(57)【要約】  本発明は、ベータアミロイド１−４２ペプチドとＶＥＧＦ１６５の結合を抑制する物質を探索して発見された化合物に関する発明である。前記本発明によって探索された抑制物質は、アルツハイマー治療物質としての有効性を向上させることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）化合物ライブラリファイル全体に対して分子ドッキングシミュレーションを行い、蛋白質チップスクリーニングのための出発物質を探索するステップと、
ｂ）前記探索された出発物質を血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）と混合して混合物を製造するステップと、
ｃ）前記混合物をベータアミロイド付着蛋白質チップに添加するステップと、及び、
ｄ）前記結合程度を分析するステップとを含んでなることを特徴とする、ベータアミロイド抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記ドッキング計算のための検索アルゴリズムが、アルファトライアングル方法を用いたことを特徴とする、請求項１に記載のベータアミロイド抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記結合程度の分析が、血管内皮成長因子に特異的に結合する一次抗体を用いてベータアミロイドに結合した血管内皮成長因子と反応させた後、前記一次抗体に結合可能な蛍光物質が結合された二次抗体を用いて行われることを特徴とする、請求項１に記載のベータアミロイド抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記蛍光物質が、Ｃｙ３（グリーン）、Ｃｙ５（レッド）、ＦＩＴＣ（グリーン）、アレクサ（Ａｌｅｘａ）、ボディピ（ＢＯＤＩＰＹ）、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、およびＱ−ドット（ｄｏｔ）からなる群より選択された１種以上の蛍光物質であることを特徴とする、請求項３に記載のベータアミロイド抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法によって得られた下記の化学式１ないし２からなる群より選択された１種以上の化合物またはその塩を含むことを特徴とする、ベータアミロイド抑制剤。
【化１】
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【化２】
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【請求項６】
下記の化学式１ないし２からなる群より選択された１種以上の化合物またはその塩を含むことを特徴とする、ベータアミロイド抑制剤。
【化３】
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【化４】
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【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法によって得られた下記の化学式１ないし２からなる群より選択された１種以上の化合物またはその塩を有効成分として含むことを特徴とする、アルツハイマー治療または予防用組成物。
【化５】
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【化６】
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【請求項８】
下記の化学式１ないし２からなる群より選択された１種以上の化合物またはその塩を有効成分として含むことを特徴とする、アルツハイマー治療または予防用組成物。
【化７】
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【化８】
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【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベータアミロイド１−４２ペプチドとＶＥＧＦ１６５の結合を抑制する物質を探索して発見された化合物に関する発明である。前記本発明によって探索された抑制物質は、アルツハイマー治療物質としての有効性を向上させることができる。
【背景技術】
【０００２】
痴呆の主な原因となっているアルツハイマー病は、記憶喪失、思考減少、進行性神経退行などの特徴がある。アルツハイマー病の病理学的な特徴としては、神経細胞外に蓄積される老人斑（ｓｅｎｉｌｅ  ｐｌａｑｕｅｓ）と、細胞内に見られる神経原繊維のもつれ（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅｓ）を挙げることができる。このような病理学的特徴は、家族性アルツハイマー病（ｆａｍｉｌｉａｌ  ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＦＡＤ）と孤発性アルツハイマー病（ｓｐｏｒａｄｉｃ  ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＳＡＤ）のすべての場合に現れ、そのうち、老人斑はベータアミロイドという毒性蛋白質が主な構成要素であることが明らかになり、ベータアミロイドの蓄積過多が共通した形状として現れることが報告されている（Ｐａｒｉｈａｒ  ＭＳ，Ｈｅｍｎａｎｉ  Ｔ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４，Ｊｕｎ；１１（５）：４５６−６７，Ｓｅｌｋｏｅ  ＤＪ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９９  Ｊｕｎ  ２４；３９９（６７３８  Ｓｕｐｐｌ）：Ａ２３−３１）。
【０００３】
このアミロイドは、βプリーツシート構造（β−ｐｌｅａｔｅｄ  ｓｈｅｅｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を有してベータアミロイドと呼ばれるようになり、略３９〜４３個のアミノ酸からなり、水溶性ペプチドがβプリーツシート構造を形成すると、繊維体（ｆｉｂｒｉｌ）を形成して沈着しやすくなって毒性を形成し、これがアルツハイマー病（ＡＤ）の重要な病因であると考えられている。大きい分子量の前駆蛋白質であるＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０が、蛋白質分解酵素による代謝過程によって分解されて生成される代謝産物である。
【０００４】
ＡＰＰは、内在性膜蛋白質（Ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）で、アミロイド生成経路（ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ）と非アミロイド生成経路（ｎｏｎ−ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ）の２つでその代謝過程が進行する。アミロイド生成経路は、ベータアミロイドが生成されるもので、ベータセクレターゼとガンマセクレターゼという蛋白質分解酵素によってベータアミロイドが形成され、このとき、付随的に細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）が切断され、ＡＰＰβの形態で細胞外に分泌される。これに対し、非アミロイド生成経路は、正常人に優れて見える経路で、ベータアミロイドが形成されず、アルファセクレターゼという蛋白質分解酵素によってベータアミロイドの１６／７番目の部分が切断され、この切断された細胞外ドメインは、ＡＰＰαの形態で細胞外に分泌される。
【０００５】
ベータセクレターゼによって切断されたＡＰＰは、Ｃ９９と呼ばれる細胞質ドメイン（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）と、ｓＡＰＰβ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  β−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ＡＰＰ）と呼ばれるＮ−末端ドメイン（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ）とに分けられる。Ｃ９９は、さらにガンマセクレターゼによって４ｋＤａのベータアミロイドを作り出し、少量に凝集力がよく、神経斑で主に発見される４２個のアミノ酸からなるベータアミロイド４２である。ｓＡＰＰβは、その機能はよく知られていないが、９０ｋＤａ前後の蛋白質を細胞外に分泌する（Ｓｕｈ  ＹＨ，Ｃｈｅｃｌｅｒ  Ｆ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ２００２；５４：４６９−５２５．，Ｓｕｈ  ＹＨ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  １９９７；６８：１７８１−９１．，Ｓｅｌｋｏｅ  ＤＪ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２００１；８１：７４１−６６）。
【０００６】
ベータアミロイドの配列において、凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）と神経毒性（ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）の特性が確認された。配列の中間部位であるＫＬＶＦＦ（Ａβ１６−２０）は、ベータアミロイド間の相互作用に重要である。また、ベータアミロイドの２５−３５番目の部位は、ペプチドに凝集と神経毒性の２つとも寄与するものとされている（Ｙａｎｇ  ＳＰ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００５  Ａｐｒ；９３（１）：１１８−２７．）。
【０００７】
血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）は、新しい血管の生成に重要な要素の一つである。ＶＥＧＦは、ホモ二量体蛋白質で、選択的スプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）によって１２１、１４５、１６５、１８９、２０６個のアミノ酸からなる５種の異性体が作られる。最近の研究によれば、ＶＥＧＦ１６５は、血管の生成とインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）における血管透過性、そして、内皮細胞成長への関与と（Ｄｉ  Ｂｅｎｅｄｅｔｔｏ  Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２００８  Ａｐｒ；１７８０（４）：７２３−３２．Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｆｅｂ  ７．）、向精神性と神経保護因子のような新たな役割が加えられた。
【０００８】
ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１６５は、ＶＥＧＦ異性体の大部分を占めており、ＶＥＧＦの活性においてもほとんど関与する。ＶＥＧＦ１６５は、ＶＥＧＦ１２１よりＶＥＧＦ受容体に対して高い親和度を有し、内皮細胞の分裂においても高い刺激効果を表す。すべてのＶＥＧＦ異性体は、共通して、１１０個のアミノ酸からなるＮ−末端受容体結合ドメインを有している。これに対し、Ｃ−末端はそうでない。ＶＥＧＦ１６５は、ヘパリンが結合可能な５５個のアミノ酸からなるヘパリン結合ドメイン（ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ、ＨＢＤ）を有しており、これは、エクソン７および８によってエンコードされている。しかし、ＶＥＧＦ１２１は、ＨＢＤを有しておらず、ヘパリンの結合が不可能である。最近の報告によれば、ＶＥＧＦはベータアミロイドと相互作用し、ベータアミロイドの細胞毒性に影響を及ぼす。ＶＥＧＦ１６５はベータアミロイドと相互作用するのに対し、ＶＥＧＦ１２１は、ＨＢＤを有していないため、ベータアミロイドと相互作用をしない。また、ＶＥＧＦ１６５がベータアミロイドに結合する核心結合部位がペプチドの２５−３５配列の部位とされている。ベータアミロイドの２５−３５部位は、前述したように、ベータアミロイドに毒性を持たせる。ＶＥＧＦ１６５は、ベータアミロイドの凝集とベータアミロイドによって誘導される神経毒性から細胞を保護する（Ｙａｎｇ  ＳＰ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００５  Ａｐｒ；９３（１）：１１８−２７）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記の必要性によってなされたものであって、本発明の目的は、ベータアミロイド抑制剤のスクリーニング方法を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、ベータアミロイド抑制剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の目的を達成するために、本発明は、ａ）化合物ライブラリファイル全体に対して分子ドッキングシミュレーションを行い、蛋白質チップスクリーニングのための出発物質を探索するステップと、ｂ）前記探索された出発物質を血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）と混合して混合物を製造するステップと、ｃ）前記混合物をベータアミロイド付着蛋白質チップに添加するステップと、ｄ）前記結合程度を分析するステップとを含むベータアミロイド抑制剤のスクリーニング方法を提供する。
【００１２】
本発明の一具体例において、前記ドッキング計算のための検索アルゴリズムは、アルファトライアングル方法を用いたものが好ましいが、これに限定されない。
【００１３】
また、本発明の一実施例において、前記結合程度の分析は、血管内皮成長因子に特異的に結合する一次抗体を用いてベータアミロイドに結合した血管内皮成長因子と反応させた後、前記一次抗体に結合可能な蛍光物質が結合された二次抗体を用いて行われることが好ましいが、これに限定されず、前記蛍光物質は、Ｃｙ３（グリーン）、Ｃｙ５（レッド）、ＦＩＴＣ（グリーン）、アレクサ（Ａｌｅｘａ）、ボディピ（ＢＯＤＩＰＹ）、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、およびＱ−ドット（ｄｏｔ）からなる群より選択された１種以上の蛍光物質であることが好ましいが、これらに限定されない。
【００１４】
さらに、本発明は、前記本発明にかかるスクリーニング方法によって得られた下記の化学式１ないし２からなる群より選択された１種以上の化合物またはその塩を含むベータアミロイド抑制剤を提供する。
【化１】
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【化２】
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【００１５】
また、本発明は、下記の化学式１ないし２からなる群より選択された１種以上の化合物またはその塩を含むベータアミロイド抑制剤を提供する。
【化３】
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【化４】
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【００１６】
さらに、本発明は、本発明にかかるスクリーニング方法によって得られた下記の化学式１ないし２からなる群より選択された１種以上の化合物またはその塩を有効成分として含むアルツハイマー治療または予防用組成物を提供する。
【化５】
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【化６】
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【００１７】
また、本発明は、下記の化学式１ないし２からなる群より選択された１種以上の化合物またはその塩を有効成分として含むアルツハイマー治療または予防用組成物を提供する。
【化７】
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【化８】
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【００１８】
化学式１または２の化合物およびその薬学的に許容可能な塩を、例えば、薬学製剤の形態で薬剤として使用することができる。前記薬学製剤を経口に、例えば、錠剤、コーティングされた錠剤、糖衣錠、硬質および軟質ゼラチンカプセル、溶液、乳化液または懸濁液の形態で投与することができる。しかし、前記投与をさらに直腸によって、例えば、座薬の形態で、非経口的に、例えば、注射液の形態で行うことができる。
【００１９】
化学式１または２の化合物を、薬学製剤の製造のために、薬学的に不活性である無機または有機担体とともに加工することができる。例えば、錠剤、コーティングされた錠剤、糖衣錠、および硬質ゼラチンカプセルに対する担体として、ラクトース、トウモロコシ澱粉またはその誘導体、滑石、ステアリン酸またはその塩などを使用することができる。軟質ゼラチンカプセルに好適な担体は、例えば、植物性オイル、ワックス、脂肪、半固体および液体ポリオールなどである。しかし、有効物質の性質によって、大体、軟質ゼラチンカプセルの場合には担体が必要でない。溶液およびシロップの製造に好適な担体は、例えば、水、ポリオール、グリセロール、植物性オイルなどである。座薬に好適な担体は、例えば、天然または硬化オイル、ワックス、脂肪、半液体または液体ポリオールなどである。
【００２０】
前記薬学製剤はさらに、保存剤、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、香料、滲透圧変化用塩、緩衝剤、マスキング剤または酸化防止剤を含むことができる。前記製剤はまた、さらに他の治療学的に貴重な物質を含むことができる。
【００２１】
化学式１または２の化合物またはその薬学的に許容可能な塩および治療学的に不活性である担体を含む薬剤がまた、１種以上の化学式１または２の化合物および／または薬学的に許容可能な酸付加塩、および場合によっては、１種以上の他の治療学的に貴重な物質を、１種以上の治療学的に不塩活性である担体とともに、生薬投与形態で作ることを含むその製造方法と同様に、本発明の目的である。
【００２２】
本発明にかかり、化学式１または２の化合物だけでなく、その薬学的に許容可能な塩は、疾病、例えば、アルツハイマー病の抑剤または予防に有用である。
【００２３】
容量を広範囲な限界内で変化させることができ、もちろん、各々の特定の場合に個別の要件によって調節しなければならない。経口投与の場合、成人容量を１日に約０．０１ないし約１０００の化学式１または２の化合物、あるいはそれ相応の量の薬学的に許容可能な塩に変化させることができる。前記１日の容量を単一容量としてまたは分割容量として投与することができ、さらに、前記上限は、使用が指示されたことが明らかになる場合も超過可能である。
【００２４】
製剤を製造して容器内に充填させて密封する工程は、通常の抗菌および無菌の条件下に行う。
【００２５】
本発明の化合物は、当業界に周知の通常の製造方法によって製造できる。
【００２６】
以下、本発明を説明する。
【００２７】
本発明は、ベータアミロイド１−４２ペプチドとＶＥＧＦの相互作用抑制剤に関する発明である。
【００２８】
ベータアミロイド１−４２（Ａβはアルツハイマー病（ＡＤ）の発病に最も有力な物質で、水溶性のアミロイドがベータプリーツシート構造（β  ｐｌｅａｔｅｄ  ｓｈｅｅｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を形成すると、繊維体（ｆｉｂｒｉｌ）を形成して沈着しやすくなって毒性を形成し、神経細胞死に関与するようになる。ここで、ＶＥＧＦ１６５のＨＢＤは、ベータアミロイドが毒性を示すのに関与する部位である２５−３５に結合して、Ａβ毒性を減少させる。ベータアミロイドとＶＥＧＦ１６５の結合を抑剤するＨＢＤと類似の化合物は、アルツハイマー病の治療剤および医薬品の原料として開発できる。ベータアミロイドとＶＥＧＦ１６５の抑制剤をスクリーニングするために、数万個の化合物を迅速かつ容易にスクリーニングする方法が必要になった。仮想探索方法と蛋白質チップを用いて探索された物質は、ベータアミロイドとＶＥＧＦ１６５の結合抑制剤として開発できる。
【発明の効果】
【００２９】
ベータアミロイドとＶＥＧＦ１６５の結合を抑剤する物質として、ＶＥＧＦ１６５のＨＢＤと結合してＶＥＧＦ１６５−ベータアミロイドの相互作用を阻害することにより、神経細胞においてＶＥＧＦ１６５がフリーになり、ＶＥＧＦ１６５が向精神性と神経保護因子として作用できるように補助する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】仮想探索に用いられた方法を整理したものである。
【図２】ベータアミロイド１−４２ペプチドとＶＥＧＦ１６５の相互作用による濃度別の結合力を確認した実験結果である。
【図３】実施例１によって探索された天然物由来の化合物ライブラリからベータアミロイド１−４２ペプチドとＶＥＧＦ１６５の相互作用を抑剤した結果である。
【図４】実施例３で行った一次スクリーニングの結果から得られた化合物を対象として、ベータアミロイドとＶＥＧＦ１６５との結合を競争的に抑剤する化合物の濃度依存的抑剤能力を実験した結果として、ＩＣ５０（最大抑剤濃度の５０％の抑剤濃度）値を示したものである。
【図５】ベータアミロイドとＶＥＧＦ１６５の相互作用を抑剤する物質の化学的構造とその名称である。
【図６】ＰＣ１２細胞とＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において、ベータアミロイドの毒性を確認した結果である。
【図７】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において、ＡｌｚｈｅｍｅｄＴＭとＩＰＳ−０４００１によってベータアミロイド毒性の減少を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、非限定的な実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。ただし、下記の実施例は本発明を説明するための目的として記載されたものであって、本発明の範囲は、下記の実施例によって制限されるものとして解釈されない。
【００３２】
実施例１：ベータアミロイドとＶＥＧＦ１６５の結合を妨げる物質の仮想探索
仮想スクリーニングのために用いられたソフトウェアは、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ社製のＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）プログラムと、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｄａｔａ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＣＣＤＣ）製のＧＯＬＤ  ４．０．１プログラムである。探索方法は、分子ドッキングシミュレーションを利用した。具体的な方法は、次のとおりである。まず、４０，０００個のライブラリ化合物ファイル全体に対して一次分子ドッキングシミュレーションを行った。ターゲットレセプター蛋白質は、ＶＥＦＧモデルのうち、プロテインデータバンク（ＰＤＢ）の１ＫＭＸ構造を使用した。ドッキング計算のための検索アルゴリズムは、アルファトライアングル（ａｌｐｈａ  ｔｒｉａｎｇｌｅ）方法を用いて、各リガンド化合物あたり最大５００，０００回の構造変化エネルギー計算を行った。この方法は、分子の３つのポイントを三角形に形状化し、レセプター蛋白質の他のトライアングルとのマッチングの有無を判断してドッキングするアルゴリズムを用いる。スコアリング方法は、ＬｏｎｄｏｎｄＧ法を用いて、リガンドあたり最大１０個のポーズを計算した。ＭＯＥで支援するスコアリング方法は、ＬｏｎｄｏｎｄＧ、ＡｆｆｉｎｉｔｙｄＧ、ＡｌｐｈａＨＢの３つがあり、本計算に用いられたＬｏｎｄｏｎｄＧは、下記のとおりである。
【数１】
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【００３３】
ＬｏｎｄｏｎｄＧ関数は、結合による回転／変換エントロピー（ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ／ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｎｔｒｏｐｙ）の変化、リガンドの結合によるフレキシビリティエネルギーの減少、水素結合エネルギー、金属イオンライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）、脱溶媒和エネルギー（ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ）の差などがパラメータとして用いられる。
【００３４】
４０，０００個の化合物に対する一次ドッキングシミュレーションの結果、結合力に優れた１０，０００個の化合物を選別して、二次ドッキングシミュレーションを行った。二次ドッキングシミュレーションでは、ＧＯＬＤプログラムを利用して、Ｓｌｏｗオプションを用いて演算を行った。ＧＯＬＤプログラムでは、スコアリング関数として、ＧｏｌｄＳｃｏｒｅ、ＣｈｅｍＳｃｏｒｅ、ＡＳＰＳｃｏｒｅの３つのオプションを支援するが、二次ドッキングシミュレーションではＧｏｌｄＳｃｏｒｅを用いた。１０，０００個の化合物に対するドッキングシミュレーションおよびエネルギーの最小化結果スコアであるＬｏｎｄｏｎｄＧ値が最も高い１４０  個の化合物を選んで、蛋白質チップスクリーニングのための出発物質として提案した（表１）。表１は、仮想スクリーニングの結果、結合力に最も優れた１４０個の化合物の一連番号を明示した表である。
【表１】
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【００３５】
表１は、仮想探索に用いられた方法を整理したものである。
【００３６】
実施例２：基板へのベータアミロイドの固定化
蛋白質を固定する基板として、ＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐＴＭ（Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．、韓国、ソウル）を用いた。基板上にシート紙を付着してウェルチップを作った。３０％のグリセロール溶液を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）に、ベータアミロイド（Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧ、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を５０μｇ／ｍｌで希釈して、各ウェルに添加し、３０℃、湿度インキュベータ（ｈｕｍｉｄｉｔｙ  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で一晩中反応させた後、結合して残留するベータアミロイドは、０．０５％のツイン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（０．０５％のＰＢＳＴ）で洗浄した後、窒素ガスで乾燥し、高速大量探索を行った。
【００３７】
実施例３：ライブラリからベータアミロイドとＶＥＧＦ１６５の相互作用抑剤物質の高速大量探索
３−１）ベータアミロイドとＶＥＧＦ１６５の相互作用
ベータアミロイドとＶＥＧＦ１６５の相互作用を調べるために、実施例２で製造したベータアミロイド付着蛋白質チップを、２時間、３％のＢＳＡでブロッキングし、洗浄溶液（０．０５％のＰＢＳＴ）で２回洗浄し、窒素ガスを用いて乾燥した。その後、前記ベータアミロイドマイクロアレイヤーに、５００μｇ／ｍｌから３．９μｇ／ｍｌ範囲の濃度のＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ  ＵＳＡ）を、３０％のグリセロール溶液を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で希釈させ、各ウェルに入れて、３０℃、湿度インキュベータで１時間反応させた後、ベータアミロイドと結合しないＶＥＧＦ１６５をウォッシング溶液で２回洗浄し、窒素ガスを用いて乾燥した。その後、３０℃、湿度インキュベータで、１時間、ＶＥＧＦ１６５に特異的に結合するＶＥＧＦ１６５抗体（一次抗体）を用いてベータアミロイドに結合したＶＥＧＦ１６５に反応させ、結合しない一次抗体をウォッシング溶液で２回洗浄後、洗浄し、窒素ガスを用いて乾燥した。その後、一次抗体に結合可能なＣｙ５蛍光物質（Ｃｙ−５；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、Ｕｐｐｓａｌａ  Ｓｗｅｄｅｎ）が結合された抗体（二次抗体）を、３０℃、湿度インキュベータで３０分間反応させた。結合しない二次抗体は、ウォッシング溶液で２回洗浄し、窒素ガスで乾燥した後、蛍光スキャナでスキャンした。
【００３８】
図２は、ベータアミロイド１−４２ペプチドとＶＥＧＦ１６５の相互作用を示す蛍光スキャンイメージ（図２の左側）と、ベータアミロイド１−４２ペプチドとＶＥＧＦ１６５の相互作用の容量−反応曲線を示すグラフ（図２の右側）である。具体的には、前記図２は、前記ベータアミロイドに結合したＶＥＧＦ１６５の相対的蛍光強度と、ＶＥＧＦ１６５と結合した一次抗体をＣｙ−５蛍光標識された二次抗体の濃度のログ間の関係を測定して示したグラフである。
【００３９】
前記図２において、ＶＥＧＦ１６５は、ベータアミロイドと結合して一次抗体と結合し、この一次抗体をＣｙ５標識された二次抗体と作用しやすいことがわかった。中でも、約１２５μｇ／ｍｌ以上において、ＶＥＧＦ１６５は飽和反応が現れはじめた。これにより、前記ベータアミロイド１−４２ペプチド付着チップが前記ベータアミロイド１−４２ペプチドとＶＥＧＦ１６５の結合抑制剤の探索のために有効で適切であることがわかった。
【００４０】
３−２）ＶＥＧＦ１６５とライブラリの混合溶液の製造
ベータアミロイドとＶＥＧＦ１６５の結合抑剤反応実験のために、ＶＥＧＦ１６５を、実施例１で得られた天然物由来の化合物（５０μＭ）１３０個とＶＥＧＦ１６５（５０μｇ／ｍｌ）とを混合して混合溶液を製造した。３０％のグリセロール溶液を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）に希釈させて使用した。
【００４１】
３−３）ベータアミロイドとＶＥＧＦ１６５の結合抑剤物質の一次スクリーニング
実施例２で製造したベータアミロイド付着蛋白質チップを、２時間、３％のＢＳＡでブロッキングし、０．０５％のＰＢＳＴで２回洗浄後、窒素ガスを用いて乾燥した。その後、実施例３−２で製造した各々のライブラリ１３０個（５０μＭの単一濃度）とＶＥＧＦ１６５を含む混合溶液を、各ウェルに入れて、３０℃、湿度インキュベータで１時間反応させた。洗浄溶液で洗浄した後、窒素を用いて乾燥し、一次抗体を各ウェルに入れた後、３０℃、湿度インキュベータで１時間反応させた後、洗浄溶液で洗浄後、窒素ガスを用いて乾燥した。その後、二次抗体を各ウェルに添加し、３０℃、湿度インキュベータで３０分間反応させ、洗浄溶液で洗浄した後、窒素ガスで乾燥し、蛍光レーザスキャナを用いて結合程度を相対的蛍光強度で分析することにより、ライブラリの抑剤能力を測定した。その結果、多数のライブラリで相対的に低い蛍光強度を示し、この化合物がベータアミロイド１−４２ペプチド−ＶＥＧＦ１６５の結合反応を効果的に抑剤することを証明した（図３）。
【００４２】
図３は、蛋白質チップシステムにおいて、ライブラリからベータアミロイド１−４２ペプチドとＶＥＧＦ１６５の相互作用を抑剤する化合物をスクリーニングした結果である。
【００４３】
前記実験において、ポジティブ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）対照群は、ライブラリを添加しない混合溶液を使用し、ネガティブ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）対照群は、ヘパリンが添加された混合溶液を使用した。ヘパリンは、ＶＥＧＦ１６５のＨＢＤに結合し、ＶＥＧＦ１６５がベータアミロイドに結合するのを抑剤する役割を果たすことができる。
【００４４】
図３において、蛍光の強度は虹色で表現される。本来、赤色または青色のように一色で結果が出るが、この場合、蛍光強度が識別されにくく、機器のソフトウェアがこれを蛍光強度に応じて色に変化を与えるようになっている。
【００４５】
通常、蛍光強度が最も強い場合、白色から赤色、橙色、黄色、緑色、青色の順に蛍光強度を表現するようになる。図３の結果をみると、ＶＥＧＦ１６５のみ反応させたのは、色が白色または赤色でベータアミロイド１−４２ペプチドとＶＥＧＦ１６５が結合されていることがわかる。ヘパリンを使用して実験したものの場合、ベータアミロイド１−４２ペプチドとＶＥＧＦ１６５の相互作用を抑剤し、ベータアミロイド１−４２ペプチドにＶＥＧＦ１６５が結合されず、蛍光が最も低い青色で表れている。
【００４６】
ライブラリのうち、一部の化合物がベータアミロイド１−４２ペプチドとＶＥＧＦ１６５の相互作用を抑剤し、ベータアミロイド１−４２ペプチドにＶＥＧＦ１６５が結合されず、蛍光の低い青色または緑色で表れている。したがって、この特定の化合物は、ベータアミロイド１−４２ペプチドとＶＥＧＦ１６５の結合を阻害する物質であることを証明するものである（図３）。
【００４７】
３−４）ベータアミロイドとＶＥＧＦ１６５の結合抑制剤の二次スクリーニング
実施例３−３で利用した方法を用いて、実施例３−３の一次スクリーニング過程で発見された抑制剤について、濃度別に１００μＭから２倍数に希釈して１μＭまで処理し、５０μｇ／ｍｌの濃度に固定されたベータアミロイドと、５０μｇ／ｍｌ濃度のＶＥＧＦ１６５の結合を抑剤するＩＣ５０値を求めた（図４）。そのうち、最も効果的に抑剤する化合物２種の結果を示した（図５）。
【００４８】
実施例４：蛋白質チップを用いて探索した物質の生物学的活性の探索
４−１）ＰＣ１２細胞およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の用意
ＰＣ１２細胞（韓国細胞株銀行、韓国、ソウル）は、１０％のＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）（Ｗｅｌｇｅｎｅ社製、韓国、大邱）と、１ＸのＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＧＩＢＣＯ社製、Ｎ．Ｙ．、ＵＳＡ）が含まれたＲＰＭＩ１６４０（Ｗｅｌｇｅｎｅ社製、韓国、大邱）の混合液で維持された。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（韓国細胞株銀行、韓国、ソウル）は、１０％のＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）（Ｗｅｌｇｅｎｅ社製、韓国、大邱）と１ＸのＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＧＩＢＣＯ、Ｎ．Ｙ．、ＵＳＡ）が含まれたＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｗｅｌｇｅｎｅ社製、韓国、大邱）の混合液で維持された。前記ＰＣ１２およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ培養細胞は、５％の二酸化炭素が加えられる気体組成が供給される環境において、１００％の湿度、３７℃の条件に維持された。
【００４９】
４−２）ＭＴＴアッセイ
ＭＴＴ［（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２イル＿−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド］実験プロトコルに従って行われた。ＭＴＴは、ＰＢＳに溶解して５ｍｇ／ｍｌとし、４℃で保管して使用し、反応が終わった各ウェルに、培養混合液１００に５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液１０μｌを加え、３時間反応させた。各ウェルの上澄液を捨てた後、発色反応物（ｆｏｒｍａｚａｎｃｒｙｓｔａｌ）を１００μｌのＤＭＳＯに溶解させた後、ＥＬＩＳＡリーダ機（５９５ｎｍ）で吸光度を測定した。
【００５０】
４−３）ベータアミロイドの細胞毒性
ＰＣ１２細胞は、ポリ−Ｄ−リジンがコーティングされた９６ウェル組職培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、ＭＡ、ＵＳＡ）に、ウェルあたり２×１０４個の細胞濃度で加えられた。その後、２４時間維持させた後、各ウェルに、濃度別にベータアミロイドを、１０％のＦＢＳが含まれた培養混合とともに加え、２４時間反応させた後、ＭＴＴアッセイを行った。
【００５１】
４−４）探索物質によるベータアミロイドの細胞毒性の抑剤
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、９６ウェル組職培養プレートに、ウェルあたり１×１０４個の細胞濃度で加えられた。その後、２４時間維持させた後、４時間、２％のＦＢＳが含まれた培養混合液でスターベーション（ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）させた後、各ウェルに、ベータアミロイド（１０μＭ）と探索物質（２０ｍＭで１／２ずつ希釈）を、２％のＦＢＳが含まれた培養混合とともに加え、２４時間反応させた後、ＭＴＴアッセイを行った。
【００５２】
図６は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞とＰＣ１２細胞において、ベータアミロイドによる細胞毒性を確認した結果である。ＰＣ１２細胞とＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において、ベータアミロイド１−４２は、濃度が増加するほど、細胞の生存率が低下することを確認することができ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞で逆方向に合成したベータアミロイド４２−１では、濃度が増加しても、細胞の生存率が正方向に合成されたベータアミロイドと比較して大きく減少しないことを確認することができ、正方向に合成されたベータアミロイドによって細胞毒性が増加することを証明した実験である。
【００５３】
図７では、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において、抑制剤候補物質（ＩＰＳ−０４００１）とＡｌｚｈｅｍｅｄＴＭによってベータアミロイドの毒性の減少を確認した結果である。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において、ベータアミロイド１０μＭに抑制剤候補物質およびＡｌｚｈｅｍｅｄＴＭ（２０μＭで１／２ずつ希釈）を濃度別に処理して細胞の生存率を確認し、抑制剤候補物質とＡｌｚｈｅｍｅｄＴＭによって生存率が増加することを確認することができた。対照群として使用したＡｌｚｈｅｍｅｄＴＭでベータアミロイド１０μＭを基準としたとき、５μＭ以上で約３０％程度生存率が増加し、抑制剤候補物質（ＩＰＳ−０４００１）では、５μＭ以上で約２０〜２５％程度生存率が増加した。それだけでなく、抑制剤候補物質（ＩＰＳ−０４００１）では、１．２５μＭ以上でもＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の生存率が１５％以上増加していることを確認することができた。全体的にみると、抑制剤候補物質（ＩＰＳ−０４００１）は、ＡｌｚｈｅｍｅｄＴＭと比較したとき、約５％程度低い生存率を示したものの、ベータアミロイドの毒性に対して細胞の生存率が全般的に似た増加ぶりを示している。
【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【国際調査報告】
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