(57)【要約】  本発明は、糸状菌細胞中においてポジティブ及びネガティブ選択遺伝子を使用して、糸状菌細胞中において遺伝子を欠失させ、破壊し、又は挿入する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌細胞のゲノム内の遺伝子又はその一部を欠失させる方法であって、以下のステップ：
（ａ）以下の：
（ｉ）発現されるとドミナント・ポジティブ選択表現型を前記糸状菌細胞に与える、ドミナント・ポジティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第１ポリヌクレオチド；
（ｉｉ）発現されるとネガティブ選択表現型を前記糸状菌細胞に与える、ネガティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第２ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）前記第１及び第２ポリヌクレオチドの５’側に位置する第１反復配列、及び第１及び第２ポリヌクレオチドの３’側に位置する第２反復配列、ここで、前記第１及び第２反復配列は同一の配列を含んでなる；並びに
（ｉｖ）構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の５’側に位置する第１フランキング配列、及び構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の３’側に位置する第２フランキング配列、ここで、前記第１フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第１領域と同一であり、且つ、前記第２フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第２領域と同一であり、ここで、（１）前記第１領域が前記糸状菌細胞の遺伝子又はその一部の５’側に位置し、且つ、前記第２領域が前記糸状菌細胞の遺伝子又はその一部の３’側に位置するか、（２）前記第１及び第２領域の両方が前記糸状菌細胞の遺伝子内に位置しているか、或いは（３）前記第１及び第２領域の一方が前記糸状菌細胞の遺伝子内に位置し、且つ、前記第１及び第２領域の他方が前記糸状菌細胞の遺伝子の５’若しくは３’側に位置する；
を含んでなる核酸構築物を、前記糸状菌細胞内に導入し、ここで、前記第１及び第２フランキング配列が、それぞれ前記糸状菌細胞の第１及び第２領域と分子間相同組換えを受けて、遺伝子又はその一部を欠失させ、及び前記核酸構築物で置き換え；
（ｂ）ポジティブ選択を適用することによって、ステップ（ａ）からドミナント・ポジティブ選択表現型を有する細胞を選択及び単離し；並びに
（ｃ）ネガティブ選択を適用することによって、ステップ（ｂ）のドミナント・ポジティブ選択表現型を有する選択された細胞からネガティブ選択表現型を有する細胞を選択及び単離して、前記第１及び第２反復配列に分子内相同組換えを強制的に施し、前記第１及び第２ポリヌクレオチドを欠失させること、
を含んでなる前記方法。
【請求項２】
前記ドミナント・ポジティブ選択マーカーが、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）、ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｔ）、ブレオマイシン、ゼオシン、及びフレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）、アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）、ピューロマイシン‐Ｎ‐アセチル−トランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ）、ネオマイシン‐カナマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）、アセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子（ａｃｕＡ）、Ｄ‐セリン・デヒドラターゼ遺伝子（ｄｓｄＡ）、ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子（ｓＣ）、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ・サブユニット９遺伝子（ｏｌｉＣ）、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（Ｉ）（ａｐｈ（３’）Ｉ）遺伝子、並びにアミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（ＩＩ）（ａｐｈ（３’）ＩＩ）遺伝子から成る群から選択される遺伝子のコード配列によってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ネガティブ選択マーカーが、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）、及びシトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）から成る群から選択される遺伝子のコード配列によってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
以下のステップ：（ｄ）ステップ（ｃ）の単離した細胞内へ対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入すること、をさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１及び第２反復配列が、前記第１フランキング配列又は第２フランキング配列のいずれかと同一である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
全遺伝子が完全に欠失され、外来ＤＮＡを残さない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
糸状菌細胞のゲノム内の遺伝子又はその一部を欠失させるための核酸構築物であって、以下の：
（ｉ）発現されるとドミナント・ポジティブ選択表現型を前記糸状菌細胞に与える、ドミナント・ポジティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第１ポリヌクレオチド；
（ｉｉ）発現されるとネガティブ選択表現型を前記糸状菌細胞に与える、ネガティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第２ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）前記第１及び第２ポリヌクレオチドの５’側に位置する第１反復配列、及び前記第１及び第２ポリヌクレオチドの３’側に位置する第２反復配列、ここで、前記第１及び第２反復配列は同一の配列を含んでなる；並びに
（ｉｖ）構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の５’側に位置する第１フランキング配列、及び構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の３’側に位置する第２フランキング配列、ここで、前記第１フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第１領域と同一であり、且つ、前記第２フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第２領域と同一であり、ここで、（１）前記第１領域が前記糸状菌細胞の遺伝子又はその一部の５’側に位置し、且つ、前記第２領域が前記糸状菌細胞の遺伝子又はその一部の３’側に位置するか、（２）前記第１及び第２領域の両方が前記糸状菌細胞の遺伝子内に位置しているか、或いは（３）前記第１及び第２領域の一方が前記糸状菌細胞の遺伝子内に位置し、且つ、前記第１及び第２領域の他方が、前記糸状菌細胞の遺伝子の５’又は３’側に位置する；
を含んでなり、ここで、前記第１及び第２フランキング配列が、それぞれ前記糸状菌細胞の第１及び第２領域と分子間相同組換えを受けて、遺伝子又はその一部を欠失させ、及び前記核酸構築物で置き換え；そして前記第１及び第２反復配列が分子内相同組換えを受けて、前記第１及び第２ポリヌクレオチドを欠失させる、前記核酸構築物。
【請求項８】
前記ドミナント・ポジティブ選択マーカーが、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）、ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｔ）、ブレオマイシン、ゼオシン、及びフレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）、アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）、ピューロマイシン‐Ｎ‐アセチル−トランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ）、ネオマイシン‐カナマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）、アセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子（ａｃｕＡ）、Ｄ‐セリン・デヒドラターゼ遺伝子（ｄｓｄＡ）、ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子（ｓＣ）、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ・サブユニット９遺伝子（ｏｌｉＣ）、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（Ｉ）（ａｐｈ（３’）Ｉ）遺伝子、並びにアミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（ＩＩ）（ａｐｈ（３’）ＩＩ）遺伝子から成る群から選択される遺伝子のコード配列によってコードされる、請求項７に記載の核酸構築物。
【請求項９】
前記ネガティブ選択マーカーが、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）、及びシトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）から成る群から選択される遺伝子のコード配列によってコードされる、請求項７に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
前記第１及び第２反復配列が、前記第１フランキング配列又は第２フランキング配列のいずれかと同一である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載の核酸構築物を含んでなる組換え糸状菌細胞。
【請求項１２】
糸状菌細胞のゲノム内にポリヌクレオチドを導入する方法であって、以下のステップ：
（ａ）以下の：
（ｉ）第１の対象ポリヌクレオチド；
（ｉｉ）発現されるとドミナント・ポジティブ選択表現型を前記糸状菌細胞に与える、ドミナント・ポジティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第２ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）発現されるとネガティブ選択表現型を前記糸状菌細胞に与える、ネガティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第３ポリヌクレオチド；
（ｉｖ）前記第２及び第３ポリヌクレオチドの５’側に位置する第１反復配列、並びに前記第２及び第３ポリヌクレオチドの３’側に位置する第２反復配列、ここで、前記第１及び第２反復配列は同一の配列を含んでなり、且つ、前記第１の対象ポリヌクレオチドは前記第１反復の５’側に位置するか又は前記第２反復の３’側に位置する；並びに
（ｖ）構成要素（ｉ）（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の５’側に位置する第１フランキング配列、及び構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の３’側に位置する第２フランキング配列、ここで、前記第１フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第１領域と同一であり、且つ、前記第２フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第２領域と同一である；
を含んでなる核酸構築物を糸状菌細胞内に導入し、ここで、前記第１及び第２フランキング配列は、それぞれ前記糸状菌細胞のゲノムの第１及び第２領域と分子間相同組換えを受けて、前記核酸構築物を前記糸状菌細胞のゲノム内に導入し；
（ｂ）ポジティブ選択を適用することによって、ステップ（ａ）からドミナント・ポジティブ選択表現型を有する細胞を選択し；並びに
（ｃ）ネガティブ選択を適用することによって、ステップ（ｂ）のドミナント・ポジティブ選択表現型を有する選択された細胞からネガティブ選択表現型を有する細胞を選択及び単離して、前記第１及び第２反復配列に分子内相同組換えを強制的に施し、前記第２及び第３ポリヌクレオチドを欠失させること、
を含んでなる、前記方法。
【請求項１３】
前記ドミナント・ポジティブ選択マーカーが、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）、ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｔ）、ブレオマイシン、ゼオシン、及びフレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）、アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）、ピューロマイシン‐Ｎ‐アセチル−トランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ）、ネオマイシン‐カナマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）、アセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子（ａｃｕＡ）、Ｄ‐セリン・デヒドラターゼ遺伝子（ｄｓｄＡ）、ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子（ｓＣ）、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ・サブユニット９遺伝子（ｏｌｉＣ）、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（Ｉ）（ａｐｈ（３’）Ｉ）遺伝子、並びにアミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（ＩＩ）（ａｐｈ（３’）ＩＩ）遺伝子から成る群から選択される遺伝子のコード配列によってコードされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ネガティブ選択マーカーが、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）、及びシトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）から成る群から選択される遺伝子のコード配列によってコードされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１及び第２反復配列が、前記第１フランキング配列又は第２フランキング配列のいずれかと同一である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
糸状菌細胞のゲノム内にポリヌクレオチドを導入するための核酸構築物であって、以下の：
（ｉ）第１の対象ポリヌクレオチド；
（ｉｉ）発現されるとドミナント・ポジティブ選択表現型を糸状菌細胞に与える、ドミナント・ポジティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第２ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）発現されるとネガティブ選択表現型を糸状菌細胞に与える、ネガティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第３ポリヌクレオチド；
（ｉｖ）前記第１及び第２ポリヌクレオチドの５’側に位置する第１反復配列、及び前記第１及び第２ポリヌクレオチドの３’側に位置する第２反復配列、ここで、前記第１及び第２反復配列が同一の配列を含んでなり、且つ、対象ポリペプチドをコードする前記第１ポリヌクレオチドは前記第１反復の５’側に位置するか又は前記第２反復の３’側に位置する；並びに
（ｖ）構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の５’側に位置する第１フランキング配列、及び構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の３’側に位置する第２フランキング配列、ここで、前記第１フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第１領域と同一であり、且つ、前記第２フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第２領域と同一である；
を含んでなり、ここで、前記第１及び第２フランキング配列は、それぞれ前記糸状菌細胞のゲノムの第１及び第２領域と分子間相同組換えを受けて、前記糸状菌細胞のゲノム内に前記核酸構築物を導入し；並びに前記第１及び第２反復配列は、分子内相同組換えを受けて、前記第２及び第３ポリヌクレオチドを欠失させることができる、前記核酸構築物。
【請求項１７】
前記ドミナント・ポジティブ選択マーカーが、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）、ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｔ）、ブレオマイシン、ゼオシン、及びフレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）、アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）、ピューロマイシン‐Ｎ‐アセチル−トランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ）、ネオマイシン‐カナマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）、アセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子（ａｃｕＡ）、Ｄ‐セリン・デヒドラターゼ遺伝子（ｄｓｄＡ）、ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子（ｓＣ）、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ・サブユニット９遺伝子（ｏｌｉＣ）、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（Ｉ）（ａｐｈ（３’）Ｉ）遺伝子、並びにアミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（ＩＩ）（ａｐｈ（３’）ＩＩ）遺伝子から成る群から選択される遺伝子のコード配列によってコードされる、請求項１６に記載の核酸構築物。
【請求項１８】
前記ネガティブ選択マーカーが、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）、及びシトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）から成る群から選択される遺伝子のコード配列によってコードされる、請求項１６に記載の核酸構築物。
【請求項１９】
前記第１及び第２反復配列が、前記第１フランキング配列又は第２フランキング配列のいずれかと同一である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項２０】
請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の核酸構築物を含んでなる組換え糸状菌細胞。
【請求項２１】
ポリペプチドを製造する方法であって、以下のステップ：（ａ）ポリペプチドの産生を促す条件下、請求項１〜６のいずれか１項に従って得た糸状菌細胞を培養し；及び（ｂ）前記ポリペプチドを回収すること、を含んでなる前記方法。
【請求項２２】
ポリペプチドを製造する方法であって、以下のステップ：（ａ）ポリペプチドの産生を促す条件下、請求項１２〜１５のいずれか１項に従って得た糸状菌細胞を培養し；及び（ｂ）前記ポリペプチドを回収すること、含んでなる前記方法。
【請求項２３】
以下の：（ａ）配列番号５２の成熟ポリペプチドに対して好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、よりいっそう好ましくは少なくとも９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９５％の同一性、そして最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ；（ｂ）好ましくは少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下、より好ましくは少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下、よりいっそう好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件下、そして最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で配列番号５１の成熟ポリペプチド・コード配列又はその完全長の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされたオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ；そして（ｃ）配列番号５１の成熟ポリペプチド・コード配列に対して好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、よりいっそう好ましくは少なくとも９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９５％の同一性、そして最も好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドによってコードされたオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ、から成る群から選択される単離されたオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ。
【請求項２４】
配列番号５２、又はオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ活性を有するその断片を含んでなるか、又はそれから成る、請求項２３に記載の単離されたオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ。
【請求項２５】
請求項２３又は２４に記載のオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項２３又は２４に記載のオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼを製造する方法であって、以下のステップ：前記オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸構築物を含んでなる宿主細胞を、そのポリペプチドの産生を促す条件下で培養すること、を含んでなる前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、コンピューターが読み取り可能な形式で配列表を含んでいる。コンピューターが読み取り可能な当該形式を、本明細書中に援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、糸状菌細胞におけるポジティブ及びネガティブ選択遺伝子の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
特定の表現型を発現する選択マーカー遺伝子は、遺伝子が導入された宿主細胞を特定し、単離するための発現ベクターの一部として組換えＤＮＡ技術において広く使用される。選択マーカー遺伝子の産物は、殺生物剤耐性若しくはウイルス耐性、重金属等に対する耐性を与えることができ、又は栄養要求性変異株に原栄養性を付与することもある。ポジティブ選択遺伝子は、導入遺伝子を保有する細胞を特定、及び／又は単離するために使用され、一方、ネガティブ選択遺伝子は、導入遺伝子を保有する細胞を排除するための手段を提供する。
【０００４】
ポジティブ選択マーカー（例えば、特定の抗生物質に対する耐性）によって与えられる表現型と、それによる細胞／宿主における選択マーカー遺伝子の存在は、細胞／宿主の最終的な利用によっては望ましくないこともある（例えば、商品菌株におけるヒグロマイシンＢ耐性遺伝子）。このため、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子などの双方向性選択マーカー遺伝子は、魅力的な代替手段の典型である。このａｍｄＳ遺伝子は、その遺伝子がポジティブ方向及びネガティブ方向の両方において優性であるという点で、優性の双方向性選択マーカーである。ａｍｄＳ遺伝子の利点は、それが優性のネガティブ選択によって宿主生物から容易に欠失させる又は取り除くことができる点である。前記の選択は、フルオロアセタミドを含有する成長培地上で細胞を平板培養することによって達成される。フルオロアセタミドは、ａｍｄＳ保有細胞によってフルオロ酢酸に代謝されるが、そのフルオロ酢酸が細胞に対して有毒である。ａｍｄＳ遺伝子を失った細胞だけが、ネガティブ選択条件下で増殖可能である。しかしながら、選択マーカーとしてのａｍｄＳの使用に伴う一つの重大な問題は、ａｍｄＳが真菌界中に極めて広範に存在しているので、選択マーカーとしてａｍｄＳ遺伝子を使用する前に、野生型宿主株のａｍｄＳ遺伝子の活性な内在性コピーのすべてを不活性化又は欠失させなければならない。比較的に少数のその他の双方向性選択マーカー遺伝子しか利用できないが（例えば、ｐｙｒＧ、ｓＣ、ｎｉａＤ、及びｏｌｉＣ）、それらは利用前に栄養要求突然変異体の作出を必要とする不都合がある。そして、前記のその他の双方向性選択マーカー遺伝子は、未知の望ましくない突然変異を宿主ゲノム内に導入する可能性がある上、これらの系がすべての真菌で機能するとは限らない。一例を挙げれば、ｐｙｒＧを双方向性選択マーカーとして無効にする一部のフサリウム菌株は、５‐フルオロオロチン酸を代謝することができる。そのため、当該技術分野では、糸状菌においてポジティブ及びネガティブ表現型を使用するための新たな手法を必要としている。
【０００５】
米国特許第６５５５３７０号明細書では、二機能性の選択性融合遺伝子の使用を開示している。
【０００６】
当該技術分野ではさらに、その真菌が組換え株の作出に使用されたＤＮＡを最小限の微量でしか含まない〜全く含まないように、遺伝子操作された糸状菌内に導入された外来性ＤＮＡ、例えば選択マーカーを取り除くための別の方法を提供する必要もある。そういったＤＮＡを取り除くあらゆる技術が、当該技術分野において有益である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、糸状菌細胞におけるポジティブ及びネガティブ選択遺伝子の使用方法を提供する。
【０００８】
発明の概要
本発明は、糸状菌細胞のゲノム内の遺伝子又はその一部を欠失させる方法であって、以下のステップ：
（ａ）以下の：
（ｉ）発現されるとドミナント・ポジティブ選択表現型を前記糸状菌細胞に与える、ドミナント・ポジティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第１ポリヌクレオチド；
（ｉｉ）発現されるとネガティブ選択表現型を前記糸状菌細胞に与える、ネガティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第２ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）前記第１及び第２ポリヌクレオチドの５’側に位置する第１反復配列、及び第１及び第２ポリヌクレオチドの３’側に位置する第２反復配列、ここで、前記第１及び第２反復配列は同一の配列を含んでなる；並びに
（ｉｖ）構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の５’側に位置する第１フランキング配列、及び構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の３’側に位置する第２フランキング配列、ここで、前記第１フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第１領域と同一であり、且つ、前記第２フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第２領域と同一であり、ここで、（１）前記第１領域が前記糸状菌細胞の遺伝子又はその一部の５’側に位置し、且つ、前記第２領域が前記糸状菌細胞の遺伝子又はその一部の３’側に位置するか、（２）前記第１及び第２領域の両方が前記糸状菌細胞の遺伝子内に位置しているか、或いは（３）前記第１及び第２領域の一方が前記糸状菌細胞の遺伝子内に位置し、且つ、前記第１及び第２領域の他方が前記糸状菌細胞の遺伝子の５’若しくは３’側に位置する；
を含んでなる核酸構築物を、前記糸状菌細胞内に導入し、ここで、前記第１及び第２フランキング配列が、それぞれ前記糸状菌細胞の第１及び第２領域と分子間相同組換えを受けて、遺伝子又はその一部を欠失させ、及び前記核酸構築物で置き換え；
（ｂ）ポジティブ選択を適用することによって、ステップ（ａ）からドミナント・ポジティブ選択表現型を有する細胞を選択及び単離し；並びに
（ｃ）ネガティブ選択を適用することによって、ステップ（ｂ）のドミナント・ポジティブ選択表現型を有する選択された細胞からネガティブ選択表現型を有する細胞を選択及び単離して、前記第１及び第２反復配列に分子内相同組換えを強制的に施し、前記第１及び第２ポリヌクレオチドを欠失させること、
を含んでなる前記方法に関する。
【０００９】
本発明はさらに、糸状菌細胞のゲノム内に対象ポリヌクレオチドを導入する方法であって、以下のステップ：
（ａ）以下の：
（ｉ）第１の対象ポリヌクレオチド；
（ｉｉ）発現されるとドミナント・ポジティブ選択表現型を糸状菌細胞に与えるドミナント・ポジティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第２ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）発現されるとネガティブ選択表現型を糸状菌細胞に与えるネガティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第３ポリヌクレオチド；
（ｉｖ）前記第２及び第３ポリヌクレオチドの５’側に位置する第１反復配列、及び前記第２及び第３ポリヌクレオチドの３’側に位置する第２反復配列、ここで、前記第１及び第２反復配列は同一の配列を含んでなり、且つ、第１の対象ポリヌクレオチドは前記第１反復配列の５’側に位置するか又は前記第２反復配列の３’側に位置する；並びに
（ｖ）構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の５’側に位置する第１フランキング配列、及び構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の３’側に位置する第２フランキング配列、ここで、前記第１フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第１領域と同一であり、且つ、前記第２フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第２領域と同一である、
を含んでなる核酸構築物を、前記糸状菌細胞内に導入し；ここで、前記第１及び第２フランキング配列は、それぞれ糸状菌細胞のゲノムの第１及び第２領域と分子間相同組換えを受けて、前記核酸構築物を糸状菌細胞のゲノム内に導入し；
（ｂ）ポジティブ選択を適用することによって、ステップ（ａ）からドミナント・ポジティブ選択表現型を有する細胞を選択し；並びに
（ｃ）ネガティブ選択を適用することによって、ステップ（ｂ）のドミナント・ポジティブ選択表現型を有する選択された細胞からネガティブ選択表現型を有する細胞を選択及び単離して、前記第１及び第２反復配列に分子内相同組換えを強制的に施し、前記第２及び第３ポリヌクレオチドを欠失させること、
を含んでなる方法にも関する。
【００１０】
本発明はさらに、そういった核酸構築物、ベクター、及びかかる核酸構築物を含んでなる糸状菌細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ｐＪａＬ５０４‐［Ｂａｍ ＨＩ］の制限地図を示す。
【図２】ｐＪａＬ５０４‐［Ｂｇｌ ＩＩ］の制限地図を示す。
【図３】ｐＪａＬ５７４の制限地図を示す。
【図４】ｐＷＴＹ１４４９‐０２‐０１の制限地図を示す。
【図５】ｐＥＪＧ６１の制限地図を示す。
【図６】ｐＥｍＹ２１の制限地図を示す。
【図７】ｐＤＭ１５６．２の制限地図を示す。
【図８】ｐＥｍＹ２３の制限地図を示す。
【図９】ｐＷＴＹ１４７０‐１９‐０７の制限地図を示す。
【図１０】ｐＷＴＹ１５１５‐０２‐０１の制限地図を示す。
【図１１】ｐＪｆｙＳ１５４０‐７５‐５の制限地図を示す。
【図１２】ｐＪｆｙＳ１５７９‐１‐１３の制限地図を示す。
【図１３】ｐＪｆｙＳ１５７９‐８‐６の制限地図を示す。
【図１４】ｐＪｆｙＳ１５７９‐２１‐１６の制限地図を示す。
【図１５】ｐＡｌＬｏ１４９２‐２４の制限地図を示す。
【図１６】ｐＪｆｙＳ１５７９‐３５‐２の制限地図を示す。
【図１７】ｐＪｆｙＳ１５７９‐４１‐１１の制限地図を示す。
【図１８】ｐＪｆｙＳ１６０４‐５５‐１３の制限地図を示す。
【図１９】ｐＪｆｙＳ１５７９‐９３‐１の制限地図を示す。
【図２０】ｐＪｆｙＳ１６０４‐１７‐２の制限地図を示す。
【図２１】ｐＥＪＧ６９の制限地図を示す。
【図２２】ｐＥＪＧ６５の制限地図を示す。
【図２３】ｐＭＳｔｒ１９の制限地図を示す。
【図２４】ｐＥＪＧ４９の制限地図を示す。
【図２５】ｐＥｍＹ１５の制限地図を示す。
【図２６】ｐＥｍＹ２４の制限地図を示す。
【図２７】ｐＤＭ２５７の制限地図を示す。
【図２８】ｐＤＭ２５８の制限地図を示す。
【図２９】フサリウム・ベネナツムａｍｙＡ欠失株の形質転換体のラクトースオキシダーゼ相対収率を示す。
【図３０】フサリウム・ベネナツムａｍｙＡ欠失株の形質転換体のアルファアミラーゼ相対活性を示す。
【図３１】ｐＪｆｙＳ１６９８‐６５‐１５の制限地図を示す。
【図３２】ｐＪｆｙＳ１６９８‐７２‐１０の制限地図を示す。
【図３３】フサリウム・ベネナツムａｌｐＡ欠失株の形質転換体のアルカリプロテアーゼ相対活性を示す。
【図３４】ｐＪｆｙＳ１８７９‐３２‐２の制限地図を示す。
【図３５】ｐＪｆｙＳ１１１の制限地図を示す。
【図３６】ｐＪｆｙＳ２０１０‐１３‐５の制限地図を示す。
【図３７】ｐＪｆｙＳ１２０の制限地図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
選択マーカー：「選択マーカー」という用語は、本明細書中では、抗生物質耐性表現型を与えることができるか、（ドミナント・ポジティブ選択のために）独立栄養要求性を提供することができるか、又は（ネガティブ選択のために）毒性代謝物を活性化することができるタンパク質をコードする遺伝子と定義される。
【００１３】
ドミナント・ポジティブ選択マーカー：「ドミナント・ポジティブ選択マーカー」という用語は、本明細書中では、糸状菌細胞内に形質転換されることによって、形質転換体のポジティブ選択を可能にする優性表現型を発現する遺伝子と定義される。
【００１４】
ドミナント・ポジティブ選択表現型：「ドミナント・ポジティブ選択表現型」という用語は、本明細書中では、形質転換体のポジティブ選択を可能にする表現型と定義される。
【００１５】
ネガティブ選択マーカー：「ネガティブ選択マーカー」という用語は、本明細書中では、糸状菌細胞内に形質転換されることによって、形質転換体のネガティブ選択（すなわち、排除）を可能にする表現型を発現する遺伝子と定義される。
【００１６】
ネガティブ選択表現型：「ネガティブ選択表現型」という用語は、本明細書中では、形質転換体のネガティブ選択（すなわち、排除）を可能にする表現型と定義される。
【００１７】
遺伝子：「遺伝子」という用語は、本明細書中では、細胞のゲノムのＤＮＡ領域と定義される。遺伝子は、通常、単一タンパク質又はＲＮＡに相当する個別の遺伝形質を制御する。「遺伝子」という用語の中には、コード配列を含む機能単位全体、非コード配列、イントロン、プロモーター、及び発現を変更するタンパク質をコードするその他の調節配列が包含される。
【００１８】
その一部：「その一部」という用語は、本明細書中では、例えばオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、プロモーター、イントロン配列、及びその他の調節配列などの遺伝子の機能単位全体；又はその一部の構成要素と定義される。
【００１９】
第１及び第２ポリヌクレオチドの５’又は３’側に位置する：「第１及び第２ポリヌクレオチドの５’側に位置する」及び「第１及び第２ポリヌクレオチドの３’側に位置する」という用語は、本明細書中では、好ましくは第１及び第２ポリヌクレオチドから１０００〜５０００ｂｐ以内、より好ましくは１００〜１０００ｂｐ以内、よりいっそう好ましくは１０〜１００ｂｐ以内、最も好ましくは１〜１０ｂｐ以内、そしてさらに最も好ましくはその直近と定義される。しかしながら、その位置は、５０００ｂｐよりさらに遠くてもよい。
【００２０】
構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の５’又は３’側に位置する：「構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の５’側に位置する」及び「構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の３’側に位置する」という用語は、本明細書中では、好ましくは構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）から１０００〜５０００ｂｐ以内、より好ましくは１００〜１０００ｂｐ以内、よりいっそう好ましくは１０〜１００ｂｐ以内、最も好ましくは１〜１０ｂｐ以内、そしてさらに最も好ましくは直近と定義される。しかしながら、その位置は、５０００ｂｐよりさらに遠くてもよい。
【００２１】
遺伝子又はその一部の５’又は３’側に位置する：「遺伝子又はその一部の５’側に位置する」及び「遺伝子又はその一部の３’側に位置する」という用語は、本明細書中では、好ましくは遺伝子又はその一部から１０００〜５０００ｂｐ以内、より好ましくは１００〜１０００ｂｐ以内、よりいっそう好ましくは１０〜１００ｂｐ以内、最も好ましくは１〜１０ｂｐ以内、そしてさらに最も好ましくは直近と定義される。しかしながら、その位置は、５０００ｂｐよりさらに遠くてもよい。
【００２２】
単離されたポリヌクレオチド：「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中では、源から単離されたポリヌクレオチドを指す。好ましい態様では、そのポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動で測定した場合に、少なくとも１％純粋であり、好ましくは少なくとも５％純粋であり、より好ましくは少なくとも１０％純粋であり、より好ましくは少なくとも２０％純粋であり、より好ましくは少なくとも４０％純粋であり、より好ましくは少なくとも６０％純粋であり、よりいっそう好ましくは少なくとも８０％純粋であり、そして最も好ましくは少なくとも９０％純粋である。
【００２３】
実質的に純粋なポリヌクレオチド：「実質的に純粋なポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中では、他の外来の又は望ましくないヌクレオチドを含まない、且つ、遺伝子操作されたタンパク質製造の中での使用に好適な形態のポリヌクレオチド調製物を指す。よって、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、多くても１０重量％、好ましくは多くても８重量％、より好ましくは多くても６重量％、より好ましくは多くても５重量％、より好ましくは多くても４重量％、より好ましくは多くても３重量％、よりいっそう好ましくは多くても２重量％、最も好ましくは多くても１重量％、そしてさらに最も好ましくは多くても０．５重量％の天然又は組換えに付随する他のポリヌクレオチド物質しか含まない。しかしながら、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、例えばプロモーターやターミネーターなどの天然に存在する５’及び３’非翻訳領域を含むこともある。実質的に純粋なポリヌクレオチドが、少なくとも９０重量％純粋であることが好ましく、好ましくは少なくとも９２重量％純粋であり、より好ましくは少なくとも９４重量％純粋であり、より好ましくは少なくとも９５重量％純粋であり、より好ましくは少なくとも９６重量％純粋であり、より好ましくは少なくとも９７重量％純粋であり、よりいっそう好ましくは少なくとも９８重量％純粋であり、最も好ましくは少なくとも９９重量％純粋であり、そしてさらに最も好ましくは少なくとも９９．５重量％純粋である。本発明のポリヌクレオチドは実質的に純粋な形態であること、すなわち、前記ポリヌクレオチド調製物は天然又は組換えに付随する他のポリヌクレオチド物質を事実上含まないことが好ましい。そのポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、及び合成起源、又はそのいずれかの組み合わせのものであり得る。
【００２４】
コード配列：本明細書中に使用されるとき、「コード配列」という用語はヌクレオチド配列を意味し、そしてそれがそのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接指定する。コード配列の境界は、一般に、オープンリーディングフレームによって判断され、そしてそれは、通常、ＡＴＧ開始コドン又は代替の開始コドン、例えばＧＴＧやＴＴＧなどで始まり、終止コドン、例えばＴＡＡや、ＴＡＧや、ＴＧＡなどで終わる。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ヌクレオチド配列、及び組換えヌクレオチド配列、又はそのいずれかの組み合わせであり得る。
【００２５】
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という用語は、本明細書中では、真核細胞から得られる成熟、つまり、スプライスされた、ｍＲＮＡ分子から逆転写によって調製できるＤＮＡ分子と定義される。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ内に通常存在しているイントロン配列を欠いている。最初の、一次ＲＮＡ転写物は、成熟したスプライスされたｍＲＮＡとして現れる前の一連のステップによって処理される、ｍＲＮＡへの前駆体である。これらのステップには、スプライシングと呼ばれる工程によるイントロン配列の欠失が含まれる。ｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡは、そのため、あらゆるイントロン配列を欠いている。
【００２６】
核酸構築物：「核酸構築物」という用語は、本明細書中で使用される場合、天然に存在する遺伝子から単離されたか、又は修飾されなければ天然に存在しない様式で核酸断片を含むように修飾されたか、又は合成されたものである、一本鎖又は二本鎖の核酸分子を指す。
【００２７】
制御配列：「制御配列」という用語は、本明細書中では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な全構成要素を含むように定義される。それぞれの制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にとって天然のものであっても、異質なものであってもよく、又は互いに天然のものであっても、異質なものであってもよい。そういった制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが挙げられるが、これだけに限定されるものではない。少なくとも、制御配列には、プロモーター、並びに転写及び翻訳終止シグナルが含まれる。制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード領域と制御配列の連結を容易にする特定の制限部位を導入する目的でリンカーと共に提供され得る。
【００２８】
作動できるように連結された：「作動できるように連結された」という用語は、本明細書中では、ポリヌクレオチド配列のコード配列に対して制御配列が、その制御配列がポリペプチドのコード配列の発現を指示するように適当な位置に配置された構造を意味する。
【００２９】
発現：「発現」という用語には、これだけに限定されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含めたポリペプチドの産生に関わるあらゆるステップが含まれる。
【００３０】
発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、本明細書中では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなり、且つ、発現を導く付加的なヌクレオチドに作動できるように連結されている線状又は環状ＤＮＡ分子と定義される。
【００３１】
導入：「導入」という用語とそのバリエーションは、本明細書中では、糸状菌細胞内へのＤＮＡの移入と定義される。糸状菌細胞内へのＤＮＡの導入は、当該技術分野で知られているいずれかの方法、例えば形質転換などで達成される。
【００３２】
形質転換：「形質転換」という用語は本明細書中では、糸状菌細胞内に、単離されたＤＮＡを、そのＤＮＡが染色体の要素として又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように導入することと定義される。
【００３３】
単離されたポリペプチド：「単離されたポリペプチド」という用語は、本明細書中では、源から単離されたポリペプチドを指す。好ましい態様では、そのポリペプチドは、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥで測定した場合に、少なくとも１％純粋であり、好ましくは少なくとも５％純粋であり、より好ましくは少なくとも１０％純粋であり、より好ましくは少なくとも２０％純粋であり、より好ましくは少なくとも４０％純粋であり、より好ましくは少なくとも６０％純粋であり、よりいっそう好ましくは少なくとも８０％純粋であり、そして最も好ましくは少なくとも９０％純粋である。
【００３４】
実質的に純粋なポリペプチド：「実質的に純粋なポリペプチド」という用語は、本明細書中では、多くても１０重量％、好ましくは多くても８重量％、より好ましくは多くても６重量％、より好ましくは多くても５重量％、より好ましくは多くても４重量％、より好ましくは多くても３重量％、よりいっそう好ましくは多くても２重量％、最も好ましくは多くても１重量％、そしてさらに最も好ましくは多くても０．５重量％の天然又は組換えに付随する他のポリペプチド物質しか含まないポリペプチド調製物と定義される。そのため、実質的に純粋なポリペプチドは、その調製物中に存在するポリペプチド物質のうち少なくとも９２重量％純粋であることが好ましく、好ましくは少なくとも９４重量％純粋であり、より好ましくは少なくとも９５重量％純粋であり、より好ましくは少なくとも９６重量％純粋であり、より好ましくは少なくとも９７重量％純粋であり、より好ましくは少なくとも９８重量％純粋であり、よりいっそう好ましくは少なくとも９９重量％純粋であり、最も好ましくは少なくとも９９．５重量％純粋であり、そしてさらに最も好ましくは１００重量％純粋である。本発明のポリペプチドは実質的に純粋な形態であること、すなわち、前記ポリペプチド調製物は天然又は組換えに付随する他のポリペプチド物質を事実上含まないことが好ましい。これは、例えば、周知の組換え法又は古典的な精製法によりポリペプチドを調製することによって達成できる。
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明は、糸状菌細胞のゲノム内の遺伝子又はその一部を欠失させる方法であって、以下のステップ：（ａ）以下の：（ｉ）発現されるとドミナント・ポジティブ選択表現型を前記糸状菌細胞に与える、ドミナント・ポジティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第１ポリヌクレオチド；（ｉｉ）発現されるとネガティブ選択表現型を前記糸状菌細胞に与える、ネガティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第２ポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）前記第１及び第２ポリヌクレオチドの５’側に位置する第１反復配列、及び第１及び第２ポリヌクレオチドの３’側に位置する第２反復配列、ここで、前記第１及び第２反復配列は同一の配列を含んでなる；並びに（ｉｖ）構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の５’側に位置する第１フランキング配列、及び構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の３’側に位置する第２フランキング配列、ここで、前記第１フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第１領域と同一であり、且つ、前記第２フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第２領域と同一であり、ここで、（１）前記第１領域が前記糸状菌細胞の遺伝子又はその一部の５’側に位置し、且つ、前記第２領域が前記糸状菌細胞の遺伝子又はその一部の３’側に位置するか、（２）前記第１及び第２領域の両方が前記糸状菌細胞の遺伝子内に位置しているか、或いは（３）前記第１及び第２領域の一方が前記糸状菌細胞の遺伝子内に位置し、且つ、前記第１及び第２領域の他方が前記糸状菌細胞の遺伝子の５’若しくは３’側に位置する；を含んでなる核酸構築物を、前記糸状菌細胞内に導入し、ここで、前記第１及び第２フランキング配列が、それぞれ前記糸状菌細胞の第１及び第２領域と分子間相同組換えを受けて、遺伝子又はその一部を欠失させ、及び前記核酸構築物で置き換え；（ｂ）ポジティブ選択を適用することによって、ステップ（ａ）からドミナント・ポジティブ選択表現型を有する細胞を選択及び単離し；並びに（ｃ）ネガティブ選択を適用することによって、ステップ（ｂ）のドミナント・ポジティブ選択表現型を有する選択された細胞からネガティブ選択表現型を有する細胞を選択及び単離して、前記第１及び第２反復配列に分子内相同組換えを強制的に施し、前記第１及び第２ポリヌクレオチドを欠失させること、を含んでなる前記方法に関する。
【００３６】
一態様では、外来ＤＮＡを全く残すことなく、前記の全遺伝子が完全に欠失される。
【００３７】
本発明はまた、糸状菌細胞のゲノム内に対象ポリヌクレオチドを導入する方法であって、以下のステップ：（ａ）以下の：（ｉ）第１の対象ポリヌクレオチド；（ｉｉ）発現されるとドミナント・ポジティブ選択表現型を前記糸状菌細胞に与えるドミナント・ポジティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第２ポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）発現されるとネガティブ選択表現型を前記糸状菌細胞に与えるネガティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第３ポリヌクレオチド；（ｉｖ）前記第２及び第３ポリヌクレオチドの５’側に位置する第１反復配列、及び前記第２及び第３ポリヌクレオチドの３’側に位置する第２反復配列、ここで、前記第１及び第２反復配列は同一の配列を含んでなり、且つ、第１の対象ポリヌクレオチドは前記第１反復配列の５’側に位置するか又は前記第２反復配列の３’側に位置する；並びに（ｖ）構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の５’側に位置する第１フランキング配列、及び構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の３’側に位置する第２フランキング配列、ここで、前記第１フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第１領域と同一であり、且つ、前記第２フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第２領域と同一である、を含んでなる核酸構築物を、前記糸状菌細胞内に導入し；この場合、前記第１及び第２フランキング配列は、それぞれ糸状菌細胞のゲノムの第１及び第２領域と分子間相同組換えを受けて、前記核酸構築物を前記糸状菌細胞のゲノム内に導入し；（ｂ）ポジティブ選択を適用することによって、ステップ（ａ）からドミナント・ポジティブ選択表現型を有する細胞を選択し；そして（ｃ）ネガティブ選択を適用することによって、ステップ（ｂ）のドミナント・ポジティブ選択表現型を有する選択された細胞からネガティブ選択表現型を有する細胞を選択及び単離して、前記第１及び第２反復配列に分子内相同組換えを強制的に施し、前記第２及び第３ポリヌクレオチドを欠失させること、を含んでなる前記方法に関する。
【００３８】
本発明では、完全な又は最小限に特徴付けられた遺伝子欠失又は挿入を受ける能力を任意の糸状菌に与える二機能性選択系を記載する。これは、ゲノム内に組み込むＤＮＡ断片を形質転換し、そしてＤＮＡ断片上にあるフランキングＤＮＡ配列と宿主の対応するゲノム配列の間の二重交差事象によって遺伝子欠失又は遺伝子挿入が引き起こされた結果として達成される。分子内の組換えは、直列反復配列の間に生じ、間にはさまれている配列の欠失をもたらし、その結果、宿主ゲノム内の標的遺伝子が欠失されるか、対象ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入するか、又はポリヌクレオチドを遺伝子内に挿入し、そして残留ＤＮＡを残さないか又は１回の反復を残す。
【００３９】
一態様では、二重マーカー系は、ハイグロマイシンＢに対して感受性があり、且つ、５‐フルオロ‐デオキシウリジンに対して耐性がある、あらゆる糸状菌に普遍的な系を提供する。本発明は、ハイグロマイシンＢに対して感受性があり、且つ、５‐フルオロ‐デオキシウリジンに対して耐性を有する任意の糸状菌株が、（１）１若しくは２以上の（数個の）完全な又は最小限に特徴付けられた遺伝子欠失を有する菌株を作出すること、又は（２）糸状菌細胞内に１若しくは２以上（数個）の遺伝子を導入すると同時に、その糸状菌細胞内に形質転換ＤＮＡを残さないか若しくは最小限しか残さないこと、を目的とした二重ポジティブ及びネガティブ選択カセットを保有するベクターを用いた形質転換のための候補となることを可能にする。
【００４０】
ドミナント・ポジティブ及びネガティブ選択マーカー
本発明の方法には、任意のドミナント・ポジティブ選択マーカーを使用できる。
【００４１】
一態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）、ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｔ）、ブレオマイシン、ゼオシン、及びフレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ／ｂｌｅＯ）、アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）、ピューロマイシン‐Ｎ‐アセチル‐トランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ）、アセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子（ａｃｕＡ／ｆａｃＡ）、Ｄ‐セリン・デヒドラターゼ（ｄｓｄＡ）、ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子（ｓＣ）、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ・サブユニット９遺伝子（ｏｌｉＣ）、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（Ｉ）（ａｐｈ（３’）Ｉ）遺伝子、及びアミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（ＩＩ）（ａｐｈ（３’）ＩＩ）遺伝子から成る群から選択される遺伝子のコード配列によってコードされる。
【００４２】
別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｔ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ブレオマイシン、ゼオシン、及びフレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ／ｂｌｅＯ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、アセトアミダーゼの遺伝子（ａｍｄＳ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ピューロマイシン‐Ｎ‐アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、アセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子（ａｃｕＡ／ｆａｃＡ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、Ｄ‐セリン・デヒドラターゼ（ｄｓｄＡ）遺伝子のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子（ｓＣ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ・サブユニット９遺伝子（ｏｌｉＣ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（Ｉ）（ａｐｈ（３’）Ｉ）遺伝子のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３（ＩＩ）’（ａｐｈ（３’）ＩＩ）遺伝子のコード配列によってコードされる。
【００４３】
ポジティブ選択マーカーは、あらゆる利用可能な供給源から得ることができる。例えば、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（EC 2.7.1.119; UniProtKB/Wwiss-Prot P09979）をコードするハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）は、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）（Zalacain et al., 1986, Nucleic Acids Research 14: 1565-1581）及びＥ．コリ（E. coli）（Lino et al., 2007, Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 63: 685-688）から得ることができる。ホスフィノトリシンＮ‐アセチルトランスフェラーゼ（EC 2.3.1.183; UniProtKB/Swiss-Prot P16426）をコードするホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｔ又はｂａｒ）は、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（White et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 1062; and Thompson et al., 1987, EMBO J. 6: 2519-2523）及びストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）（Lutz et al., 2001, Plant Physiol. 125: 1585-1590; and Strauch et al., 1988, Gene 63: 65-74）から得ることができる。
【００４４】
例えば、ｂｌｅ（UniProtKB/Swiss-Prot P13081）及びｂｌｅＯ（UniProtKB/Swiss-Prot P67925）によってコードされるブレオマイシン耐性タンパク質（ＢＲＰ）は、クレブシェラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonia）（Mazodier et al., 1985, Nucleic Acids Research 13: 195-205）及びバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）（Oskam et al., 1991, Plasmid 26: 30-39）からそれぞれ得ることができる。アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）（EC 3.5.1.4; UniProtKB/Swiss-Prot P08158）は、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）（アスペルギルス・ニデュランス）（Corrick et al., 1987, Gene 53: 63-71）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、及びペニシリウム・クリソゲヌム（Penicillium chrysogenum）（ＥＰ７５８０２０）から得ることができる。ミトコンドリア・チアゾール生合成酵素（UniProtKB/Swiss-Prot Q9UUZ9）をコードするピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ又はｔｈｉＡ）は、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）（Kubodera et al., 2000, Biosci. Biotechnol. Biochem. 64: 1416-1421）から得ることができる。
【００４５】
ピューロマイシン‐Ｎ‐アセチルトランスフェラーゼ（ＮＣＢＩ受入番号ＣＡＢ４２５７０）をコードするｐａｃ遺伝子は、Ｅ．コリ（ＷＯ１９９８／１１２４１）から得ることができる。アセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子（ａｃｕＡ／ｆａｃＡ；EC6.2.1.1）は、アスペルギルス・ニガー（UniProt A2QK81）、エメリセラ・ニデュランス（アスペルギルス・ニデュランス）（Uniprot P16928）（Papadopoulou and Sealy-Lewis, 1999, FEMS Microbiology Letters 178: 35-37;及びSandeman and Hynes, 1989, Mol. Gen. Genet. 218: 87-92）、及びフィコマイセス・ブレイクスリーアヌス（Phycomyces blakesleeanus）（UniProtKB/Swiss-Prot Q01576）（Garre et al., 1994, Mol. Gen. Gen. 244: 278-286）から得ることができる。Ｄ‐セリン・デヒドラターゼ（EC 4.3.1.18; UniProtKB/Swiss-Prot A1ADP3）をコードするｄｓｄＡ遺伝子は、Ｅ．コリ（Johnson et al., 2007, J. Bacteriol. 189: 3228-3236）から得ることができる。ＡＴＰスルフリラーゼ（ＮＣＢＩ受入番号ＡＡＮ０４４９７）をコードするｓＣ遺伝子は、アスペルギルス・ニガー（Varadarajalu and Punekar, 2005, Microbiol. Methods. 61: 219-224）から得ることができる。ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ・サブユニット９（ｏｌｉＣ）遺伝子（UniProtKB/Swiss-Prot P16000）は、エメリセラ・ニデュランス（アスペルギルス・ニデュランス）（Ward and Turner, 1986, Mol. Gen. Genet. 205: 331-338）から得ることができる。アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（Ｉ及びＩＩ）（ａｐｈ（３’）Ｉ及びＩＩ）遺伝子（EC 2.7.1.95; Interpro IPR002575）は、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）及びストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）（それぞれ、Sarwar and Akhtar, 1991, Biochem. J. 273: 807;及びTrower and Clark, 1990, N.A.R. 18: 4615）から得ることができる。
【００４６】
本発明の方法には、あらゆるネガティブ選択マーカーを使用できる。
【００４７】
一態様では、ネガティブ選択マーカーは、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）、及びシトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）から成る群から選択される遺伝子のコード配列によってコードされる。
【００４８】
別の態様では、ネガティブ選択マーカーは、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ネガティブ選択マーカーは、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ネガティブ選択マーカーは、シトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）のコード配列によってコードされる。
【００４９】
ネガティブ選択マーカーは、あらゆる利用可能な供給源から得ることができる。例えば、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）（EC 2.7.1.21; UniProtKB/Swiss-Prot P03176）は、ヒト単純ヘルペスウイルス１（McKnight, 1980, Nucleic Acids Research 8: 5949-5964）から得ることができる。オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）（EC 4.1.1.23; UniProtKB/Swiss-Prot P07817）は、アスペルギルス・ニガー（Wilson et al., 1988, N.A.R. 16: 2339）から得ることができる。シトシン・デアミナーゼ（ｃｏｄＡ）遺伝子（EC 3.5.4.1; UniProtKB/Swiss-Prot CODA_ECOLI）は、Ｅ．コリ（菌株Ｋ１２）（Danielsen et al., 1992, Molecular Microbiology 6: 1335-1344）から得ることができる。
【００５０】
核酸構築物では、ポジティブ及びネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、例えば、それらが第１及び第２ポリヌクレオチド又は第２及び第３ポリヌクレオチドと指定されているかどうかに関係なく、互いに対していずれかの順序であり得る。加えて、ポジティブ及びネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、同じ方向であっても、反対方向であってもよい。
【００５１】
別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｔ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ブレオマイシン、ゼオシン、及びフレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ／ｂｌｅＯ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のコード配列によってコードされる。
【００５２】
別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ピューロマイシン‐Ｎ‐アセチル‐トランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のコード配列によってコードされる。
【００５３】
別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、アセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子（ａｃｕＡ／ｆａｃＡ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、Ｄ‐セリン・デヒドラターゼ（ｄｓｄＡ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子（ｓＣ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のコード配列によってコードされる。
【００５４】
別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ・サブユニット９遺伝子（ｏｌｉＣ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（Ｉ）（ａｐｈ（３’）Ｉ）遺伝子のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（ＩＩ）（ａｐｈ（３’）ＩＩ）遺伝子のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のコード配列によってコードされる。
【００５５】
別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｔ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ブレオマイシン、ゼオシン、及びフレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ／ｂｌｅＯ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）のコード配列によってコードされる。
【００５６】
別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ピューロマイシン‐Ｎ‐アセチル‐トランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、アセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子（ａｃｕＡ／ｆａｃＡ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）のコード配列によってコードされる。
【００５７】
別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、Ｄ‐セリン・デヒドラターゼ（ｄｓｄＡ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子（ｓＣ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ・サブユニット９遺伝子（ｏｌｉＣ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）のコード配列によってコードされる。
【００５８】
別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（Ｉ）（ａｐｈ（３’）Ｉ）遺伝子のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（ＩＩ）（ａｐｈ（３’）ＩＩ）遺伝子のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）のコード配列によってコードされる。
【００５９】
別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、シトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｔ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、シトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ブレオマイシン、ゼオシン、及びフレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ／ｂｌｅＯ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、シトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）のコード配列によってコードされる。
【００６０】
別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、シトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、シトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ピューロマイシン‐Ｎ‐アセチル‐トランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、シトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、アセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子（ａｃｕＡ／ｆａｃＡ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、シトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）のコード配列によってコードされる。
【００６１】
別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、Ｄ‐セリン・デヒドラターゼ（ｄｓｄＡ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、シトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子（ｓＣ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、シトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）のコード配列によってコードされる。
【００６２】
別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ・サブユニット９遺伝子（ｏｌｉＣ）のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、シトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（Ｉ）（ａｐｈ（３’）Ｉ）遺伝子のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、シトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）のコード配列によってコードされる。別の態様では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーは、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（ＩＩ）（ａｐｈ（３’）ＩＩ）遺伝子のコード配列によってコードされ、且つ、ネガティブ選択マーカーは、シトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）のコード配列によってコードされる。
【００６３】
本発明はさらに、以下の：（ａ）配列番号５２の成熟ポリペプチドに対して、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、よりいっそう好ましくは少なくとも９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９５％の同一性、そして最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ、（ｂ）好ましくは少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下、より好ましくは少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下、よりいっそう好ましくは少なくとも高いストリンジェンシー条件下、そして最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で配列番号５１の成熟ポリペプチド・コード配列又はその完全長の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされたオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ；及び（ｃ）配列番号５１の成熟ポリペプチド・コード配列に対して好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、よりいっそう好ましくは少なくとも９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９５％の同一性、そして最も好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドによってコードされたオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ、から成る群から選択される単離されたオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼに関する。
【００６４】
好ましい態様では、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼは、配列番号５２、若しくはオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ活性を有する配列番号５２の断片を含んでなるか又はそれから成る。別の好ましい態様では、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼは、配列番号５２を含んでなるか又はそれから成る。
【００６５】
本発明はまた、以下の：（ａ）配列番号５２の成熟ポリペプチドに対して、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、よりいっそう好ましくは少なくとも９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９５％の同一性、そして最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｂ）好ましくは少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下、より好ましくは少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下、よりいっそう好ましくは少なくとも高いストリンジェンシー条件下、そして最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で配列番号５１又はその完全長の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んでなるオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド；及び（ｃ）配列番号５１の成熟ポリペプチド・コード配列に対して好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、よりいっそう好ましくは少なくとも９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９５％の同一性、そして最も好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなるオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、から成る群から選択される、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００６６】
好ましい態様では、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５１、又はオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ活性を有する断片をコードする配列番号５１の部分配列を含んでなるか又はそれから成る。別の好ましい態様では、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５１を含んでなるか又はそれから成る。
【００６７】
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するか又はクローニングするために使用される技術は、当該技術分野で知られていて、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、又はその組み合わせを包含する。そういったゲノムＤＮＡからの本発明のポリヌクレオチドのクローニングは、例えば、周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は共有している構造上の特徴を有するクローニングＤＮＡ断片を検出するために発現ライブラリーの抗体スクリーニングを使用することによって、達成できる。例えば、Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New Yorkを参照のこと。その他の核酸増幅手法、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、連結活性化転写（ＬＡＴ）及びヌクレオチド配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）などを使用することもできる。
【００６８】
配列番号５１のヌクレオチド配列；又はその部分配列；並びに配列番号５２のアミノ酸配列；又はその断片は、当該技術分野で周知の方法に従って異なる属又は種の菌株からオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを同定及びクローニングするための核酸プローブを設計するために使用され得る。特に、そういったプローブは、対象属又は種のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡの中の対応する遺伝子を同定及び単離するために、標準的なサザンブロッティング手法に付随するそれらとのハイブリダイゼーションに使用される。そういったプローブは、全配列よりかなり短いが、少なくとも１４、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、最も好ましくはが少なくとも７０ヌクレオチドの長さであるべきである。しかしながら、核酸プローブは、少なくとも１００ヌクレオチドの長さであることが好ましい。例えば、核酸プローブは、少なくとも２００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４００ヌクレオチド、又は最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチドの長さであり得る。さらに長いプローブ、例えば好ましくは少なくとも６００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７００ヌクレオチド、よりいっそう好ましくは少なくとも８００ヌクレオチド、又は最も好ましくは少なくとも９００ヌクレオチドの長さがある核酸プローブ、が使用され得る。ＤＮＡ及びＲＮＡプローブの両方を使用できる。通常、プローブは、対応遺伝子を検出するために（例えば32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチン、又はアビジンで）標識される。そういったプローブは、本発明に含まれる。
【００６９】
そのため、菌株から調製されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを、先に記載のプローブにハイブリダイズする、つまりオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡについてスクリーニングすることもできる。そういった他の菌株からのゲノムＤＮＡ又は他のＤＮＡは、アガロース若しくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は他の分離技法によって分離することもできる。ライブラリーからのＤＮＡ又は分離されたＤＮＡは、ニトロセルロース又は他の好適な担体物質に移され、そしてその上に固定され得る。配列番号１と相同であるクローン若しくはＤＮＡ、又はその部分配列を同定するためには、前記担体物質がサザンブロットに使用されることが好ましい。
【００７０】
本発明の目的のために、ハイブリダイゼーションは、非常に低い〜非常に高いストリンジェンシー条件下、ヌクレオチド配列が配列番号５１又はその部分配列に相当する標識された核酸プローブにハイブリダイズすることを意味する。これらの条件下で核酸プローブがハイブリダイズする分子は、例えばエックス線フィルムを使用することで検出されることができる。
【００７１】
好ましい態様では、核酸プローブは配列番号５１である。別の好ましい態様では、核酸プローブは、配列番号５２をコードするポリヌクレオチド配列又はその部分配列である。別の好ましい態様では、核酸プローブは、配列番号５２をコードするポリヌクレオチド配列である。
【００７２】
少なくとも１００ヌクレオチドの長さのプローブに関して、非常に低い〜非常に高いストリンジェンシー条件は、最適に１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング手法に従った、５ＸＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌの、剪断され且つ変性させたサケ精子ＤＮＡ、並びに非常に低い及び低いストリンジェンシーのためには２５％のホルムアミド、中程度及び中〜高いストリンジェンシーのためには３５％のホルムアミド、又は高い及び非常に高いストリンジェンシーのためには５０％のホルムアミドのいずれかの中での４２℃のプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションと定義される。
【００７３】
少なくとも１００ヌクレオチドの長さのプローブに関しては、担体物質は、最後に、好ましくは４５℃にて（非常に低いストリンジェンシー）、より好ましくは５０℃にて（低いストリンジェンシー）、より好ましくは５５℃にて（中程度のストリンジェンシー）、より好ましくは６０℃にて（中程度〜高いストリンジェンシー）、よりいっそう好ましくは６５℃にて（高いストリンジェンシー）、そして最も好ましくは７０℃にて（非常に高いストリンジェンシー）、２×ＳＳＣ、０．２％のＳＤＳを使用してそれぞれ１５分間で３回洗浄される。
【００７４】
本発明はまた、かかるオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼを含んでなる核酸構築物、組換え発現ベクター、及び組換え糸状菌細胞に関する。
【００７５】
本発明はまた、以下のステップ：ポリペプチドの産生を促す条件下、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸構築物を含んでなる宿主細胞を培養すること、を含んでなるオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼの産生方法に関する。好ましい態様では、当該宿主細胞は糸状菌細胞である。
【００７６】
反復配列
糸状菌のゲノム内の遺伝子を欠失させるための本発明の方法では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチド及びネガティブ選択マーカーをコードする第２ポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物はさらに、前記第１及び第２ポリヌクレオチドの５’側に位置する第１反復配列、及び前記第１及び第２ポリヌクレオチドの３’側に位置する第２反復配列を含んでなる。
【００７７】
糸状菌のゲノム内に対象ポリヌクレオチドを導入するための本発明の方法では、第１の対象ポリヌクレオチド、ドミナント・ポジティブ選択マーカーをコードする第２ポリヌクレオチド、及びネガティブ選択マーカーをコードする第３ポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物はまた、前記第２及び第３ポリヌクレオチドの５’側に位置する第１反復配列、並びに前記第２及び第３ポリヌクレオチドの３’側に位置する第２反復配列を含んでなり、ここで、第１の対象ポリヌクレオチドは、前記第１反復配列の５’側に位置するか、又は第２反復配列の３’側に位置するかのいずれかである。
【００７８】
両方法のための反復配列は、ポジティブ及びネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを欠失させるために第１及び第２反復配列が分子内相同組換えを受けることができるように同一の配列を含んでなることが好ましい。
【００７９】
反復配列は、任意のポリヌクレオチド配列であり得る。一態様では、反復配列は、糸状菌細胞にとって天然の配列である。別の態様では、反復配列は、糸状菌細胞にとって外来（異種）の配列である。反復配列は、非コードポリヌクレオチド配列であっても、コードポリヌクレオチド配列であってもよい。別の態様では、反復配列は、糸状菌細胞にとって天然のポリヌクレオチド配列である。別の態様では、反復配列は、完全な遺伝子欠失、破壊、又は挿入を保証する３’フランキング配列又は５’フランキング配列のいずれかと同一である。
【００８０】
ポジティブ及びネガティブ選択マーカーのためのポリヌクレオチドを欠失させるために分子内相同組換えの可能性を高めるために、反復配列は、十分な数、例えば好ましくは２０〜１００００塩基対、５０〜１００００塩基対、１００〜１００００塩基対、２００〜１００００塩基対、より好ましくは４００〜１００００塩基対、そして最も好ましくは８００〜１００００塩基対など、の核酸を含むべきである。
【００８１】
フランキング配列
糸状菌のゲノム内の対象遺伝子を欠失させるための本発明の方法では、ドミナント・ポジティブ選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチド、ネガティブ選択マーカーをコードする第２ポリヌクレオチド、第１反復配列、及び第２反復配列を含んでなる核酸構築物はさらに、先に述べたポリヌクレオチドの５’側に位置する第１フランキング配列、及び先に述べたポリヌクレオチドの３’側に位置する第２フランキング配列も含んでなる。
【００８２】
対象遺伝子を欠失させるために、前記第１フランキング配列は、糸状菌細胞の遺伝子の５’末端に位置する第１領域と同一であり、且つ、前記第２フランキング配列は、遺伝子の３’末端に位置する第２領域と同一である。前記第１及び第２フランキング配列は、それぞれ糸状菌細胞のゲノムの第１及び第２領域との分子間相同組換えを受けて、遺伝子を欠失させ、そして核酸構築物で置き換える。
【００８３】
糸状菌のゲノム内に対象ポリヌクレオチドを導入するための本発明の方法において、対象ポリヌクレオチド、ドミナント・ポジティブ選択マーカーをコードする第２ポリヌクレオチド、ネガティブ選択マーカーをコードする第３ポリヌクレオチド、第１反復配列、及び第２反復配列を含んでなる核酸構築物はまた、先に述べたポリヌクレオチドの５’側に位置する第１フランキング配列、及び先に述べたポリヌクレオチドの３’側に位置する第２フランキング配列を含んでなる。
【００８４】
対象ポリヌクレオチドを導入するために、前記第１フランキング配列は、糸状菌細胞のゲノムの第１領域と同一であり、且つ、前記第２フランキング配列は、糸状菌細胞のゲノムの第２領域と同一である。前記第１及び第２フランキング配列は、それぞれ糸状菌細胞のゲノムの第１及び第２領域との分子間相同組換えを受けて、糸状菌細胞のゲノム内に対象ポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物が導入される。
【００８５】
一態様では、前記第１領域は、糸状菌細胞の遺伝子の５’側に位置し、且つ、前記第２領域は、糸状菌細胞の遺伝子の３’側に位置する。別の態様では、前記第１及び第２領域の両方が、糸状菌細胞の遺伝子内に位置している。別の態様では、前記第１及び第２領域のうちの一方が糸状菌細胞の遺伝子内に位置し、且つ、前記第１及び第２領域の他方が糸状菌細胞の遺伝子の５’又は３’側に位置する。
【００８６】
別の態様では、前記第１及び第２反復配列は、前記第１フランキング配列又は前記第２フランキング配列のいずれかと同一である。
【００８７】
正確な位置における組込みの可能性を高めるために、好ましくは、前記フランキング配列は、十分な数、例えば、相同組換えを確実にするために十分な数の核酸、例えば１００〜１００００塩基対、好ましくは４００〜１００００塩基対、そして最も好ましくは８００〜１００００塩基対の核酸を含むべきである。前記フランキング配列は、糸状菌細胞のゲノム内の標的配列と同一であるいずれかの配列であり得る。さらに、前記フランキング配列は、非コードヌクレオチド配列であっても、コードヌクレオチド配列であってもよい。
【００８８】
ポリヌクレオチド
本発明の方法では、対象ポリヌクレオチドは任意のＤＮＡであってよい。当該ＤＮＡは、対象糸状菌細胞にとって天然であっても、異種（外来）のものであってもよい。
【００８９】
前記ポリヌクレオチドは、対象の生物学的活性を有する任意のポリペプチドをコードし得る。前記ポリペプチドは、対象の糸状菌細胞にとって天然であっても、異種（外来）のものであってもよい。「異種のポリペプチド」という用語は、本明細書中では、糸状菌細胞にとって天然ではないポリペプチド；その天然ポリペプチドを変更するために構造修飾（例えば欠失、置換、及び／又は挿入）が加えられた天然ポリペプチド；又は組換えＤＮＡ技術、例えばより強いプロモーター、によってポリペプチドをコードするＤＮＡの操作の結果として発現が量的に変更された天然ポリペプチド、と定義される。前記ポリペプチドは、以下で触れるポリペプチド及びハイブリッド・ポリペプチドの天然由来の対立遺伝子変異及び遺伝子操作変異であってもよい。
【００９０】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書中では、特定の長さのコード化産物を指すことを意味せず、そのためペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質を含む。「ポリペプチド」という用語はまた、ハイブリッド・ポリペプチド及び融合ポリペプチドを含む。ポリペプチドはさらに、ポリペプチドの天然由来の対立遺伝子変異及び遺伝子操作変異が含まれる。
【００９１】
一態様では、ポリペプチドは、抗体、抗原、抗微生物性ペプチド、酵素、増殖因子、ホルモン、免疫調節物質（immunodilator）、神経伝達物質、受容体、レポータータンパク質、構造タンパク、及び転写因子である。
【００９２】
別の態様では、ポリペプチドは、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼである。別の態様では、ポリペプチドは、α‐グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン・グリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α‐ガラクトシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α‐グルコシダーゼ、β‐グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ウロキナーゼ、又はキシラナーゼである。
【００９３】
別の態様では、ポリペプチドは、アルブミン、コラーゲン、トロポエラスチン、エラスチン、又はゼラチンである。
【００９４】
別の態様では、ポリペプチドは、ハイブリッド・ポリペプチドである。前記ハイブリッド・ポリペプチドは、少なくとも２つの異なるポリペプチドから得られる部分的な又は完全なポリペプチド配列の組み合わせを含んでなり、この場合、そのポリペプチドの１若しくは２以上が糸状菌細胞にとって異種であり得る。
【００９５】
別の態様では、ポリペプチドは、当該ポリペプチド又はその断片のＮ末端若しくはＣ末端に、別のポリペプチドが融合されている融合ポリペプチドである。融合ポリペプチドは、一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（又はその一部）を別のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（又はその一部）に融合することによって産生される。融合ポリペプチドを作り出す技術は、当該技術分野で知られており、そして、ポリペプチドをコードするコード配列を、それらがフレーム内に存在し、且つ、融合ポリペプチドの発現が、同一の１又は２以上のプロモーター、及びターミネーターの制御下にあるように、連結することを含む。
【００９６】
対象ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、いずれかの原核生物、真核生物、又はその他の源から得ることもできる。本発明の目的のために、「から得られる」という用語は、所定の源に関連して本明細書中で使用される場合、ポリペプチドがその源、又はその源からの遺伝子が挿入された細胞によって産生されていることを意味するものとする。
【００９７】
対象ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの単離又はクローニングに使用される技術は、当該技術分野で知られていて、そしてゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、又はその組み合わせを包含する。そういったゲノムＤＮＡからの対象ポリヌクレオチドのクローニングは、例えば周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって達成できる。例えばInnis et al., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New Yorkを参照のこと。クローニング手順は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる所望の核酸断片の切出しと単離、ベクター分子内へのその断片の挿入、そして前記核酸配列の複数のコピー又はクローンが複製される突然変異真菌細胞内への組換えベクターの組込みを伴うこともある。ポリヌクレオチドは、ゲノムのもの、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、及び合成起源、又はそのいずれかの組み合わせのものであり得る。
【００９８】
対象ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、好適な糸状菌細胞内におけるポリヌクレオチドの発現を提供するさまざまな方法により操作され得る。対象ポリペプチドをコードするＤＮＡのための核酸構築物及び組換え発現ベクターの構築は、本明細書中に記載したとおり実施できる。
【００９９】
ポリヌクレオチドはさらに、制御配列、例えば対象遺伝子発現を操作するためのプロモーターであり得る。制御配列に関する制限されることのない例は、本明細書中に記載されている。
【０１００】
ポリヌクレオチドはまた、糸状菌のゲノム内の遺伝子を破壊するために有用な任意の核酸分子であり得る。ポリヌクレオチドは、コーディング・ポリヌクレオチドであっても、非コーディング・ポリヌクレオチドであってもよい。ポリヌクレオチドは、以前に開示されたもの以外の別の選択マーカーをコードすることもできる。ポリヌクレオチドは、例えば先に記載したものなどのポリペプチドをコードすることもできる。ポリヌクレオチドは、単純に、遺伝子を破壊するために十分な長さの任意の核酸分子であり得る。
【０１０１】
ポリヌクレオチドは、先に開示した具体例によって範囲が限定されてはならない。なぜならば、これらの実施例は、本発明のいくつかの態様の例示として意図されているからである。
【０１０２】
核酸構築物
本発明はさらに、糸状菌細胞のゲノム内の遺伝子又はその一部を欠失させるための核酸構築物であって、以下の：（ｉ）発現されるとドミナント・ポジティブ選択表現型を前記糸状菌細胞に与える、ドミナント・ポジティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第１ポリヌクレオチド；（ｉｉ）発現されるとネガティブ選択表現型を前記糸状菌細胞に与える、ネガティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第２ポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）前記第１及び第２ポリヌクレオチドの５’側に位置する第１反復配列、及び前記第１及び第２ポリヌクレオチドの３’側に位置する第２反復配列、ここで、前記第１及び第２反復配列は同一の配列を含んでなる；並びに（ｉｖ）構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の５’側に位置する第１フランキング配列、及び構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の３’側に位置する第２フランキング配列、ここで、前記第１フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第１領域と同一であり、且つ、前記第２フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第２領域と同一であり、ここで、（１）前記第１領域が前記糸状菌細胞の遺伝子又はその一部の５’側に位置し、且つ、前記第２領域が前記糸状菌細胞の遺伝子又はその一部の３’側に位置するか、（２）前記第１及び第２領域の両方が前記糸状菌細胞の遺伝子内に位置しているか、或いは（３）前記第１及び第２領域の一方が前記糸状菌細胞の遺伝子内に位置し、且つ、前記第１及び第２領域の他方が、前記糸状菌細胞の遺伝子の５’又は３’側に位置する；を含んでなり、ここで、前記第１及び第２フランキング配列が、それぞれ前記糸状菌細胞の第１及び第２領域と分子間相同組換えを受けて、遺伝子又はその一部を欠失させ、及び前記核酸構築物で置き換え；そして前記第１及び第２反復配列が分子内相同組換えを受けて、前記第１及び第２ポリヌクレオチドを欠失させる、前記核酸構築物に関する。
【０１０３】
本発明はさらに、糸状菌細胞のゲノム内にポリヌクレオチドを導入するための核酸構築物であって、以下の：（ｉ）第１の対象ポリヌクレオチド；（ｉｉ）発現されるとドミナント・ポジティブ選択表現型を糸状菌細胞に与える、ドミナント・ポジティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第２ポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）発現されるとネガティブ選択表現型を糸状菌細胞に与える、ネガティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第３ポリヌクレオチド；（ｉｖ）前記第１及び第２ポリヌクレオチドの５’側に位置する第１反復配列、及び前記第１及び第２ポリヌクレオチドの３’側に位置する第２反復配列、ここで、前記第１及び第２反復配列が同一の配列を含んでなり、且つ、対象ポリペプチドをコードする前記第１ポリヌクレオチドは前記第１反復の５’側に位置するか又は前記第２反復の３’側に位置する；並びに（ｖ）構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の５’側に位置する第１フランキング配列、及び構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の３’側に位置する第２フランキング配列、ここで、前記第１フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第１領域と同一であり、且つ、前記第２フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第２領域と同一である；を含んでなり、ここで、前記第１及び第２フランキング配列は、それぞれ前記糸状菌細胞のゲノムの第１及び第２領域と分子間相同組換えを受けて、前記糸状菌細胞のゲノム内に前記核酸構築物を導入し；並びに前記第１及び第２反復配列は、分子内相同組換えを受けて、前記第２及び第３ポリヌクレオチドを欠失させることができる、前記核酸構築物に関する。
【０１０４】
対象ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、ドミナント・ポジティブ選択マーカー、又はネガティブ選択マーカーは、その発現をもたらすためのさまざまな方法により操作され得る。それがベクター内に挿入される前のそういったポリヌクレオチドの配列の操作は、発現ベクターによっては望ましいか又は必要であることもある。組換えＤＮＡ法を利用するポリヌクレオチド配列を修飾するための技術は、当該技術分野で周知である。
【０１０５】
制御配列は、適当なプロモーター配列、つまり対象ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現するように糸状菌細胞によって認識されるヌクレオチド配列であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモーターは、突然変異、切り詰め型、及びハイブリッド・プロモーターを含めた最適な糸状菌細胞において転写活性を示すいずれかのヌクレオチド配列であり得、そしてその糸状菌細胞にとって同種又は異種のいずれであっても細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることもできる。
【０１０６】
糸状菌細胞における本発明の核酸構築物の転写を指示するための好適なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリゼのＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性α‐アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの酸安定性α‐アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）のグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、リゾムコール・ミエヘイのリパーゼ、アスペルギルス・オリゼのアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼのトリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニデュランスのアセトアミダーゼ、フサリウム・ベネナツムのアミログルコシダーゼ（ＷＯ００／５６９００）、フサリウム・ベネナツムのａｍｙＡ、フサリウム・ベネナツムのＤａｒｉａ（ＷＯ００／５６９００）、フサリウム・ベネナツムのＱｕｉｎｎ（ＷＯ００／５６９００）、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）のトリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ９６／００７８７）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）のβ‐グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーセイのセロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・リーセイのセロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイのエンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーセイのエンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイのエンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーセイのエンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・リーセイのエンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーセイのキシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーセイのキシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイのβ‐キシロシダーゼ、並びにＮＡ２‐ｔｐｉプロモーター（アスペルギルス・ニガーの中性α‐アミラーゼとアスペルギルス・オリゼのトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）の遺伝子から得られるプロモーター；そしてその突然変異、切り詰め型、及びハイブリッド・プロモーターである。
【０１０７】
制御配列はまた、好適な転写ターミネーター配列、つまり糸状菌細胞によって認識されて転写が終結される配列であり得る。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端に作動できるように連結される。最適な糸状菌細胞において機能的であるあらゆるターミネーターが、本発明に使用され得る。
【０１０８】
糸状菌細胞のための好ましいターミネーターは、アスペルギルス・オリゼのＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニデュランスのアントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガーのα‐グルコシダーゼ、及びフサリウム・オキシスポラムのトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【０１０９】
制御配列はまた、好適なリーダー配列、つまり糸状菌細胞による翻訳に重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域であり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’末端に作動できるように連結される。最適な糸状菌細胞において機能的なあらゆるリーダー配列が、本発明に使用され得る。糸状菌細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリゼのＴＡＫＡアミラーゼ及びアスペルギルス・ニデュランスのトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子から得られる。
【０１１０】
制御配列はまた、ポリアデニル化配列、つまりヌクレオチド配列の３’末端に作動できるように連結され、そして転写された場合、転写ｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして糸状菌細胞によって認識される配列であり得る。最適な糸状菌細胞において機能的なあらゆるポリアデニル化配列が、本発明に使用され得る。
【０１１１】
糸状菌細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オリゼのＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニデュランスのアントラニル酸シンターゼ、フサリウム・オキシスポラムのトリプシン様プロテアーゼ、及びアスペルギルス・ニガーのα‐グルコシダーゼの遺伝子から得られる。
【０１１２】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたシグナルペプチドをコードし、且つ、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に向かわせるシグナルペプチド・コード配列であり得る。ヌクレオチド配列のコード配列の５’末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコード配列のセグメントを有する翻訳リーディングフレームの中に天然に連結されたシグナルペプチド・コード配列を本来含み得る。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列にとって外来のものであるシグナルペプチド・コード配列を含むこともできる。外来シグナルペプチド・コード配列は、そのコード配列がシグナルペプチド・コード配列を天然に含まない場合に必要とされることもある。あるいは、外来シグナルペプチド・コード配列は、ポリペプチドの分泌を高めるために、天然シグナルペプチド・コード配列を単純に置き換えることもできる。しかしながら、発現されるポリペプチドを最適な糸状菌細胞の分泌経路に向かわせる、すなわち培地中に分泌させる、あらゆるシグナルペプチド・コード配列が、本発明に使用され得る。
【０１１３】
糸状菌細胞のための有効なシグナルペプチド・コード配列は、アスペルギルス・オリゼのＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼ、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）のセルラーゼ、ヒューミコラ・インソレンスのエンドグルカナーゼＶ、及びヒューミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）のリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチド・コード配列である。
【０１１４】
制御配列はさらに、ポリペプチドのアミノ末端に配置されたプロペプチドをコードするプロペプチド・コード配列であり得る。得られたポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は場合によって、チモーゲン）としても知られている。プロペプチドは、一般に不活性であり、そしてプロペプチドの触媒的又は自己触媒的開裂によってプロポリペプチドから成熟活性ポリペプチドに変換されることができる。プロペプチド・コード配列は、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）のアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、バチルス・ズブチリスの中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のアルファ因子、リゾムコール・ミエヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼ、及びマイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）のラッカーゼ（ＷＯ９５／３３８３６）の遺伝子から得ることもできる。
【０１１５】
シグナルペプチドとプロペプチド配列の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在している場合、プロペプチド配列がポリペプチドのアミノ末端の次に配置され、そしてシグナルペプチド配列がプロペプチド配列のアミノ末端の次に配置される。
【０１１６】
また、糸状菌細胞の増殖に応じたポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を加えることが望まれることもある。調節系の例は、調節化合物の存在を含めた化学的又は物理的な刺激に対応して遺伝子の発現がオンにされたり、オフにされたりするものである。酵母では、ＡＤＨ２系又はＧＡＬ１系が使用され得る。糸状菌では、ＴＡＫＡのα‐アミラーゼ・プロモーター、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ・プロモーター、及びアスペルギルス・オリゼのグルコアミラーゼ・プロモーターが、調節配列として使用され得る。調節配列のその他の例は、遺伝子増幅を可能にするものであり得る。真核生物系では、これらの調節配列としては、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子、及び重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合では、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、調節配列と作動できるように連結されているであろう。
【０１１７】
発現ベクター
本発明はまた、本発明の核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクターに関連する。組換え発現ベクターは、都合よく組換えＤＮＡ手順にかけることができ、且つポリヌクレオチド配列の発現を引き起こすことができる任意のプラスミドであり得る。最適なベクターは、通常、ベクターが導入される糸状菌細胞とそのベクターの適合性による。ベクターは、第１及び第２フランキング配列が糸状菌細胞の第１及び第２領域との効果的な分子間相同組換えを受けるように、線状であることが好ましい。
【０１１８】
本発明の組換え発現ベクターを構築するのに使用される手順は、当業者にとって周知である（例えばSambrook et al., 1989、前掲を参照のこと）。
【０１１９】
糸状菌細胞
本発明はさらに、本発明の核酸構築物を含んでなる組換え糸状菌細胞に関する。
【０１２０】
本発明の方法では、糸状菌細胞は、任意の糸状菌細胞であり得る。「糸状菌細胞」という用語は、複製中に起こる突然変異に起因する親細胞と同一でない、親細胞のあらゆる子孫を含む。
【０１２１】
「糸状菌」は、（Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKによって定義されるように）下位区分である真菌類と卵菌類のすべての糸状体を包含する。糸状菌は一般に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖体から構成される菌糸体壁によって特徴づけられる。栄養成長は、菌糸伸長によってであり、そして炭素代謝は絶対好気性である。対照的に、酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエによる栄養成長は、単細胞葉状体の発芽によってであり、そして炭素代謝は発酵性であり得る。
【０１２２】
一態様では、糸状菌細胞は、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ブジャカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、コプリヌス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フサリウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humicola）、マグナポルセ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、マイセリオフトラ（Myceliophthor）、ネオカリマスチックス（Neocallimastix）、ニューロスポラ（Neurospora）、パエシロマイセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、フレビア（Phlebia）、ピロマイセス（Piromyces）、プレウロツス（Pleurotus）、シゾフィラム（Schizophyllum）、タラロマイセス（Talaromyces）、サーモアスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）、又はトリコデルマ（Trichoderma）細胞である。
【０１２３】
より好ましい態様では、糸状菌細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フォエチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）細胞である。別のより好ましい態様では、糸状菌細胞は、フサリウム・バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フサリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フサリウム・クロックウェレンズ（Fusarium crookwellense）、フサリウム・クルモラム（Fusarium culmorum）、フサリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フサリウム・グラミナム（Fusarium graminum）、フサリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フサリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フサリウム・レチキュラタム（Fusarium reticulatum）、フサリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フサリウム・サムブシウム（Fusarium sambucinum）、フサリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フサリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フサリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、フサリウム・トルロサム（Fusarium torulosum）、フサリウム・トリコセシオイデス（Fusarium trichothecioides）、又はフサリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）細胞である。
【０１２４】
別のより好ましい態様では、糸状菌細胞は、ブジャカンデラ・アヅスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・カレギエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブロサ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオプシス・スベルミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Chrysosporium keratinophilum）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、クリソスポリウム・トロピカム（Chrysosporium tropicum）、クリソスポリウム・メルダリウム（Chrysosporium merdarium）、クリソスポリウム・イノプス（Chrysosporium inops）、クリソスポリウム・パニコラ（Chrysosporium pannicola）、クリソスポリウム・クイーンズランジカム（Chrysosporium queenslandicum）、クリソスポリウム・ゾナタム（Chrysosporium zonatum）、コプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）、コリオラス・ヒルスタス（Coriolus hirsutus）、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ヒューミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Penicillium purpurogenum）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、フレビア・ラディエタ（Phlebia radiata）、プレウロタス・エリンギ（Pleurotus eryngii）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トラメテス・ビロサ（Trametes villosa）、トラメテス・ベルシコル（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞である。
【０１２５】
最も好ましい態様では、糸状菌細胞は、フサリウム・ベネナツム細胞である。別の最も好ましい態様では、糸状菌細胞は、フサリウム・ベネナツムＮＲＲＬ３０７４７である。別の最も好ましい態様では、糸状菌細胞は、フサリウム・ベネナツムＡＴＣＣ２０３３４である。
【０１２６】
別の最も好ましい態様では、糸状菌細胞は、アスペルギルス・ニガー細胞である。
【０１２７】
別の最も好ましい態様では、糸状菌細胞は、アスペルギルス・オリゼ細胞である。
【０１２８】
別の最も好ましい態様では、糸状菌細胞は、トリコデルマ・リーセイ細胞である。
【０１２９】
糸状菌細胞は、プロトプラスト形成、そのプロトプラストの形質転換、そしてそれ自体公知の様式による細胞壁の再生を伴う工程によって形質転換され得る。アスペルギルス及びトリコデルマ細胞の形質転換のための好適な手法は、ＥＰ２３８０２３及びYelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474に記載されている。フサリウム属を形質転換するための適切な方法は、Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156及びＷＯ９６／００７８７によって記載されている。
【０１３０】
製造方法
本発明はさらに、対象ポリペプチドを製造する方法であって、以下のステップ：（ａ）前記ポリペプチドの産生を促す条件下、本明細書中に記載したように得た糸状菌細胞を培養し；及び（ｂ）そのポリペプチドを回収すること、を含んでなる方法に関する。
【０１３１】
本発明の製造法では、細胞は、当該技術分野で周知の方法を使用したポリペプチドの製造に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、好適な培地中、且つ、前記ポリペプチドを発現及び／又は単離することを可能にする条件下で実施される実験室用又は産業用発酵槽内での、振盪フラスコ培養、及び小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、供給‐バッチ、又は固体状態発酵を包含する）によって培養され得る。培養は、炭素及び窒素源、及び無機塩を含んでなる好適な栄養培地中、当該技術分野で知られている手法を用いておこなわれる。好適な培地は、商業的供給業者から入手可能であるか、又は（例えば、American Type Culture Collectionのカタログ中に）公開されている組成に従って調製され得る。ポリペプチドは、栄養培地中に分泌される場合、培地から直接回収され得る。ポリペプチドは、培地中に分泌されない場合、細胞溶解物から回収できる。
【０１３２】
ポリペプチドは、そのポリペプチドに特異的な当該技術分野で知られている方法を使用することで検出され得る。これらの検出法は、特異的抗体の使用、酵素生成物の形成、又は酵素基質の消失を包含し得る。例えば、酵素アッセイは、ポリペプチドの活性を測定するために使用され得る。
【０１３３】
得られたポリペプチドは、当該技術分野で知られている方法を使用することによって回収され得る。例えばポリペプチドは、これだけに限定されるものではないが、遠心分離、濾過、抽出、噴霧‐乾燥、留去、又は沈殿を含めた従来の手法によって栄養培地から回収され得る。
【０１３４】
対象ポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチドを得るために、これだけに限定されるものではないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動手法（例えば、分取用等電点電気泳動）、示差溶解性（例えば、硫安沈殿）、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ、又は抽出を含めた当該技術分野で知られているさまざまな手法によって精製され得る（例えば、Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照のこと）。
【０１３５】
本発明は次の実施例によってさらに説明されるが、それらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１３６】
材料
バッファー及び基質として使用される化学物質は、少なくとも試薬グレードの市販の製品であった。すべてのプライマー及びオリゴヌクレオチドは、MWG Biotech, Inc., High Point, NC, USAによって供給された。
【０１３７】
真菌株
フサリウム・ベネナツム株ＷＴＹ８４２‐１‐１１は、米国特許第７３６８２７１号明細書に記載されている。フサリウム・ベネナツム株ＥｍＹ１１５４‐４６‐４．３は、フサリウム・ベネナツム株ＷＴＹ８４２‐１‐１１のΔｔｒｉ５、ａｍｄＳ＋、ΔｐｙｒＧ誘導体である。フサリウム・ベネナツム株ＷＴＹ１４４９‐０３‐０３は、フサリウム・ベネナツム株ＷＴＹ８４２‐１‐１１のΔｔｒｉ５、ａｍｄＳ＋、ｂａｒ＋、ｔｋ＋形質転換体である。フサリウム・ベネナツム株ＷＴＹ１４４９‐０９‐０１は、フサリウム・ベネナツム株ＷＴＹ１４４９‐０３‐０３のΔｔｒｉ５、ａｍｄＳ＋、ｂａｒ＋、ｔｋ取り除き誘導体である。現在、フサリウム・ベネナツム（Yoder and Christianson, 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 62-80; O'Donnell et al., 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 57-67）として再分類されているフサリウム株Ａ３／５を、Anthony Trinci博士（University of Manchester, Manchester, England）から入手した。この株の寄託物は、フサリウム株ＡＴＣＣ２０３３４としてAmerican Type Culture Collection, Manassas, VA, USAから、又はフサリウム株ＮＲＲＬ３０７４７としてAgricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, Peoria, IL, USAから入手できる。トリコデルマ・リーセイＲｕｔＣ３０は、Montenecourt and Eveleigh, 1979, Adv. Chem. Ser. 181: 289-301によって記載されている。
【０１３８】
培地及び溶液
ＬＢプレートは、１リットルあたり、１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母抽出物、５ｇのＮａＣｌ、及び１５ｇのＢａｃｔｏ寒天から構成された。
【０１３９】
ＮＺＹ上部アガロースは、１リットルあたり、５ｇのＮａＣｌ、５ｇの酵母抽出物、１０ｇのＮＺアミン、２ｇのＭｇＳＯ4、及び７ｇのアガロースから構成された。
【０１４０】
Ｍ４００培地は、１リットルあたり、５０ｇのマルトデキストリン、２ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２ｇのＫＨ2ＰＯ4、４ｇのクエン酸、８ｇの酵母抽出物、２ｇの尿素、０．５ｇのＣａＣｌ2、及び０．５ｍｌのＡＭＧ微量金属溶液（ｐＨ６．０）から構成された。
【０１４１】
ＡＭＧ微量量金属溶液は、１リットルあたり、１４．３ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２．５ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．５ｇのＮｉＣｌ2、１３．８ｇのＦｅＳＯ4、８．５ｇのＭｎＳＯ4、及び３．０ｇのクエン酸から構成された。
【０１４２】
２ＸＹＴ培地は、１リットルあたり、１６ｇのトリプトン、１０ｇの酵母抽出物、５ｇのＮａＣｌ、及び５ｇのＢａｃｔｏ寒天から構成された。
【０１４３】
ＹＰ培地は、１リットルあたり、１０ｇの酵母抽出物及び２０ｇのＢａｃｔｏペプトンから構成された。
【０１４４】
ＹＰＧ2%培地は、１リットルあたり、１０ｇの酵母抽出物、２０ｇのＢａｃｔｏペプトン、及び２０ｇのグルコースから構成された。
【０１４５】
ＹＰＧ5%培地は、１リットルあたり、１０ｇの酵母抽出物、２０ｇのＢａｃｔｏペプトン、及び５０ｇのグルコースから構成された。
【０１４６】
ＲＡ培地は、１リットルあたり、５０ｇのコハク酸、１２．１ｇのＮａＮＯ3、１ｇのグルコース、及び２０ｍｌの５０×Ｖｏｇｅｌｓ塩溶液（Ｃ不含、ＮａＮＯ3不含）から構成された。
【０１４７】
ＲＡ＋ウリジン培地は、１リットルあたり、５０ｇのコハク酸、１２．１ｇのＮａＮＯ3、１ｇのグルコース、及び２０ｍｌの５０×Ｖｏｇｅｌｓ塩溶液（Ｃ不含、ＮａＮＯ3不含）から構成された。ＲＡ培地の濾過滅菌後、濾過滅菌したウリジンを１０ｍＭの終濃度まで加えた。
ＲＡ＋ＢＡＳＴＡ（商標）培地は、１リットルあたり、５０ｇのコハク酸、１２．１ｇのＮａＮＯ3、１ｇのグルコース、及び２０ｍｌの５０×Ｖｏｇｅｌｓ塩溶液（Ｃ不含、ＮａＮＯ3不含）から構成された。ＲＡ培地の濾過滅菌後に、濾過滅菌したＢＡＳＴＡ（商標）（グルホシネート、Hoechst Schering AgrEvo, Frankfurt, Germany）を、２５０ｍｇ／ｍｌの通常原液を使用して６ｍｇ／ｍｌの終濃度まで加えた。
【０１４８】
５０×Ｖｏｇｅｌｓ塩溶液（Ｃ不含、ＮａＮＯ3不含）は、１リットルあたり、２５０ｇのＫＨ2ＰＯ4、１０ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、５ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、２．５ｍｌのビオチン液、及び５ｍｌのＶｏｇｅｌｓ微量元素溶液から構成された。
【０１４９】
ビオチン原液は、１００ｍｌの５０％エタノール中、５ｍｇのビオチンから構成された。
【０１５０】
Ｖｏｇｅｌｓ微量元素溶液は、１００ｍｌあたり、５ｇのクエン酸、５ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｇのＦｅ（ＮＨ4）2（ＳＯ4）2・６Ｈ2Ｏ、０．２５ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．０５ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．０５ｇのＨ3ＢＯ3、及び０．０５ｇのＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏから構成された。
【０１５１】
ＰＤＡプレートは、１リットルあたり、３９ｇのポテトデキストロース寒天（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）から構成された。
【０１５２】
ＰＤＡ＋１Ｍのショ糖プレートは、１リットルあたり、３９ｇのポテトデキストロース寒天（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）及び３４２ｇのショ糖から構成された。
【０１５３】
ＶＮＯ3ＲＬＭＴプレートは、１リットルあたり、２０ｍｌの５０×Ｖｏｇｅｌｓ塩溶液（２５ｍＭのＮａＮＯ3）、２７３．３３ｇのショ糖、及び１５ｇのＬＭＴアガロース（Sigma, St. Louis, MO, USA）から構成された。
【０１５４】
５０×Ｖｏｇｅｌｓ塩溶液（２５ｍＭのＮａＮＯ3）は、１リットルあたり、１２５ｇのクエン酸ナトリウム、２５０ｇのＫＨ2ＰＯ4、１０６．２５ｇのＮａＮＯ3、１０ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、５ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、２．５ｍｌのビオチン原液、及び５ｍｌのＶｏｇｅｌｓ微量元素溶液から構成された。
【０１５５】
ＶＮＯ3ＲＬＭＴ‐ＢＡＳＴＡ（商標）プレートは、１リットルあたり、２０ｍｌの５０×Ｖｏｇｅｌｓ塩溶液（２５ｍＭのＮａＮＯ3）、２７３．３３ｇのショ糖、及び１５ｇのＬＭＴアガロースから構成された。オートクレーブ処理そして冷却後に、ＢＡＳＴＡ（商標）を６ｍｇ／ｍｌの終濃度まで加えた。
【０１５６】
ＣＯＶＥ塩溶液は、１リットルあたり、２６ｇのＫＣｌ、２６ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、７６ｇのＫＨ2ＰＯ4、５０ｍｌのＣＯＶＥ微量元素から構成された。
【０１５７】
ＣＯＶＥ微量元素溶液は、１リットルあたり、０．００４ｇのＮａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ、０．４ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、１．２ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．７ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．８ｇのＮａ2ＭｏＯ2・２Ｈ2Ｏ、１０ｇのＺｎＳＯ4７Ｈ2Ｏから構成された。
【０１５８】
ＴｒＭＭ培地は、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、０．６ｇのＣａＣｌ2、６ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、３０ｇのショ糖、及び２５ｇのＡｇａｒ  Ｎｏｂｌｅから構成された。
【０１５９】
ＴｒＭＭ‐Ｇは、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、０．６ｇのＣａＣｌ2、６ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２５ｇのＡｇａｒ  Ｎｏｂｌｅから構成され、オートクレーブ処理そして冷却後に、４０ｍｌの５０％ グルコースを加えた。
【０１６０】
ＳＴＣは、０．８Ｍのソルビトール、２．５ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、及び５ｍＭのＣａＣｌ2から構成された。
【０１６１】
ＴｒＳＴＣは、１Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、及び１０ｍＭのＣａＣｌ2から構成された。
【０１６２】
ＰＥＧは、５０％のＰＥＧ４０００、１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、及び１０ｍＭのＣａＣｌ2から構成された。
【０１６３】
ＳＴＣは、０．８Ｍのソルビトール、２５ｍＭ又は５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、及び５０ｍＭのＣａＣｌ2から構成された。
【０１６４】
ＳＰＴＣは、４０％のポリエチレングリコール４０００、０．８Ｍのソルビトール、２５又は５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、及び５０ｍＭのＣａＣｌ2から構成された。
【０１６５】
ＳＹ５０培地（ｐＨ６．０）は、１リットルあたり、５０ｇのショ糖、２．０ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１０ｇのＫＨ2ＰＯ4、２．０ｇのＫ2ＳＯ4、２．０ｇのクエン酸、１０ｇの酵母抽出物、２．０ｇの尿素、０．５ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、及び５ｍｌの２００×ＡＭＧ微量金属溶液（ニッケル不含）から構成された。
【０１６６】
２００×ＡＭＧ微量量金属溶液（ニッケル不含）は、１リットルあたり、３．０ｇのクエン酸、１４．３ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２．５ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、１３．８ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及び８．５ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏから構成された。
【０１６７】
２０×ＳＳＣは、０．３Ｍのクエン酸ナトリウム ｐＨ７及び３Ｍの塩化ナトリウムから構成された。
【０１６８】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列決定は、ＡＢＩ ＰＲＩＺＭ（登録商標）３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA）でおこなった。
【０１６９】
実施例１：フサリウム・ベネナツムＷＴＹ８４２‐１‐１１の５‐フルオロ‐デオキシウリジン（ＦｄＵ）に対する感受性試験
チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）がネガティブ選択マーカーとして有用であるためには、真菌は、かなり高濃度のヌクレオシド類似体５‐フルオロ‐デオキシウリジン（ＦｄＵ）に対して非感受性でなければならない。フサリウム・ベネナツムＷＴＹ８４２‐１‐１１のＦｄＵに対する感受性の程度を確認するために、フサリウム・ベネナツムＷＴＹ８４２‐１‐１１の１週齢の培養物を、−１４０℃にて保存されていた１０％のグリセロール・ストックから取り出した株のコロニー形成した寒天プラグをＶＮＯ3ＲＬＭＴプレート上に播種し、そしてＣｈｅｘＡｌｌ Ｉｎｓｔａｎｔ Ｓｅａｌ Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｐｏｕｃｈ（Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA）内で２６〜２８℃にて７日間インキュベートすることによって調製した。７日後に、１週齢の培養物から、プラグを必要最小限以下で切り出し、６穴プレート内のさまざまな濃度のＦｄＵ（０〜５００μＭ）（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA）を添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地上に面を下にして置いた。そのプレートを開口したＺＩＰＬＯＣ（登録商標）バッグ（S.C. Johnson Home Storage, Inc., Racine, WI, USA）内で２６〜２８℃にて１４日間インキュベートし、その後、それぞれのＦｄＵ濃度における増殖の程度を記録した。
【０１７０】
フサリウム・ベネナツムＷＴＹ８４２‐１‐１１は、試験したすべてのＦｄＵ濃度において非感受性であることがわかったが、１００μｍより高い濃度にて、５０μＭ以下の濃度と比較して増殖がわずかに減少した。
【０１７１】
実施例２：プラスミドｐＪａＬ５７４の構築
プラスミドｐＤＶ８（米国特許第６８０６０６２号明細書）は、アスペルギルス・ニデュランスのグリセルアルデヒド−３‐リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄＡ）プロモーターの１．０ｋｂのＸｈｏＩ／ＢｇｌＩＩ断片と、三機能性アスペルギルス・ニデュランスのインドールグリセロールリン酸シンターゼ、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ、及びグルタミンアミドトランスフェラーゼ（ｔｒｐＣ）転写ターミネーターを保有する１．８ｋｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片の間に挿入された１．２ｋｂのＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ断片として単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１‐ＴＫ；ｔｋ）の遺伝子（ＤＮＡ配列については配列番号３７及び推定アミノ酸配列については配列番号３８）を保有する。プラスミドｐＤＶ８を、ＢａｍＨＩで消化し、フェノール‐クロロホルム抽出し、エタノール沈殿し、次にクレノウポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, CA, USA）を使用して隙間を埋めた。消化したプラスミドを、製造業者のプロトコールに従ってＱＵＩＣＫ ＬＩＧＡＴＩＯＮ（商標）Ｋｉｔ（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA）を使用して再連結し、ＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）で処理し、そして得られた連結反応産物を製造業者の取扱説明書に従ってＴＯＰＯ（登録商標）Ｂｌｕｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を使用してｐＣＲ（登録商標）４Ｂｌｕｎｔ‐ＴＯＰＯ（登録商標）（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）内にクローニングした。クローニング反応物を、製造業者の指示に従ってＯＮＥ ＳＨＯＴ（登録商標）化学的コンピテントＴＯＰ１０細胞（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）内に形質転換した。プラスミドＤＮＡを、８つの得られた形質転換体からＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００（QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）を使用して抽出し、そしてＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩとＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを使用した制限消化によってスクリーニングした。正しい制限消化パターンを有する２つの形質転換体からのプラスミドＤＮＡのＤＮＡ配列決定で、両方とも所望の配列を保有していたことを確認した。一方をｐＪａＬ５０４‐［ＢａｍＨＩ］と命名した（図１）。
【０１７２】
プラスミドｐＪａＬ５０４［ＢａｍＨＩ］を、ＢｇｌＩＩで消化し、フェノール‐クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿し、次にクレノウポリメラーゼを使用して隙間を埋めた。消化したプラスミドを、製造業者のプロトコールに従ってＱＵＩＣＫ ＬＩＧＡＴＩＯＮ（商標）Ｋｉｔを使用して再連結し、ＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔで処理し、そして得られた連結反応物を製造業者の取扱説明書に従ってＴＯＰＯ（登録商標）Ｂｌｕｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用してｐＣＲ（登録商標）４Ｂｌｕｎｔ‐ＴＯＰＯ（登録商標）内にクローニングした。クローニング反応物を、製造業者の指示に従ってＯＮＥ ＳＨＯＴ（登録商標）化学的コンピテントＴＯＰ１０細胞内に形質転換した。プラスミドＤＮＡを、８つの得られた形質転換体からＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００を使用して抽出し、そしてＸｈｏＩ／ＢｇｌＩＩとＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを使用した制限消化によってスクリーニングした。正しい制限消化パターンを有する２つの形質転換体からのプラスミドＤＮＡのＤＮＡ配列決定で、両方とも所望の配列を保有していたことを確認した。一方をｐＪａＬ５０４‐［ＢｇｌＩＩ］（図２）と命名した。Ｐｕｎｔら（1990, Gene 3: 101-109）は、３６４ｂｐのＡ．ニデュランスのｇｐｄＡプロモーターをプロモーターの強度に影響を与えることなく欠失できることを以前から示していた。これらの著者の観察に基づいて、以下に示したプライマー番号１７２４５０を、Ａ．ニデュランスｇｐｄＡプロモーターを切り詰め、ベクターのサイズを削減するように設計した。
【０１７３】
【化１】
2012504390.tif 000002
【０１７４】
下線を引いた配列は、ｇｐｄＡプロモーター配列に相当する。残りの配列は、以下の制限部位：ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩ、及びＨｉｎｄＩＩＩを保有するハンドルである。
【０１７５】
アスペルギルス・ニデュランスｔｒｐＣターミネーターを切り詰めるために（再びベクターサイズを削減するために）、以下に示したプライマー番号１７２４９９を、ＥｃｏＲＩハンドルを保有するように設計した。
【０１７６】
【化２】
2012504390.tif 000003
【０１７７】
下線を引いた配列は、ｔｒｐＣターミネーター配列に相当する。プライマー１７２４９９及び１７２４５０を使用した増幅で、３６４ｂｐだけプロモーターを、及び２３９ｂｐだけｔｒｐＣターミネーター配列を切り詰める。
【０１７８】
鋳型としてｐＪａＬ５０４‐［ＢｇｌＩＩ］を使用し、上記の２つのプライマーを用いてＰＣＲを実施して、切り詰めバージョンのＡ．ニデュランスｇｐｄＡプロモーター、ＨＳＶ１‐ＴＫ遺伝子のコード配列、及び切り詰めバージョンのＡ．ニデュランスｔｒｐＣターミネーターから構成された２．５２２ｋｂの断片を製造した。
【０１７９】
増幅反応は、５μｌの１０×バッファー（Promega Corporation, Madison, WI, USA）、０．４μｌの０．２５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．２５μｌのプライマー１７２４５０（１００ｎｇ／μｌ）、１．２５μｌのプライマー１７２４９９（１００ｎｇ／μｌ）、０．５μｌのｐＪａＬ５０４‐［ＢｇｌＩＩ］（１００ｎｇ／μｌ）、２μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Promega Corporation, Madison, WI, USA）（２．５Ｕ／μｌ）、及び３９．６μｌの滅菌蒸留水で構成された。増幅反応物を、９５℃にて４５秒間を１サイクル；そしてそれぞれ９５℃にて４５秒間、５７℃にて４５秒間、及び７２℃にて５分間を２８サイクルのためにプログラムしたＲＯＢＯＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Stratagene, La Jolla, CA, USA）を使ってインキュベートした。最後の伸長を７２℃にて１０分間実施した。
【０１８０】
増幅反応物を、５０ｍＭのＴｒｉｓ‐５０ｍＭのホウ酸‐１ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム（ＴＢＥ）バッファー中、低融点アガロースゲルを使用して１％アガロースゲル電気泳動にかけた。２５２２ｂｐの断片をゲルから切り出し、そしてＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）を使用して抽出した。そして、ゲルから精製したＤＮＡを、製造業者の取扱説明書に従ってＴＯＰＯ（登録商標）Ｂｌｕｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用してｐＣＲ（登録商標）４Ｂｌｕｎｔ‐ＴＯＰＯ（登録商標）に挿入した。クローニング反応物を、製造業者の指示に従ってＯＮＥ ＳＨＯＴ（登録商標）化学的コンピテントＴＯＰ１０細胞内に形質転換した。プラスミドＤＮＡを、８つの得られた形質転換体からＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００を使用して抽出し、そしてＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩを使用した制限消化によってスクリーニングした。正しい制限消化パターンを有する２つの形質転換体からのプラスミドＤＮＡのＤＮＡ配列決定で、両方とも所望の配列を保有していたことを確認した。一方をｐＪａＬ５７４（図３）と命名した。
【０１８１】
実施例３：プラスミドｐＷＴＹ１４４９‐０２‐０１の構築
プラスミドｐＪａＬ５７４を、製造業者の推奨するプロトコールに従ってコンピテントＥ．コリＳＣＳ１１０細胞（Stratagene, La Jolla, CA, USA）内に形質転換した。プラスミドＤＮＡを、ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００を使用して２４個の得られた形質転換体から抽出し、次にＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩを使用する分析消化にかけた。続くＤＮＡ配列分析が正しい配列を持つクローンの識別をもたらし、そのクローンをｐＷＴＹ１４４９‐０２‐０１（図４）と命名した。
【０１８２】
実施例４：プラスミドｐＥＪＧ６１の構築
ｂａｒカセットの方向を逆にした（すなわち、ヌクレオチド５９０１〜５２１０がａｍｄＳプロモーターをコードし、ヌクレオチド５２０９〜４６６１がｂａｒコード配列をコードし、そしてヌクレオチド４６６０〜４１１０がアスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ（ＡＭＧ）ターミネーターをコードする）ことを除いて、プラスミドｐＥＪＧ６１（図５）を、米国特許第７３６８２７１号明細書に記載のとおり構築した。
【０１８３】
実施例５：フサリウム・ベネナツムＷＴＹ８４２‐０１‐１１の胞子とプロトプラストの製造
フサリウム・ベネナツムＷＴＹ８４２‐０１‐１１の胞子を製造するために、実施例１に記載の新鮮な寒天培養（約１週齢）から採取した１６個の寒天プラグ（約１ｃｍ×１ｃｍ）を、２．８Ｌフェルンバッハフラスコ内の５００ｍｌのＲＡ培地中に植え付け、そして１５０ｒｐｍで振盪しながら２６．５℃にて２４時間インキュベートし、続けて２８．５℃にてさらに１２時間インキュベートした。次に培養物を、０．４５μｍの濾紙を通過させる１リットル用濾過ユニットの底部に入っている無菌のプラスチック製漏斗により無菌のＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（商標）（CalBiochem, San Diego, CA, USA）を通して濾過した。フィルターにより回収した胞子を、５００ｍｌの滅菌蒸留水によって洗浄し、次に１０ｍｌの滅菌蒸留水中に再懸濁し、そして血球計を使用してカウントした。濃度を、２ｘ１０8／ｍｌに調整した。
【０１８４】
新たに産生された胞子を、それぞれ１ｍｌの新しい胞子（２ｘ１０8／ｍｌ）を含む１００ｍｌのＹＰＧ5%培地の入った４つの５００ｍｌバッフル付き振盪フラスコの植え付けに使用した。振盪フラスコを、１５０ｒｐｍで振盪しながら２３．５℃にて１５時間インキュベートしたが、これは発芽体が約３〜５胞子長の長さになるまでの時間である。１ＭのＭｇＳＯ4中、１ｍｌあたり５ｍｇのＮＯＶＯＺＹＭＥ（商標）２３４（Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark）（濾過滅菌済み）２０ｍｌを、無菌の５０ｍｌ試験管８本の中に等分した。次に、発芽体を、無菌の漏斗により無菌のＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（商標）を通して濾過し、そして無菌の１００ｍｌの滅菌蒸留水、続いて１００ｍｌの１Ｍ ＭｇＳＯ4ですすいだ。無菌のスパチュラを使用して、すすいだ発芽体を、１ＭのＭｇＳＯ4中、ＮＯＶＯＺＹＭＥ（商標）２３４が入った試験管内に緩やかにこすり落とし、そして緩やかに混合した。留具に挟んだ試験管を、それらの傍らにおいて９０ｒｐｍで振盪しながら２９℃にて最長１時間インキュベートした。３０ｍｌの１Ｍ ソルビトールを、各試験管に加え、そしてその試験管を、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＴ６０００Ｂスウィングバケット遠心分離機（Thermo-Fischer Scientific, Waltham, MA, USA）により室温（約２４〜２８℃）にて３７７×ｇ、１０分間遠心分離した。上清をデカンテーションして捨てた後、ペレットを、１ｍｌの１Ｍ ソルビトール中に緩やかに再懸濁した。次に、３０ｍｌの１Ｍ ソルビトールを加え、そして試験管を数回、緩やかに反転した。それらを、室温にて３７７×ｇ、５分間遠心分離し、そしてペレットを１ｍｌの１Ｍ ソルビトール中に緩やかに再懸濁した。試験管の数回のゆるやかな反転の後に、３０ｍｌの１Ｍ ソルビトールを加え、そして試験管を緩やかに混合した。この時点で、１００μｌのアリコートを各試験管から取り出し、そしてプロトプラスト濃度の計算のために９００μｌのＳＴＣを入れたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）チューブに加えた。残りの懸濁液を、室温（約２４〜２８℃）にて３７７×ｇ、５分間遠心分離した。上清を取り除き、そしてペレットを、プロトプラストの終濃度が１ｍｌあたり５ｘ１０7となるようにＳＴＣ：ＳＰＴＣ：ＤＭＳＯ（９：１：０．１）中に再懸濁した。プロトプラストを、同時形質転換のために速やかに使用した。
【０１８５】
実施例６：フサリウム・ベネナツムＷＴＹ８４２‐０１‐１１内へのｐＥＪＧ６１及びｐＷＴＹ１４４９‐０１‐０２の同時形質転換
２ｍｌの新たに製造したフサリウム・ベネナツムＷＴＹ８４２‐０１‐１１プロトプラスト（５×１０7／ｍｌ）を、８０μｌ（それぞれ４０μｌ）の体積の中にそれぞれ５０μｇの環状ｐＥＪＧ６１及びｐＷＴＹ１４４９‐０２‐０１の入った５０ｍｌ無菌遠心分離管に加えた。プロトプラストとＤＮＡを、緩やかに混合し、次に３０分間氷上でインキュベートした。１００μｌのＳＰＴＣをゆっくり加え、そして緩やかに混合した。試験管を室温（２６℃）にて１０分間インキュベートした。８ｍｌのＳＰＴＣをゆっくり加え、そして緩やかに撹拌することによって混合した。次に、試験管を室温（２６℃）にて１０分間インキュベートした。次に、反応物を、１０本の無菌の５０ｍｌ試験管に分けた（１ｍｌ／試験管）。次に、３５ｍｌのＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地（上部アガロース）を、１本の試験管に一度で加え、そして緩やかに３回反転することによって混合した。次に、それぞれの試験管の内容物を、１ｍｌあたり１２ｍｇのＢＡＳＴＡ（商標）を添加した３５ｍｌのＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地が入っている事前に注ぎ込んでおいたプレート上に注ぎ入れた。そのプレートをＣｈｅｘＡｌｌ Ｉｎｓｔａｎｔ Ｓｅａｌ Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｐｏｕｃｈｅｓ内に３〜４日間保存し、その後、ポリ袋に移してさらに７〜８日間保存した。プレート上に生じたコロニーを、ＶＮＯ3ＲＬＭＴ‐ＢＡＳＴＡ（商標）プレート上で継代培養した。推定形質転換体を、フサリウム・ベネナツムＷＴＹ１４４９‐０３‐０１〜２９と命名した。
【０１８６】
実施例７：ＢＡＳＴＡ（商標）耐性形質転換体の表現型分析
フサリウム・ベネナツム形質転換体ＷＴＹ１４４９‐０３‐０１〜２９を、３種類の追加培地上でスクリーニングした：（１）異なる濃度のＦｄＵ（０〜５００μＭ）を添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地；（２）ＶＮＯ3ＲＬＭＴ‐ＢＡＳＴＡ（商標）；及び（３）ＶＮＯ3ＲＬＭＴ‐ＢＡＳＴＡ（商標）‐ＦｄＵ（後者には０〜５００μｍのＦｄＵを添加した）。プレートを、開口したポリ袋内、周囲温度（約２６℃）にて最長１５日間インキュベートした。推定形質転換体の４０パーセントが、（表現型上）同時形質転換体であり、すなわち、推定形質転換体の４０パーセントが、ＶＮＯ3ＲＬＭＴ‐ＢＡＳＴＡ（商標）上で増殖できたが、異なる濃度のＦｄＵを添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地又は異なる濃度のＦｄＵを添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ‐ＢＡＳＴＡ（商標）培地では増殖できなかった。
【０１８７】
実施例８：推定ｂａｒ＋、ｔｋ＋同時形質転換体の遺伝子型分析
５つの表現型上のｂａｒ＋、ｔｋ＋同時形質転換体（実施例７）について、４つの小プラグを、ＶＮＯ3ＲＬＭＴ＋ＢＡＳＴＡ（商標）培地上で増殖した７日齢の（実施例１に記載の）培養物から切り取り、そして２５ｍｌのＭ４００培地の入った１２５ｍｌバッフル付き振盪フラスコ内に植え付けて、ＤＮＡ抽出のためにバイオマスを製造した。振盪フラスコを、１５０ｒｐｍで振盪しながら２８℃にて４日間インキュベートした。次に、バイオマスを、無菌のＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（商標）を通して集菌した。バイオマスを、２００ｍｌの滅菌蒸留水によって十分にすすぎ、手袋をはめた手で絞り、そして清潔で長いピンセットを使用して液体窒素中に浸した。凍ったバイオマスは、すぐに処理したか、又は無菌の５０ｍｌプラスチック試験管内で−８０℃にて一時保存した。凍ったバイオマスを乳鉢と乳棒で粉砕した後に、ゲノムＤＮＡを、最初の溶解薬インキュベーションを（製造業者によって示された１０分間から）９０分まで延長したことを除いて、製造業者の指示に従ってＤＮＥＡＳＹ（登録商標）Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）を使用して抽出した。ＤＮＡを、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）ＮＤ‐１０００分光光度計（Thermo Fischer Scientific, Wilmington, DE, USA）を使用して定量化した。次に、８μｇのＤＮＡを含む各ストックからのアリコートを、ＳＰＥＥＤＶＡＣ（登録商標）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Thermo-Electron Corp., Waltham, MA, USA）を使用して濃縮乾固し、その後、６０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０をそれぞれのサンプルに加え、そして混合した。
【０１８８】
各株から８μｇのＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで消化し、そして選択された株をさらにＢａｍＨＩで消化した。ＥｃｏＲＩ反応は、１×ＥｃｏＲＩバッファー、８μｇのＤＮＡ、６５単位のＥｃｏＲＩ、及び１００μｌの最終容量までの滅菌蒸留水で構成された。３７℃にての１０時間のインキュベーション後に、ローディングバッファー（４０％のショ糖、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のブロムフェノールブルー、０．０２５％のキシレン・シアノール）を加え、そしてサンプルを４枚の１％アガロースゲルに添加し、それをＴＢＥバッファー中、６０ボルトにてにて５時間泳動した。ＢａｍＨＩ制限消化は、１×ＮＥＢバッファー３（New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA）、８μｇのＤＮＡ、６５単位のＢａｍＨＩ、１ｍｌあたり１００μｇのウシ血清アルブミン、及び１００μｌの最終容量までの滅菌蒸留水で構成された。３７℃にて１０時間のインキュベーション後に、ローディングバッファーを加え、そしてサンプルを１％のアガロースゲル上に添加し、それをＴＢＥバッファー中、６０ボルトにて５時間泳動した。
【０１８９】
エチジウムブロマイド染色及び脱染に続いて、以下のとおりゲルからＨＹＢＯＮＤ（商標）Ｎナイロン膜（Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK）を使用して、サザンブロットを調製した。脱プリン反応を、緩やかに振盪しながら０．２５ＮのＨＣｌ中、２６℃にて１０分間おこない、続いて滅菌蒸留水中、２６℃にて５分間洗浄した。洗浄の後に、緩やかに振盪しながら、０．５ＮのＮａＯＨ／１．５ＭのＮａＣｌを使用して、２６℃にて１５分間（第１反応）そして２０分間（第２反応）の２回の変性反応を続けた。もう１回の洗浄を、緩やかに振盪しながら滅菌蒸留水中、２４〜２６℃にて２分間続けた。最後の洗浄の後に、緩やかに振盪しながら、１．５ＭのＮａＣｌ、０．５ＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、及び０．００１ＭのＥＤＴＡを使用した２４〜２６℃にてそれぞれ３０分間の２回の中和反応を続けた。次に、膜をＴＵＲＢＯ ＢＬＯＴＴＥＲ（商標）Ｋｉｔ（Schleicher & Schuell, Keene, NH, USA）を使用して、１０×ＳＳＣ中、２４〜２６℃にて一晩ブロットした。膜を、振盪しながら、２×ＳＳＣ中、２４〜２６℃にて５分間洗浄した。次に、膜を２４〜２６℃にて１０分間風乾し、（１２０ｍＪ／ｃｍ2の総線量を発生する自動設定により）ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ（商標）（Stratagene, La Jolla, CA, USA）を使用してＵＶ架橋し、そして最後に真空炉により８０℃にて１時間焼成した。
【０１９０】
以下に示す、ｂａｒ及びｔｋ遺伝子特異的プローブを作り出すためのプライマーを、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩＲ（登録商標）ソフトウェア（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を使用して設計した。
ｂａｒ遺伝子順方向プライマー９９６０２３番：
５’‐ＣＧＡＧＴＧＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＧＴＴＧ‐３’（配列番号３）
ｂａｒ遺伝子逆方向プライマー９９６０２４番：
５’‐ＧＡＧＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＴＧＡＧＡＡＣ‐３’（配列番号４）
ｔｋ遺伝子順方向プライマー９９８７４４番：
５’‐ＧＧＣＧＡＴＴＧＧＴＣＧＴＡＡＴＣＣＡＧ‐３’（配列番号５）
ｔｋ遺伝子逆方向プライマー９９８７４５番：
５’‐ＴＣＴＴＣＧＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＣＡＴＣ‐３’（配列番号６）
【０１９１】
ｂａｒ及びｔｋ遺伝子のＤＩＧ標識プローブを、製造業者のプロトコールに従ってＰＣＲ ＤＩＧ Ｐｒｏｂｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA）を使用して製造した。サイクル後に、反応物を、氷上に置き、微量遠心管でしばらく遠心分離し、次に１％のアガロースゲル上に添加した。ＴＢＥバッファー中での電気泳動後に、予測されるサイズのバンドを切り出し、そしてＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してゲルから精製した。
【０１９２】
フィルターを、ガラスの試験管内、３５ｍｌのＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA）で４２℃にて３時間、プレ‐ハイブリダイズし、その後、そのＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂを取り除き、（５分間煮沸し、その後氷上に置いた）１０μｌの標識プローブを加えた７．５ｍｌの新しいＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂと置き換えた（すなわち、ＰＣＲ反応から生じたゲルから精製したＤＮＡの約３０％を使用した）。ハイブリダイゼーションを、ハイブリダイゼーション・オーブン内で４２℃にて１２時間実施した。５分間の２回のハイブリダイゼーション後洗浄を、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中、室温して実施し、続いて１５分間の２回の洗浄を０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中、６５℃にて実施した。その後の洗浄及び検出を、製造業者により推奨されたとおり、ＤＩＧ Ｗａｓｈ ａｎｄ Ｂｌｏｃｋ Ｓｅｔ、抗ジゴキシゲニンＡＰ Ｆａｂ断片、及びＣＤＰ‐Ｓｔａｒ化学発光基質（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA）を使用して行った。表現型分析（実施例７）及びサザン分析（本実施例）によって真のｂａｒ＋、ｔｋ＋同時形質転換体であると確認されたフサリウム・ベネナツム株の１つを、フサリウム・ベネナツムＷＴＹ１４４９‐０３‐０３と命名した。
【０１９３】
実施例９：フサリウム・ベネナツムＷＴＹ１４４９‐０３‐０３ｂａｒ＋、ｔｋ＋同時形質転換体からのｔｋ遺伝子の取り除き
フサリウム・ベネナツム株ＷＴＹ１４４９‐０３‐０３の胞子形成を、ＲＡ＋ＢＡＳＴＡ（商標）培地中、実施例５に記載のとおり誘発した。続いて、胞子を、ＦｄＵを添加した培地上での増殖についてスクリーニングしたが、増殖にはｔｋ遺伝子の欠失を引き起こさなくてはならない。この株の新しい培養物から切り出された４本のプラグを用いた２５ｍｌのＲＡ培地の植菌から、１．０６ｘ１０8の胞子を得た。この胞子ストックを、直径１５ｍｍのＦｄＵ添加ＶＮＯ3ＲＬＭＴプレート及び無添加ＶＮＯ3ＲＬＭＴプレート（後者は生存率を評価するため）の両方に播種するための希釈系列を作製するのに使用した。胞子（１００〜１ｘ１０7）を、複製したプレート上に広げ、そしてＣｈｅｘＡｌｌ Ｉｎｓｔａｎｔ Ｓｅａｌ Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｐｏｕｃｈｅｓ内で約２６℃にて５日間インキュベートした。
【０１９４】
（実施例８に記載のｂａｒ及びｔｋプローブを使用した）サザン解析を、５つの選択されたコロニーに対して実施した。前記コロニーは、実施例７に記載の手法を用いて２５μＭのＦｄＵ上で継代培養したときでも増殖できた。その結果は、単一胞子単離物の５つすべてでｔｋ遺伝子が取り除かれていたことを明らかにした。１つの株を、フサリウム・ベネナツムＷＴＹ１４４９‐０９‐０１と命名した。
【０１９５】
実施例１０：ウリジン添加がｔｋを保有する形質転換体のＦｄＵ感受性表現型を無効にすることの確認
ｐｙｒＧ欠失株における使用のための遺伝子欠失系を最適化するために、成長培地へのウリジンの添加がｔｋ+株のＦｄＵ感受性の機構を妨げるか否かを判定することは重要であった。前記ｐｙｒＧ欠失株は生存のためにウリジン添加を必要とする。
【０１９６】
このために、ｂａｒ＋、ｔｋ＋株のフサリウム・ベネナツムＷＴＹ１４４９‐０３‐０３を、（実施例１に記載のとおり）ＶＮＯ3ＲＬＭＴ‐ＢＡＳＴＡプレート上で再生させ、実施例５に記載のとおり胞子を産生するように誘発した。集菌及び洗浄後に、胞子を、５０μＭのＦｄＵ及びさまざまな濃度（０．１〜１ｍＭ）のウリジンを含むＦｄＵ添加ＶＮＯ3ＲＬＭＴプレートに播種した（直径１４ｃｍのプレートあたり５００００個の胞子）。これらのプレートを、ＣｈｅｘＡｌｌ Ｉｎｓｔａｎｔ Ｓｅａｌ Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｐｏｕｃｈｅｓ内、２８℃にて６日間インキュベートし、その後、それらを増殖について評価した。
【０１９７】
ウリジンなしのＦｄＵ添加ＶＮＯ3ＲＬＭＴプレート上で増殖が観察されなかったが、ｔｋ＋株の大きな増殖は、すべての濃度（０．１〜１ｍＭ）のウリジン及びＦｄＵ添加ＶＮＯ3ＲＬＭＴにて起こった。この状況では、ＦｄＵ含有培地上でｔｋ−株とｔｋ＋を区別するのは難しいか又は不可能である。その結果、ＦｄＵ及びウリジン添加培地上でｔｋ＋とｔｋ−株を識別することを可能にするであろういずれかの組み合わせが存在するのであれば、判定するためにウリジン及びＦｄＵ濃度を最適化する必要があった（実施例１５及び１６）。
【０１９８】
実施例１１：ｐＥｍＹ２１の作出
Ｅ．コリのハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）遺伝子（ＤＮＡ配列は配列番号７及び推定アミノ酸配列は配列番号８）を、プラスミドｐＰＨＴＩ（Cummings et al., 1999, Current Genetics 36: 371-382）から以下のプライマーを使用して増幅した：
【０１９９】
【化３】
2012504390.tif 000004
【０２００】
下線を引いた配列によって表される制限酵素部位ＢｓｔＢＩ（順方向プライマー）及びＥｃｏ４７ＩＩＩ（逆方向プライマー）を、クローニングのためにプライマー内に設計した。
【０２０１】
（ｈｐｔ遺伝子を増幅するための）ＰＣＲ反応を、１００μｌの全量中、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌバッファー（New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA）、２００μＭのｄＮＴＰｓ、５０ｐｍｏｌの順方向及び逆方向プライマー、１００ｐｇのｐＰＨＴ１、１単位のＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA）、及び滅菌蒸留水で構成された。増幅反応を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９５℃にて１分間、５１℃にて１分間、及び７２℃にて２分間を２５サイクル；そして７２℃にて７分間を１サイクルのためにプログラムしたＲＯＢＯＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使用して実施した。
【０２０２】
ＰＣＲ産物を、４０ｍＭのＴｒｉｓ塩基‐２０ｍＭの酢酸ナトリウム‐１ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム（ＴＡＥ）バッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって分離した。１．８ｋｂの断片を、ゲルから切り出して、そしてＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。次に、ゲルから精製断片を、ＴＯＰＯ（登録商標）Ｂｌｕｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用してｐＣＲ（登録商標）‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯ（登録商標）（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）内にクローニングした。得られたプラスミドをｐＥｍＹ１０と命名した。
【０２０３】
次に、ＥｃｏＲＩ部位を、以下に示したプライマーを使用して、製造業者の取扱説明書に従ってＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）Ｓｉｔｅ‐Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Stratagene, La Jolla, CA, USA）を使用してｐＥｍＹ１０のｈｐｔ遺伝子のコード配列から取り出した、ここで、小文字は標的ＥｃｏＲＩ部位の非変異ヌクレオチドを表し、及び下線を引かれた文字は変異ヌクレオチドを表す。得られたプラスミドをｐＢＫ３と命名した。
【０２０４】
【化４】
2012504390.tif 000005
【０２０５】
ＥｃｏＲＩ部位を含まない得られたｈｐｔ遺伝子を、以下に示した順方向及び逆方向プライマーを使用してｐＢＫ３からＰＣＲ増幅した。
【０２０６】
【化５】
2012504390.tif 000006
【０２０７】
下線部分は、クローニング用の導入したＫｐｎＩ部位を表す。
【０２０８】
アスペルギルス・オリゼｐｙｒＧ遺伝子の一部を、同方向の反復を作製するために使用し、そして以下のプライマーを使用してｐＳＯ２（ＷＯ９８／１２３００）からＰＣＲ増幅した：
【０２０９】
【化６】
2012504390.tif 000007
【０２１０】
下線部分は、クローニング用の導入した制限部位ＳｍａＩ（ｃｃｃｇｇｇ）又はＫｐｎＩ（ｇｇｔａｃｃ）を表す。
【０２１１】
３つの断片（ｈｐｔ、反復番号１、及び反復番号２）を、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌバッファー、２００μＭのｄＮＴＰｓ、０．２５μＭの各プライマー、５０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、及び１単位のＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼで構成された別々の反応（それぞれ５０μｌ）で増幅した。増幅反応を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９５℃にて１分間、６１℃にて１分間、及び７２℃にて２分間を３０サイクル；そして７２℃にて７分間を１サイクルのためにプログラムしたＲＯＢＯＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使用して実施した。
【０２１２】
ＰＣＲ産物を、ＴＡＥバッファー中での１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離した。約２ｋｂの増幅したｈｐｔ断片及び約０．２ｋｂの反復断片を、ゲルから切り出し、そしてＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。２つのｐｙｒＧ反復断片を、ＫｐｎＩで消化し、仔ウシ腸ホスファターゼ（New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA）で脱リン酸化し、そして製造業者の取扱説明書に従ってＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）で処理した。次に、反復番号１及びｈｐｔを保有する断片を、ＱＵＩＣＫ ＬＩＧＡＴＩＯＮ（商標）Ｋｉｔを使用して一つに連結し、ＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔで処理し、そして製造業者の取扱説明書に従ってＴＯＰＯ（登録商標）Ｂｌｕｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用してｐＣＲ（登録商標）‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯ（登録商標）内にクローニングした。配列分析で、反復番号１及びｈｐｔ断片が一つに連結した１つのクローンを確認した。このプラスミドをｐＥｍＹ１８と命名した。
【０２１３】
第２反復をｐＥｍＹ１８内にクローニングするために、プラスミドｐＥｍｙ１８をＥｃｏＲＶで消化し、そしてその消化物をＴＡＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。５．６ｋｂｍｐ断片を、ゲルから切り出し、そして、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。０．２ｋｂの反復２断片（先に記載）と消化したｐＥｍＹ１８を、ＱＵＩＣＫ ＬＩＧＡＴＩＯＮ（商標）Ｋｉｔを使用して一つに連結した。連結混合物を、ＳＯＬＯＰＡＣＫ（登録商標）Ｇｏｌｄ Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Stratagene, La Jolla, CA, USA）を形質転換するのに使用した。配列分析で、３つの構成要素（反復番号１、ｈｐｔ、及び反復番号２）が所望の順序及び方向で存在し、且つ、ＰＣＲエラーのないプラスミドを同定した。得られたプラスミドをｐＥｍＹ２０と命名した。
【０２１４】
続くＥｃｏＲＩでのｐＥｍＹ２０の消化が単一断片を遊離するのを確実にするために、製造業者の取扱説明書に従ってＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）Ｓｉｔｅ‐Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ、並びに以下に示した順方向及び逆方向プライマーを使用して、ＥｃｏＲＩ部位を移動した。得られたプラスミドを、配列検定後に、ｐＥｍＹ２１（図６）と命名した。
【０２１５】
順方向プライマー：
５’‐ＧＧＧＴＡＣＣＣＣＡＡＧＧＧＣＱＴＡＴＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＧＧ‐３’（配列番号１９）
逆方向プライマー：
５’‐ＣＣＣＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＡＣＧＣＣＣＴＴＧＧＧＧＴＡＣＣＣ‐３’（配列番号２０）
【０２１６】
実施例１２：フサリウム・ベネナツムのオロチジン５’‐一リン酸デカルボキシラーゼ（ｐｙｒＧ）遺伝子を組み込んだゲノムＤＮＡ断片を保有するプラスミドｐＤＭ１５６．２の構築
ニューロスポラ・クラサのオロチジン５’‐一リン酸デカルボキシラーゼ（ｐｙｒ‐４）遺伝子（ＤＮＡ配列は配列番号２１及び推定アミノ酸配列は配列番号２２）のプローブを、以下に記載したプライマーを使用したＰＣＲ組み込みジゴキシゲニン標識デオキシウリジントリホスファターゼ（ｄＵＴＰ）によって調製した。
【０２１７】
プライマー（センス）：
５’‐ＧＴＣＡＧＧＡＡＡＣＧＣＡＧＣＣＡＣＡＣ‐３’（配列番号２３）
プライマー（アンチセンス）：
５’‐ＡＧＧＣＡＧＣＣＣＴＴＧＧＡＣＧＡＣＡＴ‐３’（配列番号２４）
【０２１８】
プラスミドｐＦＢ６（Buxton et al, 1983, Molecular and General Genetics 190: 403-405）をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてその消化物を、ＴＡＥバッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。１．１ｋｂのｐｙｒ‐４断片を切り出し、そして製造業者の示したプロトコールに従ってＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。
【０２１９】
増幅反応（５０μｌ）は、１×Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ・バッファー（New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA）、５μｌのＰＣＲ ＤＩＧ ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｍｉｘ（Boehringer Hammheim, Manheim, Germany）、１０ｎｇの１．１ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ ｐｙｒ‐４断片、１０ｐｍｏｌのセンス・プライマー、１０ｐｍｏｌのアンチセンス・プライマー、及び１単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA）で構成された。反応を、９５℃にて３分間を１サイクル、続いてそれぞれ９５℃にて３０秒間、５５℃にて１分間、及び７２℃にて１分間を３５サイクルのためにプログラムしたＲＯＢＯＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使ってインキュベートした。最後の伸長を、７２℃にて５分間実施した。
【０２２０】
増幅反応産物を、ＴＡＥバッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約０．７８ｋｂのジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識プローブを、ゲルから切り出し、そしてＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。
【０２２１】
フサリウム・ベネナツム株Ａ３／５の染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、そしてＷＯ９９／６０１３７に記載のラムダ・ベクターＥＭＢＬ４内にクローニングした。
【０２２２】
ＤＩＧ標識プローブを、ラムダ・ベクターＥＭＢＬ４内にクローニングしたフサリウム・ベネナツムＡ３／５ＤＮＡのゲノムライブラリーをスクリーニングするために使用した。λファージを、Ｅ．コリＫ８０２細胞（New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA）と共にＮＺＹ上部アガロースを含むＬＢプレート上で平板培養した。プラーク・リフトを、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの技術（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition; J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）を使用してＨＹＢＯＮＤ（商標）Ｎナイロン膜に対しておこなった。ＤＮＡを、ＵＶ ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ（商標）を使用したＵＶ架橋によって膜に結合させた。次に、フィルターに、０．７８ｋｂのＤＩＧ標識Ｎ．クラサｐｙｒ‐４プローブをハイブリダイズさせた。ｐｙｒＧクローンのハイブリダイゼーション及び検出を、ＧＥＮＩＵＳ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ（Boehringer Mannheim, Hammheim, Germany）に従って、５×ＳＳＣ、３５％のホルムアミド、０．１％のＬ‐ラウロイルサルコシン、０．０２％のＳＤＳ、及び１％のブロッキング試薬（Boehringer Hammheim, Manheim, Germany）で構成されたハイブリダイゼーション溶液を用いて４２℃にて実施した。使用されるＤＩＧ標識プローブの濃度は、ハイブリダイゼーション溶液１ｍｌあたり２．５ｎｇであった。ハイブリダイズしているＤＮＡを、アルカリ‐ホスファターゼ複合抗ジゴキシゲニン抗体（Boehringer Hammheim, Manheim, Germany）を用いて免疫学的に検出し、Ｌｕｍｉｐｈｏｓ５３０、化学発光基質（Boehringer Hammheim, Manheim, Germany）を用いて可視化した。ＤＮＡ調製物を、Ｌａｍｂｄａ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）を使用して推定ポジティブラムダ・クローンから作製した。
【０２２３】
先に同定したクローンからのラムダＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで消化し、そしてＴＡＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動にかけた。３．９ｋｂの断片を切り出し、そしてＱＩＡＥＸ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）を使用してアガロースから抽出した。次に、その断片を、ｐＵＣ１１８（Viera and Messing, 1987, Methods in Enzymology 153: 3-11）のＥｃｏＲＩ部位内にクローニングし、そしてＯＮＥ ＳＨＯＴ（登録商標） ＴＯＰ１０コンピテント細胞を、２μｌのクローニング反応物で形質転換した。８つの得られた形質転換体からのプラスミドＤＮＡを、ＤＮＡ配列決定で分析した。所望の配列を有する１つのクローンを選択し、そしてｐＤＭ１５６．２（図７）と命名した。ｐｙｒＧ断片は、コード領域全体に加えて、１．３ｋｂのプロモーター及び１．５ｋｂのターミネーターを保有していた。
【０２２４】
実施例１３：フサリウム・ベネナツムｐｙｒＧ欠失ベクターｐＥｍＹ２３の作出
フサリウム・ベネナツムｐｙｒＧコード配列（２６７８ｂｐ、ＤＮＡ配列は配列番号５１、及び推定アミノ酸配列は配列番号５２）を、ＥｃｏＲＶ及びＳｔｕＩでの消化によってｐＤＭ１５６．２（実施例１２）から切り出し、そして、４３９８ｂｐの残ったベクターを、製造業者の指示に従ってＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してゲルから精製した。ｐＥｍＹ２１のＳｍａＩ断片を単離し、そして、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してゲルから精製し、そして２つのゲルから精製した断片を、製造業者の取扱説明書に従ってＱＵＩＣＫ ＬＩＧＡＴＩＯＮ（商標）を使用して一つに連結し、そしてＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔを用いて処理し、そして２μｌの得られた連結反応物を、製造業者の指示に従ってＯＮＥ ＳＨＯＴ（登録商標）化学的コンピテントＴＯＰ１０細胞の形質転換に使用した。
【０２２５】
プラスミドＤＮＡを、ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００を使用して８つの得られた形質転換体から抽出した。これらのＤＮＡを挿入方向についてスクリーニングし、エラーの不存在について配列決定し、そして正しい挿入配列を持つ１つのクローンを選択し、ｐＥｍＹ２３（図８）と命名した。
【０２２６】
実施例１４：ｐｙｒＧ欠失株ＥｍＹ１１５４‐４６‐４．３の作出
プラスミドｐＥｍＹ２３を、ＥｃｏＲＩ及びＸｍｎＩで消化し、そして３．６ｋｂのＤＮＡ断片を単離するためにＴＡＥバッファリング中での１％アガロースゲル電気泳動にかけた。３．６ｋｂの断片を、製造業者の指示に従ってＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してゲルから精製し、そして以下の２つの相違点を除き、実施例６に記載のとおりにフサリウム・ベネナツムＷＴＹ８４２‐１‐１１のプロトプラストの形質転換に使用した：第１に、１タイプの形質転換ＤＮＡだけを使用した（３．６ｋｂのＥｃｏＲＩ‐ＸｍｎＩ消化ｐＥｍＹ２３断片）；及び、第２に、形質転換体を、１ｍＭのウリジン及び１ｍｌあたり０．１２５ｍｇのハイグロマイシンＢ（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA）を添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ上で選択し、１０個の形質転換体を、２５ｍｌの無添加Ｍ４００液体培地中、さらにＶＮＯ3ＲＬＭＴ＋１ｍＭのウリジン（増殖に関するポジティブ対照）、ＶＮＯ3ＲＬＭＴ＋１ｍＭのウリジン＋１ｍｌあたり０．１２５ｍｇのハイグロマイシンＢ（形質転換に関するポジティブ対照）、無添加ＶＮＯ3ＲＬＭＴ（ｐｙｒＧ欠失に関するスクリーン）による表現型スクリーンによるスクリーニングのために選択した。ウリジン原栄養性の候補は、液体培地により３日以内に、そしてプレート・ベースの表現型スクリーンによって７日以内に同定できた。更なるスクリーニング及び胞子精製のために選ばれた候補の１つをＥｍＹ１１５４‐４６‐４と命名した。（寒天培地が１０ｍＭのウリジンを添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴであったことを除いて、実施例２１に記載のとおり得られた）この株から得られた胞子精製した単離物を、先に記載したものと同じスクリーニング・プロトコールにかけ、そして２つの単一胞子単離物を、親株との比較のためのサザンハイブリダイゼーション分析のために選択した。これらの胞子精製した株を、フサリウム・ベネナツムＥｍＹ１１５４‐４６‐４．３及びＥｍＹ１１５４‐４６‐４．５と命名した。
【０２２７】
ｐｙｒＧの存在及びｈｐｔの不存在のためのフサリウム・ベネナツムＷＴＹ８４２‐１‐１１（対照株）、つまり、一次形質転換体フサリウム・ベネナツムＥｍＹ１１５４‐４６‐４、及び単一胞子単離体フサリウム・ベネナツムＥｍＹ１１５４‐４６‐４．３とＥｍＹ１１５４‐４６‐４．５から、ゲノムＤＮＡを実施例８に記載の通りに調製した。各株からの８μｇのＤＮＡを、ＳｔｕＩ及びＭｆｅＩで消化した。ＳｔｕＩ反応は、１×ＮＥＢバッファー２（New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA）、８μｇのＤＮＡ、６５単位のＳｔｕＩ、及び１００μｌの全量までの滅菌蒸留水で構成された。３７℃にて１０時間のインキュベーション後に、ローディングバッファー（４０％のショ糖、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のブロムフェノールブルー、０．０２５％のキシレン・シアノール）を加え、そしてサンプルを２枚の１％アガロースゲルに添加し、そしてそれをＴＢＥバッファー中、６０ボルトにて５時間泳動した。ＭｆｅＩ制限消化は、１×ＮＥＢバッファー４（New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA）、８μｇのＤＮＡ、６５単位のＭｆｅＩ、及び１００μｌの全量までの滅菌蒸留水で構成された。３７℃にて１０時間のインキュベーション後に、ローディングバッファーを加え、そしてサンプルを１％のアガロースゲルに添加し、それをＴＢＥバッファー中、６０ボルトにて５時間泳動した。
【０２２８】
エチジウムブロマイド染色及び脱染に続いて、サザンブロットを以下のとおりＨＹＢＯＮＤ（商標）Ｎナイロン膜を使用してゲルから調製した。脱プリン反応を、緩やかに振盪しながら０．２５ＮのＨＣｌ中、２６℃にて１０分間おこない、続いて滅菌蒸留水中、２６℃にて５分間洗浄した。洗浄の後に、緩やかに振盪しながら０．５ＮのＮａＯＨ／１．５ＭのＮａＣｌを使用した２６℃にて１５分間（第１反応）及び２０分間（第２反応）の２回の変性反応が続いた。もう一回の洗浄を、緩やかに振盪しながら滅菌蒸留水中、２６℃にて２分間続けた。最後の洗浄後に、それぞれ緩やかに振盪しながら１．５ＭのＮａＣｌ、０．５ＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、及び０．００１ＭのＥＤＴＡを使用した２６℃にて３０分間の２回の中和反応が続いた。次に、ＴＵＲＢＯ ＢＬＯＴＴＥＲ（商標）Ｋｉｔを使用して、１０×ＳＳＣ中、２６℃にて一晩、膜をブロットした。振盪しながら２×ＳＳＣ中、２６℃にて５分間、膜を洗浄した。次に、膜を、２６℃にて１０分間風乾し、（１２０ｍＪ／ｃｍ2の総線量を発生する自動設定により）ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ（商標）を使用してＵＶ架橋し、そして最後に真空炉内で８０℃にて１時間焼成した。
【０２２９】
以下に示すｐｙｒＧ及びｈｐｔ遺伝子特異的プローブを製造するためのプライマーを、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩＲソフトウェア（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を使用して設計した。
【０２３０】
フサリウム・ベネナツムｐｙｒＧ順方向プライマー：
５’‐ＧＣＣＡＴＧＣＧＡＴＣＣＡＧＣＧＴＴＴＧＡＡＴＣＣ‐３’（配列番号２５）
フサリウム・ベネナツムｐｙｒＧ順方向プライマー：
５’‐ＧＣＧＴＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＣＧＡＴＧＧＴＣＣＴＣ‐３’（配列番号２６）
Ｅ．コリｈｐｔ順方向プライマー：
５’‐ＣＡＧＡＴＡＣＣＡＣＡＧＡＣＧＧＣＡＡＧＣ‐３’（配列番号２７）
Ｅ．コリｈｐｔ逆方向プライマー：
５’‐ＧＧＧＣＡＧＴＴＣＧＧＴＴＴＣＡＧＧ‐３’（配列番号２８）
【０２３１】
ｐｙｒＧ及びｈｐｔ遺伝子のＤＩＧ標識プローブを、製造業者のプロトコールに従ってＰＣＲ ＤＩＧ Ｐｒｏｂｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用して製造した。サイクル後に、反応物を、氷上に置き、微量遠心管でしばらく遠心分離し、次に１％アガロースゲル上に添加した。ＴＢＥバッファー中での電気泳動後に、予測されるサイズのバンドを、切り出し、そしてＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してゲルから精製した。フィルターを、ガラスの試験管内、３５ｍｌのＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ中で４２℃にて３時間プレ‐ハイブリダイズし、その後、そのＥａｓｙ Ｈｙｂを取り除き、（５分間煮沸し、その後氷上に置いた）１０μｌの標識プローブ（ＰＣＲ反応からのゲルから精製したＤＮＡの約３０％）を加えた７．５ｍｌの新しいＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂと置き換えた。ハイブリダイゼーションを、ハイブリダイゼーション・オーブン内で４２℃にて１２時間実施した。５分間の２回のハイブリダイゼーション後洗浄を、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中、室温して実施し、続いて１５分間の２回の洗浄を０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中、６５℃にて実施した。その後の洗浄及び検出を、製造業者により推奨されたとおり、ＤＩＧ Ｗａｓｈ ａｎｄ Ｂｌｏｃｋ Ｓｅｔ、抗ジゴキシゲニンＡＰ Ｆａｂ断片、及びＣＤＰ‐Ｓｔａｒ化学発光基質を使用して行った。
【０２３２】
サザンハイブリダイゼーションの結果は、フサリウム・ベネナツムＥｍＹ１１５４‐４６‐４、及びその２つの単一胞子単離体ＥｍＹ１１５４‐４６‐４．３及びＥｍＹ１１５４‐４６‐４．５がｐｙｒＧ欠失事象を維持し、且つ、ｈｐｔ遺伝子を保有していたことを明らかにした。
【０２３３】
実施例１５：ウリジン及びＦｄＵ添加培地上でのｐｙｒＧ欠失フサリウム・ベネナツム株ＥｍＹ１１５４‐４６‐４．３の胞子の発芽効率
ウリジン及びＦｄＵ添加培地上でのｐｙｒＧ欠失フサリウム・ベネナツム株ＥｍＹ１１５４‐４６‐４．３からの胞子の発芽効率を試験した。フサリウム・ベネナツムＥｍＹ１１５４‐４６‐４．３の胞子を、１０ｍＭのウリジンを添加したＲＡ培地を使用して実施例５に記載の通りに製造した。２００μｌの体積中の５０個の胞子を、０、２５、又は５０μＭのＦｄＵ及び０、０．０１、０．０５、０．１、又は０．２５ｍＭのウリジンを添加した４５枚のＶＮＯ3ＲＬＭＴプレート（直径１４ｃｍ）にそれぞれ等分した。ＦｄＵ及びウリジンのそれぞれの組み合わせの三重反復のプレートを準備し、そしてＣｈｅｘＡｌｌ Ｉｎｓｔａｎｔ Ｓｅａｌ Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｐｏｕｃｈｅｓ内、２６℃にて１０日間インキュベートした。
【０２３４】
０．０１ｍＭのウリジン濃度において、フサリウム・ベネナツムＥｍＹ１１５４‐４６‐４．３の胞子は、２５又は５０μＭのＦｄＵの存在下で発芽できなかったが、その一方で、それらは、同じ培地上のＦｄＵ不存在下では容易に発芽した。しかしながら、０．１ｍＭのウリジン濃度において、ｐｙｒＧ欠失株の胞子は、（ＦｄＵ不存在下、７５％の頻度と比べて）２５及び５０μｍのＦｄＵの存在下で約５０％の頻度で発芽できた。
【０２３５】
実施例１６：
低ウリジン濃度におけるＦｄＵ添加最少培地上でのｔｋ＋株とｔｋ−株の区別
非常に低いウリジン濃度が、ｔｋ＋株においてＦｄＵに対する耐性を与えるか否かについて判定するために、再構築実験を実施した。ｔｋ＋株のフサリウム・ベネナツムＷＴＹ１４４９‐３‐３とｔｋ−株のフサリウム・ベネナツムのＷＴＹ１４４９‐９‐１を使用した。それぞれの株の胞子を誘発し、そしてプレートあたり５０個の胞子（フサリウム・ベネナツムＷＴＹ１４４９‐９‐１）又は直径１４ｃｍのプレートあたり５００００個の胞子（フサリウム・ベネナツムＷＴＹ１４４９‐３‐３）を播種した。加えて、ＷＴＹ１４４９‐３‐３とＷＴＹ１４４９‐９‐１胞子、それぞれ５０個と５００００個の組み合わせを混合し、そして播種した。すべてのプレートには、５０μＭのＦｄＵを添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴを入れた。プレート内のウリジン濃度は、１、０．５、０．２５、又は０．１ｍＭであった。各処置を、三重反復試験で実施した。
【０２３６】
ｔｋ＋株は、それが増殖しなかったウリジンを欠く培地を除いて、すべてのプレート上で一定の曇りとして増殖した。ｔｋ‐株は、ウリジンのすべての濃度において、及びウリジンを欠く培地上で良好に増殖した。混合プレート上では、結果は、ｔｋ＋とｔｋ−株の純粋なプレートの結果を組み合わせたものであった。それぞれのウリジン含有プレートにおいて、異なるｔｋ−コロニーが、ｔｋ＋株の曇った背景にある増殖の上に重ねられた。
【０２３７】
ｔｋ＋とｔｋ−胞子が混合物を播種したプレート上に現れたコロニーを、５０μＭのＦｄＵ（ウリジンなし）を添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地の新しいプレートに継代培養した。同数のサンプルをさらに、背景にあった増殖（混合プレート１枚あたり３つのコロニー）からＶＮＯ3ＲＬＭＴ＋５０μＭのＦｄＵ（ウリジンなし）に継代培養した。加えて、コロニーと背景にある増殖を、純粋なｔｋ−プレートと純粋なｔｋ＋プレートからＶＮＯ3ＲＬＭＴ＋５０μＭのＦｄＵ（ウリジンなし）のプレートに継代培養した。（１）混合プレート上の背景にある増殖（推定ＦｄＵ感受性、ｔｋ＋株）が、ウリジン不存在下、予想される表現型（ＦｄＵに対する感受性）を続けて表すか否か；及び（２）推定ＦｄＵ耐性、ｔｋ‐コロニーが、これらの条件下で普通に増殖するか否か、を評価するために、これを行った。インキュベーション後に、ｔｋ＋株が５０μＭのＦｄＵ存在下、ウリジン欠乏培地上で全く増殖できなかったが、その一方で、ｔｋ−株が５０μＭのＦｄＵの存在下ウリジン欠乏培地上で正常に増殖することが明らかになった。ｔｋ＋の背景にある曇りが、ウリジンを含む混合プレート上で増殖したにもかかわらず、ｔｋ−株が容易に区別でき、そして主張した二重選択技術が必要とされている場合に、ｔｋ＋株が混入している危険性なしに０．１ｍＭのウリジンを添加したＦｄＵ含有培地からウリジン不含培地に容易に継代培養できた。
【０２３８】
（ウリジンの添加がＦｄＵの阻害作用を無効にすると公表した記載、例えばSachs et al., 1997, Nucleic Acids Research 25: 2389-2395とは逆に）ｔｋ遺伝子が、ウリジン添加増殖条件下、ネガティブ選択マーカーとしてうまく利用できるという結果を実証した。
【０２３９】
実施例１７：プラスミドｐＷＴＹ１４７０‐１９‐０７の構築
（フサリウム・ベネナツムのトリコジエンシンターゼ（ｔｒｉ５）遺伝子（ＤＮＡ配列については配列番号２９及び推定アミノ酸配列については配列番号３０）の５’及び３’フランキング配列を保有する）プラスミドｐＪＲｏｙ４０（米国特許第７３３２３４１号明細書）を、５’ｔｒｉ５遺伝子フランキング配列の一部の増幅のための鋳型として使用した。ＰＣＲ反応には、５０μｌの最終容量中、２００μＭのｄＮＴＰｓ、１×ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ・バッファー、１２５ｐｇのｐＪＲｏｙ４０ＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの以下に示すそれぞれのプライマー、及び１単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼが含まれた。
【０２４０】
【化７】
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【０２４１】
増幅反応を、９５℃にて３分間を１サイクル；それぞれ９５℃にて３０秒間、５２℃にて４５秒間、及び７℃にて２分間を１０サイクル；それぞれ９５℃にて３０秒間、５２℃にて４５秒間、及び７２℃にて５分間を２０サイクル；７２℃にて７分間を１サイクルのためにプログラムしたＲＯＢＯＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使ってインキュベートした。
【０２４２】
ＰＣＲ産物を、ＴＢＥバッファーを使用した１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離した。約６００ｂｐの断片を、ゲルから切り出し、そしてＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。断片を、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニングＫｉｔ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を使用してｐＣＲ（登録商標）２．１（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）内に挿入し、そしてＯＮＥ ＳＨＯＴ（登録商標）ＴＯＰ１０コンピテント細胞を２μｌのクローニング反応物で形質転換した。８つの得られた形質転換体からのプラスミドＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩで別々の反応で消化し、そして、正しい制限消化パターンを有する３つの形質転換体の挿入物を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。所望の配列を持つ１つのクローンを選択し、そしてｐＷＴＹ１４７０‐０９‐０５と命名した。
【０２４３】
ｔｒｉ５遺伝子の５’反復を保有する６０８ｂｐのＢｇｌＩＩ断片を、ＢｇｌＩＩで消化し、ＴＢＥバッファーを使用した１．０％アガロースゲル電気泳動によって精製し、ゲルから切り出し、そしてＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出することによってｐＷＴＹ１４７０‐０９‐０５から遊離させた。
【０２４４】
プラスミドｐＪＲｏｙ４０を、ＢｇｌＩＩを用いた消化によって線状化し、その後、製造業者の取扱説明書に従ってシュリンプ・アルカリホスファターゼ（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA）を使用して脱リン酸化し、そしてＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）を使用して精製した。線状化したｐＪＲｏｙ４０及びゲルから精製したＢｇｌＩＩ断片を、製造業者の取扱説明書に従ってＴ４ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA）を使用して一つに連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ（登録商標）化学的コンピテント細胞（Stratagene, La Jolla, CA, USA）の形質転換を、製造業者の指示に従って実施した。１つの形質転換体が、所望のベクターを含むこと、すなわち、ｔｒｉ５の５’及び３’フランキング配列、それに加えて５’フランキング配列の一部の反復を保有していることをＤＮＡ配列決定によって確認した。得られたプラスミドを、ｐＷＴＹ１４７０‐１９‐０７（図９）と命名した。
【０２４５】
実施例１８：プラスミドｐＷＴＹ１５１５‐０２‐０１の構築
プラスミドｐＷＴＹ１４７０‐１９‐０７を、製造業者の取扱説明書に従ってＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）Ｓｉｔｅ‐Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用して、且つ、以下に示した順方向及び逆方向プライマーを使用して試験管内突然変異誘発にかけた。
【０２４６】
順方向プライマー：
５’‐ＣＡＡＧＴＡＡＣＡＧＡＣＧＣＧＡＣＡＧＣＴＴＧＣＡＡＡＡＴＣＴＴＣＧＴＴＡＴＣＴＧＴＧ‐３’（配列番号３３）
逆方向プライマー：
５’‐ＣＡＣＡＧＡＴＡＡＣＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＧＣＴＧＴＣＧＣＧＴＣＴＧＴＴＡＣＴＴＧ‐３’（配列番号３４）
【０２４７】
突然変異誘発は、１７７９ｂｐのＢｇｌＩＩ部位を取り去り、そして独特で、且つ、チミジンキナーゼ（ｔｋ）及びハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）遺伝子カセットを保有する断片を挿入するためのその後の操作で使用可能な２３８６ｂｐのＢｇｌＩＩ部位を提供した。突然変異誘発反応を、製造業者の示したプロトコールに従って、キットで供給されたＥ．コリＸＬ１０‐ＧＯＬＤ（登録商標）Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞（Stratagene, La Jolla, CA, USA）を形質転換するのに使用した。
【０２４８】
配列分析によって確認される先に示した突然変異を保有する１つの形質転換体を、ｐＷＴＹ１５１５‐０２‐０１（図１０）と命名し、そして実施例１９の骨格として使用した。
【０２４９】
実施例１９：ｔｒｉ５欠失ベクターｐＪｆｙＳ１５７９‐２１‐１６の製造
Ｅ．コリ・ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）遺伝子カセットを、ＡＤＶＡＮＴＡＧＥ（登録商標）ＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Clonetech, Palo Alto, CA, USA）、並びに以下に示した遺伝子特異的な順方向及び逆方向プライマーを使用してプラスミドｐＥｍＹ２３からＰＣＲ増幅した。逆方向プライマーの下線部分は、クローニングのためのＢｇｌＩＩ部位である。
【０２５０】
【化８】
2012504390.tif 000009
【０２５１】
ＰＣＲ反応は、５０μｌの最終容量中、ＤＮＡ鋳型として３６２ｎｇのｐＥｍＹ２３、２００μＭのｄＮＴＰ、１．１ｍＭの酢酸マグネシウム、０．４μＭのプライマー、１×ＧＣ Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファー（Clonetech, Palo Alto, CA, USA）、０．５ＭのＧＣ Ｍｅｌｔ（Clonetech, Palo Alto, CA, USA）、及び１×ＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（Clonetech, Palo Alto, CA, USA）を含んでいた。
【０２５２】
増幅反応物を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９４℃にて３０秒間及び６６℃にて３分間を２５サイクル；そして６６℃にて３分間を１サイクル；そして４℃にて保持のためにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Eppendorf, Munich, Germany）を使ってインキュベートした。
【０２５３】
ＰＣＲ産物を、ＴＡＥバッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動によって分離した。約１．９ｋｂの断片を、ゲルから切り出し、そしてＭＩＮＩＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）を使用してアガロースから抽出した。その断片を、製造業者の取扱説明書に従ってＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用してｐＣＲ（登録商標）２．１内にクローニングした。ＯＮＥ ＳＨＯＴ（登録商標）ＴＯＰ１０コンピテント細胞（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を、２μｌのＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ反応物で形質転換した。８つの形質転換体からのプラスミドＤＮＡの配列分析では、予想した配列からの逸脱が全くなかったことを確認し、そしてそのプラスミドをｐＪｆｙＳ１５４０‐７５‐５（図１１）と命名した。
【０２５４】
ｈｐｔ挿入物を、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩでの消化によってｐＪｆｙＳ１５４０‐７５‐０５から遊離させ、そしてＴＡＥバッファー中、１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。１．９ｋｂの断片を、切り出し、そしてＭＩＮＩＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを、空のＢｇｌＩＩ線状化ｔｒｉ５欠失ベクターｐＷＴＹ１５１５‐０２‐０１（実施例１８）に前記断片を連結するのに使用したが、前記ベクターは仔ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化しておいた。Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ（登録商標）化学的コンピテント細胞を連結反応物で形質転換し、そして２４の得られた形質転換体からのプラスミドＤＮＡを、ＥｃｏＲＩを用いた制限消化によって分析して挿入物の方向を確認した。所望の方向で挿入物を保有する形質転換体の１つを選択し、そしてｐＪｆｙＳ１５７９‐１‐１３（図１２）と命名した。
【０２５５】
鋳型としてｐＷＴＹ１４４９‐２‐１を使用し、さらに以下に示した遺伝子特異的順方向及び逆方向プライマーを使用して、単純ヘルペスウイルのスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子（ＤＮＡ配列については配列番号３７及び推定アミノ酸配列については配列番号３８）をＰＣＲ増幅した。太字の配列は、導入されたＢｇｌＩＩ部位を表す。
【０２５６】
【化９】
2012504390.tif 000010
【０２５７】
ＰＣＲ反応には、５０μｌの最終容量中、１×ＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（登録商標）反応バッファー（Stratagene, La Jolla, CA, USA）、２００μＭのｄＮＴＰｓ、５５ｎｇのｐＷＴＹ１４４９‐２‐１、０．２μＭのプライマー、２％のＤＭＳＯ、及び２．５単位のＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, CA, USA）が含まれた。
【０２５８】
増幅反応物を、９５℃にて１分間を１サイクル；それぞれ９４℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、及びの６８℃にて２分４５秒間を２５サイクル；そして６８℃にて２分４５秒間を１サイクル；そして４℃にて保持のためにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使ってインキュベートした。
【０２５９】
ＰＣＲ産物を、ＴＡＥバッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動によって分離した。約２．８ｋｂの断片を、ゲルから切り出し、そしてＭＩＮＩＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製した。その断片を、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用してｐＣＲ（登録商標）２．１内にクローニングした。ＯＮＥ ＳＨＯＴ（登録商標）ＴＯＰ１０コンピテント細胞（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を、２μｌのＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ反応物で形質転換した。形質転換体の１つからのプラスミドＤＮＡの配列分析では、グリシンからアラニンへのアミノ酸変化をもたらすｔｋコード配列内の突然変異（Ｃ１６２１Ｇ）を同定した。この突然変異を、製造業者の取扱説明書に従ってＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）ＩＩ ＸＬ Ｓｉｔｅ‐Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Stratagene, La Jolla, CA, USA）を使用して、さらに以下に示した順方向及び逆方向プライマーを使用して補正した。小文字は所望の変化を示す。１６個のクローンの配列分析が、ｐＪｆｙＳ１５７９‐８‐６（図１３）と命名したものの選択をもたらした。
【０２６０】
順方向プライマー：
５’‐ＣＣＣＴＧＴＴＴＣＧＧＧｇＣＣＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＧＧ‐３’（配列番号４１）
逆方向プライマー：
５’‐ＣＣＡＧＣＡＡＣＴＣＧＧＧＧｃＣＣＣＧＡＡＡＣＡＧＧＧ‐３’（配列番号４２）
【０２６１】
プラスミドｐＪｆｙＳ１５７９‐０８‐０６を、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで消化して２．８ｋｂのｔｋ断片を遊離し、そしてその断片を先に記載した通りに精製した。この断片を、ＢｇｌＩＩで線状化し、そして仔ウシ腸ホスファターゼによって処理しておいたｐＪｆｙＳ１５７９‐１‐１３にＱＵＩＣＫ ＬＩＧＡＴＩＯＮ（商標）Ｋｉｔを使用して連結し、そして製造業者のプロトコールに従ってＥ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ（登録商標）化学的コンピテント細胞を形質転換するのに使用した。得られたプラスミドを、ｐＪｆｙＳ１５７９‐２１‐１６（図１４）と命名し、そしてｔｒｉ５欠失カセットとして使用した。
【０２６２】
実施例２０：フサリウム・ベネナツムの形質転換手法
以下の実施例に記載したそれぞれの欠失カセット１００μｇを、ＢｓｔＺ１７１／ＢａｍＨＩ（実施例２１）又はＮｏｔＩ（実施例２４、２６、３７、及び３９）のいずれかで消化した。それぞれの消化反応物をＴＡＥバッファー中、１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そしてＤＮＡバンドをＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して抽出した。得られた精製ＤＮＡを、１０％反応容量の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５の添加と、それに続く２．５倍量の氷冷エタノール（９４％）の添加、そして氷上で２０分間のインキュベーションによるエタノール沈殿によって１．５ｍｌ微量遠心管内で濃縮した。次に、その管を、ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）５４２４ベンチトップ遠心分離機（Eppendorf, Hamburg, Germany）を使って１５０００×ｇにて１０分間遠心分離した。上清を捨て、そしてペレットを、１ｍｌの氷冷７０％エタノールで洗浄し、そして１５０００×ｇにて５分間遠心分離した。上清を捨て、そしてペレットを風乾させた。次に、ペレットを、７０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８バッファー中に再懸濁した。得られたＤＮＡ含有溶液の濃度を、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）１０００分光光度計（Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA）を使用して測定した。
【０２６３】
適当な受容株のプロトプラストを、以下の方法で製造した。ＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地を含む７日齢の培養物の１５ｘ１ｃｍ2の寒天プラグを、２．８Ｌフェルンバッハフラスコ内、５００ｍｌのＲＡ培地（実施例２１）又は１０ｍＭのウリジンを添加したＲＡ培地（実施例２４、２６、３７、及び３９）に植菌し、そしてそのフラスコを１５０ｒｐｍで振盪しながら２８℃にて３６時間インキュベートすることによって、最初に胞子を得た。胞子培養物を、無菌のＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（商標）を通して濾過し、そして胞子をＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標）ＳＴＥＲＩＣＵＰ（登録商標）０．２μｍフィルターユニット（Millipore, Bellerica, MA, USA）上に捕捉した。その胞子を、２００ｍｌの無菌のガラス蒸留水によって洗浄し、そして１０ｍｌの無菌のガラス蒸留水中に再懸濁した。
【０２６４】
１ｍｌの胞子溶液を、５％のグルコースを添加した１００ｍｌのＹＰ培地（実施例２１）又は５％のグルコースと１０ｍＭのウリジンを添加したＹＰ培地（実施例２４、２６、３７、及び３９）の植菌のために使用した。植菌した培地を、１５０ｒｐｍで振盪しながら１７℃にて１６時間インキュベートした。培養物を、ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（商標）に通して濾過して菌糸を回収し、そしてそれを、無菌のスパチュラを使用して５０ｍｌのポリプロピレン管に移した。菌糸を、２０ｍｌのプロトプラスト化溶液（１ｍｌあたり１Ｍ ＭｇＳＯ4中、１ｍｌあたり５ｍｇのＮＯＶＯＺＹＭＥ（商標）２３４及び５ｍｇのＧＬＵＣＡＮＥＸ（商標）（ともにNovozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark製）を含む）中に再懸濁し、そしてそれを５０ｍｌのポリプロピレン管に移した。その試験管を、９０ｒｐｍで振盪しながら２９．５℃にて１時間インキュベートし、そして３０ｍｌの１Ｍ ソルビトールを加えた。そして、その試験管を、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＴ６０００Ｂスウィングバケット遠心分離機（Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA）を使用して８００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を捨て、そしてプロトプラストペレットを、３０ｍｌの１Ｍ ソルビトールで２回洗浄した。試験管を、８００×ｇで５分間遠心分離し、そして上清を捨てた。プロトプラストを、１ｍｌあたり５ｘ１０7の濃度にてフィルター滅菌した９：１：０．１（ｖ／ｖ）ＳＴＣ：ＳＰＴＣ：ＤＭＳＯ溶液中に再懸濁し、そしてＮＡＬＧＥＮＥ（商標）Ｃｒｙｏ １℃ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ（Thermo Fischer Scientific, Wilmington, DE, USA）を使用して制御された速度の冷凍にて一晩−８０℃にて冷凍した。
【０２６５】
氷上でプロトプラストを解凍し、そして４本の１４ｍｌ試験管それぞれに２００μｌのプロトプラストを加えることによって、形質転換を達成した。５μｇのＤＮＡ（１０μｌ未満）を、最初の３本に加え、そして４本目にはＤＮＡを加えなかった。次に、７５０μｌのＳＰＴＣを各試験管に加え、そして試験管を６回緩やかに反転した。試験管を、室温にて３０分間インキュベートし、そして６ｍｌのＳＴＣを各試験管に加えた。各形質転換物を、３つの部分に分割し、１ｍｌあたり１２５μｇのハイグロマイシン（実施例２１）を添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地、又は１ｍｌあたり１２５μｇのハイグロマイシン及び１０ｍＭのウリジン（実施例２４、２６、３７、及び３９）を添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地の入った直径１５０ｍｍのプレートに加え、そして室温にて７日間インキュベートした。
【０２６６】
実施例２１：Δｔｒｉ５フサリウム・ベネナツム株ＪｆｙＳ１６０４‐４７‐０２の構築
フサリウム・ベネナツムＡ３／５プロトプラストを、実施例２０に記載の方法を使用してＢｓｔＺ１７１／ＢａｍＨＩ線状化ｐＪｆｙＳ１５７９‐２１‐１６で形質転換した。形質転換体を、１ｍｌあたり１２５μｇのハイグロマイシンＢを含むＶＮＯ3ＲＬＭＴプレート上で選択した。７日後に、１２３個の形質転換体のうちの４８個を、同じ培地が入った新しいプレートに継代培養した。次に、８つの形質転換体を、以下の通りにサザン解析によって分析した。先に記載したように得られた７日齢の形質転換体からの４本の１ｃｍ寒天プラグを２５ｍｌのＭ４００培地に植菌することによって、これらの株の真菌バイオマスを製造した。培養物を、１５０ｒｐｍで振盪しながら２８℃にて３日間インキュベートした。寒天プラグを取り出し、そして培養物を、ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（商標）を通して濾過した。集菌したバイオマスを液体窒素で凍らせ、そして乳鉢と乳棒を使用して、菌糸を粉砕した。
【０２６７】
６５℃での溶解薬インキュベーションの時間を１０分から１．５時間まで延長したことを除いて、製造業者の取扱説明書に従ってＤＮＥＡＳＹ（登録商標）Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを使用して、ゲノムＤＮＡを単離した。
【０２６８】
２μｇのゲノムＤＮＡを、５０μｌの反応容量中、１６単位のＳｐｈＩと２２単位のＤｒａＩで３７℃にて２２時間消化した。消化物を、ＴＡＥバッファー中、１．０％アガロースゲル電気泳動にかけた。ＤＮＡを、０．２５ＭのＨＣｌで処理することによってゲル内で断片化し、１．５ＭのＮａＣｌ‐０．５ＭのＮａＯＨで変性させ、１．５ＭのＮａＣｌ‐１ＭのＴｒｉｓ ｐＨ８で中和し、次にＴＵＲＢＯＢＬＯＴＴＥＲ（商標）Ｋｉｔを使用して２０×ＳＳＣ中、ＮＹＴＲＡＮ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅナイロン膜（ともにWhatman, Kent, UK製）に移した。ＤＮＡを、ＵＶ ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ（商標）を使用して膜にＵＶ架橋し、そして２０ｍｌのＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ中、４２℃にて１時間プレハイブリダイズした。
【０２６９】
ｔｒｉ５遺伝子の３’フランキング配列のためのＰＣＲプローブを、以下の順方向及び逆方向プライマーを使用して製造した。
順方向プライマー：
５’‐ＧＴＧＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＴＧＧＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣ‐３’（配列番号４３）
逆方向プライマー：
５’‐ＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＴＣＣＧＡＡＣＧＡＴＣＴＴＴＡＣＡＡＧＧ‐３’（配列番号４４）
【０２７０】
プローブを、製造業者の取扱説明書に従ってＰＣＲ Ｄｉｇ Ｐｒｏｂｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用して製造した。プローブを、ＴＡＥバッファー中、１．２％アガロースゲル電気泳動によって精製し、プローブに相当するバンドを、切り出し、そしてＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。プローブを、５分間煮沸し、そして１０ｍｌのＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂに加えてハイブリダイゼーション溶液を作製した。ハイブリダイゼーションを、４２℃にて１５〜１７時間実施した。次に、膜を、２×ＳＳＣ＋０．１％のＳＤＳ中、室温にて５分間、高ストリンジェンシー条件下で洗浄し、続いて０．１×ＳＳＣ＋０．１％のＳＤＳ中、それぞれ６５℃にて１５分間、２回洗浄した。プローブ‐標的ハイブリッドを、製造業者の取扱説明書に従って化学発光法（Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA）によって検出した。
【０２７１】
サザン解析によって測定されるように、ｔｒｉ５遺伝子座内に単一コピーで欠失カセットを保有する形質転換体の１つであるフサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１５７９‐４３‐２３を、ＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地の入った７日齢プレートから無菌のつまようじを使用して４本の１ｃｍ2プラグを切り出し、そしてそれらを２５ｍｌのＲＡ培地の入った１２５ｍｌバッフル付き振盪フラスコに移すことによって胞子形成させた。そのフラスコを、１５０ｒｐｍで振盪しながら２８℃にて４８時間インキュベートした。胞子培養物を、無菌のＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（商標）を通して濾過し、そして５０ｍｌポリプロピレン管内に回収した。血球計を使用して胞子の濃度を測定し、（１ｍｌ中）１０5個の胞子を、５０μＭのＦｄＵを添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地の入った１５０ｍｍのプレートに移し、そして２８℃にて４日間インキュベートした。胞子単離物を、無菌のつまようじを使用して選び出し、１０μＭのＦｄＵを添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地の入った新しいプレートに移し、そして２４〜２８℃にて７日間増殖させた。
【０２７２】
ゲノムＤＮＡを７つの胞子単離物から抽出し、そして先に記載したようにサザン分析を実施してゲノムからのカセットの正しい切り出しを確実にした。サザンブロットによって分析したすべての胞子単離物が、予想されるように１回の反復を残しながらカセットを切り出していた。１つの胞子単離物は、先の段落に記載の通りに菌株において胞子形成を誘導することによって一度胞子精製し、胞子濃度を、血球計を使用して決定し、そして１ｍｌあたり４０個の胞子に希釈した。１ｍｌの希釈した胞子溶液を、ＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地の入った１５０ｍｍプレート内に播種し、そしてそのプレートを２８℃にて４日間インキュベートした。胞子単離物を、ＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地の入った新しいプレートに継代培養し、そして、フサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１６０４‐１７‐０２（Δｔｒｉ５）と命名した１つの胞子単離物を、ｐｙｒＧ遺伝子の欠失のための出発株として使用した。
【０２７３】
実施例２２：チミジンキナーゼ（ｔｋ）ネガティブ選択マーカーとハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）ポジティブ選択マーカーを保有する汎用欠失ベクターの構築
チミジンキナーゼ（ｔｋ）とハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）マーカーの両方を保有する汎用欠失ベクターを、その後の欠失プラスミドの組立てを容易にするために構築した。欠失の標的とした遺伝子の５’及び３’領域のためのフランキング配列は、ＰｍｅＩ又はＡｓｃＩ（５’フランキング配列のため）及びＳｂｆＩ又はＳｗａＩ（３’フランキング配列のため）でのベクターの消化の後に、そのベクターに容易に連結できる。
【０２７４】
フサリウム・ベネナツムｐｙｒＧ遺伝子の５’フランキング領域から得られた直列反復配列をＰＣＲ増幅するために、以下に示したプライマー５０ｐＭを、５０μｌの全量中、５０ｎｇのｐＤＭ１５６．２、１×Ｐｆｘ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）、６μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰｓの混合物、２．５単位のＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）、及び１μｌの５０ｍＭ ＭｇＳＯ4を含む２回のＰＣＲ反応に使用した。
【０２７５】
プライマー：
反復番号１
センス・プライマー：
５’‐ＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＧＣＧＣＣ ＣＧＡＣＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＧ‐３’（配列番号４５）
アンチセンス・プライマー：
５’‐ＴＴＧＴＣＧＣＣＣＧＧＧ ＡＡＴＡＣＴＣＣＡＡＣＴＡＧＧＣＣＴＴＧ‐３’（配列番号４６）
反復番号２
センス・プライマー：
５’‐ＡＧＴＡＴＴＣＣＣＧＧＧ ＣＧＡＣＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＣＡ‐３’（配列番号４７）
アンチセンス・プライマー：
５’‐ＡＴＴＴＡＡＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧ ＡＡＴＡＣＴＣＣＡＡＣＴＡＧＧＣＣＴＴＧ‐３’（配列番号４８）
【０２７６】
増幅反応物を、以下の通りにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使ってインキュベートした。反復番号１に関しては：９８℃にて２分間を１サイクル；そしてそれぞれ９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、及び６８℃にて１分間を５サイクル。この後に、それぞれ９４℃にて３０秒間、５９℃にて３０秒間、及び６８℃にて１分間を３５サイクルが続いた。反復番号２に関しては、サイクリング・パラメーターは、以下の通りであった：９８℃にて２分間を１サイクル；そしてそれぞれ９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、及び６８℃にて１分間を５サイクル。この後に、それぞれ９４℃にて３０秒間、５６℃にて３０秒間、及び６８℃にて１分間を３５サイクルが続いた。３５サイクルの後、両反応物（すなわち、反復番号１及び番号２）を、６８℃にて１０分間インキュベートし、その後さらに処理されるまで１０℃に冷やした。
【０２７７】
両反応からのＰＣＲ産物を、ＴＡＥバッファーを使用した０．８％ＧＴＧ‐アガロース（Cambrex Bioproducts, East Rutherford, NJ, USA）ゲル電気泳動によって分離した。反復番号１及び反復番号２について、約０．２６ｋｂの断片を、ゲルから切りだし、そして製造業者の取扱説明書に従ってＵｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）‐ＤＡスピンカップ（Millipore, Bellerica, MA, USA）を使用して精製した。そして、１０μｌのそれぞれの精製反復を、５０μｌの全量中に１×Ｐｆｘ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎバッファー、６μｌの１０ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰの混合物、２．５単位のＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、及び１μｌの５０ｍＭ ＭｇＳＯ4を含むシングル・オーバーラップＰＣＲ反応に使用した。
【０２７８】
増幅反応を、９８℃にて２分間を１サイクル；そしてそれぞれ９４℃にて３０秒間、５０℃にて３０秒間、及び６８℃にて１分間を５サイクルのためにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使ってインキュベートした。次に、反応物を、事前に暖めておいた５０μｌの最終容量中に、５０ｐＭの反復番号１のためのセンス・プライマー及び５０ｐＭの反復番号２のためのアンチセンス・プライマー、１×Ｐｆｘ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎバッファー、６μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２．５単位のＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、及び１μｌの５０ｍＭ ＭｇＳＯ4を含む溶液と混合した。
【０２７９】
新たな１００μｌの増幅反応物を、それぞれ９４℃にて３０秒間、５８℃にて３０秒間、及び６８℃にて１分間を３５サイクルのためにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使ってインキュベートした。３５サイクルの後に、反応物を６８℃にて１０分間インキュベートし、次にさらに処理されるまで１０℃にて冷やした。（反復組立部品を保有する）０．５ｋｂのＰＣＲ産物を、先に記載したように０．８％ＧＴＧ‐アガロースゲル電気泳動によって単離した。
【０２８０】
プラスミドｐＣＲ４（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を、汎用欠失ベクターの構築のためのベクター骨格の源として使用した。ｐＣＲ４ ＤＮＡの不必要な部分を取り除くために、２．５μｇのプラスミドｐＴｔｅｒ６１Ｃ（ＷＯ２００５／０７４６４７）を、Ｂｓｐ ＬＵ１１Ｉ及びＢｓｔＸＩで連続して消化した。次に、消化したベクターを、Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼ（New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA）で処理した。３．１ｋｂの消化した骨格を、先に記載したように０．８％ＧＴＧ‐アガロースゲル電気泳動によって単離した。次に、精製した反復組立部品を、Ｒａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA）を用いて精製したベクター骨格に連結した。連結反応は、７５ｎｇの精製したベクター骨格と３μｌの精製した反復組立部品から成った。１μｌのこの連結反応物を、製造業者の提案したプロトコールを使用して化学的コンピテントＳＯＬＯＰＡＣＫ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞（Stratagene, La Jolla, CA, USA）の形質転換に使用した。２４個の形質転換体を、ＮｃｏＩ／ＰｍｅＩ制限消化によって分析した。２４個の形質転換体のうちの２３個が、予想した制限消化パターンを有していた。クローンｐＦｖＲｓ番号１０を、配列決定のために無作為に選択して、ＰＣＲで誘発されたエラーがないことが確認した。配列決定解析では、クローンｐＦｖＲｓ番号１０内の反復組立部品が予想した配列を持っていることが示され、そのため、これをフサリウム・ベネナツム汎用ベクターの骨格として選択し、そしてｐＡｌＬｏ１４９２‐２４（図１５）と命名した。
【０２８１】
ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）遺伝子を保有しているカセットを、以下に示した遺伝子特異的な順方向及び逆方向プライマーを使用してｐＥｍＹ２３からＰＣＲ増幅した。下線を引いた配列はＸｍａＩ部位を表し、そして太字はＢｇｌＩＩ部位を表す。それぞれの５’末端の４つの「ａ」が、ＰＣＲ産物の末端のその後の消化を可能にする。
【０２８２】
【化１０】
2012504390.tif 000011
【０２８３】
増幅反応物は、５０μｌの最終容量中、６０ｎｇのｐＥｍＹ２３、２００μｍのｄＮＴＰｓ、１ｍＭの酢酸マグネシウム、０．４μＭのプライマー、１×Ｐｆｘ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎバッファー、０．５ＭのＧＣ Ｍｅｌｔ、及び２．５単位のＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｐｆｘポリメラーゼを含んでいた。反応物を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９４℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、及び６８℃にて１分５０秒を１０サイクル；そして６８℃にて７分間を１サイクルとそれに続いて４℃にて保持するためにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使ってインキュベートした。
【０２８４】
ＰＣＲ産物を、ＴＡＥバッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動によって分離した。約１．８ｋｂの断片を、ゲルから切り出し、そして、ＭＩＮＩＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。その後、ゲルから精製したＰＣＲ産物を、ＸｍａＩで消化し、１％アガロースゲル上で泳動し、そして前述の通りに再びゲルから精製した。ＱＵＩＣＫ ＬＩＧＡＴＩＯＮ（商標）Ｋｉｔを使用して、ｈｐｔ ＰＣＲ産物を（仔ウシ腸ホスファターゼで処理しておいた）ＸｍａＩ線状化ｐＡｌＬｏ１４９２‐２４に連結した。得られたプラスミドを、ｐＪｆｙＳ１５７９‐３５‐２（図１６）と命名し、そしてチミジンキナーゼ遺伝子の挿入のための受容プラスミドとして使用した。
【０２８５】
単純ヘルペスウイルスｔｋカセットの源はプラスミドｐＪｆｙＳ１５７９‐０８‐０６（実施例１９）であったので、挿入物をＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩでの消化によってそこから遊離させた。消化産物を、ＴＡＥバッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして２．８ｋｂのｔｋ遺伝子挿入物に相当する断片を、切り出し、そしてＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。ＱＵＩＣＫ ＬＩＧＡＴＩＯＮ（商標）Ｋｉｔを使用して、ｔｋ遺伝子カセットを、（仔ウシ腸ホスファターゼで処理しておいた）ＢｇｌＩＩ線状化ｐＪｆｙＳ１５７９‐３５‐０２に連結した。得られたプラスミドを、ｐＪｆｙＳ１５７９‐４１‐１１（図１７）と命名し、そしてこれをｐｙｒＧ、ａｍｙＡ、ａｌｐＡ、及びｄｐｓ１欠失ベクターの構築の出発点として使用した。
【０２８６】
実施例２３：ｐｙｒＧ欠失ベクターｐＪｆｙＳ１６０４‐５５‐１３の製造
フサリウム・ベネナツムＡ３／５のｐｙｒＧ遺伝子（ＤＮＡ配列については配列番号５１及び推定アミノ酸配列については配列番号５２）の３’フランキング配列を、ＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ システム（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA）、並びに以下に示した遺伝子特異的な順方向及び逆方向プライマーを使用して増幅した。下線部分は、クローニング用の導入したＳｂｆＩ部位であり、イタリック体で印字されている部分は、形質転換前にプラスミドのｐＣＲ（登録商標）２．１部分を取り除くためのその後の消化用の導入したＮｏｔＩ部位である。
【０２８７】
【化１１】
2012504390.tif 000012
【０２８８】
増幅反応には、５０μｌの最終容量中、１２５ｎｇのフサリウム・ベネナツムＡ３／５ゲノムＤＮＡ、２００μＭのｄＮＴＰ、０．４μＭのプライマー、５ｍＭのＭｇＣｌ2を含む１×ＥＸＰＡＮＤ（登録商標）バッファー（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA）、及び２．５単位のＥＸＰＡＮＤ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA）が含まれた。増幅反応物を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９４℃にて３０秒間、５４℃にて３０秒間、及び７２℃にて１分間を１０サイクル；そしてそれぞれ９４℃にて３０秒間、５４℃にて３０秒間、及び７２℃にて１分１０秒間を２０サイクルのためにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使ってインキュベートした。
【０２８９】
ＰＣＲ産物を、ＴＡＥバッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動によって分離し、０．７ｋｂ断片を、切り出し、そしてＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。
【０２９０】
０．７ｋｂのＰＣＲ産物を、ＳｂｆＩで消化し、ＴＡＥバッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約０．７ｋｂの断片を、ゲルから切り出し、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）ＤＡスピンカップを使用してさらに精製した。０．７ｋｂの断片を、ＱＵＩＣＫ ＬＩＧＡＴＩＯＮ（商標）Ｋｉｔを使用して（ＳｂｆＩで消化し、そして仔ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化しておいた）ｐＪｆｙＳ１５７９‐４１‐１１に連結し、そして連結反応混合物を、製造業者のプロトコールに従って、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ（登録商標）化学的コンピテント細胞の形質転換に使用した。得られたプラスミドをｐＪｆｙＳ１６０４‐３５‐１３と命名した。
【０２９１】
５’ｐｙｒＧフランキング配列を、ＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲシステム、並びに以下に示した遺伝子特異的な順方向及び逆方向プライマーを使用してｐＥｍＹ２３（実施例１３）から増幅した。下線部分はクローニング用の導入したＰｍｅＩ部位であり、イタリック体で印字された部分は、真菌形質転換前にβ‐ラクタマーゼ遺伝子を取り除くためのその後の消化用の導入したＮｏｔＩ部位である。
【０２９２】
【化１２】
2012504390.tif 000013
【０２９３】
増幅反応には、２０ｎｇのｐＥｍＹ２３、２００μＭのｄＮＴＰ、０．４μＭのプライマー、１５ｍＭのＭｇＣｌ2を含む１×ＥＸＰＡＮＤ（登録商標）バッファー、及び２．５単位のＥＸＰＡＮＤ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼが含まれた。
【０２９４】
増幅反応物を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９４℃にて３０秒間、５３℃にて３０秒間、及び７２℃にて４０秒間を１０サイクル；そしてそれぞれ９４℃にて３０秒間、５３℃にて３０秒間、及び７２℃にて４０秒間（次のサイクル毎に１０秒間を追加する）を２０サイクルのためにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使ってインキュベートした。
【０２９５】
ＰＣＲ産物を、ＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）を使用して精製した。精製したＰＣＲ産物を、ＰｍｅＩで消化し、そしてＴＡＥバッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動によって分離した。約０．５ｋｂの断片を、ゲルから切り出し、そしてＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。０．５ｋｂの断片を、ＰｍｅＩ消化し、且つ、仔ウシ腸ホスファターゼで処理したｐＪｆｙＳ１６０４‐３５‐１３にＱＵＩＣＫ ＬＩＧＡＴＩＯＮ（商標）Ｋｉｔを使用して連結した。連結反応には、２０μｌの反応容量中、５０ｎｇのベクター、２０ｎｇの挿入物、１×ＱＵＩＣＫ ＬＩＧＡＴＩＯＮ（商標）反応バッファー（New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA）、及び１０単位のＱｕｉｃｋ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼが含まれた。反応物を、室温にて５分間インキュベートし、そして、２μｌの連結反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってＥ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ（登録商標）化学的コンピテント細胞の形質転換に使用した。配列分析を使用して、所望の方向で挿入物を含んでいる形質転換体を同定し、ＰＣＲエラーの不存在を確認した。得られたプラスミドをｐＪｆｙＳ１６０４‐５５‐１３（図１８）と命名し、そしてｐｙｒＧ遺伝子欠失カセットとして使用した。
【０２９６】
実施例２４：Δｔｒｉ５ ΔｐｙｒＧフサリウム・ベネナツム株ＪｆｙＳ１６４３‐１８‐２の製造
実施例２０に記載の手法に従ってのＮｏｔＩ消化し、且つ、ゲルから精製したｐＪｆｙＳ１６０４‐５５‐１３で形質転換したフサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１６０４‐１７‐２（Δｔｒｉ５）の５１個の推定形質転換体を、無菌のつまようじを使って形質転換プレートから１ｍｌあたり１２５μｇのハイグロマイシンＢと１０ｍＭのウリジンを添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地の入った新しいプレートに移し、そして２４〜２８℃にて７日間培養した。次に、形質転換体を、ウリジン（１０ｍＭ）を含むものと含まないものの２枚のＶＮＯ3ＲＬＭＴプレートのそれぞれにプラグを移すことによって表現型的に分析した。ウリジンを含まないプレート上で増殖しないか又はわずかな増殖しか示さない９つの形質転換体を、サザン解析によって分析した。９つの形質転換体のそれぞれからのゲノムＤＮＡを、実施例２１に記載の通りに抽出し、そしてそれぞれの２μｇを２８単位のＭｆｅＩ及び１４単位のＤｒａＩで消化した。ｐｙｒＧ遺伝子の３’フランキング配列に対するＰＣＲプローブを、以下の順方向及び逆方向プライマーを使用して実施例２１に記載の方法に従って製造した：
【０２９７】
順方向プライマー：
５’‐ＧＧＡＴＣＡＴＣＡＴＧＡＣＡＧＣＧＴＣＣＧＣＡＡＣ‐３’（配列番号５７）
逆方向プライマー：
５’‐ＧＧＣＡＴＡＧＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧＣＧＣＴＣＴＣＴ‐３’（配列番号５８）
【０２９８】
サザン解析では、９つのウリジン栄養要求性変異株のうち２つが単一コピーで欠失カセットを保有した一方、残りがカセットの異所性組込みを持続していたことを示した。１つの形質転換体、フサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１６０４‐８５‐５に、１０ｍＭのウリジンを含むＲＡ培地中で実施例５に記載の通りに胞子形成させ、そして１０5個の胞子を、５０μＭのＦｄＵと０．１ｍＭのウリジンを添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地の入った１５０ｍｍプレート上に播種した。獲得した胞子単離物を、１０μＭのＦｄＵ及び０．１ｍＭのウリジンを添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地の入った新しいプレートに継代培養し、そしてその後、サザン解析によって分析して、ゲノムからの正しい切り出しを確実にした。
【０２９９】
分析した株では、すべて正確にカセットが切り出されたので、１つの株、フサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１６４３ １０‐３に，前段落に記載の通りに胞子形成させた。胞子濃度を、血球計を使用して測定し、そして原液を４０個の胞子／ｍｌの濃度に希釈した。１ｍｌを、１０ｍＭのウリジンを添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地の入った１５０ｍｍプレート上に播種した。得られた胞子コロニーを、１０ｍＭのウリジンを添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地の入った新しいプレートに継代培養し、そして１つの胞子単離物、フサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１６４３‐１８‐２（Δｔｒｉ５ ΔｐｙｒＧ）を、フサリウム・ベネナツムα‐アミラーゼＡ遺伝子（ａｍｙＡ）の欠失のための株として使用した。
【０３００】
実施例２５：ａｍｙＡ欠失ベクターｐＪｆｙＳ１６０４‐１７‐２の製造
フサリウム・ベネナツムａｍｙＡ遺伝子（ＤＮＡ配列については配列番号５９及び推定アミノ酸配列については配列番号６０）の完全欠失のための上流及び下流のフランキング配列情報を得るために、ＧＥＮＯＭＥ ＷＡＬＫＥＲ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｋｉｔ（Clonetech, Palo Alto, CA, USA）を使用した。キットを用いて製造したそれぞれのフサリウム・ベネナツムＡ３／５ゲノムＤＮＡライブラリーを、以下に示した５’遺伝子特異的プライマーと５’ネステッド・プライマーを使用した５’フランキング配列のための２ラウンドのＰＣＲにかけた。以下に示した３’遺伝子特異的プライマーと３’ネステッド・プライマーを使用して、３’フランキング配列を得た。
【０３０１】
５’遺伝子特異的プライマー：
５’‐ＧＡＧＧＡＡＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧＡＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＡ‐３’（配列番号６１）
５’ネステッド・プライマー：
５’‐ＧＧＡＧＴＣＴＴＴＧＴＴＣＣＡＡＴＧＴＧＣＴＣＧＴＴＧＡ‐３’（配列番号６２）
３’遺伝子特異的プライマー：
５’‐ＣＴＡＣＡＣＴＡＡＣＧＧＴＧＡＡＣＣＣＧＡＧＧＴＴＣＴ‐３’（配列番号６３）
３’ネステッド・プライマー：
５’‐ＧＣＧＧＣＡＡＡＣＴＡＡＴＧＧＧＴＧＧＴＣＧＡＧＴＴＴ‐３’（配列番号６４）
【０３０２】
一次ＰＣＲ反応には、５０μｌの反応容量中に、１×ＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（登録商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファー、２μｌのそれぞれの染色体ＤＮＡライブラリー（キットに記載の通りに製造された）、２００ｎＭのキットで供給されたＡＰ１（アダプター・プライマー１）、２００ｎＭの遺伝子特異的プライマー（前記）、２００μＭのｄＮＴＰｓ、及び２．５単位のＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼが含まれた。
【０３０３】
一次増幅を、それぞれ９４℃にて２５秒間及び７２℃にて３分間を７サイクル、それぞれ９４℃２５秒間及び６７℃にて３分間を３２サイクル、そして６７℃にて７分間を１サイクルのためにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使って実施した。
【０３０４】
二次ＰＣＲ反応には、５０μｌの反応容量中、１×ＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（登録商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファー、１μｌのそれぞれの一次ＰＣＲ反応物（前記）、２００ｎＭのキットで供給されたＡＰ２（アダプター・プライマー２）、２００ｎＭの遺伝子特異的なネステッド・プライマー（前記）、２００μＭのｄＮＴＰｓ、及び２．５単位のＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼが含まれた。
【０３０５】
二次増幅は、それぞれ９４℃にて２５秒間及び７２℃にて３分間を５サイクル、それぞれ９４℃にて２５秒間及び６７℃にて３分間を２０サイクル、そして６７℃にて７分間を１サイクルのためにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使って実施した。
【０３０６】
ＰＣＲ産物を、ＴＡＥバッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動によって分離した。約０．７ｋｂの断片を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってＭＩＮＩＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製した。ＰＣＲ産物を、先に記載した対応するネステッド・プライマーとキットで供給されたプライマー２を使用して直接配列決定した。得られた配列を、空の欠失ベクターｐＪｆｙＳ１５７９‐４１‐１１への挿入のためのａｍｙＡ遺伝子の５’フランキング配列の１ｋｂの領域と３’フランキング配列の０．７ｋｂの領域を増幅するためのプライマーを設計するのに使用した。
【０３０７】
ａｍｙＡ３’フランキング配列を、以下に示した順方向及び逆方向プライマーを使用してフサリウム・ベネナツムＡ３／５ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
【０３０８】
【化１３】
2012504390.tif 000014
【０３０９】
下線を引いた文字は、その後のβ‐ラクタマーゼ欠失のためのＮｏｔＩ部位を表し、イタリック体で印字された文字は、ベクタークローニングのためのＳｂｆＩ部位を表す。
【０３１０】
増幅反応には、１×ＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（登録商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファー、１２０ｎｇのゲノムＤＮＡ鋳型、４００ｎＭのプライマー、２００μＭのｄＮＴＰｓ、及び２．５単位のＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼが含まれた。
【０３１１】
増幅反応を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、及び７２℃にて１分間を１０サイクル；そしてそれぞれ９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、及び７２℃にて１分１０秒間を２０サイクルのためにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使ってインキュベートした。
【０３１２】
ＰＣＲ産物を、ＴＡＥバッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動によって分離した。約０．７ｋｂの断片を、ゲルから切り出し、そしてＭＩＮＩＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。ＰＣＲ断片を、Ｓｂｆで消化して、粘着末端を作り出した。この断片を、ＳｂｆＩで線状化し、そして仔ウシ腸ホスファターゼで処理した汎用欠失ベクターｐＪｆｙＳ１５７９‐４１‐１１内に挿入した。連結反応には、２０μｌの反応容量中、８０ｎｇのベクター、８０ｎｇの挿入物、１×ＱＵＩＣＫ ＬＩＧＡＴＩＯＮ（商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファー、及び１０単位のＱｕｉｃｋ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼが含まれた。１．５μｌの体積の連結反応を、製造業者の取扱説明書に従って１００μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ（登録商標）化学的コンピテント細胞の形質転換に使用した。クローンを、ＥｃｏＲＩを用いた制限解析（restriction analysis）と配列分析を使用して挿入方向に関してスクリーニングし、そしてＰＣＲエラーがないクローンを同定した。このプラスミドを、ｐＪｆｙＳ１５７９ ９３‐１（図１９）と命名し、そして５’ａｍｙＡフランキング配列の挿入のための受容プラスミドとして使用した。
５’ａｍｙＡフランキング配列を、以下に示した順方向及び逆方向プライマーを使用してＰＣＲ増幅した。
【０３１３】
下線を引いた塩基は、ｂｌａ遺伝子欠失のためのＮｏｔＩ部位を表し、そしてその他の小文字は、平滑末端ベクター部位内にクローニングするために断片が平滑末端であることを確実にするためのＰｍｅＩ部位を表す。
【０３１４】
【化１４】
2012504390.tif 000015
【０３１５】
ＰＣＲ増幅は、異なるサイクル・パラメーターを除いて、先に記載したものと同様であった。増幅反応を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、及び７２℃にて１分１５秒を１０サイクル；そしてそれぞれ９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、及び７２℃にて１分１５秒（次のサイクル毎に１０秒追加する）を２０サイクルのためにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使ってインキュベートした。
【０３１６】
ＰＣＲ産物を、ＴＡＥバッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動によって分離した。約１ｋｂの断片を、ゲルから切り出し、そして、ＭＩＮＩＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。１ｋｂの断片を、ＰｍｅＩで消化して、平滑末端を作り出し、そして挿入物を、ＰｍｅＩで消化した、仔ウシ腸ホスファターゼで脱リン酸化したｐＪｆｙＳ１５７９‐９３‐１内にクローニングした。
【０３１７】
連結反応には、２０μｌの反応容量中、７５ｎｇのベクター、１００ｎｇの挿入物、１×ＱＵＩＣＫ ＬＩＧＡＴＩＯＮ（商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファー、及び１０単位のＱｕｉｃｋ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼが含まれた。５分間のインキュベーションの後に、２μｌの連結反応物を、製造業者の取扱説明書に従って１００μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ（登録商標）化学的コンピテント細胞を形質転換するのに使用した。配列分析を使用して、挿入物が正しい方向で存在すること、及びＰＣＲエラーの不存在を確認した。同定された得られたベクターを、ｐＪｆｙＳ１６０４‐１７‐２（図２０）と命名した。
【０３１８】
実施例２６：Δｔｒｉ５ ΔｐｙｒＧ ΔａｍｙＡフサリウム・ベネナツム株ＪｆｙＳ１６４３‐９５‐０４の製造
実施例２０に記載の手法に従ってＮｏｔＩで消化し、ゲルから精製したｐＪｆｙＳ１６０４‐１７‐０２で形質転換したフサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１６４３‐１８‐０２（Δｔｒｉ５ ΔｐｙｒＧ）の５つの推定形質転換体を、無菌のつまようじを用いて、形質転換プレートから１ｍｌあたり１２５μｇのハイグロマイシンＢ及び１０ｍＭのウリジンを添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地の入った新しいプレートに移し、そして２４〜２８℃にて７日間インキュベートした。サザン解析のために、２μｇのゲノムＤＮＡを、２５単位のＳｓｐＩで消化した。ａｍｙＡ遺伝子の５’フランキング配列に対するＤＩＧプローブを、実施例２１に記載の方法に従い、以下に示した順方向及び逆方向プライマーを使用して製造した。
【０３１９】
順方向プライマー：
５’‐ＧＧＡＴＣＡＴＣＡＴＧＡＣＡＧＣＧＴＣＣＧＣＡＡＣ‐３’（配列番号６９）
逆方向プライマー：
５’‐ＧＧＣＡＴＡＧＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧＣＧＣＴＣＴＣＴ‐３’（配列番号７０）
【０３２０】
サザン解析を、実施例２１に記載の通りに実施し、そしてその結果は、５つの形質転換体のうち２つが、欠失カセットの単一組込みを伴う置き換えられたコード配列を持っていたことを示した。フサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１６４３‐７３‐０２と命名した一次形質転換体に、実施例５に記載の通りに胞子形成させ、そして１０5個の胞子を、５０μＭのＦｄＵと０．１ｍＭのウリジンを添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地の入った直径１５０ｍｍのプレートに播種した。獲得した胞子単離物を、１０μＭのＦｄＵと０．１ｍＭのウリジンを添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地の入った新しいプレートに継代培養されていた。
【０３２１】
２つのフサリウム・ベネナツム胞子単離物（ＪｆｙＳ１６４３‐８３‐０２及びＪｆｙＳ１６４３‐８３‐０４）を、一回、胞子精製し、そして菌株（ＪｆｙＳ１６４３‐８３‐０２からの）ＪｆｙＳ１６４３ ９５‐１及びＪｆｙＳ１６４３‐９５‐２、並びに（ＪｆｙＳ１６４３‐８３‐０４からの）Ｊｆｙｓ１６４３‐９５‐０４を得た。ＦｄＵプレートから選択された最初の胞子単離物、並びにそれらのそれぞれの一回胞子精製した単離物を、サザン解析によって分析して、ゲノムからの正しい切り出しを確実にした。分析した株のすべてで、正確にカセットを切り出せた。フサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１６４３‐９５‐０４（Δｔｒｉ５ ΔｐｙｒＧ ΔａｍｙＡ）を、フサリウム・ベネナツムのアルカリプロテアーゼＡ遺伝子（ａｌｐＡ）の欠失のための株として使用した。
【０３２２】
実施例２７：プラスミドｐＥＪＧ６９の構築
ミクロドチウム・ニバレ（Microdochium nivale）ラクトースオキシダーゼ（ＬＯｘ）遺伝子（ＤＮＡ配列については配列番号７１及び推定アミノ酸配列については配列番号７２）を、以下に示した順方向と逆方向プライマーを使用してｐＥＪＧ３３（Xu et al., 2001, European Journal of Biochemistry 268: 1136-1142）からＰＣＲ増幅した。
【０３２３】
【化１５】
2012504390.tif 000016
【０３２４】
下線部分は、クローニングのために導入されたＳｐｈＩ（順方向）又はＰａｃＩ（逆方向）部位を表す。
【０３２５】
ＰＣＲには、５０μｌの最終容量中、２００μＭのｄＮＴＰｓ、１μＭの各プライマー、５０ｎｇのｐＥＪＧ３３、１×Ｐｗｏバッファー（Promega Madison, WI, USA）、及び１μｌのＰｗｏ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔポリメラーゼ（Promega, Madison, WI, USA）が含まれた。
【０３２６】
増幅反応を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９５℃にて３０秒間、５５℃にて４５秒間、及び７２℃にて１分間を１０サイクル；それぞれ９５℃にて３０秒間、５５℃にて４５秒間、及び７２℃にて１分間（それぞれ次のサイクル毎に２０秒の延長時間を加える）を２０サイクル；そして５０℃にて１０分間を１サイクルのためにプログラムしたＲＯＢＯＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使ってインキュベートした。
【０３２７】
ＰＣＲ産物を、ＴＡＥバッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動によって分離した。約１．５ｋｂの断片を、ゲルから切り出し、そして、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。
【０３２８】
ラクトース・オキシダーゼ遺伝子を、ポリメラーゼとバッファーをそれぞれＴａｑＤＮＡポリメラーゼとＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ・バッファーで置き換え、及び前記のゲルから精製したＰＣＲ産物を鋳型として使用したことを除いて、同じ条件を使用して再増幅し、そして先に記載したように精製した。ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用してｐＣＲ（登録商標）２．１内にクローニングし、そして配列決定して、ＰＣＲエラーの不存在を確認した。得られたエラーのないプラスミドを、ＳｐｈＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA）で処理し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA）を使用して精製し、そしてＰａｃＩで消化した。断片を、ＴＡＥバッファー中、１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約１．５ｋｂの断片を、ゲルから切り出し、そしてＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。
【０３２９】
プラスミドｐＥＪＧ６１を、Ｂｓｐ ＬＵ１１Ｉで消化し、製造業者の指示に従ってクレノウＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA）で処理し、次にＰａｃＩで消化した。消化したプラスミドを、ＴＡＥバッファー中、１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして８ｋｂの断片を切り出し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。
【０３３０】
ＬＯｘコード配列を、製造業者の指示に従ってＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用してＢｓｐ ＬＵ１１Ｉ及びＰａｃＩで消化したｐＥＪＧ６１に連結した。プラスミドを、配列分析によってスクリーニングしてＰＣＲエラーの不存在を確実にし、そして、得られたプラスミドを同定し、そしてｐＥＪＧ６９（図２１）と命名した。
【０３３１】
実施例２８：プラスミドｐＥＪＧ６５の構築
プラスミドｐＥＪＧ６１（実施例４）を、Ｂｓｐ ＬＵ１１Ｉで消化し、クレノウＤＮＡポリメラーゼで処理し、そしてＰａｃＩで消化した。消化したプラスミドを、ＴＡＥバッファー中、１％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして８．１ｋｂの断片を、切り出し、そしてＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。
【０３３２】
カンジダ・アンタルクチカ・リパーゼＡコード配列（ＤＮＡ配列については配列番号７５及び推定アミノ酸配列については配列番号７６）を、以下に示した順方向と逆方向プライマーを使用してｐＭＴ１２２９（ＷＯ９４／０１５４１）からＰＣＲ増幅した。
【０３３３】
順方向プライマー：
５’‐ＧＣＡＴＧＣＧＡＧＴＧＴＣＣＴＴＧＣＧＣ‐３’（配列番号７７）
逆方向プライマー：
５’‐ＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＡＡＧＧＴＧＧＴＧＴＧＡＴＧ‐３’（配列番号７８）
【０３３４】
ＰＣＲ反応には、２００μＭのｄＮＴＰｓ、１μＭの各プライマー、２０ｎｇのｐＭＴ１２２９、１×Ｐｗｏバッファー（Promega, Madison, WI, USA）、及び１μｌのＰｗｏ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔポリメラーゼ（Promega, Madison, WI, USA）が含まれた。
【０３３５】
増幅反応を、９４℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９４℃にて３０秒間、５５℃にて４５秒間、及び７２℃にて１分間を１０サイクル；それぞれ９４℃にて３０秒間、５５℃にて４５秒間、及び７２℃にて１分間（それぞれ次のサイクル毎に２０秒の延長時間を加える）を１７サイクル；そして７２℃にて１０分間を１サイクルのためにプログラムしたＲＯＢＯＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使ってインキュベートした。
【０３３６】
ＰＣＲ産物を、ＴＡＥバッファー中、１％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして１．４ｋｂの断片を切り出し、そしてＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。ＰＣＲ断片を、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用してｐＣＲ（登録商標）２．１内にクローニングし、そして配列決定して、ＰＣＲエラーの不存在を確認した。
【０３３７】
遺伝子のコード配列内のＳｐｈＩ部位の存在により、カンジダ・アンタルクチカ・リパーゼＡコード配列は、別々の消化によって２つの別個の断片としてｐＣＲ（登録商標）２．１から遊離させた。第１断片（１ｋｂ）を遊離するために、プラスミドを、ＳｐｈＩで消化し、そしてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理した。ポリメラーゼを、７５℃にて１０分間、熱不活性化し、そしてプラスミドをＮｈｅＩで消化した。第２断片（０．４ｋｂ）を、ＮｈｅＩ／ＰａｃＩ消化を用いてプラスミドから遊離させた。両消化物を、ＴＡＥバッファー中、１％アガロースゲル電気泳動にかけ、そしてＳｐｈＩ／ＮｈｅＩ消化からの１ｋｂの断片とＮｈｅＩ／ＰａｃＩ消化からの０．４ｋｂの断片を、切り出し、そしてＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。２つの断片を、消化したｐＥＪＧ６１にＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用して連結した。連結反応には、１×Ｌｉｇａｔｉｏｎ バッファー（New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA）、１００ｎｇの前記１ｋｂ断片、５０ｎｇの０．４ｋｂ断片、５０ｎｇの消化したｐＥＪＧ６１、及び１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼが含まれた。反応物を、室温にて１６時間インキュベートし、そして製造業者の取扱説明書に従って、Ｅ．コリＸＬ１０‐ＧＯＬＤ（登録商標）Ｕｌｔｒａ‐ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞の形質転換に使用した。形質転換体を、配列分析によってスクリーニングし、所望のエラーを含まないコード配列を持つプラスミドを含む１つのクローンを同定し、そしてｐＥＪＧ６５（図２２）と命名した。
【０３３８】
実施例２９：プラスミドｐＭＳｔｒ１９の構築
フサリウム・オキシスポラム・ホスホリパーゼ遺伝子をｐＡ２Ｐｈ１０（ＷＯ１９９８／２６０５７）からフサリウム・ベネナツム発現ベクターｐＤＭ１８１（ＷＯ２０００／５６９００）内にクローニングすることによって、プラスミドｐＭＳｔｒ１９を構築した。ＰＣＲ増幅を使用して、簡便なＤＮＡ断片上のホスホリパーゼ遺伝子を単離した。
【０３３９】
フサリウム・オキシスポラム・ホスホリパーゼ遺伝子を、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Roche Molecular Biochemicals, Basel, Switzerland）を用いた標準的な増幅条件と、以下に示したプライマーを用いた４５℃のアニーリング温度を使用して、ｐＡ２Ｐｈ１０から特異的に増幅した。
【０３４０】
【化１６】
2012504390.tif 000017
【０３４１】
得られたＤＮＡ断片をゲルから精製し、そしてＳｗａＩで消化した。プラスミドｐＤＭ１８１もまた、ＳｗａＩで消化し、そして脱リン酸化した。次に、ＤＮＡ断片を一つに連結して、プラスミドｐＭＳｔｒ１８を作製した。
【０３４２】
連結混合物を使用して製造された、ｐＭＳｔｒ１８の２つの別個のＥ．コリ形質転換体のホスホリパーゼ遺伝子、４番及び１７番を、標準的なプライマーウォーキング法を使用して配列決定した。両遺伝子は、その遺伝子内の異なる位置に単一点変異を獲得していた。その突然変異は、ＮａｒＩ部位によって分離され、それがｐＭＳｔｒ１８を二回開裂する。そのため、ＮａｒＩでｐＭＳｔｒ１８の４番とｐＭＳｔｒ１８の１７番の両方を消化し、エラーを含まない断片を単離し、そしてそれらを一つに連結してｐＭＳｔｒ１９（図２３）を作製することによって、エラーを含まないホスホリパーゼ遺伝子をフサリウム発現ベクターｐＤＭ１８１内で組み立てた。ｐＭＳｔｒ１９内のホスホリパーゼ配列を、標準的な方法を使用して確認した。
【０３４３】
実施例３０：プラスミドｐＥＪＧ４９の構築
ｐＳｈｅＢ１（ＷＯ２０００／５６９００）の修飾によって、フサリウム・ベネナツム発現ベクターｐＥＪＧ４９を製造した。修飾には：（ａ）部位特異的突然変異誘発によるｐＳｈｅＢ１配列内の１つのＢｓｐ ＬＵ１１Ｉ部位の欠失；（ｂ）８５０ｂｐのフサリウム・オキシスポラムのトリプシン・プロモーターの欠失；（ｃ）２ｋｂのフサリウム・ベネナツムのグルコアミラーゼ・プロモーターの挿入を助けるリンカーの連結によるＢｓｐ ＬＵ１１Ｉ部位の導入；及び（ｄ）フサリウム・オキシスポラムのホスホリパーゼ遺伝子の導入、が含まれた。
【０３４４】
ｐＳｈｅＢ１配列内のＢｓｐ ＬＵ１１Ｉ部位の欠失は、以下の突然変異誘発プライマー対を用いて、製造業者の取扱説明書に従って、ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（商標）Ｓｉｔｅ‐Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用して実行した：
【０３４５】
５’‐ＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＡＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣ‐３’（配列番号８１）
５’‐ＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＴＴＧＴＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣ‐３’（配列番号８２）
【０３４６】
これは、ｐＳｈｅＢ１中間体１を作成した。
【０３４７】
９３０ｂｐのフサリウム・オキシスポラムのトリプシン・プロモーターの欠失は、ＳｔｕＩ及びＰａｃＩでｐＳｈｅＢ１中間体１（６９７１ｂｐ）を消化し、その消化産物をＴＢＥバッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動にかけ、６０４０ｂｐのベクター断片を切り出し、そしてＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで切り出した断片を精製することによって達成された。新しいＢｓｐ ＬＵ１１Ｉ部位を導入するために、以下のプライマーを使用してリンカーを作出した：
【０３４８】
【化１７】
2012504390.tif 000018
【０３４９】
各プライマー（それぞれ２μｇ）を、７０℃にて１０分間加熱し、次に１時間かけて室温まで冷ました。このリンカーを、ＳｔｕＩ‐ＰａｃＩで消化したｐＳｈｅＢ１中間体１ベクター断片に連結し、そしてｐＳｈｅＢＩ中間体２を作成した。次に、ベクターｐＳｈｅＢＩ中間体２を、Ｂｓｐ Ｌｕ１１Ｉ及びＰａｃＩで消化した。消化したベクターを、ＴＢＥバッファー中、１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、ゲルから切り出し、そしてＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。
【０３５０】
フサリウム・オキシスポラムのホスホリパーゼ遺伝子断片をさらに、鋳型としてｐＭＳＴＲ１９を使用してＰＣＲによって製造した。以下のＰＣＲプライマーを使用して、遺伝子の５’末端にＳｐｈＩ部位を、及び３’末端にＰａｃＩ部位を導入した：
【０３５１】
【化１８】
2012504390.tif 000019
【０３５２】
ＰＣＲ及び精製のための条件を、前述の通りに実施した。ホスホリパーゼ遺伝子断片を、製造業者の取扱説明書に従ってｐＣＲ（登録商標）‐ＴＯＰＯ（登録商標）内にクローニングした。次に、ｐＣＲ（登録商標）‐ＴＯＰＯ（登録商標）ホスホリパーゼ・クローンを、ＳｐｈＩで消化し、そしてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して、突出している３’末端を欠失させた。断片を、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔを使用して精製し、そしてＰａｃＩで消化した。消化物を、ＴＢＥバッファー中、１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして１ｋｂのバンドをゲルから切り出し、そしてＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製した。
【０３５３】
プラスミドｐＳｈｅｂ１中間体２（前記）を、ＳｔｕＩ及びＢｓｐ Ｌｕ１１Ｉで消化し、そしてＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔを使用して精製した。次に、断片を、２ｋｂのＳｔｕＩ‐Ｂｓｐ Ｌｕ１１Ｉフサリウム・ベネナツム・グルコアミラーゼ・プロモーター断片（ＷＯ２０００／０５６９００）に連結した。ｐＳｈｅｂ１中間体３として知られるこのベクターを、Ｂｓｐ Ｌｕ１１Ｉで消化し、クレノウ・フラグメントによって処理して５’オーバーハングの隙間を埋め、ＰａｃＩで消化し、そしてＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔを使用して精製した。次に、断片を、ＳｐｈＩ、平滑末端ＰａｃＩフサリウム・オキシスポラム・ホスホリパーゼ断片（前記）に連結した。ｐＥＪＧ４９（図２４）と命名した、得られたベクターは、フサリウム・ベネナツム・グルコアミラーゼ・プロモーターの転写調節下、ホスホリパーゼ・レポーター遺伝子を保有していた。
【０３５４】
実施例３１：プラスミドｐＥｍＹ１５の構築
部位特異的突然変異誘発を、発現プラスミドｐＥＪＧ４９からＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限部位のそれぞれのうちの１つを欠失させ、そしてビアラホス耐性マーカー（ｂａｒ遺伝子）に隣接するこれらの制限部位を１つだけにするために使用した。突然変異誘発を、以下に示した順方向及び逆方向プライマー、並びにＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）Ｓｉｔｅ‐Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用して完了した。
【０３５５】
順方向プライマー：
５’‐ｃｃｔｇｃａｔｇｇｃｃｇｃＣｇｃｃｇｃＣａａｔｔｃｔｔａｃａａａｃｃｔｔｃａａｃａｇｔｇｇ‐３’（配列番号８７）
逆方向プライマー：
５’‐ｃｃａｃｔｇｔｔｇａａｇｇｔｔｔｇｔａａｇａａｔｔＧｇｃｇｇｃＧｇｃｇｇｃｃａｔｇｃａｇｇ‐３’（配列番号８８）
大文字は所望の変化を示し、そして得られたプラスミドを、ｐＥｍＹ１５（図２５）と命名した。
【０３５６】
実施例３２：プラスミドｐＥｍＹ２４の構築
発現プラスミドｐＥｍＹ１５のｂａｒ遺伝子をフサリウム・ベネナツムのｐｙｒＧ遺伝子で置き換えるために、以下のプロトコールを実施した。プラスミドｐＥｍＹ１５を、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化し、そしてＴＡＥバッファー中、１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。７．１ｋｂの断片を切り出し、そしてＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。
【０３５７】
ｐｙｒＧ遺伝子の２．３ｋｂの断片を、以下に示した順方向及び逆方向プライマーを使用してｐＤＭ１５６．２からＰＣＲ増幅した。
【０３５８】
【化１９】
2012504390.tif 000020
【０３５９】
太字の配列は、それぞれ順方向及び逆方向プライマーの導入したＮｏｔＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位に相当する。
【０３６０】
増幅反応には、５０μｌの最終容量中、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌバッファー、２００μＭのｄＮＴＰｓ、３１ｎｇのｐＤＭ１５６．２、１μＭの各プライマー、及び１単位のＶＥＮＴ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼで構成された。
【０３６１】
反応を、９５℃にて３分間を１サイクル；それぞれ９５℃にて３０秒間、５５℃にて１分間、７２℃にて３分間を３０サイクル；そして７２℃にて７分間を１サイクルのためにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使ってインキュベートした。
【０３６２】
ＰＣＲ産物を、ＴＡＥバッファー中、１％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして２．３ｋｂの断片を切り出し、そしてＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。次に、断片を、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化し、そして消化反応物を、ＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔを使用して精製した。断片を、製造業者の取扱説明書に従ってＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＥｍＹ１５に連結した。連結混合物を、製造業者の取扱説明書に従ってＥ．コリＸＬ１‐Ｂｌｕｅサブクローニンググレード・コンピテント細胞（Stratagene, La Jolla, CA, USA）内に形質転換した。形質転換体を配列決定して、ＰＣＲエラーの不存在を確実にし、そして、エラーを含まないｐｙｒＧ断片を含むプラスミドを同定した。得られたプラスミドを、ｐＥｍＹ２４（図２６）と命名した。
【０３６３】
実施例３３：プラスミドｐＤＭ２５７の構築
プラスミドｐＥｍＹ２４（実施例３２）を、ＡｆｌＩＩ及びＳｎａ ＢＩで消化した。６．５ｋｂの断片を、ＴＡＥバッファー中、１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、ゲルから切り出し、そしてＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。プラスミドｐＥＪＧ６５を、ＡｆｌＩＩ及びＳｎａ ＢＩで消化した。３．３ｋｂの断片を、ＴＡＥバッファー中、１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、ゲルからから切り出し、そしてＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。
【０３６４】
２つの断片を、製造業者の取扱説明書に従ってＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用して一つに連結した。連結混合物を、製造業者の取扱説明書に従ってＥ．コリＸＬ１‐Ｂｌｕｅサブクローニンググレード・コンピテント細胞内に形質転換した。形質転換体を、配列分析によってスクリーニングし、そして所望の断片を持つプラスミドを含むクローンを同定した。得られたプラスミドを、ｐＤＭ２５７（図２７）と命名した。
【０３６５】
実施例３４：プラスミドｐＤＭ２５８の構築
プラスミドｐＤＭ２５７を、ＳｃａＩ及びＡｆｌＩＩで消化し、ＴＡＥバッファー中、１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして４．１ｋｂの断片をゲルから切り出し、そしてＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。プラスミドｐＥＪＧ６９をさらに、ＳｃａＩ及びＡｆｌＩＩで消化し、ＴＡＥバッファー中、１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして５．８ｋｂの断片をゲルから切り出し、そして前述の通りにアガロースから抽出した。
【０３６６】
２つの断片を、製造業者の取扱説明書に従ってＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用して一つに連結した。連結混合物を、製造業者の取扱説明書に従ってＥ．コリＸＬ１‐Ｂｌｕｅサブクローニンググレード・コンピテント細胞内に形質転換した。形質転換体を、配列分析によってスクリーニングし、そして所望のプラスミドを同定し、ｐＤＭ２５８（図２８）と命名した。
【０３６７】
実施例３５：フサリウム・ベネナツム株ＪｆｙＳ１６４３‐９５‐０４のラクトースオキシダーゼの発現
フサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１６４３‐９５‐０４（Δｔｒｉ５ ΔｐｙｒＧ ΔａｍｙＡ）のプロトプラストを、実施例５に記載の通りに製造した。次に、プロトプラストを、実施例２０に記載の手法に従って、ミクロドチウム・ニバレ・ラクトースオキシダーゼ発現ベクターを保有するｐＤＭ２５８で形質転換して、フサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１６４３‐９５‐０４株の発現可能性を評価した。フラスコを２００ｒｐｍで振盪しながら２８℃にて５日間インキュベートしたことを除いて、実施例２１に記載の通りに、形質転換体を振盪フラスコ内で培養した。
【０３６８】
振盪フラスコ・ブロスを、ＢＩＯＭＥＫ（登録商標）３０００（Beckman Coulter, Inc, Fullerton, CA, USA）に関連した活性分析を使用してラクトースオキシダーゼ活性についてアッセイした。ラクトースオキシダーゼ・アッセイは、Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｏｘｉｄａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（Ｋ‐Ｇｌｏｘ）（Megazyme, Wicklow, Ireland）の変法バージョンであった。培養上清を、０．１ＭのＭＯＰＳバッファーｐＨ７．０（サンプル・バッファー）中に適切に希釈し、その後、希釈したサンプルの０倍から１／３倍〜１／９倍までの希釈系列に希釈した。ラクトースオキシダーゼ標準物質（Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark）を、サンプル・バッファー中に０．０５６ｍｇ／ｍｌの濃度で始まり、０．００７ｍｇ／ｍｌの濃度で終わる２倍ステップを使用して希釈した。標準物質を含めたそれぞれの希釈物の総量２０μｌを、９６ウェル平底プレートに移した。１００μｌのＰＯＤ溶液（リン酸カリウム・バッファーｐＨ７＋ｐ‐ヒドロキシ安息香酸及びアジ化ナトリウム中、ペルオキシダーゼ、４ＡＡ、安定化剤）をそれぞれのウェルに加え、続いて１００μｌのグルコース基質（サンプル・バッファー中、０．５Ｍグルコース）を付加した。反応速度を、周囲温度（約２６℃）にて合計１０分間、５１０ｎｍにおいて計測した。サンプル濃度を、標準物質としてラクトースオキシダーゼを使用して作成した検量線からの推定によって決定した。最も多くラクトースオキシダーゼを産生する形質転換体を、２リットル発酵槽における培養と分析のために選択した。
【０３６９】
発酵培地（ｐＨ６）は、１リットルあたり、２０ｇのダイズ粉、２０ｇのショ糖、２．０ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２．０ｇの無水ＫＨ2ＰＯ4、２．０ｇのＫ2ＳＯ4、５．０ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１．０ｇのクエン酸、０．５ｍｌの２００×ＡＭＧ微量金属溶液（ニッケルなし）、及び２０％のマルトース・フィード（maltose feed）含む０．５ｍｌのプルロニック酸で構成された。発酵を、２９．０で＋／‐１．０℃、１２００ｒｐｍ、及び１．０ｖｖｍ通気にて実施したが、この場合、％ＤＯは３０％超に維持した。
【０３７０】
発酵ブロスを、ＢＩＯＭＥＫ（登録商標）３０００及びＢＩＯＭＥＫ（登録商標）ＮＸ（Beckman Coulter, Inc, Fullerton CA, USA）に関連してＡｌｐｈａ−Ａｍｙｌａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Megazyme International Ireland Ltd., Wicklow, Ireland）を使用してアルファアミラーゼ活性についてアッセイした。発酵ブロスを、先に記載した通りに、ラクトースオキシダーゼ活性についてアッセイした。
【０３７１】
得られた最高の形質転換体、フサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１６４３‐９５‐０４は、２リットル発酵槽内の欠失がないその他のフサリウム・ベネナツム形質転換体と同等のラクトースオキシダーゼ産生レベルを有したので（図２９）、ａｍｙＡ遺伝子の欠失が異種タンパク質産生にマイナスの影響を及ぼさないことを示した。しかしながら、欠失は、この菌株及びこの系統のその後の菌株すべての培養ブロス中でアルファアミラーゼ活性を無効にした（図３０）。この形質転換体は、現行の産生菌株と同等の異種タンパク質産生能を有し、且つ、発酵中のα‐アミラーゼ・レベルを減少させたので、フサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１６４３‐９５‐０４宿主株を、アルカリプロテアーゼＡ遺伝子（ａｌｐＡ）の欠失について選択した。
【０３７２】
実施例３６：フサリウム・ベネナツム・アルカリプロテアーゼＡ（ａｌｐＡ）欠失ベクターｐＪｆｙＳ１６９８‐７２‐１０の製造
フサリウム・ベネナツムＡ３／５アルカリプロテアーゼＡ（ａｌｐＡ）遺伝子（ＤＮＡ配列については配列番号９１及び推定アミノ酸配列については配列番号９２）の完全欠失に使用するための上流フランキング配列を、ＧＥＮＯＭＥ ＷＡＬＫＥＲ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｋｉｔを使用して得た。キットを用いて作成された各ライブラリーを、以下に示した５’遺伝子特異的プライマー及び５’ネステッド・プライマーを使用した、５’フランキング配列のための２ラウンドのＰＣＲにかけた。
【０３７３】
５’遺伝子特異的プライマー：
５’‐ＧＡＧＧＡＡＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧＡＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＡ‐３’（配列番号９３）
５’ネステッド・プライマー：
５’‐ＧＧＡＧＴＣＴＴＴＧＴＴＣＣＡＡＴＧＴＧＣＴＣＧＴＴＧＡ‐３’（配列番号９４）
【０３７４】
ＢＤ ＧＥＮＯＭＥ ＷＡＬＫＥＲ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｋｉｔで供給されたＮｅｓｔｅｄ Ａｄａｐｔｏｒ Ｐｒｉｍｅｒ及び５’ネステッド・プライマーを使用して、ＰＣＲ産物から配列情報を得た。得られた配列を使用して、空の欠失ベクターｐＪｆｙＳ１５７９‐４１‐１１内に挿入のための５’ａｌｐＡフランキング配列の１ｋｂの領域を増幅するためのプライマーを設計した。
【０３７５】
ａｌｐＡ５’フランキング配列を、以下に示した領域特異的な順方向及び逆方向プライマーを使用してフサリウム・ベネナツムＡ３／５ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。下線を引いた文字は、ベクターのｐＣＲ（登録商標）２．１部分のその後の欠失のためのＮｏｔＩ部位を表し、イタリック体で印字された文字は、ベクター・クローニングのためのＡｓｃＩ部位を表す。
【０３７６】
【化２０】
2012504390.tif 000021
【０３７７】
増幅反応には、１×ＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（登録商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファー、１２０ｎｇのゲノムＤＮＡ、４００ｎＭのプライマー、２００μＭのｄＮＴＰｓ、及び２．５単位のＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼが含まれた。
【０３７８】
増幅反応を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９４℃にて３０秒間、５６℃にて３０秒間、及び７２℃にて１分１０秒を２０サイクル；そして７２℃にて７分間を１サイクルのためにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使ってインキュベートした。
【０３７９】
増幅反応物の一部５μｌを、ＴＡＥバッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動によって可視化して、前記反応が所望の１ｋｂのバンドを生じたことを確実にした。次に、挿入物を、製造業者の取扱説明書に従ってＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用して、増幅反応物からｐＣＲ（登録商標）２．１ ＴＯＰＯ（登録商標）内に直接クローニングした。形質転換体を、ＥｃｏＲＩを用いた制限解析によってスクリーニングして、挿入物の存在を確実にし、そして５つの正しい調製物を組み合わた。挿入物を、ＡｓｃＩを用いた消化によって、ｐＣＲ（登録商標）２．１から遊離させ、そしてその断片を、先に記載したようにアガロースゲル電気泳動によって精製した。挿入物を、ＱＵＩＣＫ ＬＩＧＡＴＩＯＮ（商標）Ｋｉｔを使用してＡｓｃＩで線状化したｐＪｆｙＳ１５７９‐４１‐１１内にクローニングし、そして連結混合物を、製造業者のプロトコールに従ってＥ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ（登録商標）化学的コンピテント細胞の形質転換に使用した。形質転換体を、配列分析によってスクリーニングして、ＰＣＲエラーの不存在を確実にした。エラーを含まないフランキング配列を含む１つのプラスミドを、ｐＪｆｙＳ１６９８‐６５‐１５（図３１）と命名し、そして３’フランキング配列を挿入するために使用した。
【０３８０】
ａｌｐＡ遺伝子の３’フランキング配列を、以下に示した領域特異的な順方向及び逆方向プライマーを使用してフサリウム・ベネナツムＡ３／５ゲノムＤＮＡから増幅した。下線を引いた文字は、その後のβ‐ラクタマーゼ欠失のためのＮｏｔＩ部位を表し、イタリック体で印字された文字は、ベクター・クローニングのためのＳｂｆＩ部位を表す。
【０３８１】
【化２１】
2012504390.tif 000022
【０３８２】
ＰＣＲ反応物には、１×ＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（登録商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファー、１２０ｎｇのゲノムＤＮＡ鋳型、４００ｎＭのプライマー、２００μＭのｄＮＴＰｓ、及び２．５単位のＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼが含まれた。
【０３８３】
増幅反応を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９４℃にて３０秒間、５６℃にて３０秒間、及び７２℃にて１分１０秒を２０サイクル；そして７２℃にて７分間を１サイクルのためにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使ってインキュベートした。
【０３８４】
増幅反応物の一部５μｌを、ＴＡＥバッファー中、１％アガロースゲル上で可視化して、反応で所望の１ｋｂのバンドが生成されたことを確実にした。次に、直接的ＰＣＲ反応から、１ｋｂの挿入物を、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用してｐＣＲ（登録商標）２．１ＴＯＰＯ（登録商標）内にクローニングした。得られたプラスミドを、配列決定して、正しい配列を含むコロニーを同定した。次に、断片を、ＳｂｆＩ消化によってこのプラスミドから遊離させ、そしてＴＡＥバッファー中、１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。１ｋｂのバンドを切り出し、そしてＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。
【０３８５】
次に、この断片を、ＱＵＩＣＫ ＬＩＧＡＴＩＯＮ（商標）Ｋｉｔを使用して（仔ウシ腸ホスファターゼで処理した）ＳｂｆＩ線状化ｐＪｆｙＳ１６９８‐６５‐１５に連結し、そして連結混合物を、製造業者の取扱説明書に従ってＥ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ（登録商標）化学的コンピテント細胞の形質転換に使用した。形質転換体を、ＮｏｔＩを用いた制限解析によってスクリーニングして、断片が正しい方向で挿入されていたことを確実にし、且つ、配列決定して、期待した配列から逸脱がないことを確実にした。得られたプラスミドｐＪｆｙＳ１６９８‐７２‐１０（図３２）を、ａｌｐＡ遺伝子の欠失のために使用した。
【０３８６】
実施例３７：Δｔｒｉ５ ΔｐｙｒＧ ΔａｍｙＡ ΔａｌｐＡフサリウム・ベネナツム株ＪｆｙＳ１７６３‐１１‐０１の製造
実施例２０に記載の手法に従ってＮｏｔＩで消化し、ゲルから精製したｐＪｆｙＳ１６９８‐７２‐１０で形質転換したフサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１６４３‐９５‐０４（Δｔｒｉ５ ΔｐｙｒＧ ΔａｍｙＡ）（実施例２６）の３つの形質転換体を、無菌のつまようじを用いて形質転換プレートから１ｍｌあたり１２５μｇのハイグロマイシンＢと１０ｍＭのウリジンを添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地の入った新しいプレートに移し、そして室温にて７日間インキュベートした。サザン解析のために、３つの形質転換体のそれぞれからのフサリウム・ベネナツム・ゲノムＤＮＡ２μｇを、３４単位のＳｐｈＩで消化した。ａｌｐＡ遺伝子の５’フランキング配列に対するＤＩＧプローブを、実施例２１に記載の方法に従って、以下に示した順方向及び逆方向プライマーを使用して製造した。
【０３８７】
順方向プライマー：
５’‐ＧＣＡＣＧＴＴＡＧＧＣＴＣＡＡＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧ‐３’（配列番号９９）
逆方向プライマー：
５’‐ＧＡＧＧＣＴＣＡＴＧＧＡＴＧＴＧＧＣＧＴＴＡＡＴＧ‐３’（配列番号１００）
【０３８８】
実施例２１に記載の通りに実施したサザン解析では、３つの形質転換体のうちの１つがａｌｐＡ遺伝子部位に欠失カセットの単一コピーを含んでいたことが示されたので、この形質転換体を、フサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１６９８‐８３‐２と命名した。
【０３８９】
フサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１６９８‐８３‐２に、実施例５に記載の通りに胞子形成させ、そして１０5個の胞子を、５０μＭのＦｄＵと０．１ｍＭのウリジンを添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地の入った直径１５０ｍｍのプレートに播種した。獲得した胞子単離物を、１０μＭのＦｄＵと０．１ｍＭのウリジンを添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地の入った新しいプレートに継代培養した。得られた胞子単離物を、実施例２１に記載の通りにサザン解析によって分析し、そしてカセットが正しく切り出された１つの胞子単離物を同定した。その単離物を、フサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１６９８‐９４‐０４と命名した。フサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１６９８‐９４‐０４を、実施例２１に記載の通りに、１回、胞子精製し、そして１つの胞子単離物を、選び出し、そしてフサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１７６３‐１１‐０１（Δｔｒｉ５ ΔｐｙｒＧ ΔａｍｙＡ ΔａｌｐＡ）と命名した。
【０３９０】
フサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１７６３‐１１‐０１のプロトプラストを製造し、そして実施例５及び２０に記載の通りに、ｐＤＭ２５８で形質転換した。形質転換体を実施例３５に記載の通りに分析し、そして発酵ブロスをアルカリプロテアーゼ活性についてアッセイした。ＰＲＯＴＡＺＹＭＥ（登録商標）ＡＫタブレット（Megazyme, Wicklow, Ireland）を、緩やかに撹拌しながら２．０ｍｌの０．０１％ ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ‐１００中に懸濁した。５００μｌのこの懸濁液及びＰＲＯＴＡＺＹＭＥ（登録商標）ＡＫタブレットと共に供給された５００μｌのアッセイ・バッファーを、ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）チューブ中で混合し、そして氷上に置いた。２０μｌの（０．０１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ‐１００中に希釈された）プロテアーゼ・サンプルを加えた。ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）チューブをＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒに移すことによって、アッセイを開始した。前記ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒは、アッセイ温度に設定されていた。ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを使って１３００ｒｐｍにて１５分間、チューブをインキュベートした。チューブを氷浴に戻すことによって、インキュベーションを終えた。次に、そのチューブを、氷冷遠心分離機により１６０００×ｇにて数分間遠心分離し、そして２００μｌの上清をマイクロタイタープレートに移した。６５０ｎＭの吸収度を、プロテアーゼ活性の尺度として読取った。
【０３９１】
ａｍｙＡ欠失と同様に、ａｌｐＡ遺伝子の欠失は、ラクトースオキシダーゼ発現に対してプラスの影響を及ぼさなかった。しかしながら、発酵上清中のアルカリプロテアーゼの弱い活性（side activity）は、１０分の１に減少した（図３３）。
【０３９２】
実施例３８：ｄｐｓ１欠失ベクターｐＪｆｙＳ１１１の製造
フサリウム・ベネナツム・デプシペプチド・シンターゼ（ｄｐｓＩ）遺伝子（ＤＮＡ配列については配列番号１０１及び推定アミノ酸配列については配列番号１０２）の３’フランキング配列を、以下に示した順方向及び逆方向プライマーを使用してフサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１７６３‐１１‐０１ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。プライマー内の下線部分は、クローニング用の導入したＳｂｆＩ部位を表し、イタリック体で印字された部分は、その後のβ‐ラクタマーゼ欠失用の導入したＮｏｔＩ部位に相当する。ゲノムＤＮＡを、ＤＮＥＡＳＹ（登録商標）Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを使用して抽出した。
【０３９３】
【化２２】
2012504390.tif 000023
【０３９４】
増幅反応には、５０μｌの最終容量中、１×ＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（登録商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファー、４００ｎＭの各プライマー、２００μＭのｄＮＴＰｓ、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、及び１．５単位のＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼが含まれた。
【０３９５】
増幅反応を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９５℃にて３０秒間、５７℃にて３０秒間、及び７２℃にて１分２０秒間を２５サイクル；そして７２℃にて７分間を１サイクルのためにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使ってインキュベートした。
【０３９６】
増幅反応物を、ＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製した。次に、精製した反応を、ＳｂｆＩで消化し、ＴＡＥバッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動にかけた。１ｋｂのバンドをゲルから切り出し、そして、ＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。次に、消化したベクターを、製造業者の提案したプロトコールに従ってＱＵＩＣＫ ＬＩＧＡＴＩＯＮ（商標） Ｋｉｔを使用して、（仔ウシ腸ホスファターゼによって脱リン酸化された）ＳｂｆＩ消化ｐＪｆｙＳ１５７９‐４１‐１１（実施例２２）に連結した。得られたクローンを、（挿入物の存在と方向について確認するための）ＥｃｏＲＩを用いた制限解析及び（ＰＣＲエラーの不存在を確実にするための）配列分析によって分析し、そして得られたプラスミドを、ｐＪｆｙＳ１８７９‐３２‐２（図３４）と命名した。
【０３９７】
ｄｐｓ１遺伝子の５’末端のフランキング配列を得るために、ＧＥＮＯＭＥ ＷＡＬＫＥＲ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｋｉｔを、実施例３６に記載の通りに、以下に示した遺伝子特異的プライマー及び遺伝子特異的ネステッド・プライマーと共に使用した。
【０３９８】
遺伝子特異的プライマー：
５’‐ＧＣＴＡＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＡＣＴＡＣＡ‐３’（配列番号１０５）
遺伝子の特異的ネステッド・プライマー：
５’‐ＧＣＣＴＡＣＣＡＴＣＧＡＣＡＧＣＡＧＴＡＡＧＡＴＡＴＴＣＣ‐３’（配列番号１０６）
【０３９９】
５’ｄｐｓ１フランキング配列を、以下で示した順方向及び逆方向プライマーを使用してフサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１７６３ １１‐１ゲノムＤＮＡから増幅した。順方向プライマーの下線部分は、クローニング用の導入したＡｓｃＩ部位を表し、イタリック体で印字された部分は、その後のβ‐ラクタマーゼ欠失用の導入したＮｏｔＩ部位に相当する。増幅反応及びサイクル・パラメーターは、使用したプライマーが以下のものであったこと、使用したアニーリング温度が５３℃であったこと、伸長時間が１分１５秒間であったことを除いて、先に記載したものと同一であった。
【０４００】
【化２３】
2012504390.tif 000024
【０４０１】
ＰＣＲ反応物を、ＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製した。精製した反応物を、ＡｓｃＩで消化し、ＴＡＥバッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動にかけた。０．７ｋｂのバンドをゲルから切り出し、そして、先に記載したようにアガロースから抽出した。０．７ｋｂのバンドを、ＱＵＩＣＫ ＬＩＧＡＴＩＯＮ（商標）Ｋｉｔを使用して（ＡｓｃＩで消化し、そして仔ウシ腸ホスファターゼで脱リン酸化した）ｐＪｆｙＳ１８７９‐３２‐２に連結した。得られたクローンを、配列分析によって分析して、ＰＣＲエラーの不存在を確実にし、そして得られたプラスミドを、ｐＪｆｙＳ１１１（図３５）と命名し、そしてフサリウム・ベネナツムｄｐｓ１遺伝子の欠失のために使用した。
【０４０２】
実施例３９：Δｔｒｉ５ ΔｐｙｒＧ ΔａｍｙＡ ΔａｌｐＡ Δｄｐｓ１フサリウム・ベネナツム株ＪｆｙＳ１８７９‐５７‐０１の製造
フサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１７６３‐１１‐０１プロトプラストを、実施例２０に記載の手法に従ってＮｏｔＩ消化し、ゲルから精製したｐＪｆｙＳ１１１で形質転換したときに、７７個の形質転換体を獲得した。そのうち４８個を、無菌のつまようじを用いて、形質転換プレートから１ｍｌあたり１２５μｇのハイグロマイシンＢと１０ｍＭのウリジンを添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地の入った新しいプレートに移し、そして室温にて７日間インキュベートした。
【０４０３】
実施例２１に記載の通りに得られた７日齢の形質転換体からの４本の１ｃｍ寒天プラグを、１０ｍＭのウリジンを添加したＭ４００培地２５ｍｌに播種することによって、真菌バイオマスを生成した。培養物を、１５０ｒｐｍで振盪しながら２８℃にて３日間インキュベートした。寒天プラグは取り除き、そして培養物を、ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（商標）を通して濾過した。集菌したバイオマスを液体窒素で凍らせ、そして菌糸を乳鉢と乳棒を使用して粉砕した。
【０４０４】
６５℃の溶解薬インキュベーション時間を１０分から１．５時間に延長したこと除いて、製造業者の取扱説明書に従ってＤＮＥＡＳＹ（登録商標）Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを使用して、ゲノムＤＮＡを単離した。
【０４０５】
２μｇのゲノムＤＮＡを、５０μｌの反応容量中、２８単位のＮｃｏＩ及びＳｐｅＩそれぞれを用いて３７℃にて２２時間、消化した。消化物を、ＴＡＥバッファー中、１．０％アガロースゲル電気泳動にかけた。ＤＮＡを、ゲル中、０．２５ＭのＨＣｌで処理することによって断片化し、１．５ＭのＮａＣｌ‐０．５ＭのＮａＯＨで変性させ、１．５ＭのＮａＣｌ‐１ＭのＴｒｉｓ ｐＨ８で中和し、次にＴＵＲＢＯＢＬＯＴＴＥＲ（商標）Ｋｉｔを使用して２０×ＳＳＣ中、ＮＹＴＲＡＮ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅナイロン膜に移し取った。ＤＮＡを、ＵＶ ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ（商標）を使用して膜にＵＶ架橋し、そして２０ｍｌのＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ中、４２℃にて１時間プレハイブリダイズした。
【０４０６】
ｄｐｓ１遺伝子の３’フランキング配列に対するＤＩＧプローブを、実施例２１に記載の方法に従って、以下に示した順方向及び逆方向プライマーを使用して製造した。
【０４０７】
順方向プライマー：
５’‐ＣＴＴＧＡＣＴＡＴＴＡＴＣＴＣＡＣＧＴＴＧＴＣＡＧ‐３’（配列番号１０９）
逆方向プライマー：
５’‐ＴＣＡＡＧＴＧＴＴＧＴＧＴＡＡＴＧＴＴＧＧＡＡＣＡ‐３’（配列番号１１０）
【０４０８】
実施例２１に記載の通りに実施したサザン解析は、８つの形質転換体のうち３つがｄｐｓ１遺伝子座に単一コピーで欠失断片を含んでいたことを示した。１つを、フサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１８７９‐４３‐０５と命名した。
【０４０９】
実施例５に記載の通りにフサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１８７９‐４３‐０５に胞子形成させ、そして１０5個の胞子を、５０μＭのＦｄＵと０．１ｍＭのウリジンを添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地の入った直径１５０ｍｍのプレートに播種した。獲得した胞子単離物を、５０μＭのＦｄＵと０．１ｍＭのウリジンを添加したＶＮＯ3ＲＬＭＴ培地の入った新しいプレートに継代培養した。得られた胞子単離物を、実施例２１に従ってサザン解析によって分析し、そして、カセットが正しく切り出された１つの胞子単離物を同定した。その単離物を、フサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１８７９‐５２‐３と命名した。フサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１８７９‐５２‐０３を、実施例２１に記載の通りに、１回、胞子精製し、１つの胞子単離物を、選び出し、そしてフサリウム・ベネナツムＪｆｙＳ１８７９‐５７‐０１（Δｔｒｉ５ ΔｐｙｒＧ ΔａｍｙＡ ΔａｌｐＡ Δｄｐｓ１）と命名した。
【０４１０】
実施例４０：トリコデルマ・リーセイｈｅｍＡ欠失ベクターｐＪｆｙＳ１２０の構築
トリコデルマ・リーセイのアミノレブリン酸シンターゼ遺伝子を欠失させるために、３’ｈｅｍＡフランキング配列を、以下に示した順方向及び逆方向プライマーを使用してトリコデルマ・リーセイＲｕｔＣ３０ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。プライマーの下線部分は、クローニング用の導入したＳｂｆＩ部位を表し、太字の部分は、その後のβ‐ラクタマーゼ欠失用の導入したＮｏｔＩＩ部位に相当する。
【０４１１】
【化２４】
2012504390.tif 000025
【０４１２】
増幅反応物は、１×ＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（登録商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファー、４００ｎＭの各プライマー、２００μＭのｄＮＴＰｓ、１２５ｎｇのゲノムＤＮＡ、及び１．５単位のＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼで構成された。反応を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９５℃にて３０秒間、５７℃にて３０秒間、及び７２℃にて１分４５秒間を２５サイクル；そして７２℃にて７分間を１サイクルのためにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使ってインキュベートした。
【０４１３】
ＰＣＲ産物を、ＴＡＥバッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動によって分離した。約１．５ｋｂの断片をゲルから切り出し、そしてＭＩＮＩＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。
【０４１４】
１．５ｋｂの断片を、製造業者に従ってＴＯＰＯ（登録商標）‐ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇを使用してｐＣＲ（登録商標）２．１内にクローニングし、そして配列決定して、ＰＣＲエラーの不存在を確実にした。断片を、ＳｂｆＩ消化によってｐＣＲ２．１から遊離させ、そしてＴＡＥバッファー中、１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。１．５ｋｂのバンドを、切り出し、そしてＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。消化した断片を、製造業者に従ってＱＵＩＣＫ ＬＩＧＡＴＩＯＮ（商標）Ｋｉｔを使用して、（事前にＳｂｆＩで消化し、そして仔ウシ腸ホスファターゼで脱リン酸化しておいた）汎用欠失ベクターｐＪｆｙＳ１５７９‐４１‐１１（実施例２２）に連結した。得られたクローンを、配列分析によって分析して、挿入物の存在と方向を確認し、且つ、ＰＣＲエラーの不存在を確実にした。得られたプラスミドを、ｐＪｆｙＳ２０１０‐１３‐５（図３６）と命名した。
【０４１５】
５’ｈｅｍＡフランキング配列を、以下に示した順方向及び逆方向プライマーを使用してトリコデルマ・リーセイＲｕｔＣ３０ゲノムＤＮＡから増幅した。プライマーの下線部分は、クローニング用の導入したＡｓｃＩ部位を表し、太字の部分は、その後のβ‐ラクタマーゼ欠失用の導入したＮｏｔＩＩ部位に相当する。
【０４１６】
【化２５】
2012504390.tif 000026
【０４１７】
増幅反応を、先の３’フランキング配列に関する先と同じ手法で実施した。反応物を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９５℃にて３０秒間、５３℃にて３０秒間、及び７２℃にて１分１５秒間を２５サイクル；そして７２℃にて７分間を１サイクルのためにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使ってインキュベートした。
【０４１８】
ＰＣＲ産物を、ＴＡＥバッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動によって分離した。約１ｋｂの断片をゲルから切り出し、そしてＭＩＮＩＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。
【０４１９】
続いて、１ｋｂの断片を、ＡｓｃＩで消化し、そして先に記載した通りにゲルから精製した。消化した断片を、製造業者に従ってＱＵＩＣＫ ＬＩＧＡＴＩＯＮ（商標） Ｋｉｔを使用して、（事前にＳｂｆＩで消化し、そして仔ウシ腸ホスファターゼで脱リン酸化しておいた）ｐＪｆｙＳ２０１０‐１３‐５に連結した。得られたクローンを、配列分析によって分析して、ＰＣＲエラーの不存在を確実にし、そして得られたプラスミドを、ｐＪｆｙＳ１２０（図３７）と命名した。プラスミドｐＪｆｙＳ１２０を、トリコデルマ・リーセイｈｅｍＡ遺伝子を欠失させるのに使用した。
【０４２０】
実施例４１：トリコデルマ・リーセイ株ＲｕｔＣ３０のプロトプラストの製造
Ｔ．リーセイ株ＲｕｔＣ３０の新しい培養物を製造するために、プラグを、１０％のグリセロール中に浸したかかる菌株のプラグを含む貯蔵物から新しいＰＤＡプレートに移し、そして２８℃にて７日間インキュベートした。胞子を、４ｍｌの０．０１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中に無菌のスプレッダーを使用して回収し、そして３５０μｌの胞子を、バッフル付き振盪フラスコ内の２５ｍｌのＹＰＧ2%に植え付けるのに使用し、そして９０ｒｐｍで振盪しながら２８℃にて１６時間インキュベートした。菌糸を、そのフィルター上にグレムリンを回収するＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標）ＳＴＥＲＩＣＵＰ（登録商標）２５０ｍｌ０．２μｍフィルター・ユニットを通して培養物を濾過することによって回収した。菌糸を、約１００ｍｌの１．２Ｍソルビトールによって洗浄した。１ＭのＭｇＳＯ4及び０．３６単位／ｍｌのキチナーゼ（Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA）中、５ｍｇ／ｍｌのＧＬＵＣＡＮＥＸ（商標）（Novozymes, Bagsvaerd, Denmark）で構成された２０ｍｌのプロトプラスト化溶液中に、菌糸を再懸濁した。プロトプラスト化溶液を、１２５ｍｌ振盪フラスコ内、９０ｒｐｍで振盪しながら３４℃にて２５分間インキュベートした。氷上でフラスコをインキュベートすることによって、反応を止めた。プロトプラストを円錐の底を有する５０ｍｌ試験管に移し、そして３０ｍｌの氷冷１．２Ｍソルビトールを加えた。その試験管を、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＴ６０００Ｂスウィングバケット遠心分離機（Thermo-Fischer Scientific, Waltham, MA, USA）を使って３７７×ｇ、室温（約２４〜２８℃）にて１０分間遠心分離した。上清を捨て、そしてプロトプラストを、３０ｍｌの１．２Ｍソルビトールによって洗浄した。試験管での遠心分離を繰り返し、そして上清を捨てた。ペレットを、１．２Ｍソルビトール中に再懸濁し、そして１０μｌのサンプルを、血球計（VWR, West Chester, PA）を使用してプロトプラストの濃度を測定するために取り出した。プロトプラストの入った試験管を、３７７×ｇにて遠心分離し、そしてプロトプラストを、２ｘ１０8プロトプラスト／ｍｌの終濃度にＴｒＳＴＣ中に再懸濁した。
【０４２１】
実施例４２：トリコデルマ・リーセイ・アミノレブリン酸シンターゼ（ｈｅｍＡ）遺伝子の欠失
トリコデルマ・リーセイＲｕｔＣ３０プロトプラストを、以下に述べた例外を伴いながら実施例２０に記載の通りにＮｏｔＩで消化し、ゲルから精製した欠失ベクターｐＪｆｙＳ１２０で形質転換した。１００μｌのプロトプラストを、１４ｍｌポリプロピレンチューブに移し、そしてそこに２μｇのゲルから精製したｐＪｆｙＳ１２０を加えた。２５０μｌのポリエチレングリコール４０００を加え、そして６回反転することによって、そのチューブを緩やかに混合した。チューブを、３４℃にて３０分間インキュベートし、その後、３ｍｌのＴｒＳＴＣを加えた。チューブの内容物を、１Ｍのショ糖及び５ｍＭのアミノレブリン酸（ＡＬＡ）を含む２枚の１５０ｍｍＰＤＡプレート上に播種し、そしてそれを、２８℃にて１６時間インキュベートした。ＰＤＡ、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ、及び５ｍＭのＡＬＡを含む５０℃に冷やした重層を、プレート上に注ぎ入れ、そして室温にて３０分間冷ました。次に、そのプレートを２８℃にて５日間インキュベートした。
【０４２２】
形質転換は、１３４個の形質転換体をもたらした。各形質転換体を、５ｍＭのＡＬＡ及び２５μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含む５ｍｌのＰＤＡが入った６ウェル細胞培養プレートの１つのウェルに移し、そして２８℃にて５日間インキュベートした。形質転換体から、添加したＡＬＡを含まないＴｒＭＭ培地の入った別の６ウェルプレートに少量の胞子を削り落とすことによって、形質転換体をＡＬＡ栄養要求性について試験した。次に、栄養要求性を示す３つの形質転換体を、５ｍＭのＡＬＡを含むＰＤＡプレートに継代培養し、そして２８℃にて５日間インキュベートした。サザン解析のためのゲノムＤＮＡを製造するために、５日齢の形質転換体の４本の１ｃｍ2プラグを、１２５ｍｌ振盪フラスコ内、５ｍＭのＡＬＡを含む２５ｍｌのＹＰＧ2%培地に植菌し、４１５０ｒｐｍ、２８℃にて８時間培養した。実施例８に記載したものと同じ方法を使用して、ゲノムＤＮＡを培養物から単離した。
【０４２３】
サザン解析のために、２μｇのゲノムＤＮＡを、５０μｌの反応容量中、３３単位のＮｃｏＩで消化し、そしてＴＡＥバッファー中、１％アガロース電気泳動にかけた。実施例８に記載の通りに、ゲル内のＤＮＡを、脱プリン化し、変性させ、中和し、次にＮＹＴＲＡＮ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅ膜に移し取った。ＤＮＡを、ＵＶ ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ（商標）を使用して膜にＵＶ架橋し、そして２０ｍｌのＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ中、４２℃にて１時間プレハイブリダイズした。
【０４２４】
ｈｅｍＡ遺伝子の３’側面に対するプローブを、以下に示した順方向及び逆方向プライマーを用いて、製造業者の取扱説明書に従ってＰＣＲ Ｄｉｇ Ｐｒｏｂｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用して製造した。
【０４２５】
順方向（０６５７６４番）
５’‐ＧＡＣＧＣＡＴＡＣＡＡＴＡＣＡＡＧＣＡＴＡＴＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧＴＣＴ‐３’（配列番号１１５）
逆方向（０６５７６５番）
５’‐ＡＡＧＧＣＧＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴ‐３’（配列番号１１６）
【０４２６】
増幅反応物は、１×ＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（登録商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファー、４００ｎＭの各プライマー、２００μＭのＤＩＧ標識ｄＵＴＰ含有ｄＮＴＰｓ、１２５ｎｇのＴ．リーセイＲｕｔＣ３０ゲノムＤＮＡ、及び１．５単位のＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼで構成された。反応を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９５℃にて３０秒間、５８℃にて３０秒間、及び７２℃にて４５秒間を２５サイクル；そして７２℃にて７分間を１サイクルのためにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）を使ってインキュベートした。
【０４２７】
プローブを、ＴＡＥバッファー中、１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そしてプローブに相当するバンドを切り出し、そしてＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してアガロースから抽出した。プローブを、５分間煮沸し、そして１０ｍｌのＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂに加えてハイブリダイゼーション溶液を調製した。ハイブリダイゼーションを、４２℃にて１５〜１７時間実施した。次に、膜を、高ストリンジェンシー条件下、２×ＳＳＣ＋０．１％のＳＤＳ中、室温にて５分間洗浄し、続いて０．１×ＳＳＣ＋０．１％のＳＤＳ中、それぞれ６５℃にて１５分間、２回洗浄した。プローブ‐標的ハイブリッドを、製造業者の取扱説明書に従って化学発光法（Roche Diagnostics Indianapolis, IN, USA）によって検出した。
【０４２８】
３つの形質転換体のサザン解析は、３つのＡＬＡ栄養要求性形質転換体すべてが、ｈｅｍＡ遺伝子座に単一コピーで欠失カセットを含んでいることを示した。１つの形質転換体ＪｆｙＳ２０１０‐５２‐６５を、ｈｐｔ及びｔｋマーカーを取り出すのに使用した。５ｍＭのＡＬＡプレートを含む新しいＰＤＡプレートに７日齢の培養物のプラグを移し、そして２８℃にて７日間インキュベートすることによって、胞子の新しいプレートを製造した。無菌のスプレッダーを使用して、１０ｍｌの０．０１％ ＴＷＥＥＮＲ２０中に胞子を回収した。胞子の濃度を、血球計を使用して測定し、そして１０6個の胞子を、１ｍＭのＡＬＡと１μＭのＦｄＵを含むＴｒＭＭ‐Ｇ培地の入った１５０ｍｍプレートに播種した。
【０４２９】
１６個のＦｄＵ耐性胞子単離物を獲得し、そしてそれらの胞子単離物のうちの１０個から、先に記載したようにＤＮＡを抽出した。単離物を、先に記載したようにサザン解析によって分析し、そしてその結果は、１０個の胞子単離物すべてで欠失カセットの反復の間のｈｐｔ／ｔｋ領域が切り出されたことを示した。１つのフサリウム・ベネナツムの株ＪｆｙＳ２０１０‐５２‐６５‐０２（ΔｈｅｍＡ、ｈｐｔ−、ｔｋ−）を選択し、そして保管した。
【０４３０】
本発明を、以下の番号付けした段落によってさらに説明する：
［１］糸状菌細胞のゲノム内の遺伝子又はその一部を欠失させる方法であって、以下のステップ：
（ａ）以下の：
（ｉ）発現されるとドミナント・ポジティブ選択表現型を前記糸状菌細胞に与える、ドミナント・ポジティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第１ポリヌクレオチド；
（ｉｉ）発現されるとネガティブ選択表現型を前記糸状菌細胞に与える、ネガティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第２ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）前記第１及び第２ポリヌクレオチドの５’側に位置する第１反復配列、及び第１及び第２ポリヌクレオチドの３’側に位置する第２反復配列、ここで、前記第１及び第２反復配列は同一の配列を含んでなる；並びに
（ｉｖ）構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の５’側に位置する第１フランキング配列、及び構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の３’側に位置する第２フランキング配列、ここで、前記第１フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第１領域と同一であり、且つ、前記第２フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第２領域と同一であり、ここで、（１）前記第１領域が前記糸状菌細胞の遺伝子又はその一部の５’側に位置し、且つ、前記第２領域が前記糸状菌細胞の遺伝子又はその一部の３’側に位置するか、（２）前記第１及び第２領域の両方が前記糸状菌細胞の遺伝子内に位置しているか、或いは（３）前記第１及び第２領域の一方が前記糸状菌細胞の遺伝子内に位置し、且つ、前記第１及び第２領域の他方が前記糸状菌細胞の遺伝子の５’若しくは３’側に位置する；
を含んでなる核酸構築物を、前記糸状菌細胞内に導入し、ここで、前記第１及び第２フランキング配列が、それぞれ前記糸状菌細胞の第１及び第２領域と分子間相同組換えを受けて、遺伝子又はその一部を欠失させ、及び前記核酸構築物で置き換え；
（ｂ）ポジティブ選択を適用することによって、ステップ（ａ）からドミナント・ポジティブ選択表現型を有する細胞を選択及び単離し；並びに
（ｃ）ネガティブ選択を適用することによって、ステップ（ｂ）のドミナント・ポジティブ選択表現型を有する選択された細胞からネガティブ選択表現型を有する細胞を選択及び単離して、前記第１及び第２反復配列に分子内相同組換えを強制的に施し、前記第１及び第２ポリヌクレオチドを欠失させること、
を含んでなる前記方法。
【０４３１】
［２］前記優性のドミナント・ポジティブ選択マーカーが、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）、ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｔ）、ブレオマイシン、ゼオシン、及びフレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）、アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）、ピューロマイシン‐Ｎ‐アセチル−トランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ）、ネオマイシン‐カナマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）、アセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子（ａｃｕＡ）、Ｄ‐セリン・デヒドラターゼ遺伝子（ｄｓｄＡ）、ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子（ｓＣ）、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ・サブユニット９遺伝子（ｏｌｉＣ）、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（Ｉ）（ａｐｈ（３’）Ｉ）遺伝子、並びにアミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（ＩＩ）（ａｐｈ（３’）ＩＩ）遺伝子から成る群から選択される遺伝子のコード配列によってコードされる、段落１に記載の方法。
【０４３２】
［３］前記ネガティブ選択マーカーが、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）、及びシトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）から成る群から選択される遺伝子のコード配列によってコードされる、段落１に記載の方法。
【０４３３】
［４］前記ドミナント・ポジティブ選択マーカーが、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）のコード配列によってコードされる、段落１に記載の方法。
【０４３４】
［５］前記ｈｐｔコード配列を、Ｅ．コリのハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子から得る、段落４に記載の方法。
【０４３５】
［６］前記ネガティブ選択マーカーが、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のコード配列によってコードされる、段落１に記載の方法。
【０４３６】
［７］前記ｔｋコード配列を、単純ヘルペスウイルス１型遺伝子から得る、段落６に記載の方法。
【０４３７】
［８］前記ドミナント・ポジティブ選択マーカーが、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）のコード配列によってコードされ、且つ、前記ネガティブ選択マーカーが、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のコード配列によってコードされる、段落１に記載の方法。
【０４３８】
［９］前記糸状菌細胞が、アクレモニウム、アスペルギルス、アウレオバシジウム、ブジャカンデラ、セリポリオプシス、クリソスポリウム、コプリヌス、コリオラス、クリプトコッカス、フィリバシジウム、フサリウム、ヒューミコラ、マグナポルセ、ムコール、マイセリオフトラ、ネオカリマスチックス、ニューロスポラ、パエシロマイセス、ペニシリウム、ファネロカエテ、フレビア、ピロマイセス、プレウロツス、シゾフィラム、タラロマイセス、サーモアスカス、チエラビア、トリポクラジウム、トラメテス、又はトリコデルマ細胞から成る群から選択される、段落１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【０４３９】
［１０］前記糸状菌細胞が、ｐｙｒＧ栄養要求性変異株である、段落１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【０４４０】
［１１］（ｄ）対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ステップ（ｃ）の単離した細胞内に導入するステップをさらに含んでなる、段落１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【０４４１】
［１２］前記核酸構築物が、線状化した組換えベクター内に含まれている、段落１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【０４４２】
［１３］前記第１領域が、遺伝子又はその一部の５’側に位置し、且つ、前記第２領域が、糸状菌細胞の遺伝子又はその一部の３’側に位置する、段落１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【０４４３】
［１４］前記第１及び第２領域の両方が、糸状菌細胞の遺伝子内に位置している、段落１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【０４４４】
［１５］前記第１及び第２領域のうちの一方が、遺伝子内に位置し、且つ、前記第１及び第２領域のもう一方が、糸状菌細胞の遺伝子の５’又は３’側に位置する、段落１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【０４４５】
［１６］前記第１及び第２反復配列が、前記第１フランキング配列又は前記第２フランキング配列のいずれかと同一である、段落１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【０４４６】
［１７］全遺伝子が完全に欠失され、外来ＤＮＡを残さない、段落１に記載の方法。
【０４４７】
［１８］糸状菌細胞のゲノム内の遺伝子又はその一部を欠失させるための核酸構築物であって、以下の：
（ｉ）発現されるとドミナント・ポジティブ選択表現型を前記糸状菌細胞に与える、ドミナント・ポジティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第１ポリヌクレオチド；
（ｉｉ）発現されるとネガティブ選択表現型を前記糸状菌細胞に与える、ネガティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第２ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）前記第１及び第２ポリヌクレオチドの５’側に位置する第１反復配列、及び前記第１及び第２ポリヌクレオチドの３’側に位置する第２反復配列、ここで、前記第１及び第２反復配列は同一の配列を含んでなる；並びに
（ｉｖ）構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の５’側に位置する第１フランキング配列、及び構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の３’側に位置する第２フランキング配列、ここで、前記第１フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第１領域と同一であり、且つ、前記第２フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第２領域と同一であり、ここで、（１）前記第１領域が前記糸状菌細胞の遺伝子又はその一部の５’側に位置し、且つ、前記第２領域が前記糸状菌細胞の遺伝子又はその一部の３’側に位置するか、（２）前記第１及び第２領域の両方が前記糸状菌細胞の遺伝子内に位置しているか、或いは（３）前記第１及び第２領域の一方が前記糸状菌細胞の遺伝子内に位置し、且つ、前記第１及び第２領域の他方が、前記糸状菌細胞の遺伝子の５’又は３’側に位置する；
を含んでなり、ここで、前記第１及び第２フランキング配列が、それぞれ前記糸状菌細胞の第１及び第２領域と分子間相同組換えを受けて、遺伝子又はその一部を欠失させ、及び前記核酸構築物で置き換え；そして前記第１及び第２反復配列が分子内相同組換えを受けて、前記第１及び第２ポリヌクレオチドを欠失させる、前記核酸構築物。
【０４４８】
［１９］前記ドミナント・ポジティブ選択マーカーが、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）、ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｔ）、ブレオマイシン、ゼオシン、及びフレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）、アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）、ピューロマイシン‐Ｎ‐アセチル−トランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ）、ネオマイシン‐カナマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）、アセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子（ａｃｕＡ）、Ｄ‐セリン・デヒドラターゼ遺伝子（ｄｓｄＡ）、ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子（ｓＣ）、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ・サブユニット９遺伝子（ｏｌｉＣ）、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（Ｉ）（ａｐｈ（３’）Ｉ）遺伝子、並びにアミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（ＩＩ）（ａｐｈ（３’）ＩＩ）遺伝子から成る群から選択される遺伝子のコード配列によってコードされる、段落１８に記載の核酸構築物。
【０４４９】
［２０］前記ネガティブ選択マーカーが、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）、及びシトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）から成る群から選択される遺伝子のコード配列によってコードされる、段落１８に記載の核酸構築物。
【０４５０】
［２１］前記ドミナント・ポジティブ選択マーカーが、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）のコード配列によってコードされる、段落１８に記載の核酸構築物。
【０４５１】
［２２］前記ｈｐｔコード配列を、Ｅ．コリのハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子から得る、段落２１に記載の核酸構築物。
【０４５２】
［２３］前記ネガティブ選択マーカーが、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のコード配列によってコードされる、段落１８に記載の核酸構築物。
【０４５３】
［２４］前記ｔｋコード配列を、単純ヘルペスウイルス１型遺伝子から得る、段落２３に記載の核酸構築物。
【０４５４】
［２５］前記ドミナント・ポジティブ選択マーカーが、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）のコード配列によってコードされ、且つ、前記ネガティブ選択マーカーが、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のコード配列によってコードされる、段落１８に記載の核酸構築物。
【０４５５】
［２６］前記第１領域が、遺伝子又はその一部の５’側に位置し、且つ、前記第２領域が、糸状菌細胞の遺伝子又はその一部の３’側に位置する、段落１８〜２５のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【０４５６】
［２７］前記第１及び第２領域の両方が、糸状菌細胞の遺伝子内に位置している、段落１８〜２５のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【０４５７】
［２８］前記第１及び第２領域のうちの一方が、遺伝子内に位置し、且つ、前記第１及び第２領域のもう一方が、糸状菌細胞の遺伝子の５’又は３’側に位置する、段落１８〜２５のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【０４５８】
［２９］前記第１及び第２反復配列が、前記第１フランキング配列又は前記第２フランキング配列のいずれかと同一である、段落１８〜２８のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【０４５９】
［３０］段落１８〜２９のいずれか１項に記載の核酸構築物を含んでなる組換えベクター。
【０４６０】
［３１］段落１８〜２９のいずれか１項に記載の核酸構築物を含んでなる組換え糸状菌細胞。
【０４６１】
［３２］糸状菌細胞のゲノム内にポリヌクレオチドを導入する方法であって、以下のステップ：
（ａ）以下の：
（ｉ）第１の対象ポリヌクレオチド；
（ｉｉ）発現されるとドミナント・ポジティブ選択表現型を前記糸状菌細胞に与える、ドミナント・ポジティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第２ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）発現されるとネガティブ選択表現型を前記糸状菌細胞に与える、ネガティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第３ポリヌクレオチド；
（ｉｖ）前記第２及び第３ポリヌクレオチドの５’側に位置する第１反復配列、並びに前記第２及び第３ポリヌクレオチドの３’側に位置する第２反復配列、ここで、前記第１及び第２反復配列は同一の配列を含んでなり、且つ、前記第１の対象ポリヌクレオチドは前記第１反復の５’側に位置するか又は前記第２反復の３’側に位置する；並びに
（ｖ）構成要素（ｉ）（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の５’側に位置する第１フランキング配列、及び構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の３’側に位置する第２フランキング配列、ここで、前記第１フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第１領域と同一であり、且つ、前記第２フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第２領域と同一である；
を含んでなる核酸構築物を糸状菌細胞内に導入し、ここで、前記第１及び第２フランキング配列は、それぞれ前記糸状菌細胞のゲノムの第１及び第２領域と分子間相同組換えを受けて、前記核酸構築物を前記糸状菌細胞のゲノム内に導入し；
（ｂ）ポジティブ選択を適用することによって、ステップ（ａ）からドミナント・ポジティブ選択表現型を有する細胞を選択し；並びに
（ｃ）ネガティブ選択を適用することによって、ステップ（ｂ）のドミナント・ポジティブ選択表現型を有する選択された細胞からネガティブ選択表現型を有する細胞を選択及び単離して、前記第１及び第２反復配列に分子内相同組換えを強制的に施し、前記第２及び第３ポリヌクレオチドを欠失させること、
を含んでなる、前記方法。
【０４６２】
［３３］前記ドミナント・ポジティブ選択マーカーが、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）、ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｔ）、ブレオマイシン、ゼオシン、及びフレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）、アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）、ピューロマイシン‐Ｎ‐アセチル−トランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ）、ネオマイシン‐カナマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）、アセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子（ａｃｕＡ）、Ｄ‐セリン・デヒドラターゼ遺伝子（ｄｓｄＡ）、ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子（ｓＣ）、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ・サブユニット９遺伝子（ｏｌｉＣ）、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（Ｉ）（ａｐｈ（３’）Ｉ）遺伝子、並びにアミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（ＩＩ）（ａｐｈ（３’）ＩＩ）遺伝子から成る群から選択される遺伝子のコード配列によってコードされる、段落３２に記載の方法。
【０４６３】
［３４］前記ネガティブ選択マーカーが、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）、及びシトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）から成る群から選択される遺伝子のコード配列によってコードされる、段落３２に記載の方法。
【０４６４】
［３５］前記ドミナント・ポジティブ選択マーカーが、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）のコード配列によってコードされる、段落３２に記載の方法。
【０４６５】
［３６］前記ｈｐｔコード配列を、Ｅ．コリのハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子から得る、段落３５に記載の方法。
【０４６６】
［３７］前記ネガティブ選択マーカーが、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のコード配列によってコードされる、段落３２に記載の方法。
【０４６７】
［３８］前記ｔｋコード配列を、単純ヘルペスウイルス１型遺伝子から得る、段落３７に記載の方法。
【０４６８】
［３９］前記ドミナント・ポジティブ選択マーカーが、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）のコード配列によってコードされ、且つ、前記ネガティブ選択マーカーが、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のコード配列によってコードされる、段落３２に記載の方法。
【０４６９】
［４０］前記糸状菌細胞が、アクレモニウム、アスペルギルス、アウレオバシジウム、ブジャカンデラ、セリポリオプシス、クリソスポリウム、コプリヌス、コリオラス、クリプトコッカス、フィリバシジウム、フサリウム、ヒューミコラ、マグナポルセ、ムコール、マイセリオフトラ、ネオカリマスチックス、ニューロスポラ、パエシロマイセス、ペニシリウム、ファネロカエテ、フレビア、ピロマイセス、プレウロツス、シゾフィラム、タラロマイセス、サーモアスカス、チエラビア、トリポクラジウム、トラメテス、又はトリコデルマ細胞から成る群から選択される、段落３２〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【０４７０】
［４１］前記糸状菌細胞が、ｐｙｒＧ栄養要求性変異株である、段落３２〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【０４７１】
［４２］前記核酸構築物が、線状化した組換えベクター内に含まれている、段落３２〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【０４７２】
［４３］前記第１領域が、遺伝子又はその一部の５’側に位置し、且つ、前記第２領域が、糸状菌細胞の遺伝子又はその一部の３’側に位置する、段落３２〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【０４７３】
［４４］前記第１及び第２領域の両方が、糸状菌細胞の遺伝子内に位置している、段落３２〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【０４７４】
［４５］前記第１及び第２領域のうちの一方が、遺伝子内に位置し、且つ、前記第１及び第２領域のもう一方が、糸状菌細胞の遺伝子の５’又は３’側に位置する、段落３２〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【０４７５】
［４６］前記第１及び第２反復配列が、前記第１フランキング配列又は前記第２フランキング配列のいずれかと同一である、段落３２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【０４７６】
［４７］糸状菌細胞のゲノム内にポリヌクレオチドを導入するための核酸構築物であって、以下の：
（ｉ）第１の対象ポリヌクレオチド；
（ｉｉ）発現されるとドミナント・ポジティブ選択表現型を糸状菌細胞に与える、ドミナント・ポジティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第２ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）発現されるとネガティブ選択表現型を糸状菌細胞に与える、ネガティブ選択マーカーコード配列を含んでなる第３ポリヌクレオチド；
（ｉｖ）前記第１及び第２ポリヌクレオチドの５’側に位置する第１反復配列、及び前記第１及び第２ポリヌクレオチドの３’側に位置する第２反復配列、ここで、前記第１及び第２反復配列が同一の配列を含んでなり、且つ、対象ポリペプチドをコードする前記第１ポリヌクレオチドは前記第１反復の５’側に位置するか又は前記第２反復の３’側に位置する；並びに
（ｖ）構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の５’側に位置する第１フランキング配列、及び構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の３’側に位置する第２フランキング配列、ここで、前記第１フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第１領域と同一であり、且つ、前記第２フランキング配列は前記糸状菌細胞のゲノムの第２領域と同一である；
を含んでなり、ここで、前記第１及び第２フランキング配列は、それぞれ前記糸状菌細胞のゲノムの第１及び第２領域と分子間相同組換えを受けて、前記糸状菌細胞のゲノム内に前記核酸構築物を導入し；並びに前記第１及び第２反復配列は、分子内相同組換えを受けて、前記第２及び第３ポリヌクレオチドを欠失させることができる、前記核酸構築物。
【０４７７】
［４８］前記ドミナント・ポジティブ選択マーカーが、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）、ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｔ）、ブレオマイシン、ゼオシン、及びフレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）、アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）、ピューロマイシン‐Ｎ‐アセチル−トランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ）、ネオマイシン‐カナマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）、アセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子（ａｃｕＡ）、Ｄ‐セリン・デヒドラターゼ遺伝子（ｄｓｄＡ）、ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子（ｓＣ）、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ・サブユニット９遺伝子（ｏｌｉＣ）、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（Ｉ）（ａｐｈ（３’）Ｉ）遺伝子、並びにアミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ３’（ＩＩ）（ａｐｈ（３’）ＩＩ）遺伝子から成る群から選択される遺伝子のコード配列によってコードされる、段落４７に記載の核酸構築物。
【０４７８】
［４９］前記ネガティブ選択マーカーが、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）、オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）、及びシトシン・デアミナーゼ遺伝子（ｃｏｄＡ）から成る群から選択される遺伝子のコード配列によってコードされる、段落４７に記載の核酸構築物。
【０４７９】
［５０］前記ドミナント・ポジティブ選択マーカーが、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）のコード配列によってコードされる、段落４７に記載の核酸構築物。
【０４８０】
［５１］前記ネガティブ選択マーカーが、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のコード配列によってコードされる、段落４７に記載の核酸構築物。
【０４８１】
［５２］前記ドミナント・ポジティブ選択マーカーが、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）のコード配列によってコードされ、且つ、前記ネガティブ選択マーカーが、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のコード配列によってコードされる、段落４７に記載の核酸構築物。
【０４８２】
［５３］前記ｈｐｔコード配列を、Ｅ．コリのハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子から得る、段落４７に記載の核酸構築物。
【０４８３】
［５４］前記ｔｋコード配列を、単純ヘルペスウイルス１型遺伝子から得る、段落４７に記載の核酸構築物。
【０４８４】
［５５］前記第１領域が、遺伝子又はその一部の５’側に位置し、且つ、前記第２領域が、糸状菌細胞の遺伝子又はその一部の３’側に位置する、段落４７〜５４のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【０４８５】
［５６］前記第１及び第２領域の両方が、糸状菌細胞の遺伝子内に位置している、段落４７〜５４のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【０４８６】
［５７］前記第１及び第２領域のうちの一方が、遺伝子内に位置し、且つ、前記第１及び第２領域のもう一方が、糸状菌細胞の遺伝子の５’又は３’側に位置する、段落４７〜５４のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【０４８７】
［５８］前記第１及び第２反復配列が、前記第１フランキング配列又は前記第２フランキング配列のいずれかと同一である、段落４７〜５７のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【０４８８】
［５９］段落４７〜５８のいずれか１項に記載の核酸構築物を含んでなる組換えベクター。
【０４８９】
［６０］段落４７〜５８のいずれか１項に記載の核酸構築物を含んでなる組換え糸状菌細胞。
【０４９０】
［６１］ポリペプチドを製造する方法であって、以下のステップ：（ａ）ポリペプチドの産生を促す条件下、段落１〜１７のいずれか１項に従って得た糸状菌細胞を培養し；及び（ｂ）前記ポリペプチドを回収すること、を含んでなる前記方法。
【０４９１】
［６２］前記ポリペプチドが、糸状菌細胞にとって天然のものである、段落６１に記載の方法。
【０４９２】
［６３］前記ポリペプチドが、ポリヌクレオチドによってコードされた外来（異種）ポリペプチドであり、そして前記ポリヌクレオチドが、前記糸状菌細胞内に導入されている、段落６１に記載の方法。
【０４９３】
［６４］ポリペプチドを製造する方法であって、以下のステップ：（ａ）ポリペプチドの産生を促す条件下、段落３２〜４６のいずれか１項に従って得た糸状菌細胞を培養し；及び（ｂ）前記ポリペプチドを回収する、を含んでなる前記方法。
【０４９４】
［６５］前記ポリペプチドが、糸状菌細胞にとって天然のものである、段落６５に記載の方法。
【０４９５】
［６６］前記ポリペプチドが、ポリヌクレオチドによってコードされた外来（異種）ポリペプチドであり、そして前記ポリヌクレオチドが、前記糸状菌細胞内に導入されている、段落６５に記載の方法。
【０４９６】
［６７］以下の：（ａ）配列番号５２の成熟ポリペプチドに対して、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、よりいっそう好ましくは少なくとも９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９５％の同一性、そして最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ；（ｂ）好ましくは少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下、より好ましくは少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下、よりいっそう好ましくは少なくとも高いストリンジェンシー条件下、そして最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で配列番号５１の成熟ポリペプチド・コード配列又はその完全長の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされたオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ；及び（ｃ）配列番号５１の成熟ポリペプチド・コード配列に対して好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、よりいっそう好ましくは少なくとも９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９５％の同一性、そして最も好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドによってコードされたオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ、から成る群から選択される、単離されたオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ。
【０４９７】
［６８］配列番号５２、又はオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ活性を有するその断片を含んでなるか、又はそれから成る、段落６７に記載の単離されたオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ。
【０４９８】
［６９］段落６７又は６８に記載のオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【０４９９】
［７０］配列番号５１又はオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼ活性を有する断片をコードするその部分配列を含んでなる、又はそれから成る、段落６９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０５００】
［７１］段落６９又は７０に記載のポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物。
【０５０１】
［７２］段落６９又は７０に記載のポリヌクレオチドを含んでなる組換え発現ベクター。
【０５０２】
［７３］段落６９又は７０に記載のポリヌクレオチドを含んでなる組換え糸状菌細胞。
【０５０３】
［７４］オロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸構築物を含んでなる宿主細胞を、そのポリペプチドの産生を促す条件下で培養するステップ：を含んでなる、段落６７又は６８に記載のオロチジン‐５’‐リン酸デカルボキシラーゼを製造する方法。
【０５０４】
本明細書中に記載され、そして請求した発明は、本明細書中に開示される具体的な態様によって範囲を限定されるものではない。何故ならば、それらの態様は本発明のいくつかの観点を例示するものであるからである。いずれの同等の態様が本願発明の範囲内にあることが意図される。実際、本明細書中に示し、そして記載したものに加え、本発明の様々な修飾形態が前述の説明から当業者に明らかになるであろう。そういった修飾形態もまた、添付の請求項の範囲内にあるものとする。抵触する場合には、定義を含めた本開示が調整するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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