(57)【要約】  本発明は、脂肪生成調節に関与する新規標的Ｐｌａｃ８に関する。ｓｉＲＮＡ手法を用いて、本発明人らは、前駆脂肪細胞および脂肪組織におけるＰｌａｃ８活性の低下が脂肪生成の低下を誘導することを示した。従って、本発明は、Ｐｌａｃ８活性の調節因子ならびにこの標的の活性の調節因子の同定のためのスクリーニング検査ならびに、脂肪生成を調節し、従って、肥満および関連疾患を処置するための、特に医薬組成物におけるこの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪生成の調節のためのＰｌａｃ８の活性の阻害剤。
【請求項２】
脂肪生成を低下させる、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
肥満および関連疾患の処置のための、請求項１または２に記載の阻害剤。
【請求項４】
内臓および／または皮下脂肪蓄積の低下のための、請求項１または２に記載の阻害剤。
【請求項５】
小分子である、請求項１から４のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項６】
低分子干渉ＲＮＡである、請求項１から５のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項７】
ｓｉＲＮＡが配列番号５または配列番号６または配列番号７に対応する配列を有するｓｈＲＮＡである、請求項７に記載の阻害剤。
【請求項８】
脂肪生成の調節のための薬剤の製造のためのＰｌａｃ８の活性の阻害剤の使用。
【請求項９】
配列番号６または配列番号７の配列を有する核酸。
【請求項１０】
Ｐｌａｃ８転写阻害に特異的なｓｉＲＮＡである核酸。
【請求項１１】
Ｐｌａｃ８の活性の阻害剤をスクリーニングするための方法であって、
ａ）レポーター遺伝子に連結したＰｌａｃ８プロモーターを含むレポーター構築物を細胞株にトランスフェクトする工程、
ｂ）レポーター遺伝子の発現を可能にする条件で前記細胞株を培養する工程、
ｃ）候補化合物を細胞培養物に加える工程、および
ｄ）阻害剤化合物を、レポーター遺伝子発現を低下または阻害する能力を有する化合物として同定する工程
を含む、方法。
【請求項１２】
Ｐｌａｃ８活性の阻害剤と、少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤を含む組成物。
【請求項１３】
肥満および関連疾患を処置する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
内臓および／または皮下脂肪蓄積の低下のための、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
脂肪生成を調節するＰｌａｃ８の阻害剤の、これを必要とする患者への投与からなる脂肪生成の調節の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪生成調節に関与する新規標的であるＰｌａｃ８およびこの標的の活性の修飾因子の同定のためのスクリーニング検査に関する。更に、本発明は、脂肪生成を調節し、従って、肥満および関連疾患を処置するための、特に医薬組成物におけるＰｌａｃ８活性の調節因子およびこの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、高血圧、冠動脈疾患、脂質異常症、インスリン抵抗性および２型糖尿病を含む多くの疾患の主要なリスク因子である。肥満の蔓延の重要性のため、多くの研究は新しい脂肪細胞が生成される発生経路を含む脂肪細胞の生物学に重点を置いてきた。脂肪生成は未分化間葉系前駆細胞が成熟脂肪細胞になるプロセスである。過去１０年間にわたり、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰα，αおよびγ）および核内ホルモン受容体であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）のような幾つかのファミリー由来の転写因子の逐次活性化を含む脂肪細胞分化の分子機構の解明が著しく進展している（Ｒｏｓｅｎ，Ｅ．Ｄ．ら、２００２）。ＰＰＡＲγはインビトロおよびインビボにおいて脂肪生成に十分および必要であることが示されているため、脂肪生成の「マスター調節因子」と表現されている。最近、新たな転写因子、例えば、ＫＬＦファミリー（ＫＬＦ２，５およびＫＬＦ１５）（Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｓ．Ｓ．ら、２００３；Ｇｒａｙ，Ｓ．Ｍ．ら、２００２）、Ｅｂｆファミリー（Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｍ．Ａ．ら、２００７）およびＫｒｏｘ２０（Ｃｈｅｎ，Ｚ．ら、２００５）が脂肪生成に関与することが述べられており、脂肪生成時に生じる転写カスケードが以前に考えられていたよりもはるかに複雑であることを示唆している。更に、シグナル伝達分子および／または受容体、例えば、分泌タンパク質のＷｎｔファミリー（Ｋａｎｇ  Ｓ．ら、２００７）、ソニックヘッジホッグタンパク質、ノッチ受容体も脂肪細胞形成を引き起こす分子事象に関与することが述べられている。興味深いことに、細胞外および細胞内事象はどうも結合して脂肪生成を調節する。これらのシグナル伝達経路はすべて、脂肪生成の発生を潜在的に制御し、肥満を防止するためにより完全に理解される必要がある厳密に調節された転写カスケードに収斂する。
【０００３】
脂肪組織における脂肪の貯蔵は限られ、この能力を超えると、他の組織、特に筋肉、肝臓および膵臓内分泌部における脂質の蓄積ならびに脂肪細胞による種々のアディポカインの分泌を引き起こす。脂肪組織は、異なる解剖学的前駆物質に由来し得、異なる生理学的機能および病態生理学的役割を有する、異なる部位に位置する複数の沈着物から成る。内臓脂肪沈着物は皮下脂肪沈着物とは対照的にメタボリックシンドロームに関連する異常により寄与し得る。
【０００４】
カンナビノイド１受容体は糖代謝および２型糖尿病に重要な役割を果たすすべての器官、即ち、脂肪組織、消化管、肝臓、骨格筋および膵臓において同定されている。臨床使用での最初の選択的カンナビノイド受容体１（ＣＢ１Ｒ）拮抗薬であるリモナバンは、食物摂取および体重を低下させ、従って、糖代謝調節を向上させることが示されている。
【０００５】
しかし、肥満の処置のために依然として新規の治療標的の必要性がある。
【０００６】
胎盤８タンパク質（Ｐｌａｃ８）は推定シグナルペプチドを有することが報告されているが、細胞質シグナル伝達分子として公知である（Ｒｏｇｕｌｓｋｉ，Ｋ．ら、２００５）。最近、Ｐｌａｃ８ノックアウトマウスが作製され、細菌感染に対する免疫応答障害を示した（Ｌｅｄｆｏｒｄ，Ｊ．Ｇ．ら、２００７）。免疫細胞および他の細胞型におけるＰｌａｃ８の役割および機能は依然として不明である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒｏｓｅｎ，Ｅ．Ｄ．ら、２００２
【非特許文献２】Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｓ．Ｓ．ら、２００３
【非特許文献３】Ｇｒａｙ，Ｓ．Ｍ．ら、２００２
【非特許文献４】Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｍ．Ａ．ら、２００７
【非特許文献５】Ｃｈｅｎ，Ｚ．ら、２００５
【非特許文献６】Ｋａｎｇ  Ｓ．ら、２００７
【非特許文献７】Ｒｏｇｕｌｓｋｉ，Ｋ．ら、２００５
【非特許文献８】Ｌｅｄｆｏｒｄ，Ｊ．Ｇ．ら、２００７
【発明の概要】
【０００８】
本発明人らは、Ｐｌａｃ８が脂肪細胞分化に重要な役割を果たすことを見出した。従って、Ｐｌａｃ８は脂肪生成の調節ならびに肥満および関連疾患の処置のための新たな関連標的とみなされる。Ｐｌａｃ８の阻害は皮下・内臓脂肪蓄積の低下のために脂肪生成を低下させるためにも用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】重要な脂肪組織調節遺伝子の選択。ベン図は以下の基準に基づく遺伝子の選択を示す。Ａ）皮下（ＳＣＡＴまたはＳｑ）および内臓（ＶＡＴ）における高脂肪食による類似の調節。１５１個の遺伝子が選択された（ＳＣＡＴでは４８、ＶＡＴでは８８）。
【図１Ｂ】重要な脂肪組織調節遺伝子の選択。ベン図は以下の基準に基づく遺伝子の選択を示す。Ｂ）これらの１５１個の遺伝子の中でリモナバン処置によって調節される遺伝子の選択（ＳＣＡＴでは１４、ＶＡＴでは５４）。これは高脂肪食およびリモナバンによって両組織において調節される３４個の遺伝子の選択に至った。これらの遺伝子の中で１６個はＬ、ＭおよびＨ群の体重と相関する発現レベルを有し（肥満と関連）、１８個は各サブグループにおいて同じレベルまでＨＦＤによって調節される（肥満と関連しない。）。
【図２Ａ】種々の組織および細胞型におけるＰｌａｃ８発現。Ａ）種々のマウス組織：脾臓、筋肉（腓腹筋）、心臓、肺、腎臓、肝臓、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、皮下（ＳＣＡＴ）および内臓（ＶＡＴ）脂肪組織におけるｍＲＮＡ発現を示すＰｌａｃ８のノーザンブロット。対照として膜がメチレンブルーで染色される。Ｐｌａｃ８  ｍＲＮＡのサイズが右側に示されている。ＢからＥ：ＲＴ−ＰＣＲによって測定されるＰｌａｃ８のｍＲＮＡレベル。
【図２Ｂ】種々の組織および細胞型におけるＰｌａｃ８発現。Ｂ）野生型およびＯｂ／Ｏｂマウス（ｎ＝５）＊ｐ＜０．０５のＳＣＡＴおよびＶＡＴ。データは平均±ｓｄとして示され、１に設定された対照ＳＣＡＴに対して倍増加として表されている。
【図２Ｃ】種々の組織および細胞型におけるＰｌａｃ８発現。Ｃ）マウスの間質血管細胞群（ＳＶＦ）および単離脂肪細胞（各抽出でｎ＝５マウスがプールされ、実験は３回反復され、代表的な実験が示されている。）。データはＳＣＡＴ  ＳＶＦ発現に対して倍増加として表されている。
【図２Ｄ】種々の組織および細胞型におけるＰｌａｃ８発現。Ｄ）ヒト全組織ＳＣＡＴおよびＶＡＴ、単離脂肪細胞、単離前駆脂肪細胞ならびにインビトロで分化された脂肪細胞。データは１に任意に設定された全組織ＳＣＡＴ発現に対するレベルとして表されている。
【図２Ｅ】種々の組織および細胞型におけるＰｌａｃ８発現。Ｅ）ＤＭＩ処置前の第２日およびＤＭＩ処置後第７日までの３Ｔ３−Ｌ１細胞。細胞のＮ＝２−３セット。データは第０日における発現に対するレベルとして表されている。
【図３Ａ】ｓｈＲＮＡによるＰｌａｃ８発現および活性のノックダウン。Ａ）２９３Ｔ細胞へのｓｈＲＮＡのトランスフェクション。Ｐｌａｃ８に対するｓｈＲＮＡ配列を含むｐＳＩＲＥＮレトロウイルスプラスミドはｐＣＭＶＳＰＯＲＴ発現プラスミドと同時導入された。ｓｈＲＮＡ構築物の対照としてホタルルシフェラーゼタンパク質に対するｓｈＲＮＡを用いた（ｓｈＲＮＡルシフェラーゼ）。３つのｓｈＲＮＡがＰｌａｃ８について試験された。
【図３Ｂ】ｓｈＲＮＡによるＰｌａｃ８発現および活性のノックダウン。Ｂ）３Ｔ３−Ｌ１細胞はルシフェラーゼ（ｓｈＬｕｃ）またはＰｌａｃ８（ｓｈＰｌａｃ８）に対するｓｈＲＮＡを含むレトロウイルスを形質導入された。ｍＲＮＡレベルは分化前にＲＴ−ＰＣＲによって測定された。
【図３Ｃ】ｓｈＲＮＡによるＰｌａｃ８発現および活性のノックダウン。Ｃ）第９日における分化３Ｔ３−Ｌ１のオイルレッドＯ写真。
【図３Ｄ】ｓｈＲＮＡによるＰｌａｃ８発現および活性のノックダウン。Ｄ）第９日におけるＣ）と同じ細胞におけるＲＴ−ＰＣＲによって測定されたａＰ２（分化のマーカー）ｍＲＮＡ発現。結果は平均±ｓｄとして表されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００５。ｎ＝３。
【図４Ａ】３Ｔ３−Ｌ１細胞株におけるＰｌａｃ８  ｃＤＮＡの過剰発現。Ａ）Ｐｌａｃ８に対するマウスｃＤＮＡを発現するレトロウイルスまたは対照としての空レトロウイルスを形質導入された３Ｔ３−Ｌ１。第０日におけるＲＴ−ＰＣＲによって測定されたＰｌａｃ８  ｍＲＮＡ発現。
【図４Ｂ】３Ｔ３−Ｌ１細胞株におけるＰｌａｃ８  ｃＤＮＡの過剰発現。Ｂ）Ｐｌａｃ８に対するｃＤＮＡを含む構築物または空構築物レトロウイルス（対照）を形質導入された、第４日および９日における分化３Ｔ３−Ｌ１のディッシュのオイルレッドＯ写真。
【図４Ｃ】３Ｔ３−Ｌ１細胞株におけるＰｌａｃ８  ｃＤＮＡの過剰発現。Ｃ）第９日における同じ細胞におけるＲＴ−ＰＣＲによって測定されたＰＰＡＲγ２（分化のマーカー）ｍＲＮＡ発現。結果は平均±ｓｄとして表されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１。ｎ＝３。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な記述
本発明は、脂肪細胞における脂肪生成および代謝機能を調節する方法に関する。
【００１１】
本発明は、特に肥満および関連疾患の処置のための、脂肪生成の調節のためのＰｌａｃ８活性の阻害剤の使用に本質的に存する。本発明は、このような脂肪生成の調節因子を含む医薬組成物および関連疾患およびこのような調節因子のスクリーニング検査にも関する。
【００１２】
本発明人らは、脂肪生成調節におけるＰｌａｃ８の役割を同定した。トランスクリプトームアプローチを通じ、本発明人らは、この発現が高脂肪食を与えられたＣ５７ＢＩ／６マウスのコホートにおける体重増加と相関する遺伝子を同定した。次に、本発明人らは、高脂肪食を与えられたマウスのリモナバン処置によって誘導される遺伝子発現の変化を評価するために二次分析を行った。脂肪細胞生物学において以前には決して述べられていないが重要な生物学的プロセス、例えば、シグナル伝達、細胞外マトリクスタンパク質の修飾および遺伝子転写に関与し得る遺伝子が保持された。これらの遺伝子は、特にリモナバンがマウスにおいて体脂肪量を減少させる機序に関与し得るため、脂肪生成に重要であり得る。この文脈において、Ｐｌａｃ８は脂肪細胞代謝、特に新たなシグナル伝達経路に関与するとみなされた。より一般的には、この遺伝子は脂肪生成および肥満における脂肪組織発生の制御に役割を果たすように思われる。
【００１３】
本発明は、Ｐｌａｃ８活性の調節因子の同定に存する。このような調節因子はＰｌａｃ８活性を調節することができる任意の化合物または分子、特に小分子、脂質およびｓｉＲＮＡでよい。
【００１４】
Ｐｌａｃ８活性の調節因子は作用物質のＰｌａｃ８活性を調節する能力を検出することによって同定され得る。Ｐｌａｃ８の阻害剤はＰｌａｃ８の活性を全体的または部分的に低下または阻害することができる任意の化合物である。Ｐｌａｃ８の阻害剤には、限定されないが、Ｐｌａｃ８の細胞内区画におけるこの天然リガンドとの相互作用に干渉する作用物質、転写および翻訳レベルでのＰｌａｃ８発現を低下させる作用物質およびＰｌａｃ８が関与する細胞内シグナルを阻害する作用物質が含まれる。
【００１５】
一実施形態では、Ｐｌａｃ８活性はＰｌａｃ８の転写を全体的または部分的に阻害する小分子を用いて低下され得る。このような調節因子は、レポーター遺伝子にインフレームで連結され、および好適な細胞株に発現するＰｌａｃ８のプロモーターに存する報告システムとして当業者には周知の方法を用いて同定され得る。レポーター遺伝子産物の活性は定量的に測定され得る。従って、例えば、転写因子を阻害・活性化することによってレポーター遺伝子の発現を阻害する化合物は潜在的な候補物質とみなされ得る。
【００１６】
このような報告システムにおいて用いられ得るレポーター遺伝子は多数あり、当分野において周知である。例えば、このようなレポーター遺伝子は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ．．．の発現を可能にする遺伝子でよい。
【００１７】
従って、本発明の第一の態様は、Ｐｌａｃ８活性の阻害剤のスクリーニングのための方法を提供することであり、該方法は、
ａ）レポーター遺伝子に連結したＰｌａｃ８プロモーターを含むレポーター構築物を細胞株にトランスフェクトする工程、
ｂ）該レポーター遺伝子の発現を可能にする条件で前記細胞株を培養する工程、
ｃ）候補化合物を細胞培養物に加える工程、および
ｄ）阻害剤化合物を、レポーター遺伝子の発現を低下または阻害する能力を有する化合物と同定する工程
を含む。
【００１８】
上述のＰｌａｃ８転写の調節因子のスクリーニング検査において用いられるＰｌａｃ８の予測プロモーターは配列番号２３に対応する。
【００１９】
別の実施形態では、Ｐｌａｃ８の発現は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を用いてＲＮＡ干渉を通じて調節される。従って、一態様では、本発明は、Ｐｌａｃ８遺伝子発現に対してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することができる短い干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および短いヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子のような小核酸分子を含む二本鎖核酸分子に関し、このような小核酸分子のカクテルおよびこのような小核酸分子の好適な調合物を含む。
【００２０】
ＲＮＡｉ媒介遺伝子サイレンシングの現象は、最初に、長い二本鎖ＲＮＡ分子の微量注入が報告された線虫において述べられている。ＲＮＡ媒介遺伝子不活性化の機序はこれまでに研究されている様々な生物においてわずかに異なるように思われる。しかし、すべてのシステムにおいて、ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングは、いわゆるＲＩＳＣ複合体の一部であるエンドヌクレアーゼ、アルゴノート２に誘導される標的ｍＲＮＡの転写後分解に基づく。分解の配列特異性はＲＩＳＣ複合体にロードされる特異的アンチセンスＲＮＡ鎖のヌクレオチド配列によって決定される。
【００２１】
ｓｉＲＮＡ化合物の細胞への導入は、標的ｍＲＮＡ、従って、対応するポリペプチド、同時に、対応する酵素活性のレベルが低下した細胞をもたらす。
【００２２】
Ｐｌａｃ８  ｍＲＮＡの翻訳を低下させるため、Ｐｌａｃ８に特異的なｓｉＲＮＡは、本明細書で述べられるように、Ｐｌａｃ８活性の調節因子として用いられ得る。より具体的には、Ｐｌａｃ８に特異的なｓｉＲＮＡは、脂肪生成を低下させ、従って、肥満および関連疾患を処置するために用いられ得る。
【００２３】
一実施形態では、本発明は、ｓｉＲＮＡ分子のような二本鎖核酸分子を取り上げ、鎖の一本は標的Ｐｌａｃ８核酸分子またはこの一部における所定のＰｌａｃ８ヌクレオチド配列との相補性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
ＲＮＡ分子は修飾され、または修飾されずに用いられ得る。修飾の一例はオリゴヌクレオチドの血清安定性の向上を可能にするためにトリシロ（ｔｒｉｃｙｌｏ）ＤＮＡの組込みである。
【００２５】
一実施形態では、決定Ｐｌａｃ８ヌクレオチド配列は本明細書で述べられるＰｌａｃ８ヌクレオチド標的配列である（配列番号１および配列番号３）。
【００２６】
異なる生物または異なる被験者に跨るゲノムの配列多様性の可能性により、広範な治療適用のためのｓｉＲＮＡ分子の選択は遺伝子の保存領域に関わると思われる。従って、一実施形態では、本発明は、ゲノムの保存領域または異なる標的に跨って保存された領域を標的とするｓｉＲＮＡ分子に関する。種々の標的の保存領域を標的とするように設計されたｓｉＲＮＡ分子は、多様な患者集団におけるＰｌａｃ８遺伝子発現の効率的な阻害を可能にする。
【００２７】
一実施形態では、本発明は、標的Ｐｌａｃ８遺伝子の発現を下方制御し、または標的ＲＮＡの切断を指示する二本鎖の短い干渉核酸分子を取り上げ、前記ｓｉＲＮＡ分子は約１５から約２８塩基対、好ましくは、約１９塩基対を含む。本発明のｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ阻害剤は化学的に合成され、ベクターから発現され、または酵素的に合成され得る。
【００２８】
特定の実施形態では、Ｐｌａｃ８に特異的なｓｉＲＮＡは配列配列番号５または配列番号６または配列番号７を有するｓｈＲＮＡである。好ましい実施形態では、Ｐｌａｃ８に特異的なｓｉＲＮＡは配列配列番号６または配列番号７を有するｓｈＲＮＡであり、より好ましい実施形態では、Ｐｌａｃ８に特異的なｓｉＲＮＡは配列配列番号６を有するｓｈＲＮＡである。
【００２９】
本発明によるｓｉＲＮＡの使用は、対応する野生型細胞のｍＲＮＡレベルの５％から２０％、好ましくは、５％から１５％ｍ、より好ましくは、５％から１０％のｍＲＮＡレベルの低下をもたらす。野生型細胞は、標的ｍＲＮＡがｓｉＲＮＡ化合物によって分解されない、ｓｉＲＮＡ化合物をコードする核酸の導入前の細胞である。
【００３０】
Ｐｌａｃ８活性の阻害剤は、分子の性質および期待される効果により、局所または全身に任意好適な経路によって投与され得る。ｓｉＲＮＡは当分野で用いられるプロトコルに従って、二本鎖分子の場合には標的組織において局所投与され、またはｓｈＲＮＡの場合にはベクターを通じて投与され得る。
【００３１】
一実施形態では、ＲＮＡｉはｓｈＲＮＡ分子を用いて得られる。ｓｈＲＮＡ構築物はステムループＲＮＡをコードする。細胞への導入後、このステムループＲＮＡは二本鎖ＲＮＡ化合物に処理され、この配列は元のＲＮＡ分子のステムに対応する。このような二本鎖ＲＮＡは、限定されないが、Ｓａｈｂｅｒら（１９８７）、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａら（１９９０）またはＵＳ５，７９５，７１５に述べられているような、ビトロおよびインビボ法を含む当分野において公知の任意の方法に従って調製され得る。
【００３２】
インビボ投与では、ｓｈＲＮＡはプラスミドに導入され得る。プラスミド由来ｓｈＲＮＡはレポーター遺伝子または選択マーカーとの組合せならびにウイルスまたは非ウイルスベクターを介した送達の選択肢を提供する利点を提示する。ｓｈＲＮＡのベクター、次に細胞への導入はｓｈＲＮＡが継続的に発現するようにする。通常、ベクターは娘細胞に伝えられ、遺伝子サイレンシングが受け継がれることを可能にする。
【００３３】
本発明は、本発明のｓｈＲＮＡ発現の発現のためのポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。これらのベクターは、例えば、静脈内経路、筋肉内経路、皮下組織または通常の治療に従って選択される他の標的組織への直接注入を含む異なる好適な経路によって投与され得るＡＡＶベクター、レトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターである。
【００３４】
ｓｉＲＮＡの投与経路は局所、直接送達から全身静脈内投与まで様々である。局所送達の利点は、分子が標的組織またはこの近傍に注入されるため、有効性に必要なｓｉＲＮＡの用量が実質的に少ないことである。局所投与はｓｉＲＮＡの集中送達も可能にする。このような直接送達にはネイキッドｓｉＲＮＡが用いられ得る。「ネイキッドｓｉＲＮＡ」とは、食塩水または５％ブドウ糖のような他の単純な賦形剤中のｓｉＲＮＡの送達をいう。このような分子の調合および投与の容易性により、ｓｉＲＮＡの局所投与は魅力的な治療手法となる。ネイキッドＤＮＡも脂質、特にリポソームに調合され得る。
【００３５】
ｓｉＲＮＡの全身適用はより低侵襲で、より重要なことには、外側から十分にアクセス可能である組織に限定されないことが多い。全身送達では、ｓｉＲＮＡはコレステロール抱合体、リポソームまたはポリマーベースのナノ粒子と調合され得る。リポソームは伝統的に薬物動態特性の増大および／または毒性プロファイルの低下を提供するために用いられる。リポソームは有意で反復される良好なインビボ送達を可能にする。現在、特に肝細胞へのｓｉＲＮＡの全身送達の脂質ベースの調合物の使用は、ＲＮＡｉ治療の最も有望な当面の機会の１つを表すように思われる。例えば、肝細胞標的化のためにＮ−アセチルグルコサミンに結合された動的ポリ抱合体（ｄｙｎａｍｉｃ  ｐｏｌｙｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）のようなポリマーおよびシクロデキストリンベースのナノ粒子による調合物は、標的送達およびエンドソーム脱出機序を可能にする。アテロコラーゲンおよびキトサンのような他のポリマーは皮下腫瘍異種移植片および骨転移に対する治療効果を可能にする。
【００３６】
また、ｓｉＲＮＡは標的送達に役立つように設計された分子実体と直接抱合され得る。ｓｉＲＮＡ二本鎖の性質を考えると、不活性またはセンススタンド（ｓｔａｎｄ）の存在は理想的な抱合部位を生じさせる。抱合体の例はコレステロールのような親油性抱合体またはアプタマーベースの抱合体である。
【００３７】
カチオン性ペプチドおよびタンパク質もｓｉＲＮＡ二本鎖の負荷電リン酸骨格と複合体を形成するために用いられる。
【００３８】
これらの異なる送達手法はＰｌａｃ８  ｓｉＲＮＡを関連する組織、特に脂肪組織に標的化するために用いられ得る。このような標的化のため、ｓｉＲＮＡは、例えば、脂質トランスポーター、受容体、インスリン受容体または当分野において公知の任意の分子と相互作用するリガンドのような、前駆脂肪細胞および脂肪細胞と相互作用する異なる分子に抱合され得る。
【００３９】
本発明のもう１つの目的は、活性成分として本発明によるＰｌａｃ８の調節因子を含む医薬組成物である。これらの医薬組成物は、有効量の少なくとも１つの本発明による調節因子および少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤を含む。前記賦形剤は当業者には公知の通常の賦形剤の中で医薬形態および所望の投与経路に従って選択される。
【００４０】
本発明は、脂肪生成の調節のための方法にも存する。このような方法は肥満または関連疾患を処置するために用いられ得る。このような方法は美容目的で脂肪蓄積を低下させるためにも用いられ得る。
【００４１】
Ｐｌａｃ８活性の調節因子は、脂肪生成を調節する治療、特に肥満関連疾患、特に２型糖尿病、脂質異常症、血圧上昇、インスリン抵抗性、心血管疾患およびより一般的なメタボリックシンドロームの処置および予防に有用である。
【００４２】
別の態様による本発明は、有効量の本発明によるＰｌａｃ８調節因子の患者へのインビボ投与を含む上記病態の処置のための方法に関する。
【００４３】
適切な単位剤形は、吸入、局所、経皮、皮下、筋肉内もしくは静脈内形態、直腸形態および移植による、経口形態、例えば、錠剤、硬質もしくは軟質ゼラチンカプセル、粉末、顆粒および経口水溶液、舌下、頬側、気管内、眼内、鼻腔内形態を含む。局所適用では、本発明の化合物はクリーム、ゲル、軟膏またはローションとして用いられ得る。
【００４４】
通常の治療に従って、各患者に適した用量は、投与経路、患者の体重および応答に従って医師によって決定される。
【００４５】
Ｐｌａｃ８阻害剤は不名誉な脂肪蓄積を低下させるために美容適用にも有用である。美容適用では、Ｐｌａｃ８の阻害剤は局所使用に好適な調合物に組み込まれ得る。Ｐｌａｃ８の阻害剤は前述のような小分子またはｓｉＲＮＡでよい。
【００４６】
これより、単に例示的であって本発明を限定することが意図されない以下の実施例を参照して本発明は説明される。
【実施例】
【００４７】
図面の簡単な説明
図１：重要な脂肪組織調節遺伝子の選択。ベン図は以下の基準に基づく遺伝子の選択を示す。Ａ）皮下（ＳＣＡＴまたはＳｑ）および内臓（ＶＡＴ）における高脂肪食による類似の調節。１５１個の遺伝子が選択された（ＳＣＡＴでは４８、ＶＡＴでは８８）。Ｂ）これらの１５１個の遺伝子の中でリモナバン処置によって調節される遺伝子の選択（ＳＣＡＴでは１４、ＶＡＴでは５４）。これは高脂肪食およびリモナバンによって両組織において調節される３４個の遺伝子の選択に至った。これらの遺伝子の中で１６個はＬ、ＭおよびＨ群の体重と相関する発現レベルを有し（肥満と関連）、１８個は各サブグループにおいて同じレベルまでＨＦＤによって調節される（肥満と関連しない。）。
【００４８】
図２：種々の組織および細胞型におけるＰｌａｃ８発現。Ａ）種々のマウス組織：脾臓、筋肉（腓腹筋）、心臓、肺、腎臓、肝臓、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、皮下（ＳＣＡＴ）および内臓（ＶＡＴ）脂肪組織におけるｍＲＮＡ発現を示すＰｌａｃ８のノーザンブロット。対照として膜がメチレンブルーで染色される。Ｐｌａｃ８  ｍＲＮＡのサイズが右側に示されている。ＢからＥ：ＲＴ−ＰＣＲによって測定されるＰｌａｃ８のｍＲＮＡレベル。Ｂ）野生型およびＯｂ／Ｏｂマウス（ｎ＝５）＊ｐ＜０．０５のＳＣＡＴおよびＶＡＴ。データは平均±ｓｄとして示され、１に設定された対照ＳＣＡＴに対して倍増加として表されている。Ｃ）マウスの間質血管細胞群（ＳＶＦ）および単離脂肪細胞（各抽出でｎ＝５マウスがプールされ、実験は３回反復され、代表的な実験が示されている。）。データはＳＣＡＴ  ＳＶＦ発現に対して倍増加として表されている。Ｄ）ヒト全組織ＳＣＡＴおよびＶＡＴ、単離脂肪細胞、単離前駆脂肪細胞ならびにインビトロで分化された脂肪細胞。データは１に任意に設定された全組織ＳＣＡＴ発現に対するレベルとして表されている。Ｅ）ＤＭＩ処置前の第２日およびＤＭＩ処置後第７日までの３Ｔ３−Ｌ１細胞。細胞のＮ＝２−３セット。データは第０日における発現に対するレベルとして表されている。
【００４９】
図３：ｓｈＲＮＡによるＰｌａｃ８発現および活性のノックダウン。Ａ）２９３Ｔ細胞へのｓｈＲＮＡのトランスフェクション。Ｐｌａｃ８に対するｓｈＲＮＡ配列を含むｐＳＩＲＥＮレトロウイルスプラスミドはｐＣＭＶＳＰＯＲＴ発現プラスミドと同時導入された。ｓｈＲＮＡ構築物の対照としてホタルルシフェラーゼタンパク質に対するｓｈＲＮＡを用いた（ｓｈＲＮＡルシフェラーゼ）。３つのｓｈＲＮＡがＰｌａｃ８について試験された。Ｂ）３Ｔ３−Ｌ１細胞はルシフェラーゼ（ｓｈＬｕｃ）またはＰｌａｃ８（ｓｈＰｌａｃ８）に対するｓｈＲＮＡを含むレトロウイルスを形質導入された。ｍＲＮＡレベルは分化前にＲＴ−ＰＣＲによって測定された。Ｃ）第９日における分化３Ｔ３−Ｌ１のオイルレッドＯ写真。Ｄ）第９日におけるＣ）と同じ細胞におけるＲＴ−ＰＣＲによって測定されたａＰ２（分化のマーカー）ｍＲＮＡ発現。結果は平均±ｓｄとして表されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００５。ｎ＝３。
【００５０】
図４：３Ｔ３−Ｌ１細胞株におけるＰｌａｃ８  ｃＤＮＡの過剰発現。Ａ）Ｐｌａｃ８に対するマウスｃＤＮＡを発現するレトロウイルスまたは対照としての空レトロウイルスを形質導入された３Ｔ３−Ｌ１。第０日におけるＲＴ−ＰＣＲによって測定されたＰｌａｃ８  ｍＲＮＡ発現。Ｂ）Ｐｌａｃ８に対するｃＤＮＡを含む構築物または空構築物レトロウイルス（対照）を形質導入された、第４日および９日における分化３Ｔ３−Ｌ１のディッシュのオイルレッドＯ写真。Ｃ）第９日における同じ細胞におけるＲＴ−ＰＣＲによって測定されたＰＰＡＲγ２（分化のマーカー）ｍＲＮＡ発現。結果は平均±ｓｄとして表されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１。ｎ＝３。
【００５１】
材料および方法
動物の処置
肥満傾向のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃｏｌｌｉｎｓら、２００４）に６カ月間高脂肪食（ＨＦＤ）を与えた。ＨＦＤの６カ月後、マウスは様々な程度の耐糖能異常を有し、ばらついた体重を示した（糖負荷試験によって測定。ＨＦＤマウスを、同レベルの耐糖能異常を示すが低（Ｌ）、中間（Ｍ）または高（Ｈ）体重を有する３群に分け、通常の固形飼料（ＮＣ）付与マウスとともに体重を正常化するためにビヒクルまたはリモナバン（１０ｍｇ．ｋｇ−１．ｄａｙ−１）で１カ月間処置した。
【００５２】
ＲＮＡ調製、標識化およびｃＤＮＡマイクロアレイにおけるハイブリダイゼーション
ｐｅｑＧＯＬＤ  Ｔｒｉｆａｓｔ（商標）（ｐｅｑｌａｂ社）およびクロロホルム−イソアミルアルクール（ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｏｏｌ）（２４：１）抽出を用いて１群当たり５匹の異なるマウス由来のＲＮＡを内臓および皮下脂肪組織から抽出した。ＲＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、ＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ社）に通すことによって精製した。増幅前後にＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ社）でＲＮＡの質を調べた。ＲＮＡを逆転写し、ＲＮＡをＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ社）で増幅した。Ｍｏｕｓｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を同様に増幅し、公表されたプロトコル（Ｄｅ  Ｆｏｕｒｍｅｓｔｒａｕｘら、２００４）に従って脂肪組織および基準ＲＮＡをＣｙ５およびＣｙ３で間接的技法によって標識した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＬａｕｓａｎｎｅのＤＮＡ  Ａｒｒａｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで調製された１７６６４  ｃＤＮＡを含むマイクロアレイに標識ＲＮＡをハイブリダイズした。以前に公開されたように（ｄｅ  Ｆｏｕｒｍｅｓｔｒａｕｘら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４  ２７９：５０７４３−５３）スキャニング、画像および品質制御分析を行った。データをｌｏｇ２強度比（Ｃｙ５／Ｃｙ３）として表し、プリントチップ局所的加重線形回帰（ｐｒｉｎｔ  ｔｉｐ  ｌｏｃａｌｌｙ  ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｌｉｎｅａｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）（Ｌｏｗｅｓｓ）法で正規化し、スポット品質および不完全なアノテーションに基づいて選別した。Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｒ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ｃｒａｎ．ｕｓ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）において利用可能な統計的計算用のＲソフトウェアを用いてすべての解析を行った。
【００５３】
細胞培養
３Ｔ３−Ｌ１細胞を５％ＣＯ２で１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）で培養した。レトロウイルス感染後（下記参照）、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで１００−ｍｍまたは６０−ｍｍディッシュにて集密まで細胞を増殖させた。集密に達すると、デキサメタゾン（１μＭ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）およびイソブチルメチルキサンチン（０．５μＭ）（ＤＭＩ）を含む分化培地に細胞を晒した。２日後、第７日における収集の準備が整うまでインスリン（５μｇ／ｍｌ）を含む培地で細胞を維持した。
【００５４】
オイルレッドＯ染色
分化の７日から１０日後、細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、ホルムアルデヒド（Ｆｏｒｍａｌｄｅ−ｆｒｅｓｈ；Ｆｉｓｈｅｒ社）で１５分間固定した。オイルレッドＯ  ０．５ｇをイソプロパノール１００ｍｌ中に溶解させることによって染色溶液を調製し、この溶液６０ｍｌを蒸留水４０ｍｌと混合した。室温で１時間後、染色溶液を濾過し、ディッシュに４時間加えた。次に、染色溶液を除去し、細胞を蒸留水で２回洗浄した。
【００５５】
ｓｈＲＮＡ構築物
ＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ  ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ  ＺｓＧｒｅｅｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてｓｈＲＮＡを構築した。Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ｓｉＲＮＡアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｊｕｒａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃ／ｓｉＲＮＡｅｘｔ／）およびＣｌｏｎｔｅｃｈ社製のｓｉＲＮＡデザイナーソフトウェアにクエリーを行うことにより、Ｐｌａｃ８の標的配列を設計した。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ１制限部位を用いて、両方のアルゴリズムによって表される少なくとも２つの配列をｐＳＩＲＥＮベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にサブクローニングした。Ｐｌａｃ８の以下の３つの標的配列：配列番号５（ｓｈＰｌａｃ８−１）、配列番号６（ｓｈＰｌａｃ８−２）および配列番号７（ｓｈＰｌａｃ８−３）を選択した。陰性対照として配列配列番号８（ｓｈＬｕｃ）を有するルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ配列を用いた。
【００５６】
ｓｈＲＮＡ構築物のトランスフェクション
Ｊｏｒｄａｎ，Ｍ．ら（２００４）において述べられているリン酸カルシウム法を用いてＰｌａｃ８  ｃＤＮＡ（配列番号２１）を含む発現ベクターおよびシフェラーゼに対するｓｈＲＮＡ（対照ｓｈＬＵＣ）もしくはＰｌａｃ８（ｓｈＰｌａｃ８）を発現するＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ  ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ  ＺｓＧｒｅｅｎベクターと同時導入された２９３Ｔ  ＨＥＫ細胞においてｓｈＲＮＡの特異性を試験した。トランスフェクションの２４時間後に細胞ＲＮＡ抽出物に対してＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。
【００５７】
レトロウイルス構築物の生成およびレトロウイルス感染
ＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ  ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ  ＺｓＧｒｅｅｎ（ｐＳＩＲＥＮ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）またはｐＭＳＣＶピューロマイシンプラスミド（ｐＭＳＣＶ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）においてレトロウイルスを構築した。Ｊｏｒｄａｎ，Ｍ．ら（２００４）において述べられているリン酸カルシウム法を用いてウイルス構築物を、ｇａｇ−ｐｏｌおよびＶＳＶ−Ｇタンパク質をコードする構築物とともに２９３  ＨＥＫパッケージング細胞にトランスフェクトした。トリコスタチンＡ（Ｓｉｇｍａ社）３μｍの存在下、上清を４８時間後に収集し、直ちに使用し、または急速凍結させて後の使用のために−８０℃で保存した。ポリブレン（４μｇ／ｍｌ）の存在下、ウイルス上清を細胞に６時間加え、次の１５時間新鮮培地で２回希釈した。
【００５８】
過剰発現構築物
Ｐｌａｃ８のｃＤＮＡを細胞に過剰発現させるためにＧＦＰマーカーを発現する修飾ｐＭＳＣＶピューロマイシンレトロウイルスプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いた。ｃＤＮＡ（配列番号２１）をｐＭＳＣＶのマルチクローニング部位からのｈｐａｌ制限部位に鈍的に挿入した。生じたコロニーを適切な配向について試験し、酵素消化によって選択した。適切なクローンを選択し、増幅し、３Ｔ３−Ｌ１細胞のレトロウイルス感染のために用いた。
【００５９】
脂肪組織からの脂肪細胞および間質血管細胞群（ＳＶＦ）の単離
８週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝６−８）をＣＯ２吸入によって安楽死させ、精巣上体（内臓）および皮下脂肪組織を回収し、１０ｍｇ／ｍｌの脂肪酸が乏しいＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミシガン州セントルイス）を含むＤＭＥＭ培地に配置した。組織を微細な小片に刻み、次に、１時間振盪水浴（８０Ｈｚ）にて３７℃で０．１２単位／ｍｌのコラゲナーゼタイプｌ（Ｓｉｇｍａ社）で消化した。次に、未消化断片を除去するために試料を無菌２５０μｍナイロンメッシュ（Ｓｃｒｙｎｅｌ  ＮＹ２５０ＨＣ，Ｍｉｌｉａｎ社）を通して濾過した。ＳＶＦを脂肪細胞から分離するために生じた懸濁液を１１００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。脂肪細胞を除去し、ＤＭＥＭ緩衝液で洗浄した。次に、脂肪細胞をｐｅｑＧＯＬＤ  ＴｒｉＦａｓｔ試薬（Ａｘｏｎｌａｂ社）中に懸濁させ、製造業者の指示に従ってＲＮＡを単離した。ＳＶＦ細胞群を赤血球溶解緩衝液（０．１５４ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で２分間インキュベートした。次に、細胞を１１００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、ＲＮＡ単離のためにｐｅｑＧＯＬＤ  ＴｒｉＦａｓｔ試薬（Ａｘｏｎｌａｂ社）５００μｌ中に再懸濁させた。
【００６０】
ＲＮＡ抽出およびリアルタイムＰＣＲ
製造業者の指示に従って（Ａｘｏｎｌａｂ社）ｐｅｑＧＯＬＤ  ＴｒｉＦａｓｔ試薬を用いて培養細胞から全ＲＮＡを単離した。ランダムプライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて全ＲＮＡ０．５μｇから一本鎖ｃＤＮＡを合成した。Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。マウス遺伝子のために以下のプライマー：配列番号９（Ｐｌａｃ８−Ｆｏｒｗａｒｄ）、配列番号１０（Ｐｌａｃ８−Ｒｅｖｅｒｓｅ）、配列番号１１（ＰＰＡＲｇａｍｍａ２−Ｆ）、配列番号１２（ＰＰＰＡＲｇａｍｍａ２−Ｒ）、配列番号１３（Ａｐ２−Ｆ）、配列番号１４（Ａｐ２−Ｒ）、配列番号１５（シクロフィリンＡ−Ｆ）、配列番号１６（シクロフィリンＡ−Ｒ）を用いた。ヒト遺伝子のために以下のプライマー：配列番号１７（ｈＰｌａｃ８−Ｆ）、配列番号１８（ｈＰｌａｃ８−Ｒ）、配列番号１９（ｈＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＡ−Ｆ）および配列番号２０（ｈＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  Ａ−Ｒ）を用いた。
【００６１】
ノーザンブロット
製造業者の指示に従って（Ａｘｏｎｌａｂ社）ｐｅｑＧＯＬＤ  ＴｒｉＦａｓｔ試薬を用いて種々のマウス組織から全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡ（８μｇ）を１，２％アガロース／ホルルムアルデヒド（ｆｏｒｌｍａｌｄｅｈｙｄｅ）ゲル上で分離し、ナイロン膜に一晩トランスフェクトした。ＲＮＡ量ローディングを制御するため、引き続くハイブリダイゼーション前に膜をメチレンブルーで染色した。Ｐｌａｃ８シグナルの検出のため、完全長ｃＤＮＡマウスプラスミド由来のプローブ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いた。［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いてランダムプライミングによってプローブを標識した。製造業者の指示に従って（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）Ｑｕｉｃｋｈｉｂ法を用いてハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った。シグナル強度によって１日または数日間、−８０℃でＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）にブロットを晒した。
【００６２】
結果
実施例１：マイクロアレイ結果
以下の３つの基準：（ｉ）高脂肪食によって調節される、（ｉｉ）内臓および皮下脂肪における高脂肪食による同様の調節発現ならびに（ｉｉｉ）リモナバン処置によるこれらの発現の同様の正常化を満たす遺伝子を同定するためにマイクロアレイデータの生物情報解析を行った（図１）。使用したｃＤＮＡマイクロアレイ上に存在する１７’０００以下の遺伝子標的の中から３４個の遺伝子がこれらの基準を満たし、これらを表１に列挙する。際立って、これらの遺伝子のうちの１０個−Ｃａｖ１、Ｆｇｆ１、Ｆｎｄｃ３ｂ、Ｋｉｆ５ｂ、Ｍｅｓｔ、Ｎｐｒ３、Ｐｉｋ３ｃａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｌｄｌｒおよびＷｗｔｒ１−は脂肪組織の発生および機能の重要な制御因子であることが以前に知られていた。これらの遺伝子の一部は体重増加と相関する発現レベルを有し（表１に灰色で示されている。）、肥満時の脂肪組織の過形成および／または肥大における潜在的役割を示唆している。これらの結果は肥満の治療に対する新規標的の可能性を特定するために用いられる手法に有効である。
【００６３】
最も重要なことには、表１に挙げた遺伝子の多くは決して脂肪組織の発生または生物学の文脈で研究されていない。これらの遺伝子は以下の機能クラス：細胞外マトリクス／細胞相互作用、細胞骨格、細胞内シグナル伝達、酵素および転写因子／補助因子に属する。これらの遺伝子は組織リモデリング、特に脂肪細胞の発生に関与すると思われる。これらの遺伝子の１つであるＰｌａｃ８遺伝子およびこの脂肪細胞生物学における役割が本明細書で提示され、本発明の一態様を構成する。
【００６４】
本発明において用いられるＰｌａｃ８のマウスおよびヒト配列は、それぞれ配列番号１および配列番号３に対応する。
【００６５】
【表１】
2012508224.tif 000002
2012508224.tif 000003
【００６６】
表１：ＳＣＡＴおよびＶＡＴにおけるＨＦＤおよびリモナバンによって調節される３４個の遺伝子候補の一覧。フルネームおよび遺伝子シンボルは第一のコラムに示されている。既知の遺伝子に対する生物学的役割および言及は第二のコラムに示されている。ＨＦＤによって下方制御されたＰｌａｃ８およびＲｐ９ｈを除き、これらの遺伝子はすべてＨＦＤによって上方制御され、リモナバン処置によって正常化した。灰色で示されるように、遺伝子は体重増加と相関した。
【００６７】
実施例２：選択遺伝子の組織および細胞発現
脂肪細胞発生におけるＰｌａｃ８の役割をより良く理解するため、まず、この発現パターンを特徴づけた。種々のマウス組織、単離前駆脂肪細胞および脂肪細胞、マウス肥満モデル（Ｏｂ／Ｏｂマウス）の内臓脂肪組織（ＶＡＴ）および皮下脂肪組織（ＳＣＡＴ）ならびにヒト脂肪組織においてノーザンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡレベルを測定した。
【００６８】
ノーザンブロットにより、Ｐｌａｃ８（図２Ａにおける矢印によって示される１ｋｂシグナル）はＳＣＡＴおよび固形飼料Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脾臓において同じ高レベルで、ＶＡＴ、ＳＣＡＴ、筋肉、心臓、肺および筋肉においてより低レベル（図２Ａ）で発現することが示された。次に、Ｐｌａｃ８の発現パターンをマイクロアレイ検査によって観察した。Ｏｂ／Ｏｂマウスの白色脂肪組織において、Ｐｌａｃ８レベルは野生型マウスと比べて低下している（図２Ｂ）。値は１に任意に設定されたＳＣＡＴにおける対照値に対する倍増加として表されている。
【００６９】
脂肪組織は成熟脂肪細胞のみならず、前駆脂肪細胞のような前駆細胞ならびに血管、マクロファージおよび線維芽細胞も含む複雑な組織である。コラゲナーゼＩ消化法に基づき、単離脂肪細胞群から間質血管細胞群（ＳＶＦ）（前駆脂肪細胞、内皮およびマクロファージ細胞を含む。）を分離した。Ｐｌａｃ８は主に前駆脂肪細胞を含む間質血管細胞群において発現することが見出された（図２Ｃ）。これらの結果はＰｌａｃ８が前駆脂肪細胞においてより発現し、従って、分化または増殖過程に関与するように思われる。
【００７０】
次の工程はＰｌａｃ８遺伝子が種間で保存されているかを判定することであった。この問題に取り組むため、ヒト脂肪組織試料に対してＲＴ−ＰＣＲを行った。ＳＣＡＴまたはＶＡＴから前駆脂肪細胞および脂肪細胞を単離した。第７日までインビトロにて単離前駆脂肪細胞を分化誘導した。この結果はＰｌａｃ８がまさにヒト脂肪において発現することを示した（図２Ｄ）。この結果はこれらの遺伝子がヒト脂肪組織に存在することを示す。要するに、これらの結果はＰｌａｃ８が脂肪細胞発生に関連する候補遺伝子であり、おそらく肥満における脂肪生成または脂肪組織拡大に必要とされることを示唆する。
【００７１】
実施例３：３Ｔ３−Ｌ１分化時の選択遺伝子の発現
次に、脂肪生成時にＰｌａｃ８の発現を評価した。この目的のため、３Ｔ３−Ｌ１（脂肪生成細胞株）の詳細な分化時間過程時にＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡレベルを測定した（図２Ｅ）。この実験はＰｌａｃ８が初期段階（ＤＭＩ処置後１から３時間）において著明に増加すること示した。既知の脂肪生成転写因子、例えば、ＣＥＢＰβおよびγ（Ｒｏｓｅｎ  Ｅ．Ｄ．ら、２０２）、Ｋｒｏｘ２０（Ｃｈｅｎ，Ｚ．ら、２００５）ならびにＥｂｆ（Ｊｉｍｉｎｅｚ，Ｍ．Ａら、２００７）が類似の発現を示し、脂肪生成の初期段階におけるこの遺伝子の関与を示唆するため、このパターンは興味深い。
【００７２】
実施例４：３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるＰｌａｃ８のｓｈＲＮＡノックダウンは脂肪生成を低下させる
機能喪失の検討のため、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製のレトロウイルスベクター（ＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ  ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ  ＺｓＧｒｅｅｎまたはｐＳＩＲＥＮ）にサブクローニングされたＰｌａｃ８に特異的なｓｈＲＮＡを用いた。このプラスミドは３Ｔ３−Ｌ１細胞における感染効率を制御することを可能にするＧＦＰマーカーを含む。Ｐｌａｃ８に対する３つの異なるｓｈＲＮＡをｐＳＩＲＥＮプラスミドにクローニングし、最初に２９３Ｔ  ＨＥＫ細胞において試験した。この実験はＰｌａｃ８に特異的なｓｈＲＮＡのＰｌａｃ８発現を阻害する能力を示した。興味深いことに、７５％および４０％のノックダウンが、それぞれｓｈＰｌａｃ８−２およびｓｈＰｌａｃ８−３で得られ（図３Ａ）、従って、これらをともに３Ｔ３−Ｌ１細胞への形質導入に用いた。
【００７３】
次に、３Ｔ３−Ｌ１細胞にＰｌａｃ８（ｓｈＰｌａｃ８）またはルシフェラーゼ（ｓｈＬｕｃ）に向けたｓｈＲＮＡを発現するレトロウイルスベクターを６時間感染させた。ＧＦＰマーカーを用いて、本発明者らは３Ｔ３−Ｌ１細胞において９０％の感染を認めた。第０日にｓｈＰｌａｃ８−２およびｓｈＰｌａｃ８−３を感染させた細胞においてＰｌａｃ８に対する５０％のノックダウンが得られ（図３Ｂ）、一方、ｓｈＬｕｃ対照では阻害は得られなかった。次に、細胞を集密に達せさせ、１週間後にＤＭＩで分化させた。分化の７から１０日後、脂質含量を定量するためにオイルレッドＯ染色で細胞を染色した。Ｐｌａｃ８のノックダウンは、ｓｈＬｕｃをトランスフェクトされた対照細胞と比べてｓｈＰｌａｃ８をトランスフェクトされた細胞において脂質染色および脂肪生成のマーカーによって示されるように脂肪生成を低下させる（図３Ｃおよび３Ｄ）。
【００７４】
実施例５：３Ｔ３−Ｌ１細胞株におけるＰｌａｃ８の過剰発現は脂肪生成を増大させる。
【００７５】
機能獲得の検討のため、Ｐｌａｃ８のマウス配列のｃＤＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈ社製のｐＭＳＣＶレトロウイルスプラスミドにサブクローニングした。３Ｔ３−ｌ１細胞の感染後、ＲＴ−ＰＣＲによってＰｌａｃ８のＲＮＡレベルを測定した。第０日において分化前に、本発明者らは空プラスミドを感染させた対照細胞（Ｌ１対照）と比べてＰｌａｃ８を過剰発現する３Ｔ３−ｌ１細胞（Ｌ１  Ｐｌａｃ８）においてＰｌａｃ８の３，５倍の誘導を得た（図４Ａ）。細胞を集密に達せさせ、ＤＭＩで分化させた。第４日および第９日に脂質含量のためにオイルレッドＯで細胞を染色した。図４Ｂに示すように、Ｐｌａｃ８の過剰発現は３Ｔ３−Ｌ１の脂肪生成潜在力を高める。ＲＴ−ＰＣＲによって分化のマーカー（ＰＰＡＲｇ２）も測定し、この結果はこのマーカーが第９日に対照細胞と比べてＰｌａｃ８を過剰発現する３Ｔ３−Ｌ１において５４％増大することを示した（図４Ｃ）。
【００７６】
【表２】
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2012508224.tif 000005
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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