(57)【要約】【課題】本発明は、１４種の性感染症（ＳＴＤ）の原因及び関連菌の感染の有無と、更に、これらの菌の遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）とテトラサイクリン系及びベータ−ラクタム系抗生剤耐性の遺伝子型を速やかかつ正確に分析することができる新規のＤＮＡチップ、キット及び分析法に関する。【解決手段】具体的には、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １、Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ２、ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ、Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの１１種のＳＴＤ原因菌と３種のＳＴＤ関連菌であるＧ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、大腸菌を含む、全１４種の菌と、テトラサイクリン系及びベータ−ラクタム系抗生剤耐性の遺伝子に特異な新規のオリゴヌクレオチドプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）及びプローブ（ｐｒｏｂｅ）と、これを用いた多重合成酵素連鎖反応法（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍ−ＰＣＲ）、ＤＮＡチップ及びキットに関し、本発明によると、ＳＴＤ診断において感度、特異度、再現性、正確度が全て優れており、多数の検体で１４種のＳＴＤ原因及び関連菌を全部速やかに自動分析することができるだけでなく、治療抗生剤の選択にも役立つ優れた効果がある。【代表図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
序列番号３７乃至６６の塩基序列を有するオリゴヌクレオチドプローブを含む、性感染症（ｓｅｘｕａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＳＴＤ）の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析用のＤＮＡチップ。
【請求項２】
前記序列番号６６の塩基序列を有するオリゴヌクレオチドプローブは、ヒトベータグロブリン遺伝子と相補的に結合することを特徴とする、請求項１に記載の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析用のＤＮＡチップ。
【請求項３】
前記序列番号６６の塩基序列を有するオリゴヌクレオチドプローブは、５’末端がＣｙ５で標識した序列番号６７の塩基序列を有するオリゴヌクレオチドと相補的に結合することを特徴とする、請求項１に記載の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析用のＤＮＡチップ。
【請求項４】
前記ＤＮＡチップは、プローブが集積できる集積部位（ｗｅｌｌ）が８個で区切られていることを特徴とする、請求項１に記載の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析用のＤＮＡチップ。
【請求項５】
請求項１乃至請求項４のいずれか１項に係るＤＮＡチップ、性感染症の原因菌由来のＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、及び前記ＤＮＡチップと相補的に結合する増幅されたＤＮＡを検出するための標識手段を含む、性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析用のキット。
【請求項６】
前記プライマーセットは、序列番号１及び序列番号２の塩基序列を有するガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号３及び序列番号４の塩基序列を有するウレアプラズマ・ウレアリチクム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号５及び序列番号６の塩基序列を有するマイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号７及び序列番号８の塩基序列を有するクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号９及び序列番号１０の塩基序列を有する淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号１１及び序列番号１２の塩基序列を有するトリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号１３及び序列番号１４の塩基序列を有するマイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号１５及び序列番号１６の塩基序列を有するカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号１７及び序列番号１８の塩基序列を有する大腸菌（ｃｏｌｉｆｏｒｍ  ｂａｃｔｅｒｉａ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号１９及び序列番号２０の塩基序列を有するヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号２１及び序列番号２２の塩基序列を有するヘルペスシンプレックスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号２３及び序列番号２４の塩基序列を有するトレポネマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号２５及び序列番号２６の塩基序列を有するヒト乳頭腫ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ；ＨＰＶ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号２７及び序列番号２８の塩基序列を有するＳＨＶ遺伝子（ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ＳＨＶ−１２  ｇｅｎｅ）増幅用プライマーセット、序列番号２９及び序列番号３０の塩基序列を有するＴＥＭ遺伝子（ＣＭＴ−ｔｙｐｅ  ｂｅｔａ  ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｇｅｎｅ）増幅用プライマーセット、序列番号３１及び序列番号３２の塩基序列を有するＴｅｔＭ遺伝子（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｇｅｎｅ  Ｍ）増幅用プライマーセット、序列番号３３及び序列番号３４の塩基序列を有するＡｍｐＣ遺伝子（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ）増幅用プライマーセット、又は序列番号３５及び序列番号３６の塩基序列を有するＴｅｔＣ遺伝子（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｇｅｎｅ  Ｃ）増幅用プライマーセットであることを特徴とする、請求項５に記載の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析用のキット。
【請求項７】
前記標識手段は、Ｃｙ５、Ｃｙ３、バイオチン結合物質、ＥＤＡＮＳ（５−（２’−アミノエチル）アミノ−１−ナフタレン硫酸）、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＭＲＩＴＣ）、ｘ−ローダミン及びテキサスレッドからなる群から１つ以上選択されることを特徴とする、請求項５に記載の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析用のキット。
【請求項８】
前記標識手段がＣｙ５であり、標識されたｄＣＴＰと標識されていないｄＣＴＰ間のモル濃度比を１：１２．５として反応させることを特徴とする、請求項７に記載の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析用のキット。
【請求項９】
（ａ）性感染症の原因菌の核酸増幅用プライマーを用いて、前記ＤＮＡを単一（ｓｉｎｇｌｅ）又は多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲ増幅法によって増幅するステップと、
（ｂ）請求項１乃至請求項４のいずれか１項に係るＤＮＡチップに、前記増幅されたＤＮＡをハイブリッドさせるステップと、
（ｃ）前記ハイブリッドによって得られた混成化物を検出するステップと、
を含む、性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析方法。
【請求項１０】
前記単一又は多重ＰＣＲ増幅法は、序列番号１及び序列番号２の塩基序列を有するガードネレラ・バギナリス核酸増幅用プライマーセット、序列番号３及び序列番号４の塩基序列を有するウレアプラズマ・ウレアリチクム核酸増幅用プライマーセット、序列番号５及び序列番号６の塩基序列を有するマイコプラズマ・ホミニス核酸増幅用プライマーセット、序列番号７及び序列番号８の塩基序列を有するクラミジア・トラコマチス核酸増幅用プライマーセット、序列番号９及び序列番号１０の塩基序列を有する淋菌核酸増幅用プライマーセット、序列番号１１及び序列番号１２の塩基序列を有するトリコモナス・バギナリス核酸増幅用プライマーセット、序列番号１３及び序列番号１４の塩基序列を有するマイコプラズマ・ジェニタリウム核酸増幅用プライマーセット、序列番号１５及び序列番号１６の塩基序列を有するカンジダ・アルビカンス核酸増幅用プライマーセット、序列番号１７及び序列番号１８の塩基序列を有する大腸菌核酸増幅用プライマーセット、序列番号１９及び序列番号２０の塩基序列を有するヘモフィルス・デュクレイ核酸増幅用プライマーセット、序列番号２１及び序列番号２２の塩基序列を有するヘルペスシンプレックスウイルス核酸増幅用プライマーセット、序列番号２３及び序列番号２４の塩基序列を有するトレポネマ・パリダム核酸増幅用プライマーセット、序列番号２５及び序列番号２６の塩基序列を有するヒト乳頭腫ウイルス核酸増幅用プライマーセット、序列番号２７及び序列番号２８の塩基序列を有するＳＨＶ遺伝子（ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ＳＨＶ−１２  ｇｅｎｅ）増幅用プライマーセット、序列番号２９及び序列番号３０の塩基序列を有するＴＥＭ遺伝子（ＣＭＴ−ｔｙｐｅ  ｂｅｔａ  ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｇｅｎｅ）増幅用プライマーセット、序列番号３１及び序列番号３２の塩基序列を有するＴｅｔＭ遺伝子（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｇｅｎｅ  Ｍ）増幅用プライマーセット、序列番号３３及び序列番号３４の塩基序列を有するＡｍｐＣ遺伝子（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ）増幅用プライマーセット、及び序列番号３５及び序列番号３６の塩基序列を有するＴｅｔＣ遺伝子（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｇｅｎｅ  Ｃ）増幅用プライマーセットからなる群から選択される１つ以上のプライマーセットを用いることを特徴とする、請求項９に記載の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析方法。
【請求項１１】
前記単一又は多重ＰＣＲ増幅法は、
（ａ）前記プライマーセットを鋳型ＤＮＡ、Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素、ｄＮＴＰ、蒸溜水及びＰＣＲバッファーと混合するステップと、
（ｂ）前記混合物を９５℃で１０分間予備変成するステップと、
（ｃ）前記予備変成された産物を９４℃で３０秒間変成し、５８℃で３０秒間プライマーアニーリングし、７２℃で３０秒間延長することを全４０回繰り返すステップと、
（ｄ）前記延長された産物を７２℃で５分間最終延長するステップと、
を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析方法。
【請求項１２】
前記多重ＰＣＲ増幅法は、序列番号１と序列番号２の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号３と序列番号４の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号５と序列番号６の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号７と序列番号８の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号９と序列番号１０の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号１１と序列番号１２の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号１３と序列番号１４の塩基序列を有するプライマーセット、及び序列番号１５と序列番号１６の塩基序列を有するプライマーセット間のモル濃度比が１：１：１：１：１：１：１：１であることを特徴とする、請求項９に記載の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析方法。
【請求項１３】
前記多重ＰＣＲ増幅法は、序列番号１７と序列番号１８の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号１９と序列番号２０の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号２１と序列番号２２の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号２３と序列番号２４の塩基序列を有するプライマーセット、及び序列番号２５と序列番号２６の塩基序列を有するプライマーセット間のモル濃度比が１：１：１：１：１であることを特徴とする、請求項９に記載の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析方法。
【請求項１４】
前記多重ＰＣＲ増幅法は、序列番号２７と序列番号２８の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号２９と序列番号３０の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号３１と序列番号３２の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号３３と序列番号３４の塩基序列を有するプライマーセット、及び序列番号３５と序列番号３６の塩基序列を有するプライマーセット間のモル濃度比が１：１：１：１：１であることを特徴とする、請求項９に記載の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析方法。
【請求項１５】
序列番号１と序列番号２のプライマーセットによるＰＣＲ産物が４１９ｂｐ、序列番号３と序列番号４のプライマーセットによるＰＣＲ産物が３７３ｂｐ、序列番号５と序列番号６のプライマーセットによるＰＣＲ産物が３３３ｂｐ、序列番号７と序列番号８のプライマーセットによるＰＣＲ産物が３２１ｂｐ、序列番号９と序列番号１０のプライマーセットによるＰＣＲ産物が２８４ｂｐ、序列番号１１と序列番号１２のプライマーセットによるＰＣＲ産物が２６２ｂｐ、序列番号１３と序列番号１４のプライマーセットによるＰＣＲ産物が２０７ｂｐ、序列番号１５と序列番号１６のプライマーセットによるＰＣＲ産物が１４８ｂｐのサイズであることを特徴とする、請求項１２に記載の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析方法。
【請求項１６】
序列番号１７と序列番号１８のプライマーセットによるＰＣＲ産物が４６７ｂｐ、序列番号１９と序列番号２０のプライマーセットによるＰＣＲ産物が４３９ｂｐ、序列番号２１と序列番号２２のプライマーセットによるＰＣＲ産物が３５０ｂｐ、序列番号２３と序列番号２４のプライマーセットによるＰＣＲ産物が２６０ｂｐ、序列番号２５と序列番号２６のプライマーセットによるＰＣＲ産物が１９１ｂｐのサイズであることを特徴とする、請求項１３に記載の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析方法。
【請求項１７】
序列番号２７と序列番号２８のプライマーセットによるＰＣＲ産物が６７９ｂｐ、序列番号２９と序列番号３０のプライマーセットによるＰＣＲ産物が４１２ｂｐ、序列番号３１と序列番号３２のプライマーセットによるＰＣＲ産物が２９１ｂｐ、序列番号３３と序列番号３４のプライマーセットによるＰＣＲ産物が２０８ｂｐ、序列番号３５と序列番号３６のプライマーセットによるＰＣＲ産物が１５２ｂｐのサイズであることを特徴とする、請求項１４に記載の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、性感染症（ｓｅｘｕａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ；ＳＴＤ）の原因菌のうち、力学的に最も発病率が高くて重要な１１種の菌として、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリチクム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、梅毒の原因菌であるトレポネマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、軟性下疳（ｃｈａｎｃｒｏｉｄ）の原因菌であるヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、陰部ヘルペス（ｇｅｎｉｔａｌ  ｈｅｒｐｅｓ）の原因菌であるヘルペスシンプレックスウイルス１型と２型（ｇｅｎｉｔａｌ  ｈｅｒｐｅｓ；ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ａｎｄ  ２）、ヒト乳頭腫ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ、ＨＰＶ）、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）と、３種の関連菌として、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、大腸菌（ｃｏｌｉｆｏｒｍ  ｂａｃｔｅｒｉａ）の存在有無及びその遺伝子型の分析と、テトラサイクリン系及びベータ−ラクタム系抗生剤に対する耐性（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を速やかかつ正確に診断することができる、性感染症（ｓｅｘｕａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＳＴＤ）の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析用のＤＮＡチップ、キット、及びこれらを用いた探知又は分析方法に関するもので、本発明によると、ＤＮＡ試料内で、前記の１４種の菌の存在有無だけでなく、その遺伝子型、更に抗生剤耐性を同時に速やかかつ正確に分析することができる。
【背景技術】
【０００２】
細菌感染は、未だに人体疾患の中で最も重要な疾患の一つである。細菌の診断の際には、その原因菌を正確かつ速かに把握しなければならず、その原因菌の抗生剤に対する感受性と耐性を把握することが重要である。その際の原因菌の診断は、単なる菌の属と種だけでなく、亜種（ｓｕｂｔｙｐｅ）乃至菌株（ｓｔｒａｉｎ）まで把握することが重要である。前記の詳細な情報は、感染の根源と原因を把握し、病態を把握し、経過と予後を予測し、治療剤の選択や治療方針の決定、ワクチンの開発及び投与に必須である。
【０００３】
伝統的に、感染疾患の診断のためには、塗抹及び染色による顕微鏡的検査、細菌培養及び抗生剤の感受性検査、抗原抗体検査、免疫学的検査法などの様々な方法が用いられている。しかし、実際にこのような伝統的診断法は、多くの限界があることが現実である。既存の方法を用いる場合、相当数の細菌は、検出が不可能か難しく、時間とコスト及び人手が余りにも多く必要であり、一度で処理できる検体数に限界があって、大体一度の検査によって一つしか検査することができず、さらに、判読が自動化されておらず、臨床適用が難しい。また、生きている菌を対象とするため、検査時まで菌を生かさなければならず、これに伴い、検体処理と移送が難しく、そのコストも少なくない。
【０００４】
因って、最近は、感染疾患の診断に分子遺伝学的分析方法が用いられるようになり、これが既存の診断法を急速に代えていく傾向にある。特に、最近は、多数検体の自動分析が可能なＤＮＡマイクロアレイ又はＤＮＡチップが脚光を浴びている。遺伝子分析を用いた感染診断は、既存の感染診断法に比べ、長所が多く、既存の方法の問題を解決することができ、補助検査法乃至代替検査法として利用が増えている。遺伝子診断法は、ＤＮＡ及びＲＮＡ塩基序列の分析を通して、対象細菌の株型と亜型とを明確に知ることができ、死んだ細菌も検出が可能で、検体処理と移送が容易であり、ＰＣＲ増幅を通じて標的遺伝子を増幅させて検出するため、感度が高いだけでなく、極少量の検体のみでも診断が可能である。更に、感度だけでなく、特異度や再現性などあらゆる部分で優れている。大体の場合、２４時間以内に速やかかつ正確に結果が分かり、人手やコストも更に節減される。更に、ＤＮＡチップを用いると、多数の検体を速かに多量に検出することができ、忙しい病院の業務中にも臨床診療に役立つ。
【０００５】
現在、アメリカＦＤＡの公認を受けた、クラミジア・トラコマチス、淋菌、ヘルペスシンプレックスウイルス及びヒト免疫不全ウイルスなどを検出するＰＣＲ及びリアルタイム（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ）ＰＣＲキットが市販されている。しかし、まだ商業化したＤＮＡチップは少数であり、感染疾患の原因菌を速やかかつ正確に把握できるだけでなく、抗生剤耐性まで検査して臨床診断に大きく役立つＤＮＡチップは、更に珍しい。特に、本発明と同様、ＳＴＤの主な原因菌及び関連菌の診断と共に、その抗生剤耐性まで全て検出することができるＳＴＤチップは、まだ商業化されていない（Ａｎｄｒｅａ  Ｆｅｒｒｅｒｉａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ａｎｇｅｌａ  Ｍ  Ｃａｌｉｅｎｏ；Ｔｉｅｚ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ、２００６．ｐ．１５５５−１５８８）。
【０００６】
ＳＴＤ（ｓｅｘｕａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）は、性行為によって伝播する疾病をあわせて称する言葉である。ＳＴＤは非常に重要であるが、これは、人体の１０大感染疾患のうち、５つがＳＴＤであり、何よりも人体感染疾患の中で、最もありふれていて、歴史の長い疾患であるためである。アメリカの場合、毎年１５００人以上がＳＴＤに新たに感染し、６，５００万人以上がウイルス性ＳＴＤに罹患していると報告されている。最近は、特に、クラミジア・トラコマチス、ヘルペスシンプレックスウイルス、ヒト乳頭腫ウイルスの３つが増えている傾向があり、最もよくある３大ＳＴＤとして指摘されている。ＳＴＤは、高い有病率にもかかわらず、自覚症状がなくて知らずに過ごすことが多いが、進行すると、不妊や前立腺炎、副睾丸炎、免疫欠乏、癌などの合併症を引き起こす可能性がある。ＳＴＤ、特に、ウイルス性ＳＴＤは、有効な治療法がない場合が多い。このため、ＳＴＤは、正確な診断と予防が何よりも重要である。更に、無症状の患者を探して治療し、感染の拡散を防止することも重要である（Ｔａｒａ  Ｆｒｅｎｋｌ、Ｊｅａｎｅｔｔｅ  Ｐｏｔｔｓ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｗａｌｓｈ  Ｕｒｏｌｏｇｙ、９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓａｕｎｄｅｒｓ、２００７、ｐ．３７１−３８５）。
【０００７】
ＳＴＤの代表的な原因菌としては、バクテリアである淋菌とクラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリチクム、マイコプラズマ・ジェニタリウム、マイコプラズマ・ホミニス、トレポネマ・パリダム、ヘモフィルス・デュクレイ、ウイルスであるヘルペスシンプレックスウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、肝炎ウイルス、更に、原虫であるトリコモナス・バギナリスなどがある。
【０００８】
一方、ＳＴＤは大きく３つの形態がある。第一に、男性は尿道炎や前立腺炎、副睾丸炎で、女性は子宮頸部炎や膣炎、骨盤炎症性疾患（ｐｅｌｖｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）で現れる形態であって、この原因菌としては淋菌とクラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリチクム、マイコプラズマ・ジェニタリウム、マイコプラズマ・ホミニス、トリコモナス・バギナリス及びヘルペスシンプレックスウイルスが含まれる。第二に、外性器に潰瘍で現れる形態であって、この原因菌として梅毒菌（トレポネマ・パリダム）、ヘルペスシンプレックスウイルス、ヘモフィルス・デュクレイがある。第三に、外性器にいぼ（ｗａｒｔ）や子宮頸部、肛門、陰茎などに癌を引き起こす形態であって、ＨＰＶがこれに当る。第四に、全身感染を引き起こす形態であって、ＨＩＶ感染とウイルス感染がこれに当る。これと共に、正確な意味でＳＴＤではないが、ＳＴＤと類似して膣炎などの病態で現れるので鑑別すべき菌として、大腸菌、ガードネレラ・バギナリスと真菌であるカンジダ・アルビカンスがある。これらの菌は、ＳＴＤの検査の際、含まれなければならないものである。
【０００９】
本出願人（グッジェンインク）は、約７年間、延べ人員約５０万人にＳＴＤの原因菌を多様な遺伝子分析法で検査する研究及び事業を行っている。最近の１年間、１０１，５７８人の検査結果を分析した統計を下記表１に示した。
【００１０】
【表１】
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【００１１】
このような経験に基づき、本発明者らは、ＳＴＤの診療に次のような解決されていない問題点が多いことが分かった。
【００１２】
第一に、他の疾患とは異なり、無症状で潜伏しているため、症状が悪化する場合が多く、治療後にも再感染しやすい。実際に、クラミジア・トラコマチスやウレアプラズマ、マイコプラズマなどの非淋菌性尿道炎感染のような場合には、殆どが症状がなく知らずに過ごす。したがって、ＳＴＤの原因菌を早期に検出し、無症状の保菌者も効果的に選別（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）できる方法の開発が重要である。
【００１３】
第二に、実際に診断が容易ではない。数多くのＳＴＤ原因菌は培養がよくできなく、免疫学的方法でも検出が難しく、更に、検出されても時間とコストがかなり多く必要であり、臨床では実際に適用することができず、医師の経験と直感によって診断を行って治療をする場合が多い。よって、正確かつ速やかに、低コストでＳＴＤを診断することができる新しい方法の開発が切実である。
【００１４】
第三に、ＳＴＤはよく複合感染の形態で現れる。例えば、淋菌感染の場合、本発明の図１に示したように、性関係後、淋菌とクラミジア・トラコマチスとヘルペスシンプレックスに同時に複合感染される場合が少なくない。よって、このような複合感染を正確に全部診断することができる方法の開発が切実である。
【００１５】
第四に、抗生剤耐性である。特に、淋菌及びクラミジアなど重要ＳＴＤ菌の場合、抗生剤の乱用により、ベータ−ラクタム系抗生剤耐性、テトラサイクリン系耐性がよく現れる。これは、治療失敗と合併症、感染拡散、経済的損失で現れ、臨床診療で大きな問題となっている。よって、このような抗生剤耐性を正確かつ速かに分析して、適切な抗生剤を選択することが重要である。
【００１６】
このような問題があるため、ＳＴＤの診療は困難で、これが解決できる新しい方法の開発が切実なところ、本発明は前記の問題点を解決するために考案された。
【００１７】
ＳＴＤの種類のうち、臨床で最もよく発見される形態が男女の尿道と女性の子宮頸部、膣、卵管などに浸透して炎症を引き起こすものである。これは大きく、淋菌と非淋菌性に分けられ、後者としては、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリチクム、マイコプラズマ・ジェニタリウム及びマイコプラズマ・ホミニスが主要原因菌として指摘されている。これらの細菌は、共通して、男性で尿道炎の重要原因となり、副睾丸炎と前立腺炎などの合併症を誘発することがあり、不妊の重要な原因となる。更に、女性では尿道炎と膣炎、子宮頸部炎と骨盤炎症性疾患の主な原因となり、ラッパ管閉鎖を起こすことによって不妊と子宮外妊娠（ｅｃｔｏｐｉｃ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）などの合併症を誘発することがある。欧米の場合、今日、クラミジア感染が最も多く、韓国内でも、最近は、淋菌感染症は減っているものの、クラミジア感染と非淋菌性尿道炎が増えている傾向にある。これは本出願人の経験に基づく統計（前記表１参照）とも一致する。
【００１８】
患者に一旦尿道炎が発見されると、それが淋菌性であるか非淋菌性であるかを先に鑑別すべきであるが、その理由は治療方法と経過が相違するためである。しかし、最近は、抗生剤の誤乱用による細菌の変移と混合感染の増加により、両者間の区別が曖昧な傾向があり、正確な診断のためには、本発明のような分子遺伝子的検査法が必要である。
【００１９】
淋菌性尿道炎を引き起こす淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）は、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属に属する。淋菌の診断は、一次的にグラム染色（Ｇｒａｍ  ｓｔａｉｎ）による。グラム染色で特徴的な細胞内のグラム陰性双球菌の存在を確認することは便利で正確度が比較的高く、広く用いられている方法である。しかし、無症状であるか症状が微小な淋菌性尿道炎では、グラム染色による場合、判断が曖昧であったり、偽陰性（ｆａｌｓｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）に出る場合が多い。よって、グラム染色法を補完するために、淋菌培養を試みる傾向があるが、検査結果が分かるまで多くの時間とコストが消耗される短所がある。
【００２０】
この他にも、酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）と免疫蛍光測定法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）は、淋菌感染疾患診断において新しい抗原確認法として用られており、培養検査に比べ、速やかに結果が得られ、感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）と特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）が更に高いものとして報告されているが、高コストという短所がある。
【００２１】
非淋菌性尿道炎は、最近、淋菌性尿道炎が減少していることに反して、逆に発病率が増加している。非淋菌性尿道炎は、単一疾患ではなく、様々な微生物によって引き起こされる一種の症候群（ｓｙｎｄｒｏｍｅ）である。非淋菌性尿道炎の原因微生物として最も重要なものがクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ，ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）である。クラミジ・トラコマチスは、細胞内寄生性（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐａｒａｓｉｔｉｓｍ）の生存周期（ｌｉｆｅ  ｃｙｃｌｅ）を有する微生物であって、ゲノムにＤＮＡとＲＮＡを両方持っており、全部で１５種類の血清型があるが、このうち、非淋菌性尿道炎を引き起こすのはＤ−Ｋ型である。これによって発病する人体疾患としては、トラコーマと呼吸器感染、尿道炎と子宮頸部炎、副睾丸炎、骨盤炎症性疾患を含むＳＴＤがある。最近は、クラミジアが心筋炎を引き起こすという報告もある。
【００２２】
クラミジア・トラコマチスの確認方法としては、（１）感染部位から採取された可検物を培養、分離確認する方法、（２）感染部位の上皮細胞を直接に塗抹染色して、菌を確認する方法、（３）患者の血清から抗体を分離確認する蛍光抗体法が用いられており、最近は、（４）合成酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）とハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）などの分子遺伝学的技法が好まれる。しかし、前記方法（１）は、検体を培養分離することに長時間が必要で、診断感度が低いという点などから臨床診断目的には適さず、方法（２）は、感染部位の上皮細胞を直接に塗抹染色して、菌を確認する利便性は優れているが、診断感度が低く、方法（３）は、単クローン抗体に蛍光物質であるＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）が付着された試薬を用いて、感度は比較的高いが、高コストと専用装備を要するという短所があり、その使用が制限されている。
【００２３】
人間と各種の哺乳類動物に広範囲に存在するマイコプラズマとウレアプラズマ属に属し、泌尿生殖器に感染を誘発する可能性があるウレアプラズマ・ウレアリチクムとマイコプラズマ・ジェニタリウムは、培養が技術的にかなり難しく、染色や免疫学的方法でも発見することが難しい。これにより、ＰＣＲによる分子遺伝学的検査法で診断しようとするのが最近の傾向である。この場合、各菌の種に特異な遺伝子のＤＮＡの塩基序列をＰＣＲで増幅した後、これをシーケンシング反応やハイブリダイゼーションなどで確認する方法が主に用いられる。現在まで確認された１３種のマイコプラズマと２種のウレアプラズマは、１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ  ｒＲＮＡ）のＶ３の５’方向側の隣接部位（ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）とＶ６の３’方向側の隣接部位の塩基序列が互いに一致する。これに対し、Ｖ４とＶ５部位の約２５０個の塩基序列や１６Ｓ−２３ＳリボソームＲＮＡ間部位の塩基序列は、各種ごとに差がある。よって、これを検査する方法が有効であり、更に、ウレアプラズマ・ウレアリチクムの場合、これに特有のウレアーゼのサブユニット（ｕｒｅａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ）の塩基序列を分析する方法も使用可能である（Ｊｅｎｓｅｎ  ＪＳ等  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００３；４１：２６１−６；Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｔ等  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００２；４０：１０５−１１０）。
【００２４】
性感炎のもう１つのよくある形態は、外性器に潰瘍を引き起こす疾患である。代表的な原因としては、陰部ヘルペス（ｇｅｎｉｔａｌ  ｈｅｒｐｅｓ）、梅毒（ｓｙｐｈｉｌｉｓ）、軟性下疳（ｃｈａｎｃｒｏｉｄ）、性病性リンパ肉芽腫（ｌｙｍｐｈｏｇｒａｎｕｌｏｍａ  ｖｅｎｅｒｅｕｍ、ＬＧＶ）などがある。これらは、順に、ヘルペスシンプレックスウイルス１型と２型（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ２；ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２）、トレポネマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）によって発病する（Ｔａｒａ  Ｆｒｅｎｋｌ、Ｊｅａｎｅｔｔｅ  Ｐｏｔｔｓ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｗａｌｓｈ  Ｕｒｏｌｏｇｙ、９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓａｕｎｄｅｒｓ、２００７、ｐ．３７１−３８５）。本発明者らは、これらの外陰部潰瘍原因菌を同時に多重ＰＣＲで増幅した後、更に、ＤＮＡチップ上で逆交雑反応（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）により分析するという新しい遺伝子診断キットを開発した。
【００２５】
ヘルペスシンプレックスウイルスは、外陰部潰瘍の原因の中で大半を占める。ヘルペスシンプレックスウイルスには、１型と２型があるが、特に２型が陰部ヘルペスの大半を占める。しかし、最近は、口腔性交の影響によってヘルペスシンプレックスウイルス１型による陰部ヘルペスも増加している。発明者等の統計を見ても、性器潰瘍で依頼された患者の中で６０．９％で性感炎が確認されており、その中で７９．９％が第２型ヘルペスシンプレックスウイルス、１７．４％が第１型ヘルペスシンプレックスウイルスによって発病されたことが確認された。ヘルペスシンプレックスウイルスは、神経を侵して潜伏していながら、体内免疫機能が弱くなると発病して、性器に水泡や潰瘍を引き起こすのが普通であり、多くの人々が感染事実を知らずに過ごす。実際に、ヘルペスシンプレックス感染は、単一ＳＴＤの中で、最もよくある疾患として指摘されており、アメリカの場合、約４５００万人がヘルペスシンプレックスウイルス感染に罹患されており、毎年１００万人の新患が発病すると推算されている（アメリカ疾病予防管理センター  ｗｅｂｐａｇｅ．ＣＤＣ  Ｆａｃｔ  Ｓｈｅｅｔ：Ｇｅｎｉｔａｌ  Ｈｅｒｐｅｓ）。ヘルペスシンプレックスウイルス感染は、過去では培養検査で診断をしていたが、感度が低く、結果が出るのに長い時間と多額の費用がかかるなどの問題点が多く、実際の臨床では検査なしで経験的に診断して治療するケースが多い。しかし、最善の治療のためには、正確な診断が必須であり、１型と２型の感染を鑑別することも重要である。１型のヘルペスシンプレックスウイルス感染の場合、感染初年度にわずかに平均１回のみ再発し、それ以降には再発がめずらしいという良好な経過を見せることに対し、２型のヘルペスシンプレックスウイルス感染の場合には、再発が多く、初年度のみで平均４回も再発した。よって、２型ヘルペスシンプレックスウイルス感染の場合には、更に積極的な治療と綿密な追跡調査が必須である（Ｔａｒａ  Ｆｒｅｎｋｌ、Ｊｅａｎｅｔｔｅ  Ｐｏｔｔｓ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｗａｌｓｈ  Ｕｒｏｌｏｇｙ、９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓａｕｎｄｅｒｓ、２００７、ｐ．３７１−３８５）。ヘルペスシンプレックスウイルス感染の検査のうち、アメリカ食品医薬品局の承認を受けた検査としては、抗体検査であるＨｅｒｐｅｓ−Ｓｅｌｅｃｔ  ＥＬＩＳＡ、Ｈｅｒｐｅｓ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ、Ｃａｐｉｔａ  ＥＬＩＳＡなどがある。最近は、アメリカ食品医薬品局の承認なしでＰＣＲやＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ａｓｓａｙなどの簡単な遺伝子検査法が用いられているが、未だに、１型と２型のヘルペスシンプレックスウイルス感染を正確に鑑別する商業化した遺伝子分析法はあまりない（Ａｎｄｒｅａ  Ｆｅｒｒｅｒｉａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ａｎｇｅｌａ  Ｍ  Ｃａｌｉｅｎｏ；Ｔｉｅｚ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ、２００６．ｐ．１５５５−１５８８）。よって、本発明では、ヘルペスシンプレックスウイルス感染の有無だけでなく、その亜型、すなわち、１型であるか２型であるかも正確に鑑別す���ために、先にＰＣＲで増幅した後、その産物を更にＤＮＡチップ上で逆交雑反応により分析する新しいキットを開発した。このような方法は、ＰＣＲ後、電気泳動のみで把握することより、更に高感度で特異性が高いという長所がある（Ｏｌｉｖｅ  ＤＭ、Ｂｅａｎ  Ｐ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｕｎｅ  １９９９．ｐ．１６６１−１６６９．）。
【００２６】
梅毒は、人類の歴史上、最も歴史の長いＳＴＤであって、ペニシリンの台頭によって激減したが、最近は、欧米の白人男性層でまた発病率が増加しているという報告がある（アメリカ疾病予防管理センター、ＣＤＣ  Ｆａｃｔ  Ｓｈｅｅｔ、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、２００６；Ｔａｒａ  Ｆｒｅｎｋｌ、Ｊｅａｎｅｔｔｅ  Ｐｏｔｔｓ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｗａｌｓｈ  Ｕｒｏｌｏｇｙ、９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓａｕｎｄｅｒｓ、２００７、ｐ．３７１−３８５）。梅毒の診断には、実際に解決されていない問題が多い。梅毒は、伝統的に、血清検査の後で、暗視野（ｄａｒｋ  ｆｉｅｌｄ）顕微鏡下でスピロヘータ菌であるトレポネマ・パリダムを観察する方法が主に用いられてきた。しかし、本暗視野観察法は、経験を要し、発病初期には診断感度が低くて限界がある。抗体検査も梅毒の硬性下疳（ｃｈａｎｃｒｅ）が発生した後、１−３週間が過ぎるまでは陰性で現れる。いわゆる、ゴールド・スタンダード・テスト（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｔｅｓｔ）である家兎感染検査（ｒａｂｂｉｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｅｓｔ）は、正確であるが、動物実験を要し、時間とコストが必要となるという問題がある。このために、最近は、早期診断が可能なように、ＰＣＲと逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）ＰＣＲを試みている。ＰＣＲの際に、その他のスピロヘータ菌との正確な鑑別のために、トレポネマ・パリダムの４７ｋＤａ遺伝子と１６ｓ−ｒＲＮＡ、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ、ｒｐｆ−１、ｒｍｐ  Ａ、ｒｍｐ  Ｂ、ＢＭＰ遺伝子を増幅する方法が用いられる。しかし、未だにそれぞれの有意性は明らかになっておらず、まだ商業化した遺伝子検査キットも出ていない（Ｌｉｕ  Ｈ、Ｒｏｄｅｓ  Ｂ、Ｃｈｅｎ  ＣＹ、Ｓｔｅｉｎｅｒ  Ｂ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｘｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｍａｙ  ２００１．ｐ．１９４１−１９４６）。これに、本発明では、梅毒感染を更に早期に正確に鑑別しようとする目的下で、トレポネマ・パリダムのカルボキシペプチダーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ）遺伝子を増幅する新しいＰＣＲ法を開発した後、その産物をＤＮＡチップ上で逆交雑反応で再確認し、ＰＣＲのみをすることより感度と特異度が更に改善された方法を開発した。
【００２７】
軟性下疳は、欧米で最近発病頻度が減少しており、韓国内に住んでいる韓国人にはあまり見られないＳＴＤである。その原因菌であるヘモフィルス・デュクレイは、通常、潰瘍部位グラム塗抹染色で検査するが、その効用性には限界があり、培養しにくい菌である。このため、ＰＣＲ法が新しい標準的診断法として台頭している。しかし、未だにアメリカ食品医薬品局の公認を受けた検査はない。一旦軟性下疳が確認されると、梅毒とＨＩＶの検査も共にするよう勧められている（アメリカ疾病予防管理センター、ＣＤＣ  Ｆａｃｔ  Ｓｈｅｅｔ、Ｃｈａｎｃｒｏｉｄ、２００６；Ｔａｒａ  Ｆｒｅｎｋｌ、Ｊｅａｎｅｔｔｅ  Ｐｏｔｔｓ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｗａｌｓｈ  Ｕｒｏｌｏｇｙ、９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓａｕｎｄｅｒｓ、２００７、ｐ．３７１−３８５）。本発明では、軟性下疳の原因菌であるヘモフィルス・デュクレイの１６ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲで増幅して、その産物をＤＮＡチップ上で逆交雑反応で再確認するという新しい方法を開発して、その診断感度と特異度が改善できるようにした。
【００２８】
今日、人間の外性器を侵すＳＴＤのうち、最も重要で、よくある２大疾患は、前述した陰部ヘルペスとＨＰＶ感染である。アメリカの場合、約２５００万人がＨＰＶ感染しており、毎年６００万人余りが新たに感染し、成人男性と女性の約半数は生涯で一度以上感染すると推算されている（ＣＤＣ  Ｆａｃｔ  Ｓｈｅｅｔ、ＵＳＡ、２００６）。本発明者らの経験によると、ＳＴＤのうち、最もよく発見されるのがＨＰＶ感染であった（前記表１参照）。ＨＰＶには、約１００種類余りがあり、約４０種が外性器や肛門の粘膜を侵す肛門外性器型（ａｎｏｇｅｎｉｔａｌ  ｔｙｐｅ）又は粘膜型（ｍｕｃｏｓａｌ  ｔｙｐｅ）である。ＨＰＶには、その病態により、２種類の型がある。一つは、いわゆる、低危険型（ｌｏｗ  ｒｉｓｋ  ｔｙｐｅ）のＨＰＶであって、これは、いぼ、コンジローム、又は尖圭コンジローマ（ｃｏｎｄｙｌｏｍａ  ａｃｃｕｍｉｎａｔｕｍ）を引き起こす。
【００２９】
他の一つは、高危険型（ｈｉｇｈ  ｒｉｓｋ  ｔｙｐｅ）のＨＰＶであって、これは、子宮頸部や陰茎、肛門などに癌前駆病変と癌の発病を誘発することがある。ＨＰＶ感染の診断には、大きく三つ目的と方法がある。第一は、ＨＰＶによるＳＴＤ感染の有無を把握することであり、ここでは、通常、ＰＣＲ後、電気泳動や交雑反応で確認する方法が用いられる。第二は、ＨＰＶの有無を把握することから進み、罹患したＨＰＶの危険度を把握することによって子宮頸部癌を選別（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）しようとする目的下で試みる。このためには、アメリカ食品医薬品局の承認を受けた、いわゆる、Ｈｙｂｒｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ａｓｓａｙ（Ｄｉｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）が最も広く用いられる。第三は、ＨＰＶの有無から進み、罹患したＨＰＶの正確な亜型乃至遺伝子型を把握する方法（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｔｅｓｔ）である。これは、ＳＴＤの感染診断だけでなく、子宮頸部癌の選別、更に、最近台頭しているＨＰＶワクチンの適用の可否を把握することまで広く用いることができる。ＰＣＲ後の塩基序列分析で確認することが標準的遺伝子型の分析方法であるが、これは多くの時間とコストを費やし、労働集約的であるため、一度に少数の検体しか検査できないという短所がある（Ｏｌｉｖｅ  ＤＭ、Ｂｅａｎ  Ｐ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｕｎｅ  １９９９．ｐ．１６６１−１６６９．）。このために、最近は、ＰＣＲ後にＤＮＡチップ上で多数のプローブと逆交雑反応をして、遺伝子型を検査する方法が主に用いられる。本発明者らは、従来、このようなＨＰＶ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ＤＮＡチップを開発して、特許を獲得した後、製品化に成功、大韓民国食品医薬品安全庁及びＣＥの承認を受け、市販されている。よって、本発明では、これを用いてＨＰＶのＬ１遺伝子をＰＣＲで増幅して、その産物を更にＤＮＡチップ上で逆交雑反応により再確認する略式のＤＮＡチップ法を適用した。
【００３０】
トリコモナス・バギナリスは、人体にのみ寄生する原虫で、性関係を通して伝播され、男女の尿道と女性の膣を侵して、炎症（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎｉａｓｉｓ）を引き起こす代表的ＳＴＤである。実際に、よくあるＳＴＤとして、毎年全世界で１億７４００万人が新たに感染し、アメリカの場合、毎年新規発病例が６００万と推算されている（ＷＨＯ、１９９９；Ｔａｒａ  Ｆｒｅｎｋｌ、Ｊｅａｎｅｔｔｅ  Ｐｏｔｔｓ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｗａｌｓｈ  Ｕｒｏｌｏｇｙ、９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓａｕｎｄｅｒｓ、２００７、ｐ．３７１−３８５）。男性の場合、多数が症状がなくて知らずに過ごし、女性の場合にも、その半数は症状がない。通常、症状があって患者が病院に来ると、身体検査や顕微鏡観察（ｗｅｔ  ｓｍｅａｒ）で診断をすることになる。しかし、無症状の保菌者を探す方法の開発が必要な状態であり、このような点から、本発明者らは、尿や膣塗抹、尿道塗抹で速やかかつ正確にトリコモナスを診断することができるＤＮＡチップキットを開発した。
【００３１】
厳密な意味で、ＳＴＤではないが、ＳＴＤと同様に膣炎及び下部尿路感染を引き起こし、ＳＴＤと鑑別診断が必要で、本発明の検査に含むべき細菌として、カンジダ・アルビカンスとガードネレラ・バギナリス、そして大腸菌がある。
【００３２】
陰唇及び膣の炎症（ｖｕｌｖｏｖａｇｉｎｉｔｉｓ）の最もよくある原因菌はカンジダ・アルビカンスである。これは、正常な場合にも、膣と陰茎皮膚に存在することもあり、又は、性関係によって伝播されることもある。診断は、膣分泌物の塗抹染色検査（ｗｅｔ  ｓｍｅａｒ、ｇｒａｍ  ｓｔａｉｎ）により、膣のｐＨは正常であることが特徴であり、再発が多いという問題がある。この遺伝子診断キットは、まだ商業化していない。本発明では、ＳＴＤとの鑑別のために、ＤＮＡチップキットに含めた。
【００３３】
女性において、正常膣の寄生細菌の代わりに存在し、細菌性膣炎（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖａｇｉｎｏｓｉｓ）を引き起こして苦痛を与える重要原因菌として、ガードネレラ・バギナリスがある。診断は、水酸化カリウムと共に膣分泌物の塗抹染色検査（Ｗｈｉｆｆ  ｔｅｓｔ）により、膣のｐＨが上昇することが特徴である。最近は、商業化したＤＮＡプローブキットが出ているが、まだＤＮＡチップはない。ＳＴＤとの鑑別のために、やはり本発明のＤＮＡチップキットに含めた。
【００３４】
大腸菌は、女性における膀胱炎と男性における前立腺炎の主な原因菌である。これは、膣炎及び骨盤炎症性疾患としてのＳＴＤ、そして男性で尿道炎形態のＳＴＤと鑑別するために重要である。大腸菌は、通常、尿の培養検査で確診するが、４８−７２時間以上の長時間が必要という短所がある。大腸菌を分析するＤＮＡチップは、まだ商業化していない。本発明では、ＳＴＤとの速やかな鑑別診断のために、ＤＮＡチップキットに含めた。
【００３５】
ＳＴＤの診療において、もう１つの深刻な問題は、抗生剤耐性である。代表的なＳＴＤ細菌である淋菌の場合、通常、ベータ−ラクタム系（ペニシリン系）抗生剤であるペニシリン、アンピシリン、セファロスポリン、そしてテトラサイクリン系抗生剤であるオキシテトラサイクリン、そしてキノロン系抗菌剤が選択されるところ、最近、これら抗生剤に抵抗する淋菌が急増している実情がある。同様に、クラミジア感染の場合にも、テトラサイクリン系抗生剤やキノロン系抗生剤が選択される傾向があるが、これもまた耐性菌が急増する傾向にある。よって、このような耐性を同時に正確に分析することができる遺伝子診断法、特に、ＤＮＡチップが必要であるが、あまりない。
【００３６】
このような遺伝子診断法が、臨床で実際に診断に役立つためには、具備すべき条件が多い。先ず、診断の感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）と特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）及び再現性（ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ）が全て１００％に近づくように優れていなければならない。併せて、検査の方法が容易で、解釈しやすく、利便性が高くなければならず、更に、速やかに結果を得ることが可能でなければならない。更に、特別な高価な装備がなくても検査が可能でなければならず、検査が自動化していて、多数の検体を速やかに検査可能でなければならず、検査コストも安価でなければならない。このために、ＰＣＲは、なるべく対象細菌のいくつかを１つのチューブ内で一度のＰＣＲ反応で増幅して検査することができるマルチプレックス型のＰＣＲである必要がある。併せて、ＰＣＲの際、各対象細菌が菌株のレベルまで正確に識別できるように、検査対象遺伝子と塩基序列部位が適切に選択されなければならず、これに合わせて、最適のＰＣＲ条件が確立されなければならない。しかし、今までＳＴＤの主要原因菌と関連菌の１４種類を同時に検出することができるＤＮＡチップ、多重ＰＣＲに対する報告はなく、更に、このようなＰＣＲキットはまだ商業化していない。
【００３７】
更に、ＰＣＲは、単に標的核酸の増幅手段であり、それのみで細菌診断を確診することはできない。ＰＣＲ後には、増幅された産物が所望の細菌のＤＮＡであるか否かを正確に確認する手続きが必ず必要である。併せて、なるべく細菌の遺伝子型を正確に読み取り、抗生剤耐性や生物学的侵害度、予後などが正確に予測できる検査も更に必要である。このためには、各種のＳＴＤ原因菌を同時に正確かつ速かに分析し、その他の疾患と鑑別し、更に、抗生剤耐性などの情報も共に知ることができるＤＮＡチップの開発が緊急に望まれる。
【００３８】
これにより、本発明では、前記の１４種のＳＴＤ菌の属と種だけでなく、亜種まで全部正確に探知することができ、更に、テトラサイクリン系及びベータ−ラクタム系抗生剤の耐性も分析することができる、性感染症の原因菌の探知又は遺伝子型の分析用のＤＮＡチップ、キット、及びこれを利用した探知又は分析方法を開発し、実際の診断に利用できるようにした。
【００３９】
一方、これまでに本発明者らは、淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリチクム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの存在有無を同時に分析することができ、これらの菌のテトラサイクリン抗生剤に対する耐性も分析することができる多重ＰＣＲとオリゴヌクレオチドマイクロアレイを開発して、特許（韓国特許登録  第６１９１８９号）を獲得して、商品化に成功している。
【００４０】
本発明は、ここから一歩進み、更にマイコプラズマ・ジェニタリウム、マイコプラズマ・ホミニス、梅毒菌であるトレポネマ・パリダム、軟性下疳のヘモフィルス・デュクレイ、陰部ヘルペスの原因であるヘルペスシンプレックスウイルス１型と２型、ＨＰＶ、トリコモナス・バギナリスの７個のＳＴＤ原因菌と共に、ＳＴＤと鑑別しなければならない細菌であるカンジダ・アルビカンス、ガードネレラ・バギナリス及び大腸菌の存在有無と、更に、テトラサイクリン及びベータ−ラクタム系抗生剤に対する耐性が速やかかつ正確に分析できる遺伝子分析型ＤＮＡチップと多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲ分析キットを更に開発したものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００４１】
本発明の目的は、ＳＴＤの重要原因及び関連菌である淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリチクム、マイコプラズマ・ジェニタリウム、マイコプラズマ・ホミニス、トレポネマ・パリダム、ヘモフィルス・デュクレイ、ヘルペスシンプレックスウイルス１型と２型、ＨＰＶ、トリコモナス・バギナリス、カンジダ・アルビカンス、ガードネレラ・バギナリス及び大腸菌の存在の有無だけでなく、テトラサイクリン系抗生剤とペニシリン、アンピシリン、セファロスポリンなどのベータ−ラクタム系抗生剤に対する耐性をそれぞれ速やかかつ正確に診断することができる、遺伝子分析用のＤＮＡチップ、キット及びその方法を提供し、これを実際の臨床診断に応用することにある。本発明によると、代表的ＳＴＤ原因及び関連菌を全部速やかかつ正確に自動分析することができるだけでなく、治療抗生剤の選択にも役立つ。
【００４２】
本発明の解決しようとする課題及び目的を更に具体的にすると、次の通りである。
【００４３】
第一に、ＳＴＤの重要原因及び関連菌である淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリチクム、マイコプラズマ・ジェニタリウム、マイコプラズマ・ホミニス、トレポネマ・パリダム、ヘモフィルス・デュクレイ、ヘルペスシンプレックスウイルス１型と２型、ＨＰＶ、トリコモナス・バギナリス、カンジダ・アルビカンス、ガードネレラ・バギナリス、大腸菌のゲノム又はクリプティック・プラスミドの遺伝子と、ＳＴＤ菌のテトラサイクリン系及びベータ−ラクタム系抗生剤の耐性に関与する遺伝子を、少数のＰＣＲ反応で同時に増幅して分析することができる多重ＰＣＲ法を提供することである。
【００４４】
第二に、前記１４種の菌の遺伝子とテトラサイクリン系及びベータ−ラクタム系抗生剤耐性遺伝子とヒトベータグロブリンの遺伝子を多重ＰＣＲで増幅するための効果的なプライマーを提供することである。
【００４５】
第三に、前記１４種の菌に特異的な各遺伝子と対照遺伝子及び抗生剤耐性遺伝子を更に正確に検出することができるオリゴヌクレオチドプローブを提供することである。
【００４６】
第四に、前記プローブが集積されている、前記１４種の菌と抗生剤耐性遺伝子の探知及び遺伝子型の分析用のＤＮＡチップを提供することである。
【００４７】
第五に、前記プローブを含む、前記１４種の菌と抗生剤耐性遺伝子の探知及び遺伝子型の分析用のキットを提供することである。
【００４８】
第六に、前記プローブを用いた、前記１４種の菌と抗生剤耐性遺伝子の探知及び遺伝子型の分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００４９】
本発明の性感染症（ｓｅｘｕａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＳＴＤ）の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析用のＤＮＡチップは、序列番号３７乃至６６の塩基序列を有するオリゴヌクレオチドプローブを含むことが好ましい。更に、前記序列番号６６の塩基序列を有するオリゴヌクレオチドプローブは、ヒトベータグロブリン遺伝子と相補的に結合する。
【００５０】
本発明のＤＮＡチップにおいて、前記序列番号６６の塩基序列を有するオリゴヌクレオチドプローブは、５’末端がＣｙ５で標識された序列番号６７の塩基序列を有するオリゴヌクレオチドと相補的に結合する。
【００５１】
本発明のＤＮＡチップにおいて、プローブを集積することができる集積部位（ｗｅｌｌ）が８個に区切られていることが好ましい。
【００５２】
本発明の性感染症（ｓｅｘｕａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＳＴＤ）の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析用のキットは、前記ＤＮＡチップ、性感染症の原因菌由来のＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、及び前記ＤＮＡチップと相補的に結合する増幅されたＤＮＡを検出するための標識手段を含むことが好ましい。
【００５３】
本発明のキットにおいて、序列番号１及び序列番号２の塩基序列を有するガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号３及び序列番号４の塩基序列を有するウレアプラズマ・ウレアリチクム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号５及び序列番号６の塩基序列を有するマイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号７及び序列番号８の塩基序列を有するクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号９及び序列番号１０の塩基序列を有する淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号１１及び序列番号１２の塩基序列を有するトリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号１３及び序列番号１４の塩基序列を有するマイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号１５及び序列番号１６の塩基序列を有するカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号１７及び序列番号１８の塩基序列を有する大腸菌（ｃｏｌｉｆｏｒｍ  ｂａｃｔｅｒｉａ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号１９及び序列番号２０の塩基序列を有するヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号２１及び序列番号２２の塩基序列を有するヘルペスシンプレックスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号２３及び序列番号２４の塩基序列を有するトレポネマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号２５及び序列番号２６の塩基序列を有するヒト乳頭腫ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ；ＨＰＶ）核酸増幅用プライマーセット、序列番号２７及び序列番号２８の塩基序列を有するＳＨＶ遺伝子（ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ＳＨＶ−１２  ｇｅｎｅ）増幅用プライマーセット、序列番号２９及び序列番号３０の塩基序列を有するＴＥＭ遺伝子（ＣＭＴ−ｔｙｐｅ  ｂｅｔａ  ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｇｅｎｅ）増幅用プライマーセット、序列番号３１及び序列番号３２の塩基序列を有するＴｅｔＭ遺伝子（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｇｅｎｅ  Ｍ）増幅用プライマーセット、序列番号３３及び序列番号３４の塩基序列を有するＡｍｐＣ遺伝子（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ）増幅用プライマーセット、又は序列番号３５及び序列番号３６の塩基序列を有するＴｅｔＣ遺伝子（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｇｅｎｅ  Ｃ）増幅用プライマーセットを含むことが好ましい。
【００５４】
本発明のキットにおいて、標識手段は、Ｃｙ５、Ｃｙ３、バイオチン結合物質、ＥＤＡＮＳ（５−（２’−アミノエチル）アミノ−１−ナフタレン硫酸）、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＭＲＩＴＣ）、ｘ−ローダミン及びテキサスレッドからなる群で１つ以上選択されることが好ましい。
【００５５】
本発明のキットにおいて、標識手段がＣｙ５である時、標識されたｄＣＴＰと標識されていないｄＣＴＰ間のモル濃度比を１：１２．５として反応させることが好ましい。
【００５６】
本発明の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析方法は、（ａ）性感染症の原因菌の核酸増幅用プライマーを用いて、前記ＤＮＡを単一（ｓｉｎｇｌｅ）又は多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲ増幅法によって増幅するステップ；（ｂ）請求項１乃至請求項４のいずれか１項に係るＤＮＡチップに、前記増幅されたＤＮＡをハイブリッドさせるステップ；及び（ｃ）前記ハイブリッドによって得られた混成化物を検出するステップを含むことが好ましい。
【００５７】
本発明の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析方法において、単一又は多重ＰＣＲ増幅法は、序列番号１及び序列番号２の塩基序列を有するガードネレラ・バギナリス核酸増幅用プライマーセット、序列番号３及び序列番号４の塩基序列を有するウレアプラズマ・ウレアリチクム核酸増幅用プライマーセット、序列番号５及び序列番号６の塩基序列を有するマイコプラズマ・ホミニス核酸増幅用プライマーセット、序列番号７及び序列番号８の塩基序列を有するクラミジア・トラコマチス核酸増幅用プライマーセット、序列番号９及び序列番号１０の塩基序列を有する淋菌核酸増幅用プライマーセット、序列番号１１及び序列番号１２の塩基序列を有するトリコモナス・バギナリス核酸増幅用プライマーセット、序列番号１３及び序列番号１４の塩基序列を有するマイコプラズマ・ジェニタリウム核酸増幅用プライマーセット、序列番号１５及び序列番号１６の塩基序列を有するカンジダ・アルビカンス核酸増幅用プライマーセット、序列番号１７及び序列番号１８の塩基序列を有する大腸菌核酸増幅用プライマーセット、序列番号１９及び序列番号２０の塩基序列を有するヘモフィルス・デュクレイ核酸増幅用プライマーセット、序列番号２１及び序列番号２２の塩基序列を有するヘルペスシンプレックスウイルス核酸増幅用プライマーセット、序列番号２３及び序列番号２４の塩基序列を有するトレポネマ・パリダム核酸増幅用プライマーセット、序列番号２５及び序列番号２６の塩基序列を有するヒト乳頭腫ウイルス核酸増幅用プライマーセット、序列番号２７及び序列番号２８の塩基序列を有するＳＨＶ遺伝子（ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ＳＨＶ−１２  ｇｅｎｅ）増幅用プライマーセット、序列番号２９及び序列番号３０の塩基序列を有するＴＥＭ遺伝子（ＣＭＴ−ｔｙｐｅ  ｂｅｔａ  ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｇｅｎｅ）増幅用プライマーセット、序列番号３１及び序列番号３２の塩基序列を有するＴｅｔＭ遺伝子（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｇｅｎｅ  Ｍ）増幅用プライマーセット、序列番号３３及び序列番号３４の塩基序列を有するＡｍｐＣ遺伝子（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ）増幅用プライマーセット、及び序列番号３５及び序列番号３６の塩基序列を有するＴｅｔＣ遺伝子（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｇｅｎｅ  Ｃ）増幅用プライマーセットからなる群で選択される１つ以上のプライマーセットを用いることが好ましい。
【００５８】
本発明の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析方法において、単一又は多重ＰＣＲ増幅法は、（ａ）前記プライマーセットを鋳型ＤＮＡ、Ｔａｑ  ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰ、蒸溜水及びＰＣＲバッファーと混合するステップ；（ｂ）前記混合物を９５℃で１０分間予備変成するステップ；（ｃ）前記予備変成された産物を９４℃で３０秒間変成し、５８℃で３０秒間プライマーアニーリングし、７２℃で３０秒間延長することを全４０回繰り返すステップ；及び（ｄ）前記延長された産物を７２℃で５分間最終延長するステップを含むことが好ましい。
【００５９】
本発明の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析方法において、多重ＰＣＲ増幅法は、序列番号１と序列番号２の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号３と序列番号４の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号５と序列番号６の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号７と序列番号８の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号９と序列番号１０の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号１１と序列番号１２の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号１３と序列番号１４の塩基序列を有するプライマーセット、及び序列番号１５と序列番号１６の塩基序列を有するプライマーセット間のモル濃度比が１：１：１：１：１：１：１：１であることが好ましい。
【００６０】
本発明の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析方法において、多重ＰＣＲ増幅法は、序列番号１７と序列番号１８の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号１９と序列番号２０の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号２１と序列番号２２の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号２３と序列番号２４の塩基序列を有するプライマーセット、及び序列番号２５と序列番号２６の塩基序列を有するプライマーセット間のモル濃度比が１：１：１：１：１であることが好ましい。
【００６１】
本発明の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析方法において、多重ＰＣＲ増幅法は、序列番号２７と序列番号２８の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号２９と序列番号３０の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号３１と序列番号３２の塩基序列を有するプライマーセット、序列番号３３と序列番号３４の塩基序列を有するプライマーセット、及び序列番号３５と序列番号３６の塩基序列を有するプライマーセット間のモル濃度比が１：１：１：１：１であることが好ましい。
【００６２】
本発明の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析方法において、序列番号１と序列番号２のプライマーセットによるＰＣＲ産物が４１９ｂｐ、序列番号３と序列番号４のプライマーセットによるＰＣＲ産物が３７３ｂｐ、序列番号５と序列番号６のプライマーセットによるＰＣＲ産物が３３３ｂｐ、序列番号７と序列番号８のプライマーセットによるＰＣＲ産物が３２１ｂｐ、序列番号９と序列番号１０のプライマーセットによるＰＣＲ産物が２８４ｂｐ、序列番号１１と序列番号１２のプライマーセットによるＰＣＲ産物が２６２ｂｐ、序列番号１３と序列番号１４のプライマーセットによるＰＣＲ産物が２０７ｂｐ、序列番号１５と序列番号１６のプライマーセットによるＰＣＲ産物が１４８ｂｐのサイズであることが好ましい。
【００６３】
本発明の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析方法において、序列番号１７と序列番号１８のプライマーセットによるＰＣＲ産物が４６７ｂｐ、序列番号１９と序列番号２０のプライマーセットによるＰＣＲ産物が４３９ｂｐ、序列番号２１と序列番号２２のプライマーセットによるＰＣＲ産物が３５０ｂｐ、序列番号２３と序列番号２４のプライマーセットによるＰＣＲ産物が２６０ｂｐ、序列番号２５と序列番号２６のプライマーセットによるＰＣＲ産物が１９１ｂｐのサイズであることが好ましい。
【００６４】
本発明の性感染症の原因菌の探知、遺伝子型の分析及び抗生剤耐性遺伝子型の分析方法において、序列番号２７と序列番号２８のプライマーセットによるＰＣＲ産物が６７９ｂｐ、序列番号２９と序列番号３０のプライマーセットによるＰＣＲ産物が４１２ｂｐ、序列番号３１と序列番号３２のプライマーセットによるＰＣＲ産物が２９１ｂｐ、序列番号３３と序列番号３４のプライマーセットによるＰＣＲ産物が２０８ｂｐ、序列番号３５と序列番号３６のプライマーセットによるＰＣＲ産物が１５２ｂｐのサイズであることが好ましい。
【００６５】
本発明者らは、検査しようとする１４種の菌の遺伝子と５種の抗生剤耐性遺伝子及びヒトベータグロブリン遺伝子に対してそれぞれ検査する遺伝子とその部位を決定し、これを増幅するために必要なＰＣＲプライマーを考案し（実施例１）、対照群菌株と各菌株の標的遺伝子のＤＮＡクローンを確保し（実施例２）、臨床検体の採取及び貯蔵法を確立し（実施例３）、検体からのＤＮＡ分離法を確立し（実施例４）、細菌の標的遺伝子に対する単一ＰＣＲの条件を確立し（実施例５）、臨床検体で単一ＰＣＲ及びシーケンシングを行い、その結果をデータベース化し（実施例６と７）、１４種の菌と５種の抗生剤耐性遺伝子、そしてヒトベータグロブリン遺伝子に対する多重ＰＣＲの条件を確立し（実施例８）、人体検体で前記マルチプレックス分析を行うことにより、その分析方法の適正性を判断し（実施例９）、前記１４個の菌と５個の抗生剤耐性遺伝子、そしてヒトベータグロブリン遺伝子のハイブリダイゼーション分析のためのプローブのデザインとこれを用いたＤＮＡチップを製作し（実施例１０と１１）、標準物質を前記ＤＮＡチップを用いて分析した後、その分析条件を確立し（実施例１２）、前記ＤＮＡチップを用いて臨床検体を分析して、前記１４種の菌の感染有無の診断だけでなく、感染した菌の遺伝子型を判別して抗生剤耐性も把握できることを確認し（実施例１３）、本発明を完成することに至った。
【００６６】
本発明のＤＮＡチップによると、標的細菌の遺伝子別に５乃至７個のプローブが使用できるため、標的遺伝子別に１つのプローブを用いて検出する場合に伴われる假陰性と假陽性を避け、診断感度と特異度を極大化することができる。
【００６７】
本発明のＤＮＡチップによると、ヒトベータグロブリン、アクチン又はグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子を基準マーカーとして更に含むことができ、前記基準マーカーがベータグロブリンである場合には、好ましくは序列６６に示した塩基序列を有する。基準マーカーを用いることにより、ＤＮＡチップでのハイブリッド化反応、以前過程であるＤＮＡ分離過程及びＰＣＲ増幅過程が適していたかを検証し、假陰性を把握することができる。
【００６８】
本発明のＤＮＡチップによると、ベータラクタム系とテトラサイクリン系抗生剤耐性遺伝子を共に分析して、ＳＴＤの治療に最も広く用いられる抗生剤に対する耐性を予め正確に把握し、治療方針の決定と治癒に役立つことができる。前記ベータラクタム系とテトラサイクリン系抗生剤遺伝子のプローブは、好ましくは序列番号５６乃至６５の塩基序列を有する。
【００６９】
本発明のＤＮＡチップの製造方法は、ＳＴＤ原因菌の核酸と相補的に結合することができる塩基序列の５’末端にアミンが結合したＤＮＡプローブを製造する工程；製造されたＤＮＡプローブをアルデヒドが結合した固体の表面に結合する工程；及び前記ＤＮＡプローブが結合した固体表面に存在するアミンと結合しないアルデヒドを還元する工程を含む。前記固体の表面でのプローブＤＮＡとアルデヒドの結合は、アミンとアルデヒドのシッフ塩基反応を通して行われ、前記固体は、ガラス、シリコン二酸化物、プラスチック又はセラミックから選択され得る。
【００７０】
本発明のＤＮＡチップを含むキットは、序列番号１乃至序列番号３６の塩基序列からなる群から選択されたＳＴＤ原因菌の増幅用プライマーと標識手段を含み、ヒトベータグロブリンとプライマーを更に含む。
【００７１】
前記標識手段は、公知の様々な標識物を用いることができ、例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ３、バイオチン結合物質、ＥＤＡＮＳ（５−（２’−アミノエチル）アミノ−１−ナフタレン硫酸）、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＭＲＩＴＣ）、ｘ−ローダミン又はテキサスレッドを用いることができる。Ｃｙ５を用いて標識する場合、標識された反応物を検出する際、追加の反応なしで、直接に共焦点レーザースキャナーのような分析機を用いて蛍光信号を分析することができ、効率的で高感度な結果が得られる。
【発明の効果】
【００７２】
本発明に係るＤＮＡチップとキットを用いると、ＳＴＤの原因及び関連菌の中で、最も重要な１４種の菌である淋菌、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリチクム、マイコプラズマ・ジェニタリウム、マイコプラズマ・ホミニス、トレポネマ・パリダム、ヘモフィルス・デュクレイ、ヘルペスシンプレックスウイルス１型と２型、ＨＰＶ、トリコモナス・バギナリス、カンジダ・アルビカンス、ガードネレラ・バギナリス、大腸菌の感染有無と、テトラサイクリン系及びベータ−ラクタム系抗生剤に対する耐性を正確かつ速かに同時に検出することができる。更に、本発明によると、ＳＴＤ診断の感度や特異度、再現性が全て１００％に近い結果が出るほど優れており、複合感染も正確に診断することができ、検査の方法が簡便で、結果解釈も容易であり、短い時間内に多数の検体を速やかかつ正確に自動分析することができるという点で、既存の方法より優れており、経済的である。よって、本発明は、ＳＴＤの１次検出や確診と抗生剤の選択及び治療方針の決定、治療後の追跡調査などのために広く用いられ、既存の培養や染色、免疫学的検査、そしてＰＣＲ、ハイブリッド  キャプチャー分析法（ｈｙｂｒｉｄ  ｃａｐｔｕｒｅ  ａｓｓａｙ）などの商業化したＤＮＡチップ及びキットを代替することができるため、医学産業において非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１Ａは、本発明のＤＮＡチップの写真であって、１つのスライド上にＤＮＡプローブの集積部位（ｗｅｌｌ）が８個に区切られ、それぞれ相異なる検体を載せて同時に検査できるようにした。図１Ｂは、ＳＴＤ原因菌の１４種のゲノム遺伝子やプラスミド遺伝子の遺伝子型と抗生剤耐性遺伝子の遺伝子型を分析することができるＤＮＡプローブの集積順序及び位置を示す模式図である。図１Ｃは、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ヘルペスウイルス１型（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １）によって多重感染され、ペニシリン系抗生剤及びテトラサイクリン系などの抗生剤に対する耐性遺伝子を含むＳＴＤ多重感染検体の遺伝子型を本発明のＤＮＡチップで分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図２】図２は、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）のクリプティック・プラスミドｐＪＤ１に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を本発明のＤＮＡチップで分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図３】図３は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）のクリプティック・プラスミドｐＵＣＨ１に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を本発明のＤＮＡチップで分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図４】図４は、マイコプラズマ・ホミニス（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ（１６ｓ  ｒＲＮＡ）に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を本発明のＤＮＡチップで分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図５】図５は、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）の１６ＳリボソームＲＮＡ（１６ｓ  ｒＲＮＡ）に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を本発明のＤＮＡチップで分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図６】図６は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）の１８ＳリボソームＲＮＡ（１８ｓ  ｒＲＮＡ）に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を本発明のＤＮＡチップで分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図７】図７は、ウレアプラズマ・ウレアリチクム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）のＵｒｅＢ遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を本発明のＤＮＡチップで分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図８】図８は、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）のｒｅｐｅａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔ遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を本発明のＤＮＡチップで分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図９】図９は、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の１６Ｓ−２３ＳリボソームＲＮＡ（１６ｓ−２３ｓ  ｒＲＮＡ）遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を本発明のＤＮＡチップで分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図１０】図１０は、ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）１型のｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−２（ＵＳ４）遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を本発明のＤＮＡチップで分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図１１】図１１は、ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）２型のｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−２（ＵＳ４）遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を本発明のＤＮＡチップで分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図１２】図１２は、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）の１６ＳリボソームＲＮＡ（１６ｓ  ｒＲＮＡ）に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を本発明のＤＮＡチップで分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図１３】図１３は、トレポネマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）の４７ＫＤａ  ａｎｔｉｇｅｎ遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を本発明のＤＮＡチップで分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図１４】図１４は、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）のＬ１遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を本発明のＤＮＡチップで分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図１５】図１５は、大腸菌（ｃｏｌｉｆｏｒｍ  ｂａｃｔｅｒｉａ）の１６ＳリボソームＲＮＡ（１６ｓ  ｒＲＮＡ）に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を本発明のＤＮＡチップで分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図１６】図１６は、β−ラクタム系（ペニシリン系）抗生剤耐性のＳＨＶ遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を本発明のＤＮＡチップで分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図１７】図１７は、β−ラクタム系（ペニシリン系）抗生剤耐性のＴＥＭ遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を本発明のＤＮＡチップで分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図１８】図１８は、テトラサイクリン系抗生剤耐性のＴｅｔＭ遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を本発明のＤＮＡチップで分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図１９】図１９は、β−ラクタム系（ペニシリン系）抗生剤耐性のＡｍｐＣ遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を本発明のＤＮＡチップで分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図２０】図２０は、テトラサイクリン系抗生剤耐性のＴｅｔＣ遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を本発明のＤＮＡチップで分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図２１】図２１は、８種のＳＴＤ原因菌を単一又は多重ＰＣＲし、その産物を電気泳動したものであって、ｌａｎｅ１乃至９は、それぞれ１００ｂｐサイズマーカー、ガードネレラ・バギナリス、ウレアプラズマ・ウレアリチクム、マイコプラズマ・ホミニス、クラミジア・トラコマチス、淋菌、トリコモナス・バギナリス、マイコプラズマ・ジェニタリウム、カンジダ・アルビカンス遺伝子に対する単一ＰＣＲ産物であり、ｌａｎｅ１０は、前記８種のＳＴＤ原因菌遺伝子を多重ＰＣＲした産物を示す。
【図２２】図２２は、６種のＳＴＤ原因菌を単一又は多重ＰＣＲし、その産物を電気泳動したものであって、ｌａｎｅ１乃至７は、それぞれ１００ｂｐサイズマーカー、大腸菌、ヘルペスシンプレックスウイルス１型、ヘルペスシンプレックスウイルス２型、ヘモフィルス・デュクレイ、トレポネマ・パリダム、ヒト乳頭腫ウイルス遺伝子に対する単一ＰＣＲ産物であり、ｌａｎｅ８は、前記６種のＳＴＤ原因菌遺伝子を多重ＰＣＲした産物を示す。
【図２３】図２３は、５種の抗生剤耐性遺伝子を単一又は多重ＰＣＲし、その産物を電気泳動したものであって、ｌａｎｅ１乃至６は、それぞれ１００ｂｐサイズマーカー、ＳＨＶ遺伝子、ＴＥＭ遺伝子、ＴｅｔＭ遺伝子、ＡｍｐＣ遺伝子、ＴｅｔＣ遺伝子に対する単一ＰＣＲ産物であり、ｌａｎｅ７は、前記５種の抗生剤耐性遺伝子を多重ＰＣＲした結果である。
【図２４】図２４は、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）のｐｌａｓｍｉｄ  ｐＪＤ１遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を自動塩基序列分析機で分析した結果を示すエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【図２５】図２５は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）のクリプティック・プラスミドＤＮＡに対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を自動塩基序列分析機で分析した結果を示すエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【図２６】図２６は、マイコプラズマ・ホミニス（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を自動塩基序列分析機で分析した結果を示すエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【図２７】図２７は、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を自動塩基序列分析機で分析した結果を示すエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【図２８】図２８は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）の１８ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を自動塩基序列分析機で分析した結果を示すエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【図２９】図２９は、ウレアプラズマ・ウレアリチクム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）のＵｒｅＢ遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を自動塩基序列分析機で分析した結果を示すエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【図３０】図３０は、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）のｒｅｐｅａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔ遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を自動塩基序列分析機で分析した結果を示すエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【図３１】図３１は、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の１６ｓ−２３ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を自動塩基序列分析機で分析した結果を示すエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【図３２】図３２は、ヘルペスシンプレックスウイルス１型のｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−２（ＵＳ４）遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を自動塩基序列分析機で分析した結果を示すエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【図３３】図３３は、ヘルペスシンプレックスウイルス２型のｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−２（ＵＳ４）遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を自動塩基序列分析機で分析した結果を示すエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【図３４】図３４は、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を自動塩基序列分析機で分析した結果を示すエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【図３５】図３５は、トレポネマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）の４７ＫＤａ  ａｎｔｉｇｅｎ遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を自動塩基序列分析機で分析した結果を示すエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【図３６】図３６は、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）のＬ１遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を自動塩基序列分析機で分析した結果を示すエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【図３７】図３７は、β−ラクタム系抗生剤耐性のＳＨＶ遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を自動塩基序列分析機で分析した結果を示すエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【図３８】図３８は、β−ラクタム系抗生剤耐性のＴＥＭ遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を自動塩基序列分析機で分析した結果を示すエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【図３９】図３９は、テトラサイクリン系抗生剤耐性のＴｅｔＭ遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を自動塩基序列分析機で分析した結果を示すエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【図４０】図４０は、β−ラクタム系抗生剤耐性のＡｍｐＣ遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を自動塩基序列分析機で分析した結果を示すエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【図４１】図４１は、テトラサイクリン系抗生剤耐性のＴｅｔＣ遺伝子に対して特異的に結合するプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した後、その産物を自動塩基序列分析機で分析した結果を示すエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【図４２】図４２は、淋菌、クラミジア・トラコマチス、マイコプラズマ・ジェニタリウム及びガードネレラ・バギナリスに複合感染された検体に対して多重ＰＣＲを行った後、その産物を本発明のＤＮＡチップで遺伝子型を分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図４３】図４３は、ヘルペスシンプレックスウイルス２型及びトレポネマ・パリダムに複合感染された検体に対して多重ＰＣＲを行った後、その産物を本発明のＤＮＡチップで遺伝子型を分析した蛍光スキャナーイメージである。
【図４４】図４４は、テトラサイクリン系及びベータ−ラクタム系抗生剤に複合耐性を有している検体であって、ＴＥＭ、ＴｅｔＭ、ＡｍｐＣ遺伝子を内包している検体に対して多重ＰＣＲを行った後、その産物を本発明のＤＮＡチップで遺伝子型を分析した蛍光スキャナーイメージである。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。しかし、下記実施例は、本発明の構成及び効果を立証するための実施例に過ぎず、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
【００７５】
実施例１：ＰＣＲプライマーの考案
核酸増幅、特に、ＰＣＲ増幅での成功は、プライマーが自身のターゲット序列のみにアニーリングする特異性に依存するため、プライマーがこれの完全な相補体のみにアニーリングするか、又は１つ以上のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）ヌクレオチド序列を有する序列にもアニーリングするか否かは、アニーリング温度によって決定される。
【００７６】
一般に、アニーリング温度が高いと、完全なマッチ（ｍａｔｃｈ）鋳型に対するプライマーの特定アニーリングの可能性が更に高くなり、これによってターゲット序列のみが増幅される可能性が更に高くなる。アニーリング温度が低いと、鋳型とプライマーとの間のより多いミスマッチに対して耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）が発生し、結局、非ターゲット序列に対する増幅が増加する。アニーリング温度を調節すると、鋳型とプライマーとの間のペアリング特異性を変化させることができる。例えば、１つのプライマーのみに存在する対照群で生成物が発生すると、このような結果は、前記単一プライマーが鋳型の１つ以上の部位にアニーリングするということを意味する。このような場合、アニーリング温度を上昇することが好ましい。プライマーのアニーリング特異性に対するアニーリング温度の前記効果を考慮すると、アニーリング温度によってプライマーアニーリングを調節することができ、プライマーデザインに関係なく、プライマーのアニーリング特異性を改善することができるアニーリング調節プライマーシステムが強く求められていることが分かる。
【００７７】
よって、検査しようとする１４個の原因菌の遺伝子及び抗生剤耐性遺伝子別に検査する遺伝子部位を決定し、これをＰＣＲで増幅するために必要なオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを考案した。その方法は、次の通りであり、それぞれのプライマーの特性は、下記表２に纏めた。
【００７８】
【表２】
2012509686.tif 000004
【００７９】
検査する遺伝子部位は、細菌の系統（ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ）の把握に最も広く用いられる１６Ｓ  ｒＲＮＡや２３Ｓ  ｒＲＮＡ、又は両者の中間及び境界部位で一次的に選択した（Ｏｌｓｅｎ  ＧＪ等  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ：ａ  ｋｅｙ  ｔｏ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ．  ＦＡＳＥＢ  １９９３；７：１１３−１２３；Ｌａｎｅ  ＤＪＢ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １９８５；９２：６９５５−９）。
【００８０】
この際、ＰＣＲ増幅部位の基準として、５’末端には、あらゆる細菌及び同一属の細菌に同一の塩基序列の、いわゆる保存的部位（ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）を置いて、標的細菌の種（ｇｅｎｕｓ）に特有な塩基序列を基本とした。もし、１６Ｓ  ｒＲＮＡや２３Ｓ  ｒＲＮＡ、１６Ｓ−２３Ｓの間の部位に適切な塩基序列がない場合は、その他の部位で標的細菌に特有な固有の遺伝子と固有の塩基序列を選択して分析することができる。例えば、淋菌の場合、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅとＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡの類似性は９８％以上で、臨床検体で１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に特異なプライマーを用いてＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのみを検出するＰＣＲ反応を行うことはかなり難しいことである。実際に、本発明者らがＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの感染が疑われる多くの臨床検体を対象としてＰＣＲ反応を行ってＤＮＡ塩基序列を分析した結果、全検体の約８％はＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅでなくＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌が検出された。よって、本発明では、偽陽性を検出する可能性があるＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの１６Ｓ  ｒＲＮＡに特異的に反応するプライマーの代わりに、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのクリプティック・プラスミド（ｃｒｙｐｔｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄ）  ｐＪＤ１に特異的に反応するプライマーを用いた。
【００８１】
Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍとＵｒｅａｐｌａｓｍａ  ｐａｒｖｕｍの１６Ｓ  ｒＲＮＡは、９９％以上の相同性を示す。淋菌の場合のように、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍの１６Ｓ  ｒＲＮＡに特異的に反応するプライマーを用いた場合、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍをＵｒｅａｐｌａｓｍａ  ｐａｒｖｕｍと区分して、選択的に検出することは難しいため、本発明では、２つの菌種間の区分が可能なＵｒｅＢ遺伝子に特異的に反応するプライマーを用いた。
【００８２】
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓは、同じ属のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｍｕｒｉｄａｒｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｕｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｃａｖｉａｅの１６Ｓ  ｒＲＮＡとそれぞれ９８％、９７％そして９５％の相同性を示す。Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを特異的に検出するために、本発明では、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのクリプティック・プラスミドであるｐＵＣＨ１に特異的に反応するプライマーを製作した。
【００８３】
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓとＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの１６Ｓ  ｒＲＮＡ相同性は、同じＭｙｃｏｐｌａｓｍａ属の中でも多少低い７５％レベルであるが、保存部位に特異的に反応するプライマーを用いた場合、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓとＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍは区別検出が可能であるが、他のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ属とＵｒｅａｐｌａｓｍａ属を検出する恐れがあるため、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓとＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの菌種をより正確に検出するために、１６Ｓ  ｒＲＮＡの保存部位でなく非保存部位で各菌種に特異的に反応するプライマーを用いた。
【００８４】
実施例２：対照群菌株と検体及びそのクローンの確保
検査しようとする１４個の原因菌及び抗生剤耐性遺伝子別に標準的な陽性対照群の菌株及びＤＮＡをアメリカのＡＴＣＣ社（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１０８、ＵＳＡ．）から購入し、これと共に既に各細菌の感染が確認された検体及び抗生剤耐性遺伝子を内在した抗生剤耐性検体を得た。これらからＤＮＡを分離した後、それぞれ原因菌別に検査しようとする標的遺伝子部位をＰＣＲで増幅した後、クローニングとシーケンシング反応で確認して、それぞれに対するプラスミドクローンを確保した。
【００８５】
クローニング実験方法は、次の通り、公知の方法を用いており、ＰＣＲの方法は、以後の実施例と重複されるため、ここでは記述を省略する。
【００８６】
１）ＰＣＲで増幅した１４個のＳＴＤ原因菌の各遺伝子とヒトベータグロブリン遺伝子のＰＣＲ産物をアガロースゲルでＧｅｌ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）を用いて分離した後、その濃度を分光光度計やアガロースゲルの密度測定分析（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）で測定した。
【００８７】
２）冷凍保管していたｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ１３６０、ＵＳＡ）と２ｘ  Ｒａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを溶かして、指先でチューブを軽く振って混ぜた後、軽く遠心分離をして、クローニングしようとする挿入ＤＮＡと共に下記表３の組成でライゲーション反応(ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ)を０．５ｍｌチューブで実施した。
【００８８】
【表３】
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【００８９】
３）各反応液をピペットでよく混ぜた後、室温で約１時間ライゲーション反応をする。多数の形質転換産物（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ）が必要な場合は、４℃で一夜間反応することもできる。
【００９０】
４）ライゲーションされたサンプルは、零下７０℃に保管したＪＭ１０９宿主細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）（＝１ｘ１０８ｃｆｕ／μｇ  ＤＮＡ）５０μｌを用いて、形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を試みた。
【００９１】
５）先ず、１．５ｍｌチューブに、前記から得たライゲーション反応産物（ｌｉｇａｔｅ）２μｌを入れ、直前に解凍した宿主細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）５０μｌを更に入れてよく混ぜた後、氷槽（ｉｃｅ  ｂａｔｈ）で２０分間反応をさせた。
【００９２】
６）細胞を４２℃の恒温水槽に入れ、４５−５０秒間の熱衝撃（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）を与え、直ちに、再び氷の中に入れて２分間放置した。
【００９３】
７）ここに、室温に合わせたＳＯＣ培地９５０μｌを入れ、３７℃の振とう器（ｓｈａｋｉｎｇ  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）内で約１時間半の培養をした。
【００９４】
８）培養液の約１００μｌをアンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−Ｇａｌが含まれたＬＢプレートに塗布した後、プレートをひっくり返して３７℃に合わせた培養器内で１６−２４時間培養をした後、コロニー数を測定（ｃｏｌｏｎｙ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ）し、白色のコロニー（ｗｈｉｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ）のみを選択して３ｍｌ  ＬＢ／アンピシリン培養液で培養した後、ＤＮＡミニプレップ法（ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ．）でプラスミドＤＮＡを分離精製した。以後、ＰＣＲ及び制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ）切断反応を用いて、挿入ＤＮＡが正しく入ったかを確認し、このようにして得られたクローンの塩基序列を自動塩基序列分析機を用いて分析した。
【００９５】
陽性対照群の菌株と確保したプラスミドクローンの特徴は、下記表４に纏めた。
【００９６】
【表４】
2012509686.tif 000006
【００９７】
実施例３：臨床検体の採取
人体で、尿道や子宮頸部、口腔の分泌物（ｄｉｓｃｈａｒｇｅ）及び細胞を綿棒や細胞ブラシで採取して得たスワブ検体、尿、尿道洗浄液、前立腺液などの様々な検体を採取した後、運搬して、検査する時まで貯蔵する適正な方法を確立した。ここで、男性尿の採取は、伝統的な３杯試験（３−ｇｌａｓｓ  ｔｅｓｔ）により、ＶＢ（ｖｏｉｄｅｄ  ｂｌａｄｄｅｒ）１とＶＢ２、ＶＢ３及び前立腺分泌液（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ、ＥＰＳ）に分けて採取した。ＶＢ１は、排尿の際、最初に出る１０−２０ｍｌの尿、すなわち初尿（ｅａｒｌｙ  ｓｔｒｅａｍ  ｕｒｉｎｅ）を示す。ＶＢ２は、排尿の中間に出る中間尿（ｍｉｄ−ｓｔｒｅａｍ  ｕｒｉｎｅ）を示す。前立腺分泌液は、前立腺マッサージをした後に尿道から出る分泌液を示す。ＶＢ３は、前立腺マッサージをした後に排尿させ、一番初めに出る尿の１０−２０ｍｌを示す。ここで、ＶＢ１は尿道の検体、ＶＢ２は膀胱の検体、ＶＢ３は前立腺の検体を代替する。
【００９８】
検体採取方法とこれに用いられる道具、そして検体の運搬及び保管方法は、次の通りである。本ＳＴＤ検査において、標準検体は、男性の場合、尿道スワブ検体と初尿（ＶＢ１）検体とし、必要に応じて尿道分泌物や前立腺マッサージ後の尿（ＶＢ３）を追加した。これに対し、女性の場合は、子宮頸部のスワブ乃至スクレイプ（ｓｃｒａｐｅ）検体を標準検体とし、これに、必要に応じて膣（ｖａｇｉｎａ）のスワブや分泌物、尿を追加した。これに、同性愛者や売春婦の場合は、追加で直腸及び肛門と口腔からも検体を得ることができる。
【００９９】
男性において尿道のスワブ検体を得る際は、先端に綿やブラシが付いている滅菌した綿棒を尿道口の２−３ｃｍ内側に挿入し、左右に回し、尿道内の分泌物及び細胞が十分集積（ｃｏｌｌｅｃｔ）されるようにして採取した。更に、女性において子宮頸部のスワブ検体を得る際は、先端にブラシが付いている滅菌した綿棒を子宮頸部の内部に挿入し、左右に回し、分泌物及び細胞が十分集積されるようにして採取した。ここで、スワブ採取用道具としては、ＣＯＰＡＮ社（ＣＯＰＡＮ  ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）の綿棒やサンア・メディカル（ソウル、大韓民国）のＰａｐ−ｂｒｕｓｈ、又はこれに準ずる製品を用いる。以後、滅菌した検体保管溶液が入っている、ネジ蓋（ｓｃｒｅｗ  ｃａｐ）があるチューブ内に綿棒の綿部分やブラシの部分を入れて移動及び保管した。
【０１００】
尿やスワブ検体などの採取した検体は、なるべく採取後４８時間以内に分析室に運搬されるべきであり、運送中にはなるべく冷蔵温度を維持しなければならない。このようにしなければ、遺伝子増幅が難しい細菌の分離が容易でなく、成長が早い細菌の場合、過成長を抑制することができないためである。
【０１０１】
検体採取容器内には、滅菌状態の検体保管溶液を予め満たしておく。その組成は、３７％乃至４０％ホルムアルデヒド１００ｍｌにメタノール１５ｍｌ、６．５ｇのＮａ２ＨＰＯ４、４．０ｇのＮａＨ２ＰＯ４を混合した後、３次滅菌蒸溜水を添加して、最終容積１リットルとした。
【０１０２】
尿検体の場合、滅菌したノコギリ型蓋がある容積３０ｍｌのチューブに、前記の方法の通り採取した新鮮な尿１０ｍｌ乃至２０ｍｌを入れて移動して４℃に保管しておいてから検査する。又は、遠心分離して、細胞沈殿層を得て−７０℃に保管しておいてから、ＤＮＡを分離するようにした。
【０１０３】
実施例４：ＤＮＡ分離
前記実施例３の様々な人体検体から商業化したキットを用いて、次のようにＤＮＡを分離及び精製した。
【０１０４】
＜尿検体＞
５０ｍｌコニカルチューブに尿を入れ、３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離をした後、上澄液を捨て、ペレットに２００乃至５００μｌのＰＢＳで溶かした後、１．５ｍｌ微細遠心分離機で２分間遠心分離して、次の過程を進行した。
【０１０５】
＜膣スワブ、尿道バルボタージュ（ｂａｒｂｏｔａｇｅ）、尿道スワブ、前立腺分泌液、尿道分泌物又は精液検体＞
１．５ｍｌチューブに採取したサンプル０．８ｍｌを移し、微細遠心分離機に入れ、１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、細胞を沈める。上澄液を除去し、５００μｌ  １ｘ  ＰＢＳを添加した。Ｖｏｒｔｅｘを用いて細胞を溶液とよく混ぜる。１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上澄液を除去した。２００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＴＬを添加した。２０μｌのＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｋを添加した後、ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）を用いてよく混合した。恒温槽５６℃で３０分間静置反応した。反応が終わったチューブは、８，０００ｒｐｍ以上で約１０秒ｓｐｉｎ  ｄｏｗｎして、蓋に付いている溶液を集める。４００μｌ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＴＢを添加して、よく混合する。８，０００ｒｐｍ以上で約１０秒スピンダウン（ｓｐｉｎ  ｄｏｗｎ）して、蓋に付いている溶液を集める。スピンカラムをコレクションチューブに装着した後、前記の反応液をスピンカラムに入れる。８，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。カラムを通過したろ液は捨て、再び、コレクションチューブを装着した。７００μｌのバッファーＢＷを添加し、８，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。カラムを通過したろ液は捨て、再びコレクションチューブを装着した。５００μｌのバッファーＮＷを添加し、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。カラムを通過したろ液は捨て、新しい1．５ｍｌチューブを装着した。２００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＡＥや精製水をカラムの中央に添加し、２分間室温で放置した。８，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。抽出したゲノムＤＮＡは、直ちにＰＣＲに用いるか、又は長期間の保存時には−２０℃で保管することができる。抽出したゲノムＤＮＡは、０．８％アガロースゲルに電気泳動して、ＵＶ下で確認可能である。ＤＮＡ濃度を２０ｎｇ／μｌ程度で得た場合、その中で３μｌをＰＣＲ反応に用い、３％アガロースゲル上でＤＮＡバンドが見えない場合は６μｌを用いた。
【０１０６】
実施例５：単一ＰＣＲの条件確立のためＰＣＲ
滅菌した３次蒸溜水、実施例３の検体保管溶液、そして感染の症候のない正常成人男性の新鮮な尿（ＶＢ１）に、実施例２で確保した各細菌別に検査する標的遺伝子のプラスミドクローンを１０個、１００個、１，０００個、１０，０００個ずつという多様な数のコピー（ｃｏｐｙ）で混合して人工検体を作った後、それぞれの菌別に標的遺伝子に対して単一（ｓｉｎｇｌｅ）ＰＣＲを複数回繰り返して行い、単一ＰＣＲの適正条件を確立した。ＰＣＲの際には必ず内部参照遺伝子であるヒトベータグロブリン遺伝子のＰＣＲも共に行った。併せて、後の多重ＰＣＲを考慮して、各ＰＣＲ産物のサイズが互いに明確に異なるように考案し、これに対し、アニーリング温度は互いに大差がないように考慮した。
【０１０７】
本発明で考案したプライマーを用いる場合、検体溶液１ｍｌ当たり１０個乃至１００個以上のコピー（ｃｏｐｙ）数のプラスミドクローンが含まれていると、常に検出が可能である。ＰＣＲをした後、その産物を３％アガロースゲルで電気泳動をして確認した結果を、図１乃至図５に例示した。
【０１０８】
本発明のＰＣＲ法において、反応液の組成と条件を下記表５に纏めた。
【０１０９】
【表５】
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【０１１０】
実施例６：臨床検体に対する単一ＰＣＲ
ＳＴＤの罹患が疑われ、韓国内の病院の泌尿器科及び産婦人科外来に来院した５４１人の成人男女患者と、性感炎の症候のない成人男女１０３人で、実施例３の方法により、初尿（ＶＢ１）や尿道、子宮頸部のスワブなどから得た様々な検体を採取し、実施例４の方法で、ＤＮＡを分離し、実施例５の方法により、単一ＰＣＲを行った。
【０１１１】
実施例７：臨床検体のＰＣＲ産物のシーケンシング
前記実施例６のＰＣＲ産物は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を用いてシーケンシング反応を行った後、ＡＢＩ  ３１３０ｘｌ自動塩基序列分析機（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＵＳＡ）で塩基序列を分析した。これは次の順序からなる。
【０１１２】
（１）各検体から得たＰＣＲ産物をシーケンシング反応の鋳型として用いるために、最も適した濃度に合わせる。例えば、１００−２００ｂｐの長さであれば、１−３ｎｇ／μｌが必要で、２００−５００ｂｐの長さであれば、３−１０ｎｇ／μｌほどが必要である。
【０１１３】
（２）厚さが薄い（ｔｈｉｎ  ｗａｌｌ）微細遠心分離機チューブに、各ＰＣＲ産物１μｌとプライマー２ｐｍｏｌ、Ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｒｅａｄｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘ  ８μｌを入れ、最終１０μｌになるように、滅菌蒸溜水を入れて、軽くよく混合する。
【０１１４】
（３）前記（２）の混合物を９６℃で１０秒、５０℃で５秒、更に６０℃で４分間ずつ、総２５周期、ジーンアンプ２７００（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を用いて、サイクルシーケンシング（ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）反応を行う。
【０１１５】
（４）  １．５ｍｌマイクロチューブにＰＰＴ溶液（Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ＥｔＯＨ  ２５０ｍｌ、３Ｍ  ＮａＯＡｃ  １０ｍｌ、ＤＷ  ５０ｍｌ）６２μｌを分注しておいて、ここに得られたＰＣＲ反応物を入れ、ボルテックスでよく混ぜた後、−２０℃で１５分間放置した後、１４℃の１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、蛍光標識したＤＮＡのみを沈殿させる。上澄液を注意して除去した後、洗浄液（７０％  ＥｔＯＨ）１７０μｌを添加して、再度遠心分離をし、上澄液を除去、塩を除去した後、６０℃のヒートブロック（Ｈｅａｔ  ｂｌｏｃｋ）を用いて、約３分間乾かす。
【０１１６】
（５）前記（４）で得られたＤＮＡにＨｉ−Ｄｉ  １０．１μｌを添加して、ボルテックスで３０乃至６０秒間混ぜる。このうち１０μｌを新しい０．２ｍｌストリップ（ｓｔｒｉｐ）  ＰＣＲチューブに入れ、９５℃で２分、４℃で３分くらい反応を行って準備する。
【０１１７】
（６）ＡＢＩ  ３１３０ｘｌ序列分析機（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用いてキャスティングしたプレートの各ウェルに前記（５）の変成ＤＮＡ検体を入れ、２−４時間電気泳動を行った後、塩基序列を分析する。
【０１１８】
本シーケンシング分析により、ＳＴＤの１４個の原因菌及び抗生剤耐性遺伝子の検出のための単一ＰＣＲの適正性の有無を確認し、これらの検査結果から、韓国人においてＳＴＤの１４個の原因菌の分子力学と遺伝子型に対するデータベースを確立した。このようにして、ＰＣＲとシーケンシングでＳＴＤ感染の有無と原因菌が確認された検体は、以後多重ＰＣＲとＤＮＡチップの価値分析に用いた。
【０１１９】
実施例８：多重ＰＣＲの条件確立
滅菌した３次蒸溜水、実施例３の検体保管溶液、そしてＳＴＤの症候のない正常成人男性の新鮮な尿に実施例２で確保した各細菌別の特異遺伝子のプラスミドクローンを１種類から４種類まで１０個、１００個、１，０００個、１０，０００個の様々なコピー数で混合して人工検体を作った後、これに１４種の菌及び抗生剤耐性遺伝子別の標的遺伝子のプライマーを共に１つのチューブ内に入れて一気にＰＣＲを行う多重ＰＣＲを行った。
【０１２０】
多重ＰＣＲにおいて、反応液の組成と反応条件は下記表６、７、８及び９に纏めた。本多重ＰＣＲ後のその産物は、１．５乃至２．０％アガロースゲルで電機泳動して確認した（図２１乃至２３）。ＰＣＲ産物の電気泳動イメージを見ると、先ず、図２１はＳｅｔ  Ａ（８Ｐｌｅｘ）であって、順にガードネレラ・バギナリスのＰＣＲ産物が４１９ｂｐ、ウレアプラズマ・ウレアリチクムのＰＣＲ産物が３７３ｂｐ、マイコプラズマ・ホミニスのＰＣＲ産物が３３３ｂｐ、クラミジア・トラコマチスのＰＣＲ産物が３２１ｂｐ、淋菌のＰＣＲ産物が２８４ｂｐ、トリコモナス・バギナリスのＰＣＲ産物が２６２ｂｐ、マイコプラズマ・ジェニタリウムのＰＣＲ産物が２０７ｂｐ、カンジダ・アルビカンスのＰＣＲ産物が１４８ｂｐであることが分かる。更に、図２２はＳｅｔ  Ｂ（５Ｐｌｅｘ）であって、大腸菌１６ｓ  ＲＮＡのＰＣＲ産物が４６７ｂｐ、ヘモフィルス・デュクレイのＰＣＲ産物が４３９ｂｐ、ヘルペスシンプレックスウイルスのＰＣＲ産物が３５０ｂｐ、トレポネマ・パリダムのＰＣＲ産物が２６０ｂｐ、ヒト乳頭腫ウイルスのＰＣＲ産物が１９１ｂｐであることが分かる。本発明によると、１４個の原因菌遺伝子のＤＮＡが様々に混合されたあらゆる場合に、一度の多重ＰＣＲで正確に検出が可能であった。更に、図２３はＳｅｔ  Ｃ（５Ｐｌｅｘ）であって、ＳＨＶ増幅用プライマーセットのＰＣＲ産物が６７９ｂｐ、ＴＥＭ増幅用プライマーセットのＰＣＲ産物が４１２ｂｐ、ＴｅｔＭ増幅用プライマーセットのＰＣＲ産物が２９１ｂｐ、ＡｍｐＣ増幅用プライマーセットのＰＣＲ産物が２０８ｂｐ、ＴｅｔＣ増幅用プライマーセットのＰＣＲ産物が１５２ｂｐであることが分かる。本発明によると、抗生剤耐性遺伝子のＤＮＡが様々に混合されたあらゆる場合に、一度の多重ＰＣＲで正確に検出が可能であった。この際、検体１ｍｌ当たり１０個乃至１００個のコピーの相異なる細菌遺伝子のプラスミドクローンが含まれていると、常に識別が可能であった。
【０１２１】
【表６】
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【０１２２】
【表７】
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【０１２３】
【表８】
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【０１２４】
【表９】
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【０１２５】
実施例９：臨床検体に対する多重ＰＣＲ
前記実施例７で単一ＰＣＲ及びシーケンシング分析でＳＴＤ感染の有無と原因菌が予め確認されている検体ＤＮＡを対象として、前記実施例８で確立した方法の通り多重ＰＣＲを行った。
【０１２６】
検査対象に含めたＤＮＡ検体としては、単一ＰＣＲ法とシーケンシング法において既に検査して確認された、淋菌感染検体５０例、クラミジア感染検体５０例、ウレアプラズマ感染検体５０例、マイコプラズマ感染検体５０例、マイコプラズマ・ホミニス感染検体５０例、カンジダ・アルビカンス感染検体５０例、梅毒感染検体５０例、ヘモフィルス・デュクレイ感染検体１例、トリコモナス・バギナリス感染検体５０例、ガードネレラ・バギナリス感染検体５０例、ヘルペスウイルス感染検体５０例、ヒト乳頭腫ウイルス感染検体５０例、ＳＴＤ原因菌の感染のない検体５０例と、細菌性前立腺炎と確認されたが１４種類のＳＴＤ原因菌には陰性を示した検体５０例を偽陽性（ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を証明するために含めた。感染検体２００例の中には、複合感染検体も４０例含めた。更に、本多重ＰＣＲの検査結果を本発明のチップだけでなくシーケンシングのそれと比較分析し、ＳＴＤ原因菌診断の感度と特異度を調べた。これにより、本発明の多重ＰＣＲとチップが臨床でＳＴＤの原因菌を選別し、１次検出することに使用できるかを分析した。この際、得られた臨床検体を本発明のチップを用いて遺伝子型の分析（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）した結果の例を、図４２乃至４４に示した。よって、単一ＰＣＲ後のシーケンシング分析の結果を基準とすると、多重ＰＣＲの感度は９４乃至１００％、平均９８．３％であり、特異度は９６％と示された。なお、複合感染の診断感度が９７．５％と単一感染より低く示された。
【０１２７】
ＳＴＤの１４個の原因菌に対する多重ＰＣＲ及びシーケンシング分析結果を下記表１０に示した。
【０１２８】
【表１０】
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【０１２９】
また、下記表１１は、大韓民国の疾病管理本部で、２００１年と２００７年に報告したＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｄｈとＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの発病率の傾向を示したものであって、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｄｈは減少傾向だが、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓはかなり高い（特に、女性の場合が感染率が高い）割合で増加することを確認することができる。これはまたアメリカでも同一である。
【０１３０】
【表１１】
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【０１３１】
実施例１０：ハイブリダイゼーション分析のためのプローブのデザイン
ＳＴＤの１４個の原因菌の遺伝子と対照遺伝子のＰＣＲ産物を１つのチップ上でハイブリダイゼーション反応で同時に分析するためのＤＮＡチップを製作するために、先ず適正な塩基序列のオリゴヌクレオチドプローブの組合せを考案した。これは、本ＤＮＡチップ開発の最も根幹となる過程であって、ＤＮＡチップ上に載せるオリゴヌクレオチドプローブを考案及び製作する過程である。
【０１３２】
アメリカのＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の遺伝子銀行のデータベースと前記実施例７で得た韓国人から発見されたＳＴＤの１４種類の原因菌の遺伝子とヒトベータグロブリン遺伝子のデータベースを分析し、それぞれの遺伝子型の塩基序列を確保した。確保したＤＮＡ序列をコンピュータプログラムＤＮＡＳＴＡＲ（ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ  ５、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）を活用して、ＣｌｕｓｔａｌＷ法で双整列（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）及び多重序列整列（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を実行した後、分類系統図（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒｅｅ）を作成し、各グループ別類型特異的塩基序列を選別した後、更にコンピュータプログラムプライマープレミア５（ｐｒｉｍｅｒ  ｐｒｅｍｉｅｒ  ５、ＰＲＥＭＩＥＲ  Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏ．）を活用して、類型特異的プローブを設計した。この際、プローブの長さは、２０±２ｂｐ及び１８±２ｂｐのオリゴヌクレオチドで設定し、全３０類型の遺伝子型特異的なプローブ（ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｂｅ）を設計した。この際、ヒトベータグロブリン遺伝子のプローブは序列番号６６の塩基序列を有し、本発明においてチップのコーナーマーカーとして用いるためであり、序列番号６６の逆方向シーケンスの５’末端にＣｙ５物質を付けて製作した序列番号６７のオリゴヌクレオチドを用いて検出することができる。これらのプローブの名称と序列番号及び遺伝子型を下記表１２に纏めた。
【０１３３】
【表１２】
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【０１３４】
実施例１１：ＤＮＡチップの製作
実施例１０で考案されたオリゴヌクレオチドプローブを適正の試薬と混合した後、アレイヤー（ａｒｒａｙｅｒ）を用いて、顕微鏡用のガラススライド上に集積して、ＳＴＤ原因菌の遺伝子型を診断する、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、又はオリゴＤＮＡチップを下記順序及び方法で製作した。併せて、１つのチップ上に８個のグリッド（ｇｒｉｄ）を置いてそれぞれのグリッドに相違する検体を載せて分析することにより、一気に８個の検体を分析することができる改良したチップも製作した（図１参照）。
【０１３５】
１．ＳＴＤ原因菌及び抗生剤耐性遺伝子に対するＤＮＡチップ上のプローブ集積順序
本発明では、チップ上でハイブリダイゼーション反応後のＳＴＤ原因菌の遺伝子型によって現れる蛍光信号（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｉｇｎａｌ）を見て該当菌を簡単に把握できるように、グループ化してグリッド（ｇｒｉｄ）を作成した。プローブの順序及びグリッドの配列模式図を図１に示した。図１Ａは、本発明の製品化されたＳＴＤ  ＤＮＡチップであって、１個のスライド上にＤＮＡプローブの集積部位（ｗｅｌｌ）が８個存在して、それぞれの相違する検体を載せて同時に検査できるようにした。図１Ｂは、ＳＴＤ原因菌１４種のゲノム遺伝子やプラスミド遺伝子の遺伝子型と抗生剤耐性遺伝子の遺伝子型を検出することができるＤＮＡプローブの集積順序及び位置を示したものである。図１Ｃは、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ヘルペスウイルスｔｙｐｅ  １（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １）によって多重感染され、ペニシリン系抗生剤及びテトラサイクリン系などの抗生剤に対する耐性遺伝子を含むＳＴＤ感染検体に対して遺伝子型を検出した例を示したものである。
【０１３６】
それぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、アレイヤーを用いてスポッティング（集積）した。この際、同一のプローブを二重（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）に集積して、それぞれの菌株の遺伝子型が最小２回、最大４回ずつ出るように考案した。
【０１３７】
本発明のＤＮＡチップの重要な変形の１つは、区画カバーを用いて、グリッドが１つのチップ上に８個の区画に分けられ、一様に存在するようにすることである。これにより、１つのチップ上に８個の相違する検体を検出することができ、これは時間と労力及びコストを節減することに非常に役立つ（図１）。
【０１３８】
２．オリゴヌクレオチドプローブをチップ上でスポッティングする溶液の製造とマスタープレート（ｍａｓｔｅｒ  ｐｌａｔｅ）への分注
実施例１０に従って考案して、Ｃ６部位にアミンを付けて合成したオリゴヌクレオチドプローブは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製した後、滅菌した３次蒸溜水に最終濃度が２００ｐＭになるように溶かした。このように準備されたプローブをスポッティング溶液であるマイクロスポッティング溶液プラス（ｍｉｃｒｏ  ｓｐｏｔｔｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐｌｕｓ（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ、ＴＣ−ＭＳＰ、ＵＳＡ））と４．３倍の割合で混ぜて、最終濃度が３８ｐＭになるようにした。例えば、２００ｐＭ濃度のプローブ７．６μｌとスポッティング溶液３２．４μｌを混合して４０μｌになるようにする。このように準備された混合物はそれぞれ順に９６ウェル（９６−ｗｅｌｌ）のマスタープレートに分注した。
【０１３９】
３．オリゴヌクレオチドプローブの固定化
アレイヤーを用いて、前記マスタープレートからプローブ含有スポッティング溶液を移して、特殊コーティングされたガラススライド上に二重（ｄｏｕｂｌｅ  ｈｉｔ）に集積した。１つのスポットには、平均約０．００５μｌのプローブ溶液が集積される。チップの原料となるガラススライドとしては、サイズが７．５ｘ２．５ｃｍであり、スーパーアルデヒド（ｓｕｐｅｒ  ａｌｄｅｈｙｄｅ）がコーティングされているＮｕｒｉｃｅｌｌアルデヒドガラススライド（Ｎｕｒｉｃｅｌｌ、Ｋｏｒｅａ）やこれに準ずる製品が適している。アレイヤーとしては、Ｑアレイヤー２（Ｇｅｎｅｔｉｘｓ、ＵＫ）やＭＧＩＩ（Ｂｉｏｒｏｂｏｔｉｃｓ  Ｉｎｃ、ＭＡ０１８０１、ＵＳＡ）、又はこれに準ずる装備が適している。
【０１４０】
前記の通り、ガラススライドにプローブを集積して製作したＤＮＡチップを、湿度８０％で維持されるガラスジャー（ｇｌａｓｓ  ｊａｒ）内に入れ、１５分間室温で反応させた。
【０１４１】
４．後処理過程
反応が終わった後、固定化されたスライドを乾燥器（ｄｒｙ  ｏｖｅｎ）に入れて、１２０℃で１時間３０分焼いた（ｂａｋｉｎｇ）後、スライドを０．２％ソディウムドデシルサルフェート（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ、ＳＤＳ）溶液で２分間２回洗浄して、３次蒸溜水に移して２分間２回洗浄した。以後、９５℃に加熱した３次蒸溜水に３分間漬けて、スライドに付いているオリゴヌクレオチドプローブを変成（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）させ、更に３次蒸溜水に移して１分間洗浄した。洗浄を終えたスライドは、還元溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１ｇ  ＮａＢＨ４、３００ｍｌ  ＰＢＳ、１００ｍｌ  ｅｔｈａｎｏｌ）で１５分間還元させ、０．２％  ＳＤＳ溶液で２分間２回洗浄した後、３次蒸溜水に移して２分間２回洗浄し、８００ｒｐｍで１分３０秒遠心分離機を用いてスライドの水気を除去した後、スライド箱（ｓｌｉｄｅ  ｂｏｘ）に入れ、デシケーターに入れて室温で保管する。
【０１４２】
以上の過程を経て製作された本発明のチップは、次の実施例１２に記述されたような方法を用いて状態を把握して品質を管理（ＱＣ）する。
【０１４３】
実施例１２：ＤＮＡチップ上でのハイブリダイゼーション反応及び結果分析
前記実施例８のように、各菌のプラスミドクローン及びヒトベータグロブリン遺伝子のプラスミドクローンを様々な組合と濃度で混合して人工検体を作って、多重ＰＣＲを行った後、その産物を前記実施例１１で製作されたＳＴＤ  ＤＮＡチップ上に載せて数回ハイブリダイゼーション反応を行った後、蛍光スキャナーで分析して、これの最適条件を確立した。その方法は次の通りであり、その実例を図４２乃至４４に示した。
【０１４４】
１．多重ＰＣＲ
多重ＰＣＲは前記実施例８と９の方法に従って行った。
【０１４５】
２．ハイブリダイゼーション反応
オリゴヌクレオチドプローブをスポッティングさせたスライドチップ上に、検体のＤＮＡを鋳物として、遺伝子のＰＣＲ増幅産物をそれぞれ１０μｌずつ混合して、最終容積が５０μｌになるようにし、これを９５℃で５分間変成させた後、直ちに氷に３分間放置した。以後、ハイブリダイゼーション反応溶液５０μｌを添加して、最終容積を１００μｌに調整した後、４５℃でスライドに固定されたプローブと３０分間反応させる。この際、ハイブリダイゼーション反応溶液は、２０Ｘ  ＳＳＣ  ２ｍｌ、９０％グリセロール１．７ｍｌ、５０ｍＭリン酸緩衝溶液６．３ｍｌを混合して、最終１０ｍｌに組成した。
【０１４６】
３．洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）
ハイブリダイゼーション反応終了後、ＤＮＡチップから区画カバー（ｗｅｌｌ  ｃｏｖｅｒ）を除去し、チップを３Ｘ  ＳＳＰＥ溶液（ＮａＣｌ（２６．２９５ｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４−１Ｈ２Ｏ（４．１４ｇ）、Ｎａ２ＥＤＴＡ（１．１１ｇ）を蒸溜水１リットルに溶かして、１０Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．４にする）に漬けた後、室温で２分間洗浄し、更に１Ｘ  ＳＳＰＥ（ＮａＣｌ（８．７６５ｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４−１Ｈ２Ｏ（１．３８ｇ）、Ｎａ２ＥＤＴＡ（０．３７ｇ）を蒸溜水１リットルに溶かして、１０Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．４にする）溶液で常温で２分間洗浄した後、常温で８００ｒｐｍで１分３０秒遠心分離して乾燥させた。
【０１４７】
４．スキャニング分析（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）
ハイブリダイゼーション後、洗浄で非特異的な信号は除去した後、乾燥されたスライドは、蛍光スキャナーを用いて、その蛍光信号とイメージを分析した。この際のスキャナーとしては、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｘｏｎ、ＵＳＡ）やＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｌｉｔｅ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）、又はこれに準ずる装備であれば充分である。
【０１４８】
実施例１３：本発明に係るＤＮＡチップの検証実験
前記実施例７でＰＣＲ後のシーケンシング反応でＳＴＤの有無と原因菌が確認されたことがあり、実施例９で多重ＰＣＲの正確度分析に用いられた様々な人体検体のＤＮＡを対象として、更に多重ＰＣＲを行った後、そのＰＣＲ産物を前記実施例１１と１２で製作されたＳＴＤ  ＤＮＡチップ上に載せて実施例１２に記述したような方法でハイブリダイゼーション反応を行った後、蛍光スキャナーで分析した。検査対象に含めたＤＮＡ検体としては、前記表１０に示したものと同様である。
【０１４９】
相違する検査者が時間間隔をおいて同じ検査を２回繰り返して行い、本ＤＮＡチップ分析の感度と特異度、再現性を調べた。これにより、本ＤＮＡチップが臨床でＳＴＤの１４種の原因菌を正確に診断することができるか、特に、複合感染も全部正確に診断することができるかを分析した。
【０１５０】
単一ＰＣＲ及びシーケンシング分析の結果と比較したＳＴＤ  ＤＮＡチップ分析の結果は、前記表１０に纏めた。
【０１５１】
単一ＰＣＲ後のシーケンシング分析の結果を基準とすると、ＤＮＡチップの感度は９８乃至１００％、平均９９％であり、特異度は１００％であった。再現性は９９％であった。以上の結果から、多重ＰＣＲと比較すると、ＤＮＡチップの特異度が更に優れており、複合感染の診断感度も更に優れていることが分かった。
【０１５２】
以上、本発明の実施例を部分的に記述したが、これはあくまでも例示に過ぎず、本発明の思想から逸脱しない範囲で様々な変形と変更が可能であるという事実は当業者には明らかである。また、そのような変形と変更が全部本発明の権利範囲に属することは、添付した請求の範囲でより明らかになる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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