(57)【要約】本発明は、患者において神経精神障害もしくは行動障害の原因としてＧＡＳ感染を同定する方法、またはＧＡＳ感染により引き起こされる神経精神障害もしくは行動障害を発症する危険がある患者を同定する方法を提供する。本発明はまた、関連するタンパク質アレイも提供する。上記方法は、ａ）神経精神障害または行動障害を患う患者、またはこれらの危険がある患者に由来する生物学的試料を、該生物学的試料中に存在する任意の抗体が、ＧＡＳ抗原に結合するのに適切な条件下において、該ＧＡＳ抗原と接触させるステップと、ｂ）該ＧＡＳ抗原に結合した、該生物学的試料中における任意の抗体の存在を検出するステップとを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において神経精神障害もしくは行動障害の原因としてＧＡＳ感染を同定する方法、またはＧＡＳ感染により引き起こされる神経精神障害もしくは行動障害を発症する危険がある患者を同定する方法であって、
ａ）神経精神障害または行動障害を患う患者に由来する生物学的試料を、前記生物学的試料中に存在する任意の抗体が、配列番号４１、配列番号４５、配列番号２３、配列番号１９、もしくは配列番号４４のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物に結合するのに適切な条件下において、前記少なくとも１つのＧＡＳ抗原または前記その機能的同等物と接触させるステップと；
ｂ）前記少なくとも１つのＧＡＳ抗原または前記その機能的同等物に結合した、前記生物学的試料中の任意の抗体の存在を検出するステップと
を含み、
前記ＧＡＳ抗原のうちの少なくとも１つに対する抗体の検出は、前記患者が、ＧＡＳ感染により引き起こされる神経精神障害もしくは行動障害を患うこと、または前記患者が、ＧＡＳ感染により引き起こされる神経精神障害もしくは行動障害を発症する危険があることを示す、方法。
【請求項２】
前記神経精神障害または行動障害が、チック障害である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップａ）が、前記試料を、配列番号４１、配列番号４５、配列番号２３、配列番号１９、もしくは配列番号４４のアミノ酸配列を含む前記ＧＡＳ抗原のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、またはその機能的同等物と接触させるステップを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料を、前記生物学的試料中に存在する任意の抗体が、配列番号３１、２、１７、３、１６、４７、１８、５、２７、２１、２９、５、２５、３５、９、８、１３、２８、３３、３０、４８において列挙されるアミノ酸配列を含む群から選択される１もしくは複数のさらなるＧＡＳ抗原に結合するのに適切な条件下において、前記１もしくは複数のＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物と接触させるステップと、前記１もしくは複数のさらなるＧＡＳ抗原に結合した、前記生物学的試料中の抗体の存在を検出するステップとをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記試料を、前記生物学的試料中に存在する任意の抗体が、配列番号６、５３、３７、５１、２４、４６、２６、２０、４９、４、３２、４２、５０、３９、５２、１０、４０、３８、１、３４、１４、３６、２２、１２、４３において列挙されるアミノ酸配列を含む群から選択される１もしくは複数のさらなるＧＡＳ抗原に結合するのに適切な条件下において、前記１もしくは複数のＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物と接触させるステップと、前記１もしくは複数のさらなるＧＡＳ抗原に結合した、前記生物学的試料中の抗体の存在を検出するステップとをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的試料が、唾液試料、血液試料、または血清試料である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的試料が、血清試料である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的試料が、青年に由来するか、または小児に由来する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的試料が、咽頭炎の臨床症状を示す患者に由来する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＧＡＳ抗原が、１または複数のタンパク質アレイ上に提示される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号４１、配列番号４５、配列番号２３、配列番号１９、もしくは配列番号４４から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも２つのＧＡＳ抗原、またはこれらの機能的同等物を含む、タンパク質アレイ。
【請求項１２】
配列番号３１、２、１７、３、１６、４７、１８、５、２７、２１、２９、５、２５、３５、９、８、１３、２８、３３、３０、４８において列挙されるアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのさらなるＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物を含む、請求項１１に記載のアレイ。
【請求項１３】
配列番号６、５３、３７、５１、２４、４６、２６、２０、４９、４、３２、４２、５０、３９、５０、１０、４０、３８、１、３４、１４、３６、２２、１２、４３において列挙されるアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのさらなるＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物を含む、請求項１０または１１に記載のアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属；ＧＡＳ）感染と関連する神経精神障害および行動障害を有する患者を同定する分野、およびＧＡＳ感染と関連する神経精神障害および行動障害を発症する危険がある患者を同定する分野にある。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
ＧＡＳとは、上気道および皮膚のレベルで最も頻繁に生じる多種多様な感染症の一因となり、咽頭炎、膿痂疹、および蜂巣炎など、軽度の疾患を引き起こす、一般的なヒト病原体である。ＧＡＳ感染が、菌血症、肺炎、壊疽性筋膜炎（ＮＦ）、および連鎖球菌毒素性ショック症候群（ＳＴＳＳ）など、生命を脅かす侵襲性状態を結果としてもたらすことはあまりない［１（非特許文献１）］。加えて、Ａ群連鎖球菌はまた、宿主組織と、主要なＧＡＳ表面会合抗原であるＭタンパク質との間の「分子的模倣性」に起因する自己免疫反応と関連すると考えられる、急性リウマチ熱および連鎖球菌感染後糸球体腎炎など、感染症の非化膿性続発症ももたらす。実際、抗Ｍ特異的抗体は、心臓、骨格筋、脳、および糸球体基底膜を含めたヒト組織と交差反応することが示されている［２（非特許文献２）］。
【０００３】
ＧＡＳ感染に続発する感染後障害、とりわけ、リウマチ熱は、運動障害（主に、舞踏病およびチック）、ならびに行動障害（主に、強迫性症状、不安症候群、および気分障害）の随伴を特徴とする広範な神経精神病像を示しうる［３（非特許文献３）］。連鎖球菌感染後における神経精神障害の疾病論は、いまだ発展途上である。しかし、２つの実体：急性リウマチ熱を診断するための主要な基準のうちの１つを構成するシドナム舞踏病（ＳＣ）［４（非特許文献４）］、ならびに連鎖球菌感染後における急性播種性脳脊髄炎（ＰＳＡＤＥＭ）［５（非特許文献５）］が、一般的に認められている。
【０００４】
最近の１５年間においては、これらの障害の臨床スペクトルが、より広範でありうることが示唆されている。特に、１９９８年において、Ｓｗｅｄｏらは、連鎖球菌性咽頭炎の再発に随伴して悪化するチックおよび強迫性症状を主な特徴とする小児障害の存在を提起した［６（非特許文献６）］。Ｓｗｅｄｏらは、ＰＡＮＤＡＳ（Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属感染に随伴する小児自己免疫性神経精神障害））という頭字語でこの表現型を示した。しかし、この仮説は、大きな反論を巻き起こしており、重要な論点の１つは、神経精神症状と、ＧＡＳ感染との間の時間的関係を裏付けることの困難により代表されている（［７（非特許文献７）］、［８（非特許文献８）］、［９（非特許文献９）］）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＭＷ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．（２０００）１３，４７０−５１１
【非特許文献２】Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＭＷ，  Ａｄｖ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．，（２００８）６０９：２９−４２
【非特許文献３】Ｍａｒｔｉｎｏ  Ｄ，  Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ  Ｇ，  Ａｄｖ．  Ｎｅｕｒｏｌ．，（２００５）９６：３２０−３３５
【非特許文献４】Ｗｅｉｎｅｒ  ＳＧ，  Ｎｏｒｍａｄｉｎ  ＰＡ，  Ｐｅｄｉａｔｒ．  Ｅｍｅｒｇ．  Ｃａｒｅ，（２００７）２３：２０−２４
【非特許文献５】Ｄａｌｅ  ＲＣ，  Ｃｈｒｕｃｈ  ＡＪ，  Ｃａｒｄｏｓｏ  Ｆ，  Ｇｏｄｄａｒｄ  Ｅ，  Ｃｏｘ  ＴＣ，  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，（２００１）４０：５８８−５９５
【非特許文献６】Ｓｗｅｄｏ  ＳＥ，  Ｌｅｏｎａｒｄ  ＨＬ，  Ｇａｒｖｅｙ  Ｍ，  Ｍｉｔｔｅｌｍａｎ  Ｂ，  Ａｌｌｅｎ  ＡＪ，  ｅｔ  ａｌ，  Ａｍ  Ｊ．  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ（１９９８）１５５，２６４−２７１
【非特許文献７】Ｌｕｏ  Ｆ，  Ｌｅｃｋｍａｎ  ＪＦ，  Ｋａｔｓｏｖｉｃｈ  Ｌ，  Ｆｉｎｄｌｅｙ  Ｄ，  Ｇｒａｎｔｚ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（２００４）１１３，ｅ５７８−５８５
【非特許文献８】Ｍｕｒｐｈｙ  ＭＬ  ＆  Ｐｉｃｈｉｃｈｅｒｏ  ＭＥ  Ａｒｃｈ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ａｄｏｌｅｓｃ  Ｍｅｄ（２００２）１５６，３５６−３６１
【非特許文献９】Ｋｕｒｌａｎ  Ｒ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｄ，  Ｋａｐｌａｎ  ＥＬ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（２００８）１２１：１１８８−１１９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、ＧＡＳ感染は、血液寒天上において咽頭スワブを培養すること、血清中における抗ストレプトリシンＯ抗体力価（ＡＳＯ力価）を決定することにより診断されている。ストレプトリシンＯとは、免疫反応を誘導する、ＧＡＳにより放出される毒素であり、したがって、このタンパク質に対する抗体の検出を用いることにより、最近の感染を確認することができる。しかし、現在のところ、ＧＡＳ感染に続発する障害を有するか、またはこれを発症する危険がある個体を同定するのに利用可能なアッセイは見られない。特に、ＧＡＳ感染と神経精神障害または行動障害との間に確固とした連関が見られない場合、ＧＡＳ感染の結果としての神経精神障害もしくは行動障害を有するか、またはこれを発症する危険がある個体を同定するのに用いることができるアッセイはない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の開示）
本発明は、ＧＡＳ感染の結果として生じる神経精神障害または行動障害、特に、チック障害を有するか、またはこれを発症する危険がある個体を同定する方法に関する。本発明はまた、このような方法において用い得るタンパク質アレイにも関する。
【０００８】
本発明は、ＧＡＳ感染に関連するものとして、患者において神経精神障害もしくは行動障害を同定する方法、またはＧＡＳ感染に関連する神経精神障害もしくは行動障害を発症する危険がある患者を同定する方法であって、
ａ）神経精神障害または行動障害を患う患者、またはこれらの危険がある患者に由来する生物学的試料を、該生物学的試料中に存在する任意の抗体が、配列番号４１、配列番号４５、配列番号２３、配列番号１９、もしくは配列番号４４のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物に結合するのに適切な条件下において、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原またはその機能的同等物と接触させるステップと；
ｂ）該少なくとも１つのＧＡＳ抗原またはその機能的同等物に結合した、該生物学的試料中における任意の抗体の存在を検出するステップと
を含み、
該ＧＡＳ抗原のうちの少なくとも１つに結合する該抗体の検出により、該患者が、ＧＡＳ感染に関連する神経精神障害もしくは行動障害を患うこと、または該患者が、ＧＡＳ感染に関連する神経精神障害もしくは行動障害を発症する危険があることが示される方法を提供する。
【０００９】
本明細書で用いられる「神経精神障害または行動障害」という用語は、舞踏病およびチックなどの運動障害、ならびに強迫性障害、不安障害、および気分障害などの行動障害を包含する。特に、本発明の方法は、ＧＡＳに関連するチック障害を患うか、またはこれを発症する危険がある患者を同定するのに有用でありうる。
【００１０】
「チック障害」という用語は、運動チックまたは発声チックを包含する。「チック障害」という用語はまた、少なくとも４週間であるが、１２カ月未満にわたり持続する、複数の運動チックおよび／または発声チックからなる、一過性チック障害；１年超にわたり存在する、単一または複数の運動チックまたは発声チックからなる、慢性チック障害；１年超にわたり運動チックおよび発声チックの両方が存在する場合に診断される、ツレット障害；ならびにチックは存在するが、任意の特定のチック障害の基準を満たさない場合に診断される、ＮＯＳ（他に分類されない）チック障害も包含する。場合によって、チック障害は、上記で論じた行動障害および神経精神障害など、他の障害とも関連しうる。
【００１１】
チック障害に罹患した患者に由来する血清試料を分析したところ、配列番号４１（ＳＰｙ０４５３）、配列番号４５（ＳＰｙ１９３９）、配列番号２３（ＳＰｙ１７９５）、配列番号１９（ＳＰｙ１０５４）、または配列番号４４（ＳＰｙ１３０６）のアミノ酸配列を有する５つのＧＡＳ抗原が、チック障害を有さない患者に由来する血清、ならびに咽頭炎を有する患者に由来する血清と比較して、顕著により高い百分率の、チック障害を患う患者に由来する血清により認識されたという驚くべき知見がもたらされた（本明細書に記載のＳＰｙ番号は、参考文献［１０］における、ＳＦ３７０  ＧＡＳゲノムについてのアノテーションに基づく）。これらの知見により、チック患者に由来する血清が、ＧＡＳに対する特異的かつ強力な免疫反応を誘発した個体に典型的な免疫学的プロファイルを示すことの最初の証拠がもたらされる。したがって、これらのＧＡＳ抗原を用いて、ＧＡＳ感染と関連するチック障害および他の神経精神障害または行動障害を同定するため、ならびにＧＡＳ感染と関連するチック障害および他の神経精神障害または行動障害を発症する危険性が大きな患者を同定するために、患者の血清中において抗体の存在を検出することができる。
【００１２】
本発明の方法は、試料を、上記で列挙したＧＡＳ抗原のうちの１つ，２つ、３つ、４つ、もしくは５つすべて、またはその機能的同等物と接触させるステップを含みうる。したがって、試料を、ＧＡＳ抗原のうちの１つと接触させる場合、該方法は、該試料を、配列番号４１、配列番号４５、配列番号２３、配列番号１９、もしくは配列番号４４、またはこれらの機能的同等物と接触させるステップを含みうる。
【００１３】
試料を、ＧＡＳ抗原のうちの２つと接触させる場合、該方法は、該試料を、ｉ）配列番号４１および配列番号４５；ｉｉ）配列番号４１および配列番号２３；ｉｉｉ）配列番号４１および配列番号１９；ｉｖ）配列番号４１および配列番号４４；ｖ）配列番号４５および配列番号２３；ｖｉ）配列番号４５および配列番号１９；ｖｉｉ）配列番号４５および配列番号４４；ｖｉｉｉ）配列番号２３および配列番号１９；ｉｘ）配列番号２３および配列番号４４；もしくはｘ）配列番号１９および配列番号４４、またはこれらの機能的同等物と接触させるステップを含みうる。
【００１４】
試料を、ＧＡＳ抗原のうちの３つと接触させる場合、該方法は、該試料を、ｉ）配列番号４１、配列番号４５、および配列番号２３；ｉｉ）配列番号４１、配列番号２３、および配列番号１９；ｉｉｉ）配列番号４１、配列番号１９、および配列番号４４；ｉｖ）配列番号４５、配列番号２３、および配列番号１９；ｖ）配列番号４５、配列番号１９、および配列番号４４；もしくはｖｉ）配列番号２３、配列番号１９、および配列番号４４、またはこれらの機能的同等物と接触させるステップを含みうる。
【００１５】
試料を、ＧＡＳ抗原のうちの４つと接触させる場合、該方法は、該試料を、ｉ）配列番号４１、配列番号４５、配列番号２３、および配列番号１９；ｉｉ）配列番号４１、配列番号２３、配列番号１９、および配列番号４４；もしくはｉｉｉ）配列番号４５、配列番号２３、配列番号１９、および配列番号４４、またはこれらの機能的同等物と接触させるステップを含みうる。
【００１６】
代替的に、試料を、ＧＡＳ抗原の５つすべて、すなわち、配列番号４１、配列番号４５、配列番号２３、配列番号１９、および配列番号４４、またはこれらの機能的同等物と接触させることもできる。
【００１７】
チック障害などの神経精神障害または行動障害を有する患者に由来する生物学的試料中において、これらのＧＡＳ抗原のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つすべて、またはその機能的同等物に結合した抗体が検出されれば、該神経精神障害または行動障害は、ＧＡＳ感染と関連することが示される。神経精神障害または行動障害を有さない患者に由来する生物学的試料中において、これらのＧＡＳ抗原のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つすべて、またはその機能的同等物に結合した抗体が検出されれば、該患者は、チック障害など、ＧＡＳ感染と関連する神経精神障害または行動障害を発症する危険性が高いことが示される。抗体の存在を検出するのに適する方法は当技術分野において公知であり、以下でより詳細に説明される。
【００１８】
本発明の方法は、試料を、配列番号４１、４５、２３、１９、または４４のＧＡＳ抗原のうちの１または複数に加えた、さらなるＧＡＳ抗原またはこれらの機能的同等物と接触させるステップと、これらのさらなるＧＡＳ抗原に結合する抗体の存在を検出するステップとをさらに含みうる。
【００１９】
このようなさらなるＧＡＳ抗原は、
【００２０】
【化１】
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において列挙されるアミノ酸配列、またはこれらの機能的同等物を含む群から選択することができる。
【００２１】
これらの２１のＧＡＳ抗原は、チック障害を患わない患者に由来する血清と比較して、チック障害を患う患者に由来する血清、ならびに咽頭炎を患う患者に由来する血清に対して選択的に反応するものとして同定されている。したがって、上記の配列番号４１、４５、２３、１９、または４４のＧＡＳ抗原のうちの１または複数に結合する抗体を検出することに加え、生物学的試料中において、これらのさらなるＧＡＳ抗原のうちの１もしくは複数、またはその機能的同等物に結合する抗体を検出することにより、チック障害などの神経精神障害もしくは行動障害が、ＧＡＳ感染と関連すること、または患者が、ＧＡＳ感染と関連するチック障害など、神経精神障害もしくは行動障害を発症する危険性が大きいことをさらに示すことができる。
【００２２】
本発明の方法は、生物学的試料を、その中に存在する任意の抗体が、配列番号３１、２、１７、３、１６、４７、１８、５、２７、２１、２９、５、２５、３５、９、８、１３、２８、３３、３０、もしくは４８のこれらのさらなるＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物に結合するのに適切な条件下において、該さらなるＧＡＳ抗原のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１すべてと接触させるステップと；このさらなるＧＡＳ抗原に結合した抗体の存在を検出するステップとを含みうる。さらなるＧＡＳ抗原はまた、
【００２３】
【化２】
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において列挙されるアミノ酸配列、またはこれらの機能的同等物を含む群からも選択することができる。
【００２４】
これらの２５のＧＡＳ抗原は、チック血清、咽頭炎血清、および非チック血清に対して同等に反応するものとして同定されている。これらの２５のＧＡＳ抗原には、現在ＧＡＳ診断において用いられているＳＬＯタンパク質が含まれる。したがって、試料中において、これらの抗原に結合する抗体が検出されること、またはこれらの抗原に結合する抗体が検出されないことを、対照の目的で用いることができる。例えば、上記で列挙した配列番号４１、４５、２３、１９、または４４のＧＡＳ抗原のうちの１または複数に結合する抗体を検出すること（ならびに、場合によって、上記で列挙した配列番号３１、２、１７、３、１６、４７、１８、５、２７、２１、２９、５、２５、３５、９、８、１３、２８、３３、３０、または４８のさらなる２１のＧＡＳ抗原のうちの１または複数に結合する抗体を検出すること）に加え、これらのさらなるＧＡＳ抗原のうちの１もしくは複数、またはその機能的同等物に結合する抗体を検出することは、患者が、ＧＡＳに感染しているかまたは感染したことの陽性対照として用いられる。上記で列挙した配列番号４１、４５、２３、１９、または４４のＧＡＳ抗原のうちの１または複数に結合する抗体が検出されることなしに、配列番号６、５３、３７、５１、２４、４６、２６、２０、４９、４、３２、４２、５０、３９、５２、１０、４０、３８、１、３４、１４、３６、２２、１２、もしくは４３のこれらのさらなる２５のＧＡＳ抗原のうちの１もしくは複数、またはこれらの機能的同等物に結合する抗体が検出されれば、ＧＡＳと関連する神経精神障害または行動障害を発症する可能性を伴うことのないＧＡＳ感染が示される。配列番号６、５３、３７、５１、２４、４６、２６、２０、４９、４、３２、４２、５０、３９、５２、１０、４０、３８、１、３４、１４、３６、２２、１２、または４３のこれらのさらなるＧＡＳ抗原のうちの１または複数に対する抗体が検出されなければ、患者がＧＡＳ感染を患っていないことが確認される。
【００２５】
したがって、本発明の方法は、生物学的試料を、その中に存在する任意の抗体が、配列番号６、５３、３７、５１、２４、４６、２６、２０、４９、４、３２、４２、５０、３９、５２、１０、４０、３８、１、３４、１４、３６、２２、１２、もしくは４３のこれらのさらなるＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物に結合するのに適切な条件下において、該さらなるＧＡＳ抗原のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５すべて、またはその機能的同等物と接触させるステップと；このさらなるＧＡＳ抗原に結合した抗体の存在を検出するステップとを含みうる。
【００２６】
（抗体の検出）
上記で説明した本発明の方法はすべて、ＧＡＳ抗原に結合した抗体の検出を含む。抗原に結合した抗体を検出する方法は、当業者に周知であり、任意のこのような方法を用いることができる。
【００２７】
例えば、１または複数のＧＡＳ抗原（または機能的同等物）を、以下で説明するアレイ表面上など、表面上における既知の位置に固定化することができる。固定化された抗原は、試料中において存在する任意の抗体が該抗原に結合することを可能とする条件下において、固定化された抗原とインキュベートすることができる。適切なインキュベーション時間は、約１時間でありうる。洗浄して、結合しなかった抗体を除去した後、結合した抗体に結合し、これらを認識する実体を用いて、抗原に結合した抗体を検出することができる。
【００２８】
例えば、上記で説明したいずれの方法においても、ＧＡＳ抗原に結合した抗体を検出するステップは、標識した抗ＩｇＧ抗体など、標識した二次抗体が、該固定化したＧＡＳ抗原に結合した、生物学的試料中における任意の抗体に結合するのに適する条件下において、生物学的試料およびＧＡＳ抗原を、該二次抗体と接触させるステップを含みうる。
【００２９】
抗ＩｇＧ抗体など、二次抗体は、その標識を検出することにより、その結合、したがって、生物学的試料中におけるＧＡＳ抗原に対する抗体の存在が検出されるように、蛍光標識または酵素標識により標識することができる。標識が蛍光標識である場合、少なくとも１５，０００の蛍光強度により、陽性の結果、すなわち、ＧＡＳ抗原に結合した抗体が試料中に存在することが示されうる。
【００３０】
（生物学的試料）
本発明の方法において調べうる生物学的試料は、ＧＡＳ抗原に対する抗体を含有することが公知である任意の試料でありうる。適切な試料の例は、唾液試料、血液試料、または血清試料である。特に、試料は、血清試料でありうる。
【００３１】
生物学的試料は、ヒト患者に由来する。ヒト患者は、成人の場合もあり、約１２〜約１８歳の青年の場合もあり、１２歳未満の小児の場合もある。患者は、神経精神障害または行動障害、特に、チック障害の臨床症状を示しうる。代替的に、または加えて、患者は、咽頭炎など、ＧＡＳ感染と関連する臨床症状を示しうる。場合によって、患者は、既存のＧＡＳ感染について無症候でありうる。
【００３２】
本発明の方法は、インビトロで実施することができる。本発明の第１および第２の態様による方法は、患者から生物学的試料を得るステップをさらに含みうる。
【００３３】
（タンパク質アレイ）
複数のＧＡＳ抗原に対する同時的な生物学的試料のスクリーニングを容易にするためには、本発明の方法において用いられるＧＡＳ抗原を、１または複数のタンパク質アレイ上に提示することができる。例えば、各ＧＡＳ抗原を個別のアレイ上に提示することもでき、単一のアレイにより、複数のＧＡＳ抗原を同時に提示することもできる。本発明のさらなる態様によれば、タンパク質アレイも提供される。これらのアレイは、上記で説明した方法のうちのいずれにおいて用いるのにも適する。
【００３４】
本発明は、配列番号４１、配列番号４５、配列番号２３、配列番号１９、もしくは配列番号４４から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも２つのＧＡＳ抗原、またはこれらの機能的同等物を含むタンパク質アレイを提供する。
【００３５】
タンパク質アレイは、これらのＧＡＳ抗原のうちの２つ、３つ、４つ、もしくは５つすべて、またはこれらの機能的同等物を含みうる。
【００３６】
アレイが、ＧＡＳ抗原のうちの２つを含む場合、該アレイは、ｉ）配列番号４１および配列番号４５；ｉｉ）配列番号４１および配列番号２３；ｉｉｉ）配列番号４１および配列番号１９；ｉｖ）配列番号４１および配列番号４４；ｖ）配列番号４５および配列番号２３；ｖｉ）配列番号４５および配列番号１９；ｖｉｉ）配列番号４５および配列番号４４；ｖｉｉｉ）配列番号２３および配列番号１９；ｉｘ）配列番号２３および配列番号４４；もしくはｘ）配列番号１９および配列番号４４の配列を有するＧＡＳ抗原、またはこれらの機能的同等物を含みうる。
【００３７】
アレイが、ＧＡＳ抗原のうちの３つを含む場合、該アレイは、ｉ）配列番号４１、配列番号４５、および配列番号２３；ｉｉ）配列番号４１、配列番号２３、および配列番号１９；ｉｉｉ）配列番号４１、配列番号１９、および配列番号４４；ｉｖ）配列番号４５、配列番号２３、および配列番号１９；ｖ）配列番号４５、配列番号１９、および配列番号４４；もしくはｖｉ）配列番号２３、配列番号１９、および配列番号４４の配列を有するＧＡＳ抗原、またはこれらの機能的同等物を含みうる。
【００３８】
アレイが、ＧＡＳ抗原のうちの４つを含む場合、該アレイは、ｉ）配列番号４１、配列番号４５、配列番号２３、および配列番号１９；ｉｉ）配列番号４１、配列番号２３、配列番号１９、および配列番号４４；もしくはｉｉｉ）配列番号４５、配列番号２３、配列番号１９、および配列番号４４の配列を有するＧＡＳ抗原、またはこれらの機能的同等物を含みうる。
【００３９】
代替的に、アレイは、ＧＡＳ抗原の５つすべて、すなわち、配列番号４１、配列番号４５、配列番号２３、配列番号１９、および配列番号４４、またはこれらの機能的同等物を含みうる。
【００４０】
タンパク質アレイは、配列番号３１、２、１７、３、１６、４７、１８、５、２７、２１、２９、５、２５、３５、９、８、１３、２８、３３、３０、４８において列挙されるアミノ酸配列を含む群から選択されうるさらなるＧＡＳ抗原、またはこれらの機能的同等物を含みうる。アレイは、これらのさらなるＧＡＳ抗原のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１すべてを含みうる。
【００４１】
タンパク質アレイは、配列番号６、５３、３７、５１、２４、４６、２６、２０、４９、４、３２、４２、５０、３９、５２、１０、４０、３８、１、３４、１４、３６、２２、１２、４３において列挙されるアミノ酸配列を含む群から選択されうるさらなるＧＡＳ抗原、またはこれらの機能的同等物を含みうる。アレイは、これらのさらなるＧＡＳ抗原のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５すべてを含みうる。
【００４２】
本発明の方法では、当技術分野において公知の任意の種類のタンパク質アレイを用いることができる。タンパク質アレイの作製については、参考文献１１、１２において説明されている。
【００４３】
例えば、タンパク質アレイは、それに１または複数の抗原が固定されるスライドガラスでありうる。その最も単純な形態において、アレイは、顕微鏡用のスライドガラスを、アミノシラン（Ａｎｓｏｒｇｅ、Ｆａｕｌｓｔｉｃｈ）によりコーティングし、抗原を含有する溶液を該スライドに添加し、乾燥させるだけで調製される、１つの抗原だけを提示するスライドガラスでありうる。抗原によりコーティングするための、アミノシランによりコーティングされたスライドは、Ｔｅｌｅｃｈｅｍ社およびＰｉｅｒｃｅ社から購入することができる。
【００４４】
代替的に、アレイは、複数の抗原を提示しうる。例えば、ニトロセルロースでコーティングしたスライドに、複数のＧＡＳ抗原をナノリットルずつスポットすることができる。このようなアレイは、各ＧＡＳ抗原を多連（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）で提示しうる。このようなアレイ内における抗原スポットは、直径が約１５０μｍであり、約０．３５ｎｇのタンパク質を含有しうる。
【００４５】
他の種類のタンパク質アレイは、３Ｄゲルパッドおよびマイクロウェルアレイを包含する。当業者には明らかである通り、いまだ構想されてはいないが、将来的に考案される種類のタンパク質アレイは、多分、本発明に従って用いるのに適することが分かるであろう。
【００４６】
本発明は、本発明によるタンパク質アレイと、ＧＡＳ感染と関連する神経精神障害もしくは行動障害を有するか、またはこれを発症する危険がある患者を同定するのに該アレイを用いるための指示書とを含むキットをさらに提供する。
【００４７】
（機能的同等物）
上記で説明した、本発明の方法およびタンパク質アレイにおいて用い得るＧＡＳ抗原を同定するのに用いられる配列番号は、これらのＧＡＳ抗原の全長配列である。
【００４８】
本発明の方法およびタンパク質アレイは、これらの全長ＧＡＳ抗原の使用に限定されるものではなく、これらのＧＡＳ抗原のうちのいずれかに対する、任意の「機能的同等物」もまた包含する。
【００４９】
本明細書で用いられる「機能的同等物」という用語は、生物学的試料中に存在する、全長ＧＡＳ抗原に対する抗体と相互作用する能力を保持し、したがって、全長ＧＡＳ抗原の代わりに用い得る、配列表に示される全長配列を有するＧＡＳ抗原の改変体を包含することを意図する。
【００５０】
したがって、「機能的同等物」という用語は、配列表に示される配列を有する全長ＧＡＳ抗原の断片を包含する。このような断片は、全長ＧＡＳ抗原に結合する抗体に結合する能力を保持しうる。本発明の機能的同等物は、全長ＧＡＳ抗原に対して生成された抗体に、少なくとも１０−７Ｍのアフィニティーで結合しうる。
【００５１】
断片は、全長ＧＡＳ抗原配列のうち少なくともｎの連続アミノ酸を包含し、ここで、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である。断片は、全長ＧＡＳ抗原配列に由来するエピトープを含みうる。さらなる断片は、全長配列のＣ末端に由来する１もしくは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上の）アミノ酸、および／または全長配列のＮ末端に由来する１もしくは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上の）アミノ酸を欠く場合がある。例えば、本発明の方法およびアレイにおいて用い得る断片には、全長ＧＡＳ抗原において存在するリーダー配列および／または膜貫通配列を欠いている断片が含まれる。リーダー配列および膜貫通配列であると考えられるＧＡＳ抗原の部分を、配列表に示す。
【００５２】
本発明の方法およびアレイにおいて用い得る断片のさらなる例には、Ｎ末端断片が含まれる。このような断片の例には、配列番号１１（これは、配列番号１０における配列のＮ末端断片である）に示すアミノ酸配列、ならびに配列番号７（これは、配列番号６のＮ末端断片である）に示すアミノ酸配列が含まれる。
【００５３】
「機能的同等物」という用語はまた、アミノ酸置換を有する全長ＧＡＳタンパク質の改変体、ならびにこのような改変体の断片も包含する。改変体は、本明細書に記載の全長ＧＡＳ抗原配列に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有しうる。改変体は、配列表で示されるＧＡＳ抗原配列と比較して保存的なアミノ酸置換を含有しうる。このような置換の典型は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの間；ＳｅｒおよびＴｈｒの間；酸性残基であるＡｓｐおよびＧｌｕの間；ＡｓｎおよびＧｌｎの間；塩基性残基であるＬｙｓおよびＡｒｇの間；または芳香環残基であるＰｈｅおよびＴｙｒの間における置換である。
【００５４】
「機能的同等物」という用語は、ＧＡＳ抗原に化学的または遺伝学的に連結されたさらなる実体を包含する融合タンパク質を含めて、ＧＡＳ抗原のより長鎖の改変体もさらに包含する。例えば、ＧＡＳ抗原を、タンパク質アレイ上においてその位置を特定することを容易にするか、またはそれが抗体に結合した場合の検出を容易にする標識に結合させることができる。このような標識の例には、放射性同位体、蛍光分子、または酵素など、分析により検出可能な試薬が含まれる。代替的に、ＧＡＳ抗原を、ヒスチジンドメインまたはＧＳＴドメインなど、その最初の精製を容易にするドメインに融合させることもできる。
【００５５】
「機能的同等物」という用語はまた、ＧＡＳ抗原と構造的に類似し、全長ＧＡＳ抗原に対する抗体に結合する能力を保持する、上記で説明したＧＡＳ抗原の模倣体、改変体、および断片も包含する。
【００５６】
（一般）
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘだけからなる場合もあり、さらなる何かを包含する場合、例えば、Ｘ＋Ｙである場合もある。
【００５７】
「実質的に」という語は、「完全に」を除外しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない場合もある。必要な場合、「実質的に」という語は、本発明の定義から省略することができる。
【００５８】
数値ｘとの関連における「約」という用語は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【００５９】
別段に言明しない限り、２つ以上の成分を混合するステップを含む過程は、特定の混合順序を要求しない。したがって、成分は、任意の順序で混合することができる。３つの成分が存在する場合は、２つの成分を互いと混合し、次いで、この混合物を、第３の成分などと混合することができる。
【００６０】
ポリペプチド配列間における同一性は、ギャップオープンペナルティー＝１２およびギャップ伸長ペナルティー＝１というパラメータを伴う、アファインギャップ検索を用いる、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）内に実装されているＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定することが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、タンパク質マイクロアレイの構成および検証を示す図である。Ａ：クーマシーにより染色された精製組換えＧＡＳタンパク質についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。分子量マーカーをレーン１に示す。Ｂ：ヒト血清と共にインキュベートし、Ｃｙ３標識抗ヒトＩｇＧおよびＣｙ５標識抗ヒトＩｇＭと共にインキュベートした後のチップについての代表的な画像である。多連にわたる試験抗原、ならびにＩｇＧおよびＩｇＭによる陰性対照および陽性対照を強調して示す。Ｃ：ヒトＩｇＧ対照曲線についてのグラフ表示である。橙色のドットが、ｘ軸上の測定された異なるＩｇＧ濃度に対応するのに対し、実線は、外挿の結果として得られる曲線に対応する。ＭＦＩ値は、ｙ軸上において報告されている。抗ヒトＩｇＧ−Ｃｙ３と共にインキュベートすることにより明らかとなる、異なるＩｇＧ濃度に対するチップ画像を、グラフの下方に示す。Ｄ：Ｓ字型曲線により導出されるデータ正規化法について示す図である。参照Ｓ字型曲線（赤色）を参照するＳ字型対照曲線（黒色）を用いて、データを正規化する。ＩｇＧ対照濃度およびＭＦＩは、それぞれ、ｘ軸上およびｙ軸上において報告される。ＨＬ：高レベルのシグナル領域（正規化ＭＦＩ値＞４０，０００）；ＬＬ：低レベルのシグナル領域（正規化ＭＦＩ値＜１５，０００）；ｉｄ：理想型のＳ字型曲線；ＰおよびＰ’：実験によるＳ字型曲線および参照Ｓ字型曲線上における非正規化ＭＦＩ値および正規化ＭＦＩ値の交点；ＶａｌおよびＮ（Ｖａｌ）：それぞれ、バックグラウンドを差し引いたＭＦＩ値、ならびに正規化後に結果として得られる正規化値。
【図２】図２は、チック血清、非チック血清、および咽頭炎血清についての分析を示す図である。Ａ：選択されたＧＡＳ抗原に対するヒトチック血清（ｎ＝６１）、ヒト非チック血清（ｎ＝３５）、およびヒト咽頭炎血清（ｎ＝２３９）についての、教師なしの階層クラスタリングを示す図である。高ＦＩのシグナルまたは低ＦＩのシグナルを結果としてもたらす抗原／血清相互作用を、それぞれ、黄色および青色で視覚化する。シグナル強度についての色スケールを、左上方に報告する。抗原および／または血清のクラスター群は、同様の反応プロファイルを示している。樹状図右側の着色バーおよびローマ数字により、分析で考察される血清クラスターが同定される。Ｂ：異なるクラスター内における血清の分布を示す図である。ヒストグラムは、各クラスについて、定義された５つのクラスターに対する陽性血清（ＦＩ＞１５０００）の百分率を示す。
【図３】図３は、血清のＥＬＩＳＡ力価とＭＦＩとの間の相関を示す図である。バーは、ｘ軸の下方に示される４つの抗原に対する、非チック患者（黒色バー）またはチック患者（白色バー）に由来する８つの血清を用いて得たＥＬＩＳＡ力価の幾何平均値（左側のｙ軸）を示す。白色バー上方の星印は、チック患者のＥＬＩＳＡ力価と、非チック患者のＥＬＩＳＡ力価との間における統計学的な有意差を示す。白丸（非チック血清）および黒三角（チック血清）は、同じ血清により、タンパク質チップ上において得られたＭＦＩの算術平均（右側のｙ軸）を示す。ＥＬＩＳＡ力価およびＭＦＩのいずれにおける差違も、スチューデントのＴ検定（ＥＬＩＳＡ）またはフィッシャーの正確検定（ＭＦＩ）により計算されたＰ値＜０．０５をもって、統計学的に有意とした。
【図４】図４は、３つの血清クラスの相対的反応性を示す図である。Ａ：各患者群の血清のうちの少なくとも３０％により認識された試験ＧＡＳ抗原の数を示す図である。Ｂ：各クラスの血清のうちの少なくとも３０％により、ＦＩ＞４０，０００で認識された抗原の百分率を示す図である。Ｃ：抗原のうちの少なくとも３０％と、ＦＩ＞４０，０００で反応する血清の百分率を、各クラスについて示す図である。ヒストグラムバー上方の数は、両側χ２検定により計算されたＰ値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
（発明を実施するための様式）
（序説）
神経精神障害または行動障害の発症にＧＡＳ感染が寄与する可能性について光を当てようと試みる中で、本発明者らは、「異なる筋肉群に関与する、唐突で、反復的で、リズム感を欠き、非随意的な運動（運動チック）または発声（発声チック）」［１３］からなる病理学的状態であるチック障害を有する一群の若年患者に注意を集中させた。これらの小児から得た血清を、代表的なＧＡＳ抗原のパネルに対するそれらの免疫学的反応性について調べた。分析は、タンパク質アレイ法［１２］を用いて実施したが、これにより、多数の抗原に対するヒト血清のハイスループット分析が可能となった。１０２のＧＡＳタンパク質を含有するタンパク質チップに対し、チック患者に由来する血清、ならびにチックを有さない小児に由来する血清をプローブとして用いた（probe）。結果として得られるデータを、ＧＡＳに関連する咽頭炎患者の血清をプローブとして用いたチップについて得られたデータと比較した。この実験法を用いることにより、本発明者らは、チック障害と、ＧＡＳ抗原に対する免疫反応との関係をより明確に定義することができた。
【００６３】
（結果）
（マイクロアレイのデザインおよび検証）
代表的なＧＡＳ抗原のパネルに対する、チック患者の血清学的反応を調べるため、ＧＡＳ  ＳＦ３７０  Ｍ１ゲノムから主に選択された１０２の組換えタンパク質（表１）をプリントすることにより、タンパク質アレイを作製した。プリントされたＧＡＳタンパク質の大半を、Ｃ末端におけるＨｉｓタグ融合体として発現させたのに対し、２３のタンパク質は、Ｎ末端においてはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と、かつ、Ｃ末端においてはＨｉｓタグとの二重融合体として発現させた。細菌の可溶性画分からアフィニティー精製した後で得られたタンパク質は、デンシトメータによりＰＡＧＥ−ＳＤＳゲルをスキャンすることにより推定された通り、７０％以上の純度レベルを示した（図１Ａ）。規定のプリント方式および対照スポットを用いることにより、タンパク質アレイを検証した（図１Ｂ）。各抗原を４連でプリントした後で、組換えタンパク質ならびに／またはＧＳＴおよびＨｉｓ融合タグに対するマウス抗血清と共にインキュベートしたところ、それらのすべては、ニトロセルローススライド上において効率的かつ再現可能な形で固定化されることが確認された（示していない）。各タンパク質スポットのいずれかの側にスポットしたＰＢＳ緩衝液を用いて、スポッティング中のタンパク質のキャリーオーバーを検出したところ、ニトロセルロースによるバックグラウンドの平均蛍光強度（ＦＩ）値（「材料と方法」を参照されたい）より高値のシグナル強度を示すＰＢＳスポットは、１０％未満であった。空の発現ベクターを保有するＥ．ｃｏｌｉ菌株からの全可溶性抽出物をアフィニティー精製した後で溶出されるタンパク質もまたアレイ上にプリントし、試験血清と共にインキュベートすることによりおそらくは生成される、夾雑物に起因する最大のバックグラウンドシグナルを決定した（１０２３（標準偏差ＳＤは４６１）を超えない平均蛍光強度（ＭＦＩ）が常に結果としてもたらされた）。最後に、８つの異なる量のヒトＩｇＧを、アレイ上に４連でスポットし（スポット当たり、６×１０−３〜７×１０−１ｎｇの固定化タンパク質）、検出、系の再現性、およびデータの正規化のための対照として用いた。Ｃｙ３結合体化抗ヒト抗体により検出した後で得られたヒトＩｇＧスポットのＭＦＩは、約２ｌｏｇのシグナルダイナミックレンジを示すＳ字型曲線により最良の形でフィティングされ、このレンジ内における直線区間は、ＦＩ値の約１ｌｏｇに及び、結果として得られる検出下限は、約７×１０−３ｎｇであった（図１Ｃ）。異なる実験に由来するデータを比較するため、本発明者らは、既に構成された正規化法を用い、本発明者らの系について検証した（Ｒｅｇｕｚｚｉ  Ｖ．、私信）（Ｓ字型の参照ＩｇＧ曲線に基づき、実験による各スライドのＩｇＧ曲線を補正し、これにより、バックグラウンドを差し引いた各タンパク質のＭＦＩ値を正規化した（図１Ｄおよび「材料と方法」））。また、参照ＩｇＧ曲線のＭＦＩを定めることにより、スライド間における変動係数（ＣＶ）が５％未満であると評価することが可能となる一方、５０枚のスライドによるヒトＩｇＧのＭＦＩ値を計算することにより測定されたスライド間におけるＣＶは、１５０００未満のＦＩ値（「材料と方法」で説明する通り、緩衝液によるスポットについての正規化ＭＦＩ値に、２標準偏差を加えた値に対応する）については４６％〜３０％の範囲であったが、１５０００を超えるＦＩ値については約２０％まで低下した。これらの結果に基づき、タンパク質がヒト血清により確実に認識されると記録するための最小のシグナル閾値として、１５０００という正規化ＦＩ値を任意に選択した。加えて、本発明者らの実験系では、ほぼ、ヒトＩｇＧ曲線の飽和セグメントに対応する、４０，０００というＦＩの第２のカットオフ値を、高度に反応性であるタンパク質を示し、かつ／または高力価の血清を同定するものとして任意に定めた（図１Ｄ）。
【００６４】
（チック血清、非チック血清、および咽頭炎血清の血清学的プロファイリング）
ＧＡＳ感染またはＧＡＳ抗原に対する曝露と、チック障害との間に連関が見られるかどうかを判定しようと試みる中で、チックを有する患者に由来する６１例の血清を、ＧＡＳタンパク質アレイに対するプローブとして用いた。来院時において、患者は、咽頭炎の臨床徴候を示さず、患者群内におけるＧＡＳ保有者の百分率（１４．７％）は、同じ年齢範囲内に収まる正常な小児集団内において観察される百分率と異ならなかった［１４］。チック障害を有さず、咽頭炎の症状も示さない小児（「非チック」と称する）に由来する３５例の血清と、ＧＡＳ咽頭炎の患者（咽頭のスワブ、ならびに感染性ＧＡＳ菌株の単離により確認された）に由来する２３９例の血清とを用いて、同様の分析を実施した。すべての患者群は、４〜１４歳の小児により形成された。蛍光標識された抗ヒトＩｇＧを用いて、各タンパク質スポットに結合した全ＩｇＧを検出し、各抗原についてのＦＩ値を測定することにより、血清の反応性を評価した。３つの血清群の抗原認識パターンを定めるため、ピアソンによるクラスター間距離を計算するためのアルゴリズムを用いて、正規化ＦＩ値を、教師なしの二次元階層クラスタリングに供した。全３３５例の血清中、チック患者、非チック患者、および咽頭炎患者について観察された、ＧＡＳ抗原に対する抗体認識プロファイルについてのクラスター表示を、図２Ａに示す。この分析の結果、第２レベルの階層において、５つの異なる主要クラスターが定義された。クラスターＩには１８１例の血清が含まれ、クラスターＩＩには４７例の血清が含まれ、クラスターＩＶには８７例の血清が含まれた。クラスターＩＩＩおよびＶには少数の血清（それぞれ、２および１８例）が含まれた。チック血清の大半が、クラスターＩ、ＩＩ、およびＩＶにおいて、統計学的な有意差なしに分布したのに対し、咽頭炎血清は、クラスターＩ、ＩＶ、およびＶに群分けされた（図２Ｂ）。非チック血清のうちほぼ８０％がクラスターＩＩに偏在したことから、陰性対照群に属する血清の大多数が、他の２つの血清クラスと比較して、顕著に異なる抗原認識パターンを有することが示されたことは、注目に値する。
【００６５】
（チック患者、非チック患者、および咽頭炎患者におけるＧＡＳ抗原の特異的免疫原性）
本発明者らが、各単一の抗原に対するチック血清の反応頻度を分析したところ、それらのうちの５０％が、チック患者の血清のうちの少なくとも３０％により認識される結果を示したのに対し、約２５％は、それらのうちの１０％未満と反応性であるという結果を示した。免疫原性抗原の３つの群：（ｉ）３つの血清ファミリーすべてにより同様の頻度で認識された２５のタンパク質（表１）からなる群。Ｍタンパク質、ストレプトリシンＯ（ＳＬＯ）、ストレプトキナーゼＡ、およびＣ５ａペプチダーゼ前駆体など、複数の公知の免疫原性ＧＡＳ抗原が、このサブセットに収まる。これらの抗原がまた、非チック陰性対照群に属する血清によっても認識された事実は、これらの個体が、既にＧＡＳ感染を経過している可能性が極めて高いので、矛盾とは考えられなかった；（ｉｉ）チック血清および咽頭炎血清のいずれによっても同等の頻度で認識されるが、非チック血清によっては統計学的に有意に低い頻度で認識される、２１のタンパク質（表３）による別の群；（ｉｉｉ）代わって、チック血清により、咽頭炎血清および非チック血清のいずれと比較しても統計学的に有意により高度な認識率で認識される、５つのタンパク質（表４）による第３の群を識別することができた。興味深いことに、チック血清のうち約４０％が、これらの抗原のうちの少なくとも３つに対して同時に反応性であった（表５）。
【００６６】
チック患者の抗ストレプトリシンＯ（ＡＳＯ）力価を考慮することにより、観察された血清学的プロファイルと、継続中のＧＡＳ感染または最近のＧＡＳ感染との間の相関が存在する可能性について評価した。本発明者らのかつての研究［１５］に従い、本発明者らは、ＡＳＯ力価が高値であるかまたは低値であるかを判定するためのカットオフ値を、４０７国際単位（Ｉ．Ｕ．）と定めた。ＡＳＯが高値である３１例のチック血清を、ＡＳＯが低値である１６例のチック血清と比較したところ、本発明者らは、認識されたＧＡＳ抗原の種類にも、総数にも大きな差違を観察しなかった（示していない）。
【００６７】
本発明者らのデータを裏付け、さらに検証するため、標準的な方法により、３つの群に包含される少数の試験抗原に対するＩｇＧレベルを分析した。抗原ＳＰｙ０８４３、Ｍ５００５＿ＳＰｙ０２４９、ＳＰｙ１３０６、およびＳＰｙ１９３９の各々に対する８つの陰性血清（ＭＦＩ＜１５０００）および８つの陽性血清（ＭＦＩ＞１５０００）を、ＥＬＩＳＡにより調べたところ、マイクロアレイ分析の結果として得られるＭＦＩに基づき定義される陰性血清と陽性血清との間において、統計学的に有意な力価の差違が観察された（図３）。
【００６８】
（チック血清の免疫反応性の比較）
選択されたＧＡＳタンパク質に対する、３つの血清ファミリーの全体的な反応性を比較することにより、チックと、抗ＧＡＳ免疫反応との間の関係が確認および強化された。試験血清のうちの＞３０％により認識された抗原の百分率が、チック群と、咽頭炎群とで有意には異ならなかった一方で、非チック血清は全体として、より少ない抗原を認識した（図４Ａ）。代わって、抗原特異的なＩｇＧレベルの差違を示唆するものとして、スポット強度の差違を考慮したところ、チック血清ファミリーと、他の２つの血清ファミリーとの間に顕著な相違が観察された。実際、本発明者らは、３つの血清ファミリーにより最も強力に（ＦＩ＞４０，０００、任意のカットオフ値）認識される抗原の百分率がどれほどであり、逆に、アレイ上において、試験抗原のうちの少なくとも３０％に対して極めて高値（ＦＩ＞４０，０００）のシグナルを発生させる血清の百分率はどれほどであるのかについて検証した。試験血清によりＦＩ＞４０，０００で認識されるＧＡＳ抗原の百分率は、チック患者の場合が約３０％であり、咽頭炎患者の場合が１８％であり、非チック群では１３％であった（図４Ｂ）。同様に、咽頭炎患者血清のうちの１２％、ならびに陰性対照群血清のうちのわずかに３％に対して、チック患者血清のうちの３０％超が、スポット抗原のうちの少なくとも３０％と極めて強力に（ＦＩ＞４０，０００）反応した（図４Ｃ）。いずれの場合にも、χ２検定を用い、Ｐ値＜０．０５を参照して実施された統計学的分析により、チック血清群の反応性と、他の２つの血清群の反応性との間で観察される差違は統計学的に有意であることが確認された。
【００６９】
（考察）
本研究において、本発明者らは、チック障害と、ＧＡＳ感染との間に一貫した強い相関を確立しうるかどうかという問題を扱った。この目的で、本発明者らは、代表的なＧＡＳ抗原のパネルに対するチック患者血清のＩｇＧ反応について、初めて体系的な分析を実施し、結果として得られたデータを、チックを有さない小児に由来する血清、または咽頭炎を有する小児に由来する血清により得られたデータと比較した。
【００７０】
本発明者らが用いたタンパク質マイクロアレイ法が、１００を超える細菌抗原に対して、合計でほぼ３５０のヒト血清を調べるのに適切であることが明らかとなったことから、インビボにおける病原体抗原の発現、ならびにその後の宿主による免疫反応についての大規模なデータセットが要求される場合はいつでも、この技法を考慮に入れるべきことが裏付けられた。タンパク質マイクロアレイは、迅速で、容易で、かつ高感度な手法であることが確認され、本発明者らが異なる対照により得た結果は、生物学的試料により得られたデータを検証するのに十分な程度に堅調であった。さらなる確認として、陽性または陰性の血清により得られ、抗原特異的なＩｇＧレベルの差違を示す、異なるＭＦＩが、より常套的なＥＬＩＳＡアッセイを用いることにより決定される対応するＩｇＧ力価と完全に符合すると考えられた（図３）ことから、チップによる結果と、ＥＬＩＳＡによる結果とが相関することを裏付けただけでなく、また、アレイ法がより高感度であることも強調したＲｏｂｉｎｓｏｎら［１６］により既に観察されていたことが確認される。
【００７１】
本発明者らによるタンパク質アレイの結果からは、２つの主要な結論が導かれる。第１の結論は、チック患者において観察される血清学的プロファイルが、一般的な急性咽頭炎を経験した患者の血清中において観察されるプロファイルと同様であったことである。実際、本発明者らによる分析は、チップ上に存在する１０２の抗原のうち、４６の抗原が、チック患者血清および咽頭炎患者血清に対して同様の様式で反応し、それらの各々が、該２つの群に由来する同等の百分率の血清により認識されることを確立した（表２および表３）。いずれの血清群のプロファイルも、非チック患者において観察されるプロファイルとは顕著に異なっていたことは、注目に値する（表３および図２）。
【００７２】
アレイによる結果から得られる第２の結論は、チック血清によるＩｇＧ反応が、咽頭炎患者において観察されるＩｇＧ反応より、総じて定量的により強力であると考えられたことである。実際、本発明者らが、高度に反応性である（ＭＦＩが４０，０００を超える）抗原および血清の頻度を考慮したところ、それらは、咽頭炎患者および非チック患者のいずれと比較しても、チック患者において有意により高度であると考えられた（図４Ｂおよび４Ｃ）。
【００７３】
総じて、これまでに論じてきた結果は、一般的な急性咽頭炎の経過において免疫反応を誘発するＧＡＳ抗原の大多数がまた、チック血清によっても認識され、しかもより堅調に認識されることを裏付けた。これらのデータは、チック患者が、Ａ群のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属抗原に対して特異的で強力な免疫反応を誘発した個体に典型的な血清学的プロファイルを示すことについての最初の証拠をもたらすことにより、これまで、矛盾する疫学的報告、ならびに少数の感染徴候だけに基づいていた［１７］、チック障害とＧＡＳ感染との間の関係を強化する。
【００７４】
チック疾患とＧＡＳ感染との間の連関を踏まえたとして、該病原体が、チック障害の発症または再発にどの程度、どのような形で寄与し得るのかについて見通すことは難しい。咽頭炎の臨床徴候がないこと、およびチック患者集団内において観察される通常のＧＡＳ保有頻度により証拠立てられるように、神経精神症状は見られるが明らかなＧＡＳ感染は見られないチック患者において、本発明者らが分析した、ＧＡＳ抗原に対する免疫反応が生じたことを考慮するなら、これらの問題は、さらにより興味深いと考えられる。加えて、ＡＳＯ力価の低いチック患者またはＡＳＯ力価の高いチック患者の間で大きな差違が観察されなかったことから、これらの患者の血清学的プロファイルが、既存または最近のＧＡＳ誘導型咽頭炎を確認するのに日常的に用いられるパラメータであるＳＬＯに対する免疫反応と厳密には相関しないこともさらに示唆された。
【００７５】
ＧＡＳ感染が、広範なスペクトルにわたる、中枢神経系（ＣＮＳ）の連鎖球菌感染後症候群にどのような形で寄与するのかについては、さらに多くのことを説明しなければならない［１８］。ＣＮＳ疾患の素因は、遺伝学的背景における多数の因子に依存し［１９］、ＧＡＳ感染「それ自体」は、ＣＮＳ障害の結果に対する主要な原因ではなく、該障害の結果を誘発するか、またはとりわけ、特定の遺伝子的素因が存在する場合に該疾患が生じる危険性を増大させる共因子として寄与することが推測される。
【００７６】
細菌性抗原と、宿主組織との間の「分子的模倣」に起因する非化膿性続発症を誘導することが、Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属を、類縁の連鎖球菌、ならびに他のヒト細菌性病原体の大半から区別する。タンパク質Ｍは、急性ＲＦ、ならびにリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）により主に代表される「自己免疫性続発症」を引き起こす原型抗原である。実際、これらの病態は、Ｍタンパク質と心臓のミオシンとの間の模倣に連関しており、心筋または心弁に浸潤してこれを損傷する特異的な交差反応性抗体および炎症性Ｔ細胞を誘導させる、ＧＡＳ感染に対する免疫反応に起因している［２０、２１］。Ｍタンパク質と、トロポミオシン、ビメンチン、ケラチン、およびラミニンなど、他の複数の自己抗原との間にも、同様の構造的および免疫学的な類似性が見出されている［１］。糖分解性のエノラーゼ酵素もまた、急性ＲＦの発生においておそらく役割を果たすさらなる抗原として同定されている。実際、抗連鎖球菌性エノラーゼ抗体は、ヒトエノラーゼと交差反応すると考えられ、急性ＲＦ患者に由来する血清は、咽頭炎の被験体および健康な対照被験体の血清中において見出された抗ヒトエノラーゼ力価および抗細菌性エノラーゼ力価と比較して、より高値の抗ヒトエノラーゼ力価および抗細菌性エノラーゼ力価を示した［２２］。同様に、分子的模倣におそらく関与する５つの連鎖球菌性抗原および４つの組織抗原に対する抗体力価も、咽頭炎患者と比較して、急性ＲＦ患者では顕著に高値であることが近年になって示された［２３］。
【００７７】
上述の事象に類似する連鎖球菌感染後における自己免疫事象が、神経精神障害を引き起こすか、またはこれに寄与するのに役割を果たしうる可能性は、いまだ評価の途上である。ＯＣＤおよびＰＡＮＤＡＳを有する小児においては、高レベルの、脳構造に対する抗体が観察される［２４、２５］という事実、ならびにツレット症候群およびチック障害を有する患者においては、ヒト脳タンパク質と交差反応する抗体を誘発することが公知である［２７］、連鎖球菌性Ｍタンパク質に特異的な抗体の力価が上昇する［２６］という事実により、この仮説は支持されると考えられる。自己免疫仮説に対するさらなる支持は、シドナム舞踏病患者から得られたモノクローナル抗体が、哺乳動物のリソガングリオシドおよびＡ群連鎖球菌性炭水化物の主要なエピトープである、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に対して特異性を示す観察から導かれた［２８］ほか、ツレット症候群および他のＣＮＳ疾患における自己免疫標的として、ピルビン酸キナーゼのＭ１アイソフォーム［２９］、ならびにさらなるニューロン表面の糖分解酵素［３０］を示すデータからも導かれた。
【００７８】
この背景に基づき、明白な感染が見られない場合であっても、チック患者におけるＧＡＳ抗原に対する強い免疫反応を裏付ける本発明者らのデータは、特定の連鎖球菌抗原に対する抗体が、感受性の個体においてチック障害の発症を誘発する自己免疫反応の一因となりうることを提起する最新の仮説［２５、３１］のうちの１つの文脈では、これらの患者において観察される血清学的プロファイルが重要となりうることを示唆する。このシナリオでは、宿主内において生存することが可能な病原体に対する繰り返しの感染または再曝露の結果としての反復的なブースト（boost）に起因して、重大なＧＡＳ抗原に対する自己免疫反応のピークが周期的に発生し得、これは、小児における神経精神症状または行動症状の周期的な解放および悪化をもたらす。
【００７９】
結論として、本発明者らのデータにより、チック障害とＧＡＳ感染との間に存在する連関が裏付けられ、チックとＡ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属抗原に対する抗体反応との間には関連が存在しうるという考えが補強されると、本発明者らは考える。
【００８０】
（材料と方法）
（ＧＡＳ表面露出抗原の選択、発現、および精製）
ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １１．１に包含されるコンピュータプログラムを、ＰＳＯＲＴプログラムと組み合わせて用いて、ＳＦ３７０菌株配列を分析し、予測される表面露出タンパク質および分泌タンパク質のサブセットを選択した。該サブセット中に包含されるタンパク質は、リーダーペプチド、リポタンパク質シグネチャー、外膜アンカリングモチーフ、宿主細胞結合ドメイン、例えば、ＲＧＤおよび公知の表面タンパク質または公知の病原性因子との相同性を含有するタンパク質であった。この作業の結果として、９６の遺伝子をＳＦ３７０菌株から選択し、Ｅ．ｃｏｌｉ内において、Ｃ末端におけるＨｉｓタグ融合タンパク質として、またはＮ末端におけるＧＳＴペプチドとＣ末端におけるＨｉｓタグとの二重融合タンパク質としてクローニングして発現させた［３２］。ＩＭＡＣまたはグルタチオン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーの後、細菌の可溶性画分から抗原を精製し、ＰＢＳ緩衝液に対して透析し、ＧＡＳ特異的タンパク質アレイを構築するのに用いることに成功した。加えて、Ｍの種類が異なる菌株から６つのｅｍｍ遺伝子をクローニングし、対応するタンパク質を精製し、チップ上にスポットした。タンパク質は、ＳＦ３７０菌株に由来するＭ１タンパク質、２７２６菌株に由来するＭ２タンパク質、ＭＧＡＳ３１５菌株に由来するＭ３タンパク質、２７２０菌株に由来するＭ９タンパク質、２７２８菌株に由来するＭ１２タンパク質、ならびにＤＳＭ２０７１菌株に由来するＭ２３タンパク質であった。すべての抗原を、表１に列挙する。
【００８１】
（タンパク質のマイクロアレイ法）
Ｃｈｉｐｗｒｉｔｅｒ  Ｐｒｏスポッター（Ｂｉｏｒａｄ社製）により、ニトロセルロースでコーティングしたスライド（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ社製；ＦＡＳＴスライド）上において４連で、アフィニティー精製した組換えタンパク質（０．５ｍｇ／ｍｌ）をスポットすることにより、ＧＡＳタンパク質アレイを作製した。結果として得られたスポットは直径が約１５０μｍであった。アレイ構成の感度および再現性を評価するための実験用陽性対照として、ならびにデータを正規化するため、ヒトＩｇＧ（複数可）の曲線（０．００８〜１ｍｇ／ｍｌの溶液）をアレイ上に８連でスポットし、Ｃｙ３結合体化α−ヒトＩｇＧ二次抗体により検出した。同様にして、ヒトＩｇＭ（複数可）の曲線もまたアレイ上においてスポットしたが、これらは、試験条件下では検出できなかった。ＰＢＳ緩衝液は、タンパク質スポットの少なくとも２倍の数でスポットし、交差夾雑物に起因する、非特異的シグナルの可能性を評価するのに用いた。ヒト血清により実験する場合は、ＰＢＳ中に３％のＴｏｐ  Ｂｌｏｃｋ（Ｆｌｕｋａ−ＢｉｏＣｈｅｍｉＫａ社製）−０．１％のＴｗｅｅｎ２０（ＴＰＢＳ）によるブロッキング溶液でスライドを飽和させ、その後、室温で１時間にわたり、血清（ＴＰＢＳによる１：１０００希釈液）と共にインキュベートした。０．１％ＴＰＢＳ中において５分間ずつ３回にわたる洗浄の後、スライドを、暗所内、室温で１時間にわたり、Ｃｙ３結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）と共にインキュベートした。その後、ＴＰＢＳにより２回にわたり、ＰＢＳにより１回にわたり、ならびに最後にｍｉｌｌｉＱ滅菌水により（３０秒間ずつ）アレイを洗浄し、次いで、暗所内３７℃で１０〜２０分間にわたり乾燥させ、スキャンした。少なくとも２回にわたり各血清を調べた。マウス抗ＧＳＴモノクローナル抗体および抗Ｈｉｓ６タグモノクローナル抗体を用い、その後Ｃｙ３標識α−マウスＩｇＧ二次抗体で検出することによりすべての固定化タンパク質の存在を確認して、スポッティングを検証した。ＳｃａｎＡｒｒａｙ  ５０００  Ｕｎｉｔ（米国、マサチューセッツ州、ビレリカ、Ｐａｃｋａｒｄ社製）を用いることにより蛍光シグナルを検出し、ピクセル当たり１０μｍの解像度でＳｃａｎＡｒｒａｙＴＭソフトウェアにより１６ビットの画像を生成し、ＩｍａＧｅｎｅ  ６．０ソフトウェア（米国、カリフォルニア州、Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社製）を用いて加工した。生の蛍光強度（ＦＩ）データによる画像は、所内開発のソフトウェアを用いて洗練させ（elaboration）および分析した。各試料について、各スポット周囲のバックグラウンド値を差し引いた後で、多連のスポットに対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定し、その後、これをヒトＩｇＧ曲線に基づき正規化して、異なる実験に由来するデータの比較を可能とした。異なる濃度でスポットしたＩｇＧのＭＦＩ値は、最尤推定量を用いてＳ字型ファミリーに属する曲線により、最良の形でフィッティングされた［３３］。１６ビットの全ピクセル範囲にわたる参照ＩｇＧ曲線を定義し、実験によるＩｇＧ曲線を補正し、これに従ってタンパク質のＭＦＩ値を正規化することにより、正規化法を���成した。以下の式（Ｒｅｇｕｚｚｉ  Ｖ．、私信）：
【００８２】
【化３】
2012519844.tif 000005
［式中、ＨＬｉｄ、ＬＬｉｄ、σｉｄ、およびμｉｄは、参照Ｓ字型曲線のパラメータであり、ＨＬ、ＬＬ、σｉｄ、およびμｉｄは、実験によるＩｇＧ曲線のパラメータである］により、本発明者らは、実験によるＭＦＩ値から、正規化ＭＦＩ値を得た。
【００８３】
各血清の抗原応答の特異性のプロファイルを作製し、３つの血清クラスの抗原認識パターンを定義するため、ＴＩＧＲ  Ｍｕｌｔｉｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＭｅＶ）ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｔｍ４／ｍｅｖ．ｈｔｍｌ）を用いて、正規化ＭＦＩ値を、教師なしの二次元階層クラスタリングに供した。
【００８４】
（ヒト血清）
「咽頭炎」血清は、咽頭炎の臨床症状を有する、４〜１４歳の男児患者および女児患者２４９例から採取した。診断時に咽頭スワブを実施することにより、咽頭炎がＧＡＳに関連することを確認し、感染性ＧＡＳ菌株の単離を可能とし、次いで、これを、特定のＭタンパク質抗原配列により血清型分類した。疫学的に最も重要なＭタンパク質の種類のすべてが、単離菌株において代表された。
【００８５】
「チック」血清は、２００４年９月〜２００５年７月のＲｏｍｅ  Ｌａ  Ｓａｐｉｅｎｚａ大学小児青年神経精神科外来部における最初の観察時においてチック障害に罹患していた患者から採取した。組入れ基準は、チック障害の罹患を含み；除外基準は、精神遅滞、広汎発達障害、非外来の被験体、ならびに施設に収容された小児を含んだ。チック障害に罹患した４〜１４歳（平均：９．６歳；中央値：９．２歳）の継続患者、合計６１例（女児６例）を調べた。患者はすべて、ローマおよびその近郊から来院した。秋に１７例の患者を登録し、冬に２０例の患者を登録し、春に１８例の患者を登録し、夏に８例の患者を登録した。大半の症例において、観察は、数カ月間または数年間にわたりチックを有する被験体の症状が悪化する期間において行われ；チック症状の発症時において調査を受けた患者は３例に過ぎなかった。これらの患者において、Ｙａｌｅ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｔｉｃ  Ｓｅｖｅｒｉｔｙ  Ｓｃａｌｅにより測定されたチックの重症度は、１５〜３５の範囲内であった（障害スコアを除く）。咽頭−扁桃腺炎の臨床徴候を示す患者は見られず；咽頭スワブでＧＡＳについて陽性を示す患者は９例（１４．７５％）であった。すべての単離物は、Ｍタンパク質抗原の配列により類別した（ｅｍｍ類別）。同定された型は、複数のＭタンパク質型に及び、いずれか特定の型の偏在はなかった。抗ストレプトリシンＯ（ＡＳＯ）力価に関しては、１４例の患者が正常値（＜２００国際単位；Ｉ．Ｕ．）を示し、１６例が中間値（２００〜４００Ｉ．Ｕ．）を示し、１９例が高い値（４００〜１０００Ｉ．Ｕ．）を示し、１２例が非常に高い値（＞１，０００Ｉ．Ｕ．）を示した。スワブが陽性であることが、ＧＡＳ力価およびＡＳＯ力価に対して直接的に相関することは観察されなかったが、ＧＡＳ陽性患者の平均値は、本発明者らが高い値として分類した範囲内にあった（約６５０ＩＵ）。全体では、患者のうち５０．８１％のＡＳＯ力価が、高い値または非常に高い値であった。患者登録の季節は、ＡＳＯ力価の値またはＧＡＳについてスワブが陽性であることと相関しなかった。
【００８６】
「非チック」血清は、Ｒｏｍｅ  Ｌａ  Ｓａｐｉｅｎｚａ大学小児青年神経精神科に通院する、良性癲癇に罹患した４〜１４歳（平均：８．９歳；中央値：９．１歳）の外来患者３５例（女児４例）から採取した。この対照は、性別、年齢、および観察の時点（１年のうちの季節）について、チック患者と合致した。チック症状または咽頭−扁桃腺炎を有する患者は見られなかった。ＡＳＯ力価に関しては、１６例の患者が正常値（＜２００Ｉ．Ｕ．）を示し、１５例が中間値（２００〜４００Ｉ．Ｕ．）を示し、４例が高い値（４００〜１０００Ｉ．Ｕ．）を示した。全体では、患者のうち１１．４２％のＡＳＯ力価が高い値であったが、ＡＳＯ力価が非常に高い値である患者は見られなかった。
【００８７】
咽頭炎血清、チック血清、および非チック血清の試料は、ＧＡＳ咽頭炎を診断するための日常的な医療管理中、または神経精神科来院時において得られた試料の残余であり、テキサス州、ヒューストンのＢａｙｌｏｒ医科大学（咽頭炎血清）、またはローマのＩｓｔｉｔｕｔｏ  Ｓｕｐｅｒｉｏｒｅ  ｄｉ  Ｓａｎｉｔａ、ならびにローマのＬａ  Ｓａｐｉｅｎｚａ大学小児青年神経精神科（チック血清および非チック血清）において採取された。これらの施設は、研究を目的としてこのような残余材料を処理するための認可を有した。
【００８８】
（統計学的分析）
両側χ２検定、スチューデントのＴ検定、またはフィッシャーの正確検定を用いて、血清群、ＥＬＩＳＡによる力価、およびＭＦＩの統計学的差違を分析した。０．０５未満のＰ値が得られた場合に、統計学的に有意な差違であると考えた。
【００８９】
【表１−１】
2012519844.tif 000006
【００９０】
【表１−２】
2012519844.tif 000007
【００９１】
【表１−３】
2012519844.tif 000008
（ａ）ＳＰｙ番号が不明な場合は、ｇｉ番号を示す。
（ｂ）該タンパク質はＳＦ３７０中に存在するが、アノテーションされていないので、Ｍ５００５  ＳＰｙ番号とする。
【００９２】
【表２】
2012519844.tif 000009
数値は、各抗原に対する各クラスの陽性血清の％を指す。
（ａ）ＳＰｙ番号が不明な場合は、ｇｉ番号を示す。
（ｂ）咽頭炎
【００９３】
【表３】
2012519844.tif 000010
数値は、各抗原に対する各クラスの陽性血清の％を指す。両側χ２検定を用いることにより確立される、チック血清または咽頭炎血清により得られる認識率と比較したところ、非チック血清による認識率は有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。
（ａ）咽頭炎
（ｂ）該タンパク質は存在するが、ＳＦ３７０  Ｍ１菌株においてアノテーションされていないので、Ｍ５００５  ＳＰｙ番号を用いた。
【００９４】
【表４】
2012519844.tif 000011
（ａ）咽頭炎
数値は、各抗原に対する各クラスの陽性血清の％を指す。
両側χ２検定を用いて、各抗原に対して陽性であるチック血清、咽頭炎血清、および非チック血清の数を比較した結果、咽頭炎血清および非チック血清と比較して、チック血清が統計学的により多数となった（Ｐ＜０．０５）。
【００９５】
【表５】
2012519844.tif 000012
（ａ）同じ血清により同時に認識された、表４で報告された抗原の数。
（ｂ）第１列で示された数の抗原を同時に認識する陽性血清の百分率（陽性血清の数／試験した血清の合計数）。
（ｃ）両側χ２検定により計算された、咽頭炎と比べたチックについてのＰ値。
（ｄ）両側χ２検定により計算された、非チックと比べたチックについてのＰ値。
【００９６】
（参考文献）
【００９７】
【数１】
2012519844.tif 000013
【００９８】
【数２】
2012519844.tif 000014
（配列表：下線を付した部分は、リーダー配列または膜貫通ドメインであると考えられるため、発現しなかった）
【００９９】
【化４】
2012519844.tif 000015
【０１００】
【化５】
2012519844.tif 000016
【０１０１】
【化６】
2012519844.tif 000017
【０１０２】
【化７】
2012519844.tif 000018
【０１０３】
【化８】
2012519844.tif 000019
【０１０４】
【化９】
2012519844.tif 000020
【０１０５】
【化１０】
2012519844.tif 000021
【０１０６】
【化１１】
2012519844.tif 000022
【０１０７】
【化１２】
2012519844.tif 000023
【０１０８】
【化１３】
2012519844.tif 000024
【０１０９】
【化１４】
2012519844.tif 000025
【０１１０】
【化１５】
2012519844.tif 000026
【０１１１】
【化１６】
2012519844.tif 000027
【０１１２】
【化１７】
2012519844.tif 000028
【図１】
2012519844.tif 000029
【図２】
2012519844.tif 000030
【図３】
2012519844.tif 000031
【図４】
2012519844.tif 000032
【配列表】
2012519844000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成24年1月12日(2012.1.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2012519844000001.app
【国際調査報告】
2012519844.tif 000047
2012519844.tif 000048
2012519844.tif 000049