(57)【要約】【課題】本発明は、生物技術の領域に関し、詳しくは、ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質、遺伝子、組み換え体ベクター、形質転換体及びその用途と作製方法に関する。【課題を解決する手段】本発明はＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質を提供し、当該融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に述べるＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のタンパク質導入ドメイン、もしくはその変異体のアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に述べるアポプチン又はその変異体のアミノ酸配列と融合し、前記融合タンパク質は、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する極めて強い能力を有し、腫瘍を治療する薬物を作製することに用いられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のアミノ酸配列もしくはその変異体の中にＥＣ−ＳＯＤカルボキシル末端のタンパク質導入ドメインと、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２またはその変異体におけるアポプチンとを有することを特徴とするＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、式：Ｒ２−Ｒ１、Ｒ１−Ｒ２、Ｒ１−Ｌ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１、Ｒ１−Ｌ−Ｒ２、Ｒ２−Ｌ−Ｒ１もしくはＲ２−Ｌ−Ｒ１−Ｌ−Ｒ１を含み、Ｒ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１もしくはその変異体のアミノ酸配列の中のＥＣ−ＳＯＤカルボキシル末端のタンパク質入ドメインであり、Ｌは、リンケージペプチドであり、Ｒ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に述べるアミノ酸もしくはその変異体の少なくとも一つを有するアポプチンであることを特徴とするＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載のＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質であって、前記ＥＣ−ＳＯＤカルボキシル末端のタンパク質導入ドメインのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に述べるアミノ酸配列もしくはその変異体は、前記融合タンパク質のカルボキシル末端に位置することを特徴とするＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載のアＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質であって、前記ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質は、次の（ａ）もしくは（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする：
（ａ）アミノ酸配列が例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に述べるようなタンパク質；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性を有し、またアポトーシス作用を誘導する活性があるタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチド分子であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に述べる核酸配列を有するポリヌクレオチド分子。
【請求項７】
請求項５に記載のポリヌクレオチド分子を含む組み換え体発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組み換え体発現ベクターであって、当該ポリヌクレオチド分子の核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に記載のものであることを特徴とする発現ベクター。
【請求項９】
請求項７に記載の組み換え体発現ベクターを有する形質転換体。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換体であって、前記形質転換体が大腸菌であることを特徴とする形質転換体。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のアＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質の製造方法であって、下記の工程を含む：
（１）請求項１に記載の前記ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質の発現ベクターの構築；
（２）請求項１に記載のＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質の形質転換体の作製；
（３）請求項１に記載のＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質の発現；
（４）請求項１に記載のＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質の精製。
【請求項１２】
請求項１１に記載の製造方法であって、前記アＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質の形質転換体が、原核遺伝子発現システムもしくは真核遺伝子発現システムであることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質を有し、薬理学的に許容される担体を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１４】
細胞の過度の増殖により引き起こされる疾患の治療薬として請求項１〜４のいずれか１つに記載のＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質を使用する使用方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の使用方法であって、前記過度の細胞の増殖により引き起こされる疾患が腫瘍であることを特徴とする使用方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の使用方法であって、前記腫瘍が子宮頸癌、肝臓癌もしくは肺癌からなる群のいずれか一つであることを特徴とする使用方法。
【請求項１７】
過度の細胞の増殖により引き起こされる疾患や障害を予防、治療もしくは改善する方法であって、前記方法は、請求項１〜４のいずれか１つに記載されたＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質を哺乳動物へ効果的な量で投与することを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記過度の細胞の増殖により引き起こされた疾患が腫瘍であることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記腫瘍は、子宮頸癌、肝臓がん、もしくは肺癌であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物技術分野に関するものであり、特に、ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端アポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質、遺伝子、組み換え体ベクター、形質転換体及びその用途と作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スーパーオキシドジスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ、以下、ＳＯＤと略す）は、スーパーオキシドラジカル陰イオン（Ｏ２−・）の不均化反応を促進する酵素である。人と哺乳動物のＳＯＤには、細胞質基質ＳＯＤ（Ｃｕ、Ｚｎ−ＳＯＤ）、ミトコンドリアＳＯＤ（Ｍｎ−ＳＯＤ）と細胞外ＳＯＤ（ＥＣ−ＳＯＤ、つまりＣｕ、Ｚｎ−ＳＯＤ）を含む三種類のアイソザイムがある。ＥＣ−ＳＯＤ（Ｍａｒｋｌｕｎｄ  ＳＬ、Ｂｊｅｌｌｅ  Ａ、Ｅｌｍｑｖｉｓｔ  ＬＧ  ｅｔ  ａｌ、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ．１９８６、４５：８４７−８５１）は、人体内での含有量が一番少なく、主に組織の細胞外マトリクスと細胞表面に存在する。そのアミノ酸配列は、その機能により四つのドメインに分けることができる：Ｎ末端にある１８個のアミノ酸残基を有する信号ペプチド；次に、ＥＣ−ＳＯＤの四量体の形成に関係する９５個のアミノ酸残基を有するドメイン；９８個のアミノ酸残基を有するＳＯＤ活性ドメイン；最後に、塩基性アミノ酸を豊富に含む２９個のアミノ酸残基を有するタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ、ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ）（Ｈｊａｌｍａｒｓｓｏｎ  Ｋ、Ｍａｒｋｌｕｎｄ  ＳＬ、Ｅｎｇｓｔｒｏｍ  Ａ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８７、８４：６３４０−６３４４）。このタンパク質導入ドメインは、細胞表面のヘパリン様多糖体の誘導体と結合することができ（Ｋａｒｌｓｓｏｎ  Ｋ、Ｍａｒｋｌｕｎｄ  ＳＬ．Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９８９、６０：６５９−６６６）、そしてＰＴＤの細胞膜貫通型導入によりエンドサイトーシスを介してＥＣ−ＳＯＤを核に局在させることができる。
【０００３】
鶏貧血ウイルス由来のアポプチン（Ａｐｏｐｔｉｎ）もしくはアポトーシスタンパク質は、１２１個のアミノ酸残基からなる。これは、様々な腫瘍細胞において、他の正常な細胞に影響を与えずに、ｐ５３に依存せずさらにＢｃｌ−２に対して非感受性のまま、アポトーシスを誘導できるため、腫瘍の選択的な薬剤として非常に実用化の見通しが高い候補である（Ｚｈｕａｎｇ  ＳＭ、Ｓｈｖａｒｔｓ  Ａ、ｖａｎ  Ｏｒｍｏｎｄｔ  Ｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９５、５５（３）：４８６−４８９）。これまでの研究で、アポプチンにより誘導されるアポトーシスは、アポプチンを細胞内に移し、次に核局在化配列を介して細胞核に蓄積する必要があることが示されており、その後まだ解明されていないメカニズムにより細胞アポトーシスを引き起こす。アポプチンに誘導されたアポトーシスは、その特別なアミノ酸残基のリン酸化と関係しており、アポトーシスは、カスパーゼ−３経路と密接な繋がりがある。（Ｎｏｔｅｂｏｒｎ  ＭＨ．Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００４、９８（２）：８９−９４）。
【０００４】
したがって、アポプチンに誘導された腫瘍細胞のアポトーシスでの重要なポイントは、アポプチンをいかに速く効率的に、腫瘍細胞内へ移して膜を通って目標のタンパク質の移送を実現するかである。現在、例えば、ヒトＨＩＶウィルスのＴＡＴドメイン、アンテナペディア（Ａｎｔｐ）、単純ヘルペスウィルスタンパク質（ＶＰ２２）、ポリアルギニン配列及びＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のタンパク質導入ドメイン等のタンパク質転送機能を有する多くの膜貫通ドメイン（ＰＴＤ）が見つかっている。一般的に、ＰＴＤは、配列の長さが２０アミノ酸以下であり、通常螺旋構造から形成され高い正電荷を帯びたドメインを有する。ＰＴＤは、親水性のタンパク質、ポリペプチド、ＤＮＡを運ぶことができ、さらには細胞の種類に関係なく、粒子性物質等を含む種々の物質を運ぶことができ、細胞間又は細胞内への輸送することができる。（Ｓｃｈｗａｒｚｅ  ＳＲ、Ｄｏｗｄｙ  ＳＦ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｅｏｌ  Ｓｃｉ．２０００、２１（２）：４５−４８）。しかしながら、その輸送効率はＰＴＤ自体およびそれと融合しているタンパク質の性質と密接に関連している。したがって、膜を通ってタンパク質を効率的に運ぶのに最も重要なのは、適切なＰＴＤを選択することである。即ち、アポプチンが誘導する腫瘍細胞のアポトーシスを強化するには、適切なＰＴＤを見付け、アポプチンを素早くさらに効率的に細胞内へ移送することで、アポプチンのアポトーシス作用を発揮させ、それにより腫瘍細胞の増殖を阻害し、疾患を治療する。
【発明の開示】
【０００５】
公知の技術的課題を解決するため、本願発明は、アポプチン融合タンパク質を提供し、それを素早く効率的に細胞内へ移送して、アポトーシス作用を発揮させ、それにより腫瘍細胞の増殖を阻害し、さらに疾患を治療する。
【０００６】
このために、本発明の一概念は、ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質を開示し、該融合タンパク質は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１もしくはその変異体記載されたアミノ酸配列にＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のタンパク質導入ドメインと、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２もしくはその変異体に記載されたアミノ酸配列にアポプチン含むことを特徴とする。
【０００７】
本発明は、遺伝子工学を利用して、ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のタンパク質導入ドメインもしくはその変異体を、アポプチンもしくはその変異体を融合することで、融合タンパク質を人工的に構築する。ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のタンパク質導入ドメインもしくはその変異体を介して、膜貫通型タンパク質の移送を可能にし、その結果、腫瘍細胞の増殖を阻害し、疾患を治療する。本発明の範囲には、上記の融合蛋白質を含むが、それに限定されるものではない。
【０００８】
一実施形態で、前記ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質は、次の式であってもよい：  Ｒ２−Ｒ１、Ｒ１−Ｒ２、Ｒ１−Ｌ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１、Ｒ１−Ｌ−Ｒ２、Ｒ２−Ｌ−Ｒ１もしくは、Ｒ２−Ｌ−Ｒ１−Ｌ−Ｒ１であり、Ｒ１は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に記載されたＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のタンパク質導入ドメインもしくはその変異体のアミノ酸配列であり、Ｌは、リンケージペプチドであり、Ｒ２は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に記載されたアポプチンもしくはその変異体のアミノ酸配列であるが、これらは、治療を目的とした同じタンパク質である必要はない。リンケージペプチドは、例えば（ＧＧＧＧＳ）Ｎや（ＧＧＧＳ）Ｎや（ＧＧＳ）Ｎ等を含んでもよいが、それに限定されるものではない。Ｎは、１以上の整数であり、Ｇは、グリシンであり、Ｓは、セリンである。
【０００９】
他の実施形態では、上記のＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のタンパク質導入ドメインもしくはその変異体は、前記融合タンパク質のカルボキシル末端に位置している。
【００１０】
一実施形態では、上記のＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質は、次の（ａ）もしくは（ｂ）で表されるタンパク質である： 
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性があり、またアポトーシスを誘導するタンパク質。
【００１１】
本発明の一態様は、上記のＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を開示する。
【００１２】
一実施形態では、前記ポリヌクレオチド分子の核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４である。
【００１３】
本発明の一態様では、本発明の前記ポリヌクレオチド分子の組み換え体発現ベクターを開示する。
【００１４】
本発明の一態様では、本発明の前記組み換え体発現ベクターの形質転換体を開示する。
【００１５】
一実施態様で、前記形質転換体は大腸菌である。
【００１６】
本発明の他の実施形態では、上記のＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質の作製方法を開示し、下記の工程を含む：
（１）ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質の発現ベクターの構築；
（２）ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質の形質転換体の作製；
（３）ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質の発現；
（４）ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質の精製。
【００１７】
本発明の他の態様では、上記のＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質と薬理学的に許容される担体を含む組成物を開示する。
【００１８】
本発明の他の態様では、細胞の過度の増殖により引き起こされる疾患の治療ための薬剤の作成に上記のＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質に使用することを開示する。
【００１９】
一実施形態では、細胞の過度の増殖により引き起こされる前記疾患は腫瘍である。
【００２０】
本発明の他の態様では、細胞の過度の増殖により引き起こされる疾患や障害の予防、治療もしくは改善する方法を含み、この方法は、予防、治療もしくは改善する必要がある哺乳類動物へ効果的な量のＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質を投与して、その疾患や障害を予防、治療もしくは改善する。
【００２１】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏの腫瘍細胞アポトーシス試験とマウス腹水腫瘍を抑制する試験は、本発明で作製するＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質が、腫瘍細胞アポトーシスを誘導する極めて強い作用を有し、さらに抗腫瘍薬として用いことができることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ＰＣＲ増幅により生成されたＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの遺伝子の２％アガロースゲルの電気泳動を示す；
【図２】図２は、Ｃ−ｐＥＴ２８ａ発現プラスミドを構築する模式図である；
【図３】図３は、ＰＣＲ増幅により生成されたアポプチン遺伝子断片の１．５％アガロースゲルの電気泳動を示す；
【図４】図４は、Ａｐｏｐ−ｐＭＤ１８Ｔプラスミドのクローンの構築の模式図を示す；
【図５】図５は、ＡｐｏｐＣ−ｐＥＴ２８ａの発現プラスミドの構築の模式図を示す；
【図６】図６は、１．５％アガロースゲルの電気泳動を使い組み換えバクテリアに挿入された断片をＰＣＲにより検出した図を示す；
【図７】精製した組み換え体Ａｐｏｐｔｉｎ−ＥＣ−ＳＯＤ−ＰＴＤをＳＤＳ−ＰＡＧＥでの検討結果を示す；
【図８】図８は、異なる濃度における組み換え体Ａｐｏｐｔｉｎ−ＥＣ−ＳＯＤ−ＰＴＤのＨｅＬａ細胞の生存率に対する影響を示す；
【図９】図９は、組み換え体Ａｐｏｐｔｉｎ−ＥＣ−ＳＯＤ−ＰＴＤをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養したヒトの正常な肝臓細胞の生存率に対する影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本出願において、「変異体」とは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に記載するＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインのアミノ酸配列もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に記載するアポプチンのアミノ酸配列における変異体をさす。天然のＥＣ−ＳＯＤカルボキシル末端のタンパク質導入ドメインもしくはアポプチンタンパク質と比べて、該変異体は、それらの野生型より強い活性および／または、変化したステレオ特異性がある。天然のタンパク質のアミノ酸配列の変異体は、適切なヌクレオチドの変更を本発明のヌクレオチドへ挿入するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで必要なポリペプチドを合成することにより作製される。これらの変異体は、例えば、アミノ酸残基の削除、挿入または置換を含む。最終的なタンパク質産物は、削除、挿入、もしくは置換を組み合わせることにより得られる。
【００２４】
タンパク質の相同性は、ＧＡＰ（ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｈ、１９７０）分析（ＧＣＧプログラム）で確認でき、パラメーターは、ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ  ＝  ５であり、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ  ＝  ０．３である。分析される配列の長さが１５個のアミノ酸である場合、ＧＡＰ分析は、測定する二つの配列の少なくとも１５個のアミノ酸があるドメインにおいて行われる。好ましくは、分析される配列の長さが５０個のアミノ酸である場合、ＧＡＰ分析は測定する二つの配列の少なくとも５０個のアミノ酸があるドメインにおいて行われる。好ましくは、分析される配列の長さが１００個のアミノ酸である場合、ＧＡＰ分析は測定する二つの配列の少なくとも１００個のアミノ酸があるドメインにおいて行われる。好ましくは、分析される配列の長さが２５０個のアミノ酸である場合、ＧＡＰ分析は測定する二つの配列の少なくとも２５０個のアミノ酸があるドメインにおいて行われる。さらに好ましくは、分析される配列の長さが少なくとも５００個のアミノ酸である時に、ＧＡＰ分析は測定する二つの配列の少なくとも５００個のアミノ酸があるドメインにおいて行われる。
【００２５】
本発明は、ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質の相似体に関連し、これは、合成時もしくは合成後において、例えばビオチン化、ベンジル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化；公知の保護／閉鎖グループでの誘導、タンパク質の加水分解による分割、抗体または他の細胞リガンドへの結合、などの異なる修飾により得られる。これらの修飾は本発明のＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質の安定性および／または生物活性を増加することができる。
【００２６】
融合タンパク質の発現
本発明は、ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質をコードするＤＮＡ及びこれらのＤＮＡを持つベクターや形質転換体を含む。
【００２７】
本発明における「形質転換体」（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）は、すなわち異種のＤＮＡを持つ宿主細胞である。
【００２８】
本発明は、合成および組み換えの技術によりＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質を作製する方法を含む。ポリヌクレオチド（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、ベクター、形質転換体と生体の分離や精製は、当該技術分野において公知である方法で行うことができる。
【００２９】
本発明に用いるベクターは、例えばファージ、プラスミド、コスミド、ミニ染色体、ウイルスもしくは、レトロウイルスベクターなどである。ポリヌクレオチドのクローンおよび／または発現に用いるベクターは、宿主細胞の中でポリヌクレオチドをクローン化および／または発現できるベクターである。一般的に、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターは、哺乳類動物細胞（例えばヒト（例えば、ＨｅＬａ）、猿（例えば、Ｃｏｓ）、ウサギ（例えば、ウサギ網膜赤血球）、ラット、ハムスター（例えば、ＣＨＯ、ＮＳＯとベビーハムスターの腎臓細胞）やマウスの細胞（例えば、Ｌ細胞））、植物細胞、イースト細胞、昆虫細胞や細菌細胞（例えば、大腸菌）などを含む真核細胞や原核細胞に用ることができる。種々の宿主細胞に好適なベクターの例は、例えばＦ．  Ａｕｓｕｂｅｌｅｔ  ａｌ、  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９２）と  Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されている。これらのポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、例えば薬物、診断試薬、ワクチン及び治療剤薬に用いられるタンパク質を大量に発現することに使用できる。
【００３０】
粘着末端を介してポリヌクレオチドを機能的に接続する種々の方法が開発されている。例えば、ベクターに挿入するために設計されたＤＮＡ断片に相補的なホモポリマー配列の断片を挿入し、そしてベクターとＤＮＡ断片は、相補的なホモポリマー末端の間の水素結合で結合し組み換え体ＤＮＡを形成する。
【００３１】
一種以上の制限部位を有する合成リンカーは、ＤＮＡ断片とベクターを接続する他の方法を提供する。エンドヌクレアーゼにより切断されたＤＮＡ断片は、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼもしくは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて処理され、前記二つのポリメラーゼの３’，５’−エクソヌクレアーゼ活性によりγ−一本鎖の末端を削除し、さらに３’−陥凹未端をそのポリメライゼーション活性により充填する。結果として、これらの組み合わせによりフラットエンドＤＮＡを生成する。該フラットエンドＤＮＡは、フラットエンドＤＮＡの結合を触媒する酵素、例えばバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ、の存在下で、大量の高濃度のリンカー分子と共に培養する。したがって、反応産物は、重合した結合末端の配列を有するＤＮＡ断片である。これらのＤＮＡ断片を適切な制限酵素で切断し、酵素ですでに分解された発現ベクターと結合させ、前記酵素は、前記ＤＮＡ断片に相補的な末端を産生できる。多数のエンドヌクレアーゼ制限部位を含む合成リンカーは様々な業者から手に入れることができる。
【００３２】
ポリヌクレオチド挿入部位は、ポリヌクレオチドを発現する宿主細胞に相補で適切なプロモーターと機能的に接続するべきである。プロモーターは強力なプロモーターおよび／または誘導プロモーターであってもよい。プロモーターの例としては、ファージλＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒＰ、ｐｈｏＡ、ｔａｃプロモーター、初期と末期段階のＳＶ４０プロモーター及びレトロウイルスＬＴＲプロモーター等がある。他の適切なプロモーターは、当該技術の通常の知識を有する者であればよく知っているものである。発現組換え体ベクターは、更に転写開始および終結部位を有し、また転写ドメインにあるリボソーム結合部位を有する。組換え体ベクターにより転写発現するコード部分は、開始サイトに位置する開始コドンと、翻訳されたポリペプチド末端に適切に位置する終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡもしくはＵＡＧ）を含んでもよい。
【００３３】
以上のように、発現ベクターは、少なくとも一つの選択マーカーを含んでもよい。前記マーカーは、真核細胞の培地のためのジヒドロ葉酸還元酵素、Ｇ４１８、グルタミン合成酵素もしくはネオマイシン耐性、さらに大腸菌と他の細菌培養に用いるテトラサイクリン、カナマイシンもしくはアンピシリン耐性遺伝子等を含む。適切な宿主の代表的な例としては、大腸菌、ストレプトミセス、ネズミチフス菌細胞などの細菌細胞；酵母細胞（例えばサッカロマイセスセルビシエやピキア酵母）などの真菌細胞；ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳＦ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、２９３、ボーズ（Ｂｏｗｅｓ）メラノーマ細胞などの動物細胞、；と植物細胞等を含むが、これらに限定されない。以上の宿主細胞に適用する培地と培養の条件は、当該技術分野の通常の知識を有する者にはよく知られているものである。
【００３４】
簡単に分離もしくは精製できるタグタンパク質やタグポリペプチド（Ｔａｇ）は、目的タンパク質を効率的に分離もしくは精製するのに利用される。頻繁に利用されるタグタンパク質は、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ））、ヒスチジンペプチド（Ｈｉｓ．Ｔａｇ）の六量体、タンパク質Ａ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）とセルロース結合ドメイン（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）等を含む。発現後、前記タグタンパク質もしくはタグペプチドは、例えばＨｉｓ．ＴａｇとＮｉ−キレートセファロースの特異的な結合などのように、特別なタンパク質もしくはペプチドを目的タンパク質と融合して、融合タンパク質を形成することにより、目的タンパク質を分離もしくは精製することができる。精製した後、融合タンパク質における前記タグタンパク質やタグポリペプチドの配列は、例えばトロンビン、エンテロキナーゼとＸａ因子等のサイト特異的プロテアーゼで取り除くことができ、そして目的タンパク質を得ることが出来る。
【００３５】
更に、本発明は、本発明に記載のヌクレオチド配列を含有する宿主細胞を含み、前記ヌクレオチド配列は、当該分野では公知の技術により一種以上の異種制御領域（例えばプロモーターおよび／またはエンハンサー）と機能的に結合できる。挿入された遺伝子配列の発現を調節でき、もしくは必要な形態になるよう遺伝子産物を修飾および加工できる宿主株を選択する。特定の誘導物が存在する場合、いくつかプロモーターにより発現が高くなり、したがって、遺伝子的に修飾されたペプチドの発現を制御できる。さらには、異なる宿主細胞は、それぞれの特徴的且つ特異的なタンパク質翻訳、翻訳後の加工と修飾（例えばリン酸化、分断）などのメカニズムを有している。発現する外因性タンパク質に要求される修飾と加工を保証することができるように適切なセルラインを選択する。
【００３６】
本発明のヌクレオチドとヌクレオチド組み換え体ベクターは、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストランが介在する形質移入、陽イオン脂質介在型形質移入、電気穿孔、形質導入、感染もしくは他の方法により宿主細胞に挿入される。前記方法は、多くの標準的な実験室マニュアル、例えば  Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９８６）に記載されている。
【００３７】
本発明に記載する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、選択されたマーカーを持つベクターと結合することができ、そして宿主の中で増殖する。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム形質転換またはリポゾーム形質移入などにより宿主細胞内に導入できる。ベクターが、ウイルスであれば、宿主細胞に挿入する前に、好適なパッケージングセルラインによりｉｎ  ｖｉｔｒｏでそれを包装できる。
【００３８】
形質転換された細胞、すなわち、本願発明に記載するＤＮＡ組み換え体ベクターを有する細胞は、公知の技術による特定できる。例として、発現組み換え体ベクターが導入された細胞を培養して、所望のポリペプチドを産生する。細胞を回収して分解し、例えばＳｏｕｔｈｅｍ  （１９７５）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ９５、５０３或いは  Ｂｅｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ  （１９８５）  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ３、２０８  に記載する方法で、ＤＮＡ含有物内のＤＮＡを検出する。もしくは、抗体検出法を使って、上清のタンパク質を検出する。
【００３９】
公知の方法により組み換え細胞の培養物から本発明に記載する融合タンパク質を回収し精製することがより好ましく、その方法は硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷相互作用クロマトグラフィーとレクチンクロマトグラフィー等を含む。いくつか実施形態では、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を精製に用いてもよい。
【００４０】
いくつか実施形態では、上述の一種以上のクロマトグラフィー法を使って、本発明の融合タンパク質を精製する。他の実施形態では、以下の一種以上のクロマトグラフィーカラムを使って、本発明の融合タンパク質を精製してもよく、前記クロマトグラフィーカラムは、Ｑ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム、ＳＰ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム、Ｑ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  高性能カラム、Ｂｌｕｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム、Ｂｌｕｅカラム、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｎｉ−Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム又は  Ｍｅｔｈｙｌカラム等を含む。
【００４１】
さらには、国際公開第ＷＯ００／４４７７２号（全文が参照として本文に入れらている）に記載の方法を使って、本発明の融合タンパク質を精製できる。当該分野の通常の知識を有するものであれば、容易にその方法を変更し、それを本発明の融合タンパク質を精製することに用いることができる。したがって、本願発明の融合タンパク質は、例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫と哺乳類動物細胞等の原核もしくは真核宿主細胞の組み換え技術により産生された産物からを回収できる。
【００４２】
好ましい一実施形態において、本願発明は、下記の工程を含むＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質の作製方法を提供する：
ａ．クローンされたＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のタンパク質導入ドメイン遺伝子を有する発現プラスミドＣ−ｐＥＴ２８ａの構築；
ｂ．アポプチン遺伝子をクローン化しているクローン化プラスミドＡｐｏｐ−ｐＭＤ１８Ｔの構築；
ｃ．ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質遺伝子をクローン化している発現プラスミドＡｐｏｐＣ−ｐＥＴ２８ａの構築；
ｄ．ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質の発現および精製；
【００４３】
前述のａ．に記載の発現プラスミドＣ−ｐＥＴ２８ａを構築する方法は、５’末端と３’末端のプライマーを設計し、ＰＣＲ法によりＥＣ−ＳＯＤ全遺伝子をクローン化しているＥＣ−ＳＯＤ−ｐＳＫプラスミドの中のＥＣ−ＳＯＤカルボキシル末端タンパク質形質導入ドメイン（１９６−２２２番のアミノ酸残基）をクローニングする。この断片のＮ−末端に８個のアミノ酸残基を有するリンケージペプチドと結合し、さらにこの断片をｐＥＴ２８ａのＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩサイトにクローニングして、ＥＣ−ＳＯＤカルボキシル末端タンパク質形質導入ドメイン遺伝子の発現プラスミドＣ−ｐＥＴ２８ａを形成する。
【００４４】
前述のｂ．に記載されたクローン化プラスミドＡｐｏｐ−ｐＭＤ１８Ｔを構築する方法は、５’末端と３’末端端プライマーを設計し、ＰＣＲ法によりアポプチン全遺伝子をクローン化しているＡｐｏｐｔｉｎ−ｐＶＫプラスミドの中からアポプチン全遺伝子（１−１２１番のアミノ酸残基）をクローニングする。この遺伝子の５’末端は、ＮｄｅＩ制限酵素サイトに、３’末端はＢａｍＨＩ制限酵素サイトにそれぞれ結合し、そしてこの得られた断片をｐＭＤ−１８Ｔプラスミドにクローニングして、クローン化されたアポプチン遺伝子を含むクローン化プラスミドＡｐｏｐ−ｐＭＤ１８Ｔを形成する。
【００４５】
前述のｃ．に記載された発現プラスミドＡｐｏｐＣ−ｐＥＴ２８ａを構築する方法は、クローン化プラスミドＡｐｏｐ−ｐＭＤ１８Ｔから目的断片を分離し、次にこの断片を同じようにＮｄｅＩとＢａｍＨＩの二種類の酵素で切断したＣ−ｐＥＴ２８ａ発現ベクターの中に挿入して、ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質のクローン遺伝子を有する発現プラスミドＡｐｏｐＣ−ｐＥＴ２８ａを構成する。
【００４６】
前述のｄ．に記載されたＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質の発現および精製方法は、構築したＡｐｏｐＣ−ｐＥＴ２８ａ組換え体プラスミドをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を融合した大腸菌宿主の中に導入する。導入される宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ  ＤＥ３  ｐＬｙｓＳ等であってもよい。形成された人工的細菌は、５０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンの存在下において３７℃のＬＢ培地を０．３〜０．６時間振りながら培養し、それによりＯＤが６００ｎｍ達する。そして、最終濃度が０．５〜３ｍＭになるまでＩＰＴＧを加え、３〜５時間育成する。細胞を回収し、超音波により処理し、封入体を遠心分離により回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で検出した後、次に、８Ｍの尿素溶液に封入体を溶解して変性する。得られた混合溶液は、ニッケル親和性カラムクロマトグラフィーで分離し、目的タンパク質を分画採集し、そして希釈により再生し、濃縮する。滅菌濾過した後、タンパク質を定量して、保存する。
【００４７】
用途
本発明に記載する融合タンパク質は、各種の細胞の過度の増殖により引き起こされる疾患を治療する活性成分として用いることができ、例えば腫瘍：ユーイング肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫等の骨癌；聴神経腫、神経芽細胞腫、神経膠腫及び他の脳腫瘍、脊髄腫瘍、乳癌、結腸直腸癌、進行大腸癌などの脳腫瘍と中枢神経系腫瘍；副腎皮質癌、膵癌、脳下垂体癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、乳癌、多発性内分泌腫瘍などの内分泌腫瘍類；胃癌、食道癌、小腸癌、肝臓癌、肝臓外胆管癌、消化管カルチノイド、胆嚢癌などの消化管癌類；睾丸癌、陰茎癌、前立腺癌等の泌尿生殖器癌類；子宮頸癌、卵巣癌、膣癌、子宮／子宮内膜癌、陰部癌、妊娠性絨毛腫瘍、卵管癌、子宮肉腫等の婦人科癌類；口腔癌、口唇癌、唾液腺癌、喉頭癌、下咽頭癌、咽頭癌、鼻腔癌、副鼻腔癌、上咽頭癌等の頭頚部癌；小児白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛状細胞性白血病、急性前骨髄球性白血病、プラズマ細胞性白血病等の白血病類；骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、再生不良性貧血、ファンコニ貧血、特発性マクログロブリン血症等の骨髄の癌類および血液の障害；肺小細胞癌、非小細胞肺癌等の肺癌類；ホッジゴールデン疾患、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ球腫瘍、ＡＩＤＳ関連リンパ腫等のリンパ腫類；網膜芽細胞腫、ブドウ膜悪性黒色腫等の眼癌類；黒色腫、非黒色腫皮膚癌、メルケル細胞癌の皮膚癌類；小児軟組織肉腫、成人軟組織肉腫、カポジ肉腫等の軟組織肉腫類；腎臓ウィリアムズ癌、膀胱癌、尿道癌等の尿路系の癌、または転移癌等を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
本発明で開示されている融合タンパク質は、癌の治療に用いることができ、好ましくは肝臓癌や肺癌である。
【００４９】
本発明の融合タンパク質は、癌の治療に用いることができ、好ましく固形腫瘍と造血系の悪性腫瘍である。
【００５０】
本文において使われている「腫瘍」とは、一般的に制御不能および異常な増殖をする細胞により引き起こされることを特徴とする疾患を示す。
【００５１】
活性物質の有効投与量は、投与経路及び疾患の重症度により調節される。大部分の大型哺乳類に対しては、１日当たりの活性物質の有効投与量は、約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇである。通常、成人の臨床的な投与量は、０．０１ｍｇ〜２００ｍｇ／日、好ましくは０．０５ｍｇ〜１００ｍｇ／日である。
【００５２】
「有効量」もしくは「治療量」は、どちらも十分に治療効果発揮する量を示す。有効量は１回もしくは複数回で投与できる。典型的には、有効量は、疾患のより緩和、改善、安定、緩慢にするもしくは遅らせるのに十分な量をいう。
【００５３】
組成物
「組成物」とは、本発明に用いられる組成物を言い、もしくは本発明の融合タンパク質を含む組成物を言う。通常、本発明の組成物が上述の用途に用いられる場合、前記融合タンパク質は、一種以上の薬理学的に許容される担体もしくは賦形剤と混合してもよく、異なる投与経路に用いる投与形態、例えば錠剤、カプセル剤、粉末、顆粒剤、シロップ、溶液、内服液、アルコール剤、チンキ、エアゾール、エアゾール粉剤、注射剤、注射用無菌粉末、坐薬などに製造するできる。
【００５４】
「薬理学的に許容される」成分とは、ヒトおよび／または動物に過度の副作用を引き起こす事なく使用される（例えば毒性、刺激とアレルギ反応）がないもの言い、つまり合理的な効果／リスクの割合を有するものを言う。「薬学的に許容される担体」は、本発明の融合タンパク質を動物またはヒトに移すのに用いる薬理学的もしくは栄養学的に許容される溶液、懸濁剤もしくは賦形薬等のことを言う。担体は液体または固体である。
【００５５】
本発明の融合タンパク質の投与経路は、経口投与、静脈投与、筋肉投与または皮下投与などがある。
【００５６】
上述の経口投与の形態としては、錠剤、カプセル剤、粉末、顆粒剤、シロップ、溶液、アルコール剤等があげられる。固形の担体としては、澱粉、乳糖、リン酸二カルシウム、微結晶セルロース、ショ糖、カオリン、シリカ粉末、タルク、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチル澱粉ナトリウム、ポリビニルピロリドン等があげられる。溶液担体としては、滅菌水、エタノール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤および食用油（例えばコーンオイル、ピーナッツ油とゴマ油）等があげられる。薬物の組成物を製造する過程で通常に用いられるアジュバントとしては、甘味剤、着色剤、保存料（例えばブチルヒドロキシベゾエート、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸）と抗酸化剤（例えばビタミンＥ、ビタミンＣ、ビス亜硫酸ナトリウムとジブチルヒドロキシトルエン）等があげられる。
【００５７】
上述の注射投与する形態は、注射剤、注射用無菌粉末等を含み、これらは薬理学的活性物質を一種以上の薬理学的に許容される担体と一緒に薬理学的活性物質を混合して作ることができる。溶剤としては、滅菌水、アルコール、グリセリン、プロピリングリコール、ポリエチレングリコール等が挙げられる。また、抗菌剤（例えばベンジルアルコール、ブチルヒドロキシベンゾエート、マーシオレート等）、等張化剤（例えば塩化ナトリウム、ブドウ糖等）、懸濁化剤（例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、溶解補助剤（Ｔｗｅｅｎ−８０、卵のリン脂質など）、抗酸化剤（例えば、ビタミンＥ、ビタミンＣ、メタ重亜硫酸ナトリウム等）と充填剤（例えば、乳糖、マニトール等）などを含む。
【００５８】
製造および投与を容易にすることを考慮して、薬理学的組成物は、好ましくは固形組成物であり、さらに好ましくは凍結粉末である。投与経路は、好ましくは静脈投与である。
【００５９】
次に、実施例をもとに具体的に本発明を更に説明する。これらの実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。以下の実施例の中に具体的な条件が説明されない実験方法は、一般的に通常の条件もしくは製造メーカーが提案する条件を使う。特に記載しない限りは、配合とパーセンテージは質量に基づく。
【実施例】
【００６０】
（実施例１）：ＥＣ−ＳＯＤカルボキシル末端タンパク質導入ドメイン遺伝子のクローンを有する発現プラスミドＣ−ｐＥＴ２８ａを構築する
１．ＥＣ−ＳＯＤカルボキシル末端タンパク質導入ドメイン遺伝子のＰＣＲ増幅
（１）Ｇｅｎｂａｎｋで登録されているヒトＥＣ−ＳＯＤの遺伝子配列に従い、ＥＣ−ＳＯＤカルボキシル末端タンパク質導入ドメイン遺伝子のサブクローンのフォワードとリバースプライマーを設計した：
Ｐ１：５’−ＴＡＡＴＡＡＧＣＴＴＣＣＧＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＧＡＡＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＣＴＣ−３’
Ｐ２：５’−ＡＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＧＧＣＣＴＴＧＣＡＣＴＣＧＣＴＣＴ−３’
フォワードプライマーＰ１の中に、一つのＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイトと８個のアミノ酸残基を有するリンケージペプチド（ＡｌａＳｅｒＡｌａＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）を挿入した；一方で、リバースプライマーＰ２の中に、一つのＸｈｏＩ制限酵素サイトを導入した。
（２）ＰＣＲ増幅の反応条件は：９４℃において５分間変性させ、次に９４℃において３０秒間変性させ、さらに６０℃において３０秒間再生させ、その後７２℃において１分間伸長させた。これらの工程を３０回で繰り返し、最後７２℃を５分間持続した。
（３）ＰＣＲ産物を回収した後、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩの二種類の制限酵素で切断し、後で利用するために保存した。
【００６１】
２．組み換え体発現プラスミドＣ−ｐＥＴ２８ａの構築
ＰＣＲ増幅および制限酵素切断により得られた挿入断片を、同じ酵素で加水分解により処理されたｐＥＴ２８ａプラスミドの回収されたＤＮＡと結合させた。結合した断片によりＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α菌株を形質転換させ、培養した。組み換え体プラスミドＤＮＡを回収し、配列を確認した。
【００６２】
３．ＰＣＲ増幅された目的断片の２％アガロースゲルの電気泳動を図１に示す。Ｍは、標準のＤＮＡ分子量マーカーであり、１は約１２０ｂｐのＥＣ−ＳＯＤカルボキシル末端タンパク質導入ドメイン遺伝子断片を表す。
【００６３】
４．発現プラスミドの構築過程の模式図を図２に示す。
【００６４】
（実施例２）：アポプチン遺伝子を有するクローン化プラスミドＡｐｏｐ−ｐＭＤ１８Ｔの構築する
１．アポプチン遺伝子のＰＣＲ増幅
（１）Ｇｅｎｂａｎｋで登録されている鶏貧血ウイルスＶＰ３タンパク質の遺伝子配列に従い、サブクローンアポプチン遺伝子のフォワードとリバースプライマーを設計した：Ｐ３：５’−ＧＡＣＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＣＧＣＴＣＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡ−３’
Ｐ４：５’−ＴＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＣＧＣＣＴＴＴＴＴＧ−３’
フォワードプライマーＰ３の中に一つのＮｄｅＩ制限酵素サイトを挿入し、リバースプライマーＰ２の中に一つのＢａｍＨＩ制限酵素サイトと終止コドンを挿入した。
（２）ＰＣＲ増幅の反応条件は：９４℃において５分間変性させ、次に９４℃において３０秒間変性させ、さらに５５℃において３０秒間再生させ、その後７２℃において４５秒間伸長させた。この工程を３０回繰り返し、最後７２℃の５分間持続した。
（３）ＰＣＲ産物を回収し、後で利用するために保存した。
【００６５】
２．組み換え体クローン化プラスミドＡｐｏｐ−ｐＭＤ１８Ｔの構築
ＰＣＲ増幅から回収した挿入断片を、ｐＭＤ１８Ｔベクター（タカラバイオ株式会社から購入した）ＤＮＡと結合させ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α菌株を形質転換させ、培養した。液体培地で培養したものを青白検定により陽性クローンを選別した。また液体培地で培養した後、組換え体プラスミドＤＮＡを回収し、配列を確認した。
【００６６】
３．ＰＣＲ増幅により得られたアポプチン遺伝子断片の全長の１．５％アガロースゲルの電気泳動を図３に示す。１はＰＣＲ増幅により得られた約３７０ｂｐのアポプチン遺伝子であり、Ｍは、標準のＤＮＡ分子量マーカーである。
【００６７】
４．発現プラスミドの構築過程の模式図を図４に示す。
【００６８】
（実施例３）：ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質遺伝子のクローンを有している発現プラスミドＡｐｏｐＣ−ｐＥＴ２８ａの構築
１．アポプチン遺伝子の挿入断片の獲得
獲得し、シークエンシングにより確認されたＡｐｏｐ−ｐＭＤ１８ＴプラスミドＤＮＡをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩの二種類の制限酵素で切断した。切断された断片は、１％アガロースゲルの電気泳動により分離し、ゲル抽出キットを用いて目的断片ＤＮＡを回収した。
【００６９】
２．ベクターの準備
構築、増幅により作製されたＣ−ｐＥＴ２８ａプラスミドのＤＮＡを、同様にＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩの二種類の制限酵素で切断した。得られた切断断片は、１％アガロースゲルの電気泳動により分離し、ゲル抽出キットを用いて目的ＤＮＡ断片を回収した。
【００７０】
３．組み換え体発現プラスミドＡｐｏｐＣ−ｐＥＴ２８ａの構築
回収したアポプチンのＤＮＡ断片をＣ−ｐＥＴ２８ａプラスミドＤＮＡと結合させ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を形質転換させて、３７℃で培養した。プラスミドＤＮＡを回収し、シークエンシングにより確認した。
【００７１】
４．発現プラスミドの構築過程の模式図を図５に示す。
【００７２】
５．ＰＣＲにより検出された組み換え体バクテリアコロニーの１．５％アガロースゲルの電気泳動を図６に示す。１は、ｐＥＴ２８ａプラスミドＤＮＡをテンプレートとしてたネガティブコントロールであり、２は、構築したＡｐｏｐＣ−ｐＥＴ２８ａのＰＣＲでの検出結果であって、プライマーは、Ｐ３およびＰ２プライマーであり、断片の長さは、約５００ｂｐであった。Ｍは、標準ＤＮＡ分子量マーカーである。
【００７３】
（実施例４）：ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質の発現と精製
１．ＡｐｏｐＣ−ｐＥＴ２８ａプラスミドを持つＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）組み換え体合成バクテリアをカナマイシンが入ったＬＢアガープレートで培養した。クローンを一つ選び、３７℃で５０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地で、一晩培養した。次に、この培養液を、１％の接種量を使って新しい５０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地に移し、ＯＤ６００＝  ０．３〜０．６に到達するまで３７℃で培養した。導入のために０．５〜３ｍＭのＩＰＴＧ加え、３〜５時間、３７℃で引き続き培養した。バクテリアを回収して、超音波処理し、遠心分離にて封入体を収集した。
【００７４】
２．形質導入発現から得られたバクテリアを超音波処理し、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行った結果を図７に示す。図７において、１は、形質導入される前の超音波処理した組み換え体の上清であり、２、３、４、５、６は、それぞれ形質導入を１、２、３、４、５時間した後の超音波処理した組み換え体細胞の上清であり、７、８は、形質導入を４、５時間した後の超音波処理した組み換え体細胞の沈殿である。Ｍは、標準ＤＮＡ分子量マーカーである。
【００７５】
３．融合タンパク質の封入体を洗浄により精製し、８Ｍ尿素で封入体を１〜２時間溶解した。遠心分離にて沈殿を除去した。ｐＨ７．４−９．０に調節し、ニッケル親和性クロマトグラフィーゲルを加え、１〜２時間吸着させた。、そのゲルをクロマトグラフィーカラムに加え、洗浄し、２０−５００ｍＭのイミダゾールで勾配溶出した。精製された組み換え体ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質（Ａｐｏｐｔｉｎ−ＥＣ−ＳＯＤ−ＰＴＤ）を収集した。
【００７６】
４．目的タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動解析結果を図７に示す。図７において、１は、カラムクロマトグラフィー前のサンプル溶液、２は、洗浄段階で回収したサンプル、３、４、５、６は、２０ｍＭのイミダゾール溶出分画液であり、Ｍは、標準タンパク質分子量マーカーであり、７、８、９は、１００ｍＭのイミダゾール溶出分画液であり、１０、１１、１２は５００ｍＭのイミダゾール溶出分画液である。
【００７７】
（実施例５）：ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した腫瘍細胞のアポトーシスの効果。
１．ＨｅＬａ細胞を９６穴の細胞培養プレートで細胞密度が６０％程度になるまで３７℃で培養した。発現した後に分離および精製して得た組み換え体アポプチン−ＥＣ−ＳＯＤ−ＰＴＤサンプルを繰り返し透析し、イミダゾールを除去した。滅菌濾過を行った後、異なる量のＤＭＥＭ細胞培地を加えてタンパク質を希釈した。最も高いタンパク質濃度から濃度を半減していき、タンパク質濃度がゼロになるまで段階的に希釈した。そして、タンパク質を含まない溶液をネガティブコントロールとし、各タンパク質濃度を３〜４個のウェルに取って、並列コントロールとした。同時に、類似する方法を採用して、同様の方法で分離、精製した原核細胞の発現システムから得られた組み換え体アポプチンタンパク質をコントロールとして同様の実験操作を行った。２セットのサンプルを２４時間培養し、培地を除去し、１００μｌの５ｕｇ／ｍｌのＭＴＴを含有するＤＭＥＭを加え、３７℃において４時間培養し、培地を除去し、１００μｌのＤＭＳＯを加えで紫の結晶を溶解し、３７℃において１０分間培養し、マイクロプレートリーダーを使って、４９０ｎｍでの吸光度を測定した。組み換え体アポプチン−ＥＣ−ＳＯＤ−ＰＴＤ濃度が１００μｇ／ｍｌの場合、ＨｅＬａ細胞の生存率は４７％（ＩＣ５０＝１０５μｇ／ｍｌ）であった。ただし、同一の条件下における対照群の組み換え体アポプチン（１００μｇ／ｍｌ）とネガティブコントロールとしての緩衝液は、ＨｅＬａ細胞の生長に及ぼす影響が著しくなかった。
【００７８】
２．組み換え体アポプチン−ＥＣ−ＳＯＤ−ＰＴＤと組み換え体アポプチンに誘導されたＨｅＬａ細胞アポトーシスの結果を図８に示す。異なる濃度のサンプルにおけるＨｅｒａ細胞の生存率は、ＭＴＴ法で検出した。
【００７９】
（実施例６）：ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養した正常な動物細胞に及ぼす効果。
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した正常なヒト肝臓セルラインＬ０２に対しての組み換え体アポプチン−ＥＣ−ＳＯＤ−ＰＴＤのＩＣ５０をＭＴＴで測定し、投与量と細胞毒性の関係を観察した。
１．正常なヒト肝臓セルラインＬ０２をＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ウシ胎児血清を含む）で培養した。膵酵素で分解した後、培養細胞は、１×１０５／ｍｌの細胞濃度の単個細胞浮遊液を１６４０培養液で作成した。９６穴の細胞培養プレートに１００μｌ接種した。３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで４時間培養した。
【００８０】
２．培養液を用いてそれぞれ２００、１００、５０、２５、０μｇ／ｍｌの濃度のに希釈してテスト薬物を作った。、各ウェルの体積は１００μｌであり、各グループが３個のウェルの並列コントロールを有した。３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで４８時間培養した。
【００８１】
３．各培養ウェルにＭＴＴ溶液を加え、マイクロプレートリーダー比色分析法により、細胞の生存率を計算した。試験データは平均値±標準差で表示した。
【００８２】
４．ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した正常な動物細胞に及ぼす毒性の効果を図９に示す。組み換え体アポプチン−ＥＣ−ＳＯＤ−ＰＴＤはｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した正常なヒト肝臓細胞になんの毒性もないことを示した。
【００８３】
（実施例７）：ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質のマウス腹水腫瘍モデルに対しての腫瘍抑制効果。
組み換え体アポプチン−ＥＣ−ＳＯＤ−ＰＴＤの腫瘍抑制をＣ５７ＢＬ／６マウスＬｅｗｉｓ肺癌モデルを使って証明した。ブランクコントロール、ポジティブコントロール、組み換え体アポプチン−ＥＣ−ＳＯＤ−ＰＴＤ試験グループ、組み換え体ポリアルギニン−アポプチン試験グループ（Ｐｏｌｙ  Ａｒｇ−Ａｐｏｐｔｉｎ）の四つのグループを設け、各グループに対して８匹の動物をテストした。腫瘍を接種した後に、ブランクコントロールに生理食塩水を腹腔注入した。一方で、ポジティブコントロールには、シクロホスファミド溶液（２０ｍｇ／ｋｇＢＷ／日）を注射した。この二つの試験グループに、それぞれに精製、透析、滅菌濾過された組み換え体アポプチン−ＥＣ−ＳＯＤ−ＰＴＤ（１０ｍｇ／ｋｇＢＷ／日）と組み換え体Ｐｏｌｙ  Ａｒｇ−アポプチン（４０ｍｇ／ｋｇＢＷ／日）を注射した。
【００８４】
１．腫瘍セルラインの接種：六週齢の体重が約２０ｇのＣ５７ＢＬ／６（雄）マウスの腋下へ０．２ｍｌのＬｅｗｉｓ肺癌細胞の懸濁液を接種した。３〜４日後、マウス腋下の腫瘍が成長する状況を観察した。注射した部位の腫瘍は直径が数ミリメートルの大きさに至る時に、薬物を投与する試験が始められた。
【００８５】
２．薬物の投与：腹腔注入で薬物を投与し、７〜８日間継続した。毎日薬物を投与する前に体重を測定した。
【００８６】
３．腫瘍への抑制率の測定：薬物の投与を止めて二日目に、頚椎脱骨して、マウス体内の腫瘍組織を切り取って、質量を測定し、腫瘍への抑制率を計算した。
腫瘍への抑制率＝（ブランクコントロールの腫瘍の平均重量−試験グループの腫瘍の平均重量）／ブランクコントロールの腫瘍の平均重量Ｘ１００％
【００８７】
４．組み換え体アポプチン−ＥＣ−ＳＯＤ−ＰＴＤのＬｅｗｉｓ肺癌に対する抑制率は３７．８％で、組み換え体Ｐｌｏｙ  Ａｒｇ−Ａｐｏｐｔｉｎグループと比べて高く、ポジティブコントロールに近い（ポジティブコントロールグループの抑制率は４７．４％である）。これらの結果は、ＥＣ−ＳＯＤ−ＰＴＤとの結合を増加結果、アポプチンの膜貫通効果が一段と高くなったことを証明しており、腫瘍細胞の増殖に対してより好ましい抑制作用を発揮した。
【００８８】
ＥＣ−ＳＯＤのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合タンパク質の腹水腫瘍に対する抑制作用
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【００８９】
本発明の範囲は、上述の実施例に限定されるものではない。前記実施例は、本願発明の全ての概念を説明する例として使用されている。本願発明は、機能的同等な方法および組成物を含むものである。すなわち、ここに記載する内容に加えて、本明細書および図面に基づき種々の変更を加えることをは、当該技術の通常の知識を有するものには、容易なことである。これらの変更は、全て、本願発明の特許請求の範囲に入るものである。さらに、上述の各引用文献は、参考として全て本願発明に組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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