(57)【要約】  本発明は、CD3a/b/c/d/g遺伝子中の少なくとも1つのCpG位置、特にその「上流」調節領域、特に遺伝子cd3のプロモーター領域及び他の保存領域のメチル化状態分析を含み、分析試料中の少なくとも1つのCpGの少なくとも90%の脱メチル化が記憶及びナイーブCD4 Tリンパ球、及び／又は記憶及び／又はナイーブTリンパ球の指標となる、哺乳動物のCD3CD4陽性Tリンパ球を同定する方法、特にインビトロ方法に関する。さらに、本発明はTリンパ球の検出及び品質保証及び制御のための遺伝子CD3a/b/c/dのDNAメチル化分析の使用に関する。さらに、本発明は上記の方法を行うためのキット及びそのそれぞれの使用に関する。好ましい実施形態では、本発明は、採取直後でない血液試料又は血清試料といった品質が最適以下の試料からであっても正確な分析を可能にする、遺伝子CD3中の少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態を分析する改善された方法をさらに提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物に由来する試料においてＴリンパ球を同定する方法であって、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ε、又はＳＬＡ２、ＣＨＲＮＡ３、Ｃ１６ｏｒｆ２４、ＬＣＫ、ＦＡＳＬＧ、ＣＤ７、ＳＩＴ１、ＩＬ３２、ＣＸＣＲ６、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＧＲＡＰ２、ＩＴＧＢ７若しくはＴＸＫの遺伝子の１つ又は複数における少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含み、前記試料における少なくとも１つのＣｐＧ位置の少なくとも９０％の脱メチル化が、ＣＤ３＋Ｔリンパ球細胞、特にＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球細胞及び／又はＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球細胞の指標となる、方法。
【請求項２】
前記試料における前記少なくとも１つのＣｐＧ位置が９１％超、好ましくは９２％超、最も好ましくは９５％超脱メチル化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つのＣｐＧ位置が、ＣＤ３遺伝領域内の転写開始部位、プロモーター領域、イントロン及び／又はエクソン／イントロン境界より上流の５’領域に存在する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つのＣｐＧ位置が、配列番号６に記載の１４０５番の増幅産物、配列番号７に記載の１４０６番の増幅産物、及び／又は配列番号８に記載の１４０８番の増幅産物の領域を含むＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε遺伝子の調節領域に見られる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
メチル化状態の分析がメチル化特異的酵素消化、バイサルファイトシークエンシングから選択される方法、プロモーターメチル化、ＣｐＧアイランドメチル化、ＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥから選択される分析、又は増幅ＤＮＡの検出に基づく他の方法を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８、特にＣＤ８βの遺伝子中の、又はＧＮＧＴ２、ＣＲＴＡＭ、ＩＬ２ＲＢ及びＺＢＴＢ３２、又はＦＬＪ０００６０、ＦＬＪ３８３７９、ＰＰＰ６Ｃ、ＣＤ２２６、ＺＢＴＢ７Ｂ及びＴＮＦＡＩＰ８の遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化分析をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が日常的適用、例えばＤＮＡチップ上で好適である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記同定が前記Ｔリンパ球と、全ての主要な末梢血細胞型又は非血液細胞とを区別することを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記試料が、ヒト血液試料を含む哺乳動物の体液、又は組織、器官若しくは細胞型の血液試料、血中リンパ球の試料若しくはその画分から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物がマウス、ラット、サル又はヒトである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
同定された前記Ｔリンパ球に基づいて、前記哺乳動物の免疫状態を決定する工程をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物が自己免疫疾患、移植片拒絶反応、癌及び／又はアレルギーを患っているか、又はそれらを患う可能性がある、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物においてＣＤ３＋Ｔリンパ球、特にＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球又はＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球のレベルをモニタリングする方法であって、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法、並びに同定されたＴリンパ球の量を、同じ哺乳動物から採取した初期試料、及び／又は対照試料と比較することを含む、方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物が自己免疫疾患、移植片拒絶反応、癌及び／又はアレルギーを患っているか、又はそれらを患う可能性がある、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｔリンパ球の量を、前記哺乳動物に与える化学物質及び／又は生物学的物質に応じて測定及び／又はモニタリングすることをさらに含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号２〜配列番号５のいずれかに記載のオリゴマー、又は図２に記載の１４０５番の増幅産物、図３に記載の１４０６番の増幅産物、及び図５に記載の１４０８番の増幅産物。
【請求項１７】
哺乳動物においてＣＤ３＋Ｔリンパ球、特にＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球、又はＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球を、遺伝子ＣＤ３中のＣｐＧ位置のメチル化状態の分析に基づいて同定及び／又はモニタリングするキットであって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法を行うための材料を含む、キット。
【請求項１８】
ａ）バイサルファイト試薬、並びにｂ）配列番号６に記載の１４０５番の増幅産物、配列番号７に記載の１４０６番の増幅産物、及び配列番号８に記載の１４０８番の増幅産物の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０からなる位置から選択されるＣｐＧ位置のメチル化分析のための材料を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
哺乳動物においてＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球又はＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球を同定及び／又はモニタリングするための、請求項１６に記載のオリゴマー若しくは増幅産物、又は請求項１７若しくは１８に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ３δ／γ／ε遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置、特にそれらの「上流」調節領域、特にＣＤ３遺伝子のプロモーター領域及び他の保存領域のメチル化状態を分析することを含み、分析された試料中の少なくとも１つのＣｐＧの少なくとも９０％の脱メチル化が記憶及びナイーブＣＤ４＋Ｔリンパ球並びに記憶及びナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球の指標となる、哺乳動物のＣＤ３ＣＤ４陽性Ｔリンパ球及び／又はＣＤ３ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を同定する方法、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。本発明は、同様に全てのＣＤ３陽性Ｔリンパ球の明確な同定を可能にする、遺伝子ＳＬＡ２、ＣＨＲＮＡ３、Ｃ１６ｏｒｆ２４、ＬＣＫ、ＦＡＳＬＧ、ＣＤ７、ＳＩＴ１、ＩＬ３２、ＣＸＣＲ６、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＧＲＡＰ２、ＩＴＧＢ７及びＴＸＫ中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態の分析にさらに関する。全てのＣＤ８細胞のさらに明確な同定については、ＧＮＧＴ２、ＣＲＴＡＭ、ＩＬ２ＲＢ及びＺＢＴＢ３２の同等の分析を利用することもできる。これらのマーカーによって、ＣＤ３陽性Ｔリンパ球の中でＣＤ８陽性細胞とＣＤ４陽性細胞とを分離することが可能である。同様に（Equivalently）、ＦＬＪ０００６０、ＦＬＪ３８３７９、ＰＰＰ６Ｃ、ＣＤ２２６、ＺＢＴＢ７Ｂ及びＴＮＦＡＩＰ８によって、全血においてＣＤ４発現細胞を確実に同定し、ＣＤ４陽性ＣＤ３陽性細胞とＣＤ８陽性ＣＤ３陽性細胞とを分離することが可能である。
【０００２】
さらに、本発明は、Ｔリンパ球の検出及び品質保証及び制御のための遺伝子ＣＤ３χ／δ／ε、又はＳＬＡ２、ＣＨＲＮＡ３、Ｃ１６ｏｒｆ２４、ＬＣＫ、ＦＡＳＬＧ、ＣＤ７、ＳＩＴ１、ＩＬ３２、ＣＸＣＲ６、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＧＲＡＰ２、ＩＴＧＢ７及びＴＸＫ、又はＧＮＧＴ２、ＣＲＴＡＭ、ＩＬ２ＲＢ及びＺＢＴＢ３２、又はＦＬＪ０００６０、ＦＬＪ３８３７９、ＰＰＰ６Ｃ、ＣＤ２２６、ＺＢＴＢ７Ｂ及びＴＮＦＡＩＰ８のＤＮＡメチル化分析の使用に関する。さらに、本発明は上記の方法を行うためのキット及びそのそれぞれの使用に関する。好ましい実施の形態では、本発明は、採取直後でない（non-freshly obtained）血液試料又は血清試料といった品質が最適以下の試料からであっても正確な分析を可能にする、遺伝子ＣＤ３中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析する改善された方法をさらに提供する。本発明の一目的は、哺乳動物の任意の固形臓器内の血液又は任意の体液の特定のサブセットを定量的に検出及び測定する、新規のより確実な手段を提供することである。
【０００３】
この方法を利用することによって、本発明者らは、Ｔリンパ球を決定、定量及び定期的に測定する新規のこれまで知られていなかった手段を提供する。
【背景技術】
【０００４】
Ｔリンパ球は哺乳動物免疫系の主要な成分である。ＣＤ４  Ｔ細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞の両方が上記免疫系の適切な機能に関与する。ＣＤ８  Ｔ細胞は細胞傷害性免疫防御を調節するが、ＣＤ４細胞（いわゆるヘルパーＴ細胞）は、体液性免疫防御及び細胞性免疫防御の両方を補助する。ヘテロ二量体Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）はＣＤ３と呼ばれる単形性のタンパク質複合体に結合する。ＣＤ３はＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３εという部分要素からなり、全ての末梢Ｔ細胞（ただし胸腺細胞サブセットのみ）上で発現される。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３εの遺伝子は、１１番染色体（chromo-som）（１１ｑ２３）上の隣接遺伝子座にコードされる。
【０００５】
シグナル伝達におけるＣＤ３の役割−ＣＤ３鎖の機能は、完全なＣＤ３複合体の形成及び細胞表面へのその輸送、並びにヘテロ二量体Ｔ細胞抗原受容体を介した刺激の際のシグナル伝達の両方である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εの細胞質部分のアミノ酸配列は各々、刺激の際にリン酸化され、それにより活性化されるモチーフを含有する。このいわゆるＩＴＡＭ（免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ）は、種々のチロシンキナーゼのドッキング部位として機能する。ＣＤ３γ鎖又はＣＤ３ε鎖に欠陥のある個体は、重度の臨床的自己免疫不全を患う。
【０００６】
高等生物は、個体のほとんどの細胞がＤＮＡコードの全く同じ相補体を含有するにもかかわらず、様々な組織型において異なるパターンの遺伝子発現を行い、維持する必要がある。大抵の遺伝子調節は細胞の現状に応じた一時的なものであり、外部刺激によって変化する。一方で、持続的な調節は、エピジェネティクス（ＤＮＡの基本的な遺伝コードを変更しない遺伝的な調節パターン）の基本的法則（role）である。ＤＮＡメチル化は後成的調節の典型的な形態であり、安定な細胞記憶として機能し、様々な細胞型の長期同一性を維持するうえで重要な役割を果たす。
【０００７】
メチル化の主要な標的は、２ヌクレオチド配列であるシトシン−グアニン（「ＣｐＧ部位」）であり、この状況でシトシン（Ｃ）は簡単な化学修飾を受けて５−メチル−シトシンとなる場合がある。ヒトゲノムにおいては、ＣＧ配列は或る特定の比較的密なクラスター（「ＣｐＧアイランド」と呼ばれる）以外については予想されるよりもはるかに稀である。ＣｐＧアイランドは遺伝子プロモーターと関連することが多く、半数を超えるヒト遺伝子がＣｐＧアイランドを有すると推定されている（非特許文献１）。
【０００８】
異常なＤＮＡメチル化は、しばしば健常細胞から癌性細胞への形質転換を伴う。観察される影響には、ゲノム規模での低メチル化、腫瘍抑制遺伝子のメチル化の増大及び多くの癌遺伝子の低メチル化がある（例えば非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４に概説される）。メチル化プロファイルは腫瘍特異的である（すなわち、特定の遺伝子又はさらには個々のＣｐＧのメチル化パターンの変化は、特定の腫瘍型の診断に用いられる）ことが認識されており、現在では、膀胱癌、乳癌、結腸癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、肺癌及び前立腺癌の大規模な診断マーカー群が存在する（例えば非特許文献４に要約される）。
【０００９】
Flanagan et al.（非特許文献５）は、マウス及びヒトのＣＤ３Ｇ遺伝子及びＣＤ３Ｄ遺伝子が逆の転写方向に構成され、それらの５’末端は約１．６キロベース（ｋｂ）のＤＮＡによって隔てられていることを記載している。ヒトＣＤ３Ｇ及びＣＤ３Ｄ遺伝子発現の組織特異的調節の分子基盤は、マウスにおいてＤＮａｓｅＩ高感受性分析及びＣｐＧメチル化分析を用いて検査された。筆者らは、ＣＤ３Ｄ遺伝子に対して３’にあり、ＣＤ３Ｄ及びＣＤ３Ｇの発現の両方に影響を与える調節要素を含有する遺伝子間領域内の領域を規定することを試み、ＣＤ３Ｄ遺伝子及びＣＤ３Ｇ遺伝子からの転写が、メチル化したプロモーターから始まる可能性があることを示している。重要なことには（Significantly）、３’調節領域が分化系列決定及びＣＤ３転写の前にオープンクロマチン構造をとることが示された。このFlanaganの非常に限られた酵素的分析は、ヒトに見られるどの領域にも相同性を有しないマウスの領域に基づいている（based o）。さらに、この論文ではＤＣ３リンパ球の同定に好適に分析される領域は同定されていない。
【００１０】
Clevers et al.（非特許文献６）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ／ＣＤ３）複合体のＣＤ３ε鎖をコードする遺伝子が、全てのＴリンパ球系細胞において独自に転写されることを記載している。ヒトＣＤ３ε遺伝子をマウス生殖細胞系に導入したところ、正確に組織特異的に発現された。次いで、この遺伝子を一時的クロラムフェニコールトランスフェラーゼアッセイにおいてＴリンパ球特異的なシス作用エレメントについてスクリーニングした。プロモーター（−２２８〜＋１００）は細胞型に関係なく機能した。厳密なＴ細胞特異性を有する１２２５ｂｐのエンハンサーが最後のエクソンの下流、プロモーターから１２ｋｂの位置にあるＤＮａｓｅＩ高感受性部位に見られた。この部位はＴ細胞のみに存在する。ＣＤ３εエンハンサーは、胸腺内分化の間にＣＤ３εと同時調節される関連遺伝子であるＣＤ３δのＴ細胞特異的エンハンサーと配列類似性を示さなかった。ＣＤ３εエンハンサーはＣｐＧアイランドを構成し、組織型とは無関係に低メチル化したという点で独特であった。ＣＤ３ε遺伝子が発現されず、エンハンサーが不活性な２つのＨＴＬＶ  Ｉ形質転換Ｔ細胞株が同定された。本発明の好ましい実施の形態とは対照的に、Clevers et al.は、ＴＣＲ／ＣＤ３ε遺伝子に対して３’側に遠く離れて位置するエンハンサー領域を分析している。
【００１１】
Hamerman et al.（非特許文献７）は、ＣＤ４  Ｔリンパ球とＣＤ８  Ｔリンパ球とを区別している。
【００１２】
特許文献１には、細胞、組織又は核から単離したＤＮＡのメチル化パターンについての情報を収集すること、及び得られた情報を分析することを含む、細胞、組織又は核を同定する方法が記載されている。
【００１３】
特許文献２は、Ｔ細胞の亜群を記載しており、それらを調節性Ｔ細胞として規定する特徴に関する。該出願には、かかるＴ細胞、それらを含む組成物及び免疫応答調節の際にそれらを動員するケモカインの使用も記載されている。
【００１４】
最後に、特許文献３には、遺伝子ｆｏｘｐ３、又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含む、哺乳動物のＦｏｘＰ３陽性調節性Ｔ細胞、好ましくはＣＤ２５＋ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞を同定する方法、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法、並びに調節性Ｔ細胞の検出及び品質保証及び制御のための、転写因子ＦｏｘＰ３の遺伝子のＤＮＡメチル化分析の使用が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】欧州特許第１２１３３６０号
【特許文献２】国際公開第２００４／０５０７０６号
【特許文献３】欧州特許第１８２６２７９号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Antequera andBird, Proc Natl Acad Sci U S A 90:11995-9, 1993
【非特許文献２】Jones and Laird, Nature Genetics 21:163-167, 1999
【非特許文献３】Esteller, Oncogene 21:5427-5440, 2002
【非特許文献４】Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003
【非特許文献５】Flanagan BF, Wotton D, Tuck-Wah S, OwenMJ. DNase hypersensitivity and methylation of thehuman CD3G and D genes during T-cell development. Immunogenetics.1990;31(1):13-20.
【非特許文献６】Clevers H, Lonberg N, Dunlap S, Lacy E, TerhorstC.  An enhancer located in a CpG-island 3' to the TCR/CD3-epsilon gene confers T lymphocyte-specificityto its promoter. EMBO J. 1989 Sep;8(9):2527-35.
【非特許文献７】Hamerman JA, PageST, Pullen AM. Distinct methylation states of the CD8 beta gene in peripheral Tcells and intraepithelial lymphocytes. J Immunol.1997 Aug 1;159(3):1240-6
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
ＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞の測定及び決定は概して容易であり、通常は細胞表面上の上記抗原の発現を分析することによって臨床的に達成されるが、一般的に使用されるＦＡＣＳ分析については、細胞の構成要素（entities）を無傷に維持するには細胞試料を新たに単離するか、又は即座に固定する必要があるため、これらの細胞型を決定するのは依然として困難である。したがって、Ｔリンパ球の検出は所望されているが、特に日常的適用にとって問題をはらんでいる。
【００１８】
上記を鑑みると、Ｔリンパ球をより便利かつ確実に同定するための優れた手段（tool）として、ＤＮＡメチル化分析に基づく改善された、特に確実な方法を提供することが本発明の一目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、哺乳動物、特に哺乳動物に由来する試料においてＴリンパ球を同定する方法であって、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３εの遺伝子の１つ又は複数における少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含み、上記試料における少なくとも１つのＣｐＧ位置の少なくとも９０％の脱メチル化が、ＣＤ３＋Ｔリンパ球細胞、特にＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球細胞、及び／又はＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球細胞の指標となる、方法を提供することによって上記の目的を解決するものである。
【００２０】
本発明は、特異的エピジェネティックマーカーとしてのＣＤ３遺伝子の同定によって、上記のマーカーの分析の臨床的な日常的適用が非常に容易となり得るという本発明者らの驚くべき発見に基づく。ＦＡＣＳ及びｍＲＮＡ測定とは対照的に、それぞれの測定は精製、保管、また、かなりの程度まで組織品質に無関係に行うことができる。
【００２１】
本発明による方法の別の好ましい実施の形態では、上記試料における上記少なくとも１つのＣｐＧ位置が、９１％超、好ましくは９２％超、最も好ましくは９５％超脱メチル化されている。
【００２２】
この概念は、ＣＤ３陽性Ｔリンパ球におけるＣＤ３領域の特異的な脱メチル化に基づく。本発明者らは、単純かつ正確な定量ＰＣＲ方法を用いて、ＣＤ３脱メチル化が血液又は組織中のＴリンパ球数の代理マーカーとなることを示す。本発明者らはこのようにして、ＣＤ３陽性Ｔリンパ球の存在に機能的に関与するか、又は無条件に（mandatory）関連するＣＤ３遺伝子内の特定の領域を同定した。好ましい一実施の形態では、非常に良好な領域は、そのプロモーター、又は例えば配列番号１に記載のヌクレオチド配列、及び例えばバイサルファイトシークエンシング方法を使用する場合、ＣＤ４＋細胞又はＣＤ８＋細胞のいずれかにおいてＣＤ３を発現する細胞を、ＣＤ３を発現しない他の全ての細胞と比較した際に、差次的（differential）メチル化状態を示す多くのＣｐＧモチーフを含有する他のヌクレオチド配列を有するＴＬＳＤＲである。
【００２３】
本発明者らは、ＣＤ３＋細胞においてＣｐＧモチーフがほぼ完全に（すなわち７０％超、好ましくは８０％、好ましくは９０％超、最も好ましくは９５％超）脱メチル化されている一方で、全てのＣＤ３−細胞においては同じモチーフが完全にメチル化されていることを実証することができた。上述の領域内のＣｐＧモチーフの差次的メチル化は、ＣＤ３発現と相関する。したがって、ＣＤ３遺伝子座のメチル化状態の決定は、調節性Ｔ細胞の安定な集団を同定するうえで有益な手段となり得る、例えば所望される場合、任意の想定され得る状況下での自己免疫疾患、移植片拒絶反応、癌、アレルギー又は単にＴリンパ球関連免疫状態においてＴリンパ球を測定するのに必要とされるか、又は少なくとも幾らか有用であり得る。このアッセイは、精製又は任意の染色手順なしにＴリンパ球の測定を可能にする。固形腫瘍又は他の固形組織において、上記領域で脱メチル化される細胞の数もさらに報告され、それによりＣＤ３陽性腫瘍浸潤Ｔリンパ球の総量が示される。
【００２４】
本発明者らは、Ｔリンパ球におけるＣＤ３の構成的発現が、後成的調節、すなわちＤＮＡメチル化に基づく調節と同時に起こる可能性を示した。ＤＮＡメチル化は生物学的かつ化学的に安定な後成的修飾であり、長期の遺伝子発現変化をもたらす。本発明者らは、全ての主要な末梢血細胞型について試験し、非血液細胞を選択したところ、ヒトのＣＤ３遺伝子座での脱メチル化がＴリンパ球に限定されることを見出した。これらのデータによって、ＣＤ３遺伝子座における後成的修飾が、特異的なδ副鎖（sub-chains）又はγ副鎖の発現にかかわらず、Ｔリンパ球の表現型を有する細胞の同定に対する有益なマーカーとなることが示された。
【００２５】
本発明による方法の別の好ましい態様では、遺伝子ＳＬＡ２、ＣＨＲＮＡ３、Ｃ１６ｏｒｆ２４、ＬＣＫ、ＦＡＳＬＧ、ＣＤ７、ＳＩＴ１、ＩＬ３２、ＣＸＣＲ６、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＧＲＡＰ２、ＩＴＧＢ７及びＴＸＫ中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を、ＣＤ３について本明細書中に記載される場合と同様に分析する。このため、これらの遺伝子によって、全てのＣＤ３陽性Ｔリンパ球の明確な同定も可能となる。したがって、本発明による方法の好ましい実施の形態では、上記少なくとも１つのＣｐＧ位置は、遺伝子ＳＬＡ２、ＣＨＲＮＡ３、Ｃ１６ｏｒｆ２４、ＬＣＫ、ＦＡＳＬＧ、ＣＤ７、ＳＩＴ１、ＩＬ３２、ＣＸＣＲ６、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＧＲＡＰ２、ＩＴＧＢ７及びＴＸＫ内の転写開始部位、プロモーター領域、イントロン、及び／又はエクソン／イントロン境界より上流の５’領域に存在する。
【００２６】
全てのＣＤ８細胞をさらに明確に同定するために、本発明は、その別の好ましい態様において、ＣＤ３陽性Ｔリンパ球における遺伝子ＧＮＧＴ２、ＣＲＴＡＭ、ＩＬ２ＲＢ及びＺＢＴＢ３２の同等の分析を提供する（これらのマーカーによって、ＣＤ８陽性細胞とＣＤ４陽性細胞とを分離することが可能である）。この分析は、ＣＤ３表現型についてのＴリンパ球の分析と同時に、又はそれに続いて行うのが好ましい。
【００２７】
同様に、ＦＬＪ０００６０、ＦＬＪ３８３７９、ＰＰＰ６Ｃ、ＣＤ２２６、ＺＢＴＢ７Ｂ及びＴＮＦＡＩＰ８によって、全血においてＣＤ４発現細胞を確実に同定し、ＣＤ４陽性ＣＤ３陽性細胞とＣＤ８陽性ＣＤ３陽性細胞とを分離することが可能である。
【００２８】
本発明による方法の別の好ましい態様は、Ｔリンパ球の検出及び品質保証及び制御のための遺伝子ＣＤ３χ／δ／ε、又はＳＬＡ２、ＣＨＲＮＡ３、Ｃ１６ｏｒｆ２４、ＬＣＫ、ＦＡＳＬＧ、ＣＤ７、ＳＩＴ１、ＩＬ３２、ＣＸＣＲ６、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＧＲＡＰ２、ＩＴＧＢ７及びＴＸＫ、又はＧＮＧＴ２、ＣＲＴＡＭ、ＩＬ２ＲＢ及びＺＢＴＢ３２、又はＦＬＪ０００６０、ＦＬＪ３８３７９、ＰＰＰ６Ｃ、ＣＤ２２６、ＺＢＴＢ７Ｂ及びＴＮＦＡＩＰ８のＤＮＡメチル化分析の使用に関する。
【００２９】
本発明による方法の別の好ましい実施の形態では、上記少なくとも１つのＣｐＧ位置は、ＣＤ３遺伝子内の転写開始部位、プロモーター領域、イントロン、及び／又はエクソン／イントロン境界より上流の５’領域に存在する。本発明はまた、ＣＤ３遺伝子の特に好ましい領域、いわゆる「ＴＬＳＤＲ」（Ｔリンパ球特異的脱メチル化領域）においてＣｐＧモチーフがほぼ完全に（すなわち９０％超、好ましくは９１％、好ましくは９２％超、最も好ましくは９５％超）脱メチル化されている一方で、全ての非Ｔリンパ球においては同じモチーフが完全にメチル化されているという驚くべき発見を提供する。したがって、この領域及びその診断用途は、本発明による診断分析に対して有益かつ確実な手段を提供するものでもある。本発明によるＴＬＳＤＲは、１４０５番の増幅産物（ａｍｐｌｉｃｏｎ）（ＡＭＰ１４０５）（配列番号６）、１４０６番の増幅産物（ＡＭＰ１４０６）（配列番号７）及び／又は１４０８番の増幅産物（ＡＭＰ１４０８）（配列番号８）に位置する。これらの増幅産物は全て、配列番号１に示す本発明の対象とする全領域の一部である。
【００３０】
本発明による方法の好ましい実施の形態では、上記メチル化状態の分析は、配列番号１に基づいて好適に設計することのできる好適なプライマー対の少なくとも１つのプライマー、好ましくは配列番号２〜配列番号５のいずれかに記載のオリゴマーを用いた増幅を含む。
【００３１】
好ましくは、例えばＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ、ＭＳ−ＳＮＵＰＥ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、バイサルファイトシークエンシング、メチル特異的制限アッセイの状況における増幅には、ポリメラーゼ酵素、ＰＣＲ増幅反応若しくは化学的増幅反応、又は下に記載されるような当業者に既知の他の増幅方法が含まれる。増幅によって、本発明による方法（複数可）を行うための特に好ましい「手段」である、ＣＤ３遺伝子又は本明細書中に記載されるような任意のパラログ若しくはオーソログ中のＴＬＳＤＲ又は任意の他の領域の増幅産物が生成される。結果として、配列番号２〜配列番号５のいずれかに記載のオリゴマー、又は上で言及されるようなプライマー対によって増幅される増幅産物は、本発明の好ましい実施の形態を構成する。
【００３２】
当業者であれば、分析すべき部位、例えば１４０５番の増幅産物（配列番号６）、１４０６番の増幅産物（配列番号７）及び１４０８番の増幅産物（配列番号８）のＣｐＧ位置１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０の少なくとも１つ、又は配列番号１に記載の増幅産物若しくはＣＤ３遺伝子座中の他の配列上に存在する全ての部位の量を最小限にするために、ＣｐＧ位置の特異的サブセットをさらに選択することが可能である。これらの位置は、生成及び分析される増幅産物の５’末端から数値的に数えられる。４、５、６又は７の位置の組み合わせが好ましく、これらは本発明において有益となるほど十分に情報を生み出す。
【００３３】
ＣｐＧ位置のメチル化状態を分析するために、ＤＮＡメチル化を分析する任意の既知の方法を用いることができる。本発明による方法の好ましい実施の形態では、メチル化状態の分析は、メチル化特異的酵素消化、バイサルファイトシークエンシングから選択される方法、プロモーターメチル化、ＣｐＧアイランドメチル化、ＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥから選択される分析、又は増幅ＤＮＡの検出に基づく他の方法を含む。これらの方法は当業者に既知であり、それぞれの文献中に見ることができる。
【００３４】
本発明による方法の好ましい実施の形態では、上記方法は日常的適用、例えばＤＮＡチップ上で好適である。当業者であれば、上記の情報及びそれぞれの文献に基づいて上記の方法をかかる状況に適応させることができる。
【００３５】
本発明による方法の別の好ましい実施の形態では、同定には、上記Ｔリンパ球を全ての主要な末梢血細胞型又は非血液細胞、好ましくはＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９及びＣＤ５６（これらに限定されない）から区別することが含まれる。
【００３６】
本発明による方法のさらに別の好ましい実施の形態では、試料は、ヒト血液試料を含む哺乳動物の体液、又は組織、器官若しくは細胞型の血液試料、血中リンパ球の試料若しくはその画分から選択される。好ましくは、上記哺乳動物はマウス、ラット、サル又はヒトである。試料は必要に応じて好適にプールすることができる。
【００３７】
本発明による方法の別の好ましい態様は次に、同定された上記Ｔリンパ球に基づいて、上記哺乳動物の免疫状態を決定する工程をさらに含む。リンパ球の一般集団は定量する（quantified）ことができ、ＣＤ３ＣＤ４ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞等のさらに詳細な亜集団を相対的に定量するための基準として使用するか、又は最終的にこの集団を検出して、全体的な免疫活性状態を決定するために使用することができる。
【００３８】
本発明による方法のさらに別の好ましい実施の形態では、哺乳動物は自己免疫疾患、移植片拒絶反応、癌及び／又はアレルギーを患っているか、又はそれらを患う可能性がある。
【００３９】
本発明による方法の別の好ましい態様は、哺乳動物においてＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球、及び／又はＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球のレベルをモニタリングする方法であって、上記の方法、並びに同定されたＴリンパ球の量を、同じ哺乳動物から採取した初期試料、及び／又は対照試料と比較することを含む、方法に関する。本発明による方法のさらに別の好ましい実施の形態では、哺乳動物は自己免疫疾患、移植片拒絶反応、癌及び／又はアレルギーを患っているか、又はそれらを患う可能性がある。
【００４０】
本発明による方法の別の好ましい態様は次に、上記Ｔリンパ球の量を、上記哺乳動物に与える化学物質及び／又は生物学的物質に応じて測定及び／又はモニタリングすることをさらに含む、上記の方法に関する。
【００４１】
本発明による方法の別の好ましい態様は、配列番号２〜配列番号５のいずれかに記載のオリゴマー、又は配列番号１に基づくプライマー対によって増幅され、上に記載のように設計される増幅産物、特に１４０５番の増幅産物（配列番号６）、１４０６番の増幅産物（配列番号７）及び１４０８番の増幅産物（配列番号８）に関する。
【００４２】
本発明のさらに別の好ましい態様は次に、哺乳動物においてＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球及び／又はＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球を、遺伝子ＣＤ３中のＣｐＧ位置のメチル化状態の分析に基づいて同定及び／又はモニタリングするキットであって、本明細書中に記載されるような本発明による方法を行うための材料を含む、キットに関する。好ましくは、上記キットはａ）バイサルファイト試薬、並びにｂ）１４０５番の増幅産物（配列番号６）、１４０６番の増幅産物（配列番号７）及び１４０８番の増幅産物（配列番号８）に含まれるＣｐＧ位置のメチル化分析のための材料を含む。さらに好ましくは、位置は上記増幅産物の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０からなる。上記増幅産物の５、６若しくは７、又は全ての位置であるのが最も好ましい。
【００４３】
最後に、本発明は、哺乳動物においてＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球及び／又はＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球を同定及び／又はモニタリングするための、本発明によるオリゴマー若しくは増幅産物、又はキットの使用も包含する。
【００４４】
要約すると、本発明者らは、ＣＤ３マーカーを使用して、ＣＤ３／ＣＤ４陽性Ｔリンパ球及びＣＤ３／ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の両方を非常に特異的に同定した（区別はしていない）。ここで、マーカーＣＤ８βを使用すると、例えばＣＤ８陽性リンパ球をＣＤ４リンパ球から区別することができた。したがって、本発明のマーカー（複数可）とＣＤ８βマーカーとの組み合わせを使用すると、ＣＤ４細胞とＣＤ８細胞とを特異的に区別することができる。全てのＣＤ４は非Ｔリンパ球と同一に見えていたため、このことは本発明以前には可能ではなかった。
【００４５】
本発明をここで、以下の実施例に基づき、添付の図面及びシークエンシングプロトコルを参照して（これらに限定されない）さらに説明する。本発明の目的上、本明細書中に引用される全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ＣＤ３ｇ及びＣＤ３ｄに見られる差次的にメチル化した遺伝子領域を示す図であり、これらを「ｂｌａｓｔヒット」として赤線によって表示する。
【図２−１】１４０５番の増幅産物（配列番号６）（バイサルファイト鎖：２、シークエンシング方向：フォワード）の分析を示す図である。関連位置を太字で示す。
【図２−２】１４０５番の増幅産物（配列番号６）（バイサルファイト鎖：２、シークエンシング方向：フォワード）の分析を示す図である。関連位置を太字で示す。
【図３−１】１４０６番の増幅産物（バイサルファイト鎖：２、シークエンシング方向：リバース）の分析を示す図である。関連位置を太字で示す。
【図３−２】１４０６番の増幅産物（バイサルファイト鎖：２、シークエンシング方向：リバース）の分析を示す図である。関連位置を太字で示す。
【図４−１】１４０６番の増幅産物（配列番号７）（バイサルファイト鎖：２、シークエンシング方向：フォワード）の分析を示す図である。関連位置を太字で示す。
【図４−２】１４０６番の増幅産物（配列番号７）（バイサルファイト鎖：２、シークエンシング方向：フォワード）の分析を示す図である。関連位置を太字で示す。
【図５−１】１４０８番の増幅産物（配列番号８）（バイサルファイト鎖：２、シークエンシング方向：フォワード）の分析を示す図である。関連位置を太字で示す。
【図５−２】１４０８番の増幅産物（配列番号８）（バイサルファイト鎖：２、シークエンシング方向：フォワード）の分析を示す図である。関連位置を太字で示す。
【図６−１】１１番染色体（ＮＣＢＩ３６：１１：１１７７１４０００：１１７７３０５００：１）上の領域１４０５番、１４０６番及び１４０８番を含むγ，δ−Ｔ細胞受容体の調節領域を示す図である。エクソン配列は、ＣＤ３δについては下線が、ＣＤ３γについては二重下線が引いてある。ＣＧは太字で示す。
【図６−２】１１番染色体（ＮＣＢＩ３６：１１：１１７７１４０００：１１７７３０５００：１）上の領域１４０５番、１４０６番及び１４０８番を含むγ，δ−Ｔ細胞受容体の調節領域を示す図である。エクソン配列は、ＣＤ３δについては下線が、ＣＤ３γについては二重下線が引いてある。ＣＧは太字で示す。
【図６−３】１１番染色体（ＮＣＢＩ３６：１１：１１７７１４０００：１１７７３０５００：１）上の領域１４０５番、１４０６番及び１４０８番を含むγ，δ−Ｔ細胞受容体の調節領域を示す図である。エクソン配列は、ＣＤ３δについては下線が、ＣＤ３γについては二重下線が引いてある。ＣＧは太字で示す。
【図６−４】１１番染色体（ＮＣＢＩ３６：１１：１１７７１４０００：１１７７３０５００：１）上の領域１４０５番、１４０６番及び１４０８番を含むγ，δ−Ｔ細胞受容体の調節領域を示す図である。エクソン配列は、ＣＤ３δについては下線が、ＣＤ３γについては二重下線が引いてある。ＣＧは太字で示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
配列番号１は、ＣＤ３細胞において特異的なメチル化パターンを有すると考えられる領域の配列を示す。
【００４８】
配列番号２〜配列番号５及び配列番号９は、ＣＤ３γ及びＣＤ３δ及びＣＤ３εに対するＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｃｈｉｐ−Ｆｒａｇｍｅｎｔアッセイに使用したオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【００４９】
配列番号６〜配列番号８は、１４０５番の増幅産物（配列番号６）、１４０６番の増幅産物（配列番号７）及び１４０８番の増幅産物（配列番号８）の参照配列を示す。
【００５０】
配列番号１０〜配列番号３８は、実施例２に記載の本発明の他の好ましいＴリンパ球マーカーにおいて分析されたＣｐＧ位置の周辺の配列を示す。
【００５１】
配列番号３９〜配列番号６５は、図２〜図５のアラインメントにおいて示される配列を示す。他に指定のない限り、これらの配列は図２〜図５に表示される順序で配列される。
【実施例】
【００５２】
実施例１−ＣＤ３分析
ＣＤ３／ＣＤ４、ＣＤ３／ＣＤ８ナイーブ及び記憶Ｔリンパ球、ＣＤ５６ナチュラルキラー細胞、ＣＤ１９ナイーブ及び記憶Ｂ細胞、ＣＤ１４単球並びにＣＤ１５顆粒球を含む様々な血液サブセットを精製した。精製した細胞に由来するＤＮＡをバイサルファイト処理して、様々なＣｐＧジヌクレオチドモチーフにおいて分析した。次いで、メチル化状態を比較した（元の配列においてメチル化しなかったシトシンについてＴが見られるのに対し、元の配列においてメチル化したシトシンについてＣが見られる）。
【００５３】
データから、全てのＣＤ３ＣＤ４細胞型及びＣＤ３ＣＤ８細胞型において脱メチル化し、他の全ての血液細胞型においてメチル化した、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ε中の様々なＣｐＧモチーフ及び領域が示された。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３εに見られる差次的にメチル化した遺伝子領域を下記図１に示し、これらを「ｂｌａｓｔヒット」として太字で表示する。
【００５４】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ技術を用いて観察されたデータから、全てのＣＤ４陽性記憶Ｔ細胞及びＣＤ８陽性記憶Ｔ細胞（それぞれ０．０６及び０．０６）並びにＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞及びＣＤ８陽性ナイーブＴ細胞（それぞれ０．０３及び０．０６）が、他の全ての試験した細胞型（ＣＤ１５（０．９２）、ＣＤ１４（０．９０）、ＣＤ１９記憶及びナイーブ（それぞれ０．８１及び０．６７）、ＣＤ５６（０．８６）陽性血液細胞、並びに非血液組織に由来する細胞（０．７８）を含む）よりも大幅に低いメチル化率を受けることが示される。この実験結果を以下の表にさらに示す。
【００５５】
表１：メチル化分析の結果
【表１】
2012511917.tif 000002
【００５６】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ技術を用いて以下のゲノムＣｐＧ領域を分析したところ、高い特異性を示すデータが得られた。
【００５７】
ＣＤ３γ
ｃｇ１５８８０７３８（配列番号２）
（＋１）AGCTGCTGCACAGGCTGGCTGGCTGGCTGGCTGCTAAGGGCTGCTCCACG
ｃｇ０７５４５９２５（配列番号３）
（＋１）CGGAAAAACAAAAGGCATCTGCACCTGCAGCCCTGCTGAGGCCCCTGCTG
【００５８】
ＣＤ３δ
ｃｇ２４８４１２４４（配列番号４）
（−１）ACCCAGGCTGATAGTTCGGTGACCTGGCTTTATCTACTGGATGAGTTCCG
ｃｇ０７７２８８７４（配列番号５）
（−１）TGGAACATAGCACGTTTCTCTCTGGCCTGGTACTGGCTACCCTTCTCTCG
【００５９】
ＣＤ３ε
ｃｇ２４６１２１９８（配列番号９）
AGTCATCTGTTTTGCTTTTTTTCCAGAAGTAGTAAGTCTGCTGGCCTCCG
【００６０】
このＩｌｌｕｍｉｎａ技術では、単一のＣｐＧ（もっと厳密に言えば１つの遺伝子座につき２つのＣｐＧ）の分析しか可能でないため、バイサルファイトシークエンシングを用いてメチル化特性を検証した。このため、試料をQiagenのＥｐｉＴｅｃｔキットを用いてバイサルファイト処理し、試料をＡＢＩ  ３１００  ｐｒｉｓｍシークエンサーを用いてシークエンシングした。データ解釈については、ABIによって供給されるＫＢ  ｂａｓｅ  ｃａｌｌｉｎｇソフトウェアを使用した。
【００６１】
非メチル化パーセンタイル値（すなわち、プラス鎖配列上のＴＧ）に対するメチル化パーセンタイル値（すなわち、プラス鎖配列上のＣＧシグナル）を算出した完全に定量的な結果は提示していないが、データは精製した細胞型について明確であった。全てのＴリンパ球が分析した全てのＣＧ位置で圧倒的に脱メチル化した一方で、分析した他の全ての細胞型は同一位置でメチル化した。
【００６２】
実施例２−ＣＤ３と類似のさらなるマーカーの分析
Ｔリンパ球を識別及びモニタリングするのにさらに好適なマーカーを同定するために、ＣＤ３に加えて他のマーカーを同定し、メチル化分析によって試験した。ＳＬＡ２、ＣＨＲＮＡ３、Ｃ１６ｏｒｆ２４、ＬＣＫ、ＦＡＳＬＧ、ＣＤ７、ＳＩＴ１、ＩＬ３２、ＣＸＣＲ６、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＧＲＡＰ２、ＩＴＧＢ７及びＴＸＫの遺伝子中のＣｐＧ位置におけるメチル化が、これらのマーカーによってもＣＤ３陽性Ｔリンパ球を同定することが可能であるため、本発明において同様に使用され得ることが見出された。
【００６３】
さらに、ＣＤ３陽性Ｔリンパ球群においてＣＤ８陽性細胞及びＣＤ４陽性細胞のサブセットを同定する他のマーカーを同定した。ＧＮＧＴ２、ＣＲＴＡＭ、ＩＬ２ＲＢ及びＺＢＴＢ３２の遺伝子によって、ＣＤ８陽性細胞とＣＤ４陽性細胞とが分離されることが見出された。同様に、ＦＬＪ０００６０、ＦＬＪ３８３７９、ＰＰＰ６Ｃ、ＣＤ２２６、ＺＢＴＢ７Ｂ及びＴＮＦＡＩＰ８は、全血においてＣＤ４発現細胞を確実に同定し、ＣＤ４陽性ＣＤ３陽性細胞とＣＤ８陽性ＣＤ３陽性細胞とを分離することが可能である。
【００６４】
以下の表２に、選択されたＣｐＧ位置で上記のマーカーについて得られたＩｌｌｕｍｉｎａデータを要約する。好ましい例として選択されるＣｐＧ部位と共に示される他の幾つかのマーカーを、（ＣＤ３＋リンパ球サブセットを同定する目的で）ＣＤ４＋を選択的に同定するため（すなわちＦＬＪ０００６０、ＦＬＪ３８３７９、ＰＰＰ６Ｃ、ＣＤ２２６、ＺＢＴＢ７Ｂ及び／又はＴＮＦＡＩＰ８）、（ＣＤ３＋リンパ球サブセットを同定する目的で）ＣＤ８＋を選択的に同定するため（すなわちＧＮＧＴ２、ＣＲＴＡＭ、ＩＬ２ＲＢ及び／又はＺＢＴＢ３２）、ＣＤ３＋リンパ球を選択的に同定するため（すなわちＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｇ、及び／又はＣＤ３Ｅ、及び／又はＳＬＡ２、ＣＨＲＮＡ３、Ｃ１６ｏｒｆ２４、ＬＣＫ、ＦＡＳＬＧ、ＦＡＳＬＧ、ＣＤ７、ＳＩＴ１、ＩＬ３２、ＣＸＣＲ６、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＧＲＡＰ２、ＩＴＧＢ７及び／又はＴＸＫ）に使用することができることを見て取れる。当業者であれば、この表に基づいて本明細書中に記載されるようなＣＤ３に関する教示を、これらのマーカー及びそのＣｐＧ部位にまで広げることができる。
【００６５】
表２：選択されたマーカーを用いてＣｐＧ位置で得られたＩｌｌｕｍｉｎａデータ（Ｃｈｒ．＝染色体）
【表２】
2012511917.tif 000003
2012511917.tif 000004
2012511917.tif 000005
【図１】
2012511917.tif 000006
【図２−１】
2012511917.tif 000007
【図２−２】
2012511917.tif 000008
【図３−１】
2012511917.tif 000009
【図３−２】
2012511917.tif 000010
【図４−１】
2012511917.tif 000011
【図４−２】
2012511917.tif 000012
【図５−１】
2012511917.tif 000013
【図５−２】
2012511917.tif 000014
【図６−１】
2012511917.tif 000015
【図６−２】
2012511917.tif 000016
【図６−３】
2012511917.tif 000017
【図６−４】
2012511917.tif 000018
【配列表】
2012511917000001.app
【国際調査報告】
2012511917.tif 000019
2012511917.tif 000020
2012511917.tif 000021
2012511917.tif 000022