(57)【要約】  植物細胞におけるエチレン応答の制御可能な発現についての遺伝子発現システムは活性化カセットおよび標的カセットを含み、活性化カセットは応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン、エクジソン受容体リガンド結合ドメインおよび活性化ドメインを含み、標的カセットは誘導性プロモーターを含み、このプロモーターは応答エレメントと、活性化ドメインに対して応答性の最小プロモーターとを動作可能に関連して含む。誘導性プロモーターは選択された調節タンパク質をコードする核酸配列の発現を制御し、この調節タンパク質は植物における特定のシグナルタンパク質のエチレンに対する感受性を変調する。活性化カセットおよび標的カセットの構成要素間の相互作用は、誘導用組成物の存在下、植物細胞において、選択された調節タンパク質の発現を増大させ、ひいては植物におけるシグナルタンパク質の発現および蓄積を低減させ、それにより、植物細胞におけるエチレン感受性を低減させる。これは調節タンパク質の発現の増大は、特にエチレンの存在下において、誘導用組成物の添加のタイミング、濃度および期間によって制御される。トランスジェニック植物細胞、組織、器官および植物体が提供アズ−、これらは誘導用組成物の存在下でエチレン感受性を制御する。このようなトランスジェニック植物および組織におけるエチレン感受性および／またはエチレン生産は、成熟、花の老化および植物の他のエチレン感受性機能を操作する目的のために制御されうる。【選択図】図３Ａ【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞におけるエチレン誘導性タンパク質の蓄積を制御可能に抑制するための遺伝子発現システムであって、
当該遺伝子発現システムは活性化カセットおよび標的カセットを含み；
前記活性化カセットは好適なプロモーターの制御下でこれと動作可能に関連して、（ａ）選択された応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、（ｂ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン（ＥｃＲＬＢＤ）、および（ｃ）誘導用組成物の存在下で活性化される活性化ドメイン（ＡＤ）を含み；
前記標的カセットは（ｄ）誘導性プロモーターを含み、前記誘導性プロモーターは（ａ）のＤＢＤが結合する応答エレメントと（ｃ）のＡＤに対して応答性の最小プロモーターとを動作可能に関連して含み、前記誘導性プロモーターは（ｅ）選択された調節タンパク質をコードする核酸配列の発現を制御し、前記調節タンパク質は発現状態でＥＩＮ２もしくはＥＩＮ３遺伝子産物の発現を低減させるように機能し；
前記活性化カセットおよび標的カセットは、植物細胞内で誘導用組成物と共にある場合には動作可能に関連して相互作用を可能にし、前記選択された調節タンパク質の発現を制御可能に増大させ、エチレンの存在下での植物におけるＥＩＮ２もしくはＥＩＮ３遺伝子産物の蓄積を抑制し、ＥＩＮ２もしくはＥＩＮ３タンパク質発現の前記蓄積の抑制は誘導用組成物の適用のタイミング、濃度および期間によって制御可能である；
遺伝子発現システム。
【請求項２】
活性化カセットおよび標的カセットが同じプラスミド上に存在する、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
活性化カセットおよび標的カセットが別々のプラスミド上に存在する、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
活性化カセットのプロモーターが構成的プロモーター、植物細胞特異的プロモーター、植物組織特異的プロモーター、植物器官特異的プロモーター、誘導性プロモーター、発達特異的プロモーターおよび細胞分化特異的プロモーターからなる群から選択される請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
プロモーターが構成的プロモーターである請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
ＤＢＤがＧＡＬ４  ＤＢＤ、ＬｅｘＡ  ＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、グループＨ核受容体メンバーＤＢＤ、ステロイド／チロイドホルモン核受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、バクテリアＬａｃＺ  ＤＢＤ、ＥｃＲ  ＤＢＤ、ｃＩプロモーターＤＢＤからなる群から選択される請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
エクジソン受容体ＥｃＲＬＢＤが無脊椎動物エクジソン受容体もしくはその変異体の全部もしくは一部分を含む請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
活性化ドメインがＶＰ１６、グルココルチコイド活性化ドメイン、およびＧａｌ４活性化ドメインからなる群から選択される請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
誘導性プロモーターが最小プロモーター配列と、活性化カセットにおけるＤＮＡ結合ドメインに対応する１コピー以上の応答エレメントとを動作可能に関連して含む請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
選択されたタンパク質をコードする核酸配列がＥＩＮ２調節遺伝子ＥＴＰ１およびＥＴＰ２、ＥＩＮ３結合Ｆ−ボックスタンパク質ＥＢＦ１およびＥＢＦ２、並びにこれらの変異体からなる群から選択される請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
遺伝子発現システムが活性化カセットおよび標的カセットを含み、
前記活性化カセットは構成的Ｇ１０−９０プロモーターの制御下でこれと動作可能に関連して、（ａ）５コピーのＧＡＬ４応答エレメントを含む応答エレメントを認識するＧａＬ４  ＤＢＤ、（ｂ）エクジソン受容体ＬＢＤ、および（ｃ）誘導用組成物の存在下で活性化されるＶＰ１６ＡＤを含み；
前記標的カセットは（ｄ）誘導性プロモーターを含み、前記誘導性プロモーターは５コピーのＧａＬ４応答エレメントと、ＶＰ１６ＡＤの活性化に対して応答性の最小３５Ｓプロモーターとを動作可能に関連して含み、前記誘導性プロモーターは（ｅ）ＥＴＰ１もしくはＥＴＰ２タンパク質をコードする核酸配列の発現を制御し；
前記活性化カセットおよび標的カセットは、植物細胞内で誘導用組成物と共にある場合には動作可能に関連して相互作用を可能にし、ＥＴＰ１もしくはＥＴＰ２タンパク質の発現を制御可能に増大させ、エチレンの存在下での植物におけるＥＩＮ２遺伝子産物の蓄積を抑制し、ＥＩＮ２タンパク質発現の前記蓄積の抑制は誘導用組成物の適用のタイミング、濃度および期間によって制御可能である；
請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
請求項１または１１に記載の遺伝子発現システムを安定的に発現するトランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物組織もしくは器官、またはトランスジェニック植物を含む組成物。
【請求項１３】
（ａ）請求項１または１１に記載の遺伝子発現システムで植物における少なくとも１つの細胞を形質転換し、
（ｂ）形質転換された植物細胞から植物を発生させ、並びに
（ｃ）形質転換された植物細胞を含む植物であって、その植物がエチレンの存在下で誘導用組成物と接触させられる場合にエチレン非感受性を示し、その変調が誘導用組成物の適用のタイミング、濃度、および期間によって制御される、形質転換された植物細胞を含む植物を選択する
ことを含む、トランスジェニック植物を生産する方法。
【請求項１４】
誘導用組成物をトランスジェニック植物の細胞に適用し、前記植物は請求項１または１１に記載の遺伝子発現システムを安定的に発現する細胞を含み、前記誘導用組成物のタイミング、濃度または期間によって、調節タンパク質の過剰発現がエチレンの存在下での植物細胞内のエチレン誘導性シグナルタンパク質の蓄積を低減もしくは抑制させることを含む、植物におけるエチレン感受性を調節する方法。
【請求項１５】
誘導用組成物がジアシルヒドラジン化合物である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
制御されるエチレン感受性が、老化、果実熟成、ストレス応答、発芽、病原体耐性、落葉、落花、つぼみの落下、丸莢の落下、果実の落下、開花、並びに干ばつ、高温、植物密度および塩分に対する応答からなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
植物ホルモンであるエチレンは、発芽、花および果実の発生中の応答、並びに様々な環境ストレス要因、例えば、干ばつ、高温、過剰な塩分および病気などに対する植物の応答をはじめとする植物のライフサイクルにわたる多くの生理学的プロセスを調節するシグナル伝達分子である（例えば、Ｃｈｅｎら、２００５年Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ、９５；９０１−９１５；Ｃｚａｒｎｙら、２００６年  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．、２４：４１０−４１９を参照）。エチレン生合成経路およびシグナル伝達／調節経路並びにネットワークは充分に説明されている。例えば、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、２００２年（編集者Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ）ページＳ１３１−Ｓ１５１、Ｗａｎｇらの「エチレン生合成およびシグナル伝達ネットワーク（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ）」における図１および２を参照。
【０００２】
エチレンシグナル伝達経路におけるいくつかの鍵となるステップは植物において高度に調節されている。ＥＩＮ２（エチレン非感受性２）およびＥＩＮ３（エチレン非感受性３）タンパク質の双方については、その発現はエチレンによって誘導され、これは増大したエチレン応答を導く。さらに、ＥＩＮ２およびＥＩＮ３タンパク質の双方は、それぞれ、ＥＴＰ１（ＥＩＮ２標的タンパク質１）およびＥＴＰ２（ＥＩＮ１標的タンパク質２）またはＥＢＦ１（ＥＩＮ３−結合Ｆボックスタンパク質１）およびＥＢＦ２（ＥＩＮ３−結合Ｆボックスタンパク質２）によってターンオーバーのための標的にされる。これらの鍵となる応答シグナル伝達タンパク質のターンオーバーは、ホルモンであるエチレンの非存在下で抑制されているまたは「オフ」の状態に植物を維持するのを助ける。トランスジェニックシロイヌナズナにおけるＥＴＰ１もしくはＥＴＰ２（Ｑｉａｏら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、２３：０００−０００；２００８年２月１２日にオンラインで刊行）またはＥＢＦ１もしくはＥＢＦ２（ＧｕｏおよびＥｃｋｅｒ、２００３、Ｃｅｌｌ、１１５：６６７−６７７）の構成的過剰発現は部分的なエチレン非感受性をもたらし、そしてＥＩＮ２もしくはＥＩＮ３タンパク質の蓄積をそれぞれ低減させた。
【０００３】
商業的には、果実および野菜および花をはじめとする植物におけるエチレン応答を調節する一般的な方法は、植物、果実、花もしくは野菜に、例えば、１−メチルシクロプロペン（１−ＭＣＰ、アグロウフレッシュ（ＡｇｒｏＦｒｅｓｈ）、インコーポレーティド）のような化学物質を添加することを伴う。１−ＭＣＰは、エチレンが植物組織におけるその受容体に結合するのを妨げる植物生長調節剤として使用される化合物である。エチレン感受性の一時的な消耗は、植物生長の商業的に価値のある操作のなかでもとりわけ、植物のストレスへの抵抗性もしくは耐性、熟成の遅れ、老化、もしくは開花を増大させうる。
【０００４】
より最近では、例えば、特に、米国特許第６２９４７１６号、米国特許出願公開第２００６／０２００８７５号、２００５／００６６３８９号、２００５／００６０７７２号および２００４／０１２８７１９号において、改変されたエチレン応答受容体または植物におけるエチレン応答に関連する他のタンパク質で植物細胞を遺伝的に形質転換する提案が示唆されてきた。このようなシステムはエチレン経路における様々な変異型遺伝子の発現に関連する。これらのシステムは一般に、様々な示唆されたプロモーターを使用して、構成的タンパク質および組織特異的タンパク質をはじめとするタンパク質の発現を進める。
【０００５】
化学的に調節された遺伝子発現システムの使用が植物における使用に提案されてきており、概して（Ｍ．Ｐａｄｉｄｉｍ，２００３  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．、６（２）：１６９−７７）、多くのこのようなシステムは実験的なもののみであり、または特定の欠点を有すると報告されてきた。これらの欠点の中には、とりわけ、毒性もしくは揮発性誘導剤、低い誘導レベル、植物における劣った転移／移動、植物に対して非毒性である誘導剤に対して遺伝子の発現を「オフ」にするゆっくりとした能力または不充分な特異性の使用がある。このような遺伝子発現システムは全ての植物において普遍的に有用ではなく、そしてその操作可能な構成要素の選択およびその組み立ては多くの場合困難である。
【０００６】
先行技術の例においては、エチレン経路遺伝子の発現は典型的には、植物の全ての組織および部分において常にオンであり、または植物の特定の組織において常にオンである。しかし、組織特異的プロモーターまたは低レベル構成的プロモーターはリーキーでありうるかまたは望まれない誘導剤によって誘導されうる。このような従来のプロモーターは植物におけるホルモン発現の厳密な調節を可能にしない。エチレン経路遺伝子の発現のタイミング、期間およびレベルは通常の生理学的機能のために重要である。自由自在でのおよび決定された期間でのエチレン非感受性の誘導は、先行技術によっては成功裏に示されてこなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６２９４７１６号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６／０２００８７５号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／００６６３８９号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５／００６０７７２号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００４／０１２８７１９号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｈｅｎら、２００５年Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ、９５；９０１−９１５
【非特許文献２】Ｃｚａｒｎｙら、２００６年Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．、２４：４１０−４１９
【非特許文献３】Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、２００２年（編集者Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ）ページＳ１３１−Ｓ１５１、Ｗａｎｇらの「エチレン生合成およびシグナル伝達ネットワーク（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ）」における図１および２
【非特許文献４】Ｑｉａｏら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、２３：０００−０００；２００８年２月１２日にオンラインで刊行
【非特許文献５】ＧｕｏおよびＥｃｋｅｒ、２００３、Ｃｅｌｌ、１１５：６６７−６７７
【非特許文献６】Ｍ．Ｐａｄｉｄｉｍ，２００３Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．、６（２）：１６９−７７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
エチレン感受性の制御可能で一時的な調節を可能にする組成物および方法についての必要性が当該技術分野において存在している。これは、エチレンの存在によって直接その発現が誘導される遺伝子産物について特に重要である。このような組成物および方法は農作物および食品における、並びに他の植物における安全で効果的な使用のために必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書に記載される組成物および方法は、エチレン感受性の調節が安全かつ確実に、例えば、一時的な、定性的なおよび／または定量的な方法で制御されうるトランスジェニック植物、植物細胞、組織、器官、果実もしくは花を提供することによって当該技術分野における必要性を満足する。これらの組成物および方法は遺伝子発現、ひいてはホルモン発現の厳密な調節を示し、かつ農作物および食品における使用に、並びに他の商業的に価値のある植物における使用に安全である。
【００１１】
一形態においては、遺伝子発現システムは、特定のエチレン誘導性（ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）タンパク質の植物細胞における蓄積を制御可能に抑制するために提供される。このシステムは活性化カセットおよび標的カセットを含み、これらは１以上のプラスミド上に存在しうる。活性化カセットは好適なプロモーター、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、エクジソン受容体リガンド結合ドメイン（ＥｃＲＬＢＤ）および活性化ドメイン（ＡＤ）を含む。標的カセットは化学誘導プロモーター（これは化学誘導組織特異的プロモーターでありうる）を含み、このプロモーターはＤＢＤが結合する応答エレメントと、ＡＤに対して応答性の最小プロモーターとを動作可能に関連して含む。この化学誘導プロモーターは標的核酸配列の発現を制御し、この標的核酸配列は選択された調節タンパク質もしくはそのフラグメントをコードし、この調節タンパク質もしくはそのフラグメントは発現状態でＥＩＮ２もしくはＥＩＮ３遺伝子産物の発現を低減させるように機能する。２つのカセットの構成要素間の相互作用は、植物細胞内で誘導用組成物と共にある場合には、その調節タンパク質の発現を制御可能に増大させ、およびエチレンの存在下での植物におけるＥＩＮ２もしくはＥＩＮ３遺伝子産物の蓄積を抑制する。ＥＩＮ２もしくはＥＩＮ３遺伝子産物の蓄積の抑制は誘導用組成物の適用のタイミング、濃度および期間によって制御されうる。誘導用組成物は植物の細胞によって吸収されることができおよび植物の細胞内に転移させられることができ、細胞内では誘導用組成物は活性化ドメインと相互作用して、標的カセットの化学誘導プロモーターをオンにする。よって、このシステムはエチレンの存在に対する植物の通常の反応（すなわち、エチレン誘導性タンパク質、例えば、ＥＩＮ２もしくはＥＩＮ３の発現を増大させ、このことは植物における下流のエチレンシグナル伝達経路のさらなる活性化をもたらす）に打ち勝つのに充分に高いレベルで調節タンパク質を発現することにより、植物細胞におけるエチレン感受性の制御可能で選択的な調節を可能にする。
【００１２】
別の実施形態においては、安定にもしくは一時的に上記遺伝子発現システムを発現する植物細胞が提供される。
別の実施形態においては、安定にもしくは一時的に上記遺伝子発現システムを発現する植物組織もしくは器官が提供される。
別の実施形態においては、安定にもしくは一時的に上記遺伝子発現システムを発現するトランスジェニック植物が提供される。
【００１３】
別の実施形態においては、このようなトランスジェニック植物もしくはその部分を提供する方法は、植物における少なくとも１つの細胞を本明細書に記載される遺伝子発現システムで形質転換し；形質転換された植物細胞から植物細胞、組織、器官もしくは植物体（ｉｎｔａｃｔ  ｐｌａｎｔ）を生じさせ；並びに、植物細胞、組織、器官もしくは植物体がエチレンの存在下で誘導用組成物と接触させられる場合にＥＩＮ２もしくはＥＩＮ３の蓄積の抑制もしくは低減を示す植物細胞、組織、器官もしくは植物体を選択することを伴う。上述のように、ＥＩＮ２／ＥＩＮ３タンパク質蓄積の調節は誘導用組成物の適用のタイミング、濃度および期間によって制御され、結果として充分に高レベルでの調節タンパク質の発現の増大をもたらす。誘導用組成物は植物細胞、組織、器官もしくは植物体によって吸収されることができ、またはそれらの中に転移されうる。
【００１４】
さらなる形態においては、エチレン誘導タンパク質、例えば、ＥＩＮ２もしくはＥＩＮ３の発現からもたらされる植物におけるエチレン感受性を制御する方法は、トランスジェニック植物もしくはその部分の細胞に誘導用組成物を適用することを伴い、その植物は本明細書において記載される遺伝子発現システムを安定的もしくは一時的に発現する細胞を含む。誘導用組成物は植物細胞によって吸収されることができ、または植物細胞内に転移されうる。誘導用組成物の存在下で、エチレンに対する植物細胞の応答、すなわち、ＥＩＮ２もしくはＥＩＮ３の通常の増大、およびさらにはエチレンシグナル伝達経路の下流の活性化は選択された時間にわたって抑制されもしくは低減され；並びに、エチレンに対する植物細胞の応答は、植物から誘導剤をなくすることによって、選択された時間の後で増大させられる。このＥＩＮ２／ＥＩＮ３タンパク質発現の調節は誘導用組成物の適用のタイミング、濃度および期間、並びに植物をエチレン非感受性にするのに充分高いレベルで調節タンパク質を発現するその能力によって制御される。ある実施形態においては、誘導用組成物のタイミング、濃度もしくは期間は調節タンパク質の過剰発現によって、エチレンの存在下で植物細胞中のエチレン誘導性シグナルタンパク質の蓄積を低減もしくは抑制するのを可能にする。
【００１５】
これらの方法および組成物の他の形態および利点は以下の詳細な記載においてさらに説明される。
【発明の効果】
【００１６】
本明細書に記載される組成物および方法は、植物におけるエチレン感受性の制御可能な調節のための組成物および方法についての当該技術分野における必要性に取り組む。より具体的には、本明細書において記載される組成物および方法は、選択された量の化学誘導剤の使用、並びにＥＩＮ２／ＥＩＮ３調節タンパク質（それぞれ、ＥＴＰ１およびＥＴＰ２、もしくはＥＢＦ１およびＥＢＦ２）の高レベルの発現に基づく、エチレンにより誘導される（ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ）タンパク質、例えば、ＥＩＮ２もしくはＥＩＮ３の発現レベルの意図的な変化が植物をエチレン非感受性にするのを可能にする。植物のホルモン調節を操作するこのような能力は、以下に記載される利点の中でも特に、農作物の生長および熟成についての農業的利点を提供する。
【００１７】
本発明者は実際のエチレン非感受性を達成する鍵が、エチレンによって誘導されるシグナルタンパク質の量に打ち勝つために、鍵となるエチレン誘導性シグナルタンパク質のターンオーバーを標的にしている調節タンパク質の充分なレベルを得ることに依拠していることを決定した。植物をエチレンに対して非感受性にすることは、その植物に特定の利点、例えば、本明細書において論じられるようなストレスに対する耐性を提供する。しかし、エチレン感受性は植物の通常の成長および発達のためにある時点では必要とされる。よって、本明細書において論じられる組成物および方法は植物のエチレンに対する非感受性のレベルおよびタイミングを厳密に制御するのに有用であり、並びにその植物のさらなる通常の成長および発達を確実にするためにその植物をエチレン感受性の状態に戻すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は実施例１および配列番号１に開示されるように特定されるカセットの構成要素を伴う、遺伝子発現システム（Ｇ１０−９０ｐ−ＶＧＥ−ＮｏｓＴ−５ｘＧＡＬ−Ｍ３５Ｓ−ＥＴＰ１−３５ＳＴ）の活性化カセットおよび標的カセットの双方を運ぶように設計されたプラスミドｐ２０１の例の概略図である。このプラスミドのカセット部分は配列番号１に報告される。市販のプラスミド骨格は、他のプラスミド骨格と容易に置き換えられうるので、配列リストまたは図面には提供されない。
【図２】図２はＧＶＥ受容体で媒介されるＥＴＰ２の誘導性発現を使用するＥＴＰ２の発現のための活性化カセットおよび標的カセットの双方を含む（Ｇ１０−９０ｐ−ＧＶＥ−ＮｏｓＴ−５ｘＧＡＬ−Ｍ３５Ｓ−ＥＴＰ２−３５ＳＴ）ように設計されたプラスミドｐ２０２の例の概略図である。このプラスミドのカセット部分は配列番号２において報告される。市販のプラスミド骨格は、他のプラスミド骨格と容易に置き換えられうるので、配列リストまたは図面には提供されない。
【図３Ａ】図３Ａは、設計されたプラスミドｐ１００４［Ｇ１０−９０ｐ−ＶＧＥ−ＮｏｓＴ−５ｘＧＡＬ−Ｍ３５Ｓ−ＥＴＰ１およびＭＭＶｐ−ｄｅｆ−ｒｂｃＳ−Ｅ９ｔ］の例の概略図であり、その構成要素、すなわち、Ｇ１０−９０構成的プロモーター、ＶＰ１６活性化ドメインおよびＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン、並びにＮＯＳターミネーター配列と関連する野生型エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、５コピーのＧＡＬ４応答エレメントおよび最小３５Ｓプロモーターからなる誘導性プロモーター、ＥＴＰ１遺伝子、３５Ｓターミネーター配列、ＭＭＶプロモーター、Ｐ−ＤＥＦマーカー遺伝子およびｒｂｃＳ−Ｅ９ターミネーターは配列番号３および図３Ｂ〜３Ｉに示される。
【図３Ｂ】図３Ｂはｐ１００４の構成要素を示す配列マップを形成する。
【図３Ｃ】図３Ｃはｐ１００４の構成要素を示す配列マップを形成する。
【図３Ｄ】図３Ｄはｐ１００４の構成要素を示す配列マップを形成する。
【図３Ｅ】図３Ｅはｐ１００４の構成要素を示す配列マップを形成する。
【図３Ｆ】図３Ｆはｐ１００４の構成要素を示す配列マップを形成する。
【図３Ｇ】図３Ｇはｐ１００４の構成要素を示す配列マップを形成する。
【図３Ｈ】図３Ｈはｐ１００４の構成要素を示す配列マップを形成する。
【図３Ｉ】図３Ｉはｐ１００４の構成要素を示す配列マップを形成する。
【図４Ａ】図４Ａは、設計されたプラスミドｐ１００５［Ｇ１０−９０ｐ−ＧＶＥ−ＮｏｓＴ−５ｘＧＡＬ−Ｍ３５Ｓ−ＥＴＰ２およびＭＭＶｐ−ｄｅｆ−ｒｂｃＳ−Ｅ９ｔ］の例の概略図であり、その構成要素、すなわち、Ｇ１０−９０構成的プロモーター、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン、ＶＰ１６活性化ドメイン、並びにＮＯＳターミネーター配列と関連して記載される野生型エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、５コピーのＧＡＬ４応答エレメントおよび最小３５Ｓプロモーター（配列表４のヌクレオチド２４９３〜２５４８）からなる誘導性プロモーター、ＥＴＰ２遺伝子、３５Ｓターミネーター配列、ＭＭＶプロモーター、Ｐ−ＤＥＦマーカー遺伝子およびｒｂｃＳ−Ｅ９ターミネーターは配列番号４および図４Ｂ〜４Ｉに示される。
【図４Ｂ】図４Ｂはｐ１００５の構成要素を示す配列マップを形成する。
【図４Ｃ】図４Ｃはｐ１００５の構成要素を示す配列マップを形成する。
【図４Ｄ】図４Ｄはｐ１００５の構成要素を示す配列マップを形成する。
【図４Ｅ】図４Ｅはｐ１００５の構成要素を示す配列マップを形成する。
【図４Ｆ】図４Ｆはｐ１００５の構成要素を示す配列マップを形成する。
【図４Ｇ】図４Ｇはｐ１００５の構成要素を示す配列マップを形成する。
【図４Ｈ】図４Ｈはｐ１００５の構成要素を示す配列マップを形成する。
【図４Ｉ】図４Ｉはｐ１００５の構成要素を示す配列マップを形成する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
Ｉ．遺伝子発現システム
植物細胞における安定なもしくは一時的な発現のための遺伝子発現もしくは調節システムが使用される。このようなシステムの構成要素は少なくとも２つの遺伝子発現カセットを含み、そのそれぞれは植物細胞内で発現されうる。
【００２０】
ある実施形態においては、活性化カセットと称される第１の遺伝子発現カセットは、好適なプロモーターの制御下でそれと動作可能に関連している以下の構成要素をコードする、植物細胞内で発現可能なポリヌクレオチドを含む：（ａ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、このＤＮＡ結合ドメインは応答エレメントを認識し、この応答エレメントは発現が調節されるべき遺伝子、すなわち、ＥＴＰ１／ＥＴＰ２もしくはＥＢＦ１／ＥＢＦ２のような調節タンパク質をコードする遺伝子と関連しており、この調節タンパク質は鍵となるエチレン誘導性シグナルタンパク質、例えば、ＥＩＮ２およびＥＩＮ３のターンオーバーを標的とする；（ｂ）リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、このリガンド結合ドメインはエクジソン受容体リガンド結合ドメイン（ＥｃＲＬＢＤ）もしくはその機能的フラグメントを含む；並びに（ｃ）植物への適用に適する誘導用組成物の存在下で活性化される活性化もしくはトランス活性化ドメイン（ＡＤ）。ある実施形態においては、活性化カセットにおける構成要素は以下の５’から３’順に存在する：ＬＢＤがＤＢＤの下流にあり、ＤＢＤはＡＤの下流にある。別に実施形態においては、活性化カセットにおける構成要素は以下の５’から３’順に存在する：ＬＢＤがＡＤの下流にあり、ＡＤはＤＢＤの下流にある。別の実施形態においては、活性化カセットにおける構成要素は以下の５’から３’順に存在する：ＤＢＤがＬＢＤの下流にあり、ＬＢＤはＡＤの下流にある。別の実施形態においては、活性化カセットにおける構成要素は以下の５’から３’順に存在する：ＤＢＤはＡＤの下流にあり、ＡＤはＬＢＤの下流にある。別の実施形態においては、活性化カセットにおける構成要素は以下の５’から３’順に存在する：ＡＤはＬＢＤの下流にあり、ＬＢＤはＤＢＤの下流にある。別の実施形態においては、活性化カセットにおける構成要素は以下の５’から３’順に存在する：ＡＤはＤＢＤの下流にあり、ＤＢＤはＬＢＤの下流にある。活性化カセットは好ましくはカセットの３’末端に位置するターミネーターも含む。これらの構成要素の具体的な種類は以下で論じられる。
【００２１】
第２の遺伝子発現カセット、すなわち、標的カセットは以下の構成要素をコードするポリヌクレオチドを含む。１つの構成要素は化学誘導プロモーターであり、この化学誘導プロモーターは、活性化カセットによってコードされるタンパク質のＤＢＤが結合する応答エレメント（ＲＥ）と、活性化カセットのＡＤに応答性の最小プロモーターとを動作可能に関連するように含む。この他の構成要素は、ＥＴＰ１／ＥＴＰ２もしくはＥＢＦ１／ＥＢＦ２のような調節タンパク質、またはそのようなタンパク質の機能性フラグメントをコードする標的核酸配列であり、この調節タンパク質は鍵となるエチレン誘導性シグナルタンパク質、例えば、それぞれＥＩＮ２およびＥＩＮ３のターンオーバーを標的とする。ある実施形態においては、核酸配列はセンス方向である。誘導性プロモーターは選択された調節タンパク質をコードする配列の発現を制御している。
【００２２】
別の実施形態においては、活性化および／または標的カセットはさらに、例えば、タンパク質配列をコードする核酸配列の下流にターミネーター配列を、および場合によっては選択可能なマーカーを含む。このようなマーカーは、抗生物質もしくは他の化学物質の存在下で遺伝子を取り込んだ細胞を選択するために周知でありかつ使用される。これらの任意の構成要素は以下でより詳細に論じられる。
【００２３】
この遺伝子発現システムは、活性化カセットおよび標的カセットの構成要素が、植物細胞内にあってかつ誘導用組成物と共同して働く場合に、選択された調節タンパク質の発現を調節するように機能する。選択された調節タンパク質の変調および調節は植物細胞におけるエチレン感受性を選択的に変調させる。例えば、ある変調は、調節タンパク質の発現を低減させることによる植物細胞のエチレン感受性の増大を伴う。別の実施形態においては、エチレンの存在下での植物の通常の競合反応に打ち勝つのに充分高いレベルに調節タンパク質の発現を増大させることにより植物細胞のエチレン感受性が低減させられ、すなわち、これは通常、シグナルタンパク質ＥＩＮ２もしくはＥＩＮ３の遺伝子産物の発現および蓄積を増大させるように働く。エチレン経路を変調する調節タンパク質のこの発現は、遺伝子発現システムの構成要素と誘導用組成物との相互作用によって、特にエチレンの存在下で、植物細胞において制御される。誘導用組成物は植物の細胞によって吸収されることができ、および／または植物の細胞内に転移されることができる。
【００２４】
シグナルタンパク質のターンオーバーを調節する調節タンパク質の発現レベルに言及する場合の用語「充分に高いレベルの発現」は、１０ｐｐｍのエチレンもしくは１０μｍのＡＣＣ（１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸）に対する細胞もしくは植物の応答を変える発現レベルを意味する。ある実施形態においては、調節タンパク質の発現レベルは、エチレンもしくはＡＣＣの存在により通常もたらされるシグナルタンパク質の発現の増大に打ち勝つのに充分高い。別の実施形態においては、調節タンパク質の発現レベルはエチレンもしくはＡＣＣの存在下でシグナルタンパク質の発現を低減させるのに充分高い。別の実施形態においては、調節タンパク質の発現レベルはストレスをかけられた植物におけるシグナルタンパク質のストレス誘導エチレン生産に打ち勝ち、よって植物をエチレン非感受性にし、かつ植物に対するストレスの悪影響を克服するのに充分高い。
【００２５】
このシステムのある実施形態においては、第１のカセットおよび第２のカセットは、図１および２のような単一のプラスミド上に存在する。別の実施形態においては、第１および第２のカセットは別々のプラスミド上に存在する。
【００２６】
遺伝子発現システムの別の実施形態においては、第１の遺伝子発現カセットはＤＢＤおよび第１のＬＢＤを含むことができ；第２のカセットはＡＤおよび第２の異なるＬＢＤを含むことができ；並びに第３のカセットは第１のポリペプチドのＤＢＤが結合する応答エレメントをコードするポリヌクレオチド、第２のカセットのＡＤによって活性化されるプロモーター、およびその発現が調節されるべき標的調節遺伝子を含む。このシステムにおいては、ＡＤおよびＤＢＤは２つの異なるタンパク質に動作可能に関連しており、この２つの異なるタンパク質は誘導用組成物の存在下で標的遺伝子発現を活性化する。ある実施形態においては、第１のＬＢＤはＥｃＲ  ＬＢＤであることができ、一方、第２のＬＢＤはレチノイドＸ受容体からのＬＢＤであることができる。別の実施形態においては、第２のＬＢＤはＥｃＲ  ＬＢＤであることができ、一方、第１のＬＢＤはレチノイドＸ受容体からのＬＢＤであることができる。このような構成は米国特許第７０９１０３８号もしくは２００５年１２月１日に公開された米国特許出願公開第２００５／０２６６４５７に記載されている。
【００２７】
用語「動作可能に関連」とは、一方の機能が他方によって影響を受ける単一の核酸フラグメント上の核酸配列の連関をいう。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合に（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある場合に）、プロモーターはそのコード配列と動作可能に関連している。コード配列はセンスもしくはアンチセンス方向で調節配列に動作可能に関連しうる。
【００２８】
本明細書において使用される場合、用語「発現」とは核酸もしくはポリヌクレオチドから生じるセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）もしくはアンチセンスＲＮＡの転写および安定的な蓄積をいう。ある実施形態においては、発現とはｍＲＮＡのタンパク質もしくはポリペプチドへの翻訳をいう。別の実施形態においては、遺伝子発現システムの構成要素は植物細胞内で一時的に発現されうる。別の実施形態においては、遺伝子発現システムの構成要素は植物細胞の染色体への組み込みによって安定的に発現されうる。一時的発現対安定的に組み込まれた発現の選択は本明細書に記載される遺伝子発現システムを生じさせおよび使用する当業者によって選択されうる。
【００２９】
用語「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」は、特定の制限部位でまたは相同組み替えによって核酸またはポリヌクレオチドに挿入されうるＤＮＡのセグメントをいう。ＤＮＡのセグメントは目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位は、好適な方向での転写および翻訳に適する読み取りフレームにカセットを挿入することを確実にするように設計される。これらのベクターまたはプラスミドは場合によっては、特定の宿主細胞の形質転換を容易にするポリヌクレオチドに加えて、目的のポリペプチドをコードし、構成要素を有するポリヌクレオチドを含むことができる。このようなカセットは、ある実施形態においては、宿主細胞において目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの増強された発現を可能にする構成要素も含む。これらの構成要素には、これらに限定されないが、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列などが挙げられうる。
【００３０】
他に示されない限りは、本明細書において使用される全ての他の用語には、当該技術分野における従来の意味があてはまる。例えば、米国特許第７，０９１，０３８号の用語の定義を参照。
【００３１】
Ａ．活性化カセットのプロモーター
このシステムのある実施形態においては、活性化カセットのプロモーターは、形質転換された植物細胞内でＤＢＤ、ＬＢＤおよびＡＤ配列の発現を制御することができる核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。一般に、活性化カセットのこれら３つの主要な構成要素は選択されたプロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーター配列はエンハンサーと称される近接したおよびより離れた上流エレメントからなる。「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーターの本来の構成要素でありうるか、もしくはプロモーターのレベルまたは特異性を増強させるために挿入された異種構成要素でありうる。この文脈における有用なプロモーターは、その全体が本来の遺伝子からのものであることができ、または天然に認められる異なるプロモーターに由来する異なる構成要素から構成されることができ、またはさらには、合成ＤＮＡセグメントを含むこともできる。
【００３２】
ある実施形態においては、活性化カセットのプロモーターは構成的プロモーター、例えば、このカセットで形質転換された植物細胞が活性化カセット構成要素を持続的に生産しているように、ほとんどの細胞タイプにおいて、ほとんどの時点で遺伝子が発現されるようにするプロモーターである。例えば、この活性化カセットに有用な特定の構成的プロモーターには、限定されないが、例示されたＧ１０−９０プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、キャッサバモザイクウイルスプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルスプロモーター、バドナウイルス（Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ）プロモーター、ミラビリス（Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）モザイクウイルスプロモーター、ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）プロモーター、アクチンプロモーターまたはユビキチンプロモーターが挙げられる。
【００３３】
さらに他の実施形態においては、異なる組織または細胞タイプにおいて遺伝子の発現を管理するプロモーター（「組織特異的」、「細胞特異的」もしくは「植物器官特異的プロモーター」）がこの目的のために使用されうる。望ましくは、このようなプロモーターは植物組織および植物細胞において固有のもしくは機能的であるか、または植物組織および植物細胞において固有のもしくは機能的なプロモーターの変異体である。しかし、植物細胞内で機能する他のソース、例えば、ほ乳類、無脊椎動物などからの他の組織および細胞のためのプロモーターもこの目的のために使用されうる。さらに他の実施形態は、発生の異なる段階において（「発生特異的プロモーター」もしくは「細胞分化特異的プロモーター」）、または異なる環境もしくは生理的条件に応じて構成要素を発現するプロモーターを使用する。組織特異的プロモーターの広大なリストについては、Ｇａｌｌｉｅ，米国特許出願公開第２００５／００６６３８９号、これは次の遺伝子に由来する種子特異的プロモーターを記載する：トウモロコシからのＭＡＣ１（Ｓｈｅｒｉｄａｎ，１９９６，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４２：１００９−１０２０）；トウモロコシからのＣａｔ３（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｌ０５９３４，Ａｂｌｅｒ，１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：１０１３１−１０１３８）；シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）からのｖｉｖｐａｒｏｕｓ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｕ９３２１５）；シロイヌナズナからのａｔｍｙｃ１（Ｕｒａｏ，１９９６，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：５７１−５７６；Ｃｏｎｃｅｉｃａｏ，１９９４，Ｐｌａｎｔ５：４９３−５０５）；西洋アブラナからのｎａｐＡおよびＢｎＣｙｓＰ１（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｊ０２７９８，Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ，１９８７，ＪＢＬ２６：１２１９６−１２２０１，Ｗａｎら，２００２，Ｐｌａｎｔ  Ｊ３０：１−１０）；並びに、西洋アブラナからのｎａｐｉｎ遺伝子ファミリー（Ｓｊｏｄａｈｌ，１９９５，Ｐｌａｎｔａ  １９７：２６４−２７１）。果実特異的プロモーターには、ＣＹＰ７８Ａ９遺伝子からのプロモーター（ＩｔｏおよびＭｅｙｅｒｏｗｉｔｚ，２０００，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １２：１５４１−１５５０）が挙げられる。他の組織特異的プロモーターには、胚珠特異的ＢＥＬ１遺伝子、これは以下に記載される：Ｒｅｉｓｅｒ，１９９５  Ｃｅｌｌ  ８３：７３５−７４２，ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ３９９４４；Ｒａｙ，１９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：５７６１−５７６５、および卵細胞および中心細胞特異的ＦＩＥ１プロモーターが挙げられる。萼片および花弁特異的プロモーターには、シロイヌナズナ花ホメオティック遺伝子ＡＰＥＴＡＬＡ１（ＡＰ１）（Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ  Ｂｒｏｗｎ，１９９４  Ｃｅｌｌ  ７６：１３１−１４３；Ｍａｎｄｅｌ，１９９２  Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：２７３−２７７）、関連するプロモーター、ＡＰ２（例えば、Ｄｒｅｗｓ，１９９１  Ｃｅｌｌ  ６５：９９１−１００２；Ｂｏｗｍａｎ，１９９１  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：７４９−７５８参照）が挙げられる。別の有用なプロモーターは、シロイヌナズナの異常な花器官（ｕｆｏ）遺伝子の発現を制御するもの��ある（Ｂｏｓｓｉｎｇｅｒ，１９９６  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：１０９３−１１０２）。さらなる組織特異的プロモーターには、トウモロコシ花粉特異的プロモーター（Ｇｕｅｒｒｅｒｏ，１９９０  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２４：１６１−１６８）が挙げられ；Ｗａｋｅｌｅｙ，１９９８  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７：１８７−１９２；Ｆｉｃｋｅｒ，１９９８  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５７：１３２−１４２；Ｋｕｌｉｋａｕｓｋａｓ，１９９７  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４：８０９−８１４；Ｔｒｅａｃｙ，１９９７  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４：６０３−６１１）によって記載されるプロモーターも参照。有用なプロモーターには、ＦＵＬ遺伝子からのもの（ＭａｎｄｅｌおよびＹａｎｏｆｓｋｙ，１９９５  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，７：１７６３−１７７１）、およびＳＨＰ１およびＳＨＰ２遺伝子からのプロモーター（Ｆｌａｎａｇａｎら１９９６  Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １０：３４３−３５３；Ｓａｖｉｄｇｅら，１９９５  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７（６）：７２１−７３３）が挙げられる。プロモーターはＴＡ２９遺伝子に由来することができる（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら，１９９５  Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３５０：５−１７）。
【００３４】
他の好適なプロモーターには、西洋アブラナからの２Ｓ貯蔵タンパク質をコードする遺伝子（Ｄａｓｇｕｐｔａ，１９９３  Ｇｅｎｅ  １３３：３０１−３０２）；シロイヌナズナからの２ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子ファミリー；西洋アブラナからのオレオシン２０ｋＤをコードする遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｍ６３９８５；大豆からのオレオシンＡをコードする遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｕ０９１１８、およびオレオシンＢをコードする遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｕ０９１１９；シロイヌナズナからのオレオシンをコードする遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｚ１７６５７；トウモロコシからのオレオシン１８ｋＤをコードする遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｊ０５２１２およびＬｅｅ，１９９４  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：１９８１−１９８７；ならびに、大豆からの低分子量硫黄リッチタンパク質をコードする遺伝子（Ｃｈｏｉ，１９９５  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ，Ｇｅｎｅｔ．２４６：２６６−２６８）からのものが挙げられる。トマトからの組織特異的Ｅ８プロモーター、およびＡＴＨＢ−８、ＡｔＰＩＮ１、ＡｔＰ５Ｋ１またはＴＥＤ３遺伝子からのプロモーター（Ｂａｉｍａら，２００１  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２６：６４３−６５５，Ｇａｌａｗｅｉｌｅｒら，１９９８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２２２６−２２３０；Ｅｌｇｅら，２００１  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２６：５６１−５７１；Ｉｇａｒａｓｈｉら，１９９８  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６：９１７−９２７）も有用である。
【００３５】
果実の成熟、老化および落葉中、並びにより少ない程度に落花中に活性なトマトプロモーターが使用されうる（Ｂｌｕｍｅ，１９９７  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１２：７３１−７４６）。他の典型的なプロモーターには、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌ．）の雌しべ特異的プロモーター、雌しべ特異的塩基性エンドキチナーゼをコードするＳＫ２遺伝子（Ｆｉｃｋｅｒ，１９９７  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５：４２５−４３１）；トランスジェニックアルファルファの成長点の表皮組織において活性な、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ  ｃｖ．Ａｌａｓｋａ）からのＢｌｅｃ４遺伝子が挙げられる。栄養組織において特に活性な様々なプロモーター、例えば、ジャガイモ塊茎の主要貯蔵タンパク質であるパタチンを制御するプロモーター（例えば、Ｋｉｍ，１９９４  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：６０３−６１５；およびＭａｒｔｉｎ，１９９７  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１１：５３−６２）、およびアグロバクテリウムリゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）からのＯＲＦ１３プロモーター（Ｈａｎｓｅｎ，１９９７  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５４：３３７−３４３）が使用されうる。他の有用な栄養組織特異的プロモーターには：サトイモ（Ｃｏｌｏｃａｓｉａ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ  Ｌ．Ｓｃｈｏｔｔ）球茎タンパク質ファミリーのタリン（ｔａｒｉｎ）からのグロブリンをコードする遺伝子のタリンプロモーター（Ｂｅｚｅｒｒａ，１９９５  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８：１３７−１４４）；サーキュリンプロモーター（ｄｅ  Ｃａｓｔｒｏ，１９９２  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１５４９−１５５９）およびタバコ根特異的遺伝子ＴｏｂＲＢ７のためのプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，１９９１  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：３７１−３８２）が挙げられる。葉特異的プロモーターには、リブロースビホスフェートカルボキシラーゼ（ＲＢＣＳ）プロモーター、トマトＲＢＣＳ１、ＲＢＣＳ２およびＲＢＣＳ３Ａ遺伝子（Ｍｅｉｅｒ，１９９７  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１５：９１−９５）が挙げられる。葉身および葉鞘における葉肉細胞においてほとんど排他的に高レベルで発現するリブロース二リン酸カルボキシラーゼプロモーター（Ｍａｔｓｕｏｋａ，１９９４  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：３１１−３１９）、集光性クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーター（Ｓｈｉｉｎａ，１９９７  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１５：４７７−４８３；Ｃａｓａｌ，１９９８  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１６：１５３３−１５３８）、シロイヌナズナｍｙｂ−関連遺伝子プロモーター（Ａｔｍｙｂ５；Ｌｉ，１９９６  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３７９：１１７−１２１）、およびＡｔｍｙｂ５プロモーター（Ｂｕｓｋ，１９９７  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１１：１２８５−１２９５）は有用なプロモーターである。
【００３６】
有用な栄養組織特異的プロモーターには、分裂組織（根端および成長点）プロモーター、例えば、「ＳＨＯＯＴＭＥＲＩＳＴＥＭＬＥＳＳ（シュートメリステムレス）」および「ＳＣＡＲＥＣＲＯＷ」プロモーター（Ｄｉ  Ｌａｕｒｅｎｚｉｏ，１９９６  Ｃｅｌｌ  ８６：４２３−４３３；および、Ｌｏｎｇ，１９９６  Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：６６−６９）が挙げられる。別の有用なプロモーターは３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡリダクターゼＨＭＧ２遺伝子（例えば、Ｅｎｊｕｔｏ，１９９５  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．７：５１７−５２７を参照）の発現を制御する。分裂組織特異的発現を示すトウモロコシおよび他の種からのｋｎｌ関連遺伝子、例えば、Ｇｒａｎｇｅｒ，１９９６  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３７３−３７８；Ｋｅｒｓｔｅｔｔｅｒ，１９９４  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ６：１８７７−１８８７；Ｈａｋｅ，１９９５  Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３５０：４５−５１参照、例えば、シロイヌナズナＫＮＡＴ１またはＫＮＡＴ２プロモーター（例えば、Ｌｉｎｃｏｌｎ，１９９４  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ６：１８５９−１８７６を参照）も有用である。
【００３７】
活性化カセットのある実施形態においては、プロモーターは誘導性または調節可能であることができ、例えば、細胞を薬剤、生物学的分子、化学物質、リガンド、光または他の刺激に曝露またはこれらで処理した後で核酸配列の発現を生じさせる。このような誘導性プロモーターの非限定的なリストには、ＰＲ  １−ａプロモーター、原核生物リプレッサー−オペレーター系および高級真核生物転写活性化系、例えば、米国特許第７０９１０３８号に詳細が記載されているものが挙げられる。このようなプロモーターには、大腸菌からのテトラサイクリン（Ｔｅｔ）およびラクトース（Ｌａｃ）リプレッサー−オペレーター系が挙げられる。他の誘導性プロモーターには、トウモロコシの干ばつ誘導性プロモーター；ジャガイモからの寒冷、干ばつおよび高塩分誘導性プロモーター、シロイヌナズナの老化誘導性プロモーターＳＡＧ１２、並びにＬＥＣ１、ＬＥＣ２、ＦＵＳ３、ＡｔＳＥＲＫ１、およびＡＧＬＩ５の胚形成関連プロモーターが挙げられ、これら全ては当業者に知られている。植物ホルモン、例えば、オーキシンまたはサイトカイニンなどへの曝露により誘導性である他の植物プロモーターが米国特許出願公開第２００５／００６６３８９号および米国特許第６，２９４，７１６号に記載されるように、この文脈において有用である。
【００３８】
ＤＢＤ、ＬＢＤおよびＡＤの配列の発現を進めることができるあらゆるプロモーターが活性化カセットの目的に本質的に好適であり、これらプロモーターには、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：ウイルスプロモーター、バクテリアプロモーター、植物プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生特異的プロモーター、誘導性プロモーター、光調節プロモーター；発病もしくは病気関連プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓ、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ、ＣＭＶ３５Ｓ最小、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）、ゴマノハグサモザイクウイルス、バドナウイルス、ミラビリスモザイクウイルス、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質、リブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ、芽特異的、根特異的、キチナーゼ、ストレス誘導性、ライスツングロバシリフォームウイルス（ｒｉｃｅ  ｔｕｎｇｒｏ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ  ｖｉｒｕｓ）、植物スーパープロモーター、ジャガイモロイシンアミノペプチダーゼ、硝酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、スクロースシンターゼ、マンノピンシンターゼ、ノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼ、ユビキチン、ゼインタンパク質、アクチンおよびアントシアニンプロモーター。本発明の好ましい実施形態においては、プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター、およびカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ最小プロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルスプロモーター、バドナウイルスプロモーター、ミラビリスモザイクウイルス、ユビキチン（Ｕｂｃ）プロモーター、およびアクチンプロモーターからなる群から選択される。
【００３９】
Ｂ．ＤＢＤ
本明細書において使用される場合、用語「ＤＮＡ結合ドメイン」は、このＤＮＡ結合ドメインが特定の応答エレメントと関連するように機能する限りは、ＤＮＡ結合タンパク質の最小ポリペプチド配列からＤＮＡ結合タンパク質の全長までを含む。ＤＮＡ結合ドメインは、リガンドの存在下または非存在下でＲＥのＤＮＡ配列に結合し、このＲＥの制御下で下流遺伝子の転写を開始もしくは抑制する。遺伝子発現ユニットのある実施形態においては、ＤＢＤは活性化カセット内に位置し、一方、応答エレメントは標的カセット内に位置する。
【００４０】
ＤＮＡ結合ドメインは、既知の応答エレメントと関連するあらゆるＤＮＡ結合ドメインであることができ、例えば、合成およびキメラＤＮＡ結合ドメイン、またはその類似体、組み合わせもしくは改変体が挙げられる。ある実施形態においては、ＤＢＤはＧＡＬ４  ＤＢＤ、ＬｅｘＡ  ＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、グループＨ核受容体メンバーＤＢＤ、ステロイド／チロイドホルモン核受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、またはバクテリアＬａｃＺ  ＤＢＤである。より好ましくは、ＤＢＤは昆虫エクジソン受容体ＤＢＤ、ＧＡＬ４  ＤＢＤ（本明細書の実施例のプラスミドに示されている配列を参照）、またはＬｅｘＡ  ＤＢＤである。このようなＤＢＤの配列は公然と入手可能であり、例えば、米国特許第７０９１０３８号、または米国特許出願公開第２００５／０２６６４５７号のような公報に記載されている。他の実施形態においては、このカセットにおいて有用なＤＢＤには、限定されないが、ｃＩプロモーターまたはｌａｃプロモーターから得られるＤＮＡ結合ドメインが挙げられ、これらも公然と入手可能な配列である。
【００４１】
Ｃ．エクジソンＬＢＤおよび任意の第２のＬＢＤ
遺伝子発現システムのある実施形態において、エクジソン受容体（ＥｃＲ）ＬＢＤは無脊椎動物エクジソン受容体もしくはその変異体の全部または一部分を含む。ＥｃＲは、シグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）ＤＮＡおよびリガンド結合ドメインおよび活性化ドメインによって特徴づけられる核ステロイド受容体スーパーファミリーのメンバーである（Ｋｏｅｌｌｅら  １９９１，Ｃｅｌｌ，６７：５９  ７７；米国特許第６２４５５３１号（Ｓｔａｎｆｏｒｄ）も参照）。エクジソン受容体は多くのステロイド化合物、例えば、ポナステロンＡおよびムリステロンＡなど、並びに非ステロイド化合物に対して応答性である。ＥｃＲは５つのモジュラードメイン、すなわち、Ａ／Ｂ（トランス活性化）、Ｃ（ＤＮＡ結合、ヘテロダイマー化）、Ｄ（ヒンジ、ヘテロダイマー化）、Ｅ（リガンド結合、ヘテロダイマー化およびトランス活性化）、並びにＦ（トランス活性化）ドメインを有する。これらのドメインのいくつか、例えば、Ａ／Ｂ、ＣおよびＥなどは、それらが他のタンパク質に融合される場合に、その機能を保持している。本明細書において記載される遺伝子発現システムにおいてＬＢＤとして使用するのに好適なＥｃＲの部分はドメインＤ、ＥおよびＦを含む。例えば、野生型ＥｃＲ  ＬＢＤは配列番号１のヌクレオチド９９０〜１９９７に存在する。
【００４２】
好ましくは、ＥｃＲは鱗翅目ＥｃＲ、双翅目ＥｃＲ、節足動物ＥｃＲ、同翅目ＥｃＲおよび半翅目ＥｃＲである。より好ましくは、使用するＥｃＲはハマキガ類のトウヒシントメハマキ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）ＥｃＲ（ＣｆＥｃＲ）、チャイロコメノゴミムシダマシ（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ）ＥｃＲ（ＴｍＥｃＲ）、タバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）ＥｃＲ（ＭｓＥｃＲ）、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｅｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）ＥｃＲ（ＨｖＥｃＲ）、カイコガＥｃＲ（ＢｍＥｃＲ）、キイロショウジョウバエＥｃＲ（ＤｍＥｃＲ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）ＥｃＲ（ＡａＥｃＲ）、クロバエ類のルシリア・クプリナ（Ｌｕｃｉｌｉａ  ｃａｐｉｔａｔａ）ＥｃＲ（ＬｃＥｃＲ）、チチュウカイミバエ（Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ  ｃａｐｉｔａｔａ）ＥｃＲ（ＣｃＥｃＲ）、トノサマバッタ（Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）ＥｃＲ（ＬｍＥｃＲ）、モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ）ＥｃＲ（ＭｐＥｃＲ）、シオマネキ（Ｕｃａ  ｐｕｇｉｌａｔｏｒ）ＥｃＲ（ＵｐＥｃＲ）、マダニ（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）ＥｃＲ（ＡｍａＥｃＲ）、シルバーリーフコナジラミ（Ｂａｍｅｃｉａ  ａｒｇｅｎｔｉｆｏｌｉ）ＥｃＲ（ＢａＥｃＲ）、またはツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｉｘ  ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ）ＥｃＲ（ＮｃＥｃＲ）などである。さらにより好ましくは、ＬＢＤはトウヒシントメハマキＥｃＲ（ＣｆＥｃＲ）またはキイロショウジョウバエＥｃＲ（ＤｍＥｃＲ）である。
【００４３】
様々な野生型もしくは変異型ＥｃＲの配列は公然と入手可能であり、例えば、米国特許第７０９１０３８号、国際公開第９７／３８１１７号および米国特許第６３３３３１８号、第６２６５１７３号および第５８８０３３３号のような公報に記載されている。以下の実施例は野生型ＥｃＲ配列を使用するが、同様に機能する変異型配列が当業者によって選択されうることが予想される。ある実施形態においては、例えば、変異型エクジソン受容体は上で引用された米国特許出願公開第２００５／０２６６４５７号に記載されるような変異を含むものであり、例えば、少なくとも１つの変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインである。ある実施形態においては、例えば、配列番号２における１３７４〜１３７６に相当するヌクレオチド位置において、コドンＡＣＡ（Ｔｈｒ）をコドンＧＴＧ（Ｖａｌ）に変える変異を含むエクジソンＬＢＤが有用なＥｃＲＬＢＤであろう。この変異型ＥｃＲＬＢＤはＴ５２Ｖとも称されるが、全長ＣｆＥｃＲにおけるアミノ酸位置３３５におけるＴｈｒからＶａｌへの変異をコードする。その公報において記載されるＥｃＲＬＢＤのさらに他のものが本明細書に記載される遺伝子発現システムにおいて有用であり得る。別の実施形態においては、変異型エクジソン受容体ＬＢＤは米国特許第６２４５５３１号（Ｓｔａｎｆｏｒｄ）に記載されているものであり、または当該技術分野において知られている他の変異型配列の中でもとりわけ、トランケートＥｃＲＬＢＤ配列もしくは欠失変異体である。別の実施形態においては、５００ｍＭ未満の塩および少なくとも３７℃でのハイブリダイゼーション工程並びに少なくとも６３℃での２×ＳＳＰＥでの洗浄工程のような従来のハイブリダイゼーション条件下で、既知のＥｃＲＬＢＤもしくは変異型配列をハイブリダイズするポリヌクレオチドによってＬＢＤはコードされる。
【００４４】
ある実施形態においては、遺伝子発現システムは第２のＬＢＤを使用する。第２のＬＢＤはエクジソン受容体ポリペプチドではないが、第２の核受容体のリガンド結合ドメインであることができる。このような第２の結合ドメインには、限定されないが、脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、ウルトラスピラクルタンパク質リガンド結合ドメイン、およびキメラリガンド結合ドメイン、ここで当該キメラリガンド結合ドメインは２つのポリペプチドフラグメントを含み、その第１のポリペプチドフラグメントが脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインまたはウルトラスピラクルタンパク質リガンド結合ドメイン由来であり、かつその第２のポリペプチドフラグメントが異なる脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインまたはウルトラスピラクルタンパク質リガンド結合ドメイン由来であるキメラリガンド結合ドメインが挙げられる。例えば、米国特許出願公開第２００５／０２６６４５７号に記載されているような結合ドメインを参照。このようなＬＢＤは当業者に周知であり、かつ文献において充分に説明されている。
【００４５】
１種以上の好適なＥｃＲＬＢＤ配列を選択し、それを以下で例示される配列の代わりに使用することは、過度の実験を行うことなく、本明細書における教示が与えられる当業者の能力の範囲内にある。
【００４６】
Ｄ．活性化ドメイン
遺伝子発現システムにおいて有用な活性化もしくはトランス活性化ドメイン（「ＡＤ」と略す）はあらゆるグループＨ核受容体メンバーＡＤ、ステロイド／チロイドホルモン核受容体ＡＤ、合成もしくはキメラＡＤ、ポリグルタミンＡＤ、塩基性もしくは酸性アミノ酸ＡＤ、ＶＰ１６  ＡＤ、ＧＡＬ４  ＡＤおよびＮＦ−κＢ  ＡＤ、ＢＰ６４  ＡＤ、Ｂ４２酸性活性化ドメイン（Ｂ４２ＡＤ）、ｐ６５トランス活性化ドメイン（ｐ６５ＡＤ）、グルココルチコイド活性化ドメイン、またはこれらの類似体、組み合わせもしくは改変体でありうる。特定の実施形態においては、ＡＤは合成もしくはキメラＡＤであるか、またはＥｃＲ、グルココルチコイド受容体、ＶＰ１６、ＧＡＬ４、ＮＦ−κＢもしくはＢ４２酸性活性化ドメインＡＤから得られる。好ましくは、ＡＤはＥｃＲ  ＡＤ、ＶＰ１６  ＡＤ、Ｂ４２  ＡＤ、またはｐ６５  ＡＤである。このような活性化ドメインの配列は、米国特許第７，０９１，０３８号のような公報においてまたは本明細書に記載される他の文献において公然と利用可能である。典型的なＶＰ１６ＡＤは本明細書の実施例において記載されるプラスミドにおいて説明される。このようなドメインは当業者に周知であり、かつ文献において充分に説明されている。
【００４７】
Ｅ．標的カセットの「誘導性」プロモーターシステム
ある実施形態においては、標的カセットのプロモーターは複数構成要素プロモーター配列である。それは最小プロモーターを含み、この最小プロモーターは応答エレメントの１以上のコピーと動作可能に関連しており、この応答エレメントは活性化カセット内のＤＮＡ結合ドメインに対応する。
【００４８】
最小プロモーターは、本明細書において使用される場合、コアプロモーター（すなわち、転写の開始を媒介する配列）および５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含み、エンハンサー配列を含まない。よって、遺伝子発現システムの実施形態において使用するために、最小プロモーターは、活性化カセットにおける使用について項目「Ａ」において上述したあらゆるプロモーターに由来する最小プロモーターであることができる。ターゲットカセットの特定の実施形態において、望まれる最小プロモーターには、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ最小プロモーター；合成Ｅ１ｂ最小プロモーター（配列番号８；米国特許第７０９１０３８号を参照）；および合成ＴＡＴＡ最小プロモーター（ＴＡＴＡＴＡ；米国特許出願公開第２００５／０２２８０１６号を参照）が挙げられる。本明細書において記載される遺伝子発現システムにおいて有用な最小プロモーターは、文献に充分に記載されている多くのプロモーターから当業者によって容易に選択されうる。３５Ｓ最小プロモーターの配列は後述の実施例において記載されるプラスミド中に記載される。
【００４９】
標的カセットの誘導性プロモーターの他の部分は最小プロモーターに対して５’または３’側に位置する応答エレメント（ＲＥ）を含む。あるＲＥは２つの異なるもしくは同じ最小プロモーターをそれぞれの側に有することができ、２つの異なるタンパク質を発現することができる。ある実施形態においては、ＲＥは最小プロモーターに操作上または動作可能に関連している。応答エレメントは、活性化カセットのＤＮＡ結合ドメインとの相互作用を介して媒介されるプロモーターに応答をもたらす１以上のシス作動性ＤＮＡエレメントである。このＤＮＡエレメントはその配列内でパリンドローム（完全もしくは不完全）でありうるか、または変化しうる数のヌクレオチドによって分離された配列モチーフもしくはハーフサイト（ｈａｌｆ  ｓｉｔｅ）からなることができる。このハーフサイトは類似もしくは同じであってよく、そして直接反復もしくは逆方向反復で配列されてよく、または単一のハーフサイトとして配置されてよく、または直列に隣接するハーフサイトのマルチマーとして配置されてよい。天然のエクジソン受容体の応答エレメントのＤＮＡ配列の例はＣｈｅｒｂａｓ  Ｌ．ら１９９１  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５，１２０−１３１；Ｄ’Ａｖｉｎｏ  ＰＰ．ら１９９５  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１１３：１９およびＡｎｔｏｎｉｅｗｓｋｉ  Ｃ．ら１９９４  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４，４４６５−４４７４などの文献に記載されている。ＲＥは活性化カセットのＤＮＡ結合ドメインに対応するあらゆる応答エレメント、またはその類似体、組み合わせもしくは改変体であることができる。標的カセットにおいて、単一のＲＥが使用されうるか、または複数のＲＥ、すなわち、同じＲＥの複数のコピーもしくは２種以上の異なるＲＥのいずれかが使用されうる。ＲＥは改変されうるか、または酵母からのＧＡＬ−４タンパク質（Ｓａｄｏｗｓｋｉら１９８８  Ｎａｔｕｒｅ，３３５：５６３−５６４を参照）もしくは大腸菌からのＬｅｘＡタンパク質（ＢｒｅｎｔおよびＰｔａｓｈｎｅ  １９８５，Ｃｅｌｌ，４３：７２９−７３６を参照）のような他のＤＮＡ結合タンパク質ドメインのための応答エレメント、またはキメラ受容体に適合するための特異的相互作用のために設計され、改変されおよび選択されるタンパク質との標的相互作用に特異的な合成応答エレメント（例えば、Ｋｉｍら１９９７  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９４：３６１６−３６２０を参照）で置き換えられうる。特定の実施形態においては、ＲＥはＧＡＬ４からのＲＥ（ＧＡＬ４ＲＥ）、好ましくは、２以上のコピーである。後述の実施例は５コピーのＧＡＬ４ＲＥ（５ｘＧＡＬ４）の使用を示す。しかし、他の好適なＲＥには、限定されないが、ＬｅｘＡ、グループＨ核受容体ＲＥ、ステロイド／チロイドホルモン核受容体ＲＥ、または合成ＤＮＡ結合ドメインを認識する合成ＲＥが挙げられる。他の実施形態においては、ＲＥはエクジソン応答エレメント（ＥｃＲＥ）、またはポリヌクレオチド配列を含むＬｅｘＡ  ＲＥ（オペロン「ｏｐ」）である。このようなＲＥの全ては文献において充分に説明されており、かつ本明細書の教示を得た当業者によって容易に選択されうる。
【００５０】
標的カセットにおいては、この「誘導性プロモーター」は、調節核酸配列もしくは遺伝子に動作可能に関連し、その発現を制御する。その遺伝子の高レベルの発現はエチレン誘導性シグナルタンパク質、例えば、ＥＩＮ２もしくはＥＩＮ３の蓄積を低減させるように働き、それにより以下で明らかにされるようにエチレン感受性を変調する。標的カセットの誘導性プロモーターは化学誘導用組成物もしくは誘導剤によって誘導され、この組成物もしくは誘導剤は、活性化カセットのリガンド結合ドメインと接触する場合に、最小プロモーターの応答エレメントを活性化する。
【００５１】
Ｆ．選択された調節タンパク質をコードする核酸配列
このシステムにおいて有用な核酸配列は、ＥＩＮ２もしくはＥＩＮ３のようなエチレン誘導性シグナルタンパク質のターンオーバーを調節することにより、植物におけるエチレン感受性またはエチレン生産を改変する選択された調節タンパク質をコードする。このような核酸配列には、特定の実施形態においては、ＥＩＮ３結合Ｆ−ボックスタンパク質、ＥＢＦ１およびＥＢＦ２が挙げられる。別の実施形態においては、選択される調節タンパク質はＦ−ボックスタンパク質ＥＴＰ１およびＥＴＰ２である（上述のＱｉａｏら、２００８）。
【００５２】
このようなＥＴＰ１核酸配列の例は、配列番号１のヌクレオチド２５５７〜３８０４に特定される（ＧＥＮＢＡＮＫ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ  １１２８７４も参照）。このようなＥＴＰ２核酸配列の例は、配列番号２のヌクレオチド２５５１〜３７１７に特定される（ＧＥＮＢＡＮＫ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ  １１２７７７も参照）。ＥＢＦ１核酸配列の例はＧＥＮＢＡＮＫ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ  １２８１０６として公表されている。ＥＢＦ２核酸配列の例はＧＥＮＢＡＮＫ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ  １２２４４４として公表されている。これらの配列は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５３】
野生型、すなわち天然に発現している植物調節遺伝子の使用に加えて、遺伝子発現システムはこれらの遺伝子配列およびコードされたタンパク質に有用な変異を含む特定の核酸配列を含むことも可能である。
【００５４】
本明細書に記載される本発明のある実施形態においては、特定の植物についての選択されたシグナルタンパク質ＥＩＮ２もしくはＥＩＮ３のターンオーバーを制御する野生型調節遺伝子が本明細書において記載される遺伝子発現システムにおいておよび方法において使用され、エチレンの存在下でのシグナルタンパク質の蓄積を阻害することによって植物におけるエチレン感受性を制御もしくは変調する。別の実施形態においては、植物細胞におけるエチレン感受性もしくはエチレン生産を媒介する野生型タンパク質の変異体が使用される。さらなる実施形態においては、エチレンの存在下でのシグナルタンパク質の蓄積を阻害することによってある種の植物細胞においてエチレン感受性もしくはエチレン生産を変調するタンパク質をコードする遺伝子の野生型もしくは変異体が別の種類の植物細胞において使用され、例えば、潜在的なＲＮＡサイレンシングをなくするためにこのような使用が望まれる。
【００５５】
Ｇ．任意の構成要素
遺伝子発現システムのカセットに認められる任意の構成要素には、ターミネーション制御領域が挙げられる。このようなターミネーターもしくはポリアデニル化配列も本発明の特定の実施形態における活性化および標的カセットにおいて使用されうる。このような領域は、好ましい宿主本来の様々な遺伝子に由来する。本発明のある実施形態においては、ターミネーション制御領域は、合成ポリアデニル化シグナル、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）、アグロバクテリウム、ウイルスおよび植物ターミネーター配列などを含むか、またはこれらに由来する。
【００５６】
選択可能なマーカーには、その効果、すなわち、抗生物質耐性、除草剤耐性などに基づいて選択されうる抗生物質もしくは化学物質耐性遺伝子、比色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどが挙げられうる。当該技術分野で知られ、使用されている選択可能なマーカー遺伝子の例には、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、アクチノニン（ＰＤＦ１遺伝子）、ビアラホス除草剤、グリホサート除草剤、スルホンアミド、マンノースなどに対する耐性をもたらす遺伝子；並びに、表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン制御遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子、ＧＵＳおよびルシフェラーゼが挙げられる。
【００５７】
他の調節配列、例えば、プラスミドにおけるスペーサー配列として機能するヌクレオチド配列、および他のマイナーな制御配列、酵素切断部位なども、本明細書において記載された特定の実施形態に従って植物細胞を形質転換するのためのカセットを含むプラスミド中に、もしくはカセット中に認められうる。
【００５８】
好適なターミネーション配列、選択可能マーカーおよび他の従来のプラスミド制御配列は、当業者に周知で、かつ本明細書における教示をもたらす文献において充分に記載されているこのような数多くの配列から、当業者によって容易に選択されうる。
【００５９】
Ｈ．遺伝子発現システムに有用な誘導用組成物／誘導剤
遺伝子発現システムが植物において発現される場合に、選択された調節タンパク質の発現の変調、例えば、そのタンパク質の過剰発現は、選択されたシグナルタンパク質の発現および蓄積に対する調節タンパク質による制御に基づいて植物細胞内のエチレン感受性を選択的に調節するために使用される。調節タンパク質の過剰発現はシグナルタンパク質の発現の低減を生じさせる。エチレンの存在下では、調節タンパク質の過剰発現はシグナルタンパク質に対するエチレンの通常の影響（すなわち、増大した発現）に打ち勝つのに充分高いレベルである。調節タンパク質の過剰発現の程度は植物に適用される誘導用組成物のタイミング、期間および量によって制御可能である。ある実施形態においては、誘導用組成物は植物の細胞と接触して配置される化学物質である。別の実施形態においては、誘導用組成物は植物の細胞によって吸収される化学物質である。さらに別の実施形態においては、誘導用組成物は植物細胞内に転移される化学物質である。誘導用組成物は活性化カセットのＥｃＲＬＢＤに非常に特異的なリガンドでもある。誘導用組成物もしくはリガンドの活性化カセットのＬＢＤへの結合は標的カセットの誘導性プロモーターの誘導および選択された調節タンパク質をコードする核酸配列の発現をもたらす。よって、このシステムは、シグナルタンパク質の発現を低減もしくは抑制することにより、植物におけるエチレン感受性を調節する。誘導用組成物は植物細胞、組織および器官に対する低い毒性によっても特徴づけられる。誘導用組成物はエチレン感受性の調節を「オフ」にするために植物から素早く枯渇する能力、および調節の効果的な制御を可能にする能力も有し、これらは以下でより詳細に記載される。
【００６０】
このような有効な誘導用組成物には、エクジソンリガンド結合ドメインに優先的に結合するリガンドがある。ある実施形態においては、これらのリガンドには、ジアシルヒドラジン化合物、例えば、市販のテブフェノジド（ダウアグロサイエンス）、メトキシフェノジド（ダウアグロサイエンス）、ハロフェノジド（ダウアグロサイエンス）、およびクロマフェノジド（日本化薬）（国際公開第９６／０２７６７３および米国特許第５，５３０，０２８号）が挙げられる。他の有用な誘導剤は非ステロイド系リガンド、例えば、米国特許第６，２５８，６０３号に記載されるジベンゾイルヒドラジン誘導体である。さらに他の有用な誘導剤は、米国特許出願公開第２００５／０２２８０１６号に詳細に記載される４−テトラヒドロキノリン誘導体である。さらなる多くの好適な化合物、例えば、１−アロイル−４−（アリールアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン（ＴＨＱ）がＫｕｍａｒらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４，２７９（２６）：２７２１１−８；ＨｏｒｍａｎｎらＪ．Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｒｅｓ２００３  １７（２−４）：１３５−５３；ＴｉｃｅらＢｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ２００３，１３（１１：１８８３−６；およびＴｉｃｅら２００３  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２００３  １３（３）：４７５−８に示される。
【００６１】
よって、遺伝子発現システムは化学誘導用組成物もしくは誘導剤によって誘導されもしくは「オン」にされ、この化学誘導用組成物もしくは組成物は活性化カセットのリガンド結合ドメインと接触する場合に、応答エレメントの最小プロモーターを活性化し、これによりシグナルタンパク質ＥＩＮ２もしくはＥＩＮ３の発現を抑制する調節核酸配列もしくは遺伝子の発現をオンにして、植物をエチレン非感受性にする。この遺伝子発現システムは、シグナルタンパク質の発現に対するエチレンの影響に打ち勝つのに充分高いレベルで調節遺伝子を外部的に発現させるための手段も提供する。
【００６２】
ＩＩ．トランスジェニック植物、植物細胞、組織もしくは器官
上述のように、遺伝子発現システムは、植物、植物細胞または植物の他の組織もしくは器官に組み込まれるように設計される。場合によっては、このような組み込みは一時的でもありうる。しかし、本発明の特定の実施形態においては、植物の染色体への安定的な組み込みが望まれる。
【００６３】
ある実施形態においては、トランスジェニック植物細胞は、上述のような遺伝子発現システムを発現し、エチレン感受性が一時的かつ可逆的に制御されるように設計される。このような植物細胞は、ある実施形態においては、遺伝子発現システムの活性化カセットおよび標的カセットでトランスフェクトされたまたは形質転換された細胞である。ある実施形態においては、活性化カセットおよび標的カセットは同じプラスミド上にある場合には、このプラスミドで植物細胞はトランスフェクトされるかまたは形質転換される。別の実施形態においては、活性化カセットおよび標的カセットが別々のプラスミド上にある場合には、双方のプラスミドで別々にもしくは一緒に同じ植物細胞はトランスフェクトされるかもしくは形質転換される。あるいは、その２種の別々のプラスミドのそれぞれで同じ植物の異なる細胞がトランスフェクトされるかまたは形質転換される。さらに他の実施形態においては、その２種のプラスミドのそれぞれで、別々に、異なる植物が形質転換され、単一種のプラスミドを運ぶそれぞれの植物は性的に交配されて、双方のプラスミドを含む交配種を生じさせ、これにより機能的な誘導性システムをもたらす。
【００６４】
トランスフェクションは、表現型の変化をもたらすように外来もしくは異種ＲＮＡもしくはＤＮＡを細胞内に導入することを伴う。形質転換は、結果的に遺伝的に安定な形質をもたらす植物細胞の染色体ＤＮＡへの核酸フラグメントの移送および組み込みをいう。よって、形質転換核酸フラグメントを含む植物細胞は「トランスジェニック」もしくは「組み替え」もしくは「形質転換」生物と称される。よって、最初に形質転換もしくはトランスフェクトされた植物細胞の子孫も、その染色体に一時的にもしくは安定的に組み込まれたカセットを有する。
【００６５】
Ａ．形質転換
植物細胞の形質転換は、活性化カセットのみ、標的カセットのみ、または双方のカセットを含むベクターもしくはプラスミドを生じさせることを伴う。図１、２、３Ａ〜３Ｉ、および４Ａ〜４Ｉの例を参照。好適なベクターと植物との組み合わせは、当業者に容易に明らかとなり、例えば、Ｍａｌｉｇａら１９９４（植物分子生物学における方法；実験室マニュアル）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州に見いだされうる。
【００６６】
例えば、好適な「ベクター」は核酸を植物細胞内にクローニングするおよび／または移行させるためのあらゆる手段である。ベクターは、別のＤＮＡセグメントが、その結合したセグメントの複製をもたらすように結合されうるレプリコンであることができる。「レプリコン」は、ＤＮＡ複製の自律ユニットとして、すなわち、それ自身の制御下で複製可能なように機能するあらゆる遺伝的構成要素（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）である。遺伝子発現システムで植物細胞を形質転換するのに有用なベクターには、細胞内に核酸を導入するためのウイルス系手段および非ウイルス系手段の双方が挙げられる。核酸を操作し、応答エレメントおよびプロモーターを遺伝子に組み込むなどのために、当該技術分野において既知の多数のベクターが使用されうる。可能なベクターには、例えば、プラスミドまたは改変された植物ウイルス、例えば、ラムダ誘導体のようなバクテリオファージ、またはプラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド誘導体、またはブルースクリプトベクターが挙げられる。ＤＮＡ末端へヌクレオチド配列（リンカー）をライゲーションすることにより、相補的な付着端もしくは酵素で修飾された好適な挿入部位を有する選択されたベクターに、好適なＤＮＡフラグメントをライゲーションする従来の手段が知られている。植物細胞を形質転換するのに使用されうるあらゆるウイルス系もしくは非ウイルス系ベクターがこの目的のために有用である。非ウイルス系ベクターには、プラスミド、リポソーム、電荷を有する脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−タンパク質複合体、およびバイオポリマーが挙げられる。遺伝子発現システムのカセットに加えて、ベクターは１以上の調節領域、および／または核酸移行の結果（どの組織に移行するか、発現の期間など）をモニタリングし、測定し、選択するのに有用な選択可能なマーカーも含みうる。
【００６７】
用語「プラスミド」は、通常、環状２本鎖ＤＮＡ分子の形態の染色体外構成要素をいう。このような構成要素は、あらゆるソースに由来する、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列、線状、環状もしくはスーパーコイルの、１本鎖もしくは２本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡであることができ、多くのヌクレオチド配列は、プロモーターフラグメントおよび好適な３’非翻訳配列と共に選択された遺伝子産物のためのＤＮＡ配列を細胞内に導入することができる独自の構造に結合されもしくは組み替えられている。
【００６８】
ベクターもしくはプラスミドは、当該技術分野で知られた方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈降、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーター（例えば、Ｗｕら１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７；ＷｕおよびＷｕ，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４；並びに、Ｈａｒｔｍｕｔら米国特許第５３５４８４４号を参照）によって所望の植物細胞内に導入されうる。あるいは、カチオン性脂質の使用が負に帯電した核酸のカプセル封入を促進することができ、負に帯電した細胞膜との融合も促進できる（ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ，１９８９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：３８７−３８８）。核酸の移送に特に有用な脂質化合物および組成物は米国特許第６１７２０４８号、第６１０７２８６号および第５４５９１２７号に記載されている。他の分子、例えば、カチオン性オリゴペプチドもしくはカチオン性ポリマー（例えば、米国特許第５８５６４３５号）、またはＤＮＡ結合タンパク質に由来するペプチド（例えば、米国特許第６２００９５６号）なども核酸のトランスフェクションを容易にするのに有用である。裸のＤＮＡプラスミドとしてのベクターを導入することも可能である（米国特許第５６９３６２２号、第５５８９４６６号および第５５８０８５９号を参照）。受容体に媒介されたＤＮＡ送達アプローチも、遺伝子発現カセットで植物細胞の形質転換を行うために使用されうる。例えば、アグロバクテリウム媒介リーフディスク形質転換法（Ｈｏｒｓｃｈら，１９８８  Ｌｅａｆ  Ｄｉｓｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ：Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ）または当該技術分野において知られた他の方法を用いて、植物の形質転換が達成されうる。
【００６９】
Ｂ．繁殖およびスクリーニング
よって、上述のように、植物における少なくとも１つの細胞を上述の遺伝子発現システムで形質転換した後に（単一種のプラスミドで、もしくはそれぞれが異なるカセットを含む複数種の形質転換プラスミドとして）、トランスジェニック植物、植物組織もしくは植物器官を生じさせる方法は、選択された植物に典型的な条件下で形質転換された植物細胞もしくは植物から上述のような植物もしくは植物交配種を繁殖させることをさらに含む。次いで、植物は、形質転換された植物細胞の表現型特徴を含むもしくは示す植物（細胞、組織、器官）を選択するためにスクリーニングされる。例えば、植物が遺伝子発現カセットの所望の組み込まれた核酸配列を含むかどうかを決定するために、引き続いて、得られた植物またはその細胞、組織および器官のスクリーニングが行われ、これも当業者に知られている。例えば、プラスミド内の１以上のレポーター遺伝子もしくはマーカーの使用によって、安定的に染色体に組み込まれた導入ＤＮＡを有する細胞が選択されうる。以下の実施例において、カナマイシン、アクチノニンもしくはビアラホスがこの目的のために使用される。
【００７０】
成功裏に組み込まれた発現システムを有する植物（組織もしくは器官）は、その植物が上述のような誘導用組成物と接触する場合に素早いエチレン非感受性を示す。あらゆる植物（植物細胞、組織もしくは器官を含む）がこのような形質転換を受けることができ、よって組み替え植物が従来の手段によって繁殖させられうる。遺伝子発現システムでの形質転換およびそれによるそのエチレン感受性の調節を受けうることが特に望まれる植物には、双子葉植物、単子葉植物、装飾用植物、顕花植物、並びに人または動物に摂取される植物が挙げられる。限定されることなく、このような植物には、イネ、トウモロコシ、小麦、大麦、モロコシ、キビ、スイッチグラス、ススキ（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、グラス（ｇｒａｓｓ）、オーツ麦、トマト、ジャガイモ、バナナ、キウイフルーツ、アボカド、メロン、マンゴー、サトウキビ、テンサイ、タバコ、パパイヤ、桃、イチゴ、ラズベリー、ブラックベリー、ブルーベリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、タマネギ、ブロッコリー、芽キャベツ、綿、キャノーラ、ブドウ、大豆、菜種、アスパラガス、豆類、ニンジン、キュウリ、ナス、メロン、オクラ、パースニップ、落花生、コショウ、パインアップル、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、サツマイモ、ライ麦、カンタロープ、エンドウ、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）、ヒマワリ、ホウレンソウ、リンゴ、サクランボ、クランベリー、グレープフルーツ、レモン、ライム、ネクタリン、オレンジ、モモ、ナシ、タンジェロ、タンジェリン、ユリ、カーネーション、キク、ペチュニア、バラ、ゼラニウム、スミレ、グラジオラス、ラン、ライラック、野生リンゴ、モミジバフウ、カエデ、ポインセチア、ニセアカシア、セイヨウトネリコ、ポプラ、シナノキおよびシロイヌナズナが挙げられる。
【００７１】
植物組織および器官には、限定されないが、栄養組織、例えば、根、茎もしくは葉、および生殖組織、たとえば、果実、胚珠、胚、胚乳、外皮、種子、種皮、花粉、花弁、萼片、雌しべ、花、葯またはあらゆる胚組織が挙げられる。
【００７２】
ＩＩＩ．エチレン感受性を制御する方法
このようなトランスジェニック植物、細胞、組織、花、種子もしくは器官は、充分な期間にわたって好適な時点で適用される誘導用組成物の有効量を用ることによるエチレン感受性を制御する方法にかけられることができ、ＥＩＮ２もしくはＥＩＮ３のようなシグナルタンパク質の蓄積を、特に植物細胞がエチレンに曝露される場合に阻害することができる。誘導用組成物は、トランスジェニック植物、植物細胞、植物組織もしくは植物器官の細胞と接触されうるか、これらに吸収されうるか、および／またはこれらに移行しうる。適用技術には、限定されないが、植物または植物と接触している土壌もしくは媒体を、誘導剤で浸せきし、噴霧し、粉末散布し、ドレンチング（ｄｒｅｎｃｈｉｎｇ）し、ディッピングし、もしくは液体供給する（ｉｒｒｉｇａｔｉｎｇ）ことが挙げられる。
【００７３】
選択された調節もしくはターンオーバータンパク質の発現を増大させることにより、誘導用組成物の存在下でのエチレンに対する植物細胞の応答が調節される。選択されたタンパク質がＥＰＴ１である後述の実施例においては、誘導剤の適用はＥＰＴ１の発現を増大させ、これはＥＩＮ２の発現を低減もしくは抑制し、細胞内でのその蓄積を抑制し、それによりその植物のエチレンに対する感受性を低減させる。この感受性の低減は、誘導剤がその植物（細胞、組織もしくは器官）に適用されている期間にわたって続き、かつ活性剤の適用が停止された後でその植物が残りの誘導剤を代謝し続ける期間にわたって続く。さらに、エチレン誘導性シグナルタンパク質の誘導および発現に対するエチレンの直接競合効果に対抗するのに必要な程度まで調節タンパク質を過剰発現することによって、エチレンの存在下でこの低減は起こりうる。選択された時間の後で、植物から誘導剤を枯渇させることによって、エチレンに対する植物細胞の応答は野生型に戻され、この場合には増大する。シグナルタンパク質の発現に影響を及ぼしおよび植物細胞におけるエチレン感受性もしくはエチレン生産を変調する調節タンパク質の発現の「制御」、「変調」または「調節」はいくつかの方法で達成されうる。本方法のある実施形態においては、調節タンパク質発現の調節（その発現の量的大きさを含む）は植物への誘導用組成物の適用のタイミングによって制御される。別の実施形態においては、植物に適用される誘導用組成物の濃度は、タンパク質の発現（その発現の量的大きさを含む）およびこれによるエチレン感受性を制御するように使用される。さらなる実施形態においては、タンパク質発現の調節（その発現の量的大きさを含む）は植物への誘導用組成物の適用の期間により制御される。所望の結果を得るために、その植物の成長中に、誘導用組成物の適用のこれらパラメーターのいずれか１つ、２つもしくは３つ全部が変更されうる。
【００７４】
タイミングを通じた制御の一例として、誘導用組成物は植物の生長サイクルにおける選択された時点で、例えば、植物の発芽、果実成熟もしくは開花のいずれかの前もしくは後で、または、環境条件に応答して（例えば、植物がストレス要因、例えば、病原体もしくは干ばつに曝露される前もしくは後で）、エチレン感受性を調節するように適用されうる。別の実施形態においては、誘導用組成物は植物の生長サイクルにおける複数の時点で適用される。さらに他の実施形態においては、誘導用組成物の適用は、エチレン感受性を制御するために、選択された時点で停止される。適用の所望のタイミングは処理される植物の種類、誘導用組成物の効力、および植物に対するその潜在的な細胞毒性効果に応じて選択され、変化しうる。
【００７５】
誘導用組成物濃度による制御の一例として、誘導用組成物の種類、植物の種類、適用のタイミング（すなわち、誘導用組成物の適用の時点で植物がエチレンに曝露されるかまたは曝露されてきたか）、植物のサイズおよび年齢（例えば、苗もしくは成熟した植物）、適用の環境（例えば、圃場において、または組織培養、植木鉢もしくは他の実験的もしくは成長用コンテナにおいて）に基づいて、誘導用組成物は選択された濃度で植物に適用される。ある実施形態においては、誘導用組成物は植物あたり少なくとも０．０１μＭの濃度で適用される。別の実施形態においては、誘導用組成物は植物あたり少なくとも０．１μＭの濃度で適用される。別の実施形態においては、誘導用組成物は植物あたり少なくとも１μＭの濃度で適用される。別の実施形態においては、誘導用組成物は植物あたり少なくとも１０μＭの濃度で適用される。別の実施形態においては、誘導用組成物は植物あたり少なくとも２０μＭの濃度で適用される。別の実施形態においては、誘導用組成物は植物あたり少なくとも５０μＭの濃度で適用される。別の実施形態においては、誘導用組成物は植物あたり少なくとも１００μＭの濃度で適用される。別の実施形態においては、誘導用組成物は植物あたり少なくとも２００μＭの濃度で適用される。別の実施形態においては、誘導用組成物は植物あたり少なくとも５００μＭの濃度で適用される。別の実施形態においては、誘導用組成物は植物あたり少なくとも７００μＭの濃度で適用される。別の実施形態においては、誘導用組成物は植物あたり少なくとも１ｍＭの濃度で適用される。別の実施形態においては、誘導用組成物は植物あたり少なくとも３ｍＭの濃度で適用される。別の実施形態においては、誘導用組成物は植物あたり少なくとも５ｍＭの濃度で適用される。さらに別の実施形態においては、この濃度は０．０１μＭ〜少なくとも５ｍＭの間の部分である濃度の中から選択される。
【００７６】
植物におけるエチレン感受性もしくはエチレン生産を媒介するタンパク質の変調を制御する第３の方法は、誘導用組成物の適用の期間を変化させることを伴う。例えば、植物への誘導用組成物の適用の期間は、望まれる効果、誘導剤の有効性、および望まれない細胞毒性効果の可能性に応じて、少なくとも１０分から少なくとも２週間、もしくはそれより長い時間の範囲であり得る。望まれる場合には、誘導用組成物の適用は数日の期間にわたってなされうる。ある実施形態においては、誘導用組成物の適用は数週間の期間にわたってなされうる。ある実施形態においては、上記濃度が概して少なくとも１０分間にわたって植物に適用される。別の実施形態においては、上記濃度が少なくとも２０分間にわたって植物に適用され、エチレンの非存在下でシグナルタンパク質の蓄積を低減させる。別の実施形態においては、シグナルタンパク質の発現を通常は増大させるエチレンに植物細胞が曝露される場合には、誘導用組成物は少なくとも３０分間適用される。別の実施形態においては、誘導用組成物は少なくとも１時間にわたって適用される。別の実施形態においては、誘導用組成物は少なくとも２時間にわたって適用される。別の実施形態においては、誘導用組成物は少なくとも５時間にわたって適用される。別の実施形態においては、誘導用組成物は少なくとも１２時間にわたって適用される。別の実施形態においては、誘導用組成物は少なくとも１日にわたって適用される。別の実施形態においては、誘導用組成物は少なくとも２日にわたって適用される。ある実施形態においては、誘導用組成物を少なくとも２週間もしくは２週間以下にわたって適用することが必須である場合があるかまたは望ましい場合がある。ある実施形態においては、植物がエチレンの非存在下にある場合、例えば、植物がストレスを受ける前に、または植物にとってストレスのある条件を見越して、シグナルタンパク質の蓄積を抑制するように、適用のタイミングおよび濃度は当業者によって選択される。別の実施形態においては、植物がエチレンの存在下にある場合、例えば、植物がストレスを受けている間に、シグナルタンパク質の蓄積を抑制するように、適用のタイミングおよび濃度は当業者によって選択される。
【００７７】
例えば、あるプロトコルは約１０〜２４０分間で植物あたり１０μＭを超えて適用して、植物がエチレンの非存在下にある場合でのシグナルタンパク質の蓄積を低減もしくは抑制することを伴う。例えば、あるプロトコルは約５時間〜２日間で植物あたり５０μＭを超えて適用して、植物細胞内のシグナルタンパク質の発現および蓄積に対するエチレンの競合反応に打ち勝つ。例えば、以下の実施例７を参照すると、実施例７は誘導剤の濃度が植物によって示されるエチレン感受性の程度をどのように調節するかを示す。適用のタイミングによる制御に類似する方法においては、異なる成長段階での植物の要件変化に応じるもしくは環境条件の変化に応じる誘導用組成物の濃度が使用されうる。
【００７８】
すでに詳述された様々な誘導剤の組成および物理化学特性は、望まれる生物学的効果を得るのに必要な適用時間および濃度に影響を及ぼしうる。本明細書において提供された教示を考慮すると、適用の濃度、タイミングおよび期間、並びに誘導用組成物自体は経験豊かな栽培者によって過度の実験をすることなく選択されうる。
【００７９】
概して、誘導剤の適用停止とその誘導剤に対する植物の応答の反転との間の時間は、植物のサイズ、適用の方法、および適用される誘導剤の量に応じて、約２日以上である。
【００８０】
以下の実施例は、植物におけるＥＴＰ１、ＥＴＰ２の発現を増大させることおよび／またはＥＩＮ２の発現を低減させることがどのように植物をエチレンに対して低感受性にするかを詳述する。しかし、当業者は、同様の方法で、植物における他の調節タンパク質、例えば、ＥＢＦ１、ＥＢＦ２の発現を増大させることおよび／または他のエチレン誘導シグナルタンパク質、例えば、ＥＩＮ３の発現を低減させることが植物をエチレンに対して低感受性にすることを容易に認識するであろう。植物から誘導剤を奪うことによって選択された時間の後で、エチレンに対する植物細胞の応答は逆にさせられ、この場合は増大する。このことは、通常誘導剤が除去された後で、植物が正常に発生し、成長し、および熟成し続けることを可能にする。
【００８１】
本明細書において記載される遺伝子発現システムで安定的に形質転換された植物への誘導剤の適用は、エチレンに対して感受性の植物成長、例えば、老化、果実熟成、発芽、病原体耐性、落葉、落花、つぼみの落下、丸莢（ｂｏｌｌ）の落下、果実の落下、および開花、並びに干ばつ、高温、植物密度および塩分などの条件により引き起こされるようなストレスに対する植物の応答などの一以上の特徴の制御を可能にする。
【００８２】
本明細書に記載される方法は、より具体的には、植物のエチレン非感受性を増大させることによって、病気に対する植物の抵抗性および／または耐性を増大させるための方法としても使用されうる。あるいは、本方法は、植物のエチレン非感受性を増大させることによって、例えば、貯蔵もしくは輸送の目的のために、植物、組織もしくは器官の成熟もしくは開花を遅らせるために適用されうる。さらに別の実施形態においては、本明細書に記載される、誘導用組成物の好適な時点での適用で形質転換された植物を使用する方法は、誘導用組成物を適用することによって、望まれない成長条件下、例えば、干ばつもしくは過剰な高温下にある植物の処理によって、エチレンに対する感受性を低減させ、かつ植物をより容易に環境条件に耐性にすることを可能にする。植物繁殖および成長の分野の当業者は、形質転換された植物および上記核酸配列の発現の誘導方法が本明細書の教示に基づいた利益をもたらすであろう事例を容易に選択できる。
【００８３】
よって、本明細書に記載される方法を使用する、誘導剤の適用のタイミング、期間または濃度は、植物の成長中に変更されることができ、かなりの精度でエチレン感受性およびこれによる植物の生長特性を制御できる。
【００８４】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、構成的Ｇ１０−９０プロモーターの制御下にあってかつこれと動作可能に関連している、（ａ）５コピーのＧＡＬ４応答エレメントを含む応答エレメントを認識するＧＡＬ４  ＤＢＤ；（ｂ）ドメインＤ、ＥおよびＦを含むエクジソン受容体ＬＢＤ；並びに（ｃ）誘導用組成物の存在下で活性化されるＶＰ１６ＡＤを含む活性化カセットを含む上記遺伝子発現システムの使用を示す。標的カセットは誘導性プロモーターを含み、この誘導性プロモーターは、ＶＰ１６ＡＤの活性化に対して応答性の最小３５プロモーターの上流に配置された５コピーのＧＡＬ４応答エレメントを動作可能に関連するように含み、この誘導性プロモーターは（ｅ）ＥＴＰ１タンパク質をコードする核酸配列の発現を制御する。この実施形態によると、活性化カセットおよび標的カセットの構成要素は、植物細胞内にある場合、植物細胞内でＥＴＰ１タンパク質の発現を調節し、エチレン感受性を選択的に低減させる。このタンパク質発現は誘導用組成物との相互作用によって制御され、誘導用組成物は選択された調節タンパク質の発現を増大させ、これはひいてはＥＩＮ２の発現を低減させ、植物細胞におけるエチレン感受性を低減させる。タンパク質発現中のこの調節は誘導用組成物の適用のタイミング、濃度および期間によって制御される。
【００８５】
より詳細には、例示される遺伝子発現システムは単一のプラスミドｐ２０１上に存在する活性化カセットおよび標的カセットを含む。このプラスミドは図１に概略的に示される。さらに他の典型的なプラスミドｐ２０２が図２に示される。図１および２のそれぞれのプラスミドの遺伝子発現カセット構成要素の核酸配列はそれぞれ配列番号１および２としてさらに特定される。実施例において論じられる他のプラスミドｐ１００４およびｐ１００５の遺伝子発現カセット構成要素のヌクレオチド配列は図３Ａ〜３Ｉおよび４Ａ〜４Ｉ、並びに配列番号３および４に開示される。
【００８６】
次の実施例は上記組成物および方法の特定の実施形態を示す。これらの実施例は特許請求の範囲および明細書の開示を限定するものではない。
【００８７】
実施例１：プラスミド
個々にクローニングされる遺伝子カセット構成要素は活性化カセットのために以下のものを含む：
Ｇ１０−９０構成的プロモーター、
ＶＰ１６活性化ドメイン、
ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン、および
ＮＯＳターミネーター配列と関連するエクジソン受容体リガンド結合ドメイン。  同様に、標的カセット構成要素が個々にクローニングされ、標的カセット構成要素は以下のものを含む：
５コピーのＧＡＬ４応答エレメントおよび最小３５Ｓプロモーターからなる誘導性プロモーター、並びに
ＥＴＰ１遺伝子（ＧＥＮＢＡＮＫ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ  １１２８７４）またはＥＴＰ２遺伝子（ＧＥＮＢＡＮＫ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ  １１２７７７）および
３５Ｓターミネーター配列。
全ての個々の配列は以下に記載される配列番号１におけるヌクレオチド番号によって特定される。
【００８８】
活性化カセットの組み立てにおいて、次の構成要素は２つの異なる順に結合されて、２種の異なる活性化カセットを作成する：
ＶＰ１６ＡＤ→ＧＡＬ４  ＬＢＤ→ＥｃＲ（ＤＥＦ）のＤＢＤ（ＶＧＥと略する）；および
ＧＡＬ４  ＬＢＤ→ＶＰ１６ＡＤ→ＥｃＲ（ＤＥＦ）のＤＢＤ（ＧＶＥと略する）。
【００８９】
以下のプラスミドは上記構成要素について、ＥｃＲ  ＬＢＤ、ＶＧＥもしくはＧＶＥとしての構成要素の順序、標的カセットの誘導性プロモーターの影響下にある遺伝子の選択、並びにプラスミド骨格をはじめとする具体的な選択肢を有するが、このような構成要素の全ては当業者によって選択されることができ、かつこのプラスミドは過度の実験をすることなく容易に操作されうることが理解されるべきである。以下の具体的なプラスミドは例示のためだけである。
【００９０】
以下、プラスミドＤＮＡはｐブルースクリプトＩＩＳＫ−骨格（ストラタジーン）内で造られる。ＳＫ−複数クローニングサイト領域は、８ｂｐ切断酵素のための認識部位を含む新たな複数クローニングサイトで置き換えられる。これらの酵素切断部位のいくつかは図１、２、３Ａ〜３Ｉおよび４Ａ〜４Ｉの例示プラスミドにおいて特定される。
ヌクレオチド配列を確認するために、例となる大腸菌プラスミドが準備され、配列決定される。このようなプラスミドは、図１、２、３Ａ〜３Ｉおよび４Ａ〜４Ｉに示されるような各構成要素の付加／欠失／交換のための独自の酵素切断部位を含んでいる。よって、それぞれの全構築物は、植物形質転換のためのバイナリーベクターをはじめとする最適な他のベクターに移されうる。
ＳＫ−マイナスプラスミドにおいて作成された構築物はバイナリープラスミドｐＢＩＮ１９（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号３７３２７）に移される。ｐＢＩＮ１９はすでにネオマイシン植物選択可能マーカー遺伝子、ＬＢ、ＲＢおよびｎｐｔＩＩ選択可能マーカーを有しているので、図および／または配列表は骨格配列を示しておらず、目的の遺伝子発現配列のみを示し、すなわち、遺伝子発現システムの主要構成要素、例えば、Ｅｃ受容体および誘導性ＥＴＰ１もしくはＥＴＰ２は左側境界と右側境界との間にクローニングされる。
【００９１】
トランスジェニック植物の生産における使用のために、次のアグロバクテリウムバイナリープラスミドが選択される：
Ｇ１０−９０プロモーター駆動ＶＧＥ受容体および誘導性ＥＴＰ１を含むトランスジェニック植物を得るためにｐ２０１［Ｇ１０−９０ｐ−ＶＧＥ−ＮｏｓＴ−５ｘＧＡＬ−Ｍ３５Ｓ−ＥＴＰ１］が使用される。ｐ２０１の発現カセット構成要素は配列番号１に示されており、すなわち、Ｇ１０−９０構成的プロモーター（配列番号１のヌクレオチド１〜２４３）、ＶＰ１６活性化ドメイン（配列番号１のヌクレオチド２４９〜５２９）、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号１のヌクレオチド５３４〜９８５）、およびＮＯＳターミネーター配列（配列番号１のヌクレオチド２０７０〜２３６４）と関連しているエクジソン受容体リガンド結合ドメイン（配列番号１のヌクレオチド９９０〜１９９７）、５コピーのＧＡＬ４応答エレメント（配列番号１のヌクレオチド２３９１〜２４９２）および最小３５Ｓプロモーター（配列番号１のヌクレオチド２４９９〜２５５４）からなる誘導性プロモーター、ＥＴＰ１遺伝子（配列番号１のヌクレオチド２５５７〜３８０４）、並びに３５Ｓターミネーター配列（配列番号１の３８２８〜４０３８）。
【００９２】
ｐ２０１［Ｇ１０−９０ｐ−ＧＶＥ−ＮｏｓＴ−５ｘＧＡＬ−Ｍ３５Ｓ−ＥＴＰ２］は、Ｇ１０−９０プロモーター駆動ＶＧＥ受容体および誘導性ＥＴＰ２を含むトランスジェニック植物を得るために使用されるプラスミドである。図２および配列番号２を参照。ｐ２０２の発現カセット構成要素は、Ｇ１０−９０構成的プロモーター（配列番号２のヌクレオチド１〜２４３）、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号２のヌクレオチド２７６〜７１６）、ＶＰ１６活性化ドメイン（配列番号２のヌクレオチド７１７〜９７４）、およびＮＯＳターミネーター配列（配列番号２のヌクレオチド２０６４〜２３５８）と関連している上記Ｔ５２Ｖ変異型エクジソン受容体リガンド結合ドメイン（配列番号２のヌクレオチド９８４〜１９９１）、５コピーのＧＡＬ４応答エレメント（配列番号２のヌクレオチド２３８５〜２４８６）および最小３５Ｓプロモーター（配列番号２のヌクレオチド２４９３〜２５４８）からなる誘導性プロモーター、ＥＴＰ２遺伝子（配列番号２のヌクレオチド２５５１〜３７１７）、並びに３５Ｓターミネーター配列（配列番号２の３７４１〜３９５１）。
【００９３】
ｐ１００４［Ｇ１０−９０ｐ−ＶＧＥ−ＮｏｓＴ−５ｘＧＡＬ−Ｍ３５Ｓ−ＥＴＰ１、およびＭＭＶｐ−ｄｅｆ−ｒｂｃＳ−Ｅ９ｔ］およびその構成要素は配列番号３に示され、構成要素のマップおよび配列は図３Ａ〜３Ｉに示される。これらの構成要素は、Ｇ１０−９０構成的プロモーター（配列番号３のヌクレオチド１〜２４３）、ＶＰ１６活性化ドメイン（配列番号３のヌクレオチド２４９〜５２９）、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号３のヌクレオチド５３４〜９８５）、およびＮＯＳターミネーター配列（配列番号３のヌクレオチド２０７０〜２３６４）と関連しているエクジソン受容体リガンド結合ドメイン（配列番号３のヌクレオチド９９０〜１９９７）、５コピーのＧＡＬ４応答エレメント（配列番号３のヌクレオチド２３９１〜２４９２）および最小３５Ｓプロモーター（配列番号３のヌクレオチド２４９９〜２５５４）からなる誘導性プロモーター、ＥＴＰ１遺伝子（配列番号３のヌクレオチド２５５７〜３８０４）、３５Ｓターミネーター配列（配列番号３のヌクレオチド３８２８〜４０３８）、ＭＭＶプロモーター（配列番号３のヌクレオチド６２６５〜５６２９）、Ｐ−ＤＥＦマーカー遺伝子（配列番号３のヌクレオチド５５６７〜４７４６）、並びにｒｂｃＳ−Ｅ９ターミネーター（配列番号３のヌクレオチド４７１９〜４０７５）である。
【００９４】
ｐ１００５［Ｇ１０−９０ｐ−ＧＶＥ−ＮｏｓＴ−５ｘＧＡＬ−Ｍ３５Ｓ−ＥＴＰ２およびＭＭＶｐ−ｄｅｆ−ｒｂｃＳ−Ｅ９ｔ］およびその構成要素は配列番号４に示され、構成要素のマップおよび配列は図４Ａ〜４Ｉに示される。これらの構成要素は、Ｇ１０−９０構成的プロモーター（配列番号４のヌクレオチド１〜２４３）、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４のヌクレオチド２７６〜７１６）、ＶＰ１６活性化ドメイン（配列番号４のヌクレオチド７１７〜９７４）、およびＮＯＳターミネーター配列（配列番号４のヌクレオチド２０６４〜２３５８）と関連している上述のエクジソン受容体リガンド結合ドメイン（配列番号４のヌクレオチド９８４〜１９９１）、５コピーのＧＡＬ４応答エレメント（配列番号４のヌクレオチド２３８５〜２４８６）および最小３５Ｓプロモーター（配列番号４のヌクレオチド２４９３〜２５４８）からなる誘導性プロモーター、ＥＴＰ２遺伝子（配列番号４のヌクレオチド２５５１〜３７１７）、３５Ｓターミネーター配列（配列番号４のヌクレオチド３７４１〜３９５１）、ＭＭＶプロモーター（配列番号４のヌクレオチド６１７８〜５５４２）、Ｐ−ＤＥＦマーカー遺伝子（配列番号４のヌクレオチド５４８３〜４６６２）、並びにｒｂｃＳ−Ｅ９ターミネーター（配列番号４のヌクレオチド４６３２〜３９８８）である。
【００９５】
実施例２：トランスジェニックシロイヌナズナ植物の生産
シロイヌナズナ植物は実施例１からのプラスミドで、アグロバクテリウムを用い、標準的なフローラルディッププロトコールを用いて形質転換される。種子が収穫されカナマイシン含有培地上に蒔かれる。形質転換植物はカナマイシン上で成長する能力について選択され、ＥＴＰ１またはＥＴＰ２遺伝子の存在を確認するためにＰＣＲでスクリーニングされた。ポジティブ形質転換体は自家受粉させてＴ１種子を生じさせる。種子はカナマイシン含有培地上で成長させられ、導入遺伝子のホモ接合型の系統を特定する。エチレン非感受性の誘導について試験するためにホモ接合型の植物が使用される。
【００９６】
実施例３：シロイヌナズナ植物成長に及ぼすエチレン感受性の調節の影響
実施例２の形質転換されたシロイヌナズナ植物におけるエチレン感受性の変調を決定するためにトリプル応答アッセイ（上述のＧｕｚｍａｎおよびＥｃｋｅｒ、１９９０、後述のように改変される）が使用される。野生型、ｅｉｎ２−５（エチレン非感受性変異型対照）並びにｐ１００４もしくはｐ１００５シロイヌナズナ形質転換体の苗がアッセイされる。シロイヌナズナ種子は表面が滅菌され、暗所で、４日間、４℃で、２０μＭの誘導剤中で水分を吸収させられた。この種子は１％スクロースおよび２０μＭの誘導剤を含み、２０μＭのＡＣＣ（エチレンの前駆体）を含むか、含まない０．５×ＭＳ上に蒔かれ、そして２１℃で４から８日間暗所で成長させられた。いくつかの実験においては、対照として、５μＭのＡｇＮＯ３（エチレン非感受性を誘導するエチレンの阻害剤）が培地に添加される。エチレンに対する応答は最終日にスコア化される。誘導剤の存在下で、ＥＴＰ１もしくはＥＴＰ２の発現のための活性化カセットおよび標的カセットを含むトランスジェニック植物は、エチレン前駆体ＡＣＣの存在下で成長した非誘導のトランスジェニック植物と比較して増大した芽の長さおよび／または変化した根の成長に基づくエチレン非感受性を示す。この実施例の結果は、遺伝子発現システムおよびそれにより形質転換される植物は、選択された誘導用組成物で処理される場合に、その誘導用組成物に応答する遺伝子発現システムが成功裏にエチレン感受性の調節を可能にすること示すであろうことが予想される。誘導剤の存在下でのＥＴＰ１もしくはＥＴＰ２の発現のための活性化カセットおよび標的カセットを含むトランスジェニック植物は、同じ状況下での非誘導トランスジェニック植物と比較して増大した根の長さに基づいて、エチレン非感受性を示すことが予想される。
【００９７】
実施例４：トランスジェニックトマト植物の生産、および植物成長に及ぼすエチレン感受性の調節の影響
実施例１からのプラスミドを用いて、アグロバクテリウムによって、標準的な方法を用いてトマト子葉片が形質転換される。想定される形質転換体はカナマイシンまたはアクチノニンを用いて選択され、ＰＣＲ分析によって確認される。ポジティブ形質転換体は２回自家受粉されて、導入遺伝子についてホモ接合型の系統を得る。実施例３の方法と類似の方法でエチレン感受性の誘導について試験するためにホモ接合型植物が使用される。
形質転換トマト植物におけるエチレン感受性の変調を決定するためにトリプル応答アッセイ（上述のＧｕｚｍａｎおよびＥｃｋｅｒ、１９９０、後述のように改変される）が使用される。独立してｐ１００４またはｐ１００５ホモ接合体系統からの種子は暗所で、２０μＭのＡＣＣを含む０．５×ＭＳ培地＋１％スクロース上で発芽させられる。ＡＣＣ上での発芽はトマト苗の成長を阻害する。同じ系統からの種子は２０μＭのＡＣＣプラス２０μＭの誘導剤の存在下で発芽させられる。苗は２１℃で４から８日間暗所で成長させられる。エチレンに対する応答は最終日にスコア化される。
誘導剤の存在下で、ＥＴＰ１もしくはＥＴＰ２の発現のための活性化カセットおよび標的カセットを含むトランスジェニック植物は、エチレン前駆体ＡＣＣの存在下で成長する非誘導のトランスジェニック植物と比較して増大した芽の長さおよび／または変化した根の成長に基づくエチレン非感受性を示す。この実施例は、遺伝子発現システムおよびそれにより形質転換される植物は、選択される誘導用組成物で処理される場合に、その誘導用組成物に応答する遺伝子発現システムが成功裏にエチレン感受性の調節を可能にすることをさらに示す。
【００９８】
実施例５：トランスジェニックトウモロコシ植物の生産およびトウモロコシ植物成長に及ぼすエチレン感受性の調節の影響
トウモロコシ植物は実施例１のプラスミドを用いて、微粒子衝突（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）によって形質転換される。想定される形質転換体はアクチノニンまたはビアラホスを用いて選択され、ＰＣＲ分析によって確認される。ポジティブ形質転換体は近交系Ｂ７３と戻し交配されて活力を増大させる。上述のように生産されるトランスジェニックトウモロコシ植物はエチレン感受性の変調について試験される。エチレン感受性の変調は植物をエチレンの前駆体であるＡＣＣに曝露し、エチレンで誘導される遺伝子の誘導の変化を測定することにより分子レベルで決定される。温室で成長中のトランスジェニックＴ０トウモロコシ植物から茎の外皮（ｓｔａｌｋ  ｓｈｅａｔｈ）組織が摘出され、インビトロバイオアッセイにおいて使用される。ＥＴＰ１もしくはＥＴＰ２の発現を誘導するために、摘出された組織は水または２０μＭ誘導剤で２日間処理される。２日間の誘導期間の後で、この組織は１日間、０、１または１０μＭのＡＣＣで処理されてエチレンを生じさせ、次いでＲＮＡを調製するために収穫され、使用される。
エチレン誘導性遺伝子（ＡＣＣオキシダーゼ）の誘導はアプライドバイオシステムズ７９００ＨＦファーストリアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ）で定量的ＰＣＲを用いて測定され、逆転写酵素（ＲＴ）についてはＴａｑＭａｎアッセイキット（ＡＢＩ）が使用され、ＰＣＲは製造者の推奨するプロトコールを使用する。内部対照としてトウモロコシ１８ｓを使用して各サンプルについての発現を正規化する。
【００９９】
プライマーおよびプローブの配列は次の通りである：
【表１】
2012519486.tif 000002
【０１００】
遺伝子発現を決定するために、０μＭの誘導剤プラス０μＭのＡＣＣ対照の処理におけるＡＣＣオキシダーゼ発現が各トウモロコシ系統について正規化される。
【０１０１】
誘導用化合物の存在下でＥＴＰ１もしくはＥＴＰ２の発現のための活性化カセットおよび標的カセットを含むトランスジェニック植物は、ＡＣＣオキシダーゼの低減された発現に基づいてエチレン非感受性を示す。同様のアプローチを用いて、当業者はＥＩＮ２もしくはＥＩＮ３をコードするエチレン誘導性遺伝子の誘導の低減を測定することもできる。
【０１０２】
実施例６：エチレン非感受性に及ぼすＡＣＣ濃度の影響
一つのｐ１００４系統または一つのｐ１００５系統からのホモ接合型種子が、２０μＭの誘導剤と５μＭのＡｇＮＯ３または様々な量（すなわち、１．０〜２０μＭ）のエチレン前駆体であるＡＣＣとを含む培地上で４日間発芽させられ次いで成長させられる。暗所で１０日間の成長の後で胚軸および根の長さが測定される。エチレンはＥＩＮ２を誘導する一方で、ＥＴＰ１およびＥＴＰ２の誘導はターンオーバーのためのＥＩＮ２タンパク質を標的とするので、胚軸および根のわずかに少ない伸長によって認められるように、より高いＡＣＣ濃度で達成される非感受性のレベルの幾分かの低減があり得ることが予想される。この例は、ＥＴＰ１もしくはＥＴＰ２の誘導はエチレン非感受性を誘導することができ、植物の非感受性のレベルはＥＴＰ１もしくはＥＴＰ２の誘導のレベルによって調節されうることを示す。
【０１０３】
実施例７：誘導剤濃度の関数としての植物におけるエチレン非感受性の程度
一つのｐ１００４含有系統または一つのｐ１００５含有系統からのホモ接合型種子が２０μＭのＡＣＣおよび様々な量（すなわち、０．５〜２０μＭ）の誘導剤を含む培地上で発芽させられる。暗所で１０日間の成長の後で胚軸および根の長さが測定される。エチレンはＥＩＮ２を誘導する一方で、ＥＴＰ１およびＥＴＰ２の誘導はターンオーバーのためのＥＩＮ２タンパク質を標的とするので、胚軸および根のわずかに少ない伸長によって認められるように、より低い誘導剤濃度で達成されるエチレン非感受性のレベルの幾分かの低減があり得ることが予想される。この例は、ＥＴＰ１もしくはＥＴＰ２の誘導はエチレン非感受性を誘導することができ、植物の非感受性のレベルはＥＴＰ１もしくはＥＴＰ２の誘導のレベルを調節することによって変調されうることを示す。
【０１０４】
実施例８：植物におけるエチレン非感受性の一時的な誘導
誘導されたエチレン非感受性植物が、誘導剤がもはや提供されない場合にエチレン感受性に戻ることを示すために、ｐ１００４系統またはｐ１００５系統の１つからのホモ接合型種子が、２０μＭのＡＣＣおよび１０〜２０μＭの誘導剤を含む培地上で、２、４、６、８または１４日間発芽させられる。暗所で１４日間成長させた後、エチレン非感受性を評価するために胚軸および根が測定される。ＡＣＣの存在下で、エチレン非感受性苗木はより長い胚軸および根を有することが期待される。誘導剤の非存在下においては、その苗木はエチレンに対して感受性になり、暗所における矮小の成長を示すことが予想される。よって、戻された苗木の根および胚軸の成長は感受性の苗木および非感受性の苗木の中間であろう。誘導された苗木から誘導剤が除かれると、その苗木は非誘導の対照の苗木と比較してエチレン感受性の状態に戻ることが予想される。上記実施例はＥＴＰ１もしくはＥＴＰ２のヌクレオチド配列の使用を示すが、本明細書は同様の方法で他の調節遺伝子、例えば、ＥＢＦ１およびＥＢＦ２の発現を調節する能力を当業者にあきらかに提供する。エチレンシグナル伝達経路タンパク質ＥＩＮ３は、同様にエチレンによって誘導され、そしてＥＢＦ１およびＥＢＦ２によるターンオーバーの標的とされる。よって、本明細書に記載される方法および組成物の使用によるＥＢＦ１およびＥＢＦ２の誘導および調節は、非常に選択的でかつ一時的なエチレン非感受性の状態をもたらすであろうし、そのエチレン非感受性は誘導剤の除去によってエチレン感受性に戻ることができる。
【０１０５】
上述の実施形態の多くの修飾および変更が本明細書に含まれ、かつ当業者に自明であると考えられる。本明細書に記載される組成物および方法に対するこのような修飾および変更は添付の特許請求の範囲に包含されると考えられる。
【０１０６】
上に示され、参照される特許、特許出願および公報、並びに非特許文献をはじめとする全ての文献、並びに、添付の図面および／または配列表は、本明細書の明示的な教示と整合する限りは、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。しかし、本明細書におけるあらゆる参考文献の引用は、そのような参考文献が本出願に対する「先行技術」として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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