイトカイン反応を誘発すると考えられる。加えて、この状況で使用されることが多い他の標準的なＲＢＣ製剤（すなわち、洗浄ＲＢＣや冷凍保存ＲＢＣ）が類似した影響を誘発するか測定した。興味深いことに、インビトロにおけるヒト・ドナーＲＢＣ単位の保存は、おそらく損傷したＲＢＣまたは溶血したＲＢＣ由来の鉄による、非トランスフェリン結合鉄レベルの漸進的増加を導き、それが最終的には、上清中の利用可能なトランスフェリンを飽和する。加えて、少なくとも幼児では、ＲＢＣ輸血は、高いレベルの血漿非トランスフェリン結合鉄を導く［５９］。より古い保存ＲＢＣ単位の輸血による非トランスフェリン結合鉄の付随する注入が有害であれば、その時には、鉄キレート剤と抗酸化剤がこの損傷を予防できる［３１、６０］。同様に、より古い保存ＲＢＣ単位の洗浄が、上清中の非トランスフェリン結合鉄を取り除く；その結果、非トランスフェリン結合鉄の注入を予防する。しかしながら、ＲＢＣの洗浄では輸血の毒性成分を取り除けない（毒性成分は時間の経ったＲＢＣ自体であるため）と考えられているため、洗浄したＲＢＣがまだ炎症誘発性サイトカイン反応を引き起こすという副次的な考え方を検証する。マウスにおける前臨床試験では、古い保存ＲＢＣの洗浄は輸血後の炎症誘発状態の誘導を予防しなかった（図６）；この実施例では、輸血直前により古い保存ＲＢＣ単位を洗浄することによって、ヒト患者においてこの問題に対処する。また、冷凍保存の過程がＲＢＣに損傷を与え得るので、冷凍保存したＲＢＣがさらに重大な炎症誘発性サイトカイン反応を引き起こすという副次的な考え方も検証する。この試験では、献血直後に冷凍保存されたそれらの単位だけが使用される。最後に、継続的な慢性溶血状態（すなわち、鎌状赤血球症）の患者と、より軽度の継続的な溶血反応（すなわち、β−サラセミア）の患者における古い保存ＲＢＣ輸血の影響を比較することによって、慢性溶血が炎症誘発性応答を軽減するという副次的な考え方を検証する。これらの患者における鉄保護遺伝子（例えば、ヘム・オキシゲナーゼ−１）の上方制御のため、慢性溶血が炎症誘発性応答を低減し得るか、または予防し得る。これらの考え方を系統的に検証するためのデータを提供するように、以下に記載した試験を設計する。
【０１５０】
総説
２〜６週間毎に慢性的に簡易輸血を受けている、あらゆる検出可能なＲＢＣ同種抗体を持たない、そして以前の試験研究に参加しながらＣＵＭＣにて処置を受けている、鎌状赤血球症またはβ−サラセミアの患者のコホートを特定した［９０、９１］（表３）。彼らの平均年齢は１８．８歳（４歳〜４２歳の範囲）であり、６５％が男性である。過去６カ月にわたる彼らの輸血履歴の再調査では、これらの患者に輸血された単位の保存期間が５〜３２日間の範囲にわたり、そしてほとんどの患者が２〜６週間毎に１〜２単位を輸血されていることを示す。β−サラセミア患者の全員が脾摘出術を受けており、そして鎌状赤血球症患者は機能的に無脾症であると推定される；そのため、これらの患者のＲＢＣクリアランスの大部分がおそらく肝臓において起こっている。
【０１５１】
【表３】
2012530133.tif 000006
【０１５２】
前記の表３では、事象毎に輸血される単位数、輸血の頻度、および輸血した単位の保存年齢を、過去６カ月の輸血履歴の再調査に基づいて計算した。ヘモグロビン（ｇ／ｄＬ単位のＨｂ）と網状赤血球数（％）（％ｒｅｔｉｃ）を、彼らの最新の輸血直前に得られた輸血前の値である。**は、この患者が過去６カ月にわたって洗浄ＲＢＣを受けたことを示している、とはいえ、これが臨床的に必要ではなく、そしてこの試験への参加を妨げない。
【０１５３】
これらの慢性的に輸血を受けている患者に参加による何らかの利益を提供するために、そして献血者のばらつきを規制するために、専任ドナーを受血者ごとに６回の輸血を供給するために採用する。専任ドナーの採用は、慢性的に輸血を受けている患者をリスクにさらす機会を減らし、そしてニューヨーク血液センターによって管理される。試験に対するＩＲＢ承認を得る。概略すると、図１１に示すとおり、同じドナーがそれぞれの場面においてアフェレーシスによって２倍ＲＢＣ単位を提供する３対の輸血事象があるが、その単位は、白血球除去され、そして標準的なＡＳ−１保存料中に保存される。所定の献血からの２単位のそれぞれを、同じ血色素病患者に３〜６週間ずらして、連続して輸血する。各患者の輸血スケジュールは十分に融通がきく；そのため、この試験に関して、「新鮮な」輸血は３〜１４日間の保存と規定し、そして「古い」輸血は２８〜４２日間の保存と規定する。最初の対を成す輸血事象は、「新鮮な」ＲＢＣ輸血と「古い」ＲＢＣ輸血を比較したときに、検出可能な炎症誘発性サイトカイン反応があるかどうかを調べる。２回目の対を成す輸血事象は、輸血前にＲＢＣを洗浄することによる有益または不利益な効果があるか調べる。３回目の対を成す輸血事象は、炎症誘発性応答に対するＲＢＣ冷凍保存の影響を調べる。
【０１５４】
ＲＢＣ輸血の品質管理のために、輸血したＲＢＣのインビボにおける生存を定量する。鎌状赤血球症およびβ−サラセミア患者における（洗浄や冷凍保存の影響を含めた）保存ＲＢＣ輸血のＲＢＣ生存については、わずかにしか知られていない。そのため、ＲＢＣ生存の試験を実施することで、この試験の負の初期結果（すなわち、炎症誘発性サイトカイン反応の欠如）が実際には、より古い保存ＲＢＣが除去されていないことよりむしろ、病態生理学的機構の差のためであることを確認する。このために、ドナーＲＢＣの１０ｍＬのアリコートをビオチンで標識し［９８］、そして生存をその後の採血において循環ビオチン標識ＲＢＣをフローサイトメトリー検出によって計算する（詳細は以下に示す）。ＲＢＣ生存を計算するための血液サンプル（ＥＤＴＡ中で１ｍＬ）を、５ｍＬのビオチン標識ＲＢＣの注入の５分後と１時間後に得る。ＲＢＣ単位の残りを１時間サンプルの採血後に輸血する。試験の中のこの態様は、患者の採用を制限することもあるので、この要素への参加は任意である。
【０１５５】
他の分析のための血液サンプル（推定される患者の全血液量によって５〜１０ｍＬ）を、輸血前、ならびに輸血の１および２時間後に採血する。これらの時点を、前臨床マウス試験に基づいて選択した；しかしながら、実施例４の結果を調べた後に、それらを調整する必要があり得る。表４には、それぞれの時点で計測する分析物をまとめる；これらは、炎症（例えば、サイトカイン）、溶血反応（例えば、ハプトグロビン、遊離ヘモグロビン）、鉄関連の測定、および関連生理系（例えばクレアチニンおよび血中尿素窒素を使用した腎機能の評価）のマーカーに注目している。血液サンプルの体積によって制限されるときには、表中のより上にある検査室検査を優先する。サイトカインはさらに、受血者で検出したレベルがインビボにおける内因性産生によるかどうか判断するために、ＲＢＣ単位輸血前にも計測される。加えて、洗浄したＲＢＣが保存単位中のこの潜在的有害物質の蓄積を減少させるかどうかを検証するために、非トランスフェリン結合鉄をＲＢＣ単位中で計測する。
【０１５６】
【表４】
2012530133.tif 000007
【０１５７】
患者が彼の輸血投薬計画に基づいてどの場合にも２ＲＢＣ単位以上を定期的に輸血している場合には、最初に指示された単位を輸血し、そしてその後の指示のない輸血中に、輸血後の血液サンプルを採血する。その後の輸血がサイトカインの結果を妨げるのを予防するために、これらの事例中は、その後のランダムなドナーの輸血を新鮮なもの（すなわち、＜１４日間の保存）にする。最後に、これらの患者はすべて慢性的に鉄キレート療法を受けており、かつ、前臨床試験では、これが試験の結果に影響を及ぼすことが示唆されているので、デフェロキサミン（Ｄｅｓｆｅｒａｌ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、ｔ1/2＝６時間）が与えられている患者は、６回の計画されている試験輸血それぞれの３６時間前にキレート療法を中止する。デフェラシロクス（Ｅｘｊａｄｅ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、ｔ1/2＝８〜１６時間）が与えられている患者は、６回の計画されている試験輸血それぞれの３日前にキレート療法を中止する。キレート療法を中止するこの時間は、鉄関連のアッセイへの干渉を予防するのに十分である［９９、１００］。加えて、これらの患者は頻繁に短い「キレーション・ホリデー（ｃｈｅｌａｔｉｏｎ  ｈｏｌｉｄａｙｓ）」を経験しているので、こうした短期間のキレート療法の中止の副作用は最小限であると予想される。
【０１５８】
試験施設
この実施例における試験施設は、実施例４に記載されているとおりである。
【０１５９】
ＲＢＣのビオチン化
ＲＢＣを、幹細胞治療研究所でビオチン化するが、そこは、外来患者アフェレーシスおよび輸血施設から約２５ヤード（約２３メートル）離れていて、血液バンクに隣接している。幹細胞治療研究所は、ＦＡＣＴ認証されており、同種間および自家造血幹細胞製剤を患者に提供するための最新のヒト製剤の製造／品質管理基準（ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｏｏｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）（ｃＧＴＰ）を使用している。よって、ＲＢＣアリコートをビオチン化するために、［９８］に記載のような、詳細な標準的な操作手順が使用される。手順を以下に詳述する。すべてのビオチン化ＲＢＣ製剤を、リムルス溶解物アッセイを用いる現行の標準的操作手順のわずかな改法を使用して、提供前にＬＰＳ夾雑がないかどうか検証する。得られた製剤のビオチン化と無菌状態の妥当性を立証するために、血液バンクから廃棄されたドナーＲＢＣを使用した予備試験を実施する。
【０１６０】
対象（輸血受血者）の選抜
慢性的に簡易輸血療法を受けている鎌状赤血球症およびβ−サラセミアの患者を、あらかじめ試験する。表３には、（以下に詳述した具体的な組み入れおよび除外基準に基づく）この試験の潜在的な患者の匿名リストを示す。この試験への参加は、性別または民族性よって制限を受けないが、１歳より上の年齢に制限する。民族性データを、すべての試験対象について収集する。組み入れと除外の愚弟的な基準は、以下のとおりである：
【０１６１】
組み入れ基準：（ｉ）特異的で、十分に特徴がある血色素病；（ｉｉ）慢性的な簡易輸血療法（頻度が≦６週間毎の輸血エピソード）；（ｉｉｉ）慢性的な鉄キレート療法；（ｉｖ）自己申告により妊婦ではなく、かつ、妊娠を計画していない；（ｖ）年齢＞１歳。
【０１６２】
除外基準：（ｉ）陽性のＲＢＣ抗体スクリーン；（ｉｉ）臨床的に不安定；（ｉｉｉ）精神病のための処置；（ｉｖ）投獄；（ｖ）収容。
【０１６３】
対象（輸血受血者）の登録
血液科外来診療所で診察され、そして選定基準を満たす血色素病の成人および小児科の患者を、潜在的試験対象（例えば、表３の人たち）と見なす。あらゆる利害の衝突を回避するために彼らを処置している医師以外の人によって、これらの患者に口頭および書面でこの試験に関する情報を提供する。参加に前向きな人を、インフォームドコンセント後に試験に登録する。
【０１６４】
対象（輸血ドナー）の選抜
ＮＹＢＣによって維持されている頻繁なＲＢＣドナー・データベースからのドナーを、各対象の専任の有向ドナーとして採用する。ドナーは、２倍ＲＢＣ献血のためのＮＹＢＣ要件を満たさなければならない（例えば、男性は、体重１３０ｌｂｓ（約５９ｋｇ）超であって、５’１”（約１５４．９ｃｍ）より背が高くなければならず；女性は、体重１５０ｌｂｓ（約６８ｋｇ）超であって、５’５”（約１６５．１ｃｍ）より背が高くなければならない）。ニューヨーク州は、１６歳超、且つ、７６歳未満のドナーを許可したが、ドナーが頻繁な献血歴を有することを確実にし、そして健康または社会的理由によるドナーの脱落を減少させるために、ドナー年齢を２１〜６５歳に制限する。すべてのドナーに、２〜２．５年間にわたり４回の２倍ＲＢＣ献血に行くように依頼する。彼らが試験期間中にニューヨーク市の都市部にとどまっていることに十分に確信がもてないドナーを、除外する。加えて、β−サラセミア・コホートのすべてのドナーはＡＢＯおよびＲｈ（Ｄ）に合致し、そして鎌状赤血球症コホートのすべてのドナーがＡＢＯ、Ｒｈ（Ｄ、Ｃ、ｃ、Ｅ、ｅ）であり、そしてＫｅｌｌは、ＣＵＭＣのこれらの患者による実施の現行基準のとおり合致した。最後に、対を成す輸血事象が生じた後に専用ドナーが試験から脱落したら、新しい専任ドナーをその後の献血のために採用する（すなわち、このことは、自動的に調査からの輸血受血者の除外につながるわけではない）。組み入れと除外の具体的な基準は、以下のとおりである：
【０１６５】
組み入れ基準：（ｉ）２１〜６５歳；（ｉｉ）男性は体重＞１３０ｌｂｓ（約５９ｋｇ）、女性は体重＞１５０ｌｂｓ（約６８ｋｇ）；（ｉｉｉ）男性は身長＞５’１”（約１５４．９ｃｍ）、女性は身長＞５’５”（約１６５．１ｃｍ）；（ｉｖ）ヘモグロビン＞１３．３ｇ／ｄＬ；（ｖ）試験期間中にニューヨーク市の都市部にとどまっている意志の十分な確信；（ｖｉ）これまでにアフェレーシスによる２倍ＲＢＣ献血を許容されている；（ｖｉｉ）過去５年にわたる平均して１年あたり少なくとも３回のＲＢＣ単位献血によって規定されるＮＹＢＣにおける頻繁なドナー。
【０１６６】
除外基準：（ｉ）ＮＹＢＣの献血者アンケートに基づく献血の対象外；（ｉｉ）収縮期血圧＜９０または＞１８０ｍｍＨｇ、拡張期血圧＜５０または＞１００ｍｍＨｇ；（ｉｉｉ）心拍数＜５０または＞１００；（ｉｖ）体温が献血前に＞９９．５°Ｆ（３７．５℃）；（ｖ）標準的な感染症検査による陽性。
【０１６７】
インビボにおけるＲＢＣ生存試験
生存試験は任意である（すなわち、患者はＲＢＣ生存試験を見合わせるか、全般的な調査に残るかを選ぶことができる）。加えて、患者あたり最高１回のＲＢＣ生存試験を実施する。インビボにおけるＲＢＣ生存の計測のために、袋詰めされたＲＢＣの１０ｍＬのアリコートを、わずかな改変を伴って［９８］に記載のとおりビオチン化する。概略すると、袋詰めされたＲＢＣの１０ｍＬのアリコートを、輸血当日に試験単位からの無菌様式で取り出す。このアリコートを、４倍量のＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３回洗浄し、１７５ｍＬのチューブ（Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に移し、そしてビオチン化のために７％のヘマトクリットに調整する。１０％のＤＭＳＯ中の２ｍｇ／ｍＬのＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン（ＮＨＳ−ビオチン）の原液を、０．５ｍＬのＤＭＳＯ中に１０ｍｇのＮＨＳ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ）を溶解し、続いて４．５ｍＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳを添加することによって調製する。この原液を、ＤＭＳＯ抵抗性材料でできた０．２μｍのシリンジ・フイルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌａｓｓｗａｒｅ）を通す濾過によって滅菌する。ＮＨＳ−ビオチン原液を、ゆるやかに撹拌しながら７％のＲＢＣ懸濁液に加えて、１μｇ／ｍＬの最終的なＮＨＳ−ビオチン濃度を得る。室温にて３０分間のインキュベーション後に、ＲＢＣを、少なくとも３倍量のＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳで２回洗浄する。その後の２回の洗浄を、注射可能な等張食塩水で実施し、そしてＲＢＣを６〜１０ｍＬの注射用生理的食塩水中に再懸濁する。これらのＲＢＣを、ＲＢＣ単位の輸血前に「ＩＶプッシュ」によって注射する（合計５ｍＬ）。注射の５分後と１時間後に得た血液サンプル（ＥＤＴＡ中に１ｍＬ）を、１時間ＲＢＣ生存を計算するのに使用し、次いで、試験輸血を始める。総括的な考え方が、より古い保存ＲＢＣ輸血からの単球−マクロファージ系へのヘモグロビン鉄の急激な供給が炎症誘発性応答を引き起こすというものなので、そして急激なＲＢＣクリアランスの大部分が輸血後の最初の１時間以内に起こるので［３３］、１時間ＲＢＣ生存だけを計測する。
【０１６８】
血液サンプル（注射の５分後と１時間後に得た；ＥＤＴＡ中に採取した１ｍＬ）を、循環ビオチン化ＲＢＣのパーセンテージを計算するためにフローサイトメトリーによって分析する。概略すると、これらのサンプルから作製した１％のＲＢＣ懸濁液８０μＬを、（ＰＢＳ中に）１：２０希釈のストレプトアビジン−フィコエリトリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２０μＬと混合し、そして室温にて３０分間インキュベートする。ＰＢＳでの２回の洗浄に続けて、ＲＢＣをＰＢＳ中に再懸濁し、そしてフローサイトメトリーによって分析する。注入の１時間後のサンプルのフィコエリトリン陽性ＲＢＣのパーセンテージを、５分後サンプルと比較して、１時間ＲＢＣ生存を推定した。
【０１６９】
洗浄ＲＢＣと冷凍保存ＲＢＣ
２単位の献血された２倍ＲＢＣ単位のうちの１単位の冷凍保存を、採血の２４時間以内にＮＹＢＣの標準的な操作手順を使用して実施した。古い保存ＲＢＣ単位の洗浄と冷凍保存ＲＢＣ単位の脱グリセリン化を、同様にＮＹＢＣの標準的な操作手順に従って、輸血の２４時間以内にともに実施する。ＲＢＣ単位の脱グリセリン化と洗浄を、自動細胞洗浄システム（ＣＯＢＥ２９９１、ＣａｒｉｄｉａｎＢＣＴ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ，  ＣＯ）を使用してそれぞれ実施する。
【０１７０】
サイトカインの測定とその他の所定の臨床検査室アッセイ
すべての分析物を、先に開示した実施例に記載したとおりに計測する。
【０１７１】
統計的考察
これは、それぞれ３対のＲＢＣ輸血を受ける慢性的な輸血療法に関する血色素病患者の前向き試験である。それぞれの対を成す輸血事象を、１種類の対照および１種類の実験的輸血で構成する（試験の概要については図１１を参照のこと）。最初の対を成す輸血事象では、慢性的に輸血を受けている患者においてより古い保存ＲＢＣの輸血が急性炎症誘発性応答を引き起こすという考え方を検証する。この輸血事象は、１種類の対照輸血（すなわち、「新鮮：」３〜１４日間の保存）および１種類の実験的輸血（すなわち、「古い：」２８〜４２日間の保存）で構成される。初期試験の結果は、「新鮮な」ＲＢＣ輸血と「古い」ＲＢＣ輸血からの得られたレベルを比較する、各対象に関する６種類のサイトカイン（表１）の各々の輸血前レベルと輸血後レベルの間の最大差の一対比較である。他の２回の対を成す輸血事象は、洗浄した古い保存ＲＢＣが同様の炎症誘発性サイトカイン反応を引き起こすかどうか、および冷凍保存がさらに重大なサイトカイン反応を引き起こすかどうかという副次的な考え方を検証する。副次的な結果を、慢性的な溶血状況を有する鎌状赤血球症患者と通常は慢性的な溶血状況を有していないβ−サラセミア患者の間のサイトカイン反応の程度を比較することによって調べる。
【０１７２】
サンプルサイズの根拠を提示するために、より古い保存ＲＢＣの輸血によるヘモグロビン鉄の急激な供給が炎症誘発性サイトカイン反応を引き起こすと考えられる；よって、ＲＢＣ単位の洗浄は、毒性成分（すなわち、時間の経ったＲＢＣ自体）を取り除かないので、サイトカイン反応を改善するはずがない、および冷凍保存は、損傷した冷凍保存ＲＢＣのクリアランスの増加のため応答をより大きくする。初期試験の結果は、「新鮮な」輸血（３〜１４日間の保存）と「古い」輸血（２８〜４２日間の保存）を比較する、各対象に関する輸血前後のサイトカインレベル（ΔＣmax）の最高血中濃度差の一対比較である。そのため、サンプルサイズを、この初期の結果に関してだけ評価した。副次的な分析を他の試験結果に関して行うが、これらの比較をサンプルサイズ算出には加えなかった。
【０１７３】
マウスにおける前臨床データに基づいて、１単位の新鮮およびより古い保存ＲＢＣの同等物の輸血は、新鮮なＲＢＣの輸血とより古い保存ＲＢＣの輸血から得られる値を比較したとき、１３８．３ｐｇ／ｍＬの標準偏差で、３８６．４ｐｇ／ｍＬの血漿ＭＣＰ−１（強い炎症誘発性サイトカイン）のΔＣmaxをもたらした。統計的には、本初期結果判定法は、実施例４と同様である。よって、０．０５の両側有意水準、１３８．３ｐｇ／ｍＬの予想標準偏差、および０．８０の検定力を有する、対応のある２標本ｔ検定を使用すると、１５０ｐｇ／ｍＬの差を検出するために約８．９人の対象を必要とする。これは、マウスで見られた差の約４０％である。よって、試験を完成するためには、各群からの９人の患者を必要とする（すなわち、表３で列挙した鎌状赤血球症患者の約５０％とβ−サラセミア患者の１００％）。表３で列挙した患者から必要数の人を首尾よく採用し、そして維持し得るが、追加の患者を特定する必要がある可能性もある。この目的のために、ＣＵＭＣの小児科の血液学部門が行動的であり、臨床サービスを拡大する。加えて、ニューヨーク都市部からの鎌状赤血球症およびβ−サラセミアのその他の患者が、ＣＵＭＣで受診し、そして成人担当の血液学者によって治療を受けている。そのため、追加の患者が必要になることがあれば、彼らを容易に利用できる。
【０１７４】
同様の考察は副次的な考え方に適用され、そこでは洗浄ＲＢＣと冷凍保存ＲＢＣの効果を検証している。未処理の「古い」ＲＢＣ輸血から得られたレベルを、洗浄した「古い」ＲＢＣまたは冷凍保存したＲＢＣ輸血のいずれかと比較するとき、０．０５の両側有意水準と０．８０の検定力を有する、対応のある２標本ｔ検定を使用すると、少なくとも１５０ｐｇ／ｍＬの血漿ＭＣＰ−１レベルのΔＣmaxの差を検出できる。
【０１７５】
このサンプルサイズもまた、慢性的な溶血が炎症誘発性反応を軽減するかどうかを検証する（すなわち、鎌状赤血球症およびβ−サラセミア患者におけるサイトカインレベルを比較する）副次的な考え方に適当な検定力を供給する。０．０５の両側有意水準と０．８０の検定力を有する、対応のない２標本ｔ検定を使用すると、鎌状赤血球症およびβ−サラセミア患者の間の少なくとも１９５ｐｇ／ｍＬの血漿ＭＣＰ−１レベルのΔＣmaxの差を検出できる。これはマウスで見られたサイトカイン差の５０％を意味する。
【０１７６】
鎌状赤血球症またはβ−サラセミアを患っていて慢性的に輸血を受けている患者において、より古い保存ＲＢＣの輸血が急性炎症誘発性応答を引き起こすと予想される。
【０１７７】
実施例７
鉄キレート剤を用いた鎌状赤血球症およびβ−サラセミア患者の処置が、より古い保存ＲＢＣの輸血によって誘発される急性炎症誘発性応答を予防する。
【０１７８】
初期試験の考え方は、鉄キレート化が鎌状赤血球症およびβ−サラセミアの患者における炎症誘発性サイトカイン応答を改善するというものである。
【０１７９】
総説
この実験では、可能性のある治療的介入を検証する。よって、この実験は、患者が鉄キレート療法中に、「新鮮な」（すなわち、３〜１４日間の保存）ＲＢＣ単位および「古い」（２８〜４２日間の保存）ＲＢＣ単位の対を成す輸血事象を含むための、実施例５で開示した２年間の試験の続きを単に表している。実施例５で開示した３回の対を成す輸血事象では、患者は輸血前に一時的にキレート療法を中止する；この実験構成では、キレート化中の炎症誘発性サイトカイン反応が計測され、そしてその結果を実施例５に記載の最初の対を成す輸血事象で得た結果と比較する。同じ専任ドナーを使用し、そして同じ分析物を計測する。よって、すべての試験を図１２にまとめる；この４年間のプロジェクトのうちの２年目と３年目に起こることとしてこの図面に記録したが、これらの試験が一部の患者について４年目まで続くことが予想される。例えば、１８人の患者が登録されると、これは合計１４４回の輸血（すなわち、１８×８）を必要とする；目標は、平均で１週間に約１．１回の輸血を実施することである。
【０１８０】
統計的考察
これは、キレート療法中に２種類のＲＢＣ輸血を受け、そしてキレート療法を中止して２種類のＲＢＣ輸血を受ける血色素病患者の前向き試験である、１種類の対照輸血（すなわち、「新鮮：」３〜１４日間の保存）および１種類の実験的輸血（すなわち、「古い：」２８〜４２日間の保存）。初期試験の結果は、各対象に関する６種類のサイトカイン（表１）各々の輸血前後のレベルの間の最大差の一対比較であり、「新鮮な」ＲＢＣ輸血と「古い」ＲＢＣ輸血の間で、キレート療法中のこの差を、キレート療法を中止して得られた値と比較する。
【０１８１】
サンプルサイズの根拠を提示するために、より古い保存ＲＢＣの輸血によるヘモグロビン鉄の急激な供給が炎症誘発性サイトカイン反応を引き起こすと仮定する；そのため、鉄キレート化がこの応答を軽減するはずである。初期試験の結果は、各対象に関する、輸血前後のサイトカインレベル（ΔＣmax）の間、および「新鮮な」輸血事象（すなわち、３〜１４日間の保存）と「古い」輸血事象（すなわち、２８〜４２日間の保存）の間の最大濃度差の一対比較であり、そして患者がキレート療法中である間のこの値を、キレート療法を中止して得られた値と比較する。マウスにおける前臨床データに基づいて、鉄キレート化は炎症誘発性サイトカイン反応を５０％超低減する。加えて、１単位の新鮮およびより古い保存ＲＢＣの同等物の輸血は、新鮮なものとより古い保存ＲＢＣ単位の輸血とを比較したとき、１３８．３ｐｇ／ｍＬの標準偏差で、３８６．４ｐｇ／ｍＬの血漿ＭＣＰ−１（強い炎症誘発性サイトカイン）のΔＣmaxをもたらした。統計的には、この実施例における初期結果判定法は、実施例４および５のものと同様である。よって、０．０５の両側有意水準、１３８．３ｐｇ／ｍＬの予想標準偏差、およびと０．８０の検定力を有する、対応のある２標本ｔ検定を使用した場合には、１５０ｐｇ／ｍＬの差を検出するために約８．９人の対象を必要とする。これは、マウスで見られた差の約４０％であり、キレート療法によるサイトカインレベルの５０％の差を検出するためのこの試験に十分に検定力を与える。先に開示した試験に十分に検定力を与えるためには、９人の鎌状赤血球症患者と９人のβ−サラセミア患者が必要である。この慎重なサンプルサイズ見積りと０．８０の検定力を使用することで、サイトカインレベルの４０％の差を検出できる、そしてそれはマウスで見られた５０％効果をまだ下回っている。
【０１８２】
結果
鉄キレート剤による鎌状赤血球症およびβ−サラセミア患者の処置は、より古い保存ＲＢＣの輸血によって誘発される急性炎症誘発性応答を予防すると予想される。
【０１８３】
本発明が、より古い保存した白血球除去ＲＢＣの輸血が炎症誘発性応答を誘発することを初めて実証したと考えられる。従って、実質的にいかなる機構によっても、単球−マクロファージ・システムへの相当量のヘモグロビン鉄の急激な供給が酸化ストレスを引き起こし、その結果、炎症誘発性サイトカインの分泌を引き起こす。
【０１８４】
本明細書中に開示したヒト患者のこれまでの観察とマウスにおける前臨床結果に基づいて、より古い保存ＲＢＣの輸血から生じる臨床証拠と症状は、受血者の原疾患の状況によって異なると考えられる。例えば、健康なマウスへのより古い保存ＲＢＣの輸血は明白な症状を生じさせなかったが、少量のＬＰＳを注入したマウスにおいて、ＲＢＣ輸血後に劇的な応答が見られ、そしてサイトカインストームの延長と増悪に至った（図８）。そのため、試験は、慢性的なＲＢＣ輸血を必要とする２つの疾患状況：鎌状赤血球症およびβ−サラセミアを基にして行われる。患者が自分自身の対照としての役割を果たし、かつ、ドナーの露出を最小限にする計画を使用して、基本的な溶血状況（すなわち、鎌状赤血球症対β−サラセミア）が、より古い保存ＲＢＣを使用した輸血に対する炎症誘発性応答に影響を及ぼすかどうか調べる。他の標準的なＲＢＣ製剤が、輸血に続いて炎症誘発性応答を引き起こすかどうかもまた、測定する；これらには洗浄したＲＢＣ（洗浄したＲＢＣはいくつかのセンターで大規模に使用されている）および冷凍保存したＲＢＣ（冷凍保存したＲＢＣは高度に同種免疫感作された患者に必要であり得、それはインビトロにおいていくつかの損傷を有している）を含む。
【０１８５】
最後に、慢性的輸血からの鉄過負荷を予防するための、これらの患者における鉄キレート療法の所定の使用は、より古い保存ＲＢＣの輸血直後起こる急性炎症誘発性応答を鉄キレート化が阻害するかどうかに関する測定を可能にする。
【０１８６】
この試験からもたらされる陽性の知見（すなわち、より古い保存ＲＢＣが、実際には、健常ボランティアまたは患者の急性炎症誘発性応答を引き起こすこと）が、現在の輸血医薬の実施にすぐに影響を与え、そして輸血前の適当なＲＢＣ保存間隔の決定に関する証拠に基づくアプローチのための科学的根拠が提供され始める。結果は患者群によって異なる（例えば、鎌状赤血球症の慢性溶血状況は、古い保存ＲＢＣ輸血の急性副作用に対する不応期を引き起こし得る）。しかしながら、陰性の知見（すなわち、古い保存ＲＢＣの輸血は、ヒトでは急性炎症誘発性反応を引き起こさないこと）もまた、現在の輸血医薬の実施にとって大きな意味がある；よって、このことは、現在のＲＢＣ保存基準が適当であるという再確認を提供する。
【０１８７】
興味深いことに、これらの試験はさらに、現在でも説明の難しい観察結果の１つ；すなわち、（白血球除去前ほど一般的ではないが）発熱性の輸血反応が白血球除去したＲＢＣの輸血によってもまだ引き起こされていること、を解明することもできる。これらの反応の原因は、解明されないまま残されているか、または原因となるＲＢＣ単位の最適とはいえない白血球除去のせいにされるかのいずれかである。これらのケースの一部が、保存ＲＢＣのクリアランスによるヘモグロビン鉄の急激な供給後の単球−マクロファージ系による炎症誘発性サイトカインの過剰分泌から生じ得る。より古いＲＢＣ単位が輸血に使用されるときに、こういった「反応」がより高頻度で見られると予測される。宿主特異的因子（例えば、サイトカイン遺伝子における遺伝的多型［１０４］）が特定の輸血受血者にそういった反応を発現しやすくし得ることもまた可能である。実際に、これが、より古い保存ＲＢＣの非免疫介在性血管外溶血に続発する新型の輸血反応に相当し得る。
【０１８８】
参照による組み込み
本願明細書において参照された、又は以下に列挙された全ての刊行物及び特許は、あたかもそれらの個々の刊行物又は特許が、具体的に又は個別に参照により組み込まれることが意図されていたかのように、本明細書において参照により完全に組み込まれる。矛盾がある場合には、全ての定義を含む本願が支配的となり得る。
【０１８９】
【表５】
2012530133.tif 000008
【表６】
2012530133.tif 000009
【表７】
2012530133.tif 000010
【表８】
2012530133.tif 000011
【表９】
2012530133.tif 000012
【表１０】
2012530133.tif 000013
【表１１】
2012530133.tif 000014
【表１２】
2012530133.tif 000015
【表１３】
2012530133.tif 000016
【表１４】
2012530133.tif 000017
【表１５】
2012530133.tif 000018
【表１６】
2012530133.tif 000019
【表１７】
2012530133.tif 000020
【表１８】
2012530133.tif 000021
【表１９】
2012530133.tif 000022
【表２０】
2012530133.tif 000023
【表２１】
2012530133.tif 000024
【表２２】
2012530133.tif 000025
【表２３】
2012530133.tif 000026
【０１９０】
同等物
対象発明の具体的な実施形態について議論したが、先の明細書は説明のためのものであって、限定するものではない。本発明の多くの変形形態が、この明細書および以下の請求項を検討することで当業者には明らかになるであろう。本発明の完全な範囲は、同等物のそれらの完全な範囲だけでなく、請求項を参照し、そしてそういった変形形態だけでなく、明細書を参照することによって判断されるべきである。
【図１】
2012530133.tif 000027
【図２】
2012530133.tif 000028
【図３】
2012530133.tif 000029
【図４】
2012530133.tif 000030
【図５】
2012530133.tif 000031
【図６】
2012530133.tif 000032
【図７】
2012530133.tif 000033
【図８】
2012530133.tif 000034
【図９】
2012530133.tif 000035
【図１０】
2012530133.tif 000036
【図１１】
2012530133.tif 000037
【図１２】
2012530133.tif 000038
【図１３】
2012530133.tif 000039
【図１４】
2012530133.tif 000040
【図１５】
2012530133.tif 000041
【図１６】
2012530133.tif 000042
【図１７】
2012530133.tif 000043
【図１８】
2012530133.tif 000044
【図１９】
2012530133.tif 000045
【図２０】
2012530133.tif 000046
【図２１】
2012530133.tif 000047
【図２２】
2012530133.tif 000048
【図２３】
2012530133.tif 000049
【図２４】
2012530133.tif 000050
【図２５】
2012530133.tif 000051
【図２６】
2012530133.tif 000052
【図２７】
2012530133.tif 000053
【図２８】
2012530133.tif 000054
【図２９】
2012530133.tif 000055
【図３０】
2012530133.tif 000056
【図３１】
2012530133.tif 000057
【図３２】
2012530133.tif 000058
【国際調査報告】
2012530133.tif 000059
2012530133.tif 000060