(57)【要約】本発明は、抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体及びα−インターフェロンの組合せの投与を含む、Ｃ型肝炎ウイルスの治療又は予防のための方法及び組成物に関連する。【選択図】図３１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症を治療又は予防する方法であって、ａ）有効量の肝炎Ｅ２タンパク質に結合する抗ＨＣＶ抗体を含む抗体；及びｂ）有効量のα−インターフェロンを個体に投与することを含む方法。
【請求項２】
抗ＨＣＶ抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
モノクローナル抗体が、（ａ）（ｉ）配列ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ（配列番号：４１）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列ＬＡＳＮＬＮＳ（配列番号：４２）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び配列ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ（配列番号：４３）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列ＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮ（配列番号：４４）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列ＹＩＳＹＳＧＳＴＹ（配列番号：４５）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び配列ＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹ（配列番号：４６）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
モノクローナル抗体が、（ａ）（ｉ）配列ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ（配列番号：４１）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列ＬＡＳＮＬＮＳ（配列番号：４２）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び配列ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ（配列番号：４３）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列ＳＧＹＷＮ（配列番号：４７）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列ＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＬＳＬＲＳ（配列番号：４８）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び配列ＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹ（配列番号：４６）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
モノクローナル抗体がヒト化抗体である、請求項２ないし４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
ヒト化抗体が、（ａ）（ｉ）配列ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ（配列番号：４１）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列ＬＡＳＮＬＮＳ（配列番号：４２）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び配列ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ（配列番号：４３）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列ＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮ（配列番号：４４）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列ＹＩＳＹＳＧＳＴＹ（配列番号：４５）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び配列ＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹ（配列番号：４６）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ヒト化抗体が、（ａ）（ｉ）配列ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ（配列番号：４１）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列ＬＡＳＮＬＮＳ（配列番号：４２）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び配列ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ（配列番号：４３）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列ＳＧＹＷＮ（配列番号：４７）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列ＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＬＳＬＲＳ（配列番号：４８）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び配列ＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹ（配列番号：４６）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ヒト化抗体が、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７及び配列番号：１８からなる群から選択される重鎖可変ドメイン、及び配列番号：６、配列番号：７、配列番号：１９及び配列番号：２０からなる群から選択される軽鎖可変ドメインを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ヒト化抗体が抗原結合断片である、請求項５ないし８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
抗原結合断片がＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ及びダイアボディからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
α−インターフェロンが、ＩＦＮ−α１、ＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−α４、ＩＦＮ−α５、ＩＦＮ−α６、ＩＦＮ−α７、ＩＦＮ−α８、ＩＦＮ−α１０、ＩＦＮ−α１３、ＩＦＮ−α１４、ＩＦＮ−α１６、ＩＦＮ−α１７及びＩＦＮ−α２１からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
α−インターフェロンがＩＦＮ−α２である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＩＦＮ−α２が、ＩＦＮ−α２ａ、ＩＦＮ−α２ｂ又はＩＦＮ−α２ｃからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＩＦＮ−α２がペグ化されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗ＨＣＶ抗体が、α−インターフェロンと同時に、並行して、交代で、間欠的に又は連続的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
Ｃ型肝炎ウイルス感染症が急性Ｃ型肝炎ウイルス感染症である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
Ｃ型肝炎ウイルス感染症が慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染症である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
Ｃ型肝炎ウイルス感染症の治療がウイルス負荷の減少を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
Ｃ型肝炎ウイルス感染症の治療がウイルス力価の減少を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願についてのクロスリファレンス
本出願は２００８年１２月１７日に出願された仮出願第６１／１３８，４７８号の優先権の利益を請求し、それらの内容の全てが本明細書に援用されたものとする。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体及びα−インターフェロンの組合せの投与を含む、Ｃ型肝炎ウイルスの治療又は予防のための方法及び組成物に関連する。
発明の背景
【０００３】
ＨＣＶは、フラビウイルス科に属するプラス鎖ＲＮＡウィルスである。それは、非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎の主要な原因である。ＨＣＶはおよそ２億人に感染し、現在では毎年３００万人もの人に新たに感染することが推定される。感染者の約８０％は、ウイルスを除去できていない；慢性的な感染症が起こり、頻繁に重篤な慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌となる。慢性的な感染症のための現在の治療は効果がなく、予防的及び治療的ワクチンの開発の差し迫った必要性が存在する。
【０００４】
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのエラーを起こしやすい性質及びインビボでの高い複製率のために、ＨＣＶは高度な遺伝的多様性を示す。ＨＣＶは６つの遺伝子的に異なる遺伝子型に分類することができ、さらに少なくとも７０の亜型に細分することができ、それぞれヌクレオチドレベルで約３０％及び１５％異なっている。ワクチン開発のための重要な課題は、大多数のウィルス遺伝子型及び亜型において保存される保護エピトープを同定することである。エンベロープタンパク質（中和反応のための天然の標的）が最も可変的なタンパク質のうちの２つであるという事実がこの問題を大きくしている。
【０００５】
エンベロープタンパク質であるＥ１及びＥ２は、細胞への結合及び侵入に関与する。それらは、Ｎ末端外部ドメイン及びＣ末端疎水性膜アンカーを伴うＮ結合型グリコシル化膜貫通タンパク質である。インビトロでの発現実験は、Ｅ１及びＥ２タンパク質が非共有ヘテロダイマーを形成することを示し、ウイルス表面上の機能的複合体であることが提唱された。効率的な培養システムの欠如のために、ウイルス侵入の正確なメカニズムは不明である。とは言うものの、これらのレセプター単独でウイルス侵入を可能にするのには十分でないにもかかわらず、単離された一次肝細胞及び細胞株への侵入は、細胞表面レセプターＣＤ８１及び１型スカベンジャー受容体クラスＢ（ＳＲ−Ｂ１）との相互作用を必要とするという証拠が増加している。
【０００６】
現在の証拠は、細胞媒介性免疫が急性感染症のウィルス複製の除去及び制御において重要であることを示唆する。しかしながら、例えば動物の感染症アッセイ及び細胞アッセイ及びレセプター結合アッセイなどの感染の代用モデルは、急性及び慢性の感染症における抗体の潜在的役割を強調した。驚きもしないが、中和抗体は、直鎖状及び立体配置的エピトープを認識する。広い中和能を示す抗体の大多数は、Ｅ２中の立体配置的エピトープに対するものである。保存された立体配置的エピトープを認識する抗体の誘導はワクチンの設計に極めて関連しているが、可変領域が免疫主体であるようなので、これは困難そうである。そのような免疫主体直鎖状エピトープが、Ｅ２の第一の超可変領域（ＨＶＲ１）中に位置する。保存されたＨＶＲ１ミモトープの使用は制限された特異性の問題を解決するために提唱されたが、この手法が成功するかどうかはまだわかっていない。
【０００７】
ＨＶＲ１のすぐ下流の領域は、多くのエピトープを含む。残基４１２−４２３を含み、モノクローナル抗体ＡＰ３３によって定義されるエピトープは、ＣＤ８１と様々なＥ２の提示（可溶性Ｅ２、Ｅ１Ｅ２及びウイルス様粒子を含む）との間の相互作用を阻害する。Owsianka A. et al., J Gen Virol 82:1877-83 (2001)を参照。
【０００８】
ＷＯ２００６／１００４４９は、ＡＰ３３と称されるモノクローナル抗体がＨＣＶの各々の６つの既知の遺伝子型１−６と結合し、中和することができることを教示する。したがって、ＡＰ３３が標的とするエピトープはＨＣＶの遺伝子型１−６の全てと交差反応性であると推論され、抗ＨＣＶリガンドの標的及び抗ＨＣＶ抗体を産生するための免疫原であることが示される。
【０００９】
Ｃ型肝炎ウイルスのより有効な治療が必要である。
【００１０】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、特許出願及び公開された特許出願の開示は、その全でが本明細書に援用されたものとする。
【００１１】
簡単な発明の要約
本発明は、抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体及びα−インターフェロンの組合せの投与を含む、Ｃ型肝炎ウイルスの治療又は予防のための方法及び組成物に関連する。
【００１２】
個体に：ａ）肝炎Ｅ２タンパク質に結合する抗ＨＣＶ抗体を含む組成物の有効量；及びｂ）α−インターフェロンの有効量を投与することを含む、対象のＨＣＶ感染症を治療又は予防する方法が本明細書で提供される。
【００１３】
いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体はモノクローナル抗体である。
【００１４】
いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、（ａ）（ｉ）配列ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ（配列番号：４１）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列ＬＡＳＮＬＮＳ（配列番号：４２）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び配列ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ（配列番号：４３）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン及び（ｂ）（ｉ）配列ＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮ（配列番号：４４）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列ＹＩＳＹＳＧＳＴＹ（配列番号：４５）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹ（配列番号：４６）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインを含む。
【００１５】
いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、（ａ）（ｉ）配列ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ（配列番号：４１）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列ＬＡＳＮＬＮＳ（配列番号：４２）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び配列ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ（配列番号：４３）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン及び（ｂ）配列ＳＧＹＷＮ（配列番号：４７）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列ＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＬＳＬＲＳ（配列番号：４８）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹ（配列番号：４６）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインを含む。
【００１６】
いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体はヒト化抗体である。
【００１７】
いくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、（ａ）（ｉ）配列ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ（配列番号：４１）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列ＬＡＳＮＬＮＳ（配列番号：４２）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び配列ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ（配列番号：４３）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン及び（ｂ）（ｉ）配列ＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮ（配列番号：４４）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列ＹＩＳＹＳＧＳＴＹ（配列番号：４５）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹ（配列番号：４６）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインを含む。
【００１８】
いくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、（ａ）（ｉ）配列ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ（配列番号：４１）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列ＬＡＳＮＬＮＳ（配列番号：４２）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び配列ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ（配列番号：４３）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン及び（ｂ）配列ＳＧＹＷＮ（配列番号：４７）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列ＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＬＳＬＲＳ（配列番号：４８）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹ（配列番号：４６）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメインを含む。
【００１９】
いくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、配列番号：１０（配列番号）：１１（配列番号）：１２（配列番号）：１３（配列番号）：１４（配列番号）：１５（配列番号）：１６（配列番号）：１７及び配列番号：１８からなる群から選択される重鎖可変ドメイン及び配列番号：６（配列番号）：７（配列番号）：１９及び配列番号：２０からなる群から選択される軽鎖可変ドメインを含む。
【００２０】
本発明の任意の方法のいくつかの実施態様において、抗体は抗原結合断片である。いくつかの実施態様において、抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ及びダイアボディからなる群から選択される。
【００２１】
本発明の任意の方法のいくつかの実施態様において、α−インターフェロンは、ＩＦＮ−α１、ＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−α４、ＩＦＮ−α５、ＩＦＮ−α６、ＩＦＮ−α７、ＩＦＮ−α８、ＩＦＮ−α１０、ＩＦＮ−α１３、ＩＦＮ−α１４、ＩＦＮ−α１６、ＩＦＮ−α１７及びＩＦＮ−α２１からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、α−インターフェロンはＩＦＮ−α２である。いくつかの実施態様において、ＩＦＮ−α２は、ＩＦＮ−α２ａ、ＩＦＮ−α２ｂ又はＩＦＮ−α２ｃからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、ＩＦＮ−α２はペグ化されている。
【００２２】
本発明の任意の方法のいくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体は、α−インターフェロンと同時に、一斉に、ローテーションで、間欠的に又は連続的に投与される。
【００２３】
本発明の任意の方法のいくつかの実施態様において、Ｃ型肝炎ウイルスの感染は、急性のＣ型肝炎ウイルス感染である。
【００２４】
本発明の任意の方法のいくつかの実施態様において、Ｃ型肝炎ウイルス感染は、慢性のＣ型肝炎ウイルス感染である。
【００２５】
本発明の任意の方法のいくつかの実施態様において、方法は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療を含む。いくつかの実施態様において、Ｃ型肝炎ウイルス感染症の治療は、ウィルス負荷の減少を含む。いくつかの実施態様において、Ｃ型肝炎ウイルス感染症の治療は、ウィルス価の減少を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１Ａ−１Ｂは、ＡＰ３３ＲＨＡタンパク質及びＤＮＡ配列の生成を示す。図１ＡはＡＰ３３ＲＨＡタンパク質配列グラフト（配列番号：１及び４６−５４）を示し、図１ＢはＡＰ３３ＲＨＡＤＮＡ配列グラフト（配列番号：４６−４８、５０−５３及び５５−６３）を示す。太字の文字列で強調している濃い灰色は、ＣＤＲを示す。
【００２７】
【図２】図２Ａ−２Ｂは、ＡＰ３３ＲＨＡリーダーセレクション及びＶＨ４−５９リーダー及びＳ６７８２６  ＦＷ１［１４］（配列番号：５５）でのＳｉｇｎａｌＰの結果を示す。
【００２８】
【図３】図３は、ＡＰ３３ＲＨＡのＤＮＡ（配列番号：６４）及びタンパク質配列（配列番号：６５）を示す。明るい灰色のボックスは、潜在的スプライスサイトを取り除くヌクレオチド変化を示す。
【００２９】
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、ＡＰ３３ＲＫＡ配列の生成を示す。図４Ａは、ＡＰ３３ＲＫＡタンパク質配列グラフト（配列番号：２、４、４１−４３及び６６−７０）を示す。図４Ｂは、ＶＫＩＶ  Ｂ３リーダーを伴うＡＰ３３ＲＫＡ  ＤＮＡ配列グラフト（配列番号：４１−４３、６６−６９及び７１−７８）を示す。ＣＤＲは強調されている。
【００３０】
【図５】図５Ａ−５Ｂは、ＡＰ３３ＲＫ２配列の生成を示す。図５Ａは、ＡＰ３３ＲＫ２タンパク質配列グラフト（配列番号：２、４１−４３及び７９−８４）を示す。図５Ｂは、ＡＰ３３ＲＫ２  ＤＮＡ配列の生成（配列番号：４１−４３、６９、７１、７２、７４、７５、７７、８０−８２及び８５−８８）を示す。ＣＤＲは強調されている。
【００３１】
【図６】図６Ａ−６Ｄは、リーダーを伴うＡＰ３３ＲＫＡ（配列番号：８９）、ＡＰ３３ＲＫ２（配列番号：９０）、ＡＰ３３ＲＫ３（配列番号：９１）及びＡＰ３３ＲＫ４（配列番号：９２）ＤＮＡ配列を示す。ＣＤＲは強調されている。
【００３２】
【図７】図７は、リーダーを伴うＡＰ３３ＲＫＡのＤＮＡ（配列番号：９３）及びタンパク質配列（配列番号：９４）を示す。明るい灰色のボックスは、潜在的スプライスサイト又は望ましくないＢａｍＨＩ部位を取り除くために変更されたヌクレオチドを表す。
【００３３】
【図８】図８は、リーダーを伴うＡＰ３３ＲＫ２のＤＮＡ（配列番号：９５及び９６（相補配列））及びタンパク質配列（配列番号：９７）を示す。明るい灰色のボックスは、潜在的スプライスサイト又は望ましくないＢａｍＨＩ部位を取り除くために変更されたヌクレオチドを表す。
【００３４】
【図９】図９は、より長いＣＤＲ１（配列番号：９８−１０３）を伴う、ＡＰ３３  ＶＫ及び非ＶＫ４ヒトＶＫ配列のＶＣＩを示す。最高のＶＣＩスコア、適合したＣＤＲ２の大きさ及びＡＰ３３ＶＫと比較してより長いＣＤＲ１を伴う２０のヒトＶＫ  ｎｏｎＶＫ４配列。ＶＣＩ／ＦＷスコアは、ＡＰ３３ＶＫと同一のＶＣＩ又はＦＷ残基の数を示す。
【００３５】
【図１０】図１０は、より大きいＣＤＲ１（配列番号：１０４−１２３）を伴う、ＡＰ３３  ＶＫ（配列番号：２）及びヒトＶＫ  ｎｏｎ−ＶＫ４配列を示す。Ｃｙｓ、Ｐｒｏ及びＣＤＲは、それぞれ太字の文字列で強調している濃い灰色、白い文字列で強調している黒及び明るい灰色によって示されている。
【００３６】
【図１１】図１１は、より大きいＣＤＲ１を伴うＡＰ３３  ＶＫ（配列番号：２）及び非ＶＫ４ヒト配列（配列番号：１２４−１４１）のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを示す。ＡＰ３３ＶＫと同一の残基は、点によって示されている。一番上の７つの配列において、保存的な変化はミディアムグレーであり、非保存的な変化は濃い灰色である。ＣＤＲは明るい灰色である。
【００３７】
【図１２】図１２は、ＶＫＩＩ−Ａ１７リーダー及びＡＢ０６４１３３  ＦＷ１を伴う予測シグナルプロテアーゼ切断結果［２２］を示す。
【００３８】
【図１３】図１３（以前の６１／００６，０６６の表７）は、ドナー配列とのＡＰ３３  Ｈ（配列番号：１）及びＬ鎖（配列番号：２）のバーニヤ(Vernier)、カノニカル(Canonical)及び境界面の残基の比較を示す。「Ｖｅｒｎ／ＣＤＲ」は、バーニヤの残基（ｖ）及びＣＤＲ（−＝＝＝−）を示す。強調された明るい灰色はＣＤＲを示す。白い文字列で強調している黒は、ＶＣＩ残基を示す。ＡＰ３３及びＳ６７８２６（配列番号：１４２）、Ｘ６１１２５（配列番号：７０）、ＡＢ０６４１３３（配列番号：１４４）、ＡＢ０６４０７２（配列番号：１４５）及びＡＹ６８５２７（配列番号：１４３）において見いだされるＶＣＩ残基間の相違を太字の文字列で強調している濃い灰色。
【００３９】
【図１４】図１４Ａ−１４Ｂは、ＡＰ３３ＲＫ３配列の生成を示す。図１４Ａは、ＡＰ３３ＲＫ３タンパク質配列グラフト（配列番号：２、４１−４３、１４４及び１４６−１５０）を示す。図１４Ｂは、ＡＰ３３ＲＫ３  ＤＮＡ配列の生成（配列番号：４１−４３、７４、７５、７７及び１４７−１５６）を示す。ＣＤＲは強調されている。
【００４０】
【図１５】図１５は、ＡＰ３３ＲＫ４  ＤＮＡ配列の生成を示す。ＣＤＲは、強調されている（配列番号：４１−４３、７２、７４、７５、７７、８３、８８及び１５７−１６３）。
【００４１】
【図１６】図１６は、ＡＰ３３ＲＫ３構築物のＤＮＡ（配列番号：１６４）及びタンパク質（配列番号：１６５）配列を示す。ＮＢ  ＡＰ３３ＲＬＢは、突然変異した２つのＶＣＩを有する。スプライスサイトは、これによって作製されない。
【００４２】
【図１７】図１７は、ＡＰ３３ＲＫ４構築物のＤＮＡ（配列番号：１６６及び１６７（相補配列））及びタンパク質配列（配列番号：１６８）を示す。
【００４３】
【図１８】図１８は、ＡＰ３３ミモトープＨ６に対するヒト化及びキメラ抗体の結合を示す。ヒト化重鎖および軽鎖とのキメラ抗体の相対的な結合を比較するために、ＣＯＳ７細胞は一連のキメラ及びヒト化重鎖及び軽鎖構築物でトランスフェクションされ、上清はミモトープＨ６への結合を比較するために用いられた。キメラ（Ｖｈ／Ｖｌ）及びヒト化抗体ＲＨｂ−ｈ／ＲＫ２ｂｃ及びＲＨＡ／ＲＫ２ｂｃ、又はヒト化及びキメラ抗体ＲＨＡ／Ｖｌ、ＲＨｂ−ｈ／Ｖｌ又はＶｈ／ＲＫ２ｂｃの混合物へのミモトープペプチドＨ６の結合は、ＥＬＩＳＡによって測定された。
【００４４】
【図１９】図１９は、ペプチドＨ６へのＡＰ３３ＲＨＩの結合を示す。重鎖境界面残基Ｑ３９がペプチドＨ６への準最適な結合の原因となるかどうか判定するために、ヒト化重鎖ＲＨＩ（Ｑ３９Ｋ）の結合はＥＬＩＳＡで測定された。ＣＯＳ７細胞は、一連のキメラ及びＲＨＩ重鎖及びＲＫ２ｂ軽鎖の構築物でトランスフェクションされ、上清はミモトープＨ６への結合を比較するために用いられた。キメラ（Ｖｈ／Ｖｌ）及びヒト化抗体ＲＨｂ−ｈ及びＲＨＩ／ＲＫ２ｂｃ、及びヒト化及びキメラ抗体ＲＨＩ／ＶＩ又はＲＨｂ−ｈ／Ｖｌの混合物へのミモトープペプチドＨ６の結合は、ＥＬＩＳＡによって測定された。
【００４５】
【図２０】図２０Ａ−２０Ｂは、Ｅ２ペプチドへのキメラ及びヒト化抗体の結合を示す。ヒト化抗体ＲＨｂ−ｈ／Ｖｌとのキメラ抗体の相対的な結合を比較するために、ＣＯＳ７細胞は一連のキメラ及びヒト化抗体構築物でトランスフェクションされた。抗体上清は、ＥＬＩＳＡにかけられ、表５に記載されるペプチドへの結合を比較するために用いられた。
【００４６】
【図２１】図２１は、Ｈ６ペプチドへのＲＫ２変異体の結合を示す。機能するためのヒト化軽鎖ＲＫ２に必要な変異の最小の数は、軽鎖ＲＫ２、ＲＫ２ｂ及びＲＫ２ｃとのＲＨｂ−ｇの結合を比較することによって決定された。キメラ抗体Ｖｈ／Ｖｌは、前の実験に比較物として含まれた。ＣＯＳ７細胞は、一連のキメラ及びヒト化抗体構築物でトランスフェクションされた。Ｅ２ペプチド（表５）への抗体上清の結合は、ＥＬＩＳＡで測定された。
【００４７】
【図２２】図２２Ａ−２２Ｉは、ヒト化重鎖ＶＣ変異体へのＥ２ペプチドの結合を示す。機能するためのヒト化重鎖ＲＨｂ−ｈに必要な変異の最小の数は、突然変異重鎖ＲＨ−Ｂ、ＲＨ−Ｃ、ＲＨ−Ｄ、ＲＨ−Ｅ、ＲＨ−Ｆ、ＲＨ−Ｇ及びＲＨ−ＨとのＲＨｂ−ｈの結合を比較することによって決定された。キメラ抗体Ｖｈ／Ｖｌは前の実験に比較物として含まれ、ヒト化軽鎖ＲＫ２ｂｃは全てのヒト化重鎖と対をなすために用いられた。ＣＯＳ７細胞は、一連のキメラ及びヒト化抗体構築物でトランスフェクションされた。Ｅ２ペプチド（表５）への抗体上清の結合は、ＥＬＩＳＡで測定された。
【００４８】
【図２３】図２３Ａ−２３Ｅは、正規化データを用いたＥ２ペプチドへのヒト化抗体ＶＣ変異体の結合の比較を示す。図２２からデータは、Ｈ６の結合の割合としてのそれぞれのデータセット及びそれぞれ遺伝子型をまとめて標準化することによって、更に解析された。
【００４９】
【図２４】図２４Ａ−２４Ｅは、ヒト化ＡＰ３３抗体がＨＣＶｐｐ感染症を阻害することを示す。キメラＡＰ３３又は多様な遺伝子型から誘導されるＨＣＶｐｐのヒト化抗体による中和。ＨＣＶｐｐは、Ｈｕｈ−７細胞の感染の前に、精製されたキメラＡＰ３３又はヒト化抗体の異なる濃度で、３７℃、１時間プレインキュベートされた。抗体の中和活性は、感染力価の阻害の割合として表される。
【００５０】
【図２５】図２５Ａ−２５Ｂは、キメラＡＰ３３又は遺伝子型５から誘導されるＨＣＶｐｐのヒト化抗体による中和を示す。ＨＣＶｐｐは、Ｈｕｈ−７細胞の感染の前に、精製されたキメラＡＰ３３又はヒト化抗体の異なる濃度で、３７℃、１時間プレインキューベートされた。抗体の中和活性は、感染力価の阻害の割合として表される。２つの別々の実験から結果が示される。
【００５１】
【図２６】図２６Ａ−２６Ｅは、ＡＰ３３変異体Ｙ４７Ｆ及びＹ４７ＷのＥ２ペプチドへの結合を示す。ＡＰ３３のキメラ重鎖の残基Ｙ４７の突然変異の影響。表５に示されるＥ２ペプチドの結合は、野生型重鎖ＡＰ３３及び変異体Ｙ４７Ｆ及びＹ４７Ｗを比較するために用いられた。ＣＯＳ７細胞は、一連のキメラ及び変異体抗体構築物でトランスフェクションされた。Ｅ２ペプチドへの抗体上清の結合は、ＥＬＩＳＡで測定された。Ｈ６の結合の割合としてのそれぞれのデータセット及びそれぞれ遺伝子型をまとめて標準化することによって、データは操作された。
【００５２】
【図２７】図２７は、ＡＰ３３変異体Ｙ４７Ｆ及びＹ４７ＷによってＨＣＶｐｐ感染の阻害を示す。キメラＡＰ３３又は遺伝子型１ａから誘導されるＨＣＶｐｐのヒト化抗体による中和、。ＨＣＶｐｐは、Ｈｕｈ−７細胞の感染の前に、精製されたキメラＡＰ３３又はヒト化抗体の異なる濃度で、３７℃、１時間プレインキュベートされた。抗体の中和活性は、感染力価の阻害の割合として表される。
【００５３】
【図２８】図２８Ａ−２８Ｃ。感染率で測定されるように、図２８ＡはＣｏｎ１  ＨＣＶｐｐのＡＰ３３及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂによる中和を示す。感染率で測定されるように、図２８ＢはＪ６  ＨＣＶｐｐのＡＰ３３及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂによる中和を示す。図２８Ｃは、Ｃｏｎ１及びＪ６  ＨＣＶｐｐを用いた、ＡＰ３３及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂのＥＣ５０（μｇ／ｍｌ）を示す。
【００５４】
【図２９】図２９Ａ−２９Ｃ。感染率で測定されるように、図２９ＡはＣｏｎ１  ＨＣＶｃｃのＡＰ３３及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂによる中和を示す。感染率で測定されるように、図２９ＢはＪ６  ＨＣＶｃｃのＡＰ３３及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂによる中和を示す。図２９Ｃは、Ｃｏｎ１及びＪ６  ＨＣＶｐｐを用いた、ＡＰ３３及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂのＥＣ５０（μｇ／ｍｌ）を示す。
【００５５】
【図３０】図３０Ａ−３０Ｂ。図３０Ａは、ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ及び慢性的なＨＣＶ感染患者（ＣＨＣＨＳ−１及びＣＨＣＨＣ−２）からの血清又は１０％正常ヒト血清（ＮＨＳ）の存在下でＣｏｎ１  ＨＣＶｐｐを用いた中和アッセイの結果を示す。図３０Ｂは、吸光度（Ａ４５０）で測定されるように、ＧＴ１ｂ（Ｃｏｎ１）Ｅ１Ｅ２トランスフェクション２９３Ｔ細胞からの溶解物を用いたＥＬＩＳＡアッセイによる、Ｃｏｎ１  ＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２反応性抗体へのＮＨＳ、ＣＨＣＨＳ−１、ＣＨＣＨＳ−２及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂの結合のレベルを示す。
【００５６】
【図３１】図３１Ａ−３１Ｂは、Ｒｈ−Ｃ／ＲＫ２ｂ又はＩＦＮ−α単独、又はＩＦＮ−αとＲｈ−Ｃ／ＲＫ２ｂの組み合わせで処理された場合、感染を解析するために感染後１４日又は１８日で測定されたＨＣＶ  ＲＮＡを示す。図３１Ａは、感染後１４日でのＨＣＶ  ＲＮＡレベルを示す。図３１Ｂは、感染後１８日でのＨＣＶ  ＲＮＡレベルを示す。
【００５７】
【図３２】図３２Ａ１−３２Ｇ３は、表６のヒト化抗体可変鎖のアミノ酸及びヌクレオチド配列（配列番号：１−４０及び１６９−１８８）を示す。
【発明の詳細な説明】
【００５８】
Ｉ．治療的使用
本発明は、α−インターフェロンと共にＣ型肝炎ウイルス「ＨＣＶ」に結合する抗体を含む第一の治療を含む、併用療法の方法を提供する。抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンの組合せは、ＨＣＶ感染症を治療するために用いることができる。抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンの組合せは、ＨＣＶの感染の減少、除去又は阻害に有用であり、少なくとも部分的にはＨＣＶ感染により特徴づけられる任意の病的症状を治療するために用いることができる。  
【００５９】
用語「Ｃ型肝炎ウイルス」又は「ＨＣＶ」は、その分野においてよく理解されており、フラビウィルス科のヘパシウィルス属のメンバーのウイルスを意味する。ＨＣＶは、陽性鎖ＲＮＡゲノムを有する直径約５５−６５ｎｍを有している脂質エンベロープウィルスである。Ｃ型肝炎ウイルス種は、それぞれの遺伝子型の中でいくつかの亜型を有する６つの遺伝子型（１−６）に分類される。いくつかの実施態様において、対象は、遺伝子型１（例えば遺伝子型１ａ及び遺伝子型１ｂ）、遺伝子型２（例えば遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型２ｃ）、遺伝子型３（例えば遺伝子型３ａ）、遺伝子型４、遺伝子型５及び遺伝子型６からなる群から選択される一つ以上のＨＣＶ遺伝子型に感染する。北アメリカでは、遺伝子型１ａが優性であり、１ｂ、２ａ、２ｂ及び３ａが続いている。ヨーロッパでは、遺伝子型１ｂが優性であり、２ａ、２ｂ、２ｃ及び３ａが続いている。遺伝子型４及び５は、ほぼ例外なくアフリカにおいて見られる。
【００６０】
個体に：ａ）抗ＨＣＶ抗体を含む組成物の有効量；及びｂ）α−インターフェロンの有効量を投与することを含む、対象のＨＣＶ感染症を治療する方法が本明細書で提供される。
【００６１】
本明細書において用いられるように、「治療」又は「治療する」は、臨床結果を含む、有益又は所望の結果を得るための手法である。本発明の目的のために、有益又は所望の臨床結果は、これに限定されるものではないが、以下の一以上を含む：疾患から生じる一以上の症状の減少、疾患の程度の軽減、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の防止又は遅延）、疾患の進行の遅延又は鈍化、疾病状態の改善、疾患を治療することを必要とする一以上の他の薬物の用量の減少及び／又は生活の質の向上。
【００６２】
いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンの組合せは、急性ＨＣＶ感染症の治療方法において有用である。いくつかの実施態様において、急性ＨＣＶ感染症の治療は、急性ＨＣＶ感染症を減少、排除又は阻害することを含む。
【００６３】
用語「急性Ｃ型肝炎ウイルス感染症」又は「急性ＨＣＶ感染症」は、本明細書で用いられるように、ＨＣＶの感染後の最初の６ヵ月を意味する。
【００６４】
いくつかの実施態様において、急性ＨＣＶ感染症を患う対象は、何も症状を起こさない（つまり、急性ＨＣＶ感染症の症状がない）。急性ＨＣＶ感染症を患う７０％から６０％の対象は、急性期の間、症状がない。いくつかの実施態様において、急性ＨＣＶ感染症を患う対象は、症状が現れる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されている治療方法は、急性ＨＣＶ感染症の一以上の症状を改善する（例えば、発生率の減少、期間の減少、重症度の減少又は軽減）。急性期症状を経験する患者の少数において、症状は一般に穏やかで、非特異的であり、Ｃ型肝炎の特異診断に至らない。急性Ｃ型肝炎感染症の症状は、減少した食欲、疲労、腹痛、黄疸、そう痒及びインフルエンザ様症状を含む。いくつかの実施態様において、急性ＨＣＶ感染症を患う対象は、遺伝子型１のＨＣＶに感染している。遺伝子型１の急性ＨＣＶ注射の治療は、慢性的な感染症のために必要な半分の治療時間で、９０％を超える成功率を有する。
【００６５】
いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンの組合せは、慢性的なＨＣＶ感染症を治療する方法において有用である。いくつかの実施態様において、慢性的なＨＣＶ感染症の治療は、慢性的なＨＣＶ感染症を減少、排除又は阻害することを含む。
【００６６】
用語「慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染症」又は「慢性ＨＣＶ感染症」は、本明細書に用いられるように、６ヵ月以上間持続するＨＣＶの感染を意味する。
【００６７】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されている治療方法は、慢性的なＨＣＶ感染症の一以上の症状を改善する（例えば、発生率の減少、期間の減少、重症度の減少又は軽減）。慢性的なＨＣＶ感染症の症状は、疲労、著しい体重減少、インフルエンザ様症状、筋肉痛、関節痛、断続的な微熱、そう痒、睡眠障害、腹痛（特に右上腹部において）、食欲変化、嘔気、下痢、消化不良、認知変化、うつ、頭痛及び気分変動を含む。一旦慢性的なＨＣＶが肝硬変に進行すると、兆候及び症状は、一般に減少した肝機能又は肝臓循環における圧力の増加のいずれかにより引き起こされる、門脈圧亢進症として公知の状態に見える。肝硬変の起こりうる兆候及び症状は、腹水、挫傷及び出血傾向、骨痛、静脈瘤（特に胃及び食道において）、脂肪便（脂肪便症）、黄疸及び肝性脳症として公知の認知障害の症候群）を含む。いくつかの実施態様において、慢性ＨＣＶ感染症は、肝細胞癌（ＨＣＣ）を引き起こす。慢性ＨＣＶ感染症は、慢性活動性ＨＣＶ感染症及び慢性持続性ＨＣＶ感染症（その一方または両方は本明細書で提供される治療方法に含まれる）の２つの型に更に分けることができる。慢性活動性ＨＣＶ感染症は、肝臓に激しい障害を引き起こすＨＣＶである。慢性持続性ＨＣＶ感染症は、一般に肝臓に障害を引き起こさない慢性ＨＣＶ感染症であるが、既存の肝臓損傷は存在し得る。
【００６８】
いくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、肝臓移植の前に、肝臓移植と同時に、又は肝臓移植の後にＨＣＶに感染した対象に投与されてもよい。
【００６９】
本発明の治療方法のいくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンの組合せは、ＨＣＶ感染症の一以上の側面を抑制することを含む治療方法において有用である。いくつかの実施態様において、ＨＣＶ感染症は、慢性ＨＣＶ感染症である。いくつかの実施態様において、ＨＣＶ感染症は、急性ＨＣＶ感染症である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される方法は、ＨＣＶに関連する検査所見（例えば血液のＡＬＡＴ、ＡＳＴ及びＧＧＴＰレベル）、ウィルス複製、ウィルス力価、ウィルス負荷又はウィルス血症を抑制する。
【００７０】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される方法は、ウィルス力価を抑制又は減少する。「ウィルス力価」は、その分野で既知であり、特定の生体試料中のウイルスの量を示す。
【００７１】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される方法は、ウィルス血症を抑制又は減少する。「ウィルス血症」は、血流中のウイルスの存在及び／又は血液又は血清試料中のウィルス力価としてその分野において知られている。
【００７２】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される方法は、ウィルス荷重を抑制又は減少する。「ウィルス負荷」は、人の血液中のＣ型肝炎ウイルスの量を意味する。Ｃ型肝炎ウィルス荷重試験（ウィルスＲＮＡ試験又はＨＣＶ  ＲＮＡ試験として既知）の結果は、通常国際単位／ｍＬ（ＩＵ／ｍＬ）又はＲＮＡコピー数／ｍＬとして表される。１００万ＩＵ／ｍＬ以上のＣ型肝炎ウィルス荷を有する対象は、高いウィルス負荷を有すると考えられる。
【００７３】
ウイルスの量（例えばウィルス力価又はウィルス負荷）は、これに限定されるものではないが、ウィルス核酸の量、ウィルス粒子の存在、複製単位（Ｒｕ）、プラーク形成単位（ＰＦＵ）を含む様々な測定によって示される。一般に、流体サンプル（例えば血液及び尿）に対して、ウイルスの量は、例えばミリリットルなど単位液体につき測定される。固体試料（例えば組織サンプル）に対して、ウイルスの量は、例えばグラムなど単位重量につき測定される。ウイルスの量を測定するための方法は、その分野において公知であり、本明細書にも記載される。
【００７４】
いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンの組合せで治療される対象は、急速なＨＣＶ感染症進行の危険がある。ＨＣＶ疾患進行速度に影響することが報告された因子は、年齢（年齢の増加はより急速な進行と関連している）、性（男性は女性より急速な疾患進行を有する）、アルコール消費（疾患進行の速度増大と関連している）、ＨＩＶ共感染（疾患進行の顕著な速度増大と関連している）及び脂肪肝（肝細胞における脂肪の存在は疾患進行の速度増大と関連している）を含む。
【００７５】
本発明の任意の方法のいくつかの実施態様において、対象は抗ＨＣＶ抗体（すなわち内因性の抗ＨＣＶ抗体）を産生する。いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体は検出可能であり、例えば抗ＨＣＶ抗体はＥＬＩＳＡによって検出可能である。いくつかの実施態様において、対象によって産生される抗ＨＣＶ抗体は中和抗体である。いくつかの実施態様において、対象によって産生される抗ＨＣＶ抗体は、非中和性抗体である。
【００７６】
個体に：ａ）抗ＨＣＶ抗体を含む組成物の有効量；及びｂ）α−インターフェロンの有効量を投与することを含む、対象のＨＣＶ感染症を予防する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンは、ＨＣＶに感染しやすい対象のＨＣＶ感染症を予防するための方法において用いることができる。いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンの組合せは、暴露された、もしくは暴露される可能性がある対象のＨＣＶ感染症を予防する方法においても用いることができる。ＨＣＶへの「暴露」は、ＨＣＶ感染症を引き起こし得るＨＣＶとの接触、もしくは接触の可能性を意味する。一般に、暴露された対象は、ＨＣＶが感染し得る経路によってＨＣＶに暴露された対象である。いくつかの実施態様において、対象は、ＨＣＶ感染症の対象の血液又はＨＣＶに感染したか、感染していない対象の血液に暴露されたか暴露された可能性がある（すなわち、血液暴露のＨＣＶ感染の状態は知られていない）。ＨＣＶは、多くの場合、血液と血液の接触によって伝染する。いくつかの実施態様において、対象は、これに限定されるものではないが、血液製剤の使用（例えば輸血）、「針刺し」事故、薬剤注射針の使い回し、薬剤の吸引、性交渉の相手、医原性、医療又は歯科への暴露、ボディピアス及びタトゥーにおける針の使用又は母がＨＣＶ感染症を有する子供により、ＨＣＶに暴露されたか、暴露される可能性がある。本発明の予防方法のいくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンは、ＨＣＶへの暴露又は暴露の可能性と同時、又は約１日以内、１週間以内又は１ヵ月以内の何れかで投与される。
【００７７】
本明細書に記載される何れかの方法のいくつかの実施態様において、対象は人間又はチンパンジーである。いくつかの実施態様において、対象は人間である。ＨＣＶは、人間及びチンパンジーのみに感染する。
【００７８】
本明細書に記載される何れかの方法のいくつかの実施態様において、本発明の方法は、抗ＨＣＶ抗体を、α−インターフェロンと組み合わせて、連続的に、一斉に、継続的に、ローテーションで、又は間欠的に投与することを含む。いくつかの実施態様において、本発明は、ＨＣＶ及びα−インターフェロンに結合し、ＨＣＶの一以上の症状を改善し、ウィルス力価及び／又はウィルス負荷を減少及び／又は抑制し、及び／又は抗ＨＣＶ抗体又はα−インターフェロン単独での治療よりもＨＣＶを予防する、ＨＣＶ及びα−インターフェロンに結合する抗体の組み合わせを投与することを含む。いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンの組合せは、ＨＣＶの一以上の症状を改善し、ウィルス力価及び／又はウィルス負荷を減少及び／又は抑制し、及び／又は抗ＨＣＶ抗体又はα−インターフェロン単独よりも約２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％又は５００％以上の何れかでＨＣＶを予防する。
【００７９】
本明細書に記載される何れかの方法のいくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体はＨＣＶに結合する。いくつかの実施態様において、抗体は、ＨＣＶＥ２タンパク質、可溶性ＨＣＶＥ２タンパク質、又はＨＣＶＥ１タンパク質及びＨＣＶＥ２タンパク質のヘテロダイマーに結合可能である。いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体はＨＣＶＥ２タンパク質に結合する。いくつかの実施態様において、ＨＣＶＥ２タンパク質は、遺伝子型１（例えば遺伝子型１ａ及び遺伝子型１ｂ）、遺伝子型２（例えば遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型２ｃ）、遺伝子型３（例えば遺伝子型３ａ）、遺伝子型４、遺伝子型５及び遺伝子型６からなる群から選択されるＨＣＶ遺伝子型の一つ以上からのものである。いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体は、ＣＤ８１とのＨＣＶＥ２タンパク質の相互作用を阻害する。いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体は、細胞へのＨＣＶの移行を予防及び／又は阻害する。いくつかの実施態様において、細胞は、肝臓の細胞（例えば肝細胞）である。いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体は、本明細書に記載さる任意の抗体である。いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体は、抗体断片である。
【００８０】
「約」について、本明細書の値又はパラメーターは、その値又はパラメーター自体についての変数を含む（及び記載している）。例えば、「約Ｘ」を意味する記載は、「Ｘ」の記載を含む。
【００８１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲にいおいて用いられるように、単数形「ａ」、「ｏｒ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に記載しない限り、複数の対象物を含む。本明細書に記載されている発明の態様及び変形物は、「からなる」及び／又は「基本的にからなる」で表される態様及び変型物を含むことは、よく理解されている。
【００８２】
ＩＩ．抗体
本明細書に提供される併用療法の方法は、抗ＨＣＶ抗体を用いる、又は含む。いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体はＨＣＶに結合する。いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に結合する。したがって、そのような抗体の産生方法は、ここに記載される。本明細書に提供される方法において用いられる抗体の産生のための例示的な技術に関する記載が続く。
【００８３】
抗体は、当業者に明白な多くの方法で特徴づけられ得る。これらは、ＥＬＩＳＡなどの技術による濃度の物理的測定、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による抗体純度の物理的測定を含む。さらに、ポリペプチドの有効性は、溶液中又は固体相系（例えばＥＬＩＳＡ、表面プラスモン共鳴（例えばＢＩＡｃｏｒｅ）又、免疫螢光アッセイ）でのＨＣＶ  Ｅ２グリコプロテインへの分子の結合を検出することにより測定することができる。より詳細には、ポリペプチドの中和能は、ＨＣＶｐｐ及びＨＣＶｃｃ中和アッセイのような、本明細書に記載されるＨＣＶ  ｐｐ−中和アッセイにおいて、６つの既知の遺伝子型を表わすＨＣＶ試料に対して試験することができる。
【００８４】
（ｉ）定義
抗体は、様々な構造を有する天然に発生する免疫グロブリン分子であり、全てが免疫グロブリン群に基づいている。例えば、ＡＰ３３のようなＩｇＧ抗体は、機能的な抗体を形成するようにジスルフィド結合で結合した２つの『重』鎖及び２つの『軽』鎖を有する。それぞれの重鎖及び軽鎖自体は、一定の「定常」（Ｃ）領域と「可変」（Ｖ）領域とを含む。Ｃ領域は構造的支持体及び免疫エフェクターとの非抗原特異的な相互作用の機能を提供するのに対して、Ｖ領域は抗体の抗原結合特異性を決定する。抗体又は抗体の抗原結合性フラグメントの抗原結合特異性は、特定の抗原に特異的に結合する抗体の能力である。
【００８５】
抗体の抗原結合特異性は、Ｖ領域の構造的特性で決定される。多様性は、可変ドメインの１１０−アミノ酸の全長にわたって均一に分布していない。その代わりに、可変領域は、それぞれ全長９−１２アミノ酸の「超可変領域」と呼ばれる極度に多様なより短い領域によって分けられる１５−３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲｓ）と呼ばれる比較的不変な範囲から成る。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインのそれぞれは、β−シート構造に接合するかその一部を形成するループを形成している３つの超可変領域が接合している、主にβ−シート立体構造をとる４つのＦＲを含む。それぞれの鎖の超可変領域は、ＦＲにごく接近して保持され、他の鎖の超可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)を参照）。定常領域は抗体の抗原への結合に直接に関与しないが、様々なエフェクター機能（例えば抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）の抗体の関与）を示す。
【００８６】
いくつかの実施態様において、超可変領域は、抗原結合性に関与する抗体のアミノ酸残基である。超可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基を含んでもよい（例えば、ＶＬの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及びＶＬの８９−９７（Ｌ３）周辺、及びＶＨの３１−３５Ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）周辺（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）及び／又は超可変ループの残基（例えばＶＬの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及びＶＬの９１−９６（Ｌ３）及びＶＨの２６−３２（Ｈ１）、５２Ａ−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）（Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)））。  
【００８７】
それぞれのＶ領域は、一般的に３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」のそれぞれは超可変ループを含む）及び４つフレームワーク領域を含む。抗体結合部（特定の所望の抗原に実質的な親和性を伴って結合するのに必要な最小の構造単位）はしたがって、一般的に３つのＣＤＲと、適切なコンフォメーションにおいてＣＤＲを保持及び提示するためにそこに散在する少なくとも３つ、好ましくは４つのフレームワーク領域とを含む。典型的な４つの鎖の抗体（例えばＡＰ３３）は、協同するＶＨ及びＶＬドメインによって定義される抗原結合部位を有する。特定の抗体（例えばラクダ及びサメ抗体）は、軽鎖を欠いていており、重鎖のみで形成される結合部に依存している。結合部位が重鎖又は軽鎖のみで形成されており、ＶＨ及びＶＬ間の協同がない単一のドメインで設計された免疫グロブリンを調製することができる。
【００８８】
本明細書及び請求項の全体にわたって、特に明記しない限り、免疫グロブリン重鎖の定常領域の残基の番号付けは、本明細書に援用されるKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に記載のＥｕインデックスの番号付けである。「Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基番号付けを意味する。配列番号付けシステム又は他の番号付けシステムが特に示されない限り、Ｖ領域の残基はＫａｂａｔ番号付けに従って番号付けされる。
【００８９】
本明細書において用語「抗体」は、最も広い意味において用いられ、特にモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全な抗体から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の生物学的活性を示しさえすれば抗体断片を包含する。  
【００９０】
「抗体断片」は、完全な抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。
【００９１】
本明細書における目的において、「完全な抗体」は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン、及びＦｃ領域を含む抗体である。
【００９２】
「天然の抗体」は通常約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマーグリコプロテインであり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される。異なる免疫グロブリンのアイソタイプの重鎖間でジスルフィド結合の数が異なるのに対して、それぞれの軽鎖は１つの共有結合性ジスルフィド結合によって重鎖に連結されている。それぞれの重鎖及び軽鎖は、規則正しく間隔をあけた鎖内のジスルフィド架橋も有している。それぞれの重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、多くの定常領域が続く。それぞれの軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）及びもう一端に定常領域を有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一の定常ドメインと並んでおり、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の境界面を形成していると考えられる。
【００９３】
用語「可変」は、可変ドメインの特定の部分が抗体間の配列において広範囲にわたって異なっており、その特定の抗原に対するそれぞれの特定の抗体の結合及び特異性において用いられるという事実を意味する。しかしながら、多様性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布しているわけではない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの超可変領域と呼ばれている３つのセグメントに集約される。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれている。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインのそれぞれは、β−シート構造に接合するかその一部を形成するループを形成している３つの超可変領域が接合している、主にβ−シート立体構造をとる４つのＦＲを含む。それぞれの鎖の超可変領域は、ＦＲにごく接近して保持され、他の鎖の超可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)を参照）。定常領域は抗体の抗原への結合に直接に関与しないが、様々なエフェクター機能（例えば抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）の抗体の関与）を示す。
【００９４】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合性断片を産生し、それぞれの単一の抗原結合部位及び残りの「Ｆｃ」断片（その名前は容易に結晶化するその能力を反映している）を有する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、抗原を架橋させられるＦ（ａｂ’）２断片を産生する。
【００９５】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含む最小限の抗体フラグメントである。この領域は、密接な非共有結合による１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインのダイマーからなる。この立体構造において、それぞれの可変ドメインの３つの超可変領域がＶＨ−ＶＬダイマーの表面上の抗原結合部位を定義するために相互作用する。共同で、６つの超可変領域が抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は、抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、完全な結合部よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識及び結合する能力を有する。
【００９６】
Ｆａｂ断片も、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域の一以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において、数個の残基が付加している点でＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を有するＦａｂ’に対する本明細書における記号表示である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、もともとは、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的結合も公知である。
【００９７】
任意の脊椎動物種の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる型に特定され得る。
【００９８】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、抗体は異なるクラスに特定され得る。完全な抗体の５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、これらのいくつかは例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２などのサブクラス（アイソタイプ）にさらに分けられる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれている。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体構造は周知である。
【００９９】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖内に存在する。いくつかの実施態様において、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨ及びＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの概要については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと。
【０１００】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を意味し、断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）における軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成をするには短いリンカーを用いることにより、ドメインは、他の鎖の相補的なドメインと対形成し、２つの抗原結合部位を作成することとなる。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)中にさらに十分に記載されている。
【０１０１】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で用いられるように、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を意味し、すなわち、モノクローナル抗体の産生の間に発生し得る変異体（一般に少量存在する変異体）を除いて、集団を含んでいる個体抗体は、同一である、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含むポリクロナール抗体製剤とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対している。それらの特異性に加えて、他の免疫グロブリンが混入していないという点で、モノクローナル抗体は有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の性質を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本明細書において提供される方法に従って用いられるモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)によって初めて記載されたハイブリードーマ法によって製作されてもよく、組換えＤＮＡ方法（米国特許番号４，８１６，５６７参照）によって製作されてもよい。「モノクローナル抗体」は、例えばClackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載される技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
【０１０２】
本明細書におけるモノクローナル抗体は、鎖の残部が他の種から誘導されるか、他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるのに対して、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種から誘導されてるか、特定の抗体クラス又はサブクラスに属している抗体に対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を特に含み、それらが所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片も同様に含む（米国特許番号４，８１６，５６７；Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)）。本明細書において興味があるキメラ抗体は、ヒト以外の霊長類（例えば旧世界ザル、たとえばヒヒ、アカゲザル又はカニクイザル）由来の可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列（米国特許第５，６９３，７８０）を含む、「霊長類化された」抗体を含む。
【０１０３】
ヒト以外の（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、ヒト以外の免疫グロブリンに由来する最小の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域の残基がマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のようなヒト以外の種（ドナー抗体）の超可変領域の残基と置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、所望の特異性、親和性及び能力を有している。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応するヒト以外の残基と置き換えられる。さらにまた、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体では見いだされない残基を含み得る。これらの変更は、抗体の性能をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、上記の如く、ＦＲ置換を除いて、少なくとも１つ、一般的に２つの可変ドメイン（超可変ループの全て又は実質的に全てがヒト以外の免疫グロブリンのそれらに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである）の全てを実質的に含む。ヒト化抗体は、場合によって、少なくとも免疫グロブリン定常領域の一部、一般的にはヒト免疫グロブリンの定常領域を含む。詳細は、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【０１０４】
本明細書で用いられる場合、用語「超可変領域」は抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」（例えば軽鎖可変ドメインの２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）及び重鎖可変ドメインの３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３））の残基；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）、及び／又は超可変ループの残基（例えば軽鎖可変ドメインの２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）及び重鎖可変ドメインの２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３））の残基；Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）のアミノ酸残基を含む。本明細書において定義されるように、「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、超可変領域残基以外の可変ドメインの残基である。
【０１０５】
「裸の抗体」は、本明細書において定義されるように、例えば細胞障害性成分又は放射標識などの異種性の分子にコンジュゲートされていない抗体である。
【０１０６】
「単離された」抗体は、同定され、分離及び／又はその自然環境の成分から回収されたものである。その自然環境の不純成分は、抗体の診断的又は治療的使用に干渉する物質であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性又は非タンパク質性の溶質を含み得る。いくつかの実施態様において、抗体は（１）ローリー法によって定まる抗体の９５重量％以上、実施態様によっては９９重量％以上にまで、（２）スピニング・カップ・シークエネータを用いて、Ｎ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）クーマシーブルー、実施態様によっては銀染色を用いた還元又非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性にまで精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないことから、単離された抗体は組換え細胞中の抗体を含む。通常、しかしながら、単離された抗体は、少なくとも一つの精製ステップによって調製される。本明細書に記載される抗体又は抗体断片は、単離されてもよく、任意の程度にまで精製されてもよい。本明細書で使用されるように、「単離された」は、抗体又は抗体断片がその自然環境から取り除かれたことを意味する。いくつかの実施態様において、不純成分は抗体の診断的又は治療的使用と干渉する物質であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性又は非タンパク質性の溶質を含み得る。いくつかの実施態様において、抗体は（１）ローリー法によって定まる抗体の９５重量％以上、最も好ましくは９９重量％以上にまで、（２）スピニング・カップ・シークエネータを用いて、Ｎ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）クーマシーブルー、好ましくは銀染色を用いた還元又非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性にまで精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないことから、単離された抗体は組換え細胞中の抗体を含む。通常、しかしながら、単離された抗体は、少なくとも一つの精製ステップによって調製される。
【０１０７】
「精製された」は、初めに実験条件下で合成及び／又は増幅された場合、それがその自然環境中に存在するより純粋な形態で存在するように、抗体又は抗体断片の純度が増加したことを意味する。純度は、相対的な用語であって、必ずしも絶対的な純度を意味するわけではない。
【０１０８】
いくつかの実施態様において、抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然の配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因し得る生物学的活性を意味し、抗体アイソタイプにより異なる。抗体エフェクター機能の例は：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞活性化を含む。
【０１０９】
「抗体依存性細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異性の細胞障害性細胞（例えばナチュラル・キラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）が標的細胞上の細胞結合性抗体を認識し、その後に標的細胞の細胞溶解が生じる細胞媒介性反応を意味する。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞（ＮＫ細胞）は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単核細胞はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の４６４ページの表３にまとめられる。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５５００３６２又は５８２１３３７に記載されているようなインビトロでのＡＤＣＣアッセイが行われてもよい。そのようなアッセイのために有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは又はさらに、例えばClynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998）において開示されるような動物モデルにおいて、対象の分子のＡＤＣＣ活性はインビボで評価されてもよい。
【０１１０】
「ヒトエフェクター細胞」は、一以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を果たす白血球である。いくつかの実施態様において、細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単核細胞、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球を含み；ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。
【０１１１】
用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を表すために用いられる。いくつかの実施態様において、ＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合し（γ受容体）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング形態を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含み、それらは主にその細胞質ドメインにおいて異なる、類似したアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質内ドメインに免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質内ドメインに免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。（Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)を参照）。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)においてレビューされる。将来的に同定されるものを含み、他のＦｃＲは、本明細書における用語「ＦｃＲ」に含まれる。その用語は、胎児への母体ＩｇＧの移動に関与する新生児の受容体（ＦｃＲｎ）をも含む（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）。
【０１１２】
「補体依存性細胞障害」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下における分子の標的を溶解する能力を意味する。補体活性化経路は、同族の抗原と複合体化された分子（例えば抗体）への、補体系（Ｃ１ｑ）の第一の成分の結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されるようなＣＤＣアッセイが行われてもよい。  
【０１１３】
（ｉｉ）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、関連する抗原及びアジュバントの複数の皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）への注射によって、動物中で産生される（関連抗原の例として、その全てが援用されるＰＣＴ／ＧＢ２００６／０００９８７を参照こと）。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質（例えば、キーホール  リンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン又はダイズ‐トリプシン阻害因子）に関連抗原を二機能性又は誘導体化剤（例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基によるコンジュゲート）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基による）、グルタールアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２又はＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（Ｒ及びＲ１が異なるアルキル基）を用いてコンジュゲートすることは、有用であり得る。
【０１１４】
３倍量のフロインド完全アジュバントとタンパク質又はコンジュゲートの１００μｇ又は５μｇ（それぞれウサギ又はマウス）を組み合わせ、複数の部位に溶液を皮内注射することによって、動物は抗原、免疫原性結合体又は誘導体で免疫化される。１ヵ月後、最初の１／５〜１／１０の量のフロイント完全アジュバント中のペプチド又はコンジュゲートの複数の部位への皮下注射によって、動物は追加免疫される。７〜１４日間後に、動物は採血され、血清は抗体価についてアッセイされる。動物は、力価がプラトーになるまで追加免疫される。いくつかの実施態様において、動物は、同じ抗原のコンジュゲートではあるが、異なるタンパク質にコンジュゲートされたか、及び／又は異なる架橋試薬によるコンジュゲートで追加免疫される。コンジュゲートは、タンパク質融合のような、組換え細胞培養でも製作することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。  
【０１１５】
（ｉｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体群から得られる、すなわち、その群を構成する個々の抗体は同一であるか、少量存在するモノクローナル抗体の産生の間に発生し得る変異体を除いて同じエピトープに結合する。したがって、修飾語「モノクローナル」は、別々の抗体又はポリクローナル抗体の混合物でないという抗体の性質を示す。
【０１１６】
例えば、モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)によって初めて記載されたハイブリードーマ法を用いて製作されてもよく、組換えＤＮＡ方法（米国特許番号４，８１６，５６７）によって製作されてもよい。
【０１１７】
ハイブリードーマ法において、マウス又は他の適切な宿主動物（例えばハムスター）は、本明細書に記載さるように、免疫化に用いられるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することが可能なリンパ球を誘発するために免疫化される。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫化されてもよい。リンパ球は、ハイブリドーマ細胞を形成するために、適切な融合剤（例えばポリエチレングリコール）を用いて、骨髄腫細胞と融合される（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。
【０１１８】
したがって、調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは融合されていない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一以上の物質を含む適切な培地に播種され、増殖される。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマの培地は一般的にヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻止する。
【０１１９】
いくつかの実施態様において、骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルでの抗体産生を維持し、ＨＡＴ培地のような培地に感受性な細胞である。これらの中で、いくつかの実施態様において、骨髄腫細胞株は、例えばSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１、及びAmerican Type Culture Collection, Rockville, Maryland USAから入手可能なＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞から誘導される細胞などのマウスの骨髄腫株である。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、ヒトモノクローナル抗体産生のためにも記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【０１２０】
ハイブリドーマ細胞が増殖する培地は、その抗原に対するモノクローナル抗体産生のためにアッセイされる。いくつかの実施態様において、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロでの結合アッセイ（例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ））によって測定される。
【０１２１】
モノクローナル抗体の結合能は、例えば、Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャチャード解析で測定することができる。
【０１２２】
所望の特異性、親和性及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは限界希釈手法によってサブクローニングされ、標準法によって増殖される（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。この目的に適切な培養培地は、例えばＤ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。さらに、動物の腹水癌のように、ハイブリドーマ細胞はインビボで増殖し得る。
【０１２３】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、通常の免疫グロブリン精製手法（例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィ）によって、培地、腹水液又は血清から適切に分離される。
【０１２４】
モノクローナル抗体をコード化しているＤＮＡは、容易に単離され、通常の手法を用いて（例えば、マウスの抗体の重鎖および軽鎖をコード化している遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）配列決定される。いくつかの実施態様において、ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの供給源の役割をする。単離されると、ＤＮＡは発現ベクターに入れられてもよく、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得られるように宿主細胞（例えば大腸菌細胞、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞）にトランスフェクションされる。抗体をコード化しているＤＮＡの細菌における組換え発現についての総説は、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)及びPluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)を含む。
【０１２５】
さらなる実施態様において、抗体又は抗体断片は、McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)に記載さる技術を用いて作製された抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを用いたマウスの及びヒトそれぞれの抗体の単離を記載する。後の刊行物は、非常に大きいファージライブラリーを構築するためのストラテジーとしての組み合わせ感染及びインビボ遺伝子組換え（Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)）と同様に、チェインシャフリングによる高親和性（ｎＭレンジ）ヒト抗体の産生（Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)）を記載する。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代替案である。
【０１２６】
ＤＮＡは、例えばヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインコード化配列を相同のマウスの配列と置換することによって（米国特許番号４，８１６，５６７；Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)）又は非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の全て又は一部を免疫グロブリンコード化配列に共有結合で接続することによって、修飾されてもよい。
【０１２７】
一般的に、そのような非免疫グロブリンポリペプチドは抗体の定常ドメインと置換されるか、抗原に対する特異性を有するある抗原結合部位、及び異なる抗原に対する特異性を有する他の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作成するために、それらは抗体の抗原結合部位の可変ドメインと置換される。
【０１２８】
いくつかの実施態様において、モノクローナル抗ＨＣＶ抗体はＡＰ３３抗体である。その全てが援用されているＰＣＴ／ＧＢ２００６／０００９８７を参照のこと。
【０１２９】
いくつかの実施態様において、モノクローナル抗ＨＣＶ抗体は、好ましくは以下のＣＤＲ配列の１、２、３、４、５又は６つを含む：
ＣＤＲ  Ｌ１配列ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ（配列番号：４１）、
ＣＤＲ  Ｌ２配列ＬＡＳＮＬＮＳ（配列番号：４２）、
ＣＤＲ  Ｌ３配列ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ（配列番号：４３）、
ＣＤＲ  Ｈ１配列ＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮ（配列番号：４４）、
ＣＤＲ  Ｈ２配列ＹＩＳＹＳＧＳＴＹ（配列番号：４５）、及び
ＣＤＲ  Ｈ３配列ＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹ（配列番号：４６）。
【０１３０】
いくつかの実施態様において、モノクローナル抗ＨＣＶ抗体は、好ましくは以下のＣＤＲ配列の１、２、３、４、５又は６つを含む：
ＣＤＲ  Ｌ１配列ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ（配列番号：４１）、
ＣＤＲ  Ｌ２配列ＬＡＳＮＬＮＳ（配列番号：４２）、
ＣＤＲ  Ｌ３配列ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ（配列番号：４３）、
ＣＤＲ  Ｈ１配列ＳＧＹＷＮ（配列番号：４７）、
ＣＤＲ  Ｈ２配列ＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＬＳＬＲＳ（配列番号：４８）、及び
ＣＤＲ  Ｈ３配列ＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹ（配列番号：４６）。
【０１３１】
本発明の任意のモノクローナル抗体のいくつかの実施態様において、本明細書に記載さるモノクローナル抗体はＨＣＶに結合する。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、ＨＣＶＥ２タンパク質、可溶性ＨＣＶＥ２タンパク質、又はＨＣＶＥ１タンパク質及びＨＣＶＥ２タンパク質のヘテロダイマーに結合可能である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体はＨＣＶＥ２タンパク質に結合する。いくつかの実施態様において、ＨＣＶＥ２タンパク質は、遺伝子型１（例えば遺伝子型１ａ及び遺伝子型１ｂ）、遺伝子型２（例えば遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型２ｃ）、遺伝子型３（例えば遺伝子型３ａ）、遺伝子型４、遺伝子型５及び遺伝子型６からなる群から選択されるＨＣＶ遺伝子型の一以上からのものである。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、ＣＤ８１とのＨＣＶＥ２タンパク質の相互作用を阻害する。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、細胞へのＨＣＶの侵入を予防及び／又は阻害する。いくつかの実施態様において、細胞は、肝臓の細胞（例えば肝細胞）である。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、抗体断片である。
【０１３２】
いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、１−１００ｎｍの結合親和性で可溶性ＨＣＶＥ２タンパク質に結合する。いくつかの実施態様において、結合親和性は、１−１０ｎＭ、１０−５０ｎＭ又は５０−１００ｎＭのいずれかである。いくつかの実施態様において、結合親和性は、約５ｎＭ又は約５０ｎＭである。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、１−１００ｎＭの結合親和性で、ＨＣＶＥ１／ＨＣＶ  Ｅ２ヘテロダイマーと結合する。いくつかの実施態様において、結合親和性は、１−１０ｎＭ、１０−５０ｎＭ又は５０−１００ｎＭのいずれかである。いくつかの実施態様において、結合親和性は、約５ｎＭ又は約５０ｎＭである。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)に記載されるスキャチャード解析で測定することができる。
【０１３３】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載さるモノクローナル抗体は、ＨＣＶ感染を阻害する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるモノクローナル抗体は、ＨＣＶシュードパーティクル（ＨＣＶｐｐ）の感染を阻害する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるモノクローナル抗体は、組換え細胞培養由来ＨＣＶ（ＨＣＶｃｃ）の感染を阻害する。
【０１３４】
いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、上記の特性の一以上を示す。
【０１３５】
（ｉｖ）ヒト化抗体
ヒト以外の抗体をヒト化する方法は、従来技術に記載されている。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、それに導入された、ヒト以外の供給源からの一つ以上のアミノ酸残基を有する。これらのヒト以外のアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入（ｉｍｐｏｒｔ）」可変ドメインから取られる「移入」残基と称される。ヒト化は、本質的にはＷｉｎｔｅｒ及び共同研究者（Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988)；Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)）の方法に従って、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列と置換することにより、行うことができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分がヒト以外の種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には幾つかの超可変領域残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位の残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１３６】
抗原性を低減するために、ヒト化抗体を作製する際に使用される軽鎖及び重鎖両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」によれば、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列が既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリーに対してスクリーニングされる。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列がヒト化抗体のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として受け入れられ得る（Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)）。他の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用してもよい（Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)）
【０１３７】
抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することがさらに重要である。この目標を達成するために、本発明のいくつかの実施態様では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータープログラムは入手可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンのその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性の増加のような、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【０１３８】
いくつかの実施態様において、ヒト化抗ＨＣＶ抗体は、以下のＣＤＲ配列の１、２、３、４、５又は６つを含む：
ＣＤＲ  Ｌ１配列ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ（配列番号：４１）、
ＣＤＲ  Ｌ２配列ＬＡＳＮＬＮＳ（配列番号：４２）、
ＣＤＲ  Ｌ３配列ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ（配列番号：４３）、
ＣＤＲ  Ｈ１配列ＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮ（配列番号：４４）、
のＣＤＲ  Ｈ２配列ＹＩＳＹＳＧＳＴＹ（配列番号：４５）、及び
のＣＤＲ  Ｈ３配列ＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹ（配列番号：４６）。
【０１３９】
いくつかの実施態様において、ヒト化抗ＨＣＶ抗体は、以下のＣＤＲ配列の１、２、３、４、５又は６つを含む：
ＣＤＲ  Ｌ１配列ＲＡＳＥＳＶＤＧＹＧＮＳＦＬＨ（配列番号：４１）、
ＣＤＲ  Ｌ２配列ＬＡＳＮＬＮＳ（配列番号：４２）、
ＣＤＲ  Ｌ３配列ＱＱＮＮＶＤＰＷＴ（配列番号：４３）、
ＣＤＲ  Ｈ１配列ＳＧＹＷＮ（配列番号：４７）、
ＣＤＲ  Ｈ２配列ＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＬＳＬＲＳ（配列番号：４８）、及び
ＣＤＲ  Ｈ３配列ＩＴＴＴＴＹＡＭＤＹ（配列番号：４６）。
【０１４０】
上記のＣＤＲ配列は、一般的にヒト軽鎖カッパサブグループＩ（ＶＬ６Ｉ）のヒトコンセンサスＦＲ残基、及びヒト重鎖サブグループＩＩＩ（ＶＨＩＩＩ）のヒトコンセンサスＦＲ残基などのヒト可変軽鎖及び可変重鎖フレームワーク配列中に存在する。ＷＯ２００４／０５６３１２（Lowman et al.）も参照のこと。
【０１４１】
いくつかの実施態様において、可変重鎖領域はヒトＩｇＧ鎖定常領域に接続されてもよく、その領域は、例えば天然配列及び変異体の定常領域を含むＩｇＧ１又はＩｇＧ３であってもよい。
【０１４２】
一実施態様において、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：１９又は配列番号：２０の何れかに記載されるアミノ酸配列を含むヒト化ＡＰ３３抗体の可変軽鎖ドメインが提供される。
【０１４３】
もう一つの実施態様では、番号：３の位置３０、４８、６７、７１、７８及び９４におけるアミノ酸変異を含むヒト化ＡＰ３３抗体の可変重鎖ドメインが提供される。
【０１４４】
アミノ酸変異は、一つ以上のアミノ酸残基の置換によって得られうる。特定の状況では、欠失又は挿入が許容され得る。変異は、標準技術（例えば部位特異的突然変異誘発）を用いて実行することができる。
【０１４５】
最適には、アミノ酸変異は置換である。
【０１４６】
もう一つの実施態様では、可変重鎖ドメインは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、又は配列番号：１８の何れかに記載されるアミノ酸配列を含む。
【０１４７】
可変軽鎖ドメインを含むヒト化抗体又はヒト化抗体断片も提供される。
【０１４８】
可変重鎖ドメインを含むヒト化抗体又はヒト化抗体断片もまた提供される。
【０１４９】
軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域が本明細書で定義される軽鎖及び重鎖を含むヒト化抗体又はヒト化抗体断片もまた提供される。
【０１５０】
いくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７及び配列番号：１８からなる群から選択される可変重鎖ドメイン及び配列番号：６、配列番号：７、配列番号：１９及び配列番号：２０からなる群から選択される可変軽鎖ドメインを含む。
【０１５１】
いくつかの実施態様において、可変重鎖ドメインは配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７及び配列番号：１８からなる群から選択され、可変軽鎖ドメインは配列番号：６である。いくつかの実施態様において、可変重鎖ドメインは配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７及び配列番号：１８からなる群から選択され、可変軽鎖ドメインは配列番号：７である。いくつかの実施態様において、可変重鎖ドメインは配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７及び配列番号：１８からなる群から選択され、可変軽鎖ドメインは配列番号：１９である。いくつかの実施態様において、可変重鎖ドメインは配列番号：１３であり、可変軽鎖ドメインは配列番号：１９である。いくつかの実施態様において、可変重鎖ドメインは配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７及び配列番号：１８からなる群から選択され、可変軽鎖ドメインは配列番号：２０である。
【０１５２】
本発明の任意のヒト化抗体のいくつかの実施態様において、本明細書に記載されるヒト化抗体はＨＣＶに結合する。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質、可溶性ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質又はＨＣＶ  Ｅ１タンパク質及びＨＣＶ  Ｅ２タンパク質のヘテロダイマーに結合可能である。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に結合する。いくつかの実施態様において、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質は、遺伝子型１（例えば遺伝子型１ａ及び遺伝子型１ｂ）、遺伝子型２（例えば遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型２ｃ）、遺伝子型３（例えば遺伝子型３ａ）、遺伝子型４、遺伝子型５及び遺伝子型６からなる群から選択されるＨＣＶ遺伝子型の一以上からのものである。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、ＣＤ８１とのＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の相互作用を阻害する。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、細胞へのＨＣＶの侵入を防止及び／又は阻害する。いくつかの実施態様において、細胞は肝臓の細胞（例えば肝細胞）である。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、抗体断片である。
【０１５３】
いくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、１−１００ｎｍの結合親和性で可溶性ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に結合する。いくつかの実施態様において、結合親和性は、１−１０ｎＭ、１０−５０ｎＭ又は５０−１００ｎＭのいずれかである。いくつかの実施態様において、結合親和性は、約５ｎＭ又は約５０ｎＭである。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、１−１００ｎＭの結合親和性で、ＨＣＶ  Ｅ１／ＨＣＶ  Ｅ２ヘテロダイマーに結合する。いくつかの実施態様において、結合親和性は、１−１０ｎＭ、１０−５０ｎＭ又は５０−１００ｎＭのいずれかである。いくつかの実施態様において、結合親和性は、約５ｎＭ又は約５０ｎＭである。いくつかの実施態様において、抗体の結合親和性は、例えば、Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)に記載されるスキャチャード解析で測定することができる。
【０１５４】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるヒト化抗体は、ＨＣＶの感染を阻害する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるヒト化抗体は、ＨＣＶシュードパーティクル（ＨＣＶｐｐ）の感染を阻害する。適切には、本明細書に記載されいるヒト化抗体は、ＨＣＶシュードパーティクルの感染を阻害することが可能であり、ＨＣＶｐｐ中和アッセイで判断される前記ヒト化抗体の存在下における感染力価のＩＣ５０は：遺伝子型１（１ａ  Ｈ７７  ２０）に対して少なくとも約０．０３２；遺伝子型１（１Ａ２０．８）に対して少なくとも約１．６；遺伝子型１（１Ｂ５．２３）に対して少なくとも約０．９；遺伝子型２（２Ｂ１．１）に対して少なくとも約３；遺伝子型３ａ（Ｆ４／２−３５）に対して少なくとも約０．４１；遺伝子型４（４．２１．１６）に対して少なくとも約０．４１；遺伝子型６（６．５．８）に対して少なくとも約０．４１；及び遺伝子型５（５．１５．１１）に対して少なくとも０．０５３。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるヒト化抗体又はその断片は、ＨＣＶシュードパーティクルの感染を阻害することが可能であり、ＨＣＶｐｐ中和アッセイで判断される前記ヒト化抗体の存在下における感染力価のＩＣ５０は、遺伝子型１（１ａ  Ｈ７７  ２０）に対して約０．４１未満、約０．１３７未満又は約０．３２、遺伝子型１（１Ａ２０．８）に対して約１．６、遺伝子型１（１Ｂ５．２３）に対して約０．９、遺伝子型２（２Ｂ１．１）に対して約３、遺伝子型２（２ａ  ＪＦＨ１）に対して約０．６４、遺伝子型２（２Ａ２．４）に対して約０．５１、遺伝子型３（３ａ  Ｆ４／２−３５）に対して約０．４１未満、遺伝子型４（４．２１．１６）に対して約０．４１未満、遺伝子型５（５．１５．１１）に対して約０．０５３又は遺伝子型６（６．５．８）に対して約０．４１未満の何れかである。
【０１５５】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるヒト化抗体はＨＣＶｐｐの感染を阻害することが可能であり、ＨＣＶｐｐ中和アッセイで判断される前記ヒト化抗体の存在下における感染力価のＩＣ５０は：遺伝子型１ｂに対して少なくとも約０．５１１又は２ａ遺伝子型に対して少なくとも約０．７９３である。
【０１５６】
適切には、ＨＣＶｐｐ中和アッセイで判断される前記ヒト化抗体の存在下における感染力価のＩＣ９０は：遺伝子型１（１ａ  Ｈ７７  ２０）に対して少なくとも約０．６；遺伝子型１（１Ａ２０．８）に対して少なくとも約１５；遺伝子型１（１Ｂ５．２３）に対して少なくとも約８．３；遺伝子型２（２Ｂ１．１）に対して少なくとも約１５；遺伝子型３ａ（Ｄ４／２−３５）に対して少なくとも約２．１５；遺伝子型４（４．２１．１６）に対して少なくとも約０．９２；遺伝子型６（６．５．８）に対して少なくとも約１．８；及び遺伝子型５（５．１５．１１）に対して少なくとも０．８２である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるヒト化抗体又はその断片は、ＨＣＶシュードパーティクルの感染を阻害することが可能であり、ＨＣＶｐｐ中和アッセイで判断される前記ヒト化抗体の存在下における感染力価のＩＣ９０は、遺伝子型１（１ａ  Ｈ７７  ２０）に対して約０．４１、約２．４又は約０．６未満、遺伝子型１（１Ａ２０．８）に対して約１５、遺伝子型１（１Ｂ５．２３）に対して約８．３、遺伝子型２（２Ｂ１．１）に対して約１５以上、遺伝子型２（２ａ  ＪＦＨ１）に対して約７、遺伝子型２（２Ａ２．４）に対して約０．５１、遺伝子型３（３ａ  Ｆ４／２−３５）に対して約０．４１未満、遺伝子型４（４．２１．１６）に対して約６未満、遺伝子型５（５．１５．１１）に対して約０．８２又は遺伝子型６（６．５．８）に対して約１．８未満である。
【０１５７】
］  いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるヒト化抗体は、組換え細胞培養由来ＨＣＶ（ＨＣＶｃｃ）の感染を阻害する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるヒト化抗体は、ＨＣＶｃｃの感染を阻害することが可能であり、ＨＣＶｐｐ中和アッセイで判断される前記ヒト化抗体の存在下における感染力価のＥＣ５０は：遺伝子型１ｂに対して少なくとも約０．７２又は遺伝子型２ａに対して少なくとも約１．７である。
【０１５８】
いくつかの実施態様において、ヒト化抗体又はその断片は、上記の特性の一つ以上を示す。
【０１５９】
（ｖ）ヒト抗体
ヒト化に代わるものとして、ヒト抗体を作製することができる。例えば、免疫化に応じて、内因性の免疫グロブリンを産生することなくヒト抗体の完全なレパートリーを産生可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を作出することが現在可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異体マウスの抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失が、内因性の抗体産生の完全な阻害を引き起こすことは述べられてきた。そのような生殖細胞系変異体マウスへのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの導入は、抗原の暴露に応じてヒト抗体の産生を生じさせる。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)；及び米国特許第５５９１６６９、５５８９３６９及び５５４５８０７を参照のこと。
【０１６０】
あるいは、ファージディスプレイ技術（McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)）は、免疫化されていないドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産生するために用いることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージ（例えばＭ１３又はｆｄ）の主要コートタンパク質又はマイナーコートタンパク質遺伝子へインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上の機能的抗体断片として提示される。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づく選別は、それらの特性を示す抗体をコード化する遺伝子の選別をもたらす。したがって、ファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣する。ファージディスプレイは、種々のフォーマットで行われる；それらの概要として、例えばJohnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)を参照のこと。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源は、ファージディスプレイに用いることができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)は、免疫化されたマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さいランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫化されていないヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーを構築することは可能であり、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体は基本的にMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)又はＧriffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)に記載される技術に従って単離することができる。米国特許第５５６５３３２及び５５７３９０５も参照のこと。
【０１６１】
ヒト抗体は、インビトロで活性化Ｂ細胞によって作製され得る（米国特許５５６７６１０及び５，２２９，２７５を参照）。
【０１６２】
（ｖｉ）抗体断片
様々な技術は、抗体断片の産生のために発達してきた。従来は、これらの断片は完全な抗体のタンパク質消化によって誘導された（例えばMorimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan et al., Science, 229:81 (1985)を参照）。しかしながら、これらの断片は、現在では組換え宿主細胞によって直接産生することができる。例えば、抗体断片は、上記の抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、直接大腸菌から回収することができ、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成するために化学的に結合することができる（Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)）。他の手法によれば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片産生のための他の技術は、熟練した専門家には明らかである。他の実施態様において、最適の抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５５７１８９４；及び米国特許第５５８７４５８を参照のこと。例えば米国特許５６４１８７０に記載されるように、抗体断片は例えば「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は、単一特異性又は二重特性であってもよい。
【０１６３】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗体の断片が提供される。いくつかの実施態様において、抗体断片は、抗原結合断片である。いくつかの実施態様において、抗体の抗原結合断片は、ＨＣＶに結合する。いくつかの実施態様において、抗体の抗原結合断片は、ＨＣＶＥ２タンパク質、可溶性ＨＣＶＥ２タンパク質又はＨＣＶＥ１タンパク質及びＨＣＶＥ２タンパク質のヘテロダイマーに結合可能であるいくつかの実施態様において、ＨＣＶＥ２タンパク質は、遺伝子型１（例えば遺伝子型１ａ及び遺伝子型１ｂ）、遺伝子型２（例えば遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型２ｃ）、遺伝子型３（例えば遺伝子型３ａ）、遺伝子型４、遺伝子型５及び遺伝子型６からなる群から選択されるＨＣＶ遺伝子型の一つ以上からのものである。
【０１６４】
一般的に、これらの断片は、少なくとも１０７、より一般的には１０８又は１０９の親和性で、抗原への特異的結合を示す。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体断片は、１−１００ｎＭの結合親和性で、可溶性ＨＣＶＥ２タンパク質に結合する。いくつかの実施態様において、結合親和性は、１−１０ｎＭ、１０−５０ｎＭ又は５０−１００ｎＭのいずれかである。いくつかの実施態様において、結合親和性は、約５ｎＭ又は約５０ｎＭである。いくつかの実施態様において、抗体は１−１００ｎＭの結合親和性でＨＣＶ  Ｅ１／ＨＣＶ  Ｅ２ヘテロダイマーに結合する。いくつかの実施態様において、結合親和性は、１−１０ｎＭ、１０−５０ｎＭ又は５０−１００ｎＭのいずれかである。いくつかの実施態様において、結合親和性は、約５ｎＭ又は約５０ｎＭである。いくつかの実施態様において、抗体の結合親和性は、例えばMunson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)に記載されるスキャチャード解析で測定することができる。
【０１６５】
いくつかの実施態様において、これらの断片は、本明細書に記載されるＡＰ３３モノクローナル抗体又はヒト化抗体と（実質的に）同一のＨＣＶ中和活性をを示す。
【０１６６】
いくつかの実施態様において、ヒト化抗体断片は、機能性断片である。ヒト化ＡＰ３３抗体の機能性断片のような本明細書に記載されるヒト化抗体の「機能性断片」は、それらが由来する完全長分子と実質的に同一の結合性を保持し、本明細書に記載されるようなインビトロ又はインビボのアッセイで測定される生物学的活性を示す断片である。いくつかの実施態様において、機能性断片は、ＨＣＶｐｐ及び／又はＨＣＶｃｃ中和アッセイに示されるように、ＨＣＶを中和及び／又は阻害する。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体断片は、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質のＣＤ８１との相互作用を防止及び／又は阻害する。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体断片は、細胞へのＨＣＶの侵入を予防及び／又は阻害する。いくつかの実施態様において、細胞は、肝臓の細胞（例えば肝細胞）である。
【０１６７】
（ｖｉｉ）二重特異性抗体  
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、Ｂ細胞表面マーカーの２つの異なるエピトープに結合し得る。他のそのような抗体は、Ｂ細胞表面マーカーに結合し、さらに第二の異なるＢ細胞表面マーカーに結合し得る。あるいは、抗Ｂ細胞表面マーカー結合アームは、細胞防御機構をＢ細胞に集中させるために、Ｔ細胞受容体分子（例えばＣＤ２又はＣＤ３）、又は例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などのＩｇＧ（ＦｃγＲ）に対するＦｃ受容体などの白血球上にあるトリガー分子に結合するアームと組み合わせてもよい。二重特異性抗体は、Ｂ細胞に細胞障害性剤を局所化するためにも用いられ得る。これらの抗体は、Ｂ細胞表面マーカー結合アーム及び細胞障害性剤（例えばサポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位元素ハプテン）に結合するアームを有する。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製され得る。
【０１６８】
二重特異性抗体の製作方法は、従来技術において公知である。完全長二重特異性抗体の従来の製造は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づいており、２つの鎖は異なる特異性を有する（Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の任意組合せのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、一つのみが正しい二重特異性構造を有する１０の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生する。正しい分子の精製（通常アフィニティークロマトグラフィの工程により行われる）は、かなりわずらわしく、産物産生量は低い。類似の手法は、ＷＯ９３／０８８２９及びTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示される。
【０１６９】
異なる手法によれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。いくつかの実施態様において、融合物は、少なくともヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有する。いくつかの実施態様において、軽鎖との結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）は、少なくとも融合物の一つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合物及び、所望により免疫グロブリン軽鎖をコード化するＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、適切な宿主生物に同時形質導入される。構築において用いられる３つのポリペプチド鎖の不均等な比率が最適な生産量を提供する場合、実施態様の３つのポリペプチド断片の相互の比率を調整する際の大きなフレキシビリティが提供される。しかしながら、等しい比率の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収率で生じる場合、又は比率が重要でない場合、２つ又は３つ全てのポリペプチド鎖のコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することは可能である。
【０１７０】
この手法のいくつかの実施態様において、二重特異性抗体は、１つのアーム中の第一の結合特異性を有する複合型免疫グロブリン重鎖及び他のアーム中の複合型免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）から構成される。二重特異性分子の片側半分のみにある免疫グロブリン軽鎖の存在が容易な分離方法を提供するように、この非対称の構造が望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせから所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが見出された。この手法は、ＷＯ９４／０４６９０に開示される。二重特異性抗体作成の詳細については、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照のこと。
【０１７１】
米国特許第５，７３１，１６８に記載される他の手法によれば、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーの割合を最大にするように一対の抗体分子間の境界面を設計することができる。いくつかの実施態様において、境界面は、少なくとも抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの一部を含む。この方法では、第一の抗体分子の境界面の一つ以上の小さいアミノ酸側鎖は、より大きい側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置換される。大きい側鎖と同一又は類似の大きさの代償性の(compensatory)「キャビティ」は、大きいアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することによって第二の抗体分子の境界面に作成される。他の望ましくない最終生産物（例えばホモダイマー）よりもヘテロダイマーの産生を増加させるメカニズムが提供される。
【０１７２】
二重特異性抗体は、架橋された抗体又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一つはアビジンに、もう一方はビオチンに結合することができる。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞が望ましくない細胞を目標とするように（米国特許第４６７６９８０）、及びＨＩＶ感染症の治療のために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３及びＥＰ０３０８９）提唱された。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の便利な架橋法を用いて製作され得る。適切な架橋剤は公知技術であり、多くの架橋技術とともに米国特許第４６７６９８０に開示される。
【０１７３】
抗体断片から二重特異性抗体を作製するための技術もまた文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を用いて調製され得る。Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)は、Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するように完全な抗体がタンパク質分解性に切断される手法を記載する。これらの断片は、近接のジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防止するために、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウム存在下で還元される。作製されたＦａｂ’断片は、続いてチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つはそれからメルカプトエチルアミンを用いた還元によってＦａｂ’−チオールへと再変換され、二重特異性抗体を形成するために他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合される。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化剤として用いることができる。
【０１７４】
二重特異性抗体断片を製作し、組換え細胞培養物から直接単離するための様々な技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて製造された。Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。抗体ホモダイマーはモノマーを形成するようヒンジ領域で還元され、次にヘテロダイマーを形成するよう再酸化された。この方法は、抗体ホモダイマーの製造のためにも利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に記載される「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を製作するための他のメカニズムを提供した。断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間でペアリングするには短いリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは、他の断片の相補的なＶＬ及びＶＨドメインとペアリングすることが強制され、それにより２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二重特異性抗体断片を製作するための他のストラテジーも報告されている。Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照のこと。
【０１７５】
２つ以上の結合価を有する抗体が考えられる。例えば、三重特異性抗体が調製され得る。Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)。
【０１７６】
（ｖｉｉｉ）多価抗体  
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早く内部移行（及び／又は異化）され得る。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体（ＩｇＭクラス以外のもの）であり得（例えば四価抗体）、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を含み得る。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を含む（又はそれらからなる）。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。本明細書の好ましい多価抗体は、３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を含む（又はそれらからなる）。。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖（好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、ポリペプチド鎖は２又はそれ以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含み、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖は：ＶＨ−ＣＨ１−柔軟なリンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含んでもよい。本明細書の多価抗体は、好ましくは少なくとも２つの（好ましくは４つの）軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含む。本明細書の多価抗体は、例えば、約２ないし約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含んでもよい。本明細書で意図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを含み、場合によってＣＬドメインをさらに含む。
【０１７７】
（ｉｘ）他のアミノ酸配列の改変
本明細書に記載されるＨＣＶ結合抗体のアミノ酸配列の改変が意図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的性質を改善することは望ましい。ヒト化ＡＰ３３抗体のような抗ＨＣＶ抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を抗ＨＣＶ抗体核酸に導入することによって、又はペプチド合成によって調製される。そのような改変は、例えば、抗ＨＣＶ抗体のアミノ酸配列の範囲内の残基の欠失及び／又は置換及び／又は挿入を含む。最終的な構築物が所望の特性を所有すると仮定するならば、欠失、挿入及び置換の任意の組合せは最終的な構築物に到達するために行われる。アミノ酸変化は、例えばグリコシル化部位の位置を変えるなど、抗ＨＣＶ抗体の翻訳後プロセスを変更し得る。  
【０１７８】
Cunningham and Wells in Science, 244:1081-1085 (1989)に記載されるように、突然変異誘発の好ましい場所である抗ＨＣＶ抗体の特定の残基又は領域を同定するための有用な方法は、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、残基又は標的残基群は同定され（例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）、ＨＣＶ抗原とアミノ酸の相互作用に影響を及ぼすために中性又は負電荷アミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）で置換される。置換に対して機能感受性を示すそれらのアミノ酸位置は、置換部位に、更なる又は他の変異体を導入することによって改良される。したがって、アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め定められているのに対して、変異の性質自体は予め定められている必要はない。例えば、特定の部位での変異の成績を解析するために、アラニンスキャニング又はランダム突然変異誘発は、標的コドン又は領域で行われ、発現された抗ＨＣＶ抗体変異体は所望の活性についてスクリーニングされる。
【０１７９】
アミノ酸配列挿入は、単一の残基から１００以上の残基を含むポリペプチド長にわたるアミノ末端及び／又はカルボキシ末端融合、及び単一又は複数のアミノ酸残基の配列内への挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗ＨＣＶ抗体、又は細胞障害性ポリペプチドに融合された抗体を含む。抗ＨＣＶ抗体分子の他の挿入性変異体は、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えばＡＤＥＰＴ）又はポリペプチドの抗ＨＣＶ抗体のＮ又はＣ末端への融合を含む。
【０１８０】
変異体の他の型は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗ＨＣＶ抗体分子中に異なる残基で置換された少なくとも一つのアミノ酸残基を有する。置換突然変異誘発の最も興味がある部位は、超可変領域を含むが、ＦＲの変更はも意図される。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しの下、下記の表に示される。そのような置換が生物学的活性の変化を引き起こす場合、表に「例示的な置換」と示されるか、下記のアミノ酸クラスに関する文献にさらに記載されるようなより実質的な変化が導入され、その産物がスクリーニングされ得る。
表１
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【０１８１】
抗体の生物学的性質の実質的な改変は、（ａ）例えばシート構造又はヘリカル構造としての、置換の領域におけるポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性又は（ｃ）側鎖のバルクの維持に対するその効果において優位に異なる置換を選択することによって成し遂げられる。アミノ酸はそれらの側鎖の特性の類似性に従って分類され得る（A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975））：
（１）  無極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
【０１８２】
あるいは、自然発生的な残基は、共通の側鎖特性に基づいて群に分けられてもよい：
（１）  疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）  中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；  
（３）  酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）  塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）  鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）  芳香性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１８３】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスと交換することを伴う。
【０１８４】
抗ＨＣＶ抗体の適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基は、分子の酸化安定度を改良し、異常な架橋を防ぐために、（一般的にはセリンで）置換されてもよい。逆にいえば、システイン結合は、（特に抗体がＦｖ断片のような抗体フラグメントである場合）その安定性を改善するために抗体から付加されてもよい。
【０１８５】
特に好ましい置換変異の型は、親抗体（例えばヒト化抗体）の一つ以上の超可変領域残基の置換に関与する。一般に、更なる開発のために選択され、生じた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して、改善された生物学的性質を有する。そのような置換変異体を作製するための便利な方法は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟に関与する。簡潔には、いくつかの超可変領域部位（例えば６−７の部位）は、それぞれの部位で起こりうる全てのアミノ酸置換を作製するように変異される。したがって、作製される抗体変異体は、それぞれの粒子中にパックされるＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として繊維状ファージ粒子の一価性の形状で提示される。本明細書に開示されるように、ファージに提示された変異体は、それらの生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。改変のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発は、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定するために行われる。あるいは、又はさらに、抗体及びＨＣＶの間の接触点を同定するために抗原抗体複合体の結晶構造を解析することは有益である。そのような接触残基及び隣接残基は、本明細書において詳述される技術による置換の候補である。一旦そのような変異体が作製されると、本明細書において記載されているように、変異体のパネルはスクリーニングにかけられ、一つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体はさらなる開発のために選択され得る。
【０１８６】
抗体のアミノ酸変異体の他の型は、抗体本来のグリコシル化パターンが変更されている。ヒト化抗体は、アミノ酸以外の部分を含んでもよい。例えば、ヒト化抗体はグリコシル化されてもよい。そのようなグリコシル化は、宿主細胞又は宿主生物のヒト化抗体の発現において自然に発生してもよく、ヒトの介入による計画的な改変であってもよい。変更とは、抗体において見いだされる一つ以上の炭化水素部分の欠失、及び／又は抗体に存在しない一つ以上のグリコシル化部位の付加を意味する。
【０１８７】
抗体のグリコシル化は、一般的にＮ−結合型又はＯ−結合型である。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭化水素部分の給合を意味する。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）は、アスパラギン側鎖への炭化水素部分の酵素給合のための認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作製する。Ｏ−結合型グリコシル化は、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも用いられうるが、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つのヒドロキシアミノ酸（最も一般的にはセリン又はスレオニン）への付着を意味する。
【０１８８】
上記のトリペプチド配列（Ｎ結合型グリコシル化部位）の一つ以上を含むように、抗体へのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列を変更することによって簡便に成し遂げられる。変更は、抗体本来の配列（Ｏ結合型グリコシル化部位）に、一つ以上のセリン又はスレオニン残基の付加又は置換によって行われてもよい。
【０１８９】
抗ＨＣＶ抗体のアミノ酸配列変異体をコード化する核酸分子は、公知技術の種々の方法によって調製される。これらの方法は、天然の供給源からの単離（自然発生的なアミノ酸配列変異体の場合）、又は抗ＨＣＶ抗体の事前に調製された変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介（又は部位直接）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発及びカセット突然変異誘発による調製を含むが、これに限定されるものではない。
【０１９０】
本明細書で提供される抗体を、例えば抗体の抗原依存性細胞媒介細胞障害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）を増強するためにエフェクター機能に関して改変することは、望ましい。これは、抗体のＦｃ領域において一つ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成され得る。あるいは、又はさらに、システイン残基をＦｃ領域において導入してもよく、それによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能とする。したがって、作製されたホモダイマー抗体は、改善された内部移行能、及び／又は増加した補体媒介性細胞死滅及び抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を有し得る。Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, B. J., Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照のこと。増強された抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体は、Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されるように、ヘテロ二機能性架橋剤を用いても調製され得る。あるいは、二重Ｆｃ領域を有する抗体を設計することが可能であり、これにより増強された補体媒介細胞溶解及びＡＤＣＣ能を有し得る。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照のこと。
【０１９１】
抗体の血清半減期を増加させるために、アミノ酸変異は、本明細書にその全てが援用される米国第２００６／００６７９３０号に記載されるように、抗体において行うことができる。
【０１９２】
（ｘ）他の抗体改変
本明細書では、抗体の他の改変が意図される。例えば、抗体は、種々の非タンパク性ポリマー（例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールのコポリマー）の一つと結合されてもよい。抗体は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法（それぞれ、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート(methylmethacylate)）マイクロカプセル）により調製されるマイクロカプセル、コロイドドラッグデリバリーシステム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）、又はマクロエマルジョン中に封入されてもよい。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)に開示される。
【０１９３】
さらに、又はあるいは、ヒト化抗体は他の化学的改変が行われてもよい。そのような望ましい改変は、一つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）成分の付加である。ペグ化は、インビボで様々な抗体断片の半減期を有意に増加させることが示されている（Chapman 2002 Adv. Drug Delivery Rev. 54, 531-545)。しかしながら、抗体断片のランダムなペグ化は、抗原に対する断片の結合親和性に高度に悪影響を与え得る。これを回避するために、ペグ化はヒト化抗体の特定の標的残基に限定されることが望ましい（上記、Knight et al, 2004 Platelets 15, 409-418 and Chapmanを参照）。
【０１９４】
（ｘｉ）所望の特性を有する抗体のスクリーニング
実験的実施例に記載されるように、特定の生物学的特性を有する抗体は選択されてもよい。
【０１９５】
興味がある抗体が結合するＨＣＶＥ２タンパク質上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されるような慣用的な交差ブロックアッセイを行うことができる。このアッセイは、試験抗体が、本発明で提供される抗ＨＣＶＥ２抗体と同一の部位又はエピトープに結合するかどうかを決定するために用いることができる。あるいは、又はさらに、その技術分野で公知の方法によってエピトープマッピングを行うことができる。例えば、抗体配列は、接触残基を同定するために、例えばアラニンスキャニングにより、突然変異が誘発され得る。変異抗体は、まず最初に、適当な折畳みを確認するために、ポリクローナル抗体と共に結合について試験される。異なる方法において、ＨＣＶＥ２タンパク質の異なる領域に対応するペプチドは、試験抗体、又は試験抗体及びエピトープが明らかにされたが既知である抗体を用いた競合アッセイにおいて用いることができる。
【０１９６】
いくつかの実施態様において、抗体は、ＨＣＶの感染を中和する能力についてスクリーニングされ得る。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるように、ＨＣＶの感染の中和は、ＨＣＶシュードパーティクル（ＨＣＶｐｐ）中和アッセイに基づく。ＨＣＶｐｐは、レトロウイルス又はレンチウイルスのコアパーティクル上に構築された、改変されていないＨＣＶエンベロープグリコプロテインから成っている。ＨＣＶｐｐは、ＨＣＶエンベロープタンパク質依存的に、肝癌細胞株及び肝細胞に感染する。ＨＣＶｐｐ内にパッケージされたマーカー遺伝子の存在は、迅速かつ高い信頼性の抗体媒介性中和の測定を可能にする。いくつかの実施態様において、ＨＣＶの感染の中和は、本明細書に記載されるように、ヒト肝癌細胞株を感染させる組換え細胞培養誘導ＨＣＶ（ＨＣＶｃｃ）中和アッセイに基づく。
【０１９７】
ＩＩＩ．ポリヌクレオチド
【０１９８】
本発明では、本明細書に記載される抗体又は抗体断片をコード化するポリヌクレオチドも提供される。
【０１９９】
本明細書において交換可能に用いられる用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。
【０２００】
例えば、ポリヌクレオチドは、完全な免疫グロブリン分子鎖（例えば軽鎖又は重鎖）をコード化してもよい。完全な重鎖は重鎖可変領域（ＶＨ）だけでなく、通常３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３；及び「ヒンジ」領域を含む重鎖定常領域（ＣＨ）も含む。いくつかの状況において、定常領域の存在は望ましい。例えば、抗体がＨＣＶ−感染細胞を死滅させることが所望される場合、完全な定常領域の存在は補体を活性化するために望ましい。しかしながら、他の状況では、完全な定常領域の存在は望ましくない。
【０２０１】
ポリヌクレオチドは、可変軽鎖及び／又は可変重鎖をコード化してもよい。
【０２０２】
ポリヌクレオチドによってコード化される他のポリペプチドは、抗原結合性抗体断片（例えば単一領域抗体（「ｄＡｂｓ」）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２）及び「ミニボディ」を含む。ミニボディは、（一般的に）ＣＨ１及びＣＫ又はＣＬドメインが切り取られた二価抗体断片である。ミニボディが通常の抗体より小さいように、それらは臨床／診断的使用においてより望ましい組織浸透が達成されるが、二価であることで、それらは、ｄＡｂｓなどの一価の抗体断片より高い結合親和性を保持するであろう。したがって、文脈から指示されない限り、本明細書で用いられる用語「抗体」は、全抗体分子だけでなく、上記で検討される型の抗原結合性抗体断片も含む。
【０２０３】
コード化されたポリペプチドが一般的にＡＰ３３と同一又は実質的に同一のＣＤＲ配列を有するのに対して、フレームワーク領域はヒト起源のＡＰ３３とは異なる。ＡＰ３３の重鎖及び／又は軽鎖（適切に）と関連して本明細書において記載されるように、ポリヌクレオチドは、好ましくは重鎖及び／又は軽鎖可変領域を有するポリペプチドをコード化する。コード化されたポリペプチドが部分的又は完全な重鎖及び／又は軽鎖定常領域を含む場合、これもヒト起源であることが好都合である。
【０２０４】
好ましくはコード化されたポリペプチドのフレームワーク領域の少なくとも一つ及び最も好ましくはフレームワーク領域のそれぞれは、ヒト化抗体の結合活性を増加させるために、ＡＰ３３により類似したものとなるために、ヒト・アクセプターに関与するアミノ酸の置換を含む。
【０２０５】
好ましくは、コード化されたポリペプチドに存在するそれぞれのフレームワーク領域は、対応するヒトアクセプターフレームワークと関連する少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。したがって、例えば、フレームワーク領域は、全体で、アクセプターフレームワーク領域と関連する３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のアミノ酸置換を含んでもよい。好都合には、変異は、マウスのＡＰ３３フレームワークの同等の位置に存在する残基に適合する復帰突然変異である。好ましくは、６つの復帰突然変異は、重鎖において製作され、一つは軽鎖において作製される。
【０２０６】
適切には、本明細書に記載されるポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドは、単離及び／又は精製されていてもよい。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドは、単離されたポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドである。用語「単離された」は、その分子が正常又は天然の環境から分離又は除去されたこと、又は正常又は天然の環境に存在しないような方法で製造されたことを示すことが意図されている。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドは、精製されたポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドである。用語「精製された」は、少なくともいくつかの混入分子又は物質が取り除かれたことを示すことが意図されている。
【０２０７】
適切には、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドは実質的に精製され、関連するポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドは組成物に存在する主要なポリヌクレオチド又はポリペプチドを構成する（すなわち最も多量）。
【０２０８】
重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコード化する挿入物を含む組換え核酸は、本明細書に記載されるような方法において用いられてもよい。定義上、そのような核酸は、コード化一本鎖核酸、前記コード化核酸及びそれに相補的な核酸からなる二本鎖核酸、又はこれらの相補的な（一本鎖）核酸そのものを含む。
【０２０９】
改変は、ＡＰ３３抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインのの外側で製作されてもよい。そのような変異核酸は、一つ以上のヌクレオチドが同じアミノ酸をコード化する新規なコドンで置換されるサイレント変異であってもよい。そのような変異配列は、変性した配列であってもよい。変性した配列は、本来のコード化されるアミノ酸配列を変更することなく、無数のヌクレオチドが他のヌクレオチドにより置換された遺伝コードの意義の範囲内で変性される。そのような変性された配列は、重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインの最適の発現を得るために、異なる制限酵素認識部位及び／又は特定の宿主（特に酵母、バクテリア又は哺乳動物細胞に好まれる特定のコドンの頻度により、有用であり得る。
【０２１０】
本明細書において提供されるのは、本明細書で定義される特定の性質を有するポリペプチドのアミノ酸配列に対してある程度の配列同一性又は配列相同性を有する配列、又はそのようなポリペプチドをコード化する任意のヌクレオチド配列（以下に「相同配列」と称する）の使用である。ここで、用語「ホモログ」は、対象アミノ酸配列及び対象ヌクレオチド配列と一定の相同を有する対象物を意味する。ここで、用語「相同性」は、「同一性」と同等と考えることができる。
【０２１１】
いくつかの実施態様において、相同なアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列は、機能活性を保持及び／又は抗体の活性を増強するポリペプチドを提供及び／又はコード化するであろう。いくつかの実施態様において、相同配列は、対象配列に対して少なくとも７５、８５又は９０％同一であるか、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むと考えられる。一般的に、ホモログは対象アミノ酸配列と同一の活性部位等を含む。相同性は、類似性（すなわち同様の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）に関しても考慮され得る。いくつかの実施態様において、配列同一性に関して相同性で表されることが好ましい。
【０２１２】
現在の文脈において、相同配列は、本明細書に記載されるポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列（対象配列）に対して少なくとも７５、８５又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一なヌクレオチド配列を含むと考えられる。一般的に、ホモログは対象配列と同一の活性部位等をコード化する配列を含む。相同性は、類似性（すなわち同様の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）に関しても考慮され得る。いくつかの実施態様において、配列同一性に関して相同性で表されることが好ましい。
【０２１３】
更なる態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする（例えば特異的にハイブリダイズする）ことが可能なポリヌクレオチド配列が提供される。
【０２１４】
本明細書で用いられる用語「ハイブリダイゼーション」は、「ポリヌクレオチドの鎖が塩基の対合による相補鎖と連結するプロセス」を含む。ハイブリダイゼーションの条件は、Berger and Kimmel(1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, 152, Academic Press, San Diego CA)において教示されるように、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づいており、以下に説明されるように定義されている「ストリンジェンシー」を与える。
【０２１５】
最大ストリンジェンシーは、一般的にＴｍの約５℃下で起こる；Ｔｍの約５℃から１０℃下で高いストリンジェンシー；Ｔｍの約１０℃から２０℃下で中間のストリンジェンシー；及びＴｍの約２０℃から２５℃下で低いストリンジェンシー。当業者に理解されるように、中間の（又は低い）ストリンジェンシーハイブリダイゼーションが類似又は関連する配列を同定又は検出するために用いられるのに対して、最大ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、同一のヌクレオチド配列を同定又は検出するために用いることができる。
【０２１６】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下（例えば５０℃及び０．２ｘＳＳＣ｛１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウム  ｐＨ７．０｝）でハイブリダイズ可能な配列である。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチド配列は、高ストリンジェントな条件下（例えば６５℃及び０．１ｘＳＳＣ｛１ｘＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウム  ｐＨ７．０｝）で本明細書のポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能である。
【０２１７】
本明細書において提供されるのは、本発明のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な配列に相補的なポリヌクレオチド配列である（本明細書で示されるそれらの相補配列を含む）。
【０２１８】
さらに、本明細書において提供されるのは、中間から最大のストリンジェンシーの条件下で、本明細書に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列である。
【０２１９】
ＩＶ．組換え抗体の発現
ヒト化ＡＰ３３抗体のような本明細書に記載される抗ＨＣＶ抗体をコード化する単離されたポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞、及び抗体産生のための組換え技術も提供される。本明細書に記載される抗体は、組換え発現によって産生されてもよい。
【０２２０】
本明細書に記載される軽鎖及び重鎖可変領域をコード化するポリヌクレオチドは、場合により定常領域に連結されており、発現ベクターに挿入される。軽鎖及び重鎖は、同一又は異なる発現ベクターにクローニングすることができる。免疫グロブリン鎖をコード化するＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実なものとする発現ベクターのコントロール配列に作動可能な状態で連結される。発現コントロール配列は、これに限定されるものではないが、プロモーター（例えば天然に付随する又は異種のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント及び転写終結配列を含む。
【０２２１】
適切には、発現コントロール配列は、真核宿主細胞（例えばＣｏｓ細胞−ＣＯＳ７細胞−又はＣＨＯ細胞）を形質転換又は形質導入させることが可能なベクターの真核性プロモーター系である。ベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主はヌクレオチド配列の高レベルの発現及び交差反応性抗体の回収及び精製のために適切な条件下で維持される。
【０２２２】
これらの発現ベクターは、一般的に、エピソーム又は宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分のいずれかとして宿主生物において複製可能である。
【０２２３】
選別遺伝子成分
一般に、発現ベクターは所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能とするために選択マーカー（例えばアンピシリン−耐性、ハイグロマイシン−耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性又はネオマイシン耐性）を含む（Itakura et al.、ＵＳ  ４，７０４，３６２を参照）。いくつかの実施態様において、選択遺伝子は、（ａ）例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート又はテトラサイクリンなどの抗生物質又は他の毒素に対する耐性を与える、（ｂ）栄養要求性欠損を補完する、又は（ｃ）例えばバチルスに対するＤ−アラニンラセマーゼなどの複合培地から利用可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質をコード化する。
【０２２４】
選択方式の１つの例は、宿主細胞の増殖を抑えるために薬剤を利用する。異種遺伝子で成功裏に形質転換されたそれらの細胞は、薬剤耐性を与えるタンパク質を産生し、したがって選別措置を生き残る。そのような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを用いる。
【０２２５】
哺乳動物細胞の適切な選択マーカーの他の例は、ヒト化ＡＰ３３抗体などの本明細書に記載される抗ＨＣＶ抗体をコード化する核酸を取り込む能力がある細胞の同定を可能にするものであり、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子等である。
【０２２６】
例えば、ＤＨＦＲ選別遺伝子で形質転換された細胞は、全ての形質転換体をメトトレキセート（Ｍｔｘ）（ＤＨＦＲの競合的アンタゴニスト）を含む培地で培養することによって最初に同定される。適切な宿主細胞は、野生型ＤＨＦＲが使用される場合、ＤＨＦＲ活性に欠陥があるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えばＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）である。
【０２２７】
あるいは、本明細書に記載される抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質及び他の選択マーカー（例えばアミノグリコシド  ３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ））をコード化するＤＮＡ配列で形質転換又は同時形質転換された宿主細胞（特に内因性のＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、アミノグリコシド系抗生物質（カナマイシン、ネオマイシン又はＧ４１８）などの選択マーカーに対する選択剤を含む培地における細胞増殖によって選択することができる。米国特許番号４９６５１９９を参照。
【０２２８】
酵母に用いられる適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン存在下で増殖する能力を欠く酵母突然変異株（例えばＡＴＣＣ番号４４０７６又はＰＥＰ４−１）に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１損傷の存在は、トリプトファンの非存在下での増殖により形質転換を検出するのに有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ  ２０，６２２又は３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
【０２２９】
さらに、１．６  μｍの円形プラスミドｐＫＤ１から誘導されるベクターは、クリベロマイセス属酵母の形質転換のために用いることができる。あるいは、組換え子ウシキモシンの大量産生のための発現系は、K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)において報告された。クリベロマイセスの工業用菌株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定したマルチコピー発現ベクターも開示されている。Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)。
【０２３０】
シグナル配列成分
ヒト化ＡＰ３３抗体などの本明細書に記載される抗ＨＣＶ抗体は、直接的だけでなく、異種ポリペプチド（好ましくは、シグナル配列又は成熟したタンパク質又はポリペプチドのＮ末端における特定の切断部位を有する他のポリペプチド）との融合ポリペプチドとしても組み換えで製造されてもよい。好ましくは選択される異種シグナル配列は、宿主細胞により認識及びプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチターゼにより切断される）。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、１ｐｐ又は耐熱性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物のシグナル配列で置換され得る。酵母分泌のために、天然のシグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロミケス及びクリベロマイセス属α−因子リーダーを含む）又は酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンスグルコアミラーゼリーダー、又はＷＯ９０／１３６４６に記載されるシグナルによって置換されてもよい。哺乳動物細胞の発現において、哺乳動物のシグナル配列は、ウィルス分泌リーダー（例えば単純ヘルペスｇＤシグナル）と同様に利用可能である。
【０２３１】
そのような前駆体領域のＤＮＡは、ヒト化ＡＰ３３抗体などの本明細書に記載される抗ＨＣＶ抗体をコード化するＤＮＡのリーディングフレームにライゲーションされる。
【０２３２】
複製開始点
発現及びクローニングベクターは、一以上の選択された宿主細胞においてベクターを複製可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターが宿主の染色体ＤＮＡとは独立して複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自己複製配列を含む。そのような配列は、種々の細菌、酵母及びウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始点は大部分のグラム陰性菌に対して適切であり、２μプラスミド開始点は酵母に適切であり、様々なウィルスの開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウィルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞のクローニングベクターに有用である。一般に、複製開始点成分は、哺乳動物発現ベクターでは必要とされない（初期プロモーターを含むことから、ＳＶ４０開始点は一般的に用いられ得る）。
【０２３３】
プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、ヒト化ＡＰ３３抗体などの本明細書に記載される抗体をコード化する核酸に作動可能に連結されるプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に適切なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系及びハイブリッドプロモーター（例えばｔａｃプロモーター）を含む。しかしながら、他の既知のバクテリアのプロモーターは適切である。バクテリア系での使用のためのプロモーターは、抗ＨＣＶ抗体をコード化するＤＮＡに作動可能に連結されるＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
【０２３４】
真核生物に対するプロモーター配列は既知である。実質的に、全ての真核細胞遺伝子は、転写が開始される部位の約２５から３０塩基上流に位置するＡＴ−リッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０から８０塩基上流で見出された他の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域（Ｎは任意のヌクレオチドであってもよい）である。コード化配列の３’末端にポリＡテールを付加し得るシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列は、大部分の真核細胞遺伝子の３’末端に存在する。これらの配列の全ては、真核細胞発現ベクターに適切に挿入される。
【０２３５】
酵母宿主での使用のための適切なプロモーター配列の例は、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の糖分解酵素（例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース６リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼ）のためのプロモーターを含む。
【０２３６】
増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素及びマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素のためのプロモーター領域である。酵母発現における使用に適切なベクター及びプロモータは、ＥＰ  ７３，６５７にさらに記載されている。酵母エンハンサーもまた酵母プロモーターと共に有利に用いられる。
【０２３７】
そのようなプロモーターが宿主細胞系と適合している場合、  哺乳動物宿主細胞におけるベクターからのヒト化ＡＰ３３抗体などの本明細書に記載される抗ＨＣＶ抗体の転写は、例えば、ポリオーマウィルス、鶏痘ウィルス、アデノウィルス（例えばアデノウィルス２）、ウシパピローマウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及び最も好ましくはシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムからの得られるプロモーター、異種の哺乳類のプロモーター（例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター）、ヒートショックプロモーターにより制御される。
【０２３８】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウィルス複製開始点を含むＳＶ４０制限フラグメントとして好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして好都合に得られる。ベクターとしてウシパピローマウィルスを用いた哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現するための系は、米国特許番号４，４１９，４４６に開示される。この系の改変は、米国特許番号４，６０１，９７８に記載されている。単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒト．ベータ．−インターフェロンｃＤＮＡの発現については、Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)を参照のこと。あるいは、ニワトリ肉腫ウイルス末端反復配列は、プロモーターとして用いることができた。
【０２３９】
エンハンサーエレメント成分
高等真核生物による、ヒト化ＡＰ３３抗体などの本明細書に記載される抗ＨＣＶ抗体をコード化するＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって多くの場合増加する。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）の多くのエンハンサー配列は、現在公知となっている。一般的に、しかしながら、真核細胞ウイルスのエンハンサーが用いられる。例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（塩基対１００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーを含む。真核細胞プロモーターの活性化のための増強エレメントについてはYaniv, Nature 297:17-18 (1982)を参照のこと。エンハンサーは、ＨＣＶ結合抗体コード化配列の位置５’又は３’の位置でベクターにスプライスされてもよいが、好ましくはプロモーターの部位５’に位置する。
【０２４０】
転写終結成分
真核宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト又は他の多細胞生物の有核細胞）において用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡを安定化に必要な配列をも含む。そのような配列は、５’及び時折３’、真核細胞又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの非翻訳領域で一般に利用可能である。ある有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６及びそこに開示される発現ベクターを参照のこと。
【０２４１】
ポリヌクレオチド配列（例えば可変重鎖及び／又は可変軽鎖コード化配列及び選択的な発現コントロール配列）を含むベクターは、細胞宿主の型により異なる周知の方法によって宿主細胞に移すことができる。例えば、塩化カルシウム形質導入は原核細胞に対して一般に利用されているが、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクション、微粒子銃又はウィルスベースの形質導入は他の細胞宿主のために用いられてもよい。（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989）を参照のこと。哺乳動物を形質転換するために用いられる他の方法は、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション及びマイクロインジェクションの使用を含む（例えばSambrook et al.、上掲）。トランスジェニック動物の作出のために、導入遺伝子は、受精した卵母細胞に顕微注入するか、胚性幹細胞のゲノムに組み込まれ、そのような細胞の核は除核された卵母細胞に移すことができる。
【０２４２】
重鎖および軽鎖が別々の発現ベクターにクローニングされる場合、ベクターは発現及び完全な免疫グロブリンの構築を得るために同時形質導入される。発現されると、全ての抗体、それらのダイマー、個々の軽鎖及び重鎖又は他の免疫グロブリンの形態は、硫安沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィ、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動などを含む標準的方法に従って精製される（Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)を参照）。製薬学的用途においては、少なくとも約９０から９５％の均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８から９９％以上の均一性が最も好ましい。
【０２４３】
（ｉ）構築物
本明細書に記載されるように、本発明はポリヌクレオチドを含む核酸構築物を提供する
【０２４４】
一般的に、構築物は、適切な宿主において、ポリヌクレオチドによってコード化されるポリペプチドの発現を可能とする発現ベクターである。構築物は、例えば、以下の一つ以上を含んでもよい：宿主において活性なプロモーター；一以上の制御配列（例えばエンハンサー）；複製開始点；及びマーカー（好ましくは選択可能なマーカー）。宿主は真核性又は原核生物の宿主であってもよいが、真核性（及び特に哺乳動物）宿主が好ましい。適切なプロモーターの選択は、ある程度用いられる宿主細胞に明らかに依存するが、ヒトウイルス（例えばＨＳＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶスなど）のプロモーターを含んでもよい。多数のプロモーターは、当業者に公知である。
【０２４５】
構築物は、３つの軽鎖超可変ループ又は３つの重鎖超可変ループを含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含んでもよい。あるいは、ポリヌクレオチドは、長さの適度にフレキシブルなリンカーで適切に連結された３つの重鎖超可変ループ及び３つの軽鎖超可変ループを含むポリペプチドをコード化してもよい。他の可能性は、単一の構築物が２つの別々のポリペプチド（一つは軽鎖ループを含み、一つは重鎖ループを含む）をコード化するポリヌクレオチドを含むということである。別々のポリペプチドは、独立して発現されてもよく、単一の共通のオペロンの一部を形成してもよい。
【０２４６】
構築物は、一つ以上の制御特徴（例えばエンハンサー、複製開始点及び一つ以上のマーカー（選択可能又はその反対））を含んでもよい。構築物は、プラスミド、酵母人工染色体、酵母ミニクロモソームという形をとってもよく、特にヒトにとって非病原性の弱毒ウィルス又は同様のウイルスのゲノムの全部または一部に組み込まれてもよい。
【０２４７】
構築物は、哺乳動物（好ましくはヒト）対象への安全な投与に都合良く調製されてもよい。一般的に、それらは複数のアリコートにおいて提供され、それぞれのアリコートは少なくとも一人の正常な成体ヒト対象を効果的に免疫化するのに充分な構築物を含む。
【０２４８】
構築物は液体又は固体の形態で提供されてもよく、好ましくは、一般的に使用する前に無菌水性液で再水和される冷凍乾燥させたパウダーとして提供される。
【０２４９】
構築物は、構築物の投与に応答して対象の免疫応答を増加させる効果（例えば、特定の抗体価により測定されるように）を有するアジュバント又は他の成分と共に調製されてもよい。
【０２５０】
（ｉｉ）ベクター
用語「ベクター」は、発現ベクター及び形質転換ベクター及びシャトルベクターを含む。
【０２５１】
用語「発現ベクター」は、インビボ又はインビトロでの発現が可能な構築物を意味する。
【０２５２】
用語「形質転換ベクター」は、その種又は異なる種のある対象物から他の対象物に移行可能な構築物を意味する。構築物がある種から他の種へ−例えば大腸菌プラスミドから例えばバチルス属のバクテリアへ移行可能である場合、形質転換ベクターは「シャトルベクター」と呼ばれる。それは、大腸菌プラスミドからアグロバクテリウム、植物に移行可能な構築物であってもよい。
【０２５３】
ベクターは、本発明に含まれるポリペプチドの発現を提供するために、後述するように適切な宿主細胞に形質転換されてもよい。したがって、更なる態様で、本発明は、上記の発現ベクターで形質転換又は形質導入された宿主細胞をポリペプチドをコード化するコード化配列のベクターによる発現を提供する条件下で培養し、発現されたポリペプチドを回収することを含む本発明で用いるためのポリペプチドの調整方法を提供する。
【０２５４】
ベクターは、例えば、複製開始点、場合によって前記ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター、及び場合によってプロモーターのレギュレーターと共に提供される、プラスミド、ウイルス又はファージベクターである。
【０２５５】
ベクターは、その技術分野で周知の一以上の選択可能なマーカー遺伝子を含んでもよい。
【０２５６】
（ｉｉｉ）宿主細胞
本発明はさらに、本明細書に記載されるポリヌクレオチド又は構築物を含む宿主細胞―インビトロにおける宿主細胞を提供する。宿主細胞は、例えば細菌、酵母又は他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞であってもよい。
【０２５７】
本発明は、本発明のポリペプチドを製造するために遺伝子的に操作されたトランスジェニック多細胞宿主生物も提供する。生物は、例えば、トランスジェニック哺乳動物生物（例えばトランスジェニックヤギ又はマウス系統）であってもよい。
【０２５８】
大腸菌は、有用な原核生物宿主である。他の微生物宿主は、バチルス（例えばバシラスサチリス）及び他の腸内細菌科（例えばサルモネラ、セラチア及び様々なシュードモナス種）を含む。これらの原核生物宿主において、一般的に宿主細胞に適合した発現コントロール配列（例えば複製開始点）を含む発現ベクターを製作することができる。さらに、種々の周知のプロモーターが存在する（例えばラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ‐ラクタマーゼプロモーター系又はファージラムダのプロモーター系）。転写及び翻訳を開始及び完了するために、プロモーターは、一般的に、場合によってオペレーター配列と共に発現を制御し、リボソーム結合部位配列等を有する。
【０２５９】
他の微生物（例えば酵母）は、発現のために用いられ得る。サッカロミケスは、発現コントロール配列（例えばプロモーター）、複製開始点、終結配列及び所望のものを有する適切なベクターを伴う、好ましい酵母宿主である。典型的なプロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及び他の糖分解酵素を含む。誘導性の酵母プロモーターは、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロムＣ、及びマルトース及びガラクトースの利用に関与する酵素のプロモーターを含む。
【０２６０】
微生物に加えて、哺乳動物組織細胞培養は、本明細書に記載されるヒト化抗体を発現及び産生するために用いられてもよく、場合によっては好ましい（Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)を参照）。異種タンパク質（例えば完全な免疫グロブリン）を分泌可能な多くの適切な宿主細胞株が従来技術において開発されており、ＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ヒーラー細胞、好ましくは骨髄腫細胞株又は形質転換Ｂ細胞又はハイブリドーマを含むことから、いくつかの実施態様では真核細胞（例えばＣＯＳ７細胞）は好ましい。
【０２６１】
いくつかの実施態様において、宿主細胞は脊椎動物の宿主細胞である。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３又は浮遊培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）又はＣＨＯ−ＤＰ−１２株；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０２６２】
あるいは、抗体−コード化配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入及び後のトランスジェニック動物の乳中への発現のための導入遺伝子に組み込むことができる（Deboer et al.、米国特許番号５７４１９５７、Rosen、米国特許番号５３０４４８９及びMeade et al.、米国特許番号５，８４９，９９２を参照）。適切な導入遺伝子は、乳腺特異的な遺伝子（例えばカゼイン又はベータラクトグロブリン）のプロモーター及びエンハンサーと作動可能な結合した、軽鎖及び／又は重鎖コード化配列を含む。
【０２６３】
あるいは、本明細書に記載される抗体は、トランスジェニック植物（例えばタバコ、トウモロコシ、大豆及びアルファルファ）において製造することができる。改良された『プランティボディ(plantibody)』ベクター（Hendy et al. (1999) J. Immunol. Methods 231:137-146）及び形質転換性作物種の増加を伴う精製ストラテジーは、そのような方法を実用的かつ効率的な、ヒト及び動物の治療だけでなく工業的応用（例えば抗体酵素）のための組換え免疫グロブリン産生の手段にする。さらに、植物から産生された抗体は、安全、有効であり、動物由来の材料の使用を回避することが示された。さらに、植物及び哺乳動物細胞産生抗体のグリコシル化パターンの相違は、抗原結合性又は特異性に対してほとんど影響しない。さらに、毒性又はヒト抗マウス抗体反応の証拠は、植物を誘導された分泌のダイマーのＩｇＡ抗体の局所的経口服用を受けている患者において見られなかった（Larrick et al. (1998) Res. Immunol. 149:603-608を参照）。
【０２６４】
完全長抗体、抗体断片及び抗体融合タンパクは、例えば治療抗体が細胞障害性剤（例えば毒素）にコンジュゲートされ、免疫複合体がそれ自体で腫瘍細胞破壊の効果を示す場合など、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合に、細菌において製造することができる。完全長抗体は、血液循環において、より大きな半減期を有する。大腸菌における製造は、より速く、より経済的である。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、発現及び分泌を最適化する翻訳開始領域（ＴＩＲ）及びシグナル配列を記載し、本明細書に援用される米国特許番号５６４８２３７（Carter et. al.）、米国特許番号５７８９１９９（Joly et al.）及び米国特許番号５８４０５２３（Simmons et al.）を参照のこと。発現後、抗体は、可溶性分画中の大腸菌細胞ペーストから単離され、例えばアイソタイプによりプロテインＡ又はＧカラムで精製される。例えばＣＨＯ細胞において発現される抗体を精製する方法と同様に、最終的な精製が行われる。
【０２６５】
ヒト化ＡＰ３３抗体などのグリコシル化された抗ＨＣＶ抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎細胞の例は、植物及び昆虫細胞を含む。多数のバキュロウイルス株及び変異体、及びスポドプテラフルギペルダ（イモムシ）、ネッタイシマカ（カ）、ヒトスジシマカ（カ）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）及びカイコなどの宿主の対応する許容昆虫宿主は同定された。例えばキンウワバ科ＮＰＶのＬ−１変異体及びカイコＮＰＶのＢｍ−５株んどの形質導入のための種々のウイルス株は公的に利用可能であり、特にスポドプテラフルギペルダ細胞の形質導入のために、本発明のウイルスとしてそのようなウイルスは用いられてもよい。
【０２６６】
（ｉｖ）抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は、細胞内、ペリプラズム間隙に産生されるか、培地に直接分泌される。抗体が細胞内に産生される場合、第一段階として、微粒子状の破片（宿主細胞又は溶解た断片）は、例えば、遠心分離又は限外濾過によって取り除かれる。Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌のペリプラズム間隙に分泌される抗体を単離するための手法を記載する。簡潔には、細胞ペーストは、約３０分にわたって酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で解凍される。細胞片は、遠心分離によって取り除かれる。抗体が培地に分泌される場合、そのような発現系の上清は、一般的に、最初に市販のタンパク質濃度フィルター（例えばAmicon又はMillipore Pellicon限外濾過ユニット）を用いて濃縮される。ＰＭＳＦのようなプロテアーゼインヒビターはタンパク質分解を阻害するために前記のステップの何れかに含まれてもよく、抗生物質は汚染菌の増殖を防止するために含まれてもよい。
【０２６７】
細胞から調製される抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティークロマトグラフィを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィでの精製技術が好ましい。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種類及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２又はγ４重鎖に基づいて抗体を精製するために用いることができる（Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨される（Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)）。アフィニティーリガンドが付着するマトリックスは、多くの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御細孔ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定したマトリックスは、アガロースで達成されるよりも速い流速と短い作業時間を可能とする。抗体はＣ．ｓｕｂ．Ｈ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸＴＭ樹脂（J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.）は精製に有用である。タンパク質精製の他の技術（例えばイオン交換カラム、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィ、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭでのクロマトグラフィ、陰イオン又は陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィ（例えばポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫安沈殿）は、回収される抗体によっては利用可能である。
【０２６８】
任意の予備的な精製ステップに続いて、興味がある抗体及び不純物を含む混合物は、約２．５−４．５のｐＨの溶出緩衝液を用いる低いｐＨの疎水性相互作用クロマトグラフィにかけられてもよく、好ましくは低塩濃度（例えば約０−０．２５Ｍ塩）で行われる。
【０２６９】
Ｖ．抗体コンジュゲート
抗体は、細胞障害性剤（例えば毒素又は放射性同位元素）にコンジュゲートされてもよい。ある種の実施形態では、毒素はカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチンＥ及びその類似体又は誘導体が好ましい。
【０２７０】
好ましい薬剤／毒素は、ＤＮＡ傷害剤、微小管の重合又は脱重合阻害剤又は代謝拮抗剤を含む。好ましい細胞障害性剤の種類は、例えば、酵素阻害剤（例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤及びチミジル酸シンターゼ阻害剤）、ＤＮＡインターカレータ、ＤＮＡ切断剤、トポイソメラーゼ阻害剤、アンスラサイクリンファミリーの薬剤、ビンカ薬剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞障害性ヌクレオシド、プテリジンファミリーの薬剤、ジイネン、ポドフィリン及び分化誘導剤を含む。特に有用なものの中には、例としてメトトレキサート、メトプテリン(methopterin)、ジクロロメトトレキセート(dichloromethotrexate)、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、レウロシン(leurosine)、レウロシデイン(leurosideine)、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、Ｎ（５，５−ジアセトキシペンチル）ドキソルビシン、モルフォリノ−ドキソルビシン、１（２−クロエチル）−１、２−ジメタネスルホニル(dimethanesulfonyl)ヒドラジッド、Ｎ８−アセチルスペルミジン、アミノプテリンメトプテリン、エスペラマイシン、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、アクチノマイシン、ブレオマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシンおよびポドフィロトキシン誘導体、例としてエトポシドまたはエトポシドリン酸塩、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、タキソテレ、レチノイン酸、酪酸、Ｎ８−アセチルスペルミジン、カンプトテシン、カリケアマイシン、ブリオスタチン、セファロスタチン、アンサマイトシン、アクトシン、メイタンシノイド、例としてＤＭ−１、メイタンシン、メイタンシノール、  Ｎ−デスメチル−４，５−デセポキシメイタンシノイド、Ｃ−１９−デクロロメイタンシノイド、Ｃ−２０−ヒドロキシメイタンシノール、Ｃ−２０−デメトキシメイタンシノール、Ｃ−９−ＳＨ  メイタンシノール、Ｃ−１４−アルコキシメチルメイタンシノール、Ｃ−１４−ヒドロキシまたはアセチルオキシメチルメイタンシノール、Ｃ−１５−ヒドロキシ／アセチルオキシメイタンシノール、Ｃ−１５−メトキシメイタンシノール、Ｃ−１８−Ｎ−デメチルメイタンシノールおよび４，５−デオキシメイタンシノール、アウリスタチン、例としてアウリスタチンＥ、Ｍ、ＰＨＥおよびＰＥ；ドロスタチン(dolostatin)、例としてドロスタチンＡ、ドロスタチンＢ、ドロスタチンＣ、ドロスタチンＤ、ドロスタチンＥ（２０−ｅｐｉ及び１１−ｅｐｉ）、ドロスタチンＧ、ドロスタチンＨ、ドロスタチンＩ、ドロスタチン１、ドロスタチン２、ドロスタチン３、ドロスタチン４、ドロスタチン５、ドロスタチン６、ドロスタチン７、ドロスタチン８、ドロスタチン９、ドロスタチン１０、ｄｅｏ−ドロスタチン１０、ドロスタチン１１、ドロスタチン１２、ドロスタチン１３、ドロスタチン１４、ドロスタチン１５、ドロスタチン１６、ドロスタチン１７、及びドロスタチン１８；セファロスタチン(cephalostatin)、例として  セファロスタチン１、セファロスタチン２、セファロスタチン３、セファロスタチン４、セファロスタチン５、セファロスタチン６、セファロスタチン７、２５’−ｅｐｉ−セファロスタチン��、２０−ｅｐｉ−セファロスタチン７、セファロスタチン８、セファロスタチン９、セファロスタチン１０、セファロスタチン１１、セファロスタチン１２、セファロスタチン１３、セファロスタチン１４、セファロスタチン１５、セファロスタチン１６、セファロスタチン１７、セファロスタチン１８、及びセファロスタチン１９を含む。
【０２７１】
メイタンシノイドは、チュブリン重合を阻害することにより作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブＭａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａから単離されたものである（米国特許番号第３８９６１１１）。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド、例えばメイタンシノール及びＣ−３メイタンシノールエステルを産生することが発見された（米国特許番号第４１５１０４２）。その合成のマイタンシノール及び誘導体及び類似体は、例えば、米国特許番号４１３７２３０；４２４８８７０；４２５６７４６；４２６０６０８；４２６５８１４；４２９４７５７；４３０７０１６；４３０８２６８；４３０８２６９；４３０９４２８；４３１３９４６；４３１５９２９；４３１７８２１；４３２２３４８；４３３１５９８；４３６１６５０；４３６４８６６；４４２４２１９；４４５０２５４；４３６２６６３；及び４３７１５３３において開示され、その開示は明確に本明細書に援用される。
【０２７２】
メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びそれらの医薬用途は、例えば米国特許番号第５２０８０２０、同５４１６０６４、欧州特許番号第０４２５２３５Ｂ１に開示されており、その開示は明確に本明細書に援用される。Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌原遺伝子に結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。
【０２７３】
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５号Ｂ１、及びChari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)に開示されているもの等を含む、抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、その技術分野で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれ、上記特許文献に開示されているように、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【０２７４】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能価性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン−２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）（Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978]）及びジスルフィド結合により提供されるＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）が含まれる。
【０２７５】
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来のカップリング技術を用いてヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ−３位で形成される。
【０２７６】
対象の他の免疫コンジュゲートは、１以上のカリケアマイシン分子とコンジュゲートしたヒト化ＡＰＰ−３３抗体などの抗ＨＣＶ抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ−ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許番号第５７１２３７４、同５７１４５８６、同５７３９１１６、同５７６７２８５、同５７７０７０１、同５７７０７１０、同５７７３００１、同５８７７２９６（全てAmerican Cyanamid Company）を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、これに限定されるものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１（Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993)、Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許）が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは、細胞内に作用部位を有し、細胞膜を容易に通過しない。したがって、抗体媒介性内部移行によるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく増強される。
【０２７７】
放射性同位元素
ＨＣＶ感染細胞の選択的な破壊のために、抗体はより高い放射性の原子を含んでもよい。放射性コンジュゲートした抗ＨＣＶ抗体を産生するために、種々の放射性同位元素が利用可能である。例は、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位元素を含む。コンジュゲートが診断に用いられる場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）映像（磁気共鳴映像、ｍｒｉとしても公知）用のスピン標識、例えばヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含み得る。
【０２７８】
放射−又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに組み込まれる。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素−１９を含む適切なアミノ酸前駆体を用いる化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム９０は、リジン残基を介して結合することができる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57）は、ヨウ素−１２３を組み込むために用いることができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」（Chatal, CRC Press 1989）に記載されている。
【０２７９】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン−２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987)に記載されるように調製することができる。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレン−トリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。リンカーは細胞中の細胞障害性剤の放出を容易にするための「切断可能なリンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る（Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)；米国特許番号第５２０８０２０）。
【０２８０】
ＶＩ．α−インターフェロン
本明細書で提供される併用療法の本方法は、α−インターフェロンを用いる、又は組み込む。用語「ＩＦＮ−α」及び「α−インターフェロン」は、本明細書において交換可能に用いられる。
【０２８１】
ＩＦＮ−αは、生ウイルス又は不活性ウイルス、二重鎖ＲＮＡ又は細菌産物に暴露される場合に末梢血白血球又はリンパ芽球腫細胞から産生されるＩ型インターフェロンである。インターフェロン−αは、ウイルス誘導白血球培養により産生される主要なインターフェロンであり、その顕著な抗ウィルス活性に加えて、ＮＫ細胞の活性化を引き起こす。
【０２８２】
多くの異なるサブタイプが存在する。α−インターフェロンには、例えばＩＦＮ−α１、ＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−α４、ＩＦＮ−α５、ＩＦＮ−α６、ＩＦＮ−α７、ＩＦＮ−α８、ＩＦＮ−α１０、ＩＦＮ−α１３、ＩＦＮ−α１４、ＩＦＮ−α１６、ＩＦＮ−α１７及びＩＦＮ−α２１など１３のサブタイプが存在する。いくつかの実施態様において、α−インターフェロンは、ＩＦＮ−α１、ＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−α４、ＩＦＮ−α５、ＩＦＮ−α６、ＩＦＮ−α７、ＩＦＮ−α８、ＩＦＮ−α１０、ＩＦＮ−α１３、ＩＦＮ−α１４、ＩＦＮ−α１６、ＩＦＮ−α１７又はＩＦＮ−α２１のいずれかである。いくつかの実施態様において、α−インターフェロンは、ＩＦＮ−α２である。いくつかの実施態様において、ＩＦＮ−α２はＩＦＮ−α２ａ、ＩＦＮ−α２ｂ又はＩＦＮ−α２ｃの何れかである。いくつかの実施態様において、ＩＦＮ−α２はＩＦＮ−α２ａである。いくつかの実施態様において、ＩＦＮ−α２はＩＦＮ−α２ｂである。いくつかの実施態様において、α−インターフェロンは、上記のα−インターフェロンの誘導体又は変異体のいずれかである。
【０２８３】
上記の何れかのα−インターフェロンのいくつかの実施態様において、α−インターフェロンは、延長又は維持された放出のために調製される。
【０２８４】
いくつかの実施態様において、α−インターフェロンはペグ化される。いくつかの実施態様において、ペグ化されたα−インターフェロンは、ペグ化されたＩＦＮ−α１、ＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−α４、ＩＦＮ−α５、ＩＦＮ−α６、ＩＦＮ−α７、ＩＦＮ−α８、ＩＦＮ−α１０、ＩＦＮ−α１３、ＩＦＮ−α１４、ＩＦＮ−α１６、ＩＦＮ−α１７又はＩＦＮ−α２１である。いくつかの実施態様において、ペグ化されたα−インターフェロンは、ペグ化されたＩＦＮ−α２である。いくつかの実施態様において、ペグ化されたＩＦＮ−α２は、ペグ化されたＩＦＮ−α２ａ、ペグ化されたＩＦＮ−α２ｂ又はペグ化されたＩＦＮ−α２ｃの何れかである。いくつかの実施態様において、ペグ化されたＩＦＮ−α２は、ペグ化されたＩＦＮ−α２ａである。いくつかの実施態様において、ペグ化されたＩＦＮ−α２ａは、Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）である。いくつかの実施態様において、ペグ化されたＩＦＮ−α２は、ペグ化されたＩＦＮ−α２ｂである。いくつかの実施態様において、ペグ化されたＩＦＮ−α２ｂは、Ｐｅｇ−ＩｎｔｒｏｎＴＭである。
【０２８５】
いくつかの実施態様において、α−インターフェロンは、Ｂｅｌｅｒｏｆｏｎ（登録商標）、ＢＬＸ−８８３（ＬｏｃｔｅｒｏｎＴＭ）、Ａｌｂｕｆｅｒｏｎ（登録商標）（ＩＦＮ−α２ｂ）、Ｒ７０２５  （Ｍａｘｙ−ａｌｐｈａ）、ＧＥＡ０００７．１−ＩＦＮ−α変異体の何れかである。
【０２８６】
ＶＩＩ．医薬組成物
本発明において有用な医薬組成物は、治療的有効量の抗ＨＣＶ抗体及び／又はα−インターフェロン、及び薬学的に許容可能な担体、希釈液又は賦形剤（その組合せを含む）を含んでもよい。
【０２８７】
医薬組成物は、ヒト及び動物用医薬におけるヒト又は動物の使用のためであってもよく、一般的に薬学的に許容可能な希釈液、担体又は賦形剤の一以上を含む。治療用途の許容可能な担体又は希釈液は、製薬技術分野で周知であり、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリン類を含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０２８８】
薬剤担体、賦形剤又は希釈液の選択は、本意図された投与経路及び標準薬務に関して選択されてもよい。医薬品組成物は、担体、賦形剤又は希釈液に加えて、適切な結合剤、潤滑剤、沈澱防止剤、コーティング剤又は溶解剤の何れかを含んでもよい。
【０２８９】
防腐剤、安定化剤、染料及び香料も、医薬組成物において提供されてもよい。防腐剤の例は、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを含む。抗酸化剤及び沈澱防止剤も用いられ得る。
【０２９０】
異なる送達系に依存して、異なる組成物／製剤の要件が存在し得る。例として、本発明において有用な医薬組成物は、ミニポンプを用いて、又は例えば、吸入又は摂取可能な溶液の鼻内噴霧又はエアゾールとしての粘膜経路によって、又は例えば静脈内、筋肉内又は皮下の経路による送達のために組成物が注射可能な形態で調製されて非経口的に投与されるために調製されてもよい。あるいは、製剤は、多くの経路によって投与されるために設計されてもよい。
【０２９１】
ヒト化抗体は、シクロデキストリンと組み合わせて用いられてもよい。シクロデキストリンは、薬物分子と包接及び非抱接錯体を形成することは公知である。薬剤−シクロデキストリン複合体の形成は、薬物分子の溶解性、溶解速度、生体有用性及び／又は安定性性質を改変し得る。薬剤−シクロデキストリン複合体は、一般的にほとんどの剤形及び投与経路に有用である。薬剤との直接的な錯体化に代わるものとして、例えば、シクロデキストリンは補助添加物（例えば担体、希釈剤又は可溶化剤）として用いられ得る。アルファ−、ベータ−及びガンマ−シクロデキストリンは、最も共通して用いられており、適切な例はＷＯ−Ａ−９１／１１１７２、ＷＯ−Ａ−９４／０２５１８及びＷＯ−Ａ−９８／５５１４８に記載されている。
【０２９２】
医薬組成物は、所望により、リポソーム、ミクロスフィア又は他のポリマーマトリクスに組み込むことができる。例えばホスホリピド又は他の脂質から成るリポソームは、比較的容易に製作及び投与できる無毒性、生理的に許容可能、代謝可能な担体である。
【０２９３】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ−粒子及びナノカプセル）に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。  
【０２９４】
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、アンタゴニストを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエチレン、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸が含まれる。
【０２９５】
インビボ投与のために使用される製剤は無菌でなければならない。これは、濾過滅菌メンブレンによる濾過によって容易に達成される。
【０２９６】
ＶＩＩＩ．投与方法
抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンを含む本明細書に記載される治療方法は、同時に（すなわち同時投与）、並行して（すなわち並用投与）、交代で（すなわち交代投与）、間欠的に（すなわち間欠投与）及び／又は連続的に（すなわち連続投与）投与することができる。
【０２９７】
いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンは同時に投与される。用語「同時投与」は、本明細書で用いられるように、ナノ粒子組成物及び化学療法剤を、約１５分（例えば約１０、５又は１分のいずれか）の時間を隔てずに投与することを意味する。薬剤が同時に投与される場合、抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンは同じ組成物（例えば抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンを含む組成物）又は別の組成物（例えば抗ＨＣＶ抗体はある組成物に含まれ、α−インターフェロンは他の組成物に含まれる）に含まれてもよい。いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンの同時投与は、抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンの追加用量で組み合わせることができる。
【０２９８】
いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンは、連続して投与される。用語「連続投与」は、本明細書に用いられるように、抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンが、約１５分以上（例えば約２０、３０、４０、５０、６０分又はそれ以上）の時間を隔てて投与されることを意味する。抗ＨＣＶ抗体又はα−インターフェロンのいずれかが最初に投与されてもよい。抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンは、同じか異なるパッケージに含まれる別々の組成物に含まれてもよい。
【０２９９】
いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンの投与は並行であってもよい、すなわち抗ＨＣＶ抗体の投与期間及びα−インターフェロンの投与期間はお互いに重なる。いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンの投与は並行ではない。例えば、いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体の投与はα−インターフェロンが投与される前に終了する。いくつかの実施態様において、α−インターフェロンの投与は抗ＨＣＶ抗体が投与される前に終了する。これらの並行でない２つの投与の間の時間は、約２日から１ヵ月（例えば１週間）にわたる。
【０３００】
抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンの投薬頻度は、投与する医師の判断に基づいて、治療期間において調整されてもよい。別々に投与される場合、抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンは異なる投薬頻度又は間隔で投与することができる。例えば、α−インターフェロン組成物は毎週投与され得るのに対し、抗ＨＣＶ抗体はより多いか少ない頻繁で投与され得る。いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンの持続性徐放製剤が用いられてもよい。徐放性を達成する様々な製剤及び装置は、従来技術において公知である。
【０３０１】
抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンは、同じ投与経路又は異なる投与経路を用いて投与され得る。
【０３０２】
抗ＨＣＶ抗体および／またはα−インターフェロンに必要な用量は、それぞれの薬剤が単独で投与される場合、必ずではないが、通常必要な容量よりも低くなり得る。したがって、いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンの薬剤の治療量以下の量が投与される。「治療量以下の量」又は「治療量以下のレベル」は、治療的量よりも少ない量、つまり抗ＨＣＶ抗体及び／又はα−インターフェロンが単独で投与される場合に通常用いられる量よりも少ない量を意味する。減少は、特定の投与において投与される量及び／又は特定の期間を通して投与される量に関して反映され得る。
【０３０３】
いくつかの実施態様において、ヒト化抗体及び第二の治療剤の組合せの投与がＨＣＶの一以上の症状を改善し、ウィルス力価及び／又はウイルス負荷を減少及び／又は抑制し、及び／又はヒト化抗体又は第二の治療剤単独での治療以上にＨＣＶを予防する。
【０３０４】
いくつかの実施態様において、十分な抗ＨＣＶ抗体は、同程度の治療効果に必要なα−インターフェロンの通常の用量が少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上減少するように投与される。いくつかの実施態様において、十分なα−インターフェロンは、同程度の治療効果に必要な抗ＨＣＶ抗体の通常の用量が少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上減少するように投与される。
【０３０５】
抗体は、例えば、免疫血清の形態で投与されてもよく、より好ましくは、精製された組換え又はモノクローナル抗体であってもよい。所望の特異性を有する血清又はモノクローナル抗体を製造する方法は、ルーチンであり、当業者に周知である。当業者は、抗体は、例えば、座薬を介した、経口的な又は局所的な注射（挿管）を含む様々な経路によって投与され得ることを理解しており、後者は例えば抗体を含む軟膏又はパウダーの直接的な服用による受動的なものであるか、例えば鼻内噴霧又は吸入薬を用いた能動的なものであり得る。抗体は局所的スプレーとしても投与することができ、その場合、組成物の一つの成分は適切な噴霧剤である。
【０３０６】
本明細書に記載されるヒト化抗体及びその断片は、公知な方法、例えば静脈内投与、例えばボーラス又は一定期間中の継続注入、皮下、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、滑液内、クモ膜下腔内、吸入経路、静脈内、動脈内、皮下、眼球内、経皮、一般的に静脈内又は皮下投与により対象に投与される。
【０３０７】
いくつかの実施態様において、投与された抗ＨＣＶ抗体は、実質的に精製されている（例えば、好ましくは少なくとも９５％の均質性、より好ましくは少なくとも９７％の均質性、及び最も好ましくは少なくとも９８％の均質性であり、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥで判断される）。
【０３０８】
適切には、受動免疫化療法は、本明細書に記載されるヒト化抗体又はその断片の投与、及び／又は他の抗ウイルス性医薬化合物と組み合わせた抗体の投与を都合よく含んでもよい。最近、そのような受動免疫化技術はＨＩＶ感染症を治療するために安全に用いられている（Armbruster et al, J. Antimicrob. Chemother. 54, 915-920 (2004)；Stiegler & Katinger, J. Antimicrob. Chemother. 51, 757-759 (2003)）。
【０３０９】
本発明の能動又は受動免疫化方法は、上に定義される共通ペプチドエピトープといくつかのアミノ酸の相違を含む非常に稀な変異体分離株（ＵＫＮ５．１４．４によって以下に例証される）を除いて、ＨＣＶの遺伝子型１−６の何れかの感染に対する個体の保護又は治療を可能とする。
【０３１０】
当業者によく理解されるように、α−インターフェロンの適切な用量は、α−インターフェロンが単独又は他の抗ウイルス性化合物と組み合わせて投与される臨床治療において既に用いられている用量である。用量の変動は、処理されている状態によって起こるであろう。上述されるように、いくつかの実施態様において、α−インターフェロンは減少したレベルで投与され得る。
【０３１１】
本明細書で提供される任意の方法のいくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体及び／又はα−インターフェロンの投薬頻度は、これに限定されるものではないが、毎週２回、週３回、中断することなく毎週；毎週（４週間のうち３回）；  ３週間に１回；２週間に１回；又は、３週間に２回である。
【０３１２】
本明細書で提供される任意の方法のいくつかの実施態様において、α−インターフェロンの用量は、約１０−５００μｇ、２０−２５０μｇ又は４０−２００μｇのいずれかである。いくつかの実施態様において、α−インターフェロンは、皮下、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、滑液内、クモ膜下腔内、吸入経路、静脈内、動脈内、腹腔内、肺内、経口、吸入、膀胱内、気管内、皮下、眼球内、経皮、一般的に皮下投与により投与される。
【０３１３】
いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体及び／又はα−インターフェロンは有益な臨床成績（これに限定されるものではないが、一以上のＨＣＶ感染症の症状又はＨＣＶ感染症の側面を改善することを含む）をもたらす治療的有効量で投与される。いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体及び／又はα−インターフェロンは、ＨＣＶのウィルス力価及び／又はウイルス負荷を減少させるための治療的有効量で投与される。
【０３１４】
ＩＸ．診断
更なる態様において、試料中のＨＣＶの存在を測定又は検出するための診断試験装置及び方法が提供される。装置は、試薬、本明細書に記載されるような一以上のヒト化抗体を含んでもよい。抗体は、例えば固体担体（例えばマイクロタイターアッセイプレート又は微粒子支持体）に固定されてもよく、試料（例えば血液又は血清試料又は他の臨床検査材料  ―  例えば肝生検）のＨＣＶ粒子を「捕捉する」働きをしてもよい。捕捉されたウィルス粒子は、次いで、例えば捕捉されたウィルス粒子に結合する更なる標識化試薬を添加することによって検出されてもよい。都合の良いことに、アッセイはＥＬＩＳＡ（特にｓａｎｄｗｉｃｈ−ｔｙｐｅ  ＥＬＩＳＡ）の形をとってもよいが、他のアッセイフォーマットも原則として採用され得る（例えばラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット（免疫クロマトグラフィ又は試験紙型アッセイを含む））。
【０３１５】
診断目的のために、本明細書に記載されるヒト化抗体は、標識されていても標識されていなくてもよい。非標識抗体は、他の標識抗体（二次抗体）と組み合わせて用いることができる。あるいは、抗体は直接標識されてもよい。多種多様な標識は使用されてもよい−放射性核種、蛍光、酵素、酵素基質、酵素コファクター、酵素阻害剤、リガンド（特にハプテン）等。イムノアッセイの多数の型が利用可能であり、当業者に周知である。
【０３１６】
本明細書に記載されるヒト化抗体は、遺伝子型１−６のＨＣＶの何れにも結合することができることから、アッセイ装置及び対応する方法は、これらの遺伝子型の何れかで表わされる試料ＨＣＶを検出することができるであろう。
【０３１７】
いくつかの実施態様において、試料はコントロール試料と比較される。いくつかの実施態様において、コントロール試料は、ＨＣＶに感染されたことが公知の個体からのものである。いくつかの実施態様において、個体は、遺伝子型１（例えば遺伝子型１ａ及び遺伝子型１ｂ）、遺伝子型２（例えば遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型２ｃ）、遺伝子型３（例えば遺伝子型３ａ）、遺伝子型４、遺伝子型５及び遺伝子型６からなる群から選択される一つ以上のＨＣＶ遺伝子型により感染されたことが知られている。いくつかの実施態様において、コントロール試料は、ＨＣＶに感染されていないことが公知の個体からのものである。
【０３１８】
いくつかの実施態様において、記載される任意の治療方法は、本明細書に記載される抗ＨＣＶ抗体の何れかによる、試料中のＨＣＶの測定又は検出に基づいている。ここで使用されるように、「基づく」は、
（１）本明細書に記載されるように、対象の特徴を評価、決定又は測定すること（及び好ましくは治療を受けるのに適した対象を選択すること）；及び
（２）本明細書に記載されているように治療を投与する。
【０３１９】
いくつかの実施態様において、抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンでの治療に適切又は適切でない（不適切な）個体を同定する方法が提供される。
【０３２０】
Ｘ．キット及び製造品
キットも、細胞活性又は選択された抗原の存在の保護又は検出における抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンの使用のために供給され得る。したがって、抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンは、通常、容器中の凍結乾燥された形態で、単独又は所望の細胞型に特異的なさらなる抗体と共に提供される。
【０３２１】
標識又は毒素にコンジュゲートされているか、コンジュゲートされていない抗体は、バッファー（例えばトリス、リン酸塩、炭酸塩等）、安定化剤、生物致死剤、不活性タンパク質（例えば血清アルブミン等）と共にキットに包含される。一般に、これらの材料は、抗体の量に基づく約５％重量未満で存在するか、抗体濃度に基づく少なくとも約０．００１％重量の総量で存在する。しばしば、活性成分を希釈するための不活性増量剤又は賦形剤を含むことは望ましく、賦形剤は組成物の総量の約１から９９％重量で存在し得る。
【０３２２】
本発明は、診断キット（例えば調査、検出及び／又は診断キット）を提供する。本明細書に記載されているように、そのようなキットは一般的に抗ＨＣＶ抗体を含む。適切には、抗体は標識化されるか、二次標識試薬がキットに含まれる。好ましくは、キットは、例えばインビボ画像化アッセイを行うためなど、意図された適用を行うための指示書でラベルを貼られている。
【０３２３】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される任意のキットは、添付文書を含む。添付文書は、慣習的に治療製品の商業的パッケージに含まれる説明書を意味し、説明書はそのような治療製品の使用に関する、適応、使用、用量、投与、禁忌および／または警告に関する情報を含む。一実施態様において、添付文書は、組成物が本明細書に記載される任意の併用療法の方法において用いられ得ることを示す。
【０３２４】
本抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンは、別々の容器内に存在しても、単一の容器内に存在してもよい。キットは、ある組成物が抗ＨＣＶ抗体を含み、ある組成物がα−インターフェロンを含む、異なる一つの組成物、又は二以上組成物を含んでもよいことは理解されるところである。
【０３２５】
適切な容器は、例えばボトル、バイアル、シリンジ等を含む。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成され得る。容器は病状の治療に有効な組成物を収容しており、滅菌された出入口を有している（例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを具備する静脈溶液用のバック又はバイアルであってもよい）。さらに、製品は、製薬的に許容可能なバッファー（例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩緩衝食塩水、リンゲル液及びブドウ糖溶液）を含む第二の容器を更に含んでもよい。他のバッファー、希釈液、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を更に含んでもよい。
【０３２６】
本明細書に記載される抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンを含む製品が、本明細書において提供される。いくつかの実施態様において、製品は、容器、及び容器上又は容器に付随したラベル又は添付文書を含む。抗ＨＣＶ抗体及びα−インターフェロンは、別々の容器内に存在しても、単一の容器内に存在してもよい。製品は、ある組成物が抗ＨＣＶ抗体を含み、ある組成物がα−インターフェロンを含む、異なる一つの組成物、又は二以上組成物を含んでもよいことは理解されるところである。
【０３２７】
ＸＩ．一般的な組換えＤＮＡ法技術
本発明は、特に明記しない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の通常の技術を使用し、それは当業者の能力の範囲内である。そのような技術は、文献において説明される。例えばJ. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press;Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)；B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques、John Wiley & Sons; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press；及びD. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Pressを参照のこと。これらの一般的なテキストのそれぞれは、本明細書に援用される。
【０３２８】
上記の明細書において言及される全ての刊行物は、本明細書に援用される。本発明に記載される方法及びシステムの様々な改変及び変異は、本発明の範囲内であり、当業者に明白である。本発明は特定の好ましい実施態様と関連して記載されているが、特許請求の範囲にかかる本発明は、不当にそのような特定の実施態様に限定されるべきではない。実際、分子生物学又は関連分野の当業者にとって明確な、本発明を実施するために記載される形態の様々な改変は、以下の請求項の範囲内であることが意図されている。
【０３２９】
本発明は実施例によりさらに記載されており、それは当業者が本発明を実施するのを援助することを意図したものであって、いかなる形であれ本発明の範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【０３３０】
実施例は、単に発明の例示を意図したものであり、したがっていかなる形であれ発明を限定するものと考慮されるべきではなく、上記の本発明の実施態様及び態様を記載及び詳述するものである。前述の例及び詳細な説明は、限定を目的とするものではなく、例証を目的として提供される。
【０３３１】
実施例１  材料及び方法
ヒト化Ｖ遺伝子のクローニング
【０３３２】
重鎖可変領域（実施例２を参照）は、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩ制限酵素サイトを用いてｐＧ１Ｄ２００にクローニングされた。同様に、軽鎖可変領域は、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩサイトを用いてｐＫＮ１００にクローニングされた。ｐＧ１Ｄ２００ベクターは、マルチコア（Promega）制限消化バッファー中で３７℃で２時間、２０単位のＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩを用いて５μｇのＤＮＡを消化することによるライゲーションのために調製された。次いで、１単位のエビアルカリホスファターゼが３７℃で３０分間添加され、６５℃で２０分間不活性化された。ベクター調製は、製造業者の説明書に従って、Ｑｉａｑｕｉｃｋ（Qiagen）カラムで精製された。ベクターは５０μｌに溶出された。同様に、ｐＫＮ１００ベクターは、バッファーＥ（Promega）中で３７℃で１時間、２０単位のＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで５μｇのＤＮＡを消化することによって調製された。ＤＮＡは、上記の通り、エビアルカリホスファターゼで処理され、精製された。変異体可変領域を含む可変領域ＤＮＡは、ベクターｐＧＡ４又はｐＧＡ１に入った状態で、ＧＥＮＡＲＴによって供給された。挿入ＤＮＡ（約４μｇ）は上記の通りに消化され、重鎖及び軽鎖断片はゲル電気泳動によってベクターからの精製された。適切なバンドはゲルから切り取られ、Ｑｉａｑｕｉｃｋ（Qiagen）カラム上で精製され、製造業者の説明書に従って５０μｌに溶出された。ライゲーションは、ベクターの１μｌを、１×リガーゼバッファー（Promega）中の１又は３μｌの挿入ＤＮＡと１０単位のリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合することによって実行された。反応は、オーバーナイトで１４°Ｃ、インキューベートされ、２．５μｌが５０μｌのＤＨ５αコンピテント細胞（Invitrogen）を形質転換するために用いられた。
【０３３３】
部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発は、キメラ重鎖変異体ＡＰ３３  Ｙ４７Ｗ及びＹ４７Ｆを除いてＧＥＮＥＡＲＴ社に突然変異誘発を外注することによって実行された。キメラ重鎖突然変異誘発は、以下のオリゴヌクレオチドを用いて実行された：
ＡＰ３３＿Ｙ４７Ｆ＿Ｆ：ＡＡＴＡＡＡＣＴＴＧＡＧＴＴＣＡＴＧＧＧＡＴＡＣＡＴＡＡＧＴ（配列番号：１８９）
ＡＰ３３＿Ｙ４７Ｆ＿Ｒ：ＡＣＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＣＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＧＴＴＴＡＴＴ（配列番号：１９０）
ＡＰ３３＿Ｙ４７Ｗ＿Ｆ：ＧＡＡＴＡＡＡＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＡＣＡＴＡＡＧ（配列番号：１９１）
ＡＰ３３＿Ｙ４７Ｗ＿Ｒ：ＣＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＣＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＴＴＴＡＴＴＣ（配列番号：１９２）。
【０３３４】
突然変異誘発ＰＣＲ反応は、０．５マイクロモーラーの最終濃度で、２０ｎｇのＶＨ．ｐＧ１Ｄ２００（キメラ重鎖構築物）及び１ｘ  融合マスターミックス（ＮＥＢ）と組み合わされたオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲ条件は、以下の通りであった：９８℃で３０秒間、９８℃で１０秒間を１２サイクル、５５℃で１５秒間、７２℃で２分１５秒間。ＰＣＲ反応が完了すると、２０単位のＤｐｎＩがそれぞれのＰＣＲ反応に３７℃で１時間添加された。２μｌのＰＣＲ消化混合物は、５０μｌのＸＬ−１ブルーコンピテント細胞（Stratagene）を形質転換するために用いられた。
【０３３５】
組換えキメラ及びヒト化重鎖ＲＨＡ、ＲＨｂｃｄｅｆｇｈ（ＲＨｂ−ｈ）及びヒト化軽鎖ＲＫＡ及びＲＫ２ｂｃは、それぞれ抗体発現ベクターｐＧ１Ｄ２００及びｐＫＮ１００にクローニングされた。プラスミドＤＮＡは、適切なＱｉａｇｅｎプラスミド精製キットを用いて調製された。
【０３３６】
エレクトロポレーション
Ｃｏｓ７細胞は、増殖され、トランスフェクションの前日に１：３に分割された。対数期のＣｏｓ７細胞はトリプシン処理され、ＰＢＳ中で洗浄され、ＰＢＳ中に１０７細胞／ｍｌで再懸濁され、７００μｌの細胞はエレクトロポレーションキュベット（Bio-Rad）に等分された。重鎖及び軽鎖構築物のそれぞれ５μｇは、細胞と混合され、１．９ＫＶ及び２５μＦで電気穿孔された。細胞は回収するまで室温で１０分間放置され、１０  ｃｍ２組織培養プレート上で、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Invitrogen）／１０％  ＦＣＳ／ペニシリン５００Ｕ／ｍｌ／ストレプトマイシン５００μｇ／ｍｌを含む８ｍｌのＤＭＥＭに添加された。上清は３日間後に採取され、抗体濃度はＥＬＩＳＡによって解析された。
【０３３７】
ＩｇＧ１  ＥＬＩＳＡ
Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートは０．４μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体で被覆され、１ヵ月間の４℃で保存された。プレートは用いられる前に、ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）中で３回洗浄され、ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）／０．２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンでブロッキングされた。プレートは前述同様に洗浄され、試料上清は倍加希釈法を用いた濃度範囲にわたって添加され、３７℃で１時間インキューベートされた。プレートは前述同様に洗浄され、１：５０００希釈（１００μｌ／ウェル）のヤギ抗ヒトカッパ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲート（Sigma）と共にインキューベートされた。プレートは前述同様に洗浄され、次いでＫ  Ｂｌｕｅ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Neogen）１５０μｌが添加された。１０分後、反応はＲｅｄ  Ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Neogen）５０μＬを用いて停止され、光学濃度は６５５ｎｍで測定された。
【０３３８】
ペプチドＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレート（Nunc Maxisorp）は、ストレプトアビジン（Sigma  Ｓ０６７７）（１０μｇ／ｍｌ  １００ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭクエン酸ｐＨ５．０、１００μｌ／ウェル）で被覆され、４℃で最大１ヵ月保存された。プレートは、用いる前に、ＰＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄され、２００μｌのＰＢＳ／２％ウシ血清アルブミン（ｗ／ｖ）で３７℃で１時間ブロッキングされた。次いでプレートは前述同様に洗浄され、１００μｌペプチド（ＳＥＣバッファー中に０．５μｇ／ｍｌ）が３７℃で１時間添加された。全てのペプチドは、ビオチン化されたリンカー配列ＧＳＧＫ−ビオチンを含んだ。プレートは前述同様に洗浄され、ＳＥＣバッファー中の１００μｌ抗体上清の連続倍加希釈物が添加され、１時間インキューベートされた。プレートは前述同様に洗浄され、１：５０００希釈（１００μｌ／ウェル）のＨＲＰがコンジュゲートされた抗ヒトカッパ抗体（Sigma）と共に３７℃、１時間インキュベートされた。プレートは前述同様に洗浄され、ＴＭＢ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｋ−Ｂｌｕｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Neogen）１５０μｌが１０分間添加され、室温で暗所に保存された。反応はＲｅｄ  Ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Neogen）５０μＬを用いて停止された。光学濃度は６５５ｎｍで測定された。
【０３３９】
ＨＣＶｐｐ感染アッセイのための抗体の調製
ＨＣＶｐｐ実験を実行するために、ＣＯＳ７細胞トランスフェクション上清からの抗体は、精製され、プロテインＡ精製によって濃縮された。それぞれのキメラ又はヒト化抗体に対して：Ｐｒｏｓｅｐ−ｖＡビーズ（Millipore）は再懸濁され、４００μｌが使い捨て１０ｍｌクロマトグラフィカラム（Pierce）に添加され、２０ｍｌのＰＢＳで洗浄された。ＣＯＳ７トランスフェクション上清（約１５０ｍｌ）は、重力流下でカラムに添加された。カラムはその後ＰＢＳ（２０ｍｌ）で洗浄され、０．５ｍｌのＩｍｍｕｎｏｐｕｒｅ  ＩｇＧ  Ｅｌｕｔｉｏｎバッファー（Pierce）で溶出した。溶出液は、２０μｌの１Ｍトリス／ＨＣＬ  ｐＨ  ７．６で中和され、３リットルのＰＢＳ中の０．５ｍｌ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｓｅｒ（Pierce）において４℃オーバーナイトで透析された。
【０３４０】
ＨＣＶシュードパーティクル感染アッセイ
遺伝子型１、２、３、４及び６に対するＨＣＶｐｐは、ＨＣＶグリコプロテイン配列、ＭＬＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ及びルシフェラーゼレポーターをコード化するプラスミドをＨＥＫ細胞にトランスフェクションさせることによって製作され、調整培地は濃縮され、２０％スクロースのクッションを経て超遠心分離によって部分的に精製された。Owsianka A. et al., J Virol 79:11095-104 (2005)を参照のこと。遺伝子型５シュードパーティクルの悪影響のある感染力によりスクロース勾配を介した部分精製のステップが省略されたことを除いては、遺伝子型５に対するＨＣＶｐｐは同様の方法で製作された。細胞培養培地中のそれぞれの抗体の三倍希釈物はＨＣＶｐｐと混合され、抗体／ＨＣＶｐｐ混合物は３７℃で１時間インキューベートされ、次いで３組のウェル中でヒト肝癌Ｈｕｈ−７標的細胞に添加された。３７℃での４時間のインキュベーションの後、接種菌は取り除かれて新しい培地と交換された。３日間後に、細胞は溶解され、ルシフェラーゼ活性について試験された。マルチプルウェルは抗体の不存在下でＨＣＶｐｐで感染され、全ての結果はこの「抗体を含まない」コントロールとの割合で現される。以下の実験において用いられるＨＣＶの遺伝子型は、表２に示される。
表２：ＨＣＶの遺伝子型及びキメラ及びヒト化抗体のＩＣ５０及びＩＣ９０ｓ。
2012512261.tif 000004
【０３４１】
結果
実施例１Ａ−ＡＰ３３ＲＨＡのリーダー配列の選別
最初のヒト化は、ＡＰ３３ＶＨのカバットＣＤＲ  １、２及び３のアクセプターＳ６７８２６カバットＦＷｓ  １、２、３、４への移植である（図１）。この配列は、Ｓ６７８２６に最も近い配列同一性を有する生殖系列遺伝子ＶＨ４−５９（図２）のシグナルペプチドの付加を必要とする。我々は、Ｓ６７８２６  ＦＷ１配列に先行する場合、このリーダー（図２）がシグナルペプチターゼで切断ことを確認するために、ＳｉｇｎａｌＰ（Foote J. and Winter G., J Mol Biol 224:487-99 (1992)）（Ｖ２．０．ｂ２）サーバーを用いた。図１は、ヒトＦＷにＡＰ３３  ＣＤＲを差し込むことによるＡＰ３３ＲＨＡタンパク質及びＤＮＡ配列の生成を示す。そのリーダーを含むＡＰ３３ＲＨＡのＤＮＡ配列は、下記に示される：
2012512261.tif 000005
【０３４２】
リーダーを有するＡＰ３３ＲＨＡ  ＤＮＡ配列。イタリックで大文字のテキストはリーダー配列を示し、小文字のテキストはＦＷを示す。大文字で太字のテキストはＣＤＲ配列を示す。
【０３４３】
ＶＨ４−５９シグナルペプチドを含むＡＰ３３ＲＨＡの完成されたタンパク質及びＤＮＡ配列は、図３に示される。
【０３４４】
実施例１Ｂ−ＡＰ３３ＲＫＡ、ＡＰ３３ＲＫ２、ＡＰ３３ＲＫ３及びＡＰ３３  ＲＫ４配列の生成
Ｂ３リーダー（ＡＰ３３ＲＫＡ）のＤＮＡ配列と共に、Ｘ６１１２５１のＦＷ  １、２、３及び４間のＡＰ３３ＶＫ  ＣＤＲのタンパク質及びＤＮＡ配列の挿入が図４に示される。ＶＫＩ−０１２／０２のＤＮＡ配列と共に、ＡＹ６８５２７９のＦＷ  １、２、３及び４へのＡＰ３３ＶＫ  ＣＤＲのタンパク質及びＤＮＡ配列の挿入が図５に示される。付着されたそれぞれのリーダー配列を有する完成ＡＰ３３ＲＫＡ及びＡＰ３３ＲＫ２配列は、図６−８に示される。
【０３４５】
２つの更なる軽鎖フレームワークは、それぞれ、ヒト化カッパ軽鎖ＲＫ３及びＲＫ４になったヒト配列ＡＢ０６４１３３及びＡＢ０６４０７２に基づいて試験された。ＡＢ０６４１３３の選別は、図９−１１及び１２に示される。ＲＫ３及びＲＫ４のタンパク質及びＤＮＡ配列が図６及び１４−１７に示されるのに対して、ＶＣＩ残基は図１３において定義される。それは異なる生殖系列ファミリー、すなわちＶカッパ５からのものであることから、ＲＫ３が選択された。ＡＢ０６４０７２は、組換え抗体構築物において用いられる場合に歴史的に十分に発現されなかったカバットＶＫＩＶサブグループのメンバーであったにもかかわらず、この特定のヒトフレームワーク配列は以前に、ヒト化抗体の一部である場合に我々の手では、よく発現することが示されていた。
【０３４６】
実施例１Ｃ−組換え重鎖および軽鎖の発現
組換え抗体Ｖ領域は、Ｃｏｓ７細胞の一過性のトランスフェクションによって発現された。キメラＡＰ３３重鎖又は軽鎖ＤＮＡ構築物はポジティブコントロールとして用いられ、適切なヒト化抗体構築物鎖と共に同時形質導入された。まず最初に変異していないＲＨＡ及びＲＨｂ−ｈ（７つ全てがバーニヤゾーンＶＣ復帰突然変異を保存していない）、及びＲＫＡｂｄ及びＲＫ２ｂｃは試験された。ＲＫ２ｂｃは、復帰突然変異された相反するＶＣ残基の両方を有する。軽鎖ＲＫＡは置換された２つの残基を有した；  ＶＣ残基Ｙ３６Ｆ及び、Ａｓｎが位置１０７にあるのは非常に稀なので、それもリシンで置換された（ＲＫＡｂｄ）。ＲＫＡｂｄ発現は非常に低く、実行可能な実験的レベル及び商業的レベル以下のあったことが示された（表３）。後の実験において、潜在的スプライスサイト変異Ｇ３８０Ｃを取り除き、リーダーＢ３からＬ１１にリーダー配列を交換することを含む改変がＲＫＡｂｄに行われて表４に示され、我々の経験から効率的に他の軽鎖遺伝子に作用した。さらに、他の人が、アミノ酸置換Ｄ９ＳがＶＫＩＶ遺伝子の発現を救出するのに有効だったことを報告した。Saldanha J.W. et al. J Mol Biol Immunol 5391(22436): 487709-99719 (1992)を参照のこと。これらの改変のいずれも、バックグラウンド以上に発現レベルを復元するのに有効でなかった。
表３：ＲＫＡのリーダー配列。
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表４：ヒト化軽鎖の発現。ＣＯＳ７細胞は、所定の抗体構築物によってトランスフェクションされた。
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【０３４７】
さらに、他の軽鎖構築物ＲＫ３及びＲＫ４も極めて低い発現レベルを示す（表４）。ＲＫ２だけがヒト化抗体を製造するために適切なレベルで発現される。
【０３４８】
実施例１Ｄ：Ｅ２ペプチドへのＲＨｂ−ｈ／ＲＫ２ｂｃの結合
Ｃｏｓ７トランスフェクションからの上清は、キメラ抗体を伴うヒト化抗体ＲＨｂ−ｈ／ＲＫ２ｂｃの結合を比較するために用いられた。図１８を参照のこと。
【０３４９】
Ｈ６ミモトープへの抗体の結合の結果は、バーニヤゾーン（Foote J. and Winter G., J Mol Biol 224:487-99 (1992)）及びＲＨＡに導入されたカノニカル残基（Chothia C. et al., J Mol Biol 186:651-63 (1985)及びChothia C. et al., Nature 342:877-83 (1989)）は、結合に必要であることを示唆している。抗体ＲＨｂ−ｈ／ＶｌのＨ６ペプチドへの結合は、キメラ抗体（Ｖｈ／Ｖｌ）ポジティブコントロールに最も近く、完全にヒト化されたＲＨｂ−ｈ／ＲＫ２ｂｃ抗体より優れており、ヒト化軽鎖がキメラ軽鎖ほど優れていないことを示唆している。キメラ軽鎖ＲＨＡ／Ｖｌと比較すると、ＲＨＡ／ＲＫ２ｂｃの特に低い結合が強調される。
【０３５０】
この実験の結論は、重鎖ＲＨｂ−ｈが抗原結合にきわめて重要なＡＰ３３  ＶＨの構造的特徴の多くを保持しているということであるが、ヒト化軽鎖はより優れてはいないということである。しかしながら、同じＬ１ループ長を有するマウス軽鎖遺伝子のヒトオルソログが存在しないことは、ヒト化における潜在的な問題として予想されていた。
【０３５１】
実施例１Ｂ：ヒト化重鎖境界面残基Ｑ３９に媒介される重鎖および軽鎖間の境界面は、準最適な結合に関与していなかった。
軽鎖の低い機能に対する一つの説明は、重鎖および軽鎖間の境界面残基が適合しなかったということであった。Chothia C. et al., J Mol Biol 186:651-63 (1985)を参照のこと。位置３９の境界面グルタミン残基は、ＲＨｂ−ｈ及びＲＨＩと表される新規な重鎖において、マウスと同じリジンに復帰突然変異された。
【０３５２】
ＲＫ２ｂｃ又はキメラ軽鎖と対をなすＲＨＩの結合はＨ６ペプチドへの結合が改善されず、境界面残基Ｑ３９Ｋが図１９に示される準最適な結合に関与しなかったことを示唆している。
【０３５３】
実施例１Ｅ：様々なＥ２ペプチドへのＲＨｂ−ｈの結合
異なるＨＣＶ遺伝子型へのヒト化抗体の結合を推定するために、表５に示されるペプチドは、種々のＥ２変異体の代用として用いられた。キメラ軽鎖Ｖｌと対をなすＲＨｂ−ｈのペプチドへの結合は、図２０Ｂに示す。この結果は、ヒト化重鎖が様々なペプチドに結合するが、図２０Ａに示されるキメラ抗体Ｖｈ／Ｖｌほど効果的ではないことを示している。実際、ヒト化抗体は、ペプチドＢ１を結合しないようである。結果は、重鎖の保存されていないカノニカル及びバーニヤゾーン残基を置換することが、あらゆるペプチド抗原結合を保持するには不十分であることを示した。
表５：ヒト化ＡＰ３３の結合解析において用いられるペプチド。
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【０３５４】
興味深いことは、その変異体ＡＰ３３エピトープを有するペプチドが保存された変化（例えば、Ｂ１はＧｌｎをＡｓｎに置換し、ペプチドＣ２及びＧ３はＩｌｅからＶａｌへの置換である）を有することである。より小さい残基へのこれらの保存的な変化は、エピトープの収縮を表し得る。これは、よりすばらしい到達を与えるためにＡＰ３３及びヒト化抗体の抗原接触残基を変更し得るという可能性を高める。これの効果は、より短いエピトープ残基を含み、ＡＰ３３へのより弱い結合を示すＨＣＶ遺伝子型への抗体の結合を増強し得る。ヒト化抗体がＢ１ペプチドに結合しないにもかかわらず、この配列はＨＣＶの感染性株において見いだされなかったことは重要である。
【０３５５】
実施例１Ｆ：ＲＫ２の最小の変異の同定
ＲＫ２軽鎖において突然変異された、保存されていないＶＣ残基が２つ存在した（変異ｂ（Ｙ３６Ｆ）及び変異ｃ（Ｇ６８Ｒ））。それぞれのＶＣ変異は、ヒトと同じ残基、Ｙ３６及びＧ６８へと復帰突然変異された。結果（図２１）は、変異ｂが軽鎖活性のために必須であるが、変異ｃはそうではないことが示している。
【０３５６】
実施例１Ｇ：重鎖ヒト化に必要なＶＣ変化の最小数の同定
表６の変異の効果は、ヒト化抗体の異なるバージョンの表５に記載されるペプチドへの結合と比較することによって評価された。図３２Ａ−Ｇ、及びその全てが本明細書に援用される米国仮出願第６１／００６，０６６を参照のこと。
表６：ヒト化抗体変異体及び配列の同定。
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【０３５７】
結果は、図２２に示され、Ｈ６への最大結合の割合としてそれぞれのデータセットを表すことによって図２３において標準化された。抗体ＲＨ−Ｆの結果は、ＶＣ変異Ｆ（Ｖ７１Ｒ）の欠如が有意に抗体の結合に影響することを示唆した。したがって、ヒトからマウス配列への他の全てのＶＣ変異の存在にもかかわらず、位置７１のアルギニンは最適結合のために必要である。結合が検出された全ての場合において、ＲＨ−Ｆはより弱くペプチドに結合した。しかしながら、復帰突然変異された変異体によるペプチドＧ３への結合は、本来の変異Ｓ３０Ｔ（ｂ）、Ｉ４８Ｍ（ｄ）及びＶ６７Ｉ（ｅ）が結合親和性にとって重要であることを同定した。変異Ｆ７８Ｙ（ｇ）及びＲ９４Ｌ（ｈ）は、基本的に見分けがつかなく（ＲＨｂ−ｈ標準と比較して、復帰突然変異した場合わずかに低い結合を示す）、ペプチド結合に決定的ではないようであった。しかしながら、抗体ＲＨ−Ｃは、ＲＨｂ−ｈ（図２３）を含む他の全ての変異体よりもペプチドＧ３及びＣ２への増加した結合をもたらした。この場合、変異ｃ（Ｗ４７Ｙ）は存在せず、ヒトトリプトファン残基は保持される（しかし、ＶＣ変異Ｓ３０Ｔ、Ｉ４８Ｍ、Ｖ６７Ｉ、Ｖ７１Ｒ、Ｆ７８Ｙ及びＲ９４Ｌは存在する）。この基礎に、重鎖変異体ＲＨ−Ｃを含むヒト化抗体は、ＨＣＶｐｐアッセイにおいて試験するために選択され、ＲＨｂ−ｈと比較された。ヒト化抗体ＲＨ−Ｈ（変異ｈ（Ｒ９４Ｌ）は存在しない）も、ＨＣＶｐｐアッセイにおいて試験するために包含された。Ｒ９４Ｌ変異はＨ３ループを保持しするカノニカル及びバーニヤゾーン残基であり、我々はＨ３ループの破壊がＨＣＶｐｐ感染の阻害に悪影響を与えるかどうかを測定したかった。これらの重鎖は、ヒト化軽鎖変異体ＲＫ２ｂと同時発現された。
【０３５８】
実施例１Ｈ：ＨＣＶシュードパーティクル感染アッセイ
３つのヒト化抗体は、ＨＣＶｐｐ感染アッセイにおいて試験された。全てのヒト化重鎖は、軽鎖ＲＫ２ｂと対をなしていた。ペプチド結合データが重鎖ＲＨｂ−ｈ、ＲＨ−Ｃ及びＲＨ−Ｈ間でほとんど相違を示唆しなかったが、図２４及び２５に示されるデータはＲＨ−ＣがＨＣＶｐｐ感染の最良のインヒビターであることを示唆した。ＲＨ−Ｃ抗体は、少なくともポジティブコントロールであるキメラＡＰ３３とＨＣＶｐｐ感染の阻害において同程度に効果的であったが、他のヒト化抗体ＲＨｂ−ｈ及びＲＨ−Ｈは有意に効果的でなかった。４つの実験についてのＩＣ５０及びＩＣ９０は表２に示され、ヒト化抗体が全ての遺伝子型のキメラ抗体のＩＣ５０及びＩＣ９０と非常に類似した値を示すことを示している。
【０３５９】
Ｒｈ−Ｃ（すなわち残基位置４７）における復帰突然変異の位置がバーニヤ及び境界面残基であり、本来のヒトＦＷに見いだされるトリプトファン残基が重鎖および軽鎖間の境界面を改善するか、Ｈ２ループをよりよい状態で支持するか、又はその両方を行い得ることを示唆しているので、この結果は予想外だった。
【０３６０】
ＡＰ３３エピトープ中に存在するトリプトファン残基は、ＡＰ３３結合に重要であることが示された。Tarr A.W. et al., Hepatology 43:592-601 (2006)を参照のこと。Ｙ４７残基はＣＤＲの疎水性領域の真下に位置し、Ｙ４７Ｗ変異が疎水性領域の底部のすきまを埋めるのに役立つということは合理的な仮定である。
【０３６１】
Ｙ４７Ｗ変異によって媒介される改善された結合の性質を解明するに役立つ方法は、抗体Ｅ２結合の動態解析である。しかしながら、我々は、ＲＨ−ＣとＥ２タンパク質との間の相互作用の動態解析を行うことができなかった。精製されると、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質は凝集体を形成する。残念なことに、単量体のＥ２タンパク質（今までのところ利用可能ではない）は、抗体への結合親和性を測定するのに必要である。
【０３６２】
ペプチド解析のデータは、重鎖型ＲＨ−Ｇ及びＲＨ−Ｈの結合はほとんど相違していないことを示唆した。ＨＣＶシュードパーティクル実験においてＲＨ−Ｃと組み合わせたこれらの型を試験することは興味深い。これらの残基がそれぞれＨ２及びＨ３ループを支持するのに役立ち得るので、結合及び阻害について好ましい効果があるかもしれないことは当然である。
【０３６３】
実施例１Ｉ：キメラ変異体ＡＰ３３  Ｙ４７Ｆ及びＹ４７Ｗの解析
残基Ｙ４７の結合への寄付をさらに調査するために、２つのキメラ重鎖変異体（Ｙ４７Ｗ及びＹ４７Ｆ）が製作された。両方の変異体は、キメラ軽鎖Ｖｌと関連して発現され、ＨＣＶｐｐ感染アッセイ及びペプチド結合についてＡＰ３３と比較された。ペプチド結合実験（図２６）のデータは、フェニルアラニン又はトリプトファンと置換することによって残基チロシン４７をより疎水性にすることが、いくつかのＥ２ペプチド（特にペプチドＢ１（遺伝子型２ａ））への結合を改善し得ることを示唆する。しかしながら抗体が図２７に示される遺伝子型１ａ（１ａ  Ｈ７７．２０の単離）に対するＨＣＶｐｐ感染アッセイにおいて用いられた場合、Ｙ４７Ｗ又はＹ４７Ｆ変異の何れも阻害を増強しなかった。したがって、ＡＰ３３におけるＹ４７Ｗ変異が感染阻害の抗体活性を一般に改善するかどうかを決定するために様々な遺伝子型について更なるＨＣＶｐｐ感染症アッセイを実行する必要があるが、ＲＨ−Ｃの改善されたＹ４７Ｗ変異がヒト化に特異的であるという結論に達するかもしれない。
【０３６４】
実施例２
材料及び方法
以下の材料及び方法は、実施例２Ａ−Ｃに記載される実験に用いられた。
【０３６５】
バキュロウイルス発現可溶性Ｅ２（ｓＥ２）の生成
ｓＥ２発現：上で記載されているように、可溶性Ｅ２（ｓＥ２）はアミノ酸６６１（ｓＥ２６６１）で切断し、膜貫通領域を欠失させることによって作製された。Roccasecca, R. et al., J Virol 77:1856-67 (2003)を参照のこと。ｓＥ２６６１は、ＢａｃＰａｋ６線形化ウィルスＤＮＡ（ＢＤ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で同時形質導入されたバキュロウイルス導入ベクターにクローニングされ、２７℃のＥＳＦ９２１無タンパク質培地（Expression Systems, LLC）で培養された接着Ｓｆ−９昆虫細胞に形質導入された。得られたウィルス株は、大規模なタンパク質産生で用いられる前に標準的なバキュロウイルス法を用いて２倍に増殖された。産生は、ＷａｖｅＴＭバイオリアクター（GE Bioscience）中で行われた。Ｔｅｎ−ｌｉｔｅｒ  Ｔ．ｎｉ  Ｐｒｏ細胞（Expression Systems, LLC）培養は、２×１０６細胞／ｍＬまで増殖され、上記のように調製されたウィルス株５０ｍＬに感染させられた。上清は、感染後４８時間で３０００×ｇ、１５分間の遠心分離によって回収され、精製の前に０．２μＭフィルターでろ過された。
【０３６６】
ｓＥ２精製：１０Ｌのバキュロウイルス上清は、５０ｍＬのニッケル−ＮＴＡ樹脂と共にバッチ処理された。ＨＩＳで標識された可溶性Ｅ２は、ＰＢＳ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ中の２５０ｍＭイミダゾールで樹脂から溶出された。溶出液は２０ｍＭ  Ｎａ酢酸塩、ｐＨ  ５．０中に希釈され、３４ｍＬ  ＳｐＦＦ陽イオン交換カラム上にロードされ、タンパク質は０．３Ｍ  ＮａＣｌの酢酸バッファーで溶離された。溶出液は、次いでＰＢＳ＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中で、２４ｍＬ  Ｓ２００ゲル濾過カラム上にロードされ、ＰＢＳバッファーで透析された。マススペクトロメトリーを用いたＳｏｕｒｃｅ  Ｄｅｃａｙにおいて、Ｎ末端は、分泌されたタンパク質の予測されたＮ末端と適合した。
【０３６７】
ＨＣＶ  Ｅ２へのＡＰ３３／ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂの親和性の測定
バイアコアアッセイ：ＢＩＡｃｏｒｅ  Ａ１００計測器での表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の測定は、抗体への可溶性Ｅ２（ｓＥ２）の結合の親和性を測定するために用いられた。抗ヒトＦｃセンサチップ表面上のヒト化抗体の捕捉の型式が用いられ、ｓＥ２の様々な濃度の注入が続いた。製造業者によって示唆されるように、抗ヒトＦｃ抗体はアミン化学を用いてセンサーチップ表面に共有結合された。ヒト化抗体は、３０μＬ／ｍｉｎの流速で、０．５μｇ／ｍＬ溶液６０μＬを注入することによって補足された。センサーグラムはｓＥ２溶液６０μＬ注入について採取され、４８０秒間の解離のモニタリングが続いた。センサーチップ表面は、３ＭＭｇＣｌ２のアリコート１５μＬの注入によって再生され、捕捉抗体からの抗体−抗原複合体の解離をもたらした。測定は、１．５６ｎＭから５０ｎＭにわたって２倍ずつのｓＥ２濃度で繰り返された。全ての測定は、捕獲された抗Ｅ２抗体なしでの基準流入細胞のデータのリアルタイム減算法を含んだ。バッファのみの注入についてのセンサーグラムも減算された。ランニングバッファーはＨｅｐｅｓ−緩衝食塩水（ｐＨ  ７．２）であり、温度は２５℃であった。これらのデータは、動態定数を測定するために、製造業者によって供給されたソフトウェアを用いて１：１ラングミュア結合モデルで解析された。
【０３６８】
スキャチャード解析：ＨＣＶ  Ｅ２（２９３Ｔ細胞の表面に発現されるＥ１Ｅ２ヘテロダイマの一部）へのＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂの親和性は、ラジオリガンド細胞結合アッセイを用いて測定された。抗ＨＣＶ抗体（ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ  Ｆａｂ）は、ヨードゲン法を用いてヨウ化された。放射性同位元素で標識された抗ＨＣＶ抗体は、ＮＡＰ−５カラムを用いたゲル濾過によって、遊離１２５Ｉ−Ｎａから精製された。精製されたＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ  Ｆａｂ抗体は、それぞれ１７．９６μＣｉ／μｇ及び５５．２１μＣｉ／μｇの比活性を有した。ヨウ化抗体の固定濃度及び連続希釈された非標識抗体の減少性濃度を含む５０μＬ容量の競合反応混合物は、９６−ウェルプレートに入れられた。２９３Ｔ細胞は、製造業者の提言に従ってＦｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬（Roche）を用いて形質導入された。細胞は、何も補充することなく、最終的な容量２５ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Invitrogen, Gibco）中の２５μｇ／ｍＬプラスミド及び１００μＬ  Ｆｕｇｅｎｅ６試薬を用いて形質導入された。細胞は、形質導入後４８時間でＳｉｇｍａ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎバッファーを用いてプレートから分離され、結合用緩衝液（２％  ＦＢＳ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２及び２ｍＭアジ化ナトリウムをを含む５０：５０  ＤＭＥＭ／Ｆ１２）で洗浄され、０．２ｍＬの結合用緩衝液中に約２ｘ１０５細胞の密度で５０μＬ競合反応混合物に添加された。細胞を含むそれぞれの競合反応におけるヨウ化抗体の最終濃度は、ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂについては￣２００  ｐＭ、ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ  Ｆａｂについては−５００ｐＭであり、細胞を含む競合反応における非標識抗体の最終濃度は、５００ｎＭから始まり、１：２倍の減少で１０種の濃度で異なっていた。細胞の競合反応は、ＲＴで２時間インキューベートされた。非標識抗体のそれぞれの濃度についての細胞を含む競合反応は、３つ一組で試験された。インキュベーション後、競合反応は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎフィルタープレートに移され、結合しなかったヨウ化抗体を分離するために結合用バッファーで４回洗浄された。フィルターは、Ｗａｌｌａｃ  Ｗｉｚａｒｄ  １４７０ガンマカウンター（PerkinElmer Life及びAnalytical Sciences Inc.）で計数された。結合データは、抗体の結合親和性を測定するためのＭｕｎｓｏｎ及びＲｏｂａｒｄ（Munson, P. J., and D. Rodbard, Anal Biochem 107:220-39 (1980)）の適合アルゴリズムを用いたＮｅｗＬｉｇａｎｄソフトウェア（Genentech）を用いて評価された。
【０３６９】
感染性細胞培養ＨＣＶ（ＨＣＶｃｃ）の生成
Ｊｃ１（Ｊ６／Ｃ３）及びＣｏｎ１／Ｃ３の完全長ＨＣＶゲノムは、ＮＣＢＩデータベース［それぞれ、ＨＣ−Ｊ６（ＨＣ）（クローンｐＪ６ＣＦ）、Ｃｏｎ１及びＪＦＨ−１に対して受託番号ＡＦ１７７０３６、ＡＪ２３８７９９及びＡＢ０４７６３９］に記載されているように、ＨＣ−Ｊ６（ＣＨ）（Ｊ６）、ＪＦＨ−１及びＣｏｎ１のＤＮＡ配列を用いてGene Oracle Inc.（Mountain View, CA）への外注によって化学的に合成された。前述されるように、ＪＦＨ−１  ＮＳ２−ＮＳ５Ｂ領域に融合されたＪ６及びＣｏｎ１構造領域（ＮＳ２のｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ｐａｒｔ）をコード化するキメラＨＣＶｃｃウイルスが作製された（Pietschmann, T. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103:7408-13 (2006)）。Ｃｏｎ１／Ｃ３−ｎｅｏ  ＨＣＶｃｃを製作するために、ネオマイシン耐性遺伝子及びＥｃｏＲＩ及びＰｍｅＩ制限酵素認識部位が隣接する脳心筋炎ウイルス内部リボソーム移行部位（ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ）が続くエレメント５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むＤＮＡフラグメントは、Gene Oracle Inc.（Mountain View, CA）への外注によって化学的に合成された。Ｃｏｎ１／Ｃ３−ｎｅｏ  ＨＣＶｃｃをコード化するプラスミドは、ＥｃｏＲＩ及びＰｍｅＩで消化することによって生成された。Ｊｃ１（Ｊ６／Ｃ３）及びＣｏｎ１／Ｃ３−ｎｅｏ  ＤＮＡフラグメントは、ｐＵＣ−Ｊｃ１及びｐＵＣ−Ｃｏｎ１／Ｃ３−ｎｅｏを生成するために固有のＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ制限酵素認識部位を用いてｐＵＣ１９ベクターにライゲーションされた。
【０３７０】
インビトロでの転写反応：ｐＵＣ−Ｊｃ１及びｐＵＣ−Ｃｏｎ１／Ｃ３−ｎｅｏプラスミドは、ＨＣＶゲノムの３’末端に位置するＸｂａＩで消化された。３０μｇのｐＵＣ−Ｊｃ１及びｐＵＣ−Ｃｏｎ１／Ｃ３−ｎｅｏは、最終容量３００μｌで２０ＵのＸｂａＩを用いて３７℃、オーバーナイトで消化された。翌日、上述されるように、ＲＮＡは酸性フェノールを用いて抽出された。Kapadia, S. B. et al. J Virol 81:374-83 (2007)を参照のこと。インビトロでの転写反応は、Ｔ７  Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔキット（Ambion）を用いて、製造業者の提言に従って行われた。上述されるように、ＨＣＶ  ＲＮＡはフェノール／クロロホルム及びエタノール沈殿を用いて抽出された。Kapadia, S. B. et al., J Virol 81:374-83 (2007)を参照のこと。ＲＮＡは−７０℃で保存された。
【０３７１】
ＨＣＶｃｃ株の産生：Ｈｕｈ−７．５細胞は、３７℃の５％  ＣＯ２空気下において、ダルベッコ変法イーグル培地（ｃ−ＤＭＥＭ）（１０％ウシ胎児血清［ＦＢＳ］、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び０．１ｍＭ非必須アミノ酸が補充されているた）中で培養された。形質導入当日、細胞は、トリプシン処理され、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Gibco）で二回洗浄され、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中に１０７細胞／ｍｌの最終濃度で再懸濁された。インビトロで転写されたＪｃ１又はＣｏｎ１／Ｃ３−ｎｅｏ  ＲＮＡ１０μｇを加えた細胞（４×１０６細胞）４００μｌは、０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベット（BioRad）に添加された。エレクトロポレーションは、以下のパラメーターでＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（BioRad）を用いて行われた：０．２７ｋＶ、１００オーム及び９５０μＦ。キュベットは、細胞をｃ−ＤＭＥＭを含むＴ１６２フラスコに移す前に細胞が回復するように、１０分間室温でインキューベートされた。培養がコンフルエントの８０−９０％に到達した場合、細胞は必要に応じてトリプシン処理され、分割された。上清は形質導入の３日後から採取され、解明され、感染性ウィルス力価は上述したようにＴＣＩＤ５０算出方法を用いて測定された。Lindenbach, B. D., et al., Science 309:623-6 (2005)を参照のこと。上清は、等分され、−７０℃で保存された。
【０３７２】
ＨＣＶシュードパーティクル（ＨＣＶｐｐ）の生成
プラスミド：ＨＣＶ遺伝子型１ａ（Ｈ７７）、１ｂ（Ｃｏｎ１）及び２ａ（Ｊ６）のＥ１及びＥ２グリコプロテインを発現しているプラスミドは、いくつかの修正を加えて上述したように生成された（Hsu, M. et al, Proc Natl Acad Sci U S A 100:7271-6 (2003)）。簡潔には、領域コード化Ｅ１及びＥ２（及びＨＣＶ核のＣ末端のシグナルペプチドを含む）は、発現ベクターｐＲＫ−Ｈ７７、ｐＲＫ−Ｃｏｎ１及びｐＲＫ−Ｊ６それぞれを生成するために、ｐＲＫ哺乳類発現ベクターにクローニングされた。ジェネンテックは、Ｇｒｅｇ  Ｈａｎｎｏｎ（Cold Spring Harbor Labs）／Ｄａｖｉｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（Cal Tech）からΔ８．９パッケージングプラスミドを得た。Zufferey et al., Nature Biotechnology 15:871-875 (1997)を参照のこと。ＦＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ｄｓＲＥＤプラスミドは、GenentechがGreg Hannon at Cold Spring Harbor Labsから得た、それぞれ、ＨＣＭＶプロモータ及びＩＲＥＳエレメントによって駆動されるホタルルシフェラーゼ及びＤｓＲｅｄをコード化する改変ｐＦＵＧＷプラスミドである。
【０３７３】
ＨＣＶｐｐは、いくつかの修正を加えて、上述したように（Bartosch, B. et al., J Exp Med 197:633-42 (2003)）ＨＥＫ  ２９３細胞において製造された。簡潔には、２．５×１０６の２９３Ｔ細胞は、前日に１０ｃｍのプレートに播種された。翌日、細胞は、ＦＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＤｓＲｅｄプラスミド（５μｇ）、Δ８．９導入ベクター（１０μｇ）及び、ｐＲＫ−Ｈ７７、ｐＲＫ−Ｃｏｎ１又はｐＲＫ−Ｊ６プラスミド（１μｇ）の何れかで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Invitrogen）を用いて製造業者の提言に従って、同時形質導入された。形質移入後６時間にＯｐｔｉＭＥＭ培地（Invitrogen, Gibco）は、ｃ−ＤＭＥＭで置換された。形質導入の２日後、上清は採取され、浄化され、超遠心分離（３０００ｒｐｍで５分間）によってさらに精製され、感染性アッセイに用いられた。５×１０３Ｈｕｈ−７．５細胞は、白壁の９６ウェルプレート（Costar）に播種された。翌日、細胞はＨＣＶｐｐの適切な希釈物で形質導入された。感染の７２時間後、細胞は１ｘ溶解緩衝液で溶解され、ルシフェラーゼ活性はＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Promega）を用いて製造業者の提言に従って測定された。
【０３７４】
ＨＣＶ  Ｅ２への抗体結合を測定するためのＥＬＩＳＡアッセイ
Ｅ２溶解物の調製：２９３Ｔ細胞は、製造業者の提言に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いて１０μｇのｐＲＫ−Ｈ７７、ｐＲＫ−Ｃｏｎ１又はｐＲＫ−Ｊ６プラスミドで一過性に形質導入された。形質導入４８時間後、細胞はＰＢＳで洗浄され、次いで１Ｌの溶解緩衝液（２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４）；１５０ｍＭＮａＣｌ；１ｍＭＥＤＴＡ；０．５％ＮＰ−４０；２０ｍＭヨードアセトアミド）において溶解された。溶解物は、２０分間、４℃で振盪培養され、５分間遠心分離された。浄化された上清は、ＥＬＩＳＡプレートを被覆するために用いられる。
【０３７５】
ＨＣＶ  Ｅ２  ＥＬＩＳＡ：ＥＬＩＳＡアッセイは、前述したように行われた。Owsianka, A. et al., J Virol 79:11095-104 (2005)を参照のこと。簡潔には、９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ２プレートは、１００μＬのＰＢＳ中の０．２５μｇ／ウェルのＧａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓレクチン（GNA, Sigma）で被覆され、室温、オーバーナイトでインキューベートされた。翌日、プレートは、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄され、ＰＢＳＴで希釈された細胞溶解物で被覆され、室温で２時間インキューベートされた。慢性ＨＣＶ感染症患者の血清希釈物は、２％スキムミルクパウダー／ＰＢＳＴで希釈され、室温で１時間インキューベートされた。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、１００μＬ／ウェルの抗ヒトＨＲＰがコンジュゲートされた二次抗体は、ＰＢＳＴに１：１０００の希釈で添加され、室温で１時間インキューベートされた。ウェルはＰＢＳＴで６回洗浄され、ウェルは暗所、室温で３０分間１００μＬＴＭＢ基質と共にインキューベートされた。反応は０．５ＭＨ２ＳＯ４の５０μＬ／ウェルを添加することにより停止され、Ａ４５０はＳｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダー（BioTek Instruments）を用いて測定された。
【０３７６】
ＨＣＶｃｃ感染症アッセイ
９６ウェルプレートでの感染のために、５ｘ１０３のＨｕｈ−７．５細胞／ウェルは播種された。翌日、細胞は、感染効率（ＭＯＩ）＝０．３でＪｃ１又はＣｏｎ１／Ｃ３  ｎｅｏ  ＨＣＶｃｃに感染させられた。ＨＣＶｃｃを中和する抗体を同定するために、抗体はｃ−ＤＭＥＭ中に１５０μｇ／ｍｌまで希釈され、７つの抗体の３倍希釈物は別々の９６ウェルプレートに製作された。ＨＣＶｃｃ及び抗体希釈物は、組み合わせられ、ｎａｉｖｅ  Ｈｕｈ−７．５細胞に接種する前に、３７℃で１時間プレインキュベートされた。トータルＲＮＡは感染の３日後に採取され、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製（ＨＣＶ／ＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡの比率として測定された）は、後述するように、ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて測定された。
【０３７７】
ＨＣＶ感染の定量化
ＨＣＶｃｃ  ＲＮＡ複製：９６ウェルプレートで行われる実験のために、トータルＲＮＡは製造業者の説明書に従ってＳＶ９６  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Promega）を用いて抽出された。それぞれのウェルのＲＮＡは１００ＬのＲＮアーゼフリー水で溶出され、４μＬのＲＮＡはＴａｑｍａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Applied Biosystems）を用いて逆転写された。ＲＴ−ｑＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Applied Biosystems）を用いて、２５μＬ反応において５μＬのｃＤＮＡを用いて行われた。全ての反応において、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）の発現は、増幅効率及び標準化のための内部内因性標準として測定された。ＨＣＶ及びＧＡＰＤＨに対するプライマー及びプローブは、以下の通りである：
ＧＴ１ｂセンスプライマー、５’−ＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡ−３’（配列番号：２０４）；
ＧＴ１ｂアンチセンスプライマー、５’−ＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣＴＣＣ−３’（配列番号：２０５）；
ＧＴ１ｂプローブ、６ＦＡＭ−ＡＣＣＣＧＧＴＣＧＴＣＣＴＧＧＣＡＡＴＴＣＣ−ＭＧＢＮＦＱ（配列番号：２０６）；
ＧＴ２ａセンスプライマー、５’−ＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＣＣＴＡ（配列番号：２０７）；
ＧＴ２ａアンチセンスプライマー、５’−ＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴ−３’（配列番号：２０８）；
ＧＴ２ａプローブ、６ＦＡＭ−ＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣ−ＭＧＢＮＦＱ（配列番号：２０９）；
ＧＡＰＤＨセンスプライマー、５’−ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ−３’（配列番号：２１０）；
ＧＡＰＤＨアンチセンスプライマー、５’−ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ−３’（配列番号：２１１）；
ＧＡＰＤＨプローブ、ＶＩＣ−ＡＴＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡ  ＴＴＧＡＣＣＴＣ−ＭＧＢＮＦＱ（配列番号：２１２）。
蛍光は７５００ＨＴリアルタイムＰＣＲ機器を用いてモニタリングされた（Applied Biosystems, CA)。  
【０３７８】
感染性ＨＣＶｃｃの力価測定：上述したように、感染細胞の上清に存在する感染性ＨＣＶｃｃは測定された。Lindenbach, B. D. et al., Science 309:623-6 (2005)を参照のこと。簡潔には、力価測定は、ポリ‐Ｌ‐リジンで被覆された９６ウェルプレートに５×１０３Ｈｕｈ−７．５細胞を播種することによって行われた。翌日、細胞は、最終容量１００μＬの上清の１０倍希釈物で接種された。３日間後、細胞は、先に記載されたように（Kapadia, S. B. et al., J Virol 81:374-83 (2007)）４％パラホルムアルデヒドＰＢＳで固定され、抗ＨＣＶコア抗体Ｃ７−５０（Abcam）で免疫染色された。以前に記載されているように、力価はReed and Muenchの方法に従って算出された。Lindenbach, B. D. et al., Science 309:623-6 (2005)を参照のこと。
【０３７９】
ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ媒介性中和に対する慢性的ＨＣＶ感染患者の血清の作用
慢性ＨＣＶ感染症患者の血清がインビトロでＨＣＶ感染のＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ媒介性中和を拮抗したかどうか決定するために、ＨＣＶｐｐシステムを用いて中和アッセイが行われた。ＨＣＶｐｐは、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０％正常ヒト血清（ＮＨＳ）又は１０％の慢性ＨＣＶ感染症患者の血清（ＣＨＣＨＳ−１，２及び３）の何れかの存在下で、３７℃で１時間ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂの異なる濃度でインキューベートされた。９６ウェルプレートに播種されたＨｕｈ−７．５細胞は、ＨＣＶｐｐ：抗体混合物で接種された。形質導入４時間後、培地は、１０％  ＦＢＳに加えて残りのアッセイのための補助剤を含むｃ−ＤＭＥＭで置換された。３日間後、細胞は溶解され、ルシフェラーゼ活性は上述のように測定された。抗ＨＣＶＥ１／Ｅ２抗体のレベルは、上述のようにＥＬＩＳＡを用いて測定された。
【０３８０】
実施例２Ａ：ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂによるＨＣＶｃｃ及びＨＣＶｐｐの中和
ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂがＨＣＶの侵入及び感染を阻害するかどうか決定するために、中和アッセイは、ＨＣＶｐｐ及びＨＣＶｃｃを用いてＨｕｈ−７．５細胞で行われた。ＡＰ３３はコントロールとして用いられた。ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂによるＨＣＶ侵入の特定の阻害を同定するために、ＧＴ１ｂ（Ｃｏｎ１）又はＧＴ２ａ（Ｊ６）のＥ１Ｅ２配列を含むＨＣＶｐｐは、ＡＰ３３又はＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂの存在下でインキューベートされた。ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂは、Ｃｏｎ１及びＪ６  ＨＣＶｐｐ侵入を同等に阻害した（Ｃｏｎ１及びＪ６  ＨＣＶｐｐに対してそれぞれＥＣ５０＝０．５１１μｇ／ｍＬ及び０．７９３μｇ／ｍＬ）。図２８Ａ−Ｃを参照のこと。さらに、両方のＨＣＶｐｐ遺伝子型のＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ中和は、ＡＰ３３で見られるものに相当した（Ｃｏｎ１及びＪ６  ＨＣＶｐｐに対してそれぞれＥＣ５０＝１．４１７μｇ／ｍＬ及び２．０６６μｇ／ｍＬ（図２８Ａ−Ｃ））。
【０３８１】
Ｒｈ−Ｃ／ＲＫ２ｂが感染性細胞培養ウイルス（ＨＣＶｃｃ）を中和したかどうか決定するために、同様の中和アッセイがＡＰ３３及びＲｈ−Ｃ／ＲＫ２ｂで行われた。ＡＰ３３は、複数の遺伝子型のＥ１Ｅ２配列を含むＨＣＶｐｐについて以前に記載されたものに相当するレベルでＣｏｎ１及びＪ６  ＨＣＶｃｃを阻害した（Owsianka, A. et al., J Virol 79:11095-104 (2005)）。ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂがＡＰ３３と同等のレベルでＣｏｎ１  ＨＣＶｃｃ感染を阻害したのに対して（２９Ａ図及びＣ）、ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂはＡＰ３３よりも少なくとも〜４．７倍優れたＪ６  ＨＣＶｃｃの阻害を示した（図２９Ｂ−Ｃ）。
【０３８２】
実施例２Ｂ：Ｅ２への抗ＨＣＶ  Ｅ２抗体の親和性測定
さらなる実験において、ＡＰ３３及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂの可溶性Ｅ２（ｓＥ２）に対する親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイで測定された。ＡＰ３３及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂは、同様の親和性でｓＥ２に結合した（ＡＰ３３に対して〜５−８ｎＭ及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂに対して〜３．８ｎＭ）。比較として、それぞれの抗体のＦａｂ断片は、〜５０ｎＭの親和性でｓＥ２に結合した。ｓＥ２タンパク質の結合に加えて、ＡＰ３３及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂの２９３Ｔ細胞表面に発現されるＥ１Ｅ２ヘテロダイマーへの結合が測定された。Ｅ１Ｅ２コード化プラスミドで形質導入された２９３Ｔ細胞がその細胞表面上に機能的なＥ１Ｅ２ヘテロダイマーを発現することは既知であるので、スキャチャード解析がＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ  Ｆａｂの親和性を決定するために行われた。細胞表面に発現されたＥ２へのＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ  Ｆａｂの親和性（それぞれ〜５及び〜５０ｎＭ）は、上記のＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおけるｓＥ２のものと同等であった。表７を参照のこと。
表７：抗体親和性（ｎＭ）
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【０３８３】
実施例２Ｃ：慢性ＨＣＶ感染症患者の血清は、ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂに媒介される中和を拮抗しない
慢性患者血清（抗ＨＣＶ抗体を含む）がＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂの中和能力を拮抗することができるかを決定するために、中和アッセイは、１０％正常ヒト血清（ＮＨＳ）又は慢性ＨＣＶ感染症患者の血清（ＣＨＣＨＳ−１及び−２）の存在下で、Ｃｏｎ１  ＨＣＶｐｐを用いて行われた。ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂは、ヒト血清（図３０Ａ）の供給源に関係なく、同程度ＨＣＶ感染を阻害した。これらの慢性ＨＣＶ感染症患者の血清が遺伝子型１ｂに対する抗体を含むかどうかを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイは、ＧＴ１ｂ（Ｃｏｎ１）Ｅ１Ｅ２−形質導入２９３Ｔ細胞の溶解物を用いて行われた。１０μｇ／ｍＬの初濃度から始まるＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂの３倍希釈物は、コントロールとして用いられた。ＮＨＳではＥ２への結合が検出されなかったのに対して、慢性ＨＣＶ感染症患者の血清の両方では用量依存的な結合が検出され、Ｃｏｎ１  ＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２反応性抗体を含むことが示唆される。図３０Ｂを参照のこと。これらの結果は、抗ＨＣＶ抗体が患者血清中に存在するのに対して、それらがインビトロでＨＣＶを中和するためのＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂの能力と干渉しないことを示唆する。
【０３８４】
実施例３
ＩＦＮ−α及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂのインビトロでのＨＣＶｃｃ感染の相乗的阻害
ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂの添加がインビトロでのＩＦＮ−αの抗ウイルス効果を増強したかどうか試験するために、Ｈｕｈ−７．５細胞は、ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂのみ、ＩＦＮ−αのみ又はＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂに加えてＩＦＮ−αの組み合わせの存在下で、Ｊｃ１又はＣｏｎ１／Ｃ３−ｎｅｏ  ＨＣＶｃｃに感染させられた。
【０３８５】
上述されるように、Ｈｕｈ−７．５細胞を１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むｃ−ＤＭＥＭ中で増殖することにより分化させた。Sainz, B., Jr., and F. V. Chisari., J Virol 80:10253-7 (2006)を参照のこと。これは、細胞増殖によるウイルス伝播を防止し、ＨＣＶ伝播を特異的に測定する。簡潔に、Ｈｕｈ−７．５細胞はＢｉｏｃｏａｔプレート（Beckton Dickinson）に播種され、２週間の１％ＤＭＳＯを含むｃ−ＤＭＥＭに切り替える前に、９０％コンフルエントまで増殖される。培地は、２日ごとに交換された。細胞は、Ｊｃ１又はＣｏｎ１／Ｃ３−ｎｅｏの何れかに、又はＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂのみ、ＩＦＮ−αのみ又はＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ及びＩＦＮ−α＋の組合せの存在下で、感染させられた。α−インターフェロンは（PBL Biomedical Laboratories）から購入した。トータルＲＮＡは４日間ごと採取され、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製は実施例２において述べたように測定された。
【０３８６】
ＨＣＶ  ＲＮＡは、感染を解析するために、感染後１４日目又は１８日目で測定された。感染後１４日、ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ及びＩＦＮ−αのみではそれぞれ〜５倍及び〜２５０倍感染を減少させたのに対し、ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂに加えてＩＦＮ−αが存在する場合は、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製が１０００倍減少していた（図３１Ａ）。同様の相乗効果は、感染１８日後にも確認された（図３１Ｂ）。
【０３８７】
実施例４
ＩＦＮ−α及びＲＨ−Ｈ／ＲＫ２ｂ及びＲＨｂ−Ｈ／ＲＫ２ｂのインビトロでのＨＣＶｃｃ感染の相乗的阻害
ＲＨ−Ｈ／ＲＫ２ｂ又はＲＨｂ−Ｈ／ＲＫ２ｂの添加がインビトロでＩＦＮ−αの抗ウイルス効果を増強するかをどうか試験ために、Ｈｕｈ−７．５細胞は、ＲＨ−Ｈ／ＲＫ２ｂのみ、ＲＨｂ−Ｈ／ＲＫ２ｂのみ、ＩＦＮ−αのみ、又はＲＨ−Ｈ／ＲＫ２ｂ又はＲＨｂ−Ｈ／ＲＫ２ｂに加えてＩＦＮ−αの組み合わせの存在下で、Ｊｃ１又はＣｏｎ１／Ｃ３−ｎｅｏ  ＨＣＶｃｃｃで感染させられた。
【０３８８】
上述されるように、Ｈｕｈ−７．５細胞を１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むｃ−ＤＭＥＭ中で増殖することにより分化させた。Sainz, B., Jr., and F. V. Chisari., J Virol 80:10253-7 (2006)を参照のこと。これは、細胞増殖によるウイルス伝播を防止し、特異的にＨＣＶ伝播を測定する。簡潔に、Ｈｕｈ−７．５細胞はＢｉｏｃｏａｔプレート（Beckton Dickinson）に播種され、２週間の１％ＤＭＳＯを含むｃ−ＤＭＥＭに切り替える前に、９０％コンフルエントまで増殖される。培地は、２日ごと交換される。細胞は、Ｊｃ１又はＣｏｎ１／Ｃ３−ｎｅｏの何れかに、又はＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂのみ、ＲＨｂ−Ｈ／ＲＫ２ｂのみ、ＩＦＮ−αのみ又はＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ又はＲＨｂ−Ｈ／ＲＫ２ｂに加えてＩＦＮ−αの組合せの存在下で、感染させられる。α−インターフェロンは（PBL Biomedical Laboratories）から購入される。トータルＲＮＡは４日間ごと採取され、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製は実施例２において述べたように測定される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2012512261.tif 000034
【図２１】
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【図２２Ａ−Ｄ】
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【図２２Ｅ−Ｉ】
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【図２３】
2012512261.tif 000038
【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ１】
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【図３２Ａ２】
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【図３２Ｂ１】
2012512261.tif 000049
【図３２Ｂ２】
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【図３２Ｂ３】
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【図３２Ｃ１】
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【図３２Ｃ２】
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【図３２Ｃ３】
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【図３２Ｄ１】
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【図３２Ｄ２】
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【図３２Ｄ３】
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【図３２Ｅ１】
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【図３２Ｅ２】
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【図３２Ｅ３】
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【図３２Ｆ１】
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【図３２Ｆ２】
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【図３２Ｆ３】
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【図３２Ｇ１】
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【図３２Ｇ２】
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【図３２Ｇ３】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年8月29日(2011.8.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2012512261000001.app
【国際調査報告】
2012512261.tif 000067
2012512261.tif 000068
2012512261.tif 000069
2012512261.tif 000070