(57)【要約】  本発明は、眼疾患の予防及び／治療のためのペプチド化合物の使用に関する。特に、本発明は、個体における眼疾患の予防及び／又は治療における使用のための、配列番号２（ＫＥＱＷＦＧＮＲＷＨＥＧＹＲ）若しくは配列番号１（ＫＥＫＷＦＥＮＥＷＱＧＫＮＰ）のアミノ酸７〜１１により表示されるアミノ酸配列を含むペプチド化合物、又はその機能的に活性な誘導体、又はその薬学的に許容される塩に関する。配列番号２がヒトＣＤ４４ｖ６の一部である一方で、配列番号１はラットＣＤ４４ｖ６の一部である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における眼疾患の予防及び／又は治療における使用のための配列番号２又は配列番号１のアミノ酸７〜１１により表示されるアミノ酸配列を含むペプチド化合物、又はその機能的に活性な誘導体、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
前記ペプチド化合物が配列番号２を含む、請求項１に記載のペプチド化合物。
【請求項３】
前記ペプチド化合物が配列番号１を含む、請求項１に記載のペプチド化合物。
【請求項４】
前記眼疾患が、ＶＥＧＦＲ−２の過剰発現に関連する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド化合物。
【請求項５】
前記眼疾患が、内皮細胞の過剰増殖に関連する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド化合物。
【請求項６】
前記眼疾患が、黄斑変性症又は糖尿病性網膜症である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド化合物。
【請求項７】
前記個体が哺乳動物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド化合物。
【請求項８】
前記ペプチド化合物が、配列番号２のアミノ酸７〜１１により表示されるアミノ酸配列を含み、前記個体がヒトである、請求項１、請求項２及び請求項４〜７のいずれか一項に記載のペプチド化合物。
【請求項９】
前記ペプチド化合物が、配列番号１のアミノ酸７〜１１により表示されるアミノ酸配列を含み、前記個体がラットである、請求項１及び請求項３〜７のいずれか一項に記載のペプチド化合物。
【請求項１０】
前記ペプチド化合物が、環状ペプチド又はその薬学的に許容される塩である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチド化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、眼疾患の予防及び／又は治療のためのペプチド化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、既存の血管からの新たな血管の形成をもたらす複雑なプロセスである。胚形成中、血管新生は、造血前駆体からの新たな血管の作製である脈管形成を補完する（complements）。対照的に、成体生物体では、血管新生は、雌生殖周期中の正常な条件下で、又は例えば腫瘍成長及び創傷治癒における病的状態下で起きる。腫瘍塊からの血管新生因子の分泌は、血管の形成を誘導し、これががん細胞に酸素及び栄養分を供給する。これらの血管が最終的には、転移の伝播経路として使用される。
【０００３】
ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＨＧＦ、ＴＮＦ、アンジオゲニン、ＩＬ−８及びアンジオポエチンを含む幾つかの血管新生因子が記載されている。最も著名な血管新生因子は、ＰＩＧＦ（胎盤成長因子）を含む成長因子のＶＥＧＦファミリー成員であるＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ及びＶＥＧＦ−Ｅである。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＲファミリーの３つの関連成員であるＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３に結合する。ＶＥＧＦ及びそれらの受容体の重要性は、各々のノックアウトマウスの表現型により実証される。実際に、ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦＲ−２ノックアウトマウスは、脈管構造形成における不全を示し、胚形成中に死滅する一方で、ＶＥＧＦＲ−１欠損マウスは、血管の過成長が原因で死滅する。血管新生との闘い（Fighting）は、がん療法にとって非常に魅力的な目標となっている。実際に、腫瘍細胞に直接対処するのではなく、血管新生を標的とすることは、同じ試薬を多くの異なるタイプの腫瘍に適用させることができるという利点を有する。
【０００４】
さらに、ＥＣ（内皮細胞）の低い代謝回転率に起因して、ＥＣは、化学療法に耐性となりにくい。化学療法又は放射線療法と併用することができる幾つかの抗ＶＥＧＦ治療投与計画（regimen）が既に存在する。これらの治療は、ＶＥＧＦに対する抗体（ベバシズマブ）、ＶＥＧＦＲ−２シグナル伝達を阻害する幾つかの小分子及びＶＥＧＦへの結合に関して内皮受容体と競合する可溶性ＶＥＧＦ受容体のようなＶＥＧＦ阻害剤を活用する。しかしながら、これらの治療は全て、ほとんどのがん患者にとって相対的に中程度の有益性しかないため、依然として十分改善の余地がある。
【０００５】
ＨＧＦは、別の強力な血管新生因子であり、ＨＧＦ及びその受容体であるｃ−Ｍｅｔの発現は腫瘍血管新生化と相関し、様々な細胞及び組織におけるＶＥＧＦの産生はＨＧＦにより誘導され、ＨＧＦは、ＶＥＧＦの活性を高めることができる。さらに、ＨＧＦは、内皮前駆細胞の動員（mobilization）を導き、可溶性ｃ−Ｍｅｔ受容体（デコイＭｅｔ）の発現は、腫瘍血管新生を損なう。ＣＤ４４ファミリーの細胞接着タンパク質は、細胞外ドメインが異なる様々なアイソフォームを含む。この領域では、１０個の変異体エクソンは、完全に排除され得る（最小アイソフォームＣＤ４４ｓ）か、又は各種組合せにおける選択的スプライシングにより包含され得る（変異体アイソフォーム、ＣＤ４４ｖ）。これらのＣＤ４４ｖアイソフォームの発現は多くの場合、がんにおいて上方調節される。変異体エクソンｖ６を含有するＣＤ４４アイソフォームは、転移性決定因子であることが分かっている。転移におけるＣＤ４４ｖ６の役割は、ほぼ確実にＲＴＫ  ｃ−Ｍｅｔとの協働作用に起因する。多くの癌及び原発性細胞では、ｃ−Ｍｅｔ受容体からの活性化及びシグナル伝達は、ＣＤ４４ｖ６アイソフォームに依存し、ＣＤ４４ｖ６特異的抗体によって、ＣＤ４４ｖ６  ｓｉＲＮＡによって、及び最も興味深いことにはＣＤ４４エクソンｖ６特異的ペプチドによって阻止することができる。これらのアイソフォームは、ｃ−Ｍｅｔ依存的シグナル伝達に関して二重の役割を果たす。それらの細胞外部分はｃ−Ｍｅｔ活性化に必要とされるのに対して、ＣＤ４４の細胞質ドメインは、細胞骨格に結合するＥＲＭタンパク質（エズリン、ラジキシン、モエシン）を補充して（recruit）、そのグアニジン交換因子（ＧＥＦ）ＳＯＳによってＲａｓの活性化を促進する。
【０００６】
ｃ−ＭｅｔはＣＤ４４ヌルマウスの状況ではハプロ不全であることから、ｉｎ  ｖｉｖｏでもＣＤ４４とｃ−Ｍｅｔとの間の協働が確認された。複合体ｃｄ４４−／−ｍｅｔ、＋／−マウスは、重篤な呼吸欠陥を示し、出生時に死滅する。これらのマウスでは、呼吸リズム発生ネットワークにおけるシナプス伝達が、脳において損なわれている。さらに、横隔神経におけるシュワン細胞分化が変更されている。
【０００７】
ＣＤ４４タンパク質は、血管新生に関連することが既に分かっており、２つの重要な血管新生因子であるｂＦＧＦ及びＶＥＧＦは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＥＣ上のＣＤ４４をアップレギュレートし、特異的抗体によるＣＤ４４の標的化は、ＥＣ死滅をもたらす。ＣＤ４４特異的抗体は、フィブリンマトリックスにおけるＥＣ増殖及び毛細血管形成を抑制する。ＥＣの増殖及びＥＣＭの構成成分であるヒアルロナンへのＥＣの接着は、ＣＤ４４に依存する。ＣＤ４４はｂＦＧＦとともに、コラーゲンゲルにおいてＥＣの細管形成に関与する。最終的に、ＣＤ４４ｖ３は、ＥＣで検出され、ｖ３特異的抗体は、これらの細胞の走化性を阻止した。興味深いことに、組織損傷及び炎症時に放出されるマトリックスヒアルロナンの分解産物である低分子量ヒアルロナンは、ＣＤ４４への結合によってＥＣ増殖を刺激する。このことが、ＭＡＰキナーゼ経路の活性化、及び続く初期応答遺伝子の誘導をもたらす。
【０００８】
ＶＥＧＦＲ−２の活性化におけるその役割に加えて、ＣＤ４４ｖ６もまた、細胞内シグナル伝達に必要である。ＭＡＰＫ経路の活性化に関して、ＣＤ４４ｖ６細胞質ドメインは、上皮細胞においてｃ−Ｍｅｔに関して示されていることに類似して、そのＧＥＦ  ＳＯＳによるＲａｓ活性化を可能にするために、ＥＲＭタンパク質及び細胞骨格を補充するようである。これが特に興味深いのは、ＭＡＰＫ経路は、ＥＣの増殖、生存及び遊走のための血管新生において重大な役割を果たすためである。さらに、Ｍｅｋ１ノックアウトマウスは、胚性致死であり、損なわれた血管新生によって引き起こされる胎盤異常により死亡する。ＭＡＰＫ経路は、Ｒｈｏを阻害することによってＥＣ生存及び発芽（sprouting）を誘導することが分かっている。ＶＥＧＦは、へパリン結合成長因子として記載されており、ＨＳを保有するＣＤ４４エクソンｖ３含有アイソフォームと結合することが分かっている。ＶＥＧＦ−Ａ１２１は、あまり強力でないＥＣ有糸分裂促進因子であり、ＶＥＧＦ−Ａ１６５よりも１０倍〜１００倍低い生理活性を有する。ＶＥＧＦ−Ａ１６５に結合するが、ＶＥＧＦ−Ａ１２１には結合しないＨＳ改変タンパク質であるニューロピリン（ＮＲＰ１）は、ＨＳ部分を提供するための良好な候補であるようである。
【０００９】
多数の実験研究及び臨床研究により、ほとんどの新生血管疾患及び滲出性眼疾患におけるＶＥＧＦの重要な役割が示されている。抗ＶＥＧＦ療法は、多数の予測制御臨床試験において有望な結果を示している。さらに、新生血管加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療における硝子体内抗ＶＥＧＦ療法は、ほとんどの患者において視力を安定化させて、かなりの数の患者において視力を回復させることが示されている。さらに、糖尿病性網膜症を患う患者において網膜ＶＥＧＦＲの発現が増大することが既知である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の基礎となる技術的課題は、眼疾患の予防及び／又は治療に使用することができる新規薬剤を提供することである。
【００１１】
上記技術的課題に対する解決は、特許請求の範囲を特徴とする実施の形態によって達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
特に、本発明は、個体における眼疾患の予防及び／又は治療における使用のための配列番号２（ＫＥＱＷＦＧＮＲＷＨＥＧＹＲ）又は配列番号１（ＫＥＫＷＦＥＮＥＷＱＧＫＮＰ）のアミノ酸７〜１１により表示されるアミノ酸配列を含むペプチド化合物、又はその機能的に活性な誘導体、又はその薬学的に許容される塩に関する。配列番号２がヒトＣＤ４４ｖ６の一部である一方で、配列番号１はラットＣＤ４４ｖ６の一部である。
【００１３】
別の態様では、本発明は、個体における眼疾患の予防及び／又は治療用の薬剤の製造における使用のための配列番号２又は配列番号１により表示されるアミノ酸配列を含むペプチド化合物、又はその機能的に活性な誘導体、又はその薬学的に許容される塩に関する。
【００１４】
好ましい実施の形態では、本発明のペプチド化合物は、配列番号２又は配列番号１のアミノ酸７〜１１で構成されるペプチドである。
【００１５】
本発明の別の好ましい実施の形態では、本発明のペプチド化合物は、配列番号２又は配列番号１で構成されるペプチドである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のペプチド化合物は、欧州特許出願第１  ６４７  ５５６号に記載される任意のペプチド化合物であり得る。
【００１７】
好ましい実施形態では、本発明のペプチド化合物は、配列番号２若しくは配列番号１のフラグメントを含むか、又はそれらで構成され、上記フラグメントは、ＣＤ４４とＶＥＧＦＲ−２との間の複合体形成を阻害する活性を有する。
【００１８】
例えば、本発明のペプチド化合物は、
（ａ）配列番号２又は配列番号１で示されるようなアミノ酸配列を含むか、又はそれらで構成されるペプチド、
（ｂ）配列番号２又は配列番号１のフラグメントで構成され、かつＣＤ４４と、ＶＥＧＦＲ−２との間の複合体形成を阻害する活性を有するペプチド、
（ｃ）異種アミノ酸配列に融合された（ａ）若しくは（ｂ）によるペプチドを含むか、又はそれらで構成される異種融合ペプチド、及び
（ｄ）ＣＤ４４と、ＶＥＧＦＲ−２との間の複合体形成を阻害する活性を有する（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）によるペプチドの誘導体
からなる群から選択される。
【００１９】
本発明の好ましい実施の形態では、本発明のペプチド化合物は、
（ａ）配列番号２若しくは配列番号１で示されるようなアミノ酸配列を含むか、又はそれらで構成されるペプチド、
（ｂ）下記アミノ酸配列：
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸２〜１４、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸２〜１３、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸２〜１２、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸２〜１１、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸３〜１４、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸３〜１３、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸３〜１２、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸３〜１１、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸４〜１４、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸４〜１３、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸４〜１２、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸４〜１１、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸５〜１４、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸５〜１３、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸５〜１２、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸５〜１１、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸６〜１４、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸６〜１３、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸６〜１２、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸６〜１１、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸７〜１４、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸７〜１３、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸７〜１２、
配列番号２又は配列番号１のアミノ酸７〜１１
のいずれか１つを含むか、又はそれらで構成されるペプチド、及び
（ｃ）異種アミノ酸配列に融合された（ａ）又は（ｂ）を含む異種融合ペプチド
からなる群から選択される。
【００２０】
本発明のペプチド化合物は、他のタンパク質に由来するアミノ酸配列を含んでもよい。したがって、好ましい実施の形態では、本発明のペプチドは、別の（好ましくは、異種）アミノ酸配列に融合された上記アミノ酸配列の１つを含む融合ペプチドを含む。異種アミノ酸配列は、１個、２個、３個、４個若しくはそれ以上のアミノ酸を含み得るか、又はそれらで構成され得る。異種アミノ酸配列は例えば、少なくとも５個、若しくは少なくとも１０個、若しくは少なくとも２０個の異種アミノ酸を含み得るか、又はそれらで構成され得る。異種アミノ酸配列は、本発明のペプチド化合物のＮ末端及び／又はＣ末端に融合され得る。
【００２１】
本発明の更なる実施の形態では、本発明のペプチド化合物は、上述のペプチドの誘導体である。「誘導体」という用語は、本明細書中で使用する場合、ペプチド化合物の機能的に活性な誘導体、変異体及び化学的誘導体を含み、野生型と異なる翻訳後修飾、例えばグリコシル化パターンを包含する。
【００２２】
「機能的に活性な誘導体」という用語は、本明細書中で使用する場合、アミノ酸の欠失、付加及び／又は置換を含有する誘導体に関し、その存在、非存在又は置換は、ペプチド化合物の活性に対して実質的に影響を与えない（例えば、保存的アミノ酸置換、即ち、類似した化学特性を有するアミノ酸によるアミノ酸の置換）。
【００２３】
ペプチドの「変異体」は、全ペプチド又は本質的に同じ機能を有するそれらのフラグメントのいずれかに実質的に類似した分子を指すと意図される。第１のペプチドの変異体は、上記第１のペプチドに関して、１個〜５個、好ましくは１個〜４個、より好ましくは１個〜３個、より好ましくは１個又は２個のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失を有する第２のペプチドであり得る。例えば、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化及び内部移行並びにＥｒｋのリン酸化をもたらすＣＤ４４とＶＥＧＦＲ−２との間の複合体形成を阻害する活性が、配列番号２で示されるようなアミノ酸配列で構成されるペプチドの活性と実質的に同じである限りは、配列番号２の変異体は、配列番号２に関して、１個〜５個のアミノ酸置換を有し得る。
【００２４】
分子は、それが第１のペプチド中に存在しない更なる化学部分を含有する場合の第１のペプチドの「化学的誘導体」である。かかる部分は、例えば分子の溶解度、吸収又は生物学的半減期を改善させ得る。代替的に、この化学部分は、例えば分子の毒性を減少させ得るか、又は分子の任意の望ましくない副作用を排除若しくは減弱させ得る。
【００２５】
概して、誘導体は、それが由来するペプチド化合物のＣＤ４４とＶＥＧＦＲ−２との間の複合体形成を阻害する活性の少なくとも７５％、好ましくは少なくとも１００％の活性を有する。
【００２６】
所定のペプチドの「フラグメント」という用語は、本明細書中で使用する場合、上記ペプチドの任意のペプチドサブセットを指すと意図される。概して、フラグメントは、上記ペプチドの配列の少なくとも２個の隣接アミノ酸を含む。好ましくは、フラグメントは、上記ペプチドの少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも６個、より好ましくは少なくとも８個、更に好ましくは少なくとも１０個の隣接アミノ酸を含む。
【００２７】
ＣＤ４４とＶＥＧＦＲ−２との間の複合体形成を阻害する活性を求める方法は、当該技術分野で既知である。本発明のペプチド化合物は、ＣＤ４４とＶＥＧＦＲ−２との間の複合体形成を阻害する活性を有する。阻害活性は、下流のＶＥＧＦＲ−２の活性化の低減をもたらす。好ましくは、下流のＶＥＧＦＲ−２の活性化は、対照ペプチドの存在下で下流のＶＥＧＦＲ−２の活性化に関して、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、更に好ましくは少なくとも７０％低減される。例えば、活性は、細胞培養において又はｉｎ  ｖｉｖｏで求めることができる。
【００２８】
「ペプチド化合物」という用語は、本明細書中で使用する場合、少なくとも１つのペプチドを含む化合物を意味する。本願の１つの実施の形態では、「ペプチド化合物」は、ペプチドで構成される。「ペプチド化合物」という用語は、ペプチドとアミノ酸ではない化学部分とを含む化合物を包含する。
【００２９】
「ペプチド」という用語は、本明細書中で使用する場合、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合により互いに結合された２個以上のアミノ酸を含む任意の化合物、即ちペプチドアイソステア（peptide isostere）を指す。「ペプチド」は、短鎖及び、一般的にポリペプチドと称されるより長い鎖の両方を指す。ペプチドは、２０個の遺伝子によりコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。ペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然プロセスにより、当該技術分野で既知である化学的修飾技法により、修飾されたアミノ酸配列を包含する。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ末端又はカルボキシル末端を包含するペプチドにおける任意の場所で起こり得る。同じタイプの修飾は、所定のペプチドにおいて幾つかの部位で同じ程度又は様々な程度で存在し得る。同様に、所定のペプチドは、多数のタイプの修飾を含有してもよい。
【００３０】
ペプチドは分岐していてもよく、ペプチドは、分岐を伴って又は分岐を伴わずに、環状であってもよい。環状ペプチド、分岐ペプチド及び分岐環状ペプチドは、翻訳後の天然プロセスに起因し得るか、又は合成法によって作製され得る。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部位の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルコリンの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合による架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介性付加（例えば、アルギニル化）、ユビキチン化及びＳＵＭＯ化が挙げられる。
【００３１】
「ペプチド化合物」という用語は、好ましい実施の形態として、本明細書中に記載されるペプチドの塩、好ましくは薬学的に許容される塩を包含する。「薬学的に許容される塩」という用語内に包含される塩は、本発明のペプチド化合物の無毒性塩を指す。代表的な塩及びエステルとしては、アセテート、アスコルベート、ベンゼンスルホネート、ベンゾエート、ビカーボネート、ビスルフェート、ビタートレート、ボレート、カンシレート（caamsylate）、カーボネート、シトレート、ジヒドロクロリド、メタンスルホネート、エタンスルホネート、ｐ−トルエンスルホネート、シクロヘキシルスルファメート、キネート、エデテート、エジシレート、エストレート、エシレート、フマレート、グルコネート、グルタメート、グリセロホスフェート（glycerophophates）、ヒドロブロミド、ヒドロクロリド、ヒドロキシナフトエート、ラクテート、ラクトビオネート、ラウレート、マレート、マレエート、マンデレート、メシレート、ムケート、ナプシレート、ニトレート、ｎ−メチルグルカミン、オレエート、オキサレート、パルモエート、パモエート（エンボネート）、パルミテート、パントテネート、パークロレート、ホスフェート／ジホスフェート、ポリガラクツロネート、サリチレート、ステアレート、スクシネート、スルフェート、スルファメート、スバセテート、スクシネート、タンネート、タートレート、トシレート、トリフルオロアセテート及びバレレートが挙げられる。他の塩としては、Ｃａ塩、Ｌｉ塩、Ｍｇ塩、Ｎａ塩及びＫ塩、リシン又はアルギニンのようなアミノ酸の塩、グアニジン、ジエタノールアミン又はコリン、アンモニウム、置換アンモニウム塩又はアルミニウム塩が挙げられる。塩は、従来の方法により調製される。
【００３２】
本発明のペプチドは、少なくとも２アミノ酸長を有する。好ましくは、ペプチドの長さは、少なくとも４アミノ酸、より好ましくは少なくとも５アミノ酸、より好ましくは少なくとも６アミノ酸、より好ましくは少なくとも８アミノ酸、最も好ましくは少なくとも１０アミノ酸である。最大長は特に限定されない。しかしながら、ペプチドは、約６アミノ酸〜約３０アミノ酸、好ましくは約８アミノ酸〜約２５アミノ酸、より好ましくは約１０アミノ酸〜約２０アミノ酸、最も好ましくは約１０アミノ酸〜約１５アミノ酸の長さを有することが好ましい。より大きいペプチドは、例えば異種アミノ酸配列を伴う融合ペプチドが調製される場合に使用することができる。
【００３３】
本発明のペプチドは単離ペプチドであることが好ましい。
【００３４】
同様に、本発明のペプチドは純粋状態であることが好ましい。好ましくは、ペプチドは８０％純粋、好ましくは９０％純粋、より好ましくは９５％純粋、更に好ましくは９９％純粋であり、高分子、特に他のペプチドの混入に関して、９９．９％を上回り薬学的に純粋な状態であることが特に好ましい。ペプチドは、感染及び発熱因子を含まないことが好ましい。
【００３５】
好ましくは、純粋ペプチドは、他のペプチドを実質的に含まない。この文脈で使用される場合、「純粋な」という用語は、二量体のような代替的な物理的形態にある同じペプチドの存在を排除しない。
【００３６】
本発明のペプチドは、化学合成によって、又は宿主細胞における組換え発現によって調製され得る。化学合成による調製が好ましい。タンパク質産物として、配列番号２若しくは配列番号１の化合物、又は本発明の他のペプチドは、液相又は固相ペプチド合成の技法による生産に適している。合成ペプチド合成アプローチは概して、自動合成機及び固相として適切な樹脂（そこへ、所望のペプチドのＣ末端アミノ酸が結合される）の使用を伴う。続いて、Ｎ末端方向でのペプチドの伸長は、通常ＦＭＯＣ又はＢＯＣベースの化学プロトコルを使用して、次の所望のアミノ酸の適切に保護された形態を、合成が完了するまで順次カップリングさせることによって達成される。次に、通常同時に樹脂からのペプチドの切断とともに、保護基はペプチドから切断され、続いてペプチドは、従来技法を使用して、例えば溶媒としてアセトニトリル及びイオン対形成剤としてトリフルオロ酢酸を使用した逆相ＨＰＬＣによって、単離及び精製される。かかる手順は概して、多数の刊行物に記載されている。
【００３７】
本発明のペプチド化合物は、本明細書中に記載されるペプチド配列から転換された（diverted）化学的に誘導される構造、又はその薬学的に許容される塩及び／若しくはそれらの生理学的に機能的な誘導体であり得る。化学的に誘導される構造は、環状ペプチド、若しくはそれらの薬学的に許容される塩及び／又はそれらの生理学的に機能的な誘導体であり得る。本発明は更に、本発明のペプチド化合物へ代謝させる分子の使用を包含する。
【００３８】
本発明による個体は、（脊椎動物のような）眼疾患にかかりやすい任意の個体であり得る。好ましい実施の形態では、個体は（例えば、マウス、ラット、ヒト、ウサギ、ブタ、ウシ又はウマのような）哺乳類であり、最も好ましくは、ラット又はヒトである。
【００３９】
好ましい実施の形態では、ペプチド化合物は、ラットにおける眼疾患の予防及び／又は治療における使用のための配列番号１の少なくともアミノ酸７〜アミノ酸１１により表示されるアミノ酸配列、又はその機能的に活性な誘導体、又はその薬学的に許容される塩を含む。別の好ましい実施の形態では、ペプチド化合物は、ヒトにおける眼疾患の予防及び／又は治療における使用のための配列番号２の少なくともアミノ酸７〜アミノ酸１１により表示されるアミノ酸配列、又はその機能的に活性な誘導体、又は薬学的に許容される塩を含む。
【００４０】
本発明の好ましい実施の形態では、眼疾患は、血管新生に関連しており、例えば、眼疾患は、ＶＥＧＦＲ−２の過剰発現と関連し得る。本発明によれば、眼疾患は、例えばＶＥＧＦＲ−２の過剰発現により引き起こされる可能性があり、及び／又は眼疾患は、内皮細胞の過剰増殖と関連され得る。
【００４１】
本発明の別の好ましい実施の形態では、眼疾患は、黄斑変性症、糖尿病性網膜症からなる群から選択される。本発明の特に好ましい実施の形態では、眼疾患は、黄斑変性症又は糖尿病性網膜症である。
【００４２】
本発明の別の目的では、適切な量で本発明のペプチドを投与する工程を含む上記で規定されるような眼疾患の治療に関する方法が提供される。
【００４３】
本発明の薬剤は、単独で又は薬学的に許容されるキャリア、賦形剤及び／若しくは希釈剤と混合して、少なくとも１つの本発明の化合物を含む、例えば液体、懸濁液、エマルジョン、ロゼンジ、サシェ、アンプル、坐剤、ペッサリー、軟膏、ジェル、ペースト、スプレー、ローション、オイル、ボーラス、舐剤、エアロゾル、粉末、顆粒、錠剤、丸剤、カプセル、注射、溶液、フォーム、クリーム、浣腸等として配合され得る。
【００４４】
任意の特定患者に関する本発明の薬剤の特定用量レベルは、年齢、体重、全体的な健康、性別、食事及び投薬歴、並びに患者の特定疾患の重篤性、及び用いられる特定化合物の活性、投与時間、投与経路、排泄の速度、治療の持続期間、併用して使用される他の薬物、化合物及び／又は材料を含む様々な要因に応じて用いられる。薬剤の適切な投与量は、患者によって様々である。最適な投与量を求めることは、一般的に、治療の任意の危険性又は有害な副作用に対する治療上の有益性のレベルのバランスをとることを包含する。
【００４５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与は、治療のコース全体にわたって、１回用量で、連続して又は断続的に達成され得る。投与の最も有効な手段及び投与量を求める方法は、当業者に既知であり、療法に使用される配合物、療法の目的、処理対象の標的細胞及び治療対象の被験体によって様々である。単回投与又は複数回投与は、主治医によって選択される用量レベル及びパターンを用いて実行することができる。
【００４６】
概して、本発明の薬剤の活性化合物の適切な全身用量は、１日につき被験体の体重１キログラム当たり約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは体重１キログラム当たり０．１ｍｇ〜５００ｍｇ、更に好ましくは体重１キログラム当たり１．０ｍｇ〜５００ｍｇの範囲内である。活性成分が塩、エステル、プロドラッグ等である場合、投与される量は、親化合物に基づいて算出され、したがって使用されるべき実際の重量は、比例して増大する。化合物が局所的に適用される場合、化合物の量は、上記で付与される推定から変化し得る。しかしながら、かかる適用は、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲の薬物の局所濃度に到達するのを目標にする。
【００４７】
本発明によれば、ＣＤ４４細胞表面タンパク質ファミリーの特異的スプライス変異体であり、ラットに由来する場合は配列番号１で表示されるアミノ酸配列を、又はヒトに由来する場合は配列番号２で表示されるアミノ酸配列を有するＣＤ４４ｖ６は、上皮細胞上の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ｃ−Ｍｅｔに関する共受容体として作用することが分かっている。特に、同様に内皮細胞上では、ｃ−Ｍｅｔの活性は、ＣＤ４４ｖ６に依存する。さらに、別のＲＴＫであり、内皮細胞の遊走挙動を調節するＶＥＧＦＲ−２もまた、ＣＤ４４ｖ６によって調節される。ＣＤ４４ｖ６外部ドメイン、及びＣＤ４４ｖ６の特異的細胞外モチーフ又はこのエピトープを阻止する抗体を模倣する小ペプチドは、ＣＤ４４ｖ６媒介性受容体活性化を予防する。これにより、ＣＤ４４ｖ６の細胞外部分は、ｃ−Ｍｅｔ又はＶＥＧＦＲ−２との相互作用に必要とされることが示される。細胞質では、活性化されたｃ−Ｍｅｔ及びＶＥＧＦＲ−２によるシグナル伝達は、ＣＤ４４ｖ６を細胞骨格へと連結させるエズリンによるＣＤ４４カルボキシ末端の結合を必要とする。ＣＤ４４ｖ６は、内皮細胞遊走、発芽、ＨＧＦ又はＶＥＧＦＡにより誘導される細管形成及び形質転換されたランゲルハンス島により放出される血管新生因子に対する応答を制御する。移植された内皮細胞スフェロイドからの血管のｉｎ  ｖｉｖｏでの発達及び腫瘍における血管新生は、ＣＤ４４ｖ６ブロッキング試薬により損なわれ、ｃ−Ｍｅｔ及びＶＥＧＦＲ−２に対するＣＤ４４ｖ６の共受容体機能が、病的状態において血管新生を阻止するための有望な標的であることを示唆している。
【００４８】
したがって、ＣＤ４４ｖ６ペプチドは、例えばＶＥＧＦＲ−２の過剰発現に関連する眼疾患の予防及び／又は治療において血管新生阻害剤として好適に使用することができる。かかる療法に関してＣＤ４４ｖ６ペプチドを使用する利点は数倍となり得る。まず、それらの小さいサイズ（１４ｍｅｒ、又は更には５ｍｅｒ）により、ＣＤ４４ｖ６ペプチドは容易に産生することができ、ＣＤ４４ｖ６ペプチドは免疫応答を誘導する可能性が低く、ＣＤ４４ｖ６ペプチドはそれらの標的部位へ容易に送達され得る。さらに、ＣＤ４４ｖ６ペプチドは、幾つかのＲＴＫを阻止することができ、血管新生及び転移に対して効率的であり、同様に幾つかのタイプの腫瘍の療法においても有効であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ＥＣにおけるＣＤ４４ｖ６の共受容体機能。  Ａ：ＨＵＶＥＣにおけるＣＤ４４変異体のエクソン特異的ＲＴ−ＰＣＲ分析（実験手順を参照）。ｓは、ＣＤ４４定常エクソン５及び１５における２つのプライマーの使用を指し（ＣＤ４４遺伝子の関連部分の概要図における黒四角）、他のレーンは、変異体エクソンにおいてフォワードプライマー及びエクソン１５においてリバースプライマーを用いて実施したＰＣＲを指す。Ｍは、ＤＮＡラダーを指す。  Ｂ：未処理ＨＵＶＥＣ、又はＣＤ４４ｖ６特異的抗体（ａＣＤ４４ｖ６）若しくはヒトｖ６特異的１４ｍｅｒペプチド若しくは対照ペプチドで処理したＨＵＶＥＣにおけるＨＧＦ又はＶＥＧＦ−Ａ１６５により誘導されるシグナル伝達（実験手順を参照）。Ｅｒｋの活性化は、実験手順に記載されるように測定した。  Ｃ：ＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦ−Ａ１６５によるＶＥＧＦＲ−２の活性化は、ＶＥＧＦＲ−２の免疫沈降及びリン特異的ＶＥＧＦＲ−２抗体によるウェスタンブロッティング後に求めた（実験手順を参照）。ＩｇＧは、対照沈降を示す。ＶＥＧＦ−Ａ１６５及びペプチドによる処理は、実験手順に記載されるように実施した。  Ｄ：ＣＤ４４ｖ６ＥＣＤ（ＣＤ４４ｖ６外部ドメイン）又は示されるような突然変異様式の存在下で示されるようなリガンドによるＨＵＶＥＣにおけるシグナル伝達の誘導。処理は、実験手順に記載されるように行った。  数字は、コンピュータプログラムＩｍａｇｅ  Ｊにより算出された誘導倍数を示す。
【図２】ＣＤ４４ｖ６の共受容体機能は、へパリン硫酸化に非依存的である。  Ａ：ＨＵＶＥＣを、示されるようなＣＤ４４ｖ６特異的抗体及びペプチドの存在下でＶＥＧＦ−Ａ１２１により誘導した。ＶＥＧＦＲ−２（図１Ｃと同様）及びＥｒｋの活性化を求めた。ＩｇＧレーンは、ＩｇＧ対照抗体による免疫沈降に対応する。  Ｂ：ＨＥＫ２９３細胞を、ＶＥＧＦＲ−２発現構築物により一過的にトランスフェクトした（実験手順）。次に、ＨＥＫ２９３細胞をＶＥＧＦ及び示されるようなペプチドで処理して、ＶＥＧＦＲ−２の活性化（図１Ｃと同様）又はＥｒｋへのシグナル伝達を測定した。  Ｃ：ＢＳｐ７３ＡＳ細胞（ＡＳ）又はＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞を、ＶＥＧＦＲ−２発現構築物により一過的にトランスフェクトして、示される場合にはＶＥＧＦ−Ａ１６５で活性化した。ＶＥＧＦＲ−２の活性化は、ウェスタンブロッティングにおいて直接リンＶＥＧＦＲ−２特異的抗体（Ｔｙｒ  １１７５）を使用して求めた。  数字は、誘導倍数を指す。
【図３】ＶＥＧＦＲ−２及びＣＤ４４ｖ６は複合体を形成する。  ＣＤ４４ｖ６特異的抗体（ａｖ６）、ＩｇＧ対照又はヒトｖ６特異的１４ｍｅｒペプチド又は対照ペプチドの存在下での（Ａ）ＨＣＭＥＣ（ヒト心臓微小血管ＥＣ）における及び（Ｂ）ＨＡＯＥＣ（ヒト大動脈ＥＣ）における、ＨＧＦ又はＶＥＧＦ−Ａ１６５により誘導される受容体活性化（実験手順）。Ｅｒｋの活性化は、実験手順に記載されるように測定した。  Ｃ：ＣＤ４４特異的抗体ＩＭ７を使用したＶＥＧＦ−Ａ１６５で処理したＨＵＶＥＣ又は処理していないＨＵＶＥＣ由来のＣＤ４４の免疫沈降、及びＶＥＧＦＲ−２抗体によるウェスタンブロッティング。無関連ＩｇＧ抗体又はＶＥＧＦＲ−２抗体による免疫沈降を対照として使用した。
【図４】ＶＥＧＦＲ−２シグナル伝達は、ＣＤ４４へのエズリン結合に依存する。  Ａ：ＶＥＧＦＲ−２発現構築物で一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、ＣＤ４４細胞質ドメイン（ＣＤ４４ｃｙｔ）又はエズリン結合部位で突然変異させたＣＤ４４細胞質ドメイン（ＣＤ４４ｍｕｔｃｙｔ；実験手順）のいずれかを発現するベクターで同時トランスフェクトさせた。ＶＥＧＦによる誘導時のＶＥＧＦＲ−２の活性化（図２Ｃに記載されるように）及びＥｒｋへのシグナル伝達を求めた。  Ｂ：ＶＥＧＦＲ−２発現構築物で一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞は、示されるようにドミナントネガティブなエズリン（ｄｎエズリン）を発現するベクターで同時トランスフェクトさせて、ＶＥＧＦ処理時のＥｒｋへのシグナル伝達を求めた。  数字は、誘導倍数を示す。
【図５】ＥＣの遊走は、ＣＤ４４ｖ６を必要とする。  ひっ掻き傷閉塞（scratch wound closing）アッセイは、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ１６５又はＶＥＧＦ−Ａ１２１及び示されるようなペプチド又は抗体のいずれかで処理した集密的なＨＵＶＥＣ又はＨＡＯＥＣを用いて実施した（実験手順を参照）。数字は、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｊ解析プログラムを使用することによって定量化した処理の２４時間後のひっ掻き領域中のフリー領域のパーセントを示す。
【図６】内皮スフェロイドの発芽及びＨＵＶＥＣの管形成は、ＣＤ４４ｖ６に依存する。  Ａ：ＨＵＶＥＣのスフェロイド（実験手順を参照）は、コラーゲン中に配置させて、示されるように処理した。発芽を４８時間後に検査して、コンピュータプログラムＩｍａｇｅ  Ｊで定量化した。  Ｂ：マトリゲル層の最上部上でのＨＵＶＥＣの血管形成及びそれらの定量化を、実験（experimantal）手順に記載されるように求めた。  アスタリスクは統計学的有意性を示す（ｐ値０．０５未満）。標準偏差は、３回の別個の実験から算出した。
【図７】ランゲルハンス島に対するＨＵＶＥＣの血管新生応答、及びｉｎ  ｖｉｖｏでの脈管構造の形成はＣＤ４４ｖ６を必要とする。  Ａ：ＨＵＶＥＣを、ＣＤ４４ｖ６特異的阻害剤の非存在下又は存在下で、生後８週〜９週で入手したＲｉｐ１Ｔａｇ２マウスの過形成性血管新生ランゲルハンス島とともにインキュベートした。血管新生応答を、右図の非血管新生小結節と比較した場合に左図で示す。定量化のために、６０個の島を分析した。  Ｂ：マトリゲル／フィブリンマトリックスにおけるＨＵＶＥＣのスフェロイドを、成長因子（ＨＧＦ又はＶＥＧＦ−Ａ１６５）及び示されるようなペプチド又は抗体と一緒に、ＳＣＩＤマウスへ皮下注射した（実験手順を参照）。移植の２１日後、マトリゲル／フィブリンプラグにおいて形成される微小血管の数を求めた。１つの条件につき最低３つの異なるプラグを分析した。
【図８】腫瘍に誘導される血管新生は、ＣＤ４４ｖ６ペプチド及び抗体により阻害される。  Ａ：経時的にｆｐＶＣＴ（フラットパネル検出器ボリュームコンピュータ断層撮影法）データ組の３Ｄ再構成によりｉｎ  ｖｉｖｏで可視化された腫瘍及び腫瘍血管。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を、ＳＣＩＤマウスへ同所に移植した（実験手順を参照）。１週後、マウスを対照ＩｇＧ又はマウスＣＤ４４ｖ６抗体で１週に３回、４週間処理した。図は、移植の３週後、４週後及び５週後の代表的な腫瘍保有動物を示す。小血管のより良好な表示（demonstration）のために、最終的なスキャン用に従来の造影剤Ｉｓｏｖｉｓｔ  ３００の代わりに、血液プール剤ｅＸｉａ  １６０を使用した。腫瘍の局在化は、矢印によって示される。腫瘍を取り囲みかつ浸潤する小血管の密度は、対照と比較してＣＤ４４ｖ６抗体で処理したマウスにおいて減少することに留意されたい。実験の定量結果を表１に示す。スケール棒：１０ｍｍ。  Ｂ：ヒト膵がん細胞（Ｌ３．６ｐｌ）を、ヌードマウスにおいて同所に移植した（実験手順を参照）。１週後、マウスをＰＢＳ、対照ペプチド又はマウス特異的ＣＤ４４ｖ６ペプチドで１週に３回で３週間処理した。次に、動物を屠殺して、腫瘍切片を内皮マーカーＣＤ３１で染色した。代表的な染色を示す。５匹の動物から腫瘍体積、血管数及び平均血管サイズ（方法を参照）を求めて、結果をグラフに示す。
【実施例】
【００５０】
本発明はここで、下記実施例でさらに説明するが、これに限定されない。
実験手順：
【００５１】
細胞及び細胞培養
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Provitri GmbH、ドイツ、ベルリン）は、ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔＭｉｘ（Provitro GmbH、ドイツ、ベルリン）を添加した内皮細胞成長培地中で成長させた。ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＯＥＣ、Promocell、ドイツ、ハイデルベルク）及びヒト心臓微小血管内皮細胞（ＨＣＭＥＣ、Promocell、ドイツ、ハイデルベルク）は、製造業者の取扱説明書に従ってサプリメントを備えた内皮細胞成長培地ＭＶ（Prmocell、ハイデルベルク）中で成長させた。ＥＣ細胞は全て、９回を超えて継代培養させなかった（not passaged）。ＨＥＫ２９３細胞（American Tissue Culture Collection、ＡＴＣＣ、ドイツ、ウェーゼル）及びエストロゲン非依存的ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１（American Type Culture Collection、メリーランド州ロックビル）は、１０％ＦＣＳ（PAA Laboratories、ドイツ、コエルバ（Coelbe））を添加したＤＭＥＭ（Invitrogen、ドイツ、カールスルーエ）中で成長させた。ラット膵癌細胞株ＢＳｐ７３ＡＳ及びそのトランスフェクタント（Ｂｓｐ７３ＡＳｓ６）は、ＲＭＰＩ（Invitrogen、ドイツ、カールスルーエ）＋１０％ＦＣＳ中で成長させた。ドイツのミュンヘン大学のC. Bruns氏によりご厚意で提供されたヒト膵がん細胞株Ｌ３．６ｐｌは、１０％ＦＣＳ、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン及び２倍ビタミン溶液（Invitrogen、ドイツ、カールスルーエ）を添加したＤＭＥＭ中に維持した。
【００５２】
抗体及び他の試薬
ＣＤ４４ｖ６に対するヒトモノクローナル抗体ＶＦＦ１８（１４ｍｅｒ：ＫＥＱＷＦＧＮＲＷＨＥＧＹＲ、配列番号２）は、Bender（オーストリア、ウィーン）から入手した。汎ＣＤ４４抗体ＩＭ７は、BD Biosciences（カリフォルニア州サンディエゴ）製のものであり、抗Ｅｒｋ  １（Ｋ−２３）抗体は、Santa Cruz（ドイツ、ハイデルベルグ）製であった。リンＶＥＧＦＲ−２（Ｔｙｒ１１７５）及びリンＥｒｋ（リンｐ４４／４２）は、Cell Signaling Technology（イングランド、ベバリー）から購入した。ＶＥＧＦＲ−２に対する抗体は、R&D Systems（ドイツ、ウィースバーデン）から又はSanta Cruz（ハイデルベルク）（クローンＡ−３）から入手した。ＨＲＰで標識した二次抗体は、Dako（ドイツ、ハンブルク）から購入した。ＶＥＧＦ−Ａ１６５及びＶＥＧＦ−Ａ１２１は、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）で産生された。ＨＧＦは、George Vande Woude（Van Andel Institute、米国、グランド・ラピッズ）のご厚意による贈呈であった。ｖ６ヒトペプチド（１４ｍｅｒ）及び対照ペプチドは、Matzke他、「５−アミノ酸ペプチドはＭｅｔ及びＲｏｎ依存的細胞遊走を阻止する（A 5-amino-acid peptide blocks Met and Ron dependent cell migration）」（Cancer research 65: 6105-6110）に記載されている。ｖ６マウスペプチドの配列は、ＱＥＴＷＦＱＮＧＷＱＧＫＮＰ（配列番号３）であった。
【００５３】
構築物及びタンパク質産生
ＶＥＧＦＲ−２発現プラスミドｐＢＥ  ｈＶＥＧＦＲ−２は、フォワードプライマー：
ＧＣＴＣＴＴＣＧＧＧＧＡＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧ（配列番号４）及びリバースプライマー：
ＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＴＡＡＡＧＣＡＡＧＴＡＡＡＡＣＣＴＴＴＡＴＣＡＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＧＡＧ（配列番号５）を用いてＰＣＲサブクローニング法によりヒトＶＥＧＦＲ−２をコードする配列を導入して、ＧＦＰリーディングフレームを除去することによって、Clontech（カリフォルニア州マウンテンビュー）製のｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクターから得た。
【００５４】
可溶性野生型及び突然変異ＧＳＴ−ＣＤ４４細胞質ドメインをコードする構築物が記載されており、C. Isacke氏（Breakthrough Breast Cancer Research Center、英国、ロンドン）から入手した。ドミナントネガティブなエズリン（ｄｎエズリン）発現構築物は、M. Arpin氏（Institute Pasteur、フランス、パリ）からの贈呈であった。ピチア・パストリスにおけるＶＥＧＦ−Ａ及びＣＤ４４ｖ６外部ドメイン（ＣＤ４４ｖ６ＥＣＤ）を産生するための発現ベクターは、Invitrogen（米国カリフォルニア州カールズバッド）製のｐＰＩＣＺαＡベクター系を使用して生成した。発現ベクターは全て、ＰＣＲサブクローニング技術を用いて作製し、ＶＥＧＦ−Ａ１６５を除く全ての組換えタンパク質が、アミノ末端に６つのヒスチジンタグを保有した。ピチア・パストリス株Ｘ３３は、電気穿孔によりトランスフェクトして、ゼオシン耐性クローンを採取して（picked）、メタノール誘導時に導入遺伝子発現に関して試験した。分泌されたタンパク質を、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）により酵母培養上清から精製して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（GE Healthcare、ドイツ、ミュンヘン）上で完全に精製した（polished）。
【００５５】
エクソン特異的ＲＴ−ＰＣＲ
エクソン特異的ＲＴ−ＰＣＲは、Konig他、１９９６年、「トランス作動性因子はＣＤ４４スプライス変異体の発現を調節する（Trans-acting factors regulate the expression of CD44 splice variants）」（EMBO J. 15:4030-4039）に記載されるように、同じヒトプライマーを使用して実施した。
【００５６】
トランスフェクション
ＨＥＫ２９３細胞を、製造業者のプロトコルに従って、６ウェルプレート中でリポフェクトアミン  ２０００（Invitrogen、ドイツ、カールスルーエ）で一過的にトランスフェクトした。ＢＳｐ７３ＡＳ細胞及びＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞のトランスフェクションを電気穿孔により実施した。簡潔に述べると、３×１０６個の細胞を、氷上でベクターＤＮＡ  ５μｇと混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（Bio-Rad、ドイツ、ミュンヘン）を使用して、２５０μＦ、０．２８ｋＶで４ｍｍ電気穿孔キュベット中で、電気穿孔を実施した。血清を含有する予め温めた培地を添加して、細胞を６ウェルプレート中に分配した。次に、細胞を２４時間成長させ、血清を２４時間飢餓状態にさせて、実験に使用した。
【００５７】
腫瘍細胞の注入
ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞（動物１匹当たり１×１０６個）を亜集密的に収集して、ＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳ  ５０μｌ中で再懸濁した。皮膚切開を介して、インスリンシリンジを用いて、麻酔をかけた雌ＳＣＩＤマウス（株Ｃ．Ｂ−１７／Ｚｔｍ−ｓｃｉｄ）の第４乳腺複合体の乳腺脂肪体へ非常にゆっくりと細胞を移植した。皮膚用の断続バイクリル縫合（５／０、Ethicon、ドイツ、ノルダーシュテット）を使用して、切開を閉塞した。腫瘍を１週間成長させ、続いて動物をグループに分割して（１グループ当たり６匹〜７匹の動物）、抗マウスＣＤ４４ｖ６（クローン  ９Ａ４）、対照ＩｇＧ（NatuTec、ドイツ、フランクフルト）、マウスｖ６ペプチド又は対照ペプチド  ２０μｇで、１週間に３回、非経口処理した。腫瘍成長は、ノギスを使用して、又はｆｐＶＣＴ画像化により１週間に１回、モニタリングした（以下を参照）。腫瘍細胞移植の５週後に、動物を屠殺して、腫瘍を切除して、測定して、半分に分割して、免疫組織化学的分析用に４％ホルマリン又は亜鉛固定剤（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中に０．５ｇ／ｌの酢酸カルシウム、５ｇ／ｌの酢酸亜鉛、５ｇ／ｌの塩化亜鉛）中で２４時間固定させた。Ｌ３．６ｐｌヒト膵がん細胞を同所に注入した。簡潔に述べると、小さな左腹部脇腹切開を行い、脾臓を露出させた。５×１０５個の細胞／４０μｌ（ハンクス緩衝塩溶液、Invitrogen、ドイツ、カールスルーエ）を、３０ゲージ針を使用して脾臓の真下の膵臓の被膜領域へ注入した。注入の傍らに綿棒を１分間保持して、漏出を防いだ。出現してくる流動的な泡は、被膜膵臓内注入の成功の徴候とみなした。腫瘍細胞の移植の７日後、マウスをそれぞれ５匹のマウスのグループへと無作為に割り当てた：（１）ＰＢＳ、（２）対照ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）、（３）ＣＤ４４ｖ６ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）を１週に３回注入。処理の開始の２１日後に、動物を屠殺した。腫瘍体積は、長さ×高さ×幅÷２として算出した。組織は上述のように加工処理した。動物は全て、動物実験に関するドイツの規制に従って収容し、実験は全て、欧州及びドイツの法的規制に従って実施した。マウスは全て、Harlan（ドイツ）から入手した。
【００５８】
フラットパネル検出器ボリュームコンピュータ断層撮影法（ｆｐＶＣＴ）画像化
マウスは、ノンクリニカルボリュームコンピュータ断層撮影法プロトタイプフラットパネル検出器（GE Global Research、米国ニューヨーク州ニスカユナ）により画像化した。簡潔に述べると、マウスを０．８％〜１％の気化イソフルランで麻酔して、系のｚ軸に対して垂直に配置した。スキャニングの３０秒前に、ヨウ素含有造影剤Ｉｓｏｖｉｓｔ  ３００（マウス１匹当たり１５０μｌ、Bayer-Schering、ドイツ、ベルリン）を静脈内に適用した。小さな血管のより良好な表示のために、Ｉｓｏｖｉｓｔ  ３００を血液プール剤ｅＸｉａ  １６０（Binitio Biomedical Inc., カナダ、オタワ）で置き換え、それを解剖の当日にスキャンの９０秒前に使用した。データ組は全て、同じプロトコルで取得した。１回転につき５００回の表示（view）、回転時間４秒、３６０の使用検出器列、管電圧８０ｋＶｐ及び電流１００ｍＡ。修正Ｆｅｌｄｋａｍｐアルゴリズムが画像再構成に使用され、等方性高解像度ボリュームデータ組（５１２×５１２マトリクス、およそ１００£ｇｍの等方性ボクセルサイズで）。腫瘍区分け及び体積推定に関して、ｖｏｘｔｏｏｌｓ  ３．０．６４  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ４．２（GE Healthcare、英国）を用いて、データ組を解析した。
【００５９】
ＲＴＫ及びＥｒｋの活性化
血清飢餓細胞（２４時間）を、成長因子ＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を用いて３７℃にて５分間、又はＶＥＧＦ−Ａ１６５又はＶＥＧＦ−Ａ１２１（４０ｎｇ／ｍｌ）を用いて３７℃にて８分間誘導した。示されている場合は、３７℃で１０分間の誘導（１００μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４４ｖ６、１００ｎｇ／ｍｌのｖ６ペプチド又は１００ｎｇ／ｍｌの対照ペプチド、０．５μｇ／ｍｌのＣＤ４４ｖ６ＥＣＤ）の前に、細胞をブロッキング試薬で処理した。細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した。活性化Ｅｒｋを検出するために、１００ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する沸騰ＳＤＳサンプル緩衝液中に細胞を溶解させて、リン酸化Ｅｒｋに対する抗体を使用して、ウェスタンブロット分析に付した。Ｅｒｋ負荷対照は、剥脱した同じブロット上で実施して（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、０．８％ＤＴＴ）、Ｅｒｋ抗体でプローブした。活性化ＶＥＧＦＲ−２を検出するために、細胞を還元性サンプル緩衝液中に溶解させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのブロットを、リン酸化ＶＥＧＦＲ−２に対する抗体でプローブした。代替的には、溶解液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭ  アポロチニン及びロイペプチン）を調製した。遠心分離後、清澄な溶解液（１２０００ｒｐｍで１５分間）をＶＥＧＦＲ−２抗体（クローン  Ａ−３、Santa Cruz、ドイツ、ハイデルベルク）又はマウスＩｇＧ対照（Santa Cruz、ドイツ、ハイデルベルク）とともに４℃で一晩インキュベートした後、プロテインＡ／Ｇアガロースビーズ（Merck、ドイツ、ダルムシュタット）とともに４℃で２時間、インキュベートした。ビーズを３回洗浄して、サンプル緩衝液中で沸騰させて、リン特異的ＶＥＧＦＲ−２抗体を使用してウェスタンブロット分析に付した。負荷対照を得るために、ブロットを剥脱して、ＶＥＧＦＲ−２抗体で再プローブした。ブロットは、増強した化学発光系（ＥＣＬ、Thermo FIshcer Scientific Inc.,マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して染色した。ウェスタンブロット分析におけるバンドは、プログラムＩｍａｇｅ  Ｊで定量化した。
【００６０】
共免疫沈降
共免疫沈降に関して、ＨＵＶＥＣ（１０ｃｍプレート中に１．５×１０６個）は、上述するように各々のリガンドによって誘導させた。細胞を溶解緩衝液（２５ｍＭ  ヘペス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％  Ｉｇｅｐａｌ、１０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭアポロチニン及びロイペプチン）中で氷上にて３０分間インキュベートして、続いて１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。免疫沈降に関して、清澄な溶解液を汎ＣＤ４４に対する抗体（ＩＭ７）とともに４℃で一晩インキュベートした後、プロテインＡ／Ｇアガロースビーズ（Merck、ドイツ、ダルムシュタット）を用いて沈降させた。沈降物を溶解緩衝液中で３回洗浄して、ウェスタンブロット分析に付した。
【００６１】
スクラッチアッセイ
ＨＵＶＥＣ及びＨＡＯＥＣをウェル１つ当たり２．５×１０５個の細胞の濃度で１２ウェルプレート中に播種させた。２４時間後、滅菌ピペットチップを使用して集密的な細胞層にスクラッチを作製した。培地を変えて、新鮮な培地又は１００μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４４ｖ６、１００ｎｇ／ｍｌのｖ６ペプチド若しくは１００ｎｇ／ｍｌ対照ペプチドを含有する培地と交換した。３７℃で１０分後に、成長因子（ＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ−Ａ１６５又はＶＥＧＦ−Ａ１２１（４０ｎｇ／ｍｌ））による誘導を実施した。Ｃａｎｏｎ  Ｐｏｗｅｒ  Ｓｈｏｔ  Ｓ６２０デジタルカメラを使用して、誘導の２４時間後に細胞の写真を撮った。コンピュータプログラムＩｍａｇｅ  Ｊを定量的評価に使用した。スクラッチ中の細胞を含まない領域を測定した。スクラッチの閉塞の効率は、細胞を含まない領域のパーセントとして表わされる。
【００６２】
発芽アッセイ
ＨＵＶＥＣのスフェロイドを懸滴中に生成させた。０．２５％（ｗｔ／ｖｏｌ）メチルセルロースを含有する内皮細胞成長培地（Sigma、ドイツ、ハンブルク）中に懸濁させて、一晩インキュベートした（スフェロイド１個当たり：２５μｌ中に７５０個の細胞）。穏やか遠心分離（５分、８００ｒｐｍ）によりスフェロイドを収集して、１ｍｇ／ｍｌのラット尾コラーゲンＩ（BD Biosciences、マサチューセッツ州ベッドフォード）及び０．６％（ｗｔ／ｖｏｌ）メチルセルロースを含有する内皮細胞成長培地中で再懸濁させた。スフェロイド／マトリックス混合物を４８ウェルプレート中に分配した（１ウェルあたり３０個のスフェロイド）。３７℃でのコラーゲンの凝固後に、スフェロイド／マトリックス混合物を内皮細胞成長培地で覆った。ブロッキング試薬（１００μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４４ｖ６、１００ｎｇ／ｍｌのｖ６ペプチド又は１００ｎｇ／ｍｌの対照ペプチド）を添加して、スフェロイドをＶＥＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）によって誘導した。４８時間後に写真を撮った。
【００６３】
管形成アッセイ
１：１の比で内皮細胞成長培地と混合した成長因子低減マトリゲル（BD Biosciences、マサチューセッツ州ベッドフォード）で、４８ウェルプレートをコーティングした。ＨＵＶＥＣは、ウェル１つ当たり２．５×１０４個の細胞の濃度で、これらのマトリゲルでコーティングしたプレート上に播種した。ブロッキング試薬（１００μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４４ｖ６、１００ｎｇ／ｍｌのｖ６ペプチド又は１００ｎｇ／ｍｌの対照ペプチド）を３７℃で１０分間添加した後、成長因子で誘導した。２４時間後に写真を撮った。管形成の定量化は、コンピュータプログラムＩｍａｇｅ  Ｊを使用して、１視野当たりの分岐点又は総血管長を計数することにより実施した。
【００６４】
コラーゲンゲルアッセイ
８週〜９週齢のＲｉｐ１Ｔａｇ２マウスから得られた血管新生過形成性ランゲルハンス島は、コラゲナーゼ灌流により単離した。ＨＵＶＥＣはブロッキング試薬と混合して、２４ウェルプレートにおいて三次元コラーゲンマトリックス中でこれらの島と共培養した（ウェル１つ当たり：コラーゲンマトリックス  ３５０μｌ中に４×１０４個の細胞、５個の血管新生島）。３日に１回、新たなブロッキング試薬を添加した。５日〜７日後、血管新生島に対するＥＣの応答を求めた。１つの条件当たりおよそ６０個の島を分析した。
【００６５】
スフェロイドベースのｉｎ  ｖｉｖｏ血管新生アッセイ
このアッセイは、過去に記載されるように実施した（Alajati他、２００８年、「マウスにおけるヒト脈管構造のスフェロイドベースの操作（Speroid-based engineering of a human vasculature in mice」（Nat Methods 5:439-445））。ＨＵＶＥＣのスフェロイドを、１００個の細胞を含有する懸滴（０．２５％（ｗｔ／ｖｏｌ）メチルセルロースを含有する成長培地（Sigma、ドイツ、ハンブルク）２５ｍｌ）中で生成させて、一晩インキュベートした。スフェロイドは、穏やか遠心分離（５分、８００ｒｐｍ）により収集して、内皮細胞成長培地で洗浄して、マトリゲル（成長因子は低減されている；BD Sciences、ドイツ、ハイデルベルク）６００μｌ及び５００ｎｇ／ｍｌの濃度で成長因子ＨＧＦ又はＶＥＧＦ−Ａ１６５を含有するフィブリノーゲン（最終濃度  ２ｍｌ／ｍｌ、Calbiochem、英国、ビーストン）と混合した。ＣＤ４４ｖ６抗体（ＶＦＦ１８）又はペプチド２０μｇを混合物へ添加した後、トロンビン（０．４Ｕ、Carbiochem、英国、ビーストン）を添加した。混合物を、腹部正中部に対して側面の各側面上に４週〜６週齢のＳＣＩＤマウスへ皮下注入した。２日に１回、ブロッキング試薬（マウス１匹当たり２０μｇ）を、マトリゲル／フィブリンプラグの近くに注入した。移植の２１日後にマウスを屠殺して、プラグを回収して、免疫組織学的分析用に４％ホルムアルデヒド中で一晩固定した。
【００６６】
免疫組織化学的分析
固定後、マトリゲル／フィブリンプラグ又は腫瘍組織を加工処理して、パラフィン中に包埋した。パラフィンブロックの７μｍ切片を脱パラフィン処理して、再度水和させた。マトリゲル／フィブリンプラグ切片を、１０％ヤギ血清（Dako、ドイツ、ハンブルク）で６０分間ブロッキングした後、マウス抗ヒトＣＤ３４抗体（クローンＱＢＥＮＤ／１０、２０μｇ／ｍｌ、２時間；Novocastra、英国、ニューカッスルアポンタイン）で染色した。次に、切片を、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Invitrogen、ドイツ、カールスルーエ）とともに４５分間インキュベートした。核をＨｏｅｃｈｓｔ色素  ３３２５８（Sigma Aldrich、ドイツ、ハンブルク）で染色した。ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ５０倒立顕微鏡を使用して、完全マトリゲル／フィブリン領域の画像を撮影した。完全マトリックス領域中の蛍光構造を計数して、１ｍｍ２当たりの血管数として算出した。腫瘍切片において、内因性ペルオキシダーゼを、ＰＢＳ中の３％Ｈ２Ｏ２でブロックした後、アビジン／ビオチン（Dako、ドイツ、ハンブルク）とともにインキュベートした。ラット抗マウスＣＤ３１抗体とのインキュベーション（０．５μｇ／ｍｌ  ４℃で一晩）の前に、非特異的結合を１０％ウサギ血清（BD Biosciences、ドイツ、ハイデルベルク）で６０分間ブロックした。続いて、切片をビオチン化ウサギ抗ラット抗体（２μ／ｍｌ、４５分）とともにインキュベートした後、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ結合体（conjugate）（Dako、ドイツ、ハンブルク）処理を行い、ＤＡＢ基質系（３，３’−ジアミノベンジジン、Biozol、ドイツ、エヒング）で発色させた。コンピュータプログラムＩｍａｇｅ  Ｊを用いて、染色した構造全てを、１ｍｍ２当たりの血管数及び平均血管サイズに関して解析した。
【００６７】
定量化及び統計学的解析
定量化は全て、平均値±標準偏差（ｓ．ｄ．）として与えられる。各種条件間の差は、対応のあるスチューデントのｔ検定（ttest）により解析されて、ｐ＜０．０５は、統計学的に有意であるとみなした。
実施例１：ＣＤ４４ｖ６は、ＶＥＧＦＲ−２の活性化及び下流のシグナル伝達を制御する。 
【００６８】
様々ながん細胞株及び原発性細胞において、ｃ−Ｍｅｔ活性化及びシグナル伝達は、ＣＤ４４ｖ６抗体及びペプチドによってブロックすることができる。ＣＤ４４アイソフォームがＥＣにおいても同様にｃ−Ｍｅｔに関する共受容体として作用し得るかどうかを試験するために、エクソン特異的ＲＴ−ＰＣＲ分析によりＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈ＥＣ）におけるＣＤ４４変異体の発現プロフィールをまず検査した（Konig他、１９９６年、トランス作動性因子はＣＤ４４スプライス変異体の発現を調節する（Trans-acting factors regulate the expression of CD44 splice variant）」（EMBO J. 15:4030-4039））（図１Ａ）。幾つかの変異体アイソフォームは実際に発現されている。興味深いことに、エクソンｖ６は、エクソンｖ７〜エクソンｖ１０とともに（ラダーによって示されている）、またおそらく同様に単独でも（ｖ６レーン中の低バンドにより示されている）発現されるようである。ｖ６は、非依存的アイソフォームとして出現するエクソン３は、同時発現されないようであることに留意されたい。ｃ−Ｍｅｔは、ＨＵＶＥＣ中で活性化させることができ、実際に、ＥｒｋのＨＧＦ誘導性の活性化は、ＣＤ４４ｖ６抗体及びペプチドにより完全に抑止することができる（図１Ｂ）。
【００６９】
この結果は、ＥＣでは、上皮細胞と同様に、ＣＤ４４ｖ６アイソフォームは、ｃ−Ｍｅｔに関する共受容体として作用することを示唆している。血管新生に関与する最も顕著なＲＴＫであるＶＥＧＦＲ−２の活性化に対するＣＤ４４ｖ６抗体及びペプチドの効果もまた試験した。ＶＥＧＦＲ−２は、ＶＥＧＦファミリーの優勢なアイソフォームであるＶＥＧＦ−Ａ１６５で活性化された。最も興味深いことに、エクソンｖ６に対指向性がある抗体及びｖ６特異的ペプチドは、ＨＵＶＥＣにおいてＶＥＧＦＲ−２の活性化及び下流のＥｒＫの活性化を抑止した（図１Ｂ及び図１Ｃ）。対照ペプチドは効果がなかった。
【００７０】
ＥＣにおけるＣＤ４４ｖ６に対するＶＥＧＦＲ−２及びｃ−Ｍｅｔの依存性を更に確認するために、それらの活性化に対する可溶性ＣＤ４４ｖ６外部ドメイン（ＣＤ４４ｖ６ＥＣＤ）の効果を試験した。ＣＤ４４ｖ６ＥＣＤは、ＨＧＦ及びＶＥＧＦ−Ａ１６５によって誘導されるＥｒｋの活性化を完全に抑止した（図１Ｄ）。対照的に、ｃ−Ｍｅｔに関するその共受容体機能に役立つ３つのアミノ酸において突然変異させたＣＤ４４ｖ６ＥＣＤ（Matzke他、「５−アミノ酸ペプチドは、Ｍｅｔ及びＲｏｎ依存的細胞遊走を阻止する（A 5-amino-acid peptide blocks Met and Ron dependent cell migration」（Cancer research 65:6105-6110））は、いかなる効果もなかった（図１Ｄ）。エクソンｖ３を含有するＣＤ４４タンパク質は全て、ヘパラン硫酸（ＨＳ）により修飾することができる。この修飾は、ＦＧＦ又はＨＢ−ＥＧＦのような成長因子に結合するのに必要とされるようである。ヘパラン硫酸プロテオグリカンへの及びＨＳ修飾ＣＤ４４アイソフォームへのＶＥＧＦ−１６５の結合についても記載されている。ＶＥＧＦＲ−２の活性化に対するＨＳ残基の要件に対処するために、ＨＵＶＥＣを、エクソン６及びエクソン７を欠くＶＥＧＦ−Ａ１２１で活性化させた。エクソン７は、ＨＳへの結合を請け負う。ＶＥＧＦ−Ａ１２１はまた、ＨＵＶＥＣにおいてＶＥＧＦＲ−２及びＥｒｋを活性化することができ（図１Ｄ及び図２Ａ）、この活性化も同様に、ＣＤ４４ｖ６ＥＣＤ（図１Ｄ）、ＣＤ４４ｖ６抗体及びペプチド（図２Ａ）によって完全に阻止された。
【００７１】
さらに、ＶＥＧＦＲ−２発現ベクターでトランスフェクトしたヒト腎臓癌細胞（ＨＥＫ２９３細胞）では、ＣＤ４４ｖ６ペプチドはまた、ＶＥＧＦ−Ａ１６５及びＶＥＧＦ−Ａ１２１によって誘導されるＶＥＧＦＲ−２の活性化を阻止した（図２Ｂ）。これらの結果は、ＶＥＧＦＲ−２の活性化がＨＳ修飾とは無関係に起こることを示唆する。
【００７２】
さらに、ＶＥＧＦＲ−２活性化に関与するＣＤ４４ｖ６アイソフォームは、ＨＳにより修飾することができる唯一の配列であるｖ３配列（エクソンｖ６及びエクソンｖ３はＲＴ−ＰＣＲにより示されるように同じＣＤ４４アイソフォーム上では同時発現されない、図１）を保有しないようである。ＶＥＧＦＲ−２の活性化が実際にＣＤ４４のＨＳ修飾に無関係であることを確認するために、ｃ−Ｍｅｔの場合と同様に、エクソンｖ６を単独で含有するＣＤ４４変異体アイソフォームがＶＥＧＦＲ−２活性化にとって十分であるかどうかを試験した。ＶＥＧＦＲ−２発現ベクターを、ＣＤ４４のみを発現するラットＢＳｐ７３ＡＳ膵癌細胞、又はＣＤ４４ｖ６で安定的にトランスフェクトしたＢｓｐ７３ＡＳ細胞（ＡＳｓ６）のいずれかへ一過的にトランスフェクトさせた。ＶＥＧＦ−Ａ１６５による処理時に、ＡＳｓ６細胞のみが誘導性であった（図２Ｃ）。
【００７３】
したがって、変異体エクソンｖ６のみを含有するＣＤ４４変異体アイソフォームは、ＶＥＧＦＲ−２共受容体として作用するのに十分であり、またこの共受容体機能は、ＨＳ修飾を必要としない。ＶＥＧＦＲ−２に関するＣＤ４４ｖ６の共受容体機能は、ＨＵＶＥＣ又はＨＥＫ２９３及びＶＥＧＦＲ−２でトランスフェクトしたＡＳｓ６のような幾つかの細胞型で観察することができる。
【００７４】
ヒト心臓微小血管ＥＣ（ＨＣＭＥＣ）及びヒト大動脈ＥＣ（ＨＡＯＥＣ）は原発性ＥＣであり、ここで、ＣＤ４４ｖ６と、ｃ−Ｍｅｔ又はＶＥＧＦＲ−２との間のこの協働を同様に実証することができる（図３Ａ及び図３Ｂ）。実際に、両方の細胞型において、ＥｒｋのＶＥＧＦ−Ａ１６５活性化は、ＣＤ４４ｖ６ペプチド又はＣＤ４４ｖ６抗体による細胞の処理時に阻害される（図３）。対照ペプチド及び対照ＩｇＧは効果がなかった。ＣＤ４４とＶＥＧＦＲ−２との間の協働は、これらのタンパク質が近接していることを示唆している。ＨＵＶＥＣからの内因性ＣＤ４４ｖ６及びＶＥＧＦＲ−２の共沈降は、この仮定を確認する（図３Ｃ）。
【００７５】
興味深いことに、これらの２つの分子間の結合は構成的であり、かつリガンドＶＥＧＦの添加に非依存的であるようである。このことは、ＨＧＦ誘導性であるＣＤ４４ｖ６／ｃ−Ｍｅｔ結合と対照的である。ｃ−Ｍｅｔ受容体の場合、ＣＤ４４共受容体は、シグナル伝達を促進するために、ＥＲＭタンパク質及び細胞骨格と結合する。ＣＤ４４ｖ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＨＧＦ、ＥＲＭタンパク質及び細胞骨格は、そのＧＥＦ  ＳＯＳによるＲａｓの活性化を可能にするシグナロソームを形成する。
【００７６】
このメカニズムがＶＥＧＦＲ−２の場合に関与するかどうかを試験するために、ＨＥＫ２９３細胞をＶＥＧＦＲ−２及びＣＤ４４細胞質ドメイン発現ベクターで同時トランスフェクトして、このドメインが内因性ＣＤ４４の活性と競合するかどうかを観察した。これは実際にその通りであった。ＣＤ４４細胞質ドメインＶＥＧＦＲ−２の存在下で、Ｅｒｋへのシグナル伝達は、ＶＥＧＦＲ−２リン酸化自体に影響を及ぼさずに阻止された（図４Ａ）。ＥＲＭ結合配列において突然変異されたＣＤ４４細胞質ドメインの発現は、Ｅｒｋ及びＶＥＧＦＲ−２活性化に対して効果がなかった（図４Ａ）。これらの実験から、ＶＥＧＦＲ−２の活性化はＣＤ４４の細胞質ドメインに非依存的であるのに対して、シグナル伝達は、このドメイン及びＥＲＭタンパク質の結合を必要とすると結論付けることができる。
【００７７】
ＥＲＭタンパク質の関与に直接対処するために、ＨＥＫ２９３細胞を、アクチン結合ドメインを欠いているエズリンドミナントネガティブ（ｄｎ）構築物と一緒に、ＶＥＧＦＲ−２でトランスフェクトした（図４Ｂ）。エズリンのこの切断型もまた、ＥｒｋへのＶＥＧＦ−Ａ１６５及びＶＥＧＦ−Ａ１２１シグナル伝達を阻害して、同様にこのことも細胞骨格へのＥＲＭタンパク質の結合が、ＶＥＧＦＲ−２からのシグナル伝達に必要とされることを示した。
【００７８】
結論として、ＣＤ４４ｖ６は、ＥＣにおけるＶＥＧＦＲ−２に関する共受容体である。ＣＤ４４ｖ６抗体、ペプチド及びＣＤ４４ｖ６ＥＣＤは、ＶＥＧＦＲ−２活性化を阻止する。２つの分子は、共免疫沈降実験により実証されるように、構成的な複合体を形成する。さらに、ＣＤ４４ｖ６の細胞質ドメインは、ＥＲＭタンパク質及び細胞骨格を補充して、シグナル伝達を促進する。
実施例２：ＣＤ４４ｖ６ペプチド及び抗体は、ＶＥＧＦに対するＥＣの応答を阻止する。
【００７９】
血管新生プロセスは幾つかの工程を含み、最終的に新たな毛細血管の形成をもたらす。まず、血管周囲の基底層が局所的に破壊され、その結果、ＥＣが間質を浸潤することができる。ＥＣは増殖して、遊走して、最終的に互いに接着して、新たな細管を形成する。これらの工程の幾つかをｉｎ  ｖｉｔｒｏで模倣することができる。スクラッチアッセイでは、ＥＣの遊走を測定することができる。ＨＧＦ及びＶＥＧＦ−Ａは、ＨＡＯＥＣの遊走を誘導して、集密的な単層においてスクラッチの閉塞を導いた（図５）。ｖ６ペプチド又は抗体の存在下で、このプロセスは強く阻害された。３Ｈ−チミジン取込みアッセイを使用した増殖の測定により、細胞が観察の期間に増殖していないことが明らかとなった（データは示さず）。ＨＵＶＥＣを使用して同じアッセイを実施して、同様の結果を導いた（図５）。
【００８０】
ＥＣは、メチルセルロース中で成長させる場合にスフェロイドを形成する特性を有する。ＶＥＧＦＡ１６５及びＶＥＧＦ−Ａ１２１の存在下でコラーゲンへ移入されるＨＵＶＥＣからのスフェロイドは発芽した（図６Ａ）。発芽は、ＣＤ４４ｖ６ペプチドによって強く阻害されたが、対照ペプチドによっては阻害されなかった（図６Ａ、グラフ中での定量化）。最終的に、細管ネットワーク形成アッセイを使用して、新たな血管の確立におけるＣＤ４４の役割を試験した。ＨＵＶＥＣを成長因子低減マトリゲル上で成長させて、ｖ６ペプチド及び抗体の存在下又は非存在下でＨＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ１６５又はＶＥＧＦ−Ａ１２１で処理した。
【００８１】
成長因子の非存在下では、予備ネットワークは、おそらくマトリゲル中の微量の成長因子に起因して観察することができる（図６Ｂ）。種々の成長因子による誘導は、ネットワークの密度を増加させた。ＣＤ４４ｖ６ペプチド又は抗体による処理は、ネットワークの形成を妨害する一方で、対照ペプチドは効果がなかった。このアッセイの定量化により、分岐点の数がＨＧＦに関して５０％にまで、またＶＥＧＦ−Ａ１６５及びＶＥＧＦ−Ａ１２１に関しては３０％にまで劇的に低減することが明らかとなった（図６Ｂ）。血管の長さもまた、ＨＧＦに関して６０％にまで、またＶＥＧＦ−Ａ１６５及びＶＥＧＦ−Ａ１２１に関してはおよそ４５％にまで減少した。
【００８２】
結論として、スクラッチ閉塞、スフェロイド発芽及び細管ネットワーク形成のような各種アッセイは、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ１６５及びＶＥＧＦ−Ａ１２１に対するＥＣの応答にはＣＤ４４ｖ６が必要であることを実証している。
実施例３：Ｒｉｐ１Ｔａｑ２マウスから単離した過形成性ランゲルハンス島により誘導される血管新生応答は、ＣＤ４４ｖ６に依存的である。
【００８３】
これまでに、幾つかの成長因子を別個に試験して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用してそれらの効果について観察してきた。ｅｘ−ｖｉｖｏ実験も実施し、ここでは過形成性ランゲルハンス島をＲｉｐ１Ｔａｇ２マウスから単離し、ＨＵＶＥＣとともにインキュベートさせた（図７Ａ）。Ｒｉｐ１Ｔａｑ２マウスモデルは、インスリノーマの十分規定されたモデルである。これらのトランスジェニック動物は、ラットインスリンプロモーター制御下でＳＶ４０ラージＴ抗原を発現し、膵臓のランゲルハンス島において単独でＴ抗原の発現をもたらす。多段階の腫瘍発達中に、過形成性島は、様々な血管新生因子の活性化によって腫瘍血管新生を徐々に誘導する。
【００８４】
ランゲルハンス島は、大部分が血管新生性である段階で単離され（８週〜９週齢のマウス）、ＣＤ４４ｖ６抗体又はペプチドの存在下で、それらをＨＵＶＥＣとともにインキュベートした。ランゲルハンス島からの血管新生因子の放出は、それらに対するＨＵＶＥＣの成長を促進する。ＣＤ４４ｖ６抗体又はペプチドの存在下では、ランゲルハンス島の血管新生活性は阻止された（図７Ａ）。したがって、幾つかの成長因子が血管新生応答を媒介する場合でさえ、ＣＤ４４ｖ６の共受容体機能の阻止はこの応答を低減した。
実施例４：移植したＥＣスフェロイドから血管のｉｎ  ｖｉｖｏでの発達は、ＣＤ４４ｖ６ブロッキング試薬による処理時に損なわれる。
【００８５】
ヒト脈管構造は、ＳＣＩＤマウスの脇腹への移植時にマトリゲル／フィブリン中に成長因子と一緒に包埋されたヒトスフェロイドから操作することができる。このアッセイを使用して、ＣＤ４４ｖ６がこの脈管構造の発達に関与するかどうかを試験した。ＣＤ４４ｖ６ペプチド又は抗体（又は対照ペプチド若しくはＩｇＧ）と一緒にＨＧＦ又はＶＥＧＦ−Ａ１６５のいずれかを含有するマトリゲル／フィブリン中に包埋されたＨＵＶＥＣスフェロイドを、ＳＣＩＤマウスの脇腹へ皮下注入した。ヒトＣＤ３４抗体によるマトリゲル／フィブリンプラグの染色により、ヒト血管ネットワークの形成を３週後に求めた。ＨＧＦ及びＶＥＧＦはともに、いずれの成長因子の非存在下では検出不可能であった（データは示さず）血管形成を誘導した（図７Ｂ）。ＣＤ４４ｖ６ペプチド及びｖ６特異的抗体は、５０％を上回って血管新生応答を有意に低減させた（図７Ｂ）。したがって、同様にこのアッセイでは、血管新生応答は、ＣＤ４４ｖ６に依存的である。さらに、これらの結果により、ＨＧＦが血管新生因子として作用することができることが確認される。
実施例５：乳腺腫瘍及び膵臓腫瘍の血管新生化はＣＤ４４ｖ６を必要とする。
【００８６】
腫瘍誘導性の血管新生がＣＤ４４ｖ６ペプチド及び抗体により抑圧することができるかどうかを証明するために、ヒト乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）及びヒト膵癌細胞（Ｌ３．６ｐｌ）を使用した。細胞はともに、マウスにおいて同所にあるヒト腫瘍における血管新生を研究するのに既に使用されている（ＭＤＡＭＢ２３１：、Ｌ３．６ｐｌ：）。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞は、ＳＣＩＤマウスの乳腺脂肪体へ移植されたのに対して、Ｌ３．６ｐｌ細胞は、ＳＣＩＤマウスの膵臓の尾へ注入した。１週後、ＣＤ４４ｖ６ペプチド又は抗体（又は対照ペプチド若しくは対照ＩｇＧ）を、１週間につき３回をＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍の場合には４週間、又はＬ３．６ｐｌ腫瘍の場合には３週間、腹腔内投与した。
【００８７】
これまでは、ＣＤ４４ｖ６ヒトペプチド及びヒト抗体を使用して、ヒトＥＣを標的としてきた。しかしながら、腫瘍モデルでは、マウス特異的抗体及びペプチドを使用した。ＣＤ４４ｖ６ペプチドは種特異的であり、交差反応しない。特に、同所性腫瘍モデルで使用されるＣＤ４４ｖ６ペプチド及びＣＤ４４ｖ６抗体は、腫瘍細胞（ヒト）上でのＣＤ４４機能を妨害しなかった。したがって、それらは、宿主ＥＣの血管新生のみを標的とした。ＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍の場合、ＣＤ４４ｖ６抗体又は対照ＩｇＧのいずれかで処理した２つの動物群を、フラットパネル検出器ボリュームコンピュータ断層撮影法（ｆｐＶＣＴ）を使用して検査して、経時的な腫瘍成長及び腫瘍血管新生化を追跡した。実験の終了時に、腫瘍を全ての動物から単離して、切片を作製して、ＣＤ３１抗体で染色した。血管密度及び血管長を、染色した切片から推定した。ＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍に関して、腫瘍成長は、マウスＣＤ４４ｖ６ペプチド又は抗体により影響を受けなかった（データは示さず）。同様に、平均血管サイズは、ＣＤ４４ｖ６ツールにより影響を受けなかった（表１）。対照的に、微小血管密度は、ＣＤ４４ｖ６ペプチドによって１ｍｍ２当たり２４０個から１８３個へ、また抗体により１ｍｍ２当たり２４７個から２２０個へ有意に減少した（表１）。同様に、腫瘍を取り囲みかつ浸潤する小血管の減少が、抗体で処理したマウスにおいてｆｐＶＣＴによって観察された（図８Ａ）。この減少は、移植の３週後には既に見ることができ、５週後の実験の終了まで続けることができた（図８Ａ）。
【００８８】
対照的に、ＣＤ４４ｖ６ペプチドの劇的な阻害効果は、Ｌ３．６ｐｌ細胞から確立されたヒト膵臓腫瘍の成長に関して既に観察されていた：腫瘍サイズが１０パーセントへ低減された（図８Ｂ）。さらに、同様に血管密度及び血管サイズは、ＣＤ４４ｖ６ペプチドによる処理時に６０％を上回って減少した（図８Ｂ）。これらのデータにより、この膵臓腫瘍の成長は、血管脈管構造の確立に特に依存的であることが示唆される。結論として、ＣＤ４４ｖ６ペプチド及び抗体は、幾つかのＥＣ上でＶＥＧＦＲ−２の活性化及びシグナル伝達を阻止するだけでなく、それにより様々な試験系において細管伸長及びＥＣ遊走を妨害し、またそれらはｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍誘導性の血管形成を阻止することが示される。
表１：ＣＤ４４ｖ６ペプチド及び抗体による腫瘍誘導性の血管の阻害
ＳＣＩＤマウスへのＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の注入、及び続く処理は、図７Ａに記載するように実施した。腫瘍切片をＣＤ３１特異的抗体で染色して、血管数及びサイズを計数した。数は、５匹の動物それぞれのカウントを反映する。
【００８９】
【表１】
2012530735.tif 000002
【００９０】
上記実験では、ＥＣにおけるｃ−Ｍｅｔ及びＶＥＧＦＲ−２のそれらの各々のリガンドによる活性化は、変異体エクソンｖ６を含有するＣＤ４４アイソフォームに厳密に依存していることが示されている。ＨＵＶＥＣでは、ＣＤ４４ｖ６特異的抗体、ｖ６ペプチド及びＣＤ４４ｖ６ＥＣＤは、ｃ−Ｍｅｔ及びＶＥＧＦＲ−２の両方の活性化、並びに続くＥＣ遊走、スフェロイド発芽及び細管形成の誘導を抑止する。共免疫沈降研究により、ＶＥＧＦＲ−２及びＣＤ４４ｖ６は複合体を形成し、互いに構成的に結合されるようであることが示される。ＣＤ４４ｖ６に対するＶＥＧＦＲ−２の依存性はＨＵＶＥＣだけでなく、ＨＡＯＥＣ及びＨＣＭＥＣにも当てはまり、ＶＥＧＦＲ−２を発現するようにトランスフェクトされた他の細胞（ＨＥＫ２９３細胞及びＡＳｓ６細胞）でシミュレートすることができる。
【００９１】
ＨＧＦ及びｃ−Ｍｅｔはまた、血管新生でも重要であるため、それらがＥＣ細胞においても同様にＣＤ４４ｖ６アイソフォームと協働するかどうかを検査した。ＣＤ４４ｖ６特異的ペプチド及びＣＤ４４ｖ６抗体は、ＥＣ上でｃ−Ｍｅｔ活性を実際に阻止することができ、ＥＣによるＨＧＦ誘導性遊走及び細管形成が損なわれる。最も興味深いことに、このペプチド及び抗体は、ＶＥＧＦ誘導性ＶＥＧＦＲ−２活性化も阻止した。さらに、ＣＤ４４と結合するＥＲＭタンパク質は、ＶＥＧＦＲ−２からのシグナル伝達を調節する。したがって、ＣＤ４４の作用メカニズムは、ｃ−Ｍｅｔ及びＶＥＧＦＲ−２活性化の両方に関して非常に類似しているようである。実際に、ＣＤ４４ｖ６は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで及び更には腫瘍において、血管の形成を含む生理学的変化を制御する。
【００９２】
ＶＥＧＦＲ−２の活性化が、へパリン非結合性ＶＥＧＦ−Ａ１２１によっても誘導され得ること、及びこの活性化はまたＣＤ４４エクソンｖ６に依存することが上記で実証されている。さらに、ＥＣはＣＤ４４エクソンｖ３及びエクソンｖ６を発現するが、これらのエクソンは、ＲＴ−ＰＣＲ分析から推測されるのと同じタンパク質上に存在しないようである。最終的に、ＶＥＧＦＲ−２の活性化は、ＣＤ４４ｖ６及びＣＤ４４ｓだけでなく、ＣＤ４４ｖ３ヘパリン硫酸化型も発現するＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞において観察された。これらの結果により、ＶＥＧＦＲ−２の活性化自体は、ＨＳを依らない可能性があることが示される。しかしながら、ＨＳへの結合は、本格的な血管新生応答には必要とされるようである。ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦ、ニューロピリン及びＣＤ４４ｖ６間の協働は、本格的な血管新生応答に関与する可能性が高い。
【００９３】
ＶＥＧＦＲ−２に関するＣＤ４４ｖ６の共受容体機能は、２つの異なる同所性腫瘍モデル上でのＣＤ４４ｖ６ペプチド及びＣＤ４４ｖ６抗体の効果により示されるように、腫瘍血管新生において非常に関係している。ヒト乳癌ＭＢＡ−ＭＤ２３１細胞に由来する腫瘍におけるＣＤ４４ｖ６の阻止は、微小血管密度に対して有意な効果があるのに対して、平均血管サイズ及び腫瘍成長速度は影響を受けない。Ｌ３．６ｐｌ細胞に由来するヒト膵臓腫瘍では、腫瘍サイズ並びに微小血管密度及び平均血管サイズは、ＣＤ４４ｖ６ペプチドによる処理後に劇的に低減する。これらの２つの腫瘍系の異なる応答は、がん細胞の固有の特性に起因し得る。可能性の１つは、両方の場合で産生される血管新生因子が異なるということである。ＣＤ４４ｖ６は、ｃ−Ｍｅｔ、ＶＥＧＦＲ−２、Ｔｒｋ及びＲＴＫのＥＧＦＲファミリーの特定成員に関する共受容体としてだけでなく、ＰＤＧＦＲ又はＦＧＦＲに関する共受容体としても作用することができるため、ブロッキング試薬の効果は、どの血管新生成長因子が産生されるかに従って異なる。ＣＤ４４アイソフォームが血管新生に関係するという本明細書での見解は、腫瘍形成におけるＣＤ４４の役割に新たな側面を付け加えている。
【配列表フリーテキスト】
【００９４】
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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