(57)【要約】  本出願は、癌における治療および診断方法のためのＮ−カドヘリンに対する完全ヒト抗体を提供する。
2012508027.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１のアミノ酸配列を含む、Ｎ−カドヘリンの細胞外ドメイン４に結合することができるモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項２】
フラグメントがｓｃＦｖである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
フラグメントがダイアボディである、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
配列番号：２、３、４、５、６、７、８または９のアミノ酸配列を含む、Ｎ−カドヘリンの細胞外ドメイン１−３に結合することができるモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項５】
フラグメントがｓｃＦｖである、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
フラグメントがダイアボディである、請求項４に記載の抗体。
【請求項７】
癌患者を処置する方法であって、
（ａ）Ｎ−カドヘリンタンパク質を発現する癌を有する危険性がある個体由来の試験組織サンプルを得て、
（ｂ）癌に対して陰性であることが知られている個体由来のコントロール組織サンプルと比較して、試験組織サンプルにおけるＮ−カドヘリンタンパク質の存在もしくは非存在または量を測定し、それにより、Ｎ−カドヘリンタンパク質を発現する該癌を診断し、ここで、Ｎ−カドヘリンタンパク質は正常または低レベルで発現するか、または一部の細胞により発現するか、または過剰発現する、そして
（ｃ）有効量の請求項１または４に記載のＮ−カドヘリン抗体またはフラグメントを、Ｎ−カドヘリンタンパク質を発現する癌を有する危険性がある個体に投与する
工程を含む方法。
【請求項８】
該組織サンプルが前立腺または膀胱組織である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該癌が前立腺癌である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
該癌が膀胱癌である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
該癌がホルモン抵抗性前立腺癌である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
該抗体がホルモン抵抗性前立腺癌を阻止する、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
該抗体が癌幹細胞を阻止する、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
該癌が転移性癌である、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
抗体がｓｃＦｖである、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
抗体がダイアボディである、請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
癌患者を診断する方法であって、
（ａ）Ｎ−カドヘリンタンパク質を発現する癌を有する危険性がある個体由来の試験組織サンプルを得て、
（ｂ）サンプルを有効量の請求項１または４に記載のＮ−カドヘリン抗体またはフラグメントと接触させることにより、癌に対して陰性であることが知られている個体由来のコントロール組織サンプルと比較して、試験組織サンプルにおけるＮ−カドヘリンタンパク質の存在もしくは非存在または量を測定し、それにより、Ｎ−カドヘリンタンパク質を発現する該癌を診断する、ここで、Ｎ−カドヘリンタンパク質は正常または低レベルで発現するか、または一部の細胞により発現するか、または過剰発現する
工程を含む方法。
【請求項１９】
癌幹細胞を同定する方法であって、
（ａ）Ｎ−カドヘリンタンパク質を発現する癌を有する危険性がある個体由来の試験組織サンプルを得て、
（ｂ）請求項１または４に記載の抗体を使用して、癌に対して陰性であることが知られている個体由来のコントロール組織サンプルと比較して、試験組織サンプルにおける癌幹細胞の存在または非存在を測定する、ここで、Ｎ−カドヘリンタンパク質は正常または低レベルで発現するか、または一部の幹細胞により発現し、そして過剰発現しない
工程を含む方法。
【請求項２０】
該組織サンプルが前立腺または膀胱組織である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該癌が前立腺癌である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
該癌が膀胱癌である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
該癌がホルモン抵抗性前立腺癌である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
該癌が転移性癌である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１または４に記載の配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項２６】
請求項２５に記載の核酸を含む、単離されたベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年１１月１０日に出願された米国仮出願第６１／１１３，０４２号（これは、出典明示により本明細書に包含させる）の利益を主張する。
【０００２】
連邦支援研究または開発下で作成された発明の権利に関する言及
NIH/NCI SOMI Training Grant, R25 CA 098010, M. Phelps/A. Wu, Directors
NIH/NCI UCLA Protate SPORE, P50 CA 092131, R. Reiter/A. Wu。該政府機関は本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
コンパクトディスクで添付により提出された「配列表」、表またはコンピュータープログラムリストへの言及
該当なし。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
前立腺癌は、最も一般的な悪性腫瘍であり、アメリカ男性において癌関連死の第２位の原因である。前立腺癌は、生物学的および臨床的に多様な疾患である。この悪性腫瘍を有する男性の大部分は、個体の自然寿命に影響し得ない増殖遅延型腫瘍を有しているが、他は急速進行性転移性腫瘍にかかる。ＰＳＡスクリーニングは、特異性の欠如およびどの患者がホルモン抵抗性転移性疾患を発症する危険性があるかを予測することができないことにより制限される。診断のためにより小さいＰＳＡ域値を主張する最近の研究は、前立腺癌診断の数を増加させ、無痛性癌患者  対  侵襲性癌患者の同定をさらに複雑にし得る（Pungliaら., N Engl J Med, 349: 335-342 (2003)）。臨床結果と相関するか、または侵襲性疾患の可能性がある患者を同定する新規血清および組織マーカーが、早急に必要である（Welshら., Proc Natl Acad Sci U S A, 100: 3410-3415 (2003)）。
【０００５】
最近の発現プロファイリング研究は、転移性  対  非転移性腫瘍に関する発現特性が原発性腫瘍に存在し得ることを示唆する（Ramaswamyら., Nat Genet, 33: 49-54 (2003); Sotiriouら., Proc Natl Acad Sci U S A, 100: 10393-10398 (2003)）。腫瘍が特定の臓器へ転移しやすくなるさらなる特徴は、ある頻度で原発性腫瘍に存在することでもある（Kangら., Cancer Cell, 3: 537-549 (2003)）。これらの最近の観察は、前転移性または前ホルモン抵抗性前立腺癌の新規マーカーが初期段階の疾患において同定され得ることを示唆する。これらのマーカーは、また、転移性またはホルモン抵抗性前立腺癌の進行の生物学において役割を果たし得る。結果と相関し、前立腺癌の進行の生物学において役割を果たす原発性腫瘍に存在する遺伝子の最近の例は、ＥＺＨ２およびＬＩＭキナーゼを含む（Varamballyら., Nature, 419: 624-629 (2002); Yoshiokaら., Proc Natl Acad Sci U S A, 100: 7247-7252 (2003)）。しかしながら、これら２つの遺伝子のいずれもが分泌されない。
【０００６】
ホルモン抵抗性前立腺癌の新規候補血清または組織マーカーを同定するために、本発明者らは、以前に、対のホルモン依存性およびホルモン抵抗性前立腺癌の異種移植片の遺伝子発現プロフィールを比較した。ＬＡＰＣ−９異種移植片は、免疫不全マウスにおける去勢後の造骨性(osteoblastic bone)転移およびアンドロゲン依存性から非依存性への進行から確立された（Craftら., Cancer Research, In Press (1999)）。それは、以前に、前立腺癌における候補治療標的を同定するために使用されている。特異的に発現される遺伝子が確認され、次に分泌または細胞表面タンパク質に対して配列相同性に関して試験された。Ｎ−カドヘリンは、癌のマーカーとして同定されている。ホルモン抵抗性前立腺癌および膀胱癌の両方において発現される、Ｎ−カドヘリンの同定、特性化および初期検証は、以前に報告されている（ＷＯ／２００７／１０９３４７）。
【０００７】
胚形成において観察することができる細胞移動の１つの型は、個々の細胞または細胞の小集団の細胞外マトリックスを介する移動のために細胞間接触の喪失を必要とする。このプロセスは、上皮間葉転換（ＥＭＴ）と呼ばれる。ＥＭＴは、また、病理学的状態、例えば、上皮性起源の腫瘍細胞の運動性および浸潤性表現型の獲得において生じる。ＥＭＴの特徴は、Ｅ−カドヘリンの喪失およびＮ−カドヘリン接着分子のデノボ発現である。Ｎ−カドヘリンは、腫瘍細胞生存、移動および浸潤を促進し、高レベルのＮ−カドヘリン発現は、しばしば、予後不良と関連する。Ｎ−カドヘリンは、また、内皮細胞において発現され、正常血管および腫瘍−関連血管新生血管の成熟および安定化において必須の役割を果たす。Ｎ−カドヘリンが癌における治療標的の可能性があることを示唆する実験的証拠が増加している。
【０００８】
Ｎ−カドヘリンの機能は、分子レベルで研究されている。Ｎ−カドヘリンのＮ−末端細胞外領域（１６０から７２４  ａ．ａ）は、５つのドメイン（ＥＣＤ１−ＥＣＤ５）からなる。ＥＣＤ１およびＥＣＤ２は、細胞内接着のために必要な最小ドメインであるが、全ての細胞外ドメインが含まれるとき、接着のレベルは増強される。加えて、研究によって、ＥＣＤ４の６９アミノ酸部分が細胞接着ではなく移動および移動度において重要であることが見出された（Kimet al. J Cell Biol 2000）。
【０００９】
したがって、本発明は、限定はしないが、前立腺癌および膀胱癌を含む、Ｎ−カドヘリンを発現する癌の診断、予後診断および処置におけるＮ−カドヘリンを標的とする組成物および方法を提供する。Ｎ−カドヘリンの細胞外ドメインに特異的である抗体、およびそのフラグメントも、また、本明細書に記載されている。
【発明の概要】
【００１０】
発明の概要
本出願は、癌、例えば、前立腺および膀胱癌における治療および診断方法のためのＮ−カドヘリンに対する完全ヒト抗体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】連続パニングラウンドを介する抗−Ｎ−カドヘリンファージ抗体の濃縮。
【００１２】
【図２】ＰＣ３細胞のＡ１４、Ｃ７、Ｅ４およびＤ４ダイアボディ染色。
【００１３】
【図３】Ｎ−カドヘリン陰性細胞へのＣ７ダイアボディの結合。
【００１４】
【図４】Ｎ−カドヘリン発現細胞へのＥ４およびＤ４ダイアボディの特異的結合。
【００１５】
【図５】ＬＡＰＣ９  ＡＩ  腫瘍における１２４Ｉ標識Ｄ４  Ｄｂの腫瘍局在。
【００１６】
【図６】Ｎ−カドヘリンはＮＦ−κＢを活性化する。
【００１７】
【図７】Ｎ−カドヘリンはＮＦ−κＢを活性化する。
【００１８】
【図８】Ｎ−カドヘリンはＣ１細胞の細胞表面上に発現する。
【００１９】
【図９】ＮＦ−κＢは、Ｎ−カドヘリン陽性細胞（Ｃ１）の核に局在する。
【００２０】
【図１０】Ｎ−カドヘリン発現は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＧＦ  β２およびｂｃｌ−２の誘導を引き起こす。
【００２１】
【図１１】誘導遺伝子とＮ−カドヘリンレベルとの相関関係。
【００２２】
【図１２】Ｎ−カドヘリンノックダウンは、ＩＬ−６およびＩＬ−８の下方制御を引き起こす。
【００２３】
【図１３】Ｎ−カドヘリン抗体処理後のＮＦ−κＢ活性。
【００２４】
【図１４】ＰＣ３細胞におけるＮｃａｄ、４８時間抗体インキュベーション。
【００２５】
【図１５】Ｎ−カドヘリンノックダウンは、活性化されたＡｋｔの下方制御を引き起こす。
【００２６】
【図１６】Ｎ−カドヘリン特異的抗体は、活性化され、次にＡｋｔ活性化を下方制御する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明者らは、本明細書において、癌患者を処置する方法および癌幹細胞を同定する方法であって、癌細胞においてＮ−カドヘリンタンパク質が正常または低レベルで発現されるか、または一部の癌細胞により発現され、過剰発現されない方法を報告する。加えて、本発明者らは、本明細書において、Ｎ−カドヘリンの細胞外ドメインに特異的である抗体、およびそのフラグメントを報告する。
【００２８】
Ｎ−カドヘリン発現は、前立腺および膀胱癌浸潤および転移ならびにホルモン抵抗性疾患への前立腺癌の進行の一因となり得る。Ｎ−カドヘリンは、単独ならびにｍＴＯＲおよびＥＧＦＲの他の小分子阻害剤と組み合わせての両方で治療的に標的化することができる。Ｎ−カドヘリンの標的化は、浸潤性および転移性前立腺癌を予防または制御することを助けることができる。
【００２９】
本発明は、処置および診断のための標的であるＮ−カドヘリンが、正常組織と比較して過剰発現する必要がないという知見に関する。それは、低レベルで発現され得、また、一部の細胞のみにより発現されることもある。本発明者らは、わずか５％の前立腺癌細胞におけるＮ−カドヘリンの標的化が、去勢抵抗性への前立腺癌の進行を阻止するために十分であることを見出した。
【００３０】
本発明は、また、癌幹細胞における標的としてのＮ−カドヘリンに関する。本発明者らは、５％以下の細胞におけるＮ−カドヘリンの標的化が腫瘍の進行を阻止するために十分であることを見出した。この知見は、Ｎ−カドヘリンが癌幹細胞のマーカーであり、これらの幹細胞上のＮ−カドヘリンの阻害が全体として腫瘍の増殖を阻止するために十分であるという仮説と一致する。
【００３１】
本発明は、さらに、癌幹細胞マーカーであることと一致するＮ−カドヘリン発現細胞が、Ｎ−カドヘリン非発現細胞よりもさらに腫瘍形成性である知見に関する。Ｎ−カドヘリン陽性細胞は、Ｎ−カドヘリン陰性細胞を生じることができ、また、Ｎ−カドヘリンが癌幹細胞の新規マーカーであるという理論と一致する。最後に、腫瘍は、増殖するために、Ｎ−カドヘリンを上方制御するか、または獲得しなければならない。すなわち、腫瘍幹細胞は、腫瘍形成性になるために、上皮間葉転換の特性を獲得しなければならない。
【００３２】
したがって、Ｎ−カドヘリンは、とりわけ有望な治療標的である。それは、細胞表面上に見出され、多数の上皮性腫瘍において発現し、浸潤性、転移性および恐らくアンドロゲン非依存性と関連する。したがって、Ｎ−カドヘリンに対する抗体は、限定はしないが、泌尿生殖器癌（膀胱、前立腺）を含む上皮癌、さらに特に、それらの浸潤性または転移性形態の処置における使用のために特に好ましい物質である。いくつかの態様において、Ｎ−カドヘリンの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体が好ましい。さらなる態様において、Ｎ−カドヘリンの第１の細胞外ドメイン（ＥＣ１）、第１および第２のドメインの部分、第１から第３のドメインまたは第４の細胞外ドメインが、これらの癌の処置において好ましい。いくつかの態様において、細胞外ドメイン４が、機能調整性および浸潤性の可能性において重要であることが見出されているため（Kimら, J Cell Biol. 151(6):1193-206 (2000)参照、種々のＮ−カドヘリンドメインの定義に関して、その全体を出典明示により包含させる）、細胞外ドメイン４に対する抗体の使用が、これらの処置において特に好ましい。
【００３３】
本明細書において、本発明者らは、２つの非依存性Ｎ−カドヘリン組換えタンパク質、すなわち、Ｎ−カドヘリン細胞外ドメイン１から３（ＥＣＤ１−３）およびＮ−カドヘリンの第４のドメイン（ＥＣＤ４）に特異的なヒトＳｃＦｖの選択および特性を記載する。２つの非依存性スクリーンを、該分子の接着および移動表現型に影響することができる特定の試薬を生産、ならびにＮ−カドヘリン発現細胞を標的とするための試薬を生産する目的で設計した。第４パニングラウンド由来の個々のファージクローンを、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーにより特徴付けた。特異的な結合剤をシーケンシングし、選択されたクローンのいくつかを小さい二価抗体フラグメント（ダイアボディ）に再構築した。該ダイアボディは、Ｎ−カドヘリン発現細胞への特異的結合を示す。
【００３４】
本明細書に記載されている抗−Ｎ−カドヘリンフラグメントは、種々の形状およびサイズのヒト全抗体または操作された抗体を製造され得るときの基本的な構成要素であり、この主要な特性は、Ｎ−カドヘリンタンパク質に特異的に結合する能力である。これらの抗体は、Ｎ−カドヘリンタンパク質を発現する前立腺、膀胱または他の癌の処置または診断のために使用することができる。腫瘍におけるＮ−カドヘリン発現が、腫瘍細胞自体または何らかの周辺の間質（筋肉、繊維芽細胞、血管など）によるものであるかに注意することが重要である。本発明者らは、以前に、Ｎ−カドヘリンが、前立腺、膀胱および他の癌の浸潤、増殖、転移および進行の重要な生物学的決定因子であり、重要な診断、予後診断および治療標的であることを示している。Ｎ−カドヘリンに対するマウスモノクローナル抗体は、癌の動物モデルにおいて腫瘍増殖、転移、浸潤およびアンドロゲン非依存性への進行を阻止することができる。容易に全抗体または操作された抗体に再構築することができるヒトｓｃＦＶの見出したことは、抗体に対する免疫応答を刺激することなしに、癌を標的とする能力を提供する。
【００３５】
本発明者らは、知る限りにおいて、前立腺および他の癌を診断および処置する目的で導かれたＮ−カドヘリンに対する初めてのヒト抗体フラグメントを記載する。本発明は、前立腺および膀胱ならびに他の癌の進行においてＮ−カドヘリンが関与するという本発明者らのグループにより開発された先行技術、ならびに治療的にそれを標的化するという概念を前提とする。ファージディスプレイは、抗体フラグメントの単離のためによく確立された技術を表す。本明細書で使用される非免疫ファージライブラリーは、Dr. JD Marks at UC. San Franciscoにより開発された。
【００３６】
本発明は、Ｎ−カドヘリンを認識する一本鎖フラグメントの単離および特性化を表す。これらは、癌の診断または処置のために使用することができる、一本鎖フラグメントとして使用するか、またはより大きなフラグメント、例えば、全ＩｇＧに再構築することができる。
【００３７】
記載されているとおり、本発明は、より大きな構築物に再構築でき、前立腺および他の癌におけるＮ−カドヘリンを認識するために使用することができる、推定診断および治療有用性を有する多くの候補フラグメントを記載している。これらの抗体は、それら自体（裸の抗体）により、または、治療、画像もしくは他の目的のために腫瘍への送達のために放射性同位体、ナノ粒子、リポソーム、ウイルスもしくは他のあらゆる「負荷」と組み合わせて使用することができる。フラグメントは、Ｎ−カドヘリンを発現する腫瘍に対するあらゆる治療または画像診断法の特異性を増加させるために使用することができる。
【００３８】
本発明者らの知っている限りでは、Ｎ−カドヘリンに対する抗体が、このような腫瘍を標的化するあらゆる他の既知の方法より優れている治療活性を有することを初めて示す。本発明の利点は、抗体フラグメントが非免疫原性およびヒトであり、さらなる修飾なしに患者に使用することができることである。また、Ｎ−カドヘリンを認識するフラグメントは、容易にほとんどあらゆる目的のために操作することができるという柔軟性の利点を有する。
【００３９】
定義
「Ｎ−カドヘリンおよびＥ−カドヘリン」は、（１）本明細書に記載されている、例えば、図７、８および９のそれぞれに記載されているそれぞれの参照核酸によってコードされるポリペプチドまたはアミノ酸配列に対し、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、約６０％以上のアミノ酸配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、（２）図７、８および９のそれぞれに記載されている参照アミノ酸配列を含む免疫原、それらのそれぞれの免疫原性フラグメント、およびそれらのそれぞれの保存的に修飾された変異体に対する抗体、例えば、ポリクローナル抗体に特異的に結合する、（３）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、図７、８および９のそれぞれに記載されている参照アミノ酸配列をコードする核酸、およびそれらのそれぞれの保存的に修飾された変異体に特異的にハイブリダイズする、（４）図７、８および９のそれぞれに示されている参照核酸配列に対し、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、約９５％以上の、好ましくは約９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の核酸配列同一性を有する核酸配列を有する、核酸、例えば、遺伝子、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびポリペプチド、多型変異体、対立遺伝子、変異体ならびに種間相同体を示す。ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、一般的に、霊長類、例えば、ヒト、齧歯動物、例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジを含むが、これらに限定されない、哺乳動物または他の哺乳動物由来である。本発明の核酸およびタンパク質は、天然または組換え分子の両方を含む。
【００４０】
「癌」は、ヒト癌および癌腫、肉腫、腺癌、リンパ腫、白血病など、例えば、固形腫瘍およびリンパ癌、腎臓、乳房、肺、腎臓、膀胱、大腸、卵巣、前立腺、膵臓、胃、脳、頭頸部、皮膚、子宮、精巣、食道および肝臓癌、非ホジキンおよびホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、白血病および多発性骨髄腫を示す。「泌尿生殖器癌」は、腎臓、膀胱、尿路、尿道、前立腺、陰茎、精巣、外陰、膣、子宮頸および卵巣組織を含むが、これらに限定されない、尿路および生殖器組織のヒト癌を示す。
【００４１】
本明細書において処置される癌は、Ｎ−カドヘリンの過剰活性化により特徴付けられるものであり得る。あるいは、本明細書において処置される癌は、Ｎ−カドヘリンタンパク質が正常または低レベルで発現するものか、またはＮ−カドヘリンタンパク質が一部の細胞により発現し、Ｎ−カドヘリンタンパク質が過剰発現しないものであり得る。本発明の１つの態様において、診断または予後アッセイは、患者の癌がＮ−カドヘリンの発現により特徴付けられるか否かを測定するために実施される。このような増幅／発現を測定するための種々のアッセイが考慮され、免疫組織化学、ＦＩＳＨおよびｓｈｅｄ抗原アッセイ、サザンブロット法またはＰＣＲ技術を含む。さらに、Ｎ−カドヘリン発現または増幅は、インビボ診断アッセイを使用して、例えば、検出する分子に結合し、検出可能な標識（例えば、放射性同位体）で標識される分子（例えば、抗体）を投与し、外部から標識の局在に関して患者をスキャンすることにより、評価され得る。いくつかの態様において、処置される癌は、まだ浸潤性でないが、Ｎ−カドヘリンを発現する。
【００４２】
「治療耐性」癌、腫瘍細胞および腫瘍は、化学療法、ホルモン治療、放射線治療および免疫療法を含む、アポトーシス−介在（例えば、死受容体細胞シグナル伝達、例えば、Ｆａｓリガンド受容体、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ−Ｒ１、化学療法剤、放射線を介する）および非アポトーシス介在（例えば、毒性薬剤、化学物質）癌治療のいずれか、または両方に耐性または難治性となっている癌を示す。
【００４３】
「過剰発現」は、試験組織サンプルにおけるＮ−カドヘリン、ＬＹ６−ＥおよびＥ−カドヘリンのＲＮＡまたはタンパク質発現が、それぞれ、コントロール組織サンプルにおけるＮ−カドヘリン、ＬＹ６−ＥおよびＥ−カドヘリンのＲＮＡまたはタンパク質発現よりも顕著に高いことを示す。１つの態様において、組織サンプルは自己である。浸潤性、転移性、ホルモン非依存性（例えば、アンドロゲン非依存性）または処置に対して抵抗性もしくはその高い可能性と関連する癌性試験組織サンプル（例えば、膀胱、前立腺）は、一般的に、転移への進行の可能性があまりない患者由来の癌組織または正常（すなわち、非癌）組織サンプルと比較して、少なくとも２倍高いＮ−カドヘリンまたはＬＹ６−ＥのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現、しばしば３、４、５、８、１０倍まで、またはそれ以上高いＮ−カドヘリンまたはＬＹ６−Ｅの発現を有する。このような違いは、試験およびコントロールサンプルでほぼ同様に負荷されたゲルのバンドを見たとき、容易に明らかにされ得る。増加した量のＮ−カドヘリンまたはＬｙ６−Ｅを発現する前立腺癌は、浸潤性になる可能性、転移する可能性、またはアンドロゲン非依存性もしくは処置難治性癌へ進行する可能性が高い。原発性腫瘍におけるＮ−カドヘリンまたはＬｙ６−Ｅ陽性細胞の少ない割合が、再発および転移の高い危険性を有する腫瘍を同定し得る可能性があるため、種々のカットオフは、Ｎ−カドヘリンまたはＬｙ６−Ｅ陽性と関連がある。「過剰発現する」、「過剰発現」または「過剰発現された」なる用語は、互換的に、正常細胞と比較して、通常、癌細胞において検出的により良いレベルで転写されるか、または翻訳される遺伝子を示す。したがって、過剰発現は、タンパク質およびＲＮＡの両方の過剰発現（増加した転写、転写後プロセッシング、翻訳、翻訳後プロセッシング、変化した安定性、および変化したタンパク質分解による）、ならびに変化したタンパク質トラフィック・パターン（増加した核局在）による、および、例えば、基質の酵素加水分解増加におけるような、増加した機能活性による局所的過剰発現を示す。過剰発現は、また、正常細胞または比較細胞（例えば、ＢＰＨ細胞）と比較して、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上であり得る。
【００４４】
「Ｎ−カドヘリンを発現する癌」および「Ｎ−カドヘリンの発現と関連する癌」なる用語は、互換的に、上記定義にしたがってＮ−カドヘリンを発現する癌細胞または組織を示す。
【００４５】
「癌関連抗原」または「腫瘍特異的マーカー」または「腫瘍マーカー」なる用語は、互換的に、正常細胞と比較して、癌細胞において優先的に発現される分子（一般的に、タンパク質、炭水化物または脂質）を示し、これは、癌細胞に対する薬理学的物質の優先的標的化のために有用である。マーカーまたは抗原は、細胞表面上で、または細胞内に発現させることができる。しばしば、癌関連抗原は、正常細胞と比較して、癌細胞において最小分解で、例えば、正常細胞と比較して２倍発現、３倍発現またはそれ以上で発現されるか、または安定化している分子である。しばしば、癌関連抗原は、癌細胞において不適当に合成される分子、例えば、正常細胞上で発現される分子と比較して、欠失、付加または変異を含む分子である。しばしば、癌関連抗原は、もっぱら癌細胞において発現され、正常細胞において合成または発現されない。典型的な細胞表面腫瘍マーカーは、乳癌に対してタンパク質ｃ−ｅｒｂＢ−２およびヒト上皮細胞増殖因子受容体（ＨＥＲ）、前立腺癌に対してＰＳＭＡ、ならびに乳房、卵巣および結腸直腸を含む多数の癌において炭水化物ムチンを含む。典型的な細胞内腫瘍マーカーは、例えば、変異した腫瘍抑制遺伝子または細胞周期タンパク質、例えば、ｐ５３を含む。
【００４６】
Ｅ−カドヘリンは、浸潤性になる可能性、転移する可能性、またはアンドロゲン非依存性もしくは処置難治性癌へ進行する可能性のある癌患者由来の組織サンプルにおける癌性組織サンプルにおいて、逆に一般的に過少発現である(underexpress)。この過少発現は、２倍、３倍、４倍または少なくとも５倍であり得る。このような違いは、試験およびコントロールサンプルでほぼ同様に負荷されたゲルのバンドを見たとき、容易に明らかにされ得る。したがって、浸潤性になる可能性、転移する可能性、またはアンドロゲン非依存性もしくは処置難治性癌へ進行する可能性のある癌における組み合わせたＮ−カドヘリン／Ｅ−カドヘリン値は、さらに高く、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍または２０倍高い。原発性腫瘍におけるＮ−カドヘリン陽性細胞の少ない割合が、再発および転移の高い危険性を有する腫瘍を同定し得る可能性があるため、種々のカットオフはＮ−カドヘリン陽性／ｅ−カドヘリン陰性と関連がある。
【００４７】
「アゴニスト」は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合し、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性または発現を刺激するか、増加するか、活性化するか、促進するか、活性化を増強するか、増感するか、または上方調節する物質を示す。
【００４８】
「アンタゴニスト」は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現を阻害するか、またはそれらに結合し、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を部分的または全体的に刺激を阻止するか、減少するか、防止するか、活性化を遅延するか、不活性化するか、鈍感にするか、または下方調節する物質を示す。
【００４９】
発現または活性の「阻害剤」、「活性剤」および「調節剤」は、それぞれ、発現または活性に関してインビトロおよびインビボアッセイを使用して同定される阻害、活性化、または調節分子、例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニストならびにそれらの相同体および模擬体を示すために使用される。「調節剤」なる用語は、阻害剤および活性剤を含む。阻害剤は、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現を阻害するか、または結合して、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を部分的または全体的に刺激または酵素活性を阻止するか、減少するか、防止するか、活性化を遅延するか、不活性化するか、鈍感にするか、または下方調節する物質、例えば、アンタゴニストを示す。活性剤は、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現を誘導するか、もしくは活性化するか、または結合して、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性または発現を刺激するか、増加するか、開くか、活性化するか、促進するか、活性化または酵素活性を増強するか、増感するか、または上方調節する物質、例えば、アゴニストを示す。調節剤は、天然および合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、小化学分子などを含む。阻害剤および活性剤を同定するためのアッセイは、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの存在または非存在下で細胞に推定調節剤化合物を与え、次に本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド活性における機能効果を測定することを含む。可能性のある活性剤、阻害剤または調節剤で処理される本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含むサンプルまたはアッセイは、効果の程度を試験するために、阻害剤、活性剤または調節剤なしのコントロールサンプルと比較する。コントロールサンプル（調節剤で未処理）は、１００％の相対活性値を割り当てる。阻害は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性値が、コントロールと比較して、約８０％、所望により５０％または２５−１％であるとき、達成される。活性化は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性値が、コントロールと比較して、１１０％、所望により１５０％、所望により２００−５００％または１０００−３０００％以上であるとき、達成される。
【００５０】
本明細書において使用される「試験化合物」または「薬剤候補」または「調節剤」または文法的な同等物なる用語は、天然または合成のいずれかのあらゆる分子、例えば、タンパク質、オリゴペプチド（例えば、約５から約２５アミノ酸長、好ましくは約１０から２０または１２から１８アミノ酸長、好ましくは１２、１５または１８アミノ酸長）、有機小分子、多糖類、脂質、脂肪酸、ポリヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、抗体、オリゴヌクレオチドなどを表す。試験化合物は、十分な範囲の多様性を提供する試験化合物のライブラリー、例えば、コンビナトリアルまたはランダムライブラリーの形態であり得る。試験化合物は、所望により、融合パートナー、例えば、標的化化合物、レスキュー(rescue)化合物、二量化化合物、安定化化合物、アドレス可能な化合物および他の官能基に結合させる。通常、有用な特性を有する新規化学物質は、例えば活性を阻害する、いくつかの所望の特性または活性を有する試験化合物（「リード(lead)化合物」と呼ばれる）を同定し、リード化合物の変異体を創造し、これらの変異体化合物の特性および活性を評価することにより生産される。しばしば、ハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）方法が、このような分析のために使用される。
【００５１】
「有機小分子」は、約５０ダルトンを越え約２５００ダルトン未満、好ましくは約２０００ダルトン未満、好ましくは約１００から約１０００ダルトン、さらに好ましくは約２００から約５００ダルトンの分子量を有する、天然または合成のいずれかの有機分子を示す。
【００５２】
細胞毒性剤は、「細胞周期特異的」または「抗有糸分裂」または「細胞骨格−相互作用」薬剤を含む。これらの用語は、互換的に、有糸分裂において細胞を阻止するあらゆる薬理学的物質を示す。このような薬剤は化学療法に有用である。一般的に、細胞周期特異的薬剤は、細胞骨格タンパク質チューブリンに結合し、チューブリンが微小管に重合する能力を阻止し、中期で細胞分裂の停止をもたらす。典型的な細胞周期特異的薬剤は、ビンカアルカロイド、タキサン類、コルヒチンおよびポドフィロトキシンを含む。典型的なビンカアルカロイドは、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンを含む。典型的なタキサン類は、パクリタキセルおよびドセタキセルを含む。細胞骨格相互作用剤の他の例は、２−メトキシエストラジオールを含む。
【００５３】
「ｓｉＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ」は、ｓｉＲＮＡが遺伝子または標的遺伝子と同じ細胞中で発現したとき、二本鎖ＲＮＡが遺伝子または標的遺伝子の発現を減少させるか、または阻害する能力を有する、二本鎖ＲＮＡを形成する核酸を示す。したがって、「ｓｉＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ」は、相補鎖により形成される二本鎖ＲＮＡを示す。二本鎖分子を形成するためにハイブリダイズするｓｉＲＮＡの相補部分は、一般的に、実質的または完全同一性を有する。１つの態様において、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子と実質的または完全同一性を有し、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する核酸を示す。一般的に、ｓｉＲＮＡは、少なくとも約１５−５０ヌクレオチド長である（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡのそれぞれの相補配列は、１５−５０ヌクレオチド長であり、二本鎖ｓｉＲＮＡは、約１５−５０塩基対長、好ましくは約２０−３０塩基ヌクレオチド、好ましくは約２０−２５または約２４−２９ヌクレオチド長、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長である）。
【００５４】
ｓｉＲＮＡ分子およびベクターの設計および作製は、当業者によく知られている。例えば、適当なｓｉＲＮＡを設計するための有効なプロセスは、ｍＲＮＡ転写産物のＡＵＧ開始コドンで開始し（例えば、図５参照）、ＡＡジヌクレオチド配列に対してスキャンすることである（Elbashirら. EMBO J 20: 6877-6888 (2001)、参照）。それぞれのＡＡおよび３’隣接ヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ標的部位の可能性がある。隣接部位配列の長さはｓｉＲＮＡの長さを決定する。例えば、１９個の隣接部位は、２１ヌクレオチド長のｓｉＲＮＡを与える。ＵＵジヌクレオチド３’オーバーハングを有するｓｉＲＮＡが、しばしば、非常に有効である。このアプローチは、また、ヘアピンｓｉＲＮＡを転写するためにＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩの使用が可能である。ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩは、４−６個のヌクレオチドポリ（Ｔ）地域で転写を終了し、短ポリ（Ｕ）テイルを有するＲＮＡ分子を創造する。しかしながら、他の３’末端ジヌクレオチドオーバーハングを有するｓｉＲＮＡは、また、有効にＲＮＡｉを誘導することができ、該配列は、経験的に選択され得る。選択性に関して、他のコード配列と１６−１７個以上の隣接する塩基対の相同性を有する標的配列は、ＢＬＡＳＴサーチ（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST、参照）を行うことにより回避することができる。
【００５５】
ｓｉＲＮＡは、直接投与することができ、またはＲＮＡｉを誘導するために使用することができるｓｉＲＮＡ発現ベクターを、異なる設計基準で有することができる。ベクターは、短スペーサー配列により分離される２つの逆方向反復および転写を終わらせるために働くたくさんのＴを有する末端を挿入することができる。発現されるＲＮＡ転写産物は、短ヘアピンｓｉＲＮＡに折りたたまれることが予期される。ｓｉＲＮＡ標的配列の選択、推定ヘアピンのステムをコードする逆方向反復の長さ、逆方向反復の順序、ヘアピンのループをコードするスペーサー配列の長さおよび組成物、ならびに５’−オーバーハングの存在または非存在は、変化することができる。ｓｉＲＮＡ発現カセットの好ましい順序は、センス鎖、短スペーサーおよびアンチセンス鎖である。これらの種々のステム長（例えば、１５から３０）を有するヘアピンｓｉＲＮＡが適当であり得る。ヘアピンｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖に連結しているループの長さは、種々の長さ（例えば、３から９ヌクレオチドまたはそれ以上）を有し得る。ベクターは、ｓｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターおよび発現エンハンサーまたは他の調節エレメントを含み得る。「コントロール配列」なる表現は、特定の宿主生物において作動可能に連結したコード配列の発現のために必要であるＤＮＡ配列を示す。原核生物に適当であるコントロール配列は、例えば、プロモーター、所望によりオペレーター配列およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。調節エレメントが応答性である外部要因を加えるか、または制御することにより、遺伝子の発現をオンまたはオフにすることを臨床医が可能にするように、これらの制御エレメントは設計され得る。
【００５６】
所望の治療遺伝子コードおよびコントロール配列を含む適当なベクターの構築は、当該分野でよく知られている標準ライゲーションおよび制限技術を使用する（Maniatisら., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)、参照）。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列または合成オリゴヌクレオチドは、開裂され、調整され、所望の形態に再結合される。
【００５７】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に置かれているとき、「作動可能に連結した」である。例えば、ポリペプチドの分泌に関係するプレタンパク質として発現されるとき、プレ配列または分泌リーダーに対するＤＮＡは、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結しており、配列の転写に影響するとき、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列に作動可能に連結しており、または、翻訳を促進するように位置しているとき、リボソーム結合部位は、コード配列に作動可能に連結している。一般的に、「作動可能に連結した」は、連結されているＤＮＡ配列が互いに近く、分泌リーダーの場合、隣接しており、リーディング相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接していなくてもよい。連結は、便利な制限酵素認識部位でライゲーションにより達成される。このような部位が存在しないとき、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを慣用の形式にしたがって使用する。
【００５８】
「機能効果を測定すること」は、間接的または直接的に本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの影響下でパラメーターを増加または減少させる化合物についてアッセイすること、例えば、物理化学的または表現型効果を測定することを示す。このような機能効果は、当業者に知られている任意の手段、例えば、タンパク質に対する分光学的（例えば、蛍光、吸光度、屈折率）、流体力学的（例えば、形）、クロマトグラフまたは溶解度特性の変化、タンパク質の誘導マーカーまたは転写活性化を測定すること、結合活性または結合アッセイ、例えば、抗体への結合を測定すること、リガンド結合親和性における変化を測定すること、カルシウム流入の測定、本発明のポリペプチドの酵素生成物の蓄積または基質の枯渇の測定、酵素活性、例えば、キナーゼ活性における変化、本発明のポリペプチドのタンパク質レベルにおける変化の測定、ＲＮＡ安定性の測定、Ｇ−タンパク質結合、ＧＰＣＲリン酸化または脱リン酸化、シグナル変換、例えば、受容体−リガンド相互作用、セカンド・メッセンジャー濃度（例えば、ｃＡＭＰ、ＩＰ３または細胞内Ｃａ２＋）、例えば、化学発光、蛍光、比色反応、抗体結合、誘導マーカーおよびリガンド結合アッセイを介する、下流またはレポーター遺伝子発現の同定（ＣＡＴ、ルシフェラーゼ、β−ｇａｌ、ＧＦＰなど）により測定することができる。
【００５９】
可能性のある活性剤、阻害剤または調節剤で処理される本明細書に記載されている核酸またはタンパク質を含むサンプルまたはアッセイは、阻害の程度を試験するために、阻害剤、活性剤または調節剤なしのコントロールサンプルと比較する。コントロールサンプル（阻害剤で未処理）は、１００％の相対タンパク質活性値を割り当てる。阻害は、活性値が、コントロールと比較して、約８０％、好ましくは５０％、さらに好ましくは２５−０％であるとき、達成される。活性化は、活性値が、コントロール（活性剤で未処理）と比較して、１１０％、さらに好ましくは１５０％、さらに好ましくは２００−５００％（すなわち、コントロールと比較して、２から５倍高い）、さらに好ましくは１０００−３０００％以上であるとき、達成される。
【００６０】
「生物学的サンプル」は、組織学的目的のために採取した組織切片、例えば、生検および解剖検体、および凍結切片を含む。このようなサンプルは、血液および血液分画または産物（例えば、血清、血漿、血小板、赤血球など）、唾液、組織、培養細胞、例えば、初代培養物、移植片、および形質転換細胞、ふん便、尿などを含む。生物学的サンプルは、一般的に、真核生物、より好ましくは哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、チンパンジーまたはヒト、ウシ、イヌ、ネコ、齧歯動物、例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、または鳥類、は虫類、または魚類から得られる。
【００６１】
「生検」は、診断または予後評価のための組織サンプルを取り出すプロセス、および組織標本自体を示す。当該分野で知られているあらゆる生検技術を、本発明の診断および予後診断方法に適用することができる。適用される生検技術は、数ある因子のなかでも、評価される組織型（すなわち、前立腺、リンパ節、肝臓、骨髄、血球）、腫瘍のサイズおよび型（すなわち、固形または懸濁（すなわち、血液または腹水））に依存する。典型的な生検技術は、切除生検、切開生検、針生検、外科生検および骨髄生検を含む。「切除生検」は、周囲のほんのわずかの正常組織と共に全腫瘍塊を取り出すことを示す。「切開生検」は、腫瘍の断面直径を含むくさび形の組織の取り出しを示す。内視鏡検査または蛍光透視法により行われる診断または予後診断は、腫瘍塊の「コア針生検」または一般的に腫瘍塊内から細胞懸濁を得る「細針吸引生検」を必要とし得る。生検技術は、例えば、Harrison's Principles of Internal Medicine, Kasperら編、第１６版、2005, Chapter 70, およびPart Vに記載されている。
【００６２】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列との関係において、「同一」または「同一性」なる用語は、下記のデフォルトパラメーターを用いるＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、または手動アラインメントおよび目視検査により測定される場合（例えば、ＮＣＢＩウェブサイト  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/など参照）、同一の２つ以上の配列または部分配列、または同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定のパーセント有する２つ以上の配列または部分配列（すなわち、比較ウィンドウまたは指定領域にわたって最大に対応するように比較およびアラインした場合に、特定の領域にわたって、約６０％同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性）を示す。次に、このような配列は、「実質的に同一」であると言う。この定義は、また、試験配列について示すか、または適用され得る。該定義は、また、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列を含む。以下に記載されているとおり、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを説明することができる。好ましくは、同一性は、少なくとも約２５アミノ酸またはヌクレオチド長である領域にわたって、さらに好ましくは５０−１００アミノ酸またはヌクレオチド長である領域にわたって存在する。
【００６３】
配列比較のために、一般的に１つの配列が参照配列として作用し、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要ならば、部分座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。好ましくは、デフォルトプログラムパラメーターを使用できるか、または代わりのパラメーターを指定することができる。次に、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した試験配列に対する配列同一性パーセントを計算する。
【００６４】
本明細書において使用される「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適にアラインした後、１つの配列が同数の連続位置の参照配列と比較され得る、２０から６００、通常、約５０から約２００、さらに通常、約１００から約１５０からなる群から選択される連続位置の数のいずれか１つのセグメントに対する言及を含む。比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野でよく知られている。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所的相同性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA  85:2444 (1988)の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピューターでの手段（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または手動アラインメントおよび目視検査（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubelら., eds. 1995 supplement)、参照）により行うことができる。
【００６５】
配列同一性パーセントおよび配列類似性を決定するために適当なアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれAltschulら., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)およびAltschulら., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されている。本発明の核酸およびタンパク質に対する配列同一性パーセントを決定するために、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を、本明細書に記載されているパラメーターを用いて使用する。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から公的に入手できる。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインしたとき、ある正の値の閾値スコアＴとマッチするか、または満足させるいずれかである検索配列における長さＷの短いワードを同定することにより、高いスコアリング配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値（Altschulら.,（上記）参照）と呼ばれる。これらの最初の近隣ワードヒットが、それらを含有するより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するための種として作用する。このワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加することができる限り、それぞれの配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、核酸配列について、パラメーターＭ（マッチする残基のペアに対するリワードスコア(reward score)、常に＞０）およびＮ（マッチしない残基に対するペナルティースコア(penalty score)、常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列について、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。それぞれの方向でのワードのヒットの延長は、累積アラインメントスコアがその到達した最大値から数量Ｘまで低下したとき、累積スコアが１つ以上の負のスコアリング残基のアラインメントの累積によってゼロもしくはそれ以下になったとき、または、いずれかの配列の末端に達したときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（核酸配列に対して）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長３および期待値（Ｅ）１０を、そしてＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング・マトリックス（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)、参照）は、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
【００６６】
「核酸」は、一もしくは二本鎖形態のいずれかにおけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマー、およびそれらの相補体を示す。該用語は、合成、天然または非天然であり、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の方法において代謝される既知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基もしくは連結を含む核酸を包含する。このような類似体の例は、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、メチルホスホナート、キラル−メチルホスホナート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）を含むが、これらに限定されない。
【００６７】
他に記載のない限り、特定の核酸配列は、また、それらの保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補配列、ならびに明白に示されている配列を暗に含む。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生産することにより、達成され得る（Batzerら., Nucleic Res. 19:5081 (1991); Ohtsukaら., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossoliniら., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。核酸なる用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと互換的に使用される。
【００６８】
特定の核酸配列は、また、「スプライス変異体」を暗に含む。同様に、核酸によってコードされる特定のタンパク質は、核酸のスプライス変異体によってコードされる任意のタンパク質を暗に含む。「スプライス変異体」は、その用語が示唆するように、遺伝子の選択的スプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写産物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス変異体の生産のためのメカニズムは変化するが、エクソンの選択的スプライシングを含む。リードスルー（read-through）転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義により包含される。スプライス産物の組換え形態を含むスプライシング反応の全ての産物が、この定義に含まれる。カリウムチャネルスプライス変異体の例は、Leicherら., J. Biol. Chem. 273(52):35095-35101 (1998)に記載されている。
【００６９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」なる用語は、本明細書で互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを示す。該用語は、１個以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学模擬体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用する。
【００７０】
「アミノ酸」なる用語は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模擬体を示す。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびに後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を有する、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合しているα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを示す。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を維持している。アミノ酸模擬体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物を示す。
【００７１】
アミノ酸は、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨される、一般的に知られている３文字記号または１文字記号のいずれかにより、本明細書に記載され得る。同様に、ヌクレオチドも、一般的に受け入れられている１文字記号により記載され得る。
【００７２】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一または実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を示し、または核酸がアミノ酸配列をコードしていないとき、実質的に同一の配列を意味する。遺伝子コードの縮重のため、多くの機能的に同一の核酸が、任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードするポリペプチドを変化させることなく、記載されている対応するコドンのいずれかに変化させることができる。このような核酸変異は、保存的に修飾された変異の１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列は、また、核酸の全ての可能なサイレント変異を意味する。当業者は、核酸のそれぞれのコドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を、機能的に同一の分子を得るために修飾することができることを理解している。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異は、実際のプローブ配列に対してではなく、発現産物に対して、それぞれの記載されている配列に潜在している。
【００７３】
アミノ酸配列について、当業者は、コードされた配列中の１つのアミノ酸または数パーセントのアミノ酸を変化、付加または欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が「保存的に修飾された変異体」であることを理解している（ここで、該変化は化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらす）。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該分野でよく知られている。このような保存的に修飾された変異体は、さらに、本発明の多型変異体、種間相同体および対立遺伝子を除外しない。
【００７４】
下記８個のグループは、それぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む。１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)、参照）。
【００７５】
「標識」または「検出可能部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的または他の物理的手段により検出可能な組成物である。例えば、有用な標識は、３２Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、一般的にＥＬＩＳＡにおいて使用されるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはハプテンおよび、例えば、放射性標識をペプチドに組み込むことにより検出可能にできるか、またはペプチドと特異的に反応性である抗体を検出するために使用できるタンパク質を含む。
【００７６】
「組換え」なる用語は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用されるとき、該細胞、核酸、タンパク質またはベクターが異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然核酸もしくはタンパク質の変化により修飾されているか、または該細胞がそのように修飾された細胞由来であることを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形態内で見出されない遺伝子を発現するか、または天然遺伝子を発現しても異常に発現するか、もしくは全く発現しない。
【００７７】
「異種」なる用語は、核酸の部分に関して使用されるとき、核酸が本来は互いに同じ関係において見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、一般的に、新規機能性核酸を作るために配置された関係のない遺伝子由来の２つ以上の配列、例えば、１つの起源由来のプロモーターおよび別の起源由来のコード領域を有する核酸が、組換え的に生産される。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が本来は互いに同じ関係において見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。
【００７８】
「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」なる用語は、プローブが、一般的に核酸の複合混合物中で、その標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にハイブリダイズしない条件を示す。ストリンジェント条件は配列依存性であり、異なる状況において異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションのための大規模なガイドは、Tijssen, Techniquess in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of Hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)において見出される。一般的に、ストリンジェント条件は、規定のイオン強度ｐＨにて特定の配列に対する熱融点（Ｔｍ）より約５−１０℃低く選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）である（標的配列が過剰に存在するとき、Ｔｍで、５０％のプローブが平衡状態で占有される）。ストリンジェント条件は、また、脱安定化剤、例えば、ホルムアミドの添加で達成され得る。選択的または特異的ハイブリダイゼーションに関して、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、バックグラウンドの好ましくは１０倍のハイブリダイゼーションである。典型的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、以下のとおりであり得る。５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％のＳＤＳ、４２℃でインキュベーション、または５×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ、６５℃でインキュベーション、および６５℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳで洗浄。
【００７９】
ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であるとき、まだ実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝子コードで認められている最大コドン縮重を使用して創造されるとき、起こる。このような場合、核酸は、一般的に、中程度のストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。典型的な「中程度のストリンジェントハイブリダイゼーション条件」は、４０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳのバッファー中で３７℃でハイブリダイゼーション、および１×ＳＳＣ中で４５℃での洗浄を含む。陽性ハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者は、代わりのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を、同様のストリンジェンシーの条件を提供するために利用できることを容易に理解している。ハイブリダイゼーションパラメーターを決定するためのさらなるガイドラインは、多数の文献、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubelら., John Wiley & Sonsにおいて提供される。
【００８０】
ＰＣＲに関して、約３６℃の温度が低ストリンジェンシー増幅のために典型的であるが、アニーリング温度は、プライマー長に依存して約３２℃から４８℃の間で変化し得る。高ストリンジェンシーＰＣＲ増幅に関して、約６２℃の温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーアニーリング温度は、プライマー長および特異性に依存して約５０℃から約６５℃で変化し得る。高および低ストリンジェンシー増幅の両方のために典型的なサイクル条件は、変性期９０℃−９５℃で３０秒−２分、アニーリング期３０秒−２分持続、および伸長期約７２℃で１−２分を含む。低および高ストリンジェンシー増幅反応のためのプロトコールおよびガイドラインは、例えば、Innisら. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.で提供される。
【００８１】
「抗体」は、抗原に特異的に結合し、認識する免疫グロブリン遺伝子由来のフレームワーク領域を含むポリペプチドまたはそのフラグメントを示す。認識されている免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、エプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはエプシロンとして分類され、これらは順に、それぞれ、免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを定義する。一般的に、抗体の抗原結合領域は、結合の特異性および親和性において非常に重要である。
【００８２】
典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、テトラマーを含む。それぞれのテトラマーは、それぞれの対が１つの「軽」（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤ）を有する２つの同一の対のポリペプチド鎖からなる。それぞれの鎖のＮ−末端は、主に抗原認識を担う約１００から１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）なる用語は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖を示す。
【００８３】
抗体は、例えば、無傷の免疫グロブリンまたは種々のペプチダーゼでの消化により生産される多くの十分に特徴付けられた断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合より下流で抗体を消化し、それ自体、ジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１に結合した軽鎖であるＦａｂのダイマーであるＦ（ａｂ）’２を生産する。Ｆ（ａｂ）’２は、穏やかな条件下で還元されて、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合を破壊し、それにより、Ｆ（ａｂ）’２ダイマーをＦａｂ’モノマーに変換し得る。Ｆａｂ’モノマーは、本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed. 1993）参照）。種々の抗体フラグメントが無傷抗体の消化に関して定義されているが、当業者は、このようなフラグメントが化学的に、または組換えＤＮＡ方法論を使用することによりデノボ合成され得ることを理解している。したがって、本明細書において使用される抗体なる用語は、また、全抗体の修飾により生産された抗体フラグメント、または組換えＤＮＡ方法論を使用してデノボ合成されたもの（例えば、一本鎖Ｆｖ）、またはファージディスプレイライブラリーを使用して同定されたものを含む（例えば、McCaffertyら., Nature 348:552-554 (1990)、参照）。
【００８４】
本発明の適当な抗体の製造および本発明による、例えば、組換え、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用のために、当該分野で知られている多数の技術を使用することができる（例えば、Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozborら., Immunology Today 4: 72 (1983); Coleら., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988);およびGoding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986)、参照）。興味ある抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を細胞からクローニングすることができ、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、組換えモノクローナル抗体を生産するために使用することができる。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーも、ハイブリドーマまたは血漿細胞から作成することができる。重鎖および軽鎖遺伝子産物のランダムな組合せは、異なる抗原特異性を有する抗体の大きなプールを生産する（例えば、Kuby, Immunology (3rd ed. 1997)、参照）。一本鎖抗体または組換え抗体の生産のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第４，８１６，５６７号）を、本発明のポリペプチドに対する抗体を生産するために適応させることができる。また、トランスジェニックマウス、または他の生物、例えば、他の哺乳動物をヒト化またはヒト抗体を発現させるために使用し得る（例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号、Marksら., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonbergら., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwildら., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996);およびLonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)、参照）。あるいは、ファージディスプレイ技術を、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーＦａｂフラグメントを同定するために使用することができる（例えば、McCaffertyら., Nature 348:552-554 (1990); Marksら., Biotechnology 10:779-783 (1992)、参照）。抗体は、また、二重特異性、すなわち、２つの異なる抗原を認識することができるように作成することができる（例えば、ＷＯ９３／０８８２９、Trauneckerら., EMBO J. 10:3655-3659 (1991);およびSureshら., Methods in Enzymology 121:210 (1986)、参照）。抗体は、また、ヘテロ接合体、例えば、共有結合した２つの抗体、または免疫毒素（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；およびＥＰ０３０８９、参照）であることもできる。
【００８５】
非ヒト抗体をヒト化または霊長類化(primatizing)する方法は、当該分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入される１個以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、一般的に輸入(import)可変ドメインから得られる輸入残基と称される。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒらの方法（例えば、Jonesら., Nature 321:522-525 (1986); Riechmannら., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyenら., Science 239:1534-1536 (1988)およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)、参照）にしたがって、齧歯動物ＣＤＲをヒト抗体の対応する配列の代わりに用いることにより行うことができる。したがって、このようなヒト化抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に小さいなものが非ヒト種由来の対応する配列により置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、一般的に、いくつかのＣＤＲ残基および恐らくいくつかのＦＲ残基が齧歯動物抗体の類似部位由来の残基により置換されているヒト抗体である。
【００８６】
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なる、もしくは変化したクラス、エフェクター機能および／もしくは種の定常領域、またはキメラ抗体に新規特性を与える全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬剤などに連結するように、定常領域またはその部分が変化しているか、置換されているか、または交換されている、または（ｂ）可変領域またはその部分が、異なる、もしくは変化した抗原特異性を有する可変領域で変化しているか、置換されているか、もしくは交換されている、抗体分子である。本発明の好ましい抗体および本発明の使用のための好ましい抗体は、ヒト化および／またはキメラモノクローナル抗体を含む。
【００８７】
１つの態様において、抗体は、「エフェクター」部分に接合する。エフェクター部分は、標識部分、例えば、放射性標識または蛍光標識を含む多数の分子であり得るか、または治療部分であり得る。１つの局面において、抗体は、タンパク質の活性を調節する。このようなエフェクター部分は、抗腫瘍剤、毒素、放射性医薬品、サイトカイン、二次抗体または酵素を含むが、これらに限定されない。さらに、本発明は、本発明の抗体がプロドラッグを細胞毒性剤に変換する酵素に連結している態様を提供する。
【００８８】
免疫抱合体を、エフェクター部分をＮ−カドヘリン陽性細胞、特に、Ｎ−カドヘリンまたはＬｙ６タンパク質を発現する細胞に標的化するために使用することができる。このような違いは、試験およびコントロールサンプルでほぼ同様に負荷されたゲルのバンドを見たとき、容易に明らかにできる。細胞毒性剤の例は、リシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノプシド(tenoposide)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラセンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリンおよびグルココルチコイドおよび他の化学療法剤、ならびに放射性同位体を含むが、これらに限定されない。適当な検出可能マーカーは、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素を含むが、これらに限定されない。
【００８９】
いくつかの態様において、本発明は、Ｎ−カドヘリンに対する抗体を提供する。Ｎ−カドヘリン抗体は、癌（例えば、前立腺または膀胱癌）を処置するために、単独で、またはエフェクター部分と接合して全身的に使用され得る。毒物、例えば、リシンと接合させたＮ−カドヘリン抗体、ならびに非接合抗体は、Ｎ−カドヘリン含有前立腺癌細胞に自然に標的化される有用な治療剤であり得る。このような抗体は、浸潤の阻止において有用であり得る。本発明の使用のための適当なＮ−カドヘリン抗体は、ＧＣ４、１Ｈ７、１Ｆ１２、２Ｂ３を含むが、これらに限定されない。
【００９０】
さらに、本発明のモノクローナル抗体のいずれかの抗原結合領域を含む本発明の組換えタンパク質は、癌を処置するために使用することができる。このような条件において、組換えタンパク質の抗原結合領域は、治療活性を有する第２のタンパク質の少なくとも機能的に活性な部分に結合される。第２のタンパク質は、酵素、リンホカイン、オンコスタチンまたは毒素を含むことができるが、これらに限定されない。適当な毒素は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノプシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラセンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、リシン、アブリン、グルココルチコイドおよび放射性同位体を含む。
【００９１】
抗体に治療剤を接合するための技術は、よく知られている（例えば、Arnonら., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldら. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstromら., “Antibodies For Drug Delivery”in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinsonら. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review” in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pincheraら. (eds.), pp. 475-506 (1985);およびThorpeら., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)、参照）。
【００９２】
タンパク質またはペプチドに言及する場合、抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」、または「特異的に（または選択的に）免疫反応性」なるフレーズは、しばしばタンパク質および他の生物学的物質の不均一な集団中で、そのタンパク質の存在を決定する結合反応を示す。したがって、指定された免疫測定法条件下で、特定の抗体は、バックグラウンドの少なくとも２倍、より一般的にバックグラウンドの１０から１００倍以上で特定のタンパク質に結合する。このような条件下での抗体への特異的結合は、特定のタンパク質に対する特異性に関して選択される抗体を必要とする。例えば、ポリクローナル抗体は、選択された抗原と特異的に免疫反応性であり、他のタンパク質と特異的に免疫反応性ではないポリクローナル抗体のみを得るように、選択することができる。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を減ずることにより達成され得る。種々の免疫測定法形式が、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために使用され得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫測定法は、タンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために日常的に使用される（特異的な免疫反応を測定するために使用することができる免疫測定法フォーマットおよび条件の記載に関して、例えば、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)参照）。
【００９３】
本明細書における「治療有効用量または量」は、投与する目的の効果を生じる用量を意味する。正確な用量および処方は、処置の目的に依存し、既知の技術を使用して当業者により確かめることができる（例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor (2003)およびPickar, Dosage Calculations (1999)参照）。
【００９４】
「薬学的に許容される塩」または「薬学的に許容される担体」なる用語は、本明細書に記載されている化合物に見出される特定の置換基に依存して、比較的に非毒性の酸または塩基で製造される活性化合物の塩を含むことを意味する。本発明の化合物が比較的に酸性の官能基を含むとき、塩基付加塩は、溶媒を用いずに、または適当な不活性溶媒中で、このような化合物の中性型を十分な量の所望の塩基と接触させることにより得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノまたはマグネシウム塩または同様の塩を含む。本発明の化合物が比較的に塩基性の官能基を含むとき、酸付加塩は、溶媒を用いずに、または適当な不活性溶媒中で、このような化合物の中性型を十分な量の所望の酸と接触させることにより得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、炭酸一水素酸、リン酸、リン酸一水素酸、リン酸二水素酸、硫酸、硫酸一水素酸、ヨウ化水素酸または亜リン酸などのような無機酸由来の塩、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などのような比較的に非毒性の有機酸由来の塩を含む。アルギネート(arginate)などのようなアミノ酸の塩、ならびにグルクロン酸またはガラクツロン酸(galactunoric acid)などのような有機酸の塩も含む（例えば、Bergeら., Journal of Pharmaceutical Science 66:1-19 (1977)参照）。本発明の特定の化合物は、化合物を塩基または酸付加塩のいずれかに変換することが可能な塩基性および酸性官能基の両方を含む。当業者に知られている他の薬学的に許容される担体は、本発明に適当である。
【００９５】
化合物の中性型は、慣用の方法において、塩を塩基または酸と接触させ、親化合物を単離することにより再生され得る。化合物の親形態は、特定の物理的特性、例えば、極性溶媒中の溶解度において種々の塩形態と異なるが、それ以外は、該塩は、本発明の目的のための化合物の親形態と同等である。
【００９６】
塩形態に加えて、本発明は、プロドラッグ形態である化合物を提供する。本明細書に記載されている化合物のプロドラッグは、生理学的条件下で容易に化学変化して、本発明の化合物を提供する化合物である。さらに、プロドラッグは、エキソビボ環境下で化学的または生化学的方法により本発明の化合物に変換され得る。例えば、プロドラッグは、適当な酵素または化学試薬と共に経皮的パッチリザーバー中に置かれたとき、本発明の化合物にゆっくり変換され得る。
【００９７】
本発明の特定の化合物は、非溶媒和物形態ならびに水和物形態を含む溶媒和物形態で存在することができる。一般的に、溶媒和物形態は、非溶媒和物形態と同等であり、本発明の範囲内に包含されることを意図される。本発明の特定の化合物は、多結晶または非結晶形態で存在し得る。一般的に、全ての物理的形態は、本発明により考えられる使用のための同等であり、本発明の範囲内であると意図される。
【００９８】
本発明の特定の化合物は、不斉炭素原子（光学中心）または二重結合を有する。ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体および個々の異性体は、全て、本発明の範囲内に包含されることを意図される。
【００９９】
上皮間葉転換（ＥＭＴ）は、上皮性腫瘍細胞による間質特性の獲得を示す。癌において、ＥＭＴは、浸潤性および運動性行動と関連し、転移の基礎を成す中心プロセスであり得る。ＥＭＴは、予後不良と関連し、多重転写因子、例えば、ＳＮＡＩＬ、ＳＬＵＧおよびＴＷＩＳＴが介在する。
Ｅ−カドヘリンは、浸潤性および転移性固形腫瘍において一般的に喪失している上皮性細胞間接着と関連する細胞表面タンパク質である。
【０１００】
詳細な態様
本発明は、癌患者を処置する方法を提供する。該方法は、一般的に、（ａ）Ｎ−カドヘリンタンパク質を発現する癌を有する危険性がある個体由来の試験組織サンプルを得て、（ｂ）癌に対して陰性であることが知られている個体由来のコントロール組織サンプルと比較して、試験組織サンプルにおけるＮ−カドヘリンタンパク質の存在もしくは非存在または量を測定し、それにより、Ｎ−カドヘリンタンパク質を発現する該癌を診断し、ここで、Ｎ−カドヘリンタンパク質は正常または低レベルで発現するか、または一部の細胞により発現し、過剰発現しない、および（ｃ）有効量のＮ−カドヘリン抗体をＮ−カドヘリンタンパク質を発現する癌を有する危険性がある個体に投与する工程を含む。一般的に、組織サンプルは血清であるが、生検由来の組織、特に前立腺組織または膀胱組織を含む泌尿生殖器組織でもあり得る。通常、該抗体はモノクローナル抗体である。癌を有さないことが知られている個体由来のコントロール組織サンプルと比較して、より高いレベル、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、４倍またはそれ以上のＮ−カドヘリンタンパク質が試験組織サンプル中で検出されるとき、Ｎ−カドヘリンタンパク質またはｍＲＮＡ転写産物を発現する癌に対する陽性診断が示される。検出方法は、例えば、当該分野で知られている標準ＥＬＩＳＡ技術（Gosling, Immunoassays: A Practical Approach, 2000, Oxford University Pressに概説される）を使用して実施することができる。検出は、一次抗体または二次抗体を、例えば、放射性同位体、蛍光標識、酵素または当該分野で知られている他のあらゆる検出可能な標識で標識化することにより達成される。
【０１０１】
他の態様において、検出方法は、Ｎ−カドヘリンタンパク質またはｍＲＮＡ転写産物を発現する患者由来の試験組織サンプルを、Ｎ−カドヘリン核酸にそれぞれ特異的にハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドのプライマーセットと接触させ、サンプルにおけるＮ−カドヘリン核酸を増幅させ、Ｎ−カドヘリンタンパク質またはｍＲＮＡ転写産物を発現する癌に対して陰性であることが知られている個体由来のコントロール組織サンプルと比較して、試験組織サンプルにおけるＮ−カドヘリン核酸の存在または非存在を決定することにより行うことができる。また、通常、組織サンプルは血清であるが、生検由来の組織、特に前立腺または膀胱組織を含む泌尿生殖器組織でもあり得る。癌を有さないことが知られている個体由来のコントロール組織サンプルと比較して、より高いレベルのＮ−カドヘリン転写ＲＮＡが試験組織サンプル中で検出されるとき、Ｎ−カドヘリンタンパク質またはｍＲＮＡ転写産物を発現する癌に対する陽性診断が示される。
【０１０２】
該方法は、前立腺および膀胱癌の処置における特定の適用を見出す。１つの態様において、該方法は、ホルモン抵抗性または治療耐性癌に適用される。特定の態様において、該方法は、転移性癌に適用される。例えば、Ｎ−カドヘリンタンパク質および／またはｍＲＮＡの差次的発現の比較を、Ｎ−カドヘリンタンパク質またはｍＲＮＡ転写産物を発現する癌を有する個体の癌の段階を決定するために使用することができる。
【０１０３】
処置は、一般的に、許容される投与経路、例えば、静脈内注射（ＩＶ）を介する抗Ｎ−カドヘリン抗体の有効用量での反復投与を含む。用量は、癌の型、および癌の重症度、グレードまたは段階、使用される薬剤の結合親和性および半減期、患者におけるＮ−カドヘリン発現の程度、循環性シェッド(shed)Ｎ−カドヘリン抗原の程度、所望の定常状態の抗体濃度レベル、処置の頻度ならびに本発明の処置方法と組み合わせて使用される化学療法剤の影響を含むが、これらに限定されない当業者により一般的に理解されている種々の因子に依存する。典型的な１日用量は、約０．１から１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。１週あたり１０−５００ｍｇの範囲のｍＡｂの用量が有効であり、耐容性良好であり得るが、より高い１週用量でさえ有効であり、および／または耐容性良好であり得る。適当な用量の定義における主な決定因子は、特定の情況において治療的に有効であるために必要な特定の薬剤の量である。反復投与が、腫瘍阻害または退縮を達成するために必要であり得る。最初の負荷用量がより高くてもよい。最初の負荷用量は注入として投与され得る。周期的な維持用量が同様に投与されてよく、但し、最初の用量は耐容性良好である。
【０１０４】
薬剤の直接投与も可能であり、特定の情況において利点を有し得る。例えば、膀胱癌腫の処置のために、薬剤は膀胱に直接注射され得る。膀胱に直接投与された薬剤は迅速に患者から排出されるため、抗原性の重大な合併症を伴うことなく、有効に非ヒトまたはキメラ抗体を使用することが可能であり得る。
【０１０５】
いくつかの態様において、本発明は、癌細胞の増殖を阻害するために有効な量で、Ｎ−カドヘリンタンパク質を認識し、結合する抗体またはそのフラグメントで対象を処置するか、または癌細胞と該抗体またはそのフラグメントとを接触させることにより、癌、特にＮ−カドヘリンを発現する癌を処置するか、またはＮ−カドヘリンタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害する方法を提供する。いくつかの態様において、癌細胞は、前立腺癌細胞または膀胱癌細胞である。接触する抗体は、モノクローナル抗体および／またはキメラ抗体であり得る。いくつかの態様において、キメラ抗体は、ヒト免疫グロブリン定常領域を含む。いくつかの態様において、抗体は、ヒト抗体であるか、またはヒト免疫グロブリン定常領域を含む。さらなる態様において、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、またはＦｖを含む。他の態様において、フラグメントは、抗原結合領域を有する組換えタンパク質を含む。
【０１０６】
上記態様のいずれかにおいて、化学療法剤および／または放射線療法をさらに施すことができる。いくつかの態様において、患者は、また、ホルモンアンタゴニスト治療を受ける。抗体または抗体フラグメントと患者の接触は、患者の静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、腫瘍内に、または皮内に抗体を投与することにより可能である。いくつかの態様において、患者は、泌尿生殖器癌（例えば、膀胱癌、前立腺癌）を有する。上記のいくつかの態様において、患者は、前立腺癌に罹患しており、所望によりさらにホルモン除去治療を受ける。いくつかの態様において、接触は、癌または転移癌に直接、抗体を投与することを含む。
【０１０７】
いくつかの態様において、本発明は、癌患者を処置する方法を提供する。該方法は、一般的に、（ａ）Ｎ−カドヘリンタンパク質を発現する癌を有する危険性がある個体由来の試験組織サンプルを得て；（ｂ）癌に対して陰性であることが知られている個体由来のコントロール組織サンプルと比較して、試験組織サンプルにおけるＮ−カドヘリンタンパク質の存在もしくは非存在または量を測定し；それにより、Ｎ−カドヘリンタンパク質を発現する癌を診断し、ここで、Ｎ−カドヘリンタンパク質は正常または低レベルで発現するか、または一部の細胞により発現し、過剰発現しない；（ｃ）癌が浸潤性、転移性、ホルモン非依存性または処置難治性になる可能性があるか否かを決定し；（ｄ）癌が浸潤性、転移性、ホルモン非依存性または処置難治性になる可能性が高いか否かにしたがって、化学療法剤、免疫療法剤、ホルモン治療または放射線治療を施すことを含む。
【０１０８】
いくつかの態様において、化学療法剤は、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノプシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラセンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アルブリン(arbrin)Ａ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サルシン、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レトストリクトシン(retstrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン、キュリシン(curicin)、クロチン、カリケアマイシン、サポナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)阻害剤、マイタンシノイドおよびグルココルチコイド(glucocorticoidricin)からなる群から選択することができる。
【０１０９】
本発明は、さらに、癌幹細胞を同定する方法を提供する。該方法は、一般的に、（ａ）Ｎ−カドヘリンタンパク質を発現する癌を有する危険性がある個体由来の試験組織サンプルを得て；（ｂ）癌に対して陰性であることが知られている個体由来のコントロール組織サンプルと比較して、試験組織サンプルにおける癌幹細胞の存在または非存在を決定し；ここで、Ｎ−カドヘリンタンパク質は正常または低レベルで発現するか、または幹細胞の一部により発現し、過剰発現しないことを含む。
【０１１０】
いくつかの態様において、本発明は、以下のアミノ酸配列を含む、Ｎ−カドヘリンの細胞外ドメイン４に結合することができるモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む。
配列番号：１：ＭＡＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＡＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＨＡＭＩＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＤＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＴＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＡＴＧＹＳＹＹＹＧＭＤＶＷＧＰＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＴＴＬＱＨＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＩＹＦＣＱＱＡＨＳＦＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ
【０１１１】
いくつかの態様において、本発明は、以下の群から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｎ−カドヘリンの細胞外ドメイン１−３に結合することができるモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む。
配列番号２：ＭＡＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＱＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＦＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＡＳＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＲＳＬＲ
配列番号３：ＭＡＱＶＱＬＱＥＳＧＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＰＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＹＮＧＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ
配列番号４：ＭＡＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＦＳＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＲＶＫＳＹＡＤＡＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＥＮＩＬＹＶＱＩＤＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＧＤＨＡＡＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＴＧＧＲＳＤＩＧＧＹＮＹＶＳＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹＤＶＧＮＲＰＳＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴ
配列番号５：ＭＡＰＧＡＡＧＧＶＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＸＶＹＹＣＡＲＬＥＹＳＳＳＳＲＡＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＧＫＮＮＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＮＳＲＤＳＳＧＮＨＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ
配列番号６：ＭＡＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦ
配列番号７：ＭＡＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＲＰＧＡＳＶＲＩＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＴＹＰＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＮＰＮＳＧＡＴＫＮＶＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＡＤＴＳＩＲＴＡＹＭＥＬＳＲＬＴＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＥＧＤＴＧＳＹＬＧＧＹＷＧＬＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳＷＹＱＱＫＰＧＲＡＰＬＬＶＩＹＧＫＮＩＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＳＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＮＳＲＤＲＳＧＮＹＬＦＧＶＧＴＫＶＴＶＬＧ
配列番号８：ＭＡＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＥＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＡＮＮＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＳＩＹＰＧＤＳＤＶＲＹＳＲＳＦＱＧＨＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＨＲＶＡＹＳＧＹＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＶＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣＱＧＤＳＬＲＳＹＹＰＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＧＫＮＮＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＨＳＲＤＲＳＧＮＱＶＬＦＧＧＧＴＫＶＴＶＬＧ
配列番号９：ＭＡＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＧＧＥＧＧＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳ
いくつかの態様において、本発明は、ｓｃＦｖである、Ｎ−カドヘリンの細胞外ドメイン１−３またはＮ−カドヘリンの細胞外ドメイン４に結合することができる抗体フラグメントを提供する。いくつかの態様において、本発明は、ダイアボディである、Ｎ−カドヘリンの細胞外ドメイン１−３またはＮ−カドヘリンの細胞外ドメイン４に結合することができる抗体フラグメントを提供する。ダイアボディを生産するために、リンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳをＳＧＧＧＧＳと置き換えた。
【０１１２】
投与方法および製剤
抗Ｎ−カドヘリン抗体または免疫抱合体は、既知の方法、例えば、静脈内投与にしたがって、例えば、ボーラスとして、または一定期間にわたる連続的な注入により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所的または吸入経路により、ヒト患者に投与される。該抗体の静脈内または皮下投与が好ましい。該投与は、局所的または全身的であってよい。
【０１１３】
投与のための組成物は、一般的に、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解された、本明細書に記載されている物質（例えば、Ｎ−カドヘリン阻害剤、Ｎ−カドヘリン抗体および免疫抱合体、Ｎ−カドヘリンｓｉＲＮＡおよびそのベクター）を含む。種々の水性担体、例えば、緩衝食塩水などを使用することができる。これらの溶液は、滅菌され、一般的に望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、慣用のよく知られている滅菌技術により滅菌され得る。該組成物は、適当な生理学的条件に必要な薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節剤および緩衝剤、毒性調節剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含み得る。これらの製剤における活性剤の濃度は、広範に変化することができ、選択される特定の投与経路および患者の必要性にしたがって、主に液量、粘性、体重などに基づいて選択される。
【０１１４】
したがって、静脈内投与のための典型的な医薬組成物は、該物質にしたがって変化し得る。非経口的に投与することができる組成物を製造するための実際の方法は、当業者に知られ明らかであり、より詳細にはRemington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980)のような文献に記載されている。
【０１１５】
医薬組成物は、投与の方法に依存して種々の単位投与形態において投与することができる。例えば、経口投与に適当な単位投与形態は、粉末、錠剤、丸剤、カプセルおよびトローチ剤を含むが、これらに限定されない。経口的に投与されるとき、抗体は消化から保護されるべきであることが理解される。これは、一般的に、該分子を、酸および酵素加水分解に対する耐性を与える組成物と複合体化することによるか、または適当な耐性担体、例えば、リポソームまたは防護壁中に該分子をパッケージングすることによるかのいずれかで達成される。消化から薬剤を保護する方法は、よく当該分野で知られている。
【０１１６】
特に、本発明で使用するための抗体および免疫抱合体および阻害剤の医薬製剤は、所望の純度を有する抗体を任意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより製造することができる。このような製剤は、凍結乾燥製剤または水性溶液であり得る。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される用量および濃度でレシピエントに非毒性である。許容される担体、賦形剤または安定剤は、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸塩、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、防腐剤、低分子量ポリペプチド、タンパク質、例えば、血清アルブミンまたはゼラチン、または親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、およびアミノ酸、単糖類、二糖類および他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン、キレート剤、および、イオンおよび非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）、および／または非イオン界面活性剤であり得る。該抗体は、０．５−２００ｍｇ／ｍｌ、または１０−５０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化され得る。
【０１１７】
該製剤は、また、化学療法剤、細胞毒性剤、サイトカイン、増殖阻害剤および抗ホルモン剤を含むさらなる活性化合物を提供し得る。該活性成分は、また、持続放出製剤（例えば、固体疎水性ポリマー（例えば、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチドの半透過性マトリックスとして製造され得る。該抗体および免疫抱合体は、また、例えば、コアセルベーション技術または界面重合化により製造されるマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル各々により、コロイド薬剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンに包含され得る。
【０１１８】
組成物は、治療または予防処置のために投与することができる。治療適用において、組成物を、疾患（例えば、癌）に罹患している患者に「治療有効用量」で投与する。この使用のための有効量は、疾患の重症度および患者の全身健康状態に依存する。組成物の単回または複数回投与は、患者が必要とし、耐えられる用量および頻度に依存して投与され得る。本発明の目的のための「患者」または「対象」は、ヒトおよび他の動物、特に哺乳動物の両方を含む。したがって、該方法は、ヒト治療および獣医適用の両方に適用することができる。好ましい態様において、患者は哺乳動物、好ましくは霊長類であり、最も好ましい態様において、患者はヒトである。他の既知の癌治療を、本発明の方法と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の使用のための組成物は、また、他の癌治療剤、例えば、５ＦＵ、ビンブラスチン、アクチノマイシンＤ、シスプラチン、メトトレキサートなどに対して細胞を標的化または増感するために使用され得る。
【０１１９】
他の態様において、本発明の方法は、他の癌治療（例えば、前立腺全摘出術）、放射線療法（体外照射または近接照射療法）、ホルモン治療（例えば、睾丸摘出、テストステロン生産を抑制するためのＬＨＲＨ−類似体治療、抗−アンドロゲン治療）または化学療法と共に使用される。前立腺全摘出術は、前立腺全体およびいくつかの周辺組織の除去を含む。この処置は、癌が該組織以外に広がっていないと考えられるときに一般的に使用される。放射線療法は、一般的に、未だ前立腺に限定されるか、または近くの組織に広がっている前立腺癌を処置するために使用される。疾患がさらに進行しているとき、放射線が腫瘍のサイズを減少させるために使用され得る。ホルモン治療は、しばしば、前立腺癌が前立腺以外に広がっているか、または再発している患者のために使用される。ホルモン治療の目的は、男性ホルモン、アンドロゲンの量を低くするためであり、それにより、前立腺癌を縮小させるか、または増殖をより遅くする。黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニストは、テストステロンの生産を減少させる。これらの薬剤は、１月以上に１回注射され得る。かかる２つの類似体は、ロイプロリドおよびゴセレリンである。抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ビカルタミドおよびニルタミド）もまた、使用され得る。全アンドロゲン遮断は、睾丸摘出またはＬＨＲＨ類似体と組み合わせた抗アンドロゲンの使用を示し、ｓ組合せと呼ばれる。化学療法は、前立腺癌が前立腺の外側に広がっている患者およびホルモン治療が不成功であった患者のための選択肢である。全ての癌細胞を破壊することは予期されないが、腫瘍増殖を遅延させ、疼痛を減少させ得る。ホルモン治療での処置後に再発するか、または増殖し広がり続ける前立腺癌の処置において使用されるいくつかの化学療法剤は、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エストラムスチン、エトポシド、ミトキサントロン、ビンブラスチンおよびパクリタキセルを含む。２またはそれ以上の薬剤は、しばしば、癌細胞が化学療法に対して耐性になる可能性を減少させるために併用投与される。小細胞癌腫は、ホルモン治療よりも化学療法により応答しやすい前立腺癌の珍しい型である。
【０１２０】
いくつかの態様において、「心臓保護剤」も、また、本発明の使用のために、Ｎ−カドヘリン抗体、Ｎ−カドヘリン結合阻害剤またはＮ−カドヘリンｓｉＲＮＡ分子と共に投与される（米国特許第６，９４９，２４５号参照）。心臓保護剤は、患者への薬物、例えば、アントラサイクリン抗生物質の投与と関連する心筋機能障害（すなわち、心筋症および／または鬱血性心不全）を予防するか、または減少させる化合物または組成物である。心臓保護剤は、例えば、フリーラジカル介在心臓毒性作用を阻止するか、または減少させ得る、および／または酸化ストレス傷害を防止するか、または減少させ得る。本定義により包含される心臓保護剤の例は、鉄キレート剤、デクスラゾキサン（ＩＣＲＦ−１８７）（Seifertら. The Annals of Pharmacotherapy 28:1063-1072 (1994)）；脂肪低下剤および／または抗酸化剤、例えば、プロブコール（Singalら. J. Mol. Cell Cardiol. 27:1055-1063 (1995)）；ＷＲ−２７２１とも呼ばれるアミホスチン（アミノチオール２−［（３−アミノプロピル）アミノ］エタンチオール二水素ホスフェートエステル、およびＷＲ−１０６５と呼ばれるその脱リン酸化細胞摂取形態）およびＳ−３−（３−メチルアミノプロピルアミノ）プロピルホスホロ−チオ酸（ＷＲ−１５１３２７）、Greenら. Cancer Research 54:738-741 (1994)、参照；ジゴキシン（Bristow, M. R. In: Bristow M R, ed. Drug-Induced Heart Disease. New York: Elsevier 191-215 (1980)）；ベータ遮断薬、例えば、メトプロロール（Hjalmarsonら. Drugs 47:Suppl 4:31-9 (1994);およびShaddyら. Am. Heart J. 129:197-9 (1995)）；ビタミンＥ；アスコルビン酸（ビタミンＣ）；フリーラジカルスカベンジャー、例えば、オレアノール酸、ウルソル酸およびＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）；スピントラップ化合物、例えば、アルファ−フェニル−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（ＰＢＮ）；（Paracchiniら., Anticancer Res. 13:1607-1612 (1993)）；有機セレン化合物、例えば、Ｐ２５１（Ｅｌｂｅｓｅｎ）などを含む。
【０１２１】
組合せ投与は、別々の製剤または単一の医薬製剤を使用する共投与、および、いずれかの順序での連続投与（好ましくは両方の（または全ての）活性剤が同時にそれらの生物学的活性を発揮する間に一定の期間がある）を意図する。
【０１２２】
Ｎ−カドヘリンタンパク質の発現および／または機能を間接的または直接的に調節する同定された分子および化合物は、Ｎ−カドヘリンを発現するそれぞれの癌の処置に有用であり得る。Ｎ−カドヘリンタンパク質調節剤は、単独で投与され得るか、または慣用の化学療法、放射線治療または免疫療法ならびに現在開発されている治療と組み合わせて共投与され得る。
【０１２３】
経口投与に適当な製剤は、（ａ）液体溶液、例えば、希釈剤、例えば、水、塩水またはＰＥＧ４００中に懸濁された、有効量のパッケージされた核酸；（ｂ）液体、固体、顆粒またはゼラチンとして所定の量の活性成分をそれぞれ含むカプセル、サシェ(sachet)または錠剤；（ｃ）適当な液体中の懸濁液；および（ｄ）適当なエマルジョンからなることができる。錠剤形態は、１つ以上のラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸および他の賦形剤、着色剤、増量剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、香味剤、着色剤、崩壊剤および薬学的に適合性の担体を含むことができる。トローチ(lozenge)剤形態は香味剤、例えば、スクロース中に活性成分を含むことができ、ならびに、トローチ(pastille)は不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアエマルジョン中に活性成分を含むことができ、ゲルなどは、活性成分に加えて、当該分野で知られている担体を含むことができる。
【０１２４】
最適な化合物は、単独または他の適当な成分と組み合わせて、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤（すなわち、それらは「噴霧する」ことができる）に作ることができる。エアロゾル製剤は、加圧された許容される高圧ガス、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの中に置くことができる。
【０１２５】
経直腸投与のための適当な製剤は、例えば、坐薬基剤でパッケージされた核酸からなる坐薬を含む。適当な坐薬基剤は、天然または合成トリグリセリドまたはパラフィン炭化水素を含む。加えて、最適な化合物と基剤、例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコールおよびパラフィン炭化水素の組合せからなるゼラチン経直腸カプセルを使用することも可能である。
【０１２６】
例えば、関節内（関節中）、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹腔内および皮下経路による、非経口投与に適当な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および意図されるレシピエントの血液で製剤を等張にする溶質を含むことができる水性および非水性等張滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および防腐剤を含むことができる水性および非水性滅菌懸濁液を含む。本発明の実施において、組成物は、例えば、静脈内注入により、経口的に、局所的に、腹腔内に、膀胱内にまたは髄腔内に投与することができる。非経口投与、経口投与および静脈内投与は、好ましい投与方法である。化合物の製剤は、密閉された容器、例えば、アンプルおよびバイアルで、単回用量または複数回用量で存在させることができる。
【０１２７】
注射溶液および懸濁液は、以前によく記載されている滅菌粉末、顆粒および錠剤から製造することができる。エキソビボ治療のために核酸により形質導入された細胞を、また、上記のとおりに静脈内に、または非経口的に投与することができる。
【０１２８】
医薬製剤は、好ましくは単位投与形態である。このような形態において、製剤は、適当な量の活性成分を含む単位用量にさらに分割される。単位投与形態は、パッケージされた製剤であり得、該パッケージは、分離量の製剤、例えば、パック入り錠剤、カプセルおよびバイアルまたはアンプル中の粉末を含む。また、単位投与形態は、それ自体、カプセル、錠剤、カシェ剤またはトローチ剤であってよく、または、それはパッケージされた形態における適当な数の任意のこれらのものであってよい。組成物は、また、所望の場合、他の適合性治療剤を含むことができる。
【０１２９】
好ましい医薬製剤は、持続放出製剤中で、所望により１つ以上の化学療法剤および免疫療法剤と組み合わせて、１つ以上の活性なＮ−カドヘリンタンパク質調節剤を送達する。一般的に、Ｎ−カドヘリン調節剤は、化学療法、放射線療法、免疫療法およびホルモン治療を含む他の細胞毒性癌治療に対する腫瘍細胞の感受性を増加させる増感剤として治療的に投与される。
【０１３０】
癌の処置のための治療的使用において、本発明の医薬的方法に利用されるＮ−カドヘリン調節剤または阻害剤は、１日に約０．００１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇの初期用量で投与される。約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの１日用量範囲を使用することができる。しかしながら、該用量は、患者の必要性、処置される状態の重症度、および使用される化合物に依存して変化し得る。例えば、用量は、特定の患者において診断される癌の型および段階を考慮して、経験的に決定することができる。患者に投与される用量は、本発明の文脈において、時間をかけて患者において有益な治療応答をもたらすために十分であるべきである。用量サイズは、また、経験、性質および特定の患者における特定のベクターまたは形質導入細胞型の投与に付随するあらゆる副作用の程度により決定される。特定の状態に対する適当な用量の決定は、医師の範囲内である。一般的に、処置は、化合物の最適な用量よりも少ない用量で開始される。その後、用量は、状況下で最適な効果に達するまで、少しずつ増加される。便宜上、全１日用量は、所望により、１日中で部分的に分割し、投与してもよい。
【０１３１】
本発明の使用のための医薬製剤（例えば、Ｎ−カドヘリンｓｉＲＮＡ、Ｎ−カドヘリン抗体、Ｎ−カドヘリンワクチン、Ｎ−カドヘリン阻害剤および免疫抱合体）は、一般的に、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物に送達される。本方法を使用して処置される非ヒト哺乳動物は、飼育化した動物（すなわち、イヌ、ネコ、マウス、齧歯動物およびウサギ）および農業用動物（ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ）を含む。
【実施例】
【０１３２】
実施例
以下の実施例は、説明のために提供するが、本発明を限定しない。
【０１３３】
実施例１：ヒトＮ−カドヘリンに特異的なヒトＳｃＦｖの単離および特性化
原料および方法
Ｎ−カドヘリン組換えタンパク質発現および細胞系
２つの非依存性Ｎ−カドヘリン組換えタンパク質、Ｎ−カドヘリン細胞外ドメイン１から３（ＥＣＤ１−３）およびＮ−カドヘリンの第４のドメイン（ＥＣＤ４）を生産した（Ｚ  Ｗａｉｎｂｅｒｇ）。ｃＤＮＡ配列を、ｍＲＮＡ製造物からＲＴ−ＰＣＲを使用してクローニングした。ＥＣＤ１−３に対する核酸１６０から４９７および核酸４８９から６０３を細菌発現系中、６ヒスチジンタグを有するフレーム内に、およびベクター中、ＧＳＴタグを有するフレーム中にクローニングした。発現を数時間で誘導し、誘導後、ペリプラズム画分を単離し、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーを使用して組換えタンパク質を精製した。タンパク質を、サイズおよび純度に関してＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＬＮＣａｐ  Ｎ−カドヘリントランスフェクト細胞を生産した。完全Ｎ−カドヘリンｃＤＮＡをベクターにクローニングし、感染によりＬＮＣａｐにトランスフェクトした。ＰＣ３細胞およびＤＵ１４５の２つの前立腺細胞系を使用して、単離された抗−Ｎ−カドヘリン抗体フラグメントを特徴付けた。
【０１３４】
ファージライブラリーパニング
本発明者らは、以前に記載されている（Sheets M.D. PNAS 1998）とおりのＪＤ  Ｍａｒｋｓ研究室において生産された８．２×１０８メンバーを含む、ヒト一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を示す非免疫ファージライブラリーをパニングした。ファージを、Ｎ−カドヘリン組換えタンパク質に対してアフィニティー選択した。ＥＣＤ１−３およびＥＣＤ４を２つの免疫チューブ（Ｎｕｎｃ）上に別々に吸着させた。次に、免疫チューブをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の４％のミルクで室温で２時間ブロックし、次に、ＰＢＳで３回洗浄した。１ｍｌのアリコートのファージ−ディスプレイされるｓｃＦｖライブラリー（８．１０１１ｐｆｕ）を１ｍｌの８％のＭＰＢＳと混合し、抗原被覆免疫チューブに加えた。免疫チューブを室温で１時間インキュベートした。次に免疫チューブをＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で１回およびＰＢＳで３回洗浄した。ファージを、１ｍｌの１００ｍＭのトリエチルアミンで５分間溶離し、０．５ｍｌの１ＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌ  ｐＨ７．４で中和した。溶離したファージの半分をそれぞれのラウンドのために凍結し、もう半分をＴＧ１細胞に感染させるために使用した。ファージ増幅および精製を、以前に記載されている（Sheets M.D. PNAS 1998）とおりに行った。選択は、第１のラウンドと同様のさらに３回のラウンドのパニングを含む。２ｍｌの４０μｌ／ｍｌを、ラウンド１および２のために免疫チューブを被覆するために使用し、２０μｌ／ｍｌを、ラウンド３および４のために免疫チューブを被覆するために使用した。洗浄の回数を、ラウンド２、３および４において漸進的に増加させた。パニングのラウンド１、２、３由来のポリクローナルファージ抗体および第４ラウンド由来の個々の９５クローンを、以前に記載されている（文献Marks JD J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97）とおりにＥＬＩＳＡにより評価した。
【０１３５】
個々のクローンのＥＬＩＳＡスクリーニング
９５個の個々のファージクローンのそれらの標的への結合を、ＥＬＩＳＡ(Marks JD J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97) (Poul M, ら. JMB Volume 301, Issue 5, Pages 1149-1161)により評価した。選択のために使用される標的を使用して、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを被覆した。独特なｓｃＦｖの数を、制限酵素ＢｓｔＮＩでｓｃＦｖ遺伝子をフィンガープリントすることにより決定し、ＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【０１３６】
ダイアボディへのｓｃＦｖの再構築
ＳｃＦｖ挿入物を、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限酵素を使用してｐＨＥＮ１から切り出し、同じ制限酵素部位を使用してｐＳｙｎベクターにクローニングした。ｓｃＦｖをダイアボディに再構築するために、１５から５ａ．ａのリンカーを、スプライス重複伸長ＰＣＲ（ＳＯＥ−ＰＣＲ）（Yazaki PJ , ら. PEDS 2004 May;17(5):481-9）に使用した。ＳＯＥ−ＰＣＲ生成物をＴＯＰＯベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＰＣＲにより変異が生産されていないことを証明するためにシーケンシングした。最後に、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限酵素認識部位を使用して、ダイアボディ構築物をｐＳｙｎ１ベクターにクローニングした。
【０１３７】
ｓｃＦｖおよびダイアボディの発現および精製
ｐＳｙｎ１にクローニングされたＳｃＦｖおよびダイアボディを、タンパク質発現のために、ＴＧ１細菌にトランスフェクトした。細菌を０．５  Ｏ．Ｄ６００ｎｍの密度まで増殖させ、１ｍＭのＩＰＴＧで発現を誘導した。誘導の４時間後、細菌を遠沈させ、ペリプラズム画分を生成した。６ＨＩＳタグタンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラム上で精製した。溶離したタンパク質をＰＢＳ濃縮液およびフィルターに対して透析した。
【０１３８】
生化学的特性化
精製されたタンパク質を非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。天然構造サイズをサイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により測定した。
【０１３９】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーを、細胞Ｎ−カドヘリンへのファージ抗体クローンおよびダイアボディの結合を評価するために行った。ファージ抗体染色のために、２０倍に濃縮した上清を使用した。ファージをヘルパーファージでレスキューしたとき、個々のクローンを２０ｍｌの２ＴＹ中で０．５  Ｏ．Ｄ６００ｎｍの密度まで増殖させた。一晩培養後、モノクローナルファージをＰＥＧ／ＮａＣｌでの沈降により上清から回収し、１ｍｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡに再懸濁した。フローサイトメトリー染色のために、５×１０５細胞を１時間、氷上で１００μｌの２０×ＰＥＧ濃縮ファージ抗体クローンと共にインキュベートした。細胞をフローバッファー（ＰＢＳ  １％ＦＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のアジ化ナトリウム）で洗浄し、ファージ抗体クローンをモノクローナル抗−Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出した。細胞を洗浄し、Ｒ−ＰＥ接合抗−マウス抗体で染色した。ダイアボディ染色のために、５×１０５細胞を１時間、氷上でフローバッファー中２μｇ／ｍｌの濃度でダイアボディと共にインキュベートした。細胞を洗浄し、ダイアボディをフローバッファー中の１／１００  抗−ｃ−Ｍｙｃ−ビオチン抗体で検出した。最後に、細胞を洗浄し、フローバッファー中の１／４０  ストレプトアビジン−Ｒ−ＰＥ（ＳＩＧＭＡ）で染色した。
【０１４０】
インビボ試験
Ｄ４Ｄｂのタンパク質を１２４Ｉで標識化し、ＬＡＰＣ９  ＡＩ腫瘍を有するＳＣＩＤマウスおよびＰＣ３腫瘍を有するヌードマウスの尾静脈に注射した。ＭｉｃｒｏＰＥＴ画像を、注射の４および２０時間後に行った。生体内分布を注射の２０時間後に行った。
【０１４１】
パニング
８．２×１０８メンバーを含むヒト一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）を示す同じ非免疫ファージライブラリーを、独立してＥＣＤ１−３−６ＨｉｓまたはＥＣＤ４−６ＨＩＳ組換えタンパク質に対してパニングした。インプット、アウトプット、回収および濃縮を含むパニング結果を表１に示す。ＥＣＤ１−３に対するパニングは、ラウンド２から始まる早期の濃縮をもたらしたが、濃縮は、ＥＣＤ４に対する最後のパニングラウンドでのものよりも優れたものになっただけである。これらの結果は、ＥＣＤ１−３では第２のパニングラウンドでシグナルが現れたが、ＥＣＤ４では第３のパニングラウンドサンプルのみがシグナルを示したポリクローナルＥＬＩＳＡと一致する。
【０１４２】
図１において示されるとおり、パニングラウンド１、２および３由来のポリクローナルファージ抗体をＥＬＩＳＡにより分析した。パニングラウンドのために使用される標的を、ＥＬＩＳＡプレートを被覆するために使用した。ファージ抗体の結合をＨＲＰ接合抗Ｍ１３抗体で検出した。
表１
【表１】
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【０１４３】
スクリーニング
９５個のクローンを、ＥＣＤ１−３およびＥＣＤ４に関する選択の第４ラウンドから単離し、ＥＬＩＳＡにより試験した。９５個のクローンを、ＥＣＤ１−３−６ＨＩＳに関する選択の第４ラウンドから単離し、ＥＣＤ１−３−６ＨＩＳおよびＥＣＤ１−３−ＧＳＴに対してスクリーニングした。ＥＣＤ１−３  ６ＨＩＳで試験したとき、９５個のクローンのうち９３個は陽性であった。ＥＣＤ１−３  ６ＨＩＳに対して陽性のクローンのうち２２個は、ＥＣＤ１−３−ＧＳＴに対しても陽性であった。ＥＣＤ１−３  ６ＨＩＳおよびＥＣＤ１−３−ＧＳＴの両方に対して陽性の２２個のクローンをフィンガープリントし、独特なクローンを単離した。７個のクローンは、Ａ７、Ｃ７、Ｃ１２、Ｄ１０、Ｅ４、Ｅ１０およびＧ２の１つのコピーのみを有した。Ｂ１２は、１つの他のコピーを有した。Ｄ４は３つの他のコピーを有し、Ａ８は８つの他のコピーを有した。Ａ８  ＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ挿入物は、アガロースゲル上で分析されたとき、他のクローンよりも短かった。ＥＣＤ４−６ＨＩＳに関する選択の第４のラウンドから単離された９５個のクローンを、ＥＣＤ４−６ＨＩＳおよびＥＣＤ１−３  ６ＨＩＳに対してスクリーニングした。試験された全９５個のクローンは、ＥＣＤ４−６ＨＩＳで試験されたとき陽性であり、ＥＣＤ１−３  ６ＨＩＳで試験されたとき陰性であった。本発明者らは、ＥＬＩＳＡにおいてより強いシグナルを与えた８個の陽性クローンを選択し、それらをフィンガープリントした。これら８個のクローンは、同じフィンガープリントを有した。これらのクローンのうちの１つであるＡ１をＡ１４と改名した。
【０１４４】
要約すると、本発明者らは、Ｎ−カドヘリンＥＣＤ１−３組換えタンパク質を結合する１０個の個々のファージクローン（Ａ７、Ａ８、Ｂ１２、Ｃ７、Ｃ１２、Ｄ４、Ｄ１０、Ｅ４、Ｅ１０、Ｇ２）およびＮ−カドヘリンＥＣＤ４組換えタンパク質を結合する１個のファージクローン（Ａ１４）を選択した。
【０１４５】
ファージクローンの細胞表面Ｎ−カドヘリンへの結合
ＥＬＩＳＡにより選択された１１個の個々のファージクローンを、フローサイトメトリーにより、Ｎ−カドヘリン陽性細胞（ＰＣ３およびＬＮＣａＰ  Ｎ−カドヘリントランスフェクト細胞）の細胞結合に関して試験した。クローンは、また、Ｎ−カドヘリン陰性細胞（ＤＵ−１４５およびＬＮＣａｐ）に対する交差反応性を試験した。これらの実験のために、第２のバッチのファージ抗体を生産し、ＥＬＩＳＡにより再試験した。選択されたクローンに対する両方のＥＬＩＳＡ結果を表２に示す。全ファージクローンは、１つのＤ４を除きＮ−カドヘリン陽性細胞を染色したが、Ｎ−カドヘリン陰性細胞を染色しなかった。それぞれのクローンに対する平均蛍光強度を表２に示す。本発明者らは、唯一の抗−ＥＣＤ４としてＡ１４を、ならびにダイアボディに再構築されるべき最も強い細胞染色を示すので、Ｃ７およびＥ４を選択した。生産されたダイアボディＡ１４Ｄｂ、Ｃ７ＤｂおよびＥ４Ｄｂを使用して、Ｎ−カドヘリン陽性および陰性細胞を染色した。フローサイトメトリーにより分析したとき、Ａ１４ＤｂおよびＥ４Ｄｂは、Ｎ−カドヘリン陽性細胞の比較的弱い染色を示したが、Ｃ７Ｄｂは、より強い染色を示した（データは示していない）。しかしながら、Ｃ７Ｄｂは、また、Ｎ−カドヘリン陰性細胞の染色を示す。
【０１４６】
これらのクローン由来のｓｃＦｖタンパク質をシーケンシングした。配列を以下に示す。
Ａ１４ＳｃＦｖ                            配列番号：１
Ａ７不完全ＳｃＦｖ                        配列番号：２
Ａ８切断型ＳｃＦｖ                        配列番号：３
Ｂ１２不完全ＳｃＦｖ                      配列番号：４
Ｃ７ＳｃＦｃ                              配列番号：５
Ｃ１２不完全ＳｃＦｖ                      配列番号：６
Ｄ４ＳｃＦｖ                              配列番号：７
Ｅ４ＳｃＦｖ                              配列番号：８
Ｅ１０不完全ＳｃＦｖ                      配列番号：９
表２
【表２】
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表３
【表３】
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腫瘍またはマウスの注射２２時間後に得られた生体内分布データ。
腫瘍／血液＝０．７（ＬＡＰＣ９）および０．５（ＰＣ３）
【０１４７】
最も良い結合剤の選択
１０個のＥＣＤ１−３結合剤の中から最も良いものを選択するためのさらなる努力において、これらのファージクローンを生産し、ＬＮＣａＰ細胞上で枯渇させ、Ｎ−カドヘリントランスフェクトＬＮＣａＰ細胞に対して２回パニングした。クローンをシーケンシングした。Ｎ−カドヘリントランスフェクトＬＮＣａＰ細胞のＤ４ファージクローンでの染色は陰性であったが、Ｄ４クローンはＸコピーで見られた。
【０１４８】
Ｄ４ダイアボディ（Ｄ４Ｄｂ）を生産し、ＰＣ３およびＤＵ１４５染色について、Ｅ４Ｄｂと比較した（図２）。Ｅ４ＤｂおよびＤ４Ｄｂの両方は、ＰＣ３を染色し、ＤＵ１４５に対して陰性であった。ＰＣ３のＤ４Ｄｂ染色は、Ｅ４Ｄｂより強かった（図４）。
【０１４９】
図２に示されるとおり、Ｎ−カドヘリン陽性細胞（ＰＣ３）をダイアボディと共にインキュベートし、染色し、フローサイトメトリーにより分析した。二次抗体のみ：抗−Ｃ−Ｍｙｃ−ＦＩＴＣ（灰色で塗られる）、Ａ１４Ｄｂ（破線）、Ｅ４Ｄｂ（細線）、Ｃ７Ｄｂ（太線）。
【０１５０】
図３に示されるとおり、Ｎ−カドヘリン陰性細胞（ＤＵ１４５）およびＮ−カドヘリン陽性細胞（ＰＣ３）をＣ７Ｄｂと共にインキュベートし、染色し、フローサイトメトリーにより分析した。二次抗体のみ：抗−Ｃ−Ｍｙｃ−ＦＩＴＣ（灰色で塗られる）、Ｃ７Ｄｂ（実線）。
【０１５１】
図４に示されるとおり、Ｎ−カドヘリン陰性細胞（ＤＵ１４５）およびＮ−カドヘリン陽性細胞（ＰＣ３）をダイアボディと共にインキュベートし、染色し、フローサイトメトリーにより分析した。二次抗体のみ：抗−Ｃ−Ｍｙｃ−ビオチン、ストレプトアビジンＲ−ＰＥ（灰色で塗られる）、Ｅ４Ｄｂ（破線）、Ｄ４Ｄｂ（実線）。
【０１５２】
図５は、ＬＡＰＣ９  ＡＩ腫瘍における１２４Ｉ標識Ｄ４Ｄｂの腫瘍局在を示す。冠状断面を注射４時間後に記録した。
【０１５３】
本明細書に記載されている実施例および態様が説明の目的のみであり、それらを考慮すると、それらに種々の修飾または変化が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲ならびに特許請求の範囲内に包含されると理解される。本明細書に引用されている全ての文献、特許および特許出願は、ここに、全ての目的のためにそれら全体を出典明示により包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2012508027.tif 000020
【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年1月17日(2012.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2012508027.tif 000024
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