(57)【要約】本明細書において、以下を含む、免疫グロブリンをコードするｍＲＮＡの量の決定のための方法を報告する：ａ）サンプルを提供すること、ｂ）配列番号２３及び２４のプライマーならびに配列番号３３のプローブを用いて軽鎖を増幅させるためのポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、及び／又はｃ）配列番号１９及び２１のプライマーならびに配列番号４０のプローブを用いて重鎖を増幅させるためのポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、及びｄ）効率２．０を用いて定量化すること。配列番号２３及び２４を有するプライマーが、それぞれ位置ＣＬ  ２４７−２６６及びＣＬ１６６−１８５で結合し、配列番号３３を有するプローブが、ヒトＩｇＧカッパ鎖中の１８９〜２１２で結合する。配列番号１９を有するプライマーが、ＣＨ領域２位置２２０〜２３７で結合し、配列番号２１を有するプライマーが、ＣＨ領域３位置１１４〜１３３で結合する。最後に、配列番号４０を有するプローブが、ＣＨ２中の位置３１５からＣＨ３中の位置７までに結合する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）サンプルを提供すること、
ｂ）配列番号２３及び２４のプライマーならびに配列番号３３のプローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、及び／又は
ｃ）配列番号１９及び２１のプライマーならびに配列番号４０のプローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、及び
ｄ）効率２．０を用いて定量化すること
を含む、ｍＲＮＡの量の決定のための方法。
【請求項２】
ａ）未知の生産性を有する細胞及び公知の生産性を有する細胞を提供すること、
ｂ）生産性が公知の該細胞のＲＮＡを用いて、配列番号２３及び２４のプライマーならびに配列番号３３のプローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、及び／又は配列番号１９及び２１のプライマーならびに配列番号４０のプローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、それにより生産性が公知の細胞において該免疫グロブリンをコードするｍＲＮＡの量を決定すること、
ｃ）生産性が未知の該細胞のＲＮＡを用いて、配列番号２３及び２４のプライマーならびに配列番号３３のプローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、及び／又は配列番号１９及び２１のプライマーならびに配列番号４０のプローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、それにより生産性が未知の細胞において該免疫グロブリンをコードするｍＲＮＡの量を決定すること、
ｄ）生産性が公知の該細胞に対する生産性が未知の該細胞の該免疫グロブリンをコードするｍＲＮＡの決定量の比率を算出すること、
ｅ）生産性が公知の該細胞の生産性を、算出された該比率を用いて乗じ、それにより免疫グロブリンを発現する細胞の生産性を決定すること
を含む、免疫グロブリンを発現する細胞の生産性を決定するための方法。
【請求項３】
ａ）細胞を提供すること、
ｂ）該細胞のＲＮＡを単離すること、
ｃ）単離ＲＮＡを用いて、配列番号２３及び２４のプライマーならびに配列番号３３のプローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、
ｄ）単離ＲＮＡを用いて、配列番号１９及び２１のプライマーならびに配列番号４０のプローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、
ｅ）工程ｃ）及びｄ）においてポリメラーゼ連鎖反応産物が得られる場合、免疫グロブリン産生細胞として細胞を選択すること
を含む、免疫グロブリン産生細胞の選択のための方法。
【請求項４】
ａ）複数の細胞を提供すること、
ｂ）該細胞の各々のＲＮＡを単離すること、
ｃ）単離ＲＮＡの各々を用いて、配列番号２３及び２４のプライマーならびに配列番号３３のプローブを用いて個別にポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、
ｄ）単離ＲＮＡの各々を用いて、配列番号１９及び２１のプライマーならびに配列番号４０のプローブを用いて個々にポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、
ｅ）工程ｃ）及びｄ）において形成されたポリメラーゼ連鎖反応産物の量に基づいて免疫グロブリン産生細胞として細胞を選択すること
を含む、免疫グロブリン産生細胞の選択のための方法。
【請求項５】
ａ）複数の細胞を提供すること、
ｂ）該細胞の各々のＲＮＡを単離すること、
ｃ）単離ＲＮＡの各々を用いて、配列番号２３及び２４のプライマーならびに配列番号３３のプローブを用いて個別にポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、
ｄ）単離ＲＮＡの各々を用いて、配列番号１９及び２１のプライマーならびに配列番号４０のプローブを用いて個別にポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、
ｅ）工程ｃ）及び／又はｄ）において形成されたポリメラーゼ連鎖反応産物の量に基づき細胞を選択すること、
ｆ）選択された細胞を培養すること、
ｇ）細胞又は培養培地から免疫グロブリンを回収し、それにより免疫グロブリンを生産すること
を含む、免疫グロブリン生産のための方法。
【請求項６】
工程ｄ）において最高量のポリメラーゼ連鎖反応産物を有する細胞を選択することを特徴とする、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
提供された細胞又は提供された細胞群が、免疫グロブリンをコードする核酸を用いてトランスフェクトされていることを特徴とする、請求項３〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
比率が因数０．９２５を用いて乗じられることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項９】
ポリメラーゼ連鎖反応がTaqMan加水分解プローブフォーマットであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
配列番号２３及び２４のプライマーが免疫グロブリン軽鎖用であり、配列番号１９及び２０のプライマーが免疫グロブリン重鎖用であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
軽鎖プライマーを、色素ＦＡＭを用いて標識し、重鎖プライマーを色素Ｃｙ５を用いて標識することを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ポリメラーゼ連鎖反応を実施する工程が、さらに、リアルタイムで核酸の増幅を測定し、核酸の増幅量を決定することを含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
ポリメラーゼ連鎖反応が逆転写ポリメラーゼ連鎖反応であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
ａ）配列番号２３の核酸、
ｂ）配列番号２４の核酸、及び
ｃ）配列番号３３の核酸
を含むキット。
【請求項１５】
ａ）配列番号１９の核酸、
ｂ）配列番号２１の核酸、及び
ｃ）配列番号４０の核酸
を含むキット。
【請求項１６】
ポリメラーゼ連鎖反応における配列番号２３、２４、及び３３又は配列番号１９、２１、及び４０の核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンをコードする核酸、即ち、ＲＮＡ及びＤＮＡ、ならびに免疫グロブリンをコードする核酸のＰＣＲ決定用のプライマーの決定のための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
現在のバイオテクノロジープロセスにおいて、遺伝子操作された微生物が、治療用ポリペプチドを高収率で提供するために用いられる。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株が、組換えポリペプチド、特に治療用免疫グロブリンの産生のために広く使用される。この細胞株は二次改変を提供することが可能であり、最も重要なことは、ＣＨＯ細胞株は、組換え産生されたポリペプチドを培養液に分泌することが可能であり、下流のプロセス操作を容易にする（Jiang, Z., et al., Biotechnol. Prog. 22 (2006) 313-138; Yee, J. C., et al., Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 246-263）。親細胞株と同様の組換え細胞株パラメータの生産性を増加させるために、培養液、又は培養条件を最適化しなければならない（Yee, J. C., et al., Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 246-263）。
【０００３】
組換え細胞株のゲノムにおいて組込まれた異種核酸の位置、構造、及びコピー数の分析に基づき、組換え細胞株の特性についての決定のための指標を確立すべきである（Wurm, F. M., Ann. N. Y. Acad. Sci. 782 (1996) 70-78）。異種ポリペプチドをコードする核酸を、組換え細胞株のゲノム中にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として組込み、それは転写プロセスの間にリボ核酸（ＲＮＡ）に転写される。ＲＮＡは、次に、翻訳プロセスにおけるタンパク質生合成のためのテンプレートである。遺伝子発現のためのＲＮＡの重要性のために、この核酸の分析が重要性を得る（Seth, G., et al., Biotechnol Bioeng. 97 (2007) 933-951）。
【０００４】
ＷＯ２００８／０９４８７１において、高産生細胞株の選択のための方法が報告される。モノクローナル抗体産生ＣＨＯ細胞株の試験が、Chusainow, J., et al.（Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 1182-1196）により報告される。Barnes, L. M., et al.（Biotechnol. Bioeng. 85 (2004) 115-121）は、組換えＮＳ０骨髄腫細胞における安定的なタンパク質発現の予測指標の分子定義を報告する。
【０００５】
発明の要約
本発明の一局面は、ポリメラーゼ連鎖反応及び絶対的定量化を用いた、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリン軽鎖及び／又は免疫グロブリン重鎖をコードするｍＲＮＡの量の決定のための方法であって、以下
ａ）配列番号２３及び２４のプライマーならびに配列番号３３のプローブを用いて、TaqMan加水分解プローブフォーマットにおける色素ＦＡＭを用いて免疫グロブリン軽鎖についてのポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、及び／又は
ｂ）配列番号１９及び２１のプライマーならびに配列番号４０のプローブを用いて、TaqMan加水分解プローブフォーマットにおける色素Ｃｙ５を用いて免疫グロブリン重鎖についてのポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、及び
ｃ）効率２．０を用いて絶対的定量化を実施すること
による。
【０００６】
本発明のさらなる局面は、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号３３の核酸を含む第１のキットならびに配列番号１９、配列番号２１、及び配列番号４０の核酸を含む第２のキットである。
【０００７】
別の局面は、ポリメラーゼ連鎖反応における配列番号２３、２４、及び３３又は配列番号１９、２１、及び４０の核酸の使用である。
本発明の別の局面は、以下の順番で以下：
−  生産性が公知の細胞において異種ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量を決定すること、
−  生産性が未知の細胞において前記異種ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量を決定すること、
−  生産性が公知の前記細胞に対する生産性が未知の前記細胞の前記異種ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの決定量の比率を算出すること、
−  生産性が公知の前記細胞の生産性を、算出された前記比率を用いて乗じ、それにより異種ポリペプチドを発現する細胞の生産性を決定すること
の工程を含む、異種ポリペプチドを発現する細胞の生産性を決定するための方法である。
【０００８】
一実施態様において、前記異種ポリペプチドは、免疫グロブリン、又は免疫グロブリンフラグメント、又は免疫グロブリン抱合体である。さらなる実施態様において、ｍＲＮＡの前記量の前記決定は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介する。一実施態様において、ｍＲＮＡの量を決定することは、配列番号２３及び２４のプライマーならびに配列番号３３のプローブを用いた、TaqMan加水分解プローブフォーマットにおける色素ＦＡＭを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、及び／又は、配列番号１９及び２１のプライマーならびに配列番号４０のプローブを用いた、TaqMan加水分解プローブフォーマットにおける色素Ｃｙ５を用いたポリメラーゼ連鎖反応による。さらなる実施態様において、前記異種免疫グロブリンをコードするｍＲＮＡの前記量は、前記異種免疫グロブリンの軽鎖をコードするｍＲＮＡの量及び前記異種免疫グロブリンの重鎖をコードするｍＲＮＡの量の平均である。別の実施態様において、前記生産性は、pg/細胞/日の特定産生率である。別の実施態様において、前記ポリメラーゼ連鎖反応は、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応である。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明において、免疫グロブリンをコードする核酸（ＤＮＡ）のコピー数及びそこから生成される転写物（ＲＮＡ）の量を使用し、異種免疫グロブリンを発現する組換えＣＨＯ細胞株の生産性を決定できることが見出されている。また、異種ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量が、そのような細胞の特定の生産性についての測定であることが見出されている。
【００１０】
本発明は、以下：
ａ）配列番号２３及び２４のプライマーならびに配列番号３３のプローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、及び／又は配列番号１９及び２１のプライマーならびに配列番号４０のプローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、それにより生産性が公知の細胞において免疫グロブリンをコードするｍＲＮＡの量を決定すること、
ｂ）配列番号２３及び２４のプライマーならびに配列番号３３のプローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、及び／又は配列番号１９及び２１のプライマーならびに配列番号４０のプローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、それにより生産性が未知の細胞において免疫グロブリンをコードするｍＲＮＡの量を決定すること、
ｃ）生産性が公知の細胞に対する生産性が未知の細胞の免疫グロブリンをコードするｍＲＮＡの決定量の比率を算出すること、
ｄ）生産性が公知の細胞の生産性を、算出された比率を用いて乗じ、それにより免疫グロブリンを発現する細胞の生産性を決定すること
を含む、免疫グロブリンを発現する細胞の生産性を決定するための方法を含む。
【００１１】
当業者に公知の方法及び技術は、本発明を行うために有用であり、例えば、Ausubel, F. M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997), Wiley and Sons; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)において記載される。
【００１２】
本願内で使用する「アミノ酸」という用語は、カルボキシαアミノ酸の群を示し、それらは直接的に又は前駆体の形態で、核酸によりコードされうる。個々のアミノ酸は、３つのヌクレオチドからなる核酸、いわゆるコドン又は塩基トリプレットによりコードされる。各アミノ酸は、少なくとも１つのコドンによりコードされる。異なるコドンによる同じアミノ酸のコードは、「遺伝コードの縮重」として公知である。本願内で使用する「アミノ酸」という用語は、天然に存在するカルボキシαアミノ酸を示し、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含んでいる。
【００１３】
「核酸」又は「核酸配列」は、これらの用語は本願内で互換的に使用され、個々のヌクレオチド（塩基とも呼ぶ）Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ（又はＲＮＡ中のＵ）からなるポリマー分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその改変を指す。このポリヌクレオチド分子は、天然に存在するポリヌクレオチド分子もしくは合成ポリヌクレオチド分子又は１つ又は複数の天然に存在するポリヌクレオチド分子と１つ又は複数の合成ポリヌクレオチド分子の組み合わせでありうる。また、この定義により、１つ又は複数のヌクレオチドが変化（例、突然変異誘発による）、欠失、又は付加されている天然に存在するポリヌクレオチド分子が包含される。核酸を、単離する、又は別の核酸、例えば、発現カセット、プラスミド、又は細胞の染色体中に組込むことができる。
【００１４】
当業者に対して、（例、ポリペプチドの）アミノ酸配列を、このアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列に変換するための手順及び方法が周知である。従って、核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列により、及び同様に、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列により特徴付けられる。
【００１５】
「ポリペプチド」は、天然で又は合成的に産生されたかを問わず、ペプチド結合により連結されたアミノ酸からなるポリマーである。約２０アミノ酸残基未満のポリペプチドを「ペプチド」といってもよいのに対し、２つ又はそれ以上のポリペプチドからなる又は１００を上回るアミノ酸残基の１つのポリペプチドを含む分子を「タンパク質」といってもよい。ポリペプチドは、また、非アミノ酸成分、例えば炭水化物基、金属イオン、又はカルボン酸エステルなどを含んでもよい。非アミノ酸成分を、ポリペプチドが発現される細胞により加えてもよく、細胞型によって変動しうる。ポリペプチドは、本明細書において、それらのアミノ酸骨格構造又はこれをコードする核酸に関して定義する。付加物、例えば炭水化物基などは、一般的に特定されず、しかし、それにもかかわらず存在してもよい。
【００１６】
「免疫グロブリン」という用語は、種々の形態の免疫グロブリン構造（完全免疫グロブリン及び免疫グロブリン抱合体を含む）を包含する。本発明において用いられる免疫グロブリンは、一実施態様において、ヒト抗体、又はヒト化抗体、又はキメラ抗体、又はＴ細胞抗原枯渇抗体である（例、ＷＯ９８／３３５２３、ＷＯ９８／５２９７６、及びＷＯ００／３４３１７を参照のこと）。免疫グロブリンの遺伝子操作は、例えば、Morrison, S. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238及びUS 5,204,244; Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M. S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125に記載されている。免疫グロブリンは、種々のフォーマット（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ）２ならびに一本鎖（ｓｃＦｖ）又はダイアボディ）で存在しうる（例、Huston, J. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R. E., et al., Science 242 (1988) 423-426；一般的に、Hood et al., Immunology, Benjamin N. Y., 2nd edition (1984);及びHunkapiller, T. and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16）。
【００１７】
「完全免疫グロブリン」という用語は、２つのいわゆる軽鎖及び２つのいわゆる重鎖を含む免疫グロブリンを示す。完全免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の各々は、抗原と相互作用できる結合領域を含む可変ドメイン（可変領域）（一般的に、ポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含む。完全免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の各々は、定常領域（一般的に、カルボキシ末端部分）を含む。重鎖の定常領域は、抗体の、ｉ）Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）を持つ細胞、例えば食細胞など、又はｉｉ）Ｂｒａｍｂｅｌｌ受容体としても公知の新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を持つ細胞に対する結合を媒介する。それは、また、古典的補体系、例えば成分（Ｃ１ｑ）などの因子を含む一部の因子に対する結合を媒介する。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の可変ドメインは、次に、異なるセグメント、即ち、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＣＤＲ）を含む。
【００１８】
「免疫グロブリン抱合体」という用語は、ペプチド結合を介してさらなるポリペプチドに抱合された免疫グロブリン重鎖又は軽鎖の少なくとも１つのドメインを含むポリペプチドを示す。さらなるポリペプチドは、非免疫グロブリンペプチド、例えばホルモン、又は増殖受容体、又は抗融合ペプチド、又は補体因子などである。例示的な免疫グロブリン抱合体が、ＷＯ２００７／０４５４６３に報告されている。
【００１９】
「異種免疫グロブリン」という用語は、哺乳動物細胞又は宿主細胞により天然で産生されない免疫グロブリンを示す。本発明の方法に従い産生される免疫グロブリンは、組換え手段により産生される。そのような方法は、最先端技術において広く公知であり、真核細胞におけるタンパク質発現を含み、続く異種免疫グロブリンの回収及び単離、ならびに通常は医薬的に許容可能な純度までの精製を伴う。免疫グロブリンの産生、即ち、発現のために、軽鎖をコードする核酸及び重鎖をコードする核酸を、各々、標準方法により発現カセット中に挿入する。免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードする核酸を、従来手順を使用して、容易に単離及び配列決定する。ハイブリドーマ細胞は、そのような核酸の供給源としての役割を果たしうる。発現カセットを発現プラスミド中に挿入してもよく、それを次に本来は免疫グロブリンを産生しない宿主細胞中にトランスフェクトする。発現を、適切な原核又は真核宿主細胞中で実施し、免疫グロブリンを、溶解後の細胞から又は培養上清から回収する。
【００２０】
「単離ポリペプチド」には、本質的に、混入する細胞成分、例えば炭水化物、脂質、又は天然でポリペプチドに関連する他のタンパク質性不純物などがないポリペプチドである。典型的には、単離ポリペプチドの調製物は、ポリペプチドを、高度に精製された形態で、即ち、少なくとも約８０%純粋、少なくとも約９０%純粋、少なくとも約９５%純粋、９５%を上回り純粋、又は９９%を上回り純粋に含む。特定のタンパク質調製物が単離ポリペプチドを含むことを示す１つの方法は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びゲルのクーマシーブリリアントブルー染色に続く単一バンドの出現による。しかし、「単離」という用語は、代わりの物理的形態、例えば二量体又は代わりにグリコシル化又は誘導体化形態などでの同じポリペプチドの存在を除外しない。
【００２１】
「異種ＤＮＡ」又は「異種ポリペプチド」は、所与の宿主細胞内で天然に存在しないＤＮＡ分子もしくはポリペプチド、又はＤＮＡ分子の集団もしくはポリペプチドの集団を指す。特定の宿主細胞に対して異種であるＤＮＡ分子は、宿主ＤＮＡが非宿主ＤＮＡ（即ち、外因性ＤＮＡ）と組み合わされる限り、宿主細胞種に由来するＤＮＡ（即ち、内因性ＤＮＡ）を含みうる。例えば、プロモーターを含む宿主ＤＮＡセグメントに機能的に連結されたポリペプチドをコードする非宿主ＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ分子は、異種ＤＮＡ分子であると考えられる。逆に、異種ＤＮＡ分子は、外因性プロモーターに機能的に連結された内因性構造遺伝を含みうる。非宿主ＤＮＡ分子によりコードされるペプチド又はポリペプチドは、「異種」ペプチド又はポリペプチドである。
【００２２】
「細胞」又は「宿主細胞」という用語は、核酸（例、異種ポリペプチドをコードする）をトランスフェクトできる又はされる細胞を指す。「細胞」は、原核細胞（プラスミドの増殖のために使用される）及び真核細胞（核酸の発現及びコードされるポリペプチドの産生のために使用される）の両方を含む。一実施態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。別の実施態様において、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、好ましくはＣＨＯ  Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１又はＤＳＭ  ＡＣＣ  １１０）、又はＣＨＯ  ＤＧ４４細胞（ＣＨＯ−ＤＨＦＲ［−］，  ＤＳＭ  ＡＣＣ  １２６としても公知）、又はＣＨＯ  ＸＬ９９細胞、ＣＨＯ−Ｔ細胞（例、Morgan, D., et al., Biochemistry 26 (1987) 2959-2963を参照のこと）、又はＣＨＯ−Ｓ細胞、又はＳｕｐｅｒ−ＣＨＯ細胞（Pak, S. C. O., et al., Cytotechnology. 22 (1996) 139-146）である。これらの細胞が無血清培地中又は浮遊状態での増殖に適応されない場合、本発明における使用前での適応を実施すべきである。本明細書において使用される「細胞」という表現は、対象細胞及びその子孫を含む。このように、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語は、トランスファー又は継代培養の数にかかわらず、初代対象細胞及びそれに由来する培養物を含む。また、全ての子孫が、意図的又は偶発的な突然変異のため、ＤＮＡ含量において正確に同一ではない場合があることが理解される。元の形質転換細胞についてスクリーニングされたのと同じ機能及び生物学的活性を有するバリアント子孫が含まれる。
【００２３】
本明細書において使用される「発現」という用語は、細胞内で生じる転写及び翻訳プロセスを指す。細胞における目的の核酸配列の転写レベルを、細胞中に存在する対応するｍＲＮＡの量に基づき決定できる。例えば、目的の配列から転写されるｍＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲにより又はノーザンハイブリダイゼーションにより定量化できる（Sambrook, et al., 1989、上記を参照のこと）。目的の核酸によりコードされるポリペプチドを、種々の方法、例、ＥＬＩＳＡにより、ポリペプチドの生物学的活性をアッセイすることにより、又はそのような活性に非依存的なアッセイ（例えばウエスタンブロッティング又はラジオイムノアッセイなど）を用いることにより、ポリペプチドを認識し、それに結合する免疫グロブリンを使用して定量化できる（Sambrook, et al., 1989、上記を参照のこと）。
【００２４】
遺伝子の発現は、一過性又は持続性の発現として実施される。目的のポリペプチドは、一般的に、分泌ポリペプチドであり、従って、Ｎ末端伸長（シグナル配列としても公知）を含み、それは、細胞壁を通じた、細胞外培地中へのポリペプチドの輸送／分泌のために必要である。一般的に、シグナル配列は、分泌ポリペプチドをコードする任意の遺伝子に由来しうる。異種シグナル配列が使用される場合、それは、好ましくは、宿主細胞により認識され、プロセシングされる（即ち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。酵母における分泌のために、例えば、発現させるべき異種遺伝子の天然シグナル配列を、分泌遺伝子に由来する同種の酵母シグナル配列、例えば酵母インベルターゼシグナル配列、アルファ因子リーダー（サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、及びハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）α因子リーダーを含み、第２はＵＳ５，０１０，１８２に記載されている）、酸性ホスファターゼシグナル配列、又はＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼシグナル配列（ＥＰ０３６２１７９を参照のこと）などにより置換してもよい。哺乳動物細胞での発現において、目的のタンパク質の天然シグナル配列が満足できるが、他の哺乳動物シグナル配列が適する場合がある。例えば、同種の又は関連種の分泌ポリペプチドからのシグナル配列（例、ヒト又はマウス由来の免疫グロブリン用）、ならびにウイルス分泌シグナル配列、例えば、ヘルペス単純糖タンパク質Ｄシグナル配列など。そのようなプレセグメントをコードするＤＮＡフラグメントを、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントにインフレームでライゲーションし、即ち、機能的に連結する。
【００２５】
本発明の方法に従った、例えば、ＣＨＯ細胞のトランスフェクションを、トランスフェクション及び選択の連続工程として実施する。本発明の方法において適するＣＨＯ細胞は、例えば、ＣＨＯ  Ｋ１細胞、又はＣＨＯ  ＤＧ４４細胞、又はＣＨＯ  ＸＬ９９細胞、又はＣＨＯ  ＤＸＢ１１細胞、又はＣＨＯ  ＤＰ１２細胞、又はｓｕｐｅｒ−ＣＨＯ細胞である。本発明の範囲内で、トランスフェクト細胞を、当技術分野において公知の実質的に任意の種類のトランスフェクション方法を用いて得てもよい。例えば、核酸を、細胞中に、エレクトロポレーション又はマイクロインジェクションを用いて導入してもよい。あるいは、リポフェクション試薬、例えばFuGENE 6（Roche Diagnostics GmbH, Germany）、X-tremeGENE（Roche Diagnostics GmbH, Germany）、LipofectAmine（Invitrogen Corp., USA）、及びnucleotransfection（AMAXA Corp.）などを使用してもよい。あるいは、核酸を、細胞中に、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ関連ウイルスに基づく適切なウイルスベクターシステムにより導入してもよい（Singer, O., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 5313-5314）。
【００２６】
通常、ＤＮＡ又はＲＮＡレベルでの遺伝子発現プロファイリングを、マルチステップ手順によりルーチンでモニターする。第１に、それぞれの細胞サンプルを培養容器から除去する。付着細胞の場合において、回収は、固形支持体から付着細胞を剥離するためのトリプシン処理（トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いた処理）により支持されうる。第２に、回収した細胞をペレット状にして細胞溶解に供する。第３の工程として、通常、サンプル中に存在する全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はＤＮＡを少なくとも部分的に精製することが要求される（例、ＥＰ０３８９０６３を参照のこと）。その後、要求される場合、第１鎖ｃＤＮＡ合成工程を、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばAMV又はMoMULV Reverse Transcriptase（Roche Applied Science, Germany）などを用いて実施する。
【００２７】
続いて、ＤＮＡ又は生成されたｃＤＮＡの量を、定量的ＰＣＲ（Sanger, G. and Goldstein, C., Biochemica 3 (2001) 15-17）を用いて又は代わりにＤＮＡマイクロアレイ上での増幅及び続くハイブリダイゼーション（Kawasaki, E. S., Ann. N. Y. Acad. Sci. 1020 (2004) 92-100）を用いて定量化する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の場合において、ワンステップＲＴ−ＰＣＲを実施してよく、第１鎖ｃＤＮＡ合成及び続く増幅は、同じポリメラーゼ、例えばＴ．ｔｈポリメラーゼ（Roche Applied Science Cat. No. 11 480 014, Germany）などにより触媒されることを特徴とする。
【００２８】
一実施態様において、遺伝子発現分析はリアルタイムＰＣＲに基づく。そのようなリアルタイムでのモニタリングは、ＰＣＲ反応における核酸の増幅の進行をリアルタイムでモニター及び定量化することを特徴とする。様々な検出フォーマットが当技術分野において公知である。以下で言及する検出フォーマットは、ＰＣＲのために有用であることが証明されており、ひいては遺伝子発現分析のための簡単で分かりやすい可能性を提供する：
【００２９】
ａ）TaqMan加水分解プローブフォーマット：
一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを２つの成分を用いて標識する。第１成分が適した波長の光を用いて励起される場合、吸収エネルギーは、蛍光共鳴エネルギー転移の原理に従い、第２成分、いわゆるクエンチャーに移される。ＰＣＲ反応のアニーリング工程の間に、ハイブリダイゼーションプローブが標的ＤＮＡに結合し、続く伸長段階の間にＴａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性により分解される。結果として、励起された蛍光成分及びクエンチャーが互いに空間的に分離され、ひいては第１成分の蛍光放出を測定できる。TaqManプローブアッセイが、詳細に、ＵＳ５，２１０，０１５、ＵＳ５，５３８，８４８、及びＵＳ５，４８７，９７２において報告されている。TaqManハイブリダイゼーションプローブ及び試薬混合物が、ＵＳ５，８０４，３７５において報告されている。
【００３０】
ｂ）分子ビーコン：
これらのハイブリダイゼーションプローブを蛍光成分及びクエンチャーを用いて標識し、標識は、好ましくは、プローブの両端に位置付けられる。プローブの二次構造の結果として、両方の成分が溶液中で空間的に近接する。標的核酸へのハイブリダイゼーション後、両方の成分を互いに分離し、適した波長の光を用いた励起後、第１成分の蛍光放出を測定できるようにする（ＵＳ５，１１８，８０１）。
【００３１】
ｃ）ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ：
ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブテストフォーマットは、全ての種類の同種ハイブリダイゼーションアッセイのために特に有用である（Matthews, J. A. and Kricka, L. J., Anal. Biochem. 169 (1988) 1-25）。それは、同時に使用され、増幅された標的核酸の同じ鎖の隣接部位に相補的である二本鎖ハイブリダイゼーションプローブにより特徴付けられる。両方のプローブを、異なる蛍光成分を用いて標識する。適した波長の光を用いて励起した場合、第１成分は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の原理に従い、吸収エネルギーを第２成分に移し、第２成分の蛍光放出を、両方のハイブリダイゼーションプローブが検出すべき標的分子の隣接位置に結合した場合、測定できる。ＦＲＥＴアクセプター成分の蛍光における増加をモニターする代わりに、ＦＲＥＴドナー成分の蛍光減少を、ハイブリダイゼーション事象の定量的測定値としてモニターすることも可能である。
【００３２】
特に、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブフォーマットを、増幅した標的ＤＮＡを検出するために、リアルタイムＰＣＲにおいて使用してもよい。リアルタイムＰＣＲの技術分野において公知の全ての検出フォーマットの内、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブフォーマットが、高感度で、正確で、信頼できることが証明されている（ＷＯ９７／４６７０７；ＷＯ９７／４６７１２；ＷＯ９７／４６７１４を参照のこと）。２つのＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの代用として、蛍光標識プライマー及び１つだけの標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用することも可能である（Bernard, P. S., et al., Anal. Biochem. 255 (1998) 101-107）。これに関して、任意に、プライマーをＦＲＥＴドナー又はＦＲＥＴアクセプター化合物を用いて標識することを選んでもよい。
【００３３】
ｄ）SYBR（登録商標）Greenフォーマット：
リアルタイムＰＣＲを添加剤の存在において実施する場合、増幅産物が二本鎖核酸結合成分を使用して検出されることも本発明の範囲内である。例えば、それぞれの増幅産物を、本発明に従い、蛍光ＤＮＡ結合色素により検出することもでき、それは、適した波長の光を用いた励起後、二本鎖核酸との相互作用時に対応する蛍光シグナルを放出する。色素SYBR（登録商標）Green I及びSYBR（登録商標）Gold（Molecular Probes, USA）が、この適用に特に適することが証明されている。インターカレート色素を代わりに使用できる。しかし、このフォーマットのために、異なる増幅産物を識別するために、それぞれの融解曲線分析を実施する必要がある（ＵＳ６，１７４，６７０）。
【００３４】
ｅ）マルチプレックスフォーマット：
１つの反応容器における異なる核酸の同時決定を、マルチプレックスリアルタイムＰＣＲと称する。一般的に、各々の核酸の決定のために、他の用いられる色素と干渉しない又は小さな重複だけを有する蛍光色素が要求される。
【００３５】
本発明において使用され、本発明の局面でもあるＰＣＲプライマーを、以下：
−  増幅すべき配列に対する特異的結合、
−  プライマー二量体の形成がない又は可能性が低い、
−  長さ１８〜２５ヌクレオチド、
−  Ｇ／Ｃ含量が約５０%、
−  融解温度が約６０℃、
−  ５００塩基対又はそれ以下、一実施態様において、１００〜２５０塩基対のアンプリコン、
−  好ましくは、プライマーは隣接エクソンには結合し、ＰＣＲ産物は、ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの増幅の間の識別を可能にする少なくとも１つのイントロンに及ぶべきである
のパラメータに従い、ソフトウェアeprimer3を用いて設計した。
【００３６】
設計されたプライマーと相補的な核酸が、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４型の免疫グロブリンと同一の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の定常領域内に位置付けられる。
【００３７】
本発明において使用され、本発明の局面でもあるプローブを、以下：
−  融解温度が約７０℃、
−  ５’末端にＧなし、
−  プライマー又は他のプローブと二量体形成なし又は可能性が低い、
−  好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲのために使用されることが意図されるプローブは、ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの増幅の間での識別を可能にする２つの異なる隣接エクソンに結合すべきである
のパラメータに従い、ソフトウェアeprimer3を用いて設計した。
【００３８】
一実施態様において、設計されたプライマーと相補的な核酸が、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４型の免疫グロブリンと同一の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の定常領域内に位置付けられる。プローブを、以下：
−  軽鎖：蛍光色素ＦＡＭ、４６５nmで励起、５１０nmで検出、
−  参照遺伝子：Yakima Yellow色素、５３３nmで励起、５８０nmで検出、
−  重鎖：蛍光色素ＩＲＤ  ７００又はＣｙ５、６１８nmで励起、６６０nmで検出
の通りにマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲを可能にするために、標識した。
【００３９】
表１に列挙するプライマー及びプローブを設計し、各々は個々に及び組み合わせは本発明の局面である。
【００４０】
【表１】
2012506243.tif 000002
【００４１】
免疫グロブリン定常領域中のプライマー及びプローブの位置を、図１〜４に示す。
【００４２】
以下において、本発明を、アミロイドβ−Ａ４ペプチドに特異的に結合する免疫グロブリン（抗Ａβ抗体）を産生する３つの細胞株に基づき例示し、それにより免疫グロブリンをコードする核酸を含むプラスミドを用いて、第１の細胞株を１回トランスフェクトし、第２の細胞株を２回トランスフェクトし、第３の細胞株を３回トランスフェクトする。
【００４３】
免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子発現を、色素SYBR（登録商標）Green I及びTaqManプローブを使用し、定常領域コード部分中の重鎖及び軽鎖ｍＲＮＡの定量化によるＲＴ−ＰＣＲを用いて決定した。決定は、一実施態様において、全細胞ＲＮＡを用いて実施する。
【００４４】
３つの細胞株での抗体軽鎖のｍＲＮＡ量の決定を、非依存的に、各々３つの異なるｍＲＮＡ量（２５０ng、５０ng、及び１０ng）及び色素SYBR（登録商標）Green Iを用いて５回実施した。プライマーの組み合わせ＃１３１及び＃１３２を用いて得られた１つの代表的な実験での結果を、１回トランスフェクトされた細胞株８Ｃ８でのｍＲＮＡ量に基づいて列挙し、それは表２において１００%相対量に設定された。２回トランスフェクトされた細胞株４Ｆ５は、１回トランスフェクトされた細胞株よりも約４０%多い免疫グロブリン軽鎖をコードするｍＲＮＡを有すること、及び３回トランスフェクトされた細胞株２０Ｆ２は約７０%多い免疫グロブリン軽鎖をコードするｍＲＮＡを有することが分かる。
【００４５】
【表２】
2012506243.tif 000003
【００４６】
上で実施された決定方法は特異的である。なぜなら、単一産物だけが、アガロースゲル電気泳動により確認され、図５に示される通りに得られるからである。
【００４７】
TaqMan加水分解プローブを用いた３つの細胞株での抗体軽鎖のｍＲＮＡ量の決定のために、最初に、本発明のこの局面において有用なプライマー及びプローブの組み合わせを決定しなければならなかった。表３に列挙する組み合わせをテストした。
【００４８】
【表３】
2012506243.tif 000004
【００４９】
上に列挙する異なるプライマー−プローブの組み合わせを用いて得られるＰＣＲ産物（例、図６）は、プライマー＃１３３及び＃１３２とプローブ＃１６６の組み合わせならびにプライマー＃１３３及び＃３８とプローブ＃１６６の組み合わせが、高い特異性の産物収率及び低い副産物形成を伴うＰＣＲ産物をもたらしたことを示す。このように、プライマー−プローブの組み合わせ＃１３３、＃１３２、及び＃１６６ならびにプライマー−プローブの組み合わせ＃１３３、＃３８、及び＃１６６自体が、本発明の特定の局面ならびにこれらのプライマー−プローブの組み合わせの使用の態様である。一実施態様において、プライマー−プローブの組み合わせ＃１３３、＃１３２、及び＃１６６である。この組み合わせが好ましい。なぜなら、それはより良好なＰＣＲ効率、即ち、図７に示す増幅曲線での急勾配の増加を示すからである。
【００５０】
３つの細胞株での抗体軽鎖のｍＲＮＡ量の決定を、独立に、３つの異なるｍＲＮＡ量（２５０ng、５０ng、及び１０ng）を用いて各々４回実施した。プライマーの組み合わせ＃１３３／＃１３２及びプローブ＃１６６を用いて得られた１つの代表的な実験での結果を、１回トランスフェクトされた細胞株でのｍＲＮＡ量に基づいて列挙し、それは表４において１００%相対量に対して設定された。細胞株４Ｆ５は、１回トランスフェクトされた細胞株よりも約７７%多い免疫グロブリン軽鎖をコードするｍＲＮＡを有すること、及び細胞株２０Ｆ２は約１１４%多い免疫グロブリン軽鎖をコードするｍＲＮＡを有することが分かる。
【００５１】
【表４】
2012506243.tif 000005
【００５２】
上で実施された決定方法は特異的である。なぜなら、単一産物だけが、アガロースゲル電気泳動により確認される通りに得られるからである。
【００５３】
抗体重鎖のｍＲＮＡ量の決定のために、プライマー＃６２及び＃６５ならびに色素SYBR（登録商標）Green Iを使用した。これらのプライマーは２つの異なるエクソン（それぞれＣＨ１及びＣＨ２領域）に結合し、それらは１つのイントロン、ヒンジエクソン、及び第２イントロンにより分離される。
【００５４】
３つの細胞株での抗体重鎖のｍＲＮＡ量の決定を、独立に、３つの異なるｍＲＮＡ量（２５０ng、５０ng、及び１０ng）を用いて各々３回実施した。上で実施された決定方法は特異的である。なぜなら、単一産物だけが、アガロースゲル電気泳動により確認され、図８に示される通りに得られるからである。
【００５５】
プライマーの組み合わせ＃６２／＃６５を用いて得られた１つの代表的な実験での結果を、１回トランスフェクトされた細胞株でのｍＲＮＡ量に基づいて列挙し、それは表５において１００%相対量に対して設定された。細胞株４Ｆ５は、１回トランスフェクトされた細胞株よりも約６０%多い免疫グロブリン軽鎖をコードするｍＲＮＡを有すること、及び細胞株２０Ｆ２は約１４０%多い免疫グロブリン軽鎖をコードするｍＲＮＡを有することが分かる。
【００５６】
【表５】
2012506243.tif 000006
【００５７】
TaqMan加水分解プローブを用いた３つの細胞株での抗体重鎖のｍＲＮＡ量の決定のために、最初に、本発明のこの局面において有用なプライマー及びプローブの組み合わせを決定しなければならなかった。プライマー＃６２、＃６５、＃６６、＃６８、＃６７、＃６２、＃６３ならびにTaqManプローブ＃１６７及び＃１６８の組み合わせをテストした。プローブは、５’末端に色素ＩＲＤ７００を含んだ。上に列挙する異なるプライマー−プローブの組み合わせを用いて得られるＰＣＲ産物（例、図９）は、組み合わせプライマー＃６６及び＃６８とプローブ＃１６８ならびに組み合わせプライマー＃６７及び＃６８とプローブ＃１６８が、高い特異性の産物収率及び低い副産物形成を伴うＰＣＲ産物をもたらしたことを示す。蛍光強度における増加のため、プローブ＃１６８の蛍光色素がＣｙ５に交換した。この新たなプローブをプローブ＃１７３として示す。このように、プライマー−プローブの組み合わせ＃６６、＃６８、及び＃１６８又は＃１７３ならびにプライマー−プローブの組み合わせ＃６７、＃６８、及び＃１６８又は＃１７３自体が、本発明の特定の局面ならびに本発明の方法におけるこれらのプライマー−プローブの組み合わせの使用である。一実施態様において、プライマー−プローブの組み合わせ＃６６、＃６８、及び＃１７３である。この組み合わせが好ましい。なぜなら、それはより良好なＰＣＲ効率、即ち、増幅曲線での急勾配の増加を示すからである。
【００５８】
３つの細胞株での抗体重鎖のｍＲＮＡ量の決定を、独立に、３つの異なるｍＲＮＡ量（２５０ng、５０ng、及び１０ng）を用いて各々４回実施した。プライマーの組み合わせ＃６６／＃６８及びプローブ＃１７３を用いて得られた１つの代表的な実験での結果を、１回トランスフェクトされた細胞株でのｍＲＮＡ量に基づいて列挙し、それは表６において１００%相対量に対して設定された。細胞株４Ｆ５は、１回トランスフェクトされた細胞株よりも約８８%多い免疫グロブリン重鎖をコードするｍＲＮＡを有すること、及び細胞株２０Ｆ２は約１２６%多い免疫グロブリン軽鎖をコードするｍＲＮＡを有することが分かる。
【００５９】
【表６】
2012506243.tif 000007
【００６０】
上で実施された決定方法は特異的である。なぜなら、単一産物だけが、アガロースゲル電気泳動により確認される通りに得られるからである。
【００６１】
日内及び研究室間での変動を排除するために得られた結果を標準化するために、ハウスキーピング遺伝子に対する相関を使用できる。酵素グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をコードする遺伝子をこの目的のために使用できることが見出されている。このように、本発明の一局面は、プライマー−プローブの組み合わせ＃１６９／＃１７０及び＃１７１ならびにＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの決定のためのTaqManプローブＰＣＲフォーマットにおける前記組み合わせの使用である。
【００６２】
マルチプレックスＰＣＲ反応において、免疫グロブリン重鎖をコードするｍＲＮＡ、免疫グロブリン軽鎖をコードするｍＲＮＡ、及びＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡの同時増幅及び検出を実施した。単一決定のために、プライマー−プローブの組み合わせ＃１３２／＃１３３／＃１６６（軽鎖、ＦＡＭ色素）、＃６６／＃６８／＃１７３（重鎖、Ｃｙ５色素）、及び＃１６９／＃１７０／＃１７１（ＧＡＰＤＨ、Yakima Yellow色素）を使用した。ＧＡＰＤＨ遺伝子についての組み合わせは、マルチプレックスＰＣＲ反応において有用ではなかった。しかし、プライマー−プローブの組み合わせ＃１４８／＃１４９／＃１７４が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのマルチプレックスＰＣＲ決定において有用であることが見出されている。このように、本発明の一局面は、プライマー−プローブの組み合わせ＃１４８／＃１４９及び＃１７４ならびにマルチプレックスＰＣＲ反応におけるその使用である。
【００６３】
プライマー−プローブの組み合わせ＃１３２／＃１３３／＃１６６（軽鎖の増幅及び検出用、ＦＡＭ色素）、＃６６／＃６８／＃１７３（重鎖の増幅及び検出用、Ｃｙ５色素）、及び＃１４８／＃１４９／＃１７４（ＧＡＰＤＨ増幅及び検出用、Yakima Yellow色素）を用いたマルチプレックスＰＣＲ後、ＰＣＲ産物を２%アガロースゲル上で分離した。検出されたバンドは、予測されたフラグメント１０１bp（軽鎖）、１９７bp（ＧＡＰＤＨ）、２４４bp（重鎖）に相関した（図１０を参照のこと）。
【００６４】
リアルタイムＰＣＲ反応の効率は、４重で決定された希釈系列（２００ng、１００ng、５０ng、２５ng、１２．５ng、６．２５ng、３．１２５ng）に基づいて決定され、表７に与える。
【００６５】
【表７】
2012506243.tif 000008
【００６６】
このように、算出のための効率２を使用できる。
【００６７】
マルチプレックスＰＣＲにおいて、細胞株８Ｃ８と比較し、細胞株４Ｆ５及び２０Ｆ２における免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖をコードするｍＲＮＡについての以下の量（１００%に設定する）が見出された。
【００６８】
【表８】
2012506243.tif 000009
【００６９】
現在、細胞の特定産生率（ＳＰＲ）は、産生された異種ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量と十分に相関することが見出されている。
【００７０】
これは、シンプレックスＰＣＲ反応（表９）ならびにマルチプレックスＰＣＲ反応（表１０）について見出された。
【００７１】
【表９】
2012506243.tif 000010
【００７２】
【表１０】
2012506243.tif 000011
【００７３】
現在、因数を、異種ポリペプチドの未知のＳＰＲを伴う細胞及び公知のＳＰＲを伴う細胞のＰＣＲを介して決定されたｍＲＮＡの量に基づいて算出できることが見出されており、それによって未知のＳＰＲの算出が可能になる。
【００７４】
【表１１】
2012506243.tif 000012
【００７５】
このように、本発明の一局面は、以下：
−  生産性が公知の細胞において異種ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量を決定すること、
−  生産性が未知の細胞において異種ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量を決定すること、
−  生産性が公知の細胞に対する生産性が未知の細胞の異種ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの決定量の比率を算出すること、
−  生産性が公知の前記細胞の生産性を、算出された前記比率を用いて乗じ、それにより異種ポリペプチドを発現する細胞の生産性を決定すること
の工程を含む、異種ポリペプチドを発現する細胞の生産性を決定するための方法である。
【００７６】
一実施態様において、異種ポリペプチドは、免疫グロブリン又は免疫グロブリンフラグメント又は免疫グロブリン抱合体である。一実施態様において、異種免疫グロブリンは、多量体異種免疫グロブリンである。別の実施態様において、異種ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量は、サブユニットの数で割った、前記異種ポリペプチドの全サブユニットをコードするｍＲＮＡの量の合計である。一実施態様において、生産性は、特定産生率（pg/細胞/日）である。一実施態様において、異種免疫グロブリンをコードするｍＲＮＡの量は、異種免疫グロブリンの軽鎖をコードするｍＲＮＡの量と異種免疫グロブリンの重鎖をコードするｍＲＮＡの量の平均である。一実施態様において、ｍＲＮＡの量を決定することは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介する。一実施態様において、ＰＣＲはマルチプレックスＰＣＲである。別の実施態様において、ＰＣＲは逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）である。一実施態様において、算出された比率を因数０．９２５により乗ずる。
【００７７】
例えば、親細胞での特定産生率は１００pg/細胞/日である。生産性が未知の細胞のｍＲＮＡのマルチプレックスＰＣＲを介して、免疫グロブリン軽鎖をコードするｍＲＮＡの量を１６９%に決定し、免疫グロブリン重鎖をコードするｍＲＮＡの量を親細胞のｍＲＮＡの量の１６１%に決定した。前記ｍＲＮＡ量の平均は、親細胞のｍＲＮＡの量の１６５%又は１．６５倍である。このように、親細胞のＳＰＲ１００pg/細胞/日を１．６５により乗じ、それによりＳＰＲ１６５pg/細胞/日を得る。未知の細胞のＳＰＲを１６５pg/細胞/日に決定した。
【００７８】
本願内で使用する「約」という用語は、示した値の＋／−１０%の偏差を示す。このように、「約１．６５」という用語は、１．４９〜１．８２の範囲を示す。
【００７９】
それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存し、抗体をクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに分け、これらのいくつかをさらにサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２などに分けてもよい。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常領域をそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ぶ。全ての５つの抗体クラスにおいて見出すことができる軽鎖定常領域をκ（カッパ）及びλ（ラムダ）と呼ぶ。
【００８０】
ゲノム中に組込まれる異種免疫グロブリンをコードする異なる遺伝子コピー数のため、これらの遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量も異なる。このように、本発明のさらなる局面は、以下：
ａ）サンプルを提供すること、
ｂ）配列番号２３及び２４のプライマーならびに配列番号３３のプローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、及び／又は
ｃ）配列番号１９及び２１のプライマーならびに配列番号４０のプローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、及び
ｄ）効率２．０を用いて定量化すること
を含む、ｍＲＮＡについての相対的定量化又はＤＮＡについての絶対的定量化を用いたｍＲＮＡ又はＤＮＡの量の決定のための方法である。
【００８１】
異なる細胞株の特定の生産性がｍＲＮＡ量と十分に相関することがさらに見出されている。免疫グロブリンの重鎖をコードするｍＲＮＡが、免疫グロブリンをコードするｍＲＮＡの３０%を占め、免疫グロブリンの軽鎖をコードするｍＲＮＡが、免疫グロブリンをコードするｍＲＮＡの７０%を占めることも見出されている。
【００８２】
本発明のさらなる局面は、以下：
ａ）細胞を提供すること、
ｂ）前記細胞のＲＮＡを単離すること、
ｃ）単離ＲＮＡを用いて、配列番号２３及び２４のプライマーならびに配列番号３３のプローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、
ｄ）単離ＲＮＡを用いて、配列番号１９及び２１のプライマーならびに配列番号４０のプローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、
ｅ）工程ｃ）及びｄ）においてポリメラーゼ連鎖反応産物が得られる場合、免疫グロブリン産生細胞として細胞を選択すること
を含む、免疫グロブリン産生細胞の選択のための方法である。
【００８３】
一実施態様において、提供される細胞を、免疫グロブリンをコードする核酸を用いてトランスフェクトしている。別の実施態様において、提供される細胞は、内因性に免疫グロブリンを産生しない細胞である。一実施態様において、細胞は複数の細胞である。
【００８４】
本発明の別の局面は、以下：
ａ）複数の細胞を提供すること、
ｂ）前記細胞の各々のＲＮＡを単離すること、
ｃ）単離ＲＮＡを用いて、配列番号２３及び２４のプライマーならびに配列番号３３のプローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、
ｄ）単離ＲＮＡを用いて、配列番号１９及び２１のプライマーならびに配列番号４０のプローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、
ｅ）工程ｃ）及びｄ）において形成されたポリメラーゼ連鎖反応産物の量に基づき細胞を選択すること、
ｆ）選択された細胞を培養すること、
ｇ）細胞又は培養液から免疫グロブリンを回収し、それにより免疫グロブリンを生産すること
を含む、免疫グロブリンの生産のための方法である。
【００８５】
一実施態様において、工程ｄ）において最高量のポリメラーゼ連鎖反応産物を有する細胞を選択する。
【００８６】
本発明のさらなる局面は、ハイスループット様式での  ＩｇＧ１及びＩｇＧ４重鎖及び軽鎖の同時決定のための方法である。
【００８７】
本発明の一実施態様において、異種ポリペプチドは抗Ａｂｅｔａ抗体である。
【００８８】
先に提示した本発明の方法の一実施態様において、ポリメラーゼ連鎖反応はTaqMan加水分解プローブフォーマットである。別の実施態様において、前記軽鎖プライマーを、色素ＦＡＭを用いて標識し、重鎖プライマーを色素Ｃｙ５を用いて標識する。一実施態様において、配列番号２３及び２４のプライマーは免疫グロブリン軽鎖用であり、配列番号１９及び２０のプライマーは免疫グロブリン重鎖用である。一実施態様において、工程ｃ）及びｄ）は、また、リアルタイムで核酸の増幅を測定し、核酸の増幅量を決定することを含む。
【００８９】
以下の実施例、配列リスト、及び図を提供し、本発明の理解を助け、その真の範囲を添付の特許請求の範囲に記載する。本発明の精神から逸脱することなく、記載する手順を修正できることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】軽鎖定常領域（ヒトＩｇＧカッパ鎖；配列番号４４）におけるプライマー及びプローブの位置及び方向。
【図２】重鎖定常領域１（ヒトＩｇＧ重鎖ＣＨ１；配列番号４５）におけるプライマー及びプローブの位置及び方向。
【図３】重鎖定常領域２（ヒトＩｇＧ重鎖ＣＨ２；配列番号４６）におけるプライマー及びプローブの位置及び方向。
【図４】重鎖定常領域３（ヒトＩｇＧ重鎖ＣＨ３；配列番号４７）におけるプライマー及びプローブの位置及び方向。
【図５】プライマーの組み合わせ＃１３１及び＃１３２ならびにSYBR（登録商標）GREEN Iを用いた軽鎖ＰＣＲ反応のアガロースゲル分離。
【図６】４５サイクルＰＣＲ反応の８μlサンプルのアガロースゲル分離；サンプル：ＭＷ：塩基対マーカー；１：１３９／１３４−１６５；２：１３９／１３４−１６６；３：１３９／１３２−１６５；４：１３９／１３２−１６６；５：１３９／１４６−１６５；６：１３９／１４６−１６６；７：１３９／３８−１４７；８：１３９／３８−１６５；９：１３９／３８−１６６；１０：１３９／１４６−１４７；１１：１３１／３８−１６６；１２：１３１／３８−１４７；１３：３７／１３４−１６６；１４：３７／１３２−１６６；１５：３７／１４６−１６６；１６：３７／１４６−１４７；１７：１４５／１４６−１４７；１８：１４５／３８−１４７；１９：１３１／１３４−１６５；２０：１３１／１３４−１６６；２１：１３１／１３２−１６５；２２：１３１／１３２−１６６；２３：１３１／１４６−１６６；２４：１３１／１４６−１６５；２５：１３１／１４６−１４７；２６：１３１／３８−１６５；２７：３７／３８−１６６；２８：１３３／１３４−１６６；２９：１３３／１３２−１６６；３０：１３３／１４６−１６６；３１：１３３／１４６−１４７；３２：１３３／３８−１６６。
【図７】それぞれプライマー−プローブの組み合わせ＃１３３、＃１３２、及び＃１６６、又は＃１３３／＃３８、及び＃１６０を用いたＰＣＲ反応の増幅曲線。
【図８】プライマー＃６２及び＃６５ならびに色素SYBR（登録商標）Green Iを用いた重鎖ＰＣＲ反応のアガロースゲル分離；ｂｐｍ＝塩基対標準マーカー；１：空の参照；２：８Ｃ８；３：４Ｆ５；４：２０Ｆ２。
【図９】４５サイクルＰＣＲ反応の８μlサンプルのアガロースゲル分離；サンプル：ＭＷ：塩基対マーカー；１：空の参照；２：６２／６５−１６７；３：６６／６８−１６８；４：６７／６８−１６８。
【図１０】プライマー−プローブの組み合わせ＃１３２／＃１３３／＃１６６（軽鎖の増幅及び検出用、ＦＡＭ色素）、＃６６／＃６８／＃１７３（重鎖の増幅及び検出用、Ｃｙ５色素）、及び＃１４８／＃１４９／＃１７４（ＧＡＰＤＨの増幅及び検出用、Yakima Yellow色素）を用いたマルチプレックスＰＣＲのＰＣＲ産物のアガロースゲル。検出されたバンドは、予測されたフラグメント１０１bp（軽鎖）、１９７bp（ＧＡＰＤＨ）、及び２４４bp（重鎖）に相関した。
【００９１】
実施例
材料＆方法
ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報を以下に与える：Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)。抗体鎖のアミノ酸をＥＵナンバリングに従って番号付けする（Edelman, G. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)）。
【００９２】
組換えＤＮＡ技術：
標準方法を使用し、Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されている通りにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を製造業者の指示に従って使用した。
【００９３】
遺伝子合成：
所望の遺伝子セグメントを、化学合成により作製されたオリゴヌクレオチドから調製した。１００〜６００bp長のセグメントは、１つの制限エンドヌクレアーゼ切断部位により隣接されており、ＰＣＲ増幅を含むアニーリング及びライゲーションにより組み立てられ、続いて、Ａオーバーハングを介してｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングベクター（Invitrogen Corp., USA）又はｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）クローニングベクター（Stratagene Corp., USA）中にクローニングした。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
【００９４】
ＤＮＡオリゴヌクレオチド合成：
未標識プライマー及びプローブを、蛍光色素及びクエンチャーを用いて標識し、化学合成により生成した。
【００９５】
タンパク質の決定：
タンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づき算出されたモル吸光係数を使用し、２８０nmでの光学密度を決定することにより決定した。
ＤＮＡ及びＲＮＡの決定：ＤＮＡ及びＲＮＡ濃度を、光学密度１が５０μg/ml二本鎖ＤＮＡ又は４０μg/ml  ＲＮＡに対応すると仮定し、２６０nmでの光学密度を測定することにより決定した。
【００９６】
細胞数の決定：
細胞数をCASY（登録商標）TTモデルにおいて決定した。細胞数決定の前に、細胞を、トリプシンを用いた３７℃で１０分間の処理により個別化した。トリプシン処理を、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）の添加により終結した。
【００９７】
免疫グロブリン力価の決定：
免疫グロブリン力価を、抗ヒトＦｃ  ＥＬＩＳＡにより又はプロテインＡクロマトグラフィーにより、自己精製抗体を参照として使用して決定した。
【００９８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＬＤＳサンプルバッファー、４倍濃縮液（４×）：４gグリセロール、０．６８２g  ＴＲＩＳ−Ｂａｓｅ、０．６６６g  ＴＲＩＳ−ハイドロクロライド、０．８g  ＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）、０．００６g  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、０．７５mlの水中Serva Blue G250の１重量%（ｗ／ｗ）溶液、０．７５mlのフェノールレッドの１重量%（ｗ／ｗ）溶液、水を加えて全容積１０mlにする。分泌された免疫グロブリンを含む培養ブロスを遠心分離し、細胞及び細胞細片を除去した。一定分量の浄化された上清を、１／４容積（ｖ／ｖ）の４×ＬＤＳサンプルバッファー及び１／１０容積の（ｖ／ｖ）の０．５M  １，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）と混合した。次に、サンプルを１０分間にわたり７０℃でインキュベートし、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。NuPAGE（登録商標）Pre-Castゲルシステム（Invitrogen Corp., USA）を、製造業者の指示に従い使用した。特に、１０%  NuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）Bis-TRIS Pre-Castゲル（ｐＨ  ６．４）及びNuPAGE（登録商標）ＭＯＰＳバッファーを使用した。
【００９９】
ウエスタンブロット
トランスファーバッファー：３９mMグリシン、４８mM  ＴＲＩＳ−ハイドロクロライド、０．０４%（ｗ／ｗ）ＳＤＳ、及び２０%（ｖ／ｖ）メタノール。
【０１００】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、分離された免疫グロブリン鎖を、Burnetteの「セミドライブロッティング方法」（Burnette, W. N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203）に従い、電気泳動的にニトロセルロースフィルター膜（孔径：０．４５μm）にトランスファーした。
【０１０１】
ＲＮＡ単離
ＲＮＡを、Qiagen（Hilden, Germany）からのRNeasy（登録商標）mini-Kitを用いて、製造業者のマニュアルに従って単離している。ＤＮＡ混入を、ＤＮＡｓｅの添加により排除した。ＲＮＡを、培養３日目に採取された１×１０７個の細胞から単離した。
【０１０２】
ＤＮＡ単離
ゲノムＤＮＡを、Qiagen（Hilden, Germany）からのBlood & Cell Culture DNA Midi Kitを用いて、製造業者のマニュアルに従い、培養４日目の１×１０７個の細胞から単離した。
【０１０３】
リアルタイムＰＣＲ又はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲ又はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲのために、色素SYBR（登録商標）Green I及びTaqManプローブを使用している。反応混合物を、調製後及び増幅前に、暗所において氷上に置く。決定及び分析を、LightCycler（登録商標）2.0-System及びLightCycler（登録商標）ソフトウェア4.1又はLightCycler（登録商標）II 480-System及びLightCycler（登録商標）ソフトウェア1.5（全てRoche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を用いて実施した。
【０１０４】
実施例１
抗Ａβ抗体を発現させるための発現ベクター
本発明の方法を例示できる例の抗体は、アミロイドβ−Ａ４ペプチドに対する抗体（抗Ａβ抗体）である。そのような抗体及び対応する核酸配列は、例えば、ＷＯ２００３／０７０７６０又はＵＳ２００５／０１６９９２５又は配列番号１〜１２に報告されている。
【０１０５】
３つの抗Ａβ抗体を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を、ＷＯ２００９／０４６９７８に報告する通りに、３つの連続的な完全トランスフェクション及び選択操作により生成した。
【０１０６】
ゲノムヒトκ軽鎖定常領域遺伝子セグメント（Ｃカッパ、ＣＬ）を、抗Ａβ抗体の軽鎖可変領域に加え、ヒトγ１重鎖定常領域遺伝子セグメント（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を、抗Ａβ抗体の重鎖可変領域に加えた。完全κ軽鎖及びγ１重鎖抗体遺伝子を、次に、５’末端のヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター及び３’末端のヒト免疫グロブリンポリアデニル化シグナル配列に連結させた。
【０１０７】
抗Ａβ抗体の発現及び産生のために、軽鎖及び重鎖発現カセットを単一の発現ベクターに置いた（時計回りで軽鎖の上流の重鎖）。３つの同一の発現ベクターを生成し、選択マーカー遺伝子、特にネオマイシン、ハイグロマイシン、又はピューロマイシンに対する耐性を与える遺伝子を含むことだけが異なった。
【０１０８】
前適応させた親宿主細胞を、浮遊状態で、合成の動物成分不含ＰｒｏＣＨＯ４完全培地中で、標準的な加湿条件（９５%、３７℃、及び５%  ＣＯ２）下で増殖させた。細胞密度に応じた定期的な間隔で、細胞を新鮮培地中に分割した。細胞を、対数増殖期において遠心分離により回収し、無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１回洗浄し、無菌ＰＢＳ中に再懸濁した。
【０１０９】
トランスフェクション前に、抗Ａβ抗体発現プラスミドを、βラクタマーゼ遺伝子（Ｅ．ｃｏｌｉアンピシリン耐性マーカー遺伝子）内で、制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩ又はＡｖｉＩＩを使用して線形化した。切断したＤＮＡを、エタノールを用いて沈殿させ、真空下で乾燥させ、無菌ＰＢＳ中に溶解した。一般的に、トランスフェクションのために、ＣＨＯ細胞を、ＰＢＳ中で約１０７個の細胞当たり２０〜５０μg線形化プラスミドＤＮＡを用いて、室温でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションを、Gene Pulser XCellエレクトロポレーションデバイス（Bio-Rad Laboratories）を用いて、２mmギャップキュベット中で、単一１８０Ｖパルスを用いた方形波プロトコールを使用して実施した。トランスフェクション後、細胞を、９６ウェル培養プレート中のＰｒｏＣＨＯ４完全培地中にプレーティングした。２４時間の増殖後、１つ又は複数の選択剤を含む溶液を加えた（ＰｒｏＣＨＯ４完全選択培地；Ｇ４１８：４００μg/ml；ハイグロマイシン：６００μg/ml；ピューロマイシン：８μg/ml）。１週間に１回、ＰｒｏＣＨＯ４完全選択培地を交換した。抗Ａβ抗体の抗体濃度を、培養上清中のヒトＩｇＧ１に特異的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて分析した。
【０１１０】
抗Ａβ抗体産生細胞株の選択のために、生産性を、抗ヒトＩｇＧ１  ＥＬＩＳＡ及び／又は分析プロテインＡ  ＨＰＬＣを使用し、６ウェル培養プレート、Ｔフラスコ、及び／又はエルレンマイヤー撹拌フラスコ中での増殖後、ＰｒｏＣＨＯ４完全選択培地中でテストした。
【０１１１】
１回目のトランスフェクション及び選択工程のために、選択剤ネオマイシンに対する耐性を与える遺伝子を含むプラスミドを使用している。プラスミドを、エレクトロポレーションを用いて、ＰｒｏＣＨＯ４完全培地中の増殖に適応させた親細胞株中にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、９６ウェルプレート中の７００μg/mlまでのＧ４１８を添加したＰｒｏＣＨＯ４完全培地中で培養した。培養上清中の抗体濃度を、抗ヒトＩｇＧ１  ＥＬＩＳＡにより評価した。約１０００クローンをテストしており、その内の選択されたものを、２４ウェルプレート、６ウェルプレート、続いて撹拌フラスコ中でさらに培養した。約２０クローンの増殖及び生産性を、静置培養及び浮遊培養において、抗ヒトＩｇＧ１  ＥＬＩＳＡ及び／又は分析プロテインＡ  ＨＰＬＣにより評価した。最良のクローン（最良のクローンは最も生産的なクローンを示さず、それは、さらなる工程のための最良の特性を伴うクローンを示す）を、７００μg/ml  Ｇ４１８を添加したＰｒｏＣＨＯ４条件培地中での限界希釈によりサブクローニングした。選択したクローンを８Ｃ８と名付けた。
【０１１２】
２回目のトランスフェクション及び選択工程のために、選択剤ハイグロマイシンに対する耐性を与える遺伝子を含むプラスミドを使用している。プラスミドを、エレクトロポレーションを用いて、７００μg/ml  Ｇ４１８を添加したＰｒｏＣＨＯ４完全培地中で培養された細胞株中にトランスフェクトしている。トランスフェクト細胞を、約２〜３週間にわたり、２００μg/ml  Ｇ４１８及び３００μg/mlハイグロマイシンを添加したＰｒｏＣＨＯ４条件培地（ＰｒｏＣＨＯ４二重選択培地）中で拡大した。単一の抗体分泌細胞を、Protein A Alexa Fluor抱合体を用いた染色後でのＦＡＣＳ分析によるそれらの蛍光強度に基づき特定及び寄託した。寄託細胞を、９６ウェルプレート中のＰｒｏＣＨＯ４二重選択培地中で培養した。培養上清中の抗体濃度を、抗ヒトＩｇＧ１  ＥＬＩＳＡにより評価した。約５００クローンをテストしており、その内の選択されたものを、２４ウェルプレート、６ウェルプレート、続いて撹拌フラスコ中でさらに培養した。約１４クローンの増殖及び生産性を、静置培養及び浮遊培養において、抗ヒトＩｇＧ１  ＥＬＩＳＡ及び／又は分析プロテインＡ  ＨＰＬＣにより評価した。選択したクローンを４Ｆ５と名付けた。
【０１１３】
３回目のトランスフェクション及び選択工程のために、選択剤ピューロマイシンに対する耐性を与える遺伝子を含むプラスミドを使用している。プラスミドを、エレクトロポレーションを用いて、ＰｒｏＣＨＯ４二重選択培地中で培養された細胞株中にトランスフェクトしている。トランスフェクト細胞を、約２〜３週間にわたり、ＰｒｏＣＨＯ４三重選択培地（２００μg/ml  Ｇ４１８及び３００μg/mlハイグロマイシン及び４μg/mlピューロマイシンを添加したＰｒｏＣＨＯ４条件培地）中で拡大した。単一の抗体分泌細胞を、Protein A Alexa Fluor抱合体を用いた染色後でのＦＡＣＳ分析によるそれらの蛍光強度に基づき特定及び寄託した。寄託細胞を、９６ウェルプレート中のＰｒｏＣＨＯ４三重選択培地中で培養した。培養上清中の抗体濃度を、抗ヒトＩｇＧ１  ＥＬＩＳＡにより評価した。約５００クローンをテストしており、その内の選択されたものを、２４ウェルプレート、６ウェルプレート、続いて撹拌フラスコ中でさらに培養した。約１０クローンの増殖及び生産性を、静置培養及び浮遊培養において、抗ヒトＩｇＧ１  ＥＬＩＳＡ及び／又は分析プロテインＡ  ＨＰＬＣにより評価した。選択したクローンを２０Ｆ２と名付けた。
【０１１４】
クローンの特徴：
以下の表から分かる通り、３日間の培養後での倍加時間及び細胞密度は、基礎細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（野生型）及び選択されたクローンを比較した場合、同程度であった。
【０１１５】
【表１２】
2012506243.tif 000013
【０１１６】
実施例２
SYBR（登録商標）Green Iを用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
SYBR（登録商標）Green Iを用いたＲＴ−ＰＣＲのために、LightCycler（登録商標）2.0システムを用いた（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）。細胞株８Ｃ８、４Ｆ５、及び２０Ｆ２の各々のＲＮＡから、減少するＲＮＡ濃度を伴う希釈系列を調製及び分析した。全サンプル中のＲＮＡ量に、全ＲＮＡ量、即ち、野生型ＲＮＡ及びサンプルＲＮＡの合計が、全サンプル中で同じになる方法で、野生型ＲＮＡを添加した。
【０１１７】
サンプル調製後、５μlのサンプルを１５μlのＲＴ−ＰＣＲ−ＳＧ溶液と混合した。ＲＴ−ＰＣＲ−ＳＧ溶液は以下：
５μlのＰＣＲグレード水
１．３μlの５０nM  Ｍｎ（ＯＡｃ）２
７．５μlのSYBR（登録商標）Green I Pre-Mix
０．６μlのフォワードプライマー（１０pmol/μl）
０．６μlのリバースプライマー（１０pmol/μl）
を含む。
【０１１８】
各サンプルから、３つの異なるＲＮＡ量を分析した（２５０ng、５０ng、及び１０ng）。ＰＣＲ条件は表１３に示す通りである。
【０１１９】
【表１３】
2012506243.tif 000014
【０１２０】
蛍光を５３０nmで決定した。
【０１２１】
類似して、LightCycler（登録商標）II 480をＲＴ−ＰＣＲにおいて用いた。ＰＣＲ条件を表１４に示した。
【０１２２】
【表１４】
2012506243.tif 000015
【０１２３】
実施例３
TaqMan加水分解プローブを用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
TaqMan加水分解プローブを用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲのために、LightCycler（登録商標）II 480システムを用いた（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）。ＰＣＲサンプルを、LightCycler（登録商標）480 RNA Master Hydrolysis Probes Kit（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を使用して調製した。
【０１２４】
サンプル調製後、５μlのサンプルを１５μlのＲＴ−ＰＣＲ−ＨＳ溶液と混合した。ＲＴ−ＰＣＲ−ＨＳ溶液は以下：
３．８μlのＰＣＲグレード水
１．３μlの３．２５nM  Ｍｎ（ＯＡｃ）２
７．４μlのLightCycler（登録商標）Pre-Mix
１．０μlのフォワードプライマー（１０pmol/μl）
１．０μlのリバースプライマー（１０pmol/μl）
０．５μlのTaqMan加水分解プローブ（１０pmol/μl）
を含む。
【０１２５】
ＰＣＲ条件は表１５に示す通りである。
【０１２６】
【表１５】
2012506243.tif 000016
【０１２７】
実施例４
TaqMan加水分解プローブを用いたリアルタイムマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ
マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲのために、それぞれ２又は３のTaqMan加水分解プローブを組み合わせた。サンプル調製後、５μlのサンプルを１５μlのＲＴ−ＰＣＲ−Ｍ＿ＨＳ溶液を混合した。
【０１２８】
【表１６】
2012506243.tif 000017
【０１２９】
マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲの結果は、用いられたTaqManプローブについて生成された色補償プログラムを用いて補正されている。
【０１３０】
実施例５
リアルタイムＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲのために、SYBR（登録商標）Green I及びTaqManプローブを用いたLightCycler（登録商標）II 480システムを使用している。各サンプルを、サンプル−ＤＮＡ希釈物５０ng、２５ng、１０ng、５ng、及び２．５ng中で４重で決定した。リアルタイムＰＣＲのために、１５μlの対応するＰＣＲ溶液を、続いて５μlのサンプル−ＤＮＡを、９６ウェルマイクロタイタ―プレートのウェル中に置いた。プレートを、LightCycler（登録商標）480密封ホイル（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を用いて密封し、１，５００×gで２分間にわたり遠心した。その後、プレートをLightCycler（登録商標）480システムに乗せた。データの決定及び分析を、LightCycler（登録商標）480ソフトウェアバージョン１．５を用いて行った。
【０１３１】
コピー数を、線形形態の外部標準としての実施例１の第１トランスフェクションプラスミドを用いた絶対的定量化により決定した。
【０１３２】
SYBR（登録商標）Green I
リアルタイムＰＣＲのために、LightCycler（登録商標）FastStart Master PLUS SYBR Green I Kit（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を用いた。
【０１３３】
反応混合物は以下：
９μlのＰＣＲグレード水
４μlのSYBR（登録商標）Green I Pre-Mix
１μlのフォワードプライマー（１０pmol/μl）
１μlのリバースプライマー（１０pmol/μl）
で構成された。
【０１３４】
用いたＰＣＲ条件は、表１７に示す通りであった。
【０１３５】
【表１７】
2012506243.tif 000018
【０１３６】
TaqMan加水分解プローブ
ＲＴ−ＰＣＲのために、LightCycler（登録商標）480 Probes Master Kit（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を使用した。反応混合物は以下：
２．５μlのＰＣＲグレード水
１０μlのLightCycler（登録商標）Pre-Mix
１μlのフォワードプライマー（１０pmol/μl）
１μlのリバースプライマー（１０pmol/μl）
０．５μlのTaqMan加水分解プローブ（１０pmol/μl）
で構成された。
【０１３７】
用いたＰＣＲ条件は、表１８に示す通りであった。
【０１３８】
【表１８】
2012506243.tif 000019
【０１３９】
絶対的定量化
絶対的定量化において、核酸配列の量を、前記配列のコピー数に関して決定する。標準及び参照関数を、実施例１で使用した第１プラスミドの公知の濃度を伴う５つの溶液の分析により決定した。参照関数は、Ｃｐ値と核酸のコピー数の間での直線関係を提供し、サンプル中での未知コピー数の決定を可能にした。
【０１４０】
標準サンプルの希釈物は、２．５×１０７〜２．５×１０２コピーのプラスミドを含んだ。標準関数での線形化プラスミドのコピー数（Ｎｋ）の算出を、以下の等式（１）〜（４）に従い行った（例、Jiang, Z., et al., Biotechnol. Prog.22 (2006) 313-318を参照のこと）：
【０１４１】
（１）Ｍプラスミド＝ｂｐプラスミド×Ｍｂｐ＝１４，０３３ｂｐ・６６０gmol-1＝９，２６１，７８０gmol-1
（２）ｃプラスミド＝９２．９２ngμl-1（線形化後）
（３）ＮＡ＝６．０２２×１０２３mol-1（アボガドロ数）
（４）ＮＫ＝ｃプラスミド・ＮＡ／Ｍプラスミド＝６．０４１６×１０９コピーμl-1
【図５】
2012506243.tif 000020
【図６】
2012506243.tif 000021
【図８】
2012506243.tif 000022
【図９】
2012506243.tif 000023
【図１０】
2012506243.tif 000024
【図１】
2012506243.tif 000025
【図２】
2012506243.tif 000026
【図３】
2012506243.tif 000027
【図４】
2012506243.tif 000028
【図７】
2012506243.tif 000029
【配列表】
2012506243000001.app
【国際調査報告】
2012506243.tif 000030
2012506243.tif 000031
2012506243.tif 000032
2012506243.tif 000033