(57)【要約】アメーバ目の少なくとも１つの生物の増殖の制御における化合物の使用であって、当該化合物は当該生物におけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路および／またはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節することができる、使用。【選択図】図１
2012502897.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アメーバ目の少なくとも１つの生物の増殖の制御における、ヒスチジン生合成経路、および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節することができる化合物の使用。
【請求項２】
請求項１に記載のアメーバ目の少なくとも１つの生物の増殖の制御における使用であって、
前記化合物は、前記生物におけるヒスチジン生合成経路を調節することができる、使用。
【請求項３】
請求項１に記載のアメーバ目の少なくとも１つの生物の増殖の制御における使用であって、
前記化合物は、前記生物におけるメチオニン生合成経路を調節することができる、使用。
【請求項４】
前記少なくとも１つの生物は、アカントアメーバの科の生物である、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記少なくとも１つの生物はアカントアメーバ属の生物である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記少なくとも１つの生物はカステラーニアメーバまたは多食アメーバである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記化合物は、
ｉ）ヒスチジン生合成経路もしくはメチオニン生合成経路の少なくとも１つの酵素の阻害剤、
ｉｉ）ヒスチジン生合成経路もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の少なくとも１つの酵素の阻害剤、
ｉｉｉ）ヒスチジン生合成経路もしくはメチオニン生合成経路の酵素の発現の阻害剤、または
ｉｖ）ヒスチジン生合成経路もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の酵素の発現の阻害剤、
から選択される、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記化合物は、
ヒスチジン生合成経路の少なくとも１つの酵素をコードする核酸配列、
メチオニン生合成経路の少なくとも１つの酵素をコードする核酸配列、
ヒスチジン生合成経路から分岐する経路の少なくとも１つの酵素をコードする核酸配列、
メチオニン生合成経路から分岐する少なくとも１つの酵素をコードする核酸配列、または
ヒスチジンもしくはメチオニン生合成経路の酵素をコードする核酸配列の発現を制御する核酸配列、
に結合するオリゴヌクレオチド配列である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチド配列はＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡまたは少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記化合物は小有機分子である、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記小有機分子は、ヒスチジン生合成経路で利用される酵素のうちの少なくとも１つの少なくとも１つの基質の類似体、またはメチオニン生合成経路で利用される酵素のうちの少なくとも１つの少なくとも１つの基質の類似体、またはヒスチジン生合成経路もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の酵素の少なくとも１つの基質の類似体である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記小分子は３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（３ＡＴ）である、請求項１０または請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記化合物は、コンタクトレンズ液中、手術器具上のコーティング、人工器官上のコーティングおよび／または薬用石鹸中、のうちの少なくとも１つにおいて提供される、請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
アメーバ目におけるヒスチジン生合成経路および／もしくはヒスチジン生合成経路から分岐する経路ならびに／またはアメーバ目におけるメチオニン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節することにおいて使用するための組成物であって、前記組成物は、
ｉ）ヒスチジン生合成経路および／またはメチオニン生合成経路の少なくとも１つの酵素、
ｉｉ）ヒスチジンおよび／またはメチオニン生合成経路から分岐する経路の少なくとも１つの酵素、
の活性および／または発現を調節することができる第１の化合物と、
少なくとも第２の化合物であって、前記第２の化合物は、アメーバ目に存在するさらなる生合成経路を調節することができる、第２の化合物と、
を含む組成物。
【請求項１５】
前記第２の化合物は、シキミ酸経路または葉酸経路の酵素を調節することができる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第２の化合物は、スルホンアミド、ピリメタミン、プログアニル、シクログアニルまたはトリメトプリムまたはその誘導体、トリアジン、ＰＳ−１５、ヘキサミジン、ビグアニドまたはグルコン酸クロルヘキシジンからなる群から選択される、請求項１４または請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記第１の化合物は、ｉ）ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路の少なくとも１つの酵素、ならびに／またはｉｉ）ヒスチジンおよび／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の少なくとも１つの酵素、の阻害剤である、請求項１４または請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
アメーバ目の少なくとも１つの生物によって引き起こされ、かつ／またはこれらによる寄与を受ける疾患の治療のために、ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路、ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節すること、好ましくは阻害することができることを特徴とする化合物。
【請求項１９】
アメーバ目によって引き起こされ、かつ／またはこれらによる寄与を受ける疾患の治療のための、請求項１４から請求項１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記疾患は角膜炎または脳炎である、請求項１８または請求項１９に記載の化合物または組成物。
【請求項２１】
アメーバ目によって引き起こされ、かつ／またはこれらによる寄与を受ける疾患を患っているかまたはその疾患に対して感受性である対象を治療する方法であって、前記方法は、必要とする対象に、
（ａ）治療上有効量の、ヒスチジン生合成経路を調節すること、好ましくは阻害することができる化合物、および／または
（ｂ）治療上有効量の、メチオニン生合成経路を調節すること、好ましくは阻害することができる化合物、および／または
（ｃ）治療上有効量の、アメーバ目におけるヒスチジンもしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節すること、好ましくは阻害することができる化合物を投与する工程を含む、方法。
【請求項２２】
前記アメーバ目はカステラーニアメーバまたは多食アメーバである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１４から請求項１７のいずれか１項に記載の組成物を含む、医薬製剤。
【請求項２４】
コンタクトレンズを洗浄するためおよび／またはコンタクトレンズを保存するための組成物であって、ヒスチジン生合成経路および／もしくはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および抗菌剤ならびに／またはメチオニン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節すること、好ましくは阻害することができる化合物を含む、組成物。
【請求項２５】
コンタクトレンズを洗浄および／または保存するための容器であって、前記容器は少なくとも１つのコンタクトレンズおよび請求項２４に記載の組成物を含有する、容器。
【請求項２６】
試料の中のアメーバ目を検出するインビトロ方法であって、
ａ）試料を準備する工程と、
ｂ）ｉ）ヒスチジン生合成経路の遺伝子および／もしくはタンパク質、
ｉｉ）メチオニン生合成経路の遺伝子および／もしくはタンパク質、
ｉｉｉ）ヒスチジン生合成経路から分岐する経路の遺伝子および／もしくはタンパク質、または
ｉｖ）メチオニン生合成経路から分岐する経路の遺伝子および／もしくはタンパク質
の存在を検出する工程と
を含み、前記遺伝子はアメーバ目によってコードされる遺伝子であり、かつ前記タンパク質はアメーバ目によってコードされるタンパク質である、インビトロ方法。
【請求項２７】
前記試料は、アメーバ目に感染していると疑われる対象に由来する細胞および／または体液を含む、請求項２６に記載のインビトロ方法。
【請求項２８】
アメーバ目におけるヒスチジンおよび／もしくはメチオニン生合成経路の酵素（１種または複数種）ならびに／またはヒスチジンもしくはメチオニン生合成経路から分岐するいずれかの経路の酵素（１種または複数種）を調節することができる薬剤を同定する方法であって、
（ａ）試験薬剤を、アメーバ目の種からのヒスチジンおよび／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジンおよび／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の１以上の酵素を発現することができる系と接触させる工程と、
（ｂ）ヒスチジンおよび／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジンおよび／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の１以上の酵素の発現および／または活性の調節を検出する工程と、
を含み、工程（ｂ）における前記１以上の酵素の発現および／または活性の調節の検出は、前記試験薬剤が、アメーバ目におけるヒスチジンおよび／もしくはメチオニン生合成経路の酵素ならびに／またはヒスチジンおよび／もしくはメチオニン生合成経路から分岐するいずれかの経路の酵素を調節することができる薬剤であることを示す、方法。
【請求項２９】
工程（ｂ）は、アメーバ目におけるイミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼ（ＩＧＰＤ）ポリペプチドの発現および／または活性の調節の検出を含み、前記方法は、
ａ）宿主細胞を、適切な調節配列に操作可能に結合された、アメーバ目由来のイミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼをコードする核酸断片で形質転換する工程と、
ｂ）アメーバ目由来の前記イミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼの発現に適した条件下で、前記形質転換された宿主細胞を増殖させる工程であって、アメーバ目由来の前記イミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼの発現は、前記形質転換された宿主細胞の中でイミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼの産生をもたらす、工程と、
ｃ）前記イミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼを試験されるべき化合物で処理する工程と、
ｄ）試験化合物で処理された前記イミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼの活性を未処理のイミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼの活性と比較する工程と、
を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
工程ｃ）に先だって、前記形質転換された宿主細胞によって発現される前記イミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼを精製する工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ヒスチジンおよび／もしくはメチオニン生合成経路またはヒスチジンおよび／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節すること、好ましくは阻害することができる化合物と、第２の抗菌性化合物であって、前記抗菌性化合物は、ＭＲＳＡまたはレジオネラ属の増殖を低下させることにおいて有効である第２の抗菌性化合物、とを含む組成物。
【請求項３２】
ＭＲＳＡまたはレジオネラ属の処理のための組成物の使用であって、前記組成物は、ヒスチジンおよび／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジンおよび／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節すること、好ましくは阻害することができる化合物と、第２の抗菌性化合物であって、前記抗菌性化合物は、ＭＲＳＡまたはレジオネラ属の増殖を低下させることにおいて有効である第２の抗菌性化合物、とを含む、使用。
【請求項３３】
アメーバ目におけるヒスチジンおよび／もしくはメチオニン生合成経路、ならびに／またはヒスチジンおよび／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の少なくとも１つの酵素、を調節すること、好ましくは阻害することができる化合物を含む、コンタクトレンズまたは眼用人工器官。
【請求項３４】
請求項３３に記載のコンタクトレンズまたは眼用人工器官を調製する方法であって、
（ａ）コンタクトレンズまたは眼用人工器官を、アメーバ目におけるヒスチジンおよび／もしくはメチオニン生合成経路の酵素のうちの少なくとも１つ、ならびに／またはヒスチジンおよび／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の酵素のうちの少なくとも１つを調節すること、好ましくは阻害することができる化合物で処理する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記レンズまたは眼用人工器官を、前記化合物を前記コンタクトレンズまたは眼用人工器官の表面に結合するための結合剤で処理する工程と、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アメーバ目におけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節する化合物、アメーバ目のメンバーによって引き起こされ、またはこれらによる寄与を受ける疾患の治療または予防におけるこのような化合物の使用ならびに非治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）種は環境のいたるところで見出される自由生活性の原虫である。アカントアメーバ種は、二相性の生活環を有し、活動的な栄養体または休眠中の被覆体のいずれかとして存在する。この種は、水道水、水槽、コンタクトレンズの入れ物および洗眼液を含めて、環境の中で遍在的に見出される。
【０００３】
アカントアメーバはヒトに寄生して、アカントアメーバ角膜炎と呼ばれる健常な個体における重篤な衰弱性の眼疾患および易感染性のヒトにおいて死にかかわる疾患である肉芽腫性アメーバ性脳炎（ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｕｓ  Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ、ＧＡＥ）を引き起こす。
【０００４】
アカントアメーバ角膜炎の発生率は、１年あたりで３００００人のコンタクトレンズ着用者あたり１であると推定されてきたが、別個の研究では、連続装用レンズ、１日使い捨てレンズおよび酸素透過性ハードレンズに対して、それぞれ１０，０００人あたり２０、３．３および１．１ほどに高い可能性があるということが見出されている。
【０００５】
「ワンステップ」コンタクトレンズ液はアカントアメーバを撲滅することができず、過酸化水素を含有する「ツーステップ」液の正しい使用によってのみ、眼へのアカントアメーバの伝染に対してわずかの保護がもたらされる。個体がアカントアメーバに感染すると、治療は非常に苦痛でかつ極めてつらいものであることが多く、入院を伴い、そしてしばしば角膜移植が必要になる。移植された角膜で再賦活が起こって失明に至る可能性もある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
アメーバ目に対して有効な新しい化合物が至急必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ヒスチジン経路が細菌、真菌および植物の中に存在するということがこれまでに示されてきた一方で、アカントアメーバなどの原虫の中に存在するとは考えられていなかった。本発明者らは、驚くべきことに、アカントアメーバにおけるヒスチジン生合成経路を同定し、そしてアカントアメーバの増殖はヒスチジン経路の公知の阻害剤によって用量依存的に阻害されうるということ、および阻害はヒスチジンをアカントアメーバ増殖培地に加えることによって用量依存的に取り除かれるということの両方を実証した。
【０００８】
従って、本発明の第１の態様では、アメーバ目におけるヒスチジン生合成経路および／またはヒスチジン生合成経路から分岐するいずれかの経路を調節するための化合物の使用が提供される。
【０００９】
細菌、真菌および植物は、コバラミン非依存的にシステインからメチオニンを合成することができる（図６）。本発明者らはカステラーニアメーバ（Ａ．ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ）がメチオニン生合成、メチオニンシンターゼおよびシスタチオン（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ）  γ−シンターゼに関与する２つの遺伝子を発現するということを同定したため、本発明者らは、カステラーニアメーバもこの代謝経路を有することを確立し、そして本発明者らは、カステラーニアメーバ栄養体をメチオニン不含限定培地の中で維持することができ、従ってコバラミン非依存性メチオニン生合成経路を抗菌療法のために利用することができるということを確立した。従って、アカントアメーバの増殖は、メチオニン経路の阻害剤によっても用量依存的に阻害することができ、阻害はメチオニンをアカントアメーバ増殖培地に加えることによって用量依存的に取り除かれうる。
【００１０】
従って、本発明の第２の態様では、アメーバ目におけるメチオニン生合成経路および／またはメチオニン生合成経路から分岐するいずれかの経路を調節するための化合物の使用が提供される。
【００１１】
本発明の第３の態様では、キットであって、アメーバ目、特にカステラーニアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ  ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ）および多食アメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ  ｐｏｌｙｐｈａｇａ）における、
ヒスチジン生合成経路および／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路を調節するため、例えば阻害するための化合物と、
メチオニン生合成経路および／またはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節するため、例えば阻害するための化合物と
を含み、ｉ）およびｉｉ）の別々の、同時の、または逐次的な投与のためのものであるキットが提供される。このキットは、人工涙液製剤または他のアイケア製品の中で、および洗浄用製剤の中で眼用人工器官（ｅｙｅ  ｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ）、コンタクトレンズ、眼用人工器官またはコンタクトレンズ用の保存用ホルダーなどの製品を消毒するために使用してもよい。あるいは、このキットは、アメーバ目、特にカステラーニアメーバおよび多食アメーバによって引き起こされる疾患の治療において使用することができる。
【００１２】
アメーバ目は原生動物門の中の目であり、この門には、Ｖａｈｌｋａｍｐｆｉｄａｅ（バールカンプフィア科）、Ｐｅｌｏｍｙｘｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｏｅｂｉｄａｅ（パラメーバ科）、Ｍａｓｔｉｇａｍｏｅｂｉｄａｅ（マスチゴアメーバ科）、Ｈａｒｔｍａｎｎｅｌｌｉｄａｅ（ハルトマネラ科）、Ｆｌａｂｅｌｌｕｌｉｄａｅ（フラベルラ科）、Ｅｎｔａｍｏｅｂｉｄａｅ（エントアメーバ科）、Ａｍｏｅｂｉｄａｅ（アメーバ科）およびＡｃａｎｔｈａｍｏｅｂｉｄａｅ（アカントアメーバ科）の科が含まれる。
【００１３】
ヒスチジンおよびメチオニンはヒトおよび他の哺乳動物における必須アミノ酸である。これは、ヒトはこのような生化学的経路を持たないということ、およびヒスチジンおよびメチオニンは食事から得なければならないということを意味する。これを考慮すれば、ヒスチジン生合成経路およびメチオニン生合成経路は、有利な薬物標的を提示する。なぜなら、このような経路を標的指向化することによって増殖を阻害するように設計された抗アカントアメーバ化合物は、ヒト宿主に対してほとんど副作用をもたらさないかまたはまったく副作用をもたらさないと予想されるであろうからである。
【００１４】
本発明の実施形態では、アカントアメーバ科におけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節するための化合物の使用が提供される。特定の実施形態では、アカントアメーバ、特定すれば例えばカステラーニアメーバおよび多食アメーバにおける上記経路を調節するための化合物の使用が提供される。
【００１５】
用語「分岐する」は、ヒスチジンまたはメチオニン生合成経路から誘導される特定の産物を代謝する経路を意味すると解釈されうる。
【００１６】
ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節することができる化合物の使用は、アメーバ目のメンバーによるそれぞれヒスチジン／メチオニンの産生を調節すると予想される可能性があり、そしてアメーバ目が増殖および／または生存する能力に対してある効果を有する可能性があるであろう。
【００１７】
ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐をする経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節することができる化合物の使用は、アメーバ目の増殖が阻害される（すなわち増殖阻害性である（ｍｉｃｒｏｂｉｓｔａｔｉｃ）（アメーバ増殖阻害性である（ａｍｏｅｂｉｄａｓｔａｉｃ）））程度まで当該経路を調節する可能性があり、かつ／または、あるいはアメーバ目を死滅させる（すなわち殺菌性である（殺アメーバ性である（ａｍｏｅｂｉｄａｃｉｄａｌ））可能性がある。
【００１８】
実施形態では、本発明で使用される化合物は、ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の酵素（１種または複数種）の阻害剤である可能性がある。
【００１９】
実施形態では、本発明で使用するための化合物は、ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の酵素の活性および／または発現を調節することにより、ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐をする経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節しうる。
【００２０】
適切には、実施形態では、本発明で使用するための化合物は、酵素調節因子、例えば酵素阻害剤または酵素発現の調節因子であってもよい。
【００２１】
実施形態では、酵素発現の調節因子としては、ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路に関与する酵素をコードする、アメーバ目のメンバーのゲノムのセクションに相補的なオリゴヌクレオチド配列を含んでもよい。適切には、実施形態では、このオリゴヌクレオチドはＲＮＡｉまたはアンチセンスであってもよい。このアンチセンス分子は天然物または合成物であってもよい。合成アンチセンス分子は未変性の核酸からの化学修飾を有してもよい。アンチセンス分子は、種々の機序を通して、例えば翻訳に利用できるｍＲＮＡの量をＲＮＡｓｅ  Ｈの活性化を通してまたは立体障害を通して低下させることによって、遺伝子発現を阻害する。１つまたは組み合わせのアンチセンス分子が投与されてもよく、１つの組み合わせは複数の異なる配列を含んでもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般に、長さが約７ヌクレオチド、通常少なくとも約１２ヌクレオチド、より通常は少なくとも約１６ヌクレオチド、そして長さが通常約５０ヌクレオチド以下、好ましくは約３５ヌクレオチド以下であろう。
【００２２】
本発明の、そして本発明で使用するための好ましいＲＮＡｉ剤は、長さが１５〜２５ヌクレオチド、好ましくは１９〜２２ヌクレオチド、最も好ましくは長さが２１ヌクレオチドである。実施形態では、本発明は、発現を調節するために、好ましくはヒスチジンおよび／またはメチオニン生合成経路における酵素の発現を低下させるためにＲＮＡｉ剤を用いる方法を提供する。発現を低下させることとは、標的遺伝子またはコード配列の発現のレベルが対照と比較して少なくとも約２倍、通常少なくとも約５倍、例えば１０倍、１５倍、２０倍、５０倍、１００倍またはこれよりも多く低下または阻害されるということを意味する。本発明の好ましい実施形態で用いられうるＲＮＡｉ剤は、二本鎖構造で、例えば互いにハイブリダイズした２つの別個のオリゴリボヌクレオチドで存在するか、または二本鎖構造を生成するために小ヘアピン構造をとる一本のリボオリゴヌクレオチドで存在する小リボ核酸分子（本願明細書中では干渉性リボ核酸とも呼ばれる）である。好ましいオリゴリボヌクレオチドは、長さが１００ｎｔ以下、典型的には長さが７５ｎｔ以下のリボ核酸である。ＲＮＡがｓｉＲＮＡである場合、二本鎖構造の長さは、典型的には約１５〜３０ｂｐ、通常約２０〜２９ｂｐの範囲にあり、最も好ましくは２１ｂｐである。ＲＮＡ剤がヘアピン構造で存在する一本のリボ核酸の二本鎖構造、すなわちｓｈＲＮＡである場合、このヘアピンのハイブリダイズした部分の長さは典型的にはｓｉＲＮＡ剤についての長さと同じであるか、または４〜８ヌクレオチドだけ長い。
【００２３】
ある実施形態では、干渉性リボ核酸であるＲＮＡｉ剤、例えば上記のとおりのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの代わりに、このＲＮＡｉ剤が干渉性リボ核酸をコードしてもよい。これらの実施形態では、このＲＮＡｉ剤は、典型的には干渉性リボ核酸をコードするＤＮＡである。このＤＮＡは、ベクターの中に存在してもよい。
【００２４】
このＲＮＡｉは、当該技術分野で公知のいずれかの適切なプロトコルを使用して宿主に投与することができる。例えば、この核酸は、ウイルス感染、微量注入（マイクロインジェクション）、小胞の融合、微粒子銃、または流体力学的な（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ）核酸投与によって組織または宿主細胞の中へと導入されてもよい。
【００２５】
ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ＤＮＡ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ｄｄＲＮＡｉ）は、本発明の方法で使用されてもよいＲＮＡｉ技術である。
【００２６】
他の実施形態では、アンチセンス技術を使用して遺伝子発現を下方制御するためにモルホリノが使用されてもよい。このような実施形態では、ホスホロジアミダートで連結されたモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）は、ヒスチジンおよびメチオニン生合成経路のうちの少なくとも１つ、好ましくはその両方、ならびに／またはそれらから分岐する経路における遺伝子発現をノックダウンするために使用することができる。これは、典型的には、ＲＮＡを立体的にブロックするＰＭＯによって成し遂げることができる。ホスホロジアミダートで連結されたモルホリノオリゴマーはペプチドに接合されてもよい。これらのものはアカントアメーバ角膜炎のための治療様式として使用できる可能性があり、すでに眼におけるＨＳＶ−１感染症を阻害することが成功裏に実証された（Ｍｏｅｒｄｙｋ−Ｓｃｈａｕｗｅｃｋｅｒら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．  ２００９）。
【００２７】
実施形態では、このオリゴヌクレオチド配列は、アメーバ目におけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の酵素をコードする機能配列に干渉するＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびに／または機能的酵素遺伝子のＲＮＡ転写物に干渉するオリゴヌクレオチド配列、例えば干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００２８】
ＢＩＯＰＲＥＤ５７などのアルゴリズムは、ヒスチジン生合成経路および／またはメチオニン生合成経路の与えられた遺伝子の最適のノックダウン効果を有するｓｉＲＮＡ配列をコンピューターにより予測するために使用してよい。
【００２９】
ヒスチジン生合成経路またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路の酵素阻害剤は当業者に周知であり、例えば３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（３ＡＴ）がある。酵素阻害剤は、例えば、特異的、非特異的、可逆的、不可逆的、競合的および非競合的と分類されてもよい。
【００３０】
メチオニン生合成経路またはメチオニン生合成経路から分岐する経路の調節に潜在的に有用な化合物としては、ｄｌ−Ｅ−アミノ−５−ホスホノ−３−ペンテン酸、３−（ホスホノメチル）ピリジン−２−カルボン酸および５−カルボキシメチルチオ−３−（３’−クロロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾールなどのシスタチオニン  γ−シンターゼの阻害剤を挙げることができる。
【００３１】
本発明では、ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路のいずれかの酵素（１種または複数種）を阻害することができるいずれの化合物も、アメーバ目におけるそれぞれヒスチジン／メチオニンの産生を調節するために潜在的に使用してよい。
【００３２】
特定の実施形態では、本発明で使用するための化合物は、ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の酵素（１種または複数種）の機能を調節することができる小有機分子であってもよい。典型的には、小有機分子は、このような経路で利用される酵素の基質のうちのいずれかの類似体であってもよい。好都合なことには、この基質類似体は、ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路における特定の酵素反応の進行を阻害しかつ防止するか、または阻害もしくは防止するかのいずれかのように修飾されてもよい。
【００３３】
加えてまたはあるいは、アメーバ目におけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節する際に使用するための化合物、例えば小さい有機の酵素基質類似体は、その経路の特定の酵素（１種もしくは複数種）または基質と相互作用してもよく、ひいてはヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の別の酵素によって利用されえない産物の産生をもたらしてもよい。こうなると、さらなる酵素反応は可能ではないであろうし、この経路は進行しえないであろう。
【００３４】
ヒスチジン生合成経路および／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路を調節するために本発明で使用するために適切な化合物としては３−アミノトリアゾール（３−ＡＴ）が挙げられる。当業者は、例えば除草剤に関連してこれまでに明らかにされた他の適切な化合物を熟知しているであろう。
【００３５】
有利なことには、本発明で使用するための化合物は細菌増殖を防止するために使用することもでき、従って細菌増殖を防止するための、例えばコンタクトレンズ用の溶液などの溶液の中の成分として使用されてもよい。それらはまた、手術器具上の抗生物性コーティングにおいて、および薬用石鹸などの製品において使用されてもよい。従って、本発明は、細菌増殖を阻害する上での本発明の化合物の非治療的使用を提供する。アメーバ目におけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節することができる化合物を含むコンタクトレンズ液、アイケア製品または薬用石鹸も提供される。さらには、本発明は、アメーバ目における、特にアカントアメーバにおけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節することができる化合物を含む抗生物性コーティングを外面に有する手術器具または人工器官を提供する。
【００３６】
理解されるであろうように、アメーバ目における、特にアカントアメーバにおけるさらなる薬物標的の決定は、ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の酵素の活性および／または発現を調節することができる化合物を含む活性薬剤と、少なくとも１つの第２の化合物との組み合わせを含む新規な組成物を提供し、このような新規な組成物は相加的なまたは相乗的な抗細菌効果および／または抗原虫効果を提供する。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態では、ヒスチジン生合成経路の阻害剤およびメチオニン生合成経路の阻害剤またはアメーバ目または別の病原体の別の公知の阻害剤を増強比で投与することができる。用語「増強比（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｒａｔｉｏ）」は、本発明に関しては、その組み合わせのアメーバ目の数の減少が、いずれかの阻害剤単独のアメーバ目の数の減少または個々の阻害剤の活性に基づいてその組み合わせに対して予測されるであろう相加的な活性のアメーバ目の数の減少よりも大きいような比で、ヒスチジン阻害剤およびメチオニン阻害剤または他の阻害剤が存在するということを示すために使用される。従って、増強比では、個々の阻害剤は相乗的に作用する。
【００３８】
相乗作用は、いくつかの方法を使用して定義することができる。例えば、相乗作用は、１を超えるＲＩとして定義されてもよい。このＲＩは、ＡおよびＢの組み合わせについての、観察された細胞生存（Ｓｏｂｓ）に対する予想される細胞生存（Ｓｅｘｐ、阻害剤Ａ単独を用いて観察される生存と阻害剤Ｂ単独を用いて観察される生存との積として定義される）の比として算出されてもよい（ＲＩ＝Ｓｅｘｐ／Ｓｏｂｓ）。相乗作用は、その場合、１を超えるＲＩとして定義されてもよい。当該技術分野で公知であろう、相乗効果を判定するための他の方法も使用されてもよい。本発明の好ましい実施形態では、この複合阻害剤は１．５を超える、より好ましくは２．０を超える、最も好ましくは２．２５を超えるＲＩをもたらすのに十分な濃度で与えられる。
【００３９】
従って、本発明の第４の態様は、ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節することにおいて使用するための組成物であって、当該組成物は、ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の酵素の活性および／または発現を調節することができる化合物と、少なくとも第２の化合物とを含む、組成物を提供する。
【００４０】
特定の実施形態では、第２の化合物は、アメーバ目、特にアカントアメーバ、特定すれば例えばカステラーニアメーバおよび多食アメーバに存在するさらなる生合成経路を調節することができ、かつ／または抗菌剤として作用することができる。実施形態では、この第２の化合物は、活性であってもよいが、すなわちアメーバ目、特にアカントアメーバの増殖を阻害するかまたは死を導くかしてもよいが、この組成物が第２の化合物単独に勝って改善した作用の範囲を提供するように、他の病原体に作用してもよい。
【００４１】
例として、このような組成物は、ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節することにおいて使用するための化合物と、シキミ酸経路の酵素を調節することができる化合物または葉酸経路の酵素を調節することができる化合物とを含んでもよい。
【００４２】
シキミ酸経路の調節に潜在的に有用な化合物は、当業者にとって周知であると思われ、グリフォセート、スルホセート（ｓｕｌｆｏｓａｔｅ）およびＥＰＳＰシンターゼに対する修飾された前駆体を挙げることができる。
【００４３】
葉酸経路の酵素の調節に潜在的に有用な化合物は、当業者にとって周知であると思われ、例えば、スルホンアミド、ピリメタミンまたは葉酸合成に干渉することが知られているいずれかの他の化合物、例えば、プログアニル、シクログアニルまたはトリメトプリムおよびいくつかの誘導体、ＷＲ９９２１０によって例示されるトリアジンならびにプロドラッグ  ＰＳ−１５（Ｋｉｎｙａｎｊｕｉら  １９９９）を挙げることができる。
【００４４】
本発明の実施形態では、ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の酵素の活性および／または発現を調節することができる化合物との複合組成物において使用するための抗菌性化合物としては、ヘキサミジン、ビグアニドまたはグルコン酸クロルヘキシジンを挙げることができる。適切には、このような実施形態では、ヘキサミジンは０．１％で与えられてもよく、ポリヘキサメチレンビグアニドは０．０２％で与えられてもよい。
【００４５】
非治療的使用に加えて、本発明はまた、ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の酵素の活性および／または発現を調節することができる化合物の治療的使用を提供する。
【００４６】
従って、本発明の第５の態様は、アメーバ目によって引き起こされ、かつ／またはアメーバ目によって寄与を受ける疾患の治療のための医薬の調製のための、アメーバ目における、特にアカントアメーバ、特定すれば例えばカステラーニアメーバおよび多食アメーバにおけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節することができる化合物の使用を提供する。
【００４７】
例えば、このような医薬を用いて潜在的に治療可能である疾患としては、ヒトにおける角膜炎および／または脳炎、特定すれば肉芽腫性アメーバ性脳炎（ＧＡＥ）を挙げることができる。
【００４８】
本発明の第６の態様では、アメーバ目、特にアカントアメーバ、特定すれば例えばカステラーニアメーバおよび多食アメーバによって引き起こされ、かつ／またはこれらによって寄与を受ける疾患を患っているかまたはその疾患に対して感受性である対象を治療する方法であって、当該方法は、ａ）必要とする対象に、アメーバ目におけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節すること、好ましくは阻害することができる化合物の治療上有効量を投与する工程を含む、方法が提供される。
【００４９】
上記の障害を治療するために使用される場合、アメーバ目におけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路、ならびに／またはヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節することができる化合物は、様々な剤形で投与されてもよい。従って、例えばそれらは、水系または油性の懸濁液として、または溶液またはいずれかの他の適した形態で投与することができる。
【００５０】
別個にまたは逐次的に投与される場合、本願明細書に記載される調節因子、例えば阻害剤は、いずれの適切な期間内、例えば互いの１時間以内、２時間以内、３時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、４８時間以内または７２時間以内に投与されてもよい。好ましい実施形態では、それらは、互いの６時間以内、好ましくは２時間以内、より好ましくは１時間以内、最も好ましくは２０分以内に投与される。
【００５１】
本発明の医学的処置の方法において使用される化合物が何であれ、投与は、好ましくは「予防上有効量」または「治療上有効量」（よくあることかもしれないが、予防は治療と考えてよい）でされ、これは個体に対して恩恵を示すのに十分なものである。投与される実際の量、および投与の速度および時間的経過は、治療しようとするもの性質および重症度に依存するであろう。治療の処方、例えば投薬量の決定などは、一般開業医および他の医師の職責の範囲内にある。
【００５２】
アメーバ目におけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路、ならびに／またはヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節することができる化合物、例えばペプチド、ポリペプチド、核酸調節因子、小さい分子、物質または組成物は、治療されるべき状態に応じて、単独で、または同時にもしくは逐次的に他の治療法と組み合わせて投与されてもよい。例えば、ヒスチジン経路を阻害することができる化合物およびメチオニン生合成経路を阻害することができる化合物は、相乗効果をもたらすために、同時にまたは逐次的に与えられてもよい。あるいは、ヒスチジンおよび／またはメチオニン生合成経路を阻害することができる化合物は、相乗効果をもたらすために、調節因子、例えば葉酸経路またはシキミ酸経路の阻害剤と同時または逐次的に組み合わせて与えられてもよい。
【００５３】
本発明の第７の態様では、アメーバ目のメンバーによって引き起こされ、またはこれらによる寄与を受ける角膜炎を治療することにおいて使用するためのヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節することができる化合物を、薬学的に許容できる担体または希釈剤と合わせて含む医薬製剤が提供される。適切な実施形態では、ヒスチジン生合成経路を阻害することができる化合物は、角膜炎を治療することにおいて使用するための相乗効果をもたらすために、メチオニン経路の阻害剤と組み合わせて与えられる。
【００５４】
実施形態では、本発明の医薬製剤は、例えば局所投与に適した形態で調合されてもよい。例えば、局所投与用の製剤は、水系もしくは非水系液体中の溶液または懸濁液として、または水中油型液体エマルションとして与えられてもよい。特定の実施形態では、本発明の医薬製剤は、リウェッティング用点眼液（ｒｅｗｅｔｔｉｎｇ  ｄｒｏｐｓ）および人工涙液を含めてよいアイケア製品など、それが眼に対して使用できるように調合されてもよい。
【００５５】
好都合なことには、この医薬製剤は、眼への直接の使用が可能であるような容器内に包装されてもよい。例えばこの医薬製剤は、感染の部位、例えば眼への当該製剤の所定量を送達することができる容器内に包装されてもよい。
【００５６】
本発明に係るそして本発明に従って使用するための医薬組成物は、活性成分に加えて、薬学的に許容できる賦形剤、担体、緩衝液、安定剤または当業者にとっては周知である他の物質を含んでもよい。このような物質は無毒であるべきであり、かつ活性成分の有効性を妨げてはいけない。担体または他の物質の厳密な性質は投与経路に依るであろう。防腐剤、安定剤、緩衝液、抗酸化物質および／または他の添加剤が必要に応じて含まれてもよい。
【００５７】
本発明で使用するための化合物は、所望の部位に局在化した様式で投与されてもよいし、またはその化合物が原虫を標的にするようにして送達されてもよい。標的指向化療法は、抗体または細胞特異的リガンドなどの標的指向化系の使用によって本発明の化合物を原虫に対してより特異的に送達するために、使用されてもよい。標的指向化は、様々な理由から所望される可能性があり、例えば、標的指向化を用いなければ当該化合物があまりに高い投薬量を必要とする場合、などがそうである。
【００５８】
このような物質を直接投与する代わりに、それらは、原虫の中に導入されたコード核酸から、例えばベクターからの発現によって原虫の中で産生されてもよい。このベクターは、処置しようとする原虫を標的にしたものでもよく、またはそれは原虫が程度の差はあるが選択的に作動させる調節エレメントを含有してもよい。従って、本発明の化合物をコードする核酸は、遺伝子治療の方法において、例えば個体の治療において、例えば障害を予防することまたは（全体的にまたは部分的に）治癒することを目的として使用されてもよい。
【００５９】
本発明の第８の態様では、コンタクトレンズを洗浄するためおよび／またはコンタクトレンズを保存するための組成物であって、当該組成物は、ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節することができる化合物を含む、組成物が提供される。
【００６０】
このような組成物は、有利に、アメーバ目のメンバー、例えばカステラーニアメーバおよび多食アメーバによって引き起こされ、かつ／またはこれらによって寄与を受ける感染症を低減しうる。
【００６１】
実施形態では、コンタクトレンズを洗浄するためおよび／またはコンタクトレンズを保存するための組成物は、溶液として与えられてもよい。特定の実施形態では、このような溶液は、ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節することにおいて使用するための化合物と組み合わせて中性の生理食塩水溶液を含んでもよい。適切には、特定の実施形態では、「ワンステップ」コンタクトレンズ洗浄／保存溶液は、ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路において使用するための化合物を具えていてもよい。例えば、非イオン性、アニオン性または両性界面活性剤から選択される界面活性剤および／または界面活性剤の組み合わせと、ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節することにおいて使用するための化合物とを含むコンタクトレンズ洗浄保存溶液が提供されてもよい。
【００６２】
本発明の第９の態様では、少なくとも１つのコンタクトレンズと、コンタクトレンズを洗浄することおよび／またはコンタクトレンズを保存することに適した組成物とを含有する容器であって、この組成物はヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路を調節することができる化合物を含む、容器が提供される。
【００６３】
実施形態では、この容器は、容器が開けられるまで内容物が滅菌状態で保たれるように、密封されていてもよい。特定の実施形態では、この容器は再密封可能であってもよい。
【００６４】
本発明の第１０の態様によれば、試料の中のアメーバ目、例えばアカントアメーバ、特にカステラーニアメーバおよび多食アメーバを検出するインビトロ方法であって、ａ）試料を準備する工程と、ｂ）アメーバ目におけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路のいずれかの遺伝子および／またはタンパク質の存在を検出する工程とを含む方法が提供される。
【００６５】
実施形態では、試料は、アメーバ目に感染していると疑われる対象に由来する細胞または他の体液を含んでもよい。体液としては、例えば、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液または涙を挙げることができる。
【００６６】
アメーバ目におけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路のいずれかの遺伝子および／またはタンパク質の存在を検出するために、当該技術分野のいずれの公知の技術が使用されてもよい。実施形態では、ｍＲＮＡまたはタンパク質のいずれかは、遺伝子の発現の上方制御または下方制御を判定する手段として，測定することができる。定量的技術が好ましい。しかしながら、半定量的なまたは定性的な技術も使用することができる。遺伝子産物を測定するための適切な技術としては、ＳＡＧＥ分析、ＤＮＡマイクロアレイ解析、ノーザンブロット、ウエスタンブロット、免疫細胞化学分析、ＥＬＩＳＡ、（ＰＣＲ）または逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）またはリアルタイムＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
アメーバ目におけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路のタンパク質をコードする遺伝子への結合特異性を有するオリゴヌクレオチドプローブが、このような遺伝子を同定するために使用されてもよい。適切なプローブは、本願で記載されるヒスチジン経路またはメチオニン経路の遺伝子のいずれかの部分からなっていてもよい。これらは、合成によってまたはランダムプライミング技術を通して生成されてもよい。このような方法では、プローブの可視化／測定を可能にするために、オリゴヌクレオチドプローブは、例えば化学発光標識、蛍光標識または放射活性標識で標識されてもよいし、またはアメーバ目におけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路のタンパク質をコードする遺伝子に対する結合特異性を有するオリゴヌクレオチドプローブを可視化する／測定するために二次プローブが使用されてもよい。
【００６８】
アメーバ目におけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路のタンパク質を検出するために、当業者に公知の方法が使用されてもよく、例えば未変性または変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による抽出されたタンパク質の分割、次いで例えば銀染料、クマシー・ブルー染料、コロイダルブルーおよびコロイダルゴールド染料を使用したこの分割されたタンパク質の検出が行われてもよい。
【００６９】
加えてまたはあるいは、タンパク質は、例えば特定のタンパク質（１種または複数種）に特異的な抗体を使用して検出されてもよい。このような場合には、この抗体は、タンパク質への抗体の結合が検出できるように、例えば蛍光標識、化学発光標識または放射活性標識で標識されてもよい。
【００７０】
本発明の第１１の態様では、アメーバ目におけるヒスチジン生合成経路の酵素（１種もしくは複数種）を調節すること、例えば阻害することができる薬剤、ならびに／またはメチオニン生合成経路を調節すること、例えば阻害することができる薬剤、ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐するいずれかの経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の酵素（１種もしくは複数種）を調節すること、例えば阻害することができる薬剤を同定する方法であって、
（ａ）試験薬剤を、アメーバ目の種からのヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の１以上の酵素を発現することができる系と接触させる工程と、
（ｂ）ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の１以上の酵素の発現および／または活性のいずれかの調節を検出する工程と、
を含み
（ｃ）ヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の１以上の酵素の発現および／または活性の調節は、その試験薬剤が、アメーバ目におけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の酵素を調節することができる薬剤であることを示す、方法が提供される。
【００７１】
特定の実施形態では、ヒスチジン生合成経路および／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路の当該１以上の酵素の発現および／または活性のいずれかの調節を検出する工程は、アメーバ目におけるイミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼ（ＩＧＰＤ）ポリペプチドの発現および／または活性の調節の検出を含んでもよく、当該方法は、
−  宿主細胞を、適切な調節配列（１つまたは複数）に操作可能に結合された、アメーバ目由来のイミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼをコードする核酸断片で形質転換する工程と、
−  アメーバ目由来のイミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼの発現に適した条件下で、この形質転換された宿主細胞を増殖させる工程であって、このアメーバ目由来のイミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼの発現は、その形質転換された宿主細胞の中でイミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼの産生をもたらす、工程と、
−  形質転換された宿主細胞によって発現されるこのイミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼを任意に精製する工程と、
−  このイミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼを試験されるべき化合物で処理する工程と、
−  試験化合物で処理されたイミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼの活性を未処理のイミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼの活性と比較する工程であって、差が検出され、これにより調節活性、例えば、阻害活性についての潜在性を有する化合物を選択する工程と、
を含む。
【００７２】
理解されるであろうように、この方法論は、アメーバ目の中で同定されるヒスチジン生合成経路もしくはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の酵素のいずれに適用されてもよい。
【００７３】
薬剤としては、試験されるべき小有機分子、アミノ酸、ペプチド、タンパク質または別の適切な化合物、例えば核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）などを挙げることができる。理解されるであろうように、このような薬剤は、ライブラリー（化学物質のライブラリーまたはタンパク質ライブラリー）から得てもよい。
【００７４】
自由生活性のアカントアメーバはＭＲＳＡおよびレジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）などの病原菌を宿している可能性があるということが考えられる。これは、病院の環境では特に危険である。なぜなら、易感染性の個体がこれに曝露されるからである。
【００７５】
従って、本発明の第１２の態様では、ＭＲＳＡおよびレジオネラ属を含めた病原菌を処置することにおける使用に適した抗菌性化合物と組み合わせた、アメーバ目におけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の酵素を調節することができる化合物が提供される。本発明のさらなる態様では、ＭＲＳＡおよびレジオネラ属を含めた病原菌を処置するための、アメーバ目におけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の酵素を調節することができる化合物の使用が提供される。本発明のなおさらなる態様では、アメーバ目におけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の酵素を調節することができる化合物を含む殺菌薬（ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  ａｇｅｎｔ）、抗菌薬（ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｇｅｎｔ）、抗感染薬、抗菌薬（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔ）、殺胞子薬、消毒薬、抗真菌薬、殺菌薬（ｇｅｒｍｉｃｉｄａｌ  ａｇｅｎｔ）および抗ウイルス薬が提供される。
【００７６】
上で示されたように、アカントアメーバ種は、ヒトに寄生して重篤な衰弱性の眼疾患、例えばアカントアメーバ角膜炎、を個体で引き起こす可能性があり、感染はコンタクトレンズ着用者では増加する。アカントアメーバおよび他の細菌または他の微生物の増殖を阻害するコンタクトレンズを製造することが有利であろう。従って、アメーバ目におけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の酵素を調節することができる化合物を含む眼用人工器官、コンタクトレンズ、眼用人工器官またはコンタクトレンズ保存容器が提供される。さらなる態様では、抗菌性のレンズまたは眼用人工器官を調製する方法であって、（ａ）コンタクトレンズまたは眼用人工器官を、アメーバ目におけるヒスチジン生合成経路および／もしくはメチオニン生合成経路ならびに／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路および／もしくはメチオニン生合成経路から分岐する経路の酵素のうちの少なくとも１つを調節することができる化合物で処理する工程と、（ｂ）当該化合物をコンタクトレンズまたは人工器官の表面に結合させるように、工程（ａ）のレンズまたは眼用人工器官を処理する工程と、を含む方法が提供される。適切には、実施形態では、当該化合物を結合することは、コンタクトレンズまたは人工器官の表面上に適切な官能基を提供する工程によってもたらされてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
本発明は、これより、図面を参照して例のみとして説明される。
【図１】１０種の酵素反応からなるヒスチジン生合成経路を図示する。
【図２】ヒスチジンの不存在下でのアカントアメーバの増殖阻害を図示する。アカントアメーバの増殖は用量依存的に  −  ＩＣ５０は０．０１５ｍＭ〜０．０３１ｍＭの間である  −  阻害される。Ｘ軸は３−ＡＴの用量（ｍＭ単位）を表し、Ｙ軸はミトコンドリア活性に正比例するアラマーブルー（ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ）還元の百分率である。
【図３】アカントアメーバの増殖阻害がヒスチジンの存在下で取り除かれるということを図示する。１０ｍＭ  ヒスチジンの添加は０．９８ｍＭ（ＩＣ２０）  ３−ＡＴの存在下でアカントアメーバが増殖することを可能にすることができ、  −ｘ軸はヒスチジンの量を表し、ｙ軸はアラマーブルー還元の百分率を表し、そして１００ｍＭ  ヒスチジンはアカントアメーバに対して毒性であったが、１０ｍＭ  ヒスチジンでは３ＡＴの効果は有意に（ｐ＜０．０５）取り除かれた。
【図４】３ＡＴの濃度のある範囲にわたるアラマーブルーの還元を図示する。３ＡＴ（■）は、０．０００９５ｍＭ以上の濃度で用量依存的に、未処理の対照培養物と比較して有意に（ｐ＜０．０５）カステラーニアメーバの増殖を阻害した。１ｍＭ  ヒスチジンの存在下で（◆）、これは還元され、カステラーニアメーバの増殖を有意に（ｐ＜０．０５）阻害するために、０．０６ｍＭ以上の３ＡＴが必要であった。
【図５】アカントアメーバのＩＧＰＤ遺伝子の配列比較を図示する。
【図６】コバラミン非依存性メチオニン生合成経路およびその酵素反応を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
（定義された用語）
用語「阻害」は、酵素の活性を阻害する可能性がある化合物にすでに接触および／または曝露された酵素と比較したときに、特定の基質からの特定の化合物の産生を酵素が触媒する速度が低下しているということを意味すると解釈されうる。
【００７９】
用語「非特異的」は、化合物の効果が特定の酵素または酵素の類に限定されず、実質的にすべての酵素の活性に全般的に影響を及ぼす、その化合物を意味すると解釈されうる。典型的には、非特異的阻害剤は、温度、ｐＨなどの変化によって酵素が変性するという事実の結果として機能しうる。しかしながら、非特異的阻害剤はまた、酵素の活性部位に不可逆的に結合しそれをブロックし、そのようにしてその酵素の活性部位が特定の化合物の産生を触媒するという機能を果たすことを防止してもよい。
【００８０】
用語「特異的阻害剤」は、特定の酵素を阻害しうるが別の酵素の活性に対しては効果を有しない化合物を指すと解釈されうる。特異的酵素阻害剤は、特定の酵素に、例えば酵素の活性部位で、またはその周囲で結合して、活性部位がブロックされることを引き起こすか、またはその活性部位への基質の近づきを立体的に妨害することにより、機能を果たす可能性がある。あるいは、または加えて、阻害剤は、活性部位以外の領域で酵素に結合して、その酵素がもはや特定の基質を受け容れて特定の基質の転化を触媒することができないような立体構造の変化をその酵素が受けることを引き起こしてもよい。
【００８１】
用語「競合的阻害剤」は、特定の酵素の活性部位を占めて正しい基質の排除を生じることができ、そのためその酵素が反応を触媒する速度が減少する、そのような化合物を含むと解釈されうる。特定の実施形態では、このような化合物は、その酵素の未変性の（天然の／正しい）基質と非常に類似している可能性がある。
【００８２】
用語「非競合的阻害剤」は、酵素が特定の化合物の産生を触媒する速度に影響を及ぼす化合物を包含すると解釈されうる。競合的阻害剤とは対照的に、非競合的阻害剤は酵素の活性部位以外の位置で酵素と相互作用しうる。例えば、非競合的阻害剤は、酵素に結合して、その酵素の結合部位がもはや基質を受け容れないかもしれないようなその酵素の立体構造の変化を誘導する可能性がある。
【００８３】
「アメーバ目の種からのヒスチジン生合成経路および／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路の１以上の酵素を発現することができる系」は、無細胞系または細胞ベースの系であってもよい。この「系」は、ヒスチジン生合成経路および／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路に由来する１以上の酵素を含んでもよい。加えて、この「系」は、当該酵素（１種または複数種）が相互作用することができる基質（１種または複数種）を含んでもよい。
【００８４】
用語「調節」は、試験薬剤または化合物に曝露されたことがない同じ酵素の活性または発現と比較したときの、酵素活性の増加もしくは減少および／または酵素発現の増加もしくは減少を意味すると解釈されうる。
【００８５】
発現の調節は、例えばヒスチジン生合成経路の酵素および／またはヒスチジン生合成経路から分岐する経路の酵素と、検出可能なタグ、例えば化学発光タグ、生物発光タグ、蛍光タグ、ＨｉｓもしくはＧＳＴタグまたは抗体もしくはこれと類似のものによって検出されうる別の適切なタグとを含む融合タンパク質を作製することにより検出されてもよい。このような方法論を適切に使用すれば、酵素の発現の増加は、より多くのタグが検出されるということをもたらすであろう。酵素（１種または複数種）の発現のレベルは、例えば定量的リアルタイムＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動および／またはノーザン／サザンブロッティングを使用して、存在する特異的ｍＲＮＡの量を定量することによって決定されてもよい。
【００８６】
本願明細書全体を通して、文脈からそうではないことが要求される場合を除いて、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（を含む）」または「ｉｎｃｌｕｄｅ（を包含する）」、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」または「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」などの派生語は、それらが明記された整数または整数の群を包含しいずれの他の整数または整数の群も排除しないということを意味すると理解されよう。
【００８７】
本発明の実施形態では、本願明細書に開示される本発明のすべての態様について、上記生合成経路の調節因子は阻害剤であってもよい。
【００８８】
本発明の各態様の好ましい特徴および実施形態は、文脈からそうではないことが要求される場合を除いて、変更すべきところは変更して他の態様の各々のためにも適用される。
【実施例】
【００８９】
（実施例１）
本発明者らは、カステラーニアメーバ由来のヒスチジン生合成経路の中の６番目の酵素、イミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼ（ＩＧＰＤ）（ＥＣ４．２．１．１９）（図１を参照）をクローン化し、配列決定した。この酵素は、市販の除草剤で一般に使用されている３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（３ＡＴ）についての分子標的である。アカントアメーバのイミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼ（ＩＧＰＤ）遺伝子（ｈｉｓＢ）は、以下のプロトコルに従って入手することができる。
【００９０】
全量２５μｌの中で、１μｌ  ｃＤＮＡ（ヒスチジンの不存在下で増殖させたアカントアメーバに由来する）を、１単位のＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙおよび１０×Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｂｕｆｆｅｒの存在下で、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２５ｐｍｏｌの順方向プライマー（５’  ＧＡＡＡＡＧＡＧＧＧＡＧＧＣＡＣＡＧＧＴ  ３’）（配列番号：１）および２５ｐｍｏｌの逆方向プライマー（５’  ＡＴＣＡＣＴＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＣＴＴＧＧ  ３’）（配列番号：２）に加えた。熱サイクル条件は、９５℃で３分間の初期変性、次いで３５サイクルの、９５℃で３０秒間の変性、６２℃でのアニーリングおよび７２℃での伸張、からなる。最終の伸張工程は７２℃で１０分間である。これらの熱サイクル条件は、ヒスチジン生合成経路に属する酵素の他の遺伝子の断片を入手するためにも使用した。
【００９１】
アカントアメーバのイミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼ（ＩＧＰＤ）遺伝子（ｈｉｓＢ）
【化１】
2012502897.tif 000003
【００９２】
（実施例２）
図２および図３に図示するように、本発明者らは、アカントアメーバはヒスチジンの不存在下で増殖することができるということ、および３−アミノトリアゾール（ヒスチジン生合成経路の６番目の酵素であるＩＧＰＤの阻害剤）がアカントアメーバの増殖を阻害するということを見つけ出した。さらには、阻害は、ヒスチジンを培地に添加することによって用量依存的に取り除かれた。これは、３ＡＴがＩＧＰＤを阻害するように特異的に作用するということ、およびカステラーニアメーバにおけるヒスチジン生合成経路を実証する。これは、原虫におけるヒスチジン生合成経路の最初の証拠を提供し、そしてアカントアメーバ感染の間の治療的介入のための標的としてのその潜在性を実証する。
【００９３】
（実施例３）
本発明者らはさらに、ヒスチジン経路に属する酵素を転写する遺伝子の部分を同定した。これは、ヒスチジン生合成経路がアカントアメーバの中に存在するということのさらなる支持を与える。
【００９４】
ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ部分的ゲノム配列
【化２】
2012502897.tif 000004
ホスホリボシルＡＴＰピロホスファターゼ部分的コード配列
【化３】
2012502897.tif 000005
ホスホリボシル−５−アミノ−１−ホスホリボシル−イミダゾールカルボキシアミド異性化酵素部分的ゲノム配列
【化４】
2012502897.tif 000006
イミダゾールグリセロール−リン酸デヒドラターゼ、部分的コード配列
【化５】
2012502897.tif 000007
ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ部分的ゲノム配列
【化６】
2012502897.tif 000008
【００９５】
（実施例４）
本発明者らはまた、コバラミン非依存的にシステインからメチオニンを合成することができるメチオニン経路（図６を参照）に属する酵素を転写する遺伝子の部分を決定した。
【００９６】
本発明者らはさらに、カステラーニアメーバがこの代謝経路を保有するということを確立した。というのも、本発明者らは、カステラーニアメーバがメチオニン生合成に関与する酵素、つまり、メチオニンシンターゼおよびシスタチオン  γ−シンターゼを転写する２つの遺伝子を発現するということを同定したためである。
【００９７】
現在、コバラミン非依存性メチオニンシンターゼに対する公知の阻害剤は存在しないが、真菌種由来のコバラミン非依存性メチオニンシンターゼに集中した研究によって、妥当と思われる候補が同定されると予想される。
【００９８】
シスタチオニン  γ−シンターゼの阻害剤としては、ｄｌ−Ｅ−２−アミノ−５−ホスホノ−３−ペンテン酸、３−（ホスホノメチル）ピリジン−２−カルボン酸および５−カルボキシメチルチオ−３−（３’−クロロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾールが挙げられる。
【００９９】
実施例１のプロトコルおよび熱サイクル条件を使用して、メチオニン生合成経路に属するメチオニンシンターゼおよびシスタチオン  γ−シンターゼの遺伝子の断片を入手した。ここで使用するための逆方向および順方向プライマーを下記の表１に示す。
【０１００】
【表１】
2012502897.tif 000009
【０１０１】
ＡｃＣＧＳ  −  シスタチオニン  γ−シンターゼ部分的ゲノム配列
【化７】
2012502897.tif 000010
【０１０２】
上記のプロトコルを使用して、メチオニンシンターゼ遺伝子の異なるセクションを、後述するようにして決定した。
【０１０３】
ＭＳ１  −  メチオニンシンターゼ部分的ゲノム配列
【化８】
2012502897.tif 000011
ＭＳ２  −  メチオニンシンターゼ部分的ゲノム配列
【化９】
2012502897.tif 000012
ＭＳ５  −  メチオニンシンターゼ部分的ゲノム配列
【化１０】
2012502897.tif 000013
【０１０４】
実施例５
本発明者らは、ヒスチジンおよび／またはメチオニン経路の阻害剤は人工涙液およびリウェッティング用点眼液を含めたアイケア製品において有用であるということを見出した。このような調剤では、当該阻害剤は、アカントアメーバによる汚染を予防することによって、一般に防腐剤として機能することができ、そうして製品の貯蔵寿命を延ばすことができる。
【０１０５】
典型的なアイケア製品製剤は、水、ならびにカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００）およびＨＰ−グアーのうちの１以上との塩を含んでもよい。このような製剤の重要な態様は、潤滑および浸透圧保護であり、当該製剤は眼用コンタクトレンズ液として考えられるであろうから、当該製剤はコンタクトレンズ着用と適合性でなければならない。
【０１０６】
特に、特定の実施例を参照して本発明を示しかつ説明してきたが、本発明の範囲から逸脱せずに形態および細部の種々の変更がなされてもよいということは当業者なら分かるであろう。
【図１】
2012502897.tif 000014
【図２】
2012502897.tif 000015
【図３】
2012502897.tif 000016
【図４】
2012502897.tif 000017
【図５】
2012502897.tif 000018
2012502897.tif 000019
2012502897.tif 000020
【図６】
2012502897.tif 000021
【配列表】
2012502897000001.app
【国際調査報告】
2012502897.tif 000022
2012502897.tif 000023
2012502897.tif 000024
2012502897.tif 000025
2012502897.tif 000026
2012502897.tif 000027