(57)【要約】本技術は、部分的に、アジピン酸を産生するための生物学的方法およびそのような産生が可能な工学的に作り出された微生物に関する。ある実施形態では、方法は、脂肪アルコールオキシダーゼ活性（たとえば６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性）を追加するもしくは増加させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、宿主微生物に比べて検出可能なおよび／または増加した６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性またはオメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物であって、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、脂肪アルコールオキシダーゼ活性、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−Ｌ−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、およびアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性から成る群から選択される１つ以上の改変された活性を含む、工学的に作り出された微生物。
【請求項２】
前記６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、脂肪アルコールオキシダーゼ活性、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−Ｌ−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、および／またはアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子修飾を含む、請求項１に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項３】
前記アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を低下させる遺伝子修飾を含む、請求項１に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項４】
前記遺伝子修飾は、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、脂肪アルコールオキシダーゼ活性、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−Ｌ−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、またはアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピーの増加を含む、請求項２に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項５】
前記遺伝子修飾は、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、脂肪アルコールオキシダーゼ活性、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−Ｌ−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、またはアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連する異種のプロモーターおよび／または５’ＵＴＲを前記微生物のゲノムＤＮＡに挿入することを含む、請求項２に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項６】
改変されたチオエステラーゼ活性を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項７】
チオエステラーゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子改変を含む、請求項６に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項８】
チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、請求項７に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項９】
６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、または６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性およびオメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項１０】
前記異種のポリヌクレオチドは、細菌に由来する、請求項９に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項１１】
前記細菌は、アシネトバクター属細菌、ノカルジア属細菌、シュードモナス属細菌、またはザントバクター属細菌である、請求項１０に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項１２】
６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、または６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性およびオメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、請求項１または６に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項１３】
前記異種のポリヌクレオチドは、細菌に由来する、請求項１２に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項１４】
前記細菌は、アシネトバクター属細菌、ノカルジア属細菌、シュードモナス属細菌、またはザントバクター属細菌である、請求項１３に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項１５】
ヘキサノエートシンターゼサブユニットＡ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、請求項１または６に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項１６】
ヘキサノエートシンターゼサブユニットＢ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、請求項１または６に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項１７】
前記異種のポリヌクレオチドは、細菌から独立して選択される、請求項１５または１６に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項１８】
前記細菌は、バチルス属細菌である、請求項１７に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項１９】
前記バチルス属細菌は、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍである、請求項１８に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項２０】
モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、請求項１または６に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項２１】
前記異種のポリヌクレオチドは、真菌に由来する、請求項２０に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項２２】
前記真菌は、アスペルギルス属真菌である、請求項２１に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項２３】
前記アスペルギルス属真菌は、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓである、請求項２２に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項２４】
モノオキシゲナーゼ活性による一次のヘキサノエート使用をもたらす遺伝子修飾を含む、請求項１または２に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項２５】
前記遺伝子修飾は、ポリケチドシンターゼ活性を低下させる、請求項２４に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項２６】
真核生物である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項２７】
酵母である、請求項２６に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項２８】
前記酵母は、カンジダ属酵母である、請求項２７に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項２９】
前記カンジダ属酵母は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株である、請求項２８に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項３０】
真菌である、請求項２６に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項３１】
前記真菌は、ヤロウイア属真菌である、請求項３０に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項３２】
前記ヤロウイア属真菌は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである、請求項３１に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項３３】
前記真菌は、アスペルギルス属真菌である、請求項３０に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項３４】
前記アスペルギルス属真菌は、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ株またはＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ株である、請求項３３に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項３５】
６−ヒドロキシヘキサン酸変換を低下させる遺伝子修飾を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項３６】
前記遺伝子修飾は、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させる、請求項３５に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項３７】
ベータ酸化活性を低下させる遺伝子修飾を含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項３８】
前記遺伝子修飾は、ベータ酸化活性を検出不可能にする、請求項３７に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項３９】
前記遺伝子修飾は、ベータ酸化活性を部分的に低下させる、請求項３７に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項４０】
前記遺伝子修飾は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊することを含む、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項４１】
前記遺伝子修飾は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連するプロモーターを破壊することを含む、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項４２】
前記アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、ＰＯＸポリペプチドである、請求項４０または４１に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項４３】
前記ＰＯＸポリペプチドは、ＰＯＸ４ポリペプチド、ＰＯＸ５ポリペプチド、またはＰＯＸ４ポリペプチドおよびＰＯＸ５ポリペプチドである、請求項４２に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項４４】
供給材料と接触する、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項４５】
前記供給材料は、糖類を含む、請求項４４に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項４６】
前記糖類は、単糖、多糖、または単糖および多糖の混合物である、請求項４５に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項４７】
前記供給材料は、パラフィンを含む、請求項４４に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項４８】
前記パラフィンは、飽和パラフィン、不飽和パラフィン、置換パラフィン、分岐パラフィン、直鎖状パラフィン、またはその組合せである、請求項４７に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項４９】
前記パラフィンは、約１〜約６０個の炭素原子を含む、請求項４７または４８に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項５０】
前記パラフィンは、複数のパラフィンの混合物中にある、請求項４７〜４９に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項５１】
前記複数のパラフィンの混合物中の前記複数のパラフィンは、約８〜約１８の平均炭素原子数を有する、請求項５０に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項５２】
前記平均炭素原子数は、約１０〜約１６である、請求項５１に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項５３】
前記平均炭素原子数は、約１２である、請求項５２に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項５４】
前記パラフィンは、ろう中にある、請求項４７〜５３１のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項５５】
前記パラフィンは、オイル中にある、請求項４７〜５３のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項５６】
前記パラフィンは、石油生成物に由来する、請求項４７〜５５のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項５７】
前記石油生成物は、石油蒸留物である、請求項５６に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項５８】
前記パラフィンは、植物または植物生成物に由来する、請求項４７〜５５のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項５９】
改変されたモノオキシゲナーゼ活性を含み、アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物。
【請求項６０】
前記モノオキシゲナーゼ活性を改変する遺伝子修飾を含む、請求項５９に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項６１】
ＣＹＰ５２１５活性、ＣＹＰ５２１６活性、またはＣＹＰ５２１５活性およびＣＹＰ５２１６活性から成る群から選択されるモノオキシゲナーゼ活性を改変する遺伝子修飾を含む、請求項５９または６０に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項６２】
モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、請求項６０に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項６３】
前記異種のポリヌクレオチドは、真菌に由来する、請求項６２に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項６４】
前記真菌は、アスペルギルス属真菌である、請求項６３に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項６５】
前記アスペルギルス属真菌は、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓである、請求項６４に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項６６】
前記モノオキシゲナーゼ活性による実質的なヘキサノエート使用をもたらす遺伝子修飾を含む、請求項５９〜６５のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項６７】
前記遺伝子修飾は、ポリケチドシンターゼ活性を低下させる、請求項６６に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項６８】
改変されたヘキサノエートシンターゼ活性を含む、請求項５９〜６５のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項６９】
前記改変されたヘキサノエートシンターゼ活性は、改変されたヘキサノエートシンターゼサブユニットＡ活性、改変されたヘキサノエートシンターゼサブユニットＢ活性、または改変されたヘキサノエートシンターゼサブユニットＡ活性および改変されたヘキサノエートシンターゼサブユニットＢ活性である、請求項６８に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項７０】
ヘキサノエートシンターゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子改変を含む、請求項６９に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項７１】
ヘキサノエートシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、請求項６８、６９または７０のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項７２】
前記異種のポリヌクレオチドは、真菌に由来する、請求項７１に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項７３】
前記真菌は、アスペルギルス属真菌である、請求項７２に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項７４】
前記アスペルギルス属真菌は、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓである、請求項７２に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項７５】
改変されたチオエステラーゼ活性を含む、請求項５９〜７４のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項７６】
前記チオエステラーゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子修飾を含む、請求項７５に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項７７】
チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、請求項７５または７６に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項７８】
改変された６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、改変されたオメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、または改変された６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性および改変されたオメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を含む、請求項５９〜７７のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項７９】
前記６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる、前記オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる、または前記６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性および前記オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる遺伝子修飾を含む、請求項７８に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項８０】
６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチド、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチド、または６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドおよびオメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、請求項７８または７９に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項８１】
前記異種のポリヌクレオチドは、細菌に由来する、請求項８０に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項８２】
前記細菌は、アシネトバクター属細菌、ノカルジア属細菌、シュードモナス属細菌、またはザントバクター属細菌である、請求項８１に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項８３】
改変された６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、改変されたオメガヒドキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、または改変された６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性および改変されたオメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を含む、請求項５９〜８２のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項８４】
前記６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる、前記オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる、または前記６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性および前記オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる遺伝子修飾を含む、請求項８３に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項８５】
６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチド、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチド、または６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドおよびオメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、請求項８３または８４に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項８６】
前記異種のポリヌクレオチドは、細菌に由来する、請求項８５に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項８７】
前記細菌は、アシネトバクター属細菌、ノカルジア属細菌、シュードモナス属細菌、またはザントバクター属細菌である、請求項８６に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項８８】
真核生物である、請求項５９〜８７のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項８９】
酵母である、請求項８８に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項９０】
前記酵母は、カンジダ属酵母である、請求項８９に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項９１】
前記カンジダ属酵母は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓである、請求項９０に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項９２】
真菌である、請求項８８に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項９３】
前記真菌は、ヤロウイア属真菌である、請求項９２に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項９４】
前記ヤロウイア属真菌は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである、請求項９３に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項９５】
前記真菌は、アスペルギルス属である、請求項９２に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項９６】
前記アスペルギルス属真菌は、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓまたはＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓである、請求項９５に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項９７】
６−ヒドロキシヘキサン酸変換を低下させる遺伝子修飾を含む、請求項５９〜９６のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項９８】
前記遺伝子修飾は、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させる、請求項９７に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項９９】
ベータ酸化活性を低下させる遺伝子修飾を含む、請求項５９〜９８のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項１００】
前記遺伝子修飾は、ベータ酸化活性を検出不可能にする、請求項９９に記載の工学的に作り出された微生物。
【請求項１０１】
請求項１〜１００のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物を、培養された微生物がアジピン酸を産生する培養条件下で培養するステップを含む、アジピン酸を製造するための方法。
【請求項１０２】
前記工学的に作り出された微生物が産生される宿主微生物は、検出可能な量のアジピン酸を産生しない、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記培養条件は、発酵条件を含む、請求項１０１または１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記培養条件は、バイオマスの導入を含む、請求項１０１〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記培養条件は、グルコースの導入を含む、請求項１０１または１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記培養条件は、ヘキサンの導入を含む、請求項１０１または１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
前記アジピン酸は、追加されるグルコース１グラム当たり約０．３グラムを超える収量で産生される、請求項１０１〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記培養された微生物から前記アジピン酸を精製するステップを含む、請求項１０１〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記アジピン酸を修飾し、それによって、修飾されたアジピン酸を産生するステップを含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記培養された微生物、前記アジピン酸、または前記修飾されたアジピン酸を容器に配置するステップを含む、請求項１０１〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記容器を輸送するステップを含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
請求項３５、３６、９７または９８のいずれか一項に記載の工学的に作り出された微生物を、培養された微生物が６−ヒドロキシヘキサン酸を産生する培養条件下で培養するステップを含む、６−ヒドロキシヘキサン酸を製造するための方法。
【請求項１１３】
前記工学的に作り出された微生物が産生される宿主微生物は、検出可能な量の６−ヒドロキシヘキサン酸を産生しない、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記培養条件は、発酵条件を含む、請求項１１２または１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記培養条件は、バイオマスの導入を含む、請求項１１２〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記培養条件は、グルコースの導入を含む、請求項１１２または１１４に記載の方法。
【請求項１１７】
前記培養条件は、ヘキサンの導入を含む、請求項１１２または１１４に記載の方法。
【請求項１１８】
前記６−ヒドロキシヘキサン酸は、追加されるグルコース１グラム当たり約０．３グラムを超える収量で産生される、請求項１１２〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記培養された微生物から前記６−ヒドロキシヘキサン酸を精製するステップを含む、請求項１１２〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記６−ヒドロキシヘキサン酸を修飾し、それによって、修飾された６−ヒドロキシヘキサン酸を産生するステップを含む、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記培養された微生物、前記６−ヒドロキシヘキサン酸、または前記修飾された６−ヒドロキシヘキサン酸を容器に配置するステップを含む、請求項１１２〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記容器を輸送するステップを含む、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物を調製するための方法であって、
（ａ）モノオキシゲナーゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子修飾を宿主生物に導入し、それによって、検出可能なおよび／または増加したモノオキシゲナーゼ活性を有する工学的に作り出された微生物を産生するステップと、
（ｂ）アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物を選択するステップと
を含む方法。
【請求項１２４】
前記モノオキシゲナーゼ活性は、６炭素分子へのヒドロキシル部分の組込みである、請求項Ｅ１に記載の方法。
【請求項１２５】
前記６炭素分子は、ヘキサノエートである、請求項１２３または１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物を調製するための方法であって、
（ａ）宿主生物を栄養源であるヘキサンと共に培養し、それによって、検出可能なモノオキシゲナーゼ活性を有する工学的に作り出された微生物を産生するステップと、
（ｂ）アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物を選択するステップと
を含む方法。
【請求項１２７】
前記モノオキシゲナーゼ活性は、６炭素分子へのヒドロキシル部分の組込みである、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記６炭素分子は、ヘキサノエートである、請求項１２６または１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
検出可能な量の前記モノオキシゲナーゼ活性を有する、前記工学的に作り出された微生物を選択するステップを含む、請求項１２６〜１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
ヘキサノエートシンターゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、検出可能なおよび／または増加したヘキサノエートシンターゼ活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、請求項１２６〜１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記遺伝子修飾は、ヘキサノエートシンターゼサブユニットＡ活性、ヘキサノエートシンターゼサブユニットＢ活性、またはヘキサノエートシンターゼサブユニットＡ活性およびヘキサノエートシンターゼサブユニットＢ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる、または６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性およびオメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、宿主微生物に比べて検出可能なおよび／または増加した６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼおよび／またはオメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、請求項１２３〜１３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる、または６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性およびオメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、前記宿主微生物に比べて検出可能なおよび／または増加した６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性および／またはオメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、請求項１２３〜１３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
チオエステラーゼ活性を追加するもしくは増加させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、前記宿主微生物に比べて検出可能なおよび／または増加したチオエステラーゼ活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、請求項１２３〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
６−ヒドロキシヘキサン酸変換を低下させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、前記宿主微生物に比べて低下した６−ヒドロキシヘキサン酸変換を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、請求項１２３〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
ベータ酸化活性を低下させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、前記宿主微生物に比べて低下したベータ酸化活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、請求項１２３〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記モノオキシゲナーゼ活性による実質的なヘキサノエート使用をもたらす遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、前記宿主微生物と比較して、実質的なヘキサノエート使用が前記モノオキシゲナーゼ活性によるものである工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、請求項１２３〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
アジピン酸を産生する微生物を調製する方法であって、（ａ）６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性、およびモノオキシゲナーゼ活性から成る群から選択される１つ以上の活性を追加するまたは増加させる１つ以上の遺伝子修飾を宿主生物に導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、（ｂ）アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む方法。
【請求項１３９】
宿主微生物に比べて、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性、およびモノオキシゲナーゼ活性から成る群から選択される１つ以上の検出可能なおよび／または増加した活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップを含む、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
６−ヒドロキシヘキサン酸変換を低下させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、前記宿主微生物に比べて低下した６−ヒドロキシヘキサン酸変換を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、請求項１３８または１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
ベータ酸化活性を低下させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、前記宿主微生物に比べて低下したベータ酸化活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、請求項１３８〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記モノオキシゲナーゼ活性による実質的なヘキサノエート使用をもたらす遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、前記宿主微生物と比較して、実質的なヘキサノエート使用が前記モノオキシゲナーゼ活性によるものである工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、請求項１３８〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
６−ヒドロキシヘキサン酸を産生する微生物を調製するための方法であって、（ａ）６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性、およびモノオキシゲナーゼ活性から成る群から選択される１つ以上の活性を追加するまたは増加させる１つ以上の遺伝子修飾を宿主生物に導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、（ｂ）６−ヒドロキシヘキサン酸変換を低下させる遺伝子修飾を宿主生物に導入するステップと、（ｃ）６−ヒドロキシヘキサン酸を産生する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む方法。
【請求項１４４】
前記宿主微生物に比べて低下した６−ヒドロキシヘキサン酸変換を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップを含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記宿主微生物に比べて、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性、およびモノオキシゲナーゼ活性から成る群から選択される１つ以上の検出可能なおよび／または増加した活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップを含む、請求項１４３または１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
ベータ酸化活性を低下させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、前記宿主微生物に比べて低下したベータ酸化活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、請求項１４３〜１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４７】
前記モノオキシゲナーゼ活性による実質的なヘキサノエート使用をもたらす遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、前記宿主微生物と比較して、実質的なヘキサノエート使用が前記モノオキシゲナーゼ活性によるものである工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、請求項１４３〜１４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４８】
ａ．ベータ酸化活性をブロックする遺伝子改変、および
ｂ．モノオキシゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる遺伝子改変、またはヘキサノエートシンテターゼ活性を追加するもしくは増加させる遺伝子改変
を含む工学的に作り出された微生物を、１つ以上の多糖を含む供給材料と接触させるステップと、
アジピン酸が産生される条件下で、前記工学的に作り出された微生物を培養するステップと
を含む方法。
【請求項１４９】
前記工学的に作り出された微生物は、ヘキサノエートシンテターゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子改変を含む、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記工学的に作り出された微生物は、ヘキサノエートシンターゼサブユニットＡ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記工学的に作り出された微生物は、ヘキサノエートシンターゼサブユニットＢ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５２】
前記異種のポリヌクレオチドは、細菌から独立して選択される、請求項１５０または１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記細菌は、バチルス属細菌である、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記バチルス属細菌は、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍである、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記微生物は、カンジダ属酵母である、請求項１４９または１５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５６】
前記微生物は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株である、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
モノオキシゲナーゼ活性を増加させる前記遺伝子改変は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を増加させる遺伝子改変を含む、請求項１４８〜１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５８】
前記遺伝子改変は、前記シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させる、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記遺伝子改変は、前記シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連するプロモーターを配置する、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６０】
前記モノオキシゲナーゼ活性は、ＣＹＰ５２１５活性、ＣＹＰ５２１６活性、またはＣＹＰ５２１５活性およびＣＹＰ５２１６活性である、請求項１４８〜１５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記遺伝子改変は、前記モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させる、請求項１４８〜１６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６２】
前記遺伝子改変は、前記モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連するプロモーターを配置する、請求項１４８〜１６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６３】
ベータ酸化活性をブロックする前記遺伝子改変は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を破壊する、請求項１４８〜１６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６４】
前記遺伝子改変は、ＰＯＸ４活性およびＰＯＸ５活性を破壊する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記遺伝子改変は、前記アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、請求項１６３または１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記遺伝子改変は、前記アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連するプロモーターを破壊する、請求項１６３または１６４に記載の方法。
【請求項１６７】
前記供給材料は、６炭素糖を含む、請求項１４８〜１６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６８】
前記供給材料は、５炭素糖を含む、請求項１４８〜１６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６９】
前記アジピン酸は、約８０％以上の理論的収率のレベルで産生される、請求項１４８〜１６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７０】
産生されたアジピン酸の量を検出するステップを含む、請求項１４８〜１６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７１】
産生された前記アジピン酸を単離するステップを含む、請求項１４８〜１７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７２】
前記培養条件は、前記工学的に作り出された微生物を発酵させることを含む、請求項１４８〜１７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７３】
ベータ酸化活性を部分的にブロックする遺伝子改変を含む工学的に作り出された微生物を、１つ以上のパラフィンを含む供給材料と接触させるステップと
前記工学的に作り出された微生物をアジピン酸が産生される条件下で培養するステップと
を含む方法。
【請求項１７４】
前記微生物は、モノオキシゲナーゼ活性を増加させる遺伝子改変を含む、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
前記微生物は、カンジダ属酵母である、請求項１７３または１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
前記微生物は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株である、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
モノオキシゲナーゼ活性を増加させる前記遺伝子改変は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を増加させる遺伝子改変を含む、請求項１７３〜１７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７８】
前記遺伝子改変は、前記シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させる、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７９】
前記遺伝子改変は、前記シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連するプロモーターを配置する、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１８０】
前記モノオキシゲナーゼ活性は、ＣＹＰ５２１５活性、ＣＹＰ５２１６活性、またはＣＹＰ５２１５活性およびＣＹＰ５２１６活性である、請求項１７３〜１７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８１】
前記遺伝子改変は、前記モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させる、請求項１７３〜１８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８２】
前記遺伝子改変は、前記モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連するプロモーターを配置する、請求項１７３〜１８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８３】
ベータ酸化活性をブロックする前記遺伝子改変は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を破壊する、請求項１７３〜１８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８４】
前記遺伝子改変は、ＰＯＸ４活性またはＰＯＸ５活性を破壊する、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
前記遺伝子改変は、前記アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、請求項１８３または１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
前記遺伝子改変は、前記アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連するプロモーターを破壊する、請求項１８３または１８４に記載の方法。
【請求項１８７】
前記アジピン酸は、約８０％以上の理論的収率のレベルで産生される、請求項１７３〜１８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８８】
産生されたアジピン酸の量を検出するステップを含む、請求項１７３〜１８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８９】
産生された前記アジピン酸を単離するステップを含む、請求項１７３〜１８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９０】
前記培養条件は、前記工学的に作り出された微生物を発酵させることを含む、請求項１７３〜１８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９１】
前記パラフィンは、飽和パラフィン、不飽和パラフィン、置換パラフィン、分岐パラフィン、直鎖状パラフィン、またはその組合せである、請求項１７３〜１９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９２】
前記パラフィンは、約１〜約６０個の炭素原子を含む、請求項１７３〜１９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９３】
前記パラフィンは、複数のパラフィンの混合物中にある、請求項１７３〜１９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９４】
前記複数のパラフィンの混合物中の前記複数のパラフィンは、約８〜約１８の平均炭素原子数を有する、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９５】
前記平均炭素原子数は、約１０〜約１６である、請求項１９４に記載の方法。
【請求項１９６】
前記平均炭素原子数は、約１２である、請求項１９５に記載の方法。
【請求項１９７】
前記パラフィンは、ろう中にある、請求項１７３〜１９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９８】
前記パラフィンは、オイル中にある、請求項１７３〜１９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９９】
前記パラフィンは、石油生成物に由来する、請求項１７３〜１９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２００】
前記石油生成物は、石油蒸留物である、請求項１９９に記載の方法。
【請求項２０１】
前記パラフィンは、植物または植物生成物に由来する、請求項１７３〜２００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０２】
配列番号１のヌクレオチド配列と９６％以上同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
配列番号８のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および
配列番号１のヌクレオチド配列と９６％以上同一のヌクレオチド配列の一部を有し、脂肪アルコールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
から成る群から選択される単離ポリヌクレオチド。
【請求項２０３】
配列番号２のヌクレオチド配列と９８％以上同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
配列番号１０のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および
配列番号２のヌクレオチド配列と９８％以上同一のヌクレオチド配列の一部を有し、脂肪アルコールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
から成る群から選択される単離ポリヌクレオチド。
【請求項２０４】
配列番号３のヌクレオチド配列と９５％以上同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
配列番号９のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および
配列番号３のヌクレオチド配列と９５％以上同一のヌクレオチド配列の一部を有し、脂肪アルコールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
から成る群から選択される単離ポリヌクレオチド。
【請求項２０５】
配列番号４のヌクレオチド配列と８３％以上同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
配列番号１１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および
配列番号４のヌクレオチド配列と８３％以上同一のヌクレオチド配列の一部を有し、脂肪アルコールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
から成る群から選択される単離ポリヌクレオチド。
【請求項２０６】
配列番号５のヌクレオチド配列と８２％以上同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
配列番号１２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および
配列番号５のヌクレオチド配列と８２％以上同一のヌクレオチド配列の一部を有し、脂肪アルコールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
から成る群から選択される単離ポリヌクレオチド。
【請求項２０７】
請求項２０２〜２０６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２０８】
請求項２０２〜２０６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む組込み型ベクター。
【請求項２０９】
請求項２０７に記載の発現ベクターまたは請求項２０８に記載の組込み型ベクターを含む微生物。
【請求項２１０】
請求項２０９に記載の微生物を含む培養物。
【請求項２１１】
請求項２１０に記載の微生物を含む発酵デバイス。
【請求項２１２】
請求項２０２〜２０６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、または請求項Ｊ４に記載の発現ベクターもしくは請求項２０９に記載の微生物によって産生されるポリペプチド。
【請求項２１３】
請求項２１２に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願
本願は、発明者がＳｔｅｐｈｅｎ  Ｐｉｃａｔａｇｇｉｏであり、代理人整理番号がＶＲＤ−１００１−ＰＶであり、「ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＰＲＥＰＡＲＩＮＧ  ＡＤＩＰＩＣ  ＡＣＩＤ」と題された、２００９年７月２日に出願された米国仮特許出願第６１／２２２，９０２号の利益を主張する。この特許出願の全体の内容は、限定なく、すべての文章、表、および図面について、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
分野
本技術は、部分的に、アジピン酸を産生するための生物学的方法およびそのような産生が可能な工学的に作り出された微生物に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
微生物は、それら自体の代謝および成長を持続させるために、様々な、酵素により駆動される生物学的経路を利用する。細胞は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）から、酵素を含む天然のタンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで合成する。ＤＮＡは、最初に、そのタンパク質をコードするリボヌクレオチド配列を含む相補的なリボ核酸（ＲＮＡ）に転写される。次いで、ＲＮＡは、リボソームなどの様々な細胞の構成要素との相互作用によって、コードタンパク質の翻訳を指示する。結果として生じる酵素は、生物による分子の産生に関与する経路において生物学的触媒として参加する。
【０００４】
これらの経路は、天然に産生される産物の収集に活用することができる。経路はまた、産生を増加させるまたは商業的に価値があるかもしれない種々の産物を産生するために改変することができる。組換え分子生物学の手法における進歩は、研究者らが、ある生物からＤＮＡを単離し、他の生物にそれを挿入し、したがって、酵素または他のタンパク質の細胞合成を改変することを可能にする。そのような遺伝子操作は、宿主生物内の生物学的経路を変化させ、それに所望の産物を産生させることができる。微生物による工業生産は、腐食性の化学物質の使用および毒性副産物の産生を最小限にし、したがって、ある種の化合物に「低公害の」供給源を提供することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
アジピン酸などの６炭素有機分子を産生する、工学的に作り出された微生物、そのような微生物を生産するための方法、ならびにアジピン酸および他の６炭素有機分子を産生するためにそれらを使用するための方法が本明細書において提供される。
【０００６】
したがって、いくつかの実施形態では、アジピン酸を産生することができるまたはアジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物が本明細書において提供され、微生物は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性（たとえば６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性）、脂肪アルコールオキシダーゼ活性（たとえば６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性）、ヘキサノエートシンターゼ活性、およびモノオキシゲナーゼ活性から成る群から選択される、１つ以上の改変された活性を含む。ある実施形態では、微生物は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性（たとえば６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性）、脂肪アルコールオキシダーゼ活性（たとえば６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性）、ヘキサノエートシンターゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、脂肪アルコールオキシダーゼ活性、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、および／またはアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物もまた、提供され、微生物は、改変されたモノオキシゲナーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を低下させる遺伝子修飾を含む、工学的に作り出された微生物もまた本明細書において提供される。
【０００７】
いくつかの実施形態では、工学的に作り出された微生物は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性（たとえば６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性）、脂肪アルコールオキシダーゼ活性（たとえば６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性）、ヘキサノエートシンターゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、脂肪アルコールオキシダーゼ活性、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、および／またはアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの複数のコピーを含む遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、特定のポリヌクレオチドの２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のコピーが、微生物体中に存在する。ある実施形態では、工学的に作り出された微生物は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性（たとえば６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性）、脂肪アルコールオキシダーゼ活性（たとえば６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性）、ヘキサノエートシンターゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、脂肪アルコールオキシダーゼ活性、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、および／またはアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に関連する異種のプロモーター（および／または５’ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、酵母（たとえばカンジダ属酵母株（たとえばＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株））に由来するＰＯＸ４プロモーターもしくはＰＯＸ５プロモーターまたはモノオキシゲナーゼプロモーターまたは他のプロモーターである。利用することができるプロモーターの例は、本明細書において記載される。プロモーターは、時に、微生物体に関して外因性または内因性である。
【０００８】
アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物もまた、本明細書において提供され、微生物は、改変されたモノオキシゲナーゼ活性を含む。ある実施形態では、工学的に作り出された微生物は、モノオキシゲナーゼ活性を改変する遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、工学的に作り出された微生物は、ＣＹＰ５２Ａ１５活性、ＣＹＰ５２Ａ１６活性、またはＣＹＰ５２Ａ１５活性およびＣＹＰ５２Ａ１６活性から成る群から選択されるモノオキシゲナーゼ活性を改変する遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、モノオキシゲナーゼ活性は、ＣＹＰ５２Ａ１５ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１６ポリヌクレオチド、またはＣＹＰ５２Ａ１５ポリヌクレオチドおよびＣＹＰ５２Ａ１６ポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、モノオキシゲナーゼ活性を増加させる。ある実施形態では、遺伝子修飾は、モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性のポリヌクレオチドのコピー数を増加させる（たとえば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の、ポリヌクレオチドのコピー）。ある実施形態では、工学的に作り出された微生物は、プロモーター（たとえばプロモーターおよび／または５’ＵＴＲ）を含み、かつモノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。プロモーターは、微生物体に関して外因性または内因性であってもよい。ある実施形態における工学的に作り出された微生物は、モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む。関連する実施形態では、異種のポリヌクレオチドは、ある実施形態では、カンジダ属酵母などの酵母に由来する（たとえばＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）。
【０００９】
ある実施形態では、工学的に作り出された微生物は、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性を改変する遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性のポリヌクレオチドのコピー数を増加させる（たとえば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の、ポリヌクレオチドのコピー）。ある実施形態における工学的に作り出された微生物は、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連する異種のプロモーター（たとえば微生物体に関して内因性または外因性のプロモーター）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、酵母に由来し、ある実施形態では、酵母は、カンジダ属酵母（たとえばＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）である。
【００１０】
いくつかの実施形態における工学的に作り出された微生物は、改変されたチオエステラーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、工学的に作り出された微生物は、チオエステラーゼ活性を改変する遺伝子修飾を含み、ある実施形態では、工学的に作り出された微生物は、チオエステラーゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、工学的に作り出された微生物は、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態における工学的に作り出された微生物は、改変された脂肪アルコールオキシダーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、工学的に作り出された微生物は、脂肪アルコールオキシダーゼ活性を改変する遺伝子修飾を含み、ある実施形態では、工学的に作り出された微生物は、脂肪アルコールオキシダーゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、脂肪アルコールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性のポリヌクレオチドのコピー数を増加させる（たとえば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の、ポリヌクレオチドのコピー）。ある実施形態における工学的に作り出された微生物は、脂肪アルコールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連する異種のプロモーター（たとえば微生物体に関して内因性または外因性のプロモーター）を含む。いくつかの実施形態では、工学的に作り出された微生物は、脂肪アルコールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、酵母に由来し、ある実施形態では、酵母は、カンジダ属酵母（たとえばＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株）である。
【００１２】
いくつかの実施形態における工学的に作り出された微生物は、改変された６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性または改変されたオメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、工学的に作り出された微生物は、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性またはオメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子修飾を含み、ある実施形態では、工学的に作り出された微生物は、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性またはオメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む。関連する実施形態では、異種のポリヌクレオチドは、時に、いくつかの実施形態におけるアシネトバクター属、ノカルジア属、シュードモナス属、またはザントバクター属の細菌などの細菌に由来する。
【００１３】
いくつかの実施形態における工学的に作り出された微生物は、改変された６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性または改変されたオメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、工学的に作り出された微生物は、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性またはオメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子修飾を含み、ある実施形態では、工学的に作り出された微生物は、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性またはオメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む。関連する実施形態では、異種のポリヌクレオチドは、いくつかの実施形態におけるアシネトバクター属、ノカルジア属、シュードモナス属、またはザントバクター属の細菌などの細菌に由来する。
【００１４】
いくつかの実施形態における工学的に作り出された微生物は、改変されたヘキサノエートシンターゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、工学的に作り出された微生物は、ヘキサノエートシンターゼ活性を改変する遺伝子修飾を含む。ある実施形態では、工学的に作り出された微生物は、ヘキサノエートシンターゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、工学的に作り出された微生物は、ヘキサノエートシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、ヘキサノエートシンターゼ活性は、ヘキサノエートシンターゼ活性を有するポリペプチドによって提供される。ある実施形態では、ヘキサノエートシンターゼ活性は、ヘキサノエートシンターゼサブユニットＡ活性、ヘキサノエートシンターゼサブユニットＢ活性、またはヘキサノエートシンターゼサブユニットＡ活性およびヘキサノエートシンターゼサブユニットＢ活性を有するポリペプチドによって提供される。いくつかの実施形態では、異種のポリヌクレオチドは、ある実施形態におけるアスペルギルス属の真菌などの真菌に由来する（たとえばＡ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）。
【００１５】
ある実施形態では、工学的に作り出された微生物は、モノオキシゲナーゼ活性による実質的な（たとえば一次の（ｐｒｉｍａｒｙ））ヘキサノエート使用をもたらす遺伝子修飾を含む。関連する実施形態では、遺伝子修飾は、ポリケチドシンターゼ活性を低下させる。
【００１６】
いくつかの実施形態における工学的に作り出された微生物は、非原核生物であり、時に真核生物である。真核生物は、たとえば、カンジダ属酵母（たとえばＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）などの、いくつかの実施形態における酵母とすることができる。ある実施形態では、真核生物は、たとえば、ヤロウイア属の真菌（たとえばＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）またはアスペルギルス属の真菌（たとえばＡ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓもしくはＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）などの真菌である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、工学的に作り出された微生物は、６−ヒドロキシヘキサン酸変換を低下させる遺伝子修飾を含む。関連する実施形態では、遺伝子修飾は、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性またはオメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させる。
【００１８】
ある実施形態では、工学的に作り出された微生物は、ベータ酸化活性を低下させる遺伝子修飾を含み、いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ベータ酸化活性を検出不可能にする（たとえば、完全にブロックされたベータ酸化活性）。ある実施形態では、遺伝子修飾は、ベータ酸化活性を部分的に低下させる。いくつかの実施形態では、工学的に作り出された微生物は、オメガ酸化活性を増加させる遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態では、工学的に作り出された微生物は、ベータ酸化経路、オメガ酸化経路、またはベータ酸化経路およびオメガ酸化経路における逆性の活性を改変する、１つ以上の遺伝子修飾を含み、それによって、１つ以上の逆性の酵素活性における低下により、それぞれの経路を通しての炭素フラックスを増加させる。
【００１９】
脂肪酸−ＣｏＡ誘導体またはジカルボン酸−ＣｏＡ誘導体は、多くの生物において、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ（たとえばアシル−ＣｏＡオキシドレダクターゼおよび脂肪酸アシル−コエンザイムＡオキシダーゼとしても公知またはそれとも呼ばれる）の活性によって、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ誘導体に変換することができる。いくつかの実施形態では、工学的に作り出された微生物は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性の特異性を改変するおよび／またはその活性を低下させる遺伝子修飾を含む。ある実施形態では、遺伝子修飾は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を破壊する。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊することを含む。ある実施形態では、遺伝子修飾は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連するプロモーターおよび／または５’ＵＴＲを破壊することを含む。いくつかの実施形態では、アシル−ＣｏＡ活性を有するポリペプチドは、ＰＯＸポリペプチドである。ある実施形態では、ＰＯＸポリペプチドは、ＰＯＸ４ポリペプチド、ＰＯＸ５ポリペプチド、またはＰＯＸ４ポリペプチドおよびＰＯＸ５ポリペプチドである。ある実施形態では、遺伝子修飾は、ＰＯＸ４ヌクレオチド配列、ＰＯＸ５ヌクレオチド配列、またはＰＯＸ４およびＰＯＸ５ヌクレオチド配列を破壊することによってアシル−ＣｏＡ活性を破壊する。
【００２０】
工学的に作り出された微生物は、上記に記載される活性を提供するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含むことができ、異種のポリヌクレオチドは、任意の適した微生物に由来するものとすることができる。微生物の例が、本明細書において記載され（たとえば、カンジダ属酵母、サッカロミセス属酵母、ヤロウイア属酵母、シュードモナス属細菌、バチルス属細菌、クロストリジウム属細菌、ユーバクテリウム属細菌、および他、メガスフェラ属細菌を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、アジピン酸を製造するための方法であって、本明細書において記載される工学的に作り出された微生物を、培養された微生物がアジピン酸を産生する培養条件下で培養するステップを含む方法もまた、提供される。いくつかの実施形態では、工学的に作り出された微生物が生成される宿主微生物は、検出可能な量のアジピン酸を産生しない。ある実施形態では、培養条件は、発酵条件、バイオマスの導入、グルコースの導入、パラフィン（たとえばヘキサンもしくはヤシ油などの、たとえば植物もしくは石油ベースのもの）の導入、および／またはその組合せを含む。いくつかの実施形態では、アジピン酸は、追加されるグルコース１グラム当たり約０．３グラムを超える収量で産生される。関連する実施形態では、方法は、培養された微生物からアジピン酸を精製するおよび／またはアジピン酸を修飾するステップを含み、それによって、修飾されたアジピン酸を産生する。ある実施形態では、方法は、培養された微生物、アジピン酸、または修飾されたアジピン酸を容器に配置するステップと、任意選択で、容器を輸送するステップとを含む。
【００２２】
ある実施形態では、６−ヒドロキシヘキサン酸を製造するための方法であって、本明細書において記載される工学的に作り出された微生物を、培養された微生物が６−ヒドロキシヘキサン酸を産生する培養条件下で培養するステップを含む方法もまた、提供される。いくつかの実施形態では、工学的に作り出された微生物が生成される宿主微生物は、検出可能な量の６−ヒドロキシヘキサン酸を産生しない。ある実施形態では、培養条件は、発酵条件、バイオマスの導入、グルコースの導入、および／またはヘキサンの導入を含む。いくつかの実施形態では、６−ヒドロキシヘキサン酸は、追加されるグルコース１グラム当たり約０．３グラムを超える収量で産生される。関連する実施形態では、方法は、培養された微生物から６−ヒドロキシヘキサン酸を精製するおよび／または６−ヒドロキシヘキサン酸を修飾するステップを含み、それによって、修飾された６−ヒドロキシヘキサン酸を産生する。ある実施形態では、方法は、培養された微生物、６−ヒドロキシヘキサン酸、または修飾された６−ヒドロキシヘキサン酸を容器中に配置するステップと、任意選択で、容器を輸送するステップとを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、アジピン酸を産生する、工学的に作り出された微生物を調製するための方法であって、（ａ）モノオキシゲナーゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子修飾を宿主生物に導入し、それによって、検出可能なおよび／または増加したモノオキシゲナーゼ活性を有する工学的に作り出された微生物を産生するステップと、（ｂ）アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む方法もまた、提供される。いくつかの実施形態では、アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物を調製するための方法であって、（ａ）宿主生物を栄養源であるヘキサンと共に培養し、それによって、検出可能なモノオキシゲナーゼ活性を有する工学的に作り出された微生物を産生するステップと、（ｂ）アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む方法もまた、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、モノオキシゲナーゼ活性は、６炭素分子へのヒドロキシル部分の組込みであり、ある実施形態では、６炭素分子は、ヘキサノエートである。関連する実施形態では、方法は、検出可能な量のモノオキシゲナーゼ活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ヘキサノエートシンターゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、検出可能なおよび／または増加したヘキサノエートシンターゼ活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む。関連する実施形態では、遺伝子修飾は、ヘキサノエートシンターゼサブユニットＡ活性、ヘキサノエートシンターゼサブユニットＢ活性、またはヘキサノエートシンターゼサブユニットＡ活性およびヘキサノエートシンターゼサブユニットＢ活性を有するポリペプチドをコードする。
【００２４】
いくつかの実施形態では、方法は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性（たとえば６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ）を追加するまたは増加させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、宿主微生物に比べて検出可能なおよび／または増加した６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性またはオメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼを有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む。ある実施形態では、アジピン酸を産生する微生物を調製するための方法は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性（たとえば６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ）、脂肪アルコールオキシダーゼ活性（たとえば６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ）、ヘキサノエートシンターゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、脂肪アルコールオキシダーゼ活性、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、および／またはアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性から成る群から選択される１つ以上の検出可能なおよび／または増加した活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップを含む。
【００２５】
ある実施形態では、方法は、脂肪アルコールオキシダーゼ活性（たとえば６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性）を追加するもしくは増加させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、宿主微生物に比べて検出可能なおよび／または増加した６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性またはオメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む。いくつかの実施形態では、方法は、チオエステラーゼ活性を追加するもしくは増加させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、宿主微生物に比べて検出可能なおよび／または増加したチオエステラーゼ活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む。
【００２６】
ある実施形態では、方法は、６−ヒドロキシヘキサン酸変換を低下させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、宿主微生物に比べて低下した６−ヒドロキシヘキサン酸変換を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ベータ酸化活性を低下させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、宿主微生物に比べて低下したベータ酸化活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む。ある実施形態では、方法は、モノオキシゲナーゼ活性による実質的なヘキサノエート使用をもたらす遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、宿主微生物と比較して、実質的なヘキサノエート使用がモノオキシゲナーゼ活性によるものである工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む。いくつかの実施形態では、方法は、オメガ酸化活性を増加させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、宿主微生物に比べて増加したオメガ酸化活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む。
【００２７】
ある実施形態では、アジピン酸を産生する微生物を調製するための方法であって、（ａ）６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、脂肪アルコールオキシダーゼ活性、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、および／またはアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性から成る群から選択される１つ以上の活性を追加するまたは増加させる１つ以上の遺伝子修飾を宿主生物に導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、（ｂ）アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む方法がまた、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、方法は、宿主微生物に比べて、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、脂肪アルコールオキシダーゼ活性、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、および／またはアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性から成る群から選択される１つ以上の検出可能なおよび／または増加した活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップを含む。
【００２８】
ある実施形態では、方法は、６−ヒドロキシヘキサン酸変換を低下させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、宿主微生物に比べて低下した６−ヒドロキシヘキサン酸変換を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ベータ酸化活性を低下させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、宿主微生物に比べて低下したベータ酸化活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む。ある実施形態では、方法は、モノオキシゲナーゼ活性による実質的なヘキサノエート使用をもたらす遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、宿主微生物と比較して、実質的なヘキサノエート使用がモノオキシゲナーゼ活性によるものである工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、６−ヒドロキシヘキサン酸を産生する微生物を調製するための方法であって、（ａ）６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、脂肪アルコールオキシダーゼ活性、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、および／またはアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性から成る群から選択される１つ以上の活性を追加するまたは増加させる１つ以上の遺伝子修飾を宿主生物に導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、（ｂ）６−ヒドロキシヘキサン酸変換を低下させる遺伝子修飾を宿主生物に導入するステップと、（ｃ）６−ヒドロキシヘキサン酸を産生する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む方法もまた、提供される。ある実施形態では、方法は、宿主微生物に比べて低下した６−ヒドロキシヘキサン酸変換を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、宿主微生物に比べて、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性（たとえば、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性）、脂肪アルコールオキシダーゼ活性（たとえば、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性）、ヘキサノエートシンターゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、脂肪アルコールオキシダーゼ活性、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、および／またはアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性から成る群から選択される１つ以上の検出可能なおよび／または増加した活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップを含む。ある実施形態では、方法は、ベータ酸化活性を低下させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、宿主微生物に比べて低下したベータ酸化活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む。いくつかの実施形態では、方法は、モノオキシゲナーゼ活性による実質的なヘキサノエート使用をもたらす遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、宿主微生物と比較して、実質的なヘキサノエート使用がモノオキシゲナーゼ活性によるものである工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む。
【００３０】
（ａ）ベータ酸化活性をブロックする遺伝子改変および（ｂ）モノオキシゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる遺伝子改変またはヘキサノエートシンテターゼ活性を追加するもしくは増加させる遺伝子改変を含む工学的に作り出された微生物を、１つ以上の多糖を含む供給材料と接触させるステップと、アジピン酸が産生される条件下で、工学的に作り出された微生物を培養するステップとを含む方法もまた、提供される。いくつかの実施形態では、工学的に作り出された微生物は、ヘキサノエートシンテターゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子改変を含む。ある実施形態では、工学的に作り出された微生物は、ヘキサノエートシンターゼサブユニットＡ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含み、いくつかの実施形態では、工学的に作り出された微生物は、ヘキサノエートシンターゼサブユニットＢ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、異種のポリヌクレオチドは、真菌から独立して選択される。いくつかの実施形態では、真菌は、アスペルギルス属真菌であり、ある実施形態では、アスペルギルス属真菌は、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓである。いくつかの実施形態では、微生物は、カンジダ属酵母であり、ある実施形態では、微生物は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株である。
【００３１】
ベータ酸化活性を部分的にブロックする遺伝子改変を含む工学的に作り出された微生物を、１つ以上のパラフィンを含む供給材料と接触させるステップと、アジピン酸が産生される条件下で、工学的に作り出された微生物を培養するステップとを含む方法もまた提供される。ある実施形態では、微生物は、モノオキシゲナーゼ活性を増加させる遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、微生物は、カンジダ属酵母であり、ある実施形態では、微生物は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、モノオキシゲナーゼ活性を増加させる遺伝子改変は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を増加させる遺伝子改変を含む。ある実施形態では、遺伝子改変は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連するプロモーターおよび／または５’ＵＴＲを配置する。ある実施形態では、モノオキシゲナーゼ活性は、ＣＹＰ５２Ａ１５活性、ＣＹＰ５２Ａ１６活性、またはＣＹＰ５２Ａ１５活性およびＣＹＰ５２Ａ１６活性である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させる。ある実施形態では、遺伝子改変は、モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連するプロモーターおよび／または５’ＵＴＲを配置する。
【００３３】
ある実施形態では、ベータ酸化活性をブロックする遺伝子改変は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を破壊する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、ＰＯＸ４活性および／またはＰＯＸ５活性を破壊する。ある実施形態では、遺伝子改変は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連するプロモーターおよび／または５’ＵＴＲを破壊する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、供給材料は、６炭素糖を含む。ある実施形態では、供給材料は、５炭素糖を含む。ある実施形態では、アジピン酸は、約８０％以上の理論的収率のレベルで産生される。いくつかの実施形態では、産生されたアジピン酸の量は、検出される。ある実施形態では、産生されたアジピン酸は、単離される（たとえば、部分的にまたは完全に精製される）。いくつかの実施形態では、培養条件は、工学的に作り出された微生物を発酵させることを含む。
【００３５】
供給材料と接触した、工学的に作り出された微生物もまた、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、供給材料は、糖類を含む。ある実施形態では、糖類は、単糖、多糖、または単糖および多糖の混合物である。いくつかの実施形態では、供給材料は、パラフィンを含む。ある実施形態では、パラフィンは、飽和パラフィン、不飽和パラフィン、置換パラフィン、分岐パラフィン、直鎖状パラフィン、またはその組合せである。
【００３６】
いくつかの実施形態では、パラフィンは、約１〜約６０個の炭素原子を含む（たとえば約１個の炭素原子、約２個の炭素原子、約３個の炭素原子、約４個の炭素原子、約５個の炭素原子、約６個の炭素原子、約７個の炭素原子、約８個の炭素原子、約９個の炭素原子、約１０個の炭素原子、約１２個の炭素原子、約１４個の炭素原子、約１６個の炭素原子、約１８個の炭素原子、約２０個の炭素原子、約２２個の炭素原子、約２４個の炭素原子、約２６個の炭素原子、約２８個の炭素原子、約３０個の炭素原子、約３２個の炭素原子、約３４個の炭素原子、約３６個の炭素原子、約３８個の炭素原子、約４０個の炭素原子、約４２個の炭素原子、約４４個の炭素原子、約４６個の炭素原子、約４８個の炭素原子、約５０個の炭素原子、約５２個の炭素原子、約５４個の炭素原子、約５６個の炭素原子、約５８個の炭素原子〜約６０個の炭素原子）。ある実施形態では、パラフィンは、パラフィンの混合物中にある。いくつかの実施形態では、パラフィンの混合物中のパラフィンは、約８〜約１８（たとえば、約８個の炭素原子、約９個の炭素原子、約１０個の炭素原子、約１１個の炭素原子、約１２個の炭素原子、約１３個の炭素原子、約１４個の炭素原子、約１５個の炭素原子、約１６個の炭素原子、約１７個の炭素原子または約１８個の炭素原子）の平均炭素原子数を有する。ある実施形態では、パラフィンは、ろう中にあり、いくつかの実施形態では、パラフィンは、オイル中にある。ある実施形態では、パラフィンは、石油生成物に由来し、いくつかの実施形態では、石油生成物は、石油蒸留物である。ある実施形態では、パラフィンは、植物または植物生成物に由来する。
【００３７】
配列番号１のヌクレオチド配列と９６％以上（たとえば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％）同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、配列番号８のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および配列番号１のヌクレオチド配列と９６％以上同一のヌクレオチド配列の一部を有し、脂肪アルコールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む群から選択される、単離ポリヌクレオチドもまた、本明細書において提供される。
【００３８】
配列番号２のヌクレオチド配列と９８％以上（たとえば、９８％以上、９９％以上または１００％）同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１０のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および配列番号２のヌクレオチド配列と９８％以上同一のヌクレオチド配列の一部を有し、脂肪アルコールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む群から選択される、単離ポリヌクレオチドもまた、本明細書において提供される。
【００３９】
配列番号３のヌクレオチド配列と９５％以上（たとえば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％）同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、配列番号９のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および配列番号３のヌクレオチド配列と９５％以上同一のヌクレオチド配列の一部を有し、脂肪アルコールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む群から選択される、単離ポリヌクレオチドもまた、本明細書において提供される。
【００４０】
配列番号４のヌクレオチド配列と８３％以上（たとえば、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％）同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および配列番号３のヌクレオチド配列と８３％以上同一のヌクレオチド配列の一部を有し、脂肪アルコールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む群から選択される、単離ポリヌクレオチドもまた、本明細書において提供される。
【００４１】
配列番号５のヌクレオチド配列と８２％以上（たとえば、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％）同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および配列番号３のヌクレオチド配列と８２％以上同一のヌクレオチド配列の一部を有し、脂肪アルコールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む群から選択される、単離ポリヌクレオチドもまた、本明細書において提供される。
【００４２】
ある実施形態では、発現ベクターは、配列番号１〜５のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、組込み型ベクターは、配列番号１〜５のポリヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、微生物は、配列番号１〜５のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、組込み型ベクター、または発現ベクターおよび組込み型ベクターを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、配列番号１〜５のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、組込み型ベクター、または発現ベクターおよび組込み型ベクターを含む微生物を含む。ある実施形態では、発酵デバイスは、配列番号１〜５のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、組込み型ベクター、または発現ベクターおよび組込み型ベクターを含む微生物を含む。配列番号１〜５のポリヌクレオチド配列によってコードされるまたは配列番号１〜５のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターによって産生されるポリペプチドもまた、本明細書において提供される。配列番号１〜５のポリヌクレオチド配列によってコードされるまたは配列番号１〜５のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターによって産生されるポリペプチドに特異的に結合する抗体もまた、本明細書において提供される。
【００４３】
ある実施形態は、以下の説明、実施例、請求項、および図面においてさらに記載される。
【００４４】
図は技術の実施形態を例示しており、限定するものではない。例示の明快さおよび容易さのために、図は一定の比率で示されておらず、一部の例では、特定の実施形態の理解を促進するために、様々な態様が誇張または拡張によって示されていることもある。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、アジピン酸を作製するための代謝経路を表す。この経路を真核生物の微生物に組み入れて、アジピン酸を産生することができる微生物を生成することができる。
【図２】図２は、アジピン酸産生微生物を生成する方法の実施形態を表す。この方法は、ヘキサノエートを産生する宿主微生物でジカルボン酸への脂肪酸のオメガ酸化を触媒する１つ以上の遺伝子を発現させることを含む。表す方法では、宿主生物体、例えばＡ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓまたはＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓは、ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢ（またはＳＴＣＪおよびＳＴＣＫ）遺伝子を内因的に含む。一実施形態では、この方法は、マイコトキシン生産などの内因性経路へのヘキサノエートの転用をコードする遺伝子をノックアウトするか、さもなければ無効にすることを含む。本方法の特定の実施形態は、異種チトクロームＰ４５０遺伝子を挿入することをさらに含む。本方法の一部の実施形態は、ヘキサン上で培養を増殖させ、Ｐ４５０発現の増加についてスクリーニングすることを含む。ヘキサノエートによって誘導されたＰ４５０のコピー数は、特定の実施形態では増加することがある。一部の実施形態では、最終の２つの酸化ステップを通して６炭素基質のフラックスを増加させるように微生物を変化させることができる。
【図３】図３は、アジピン酸生産生物を生成する方法の実施形態を表す。本方法は、オメガ酸化経路を通してジカルボン酸を生産する宿主微生物で、ヘキサノエートシンターゼをコードする１つ以上の遺伝子を発現させることを含む。そのような微生物には、限定されずに、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＣ．ｍａｌｔｏｓａを含めることができる。表すように、本方法はＨＥＸＡおよびＨＥＸＢ遺伝子を宿主微生物に挿入することを含む。これらの遺伝子は、アスペルギルスまたは別の適当な生物体から単離することができる。一部の実施形態では、これらの遺伝子を本明細書に記載の代替配列から合成し、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓの非標準翻訳機構を通してドナー微生物の酵素のアミノ酸配列を生成する。一部の実施形態では、本方法は異種チトクロームＰ４５０遺伝子を宿主生物体に挿入することを含む。特定の実施形態では、最終の２つの酸化ステップを通して６炭素基質のフラックスを増加させるように微生物を変化させることができる。
【図４】図４は、アジピン酸生産生物を生成する方法の実施形態を表す。本方法は、オメガ酸化経路を通してジカルボン酸を生産する宿主微生物で、ヘキサノエートシンターゼをコードする１つ以上の遺伝子を発現させることを含む。この微生物には、限定されずに、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＣ．ｍａｌｔｏｓａを含めることができる。一部の実施形態では、本方法は、ヘキサン上で宿主微生物を増殖させ、Ｐ４５０発現の増加についてスクリーニングすることを含む。特定の実施形態では、ヘキサンによって誘導されるＰ４５０のコピー数を増加させることができる。ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢ遺伝子を、宿主微生物に挿入することができる。特定の実施形態では、最終の２つの酸化ステップを通して６炭素基質のフラックスを増加させるように宿主微生物を変化させることができる。
【図５】図５は、アスペルギルスのヘキサノエートシンターゼ遺伝子ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢをＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓまたはＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに挿入するためのプラスミドの図を表す。
【図６】図６は、異種チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子およびチトクロームＰ４５０レダクターゼ遺伝子をＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓまたはＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに挿入するためのプラスミドの図を表す。
【図７】図７は、異種チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子およびチトクロームＰ４５０レダクターゼ遺伝子をＡ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓまたはＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓに挿入するためのプラスミドの図を表す。
【図８】図８は、標的生成物の生物産生のための系を表す。表すように、標的生成物産生が組み入れられた微生物を発酵槽に住みつかせる。可変的な供給材料が、微生物のためにエネルギーおよび栄養源を発酵槽に供給する。一部の実施形態では、供給材料は糖を含む。特定の実施形態では、供給材料は脂肪酸を含む。供給材料は、バイオマス、産業廃棄物生成物および他の炭素源を含むこともできる。ビタミン、ミネラル、酵素および他の増殖または産生エンハンサーを、供給材料に加えてもよい。特定の実施形態では、発酵はアジピン酸を産生する。発酵工程は、他の新規化学物質を生産することができる。
【図９】図９は、図１に表す経路に類似した、糖類または多糖類炭素源からアジピン酸を作製するための代謝経路を表し、経路中間体の代謝を助けるか代謝を増強し、それによって潜在的にアジピン酸の収量を増加させる追加の活性を有する。追加の活性は、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性（チトクロームＰ４５０レダクターゼまたはＣＰＲ）および脂肪アルコールオキシダーゼ活性（ＦＡＯ）である。経路の一部またはすべてを真核生物の微生物に組み入れて、アジピン酸を産生することができる微生物を生成することができる。
【図１０】図１０は、図２に記載のような、パラフィン、脂肪、油、脂肪酸またはジカルボン酸からアジピン酸を作製する代謝経路の非限定例を表す。宿主生物体に既存の活性によって経路の一部またはすべてを微生物に組み入れて（例えば、所望の効果によって加えるか、コピー数を増加もしくは減少させるために変化させるか、またはプロモーター活性を増加もしくは減少させる）、アジピン酸を産生することができる微生物を生成することができる。
【図１１Ａ】図１１Ａおよび１１Ｂは、様々な炭素源からのアジピン酸の生産に役立つオメガおよびベータ酸化経路を表す。図１１Ａに示すように、アジピン酸はオメガ酸化を用いて、パラフィン、脂肪、油および糖代謝中間体から生産することができる。図１１Ａに示すように、アジピン酸はベータ酸化を用いて、長鎖脂肪酸またはジカルボン酸から産生することもできる。図１１Ｂは、オメガ酸化経路に入って最終的にアジピン酸を産生する、脂肪および糖の代謝からの一般的な中間体を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａおよび１１Ｂは、様々な炭素源からのアジピン酸の生産に役立つオメガおよびベータ酸化経路を表す。図１１Ａに示すように、アジピン酸はオメガ酸化を用いて、パラフィン、脂肪、油および糖代謝中間体から生産することができる。図１１Ａに示すように、アジピン酸はベータ酸化を用いて、長鎖脂肪酸またはジカルボン酸から産生することもできる。図１１Ｂは、オメガ酸化経路に入って最終的にアジピン酸を産生する、脂肪および糖の代謝からの一般的な中間体を示す。
【図１２】図１２は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＹ４７４２で発現される６×Ｈｉｓ標識タンパク質の免疫検出の結果を示す。株ｓＡＡ０６１、ｓＡＡ１４０、ｓＡＡ１４１、ｓＡＡ１４２は、６×Ｈｉｓ標識ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢタンパク質を含む。株ｓＡＡ１４４は、６×Ｈｉｓ標識ＳＴＣＪおよびＳＴＣＫタンパク質を含む。株ｓＡＡ０４８は、ベクターｐ４２５ＧＰＤおよびｐ４２６ＧＰＤだけを含む。
【図１３】図１３は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ｓＡＡ１４４）またはＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ（ｓＡＡ１０３、ｓＡＡ２７０、ｓＡＡ２６９）で発現される６×Ｈｉｓ標識タンパク質の免疫検出の結果を示す。株ｓＡＡ２６９およびｓＡＡ２７０で発現される６×Ｈｉｓ標識ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢを、矢印で示す。株ｓＡＡ１４４からの６×Ｈｉｓ標識ＳＴＣＪおよびＳＴＣＫは、陽性対照として含まれた。株ｓＡＡ１０３は、ｓＡＡ２６９およびｓＡＡ２７０の親株であり、６×Ｈｉｓ標識ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢの発現のための組込み型ベクターを含まない。
【図１４】図１４は、グルコース（Ｇｌｃ）だけ、ヘキサン（Ｈｅｘ）だけまたはヘキサン酸（ＨＡ）だけに曝露させたＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株ｓＡＡ００３の培養からのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。Ａ１５およびＡ１６対立遺伝子のＰＣＲ生成物は、ヘキサンおよびヘキサン酸特異的誘導を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｃは、ＰＯＸ遺伝子が破壊されていない（図１５Ａを参照）、ＰＯＸ４遺伝子が破壊されている（図１５Ｃを参照）またはＰＯＸ５遺伝子が破壊されている（図１５Ｂを参照）Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株からのアシル−ＣｏＡ酵素調製物を用いる、様々な炭素長の基質の上でのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＰＯＸ）酵素活性アッセイの結果を例示する。実験の結果および条件は、発明を実施するための形態および実施例のセクションで与えられる。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜１５Ｃは、ＰＯＸ遺伝子が破壊されていない（図１５Ａを参照）、ＰＯＸ４遺伝子が破壊されている（図１５Ｃを参照）またはＰＯＸ５遺伝子が破壊されている（図１５Ｂを参照）Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株からのアシル−ＣｏＡ酵素調製物を用いる、様々な炭素長の基質の上でのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＰＯＸ）酵素活性アッセイの結果を例示する。実験の結果および条件は、発明を実施するための形態および実施例のセクションで与えられる。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜１５Ｃは、ＰＯＸ遺伝子が破壊されていない（図１５Ａを参照）、ＰＯＸ４遺伝子が破壊されている（図１５Ｃを参照）またはＰＯＸ５遺伝子が破壊されている（図１５Ｂを参照）Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株からのアシル−ＣｏＡ酵素調製物を用いる、様々な炭素長の基質の上でのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＰＯＸ）酵素活性アッセイの結果を例示する。実験の結果および条件は、発明を実施するための形態および実施例のセクションで与えられる。
【図１６】図１６〜３４は、宿主生物体または遺伝子操作生物体への、本明細書に記載される様々な活性のクローニング、発現または組込みのための様々なプラスミドを例示する。図１６は、異種ＨＥＸＡ遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに挿入するためのプラスミドの図を表す。
【図１７】図１６〜３４は、宿主生物体または遺伝子操作生物体への、本明細書に記載される様々な活性のクローニング、発現または組込みのための様々なプラスミドを例示する。図１７は、異種ＨＥＸＢ遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに挿入するためのプラスミドの図を表す。
【図１８】図１６〜３４は、宿主生物体または遺伝子操作生物体への、本明細書に記載される様々な活性のクローニング、発現または組込みのための様々なプラスミドを例示する。図１８は、異種ＨＥＸＡ−６×Ｈｉｓ遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに挿入するためのプラスミドの図を表す。
【図１９】図１６〜３４は、宿主生物体または遺伝子操作生物体への、本明細書に記載される様々な活性のクローニング、発現または組込みのための様々なプラスミドを例示する。図１９は、異種ＨＥＸＢ−６×Ｈｉｓ遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに挿入するためのプラスミドの図を表す。
【図２０】図１６〜３４は、宿主生物体または遺伝子操作生物体への、本明細書に記載される様々な活性のクローニング、発現または組込みのための様々なプラスミドを例示する。図２０は、異種ＳＴＣＪ遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに挿入するためのプラスミドの図を表す。
【図２１】図１６〜３４は、宿主生物体または遺伝子操作生物体への、本明細書に記載される様々な活性のクローニング、発現または組込みのための様々なプラスミドを例示する。図２１は、異種ＳＴＣＫ遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに挿入するためのプラスミドの図を表す。
【図２２】図１６〜３４は、宿主生物体または遺伝子操作生物体への、本明細書に記載される様々な活性のクローニング、発現または組込みのための様々なプラスミドを例示する。図２２は、異種ＳＴＣＪ−６×Ｈｉｓ遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに挿入するためのプラスミドの図を表す。
【図２３】図１６〜３４は、宿主生物体または遺伝子操作生物体への、本明細書に記載される様々な活性のクローニング、発現または組込みのための様々なプラスミドを例示する。図２３は、異種ＳＴＣＫ−６×Ｈｉｓ遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに挿入するためのプラスミドの図を表す。
【図２４】図１６〜３４は、宿主生物体または遺伝子操作生物体への、本明細書に記載される様々な活性のクローニング、発現または組込みのための様々なプラスミドを例示する。図２４は、異種代替遺伝子コード（ＡＧＣ）ＨＥＸＡ遺伝子をＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓに挿入するためのプラスミドの図を表す。
【図２５】図１６〜３４は、宿主生物体または遺伝子操作生物体への、本明細書に記載される様々な活性のクローニング、発現または組込みのための様々なプラスミドを例示する。図２５は、異種ＡＧＣ−ＨＥＸＢ遺伝子をＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓに挿入するためのプラスミドの図を表す。
【図２６】図１６〜３４は、宿主生物体または遺伝子操作生物体への、本明細書に記載される様々な活性のクローニング、発現または組込みのための様々なプラスミドを例示する。図２６は、異種ＡＧＣ−ＨＥＸＡ−６×Ｈｉｓ遺伝子をＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓに挿入するためのプラスミドの図を表す。
【図２７】図１６〜３４は、宿主生物体または遺伝子操作生物体への、本明細書に記載される様々な活性のクローニング、発現または組込みのための様々なプラスミドを例示する。図２７は、異種ＡＧＣ−ＨＥＸＢ−６×Ｈｉｓ遺伝子をＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓに挿入するためのプラスミドの図を表す。
【図２８】図１６〜３４は、宿主生物体または遺伝子操作生物体への、本明細書に記載される様々な活性のクローニング、発現または組込みのための様々なプラスミドを例示する。図２８は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓからのＰＯＸ５遺伝子をクローニングするために用いられるプラスミドの図を表す。
【図２９】図１６〜３４は、宿主生物体または遺伝子操作生物体への、本明細書に記載される様々な活性のクローニング、発現または組込みのための様々なプラスミドを例示する。図２９は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓからのＰＯＸ４遺伝子をクローニングするために用いられるプラスミドの図を表す。
【図３０】図１６〜３４は、宿主生物体または遺伝子操作生物体への、本明細書に記載される様々な活性のクローニング、発現または組込みのための様々なプラスミドを例示する。図３０は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓでのＵＲＡ選択の使用のために構築されるプラスミドを例示する。
【図３１】図１６〜３４は、宿主生物体または遺伝子操作生物体への、本明細書に記載される様々な活性のクローニング、発現または組込みのための様々なプラスミドを例示する。図３１は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓからのＰＧＫプロモーターおよびターミネーターを含むプラスミドを表す。
【図３２】図１６〜３４は、宿主生物体または遺伝子操作生物体への、本明細書に記載される様々な活性のクローニング、発現または組込みのための様々なプラスミドを例示する。図３２は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓでのＣＰＲ遺伝子の組込みのために用いられるプラスミドを表す。
【図３３】図１６〜３４は、宿主生物体または遺伝子操作生物体への、本明細書に記載される様々な活性のクローニング、発現または組込みのための様々なプラスミドを例示する。図３３は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓでのＣＹＰ５２Ａ１５遺伝子の組込みのために用いられるプラスミドを表す。
【図３４】図１６〜３４は、宿主生物体または遺伝子操作生物体への、本明細書に記載される様々な活性のクローニング、発現または組込みのための様々なプラスミドを例示する。図３４は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓでのＣＹＰ５２Ａ１６遺伝子の組込みのために用いられるプラスミドを表す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
アジピン酸は、ある種のポリアミド、ポリウレタン、および可塑剤を作製するために使用される、生産プロセスにおける化学的中間体である６炭素有機分子であり、これらはすべて、たとえば、カーペット、被覆剤、接着剤、エラストマー、食品包装、および潤滑剤などの用品を製造する際に広い用途を有する。アジピン酸を作製するためのいくつかの大規模プロセスは、（ｉ）ケトンアルコールオイル（ＫＡオイル）の液相酸化；（ｉｉ）シクロヘキサノールを作製するための、ホウ酸を用いるシクロヘキサンの空気酸化／水和、その後に続く硝酸を用いる酸化；および（ｉｉｉ）ペンタンニトリル（ｐｅｎｔｅｎｅｎｉｔｒｉｌｅ）混合物へのブタジエンのヒドロシアン化（ｈｙｄｒｏｃｙａｎａｔｉｏｎ）、その後に続くアジポニトリルのヒドロ異性化（ｈｙｄｒｏｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、その後に続く水素化を含む。それぞれの後者のプロセスは、有害化学物質および／または溶媒の使用を必要とし、いくつかのものは、高温を必要とし、すべて、著しいエネルギー入力を必要とする。さらに、プロセスのうちのいくつかは、毒性副産物（亜酸化窒素など）を排出し、環境問題を引き起こす。
【００４７】
生物系を使用して、アジピン酸および他の有機化学物質中間体を産生するための方法が、本明細書において提供される。そのような産生系は、環境影響を著しく減らし、現在の生産システムと経済的に競争できる。したがって、工学的に作り出された微生物によってアジピン酸を製造するための方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、微生物は、酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含有するように遺伝子操作され、酵素は、微生物の中に工学的に作り出された新規な経路のメンバーである。ある実施形態では、生物は、天然の酵素の活性の上昇について選択されてもよい。
【００４８】
微生物
選択された微生物は、多くの場合、遺伝的操作に適しており、多くの場合、標的産物の工業生産に有用な細胞密度で培養することができる。選択された微生物は、多くの場合、発酵デバイス中で維持することができる。
【００４９】
本明細書において使用される用語「工学的に作り出された微生物」は、出発点として利用される微生物（以下「宿主微生物」）中に存在する活性とは異なる１つ以上の活性を含む、修飾された微生物を指す。工学的に作り出された微生物は、いくつかの実施形態では、異種のポリヌクレオチドを含み、ある実施形態では、工学的に作り出された生物は、宿主微生物に対して活性を改変するまたは活性を導入する選択的条件にかけられる。したがって、工学的に作り出された微生物は、人間によって直接または間接的に改変されている。宿主微生物は、時に、天然の微生物であり、時には、ある点まで工学的に作り出された微生物である。
【００５０】
いくつかの実施形態では、工学的に作り出された微生物は、単細胞生物であり、多くの場合、分裂し、増殖することができる。微生物は、１つ以上の以下の特徴を含むことができる：好気性菌、嫌気性菌、糸状、非糸状、一倍体、二倍体、栄養要求性、および／または非栄養要求性。ある実施形態では、工学的に作り出された微生物は、原核微生物（たとえば細菌）であり、ある実施形態では、工学的に作り出された微生物は、非原核微生物である。いくつかの実施形態では、工学的に作り出された微生物は、真核微生物（たとえば酵母、真菌、アメーバ）である。
【００５１】
任意の適した酵母は、宿主微生物、工学的に作り出された微生物、または異種のポリヌクレオチドの供給源として選択されてもよい。酵母は、ヤロウイア属酵母（たとえばＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（以前はＣａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａとして分類された））、カンジダ属酵母（たとえばＣ．ｒｅｖｋａｕｆｉ、Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、ロドトルラ属酵母（たとえばＲ．ｇｌｕｔｉｎｕｓ、Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）酵母（たとえばＲ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、サッカロミセス属酵母（たとえばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ、Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ、Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、クリプトコックス属酵母、トリコスポロン属酵母（たとえばＴ．ｐｕｌｌａｎｓ、Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ピキア属酵母（たとえばＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、およびリポマイセス属酵母（たとえばＬ．ｓｔａｒｋｅｙｉｉ、Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、酵母は、ＡＴＣＣ２０３６２、ＡＴＣＣ８８６２、ＡＴＣＣ１８９４４、ＡＴＣＣ２０２２８、ＡＴＣＣ７６９８２、およびＬＧＡＭ  Ｓ（７）１株を含むが、これらに限定されないＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株である（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．およびＡｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２巻（１号）：４３〜９頁（２００２年））。ある実施形態では、酵母は、ＡＴＣＣ２０３３６、ＡＴＣＣ２０９１３、ＳＵ−２（ｕｒａ３−／ｕｒａ３−）、ＡＴＣＣ２０９６２、Ｈ５３４３（ベータ酸化ブロック；米国特許第５６４８２４７号）株を含むが、これらに限定されないＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株である。
【００５２】
任意の適した真菌は、宿主微生物、工学的に作り出された微生物、または異種のポリヌクレオチドの供給源として選択されてもよい。真菌の非限定的な例は、アスペルギルス属真菌（たとえばＡ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ヤブレツボカビ属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）真菌、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）真菌、およびクモノスカビ属真菌（たとえばＲ．ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ、Ｒ．ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、真菌は、株ＡＴＣＣ２４６９０を含むが、これらに限定されないＡ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ株であり、ある実施形態では、真菌は、株ＡＴＣＣ３８１６３を含むが、これらに限定されないＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ株である。
【００５３】
任意の適した原核生物は、宿主微生物、工学的に作り出された微生物、または異種のポリヌクレオチドの供給源として選択されてもよい。グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌が、選択されてもよい。細菌の例は、バチルス属細菌（たとえばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、アシネトバクター属細菌、ノルカルディア属（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）細菌、ザントバクター属細菌、エシェリキア属細菌（たとえばＥ．ｃｏｌｉ（たとえば株ＤＨ１０Ｂ、Ｓｔｂｌ２、ＤＨ５−アルファ、ＤＢ３、ＤＢ３．１）、ＤＢ４、ＤＢ５、ＪＤＰ６８２、およびｃｃｄＡ−ｏｖｅｒ（たとえば米国特許出願第０９／５１８，１８８号）））、ストレプトマイセス属細菌、エルウィニア属細菌、クレブシエラ属細菌、セラチア属細菌（たとえばＳ．ｍａｒｃｅｓｓａｎｓ）、シュードモナス属細菌（たとえばＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、サルモネラ属細菌（たとえばＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、メガスフェラ属細菌（たとえばＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ）を含むが、これらに限定されない。細菌は、光合成細菌（たとえば緑色非硫黄細菌（たとえばクロロフレクサス属（Ｃｈｏｒｏｆｌｅｘｕｓ）細菌（たとえばＣ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、クロロネマ属（Ｃｈｌｏｒｏｎｅｍａ）細菌（たとえばＣ．ｇｉｇａｔｅｕｍ）、緑色硫黄細菌（たとえばクロロビウム属細菌（たとえばＣ．ｌｉｍｉｃｏｌａ）、ペロディクチオン属細菌（たとえばＰ．ｌｕｔｅｏｌｕｍ）、紅色硫黄細菌（たとえばクロマチウム属細菌（たとえばＣ．ｏｋｅｎｉｉ））、ならびに紅色非硫黄細菌（たとえばロドスピリルム属細菌（たとえばＲ．ｒｕｂｒｕｍ）、ロドバクター属細菌（たとえばＲ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、およびロドミクロビウム属細菌（たとえばＲ．ｖａｎｅｌｌｉｉ））を含むが、これらに限定されない。
【００５４】
非微生物生物に由来する細胞は、宿主微生物、工学的に作り出された微生物、または異種のポリヌクレオチドの供給源として利用することができる。そのような細胞の例は、昆虫細胞（たとえばショウジョウバエ属（たとえばＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、スポドプテラ属（たとえばＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９細胞またはＳｆ２１細胞）、およびキンウワバ属（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓａ）（たとえばＨｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞）；線虫細胞（たとえばＣ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞）；鳥類の細胞；両生類の細胞（たとえばＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ細胞）；爬虫類の細胞；ならびに哺乳動物の細胞（たとえばＮＩＨ３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＨＫ細胞、Ｐｅｒ−Ｃ６細胞、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞、およびＨｅＬａ細胞）を含むが、これらに限定されない。
【００５５】
異種のポリヌクレオチドについての宿主生物または供給源として使用される微生物または細胞は、市販で入手可能である。本明細書において記載される微生物および細胞ならびに他の適した微生物および細胞は、たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）、およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ；Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から入手可能である。
【００５６】
宿主微生物および工学的に作り出された微生物は、任意の適した形態で提供されてもよい。たとえば、そのような微生物は、初代培養物であってもよいまたは１回もしくは複数回、継代培養されていてもよい（たとえば希釈し、培養されていてもよい）液体培養物または固体培養物（たとえば寒天ベースの培地）で提供されてもよい。微生物はまた、凍結形態または乾燥形態（たとえば凍結乾燥）で提供されてもよい。微生物は、任意の適した濃度で提供されてもよい。
【００５７】
炭素プロセシング経路および活性
図１および９は、炭素源出発物質として糖を使用して、アジピン酸を作製するための生物学的経路の実施形態を示す。任意の適した糖は、供給材料として生物に使用することができる（たとえば６炭素糖（たとえばグルコース、フルクトース）、５炭素糖（たとえばキシロース）、その他同種のもの、またはその組合せ）。糖は、初めに、天然に存在するおよび／または工学的に作り出された経路を使用して代謝され、マロニル−ＣｏＡが得られ、これは、図９中に示されるオメガ酸化経路に入る分子として示される。示されるように、酵素ヘキサノエートシンターゼは、２分子のマロニル−ＣｏＡおよび１分子のアセチル−ＣｏＡを１分子のヘキサン酸に変換する。いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０酵素は、ヘキサン酸を６−ヒドロキシヘキサン酸に変換し、これは、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼまたは脂肪アルコールオキシダーゼを介して６−オキソヘキサン酸に酸化されてもよい。６−オキソヘキサン酸は、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼによってアジピン酸に変換されてもよい。
【００５８】
ヘキサノエートシンターゼ酵素（ＨｅｘＳ）は、ヘキソネートシンターゼサブユニットアルファ（ＨＥＸＡ）およびヘキサノエートシンターゼサブユニットベータ（ＨＥＸＢ）遺伝子によってコード化される。いくつかの実施形態では、ＨｅｘＳ酵素は、宿主微生物にとって内因性である。ある実施形態では、ＨＥＸＡ遺伝子およびＨＥＸＢ遺伝子は、適した生物（たとえばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）から単離されてもよい。いくつかの実施形態では、ＳＴＣＪおよびＳＴＣＫなどのＨＥＸＡおよびＨＥＸＢのオルソログもまた、適した生物（たとえばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）から単離されてもよい。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ヘキサノエートは、酵素シトクロムＰ４５０によってオメガヒドロキシル化され、それによって、６炭素アルコールが生成される。ある実施形態では、シトクロムＰ４５０酵素は、宿主微生物にとって内因性である。いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍから単離され、単一サブユニットの可溶性細胞質酵素をコード化する。ある種の宿主生物に由来する可溶性または膜結合シトクロムＰ４５０は、６炭素基質に対して特異的であり、いくつかの実施形態で使用されてもよい。
【００６０】
シトクロムＰ４５０は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）の活性によって低下し、それによって、シトクロムＰ４５０を再利用して、さらなる酵素活性を可能にする。ある実施形態では、ＣＰＲ酵素は、宿主微生物にとって内因性である。いくつかの実施形態では、宿主ＣＰＲ活性は、ＣＰＲ遺伝子のコピー数を増加させることによって（たとえば、遺伝子の２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０以上のコピー）、ＣＰＲ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって、またはＣＰＲ遺伝子のコピー数を増加させ、ＣＰＲ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させて、それによって、シトクロムＰ４５０の再利用の増加を介して、標的産物（たとえばアジピン酸）の産生を増加させることができる。ある実施形態では、プロモーターは、異種のプロモーター（たとえば内因性または外因性のプロモーター）とすることができる。いくつかの実施形態では、ＣＰＲ遺伝子は、異種で、外因性のものであり、任意の適した生物から単離することができる。ＣＰＲ遺伝子を単離することができる生物の非限定的な例は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍを含む。
【００６１】
アルデヒドへのアルコールの酸化は、脂肪アルコールオキシダーゼファミリーの酵素（たとえば６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼファミリーの酵素（たとえば６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ）によって実行されてもよい。酵素６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼまたはオメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼは、アルデヒドを酸化して、カルボン酸アジピン酸にしてもよい。いくつかの実施形態では、酵素６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ、脂肪アルコールオキシダーゼ、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、またはオメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼは、宿主生物中に存在する。これらの２ステップを通してのフラックスは、時に、酵素のコピー数を増加させることによってまたは遺伝子を転写するプロモーターの活性を増加させることによって増大させてもよい。いくつかの実施形態では、６炭素基質に対して特異的なアルコールデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼは、他の生物、たとえばアシネトバクター属、カンジダ属、サッカロミセス属、またはシュードモナス属から単離され、宿主生物の中に挿入されてもよい。
【００６２】
図１０は、炭素源出発物質として、脂肪、オイル、ジカルボン酸、パラフィン（たとえば直鎖状、分岐、置換、飽和、不飽和、その他同種のもの、およびその組合せ）、脂肪アルコール、脂肪酸、またはその他同種のものを使用して、アジピン酸を作製するための生物学的経路の実施形態を示す。任意の適した脂肪アルコール、脂肪酸、パラフィン、ジカルボン酸、脂肪、またはオイルは、供給材料として生物に使用することができる（たとえばヘキサン、ヘキサン酸、オレイン酸、ヤシ油、その他同種のもの、またはその組合せ）。より長い鎖長（たとえば長さが８炭素以上）を有する炭素源は、天然に存在するおよび／または工学的に作り出された経路を使用して、代謝され、図１０および図１１Ａの下部に示されるベータ酸化経路を使用してさらに代謝することができる分子を得ることができる。いくつかの実施形態では、図１０に示される経路における活性もまた、代謝および標的産物形成を増強するために遺伝子操作することができる（たとえば本明細書において記載されるように）。酵素アシル−ＣｏＡリガーゼは、図１０における反応の第１のステップに示されるように、ＡＭＰおよび無機リン酸へのＡＴＰの変換と共に、長鎖脂肪アルコール、脂肪酸、またはジカルボン酸および１分子のアセチル−ＣｏＡを、長鎖脂肪アルコール、脂肪酸、またはジカルボン酸のアシル−ＣｏＡ誘導体に変換する。本明細書において使用される用語「ベータ酸化経路」は、脂肪アルコール、脂肪酸、またはジカルボン酸を代謝するために利用される一連の酵素活性を指す。脂肪アルコール、脂肪酸、またはジカルボン酸を代謝するために利用される活性は、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、およびアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性を含むが、これらに限定されない。用語「ベータ酸化活性」は、脂肪アルコール、脂肪酸、またはジカルボン酸を代謝するために利用されるベータ酸化経路における活性のいずれかを指す。用語「オメガ酸化活性」は、脂肪アルコール、脂肪酸、ジカルボン酸、または糖を代謝するために利用されるオメガ酸化経路における活性のいずれかを指す。
【００６３】
ある実施形態では、アシル−ＣｏＡリガーゼ酵素は、長鎖脂肪アルコール、脂肪酸、またはジカルボン酸をアシル−ＣｏＡ誘導体に変換し、これは、アシルＣｏＡオキシダーゼ（たとえばアシル−ＣｏＡオキシドレダクターゼおよび脂肪酸アシル−コエンザイムＡオキシダーゼとしても公知）の活性によって酸化されて、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ誘導体が得られてもよい。トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ誘導体長鎖脂肪アルコール、脂肪酸、またはジカルボン酸は、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼの活性によって３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡにさらに変換されてもよい。３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡは、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの活性によって、３−オキソアシル−ＣｏＡに変換することができる。３−オキソアシル−ＣｏＡは、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ（たとえばベータケトチオラーゼおよびβ−ケトチオラーゼとしても公知）の活性によって、２炭素短いアシル−ＣｏＡ分子およびアセチル−ＣｏＡに変換されてもよい。いくつかの実施形態では、アシル−ＣｏＡ分子は、所望の炭素鎖長が生成されるまで（たとえば６炭素、アジピン酸）、ベータ酸化によって繰り返し短くされてもよい。短くなった脂肪酸は、アジピン酸を得るためにオメガ酸化を使用してさらに処理することができる。
【００６４】
アシル−ＣｏＡリガーゼ酵素は、宿主生物によって時にコードされ、工学的に作り出された生物を生成するために追加することができる。いくつかの実施形態では、宿主アシル−ＣｏＡリガーゼ活性は、アシル−ＣｏＡリガーゼ遺伝子のコピー数を増加させることによって、アシル−ＣｏＡリガーゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって、または遺伝子の数コピーを増加させることによってかつ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させ、それによって、経路を通しての炭素フラックスの増加により、標的産物（たとえばアジピン酸）の産生を増加させることができる。ある実施形態では、アシル−ＣｏＡリガーゼ遺伝子は、任意の適した生物から単離することができる。アシル−ＣｏＡリガーゼ酵素を含むまたはそのドナーとして使用することができる生物の非限定的な例は、カンジダ属、サッカロミセス属、またはヤロウイア属を含む。
【００６５】
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素は、脂肪酸アシルＣｏＡ上の不飽和β炭素へのヒドロキシル基およびプロトンの追加を触媒し、それは、時に、宿主生物によってコードされ、時に、工学的に作り出された生物を生成するために追加することができる。ある実施形態では、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性は、宿主または工学的に作り出された生物において不変である。いくつかの実施形態では、宿主エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性は、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子のコピー数を増加させることによって、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって、または遺伝子の数コピーを増加させることによってかつ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させ、それによって、経路を通しての炭素フラックスの増加により、標的産物（たとえばアジピン酸）の産生を増加させることができる。ある実施形態では、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子は、任意の適した生物から単離することができる。エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素を含むまたはそのドナーとして使用することができる生物の非限定的な例は、カンジダ属、サッカロミセス属、またはヤロウイア属を含む。
【００６６】
３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素は、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼの活性によって作られた、新しく形成されたヒドロキシル基に由来する水素の除去によって３−ケトアシル−ＣｏＡの形成を触媒する。いくつかの実施形態では、活性は、宿主生物によってコードされ、時に、工学的に作り出された生物を生成するために追加されるまたは増加させることができる。ある実施形態では、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ活性は、宿主または工学的に作り出された生物において不変である。いくつかの実施形態では、宿主３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性は、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を増加させることによって、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって、または遺伝子の数コピーを増加させることによってかつ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させ、それによって、経路を通しての炭素フラックスの増加により、標的産物（たとえばアジピン酸）の産生を増加させることができる。ある実施形態では、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子は、任意の適した生物から単離することができる。３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素を含むまたはそのドナーとして使用することができる生物の非限定的な例は、カンジダ属、サッカロミセス属、またはヤロウイア属を含む。
【００６７】
アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ（たとえばβ−ケトチオラーゼ）酵素は、ＣｏＡのもう一つの分子のチオール基による３−ケトアシル−ＣｏＡの切断によって、２炭素短い脂肪酸アシル−ＣｏＡの形成を触媒する。チオールは、Ｃ−２およびＣ−３の間に挿入され、これにより、アセチルＣｏＡ分子および２炭素短いアシルＣｏＡ分子が得られる。アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼは、時に、宿主生物によってコードされ、時に、工学的に作り出された生物を生成するために追加することができる。ある実施形態では、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性は、宿主または工学的に作り出された生物において不変である。いくつかの実施形態では、宿主アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性は、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ遺伝子のコピー数を増加させることによってまたはアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させ、それによって、経路を通しての炭素フラックスの増加により、標的産物（たとえばアジピン酸）の産生を増加させることができる。ある実施形態では、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ遺伝子は、任意の適した生物から単離することができる。アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ酵素を含むまたはそのドナーとして使用することができる生物の非限定的な例は、カンジダ属、サッカロミセス属、またはヤロウイア属を含む。
【００６８】
微生物は、アジピン酸経路における１つ以上の活性を含めるまたは調節するために修飾され、遺伝子操作されてもよい。本明細書において使用される用語「活性」は、アジピン酸およびその前駆体を含む様々な産物を得るための、微生物の天然のまたは工学的に作り出された生物学的経路の機能化を指す。アジピン酸産生活性は、ある実施形態では、任意の非哺乳動物供給源によって提供することができる。そのような供給源は、限定を伴うことなく、酵母および真菌などの真核生物ならびに細菌などの原核生物を含む。いくつかの実施形態では、本明細書において記載される経路における逆性の活性は、標的産物（たとえばアジピン酸）の産生に向けて、ベータ酸化経路、オメガ酸化経路、またはベータ酸化経路およびオメガ酸化経路によって炭素フラックスを増加させるために、改変する（たとえば破壊する、低下させる）ことができる。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ベータ酸化経路における活性を破壊しまたはベータ酸化経路における正反応を実行するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊し、これにより、ベータ酸化活性を検出不可能にする。本明細書において使用される用語「検出不可能な」は、公知の（たとえば本明細書において記載される）検出方法またはアッセイを使用して検出限界未満である、分析物の量を指す。ある実施形態では、遺伝子修飾は、ベータ酸化活性を部分的に低下させる。本明細書で使用される用語「ベータ酸化活性を部分的に低下させる」は、宿主または出発生物において見つけられる活性のレベルよりも低い、工学的に作り出された生物における活性のレベルを指す。
【００６９】
本明細書において提供される工学的に作り出された微生物内の活性は、下記の活性の１つ以上（たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはすべて）を含むことができる：６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性；６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性；ヘキサノエートシンターゼ活性；シトクロムＰ４５０活性；シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性；脂肪アルコールオキシダーゼ活性；アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性；エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、およびチオエステラーゼ活性（たとえばアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ、ベータケトチオラーゼ）。ある実施形態では、先の活性の１つ以上（たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはすべて）は、遺伝子修飾を介して改変される。いくつかの実施形態では、先の活性の１つ以上（たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはすべて）は、（ｉ）活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを追加することおよび／または（ｉｉ）活性を有するポリペプチドの発現を調節する調節配列を改変または追加することを介して改変される。
【００７０】
本明細書において使用される用語「６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性」は、アジピン酸への６−オキソヘキサン酸の変換を指す。６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性は、ポリペプチドによって提供することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、宿主微生物に導入された異種のヌクレオチド配列によってコードされる。ある実施形態では、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する内因性のポリペプチドは、宿主微生物において同定され、宿主微生物は、産生されるポリペプチドの量を増加させるために遺伝子的に改変される（たとえば、異種のプロモーターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの作動可能な連結で、導入される；ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数は、増加される（たとえばポリヌクレオチドを含むプラスミドの導入によって））。６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を与える核酸配列は、アクチノバクター属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒ）、ノルカルディア属（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、シュードモナス属、およびザントバクター属細菌を含む多くの供給源から得ることができる。６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｅｈｙｒｄｏｇｅｎａｓｅ）活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列およびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の例は、本明細書において示される。６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性の存在、不在、または量は、当技術分野において公知の任意の適した方法によって検出することができる。アルコールオキシダーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼ活性についての検出方法の例については（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７０巻：４８７２頁を参照されたい）。いくつかの実施形態では、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性は、宿主微生物において改変されず、ある実施形態では、活性は、宿主微生物に比べて、工学的に作り出された微生物において追加されるまたは増加される。
【００７１】
本明細書において使用される用語「オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性」は、ジカルボン酸へのオメガオキソ脂肪酸の変換を指す。オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性は、ポリペプチドによって提供することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、宿主微生物に導入された異種のヌクレオチド配列によってコードされる。ある実施形態では、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有する内因性のポリペプチドは、宿主微生物において同定され、宿主微生物は、産生されるポリペプチドの量を増加させるために遺伝子的に改変される（たとえば、異種のプロモーターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの作動可能な連結で、導入される；ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数は、増加される（たとえばポリヌクレオチドを含むプラスミドの導入によって））。オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を与える核酸配列は、アクチノバクター属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒ）、ノルカルディア属（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、シュードモナス属、およびザントバクター属細菌を含む多くの供給源から得ることができる。オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列およびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の例は、本明細書において示される。オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性の存在、不在、または量は、当技術分野において公知の任意の適した方法によって検出することができる。いくつかの実施形態では、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性は、宿主微生物において改変されず、ある実施形態では、活性は、宿主微生物に比べて、工学的に作り出された微生物において追加されるまたは増加される。
【００７２】
本明細書において使用される用語「６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性」は、６−オキソヘキサン酸への６−ヒドロキシヘキサン酸の変換を指す。６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性は、ポリペプチドによって提供することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、宿主微生物に導入された異種のヌクレオチド配列によってコードされる。ある実施形態では、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する内因性のポリペプチドは、宿主微生物において同定され、宿主微生物は、産生されるポリペプチドの量を増加させるために遺伝子的に改変される（たとえば、異種のプロモーターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの作動可能な連結で、導入される；ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数は、増加される（たとえばポリヌクレオチドを含むプラスミドの導入によって））。６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を与える核酸配列は、アクチノバクター属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒ）、ノルカルディア属（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、シュードモナス属、およびザントバクター属を含む多くの供給源から得ることができる。６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列およびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の例は、本明細書において示される。６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性の存在、不在、または量は、当技術分野において公知の任意の適した方法によって検出することができる。そのような方法の例は、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８８巻：１７６頁において記載される。いくつかの実施形態では、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性は、宿主微生物において改変されず、ある実施形態では、活性は、宿主微生物に比べて、工学的に作り出された微生物において追加されるまたは増加される。
【００７３】
本明細書において使用される用語「オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性」は、オメガオキソ脂肪酸へのオメガヒドロキシル脂肪酸の変換を指す。オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性は、ポリペプチドによって提供することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、宿主微生物に導入された異種のヌクレオチド配列によってコードされる。ある実施形態では、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有する内因性のポリペプチドは、宿主微生物において同定され、宿主微生物は、産生されるポリペプチドの量を増加させるために遺伝子的に改変される（たとえば、異種のプロモーターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの作動可能な連結で、導入される；ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数は、増加される（たとえばポリヌクレオチドを含むプラスミドの導入によって））。オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を与える核酸配列は、アクチノバクター属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒ）、ノルカルディア属（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、シュードモナス属、およびザントバクター属細菌を含む多くの供給源から得ることができる。オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列およびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の例は、本明細書において示される。オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性の存在、不在、または量は、当技術分野において公知の任意の適した方法によって検出することができる。いくつかの実施形態では、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性は、宿主微生物において改変されず、ある実施形態では、活性は、宿主微生物に比べて、工学的に作り出された微生物において追加されるまたは増加される。
【００７４】
本明細書において使用される用語「ヘキサノエートシンターゼ活性」は、ヘキサン酸へのアセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡの変換を指す。ヘキサノエートシンターゼ活性は、１つまたは２つのサブユニット（以下「サブユニットＡ」および／または「サブユニットＢ」と呼ばれる）を含む酵素によって提供されてもよい。ヘキサノエートシンターゼ活性は、ポリペプチドによって提供することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、宿主微生物に導入された異種のヌクレオチド配列によってコードされる。ヘキソネートシンターゼ活性を与える核酸配列は、たとえば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒｉｓｉｔｉｃｕｓを含む多くの供給源から得ることができる。ヘキサノエートシンターゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列およびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の例は、本明細書において示される。いくつかの実施形態では、ヘキサノエートシンターゼ活性は、宿主微生物において改変されず、ある実施形態では、活性は、宿主微生物に比べて、工学的に作り出された微生物において追加されるまたは増加される。
【００７５】
ヘキサノエートシンターゼ活性の存在、不在、または量は、当技術分野において公知の任意の適した方法によって検出することができる。そのような方法の例は、Ｈｅｘａｎｏａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＋  ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９巻：９８１〜９８８頁）において記載されている。手短かに言えば、指示株が、調製されてもよい。指示株は、たとえば、ＬｉａＲによって調節されるプロモーターの制御下でレポーター遺伝子（ベータ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質など）を含有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓであってもよい。指示株はまた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに由来するＬｉａＲ調節可能プロモーターまたはたとえばペルオキシソーム３−ケトアシル補酵素Ａチオラーゼ遺伝子（ＣＴ−Ｔ３Ａ）についての天然の遺伝子に対するアルカン誘発性プロモーターを含有するＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓであってもよい。ＨｅｘＳの改善された機能性を有し、それによって、より多くのヘキサン酸を産生する突然変異体は、指示株の菌叢上に平板培養することができる。試験突然変異体および指示株の両方のインキュベーションおよび成長に際して、対照株と比較して、レポーター株の誘発に相関するより大きなｈａｌｏの出現は、改善された活性を有する突然変異体を示す。代替アプローチでは、突然変異体は、ヘキサノイル−ＣｏＡまたはヘキサン酸の産生を好む条件で成長させ、溶解される。細胞溶解物は、ＰＫＳからヘキサン酸を放出するかもしれないプロテアーゼを用いて処理される。浄化された溶解物は、改善された産生を評価するために指示株の菌叢上にスポットされてもよい。他の代替アプローチでは、指示株は、ヘキサン酸によって誘発される場合、レポーター遺伝子の発現を持続させるのに適した条件下で成長させる。ヘキサン酸の既知濃度の希釈物は、標準曲線を決定するために使用される。ヘキサン酸の産生を好む条件下で成長させた試験株の溶解物が調製され、溶解物の希釈物は、指示株に追加される。溶解物を有する指示株は、標準曲線を決定するために使用されるのと同一の条件下に入れられる。最小限に誘発を持続させる溶解物希釈物は、標準曲線と比較した場合に産生される量を定量的に決定するために使用することができる。
【００７６】
本明細書において使用される用語「モノオキシゲナーゼ活性」は、有機基質（ＲＨ）の中にＯ２に由来する１原子の酸素を挿入し、他の酸素原子を水に還元することを指す。いくつかの実施形態では、モノオキシゲナーゼ活性は、６炭素有機基質上への酸素原子の組込みを指す。ある実施形態では、モノオキシゲナーゼ活性は、６−ヒドロキシヘキサン酸へのヘキサノエートの変換を指す。モノオキシゲナーゼ活性は、ある実施形態では、シトクロムＰ４５０ポリペプチド（以下「ＣＹＰ４５０」）などの任意の適したポリペプチドによって提供することができる。ＣＹＰ４５０活性を与える核酸配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍを含む、多くの供給源から得ることができ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓを含むが、これらに限定されない生物において誘発されてもよい。ＣＹＰ４５０活性（たとえばＣＹＰ５２Ａ１５活性、ＣＹＰ５２Ａ１６活性、またはＣＹＰ５２Ａ１５活性およびＣＹＰ５２Ａ１６活性）を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を単離するために利用されるオリゴヌクレオチド配列の例は、本明細書において示される。いくつかの実施形態では、モノオキシゲナーゼ活性は、宿主微生物において改変されず、ある実施形態では、活性は、宿主微生物に比べて、工学的に作り出された微生物において追加されるまたは増加される。
【００７７】
シトクロムＰ４５０活性の存在、不在、または量は、当技術分野において公知の任意の適した方法によって検出することができる。たとえば、検出は、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ５２Ａファミリー）およびＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼを含有する反応をアッセイすることによって実行することができる（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６９巻：５９８３および５９９２頁を参照されたい）。手短かに言えば、細胞は標準的な条件下で成長させ、ミクロソームの産生について収集し、これは、ＣＹＰ活性を検出するために使用される。ミクロソームは、Ｔｒｉｓバッファースクロース（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５Ｍスクロース）中で細胞を溶解することによって調製される。分画遠心分離は、それぞれ、細胞細片、次いでミクロソームをペレットにするために、最初に２５，０００ｘｇで、次いで１００，０００ｘｇで実行される。ミクロソームペレットは、約１０ｍｇタンパク質／ｍＬの最終濃度に、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で再懸濁される。１ｍＬ中約０．３ｍｇのミクロソーム、０．１ｍＭヘキサン酸ナトリウム、０．７ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５を含有する反応混合物は、ＮＡＤＰＨの追加によって開始され、１０分間３７℃でインキュベートされる。反応は、０．２５ｍＬ  ５Ｍ  ＨＣｌの追加によって終了させ、０．２５ｍＬ  ２．５ｕｇ／ｍＬ  １０−ヒドロキシデカン酸は、内部標準（３．３ｎｍｏｌ）として追加される。混合物は、ＮａＣｌ飽和条件下で４．５ｍＬジエチルエーテルを用いて抽出される。有機相は新しい試験管に移され、乾燥するまで蒸発させる。残留物は、１０ｍＭ  ３−ブロモメチル−７−メトキシ−１，４−ベンゾオキサジン−２−オン（ＢｒＭＢ）およびＫ２ＣＯ３を用いて飽和されたアセトニトリル中０．１ｍＬの１５ｍｇ／ｍＬ  １８−クラウン−６を含有するアセトニトリル中に溶解される。溶液は、０．０５ｍＬ  ２％酢酸の追加の前に３０分間、４０℃でインキュベートされる。蛍光標識オメガヒドロキシ脂肪酸は、４３０ｎｍでの検出および３５５ｎｍでの励起と共にＨＰＬＣを介して分解される（Ｙａｍａｄａら、１９９１年、ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ  １９９巻：１３２〜１３６頁）。任意選択で、特異的に誘発されたＣＹＰ遺伝子（複数可）は、ノーザンブロッティングおよび／または定量ＲＴ−ＰＣＲによって検出されてもよい（Ｃｒａｆｔら、２００３年、ＡｐｐＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏ  ６９巻：５９８３〜５９９１頁）。
【００７８】
本明細書において使用される用語「モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性」は、電子移動連鎖を介しての、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＦＭＮ、またはＦＡＤからの電子の移動を指し、シトクロムＰ４５０の第二鉄ヘム鉄を鉄の状態に還元する。本明細書において使用される用語「モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性」はまた、電子伝達系を介しての第２の電子の移動を指すこともでき、二原子酸素付加物を負に荷電したペルオキソ基に還元する。いくつかの実施形態では、モノオキシゲナーゼ活性は、２電子供与体ＮＡＤ（Ｐ）ＨからシトクロムＰ４５０のヘムに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性を有するポリペプチドのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ結合ドメインに結合することができ、電子は、ＮＡＤ（Ｐ）ＨからＦＡＤおよびＦＭＮを通してモノオキシゲナーゼ活性のヘムに送り届けられ、それによって、活性モノオキシゲナーゼ活性（たとえばシトクロムＰ４５０）を再生成する共役ツーステップ反応において、電子を提供することができる（たとえばモノオキシゲナーゼ活性）。モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性は、ある実施形態では、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド（以下「ＣＰＲ」）などの任意の適したポリペプチドによって提供することができる。ＣＰＲ活性を与える核酸配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓを含むが、これらに限定されない、多くの供給源から得るおよび／またはこれらにおいて誘発することができる。ＣＰＲ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を単離するために利用されるオリゴヌクレオチド配列の例は、本明細書において示される。いくつかの実施形態では、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性は、宿主微生物において改変されず、ある実施形態では、活性は、宿主微生物に比べて、工学的に作り出された微生物において追加されるまたは増加される。
【００７９】
ＣＰＲ活性の存在、不在、または量は、当技術分野において公知の任意の適した方法によって検出することができる。たとえば、宿主微生物に比べて、ＣＰＲ活性をコードする遺伝子の数が増加した工学的に作り出された微生物は、定量核酸検出方法（たとえばサザンブロッティング、ＰＣＲ、プライマー伸長、その他同種のもの、およびその組合せ）を使用して検出することができる。宿主微生物に比べて、ＣＰＲ活性をコードする遺伝子の発現が増加した工学的に作り出された微生物は、定量発現ベースの分析（たとえばＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット解析、ノーザンブロット解析、その他同種のもの、およびその組合せ）を使用して検出することができる。代わりに、酵素アッセイは、シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を検出するために使用することができ、酵素活性は、基質溶液の５５０ナノメートルでの光学的吸光度を改変する（Ｍａｓｔｅｒｓ，  Ｂ．Ｓ．Ｓ．、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｃ．Ｈ．、Ｋａｍｉｎ，  Ｈ．（１９６７年）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｘ、５６５〜５７３頁）。
【００８０】
本明細書において使用される用語「脂肪アルコールオキシダーゼ活性」は、有機基質の中にＯ２に由来する１原子の酸素を挿入し、他の酸素原子を過酸化物に還元することを指す。脂肪アルコールオキシダーゼ活性はまた、時に、「長鎖アルコールオキシダーゼ活性」、「長鎖アルコール：酸素オキシドレダクターゼ活性」、「脂肪アルコール：酸素オキシドレダクターゼ活性」、および「長鎖脂肪酸オキシダーゼ活性」とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールオキシダーゼ活性は、６炭素有機基質上への酸素原子の組込みを指す。ある実施形態では、脂肪アルコールオキシダーゼ活性は、６−オキソヘキサン酸への６−ヒドロキシヘキサン酸の変換を指す。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールオキシダーゼ活性は、オメガオキソ脂肪酸へのオメガヒドロキシル脂肪酸の変換を指す。脂肪アルコールオキシダーゼ（ＦＡＯ）活性は、脂肪アルコールオキシダーゼペプチド、長鎖アルコールオキシダーゼペプチド、長鎖アルコール：酸素オキシドレダクターゼペプチド、脂肪アルコール：酸素オキシドレダクターゼペプチド、および長鎖脂肪酸オキシダーゼペプチドなどの任意の適したポリペプチドによって提供することができる。ＦＡＯ活性を与える核酸配列は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｌｏａｃａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａを含むが、これらに限定されない、多くの供給源から得ることができる。ＦＡＯ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列およびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の例は、本明細書において示される。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールオキシダーゼ活性は、宿主微生物において改変されず、ある実施形態では、活性は、宿主微生物に比べて、工学的に作り出された微生物において追加されるまたは増加される。
【００８１】
ＦＡＯ活性の存在、不在、または量は、当技術分野において公知の任意の適した方法によって検出することができる。たとえば、宿主微生物に比べて、ＦＡＯ活性をコードする遺伝子の数が増加した工学的に作り出された微生物は、定量核酸検出方法（たとえばサザンブロッティング、ＰＣＲ、プライマー伸長、その他同種のもの、およびその組合せ）を使用して検出することができる。宿主微生物に比べて、ＦＡＯ活性をコードする遺伝子の発現が増加した工学的に作り出された微生物は、定量発現ベースの分析（たとえばＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット解析、ノーザンブロット解析、その他同種のもの、およびその組合せ）を使用して検出することができる。代わりに、酵素アッセイは、Ｅｉｒｉｃｈら、２００４年において記載されるようにまたは本明細書における実施例において修飾されるように、脂肪アルコールオキシダーゼ活性を検出するために使用することができる。
【００８２】
本明細書において使用される用語「アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性」は、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ脂肪アルコールへの長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡの酸化を指す。いくつかの実施形態では、アシル−ＣｏＡ活性は、ペルオキシソームに由来する。ある実施形態では、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、ＰＯＸポリペプチドによって実行されるペルオキシソームアシル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＰＯＸ）活性である。いくつかの実施形態では、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、宿主生物によってコードされ、時に、工学的に作り出された生物を生成するために改変されてもよい。アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性はＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓのＰＯＸ４遺伝子およびＰＯＸ５遺伝子によってコードされる。ある実施形態では、内因性のアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、増加させることができる。いくつかの実施形態では、ＰＯＸ４ポリペプチドまたはＰＯＸ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、互いに独立して改変されてもよい（たとえば、ＰＯＸ４のみおよびＰＯＸ５のみの活性を増加させる、一方を増加させ、かつ他方を破壊する、ならびにその他同種のもの）。他方のＰＯＸ活性の活性を破壊しながらの、一方のＰＯＸ活性の増加は、ある実施形態では、ベータ酸化経路を通して全体的なフラックスを維持しながらまたは増加させながら、炭素鎖長に関してのアシル−ＣｏＡオキシダーゼの比活性を改変してもよい。
【００８３】
図１５Ａ〜１５Ｃは、特異的な鎖長の供給材料によって誘発された、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓの様々な株における、タンパク質１ミリグラム当たりの単位（Ｕ）（Ｙ軸）として表現したアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性の単位を図面で示す（Ｐｉｃａｔａｇｇｉｏら  １９９１年  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１巻：４３３３〜４３３９頁）。単離タンパク質は、様々な長さの炭素鎖（Ｘ軸）を使用して、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性についてアッセイした。図１５Ａ〜１５ＣにおけるＸ軸およびＹ軸は、実質的に同様のデータを表す。図１５Ａは、ＰＯＸ遺伝子の完全な補足物を有する株において測定されるアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を示す（たとえば、ＰＯＸ４およびＰＯＸ５は活性である）。図１５Ｂは、破壊されたＰＯＸ５遺伝子を有する株において測定されるアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を示す。機能的なＰＯＸ４遺伝子によってコードされる活性は、より短い炭素鎖長（たとえば１０炭素未満）のアシル−ＣｏＡ分子に対してより高い比活性を示す。ＰＯＸ５破壊株の結果はまた、図１５Ｂの表においても数的に示す。図１５Ｃは、破壊されたＰＯＸ４遺伝子を有する株において測定されるアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を示す。機能的なＰＯＸ５遺伝子によってコードされる活性は、長さが１２炭素のアシル−ＣｏＡ分子に対して、狭いピークの高い比活性を示し、長さが１０炭素の分子に対する比活性はより低い。ＰＯＸ４破壊株の結果は、図１５Ｃの表において数的に示す。
【００８４】
ある実施形態では、ＰＯＸ遺伝子のうちの１つの宿主アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、産生されるポリペプチドの量を遺伝子的に改変する（たとえば増加させる）ことによって増加させることができる（たとえば、強力に転写されるまたは恒常的に発現される異種のプロモーターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの作動可能な連結で、導入される；ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させる（たとえばポリヌクレオチドを含むプラスミドの導入、宿主ゲノム中へのさらなるコピーの統合によって））。いくつかの実施形態では、宿主アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子の破壊によって（たとえばノックアウト、挿入突然変異誘発、その他同種のもの、およびその組合せ）またはアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子を転写するプロモーターの活性を減少させることによって（たとえばプロモーターもしくは５’ＵＴＲへのリプレッサー配列の追加）、減少させることができる。
【００８５】
上記に述べられるように、ＰＯＸ４、ＰＯＸ５、またはＰＯＸ４およびＰＯＸ５をコードするヌクレオチド配列の破壊は、時に、種々の長さの炭素鎖（たとえば、長さが約１〜約６０炭素の脂肪アルコール、脂肪酸、パラフィン、ジカルボン酸を含む炭素鎖）の代謝に関して、経路の効率、特異性、および／または比活性を改変することができる。いくつかの実施形態では、ＰＯＸ４、ＰＯＸ５、またはＰＯＸ４およびＰＯＸ５のヌクレオチド配列は、選択マーカーをコードするＵＲＡ３ヌクレオチド配列を用いて破壊し、宿主微生物に導入し、それによって、ＰＯＸ４、ＰＯＸ５、またはＰＯＸ４およびＰＯＸ５の活性が欠損した工学的に作り出された生物が生成される。ＰＯＸ４およびＰＯＸ５をコードする核酸配列は、たとえば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓを含む多くの供給源から得ることができる。ＰＯＸ４およびＰＯＸ５のアミノ酸配列ならびにポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の例は、本明細書において示される。
【００８６】
ＰＯＸ４および／またはＰＯＸ５の活性の存在、不在、または量は、当技術分野において公知の任意の適した方法によって検出することができる。たとえば、Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９７９年において記載され、実施例において本明細書において記載される酵素アッセイを使用して。あるいは、天然のおよび／または破壊されたＰＯＸ４およびＰＯＸ５の配列を表す核酸配列はまた、核酸検出方法（たとえばＰＣＲ、プライマー伸長、核酸ハイブリダイゼーション、その他同種のもの、およびその組合せ）または定量発現ベースの分析（たとえばＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット解析、ノーザンブロット解析、その他同種のもの、およびその組合せ）を使用して検出することができ、工学的に作り出された生物は、宿主生物と比較して、減少したＲＮＡおよび／またはポリペプチドレベルを示す。
【００８７】
本明細書において使用される用語「チオエステラーゼ活性」は、ヘキサノエートからの補酵素Ａの除去を指す。チオエステラーゼ活性は、ポリペプチドによって提供することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、宿主微生物に導入された異種のヌクレオチド配列によってコードされる。チオエステラーゼ活性を与える核酸配列は、Ｃｕｐｈｅａ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａを含む多くの供給源から得ることができる。そのようなポリペプチドの例は、限定を伴うことなく、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）のワールドワイドウェブユニフォームリソースロケーター（ＵＲＬ）ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで受託番号ＣＡＢ６０８３０によって参照されるヌクレオチド配列によってコードされる、Ｃｕｐｈｅａ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａに由来するアシル−（ＡＣＰ）チオエステラーゼＢ型を含む。
【００８８】
チオエステラーゼ活性の存在、不在、または量は、当技術分野において公知の任意の適した方法によって検出することができる。そのような方法の例は、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９巻：９８１〜９８８頁において記載されている。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼ活性は、宿主微生物において改変されず、ある実施形態では、活性は、宿主微生物に比べて、工学的に作り出された微生物において追加されるまたは増加される。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドは、他のポリペプチド（たとえばヘキサノエートシンターゼＡまたはヘキサノエートシンターゼＢのポリペプチド）に連結される。チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドについてのアミノ酸配列（一文字コード配列）の非限定的な例は、以下に提供される。
【００８９】
【化１】
2012531903.tif 000002
本明細書において使用される用語「モノオキシゲナーゼ活性による実質的なヘキサノエート使用をもたらす遺伝子修飾」は、ヘキサノエートを他の産物に変換する内因性の活性を低下させる、宿主微生物の遺伝子改変を指す。いくつかの実施形態では、ヘキサノエートを毒素（たとえば真菌において）に変換する内因性の活性を低下させる。ある実施形態では、ポリケチドシンターゼ活性を低下させる。そのような改変は、アジピン酸などの最終産物の収量を有利に増加させることができる。
【００９０】
本明細書において使用される用語「ポリケチドシンターゼ活性」は、マイコトキシンを含む他の産物の産生における１ステップとしての、ポリケチドシンターゼ酵素（ＰＫＳ）によるヘキサン酸の改変を指す。ＰＫＳ活性は、ポリペプチドによって提供することができる。そのようなポリペプチドの例は、限定を伴うことなく、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のワールドワイドウェブユニフォームリソースロケーター（ＵＲＬ）ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで受託番号ＡＡＳ６６００４によって参照されるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ酵素を含む。ある実施形態では、ＰＫＳ酵素は、基質としてヘキサノエートシンターゼによって生成されるヘキサン酸およびミトキシンを含む様々な産物の合成に関与する、密接に関連する遺伝子クラスターであるアスペルギルス属ＮｏｒＳ多酵素複合体の構成要素を使用する。したがって、ＰＫＳ活性は、時に、工学的に作り出されたアジピン酸経路用にヘキサン酸を解放するために改変される。いくつかの実施形態では、ＰＫＳ活性は、減らされるまたはブロックされる。ある実施形態では、ＰＫＳ酵素はＰＫＳ活性の代わりにチオエステラーゼ活性を用いるために遺伝子操作される。ＰＫＳ活性の存在、不在、または量は、Ｗａｔａｎａｂｅ  ＣおよびＴｏｗｎｓｅｎｄ  Ｃ（２００２年）Ｉｎｉｔｉａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ＮｏｒＳ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｆｌａｔｏｘｉｎ  Ｂ１．  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９巻：９８１〜９８８頁において記載されるものなどの、当技術分野において公知の任意の適した方法によって検出することができる。
【００９１】
ポリケチドシンターゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列（一文字コード配列）の非限定的な例は、以下に提供される。
【００９２】
【化２】
2012531903.tif 000003
本明細書において使用される用語「６−ヒドロキシヘキサン酸変換を低下させる遺伝子修飾」または「オメガヒドロキシル脂肪酸変換を低下させる遺伝子修飾」は、６−ヒドロキシヘキサン酸を他の産物に変換する内因性の活性を低下させる、宿主微生物の遺伝子改変を指す。いくつかの実施形態では、内因性の６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させる。そのような改変は、６−ヒドロキシヘキサン酸の量を有利に増加させることができ、これは、精製し、さらに処理することができる。
【００９３】
本明細書において使用される用語「ベータ酸化活性を低下させる遺伝子修飾」は、有機分子を含有するカルボン酸のベータ炭素を酸化する内因性の活性を低下させる、宿主微生物の遺伝子改変を指す。ある実施形態では、有機分子は、６炭素分子であり、時に、分子（たとえばアジピン酸）の末端に位置する１つまたは２つのカルボン酸部分を含有する。そのような改変は、アジピン酸などの最終産物の収量を有利に増加させることができる。
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
核酸（たとえば、核酸試薬、標的核酸、標的ヌクレオチド配列、対象の核酸配列、または対象の核酸領域とも本明細書において呼ばれる）は、たとえばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ＲＮＡｉ、ｔＲＮＡ、またはｍＲＮＡなどの任意の供給源または組成物からのものとすることができ、任意の形態（たとえば直鎖状、環状、スーパーコイル、一本鎖、二本鎖、およびその他同種のもの）とすることができる。核酸はまた、ＤＮＡアナログまたはＲＮＡアナログを含むことができる（たとえば塩基アナログ、糖アナログ、および／または非天然主鎖、ならびにその他同種のものを含有する）。用語「核酸」は、特異的な長さのポリヌクレオチド鎖を指さないまたは暗示しないことが理解され、したがって、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドもまた、定義に含まれる。デオキシリボヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、およびデオキシチミジンを含む。ＲＮＡについては、ウラシル塩基は、ウリジンである。
【００９４】
核酸は、時に、複製することができるまたは宿主細胞において複製されるプラスミド、ファージ、自己複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、人工染色体、酵母人工染色体（たとえばＹＡＣ）、または他の核酸である。ある実施形態では、核酸は、ライブラリーからのものとすることができ、対象の生物に由来する酵素により消化された、剪断された、または超音波処理されたゲノムＤＮＡ（たとえば断片化された）から得ることができる。いくつかの実施形態では、断片化または切断にかけられた核酸は、約５〜約１０，０００塩基対、約１００〜約１，０００塩基対、約１００〜約５００塩基対、または約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、もしくは１００００塩基対の基準の、平均的な、または平均の長さを有していてもよい。断片は、当技術分野における任意の適した方法によって生成することができ、核酸断片の平均的な、平均の、または基準の長さは、当業者によって適切な断片生成手順を選択することによって制御することができる。いくつかの実施形態では、断片化されたＤＮＡは、特定のサイズ範囲の核酸断片を得るために選択されたサイズとすることができる。
【００９５】
核酸は、限定を伴うことなく、物理的な、化学的な、および酵素によるプロセスを含む、当業者に公知の様々な方法によって断片化することができる。そのようなプロセスの例は、米国特許出願第２００５０１１２５９０号（２００５年５月２６日に公開され、「Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」と題され、Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｏｏｍらを指定する）において記載されている。ある種のプロセスは、非特異的に切断された断片または特異的に切断された断片を生成するために当業者によって選択することができる。非特異的に切断された断片の試料核酸を生成することができるプロセスの例は、限定を伴うことなく、剪断力に核酸を曝露する装置と試料核酸を接触させること（たとえば、核酸を注射器針に通過させること；フレンチプレスの使用）；照射に試料核酸を曝露すること（たとえばガンマ線、Ｘ線、ＵＶ照射；断片サイズは照射強度によって制御することができる）；水中で核酸を煮沸すること（たとえば約５００塩基対断片を得る）、ならびに酸および塩基の加水分解プロセスに核酸を曝露することを含む。
【００９６】
核酸は、１つ以上の特異的な切断作用物質と核酸を接触させることによって特異的に切断されてもよい。本明細書において使用される用語「特異的な切断作用物質」は、作用物質、時に、１つ以上の特異的な部位で核酸を切断することができる化学物質または酵素を指す。特異的な切断作用物質は、多くの場合、特定の部位の特定のヌクレオチド配列に従って特異的に切断するであろう。酵素特異的切断作用物質の例は、限定を伴うことなく、エンドヌクレアーゼ（たとえばＤＮアーゼ（たとえばＤＮアーゼＩ、ＩＩ）；ＲＮアーゼ（たとえばＲＮアーゼＥ、Ｆ、Ｈ、Ｐ）；Ｃｌｅａｖａｓｅ（商標）酵素；Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩおよび真核生物構造特異的エンドヌクレアーゼ；マウスＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ；Ａｃｃ  Ｉ、Ａｆｌ  ＩＩＩ、Ａｌｕ  Ｉ、Ａｌｗ４４  Ｉ、Ａｐａ  Ｉ、Ａｓｎ  Ｉ、Ａｖａ  Ｉ、Ａｖａ  ＩＩ、ＢａｍＨ  Ｉ、Ｂａｎ  ＩＩ、Ｂｃｌ  Ｉ、Ｂｇｌ  Ｉ、Ｂｇｌ  ＩＩ、Ｂｌｎ  Ｉ、Ｂｓｍ  Ｉ、ＢｓｓＨ  ＩＩ、ＢｓｔＥ  ＩＩ、Ｃｆｏ  Ｉ、ＣＩａ  Ｉ、Ｄｄｅ  Ｉ、Ｄｐｎ  Ｉ、Ｄｒａ  Ｉ、ＥｃＩＸ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉ、ＥｃｏＲ  ＩＩ、ＥｃｏＲ  Ｖ、Ｈａｅ  ＩＩ、Ｈａｅ  ＩＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｈｐａ  Ｉ、Ｈｐａ  ＩＩ、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｋｓｐ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ、ＭＩｕＮ  Ｉ、Ｍｓｐ  Ｉ、Ｎｃｉ  Ｉ、Ｎｃｏ  Ｉ、Ｎｄｅ  Ｉ、Ｎｄｅ  ＩＩ、Ｎｈｅ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｎｒｕ  Ｉ、Ｎｓｉ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｐｖｕ  Ｉ、Ｐｖｕ  ＩＩ、Ｒｓａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉ、Ｓａｕ３Ａ  Ｉ、Ｓｃａ  Ｉ、ＳｃｒＦ  Ｉ、Ｓｆｉ  Ｉ、Ｓｍａ  Ｉ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ｓｐｈ  Ｉ、Ｓｓｐ  Ｉ、Ｓｔｕ  Ｉ、Ｓｔｙ  Ｉ、Ｓｗａ  Ｉ、Ｔａｑ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｘｈｏ  ＩなどのＩ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ）；グリコシラーゼ（たとえばウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ｇｌｙｃｏｌｓｙｌａｓｅ）（ＵＤＧ）、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼＩＩ、ピリミジン水和物−ＤＮＡグリコシラーゼ、ＦａＰｙ−ＤＮＡグリコシラーゼ、チミンミスマッチ−ＤＮＡグリコシラーゼ、ヒポキサンチン−ＤＮＡグリコシラーゼ、５−ヒドロキシメチルウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＨｍＵＤＧ）、５−ヒドロキシメチルシトシンＤＮＡグリコシラーゼ、または１，Ｎ６−エテノ−アデニンＤＮＡグリコシラーゼ）；エキソヌクレアーゼ（たとえばエキソヌクレアーゼＩＩＩ）；リボザイム、ならびにＤＮＡザイムを含む。試料核酸は、化学薬品を用いて処理されてもよくまたは修飾されたヌクレオチドを使用して合成されてもよく、修飾された核酸は、切断されてもよい。非限定的な例では、試料核酸は、（ｉ）アルキルプリンＤＮＡグリコシラーゼによって認識され、切断されるＮ３−メチルアデニンおよびＮ３−メチルグアニンを含む、いくつかのアルキル化塩基を生成する、メチルニトロソ尿素などのアルキル化剤；（ｉｉ）ＤＮＡのシトシン残基の脱アミノを引き起こし、ウラシルＮ−グリコシラーゼによって切断することができるウラシル残基を形成する亜硫酸水素ナトリウム；ならびに（ｉｉｉ）グアニンを、ホルムアミドピリミジンＤＮＡ  Ｎ−グリコシラーゼによって切断することができるその酸化形態、８−ヒドロキシグアニンに変換する化学薬品を用いて処理されてもよい。化学的な切断プロセスの例は、限定を伴うことなく、アルキル化（たとえばホスホロチオエート修飾核酸のアルキル化）；Ｐ３’−Ｎ５’−ホスホロアミデート含有核酸の酸不安定性の切断；ならびに核酸の四酸化オスミウムおよびピペリジン処理を含む。
【００９７】
本明細書において使用される用語「相補的な切断反応」は、同じ標的または参照核酸もしくはタンパク質の代替切断パターンが生成されるように、種々の切断試薬を使用してまたは同じ切断試薬の切断特異性を改変することによって同じ核酸に対して実行される切断反応を指す。ある実施形態では、対象の核酸は、１つ以上の反応器において（たとえば、対象の核酸は、別々の容器中でそれぞれの特異的な切断作用物質を用いて処理される）、１つ以上の特異的な切断作用物質（たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の特異的な切断作用物質）を用いて処理されてもよい。
【００９８】
本明細書において記載される実施形態において使用されるのに適した核酸は、時に、当技術分野において公知の任意の増幅プロセスによって増幅される（たとえばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、およびその他同種のもの）。培養するのが典型的に難しい生物を使用する場合（たとえば遅い成長、特殊な培養条件を必要とする、およびその他同種のもの）、核酸増幅は特に有益であるかもしれない。本明細書において使用される用語「増幅する」、「増幅」、「増幅反応」、または「増幅すること」は、核酸の標的配列のコピーを増倍するための任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセスを指す。増幅は、時に、標的核酸における「指数関数的な」増加を指す。しかしながら、本明細書において使用される「増幅すること」はまた、核酸の選択される標的配列の数の線形増加を指してもよいが、一度だけの単一プライマーによる伸長ステップと異なる。いくつかの実施形態では、プレ増幅としても公知である限られた増幅反応を実行することができる。プレ増幅は、実行されている少数のサイクル、たとえば１０サイクルにより、限られた量の増幅が生じる方法である。プレ増幅は、いくらかの増幅を可能にすることができるが、対数期前に増幅を停止し、典型的に、約５００コピーの所望のヌクレオチド配列を産生する。プレ増幅の使用はまた、標準的なＰＣＲ反応における、枯渇した反応物と関連する誤りを制限するかもしれない。
【００９９】
いくつかの実施形態では、核酸試薬は、時に、宿主生物の染色体の中に安定して統合されるまたは核酸試薬は、ある実施形態では、宿主染色体の一部の欠失部分とすることができる（たとえば、宿主ゲノムの改変が、遺伝子修飾を運ぶ所望の生物を選択的にまたは優先的に維持する能力を与える、遺伝子的に修飾された生物）。そのような核酸試薬（たとえば、核酸または改変されたゲノムが生物に選択可能な形質を与える遺伝子的に修飾された生物）は、所望のタンパク質または核酸分子の産生を誘導するそれらの能力について選択することができる。所望の場合、核酸試薬は、コドンが、（ｉ）天然の配列において指定されるものとは異なるｔＲＮＡを使用する同じアミノ酸または（ｉｉ）特殊なもしくは非天然のアミノ酸を含む、通常とは異なるアミノ酸（検出可能に標識されたアミノ酸を含む）をコードするように改変することができる。本明細書において記載されるように、用語「天然の配列」は、その自然環境において見つけられるような非修飾ヌクレオチド配列（たとえば、生物中に見つかるようなヌクレオチド配列）を指す。
【０１００】
核酸または核酸試薬は、核酸の意図される使用に従って多くの場合選択される、ある種のエレメントを含むことができる。以下のエレメントのいずれも、核酸試薬中に含むことができるまたはそれから除外することができる。核酸試薬は、たとえば、１つもしくは複数のまたはすべての以下のヌクレオチドエレメントを含んでいてもよい：１つ以上のプロモーターエレメント、１つ以上の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、標的ヌクレオチド配列が挿入されてもよい１つ以上の領域（「挿入エレメント」）、１つ以上の標的ヌクレオチド配列、１つ以上の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、および１つ以上の選択エレメント。核酸試薬は、１つ以上のそのようなエレメントと共に提供することができ、他のエレメントは、核酸が所望の生物の中に導入される前に、核酸の中に挿入されてもよい。いくつかの実施形態では、提供される核酸試薬は、プロモーター、５’ＵＴＲ、任意選択の３’ＵＴＲ、およびそれによって標的ヌクレオチド配列が核酸試薬の中に挿入される（つまりクローニングされる）挿入エレメントを含む。ある実施形態では、提供される核酸試薬は、プロモーター、挿入エレメント、および任意選択の３’ＵＴＲを含み、５’ＵＴＲ／標的ヌクレオチド配列は、任意選択の３’ＵＴＲと共に挿入される。エレメントは、選ばれた発現系における発現（たとえば、選ばれた生物における発現またはたとえば無細胞系における発現）のために、任意の適した順で配置することができ、いくつかの実施形態では、核酸試薬は、５’から３’方向に以下のエレメントを含む：（１）プロモーターエレメント、５’ＵＴＲ、および挿入エレメント（複数可）；（２）プロモーターエレメント、５’ＵＴＲ、および標的ヌクレオチド配列；（３）プロモーターエレメント、５’ＵＴＲ、挿入エレメント（複数可）、および３’ＵＴＲ；ならびに（４）プロモーターエレメント、５’ＵＴＲ、標的ヌクレオチド配列、および３’ＵＴＲ。
【０１０１】
プロモーターエレメントは、典型的に、ＤＮＡ合成および／またはＲＮＡ合成に必要とされる。プロモーターエレメントは、多くの場合、遺伝子に対応するＲＮＡの合成のための開始部位を提供することによって、特定の遺伝子の転写を促進することができるＤＮＡの領域を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、一般に、それらが調節する遺伝子の近くにあり、遺伝子の上流（たとえば遺伝子の５’側）に位置し、ＤＮＡの遺伝子のセンス鎖と同じ鎖上にある。いくつかの実施形態では、プロモーターエレメントは、遺伝子または生物から単離し、改変されたおよび／または調節された発現を可能にするためにポリヌクレオチド配列と機能的に関連して挿入することができる。核酸の発現に使用される非天然プロモーター（たとえば、通常、所与の核酸配列と関連しないプロモーター）は、多くの場合、異種のプロモーターと呼ばれる。ある実施形態では、異種のプロモーターおよび／または５’ＵＴＲは、本明細書において記載される所望の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関係して挿入することができる。プロモーターに関して本明細書において使用される用語「作動可能に連結される」および「〜と機能的に関係する」は、コード化配列とプロモーターエレメントとの間の関係を指す。転写を介してのコード化配列からの発現がプロモーターエレメントによって調節されるまたは制御される場合、プロモーターは、コード化配列に作動可能に連結されているまたは機能的に関係している。用語「作動可能に連結される」および「〜と機能的に関係する」は、プロモーターエレメントに関して区別なく本明細書において利用される。
【０１０２】
プロモーターは、多くの場合、ＲＮＡポリメラーゼと相互作用する。ポリメラーゼは、先在する核酸試薬を使用する核酸の合成を触媒する酵素である。鋳型がＤＮＡ鋳型である場合、ＲＮＡ分子は、タンパク質が合成される前に転写される。本方法において使用するのに適したポリメラーゼ活性を有する酵素は、タンパク質を合成するための選ばれた鋳型と共に、選ばれた系において活性な任意のポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターエレメントとしても本明細書において呼ばれるプロモーター（たとえば異種のプロモーター）は、ヌクレオチド配列またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結することができる。プロモーターエレメントからの転写は、プロモーターに作動可能に連結されるヌクレオチド配列またはＯＲＦ配列に対応するＲＮＡの合成を触媒することができ、これは、次には所望のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の合成に至る。
【０１０３】
プロモーターエレメントは、時に、調節性の制御に対して応答性を示す。プロモーターエレメントはまた、時に、選択的な作用物質によって調節することもできる。すなわち、プロモーターエレメントからの転写は、時に、環境上の、栄養上の、または内部の条件またはシグナルにおける変化に応じてオンにする、オフにする、アップレギュレートする、またはダウンレギュレートすることができる（たとえば熱誘発性プロモーター、光調節プロモーター、フィードバック調節プロモーター、ホルモンにより影響を及ぼされるプロモーター、組織特異的プロモーター、酸素およびｐＨにより影響を及ぼされるプロモーター、たとえば選択的な作用物質（たとえばカナマイシン）に対して応答性のプロモーター、ならびにその他同種のもの）。環境上の、栄養上の、または内部のシグナルによって頻繁に影響を及ぼされるプロモーターは、プロモーターにまたはその近くに結合し、ある種の条件下で標的配列の発現を増加させるまたは減少させるシグナル（直接的または間接的）によって影響を及ぼされる。
【０１０４】
本明細書において記載される実施形態において使用されるプロモーターエレメントからの転写に影響を及ぼすことができる、選択的なまたは調節性の作用物質の非限定的な例は、限定を伴うことなく、（１）そうでなければ毒性の化合物に対する抵抗性を提供する産物をコードする核酸セグメント（たとえば抗生物質）；（２）そうでなければレシピエント細胞において欠けている産物をコードする核酸セグメント（たとえば必須の産物、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）；（３）遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードする核酸セグメント；（４）容易に同定することができる産物をコードする核酸セグメント（たとえば、抗生物質（たとえばβ−ラクタマーゼ）、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、および細胞表面タンパク質などの表現型マーカー）；（５）そうでなければ細胞生存および／もしくは機能に有害な産物に結合する核酸セグメント；（６）上記の１〜５において記載される核酸セグメントのいずれかの活性をそうでなければ阻害する核酸セグメント（たとえばアンチセンスオリゴヌクレオチド）；（７）基質を修飾する産物（たとえば制限エンドヌクレアーゼ）に結合する核酸セグメント；（８）所望の分子を単離するもしくは同定するために使用することができる核酸セグメント（たとえば特異的タンパク質結合部位）；（９）そうでなければ非機能的になり得る特異的なヌクレオチド配列をコードする核酸セグメント（たとえば分子のサブ集団のＰＣＲ増幅のための）；（１０）不在の場合、特定の化合物に対する抵抗性もしくは感受性を直接もしくは間接的に与える核酸セグメント；（１１）レシピエント細胞において毒性の産物をコードするもしくは比較的非毒性の化合物を毒性化合物に変換する核酸セグメント（たとえばＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）；（１２）それらを含有する核酸分子の複製、分配、もしくは遺伝力を阻害する核酸セグメント；ならびに／または（１３）条件的な複製機能、たとえば、ある種の宿主もしくは宿主細胞株におけるまたはある種の環境条件（たとえば温度、栄養状態、およびその他同種のもの）下での複製をコードする核酸セグメントを含む。いくつかの実施形態では、調節性のまたは選択的な作用物質は、生物がさらされている既存の増殖条件を変化させるために追加することができる（たとえば、たとえば液体培養物における成長、発酵槽における成長、固体栄養プレート上での成長、およびその他同種のもの）。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、プロモーターエレメントの調節は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の活性（たとえば、たとえば酵素活性）を改変する（たとえば増加させる、追加する、減少させる、実質的に排除する）ために使用することができる。たとえば、ある実施形態では、微生物は、新規な活性（たとえば宿主生物において通常見つからない活性）を追加することができる核酸試薬を発現するためにまたは対象のヌクレオチド配列（たとえば対象の同種もしくは異種のヌクレオチド配列）に作動可能に連結された同種もしくは異種のプロモーターからの転写を増加させることによって既存の活性の発現を増加させるために、遺伝子修飾によって遺伝子操作することができる。いくつかの実施形態では、微生物は、ある実施形態では対象のヌクレオチド配列に作動可能に連結された同種もしくは異種のプロモーターからの転写を減少させるもしくは実質的に排除することによって、活性の発現を減少させることができる核酸試薬を発現するために遺伝子修飾によって遺伝子操作することができる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、活性は、当業者に公知の組換えＤＮＡおよび遺伝学的技術を使用して改変することができる。微生物を遺伝子操作するための方法は、本明細書においてさらに記載される。本明細書における表は、酸素によってアップレギュレートされる酵母プロモーター、酸素によってダウンレギュレートされる酵母プロモーター、酵母転写リプレッサーおよびそれらの関連する遺伝子、ＭＥＭＥ配列分析ソフトウェアを使用して決定されるＤＮＡ結合モチーフの非限定的なリストを提供する。潜在的なレギュレーター結合モチーフは、不釣合いに多い配列に対してレギュレーターが結合する遺伝子間領域を検索するために、プログラムＭＥＭＥを使用して同定することができる。それぞれのレギュレーターについて、０．００１未満のｐ値で結合する遺伝子間領域の配列は、モチーフ発見用に入力として使用するために抽出された。ＭＥＭＥソフトウェアは、以下の設定を使用して実行された：６〜１８塩基の範囲のモチーフ幅、「ｚｏｏｐｓ」分配モデル、第６次Ｍａｒｋｏｖバックグラウンドモデル、および２０モチーフのディスカバリーリミット。発見された配列モチーフは、２つの基準によって有意性についてスコア化された：ＭＥＭＥによって計算されるＥ値および特異性スコア。それぞれの計量を使用する最良のスコアを有するモチーフが、それぞれのレギュレーターについて示される。示されたモチーフはすべて、ガラクトース中で成長させたエピトープタグ付きＧａｌ４について以前に公開されたデータセットを例外として、豊富な増殖条件において生成されたデータセットに由来する。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、改変された活性は、活性における所望の変化について選択する条件下で生物をスクリーニングすることによって見つけることができる。たとえば、ある種の微生物は、代謝が不十分であるまたはさらに毒性である物質を含有する培地上で問題の生物を選択またはスクリーニングすることによって、活性を増加させるまたは減少させるために適応させることができる。通常代謝が不十分である物質上で生物が成長する能力の増加は、たとえば、その物質上での成長速度の増加をもたらすであろう。毒性物質に対する感受性の減少は、たとえば、より高濃度の毒性物質上での成長によって明らかになるかもしれない。このように同定される遺伝子修飾は、時に、天然に存在する突然変異と呼ばれるまたはそれらを運ぶ生物は、時に、天然に存在する突然変異体と呼ぶことができる。このように得られた修飾は、プロモーター配列における改変に限定されない。すなわち、上記に記載されるように、選択圧による微生物のスクリーニングは、非プロモーター配列において生じ得、対象のヌクレオチド配列ではないが関連するヌクレオチド配列（たとえば同じ経路の異なるステップに関与する遺伝子、輸送遺伝子、およびその他同種のもの）中にある配列においても生じ得る、遺伝子改変を得ることができる。いくつかの実施形態では、天然に存在する突然変異体は、時に、特有の環境から天然に存在する変異体を単離することによって見つけることができる。
【０１０８】
本明細書において提供される調節プロモーター配列、調節性配列、および、コード化ポリヌクレオチドに加えて、核酸試薬は、先のものと（または相補的配列と）８０％以上同一のポリヌクレオチド配列を含んでいてもよい。すなわち、本明細書において記載されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上同一のヌクレオチド配列を利用することができる。本明細書において使用される用語「同一の」は、互いに比較された場合に、同じヌクレオチド配列を実質的に有する２つ以上のヌクレオチド配列を指す。２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が実質的に同一かどうかを決定するための１つの試験は、共有される同一のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のパーセントを決定することである。
【０１０９】
配列同一性の計算は、以下のように実行することができる。配列は、最適な比較目的のためにアライメントされる（たとえば、ギャップは、最適なアライメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入することができ、非相同性の配列は比較目的のために無視することができる）。比較目的のためにアライメントされた参照配列の長さは、時に、参照配列の長さの３０％以上、４０％以上、５０％以上、多くの場合６０％以上、より多くの場合７０％以上、８０％以上、９０％以上、または１００％である。次いで、対応するヌクレオチドまたはポリペプチドの位置のヌクレオチドまたはアミノ酸は、それぞれ、２つの配列の間で比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じヌクレオチドまたはアミノ酸によって占められる場合、ヌクレオチドまたはアミノ酸は、その位置で同一であると考えられる。２つの配列の間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアライメントのために導入されたギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【０１１０】
配列の比較および２つの配列の間のパーセント同一性の決定は、数学的なアルゴリズムを使用して達成することができる。２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用し、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）の中に組み込まれているＭｅｙｅｒｓ  ＆  Ｍｉｌｌｅｒ、ＣＡＢＩＯＳ  ４巻：１１〜１７頁（１９８９年）のアルゴリズムを使用して決定することができる。また、２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５、または６の長さウェイトを使用し、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるギャッププログラム（ｈｔｔｐアドレスｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）の中に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８巻：４４４〜４５３頁（１９７０年）アルゴリズムを使用して決定することもできる。２つのヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０、または８０のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５、または６の長さウェイトを使用し、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるギャッププログラム（ｈｔｔｐアドレスｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）を使用して決定することができる。多くの場合使用されるパラメータのセットは、１２のギャップオープンペナルティー、４のギャップエクステンドペナルティー、および５のフレームシフトギャップペナルティーを用いるＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックスである。
【０１１１】
配列同一性はまた、ストリンジェントな条件下で行われるハイブリダイゼーションアッセイによって決定することができる。本明細書において使用されるように、用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を指す。ストリンジェントな条件は、当業者らに公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．、６．３．１〜６．３．６頁（１９８９年）において見つけることができる。水性および非水性の方法は、その参考文献において記載されており、どちらも使用することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、その後に続く、５０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の他の例は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、その後に続く、５５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、その後に続く、６０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。多くの場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、その後に続く、６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。より多くの場合、ストリンジェンシー条件は、６５℃での０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、その後に続く、６５℃での０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄である。
【０１１２】
上記に述べられるように、核酸試薬はまた、１つ以上の５’ＵＴＲおよび１つ以上の３’ＵＴＲを含んでいてもよい。５’ＵＴＲは、それが起源とするヌクレオチド配列に対して内因性の１つ以上のエレメントを含んでいてもよく、時に、１つ以上の外因性のエレメントを含む。５’ＵＴＲは、たとえば任意の適した生物（たとえばウイルス、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、または哺乳動物）に由来するゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｍＲＮＡなどの、任意の適した核酸を起源とすることができる。当業者は、選ばれた発現系（たとえば、たとえば選ばれた生物における発現または無細胞系における発現）に基づいて、５’ＵＴＲに適切なエレメントを選択してもよい。５’ＵＴＲは、時に、当業者に公知の以下のエレメントの１つ以上を含む：エンハンサー配列（たとえば転写または翻訳）、転写開始部位、転写因子結合部位、翻訳調節部位、翻訳開始部位、翻訳因子結合部位、アクセサリータンパク質結合部位、フィードバック調節作用物質結合部位、プリブノーボックス、ＴＡＴＡボックス、−３５エレメント、Ｅ−ボックス（ヘリックス−ループ−ヘリックス結合エレメント）、リボソーム結合部位、レプリコン、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、サイレンサーエレメント、およびその他同種のもの。いくつかの実施形態では、プロモーターエレメントは、適した条件的な調節に必要な５’ＵＴＲエレメントがすべて、プロモーターエレメント断片中にまたはプロモーターエレメント断片の機能的なサブ配列内に含有されるように、単離されてもよい。
【０１１３】
核酸試薬における５’ＵＴＲは、翻訳エンハンサーヌクレオチド配列を含むことができる。翻訳エンハンサーヌクレオチド配列は、多くの場合、核酸試薬においてプロモーターおよび標的ヌクレオチド配列の間に位置する。翻訳エンハンサー配列は、多くの場合、リボソームに結合し、時に、１８Ｓ  ｒＲＮＡ結合リボヌクレオチド配列（つまり４０Ｓリボソーム結合配列）であり、時に、配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳは、一般に、多くの特異的な分子間相互作用を介して４０Ｓリボソームサブユニットに接触する正確に配置されたＲＮＡ三次構造を伴って、ＲＮＡ骨格を形成する。リボソームのエンハンサー配列の例は、公知であり、当業者によって同定することができる（たとえばＭｉｇｎｏｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３巻：Ｄ１４１〜Ｄ１４６頁（２００５年）；Ｐａｕｌｏｕｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１巻：７２２〜７３３頁（２００３年）；Ａｋｂｅｒｇｅｎｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２巻：２３９〜２４７頁（２００４年）；Ｍｉｇｎｏｎｅら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３巻（３号）：総説０００４．１〜０００１．１０頁（２００２年）；Ｇａｌｌｉｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０巻：３４０１〜３４１１頁（２００２年）；Ｓｈａｌｏｉｋｏら、ｈｔｔｐ  ａｄｄｒｅｓｓ  ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ，ＤＯＩ：１０．１００２／ｂｉｔ．２０２６７；およびＧａｌｌｉｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５巻：３２５７〜３２７３頁（１９８７年））。
【０１１４】
翻訳エンハンサー配列は、時に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列または他の配列（たとえばヒドロポリプ配列、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０７１２８）などの真核生物の配列である。翻訳エンハンサー配列は、時に、シャイン−ダルガルノコンセンサス配列などの原核生物の配列である。ある実施形態では、翻訳エンハンサー配列は、ウイルスヌクレオチド配列である。翻訳エンハンサー配列は、時に、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）；タバコエッチ病ウイルス（ＥＴＶ）；ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）；カブモザイク（ポティ）ウイルス、およびたとえばエンドウ種子伝染モザイクウイルスなどの植物ウイルスの５’ＵＴＲに由来する。ある実施形態では、ＴＭＶに由来する長さが約６７塩基のオメガ配列は、翻訳エンハンサー配列として核酸試薬中に含まれる（たとえば、グアノシンヌクレオチドがなく、２５ヌクレオチド長ポリ（ＣＡＡ）中心領域を含む）。
【０１１５】
３’ＵＴＲは、それが起源とするヌクレオチド配列に対して内因性の１つ以上のエレメントを含んでいてもよく、時に、１つ以上の外因性のエレメントを含む。３’ＵＴＲは、たとえば任意の適した生物（たとえばウイルス、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、または哺乳動物）に由来するゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｍＲＮＡなどの、任意の適した核酸を起源としてもよい。当業者は、選ばれた発現系（たとえば、たとえば選ばれた生物における発現）に基づいて、３’ＵＴＲに適切なエレメントを選択することができる。３’ＵＴＲは、時に、当業者に公知の以下のエレメントの１つ以上を含む：転写調節部位、転写開始部位、転写終結部位、転写因子結合部位、翻訳調節部位、翻訳終結部位、翻訳開始部位、翻訳因子結合部位、リボソーム結合部位、レプリコン、エンハンサーエレメント、サイレンサーエレメント、およびポリアデノシンテイル。３’ＵＴＲは、多くの場合、ポリアデノシンテイルを含み、また時に含まず、ポリアデノシンテイルが存在する場合、１つ以上のアデノシン部分は、追加されてもよいまたはそれから欠失させてもよい（たとえば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０のアデノシン部分は、追加されてもよいまたは削除されてもよい）。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲの修飾は、プロモーターの活性を改変する（たとえば増加させる、追加する、減少させる、または実質的に排除する）ために使用することができる。プロモーター活性の改変は、次には、修飾５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む、作動可能に連結されたプロモーターエレメントに由来する対象のヌクレオチド配列の転写の変化によって、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（たとえば、たとえば酵素活性）の活性を改変することができる。たとえば、ある実施形態では、微生物は、新規な活性（たとえば宿主生物において通常見つからない活性）を追加することができる、修飾５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む核酸試薬を発現するためにまたは対象のヌクレオチド配列（たとえば対象の同種もしくは異種のヌクレオチド配列）に作動可能に連結された同種もしくは異種のプロモーターからの転写を増加させることによって、既存の活性の発現を増加させるために遺伝子修飾によって遺伝子操作することができる。いくつかの実施形態では、微生物は、ある実施形態では対象のヌクレオチド配列に作動可能に連結された同種もしくは異種のプロモーターからの転写を減少させるもしくは実質的に排除することによって、活性の発現を減少させることができる、修飾５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む核酸試薬を発現するために遺伝子修飾によって遺伝子操作することができる。
【０１１７】
ヌクレオチド試薬は、時に、標的ヌクレオチド配列を含むことができる。本明細書において使用される「標的ヌクレオチド配列」は、対象の核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードし、リボヌクレオチド配列またはデオキシリボヌクレオチド配列であってもよい。標的核酸は、時に、非翻訳リボ核酸であり、時に、翻訳リボ核酸である。非翻訳リボ核酸は、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型リボ核酸（ｓｈＲＮＡ）、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が可能な他のリボ核酸、アンチセンスリボ核酸、またはリボザイムを含むが、これらに限定されない。翻訳可能な標的ヌクレオチド配列（たとえば標的リボヌクレオチド配列）は、時に、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードし、これらは、時に、「標的ペプチド」、「標的ポリペプチド」、または「標的タンパク質」と本明細書において呼ばれる。
【０１１８】
任意のペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質または１つもしくは複数のペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質によって触媒される活性は、標的ヌクレオチド配列によってコードされ、使用者によって選択されてもよい。代表的なタンパク質は、酵素（たとえば、たとえばヘキサノエートシンターゼ、チオエステラーゼ、モノオキシゲナーゼ、モノオキシゲナーゼレダクターゼ、脂肪アルコールオキシダーゼ、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｅｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、およびその他同種のもの）、抗体、血清タンパク質（たとえばアルブミン）、膜結合タンパク質、ホルモン（たとえば成長ホルモン、エリトロポイエチン、インスリンなど）、サイトカインなどを含み、天然に存在し、外因的に発現されるポリペプチドを含む。たとえば、代表的な活性（たとえば、活性を提供するために機能的に関連する酵素または酵素の組合せ）は、ヘキサノエートシンターゼ活性、チオエステラーゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、ベータ酸化活性、およびその他同種のものを含む。本明細書において使用される用語「酵素」は、他の化合物における化学的変化を誘発するために触媒として作用し、それによって、１つ以上の基質から１つ以上の産物を産生することができるタンパク質を指す。
【０１１９】
本明細書において記載される実施形態に有用な特異的なポリペプチド（たとえば酵素）は、本明細書において列挙される。本明細書において使用される用語「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の配列を有する分子を指す。この用語は、天然または組換えにかかわらず、融合タンパク質、オリゴペプチド、ペプチド、環状ペプチド、ポリペプチド、およびポリペプチド誘導体を含み、また、その断片、誘導体、ホモログ、および変異体をも含む。タンパク質またはポリペプチドは、時に、細胞内を起源とし（たとえば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて宿主細胞の核、サイトゾル、または間隙中に位置し）、時に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて細胞膜タンパク質である。いくつかの実施形態（上記におよび遺伝子操作および改変の方法において以下にさらに詳細に記載される）では、遺伝子修飾は、標的活性の修飾をもたらす（たとえば、増加させる、実質的に増加させる、減少させる、または実質的に減少させる）ことができる。
【０１２０】
翻訳可能なヌクレオチド配列は、一般に、開始コドン（リボ核酸におけるＡＵＧおよびデオキシリボ核酸におけるＡＴＧ）ならびに終止コドン（たとえば、リボ核酸におけるＵＡＡ（オーカー）、ＵＡＧ（アンバー）、またはＵＧＡ（オパール）およびデオキシリボ核酸におけるＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）の間に位置し、時に、「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）と本明細書において呼ばれる。翻訳可能なヌクレオチド配列（たとえばＯＲＦ）は、時に、ある生物（たとえば、ほとんどの生物はロイシンとしてＣＴＧをコードする）において、他の生物（たとえば、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓはセリンとしてＣＴＧをコードする）と異なってコードされる。いくつかの実施形態では、翻訳可能なヌクレオチド配列は、ヌクレオチドドナー生物およびヌクレオチドレシピエント生物（たとえば、工学的に作り出された生物）の間の交替の遺伝子コード（たとえばコドン使用頻度）の差異を修正するように改変される。ある実施形態では、翻訳可能なヌクレオチド配列は、（ｉ）コドン使用頻度、（ｉｉ）転写効率、（ｉｉｉ）翻訳効率、（ｉｖ）その他同種のもの、およびその組合せを改善するように改変される。
【０１２１】
核酸試薬は、時に、１つ以上のＯＲＦを含む。ＯＲＦは、任意の適した供給源に由来してもよく、時に、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、逆転写ＲＮＡ、もしくは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）または先のものの１つもしくは複数を含む核酸ライブラリーに由来してもよく、対象の核酸配列、対象のタンパク質、または対象の活性を含有する任意の生物種に由来する。たとえば、ＯＲＦを得ることができる生物の非限定的な例は、細菌、酵母、真菌、ヒト、昆虫、線虫、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ラット、またはマウスを含む。
【０１２２】
核酸試薬は、時に、ＯＲＦと関連して翻訳され、アミノ酸タグをコードするＯＲＦに隣接するヌクレオチド配列を含む。タグコードヌクレオチド配列は、核酸試薬中のＯＲＦの３’および／または’５に位置し、それによって、ＯＲＦによってコードされるタンパク質またはペプチドのＣ末端またはＮ末端にタグをコードする。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および／または翻訳を抑止しない任意のタグが利用されてもよく、当業者によって適切に選択されてもよい。タグは、培養物または発酵培地からの所望のＯＲＦ産物の単離および／または精製を促進してもよい。
【０１２３】
たとえば、タグは、時に、固相または検出可能な標識の分子または部分に特異的に結合し、それによって、ＯＲＦによってコードされるタンパク質またはペプチドを単離する、精製する、および／または検出するための有用性を有する。いくつかの実施形態では、タグは、以下のエレメントの１つ以上を含む：ＦＬＡＧ（たとえばＤＹＫＤＤＤＤＫＧ）、Ｖ５（たとえばＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）、ｃ−ＭＹＣ（たとえばＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、ＨＳＶ（たとえばＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ）、インフルエンザ赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＨＡ（たとえばＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）、ＶＳＶ−Ｇ（たとえばＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）、細菌グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、ストレプトアビジン結合タグもしくはアビジン結合タグ（たとえばｐｃＤＮＡ（商標）６  ＢｉｏＥａｓｅ（商標）Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、ＶＳＶ−糖タンパク質、蛍光タンパク質（たとえば緑色蛍光タンパク質もしくはその多くの色変異体（たとえば黄色、赤色、青色））、ポリリシン配列もしくはポリアルギニン配列、金属（たとえばコバルト、亜鉛、銅）をキレート化するポリヒスチジン配列（たとえばＨｉｓ６）もしくは他の配列、および／またはヒ素含有分子に結合するシステインリッチ配列。ある実施形態では、システインリッチタグは、アミノ酸配列ＣＣ−Ｘｎ−ＣＣを含み、Ｘは、任意のアミノ酸であり、ｎは、１〜３であり、システインリッチ配列は、時に、ＣＣＰＧＣＣである。ある実施形態では、タグは、システインリッチエレメントおよびポリヒスチジンエレメント（たとえばＣＣＰＧＣＣおよびＨｉｓ６）を含む。
【０１２４】
タグは、多くの場合、結合パートナーに好都合に結合する。たとえば、いくつかのタグは、抗体（たとえばＦＬＡＧ）に結合し、時に、小分子に特異的に結合する。たとえば、ポリヒスチジンタグは、銅、亜鉛、およびコバルトなどの二価金属を特異的にキレート化し、ポリリシンタグまたはポリアルギニンタグは、ジンクフィンガーに特異的に結合し、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグは、グルタチオンに結合し、システインリッチタグは、ヒ素含有分子に特異的に結合する。ヒ素含有分子は、ＦｌＡｓＨ（商標）試薬（ＥＤＴ２［４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン−（１，２−エタンジチオール）２］）およびＲｅＡｓＨ試薬などのＬＵＭＩＯ（商標）作用物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含む（たとえば、「Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」と題する、Ｔｓｉｅｎらに対する米国特許第５，９３２，４７４号；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と題する、Ｔｓｉｅｎらに対する米国特許第６，０５４，２７１号；米国特許第６，４５１，５６９号および米国特許第６，００８，３７８号；米国特許出願公開第２００３／００８３３７３号、ならびにＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ９９／２１０１３、すべて、Ｔｓｉｅｎらに対するものであり、すべて、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  Ｒｅａｃｔ  ｗｉｔｈ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と題する）。そのような抗体および小分子は、時に、標的タンパク質または標的ペプチドの好都合な単離のために固相に連結される。
【０１２５】
タグは、時に、翻訳タンパク質または翻訳ペプチドを、系における構成要素に局在化させる配列を含み、これらは、「シグナル配列」または「局在化シグナル配列」と本明細書において呼ばれる。シグナル配列は、多くの場合、標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端に組み込まれ、時に、Ｃ末端に組み込まれる。シグナル配列の例は、当業者に公知であり、核酸試薬の中に容易に組み込まれ、多くの場合、核酸試薬の発現が実行される生物に従って選択される。いくつかの実施形態におけるシグナル配列は、翻訳タンパク質または翻訳ペプチドを細胞膜に局在化させる。シグナル配列の例は、核標的シグナル（たとえばステロイド受容体配列およびＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮ末端配列）；ミトコンドリア標的シグナル（たとえば両親媒性ヘリックスを形成するアミノ酸配列）；ペルオキシソーム標的シグナル（たとえばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＹＦＧにおけるＣ末端配列）；ならびに分泌シグナル（たとえばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるインベルターゼ、接合因子アルファ、ＰＨＯ５、およびＳＵＣ２に由来するＮ末端配列；Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓタンパク質の多数のＮ末端配列（たとえばＴｊａｌｓｍａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６４巻：５１５〜５４７頁（２０００年））；アルファアミラーゼシグナル配列（たとえば米国特許第６，２８８，３０２号）；ペクチン酸リアーゼシグナル配列（たとえば米国特許第５，８４６，８１８号）；前コラーゲンシグナル配列（たとえば米国特許第５，７１２，１１４号）；ＯｍｐＡシグナル配列（たとえば米国特許第５，４７０，７１９号）；ｌａｍベータシグナル配列（たとえば米国特許第５，３８９，５２９号）；Ｂ．ｂｒｅｖｉｓシグナル配列（たとえば米国特許第５，２３２，８４１号）；ならびにＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓシグナル配列（たとえば米国特許第５，２６８，２７３号）を含むが、これらに限定されない。
【０１２６】
タグは、時に、ＯＲＦによってコードされるアミノ酸配列に直接、隣接し（つまり、介在配列はなく）、時に、タグは、ＯＲＦコードアミノ酸配列に実質的に隣接する（たとえば介在配列が存在する）。介在配列は、時に、プロテアーゼについての認識部位を含み、これは、標的タンパク質または標的ペプチドからタグを切断するのに有用である。いくつかの実施形態では、介在配列は、たとえば第Ｘａ因子（たとえば認識部位Ｉ（Ｅ／Ｄ）ＧＲ）、トロンビン（たとえば認識部位ＬＶＰＲＧＳ）、エンテロキナーゼ（たとえば認識部位ＤＤＤＤＫ）、ＴＥＶプロテアーゼ（たとえば認識部位ＥＮＬＹＦＱＧ）、またはＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ（たとえば認識部位ＬＥＶＬＦＱＧＰ）によって切断される。
【０１２７】
介在配列は、時に、本明細書において「リンカー配列」と呼ばれ、当業者によって選択される任意の適した長さをしていてもよい。リンカー配列は、時に、長さが約１〜約２０アミノ酸であり、時に、長さが約５〜約１０アミノ酸である。当業者は、標的タンパク質または標的ペプチドの機能を実質的に保つように（たとえば、リンカーによって分離されない場合、タグは、標的タンパク質または標的ペプチドの機能を低下させるかもしれない）、プロテアーゼ切断部位が存在する場合に、標的タンパク質または標的ペプチドからのタグの分離を増強するように（たとえば、リンカーが存在する場合、切断は増強されるかもしれない）、固相とのタグ／標的タンパク質産物の相互作用を増強するように、リンカーの長さを選択してもよい。リンカーは、任意の適したアミノ酸含有量のものとすることができ、多くの場合、比較的短い側鎖（たとえばグリシン、アラニン、セリン、およびトレオニン）を有する、より高い割合のアミノ酸を含む。
【０１２８】
核酸試薬は、時に、タグエレメントおよび挿入エレメントまたはＯＲＦの間に終止コドンを含み、これは、タグを有するまたは有していないＯＲＦを翻訳するのに有用となり得る。終止コドン（上記に記載される）を認識する突然変異体ｔＲＮＡ分子は、翻訳終結を抑制し、それによって、「サプレッサーｔＲＮＡ」と呼ばれる。サプレッサーｔＲＮＡは、アミノ酸の挿入および終止コドン後の翻訳の継続をもたらすことができる（たとえば、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」と題する、２００４年７月１４日に提出された米国特許出願第６０／５８７，５８３号；Ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎら（１９８８年）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ５２巻（３号）：３５４〜３７４頁、およびＥｎｇｌｅｅｒｇ−Ｋｕｋｌａら（１９９６年）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６０章、９０９〜９２１頁、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら編、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ中）。多くのサプレッサーｔＲＮＡは、公知であり、アンバー終止コドンの翻訳の終結を抑制するｓｕｐＥ、ｓｕｐＰ、ｓｕｐＤ、ｓｕｐＦ、およびｓｕｐＺサプレッサー；オーカー終止コドンの機能を抑制するｓｕｐＢ、ｇｌＴ、ｓｕｐＬ、ｓｕｐＮ、ｓｕｐＣ、およびｓｕｐＭサプレッサー、ならびにオパール終止コドンの機能を抑制するｇｌｙＴ、ｔｒｐＴ、およびＳｕ−９サプレッサーを含むが、これらに限定されない。一般に、サプレッサーｔＲＮＡは、終止コドンとして通常機能するコドンとｔＲＮＡが塩基対を形成することを可能にする、１つ以上の突然変異をｔＲＮＡのアンチコドンループ中に含有する。突然変異体ｔＲＮＡは、その関連するアミノ酸残基を担い、終止コドンに出会うと、関連するアミノ酸残基は、翻訳されているポリペプチドの中に挿入される。終結サプレッサーの効率を増強する（つまり、終止コドンリードスルーを増加させる）突然変異が同定されている。これらは、ｕａｒ遺伝子（ｐｒｆＡ遺伝子としても公知である）における突然変異、ｕｐｓ遺伝子における突然変異、ｓｕｅＡ遺伝子、ｓｕｅＢ遺伝子、およびｓｕｅＣ遺伝子における突然変異、ｒｐｓＤ（ｒａｍＡ）遺伝子およびｒｐｓＥ（ｓｐｃＡ）遺伝子における突然変異、ならびにｒｐｌＬ遺伝子における突然変異を含むが、これらに限定されない。
【０１２９】
したがって、ＯＲＦおよびタグの間に位置する終止コドンを含む核酸試薬は、サプレッサーｔＲＮＡが翻訳系に存在しない場合、翻訳ＯＲＦを単独で得ることができ、サプレッサーｔＲＮＡが系に存在する場合、翻訳ＯＲＦ−タグ融合物を得ることができる。サプレッサーｔＲＮＡは、ｔＲＮＡをコードする核酸を用いてトランスフェクトされた細胞において生成することができる（たとえば、ヒトｔＲＮＡ−Ｓｅｒサプレッサー遺伝子を含有する複製不全アデノウイルスは、細胞の中にトランスフェクトすることができるまたはたとえば、酵母または細菌のｔＲＮＡサプレッサー遺伝子を含有するＹＡＣは、酵母細胞の中にトランスフェクトすることができる）。サプレッサーｔＲＮＡを合成するためのおよびタグを有するまたは有していないＯＲＦを翻訳するためのベクターは、当業者に入手可能である（たとえばＴａｇ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；ｈｔｔｐアドレスｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｔａｇｏｎｄｅｍａｎｄ＿ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ＿ｍａｎ．ｐｄｆのＴａｇ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ、バージョンＢ、２００３年６月６日；ｈｔｔｐアドレスｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｔａｇｏｎｄｅｍａｎｄ＿ｖｅｃｔｏｒｓ＿ｍａｎ．ｐｄｆのＴａｇ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）Ｇａｔｅｗａｙ（商標）Ｖｅｃｔｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ、バージョンＢ、２００３年６月２０日；およびＣａｐｏｎｅら、Ａｍｂｅｒ，  ｏｃｈｒｅ  ａｎｄ  ｏｐａｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔＲＮＡ  ｇｅｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｉｎｅ  ｔＲＮＡ  ｇｅｎｅ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．４巻：２１３頁、１９８５年）。
【０１３０】
当技術分野において公知の任意の好都合なクローニング戦略は、ＯＲＦなどのエレメントを核酸試薬の中に組み込むために利用されてもよい。公知の方法は、（１）１つ以上の既存の制限酵素部位で鋳型を切断し、対象のエレメントをライゲーションすることおよび（２）１つ以上の適した制限酵素部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズし、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することによって鋳型に制限酵素部位を追加すること（本明細書においてより詳しく記載される）などのように、挿入エレメントと無関係の鋳型の中にエレメントを挿入するために利用することができる。他のクローニング戦略は、たとえばＰＣＲのためのオリゴヌクレオチドプライマーハイブリダイゼーション部位および本明細書において記載される他のものなどのように、存在するまたは核酸試薬の中に挿入された１つ以上の挿入部位を利用する。いくつかの実施形態では、クローニング戦略は、組換え（たとえば、本明細書においてさらに記載されるように、修飾されることとなる生物のゲノムの中への、対象の核酸配列との核酸試薬の組換え）などの遺伝的操作と組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、クローニングＯＲＦ（複数可）は、対象の１つ以上のＯＲＦを用いて微生物を遺伝子操作することによって、アジピン酸を（直接または間接的に）産生することができ、微生物は、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性、およびモノオキシゲナーゼ活性から成る群から選択される１つ以上の改変された活性を含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、核酸試薬は、１つ以上のレコンビナーゼ挿入部位を含む。レコンビナーゼ挿入部位は、組換えタンパク質による統合／組換え反応に参加する核酸分子上の認識配列である。たとえば、Ｃｒｅレコンビナーゼについての組換え部位は、ｌｏｘＰであり、これは、８塩基対コア配列が側面に位置する２つの１３塩基対反復配列（レコンビナーゼ結合部位として果たす）から構成される３４塩基対配列である（たとえばＳａｕｅｒ，  Ｂ．、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．５巻：５２１〜５２７頁（１９９４年）の図１）。組換え部位の他の例は、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列ならびにその突然変異体、断片、変異体、および誘導体を含み、これらは、組換えタンパク質λ  Ｉｎｔによってならびに補助タンパク質統合宿主因子（ＩＨＦ）、ＦＩＳ、および除去酵素（Ｘｉｓ）によって認識される（たとえば米国特許第５，８８８，７３２号；第６，１４３，５５７号；第６，１７１，８６１号；第６，２７０，９６９号；第６，２７７，６０８号；および第６，７２０，１４０号；２０００年３月２日に提出された米国特許出願第０９／５１７，４６６号および２００３年８月１４日に提出された第０９／７３２，９１４号ならびに米国特許出願公開第２００２−０００７０５１−Ａ１号；Ｌａｎｄｙ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．３巻：６９９〜７０７頁（１９９３年））。
【０１３２】
レコンビナーゼクローニング核酸の例は、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中に存在し、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて所望の核酸分子をクローニングするための少なくとも１つの組換え部位を含む。いくつかの実施形態では、系は、多くの場合バクテリオファージラムダ系（たとえばａｔｔ１およびａｔｔ２）に基づく少なくとも２つの異なる部位特異的組換え部位を含有し、野生型（ａｔｔ０）部位から突然変異したベクターを利用する。突然変異した部位はそれぞれ、同じ型のその関連するパートナーａｔｔ部位（つまりその結合パートナー組換え部位）に対して特有の特異性を有し（たとえばａｔｔＰ１とａｔｔＢ１またはａｔｔＲ１とａｔｔＬ１）、他の突然変異体型の組換え部位または野生型のａｔｔ０部位と交差反応しないであろう。異なる部位特異性は、所望の分子の方向性をもつクローニングまたは連結を可能にし、したがって、クローニングされた分子の所望の方向づけをもたらす。組換え部位が側面に位置する核酸断片は、時にＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒと称されるレシピエントプラスミド分子上のａｔｔ部位が側面に位置する選択マーカー（たとえばｃｃｄＢ）を交換することによって、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）系を使用してクローニングされ、サブクローニングされる。次いで、所望のクローンは、ｃｃｄＢ感受性宿主株の形質転換およびレシピエント分子上のマーカーについてのポジティブ選択によって選択される。ネガティブ選択に対する類似する戦略（たとえば、毒性遺伝子の使用）は、哺乳動物および昆虫におけるチミジンキナーゼ（ＴＫ）などのように、他の生物において使用することができる。
【０１３３】
酵母を遺伝子操作するのに有用な組換え系を、簡単に概説する。系は、ＵＲＡ３遺伝子（たとえば、たとえばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉｅａｅおよびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓについての）またはＵＲＡ４遺伝子およびＵＲＡ５遺伝子（たとえば、たとえばＳ．ｐｏｍｂｅについての）ならびにヌクレオチドアナログ５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）の毒性を利用する。ＵＲＡ３遺伝子またはＵＲＡ４遺伝子およびＵＲＡ５遺伝子は、オロチン−５’−一リン酸（ＯＭＰ）ジカルボキシラーゼをコードする。活性ＵＲＡ３遺伝子またはＵＲＡ４遺伝子およびＵＲＡ５遺伝子（表現型でＵｒａ＋）を有する酵母は、５−ＦＯＡをフルオロデオキシウリジンに変換する、これは、酵母細胞に対して毒性である。適切な遺伝子（複数可）中に突然変異を保有するまたは適切な遺伝子（複数可）のノックアウトを有する酵母は、培地にウラシルが補足される場合、５−ＦＯＡの存在下において成長することができる。
【０１３４】
同じ方向づけの同じヌクレオチド配列が両側で側面に位置する、ＵＲＡ３遺伝子またはＵＲＡ３カセット（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉｅａｅについて）を含んでいてもよい核酸遺伝子操作用構築物を作製することができる。ＵＲＡ３カセットは、プロモーター、ＵＲＡ３遺伝子、および機能的転写ターミネーターを含む。遺伝子操作されることとなる生物における対象の特定の核酸領域に構築物を向ける標的配列は、標的配列が、ＵＲＡ３カセットの両側のフランキング配列に隣接し、接するように、追加される。酵母は、遺伝子操作用構築物を用いて形質転換し、ウラシルを有していない最少培地上で平板培養することができる。コロニーは、ゲノム中の適切な位置に挿入された遺伝子操作用構築物を有する形質転換体を決定するためにＰＣＲによってスクリーニングすることができる。ｕｒａ３カセットの組換えについて選択する前の挿入位置のチェックにより、後期段階の手順を続ける不正確なクローンの数を低下させてもよい。次いで、正確に挿入された形質転換体は、構築物からのＵＲＡ３カセットの組換えについて選択するために、５−ＦＯＡを含有する最少培地上でレプリカ平板法を行うことができ、破壊された遺伝子および破壊された遺伝子の存在を確証するために使用することができる、同定可能なフットプリント（たとえば核酸配列）を残す。記載される技術は、遺伝子機能を破壊するまたは「ノックアウトする」のに有用であるが、また、標的配列特異的な方法で遺伝子または構築物を宿主生物ゲノムの中に挿入するために使用することもできる。
【０１３５】
ある実施形態では、核酸試薬は、１つ以上のトポイソメラーゼ挿入部位を含む。トポイソメラーゼ挿入部位は、部位特異的なトポイソメラーゼによって認識され、それが結合する明確なヌクレオチド配列である。たとえば、ヌクレオチド配列５’−（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＴ−３’は、ワクシニアウイルスＤＮＡトポイソメラーゼＩを含む、ほとんどのポックスウイルストポイソメラーゼが特異的に結合するトポイソメラーゼ認識部位である。認識配列に結合した後、トポイソメラーゼは、認識部位の３’−最多チミジンで鎖を切断して、トポイソメラーゼ中のチロシンを介して３’リン酸に共有結合したトポイソメラーゼの複合体である５’−（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＴ−ＰＯ４−ＴＯＰＯを含むヌクレオチド配列を産生する（たとえばＳｈｕｍａｎ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６６巻：１１３７２〜１１３７９頁、１９９１年；ＳｅｋｉｇｕｃｈｉおよびＳｈｕｍａｎ、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２巻：５３６０〜５３６５頁、１９９４年；米国特許第５，７６６，８９１号；ＰＣＴ／ＵＳ９５／１６０９９；およびＰＣＴ／ＵＳ９８／１２３７２）。それに比べて、ヌクレオチド配列５’−ＧＣＡＡＣＴＴ−３’は、ＩＡ型  Ｅ．ｃｏｌｉトポイソメラーゼＩＩＩについてのトポイソメラーゼ認識部位である。挿入されることとなるエレメントは、多くの場合、トポイソメラーゼ反応鋳型と組み合わせられ、それによって、核酸試薬の中に組み込まれる（たとえばワールドワイドウェブＵＲＬ  ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／Ｆ−１３５１２＿Ｔｏｐｏ＿Ｆｌｙｅｒ．ｐｄｆ；ワールドワイドウェブＵＲＬ  ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｂｒｏｃｈｕｒｅｓ／７１０＿０２１８４９％２０＿Ｂ＿ＴＯＰＯＣｌｏｎｉｎｇ＿ｂｒｏ．ｐｄｆ；ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット、およびＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングキット製品情報）。
【０１３６】
核酸試薬は、時に、１つ以上の複製開始点（ＯＲＩ）エレメントを含有する。いくつかの実施形態では、鋳型は、２つ以上のＯＲＩを含み、一方は、一方の生物（たとえば細菌）において効率的に機能し、他方は、他方の生物（たとえば真核生物、たとえば酵母のような）において効率的に機能する。いくつかの実施形態では、ＯＲＩは、ある種（たとえばたとえばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉｅａｅ）において効率的に機能してもよく、他方のＯＲＩは、異なる種（たとえばたとえばＳ．ｐｏｍｂｅ）において効率的に機能してもよい。核酸試薬はまた、時に、１つ以上の転写調節部位を含む。
【０１３７】
核酸試薬は、１つ以上の選択エレメントを含むことができる（たとえば、選択的に調節することができるプロモーターエレメントの活性化のためのではなく、核酸試薬の存在の選択のためのエレメント）。選択エレメントは、多くの場合、核酸試薬が細胞中に含まれているかどうかを決定するために公知のプロセスを使用して利用される。いくつかの実施形態では、核酸試薬は、２つ以上の選択エレメントを含み、一方は、一方の生物において効率的に機能し、他方は、他方の生物において効率的に機能する。選択エレメントの例は、（１）そうでなければ毒性の化合物に対する抵抗性を提供する産物をコードする核酸セグメント（たとえば抗生物質）；（２）そうでなければレシピエント細胞において欠けている産物をコードする核酸セグメント（たとえば必須の産物、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）；（３）遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードする核酸セグメント；（４）容易に同定することができる産物をコードする核酸セグメント（たとえば、抗生物質（たとえばβ−ラクタマーゼ）、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、および細胞表面タンパク質などの表現型マーカー）；（５）そうでなければ細胞生存および／もしくは機能に有害な産物に結合する核酸セグメント；（６）上記の１〜５において記載される核酸セグメントのいずれかの活性をそうでなければ阻害する核酸セグメント（たとえばアンチセンスオリゴヌクレオチド）；（７）基質を修飾する産物（たとえば制限エンドヌクレアーゼ）に結合する核酸セグメント；（８）所望の分子を単離するもしくは同定するために使用することができる核酸セグメント（たとえば特異的タンパク質結合部位）；（９）そうでなければ非機能的になり得る特異的なヌクレオチド配列をコードする核酸セグメント（たとえば分子のサブ集団のＰＣＲ増幅のための）；（１０）不在の場合、特定の化合物に対する抵抗性もしくは感受性を直接もしくは間接的に与える核酸セグメント；（１１）レシピエント細胞において毒性の産物をコードするもしくは比較的非毒性の化合物を毒性化合物に変換する核酸セグメント（たとえばＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）；（１２）それらを含有する核酸分子の複製、分配、もしくは遺伝力を阻害する核酸セグメント；ならびに／または（１３）条件的な複製機能、たとえば、ある種の宿主もしくは宿主細胞株におけるまたはある種の環境条件（たとえば温度、栄養状態、およびその他同種のもの）下での複製をコードする核酸セグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１３８】
核酸試薬は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける転写および／または翻訳に有用な任意の形態である。核酸は、時に、スーパーコイルプラスミドなどのプラスミドであり、時に、酵母人工染色体（たとえばＹＡＣ）であり、時に、直鎖状核酸（たとえば、ＰＣＲまたは制限消化によって産生される直鎖状核酸）であり、時に一本鎖であり、時に、二本鎖である。核酸試薬は、時に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスまたは転写媒介性増幅プロセス（ＴＭＡ）などの増幅プロセスによって調製される。ＴＭＡでは、光放射によって検出される増幅産物を産生するために、２つの酵素が等温反応において使用される（たとえばＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９６年６月２５日；３５巻（２５号）：８４２９〜３８頁およびｈｔｔｐアドレスｗｗｗ．ｄｅｖｉｃｅｌｉｎｋ．ｃｏｍ／ｉｖｄｔ／ａｒｃｈｉｖｅ／００／１１／００７．ｈｔｍｌを参照されたい）。標準的なＰＣＲプロセスは、公知であり（たとえば米国特許第４，６８３，２０２号；第４，６８３，１９５号；第４，９６５，１８８号；および第５，６５６，４９３号）、一般にサイクルで実行される。サイクルはそれぞれ、ハイブリッド核酸が解離する熱変性；プライマーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする冷却；およびポリメラーゼ（つまりＴａｑポリメラーゼ）によるオリゴヌクレオチドの伸長を含む。ＰＣＲの周期的プロセスの例は、５分間９５℃で試料を処理すること；１分間９５℃、１分１０秒間５９℃、および１分３０秒間７２℃の４５回のサイクルを繰り返すこと；ならびに次いで、５分間７２℃で試料を処理することである。多数回のサイクルは、市販の熱のサイクラーを使用して、頻繁に実行される。ＰＣＲ増幅産物は、低温度で（たとえば４℃で）一時保存され、時に、分析前に凍結される（たとえば−２０℃で）。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本明細書において記載される核酸試薬、タンパク質試薬、タンパク質断片試薬、または他の試薬は、単離されるまたは精製される。本明細書において使用される用語「単離された」は、その本来の環境から取り出された物質を指し（たとえば、それが天然に存在する場合、自然環境または外因的に発現される場合、宿主細胞）、したがって、その本来の環境から「人の手によって」改変されている。分子に関して本明細書において使用される用語「精製された」は、絶対的な純度を指さない。むしろ、「精製された」は、それが起源とする試料と比較して、対象の物質以外の、同じクラス（たとえば核酸またはタンパク質種）のより少ない物質種を含有する組成物中の物質を指す。「精製された」は、たとえば核酸またはタンパク質の場合、それが起源とする試料と比較して、対象の核酸またはタンパク質以外の、より少ない核酸種またはタンパク質種を含有する組成物中の物質を指す。時に、タンパク質または核酸は、「実質的に純粋であり」、組成物の質量基準に基づいてタンパク質または核酸がタンパク質または核酸の少なくとも５０％に相当することを示す。多くの場合、実質的に純粋なタンパク質または核酸は、組成物の質量基準に基づいて少なくとも７５％であり、時に、組成物の質量基準に基づいて少なくとも９５％である。
遺伝子操作および改変方法
本明細書に記載される方法および組成物（例えば、核酸試薬）は、工学的に作り出された微生物を生成するために用いることができる。上記のように、本明細書で用いる用語「工学的に作り出された微生物」は、修飾の出発点として利用される微生物（例えば、宿主微生物または未修飾生物体）に存在する活性と異なる１つ以上の活性を含む修飾生物体を指す。一般的に、工学的に作り出された微生物は、容易に利用できる技術を用いて当業者によって通常導入されるかそれについて選択される、遺伝子修飾の結果として生じる。改変された活性を生成することに役立つ方法の非限定例には、異種ポリヌクレオチドを導入すること（例えば、核酸もしくは遺伝子の組込み、「ノックイン」とも呼ばれる）、内因性ポリヌクレオチドを除去すること、既存の内因性核酸配列の配列を改変すること（例えば、部位特異的突然変異誘発）、既存の内因性核酸配列の破壊（例えば、ノックアウトおよびトランスポゾンもしくは挿入エレメントによって媒介される突然変異誘発）、安定して遺伝させることができる天然に存在する活性の変化を選択が引き起こす（例えば、生物体のゲノム内の核酸配列、または複製されて娘細胞に受け継がれる後成的核酸の変化を引き起こす）、改変された活性についての選択、ＰＣＲベースの突然変異誘発などが含まれる。本明細書で用いる用語「突然変異誘発」は、宿主または修飾生物体で生成物を生成するためにその後用いられる、核酸（例えば、核酸試薬、または宿主染色体など）の任意の修飾を指す。突然変異誘発の非限定例には、欠失、挿入、置換、再配列、点突然変異、サプレッサー突然変異などが含まれる。突然変異誘発の方法は当技術分野で公知であり、熟練者に容易に利用可能である。突然変異誘発の方法の非限定例は本明細書に記載され、Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．、Ｅ．  Ｆ．  ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８２年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に見出すこともできる。突然変異誘発の別の非限定例は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）「ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ」キットを製造業者の使用説明書に従って用いて実行することができる。
【０１４０】
本明細書で用いる用語「遺伝子修飾」は、工学的に作り出された微生物での標的生成物（例えば、アジピン酸、６−ヒドロキシヘキサン酸）の生産を促進する任意の適する核酸の付加、除去または改変を指す。遺伝子修飾には、限定されずに、１つ以上の位置での宿主生物体の本来の核酸の１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上の位置での宿主生物体の本来の核酸の１つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上の位置での宿主生物体の本来の核酸の１つ以上のヌクレオチドの修飾または置換、宿主生物体への非在来の核酸の挿入（例えば、自律的に複製するベクターの挿入）、および宿主生物体の非在来核酸の除去（例えば、ベクターの除去）が含まれる。
【０１４１】
本明細書で用いる用語「異種ポリヌクレオチド」は、一部の実施形態では宿主微生物に存在しないヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、宿主微生物と異なる量（例えば、異なるコピー数）で存在し、それは、例えば特定のヌクレオチド配列のより多くのコピーを宿主微生物に導入することによって達成することができる（例えば、特定のヌクレオチド配列は宿主染色体から独立した核酸中にあってもよく、または染色体に挿入されてもよい）。異種ポリヌクレオチドは一部の実施形態では異なる生物体に由来し、特定の実施形態では、同じ種類の生物体であるが外部源（例えば、組換え生物源）に由来する。
【０１４２】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法および核酸試薬を用いて工学的に作り出された生物体は、アジピン酸を産生することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載されるアジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物は、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性およびモノオキシゲナーゼ活性から成る群から選択される１つ以上の改変された活性を含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される工学的に作り出された微生物は、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性およびモノオキシゲナーゼ活性を付加または増加する、遺伝子修飾を含むことができる。
【０１４３】
特定の実施形態では、本明細書に記載される工学的に作り出された微生物は、改変されたチオエステラーゼ活性を含むことができる。一部の実施形態では、工学的に作り出された微生物は、チオエステラーゼ活性を付加または増加する遺伝子改変を含むことができる。一部の実施形態では、チオエステラーゼ活性を付加または増加する遺伝子改変を含む工学的に作り出された微生物は、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含むことができる。
【０１４４】
本明細書で用いる用語「改変された活性」は、工学的に作り出された微生物中の、宿主微生物と比較して付加または修飾された活性（例えば、付加、増加、低減、阻害または除去された活性）を指す。活性は、付加、増加、低減、阻害または除去された活性を有する工学的に作り出された微生物を与える遺伝子修飾を、宿主微生物に導入することによって改変することができる。
【０１４５】
付加された活性は、しばしば、宿主微生物で検出不能な活性である。増加された活性は、一般に、工学的に作り出された微生物で増加されている、宿主微生物で検出可能な活性である。活性は、それらに限定されないが、２倍未満（例えば、約１０％増から約９９％増；約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％増）、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍増または約１０倍を超える増加を含む、標的生成物（例えば、アジピン酸、６−ヒドロキシヘキサン酸）の生産のための任意の適するレベルまで増加することができる。低減または阻害された活性は、一般に、工学的に作り出された微生物で低減または阻害されている、宿主微生物で検出可能な活性である。活性は、一部の実施形態では検出不能なレベルまで、または特定の実施形態では検出可能なレベルまで減少されてもよい。活性は、それらに限定されないが、２倍未満（例えば、約１０％減から約９９％減；約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％減）、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍減または約１０倍を超える減少を含む、標的生成物（例えば、アジピン酸、６−ヒドロキシヘキサン酸）の生産のための任意の適するレベルまで低減することができる。
【０１４６】
改変された活性は、時には宿主生物体で検出不能な活性であり、遺伝子操作生物体に付加される。改変された活性は、宿主生物体で検出可能な活性なこともあり、遺伝子操作生物体で増加される。一部の実施形態では、活性は、標的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させることによって、付加または増加することができる。特定の実施形態では、活性は、付加された活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを宿主微生物に挿入することによって、付加または増加することができる。特定の実施形態では、活性は、（ｉ）付加された活性を有するポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドに作動可能に連結され、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの生産を上方制御する異種ポリヌクレオチドを宿主微生物に挿入することによって、付加または増加することができる。したがって、活性は、標的活性を有するポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドに作動可能に連結される調節ポリヌクレオチドを挿入または修飾することによって、付加または増加することができる。特定の実施形態では、活性は、宿主微生物を選択的な環境にさらし、標的活性の検出可能なレベルを有する微生物についてスクリーニングすることによって、付加または増加することができる。選択的な環境の例には、限定されずに、宿主生物体が加工することができる基質を含む培地、および宿主生物体が加工することができる基質を欠く培地が含まれる。
【０１４７】
改変された活性は、時には宿主生物体で検出可能な活性であり、遺伝子操作生物体で低減、阻害または除去（すなわち、検出不能）される。一部の実施形態では、活性は、標的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を減少させることによって、低減または除去することができる。一部の実施形態では、活性は、（ｉ）標的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中にポリヌクレオチドを挿入すること（破壊的挿入）、および／または（ｉｉ）標的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部もしくはすべてを除去すること（それぞれ欠失またはノックアウト）によって、低減または除去することができる。特定の実施形態では、活性は、（ｉ）標的活性を有するポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドに作動可能に連結され、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの生産を下方制御する異種ポリヌクレオチドを宿主微生物に挿入することによって、低減または除去することができる。したがって、活性は、標的活性を有するポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドに作動可能に連結される調節ポリヌクレオチドを挿入または修飾することによって、低減または除去することができる。
【０１４８】
活性は、（ｉ）活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを阻害するか、または（ｉｉ）活性を有するポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドに作動可能に連結されるポリヌクレオチドを阻害することによって、低減または除去することもできる。ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知である適する技術によって、例えばポリヌクレオチドによってコードされるＲＮＡを特異的阻害性ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム）と接触させることによって阻害することができる。活性は、活性を有するポリペプチドを活性を特異的に阻害する分子（例えば、酵素阻害剤、抗体）と接触させることによって低減または除去することもできる。特定の実施形態では、活性は、宿主微生物を選択的な環境にさらし、標的活性の低減されたレベルを有するかまたは除去された微生物についてスクリーニングすることによって、低減または除去することができる。
【０１４９】
一部の実施形態では、特定の活性または酵素の発現を低減するために、非翻訳リボ核酸またはｃＤＮＡを用いることができる。例えば、対象の活性をコードする対象の核酸配列に部分的または実質的に相同であるＲＮＡ分子を産生することによって活性の発現を低減する核酸試薬を発現させるための遺伝子修飾によって、微生物を遺伝子操作することができる。特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は対象の核酸配列に結合し、核酸配列がその本来の機能を果たすことを阻害することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡは、対象の活性をコードする対象の核酸配列を、対象の核酸配列がその本来の機能（例えば、リボザイムの作用など）を果たすことがもはやできない方法で改変することができる。
【０１５０】
特定の実施形態では、時には、そのようなエレメントが核酸試薬に取り込まれる前またはその後に、転写および／または翻訳を増強するか、潜在的に増強するか、低減するか、潜在的に低減するために、ヌクレオチド配列が核酸試薬エレメント、例えばプロモーター、５’ＵＴＲ、標的配列または３’ＵＴＲエレメントの１つ以上に付加されるか、修飾されるか、またはそこから除去される。一部の実施形態では、それらが５’ＵＴＲに存在する場合、以下の配列の１つ以上を修飾または除去することができる：安定二次構造（例えば、四重構造またはステムループステム構造（例えば、ＥＭＢＬ配列Ｘ１２９４９、ＡＦ２７４９５４、ＡＦ１３９９８０、ＡＦ１５２９６１、Ｓ９５９３６、Ｕ１９４１４４、ＡＦ１１６６４９またはそのようなステムループステム構造を形成する実質的に同一の配列））を形成する配列；標的ヌクレオチド配列開始コドン上流の翻訳開始コドン；標的ヌクレオチド配列翻訳開始コドン上流の終止コドン；標的ヌクレオチド配列翻訳開始コドン上流のＯＲＦ；鉄応答エレメント（ＩＲＥ）または類似配列；および５’末端オリゴピリミジン域（ＴＯＰ、例えばキャップに隣接する５〜１５ピリミジンから成る）。翻訳エンハンサー配列および／またはリボソーム内部侵入部位（ＩＲＥＳ）は、時には５’ＵＴＲ（例えば、ＥＭＢＬヌクレオチド配列Ｊ０４５１３、Ｘ８７９４９、Ｍ９５８２５、Ｍ１２７８３、ＡＦ０２５８４１、ＡＦ０１３２６３、ＡＦ００６８２２、Ｍ１７１６９、Ｍ１３４４０、Ｍ２２４２７、Ｄ１４８３８およびＭ１７４４６および実質的に同一のヌクレオチド配列）に挿入される。時には、ナンセンスコドンに続くＡＵに富むエレメント（ＡＲＥ、例えばＡＵＵＵＡリピート）および／またはスプライシング接合部は、３’ＵＴＲから除去されるか３’ＵＴＲで修飾される。ポリアデノシンテイルは、存在しない場合には３’ＵＴＲに挿入されるときもあり、存在する場合には除去されるときもあり、アデノシン部分は、３’ＵＴＲに存在するポリアデノシンテイルに時々加えられるか、またはそこから除去される。したがって、一部の実施形態は、以下を含む工程を目的にする：翻訳効率を増加させるか、潜在的に増加させるか、低減させるか、潜在的に低減させる任意のヌクレオチド配列がエレメントに存在するかどうかを判定すること、およびそれらが特定される場合、そのような配列の１つ以上を付加、除去または修飾すること。特定の実施形態は、以下を含む工程を目的とする：翻訳効率を増加させるか、潜在的に増加させるヌクレオチド配列がエレメントに存在しないかどうか判定すること、およびそのような配列を核酸試薬に取り込むこと。
【０１５１】
一部の実施形態では、活性は、ＯＲＦのヌクレオチド配列を修飾することによって改変することができる。コードされるタンパク質またはペプチドの活性を改変、増強もしくは増加、低減、実質的に低減または除去するために、ＯＲＦは時々突然変異または修飾される（例えば、点突然変異、欠失突然変異、挿入突然変異、ＰＣＲベースの突然変異誘発などによって）。修飾ＯＲＦによってコードされるタンパク質またはペプチドは、時にはより低い量で産生されるか、または検出可能なレベルで産生されないことがあり、他の実施形態では、修飾ＯＲＦによってコードされる生成物またはタンパク質は、より高いレベルで産生される（例えば、コドンは、それらが宿主生物体または遺伝子操作生物体で優先的に用いられるｔＲＮＡに適合するように時々修飾される）。相対活性を測定するために、突然変異ＯＲＦの生成物（またはそれを含む細胞）からの活性を、修飾されていないＯＲＦによってコードされる生成物またはタンパク質（またはそれを含む細胞）の活性と比較することができる。
【０１５２】
一部の実施形態では、ＯＲＦヌクレオチド配列は、アミノ酸をコードするために用いられる三重項ヌクレオチド配列（例えば、アミノ酸コドン三重項など）を改変するために時々突然変異または修飾される。コドン三重項を改変するためのＯＲＦのヌクレオチド配列の修飾は、ＯＲＦまたは核酸試薬が発現される生物体の好ましいコドン使用により一致させるために、元の配列で見出されるコドンを変化させるのに時々用いられる。細菌でのコドンの使用、したがって核酸配列によってコードされるコドン三重項は、例えば酵母または植物のような真核生物での好ましいコドン使用と異なってもよい。好ましいコドン使用は、細菌種の間で異なってもよい。特定の実施形態では、ＯＲＦヌクレオチド配列は、ＯＲＦヌクレオチド配列によってコードされるｍＲＮＡの翻訳の間に停止を引き起こすことがあるコドン対を除去、および／またはｍＲＮＡ二次構造を除去するために時々修飾される。翻訳停止は、核酸二次構造がｍＲＮＡに存在する場合に時々起こり、リボソームの停止を引き起こすことによって翻訳速度を遅くするコドン対の存在のために時々起こる。一部の実施形態では、より低い存在度のコドン三重項の使用は、チャージされたｔＲＮＡをリボソーム翻訳機構に加えるために必要な停止期間の短縮により、翻訳停止を低減させることができる。したがって、細菌（例えば、転写および翻訳が同時並行であるなど）で転写および翻訳効率を高めるために、または真核生物（例えば、転写および翻訳が機能的に分離されている）で翻訳効率を高めるために、対象のヌクレオチド配列のヌクレオチド配列は、宿主および／または遺伝子修飾微生物の転写および／または翻訳機構により適するように改変することができる。特定の実施形態では、リボソームを遅くするか停止させるより低い存在度のコドンを用いて翻訳速度を遅くすることは、正しく折り畳まれたタンパク質の増加および混在体の形成の減少により、所望の生成物のより高い収量をもたらすことができる。
【０１５３】
ヌクレオチド配列のドナー生物体のコドン分布を測定し、そのコドン分布をレシピエントまたは宿主生物体のコドン分布と比較することによって、コドンを所与の生物体による好ましい使用によって改変および最適化することができる。したがって、本明細書に記載される技術（例えば、部位特異的突然変異誘発など）は、それに応じてコドンを改変するために用いることができる。コドン使用の比較は、手作業で、または熟練者が入手できる市販の核酸分析ソフトウェアを用いて実行することができる。
【０１５４】
ＯＲＦのヌクレオチド配列の修飾は、異なる生物体で逸脱したコドン三重項配列を補正するために用いることもできる。例えば、特定の酵母（例えば、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＣ．ｍａｌｔｏｓａ）は、セリンをコードするために、アミノ酸三重項ＣＵＧ（例えば、ＤＮＡ配列のＣＴＧ）を用いる。ＣＵＧは、ほとんどの生物体では一般的にロイシンをコードする。生じるポリペプチドまたはタンパク質の正しいアミノ酸を維持するために、核酸試薬が発現される生物体を反映するようにＣＵＧコドンを改変しなければならない。したがって、細菌ドナーからのＯＲＦが上で指摘されるいずれかのカンジダ酵母株で発現される場合、異種ヌクレオチド配列は適当なロイシンコドンに先ず改変または修飾されなければならない。したがって、一部の実施形態では、異なる生物体の間でのアミノ酸コドン三重項の発展で起こった差を補正するために、ＯＲＦのヌクレオチド配列は時々改変または修飾される。一部の実施形態では、当初コードされたアミノ酸と比較してコードされるアミノ酸が保存的であるかアミノ酸の中立変化である場合、ヌクレオチド配列は特定のアミノ酸コドンで変更されずにそのままであってもよい。
【０１５５】
一部の実施形態では、活性は、例えば終止コドンのような翻訳調節シグナルを修飾することによって改変することができる。ＯＲＦの末端の終止コドンは、上記のアンバー終止コドンなどの別の終止コドンに時々修飾される。一部の実施形態では、終止コドンは、時には既存のコドンの挿入または突然変異によってＯＲＦの中に導入される。修飾された末端終止コドンおよび／または内部終止コドンを含むＯＲＦは、しばしば終止コドンを認識するサプレッサーｔＲＮＡを含む系で翻訳される。時には、終止コドンを含むＯＲＦは、標的タンパク質または標的ペプチドの翻訳の間、非天然アミノ酸を取り込むサプレッサーｔＲＮＡを含む系で翻訳される。非天然アミノ酸を標的タンパク質またはペプチドに取り込む方法は公知であり、それには、例えば異種ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を利用する工程が含まれ、そこでは、ｔＲＮＡはアンバー終止コドンを認識し、非天然アミノ酸を積む（例えば、ワールドワイドウェブＵＲＬ  ｉｕｐａｃ．ｏｒｇ／ｎｅｗｓ／ｐｒｉｚｅ／２００３／ｗａｎｇ．ｐｄｆ）。
【０１５６】
改変（例えば、突然変異誘発、導入または欠失などによる）のために選択される核酸試薬の部分（例えば、プロモーター、５’または３’ＵＴＲ、ＯＲＩ、ＯＲＦなど）に従い、上記の修飾は、（ｉ）フィードバック阻害機構を増加もしくは減少させること、（ｉｉ）プロモーター開始を増加もしくは減少させること、（ｉｉｉ）翻訳開始を増加もしくは減少させること、（ｉｖ）翻訳効率を増加もしくは減少させること、（ｖ）本明細書に記載される核酸試薬から発現されるペプチドまたは生成物の局在化を修飾すること、または（ｖｉ）対象のヌクレオチド配列のコピー数を増加もしくは減少させること、（ｖｉｉ）アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、リボザイムなどの発現によって所与の活性を改変することができる。一部の実施形態では、核酸試薬またはヌクレオチド配列の改変は、フィードバック阻害に関与する領域（例えば、５’ＵＴＲ、プロモーターなど）を改変することができる。フィードバック調節因子の結合性を付加または増加することができる修飾が時々加えられ、フィードバック調節因子の結合性を低減、阻害または除去することができる修飾が時々加えられる。
【０１５７】
特定の実施形態では、核酸試薬またはヌクレオチド配列の改変は、転写開始に関与する配列（例えば、プロモーター、５’ＵＴＲなど）を改変することができる。内因性または異種のプロモーターエレメントからの開始を増強または増加させることができる修飾を時には加えることができる。転写開始を増加または増強する配列を除去または破壊し、内因性または異種のプロモーターエレメントからの転写の減少または除去をもたらす修飾を時には加えることができる。
【０１５８】
一部の実施形態では、核酸試薬またはヌクレオチド配列の改変は、翻訳開始または翻訳効率に関与する配列（例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、より高いかより低い存在度のコドン三重項、翻訳ターミネーター配列など）を改変することができる。翻訳開始を増加または減少させることができ、例えばリボソーム結合部位を修飾する修飾を時には加えることができる。翻訳効率を高めるかまたは低下させることができる修飾を時には加えることができる。ヘアピンを形成する配列を除去または付加し、コドン三重項を多少好ましいコドンに変化させることは、翻訳開始および翻訳効率を改変するために加えることができる遺伝子修飾の非限定例である。
【０１５９】
特定の実施形態では、核酸試薬またはヌクレオチド配列の改変は、ペプチド、タンパク質または他の所望の生成物（例えば、アジピン酸など）の局在化に関与する配列を改変することができる。ポリペプチド、タンパク質または生成物の標的を細胞内オルガネラ、周辺質、細胞膜に、または細胞外にする役割を担う配列を改変、付加または除去することができる修飾を時には加えることができる。異なる細胞内空間または細胞外への異種生成物の輸送は、混在体（例えば、所望の生成物の不溶性凝集体）の形成を低減または除去することができる。
【０１６０】
一部の実施形態では、核酸試薬またはヌクレオチド配列の改変は、対象のヌクレオチド配列のコピー数を増加または減少させることに関与する配列を改変することができる。生物体のゲノム中に、または後成的核酸試薬に安定して組み込まれるＯＲＦのコピー数を増加または減少させる修飾を時には加えることができる。対象の配列のコピー数を増加させることができる改変の非限定例には、ゲノム中の領域の複製によって対象の配列のコピーを加えること（例えば、組換えによって、または宿主ゲノムの遺伝子増幅を引き起こすことによって追加のコピーを加えることなど）、核酸試薬に配列の追加のコピーをクローニングすること、または後成的核酸試薬のコピー数を増加させるためにＯＲＩを改変することが含まれる。対象の配列のコピー数を減少させることができる改変の非限定例には、ゲノム中の領域の欠失または破壊によって対象の配列のコピーを除去すること、後成的核酸試薬から配列の追加のコピーを除去すること、または後成的核酸試薬のコピー数を減少させるためにＯＲＩを改変することが含まれる。
【０１６１】
特定の実施形態では、対象のヌクレオチド配列の発現を増加または減少させることは、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、リボザイムなどの発現に関与する配列を改変、付加、または除去することによって達成することもできる。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、リボザイムなどの発現を修飾するために、上記の方法を用いることができる。
【０１６２】
本明細書に記載される方法および核酸試薬は、アジピン酸合成に関与する細胞工程で、改変された活性を有する遺伝子修飾微生物を生成するために用いることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される工学的に作り出された微生物は、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むことができ、特定の実施形態では、本明細書に記載される工学的に作り出された微生物は、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される工学的に作り出された微生物は、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むことができ、特定の実施形態では、本明細書に記載される工学的に作り出された微生物は、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、細菌からのものであってよい。一部の実施形態では、細菌は、アシネトバクター属、ノカルジア属、シュードモナス属、またはザントバクター属の細菌であってよい。
【０１６３】
特定の実施形態では、本明細書に記載される工学的に作り出された微生物は、ヘキサノエートシンターゼサブユニットＡ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される工学的に作り出された微生物は、ヘキサノエートシンターゼサブユニットＢ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むことができる。特定の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、真真菌から独立に選択される。一部の実施形態では、真真菌はアスペルギルス属の真菌であってよい。特定の実施形態では、アスペルギルス属の真菌は、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓである。
【０１６４】
一部の実施形態では、本明細書に記載される工学的に作り出された微生物は、モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むことができる。特定の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、細菌からのものであってよい。一部の実施形態では、細菌はバチルス属の細菌であってよい。特定の実施形態では、バチルス属の細菌は、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍである。
【０１６５】
一部の実施形態では、本明細書に記載される工学的に作り出された微生物は、モノオキシゲナーゼ活性による一次ヘキサノエート利用をもたらす遺伝子修飾を含むことができる。特定の実施形態では、遺伝子修飾は、ポリケチドシンターゼ活性を低減させることができる。一部の実施形態では、工学的に作り出された微生物は真核生物であってよい。特定の実施形態では、真核生物は酵母であってよい。一部の実施形態では、真核生物は真真菌であってよい。特定の実施形態では、酵母はカンジダ属の酵母であってよい。一部の実施形態では、カンジダ属の酵母は、Ｃ．ｔｒｏｐｌｉｃａｌｉｓであってよい。特定の実施形態では、真真菌はヤロウイア属の真真菌であってよい。一部の実施形態では、ヤロウイア属の真菌は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａであってよい。特定の実施形態では、真真菌はアスペルギルス属の真真菌であってよい。一部の実施形態では、アスペルギルス属の真菌は、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓまたはＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓであってよい。
【０１６６】
特定の実施形態では、本明細書に記載される工学的に作り出された微生物は、６−ヒドロキシヘキサン酸変換を低減させる遺伝子修飾を含むことができる。一部の実施形態では、遺伝子修飾は、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減させることができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される工学的に作り出された微生物は、ベータ酸化活性を低減させる遺伝子修飾を含むことができる。一部の実施形態では、遺伝子修飾は、本明細書に記載される標的活性を低減させることができる。
【０１６７】
特定の実施形態では、本明細書に記載される、アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物は、改変されたモノオキシゲナーゼ活性を含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される工学的に作り出された微生物は、モノオキシゲナーゼ活性を改変する遺伝子修飾を含むことができる。特定の実施形態では、遺伝子修飾は、モノオキシゲナーゼ活性による実質的なヘキサノエート利用をもたらすことができる。一部の実施形態では、遺伝子修飾は、ポリケチドシンターゼ活性を低減させることができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される工学的に作り出された微生物は、モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むことができる。特定の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、細菌からのものであってよい。一部の実施形態では、細菌はバチルス属の細菌であってよい。特定の実施形態では、バチルス属の細菌は、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍである。
【０１６８】
一部の実施形態では、本明細書に記載される工学的に作り出された微生物は、改変されたヘキサノエートシンターゼ活性を含むことができる。特定の実施形態では、改変されたヘキサノエートシンターゼ活性は、改変されたヘキサノエートシンターゼサブユニットＡ活性、改変されたヘキサノエートシンターゼサブユニットＢ活性、または改変されたヘキサノエートシンターゼサブユニットＡ活性および改変されたヘキサノエートシンターゼサブユニットＢ活性である。一部の実施形態では、工学的に作り出された微生物は、ヘキサノエートシンターゼ活性を付加または増加する遺伝子改変を含むことができる。特定の実施形態では、工学的に作り出された微生物は、ヘキサノエートシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、真真菌からのものであってよい。特定の実施形態では、真真菌はアスペルギルス属の真真菌であってよい。一部の実施形態では、アスペルギルス属の真真菌は、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓである。
【０１６９】
特定の実施形態では、本明細書に記載される、アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物は、改変されたチオエステラーゼ活性を含むことができる。一部の実施形態では、工学的に作り出された微生物は、チオエステラーゼ活性を付加または増加する遺伝子修飾を含むことができる。特定の実施形態では、工学的に作り出された微生物は、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むことができる。
【０１７０】
一部の実施形態では、改変されたチオエステラーゼ活性を有する工学的に作り出された微生物は、改変された６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、または改変されたオメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を含むことができる。特定の実施形態では、改変されたチオエステラーゼ活性を有する工学的に作り出された微生物は、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を付加もしくは増加する遺伝子修飾を、またはオメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を付加もしくは増加する遺伝子修飾を含むことができる。一部の実施形態では、工学的に作り出された微生物は、改変された６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むことができ、一部の実施形態では、工学的に作り出された微生物は、改変されたオメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むことができる。特定の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、細菌からのものであってよい。一部の実施形態では、細菌は、アシネトバクター属、ノカルジア属、シュードモナス属、またはザントバクター属の細菌であってよい。
【０１７１】
本明細書に記載される、アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物は、特定の実施形態では、改変された６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を含むことができ、一部の実施形態では、改変されたオメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を含むことができる。特定の実施形態では、工学的に作り出された微生物は、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を付加または増加する遺伝子修飾を含むことができ、一部の実施形態では、工学的に作り出された微生物は、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を付加または増加する遺伝子修飾を含むことができる。特定の実施形態では、工学的に作り出された微生物は、改変された６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むことができ、一部の実施形態では、工学的に作り出された微生物は、改変されたオメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、細菌からのものである。特定の実施形態では、細菌は、アシネトバクター属、ノカルジア属、シュードモナス属、またはザントバクター属の細菌であってよい。一部の実施形態では、工学的に作り出された微生物は、真核生物であってよい。特定の実施形態では、真核生物は酵母であってよい。一部の実施形態では、真核生物は真真菌であってよい。特定の実施形態では、酵母はカンジダ属の酵母であってよい。一部の実施形態では、カンジダ属の酵母は、Ｃ．ｔｒｏｐｌｉｃａｌｉｓであってよい。特定の実施形態では、真真菌はヤロウイア属の真真菌であってよい。一部の実施形態では、ヤロウイア属の真菌はＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａであってよい。特定の実施形態では、真真菌はアスペルギルス属の真真菌であってよい。一部の実施形態では、アスペルギルス属の真菌は、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓまたはＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓであってよい。
【０１７２】
一部の実施形態では、上記工学的に作り出された微生物は、６−ヒドロキシヘキサン酸変換を低減させる遺伝子修飾を含むことができる。特定の実施形態では、遺伝子修飾は、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減させることができる。一部の実施形態では、遺伝子修飾はベータ酸化活性を低減させることができる。特定の実施形態では、遺伝子修飾は、本明細書に記載される標的活性を低減させることができる。
【０１７３】
工学的に作り出された微生物は、宿主ゲノム、または上記の安定して維持される後成的核酸試薬で、ヌクレオチド配列を改変、導入または除去することによって調製することができる。宿主ゲノムまたは後成的核酸でヌクレオチド配列を改変、導入または除去するために用いられる核酸試薬は、本明細書に記載されるかまたは熟練者に利用可能な方法を用いて調製することができる。
【０１７４】
所望の活性を有する核酸配列は、公知のリファレンスマニュアル（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．、Ｅ．  Ｆ．  ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８２年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）に記載される溶解および核酸精製手順を用いるか、または市販の細胞溶解およびＤＮＡ精製の試薬およびキットを用いて、適する生物体の細胞から単離することができる。一部の実施形態では、微生物を遺伝子操作するために用いられる核酸は、その核酸を含む生物体の処理の後に本明細書に記載される方法を実行するために提供することができる。例えば、試料から（例えば、対象の生物体から、または酵母もしくは細菌のような対象の複数の生物体を含む培養から）から、対象の核酸を抽出、単離、精製または増幅することができる。本明細書で用いる用語「単離された」は、その元の環境（例えば、それが天然に存在する場合は天然の環境、外因的に発現される場合は宿主細胞）から取り出され、したがってその元の環境から「人の手によって」改変される核酸を指す。単離された核酸は、供給源試料中に存在する成分の量より少ない非核酸成分（例えば、タンパク質、脂質）で一般に提供される。単離された試料中核酸を含む組成物は、実質的に単離されてよい（例えば、非核酸成分を約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％を超えて含まない）。本明細書で用いる用語「精製された」は、試料中核酸が由来する試料供給源でよりも少ない核酸種を含む、提供試料中核酸を指す。試料中核酸を含む組成物は、実質的に精製されてよい（例えば、他の核酸種を約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％を超えて含まない）。本明細書で用いる用語「増幅された」は、試料中の核酸のヌクレオチド配列またはその一部と同じか実質的に同じヌクレオチド配列を有するアンプリコン核酸を直線的または指数的に生成する工程に、細胞、生物体または試料の核酸をさらすことを指す。上記のように、本明細書に記載される核酸試薬を調製するために用いられる核酸は、断片化または切断にさらすことができる。
【０１７５】
培養が困難である生物体を扱う場合、核酸の増幅が時々必要である。増幅を所望する可能性がある場合、任意の適する増幅技術を利用することができる。ポリヌクレオチドの増幅のための方法の非限定例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；ライゲーション増幅（またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））；Ｑベータレプリカーゼまたは鋳型依存性ポリメラーゼの使用に基づく増幅方法（米国特許出願公開第２００５０２８７５９２号を参照）；ヘリカーゼ依存性等温増幅（Ｖｉｎｃｅｎｔら、「Ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、ＥＭＢＯ報告５巻（８号）：７９５〜８００頁（２００４年））；ストランド置換増幅（ＳＤＡ）；好熱性ＳＤＡ核酸配列に基づく増幅（３ＳＲまたはＮＡＳＢＡ）および転写付随増幅（ＴＡＡ）が含まれる。ＰＣＲ増幅方法の非限定例には、標準ＰＣＲ、ＡＦＬＰ−ＰＣＲ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、Ａｌｕ−ＰＣＲ、不斉ＰＣＲ、コロニーＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、逆ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）、ｉｎ  ｓｉｔｕＰＣＲ（ＩＳＨ）、配列間特異的ＰＣＲ（ＩＳＳＲ−ＰＣＲ）、長ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、ネスト状ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、単一細胞ＰＣＲ、固相ＰＣＲ、それらの組合せなどが含まれる。ＰＣＲを行うための試薬およびハードウェアは、市販されている。
【０１７６】
上記ＰＣＲの様々な型を実行するためのプロトコールは、熟練者ならば容易に利用できる。ＰＣＲ条件は、プライマー配列、標的存在度および所望の増幅量に依存することができ、したがって、当業者はいくつかの利用可能なＰＣＲプロトコールから選択することができる（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号；ならびにＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓら著、１９９０年を参照）。ＰＣＲは、熱安定酵素による自動化工程としてしばしば実行される。この工程では、反応混合液の温度は、変性領域、プライマーアニーリング領域および伸長反応領域を通して自動的に循環される。この目的のために特異的に適応された機器は、市販されている。本明細書に記載される実施形態に適することができるＰＣＲプロトコールの非限定例は、試料を９５℃で５分間処理し；９５℃で１分間、５９℃で１分間、１０秒、および７２℃で１分３０秒間の４５サイクルを繰り返し；次に試料を７２℃で５分間処理する。さらなるＰＣＲプロトコールは、実施例のセクションに記載される。しばしば市販のサーマルサイクラーを用いて、複数のサイクルが実施される。特定の実施形態では、当業者に公知であり、および選択される、適する等温増幅工程を適用することもできる。一部の実施形態では、所望の活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、本明細書に記載される配列に基づいて設計されるオリゴヌクレオチドまたはプライマーを用い、所望の活性を有する生物体から所望の配列を増幅することによって単離することができる。
【０１７７】
増幅、単離および／または精製された核酸は、本明細書の図に記載される組換えＤＮＡベクターに、または適する市販の組換えＤＮＡベクターにクローニングすることができる。組換えＤＮＡベクターへの対象の核酸配列のクローニングは、核酸試薬の調製のための核酸のさらなる操作（例えば、突然変異誘発、相同組換え、増幅などによるヌクレオチド配列の改変）を促進することができる。標準のクローニング手順（例えば、酵素消化、ライゲーションなど）が公知である（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．、Ｅ．  Ｆ．  ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８２年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に記載される）。
【０１７８】
一部の実施形態では、活性を微生物に付加し、それによって遺伝子修飾または工学的に作り出された微生物を作製するために、単離または増幅によって調製された核酸配列をさらなる修飾なしで用いることができる。特定の実施形態では、単離または増幅によって調製された核酸配列は、所望の活性を改変する（例えば、増加または減少する）ために遺伝子修飾されてもよい。一部の実施形態では、生物体に活性を付加するために用いられる核酸は、所望の活性をコードする異種ポリヌクレオチド配列（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質など）を最適化するために、時々遺伝子修飾される。本明細書で用いる用語「最適化する」は、好ましいコドン使用によって発現を増加または増強する改変を指すことができる。用語最適化は、その活性がそのポリペプチドまたはタンパク質の「天然」バージョンと比較してより高い触媒活性を示すように、ポリペプチドまたはタンパク質の活性を増加するアミノ酸配列の修飾を指すこともできる。
【０１７９】
対象の核酸配列は、当技術分野で公知である方法を用いて遺伝子修飾することができる。突然変異誘発技術は、小規模（例えば、１、２、５、１０もしくはそれより多くのヌクレオチド）または大規模（例えば、５０、１００、１５０、２００、５００もしくはそれより多くのヌクレオチド）遺伝子修飾に特に役立つ。突然変異誘発は、熟練者が、自然に（例えば、選択およびスクリーニングを用いる単離）または化学物質、放射線もしくは不正確なＤＮＡ複製（例えば、ＰＣＲ突然変異誘発）の使用によって実験的に、安定した方法で生物体の遺伝情報を改変することを可能にする。一部の実施形態では、遺伝子修飾は、参照配列として本来のヌクレオチド配列を用いる核酸の全スケール人工合成、および活性の所望の改変をもたらすことができるヌクレオチドの修飾によって実施することができる。突然変異誘発法は、時々特定の領域またはヌクレオチドに特異的であるかそれを標的にする（例えば、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発技術、例えばトランス配置およびｉｎ  ｖｉｖｏオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発など）。突然変異誘発法は、遺伝子修飾の配置に関して時々非特異的であるかランダムである（例えば、化学突然変異誘発、挿入エレメント（例えば、挿入またはトランスポゾンエレメント）および不正確なＰＣＲに基づく方法など）。
【０１８０】
部位特異的突然変異誘発は、ＤＮＡ分子中の１つ以上の特定のヌクレオチドが突然変異または改変される手順である。部位特異的突然変異誘発は、一般的に、環状プラスミドベクターにクローニングされた対象の核酸配列を用いて実施される。部位特異的突然変異誘発は、野生型配列が公知であり、遺伝子改変のためのプラットホームとして用いられることを必要とする。部位特異的突然変異誘発は、対象のヌクレオチド配列を補体に取り込んだ所望の遺伝子修飾を有するオリゴヌクレオチドを用いてその技術を実施することができるので、時々オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発と呼ばれる。野生型配列および改変されたヌクレオチドをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長および複製される。二本鎖核酸が宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入され、さらなる回数の複製がｉｎ  ｖｉｖｏで実行される。次に、突然変異した核酸配列を運ぶ形質転換細胞を、正しく突然変異した配列を運ぶ細胞について選択および／またはスクリーニングする。カセット式突然変異誘発およびＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発は、部位特異的突然変異誘発技術のさらなる修飾形態である。部位特異的突然変異誘発は、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施することもできる（例えば、トランス配置「ポップインポップアウト」、合成オリゴヌクレオチドによるｉｎ  ｖｉｖｏ部位特異的突然変異誘発など）。
【０１８１】
ＰＣＲに基づく突然変異誘発は、１つ以上の所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーでＰＣＲを用いて実施することができる。この技術は、微生物宿主でクローンの複製および選択に代えてサーモサイクラーおよびＰＣＲ条件が用いられることを除いて、標準の部位特異的突然変異誘発に類似した方法で機能する。ＰＣＲに基づく突然変異誘発は環状プラスミドベクターも用いるので、取り込まれた遺伝子修飾を含む増幅断片（例えば、線状核酸分子）は、十分な回数のサーモサイクラー増幅の後に、標準の電気泳動手順を用いて鋳型配列を含むプラスミドから分離することができる。この方法の修飾形態は、プラスミド全体を増幅する線状増幅方法および一対の突然変異誘発プライマーを用いる。この手順は、ｉｎ  ｖｉｖｏで複製されるＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩに感受性にするＥ．ｃｏｌｉ  Ｄａｍメチラーゼ系を利用する。ＰＣＲで合成されたＤＮＡはメチル化されず、したがってＤｐｎＩに抵抗性である。この手法は、鋳型プラスミドが消化され、遺伝子修飾されたＰＣＲで合成されたプラスミドが単離され、ＤＮＡ修復および複製のために宿主菌に形質転換されることを可能にし、それによって以降のクローニングおよび同定ステップを促進する。部分変性プライマーを用いることにより、ＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発に一定量のランダム性を加えることができる。
【０１８２】
時には、突然変異誘発のためのツールとして組換えを用いることができる。相同組換えは、熟練者が宿主生物の天然のＤＮＡ複製および修復酵素を用いて、異種ヌクレオチド配列の挿入のために公知の配列の領域を特異的に標的にすることを可能にする。相同組換え法は、「ポップインポップアウト」突然変異誘発、トランス配置、ノックアウト突然変異誘発またはノックイン突然変異誘発と時々呼ばれる。宿主ゲノムへの核酸配列の組込みは、核酸試薬全体を挿入する単一の交差事象である（例えば、ポップイン）。第二の交差事象は、核酸試薬の一部以外のすべてを切除し、異種配列を残し、しばしば、「フットプリント」と呼ばれる（例えば、ポップアウト）。挿入（例えば、ノックイン）、または破壊性の異種核酸を残す二重組換え（例えば、ノックアウト）による突然変異誘発は、挿入が起こる遺伝子または核酸配列の機能を破壊または「ノックアウト」する働きを両方ともする。選択可能なマーカーおよび／または栄養要求性マーカーを適当な核酸標的配列を提供するように設計された核酸試薬と組み合わせることによって、熟練者は特定の領域を選択可能な核酸試薬の標的にし、挿入（例えば、「ポップイン」）された核酸試薬の一部を「ポップアウト」する組換え事象について次に選択することができる。
【０１８３】
そのような方法は、対象の核酸またはゲノム領域の、またはその近くの公知の標的核酸配列で特異的に設計された核酸試薬を利用する。ポップアウトすることは、組換え事象の後に残る残余配列の「フットプリント」を一般的に残す。残余配列は遺伝子を破壊し、それによってその遺伝子の発現を低減または除去することができる。一部の実施形態では、その遺伝子の上流または下流に、遺伝子の発現の増強または低減をもたらすことができる配列を挿入するためにこの方法を用いることができる。特定の実施形態では、類似した組換え法または「ポップイン」法を用いて、新しい遺伝子を宿主生物体のゲノムに導入することができる。ｕｒａ３遺伝子および５−ＦＯＡを用いる酵母組換系の例を上で簡潔に記載し、さらなる詳細が本明細書で提示される。
【０１８４】
修飾のための方法は、Ａｌａｎｉら、「Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ａｌｌｏｗｓ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ＵＲＡ３  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｙ  ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ  ｙｅａｓｔ  ｓｔｒａｉｎｓ」、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１１６巻（４号）：５４１〜５４５頁、１９８７年８月に記載されている。元の方法は、ＵＲＡ３カセットの両側に同じ配向でクローニングされた同じヌクレオチド配列の１０００塩基対（ｂｐ）を有するＵｒａ３カセットを用いる。約５０ｂｐのターゲッティング配列が、構築物の両側に加えられる。二本鎖ターゲッティング配列は、宿主生物体のゲノム中の配列に相補的である。ターゲッティング配列は、対象領域での部位特異的組換えを可能にする。元の技術の修飾形態は、２つの１０００ｂｐ配列ダイレクトリピートを２つの２００ｂｐダイレクトリピートで置換する。修飾方法は、５０ｂｐターゲッティング配列も用いる。修飾は第一の突然変異誘発で残される１０００ｂｐ反復配列への第二のノックアウトの組換えを低減または除去し、したがって多重ノックアウト酵母を可能にする。さらに、本明細書で用いられる２００ｂｐ配列は、識別可能なフットプリントを残す、特異的に設計された自己組織化配列である。配列を設計するために用いられる技術は、酵母ゲノムとの低い同一性およびお互いとの低い同一性などの設計特徴を取り込む。したがって、前のノックアウトへの組込みの可能性を低減または除去しつつ、同じ生物体で複数のノックアウトを可能にするために、自己組織化配列のライブラリーを生成することができる。
【０１８５】
上記のように、ＵＲＡ３カセットは、機能的ＵＲＡ３遺伝子を運ぶ酵母で５−ＦＯＡの毒性を利用する。ウラシル合成欠損酵母は、標準の酵母形質転換プロトコールを用いて修飾ＵＲＡ３カセットで形質転換され、形質転換細胞はウラシルを欠く最少培地に平板培養される。一部の実施形態では、宿主ゲノムでの対象領域への正しい挿入を検証するためにＰＣＲを用いることができ、特定の実施形態ではＰＣＲステップを省略することができる。ＰＣＲステップの組入れは、ＵＲＡ３カセットを「ポップアウト」するために対抗選択される必要性がある形質転換体数を減少させることができる。形質転換体（例えば、すべてまたはＰＣＲによって正しいと決定されたもの）は、ＵＲＡ３カセットから組換えについて選択する（例えば、ポップアウトする）、５−ＦＯＡ含有培地で次に対抗選択することができ、このように酵母を再びｕｒａ３欠損に、および５−ＦＯＡ毒性耐性にする。組換え事象を特異的領域に誘導するのに用いられるターゲッティング配列は、本明細書で提示される。上記の方法の修飾形態は、染色体に遺伝子を組み込むために用いることができ、そこでは、組換えの後、機能的遺伝子は染色体の２００ｂｐフットプリントの隣に残される。
【０１８６】
一部の実施形態では、選択培地および選択剤に適当な変更を加えて、他の栄養要求性またはドミナント選択マーカーをＵＲＡ３の代わりに用いることができる（例えば、栄養要求性選択マーカー）。栄養要求性選択マーカーは、必要とされる生体分子（例えば、アミノ酸またはヌクレオシドなど）の合成に欠陥のある株で用いられる。さらなる栄養要求性マーカーの非限定例には、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＬＥＵ２−ｄおよびＬＹＳ２が含まれる。特定の栄養要求性マーカー（例えば、ＵＲＡ３およびＬＹＳ２）は、組換え構築物のダイレクトリピートの１つ以外のすべてをポップアウトする第二の組換え事象について選択する対抗選択を可能にする。ＨＩＳ３は、ヒスチジン合成に関与する活性をコードする。ＴＲＰ１は、トリプトファン合成に関与する活性をコードする。ＬＥＵ２は、ロイシン合成に関与する活性をコードする。ＬＥＵ２−ｄは、ロイシンを欠く最少培地での生存を可能にするために、コピー数（例えば、遺伝子またはプラスミドのコピー数など）の増加について選択するＬＥＵ２の低発現バージョンである。ＬＹＳ２はリシン合成に関与する活性をコードし、アルファ−アミノアジピン酸塩（αアミノアジピン酸塩）を用いて、ＬＹＳ２遺伝子からの組換えについての対抗選択を可能にする。
【０１８７】
ドミナント選択マーカーは、産業用のおよび／または原栄養体性の株を遺伝子操作のために用いることも可能にするので役立つ。さらに、ドミナント選択マーカーは、平板培養および培養増殖のために富栄養培地を用いることができ、したがって増殖速度が著しく高まる利点を提供する。ドミナント選択マーカーの非限定例には、Ｔｎ９０３  ｋａｎｒ、Ｃｍｒ、Ｈｙｇｒ、ＣＵＰ１およびＤＨＦＲが含まれる。Ｔｎ９０３  ｋａｎｒは、カナマイシン抗生物質耐性に関与する活性をコードする（例えば、一般的にネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩまたはＮＰＴＩＩなど）。Ｃｍｒは、クロラムフェニコール抗生物質耐性に関与する活性をコードする（例えば、一般的にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたはＣＡＴなど）。Ｈｙｇｒは、ハイグロマイシンＢのリン酸化によってハイグロマイシン耐性に関与する活性をコードする（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼまたはＨＰＴ）。ＣＵＰ１は、重金属（例えば、銅など）による毒性への耐性に関与する活性をコードする。ＤＨＦＲは、メトトレキセートおよびスルファニルアミド（ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｄｅ）化合物への耐性を与えるジヒドロ葉酸レダクターゼ活性をコードする。
【０１８８】
部位特異的もしくは特異的突然変異誘発と対照的に、ランダム突然変異誘発は配列情報を必要とせず、いくつかの大きく異なる方法によって達成することができる。ランダム突然変異誘発は、所望の遺伝子型または表現型についてスクリーニングするために用いることができる突然変異体ライブラリーを作製するために、しばしば用いられる。ランダム突然変異誘発の非限定例には、化学突然変異誘発、ＵＶ誘発突然変異誘発、挿入エレメントまたはトランスポゾン媒介突然変異誘発、ＤＮＡシャフリング、変異性ＰＣＲ突然変異誘発などが含まれる。
【０１８９】
化学突然変異誘発は、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、亜硝酸、マイトマイシンＣ、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）、ジエポキシブタン（ＤＥＢ）、１，２，７，８−ジエポキシオクタン（ＤＥＯ）、メチルメタンスルホン酸（ＭＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、４−ニトロキノリン１−オキシド（４−ＮＱＯ）、２−メチルオキシ−６−クロロ−９（３−［エチル−２−クロロエチル］−アミノプロピルアミノ）−アクリジンジヒドロクロリド（ＩＣＲ−１７０）、２−アミノプリン（２ＡＰ）およびヒドロキシルアミン（ＨＡ）のような化学物質をしばしば含み、これらは非限定例として本明細書で提供される。これらの化学物質は、塩基対置換、フレームシフト突然変異、欠失、塩基転換型突然変異、転移突然変異、誤った複製などを引き起こすことができる。一部の実施形態では、突然変異誘発をｉｎ  ｖｉｖｏで実行することができる。時々、突然変異誘発工程は、突然変異を起こした１つ以上の塩基を取り込み、複製するために、宿主生物体ＤＮＡの複製および修復機構の使用を含む。
【０１９０】
化学突然変異誘発の別の型は、塩基類似体の使用を含む。塩基類似体の使用は、複製の次の回で出発配列と比較して不一致のヌクレオチドに補正される、誤った塩基対形成を引き起こす。出発配列の特定のヌクレオチドに取り込むことができる特異的塩基類似体を選択することができるので、塩基類似体突然変異誘発は、ランダム突然変異誘発に少量の非ランダム性を導入する。誤対合の補正は、公知の置換を一般的に与える。例えば、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）は、ＤＮＡに取り込ませることができ、配列でＴを置換する。宿主ＤＮＡの修復および複製機構は、時に欠陥を補正することができるが、時々ＢｒｄＵをＧと誤って対合させる。次の回の複製は、本来の配列の元のＡ−ＴからのＧ−Ｃトランスバージョンを次に引き起こす。
【０１９１】
紫外線（ＵＶ）誘発突然変異誘発は、紫外線が２つの隣接チミン残基の間の化学結合を照射するときに、チミジンダイマーの形成によって引き起こされる。宿主生物体の切除修復機構はＤＮＡの損傷を補正するが、損傷は時折誤って修復され、ＣからＴへの転移を一般的にもたらす。
【０１９２】
挿入エレメントまたはトランスポゾン媒介突然変異誘発は、天然に存在するか、または修飾された天然に存在する可動遺伝子エレメントを利用する。トランスポゾンは、転位のために必要な活性（例えば、トランスポザーゼ活性を用いる移動）に加えて、補助活性をしばしばコードする。多くの例では、トランスポゾン補助活性は、抗生物質耐性マーカー（例えば、上記のＴｎ９０３  ｋａｎｒを参照）である。一般的に、挿入エレメントは、核酸配列の移動に必要な活性をコードするだけである。挿入エレメントおよびトランスポゾン媒介突然変異誘発はしばしばランダムに起こることができるが、特異的標的配列が一部のトランスポゾンで公知である。ＩＳエレメントまたはトランスポゾン（Ｔｎ）のような可動遺伝子エレメントは、転位遺伝子をコードする領域に連なる逆方向リピート、ダイレクトリピート、または逆方向およびダイレクトリピートの両方をしばしば有する。トランスポザーゼによって触媒される組換え事象は、エレメントにゲノムからそれ自体を切り離させて新しい場所へ移動させ、逆方向またはダイレクトリピートの一部を残す。トランスポゾンの古典的な例は、トウモロコシで発見された「可動遺伝子エレメント」である。トランスポゾン突然変異キットは市販されており、それらは５コドンの挿入断片を残すように設計されている（例えば、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍキット、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、ワールドワイドウェブＵＲＬ、ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ．ｕｓ）。これは、ほとんどの遺伝子の機能を完全に破壊することなく、熟練者が挿入部位を同定することを可能にする。
【０１９３】
ＤＮＡシャフリングは、突然変異体ライブラリーのメンバーからのＤＮＡ断片を用い、断片をランダムに改造して新しい突然変異体配列の組合せを生成する方法である。断片は、ＤＮａｓｅＩを用い、続いてランダムなアニーリング、および自己プライミングＰＣＲを用いる再結合を用いて一般的に生成される。ランダムな断片のアニーリングからのＤＮＡ突出末端は、ＰＣＲ法のための「プライマー」配列を提供する。シャフリングは、上記の突然変異誘発法のいずれかによって生成されるライブラリーに適用することができる。
【０１９４】
変異性ＰＣＲおよびその誘導体ローリングサークル変異性ＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼの忠実度を低減させるために、１つまたは２つのヌクレオチドの制限量と一緒に、増加させた濃度のマグネシウムおよびマンガンを用いる。生じた突然変異体配列を野生型出発配列と比較したとき、誤り率は、適当な条件下で２％の高さになることがある。増幅の後、突然変異体コード配列のライブラリーは、適するプラスミドにクローニングされなければならない。点突然変異は変異性ＰＣＲで最も一般的な型の突然変異であるが、欠失およびフレームシフト突然変異も可能である。いくつかの市販の変異性ＰＣＲキットが利用でき、それらには、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅおよびＣｌｏｎｔｅｃｈからのものが含まれる（例えば、それぞれワールドワイドウェブＵＲＬ、ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ．ｃｏｍおよびワールドワイドウェブＵＲＬ、ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ）。ローリングサークル変異性ＰＣＲは、野生型配列がプラスミドに先ずクローニングされ、次に全プラスミドが誤りを起こしやすい条件下で増幅される、変異性ＰＣＲの変異体である。
【０１９５】
上記したように、改変された活性を有する生物体は、遺伝子選択および選択培地に曝露させた生物体のスクリーニングを用いて、または特異な環境から天然に存在する変異体を同定することによって単離することもできる。例えば、２−デオキシ−Ｄ−グルコースは毒性のグルコース類似体である。この物質の上での酵母の生育は、グルコース脱制御される突然変異体を与える。２−デオキシ−Ｄ−グルコースを用いて、輸送突然変異体、および先ずグルコース、その後グルコースが消耗されるとガラクトースを発酵させる代わりにグルコースおよびガラクトースを同時に発酵させる突然変異体を含む、いくつかの突然変異体が単離されている。研究室の状況で、または特異な環境からのプラスチック（例えば、埋め立て地から）、石油化学製品（例えば、石油流出から）などを代謝することができる突然変異体微生物を単離するために、類似した技術が用いられている。
【０１９６】
一部の実施形態では、選択される生物体で活性が比較的低いかほとんど検出不能であるレベルで存在する場合に、所望の活性で天然に存在する突然変異を単離するために、類似した方法を用いることができる。この方法は、生物体を液体培養で特定の密度まで生育させ、細胞を濃縮し、代謝活性の増加が所望である物質の様々な濃度で細胞を平板培養することから成る。５〜１０日の間、細胞を中程度の成長温度でインキュベートする。選択工程を強化するために、プレートを低温でさらに５〜１０日の間保存してもよい。低温は、活性を得たかまたは増加させた株に生育を継続させることが時にはできるが、他の株は低温で生育が阻害される。低温での最初の選択および二次生育の後に、所望の活性についてさらに選択するために、選択物質のより高いかより低い濃度でプレートを繰り返し平板培養してもよい。
【０１９７】
宿主生物体への導入のために、天然、異種、または突然変異を起こしたポリヌクレオチドを核酸試薬に導入し、それによって工学的に作り出された微生物を生成することができる。熟練者ならば、標準の組換えＤＮＡ技術（制限酵素消化、ライゲーションなど）を用いて、対象の突然変異を起こした核酸を、（ｉ）宿主生物体で選択によって安定して維持することができるか、または（ｉｉ）宿主生物体のゲノムに組み込むことができる、適する核酸試薬と組み合わせることができる。上記したように、宿主生物体（例えば、酵母または真真菌）への最終生成物の最終導入の前に、細菌で同じ核酸試薬の操作を可能にするために、核酸試薬は時々２つの複製起源を含む。標準の分子生物学および組換えＤＮＡ方法が公知である（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．、Ｅ．  Ｆ．  ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８２年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に記載されている）。
【０１９８】
様々な技術を用いて、核酸試薬を微生物に導入することができる。異種核酸を様々な生物体に導入するために用いられる方法の非限定例には、以下のものが含まれる；形質転換、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、超音波媒介形質転換、粒子衝撃など。一部の例では、担体分子（例えば、ビスベンズイミダゾリル化合物、例えば、米国特許第５５９５８９９号を参照）の付加は、一般的に従来の方法によって形質転換するのは困難であると思われている細胞でＤＮＡの取込みを増加させることができる。従来の形質転換方法が公知である（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．、Ｅ．  Ｆ．  ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８２年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に記載されている）。
【０１９９】
培養、生産および処理方法
工学的に作り出された微生物は、多くの場合、標的分子（例えば、６炭素標的分子）の収量を最適化する条件下で培養される。そのような標的分子の非限定例は、アジピン酸および６−ヒドロキシヘキサン酸である。培養条件は、しばしば以下の活性の１つ以上の活性を最適化する：６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ、モノオキシゲナーゼ、モノオキシゲナーゼレダクターゼ、脂肪アルコールオキシダーゼ、アシル−ＣｏＡリガーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよび／またはアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性。一般に、最適化することができる条件の非限定例には、炭素源の型および量、窒素源の型および量、Ｃ／Ｎ比、酸素レベル、生育温度、ｐＨ、バイオマス生産段階の長さ、標的生成物蓄積段階の長さ、および細胞収穫時間が含まれる。
【０２００】
培地は、一般に適する炭素源を含む。微生物培養および／または発酵工程に役立つ炭素源は、供給材料と時々呼ばれる。本明細書で用いる用語「供給材料」は、生物体に提供される、生育に役立つエネルギーおよび代謝産物を生成するために生物体によって用いられる炭素源を含む組成物を指す。供給材料は、天然の物質、「人工物質」、精製もしくは単離された物質、精製された物質の混合物、精製されていない物質の混合物、またはそれらの組合せであってよい。供給材料は、多くの場合人によって調製され、および／または人によって生物体に提供され、供給材料はたいてい生物体への投与の前に製剤化される。炭素源には、それらに限定されないが、以下の物質の１つ以上を含めることができる：単糖（例えば、「サッカライド」とも呼ばれ、６炭素糖（例えば、グルコース、フルクトース）、５炭素糖（例えば、キシロースおよび他のペントース）などが含まれる）、二糖（例えば、ラクトース、スクロース）、オリゴ糖（例えば、グリカン、単糖のホモポリマー）、多糖（例えば、デンプン、セルロース、単糖のヘテロポリマーまたはそれらの混合物）、糖アルコール（例えば、グリセロール）、ならびに再生可能な供給材料（例えば、乳清透過水、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜、大麦の麦芽）。炭素源は、以下の非限定例の１つ以上から選択されてもよい：パラフィン（例えば、飽和パラフィン、不飽和パラフィン、置換されたパラフィン、線状パラフィン、分枝状パラフィンまたはそれらの組合せ）；その各々は線状、分枝状、飽和、不飽和、置換の状態であってよいアルカン（例えば、ヘキサン）、アルケンまたはアルキンまたはそれらの組合せ（後にさらに詳しく記載される）；線状または分枝状のアルコール（例えば、ヘキサノール）；脂肪酸（例えば、遊離脂肪酸、ソーダ油滓などを含む、約１炭素から約６０炭素のもの）；脂肪酸のエステル；モノグリセリド；ジグリセリド；トリグリセリド、リン脂質。供給材料を調製するための非限定的市販製品源には、植物または植物生産物（例えば、植物油（例えば、アーモンドオイル、カノーラ油、カカオバター、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、アマニ油、ブドウ種子油、イリッペ、オリーブ油、パーム油、パームオレイン、パーム核油、サフラワー油、落花生油、ダイズ油、ゴマ油、シアナッツ油、ヒマワリ油胡桃油など、およびそれらの組合せ）ならびに動物脂肪（例えば、牛脂、乳脂、豚脂、タラ肝油））が含まれる。炭素源には、石油生成物および／または石油蒸留物（例えば、ディーゼル、重油、ガソリン、灯油、パラフィンワックス、パラフィン油、石油化学製品）が含まれてもよい。
【０２０１】
本明細書で用いる用語「パラフィン」は、供給源（例えば、植物由来、石油由来、化学合成、微生物発酵）または炭素鎖長とは無関係に、アルカン炭化水素の一般名を指す。炭素源は時々パラフィンを含み、一部の実施形態では、パラフィンは炭素源中で優勢である（例えば、約７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のパラフィン）。パラフィンは、時には飽和し（例えば、完全飽和）、時には１つ以上の不飽和（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の不飽和）を含み、時には１つ以上の非水素置換基で置換されている。非水素置換基の非限定例には、ハロ、アセチル、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ、＝ＮＲ、ＯＲ、ＮＲ２、ＳＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＮＲ２、ＮＲＳＯ２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲおよびＮＯ２が含まれ、式中、各Ｒは、独立にＨ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールまたはＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリールであり、各Ｒは、任意選択でハロ、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ’、＝ＮＲ’、ＯＲ’、ＮＲ’２、ＳＲ’、ＳＯ２Ｒ’、ＳＯ２ＮＲ’２、ＮＲ’ＳＯ２Ｒ’、ＮＲ’ＣＯＮＲ’２、ＮＲ’ＣＯＯＲ’、ＮＲ’ＣＯＲ’、ＣＮ、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’２、ＯＯＣＲ’、ＣＯＲ’およびＮＯ２で置換され、各Ｒ’は、独立にＨ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールまたはＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリールである。
【０２０２】
一部の実施形態では、供給材料は、培養される工学的に作り出された微生物の遺伝子型および／または表現型によって選択される。例えば、本明細書に記載されるように、１２炭素脂肪酸、１２炭素ジカルボン酸または１２炭素パラフィン、または１０炭素および１２炭素化合物の混合物に富む供給材料は、ＰＯＸ４活性を破壊することによってベータ酸化を部分的にブロックする改変を抱える酵母株の培養に役立つことができる。１０および／または１２炭素を有する炭素源の非限定例には、脂肪（例えば、ヤシ油、パーム核油）、１０または１２炭素を有するパラフィン（例えば、アルカン、アルケンまたはアルキン）、（例えば、デカン、ドデカン（アダカン（ａｄａｋａｎｅ）１２、ビヘキシル、ジヘキシルおよびデュオデカンとも呼ばれる）、アルケンおよびアルキン誘導体）、脂肪酸（デカン酸、ドデカン酸）、脂肪アルコール（デカノール、ドデカノール）など、無毒性置換誘導体またはそれらの組合せが含まれる。
【０２０３】
炭素源は、時々アルキル、アルケニルまたはアルキニル化合物もしくは分子（例えば、アルキル、アルケニルまたはアルキニル部分を含む化合物（例えば、アルカン、アルケン、アルキン））を含む。特定の実施形態では、アルキル、アルケニルまたはアルキニル分子、またはそれらの組合せは炭素源中で優勢である（例えば、約７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のそれらの分子）。本明細書で用いるように、用語「アルキル」、「アルケニル」および「アルキニル」には、直鎖状（本明細書で「線状」と呼ばれる）、分岐鎖の（本明細書で「非線状」と呼ばれる）、環状一価のヒドロカルビル基、およびこれらの組合せが含まれ、それらは非置換の場合にＣおよびＨ原子だけを含む。アルキル部分の非限定例には、メチル、エチル、イソブチル、シクロヘキシル、シクロペンチルエチル、２−プロペニル、３−ブチニルなどが含まれる。ＣおよびＨ原子だけを含み、非置換であるアルキルは、時々「飽和」と呼ばれる。アルケニルまたはアルキニルは、それぞれ１つ以上の二重結合または三重結合を含み、一般に「不飽和」である。アルケニルは、任意の数の二重結合、例えば１、２、３、４または５個の二重結合を含むことができる。アルキニルは、任意の数の三重結合、例えば１、２、３、４または５個の三重結合を含むことができる。アルキル、アルケニルおよびアルキニル分子は、約２個から約６０個の間の炭素原子（Ｃ）を時々含む。例えば、アルキル、アルケニルおよびアルキニル分子は、約１炭素原子、約２炭素原子、約３炭素原子、約４炭素原子、約５炭素原子、約６炭素原子、約７炭素原子、約８炭素原子、約９炭素原子、約１０炭素原子、約１２炭素原子、約１４炭素原子、約１６炭素原子、約１８炭素原子、約２０炭素原子、約２２炭素原子、約２４炭素原子、約２６炭素原子、約２８炭素原子、約３０炭素原子、約３２炭素原子、約３４炭素原子、約３６炭素原子、約３８炭素原子、約４０炭素原子、約４２炭素原子、約４４炭素原子、約４６炭素原子、約４８炭素原子、約５０炭素原子、約５２炭素原子、約５４炭素原子、約５６炭素原子、約５８炭素原子または約６０炭素原子を含むことができる。一部の実施形態では、パラフィンは約８個から約１８個の間の炭素原子の平均炭素原子数を有することができる（例えば、約８炭素原子、約９炭素原子、約１０炭素原子、約１１炭素原子、約１２炭素原子、約１３炭素原子、約１４炭素原子、約１５炭素原子、約１６炭素原子、約１７炭素原子および約１８炭素原子）。単一の基は、複数の型の多重結合、以上の多重結合を含むことができる。そのような基は、それらが少なくとも１つの炭素間二重結合を含む場合には用語「アルケニル」の定義に含まれ、それらが少なくとも１つの炭素間三重結合を含む場合には用語「アルキニル」に含まれる。アルキル、アルケニルおよびアルキニル分子には、アルキル、アルケニルおよび／またはアルキニル部分を含む分子が含まれ、アルキル、アルケニルまたはアルキニル部分から成る分子が含まれる（すなわち、アルカン、アルケンおよびアルキン分子）。
【０２０４】
アルキル、アルケニルおよびアルキニル置換基は、１〜２０Ｃ（アルキル）または２〜２０Ｃ（アルケニルもしくはアルキニル）を時々含む。それらは、一部の実施形態では約８〜１４Ｃまたは約１０〜１４Ｃを含むことができる。単一の基は、複数の型の多重結合、以上の多重結合を含むことができる。そのような基は、それらが少なくとも１つの炭素間二重結合を含む場合には用語「アルケニル」の定義に含まれ、それらが少なくとも１つの炭素間三重結合を含む場合には用語「アルキニル」に含まれる。
【０２０５】
アルキル、アルケニルおよびアルキニルの基または化合物は、そのような置換を合成することができ、存在することができる範囲で時々置換される。一般的な置換基には、それらに限定されないが、ハロ、アセチル、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ、＝ＮＲ、ＯＲ、ＮＲ２、ＳＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＮＲ２、ＮＲＳＯ２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲおよびＮＯ２が含まれ、式中、各Ｒは、独立にＨ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ６〜Ｃ１１アリールまたはＣ５〜Ｃ１１ヘテロアリールであり、各Ｒは、任意選択でハロ、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ’、＝ＮＲ’、ＯＲ’、ＮＲ’２、ＳＲ’、ＳＯ２Ｒ’、ＳＯ２ＮＲ’２、ＮＲ’ＳＯ２Ｒ’、ＮＲ’ＣＯＮＲ’２、ＮＲ’ＣＯＯＲ’、ＮＲ’ＣＯＲ’、ＣＮ、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’２、ＯＯＣＲ’、ＣＯＲ’およびＮＯ２で置換され、各Ｒ’は、独立にＨ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールまたはＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリールである。アルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールまたはＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリールによって置換されてもよく、それぞれは特定の基に適当である置換基によって置換されてもよい。
【０２０６】
「アセチレン」または「アセチル」置換基は、任意選択で置換される２〜１０Ｃアルキニル基であり、式−Ｃ≡Ｃ−Ｒｉで表され、式中、ＲｉはＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ７〜Ｃ１２アリールアルキルまたはＣ６〜Ｃ１２ヘテロアリールアルキルであり、各Ｒｉ基は、ハロ、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ’、＝ＮＲ’、ＯＲ’、ＮＲ’２、ＳＲ’、ＳＯ２Ｒ’、ＳＯ２ＮＲ’２、ＮＲ’ＳＯ２Ｒ’、ＮＲ’ＣＯＮＲ’２、ＮＲ’ＣＯＯＲ’、ＮＲ’ＣＯＲ’、ＣＮ、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’２、ＯＯＣＲ’、ＣＯＲ’およびＮＯ２から選択される１つ以上の置換基によって任意選択で置換され、各Ｒ’は、独立にＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アシル、Ｃ２〜Ｃ６ヘテロアシル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ７〜１２アリールアルキルまたはＣ６〜１２ヘテロアリールアルキルであり、それぞれはハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アシル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアシル、ヒドロキシ、アミノおよび＝Ｏから選択される１つ以上の基によって任意選択で置換され；２つのＲ’は連結されて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される最高３つのヘテロ原子を任意選択で含む３〜７員環を形成することができる。一部の実施形態では、−Ｃ≡Ｃ−ＲｉのＲｉはＨまたはＭｅである。
【０２０７】
炭素源は、時々、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニルおよび／またはヘテロアルキニルの分子または化合物を含む（例えば、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニルおよび／またはヘテロアルキニル部分を含む（例えば、ヘテロアルカン、ヘテロアルケンまたはヘテロアルキン））。「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」および「ヘテロアルキニル」などは、対応するヒドロカルビル（アルキル、アルケニルおよびアルキニル）基と同様に定義されるが、用語「ヘテロ」は、骨格中に１〜３個のＯ、ＳまたはＮヘテロ原子またはそれらの組合せを含む基を指し、したがって対応するアルキル、アルケニルまたはアルキニル基の少なくとも１つの炭素原子は、指定されるヘテロ原子の１つによって置換され、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニルまたはヘテロアルキニル基を形成する。アルキル、アルケニルおよびアルキニル基のヘテロ形の種類およびサイズは、対応するヒドロカルビル基に一般的に同じであり、ヘテロ形に存在することができる置換基は、ヒドロカルビル基について上に記載されたものと同じである。化学安定性の理由で、特に明記しない限り、ニトロまたはスルホニル基の場合のようにオキソ基がＮまたはＳの上に存在する場合を除き、そのような基は２つを超える連続するヘテロ原子を含まないとも理解される。
【０２０８】
本明細書で用いる用語「アルキル」には、シクロアルキルおよびシクロアルキルアルキルの基および化合物が含まれ、用語「シクロアルキル」は、環炭素原子を通して連結される炭素環式非芳香族の化合物または基を記載するために本明細書で用いることができ、「シクロアルキルアルキル」は、アルキルリンカーを通して分子に連結される炭素環式非芳香族の化合物または基を記載するために用いることができる。同様に、「ヘテロシクリル」は、環メンバーとして少なくとも１つのヘテロ原子を含み、ＣまたはＮであってよい環原子を通して分子に連結される非芳香族環状基を記載するために用いることができ、「ヘテロシクリルアルキル」は、リンカーを通して別の分子に連結されるそのような基を記載するために用いることができる。シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキル基に適するサイズおよび置換基は、アルキル基について上に記載されるものと同じである。本明細書で用いるように、これらの用語には、その環が芳香族でない限り、１つまたは２つの二重結合を含む環も含まれる。
【０２０９】
炭素源は、時にはアシル化合物または部分を含む（例えば、アシル部分を含む化合物）。本明細書で用いるように、「アシル」は、カルボニル炭素原子の２つの利用可能な原子価位置の１つで結合するアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアリールアルキル基を含む基を包含し、ヘテロアシルは、カルボニル炭素以外の少なくとも１つの炭素がＮ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子によって置換されている、対応する基を指す。したがって、ヘテロアシルには、例えば、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲおよび−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２ならびに−Ｃ（＝Ｏ）−ヘテロアリールが含まれる。
【０２１０】
アシルおよびヘテロアシル基は、それらがカルボニル炭素原子の開放原子価を通して結合する任意の基または分子に結合している。一般的に、それらは、ホルミル、アセチル、ピバロイルおよびベンゾイルが含まれるＣ１〜Ｃ８アシル基、ならびにメトキシアセチル、エトキシカルボニルおよび４−ピリジノイルが含まれるＣ２〜Ｃ８ヘテロアシル基である。ヒドロカルビル基、アリール基およびアシルまたはヘテロアシル基を含むそのような基のヘテロ形は、アシルまたはヘテロアシル基の対応する成分の各々のための一般に適する置換基として本明細書に記載される置換基で置換されてもよい。
【０２１１】
炭素源は、時には１つ以上の芳香族部分および／または複素環式芳香族部分を含む。「芳香族」部分または「アリール」部分は、芳香族性の周知の特性を有する単環式または縮合二環式部分を指し、例には、フェニルおよびナフチルが含まれる。同様に、「複素環式芳香族」および「ヘテロアリール」は、環メンバーとしてＯ、ＳおよびＮから選択される１つ以上のヘテロ原子を含むそのような単環式または縮合二環式環系を指す。ヘテロ原子の組入れは、５員環ならびに６員環で芳香族性を許す。一般的な複素芳香族系には、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、チエニル、フラニル、ピロリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリルおよびイミダゾリルなどの単環式のＣ５〜Ｃ６芳香族基、ならびにこれらの単環式の基の１つをフェニル環または複素芳香族単環式の基のいずれかと縮合させ、インドリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、イソキノリル、キノリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、ピラゾロピリジル、キナゾリニル、キノキサリニル、シノリニルなどのＣ８〜Ｃ１０二環式基を形成することによって形成される縮合二環式部分が含まれる。環系全体の電子分布に関して芳香族の特性を有するあらゆる単環式または縮合環二環式系がこの定義に含まれる。それは、分子の残りに直接に結合する環だけでも芳香族の特性を有する二環式基も含む。一般的に、環系は、５〜１２の環メンバー原子を含む。単環式ヘテロアリールは、時には５〜６の環メンバーを含み、二環式ヘテロアリールは時には８〜１０の環メンバーを含む。
【０２１２】
アリールおよびヘテロアリール部分は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ５〜Ｃ１２アリール、Ｃ１〜Ｃ８アシルおよびこれらのヘテロ形を含む様々な置換基で置換されてもよく、それぞれはそれ自体さらに置換されてもよく、アリールおよびヘテロアリール部分のための他の置換基には、ハロ、ＯＲ、ＮＲ２、ＳＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＮＲ２、ＮＲＳＯ２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲおよびＮＯ２が含まれ、式中、各Ｒは独立にＨ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ７〜Ｃ１２アリールアルキルまたはＣ６〜Ｃ１２ヘテロアリールアルキルであり、各Ｒは、アルキル基について上に述べたように任意選択で置換される。アリールまたはヘテロアリール基の上の置換基は、そのような置換基の各型のために、または置換基の各成分のために適すると本明細書に記載される基でさらに置換されてもよい。したがって、例えば、アリールアルキル置換基は、アリール部分でアリール基に一般的な置換基で置換されてもよく、それは、アルキル部分でアルキル基に一般的であるか適する置換基でさらに置換されてもよい。
【０２１３】
同様に、「アリールアルキル」および「ヘテロアリールアルキル」は芳香族および芳香族複素環系を指し、それらはスタンドアロン分子（例えば、ベンゼンまたは置換されたベンゼン、ピリジンまたは置換されたピリジン）であるか、またはそれらは、置換もしくは無置換、飽和もしくは不飽和、環式もしくは非環式のリンカーを含む、アルキレンなどの連結基を通して結合点に結合している。リンカーは、多くの場合Ｃ１〜Ｃ８アルキルまたはそのヘテロ形である。これらのリンカーにはカルボニル基が含まれてもよく、このように、それらがアシルまたはヘテロアシル部分として置換基を提供することができるようにしている。アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル基中のアリールまたはヘテロアリール環は、アリール基について上で記載されるのと同じ置換基で置換されてもよい。アリールアルキル基には、アリール基について上で定義される基、および非置換であるかまたは１つもしくは２つのＣ１〜Ｃ４アルキル基またはヘテロアルキル基で置換されているＣ１〜Ｃ４アルキレンによって任意選択で置換されるフェニル環が時には含まれ、そこで、アルキルまたはヘテロアルキル基は任意選択で環化して、シクロプロパン、ジオキソランまたはオキサシクロペンタンなどの環を形成することができる。同様に、ヘテロアリールアルキル基には、多くの場合、アリール基で一般的な置換基として上に記載される基および非置換であるＣ１〜Ｃ４アルキレンの１つ以上によって任意選択で置換されるＣ５〜Ｃ６単環式ヘテロアリール基が含まれる。ヘテロアリールアルキル基は、時には１つもしくは２つのＣ１〜Ｃ４アルキル基またはヘテロアルキル基で置換されるか、あるいは、任意選択で置換されるフェニル環またはＣ５〜Ｃ６単環式ヘテロアリール、および非置換であるか１つもしくは２つのＣ１〜Ｃ４アルキルまたはヘテロアルキル基で置換されるＣ１〜Ｃ４ヘテロアルキレンを含み、そこで、アルキルまたはヘテロアルキル基は任意選択で環化して、シクロプロパン、ジオキソランまたはオキサシクロペンタンなどの環を形成することができる。
【０２１４】
アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル基が任意選択で置換されると記載される場合、置換基は基のアルキルもしくはヘテロアルキル部分の上、またはアリールもしくはヘテロアリール部分の上にあってよい。アルキルまたはヘテロアルキル部分の上に任意選択で存在する置換基は、アルキル基について上に記載されるものと時には同じであり、アリールまたはヘテロアリール部分の上に任意選択で存在する置換基は、アリール基一般について上に記載されるものと多くの場合同じである。
【０２１５】
本明細書で用いる「アリールアルキル」基は、それらが非置換である場合にはヒドロカルビル基であり、環およびアルキレンまたは類似したリンカー中の総炭素原子数によって記載される。したがって、ベンジル基はＣ７−アリールアルキル基であり、フェニルエチルはＣ８−アリールアルキルである。
【０２１６】
上記の「ヘテロアリールアルキル」は、連結基を通して結合するアリール基を含む部分を指し、アリール部分の少なくとも１つの環原子または連結基の１つの原子がＮ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子であるという点で「アリールアルキル」と異なる。本明細書で、ヘテロアリールアルキル基は、環およびリンカーを合わせた総原子数によって記載され、それらには、ヘテロアルキルリンカーを通して連結されるアリール基、アルキレンなどのヒドロカルビルリンカーを通して連結されるヘテロアリール基、およびヘテロアルキルリンカーを通して連結されるヘテロアリール基が含まれる。したがって、例えば、Ｃ７−ヘテロアリールアルキルには、ピリジルメチル、フェノキシおよびＮ−ピロリルメトキシが含まれる。
【０２１７】
本明細書で用いる「アルキレン」は、二価のヒドロカルビル基を指す。アルキレンは二価であるので、それは２つの別の基を一緒に連結することができる。アルキレンは、しばしば−（ＣＨ２）ｎ−と呼ばれ、そこでｎは１〜２０、１〜１０、１〜８または１〜４であってよいが、明記される場合、アルキレンは他の基によって置換されてもよく、他の長さであってもよく、開放原子価は鎖の反対側の末端にある必要はない。したがって、シクロプロパン−１，１−ジイルなどの環状基がそうすることができるように、−ＣＨ（Ｍｅ）−および−Ｃ（Ｍｅ）２−は、アルキレンと呼ぶこともできる。アルキレン基が置換される場合、置換基には、本明細書に記載されるようなアルキル基に一般的に存在するものが含まれる。
【０２１８】
窒素は、無機（例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機（例えば、尿素またはグルタミン酸）の供給源から供給されてもよい。適当な炭素および窒素源に加えて、培地は、適するミネラル、塩、コファクター、緩衝剤、ビタミン、金属イオン（例えば、Ｍｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２、Ｍｇ＋２）および微生物の培養に適する他の成分を含むことができる。
【０２１９】
工学的に作り出された微生物は、時には複合培地（例えば、酵母抽出物−ペプトン−デキストロース培養液（ＹＰＤ））で培養される。一部の実施形態では、工学的に作り出された微生物は、生育に必要な成分を欠き、それによって所望の発現カセットの選択を強制する規定の最少培地で培養される（例えば、酵母窒素ベース（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈ．））。一部の実施形態では、培地は、酵母窒素ベース（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈ．）などの、一般的な市販調製培地である。他の規定のまたは合成された増殖培地を用いることもでき、特定の微生物の増殖のための適当な培地は公知である。工学的に作り出された微生物の生成のために、様々な宿主生物体を選択することができる。非限定例には、酵母（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ（例えば、ＡＴＣＣ２０３３６、ＡＴＣＣ２０９１３、ＡＴＣＣ２０９６２）、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（例えば、ＡＴＣＣ２０２２８））および糸状菌（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ（例えば、ＡＴＣＣ３８１６４）およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ（例えば、ＡＴＣＣ２４６９０））が含まれる。具体的な実施形態では、酵母はＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏペプトンおよび２０ｇ／Ｌデキストロース）で培養される。特定の実施形態では、糸状菌は、１０ｇ／Ｌデキストロース、２ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏペプトン、１ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ酵母抽出物、１ｇ／Ｌカザミノ酸、５０ｍＬ／Ｌ  ２０×硝酸塩（１２０ｇ／Ｌ  ＮａＮＯ３、１０．４ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、１０．４ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、１ｍＬ／Ｌ  １０００×極微量元素（２２ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１１ｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、５ｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、５ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．７ｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏおよび５０ｇ／Ｌ  Ｎａ４ＥＤＴＡ）、および１ｍＬ／Ｌビタミン溶液（１００ｍＬ水に各々１００ｍｇのビオチン、ピリドキシン、チアミン、リボフラビン、ｐ−アミノ安息香酸およびニコチン酸）を含むＣＭ（完全培地）で増殖される。
【０２２０】
発酵に適するｐＨ範囲は、多くの場合約ｐＨ４．０から約ｐＨ８．０の間であり、約ｐＨ５．５から約ｐＨ７．０の範囲のｐＨが最初の培養条件のために時々利用される。宿主生物体によって、好気的または嫌気的条件の下で培養を実行することができ、微好気的条件が時々維持される。１つの段階が微生物の増殖を促進し、別の段階が標的分子の生産を促進する、二段階法を利用することができる。二段階法では、第一段階は好気的条件（例えば、空気および／または酸素の導入）の下で行うことができ、第二段階は嫌気的条件（例えば、空気または酸素は培養条件に導入されない）の下で行うことができる。一部の実施形態では、第一段階は嫌気的条件下で行うことができ、第二段階は好気的条件下で行うことができる。特定の実施形態では、二段階法は、２つより多くの生物体を含むことができ、例えば１つの生物体は１つの段階で中間生成物を生成し（例えば、メガスフェラ属の種によって産生されるヘキサン酸）、別の生物体は別の段階で中間生成物を標的生成物（例えば、アジピン酸）に加工する。
【０２２１】
標的生成物の商業的生物生産のために、様々な発酵工程を適用することができる。一部の実施形態では、組換え微生物宿主からの標的生成物の商業的生産は、例えば、バッチ、流加または連続発酵工程を用いて行われる。
【０２２２】
バッチ発酵工程は、多くの場合、培地組成物が工程の初めに固定され、工程中にｐＨおよび酸素レベルの維持のために必要とされるもの以外にさらなる添加を受けない閉鎖系である。培養工程の始めに、培地に所望の生物体を接種し、追加の供給源（すなわち、炭素および窒素源）を培地に加えることなく増殖または代謝活性を起こさせる。バッチ工程では、系の代謝産物およびバイオマス組成物は、培養が終了する時間まで継続的に変化する。一般的なバッチ工程では、細胞は、静的遅滞期から高対数増殖期に、および最後に、増殖速度が低下または停止する静止期まで進行する。無処置で放置すると、静止期の細胞は最終的には死滅する。
【０２２３】
標準のバッチ工程の変形形態は流加工程であり、そこでは、発酵工程の間、炭素源が発酵槽に連続的に加えられる。流加工程は、異化産物抑制が細胞の代謝を阻害しやすいとき、またはいかなる一時にも培地中に限られた量の炭素源を有することが望ましい場合に役立つ。流加系での炭素源濃度の測定は、ｐＨ、溶存酸素および廃ガス（例えば、ＣＯ２）のガス分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定することができる。
【０２２４】
バッチおよび流加培養法は、当技術分野で公知である。そのような方法の例は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．  Ｂｒｏｃｋ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２版、（１９８９年）、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．およびＤｅｓｈｐａｎｄｅ，  Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．、Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６巻：２２７頁（１９９２年）に見出すことができる。
【０２２５】
連続発酵工程では、多くの場合規定の培地がバイオリアクターに連続的に加えられ、生成物回収のために同量の培養容量が同時に取り出される。連続的培養は、一般に一定の細胞密度の対数増殖期に細胞を維持する。連続または半連続培養法は、細胞増殖または最終生成物濃度に影響を及ぼす１つの因子、または任意の数の因子の調節を許す。例えば、ある手法は炭素源を制限することができ、すべての他のパラメータが代謝を適度にすることを可能にすることができる。一部の系では、培地の濁度で測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼすいくつかの因子を連続的に改変することができる。連続系は多くの場合定常状態の増殖を維持し、したがって、細胞増殖速度は培養から抜かれる培地による細胞減少に対してしばしば均衡している。連続培養工程の栄養素および増殖因子を調節する方法、ならびに生成物形成の速度を最大にする技術は公知であり、様々な方法が上記Ｂｒｏｃｋによって詳述されている。
【０２２６】
発酵を含む一部の実施形態では、２つ以上の微生物（例えば、宿主微生物、工学的に作り出された微生物、単離された天然に存在する微生物など、およびそれらの組合せ）を用いて発酵を実行することができ、そこでは、供給材料は発酵（例えば、混合発酵）で１つ以上の生物体によって部分的または完全に利用され、１つ以上の生物体の細胞呼吸または代謝の生成物は、１つ以上の他の生物体がさらに代謝して、所望の標的生成物（例えば、アジピン酸、ヘキサン酸）を産生することができる。特定の実施形態では、各生物体は独立に発酵させることができ、細胞呼吸または代謝の生成物を精製して別の生物体と接触させ、所望の標的生成物を生成することができる。一部の実施形態では、１つ以上の生物体は代謝経路（例えば、ベータ酸化、オメガ酸化など、またはそれらの組合せ）が部分的または完全にブロックされ、それによって、１つ以上の他の生物体のための供給材料として用いることができる所望の生成物を産生する。混合発酵または逐次的発酵を実行するために、微生物の任意の適する組合せを利用することができる。混合発酵、または第一の生物体からの発酵培地が第二の生物体の供給材料として用いられる逐次的発酵で使用するために適する生物体組合せおよび供給材料の非限定例は、ヘキサン酸を産生するためのＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ、およびＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉによって産生されるヘキサン酸からアジピン酸を産生するために本明細書に記載のように工学的に作り出されたＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓの発酵培地としての長鎖ジカルボン酸の使用である。Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉは、通性嫌気性菌である。理論によって限定されないが、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉは、嫌気的呼吸の結果としてヘキサン酸を天然に蓄積すると考えられている。Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓは、好気的および嫌気的に生育することができる。一部の実施形態では、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉによって産生されるヘキサン酸は、アジピン酸を産生するためにＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓの供給材料として利用することができる。特定の実施形態では、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａによって産生されるヘキサン酸は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓの供給材料として用いられる前に精製される（例えば、部分的に、完全に）。
【０２２７】
様々な実施形態では、アジピン酸は培地から単離もしくは精製されるか、または工学的に作り出された微生物から抽出される。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法による供給材料の発酵は、標的生成物（例えば、アジピン酸）を理論収量の約８０％以上のレベル（例えば、理論収量の８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）で生産することができる。本明細書で用いる用語「理論収量」は、反応が１００％完了する場合に、出発物質から作ることができる生成物の量を指す。理論収量は、出発物質が完全に消費され、望ましくない副反応が起こらず、逆反応が起こらず、作業手順で損失がない反応の化学量および理想的な条件に基づく。濃度が所定レベルに到達するときに、培地を標的生成物（例えば、アジピン酸）濃度について試験し、引き抜くことができる。それらに限定されないが、Ｂ  ＳｔｉｅｇｌｉｔｚおよびＰ  Ｊ  Ｗｅｉｍｅｒ、Ｎｏｖｅｌ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｃｒｅｅｎ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １，４−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ，  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ，  ａｎｄ  ａｄｉｐｉｃ  ａｃｉｄ、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８巻に示されるものを含め、検出方法は当技術分野で公知である。標的生成物（例えば、アジピン酸）は、本明細書に記載されるように様々なレベルで存在することができる。
【０２２８】
標的生成物は培養工程の完了後に工学的に作り出された微生物の中に時々保持され、特定の実施形態では、標的生成物は微生物から培地に分泌される。後者の実施形態については、（ｉ）培地を培養系から引き抜くことができ、新しい培地を補うことができ、および／または（ｉｉ）培養工程の間または完了後に標的生成物を培地から抽出することができる。工学的に作り出された微生物は、固体、半固体または液体培地の上または中で培養することができる。一部の実施形態では、培地はプレートに付着している細胞から抜かれる。特定の実施形態では、当技術分野で公知であるように、細胞をペレットにするのに十分であるが、細胞を破壊しないで培地の抽出を可能にする速度で液体細胞混合物を遠心分離する。次に、細胞を新しい培地に再懸濁することができる。標的生成物は、例えば米国特許第６，７８７，６６９号および米国特許第５，２９６，６３９号に記載されるものなどの、公知の方法によって培地から精製することができる。
【０２２９】
特定の実施形態では、標的生成物は、培養された工学的に作り出された微生物から抽出される。微生物細胞は、細胞膜を剪断するのに十分な速度の遠心分離を通して濃縮することができる。一部の実施形態では、細胞は、物理的に破壊することができるか（例えば、剪断力、超音波処理）、化学的に破壊することができる（例えば、界面活性剤または他の溶解剤と接触させる）。相は遠心分離または当技術分野で公知である他の方法によって分離することができ、標的生成物は公知の方法によって単離することができる。
【０２３０】
市販グレードの標的生成物は、時には実質的に純粋な形（例えば、９０％以上純粋、９５％以上純粋、９９％以上純粋、または９９．５％以上純粋である）で提供される。一部の実施形態では、標的生成物は、いくつかの下流生成物のいずれか１つに改変されてもよい。例えば、アジピン酸はヘキサメチレンジアミンで多縮合してナイロンを生成することができる。ナイロンは、カーペット、自動車タイヤコードおよび衣服での適用のために、線維にさらに加工されてもよい。アジピン酸は、ポリウレタン系のための可塑剤、滑沢剤成分およびポリエステルポリオールを製造するためにも用いられる。食品グレードのアジピン酸は、ゲル化助剤、酸味料、発酵素および緩衝剤として用いられる。アジピン酸は２つのカルボン酸（−ＣＯＯＨ）基を有し、それらは２種類の塩を与えることができる。その誘導体、アシルハロゲン化物、無水物、エステル、アミドおよびニトリルは、着香料、内部可塑剤、殺虫剤、色素、繊維処理剤、殺菌剤および医薬などの下流生成物の、置換、触媒性還元、金属水素化物還元、ジボラン還元、有機金属試薬によるケト形成、酸素での求電子結合、および縮合のさらなる反応を通しての作製で用いられる。
【０２３１】
標的生成物は標的生成物を含む培養された微生物体の中で提供されてもよく、培養された微生物体は新鮮な状態で、または液体培地中に冷凍されて、または乾燥状態で供給されてもよい。新鮮なまたは冷凍された微生物体は、必要に応じて温度制御されてもよい適当な防湿性容器に含まれてもよい。標的生成物は、時々、実質的に無細胞である培地で提供される。一部の実施形態では、微生物体から精製される標的生成物または修飾標的生成物が提供され、標的生成物は、時には実質的に純粋な形で提供される。特定の実施形態では、結晶状または粉末状の標的生成物が提供される。結晶性アジピン酸は３６０°Ｆの融点を有する白色粉末であり、１トンカートン、ドラム、５０ポンドの袋などを含む様々な容器で輸送することができる。
【０２３２】
特定の実施形態では、標的生成物（例えば、アジピン酸、６−ヒドロキシヘキサン酸）は、発酵工程で加えられるグルコース１グラムにつき、標的生成物が約０．３０グラム以上（例えば、加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が約０．３１グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が約０．３２グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が約０．３３グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が約０．３４グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が約０．３５グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が約０．３６グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が約０．３７グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が約０．３８グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が約０．３９グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が約０．４０グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が約０．４１グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．４２グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．４３グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．４４グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．４５グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．４６グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．４７グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．４８グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．４９グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．５０グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．５１グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．５２グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．５３グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．５４グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．５５グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．５６グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．５７グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．５８グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．５９グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．６０グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．６１グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．６２グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．６３グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．６４グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．６５グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．６６グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．６７グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．６８グラム以上；加えられるグルコース１グラムにつき標的生成物が０．６９または０．７０グラム以上）の収量で生成される。
【実施例】
【０２３３】
下に示す実施例は特定の実施形態を例示し、技術を限定するものではない。下に示す特定の実施例は、当技術分野で公知である標準の組換えＤＮＡプロトコールおよび他のバイオテクノロジープロトコールを利用する。多くのそのような技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．、Ｅ．  Ｆ．  ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８２年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．で詳細に記載されている。ＤＮＡ突然変異誘発は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）「ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ」キットを製造業者の使用説明書に従って用いて遂行することができる。
【０２３４】
（実施例１）
ヘキサノエートシンターゼ（「ＨｅｘＳ」）サブユニット遺伝子のクローニング
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓからの総ＲＮＡを、酵母のためにＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）キットを用いて調製した。ヘキサノエートシンターゼの２つのサブユニットをコードする遺伝子（「ｈｅｘＡ」および「ｈｅｘＢ」と呼ばれる）を、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）による２ステップＲＴ−ＰＣＲ法を用いてこの総ＲＮＡから単離し、断片をゲル精製した。各ＲＴ−ＰＣＲ反応のために用いたプライマーは、以下の通りである。
【０２３５】
【化３】
2012531903.tif 000004
各々異なるｈｅｘＡ遺伝子断片を有する４つのｈｅｘＡプラスミド、および各々異なるｈｅｘＢ遺伝子断片を有する５つのｈｅｘＢプラスミドがあるように、断片の各々を別々にプラスミドｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に挿入した。各ｈｅｘＡおよびｈｅｘＢ断片の配列を検証し、その後、各プラスミドから断片をＰＣＲでクローニングした。完全長ｈｅｘＡおよびｈｅｘＢ遺伝子を作製するために、次に重複ＰＣＲを用いた。ＬＥＵ２選択マーカーおよびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターを有するベクターｐ４２５ＧＰＤ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）にｈｅｘＡ遺伝子を挿入し、ｈｅｘＢ完全長遺伝子は、ＵＲＡ３選択マーカーおよびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターを有するｐ４２６ＧＰＤ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に挿入した。
【０２３６】
（実施例２）
ＨｅｘＡおよびＨｅｘＢ遺伝子によるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ細胞（ＢＹ４７４２株、ＡＴＣＣ受託番号２０１３８９）を、標準のＹＰＤ（１０ｇ酵母抽出物、２０ｇ  Ｂａｃｔｏペプトン、２０ｇグルコース、合計１Ｌ）培地に約３日の間摂氏約３０度で生育させた。ｈｅｘＡおよびｈｅｘＢ遺伝子を含むプラスミドを、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに同時形質転換させた。１μｇプラスミドＤＮＡを用いて、Ｚｙｍｏキット（目録番号Ｔ２００１、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ９２８６７）を用いて形質転換を達成し、グルコースを含むＳＣドロップアウト培地（ウラシルおよびロイシンを含まない）（２０ｇグルコース、２．２１ｇ  ＳＣ（−ＵＲＡ、−Ｌｅｕ）ドライミックス、６．７ｇ酵母窒素ベース、合計１Ｌ）に約３０℃で２〜３日の間培養した。
ＳＣ（−ＵＲＡ）ミックスは以下を含む。
０．４ｇ  アデニンヘミスルフェート
３．５ｇ  アルギニン
１ｇ  グルタミン酸
０．４３３ｇ  ヒスチジン
０．４ｇ  ミオイノシトール
５．２ｇ  イソロイシン
０．９ｇ  リシン
１．５ｇ  メチオニン
０．８ｇ  フェニルアラニン
１．１ｇ  セリン
１．２ｇ  トレオニン
０．８ｇ  トリプトファン
０．２ｇ  チロシン
１．２ｇ  バリン
必要な場合：
０．２６３ｇ  ロイシン
０．２ｇ  ウラシル。
【０２３７】
同時形質転換体は、標準の条件下のＹＰＤ培地で液体培養物として選択および確立された。
【０２３８】
（実施例３）
合成ＨｅｘＡおよびＨｅｘＢ遺伝子の生成
合成ヘキサノエート（ｈｅｘａｏｎｏａｔｅ）シンターゼサブユニット遺伝子は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓで使用するために設計された。この生物体は、コドン「ＣＴＧ」がロイシンの代わりにセリンをコードする代わりの遺伝子コードを用いる。したがって、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓによって翻訳されるとき、これらの遺伝子がＡ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓで見出される野生型ポリペプチドに同じアミノ酸配列のポリペプチドを生成することを保証するために、すべての「ＣＴＧ」コドンがコドン「ＴＴＧ」で置換された。各サブユニットの大きなサイズのために、各々は４つの断片として合成され、各断片はベクターｐＵＣ５７に挿入された。各断片をクローニングするためにＰＣＲを用い、各完全長遺伝子を生成するために次に重複伸長ＰＣＲを用いた。
【０２３９】
各ヘキサノエートシンターゼサブユニットの合成遺伝子の配列を、下に示す。ｈｅｘＡサブユニットをコードする合成遺伝子はｈｅｘＡ−ＡＧＣ（「代替遺伝子コード」）と呼ばれ、ｈｅｘＢサブユニットをコードする合成遺伝子はｈｅｘＢ−ＡＧＣと呼ばれる。
【０２４０】
【化４】
2012531903.tif 000005
【０２４１】
【化５】
2012531903.tif 000006
【０２４２】
【化６】
2012531903.tif 000007
【０２４３】
【化７】
2012531903.tif 000008
（実施例４）
合成ヘキサノエートシンターゼサブユニット遺伝子によるＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓの形質転換
摂氏３０度のＹＰＤ培地でＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ細胞（ＡＴＣＣ番号２０９６２）を標準条件下で培養する。ｈｅｘＡおよびｈｅｘＢをコードする合成遺伝子を、標準のＰＣＲ増幅技術を用いて増幅する。５’から３’にかけてＴＥＦ（転写伸長因子）プロモーター、ｈｅｘＡ−ＡＧＣ遺伝子、ＴＥＦプロモーター、ｈｅｘＢ−ＡＧＣ遺伝子およびＵＲＡ３マーカーを含む線状ＤＮＡ構築物。この構築物の各末端は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓゲノムＤＮＡへの構築物の組込みのための、ミニＵＲＡブラスターを含むように設計されている（Ａｌａｎｉ  Ｅ、Ｃａｏ  Ｌ、Ｋｌｅｃｋｎｅｒ  Ｎ。Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ａｌｌｏｗｓ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ＵＲＡ３  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｙ  ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ  ｙｅａｓｔ  ｓｔｒａｉｎｓ。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。１９８７年８月；１１６巻（４号）：５４１〜５４５頁）。
【０２４４】
この構築物は、標準の技術を用いて増幅される。この線状構築物によるＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ細胞の形質転換は、米国特許第５，６４８，２４７号または第５，２０４，２５２号に示されるものなどの標準のエレクトロポレーション技術を用いて達成される。形質転換体は、形質転換体だけが生存する上記ＳＣ−ＵＲＡ培地の上で形質転換細胞を平板培養して生育させることによって選択される。ＵＲＡカセットを除去するために、確認された株を次に５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）含有ＳＣ完全培地に再び平板培養し、ＵＲＡカセットの消失について確認する。
【０２４５】
（実施例５）
Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓにおける６炭素鎖への活性を有するチトクロームＰ４５０のアッセイ
Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓの培養物を後期対数期までＹＰＤ培地で培養し、約０．１％（ｖ／ｖ）までのヘキサンの様々な濃度に次に曝露させ、６炭素基質に特異的な活性を有するチトクロームｐ４５０遺伝子の発現を誘導する。ヘキサン溶液への約２時間の曝露の後、上記の技術を用いて細胞を収穫し、ＲＮＡを単離した。特異的に誘導された遺伝子は、ノーザンブロッティングおよび／または定量的ＲＴ−ＰＣＲによって検出することができる。
【０２４６】
チトクロームＰ４５０活性について分析する細胞を標準の条件下で生育させ、ミクロソームの生成のために収穫する。トリス緩衝スクロース（１０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５Ｍスクロース）で細胞を溶解することによって、ミクロソームを調製した。分画遠心分離を最初に２５，０００×ｇで、次に１００，０００×ｇで実施して、細胞片、次にミクロソームをそれぞれペレットにする。ミクロソームペレットを、約１０ｍｇタンパク質／ｍＬの最終濃度まで０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁する。
【０２４７】
１ｍＬ中に約０．３ｍｇミクロソーム、０．１ｍＭヘキサン酸ナトリウム、０．７ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、５０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．５を含む反応混合液を、ＮＡＤＰＨの添加によって開始させ、３７℃で１０分間インキュベートする。反応を０．２５ｍＬの５Ｍ  ＨＣｌの添加によって終了させ、０．２５ｍＬの２．５μｇ／ｍＬの１０−ヒドロキシデカノン酸を内標準として加える（３．３ｎｍｏｌ）。ＮａＣｌ飽和条件下で、混合液を４．５ｍＬジエチルエーテルで抽出する。有機相を新しい管へ移し、蒸発乾固させる。１０ｍＭ  ３−ブロモメチル−７−メトキシ−１，４−ベンゾキサジン−２−オン（ＢｒＭＢ）、およびＫ２ＣＯ３で飽和させたアセトニトリル中の０．１ｍＬの１５ｍｇ／ｍＬ  １８−クラウン−６を含有するアセトニトリルに残留物を溶解する。溶液を４０℃で３０分間インキュベートした後、０．０５ｍＬの２％酢酸を添加する。４３０ｎｍでの検出および３５５ｎｍでの励起により、蛍光標識オメガヒドロキシ脂肪酸をＨＰＬＣで分解する。
【０２４８】
（実施例６）
ポリヌクレオチド調節因子の例
本明細書の実施形態で利用することができる調節因子ポリヌクレオチドの非限定例が、以下の表で提供される。そのようなポリヌクレオチドは本来の形で利用されてもよいか、または本明細書での使用のために修飾されることがある。調節ポリヌクレオチドの例には、系の酸素レベルによって調節されるものが含まれる（例えば、比較的高い酸素レベルまたは比較的低い酸素レベルによって上方制御または下方制御される）。
調節される酵母プロモーター−酸素によって上方制御される
【０２４９】
【表１−１】
2012531903.tif 000009
【０２５０】
【表１−２】
2012531903.tif 000010
調節される酵母プロモーター−酸素によって下方制御される
【０２５１】
【表２】
2012531903.tif 000011
公知および推定上のＤＮＡ結合モチーフ
【０２５２】
【表３−１】
2012531903.tif 000012
【０２５３】
【表３−２】
2012531903.tif 000013
【０２５４】
【表３−３】
2012531903.tif 000014
転写リプレッサー
【０２５５】
【表４−１】
2012531903.tif 000015
【０２５６】
【表４−２】
2012531903.tif 000016
【０２５７】
【表４−３】
2012531903.tif 000017
転写活性化因子
【０２５８】
【表５−１】
2012531903.tif 000018
【０２５９】
【表５−２】
2012531903.tif 000019
【０２６０】
【表５−３】
2012531903.tif 000020
【０２６１】
【表５−４】
2012531903.tif 000021
【０２６２】
【表５−５】
2012531903.tif 000022
【０２６３】
【表５−６】
2012531903.tif 000023
【０２６４】
【表５−７】
2012531903.tif 000024
（実施例７）
ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢ遺伝子のクローニング
麦芽エキス培養液（１５ｇ／Ｌ麦芽エキス培養液、Ｄｉｆｃｏ）に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ２４６９０）培養物を振盪させながら２５℃で３日の間生育させた。Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓペレットを１．５ｍＬ管へ移し、約５００μＬと同等のペレット容量を与えた。菌糸体をドライアイスエタノール浴で凍結させ、乳鉢および乳棒へ移し、微細粉末に粉砕した。粉末を約５００μＬの０．７ｍｍのジルコニアビーズを含む１．５ｍＬ管に入れ、製造業者の推奨に従ってＲｉｂｏｐｕｒｅ  Ｐｌａｎｔキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて総ＲＮＡを調製した。
【０２６５】
ｃＤＮＡの第一鎖の合成は、０．２μＬの遺伝子特異的プライマー（１０μＭ）、３００ｎｇ総ＲＮＡ、１．０μＬ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）および容量１３μＬにする無菌水を含む反応液で、遺伝子特異的プライマーｏＡＡ００３１（ＨＥＸＡのため）およびｏＡＡ００４１（ＨＥＸＢのため）により実施した。総ＲＮＡ／プライマー混合液を６５℃で５分の間加熱し、次に氷上で５分の間冷却させた後、４μＬの５×第一鎖緩衝液、１μＬの０．１Ｍ  ＤＴＴ、１μＬのＨ２Ｏおよび１μＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。第一鎖の合成反応液を、５５℃で１時間インキュベートし、続いて７０℃で１５分の間酵素を不活性化させ、反応液を４℃に冷却させた。ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢ遺伝子の単離のために利用されたプライマーは、断片間で約２００ｂｐの重複する配列を有し、約１．０キロベース（ｋｂ）から約１．６ｋｂの範囲の断片長を有する断片でＨＥＸＡおよびＨＥＸＢ遺伝子を独立に増幅するように構成された。配列を、下記の表に示す。
【０２６６】
【表６】
2012531903.tif 000025
５μＬの１０×Ｐｆｕ反応緩衝液、１．０μＬのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、１．０μＬのセンスおよびアンチセンスプライマーミックス（１０μＭ）、１．０μＬのＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、２．０μＬのｃＤＮＡ、４０μＬの無菌のＨ２Ｏの添加によって上で生成されたｃＤＮＡを用いて、ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢ遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢ遺伝子を増幅するために用いたサーモサイクリングパラメータは、９４℃で５分間、および９４℃で３０秒間、６２℃で４０秒間、７２℃で４分間を４０サイクル、続いて７２℃で１０分間および４℃で保持であった。正しいサイズのＰＣＲ生成物をゲル精製し、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、コンピテントＴＯＰ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換させ、ＰＣＲ挿入断片を含むクローンを配列決定して正しいＤＮＡ配列を確認した。
【０２６７】
ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢの配列全体を含む重複ＤＮＡ断片を生成するために、鋳型としてｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩの配列確認された断片を用いてＨＥＸＡおよびＨＥＸＢのＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。０．２ｎＭの各ＤＮＡ断片、各々０．２μＭのセンスおよびアンチセンスプライマー、１×Ｐｆｕ反応緩衝液、１．０μＬのＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳポリメラーゼおよび０．２ｍＭのｄＮＴＰを含む５０μＬの重複伸長ＰＣＲ反応液で、各遺伝子の重複ＤＮＡ断片を組み合わせた。それぞれｐ４２５ＧＰＤおよびｐ４２６ＧＰＤへのＨＥＸＡおよびＨＥＸＢ遺伝子のクローニングを可能にするために、特異な制限部位をセンスおよびアンチセンスプライマーに取り込ませた。ＨＥＸＡについては、制限部位はＳｐｅＩ／ＳｍａＩであり、ＨＥＸＢについては、制限部位はＳｐｅＩ／ＰｍｅＩであった。ｐ４２５ＧＰＤおよびｐ４２６ＧＰＤへのＨＥＸＡおよびＨＥＸＢ遺伝子のライゲーションは、それぞれプラスミドｐＡＡ０２０およびｐＡＡ０２１をもたらした。Ｃ末端の６×Ｈｉｓ標識を取り込んだＨＥＸＡおよびＨＥＸＢ遺伝子の変異体は、６×Ｈｉｓ配列をコードするアンチセンスプライマーを用いて構築された。ｐ４２５ＧＰＤおよびｐ４２６ＧＰＤへのＨＥＸＡ−６×ＨｉｓおよびＨＥＸＢ−６×Ｈｉｓ遺伝子のライゲーションは、それぞれプラスミドｐＡＡ０３１およびｐＡＡ０３２をもたらした。図１１および１２に示すように、ベクターｐＡＡ０２０、ｐＡＡ０２１、ｐＡＡ０３１およびｐＡＡ０３２は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでのタンパク質発現を証明するために用いられた。
【０２６８】
（実施例８）
ＳＴＣＪおよびＳＴＣＫ遺伝子のクローニング
実施例１に記載のように、総ＲＮＡをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ（ＡＴＣＣ３８１６３）から調製した。ｃＤＮＡの第一鎖の合成は、０．２μＬの遺伝子特異的プライマー（１０μＭ）、３００ｎｇ総ＲＮＡ、１．０μＬ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）および容量１３μＬにする無菌水を含む反応液で、遺伝子特異的プライマーｏＡＡ０００８（ＳＴＣＪのため）およびｏＡＡ００２１（ＳＴＣＫのため）により実施した。総ＲＮＡ／プライマー混合液を６５℃で５分の間加熱し、次に氷上で５分の間冷却させた後、４μＬの５×第一鎖緩衝液、１μＬの０．１Ｍ  ＤＴＴ、１μＬのＨ２Ｏおよび１μＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。第一鎖の合成反応液を、５５℃で１時間インキュベートし、続いて７０℃で１５分の間酵素を不活性化させ、反応液を４℃に冷却させた。断片間で約２００ｂｐの重複する配列を有する、約１．１ｋｂから約１．６ｋｂの範囲の断片でＳＴＣＪおよびＳＴＣＫ遺伝子を増幅するために、本明細書に記載のものに実質的に類似したプライマー設計戦略を用いた。ＳＴＣＪおよびＳＴＣＫ遺伝子を増幅するために用いたプライマーを、下記の表に示す。
【０２６９】
【表７】
2012531903.tif 000026
５μＬの１０×Ｐｆｕ反応緩衝液、１．０μＬのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、１．０μＬのセンスおよびアンチセンスプライマーミックス（１０μＭ）、１．０μＬのＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、２．０μＬのｃＤＮＡ、４０μＬの無菌のＨ２Ｏを含むＰＣＲ反応によって上で調製されたｃＤＮＡを用いて、ＳＴＣＪおよびＳＴＣＫ断片を増幅した。用いたサーモサイクリングパラメータは、９４℃で５分間、および９４℃で３０秒間、６２℃で４０秒間、７２℃で４分間を４０サイクル、続いて７２℃で１０分間および４℃で保持であった。正しいサイズのＰＣＲ生成物をゲル精製し、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、コンピテントＴＯＰ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換させた。ＰＣＲ挿入断片を配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。ＳＴＣＪおよびＳＴＣＫ両方の配列全体を含む重複ＤＮＡ断片を生成するために、鋳型としてｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩの配列確認された断片を用いてＳＴＣＪおよびＳＴＣＫのＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。０．２ｎＭの各ＤＮＡ断片、各々０．２μＭのセンスおよびアンチセンスプライマー、１×Ｐｆｕ反応緩衝液、１．０μＬのＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳポリメラーゼおよび０．２ｍＭのｄＮＴＰを含む５０μＬの重複伸長ＰＣＲ反応液で、各遺伝子の重複ＤＮＡ断片を組み合わせた。
【０２７０】
センスおよびアンチセンスプライマーは、それぞれｐ４２５ＧＰＤおよびｐ４２６ＧＰＤにＳＴＣＪおよびＳＴＣＫ遺伝子をクローニングするための特異な制限部位を取り込むように設計された。ＳＴＣＪについては、制限部位はＳｐｅＩ／ＸｍａＩであり、ＳＴＣＫについては、制限部位はＳｐｅＩ／ＳｍａＩであった。ｐ４２５ＧＰＤおよびｐ４２６ＧＰＤへのＳＴＣＪおよびＳＴＣＫ遺伝子のライゲーションは、それぞれプラスミドｐＡＡ０４０およびｐＡＡ０４２をもたらした。Ｃ末端の６×Ｈｉｓ標識を取り込んだＳＴＣＪおよびＳＴＣＫ遺伝子の変異体は、６×Ｈｉｓ配列をコードするアンチセンスプライマーを用いて構築された。ｐ４２５ＧＰＤおよびｐ４２６ＧＰＤへのＳＴＣＪ−６×ＨｉｓおよびＳＴＣＫ−６×Ｈｉｓ遺伝子のライゲーションは、それぞれプラスミドｐＡＡ０４１およびｐＡＡ０４３をもたらした。図１１および１２に示すように、ベクターｐＡＡ０４０、ｐＡＡ０４２１、ｐＡＡ０４２およびｐＡＡ０４３は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでのタンパク質発現を証明するために用いられた。
【０２７１】
（実施例９）
Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓの代替遺伝子コードのためのＨＥＸＡおよびＨＥＸＢ遺伝子の設計およびクローニング
ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢ遺伝子は複数のＣＴＧコドンを含み、それは通常ロイシンをコードする。しかし、特定の生物体、例えばＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓは、ＣＴＧをセリンと翻訳する。Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓではロイシンと翻訳されるＴＴＧコドンですべてのＣＴＧコドンを置換した、ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢのＤＮＡ配列を調製した。それがＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓで最も頻繁に使われるロイシンコドンであるために、ＴＴＧコドンが選択された。代替遺伝子コード（ＡＧＣ）のＨＥＸＡおよびＨＥＸＢ遺伝子は、２００ｂｐの重複を有する同等サイズの断片として合成され、ｐＵＣ５７ベクター（組込みＤＮＡ技術）に連結された。ＡＧＣ−ＨＥＸＡおよびＡＧＣ−ＨＥＸＢ両方の配列全体を含む重複ＤＮＡ断片を生成するために、鋳型としてｐＵＣ５７の断片を用いてＡＧＣ−ＨＥＸＡおよびＡＧＣ−ＨＥＸＢのＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。
【０２７２】
０．２ｎＭの各ＤＮＡ断片、各々０．２μＭのセンスおよびアンチセンスプライマー、１×Ｐｆｕ反応緩衝液、１．０μＬのＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳポリメラーゼおよび０．２ｍＭのｄＮＴＰを含む５０μＬの重複伸長ＰＣＲ反応液で、各遺伝子の重複ＤＮＡ断片を組み合わせた。センスおよびアンチセンスプライマーは、ｐＡＡ１０５にＡＧＣ−ＨＥＸＡおよびＡＧＣ−ＨＥＸＢ遺伝子をクローニングし、それぞれプラスミドｐＡＡ１２７およびｐＡＡ１２９をもたらすために、特異なＳａｐＩ制限部位を取り込んだ。Ｃ末端の６×Ｈｉｓ標識を含んだＡＧＣ−ＨＥＸＡおよびＡＧＣ−ＨＥＸＢの遺伝子変異体をｐＡＡ１０５に連結し、それぞれプラスミドｐＡＡ１２８およびｐＡＡ１３０をもたらした。ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢのＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓでの発現のためにロイシンコドンを改変するために用いた代替遺伝子コードプライマーを、下記の表に示す。
【０２７３】
【表８】
2012531903.tif 000027
（実施例１０）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ形質転換手順
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＢＹ４７４２のコンピテント細胞を、製造業者の使用説明書に従って凍結ＥＺ酵母形質転換ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて調製した。コンピテント細胞の５０μＬの一定量を、使用時まで−８０℃で保存した。凍結ＥＺ酵母形質転換ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で指示された通りに、コンピテント細胞を０．５〜１．０μｇの完全なプラスミドＤＮＡの添加によって形質転換させた。形質転換体の選択は、選択培地ＳＣ−ＵＲＡ（ｐ４２６に基づくベクターのため）またはＳＣ−ＬＥＵ（ｐ４２５に基づくベクターのため）に平板培養することによって実施した。
【０２７４】
（実施例１１）
Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ形質転換手順
５ｍＬのＹＰＤ出発培養物にＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓの単一のコロニーを接種し、約２００ｒｐｍで振盪させながら３０℃で一晩インキュベートした。翌日、０．０５％のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ｂを含む新しい２５ｍＬのＹＰＤ培養物に、０．４の初期ＯＤ６００ｎｍで接種し、１．０〜２．０のＯＤ６００ｎｍに到達するまで約２００ｒｐｍで振盪させながら培養物を３０℃でインキュベートした。４℃で１０分間の１，０００ｘｇによる遠心分離によって、細胞をペレットにした。１０ｍＬ無菌水に再懸濁することによって細胞を洗浄し、ペレットにし、１ｍＬ無菌水に再懸濁し、１．５ｍＬ微量遠心管へ移した。次に１ｍＬの無菌ＴＥ／ＬｉＯＡＣ溶液ｐＨ７．５で細胞を洗浄し、ペレットにし、０．２５ｍＬのＴＥ／ＬｉＯＡＣ溶液に再懸濁し、振盪させながら３０℃で３０分の間インキュベートした。
【０２７５】
細胞溶液を５０μＬの一定量に分割して１．５ｍＬ試験管に入れ、そこに５〜８μｇの線状化ＤＮＡおよび５μＬの担体ＤＮＡ（沸騰、冷却させたサケ精子ＤＮＡ、１０ｍｇ／ｍＬ）を加えた。３００μＬの無菌ＰＥＧ溶液（４０％ＰＥＧ３５００、１×ＴＥ、１×ＬｉＯＡＣ）を加え、完全に混合し、１５分ごとに穏やかに混合しながら３０℃で６０分の間インキュベートした。４０μＬのＤＭＳＯを加え、完全に混合し、細胞溶液を４２℃で１５分の間インキュベートした。次に、１，０００×ｇで３０秒間の遠心分離によって細胞をペレットにし、５００μＬのＹＰＤ培地に再懸濁し、約２００ｒｐｍで２時間振盪させながら３０℃でインキュベートした。次に遠心分離によって細胞をペレットにし、１ｍＬの１×ＴＥに再懸濁し、細胞を再びペレットにし、０．２ｍＬの１×ＴＥに再懸濁し、選択培地に平板培養した。形質転換体の増殖のために、プレートを３０℃でインキュベートした。
【０２７６】
（実施例１２）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでのＨＥＸＡおよびＨＥＸＢの発現
プラスミドｐＡＡ０３１およびｐＡＡ０３２を、コンピテントＢＹ４７４２  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞に独立におよび組合せで形質転換させた。ｐＡＡ０３１を含む形質転換体の選択は、ＳＣ−ＬＥＵプレートの上で実施した。ｐＡＡ０３２を含む形質転換体の選択は、ＳＣ−ＵＲＡプレートの上で実施した。ｐＡＡ０３１およびｐＡＡ０３２の両方を含む形質転換体の選択は、ＳＣ−ＵＲＡ−ＬＥＵプレートの上で実施した。本明細書に記載される通り、５ｍＬのＳＣドロップアウト培地に接種するために単一のコロニーを用い、振盪させながら３０℃で一晩生育させた。３ｍＬの一晩培養物からの細胞を、１２，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離によって収穫した。細胞ペレットを、凍結するまで−８０℃でインキュベートした。
【０２７７】
約５００μＬの冷たい０．７ｍｍのジルコニアビーズ（Ａｍｂｉｏｎ）を、凍結細胞ペレットの上に加えた。酵母溶解緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ８．０、０．１％トリトンＸ１００、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１×ＰｒｏＣＥＡＳＥプロテアーゼ阻害剤［Ｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ］）を加えて管にできるだけ少ない空気を残して管を満たし、管は操作の間氷上に置いた。サイクルの間は氷上で１分間休止させて、ビーズ泡立て器（ＢｉｏＳｐｅｃ）で２分のサイクルを３回用いて細胞を破壊した。２００μＬの全細胞抽出物（ＷＣＥ）を新しい管に取り出し、全細胞抽出物の残りを４℃で１５分間の１６，０００×ｇで遠心分離して不溶性破片をペレットにした。溶解性の細胞抽出物（ＳＣＥ）として、上清を新しい管に取り出した。溶解性の細胞抽出物中のタンパク含有量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）で測定した。５０μｇのタンパク質を含むＳＣＥの容量（および同じ容量のＷＣＥ）を、４容の１００％冷アセトンの添加によって沈殿させた。４℃で１５分間の１６，０００×ｇでの遠心分離の後、上清を注意深く取り出し、ペレットを２００μＬの８０％冷アセトンで洗浄して再び遠心分離した。上清を再び注意深く取り出し、細胞ペレットを５分の間風乾させた。
【０２７８】
次に、約１２００ｒｐｍで振盪させながら７０℃でインキュベートすることによって、タンパク質ペレットを５０ｍＭのＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１×ＬＤＳ試料緩衝液に再懸濁した。短時間の遠心分離および室温冷却の後に、試料（２０μｇ）をＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分離し、マウス抗６×Ｈｉｓ抗体（Ａｂｃａｍ）による免疫検出のためにニトロセルロースに移した。１：５，０００の一次抗体でのインキュベーションを室温で一晩実施し、１：５，０００のロバ抗マウスＨＲＰコンジュゲート二次抗体でのインキュベーションを室温で３時間実施し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）で検出を実施した。複数のクローンは、ヘキサノエートシンターゼのＨＥＸＡおよびＨＥＸＢの両サブユニットの溶解性の発現を提示した。図１１に示すように、発現タンパク質のかなりの部分が不溶性ペレットと一緒に分別された。株ｓＡＡ０６１、ｓＡＡ１４０、ｓＡＡ１４１、ｓＡＡ１４２は、６×Ｈｉｓ標識ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢタンパク質を含んでいた。株ｓＡＡ０４８は、ベクターｐ４２５ＧＰＤおよびｐ４２６ＧＰＤだけを含んでいた。
【０２７９】
（実施例１３）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでのＳＴＣＪおよびＳＴＣＫの発現
プラスミドｐＡＡ０４１およびｐＡＡ０４３を、コンピテントＢＹ４７４２  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに同時形質転換させた。ｐＡＡ０４１およびｐＡＡ０４３の両方を含む形質転換体の選択は、ＳＣ−ＵＲＡ−ＬＥＵプレートの上で実施した。培養増殖、細胞抽出物調製、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよび免疫検出は、本明細書に記載される通りに実施された。１つのクローンは、ＳＴＣＪおよびＳＴＣＫ両サブユニットの溶解性の発現を提示した。図１１に示すように、発現タンパク質のかなりの部分が不溶性ペレットと一緒に分別された。株ｓＡＡ１４４は、６×Ｈｉｓ標識ＳＴＣＪおよびＳＴＣＫタンパク質を含んでいた。株ｓＡＡ０４８は、ベクターｐ４２５ＧＰＤおよびｐ４２６ＧＰＤだけを含んでいた。
【０２８０】
（実施例１４）
Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓでのＨＥＸＡおよびＨＥＸＢの発現
ＣｌａＩを用いてプラスミドｐＡＡ１２８およびｐＡＡ１３０を線状化し、コンピテントｓＡＡ１０３細胞（ｕｒａ３／ｕｒａ３、ｐｏｘ４：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４：：ｕｒａ３、ｐｏｘ５：：ｕｒａ３／ｐｏｘ５：：ｕｒａ３）に同時形質転換させた。ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢ  ＯＲＦのＣｌａＩ認識部位は、重複するｄａｍメチル化のためにブロックされる。組込みベクターＤＮＡを含む形質転換体の選択は、ＳＣ−ＵＲＡプレートの上で実施した。ベクター組込みの確認は、ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢ特異的プライマーを用いてＰＣＲによって実施した。ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢの両方にＰＣＲ陽性であった形質転換体が、標的タンパク質発現の分析のために選択された。一晩の培養増殖を、本明細書に記載される通りに実施した。新しい５ｍＬのＹＰＤ培養物を、一晩培養物から０．４の初期ＯＤ６００ｎｍで接種し、ＯＤ６００ｎｍが約５〜８に到達するまでインキュベートし、その時点で培養物を収穫した。細胞抽出物調製、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよび免疫検出は、本明細書に記載される通りに実施された。株ｓＡＡ２６９およびｓＡＡ２７０は、６×Ｈｉｓ標識ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢタンパク質の発現のためにゲノムに組み込まれたプラスミドｐＡＡ１２８およびｐＡＡ１３０を含んでいた。両方の株は、図１２に示すように６×Ｈｉｓ標識ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢサブユニットの溶解性の発現を提示した。株ｓＡＡ２６９およびｓＡＡ２７０で発現される６×Ｈｉｓ標識ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢを、矢印で示す。株ｓＡＡ１４４からの６×Ｈｉｓ標識ＳＴＣＪおよびＳＴＣＫは、陽性対照として含まれた。株ｓＡＡ１０３は、ｓＡＡ２６９およびｓＡＡ２７０の親株であり、６×Ｈｉｓ標識ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢの発現のための組込みベクターを含まない。
【０２８１】
（実施例１５）
ＵＲＡ３マーカーをリサイクルするための手順
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと比較してＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓは限られた数の選択マーカーを有し、したがって、ＵＲＡ３マーカーはＵＲＡ３を用いる複数回の選択を可能にするために「リサイクル」される。Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓの以降の遺伝子操作のためにＵＲＡ３マーカーを再利用するために、Ｕｒａ＋表現型を有する単一のコロニーを、３ｍＬのＹＰＤに接種し、振盪させながら３０℃で一晩生育させた。次に一晩培養物を遠心分離によって収穫し、１ｍＬ  ＹＮＢ＋ＹＥ（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素培養液、３ｇ／Ｌ酵母抽出物）に再懸濁した。次に、再懸濁した細胞をＹＮＢ＋ＹＥで連続希釈し、１００μＬの一定量をＹＰＤプレートに平板培養して（３０℃で一晩のインキュベーション）、元の懸濁液の力価を測定した。さらに、未希釈懸濁液の３反復の１００μＬの一定量を、３つの異なる濃度（０．５、０．７５、１ｍｇ／ｍＬ）で、ＳＣデキストロース（Ｂａｃｔｏ寒天２０ｇ／Ｌ、ウラシル０．３ｇ／Ｌ、デキストロース２０ｇ／Ｌ、酵母窒素培養液６．７ｇ／Ｌ、アミノ酸ドロップアウトミックス２．１４ｇ／Ｌ）および５−ＦＯＡに平板培養した。
【０２８２】
プレートは、３０℃で少なくとも５日の間インキュベートした。ＳＣデキストロース＋５−ＦＯＡプレートに生じたコロニーを５０μＬの無菌蒸留水に再懸濁し、ＹＰＤおよびＳＣ−ＵＲＡ（ウラシルを含まないＳＣデキストロース培地）プレートに画線培養するために５μＬを用いた。ＹＰＤだけで生育し、ＳＣ−ＵＲＡプレートで生育しなかったコロニーを、次に３ｍＬのＹＰＤに接種して、振盪させながら３０℃で一晩生育させた。一晩培養物を遠心分離によって収穫し、１．５ｍＬのＹＮＢ（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素培養液）に再懸濁した。再懸濁した細胞をＹＮＢで連続希釈し、１００μＬの一定量をＹＰＤプレートに平板培養して３０℃で一晩インキュベートし、初期力価を測定した。希釈されていない各細胞懸濁液の１ｍＬもＳＣ−ＵＲＡに平板培養し、３０℃で最高７日の間インキュベートした。ＳＣ−ＵＲＡプレート上のコロニーは復帰突然変異体であり、最も低い復帰頻度（＜１０−７）の分離株を以降の株遺伝子操作のために用いた。
【０２８３】
（実施例１６）
アジピン酸へのヘキサンおよびヘキサン酸のオメガ酸化
記載されるように、株ｓＡＡ００３のスターター培養物をＹＰＤ２．０（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％デキストロース）で一晩生育させた。スターター培養物を用いて０．４の初期ＯＤ６００ｎｍで１００ｍＬの新しいＹＰＤ２．０に接種し、約２００ｒｐｍで振盪させながら３０℃で一晩インキュベートした。１００ｍＬの培養物を２３℃で１０分間の４，０００×ｇの遠心分離によってペレットにし、１００ｍＬの新しいＹＰＤ０．１培地（１％酵母抽出物、１％ペプトン、０．１％デキストロース）に再懸濁した。培養物を４×２５ｍＬの培養物に分割し、そこに１％ヘキサン、０．０５％ヘキサン酸、１．０％ヘキサン酸のいずれかを加えたか、またはいかなる他の炭素源も加えなかった。株ｓＡＡ００３はβ酸化が完全にブロックされ、したがって発酵はＣ６基質を酸化するβ酸化経路の能力を試験した。２４、４８および７２時間時に試料を採取し、アジピン酸の検出のための公開された方法（Ｃｈｅｎｇら、２０００年）を用いてＬＣ−ＭＳ（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）によって分析した。下記の表に示す７２時間時点のデータは、株ｓＡＡ００３がヘキサン酸およびヘキサンの両方をアジピン酸に酸化することができたことを証明する。結果は、１％のヘキサン酸レベルが細胞に毒性であり、バックグラウンドレベルを超えるアジピン酸が生成されなかったことも示す。
【０２８４】
【表９】
2012531903.tif 000028
（実施例１７）
ヘキサンまたはヘキサン酸への曝露によって誘導されるＰ４５０対立遺伝子の同定
ＹＮＢ−塩＋２．０％グルコース（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素培養液、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、３．０ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、３．０ｇ／Ｌリン酸一カリウム、０．５ｇ／Ｌ塩化ナトリウムおよび２０ｇ／Ｌデキストロース）で一晩生育させた３５０ｍＬの培養物を、ＹＰＤ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％デキストロース）の３ｍＬの一晩培養物から接種し、ＲＮＡ調製のために用いた。培養物を遠心分離によって収穫した。グルコースを含まない１００ｍＬのＹＮＢ−塩培地で各ペレットを再懸濁した。ＲＮＡ単離のために、１ｍＬの一定量を時間０の対照としてとった。各１００ｍＬの懸濁液に、異なる誘導因子、１％グルコース、１％ヘキサンまたは０．０５％ヘキサン酸を加え、５０ｍＬ部分に２等分して２５０ｍＬのバッフルフラスコに入れ、振盪させながら３０℃で２時間または４時間インキュベートした。２時間および４時間時に、各誘導因子に１つのフラスコを遠心分離によって収穫し、培養泡を崩壊させるためにそれ自身の使用済み培地に再懸濁した。各培養物の１ｍＬの遠心分離によって１ｍＬの試料を単離し、製造業者の使用説明書に従ってＲｉｂｏＰｕｒｅ酵母キットを用いてＲＮＡを調製し、さらに、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）による溶解および抽出の後１容のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で最初のＲＮＡ調製物を水相に抽出した。
【０２８５】
製造業者の推奨に再度従い、エタノール沈殿およびＤＮアーゼＩ処理によって各ＲＮＡ調製物をさらに精製した。電気泳動によって、およびＵＲＡ３遺伝子のＰＣＲ生成物を刺激することに失敗したことによって、すべてのＲＮＡ調製物は混在するゲノムＤＮＡが存在しないことがわかった。本明細書に記載される通り、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、各ＲＮＡ調製物について第一鎖合成反応を完了した。各試料の反応は、１３μＬ無菌蒸留水中の、１μＬ  ｏＡＡ０５４２（ポリＴ  １０μＭ）、１μＬ  ｄＮＴＰミックス（各々１０ｍＭ）、１μｇ  ＲＮＡから成った。ＲＮＡ／プライマー混合物を６５℃に５分間加熱し、氷上に１分間置いた。各チトクロームＰ４５０のかなり特異な区域を増幅させるプライマーを生成し、それらを下記の表に示す。
【０２８６】
２時間誘導されたｃＤＮＡ試料でＰＣＲ反応を実施し、時間０およびゲノムＤＮＡ対照と比較した。各ｃＤＮＡおよびプライマー対組合せのＰＣＲ反応は、０．５μＬ鋳型、各々０．４μＭのセンスおよびアンチセンスプライマー、１×Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、０．１μＬ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、および２５μＬまでの無菌蒸留水から成った。用いたサイクリングパラメータは、９５℃で５分間、および９５℃で３０秒間、５０℃で４０秒間、７２℃で２分間を３０サイクル、続いて７２℃で５分間および４℃で保持であった。用いた誘導因子による差別的な発現を同定するために、ＰＣＲ反応物を１．２％アガロースゲルでの電気泳動にかけた。いくつかのＰ４５０はヘキサンまたはヘキサン酸の存在下で増加した誘導を示したが、結果は定量的でなかった。図１３に示す通り、２つのチトクロームＰ４５０、ＣＹＰ５２Ａ１５およびＣＹＰ５２Ａ１６は、ヘキサンおよびヘキサン酸の存在下でだけ誘導を示し、グルコースの存在下では誘導を示さなかった。誘導された発現のＰＣＲ分析のために用いたプライマーを、下記の表に示す。
【０２８７】
【表１０】
2012531903.tif 000029
（実施例１８）
Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓの脂肪アルコールオキシダーゼ（ＦＡＯ）対立遺伝子のクローニングおよび分析
Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓからの脂肪アルコールオキシダーゼ遺伝子の単離
ＦＡＯ１配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＡＯ１  ＡＹ５３８７８０）のプロモーター、脂肪アルコールオキシダーゼ遺伝子（ＦＡＯ）およびターミネーターを含む配列領域を増幅するために生成されたプライマーを用いて、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ（ＡＴＣＣ２０３３６）の脂肪アルコールオキシダーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅によって単離した。Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株ＡＴＣＣ２０３３６からの脂肪アルコールオキシダーゼヌクレオチド配列を増幅するために用いたプライマーを、下の表に示す。
【０２８８】
【表１１】
2012531903.tif 000030
ＰＣＲ反応は、２５μＬの２×マスターミックス、１．５μＬのｏＡＡ０１４４およびｏＡＡ０１４５（１０μＭ）、３．０μＬのゲノムＤＮＡ、および１９μＬ無菌Ｈ２Ｏを含んでいた。用いたサーモサイクリングパラメータは、９８℃で２分間、および９８℃で２０秒間、５２℃で２０秒間、７２℃で１分間を３５サイクル、続いて７２℃で５分間および４℃で保持であった。正しいサイズのＰＣＲ生成物をゲル精製し、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、コンピテントＴＯＰ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換させた。ＰＣＲ挿入断片を含むクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。４つのＦＡＯ対立遺伝子を配列分析から同定し、ＦＡＯ−１３、ＦＡＯ−１７、ＦＡＯ−１８およびＦＡＯ−２０と命名した。ＦＡＯ−１８と命名されたクローンの配列は、ＧｅｎＢａｎｋからのＦＡＯ１の配列と実質的に同一であった配列を有した。４つの対立遺伝子の生じたプラスミドは、それぞれｐＡＡ０８３、ｐＡＡ０８４、ｐＡＡ０５９およびｐＡＡ０８５と命名した。本明細書に記載の単離されたＦＡＯ遺伝子の配列同一性の比較を、下の表に示す。
【０２８９】
【表１２】
2012531903.tif 000031
Ｅ．ｃｏｌｉでのＦＡＯ対立遺伝子の発現
様々な炭素源に関してＦＡＯ酵素活性のレベルを測定するために、４つの単離されたＦＡＯ対立遺伝子をＥ．ｃｏｌｉでさらにクローニングし、過剰発現させた。上で指摘したプラスミドをＤＮＡ鋳型として用いて、ＦＡＯ−１３およびＦＡＯ−２０についてはプライマーｏＡＡ０２６８およびｏＡＡ０２６９により、ＦＡＯ−１７およびＦＡＯ−１８についてはｏＡＡ０２６８およびｏＡＡ０２８２により、本明細書に記載される条件を用いてＦＡＯをＰＣＲによって増幅した。正しいサイズのＰＣＲ生成物をゲル精製し、ｐＥＴ１１ａベクターにＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位の間に連結し、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換させた。対応するＦＡＯを含むコロニーは、ＤＮＡ塩基配列決定によって確認した。対照として、修飾されていないｐＥＴ１１ａベクターもＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換させた。生じた株およびプラスミドは、それぞれｓＡＡ１５３（ｐＥＴ１１ａ）、ｓＡＡ１５４（ＦＡＯ−１３を含有するｐＡＡ０７９）、ｓＡＡ１５５（ＦＡＯ−１７を含有するｐＡＡ０８０）、ｓＡＡ１５６（ＦＡＯ−１８を含有するｐＡＡ０８１）およびｓＡＡ１５７（ＦＡＯ−２０を含有するｐＡＡ０８２）と命名した。株およびプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉでのＦＡＯ過剰発現のために用いられた。各株の１コロニーを、１００ｇ／ｍｌアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地に移し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩生育させた。一晩培養物を用いて、１００ｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２５ｍｌ  ＬＢ中の新しい培養物にＯＤ６００ｎｍ  ０．２で接種した。細胞を０．３ｍＭ  ＩＰＴＧによりＯＤ６００ｎｍ  ０．８で３時間誘導し、４℃で１０分間の１，０５０×ｇの遠心分離によって収穫した。細胞ペレットを−２０℃で保存した。
【０２９０】
Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓでのＦＡＯの発現
Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓでの増幅のために、過剰発現されたＦＡＯを有するＥ．ｃｏｌｉの溶解性細胞抽出物の酵素アッセイから決定されたそれらの基質特異性プロファイルに基づいて、２つの対立遺伝子、ＦＡＯ−１３およびＦＡＯ−２０を選択した。ＦＡＯ−１３およびＦＡＯ−２０を含むＤＮＡ断片は、それぞれプラスミドｐＡＡ０７９およびｐＡＡ０８２をＤＮＡ鋳型として用いて、プライマーｏＡＡ０４２１およびｏＡＡ０４２２によるＰＣＲによって増幅された。正しいサイズのＰＣＲ生成物をゲル精製し、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、コンピテントＴＯＰ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換させ、ＦＡＯ挿入断片を含むクローンを配列決定して正しいＤＮＡ配列を確認した。ＦＡＯ−１３およびＦＡＯ−２０を含むプラスミドをＳａｐＩで消化し、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓのＰＧＫプロモーターおよびターミネーターを含むベクターｐＡＡ１０５に連結した。生じたプラスミドは制限消化およびＤＮＡ塩基配列決定によって確認され、それぞれｐＡＡ１１５（ＦＡＯ−１３）およびｐＡＡ１１６（ＦＡＯ−２０）と命名された。プラスミドｐＡＡ１１５およびｐＡＡ１１６をＳｐｅＩで線状化し、コンピテントなＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  Ｕｒａ−株ｓＡＡ００２（ＳＵ−２、ＡＴＣＣ２０９１３）およびｓＡＡ１０３に形質転換させた。ＦＡＯ−１３およびＦＡＯ−２０の組込みは、プライマーｏＡＡ０４２９およびｏＡＡ０２８１を用いてコロニーＰＣＲによって確認された。生じた株は、ｓＡＡ２７８（ｐＡＡ１１５が株ｓＡＡ００２に組み込まれた）、ｓＡＡ２８０（ｐＡＡ１１６がｓＡＡ００２に組み込まれた）、ｓＡＡ２８２（ｐＡＡ１１５がｓＡＡ１０３に組み込まれた）およびｓＡＡ２８４（ｐＡＡ１１６がｓＡＡ１０３に組み込まれた）と命名され、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓでの脂肪アルコールオキシダーゼ過剰発現のために用いられた。
【０２９１】
本明細書に記載の通り、各株の１つのコロニーを５ｍｌ  ＹＰＤに接種し、一晩生育させた。一晩培養物を用いて、ＯＤ６００ｎｍ約０．５で新しい２５ｍＬ  ＹＰＤ培養に接種した。ＦＡＯ過剰発現は、ＰＧＫプロモーター／ターミネーターによって調節され、培地中のグルコースによって誘導され、構成的に発現された。株ｓＡＡ００２およびｓＡＡ１０３（例えば、形質転換されていない出発株）は、ＦＡＯ過剰発現の陰性対照として含まれた。細胞は、初期対数期（約３から約５の間のＯＤ６００ｎｍ）に４℃で１０分間の１，０５０×ｇの遠心分離によって収穫した。細胞ペレットは、−２０℃で保存した。
【０２９２】
Ｅ．ｃｏｌｉからの細胞抽出物の調製
ＦＡＯを発現するＥ．ｃｏｌｉ培養物２５ｍＬからの細胞ペレットを、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、２０％グリセロール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、２μＬ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ２５Ｕ／μＬ、２０μＬ  １０ｍｇ／ｍＬリゾチームを含む１０ｍＬのリン酸−グリセロール緩衝液に再懸濁した。次に回転振盪機の上での室温で５０分間のインキュベーションによって細胞を溶解し、細胞懸濁液を１５，０００×ｇにより４℃で３０分間遠心分離した。上清を１．５ｍｌ微量遠心管に等分し、ＦＡＯ酵素活性アッセイのために−２０℃で保存した。
【０２９３】
Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓからの細胞抽出物の調製
凍結Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ細胞ペレットを、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、２０％グリセロール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含む１．２ｍｌのリン酸−グリセロール緩衝液に再懸濁した。再懸濁した細胞を、氷上の約５００μＬのジルコニアビーズを含む１．５ｍＬねじ口試験管へ移した。氷の上で２分間のパルスおよび１分間の休止間隔を用いてビーズ泡立て器（Ｂｉｏｓｐｅｃ）で細胞を溶解した。工程を３回繰り返した。全細胞抽出物を次に新しい１．５ｍｌ管へ移し、４℃で１５分間の１６，０００×ｇで遠心分離した。上清を新しい管に移し、ＦＡＯ酵素活性アッセイのために用いた。
【０２９４】
タンパク質濃度測定
細胞抽出物のタンパク質濃度は、製造業者の推奨に従ってＢｒａｄｆｏｒｄ試薬を用いて（Ｃａｔ＃２３２３８、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）測定した。
【０２９５】
ＦＡＯ酵素活性アッセイ
ＦＡＯ酵素活性アッセイは、Ｅｉｒｉｃｈら（２００４）の変法を用いて実施した。アッセイは２酵素共役反応（例えば、ＦＡＯおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））を利用し、分光測光によって監視することができる。脂肪アルコールオキシダーゼ酵素活性アッセイのための標準基質として、１−ドデカノールを用いた。ＦＡＯはドデカノールをドデカナールに酸化する一方、同時に分子酸素を過酸化水素に還元する。ＨＲＰは２酵素共役反応で（２，２’−アジノ−ビス３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸；ＡＢＴＳ）を還元し、そこでは過酸化水素をＡＢＴＳに酸化することから電子が得られ、それは４０５ｎｍでの分光分析によって測定することができる。アッセイは、内因性カタラーゼによるＨ２Ｏ２の破壊を予防するためにアミノトリアゾール（ＡＴ）を用いて改変され、このようにミクロソームの分別の必要性をなくした。ＦＡＯ酵素アッセイのための最終反応混合液（１．０ｍＬ）は、５００μＬの２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．６；脱イオン水中の５０μＬの１０ｍｇ／ｍＬ  ＡＢＴＳ溶液；アセトン中の１０μＬの５ｍＭドデカノール溶液；５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．６中の、４０μＬの１Ｍ  ＡＴおよび５μＬの２ｍｇ／ｍＬ西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液から成った。反応活性は、抽出物を加えた後に、室温で吸光度を４０５ｎｍで１０分間測定することによって測定した。活性が０．２から１．０のΔＡ４０５ｎｍ／分の範囲に入るように、反応混合液に加えた抽出物の量を変化させた。用いた抽出物の実際量は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ＦＡＯ−１３については約１．６９Ｕ／ｍｇ、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ＦＡＯ−１７については０．０１８Ｕ／ｍｇ、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ＦＡＯ−１８（例えば、ＦＡＯ１）については０．３５Ｕ／ｍｇ、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ＦＡＯ−２０については０．４７Ｕ／ｍｇ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ（株ｓＡＡ２７８）発現ＦＡＯ−１３については０．０３６Ｕ／ｍｇ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ（株ｓＡＡ２８２）発現ＦＡＯ−１３については０．０１６Ｕ／ｍｇ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ（株ｓＡＡ２８０）発現ＦＡＯ−２０については０．０３２Ｕ／ｍｇ、およびＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ（株ｓＡＡ２８４）発現ＦＡＯ−２０については０．０２９Ｕ／ｍｇであった。ＦＡＯ活性は、総タンパク１ｍｇ当たりの活性単位（１単位＝１分間に１モルの基質が酸化される）で報告した。１８．４の４０５ｎｍの吸光係数をＡＢＴＳのために用い、それは０．５ｍＭの酸化基質と同等であった。活性アッセイの結果を、下の表に示す。
【０２９６】
【表１３】
2012531903.tif 000032
（実施例１９）
Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓシャトルベクターｐＡＡ０６１の構築
Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株ＡＴＣＣ２０３３６からの選択マーカーＵＲＡ３ならびにＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓのプロモーターおよびターミネーターの挿入を可能にする改変を抱えるように、ベクターｐＡＡ０６１をｐＵＣ１９骨格から構築した。Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ２０３３６からのＵＲＡ３のプロモーター、ＯＲＦおよびターミネーターを含む１，５０７ｂｐ  ＤＮＡ断片を、下の表に示すプライマーｏＡＡ０１２４およびｏＡＡ０１２５を用いて増幅した。ＵＲＡ３  ＰＣＲ生成物をＮｄｅＩ／ＭｌｕＩで消化し、ＮｄｅＩ／ＢｓｍＢＩ（ＭｌｕＩ適合性オーバーハングはＢｓｍＢＩによって生成された）で消化したｐＵＣ１９の２，５０５ｂｐ断片に連結した。ｌａｃプロモーターを短い２１ｂｐリンカー配列と入れ替えるために、生じたプラスミドをＳｐｈＩ／ＳａｐＩで消化し、オリゴｏＡＡ０１７３およびｏＡＡ０１７４をアニールすることによって生成されたリンカーで埋めた。生じたプラスミドはｐＡＡ０６１と命名し、図３０に示す。
【０２９７】
【表１４】
2012531903.tif 000033
（実施例２０）
Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ＰＧＫプロモーターおよびターミネーターのクローニング
Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ２０３３６からのホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびターミネーター領域を読取り枠（ＯＲＦ）の挿入のための介在多クローニング部位（ＭＣＳ）と含むように、ベクターｐＡＡ１０５をベースベクターｐＡＡ０６１から構築した。下の表に示すプライマーｏＡＡ０３４７およびｏＡＡ０３４８を用いて、ＰＣＲによってＰＧＫプロモーター領域を増幅した。ＰＧＫプロモーターを含む１，０２９ｂｐ  ＤＮＡ断片を、制限酵素ＰｓｔＩ／ＸｍａＩで消化した。同様に下の表に示すプライマーｏＡＡ０３５１およびｏＡＡ０３５２を用いて、ＰＧＫターミネーター領域をＰＣＲによって増幅した。ＰＧＫターミネーターを含む３９６ｂｐ  ＤＮＡ断片を、制限酵素ＸｍａＩ／ＥｃｏＲＩで消化した。ｐＡＡ０６１からの３，７２８ｂｐのＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡ断片を、ｐＡＡ１０５を産生するためにＰＧＫプロモーターおよびターミネーター領域による３片ライゲーション反応で用いた。ＰＧＫプロモーターとターミネーターの間の配列は、機能的に連結する構成的ＰＧＫプロモーターによって制御されるＯＲＦを取り込むための制限部位を含む。
【０２９８】
【表１５】
2012531903.tif 000034
（実施例２１）
ＰＯＸ４遺伝子座のクローニング
Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株ＡＴＣＣ２０３３６から調製されるゲノムＤＮＡからのＹＳＡＰＯＸ４遺伝子座のＮＣＢＩ受託番号Ｍ１２１６０の全配列を増幅するために、プライマーｏＡＡ０１３８およびｏＡＡ０１４１（下の表に示す）を生成した。２，８４５ｂｐのＰＣＲ生成物をベクターｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定をし、ｐＡＡ０５２と命名し、それを図２９に示す。
【０２９９】
【表１６】
2012531903.tif 000035
（実施例２２）
ＰＯＸ５遺伝子座のクローニング
Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株ＡＴＣＣ２０３３６から調製されるゲノムＤＮＡからのＹＳＡＰＯＸ５遺伝子座のＮＣＢＩ受託番号Ｍ１２１６１の全配列を増幅するために、プライマーｏＡＡ０１７９およびｏＡＡ０１８２（下の表に示す）を生成した。２，６２４ｂｐのＰＣＲ生成物をベクターｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定をし、ｐＡＡ０４９と命名し、それを図２８に示す。
【０３００】
【表１７】
2012531903.tif 000036
（実施例２３）
株ｓＡＡ１０５およびｓＡＡ１０６の構築
ｕｒａ３破壊遺伝子座を機能的対立遺伝子と入れ替えるために、ＰＯＸ４線状ＤＮＡによるｓＡＡ００３の形質転換によって、機能的ＰＯＸ４対立遺伝子をＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株ｓＡＡ００３に復元した（ＡＴＣＣ２０９６２；ｕｒａ３／ｕｒａ３、ｐｏｘ４：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４：：ｕｒａ３、ｐｏｘ５：：ｕｒａ３／ｐｏｘ５：：ＵＲＡ３）。鋳型としてプラスミドｐＡＡ０５２を用い、ＰＯＸ４  ＯＲＦならびにＯＲＦの５３１ｂｐ上流および１８４ｂｐ下流を含んだプライマーｏＡＡ０１３８およびｏＡＡ０１４１（実施例２１に記載）を用いて、２，８４５ｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅した。精製されたＰＣＲ生成物を用いて、炭素源としてヘキサデカン蒸気が補われた（例えば、逆転されたペトリ皿の蓋に、ヘキサデカンを浸したろ紙を置くことによって）ＹＮＢ−寒天プレートに平板培養されたコンピテントｓＡＡ００３細胞を形質転換し、３０℃で４〜５日の間インキュベートした。唯一の炭素源としてヘキサデカンの上で生育したコロニーを、ＹＰＤ−寒天に再び画線培養し、３０℃でインキュベートした。単一のコロニーをＹＰＤ培養で生育させ、ゲノムＤＮＡの調製のために用いた。
【０３０１】
形質転換体から調製されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析は、オリゴｏＡＡ０１３８およびｏＡＡ０１４１で実施した。ＵＲＡ３破壊ＰＯＸ４は、５，０４５ｂｐのＰＣＲ生成物を産生し、機能的ＰＯＸ４は２，８４５ｂｐのＰＣＲ生成物を産生するであろう。株ｓＡＡ１０５では、１つのＰＣＲ生成物だけが２，８４５ｂｐのサイズで増幅され、このことは、両方のＰＯＸ４対立遺伝子が機能的に回復したことを示している。株ｓＡＡ１０６では、２，８４５ｂｐおよび５，０４５ｂｐ両方のＰＣＲ生成物が増幅され、このことは、１つのＰＯＸ４対立遺伝子が機能的に回復し、他のＰＯＸ４対立遺伝子はＵＲＡ３によって破壊されたままであることを示している。生じた株の遺伝子型は以下の通りである：ｓＡＡ１０５（ｕｒａ３／ｕｒａ３、ＰＯＸ４／ＰＯＸ４、ｐｏｘ５：：ｕｒａ３／ｐｏｘ５：：ＵＲＡ３）およびｓＡＡ１０６（ｕｒａ３／ｕｒａ３、ＰＯＸ４／ｐｏｘ４：：ｕｒａ３、ｐｏｘ５：：ｕｒａ３／ｐｏｘ５：：ＵＲＡ３）。
【０３０２】
（実施例２４）
株ｓＡＡ１５２の構築
機能的ＰＯＸ５対立遺伝子は、ＰｍｌＩ線状化プラスミドｐＡＡ０８６（ＰＯＸ５プロモーター、遺伝子、ターミネーターおよびＵＲＡ３マーカーを含む）によるｓＡＡ１０３の形質転換によって、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株ｓＡＡ１０３で復元された（ｕｒａ３／ｕｒａ３、ｐｏｘ４：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４：：ｕｒａ３、ｐｏｘ５：：ｕｒａ３／ｐｏｘ５：：ｕｒａ３）。形質転換体の選択は、ＳＣ−ＵＲＡ寒天プレートに平板培養することによって実施した。プラスミド組込みの検証は、プライマーｏＡＡ１７９およびｏＡＡ１８２（実施例２２に記載）によるＰＣＲによって実施した。プラスミドの組込みは２，５８４ｂｐのＰＣＲ生成物によって明らかにされ、機能的ＰＯＸ５対立遺伝子の存在を示していた。ｓＡＡ１５２の他のＰＯＸ５対立遺伝子はｕｒａ３遺伝子で破壊され、非機能的対立遺伝子のＰＣＲ生成物のサイズを４，７３４ｂｐに増加させた。株ｓＡＡ１５２の遺伝子型は、ｕｒａ３／ｕｒａ３、ｐｏｘ４：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４：：ｕｒａ３、ｐｏｘ５：：ｕｒａ３／ｐｏｘ５：：ｕｒａ３、ｕｒａ３：：ＰＯＸ５、ＵＲＡ３）である。
【０３０３】
（実施例２５）
株ｓＡＡ２３２の構築
機能的ＰＯＸ５対立遺伝子は、ＵＲＡ３破壊遺伝子座を機能的対立遺伝子と入れ替えるために、ＰＯＸ５線状ＤＮＡによるｓＡＡ００３の形質転換によってＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株ｓＡＡ００３で復元された。鋳型としてプラスミドｐＡＡ０４９を用い、ＰＯＸ５  ＯＲＦならびにＯＲＦの４５６ｂｐ上流および１７９ｂｐ下流を含んだプライマーｏＡＡ０１７９およびｏＡＡ０１８２（実施例２２に記載）を用いて、２，５８４ｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅した。精製されたＰＣＲ生成物を用いて、ＳＣ＋ＵＲＡ＋５ＦＯＡプレートに平板培養したコンピテントｓＡＡ００３細胞を形質転換し、３０℃で３〜４日の間インキュベートした。コロニーをＹＰＤ−寒天に再び画線培養し、３０℃でインキュベートした。単一のコロニーをＹＰＤ培養で生育させ、ゲノムＤＮＡの調製のために用いた。形質転換体から調製されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析は、オリゴｏＡＡ０１７９およびｏＡＡ０１８２で実施した。ｕｒａ３破壊ＰＯＸ５は、４，７８４ｂｐのＰＣＲ生成物を産生し、機能的ＰＯＸ５は２，５８４ｂｐのＰＣＲ生成物を産生するであろう。株ｓＡＡ２３２では、２，５８４ｂｐおよび４，７８４ｂｐ両方のＰＣＲ生成物が増幅され、このことは、１つのＰＯＸ５対立遺伝子が機能的に回復し、他のＰＯＸ５対立遺伝子はｕｒａ３によって破壊されたままであることを示している。株ｓＡＡ２３２の生じた遺伝子型は、ｕｒａ３／ｕｒａ３、ｐｏｘ４：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４：：ｕｒａ３、ｐｏｘ５：：ｕｒａ３／ＰＯＸ５である。５−ＦＯＡ選択は、ｓＡＡ２３２株Ｕｒａ−を残して機能的ＵＲＡ３で破壊された、ＰＯＸ５対立遺伝子を回復した。
【０３０４】
（実施例２６）
株ｓＡＡ２３５の構築
機能的ＰＯＸ５対立遺伝子は、ＵＲＡ３破壊遺伝子座を機能的対立遺伝子と入れ替えるために、ＰＯＸ５線状ＤＮＡによるｓＡＡ００３の形質転換によってＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株ｓＡＡ００３で復元された。鋳型としてプラスミドｐＡＡ０４９を用い、ＰＯＸ５  ＯＲＦならびにＯＲＦの４５６ｂｐ上流および１７９ｂｐ下流を含んだプライマーｏＡＡ０１７９およびｏＡＡ０１８２（実施例２２に記載）を用いて、２，５８４ｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅した。精製されたＰＣＲ生成物を用いて、炭素源としてドデカン蒸気が補われた（例えば、逆転されたペトリ皿の蓋に、ドデカンを浸したろ紙を置くことによって）ＹＮＢ−寒天プレートに平板培養されたコンピテントｓＡＡ００３細胞を形質転換し、３０℃で４〜５日の間インキュベートした。唯一の炭素源としてドデカンの上で生育したコロニーを、ＹＰＤ−寒天に再び画線培養し、３０℃でインキュベートした。単一のコロニーをＹＰＤ培養で生育させ、ゲノムＤＮＡの調製のために用いた。形質転換体から調製されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析は、オリゴｏＡＡ０１７９およびｏＡＡ０１８２で実施した。ｕｒａ３破壊ＰＯＸ５は、４，７８４ｂｐのＰＣＲ生成物を産生し、機能的ＰＯＸ５は２，５８４ｂｐのＰＣＲ生成物を産生するであろう。株ｓＡＡ２３５では、２，５８４ｂｐのＰＣＲ生成物が増幅され、両方のＰＯＸ５対立遺伝子が機能的に回復したことを示している。選択戦略（ドデカンを含むＹＮＢ寒天）の予想外の帰結は、細胞がＵｒａ＋表現型に復帰したことであった。任意の理論によって制限されることなく、固体培地でのウラシルの非存在および唯一の機能的ＵＲＡ３の置換が、細胞に他のｕｒａ３遺伝子座の１つを機能的対立遺伝子へ復帰突然変異させたと考えられている。したがって、株ｓＡＡ２３５の遺伝子型は、ＵＲＡ３／ｕｒａ３、ｐｏｘ４：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４：：ｕｒａ３、ＰＯＸ５／ＰＯＸ５であると考えられている。遺伝子座のいずれが機能的ＵＲＡ３であるかの検証が、進行中である。
【０３０５】
（実施例２７）
増幅されたＣＰＲおよびＣＹＰ５２遺伝子を有する株の構築
ＣＰＲおよびＣＹＰ５２の過剰発現が二酸産生にどのように影響するかを判定するために、チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）および／またはチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ５２）遺伝子の増加したコピー数を有する株を構築した。
【０３０６】
ＣＰＲ遺伝子のクローニングおよび組込み。
【０３０７】
Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ７５０からのＣＰＲプロモーター、ＯＲＦおよびターミネーターをコードする３，０１９ｂｐのＤＮＡ断片を、特異なＳａｐＩおよびＳｐｈＩ部位を取り込んだプライマーｏＡＡ０１７１およびｏＡＡ０１７２（下の表を参照）を用いてＰＣＲによって増幅した。増幅したＤＮＡ断片を指示された制限酵素で切断し、図３０に示すプラスミドｐＡＡ０６１に連結して、図３２に示すプラスミドｐＡＡ０６７を生成した。プラスミドｐＡＡ０６７をＣｌａＩで線状化し、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  Ｕｒａ−株ｓＡＡ１０３（ｕｒａ３／ｕｒａ３、ｐｏｘ４：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４：：ｕｒａ３、ｐｏｘ５：：ｕｒａ３／ｐｏｘ５：：ｕｒａ３）に形質転換させた。形質転換は、プラスミドｐＡＡ０６７単独で、および下に記載されるＣＹＰ５２Ａ１５またはＣＹＰ５２Ａ１６遺伝子を抱えるプラスミドと組み合わせて実施した。
【０３０８】
ＣＹＰ５２Ａ１５遺伝子のクローニングおよび組込み。
【０３０９】
Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ２０３３６からのＣＹＰ５２Ａ１５プロモーター、ＯＲＦおよびターミネーターをコードする２，８４２ｂｐのＤＮＡ断片を、プライマーｏＡＡ０１７５およびｏＡＡ０１７８（下の表を参照）を用いてＰＣＲによって増幅し、ＤＮＡ配列の検証のためにｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯにクローニングした。クローニングされたＣＹＰ５２Ａ１５  ＤＮＡ断片を、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩによる制限消化によって単離し（２，７４２ｂｐ）、図３０に示すプラスミドｐＡＡ０６１に連結して、図３３に示すプラスミドｐＡＡ０７７を生成した。プラスミドｐＡＡ０７７をＰｍｌＩで線状化し、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  Ｕｒａ−株ｓＡＡ１０３（ｕｒａ３／ｕｒａ３、ｐｏｘ４：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４：：ｕｒａ３、ｐｏｘ５：：ｕｒａ３／ｐｏｘ５：：ｕｒａ３）に形質転換させた。ｐＡＡ０７７は、ＣＰＲ遺伝子を抱えるプラスミドｐＡＡ０６７で同時形質転換された。
【０３１０】
ＣＹＰ５２Ａ１６遺伝子のクローニングおよび組込み。
【０３１１】
Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ２０３３６からのＣＹＰ５２Ａ１６プロモーター、ＯＲＦおよびターミネーターをコードする２，７２８ｂｐのＤＮＡ断片を、プライマーｏＡＡ０１７７およびｏＡＡ０１７８（下の表を参照）を用いてＰＣＲによって増幅し、ＤＮＡ配列の検証のためにｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯにクローニングした。クローニングされたＣＹＰ５２Ａ１６  ＤＮＡ断片を、特異なＳａｃＩ／ＸｂａＩ制限部位を取り込んだプライマーｏＡＡ０２６０およびｏＡＡ０２６１（下の表を参照）で増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をＳａｃＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化し、プラスミドｐＡＡ０６１に連結して、図３４に示すプラスミドｐＡＡ０７８を生成した。プラスミドｐＡＡ０７８をＣｌａＩで線状化し、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  Ｕｒａ−株ｓＡＡ１０３（ｕｒａ３／ｕｒａ３、ｐｏｘ４：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４：：ｕｒａ３、ｐｏｘ５：：ｕｒａ３／ｐｏｘ５：：ｕｒａ３）に形質転換させた。ｐＡＡ０７８は、ＣＰＲ遺伝子を抱えるプラスミドｐＡＡ０６７で同時形質転換された。
【０３１２】
【表１８】
2012531903.tif 000037
ゲノムＤＮＡの調製。
【０３１３】
ＰＣＲ検証およびサザンブロット分析のために、ゲノムＤＮＡを形質転換体から調製した。単離されたコロニーを３ｍＬのＹＰＤに接種し、振盪させながら３０℃で一晩生育させた。細胞を、遠心分離によってペレットにした。各ペレットに、２００μＬ切断緩衝液（２％トリトンＸ−１００、１％ＳＤＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリスｐＨ８および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、ペレットを再懸濁して、２００μＬの０．５ｍｍのジルコニア／シリカビーズを含む新しい管へ移した。２００μＬのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を各管に加え、続いて１分間のボルテキシングを行った。無菌蒸留水を各管に加え（２００μＬ）、管を１３０００ｒｐｍで１０分の間遠心分離した。水層をエタノール沈殿させ、７０％エタノールで洗浄した。乾燥の後、ペレットを１００〜２００μｌの１０ｍＭトリスに再懸濁した。サザンブロット解析のためのゲノムＤＮＡ調製は、同じ方法を用いて、試験された各コロニーにつき２５ｍＬの培養物で実施した。
【０３１４】
増幅されたＣＰＲおよびＣＹＰ５２遺伝子を有する株の特性評価。
【０３１５】
組込み体の検証は、プライマーｏＡＡ０２５２およびｏＡＡ０２５６（ＣＰＲ）、ｏＡＡ０２３１およびｏＡＡ０２８１（ＣＹＰ５２Ａ１５）およびｏＡＡ２４２およびｏＡＡ０２５７（ＣＹＰ５２Ａ１６）を用いてＰＣＲによって実施した。検証のために用いたプライマーを、下の表に示す。
【０３１６】
【表１９】
2012531903.tif 000038
ＣＰＲ、ＣＹＰ５２Ａ１５およびＣＹＰ５２Ａ１５遺伝子のコピー数を測定するために、サザンブロット分析を用いた。ビオチン化ＤＮＡプローブは、下の表に指定される各遺伝子標的から生成されたＰＣＲ生成物で、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓからのＮＥＢｌｏｔ  Ｐｈｏｔｏｔｏｐｅキット（目録番号Ｎ７５５０Ｓ）を用いて、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドで調製された。サザンハイブリダイゼーションは、標準の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，  Ｄ．  Ｗ．（２００１年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（３版）、６．３３〜６．６４頁。Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて実施した。ハイブリダイズしたプローブの検出は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓからのＰｈｏｔｏｔｏｐｅ−Ｓｔａｒ検出キット（目録番号Ｎ７０２０Ｓ）を用いて実施した。コピー数は、生じたバンドのデンシトメトリーで判定した。
【０３１７】
【表２０】
2012531903.tif 000039
（実施例２８）
部分的にβ酸化ブロックされた株の株評価
ラウリン酸メチルフィードストックの発酵。
【０３１８】
ＳＰ９２培地（６．７ｇ／Ｌディフコ酵母窒素ベース、３．０ｇ／Ｌディフコ酵母抽出物、３．０ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、１．０ｇ／Ｌリン酸カリウム一塩基、１．０ｇ／Ｌリン酸カリウム二塩基、７５ｇ／Ｌデキストロース）中の５ｍＬのスターター培養物を、振盪させながら３０℃で一晩インキュベートし、２５ｍＬのＳＰ９２培地を含むフラスコに約０．４の初期ＯＤ６００ｎｍで接種するために用いた。約２００ｒｐｍで振盪させながら、培養物を３０℃で約１８時間インキュベートした。４℃で１０分間の４，０００×ｇでの遠心分離によって細胞をペレットにし、次に０．１％デキストロースおよび２％ラウリン酸メチルを補ったＳＰ９２−Ｄ培地（６．７ｇ／Ｌディフコ酵母窒素ベース、３．０ｇ／Ｌディフコ酵母抽出物、３．０ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、１．０ｇ／Ｌリン酸カリウム一塩基、１．０ｇ／Ｌリン酸カリウム二塩基）に再懸濁した。振盪させながら培養物のインキュベーションを３０℃で続け、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による脂肪酸および二酸の分析のために試料を採取した。
【０３１９】
０．８ｍＬの６．０Ｍ  ＨＣｌを１ｍＬの全培養試料に加えることによってＧＣのための試料を調製し、試料は、処理までの間４℃で保存した。６０℃の水浴に５分間インキュベートすることによって試料を処理し、その後４．０ｍＬのＭＴＢＥを１．８ｍＬの酸性化させた全培養試料に加え、２０秒間撹拌した。室温で１０分間、相を分離させた。１ｍＬのＭＴＢＥ相を抜き、硫酸ナトリウムで乾燥させた。ＭＴＢＥ相の一定量をＢＳＴＦＡ試薬（Ｒｅｇｉｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）で誘導体化し、炎イオン化検出器を備えたＧＣによって分析した。ガスクロマトグラフィーの結果を、下の表に示す。
【０３２０】
【表２１】
2012531903.tif 000040
ミリスチン酸メチルおよびオレイン酸供給材料の発酵。
【０３２１】
２％ラウリン酸メチルが２％ミリスチン酸メチルまたは２％オレイン酸で置換された以外は、基本的にラウリン酸メチル供給材料について記載した通りに発酵を実施した。ガスクロマトグラフィーの結果を、下の表に示す。
【０３２２】
【表２２】
2012531903.tif 000041
供給材料としてヤシ油を用いた発酵も実施した。ヤシ油は、異なる炭素鎖長の脂肪酸の混合物を含む。重量による脂肪酸の組成百分率は、約６％カプリン酸（Ｃ１０：０、そこで０は二重結合または不飽和結合の数を指す）、約４７％ラウリン酸（Ｃ１２：０）、約１８％ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、約９％パルミチン酸（Ｃ１６：０）である。約３％ステアリン酸（Ｃ１８：０）、約６％オレイン酸（Ｃ１８：１、そこで、１は二重結合の数を指す）および約２％リノール酸（オメガ６脂肪酸、Ｃ１８：２）。一部の実施形態では、パーム核油でヤシ油を置換することができる。パーム核油は、ヤシ油のそれに類似した脂肪酸分布を有する。用いた供給材料を除いて、基本的に本明細書に記載される通りに発酵およびＧＣを実施した。供給材料としてヤシ油を用いて実施された発酵の結果を、下に示す。
【０３２３】
【表２３】
2012531903.tif 000042
（実施例２９）
完全にβ酸化ブロックされた株の株評価
供給材料としてミリスチン酸メチルを用いた発酵も実施した。用いた供給材料を除いて、基本的に本明細書に記載される通りに発酵およびＧＣを実施した。供給材料としてヤシ油を用いて実施された発酵の結果を、下に示す。
【０３２４】
【表２４】
2012531903.tif 000043
（実施例３０）
新規脂肪アルコールオキシダーゼ遺伝子の核酸およびアミノ酸配列
上記した通り、新規脂肪アルコールオキシダーゼ遺伝子を同定し、クローニングした。新規配列のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、本明細書に示す。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列同一性の比較は、実施例１８に示される。
【０３２５】
ヌクレオチド配列
【０３２６】
【化８】
2012531903.tif 000044
【０３２７】
【化９】
2012531903.tif 000045
【０３２８】
【化１０】
2012531903.tif 000046
【０３２９】
【化１１】
2012531903.tif 000047
【０３３０】
【化１２】
2012531903.tif 000048
（Ａ）単離された新規のＦＡＯ遺伝子に加えて、上記のプライマー設計のために使用された配列に実質的に同一である配列もまた単離された。この遺伝子のヌクレオチド配列が以下に示される。
【０３３１】
【化１３】
2012531903.tif 000049
【０３３２】
【化１４】
2012531903.tif 000050
【０３３３】
【化１５】
2012531903.tif 000051
【０３３４】
【化１６】
2012531903.tif 000052
【０３３５】
【化１７】
2012531903.tif 000053
【０３３６】
【化１８】
2012531903.tif 000054
【０３３７】
【化１９】
2012531903.tif 000055
【０３３８】
【化２０】
2012531903.tif 000056
【０３３９】
【化２１】
2012531903.tif 000057
【０３４０】
【化２２】
2012531903.tif 000058
【０３４１】
【化２３】
2012531903.tif 000059
【０３４２】
【化２４】
2012531903.tif 000060
（実施例３１）
実施形態の例
以後、特定の実施形態の非限定例が提供される。
Ａ１  アジピン酸を産生することができる工学的に作り出された微生物であって、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、脂肪アルコールオキシダーゼ活性、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−Ｌ−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性およびアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性から成る群から選択される１つ以上の改変された活性を含む、工学的に作り出された微生物。
Ａ１．１  前記６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、脂肪アルコールオキシダーゼ活性、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−Ｌ−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、および／またはアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子修飾を含む、実施形態Ａ１に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ１．２  前記アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を低下させる遺伝子修飾を含む、実施形態Ａ１に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ１．３  前記遺伝子修飾は、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、脂肪アルコールオキシダーゼ活性、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−Ｌ−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、またはアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの増加したコピーを含む、実施形態Ａ１．１に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ１．４  前記遺伝子修飾は、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、脂肪アルコールオキシダーゼ活性、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−Ｌ−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、またはアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連する異種のプロモーターおよび／または５’ＵＴＲを前記微生物のゲノムＤＮＡに挿入することを含む、実施形態Ａ１．１に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ２  改変されたチオエステラーゼ活性を含む、実施形態Ａ１〜Ａ１．４のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ２．１  チオエステラーゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子改変を含む、実施形態Ａ２に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ２．２  チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ２．１に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ３  ６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１〜Ａ２．２のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ３．１  オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１〜Ａ３のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ４  前記異種のポリヌクレオチドは、細菌に由来する、実施形態Ａ３およびＡ３．１に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ５  前記細菌は、アシネトバクター属細菌、ノカルジア属細菌、シュードモナス属細菌、またはザントバクター属細菌である、実施例Ａ４に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ６  ６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１またはＡ２に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ６．１  オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１またはＡ２に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ７  前記異種のポリヌクレオチドは、細菌に由来する、実施形態Ａ６またはＡ６．１に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ８  前記細菌は、アシネトバクター属細菌、ノカルジア属細菌、シュードモナス属細菌、またはザントバクター属細菌である、実施形態Ａ７に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ９  ヘキサノエートシンターゼサブユニットＡ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１またはＡ２に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ１０  ヘキサノエートシンターゼサブユニットＢ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１またはＡ２に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ１１  前記異種のポリヌクレオチドは、細菌から独立して選択される、実施形態Ａ９またはＡ１０に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ１２  前記細菌は、バチルス属細菌である、実施形態Ａ１１に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ１３  前記バチルス属細菌は、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍである、実施形態Ａ１２に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ１４  モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１またはＡ２に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ１５  前記異種のポリヌクレオチドは、真菌に由来する、実施形態Ａ１４に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ１６  前記真菌は、アスペルギルス属真菌である、実施形態Ａ１５に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ１７  前記アスペルギルス属真菌は、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓである、実施形態Ａ１６に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ１８  モノオキシゲナーゼ活性による一次のヘキサノエート使用をもたらす遺伝子修飾を含む、実施形態Ａ１またはＡ２に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ１９  前記遺伝子修飾は、ポリケチドシンターゼ活性を低下させる、実施形態Ａ１８に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ２０  真核生物である、実施形態Ａ１〜Ａ１９のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ２１  酵母である、実施形態Ａ２０に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ２２  前記酵母は、カンジダ属酵母である、実施形態Ａ２１に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ２３  前記カンジダ属酵母は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株である、実施形態Ａ２２に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ２４  真菌である、実施形態Ａ２０に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ２５  前記真菌は、ヤロウイア属真菌である、実施形態Ａ２４に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ２６  前記ヤロウイア属真菌は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである、実施形態Ａ２５に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ２７  前記真菌は、アスペルギルス属真菌である、実施形態Ａ２４に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ２８  前記アスペルギルス属真菌は、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ株またはＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ株である、実施形態Ａ２７に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ２９  ６−ヒドロキシヘキサン酸変換を低下させる遺伝子修飾を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２８のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ３０  前記遺伝子修飾は、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させる、実施形態Ａ２９に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ３１  ベータ酸化活性を低下させる遺伝子修飾を含む、実施形態Ａ１〜Ａ３０のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ３２  前記遺伝子修飾は、ベータ酸化活性を検出不可能にする、実施形態Ａ３１に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ３３  前記遺伝子修飾は、ベータ酸化活性を部分的に低下させる、実施形態Ａ３１に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ３４  前記遺伝子修飾は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊することを含む、実施形態Ａ３１〜Ａ３３のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ３５  前記遺伝子修飾は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連するプロモーターを破壊することを含む、実施形態Ａ３１〜Ａ３３のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ３６  前記アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を有するポリペプチドは、ＰＯＸポリペプチドである、実施形態Ａ３４またはＡ３５に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ３７  前記ＰＯＸポリペプチドは、ＰＯＸ４ポリペプチド、ＰＯＸ５ポリペプチド、またはＰＯＸ４ポリペプチドおよびＰＯＸ５ポリペプチドである、実施形態Ａ３６に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ３８  供給材料と接触した、実施形態Ａ１〜Ａ３７のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ３９  前記供給材料は、糖類を含む、実施形態Ａ３８に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ４０  前記糖類は、単糖、多糖、または単糖および多糖の混合物である、実施形態Ａ３９に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ４１  前記供給材料は、パラフィンを含む、実施形態Ａ３８に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ４２  前記パラフィンは、飽和パラフィン、不飽和パラフィン、置換パラフィン、分岐パラフィン、直鎖状パラフィン、またはその組合せである、実施形態Ａ４１に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ４３  前記パラフィンは、約１〜約６０個の炭素原子を含む、実施形態Ａ４１またはＡ４２に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ４４  前記パラフィンは、パラフィンの混合物中にある、実施形態Ａ４１〜Ａ４３に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ４５  前記パラフィンの混合物中の前記パラフィンは、約８〜約１８の平均炭素原子数を有する、実施形態Ａ４４に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ４６  前記平均炭素原子数は、約１０〜約１６である、実施形態Ａ４５に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ４６．１  前記平均炭素原子数は、約１２である、実施形態Ａ４６に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ４７  前記パラフィンは、ろう中にある、実施形態Ａ４１〜Ａ４６．１のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ４８  前記パラフィンは、オイル中にある、実施形態Ａ４１〜Ａ４６．１のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ４９  前記パラフィンは、石油生成物に由来する、実施形態Ａ４１〜Ａ４８のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ５０  前記石油生成物は、石油蒸留物である、実施形態Ａ４９に記載の工学的に作り出された微生物。
Ａ５１  前記パラフィンは、植物または植物生成物に由来する、実施形態Ａ４１〜Ａ４８のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ１  改変されたモノオキシゲナーゼ活性を含む、アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物。
Ｂ１．１  モノオキシゲナーゼ活性を改変する遺伝子修飾を含む、実施形態Ｂ１に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ１．２  から成る群から選択されるモノオキシゲナーゼ活性を改変する遺伝子修飾を含む、実施形態Ｂ１またはＢ１．１に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ２  モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１．１に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ３  前記異種のポリヌクレオチドは、真菌に由来する、実施形態Ｂ２に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ４  前記真菌は、アスペルギルス属真菌である、実施形態Ｂ３に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ５  前記アスペルギルス属真菌は、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓである、実施形態Ｂ４に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ６  前記モノオキシゲナーゼ活性による実質的なヘキサノエート使用をもたらす遺伝子修飾を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ５のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ７  前記遺伝子修飾は、ポリケチドシンターゼ活性を低下させる、実施形態Ｂ６に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ８  改変されたヘキサノエートシンターゼ活性を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ５のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ９  前記改変されたヘキサノエートシンターゼ活性は、改変されたヘキサノエートシンターゼサブユニットＡ活性、改変されたヘキサノエートシンターゼサブユニットＢ活性、または改変されたヘキサノエートシンターゼサブユニットＡ活性および改変されたヘキサノエートシンターゼサブユニットＢ活性である、実施形態Ｂ８に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ９．１  ヘキサノエートシンターゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子改変を含む、実施形態Ｂ９に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ１０  ヘキサノエートシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ８、Ｂ９またはＢ９．１のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ１１  前記異種のポリヌクレオチドは、真菌に由来する、実施形態Ｂ１０に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ１２  前記真菌は、アスペルギルス属真菌である、実施形態Ｂ１１に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ１３  前記アスペルギルス属真菌は、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓである、実施形態Ｂ１１に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ１４  改変されたチオエステラーゼ活性を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１３のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ１４．１  前記チオエステラーゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子修飾を含む、実施形態Ｂ１４に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ１４．２  チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１４またはＢ１４．１に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ１５  改変された６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１４．２のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ１５．１  前記６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる、遺伝子修飾を含む、実施形態Ｂ１５に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ１５．２  改変されたオメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１５．１のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ１５．３  前記オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる遺伝子修飾を含む、実施形態Ｂ１５．２に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ１６  ６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１５〜Ｂ１５．３のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ１６．１  オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１５〜Ｂ１６のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ１７  前記異種のポリヌクレオチドは、細菌に由来する、実施形態Ｂ１６またはＢ１６．１に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ１８  前記細菌は、アシネトバクター属細菌、ノカルジア属細菌、シュードモナス属細菌、またはザントバクター属細菌である、実施形態Ｂ１７に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ１９  改変された６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１８のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ１９．１  前記６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる遺伝子修飾を含む、実施形態Ｂ１９に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ１９．２  改変されたオメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１９．１のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ１９．３  前記オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる遺伝子修飾を含む、実施形態Ｂ１９．２に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ２０  ６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１９〜Ｂ１９．３のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ２０．１  オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１９〜Ｂ２０のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ２１  前記異種のポリヌクレオチドは、細菌に由来する、実施形態Ｂ２０またはＢ２０．１に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ２２  前記細菌は、アシネトバクター属細菌、ノカルジア属細菌、シュードモナス属細菌、またはザントバクター属細菌である、実施形態Ｂ２１に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ２３  真核生物である、実施形態Ｂ１〜Ｂ２２のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ２４  酵母である、実施形態Ｂ２３に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ２５  前記酵母は、カンジダ属酵母である、実施形態Ｂ２４に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ２６  前記カンジダ属酵母は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓである、実施形態Ｂ２５に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ２７  真菌である、実施形態Ｂ２３に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ２８  前記真菌は、ヤロウイア属真菌である、実施形態Ｂ２７に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ２９  前記ヤロウイア属真菌は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである、実施形態Ｂ２８に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ３０  前記真菌は、アスペルギルス属である、実施形態Ｂ２７に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ３１  前記アスペルギルス属真菌は、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓまたはＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓである、実施形態Ｂ３０に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ３２  ６−ヒドロキシヘキサン酸変換を低下させる遺伝子修飾を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３１のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ３３  前記遺伝子修飾は、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させる、実施形態Ｂ３２に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ３４  ベータ酸化活性を低下させる遺伝子修飾を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３３のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物。
Ｂ３５  前記遺伝子修飾は、ベータ酸化活性を検出不可能にする、実施形態Ｂ３４に記載の工学的に作り出された微生物。
Ｃ１  実施形態Ａ１〜Ｂ３５のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物を、培養された微生物がアジピン酸を産生する培養条件下で培養するステップを含む、アジピン酸を製造するための方法。
Ｃ１．１  前記工学的に作り出された微生物が産生される宿主微生物は、検出可能な量のアジピン酸を産生しない、実施形態Ｃ１に記載の方法。
Ｃ２  前記培養条件は、発酵条件を含む、実施形態Ｃ１．１のＣ１に記載の方法。
Ｃ３  前記培養条件は、バイオマスの導入を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ２のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ４  前記培養条件は、グルコースの導入を含む、Ｃ１またはＣ２に記載の方法。
Ｃ５  前記培養条件は、ヘキサンの導入を含む、Ｃ１またはＣ２に記載の方法。
Ｃ６  前記アジピン酸は、追加されるグルコース１グラム当たり約０．３グラムを超える収量で産生される、実施形態Ｃ１〜Ｃ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ７  前記培養された微生物から前記アジピン酸を精製するステップを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ６のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ８  前記アジピン酸を修飾し、それによって、修飾されたアジピン酸を産生するステップを含む、実施形態Ｃ７に記載の方法。
Ｃ９  前記培養された微生物、前記アジピン酸、または前記修飾されたアジピン酸を容器に配置するステップを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ８のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１０  前記容器を輸送するステップを含む、実施形態Ｃ９に記載の方法。
Ｄ１  実施形態Ａ２９、Ａ３０、Ｂ３２、またはＢ３３のいずれか１つに記載の工学的に作り出された微生物を、培養された微生物が６−ヒドロキシヘキサン酸を産生する培養条件下で培養するステップを含む、６−ヒドロキシヘキサン酸を製造するための方法。
Ｄ１．１  前記工学的に作り出された微生物が産生される宿主微生物は、検出可能な量の６−ヒドロキシヘキサン酸を産生しない、実施形態Ｄ１に記載の方法。
Ｄ２  前記培養条件は、発酵条件を含む、実施形態Ｄ１またはＤ１．１に記載の方法。
Ｄ３  前記培養条件は、バイオマスの導入を含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ２のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ４  前記培養条件は、グルコースの導入を含む、Ｄ１またはＤ２に記載の方法。
Ｄ５  前記培養条件は、ヘキサンの導入を含む、Ｄ１またはＤ２に記載の方法。
Ｄ６  前記６−ヒドロキシヘキサン酸は、追加されるグルコース１グラム当たり約０．３グラムを超える収量で産生される、実施形態Ｄ１〜Ｄ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ７  前記培養された微生物から前記６−ヒドロキシヘキサン酸を精製するステップを含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ６のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ８  前記６−ヒドロキシヘキサン酸を修飾し、それによって、修飾された６−ヒドロキシヘキサン酸を産生するステップを含む、実施形態Ｄ７に記載の方法。
Ｄ９  前記培養された微生物、前記６−ヒドロキシヘキサン酸、または前記修飾された６−ヒドロキシヘキサン酸を容器に配置するステップを含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ８のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ１０  前記容器を輸送するステップを含む、実施形態Ｄ９に記載の方法。
Ｅ１  アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物を調製するための方法であって、
（ａ）モノオキシゲナーゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子修飾を宿主生物に導入し、それによって、検出可能なおよび／または増加したモノオキシゲナーゼ活性を有する、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、
（ｂ）アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物を選択するステップと
を含む方法。
Ｅ１．１  前記モノオキシゲナーゼ活性は、６炭素分子へのヒドロキシル部分の組込みである、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ１．２  前記６炭素分子は、ヘキサノエートである、実施形態Ｅ１またはＥ１．１に記載の方法。
Ｅ２  アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物を調製するための方法であって、
（ａ）宿主生物を栄養源であるヘキサンと共に培養し、それによって、検出可能なモノオキシゲナーゼ活性を有する工学的に作り出された微生物を産生するステップと、
（ｂ）アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物を選択するステップと
を含む方法。
Ｅ２．１  前記モノオキシゲナーゼ活性は、６炭素分子へのヒドロキシル部分の組込みである、実施形態Ｅ２に記載の方法。
Ｅ２．２  前記６炭素分子は、ヘキサノエートである、実施形態Ｅ２またはＥ２．１に記載の方法。
Ｅ３  検出可能な量の前記モノオキシゲナーゼ活性を有する前記工学的に作り出された微生物を選択するステップを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ２．２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４  ヘキサノエートシンターゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、検出可能なおよび／または増加したヘキサノエートシンターゼ活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５  前記遺伝子修飾は、ヘキサノエートシンターゼサブユニットＡ活性、ヘキサノエートシンターゼサブユニットＢ活性、またはヘキサノエートシンターゼサブユニットＡ活性およびヘキサノエートシンターゼサブユニットＢ活性を有するポリペプチドをコードする、実施形態Ｅ４に記載の方法。
Ｅ６  ６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、宿主微生物に比べて検出可能なおよび／または増加した６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７  ６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、前記宿主微生物に比べて検出可能なおよび／または増加した６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７．１  ６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、前記宿主微生物に比べて検出可能なおよび／または増加したオメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ８  チオエステラーゼ活性を追加するもしくは増加させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、前記宿主微生物に比べて検出可能なおよび／または増加したチオエステラーゼ活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ７．１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ９  ６−ヒドロキシヘキサン酸変換を低下させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、前記宿主微生物に比べて低下した６−ヒドロキシヘキサン酸変換を有する、工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１０  ベータ酸化活性を低下させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、前記宿主微生物に比べて低下したベータ酸化活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１１  前記モノオキシゲナーゼ活性による実質的なヘキサノエート使用をもたらす遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、前記宿主微生物と比較して、実質的なヘキサノエート使用が前記モノオキシゲナーゼ活性によるものである工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｆ１  アジピン酸を産生する微生物を調製するための方法であって、（ａ）６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性、およびモノオキシゲナーゼ活性から成る群から選択される１つ以上の活性を追加するまたは増加させる１つ以上の遺伝子修飾を宿主生物に導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、（ｂ）アジピン酸を産生する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む方法。
Ｆ２  宿主微生物に比べて、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性、およびモノオキシゲナーゼ活性から成る群から選択される１つ以上の検出可能なおよび／または増加した活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップを含む、実施形態Ｆ１に記載の方法。
Ｆ３  ６−ヒドロキシヘキサン酸変換を低下させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、前記宿主微生物に比べて低下した６−ヒドロキシヘキサン酸変換を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、実施形態Ｆ１またはＦ２に記載の方法。
Ｆ４  ベータ酸化活性を低下させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、前記宿主微生物に比べて低下したベータ酸化活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、実施形態Ｆ１〜Ｆ３のいずれか１つに記載の方法。
Ｆ５  前記モノオキシゲナーゼ活性による実質的なヘキサノエート使用をもたらす遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、前記宿主微生物と比較して、実質的なヘキサノエート使用が前記モノオキシゲナーゼ活性によるものである工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、実施形態Ｆ１〜Ｆ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｇ１  ６−ヒドロキシヘキサン酸を産生する微生物を調製するための方法であって、（ａ）６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性、およびモノオキシゲナーゼ活性から成る群から選択される１つ以上の活性を追加するまたは増加させる１つ以上の遺伝子修飾を宿主生物に導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、（ｂ）６−ヒドロキシヘキサン酸変換を低下させる遺伝子修飾を宿主生物に導入するステップと、（ｃ）６−ヒドロキシヘキサン酸を産生する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む方法。
Ｇ２  前記宿主微生物に比べて低下した６−ヒドロキシヘキサン酸変換を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップを含む、実施形態Ｇ１に記載の方法。
Ｇ３  前記宿主微生物に比べて、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、ヘキサノエートシンターゼ活性、およびモノオキシゲナーゼ活性から成る群から選択される１つ以上の検出可能なおよび／または増加した活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップを含む、実施形態Ｇ１またはＧ２に記載の方法。
Ｇ４  ベータ酸化活性を低下させる遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、前記宿主微生物に比べて低下したベータ酸化活性を有する工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、実施形態Ｇ１〜Ｇ３のいずれか１つに記載の方法。
Ｇ５  前記モノオキシゲナーゼ活性による実質的なヘキサノエート使用をもたらす遺伝子修飾を導入し、それによって、工学的に作り出された微生物を産生するステップと、前記宿主微生物と比較して、実質的なヘキサノエート使用が前記モノオキシゲナーゼ活性によるものである工学的に作り出された微生物を選択するステップとを含む、実施形態Ｇ１〜Ｇ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｈ１  
ａ．ベータ酸化活性をブロックする遺伝子改変、および
ｂ．モノオキシゲナーゼ活性を追加するもしくは増加させる遺伝子改変、またはヘキサノエートシンテターゼ活性を追加するもしくは増加させる遺伝子改変
を含む工学的に作り出された微生物を、１つ以上の多糖を含む供給材料と接触させるステップと、
アジピン酸が産生される条件下で、前記工学的に作り出された微生物を培養するステップと
を含む方法。
Ｈ１．１  前記工学的に作り出された微生物は、ヘキサノエートシンテターゼ活性を追加するまたは増加させる遺伝子改変を含む、実施形態Ｈ１に記載の方法。
Ｈ１．２  前記工学的に作り出された微生物は、ヘキサノエートシンターゼサブユニットＡ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ１．１に記載の方法。
Ｈ１．３  前記工学的に作り出された微生物は、ヘキサノエートシンターゼサブユニットＢ活性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ１．１に記載の方法。
Ｈ１．４  前記異種のポリヌクレオチドは、細菌から独立して選択される、実施形態Ｈ１．２またはＨ１．３に記載の方法。
Ｈ１．５  前記細菌は、バチルス属細菌である、実施形態Ｈ１．４に記載の方法。
Ｈ１．６  前記バチルス属細菌は、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍである、実施形態Ｈ１．５に記載の方法。
Ｈ２  前記微生物は、カンジダ属酵母である、実施形態Ｈ１またはＨ１．６のいずれか１つに記載の方法。
Ｈ３  前記微生物は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株である、実施形態Ｈ２に記載の方法。
Ｈ４  前記モノオキシゲナーゼ活性を増加させる遺伝子改変は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を増加させる遺伝子改変を含む、実施形態Ｈ１〜Ｈ３のいずれか１つに記載の方法。
Ｈ５  前記遺伝子改変は、前記シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させる、実施形態Ｈ４に記載の方法。
Ｈ６  前記遺伝子改変は、前記シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連するプロモーターを配置する、実施形態Ｈ４に記載の方法。
Ｈ７  前記モノオキシゲナーゼ活性は、ＣＹＰ５２Ａ１５活性、ＣＹＰ５２Ａ１６活性、またはＣＹＰ５２Ａ１５活性およびＣＹＰ５２Ａ１６活性である、実施形態Ｈ１〜Ｈ６のいずれか１つに記載の方法。
Ｈ８  前記遺伝子改変は、前記モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させる、実施形態Ｈ１〜Ｈ７のいずれか１つに記載の方法。
Ｈ９  前記遺伝子改変は、前記モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連するプロモーターを配置する、実施形態Ｈ１〜Ｈ７のいずれか１つに記載の方法。
Ｈ１０  前記ベータ酸化活性をブロックする遺伝子改変は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を破壊する、実施形態Ｈ１〜Ｈ７のいずれか１つに記載の方法。
Ｈ１１  前記遺伝子改変は、ＰＯＸ４活性およびＰＯＸ５活性を破壊する、実施形態Ｈ１０に記載の方法。
Ｈ１２  前記遺伝子改変は、前記アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、実施形態Ｈ１０またはＨ１１に記載の方法。
Ｈ１３  前記遺伝子改変は、前記アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連するプロモーターを破壊する、実施形態Ｈ１０またはＨ１１に記載の方法。
Ｈ１４  前記供給材料は、６炭素糖を含む、実施形態Ｈ１〜Ｈ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ｈ１５  前記供給材料は、５炭素糖を含む、実施形態Ｈ１〜Ｈ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ｈ１６  前記アジピン酸は、約８０％以上の理論的収率のレベルで産生される、実施形態Ｈ１〜Ｈ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ｈ１７  産生されたアジピン酸の量を検出するステップを含む、実施形態Ｈ１〜Ｈ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ｈ１８  前記産生されたアジピン酸を単離するステップを含む、実施形態Ｈ１〜Ｈ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ｈ１９  前記培養条件は、前記工学的に作り出された微生物を発酵させることを含む、実施形態Ｈ１〜Ｈ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ｉ１  ベータ酸化活性を部分的にブロックする遺伝子改変を含む工学的に作り出された微生物を、１つ以上のパラフィンを含む供給材料と接触させるステップと、
前記工学的に作り出された微生物をアジピン酸が産生される条件下で培養するステップと
を含む方法。
Ｉ１．１  前記微生物は、モノオキシゲナーゼ活性を増加させる遺伝子改変を含む、実施形態Ｉ１に記載の方法。
Ｉ２  前記微生物は、カンジダ属酵母である、実施形態Ｉ１またはＩ１．１に記載の方法。
Ｉ３  前記微生物は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株である、実施形態Ｉ２に記載の方法。
Ｉ４  前記モノオキシゲナーゼ活性を増加させる遺伝子改変は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を増加させる遺伝子改変を含む、実施形態Ｉ１〜Ｉ３のいずれか１つに記載の方法。
Ｉ５  前記遺伝子改変は、前記シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させる、実施形態Ｉ４に記載の方法。
Ｉ６  前記遺伝子改変は、前記シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連するプロモーターを配置する、実施形態Ｉ４に記載の方法。
Ｉ７  前記モノオキシゲナーゼ活性は、ＣＹＰ５２Ａ１５活性、ＣＹＰ５２Ａ１６活性、またはＣＹＰ５２Ａ１５活性およびＣＹＰ５２Ａ１６活性である、実施形態Ｉ１〜Ｉ６のいずれか１つに記載の方法。
Ｉ８  前記遺伝子改変は、前記モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させる、実施形態Ｉ１〜Ｉ７のいずれか１つに記載の方法。
Ｉ９  前記遺伝子改変は、前記モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連するプロモーターを配置する、実施形態Ｉ１〜Ｉ７のいずれか１つに記載の方法。
Ｉ１０  前記ベータ酸化活性をブロックする遺伝子改変は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を破壊する、実施形態Ｉ１〜Ｉ７のいずれか１つに記載の方法。
Ｉ１１  前記遺伝子改変は、ＰＯＸ４活性またはＰＯＸ５活性を破壊する、実施形態Ｉ１０に記載の方法。
Ｉ１２  前記遺伝子改変は、前記アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、実施形態Ｉ１０またはＩ１１に記載の方法。
Ｉ１３  前記遺伝子改変は、前記アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連するプロモーターを破壊する、実施形態Ｉ１０またはＩ１１に記載の方法。
Ｉ１４  前記アジピン酸は、約８０％以上の理論的収率のレベルで産生される、実施形態Ｉ１〜Ｉ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ｉ１５  産生されたアジピン酸の量を検出するステップを含む、実施形態Ｉ１〜Ｉ１４のいずれか１つに記載の方法。
Ｉ１６  前記産生されたアジピン酸を単離するステップを含む、実施形態Ｉ１〜Ｉ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ｉ１７  前記培養条件は、前記工学的に作り出された微生物を発酵させることを含む、実施形態Ｉ１〜Ｉ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ｉ１８  前記パラフィンは、飽和パラフィン、不飽和パラフィン、置換パラフィン、分岐パラフィン、直鎖状パラフィン、またはその組合せである、実施形態Ｉ１〜Ｉ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ｉ１９  前記パラフィンは、約１〜約６０個の炭素原子を含む、実施形態Ｉ１〜Ｉ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ｉ２０  前記パラフィンは、パラフィンの混合物中にある、実施形態Ｉ１〜Ｉ１１９のいずれか１つに記載の方法。
Ｉ２１  前記パラフィンの混合物中の前記パラフィンは、約８〜約１８の平均炭素原子数を有する、実施形態Ｉ２０に記載の方法。
Ｉ２２  前記平均炭素原子数は、約１０〜約１６である、実施形態Ｉ２１に記載の方法。
Ｉ２３  前記平均炭素原子数は、約１２である、実施形態Ｉ２２に記載の方法。
Ｉ２４  前記パラフィンは、ろう中にある、実施形態Ｉ１〜Ｉ２３のいずれか１つに記載の方法。
Ｉ２５  前記パラフィンは、オイル中にある、実施形態Ｉ１〜Ｉ２３のいずれか１つに記載の方法。
Ｉ２６  前記パラフィンは、石油生成物に由来する、実施形態Ｉ１〜Ｉ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ｉ２７  前記石油生成物は、石油蒸留物である、実施形態Ｉ２６に記載の方法。
Ｉ２８  前記パラフィンは、植物または植物生成物に由来する、実施形態Ｉ１〜Ｉ２７のいずれか１つに記載の方法。
Ｊ１  配列番号１のヌクレオチド配列と９６％以上同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
配列番号８のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および
配列番号１のヌクレオチド配列と９６％以上同一のヌクレオチド配列の一部を有し、脂肪アルコールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
から成る群から選択される単離ポリヌクレオチド。
Ｊ２  配列番号２のヌクレオチド配列と９８％以上同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
配列番号１０のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および
配列番号２のヌクレオチド配列と９８％以上同一のヌクレオチド配列の一部を有し、脂肪アルコールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
から成る群から選択される単離ポリヌクレオチド。
Ｊ３  配列番号３のヌクレオチド配列と９５％以上同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
配列番号９のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および
配列番号３のヌクレオチド配列と９５％以上同一のヌクレオチド配列の一部を有し、脂肪アルコールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
から成る群から選択される単離ポリヌクレオチド。
Ｊ３．１  配列番号４のヌクレオチド配列と８３％以上同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
配列番号１１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および
配列番号４のヌクレオチド配列と８３％以上同一のヌクレオチド配列の一部を有し、脂肪アルコールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
から成る群から選択される単離ポリヌクレオチド。
Ｊ３．２  配列番号５のヌクレオチド配列と８２％以上同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
配列番号１２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および
配列番号５のヌクレオチド配列と８２％以上同一のヌクレオチド配列の一部を有し、脂肪アルコールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
から成る群から選択される単離ポリヌクレオチド。
Ｊ４  実施例Ｊ１〜Ｊ３．２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
Ｊ５  実施例Ｊ１〜Ｊ３．２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む組込み型ベクター。
Ｊ６  実施例Ｊ４に記載の発現ベクターまたは実施例Ｊ５に記載の組込み型ベクターを含む微生物。
Ｊ７  実施例Ｊ６に記載の微生物を含む培養物。
Ｊ８  実施例Ｊ７に記載の微生物を含む発酵デバイス。
Ｊ１０  実施例Ｊ１〜Ｊ３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドによってコードされるまたは実施例Ｊ４に記載の発現ベクターもしくは実施例Ｊ６に記載の微生物によって産生されるポリペプチド。
Ｊ１１  実施例Ｊ１０に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【０３４３】
本明細書で参照される各特許、特許出願、刊行物および文書の全部は、参照により本明細書に組み込まれる。上記の特許、特許出願、刊行物および文書の引用は、上記のいずれも関係する先行技術であることを容認するものではなく、またはそれはこれらの刊行物または文書の内容または日付に関していかなる容認を構成するものでもない。
【０３４４】
本技術の基本態様から逸脱しない範囲で、上記のものに改変を加えることができる。１つ以上の具体的な実施形態に関して本技術がかなり詳細に記載されているが、当分野の技術者は、本出願で具体的に開示される実施形態に変更を加えることができることを認識しようが、これらの改変および改善は本技術の範囲および精神の範囲内である。
【０３４５】
実例として本明細書に記載される技術は、好適には本明細書に具体的に開示されていない任意の要素（複数可）の不在下で実践することができる。したがって、例えば、本明細書の各例で、用語「含む」、「から事実上成る」および「から成る」のいずれも、他の２つの用語のいずれかで置換することができる。使用された用語および表現は、限定ではなく記載の用語として用いられ、そのような用語および表現の使用は、示され、記載される特徴またはその部分のいかなる同等物も除外せず、請求技術の範囲内で様々な改変が可能である。用語「ａ」または「ａｎ」は、要素の１つまたは要素の複数のいずれかが記載されていることが文脈上明らかでない限り、それが修飾する要素の１つ以上を指すことができる（例えば、「試薬」は１つ以上の試薬を意味することができる）。本明細書で用いる用語「約」は、根底にあるパラメータの１０％以内の値（すなわち、プラスマイナス１０％）を指し、値の列の初めでの用語「約」の使用は、値の各々を修飾する（すなわち、「約１、２および３」は約１、約２および約３を指す）。例えば、「約１００グラム」の重量は、９０グラムから１１０グラムの間の重量を含むことができる。さらに、本明細書で値のリストが記載されている場合（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または８６％）、リストはそのすべての中間値および端数値を含む（例えば、５４％、８５．４％）。したがって、本技術は代表的な実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示される概念の改変および変形形態を当業者が援用することができ、そのような改変および変形形態は本技術の範囲内であるとみなされることを理解すべきである。
【０３４６】
本技術の特定の実施形態は、以下の請求項（複数可）で示される。
【図１】
2012531903.tif 000061
【図２】
2012531903.tif 000062
【図３】
2012531903.tif 000063
【図４】
2012531903.tif 000064
【図５】
2012531903.tif 000065
【図６】
2012531903.tif 000066
【図７】
2012531903.tif 000067
【図８】
2012531903.tif 000068
【図９】
2012531903.tif 000069
【図１０】
2012531903.tif 000070
【図１１Ａ】
2012531903.tif 000071
【図１１Ｂ】
2012531903.tif 000072
【図１２】
2012531903.tif 000073
【図１３】
2012531903.tif 000074
【図１４】
2012531903.tif 000075
【図１５Ａ】
2012531903.tif 000076
【図１５Ｂ】
2012531903.tif 000077
【図１５Ｃ】
2012531903.tif 000078
【図１６】
2012531903.tif 000079
【図１７】
2012531903.tif 000080
【図１８】
2012531903.tif 000081
【図１９】
2012531903.tif 000082
【図２０】
2012531903.tif 000083
【図２１】
2012531903.tif 000084
【図２２】
2012531903.tif 000085
【図２３】
2012531903.tif 000086
【図２４】
2012531903.tif 000087
【図２５】
2012531903.tif 000088
【図２６】
2012531903.tif 000089
【図２７】
2012531903.tif 000090
【図２８】
2012531903.tif 000091
【図２９】
2012531903.tif 000092
【図３０】
2012531903.tif 000093
【図３１】
2012531903.tif 000094
【図３２】
2012531903.tif 000095
【図３３】
2012531903.tif 000096
【図３４】
2012531903.tif 000097
【手続補正書】
【提出日】平成24年2月22日(2012.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2012531903000001.app
【国際調査報告】
2012531903.tif 000098
2012531903.tif 000099
2012531903.tif 000100
2012531903.tif 000101