(57)【要約】本発明は、生体内又は試験管内において、微小血管透過性亢進疾患を治療又は予防するか、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生透過性亢進性を調節するか、血管透過性の増加に依存することなく上皮細胞生存を維持するか、上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）を減少させるために使用される、ＶＥＧＦｘｘｘｂ、被投与者の細胞又は試験管内においてＶＥＧＦｘｘｘに優先してＶＥＧＦｘｘｘｂの発現を選択的に促進する薬剤又はＶＥＧＦｘｘｘｂを宿主生物内において発現させる発現ベクター系を提供する。また、上皮細胞生存を維持するために使用されるＶＥＧＦｘｘｘｂ、被投与者の細胞内又は試験管内においてＶＥＧＦｘｘｘに優先してＶＥＧＦｘｘｘｂの発現を選択的に促進する物質、宿主生物内においてＶＥＧＦｘｘｘｂを発現させる発現ベクター系を提供する。ＶＥＧＦｘｘｘｂは、好ましくはＶＥＧＦ１６５ｂである。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小血管透過性亢進疾患を治療又は予防するために使用されるか、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生透過性亢進性を調節するために使用されるか、透過性の増加に依存することなく上皮細胞生存を維持するために使用されるか、上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）を減少させるために使用されるＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤。
【請求項２】
微小血管透過性亢進疾患を治療又は予防するか、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生透過性亢進性を調節するか、血管透過性の増加に依存することなく上皮細胞生存を維持するか、上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）を減少させるための方法であって、生体内又は試験管内において、被投与者又は上皮濾過膜に有効量のＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤を投与することを含む方法。
【請求項３】
ＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤の、生体内又は試験管内において、微小血管透過性亢進疾患を治療又は予防するか、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生透過性亢進性を調節するか、血管透過性の増加に依存することなく上皮細胞生存を維持するか、上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）を減少させるために使用される組成物の製造における使用。
【請求項４】
生体内又は試験管内において微小血管膜の透過性を減少させるか、膜に関連してＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生透過性亢進性を調節するか、血管透過性の増加に依存することなく膜内において上皮細胞生存を維持するか、生体内において上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）を減少させるための方法であって、前記膜に有効量のＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤を接触させることを含む方法。
【請求項５】
請求項１において、ＶＥＧＦｘｘｘｂ又は被投与者の細胞内又は試験管内においてＶＥＧＦｘｘｘに優先してＶＥＧＦｘｘｘｂの存在又は発現を選択的に促進する薬剤である、薬剤。
【請求項６】
請求項２又は４において、前記ＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤が、ＶＥＧＦｘｘｘｂ又は被投与者の細胞内又は試験管内においてＶＥＧＦｘｘｘに優先してＶＥＧＦｘｘｘｂの存在又は発現を選択的に促進する薬剤である、方法。
【請求項７】
請求項３において、前記ＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤が、ＶＥＧＦｘｘｘｂ又は被投与者の細胞内又は試験管内においてＶＥＧＦｘｘｘに優先してＶＥＧＦｘｘｘｂの存在又は発現を選択的に促進する薬剤である、使用。
【請求項８】
生体内又は試験管内において、微小血管透過性亢進疾患を治療又は予防するか、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生透過性亢進性を調節するか、血管透過性の増加に依存することなく上皮細胞生存を維持するか、上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）を減少させるために使用されるＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤を宿主生物内において発現させる発現ベクター系。
【請求項９】
微小血管透過性亢進疾患を治療又は予防するか、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生透過性亢進性を調節するか、血管透過性の増加に依存することなく上皮細胞生存を維持するか、上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）を減少させるための方法であって、生体内又は試験管内において、被投与者又は上皮濾過膜に、有効量の、ＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤を宿主生物内において発現させる発現ベクター系を投与することを含む方法。
【請求項１０】
ＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤を宿主生物内において発現させる発現ベクター系の、生体内又は試験管内において、微小血管透過性亢進疾患を治療又は予防するか、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生透過性亢進性を調節するか、血管透過性の増加に依存することなく上皮細胞生存を維持するか、上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）を減少させるための組成物の製造における使用。
【請求項１１】
生体内において、微小血管膜の透過性を減少させるか、膜に関連してＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生透過性亢進性を調節するか、血管透過性の増加に依存することなく膜内において上皮細胞生存を維持するか、生体内において上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）を減少させるための方法であって、前記膜に、有効量の、ＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤を宿主生物内において発現させる発現ベクター系を接触させることを含む方法。
【請求項１２】
微小血管透過性亢進疾患、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生促進・透過性促進性調節疾患、上皮細胞生存及び透過性疾患及び／又は上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）疾患に対するリスク又は感受性について患者を検査する方法であって、前記患者から生体試料を採取し、正常な絶対ＶＥＧＦｘｘｘｂ濃度又は正常なＶＥＧＦｘｘｘｂ：ＶＥＧＦｘｘｘ比に対する前記試料中のＶＥＧＦｘｘｘｂ濃度について分析することを含む方法。
【請求項１３】
微小血管透過性亢進疾患、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生促進・透過性促進性調節疾患、上皮細胞生存及び透過性疾患及び／又は上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）疾患に対するリスク又は感受性について患者を検査する方法であって、前記患者の遺伝子型を決定して正常な絶対ＶＥＧＦｘｘｘｂ濃度又は正常なＶＥＧＦｘｘｘｂ：ＶＥＧＦｘｘｘ比に対するＶＥＧＦｘｘｘｂの過小発現のリスクを判定することを含む方法。
【請求項１４】
前記請求項のいずれか１項において、前記ＶＥＧＦｘｘｘｂが、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１８９ｂ、ＶＥＧＦ１４５ｂ、ＶＥＧＦ１８３ｂ及びＶＥＧＦ１２１ｂの１以上、好ましくはＶＥＧＦ１６５ｂを含む、薬剤、使用又は方法。
【請求項１５】
上皮細胞変性の増加又は上皮残存の減少によって生じる疾患を治療又は予防するために使用されるＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤。
【請求項１６】
上皮細胞変性の増加又は上皮残存の減少によって生じる疾患を予防又は治療するための方法であって、生体内又は試験管内において、被投与者又は上皮細胞集団に有効量のＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤を投与することを含む方法。
【請求項１７】
ＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤の、上皮細胞変性の増加又は上皮残存の減少によって生じる疾患を治療又は予防するために使用される組成物の製造における使用。
【請求項１８】
上皮細胞変性の増加又は上皮残存の減少によって生じる疾患を予防又は治療するための方法であって、膜又は細胞に有効量のＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤を接触させることを含む方法。
【請求項１９】
請求項１５において、ＶＥＧＦｘｘｘｂ又は被投与者の細胞内又は試験管内においてＶＥＧＦｘｘｘに優先してＶＥＧＦｘｘｘｂの存在又は発現を選択的に促進する薬剤である、薬剤。
【請求項２０】
請求項１６又は１８において、前記ＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤が、ＶＥＧＦｘｘｘｂ又は被投与者の細胞内又は試験管内においてＶＥＧＦｘｘｘに優先してＶＥＧＦｘｘｘｂの存在又は発現を選択的に促進する薬剤である、方法。
【請求項２１】
請求項１７において、前記ＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤が、ＶＥＧＦｘｘｘｂ又は被投与者の細胞内又は試験管内においてＶＥＧＦｘｘｘに優先してＶＥＧＦｘｘｘｂの存在又は発現を選択的に促進する薬剤である、使用。
【請求項２２】
上皮細胞生存を維持するために使用される、宿主生物内においてＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤を発現させる発現ベクター系。
【請求項２３】
上皮細胞生存を維持するための方法であって、生体内又は試験管内において、被投与者又は上皮膜に、有効量の、宿主生物内においてＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤を発現させる発現ベクター系を投与することを含む方法。
【請求項２４】
宿主生物内においてＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤を発現させる発現ベクター系の、上皮細胞生存を維持するために使用される組成物の製造における使用。
【請求項２５】
生体内において膜内における上皮細胞生存を維持するための方法であって、前記膜に、有効量の、宿主生物内においてＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤を発現させる発現ベクター系を接触させることを含む方法。
【請求項２６】
上皮細胞生存疾患に対するリスク又は感受性について患者を検査する方法であって、前記患者から生体試料を採取し、正常な絶対ＶＥＧＦｘｘｘｂ濃度又は正常なＶＥＧＦｘｘｘｂ：ＶＥＧＦｘｘｘ比に対する前記試料中のＶＥＧＦｘｘｘｂ濃度について分析することを含む方法。
【請求項２７】
上皮細胞生存疾患に対するリスク又は感受性について患者を検査する方法であって、前記患者の遺伝子型を決定して正常な絶対ＶＥＧＦｘｘｘｂ濃度又は正常なＶＥＧＦｘｘｘｂ：ＶＥＧＦｘｘｘ比に対するＶＥＧＦｘｘｘｂの過小発現のリスクを判定することを含む方法。
【請求項２８】
請求項１５〜２７のいずれか１項において、前記ＶＥＧＦｘｘｘｂが、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１８９ｂ、ＶＥＧＦ１４５ｂ、ＶＥＧＦ１８３ｂ及びＶＥＧＦ１２１ｂの１以上、好ましくはＶＥＧＦ１６５ｂを含む、薬剤、使用、方法又は発現ベクター系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小血管透過性亢進疾患、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生促進・透過性促進性調節疾患、透過性増加に依存しない上皮細胞生存疾患及び上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）疾患に対するＶＥＧＦｘｘｘｂの使用に関する。
【０００２】
また、本発明は、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の選択的スプライシングによって、微小血管透過性亢進疾患、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生促進・透過性促進性調節疾患、上皮細胞生存及び透過性疾患及び上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）疾患に罹患しているか、罹患するリスクのある患者によるＶＥＧＦｘｘｘｂの内因性発現を促進する薬剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
以下に言及する先行技術文献は、本願及び本願に対応する特許に適用される法律によって規定される範囲において本願明細書に援用する。
【０００４】
血管内皮細胞増殖因子Ａ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）−Ａ）は、内皮細胞の遊走、増殖、分化及び再生を引き起こす強力な血管新生因子である［１］。胎芽から成人の腎臓では、ＶＥＧＦ−Ａは推定及び成熟糸球体上皮細胞（足細胞）及び尿細管上皮細胞に発現する［２〜７］。
【０００５】
通常、糸球体形成には、上皮分化、内皮細胞浸潤並びに尿細管及び血管組織の増殖の協調誘導が必要となる。ＶＥＧＦタンパク質にヒトよりも１つ少ないアミノ酸を有するマウスでは、足細胞におけるＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の特定の過剰発現又は欠失によって糸球体機能不全が生じる［８，９］。１つの遺伝子コピーの足細胞特異的ｃｒｅレコンビナーゼノックアウトであっても、ネフローゼ症候群、尿毒症及び分娩後９週間における死亡が発生し、完全なノックアウトの場合には分娩後数時間で死亡した［８］。マウスでは、最も広く研究されているＶＥＧＦ−ＡのアイソフォームであるＶＥＧＦ１６４の糸球体過剰発現により、腎出血と共に分娩後数日間での死亡が発生する［８］。ＶＥＧＦ阻害研究では、生後０日目にＶＥＧＦ遮断抗体で治療したマウスは糸球体の著しい異常を示し、糸球体の多くは毛細血管網を欠いていた［４］。同様に、生後１日目及び８日目にマウスの子にｍＦｌｔ（１−３）ＩｇＧ（可溶性ＶＥＧＦ受容体−１キメラタンパク質）を投与すると、内皮細胞の喪失、メサンギウム基質の蓄積及び低細胞性を含む著しい糸球体の欠陥が生じる［１０］。これらの結果は、正常な糸球体の発達及び健康にはＶＥＧＦ−Ａ発現の厳格な管理が必要であることを示唆している。
【０００６】
（足細胞による）ＶＥＧＦ−Ａの発現と（糸球体内皮細胞上の）ＶＥＧＦ−Ａ受容体の時間的及び空間的に密接な関連は、ＶＥＧＦ−Ａはパラクリンループの存在によって糸球体の完全性を維持するために極めて重要な役割を果たすことを示唆しており［１１］、糸球体のＶＥＧＦ−Ａ発現の調節不全はヒトの様々な腎疾患に関連があることが示されている［１１］。また、ＶＥＧＦ−Ａ１６５は、オートクリン成長因子として増殖及び分化する糸球体上皮細胞（足細胞）に作用し［９］、細胞内カルシウム濃度の変化に関連して長期生存及びアポプトーシス耐性が得られる［１２］。
【０００７】
ＶＥＧＦ−Ａのアイソフォーム（アミノ酸数に応じて命名）は、単一のＶＥＧＦ−Ａ遺伝子からの完全長ｍＲＮＡ前駆体の８つのエクソンのディファレンシャルスプライシング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）によって生成する［国際公開第ＷＯ０３／０１２１０５号］。エクソン６及び７のディファレンシャルスプライシングによってヘパリン結合親和性が異なるアイソフォームが生成し［１３］、エクソン８（末端エクソン）のディファレンシャルスプライシングによってＣ末端の６個のアミノ酸のみが異なる血管新生促進及び抗血管新生アイソフォームのファミリーが生成する［１４］。血管新生促進ＶＥＧＦ−Ａアイソフォーム（ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９（ＶＥＧＦｘｘｘと総称、ｘｘｘはコードされたアミノ酸の数を示す））は、６個のアミノ酸のオープンリーディングフレームが翻訳されるエクソン８の近位スプライス部位（エクソン８ａ）の選択によって形成される。抗血管新生ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームはエクソン８の遠位スプライス部位（エクソン８ｂ）を使用して生成され、異なるアミノ酸配列をコードする近位（又は血管新生促進）スプライス変異体と同じ数のヌクレオチドのオープンリーディングフレームが得られる。そのため、得られるタンパク質は通常のアイソフォームと同じアミノ酸長を有し、ＶＥＧＦｘｘｘｂと総称される［１５］。
【０００８】
ヒトの腎皮質から特定された最初の抗血管新生アイソフォームはＶＥＧＦ１６５ｂである［１４］。ＶＥＧＦ１６５ｂは、ラット、ウサギ及びマウスの生理的・病理学的血管新生モデルにおいて生体内でＶＥＧＦ１６５及び低酸素による血管新生を阻害する［１６，１７］。ＶＥＧＦ１６５ｂは、試験管内において微小血管内皮細胞におけるＭＡＰＫを介したシグナリングを減衰及び遅延させ［１８］、完全な微小血管がＶＥＧＦ１６５ｂに暴露されると生体内において流体の急速かつ一過性の溢出を引き起こすが、微小血管の透水性の持続的な変化は引き起こさない［１９］。そのため、ＶＥＧＦ１６５ｂは促進性の生理学的役割を有するように思われる。タンパク質レベルでは、ＶＥＧＦｘｘｘｂは、眼球組織、結腸及び膵島等の多くの成体組織において優位なアイソフォームであるように思われる［１５］。そのため、ＶＥＧＦｘｘｘｂは正常な成熟糸球体の生理学的表現型（血管新生がない場合の高い透水性及び低いタンパク質透過性）を決定する役割を有する可能性がある。
【０００９】
糸球体濾過障壁（ＧＦＢ（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｂａｒｒｉｅｒ））はユニークな多層構造体であり（４１）、大きさ、形状及び電荷が異なる分子の溢出を制限する。ＧＦＢは、大きな脂質不溶性又はアニオン性分子に対して低い透過性を示し、水及び小さな水溶性物質に対して高い透過性を示す。糸球体疾患では、ＧＦＢによる分離機能が損なわれるか、失われる。そのような現象は、尿中のアルブミンによって発現する場合が最も多い。タンパク尿の糸球体疾患との関連性（重症のタンパク尿は重症の糸球体病変に関連する傾向がある）並びに一般集団においてもタンパク尿は血管疾患の主要な危険因子として現在分類されているため（８）、タンパク尿のメカニズムについては広く研究が行われている（１９，３４）。しかしながら、糸球体の透過選択性及び疾患におけるその喪失を決定する因子については現在も十分に理解されていない。正常な糸球体の表現型の制御メカニズムはおそらくは非常に複雑だが、ａ）物理的構造（例えば、足突起、スリット隔膜、関連タンパク質、窓、ＧＢＭ、糖衣、足細胞下空間）及びｂ）物理的変化（例えば、足細胞の移動、収縮、消失）又は成長因子（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、アンジオポイエチン−１、ＶＥＧＦ−Ｃ）の発現／分泌を介して障壁に寄与する細胞型の機能（すなわち、他の微小血管床における透過性に影響を及ぼす足細胞由来物質及び糸球体内皮細胞（１５）及び足細胞（１６）に存在する受容体）という２つの要因に依存する可能性が高い。
【００１０】
足細胞由来ＶＥＧＦの特異的な役割は明らかになっていないが、足細胞由来ＶＥＧＦの血管新生／透過能は注目を集めている（ただし、ＶＥＧＦ糸球体に関する文献では、矛盾や説明不可能な観察が見られる）。例えば、
ｉ）マウスにおける足細胞特異的ＶＥＧＦ１６４の過剰発現により、タンパク尿、崩壊腎症、尿毒症及び出生後５日間での死亡が発生するが（１４）、足細胞ＶＥＧＦ−Ａ糸球体の減少（ヘテロ接合体の不活性化）によっても、ネフローゼ症候群、尿毒症、２〜５週間での死亡が発生する（糸球体内皮症の場合）（１４）。
ｉｉ）成熟糸球体では、足細胞特異的ＶＥＧＦ１６４の過剰発現を誘導すると、遺伝子刺激から数時間以内にタンパク尿が生じるが［Ｑｕａｇｇｉｎの私信］、ヒトにおけるアバスチンによるＶＥＧＦの全身性阻害によってタンパク尿（４９）及び腎不全（１３）が生じる。
ｉｉｉ）抗ＶＥＧＦ抗体を投与すると、糖尿病性ネフロパシーの動物モデルにおいてタンパク尿が減少するが（９）、正常な動物ではタンパク尿を引き起こし（４５）、非糖尿病性動物モデルにＶＥＧＦを投与すると、糸球体障害が軽減する（３２）。
【００１１】
ＶＥＧＦを単に内皮細胞のみに作用する血管新生促進・透過性促進血管拡張因子と考える場合には、これらの研究の多くは矛盾する。
【００１２】
しかし、ＶＥＧＦの理解における２つの主要な変化により、ＶＥＧＦ生物学を根本的に再評価することになった。
【００１３】
第１の変化は、２００２年にペプチドの抗血管新生ＶＥＧＦｘｘｘｂファミリーが特定されたことである（１）。ＶＥＧＦ−Ａは、第６染色体上のエクソン８遺伝子からの選択的ｍＲＮＡスプライシングによって得られる２つのペプチドファミリーである。ファミリーのメンバー（アミノ酸数によって命名）は大きく異なる特性を有する（２２）。これらのファミリーは、６個のアミノ酸をコードする最終エクソンによってコードされた１８個のヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを有する。エクソン８ａが含まれる場合には、ペプチドの血管新生促進・透過促進ファミリー（ＶＥＧＦｘｘｘ）となるエクソン８ｂによってエクソン８ａを置換する（ＶＥＧＦｘｘｘｂファミリー）ことにより、生体内における生成物の特性が影響を受け、腫瘍の増殖を阻害する抗血管新生ぺプチドが得られる（１，３５，３７，４６，４８）。エクソン６及び７の選択的スプライシングにより、ヘパリン結合特性が異なる各ファミリーの複数のアイソフォームが得られる。各ファミリーにおいて主要なメンバーは１６５個のアミノ酸を含む（図８を参照）。
【００１４】
ＶＥＧＦ生物学における第２の変化は、ＶＥＧＦは内皮細胞特異的ではなく、非内皮細胞の生存を高めることが判明したことである。例えば、ＶＥＧＦ１６５は神経保護作用を有し（２６）、ＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１６５ｂはヒト足細胞保護性を有する（１６，１７）。本願明細書に記載する試験データは、ＶＥＧＦｘｘｘｂファミリー（例えば、ＶＥＧＦ１６５ｂ）がヒト足細胞保護性を有することを示している。
【００１５】
発達中又は成熟した糸球体におけるＶＥＧＦ−Ａに関する研究のほとんどは、ＶＥＧＦ１６５又は他の血管新生促進スプライス変異体の役割について調査又は推測している。ＶＥＧＦ−ＡアイソフォームのＶＥＧＦｘｘｘ及びＶＥＧＦｘｘｘｂファミリーを識別する抗体又はプローブはなかったため、過去の研究ではＶＥＧＦｘｘｘ及びＶＥＧＦｘｘｘｂファミリーを検出する抗体（ｐａｎ−ＶＥＧＦ抗体）を使用している。
【００１６】
Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．［２０］は、健康なヒト成人の腎臓の糸球体においてＶＥＧＦ１６５ｂがＶＥＧＦ１６５よりも高い濃度で発現するが、致命的な新生児期症状であるＤｅｎｙｓ−Ｄｒａｓｈ症候群において新生児期のヒト腎臓の糸球体にはＶＥＧＦ１６５ｂが存在しないことを実証している。しかしながら、Ｄｅｎｙｓ−Ｄｒａｓｈ症候群は、ＷＴ１遺伝子の突然変異によって生じる先天的な腎異常であることが知られている。そのため、微小血管透過性亢進疾患の治療におけるＶＥＧＦｘｘｘｂの有用性又は正常な腎臓の発達及び機能におけるＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォーム発現の役割についてはＳｃｈｕｍａｃｈｅｒの知見から推定することはできない。
【００１７】
本発明は、微小血管透過性亢進疾患、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生促進・透過性促進性調節疾患、上皮細胞生存及び透過性疾患、特に、ＧＦＢ関連腎透過性亢進疾患、特に、これらの種類のＶＥＧＦ依存性疾患に対してＶＥＧＦｘｘｘｂが活性を示すという予期せぬ知見に基づいてなされたものである。
【００１８】
特に、本願明細書に記載する試験管内データは、ＶＥＧＦ１６５ｂは生体内において抗血管新生作用を有すると共にＶＥＧＦ１６５−誘導ヒト内皮単層透過性を減少させることを示している。ネフリンプロモーターを対照とした足細胞においてＶＥＧＦ１６５ｂを過剰発現したヘテロ接合及びホモ接合形質転換マウスの生体内データは、エクソン８ｂ含有ＶＥＧＦペプチドの持続的な発現により、エクソン８ａ含有ペプチドを過剰発現した形質転換マウスから異なるマウス個体及び内臓表現型が得られることを示している。ホモ接合形質転換マウスは低い尿タンパク質：クレアチニン比を有し、内皮開窓密度の現象を伴う有意に低い糸球体正規化限外濾過係数（ＬｐＡ／ｖｉ）を有していた。また、ＶＥＧＦ１６５ｂの過剰発現により、マウスにおける全ＶＥＧＦの内因性発現が有意に減少した。マウスの足細胞の濾過膜の開窓数及び／又は大きさはＶＥＧＦｘｘｘｂによって有意に減少し、これは微小血管透過性の減少のメカニズムの一部であり、同様な現象は他の上皮濾過膜でも予想されることを示唆している。従って、これらのマウスモデルに関するデータは、ＶＥＧＦｘｘｘｂ（例えば、ＶＥＧＦ１６５ｂ）が、生体内において、微小血管透過性亢進疾患に対する活性、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生透過性亢進性を調節するための活性、透過性の増加に依存することなく上皮細胞生存を維持するための活性又は上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）を減少させるための活性を有することを示唆するものである。
【００１９】
ただし、ＶＥＧＦの作用は腎臓の上皮細胞に対する作用に限定されるものではない。網膜上皮及び内皮細胞消失は、眼の病変の多くの進行時における重要な事象（イベント）である。例えば、糖尿病性網膜症（ＤＲ）は、血管閉鎖、再発性虚血及びそれに続く低酸素誘発増殖性血管新生に関連する。進行した網膜血管新生（ＲＮＶ）では、硝子体出血、線維症及び網膜剥離が生じる場合がある。重症の糖尿病性網膜症は、従来の治療法にもかかわらず、先進国における労働人口の失明の最も一般的な原因である。また、加齢黄斑変性症における網膜色素上皮細胞消失により、地図状萎縮や、新生血管ＡＭＤにおいて見られる浸潤性脈絡叢血管新生が生じる場合がある。
【００２０】
血管新生を阻害することにより、ヒトの眼における血管新生を予防し、低酸素による血管由来の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の発現及びＲＰＥ細胞に対する代謝性発作（過剰な酸化コレステロール取り込みが関与する場合がある）による脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を介して生じるモデルにおける増殖性ＲＮＶの進行を予防することができる。ＶＥＧＦ阻害剤は、血管新生を阻害し、血管透過性を減少させることによって、加齢黄斑変性症における脈絡膜血管新生を治療するために有効であることが示されている。また、ＶＥＧＦ阻害剤は、内皮細胞死及び血管退行を引き起こすことが示されている。後者の特性は低酸素性糖尿病性眼症には望ましくないため、糖尿病性増殖性網膜症に対する治療としての利用は制限される。
【００２１】
ＶＥＧＦ−Ａの阻害スプライス変異体（ＶＥＧＦｘｘｘｂ）は、試験管内において血管内膜増殖、遊走、血管拡張及び管形成を刺激するＶＥＧＦの能力を妨げる。また、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂ及びＶＥＧＦ１２１ｂは、ウサギ角膜、マウス乳腺及び皮膚、ラット腸間膜、ニワトリ絨毛尿膜及び５つの異なる腫瘍モデルにおいて血管新生を阻害することが示されている。ヒト及び齧歯動物の網膜、硝子体及び虹彩における血管新生及び抗血管新生アイソフォームの存在が実証されている。また、阻害的ＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームは正常な硝子体で最も多く存在するが、糖尿病の硝子体で比較的ダウンレギュレートされ、血管由来の表現型に切り替わる。さらに、血管新生促進アイソフォームであるＶＥＧＦ−Ａ１６５は、網膜虚血において神経保護剤として機能することが示されている。従って、内因的には、眼は、正常な生理機能におけるＶＥＧＦ−Ａ１６５の作用に対する拮抗阻害剤であるＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂの高濃度で含むが、十分に血管が発達し、健康な神経細胞を有するという矛盾があるように思われる。そのため、眼におけるＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂ媒介血管新生阻害は、血管退行、内皮細胞死又はニューロン損傷を引き起こさないと考えることができる。ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂは、再血管新生（網膜の血管形成領域への既存の血管の再構成）ではなく、ＶＥＧＦ−Ａ１６５媒介新血管形成（網膜における新たな血管の形成）を標的とする可能性がある。ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂがヒト糸球体上皮細胞を保護するとすれば、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂは同様に網膜上皮及び内皮細胞を保護する可能性がある。内皮及び網膜上皮生存、新血管形成、血管再生に対するＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂの作用の研究結果を本願明細書に記載する。
【発明の概要】
【００２２】
本発明の第１の態様は、微小血管透過性亢進疾患を治療又は予防するために使用されるか、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生透過性亢進性を調節するために使用されるか、血管透過性の増加に依存することなく上皮細胞生存を維持するために使用されるか、上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）を減少させるために使用されるＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤を提供する。
【００２３】
本発明の第２の態様は、微小血管透過性亢進疾患を治療又は予防するか、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生透過性亢進性を調節するか、血管透過性の増加に依存することなく上皮細胞生存を維持するか、上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）を減少させるための方法であって、そのような疾患に罹患しているか、罹患しやすい被投与者に有効量のＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤を投与することを含む方法を提供する。
【００２４】
本発明の第３の態様は、ＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤の、微小血管透過性亢進疾患を治療又は予防するか、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生透過性亢進性を調節するか、血管透過性の増加に依存することなく上皮細胞生存を維持するか、上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）を減少させるための組成物（例えば、医薬組成物）の製造における使用を提供する。
【００２５】
本発明の第４の態様は、生体内又は試験管内（生体外を含む）において微小血管膜の透過性を減少させるか、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生透過性亢進性を調節するか、血管透過性の増加に依存することなく上皮細胞生存を維持するか、生体内において上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）を減少させるための方法であって、前記膜に有効量のＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤を接触させることを含む方法を提供する。
【００２６】
本発明の第５の態様は、上皮細胞変性の増加又は上皮残存の減少によって生じる疾患を治療又は予防するために使用されるＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤を提供する。前記薬剤を使用することにより、上皮細胞生存が維持されるか、上皮細胞死が防止される。
【００２７】
本発明の第６の態様は、上皮細胞変性の増加又は上皮残存の減少によって生じる疾患を予防又は治療するための方法であって、そのような疾患に罹患しているか、罹患しやすい被投与者に有効量のＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤を投与することを含む方法を提供する。
【００２８】
本発明の第７の態様は、ＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤の、上皮細胞変性の増加又は上皮残存の減少によって生じる疾患を治療又は予防するための組成物（例えば、医薬組成物）の製造における使用を提供する。
【００２９】
本発明の第８の態様は、上皮細胞変性の増加又は上皮残存の減少によって生じる疾患を予防又は治療するための方法であって、膜に有効量のＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤を接触させることを含む方法を提供する。
【００３０】
本発明の第５〜第８の態様並びに対応する同様な態様では、前記薬剤を使用することにより、上皮細胞生存が維持されるか、上皮細胞死が防止される。上皮細胞生存の維持は、上皮膜の血管透過性の増加を伴うものであってもよく、上皮膜の血管透過性の増加を伴わないものであってもよい。
【００３１】
また、本発明は、ＶＥＧＦｘｘｘｂの代わりに使用する、又はＶＥＧＦｘｘｘｂと共に使用する、国際公開第ＷＯ２００８／１１０７７７号に開示された薬剤等の、健常者又は治療を受けていない患者に対して相対的に、又は被投与者の細胞内又は試験管内においてＶＥＧＦｘｘｘに優先してＶＥＧＦｘｘｘｂの存在又は発現を選択的に促進する薬剤の対応する使用を含む。そのような薬剤の使用は、本発明の別の態様を構成するものである。特に、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子のＣ末端エクソン８から転写されたＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ前駆体のプロセッシング時に遠位スプライシング部位（ＤＳＳ）スプライシングに有利に作用する物質が挙げられる。そのような薬剤は、必要に応じて、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子のＣ末端エクソン８から転写されたＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ前駆体のプロセッシング時に近位スプライシング部位（ＰＳＳ）スプライシングを抑制又は阻害する１種以上の制御剤と共に使用することができる（国際公開第ＷＯ２００８／１１０７７７号を参照）。被投与者の細胞内又は試験管内においてＶＥＧＦｘｘｘと相対的にＶＥＧＦｘｘｘｂの発現（存在）を選択的に促進する薬剤としては、特異的抗ＶＥＧＦｘｘｘ抗体等のＶＥＧＦｘｘｘの機能を選択的に阻害する薬剤も挙げられる。
【００３２】
ＶＥＧＦｘｘｘｂは、完全長ＶＥＧＦｘｘｘｂタンパク質又はその抗血管新生フラグメントあるいは完全長ＶＥＧＦｘｘｘｂタンパク質と機能的に同等なＶＥＧＦｘｘｘｂ由来又は関連タンパク質であってもよい。「ＶＥＧＦｘｘｘｂ」という用語は上述した意味で使用する。
【００３３】
本願明細書において使用する「活性薬剤」及び「ＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤」という用語は、生体内又は試験管内において、健常者又は治療を受けていない患者に対して相対的に又はＶＥＧＦｘｘｘに優先して（ＶＥＧＦｘｘｘに対して相対的に）ＶＥＧＦｘｘｘｂの存在又は内因性発現を促進するＶＥＧＦｘｘｘｂタンパク質及び薬剤を含む。
【００３４】
本発明の別の態様は、微小血管透過性亢進疾患、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生促進・透過性促進性調節疾患、上皮細胞生存及び透過性疾患及び／又は上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）疾患に対するリスク又は感受性について患者を検査する方法であって、前記患者から生体試料を採取し、正常な絶対ＶＥＧＦｘｘｘｂ濃度又は正常なＶＥＧＦｘｘｘｂ：ＶＥＧＦｘｘｘ比に対する前記試料中のＶＥＧＦｘｘｘｂ濃度について分析することを含む方法を提供する。分析結果に応じて、本発明の第２の態様に係る方法を患者に対して適用することができる。
【００３５】
本発明の別の態様は、微小血管透過性亢進疾患、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生促進・透過性促進性調節疾患、上皮細胞生存及び透過性疾患及び／又は上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）疾患に対するリスク又は感受性について患者を検査する方法であって、前記患者の遺伝子型を決定して正常な絶対ＶＥＧＦｘｘｘｂ濃度又は正常なＶＥＧＦｘｘｘｂ：ＶＥＧＦｘｘｘ比に対するＶＥＧＦｘｘｘｂの過小発現のリスクを判定することを含む方法を提供する。分析結果に応じて、本発明の第２の態様に係る方法を患者に対して適用することができる。
【００３６】
本発明の別の態様は、上皮細胞生存疾患に対するリスク又は感受性について患者を検査する方法であって、前記患者から生体試料を採取し、正常な絶対ＶＥＧＦｘｘｘｂ濃度又は正常なＶＥＧＦｘｘｘｂ：ＶＥＧＦｘｘｘ比に対する前記試料中のＶＥＧＦｘｘｘｂ濃度について分析することを含む方法を提供する。分析結果に応じて、本発明の第２の態様に係る方法を患者に対して適用することができる。
【００３７】
本発明の別の態様は、上皮細胞生存疾患に対するリスク又は感受性について患者を検査する方法であって、前記患者の遺伝子型を決定して正常な絶対ＶＥＧＦｘｘｘｂ濃度又は正常なＶＥＧＦｘｘｘｂ：ＶＥＧＦｘｘｘ比に対するＶＥＧＦｘｘｘｂの過小発現のリスクを判定することを含む方法を提供する。分析結果に応じて、本発明の第２の態様に係る方法を患者に対して適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】正常なヒト腎皮質におけるＶＥＧＦ及びＶＥＧＦアイソフォームの２つのファミリーの発現を示す。ＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームは成人の腎皮質組織において全ＶＥＧＦの４５％を超える。
【図２】成人の腎臓におけるＶＥＧＦｘｘｘｂ及びｐａｎ−ＶＥＧＦの免疫組織化学染色を示す。糸球体足細胞（Ａ、矢印）、腎皮質の近位及び遠位細管（Ｂ）、腎髄質のヘンレ係蹄（Ｃ）におけるＶＥＧＦｘｘｘｂの染色が明確に観察できる。ｐａｎ−ＶＥＧＦ抗体で処理した切片（Ｄ及びＦ）も同様な染色パターンを示した。マウスＩｇＧ対照は陰性だった（Ｇ〜Ｉ）。スケール＝３０μｍ、Ａ＝１０μｍ。（ＰＴ＝近位尿細管、ＤＴ＝遠位尿細管、ＴＬＨ＝薄いヘンレ係蹄、ＴｋＬＨ＝厚いヘンレ係蹄、ＣＤ＝集合管、ＶＲ＝直細血管）。
【図３】後腎のＶＥＧＦｘｘｘｂ及びｐａｎ−ＶＥＧＦの免疫組織化学染色の概観を示す。ＶＥＧＦｘｘｘｂ（Ａ及びＢ）及びｐａｎ−ＶＥＧＦ（Ｃ及びＤ）染色は１０週目（Ａ及びＣ）及び１２週目（Ｂ及びＤ）の胎児の後腎の特定の発育領域で観察された。マウスＩｇＧ対照は陰性だった（Ｅ及びＦ）。スケール＝６００μｍ。
【図４】ネフロン形成の初期におけるＶＥＧＦｘｘｘｂ及びｐａｎ−ＶＥＧＦの免疫組織化学染色を示す。糸球体発達時に細胞内のＶＥＧＦｘｘｘｂ（Ａ〜Ｄ）及びｐａｎ−ＶＥＧＦ（Ｅ〜Ｈ）染色が観察された。ネフロン形成の様々な段階においてＶＥＧＦｘｘｘｂ（Ａ）及びｐａｎ−ＶＥＧＦ（Ｅ）染色が特定の染色パターンで観察された。例えば、凝集小胞（Ｂ、Ｆ）において、間葉細胞が上皮特性を獲得すると染色はさらに分極した。Ｃ体（Ｃ、Ｇ）及びＳ体（Ｄ、Ｈ）において、ＶＥＧＦｘｘｘｂ（Ｃ、Ｄ）及びｐａｎ−ＶＥＧＦ（Ｇ、Ｈ）染色は原始上皮細胞（特に先端）及び糸球体裂溝に局在化した。スケール＝３０μｍ。（ＧＣ＝糸球体裂溝、ＣＶ＝凝集小胞、ＣＳＢ＝Ｃ体、ＳＳＢ＝Ｓ体、Ｇ＝糸球体、矢印＝糸球体裂溝のびまん性染色）。
【図５】糸球体の成熟時のＶＥＧＦｘｘｘｂ免疫組織化学染色を示す。先端及び基底外側のＶＥＧＦｘｘｘｂ（Ａ、Ｃ、Ｅ）及びｐａｎ−ＶＥＧＦ（Ｂ、Ｄ、Ｆ）染色。推定足細胞及び糸球体裂溝は毛細血管係蹄段階（Ａ、Ｂ）にびまん性染色を示す。糸球体が発達し、推定足細胞が成熟すると、ＶＥＧＦｘｘｘｂ染色強度は減少するが（Ｃ）、ｐａｎ−ＶＥＧＦ染色は強いままであり（Ｄ）、ＶＥＧＦｘｘｘｂは成熟足細胞の亜集団により特異的になる（Ｅ）。この段階では、ｐａｎ−ＶＥＧＦ染色は足細胞においてより広範囲となる（Ｆ）。スケール＝５０μｍ。（ＧＣ＝糸球体裂溝、ＭＤ＝緻密斑、矢印＝上皮細胞（ｐａｒｉｅｔａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ））。
【図６】発育中の腎皮質及び髄質の細管におけるＶＥＧＦｘｘｘｂ及びｐａｎ−ＶＥＧＦの免疫組織化学染色を示す。曲尿細管の近位及び遠位領域においてＶＥＧＦｘｘｘｂの染色が観察された（Ａ及びＣ）。近位尿細管及び導管において強いｐｅｒｉｌｕｍｉｎａｌ染色が観察された。ｐａｎ−ＶＥＧＦ染色でも同様な免疫組織化学染色が観察された（Ｂ及びＤ）。スケール＝３０μｍ。（ＧＣ＝糸球体裂溝、ＭＤ＝緻密斑、ＰＴ＝近位尿細管、ＤＴ＝遠位尿細管、ＣＤ＝集合管、ＶＲ＝直細血管）。
【図７】ＶＥＧＦ１６５ｂは糸球体上皮細胞に対する細胞保護作用を有し、内皮細胞のＶＥＧＦ１６５媒介遊走及び透過性増加を阻害することを示す。（Ａ）ＶＥＧＦ１６５ｂは、用量依存的にＶＥＧＦ１６５による内皮細胞の遊走を阻害する（ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ）。（Ｂ）ＶＥＧＦ１６５ｂは、用量依存的に初代培養足細胞における細胞死を防止する（ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ）。（Ｃ）ＶＥＧＦ１６５ｂは、血清飢餓によるアポプトーシスを阻害する。（Ｃｉ）４８時間の血清飢餓（ＳＳ）又は（Ｃ２）１ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５ｂ及びＳＳで処理したアネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム染色ヒト条件的不死化足細胞（ｈＣＩＰ）のフローサイトメトリー。Ｖ＝ｖｉａｂｌｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ、Ｎ＝ｎｅｃｒｏｔｉｃ、Ａ＝ａｐｏｐｔｏｔｉｃ、ＬＡ＝Ｌａｔｅ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ。（Ｄ）ＶＥＧＦ１６５ｂは糸球体単層の透過性を減少させる。ＶＥＧＦ１６５ｂは培養単層における糸球体の経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を増加させ、ＶＥＧＦ１６５はＴＥＥＲを減少させ（透過性を増加させ）、ＶＥＧＦ１６５ｂはＶＥＧＦ１６５による減少を阻害する。（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１（対照と比較）、＋＋＝ｐ＜０．０１（ＶＥＧＦ１６５ｂ及びＶＥＧＦ１６５と比較））。片側ＡＮＯＶＡ及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ分析。
【図８】ＶＥＧＦ−Ａサブファミリーを示す。命名法は最終的なペプチドのアミノ酸数に基づく。２つのｍＲＮＡイソフォームファミリーは異なるヘパリン結合領域で発生する（エクソン６及び７）。血管新生促進アイソフォーム（ＶＥＧＦｘｘｘ、左）はエクソン８（８ａ）の近位スプライス部位（ＰＳＳ）選択によって発生し、抗血管新生（ＶＥＧＦｘｘｘｂ）ファミリーはエクソン８の遠位スプライス部位選択（エクソン８ｂ）（ＤＳＳ）によって発生する。そのため、エクソン８のＰＳＳ選択によって形成されたＶＥＧＦ１６５は遠位スプライス部位（ＤＳＳ）アイソフォームとしてＶＥＧＦ１６５ｂを有する。ＤＳＳ選択ｍＲＮＡはＶＥＧＦ１６５と同じ長さのタンパク質をコードする。エクソン６ａ’はエクソン６ａの保存された選択的スプライシング供与部位の結果としてＶＥＧＦ１８３に生じ、完全長のエクソン６ａよりも１８ｂｐ短い。ＶＥＧＦ２０６ｂはまだ特定されていない。ＵＴＲ＝非翻訳領域。
【図９】ｐＮｅｐｈ−ＶＥＧＦ１６５ｂヘテロ接合形質転換マウスの継代を示す。ネフリンプロモーターの対照下でＶＥＧＦ１６５ｂを発現ベクターにクローニングした（形質転換構成体、図９Ａｉ）。ヒト足細胞にトランスフェクトすると、対照ベクター又はトランスフェクトしていない細胞と比較してＶＥＧＦ１６５ｂの発現は有意に多かった（図９Ａｉｉ）。図９Ｂは胎芽から生まれた子のＰＣＲスクリーンを示す。図９Ｃはサザンブロットを示し、ゲノムＤＮＡへの単一の挿入部位を示す。ｇＤＮＡはＥｃｏＲ１で消化させ、形質転換体を作成するためのｃＤＮＡからプローブを作成した。挿入部位の５’末端に１つのＥｃｏＲ１部位があり、複数の挿入によってトランス遺伝子において複数の異なる大きさのバンドが生成する。ライン１には１つのバンドのみがあり、１つの挿入点を示す（複数の部位への挿入によって複数のバンドが生成する）。ライン１はヘテロ接合体及びホモ接合体コロニーの作成に使用した。図９Ｄは創始系統からの限外濾過係数は互いに異なっていなかったことを示す。
【図１０】腎臓の糸球体上皮細胞（足細胞）においてｐＮｅｐｈ−ＶＥＧＦ１６５ｂヘテロ接合及びホモ接合形質転換マウスがＶＥＧＦ１６５ｂを過剰発現していることを示す。腎臓糸球体におけるＶＥＧＦ１６５ｂの発現を調べた（図１０Ａｉ及び図１０Ａｉｉ）。トランス遺伝子のための腎皮質のエクソン８ｂ特異的ＲＴ  ＰＣＲ（＜０．０５、カイ二乗傾向性検定、１群あたりＮ＝３）。図１０Ｂは、抗ヒトＶＥＧＦ（Ａ２０  ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ）ｘ１０００を使用した免疫組織化学分析を示し、足細胞におけるＶＥＧＦの発現を示している。図１０Ｃは、ＶＥＧＦｘｘｘｂ特異的ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した形質転換及び野生型マウスの腎皮質から遺伝子変異から抽出したタンパク質のＥＬＩＳＡを示す（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）。
【図１１】足細胞特異的ＶＥＧＦ１６５ｂの過剰発現によって糸球体の透水性が減少したことを示す。ヘテロ接合及びホモ接合ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂ過剰発現のマウスにおいて正規化糸球体限外濾過係数は有意に減少した。ＶＥＧＦ１６５ｂ過剰発現ヘテロ接合体マウスにおける糸球体の透水性の減少はＶＥＧＦ１６５との培養によって減少した。処理前後に同じ糸球体に対してペア測定を行った。バーは平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．ＬｐＡ／ｖｉ測定値を表す。括弧内の数字は糸球体の数を示す。（＊＝ｐ＜０．０５（野生型同腹子と比較）、††＝ｐ＜０．００１（野生型と比較）、＃＃ｐ＜０．００１（ヘテロ接合体と比較）、片側ＡＮＯＶＡ及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正、‡＝ｐ＜０．０５（同じＮｅｐｈＶＥＧＦ１６５ｂ形質転換マウスの未処理糸球体と比較）、ペアｔ検定）。
【図１２】糸球体のＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂ過剰発現は腎機能に大きな影響を与えないことを示す。（Ａ）血漿［クレアチニン］（μｍｏｌ／Ｌ）、（Ｂ）血漿［尿素］（ｍｍｏｌ／Ｌ）、（Ｃ）代謝ケージを使用して採取した尿のタンパク質：クレアチニン比（ｍｇ／ｍｍｏｌ）を測定することによって形質転換マウス及び野生型同腹子における腎臓機能及びタンパク尿を調べた。
【図１３】対照野生型糸球体へのＶＥＧＦ１６５ｂの外因性投与によって正規化糸球体限外濾過係数が減少したことを示す。図１３Ａは、対照溶液、４０ｐＭ組替え型ヒトＶＥＧＦ１６５ｂ又は１ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５ｂに６０分間暴露した正常な野生型糸球体の集団を示す。バーは平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．ＬｐＡ／ｖｉ測定値を表す。括弧内の数字は糸球体の数を示す。＊ｐ＜０．０５（対照と比較）、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ片側ＡＮＯＶＡ及びＤｕｎｎｅｔｔ補正）。図１３Ｂは、単離マウス糸球体の正規化ＬｐＡ／ｖｉに対するｒｈＶＥＧＦ１６５ｂの対照的な特性（図１３Ｂｉ）及びラット糸球体に対する同様な濃度のｒｈＶＥＧＦ１６５の公表データ（参考文献３９）（図１３Ｂｉｉ）を示す。
【図１４】足細胞におけるヒトＶＥＧＦ１６５ｂ（ヘテロ接合及びホモ接合）の過剰発現は内因性ＶＥＧＦ発現の減少を引き起こすことを示す。タンパク質は、野生型、ヘテロ接合体及びホモ接合体の腎臓からシグマプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加したＲＩＰＡ緩衝液を使用して抽出した。組織ホモジネート内の内因性マウスＶＥＧＦをＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ＭＯＵＳＥ  ＶＥＧＦ）を使用して測定した。ＥＬＩＳＡによってマウスＶＥＧＦ１２０及びＶＥＧＦ１６４が検出され、ヒトＶＥＧＦと低い交差反応性（０．２％）が見られた（＊ｐ＜０．０５、Ｋｒｕｓｋｉｌ  Ｗａｌｉｓ  Ｄｕｎｎｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定）。
【図１５】超微形態学的表現型を示す。図１５Ａは全ての動物におけるヘマトキシリン及びエオシン光学顕微鏡分析を示す。図１５Ｂは電子顕微鏡分析を示し、足細胞下空間（ＳＰＳ）によって囲まれたＧＦＢの面積の有意差は見られなかった（野生型同腹子［ＷＴ］対照：５５ア５％、ホモ接合体：４１ア１０％、ｐ＝ＮＳ）。しかし、開窓の数及び大きさの有意な減少がホモ接合体マウスで観察された（図１５Ｃ）。上記ＥＭ研究では７０ｎｍの切片を使用した。図１５Ｄは、通常の隔壁開窓（図１５Ｅ、矢印）よりも電子高密度物質を含む閉鎖型開窓はホモ接合体マウスにおいて顕著であったことを示す（矢印）。
【図１６】ホモ接合体マウスの糸球体基底膜の血管側の超微形態学的表現型を示す（開窓パラメータは４０ｎｍの切片を使用して調べた）。図１６Ａはホモ接合形質転換マウスの糸球体における閉鎖型開窓の例（９／１１）を示す。図１６ＢはＧＦＢの機能的領域において開窓密度が有意に減少したことを示す。図１６Ｃは総開窓の割合としての閉鎖型開窓の割合を示す。図１６Ｄは開窓幅を示す。図１６Ｄは閉じた開窓幅を示す。ＷＴ＝野生型同腹子対照、Ｈｏｍ＝トランス遺伝子のホモ接合体。ＳＰＳ  ｃｏｖｅｒｅｄ  ＧＦＢ＝濾液がボーマン空間に達するように制限的な足細胞下空間から出るＧＦＢの領域。Ｎｏｎ−ＳＰＳ  ｃｏｖｅｒｅｄ  ＧＦＢ＝濾液がボーマン空間に直接入るＧＦＢの領域。
【図１７】足細胞特異的ＶＥＧＦ１６５ｂ過剰発現ヘテロ接合形質転換マウスは、ＳＴＺ誘導性糖尿病に関連する糸球体病変に対して耐性を有することを示す。野生型同腹子対照と同一齢の１２週目のヘテロ接合体ＶＥＧＦ１６５ｂマウスの群（ｎ＝５、各群）には１００μｇ／ｇ（体重）／日の用量で３日間投与した（２００μＬの注入量）。対照には同量のクエン酸塩緩衝液を投与した。空腹時（１時間）血糖値、尿タンパク質／クレアチニン比及び体重を２週間毎に測定した。誘導後６週間目に、マウスを代謝ケージに入れ、尿を１２時間にわたって採取し、ＥＬＩＳＡによって尿中アルブミン量を測定した（＊ｐ＜０．０５（糖尿病野生型と比較、ＡＮＯＶＡ、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）。ＳＴＺ群の血中グルコース濃度は同様だった（ＳＴＺ  ＷＴ：２２．９７±１．４７ｍｍｏｌ／Ｌ、ＳＴＺ  ＨＥＴ：２６．４２±１．４５ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐ＝ＮＳ））。
【図１８】ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂは酸素誘発網膜障害モデルにおいて新血管形成を阻害するが、血管再生を妨げないことを示す。
【図１９】ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂはヒト網膜内皮細胞の遊走を阻害することを示す。
【図２０】ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂはヒト内皮細胞の生存因子であることを示す。
【図２１】ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂはＲＰＥ細胞の細胞保護剤であることを示す。
【図２２】ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂは内因性生存因子であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
図面及び実施例を参照して本発明についてさらに説明する。
【００４０】
ＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤
「ＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤」という用語は、生体内又は試験管内において、健常者又は治療を受けていない患者に対して相対的に又はＶＥＧＦｘｘｘに優先して（ＶＥＧＦｘｘｘに対して相対的に）ＶＥＧＦｘｘｘｂの存在又は内因性発現を促進するＶＥＧＦｘｘｘｂタンパク質（例えば、完全長タンパク質及びその抗血管新生フラグメント）及び薬剤を含む。
【００４１】
本発明において使用するＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤は、任意の適当な手段によって調製することができる。
【００４２】
細胞内においてＶＥＧＦｘｘｘに優先して（ＶＥＧＦｘｘｘに対して相対的に）ＶＥＧＦｘｘｘｂの内因性発現を促進するように細胞に作用する薬剤の使用は、本発明において使用するＶＥＧＦｘｘｘｂを調製する手段の１つである。そのような薬剤の詳細については国際公開第ＷＯ２００８／１１０７７７号を参照されたい。
【００４３】
従って、「ＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤」という用語の範囲には、宿主生物内においてＶＥＧＦｘｘｘｂを発現させる発現ベクター系が含まれる。宿主生物は、治療対象の患者又は治療対象の患者に適した他の生物であってもよい。そのような発現ベクター系は、好適には、ＶＥＧＦｘｘｘｂをコードするヌクレオチド配列に関連するプロモーターヌクレオチド配列を含み、適当なトランスフェクション及び培養条件下において宿主生物内においてＶＥＧＦｘｘｘｂを発現させることができる。さらなる詳細については、「遺伝子療法」と題する節を参照されたい。
【００４４】
従って、「ＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤」という用語の範囲には、宿主生物（好適には治療対象の患者）内におけるＶＥＧＦｘｘｘ阻害系が含まれ、ＶＥＧＦｘｘｘ阻害系により、宿主生物又は宿主生物の特定の組織内におけるＶＥＧＦｘｘｘに対する活性ＶＥＧＦｘｘｘｂの比率は増加する。ＶＥＧＦｘｘｘ阻害系は、例えば、モノクローナル又はポリクローナル特異的抗ＶＥＧＦｘｘｘ抗体等の特異的抗ＶＥＧＦｘｘｘ抗体を含むことができる［１５，１６，２５］。あるいは、ＶＥＧＦｘｘｘ阻害系は、宿主生物内においてＶＥＧＦｘｘｘ阻害系を発現させる発現ベクター系を含むことができる。そのような発現ベクター系は、好適には、特異的抗ＶＥＧＦｘｘｘ抗体等のＶＥＧＦｘｘｘタンパク質阻害系をコードするヌクレオチド配列に関連するプロモーターヌクレオチド配列を含み、適当なトランスフェクション及び培養条件下において宿主生物内においてＶＥＧＦｘｘｘタンパク質阻害系を発現させることができる。
【００４５】
必要に応じて、２種以上のＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤及び／又は特定のＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤の２以上の実施形態を同時又は連続的に使用することができる。
【００４６】
例えば、ＶＥＧＦｘｘｘｂは、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１８９ｂ、ＶＥＧＦ１４５ｂ、ＶＥＧＦ１８３ｂ及びＶＥＧＦ１２１ｂの１以上を含むことができる。ＶＥＧＦｘｘｘｂは、好適には、組換え型ＶＥＧＦｘｘｘｂ、好ましくは組替え型ヒトＶＥＧＦｘｘｘｂ（ｒｈＶＥＧＦｘｘｘｂ）を含む。
【００４７】
ＶＥＧＦｘｘｘｂは、好ましくは、ＶＥＧＦ１６５ｂ、例えば組換え型ＶＥＧＦ１６５ｂ（組替え型ヒトＶＥＧＦ１６５ｂ（ｒｈＶＥＧＦ１６５ｂ）等）を含む。
【００４８】
例えば、ＶＥＧＦｘｘｘｂは、ＶＥＧＦ１６５ｂ、例えば組換え型ＶＥＧＦ１６５ｂ（組替え型ヒトＶＥＧＦ１６５ｂ（ｒｈＶＥＧＦ１６５ｂ）等）から実質的になることができる。例えば、ＶＥＧＦｘｘｘｂは、ＶＥＧＦ１６５ｂ、例えば組換え型ＶＥＧＦ１６５ｂ（組替え型ヒトＶＥＧＦ１６５ｂ（ｒｈＶＥＧＦ１６５ｂ）等）からなることができる。
【００４９】
被投与者の細胞内又は試験管内においてＶＥＧＦｘｘｘに優先して（ＶＥＧＦｘｘｘに対して相対的に）ＶＥＧＦｘｘｘｂの発現を選択的に促進するＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤
そのような薬剤は、国際公開第ＷＯ２００８／１１０７７７号の６頁２２行〜８頁９行に開示されており、国際公開第ＷＯ２００８／１１０７７７号の残りの部分では、ＰＳＳスプライシングと比較してＤＳＳスプライシングに有利に作用する点が詳述されている。以下の説明においては、国際公開第ＷＯ２００８／１１０７７７号の該当部分も参照されたい。
【００５０】
特に、形質転換成長因子（ＴＧＦ）−β１、ＴＧＦ−βＲ１、ＳＲＰＫ１特異的阻害剤（例えば、ＳＲＰＩＮ３４０）、Ｔ細胞細胞内抗原−１（ＴＩＡ−１）、ＭＫＫ３／ＭＫＫ６−活性化ＭＡＰキナーゼ（例えば、ｐ３８  ＭＡＰＫ）、Ｃｄｃ２０様（Ｃｌｋ）ファミリーキナーゼＣｌｋ１／ｓｔｙ、Ｃｌｋ２、Ｃｌｋ３、Ｃｌｋ４、ＳＲスプライシング因子ＳＲｐ５５、それらの生体内活性剤、アップレギュレータ、増強剤、一次活性又はその作用の制御に有用な二次機能を有する上記物質の修飾体、上記物質を生体内において発現させるための発現ベクター、ｍＲＮＡ前駆体のエクソン８ａのＰＳＳ及び／又はスプライシング調節タンパク質が結合するｍＲＮＡ前駆体の領域に結合して近位スプライシングを阻害する転写／翻訳遮断剤（例えば、モルフォリノ又はその他の合成遮断剤、共役ペプチド、ＲＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ポリ及びオリゴヌクレオチド遮断剤（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ））、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＳＲタンパク質キナーゼ（ＳＲＰＫ）阻害剤（例えば、ＳＲＰＩＮ３４０）、その他の機構的に類似するＳＲＰＫ阻害剤、特にＳＲＰＫ触媒領域で結合する阻害剤）又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００５１】
そのような発現ベクター系は、好適には、ＶＥＧＦｘｘｘに優先してＶＥＧＦｘｘｘｂの発現を促進する物質をコードするヌクレオチド配列に関連するプロモーターヌクレオチド配列を含み、適当なトランスフェクション及び培養条件下において宿主生物（好適には治療対象の被投与者）内においてＶＥＧＦｘｘｘに優先してＶＥＧＦｘｘｘｂの発現を促進する物質を発現させることができる。さらなる詳細については、「遺伝子療法」と題する節を参照されたい。
【００５２】
治療対象の症状及び疾患
微小血管過透過性、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生促進・透過性促進性調節疾患、上皮細胞生存及び透過性疾患及び／又は上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）疾患は、多くの重度の病状の根底にある。
【００５３】
そのような病状の例としては、タンパク尿、尿毒症、微量アルブミン尿、低タンパク血症、腎臓の過剰濾過、ネフローゼ症候群、腎不全、肺動脈高血圧、毛細血管過透過性、毛細血管瘤、浮腫、糖尿病の血管合併症が挙げられる。
【００５４】
糖尿病の血管合併症の例としては、糖尿病性網膜症（増殖性及び非増殖性）及び糖尿病性腎症が挙げられる。糖尿病の血管合併症は、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病に伴って生じ得る。
【００５５】
血液からタンパク質が失われると、血栓症（特に脳血栓症）感染症感受性等のさらなる合併症が生じ得る。血液から天然タンパク質が失われると、癌療法の有効性が大きく損なわれる。
【００５６】
微小血管透過性亢進疾患は、特に、ＧＦＢの透過性疾患（例えば、足細胞の透過性疾患）等の腎障害であってもよい。
【００５７】
上皮細胞生存を維持する治療が有効な疾患の例としては、急性肺線維症、成人呼吸促窮迫症候群、進行癌、アレルギー性呼吸器疾患、肺胞傷害、血管新生、関節炎、腹水、喘息、火傷後の喘息又は水腫、アテローム性動脈硬化、自己免疫疾患、骨吸収、水疱性類天疱瘡等の表皮下水疱形成に関連する水疱性障害、心臓血管症状、糸球体又はメサンギウム細胞の増殖に関連する腎臓病、慢性及びアレルギー性炎症、慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、肝硬変、角膜血管新生、角膜疾患、冠状動脈及び脳側副血管新生（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｎｄ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、冠状動脈再狭窄、心臓病後の損傷、疱疹状皮膚炎、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、内毒素性ショック、多型紅斑、線維症、糸球体腎炎、腎炎、移植片拒絶、グラム陰性菌敗血、血管腫、肝硬変、肝不全、帯状疱疹、宿主対移植片反応（腎臓、肝臓、心臓及び皮膚の虚血再潅流損傷及び同種移植拒絶反応）、感染症における創傷治癒不全、単純ヘルペスによる感染症、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、炎症、癌、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎）、炎症性疾患、ステント再狭窄、ステント狭窄、虚血、虚血性網膜静脈閉塞症、静脈うっ血性網膜症、カポージ肉腫、ケロイド、急性炎症時の肝臓疾患、肺同種移植拒絶反応（閉塞性気管支炎）、リンパ性悪性疾患、黄斑退化未熟網膜症、骨髄形成異常症候群、心筋血管新生、新生血管緑内障、非インスリン依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、閉塞性細気管支炎、眼症状又は疾患、網膜血管増殖に関連する眼疾患、オースラー・ウェーバー・ランデュ病、変形性関節症、卵巣過刺激症候群、ページェット病、すい臓炎、類天疱瘡、多嚢胞性腎臓病、ポリープ、閉経後の骨粗鬆症、子癇前症、乾癬、肺浮腫、肺線維症、肺型サルコイドーシス、再狭窄、糖尿病性網膜症等の網膜障害、未熟網膜症、加齢黄斑ジストロフィー症、関節リウマチ、関節リウマチ、皮膚潮紅、サルコイドーシス、敗血症、脳卒中、滑膜炎、全身性紅斑性狼瘡、甲状腺炎、血栓性微小血管症候群、移植拒絶反応、損傷、腫瘍関連血管新生、人工血管再狭窄、フォン・ヒッペル・リンドウ病、創傷治癒が挙げられる。
【００５８】
本発明は、黄斑ジストロフィーの治療に使用することができる。黄斑ジストロフィーの例としては、シュタルガルト病／黄色斑眼底、シュタルガルト病様黄斑ジストロフィー、常染色体優性「標的」黄斑ジストロフィー、ベスト黄斑ジストロフィー、成人型卵黄様ジストロフィー、パターン性ジストロフィー、Ｄｏｙｎｅ蜂巣状網膜ジストロフィー、ノースカロライナ黄斑ジストロフィー、ＭＣＤＲ１に類似した常染色体優性黄斑ジストロフィー、聴覚障害に関連するノースカロライナ様黄斑ジストロフィー、進行性二重焦点網脈絡膜萎縮、ソースビー黄斑変性症、中心性輪紋状脈絡膜萎縮症、優位性嚢腫様黄斑ジストロフィー、若年性網膜分離、オカルト黄斑ジストロフィー、非家族性オカルト黄斑ジストロフィーが挙げられる。
【００５９】
疾患は、特に、地図状萎縮及び加齢黄斑変性症等の網膜上皮疾患であってもよい。
【００６０】
ＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤は、必要に応じて、１種以上の他の活性薬剤、例えば、抗血管新生化合物（血管形成を阻害することができる化合物）から選択される１種以上の他の薬剤と共に共投与することができる。好適な化合物の例としては、１種以上のＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）阻害剤、１種以上のアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、１種以上のコルチコステロイド及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【００６１】
疾患の検査
本発明によれば、患者から採取した生体試料に対して、微小血管透過性亢進疾患、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生促進・透過性促進性調節疾患、上皮細胞生存及び透過性疾患及び／又は上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）疾患に対するリスク又は感受性に関する検査を行うことができる。本発明の方法は、試料中のＶＥＧＦｘｘｘｂ濃度又はＶＥＧＦｘｘｘｂとＶＥＧＦｘｘｘの相対レベルを分析するか、患者の遺伝子型を決定して正常な絶対ＶＥＧＦｘｘｘｂ濃度又は正常なＶＥＧＦｘｘｘｂ：ＶＥＧＦｘｘｘ比に対するＶＥＧＦｘｘｘｂの過小発現のリスクを判定することを含む。
【００６２】
試料は、尿、血液、血漿、唾液、血清等の体液試料であることが好ましい。
【００６３】
通常、正常レベルよりも低い試料中のＶＥＧＦｘｘｘｂ濃度又はＶＥＧＦｘｘｘｂとＶＥＧＦｘｘｘの相対レベルは、１以上の疾患、例えば、本発明によって治療することができる１以上の特定の疾患又は障害に対する高いリスク又は感受性と相関関係がある。
【００６４】
試料中のＶＥＧＦｘｘｘｂ濃度又はＶＥＧＦｘｘｘｂとＶＥＧＦｘｘｘの相対レベルは、引用文献及び以下に記載する実施例に記載された周知の方法によって分析することができる。そのため、詳細な説明は省略する。リスク又は感受性は、健常者群及び疾患に罹患した患者群から得られた（ＶＥＧＦｘｘｘｂ濃度又はＶＥＧＦｘｘｘｂとＶＥＧＦｘｘｘの相対レベルをリスク又は感受性に相関付ける）比較データに基づいて判断することができる。
【００６５】
上述した事項は、患者から採取した生体試料に対して上皮細胞生存疾患に対するリスク又は感受性に関する検査を行う場合にも当てはまる。
【００６６】
組成物及び投与
活性薬剤は、活性薬剤と適当なその他の成分を含む組成物として投与することができる。組成物は、例えば、医薬組成物（薬剤）であってもよい。
【００６７】
本発明の別の態様は、微小血管透過性亢進疾患を治療又は予防するために使用されるか、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生透過性亢進性を調節するために使用されるか、血管透過性の増加に依存することなく上皮細胞生存を維持するために使用されるか、生体内又は試験管内（生体外を含む）において上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）を減少させるために使用される、有効量のＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤を含む組成物を提供する。
【００６８】
本発明の別の態様は、上皮細胞生存を維持するために使用される、有効量のＶＥＧＦｘｘｘｂ活性薬剤を含む組成物を提供する。
【００６９】
本発明に係る活性薬剤は、活性薬剤と適当なその他の成分を含む組成物として投与することができる。組成物は、例えば、非経口投与（例えば、注射、埋込又は注入）に適した医薬組成物（薬剤）であってもよい。
【００７０】
本発明において使用する「医薬組成物」又は「薬剤」という用語は、活性薬剤と、１種以上の薬学的に許容し得る担体と、を含む組成物を意味する。組成物は、投与形態に応じて、希釈剤、助剤、賦形剤、保存剤、充填剤、分解剤、保湿剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料、調味料、香料、抗菌剤、抗黴剤、潤滑剤、調合剤から選択される成分をさらに含むことができる。組成物は、例えば、錠剤、糖剤、粉末、エリキシル剤、シロップ、懸濁液、噴霧剤、吸入剤、錠剤、トローチ、エマルション、溶液、カシェ剤、顆粒、カプセル、坐剤を含む液状製剤、リポソーム製剤を含む注射用液状製剤であってもよい。製薬方法及び処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，最新版に記載されている。
【００７１】
液体製剤の例としては、溶液、懸濁液、エマルションが挙げられる。例えば、水又は非経口注入用の水−プロピレングリコール溶液が挙げられる。また、液状製剤はポリエチレングリコール水溶液に溶解した溶液であってもよい。
【００７２】
また、使用直前に経口投与又は非経口投与のために液体製剤とする固体製剤も挙げられる。そのような液体製剤の例としては、溶液、懸濁液、エマルションが挙げられる。これらの固体製剤は単位用量で用意し、一回の液体単位用量となるように使用される。あるいは、液体化した後に、注射器、ティースプーン又はその他の容器又は装置を使用して所定量の液体製剤を測定することによって複数回分の液体単位用量を得るように十分な量の固体製剤とすることもできる。液体化する固体製剤は、活性物質に加えて、香味剤、着色剤、安定化剤、緩衝剤、人工又は天然甘味剤、分散剤、増粘剤、溶解剤等を含むことができる。液体製剤を調製するために使用する液体は、水、等張水、無水エタノール、グリセリン、プロピレングリコール等又はそれらの混合物であってもよい。使用する液体は、投与経路を考慮して選択する（例えば、大量のエタノールを含有する液状製剤は非経口投与には適していない）。
【００７３】
用量は、患者の状態、治療する症状の重症度、使用する化合物に応じて変更することができる。当業者は、特定の状況のために適切な用量を判断することができる。通常、化合物の最適な量よりも少ない用量で治療を開始する。次に、最適な効果が得られるまで用量を少しずつ増加させる。必要に応じて、１日の用量を分割して投与することができる。
【００７４】
遺伝子療法
本発明は、遺伝子療法を使用して実施することもできる。遺伝子療法は当技術分野において知られており、本発明はそのような公知の方法で好適に実施することができる。以下に概要を説明する。
【００７５】
遺伝子療法は、生体内療法及び生体外療法に大きく分類される。生体内遺伝子療法は、治療遺伝子を体内に直接導入することを含み、生体外遺伝子療法は、生体外で標的細胞を培養し、遺伝子を細胞に導入し、遺伝子組み換え細胞を体内に導入することを含む。
【００７６】
遺伝子導入技術は、ウイルスを担体として使用するウイルスベクター導入法、合成リン脂質又は合成カチオン性ポリマーを使用する非ウイルス導入法、エレクトロポレーション又は一時的な電気刺激を細胞膜に与えることによって遺伝子を導入する物理的な方法に大別される。
【００７７】
これらの遺伝子導入技術のうち、ウイルスベクター導入法が遺伝子療法に好ましいと考えられる。これは、複製能の一部又は全てを失った治療遺伝子を置換した遺伝子を有するベクターを使用して遺伝因子を効率的に導入することができるためである。ウイルス担体又はベクターとして使用されるウイルスの例としては、ＲＮＡウイルスベクター（レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等）及びＤＮＡウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等）が挙げられる。また、単純ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター等も例として挙げられる。これらのうち、レトロウイルス及びアデノウイルスベクターが特に積極的に研究されている。
【００７８】
宿主細胞のゲノムに組み込まれるレトロウイルスは人体に対して無害だが、組み込み後に正常細胞の機能を阻害することができる。また、レトロウイルスは様々な細胞を感染させ、迅速に増殖し、外来遺伝子の約１〜７ｋｂを受容することができ、複製欠乏性ウイルスを製造することができる。しかし、レトロウイルスは、有糸核分裂後に細胞を感染させにくく、生体内で遺伝子を導入することが難しく、体細胞組織を常に生体内で増殖させることが必要であるという欠点を有する。また、レトロウイルスはプロトオンコジーンに組み込むことができるため、突然変異のリスクを有し、細胞壊死を引き起こす場合がある。
【００７９】
一方、アデノウイルスはクローニングベクターとして使用するための様々な利点がある。すなわち、アデノウイルスは適度な大きさを有し、細胞核内で複製でき、臨床的に無毒である。また、アデノウイルスは外来遺伝子が導入されても安定であり、遺伝子の再編成又は損失を引き起こさず、真核生物を形質転換させることができ、宿主細胞の染色体に組み込まれた場合でも非常に安定して発現する。アデノウイルスに適した宿主細胞は、ヒトの血液生成、リンパ腫、骨髄腫を引き起こす細胞である。しかし、これらの細胞は直鎖ＤＮＡであるため、増殖は困難である。また、感染したウイルスを回収することは容易ではないと共にこれらの細胞は低いウイルス感染率を有する。また、導入された遺伝子の発現は１〜２週間後に最も高くなり、いくつかの細胞では発現は約３〜４週間しか維持されない。さらに、免疫抗原性が高いという問題がある。
【００８０】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は上述した問題を克服することができると共に遺伝子治療薬として使用する場合に多くの利点を有し、最近は好ましいと考えられている。ＡＡＶ（一本鎖プロウイルス）は複製のためにアシスタントウイルスを必要とし、ＡＡＶゲノムは４６８０ｂｐのサイズを有し、被感染細胞の第１９染色体のあらゆる部位に挿入することができる。形質転換遺伝子は、２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）及びシグナル配列のそれぞれの１４５ｂｐに連結されたプラスミドＤＮＡに挿入される。この遺伝子は、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を発現させる別のプラスミドＤＮＡによって感染させ、アデノウイルスをアシスタントウイルスとして添加する。ＡＡＶは、遺伝子を導入する宿主細胞の範囲は広く、繰り返し投与による免疫副作用がほとんどなく、遺伝子発現時間が長いという利点を有する。また、ＡＡＶは、ＡＡＶゲノムが宿主細胞の染色体に組み込まれても安定であり、宿主細胞における遺伝子発現の変化又は再編成を引き起こさない。ＣＦＴＲ遺伝子を含むＡＡＶベクターは、１９９４年に嚢胞性繊維症の治療のためにＮＩＨによって承認されて以来、様々な病気の臨床治療に使用されている。血液凝固因子であるＩＸ因子の遺伝子を含むＡＡＶベクターは血友病Ｂの治療に使用されており、ＡＡＶベクターを有する血友病治療薬の開発が現在行われている。また、様々な抗ガン性遺伝子を含むＡＡＶベクターは腫瘍ワクチンとして認可されている。
【００８１】
遺伝子の導入と発現によって病気を治療する方法である遺伝子療法は、薬物療法とは異なり、ある遺伝子を調節するために使用される。遺伝子療法の目的は、生きた遺伝子を組み換えることによって有用な治療効果を得ることである。遺伝子療法は、病気部位への遺伝因子の正確な導入、生体内での遺伝因子の完全な分解、毒性と免疫抗原性がない、遺伝因子の長期間にわたって安定な発現という利点を有しているため、本発明に関連して潜在的に好適な治療経路として注目した。
【００８２】
遺伝子療法が標的とする宿主細胞は足細胞であることが好ましい。
【００８３】
本願明細書において、特定の化合物群の１つ、例えば、ＶＥＧＦｘｘｘｂの存在という場合には、そのような化合物の２種以上の混合物の存在をその範囲に含む。
【００８４】
治療又は予防
本願明細書において使用する「治療又は予防」という表現並びに類似する用語は、医学的診療において利用可能な試験のいずれかに従って判断される予防、治癒及び緩和治療を含む、障害を除去又は回避あるいは症状を軽減することを意図するあらゆる形態の健康管理を意味する。合理的な期待の下に特定の結果を得ることを目的とするが、必ずしも特定の結果が得られるわけではない治療介入も、「治療又は予防」という表現の範囲に含まれる。障害の進行を成功裏に遅らせるか、停止させる治療介入は、「治療又は予防」という表現の範囲に含まれる。
【００８５】
感受性
本願明細書において使用する「感受性を有する」という表現並びに類似する用語は、特に、個体又は障害の公知のリスク因子を使用して評価した場合に、医学的障害あるいは人格変化を発症するリスクが通常よりも高い個体を意味する。例えば、そのような個体は、薬物の処方及び／又は特別な食事、ライフスタイル等の推奨がなされる範囲において、１以上の特定の障害を発症する高いリスクを有していると分類される。
【００８６】
患者（被投与者）
患者（被投与者）は、好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物である。
【００８７】
本発明はヒトの治療に有用だが、本発明は様々な哺乳動物にも有用である。そのような哺乳動物の例としては、（動物園等の）非ヒト霊長動物（類人猿、サル、キツネザル等）、ネコやイヌ等のコンパニオン・アニマル、イヌ、ウマ、ポニー等の使役・狩猟用動物、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シカ、去勢牛、畜牛等の家畜動物、齧歯動物（ウサギ、ラット、ネズミ、ハムスター、アレチネズミ、モルモット等）等の実験動物が挙げられる。
【００８８】
治療対象の障害又は機能がヒトに特有のものである場合には、治療対象の哺乳動物はヒトである。治療対象の障害又は機能がある哺乳動物種に特有のものである場合には、治療対象の哺乳動物は当該哺乳動物種である。
【００８９】
文脈によっては、患者（被投与者）は胎内の胎児であってもよい。例えば、微小血管透過性亢進疾患、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生促進・透過性促進性調節疾患、上皮細胞生存及び透過性疾患及び／又は上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）疾患に対するリスク又は感受性に関する検査を患者（被験者）に対して行うための分析・遺伝子型決定方法では、患者（被験者）は胎内の胎児であってもよく、胎児、胎盤又は羊水から採取した生体試料に対して方法を実施することができる。例えば、上皮細胞生存疾患に対するリスク又は感受性に関する検査を患者（被験者）に対して行うための分析・遺伝子型決定方法では、患者（被験者）は胎内の胎児であってもよく、胎児、胎盤又は羊水の生体試料に対して方法を実施することができる。
【００９０】
「ヒト又は非ヒト哺乳動物」という表現は、あらゆる発育（成長）段階及び年齢（胚、胎児、新生児、子供、青年者、若年成人、老人、高齢者）のヒト及び非ヒト哺乳動物を意味する。
【実施例】
【００９１】
実施例１
材料及び方法
組織材料
地域倫理委員会（ブリストル）の承認を得た上で、ヒト成人腎皮質を腎癌摘出標本から採取した。地域倫理委員会（ライデン）の承認を得た上で、妊娠後１０週間及び１２週間目の３人のヒト胎児（女性）を入手した。
【００９２】
免疫組織化学分析及びＥＬＩＳＡ
０．０１ｍＭクエン酸・飽和クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）内において、９５℃で１２分間（ＶＥＧＦｘｘｘｂ）又は８００Ｗで７分間及び１２０Ｗで９分間（ｐａｎ−ＶＥＧＦ染色）、切片をマイクロ波加熱した。切片をＰＢＳで２回洗浄し、３％過酸化水素水溶液と共に２０分間培養し、再び洗浄し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ（ＴＢＳ）に溶解した１０％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ａ４３７８）でブロックした後、ＴＢＳに溶解した１．５％正常ウマ血清（ＮＨＳ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂ、Ｓ−２０００）でブロックした（１時間）。次に、１％ＢＳＡを溶解したＴＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した８μｇ／ｍＬ一次抗体（ＭＡＢ３０４５、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｉｇｍａ、Ｉ８７６５又はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ７２６９）と共に切片を培養し、ＴＢＳで２回洗浄し、ブロックした後、二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ、ＢＡ２０００）と共に培養し、ＴＢＳに溶解したＮＨＳで１時間希釈（１：２００）し、２回洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ、ＰＫ４０００）と共に４５分間培養した。
【００９３】
細胞毒性、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー及びマイグレーションアッセイ
ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ［２１］、細胞毒性［１２］、アポプトーシス［２２］及びマイグレーション［２３］は参考文献に記載された方法で測定した。
【００９４】
糸球体内皮細胞（ＧＥｎＣ）の培養
正常ヒト腎臓から単離した糸球体に由来するＧＥｎＣ（供給者のデータシートによる）をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＡＣＢＲＩ、カークランド（米国））から入手した。ＥＢＭ２（内皮細胞基本培地２、Ｃａｍｂｒｅｘ）、牛胎児血清（ＦＣＳ、５％）、抗菌剤及び成長因子からなるＥＧＭ２−ＭＶ（内皮細胞増殖培地２、微小血管、Ｃａｍｂｒｅｘ、ウォーキンガム（英国））内で細胞を培養した。実験のために調製（使用）した細胞は、ＶＥＧＦを含まないＥＧＭ２−ＭＶ内で培養した。
【００９５】
経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定
ＴＥＥＲはイオンフラックスの尺度であり、細胞単層における水及び小分子への経路の面積に反比例する。ポリカーボネート担体（細孔径：０．４μｍ、Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ロチェスター）を含む組織培養インサートにＧＥｎＣを播種した（１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）。ＧＥｎＣ単層のＴＥＥＲは、文献［２４］に記載された方法で、Ｅｎｄｏｈｍ  １２電極チャンバ及びＥＶＯＭｘ電圧計（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、サラソータ（米国））を使用して測定した。培地を無血清培地（ＥＢＭ２）と交換した。１時間にベースラインＴＥＥＲを測定し、培地をＳＦＭ（対照）のみ又は１ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）又は１ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５ｂを含む培地と交換した。１５分、３０分及び６０分が経過した時点でＴＥＥＲを再び測定した。過去の研究では、この検定法において３０〜６０分の間でＶＥＧＦに対するピーク応答を示している。
【００９６】
結果
成人腎皮質におけるＶＥＧＦｘｘｘｂの発現
正常な成人の腎臓におけるＶＥＧＦの全発現に対するＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームの寄与を定量的に測定するために、冷凍腎皮質から抽出したタンパク質におけるＶＥＧＦｘｘｘｂ濃度及び総ＶＥＧＦ濃度を測定した。総タンパク質濃度は市販のＥＬＩＳＡを使用して測定し、ＶＥＧＦｘｘｘｂ濃度は、ＶＥＧＦｘｘｘｂのＣ末端に特異的なビオチン化検出抗体を使用した同様なＥＬＩＳＡによって測定した。正常な腎皮質における総ＶＥＧＦ濃度は、平均で５４．２±１４ｎｇ／ｍｇタンパク質だった。ＶＥＧＦｘｘｘｂ濃度は平均で２５．８±９．６ｎｇ／ｍｇ（ｎ＝３、図１）（総ＶＥＧＦ濃度の４５±５％）だった。この結果は、ヒト腎摘出標本から採取した正常な糸球体から抽出したタンパク質において測定されたＶＥＧＦ１６５ｂである総ＶＥＧＦ濃度の相対的比率（４６．６±１８％、ｎ＝３）と同様だった。
【００９７】
成人腎臓におけるＶＥＧＦｘｘｘｂ染色
免疫組織化学分析に使用したＶＥＧＦｘｘｘｂに対する抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍから市販されているアフィニティー精製マウスモノクローナルＩｇＧ１抗体（Ｃａｔ  ＭＡＢ３０４５）であり、特性分析されている［１５，１６，２５］。Ｃａｔ  ＭＡＢ３０４５は組換えＶＥＧＦ１６５ｂに結合し、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１８９ｂ、ＶＥＧＦ１２１ｂ  ＶＥＧＦ１８３ｂ、ＶＥＧＦ１４５ｂ（ＶＥＧＦｘｘｘｂ）の発現を示すが、ＶＥＧＦ１６５の発現は示さない。ウェスタンブロッティング法により、この抗体によって認識された全てのタンパク質がＶＥＧＦ−Ａに対する市販の抗体によって認識されることが示されている。この抗体はＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームを認識しないが、組換え型ＶＥＧＦ１６５ｂ及びＶＥＧＦ１２１ｂは認識し、ＶＥＧＦｘｘｘｂに特異的である［１６］ＶＥＧＦｘｘｘｂ染色は足細胞のかなりの割合に限定されたが（図２Ａ、矢印を参照）、腎皮質の上皮細胞、緻密斑及び近位・遠位尿細管に存在した（図２Ｂ）。また、ＶＥＧＦｘｘｘｂ染色は直細血管、集合管及びヘンレ係蹄上行脚で観察された。ヘンレ係蹄上行脚の上皮細胞では強い細胞内染色が観察されたが、集合管の上皮細胞では、染色は先端面の先端（青い矢印）及び基底外側の細胞質（黒い矢印、図２Ｃ）に局在していた。ｐａｎ−ＶＥＧＦ染色でも同様な傾向が観察された（図２Ｄ及び図２Ｆ）。同一条件下においてアイソタイプマッチ（ｉｓｏｔｙｐｅ  ｍａｔｃｈｅｄ）ＩｇＧ抗体を対照（図２Ｇ〜図２Ｉ）として使用した場合には染色は観察されなかった。
【００９８】
発育糸球体におけるＶＥＧＦｘｘｘｂ染色
発育糸球体（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｕｓ）におけるＶＥＧＦ１６５ｂの発現を調べるために、ヒト胎児腎組織の切片に対して免疫組織化学分析を行った。１０及び１２週目の胎児のＶＥＧＦｘｘｘｂのための免疫組織化学染色は、周囲の間葉よりも顕著な発育ネフロンにおける明確な発現を示した（図３Ａ：１０週目、図３Ｂ：１２週目）。染色は、凝集小胞段階から後のネフロン形成の全ての段階において非常に強かった（図４Ａ〜図４Ｄ）。ＶＥＧＦの全てのアイソフォームに対する抗体による染色により、ＶＥＧＦは発育中の腎臓全体に位置することが確認された（図３Ｃ：１０週目、図３Ｄ：１２週目）。興味深いことに、ＶＥＧＦｘｘｘｂについて染色されたが、ｐａｎ−ＶＥＧＦについて染色されなかった領域はなかった。一方、ＶＥＧＦｘｘｘｂ抗体は発現を検出しなかったが、ｐａｎ−ＶＥＧＦ抗体は発現を検出した領域（間葉を含む）は多かった（図４Ａ及び図４Ｅ）。アイソタイプマッチアフィニティー精製マウスＩｇＧを使用した場合には染色は観察されなかった（図３Ｅ：１０週目、図３Ｆ：１２週目）。
【００９９】
凝集小胞では（図４Ｂ、ｃｖ）、ＶＥＧＦｘｘｘｂ染色は周囲の間葉よりも強かった（図４Ａ及び図４Ｂ、ｍ）。上皮形成時に最も強度の高い染色が観察され、原始上皮細胞の先端及び基底外側の部分において染色は最も強く、核領域において最も弱く、細胞質細胞内局所化を示した。また、ｐａｎ−ＶＥＧＦ染色も凝集小胞におけるこれらの領域で明らかだった（図４Ｅ及び図４Ｆ）。Ｃ（図４Ｃ、Ｇ）及びＳ体（図４Ｄ、Ｈ）に発育が進むと、ＶＥＧＦｘｘｘｂ染色（図４Ｃ及び図４Ｄ）は、ｐａｎ−ＶＥＧＦ染色（図４Ｇ及び図４Ｈ）と同様に、発育中のネフロンの原始円柱上皮細胞の先端及び基底外側の部分にさらに限定された。内皮細胞が浸潤する糸球体裂溝においてＶＥＧＦｘｘｘｂ染色はより拡散していた（図４Ｄ、Ｈ、矢印）。
【０１００】
原始上皮細胞及び糸球体裂溝で観察された上記染色パターンは、糸球体形成の毛細血管係蹄段階においてより拡散しているように見えた（図５Ａ）。一方、ｐａｎ−ＶＥＧＦではより強く見えた（図４Ｅと図４Ｆの比較及び図５Ａと図５Ｂの比較）。糸球体が形成されると（図５Ｃ）、ＶＥＧＦｘｘｘｂ染色は発育中の糸球体上皮（足細胞）及び内皮細胞で減少するように見えるが（図５Ｅ）、ボーマン嚢に沿った体腔壁上皮細胞及び密集斑細胞では著しい染色が観察された（図５Ｅ）。ｐａｎ−ＶＥＧＦ発現は糸球体成熟化にわたって維持されるように思われ、ＶＥＧＦｘｘｘｂよりも多くの糸球体上皮細胞が染色された（図５Ｄ及び図５Ｆ）。一方、成熟した糸球体では、ＶＥＧＦｘｘｘｂ染色は足細胞の亜集団に限定された（図２Ａ）。これはｐａｎ−ＶＥＧＦ染色にも当てはまるように思われたが、ｐａｎ−ＶＥＧＦ抗体によってＶＥＧＦｘｘｘｂ抗体よりも多くの足細胞が特定された（図２Ｄ）。
【０１０１】
原始腎皮質の発育細管におけるＶＥＧＦｘｘｘｂの発現
調査を行った発育段階全体にわたって、曲細管の近位及び遠位部分で明確なＶＥＧＦｘｘｘｂ染色が観察された（図６Ａ）。より具体的には、原始上皮細胞の先端及び基底外側部分で染色が観察された。また、腎皮質の細管発育の全ての領域で染色が観察された。発育中の腎皮質の細管において同等なｐａｎ−ＶＥＧＦ染色が観察された（図６Ｂ）。
【０１０２】
原始腎髄質におけるＶＥＧＦｘｘｘｂ染色
ＶＥＧＦｘｘｘｂ染色は発育中のネフロンの原始上皮細胞に局在しているように見えたが（図６Ｃ）、ｐａｎ−ＶＥＧＦ染色は腎髄質全体に高い強度で広がり（図６Ｄ）、ＶＥＧＦｘｘｘｂ染色は先端及び基底外側で観察されたが、髄質に延びる遠位尿細管及び集合管の上皮細胞の中央核周囲領域ほど強くはなかった（図６Ｃ）。また、曲細管の遠位部分が特別な輸送セグメントに分化している部分（ヘンレ係蹄）では、ＶＥＧＦｘｘｘｂ染色強度は低くなっていた（図６Ｃ）。また、弱いＶＥＧＦｘｘｘｂ染色は直細血管の内皮細胞でも観察された（図６Ｃ）。
【０１０３】
試験管内におけるヒト糸球体及び内皮細胞に対するＶＥＧＦ１６５ｂの作用
発現の変化は、胚、成人及び疾患における機能の変化を反映する場合がある。発育中のヒト腎臓におけるＶＥＧＦｘｘｘｂの役割は未知である。ＶＥＧＦ１６５ｂは、ＶＥＧＦ１６５に応答して内皮細胞の遊走を阻害することが示されているが、ＶＥＧＦアイソフォームの発現レベルを制御することによって阻害を均衡させることができるか否かについては判明していない。試験管内においてＶＥＧＦ１６５ｂが用量依存的に内皮細胞に作用するか否かを調べるために、ヒト内皮細胞の遊走に対するＶＥＧＦ１６５ｂの作用を推定した。図７ａは、ＶＥＧＦ１６５ｂがＶＥＧＦ１６５に応答してＨＵＶＥＣの遊走を阻害したことを示している（ＩＣ５０＝０．２９±０．０３倍（すなわち、４０ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦ１６５が１１．４±１．４ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦ１６５ｂによって５０％阻害、ｎ＝３）。これは、糸球体の発育の内皮浸潤段階におけるＶＥＧＦ１６５ｂのダウンレギュレーションと一致している。ＶＥＧＦ１６５ｂが糸球体の発育時に有利な作用を有するか否かを調べるために、足細胞の細胞毒性に対するＶＥＧＦ１６５ｂの作用を測定した。ＶＥＧＦ１６５ｂは、１０７±１．２ｐＭのＥＣ５０で用量依存的に初代培養足細胞の細胞毒性を減少させ（図７ｂ）、ＶＥＧＦ１６５ｂが細胞保護作用を有することが分かった（ｎ＝８）。ＬＤＨアッセイは細胞質タンパク質を放出する細胞の数だけを測定し、アポプトーシスと壊死を区別しない。興味深いことに、ＶＥＧＦ１６５ｂは足細胞の増殖に影響を与えず（１５．８±１．０×１０３ｃｐｍ／ｃｅｌｌに対して１６．５±１．１×１０３ｃｐｍ／ｃｅｌｌ、ｎ＝６）、ヒト足細胞に対する抗アポプトーシス作用を示唆している。これは、アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム染色を使用したフローサイトメトリーによって確認された（図７ｃ）。血清飢餓は、かなりの割合の細胞のアポプトーシスを引き起こしたが（図７Ｃｉの領域Ａ）、アポプトーシスは０．３ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５ｂによる処理によって阻害された（図７ｃｉｉ）。ＶＥＧＦ１６５ｂが経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の糸球体内皮障壁機能に影響を与えるか否かを調べるために、糸球体内皮透過性のインビトロ検定を使用した。ＶＥＧＦ１６５は糸球体内皮ＴＥＥＲを有意に減少させたが（単層透過性の上昇を示す）、ＶＥＧＦ１６５ｂはＴＥＥＲを有意に上昇させ、ＶＥＧＦ１６５による上昇を阻害した（図７ｄ、ｎ＝４）。そのため、ＶＥＧＦ１６５とは対照的に、ＶＥＧＦ１６５ｂは、試験管内における足細胞の生存を維持しながら、内皮細胞の遊走を防止し、単層透過性を減少させる。
【０１０４】
考察
正常状態及び疾病状態の両方において抗体染色法、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びノーザンブロッティングによって腎皮質及び髄質におけるＶＥＧＦの発現が明らかになっているため、腎臓の機能及び発育におけるＶＥＧＦの役割は調査対象となってきた。ＶＥＧＦは他の組織のほとんどと比較して腎臓において高度に発現するが、抗血管新生ＶＥＧＦｘｘｘｂ変異体に関する研究はほとんど行われていない［１６，２０，２５］。正常な腎皮質においてＶＥＧＦｘｘｘｂスプライス変異体をコードするｍＲＮＡが最初に文献に記載され、アイソフォーム特異的ｓｉＲＮＡによってヒト足細胞においてＶＥＧＦ１６５ｂタンパク質が最初に特定された［２６］。しかしながら、本願明細書に記載した実験は、総ＶＥＧＦ濃度に対するＶＥＧＦｘｘｘｂの寄与を最初に定量化したものである。正常な腎皮質ではＶＥＧＦの約半分がＶＥＧＦｘｘｘｂであるという知見は、正常な腎組織及び疾患状態におけるＶＥＧＦの発現に関する多くの研究に関する我々の解釈にとって重要な意義を有する［１５］。ＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームは腎組織における総ＶＥＧＦ濃度の非常に重要な成分であるという知見は、未知の生理的関連性を示唆するものである。
【０１０５】
ｐａｎ−ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦｘｘｘｂ染色パターンの比較
未知のアイソフォームファミリーのＶＥＧＦ−Ａ（ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質）は、齧歯動物及びヒトの組織における発育中のネフロンの推定及び成熟足細胞及び原始円柱上皮細胞内において検出されている［２，４〜７，２７，２８］。本研究では、ヒト後腎臓におけるＶＥＧＦｘｘｘｂタンパク質の存在及び局在化を調べ、その時空間染色パターンをｐａｎ−ＶＥＧＦ抗体によって検出されたものと比較した。免疫組織化学的染色を使用して、１０及び１２週目の胎児から採取した後腎臓においてＶＥＧＦｘｘｘｂを検出した。後腎臓のｐａｎ−ＶＥＧＦ染色は過去の研究（ＶＥＧＦはネフロンの推定及び成熟足細胞及び原始円柱上皮細胞内において検出された［２，４〜７，２９］）と非常に良く一致した。後腎臓には、ＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームについて染色されるが、ｐａｎ−ＶＥＧＦについて染色されない領域はなく、ｐａｎ−ＶＥＧＦについて染色されるが、ＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームについて染色されない領域があったため、ＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームはＶＥＧＦを発現する細胞のサブセットに存在するように思われた。成人の腎臓では、曲細管におけるＶＥＧＦの存在は、成体組織における腎臓ＶＥＧＦ合成の主要な源は足細胞であることを示すｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション研究［３０］と対照的であり、尿細管細胞による糸球体由来ＶＥＧＦタンパク質の取り込みの可能性を示唆している。
【０１０６】
糸球体形成及びＶＥＧＦｘｘｘｂ
糸球体形成は腎臓内皮細胞とネフロン上皮細胞の間の相互誘導的な相互作用に依存する。特定の段階において様々な遺伝子［３１〜３４］及び成長因子［９，１１，３５〜３７］の関連が明らかにされているが、細胞分化イベントの分子調整剤は十分に理解されていない。胚全体におけるＶＥＧＦの発現において観察されるように［３８，３９］、ＶＥＧＦに対する用量感受性は発育糸球体内に存在している［８］。ＶＥＧＦ１６５ｂは、ＶＥＧＦ１６５の作用のいくつかを打ち消し、足細胞生存に用量依存的作用を有することが示されているため、ＶＥＧＦｘｘｘｂに対する糸球体形成の用量感受性も正常な腎皮質形成の重要な要素である可能性が高く、マウス足細胞におけるＶＥＧＦ１６５ｂ過剰発現を示す遺伝子導入マウスは糸球体透過性を減少させたことを示す最近の研究［４０］は上記示唆を支持するものである。
【０１０７】
ＶＥＧＦに関する過去の研究
腎皮質［１４］及び糸球体内のタンパク質［１６］からのＶＥＧＦ１６５ｂ  ｍＲＮＡの単離並びに分化しているが、増殖していない不死化足細胞株におけるＶＥＧＦ１６５ｂ  ｍＲＮＡ及びタンパク質の特定［２６］は別として、過去に使用されている方法は、ＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームを検出しないか（エクソン８の近位部におけるプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲ）、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームとＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームを区別していない。この点を扱った唯一の研究は、胎児、子供及び成人の糸球体から採取した顕微解剖ｍＲＮＡを調べ、Ｓ及びＣ体におけるＶＥＧＦ１６５ｂ  ｍＲＮＡの発現は成人又は子供の糸球体よりも低いことを見い出している。従って、Ｓ及びＣ体を介した凝集小胞から未成熟糸球体へのタンパク質発現の減少は、ＶＥＧＦタンパク質はｍＲＮＡよりもゆっくりとターンオーバーされるため、一時的にわずかにシフトしたｍＲＮＡレベルにおける内因性ダウンレギュレーションの結果である可能性がある。また、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒらは、成人の糸球体においてＶＥＧＦ１６５よりも高度にＶＥＧＦ１６５ｂが発現することを報告している。ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームを特異的に検出する抗体は得られていないが、成人の糸球体におけるＶＥＧＦ染色のほとんどはＶＥＧＦ１６５ｂである可能性が高い。興味深いことに、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒらは、Ｄｅｎｙｓ−Ｄｒａｓｈ糸球体におけるＶＥＧＦ１６５ｂの完全な喪失について報告しており（ＷＴ１へのリンク［２０］）、この知見は試験管内における過剰発現研究によって最近確認されている［４１］。発育時のＶＥＧＦの足細胞特異的ノックアウトにより、糸球体形成の不足及び出産直後の腎不全及び６時間以内の死亡が発生する［８］。これは、おそらくは、内皮細胞は糸球体に移動せず（糸球体における表現型識別可能な内皮細胞の不足によって証明）並びに異常な微小血管形成及び糸球体濾過によるものである。しかしながら、ＶＥＧＦノックアウトはＶＥＧＦｘｘｘｂノックアウトでもあり、表現型のどの部分がＶＥＧＦｘｘｘｂノックアウトに依存しているかは明らかではない。腎臓機能に影響を与えることが示されているＶＥＧＦ−ＴＲＡＰ［４２］、ｓＦｌｔ−１［４３］、ベバシズマブ［４４］及びその他のモノクローナル抗体等のＶＥＧＦの阻害剤もＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームに影響を与える可能性が高い。従って、糸球体機能におけるＶＥＧＦの阻害的役割について行われた過去の研究の結果が血管新生促進アイソフォーム及び／又は抗血管新生アイソフォームによるものであるか否かは明らかでではない。
【０１０８】
腎臓におけるＶＥＧＦｘｘｘｂ発現の機能
ＶＥＧＦ１６５ｂは、試験管内におけるＶＥＧＦ１６５媒介上皮細胞増殖及び遊走並びに生体外における単離動脈の血管拡張［１４，１６］、腸間膜及び眼におけるＶＥＧＦ１６５媒介生理的血管新生［１６］、ニワトリ絨毛尿膜及びマウスのｄｏｒｓａｌ  ｓｋｉｎ  ｃｈａｍｂｅｒ［１８］、腫瘍モデルにおける病理学的ＶＥＧＦ−媒介血管形成［１６］及び生体内における眼の低酸素による網膜血管新生［１７］を阻害する。ＶＥＧＦ１６５ｂは、内皮媒介シグナル伝達に対する優性阻害及び部分的アゴニスト活性を有することが示されており［１８］［１６］、遊走を阻害し、細胞毒性から保護する能力を有することを潜在的に示している。一方、ＶＥＧＦ１６５ｂは試験管内における糸球体の内皮単層の完全性に対する作用は示さなかった（図７Ｃ）。発育中の腎臓では、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームは、内皮細胞の生存及び遊走、毛細血管透過性［９］及びおそらくは上皮細胞の生存［１２］を調節（媒介）すると考えられる。本願明細書に示す結果は、ＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームは透過性の増加に依存することなく上皮細胞生存を維持し、内皮細胞の遊走時にダウンレギュレートされ、おそらくは糸球体裂溝への浸潤を可能とするというコンセプトと矛盾していない。
【０１０９】
Ｅｒｅｍｉｎａら［８］は、発育時のＶＥＧＦ１６５の無制限の発現はかなり有害であることを示しており、これらの結果と考え合わせると、血管新生促進／抗血管新生ＶＥＧＦ−Ａの均衡が正常な発育及び機能に必要であることを示唆している［８，９，３１，３３，４５，４６］。従って、ＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームの発現並びに腎臓発育時の遠位及び近位３’末端スプライシングの制御は、ＶＥＧＦｘｘｘによる応答の調節に重要な役割を果たす可能性がある。ＶＥＧＦｘｘｘｂは発育中の腎臓において調節的な役割を果たす可能性がある。例えば、因子は、原始糸球体及びその後の糸球体の発育において糸球体裂溝への内皮細胞の浸潤を制限・停止させなければならない。この仮説を取り組むためには、ＶＥＧＦ−Ａ生態（血管新生及び透過性）並びにより重要にはそれらの阻害を考慮に入れて設計された条件的トランスジェニックノックアウト及び過剰発現モデルを含むさらなる調査が必要である。
【０１１０】
結論
本実施例では、ヒト胎児から採取した後腎臓におけるＶＥＧＦｘｘｘｂの発現について調べ、糸球体機能に関与する細胞型に対するＶＥＧＦｘｘｘｂの役割を理解するためのインビトロ実験を行った。ＶＥＧＦｘｘｘｂは成人の腎皮質において総ＶＥＧＦタンパク質の４５％を構成し、ＶＥＧＦ１６５ｂは糸球体内皮細胞透過性を増加させず、遊走を阻害し、足細胞に対して細胞保護作用を有する。腎臓の発育時には、ＶＥＧＦｘｘｘｂは後腎の凝縮小胞、Ｃ体の上皮細胞、Ｓ体の内皮細胞及び上皮細胞並びに未成熟足細胞で発現した。糸球体が成熟すると発現は減少した。これらの結果は、抗血管新生ＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームは成人及び発育中の腎皮質において高度に発現することを示し、ＶＥＧＦｘｘｘｂファミリーは、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生透過性亢進性を調節することによって糸球体成熟化及び足細胞保護において役割を果たすことを示唆している。
【０１１１】
実施例２
材料及び方法
実験動物
全ての形質転換（ＴＧ）系統は、Ｃ５７ＢＬ６ｘＣＢＡ／ＣＡバックグラウンドで発生した。動物の飼育及び処置は、英国内務省のプロトコル及びガイドラインに従って行った。形質転換マウスはＣ５７ＢＬ６バックグラウンドのマウスと掛け合わせた。透過性実験のために、Ｆ２−３継代形質転換マウス（雄）を選択し、野生型同腹子をヘテロ接合体マウスの対照として使用した。
【０１１２】
ｐネフリン−ＶＥＧＦ１６５ｂの作成（図９Ａｉ）
文献に記載されている方法でｐｃＤＮＡ３−ＶＥＧＦ１６５ｂをクローニングした［１］。ＶＥＧＦ１６５ｂ  ｃＤＮＡとポリＡ信号の上流のマウスネフリンプロモーターを有するプラスミドを発生させるために、ｐｃＤＮＡ３−ＶＥＧＦ１６５ｂをＨｉｎｄＩＩＩで消化させてＣＭＶプロモーターを除去した。マウスネフリンプロモーター（Ｓｕｓａｎ  Ｑｕａｇｇｉｎ教授が提供）はプラスミド５’−ネフリン−ｐＫＯに由来する。５’−ネフリン−ｐＫＯをＰａｃ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉ酵素で消化させ、末端を平滑化させた。Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ結合末端を得るために、平滑化ＤＮＡ生成物をリン酸化ＨｉｎｄＩＩＩリンカーでライゲートし、ＨｉｎｄＩＩＩ酵素で消化させた。ラピッドＤＮＡライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用し、ＣＭＶプロモーターを除去し、正しい配向を有するコロニーを選択した鎖状化ｐｃＤＮＡ３−ＶＥＧＦ１６５ｂにネフリンプロモーターＤＮＡフラグメントを挿入した。
【０１１３】
足細胞トランスフェクション
特性分析されているヒト条件的不死化内蔵糸球体上皮細胞（ｈＣＩＰ）（３９）（Ｍｏｉｎ  Ｓａｌｅｅｍ教授から寄贈）を、ＲＰＭＩ  １６４０培地内において、インシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸塩（Ｓｉｇｍａ、ドーセット（英国））及び１０％胎児ウシ血清と共に３３℃、５％ＣＯ２で培養した。トランスフェクション実験のために、ｈＣＩＰを約５０％のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅまで培養し、リポフェクトアミン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、取扱説明書に従って等量のｐネフリン−ＶＥＧＦ１６５ｂ及び５’−ネフリン−ｐＫＯ（空のベクター）をＨＣＩＰにトランスフェクトした。対照、模擬トランスフェクト足細胞及びｐネフリン−ＶＥＧＦ１６５ｂトランスフェクト足細胞の上清におけるＶＥＧＦ１６５ｂの発現を、ＶＥＧＦｘｘｘｂ−ファミリー特異的ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹ３０４Ｅ）によって分析した（図９Ａｉｉ）。
【０１１４】
形質転換マウスの継代
微量注入のためのｍＮｅｐｈｒｉｎ−ＶＥＧＦ１６５ｂ−ｐＡのＤＮＡフラグメントは、ｐネフリン−ＶＥＧＦ１６５ｂのＨｉｎｄＩＩＩとＨａｅＩＩによる消化によって生成し、ｅｌｕｔｉｐミニカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による最終精製の前に、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ、英国）を使用して取扱説明書に従ってゲル精製した。胎芽への精製ＤＮＡの微量注入は、Ｂ＆Ｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌｔｄ．（英国）によって行った。簡単に説明すると、５〜１０ｎｇ／μＬの精製ＤＮＡフラグメントを、若齢のＣ５７ＢＬ６ｘＣＢＡ／ＣＡマウスから得た受精１細胞期の胎芽の前核に微量注入した。Ｍ１６培地（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）内において胎芽を３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養し、翌日、Ｃ５７ＢＬ６ｘＣＢＡ／ＣＡバックグラウンドの疑似妊娠マウスの卵管に移植した。離乳後、尾部生検から抽出したゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）を使用し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（図９Ｂ）及びサザンブロッティング（図９Ｃ）によってトランス遺伝子の存在についてスクリーニングした。マウスは、標準的な飼育／遺伝子型決定プログラムを使用して同型接合性に飼育した。ホモ接合動物を発生させるために、兄弟（創始系統１）を掛け合わせ、野生型と掛け合わせたＦ１世代の遺伝子型を決定した。ホモ接合体を得るためには、トランス遺伝子を有するようにするために少なくとも３匹の同腹子及び２０匹以上の子が必要だった。機能表現型分析のための動物数は、統計分析を行うために必要な数によって決定した（過去のデータによれば、２５％の糸球体ＬｐＡ／ｖの有意差を得るためには、３匹以上の動物と５つの糸球体の使用が必要である）。（英国内務省（ｌｉｃｅｎｓｅ  ａｎｄ  ｅｔｈｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｂｏａｒｄ）の制限）。
【０１１５】
ＰＣＲ
ＰＣＲは、文献に記載されている方法で行った（Ｙ  Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．、２００８、Ｆａｓｅｂ  Ｊ．、２００８、２２（４）、１１０４−１２）。簡単に説明すると、１対のプライマー（フォワードプライマー配列：５’−ＴＣＡ  ＧＣＧ  ＣＡＧ  ＣＴＡ  ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＴＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１）及びリバースプライマー配列：５’−ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＧＣＣ  ＴＴＧ  ＧＴＧ  ＡＧＧ  ＴＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２））によって２０８ｂｐのＰＣＲ産物を得、トランス遺伝子を特異的に検出した。
【０１１６】
２５３ｂｐのバンドのマウスβ−グロビンのための別の１対のプライマー（フォワードプライマー配列：５’−ＡＣＧ  ＴＣＣ  ＴＡＡ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  ＧＡＧ  ＴＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３）及びリバースプライマー配列：５’−ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＣＡＧ  ＴＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４））も増幅に含めた（内部対照）。
【０１１７】
各反応には、２μＬの１０ｘ緩衝液、０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、１．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０  ｎＭフォワード及びリバースプライマー、０．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ａｂｇｅｎｅ、英国）、０．５μＬのゲノムＤＮＡ、２０μＬの水を使用した。ＰＣＲは９４℃で４分の条件で開始し、変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（６２℃、３０秒）、伸長（７２℃、３０秒）、最終伸長（７２℃、１０分）からなるサイクルを３５回行った。
【０１１８】
サザンブロッティング
１０〜１５μｇのｇＤＮＡ（尾）をＥｃｏＲＩ制限酵素で消化させた。ＤＮＡを０．８％アガロースゲルで分離し、変性し、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）に移した（ｃａｐｉｌｌａｒｙ−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ）。ＤＮＡは８０℃で２時間のべークによって固定した。膜は、アルカリホスファターゼ標識ＤＮＡフラグメント（微量注入に使用したものと同じ）で調べた。プローブの調製及びトランス遺伝子の検出は、Ｇｅｎｅ  Ｉｍａｇｅｓ  Ａｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）を使用して製造者のガイドラインに従って行った。
【０１１９】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲは、文献に記載されている方法で行った（Ｙ  Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．、２００８、Ｆａｓｅｂ  Ｊ．、２００８、２２（４）、１１０４−１２）。簡単に説明すると、ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抽出によって単離し、ｇＤＮＡ汚染を防ぐために製造者の取扱説明書に従ってＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって消化させた。製造者（Ｐｒｏｍｅｇａ）が推奨しているように、表十的な方法により、ＡＭＶ逆転写酵素を使用して１μｇのＤＮａｓｅ処理ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。フォワードプライマー（５’−ＴＣＡ  ＧＣＧ  ＣＡＧ  ＣＴＡ  ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＴＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：５）及びリバースプライマー（５’−ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＣＡＡ  ＣＴＡ  ＧＡ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：６）を使用して、ＤＮａｓｅ処理ｃＤＮＡ及びＲＮＡに対してＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅は９４℃で４分の条件で開始し、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で３０秒、最終伸長（７２℃、１０分）からなるサイクルを３５回行った。１９９ｂｐにおけるバンドはＶＥＧＦ１６５ｂトランスジェニック発現を示した。
【０１２０】
ＶＥＧＦｘｘｘｂの酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳＡ）
ＲＩＰＡ緩衝液を使用してマウス腎臓組織から組織タンパク質溶解物を調製した。培養足細胞のために、トランスフェクション行った細胞又は行っていない細胞を含む馴化培地を使用した。タンパク質濃度はＢｉｏ−ｒａｄアッセイ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）によって測定し、ＶＥＧＦ１６５ｂ濃度は、ＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームに対する特異的検出抗体について報告されているようにＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１２１】
簡単に説明すると、１ｘ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した０．０８μｇのヤギ抗ＶＥＧＦポリクローナルＩｇＧ（ＡＦ２９３−ＮＡ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ベイジングストーク（英国））の各ウェルに室温で一晩吸着させた。各工程間に、プレートを１ｘＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で３回洗浄した。３７℃で１時間、ＰＢＳに溶解した１００μＬの５％ＢＳＡでブロックした後、ＰＢＳに溶解した１％  ＢＳＡで希釈した１００μＬの組替え型ヒトＶＥＧＦ１６５ｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（６２．５ｐｇ／ｍＬ〜４ｎｇ／ｍＬ）又はタンパク質試料を各ウェルに添加した。振とうしながら３７℃で１時間にわたって培養し、３回洗浄した後、１００μＬのマウスモノクローナル抗ＶＥＧＦｘｘｘｂビオチン化ＩｇＧ（クローン２６４６１０／１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（０．４μｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、振とうしながら３７℃で１時間放置した。ＰＢＳに溶解した１％ＢＳＡで１：２００に希釈した１００μＬのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、室温で２０分間放置し、１００μＬ／ウェルのＯ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド溶液（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐａｃｋ  ＤＹ−９９９；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、遮光し、室温で２０分間培養した。５０μＬ／ウェルの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４によって反応を停止させた後、Ｏｐｓｙｓ  ＭＲ  ９６ウェルプレートリーダー（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バージニア州シャンティイ（米国））を使用して４９２ｎｍの吸光度を直ちに読み取った（対照は４６０ｎｍ）。
【０１２２】
糸球体透過性
単離した完全な糸球体の正規化糸球体限外濾過係数（ＬｐＡ／ｖｉ）を、Ｓａｌｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００６（４０）に記載されたオンコメトリー法を使用して算出した。
【０１２３】
糸球体の単離及び溶液
マウス（８〜１０カ月齢）を頸椎脱臼によって殺し、腎臓を取り出した。通常の方法を使用して、糸球体を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリンゲル液に単離した。１００μｍのメッシュに保持された糸球体を氷上に保持してモフォロジを保存した。単離時に、糸球体毛細血管内の血漿タンパク質濃度は周囲の溶液と平衡化した。希釈ＢＳＡ（１％）又は濃縮ＢＳＡ（８％）を含む潅流液をリンゲル液内において調製し、ｐＨを７．４５±０．０２に調節した。
【０１２４】
装置
ガラス毛管に接続されたミクロピペット（外径：１．２ｍｍ、Ｃｌａｒｋ  Ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、レディング（英国））を使用した。１３μｍの開口部先端は矩形断面を有するマイクロスライド（ガラス製）（内径４００μｍ×４ｍｍ、Ｃａｍｌａｂ、ケンブリッジ（英国））内に取り付けた。マイクロスライドは、倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＬ  ＨＣ  Ｆｌｕｏ）を使用して１０ｘ対物レンズ上で可視化した。モノクロビデオカメラ（日立ＫＰ−Ｍ３ＡＰ）を顕微鏡の上部に取り付け、システムに導入した各糸球体を録画した。ビデオカメラは、デジタルタイマ（ＦＯＲ．Ａ  ＶＴ３３）を介してビデオカセットレコーダ（パナソニックＡＧ７３５０）及びモノクロモニタ（ソニーＳＳＭ−１２５ＣＥ）に接続した。潅流液は管を介してマイクロスライドに接続された加熱貯槽に保持した。ラピッドレスポンスリモートタップ（０７５Ｐ３、Ｂｉｏ−Ｃｈｅｍ  Ｖａｌｖｅ，Ｉｎｃ．）により、マイクロスライドに流れる潅流液を制御した。システム内の流体は、温水浴に接続されたチューブ及び加熱コイルからなる装置を使用して３７℃に維持した。
【０１２５】
糸球体の体積変化
ボーマン嚢及び細動脈又は管状フラグメントを含まない糸球体を選択した。全ての糸球体の観察は腎切除から３時間以内に行った。希釈潅流液内における平衡化（２分）の後、ラピッドレスポンスタップを切り替え、濃縮ＢＳＡをマイクロスライドに流した。
【０１２６】
糸球体の体積変化の分析
潅流液の切り替えはビデオテープに記録し、Ａｐｐｌｅ  ｉｍｏｖｉｅｓ（Ａｐｐｌｅ  ＵＳＡ）及びアナログデジタルコンバータ（ＡＤＶＣ−３００、Ｃａｎｏｐｕｓ）を使用してシーケンスをオフラインでレビューした。全ての測定は遺伝子型又は処理を知らないオペレータが行った。潅流液を切り替えた時点の前後の画像のシーケンスを作成した。各糸球体像をＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ３（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州（米国））で複製し、ｉｍａｇｅ  Ｊ（米国国立衛生研究所）を使用して面積（Ａμｍ２）を算出した。糸球体の体積は、糸球体の画像面積（Ａ）を以下の式に代入することによって得た。
【０１２７】
糸球体の体積＝４／３πｒ３
式中、ｒは糸球体の半径である。従って、糸球体の体積は以下のように表される。
【０１２８】
糸球体の体積＝［４／３Ａ（（Ａ／π））］／１０−６
糸球体の体積（ｎＬ）を、新たなｏｎｃｏｐｒｅｓｓｉｖｅ潅流液の到着を示すシュリーレン現象が生じてからの時間に対してプロットした。次に、２つの回帰線がこれらの点に適用した。第１の回帰線の傾きはゼロに設定し、糸球体の体積が安定していた時の溶液切り替え前の点に適用した。２つの線はブレイクポイントで交わるように計算した。ブレイクポイントは、糸球体の体積が減少する時点と定義した。第２の線は、ブレイクポイントから少なくとも０．０４〜０．１の期間をカバーする点に適用した。これらの境界内において適用した回帰線が最も大きな傾きを有する点を選択した。
【０１２９】
ＬｐＡの算出
第２の回帰線の傾きは糸球体の体積変化の最も大きな初期変化度を示し、スターリングの式におけるＪｖと等しい。
【０１３０】
Ｊｖ／Ａ＝Ｌｐ［（Ｐｃ−Ｐｉ）−σ（Πｃ−Πｉ）］
単離した糸球体に作用する正味静水圧は無視することができる。過去の研究は、単離した糸球体の反射率はほぼ１であることを示唆している。従って、スターリングの式は以下のように書き直すことができる。
【０１３１】
ＬｐＡ＝Ｊｖ／−ΔΠ（ｎｌｍｉｎ−１ｍｍＨｇ−１）
式中、ΔΠは毛管及び間質膠質浸透圧の差である。
【０１３２】
ＶＥＧＦ１６５ｂ実験
実験の各群では、野生型Ｃ５７／Ｂｌｋ６マウスから採取した糸球体を組替え型ヒトＶＥＧＦ１６５ｂ（ｒｈＶＥＧＨ１６５ｂ；ＰｈｉｌｏＧｅｎｅ  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州（米国））に暴露した。単離後、１％ＢＳＡ溶液又は４０ｐｍ  ＶＥＧＦ１６５ｂ又は１ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５ｂを含有する１％ＢＳＡ溶液内において、糸球体を３７℃で培養した。そして、各溶液の糸球体を個別にマイクロスライドに載置し、限外濾過係数を上述したように算出した。
【０１３３】
表現型及び組織学的分析
各群のマウス（８〜１０カ月齢）から、表現型及び組織学的分析のための組織、血漿及び尿を採取した。動物は代謝ケージ内に個別に１２時間収容して尿試料を採取した。５％イソフルランを使用してマウスに麻酔をかけ、心臓から血液試料を直接採取した。次に、頸椎脱臼によってマウスを殺した。腎臓を取り出し、分割し、４％ＰＦＡ、２．５％グルタルアルデヒド又は液体窒素内に浸漬して保存した。
【０１３４】
免疫組織化学分析
野生型、ヘテロ接合及びホモ接合体マウスから採取した腎臓試料をホルマリンによって固定し、パラフィンに包埋した。５μｍの切片をゼラチン／ポリ−ｌ−リジン被覆ガラススライドに封入した。３７℃のインキュベータ内において切片をスライド上で一晩乾燥した。次に、Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒ（ＲＡ  Ｌａｍｂ、イーストボーン（英国））を使用して切片を５分間脱ろうし、エタノール溶液（１００、９０、７０％ｖ／ｖ）を使用して再水和させた。全ての腎臓の矢状切片を切断し、染色した（Ｈ＆Ｅ）。切片は、２人の査定者が独自にコード化・レビューした。査定者は切片の由来を知らず、糸球体の大きさ、メサンギウム基質、糸球体のセルスコア又は管状形態に関してマウスを区別することができなかった。
【０１３５】
０．０１ｍＭクエン酸・飽和クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）内において、８００Ｗ、９５℃で７分間及び１２０Ｗで９分間、マイクロ波抗原回復を行った。切片を室温に冷却し、脱イオン水内で二度洗浄した（各５分間）。次に、１ｘＰＢＳで希釈した３％ｖ／ｖ過酸化水素（ＢＤＨ、プール（英国））と共に切片を５分間培養し、１ｘＰＢＳで５回洗浄し、５  ％ｗ／ｖ  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）でブロックした後、５％ｗ／ｖ  ＢＳＡに溶解した１．５％ｗ／ｖ  正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でブロックした（３０分間）。切片を室温において０．０５％ｖ／ｖ  ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５分間洗浄した後、１ｘＰＢＳに溶解した１．５％ｗ／ｖ  正常ヤギ血清で希釈した一次抗体と共に培養した。ポリクローナルウサギＶＥＧＦ抗体（Ａ２０  ｓｃ１５２；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンタクルス（米国））を使用した。また、組織切片をアフィニティー精製した正常ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）（等濃度）で処理した（陰性対照）。切片は０．０５％ｖ／ｖ  ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２回洗浄した（各５分間）。ブロッキング工程は上述したように繰り返し、０．０５％ｖ／ｖ  ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ内で５分間洗浄した。対照を含む全ての切片を、室温の湿度室内において、１．５％ｗ／ｖ正常ヤギ血清で希釈したビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に１時間培養した。切片を０．０５％ｖ／ｖ  ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２回洗浄し（各５分間）、室温の湿度室内において、アビジン−ビオチン化酵素完全キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に４５分間培養した。さらに、切片を０．０５％ｖ／ｖ  ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２回洗浄し（各５分間）、３，３’−ジアミノベンジジン基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に培養して茶色の生成物を得た。脱イオン水で２回洗浄（５分間）することによって反応を停止させた。切片をマイヤーヘマトキシリン（ＢＤＨ）で対比染色し、水中で分化させた。切片を高濃度のエタノール（７０、９０、１００％ｖ／ｖ）内を通過させることによって脱水し（少なくとも各２分間）、キシレン内で少なくとも１０分間洗浄し、組織学的分析のためにＤＰＸ  ｍｏｕｎｔａｎｔに封入した。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ−４００顕微鏡を使用して染色を調べた。画像はＤＣＮ−１００デジタルイメージングシステム（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して撮影した。
【０１３６】
電子顕微鏡分析
Ｈａｙａｔ（２３）に記載された腎臓固定法を修正して使用した。各マウスから採取した腎臓の一部を直ちに切除し、グルタルアルデヒド固定液プール（０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．３）に２．５％グルタルアルデヒドを添加、４〜８℃）内でスライスした。また、腎臓皮質の立方体（直径：０．５〜１ｍｍ）をグルタルアルデヒド固定液によって４℃で固定した。最低３時間の固定後、組織を新鮮な固定液内に一晩放置し、カコジル酸緩衝液で洗浄し、オスミウム（０．１Ｍカコジル酸緩衝液に１％四酸化オスミウムを添加、ｐＨ７．３、４℃）内において１時間固定した。組織をカコジル酸緩衝液及び蒸留水で洗浄し、エタノールで脱水し、浸透させ、アラルダイト樹脂（Ａｇａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、スタンステッド（英国））に包埋した。糸球体は、トルイジンブルーで染色した切片（０．５μｍ）から同定した。ＥＭ観察のために糸球体を７０〜１００ｎｍの厚みに切断した。デジタル電子顕微鏡写真（８９０〜２９００倍）を分析した。足細胞下空間（ＳＰＳ）による糸球体濾過障壁のパーセント範囲（％ｃｏｖｅｒａｇｅ）、糸球体基底膜の厚み、ＳＰＳの高さ、足突起幅（又はスリット隔膜間の間隔）、内皮開窓間の間隔及び開窓幅（ｗｉｄｔｈ  ｏｆ  ｆｅｎｅｓｔｒａｔｉｏｎｓ）を測定した。電子顕微鏡写真からの直線的な測定は、Ｐｈｏｔｏｓｈｉｐグリッドを使用してランダムな点で行った。開窓の変化を明確にするために、４０ｎｍの切片を使用した。
【０１３７】
マウス特異的ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ
形質転換及び対照マウスから腎臓組織タンパク質溶解物を調製し、総タンパク質を上述したようにを定量化した。各試料のマウスＶＥＧＦ−Ａ濃度は、可溶性アイソフォームであるＶＥＧＦ１２０及びＶＥＧＦ１６４を認識する市販の酵素免疫測定キット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；ミネソタ州ミネアポリス）を使用して２連（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で測定した。ＶＥＧＦに特異的なモノクローナル抗体でマイクロプレートを予めコーティングした。遺伝子組み換えマウスＶＥＧＦを７．８〜２５０ｐｇ／ｍＬの範囲の濃度に希釈した。標準及び試料をウェルにピペットで添加した。試料中に存在するＶＥＧＦ−Ａは固定化抗体に結合した。未結合の物質を洗い流した後、セイヨウワサビペルオキシターゼに結合させたＶＥＧＦに特異的な酵素結合ポリクローナル抗体をウェルに添加した。洗浄によって未結合の抗体酵素試薬を除去した後、１００μＬ／ウェルのＯ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド溶液（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐａｃｋ  ＤＹ−９９９；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を各ウェルに添加し、ホイルを使用してプレートを遮光し、室温で２０分間培養した。５０μＬ／ウェルの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４によって反応を停止させた後、Ｏｐｓｙｓ  ＭＲ  ９６ウェルプレートリーダー（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バージニア州シャンティイ（米国））を使用して４９２ｎｍの吸光度を直ちに読み取った（対照は４６０ｎｍ）。
【０１３８】
糸球体濾過率
糸球体濾過率（ＧＦＲ）は、麻酔をかけた９ヵ月齢のヘテロ接合体マウス及び同一齢の同腹子対照マウスにＦＩＴＣ−イヌリンを１回ボーラス注入することによって測定した。
【０１３９】
条件的不死化ヒト糸球体内皮細胞（ｃｉＧＥｎＣ）
ｃｉＧＥｎＣｓは十分に特性分析されており、文献に記載されている方法で増殖させ、維持した（４８）。ＰＶ−１ウェスタンブロット実験の場合には、３３℃で６日間増殖させた後、３７℃で５日間増殖させた。細胞を４時間血清飢餓培養した後、１ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５又は１ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５ｂ又は１ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５又は１ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５ｂの組み合わせによって処理し、２４時間放置した。腎皮質、１２５ｍ及び１８０ｍの篩いを通過した糸球体溶解物及び足細胞溶解物を対照とした。文献に記載された実験プロトコルを使用した（１）（一次抗体濃度１：２００（抗ＰＶ−１）、二次抗体濃度１：１０，０００）。
【０１４０】
統計
数値は平均±標準誤差として示す。ｐ＜０．０５は有意であるとみなした。統計分析方法は、「図面の簡単な説明」に記載されているように関連する図面の凡例に含まれる。
【０１４１】
結果
ｐＮｅｐｈ−ＶＥＧＦ１６５ｂヘテロ接合形質転換マウスの継代
ネフリンプロモーターの対照下でＶＥＧＦ１６５ｂ  ｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングした（図９Ａｉ）。トランスフェクション及び構成機能性を評価するために、条件的不死化ヒト足細胞を発現構成体でトランスフェクトし、細胞上清における４８時間でのＶＥＧＦ１６５ｂの発現を調べた。対照ベクター又はトランスフェクトしていない細胞と比較して有意に多くのＶＥＧＦ１６５ｂがトランスフェクトした足細胞で観察された（図９Ａｉｉ）。潜在的な創始系統を、注入胎芽からの子のＰＣＲ（図９Ｂ）及びサザンブロット分析スクリーニングによって特定した（図９Ｃ）。これらの創始系統をその後の研究に使用した。創始系統間には、単離した糸球体の機能表現型（ＬｐＡ／ｖｉ：ｗａｔｅｒ−ａｒｅａ  ｐｒｏｄｕｃｔ透過性）には差がなかった（図９Ｄ）。
【０１４２】
ｐＮｅｐｈ−ＶＥＧＦ１６５ｂヘテロ接合及びホモ接合形質転換マウスの腎皮質におけるＶＥＧＦ１６５ｂの発現
形質転換マウス及び同一齢の同腹子野生型対照の腎皮質におけるＶＥＧＦ１６５ｂの発現を３つの方法を使用して測定した。第１の方法は、トランス遺伝子のための腎皮質のエクソン８ｂ特異的ＲＴ  ＰＣＲ（図１０Ａｉ及び図１０Ａｉｉ）（＜０．０５、カイ二乗傾向性検定、１群あたりＮ＝３）である。第２の方法は、抗ヒト抗ＶＥＧＦ抗体を使用する免疫組織化学分析（図１０Ｂ）であり、足細胞におけるＶＥＧＦのＩＨＣ染色増加が見られた。第３の方法は、ＶＥＧＦｘｘｘｂ特異的ＥＬＩＳＡを使用する、形質転換及び野生型マウスの腎皮質から抽出したタンパク質に対するエクソン８ｂ特異的ＥＬＩＳＡである（図１０Ｃ）（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）。これらの方法は、野生型同腹子対照からヘテロ接合体マウス並びにホモ接合体マウスへの形質転換マウスへの発現の勾配があることを示した。
【０１４３】
機能表現型：足細胞特異的ＶＥＧＦ１６５ｂの過剰発現によって糸球体の透水性と尿タンパク喪失が減少（表１に要約を示す）
トランスジェニック動物の糸球体の透水性がＶＥＧＦ１６５ｂの過剰発現によって変化したか否かを調べるために、野生型、ヘテロ接合及びホモ接合ＶＥＧＦ１６５ｂ過剰発現マウスの糸球体群における正規化糸球体限外濾過係数（ＬｐＡ／ｖｉ）を（我々が過去に特性を明らかにしたオンコメトリー検定（４０）を使用して）調べた。これらの３群間ではＬｐＡ／ｖｉの著しい差が観察された（図１１）（野生型では１．９５±０．１６ｎｌ．ｍｉｎ−１ｍｍＨｇ−１、ヘテロ接合体マウスでは１．４３±０．１ｎｌ．ｍｉｎ−１ｍｍＨｇ−１、ホモ接合体マウスでは０．６７±０．０７ｎｌ．ｍｉｎ−１ｍｍＨｇ−１、表１）。上記減少が外因性ＶＥＧＦ１６５によって弱められたか否かを調べるために、形質転換マウスの糸球体のＬｐＡ／ｖｉを測定した後、糸球体を１時間にわたって１ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５に暴露した。図１１は、この処理によってＬｐＡ／ｖｉが野生型と同等のレべルに回復したことを示す。ＬｐＡは透過率と面積の積（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ−ａｒｅａ  ｐｒｏｄｕｃｔ）であり、糸球体毛細血管体積は対照及び形質転換体の糸球体から算出した。有意差は観察されず（野生型（平均０．９８±０．１６）、形質転換（平均０．８１±０．１１、ｐ＞０．４））、ＬｐＡ／ｖｉの変化は、発達異常による糸球体毛細血管面積の減少ではなく、透水性の変化によるものであることを示唆している。また、形質転換マウス及び野生型マウスにおけるＶＥＧＦ１６４の発現を推定したが、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの補償的増加に関する証拠は見出されなかった（データは示さず）。血漿クレアチニン及び尿素濃度及びＧＦＲ（３０６．７±５７．５２μＬ／ｍｉｎ、ｎ＝４、野生型対照対３４４．１±４１．８０μＬ／ｍｉｎ、ｎ＝４、ヘテロ接合体）には有意な差は観察されなかった。形質転換マウス及び野生型同腹子における血漿クレアチニン及び尿素濃度には有意な差はなかった（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。しかしながら、代謝ケージを使用して採取した尿の尿タンパク質：クレアチニン比（ｕＰＣＲ）は、野生型対照と比較してホモ接合体マウスにおいて低かったが（図１２Ｃ及び表１）、有意ではなかった。また、形質転換マウスの体重と血中グルコース濃度は変化しなかった。
【０１４４】
【表１】
2012509306.tif 000003
【０１４５】
ｒｈＶＥＧＦ１６５ｂの外因性投与によってＬｐＡ／ｖｉの減少を再現することができるか否かを調べるために、ｒｈＶＥＧＦ１６５ｂの用量を漸増させて野生型糸球体を培養した。ＶＥＧＦ１６５ｂの外因性投与により、限外濾過係数は用量依存的に有意に減少した（図１３Ａ）。図１３Ｂｉ及び図１３Ｂｉｉに、ＶＥＧＦ１６５（増加）（図１３Ｂｉｉ）及びＶＥＧＦ１６５ｂ（減少）（図１３Ｂｉ）によるＬｐＡ／ｖｉにおいて誘発される特徴的に異なる透過性の変化を示す。
超微形態学的表現型：足細胞特異的ＶＥＧＦ１６５ｂの過剰発現によって開窓の大きさ及び密度が減少
巨視的には、マウスは１８カ月齢まで正常であり、行動、成長率、摂食は正常で、尿沈渣はなかった。光学顕微鏡による組織学的評価により、野生型（ＷＴ）及び形質転換マウスの間には明らかな異常がないことが明らかになった（図１５Ａ）。しかしながら、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）による調査により、典型的な糸球体内皮開窓はホモ接合体マウスにおいて特定することが困難であることが分かった（図１５Ｂ）。
【０１４６】
超微形態学的測定では、足細胞下空間の範囲、足突起幅及びＳＰＳ領域におけるＧＢＭの厚みの変化は見られなかった（表１）。しかしながら、ＳＰＳ範囲のないＧＦＢの領域におけるＧＢＭの厚みはホモ接合体マウス（２４０±１４ｎｍ）に対して野生型対照（１９６±６ｎｍ）で有意に小さかった（ｐ＜０．０１）。また、開窓密度はホモ接合体マウスにおいて減少した（図１６Ｃ、表１）。さらに、野生型同腹子対照における開窓のほとんどは開窓隔膜を示さなかった。一方、生体内において通常の糸球体内皮に通常見られる（まれな）明確な隔膜（図１６Ｅ）とは対照的に、ホモ接合形質転換マウスの開窓の多くは電子高密度物質を含んでいた（図１６Ｄ）。これらの開窓が異常な隔膜（過剰糖衣、糖衣状物質、篩の栓又は開窓の減衰する端部の（比較的）より頻繁な切断よりも小さな開窓を反映）を含むか否かを定義することはできなかったため、これらを「閉鎖型開窓」と呼ぶ。そのため、さらなるＥＭ特性決定は、ホモ接合体マウスと同腹子対照から平行して固定及び処理した一対の試料から得た４０ｎｍの切片を使用して行った。Ｐｈｏｔｏｓｈｉｐグリッドを使用してランダムな測定（複数のマウスから２００個所超）を行った（図１６）。
【０１４７】
ＧＢＭの尿側では、足細胞、足突起及びスリット隔膜の幅及び密度の有意な差は見られなかった（表１）。一方、血管側では、閉鎖型開窓の割合の有意な増加が見られた（図１６Ａ及び図１６Ｂ）。また、開いた開窓の大きさは野生型対照及びホモ接合体マウスにおいて同様だが（図１６Ｃ）、閉鎖型開窓はかなり狭かった（図１６Ｄ）。
【０１４８】
閉鎖型開窓の性質の詳細な研究は不可能だったが、ＶＥＧＦ１６５ｂの過剰発現がＰＶ−１（ｐｌａｓｍａｌｅｍｍａ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１（原形質膜小胞タンパク質−１））の発現に影響を及ぼすか否かを明らかにしようと試みた。免疫金研究において実証された抗体を使用することはできなかったため、条件的不死化糸球体内皮細胞におけるＰＶ−１の発現をウエスタンブロッティングによって調べた。これらの研究では、ＶＥＧＦ１６５ｂに暴露した糸球体内皮細胞におけるタンパク質レベルでのＰＶ−１の発現の有意な変化は観察されなかった。
【０１４９】
糖尿病性糸球体病変に対する耐性
図１７は、足細胞特異的ＶＥＧＦ１６５ｂ過剰発現ヘテロ接合形質転換マウスは、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導性糖尿病に関連する糸球体病変に対して耐性を有することを示している。
【０１５０】
野生型同腹子対照と同一齢の１２週目のヘテロ接合体ＶＥＧＦ１６５ｂマウスの群（ｎ＝５、各群）には１００μｇ／ｇ（体重）／日の用量で３日間投与した（２００μＬの注入量）。対照には同量のクエン酸塩緩衝液を投与した。空腹時（１時間）血糖値、尿タンパク質／クレアチニン比及び体重を２週間毎に測定した。
【０１５１】
誘導後６週間目に、マウスを代謝ケージに入れ、尿を１２時間にわたって採取し、ＥＬＩＳＡによって尿中アルブミン量を測定した（＊ｐ＜０．０５（糖尿病野生型と比較、ＡＮＯＶＡ、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）。ＳＴＺ群の血中グルコース濃度は同様だった（ＳＴＺ  ＷＴ：２２．９７±１．４７ｍｍｏｌ／Ｌ、ＳＴＺ  ＨＥＴ：２６．４２±１．４５ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐ＝ＮＳ））。
【０１５２】
考察
三層フィルタとしての糸球体濾過障壁の従来の見方は、従来は見過ごされていた流体及び分子流に対する抵抗を付加する糸球体構造の超微細構造的（２９、３０、４２）及び生化学的（糖衣）（３３）考察並びにＧＦＢは、生物物理学的モデルによって予測されているように水と溶質の移動に対する抵抗となる固定された受動的な篩（又は一連の篩）以上のものであるという認識によって大きく発展した（４１）。複雑な超微細構造上には、ＧＦＢ内において開始し、ＧＦＢを変更し、正常な糸球体の表現型を維持するために必要なシグナリング経路が存在する。これらのシグナリング経路はＧＦＢ全体において機能し、足細胞と隣接するＧＥＣとの間のクロストークに関与すると思われる（１２）。そのようなクロストークは、ＶＥＧＦｘｘｘ／ＶＥＧＦｘｘｘｂ−ＶＥＧＦ−Ｒ２；ＶＥＧＦ−Ｃ−ＶＥＧＦ−Ｒ３及びＡｎｇ−１−Ｔｉｅ２軸（他の血管床における微小血管透過性に影響を与えることが示されている全ての分子）を含む（１８，２，２０，２４）。これらの軸は、隣接しているが、上流の糸球体内皮のパラクリン変化を引き出す。これらのｔｒａｎｓ−ＧＢＭ作用の機能的重要性は、複数の足細胞特異的形質転換モデルによって実証されている（１４，１３，１１）。それらのいくつか（タンパク尿及び糸球体血栓性細小血管障害）（１３）の表現型は、抗ＶＥＧＦ療法（例えば、モノクローナル抗体であるベバシズマブ）の点からヒトに臨床的に反映されている。これらの研究は、成熟糸球体におけるＧＥＣ表現型を維持するために足細胞由来ＶＥＧＦが必要であるという確固たる証拠となるものである。足細胞ＶＥＧＦ転位によって生じる内皮細胞の変化は、ＶＥＧＦは確実に足細胞に対する自己分泌作用を有するという事実によって支持され、これは、上皮細胞生存に関して同様な特性を有するＶＥＧＦ１６５（１６，１７）及びＶＥＧＦ１６５ｂ（５）アイソフォームに当てはまる（１６，５）。
【０１５３】
その後、足細胞由来ＶＥＧＦ−Ａは、細胞生存、増殖及び／又は隣接する糸球体内皮及び足細胞への分化によって濾過障壁を維持する際に重要な役割を果たすことが提案された（１４，１７）。ヘテロ接合体ヌルＶＥＧＦ−Ａマウスであっても性交後数日間で死ぬため、胚性血管形成の本態性媒介物質である（６）。しかしながら、糸球体等の微小血管における具体的な役割は完全に理解されておらず、糸球体ＶＥＧＦ及び特性が大きく異なるＶＥＧＦアイソフォーム（２２）の役割は、文献における実験的な矛盾について説明するものと思われる。また、Ｅｒｅｍｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．の研究（１４）は、足細胞特異的形質転換過剰発現又はヘテロ接合体ＫＯマウスは異なる糸球体表現型を生じるが、末期腎不全となったため、糸球体における最適なＶＥＧＦ用量は正常な糸球体の表現型を実証する可能性が高いという見解を最初に支持するものとなった（１４）。我々の研究は、ＶＥＧＦ用量は定性的（ＶＥＧＦｘｘｘ／ＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームのバランス）かつ定量的（生物学的に利用可能なＶＥＧＦアイソフォームの絶対量）な特徴を含むかもしれないことを示唆するものである。（ｌｏｘ−Ｐ系統はＶＥＧＦｘｘｘ及びＶＥＧＦｘｘｘｂアイソホームをノックアウトする可能性があるため）Ｅｒｅｍｉｎａ（１４）の研究におけるＫＯ表現型の包括的かつ直接的な比較を行うことは困難だが、ＶＥＧＦ１６４足細胞特異的ｐネフリン過剰発現形質転換マウスは同等である。これにより、崩壊腎症及びＨＩＶ腎症に典型的な糸球体病変に続くＥＳＲＦを示す表現型が得られる（２７）。腎臓は腎出血を示し、マウスは５日目に死亡した。これは、通常の平均余命を有するマウスにおける適度に減少した透水性及び尿中タンパク喪失の表現型と異なる。また、我々の研究により、ＶＥＧＦ１６５ｂの過剰発現により、マウスにおけるＶＥＧＦの発現が減少することが示された。これにより、ＥｒｅｍｉｎａのＫＯ表現型のどれだけの割合がＶＥＧＦｘｘｘ阻害によるものであり、ＶＥＧＦｘｘｘｂ減少によってどの程度の異常が生じたかについて疑問が生じる。また、本願明細書に記載したモデルにおけるマウスＶＥＧＦの寄与が明らかではない。Ｅｒｅｍｉｎａの研究におけるマウスの表現型を改善するためのＶＥＧＦｘｘｘｂの有効性を評価するこれらの２つの線を横切る実験がアイソフォーム特異的ノックアウトと同様に有益であると思われる。
【０１５４】
足細胞ＶＥＧＦ  ＫＯ（１４）は我々のモデルと直接比較できるものではないが、Ｅｒｅｍｉｎａの研究におけるヘテロ接合体マウスは開窓の喪失を示した（１４）。ＶＥＧＦ１６５は、生体外において内皮開窓を生じさせることが示されている（３８）。我々の知見は、ＶＥＧＦの定性的なバランスは生体内における開窓の形成及び維持のために重要である可能性があることを示唆している。
【０１５５】
糸球体形成におけるＶＥＧＦの発現は、単一の毛細血管が糸球体裂溝になるｓ形状段階で開始する。我々は、ｓ形状段階で発現するＶＥＧＦの少なくとも一部がＶＥＧＦｘｘｘｂであることを示した（５）。当該モデルは、ＶＥＧＦ１６５ｂの過剰発現によって特徴付けられ、糸球体は組織学的に正常に思われるため、内皮細胞の原始糸球体への遊走に影響を及ぼさないと思われる。
【０１５６】
エクソン８ｂ  ＶＥＧＦ特異的ＥＬＩＳＡを使用し、エクソン８ｂ特異的アイソフォームは多くの組織において支配的であり（３）、正常な腎臓におけるＶＥＧＦの約半数に寄与することを示した（５，３７）。これらの２つのアイソフォームファミリーの特性は大きく異なる。世界中の多くの研究所では、受容体結合研究、試験管内の内皮増殖及びマイグレーションアッセイ、生体外単離抵抗血管ミオグラフ研究及び生体内新生血管及び腫瘍増殖モデルにおいて、ＶＥＧＦ１６５ｂは血管形成性であるだけではなく、抗血管新生性を示し、ＶＥＧＦ１６５の作用を阻害する（１，４８，２５，７）ことを確認している。従って、ＶＥＧＦ１６５ｂは、ヌードマウスの感染黒色腫（４８）、結腸癌（４７）、ＰＣ３前立腺癌、ユーイング肉腫、ＣａＫｉ腎癌の腫瘍増殖を減少させる（３７）。また、非経口的投与されたｒｈＶＥＧＦ１６５ｂ（ＩＰ及びＳＣ）はヌードマウスにおける結腸癌の腫瘍増殖を停止させる（４６）。また、我々は、乳房組織においてＶＥＧＦ１６５ｂを過剰発現した形質転換マウスが生理的血管新生を阻害することを示した（１７）。従って、ＶＥＧＦ１６５ｂは、おそらくはＶＥＧＦ−Ｒ２のＶＥＧＦ１６５媒介活性化を阻害することによって血管新生及び血管拡張を阻害することができることは明らかである。
【０１５７】
微小血管透過性に関しては、カニューレ処置された毛細血管におけるＬａｎｄｉｓ−Ｍｉｃｈｅｌマイクロ吸蔵（Ｌａｎｄｉｓ−Ｍｉｃｈｅｌ  ｍｉｃｒｏ−ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）技術を使用した研究は、大量のｒｈＶＥＧＦ１６５ｂに応じて、おそらくはＶＥＧＦ−Ｒ１の媒介により、微小血管透水性が数秒間のみ（急速に正常に戻る）増加することを示している（２０）。しかしながら、この現象に対する生理学的相関はなく、上記研究では、ＶＥＧＦ１６５とは対照的に、ＶＥＧＦ１６５ｂに対応する透水性の長期的な変化は見られなかった（２１）。また、ＶＥＧＦ１６５ｂは、試験管内においてＶＥＧＦ１６５の媒介による経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の減少（透過性の増加）を阻害する（５，４）。
【０１５８】
従来のアイソフォームを含むエクソン８ａ（例えば、ＶＥＧＦ１６５）が、分化型足細胞に存在するエクソン８ｂ含有アイソフォームを含有しない脱分化型（ｄｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）ヒト条件的不死化足細胞において支配的となる傾向があるという知見に基づき、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒらは、足細胞（糸球体内皮細胞及びＧＢＭ）の成熟化はこれらのアイソフォームファミリーの比率に応じて異なる可能性があることを示唆した。Ｄｅｎｙｓ−Ｄｒａｓｈ症候群（ＤＤＳ）（糸球体発育不全、ＦＳＧＳによって早発性腎炎症候群、腎不全症及び男性の偽半陰陽が生じる）におけるＶＥＧＦアイソフォームファミリーの発現に関するＳｃｈｕｍａｃｈｅｒらの研究では、ＤＤＳ足細胞は十分な血管新生・透過性促進ＶＥＧＦ１６５を産生するが、抗血管新生・抗透過性ＶＥＧＦ１６５ｂを完全に欠いていることが示されている（４３）。ＶＥＧＦ−Ａファミリー間のスプライシングに影響を及ぼす因子が明らかになっており（３１）、ヒト遺伝子の７４％がｍＲＮＡスプライシングを示すため（４４）、多くの足細胞由来産物がこの特性を示すことは驚きではない（例えば、ウィルムス腫瘍及びＤＤＳに関与する転写因子ＷＴ−１）（２８）。ＷＴ−１には４種類の主要なアイソフォームがある。ＷＴ−１のジンクフィンガー領域はＤＮＡ及びＲＮＡに結合することができる。ＷＴ−１の標的は未知だが、ヒトにおけるＷＴ−１の突然変異によって糸球体間質硬化症及び十分に特性分析された糸球体病変が生じる場合があることが示されている（２８，３６）。ＷＴ−１は、ＶＥＧＦ等の血管形成に影響を与える因子の発現を調整する可能性があることが示唆されている（２８）。従って、ＷＴ−１は、足細胞におけるＶＥＧＦのスプライシング及び関連する糸球体の表現型を制御する因子である可能性がある。
【０１５９】
例えば、ヒッペル・リンドウ遺伝子を除去した（ＨＩＦ−１αサブユニット及びＣｘｃｒ４発現が増加、半月体形成性腎炎）形質転換モデル（１０）において、ＶＥＧＦアイソフォームバランスの変化は他の形態の糸球体病変に関連付けられている。このモデルでは、足細胞は、ＶＥＧＦｘｘｘの発現を増加させるが、ＶＥＧＦｘｘｘｂの産生には影響を与えない、低酸素血症において活性化されるシグナリング経路に機能的に応答する（４６）。
【０１６０】
要約すると、ＶＥＧＦ１６５ｂの過剰発現により、ＶＥＧＦ１６５の過剰発現とは異なり、組織学的及び生理学的に健康な腎臓機能が得られ、糸球体の透水性及び尿中タンパク喪失は減少する。
【０１６１】
実施例３
網膜上皮及び内皮細胞の生存に関する研究
材料及び方法
Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（オレゴン州ポートランド（米国））から購入したヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）を、５％ＦＢＳ及び補助物質を含むＥＧＭ−２ＭＶ培地（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、スイス）内において培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を文献に記載された方法で臍帯から抽出し（Ｓｔ  Ｍｉｃｈａｅｌ’ｓ病院、ブリストル、イギリス）、５％ＦＢＳ及び補助物質を含むＥＧＭ−ＭＶ２培地内において培養した。Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ワシントン州カークランド（米国））から購入したヒト網膜微小血管内皮細胞（ＲＥＣ）を、１０％  ＦＢＳを含むＣＳＣ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ培地（Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ワシントン州カークランド（米国））内において培養した。ヒト網膜色素性内皮細胞（ＲＰＥ）をヒトの網膜（アイバンク、ブリストル（英国））から単離し、１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ  Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ペイズリー（英国））内において培養した。ＡＴＣＣから購入した不死化ＡＲＰＥ−１９細胞を１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ  Ｆ１２培地内において培養した。細胞は、サイトケラチン１８、レチナールデヒド結合タンパク質１及びレチノールデヒドロゲナーゼ５を対象とするＲＴ−ＰＣＲによって確認した。
【０１６２】
ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂ及びＶＥＧＦ−Ａ１６５
ＶＥＧＦ−Ａ１６５タンパク質は、Ｒ＆Ｄ（ミネソタ州ミネアポリス（米国））から購入し、Ｋｕｒｔ  Ｂａｌｌｍｅｒ−Ｈｏｆｅｒ氏（Ｐａｕｌ  Ｓｃｈｅｒｒｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（スイス））から受領した。ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂタンパク質は、ＰｈｉｌｏＧｅｎｅ  Ｉｎｃ．（イスラエル）から受領した。
【０１６３】
細胞毒性アッセイ
細胞を９６ウェルプレート（１０，０００  ＨＵＶＥＣ、１５，０００  ＡＲＰＥ−１９）に播種し、一晩血清飢餓状態とし、Ｈ２Ｏ２、Ｎａブチレート又は高濃度の７−ケトコレステロール（Ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ  Ｉｎｃ．、ロードアイランド州ニューポート）及び阻害剤又は賦形剤と共に、２．５ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５ｂ（Ｒｅｎｎｅｌ、２００８＃３８４９）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ又はＰｈｉｌｏｇｅｎｅ  Ｉｎｃ、ニューヨーク）と共に培養した。４８時間（ＨＵＶＥＣ）又は２４時間（ＡＲＰＥ−１９）後、５０μＬの培地を取り出し、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞毒性検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン（米国））を使用して細胞毒性を調べ、Ｂｉｃｈｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して定量化した。総細胞数を調べるために、１０μＬの１０ｘ溶解緩衝液を添加して細胞を溶解し、製造者の取扱説明書に従って総ＬＤＨ濃度を測定した。ＡＲＰＥ−１９細胞の細胞生存性アッセイは、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、マンハイム（ドイツ））を使用し、取扱説明書に従って行った。試薬と共に２４時間培養した後、１０μＬのＷＳＴ−１試薬を添加し、３７℃で培養し、３０分後、上記プレートリーダーを使用して４時間毎に発色を定量的に測定した。
【０１６４】
ヒトの全ＲＮＡからのｃＤＮＡに対するＰＣＲ
１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ試薬を６ウェルプレートの各ウェルに添加し、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａｃｃｈｉの方法を使用してｍＲＮＡを抽出した。ｍＲＮＡの５０％を、プライマーとしてＭＭＬＶ  ＲＴ、ＲＮａｓｅ  Ｈ  Ｍｉｎｕｓ、Ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐｏｌｙｄ（Ｔ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して逆転写した。次に、ｃＤＮＡの１０％を、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ２を検出するように設計されたプライマーを使用して増幅し（表２）、ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して反応（３０サイクル）を行った（変性：９５℃、６０秒、アニール：５５℃、６０秒、伸長：７２℃、６０秒）。ＰＣＲ産物を０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含むアガロースゲルに流し、トランスイルミネーターを使用して可視化した。
【０１６５】
【表２】
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【０１６６】
トランスウェルマイグレーションアッセイ
マイグレーション（遊走）用の内皮細胞は７０〜８０％の密集度で使用した（３〜６継代）。ＨＭＶＥＣは、ＦＢＳ及び補助物質（ＥＢＭ）を含まない内皮基底培地内において８〜１０時間血清飢餓培養した。細胞をトリプシン化し、０．１％  ｖ／ｖ  ＦＢＳを添加したＥＢＭ内に再懸濁させ、５００μＬの培地に１５０，０００細胞を播種した（接合因子（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、オレゴン州ポートランド（米国））被覆フィルタインサート（８μｍ、１２ｍｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ビルリカ（米国））を使用）。各処理は三連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で行った。細胞を３７℃で培養し、一晩放置した（マイグレーション（遊走）させた）。インサートをＰＢＳで洗浄し、４％ＰＦＡ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で細胞を１０分間固定した。マイグレーション（遊走）していない細胞を膜から除去し、マイグレーション（遊走）した細胞の核をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（５μｇ／ｍＬ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳで希釈）で染色し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｔｏｒｌａｂｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム（米国））を備えた顕微鏡スライドに封入した。蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭ、ドイツ、４０ｘ対物レンズ）を使用してマイグレーション（遊走）した細胞数を計測した（１０フィールド／膜）。マイグレーション（遊走）の変化は基底マイグレーション（遊走）率に対する相対率として示し、平均±ｓｅｍとしてプロットした。１ｎＭ  ＶＥＧＦ−Ａ１６５を使用した場合及び使用しない場合でＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂの濃度（０〜２ｎＭ）を増加させることによってＶＥＧＦ−Ａ１６５と比較した場合のＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂのマイグレーション（遊走）阻害作用を調べた。ＩＣ５０は、ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｌｏｐｅ  ｓｉｇｍｏｉｄａｌ  ｆｉｔ（Ｐｒｉｓｍ４  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して正規化データから算出した。ＲＥＣは血清飢餓培養し、血清及び増殖因子を含まないＣＳＣ培地（Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ワシントン州カークランド（米国））に再懸濁し、上述したように実験を行った。
【０１６７】
細胞シグナリング
血清飢餓培養したヒト皮膚内皮細胞を１ｎＭ  ＶＥＧＦ−Ａ１６５又はＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂによって活性化させた。変性条件下において、７．５％ＬａｅｍｍｌｉアクリルアミドＳＤＳゲル上において細胞溶解物からタンパク質を分離した。タンパク質をゲルからニトロセルロース膜に移し（ウェット移動法）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで希釈した５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）によって４℃で一晩ブロックした。３％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ内において、マウス抗ヒトホスホｐ３８ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）抗体（９２１６）、ウサギ抗ヒトＶＥＧＦ受容体２（Ｔｙｒ１１７５）（２４７８）、ウサギ抗ヒトＶＥＧＦ受容体２抗体（２４７９）、マウス抗ヒトホスホｐ４４／ｐ４２  ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体（９１０６）、ウサギ抗ヒトｐ４４／４２  ＭＡＰＫ抗体（９１０２）（全てＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）又はマウス抗ヒトＩＧＦＢＰ３抗体（Ｓｉｇｍａ、２μｇ／ｍＬ）と共に膜を室温で２．５時間培養し、二次抗体（１：１５，０００、３％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ）と共に４５分間培養し、上述したように処理した。
【０１６８】
ＶＥＧＦタンパク質ブロッティング
ＲＰＥ細胞溶解物（３０μｇ（総タンパク質））及び組み替え型ヒト対照タンパク質（３０ｎｇ）を、変性条件下において、１２％ＬａｅｍｍｌｉアクリルアミドＳＤＳゲル上に流し、上述したように処理した。
【０１６９】
ＩＧＦＢＰ３の発現に対するＶＥＧＦの作用
ヒトＲＰＥ（３〜４経代、密集度：７０〜８０％）をＦＢＳを含まない無血清培地内で２４時間培養した。無血清培地に添加した２ｍＬの１ｎｇ／ｍＬヒト組み換え型ＶＥＧＦ−Ａ１６５又はＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂを添加した。２４時間後、ＲＰＥ細胞は氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、ウェスタンブロッティングのためにＬａｅｍｍｌｉ緩衝液（２００μＬ）に溶解させた。
【０１７０】
ＲＰＥ細胞に対する抗体の細胞毒性作用
フラスコ内の単離したＲＰＥ又はＡＲＰＥ−１９細胞（サブコンフルエント）を９６ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ  Ｆ１２内において７０〜８０％コンフルエントまで増殖させた。培地を無血清ＤＭＥＭに取り替え、血清飢餓培養し（一晩）、マウスＩｇＧ抗ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂ抗体（５６／１）又はベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））で４８時間処理した。Ｃｙｔｏｔｏｘ  Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  （Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン（米国））を使用し、培地に放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の量によって相対細胞死を測定した。実験は製造者のプロトコルに従って行った。
【０１７１】
ＡＲＰＥ−１９細胞の免疫組織化学分析
細胞を無菌カバースリップ上で５０％コンフルエントまで増殖させた。細胞を４％ＰＦＡ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で固定し（１０分間）、２ｘＰＢＳで洗浄し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳで希釈した５％正常ヤギ血清（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）でブロックし（１時間）、加湿室内において抗ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂ抗体（Ｒ＆Ｄ、ＭＡＢ３０４５）（８μｇ／ｍＬ、ブロッキング溶液）と共に一晩培養した。細胞を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳで洗浄し、１：４００ヤギ抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｔｉｔｒｏｇｅｎ、英国）（ブロッキング溶液で希釈）と共に３時間培養し、最後の３０分間は、ファロイジンＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）及び５μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８の１：２００希釈液と共に培養した。Ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳで洗浄し、カバースリップにＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを取り付け、Ｌｅｉｃａ  ＤＭ蛍光顕微鏡（４０ｘ対物レンズ）に適当なフィルタを付けて画像を撮影し、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐで統合した。
【０１７２】
図１８〜図２２に得られた結果を示す。図１８〜図２２は、上皮細胞生存を維持するための薬剤としてのＶＥＧＦ１６５ｂの作用を示している。
【０１７３】
図１８は、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂが酸素誘発網膜障害モデルにおいて新血管形成を阻害するが、血管再生を妨げないことを示している。
【０１７４】
図１８Ａに示すように、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂの眼内注射は６２．６時間の半減期を有する。１２５Ｉ−ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂを硝子体に注射し、ラットを殺し、ガンマカウンターを使用して眼、尿及び血液を調べた。双指数クリアランス（ｂｉ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ）は組織１ｇ当たりのガンマカウントで表し、消失半減期は２．６日間（６２．６時間）だった。尿及び血液への取り込みは３０分以内に見られた。フルオレセインデキストランはマウスの眼内注射後にリークしていない（挿入画像を参照）。
【０１７５】
図１８Ｂに示すように、生後発育時にマウスを酸素過剰とした。マウスに高濃度のＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂ又はＨＢＳＳ（対照）を注射し、イソレクチンＢ４染色によって網膜血管を可視化した。左側の画像はＨＢＳＳ（対照）を示し、右側の画像はＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂによって処理した網膜を示す。中央の虚血性無血管領域（矢印Ｃで示す）、網膜下増殖領域（新血管形成、矢印Ｂで示す）、総血管形成網膜（矢印Ａで示す）及び面積を測定した。
【０１７６】
図１８Ｃ〜図１８Ｅに示すように、画像Ｊにおける各領域の面積（μｍ２）を測定した。ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂ注射によって新血管形成は有意に減少し（図１８Ｃ）、正常な血管新生量は増加した（図１８Ｄ）。これは、部分的に、無血管野になる血管が減少した結果によるものである（図１８Ｅ）。従って、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂは、新血管形成を阻害すると共に正常な血管再生を維持することができ、虚血誘発性血管新生に理想的な薬剤である。
【０１７７】
図１９は、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂがヒト網膜内皮細胞の遊走を阻害することを示している。
【０１７８】
図１９Ａに示すように、ヒトＲＥＣをポリカーボネートフィルタに播種し、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂ濃度の上昇に対する遊走を測定した。
【０１７９】
図１９Ｂでは、１ｎＭ  ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂによるＲＥＣ遊走の阻害を１ｎＭ  ラニビズマブと比較している。
【０１８０】
図２０は、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂがヒト内皮細胞の生存因子であることを示している。
【０１８１】
図２０Ａにおいて、ＨＵＶＥＣ細胞を血清飢餓培養した（０．１％血清、ＳＦＭ）。ＬＤＨアッセイにより、４８時間の処理後のＶＥＧＦアイソフォームによる細胞毒性を測定した。ＶＥＧＦ−Ａ１６５及びＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂは、血清飢餓による細胞毒性を阻害した。
【０１８２】
図２０Ｂにおいて、細胞をＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂ、ＶＥＧＦ−Ａ１６５又はＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂ及びＶＥＧＦＲ阻害剤と共に培養し、培地内のＬＤＨについてＥＬＩＳＡによって細胞毒性を測定した。細胞毒性は適当な対照（ＳＦＭ内の阻害剤）と相対的な値として表した。ＶＥＧＦＲ阻害剤（ＰＴＫ７８７（両ＶＥＧＦＲを阻害）、ＺＭ３２３８８１（ＶＥＧＦＲ２に特異的））は細胞毒性を阻害した。
【０１８３】
図２０Ｃにおいて、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂ、ｐ３８ＭＡＰＫを阻害するＳＢ２０３５８０、ＭＥＫによるｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫリン酸化を阻害するＰＤ９８０５９、ＰＩ３Ｋを阻害するＬＹ２９４００２の存在下又は非存在下で細胞を３種類のシグナル伝達阻害剤で処理し、細胞毒性を測定した。ＭＥＫ及びＰＩ３Ｋ阻害剤は細胞毒性の減少を阻害したが、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は阻害しなかった。
【０１８４】
図２０Ｄは、内皮細胞におけるＶＥＧＦ−Ａ１６５及びＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂによるＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ２のＴｙｒ残基１１７５、Ａｋｔ、ｐ４２ｐ４４ＭＡＰＫ及びｐ３８ＭＡＰＫの活性化を示す。細胞はＶＥＧＦで１０分間処理した（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（対照と比較）、片側ＡＮＯＶＡ、Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｎｅｗｍａｎ  Ｋｅｕｌｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定）。
【０１８５】
図２１は、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂがＲＰＥ細胞の細胞保護剤であることを示している。
【０１８６】
図２１Ａ〜図２１Ｃにおいて、ＡＲＰＥ１９細胞をＮａブチレート（図２１Ａ）又は過酸化水素（図２１Ｂ及び図２１Ｃ）で処理した。細胞をＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂ、ＶＥＧＦ−Ａ１６５又はＥＧＦと共に培養し、培地内のＬＤＨについてＥＬＩＳＡによって細胞毒性を測定した。ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂはＮａブチレート（図２１Ａ）及び過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）（図２１Ｂ）による細胞毒性を阻害した。細胞をＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂの存在下又は非存在下において過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）及び２種類の阻害剤で処理した（図２１Ｃ）。阻害剤としては、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２を阻害するＰＴＫ７８７又はＶＥＧＦＲ２に特異的なＺＭ３２３８８１を使用した。これらの阻害剤はＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂによる細胞毒性の減少を阻害した。
【０１８７】
図２１Ｄにおいて、ＲＰＥ細胞から抽出したｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲはＶＥＧＦＲ２の発現を示している。
【０１８８】
図２１Ｅにおいて、ＶＥＧＦ１６５ｂは７−ケトコレステロールによる細胞生存率の低下を減少させた（ＷＳＴ１アッセイ）。具体的には、２．５ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５ｂは、対照と比較して、７−ケトコレステロールの存在下においてＡＲＰＥ−１９細胞生存率を高めた（ＷＳＴ−１細胞生存率アッセイ）。細胞を７−ケトコレステロールで２４時間処理し、ＷＳＴ−１と共に２４０分間培養した。着色物（ホルマザン塩）を４５０ｎｍで観察し、細胞生存率の基準とした。ＶＥＧＦ１６５ｂは処理培地内においてＡＲＰＥ−１９の増殖を引き起こさず、細胞生存率の上昇は細胞保護作用によるものであることが示された。
【０１８９】
図２１Ｆにおいて、ＶＥＧＦ１６５ｂは７−ケトコレステロールによる処理時に細胞からのＬＤＨの放出を減少させた（ＶＥＧＦ１６５ｂ媒介細胞保護作用）。
【０１９０】
図２１Ｇにおいて、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂはＲＰＥ細胞におけるＩＧＦＢＰ３の発現を増加させたが、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ではＩＧＦＢＰ３の発現の増加は観察されなかった。
【０１９１】
図２２は、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂが内因性生存因子であることを示している。
【０１９２】
図２２Ａにおいて、免疫蛍光染色によってＲＰＥ細胞におけるＶＥＧＦ１６５ｂ（赤）の発現が観察され（ｉ）、ＶＥＧＦｘｘｘｂ特異的抗体を使用したウエスタンブロッティングによって確認し（ｉｉ）、ｍＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲによって確認した（ｉｉｉ）。ベバシズマブによる内因性ＶＥＧＦｘｘｘｂ又は全てのＶＥＧＦアイソフォームの阻害によって細胞毒性が増加した（ｉｖ）。
【０１９３】
図２２Ｂにおいて、ヒト内皮細胞はＶＥＧＦ１６５ｂの発現を示し（ｉ）、ＶＥＧＦｘｘｘｂの阻害によって細胞毒性が増加した（ｉｉ）（＊＊＊＝ｐ＜０．００１（対照と比較）、アクチン（緑）、核（青））。
【０１９４】
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(47). Varey, AH, Rennel, ES, Qiu, Y, Bevan, HS, Perrin, RM, Raffy, S, Dixon, AR, Paraskeva, C, Zaccheo, O, Hassan, AB, Harper, SJ & Bates, DO: VEGF(165)b, an antiangiogenic VEGF-A isoform, binds and inhibits bevacizumab treatment in experimental colorectal carcinoma: balance of pro- and antiangiogenic VEGF-A isoforms has implications for therapy. Br. J. Cancer,  98(8): 1366-1379, 2008.
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さらなる参考文献
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【産業上の利用可能性】
【０１９５】
本発明は、微小血管透過性亢進疾患を治療又は予防するために使用されるか、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの血管新生透過性亢進性を調節するために使用されるか、血管透過性の増加に依存することなく上皮細胞生存を維持するために使用されるか、上皮濾過膜の開窓性（例えば、数密度及び／又は大きさ）を減少させるために使用される活性薬剤の新たなファミリーを提供する。
【０１９６】
ＶＥＧＦｘｘｘｂファミリータンパク質、特にＶＥＧＦ１６５ｂの活性は、これらのタンパク質の公知の特性から予期されるものではない。
【０１９７】
この知見は、微小血管透過性亢進疾患に罹患したか、罹患しやすいヒト及び動物の多くの新たな治療及び非治療処置の可能性を開くものである。
【配列表フリーテキスト】
【０１９８】
配列データ
SEQ. ID. NO: 1
TCA GCG CAG CTA CTG CCA TC
SEQ. ID. NO: 2
GTG CTG GCC TTG GTG AGG TT
SEQ. ID. NO: 3
ACG TCC TAA GCC AGT GAG TG
SEQ . ID. NO: 4
CAG CCT TCT CAG CAT CAG TC
SEQ. ID. NO: 5
ACA AGA TCC GCA GAC GTG TA
SEQ.ID. NO. 6
ACA GAT GGC TGG CAA CTA GA
SEQ.ID NO. 7
AAA ACC TTT TGT TGC TTT GGA
SEQ.ID NO. 8
GAA ATG GGA TTG GTA AGA TGA
SEQ.ID NO. 9
GGC AGC TTG AGT TAA ACG AAC G
SEQ.ID NO. 10
ATG GAT CCG TAT CAG TCT TTC CTG C
【図１】
2012509306.tif 000005
【図７】
2012509306.tif 000006
【図１７】
2012509306.tif 000007
【図１９】
2012509306.tif 000008
【図２】
2012509306.tif 000009
【図３】
2012509306.tif 000010
【図４】
2012509306.tif 000011
【図５】
2012509306.tif 000012
【図６】
2012509306.tif 000013
【図８】
2012509306.tif 000014
【図９】
2012509306.tif 000015
【図１０】
2012509306.tif 000016
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2012509306.tif 000020
【図１５】
2012509306.tif 000021
【図１６】
2012509306.tif 000022
【図１８】
2012509306.tif 000023
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2012509306.tif 000027
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