(57)【要約】  本発明は、ヒト患者集団における、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療の最適化に役立つ患者の評価方法に関する。詳細には、本発明は、ＣＭＬ患者向けのバイオマーカーとしてのＳＨＰ１および／またはＳＨＰ２に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＭＬ患者のためのバイオマーカーとしてのＳＨＰ１および／またはＳＨＰ２の使用。
【請求項２】
イマチニブまたはその製薬的に許容される塩の治療有効性を決定するための、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＳＨＰ１および／またはＳＨＰ２レベルを決定するためのｅｘ  ｖｉｖｏの方法であって、
ａ）サンプルのＳＨＰ１および／またはＳＨＰ２のｍＲＮＡレベルを決定するステップと、
ｂ）ＡＢＬのｍＲＮＡレベルを決定するステップと、
ｃ）ＡＢＬに対してＳＨＰ１および／またはＳＨＰ２のｍＲＮＡを正規化するステップ
とを含む方法。
【請求項４】
イマチニブ、ニロチニブ、および／またはダサチニブ、または製薬的に許容されるそれらの塩による適切な治療を決定するためにＣＭＬ患者をスクリーニングするための請求項３に記載の方法の使用。
【請求項５】
ａ）サンプルのＳＨＰ１および／またはＳＨＰ２のｍＲＮＡレベルを決定するための手段と、
ｂ）ＡＢＬのｍＲＮＡレベルを決定するための手段と、
ｃ）ＡＢＬに対してＳＨＰ１および／またはＳＨＰ２のｍＲＮＡを正規化するための手段
とを備えた診断キット。
【請求項６】
ＳＨＰ１レベルが約３未満のＣＭＬ患者を治療するための、イマチニブ、ニロチニブ、および／またはダサチニブ、または製薬的に許容されるそれらの塩の使用。
【請求項７】
患者のＳＨＰ１レベルが約３未満であるＣＭＬを治療するための医薬を製造するための、イマチニブ、ニロチニブ、および／またはダサチニブ、または製薬的に許容されるそれらの塩の使用。
【請求項８】
温血動物においてＣＭＬを治療する方法であって、
ａ）治療前に、ＣＭＬに罹患している患者の血液中のＳＨＰ１レベルを決定するステップ、および
ｂ）約３未満のＳＨＰ１レベルを示すＣＭＬに罹患している患者に１日用量のメシル酸イマチニブ、ニロチニブ、またはダサチニブを投与するステップであって、メシル酸イマチニブの前記１日用量が、ＣＭＬ患者に処方される標準的な投与量の少なくとも１５０％であるステップ
を含む方法。
【請求項９】
ヒト患者において慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を治療する方法であって、
ａ）治療前に、ＣＭＬに罹患している患者の血液中のＳＨＰ１発現レベルを決定するステップ、および
ｂ）約３未満のＳＨＰ１発現レベルを示すＣＭＬに罹患している患者に１日用量のメシル酸イマチニブを投与するステップであって、メシル酸イマチニブの前記１日用量が、ＣＭＬ患者に処方される標準的な投与量の少なくとも１５０％であるステップ
を含む方法。
【請求項１０】
ＳＨＰ１レベルが約３未満の患者に使用するための指示書を含むことを特徴とする、イマチニブ、ニロチニブ、および／またはダサチニブ、または製薬的に許容されるそれらの塩を含む医薬の添付文書。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト患者集団における、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性期のＣＭＬ患者の大部分におけるメシル酸イマチニブによる治療の成功は、十分に立証されている。しかし、それほどよく機能しない患者に対する治療転帰を改善するには、治療応答の重大な決定要因の詳細な理解が必要となる。
【０００３】
ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２は、細胞増殖制御シグナル伝達に対するいくつかの病理学的関連性を有する、Ｓｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメインを含有する２種のチロシンホスファターゼである。ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２は、総合的な配列同一性をかなり共有する。それらの生物的機能は、十分には解明されていない。ＳＨＰ−１は、一般に負のシグナル伝達物質と考えられており、また、ＳＨＰ−２は正のシグナル伝達物質と考えられている。ＳＨＰ−２は、広く発現されることが見出されている一方、ＳＨＰ−１は、造血細胞中では高度に、また、ある種の非造血細胞中では低レベルで発現される。
【０００４】
ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２はいずれも、重要な病理学的関連性を有すると考えられている。すなわち、ＳＨＰ−１は、増殖因子、サイトカイン、および抗原の受容体、ならびにこれらの受容体と関連するチロシンリン酸化タンパク質を脱リン酸化する。したがって、多くの場合、ＳＨＰ−１は負のシグナル伝達物質と定義される。ヒトでは、ＳＨＰ−１遺伝子発現の低下は、ナチュラルキラー細胞リンパ腫、および別のタイプのリンパ腫／白血病において認められる。ＳＨＰ−１のプロモーターをメチル化すると、悪性のＴ−リンパ腫細胞中でのＳＨＰ−１発現が失われる。ＳＨＰ−１の発現レベルの低下は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の進行と関連していることが見出されている。さらに、Ｓｈｐ１は、Ｂｃｒ−Ａｂｌと物理的に関連していることが示されており、それらの機能的な相互作用を示唆している。さらに、Ｓｈｐ１の過剰発現は、Ｂｃｒ−Ａｂｌによる形質転換を阻止する。
【０００５】
ＳＨＰ−２の活性化変異は、異形的な顔貌、均衡性低身長、および心臓疾患（肺動脈狭窄症および肥大性心筋症が最も一般的である）によって特徴づけられる常染色体優性遺伝疾患であるヌーナン症候群の原因となる。このＳＨＰ−２の機能獲得型変異はまた、散発性若年性骨髄単球性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、および急性骨髄性白血病とも関連している。ＳＨＰ−２は、胃炎および胃がんと関連のあるヘリコバクターピロリＣａｇＡタンパク質の細胞内標的として記述されている。マウスにおいて、Ｓｈｐ−２遺伝子を機能的にノックアウトすると、妊娠中期に胚の死亡を引き起こす。システインがセリンになったＳＨＰ−２の触媒的に不活性な変異体を発現する細胞、およびＳＨＰ−２ノックアウトマウス由来の細胞は、増殖因子およびサイトカインによって誘発されるシグナル伝達経路の活性化の低下を示した。ＳＨＰ−２はまた、その変異に関連する心臓の発達の欠陥の原因となる可能性があるアンジオテンシンＩＩシグナル伝達においても役割を有する。
【発明の概要】
【０００６】
２種のＳＨＰ構成的な非受容体タンパク質チロシンホスファターゼであるＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２が、Ｂｃｒ−Ａｂｌの負の調節において役割を果たすこと、およびＳｈｐ１の欠損は、ＣＭＬ形質転換に重要となる可能性があることが、今や見出された。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、ＣＭＬ患者の初期評価およびその後のモニタリングの両方を改善するための新規な予後指標を特定することである。本発明のさらなる目的は、特に治療応答を推定することによって、ＣＭＬの治療のための患者集団を特定することである。本発明のさらなる目的は、ＣＭＬの治療の成功を改善することである。本発明のさらなる目的は、ＣＭＬ患者において、分子遺伝学的寛解（ｍａｊｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ＭＭＲ）の達成を予測することである。
【０００８】
驚くべきことに、ホスフォキナーゼのみならず、ホスファターゼＳＨＰ１およびＳＨＰ２もまた、バイオマーカーとして作用し得ることが見出された。
【０００９】
したがって、一態様では、本発明は、ＣＭＬ患者のためのバイオマーカーとしてのＳＨＰ１および／またはＳＨＰ２の使用に関する。好ましくは、本発明はＣＭＬ患者のためのバイオマーカーとしてのＳＨＰ１の使用に関する。これによって、ＳＨＰ１および／またはＳＨＰ２のレベルは、イマチニブまたはその製薬的に許容される塩の治療有効性の指標となる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義
本明細書で使用される「ＳＨＰ１レベル」は、Ａｂｌレベルに対する相対値として定義される。本明細書で使用される「ＳＨＰ２レベル」は、Ａｂｌレベルに対する相対値として定義される。ＳＨＰ１およびＳＨＰ２のｍＲＮＡレベルとは、それぞれ、Ｑ−ＰＣＲによってアッセイされたものおよびＡＢＬに対する比として表されることを意味する。
【００１１】
ＳＨＰ１レベルおよびＳＨＰ２レベルの測定は、それぞれ、例えば、骨髄または血液から採取されたサンプル、好ましくは末梢血液のサンプルに対して行うことができると述べることができる。しかし、定義を明確にするために、ＳＨＰ１レベルおよびＳＨＰ２レベルは、それぞれ、末梢血液のサンプルから測定されることが好ましい。レベルの決定方法を以下に記載する。
【００１２】
「サンプル」は、血液または骨髄サンプル、好ましくは末梢血液サンプルを意味する。
【００１３】
本明細書および出願全体を通して使用される「約」という語は、示した値の−１０％から＋１０％、好ましくは、示した値の−５％から＋５％の範囲内で変化し得る値を言う。
【００１４】
「温血動物」という用語は、好ましくは、ヒトまたはヒト患者を意味する。「患者」は好ましくは、ヒト患者に関する。
【００１５】
本明細書で使用される「Ｉｍａ」という用語は、イマチニブまたはその製薬的に許容される塩、好ましくはメシル酸塩と同義語である。
【００１６】
ＣＭＬ患者における、ＳＨＰ１および／またはＳＨＰ２のレベルは、イマチニブまたはその製薬的に許容される塩の治療量を評価するため、およびニロチニブおよび／またはダサチニブ、または製薬的に許容されるそれらの塩による前記患者の追加的治療または代替的治療のために使用することができる。特に、３未満のＳＨＰ１レベルは、イマチニブまたはその製薬的に許容される塩の治療量を、好ましくはＣＭＬ患者に処方される標準的な投与量の少なくとも１５０％に引き上げる指標となる。ニロチニブまたはダサチニブ、または製薬的に許容されるそれらの塩による治療は、追加的に行ってもよく、またはイマチニブの代替としてもよい。
【００１７】
本発明の一実施形態では、低いＳＨＰ１レベルとは３未満である。さらなる実施形態では、ＳＨＰ１レベルは０．０１から３である。さらなる実施形態では、ＳＨＰ１レベルの上限は、３、２．８、２．６、２．４、２．２および２であり、またＳＨＰ１レベルの下限は、０．０１または０．１である。上限および下限のすべての組合せが、本発明に含まれることが理解される。
【００１８】
したがって、一態様では、本発明はイマチニブまたはその製薬的に許容される塩の治療有効性を決定するための、ＣＭＬ患者のためのバイオマーカーとしてのＳＨＰ１および／またはＳＨＰ２の使用に関する。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、ＳＨＰ１および／またはＳＨＰ２レベルを決定するためのｅｘ  ｖｉｖｏの方法であって、
ａ）サンプルのＳＨＰ１および／またはＳＨＰ２のｍＲＮＡレベルを決定するステップと、
ｂ）ＡＢＬのｍＲＮＡレベルを決定するステップと、
ｃ）ＡＢＬに対してＳＨＰ１および／またはＳＨＰ２のｍＲＮＡを正規化するステップ、
を含む方法に関する。好ましくは、ＳＨＰ１レベルを、このようなｅｘ  ｖｉｖｏ方法で決定する。決定および正規化は、好ましくは、以下の実験項に記載された方法で実施される。好ましくは、血液サンプルは末梢血液サンプルである。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、イマチニブ、ニロチニブ、および／またはダサチニブ、または製薬的に許容されるそれらの塩による適切な治療を決定するために、ＣＭＬ患者をスクリーニングするための、上記のｅｘ  ｖｉｖｏの方法の使用に関する。この文脈において、「適切な治療」という用語は、特にイマチニブに対する応答のより低い患者において、ＣＭＬのより効果的な治療を得ることを意味する。イマチニブまたはその製薬的な塩に対する応答がより低いとは、ＳＨＰ１レベルが３未満であることを意味する。「適切な治療」は、イマチニブまたはその製薬的に許容される塩の治療量の増加、ニロチニブまたはダサチニブ、または製薬的に許容されるそれらの塩による追加的治療、あるいはニロチニブまたはダサチニブ、または製薬的に許容されるそれらの塩による治療でイマチニブ治療を代替することを含む。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、
ａ）サンプルのＳＨＰ１および／またはＳＨＰ２のｍＲＮＡレベルを決定するための手段と、
ｂ）ＡＢＬのｍＲＮＡレベルを決定するための手段と、
ｃ）ＡＢＬに対してＳＨＰ１および／またはＳＨＰ２のｍＲＮＡを正規化するための手段
を含む診断キットに関する。好ましくは、ＳＨＰ１レベルは、このようなｅｘ  ｖｉｖｏの方法で決定する。決定および正規化は、以下の実験項に記載された方法で、好ましくは実施される。好ましくは、血液サンプルは末梢血液サンプルである。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、ＳＨＰ１レベルが約３未満のＣＭＬ患者を治療するための、イマチニブ、ニロチニブ、および／またはダサチニブ、または製薬的に許容されるそれらの塩の使用に関する。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、患者のＳＨＰ１レベルが約３未満である、ＣＭＬを治療するための医薬を製造するための、イマチニブ、ニロチニブ、および／またはダサチニブ、または製薬的に許容されるそれらの塩の使用に関する。
【００２４】
本発明のさらなる態様は、温血動物においてＣＭＬを治療する方法であって、
（ａ）治療前に、ＣＭＬに罹患している患者の血液中のＳＨＰ１レベルを決定するステップ、および
（ｂ）約３未満のＳＨＰ１レベルを示すＣＭＬに罹患している患者に、１日用量のメシル酸イマチニブ、ニロチニブ、またはダサチニブを投与するステップであって、メシル酸イマチニブの前記１日用量が、ＣＭＬ患者に処方される標準的な投与量の少なくとも１５０％であるステップ
を含む方法に関する。
【００２５】
したがって、ステップｂ）は、イマチニブまたはその製薬的に許容される塩の治療量の増加、ニロチニブまたはダサチニブ、または製薬的に許容されるそれらの塩による追加的治療、またはニロチニブまたはダサチニブ、または製薬的に許容されるそれらの塩による治療で、イマチニブ治療を代替することを含む。ダサチニブの治療量は、一般に１００ｍｇ／日であり、ニロチニブの治療量は８００ｍｇ／日である。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、ヒト患者において慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を治療する方法であって、
ａ）治療前に、ＣＭＬに罹患している患者の血液中のＳＨＰ１発現レベルを決定するステップ、および
ｂ）約３未満のＳＨＰ１発現レベルを示すＣＭＬに罹患している患者に、１日用量のメシル酸イマチニブを投与するステップであって、メシル酸イマチニブの前記１日用量が、ＣＭＬ患者に処方される標準的な投与量の少なくとも１５０％であるステップ
を含む方法に関する。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、ＳＨＰ１レベルが約３未満の患者に使用するための指示書を含むことを特徴とする、イマチニブ、ニロチニブ、および／またはダサチニブ、または製薬的に許容されるそれらの塩を含む医薬の添付文書（packageinsert）に関する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、温血動物におけるＣＭＬを治療する方法であって、より低いＳＨＰ２を示すＣＭＬに罹患している患者に、メシル酸イマチニブ、ニロチニブまたはダサチニブの１日用量を増量するステップを含む方法に関する。
【００２９】
ＣＭＬ患者に処方される標準的な投与量に関する情報は、通常、薬物パッケージに含まれるラベルから得ることができる。
【００３０】
好ましい実施形態では、メシル酸イマチニブ、ニロチニブ、またはダサチニブの前記１日用量は、ＣＭＬ患者に処方される標準的な投与量の１５０％、２００％、２５０％、または３００％である。
【００３１】
例えば、ＣＭＬ患者に処方される標準的な投与量が４００ｍｇの場合、より低いＳＨＰ１を有する患者に投与されるべき１日用量は、約６００ｍｇから１２００ｍｇの間のメシル酸イマチニブ、例えば、６００ｍｇ／日、８００ｍｇ／日、１０００ｍｇ／日、または１２００ｍｇ／日である。
【００３２】
ＳＨＰ１レベルが３未満の場合におけるメシル酸イマチニブの好ましい量は、６００ｍｇ／日から１２００ｍｇ／日である。さらに好ましい下限は、６５０ｍｇ／日、７００ｍｇ／日、７５０ｍｇ／日、８００ｍｇ／日および８５０ｍｇ／日である。さらに好ましい上限は、１１５０ｍｇ／日、１１００ｍｇ／日、１０５０ｍｇ／日、１０００ｍｇ／日、９５０ｍｇ／日および９００ｍｇ／日である。上限および下限の各組合せは、本発明に含まれると理解されたい。
【００３３】
一実施形態では、ステップ（ｂ）における１日用量のメシル酸イマチニブは、経口投与される。
【００３４】
イマチニブは、特許出願ＵＳ５，５２１，１８４の特に実施例２１に、一般的かつ具体的に開示されており、その主題は、参照により本出願に組み込まれている。イマチニブはまた、ＷＯ０３／０６６６１３に開示の方法に従っても調製できる。
【００３５】
本発明の目的のために、イマチニブはそのモノ−メシル酸塩の形態で好ましくは適用される。モノ−メシル酸イマチニブは、ＵＳ６，８９４，０５１に開示されている方法に従って調製することができ、その主題は、参照により本出願に組み込まれている。対応する多形体、例えば、結晶変態が同様に含まれ、その結晶変態はその中に開示されている。
【００３６】
モノ−メシル酸イマチニブは、ＵＳ５，５２１，１８４、ＵＳ６，８９４，０５１またはＵＳ２００５−０２６７１２５に記載されている剤形で投与することができる。
【００３７】
ニロチニブは、例えば、ＷＯ２００４００５２８１の実施例９２に開示されており、その主題は、参照により本出願に組み込まれている。
【００３８】
ダサチニブは、例えば、ＷＯ  ００／６２７７８に開示されている。
【実施例】
【００３９】
ＳＨＰ１および／またはＳＨＰ２レベルの検出
ＣＭＬ患者の血液サンプルの採集は、最新技術の標準的手順によって達成することができる。Ｑ−ＰＣＲは、以下のように実施される。
【００４０】
患者のサンプルまたは細胞系から抽出したトータルＲＮＡ  １μｇを、７０℃で１０分間、事前加温し、次に１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭの各デオキシリボヌクレオチド、２０Ｕ  ＲＮＡｓｉｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ウプサラ、スウェーデン）、２５ｍＭランダムエキサマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、１０ｍＭ  ＤＴＴ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および１００Ｕ  ＭｏＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｔｄ）を含有する２０μＬの反応混合物中で、該ＲＮＡ溶液を２５℃で１０分間、４２℃で４５分間、および９９℃で３分間インキュベートした。以下の時間／温度プロファイル：９５℃で１５秒および６０℃で１分を５０サイクルを用い、最終容量が２５μLの１×Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ、フォスターシティー、ＣＡ  米国）、３００ｎＭの適切なプライマーペアおよび２００ｎＭの適切なプローブからなる反応混合物中で、ｃＤＮＡをコードするＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２のＰＣＲ増幅を別々に実施した。増幅反応はすべて、３連で実施した。プライマーおよびプローブの配列は、次の通りである。
ＳＨＰ１：１３９ｂｐ；フォワード：ＣＧＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＧＧＴＡＧＣＴＴ、リバース：ＣＣＣＣＴＣＣＡＴＡＣＡＧＧＴＣＡＴＡＧＡＡＡＴ、プローブ：Ｆａｍ−ＴＧＡＣＣＣＡＴＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＧＡＡＣＴＣＡＧＧ−Ｔａｍｒａ；ＳＨＰ２：８９ｂｐ；フォワード：ＧＣＧＡＣＡＡＣＴＧＣＡＣＧＧＡＴＣＴ、リバース：ＣＡＧＣＧＴＣＡＣＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧ、プローブ：Ｆａｍ−ＣＴＣＧＣＡＣＴＧＧＧＡＡＴＣＣＣＣＴＣＣＡＴ−Ｔａｍｒａ、ＡＢＬ：１２３ｂｐ；フォワード：ＴＧＧＡＧＡＴＡＡＣＡＣＴＣＴＡＡＧＣＡＴＡＡＣＴＡＡＡＧＧＴ、リバース：ＧＡＴＧＴＡＧＴＴＧＣＴＴＧＧＧＡＣＣＣＡ、プローブ：Ｆａｍ−ＣＣＡＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＣＡＴＴ−Ｔａｍｒａ。ＡＢＬは、内部対照として使用した。ＳＨＰ１およびＳＨＰ２のｍＲＮＡを、ＡＢＬに対して正規化した。すべての反応は、ＡＢＩ−７９００  配列検出器（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ）を用いて実施した。
【００４１】
臨床試験
一つの試験で、ＴＯＰＳ[チロシンキナーゼ阻害剤の最適化および選択性（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）]試験に登録された、新たに診断されたＣＭＬ患者から得た白血病細胞中の２種のＳＨＰ構成的な非受容体タンパク質チロシンホスファターゼであるＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２の発現レベルを評価した。ＴＯＰＳは、ＣＰ−ＣＭＬにおいて、８００ｍｇ／ｄと４００ｍｇ／ｄのＩｍａを比較した、前向き非盲検無作為化（２：１）第ＩＩＩ相試験である。本試験のエンドポイントは、分子遺伝学的寛解（ＭＭＲ）の割合であり、これは無増悪生存期間（ＰＦＳ）に対する有益性を予測する指標として、いくつかの報告によって示されている。１２ヶ月の時点において、ＭＭＲを達成しなかった患者と比較したときのＳＨＰ１およびＳＨＰ２のレベルの差はＭＭＲを達成した患者と関連がある、というのが本発明者らの仮説であった。ＴＯＰＳ試験に登録された４８人の新たに診断されたＣＭＬ患者から得られた初期の結果は、これらの患者の末梢血液中のＱＰＣＲによって評価され、またＡＢＬに対する比として表されるＳＨＰ１およびＳＨＰ２の両方の発現レベルが、１２ヶ月までにＭＭＲを達成する患者と達成しない患者との間で有意な差があることを示している。具体的には、ＳＨＰ１／Ａｂｌ％が７．４±３．８対５．０±３．２（ｐ＝０．０１７）であり、ＳＨＰ２／ＡＢＬ％が０．１９±０．１５対０．１０±０．１２（ｐ＝０．０１７）であった。
【００４２】
本試験では、本発明者らは、Ｉｍａ感受性ＫＣＬ２２細胞系（ＫＣＬ２２ｓ）およびＩｍａ抵抗性ＫＣＬ２２細胞系（ＫＣＬ２２ｒ）の二つを、モデルシステムとして初めて使用した。これらの細胞では、Ｉｍａ抵抗性は、発がん性のＢｃｒ／Ａｂｌ活性に非依存的である。ＫＣＬ２２ｓ感受性細胞と比較した場合、ＫＣＬ２２ｒ抵抗性細胞では、腫瘍抑制因子活性を有するタンパク質であるＳｈｐ１（ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方）のレベルが非常に低いことを、本発明者らは見出している。本発明者らはまた、この遺伝子の下方調節が、ＳＨＰ１のプロモーターのメチル化レベルに関係があることも示す。実際に、プロモーター領域の脱メチル化を伴う５−アザシチジン（５−ＡＣ）治療により、ＫＣＬ２２ｒにおけるＳｈｐ１の発現が再誘起した。そのような治療は、これらの細胞において、Ｉｍａ感受性すなわちＩｍａによる増殖阻害も再確立した。Ｉｍａ感受性の回復は、分子レベルでは、ＳＴＡＴ３およびＥＲＫ１／２の両方のリン酸化が有意に低下することと関連があった。Ｓｈｐ１の機能的役割をより一層理解するため、本発明者らは、Ｓｈｐ１−結合タンパク質を調べるために質量分析法を実施し、Ｓｈｐ１は、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路を含めた発がん経路の正の調節因子としてよく知られているタンパク質ホスファターゼであるＳｈｐ２と、これらの細胞において相互作用していることを見出した。若年性慢性骨髄単球性白血病を含む種々の造血系腫瘍において、機能獲得型変異が述べられている。Ｐｈ＋細胞において、発がん性のＢｃｒ／Ａｂｌタンパク質は、一旦リン酸化すると、Ｓｈｐ２のＳＨ２ドメインに結合することができるアダプタータンパク質であるＧａｂ２を介してＳｈｐ２を活性化する。Ｓｈｐ２はまた、２つのカルボキシ末端のチロシン残基（５４２および５８０）を伴い得る複合体の相互作用を介した増殖因子受容体のシグナル伝達物質でもある。Ｓｈｐ１は脱リン酸化によってＳｈｐ２の活性を調節し、かつＩｍａ抵抗性の重要な機構を構成すると、本発明者らは仮説を立てた。ＫＣＬ２２ｓ細胞系におけるＳｈｐ１のノックダウンは、Ｓｈｐ２の５４２および５８０のチロシン残基の完全なリン酸化、および薬物に対するその感受性の低下という結果となり、したがって、Ｉｍａ感受性における、このタンパク質の役割を支持した。一方、低Ｓｈｐ１レベルを示すＫＣＬ２２ｒでのＳｈｐ２のノックダウンは、増殖阻害つまり、Ｉｍａ感受性の回復をもたらし、かつ、ＳＴＡＴ３（６０％）およびＥＲＫ１／２（７０％）の両方のリン酸化の有意な低下を伴う。一次細胞に関するデータは、患者のＩｍａ抵抗性におけるＳｐｈ１の役割を支持している。
【００４３】
実際に、ＥＬＮ定義に従い、最適（ｏｐｔｉｍａｌ）Ｉｍａ応答者（ｎ＝３５）、不十分（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）Ｉｍａ応答者（ｎ＝１７）、およびＩｍａに対し一次抵抗性（ｎ＝５）または二次抵抗性（ｎ＝３）として分類される６０人のＣＭＬ患者の骨髄サンプルを本発明者らは解析した。不十分応答者（３．８±１．５４）および最適応答者（５．８±１．７７）と比較した場合、抵抗性患者［ＳＨＰ１／ＡＢＬ比は３．２±１．０４（平均±ＳＤ）、＊ｐ＜０．０５］では、Ｓｈｐ１のｍＲＮＡのレベルは有意に低下していた。さらに、６人の最適応答者との比較では、６人の抵抗性患者から単離したＣＤ３４＋細胞において、Ｓｈｐ１の減少が認められた。結論として、Ｓｈｐ１およびＳｈｐ２のレベル間の異常なバランスは、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路の活性化を介して、Ｉｍａに対するＢｃｒ−Ａｂｌ非依存的な抵抗性において役割を果たしていること、および、Ｓｈｐ１レベルの低下は、非応答性患者と関連があることを本発明者らの研究は示唆している。
【００４４】
本試験では、ＴＯＰＳ（チロシンキナーゼ阻害剤の最適化および選択性）試験に登録された４８人の新たに診断されたＣＭＬ患者から得られた白血病細胞中における、２種のＳＨＰ構成的な非受容体タンパク質チロシンホスファターゼであるＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２の発現レベルの予測的な役割を研究した。ＴＯＰＳは、ＣＰ−ＣＭＬにおける８００ｍｇ／ｄと４００ｍｇ／ｄのＩｍａを比較する前向き非盲検無作為化（２：１）第ＩＩＩ相試験である。本試験のエンドポイントの知見は、無増悪生存期間（ＰＦＳ）に対する有益性を予測するパラメータとして、いくつかの報告によって示されている分子遺伝学的寛解（ＭＭＲ）の比である。新たに診断された患者の末梢血液中のＱＰＣＲによってアッセイされ、またＡＢＬに対する比として表されるＳＨＰ１およびＳＨＰ２の両方のｍＲＮＡレベルが、１２ヶ月までにＭＭＲを達成している患者と達成していない患者との間で有意な差があることを、結果は示している（ＳＨＰ１／Ａｂｌ％は７．４±３．８対５．０±３．２、ｐ＝０．０１７、およびＳＨＰ２／ＡＢＬ％は０．１９±０．１５対０．１０±０．１２、ｐ＝０．０１７）。
【００４５】
イマチニブ感受性の決定要因としてＳＨＰ１の役割をさらに調査するために、本発明者らは、ＴＯＰＳ−チロシンキナーゼ阻害剤の最適化および選択性試験に登録された９３人の新たに診断されたＣＭＬ患者における、ＳＨＰ１の発現を評価した[Ｃｏｒｔｅｓら、２００８年度欧州血液学会議（ＥＨＡ  ２００８）]。ＱＰＣＲによって評価された、登録時点の患者の末梢血液中のＳＨＰ１のｍＲＮＡレベルが、１２ヶ月までにＭＭＲを達成する患者と達成しない患者との間では有意な差があることを、本研究の結果は示している（７．９±４．０対５．９±３．４、ｐ＝０．０１）。本発明者らのモデルにおける転帰変数として１２ヶ月までのＭＭＲを用い、ロジスティック回帰を用いて回帰係数および対応するオッズ比を概算した。ＳＨＰ１の２５および７５パーセンタイルは、それぞれ４．３および８．４であったので（四分位範囲は４．１となった）、ＳＨＰ１が４．１以上という値は、１２ヶ月までのＭＭＲ達成のほとんど２倍のオッズと関連があることを統計学的解析が示している（ＯＲ＝１．９２；９５％  ＣＩ＝１．１２、３．２９；ｐ＝０．０１８）。さらに、分割表において、高中位のＳＨＰ１発現および低中位のＳｏｋａｌスコア（ｐ＝０．００６８）を有する患者と比較した場合、低ＳＨＰ１発現および高Ｓｏｋａｌスコアのいずれか一方を有するこれらの患者では、１２ヶ月時点でＭＭＲを達成していないという高いリスクがあることを、カイ二乗解析が示している。結論として、新たに診断されたＣＰ−ＣＭＬ患者の評価、および治療応答の推定において、ＳＨＰ１の発現レベルを測定することには価値があり、このことは、グリベック治療を最適化する、またはより効能の高いチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を患者に推薦する一助となることを、これらの結果が示唆している。
【００４６】
結論として、ＳＨＰ１およびＳＨＰ２の発現レベルは、新たに診断されたＣＰ−ＣＭＬ患者において、ＭＭＲの有用な予測値であることを本発明者らの結果は示している。
【国際調査報告】
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