(57)【要約】  本発明者らは、軟骨、骨または靭帯修復を促進するかまたは軟骨性組織の修復または再生を誘導する方法を開示し、該方法は、軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞においてＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性を増強させるステップを含む。本発明者らはまた、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性を増大させるように改変された軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を提供する。
2012502655.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＺＮＦ１４５、またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性を増大させるよう改変された、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）などの軟骨形成前駆細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞であって、
改変されていない軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞と比較して、
（ａ）２型コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１）、アグリカン、ｃｏｌ１０Ａ１またはＳｏｘ９などの軟骨形成マーカーの発現の増強、
（ｂ）例えばアルシアンブルー染色により検出される、軟骨プロテオグリカンの分泌の増強、または
（ｃ）例えばＷａｋｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）により記載されるような組織学的類別により検出される、例えば細胞形態の任意の１以上の組織学的類別、マトリックス染色、表面規則性、軟骨の厚さおよびホスト隣接軟骨へのドナーの組込みにより検出される、軟骨、骨または靭帯欠損を修復する能力の増強、
あるいはそれらの任意の組合せを提示する、細胞。
【請求項３】
前記軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞、またはその祖先が、前記ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性を増加させる発現構築物、例えばレンチウイルス発現構築物などでトランスフェクトされている、請求項１または２に記載の軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞。
【請求項４】
例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７に記載されるようなペレット培養系により、すなわち軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞をペレット化し、１０ｎｇ／ｍｌトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β３、１０−７Ｍデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸−２−リン酸、４０μｇ／ｍｌプロリン、１００μｇ／ｍｌピルビン酸、および５０ｍｇ／ｍｌＩＴＳ＋プレミックス（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；６．２５μｇ／ｍｌインスリン、６．２５μｇ／ｍｌトランスフェリン、６．２５μｇ／ｍｌ亜セレン酸、１．２５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、および５．３５ｍｇ／ｍｌリノール酸）を含有する軟骨形成培地で培養することにより軟骨細胞分化が誘導されている、請求項１、２または３に記載の軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞。
【請求項５】
Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７およびＢｍｉ−１のいずれか１以上の発現または活性を増大させるように改変された、請求項１〜４のいずれか一項に記載の軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞を含むかまたはそれに由来する細胞株、例えば不死または不死化細胞株。
【請求項７】
疾患の治療、例えば軟骨性組織、軟骨、骨または靭帯欠損に関連する疾患、損傷、障害または傷害、外傷性疾患、加齢性変性疾患または変性関節疾患の修復または再生の方法で使用するための、軟骨形成活性を含むポリペプチドをコードする能力のあるＺＮＦ１４５配列、またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体を含む核酸、例えば発現ベクター。
【請求項８】
疾患の治療、例えば軟骨性組織、軟骨、骨または靭帯欠損に関連する疾患、損傷、障害または傷害、外傷性疾患、加齢性変性疾患または変性関節疾患の修復または再生の方法で使用するための、軟骨形成活性を含む、ＺＮＦ１４５配列、またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体を含むポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞、請求項６に記載の細胞株、請求項７に記載の核酸または請求項８に記載のポリペプチドを含む、それらの請求項で特定された使用のための医薬組成物。
【請求項１０】
軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞において、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の該発現または活性を調節するステップと、例えばＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性を増大させて軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞の軟骨形成を促進するステップと、またはＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性をダウンレギュレートして、軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞の軟骨形成を低下させるステップとを含む、方法。
【請求項１１】
軟骨、骨または靭帯修復を促進するか、あるいは軟骨性組織の修復または再生を誘導する方法であって、該方法が、軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞において、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の前記発現または活性を増強させるステップを含む、方法。
【請求項１２】
軟骨性組織、軟骨、骨または靭帯欠損に関連する疾患、損傷、障害または傷害、外傷性疾患、加齢性変性疾患または変性関節疾患の修復または再生、のいずれか１つの該治療のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の改変された軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞、請求項６に記載の細胞株、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載のポリペプチドまたは請求項９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１３】
例えば軟骨性組織、軟骨、骨または靭帯欠損に関連する疾患、損傷、障害または傷害、外傷性疾患、加齢性変性疾患または変性関節疾患を修復または再生する、個体において疾患を治療する方法であって、該個体においてまたは該個体の軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞において、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の該発現または活性をアップレギュレートするステップ、あるいは、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性の増加を提示する軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞を、そのような治療を必要とする個体に投与するステップを含む、方法。
【請求項１４】
軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞の軟骨細胞分化のマーカーとしての、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の使用。
【請求項１５】
Ｓｏｘ９の該発現または活性を調節する方法であって、該方法が、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の前記発現または活性を調節するステップを含む、方法。
【請求項１６】
軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞の軟骨形成を可能にするかまたは促進する能力のある薬剤を同定する方法であって、該方法が、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体を候補薬剤に接触させるステップと、該候補薬剤がＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体に結合するかどうかを決定するステップと、任意選択的に、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の該発現または活性がそれによって調節されるかどうかを決定するステップとを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発達、細胞生物学、分子生物学および遺伝学の分野に関する。より詳細には、本発明は、軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞の軟骨形成を促進するポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医学の主な領域は、軟骨組織工学での幹細胞の適用および再建手術である。幹細胞は、その自己再生と多系列分化の両方の能力により前駆細胞と区別することができ、一方前駆細胞は、自己再生せずに多系列分化の能力だけがある（３）。この自己再生の能力が、幹細胞を移植医学に特に有用なものにするのである。軟骨修復のための幹細胞は、２つの主な起源：胚盤胞期胚の内細胞塊に由来するＥＳ細胞、および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に由来し得る。
【０００３】
ＥＳ細胞を軟骨再生のために使用する最も明白な利点は、ＥＳ細胞が不死であり、理論上は移植用の分化型軟骨細胞および軟骨前駆細胞の無限の供給を提供する可能性があり得ることである。しかし、ＥＳ細胞が複数の系列に自発的に分化する傾向およびＥＳ細胞の軟骨形成分化への定方向分化の効率の低いことが、依然としてそれらを再生医学に使用する主な障害となっている。その上、移植レシピエントの中でのＥＳ細胞の免疫原性および奇形腫形成に関連する潜在的な問題も、これらの細胞を組織移植に使用することの高い危険性を示す。
【０００４】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨髄、脂肪組織および臍帯血、ならびに、骨、軟骨、脂肪、筋肉、靭帯、腱および間質などの間葉組織の再生に寄与するその他の組織に存在する、成体多能性幹細胞である（４−５）。本明細書に記載される方法および組成物は、従って軟骨修復を促進するか、またはかかる組織の修復または再生を誘導するために使用することができる。
【０００５】
ＭＳＣの１つの可能性のある用途は、ＭＳＣが骨および軟骨に分化する能力が明らかに示されるという理由で、整形外科の状況である（６−９）。ＭＳＣが骨および軟骨へ分化する可能性、およびインビトロ増殖および遺伝子操作に対する要件が比較的単純であることが原因で、ＭＳＣは軟骨修復のための最も有望な幹細胞種の一つである。しかし、ＭＳＣの自己再生および増殖能力は、非常に限定され、年齢とともに低下すると思われる（１０−１１）。その上、ＭＳＣは、生体外での増殖の間にその幹細胞特性を次第に失う。ＭＳＣを組織工学に使用する主な制限は、移植に十分な細胞を得る際にある。このことは、変形性関節症などの軟骨の加齢性変性疾患の治療に対するＭＳＣの有用性を明らかに制限する。
【０００６】
骨髄からの推定ＭＳＣは、実際は非常に異質な集団であり、限られた一部の細胞だけが軟骨形成系列へ分化する能力がある。その代わりに、それらは、多能性幹細胞と、三分化能、二分化能および単分化能前駆体の両方の異種集団で構成されている（１２−１３）。その上、軟骨分化の異なる患者由来の試料の変異性も、ＭＳＣの臨床応用およびＭＳＣに関連する基本的問題の解明に大きな不自由をもたらす。
【発明の概要】
【０００７】
概要
本発明の第１の態様に従って、本発明者らは、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性を増大させるように改変された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）などの軟骨形成前駆細胞を提供する。
【０００８】
軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞は、軟骨形成マーカーの発現の増強を提示することができる。軟骨形成マーカーは、２型コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１）を含んでよい。軟骨形成マーカーはアグリカンを含んでよい。軟骨形成マーカーはｃｏｌ１０Ａ１を含んでよい。軟骨形成マーカーはＳｏｘ９を含んでよい。
【０００９】
軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞は、軟骨プロテオグリカンの分泌の増強を提示し得る。増強された分泌は、アルシアンブルー染色により検出することができる。
【００１０】
軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞は、軟骨、骨または靭帯欠損を修復する能力の改良を提示することができる。強化された能力は、任意の適したマーカーの組織学的類別により検出することができる。これは、細胞形態、マトリックス染色、表面規則性、軟骨の厚さおよびホスト隣接軟骨へのドナーの組込みの１以上を含んでよい。強化された能力は、Ｗａｋｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）により記載されるような組織学的類別により検出することができる。
【００１１】
軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞は、上記の任意の組合せを提示することができる。上に示される特徴は、まだそのように改変されていない軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞と比較されるものであってよい。
【００１２】
軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞、またはその祖先は、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性を増大させる発現構築物でトランスフェクトされてよい。発現構築物は、レンチウイルス発現構築物を含み得る。
【００１３】
軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞は、軟骨細胞分化が誘導されてよい。それは、ペレット培養系、例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７に記載されるようなものにより軟骨細胞分化が誘導されてよい。この系は、軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞をペレット化すること、および１０ｎｇ／ｍｌトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β３、１０−７Ｍデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸−２−リン酸、４０μｇ／ｍｌプロリン、１００μｇ／ｍｌピルビン酸、および５０ｍｇ／ｍｌＩＴＳ＋プレミックス（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；６．２５μｇ／ｍｌインスリン、６．２５μｇ／ｍｌトランスフェリン、６．２５μｇ／ｍｌ亜セレン酸、１．２５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、および５．３５ｍｇ／ｍｌリノール酸）を含有する軟骨形成培地で培養することを含み得る。
【００１４】
軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７およびＢｍｉ−１のいずれか１以上の発現または活性を増大させるように改変されてよい。
【００１５】
本発明の第２の態様に従って、上記に示したような軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞を含むかまたはそれに由来する細胞株が提供される。軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞株は、不死もしくは不死化細胞株を含み得る。
【００１６】
本発明者らは、本発明の第３の態様に従って、疾患の治療方法で使用するための軟骨形成活性を含むポリペプチドをコードする能力のあるＺＮＦ１４５配列、またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体を含む核酸を提供する。核酸は、発現ベクターを含んでよい。疾患は、軟骨性組織、軟骨、骨または靭帯欠損に関連する疾患、損傷、障害または傷害、外傷性疾患、加齢性変性疾患または変性関節疾患の修復または再生を含み得る。
【００１７】
本発明の第４の態様として、疾患の治療方法で使用するための軟骨形成活性を含む、ＺＮＦ１４５配列、またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体を含むポリペプチドが提供される。疾患は、軟骨性組織、軟骨、骨または靭帯欠損に関連する疾患、損傷、障害または傷害、外傷性疾患、加齢性変性疾患または変性関節疾患の修復または再生を含み得る。
【００１８】
本発明者らは、本発明の第５の態様に従って、上記に示したような軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞、上記に示したような細胞株、上記に示したような核酸、または上記に示したようなポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００１９】
本発明の、第６の態様では、軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞においてＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性を調節することを含む方法である。この方法は、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性を増大させることを含み得る。そのような増大は、軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞の軟骨形成を促進することができる。この方法は、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性をダウンレギュレートすることを含み得る。そのような低下は、軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞の軟骨形成を低下させ得る。
【００２０】
本発明の第７の態様では、軟骨、骨または靭帯修復を促進するかまたは軟骨性組織の修復または再生を誘導する方法を提供する。この方法は、軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞でＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性を増強させることを含み得る。
【００２１】
本発明の第８の態様に従って、上記に示したような改変された軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞、上記に示したような細胞株、上記に示したような核酸、または上記に示したようなポリペプチド、または上記に示したような医薬組成物の、軟骨性組織、軟骨、骨または靭帯欠損に関連する疾患、損傷、障害または傷害、外傷性疾患、加齢性変性疾患または変性関節疾患の修復または再生のいずれか１つの治療、またはその治療のための医薬組成物の調製のための使用が提供される。
【００２２】
本発明者らは、本発明の第９の態様に従って、個体において疾患を治療する方法を提供し、該方法は、該個体において、または該個体の、軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞でＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性をアップレギュレートすること、またはＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性の増加を提示する軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞を、そのような治療を必要とする個体に投与することを含む。治療は、軟骨性組織、軟骨、骨または靭帯欠損に関連する疾患、損傷、障害または傷害、外傷性疾患、加齢性変性疾患または変性関節疾患の修復または再生のためのものであってよい。
【００２３】
軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞は、上記に示したような特徴を含み得る。
【００２４】
本発明の第１０の態様に従って、軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞の軟骨細胞分化のマーカーとしての、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の使用が提供される。
【００２５】
本発明の第１１の態様として、本発明者らは、Ｓｏｘ９の発現または活性を調節する方法を提供し、該方法は、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性を調節することを含む。
【００２６】
本発明者らは、本発明の第１２の態様に従って、軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞の軟骨形成を可能にするかまたは促進する能力のある薬剤を同定する方法を提供し、該方法は、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体を、候補薬剤に接触させて、候補薬剤がＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体と結合するかどうかを決定すること、および所望によりＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性がそれにより調節されるかどうかを決定することを含む。
【００２７】
本発明の実践は、特に断りのない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技法を用いることになり、それは当業者の能力の範囲内である。かかる技法は、文献中で説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９，１３，ａｎｄ  １６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ  Ａ．Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ  Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ，１９９０，Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ；Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ．Ｉ  ｂｙ  Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（１９９９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５４４−７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｂｙ  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（Ｅｄｉｔｏｒ）（１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３１４−２），１８５５．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ  Ｓｅｅｔｈａｌａ，Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ  Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ（２００１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＩＳＢＮ  ０−８２４７−０５６２−９）；ａｎｄ  Ｌａｂ  Ｒｅｆ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｒｅｃｉｐｅｓ，  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｂｅｎｃｈ，Ｅｄｉｔｅｄ  Ｊａｎｅ  Ｒｏｓｋａｍｓ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄａ  Ｒｏｄｇｅｒｓ，２００２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒ��ｔｏｒｙ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−６３０−３を参照されたい。これらの全般にわたる本文の各々は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＭＳＣの３つの系列への分化の間のＺＮＦ１４５のアップレギュレートを示す図である。  図１Ａ．７日間の３つの系列への分化の間のＺＮＦ１４５の発現をリアルタイムＰＣＲにより定量化する。３つの系列への分化の間のＺＮＦ１４５のアップレギュレートを示す。  図１Ｂ．７日間の脂肪生成および骨形成の間のＺＮＦ１４５の発現は、免疫蛍光により核に局在するが、一方でＺＮＦ１４５は対照ＭＳＣでは発現されない。  図１Ｃ．７日間のペレット培養下での軟骨形成の間のＺＮＦ１４５の発現は、免疫蛍光により核に局在するが、一方でＺＮＦ１４５は、対照ＭＳＣにおいて検出されない。  図１Ｄ．ＭＳＣの軟骨形成の間のＺＮＦ１４５の発現パターンを示す図である。
【図２】低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に媒介されるＺＮＦ１４５の遺伝子サイレンシングのＭＳＣの分化への影響を示す図である。  図２Ａ．ＭＳＣを高い効率でＺＮＦ１４５  ｓｈＲＮＡおよびＧＦＰを含むレンチウイルスによって感染させる。  図２Ｂ．ペレット培養下のＺＮＦ１４５ノックダウンＭＳＣの軟骨形成の４８時間後、ＺＮＦ１４５および軟骨形成マーカーの低下の有効性をリアルタイムＰＣＲにより測定し、非挿入対照（ｎｏ  ｉｎｓｅｒｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較する。  図２Ｃ．ＺＮＦ１４５ノックダウンは、ＭＳＣの３つの系列への分化を遅らせた。ＭＳＣをＺＮＦ１４５  ｓｈＲＮＡに感染させ、１４日間の脂肪生成、２８日間の軟骨形成および１４日間の骨形成に誘導し、３つの系列のマーカーをリアルタイムＰＣＲにより測定し、非挿入対照と比較する。  図２Ｄ．ＺＮＦ１４５ノックダウンおよび対照ＭＳＣを、１４日間の脂肪生成、２８日間の軟骨形成および１４日間の骨形成に誘導する。ＺＮＦ１４５ノックダウンのＭＳＣの分化への効果を、それぞれ、脂肪生成での細胞内の脂質の充満した滴に対するオイルレッド染色、および軟骨形成での２型コラーゲンに対する免疫染色および硫酸プロテオグリカンマトリックスに対するアルシアンブルー染色、および骨形成での石灰沈着に対するアリザリンレッド染色により評価する。陰性対照と比較して、ＺＮＦ１４５−ノックダウンＭＳＣは、全ての３つの分化経路において顕著な染色の低下（ｌｏｗｅｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を示した。
【図３】ＭＳＣの分化へのＺＮＦ１４５過剰発現の効果を示す図である。  図３Ａ．ＺＮＦ１４５は、レンチウイルス系によってＭＳＣの核で過剰発現するが、未分化型ＭＳＣではＺＮＦ１４５は検出されない。  図３Ｂ．ＺＮＦ１４５過剰発現は、非挿入対照と比較して軟骨および骨へのＭＳＣの分化を改善した。ＺＮＦ１４５過剰発現ＭＳＣを、１４日間の骨形成および２８日間の軟骨形成に誘導し、骨原性および軟骨形成マーカーをリアルタイムＰＣＲにより測定し、非挿入対照と比較する。  図３Ｃ．ＺＮＦ１４５過剰発現ＭＳＣおよび対照ＭＳＣを、２８日間の軟骨形成および１４日間の骨形成に誘導する。ＺＮＦ１４５過剰発現のＭＳＣの分化への効果を、軟骨形成での２型コラーゲンに対する免疫染色、および硫酸プロテオグリカンマトリックスに対するアルシアンブルー染色、および骨形成での石灰沈着に対するアリザリンレッド染色により評価する。非挿入対照と比較して、ＺＮＦ１４５過剰発現ＭＳＣは、軟骨および骨分化経路において染色の増強を示した。  図３Ｄおよび図３Ｅ．ＭＳＣ細胞株の骨形成におけるＺＮＦ１４５過剰発現へのＡＰアッセイによる、アルカリホスファターゼ活性の増強。ＺＮＦ１４５過剰発現ＭＳＣおよび対照ＭＳＣ細胞株を、１４日間の骨形成に誘導し、アルカリホスファターゼ活性を、ＡＰアッセイにより定量化し、対照と比較する。  図３Ｄ．ＡＰ染色は、骨形成におけるＺＮＦ１４５過剰発現によるアルカリホスファターゼ染色の増強を示す。  図３Ｅ．ＡＰアッセイは、骨形成におけるＺＮＦ１４５過剰発現によるアルカリホスファターゼ活性の増強を示す。  図３Ｆ．ＺＮＦ１４５過剰発現は、非挿入対照と比較して、インビトロでＭＳＣ細胞株の軟骨形成および骨形成を増強した。ＺＮＦ１４５過剰発現ＭＳＣ細胞株を、２８日間の軟骨形成および１４日間の骨形成に誘導し、軟骨形成および骨原性マーカーをリアルタイムＰＣＲにより測定し、非挿入対照と比較する。  図３Ｇ．ＺＮＦ１４５過剰発現は、ＭＳＣ細胞株の軟骨形成および骨形成を改善する。ＺＮＦ１４５過剰発現ＭＳＣおよび対照ＭＳＣを、２８日間の軟骨形成および１４日間の骨形成に誘導する。ＺＮＦ１４５過剰発現のＭＳＣ細胞株の分化への効果を、軟骨におけるＣｏｌ２Ａ１に対する免疫染色、および硫酸プロテオグリカンマトリックスに対するアルシアンブルー染色、および骨形成における石灰沈着に対するアリザリンレッドＳ染色により評価する。非挿入対照と比較して、ＺＮＦ１４５過剰発現ＭＳＣ細胞株は、軟骨形成および骨原性分化に対する染色の増強を示す。  図３Ｈ．骨形成の間のＺＮＦ１４５過剰発現によるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色の増強。ＺＮＦ１４５過剰発現ＭＳＣおよび対照ＭＳＣ細胞株を１４日間の骨形成に誘導し、アルカリホスファターゼ活性をＡＰ染色により決定した。  図３Ｉ．ＭＳＣ細胞株の骨形成におけるＺＮＦ１４５過剰発現へのＡＰアッセイによるアルカリホスファターゼ活性の増強。ＺＮＦ１４５過剰発現ＭＳＣおよび対照ＭＳＣ細胞株を１４日間の骨形成に誘導し、アルカリホスファターゼ活性を、ＡＰアッセイにより定量化し、対照と比較した。
【図４】マイクロアレイによる全般的遺伝子発現分析を示す図である。  図４Ａ．１４３１２プローブのピアソン相関分析を行って、２つの異なる個体由来の、非挿入対照ＭＳＣおよびＺＮＦ１４５過剰発現ＭＳＣをクラスター化する。赤色は、発現の増加を示し、一方、緑色は発現の低下を示す。  図４Ｂ．遺伝子はＺＮＦ１４５過剰発現ＭＳＣにおいてアップレギュレートされた。２人の患者由来のＺＮＦ１４５過剰発現ＭＳＣは、アップレギュレートされた遺伝子において類似する発現プロフィールを示した。  図４Ｃ．ＲＴ−ＰＣＲによるマイクロアレイデータの検証。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、マイクロアレイデータに一致する。
【図５】未分化型ＭＳＣにおけるＺＮＦ１４５過剰発現によるＳｏｘ９アップレギュレートを示す図である。ＺＮＦ１４５およびＳｏｘ９を過剰発現するためのレンチウイルスにＭＳＣを感染させ、挿入物を含まないもの（ｎｏ  ｉｎｓｅｒｔ）を対照として使用する。これらの結果として、ＺＮＦ１４５はＳｏｘ９をアップレギュレートしたが、Ｓｏｘ９はＺＮＦ１４５を調節しなかったことが示され、ＺＮＦ１４５がＳｏｘ９の上流調節因子であることが示唆される。Ａ、ＲＴ−ＰＣＲ；Ｂ、ウエスタンブロット解析。
【図６】ＺＮＦ１４５は、ラットモデルにおいて骨軟骨欠損修復を改善する。  図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃ．ＺＮＦ１４５−過剰発現ＭＳＣおよび非挿入対照ＭＳＣを、ペレット培養下での７日間の軟骨分化に誘導し、次に、ペレットを、ラット膝の骨軟骨欠損部に６週間移植する。結果は、６週間で、挿入物を含まない対照群よりも、ＺＮＦ１４５群が、骨軟骨欠損部の良好かつ早期の修復を示した。  図６Ａ．倍率４０倍。図６Ｂ．倍率１００倍。図６Ｃ．組織学的類別スケールにより、Ｗａｋａｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）に従って評価した、ＺＮＦ１４５と非挿入対照群間の、６週での軟骨欠損の修復の有意な差異が示される（＊Ｐ＜０．０５）。  図６Ｄ、図６Ｅおよび図６Ｆ．ＺＮＦ１４５−過剰発現ＭＳＣおよび非挿入対照ＭＳＣを、ペレット培養下での７日間の軟骨分化に誘導し、次にペレットを、ラット膝の骨軟骨欠損部に１２週間移植した。結果は、１２週で、非挿入対照群よりも、ＺＮＦ１４５群が骨軟骨欠損部の良好な修復および組込みを示したことを示した。図６Ｄ．倍率４０倍。図６Ｅ．倍率１００倍。図６Ｆ．組織学的類別スケールにより、Ｗａｋａｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）に従って評価した、ＺＮＦ１４５と非挿入対照群間の、１２週での軟骨欠損の修復の有意な差異が示された（＊Ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明者らの発明は、ＺＮＦ１４５が、間葉系幹細胞などの軟骨形成前駆細胞の軟骨形成分化の調節に役割を有するという実証に基づく。
【００３０】
本発明者らは、ＺＮＦ１４５の低分子干渉ＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシングの結果、軟骨形成特異的遺伝子の発現の低下がもたらされることを示す。ＺＮＦ１４５の過剰発現は、２Ａ１型コラーゲン（ｃｏｌ２Ａ１）、アグリカン、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ｂｏｘ９（Ｓｏｘ９）および１０Ａ１型コラーゲン（ｃｏｌ１０Ａ１）などの遺伝子の発現を増加させる。ＺＮＦ１４５発現は、従って軟骨形成のマーカーとして使用することができる。
【００３１】
本発明者らは、未分化型ＭＳＣにおけるＺＮＦ１４５の標的には、マイクロアレイによって測定されるＳｏｘ９、軟骨リンクタンパク質１（ＨＡＰＬＮ１）およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰＬ）が含まれることを実証する。ＺＮＦ１４５過剰発現は、Ｓｏｘ９の発現を増強させるが、Ｓｏｘ９過剰発現は、ＺＮＦ１４５の発現に影響を及ぼさない。このことは、ＺＮＦ１４５がＳｏｘ９の上流調節因子として軟骨形成を制御することを示す。
【００３２】
実施例では、ＺＮＦ１４５を過剰発現するｈＭＳＣのラットへの同種移植により、ＺＮＦ１４５が、非挿入対照ＭＳＣよりもはるかに良好に軟骨欠損を修復することが示される。これらの知見は、ＺＮＦ１４５療法を、軟骨の再生および修復に向けての戦略として用いることができることを示す。また、それはその他の組織、例えば骨および靭帯などの再生および修復に使用してもよい。
【００３３】
核酸形態またはポリペプチド形態のＺＮＦ１４５、その活性または発現をアップレギュレートする能力のあるＺＮＦ１４５のアゴニスト、および間葉系幹細胞などのＺＮＦ１４５過剰発現細胞は、従って本明細書に記載される軟骨形成促進剤として使用することができる。
【００３４】
軟骨形成促進剤
実施例は、ＺＮＦ１４５およびそのアゴニストを、軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞における軟骨形成を開始させる、維持する、または安定化させるために使用することができることを示す。
【００３５】
従って、本発明者らは、ＺＮＦ１４５、そのアゴニスト、およびＺＮＦ１４５過剰発現細胞の任意の組合せを含むいくつかの軟骨形成促進剤を提供する。ＺＮＦ１４５過剰発現細胞は、ＺＮＦ１４５を過剰発現するかまたはＺＮＦ１４５を過剰発現するように改変されている軟骨前駆細胞を含み得る。ＺＮＦ１４５過剰発現細胞は、任意の適した種類の細胞を含んでよい。それは、間葉系幹細胞を含んでよい。また、それは、骨膜または滑膜に由来する軟骨細胞、臍帯幹細胞、骨髄間質細胞、脂肪間質細胞または軟骨形成前駆細胞を含んでよい。
【００３６】
本発明者らは、治療上有効な量の本明細書に記載される軟骨形成促進剤を、所望により製薬上許容される担体と一緒に投与することを含む、軟骨形成を誘導するための方法を提供する。
【００３７】
本発明者らは、ＺＮＦ１４５核酸を含む軟骨形成促進剤を記載する。軟骨形成促進剤は、ＺＮＦ１４５ポリペプチドを含んでよい。従って、本発明者らは、医学における、例えば変性疾患の治療における、ＺＮＦ１４５核酸およびポリペプチドの使用を提供する。
【００３８】
本明細書に記載される方法は、軟骨形成を導くことができる。それらの方法は、脊椎動物において新しい骨組織の形成をさらに媒介する軟骨形成を導き得る。これらの方法は、軟骨、靭帯または骨の発生、再生または修復に使用することができる。これらの方法は、これらの目的のうちのいずれかが望ましい、あらゆる治療のために使用することができる。そのような治療は、軟骨、靭帯または骨の疾患、外傷性疾患などの傷害、損傷などに用いることができる。
【００３９】
軟骨形成促進剤は、ＺＮＦ１４５の活性または発現をアップレギュレートする能力のある薬剤を含んでよい。ＺＮＦ１４５の活性または発現をアップレギュレートする能力のある薬剤は、一般に、本明細書の目的のためのＺＮＦ１４５アゴニストと称される。一般に、ＺＮＦ１４５アゴニストは、１マイクロモル未満のＫｄをもつＺＮＦ１４５に結合するあらゆる化学物質を含み得る。ＺＮＦ１４５アゴニストは、下に詳細に記載されるように、ＺＮＦ１４５の活性または機能のいずれか１以上を増強させるかまたは上昇させる化学薬品を含み得る。
【００４０】
ＺＮＦ１４５アゴニストには、ＺＮＦ１４５の転写活性化因子、翻訳活性化因子または翻訳後活性化因子が含まれる。また、ＺＮＦ１４５アゴニストには、ＺＮＦ１４５のその標的配列へのＤＮＡ結合活性または転写活性化活性（またはその両方）を強化する分子も含まれる。ＺＮＦ１４５アゴニストは、下に詳細に記載されるように試験またはスクリーニングにより同定することができる。
【００４１】
ＺＮＦ１４５アゴニストの一例は、ＺＮＦ１４５発現ベクターである。ＺＮＦ１４５発現ベクターを用いて、細胞、例えば間葉系幹細胞などにおいてＺＮＦ１４５の発現をアップレギュレートすることができる。発現ベクターの一例は、調節配列およびＺＮＦ１４５コード配列を含む発現ベクターである。宿主細胞に適したあらゆる発現ベクターを使用してよい。例えば、ＺＮＦ１４５の発現をアップレギュレートする能力のあるレンチウイルス発現ベクターを、軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞などの細胞にトランスフェクトすることができる。
【００４２】
軟骨形成促進剤を用いて、任意の適した細胞または細胞種の軟骨形成を促進することができる。軟骨形成促進剤を用いて、間葉系幹細胞軟骨細胞、軟骨細胞（ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、臍帯幹細胞軟骨細胞、骨髄間質細胞軟骨細胞、脂肪間質細胞軟骨細胞、軟骨形成前駆細胞軟骨細胞またはそれらの組合せの軟骨形成を促進することができる。
【００４３】
軟骨細胞は、硝子軟骨細胞、線維軟骨細胞、弾性軟骨細胞、幼若関節軟骨細胞、成人関節軟骨細胞およびそれらの組合せからなる群から選択されてよい。軟骨形成前駆体は、滑液包軟骨形成前駆細胞、骨膜軟骨形成前駆細胞、胚幹細胞軟骨形成前駆細胞およびそれらの組合せからなる群から選択されてよい。
【００４４】
軟骨形成促進剤を用いて、軟骨形成前駆細胞の軟骨形成を促進することができる。軟骨形成促進剤を用いて、間葉系幹細胞の軟骨形成を促進することができる。
【００４５】
軟骨形成促進剤は、ＺＮＦ１４５過剰発現細胞を含んでよい。この細胞は、間葉系幹細胞を含んでよい。ＺＮＦ１４５過剰発現細胞を、治療のためのＺＮＦ１４５の供給源として使用することができる。それを使用して軟骨を生成し、その軟骨を修復に使用してよい。修復は、軟骨、骨または靭帯に対するものであってよい。そのような細胞、例えば、ＺＮＦ１４５の発現がアップレギュレートされている間葉系幹細胞は、それ自体薬物として使用してよい。ＺＮＦ１４５過剰発現細胞は、トランスフェクト、形質転換によるか、またはそうでなければＺＮＦ１４５発現ベクターを間葉系幹細胞などの細胞に侵入させ、その間葉系幹細胞を培養し、ＺＮＦ１４５をそこから発現させることにより産生させることができる。そのような細胞から細胞株を誘導することができる。細胞株は、形質転換させてもよいし、またはそうでなければ不死化させてもよい。不死化の方法には、以下および実施例に詳細に記載されるように、テロメラーゼまたは１以上のウイルス遺伝子の発現が含まれる。
【００４６】
テロメラーゼおよび／またはウイルス遺伝子を発現するように改変することにより不死化されたＺＮＦ１４５過剰発現細胞または細胞株は、本明細書に記載されるように、治療に、または医薬組成物の製造に使用することができる。
【００４７】
ＺＮＦ１４５過剰発現間葉系幹細胞は、治療を必要とする患者に投与することができる。発現ベクターをトランスフェクトするなどされた間葉系幹細胞は、任意の供給源に由来するものであってよい。例えば、それは、後にその細胞を投与する患者と同じ患者から採取したものであってよい（同種移植）。
【００４８】
本明細書に記載される軟骨形成促進剤は、一般に軟骨形成を促進する際に使用することができる。それらを使用して、細胞、組織、器官または個体での軟骨形成を促進することができる。それらは、一般に軟骨性組織の発生、修復または再生のために使用することができる。それらは、一般に軟骨発生、再生または修復のために使用することができる。それらは、骨発生、再生または修復のために使用することができる。それらは、靭帯発生、再生または修復のために使用することができる。
【００４９】
それら軟骨形成促進剤を使用して、軟骨形成が影響を受けている、欠損している、低下している、抑制されている、またはそうでなければ損なわれている疾患を治療することができる。一般に、これらの方法を用いて、骨、軟骨または靭帯の構造または機能の喪失または損傷に関連するあらゆる障害を治療することができる。
【００５０】
これらの方法は、変性疾患、例えば軟骨、骨または靭帯が損傷しているかまたは欠損しているなどの疾患の治療に使用することができる。それらを使用して、かかる疾患の発症を防ぐかまたは遅らせることができる。
【００５１】
変性疾患は、以下にさらに詳細に記載されるが、それには、軟骨欠損、骨欠損、靭帯欠損に関連する疾患、加齢性変性疾患または変性関節疾患が含まれ得る。
【００５２】
軟骨形成促進剤はまた、軟骨、骨または靭帯が損傷している傷害を治療する際にも使用することができる。そのような傷害には、外傷性疾患またはスポーツ傷害が含まれ得る。それには、外傷性損傷が含まれ得る。
【００５３】
上記の軟骨形成促進剤は、任意の組合せで治療を必要とする患者に投与されてよい。それらは、医薬組成物の形態で提供されてよく、それは軟骨形成促進剤の１以上のいずれの組合せも含むことができる。
【００５４】
本発明者らは、（ａ）間葉系幹細胞などの細胞を単離するステップと、（ｂ）例えばＺＮＦ１４５発現ベクターを細胞にトランスフェクトすることにより、細胞にＺＮＦ１４５を過剰発現する能力を持たせるステップと、（ｃ）細胞をインビトロで増殖させるステップと、および（ｄ）硝子質様軟骨組織か、または移植に有用な細胞の集団を作成するために増殖した細胞を使用するステップとを含む方法を記載する。
【００５５】
本発明者らは、少なくとも１つのドナーから採取した、上記のような細胞、例えば間葉系幹細胞などを個体に投与することを含む、個体を治療する方法を記載する。「ドナー」とは、本明細書において、成人、小児、乳児、または、好ましくは、胎盤を意味する。この方法は、複数のドナーから採取され貯蔵された細胞を個体に投与することを含み得る。細胞は、複数のドナーより採取された軟骨形成前駆体幹細胞であってよい。複数のドナーから採取される場合、投薬単位（ここで「投薬単位」とは、単一のドナー由来の採取物である）は、投与の前に貯蔵されてもよいし、順次投与されてもよいし、または代替的に投与されてもよい。
【００５６】
本発明者らは、軟骨、骨または靭帯修復のために細胞を発生させるためのキットをさらに記載し、このキットは、１以上のＺＮＦ１４５核酸、ＺＮＦ１４５ポリペプチド、ＺＮＦ１４５アゴニストおよびＺＮＦ過剰発現細胞を、使用説明書と一緒に含む。
【００５７】
キットは、医薬パック（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐａｃｋ）を含んでよい。それは、本明細書に記載される医薬組成物の１以上の成分で満たした１以上の容器を含んでよい。所望によりかかる容器（群）に関連するものは、細胞培養用の器具、細胞培養液または細胞培養液の１以上の成分で満たした１以上の容器、本明細書に記載される組成物の送達に使用する器具、例えば、本発明の組成物の静脈注射用の器具、および／または医薬品または生物由来物質の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定された形態の通知（その通知は、同機関によるヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す）であってよい。キットは、本明細書の他所に開示されるように、間葉系幹細胞などの軟骨形成前駆体幹細胞で満たした１以上の容器およびＺＮＦ１４５またはそのアゴニストで満たした１以上の異なる容器を含み得る。
【００５８】
ＺＮＦ１４５軟骨形成促進剤の使用
本発明者らは、かかる軟骨形成促進剤を含む組成物を提供し、軟骨形成促進剤は、ＺＮＦ１４５、ＺＮＦ１４５アゴニストおよびＺＮＦ１４５過剰発現細胞のいずれか１以上を含み得る。
【００５９】
本発明者らは、軟骨形成、骨形成および靭帯形成を含む異常な組織形成を含む障害を治療するための、治療組成物およびかかる組成物の使用を記載する。治療組成物は、異常な軟骨、靭帯または骨形成を伴い、疾患によりもたらされるかまたは外傷に起因する異常な骨格の発達に関連する障害の治療のために使用することができる。
【００６０】
治療組成物は、有効量の軟骨形成促進剤を含んでよい。それらは、製薬上許容される担体をさらに含む医薬組成物の形態で提供されてよい。軟骨形成促進剤は、軟骨、骨または靭帯形成への刺激効果を含み、脊椎動物において関連する骨発達をもたらすことができる。
【００６１】
軟骨形成促進剤は、脊椎動物において軟骨、骨または靭帯形成を刺激するための方法で使用することができる。そのような方法は、脊椎動物に有効な軟骨、骨または靭帯形成刺激量の軟骨形成促進剤を投与することを含み得る。それは、被験体において損傷した軟骨、骨または靭帯および関連する骨を治療するための方法で使用することができる。そのような方法は、被験体に有効量の軟骨形成促進剤を投与することを含み得る。軟骨形成促進剤は、関連する骨修復を媒介する、軟骨、骨または靭帯修復および形成を刺激し得る。
【００６２】
軟骨形成促進剤は、被験体において関節炎を治療するための方法で使用することができる。この方法は、被験体に有効量の軟骨形成促進剤を投与することを含み得る。従って、本発明者らは、被験体に、有効量の軟骨形成促進剤で治療した軟骨形成細胞を投与することを含む、被験体において関節炎を治療するための方法を提供する。
【００６３】
本発明者らは、脊椎動物における軟骨形成および関連する骨格の発達を誘導するための組成物をさらに提供し、該組成物は、軟骨形成促進剤および製薬上許容される担体を含む。脊椎動物における軟骨、骨または靭帯部位での移植のための形態形成装置も提供され、該装置は、埋め込み可能な生体適合性担体および該担体の内部または該担体の上に分散した軟骨形成促進剤を含む。本発明者らは、インビトロで軟骨形成を誘導するための、軟骨形成促進剤および製薬上許容される担体を含む組成物の使用を記載する。
【００６４】
軟骨細胞は、軟骨前駆体間葉細胞を軟骨形成促進剤にインビトロで接触させることにより、軟骨前駆体間葉細胞から産生させることができる。用語「軟骨細胞」とは、インビボで正常な軟骨組織の成長を生じさせる細胞（例えば軟骨、骨または靭帯細胞など）をさす；これらの細胞は、軟骨の支持マトリックス（主にコラーゲンおよびプロテオグリカンからなる）を合成および堆積する。
【００６５】
本発明者らは、脊椎動物において、軟骨、骨または靭帯に関連する整形外科的な欠損、傷害または異常を修復するための埋め込み可能な補綴装置を提供し、該装置は、軟骨、骨または靭帯組織に隣接するかまたは軟骨、骨または靭帯組織の中の埋め込み可能な表面領域を有する補綴移植片、軟骨、骨または靭帯の表面への成長の増強を促進するために十分な量で表面領域に配置された軟骨形成促進剤組成物、を含む。埋め込み可能な補綴装置の、脊椎動物の標的軟骨、骨または靭帯組織へのインビボ組込みを促進するための方法も記載され、該方法は、補綴装置の表面に、軟骨形成促進剤および製薬上許容される担体を含む組成物を準備するステップと、脊椎動物において、標的軟骨、骨または靭帯組織および補綴装置の表面が少なくとも一部分、標的軟骨、骨または靭帯組織と装置との間の組織の成長を許容するために十分な時間接触させた状態で維持される部位で、装置を移植するステップとを含む。
【００６６】
本発明者らは、脊椎動物において骨格手術の部位での自然骨形成を促進するための方法を提供し、該方法は、軟骨形成促進剤組成物を骨格手術部位に送達するステップを含み、それによって、かかる送達により、軟骨により媒介される新しい骨組織の形成が間接的に促進される。
【００６７】
本発明者らは、脊椎動物において外傷または手術に起因する大きな分節状の骨格間隙および偽関節骨折を修復するための方法を記載し、該方法は、本明細書に記載される軟骨形成促進剤組成物を分節状の骨格間隙または偽関節骨折の部位に送達することを含み、それによって、かかる送達により、新しい骨組織形成を媒介する軟骨の形成が促進される。
【００６８】
本発明者らは、軟骨、骨または靭帯部位への埋め込み可能な人工器官の付着を助けるための、かつ脊椎動物において人工器官の長期安定性を維持するための方法を提供し、該方法は、埋め込み可能な人工器官の選択された領域に軟骨形成促進剤組成物をコーティングすること、およびコーティングされた人工器官を軟骨、骨または靭帯部位に移植することを含み、それによって、かかる移植により、新しい軟骨、骨または靭帯組織の形成が促進され、かつ、間接的に骨形成が刺激される。
【００６９】
本発明者らは、インビボで軟骨、骨または靭帯欠損部位に軟骨、骨または靭帯を産生する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載される軟骨形成促進剤の存在下でインビトロ培養された軟骨形成細胞集団を欠損部位に移植することを含む。
【００７０】
本発明者らは、軟骨、骨または靭帯変性を特徴とする変性関節疾患を治療するための方法を提供し、該方法は、本明細書に記載される治療上有効な量の軟骨形成促進剤を疾患部位に送達することを含む。
【００７１】
本明細書に記載される少なくとも１つの軟骨形成促進剤を含む医薬組成物は、例えば生分解性スポンジ、ゲル、コーティングまたはペーストを用いて局所的に治療部位に適用することができる。使用に適したゲルは、コラーゲンＩなどのコラーゲン型ゲルである。また、軟骨形成促進剤を整形外科用または歯科用移植片の治療に用いて骨の統合を強化または加速することができる。少なくとも１つの軟骨形成促進剤を含む医薬組成物は、直接的に所望の骨の統合部位に局所適用するか、あるいは移植片上のコーティングとして適用することができる。
【００７２】
また、軟骨形成促進剤は、埋め込み可能な補綴装置のインビボでの組込みを促進するためにも使用することができる。一般に、本明細書に記載される軟骨形成促進剤組成物は、移植のための合成骨移植に適用することができ、それによって、該組成物により軟骨、骨または靭帯形成および間接的に骨形成が刺激される。従ってこの組成物は、整形外科産業において多数の用途を有する。特に、外傷修復、脊椎固定術、再建外科、顎顔面外科術および口腔外科の分野に用途がある。軟骨形成促進剤組成物の局所的な自然骨成長を刺激する能力は、安定性および迅速な組込みを提供し、それと同時に身体の正常細胞に基づく骨再形成プロセスはゆっくりと再吸収し、選択された移植片を自然骨に置き換える。インビボでの使用に適した移植片は、一般に当業者に公知である。
【００７３】
本明細書に記載される軟骨形成促進剤は、軟骨、骨または靭帯および骨格の再構築のために使用することができる。そのような用途では、軟骨形成促進剤は、脊椎動物における軟骨、骨または靭帯の生体外組織工学または移植用の骨格組織に使用され得る。細胞は、骨軟骨自家移植または同種移植の間に軟骨形成促進剤で治療され得る（Ｍｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ  ２０，５２５  ５３８）。自家移植では、軟骨形成細胞または軟骨形成能をもつ細胞を、患者から（例えば肋骨から）取り出し、軟骨性病変を充填するために使用する。代替方法は、これらの細胞をインビトロで増殖させ、次にそれらを軟骨性病変に移植することを含む。少なくとも１つの軟骨形成を刺激する軟骨形成促進剤を含む医薬組成物を用いて、関節内注射を通じて生着の前および／または生着後にインビトロ培養細胞を処理してもよい。本明細書に記載される軟骨形成促進剤組成物の使用は、疼痛、および自家移植用移植片に必要とされる骨採取手順に関連するコストを除去することができる。さらに、軟骨形成促進剤組成物を合成によって製作することができ、従って感染および疾患の伝染の可能性を低減し、同時に患者による免疫拒絶の可能性を減少させる。
【００７４】
本明細書に記載される軟骨形成促進剤組成物はまた、関節炎、変形性関節症かまたは関節リウマチを含むその他の種類の関節炎の治療に使用することもできる。軟骨、骨または靭帯の変性を特徴とする変性関節疾患を逆行させるかまたは遅らせるために、少なくとも１つの軟骨形成を刺激する軟骨形成促進剤を含む医薬組成物を、関節内注射によるか、または関節内補充薬と組み合わせて局所に適用することができる。組成物は、急速放出または持続放出製剤で提供することができる。かかる組成物は、例えば変性股関節または膝関節の患者において用途がある。
【００７５】
一般に、軟骨形成促進剤を用いて、間葉前駆体細胞からのインビトロ軟骨形成および軟骨細胞のインビトロ形成を刺激することができる。かかる細胞培養材料および方法は、当業者に公知である。選択された軟骨形成促進剤によってインビトロで処理された細胞および組織は、治療的にインビボで使用されるか、あるいはインビトロの細胞アッセイ系に使用され得る。
【００７６】
例えば、インビボまたはインビトロでの軟骨細胞増殖は、軟骨、骨または靭帯修復のためのものであってよい。間葉系幹細胞などの軟骨形成前駆細胞は、例えば、個体由来の骨髄試料から取り出すことができる。単離された間葉系幹細胞などの軟骨形成前駆細胞を、培養し、ＺＮＦ１４５発現ベクター、例えばレンチウイルスベクターなどでトランスフェクトしてよい。それらはテロメラーゼ発現ベクターまたはウイルスタンパク質、例えばＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７またはＢｍｉ−１などによる形質転換により不死化させてよい。細胞株を、かかる不死化した間葉系幹細胞などの軟骨形成前駆細胞から誘導してよい。
【００７７】
次に、ＺＮＦ１４５を過剰発現する、間葉系幹細胞などの軟骨形成前駆細胞を患者の身体に投与してよい。この前に、例えばＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７に記載されるペレット培養系により、これらの細胞を軟骨細胞分化に誘導することができる。
【００７８】
記載されるプロセスにより単離された解離細胞は、足場の支えなしに成長して、軟骨修復のための三次元組織を作成する（米国特許第６，２３５，３１６号）。しかし、この方法によって増殖させた細胞は、適した生分解性のポリマーマトリックスまたはヒドロゲルと組み合わせて移植して、新しい軟骨組織を形成することができる。様々なマトリックスを使用してよく、それには、例えばその中に細胞を懸濁させたフィブリンまたはアルギン酸などの材料で形成された高分子ヒドロゲル、および約４０〜２００μｍの間の間質腔を有する線維性マトリックスが含まれる。ポリマーマトリックスの一例は、移植後約１〜２ヶ月で分解するもの：例えばポリ酪酸−グリコール酸共重合体（米国特許第５，７１６，４０４号）などである。マトリックスには、移植の前に播種してもよいし、移植し、血管新生化させた後に細胞を播種してもよい。（Ｃｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｖａｃａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；ａｎｄ  Ｖａｃａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。その他の材料、例えば移植した組織の血管新生を増強し、かつ／または線維性組織の内殖を抑制する生理活性分子を、マトリックスとともに移植して、より正常な組織の発生を増強することができる。
【００７９】
本明細書に記載される医薬組成物は、その他の軟骨形成刺激物質、例えば骨形成タンパク質（ＢＭＰ）特にＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４、ＯＰ−１などの骨原性タンパク質（ＯＰ）および／またはサイトカインと組み合わせて使用して、組成物の効果を増強させ、かつ／または維持することができる。ＢＭＰとＯＰは両方とも、成長および分化ならびに組織形態の形成および修復に関与するタンパク質を表すＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質である。また、本明細書に記載される軟骨形成促進剤組成物が、任意の天然または合成の有機または無機の化学物質または生化学物質として規定されるその他の軟骨誘導性薬剤または因子、あるいは軟骨形成を刺激する化合物の混合物をさらに含むことができることも理解される。また、本明細書に記載される軟骨形成促進剤組成物が、軟骨、骨または靭帯の成長および形成に刺激効果を有することが公知のその他の増殖因子を含んでよいこともさらに理解される。
【００８０】
軟骨形成前駆体幹細胞
本発明者らは、ＺＮＦ１４５過剰発現細胞の使用を提供する。かかる細胞は、軟骨形成前駆体幹細胞を含み得る。かかる細胞は、胎盤から単離されていてよい（Ｋｏｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。それらは骨髄間葉間質細胞（Ｍａｃｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｋａｖａｌｋｏｖｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、脂肪間質細胞（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、滑膜（ＤｅＢａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）および骨膜（ＤｅＢａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）を含んでよい。
【００８１】
間葉系幹細胞
ＺＮＦ１４５過剰発現細胞は、間葉系幹細胞を含み得る。間葉系幹細胞およびその使用は、Ｂａｒｒｙ  ＦＰ，Ｍｕｒｐｈｙ  ＪＭ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；３６：５６８−５８４に記載されている。
【００８２】
ＺＮＦ１４５
本明細書に記載される方法および組成物は、ＺＮＦ１４５を利用する。ＺＮＦ１４５は、前骨髄球性白血病ジンクフィンガータンパク質、ＰＬＺＦ、クルッペル様ジンクフィンガータンパク質、ジンクフィンガータンパク質１４５（クルッペル様、前骨髄球性白血病において発現）としても公知である。それは、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅデータベースに遺伝子ＩＤ：７７０４として記載されている。
【００８３】
ＺＮＦ１４５は、クルッペル（Ｋｒｕｅｐｐｅｌ）Ｃ２Ｈ２型ジンクフィンガータンパク質ファミリーのメンバーであり、９個のクルッペル型ジンクフィンガードメインをカルボキシル末端に含むジンクフィンガー転写因子をコードする。ＺＮＦ１４５は、核に位置し、細胞周期進行に関与し、ヒストンデアセチラーゼと相互作用する。この遺伝子座での異常な遺伝子再構成の具体的な事例は、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）に関連してきた。代わりの転写スプライスバリアントが特徴付けられている。
【００８４】
ＺＮＦ１４５のヌクレオチド配列の一例は、ＮＭ＿００６００６．４である。ＺＮＦ１４５のもう一つの核酸配列は、ＮＭ＿００１０１８０１１である。これらの２つの配列はヒト変異体（１）および（２）を表し、その両方ともが本明細書で用いられる用語ＺＮＦ１４５に包含される。また、用語ＺＮＦ１４５には、かかる配列の相同体、誘導体、断片および変異体が含まれる。
【００８５】
ＺＮＦ１４５の核酸変異体および相同体には、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６０５６８．１、ＡＦ０７６６１３．１、ＡＦ０７６６１５．１、ＡＦ０７６６１６．１、ＡＰ０００９０８．４（１０９９２２．．１４９１３２）、ＡＰ００２５１８．３、ＡＰ００２７５５．２（２００７．．１０９３２２）、ＣＨ４７１０６５．１、Ｓ６００９３．１、ＡＢ２０８９１６．１、ＡＫ１２６４２２．１、ＢＣ０２６９０２．１、ＢＣ０２９８１２．１、ＢＭ９６９１４５．１、ＢＸ６４８９７３．１、Ｚ１９００２．１、ＥＵ４４６７２５．１、ＣＣＤＳ８３６７．１が含まれる。文脈上別段の指示のない限り、これらの配列、ならびにその相同体、変異体、誘導体および断片の各々は、用語「ＺＮＦ１４５」に包含される。
【００８６】
ＺＮＦ１４５のタンパク質配列は、ＮＰ＿００５９９７．２である。ＺＮＦ１４５のさらなるポリペプチド配列は、ＮＰ＿００１０１８０１１．１である。両方の配列とも、この用語が本明細書で用いられる時に「ＺＮＦ１４５」と記載され得る。
【００８７】
ＺＮＦ１４５のポリペプチド変異体および相同体には、ＡＡＤ０３６１９．１、ＡＡＣ３２８４７．１、ＡＡＣ３２８４８．１、ＡＡＣ３２８４９．１、ＥＡＷ６７２４１．１、ＥＡＷ６７２４２．１、ＡＡＣ６０５９０．２、ＢＡＤ９２１５３．１、ＡＡＨ２６９０２．１、ＡＡＨ２９８１２．１、ＣＡＡ７９４８９．１、ＡＢＺ９２２５４．１、Ｑ０５５１６．２、Ｑ５９Ｈ４３、Ｑ７１ＵＬ５、Ｑ７１ＵＬ６、Ｑ７１ＵＬ７が含まれる。文脈上別段の指示のない限り、これらの配列、ならびにその相同体、変異体、誘導体および断片の各々は、用語「ＺＮＦ１４５」に包含される。
【００８８】
ＺＮＦ１４５配列は、天然または野生型ＺＮＦ１４５のいずれか１以上の機能を含み得る。ＺＮＦ１４５の機能には、ＤＮＡ結合、金属イオン結合、タンパク質ホモ二量体化活性、特異的転写制御活性および亜鉛イオン結合が含まれる。これらの活性の各々のアッセイは、当分野で周知である。ＺＮＦ１４５の関与するプロセスには、アポトーシス、中枢神経系発生、中腎発生、骨髄系細胞分化の負の調節、転写の負の調節、ＤＮＡ依存性転写およびユビキチンサイクルが含まれる。
【００８９】
特定のタンパク質がこれらのプロセスのいずれかに関与しているかどうかを試験する方法は、当分野で公知であり、Ｂｅｒｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，３５９（２）：３１７−３２２．Ｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１９９５，９２（６）：２２４９−２２５３；Ｓｈａｋｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９８，１８：５５３３?５５４５；Ｐｅｔｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００８  Ｍａｙ  ２６  に具体的に記載されている。
【００９０】
用語「ＺＮＦ１４５」および「ＺＮＦ１４５配列」は、それらが本明細書において使用される時に、上記配列、ならびにそれらの断片、相同体、誘導体および変異体の各々への参照を含むものとする。ＺＮＦ１４５核酸、ＺＮＦ１４５ポリペプチド、ならびにその断片、相同体、誘導体および変異体は、本明細書の他所でさらに詳細に記載されている。
ＺＮＦ１４５の特性
【００９１】
以下のテキストは、ＯＭＩＭエントリ１７６７９７：ジンクフィンガー含有およびＢｔｂドメイン含有タンパク質１６；ＺＢＴＢ１６（ジンクフィンガータンパク質１４５；Ｚｎｆ１４５、前骨髄球性白血病ジンクフィンガー；Ｐｌｚｆ、Ｐｌｚｆ／Ｒａｒａ融合遺伝子Ｉｎｃｌｕｄｅｄ．としても公知）から編集する。
【００９２】
Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２６０−２２６７，１９９３）は、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）の中国人患者において染色体１７上のレチノイン酸受容体−α遺伝子（ＲＡＲＡ；１８０２４０）の融合パートナーとしての染色体１１上のＰＬＺＦ遺伝子および転座ｔ（１１；１７）（ｑ２３；２１）を同定した。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：１１６１−１１６７，１９９３）は、ＰＬＺＦ遺伝子を記載した。
【００９３】
Ｒｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５，Ｂｌｏｏｄ  ８６：４５４４−４５５２，１９９５）は、未分化の多能性造血前駆細胞においてネズミＰＬＺＦが最高レベルで発現され、その発現は細胞がより成熟して様々な造血系列に関係付けられてゆくにつれて低下することを示した。ヒトでは、成熟末梢血単核細胞においてＰＬＺＦタンパク質の発現はなく、ＰＬＺＦレベルはＣＤ３４＋ヒト骨髄前駆細胞の核において高い。多くの転写因子と違って、ＰＬＺＦタンパク質はこれらの細胞において明確な点状分布を示し、核におけるその区画化が示唆される。
【００９４】
Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：１１４２２−１１４２７，１９９９）は、少なくとも４つの選択的スプライシング（ＡＳ−Ｉ、−ＩＩ、−ＩＩＩ、および−ＩＶ）をＰＬＺＦ遺伝子のエキソン１の中で同定した。ＡＳ−Ｉは、試験したほとんどの組織で検出されたが、ＡＳ−ＩＩ、−ＩＩＩ、および−ＩＶは、それぞれ胃、精巣、および心臓に存在していた。ＡＳ−Ｉおよびエキソン１−６のエキソン−イントロン境界でのスプライシングドナーおよびアクセプターシグナルは古典的であったが（ｇｔ−ａｇ）、ＡＳ−ＩＩ、−ＩＩＩ、および−ＩＶは、非定型スプライシング部位を有していた。それにもかかわらず、これらの選択的スプライシングは、オープンリーディングフレームを維持し、重要な機能ドメインなしにイソ型をコードすることができる。ＡＳ−Ｉを含まないｍＲＮＡ種では、６．０ｋｂの比較的長い５−ｐｒｉｍｅ  ＵＴＲが存在する。Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９，ｓｕｐｒａ）は、ＰＬＺＦが、線虫からヒトまでよく保存された遺伝子であることを突き止めた。ＰＬＺＦパラロガス配列が、ヒトゲノムにおいて見出される。ヒト染色体１１ｑ２３および１９上の２ＭＬＬ／ＰＬＺＦ様アラインメントは、進化の間のシンテニーの複製を示唆する。
【００９５】
遺伝子機能
Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：５１４７９−５１４８３，２００３）は、ヒト前骨髄球性細胞株において内在性のＰＬＺＦがＳＵＭＯ１（６０１９１２）とともに修飾されたこと、およびＰＬＺＦがトランスフェクトされたヒト胚腎臓細胞の核でＳＵＭＯ１と共局在したことを見出した。部位特異的変異誘発により、ＰＬＺＦ  ＳＵＭＯ化の部位のように転写抑制ドメイン−２においてｌｙｓ２４２が同定された。レポーター遺伝子アッセイにより、ｌｙｓ２４２のＳＵＭＯ１修飾がＰＬＺＦによる転写抑制を必要とすることが示唆され、電気泳動移動度シフトアッセイにより、ＳＵＭＯ化がＰＬＺＦのＤＮＡ−結合活性を増大させることが示された。ＰＬＺＦに媒介される細胞周期の調節およびサイクリンＡ２遺伝子（ＣＣＮＡ２；１２３８３５）の転写抑制も、ｌｙｓ２４２上のＰＬＺＦのＳＵＭＯ化に依存していた。
【００９６】
Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：８５２３−８５３０，２００５）は、ＰＬＺＦが、培養ＯＰＬＬ（６０２４７５）靭帯細胞の骨芽細胞分化の間にアップレギュレートされた２４の遺伝子のうちの１つであったことを見出した。ＰＬＺＦは、調査した全ての靭帯および間葉系幹細胞において骨芽細胞分化の間に高度に発現された。ヒトおよびマウス間葉系幹細胞における低分子干渉ＲＮＡによるＰＬＺＦ遺伝子のサイレンシングにより、骨芽細胞特異的遺伝子、例えばアルカリホスファターゼ（ＡＬＰＬ；１７１７６０）、コラーゲン１Ａ１（ＣＯＬ１Ａ１；１２０１５０）、Ｃｂｆａ１（ＲＵＮＸ２；６００２１１）、およびオステオカルシン（ＢＧＬＡＰ；１１２２６０）などの発現が低下した。ＰＬＺＦ発現は、ＢＭＰ２（１１２２６１）の添加の影響を受けず、ＢＭＰ２発現はＰＬＺＦ発現の影響を受けなかった。マウス間葉細胞株では、ＰＬＺＦの過剰発現は、Ｃｂｆａ１およびＣｏｌ１ａ１の発現を増加させた；一方、ＣＢＦＡ１過剰発現はＰｌｚｆの発現に影響を及ぼさなかった。Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５，ｓｕｐｒａ）は、ＰＬＺＦが、初期の骨芽細胞分化に役割を果たし、かつＣＢＦＡ１の上流調節因子であると結論付けた。
【００９７】
酵母２−ハイブリッド分析およびタンパク質プルダウンアッセイを用いて、Ｒｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００６，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８０：４０７３−４０８０，２００６）は、ＰＬＺＦがＥＥＦ１Ａ１（１３０５９０）のＣＣＳ３イソ型と相互作用したことを示した。変異解析により、ＰＬＺＦのリプレッサードメイン−２およびジンクフィンガードメインが相互作用に必要であることが明らかになった。ＣＣＳ３は、レポーター遺伝子アッセイにおいてＰＬＺＦの転写効果に必要とされた。
【００９８】
Ｔｉｓｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７，Ｂｌｏｏｄ  １０９：３９２９−３９３５，２００７）は、８時間のプレドニゾロン処置により、非曝露細胞と比較して、前駆体ＢまたはＴ急性リンパ芽球性白血病の子供由来の白血病細胞において、５１遺伝子の発現が変更されたことを見出した。最も高度にアップレギュレートされた３つの遺伝子は、ＦＫＢＰ５（６０２６２３）、ＺＢＴＢ１６、およびＴＸＮＩＰ（６０６５９９）であり、それらはそれぞれ３５．４倍、８．８倍、および３．７倍アップレギュレートされた。
【００９９】
ＰＬＺＦ／ＲＡＲＡ融合タンパク質
Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１１７８−１１８２，１９９４）は、ＰＬＺＦ−ＲＡＲＡキメラタンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニングし、それらのトランス活性化活性を調べた。ＰＬＺＦ−ＲＡＲＡ融合タンパク質を、ＲＡＲＡおよびレチノイドＸ受容体α（ＲＸＲＡ；１８０２４５）を発現するベクターとともに同時導入した時に、「ドミナントネガティブ」効果が観察された。レチノイン酸感受性骨髄系細胞で観察されたこれらの異常なトランス活性化特性は、融合タンパク質をＡＰＬの分子病態に強く関係付けた。
【０１００】
Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８１１−８１４，１９９８）は、ＰＬＺＦ−ＲＡＲ−αおよびＰＭＬ−ＲＡＲ−α（１０２５７８参照）とヒストンデアセチラーゼ複合体（６０５１６４参照）の会合が、ＡＰＬの発生とレチノイドに応答する患者の能力の両方を決定するのに役立つことを報告した。これらの所見に一致して、ヒストンデアセチラーゼの阻害剤は、レチノイン酸感受性ＡＰＬ細胞株のレチノイド誘導性分化を劇的に増強し、レチノイン酸耐性ＡＰＬ細胞株のレチノイド応答を回復させる。Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）は、発癌性レチノイン酸受容体が、異常なクロマチンアセチル化によって白血病誘発を媒介すること、および核内受容体補因子の薬理学的処置が、ヒト疾患の治療において有用なアプローチであり得ることを結論付けた。
【０１０１】
Ｇｒｉｇｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８１５−８１８，１９９８）は、ＰＭＬ−ＲＡＲ−α融合タンパク質とＰＬＺＦ−ＲＡＲ−α融合タンパク質の両方が、ＲＡＲ−α  ＣｏＲ  ｂｏｘを通じて核コリプレッサー（ＮＣＯＲ；６００８４９参照）−ヒストンデアセチラーゼ複合体を補充することを実証した。ＰＬＺＦ−ＲＡＲ−αは、第２のレチノイン酸耐性結合部位をＰＬＺＦアミノ末端領域に有する。高用量のレチノイン酸は、ヒストンデアセチラーゼ活性をＰＭＬ−ＲＡＲ−αから放出するが、ＰＬＺＦ−ＲＡＲ−αからは放出しない。ＮＣＯＲ結合部位の変異は、ＰＭＬ−ＲＡＲ−αの分化を遮断する能力を消失させるが、ヒストンデアセチラーゼ活性の阻害は、ＰＬＺＦ−ＲＡＲ−αの転写効果および生物学的効果をレチノイン酸シグナル伝達経路の抑制物質から活性化因子に変える。従って、Ｇｒｉｇｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８，ｓｕｐｒａ）は、ヒストンデアセチラーゼの補充がＡＰＬ融合タンパク質の形質転換能に重大であり、ＰＭＬ−ＲＡＲ−αおよびＰＬＺＦ−ＲＡＲ−αコリプレッサー複合体の安定性へのレチノイン酸の異なる効果が、レチノイン酸に対するＡＰＬの応答の差を決定すると結論付けた。
【０１０２】
Ｇｕｉｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０４：１８６９４−１８６９９，２００７）は、ＣＲＡＢＰ１（１８０２３０）をＰＬＺＦおよびＲＡＲＡ／ＰＬＺＦ融合タンパク質の両方の標的として同定した。ＰＬＺＦは、遠隔のイントロン結合要素からのクロマチン縮合の伝播によってＣＲＡＢＰ１を抑圧し、ついにＣＲＡＢＰ１プロモーターのサイレンシングとなった。標準的なＰＬＺＦ／ＲＡＲＡ腫瘍性タンパク質は、ＰＬＺＦ媒介性抑制に効果がなかったが、この遠隔の結合部位に結合した相互転座産物であるＲＡＲＡ／ＰＬＺＦは、ｐ３００（ＥＰ３００；６０２７００）を補充し、プロモーターの低メチル化およびＣＲＡＢＰ１のアップレギュレートを誘導した。同様に、両方の融合タンパク質を発現したレチノイン酸耐性ネズミ芽細胞は、Ｐｌｚｆ／Ｒａｒａのみを発現しているレチノイン酸感受性細胞よりもはるかに高いレベルのＣｒａｂｐ１を発現した。ＲＡＲＡ／ＰＬＺＦは、レチノイド感受性急性骨髄性白血病細胞株にＣＲＡＢＰ１依存性の様式でレチノイン酸耐性を付与した。Ｇｕｉｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）は、ＲＡＲＡ／ＰＬＺＦによるＣＲＡＢＰ１のアップレギュレートが、白血病におけるレチノイド耐性に寄与すると結論付けた。
【０１０３】
生化学的特徴
Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１２１２３−１２１２８，１９９８）は、ＰＬＺＦのＢＴＢドメインの結晶構造を報告した。ＢＴＢドメイン（ＰＯＺドメインとしても公知）は、５〜１０％のＣ２Ｈ２型ジンクフィンガー転写因子のＮ末端に見出される、進化的に保存されたタンパク質−タンパク質相互作用モチーフである。ＢＴＢドメインは、転写抑制活性を有し、ヒストンデアセチラーゼ複合体の成分と相互作用する。後者の会合により、クロマチン高次構造を調節する酵素活性をもつ転写因子を結びつける機構がもたらされる。
【０１０４】
遺伝子構造
Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：１１４２２−１１４２７，１９９９）は、全ＰＬＺＦ遺伝子を含有する２０１ｋｂのゲノムＤＮＡ領域を配列決定した。反復要素が１９．８３％の割合を占め、ＰＬＺＦ以外の明らかなコード情報はこの領域には存在しなかった。ＰＬＺＦは６個のエキソンおよび５個のイントロンを含むことが見出され、エキソンの構成はタンパク質ドメインによく一致した。Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９，ｓｕｐｒａ）は、少なくとも４つの選択的スプライシング（ＡＳ−Ｉ、−ＩＩ、−ＩＩＩ、および−ＩＶ）をエキソン１の中で同定した。
【０１０５】
Ｖａｎ  Ｓｃｈｏｔｈｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９，Ｇｅｎｅ  ２３６：２１−２４，１９９９）は、ＺＮＦ１４５遺伝子が、７個のエキソンを含み、少なくとも１２０ｋｂに及ぶことを決定した。未翻訳エキソン１は、ＣｐＧアイランドの中に位置し、数個のＳＰ１（１８９９０６）−およびＧＡＴＡ１（３０５３７１）結合部位は、エキソン１の上流である。
【０１０６】
マッピング
ＦＩＳＨ法により、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２６０−２２６７，１９９３）は、ＰＬＺＦ遺伝子を染色体１１ｑ２３．１に局在させた。
【０１０７】
細胞遺伝学
ほとんど全部のＡＰＬ患者は、染色体転座ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）を有する。分子研究により、転座の結果、染色体１５上の前骨髄球性白血病遺伝子（ＰＭＬ；１０２５７８）と染色体１７上のレチノイン酸受容体−α遺伝子（ＲＡＲＡ；１８０２４０）との融合を経てキメラ遺伝子がもたらされることが明らかにされる。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２６０−２２６７，１９９３）は、中国人ＡＰＬ患者および染色体１１ｑ２３．１上のＰＬＺＦ遺伝子が染色体１７上のＲＡＲＡ遺伝子に融合した変異転座ｔ（１１；１７）（ｑ２３；２１）の研究を報告した。ｔ（１５；１７）ＡＰＬに類似して、オールトランスレチノイン酸処置は、初期白血球増多症を生じ、それに続いて骨髄が成熟するが、患者は緩解を達成するにはあまりにも早く死亡した。
【０１０８】
Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：１１４２２−１１４２７，１９９９）は、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）によって報告されたｔ（１１；１７）を有するインデックス急性前骨髄球性白血病症例（ｔｈｅ  ｉｎｄｅｘ  ａｃｕｔｅ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃａｓｅ）において、染色体切断点および結合部位を特徴付けた。これらの結果により、ＤＮＡ損傷−修復機構の関与が示唆された。
【０１０９】
動物モデル
Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：６３１８−６３２３，１９９９）は、ＰＬＺＦ−ＲＡＲＡおよびＮＰＭ（１６４０４０）−ＲＡＲＡを有するトランスジェニックマウスを作製した。ＰＬＺＦ−ＲＡＲＡトランスジェニック動物は、生涯の初期段階で慢性骨髄性白血病様の表現型を発症した（６匹のマウスのうち５匹が３ヶ月以内）が、３匹のＮＰＭ−ＲＡＲＡトランスジェニックマウスは、典型的なＡＰＬから生涯の比較的後期（１２〜１５ヶ月）の慢性骨髄性白血病までの一連の表現型を示した。ＰＬＺＦ−ＲＡＲＡトランスジェニックマウス由来の骨髄細胞とは対照的に、ＮＰＭ−ＲＡＲＡトランスジェニックマウス由来の骨髄細胞は、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）により分化誘導されることができた。Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９，ｓｕｐｒａ）は、核内受容体との相互作用において、２つの融合タンパク質が、ＡＴＲＡに対する応答の差に対して根底にある分子機構であり得る、異なるリガンド感受性を有することを見出した。これらのデータは、発病における、さらにＡＰＬの異なる臨床表現型の決定における、ＰＬＺＦ−ＲＡＲＡおよびＮＰＭ−ＲＡＲＡの白血病誘発性の役割および融合受容体／コリプレッサー相互作用の重要性を明らかに証明した。
【０１１０】
Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  ６：１１３１−１１４１，２０００）は、それらの前骨髄球においてＲＡＲＡ−ＰＬＺＦおよびＰＬＺＦ−ＲＡＲＡを発現するトランスジェニックマウスを作製した。ＲＡＲＡ−ＰＬＺＦトランスジェニックマウスは白血病を発症しなかった。しかし、ＰＬＺＦ−ＲＡＲＡ／ＲＡＲＡ−ＰＬＺＦ二重トランスジェニックマウスは従来のＡＰＬの特徴をもつ白血病を発症した。著者らは、ＲＡＲＡ−ＰＬＺＦがＰＬＺＦ転写抑制を妨げることができること、ならびに、白血病は、ＰＬＺＦ欠損／ＰＬＺＦ−ＲＡＲＡ変異株において、およびＰＬＺＦ−ＲＡＲＡ／ＲＡＲＡ−ＰＬＺＦトランスジェニックマウスにおいて見分けが付かなかったので、これがＡＰＬ発病に重大であることを実証した。従って、癌関連転座の両産物は、疾患の弁別的特徴を決定する際に重大である。
【０１１１】
Ｂａｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２５：１６６−１７２，２０００）は、Ｚｆｐ１４５−／−マウスを作製し、Ｐｌｚｆが四肢および軸骨格のパターン形成に必須であることを示した。遺伝子の不活性化により、四肢の全ての骨格構造に影響を及ぼすパターン形成不全がもたらされ、それには前部の骨格要素の後部構造へのホメオティック形質転換が含まれた。Ｐｌｚｆが肢芽において成長抑制因子およびアポトーシス促進因子として働くことを彼らは実証した。Ａｂｄｏｍｉｎａｌ  Ｂ（Ａｂｄｂ）Ｈｏｘ遺伝子複合体のメンバー（１４２９５６参照）、ならびに骨形成タンパク質をコードする遺伝子（例えば、１１２２６７）の発現は、Ｚｆｐ１４５−／−マウスの四肢の発達において変化した。また、マウスは、関連するＨｏｘ遺伝子発現の変化を伴って、前部に向けられたホメオティック形質転換を軸骨格全体にわたって提示した。従って、Ｐｌｚｆは、軸および四肢骨格の両方において前部から後部へのパターン形成のメディエーターであり、Ｈｏｘ遺伝子発現の制御因子として働く。
【０１１２】
Ｂａｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ３：４９９−５１０，２００２）は、Ｐｌｚｆ−／−マウスの欠陥が、Ａｂｄｂ  Ｈｏｘｄ複合体の空間的な（しかし時間的でない）調節解除に起因すると決定した。彼らはＨｏｘｄ１１（１４２９８６）のいくつかのＰｌｚｆ結合部位を同定し、ＰｌｚｆがＨｏｘｄ１１ゲノムＤＮＡ断片に二量体または場合によっては三量体として、主にＤＮＡループが形成される時に結合することを示した。Ｂａｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）も、Ｈｏｘｄ調節エレメント内の遠位Ｐｌｚｆ結合部位間の長距離相互作用の証拠を見出した。ＰｌｚｆはＨｏｘｄレポーター構築物の転写抑制を媒介し、Ｐｌｚｆの不在下では、アセチル化ヒストンがＨｏｘｄ調節領域で増加した。Ｐｌｚｆは、マウス前肢ミクロマス培養で用量依存性のＨｏｘｄレポーターの転写抑制を示したが、後肢ミクロマス培養では抑制されなかった。Ｐｌｚｆはまた、四肢の後方化シグナルをアンタゴナイズする、ＤＮＡ上のポリコームタンパク質Ｂｍｉ１（１６４８３１）を直接拘束した。Ｂａｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）は、ＰＬＺＦによるヒストンデアセチラーゼおよびポリコームタンパク質の補充が、真性染色質から異質染色質への移行を支持すると結論付けた。
【０１１３】
成体生殖系列幹細胞は、自己再生、組織再生、および多数の分化した後代の産生の能力がある。マウス変異体「ｌｕｘｏｉｄ」（ｌｕ）は、自発的に生じ、マウス染色体９にマッピングされ（Ｇｒｅｅｎ，１９５５，Ｊ．Ｈｅｒｅｄ．４６：９１−９９，１９５５）、最初はその半優性の異常ならびに劣性の骨格および雄性不妊の表現型を特徴とした（Ｆｏｒｓｔｈｏｅｆｅｌ，１９５８，Ｊ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．１０２：２４７−２８７，１９５８）。Ｂｕａａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３６：６４７−６５２，２００４）は、マウス変異体ｌｕｘｏｉｄが成体生殖系列幹細胞の自己再生に影響を及ぼすことを示した。若年ホモ型接合体ｌｕｘｏｉｄ変異マウスは、限定された数の正常精子を産生し、その後次第に出生後にその生殖系列を失う。移植研究により、変異体マウスの生殖細胞がレシピエントの精巣にコロニー形成しなかったことが示され、この欠陥が幹細胞に内因性であることが示唆された。Ｂｕａａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）は、ｌｕｘｏｉｄ変異株は、未分化細胞のエピジェネティックな状態を制御する転写抑制因子である、ナンセンス変異をＰｌｚｆ遺伝子中に含むことを決定した。彼らは、さらに、未分化型精原細胞においてＰｌｚｆがＯｃｔ４（１６４１７７）と同時発現することを示した。これは、哺乳類における幹細胞の自己再生に生殖細胞で必要とされると分かった最初の遺伝子であるといわれている。
【０１１４】
Ｃｏｓｔｏｙａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３６：６５３−６５９，２００４）は、同様にＰｌｚｆが精子形成に重大な役割を有することを示した。遺伝子の発現は、始原生殖細胞および未分化型精原細胞に制限され、これらの細胞を欠いているＷ／Ｗ（ｖ）変異体の尿細管では遺伝子の発現はなかった。Ｐｌｚｆを欠いているマウスは、アポトーシスの増加およびその後の尿細管構造の消失に関連して、年齢とともに精原細胞を徐々に消失したが、明白な分化欠損または支持しているセルトリ細胞の消失はなかった。精原細胞移植実験により、成体において精原細胞幹細胞の枯渇が明らかとなった。これらのおよびその他の結果から、Ｐｌｚｆは、自己再生および幹細胞プールの維持を制御するために必要とされる、精巣の精原細胞特異的転写因子と同定された。
【０１１５】
Ｂａｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５，Ｎａｔｕｒｅ  ４３６：２７７−２８１，２００５）は、後肢（大腿骨、脛骨、腓骨）における全ての近位の軟骨凝縮のために四肢発達のごく初期段階に特異的に必要とされる、Ｇｌｉ３（１６５２４０）とＰｌｚｆとの間の遺伝子相互作用を特定した。特に、足を含む遠位の凝縮は、Ｇｌｉ３／Ｐｌｚｆ二重ノックアウトマウス胚において比較的落ち着いていた。Ｂａｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５，ｓｕｐｒａ）は、Ｇｌｉ３およびＰｌｚｆの協同的活性により、軟骨細胞前駆体の妥当な時間的かつ空間的分布が、近位の肢芽において近位−遠位（Ｐ−Ｄ）パターン形成マーカーおよび全体的な肢芽サイズとは独立に確立されることを実証した。さらに、二重ノックアウト胚における四肢欠損は、骨形成タンパク質受容体１Ｂ型（Ｂｍｐｒ１ｂ；６０３２４８）を四肢発達の開始時に発現する近位の間葉細胞の特定のサブセットの一過性の死に相関した。Ｂａｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５，ｓｕｐｒａ）は、近位および遠位の骨格要素の発達は、初期の肢芽形成の間に明確に制御されると結論付けた。脊椎動物四肢の２つの異なる分子領域への最初の分裂は、四肢の上肢および下肢が異なる進化上の起源を有することを示す化石証拠に一致する。
【０１１６】
ＺＮＦ１４５ポリペプチド
本明細書に記載される方法および組成物は、下に詳細に記載されるＺＮＦ１４５ポリペプチドを利用する。
【０１１７】
本明細書において、用語「ＺＮＦ１４５ポリペプチド」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５９９７．２（タンパク質変異体１）またはＮＰ＿００１０１８０１１．１（タンパク質変異体２）を有する配列をさすことを意図する。その他のＺＮＦ１４５ポリペプチド配列には、ＡＡＤ０３６１９．１、ＡＡＣ３２８４７．１、ＡＡＣ３２８４８．１、ＡＡＣ３２８４９．１、ＥＡＷ６７２４１．１、ＥＡＷ６７２４２．１、ＡＡＣ６０５９０．２、ＢＡＤ９２１５３．１、ＡＡＨ２６９０２．１、ＡＡＨ２９８１２．１、ＣＡＡ７９４８９．１、ＡＢＺ９２２５４．１、Ｑ０５５１６．２、Ｑ５９Ｈ４３、Ｑ７１ＵＬ５、Ｑ７１ＵＬ６およびＱ７１ＵＬ７が含まれる。
【０１１８】
「ＺＮＦ１４５ポリペプチド」は、ヒトＺＮＦ１４５ポリペプチド、例えば受託番号ＮＰ＿００５９９７．２またはＮＰ＿００１０１８０１１．１を有する配列などを含むかまたはそれからなってよい。
【０１１９】
これらのポリペプチドのいずれか、一部または全部の相同体変異体および誘導体も含まれる。例えば、ＺＮＦ１４５には、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ０３６１９が含まれてよい。
【０１２０】
ＺＮＦ１４５ポリペプチドは、多様な手段、例えば、変性疾患に罹患している個体、または変性疾患に罹患している疑いのある個体への、その治療のための投与に使用することができる。また、それらは、抗ＺＮＦ１４５剤、例えば特異的ＺＮＦ１４５結合剤、特に、抗ＺＮＦ１４５抗体の製造またはスクリーニングに使用してもよい。これらは以下にさらに詳細に記載される。ＺＮＦ１４５ポリペプチドの発現は、変性疾患の診断または検出のために検出されてよい。
【０１２１】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチドアイソスターにより相互に連結された２またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質をさす。「ポリペプチド」とは、短鎖、一般にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれるものと、長鎖、一般にタンパク質と呼ばれるものの両方をさす。ポリペプチドは、２０種類の遺伝子にコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含んでよい。
【０１２２】
「ポリペプチド」には、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセスによるか、または当分野で周知の化学修飾技法によって修飾されたアミノ酸配列が含まれる。かかる修飾は、基本的なテキスト、より詳細な研究書、ならびに膨大な研究文献に十分に記載されている。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのどこでも行うことができる。同じ種類の修飾が、所与ポリペプチドのいくつかの部位に同じまたは異なる程度で存在してもよいことは当然理解される。また、所与ポリペプチドは、多くの種類の修飾を含んでよい。
【０１２３】
ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分岐していてもよく、それらは分枝を含むまたは含まない環状であってよい。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスの結果起こってもよいし、合成法により作成されてもよい。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのアミノ酸のタンパク質への転移ＲＮＡ媒介性付加、およびユビキチン化が含まれる。例として、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３  ａｎｄ  Ｗｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，ｐｇｓ．１−１２  ｉｎ  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｆａｃｔｏｒｓ」，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９０）１８２：６２６−６４６  ａｎｄ  Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａＬ，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ」，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（１９９２）６６３：４８−６２  を参照されたい。
【０１２４】
用語「ポリペプチド」には、当分野で公知の様々な合成ペプチドの変型、例えば反転（Ｒｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏ）Ｄペプチドが含まれる。ペプチドは、抗原決定基および／またはＴ細胞エピトープであってよい。ペプチドはインビボで免疫原性であってよい。ペプチドは、インビボで抗体の中和を誘導する能力があり得る。
【０１２５】
ＺＮＦ１４５に適用される場合、結果として得られるアミノ酸配列は、１以上の活性、例えば生物学的活性などをＺＮＦ１４５ポリペプチド、例えばヒトＺＮＦ１４５ポリペプチドと共通して有してよい。例えば、ＺＮＦ１４５相同体は、非軟骨形成間葉系幹細胞と比較して、軟骨形成間葉系幹細胞において発現レベルの増加を有し得る。特に、用語「相同体」は、結果として得られるアミノ酸配列がＺＮＦ１４５活性を有するという条件で、構造および／または機能に関して同一性を包含する。配列同一性（すなわち、類似性）に関して、それは少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％の配列同一性であってよい。それは、少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性であってよい。これらの用語はまた、ＺＮＦ１４５核酸配列の対立遺伝子変異であるアミノ酸から誘導されるポリペプチドも包含する。
【０１２６】
ＺＮＦ１４５などのポリペプチドの「活性」または「生物活性」に言及する場合、これらの用語は、ＺＮＦ１４５の代謝または生理学的機能をさすことが意図され、同様の活性または改良された活性または望ましくない副作用の低下した活性が含まれる。ＺＮＦ１４５の抗原活性および免疫原活性も含まれる。かかる活性、およびこれらの活性をアッセイし、定量化する方法の例は当分野で公知であり、本明細書の他所に詳細に記載されている。
【０１２７】
例えば、かかる活性には、ＤＮＡ結合、金属イオン結合、タンパク質ホモ二量体化活性、特異的転写制御活性および亜鉛イオン結合、アポトーシス、中枢神経系発生、中腎発生、骨髄系細胞分化の負の調節、転写の負の調節、ＤＮＡ依存性転写およびユビキチンサイクルのいずれか１以上が含まれ得る。特定のタンパク質がこれらのプロセスのいずれかに関与しているかどうかを試験する方法も、当分野で公知である。
【０１２８】
その他のＺＮＦ１４５ポリペプチド
ＺＮＦ１４５変異体、相同体、誘導体および断片も、本明細書に記載される方法および組成物において役立つ。
【０１２９】
ＺＮＦ１４５に関して、用語「変異体」、「相同体」、「誘導体」または「断片」には、配列から、または配列への１個（またはそれ以上）のアミノ酸の任意の置換、変異、修飾、交換、欠失または付加が含まれる。文脈上そうでないと認めない限り、「ＺＮＦ１４５」への言及には、かかるＺＮＦ１４５の変異体、相同体、誘導体および断片への言及が含まれる。
【０１３０】
本明細書において、「欠失」は、１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基がそれぞれ不在のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化と定義される。本明細書において「挿入」または「付加」は、天然に存在する物質と比較して、それぞれ、１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の付加の結果もたらされたヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化である。本明細書において「置換」は、１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の、それぞれ異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による置換によって生じる。
【０１３１】
本明細書に記載されるＺＮＦ１４５ポリペプチドも、サイレント変化を生じて機能的に同等のアミノ酸配列をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有してよい。残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質の類似性に基づいて、計画的なアミノ酸置換を行ってよい。例えば、負に帯電したアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ；正に帯電したアミノ酸には、リジンおよびアルギニンが含まれ；かつ、同様の親水性価を有する非電荷極性頭部基をもつアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが含まれる。
【０１３２】
保存的置換は、例えば下の表に従って行ってよい。２列目の同じブロック内のアミノ酸および３列目の同じ行内のアミノ酸は相互に置換することができる。
【０１３３】
【表１】
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【０１３４】
ＺＮＦ１４５ポリペプチドは、一般にＮ末端またはＣ末端、例えばＮ末端に異種アミノ酸配列をさらに含んでよい。異種配列には、細胞内または細胞外タンパク質ターゲティングに影響を及ぼす配列が含まれてよい（例えばリーダー配列など）。また、異種配列には、ＺＮＦ１４５ポリペプチドの免疫原性を増加させる配列、ならびに／あるいはポリペプチドの同定、抽出および／または精製を促進する配列も含まれてよい。使用することのできる別の異種配列は、Ｎ末端であってよいポリヒスチジンなどのポリアミノ酸配列である。少なくとも１０アミノ酸のポリヒスチジン配列、例えば少なくとも１７アミノ酸であるが５０アミノ酸よりも少ないものを用いてよい。
【０１３５】
ＺＮＦ１４５ポリペプチドは、「成熟した」タンパク質の形態であってもよいし、または融合タンパク質などの大きなタンパク質の一部であってもよい。多くの場合、分泌配列またはリーダー配列を含有するさらなるアミノ酸配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基などの精製を助ける配列、または組換え体産生の間の安定性のためのさらなる配列を含むことが有利である。
【０１３６】
本明細書に記載されるＺＮＦ１４５ポリペプチドは、公知の技法を用いて組換え手段によって有利に作成される。しかし、それらは固相合成などの当業者に周知の技法を用いる合成手段によっても作成することができる。かかるポリペプチドはまた、例えば抽出および精製を助けるために、融合タンパク質として産生されてもよい。融合タンパク質のパートナーの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。また、融合タンパク質パートナーと対象のタンパク質配列との間にタンパク質分解切断部位を含めて融合タンパク質配列の除去を可能にすることも便宜であり得る（トロンビン切断部位など）。融合タンパク質は、対象配列のタンパク質の機能を妨げないものであってよい。
【０１３７】
ＺＮＦ１４５ポリペプチドは、実質的に単離された形態であってよい。この用語は、人の手による自然状態からの変更をさすことを意図する。「単離された」組成物または物質が自然界に存在する場合、それはその元の環境から変化しているかまたは取り出されているか、またはその両方である。例えば、その用語を本明細書で用いる場合、生きている動物に天然に存在するポリヌクレオチド、核酸またはポリペプチドは、「単離され」ていないが、その自然状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチド、核酸またはポリペプチドは、「単離され」ている。
【０１３８】
しかし、ＺＮＦ１４５タンパク質が、そのタンパク質の意図する目的に干渉しない担体または希釈剤と混合されてよく、なお実質的に単離されたと見なされることは当然理解される。ＺＮＦ１４５ポリペプチドも実質的に精製された形態であってよく、その場合それは一般に、調製物中の該タンパク質の９０％超、例えば９５％、９８％または９９％がＺＮＦ１４５ポリペプチドであるように、調製物中に該タンパク質を含む。
【０１３９】
異なる種由来のＺＮＦ１４５配列をアラインすることにより、アミノ酸配列のどの領域が異なる種間で保存されているか（「相同領域」）、およびどの領域が異なる種間で変化しているか（「異種領域」）を特定することが可能である。
【０１４０】
従って、ＺＮＦ１４５ポリペプチドは、相同領域の少なくとも一部に相当する配列を含み得る。相同領域は、少なくとも２つの種間の高い程度の相同性を示す。例えば、相同領域は、上記の試験を用いて、アミノ酸レベルで少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を示し得る。相同領域に相当する配列を含むペプチドは、下でさらに詳細に説明される治療戦略で使用することができる。あるいは、ＺＮＦ１４５ペプチドは、異種領域の少なくとも一部に相当する配列を含んでよい。異種領域は、少なくとも２つの種間の低い程度の相同性を示す。
【０１４１】
ＺＮＦ１４５相同体
使用のために開示されるＺＮＦ１４５ポリペプチドには、任意の供給源、例えば関連ウイルス／細菌タンパク質、細胞相同体および合成ペプチド、ならびにその変異体または誘導体から得た相同配列が含まれる。従って、ポリペプチドにも、動物、例えば哺乳類（例えばマウス、ラットまたはウサギ）、特に霊長類、より詳細にはヒトを含むその他の種由来のＺＮＦ１４５の相同体をコードするポリペプチドが含まれる。より具体的には、相同体には、ヒト相同体が含まれる。
【０１４２】
本明細書の状況において、相同配列は、当該ＶＨＺ１４５配列の配列とアミノ酸レベルで、例えば少なくとも５０または１００、２００、３００、４００または５００のアミノ酸にわたって、少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％同一、例えば、少なくとも９５または９８％同一であるアミノ酸配列を含むものとする。
【０１４３】
特に、相同性は一般に、非必須隣接配列ではなく、タンパク質機能に必須であることが公知の配列の領域に関して考慮すべきである。このことは遠縁生物の相同配列を考える場合に特に重要である。
【０１４４】
相同性は類似性（すなわち、類似する化学特性／機能を有するアミノ酸残基）に関して考えることもできるが、本明細書の状況において、相同性は、配列同一性に関して表され得る。
【０１４５】
相同性比較は、目測で、またはより通常には、容易に入手可能な配列比較プログラムの助けにより行うことができる。これらの公的および商業的に入手可能なコンピュータープログラムは、２またはそれ以上の配列間の同一性％を算出することができる。
【０１４６】
同一性％は隣接する配列にわたって算出することができる、すなわち、一方の配列を他方の配列とともにアラインし、一方の配列のそれぞれのアミノ酸を他方の配列の対応するアミノ酸と一残基ずつ直接比較する。これは、「ギャップ無し」アラインメントと呼ばれる。一般に、かかるギャップ無しアラインメントは、比較的短い個数の残基（例えば、５０個未満の隣接するアミノ酸）にわたってのみ行われる。
【０１４７】
これは非常に単純かつ一貫性のある方法であるが、例えば、それ以外は同一な配列対において、１つの挿入または欠失により、それに続くアミノ酸残基がアラインされなくなるということは考慮されないので、従ってグローバルアライメントを行った場合に、相同性％が大幅に低下する可能性がある。結果的に、ほとんどの配列比較方法は、総合的な相同性スコアに過度のペナルティを課すことなく可能性のある挿入および欠失を考慮した最適なアラインメントを生じるように設計される。これは、局所相同性または類似性を最大化しようと試みるために配列アライメント中に「ギャップ」を挿入することにより実現される。
【０１４８】
しかし、これらのより複雑な方法では、アラインメントに生じるそれぞれのギャップに「ギャップペナルティ」が割り当てられ、それにより同じ数の同一アミノ酸について、できる限り少ないギャップをもつ配列アライメントが、２つの比較配列間のより高い関連性を反映して、多くのギャップをもつ配列アラインメントよりも高いスコアを達成する。一般に、ギャップの存在に対して相対的に高いコストを課し、かつギャップ中のそれぞれの後続残基により小さいペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が使用される。これは、最もよく使用されるギャップスコアリングシステムである。ギャップペナルティが高いと、当然、ギャップのより少ない最適化されたアライメントが生成される。ほとんどのアライメントプログラムでは、ギャップペナルティを変更できるようになっている。しかし、配列比較用のこのようなソフトウェアを使用する場合には、デフォルト値を用いてよい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（下記参照）を使用する場合、アミノ酸配列に対するデフォルトギャップペナルティーは、１つのギャップに対して−１２、それぞれの伸長に対して−４である。
【０１４９】
従って、最大相同性％の計算では、まず、ギャップペナルティを考慮して最適アライメントを生成することが必要である。このようなアライメントを行うのに適したコンピュータープログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７）である。配列比較を行うことのできるその他のソフトウェアの例としては、限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  ｉｂｉｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ  １８参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１０）、および比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートが挙げられる。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡは両方ともオフラインおよびオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  ｉｂｉｄ，ｐａｇｅｓ  ７−５８  ｔｏ  ７−６０参照）。ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用してよい。
【０１５０】
最終相同性％は同一性に関して測定することができるが、アライメント法自体は、一般に、オールオアナッシング対比較に基づくものではない。その代わりに、化学的類似性または進化距離に基づいて各々のペアワイズ比較にスコアを割り当てる、スケールド類似性スコアマトリックスが一般に使用される。慣用されているこのようなマトリックスの一例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス−プログラムのＢＬＡＳＴスイート用のデフォルトマトリックス−である。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般にパブリックデフォルト値かまたは提供されている場合にはカスタムシンボル比較表のいずれかを使用する（さらなる詳細はユーザーマニュアルを参照）。ＧＣＧパッケージ用のパブリックデフォルト値を使用するか、またはその他のソフトウェアの場合にはＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルトマトリックスを使用することができる。
【０１５１】
ソフトウェアが最適なアラインメントを生成してしまえば、相同性％、例えば配列同一性％などを算出することが可能である。ソフトウェアは、一般にこれを配列比較の一部として行い、数値結果を生成する。
【０１５２】
用語「変異体」または「誘導体」には、アミノ酸配列に関して、結果として得られるアミノ酸配列が非修飾配列と実質的に同じ活性を保持する、例えば少なくともＺＮＦ１４５ポリペプチドと同じ活性を有するという条件で、配列から、または配列への１個（またはそれ以上）のアミノ酸の任意の置換、変異、修飾、置換、欠失または付加が含まれる。
【０１５３】
本明細書に開示されるＺＮＦ１４５アミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいはその断片または相同体は、本明細書に記載される方法および組成物で使用するために修飾されてよい。一般に、配列の生物活性を維持する修飾が行われる。アミノ酸置換は、修飾した配列が修飾されていない配列の生物活性を保持するという条件で、例えば１、２または３個から１０、２０または３０個までの置換を行ってよい。あるいは、修飾は、本明細書に記載されるポリペプチドの１以上の機能ドメインを意図的に失活させるように行ってよい。アミノ酸置換には、例えば治療的に投与されたポリペプチドの血漿半減期を増加させるために、天然に存在しない類似体の使用が含まれてよい。
【０１５４】
ＺＮＦ１４５断片
本明細書に記載される方法および組成物で使用するためのポリペプチドには、上に同定されるＺＮＦ１４５ポリペプチドのいずれかの全長配列の断片も含まれる。断片は、少なくとも１つのエピトープを含んでよい。エピトープを同定する方法は当分野で周知である。断片は、一般に少なくとも６個のアミノ酸、例えば少なくとも１０、２０、３０、５０または１００個のアミノ酸を含むことになる。
【０１５５】
当該ＺＮＦ１４５アミノ酸配列由来の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５またはそれ以上の残基を含むか、またはそれらの残基からなる断片が含まれる。
【０１５６】
本発明者らは、本明細書に記載されるＺＮＦ１４５ポリペプチドの一部分を含むペプチドをさらに記載する。従って、ＺＮＦ１４５の断片およびその相同体、変異体または誘導体が含まれる。ペプチドは、２〜２００個の間のアミノ酸長、例えば４〜４０個のアミノ酸長であってよい。ペプチドは、例えばトリプシンなどの適した酵素による消化によって、本明細書に開示されるＺＮＦ１４５ポリペプチドから誘導されてよい。あるいは、ペプチド、断片などは、組換え手段により作製するか、または合成的に合成してよい。
【０１５７】
そのようなＺＮＦ１４５断片を用いて、例えば、かかる断片に対して作製された抗体によって、ＺＮＦ１４５発現を選択的に検出するプローブを生成することができる。これらの抗体は、ＺＮＦ１４５に特異的に結合すると予期され、本明細書に開示される検出、診断および治療の方法において有用である。
【０１５８】
ＺＮＦ１４５およびその断片、相同体、変異体および誘導体は、組換え手段により作製されてよい。しかし、それらは、固相合成などの当業者に周知の技法を用いる合成手段により作製することもできる。タンパク質はまた、例えば抽出および精製を助けるために、融合タンパク質として産生されてもよい。融合タンパク質のパートナーの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。また、融合タンパク質パートナーと対象のタンパク質配列との間にタンパク質分解切断部位を含めて融合タンパク質配列の除去を可能にすることも便宜であり得る。融合タンパク質は、対象配列のタンパク質の機能を妨げないものであってよい。また、タンパク質は、動物細胞からの細胞抽出物の精製により得ることもできる。
【０１５９】
本明細書に開示されるＺＮＦ１４５ポリペプチド、変異体、相同体、断片および誘導体は、実質的に単離された形態であってよい。かかるポリペプチドが、そのタンパク質の意図する目的に干渉しない担体または希釈剤と混合されてよく、なお実質的に単離されたと見なされることは当然理解される。ＺＮＦ１４５変異体、相同体、断片または誘導体も実質的に精製された形態であってよく、その場合それは一般に、調製物中の該タンパク質の９０％超、例えば９５％、９８％または９９％が１種類のタンパク質であるように、調製物中に該タンパク質を含む。
【０１６０】
本明細書に開示されるＺＮＦ１４５ポリペプチド、変異体、相同体、断片および誘導体は、明示用標識で標識されてよい。この明示標識は、ポリペプチドなどを検出させる任意の適した標識であってよい。適した標識としては、放射性同位元素、例えば１２５Ｉ、酵素、抗体、ポリヌクレオチドおよびビオチンなどのリンカーが挙げられる。標識されたポリペプチドは、試料中のポリペプチドの量を決定するためのイムノアッセイなどの診断法に使用することができる。ポリペプチドまたは標識ポリペプチドはまた、標準的なプロトコールを用いて、動物およびヒトにおける該ポリペプチドに対する免疫応答の検出のための血清学的または細胞媒介性の免疫分析で使用することもできる。
【０１６１】
また、本明細書に開示される、所望により標識されたＺＮＦ１４５ポリペプチド、変異体、相同体、断片および誘導体は、固相、例えばイムノアッセイのウェルまたはディップスティックの表面に固定することもできる。かかる標識された、かつ／または固定化されたポリペプチドは、適した試薬、対照、取扱説明書などと一緒に、適した容器中のキットにパッケージングされてよい。かかるポリペプチドおよびキットは、イムノアッセイにより、該ポリペプチドに対する抗体またはその対立遺伝子変異体または種変異体に対する工程の検出方法で使用することができる。
【０１６２】
イムノアッセイ法は、当分野で周知であり、一般に、（ａ）該タンパク質に対する抗体により結合可能なエピトープを含むポリペプチドを準備するステップと、（ｂ）生体試料を該ポリペプチドとともに抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートするステップと、（ｃ）該ポリペプチドを含む抗体−抗原複合体が形成されているかどうかを判定するステップとを含む。
【０１６３】
ＺＮＦ１４５に対する抗体は、当分野で公知であり、例えばウサギ抗ヒトＰＭＬポリクローナル抗体−ａ（カタログ番号ＡＩ７０００２Ａ）およびウサギ抗ヒトＰＭＬポリクローナル抗体−ｂ（ＡＩ７０００２Ｂ）が、Ａｎｏｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａから市販されている。
【０１６４】
本明細書に開示されるＺＮＦ１４５ポリペプチド、変異体、相同体、断片および誘導体をインビトロまたはインビボ細胞培養系で使用して、疾患におけるそれらの機能を含む、細胞機能におけるそれらの対応する遺伝子およびその相同体の役割を研究することができる。例えば、末端切断型ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドを、細胞に導入して、細胞で生じる正常な機能を混乱させることができる。ポリペプチドは、組換え発現ベクターからのポリペプチドの原位置での発現によって、細胞の中に導入することができる（下記参照）。発現ベクターは、所望によりポリペプチドの発現を制御するために誘導プロモーターを保有する。
【０１６５】
適切な宿主細胞、例えば昆虫細胞または哺乳類細胞の使用は、最適な生物活性を組換え発現産物に付与するために必要とされ得るような翻訳後修飾（例えばミリストル化）、グリコシル化、トランケーション、脂質化およびチロシン、セリンまたはトレオニンリン酸化）を提供すると思われる。本明細書に開示されるＺＮＦ１４５ポリペプチド、変異体、相同体、断片および誘導体が発現されるかかる細胞培養系をアッセイ系で使用して、細胞内のポリペプチドの機能を干渉するかまたは増強させる候補物質を同定することができる。
【０１６６】
ＺＮＦ１４５核酸
本明細書に記載される方法および組成物は、ＺＮＦ１４５ポリヌクレオチド、ＺＮＦ１４５ヌクレオチドおよびＺＮＦ１４５核酸、ならびにこれらのうちのいずれかの変異体、相同体、誘導体および断片を、ＺＮＦ１４５の発現レベルを検出するための手段として用い得る。その上、本発明者らは、本明細書に記載される診断方法に有用な特定のＺＮＦ１４５断片を開示する。ＺＮＦ１４５核酸はまた、記載される治療または予防方法のために使用されてもよい。
【０１６７】
用語「ＺＮＦ１４５ポリヌクレオチド」、「ＺＮＦ１４５ヌクレオチド」および「ＺＮＦ１４５核酸」は、同義的に使用されてよく、ｃＤＮＡ配列とゲノムＺＮＦ１４５配列の両方を特異的に含むと理解されるべきである。これらの用語はまた、ＺＮＦ１４５ポリペプチドおよび／またはこの断片、誘導体、相同体または変異体をコードする能力のある核酸配列を含むことが意図される。
【０１６８】
ＺＮＦ１４５核酸について言及する場合、これは、核酸のＺＮＦ１４５ファミリーのあらゆるメンバーへの言及と解釈されるべきである。ＺＮＦ１４５核酸の例としては、ＮＭ＿００６００６．４（ｍＲＮＡ変異体１）およびＮＭ＿００１０１８０１１（ｍＲＮＡ変異体２）が挙げられる。その他のＺＮＦ１４５核酸としては、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６０５６８．１、ＡＦ０７６６１３．１、ＡＦ０７６６１５．１、ＡＦ０７６６１６．１、ＡＰ０００９０８．４（１０９９２２．．１４９１３２）、ＡＰ００２５１８．３、ＡＰ００２７５５．２（２００７．．１０９３２２）、ＣＨ４７１０６５．１、Ｓ６００９３．１、ＡＢ２０８９１６．１、ＡＫ１２６４２２．１、ＢＣ０２６９０２．１、ＢＣ０２９８１２．１、ＢＭ９６９１４５．１、ＢＸ６４８９７３．１、Ｚ１９００２．１、ＥＵ４４６７２５．１およびＣＣＤＳ８３６７．１が挙げられる。
【０１６９】
以下に「その他のＺＮＦ１４５核酸配列」として示される核酸配列のいずれか１以上も含まれる。
【０１７０】
例えば、ＺＮＦ１４５核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６００６．４またはＮＭ＿００１０１８０１１（ｍＲＮＡ変異体２）を有するヒトＺＮＦ１４５配列を含み得る。
【０１７１】
ＺＮＦ１４５核酸は、多様な手段、例えば、変性疾患に罹患している個体、または変性疾患に罹患している疑いのある個体への、その治療のための投与に使用することができる。ＺＮＦ１４５核酸の発現は、軟骨形成間葉系幹細胞の検出のために検出されてよい。ＺＮＦ１４５核酸はまた、ＺＮＦ１４５ポリペプチドの発現または産生のために使用されてよい。
【０１７２】
「ポリヌクレオチド」は、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをさし、修飾されていないＲＮＡまたはＤＮＡであってもよいし、修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。「ポリヌクレオチド」としては、限定されないが、  一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖であってもよいし、より一般には二本鎖であってもよいし、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であってもよい、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。その上、「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域をさす。また、用語ポリヌクレオチドには、１以上の修飾された塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性のためかまたはその他の理由のために修飾された主鎖をもつＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。「修飾された」塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンなどの普通でない塩基が挙げられる。多様な修飾がＤＮＡおよびＲＮＡになされた；従って、「ポリヌクレオチド」は、一般に天然に見出される化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞に特有のＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる、比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【０１７３】
遺伝子コードの縮重の結果として、多数のヌクレオチド配列が同じポリペプチドをコードすることができることは当業者に理解される。
【０１７４】
本明細書において、用語「ヌクレオチド配列」とは、ヌクレオチド配列、オリゴヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列およびその変異体、相同体、断片および誘導体（例えばその一部分など）をさす。ヌクレオチド配列は、センスもしくはアンチセンス鎖を表そうと、またはそれらの組合せを表そうと、二本鎖または一本鎖であってよいゲノムまたは合成または組換え起源のＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。用語ヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術の使用により調製することができる（例えば、組換えＤＮＡ）。
【０１７５】
用語「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡを意味し得る。
【０１７６】
その他の核酸
本発明者らはまた、ＺＮＦ１４５核酸の断片、相同体、変異体または誘導体である核酸を提供する。ＺＮＦ１４５核酸に関して、用語「変異体」、「相同体」、「誘導体」または「断片」には、ＺＮＦ１４５ヌクレオチド配列の配列から、または配列への１個（またはそれ以上）の核酸の任意の置換、変異、修飾、交換、欠失または付加が含まれる。文脈上そうでないと認めない限り、「ＺＮＦ１４５」および「ＺＮＦ１４５」への言及には、かかるＺＮＦ１４５の変異体、相同体、誘導体および断片への言及が含まれる。
【０１７７】
結果として得られるヌクレオチド配列は、任意の１以上のＺＮＦ１４５活性を有するポリペプチドをコードすることができる。用語「相同体」は、結果として得られるヌクレオチド配列がＺＮＦ１４５活性を有するポリペプチドをコードするように、構造および／または機能に関して同一性を包含することが意図され得る。例えば、ＺＮＦ１４５の相同体などは、非軟骨形成間葉系幹細胞と比較して、軟骨形成間葉系幹細胞において増強された発現レベルを有し得る。配列同一性（すなわち類似性）に関して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％または少なくとも９０％の配列同一性であってよい。当該配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  受託番号ＮＭ＿０１５４７２を有するＺＮＦ１４５配列）に対して、少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性であってよい。これらの用語は、配列の対立遺伝子変異も包含する。
【０１７８】
変異体、誘導体および相同体
ＺＮＦ１４５核酸変異体、断片、誘導体および相同体は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでよい。それらは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。それらはまた、その中に合成または修飾されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なる種類の修飾が当分野で公知である。これらには、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート主鎖、分子の３’および／または５’末端でのアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が挙げられる。本明細書の目的のために、ポリヌクレオチドは、当分野で利用可能なあらゆる方法により修飾することができると理解されるべきである。かかる修飾は、目的のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増強するために行われてよい。
【０１７９】
ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、二本鎖の両方の鎖は、個別にまたは組み合わせて、本明細書に記載される方法および組成物に包含される。ポリヌクレオチドが一本鎖である場合、そのポリヌクレオチドの相補的配列も含められると理解されるべきである。
【０１８０】
ヌクレオチド配列に関して、用語「変異体」、「相同体」または「誘導体」には、配列から、または配列への１個（またはそれ以上）の核酸の任意の置換、変異、修飾、交換、欠失または付加が含まれる。該変異体、相同体または誘導体は、生物活性を有するポリペプチドをコードし得る。かかるＺＮＦ１４５の断片、相同体、変異体および誘導体は、上記に示したような調節された活性を含み得る。
【０１８１】
上記のように、配列同一性に関して、「相同体」は、当該配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１５４７２を有するＺＮＦ１４５配列）に対して少なくとも５％の同一性、少なくとも１０％の同一性、少なくとも１５％の同一性、少なくとも２０％の同一性、少なくとも２５％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも３５％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも４５％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有し得る。
【０１８２】
少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性または少なくとも９９％の同一性であってもよい。ヌクレオチド同一性比較を上記のように行うことができる。用いてよい配列比較プログラムは、上記のＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムである。デフォルトスコアリングマトリックスは、各々の同一ヌクレオチドに対して１０、各々のミスマッチに対して−９のマッチ値を有する。デフォルトギャップ生成ペナルティは、−５０であり、デフォルトギャップ延長ペナルティは、各々のヌクレオチドに対して−３である。
【０１８３】
ハイブリダイゼーション
本発明者らは、本明細書に提示される配列、またはその任意の変異体、断片または誘導体のいずれかと、あるいは上記のいずれかの補体と、選択的にハイブリダイズする能力のあるヌクレオチド配列をさらに記載する。ヌクレオチド配列は、少なくとも１５ヌクレオチド長、例えば少なくとも２０、３０、４０または５０ヌクレオチド長であってよい。
【０１８４】
用語「ハイブリダイゼーション」は、本明細書において「塩基対形成によって核酸の鎖が相補鎖と結合するプロセス」ならびにポリメラーゼ連鎖反応技術で行われるような増幅のプロセスを含むものとする。
【０１８５】
本明細書に提示されるヌクレオチド配列またはそれらの補体と選択的にハイブリダイズする能力のあるポリヌクレオチドは、本明細書に提示される対応するヌクレオチド配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅ）ＮＭ＿０１５４７２を有するＺＮＦ１４５配列）と、少なくとも４０％相同、少なくとも４５％相同、少なくとも５０％相同、少なくとも５５％相同、少なくとも６０％相同、少なくとも６５％相同、少なくとも７０％相同、少なくとも７５％相同、少なくとも８０％相同、少なくとも８５％相同、少なくとも９０％相同、または少なくとも９５％相同であり得る。かかるポリヌクレオチドは、対応するヌクレオチド配列と、少なくとも２０、例えば少なくとも２５または３０、例として少なくとも４０、６０または１００またはそれ以上の隣接ヌクレオチドの領域にわたって、一般に少なくとも７０％、少なくとも８０または９０％または少なくとも９５％または９８％相同であり得る。
【０１８６】
用語「選択的にハイブリダイズ可能な」とは、プローブとして使用されるポリヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドがバックグラウンドを有意に超えるレベルでプローブとハイブリダイズすることが見出される条件下で使用されることを意味する。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えば、スクリーニングされているｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーに存在するその他のポリヌクレオチドのために起こり得る。この場合、バックグラウンドは、プローブとライブラリーの非特異的ＤＮＡメンバーの間の相互作用により生じるシグナルのレベルを意味し、それは標的ＤＮＡで観察される特異的相互作用の１０分の１、例えば１００分の１の強度である。相互作用の強度は、例えば、プローブを、例えば３２Ｐもしくは３３Ｐで放射性標識することによるか、または非放射性プローブ（例えば、蛍光色素、ビオチンまたはジゴキシゲニン）を用いて測定することができる。
【０１８７】
ハイブリダイゼーション条件は、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）に教示されるように核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、以下に説明するように規定された「ストリンジェンシー」を付与する。
【０１８８】
最大ストリンジェンシーは一般に約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い温度）で生じ；高ストリンジェンシーはＴｍより約５℃〜１０℃低い温度で生じ；中ストリンジェンシーはＴｍより約１０℃〜２０℃低い温度で生じ；かつ、低ストリンジェンシーはＴｍより約２０℃〜２５℃低い温度で生じる。当業者に理解されるように、最大ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、同一のポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用することができるが、中（または低）ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、類似または近縁ポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用することができる。
【０１８９】
本発明者らは、ストリンジェント条件下（例えば、６５℃および０．１ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸Ｎａ３  ｐＨ７．０））でＺＮＦ１４５核酸、断片、変異体、相同体または誘導体とハイブリダイズすることが可能であり得るヌクレオチド配列を提供する。
【０１９０】
相同体、変異体および誘導体の生成
当該配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１５４７２を有するヒトＺＮＦ１４５配列）と１００％同一ではないが、それも含むポリヌクレオチド、ならびにＺＮＦ１４５の相同体、変異体および誘導体は、いくつかの方法で得ることができる。これらの配列の他の変異体は、例えば、一連の個体、例えば、異なる集団からの個体から作製されたＤＮＡライブラリーをプロービングすることにより得ることができる。例えば、ＺＮＦ１４５相同体は、その他の個体またはその他の種から同定することができる。さらなる組換えＺＮＦ１４５核酸およびポリペプチドは、その相同体中の対応する位置を特定すること、および本明細書の他所に記載されているようにその分子を合成または作製することにより作製することができる。
【０１９１】
その上、ＺＮＦ１４５のその他のウイルス／細菌、または細胞相同体、特に哺乳類細胞（例えばラット細胞、マウス細胞、ウシ細胞および霊長類細胞）において見出される細胞相同体を得ることができ、かかる相同体およびその断片は、一般に、ヒトＺＮＦ１４５と選択的にハイブリダイズする能力があることになる。かかる相同体を用いて、非ヒトＺＮＦ１４５核酸、断片、変異体および相同体を設計することができる。当分野で公知の手段により突然変異誘発を行ってさらなる変種を作製することができる。
【０１９２】
ＺＮＦ１４５相同体の配列は、その他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリーまたは他の動物種に由来するゲノムＤＮＡライブラリーをプロービングすること、およびかかるライブラリーを、ＺＮＦ１４５核酸、断片、変異体および相同体、またはその他のＺＮＦ１４５の断片のいずれかの全部または一部を含むプローブを用いて、中〜高ストリンジェンシー条件下でプロービングすることにより得ることができる。
【０１９３】
本明細書に開示されるポリペプチドまたはヌクレオチド配列の種相同体および対立遺伝子変異体を得るために同様の考慮事項を適用する。
【０１９４】
また、変異体および株／種相同体はまた、ＺＮＦ１４５核酸の配列内に保存されたアミノ酸配列をコードする、変異体および相同体内の配列を標的とするように設計されたプライマーを用いる縮重ＰＣＲを用いて得ることもできる。保存された配列は、例えば、いくつかの変異体／相同体からのアミノ酸配列をアラインすることにより推定することができる。配列アラインメントは当分野で公知のコンピューターソフトウエアを用いて行うことができる。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く使用されている。
【０１９５】
縮重ＰＣＲで使用されるプライマーは、１以上の縮重位置を含み、かつ既知配列に対して単一の配列プライマーを用いて配列をクローニングするのに使用される条件よりも低いストリンジェンシー条件で使用されることになる。遠縁生物由来の配列間の全体的なヌクレオチド相同性は非常に低い可能性が高く、従ってこれらの状況において縮重ＰＣＲはＺＮＦ１４５配列の標識断片でライブラリーをスクリーニングすることよりも最適な方法であり得ることを当業者は理解する。
【０１９６】
その上、相同配列は、プログラムのＢＬＡＳＴスイートなどの検索アルゴリズムを用いてヌクレオチドおよび／またはタンパク質データベースを検索することにより同定することができる。
【０１９７】
あるいは、かかるポリヌクレオチドは、特徴付けられた配列、例えば、ＺＮＦ１４５核酸、あるいはその変異体、相同体、誘導体または断片の部位特異的変異誘発により得ることができる。これは、例えばポリヌクレオチド配列を発現させている特定の宿主細胞に対するコドン選択を最適化するために、サイレントコドン変化が配列に必要とされる場合に有用であり得る。制限酵素認識部位を導入するため、またはポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの特性または機能を変更するために、その他の配列変化が望まれる場合もある。
【０１９８】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、プライマー（例えばＰＣＲプライマー、選択的増幅反応のためのプライマー）、プローブ（例えば従来の手段により放射性もしくは非放射性標識を用いて明示標識で標識されたプローブ）を作製するために使用してもよいし、またはポリヌクレオチドをベクターにクローニングしてもよい。かかるプライマー、プローブおよびその他の断片は、少なくとも８、９、１０、または１５、例えば少なくとも２０、例えば少なくとも２５、３０または４０ヌクレオチド長となり、同様に本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」に包含される。
【０１９９】
ＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドおよびプローブは、組換えによって、合成によって、または当業者の利用可能な任意の手段によって作製することができる。それらも同様に標準技法によりクローニングされてよい。
【０２００】
一般に、プライマーは、所望する核酸配列を一度に１ヌクレオチドずつ段階毎に製造することを伴う合成手段により作製されることになる。自動化技術を使用してこれを達成するための技法は、当分野で容易に利用可能である。
【０２０１】
ＺＮＦ１４５の断片を含むプライマーは、例えば軟骨形成に関連するＺＮＦ１４５発現のアップレギュレートなどの、ＺＮＦ１４５発現の検出方法において特に有用である。ＺＮＦ１４５の増幅のために適したプライマーは、ＺＮＦ１４５の任意の適したストレッチから生成することができる。使用することのできるプライマーとしては、特異的なＺＮＦ１４５の配列を増幅する能力のあるプライマーが挙げられる。
【０２０２】
ＺＮＦ１４５プライマーはそれ自体で提供されてもよいが、それらは最も有用には、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むプライマー対として提供される。
【０２０３】
さらに長いポリヌクレオチドは、一般に、組換え手段、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて生成される。これは、１対のプライマー（例えば、約１５〜３０ヌクレオチドのプライマー）を作製し、プライマーを動物細胞またはヒト細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させ、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅された断片を（例えばアガロースゲル上の反応混合物を精製することにより）単離し、増幅されたＤＮＡを回収することを伴うことになる。これらのプライマーは、増幅されたＤＮＡが適したクローニングベクターにクローニングできるように適した制限酵素認識部位を含有するように設計することができる。
【０２０４】
ポリヌクレオチドまたはプライマーは明示標識を有することができる。適した標識としては、３２Ｐまたは３５Ｓなどの放射性同位元素、ジゴキシゲニン、蛍光色素、酵素標識、あるいはビオチンなどのその他のタンパク質標識が挙げられる。かかる標識は、ポリヌクレオチドまたはプライマーに付加することができ、それ自体公知の技法を用いて検出することができる。標識されたまたは標識されていない、ポリヌクレオチドまたはプライマーまたはその断片は、ヒトまたは動物の身体のポリヌクレオチドを検出または配列決定するための核酸に基づく試験で当業者が使用することができる。
【０２０５】
かかる検出のための試験は、一般に、ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する生体試料をポリヌクレオチドまたはプライマーを含むプローブとハイブリダイズ条件下で接触させること、および試料中のプローブと核酸の間に形成された二重鎖を検出することを含む。かかる検出は、ＰＣＲなどの技法を用いて、またはプローブを固相支持体上に固定化し、プローブとハイブリダイズしていない試料中の核酸を除去し、次にプローブとハイブリダイズした核酸を検出することによって実現することができる。あるいは、試料核酸を固相支持体に固定化させ、そのような支持体に結合したプローブの量を検出すればよい。この形式およびその他の形式の適したアッセイ方法は、例えばＷＯ８９／０３８９１号およびＷＯ９０／１３６６７号に見出すことができる。
【０２０６】
ヌクレオチド、例えば、ＺＮＦ１４５核酸を配列決定するための試験は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する生体試料をポリヌクレオチドまたはプライマーを含むプローブとハイブリダイズ条件下で接触させること、および例えばサンガーのジデオキシ鎖停止法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．参照）により配列を決定することを伴う。
【０２０７】
そのような方法は、一般に、適した試薬の存在下で、標的ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的な鎖の合成によりプライマーを伸長させて、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ／Ｕ残基の１以上でその伸張反応を選択的に終結させること；鎖伸長および終結反応を行わせること；伸長産物のサイズに従って分離して、選択的終結の生じたヌクレオチドの配列を決定することを含む。適した試薬としては、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、デオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、バッファーおよびＡＴＰが挙げられる。ジデオキシヌクレオチドが選択的終結に使用される。
【０２０８】
ＺＮＦ１４５制御領域
一部の目的のため、ＺＮＦ１４５の制御領域を利用または調査する必要があり得る。かかる制御領域には、プロモーター、エンハンサーおよび遺伝子座制御領域が含まれる。制御領域により、本発明者らは、それに作動可能に連結されているコード配列の発現を調節する能力のある核酸配列または構造を意味する。
【０２０９】
例えば、制御領域は、ＺＮＦ１４５を発現するトランスジェニック動物を作出する際に有用である。さらに、制御領域を用いてＺＮＦ１４５の発現構築物を作出することができる。このことは以下でさらに詳細に記載される。
【０２１０】
ＺＮＦ１４５の制御領域の同定は簡単であり、いくつかの方法で行うことができる。例えば、ＺＮＦ１４５のコード配列は、ヒトまたはマウスＺＮＦ１４５ｃＤＮＡ配列をプローブとして用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより生物から得ることができる。５’配列は、適切なゲノムライブラリーのスクリーニング、または当分野で公知のプライマー伸長により得ることができる。ゲノムデータベースのデータベース検索を使用してもよい。特に注目されるかかる５’配列には非コード領域が含まれる。５’領域は、目視で、またはコンピュータープログラムの助けを借りて調査して、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域の存在を示す配列モチーフを特定することができる。
【０２１１】
さらに、２またはそれ以上の生物由来のＺＮＦ１４５核酸配列の配列アラインメントを行ってよい。異なる種由来のＺＮＦ１４５配列をアラインすることにより、アミノ酸配列のどの領域が異なる種間で保存されているかを決定することが可能である。かかる保存された領域は、問題の遺伝子（すなわちＺＮＦ１４５）の制御領域を含んでいる可能性が高い。本明細書に開示されるマウスおよびヒトゲノム配列、例えば、マウスＺＮＦ１４５ゲノム配列は、この目的のために用いることができる。さらに、その他の生物由来のＺＮＦ１４５相同体を、マウスおよびヒトＺＮＦ１４５配列から生成した適切なプローブを用いて標準的なスクリーニング方法を用いて得ることができる。フグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ）またはゼブラフィッシュのゲノムもＺＮＦ１４５相同体を同定するためにスクリーニングすることができ、従って、ＺＮＦ１４５の数種類のゼブラフィッシュ配列が同定されている（上述）。フグまたはゼブラフィッシュＺＮＦ１４５遺伝子の５’非コード領域の、マウスまたはヒトゲノムＺＮＦ１４５配列との比較を用いて、制御領域を含有する保存領域を同定することができる。
【０２１２】
欠失研究を行って、ＺＮＦ１４５プロモーター領域および／またはエンハンサー領域を同定してよい。
【０２１３】
推定制御領域の同一性は、候補配列をレポーター遺伝子に連結し、レポーターの発現を検出する分子生物学実験により確認することができる。
【０２１４】
ＺＮＦ１４５過剰発現細胞
本明細書に記載される方法および組成物は、一部の態様において、ＺＮＦ１４５を過剰発現する細胞、つまり、ＺＮＦ１４５の発現または活性がアップレギュレートされた細胞を使用する。そのような細胞は、間葉系幹細胞などの軟骨形成前駆細胞を含んでよい。それは、またはその祖先は、かかる特性を有するように改変されてよい。
【０２１５】
一般に、ＺＮＦ１４５過剰発現細胞は、ＺＮＦ１４５発現ベクター（下に記載される通り）を、適した宿主細胞、例えば、間葉系幹細胞などの軟骨形成前駆体幹細胞にトランスフェクトするかまたはそうでなければ導入することにより構築され得る。
【０２１６】
ＺＮＦ１４５を過剰発現する細胞は、増強された軟骨形成マーカーの発現を提示し得る。軟骨形成マーカーは、当分野で公知の軟骨形成のためのあらゆるマーカーを含んでよい。例えば、軟骨形成マーカーは、２型コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１）を含んでよい。かかるマーカーは、当分野で公知の方法、例えば抗体を使用して、および組織学的染色、ウエスタンブロットなどにより検出することができる。２種類の２型コラーゲン変異体、すなわちＣｏｌ２Ａ１変異体１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１８４４）およびＣｏｌ２Ａ１変異体２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３３１５０）のうちいずれかを検出することができる。同様に、２種類のアグリカン変異体、すなわちアグリカン変異体１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１３５）およびアグリカン変異体２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１３２２７）のうちのいずれかを検出することができる。Ｃｏｌ１０Ａ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００４９３）およびＳｏｘ９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３４６）も、当分野で公知の方法により軟骨形成マーカーとして検出することができる。
【０２１７】
ＺＮＦ１４５を過剰発現する細胞は、軟骨、骨または靭帯プロテオグリカンの増強された分泌を提示し得る。かかる増強された分泌は、当分野で公知の方法により検出することができ、例えばアルシアンブルー染色により検出することができる。それは軟骨、骨または靭帯欠損を修復する能力の改良を提示することができる。このことは、任意の１以上の細胞形態の組織学的類別、マトリックス染色、表面規則性、軟骨、骨または靭帯の厚さおよびホスト隣接軟骨へのドナーの組込みにより検出することができる。Ｗａｋｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）により記載されるような組織学的類別をかかるアッセイで使用してよい。
【０２１８】
ＺＮＦ１４５過剰発現細胞を培養して細胞株としてよい。ＺＮＦ１４５過剰発現細胞は、当分野で公知の手段により、例えば、実施例に詳細に記載されるテロメラーゼの発現により不死化することができる。
【０２１９】
ＺＮＦ１４５の発現をアップレギュレートするため、調節配列がＺＮＦ１４５ポリヌクレオチドの発現を指示することができるように、ＺＮＦ１４５ポリヌクレオチド配列を調節配列と会合させてよい。次に、調節配列の制御下でポリペプチドの発現を適した標的細胞、例えば間葉系幹細胞内で起こさせる。
【０２２０】
調節配列は、ＺＮＦ１４５ポリヌクレオチド配列が自然に会合しない配列であってよい。
【０２２１】
本発明者らは、調節配列が該ポリヌクレオチドの発現を指示することができるように、ＺＮＦ１４５ポリヌクレオチド配列を調節配列と会合させた細胞、例えば間葉系幹細胞を準備すること、および該細胞をポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養することを含む、ＺＮＦ１４５ポリペプチドを発現させる方法を記載する。
【０２２２】
本発明者らは、（ａ）調節配列が該ポリヌクレオチドの発現を指示することができるように、ＺＮＦ１４５ポリヌクレオチド配列を調節配列と会合させることにより形成された発現配列を得るステップと、（ｂ）調節配列の制御下で発現配列由来のポリペプチドを発現させるステップとを含む、ポリペプチドを産生する方法をさらに記載する。
【０２２３】
特に、個別のＺＮＦ１４５核酸あるいはその相同体、変異体、または誘導体をコードするＺＮＦ１４５ヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター、すなわち挿入されるコード配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入されてよい。
【０２２４】
本発明者らはまた、上記の方法のいずれかにより産生されるポリペプチドも提供する。
【０２２５】
ＺＮＦ１４５ポリペプチドの発現を可能にする方法を以下に記載する。これらの方法が、間葉系幹細胞の増強された軟骨形成を実現するために、ポリペプチドのアップレギュレート、例えば、ＺＮＦ１４５のアップレギュレートが望ましい、本明細書に記載される方法および組成物の実施形態で使用するために適し得ることは、当然理解される。
【０２２６】
発現されたポリペプチドを提供する一方法は、調節可能なプロモーターを、所望により、発現ベクターにクローニングされているＺＮＦ１４５などの目的のポリペプチドをコードする配列と作動可能に連結されている、エンハンサーなどのその他の調節配列とともに含む発現ベクター、すなわちベクター（例えば、プラスミド）を用いることである。
【０２２７】
当業者に周知の方法を用いてＺＮＦ１４５をコードする配列を含有する発現ベクターおよび適切な転写制御因子および翻訳制御因子を構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ法、合成法、およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。かかる技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｃｈ．４，８，ａｎｄ  １６−１７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９，１３，ａｎｄ  １６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）に記載されている。
【０２２８】
多様な発現ベクター／宿主系を利用して、ＺＮＦ１４５をコードする配列を含め、かつ発現させることができる。これらの発現ベクター／宿主系としては、限定されるものではないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）またはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；あるいは動物細胞系が挙げられる。いずれの適した宿主細胞を用いてもよい。哺乳類細胞発現は、下でさらに詳細に記載される。
【０２２９】
「制御因子」または「調節配列」は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を実行するベクターの非翻訳領域（すなわちエンハンサー、プロモーター、ならびに５’および３’非翻訳領域）のものである。かかる因子は、その強度および特異性の点で様々であり得る。利用するベクター系および宿主に応じて、構成および誘導プロモーターを含む、任意の数の適した転写および翻訳因子が使用され得る。これらは下にさらに詳細に記載される。
【０２３０】
ＺＮＦ１４５を過剰発現する細胞は、軟骨形成分化に偏っている可能性がある。このことは、当分野で公知の様々な手段、例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７に記載されるペレット培養系により実現することができる。この参照文献に示される方法は、軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞をペレット化し、１０ｎｇ／ｍｌトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β３、１０−７Ｍデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸−２−リン酸、４０μｇ／ｍｌプロリン、１００μｇ／ｍｌピルビン酸、および５０ｍｇ／ｍｌＩＴＳ＋プレミックス（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；６．２５μｇ／ｍｌインスリン、６．２５μｇ／ｍｌトランスフェリン、６．２５μｇ／ｍｌ亜セレン酸、１．２５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、および５．３５ｍｇ／ｍｌリノール酸）を含有する軟骨形成培地で培養することを含む。細胞を軟骨形成分化に偏らせるその他の方法は、当分野で公知であり、本明細書に記載される方法および組成物で使用することができる。
【０２３１】
細胞内での過剰発現ＺＮＦ１４５に加えて、その他のタンパク質の発現を制御して軟骨形成を改善または増強することができる。例えば、細胞（またはその祖先）は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７およびＢｍｉ−１のいずれか１以上の発現または活性を増大させるように改変されてよい。
【０２３２】
ＺＮＦ１４５発現ベクター
間葉系幹細胞でのＺＮＦ１４５操作および過剰発現のために、ＺＮＦ１４５ポリヌクレオチドを組換え複製可能なベクターに組み込むことができる。このベクターは、適合する宿主細胞において核酸を複製するために使用することができる。
【０２３３】
本発明者らは、ポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入し、ベクターを適合する宿主細胞に導入し、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることにより、ポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収することができる。適した宿主細胞としては、大腸菌などの細菌、酵母、哺乳類細胞株およびその他の真核細胞株、例えば昆虫Ｓｆ９細胞が挙げられる。
【０２３４】
ＺＮＦ１４５ポリヌクレオチドも、間葉系幹細胞におけるＺＮＦ１４５の発現のために、発現ベクターに組み込むことができる。例えば、ベクター中のＺＮＦ１４５ポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現をもたらす能力のある制御配列と作動可能に連結されてよい（すなわち、ベクターは発現ベクターである）。用語「作動可能に連結された」とは、記載される成分がそれらの意図されるやり方で機能できるような関係にあることを意味する。コード配列に「作動可能に連結された」調節配列または調節領域は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で実現するような方法で連結されている。
【０２３５】
調節領域
好ましい実施形態では、ＺＮＦ１４５は、そのような細胞により発現される遺伝子の調節領域に作動可能に連結されている間葉系幹細胞で発現する。
【０２３６】
真核細胞において遺伝子をコードするタンパク質の転写を制御するプロモーターおよびエンハンサーは、複数の遺伝因子から構成される。細胞機構は、各々の因子によって伝えられる調節情報を収集および統合する能力があり、様々な遺伝子に別個の、多くの場合複雑なパターンの転写調節を展開させる。
【０２３７】
本明細書で使用するための制御配列は、例えばさらなる転写調節エレメントの付加により修飾して、制御配列により指示される転写のレベルを、転写モジュレーターに対してより応答性とすることができる。
【０２３８】
用語プロモーターは、本明細書において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位の周囲にクラスター化した一群の転写制御モジュールをさすために用いられる。プロモーターがどのように組織化されるかについての見解の多くは、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）およびＳＶ４０初期転写単位のプロモーターを含む、いくつかのウイルスプロモーターの分析から導かれる。より最近の研究によって増大したこれらの研究は、プロモーターが、別個の機能モジュールから構成され、それぞれ約７〜２０ｂｐのＤＮＡからなり、転写活性化タンパク質の１またはそれ以上の認識部位を含有することを示した。
【０２３９】
各々のプロモーターにおいて少なくとも１つのモジュールが、ＲＮＡ合成のための開始部位を位置づける働きをする。この最もよく知られた例は、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠く一部のプロモーター、例えば哺乳類ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターでは、開始部位自体の上に重なっている別個のエレメントが開始の場所を固定するのに役立つ。
【０２４０】
さらなるプロモーターエレメントが転写開始の頻度を調節する。一般に、これらは開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、いくつかのプロモーターは開始部位の下流にも機能エレメントを同様に含むことが最近になって示された。エレメント間の間隔はフレキシブルであり、そのためプロモーター機能はエレメントが逆になっているかまたは相互に対して移動している場合にも保持される。ｔｋプロモーターでは、エレメント間の間隔は５０ｂｐ離れるまで増大されてよく、その後活性は減少し始める。プロモーターに応じて、個々のエレメントは協同でまたは独立に機能して転写を活性化することができると思われる。
【０２４１】
エンハンサーは、元来ＤＮＡの同じ分子上の離れた位置に位置するプロモーターからの転写を増大させる遺伝因子として検出された。大きな距離にわたって作用するこの能力は、従来の原核生物の転写調節の研究において先例がほとんどなかった。その後の研究により、エンハンサー活性をもつＤＮＡの領域がプロモーターそっくりに組織化されることが示された。つまり、それらは多くの個体エレメントから構成され、その各々が１以上の転写タンパク質に結合する。
【０２４２】
エンハンサーとプロモーターの基本的な差異は動作上の差異である。エンハンサー領域は全体として離れた地点で転写を刺激できなければならない；これはプロモーター領域またはその成分エレメントに当てはまる必要はない。一方、プロモーターは特定の部位かつ特定の方向でＲＮＡ合成の開始を指示する１以上のエレメントを有さなければならないが、エンハンサーはこれらの特異性を欠いている。この動作上の差異は別として、エンハンサーおよびプロモーターは非常に類似した実体である。
【０２４３】
プロモーターおよびエンハンサーは、細胞内で転写を活性化させるという同じ一般的機能を有する。それらはしばしば重なり合い、かつ隣接し、多くの場合非常によく似たモジュール構造を有すると思われる。総合すると、これらの検討により、エンハンサーとプロモーターは、相同な実体であること、およびこれらの配列に結合した転写活性化タンパク質は基本的に同じように細胞の転写機構と相互作用し得ることが示唆される。従って、ＺＮＦ１４５発現ベクターは、プロモーター、エンハンサー、または両方を、ＺＮＦ１４５コード配列に加えて含んでよい。
【０２４４】
ＺＮＦ１４５の発現構築物を用いるＭＳＣのウイルス形質転換
ＺＮＦ１４５ベクター、例えばＺＮＦ１４５発現ベクターなどは、適した宿主細胞、例えば下に記載される間葉系幹細胞などに形質転換またはトランスフェクトし、ＺＮＦ１４５タンパク質の発現をもたらすことができる。
【０２４５】
ａ．アデノウイルス感染
ＺＮＦ１４５の発現増大のための発現構築物の送達の一方法は、アデノウイルス発現ベクターの使用を伴う。アデノウイルスベクターは、ゲノムＤＮＡ内への組込みの能力が低いことが公知であるが、この特徴はこれらのベクターによる高効率の遺伝子導入により相殺される。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）該構築物のパッケージングをサポートし、かつ（ｂ）その中でクローニングされたトランスジェニック構築物を最終的に発現するために十分なアデノウイルス配列を含有するこれらの構築物を含むことが意図される。
【０２４６】
ベクターは、遺伝子操作された形態のアデノウイルスを含む。３６ｋｂの直鎖状二本鎖ＤＮＡウイルスというアデノウイルスの遺伝子構成を知ることにより、大きなアデノウイルスＤＮＡを７ｋｂまでの外来配列と置換することが可能になる（Ｇｒｕｎｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２）。レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は染色体への組込みを生じない。これは、アデノウイルスＤＮＡがエピソームとして潜在的遺伝毒性なく複製することができるためである。また、アデノウイルスは構造的に安定であり、ゲノム再配列は、広範囲な増幅後、検出されていない。
【０２４７】
アデノウイルスは、中程度の大きさのゲノムであること、操作の容易さ、高い力価、広い標的細胞範囲および高い感染力のため、遺伝子導入ベクターとしての使用に特に適している。ウイルスゲノムの両端は、１００〜２００塩基対の逆方向反復（ＩＴＲ）を含み、それらは、ウイルスＤＮＡ複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである。ゲノムの初期（Ｅ）および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始により分けられる様々な転写単位を含む。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよび少数の細胞遺伝子の転写の調節を担うタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成をもたらす。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現および宿主細胞停止に関与している（Ｒｅｎａｎ，１９９０）。ウイルスキャプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子の産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）により生ずる単一の一次転写産物の重要なプロセシング後のみ発現される。該ＭＬＰ（１６．８マップユニットに位置する）は、感染の後期フェーズの間に特に効率的となり、このプロモーターから生じた全てのｍＲＮＡは、５’−三分節リーダー（ＴＰＬ）配列を有し、その配列により、翻訳に適したｍＲＮＡとなる。
【０２４８】
組換え型アデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの間の相同組換えから作製することができる。２つのプロウイルスベクター間で起こり得る組換えに起因して、野生型アデノウイルスが、このプロセスから生成される。従って、個々のプラークからウイルスの単一クローンを単離し、そのゲノム構造を調査することが重要である。
【０２４９】
現在の複製欠損アデノウイルスベクターの作製および増幅は、２９３と表される、特有のヘルパー細胞株によって決まり、２９３はＡｄ５ＤＮＡ断片によりヒト胚腎臓細胞から形質転換され、Ｅ１タンパク質を構成的に発現する（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）。Ｅ３領域はアデノウイルスゲノムには必要ない領域であるため（Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ，１９７８）、現在のアデノウイルスベクターは、２９３細胞の助けにより、Ｅ１、Ｄ３のいずれか、または両方の領域に外来ＤＮＡを有する（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｃ，１９９１）。本来、アデノウイルスは、野生型ゲノムのおよそ１０５％をパッケージすることができ（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）、約２ｋｂの追加のＤＮＡの収容能力を提供する。Ｅ１およびＥ３領域において置換可能なおよそ５．５ｋｂのＤＮＡと組み合わせると、現在のアデノウイルスベクターの最大収容能は、７．５ｋｂ未満、または該ベクターの全長の約１５％である。８０％を超えるアデノウイルスのウイルスゲノムが、ベクター主鎖内にとどまる。
【０２５０】
ヘルパー細胞株は、ヒト細胞、例えばヒト胚腎臓細胞、筋肉細胞、造血細胞または他のヒト胚間葉もしくは上皮細胞などから誘導することができる。あるいは、該ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスにとって許容状態にある他の哺乳類種の細胞から誘導することができる。かかる細胞としては、例えば、ベロ細胞または他のサル胚間葉もしくは上皮細胞が挙げられる。ヘルパー細胞株の例は、２９３細胞株である。
【０２５１】
Ｒａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）は、２９３細胞を培養し、アデノウイルスを増殖させるための改良法を開示した。一形式では、天然の細胞凝集体を、１００〜２００ｍｌの培地を含有する１リットルのシリコン処理したスピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に個々の細胞を接種することにより培養する。４０ｒｐｍで撹拌後、細胞生存力をトリパンブルーで評価する。別の形態では、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌマイクロキャリア（Ｂｉｂｂｙ  Ｓｔｅｒｌｉｎ，Ｓｔｏｎｅ，ＵＫ）（５ｇ／ｌ）を以下のように用いる。５ｍｌの培地に再懸濁した細胞接種材料を、２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中の該キャリア（５０ｍｌ）に加え、時折撹拌しながら１〜４時間静置させる。次いで、培地を５０ｍｌの新鮮培地と取り換え、撹拌を開始する。ウイルス産生のために、細胞を約８０％コンフルエンスにまで増殖させ、その後培地を（最終体積の２５％まで）交換し、アデノウイルスをＭＯＩ０．０５で加える。培養物を一夜静置し、その後、体積を１００％に増加させ、さらに７２時間の撹拌を開始する。
【０２５２】
アデノウイルスベクターが複製欠損である、または少なくとも条件的に欠損であるという要件以外は、アデノウイルスベクターの性質は、ＺＮＦ１４５の発現の増大のための良好な形質転換および発現構築物の発現に対してあまり重要でないと思われる。アデノウイルスは、４２の異なる既知血清型またはサブグループＡ〜Ｆのいずれかであってよい。サブグループＣのアデノウイルス５型は、本明細書に記載の方法および組成物における使用のための、条件付きの複製欠損アデノウイルスベクターを得るための出発物質として使用することができる。これは、アデノウイルス５型がヒトアデノウイルスであり、かなりの量の生化学的および遺伝情報が公知であり、アデノウイルスをベクターとして用いる大部分の構築物に歴史的に用いられているためである。
【０２５３】
前述のように、典型的なベクターは複製欠損であり、アデノウイルスＥ１領域を有していない。従って、Ｅ１コード配列が取り除かれた位置に、ＺＮＦ１４５発現増大のための形質転換構築物を導入することが最も便利である。しかし、アデノウイルス配列中のＺＮＦ１４５発現増大のための発現構築物の挿入位置はあまり重要ではない。ＺＮＦ１４５をコードするポリヌクレオチドは、Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）により記載されるようにＥ３置換ベクター中の欠失Ｅ３領域の代わりに、または、ヘルパー細胞株またはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補うＥ４領域に挿入されてもよい。
【０２５４】
アデノウイルスの増殖および操作は当業者に公知であり、インビトロおよびインビボで広い宿主域を示す。このグループのウイルスは、高力価、例えば、１０．ｓｕｐ．９−１０．ｓｕｐ．１１プラーク形成単位／ｍｌで得ることができ、かつ、それらは高感染性である。アデノウイルスの生活環は、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。アデノウイルスベクターにより送達された外来遺伝子はエピソーム性であり、そのために、宿主細胞に対する遺伝毒性が低い。野生型アデノウイルスを用いるワクチン接種の研究において、副作用は報告されておらず（Ｃｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９６３；Ｔｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９７１）、このことは、インビボ遺伝子導入ベクターとしてのそれらの安全性および治療可能性を実証している。
【０２５５】
アデノウイルスベクターは、真核生物の遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、およびワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２；Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｃ，１９９２）に使用されてきた。最近では、動物試験から、組換え型アデノウイルスを遺伝子療法に使用し得ることが示唆された（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。組換え型アデノウイルスを様々な組織に投与する試験としては、気管内注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、末梢静脈内注射（Ｈｅｒｚ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｒｄ，１９９３）、および脳内への定位接種（Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）が挙げられる。
【０２５６】
ｂ．ＡＡＶ感染
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、組込みが高頻度で起こり、かつ、非分裂細胞にも感染可能であり、従って組織培養中の哺乳類細胞に遺伝子を送達するために有用であるので（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２）、本明細書に記載の方法および組成物における使用のための魅力的なベクター系である。ＡＡＶは感染性に関して広い宿主域を有し（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８４；Ｌａｕｇｈｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、これは、ＡＡＶが使用に適していることを意味する。ｒＡＡＶベクターの作製および使用に関する詳細は、米国特許第５，１３９，９４１号および米国特許第４，７９７，３６８号に記載され、それぞれ引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０２５７】
遺伝子送達におけるＡＡＶの使用を実証する研究としては、ＬａＦａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）；Ｆｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）；およびＷａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）が挙げられる。組換え型ＡＡＶベクターは、マーカー遺伝子（Ｋａｐｌｉｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｓａｍｕｌｓｋｉ、ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｓｈｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９４；Ｙｏｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｚｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ａｎｄ  Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９８４；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８５；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、およびヒト疾患に関与する遺伝子（Ｆｌｏｔｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｌｕｏ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｏｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｗａｌｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｗｅｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４）のインビトロおよびインビボ形質導入に使用され、成果を挙げている。最近では、嚢胞性線維症の治療のためのＡＡＶベクターの第Ｉ相臨床試験が承認されている。
【０２５８】
ＡＡＶは、培養細胞において生産的感染を行うために別のウイルス（アデノウイルスまたはヘルペスウイルスファミリーのメンバー）と同時感染を必要とする依存性パルボウイルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２）。ヘルパーウイルスと同時感染しない場合は、野生型ＡＡＶゲノムはその末端を介してヒト染色体１９に組み込まれ、プロウイルスとして潜伏状態で存在する（Ｋｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。しかし、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質もまた発現されない限り、ｒＡＡＶは、組込みに関して染色体１９に限定されない（Ｓｈｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９４）。ＡＡＶプロウイルスを有している細胞がヘルパーウイルスに重複感染した場合、ＡＡＶゲノムは染色体または組換え型プラスミドから「救出」され、通常の生産的感染が確立される（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｋｏｔｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２）。
【０２５９】
一般に、組換え型ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルスは、目的の遺伝子、例えば、両側に２つのＡＡＶ末端反復が配置されているＺＮＦ１４５などを含むプラスミド（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；それぞれ引用することにより本明細書の一部をなすものとする）、および末端反復を持たない野生型ＡＡＶコード配列、例えばｐＩＭ４５を含む発現プラスミド（ＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を、コトランスフェクトすることにより作製される。該細胞はまた、アデノウイルス、またはＡＡＶヘルパー機能に必要なアデノウイルス遺伝子を有するプラスミドとともに感染またはトランスフェクトされる。かかる方法で作製されたｒＡＡＶウイルスストックには、アデノウイルスが混入しているが、これはｒＡＡＶ粒子から物理的に分離しなくてはならない（例えば、塩化セシウム密度遠心分離法により）。あるいは、ＡＡＶコーディング領域を含むアデノウイルスベクター、またはＡＡＶコーディング領域および一部または全てのアデノウイルスヘルパー遺伝子を含む細胞株を使用し得る（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４ａ；Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。組み込まれたプロウイルスとしてｒＡＡＶ  ＤＮＡを有する細胞株も使用することができる（Ｆｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【０２６０】
ｃ．レトロウイルス感染
レトロウイルスは、逆転写のプロセスにより感染細胞内でそのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換する能力を特徴とする、一本鎖ＲＮＡウイルスのグループである（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。次に、得られるＤＮＡをプロウイルスとして細胞染色体に安定に組込み、ウイルスタンパク質を合成させる。この組込みの結果として、ウイルスの遺伝子配列がレシピエント細胞およびその子孫に保存される。レトロウイルスゲノムは、キャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする３つの遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖを含む。ｇａｇ遺伝子の上流に見出される配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルを含む。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列は、ウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは強力なプロモーターおよびエンハンサー配列を含み、また、宿主細胞ゲノム内への組込みのために必要である（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。
【０２６１】
レトロウイルスベクターを構築するために、目的の導入遺伝子、例えばＺＮＦ１４５などをコードする核酸を、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入し、複製欠損型ウイルスを作出する。ビリオンを作出するためには、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含むがＬＴＲおよびパッケージング成分は含まないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）。ｃＤＮＡとともにレトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列を含む組換えプラスミドをこの細胞株に導入する場合（例えば、リン酸カルシウム沈澱により）、該パッケージング配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物をウイルス粒子中にパッケージングさせ、次にそれは培地中へ分泌される（Ｎｉｃｏｌａｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６；Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）。次に、組換え型レトロウイルスを含む培地を収集し、所望により濃縮して、遺伝子導入に使用する。レトロウイルスベクターは、幅広い細胞種に感染可能である。しかし、組込みおよび安定な発現には、宿主細胞の細胞分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５）。
【０２６２】
欠損レトロウイルスベクター使用に対する懸念は、パッケージング細胞中に野生型の複製能力のあるウイルスが出現する可能性があることである。これは、宿主細胞ゲノム中に組み込まれたｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ配列の上流に組換え型ウイルス由来の完全なままの配列を挿入するという組換え事象により生じ得る。しかし現在、組換えの可能性を大幅に低減する新規パッケージング細胞株が入手可能である（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｈｅｒｓｄｏｒｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。
【０２６３】
ｄ．レンチウイルス
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型（ＨＩＶ−１）に基づくレンチウイルスベクターは、遺伝子療法の分野における最近の進展を構成する。ＨＩＶ−１由来ベクターの重要な特性は、非分裂細胞を感染させる能力である。高力価のＨＩＶ−１由来ベクターが作出されている。レンチウイルスベクターの例には、Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）がＨＩＶ、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に基づき、本発明者らがＨＩＶ／ＳＩＶｐａｃｋ／Ｇと呼ぶレンチウイルスベクターを記載している。このベクター系の病原性の可能性は最小限である。ＨＩＶ／ＳＩＶｐａｃｋ／Ｇの形質導入能力は、不死化ヒトリンパ球、ヒト初代マクロファージ、ヒト骨髄由来ＣＤ３４（＋）細胞、および初代マウスニューロンを用いて実証された。Ｇａｓｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）は、サイトメガロウイルス前初期プロモーターの制御下で、ＨＩＶ−１のｇａｇ、ｐｏｌ、およびｔａｔをコードする発現プラスミドを用いることにより、ＨＩＶ−１に基づくベクターを一過性に作出するためのシステムについて記載している。
【０２６４】
ｅ．その他のウイルスベクター
その他のウイルスベクターを構築物として用いてよい。ウイルス、例えばワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｃｏｕｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、および疱疹ウイルスなどのウイルス由来のベクターを使用することができる。それらは、様々な哺乳類細胞に対していくつかの魅力的な特徴を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９；  Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｃｏｕｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。
【０２６５】
欠損Ｂ型肝炎ウイルスの最新の認識によって、様々なウイルス配列の構造と機能の関係への新たな識見が得られた。インビトロ試験により、ウイルスがそのゲノムの８０％までを欠失しているにもかかわらず、ヘルパー依存性パッケージングおよび逆転写の能力を保持し得ることが示された（Ｈｏｒｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。このことは、ゲノムの大部分が外来遺伝物質と置換され得ることを示唆した。Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、最近、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を、ポリメラーゼ、表面、およびプレ−表面コード配列の代わりに、アヒルＢ型肝炎ウイルスゲノム中に導入した。それを野生型ウイルスとともに鳥類肝細胞腫細胞株にコトランスフェクトさせた。高力価の組換えウイルスを含有する培地を用いて、一次アヒル肝細胞を感染させた。トランスフェクションの後少なくとも２４日間にわたり安定したＣＡＴ遺伝子発現が検出された（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。
【０２６６】
送達される核酸、例えばＺＮＦ１４５発現構築物などは、特異的結合リガンドを発現するために改変された感染性ウイルス中に収めることもできる。従って、ウイルス粒子は、標的細胞の同族受容体に特異的に結合し、細胞に内容物を送達することになる。レトロウイルスベクターの特異的ターゲティングを可能にするために設計された新規アプローチが、ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的付加による、レトロウイルスの化学修飾に基づいて最近開発された。この修飾は、シアロ糖タンパク質受容体を介する肝細胞の特異的感染を可能にし得る。
【０２６７】
組換えレトロウイルスをターゲティングする別のアプローチが設計され、そこではレトロウイルスエンベロープタンパク質および特異的細胞受容体に対するビオチン化抗体が使用された。ストレプトアビジンを用いてビオチン成分を介して抗体を結合させた（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。主要組織適合複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を用いて、彼らはインビトロで、それらの表面抗原を有する多様なヒト細胞の、エコトロピックウイルスによる感染を実証した（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。
【０２６８】
ｆ．非ウイルス的導入
ＤＮＡ構築物、例えば本明細書に記載の発現ベクターなどは、一般に、細胞に送達され、導入される核酸が非感染性である特定の状況では、非ウイルス的な方法を用いて導入されてよい。
【０２６９】
発現構築物を培養哺乳類細胞に導入するための、いくつかの非ウイルス的な方法を用いることができる。これらには、リン酸カルシウム沈澱法（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，１９７３；Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，１９８７；Ｒｉｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｇｏｐａｌ，１９８５）、エレクトロポレーション法（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｐｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）、直接マイクロインジェクション法（Ｈａｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５）、ＤＮＡ封入リポソーム法（Ｎｉｃｏｌａｕ  ａｎｄ  Ｓｅｎｅ，１９８２；Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９）、細胞超音波処理法（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）、高速マイクロプロジェクタイルを用いる遺伝子衝撃法（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、および受容体媒介トランスフェクション法（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８７；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８８）などが挙げられる。
【０２７０】
構築物が細胞内へ送達された後、ＺＮＦ１４５をコードする核酸は様々な部位に配置され発現され得る。この核酸ＺＮＦ１４５は、細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る。この組込みは、相同組換えを介して同じ位置および配向であってもよいし（遺伝子置換）、または無作為な非特異的位置に組み込まれてもよい（遺伝子増大）。核酸は、細胞内で、ＤＮＡの別個のエピソームセグメントとして安定に維持され得る。かかる核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期とは無関係に、またはこれと同調して、維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードしている。どのようにして発現構築物を細胞に送達するか、および細胞内のどこに核酸がとどまるのかは、使用する発現構築物の種類によって決まる。
【０２７１】
一例として、発現構築物はリポソーム中に封入することができる。リポソームは、リン脂質二重膜および内部の水性媒体を特徴とする小胞状の構造である。多重膜リポソームは、水性媒体により隔てられる多重脂質層を有する。リポソームは、リン脂質を過剰の水性溶液中に懸濁した場合に自然に生じる。脂質成分は、閉鎖構造を形成する前に自己再配列を行い、脂質二重層の間に水および溶解溶質を取り込む（Ｇｈｏｓｈ  ａｎｄ  Ｂａｃｈｈａｗａｔ，１９９１）。陽イオン性リポソームへのＤＮＡの添加は、リポソームから光学的に複屈折な液晶凝縮球へのトポロジー転移を引き起こす（Ｒａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。これらのＤＮＡ−脂質複合体は、遺伝子療法における使用のための、可能性のある非ウイルス性ベクターである。
【０２７２】
リポソームにより媒介される核酸送達およびインビトロ外来ＤＮＡの発現は、極めて良好に行われている。β−ラクタマーゼ遺伝子を用いることにより、Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）は、培養ニワトリ胚、ＨｅＬａ、および肝細胞腫細胞において、リポソームにより媒介される送達および外来ＤＮＡ発現の実現可能性を実証した。Ｎｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）は、ラットに静脈内注射後に、良好なリポソーム媒介遺伝子導入を達成している。「リポフェクション」技術に関与する様々な商業的なアプローチもまた含められる。
【０２７３】
リポソームは、赤血球凝集性ウイルス（ＨＶＪ）と複合体化することができる。このことは、細胞膜との融合を容易にし、リポソームカプセル化ＤＮＡの細胞への侵入を促進することが示されている（Ｋａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。リポソームは、核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）とともに複合体化することができるか、または使用することができる（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１両方とともに複合体化することができるか、または使用することができる。かかる発現構築物は、インビトロおよびインビボで核酸の導入および発現に良好に用いられている。
【０２７４】
治療遺伝子をコードする核酸を細胞内に送達するために使用できるその他のベクター送達系としては、受容体媒介性送達ビヒクルが挙げられる。これらは、ほとんど全ての真核細胞において受容体により媒介されるエンドサイトーシスによる、高分子の選択的取り込みをうまく利用している。様々な受容体の細胞種特異的分布により、送達は高度に特異的なものとすることができる（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９９３）。
【０２７５】
受容体により媒介される標的遺伝子組換えビヒクルは一般に、細胞受容体特異的リガンドおよびＤＮＡ結合剤の２つの成分からなる。いくつかのリガンドは、受容体により媒介される遺伝子導入に使用されている。最も広範に特性化されているリガンドは、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８７）、およびトランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）である（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。最近では、ＡＳＯＲと同じ受容体を認識する合成ネオ糖タンパク質が遺伝子送達ビヒクルとして使用され（Ｆｅｒｋｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｐｅｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、上皮成長因子（ＥＧＦ）もまた、扁平上皮癌腫細胞に遺伝子を送達するために使用されている（Ｍｙｅｒｓ，ＥＰＯ  ０２７３  ０８５）。
【０２７６】
送達ビヒクルは、リガンドおよびリポソームを含み得る。例えば、Ｎｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）は、リポソームに組み込まれたガラクトース末端アシアルガングリオシドであるラクトシルセラミドを使用し、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増大を観察している。従って、治療遺伝子をコードする核酸もまた、リポソームの有無にかかわらずいくつもの受容体−リガンドシステムを用いて、細胞種、例えば間葉系幹細胞などに特異的に送達することができる。
【０２７７】
発現構築物は、単純に裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドで構成されてよい。構築物の導入は、物理的または化学的に細胞膜を透過させる、前述のいずれの方法で行ってもよい。このことは、特にインビトロでの導入に適用可能であるが、同様にインビボでの使用にも同様に適用されてよい。Ｄｕｂｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）は、ポリオーマウイルスＤＮＡをＣａＰＯ４沈殿物として成体および新生児マウスの肝臓および脾臓に注入し、活発なウイルス複製および急性感染を実証することに成功した。Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ  ａｎｄ  Ｎｅｓｈｉｆ（１９８６）もまた、ＣａＰＯ４沈殿プラスミドの直接腹腔内注射により、トランスフェクトされた遺伝子の発現が得られることを実証した。ＣＡＭをコードするＤＮＡもまた、同様の方法でインビボにて導入され、ＣＡＭを発現することができると想定される。
【０２７８】
裸のＤＮＡ発現構築物を細胞内に導入するためのもう一つの実施形態は、粒子衝突を伴う場合がある。この方法は、ＤＮＡ被覆マイクロプロジェクタイルを高速に加速し、それらが細胞膜に穴をあけて細胞を死滅させずに細胞の中に侵入することを可能にする能力による（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。小粒子を加速する数種類の装置が開発されている。かかる装置の一つは、電流を発生させ、それが推進力をもたらす高圧放電による（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。使用するマイクロプロジェクタイルは、タングステンまたは金ビーズなどの生物学的不活性物質からなる。
【０２７９】
ＺＮＦ１４５の発現
哺乳類宿主細胞においては、多くのウイルスによる発現系を利用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合には、ＺＮＦ１４５をコードする配列を、後期プロモーターおよび三分節リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に連結することができる。ウイルスゲノムのＥ１またはＥ３という非必須領域への挿入を利用して、感染宿主細胞においてＺＮＦ１４５を発現する能力を有する生存ウイルスを得ることができる（Ｌｏｇａｎ，Ｊ．ａｎｄ  Ｔ．Ｓｈｅｎｋ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３６５５−３６５９）。さらに、転写エンハンサー、例えばラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどを用いて、哺乳類宿主細胞における発現を増大させることができる。
【０２８０】
従って、例えば、ＺＮＦ１４５タンパク質は、ヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞または接着性ｄｈｆｒＣＨＯ細胞のいずれかにおいて発現させてよい。受容体発現を最大にするために、ｐＣＤＮまたはｐＣＤＮＡ３ベクターへの挿入に先立って、一般に全ての５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を受容体ｃＤＮＡから除去する。細胞に、リポフェクチンにより個々の受容体ｃＤＮＡをトランスフェクトし、４００ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で選択する。選択の３週間後、個々のクローンを選択し、さらなる分析のために拡大培養する。ベクター単独でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞を、陰性対照とする。個々の受容体を安定に発現する細胞株を単離するために、一般に約２４のクローンを選択し、ノーザンブロット解析により解析する。受容体ｍＲＮＡは、一般に解析されたＧ４１８−耐性クローンの約５０％において検出可能である。
【０２８１】
もう一つの例として、ＺＮＦ１４５は、細胞、例えば間葉系幹細胞などに、レンチウイルスベクター系により導入することができる。従って、ＺＮＦ１４５配列は、例えば適した供給源、例えば骨形成下のＭＳＣのｃＤＮＡなどから得ることができ、ｐＥｎｔｒｙ３Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの適したベクターにクローニングすることができる。ＺＮＦ１４５過剰発現のためのレンチウイルスベクター（すなわちレンチウイルスＺＮＦ１４５発現ベクター）は、組換え、例えば、このベクターとｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の間のＬＲ組換えを介して作出することができる。レンチウイルスは、レンチウイルスＺＮＦ１４５発現ベクターを適したパッケージングミックスとともに（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）適した宿主細胞、例えば、２９３ＦＴ細胞中にコトランスフェクトすることにより作製することができる。レンチウイルス発現ベクターを含むウイルス上清は、選択された宿主細胞、例えば間葉系幹細胞などを感染させるために使用される。感染細胞は、例えば、５μｇ／ｍｌブラストサイジンを７日間用いて選択する。
【０２８２】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）もまた、プラスミドに含め、発現させ得るよりも大きいＤＮＡ断片を送達するために使用することができる。約６ｋｂから１０ＭｂのＨＡＣを構築し、治療目的のための従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオン性アミノポリマー、または小胞）を介して送達する。
【０２８３】
また、特定の開始シグナルを使用して、ＺＮＦ１４５をコードする配列のより効率的な翻訳を実現することができる。かかるシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列が含まれる。ＺＮＦ１４５およびその開始コドンをコードする配列、ならびに上流配列を適切な発現ベクター中に挿入する場合に、さらなる転写または翻訳調節シグナルが必要でない可能性がある。しかし、コード配列のみ、またはその断片のみを挿入する場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外来の翻訳調節シグナルを用意する必要がある。さらに、該開始コドンを正しいリーディングフレームに入れて、挿入部分全体が確実に翻訳されるようにしなければならない。外来の翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然起源のものも、合成されたものも、様々な起源のものであってよい。発現の効率は、使用する特定の細胞系に適切なエンハンサー、例えば文献に記載されているものなどを含めることにより、強化することができる（Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５−１６２）。
【０２８４】
さらに、宿主細胞株は、挿入配列の発現を調節する能力、または所望の様式で発現タンパク質をプロセシングする能力に関して選択することができる。かかるポリペプチドの修飾としては、限定されるものではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が挙げられる。「プレプロ」型のタンパク質を切断する翻訳後プロセシングを用いて、正確な挿入、折り畳み、および／または機能を促進することも可能である。翻訳後の活性について特定の細胞機構および特徴的なメカニズムを有する様々な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷＩ３８）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）から入手することができ、外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを保証するために選択することができる。
【０２８５】
長期間、高収率で組換えタンパク質を作出するために、安定な発現を利用することができる。例えば、ＺＮＦ１４５を安定して発現する能力を有する細胞株を、ウイルス起源の複製および／または内因性発現エレメントおよび選択可能マーカー遺伝子を同一または別のベクター上に含むことができる発現ベクターを用いて形質転換することができる。ベクターの導入に続いて、強化培地中で約１〜２日間、細胞を増殖させてから、選択培地と交換する。選択可能マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、それが存在すると、導入配列の発現に成功した細胞の増殖および回収が可能になる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞種に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。
【０２８６】
形質転換された細胞株を回収するためにいくつの選択系を用いてもよい。これらには、限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｃｅｌｌ  １１：２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙ，Ｉ  ．ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２２：８１７−２３）が含まれ、それぞれｔｋ−細胞またはａｐｒ−細胞において用いることができる。また、代謝拮抗物質、抗生物質、または除草剤耐性を選択のための基礎として使用することもできる。例えば、ｄｈｆｒはメトトレキサートに対する耐性を付与し（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：３５６７−７０）；ｎｐｔはアミノグリコシド系ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与し（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４）；ａｌｓまたはｐａｔはそれぞれ、クロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する（Ｍｕｒｒｙ，ｓｕｐｒａ）。さらなる選択可能遺伝子、例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするｔｒｐＢ、または細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにするｈｉｓＤなどが記載されている（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ．ａｎｄ  Ｒ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８０４７−５１）。最近、アントシアニン、β−グルクロニダーゼとその基質ＧＵＳ、およびルシフェラーゼとその基質ルシフェリンなどのマーカーによって、可視的なマーカーの使用が人気を博している。これらのマーカーは、形質転換細胞を同定するためだけでなく、特定のベクター系に帰せられる一過的または安定的なタンパク質発現の量を定量するためにも使用することもできる（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：１２１−１３１）。
【０２８７】
マーカー遺伝子発現の存在／不在は、目的の遺伝子もまた存在することを示唆するが、遺伝子の存在および発現を確認する必要があり得る。例えば、ＺＮＦ１４５をコードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、ＺＮＦ１４５をコードする配列を含む形質転換細胞は、マーカー遺伝子機能の不在によって同定することができる。あるいは、マーカー遺伝子は単一プロモーターの制御下でＺＮＦ１４５をコードする配列とともにタンデムに配置することができる。誘導または選択に反応したマーカー遺伝子の発現は、通常、タンデムな遺伝子の発現も同様に示す。
【０２８８】
あるいは、ＺＮＦ１４５をコードする核酸配列を含み、ＺＮＦ１４５を発現する宿主細胞は、当業者に公知の多様な方法により同定することができる。これらの方法には、限定されるものではないが、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術が含まれ、核酸またはタンパク質配列の検出および／または定量化のための膜、溶液、またはチップに基づく技術が含まれる。
【０２８９】
ＺＮＦ１４５をコードするポリヌクレオチド配列の存在は、ＺＮＦ１４５をコードするプローブもしくは断片もしくはポリヌクレオチド断片を用いる、ＤＮＡ−ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅により検出することができる。核酸増幅に基づくアッセイには、ＺＮＦ１４５をコードする配列に基づくオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用が含まれ、ＺＮＦ１４５をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む形質転換細胞を検出する。
【０２９０】
タンパク質に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを用いてＺＮＦ１４５の発現を検出および測定するための多様なプロトコールが、当分野で公知である。かかる技法の例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）が挙げられる。ＺＮＦ１４５上の２つの非干渉性エピトープに反応性のモノクローナル抗体を利用する、二部位モノクローナルベースイムノアッセイを使用することができるが、競合結合アッセイも用いることができる。これらおよび他のアッセイは、当分野で、例えば、Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＳｅｃｔｉｏｎＩＶ，ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ  Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎ．）およびＭａｄｄｏｘ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９８３；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１−１２１６）に詳細に記載されている。
【０２９１】
幅広い種類の標識および接合技術は、当業者に公知であり、様々な核酸およびアミノ酸アッセイにおいて使用されてよい。ＺＮＦ１４５をコードするポリヌクレオチドに関連する配列の検出のための、標識ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを作出する手段としては、オリゴラベリング、ニックトランスレーション、エンドラベリングまたは標識ヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、ｍＲＮＡプローブ作出のために、ＺＮＦ１４５をコードする配列、またはその任意の断片が、ベクター内にクローニングされてよい。かかるベクターは当分野で公知であり、市販されているものであり、そしてＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６などの適切なＲＮＡポリメラーゼ、および標識ヌクレオチドを付加することによって、ＲＮＡプローブをインビトロで合成するために使用することができる。これらの手法は、多様な市販のキット、例えばＰｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ（Ｋａｌａｍａｚｏｏ，Ｍｉｃｈ．）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、およびＵ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）などにより供給されるものを使用して実施され得る。検出を容易にするために使用することのできる、適したレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または色素形成剤ならびに基質、補因子、阻害剤、磁性粒子などが挙げられる。
【０２９２】
ＺＮＦ１４５をコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培養からタンパク質を発現および回収するために適した条件下で培養されてよい。形質転換細胞により産生されたタンパク質は、使用された配列および／またはベクターによって細胞膜に局在し、細胞内に分泌され、または含まれ得る。当業者により理解されるように、ＺＮＦ１４５をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を介して、ＺＮＦ１４５の分泌を指示するシグナル配列を含むように設計することができる。他の構築物を使用して、ＺＮＦ１４５をコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合させてよい。かかる精製促進ドメインとしては、限定されるものではないが、金属キレート化ペプチド、例えば固定化された金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールなど、固定化された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製系（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）において利用されるドメインが挙げられる。精製ドメインとＺＮＦ１４５コード配列との間に切断可能なリンカー配列、例えば第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼに特異的な配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を含めることにより、精製を促進させることができる。かかる発現ベクターの一つは、ＺＮＦ１４５と、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位に先行する６つのヒスチジン残基をコードする核酸とを含む融合タンパク質の発現をもたらす。ヒスチジン残基は、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＩＡＣ；Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３−２８１に記載）上での精製を促進する一方で、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質からＺＮＦ１４５を精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターの考察は、Ｋｒｏｌｌ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３；ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：４４１−４５３）に記載されている。
【０２９３】
ＺＮＦ１４５断片、ならびに全長ポリペプチドは、組換え体の作出によるだけでなく、固相技術を使用する直接ペプチド合成によっても作出することができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｊ．（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）。タンパク質合成は、手動技術または自動化によって実施されてよい。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して達成されてよい。ＺＮＦ１４５の種々の断片は、別々に合成されて、次に組み合わせて全長分子を作出することができる。
【０２９４】
その他の発現方法もまた公知であり、例えば、「遺伝子活性化」として知られる方法を利用して、ＺＮＦ１４５の活性または発現を調節することができる。この方法は米国特許第５，６４１，６７０号に詳細に記述され、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。本質的に、遺伝子活性化法は、細胞における目的の内因性遺伝子の調節または活性が、相同組換えによって予め選択された部位で、（ａ）ターゲティング配列；（ｂ）調節配列；（ｃ）エキソンおよび（ｄ）対になっていないスプライスドナー部位：を含む、適したＤＮＡ構築物を細胞ゲノムへ挿入することにより変えることができるという認識に基づき、該ターゲティング配列は、エレメント（ｂ）〜（ｄ）が内因性遺伝子に作動可能に連結されるようにエレメント（ａ）〜（ｄ）の組込みを命令する。ＤＮＡ構築体は、あるいは（ａ）ターゲティング配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライスドナー部位、（ｅ）イントロン、および（ｆ）スプライスアクセプター部位を含んでよく、該ターゲティング配列は（ｂ）〜（ｆ）のエレメントが内因性遺伝子の第１エキソンに作動可能に連結されるようにエレメント（ａ）〜（ｆ）の組込みを命令する。
【０２９５】
使用されるターゲティング配列は、ＤＮＡが挿入されることになる部位に関連して選択される。両方の配置において、ターゲティング事象はＤＮＡ構築物および内因性細胞遺伝子をターゲティングすることによって導入される配列の融合産物である新たな転写単位を作出するために使用される。例えば、新たな転写単位の形成は、記載されるＤＮＡ構築物を宿主細胞のゲノムの中に導入することによって、転写的にサイレントな遺伝子（トランスフェクション前には細胞内で発現されない遺伝子）を宿主細胞で活性化させる。得られるように細胞で発現されるＺＮＦ１４５などの内因性遺伝子の発現は、それが増加する、減少する（排除されることを含む）、または調節もしくは誘導のパターンが遺伝子活性化法の使用によって変えられるという点で変更することができる。
【０２９６】
ＺＮＦ１４５アゴニスト
ＺＮＦ１４５モジュレーター、アゴニストおよびアンタゴニストの同定
アゴニスト、特に、小分子は、軟骨形成促進剤としての使用のためのＺＮＦ１４５の活性または発現を特異的に増強するために使用してよい。
【０２９７】
そのために、発明者らは、小分子であってよいＺＮＦ１４５アゴニスト、ならびにこれらのスクリーニングのためのアッセイを開示する。ＺＮＦ１４５のアゴニストは、結合の調節、例えばアップレギュレートなど、または他のＺＮＦ１４５活性の検出によりスクリーニングすることができる。そのために、発明者らは、ＺＮＦ１４５ポリペプチドの発現、量または活性をアップレギュレートする能力のある化合物を提供する。かかる化合物は、軟骨形成の促進、軟骨、骨または靭帯の修復、再生、変性疾患の治療などのために、本明細書に記載の方法および組成物で使用されてよい。
【０２９８】
そのために、ＺＮＦ１４５を用いて、例えば、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリー、および天然物の混合物における小分子基質とリガンドの結合を評価することができる。これらの基質およびリガンドは、天然の基質およびリガンド、または構造的もしくは機能的ミメティクスであってよい。Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １（２）：Ｃｈａｐｔｅｒ  ５（１９９１）を参照されたい。さらに、スクリーニングを行って、特に軟骨形成前駆体幹細胞、例えば間葉系幹細胞などにおいてＺＮＦ１４５の発現に影響を及ぼす因子を同定することができる。
【０２９９】
一般に、アゴニストのアッセイは、１以上のＺＮＦ１４５の活性への候補分子の影響を測定することによる。アッセイは、候補分子の存在下、および所望により候補分子の不在下、あるいはＺＮＦ１４５活性を抑制するかまたは活性化させることが公知の分子の存在下で、ＺＮＦ１４５活性をアッセイすることを伴い得る。
【０３００】
本発明者らは、ＺＮＦ１４５の発現が軟骨形成間葉系幹細胞において増大していることを実証した；したがってＺＮＦ１４５発現の制御を、軟骨形成促進のために用いることができる。そのために、ＺＮＦ１４５の発現および／または活性を刺激する、またはこのタンパク質の機能を抑制することのできる化合物および薬物の発見が望まれる。一般に、アゴニストおよびアンタゴニストは、任意の公知の変性疾患の治療および予防目的に利用される。
【０３０１】
発明者らは、「アップレギュレート」には、研究中の作用に対する任意のプラス効果を含める；これは、全体的なものでも、部分的なものでもよい。従って、結合が検出される場合には、候補アゴニストは２つの実体間の結合を強化、促進、増強する能力を有する。候補分子により達成される結合のアップレギュレート（またはその他の活性）は、候補分子の不在下での結合（またはいずれかの活性）と比較して、少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％あるいはそれ以上であり得る。従って、アゴニストとしての使用が適している候補分子は、結合または他の活性を１０％以上増大させる能力を有するものである。
【０３０２】
用語「化合物」は、（天然に存在するまたは合成された）化学物質、例えば生体高分子（例えば、核酸、タンパク質、非ペプチド、または有機分子）、または生物学的材料、例えば細菌、植物、真菌など、または動物（特に哺乳類）細胞もしくは組織などから作られる抽出物、またはさらに無機製剤もしくは分子をさす。該化合物は、抗体であり得る。
【０３０３】
ＺＮＦ１４５の可能性のあるアンタゴニストの例には、小分子、プリンおよびプリン類似体を含むヌクレオチドおよびそれらの類似体、例えば結合パートナーの断片などＺＮＦ１４５の結合パートナーと密接に関連しているオリゴヌクレオチドまたはタンパク質、またはＺＮＦ１４５に結合するが反応は引き起こさず、その結果ポリペプチドの活性が抑制される小分子などが含まれる。
【０３０４】
スクリーニングキット
行われるかかるスクリーニングに必要な材料は、スクリーニングキット中にパッケージングすることができる。
【０３０５】
かかるスクリーニングキットは、ＺＮＦ１４５ポリペプチドまたはＺＮＦ１４５の産生を減少させる、または増強する化合物に対するアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素等を同定するために有用である。スクリーニングキットには：（ａ）ＺＮＦ１４５ポリペプチド；（ｂ）ＺＮＦ１４５ポリペプチドを発現する組換え細胞；または（ｃ）ＺＮＦ１４５ポリペプチドに対する抗体が含まれてよい。
【０３０６】
ＺＮＦ１４５に対する抗体は当分野で公知であり、市販もされているものであり、例えばＡｎｏｇｅｎ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）社製のウサギ抗ヒトＰＭＬポリクローナル抗体−ａ（カタログ番号  ＡＩ７０００２Ａ）、およびウサギ抗ヒトＰＭＬポリクローナル抗体−ｂ（ＡＩ７０００２Ｂ）がある。
【０３０７】
スクリーニングキットは、ライブラリーを含んでよい。スクリーニングキットには、下に記載される、スクリーニングに必要な任意の１以上の成分が含まれてよい。スクリーニングキットには、所望により使用説明書が含まれてよい。
【０３０８】
ＺＮＦ１４５発現を核酸レベルで検出することができるスクリーニングキットもまた、提供され得る。かかるキットは、ＺＮＦ１４５増幅のためのプライマー、または増幅のための一対のプライマーを含んでよい。該プライマーまたはプライマー対は、任意の好適な配列、例えばＺＮＦ１４５配列の一部から選択されてよい。プライマー配列を同定する方法は当分野で周知であり、当業者ならば、かかるプライマーを容易に設計することができる。キットには、本明細書に記載されるようにＺＮＦ１４５発現のための核酸プローブが含まれてよい。該キットにはまた、所望により使用説明書が含まれてよい。
【０３０９】
合理的設計
ＺＮＦ１４５と相互作用する能力のある可能性の高い候補化合物の合理的設計は、ＺＮＦ１４５ポリペプチドの分子形状の構造研究に基づくものであり得る。特定の他のタンパク質とどの部位が相互作用するかを決定する一つの手段は、物理的構造の決定、例えば、Ｘ線結晶学または二次元ＮＭＲ技術である。これらは、どのアミノ酸残基が分子接触領域を形成するかに関するガイダンスを提供する。タンパク質構造決定の詳細な記述は、例えば、Ｂｌｕｎｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９７６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【０３１０】
ポリペプチド結合アッセイ
ＺＮＦ１４５活性または発現のモジュレーターおよびアンタゴニストは、当分野で公知の任意の方法で同定してよい。
【０３１１】
それらの最も簡単な形態において、アッセイは、単に、候補化合物を、ＺＮＦ１４５ポリペプチドを含有する溶液と混合して混合物を作り、混合物中のＺＮＦ１４５ポリペプチド活性を測定し、混合物の活性を標準と比較するステップから構成され得る。
【０３１２】
さらに、分子は、ＺＮＦ１４５と推定される分子との間の結合を検出するアッセイにおいて、それらのＺＮＦ１４５との結合によって同定されてよい。
【０３１３】
本明細書に記載のＺＮＦ１４５ポリペプチドに結合する物質を同定するためのアッセイの一つの種類は、固相支持体上に固定化されたＺＮＦ１４５ポリペプチドと、非固定化候補分子とを接触させることを含み、目的のＺＮＦ１４５ポリペプチドと候補物質が相互に結合するかどうか、かつ／またはどの程度結合するかを測定する。あるいは、候補物質を固定化し、本明細書に示されるようにＺＮＦ１４５ポリペプチドを非固定化してもよい。
【０３１４】
物質とＺＮＦ１４５ポリペプチドとの結合は、一過性、可逆性、または持続性のものであってよい。物質は、対照ポリペプチド（例えば、軟骨形成には関与しないことが公知のポリペプチド）との結合のＫｄ値よりも低いＫｄ値で、ポリペプチドに結合してよい。物質のＫｄ値は、対照ポリペプチドとの結合のＫｄ値の２分の１、例えば対照ポリペプチドとの結合のＫｄ値の１００分の１、または１０００分の１であってよい。
【０３１５】
実施例のアッセイ法では、ＺＮＦ１４５ポリペプチドをアガロースビーズなどのビーズ上に固定化することができる。一般に、これはＺＮＦ１４５ポリペプチドをＧＳＴ融合タンパク質として細菌、酵母、または高等真核細胞株中で発現させ、グルタチオン−アガロースビーズを用いて粗細胞抽出物からＧＳＴ−ＺＮＦ１４５融合タンパク質を精製することにより実現することができる（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８；Ｇｅｎｅ  ６７（１０）：３１−４０）。対照として、ＧＳＴ融合タンパク質ではない候補物質と固定化ポリペプチドとの結合を、ＺＮＦ１４５ポリペプチドの不在下で測定してよい。次に、候補物質と固定化ＺＮＦ１４５ポリペプチドとの結合を測定してよい。この種類のアッセイは、当分野でＧＳＴ−プルダウンアッセイとして公知である。この場合もやはり、候補物質を固定化し、ＺＮＦ１４５ポリペプチドを非固定化してもよい。
【０３１６】
この種類のアッセイは、成分のうちの一つ、例えば、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースおよびヒスチジン標識成分を固定化するために様々なアフィニティー精製系を用いて行うことも可能である。
【０３１７】
ポリペプチドと候補物質との結合は、当分野で周知の多様な方法により測定することができる。例えば、非固定化成分を（例えば、放射性標識、エピトープタグまたは酵素−抗体コンジュゲートを用いて）標識してよい。あるいは、免疫学的検出法により結合を測定してもよい。例えば、反応混合物をウエスタンブロットし、非固定化成分を検出する抗体を用いてブロットを探索することもできる。ＥＬＩＳＡ法を使用してもよい。
【０３１８】
候補物質は一般に、１〜１０００ｎｍｏｌ／ｍｌ、例えば１〜１００ｎｍｏｌ／ｍｌの終濃度で加える。抗体の場合は、用いる終濃度は一般に、１００〜５００μｇ／ｍｌ、例えば２００〜３００μ／ｍｌである。
【０３１９】
ＺＮＦ１４５のモジュレーターおよびアンタゴニストもまた、ＺＮＦ１４５とこのポリペプチドが結合する任意の分子との結合の調節、またはかかる結合もしくは放出の結果として起こるあらゆる活性の調節を検出することにより同定することができる。
【０３２０】
細胞系アッセイ
細胞系アッセイは、単に候補化合物の結合のみを試験してよく、ＺＮＦ１４５ポリペプチドを有する細胞との付着が、候補化合物と直接的または間接的に会合した標識を用いて、または標識競合物質との競合を伴うアッセイにおいて、検出される。
【０３２１】
さらに、これらのアッセイは、候補化合物がＺＮＦ１４５ポリペプチドとの結合により生じるシグナルをもたらすかどうかを、その表面にポリペプチドを有する細胞に適した検出系を用いて試験することができる。活性化の阻害剤は、一般に既知のアゴニストの存在下でアッセイされ、候補化合物の存在によるアゴニストによる活性化に及ぼす影響を観察される。
【０３２２】
化合物をスクリーニングするもう一つの方法は、化合物のライブラリーを発現する組換えＤＮＡ分子により安定に形質転換された真核生物または原核生物の宿主細胞を利用する。かかる細胞は、生存または固定状態いずれにおいても、標準的な結合パートナーアッセイに使用することができる。細胞応答を検出するための高感度法を記載しているＰａｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：２４３−２４７；およびＯｗｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７；４００７−４０１１も参照されたい。
【０３２３】
競合アッセイは特に有用であり、化合物ライブラリーを発現する細胞を、ＺＮＦ１４５ポリペプチドと結合することが知られている標識抗体、例えば１２５Ｉ−抗体など、および試験サンプル、例えば結合組成物に対する結合親和性が測定される候補化合物とともに、接触させるかまたはインキュベートする。次に、結合または遊離しているＺＮＦ１４５ポリペプチドの標識結合パートナーを分離して結合の程度を評価する。結合した試験サンプルの量は、ＺＮＦ１４５ポリペプチドに結合する標識抗体の量に反比例する。
【０３２４】
多数の技法のうちのいずれか一つを用いて、遊離結合パートナーから結合を分離して、結合の程度を評価することができる。この分離ステップは、一般に、例えば、フィルターへの付着後の洗浄、プラスチックへの付着後の洗浄、または細胞膜の遠心分離などの手順を伴い得る。
【０３２５】
該アッセイは、細胞、例えば軟骨形成前駆体幹細胞、例えば間葉系幹細胞に候補分子を曝露し、ＺＮＦ１４５の発現を任意の好適な手段でアッセイすることを伴い得る。かかるアッセイにおいてＺＮＦ１４５の発現をアップレギュレートする分子を、所望によりさらなる研究のために選択し、ＺＮＦ１４５発現をアップレギュレートするための薬剤として使用してよい。かかる薬剤は、変性疾患の治療もしくは予防、または軟骨、骨もしくは靭帯等の修復もしくは再生を促進するために、有効に利用され得る。
【０３２６】
ＺＮＦ１４５タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび該タンパク質に対する抗体もまた、細胞におけるＺＮＦ１４５  ｍＲＮＡおよびタンパク質の産生への付加化合物の影響を検出するためのアッセイを構成するために使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡは、ＺＮＦ１４５ポリペプチドの分泌レベルまたは細胞会合レベルを測定するために、当分野で公知の標準的な方法によりモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いて構成することができ、これは適切に操作された細胞または組織からのＺＮＦ１４５タンパク質の産生を阻害または増強する薬剤（それぞれアンタゴニストまたはアゴニストとも呼ばれる）を発見するために使用され得る。スクリーニングアッセイを実施するための標準法は、当分野で十分理解されている。
【０３２７】
活性アッセイ
モジュレーターまたはアンタゴニストを検出するためのアッセイは一般に、候補分子の存在下で、所望により候補分子の不在下での活性の調節の検出とともに、ＺＮＦ１４５の任意の活性の調節を検出することを伴う。
【０３２８】
検出され得る活性は、任意のＺＮＦ１４５依存性活性、例えば結合活性が含まれ得る。ＺＮＦ１４５は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）と結合することが既知であり（Ｗｅｉｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００６  Ｄｅｃ  １１；５８０（２８−２９）：６６４９−５４）、ＺＮＦ１４５のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）に対する結合活性は、当分野で公知の手段、例えば、ＧＳＴ−プルダウンアッセイによりアッセイされてよい。ＺＮＦ１４５およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）のうちの一方は固定化され、他方を放射性標識されてよい。次に、ＺＮＦ１４５とＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）との結合を、ＺＮＦ１４５のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）への曝露で捕捉された放射能をアッセイすることにより検出することができる。
【０３２９】
ＺＮＦ１４５の特異的な生物活性を検出するアッセイも使用することができる。該アッセイは、一般に、候補分子（例えば、ライブラリーの形態）を、ポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸、または細胞、オルガネラ、抽出物、もしくはそのようなものを含む他の材料のいずれかの形態のＺＮＦ１４５と、候補モジュレーターとともに接触させることを含む。候補モジュレーターの存在が何らかの影響を及ぼすかどうかを証明するために、ＺＮＦ１４５の関連活性（下に記載）を検出してもよい。
【０３３０】
その任意の１以上の活性がＺＮＦ１３４活性のアッセイに使用されてよい、ＺＮＦ１４５の既知の活性には、ＤＮＡ結合、金属イオン結合、タンパク質ホモ二量体化活性、特異的な転写リプレッサー活性および亜鉛イオン結合が含まれる。これらの活性のそれぞれのアッセイは、当分野で周知である。ＺＮＦ１４５が関与するプロセスとしては、アポトーシス、中枢神経系発生、中腎発生、骨髄細胞分化の負の制御、転写の負の制御、ＤＮＡ−依存性、転写およびユビキチンサイクルが挙げられる。これらのプロセスをアッセイする方法もまた、当分野で公知である。
【０３３１】
上記のアッセイは、ＺＮＦ１４５活性の調節、および従ってＺＮＦ１４５の候補モジュレーターおよび／またはアンタゴニストの同定を検出するために、候補モジュレーターおよび検出された適切な活性の存在下または不在下で行われてよい。
【０３３２】
ＺＮＦ１４５に結合する、および／またはＺＮＦ１４５の転写または発現に影響を及ぼす候補モジュレーターを検出するためのプロモーター結合アッセイを使用することもできる。次に、候補モジュレーターをさらなる実験のために選択するか、使用のために単離してもよい。かかるスクリーニング手順の詳細は当分野で周知であり、例えばＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ  Ｓｅｅｔｈａｌａ，Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ  Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ（２００１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＩＳＢＮ  ０−８２４７−０５６２−９）に記載されている。
【０３３３】
本明細書に記載のスクリーニング方法は、インビトロでの使用のために構成されているが、インビボアッセイを用いてもよい。インビボアッセイは、一般に、ＺＮＦ１４５を含む細胞を候補分子に曝露させることを伴う。インビトロアッセイでは、所望により他の成分、例えば粗細胞抽出物または半精製細胞抽出物または精製タンパク質の存在下で、ＺＮＦ１４５を候補分子に曝露させる。インビトロアッセイを行う場合は、これらには候補分子のアレイを用いることができる（例えば、アレイライブラリー）。インビボアッセイを用いてもよい。そのために、ＺＮＦ１４５ポリペプチドは細胞中に、例えば異種性に含まれてよい。そのような細胞は、トランスジェニック細胞であってよく、前述のようにＺＮＦ１４５を発現するように改変されている。
【０３３４】
抽出物を用いる場合は、細胞質抽出物または核抽出物を含んでよく、その調製方法は当分野で周知である。
【０３３５】
ＺＮＦ１４５を含む細胞の任意の成分、例えばオルガネラを用いてよいことは当然理解される。一実施形態は、例えば、記載されるＺＮＦ１４５を含む細胞核を含む、細胞質もしくは核調製物を用いる。核調製物は１以上の核を含んでよく、それは、例えば界面活性剤処理により透過化または半透過化されてよい。
【０３３６】
従って、特定の実施形態では、アッセイフォーマットには次が含まれ得る：マルチウェルマイクロタイタープレートを、各々のウェルにＺＮＦ１４５ポリペプチドを発現する１以上の細胞を含めるように配置する；個々の候補分子、または例えばライブラリーに由来する候補分子のプールを、個々のウェルに加え、ＺＮＦ１４５活性の調節を測定する。プールを使用する場合は、これらをさらなるプールに再分割し、同様に試験することができる。次に、本明細書の他所に記載のＺＮＦ１４５活性、例えば結合活性または転写同時活性化活性をアッセイしてよい。
【０３３７】
あるいは、または前述のアッセイ方法に加えて、ＺＮＦ１４５のモジュレーターまたはアンタゴニストを同定するために「サブトラクション法」もまた使用することができる。そのような「サブトラクション法」においては、複数の分子が提供され、それらにはモジュレーターとして機能する能力を有する１以上の候補分子（例えば、細胞抽出物、核抽出物、分子ライブラリー等）が含まれ、かつ複数の分子から１以上の成分が除去、欠失または差し引かれる。次に、「サブトラクトされた」抽出物などを、記載されるように、ＺＮＦ１４５（またはその成分）を含む細胞への曝露により、活性についてアッセイする。
【０３３８】
従って、例えば、「免疫枯渇」アッセイを実施して次のようなモジュレーターを同定することができる。細胞質または核抽出物は、多能性細胞、例えば、多能性ＥＧ／ＥＳ細胞から調製されてよい。抽出物を、例えば適当な抗体を用いる免疫枯渇の使用により、枯渇させるかまたは分画して、推定モジュレーターを除去してよい。抽出物のモジュレーターが枯渇した場合、抽出物はＺＮＦ１４５の機能または活性または発現に影響を及ぼす能力を失うことになる。一連のサブトラクションおよび／または枯渇は、モジュレーターまたはアンタゴニストを同定するために必要とされ得る。
【０３３９】
当然のことながら、該「枯渇」または「サブトラクション」アッセイは、さらなるスクリーニングのための推定モジュレーター因子同定の予備段階として使用し得る。さらに、またはあるいは、「枯渇」または「サブトラクション」アッセイを用いて、その他の手段（例えば、本明細書の他所に記載の「陽性」スクリーニング）により、推定モジュレーターとして同定された分子のモジュレーター活性を確認することができる。
【０３４０】
アッセイに供され、目的の分子であることが分かった候補分子は、単離され、さらに検討され得る。目的の分子の単離方法は、使用する分子の種類、それがライブラリーの形態であるかどうか、一度にいくつの候補分子が試験されるのか、その後にバッチ手順が行われるかどうか等によって決まることになる。
【０３４１】
候補分子は、ライブラリーの形態で提供されてよい。一実施形態では、２以上の候補分子を同時にスクリーニングすることができる。候補分子のライブラリー、例えば、小分子ライブラリー、ポリペプチドライブラリー、核酸ライブラリー、化合物ライブラリー（例えばコンビナトリアルライブラリーなど）、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡなどのアンチセンス分子ライブラリー、抗体ライブラリー等が、当分野で公知の方法により作製されてよい。かかるライブラリーは、ハイスループットスクリーニングに適している。ＺＮＦ１４５を含む様々な細胞を、個々のライブラリーメンバーに曝露させ、ＺＮＦ１４５活性に及ぼす影響を測定することができる。この目的にアレイ技術を用いてよい。細胞は、空間的に、例えばマイクロタイタープレートのウェル中で、分離されてよい。
【０３４２】
一実施形態では、小分子ライブラリーが用いられる。「小分子」により、本発明者らは分子量が約５０ｋＤａより小さい可能性がある分子をさす。特定の実施形態では、小分子は約３０ｋＤａ未満、例えば約１５ｋＤａ未満、または１０ｋＤａ未満またはそれくらいの分子量であり得る。かかる小分子のライブラリーは、本明細書において「小分子ライブラリー」と呼ばれ、ポリペプチド、小ペプチド、例えば、２０アミノ酸以下のペプチド、例えば、１５、１０または５アミノ酸、単純化合物等を含んでよい。
【０３４３】
あるいは、またはさらに、下にさらに詳細に記載されるコンビナトリアルライブラリーを、ＺＮＦ１４５のモジュレーターまたはアンタゴニストについてスクリーニングすることができる。ＺＮＦ１４５活性のためのアッセイは上に記載されている。
【０３４４】
ライブラリー
候補分子のライブラリー、例えばポリペプチドまたは核酸のライブラリーなどは、本明細書に記載のＺＮＦ１４５アンタゴニストおよび阻害剤のスクリーニングにおいて用いることができる。かかるライブラリーを、ＺＮＦ１４５タンパク質に曝露させ、タンパク質の活性へのそれらの影響を、存在する場合には測定する。
【０３４５】
大規模なライブラリーの所望のメンバーを単離するための選択プロトコールは、当分野で公知であり、典型的な例としてはファージディスプレイ法がある。かかる系では、線状バクテリオファージの表面に様々なペプチド配列が提示されるが（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９０）ｓｕｐｒａ）、標的抗原に結合する特異的抗体フラグメントのインビトロ選択および増幅のための、抗体フラグメント（およびそれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーを作出するために、かかる系が有用であることが実証されている。ＶＨおよびＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、それらを大腸菌の細胞膜周辺腔へ指向させるリーダーシグナルをコードする遺伝子断片に連結され、結果として得られる抗体フラグメントは、一般にバクテリオファージコートタンパク質との融合体としてバクテリオファージの表面に提示される（例えば、ｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩ）。あるいは、抗体フラグメントはλファージキャプシド（ファージボディー）の外部に提示される。ファージに基づくディスプレイ系の利点は、それらが生物系であるため、選択されたライブラリーメンバーを含有するファージを単純に細菌細胞中で増殖させることによって、選択されたライブラリーメンバーを増幅できる点にある。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列がファージまたはファージミドベクター上に含有されているため、配列決定、発現、および後続する遺伝操作が比較的簡単である。
【０３４６】
バクテリオファージ抗体提示ライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーの構築のための方法は、当分野で周知である（引用することにより本明細書の一部をなすものとする、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ｓｕｐｒａ；Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：４３６３；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：１０１３４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：４１３３；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：３６１０；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅ，１０４：１４７；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ｓｕｐｒａ；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ｓｕｐｒａ；Ｈａｗｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：８６７；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１６００７；Ｌｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１３１３）。かかる技法は、一般にポリペプチドライブラリーの発現のために必要ならば改変されてよい。
【０３４７】
一つの特に有利なアプローチは、ｓｃＦｖファージ−ライブラリーの使用である（Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−６，Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：５８７９−５８８３；Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：１０６６−１０７０；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ｓｕｐｒａ；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ｓｕｐｒａ；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ｓｕｐｒａ；Ｃｈｉｓｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１０：８０；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ｓｕｐｒａ）。バクテリオファージコートタンパク質上に提示されたｓｃＦｖライブラリーの様々な実施形態が記載されている。ファージ提示アプローチの改良も公知であり、例えば、ＷＯ９６／０６２１３号およびＷＯ９２／０１０４７号（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｅｔ  ａｌ．）およびＷＯ９７／０８３２０号（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ，ｓｕｐｒａ）に記載され、これらは引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０３４８】
別のライブラリー選択技術には、バクテリオファージλ発現系が含まれ、これはバクテリオファージプラークとして、または溶原菌コロニーとして直接的にスクリーニングされてもよく、両方とも既に記載される通りであり（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５；Ｃａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７；Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：８０９５；Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：２４３２）、本明細書に記載の方法および組成物に有用である。これらの発現系は、ほぼ約１０６またはそれ以上のライブラリーの多数の様々なメンバーをスクリーニングするために用いることができる。その他のスクリーニング系は、例えば、ライブラリーメンバーの直接的な化学合成による。初期の一方法は、例えばＷＯ８４／０３５６４号に記載されるように、１セットのピンまたはロッド上でのペプチド合成を行うものを含む。各々のビーズが個々のライブラリーメンバーであるペプチドライブラリーを形成する、ビーズ上でのペプチド合成を含む同様の方法が、米国特許第４，６３１，２１１号に記載され、関連法がＷＯ９２／０００９１号に記載されている。ビーズに基づく方法の顕著な改善には、各々のビーズに特有の識別子タグ、例えばオリゴヌクレオチドなどのタグを付け、各々のライブラリーメンバーのアミノ酸配列の同定を容易にすることが含まれる。これらの改善されたビーズに基づく方法は、ＷＯ９３／０６１２１号に記載されている。
【０３４９】
別の化学合成法は、各々の別個のライブラリーメンバー（例えば、特有のペプチド配列）が、アレイ中の個別の所定の位置に配置されるような方法で、表面に、ペプチド（またはペプチドミメティクス）アレイを合成することを含む。各ライブラリーメンバーの同一性は、アレイ中の空間的位置によって決定される。所定の分子（例えば、受容体）と、反応性ライブラリーメンバーとの間の結合相互作用が起こったアレイ内の位置が決定され、それによって空間位置に基づいて反応性ライブラリーメンバーの配列が同定される。これらの方法は、米国特許第５，１４３，８５４号；ＷＯ９０／１５０７０号、およびＷＯ９２／１００９２号；Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７；Ｄｏｗｅｒ  ａｎｄ  Ｆｏｄｏｒ（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２６：２７１に記載されている。
【０３５０】
ポリペプチドまたはヌクレオチドのライブラリーを作製する他の系は、ライブラリーメンバーのインビトロ合成を行うための無細胞酵素機構の使用を伴う。一つの方法においては、標的リガンドに対する選択とＰＣＲ増幅を交互のラウンドで行ってＲＮＡ分子を選択する（Ｔｕｅｒｋ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５０５；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４６：８１８）。同様の技法を用いて、所定のヒト転写因子に結合するＤＮＡ配列を同定してもよい（Ｔｈｉｅｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｃｈ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：３２０３；Ｂｅａｕｄｒｙ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：６３５；ＷＯ９２／０５２５８号、およびＷＯ９２／１４８４３号）。大規模なライブラリーを作製する方法として、同様の方法でインビトロ翻訳を用いてポリペプチドを合成することができる。これらの方法は一般に安定化したポリゾーム複合体を含み、ＷＯ８８／０８４５３号、ＷＯ９０／０５７８５号、ＷＯ９０／０７００３号、ＷＯ９１／０２０７６号、ＷＯ９１／０５０５８号、およびＷＯ９２／０２５３６号にさらに詳細に記載されている。ファージに基づくものではない別のディスプレイ系では、例えばＷＯ９５／２２６２５号およびＷＯ９５／１１９２２号（Ａｆｆｙｍａｘ）に開示されているものが、選択用のポリペプチドをポリゾームを用いて提示する。これらの文献、および前述の全ての文献も、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０３５１】
該ライブラリーは、特にジンクフィンガーのライブラリーを含んでよい；ジンクフィンガーは、当分野で公知であり、転写因子としての機能を果たす。好適なジンクフィンガーライブラリーは、例えば、ＷＯ９６／０６１６６号およびＷＯ９８／５３０５７号に開示されている。ジンクフィンガーライブラリーの構築には、例えばＷＯ９８／５３０５８号およびＷＯ９８／５３０６０号に開示されているように、特異的なＤＮＡ配列との相互作用を測定するためのルールを利用してよい。メチル化ＤＮＡと特異的に相互作用する能力を有するジンクフィンガーは、ＷＯ９９／４７６５６号に開示されている。該ジンクフィンガーライブラリーは、例えば、ＷＯ０１／２５４１７号に開示されているようにアレイの形態で固定化されてよい。
【０３５２】
アッセイに供され、目的の分子であることが分かった候補分子は、単離され、さらに調査され得る。目的の分子の単離方法は、使用する分子の種類、ライブラリーの形態であるかどうか、一度にいくつの候補分子が試験されるのか、その後にバッチ法が行われるかどうか等によって決まることになる。
【０３５３】
候補分子は、ライブラリーの形態で提供されてよい。一実施形態では、２以上の候補分子を同時にスクリーニングすることができる。候補分子のライブラリー、例えば、小分子ライブラリー、ポリペプチドライブラリー、核酸ライブラリー、化合物ライブラリー（例えばコンビナトリアルライブラリーなど）、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡなどのアンチセンス分子ライブラリー、抗体ライブラリー等が、当分野で公知の手段により作製されてよい。かかるライブラリーは、ハイスループットスクリーニングに適している。軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞を、個々のライブラリーメンバーに曝露させ、軟骨形成細胞に及ぼす影響を、存在する場合には測定することができる。この目的にアレイ技術を用いてよい。細胞は、空間的に、例えばマイクロタイタープレートのウェル中で、分離されてよい。
【０３５４】
一実施形態では、小分子ライブラリーが用いられる。「小分子」により、本発明者らは分子量が約５０ｋＤａより小さい分子をさす。特定の実施形態では、小分子は約３０ｋＤａ未満、例えば約１５ｋＤａ未満、または１０ｋＤａ未満またはそれくらいの分子量であり得る。かかる小分子のライブラリーは、本明細書において「小分子ライブラリー」と呼ばれ、ポリペプチド、小ペプチド、例えば、２０アミノ酸以下のペプチド、例えば、１５、１０または５アミノ酸、単純化合物等を含んでよい。
【０３５５】
細胞集団における軟骨形成間葉系幹細胞の検出
本明細書に記載のポリヌクレオチドプローブまたは抗体は、細胞集団において軟骨を形成する、軟骨形成の潜在能力を有する、または軟骨形成経路において分化する能力を有する、間葉系幹細胞の検出のために使用することができる。本明細書において、「細胞集団」とは、１以上の細胞、例えば間葉系幹細胞などを含み得る細胞の任意の集合である。例えば、細胞の集合は、単に間葉系幹細胞のみから構成されるのではなく、少なくとも１つの他の細胞種を含んでよい。
【０３５６】
細胞集団は、胚および胚組織を含むが、成体組織および培養で増殖した組織ならびに前述のいずれかに由来する細胞調製物もまた含む。
【０３５７】
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、核酸ハイブリダイゼーション技術による、間葉系幹細胞におけるＺＮＦ１４５転写物の検出のために使用することができる。かかる技術には、プライマーをＺＮＦ１４５転写物にハイブリダイズさせ、転写物を増幅するために使用して、検出可能なシグナルをもたらすＰＣＲ；および、ＺＮＦ１４５転写物中の特有配列に特異的なプローブを用いて標的細胞における転写物を検出する標識プローブのハイブリダイゼーションが含まれる。
【０３５８】
前述のように、当分野で公知のように、プローブは、放射性、放射線不透過性、蛍光性または他の標識を用いて標識することができる。
【０３５９】
当分野で公知の手段により作製され得るＺＮＦ１４５に対する抗体もまた、ＺＮＦ１４５の検出に使用することができる。例えば、細胞内ｓｃＦｖを用いて細胞内ＺＮＦ１４５を検出することができる。
【０３６０】
特に望ましいのは、免疫染色およびＦＡＣＳ法である。適したフルオロフォアは当分野で公知であり、化学フルオロフォアおよび蛍光ポリペプチド、例えばＧＦＰ、およびその変異体が含まれる（ＷＯ９７／２８２６１号を参照）。化学フルオロフォアは、その合成時にそれに対する結合部位を免疫グロブリン分子に組み込むことにより、免疫グロブリン分子に結合させることができる。
【０３６１】
フルオロフォアは、蛍光タンパク質を含んでよく、それは有利にはＧＦＰまたはその変異体である。ＧＦＰおよびその変異体は、当分野で周知の方法に従って、免疫グロブリンまたは標的分子とともに融合ポリペプチドとして発現させることにより合成してもよい。例えば、所望のＧＦＰと、免疫グロブリンまたは標的のインフレーム融合として転写単位を構築し、従来のＰＣＲクローニング法およびライゲーション法を用いて上記のようにベクターに挿入してもよい。
【０３６２】
ＺＮＦ１４５に対する抗体は、シグナルを生じる能力のある任意の標識を用いて標識することができる。シグナルは検出可能な任意のシグナル、例えば、検出可能な遺伝子産物の発現の誘導などであってよい。検出可能な遺伝子産物の例としては、生物発光ポリペプチド、例えばルシフェラーゼおよびＧＦＰなど、特異的なアッセイにより検出可能なポリペプチド、例えばβ−ガラクトシダーゼおよびＣＡＴなど、ならびに宿主細胞の増殖特性を調節するポリペプチド、例えば代謝に必要な酵素、例えばＨＩＳ３など、または抗生物質抵抗性遺伝子、例えばＧ４１８などが挙げられる。例えば、シグナルは細胞表面で検出可能であっても、細胞内で検出可能であってもよい。例えば、シグナルは発光シグナルまたは蛍光シグナルであってよく、それは細胞外から検出可能であり、ＦＡＣＳまたはその他の光学的分類技法による細胞の分類を可能にする。
【０３６３】
蛍光標識抗体の光学的検出法に基づく光学的免疫センサ技術を用いることができる。免疫センサは、相補的な種の結合を検出するシグナル伝達物質と結合する抗原または抗体種を含む生化学的検出器である（Ｒａｂｂａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ  ２２：３０７−３４６；Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４２：１９３−２０９）。かかる相補的種の例としては、抗原Ｚｉｆ２６８および抗−Ｚｉｆ２６８抗体が挙げられる。免疫センサは、血清または全血などの複合体試料中に存在する抗体、抗原またはハプテンの量の定量的尺度をもたらす（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  １９９１  Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ６：１８３−１９１）。免疫センサの感度は、スピードと正確さが求められる状況に最適である（Ｒａｂｂａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ  ２２：３０７−３４６）。
【０３６４】
免疫センサに用いられる検出技術としては、免疫相互作用の電気化学的、圧電的、または光学的検出が挙げられる（Ｇｈｉｎｄｉｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  １：１１３−１３１）。間接免疫センサは、結合後に例えば、蛍光または発光により検出される単独の標識種を使用する（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４２：１９３−２０９）。直接免疫センサは、電位差、電流、抵抗、質量、熱、または光学特性における変化により結合を検出する（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４２：１９３−２０９）。間接的免疫センサは、非特異的結合であるので、問題に直面することが少ない可能性がある（Ａｔｔｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｏｎ  ６：２０１−２１４；Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４２：１９３−２０９）。
【０３６５】
医薬組成物
ＺＮＦ１４５核酸、ＺＮＦ１４５ポリペプチド、ＺＮＦ１４５アゴニストおよびＺＮＦ１４５過剰発現細胞を含む本明細書に記載される軟骨形成促進剤は、生理活性形態で大量に低コストで生成することができ、エアロゾル化、噴霧、鼻腔内または気管内投与などにより、軟骨形成促進剤含有製剤を展開させることができる。
【０３６６】
軟骨形成促進剤を含む組成物は単独で投与することが可能であるが、有効成分を医薬製剤として処方してよい。従って、本発明者らは、１以上のＺＮＦ１４５核酸、ＺＮＦ１４５ポリペプチド、ＺＮＦ１４５アゴニストおよびＺＮＦ１４５過剰発現細胞を含む、本明細書に記載される軟骨形成促進剤を含む医薬組成物も開示する。かかる医薬組成物は、記載される症状の治療または軽減のために軟骨形成促進剤を個体に送達するために有用である。
【０３６７】
組成物には、ＺＮＦ１４５核酸、ＺＮＦ１４５ポリペプチド、ＺＮＦ１４５アゴニストおよびＺＮＦ１４５過剰発現細胞を含む、軟骨形成促進剤、構造上関連する化合物、またはその酸性塩が含まれてよい。医薬製剤は、有効量の軟骨形成促進剤、例えばＺＮＦ１４５核酸、ＺＮＦ１４５ポリペプチド、ＺＮＦ１４５アゴニストおよびＺＮＦ１４５過剰発現細胞を、１以上の製薬上許容される担体と一緒に含む。軟骨形成促進剤、例えばそのＺＮＦ１４５核酸、ＺＮＦ１４５ポリペプチド、ＺＮＦ１４５アゴニストおよびＺＮＦ１４５過剰発現細胞の「有効量」とは、記載される疾患の少なくとも１つの症状、例えばアトピー性アレルギーを軽減するために十分な量である。
【０３６８】
有効量は、治療または軽減される特定の疾患もしくは症候群、ならびに患者の年齢および体重、疾患などの状態がどの程度進行しているか、患者の健康状態、症状の重篤度、および軟骨形成促進剤、例えばＺＮＦ１４５核酸、ＺＮＦ１４５ポリペプチド、ＺＮＦ１４５アゴニストおよびＺＮＦ１４５過剰発現細胞などが単独で投与されるか他の療法とともに投与されるかどうかを含む、その他の因子によって異なる。
【０３６９】
適した製薬上許容される担体は当分野で周知であり、その医薬製剤の所望の形態および投与様式によって異なる。例えば、それらは希釈剤または賦形剤、例えば、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤などを含んでよい。一般に、担体は固体、液体または揮発可能な担体、またはその組合せである。各担体は、その製剤中の他の成分と適合していて、かつ、患者に害がないという意味で「許容される」ものでなければならない。担体は、宿主に投与した際に有害反応（例えば、免疫応答）を誘発することなく生物学的に許容されるものでなければならない。
【０３７０】
本明細書に開示される医薬組成物には、局所および経口投与に適した医薬組成物が含まれ、局所製剤は、例えば患部組織が主に皮膚または表皮である（例えば、乾癬、湿疹およびその他の上皮疾患）場合に使用される。局所製剤には、治療される皮膚表面への直接接触によって組成物が外側に適用される医薬形態が含まれる。従来の局所適用のための医薬形態としては、浸漬液、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スティック、スプレー、エアロゾル、バスオイル、溶液などが挙げられる。局所療法は、様々なビヒクルにより送達され、ビヒクルの選択は重要であり得、一般に急性疾患を治療するか慢性疾患を治療するかに関連する。その他の局所適用のための製剤としては、シャンプー、石鹸、シェイクローションなど、特に下にある皮膚、例えば頭皮などの上に残留物を残すように処方された製剤が挙げられる（Ａｒｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｉｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：２８３８（１９９３））。
【０３７１】
一般に、局所製剤中の軟骨形成促進剤、例えばＺＮＦ１４５核酸、ＺＮＦ１４５ポリペプチド、ＺＮＦ１４５アゴニストおよびＺＮＦ１４５過剰発現細胞などの濃度は、組成物の約０．５〜５０重量％、例えば約１〜３０％、約２〜２０％または約５〜１０％の量である。使用濃度は、最初はその範囲の上部とし、治療を続けるにつれて濃度を引き下げるか、またはその製剤の適用頻度を少なくすることができる。局所適用は多くの場合、１日に２回行う。しかし、より高用量の１日１回適用、またはより低用量のより高い頻度での適用も効果的であり得る。角質層は貯蔵庫として働き、長時間かけて生きている皮膚層に薬剤を徐々に浸透させることができる。
【０３７２】
局所適用では、所望の薬理作用を得るためには、十分な量の有効成分が患者の皮膚に浸透しなければならない。一般に、皮膚への薬物の吸収はその薬物の性質、ビヒクルの挙動、および皮膚の関数であると理解される。３つの主要な変数は、異なる局所薬または異なるビヒクル中の同じ薬物の吸収または流動速度；ビヒクル中の薬物の濃度、角質層とビヒクルの間の薬物分配係数および角質層における薬物の拡散係数の違いを説明する。治療に有効となるには、薬物は皮膚のバリア機能を担う角質層を通過しなければならない。一般に、高いインビトロ皮膚浸透を発揮する局所製剤はインビボにおいて有効である。Ｏｓｔｒｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６０：１１７５−１１７９（１９７１）は、局所適用されたステロイドのインビボ有効性が、インビトロで採取された（ｄｅｒｍａｔｏｍｅｄ）ヒト皮膚へのステロイド浸透速度に比例することを実証した。
【０３７３】
皮膚科学的に許容可能であり、かつ、当該薬剤に適合する皮膚浸透エンハンサーは、皮膚表面から上皮ケラチノサイトへの活性化合物の浸透を増強するために製剤に組み入れることができる。活性化合物の皮膚への吸収を高める皮膚エンハンサーは、有効な治療に必要とされる薬剤の量を低減し、その製剤のより長く持続する効果を提供する。皮膚浸透エンハンサーは当分野で周知である。例えば、ジメチルスルホキシド（米国特許第３，７１１，６０２号）；オレイン酸、１，２−ブタンジオール界面活性剤（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，７３：１１５３−１１５６（１９８４））；エタノールとオレイン酸またはオレイルアルコールの組合せ（ＥＰ２６７，６１７）、２−エチル−１，３−ヘキサンジオール（ＷＯ８７／０３４９０号）；デシルメチルスルホキシドおよびＡｚｏｎｅ．ＲＴＭ．（Ｈａｄｇｒａｆｔ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ，２１：１６５−１７３（１９９６））；アルコール、スルホキシド、脂肪酸、エステル、Ａｚｏｎｅ．ＲＴＭ．、ピロリドン、尿素およびポリオール（Ｋａｌｂｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，５１：６１９−６３７（１９９６））；
【０３７４】
テルペン、例えば１，８−シネオール、メントン、リモネンおよびネロリドールなど（Ｙａｍａｎｅ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｙ  ＆  Ｐｈａｒｍｏｃｏｌｏｇｙ，４７：９７８−９８９（１９９５））；Ａｚｏｎｅ．ＲＴＭ．およびトランスクトール（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．１３：５４２−５４６（１９９６））；およびオレイン酸、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，５１：７４１−７４４（１９９６））が有効成分の皮膚浸透を向上させることが知られている。
【０３７５】
薬剤または組成物の浸透のレベルは、当業者に知られている技術により決定することができる。当業者ならば、例えば、活性化合物を放射性標識した後、皮膚が吸収した放射性標識化合物の量を測定することで、試験化合物の皮膚浸透を測定するいくつかの方法のいずれかを用いて、吸収された組成物のレベルを決定することができる。皮膚浸透試験に関する刊行物としては、Ｒｅｉｎｆｅｎｒａｔｈ，Ｗ  Ｇ  ａｎｄ  Ｇ  Ｓ  Ｈａｗｋｉｎｓ．Ｔｈｅ  Ｗｅａｎｉｎｇ  Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ  Ｐｉｇ  ａｓ  ａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｓｗｉｎｅ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍ．Ｅ．Ｔｕｍｂｌｅｓｏｎ  Ｅｄ．）Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８６、およびＨａｗｋｉｎｓ，Ｇ．Ｓ．Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｓｋｉｎ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ．Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｋｉｎ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，Ｂ  Ｗ  Ｋｅｍｐｐａｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｗ  Ｇ  Ｒｅｉｆｅｎｒａｔｈ，Ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９０，ｐｐ．６７−８０；およびＷ．Ｇ．Ｒｅｉｆｅｎｒａｔｈ，Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ  ＆  Ｔｏｉｌｅｔｒｉｅｓ，１１０：３−９（１９９５）が挙げられる。
【０３７６】
いくつかの適用では、長時間作用型の薬剤または組成物は、当分野で公知の製剤、例えばポリマーなどを用いて投与することができる。この薬剤は、当分野で公知の方法に従って、皮膚パッチ（Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｅ．，ｉｎ  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｎｏｒｄｉｃａ  ４：１１７（１９９２）；Ｔｈａｃｈａｒｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １６：１４５−１４８（１９９５）；Ｎｉｅｄｎｅｒ  Ｒ．，ｉｎ  Ｈａｕｔａｒｚｔ  ３９：７６１−７６６（１９８８））または包帯に組み入れて、処置される領域への薬物の送達効率を高めることができる。
【０３７７】
所望により、本明細書に記載される局所製剤は、さらなる賦形剤、例えば、防腐剤、例えばメチルパラベン、ベンジルアルコール、ソルビン酸または第四級アンモニウム化合物など；安定剤、例えばＥＤＴＡなど、酸化防止剤、例えばブチル化ヒドロキシトルエンまたはブチル化ヒドロキシアニソールなど、ならびにバッファー、例えばクエン酸塩およびリン酸塩などを含んでよい。
【０３７８】
医薬組成物は、錠剤、カプセル剤または溶液の形態の経口製剤で投与することができる。有効量の経口製剤を患者に毎日１〜３回、疾患の症状が軽減されるまで投与する。薬剤の有効量は、患者の年齢、体重および状態によって異なる。一般に、薬剤の１日経口用量は１２００ｍｇ未満、１００ｍｇ超である。１日経口用量は約３００〜６００ｍｇであってよい。経口製剤は、便宜的には単位剤形で提供され、製薬分野で公知の任意の方法によって調製することができる。組成物は、適した製薬上許容される担体とともに任意の所望の剤形に処方することができる。典型的な単位剤形としては、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤が挙げられる。一般に処方物は、薬剤組成物を液体担体または微粉固体担体またはその両方と均一かつ緊密に会合させ、必要に応じて、その生成物を成形することによって調製される。有効成分は、液剤、散剤、錠剤またはカプセル剤の形態の様々な基本材料に組み入れ、疾患の治療に有効な量の有効成分とすることができる。
【０３７９】
本明細書における使用に適したその他の治療薬は、意図する目的にとって有効な任意の相溶性の薬物、または薬剤製剤に補完的な薬物である。併用療法で利用される製剤は、複合効果が実現されるようにその他の治療と同時に、または順次に投与されてよい。
【０３８０】
ＺＮＦ−１４５過剰発現細胞の投与
本発明者らは、ＺＮＦ１４５過剰発現細胞の個体への投与を記載する。
【０３８１】
ＺＮＦ１４５過剰発現細胞を用いる個体の治療的または予防的処置は、疾患、障害または状態が多少なりとも測定可能な程度に改善されているならば効果的と考えてよい。かかる改善は、いくつかの指標によって示すことができる。測定可能な指標としては、例えば、特定の疾患、障害または状態に関連する生理学的状態または一連の生理学的条件（限定されるものではないが、血圧、心拍数、呼吸数、様々な血液細胞種の数値、特定のタンパク質、炭水化物、脂質またはサイトカインの血中レベル、あるいは該疾患、障害または状態に関連する遺伝子マーカーの調節発現を含む）の検出可能な変化が挙げられる。ＺＮＦ１４５過剰発現細胞による個体の治療は、そのような指標のいずれか１つが、正常値の範囲内かまたは正常値に近い値へ変化することによってそのような治療に応答するならば効果的とみなすことができよう。正常値は、様々な指標について当分野で公知の正常範囲によるか、または対照におけるそのような値を比較することにより確立することができる。医科学では、治療の有効性はまた、多くの場合個体の印象および個体の健康状態の主観的感情に関しても特徴付けられる。従って、改善も、本明細書に記載されるＺＮＦ１４５過剰発現細胞の投与後の、主観的指標、例えば個体の改善したという主観的感情、満足のいく状態の増加、健康状態の増加、エネルギーのレベルの改善などにより特徴付けることができる。
【０３８２】
本明細書に記載されるＺＮＦ１４５過剰発現細胞は、注射または注入によるものを含む、任意の薬剤的にまたは医学的に許容される方法で、患者に投与することができる。ＺＮＦ１４５過剰発現細胞は、任意の薬剤的に許容される担体を含むか、または薬剤的に許容される担体に含まれてよい。ＺＮＦ１４５過剰発現細胞は、任意の薬剤的にまたは医学的に許容される容器、例えば、血液バッグ、輸送用バッグ、プラスチックチューブまたはバイアル中で運搬、貯蔵、または輸送されてよい。
実施例
〔実施例１〕
【０３８３】
ＭＳＣ培養および骨芽細胞、軟骨細胞および脂肪細胞分化
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）を、シンガポールの国立大学病院のガイドラインに従ってインフォームドコンセントの後に腸骨稜から収集し、記載される通り培養する（Ｓｅｋｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０３８４】
自発的分化を防ぐため、細胞をサブコンフルエントレベルで維持する。ＭＳＣを誘導して記載される通り脂肪細胞および骨芽細胞へ分化させ（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、Ｗ６プレート中の２×１０５および１．５×１０５ＭＳＣを導入して、それぞれ脂肪生成培地および骨原性培地中で１４日間脂肪細胞および骨芽細胞に分化させる。
【０３８５】
脂肪生成培地は、０．５ｍＭイソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、１μＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０μＭインスリン、２００μＭインドメタシン、および１％抗生物質／抗真菌薬を含んでいた。骨原性培地は、０．１μＭデキサメタゾン、５０μＭアスコルビン酸−２−リン酸、１０ｍＭβ−グリセロリン酸塩、および１％抗生物質／抗真菌薬を含んでいた。
【０３８６】
記載されるペレット培養系（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）を軟骨細胞分化に使用する。手短に言えば、２×１０５ＭＳＣを１５ｍｌポリプロピレンチューブ（Ｆａｌｃｏｎ）に入れ、ペレットに遠心する。ペレットを、１０ｎｇ／ｍｌトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β３、１０−７Ｍデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸−２−リン酸、４０μｇ／ｍｌプロリン、１００μｇ／ｍｌピルビン酸、および５０ｍｇ／ｍｌＩＴＳ＋プレミックス（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；６．２５μｇ／ｍｌインスリン、６．２５μｇ／ｍｌトランスフェリン、６．２５μｇ／ｍｌ亜セレン酸、１．２５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、および５．３５ｍｇ／ｍｌリノール酸）を含む５００μｌの軟骨形成培地中で、３７℃にて５％ＣＯ２とともに培養する。培地は２８日間、３〜４日毎に交換する。
【０３８７】
ＭＳＣの分化は、リアルタイムＰＣＲおよび染色により評価する。脂肪生成におけるリポイド堆積のためのオイルレッドＯ染色、骨形成におけるカルシウム堆積に対するアリザリンレッドＳ染色、２型コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１）に対する免疫染色および軟骨形成における軟骨プロテオグリカンに対するアルシアンブルー染色を本研究で使用する。
〔実施例２〕
【０３８８】
発現プラスミドの構築およびＭＳＣへの感染
ＺＮＦ１４５を、１４日間の骨形成のもと、ＭＳＣのｃＤＮＡから増幅させ、その後ｐＥｎｔｒｙ３Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。
【０３８９】
Ｓｏｘ９アルティメイトＯＲＦクローンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製である。ｐＥｎｔｒｙ３ＣとｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）との間のＬＲ組換えによって、ＺＮＦ１４５またはＳｏｘ９を過剰発現させるためのｐＬｅｎｔｉウイルスベクターを作成する。レンチウイルスを、ＺＮＦ１４５またはＳｏｘ９を過剰発現させるためのｐＬｅｎｔｉウイルスベクターと、パッケージングミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２９３ＦＴ細胞にコトランスフェクトすることにより生成し、次にＭＳＣをウイルス上清に感染させてＺＮＦ１４５またはＳｏｘ９過剰発現を実現し、７日間５μｇ／ｍｌのブラストサイジンで選択する。挿入物のない空のｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５を対照（Ｅｍｐｔｙ）として使用する。
〔実施例３〕
【０３９０】
定量的リアルタイムＰＣＲ
ＺＮＦ１４５過剰発現またはノックダウンの、ＭＳＣの分化への影響を定量化するため、定量的リアルタイムＰＣＲを、製造業者に従ってＴａｑｍａｎ発現アッセイおよびＡＢＩ  ７７００  Ｐｒｉｓｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行う。
【０３９１】
手短に言えば、０．３μｇの全ＲＮＡを、３０ｕｌ中で高容量ｃＤＮＡアーカイブ・キットを用いてｃＤＮＡに変換し、次いで３００μｌに希釈する。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、次の通り行う：初期変性５０℃にて２分、９５℃にて１０分、それに続いて４０サイクルのＰＣＲ（９５℃１５秒、６０℃１分）を、５μｌの２ｘマスターミックス、０．５μｌのＴａｑｍａｎプローブおよび４．５μｌのｃＤＮＡを用いて行う。
【０３９２】
全てのプローブは、５’蛍光６−カルボキシルフルオレセイン、および３’クエンチャー、テトラメチル−６−カルボキシローダミンを考慮して設計されている。ヒトＧＡＰＤＨの発現を使用して遺伝子発現レベルを正規化する。
〔実施例４〕
【０３９３】
間接免疫蛍光細胞染色
チャンバで成長する細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％中性ホルマリンで１５分間室温にて固定化する。
【０３９４】
リンスバッファー（１ｘＴＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で２回洗浄した後、細胞を０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで１０分間透過処理する。細胞を４％ヤギ血清（ブロッキングバッファー）で３０分間処理し、次いで、ブロッキングバッファー中１：５０に希釈した、ＺＮＦ１４５に対する一次抗体とともに１時間インキュベートする。
【０３９５】
リンスバッファーで３回洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ中１：１５０に希釈したＦＩＴＣ結合二次抗体とともに４５分間インキュベートする。３回洗浄した後、免疫学的局在を蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で調べる。
〔実施例５〕
【０３９６】
ウエスタンブロット解析
細胞を遠心分離により収集し、細胞ペレットを、プロテイナーゼ阻害剤を含有する溶解バッファー（２５ｍＭ  トリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％  デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ）に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートする。
【０３９７】
４℃にて１６０００ｇで１５分間の遠心分離に続いて、全細胞抽出物を含有する上清を収集し、−８０℃で保持する。ゲル中の、細胞抽出物から得たタンパク質を、電気泳動によってＨｙｂｏｎｄ−ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の上に移す。この膜をブロッキングバッファー（５％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ）中で室温にて１時間インキュベートして非特異的タンパク質結合を阻止し、次に、ブロッキングバッファーに１時間希釈した（１：３００）ＺＮＦ１４５またはＳｏｘ９に対する一次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）とともに室温にて１時間インキュベートする。
【０３９８】
ＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、ブロッキングバッファーに１時間希釈した（１：３０００）ＨＰＲ結合二次抗体とともに膜を１時間インキュベートする。ＥＣＬウエスタンブロット法検出系（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて抗体結合を可視化する。
〔実施例６〕
【０３９９】
ｃＤＮＡマイクロアレイ分析
ＭＳＣにおけるＺＮＦ１４５の標的を決定するため、本発明者らはＺＮＦ１４５をＭＳＣで過剰発現させ、マイクロアレイを用いて未分化型ＭＳＣにおけるそれらの遺伝子発現プロフィールを分析した。
【０４００】
全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を製造業者のプロトコールによって用いて、ＺＮＦ１４５過剰発現ＭＳＣおよび非挿入対照ＭＳＣから単離する。手短に言えば、３．５μｇの全ＲＮＡを使用して、１サイクルｃＤＮＡ合成キットを用いて二本鎖ＤＮＡを合成する。サンプルクリーンアップモジュールを用いることによりｃＤＮＡを精製する。インビトロ転写を行って、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＩＶＴ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔを用いてビオチン標識されたｃＲＮＡを生成する。ビオチン化ｃＲＮＡを清浄し、サンプルクリーンアップモジュールによって５０〜２００ヌクレオチドに細分化し、５４６７５より多くのヒト遺伝子を含有するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ  Ｕ１３３プラス２に４５℃にて１６時間ハイブリダイズする。
【０４０１】
洗浄後、アレイをストレプトアビジン−フィコエリトリン（分子プローブ）で染色する。染色シグナルを、ビオチン化抗ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により増幅させ、それに続いてストレプトアビジン−フィコエリトリンで染色し、次いでＧＣＯＳ  ３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）でスキャンする。
【０４０２】
これらのデータは、Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ  Ｖ７．３を用いて分析する。正規化された強度についてのｔ検定に続いて、比率変化（正規化された強度の比率は≧２または≦−２）を用いて、遺伝子発現プロフィールの有意な変化を含む遺伝子リストを作成する。この研究では、２人の患者由来のＭＳＣを二重反復で使用する。
〔実施例７〕
【０４０３】
ヒトＭＳＣのラットへの移植および組織学的評価
雄スプラーグドーリー（ＳＤ）ラット（５００ｇ）にケタミン（１０ｍｇ／１００ｇ）およびキシラジン（１ｍｇ／１００ｇ）の混合物の腹腔内注射を用いて麻酔をかける。
【０４０４】
前部正中線切開を膝の皮膚を通じて行う。膝蓋傍中央の（ｐａｒａｐａｔｅｌｌａｒ−ｍｅｄｉａｌ）アプローチを経て膝関節を開き、膝蓋を裏返す。骨軟骨欠損（直径１．５ｍｍおよび深さ１．５ｍｍ）を遠位大腿骨の膝蓋溝に作成する。３匹のラットに、右膝に移植したＺＮＦ１４５過剰発現ｈＭＳＣを含むペレットおよび左膝に移植した対照ｈＭＳＣを投与した。ペレット化した３ｘ１０＾５のＺＮＦ１４５過剰発現ｈＭＳＣから得たペレットを、移植前に１週間インビトロで軟骨細胞分化に誘導した（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【０４０５】
非挿入対照ＭＳＣから得たペレットによる欠陥物を対照として使用する。レシピエント動物は、手術するとすぐにシクロスポリン（１４ｍｇ／ｋｇ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｈｅｒｌａｎｄ）の皮下注射を毎日受けた。
【０４０６】
手術後６週に、各群から３匹のラットを毎回犠牲にする。欠損を含む遠位大腿骨を回収し、１０％緩衝製剤中で固定化し、組織を脱灰し、５μｍの切片に切断する。ヘマトキシリン／エオシン、軟骨プロテオグリカンに対するアルシアンブルーおよびＣｏｌ２Ａ１免疫染色で染色を行う。
【０４０７】
各々の試料は、Ｗａｋｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）によって記載される組織学的スケールに従って類別される。このスケールは、５つのカテゴリー：細胞形態、マトリックス染色、表面規則性、軟骨の厚さ、および宿主軟骨によるドナーの組込みで構成された。スコアは０（正常な関節軟骨）から１４（軟骨組織無し）の範囲であった。
〔実施例８〕
【０４０８】
結果：インビトロ軟骨形成の間のＺＮＦ１４５の発現パターン
リアルタイムＰＣＲによる定量的データ（図１Ａ）は、ＺＮＦ１４５が初期および後期段階のＭＳＣの３つの系列分化の間に一般にアップレギュレートされることを示す。
【０４０９】
ＺＮＦ１４５に対する免疫蛍光は、ＺＮＦ１４５が３つの分化系列の間にアップレギュレートされて核に局在するのに対して、ＺＮＦ１４５は未分化型ＭＳＣでは発現されないことを示す（図１Ｂおよび図１Ｃ）。
〔実施例９〕
【０４１０】
結果：ＺＮＦ１４５ノックダウンの３つの分化系列への効果
ＺＮＦ１４５は、ＭＳＣの３つの分化系列の間にアップレギュレートされた一般的な遺伝子として示される。
【０４１１】
実験手順のもとに示される、ＺＮＦ１４５を標的とする２つのｓｈＲＮＡを構築する。ＺＮＦ１４５を標的とするｓｈＲＮＡは、レンチウイルスｐＬＬ３．７によりＭＳＣに効率的に導入される（図２Ａ）。ｓｉＲＮＡによるＺＮＦ１４５の遺伝子サイレンシングは、リアルタイムＰＣＲにより定量化されるマーカーの３つの系列をダウンレギュレートした（図２Ｂおよび図２Ｃ）。これらの結果は、ＺＮＦ１４５がＭＳＣの分化において重要な役割を果たすことを示す。これらは、３つの分化系列に対する染色に一致する。
【０４１２】
ＺＮＦ１４５ノックダウンＭＳＣは、脂肪生成における油滴に対するオイルレッド染色の低下、軟骨形成における主なコラーゲンに対するＣｏｌ２ａ１および硫酸プロテオグリカンマトリックスに対するアルシアンブルー、ならびに骨形成におけるカルシウム堆積に対するアリザリンレッド染色を示す（図２Ｄ）。
〔実施例１０〕
【０４１３】
結果：ＺＮＦ１４５過剰発現の軟骨形成および骨形成への効果
ＺＮＦ１４５過剰発現のＭＳＣの分化への効果を評価するため、安定したＺＮＦ１４５過剰発現のためにＭＳＣをレンチウイルスに感染させる。
【０４１４】
免疫染色により、ＺＮＦ１４５がＭＳＣの核で過剰発現されるのに対して、未分化型ＭＳＣではＺＮＦ１４５は発現されないことが示される（図３Ａ）。
【０４１５】
次に、ＺＮＦ１４５過剰発現ＭＳＣをペレット培養下での２８日間の軟骨形成および１４日間の骨形成に誘導する。
【０４１６】
ＭＳＣにおけるＺＮＦ１４５の過剰発現により、軟骨形成におけるｃｏｌ２Ａ１の発現が１２．６４倍、アグリカンが７．９２倍、ｃｏｌ１０Ａ１が７．５倍、そしてｓｏｘ９が２．４５倍促進され（図３Ｂ）、ＺＮＦ１４５が軟骨形成を促進することが示される。
【０４１７】
この知見は、ｃｏｌ２Ａ１染色に対する免疫染色および軟骨のプロテオグリカンに対するアルシアンブルーによりさらに検証される（図３Ｃ）。
【０４１８】
骨形成では、非挿入対照と比較してＺＮＦ１４５過剰発現ＭＳＣにおいて、オステオカルシン、アルカリホスファターゼおよびｃｏｌ１Ａ１のアップレギュレートが観察される（図３Ｂ）。これは、骨形成におけるカルシウム堆積に対するアリザリンレッド（図３Ｃ）およびアルカリホスファターゼに対するＡＰ染色（図３Ｄおよび図３Ｅ）に一致し、ＺＮＦ１４５過剰発現が骨形成を向上させることを示す。
〔実施例１０Ａ〕
【０４１９】
ＺＮＦ１４５過剰発現はＭＳＣ細胞株の軟骨形成および骨形成を向上させる
一次ＭＳＣは、制限された寿命およびドナー間の変動に関連する問題を提起する。一次ＭＳＣによるこれらの不都合を克服するため、レトロウイルス系によってｈＴＥＲＴとＳＶ４０のラージＴ抗原の組合せを用いてＭＳＣ細胞株を生成する。ＭＳＣ細胞株は、一次ＭＳＣと同様の表面抗原プロフィールを提示し、３つの系列（脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞）への分化能を有した。
【０４２０】
ＭＳＣ細胞株の腫瘍形成を試験するため、５×１０６ＭＳＣ細胞株を、部位ごとに５匹のヌードマウスおよび５匹のＮＯＧマウスの皮下に移植する。１２週に腫瘍は観察されない。
【０４２１】
本発明者らの知見は、ＺＮＦ１４５過剰発現がＭＳＣ細胞株において一次ＭＳＣと同様の効果を有したことを示し、ＭＳＣ細胞株におけるＺＮＦ１４５過剰発現は軟骨形成および骨原性マーカーの発現を増強し（図３Ｆ）、軟骨分化における、Ｃｏｌ２Ａ１に対する免疫染色によるＣｏｌ２Ａ１の増強および硫酸プロテオグリカンマトリックスに対するアルシアンブルー染色の増強、ならびに骨形成における、アリザリンレッド染色による石灰沈着の増強（図３Ｇ）およびＡＰ染色（図３Ｈ）およびＡＰアッセイ（図３Ｉ）によるアルカリホスファターゼの増強に一致する。
〔実施例１１〕
【０４２２】
結果：ＭＳＣにおけるＺＮＦ１４５の標的
ＺＮＦ１４５過剰発現のＭＳＣへの効果の基礎をなす機構を解明するため、本発明者らは、２人の患者由来のＭＳＣにおいてＺＮＦ１４５を過剰発現させ、その後ＭＳＣにおけるその標的をマイクロアレイにより二重反復でチェックする。
【０４２３】
本発明者らのデータは、４２３遺伝子がＺＮＦ１４５過剰発現によってアップレギュレートされるのに対して、未分化型ＭＳＣにおいて６７８遺伝子がＺＮＦ１４５過剰発現によりダウンレギュレートされることを示す（図４Ａ）。
【０４２４】
２人の患者由来のＭＳＣは、ＺＮＦ１４５過剰発現において同様の発現パターンを示す（図４Ｂ）。
【０４２５】
マイクロアレイにより分析した平行試料から選択された遺伝子の発現パターンを、その後、検証のためにＲＴ−ＰＣＲにより比較する。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、マイクロアレイデータに一致する（図４Ｃ）。
〔実施例１２〕
【０４２６】
結果：ＺＮＦ１４５はＳｏｘ９の上流調節因子として軟骨形成を調節した
Ｓｏｘ９は、軟骨形成の間の主要な制御因子である。ＺＮＦ１４５が軟骨形成においてどのように機能するかを理解するため、ＺＮＦ１４５とＳｏｘ９の関係を特定することが非常に重要である。
【０４２７】
Ｓｏｘ９およびＺＮＦ１４５をＭＳＣに導入する。ＭＳＣにおけるＺＮＦ１４５の過剰発現は、Ｓｏｘ９の発現を増強するのに対して、Ｓｏｘ９の過剰発現はＲＮＡ（図５Ａ）およびタンパク質レベル（図５Ｂ）においてＺＮＦ１４５の発現を増強しない。この知見は、ＺＮＦ１４５がＳｏｘ９の上流調節因子であることを示唆する。
〔実施例１３〕
【０４２８】
ＺＮＦ１４５は、インビボラットモデルにおいて軟骨欠損の修復を向上させた。
ＺＮＦ１４５過剰発現ＭＳＣがインビボ軟骨欠損の修復の質を向上させるかどうかを評価するため、本発明者らは、ＭＳＣ過剰発現ＺＮＦ１４５と非挿入対照ＭＳＣを比較した。その比較において、ＭＳＣをペレット培養下で７日間のインビトロ軟骨形成に供し、その後ラット膝の骨軟骨欠損部に移植した。
【０４２９】
手術するとすぐに、レシピエント動物に毎日シクロスポリンの皮下注射（１４ｍｇ／ｋｇ）を投与した。移植の６週後、欠損部は硝子軟骨に似た修復組織で満たされている。
【０４３０】
ＺＮＦ１４５−ＭＳＣ移植片からの表層は、対照ＭＳＣと比較してより強いマトリックス染色を有した。高い倍率では、細胞は分化型の軟骨細胞によく似ていて、異染性のマトリックスに取り囲まれている。
【０４３１】
ＺＮＦ１４５群は、隣接する軟骨に対して連続的かつ同様の、硫酸プロテオグリカンマトリックスに対するアルシアンブルー染色および軟骨の主なコラーゲンに対するＣｏｌ２Ａ１免疫染色を示したのに対して、非挿入対照ＭＳＣ群は、欠損部位で不連続なアルシアンブルー染色およびＣｏｌ２Ａ１免疫染色を示した。主に重要なことには、ＺＮＦ１４５−ＭＳＣからの軟骨は、隣接する軟骨の両端にうまく統合された（図６Ａおよび６Ｂ）。
【０４３２】
組織学的類別スコアは、細胞形態、マトリックス染色、表面規則性、軟骨の厚さおよびホスト隣接軟骨へのドナーの組込みに基づいて、Ｗａｋｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）に従ってＺＮＦ１４５群と非挿入対照群間の修復組織を比較するために決定される。
【０４３３】
ＺＮＦ１４５群の類別スコアは、非挿入対照群のスコアよりも有意に良好である（図６Ｃ）。これらの結果は、ＺＮＦ１４５過剰発現ＭＳＣが対照群よりもはるかに良好かつ早期に軟骨欠損を修復し、ＺＮＦ１４５群が優れた軟骨を保有することを示した。
【０４３４】
６週での修復作用に似て、１２週のＺＮＦ１４５群は、対照ＭＳＣと比較して良好な修復作用を示す（図６Ｄおよび６Ｅ）。１２週のＺＮＦ１４５群の類別スコアは、対照群よりもはるかに良好である（図６Ｆ）。
【０４３５】
これらの結果は、ＺＮＦ１４５が軟骨欠損の修復の質を改良し、かつそれを良好かつ早期に行うことができることを示す。これらの知見は、ＺＮＦ１４５療法が、軟骨の再生および修復に向けての有用な戦略であり得ることを示唆する。
〔実施例１５〕
【０４３６】
間葉系幹細胞株の生成
間葉系幹細胞株を不死化するために、ウイルスタンパク質もテロメラーゼに加えて発現させてよい。上の実験を反復して、（ａ）ｈＴＥＲＴおよびＳＶ−４０ラージＴ抗原、（ｂ）ｈＴＥＲＴ＋ＨＰＶ  Ｅ７、（ｃ）ｈＴＥＲＴ＋ＨＰＶ  Ｅ６＋ＨＰＶ  Ｅ７、または（ｄ）ｈＴＥＲＴ＋ｂｍｉ−１＋ＨＰＶ  Ｅ６を発現する間葉系幹細胞株を作成する。
【０４３７】
間葉系幹細胞株の生成の簡単な手順は、（ａ）上に詳細に記載されるレンチウイルス発現ベクターを作成するステップと、（ｂ）ウイルスを別々に作成するステップ（実施例−材料および方法を参照）と、（ｃ）骨髄−ＭＳＣ（または脂肪組織−ＭＳＣ、ＥＳ−ＭＳＣなどを含む、その他の種類のＭＳＣ）とウイルスをコインフェクトするか、あるいは上の組合せに従って次々にＭＳＣを感染させるステップと、（ｄ）作成した上の組合せをもつＭＳＣが不死系統であるかどうかを試験し、さらに軟骨分化を含むそれらの分化能をチェックするために、継代を継続するステップとを含む。
【０４３８】
結果
ｈＴＥＲＴ＋ラージＴ抗原を発現している間葉系幹細胞株を上記のように生成する。データは、この組合せが、遺伝子対照ＭＳＣが継代１５回で老化を経験しない、２５代継代まで骨髄ＭＳＣの寿命を延長することができることを示す。生成したＭＳＣは、良好な形態のＭＳＣおよび骨、軟骨および脂肪分化への３つの分化系列を示す。
【０４３９】
［文献］
文献１から１３は、「背景技術」に関するものである。
【表２Ａ】
2012502655.tif 000004
【表２Ｂ】
2012502655.tif 000005
【０４４０】
以下の文献は、「発明を実施するための形態」に関するものである（「背景技術」は含まない）。
【表３Ａ】
2012502655.tif 000006
【表３Ｂ】
2012502655.tif 000007
【表３Ｃ】
2012502655.tif 000008
【表３Ｄ】
2012502655.tif 000009
【０４４１】
本明細書において言及されるあらゆる特許出願および特許、ならびに上記特許出願および特許の各々で引用または参照されるあらゆる文書（各々の特許出願および特許の審査中のものを含む）（「出願引用文書」）、ならびに特許出願および特許の各々および出願引用文書のいずれかで引用または言及されるあらゆる生産品のあらゆる製造業者の取扱説明書またはカタログは、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。さらに、本文中で引用される全ての文書、および本文中で引用される文書において引用または参照される全ての文書、および本文中で引用または言及されるあらゆる生産品に対するあらゆる製造業者の取扱説明書またはカタログは、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０４４２】
本発明の記載される方法およびシステムの様々な変更および変形は、本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は具体的な好ましい実施形態に関連して記載されたが、特許請求される本発明がそのような具体的な実施形態に不当に制限されるべきでないことは当然理解される。実際に、分子生物学または関連分野の当業者には明白な、記載される本発明を実施するための様式の様々な変更は、特許請求の範囲内であることが意図される。
【図１Ａ】
2012502655.tif 000010
【図１Ｂ】
2012502655.tif 000011
【図１Ｃ】
2012502655.tif 000012
【図１Ｄ】
2012502655.tif 000013
【図２Ａ】
2012502655.tif 000014
【図２Ｂ】
2012502655.tif 000015
【図２Ｃ】
2012502655.tif 000016
【図２Ｄ】
2012502655.tif 000017
【図３Ａ】
2012502655.tif 000018
【図３Ｂ】
2012502655.tif 000019
【図３Ｃ】
2012502655.tif 000020
【図３Ｄ】
2012502655.tif 000021
【図３Ｅ】
2012502655.tif 000022
【図３Ｆ】
2012502655.tif 000023
【図３Ｇ】
2012502655.tif 000024
【図３Ｈ】
2012502655.tif 000025
【図３Ｉ】
2012502655.tif 000026
【図４Ａ】
2012502655.tif 000027
【図４Ｂ】
2012502655.tif 000028
【図４Ｃ】
2012502655.tif 000029
【図５Ａ】
2012502655.tif 000030
【図５Ｂ】
2012502655.tif 000031
【図６Ａ】
2012502655.tif 000032
【図６Ｂ】
2012502655.tif 000033
【図６Ｃ】
2012502655.tif 000034
【図６Ｄ】
2012502655.tif 000035
【図６Ｅ】
2012502655.tif 000036
【図６Ｆ】
2012502655.tif 000037
【国際調査報告】
2012502655.tif 000038
2012502655.tif 000039
2012502655.tif 000040
2012502655.tif 000041
2012502655.tif 000042