(57)【要約】本発明は、ＥＲＢＢ２のいずれかの側から１メガベース未満以内に位置するＥＲＢＢ２の増幅産物の少なくとも３の遺伝子、ひいては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  プローブセット  ２３４０４６＿ａｔ（配列番号３１）に対応する遺伝子の発現の分析に基づく、腫瘍（特に癌）中のＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２とも命名される）の変化の特定のための方法に関する。本発明は、さらに、上記遺伝子を検出するためのポリヌクレオチド配列を含む癌の分子キャラクタリゼーションにおいて有用なポリヌクレオチドライブラリー、および上記ライブラリーを含むキットに関する。【選択図】図１
2012511323.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織試料中の遺伝子の過剰発現または過小発現の分析に基づく腫瘍（特に癌）中のＥＲＢＢ２の変化を特定するための方法であって、前記分析は下記の工程を含む方法：
−  ＥＲＢＢ２の増幅産物の少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、または少なくとも８の遺伝子（これらの遺伝子はＥＲＢＢ２のいずれかの側から１メガベース未満以内に位置する）を含む、またはそれらからなる遺伝子群の発現の検出、あるいは
−  ＥＲＢＢ２の増幅産物の少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、または少なくとも８の遺伝子（これらの遺伝子はＥＲＢＢ２のいずれかの側から１メガベース未満以内に位置する）および配列番号３１に対応する遺伝子を含む、またはそれらからなる遺伝子群の発現の検出。
【請求項２】
前記遺伝子群は、下記の遺伝子：ＥＲＢＢ２、Ｃ１７ｏｒｆ３７、ＧＲＢ７、ＰＥＲＬＤ１、ＳＴＡＲＤ３、ＣＲＫＲＳ、ＦＧＦＲ２、ＺＲＡＮＢ１から選択される少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、または少なくとも８の遺伝子を含む、またはそれらからなる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子群は、ＥＲＢＢ２、Ｃ１７ｏｒｆ３７、ＧＲＢ７およびＰＥＲＬＤ１を含む、またはそれらからなる請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子群は、ＥＲＢＢ２、Ｃ１７ｏｒｆ３７、ＧＲＢ７、ＰＥＲＬＤ１およびＳＴＡＲＤ３を含む、またはそれらからなる請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子群は、ＥＲＢＢ２、Ｃ１７ｏｒｆ３７、ＧＲＢ７、ＰＥＲＬＤ１、ＳＴＡＲＤ３およびＣＲＫＲＳを含む、またはそれらからなる請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子群は、ＥＲＢＢ２、Ｃ１７ｏｒｆ３７、ＧＲＢ７、ＰＥＲＬＤ１、ＳＴＡＲＤ３、ＣＲＫＲＳおよび配列番号３１に対応する遺伝子を含む、またはそれらからなる請求項２記載の方法。
【請求項７】
前記検出は、前記遺伝子のｃＤＮＡ全配列もしくはｃＤＮＡサブシーケンス、または下記のポリヌクレオチド配列：配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２を有する組織試料由来のポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションによって実現される請求項１〜６いずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記検出は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２を含む、またはこれらからなるポリヌクレオチド配列群を有する組織試料由来のポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションによって実現される請求項１〜７いずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ａ）核酸試料と請求項７または８記載のポリヌクレオチド配列とを反応させる工程、および
ｂ）工程（ａ）の反応生成物を検出する工程
を含む請求項１〜８いずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸試料は、反応工程（ａ）の前に標識されている請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチド試料の標識は、放射性標識、比色法標識、酵素標識、分子増幅標識、生物発光標識または蛍光標識からなる群から選択される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記標識は酵素標識、例えば、ビオチン標識である請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記組織は、固定され、パラフィン封入され、または新鮮であり、または凍結されている請求項１〜１２いずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記発現は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってＲＮＡ転写物（単数または複数）の発現レベルを測定することによって特定される請求項１〜１３いずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
対照ポリヌクレオチド試料を入手する工程、前記対照試料と前記ポリヌクレオチド配列とを反応させる工程、対照試料反応生成物を検出する工程、および前記ポリヌクレオチド試料反応生成物の量と前記対照試料反応生成物の量とを比較する工程をさらに含む請求項９〜１４いずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記組織試料はヒト試料である請求項１〜１５いずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌は、乳癌、肺癌、結直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、卵嚢癌、頭頸部癌、食道癌、多形神経膠芽腫、肝細胞癌、胃癌、子宮頸癌、肝癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎癌、細胞癌、黒色腫、および脳癌からなる群から選択される請求項１〜１６いずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
組織試料は乳癌試料である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
細胞膜レベルでの前記ＥＲＢＢ２タンパク質の発現を特定するための請求項１〜１８いずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
癌患者、例えば、乳癌患者におけるＥＲＢＢ２の免疫組織化学的（ＩＨＣ）状態を特定するための請求項１〜１９いずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０いずれか１項に記載の方法の使用であって、前記方法は、癌の検出、診断、病期分類、モニタリングまたは癌のステージもしくは悪性度の追跡のために使用される使用。
【請求項２２】
患者の癌組織、例えば乳癌の組織試料由来の核酸に対する請求項１〜７いずれか１項に記載の方法の実行を含む、乳癌、肺癌、結直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、卵嚢癌、頭頸部癌、食道癌、多形神経膠芽腫、肝細胞癌、胃癌、子宮頸癌、肝癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎癌、細胞癌、黒色腫、および脳癌からなる群から選択される癌、例えば、乳癌を有する患者の治療をモニタリングするための請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
乳癌におけるＥＲＢＢ２の過剰発現の特定のための免疫組織化学的（ＩＨＣ）アッセイで、以前に状態が評価された患者（例えば、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ，ＡＳ）において２＋のスコアである患者）におけるＥＲＢＢ２遺伝子の発現状態の評価のための請求項２１または２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記モニタリングは、例えばＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）（トラスツズマブ）治療による抗ＥＲＢＢ２治療の臨床的な有効性に関する請求項２１または２２に記載の使用。
【請求項２５】
前記方法によって得られた遺伝子発現差異プロファイルの分析に基づく、癌（例えば乳癌）を有する患者または動物のための治療を決定するための請求項１〜２０いずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項２６】
請求項１〜６のいずれか１項で定義された遺伝子を検出するためのポリヌクレオチド配列群からなる、癌、例えば乳癌の分子キャラクタリゼーションにおいて有用なポリヌクレオチドライブラリー。
【請求項２７】
前記遺伝子のｃＤＮＡ全配列またはｃＤＮＡサブシーケンスからなる請求項２６記載のポリヌクレオチドライブラリー。
【請求項２８】
下記の配列からなる請求項２６記載のポリヌクレオチドライブラリー：配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２。
【請求項２９】
下記の配列からなる請求項２６記載のポリヌクレオチドライブラリー：配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２。
【請求項３０】
固形担体上に固定化された、請求項２６〜２９いずれか１項に記載のポリヌクレオチドライブラリー。
【請求項３１】
前記担体は、ナイロン（登録商標）膜、ニトロセルロース膜、ガラススライド、ガラスビーズ、ガラス担体上の膜またはシリコンチップを含む群から選択される請求項２６〜３０いずれか１項に記載のポリヌクレオチドライブラリー。
【請求項３２】
請求項２６〜３１いずれか１項に記載のポリヌクレオチドライブラリーを含むキット。
【請求項３３】
染色体１７ｑ１２−１７ｑ２１．１上のＥＲＢＢ２遺伝子座位の増幅を特定するための方法であって、前記被験者から入手した癌細胞を含む生物学的試料中の１以上のＲＮＡ転写物またはその発現産物の発現レベルを特定する工程を含み、前記ＲＮＡ転写物は、染色体１７ｑ１２−１７ｑ２１．１上のＥＲＢＢ２のいずれかの側から１メガベース未満以内に位置する遺伝子群から選択される遺伝子の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、または少なくとも８、またはより大きな遺伝子群のものである方法。
【請求項３４】
前記遺伝子（単数または複数）は、請求項６記載のものである請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ＥＲＢＢ２阻害剤による治療に対してＥＲＢＢ２陽性の癌と診断された被験者の反応を予測するための方法であって、前記被験者から入手した癌細胞を含む生物学的試料中の１以上のＲＮＡ転写物またはその発現産物の発現レベルを特定する工程を含み、前記ＲＮＡ転写物は、ＥＲＢＢ２および染色体１７ｑ１２−１７ｑ２１．１上のＥＲＢＢ２の近くに位置する遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子のものである方法。
【請求項３６】
前記１以上の遺伝子は、表１の遺伝子から選択される１、２、３、４、５、６、７または８の遺伝子の群である請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
配列番号３１の発現を検出する工程をさらに含む請求項３６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織試料中のポリヌクレオチド配列の過剰発現または過小発現の分析に基づき、腫瘍（特に癌）中のＥＲＢＢ２の変化を特定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
染色体１７のＥＲＢＢ２領域の増幅は、ＥＲＢＢ２（「ＨＥＲ２」とも命名される）癌遺伝子タンパク質の構成的過剰発現をもたらし、乳腺腫瘍のうちおよそ１５〜３０％における制御できない腫瘍増殖を刺激する。現在、ＥＲＢＢ２は、原発性および転移性の腫瘍の両方において、ＥＲＢＢ２タンパク質に対するモノクローナル抗体であるトラスツズマブ、またはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）についての臨床的有用性に対する予測マーカーであると考えられている。しかし、現在の試験方法は、２０％もの症例において不正確であり、これによって、一部の患者においてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）治療の有用性を逃してしまう可能性があり、または、一方で、別の患者においては不必要な治療を処方してしまう可能性がある。
【０００３】
現在、腫瘍は、下記の２つの主要な相補的な技術を用いて、ＥＲＢＢ２について試験される：腫瘍細胞中に発現したＥＲＢＢ２タンパク質を特定する免疫組織化学（ＩＨＣ）、および、細胞染色体中のＥＲＢＢ２  ＤＮＡのコピー数を定量化するｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）。ＥＲＢＢ２  ｍＲＮＡの量を定量化するいくつかのＲＴ−ＰＣＲアッセイもまた、近年開発されてきている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
頑強性、特異性および感受性の観点から、より高い性能を示す、腫瘍（特に癌）中のＥＲＢＢ２の変化を特定するための癌のシグネチャーに対するニーズが存在する。
【０００５】
出願人は、今回、ＥＲＢＢ２の状態を予測する新規なシグネチャーを特定した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、今回、全く予想外なことに、細胞膜レベルでＨＥＲ２タンパク質の発現と相関する、ＥＲＢＢ２の状態を予測するシグネチャーを発見した。試験を、一連の１５２の腫瘍について行い、１５２の腫瘍を総計した３つの別個のデータセットにおいて検証した。当該試験は、症例のうち９６％においてＩＨＣ法と相関し、あいまいなＩＨＣ症例のうち９５％を解決した。
【０００７】
驚いたことに、発明者らは、いくつかの遺伝子が、ＥＲＢＢ２  ＩＨＣと強力に相関することを見出した。
【０００８】
これらの遺伝子によって、ＩＨＣ法を行った後にＦＩＳＨスコアを行うことを要求する方法等の従来の２段階の方法と比較して改善され、網羅的な性能（感受性、特異性、頑強性等）を有する、１段階での、ＥＲＢＢ２の状態を予測するシグネチャーを得ることができる。
【０００９】
さらに、これらの遺伝子は、患者のエストロゲン受容体（ＥＲ）の状態と無関係である。そのため、本発明の遺伝子について試験を行う前に、ＥＲ試験を行う必要がない。
【００１０】
最終的に、発明者らは、これらの遺伝子がＥＲＢＢ２の増幅産物中に位置し、ＤＮＡ増幅についての情報をとらえることを見出した。
【００１１】
本発明の方法はまた、タンパク質レベル、ＲＮＡレベルおよびＤＮＡレベルの情報を調整する。換言すると、本発明の方法の使用によって得られる情報は、ゲノムレベル、トランスクリプトームレベル、およびプロテオミクスレベルでの状況を反映する。
【００１２】
そのため、本発明は、組織試料中の遺伝子の過剰発現または過小発現の分析に基づく腫瘍（特に癌）中のＥＲＢＢ２の変化を特定するための方法に関し、上記分析は下記の工程を含む：
−  ＥＲＢＢ２の増幅産物の少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、または少なくとも８の遺伝子（これらの遺伝子はＥＲＢＢ２のいずれかの側から１メガベース未満以内に位置する）を含む遺伝子群の発現の検出、あるいは
−  ＥＲＢＢ２の増幅産物の少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、または少なくとも８の遺伝子（これらの遺伝子はＥＲＢＢ２のいずれかの側から１メガベース未満以内に位置する）および配列番号３１に対応する遺伝子を含む遺伝子群の発現の検出、あるいは
−  ＥＲＢＢ２の増幅産物の少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、または少なくとも８の遺伝子（これらの遺伝子はＥＲＢＢ２のいずれかの側から１メガベース未満以内に位置する）からなる遺伝子群の発現の検出、あるいは
−  ＥＲＢＢ２の増幅産物の少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、または少なくとも８の遺伝子（これらの遺伝子はＥＲＢＢ２のいずれかの側から１メガベース未満以内に位置する）および配列番号３１に対応する遺伝子からなる遺伝子群の発現の検出。
【００１３】
本発明の特定の態様では、遺伝子群の発現の検出方法は、下記の遺伝子：ＥＲＢＢ２、Ｃ１７ｏｒｆ３７、ＧＲＢ７、ＰＥＲＬＤ１、ＳＴＡＲＤ３、ＣＲＫＲＳ、ＦＧＦＲ２、ＺＲＡＮＢ１から選択される少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、または少なくとも８の遺伝子を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。
【００１４】
本発明の別の特定の態様では、遺伝子群の発現の検出方法は、下記の遺伝子：ＥＲＢＢ２、Ｃ１７ｏｒｆ３７、ＧＲＢ７、ＰＥＲＬＤ１、ＳＴＡＲＤ３、ＣＲＫＲＳ、ＦＧＦＲ２、ＺＲＡＮＢ１および配列番号３１に対応する遺伝子から選択される少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、または少なくとも８の遺伝子を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。
【００１５】
本発明の特定の実施態様では、当該遺伝子群は、ＥＲＢＢ２、Ｃ１７ｏｒｆ３７およびＧＲＢ７を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。
【００１６】
別の本発明の特定の実施態様では、当該遺伝子群は、ＥＲＢＢ２、Ｃ１７ｏｒｆ３７、ＧＲＢ７および配列番号３１に対応する遺伝子を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。
【００１７】
本発明の別の特定の態様では、当該遺伝子群は、ＥＲＢＢ２、Ｃ１７ｏｒｆ３７、ＧＲＢ７およびＰＥＲＬＤ１を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。
【００１８】
本発明の別の特定の態様では、当該遺伝子群は、ＥＲＢＢ２、Ｃ１７ｏｒｆ３７、ＧＲＢ７およびＰＥＲＬＤ１および配列番号３１に対応する遺伝子を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。
【００１９】
本発明の別の特定の態様では、当該遺伝子群は、ＥＲＢＢ２、Ｃ１７ｏｒｆ３７、ＧＲＢ７、ＰＥＲＬＤ１およびＳＴＡＲＤ３を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。
【００２０】
本発明の別の特定の態様では、当該遺伝子群は、ＥＲＢＢ２、Ｃ１７ｏｒｆ３７、ＧＲＢ７、ＰＥＲＬＤ１およびＳＴＡＲＤ３および配列番号３１に対応する遺伝子を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。
【００２１】
本発明の別の態様では、当該遺伝子群は、ＥＲＢＢ２、Ｃ１７ｏｒｆ３７、ＧＲＢ７、ＰＥＲＬＤ１、ＳＴＡＲＤ３およびＣＲＫＲＳを含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。
【００２２】
本発明の別の態様では、当該遺伝子群は、ＥＲＢＢ２、Ｃ１７ｏｒｆ３７、ＧＲＢ７、ＰＥＲＬＤ１、ＳＴＡＲＤ３およびＣＲＫＲＳおよび配列番号３１に対応する遺伝子を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。
【００２３】
上記の遺伝子を検出できる配列は、いずれかの種類の核酸のものであってよく、当業者であれば組織試料中の特定の遺伝子を検出する方法を確実に知っている。
【００２４】
本発明の特定の実施態様では、この検出は、上記遺伝子のｃＤＮＡ全配列もしくはｃＤＮＡサブシーケンス、またはプライマー、または下記のポリヌクレオチド配列：配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２と、組織試料由来のポリヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションによって実現されてもよい。
【００２５】
別の本発明の特定の実施態様では、この検出は、下記の配列：配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２のうちの少なくとも１、または少なくとも２、または少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７を含み、これらからなるポリヌクレオチド配列の群と、組織試料由来のポリヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションによって実現されてもよい。
【００２６】
配列番号１７〜配列番号３２のポリヌクレオチド配列は、表１中に示される遺伝子の核酸試料と反応できるポリヌクレオチド配列（「プローブセット」とも呼ばれる）である。
【００２７】
【表１−１】
2012511323.tif 000003
【００２８】
【表１−２】
2012511323.tif 000004
【００２９】
上記の配列は、下記のものである。
【００３０】
【表２−１】
2012511323.tif 000005
【００３１】
【表２−２】
2012511323.tif 000006
【００３２】
【表２−３】
2012511323.tif 000007
【００３３】
【表２−４】
2012511323.tif 000008
【００３４】
【表２−５】
2012511323.tif 000009
【００３５】
【表３−１】
2012511323.tif 000010
【００３６】
【表３−２】
2012511323.tif 000011
【００３７】
【表３−３】
2012511323.tif 000012
【００３８】
【表３−４】
2012511323.tif 000013
【００３９】
【表４−１】
2012511323.tif 000014
【００４０】
【表４−２】
2012511323.tif 000015
【００４１】
【表４−３】
2012511323.tif 000016
【００４２】
【表５】
2012511323.tif 000017
【００４３】
【表６−１】
2012511323.tif 000018
【００４４】
【表６−２】
2012511323.tif 000019
【００４５】
【表７−１】
2012511323.tif 000020
【００４６】
【表７−２】
2012511323.tif 000021
【００４７】
【表７−３】
2012511323.tif 000022
【００４８】
【表８−１】
2012511323.tif 000023
【００４９】
【表８−２】
2012511323.tif 000024
【００５０】
【表９−１】
2012511323.tif 000025
【００５１】
【表９−２】
2012511323.tif 000026
【００５２】
【表９−３】
2012511323.tif 000027
【００５３】
【表９−４】
2012511323.tif 000028
【００５４】
【表９−５】
2012511323.tif 000029
【００５５】
【表９−６】
2012511323.tif 000030
【００５６】
【表９−７】
2012511323.tif 000031
【００５７】
【表１０−１】
2012511323.tif 000032
【００５８】
【表１０−２】
2012511323.tif 000033
【００５９】
【表１０−３】
2012511323.tif 000034
【００６０】
【表１０−４】
2012511323.tif 000035
【００６１】
【表１０−５】
2012511323.tif 000036
【００６２】
【表１０−６】
2012511323.tif 000037
【００６３】
【表１０−７】
2012511323.tif 000038
【００６４】
【表１１−１】
2012511323.tif 000039
【００６５】
【表１１−２】
2012511323.tif 000040
【００６６】
【表１１−３】
2012511323.tif 000041
【００６７】
【表１１−４】
2012511323.tif 000042
【００６８】
【表１２−１】
2012511323.tif 000043
【００６９】
【表１２−２】
2012511323.tif 000044
【００７０】
【表１２−３】
2012511323.tif 000045
【００７１】
【表１２−４】
2012511323.tif 000046
【００７２】
【表１３−１】
2012511323.tif 000047
【００７３】
【表１３−２】
2012511323.tif 000048
【００７４】
【表１３−３】
2012511323.tif 000049
【００７５】
【表１３−４】
2012511323.tif 000050
【００７６】
【表１４】
2012511323.tif 000051
【００７７】
【表１５】
2012511323.tif 000052
【００７８】
【表１６】
2012511323.tif 000053
【００７９】
【表１７】
2012511323.tif 000054
【００８０】
【表１８】
2012511323.tif 000055
【００８１】
【表１９】
2012511323.tif 000056
【００８２】
【表２０】
2012511323.tif 000057
【００８３】
【表２１】
2012511323.tif 000058
【００８４】
【表２２】
2012511323.tif 000059
【００８５】
【表２３】
2012511323.tif 000060
【００８６】
【表２４】
2012511323.tif 000061
【００８７】
【表２５】
2012511323.tif 000062
【００８８】
【表２６】
2012511323.tif 000063
【００８９】
【表２７】
2012511323.tif 000064
【００９０】
【表２８】
2012511323.tif 000065
【００９１】
【表２９】
2012511323.tif 000066
【００９２】
これらのプローブセットは、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（ＨＧ−Ｕ１３３＿ＰＬＵＳ＿２）プローブである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ａｒｒａｙｓ／ｓｐｅｃｉｆｉｃ／ｈｇｕ１３３ｐｌｕｓ．ａｆｆｘ）。
【００９３】
配列番号１および２は、ＥＲＢＢ２遺伝子の２つのアイソフォームを示す。これらの２つのアイソフォームは、プローブセット配列番号１７と対応する。
【００９４】
配列番号５および６は、ＧＲＢ７遺伝子の２つのアイソフォームを示す。これらの２つのアイソフォームは、プローブセット配列番号２０と対応する。
【００９５】
配列番号８および９は、ＣＲＫＲＳ遺伝子の２つのアイソフォームを示す。これらの２つのアイソフォームは、プローブセット配列番号２５と対応する。
【００９６】
配列番号１０および１１は、ＦＧＦＲ２遺伝子の２つのアイソフォームを示す。これらの２つのアイソフォームは、プローブセット配列番号２７と対応する。
【００９７】
本発明の特定の実施態様によれば、本発明の方法は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０を含む、またはそれらからなるポリヌクレオチド配列群のハイブリダイゼーションによって実現されてもよい。
【００９８】
本発明の別の特定の実施態様によれば、本発明の方法は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０および配列番号３１を含む、またはそれらからなるポリヌクレオチド配列群のハイブリダイゼーションによって実現されてもよい。
【００９９】
本発明の別の特定の実施態様によれば、本発明の方法は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１，および配列番号２２を含む、またはそれらからなるポリヌクレオチド配列群のハイブリダイゼーションによって実現されてもよい。
【０１００】
本発明の別の特定の実施態様によれば、本発明の方法は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号３１を含む、またはそれらからなるポリヌクレオチド配列群のハイブリダイゼーションによって実現されてもよい。
【０１０１】
本発明の別の特定の実施態様によれば、本発明の方法は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４を含む、またはそれらからなるポリヌクレオチド配列群のハイブリダイゼーションによって実現されてもよい。
【０１０２】
本発明の別の特定の実施態様によれば、本発明の方法は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号３１を含む、またはそれらからなるポリヌクレオチド配列群のハイブリダイゼーションによって実現されてもよい。
【０１０３】
本発明の別の特定の実施態様によれば、本発明の方法は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２を含む、またはそれらからなるポリヌクレオチド配列群のハイブリダイゼーションによって実現されてもよい。
【０１０４】
本発明の別の特定の実施態様によれば、本発明の方法は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２を含む、またはそれらからなるポリヌクレオチド配列群のハイブリダイゼーションによって実現されてもよい。
【０１０５】
有利には、本発明の方法は、下記の工程を含む：
ａ）核酸試料と上記のポリヌクレオチド配列群とを反応させる工程、および
ｂ）工程（ａ）の反応生成物を検出する工程。
【０１０６】
有利には、当該核酸試料は、反応工程（ａ）の前に標識されていてもよい。
【０１０７】
有利には、当該ポリヌクレオチド試料の標識は、放射性標識、比色法標識、酵素標識（例えばビオチン標識）、分子増幅標識、生物発光標識または蛍光標識からなる群から選択されてもよい。
【０１０８】
有利には、当該組織は、固定され、パラフィン封入され、または新鮮であってもよく、または凍結されていてもよい。
【０１０９】
本発明の特定の態様の全てについて、組織試料中のポリヌクレオチド配列の発現は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってＲＮＡ転写物（単数または複数）の発現レベルを測定することによって特定されてもよい。
【０１１０】
本発明の特定の態様の全てについて、当該方法は、対照ポリヌクレオチド試料を入手する工程、上記対照試料と上記ポリヌクレオチド配列とを反応させる工程、対照試料反応生成物を検出する工程および上記ポリヌクレオチド試料反応生成物の量と上記対照試料反応生成物の量とを比較する工程をさらに含んでいてもよい。
【０１１１】
有利には、当該方法における組織試料はヒト試料であってもよい。
【０１１２】
有利には、本発明の方法は、乳癌、肺癌、結直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、卵嚢癌、頭頸部癌、食道癌、多形神経膠芽腫、肝細胞癌、胃癌、子宮頸癌、肝癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎癌、細胞癌、黒色腫、および脳癌からなる群から選択される癌を検出できる。
【０１１３】
有利には、当該組織試料は乳癌試料でもよい。
【０１１４】
有利には、本発明の方法は、細胞膜レベルで上記ＥＲＢＢ２タンパク質の発現を特定できる。
【０１１５】
有利には、本発明の方法は、癌患者、例えば、乳癌患者におけるＥＲＢＢ２の免疫組織化学的（ＩＨＣ）状態を特定できる。
【０１１６】
本発明の別の対象は、癌の検出、診断、病期分類、モニタリングまたは癌のステージもしくは悪性度の追跡のための本発明の方法の使用である。
【０１１７】
上記のポリヌクレオチド配列群のいずれも、本発明の使用のために使用してもよい。
【０１１８】
有利には、この使用は、乳癌、肺癌、結直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、卵嚢癌、頭頸部癌、食道癌、多形神経膠芽腫、肝細胞癌、胃癌、子宮頸癌、肝癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎癌、細胞癌、黒色腫、および脳癌からなる群から選択される癌、例えば、乳癌を有する患者の治療のモニタリングを可能にし、患者の癌組織、例えば乳癌の組織試料由来の核酸に対する、いずれかの態様における当該方法の実行を含む。
【０１１９】
有利には、本発明の方法の使用によって、乳癌におけるＥＲＢＢ２の過剰発現の特定のための免疫組織化学的（ＩＨＣ）アッセイで、以前に明確に評価できなかった状態の患者、（例えば、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ，ＡＳ）において２＋のスコアである患者）におけるＥＲＢＢ２遺伝子の発現状態の評価が可能である。
【０１２０】
換言すると、この方法の使用は、ＩＨＣアッセイについてあいまいな結果を示す患者のＥＲＢＢ２遺伝子の発現状態の評価を可能にする。
【０１２１】
実際、Ｈｅｒｃｅｐｔｅｓｔ（商標）から得られる２＋のスコアによっては、ＥＲＢＢ２の状態を特定することはできない。
【０１２２】
有利には、当該モニタリングは、例えばＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）（トラスツズマブ）治療による抗ＥＲＢＢ２治療の臨床的な有効性に関する。
【０１２３】
有利には、当該方法の使用により、上記方法によって得られた遺伝子発現差異プロファイルの分析に基づき、癌（例えば乳癌）を有する患者または動物のための治療の特定が可能になる。
【０１２４】
本発明の別の対象は、上記で定義された遺伝子の検出のためのポリヌクレオチド配列を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい、癌、例えば乳癌の分子キャラクタリゼーションにおいて有用なポリヌクレオチドライブラリーである。
【０１２５】
有利には、当該ポリヌクレオチドライブラリーは、上記遺伝子のｃＤＮＡ全配列またはｃＤＮＡサブシーケンスを含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。
【０１２６】
有利には、当該ポリヌクレオチドライブラリーは、上記の遺伝子を検出できるプライマーを含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。
【０１２７】
有利には、当該ポリヌクレオチドライブラリーは、上記のプローブセット群のうちのいずれかを含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。
【０１２８】
有利には、当該ポリヌクレオチドライブラリーは、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。
【０１２９】
これらの実現の方法の全てにおいて、当該ポリヌクレオチドライブラリーは、固形担体上に固定化されていてもよい。
【０１３０】
この場合、当該担体は、ナイロン（登録商標）膜、ニトロセルロース膜、ガラススライド、ガラスビーズ、ガラス担体上の膜またはシリコンチップを含む群から選択されてもよい。
【０１３１】
本発明の別の対象は、上記で定義された本発明の遺伝子（単数または複数）および／または配列（単数または複数）の発現を検出できるポリヌクレオチド配列、例えば、プライマーおよびプローブを含むキットである。
【０１３２】
本発明の特定の実施態様では、当該キットは、上記のポリヌクレオチドライブラリーを含む。
【０１３３】
上記のポリヌクレオチド配列群のいずれかを本発明のキットにおいて使用してもよい。
【０１３４】
当該キットは、本発明の方法を実施するために適した（１）核酸抽出バッファー／試薬および手順；（２）逆転写バッファー／試薬および手順；および（３）ｑＰＣＲバッファー／試薬および手順のうちの１以上を含んでいてもよい。
【０１３５】
当該キットはまた、１）データ検索および／または分析ソフトウェアを含んでいてもよい。
【０１３６】
当該キットは、研究室において、または医師が使用してもよく、高い再現性の試料処理を保証するため、試料の試験（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍｓ  ３０００Ｄ×２（ＧＣＳ３０００Ｄ×２）上で、ＤＮＡＶｉｓｉｏｎ  ＳＡ（ベルギー、Ｇｏｓｓｅｌｉｅｓ）のＩＳＯ−１７０２５  ＭａｐＱｕａｎｔ  Ｄｘ（商標）Ｌａｂ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）のために研究室に送付してもよい。
【０１３７】
本発明の別の態様は、被験者から得られた癌細胞中のＲＮＡ転写物またはその発現産物の基準化された発現レベルの概要を含む報告に関し、上記ＲＮＡ転写物は、上記の群のうちの１つから選択される遺伝子セットのＲＮＡである。
【０１３８】
本発明の別の態様は、被験者から得られた癌細胞中のＲＮＡ転写物またはその発現産物の基準化された発現レベルの特定であって、上記ＲＮＡ転写物は、上記の遺伝子群のＲＮＡ転写物である特定に基づく、抗ＥＲＢＢ２治療（例えばＥＲＢＢ２抗体）による治療に対する被験者の反応の予測を含む報告に関する。
【０１３９】
本発明の別の対象は、上記被験者から入手した癌細胞を含む生物学的試料中の１以上のＲＮＡ転写物またはその発現産物の発現レベルを特定する工程であって、上記ＲＮＡ転写物は、染色体１７ｑ１２−１７ｑ２１．１上のＥＲＢＢ２遺伝子のいずれかの側から１メガベース未満以内に位置する遺伝子群から選択される少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、または少なくとも８またはより大きな遺伝子群のものである工程を含む、染色体１７ｑ１２−１７ｑ２１．１上のＥＲＢＢ２遺伝子座位の増幅を定量するための方法である。
【０１４０】
当該方法において、当該遺伝子（単数または複数）は、ＥＲＢＢ２、Ｃ１７ｏｒｆ３７、ＧＲＢ７、ＰＥＲＬＤ１、ＳＴＡＲＤ３およびＣＲＫＲＳから選択される。有利には、当該方法は、配列番号３１のポリヌクレオチド配列と組織試料とのハイブリダイゼーションをさらに含む。
【０１４１】
本発明の別の対象は、上記被験者から入手した癌細胞を含む生物学的試料中の１以上のＲＮＡ転写物またはその発現産物の発現レベルを特定する工程であって、上記ＲＮＡ転写物は、ＥＲＢＢ２および染色体１７ｑ１２−１７ｑ２１．１上のＥＲＢＢ２の近くに位置する遺伝子、特に上記の遺伝子群、とりわけ表１の遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子のものである工程を含む、ＥＲＢＢ２阻害剤による治療に対してＥＲＢＢ２陽性の癌と診断された被験者の反応を予測するための方法である。
【０１４２】
この方法は、配列番号３１の発現を検出する工程をさらに含んでいてもよい。
【０１４３】
特段の記載がない限り、技術用語は、従来の用法に従って使用される。
【０１４４】
本発明の様々な実施態様の概説を容易にするために、特定の用語についての下記の説明が与えられる。
【０１４５】
「ポリヌクレオチド配列の過剰発現」とは、特定のポリヌクレオチド配列の発現レベルが参照ポリヌクレオチド配列の発現レベルよりも高いことを意味する。
【０１４６】
「ポリヌクレオチド配列の過小発現」とは、特定のポリヌクレオチド配列の発現レベルが参照ポリヌクレオチド配列の発現レベルよりも低いことを意味する。
【０１４７】
核酸配列についての定量的または相対的なデータを収集する方法は数多く存在し、分析的方法論は、乳癌を患っているメスの哺乳類の臨床成績についての評価における核酸配列の発現の有用性に影響しない。生物学的試料中の核酸の発現量を定量するための方法は、当業者に周知である。このような方法の例として、ノーザンブロット法、ｃＤＮＡアレイ、オリゴアレイ、定量的逆転写ＰＣＲ、例えばリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を挙げることができる。
【０１４８】
本発明において、用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖であり、任意に、合成の、非天然の、または変化したヌクレオチド塩基を含むＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指す。ＤＮＡのポリマーの形態であるポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１以上の断片で構成されていてもよい。
【０１４９】
検出は、好ましくは、各核酸配列についての相対的な発現（転写）レベルの算出／定量化を含む。
【０１５０】
「ＥＲＢＢ２の増幅産物」は、本発明の意味において、染色体１７ｑ１２−１７ｑ２１．１上の広い領域の増幅を意味し、これは、乳腺腫瘍中で頻繁に増幅される多くの遺伝子を含む。この増幅産物は、特にＥＲＢＢ２遺伝子を含む。
【０１５１】
「遺伝子」は、本発明の意味において、ポリヌクレオチド配列、例えば、単離されたポリヌクレオチド配列（デオキシリボ核酸（ＤＮＡ））および、適切な場合には、リボ核酸（ＲＮＡ）等を意味する。この配列は、遺伝子の全配列、または当該全遺伝子配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％同一であってもよい遺伝子のサブシーケンスであってもよく、本発明の分析の方法を行うのに適したものであってもよい。当業者は、日常的な実験にあてはめることによって遺伝子の位置および長さを選択してもよい。当該用語はまた、等価物として、ヌクレオチド類似体由来のＲＮＡまたはＤＮＡの類似体、ならびに、記載された実施態様で適用可能であるように、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖のポリヌクレオチドを含むように理解されなければならない。ＥＳＴ、染色体、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡは、核酸と呼ばれ得る分子の代表的な例である。ＤＮＡは、上記核酸試料から得てもよく、ＲＮＡは上記ＤＮＡの転写によって得てもよい。さらに、ｍＲＮＡは、上記核酸試料から単離されてもよく、ｃＤＮＡは上記ｍＲＮＡの逆転写によって得てもよい。
【０１５２】
「からなるポリヌクレオチド配列群」は、本発明の意味において、上記ポリヌクレオチド配列を正確に含み、かつ、ポリヌクレオチド配列が全く付加されておらず、また、ポリヌクレオチド配列群のポリヌクレオチド配列が欠けてもいないポリヌクレオチド配列群を意味する。
【０１５３】
「遺伝子のｃＤＮＡ全配列」は、本発明の意味において、当該遺伝子をコードするＤＮＡ配列の転写から得られるｃＤＮＡ配列を意味する。
【０１５４】
「遺伝子のｃＤＮＡサブシーケンス」は、本発明の意味において、ストリンジェントな条件下で特異的なハイブリダイゼーションが可能となる遺伝子のｃＤＮＡ全配列の核酸の配列（例として、１０ヌクレオチド超、好ましくは１５ヌクレオチド超、最も好ましくは２５ヌクレオチド超、例として、５０ヌクレオチド超または１００ヌクレオチド超）を意味する。
【０１５５】
被験者から単離され、工程（ａ）で入手されるポリヌクレオチド試料は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡであってもよい。患者から単離された上記ポリヌクレオチド試料はまた、ｍＲＮＡの逆転写によって得られたｃＤＮＡまたはｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡに対して特異的なプローブの特異的なハイブリダイゼーション後のライゲーションの生成物に対応していてもよい。
【０１５６】
配列番号１７〜配列番号３２の配列は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ配列（以下、「プローブセット配列」とも呼ばれる）である。
【０１５７】
「核酸試料とポリヌクレオチド配列との反応」は、本発明の意味において、遺伝子のｃＤＮＡ全配列またはｃＤＮＡサブシーケンスまたは遺伝子のプライマーまたはプローブセット配列と、対応する遺伝子のポリヌクレオチド配列と、のハイブリダイゼーションが可能な条件で、核酸試料と、ポリヌクレオチド配列と、を接触させることを意味する。
【０１５８】
動物は、ヒト、マウス、ラット、モルモット、サル、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、またはウシ等の動物、好ましくはヒト、最も好ましくは女性に対応する。
【０１５９】
生物学的試料は、細胞、組織試料、または乳癌からの生検等の全ての生物学的物質を意味する。
【０１６０】
本願明細書で使用される「対照」は、細胞、組織試料または乳房からの生検由来の１以上の生物学的試料に対応する。上記対照は、試験されるメスの哺乳類または被験者と同一であってもよく、または異なっていてもよい、試験されるものと同一のメスの哺乳類、または別のメス、好ましくは同一の種、またはメスの哺乳類、好ましくは同一の種の集団から得られていてもよい。上記対照は、細胞、細胞株、組織試料または乳房由来の生検からの生物学的試料に対応していてもよい。
【０１６１】
ＤＮＡアレイまたはＲＮＡアレイは、固形担体または基材（ナイロン（登録商標）膜、ガラススライド、ガラスビーズまたはシリコンチップ等）上に規則正しい順序でスポットされた多数の各ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子からなる。アレイ上の各ＤＮＡまたはＲＮＡのスポットの大きさに応じて、ＤＮＡアレイまたはＲＮＡアレイは、マイクロアレイ（各ＤＮＡまたはＲＮＡのスポットは、２５０ミクロン未満の直径を有する）およびマクロアレイ（スポットの直径は３００ミクロン超である）として分類できる。使用される固形基材の大きさが小さい場合、アレイは、ＤＮＡチップまたはＲＮＡチップとも呼ばれる。使用されるスポット技術に応じて、ガラスマイクロアレイ上のスポットの数は何百から何千に及ぶ可能性がある。
【０１６２】
典型的に、ＤＮＡアレイまたはＲＮＡアレイによる遺伝子発現のモニタリングの方法は下記の工程を含む：
ａ）被験者からポリヌクレオチド試料を得る工程、および
ｂ）工程（ａ）において得られたポリヌクレオチド試料と、固形担体上に固定化されたプローブとを反応させる工程であって、上記プローブは、前述の核酸配列を有するポリヌクレオチドからなる工程、
ｃ）工程（ｂ）の反応生成物を検出する工程。
【０１６３】
本発明において、用語「担体上に固定化された」は、共有結合、水素結合、イオン相互作用、疎水性相互作用等による付着等の、直接的または間接的な担体への結合を意味する。
【０１６４】
好ましくは、工程（ａ）で得られたポリヌクレオチド試料は、工程（ｂ）での、固形担体上に固定化されたプローブとのその反応の前に標識される。このような標識は、当業者に周知であり、放射性標識、比色法標識、酵素標識、例えばビオチン標識、分子増幅標識、生物発光標識、電気化学的標識または蛍光標識が挙げられるが、これらに制限されない。
【０１６５】
有利には、工程（ｃ）の反応生成物は、対照試料に対する上記反応生成物のさらなる比較によって定量化される。
【０１６６】
検出は、好ましくは、各核酸配列についての相対的な発現（転写）レベルの算出／定量化を含む。
【０１６７】
次いで、前述の各核酸配列の相対的な発現レベルの特定により、癌（例えば乳癌）を患っている被験者（すなわちメスの哺乳類）の臨床成績を、本発明の方法によって評価することができる。
【０１６８】
癌を患っている患者の臨床成績の評価方法は、さらに、生物学的試料、好ましくは  乳癌の組織または細胞を、患者から採取する工程を含んでいてもよい。サンプリングのこのような方法は、当業者に周知であり、例として、手術を挙げることができる。
【０１６９】
提供される方法はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法に対応していてもよく、これはこのようなサンプリングの工程を含まない。
【０１７０】
「発現差異プロファイル」は、本発明の意味において、対照組織、すなわち癌のない乳房組織中の遺伝子の発現レベルと、分析された試料中の同一の遺伝子の発現レベルとの差異を意味する。
【０１７１】
「癌の悪性度」は、本発明の意味において、例えば、癌の増殖率または転移する可能性を意味する。いわゆる「高悪性度の癌」は、迅速に増殖もしくは転移し、または、全体の健康状態および生活の質に顕著に影響する。
【０１７２】
「特異性」は、本発明の意味において、方法、特に診断方法についての、疾病（または健康問題）が実際に存在しない場合に、これを除外する能力を意味する。当該特異性は、方法または試験の結果が陰性である健康な人の割合であり、下記のように算出される：真陰性／（真陰性＋偽陽性）。
【０１７３】
「感受性」は、本発明の意味において、方法、特に診断方法についての、疾病（または健康問題）が実際に存在する場合に、これを検出する能力を意味する。当該感受性は、方法についての結果が陽性である全ての病人の割合であり、下記のように算出される：真陽性／（真陽性＋偽陰性）。
【０１７４】
「頑強性」は、本発明の意味において、手順または環境における変化に耐えられる質を意味する。これは、操作環境において、変化（予測できない変化である場合もある）について、良好に対処できる方法、または遺伝子群を定める。
【０１７５】
当該方法、および特に本発明のポリヌクレオチド配列群は、交差検定によって構築されたため、「頑強」である。これは、さらに、病理学者の主観的解釈とは無関係である。
【０１７６】
ＥＲＢＢ２＋またはＥＲＢＢ２−の観点での患者の分類のために、当業者は、本発明の遺伝子の発現の測定を可能にする全ての方法を使用できる。例えば、当業者は、Ｖａｋｎｉｋら（Ｖａｐｎｉｋ、１９９８、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｔｈｅｏｒｙ．  Ｖ．Ｎ．  Ｖａｐｎｉｋ．Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）が記載したＳＶＭ法を使用することができる。この文献の内容は参照により本願明細書に組み入れられる。
【０１７７】
出願人によって行われた研究に関連して実施された実験研究についての記載（これは、本質的に制限するものとして解釈してはならない）を読むことで、本発明はより明確に理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】「結果：ＨＥＲ２−」は、ＨＥＲ２スコアに応じたＨＥＲ２の状態の可能性を示す。当該試験は、予測スコア（ｘ軸）の関数として、ＨＥＲ２−またはＨＥＲ２＋の腫瘍を有するオッズ（ｙ軸）を回帰する。オッズ曲線は、１５％のＨＥＲ２＋を有する３２６腫瘍の対照セットを使用して較正した。３：１のオッズ比の閾値（灰色の領域の外側）を使用し、９５％の２＋ＩＨＣの腫瘍を明確に分類できた。
【図２】「品質：ＯＫ」は、ＨＥＲ２スコアの偏差を示す。品質管理は、品質指数（ｘ軸）の関数として、ＨＥＲ２予測スコアの最大の予測される偏差（ｙ軸）を回帰する。関数は、様々な条件にさらされた４２の異なる乳腺腫瘍試料とハイブリダイスした１３８のマイクロアレイを使用して較正した。品質指数（ｐ値）は、ＨＥＲ２予測モデルを構成する特に６のｍＲＮＡについてのチップ内の再現性を検定する。
【実施例】
【０１７９】
（実施例１）
（物質および方法）
当該試験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｏｌｉ  Ｃａｌｍｅｔｔｅｓ（ＩＰＣ）ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒから得た１５２の腫瘍試料について行った：１２６  ＩＨＣ  ０、２６  ＩＨＣ  ３＋。これらの腫瘍を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｐｌａｔｆｏｒｍ、ＨＧ−Ｕ１３３  ｐｌｕｓ  ２．０  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）で特性付けた。
【０１８０】
ＨＥＲ２のシグネチャーは、ＲＦＥ−ＳＶＭ（Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ−Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅ）分類法（Ｇｕｙｏｎら、２００２；Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ、４６、３８９−４２２）によって、試験（ｌｅａｒｎｉｎｇ）セットとして所定のセットを使用することによって得た。
【０１８１】
Ｒ  Ｍａｇｐｉｅ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐａｃｋａｇｅ（Ａｍｂｒｏｉｓｅ、ＭｃＬａｃｈｌａｎ）を使用した。選択の頑強性を保証するため、交差検定の手順を使用した。最初に、非存在のプローブセット（全腫瘍セット上で発現レベルが５．５未満）および不変量（０．５未満の標準偏差）を選別した。これらの２つのプローブセットの分類は実際に分類にノイズをもたらす傾向があった。
【０１８２】
（結果）
ＲＦＥ−ＳＶＭアルゴリズムは、１６のプローブセット（表１の配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２）について最適なシグネチャーを与えた。
【０１８３】
ともに座位１０ｑ２６上にあるＺＲＡＮＢ１およびＦＧＦＲ２以外は、この１６のプローブセットは、１７ｑ１２−１７ｑ２１．１座位上に位置する。
【０１８４】
１６のプローブセット（表１の配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２）のうち、下記の１４のプローブセットを選択した。
【０１８５】
最初に、性能を、腫瘍の３つの別個のセットについて、下記の臨床的基準に従って評価した。
【０１８６】
【表３０】
2012511323.tif 000067
【０１８７】
１６のプローブセットを使用して、性能はすでに非常に良好である（表２）。
【０１８８】
【表３１】
2012511323.tif 000068
【０１８９】
ＺＲＡＮＢ１およびＦＧＦＲ２の役割を理解するために、増幅産物の１４のプローブセットを試験することを選択した。その際に、性能を包括的に改善し、１４のプローブセットの群のシグネチャーを検証した。
【０１９０】
【表３２】
2012511323.tif 000069
【０１９１】
この遺伝子の収集物は、ＣＲＫＲＳからＧＲＢ７のＥＲＢＢ２の増幅産物を網羅しているため、特に関連がある。
【０１９２】
１４のプローブセットのシグネチャーと、先行技術のシグネチャーまたは１つだけのＡＲＮｍとを比較した場合、感受性、特異性および頑強性の観点で改善されていることが認められた。
【０１９３】
【表３３】
2012511323.tif 000070
【０１９４】
（結論）
本発明の方法は、１７ｑ１２座位の６の遺伝子および、１７ｑ座位の配列の１つの未知の配列に対応する１４のプローブセットの発現に基づく、ＳＶＭモデルである。
【０１９５】
当該試験は、１５２の腫瘍について行い、１５２の腫瘍の３つの別個のセットについて検証した。当該試験は、９６％の症例においてＩＨＣ法と相関し、９５％の症例においてあいまいな症例（ＩＨＣ２＋）を解決した。９１％超の症例におけるＦＩＳＨとの一致も認められたが、限られた数の腫瘍（ｎ＝１１）におけるものだった。
【０１９６】
（実施例２）
（物質および方法）
下記の臨床的基準に従い、腫瘍の５の別個のセットについて、１４のプローブセットのシグネチャーを検証した。
【０１９７】
【表３４】
2012511323.tif 000071
【０１９８】
これらの５の別個のセットから、２８２の腫瘍を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ、２００４）によって定められ、当該技術分野において一般的に利用されている基準（平均的バックグラウンド、平均的ノイズ、尺度因子、存在する割合、ｇａｐｄｈ、β−アクチンおよびＲＮＡの分解の勾配）に従い、高品質なゲノムの特性に基づいて選択した。閾値として、２つの標準偏差（分布が正規である場合、５％のαをもたらす）を、各基準について選択した。
【０１９９】
これらの腫瘍の全てについて、詳細なＩＨＣ情報を得た：１８９  ＩＨＣ  ０、２２  ＩＨＣ  １＋、２０  ＩＨＣ  ２＋、５１  ＩＨＣ  ３＋。
【０２００】
さらに、ＩＨＣ２＋について、陽性または陰性として表現されたＦＩＳＨスコアを得た。
【０２０１】
【表３５】
2012511323.tif 000072
【０２０２】
１４のプローブセットのシグネチャーと、先行技術のシグネチャー、または１つのみのＡＲＮｍとを比較した場合、２８２の選択された腫瘍を代表する５の別個のセットについて、良好な全体相関だけでなく、感受性および特異性の点でも良好であることを認めた。
【０２０３】
【表３６】
2012511323.tif 000073
【０２０４】
（結論）
１５２の腫瘍について以前に行った試験で、２８２の選択された腫瘍を代表する５の別個のセットについて検証した。当該試験は、広範囲な感受性および特異性（それぞれ７８％および９８％）で、９４％の症例において、ＩＨＣ法と相関した。当該試験は、２８２中２７１の腫瘍（９６％）の分類に役立った。当該試験はまた、９５％の症例（１９／２０）において、あいまいな症例（ＩＨＣ２＋）を解決するのにも役立った。９５％の症例（ｎ＝１９）において、ＦＩＳＨと一致することも見出した。
【０２０５】
従って、ＩＨＣ法を行った後にＦＩＳＨスコアを実施することが要求される等の従来の２段階の試験と比較して、性能（感受性、特異性）を包括的に改善する１４のプローブセットのシグネチャーを使用する１段階の試験に成功した。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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