(57)【要約】  親ＧＰＣＲに対して増加した安定性を持つ変異体のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を生産する方法であって、該方法は親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に一以上の変異を作ることを含み、（ｉ）一以上の変異がｉプラス又はマイナス５残基のウインドウ内に位置し、ここでｉは親ＧＰＣＲがクラス１ＧＰＣＲである場合、親ＧＰＣＲのアミノ酸残基２．４６の位置であり、又は親ＧＰＣＲがクラス２又は３ＧＰＣＲである場合、ｉは親ＧＰＣＲの等価なアミノ酸残基の位置であり、及び／又は（ｉｉ）一以上の変異が親ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス７のアミノ酸配列内に位置し、該アミノ酸配列がｉプラス又はマイナス５残基のウインドウと相互作用し、増加した安定性を持つ親ＧＰＣＲの一以上の変異体を与えることを含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
親ＧＰＣＲに対して増加した安定性を持つ変異体のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を生産する方法であって、該方法は親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に一以上の変異を作ることを含み、（ｉ）一以上の変異がｉプラス又はマイナス５残基のウインドウ内に位置し、ここでｉは親ＧＰＣＲがクラス１ＧＰＣＲである場合、親ＧＰＣＲのアミノ酸残基２．４６の位置であり、又は親ＧＰＣＲがクラス２又は３ＧＰＣＲである場合、ｉは親ＧＰＣＲの等価なアミノ酸残基の位置であり、及び／又は（ｉｉ）一以上の変異が親ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス７のアミノ酸配列内に位置し、該アミノ酸配列がｉプラス又はマイナス５残基のウインドウと相互作用し、増加した安定性を持つ親ＧＰＣＲの一以上の変異体を与えることを含む方法。
【請求項２】
工程（ｉ）における一以上の変異がｉプラス又はマイナス４残基のウインドウ内に位置し、工程（ｉｉ）における一以上の変異が親ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス７のアミノ酸配列内に位置し、該アミノ酸配列がｉプラス又はマイナス４残基のウインドウと相互作用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
親ＧＰＣＲの一以上の変異体が特定の立体構造の増加した安定性を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
一以上の変異体がアゴニスト型又はアンタゴニスト型の立体構造において、増加した安定性を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
親ＧＰＣＲの一以上の変異体が、熱、界面活性剤、カオトロピック剤及び極端なｐＨの任意の一以上に対して増加した安定性を有する、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
一以上の変異体が増加した熱安定性を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
親ＧＰＣＲの一つ又は変異体がＧタンパク質と共役することが可能であるかどうか決定される、請求項１から６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
親ＧＰＣＲがクラス１ＧＰＣＲ又はクラス２ＧＰＣＲである、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
親ＧＰＣＲがアデノシン受容体、セロトニン受容体、βアドレナリン受容体、ニューロテンシン受容体、ムスカリン受容体、コルチコトロピン放出ホルモン受容体又はオレキシン受容体の何れかである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
親ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス７のアミノ酸配列が、該アミノ酸配列がｉプラス又はマイナス５残基のウインドウと相互作用し、親ＧＰＣＲがクラス１ＧＰＣＲである場合、ＮＰｘｘＹ（配列番号１）モチーフプラス又はマイナス３残基であり、又は親ＧＰＣＲがクラス２ＧＰＣＲである場合、ＳＦＱモチーフプラス又はマイナス３残基であり、又は親ＧＰＣＲがクラス３ＧＰＣＲである場合、ｘＰＫｘＹ（配列番号４）モチーフプラスマイナス３残基である、請求項１から９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
親ＧＰＣＲに対して増加した安定性を持つ変異体ＧＰＣＲが、対応する親受容体と比較した場合、図２に示したヒトアデノシンＡ２Ａ受容体の番号付けによるＬｅｕ４８及びＡｓｎ２８４の何れか一以上に対応する位置に異なるアミノ酸を有する変異体アデノシン受容体である、請求項１から１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
変異体アデノシン受容体が、図２に配列が示されたヒトアデノシンＡ２Ａ受容体のアミノ酸配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
親ＧＰＣＲに対して増加した安定性を持つ変異体ＧＰＣＲが、対応する親受容体と比較した場合、図３に示したヒト５ＨＴ２Ｃ受容体の番号付けによるＭｅｔ９３、Ｓｅｒ９４、Ｌｅｕ９５、Ｉｌｅ３６３及びＬｅｕ３６６の何れか一以上に対応する位置に異なるアミノ酸を持つ変異体セロトニン受容体である、請求項１から１０の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
変異体セロトニン受容体が、図３に配列が示されたヒト５ＨＴ２Ｃ受容体のアミノ酸配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
親ＧＰＣＲに対して増加した安定性を持つ変異体ＧＰＣＲが、対応する親受容体と比較した場合、図４に配列が示されたヒトＭ４ムスカリン受容体の番号付けによるＬｅｕ７１に対応する位置に異なるアミノ酸を持つ変異体ムスカリン受容体である、請求項１から１０の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
変異体ムスカリン受容体が、図４に配列が示されたヒトＭ４ムスカリン受容体のアミノ酸配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
親ＧＰＣＲに対して増加した安定性を持つ変異体ＧＰＣＲが、対応する親受容体と比較した場合、図１１に示されたラットニューロテンシン受容体の番号付けによるＴｙｒ３６９に対応する位置に異なるアミノ酸を持つ変異体ニューロテンシン受容体である、請求項１から１０の何れかに記載の方法。
【請求項１８】
変異体ニューロテンシン受容体が、図１１に配列が示されたラットニューロテンシン受容体と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
親ＧＰＣＲに対して増加した安定性を持つ変異体ＧＰＣＲが、対応する親受容体と比較した場合、図１２に示されたヒトＣＲＦ１の番号付けによるＩｌｅ１６３に対応する位置に異なるアミノ酸を有する変異体コルチコトロピン放出ホルモン受容体である、請求項１から１０の何れかに記載の方法。
【請求項２０】
変異体コルチコトロピン放出ホルモン受容体が、図１２に配列が示されたヒトＣＲＦ１と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
親ＧＰＣＲに対して増加した安定性を持つ変異体ＧＰＣＲが、対応する親受容体と比較した場合、図１３に示されたヒトＯＸ２の番号付けによるＴｙｒ９１に対応する位置に異なるアミノ酸を有する変異体オレキシン受容体である、請求項１から１０に記載の方法。
【請求項２２】
変異体オレキシン受容体が、図１３に配列が示されたヒトＯＸ２のアミノ酸配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１から２２に記載の何れかの方法で生産された親ＧＰＣＲに対して増加した安定性を持つ変異体ＧＰＣＲ。
【請求項２４】
親ＧＰＣＲと比較した場合、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列において一以上の変異を有する変異体ＧＰＣＲであって、（ｉ）一以上の変異がｉプラス又はマイナス５残基のウインドウ内に位置し、ここでｉは親ＧＰＣＲがクラス１ＧＰＣＲである場合、親ＧＰＣＲのアミノ酸残基２．４６の位置であり、又は親ＧＰＣＲがクラス２又は２ＧＰＣＲである場合、ｉは親ＧＰＣＲの等価なアミノ酸残基の位置であり、及び／又は（ｉｉ）一以上の変異が、親ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス７のアミノ酸配列内に位置し、該アミノ酸配列はｉプラス又はマイナス５残基のウインドウと相互作用し、該変異体ＧＰＣＲが不安定化条件に曝された場合、親ＧＰＣＲと比較して増加した安定性を有する変異体ＧＰＣＲ。
【請求項２５】
親ＧＰＣＲと比較した場合、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列において一以上の変異を有し、ここで（ｉ）一以上の変異がｉプラス又はマイナス５残基のウインドウ内に位置し、ここでｉは親ＧＰＣＲがクラス１ＧＰＣＲである場合、親ＧＰＣＲのアミノ酸残基２．４６の位置であり、又は親ＧＰＣＲがクラス２又は３ＧＰＣＲである場合、ｉは親ＧＰＣＲの等価なアミノ酸残基の位置であり、及び／又は（ｉｉ）一以上の変異が、親ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス７のアミノ酸配列内に位置し、該アミノ酸配列がｉプラス又はマイナス５残基のウインドウと相互作用する変異体ＧＰＣＲを含む組成物において、該変異体ＧＰＣＲが、変異体ＧＰＣＲよりも大きく親ＧＰＣＲを不安定にするのに有効な不安定化条件に曝されることを特徴とする組成物。
【請求項２６】
変異体ＧＰＣＲが変異体アデノシン受容体であって、対応する親受容体と比較した場合、図２に示されたヒトアデノシンＡ２Ａ受容体の番号付けによるＬｅｕ４８及びＡｓｎ２８４の何れか一以上に対応する位置に異なるアミノ酸を有する、請求項２４に記載の変異体ＧＰＣＲ又は請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
アデノシン受容体が図２に配列が示されたヒトアデノシンＡ２Ａ受容体のアミノ酸配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載の変異体ＧＰＣＲ又は組成物。
【請求項２８】
変異体ＧＰＣＲが、対応する親受容体と比較した場合、図３に示されたヒト５ＨＴ２Ｃ受容体の番号付けによるＭｅｔ９３、Ｓｅｒ９４、Ｌｅｕ９５、Ｉｌｅ３６３及びＬｅｕ３６６の何れか一以上に対応する位置に異なるアミノ酸を有する変異体セロトニン受容体である、請求項２４に記載の変異体ＧＰＣＲ又は請求項２５に記載の組成物。
【請求項２９】
変異体セロトニン受容体が図３に配列が示されたヒト５ＨＴ２Ｃ受容体のアミノ酸配列にと少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２８に記載の変異体ＧＰＣＲ又は組成物。
【請求項３０】
変異体ＧＰＣＲが、対応する親受容体と比較した場合、図４に示されたヒトＭ４ムスカリン受容体の番号付けによるＬｅｕ７１に対応する位置に異なるアミノ酸を有するムスカリン受容体である、請求項２４に記載の変異体ＧＰＣＲ又は請求項２５に記載の組成物。
【請求項３１】
変異体ムスカリン受容体が、図４に配列が示されたヒトＭ４ムスカリン受容体のアミノ酸配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３０に記載の変異体ＧＰＣＲ又は組成物。
【請求項３２】
変異体ＧＰＣＲが、対応する親ＧＰＣＲと比較した場合、図１１に示されたラットニューロテンシン受容体の番号付けによるＴｙｒ３６９に対応する位置に異なるアミノ酸を有するニューロテンシン受容体である、請求項２４に記載の変異体ＧＰＣＲ又は請求項２５に記載の組成物。
【請求項３３】
変異体ニューロテンシン受容体が、図１１に配列が示されたラットニューロテンシン受容体のアミノ酸配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３２に記載の変異体ＧＰＣＲ又は組成物。
【請求項３４】
変異体ＧＰＣＲが、対応する親受容体と比較した場合、図１２に示されたヒトＣＲＦ１の番号付けによるＩｌｅ１６３に対応する位置に異なるアミノ酸を有するコルチコトロピン放出ホルモン受容体である、請求項２４に記載の変異体ＧＰＣＲ又は請求項２５に記載の組成物。
【請求項３５】
変異体コルチコトロピン放出ホルモン受容体が、図１２に配列が示されたヒトＣＲＦ１のアミノ酸配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３４に記載の変異体ＧＰＣＲ又は組成物。
【請求項３６】
変異体ＧＰＣＲが、対応する親受容体と比較した場合、図１３に示されたヒトＯＸ２の番号付けによるＴｙｒ９１に対応する位置に異なるアミノ酸を有するオレキシン受容体である、請求項２４に記載の変異体ＧＰＣＲ又は請求項２５に記載の組成物。
【請求項３７】
変異体オレキシン受容体が、図１３に配列が示されたヒトＯＸ２のアミノ酸配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３６に記載の変異体ＧＰＣＲ又は組成物。
【請求項３８】
変異体ＧＰＣＲには膜が無い、請求項２３、２４、及び２６から３７の何れかに記載の変異体ＧＰＣＲ、又は請求項２５から３７の何れかに記載の組成物。
【請求項３９】
変異体ＧＰＣＲがリガンドの欠損下で親ＧＰＣＲと比べて増加した安定性を有する、請求項２３、２４及び２６から３８の何れかに記載の変異体ＧＰＣＲ、又は請求項２５から３８の何れかに記載の組成物。
【請求項４０】
変異体ＧＰＣＲがリガンドの存在下で親ＧＰＣＲと比べて増加した安定性を有する、請求項２３、２４及び２５から３９の何れかに記載の変異体ＧＰＣＲ、又は請求項２５から３９の何れかに記載の組成物。
【請求項４１】
不安定化条件が、熱、界面活性剤、カオトロピック剤、極端なｐＨ、有機溶媒、水溶液又は膜の無い環境の何れかである、請求項２３、２４及び２６から４０の何れかに記載の変異体ＧＰＣＲ、又は請求項２５から４０の何れかに記載の組成物。
【請求項４２】
変異体ＧＰＣＲが、熱、界面活性剤、カオトロピック剤及び極端なｐＨの何れか一に対して増加した安定性を有する、請求項２３、２４及び２６から４１の何れかに記載の変異体ＧＰＣＲ、又は請求項２５から４１の何れかに記載の組成物。
【請求項４３】
変異体ＧＰＣＲが増加した安定性を有する、請求項２３、２４及び２６から４１の何れかに記載の変異体ＧＰＣＲ、又は請求項２５から４１の何れかに記載の組成物。
【請求項４４】
変異体ＧＰＣＲがその親よりも少なくとも１℃、より安定である、請求項４３に記載の変異体ＧＰＣＲ又は組成物。
【請求項４５】
変異体ＧＰＣＲが可溶化形態にある、請求項２３、２４及び２６から４４の何れかに記載の変異体ＧＰＣＲ、又は請求項２５から４４の何れかに記載の組成物。
【請求項４６】
変異体ＧＰＣＲには実質的に他のタンパク質が無い、請求項２３、２４及び２６から４５の何れかに記載の変異体ＧＰＣＲ、又は請求項２５から４５の何れかに記載の組成物。
【請求項４７】
固体支持体に固定された、請求項２３、２４及び２６から４６の何れかに記載の変異体ＧＰＣＲ、又は請求項２５から４６の何れかに記載の組成物。
【請求項４８】
請求項２３、２４及び２６から４６の何れかに記載の変異体ＧＰＣＲ、又は請求項２５から４６の何れかに記載の組成物が固定される固体支持体。
【請求項４９】
請求項２３、２４及び２６から４６の何れかに記載の変異体ＧＰＣＲ、又は請求項２５から４６の何れかに記載の組成物の結晶化のための使用。
【請求項５０】
請求項２３，２４及び２６から４６の何れかに記載の変異体ＧＰＣＲ、又は請求項２５から４６の何れかに記載の組成物の創薬における使用。
【請求項５１】
変異体ＧＰＣＲ又は組成物がリガンド結合スクリーニング又はアッセイの開発に使用される、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
請求項２３、２４及び２６から４６の何れかに記載の変異体ＧＰＣＲ、又は請求項２５から４６の何れかに記載の組成物のバイオセンサーとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、変異体７回膜貫通型受容体（７−ＴＭＲ）、又はＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）及び増加した安定性を有するものを選ぶ方法に関する。特に、それは、それらの各々の親タンパク質と比較して、特定の条件下で増加した安定性を有する変異体ＧＰＣＲの選択及び調製に関する。そのようなタンパク質は、親タンパク質よりも結晶化可能である可能性がより高く、そのため構造決定に適している。それらはまた薬剤の探索及び開発の研究に有用である。
【０００２】
過去２０年間にわたり、膜タンパク質構造決定の速度は次第に向上してきたが、大部分の成功は真核生物由来よりむしろ細菌由来の膜タンパク質の結晶化におけるものであった［非特許文献１］。細菌の膜タンパク質は、真核生物膜タンパク質よりも大腸菌において標準的技術を使用して過剰発現させるのが容易であり[非特許文献２及び３］、細菌のタンパク質は、場合によっては界面活性剤中においてはるかに安定しており、界面活性剤の安定性は精製及び結晶化に本質的に必要な条件である。ゲノム塩基配列決定プロジェクトはまた、特定の輸送体又はイオン・チャネルの数多くのホモログのクローニング及び発現を可能とし、結晶化の成功率も大幅に向上させた。１００以上の固有のポリトピック内在性膜タンパク質の構造が決定されたが（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｎｃｏ．ｂｉｏｍｏｌ．ｕｃｉ．ｅｄｕ／を参照）、これらの膜タンパク質の１０％未満が哺乳類の起源であり、半数以上が天然源から精製され、界面活性剤の溶液中で安定している。真核生物の膜タンパク質を過剰発現させることの困難さは別として、それらはしばしば界面活性剤溶液中で乏しい安定性を有し、それらの急激に変性し又は沈殿することなしに探索され得る結晶化条件の範囲を厳しく制限する。理想的には、膜タンパク質は、任意の所定の界面活性剤溶液中において、何日間も安定していなければならないが、回折する品質の結晶を成長させることに最適な界面活性剤は、最も不安定な界面活性剤、すなわち短い脂肪族鎖と小さい若しくは荷電した頭部基を持つものである傾向がある。我々が解きたいのはヒトの膜タンパク質の構造であり、その理由はこれらは製薬企業による治療薬の開発を支援するために必要なためである；しばしば異なる哺乳類由来の受容体、チャネル及びトランスポーターの薬理学には実質的な相違がある一方で、酵母と細菌のゲノムは、任意の相同タンパク質を含んでいない可能性がある。従って、結晶化と構造決定のため、及び潜在的には薬のスクリーニング、バイオアッセイやバイオセンサーアプリケーションなどの他の目的ために、界面活性剤に安定な真核生物の内在性膜タンパク質の生産を可能にする一般的な戦略の開発が非常に必要とされている。
【０００３】
膜タンパク質は細胞生存能を保障するために膜において十分に安定であるように進化してきたが、しかし、それらは界面活性剤溶液中において、安定しているためには進化しておらず、膜タンパク質を人工的に進化させ、界面活性剤に安定な変異体を単離し得ることを示唆している［非特許文献４］。このことは、その後、２つの細菌のタンパク質、すなわちジアシルグリセロール・キナーゼ（ＤＧＫ）［非特許文献５及び６］及びバクテリオ・ロドプシン［非特許文献７］において証明された。ＤＧＫのランダムな変異誘発は耐熱性を増す特定の点変異を識別し、組み合わせられた場合、最適な安定変異体が、天然型タンパク質が５５℃で６分の半減期を有するのと比較して、８０℃で３５分の半減期を有したため、その効果は付加的であった［非特許文献６］。界面活性剤耐性ＤＧＫ変異体の三量体がＳＤＳ中で安定になったことが示され、従って、オリゴマー状態の安定化が熱安定性において重要な役割を果たした可能性がある。変異誘発の目的は結晶化に適している膜タンパク質を生産することであったが、ＤＧＫの構造はまだ決定されておらず、かつ成功した結晶化の報告は無い。ヘリックスＢに沿ってシステインスキャンニング変異誘発によるバクテリオロドプシンに対する更なる研究は、どのアミノ酸残基が突然変異により耐熱性を導くかを予測することが可能でなく、またその構造との関係で、なぜ熱安定性が生じるのか明らかではないことを示した［非特許文献７］。
【０００４】
ＧＰＣＲは、数多くの生理プロセスを制御する非常に大きなタンパク質ファミリーを構成し、数多くの効果的な薬剤の標的である。したがって、それらは非常に薬理学的に重要である。ＧＰＣＲの一覧は、Ｆｏｏｒｄ等（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ.５７,２７９−２８８に挙げられており、本明細書において参照により取り込まれる。ＧＰＣＲは単離されると一般的に不安定であり、本来の照らされてない状態において例外的に安定なウシロドプシンを除いて、最近まで如何なるものも結晶化可能でなかった。
【０００５】
ＧＰＣＲにより、我々はＧタンパク質に信号を送る受容体並びにＧタンパク質に信号を送らない受容体を含む、ＧＰＣＲスーパーファミリーの全ての７−ＴＭＲを含める。
【０００６】
ＧＰＣＲは新薬の開発につながるようなターゲットであり、Ｏｖｅｒｉｎｇｔｏｎ等 （２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ５，９９３−９９６を参照すると、現在の薬の４分の１以上がＧＰＣＲをターゲットとすることが示されている。このカテゴリの合計１８６の全体のターゲットの中から、経口的に利用できる薬に対する５２のＧＰＣＲターゲットがある。ＧＰＣＲは、例えばアゴニスト及びアンタゴニスト等の異なる薬理学的種類のリガンドと結合する多数の異なる立体構造で存在し、機能するためにこれらの立体構造の間を循環すると考えられる（Ｋｅｎａｋｉｎ Ｔ．（１９９７）Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１２，１１６−１２５）。
【０００７】
ＧＰＣＲは、広範囲にわたる異なるリガンドを認識するように進化した；しかしながら、受容体活性化のための基本的機構は受容体全体に保存され、その結果、異なるサブファミリーの中で大多数のＧＰＣＲに存在する良く知られた構造モチーフがある。これらのモチーフは、例えばＧタンパク質等のエフェクターへの結合に関与すると考えられている領域である、クラス１ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス７（ＴＭ７）にあるＮＰｘｘＹ（配列番号１）配列を含む（Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ，Ｓｈｉ及びＪａｖｉｔｃｈ ２００１ Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ６０，１−１９）。膜貫通ヘリックス２（ＴＭ２）はＧＰＣＲのコア構造の一部であり、クラス１においては、生体アミン受容体に存在するＳＬＡＣＡＤ（配列番号３）（Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｃｈｅｒｔｌｅｒ，Ｇ．Ｆ．Ｘ．及び Ｕｎｇｅｒ，Ｖ．Ｍ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２，１４４−１６４）モチーフとしても知られた非常に保存された配列モチーフ（Ｎ／Ｓ）ＬＡＸ（Ａ／Ｓ）Ｄ（配列番号２）を含む。後述するバレステロス番号付け方式を用いて定められるように、このモチーフ内にあるロイシンはＬ２．４６である。相互的変異誘発研究は、ＮＰｘｘＹ（配列番号１）モチーフ及び（Ｎ／Ｓ）ＬＡＸ（Ａ／Ｓ）Ｄ（配列番号２）モチーフ（Ｂｅｅ及びＨｕｌｍｅ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００７ Ｎｏｖ ２；２８２（４４）：３２４７１−９、及びその参照文献）を含むＴＭ２とＴＭ７の間の連結を示唆した。これらの領域は、受容体の活性化、及びアゴニスト及びアンタゴニストのリガンドおいてお互いの親和性を変える活性化と不活性化状態の切り替えに関与している。これらの２つのモチーフ内の残基の変異誘発は受容体の立体構造を変えることが可能である。
【０００８】
クラス２ＧＰＣＲにおいてはまた、ＴＭ２とＴＭ７の間に機能的に重要な結合の証拠がある。ＴＭ７はクラス２ＧＰＣＲの中で保存されるモチーフＳＦＱを含み、これはＴＭ２のＡＲＬモチーフに結合していることが示されている。例えば、副甲状腺受容体（ＰＴＨＲ１）では、ＴＭ２のＡｒｇ２３３（Ｌｅｕ２３２に隣接している）及びＴＭ７のＧｌｎ４５１はアゴニストの結合及びシグナル伝達に影響を及ぼす（Ｇａｒｄｅｌｌａ ＴＪ，Ｌｕｃｋ ＭＤ，Ｆａｎ ＭＨ，Ｌｅｅ Ｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９６ Ｍａｙ ３１；２７１（２２）：１２８２０−５）。従って、ＰＴＨＲ１受容体のＬｅｕ２３２であるＡＲＬモチーフのロイシンは、上記のＬ２．４６と等価な役割を有する。この位置にロイシンを有しないクラス２セクレチンファミリーの一員のみがカルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ）であることは特記すべきである。これは、単独ではシグナル伝達ＧＰＣＲとして機能しないが、ＲＡＭＰタンパク質と相互作用を必要とするこの群における唯一の受容体である（Ｆｏｏｒｄ及びＭａｒｓｈａｌｌ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．１９９９ Ｍａｙ、２０（５）：１８４−７）。
【０００９】
ＮＰｘｘＹ（配列番号：１）モチーフはまたクラス３ＧＰＣＲ（ｘＰＫｘＹ；配列番号４）（Ｐｉｎ，Ｇａｌｖｅｚ及びＰｒｅｚｅａｕ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ及びＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ９８，３２５−３５４）に存在し、クラス１受容体のＬ２．４６と同等な様式で、ＴＭ２の非常に保存されたロイシン残基（代謝型グルタミン酸受容体のＬｅｕ６３５）と結合し得る。この位置にロイシン又は関連アミノ酸を有しないクラス３ＧＰＣＲのみがＧＡＢＡＢ受容体のＲ１サブユニットであることは特記すべきである。この受容体はＧタンパク質に直接シグナルは送らず、その代わりこの位置に密接に関係するイソロイシンを含む結合パートナーＧＡＢＡＢ Ｒ２（Ｄｕｔｈｅｙ等，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００２ Ｆｅｂ １、２７７（５）：３２３６−４１）を介してシグナルを送る。
【００１０】
発明者は、以前、ＧＰＣＲの安定性を向上し、加えて受容体を生物学的に重要な特定の立体構造に優先的に固定する変異を選択するための様々は方法論を開発した。そうした方法は国際公開第２００８／１１４０２０号、及び国際公開第２００９／０７１９１４号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１１】
発明者は、現在、親ＧＰＣＲと比較して増加した安定性を有する変異体ＧＰＣＲを生産する更なる方法を開発した。具体的には、本発明者らはアミノ酸残基２．４６及び近傍の残基を変異することが特定の立体構造にて高い安定性を持つ変異体ＧＰＣＲを与えることに使用可能であることを特定した。
【００１２】
従って、本発明の第一の態様は、親ＧＰＣＲに比較して高い安定性を持つ変異体Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の生産方法を提供し、本方法は、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列において、一以上の変異を作製することを含み、ここで（ｉ）一以上の変異がｉ番目プラス又はマイナス５残基のウインドウ内に位置し、ここで親ＧＰＣＲがクラス１のＧＰＣＲである場合、ｉは親ＧＰＣＲのアミノ酸残基２．４６の位置であり、又は親ＧＰＣＲがクラス２又は３のＧＰＣＲである場合、ｉは親ＧＰＣＲにおける等価なアミノ酸残基の位置であり、及び／又は（ｉｉ）一以上の変異が親ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス７のアミノ酸配列に位置し、そのアミノ酸配列はｉ番目プラス又はマイナス５残基のウインドウと相互作用し、増加した安定性を有する親ＧＰＣＲの一以上の変異体を与える。
【００１３】
従って、本発明は、親ＧＰＣＲに比較して高い安定性を持つ変異体Ｇ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の生産方法を提供する、本方法は、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に一以上の変異を作製することを含み、（ｉ）一以上の変異がｉプラス又はマイナス４残基のウインドウ内に位置し、ここで親ＧＰＣＲがクラス１のＧＰＣＲである場合、ｉは親ＧＰＣＲのアミノ酸残基２．４６の位置であり、又は親ＧＰＣＲがクラス２又は３のＧＰＣＲである場合、ｉは親ＧＰＣＲにおける等価なアミノ酸残基の位置であり、及び／又は（ｉｉ）一以上の変異が親ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス７のアミノ酸配列に位置し、そのアミノ酸配列はｉプラス又はマイナス４残基のウインドウと相互作用し、高い安定性を有する親ＧＰＣＲの一以上の変異体を提供する。
【００１４】
本発明の実施に使用するために適したＧＰＣＲは、アデノシン受容体に限定しないが、特にアデノシンＡ２Ａ受容体（遺伝子名：ＡＤＯＲＡ２Ａ）、ムスカリン受容体、セロトニン受容体（例えば、５ＨＴ２Ｃ；遺伝子名ＨＴＲ２Ｃ）、β−アドレナリン受容体（例えば、βＡＲ−１；遺伝子名：ＡＤＲＢ１）、ニューロテンシン受容体（ＮＴＳ１；遺伝子名：ＮＴＳＲ１）、コルチコトロピン放出ホルモン受容体（例えばＣＲＦ１；遺伝子名：ＣＲＨＲ１）、及びオレキシン受容体（例えば、ＯＸ２；遺伝子名：ＨＴＲ２Ｃを含む。更に、国際薬理学連合はＧＰＣＲの一覧を作成している（Ｆｏｏｒｄ等（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５７，２７９−２８８，参照により本明細書に援用され、この一覧は定期的にｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｕｐｈａｒ−ｄｂ．ｏｒｇ／ＧＰＣＲ／ＲｅｃｅｐｔｏｒＦａｍｉｌｉｅｓＦｏｒｗａｒｄにて更新される）。ＧＰＣＲが原則的にアミノ酸配列類似性に基づいて異なるクラス、例えば原型がロドプシン、セクレチン受容体と代謝型グルタミン酸受容体１であるクラス１、２及び３に分けられることが注目されよう。クラス１、２及び３のＧＰＣＲの一覧は、図１ａ、１ｂ及び１ｃに与えられる。クラス２ＧＰＣＲは図１４にもリストされている。ＧＰＣＲはまた結合する天然のリガンドを参照することによりファミリーに分けられる。ＧＰＣＲのスーパーファミリーの７−ＴＭＲを含む、全てのＧＰＣＲが本発明の範囲に含まれている。
【００１５】
多くのＧＰＣＲのアミノ酸配列（およびそれらをコードするｃＤＮＡの塩基配列）は、例えばジェンバンクを参照することにより、容易に入手可能である。特に上掲のＦｏｏｄ等はＥｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ）由来のヒトの遺伝子記号、及びヒト、マウス、及びラットの遺伝子番号を与えている。また留意すべきことは、ヒトのゲノム配列は実質的に完全なため、ヒトＧＰＣＲのアミノ酸配列は、そこから推測できることである。
【００１６】
親ＧＰＣＲは任意のＧＰＣＲであり得るが、真核生物のＧＰＣＲである場合、つまりＧＰＣＲをコードするｃＤＮＡ又は遺伝子が真核生物のｃＤＮＡ又は遺伝子である場合が特に好ましい。例えば、親ＧＰＣＲは、哺乳動物由来のＧＰＣＲ等、脊椎動物のＧＰＣＲである場合が特に好ましい。親ＧＰＣＲがラット、マウス、ウサギ又はイヌ又はヒト以外の霊長類又はヒト、又は鶏又は七面鳥由来である場合が特に好ましい。親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列は、天然に存在する蛋白質を定めるアミノ酸配列である必要はないことが理解される。都合の良いことに、それは細菌、酵母、昆虫細胞又は哺乳動物細胞のような適切な宿主生物で発現することができる人工的な型を定義し得る。親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列は天然に存在するタンパク質の（末端の一方か又は両端を切断した）切断型を定めるアミノ酸配列であるか、又は天然に存在するタンパク質か又はその断片への融合を定めるアミノ酸配列であるか、又は天然に存在するタンパク質と比較して変異を含むアミノ酸配列であり得る。あるいは若しくは追加として、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列は、天然に存在するＧＰＣＲと比較して、例えば、溶解性又はタンパク分解安定性を（例えば、トランケーション、ループの削除、糖鎖付加部位の変異又はシステイン等の反応性アミノ酸側鎖の変異により）改善するために修飾され得る。いずれにせよ、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列は、リガンドに結合することができるＧＰＣＲを定めるものであることが理解されるであろう。リガンドは、天然に存在するＧＰＣＲ又はその変異体、又は天然に存在するＧＰＣＲの誘導体又はその変異体に結合し得る。「誘導体」とは、天然に存在するＧＰＣＲと比較して、例えば、任意の化学基が一以上のアミノ酸側鎖に付加することにより、又は任意の化学基がアミノ酸配列中に挿入されることにより化学的に修飾され、しかしその誘導体はリガンドに結合する能力を保持するＧＰＣＲを意味することを含む。
【００１７】
好都合なことに、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列は、適切な配位子を添加して、一般的にＧタンパク質の活性化によって影響を受けることが知られている下流の活動のいずれか一つ又は複数に、又は例えばアレスチンを含むようなＧタンパク質とは無関係な他の経路に影響を与えることが可能なＧＰＣＲを定めるものである。例えば、親ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質（例えば、スムーズンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）、又はＧタンパク質シグナル伝達能力を失ったが他の経路にシグナル伝達を保持する変異体ＧＰＣＲ）とは独立にシグナルを伝達できる７−ＴＭＲであり、そのアミノ酸配列は、適切なリガンドを添加して、Ｇタンパク質とは独立したシグナル伝達経路を活性化する親ＧＰＣＲを定めるものであり得る。
【００１８】
「２．４６アミノ酸残基」とは、バレステロス番号付け方式によって定められる位置２．４６のアミノ酸残基を意味する（Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ ＪＡ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｈ． Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｍｏｄｅｌｓ及びｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｂｉｎｇ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９９５；２５：３６６−４２８）。これは、すべてのロドプシン様ＧＰＣＲ（クラス１ＧＰＣＲ）に適用される一般的な番号付け方式である。各々の残基が膜貫通ヘリックス（ＴＭ）番号（１〜７）により識別され、各々のＴＭ内の最も保存された残基は番号「５０」が割り当てられ、全ての他の残基の位置は、各ＴＭセグメントで最も保存されたアミノ酸に相対的に番号付けされる。従って、アミノ酸残基２．４６はＴＭ２で最も保存された残基の４残基前のＴＭ２の残基に対応する。各ＴＭにおいてリファレンス残基（すなわち番号５０）が割り当てられ、それらは以下のロドプシンの残基に対応する：ＴＭ１ Ｎ５５、ＴＭ２ Ｄ８３、ＴＭ３ Ｒ１３５、ＴＭ４ Ｗ１６１、ＴＭ５ Ｐ２１５、ＴＭ６ Ｐ２６７及びＴＭ７ Ｐ３０３。バレステロス番号付け方式の目的は、ロドプシンのアラインメントを参考のために用いて異なるＧＰＣＲ間の相同残基の同定を容易にするためである。
【００１９】
従って、親ＧＰＣＲがクラス１ＧＰＣＲである場合、ｉはＴＭ２で最も保存された残基（すなわち番号５０）である残基の位置を決めて前に４残基を数えることによって同定することができる２．４６アミノ酸残基の位置である。２．４６残基がすべてのロドプシン様ＧＰＣＲの中に非常に良く保存されていることは注目に値する。一般的に２．４６残基は、保存されたアスパラギン酸残基の一ヘリックスターン下の保存されたロイシン残基であり、そのヘリックスのほぼ中央に位置するＴＭ７内の保存された配列のドメイン（ＮＰｘｘＹ；配列番号１）と相互作用することが提唱されている。図１ａは、クラス１ＧＰＣＲのアラインメントを与え、各ＧＰＣＲにおける２．４６アミノ酸残基の位置を示している。
【００２０】
親ＧＰＣＲがクラス２または３のＧＰＣＲである場合、ｉは２．４６のアミノ酸残基に等価なアミノ酸残基の位置である。「２．４６アミノ酸残基に等価なアミノ酸残基」とは、クラス１ＧＰＣＲの２．４６のアミノ酸残基に対応するクラス２又は３のＧＰＣＲのアミノ酸残基を意味する。例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷを使用してＧＰＣＲが比較され場合に、クラス２又は３のＧＰＣＲの等価なアミノ酸残基がクラス１ＧＰＣＲの２．４６のアミノ酸残基に対してアラインする残基とはなり得ないことが理解される（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等（１９９４）Ｎｕｃｌ. Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，４６７３−４６８０）。むしろ、残基２．４６がＴＭ２に存在し、クラス１ＧＰＣＲのＴＭ７内の保存されたドメインと相互作用するのと同じように、そのアミノ酸残基がＴＭ２に存在し、クラス２または３のＧＰＣＲのＴＭ７内の保存されたドメインと相互作用するという意味で同等である。ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックスは、当技術分野で良く知られた疎水性分析を用いて定めることができる。
【００２１】
図１ｂおよび１４は、クラス２ＧＰＣＲアミノ酸配列のアラインメントを提供し、各ＧＰＣＲに対して２．４６アミノ酸残基に等価なアミノ酸残基の位置を示す。図に示すように、クラス２ＧＰＣＲの２．４６残基は、典型的には、高度に保存されたアルギニン残基に隣接する、ＴＭ２にある高度に保存されたロイシン残基である。例えば、副甲状腺ホルモン受容体の２．４６アミノ酸残基（ＰＴＨＲ１は）のＡｒｇ２３３に隣接するロイシン２３２である。更に、実施例３にて議論された通り、ヒトＣＲＦ１のＬｅｕ１６４はクラス１ＧＰＣＲの２．４６アミノ酸残基に相当するものである。例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，４６７３−４６８０）を使用してＧＰＣＲを比較した場合、任意の他のクラス２ＧＰＣＲにおける等価なアミノ酸残基は、図１ｂまたは１４（例えばＣＲＦ１）にリストされたクラス２ＧＰＣＲの一つにおける「等価なアミノ酸残基」にアラインするアミノ酸残基の位置を決めることにより同定することができると理解される。
【００２２】
図１ｃは、クラス３ＧＰＣＲアミノ酸配列のアラインメントを与え、各ＧＰＣＲに対して２．４６のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の位置を示す。図に示すように、クラス３ＧＰＣＲの２．４６残基は典型的にはＴＭ２の高度に保存されたロイシン残基である。例えば、代謝型グルタミン酸受容体１（ｍＧｌｕＲ１）の２．４６アミノ酸残基はＬｅｕ６３５である。例えばＭａｃＶｅｃｔｏｒとＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，４６７３−４６８０）を用いてＧＰＣＲを比較した場合、任意の他のクラス３ＧＰＣＲにおける等価なアミノ酸残基は、図１ｃにリストされたクラス３ＧＰＣＲの一つにおける「等価なアミノ酸残基」にアラインするアミノ酸残基の位置を決めることにより同定することができると理解される。
【００２３】
一般的に、２．４６アミノ酸残基又は等価な残基はロイシンであるが、それがイソロイシン、メチオニン、バリン、グリシン又はスレオニン等の別のアミノ酸残基であり得ることが理解される。
【００２４】
限定しないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｄ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ（第１章、Ａ．Ｍ．Ｇｒｉｆｆｉｎ及びＨ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，編集、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９４）；Ｇ．ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｍ．Ｇｒｉｂｓｋｏｖ及びＪ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ １９９１）；及び Ｃａｒｉｌｌｏ等，ＳＩＡＭＪ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３（１９８８）に記載されてものを含む、任意の適切な方法が２つのポリペプチド配列をアラインするために使用され得る。ポリペプチドをアラインするための好ましい方法は、試べられる配列の間に最大の一致を与えるように設計されている。同一性及び類似性を決定する方法は、公に入手可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。
【００２５】
ポリペプチド配列をアラインし、２つの配列間の同一性と類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム法は、限定されないが、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージを含む（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ等，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，及びＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ等,Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０））。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）及び他の情報源から公に入手可能である（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ（ＮＣＢ ＮＬＭ ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０，上記を参照）。よく知られたスミス-ウォーターマンアルゴリズムも同一性を決定するために使用される場合がある。
【００２６】
例として、コンピュータアルゴリズムのＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）を使用して、百分率による配列同一性が決定されるべき２つのポリペプチドは、それぞれのアミノ酸の最適なマッチング（アルゴリズムにより決定した「一致した範囲」）に対してアラインされる。ギャップオープニングペナルティ（３×平均対角として計算される；「平均対角」とは用いる比較マトリックスの対角の平均である；「対角」はスコア、又は特定の比較マトリックスによって各々の完全なるアミノ酸の一致に割り当てられた数である）及びギャップ伸張ペナルティ（通常０．１×ギャップオープニングペナルティである）、並びにＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２等の比較マトリックスが本アルゴリズムと併せて使用される。標準的な比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスに対してはＤａｙｈｏｆｆ等，５ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（補遺３ １９７８）を参照；ＢＬＯＳＵＭ ６２比較マトリックスに対してはＨｅｎｉｋｏｆｆ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０９１５−１９（１９９２）を参照）もまた本アルゴリズムによって用いられる。ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメーターは次のとおりである。アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−５３（１９７０）。比較マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ ６２ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５−１９（１９９２）、ギャップペナルティ：１２、ギャップ長ペナルティ：４、類似度の閾値：０。ＧＡＰプログラムは、上記のパラメータの使用により有用である。前述のパラメーターは、ＧＡＰアルゴリズムを用いてポリペプチド比較するための（エンドギャップに対してペナルティなしと共に）デフォルトパラメーターである。
【００２７】
「ｉプラス又はマイナス５残基のウインドウ」とは、２．４６アミノ酸残基又は場合によってはそれに等価なもの、及び、２．４６アミノ酸残基又はそれに等価なものの前の５残基と後ろの５残基を含む。従って、ｉプラス又はマイナス５残基のウインドウ内において、ｉ−５、ｉ−４、ｉ−３、ｉ−２、ｉ−１、ｉ、ｉ＋１、ｉ＋２、ｉ＋３、ｉ＋４及びｉ＋５アミノ酸残基の一以上が変異され得、例えば、ｉ−５、ｉ−４、ｉ−３、ｉ−２、ｉ−１、ｉ、ｉ＋１、ｉ＋２、ｉ＋３、ｉ＋４及びｉ＋５アミノ酸残基のうち、任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１全てが変異され得る。
【００２８】
一実施態様では、一つ以上の変異が、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列において、ｉプラス又はマイナス４残基のウインドウ内でなされ、ここでｉは親ＧＰＣＲにおいてアミノ酸残基２．４６の位置又は場合によってはそれと等価であり、増加した安定性を持つ一以上の親ＧＰＣＲの変異体を与える。「ｉプラス又はマイナス４残基のウインドウ」とは、２．４６アミノ酸残基又は場合によってはそれに等価なもの、及び、２．４６アミノ酸残基又は場合によってはそれに等価なものの前の４残基と後ろの４残基を含む。従って、ｉプラス又はマイナス４残基のウインドウ内において、ｉ−４、ｉ−３、ｉ−２、ｉ−１、ｉ、ｉ＋１、ｉ＋２、ｉ＋３、及びｉ＋４アミノ酸残基の一以上が変異され得、例えば、ｉ−４、ｉ−３、ｉ−２、ｉ−１、ｉ、ｉ＋１、ｉ＋２、ｉ＋３、及びｉ＋４アミノ酸残基のうち、任意の１、２、３、４、５、６、７、８又は９つ全てが変異され得る。
【００２９】
一実施態様では、一つ以上の変異が、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列において、ｉプラス又はマイナス３残基のウインドウ内でなされ、ここでｉは親ＧＰＣＲにおいてアミノ酸残基２．４６の位置又は場合によってはそれと等価であり、増加した安定性を持つ一以上の親ＧＰＣＲの変異体を与える。「ｉプラス又はマイナス３残基のウインドウ」とは、２．４６アミノ酸残基又は場合によってはそれに等価なもの、及び、２．４６アミノ酸残基又は場合によってはそれに等価なものの前の３残基と後ろの３残基を含む。従って、ｉプラス又はマイナス３残基のウインドウ内において、ｉ−３、ｉ−２、ｉ−１、ｉ、ｉ＋１、ｉ＋２、及びｉ＋３アミノ酸残基の一以上が変異され得、例えば、ｉ−３、ｉ−２、ｉ−１、ｉ、ｉ＋１、ｉ＋２、及びｉ＋３アミノ酸残基のうち、任意の１、２、３、４、５、６、又は７つ全てが変異され得る。
【００３０】
一実施態様では、一つ以上の変異が、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列において、ｉプラス又はマイナス２残基のウインドウ内でなされ、ここでｉは親ＧＰＣＲにおいてアミノ酸残基２．４６の位置又は場合によってはそれと等価であり、増加した安定性を持つ一以上の親ＧＰＣＲの変異体を与える。「ｉプラス又はマイナス２残基のウインドウ」とは、２．４６アミノ酸残基又は場合によってはそれに等価なもの、及び、２．４６アミノ酸残基又は場合によってはそれに等価なものの前の２残基と後ろの２残基を含む。従って、ｉプラス又はマイナス２残基のウインドウ内において、ｉ−２、ｉ−１、ｉ、ｉ＋１、及びｉ＋２アミノ酸残基の一以上が変異され得、例えば、ｉ−２、ｉ−１、ｉ、ｉ＋１、及びｉ＋２アミノ酸残基のうち、任意の１、２、３、４、又は５つ全てが変異され得る。
【００３１】
その他の実施態様では、一つ以上の変異が、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列において、ｉプラス又はマイナス１残基のウインドウ内でなされ、ここでｉは親ＧＰＣＲにおいてアミノ酸残基２．４６の位置又は場合によってはそれと等価であり、増加した安定性を持つ一以上の親ＧＰＣＲの変異体を与える。「ｉプラス又はマイナス１残基のウインドウ」とは、２．４６アミノ酸残基又は場合によってはそれに等価なもの、及び、２．４６アミノ酸残基又は場合によってはそれに等価なものの前の１残基と後ろの１残基を含む。従って、ｉプラス又はマイナス１残基のウインドウ内において、ｉ−１、ｉ、及びｉ＋１アミノ酸残基の一以上が変異され得、例えば、ｉ−１、ｉ、及びｉ＋１アミノ酸残基のうち、任意の１、２又は３つ全てが変異され得る。
【００３２】
実施例２に示すように、本発明者らは、アミノ酸配列がＴＭ２内のｉプラス又はマイナス５残基のウインドウ（例えば、ｉプラス又はマイナス４残基のウインドウ）と相互作用する、親ＧＰＣＲのＴＭ７のアミノ酸配列中に変異を作成することは、また、増加した安定性を持つ変異体ＧＰＣＲを与えるために使用可能であることを実証した。
【００３３】
従って、本発明の第一態様の方法は、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に一以上の変異を作成し、一以上の変異が親ＧＰＣＲのＴＭ７のアミノ酸配列中に位置し、そのアミノ酸配列は上記の通りｉプラス又はマイナス５残基のウインドウと（例えば、ｉプラス又はマイナス４残基のウインドウと）相互作用し、増加した安定性を持つ親ＧＰＣＲの一以上の変異体を与えることを含み得る。そのような変異はiプラス又はマイナス５残基基のウインドウ（例えば、iプラス又はマイナス４残基のウインドウ）において一以上の変異を行うことに加えて、若しくはその代わりに作成され得ることが理解される。
【００３４】
所定のＧＰＣＲ内のＴＭ７のアミノ酸配列は、上記の疎水性分析を含む当該技術分野における任意の適切な技術を用いて同定されることが可能である。
【００３５】
「ｉプラス又はマイナス５残基のウインドウと相互作用する」とは、ＴＭ７中の一以上のアミノ酸が上記のｉプラス又はマイナス５残基のウインドウ内の一以上のアミノ酸と３次元空間において接近していることを意味することを含む。「ｉプラス又はマイナス４残基のウインドウと相互作用する」とは、ＴＭ７中の一以上のアミノ酸が上記のｉプラス又はマイナス４残基のウインドウ内の一以上のアミノ酸と３次元空間において接近していることを意味することを含む。アデノシンＡ２Ａ受容体のＬｅｕ４８（Ｌ２．４６）のＣα原子とＴＭ７のＮＰｘｘＹ（配列番号１）モチーフのアミノ酸残基のＣα原子との距離は実施例２及び図１０に与えられる。その距離は、ＮＰｘｘＹ（配列番号１）モチーフの各残基のＣα原子はＬ２．４６のＣα原子と１５オングストローム以内にあることを示している。従って、好ましい実施態様では、ｉプラス又はマイナス５残基のウインドウ（例えば、ｉプラス又はマイナス４残基のウインドウ）と相互作用するアミノ酸配列は、ＴＭ７中の一以上のアミノ酸に対応し、そのＣα原子はｉプラス又はマイナス５残基のウインドウ（例えば、ｉプラス又はマイナス４残基のウインドウ）内のアミノ酸の任意のＣα原子と、１５オングストローム以内、例えば１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６又は５オングストローム以内にある。
【００３６】
Ｃα原子間距離は３次元の座標に基づいて測られたものである。例えば、距離は典型的には２つの原子のＸ、Ｙ、及びＺ座標による標準的な幾何学（例えば、平方根（（ｘ１−ｘ２）２＋（ｙ１−ｙ２）２＋（ｚ１−ｚ２）２））により測られる。親ＧＰＣＲの構造が知られており、タンパク質がその天然状態にフォールドしている場合に距離が測られることが理解される。さもなければ、距離は親ＧＰＣＲの構造モデル内で測られ得る。構造モデルは当該技術分野で知られた任意の適切な方法を使用して発生させることが可能である。例えば、構造モデルに基づくか、若しくは相同性又は新たに構造予測法を使用して計算機で発生させたモデルであり得る（Ｑｉａｎ等 Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４５０：２５９−６４）。
【００３７】
クラス１ＧＰＣＲにおいて、ｉプラス又はマイナス５残基のウインドウ（例えば、ｉプラス又はマイナス４残基のウインドウ）と相互作用するＴＭ７のアミノ酸配列は、好ましくはＴＭ７のＮＰｘｘＹ（配列番号１）モチーフ、プラス又はマイナス３残基である。従って、一実施態様では、本発明の第一態様の方法は、一以上の変異がＴＭ７のＮＰｘｘＹ（配列番号１）アミノ酸配列内に位置する、クラス１ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中に一以上の変異を作成することを含み、その一以上の変異はＴＭ７のＮＰｘｘＹ（配列番号１）アミノ酸配列プラス又はマイナス３残基以内に位置し、増加した安定性を持つ親ＧＰＣＲの一以上の変異体を与える。更なる実施態様では、一以上の変異はＴＭ７のＮＰｘｘＹ（配列番号１）モチーフ、プラス又はマイナス２残基以内に、又はＴＭ７のＮＰｘｘＹ（配列番号１）モチーフ、プラス又はマイナス１残基以内に位置する。「ＮＰｘｘＹ（配列番号１）モチーフ、プラス又はマイナスＸ（例えば、１、２又は３）残基」とは、ＮＰｘｘＹ（配列番号１）モチーフ、及びＮＰｘｘＹ（配列番号１）モチーフの前のｘ（すなわち１、２、又は３）アミノ酸、及び後ろのｘ（すなわち１、２又は３）アミノ酸を含む。
【００３８】
クラス２ＧＰＣＲにて、ｉプラス又はマイナス５残基のウインドウ（例えば、ｉプラス又はマイナス４残基のウインドウ）と相互作用するＴＭ７のアミノ酸配列は、好ましくはＴＭ７のＳＦＱモチーフ、プラス又はマイナス３残基である。従って、一実施態様では、本発明の第一態様の方法は、クラス２の親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中に一以上の変異を作成し、そこでは一以上の変異がＴＭ７のＳＦＱアミノ酸配列プラス又はマイナス３残基内に位置し、増加した安定性を持つ親ＧＰＣＲの一以上の変異体を与える。更なる実施態様では、一以上の変異がＴＭ７のＳＦＱアミノ酸配列プラス又はマイナス２残基以内、又はＴＭ７のＳＦＱアミノ酸配列プラス又はマイナス１残基以内、又はＳＦＱアミノ酸配列内のみに位置する。「ＴＭ７のＳＦＱモチーフプラス又はマイナスｘ（すなわち、１、２又は３）残基」とは、ＳＦＱモチーフ、及びＳＦＱモチーフの前のｘ（すなわち、１、２又は３）アミノ酸、及び後ろのｘ（すなわち、１、２又は３）アミノ酸を含む。
【００３９】
クラス３ＧＰＣＲにて、ｉプラス又はマイナス５残基のウインドウ（例えば、ｉプラス又はマイナス４残基のウインドウ）と相互作用するＴＭ７のアミノ酸配列は、好ましくはＴＭ７のｘＰＫｘＹ（配列番号４）モチーフプラス又はマイナス３残基である。従って、一実施態様では、本発明の第一態様は、クラス３の親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中の一以上の変異を作成し、そこでは一以上の変異がＴＭ７のｘＰＫｘＹ（配列番号４）アミノ酸配列プラス又はマイナス３残基以内に位置し、増加した安定性を持つ親ＧＰＣＲの一以上の変異体を与えることを含む。更なる実施態様では、一以上の変異がＴＭ７のｘＰＫｘＹ（配列番号４）アミノ酸配列プラス又はマイナス２残基以内、又はＴＭ７のｘＰＫｘＹ（配列番号４）アミノ酸配列プラス又はマイナス１残基以内、又はｘＰＫｘＹ（配列番号４）アミノ酸配列以内のみに位置する。「ＴＭ７のｘＰＫｘＹ（配列番号４）モチーフプラス又はマイナスｘ（すなわち、１、２又は３）残基」とは、ｘＰＫｘＹ（配列番号４）モチーフ、及びｘＰＫｘＹ（配列番号４）モチーフの前のｘ（すなわち、１、２、又は３）アミノ酸、及び後ろのｘ（すなわち、１、２、又は３）アミノ酸を含む。
【００４０】
実施例１に示すように、驚くべきことに、ＧＰＣＲ内の単一アミノ酸の変化は、親タンパク質と比較してタンパク質の安定性を増加させ得る。従って、安定性が増加した変異体ＧＰＣＲを作成する方法の一実施態様にて、親タンパク質の単一アミノ酸残基が変異体タンパク質において変えられる。しかしながら、更なる安定性の増加が親タンパク質の一以上のアミノ酸を変えることにより得られる可能性があることが理解される。例えば、ｉプラス又はマイナス５残基のウインドウ（例えば、ｉプラス又はマイナス４残基のウインドウ）内の一以上のアミノ酸が親ＧＰＣＲにて変えられる可能性があり、及び／又はアミノ酸配列がｉプラス又はマイナス５残基のウインドウ（例えば、ｉプラス又はマイナス４残基のウインドウ）と相互作用する、親ＧＰＣＲ内のＴＭ７を定めるアミノ酸配列内の一以上のアミノ酸が変えられる可能性がある。
【００４１】
典型的には、安定性が増加した変異体ＧＰＣＲを生産する場合、変異体ＧＰＣＲは親タンパク質と比較して、１から１１個の変更されたアミノ酸、好ましくは１から８又は１から６、２から６、例えば、２、３、４、５、又は６等の変えられたアミノ酸を含む。しかし、増加した安定性を付与するために必要な変異の合計数はこれより多くの可能性があることが理解され、そして最終的には、親の受容体の固有の安定性等の様々な要因に依存し、受容体により異なる。
【００４２】
変異は、当該技術分野にて知られた任意の適切な技術を使用して、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中に作ることができる。例えば、特定のアミノ酸残基が独立して他のアミノ酸残基と置換されるように、通常の部位特異的変異誘発を用いても良く、又はポリメラーゼ連鎖反応応に基づいた手順を使用しても良い。ＤＮＡを変異させ、宿主細胞中でポリヌクレオチドからポリペプチドを発現させるための遺伝子とｃＤＮＡのクローニング及び操作のための分子生物学的方法は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”第３版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（編集），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに例示され当該技術分野で良く知られている。
【００４３】
典型的には、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列において一以上の変異を作成することは、一以上のアミノ酸をＡｌａで置換すること（任意の他のアミノ酸により置換され得るが）を含む。例えば、親GPCRにおいてもしｉプラス又はマイナス５残基のウインドウ（例えば、ｉプラス又はマイナス４残基のウインドウ）内の特定のアミノ酸が（ここでｉは親ＧＰＣＲ内のアミノ酸残基２．４６又は場合によってはその等価である）、Ａｌａであれば、（Ｌ２．４６の場合のように、既にその残基である場合を除いて）都合良くＬｅｕにより置換され得る。あるいは、アミノ酸は例えばＧｌｙにより置換されても良く、タンパク質を特定の立体構造に固定することが可能なように近接ヘリックスの密接したパッキングを可能にし得る。アミノ酸がＧｌｙである場合、例えばＡｌａに都合良く置換され得る。
【００４４】
特定の位置の所定のアミノ酸を置換することに使用されるアミノ酸は、典型的には天然に存在するアミノ酸、典型的には「コード化可能な」アミノ酸であり、非天然アミノ酸であり得る（そのような場合、タンパク質は一般的には化学合成によるか、又は非天然アミノアシルｔＲＮＡの使用により作成される）。「コード化可能な」アミノ酸はｍＲＮＡの翻訳によりポリペプチドに組込まれるものである。また、非天然アミノ酸を作成したり、例えば蛋白質の翻訳後処理又は半合成による共有結合の化学修飾によって所定の位置に非ペプチド結合を導入することも可能である。これらの翻訳後修飾は、リン酸化、グリコシル化又はパルミトイル化、又は合成若しくは生合成として自然なことであり得る。場合によっては修飾が、例えば、塩橋、ジスルフィド結合又は金属イオンのキレート化部位の導入を通じて、膜貫通ヘリックス２と膜貫通ヘリックス７との間の相互作用を安定化させることができる。
【００４５】
発明者らは、残基２．４６、及び近傍の残基を変異させることが特定の立体構造（例えば、アゴニスト型又はアンタゴニスト型）の安定性を増加させることを示した。従って、本発明の方法は、特定の立体構造の安定性を増加させるＧＰＣＲの変異体を生産する方法であると考えられ、例えば、それらは立体構造の熱安定性を増加させる可能性がある。本発明の方法は、従って、変異導入により安定で立体構造的に固定されたＧＰＣＲを作成するために使用され得る。図１に示すように、２．４６残基、又は場合によってはその等価なものは、クラス１、クラス２及びクラス３ＧＰＣＲにおいて高度に保存されており、本方法は全てのＧＰＣＲに対して適用され、安定で立体構造的に固定された受容体を創ることができる。変異体ＧＰＣＲは、その大部分の割合が特定の立体構造状態を占めるという点で、事実上親分子の純粋な形である。一実施態様では、親ＧＰＣＲの一以上の変異体は、アゴニスト型又はアンタゴニスト型の立体構造において増加した安定性を有している。本発明の方法はまた、結晶化に対してより扱い易い変異体ＧＰＣＲを生産するための方法として考慮され得ると理解される。
【００４６】
好都合なことに、本発明の第一態様の方法が実施され、得られた一以上の変異体の安定性が評価される。ＧＰＣＲの安定性を評価する方法は当該技術分野で知られており、例えば国際公開第２００８／１１４０２０号、及び国際公開第２００９／０７１９１４号に記載されている。好ましくは、特定の立体構造をとる得られた一以上の変異体が、リガンド（リガンドは親ＧＰＣＲが特定の立体構造にある場合に親ＧＰＣＲに結合するものである）に結合することに関して、そのリガンドに結合することに関して同一の立体構造をとる親ＧＰＣＲの安定性と比較して、安定性を増加させるかどうかが決定される。一以上の変異体の安定性の比較は同一条件下において親分子を参照することで成されると理解される。
【００４７】
増加した安定性に関して一つのＧＰＣＲにおいて調べられ得る多数の変異体が潜在的に存在するため、安定性を付与するにおいて重要であると知られている特定の変異体に標的を絞ると都合が良い。従って、本発明の第一態様の方法は、増加した安定性を持つ変異体ＧＰＣＲを選択する方法としても用いられ得る。特に、本発明の第一態様の方法を実施することは、特定のアミノ酸残基に対する変異（安定化させる変異はこのウインドウの外に位置するかも知れないことは理解されるものの、例えば、iプラス又はマイナス５残基のウインドウ内、又はｉプラス又はマイナス４残基のウインドウ内（ここでiは親ＧＰＣＲのアミノ酸残基２．４６の位置であるか、又は場合によってはその等価なものである））を標的にすることに用いることが可能である。得られた一以上の変異体は次いで安定性の増加について試験され、増加した安定性を有するものが選択され得る。
【００４８】
本発明の第一態様の方法は繰り返されることができ、例えば、得られた一以上の変異体の安定性が評価されると、第一ラウンドで生みだされた一以上の変異体が、続くラウンドにおいて親ＧＰＣＲになることが理解される。従って、本方法は反復方法にて用いられることが可能であり、例えば、増加した安定性を持つ単一変異を同定する方法を実施し、それらの変異を単一の変異体ＧＰＣＲに組合わせ、次いで続くラウンドにて変異される親ＧＰＣＲとなる。
【００４９】
例えば、本発明の第一態様の一実施態様にて、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に、徐々に増大するウインドウサイズ内で、一以上の変異が作成され得る。典型的には最初に小さなウインドウサイズが用いられ、その配列のサブセットから安定化させる変異が同定され、続いて望まれる数の変異が見つけられるまでウインドウサイズを増大させながら更に残基を走査する。従って第一ラウンドにて、一以上の変異が、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中、ｉプラス又はマイナス１残基のウインドウ内において（ここでｉはアミノ酸残基２．４６の位置であり、又は場合によっては親ＧＰＣＲの等価なものである）、作成される可能性がある。得られた変異体の安定性は評価され、親ＧＰＣＲと比較して増加した安定性を有するそれらの変異体が選択され得る。本方法は次いで、（第一ラウンドにて選択された変異体に対応する）親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中に、一つのウインドウ又はｉプラス又はマイナス２残基のウインドウ内等において、一以上の変異を作成することで反復され得る。
【００５０】
変異体ＧＰＣＲは、任意の変性剤、若しくは熱、界面活性剤、カオトロピック剤又は極端なｐＨの一つか複数等の変性条件に対して安定性を増加させたものであり得る。
【００５１】
熱に対して増加した安定性（すなわち熱安定性）に関して、これは特定の温度で蛍光、ＣＤ又は光散乱等の分光学的方法を用いてリガンド結合を側定することで容易に決定することが可能である。典型的には、ＧＰＣＲがリガンドに結合する場合、特定の温度でＧＰＣＲがそのリガンドへ結合する能力を、その変異体の熱安定性を決定することに用いることが可能である。「疑似Ｔｍ」すなわち５０％の受容体が、所定の時間（例えば３０分間）インキュベート後にある条件下で不活性化される温度を決定するのが便利である。高い熱安定性の変異体ＧＰＣＲはその親に比較して増加した疑似Ｔｍを有する。あるいは、熱安定性は所定の温度における安定性を時間の関数として測定することで評価することができる。例えば、所定の温度においてリガンド結合の水準が時間ゼロ時点でのリガンド結合の水準の５０％に下がる時間が決定され得る（Ｓｈｉｂａｔａ等、２００９ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ）。しかしながら何れにせよ、温度は変性剤であることが理解される。
【００５２】
変性剤又はカオトロープに対して増加した安定性に関して、典型的にはＧＰＣＲが定められた時間、試験界面活性剤又は試験カオトロピック剤の存在下でインキュベートされ、その安定性は、例えば、リガンド結合若しくは上記で議論された分光学的方法を用いて決定される。
【００５３】
極端なｐＨに関して、典型的な試験ｐＨが選択され、例えば４．５から５．５の範囲（低ｐＨ）又は８．５から９．５の範囲（高ｐＨ）にて選択される。
【００５４】
比較的過酷な（ｈａｒｓｈ）界面活性剤が結晶化方法で使用されるため、変異体ＧＰＣＲはそのような界面活性剤の存在において安定であることが好ましい。所定の界面活性剤の「過酷さ」の順番は、ＤＤＭ、Ｃ１１→Ｃ１０→Ｃ９→Ｃ８マルトシド又はグルコシド、ラウリルジメチルアミン酸化物（ＬＤＡＯ）及びＳＤＳである。とりわけ好まれるのは、変異体ＧＰＣＲがＣ９マルトシド又はグルコシド、Ｃ８マルトシド又はグルコシド、ＬＤＡＯ及びＳＤＳの何れかに対してより安定である場合であり、これらの界面活性剤が安定性試験に用いられる。
【００５５】
その決定の容易さのため、変異体ＧＰＣＲは親タンパク質に比較して増加した熱安定性を有することが好ましい。熱は変性剤として作用することが理解され、これは試料を例えば氷上に置き冷却することで容易に取り除くことが可能である。熱安定性はまた他の変性剤又は変性条件に対する安定性に対する指標となり得る。従って、増加した熱安定性は変性界面活性剤、特にＤＤＭより強く変性させる、例えば小さな頭部基と短いアルキル鎖、及び／又は荷電頭部基を持った界面活性剤等における安定性と言い換えられる可能性がある。我々は熱に安定なＧＰＣＲはまた過酷な界面活性剤に対してより安定であることを見いだした。
【００５６】
極端なｐＨが変性条件として用いられる場合、中和剤を添加することで迅速に取り除かれることが可能であると理解されるであろう。同様に、カオトロープが変性剤として用いられる場合、その変性効果はカオトロープがそのカオトロープ効果を発揮する濃度未満に試料を希釈することで取り除くことが可能である。
【００５７】
更なる本発明の第一態様の実施態様では、変異体ＧＰＣＲがＧタンパク質又はＧＰＣＲと相互作用すると知られたその他のタンパク質、例えばアレスチン又はＧＰＣＲキナーゼ等のシグナル伝達タンパク質と共役することが可能かどうか決定される。好ましくは、変異体ＧＰＣＲが同じクラス（例えばアゴニスト又はアンタゴニスト）の複数のリガンドと親ＧＰＣＲとしての親和性に匹敵する広がり及び／又は序列を持って、結合することが可能かどうかも決定される。
【００５８】
好ましくは、親ＧＰＣＲはクラス１（すなわちロドプシン様ＧＰＣＲ）であり、アデノシン受容体、セロトニン受容体、β-アドレナリン受容体、ニューロテンシン受容体又はムスカリン受容体を含む図１aにリストされたものの何れかである。より好ましくは、親ＧＰＣＲはアデノシンＡ２Ａ受容体又はＭ４ムスカリン受容体又は５ＨＴ２Ｃ受容体又はＮＴＳ１ニューロテンシン受容体又はオレキシン受容体である。しかしながら、親ＧＰＣＲは図１ｂ、１ｃ及び１４、及び実施例３（例えばＣＲＦ１）にリストされたクラス２及び３ＧＰＣＲ、及び上記の通り国際薬理学連合によりリストされたものの全てを含む任意のＧＰＣＲであっても良い。
【００５９】
変異体アデノシン受容体
アデノシン受容体は当該技術分野にて良く知られている。それらはお互いに配列相同性を共有し、アデノシンと結合する。
【００６０】
特に好ましい実施態様では、親ＧＰＣＲに対して増加した安定性を持つ変異体ＧＰＣＲ
は、対応する親受容体と比較した場合、図２に示したヒトアデノシンＡ２Ａ受容体の番号付けによるＬｅｕ４８及びＡｓｎ２８４の一以上に対応する位置において異なるアミノ酸を有する変異体アデノシン受容体である。
【００６１】
変異体アデノシン受容体は、図２に示したヒトアデノシンＡ２Ａ受容体の番号付けによるＬｅｕ４８及びＡｓｎ２８４の一以上に対応する位置において変異を受けているという条件で任意のアデノシン受容体の変異体であり得る。
【００６２】
変異体ＧＰＣＲは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２,４６７３−４６８０）を使用して決定した通り、図２に配列が示された所定のヒトアデノシンＡ２Ａ受容体と比較した場合、少なくとも２０％のアミノ酸配列同一性を有するものであれば特に好ましい。より好ましくは、変異体ＧＰＣＲは少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する。一般的にアデノシン結合部位に高次の配列保存性がある。
【００６３】
下記実施例１に記載の通り、Ｌｅｕ４８の単一置換は、アゴニストの５’-Ｎ-エチルカルボキサミドアデノシン（ＮＥＣＡ）で測定した場合、熱安定性の増加をもたらす。同様に、実施例２に記載の通り、Ａｓｎ２８４の単一置換は、アゴニストのＮＥＣＡで測定した場合、熱安定性の増加をもたらす。
【００６４】
従って、変異体ＧＰＣＲは親と比較した場合にＬｅｕ４８及びＡｓｎ２８４の一以上がその他のアミノ酸残基により置換された、変異体ヒトアデノシンＡ２Ａ受容体であり得る。変異体ＧＰＣＲはまた、親受容体の一以上の対応するアミノ酸がその他のアミノ酸残基によって置換された、その他の種由来の変異体アデノシン受容体であり得る。誤解を避けるために、親は天然に存在する配列を有するアデノシン受容体であり得、又はそれは切断された型であり得、又はそれは天然に存在するタンパク質か又その断片に対する融合物であり得、又はそれはリガンド結合能を保持することを条件として、天然に存在する配列と比較して変異を含み得る。
【００６５】
「対応するアミノ酸残基」とは、ヒトアデノシンＡ２Ａ受容体と他のアデノシン受容体をＭａｃＶｅｃｔｏｒとＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して比較した場合、ヒトアデノシンＡ２Ａ受容体の所定のアミノ酸残基に対しアラインするその他のアデノシン受容体のアミノ酸残基を意味することを含む。
【００６６】
他のヒトアデノシン受容体はアデノシンＡ２ｂ、Ａ３及びＡ１受容体を含む。アデノシンＡ２ｂ、Ａ３及びＡ１受容体の各々におけるヒトアデノシンＡ２Ａ受容体のＬｅｕ４８に対応するアミノ酸残基はそれぞれＬｅｕ４９、Ｌｅｕ５４及びＬｅｕ５１である。従って、変異体ＧＰＣＲはＬｅｕ４９がその他のアミノ酸により置換された変異体アデノシンＡ２ｂ受容体であり得、又はそれはＬｅｕ５４がその他のアミノ酸により置換された変異体アデノシンＡ３受容体であり得、又はそれはＬｅｕ５１がその他のアミノ酸により置換された変異体アデノシンＡ１受容体であり得る。
【００６７】
変異体セロトニン受容体
セロトニン受容体は当該技術分野にて良く知られている。それらはお互いに配列相同性を共有し、セロトニンに結合する。
【００６８】
特に好ましい実施態様では、親ＧＰＣＲと比較して増加した安定性を持つ変異体ＧＰＣＲは、変異体セロトニン受容体であり、対応する親受容体と比較した場合、図３に示されたヒト５ＨＴ２Ｃ受容体の番号付けによるＭｅｔ９３、Ｓｅｒ９４、Ｌｅｕ９５、Ｉｌｅ３６３及びＬｅｕ３６６のうち一以上に対応する位置にて異なるアミノ酸を有する。
【００６９】
変異体セロトニン受容体は、図３に示されたヒト５ＨＴ２Ｃ受容体の番号付けによるＬｅｕ９５、Ｓｅｒ９４及びＭｅｔ９３、Ｓｅｒ９４、Ｌｅｕ９５、Ｉｌｅ３６３及びＬｅｕ３６６のうち一以上に対応する位置にて変異されていることを条件として、任意のセロトニン受容体の変異体であり得る。
【００７０】
ＭａｃＶｅｃｔｏｒとＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，４６７３−４６８０）を用いて決められた通り、もし変異体ＧＰＣＲが、図３に配列が示された所定のヒト５ＨＴ２Ｃ受容体と比較した場合に、少なくとも２０％のアミノ酸配列同一性を有するものであるならば特に望ましい。より好ましくは、変異体ＧＰＣＲは少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する。一般的にセロトニン結合部位により高次の配列保存性がある。
【００７１】
下記実施例１に記載の通り、５ＨＴ２Ｃ受容体配列（図３に示した通り）においてＬｅｕ９５及びＭｅｔ９３の個々の置換は、アゴニストＳＣＨ２３３９０により測定した場合に熱安定性の増加をもたらす。
【００７２】
５ＨＴ２Ｃ受容体配列（図３に示した通り）においてＳｅｒ９４の置換は、アンタゴニストのメスレルギンにより測定した場合に熱安定性の増加をもたらす。
【００７３】
実施例２に記載の通り、５ＨＴ２Ｃ受容体配列のＩｌｅ３６３及びＬｅｕ３６６の個々の置換はアゴニストＳＣＨ２３３９０により測定した場合に熱安定性の増加をもたらす。
【００７４】
従って、変異体ＧＰＣＲは、親と比較してこれらのアミノ酸残基（すなわちＭｅｔ９３、Ｓｅｒ９４、Ｌｅｕ９５、Ｉｌｅ３６３及びＬｅｕ３６６）の一以上がその他のアミノ酸残基により置換された変異体ヒト５ＨＴ２Ｃ受容体であり得る。変異体ＧＰＣＲはまた、親受容体の一以上の対応するアミノ酸がその他のアミノ酸残基によって置換された、その他の種由来の変異体セロトニン受容体であり得る。誤解を避けるために、親は天然に存在する配列を有するセロトニン受容体であり得、又はそれは切断された型であり得、又はそれは天然に存在するタンパク質か又その断片に対する融合物であり得、又はそれはリガンド結合能を保持することを条件とし、天然に存在する配列と比較して変異を含み得る。
【００７５】
「対応するアミノ酸残基」とは、５ＨＴ２Ｃ受容体と他のセロトニン受容体をＭａｃＶｅｃｔｏｒとＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して比較した場合、５ＨＴ２Ｃ受容体の所定のアミノ酸残基に対しアラインするその他のセロトニン受容体のアミノ酸残基を意味することを含む。
【００７６】
他のヒトセロトニン受容体は、５ＨＴ１Ａ、５ＨＴ１Ｂ、５ＨＴ１Ｄ、５ＨＴ１Ｅ、５ＨＴ１Ｆ、５ＨＴ２Ａ、５ＨＴ２Ｂ、５ＨＴ４、５ＨＴ５Ａ、５ＨＴ６及び５ＨＴ７受容体を含む。
【００７７】
５ＨＴ２Ｃ受容体のＬｅｕ９５、Ｓｅｒ９４及びＭｅｔ９３に対応するアミノ酸残基は５ＨＴ１Ａ受容体ではそれぞれＬｅｕ７８、Ｓｅｒ７７、及びＧｌｙ７６であり、それゆえ変異体ＧＰＣＲは、Ｌｅｕ７８、Ｓｅｒ７７及びＧｌｙ７６のうち一以上がその他のアミノ酸で置換された変異体５ＨＴ１Ａ受容体であり得る。
【００７８】
５ＨＴ２Ｃ受容体のＬｅｕ９５、Ｓｅｒ９４及びＭｅｔ９３に対応するアミノ酸残基は５ＨＴ１Ｂ受容体ではそれぞれＬｅｕ９１、Ｓｅｒ９０、及びＡｌａ８９であり、それゆえ変異体ＧＰＣＲは、Ｌｅｕ９１、Ｓｅｒ９０及びＡｌａ８９のうち一以上がその他のアミノ酸で置換された変異体５ＨＴ１Ｂ受容体であり得る。
【００７９】
５ＨＴ２Ｃ受容体のＬｅｕ９５、Ｓｅｒ９４及びＭｅｔ９３に対応するアミノ酸残基は５ＨＴ１Ａ受容体ではそれぞれＬｅｕ１１６、Ｓｅｒ１１５及びＭｅｔ１１４であり、それゆえ変異体ＧＰＣＲは、Ｌｅｕ１１６、Ｓｅｒ１１５及びＭｅｔ１１４のうち一以上がその他のアミノ酸で置換された変異体５ＨＴ１Ａ受容体であり得る。
【００８０】
５ＨＴ２Ｃ受容体のＬｅｕ９５、Ｓｅｒ９４及びＭｅｔ９３に対応するアミノ酸残基は５ＨＴ６受容体ではそれぞれＬｅｕ６８、Ｓｅｒ６７及びＶａｌ６６であり、それゆえ変異体ＧＰＣＲは、Ｌｅｕ６８、Ｓｅｒ６７及びＶａｌ６６のうち一以上がその他のアミノ酸で置換された変異体５ＨＴ６受容体であり得る。
【００８１】
５ＨＴ２Ｃ受容体のＬｅｕ９５、Ｓｅｒ９４及びＭｅｔ９３に対応するアミノ酸残基は５ＨＴ７受容体ではそれぞれＬｅｕ１２３、Ｓｅｒ１２２及びＶａｌ１２１であり、それゆえ変異体ＧＰＣＲは、Ｌｅｕ１２３、Ｓｅｒ１２２及びＶａｌ１２１のうち一以上がその他のアミノ酸で置換された変異体５ＨＴ７受容体であり得る。
【００８２】
変異体ムスカリン受容体
ムスカリン受容体は当該技術分野にて良く知られている。それらはお互いに配列相同性を共有しムスカリンに結合する。
【００８３】
特に好ましい実施態様では、親ＧＰＣＲと比較して増加した安定性を持つ変異体ＧＰＣＲは、変異体ムスカリン受容体であり、対応する親受容体と比較した場合、図４に示されたヒトＭ４ムスカリン受容体の番号付けによるＬｅｕ７１に対応する位置にて異なるアミノ酸を有する。
【００８４】
変異体ムスカリン受容体は、図４に示されたヒトＭ４受容体の番号付けによるＬｅｕ７１に対応する位置にて変異されていることを条件とし、任意のセロトニン受容体の変異体であり得る。
【００８５】
変異体ＧＰＣＲは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，４６７３−４６８０）を使用して決定した通り、図４に配列が示された所定のヒトＭ４ムスカリン受容体と比較した場合、少なくとも２０％のアミノ酸配列同一性を有するものであることが特に好ましい。より好ましくは、変異体ＧＰＣＲは少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する。一般的にムスカリン結合部位に高次の配列保存性がある。
【００８６】
下記実施例１に記載の通り、Ｍ４ムスカリン受容体配列（図４に示した通り）のＬｅｕ７１の単一置換は、アゴニストのＮＭＳで測定した場合、熱安定性の増加をもたらす。
【００８７】
従って、変異体ＧＰＣＲは親と比較した場合にＬｅｕ７１がその他のアミノ酸残基により置換されたヒト変異体Ｍ４ムスカリン受容体であり得る。変異体ＧＰＣＲはまた、親受容体の一以上の対応するアミノ酸がその他のアミノ酸残基によって置換された、その他の種由来の変異体ムスカリン受容体であり得る。誤解を避けるために、親は天然に存在する配列を有するムスカリン受容体であり得、又はそれは切断された型であり得、又はそれは天然に存在するタンパク質か又その断片に対する融合物であり得、又はそれはリガンド結合能を保持することを条件とし、天然に存在する配列と比較して変異を含み得る。
【００８８】
「対応するアミノ酸残基」とは、Ｍ４ムスカリン受容体と他のムスカリン受容体をＭａｃＶｅｃｔｏｒとＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して比較した場合、Ｍ４ムスカリン受容体の所定のアミノ酸残基に対しアラインするその他のムスカリン受容体のアミノ酸残基を意味することを含む。
【００８９】
他のヒトムスカリン受容体はＭ１、Ｍ２、Ｍ３、及びＭ５ムスカリン受容体を含む。Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、及びＭ５ムスカリン受容体の各々におけるヒトＭ４ムスカリン受容体のＬｅｕ７１に対応するアミノ酸残基はそれぞれＬｅｕ６４、Ｌｅｕ６２、Ｌｅｕ１０７及びＬｅｕ６９である。従って変異体ＧＰＣＲはＬｅｕ６４がその他のアミノ酸により置換された変異体Ｍ１ムスカリン受容体であり得、又はそれはＬｅｕ６２がその他のアミノ酸により置換された変異体Ｍ２ムスカリン受容体であり得、又はそれはＬｅｕ１０７がその他のアミノ酸により置換された変異体Ｍ３ムスカリン受容体であり得、又はそれはＬｅｕ６９がその他のアミノ酸により置換された変異体Ｍ５ムスカリン受容体であり得る。
【００９０】
変異体ニューロテンシン受容体
ニューロテンシン受容体は当該技術分野にて良く知られている。それらはお互いに配列相同性を共有しムスカリンに結合する。
【００９１】
特に好ましい実施態様では、親ＧＰＣＲと比較して増加した安定性を持つ変異体ＧＰＣＲは変異体ニューロテンシン受容体であり、対応する親受容体と比較した場合、図１１に示されたラットニューロテンシン受容体の番号付けによるＴｙｒ３６９に対応する位置にて異なるアミノ酸を有する。
【００９２】
変異体ニューロテンシン受容体は、図１１に示されたラットニューロテンシン受容体の番号付けによるＴｙｒ３６９に対応する位置にて変異されていることを条件とし、任意のニューロテンシン受容体の変異体であり得る。
【００９３】
変異体ＧＰＣＲは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，４６７３−４６８０）を使用して決定した通り、図１１に配列が示された所定のラットニューロテンシン受容体と比較した場合、少なくとも２０％のアミノ酸配列同一性を有するものであることが特に好ましい。より好ましくは、変異体ＧＰＣＲは少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する。一般的にニューロテンシン結合部位に高次の配列保存性がある。
【００９４】
下記実施例２に記載の通り、ラットニューロテンシン受容体配列（図１１に示した通り）のＴｙｒ３６９の単一置換は、アゴニストのニューロテンシンで測定した場合、熱安定性の増加をもたらす。
【００９５】
従って、変異体ＧＰＣＲは、親と比較した場合にＴｙｒ３６９がその他のアミノ酸残基により置換された、ラットニューロテンシン受容体であり得る。変異体ＧＰＣＲはまた、親受容体の一以上の対応するアミノ酸がその他のアミノ酸残基によって置換された、その他の種由来の変異体ニューロテンシン受容体であり得る。誤解を避けるために、親は天然に存在する配列を有するニューロテンシン受容体であり得、又はそれは切断された型であり得、又はそれは天然に存在するタンパク質か又その断片に対する融合物であり得、又はそれはリガンド結合能を保持することを条件とし、天然に存在する配列と比較して変異を含み得る。
【００９６】
「対応するアミノ酸残基」とは、ラットニューロテンシン受容体と他のニューロテンシン受容体をＭａｃＶｅｃｔｏｒとＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて比較した場合、ラットニューロテンシン受容体の所定のアミノ酸残基に対しアラインするその他のニューロテンシン受容体のアミノ酸残基を意味することを含む。
【００９７】
変異体コルチコトロピン放出ホルモン受容体
コルチコトロピン放出ホルモン受容体は当該技術分野にて良く知られている。それらはお互いに配列相同性を共有しコルチコトロピン放出ホルモンに結合する。
【００９８】
特に好ましい実施態様では、親ＧＰＣＲと比較して増加した安定性を持つ変異体ＧＰＣＲは、変異体コルチコトロピン放出ホルモン受容体であり、対応する親受容体と比較した場合、図１２に示されたヒトコルチコトロピン放出ホルモン受容体１（ＣＲＦ１）の番号付けによるＩｌｅ１６３に対応する位置にて異なるアミノ酸を有する。
【００９９】
変異体コルチコトロピン放出ホルモン受容体は、図１２に示されたヒトＣＲＦ１の番号付けによるＩｌｅ１６３に対応する位置にて変異されていることを条件とし、任意のコルチコトロピン放出ホルモン受容体の変異体であり得る。
【０１００】
変異体ＧＰＣＲは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，４６７３−４６８０）を用いて決定した通り、図１２に配列が示された所定のヒトＣＲＦ１受容体と比較した場合、少なくとも２０％のアミノ酸配列同一性を有するものであることが特に好ましい。より好ましくは、変異体ＧＰＣＲは少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する。一般に、コルチコトロピン放出ホルモン結合部位に高次の配列保存性がある。
【０１０１】
下記実施例３に記載の通り、ヒトＣＲＦ１配列（図１２に示した通り）のＩｌｅ１６３の単一置換は、アゴニストのＣＰ−３７６３９５で測定した場合、熱安定性の増加をもたらす。
【０１０２】
従って、変異体ＧＰＣＲは親と比較した場合にＩｌｅ１６３がその他のアミノ酸残基により置換された、変異体ＣＲＦ１であり得る。変異体ＧＰＣＲはまた、親受容体の一以上の対応するアミノ酸がその他のアミノ酸残基によって置換された、その他の種由来の変異体ＣＲＦ１受容体であり得る。誤解を避けるために、親は天然に存在する配列を有するコルチコトロピン放出ホルモン受容体であり得、又はそれは切断された型であり得、又はそれは天然に存在するタンパク質か又その断片に対する融合物であり得、又はそれはリガンド結合能を保持することを条件とし、天然に存在する配列と比較して変異を含み得る。
【０１０３】
「対応するアミノ酸残基」とは、ヒトＣＲＦ１受容体と他のコルチコトロピン放出ホルモン受容体をＭａｃＶｅｃｔｏｒとＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて比較した場合、ヒトＣＲＦ１受容体の所定のアミノ酸残基に対しアラインするその他のコルチコトロピン放出ホルモン受容体のアミノ酸残基を意味することを含む。
【０１０４】
変異体オレキシン受容体
オレキシン受容体は当該技術分野にて良く知られている。それらはお互いに配列相同性を共有しオレキシンに結合する。
【０１０５】
特に好ましい実施態様では、親ＧＰＣＲと比較して増加した安定性を持つ変異体ＧＰＣＲは変異体オレキシン受容体であり、対応する親受容体と比較した場合、図１３に示されたヒトオレキシン２受容体（ＯＸ２）の番号付けによるＴｙｒ９１に対応する位置にて異なるアミノ酸を有する。
【０１０６】
変異体オレキシン受容体は、図１３に示されたヒトＯＸ２の番号付けによるＴｙｒ９１に対応する位置にて変異されていることを条件とし、任意のオレキシン受容体の変異体であり得る。
【０１０７】
変異体ＧＰＣＲは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，４６７３−４６８０）を使用して決定した通り、図１３に配列が示された所定のヒトＯＸ２と比較した場合、少なくとも２０％のアミノ酸配列同一性を有するものであることが特に好ましい。より好ましくは、変異体ＧＰＣＲは少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する。一般的にオレキシン結合部位に高次の配列保存性がある。
【０１０８】
下記実施例４に記載の通り、ヒトＯＸ２配列（図１３に示した通り）のＴｙｒ９１の単一置換は、アゴニストのＥＭＰＡで測定した場合、熱安定性の増加をもたらす。
【０１０９】
従って、変異体ＧＰＣＲは、親と比較した場合にＴｙｒ９１がその他のアミノ酸残基により置換されたヒトＯＸ２受容体であり得る。変異体ＧＰＣＲはまた、親受容体の一以上の対応するアミノ酸がその他のアミノ酸残基によって置換された、その他の種由来の変異体オレキシン受容体であり得る。誤解を避けるために、親は天然に存在する配列を有するオレキシン受容体であり得、又はそれは切断された型であり得、又はそれは天然に存在するタンパク質か又その断片に対する融合物であり得、又はそれはリガンド結合能を保持することを条件とし、天然に存在する配列と比較して変異を含み得る。
【０１１０】
「対応するアミノ酸残基」とは、ヒトＯＸ２と他のオレキシン受容体をＭａｃＶｅｃｔｏｒとＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて比較した場合、ヒトＯＸ２の所定のアミノ酸残基に対しアラインするその他のオレキシン受容体のアミノ酸残基を意味することを含む。
【０１１１】
本発明の第二態様は本発明の第一態様の方法により作成された親ＧＰＣＲと比較して増加した安定性を持つ変異体ＧＰＣＲを提供する。
【０１１２】
本発明者らは親のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列にiプラス又はマイナス５残基のウインドウ（例えば、iプラス又はマイナス４残基のウインドウ）内で変異を作成することは（ここでiは親ＧＰＣＲの残基２．４６の位置である）、増加した安定性を有する親ＧＰＣＲの一以上の変異体を与えることができることを実証した。更に、本発明者らはアミノ酸配列がiプラス又はマイナス５残基のウインドウ（例えばiプラス又はマイナス４残基のウインドウ）と相互作用する、親ＧＰＣＲ内の膜貫通へリックス７のアミノ酸配列内において変異を作成することは、増加した安定性を有する親ＧＰＣＲの一以上の変異体を与えることができることを実証した。従って、本発明の第二態様の変異体ＧＰＣＲは不安定化条件下においてその親と比較して長寿命であろうことが理解される。
【０１１３】
従って、本発明の第三態様は、親ＧＰＣＲと比較した場合、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中に一以上の変異を有する変異体ＧＰＣＲを与え、（ｉ）一以上の変異がｉプラス又はマイナス５残基以内に位置し（親ＧＰＣＲがクラス１ＧＰＣＲである場合、ｉは親ＧＰＣＲの残基２．４６の位置であり、又は親ＧＰＣＲがクラス２又は３ＧＰＣＲである場合ｉは親ＧＰＣＲの等価なアミノ酸の位置である）、及び／又は（ｉｉ）一以上の変異が、親ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス７のアミノ酸配列中に位置し、そのアミノ酸配列はｉプラス又はマイナス５残基のウインドウと相互作用し、その変異体ＧＰＣＲが不安定化条件に曝された場合、親ＧＰＣＲと比較して増加した安定性を有する。
【０１１４】
従って、本発明は、親ＧＰＣＲと比較した場合に、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中に一以上の変異を有する変異体ＧＰＣＲを与え、（ｉ）一以上の変異がｉプラス又はマイナス４残基以内に位置し（親ＧＰＣＲがクラス１ＧＰＣＲである場合、ｉは親ＧＰＣＲの残基２．４６の位置であり、又は親ＧＰＣＲがクラス２又は３ＧＰＣＲである場合ｉは親ＧＰＣＲの等価なアミノ酸の位置である）、及び／又は（ｉｉ）一以上の変異が、親ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス７のアミノ酸配列中に位置し、そのアミノ酸配列はｉプラス又はマイナス４残基のウインドウと相互作用し、その変異体ＧＰＣＲが不安定化条件に曝された場合、親ＧＰＣＲと比較して増加した安定性を有する。
【０１１５】
また、変異体ＧＰＣＲを含む組成物の生産を可能にし、変異体ＧＰＣＲが不安定化条件に曝されることを特徴とすると理解される。そのような組成物は、例えば、結晶化、薬物スクリーニング、生検及びバイオセンサーへの適用において様々な用途を有している。
【０１１６】
従って、本発明の第四態様は、親ＧＰＣＲと比較した場合、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中に一以上の変異を有する変異体ＧＰＣＲを含む組成物を与え、（ｉ）一以上の変異がｉプラス又はマイナス５残基以内に位置し（親ＧＰＣＲがクラス１ＧＰＣＲである場合、ｉは親ＧＰＣＲの残基２．４６の位置であり、又は親ＧＰＣＲがクラス２又は３ＧＰＣＲである場合ｉは親ＧＰＣＲの等価なアミノ酸の位置である）、及び／又は（ｉｉ）一以上の変異が親ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス７のアミノ酸配列中に位置し、そのアミノ酸配列はｉプラス又はマイナス５残基のウインドウと相互作用し、変異体ＧＰＣＲが変異体ＧＰＣＲよりも親ＧＰＣＲを非常に不安定にするのに有効な不安定化条件に曝されることを特徴とする。
【０１１７】
従って、本発明は、親ＧＰＣＲと比較した場合、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中に一以上の変異を有する変異体ＧＰＣＲを含む組成物を与え、（ｉ）一以上の変異がｉプラス又はマイナス４残基以内に位置し（親ＧＰＣＲがクラス１ＧＰＣＲである場合、ｉは親ＧＰＣＲの残基２．４６の位置であり、又は親ＧＰＣＲがクラス２又は３ＧＰＣＲである場合ｉは親ＧＰＣＲの等価なアミノ酸の位置である）、及び／又は（ｉｉ）一以上の変異が親ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス７のアミノ酸配列中に位置し、そのアミノ酸配列はｉプラス又はマイナス４残基のウインドウと相互作用し、変異体ＧＰＣＲが変異体ＧＰＣＲよりも親ＧＰＣＲを非常に不安定にするのに有効な不安定化条件に曝されることを特徴とする。
【０１１８】
「不安定化条件」とは、膜内でフォールドした天然型状態からアンフォールドした状態にＧＰＣＲタンパク質の集団の平衡をシフトさせることのできる任意の条件を含む。このようにして、アンドールド状態で存在するＧＰＣＲタンパク質の割合が増加し、膜内でフォールドした天然型状態の割合が減少する。
【０１１９】
「集団」とは、異なるＧＰＣＲの混合物とは対照的に、複数の同一の特定型のＧＰＣＲを含む。例えば、集団は少なくとも２、５、１０、５０、１００、２００、５００、１０００、５０００、１００００、１０００００、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３又は１０１４のＧＰＣＲ分子を含み得る。好ましくは、集団はＧＰＣＲが１０９及び１０１２のＧＰＣＲ分子を含み得る。
【０１２０】
膜内でフォールドした天然型状態にて、ＧＰＣＲは生物学的活性、例えば結合活性又はシグナル伝達経路調節活性を示す。上記の通り不安定化条件に対する曝露が増加すると、更にアンフォールドした状態に向かって平衡がシフトし、アンフォールドした状態で存在するＧＰＣＲの占める割合が次第に高くなる。フォールド状態からアンフォールド状態への構造の変化はＧＰＣＲ集団の構造において検出可能な変化をもたらす。また、この構造変化はＧＰＣＲ集団の生物学的活性に検出可能な減少をもたらす。
【０１２１】
それゆえ、一実施態様にて、不安定化条件は不安定化条件が存在しないときのＧＰＣＲ集団の構造と比較して、ＧＰＣＲ集団の構造に有意な揺らぎ（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）をもたらすのに有効なものである。
【０１２２】
「ＧＰＣＲ集団の構造における有意な揺らぎ」とは、揺らぎを検出するために用いた測定の統計的変動に関して評価した場合、１０回の測定に１回未満、より好ましくは２０回の測定に１回未満、及び更により好ましくは５０回の測定に１回又は１００回の測定に１回、偶然起きるであろう揺らぎを意味する。
【０１２３】
タンパク質の構造を精査する様々な方法が当該技術分野で知られており任意の適切な方法が用いられ得る。例えば、構造揺らぎは例えば共有結合した蛍光標識又はｅｓｒによるスピン標識等により直接的に立体構造を精査することによるか、若しくはタンパク質集団において天然型又は計画的に導入されたアミノ酸側鎖の接触性を測定することにより分析され得る（Ｈｕｂｂｅｌｌ，Ｗ．Ｌ.等，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｈｅｍ ６３，２４３−２９０（２００３）；Ｂａｎｅｒｅｓ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，２０２５３−２０２６０（２００５）；Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．及びＤｅｕｐｉ，Ｘ．Ｔｒｅｎｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２８，３９７−４０６（２００７））。例えば、蛍光スペクトルの変化は、内在トリプトファン蛍光の使用によるか、又はタンパク質のアンフォールディングにより露出したシステイン残基と反応して蛍光性となるチオール固有の蛍光色素Ｎ−［４−（７−ジエチルアミノ−４−メチル−３−クマリニル）フェニル］マレイミド（ｃｐｍ）の使用によるかにより、タンパク質のアンフォールディングの高感度指標となる可能性がある（Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ等（２００８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １６：３５１−３５９）。タンパク質分解に関する安定性、質量分析又は核磁気共鳴スペクトルにより測定される重水素／水素交換、青色天然ゲル、キャピラリーゾーン電気泳動、円偏光二色性（ＣＤ）又は線二色性（ＬＤ）スペクトル及び光散乱はまた２次又は３次構造に関連するシグナルの消失により構造ゆらぎを測定するために用いられ得る。
【０１２４】
その他の実施態様では、不安定化条件とは不安定化条件の非存在下における同じ活性の水準と比較して、ＧＰＣＲ集団の生物活性（例えば、結合活性又はシグナル伝達調節活性）に有意な減少をもたらすのに有効なものである。例えば、薬剤はＧＰＣＲ集団の生物活性を、不安定化条件の非存在下において測定した場合の同じ活性レベルの９０−１０％、例えば７０−３０％又は６０−４０％に減少させるものであり得る。
【０１２５】
生物活性に依存して、ＧＰＣＲ集団の生物活性が当該技術分野で知られた任意の適切な方法を使用して測定され得ると理解されるであろう。
【０１２６】
「結合活性」とは、ＧＰＣＲに結合することが知られた任意の結合パートナーへの結合を含む。例えば、結合パートナーは、リガンド、例えばＧＰＣＲを特定の立体構造において存在させるものであり得、又は抗体、例えば立体構造特異的抗体であり得る。結合活性は当該技術分野で知られた通例の結合実験を用いて評価可能である。都合良いことに、結合パートナーは検出可能なように標識され、例えば放射性標識又は蛍光標識される。あるいは、結合は、例えば抗体又は検出可能な成分に共有結合した高親和性結合パートナー、例えば比色分析に用いられ得る酵素（例えばアルカリフォスファターゼ又は西洋わさびペルオキシダーゼ）等、２次的検出システムを用いて、非結合の結合パートナーの量を測定することで評価可能である。パッチクランプ、蛍光相関分光法、蛍光共鳴エネルギー移動及び分析超遠心分離等の生物物理学的技術も使用され得る（Ｎｅｗ，Ｒ．Ｃ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．第１版；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ，１９９０，及びＧｒａｈａｍ，Ｊ．Ｍ．；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７．に記載の通り）。
【０１２７】
生物活性はシグナル伝達経路調節活性であり、活性は特定のシグナル伝達経路のアッセイのための任意の適したアッセイにより評価可能である。経路はＧタンパク質活性化の下流であるか、又はＧタンパク質活性化とは独立であり得る。Ｇタンパク質の活性化は放射標識されたＧＴＰ等のグアニンヌクレオチドがＧタンパク質へ結合することにより直接測定可能である（Ｊｏｈｎｓｏｎ等，Ａｓｓａｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ．２００８ Ｊｕｎ；６（３）：３２７−３７）。あるいは、受容体に対するＧタンパク質又はアレスチン等のシグナル伝達タンパク質の結合は蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）（Ｌｏｈｓｅ等，Ａｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．２００７；７４：１６７−８８）又は生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）（Ｇａｌｅｓ等，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００５ Ｍａｒ；２（３）：１７７−８４）等の関連のアッセイ、又は酵素相補アッセイ（Ｚｈａｏ等，Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ．２００８ Ｓｅｐ；１３（８）：７３７−４７．Ｅｐｕｂ ２００８）により測定され得る。これらのアッセイは、例えばＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ又はＣｉｓＢｉｏ又はＤｉｓｃｏｖｅｒＸからキットとして一般的入手される。活性は特定のシグナル伝達経路の活性を測定するレポーター遺伝子を用いて測定され得る。レポーター遺伝子とは、活性を容易にアッセイすることができるレポータータンパク質をコードする遺伝子、例えばβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、ルシフェラーゼ、又は緑蛍光タンパク質（例えばＴａｎ等，１９９６ ＥＭＢＯ Ｊ １５（１７）：４６２９−４２を参照）を含む。本発明における使用に適しているであろうレポーター遺伝子の発現を検出し測定するために、当該技術分野にて複数の技術が入手可能である。これらの多くはインビトロ及びインビボにおける発現を決定するために両方のキットが入手できる。あるいは、シグナル伝達が下流のターゲットの分析によりアッセイされ得る。例えば、発現が特定のシグナル伝達経路のコントロール下にあることが知られている特定のタンパク質が定量化されるか、又は二次代謝が定量化され得る。Ａ２Ａアゴニスト刺激の結果として細胞内ｃＡＭＰレベルの定量化が実施例１に説明されている。生物学試料中のタンパク質レベルは当該技術分野にて知られた任意の適した方法を使用して決定することが可能である。例えば、タンパク質濃度は、例えばＥＬＩＺＡ、ウエスターンブロッット法、及びラジオイムノアッセイ等のイムノアッセイを含む抗体に基づく方法によるか、又はバイオセンサーの使用により調べることが可能である（Ｐｏｎｓｉｏｅｎ等 ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．２００４ Ｄｅｃ；５（１２）：１１７６−８０）。
【０１２８】
一実施態様では、不安定化条件は、熱、界面活性剤、グアニジニウムチオシアネート等のカオトロピック剤、極端なｐＨ、有機溶液、水溶液又は膜の無い環境のうちの何れかである。
【０１２９】
例えば、不安定化条件は、例えば次の結晶化研究のために関心がある界面活性剤であり、例えばＣ８−グルコシド、Ｃ８−チオグルコシド、Ｃ９−グルコシド、Ｃ８−マルトシド、Ｃ８−チオマルトシド、Ｃ９マルトシド、Ｃ９チオマルトシド、Ｃｙｍａｌ ５、Ｃ８Ｅ５、又はラウリルジメチルアミンオキシド等の高ＣＭＣを持つ短鎖長界面活性剤を含む界面活性剤であり得る。短鎖長界面活性剤は３次元結晶格子の形成を可能にしやすく、低ＣＭＣを持つ長鎖長界面活性剤よりも、透析又は他の方法により受容体の調製液から除去することが容易である。
【０１３０】
不安定化条件は任意の他の両親媒性分子であり得る。例えば、不安定化条件はアンフィポル（ａｍｐｈｉｐｏｌｓ）、メリチン等の両親媒性ペプチド、アポリポタンパク質及びその誘導体等のタンパク質、トリフルオロエタノール、ジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍｉｄｅ）、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒、クロロホルム／メタノール混合物、尿素、シクロデキストリン、ポリエン系抗生物質、グアニジン塩化水素、プロカインやクロルプロマジン等の局所麻酔薬や薬剤、ブタンジオール、ヘプタントリオール等のポリオール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタンジオールおよびベンジルアルコール等の短鎖アルコールの何れかであり得る。
【０１３１】
不安定化条件は任意の水溶液であり得ることも理解されよう。
【０１３２】
不安定化条件は、下記に議論される通り変異体ＧＰＣＲが膜の無い形態で存在するような、膜の無い環境であり得ると更に理解されるであろう。
【０１３３】
とにかく、不安定化条件はＧＰＣＲタンパク質集団の平衡を膜の中でフォールドした天然型状態からアンフォールド状態へシフトすることが可能である条件である。
【０１３４】
本発明の第三及び第四の態様の一実施態様にて、変異体ＧＰＣＲは膜が無い。「膜の無い（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｒｅｅ)」とは、脂質二分子層又は脂質単分子層等の膜が実質的に無い変異体ＧＰＣＲを意味することを含む。例えば、変異体ＧＰＣＲが、天然型のフォールド状態で膜に存在する場合と異なり、膜内に存在しない形態であり得る。
【０１３５】
親ＧＰＣＲと比較して、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列において、iプラス又はマイナス５残基のウインドウ（例えば、iプラス又はマイナス４残基のウインドウ）内に一以上の変異を有し、ここでiはアミノ酸残基２．４６又は場合によっては親ＧＰＣＲにおけるその等価であり、及び／又は親ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス７のアミノ酸配列中に一以上の変異を有し、そのアミノ酸配列が、iプラス又はマイナス５残基のウインドウ（例えば、iプラス又はマイナス４残基のウインドウ）と相互作用する変異体ＧＰＣＲの増加した安定性を考慮すると、不安定化条件は親ＧＰＣＲを変異体ＧＰＣＲよりもより大きく不安定にする、すなわち変異体ＧＰＣＲ集団の平衡を膜の中でフォールドした天然型状態からアンフォールド状態へシフトさせるよりも更に、親ＧＰＣＲの集団の平衡をフォールドした天然型状態からアンフォールド状態へシフトさせるであろうことが理解される。
【０１３６】
従って、親ＧＰＣＲが、例えば不安定化条件に曝露された場合に生物活性の５０％を示す場合、典型的には親タンパク質に比較して増加した安定性を持つ変異体ＧＰＣＲは、不安定化条件に曝露された親タンパク質よりも、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％又は５０％、より生物活性を有し、及びより好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％、より活性を、及び更により好ましくは、少なくとも１５０％又は２００％、より活性を有するであろう。
【０１３７】
同様に、親ＧＰＣＲに比較して増加した安定性を持つ変異体ＧＰＣＲは、不安定化条件に曝された場合、親タンパク質の構造がフォールドした天然型状態に似ているよりも、よりフォールドした天然型状態に似ている構造を有するであろう。
【０１３８】
このようにして、本発明は、不安定化条件に曝された場合、親ＧＰＣＲに比較して増加した安定性を有する変異体ＧＰＣＲ、及び本発明の変異体ＧＰＣＲを含む組成物を可能にし、変異体ＧＰＣＲが、親ＧＰＣＲを変異体ＧＰＣＲよりも大きく不安定化するのに有効な、不安定化剤に曝されることを特徴とする。例えば、本発明は本発明による変異体ＧＰＣＲの可溶化形態を可能にする。
【０１３９】
変異体ＧＰＣＲにおいて好ましいのは、本発明の第一態様に関して上記に定義された通りである。例えば、本発明の第三態様の変異体ＧＰＣＲは、対応する親の受容体と比較した場合、図２に示したヒトアデノシンＡ２Ａ受容体の番号付けによるＬｅｕ４８及びＡｓｎ２８４の一以上に対応する位置に異なるアミノ酸を有する変異体アデノシン受容体であり得、又は本発明の第四態様の組成物は該変異体アデノシン受容体を含み得る。好ましくは、アデノシン受容体は、図２に配列が示されたヒトアデノシン受容体と少なくとも２０％同一なアミノ酸配列を有する。
【０１４０】
本発明の第三態様の変異体ＧＰＣＲは、対応する親の受容体と比較した場合、図３に示した５ＨＴ２Ｃ受容体の番号付けによるＭｅｔ９３、Ｓｅｒ９４、Ｌｅｕ９５、Ｉｌｅ３６３、及びＬｅｕ３６６の一以上に対応する位置に異なるアミノ酸を有する変異体セロトニン受容体であり得、又は本発明の第四態様の組成物は該変異体セロトニン受容体を含み得る。好ましくは、セロトニン受容体は、図３に配列が示されたヒト５ＨＴ２Ｃ受容体と少なくとも２０％同一なアミノ酸配列を有する。
【０１４１】
本発明の第三態様の変異体ＧＰＣＲは、対応する親の受容体と比較した場合、図４に示したＭ４ムスカリン受容体の番号付けによるＬｅｕ７１に対応する位置に異なるアミノ酸を有するムスカリン受容体であり得、又は本発明の第四態様の組成物は該ムスカリン受容体を含み得る。好ましくは、変異体ムスカリン受容体は、図４に配列が示されたヒトＭ４ムスカリン受容体と少なくとも２０％同一なアミノ酸配列を有する。
【０１４２】
本発明の第三態様の変異体ＧＰＣＲは、対応する親の受容体と比較した場合、図１１に示したラットニューロテンシン受容体の番号付けによるＴｙｒ３６９に対応する位置に異なるアミノ酸を有するニューロテンシン受容体であり得、又は本発明の第四態様の組成物は該ニューロテンシン受容体を含み得る。好ましくは、変異体ニューロテンシン受容体は、図１１に配列が示されたラットニューロテンシン受容体と少なくとも２０％同一なアミノ酸配列を有する。
【０１４３】
本発明の第三態様の変異体ＧＰＣＲは、対応する親の受容体と比較した場合、図１２に示したヒトＣＲＦ１受容体の番号付けによるＩｌｅ１６３に対応する位置に異なるアミノ酸を有するコルチコトロピン放出ホルモン受容体であり得、又は本発明の第四態様の組成物は該コルチコトロピン放出ホルモン受容体を含み得る。好ましくは、変異体コルチコトロピン放出ホルモン受容体は、図１２に配列が示されたヒトＣＲＦ１受容体と少なくとも２０％同一なアミノ酸配列を有する。
【０１４４】
本発明の第三態様の変異体ＧＰＣＲは、対応する親の受容体と比較した場合、図１３に示したヒトＯＸ２受容体の番号付けによるＴｙｒ９１に対応する位置に異なるアミノ酸を有するオレキシン受容体であり得、又は本発明の第四態様の組成物は該オレキシン受容体を含み得る。好ましくは、変異体オレキシン受容体は、配列が図１３に示されたヒトＯＸ２受容体と少なくとも２０％同一なアミノ酸配列を有する。
【０１４５】
本発明の第三及び第四の態様の実施態様では、変異体ＧＰＣＲは、Ｍａｄａｂｕｓｈｉ等、２００４ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９（９）：８１２６−８１３２（あらゆる免責事項を作る目的を含み、参照により本明細書に援用される）に記載された通り、位置７９のロイシン残基がアラニン又はセリン残基に変化した変異体ウシロドプシン受容体では無い。
【０１４６】
本発明の第二又は第三態様の変異体ＧＰＣＲ、又は本発明の第四態様の組成物中の変異体ＧＰＣＲは、熱、界面活性剤、カオトロピック剤及び極端なｐＨの何れか一つに対して増加した安定性を有する。好ましくは変異体ＧＰＣＲは、そのリガンドの存在下又は非存在下においてその親と比較して増加した安定性（例えば、熱安定性）を有する。典型的には、リガンドはオルソステリック又はアロステリックを問わず、アンタゴニスト、完全なるアゴニスト、部分的なアゴニスト又は逆アゴニストである。リガンドは抗体等のポリペプチドであり得る。
【０１４７】
本発明の第二又は第三態様の変異体ＧＰＣＲ、又は本発明の第四態様の組成物中の変異体ＧＰＣＲは、その親よりも少なくとも１℃又は２℃、より安定であり、好ましくはその親よりも少なくとも５℃、より安定であり、より好ましくは少なくとも８℃、より安定であり、更により好ましくは少なくとも１０℃又は１５℃又は２０℃、より安定である。典型的には、親と変異体受容体の熱安定性は同一条件下で測定される。典型的には、熱安定性はＧＰＣＲが特定の立体構造にて存在する条件下でアッセイされる。典型的には、選択された条件はＧＰＣＲに結合するリガンドの存在である。
【０１４８】
本発明の第二又は第三態様の変異体ＧＰＣＲ、又は本発明の第四態様の組成物中の変異体ＧＰＣＲは、適切な界面活性剤に可溶化され精製された場合、ドデシルマルトシドで精製されたウシロドプシンと似た熱安定性を有する；しかしながら、安定性の任意の増加は結晶化研究等の適用に対して有用となるであろう。本発明の第二又は第三態様の変異体ＧＰＣＲ、又は本発明の第四態様の組成物中の変異体ＧＰＣＲは、４０℃で３０分間加熱後にそのリガンド結合活性の少なくとも５０％を保持することが特に好ましい。本発明の第二又は第三態様の変異体ＧＰＣＲ、又は本発明の第四態様の組成物中の変異体ＧＰＣＲは、５５℃で３０分間加熱後にそのリガンド結合活性の少なくとも５０％を保持することが更に好ましい。
【０１４９】
本明細書で開示された変異体ＧＰＣＲ及び組成物は結晶化研究に有用で、創薬プログラムにおいて有用である。それらは、例えば、表面プラズモン又は蛍光に基づく技術による、受容体／リガンドの速度論的及び熱力学的パラメーターの生物物理学測定に使用され得る。それらはリガンド結合スクリーニングに用いられ、ハイスループットスクリーンにおける又はバイオセンサーチップとしての使用のため固体表面に結合され得る。変異体ＧＰＣＲ又は組成物を含むバイオセンサーチップは分子、とりわけ生物分子の検出のために用いられ得る。
【０１５０】
本発明はまた本発明の第二又は第三態様の変異体ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む。特に、ポリヌクレオチドは、本発明の変異体アデノシン受容体、変異体セロトニン受容体又は変異体ムスカリン受容体をコードするものが含まれる。ポリヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。典型的にはそれはベクター、例えば前記変異体ＧＰＣＲを発現するために使用可能なベクターに含まれる。適切なベクターは、細菌又は哺乳動物又は昆虫の細胞において増殖するか、及び／又はその発現を可能とするものである。
【０１５１】
本発明はまた変異体ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む細菌性又は真核細胞等の宿主細胞を含む。適切な細胞は、大腸菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞及び昆虫細胞を含む。
【０１５２】
この明細書で明らかに先行公開された文書の一覧や議論は、必ずしも文書が最先端の一部であるか、または共通の一般的知識であるとの確認として解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
本発明は以下の図と実施例に関してより詳細に説明される。
【図１】ＧＰＣＲのＣｌｕｓｔａｌ Ｗによる解析。（Ａ）クラス１ＧＰＣＲ（配列番号５−２８４）；（Ｂ）クラス２ＧＰＣＲ（配列番号２８５−２９９）；及び（Ｃ）クラス３ＧＰＣＲ（配列番号３００−３１４）、各々のクラスにおいて、強調表示した領域は保存された２．４６残基又は場合によってはそれと等価な残基を意味する。
【図２】ヒトアデノシンＡ２Ａ受容体のアミノ酸配列（配列番号３１５）。
【図３】ヒト５ＨＴ２Ｃ受容体のアミノ酸配列（配列番号３１６）。
【図４】ヒトＭ４ムスカリン受容体のアミノ酸配列（配列番号３１７）。
【図５】Ａ２Ａ−ＷＴ受容体（黒い円）及びＤＤＭに可溶化したリガンド結合状態のＡ２Ａ−Ｌ４８Ａ変異体（黒い四角）。（Ａ）ＮＥＣＡアゴニスト結合状態、ＴｍＷＴ＝２８．７±０．５℃、ＴｍＬ４８Ａ＝４２．５±１．０℃；（Ｂ）ＺＭアンタゴニスト結合状態、ＴｍＷＴ＝３３．０±０．７℃、ＴｍＬ４８Ａ＝ｎ．ａ；結合検出されず。各々１００ｎＭ及び４００ｎＭで、ＺＭ及びＮＥＣＡは１０×Ｋｄ。
【図６】ＮＥＣＡ刺激の効果を示す代表的なｃＡＭＰの用量応答曲線。（黒い円）Ａ２Ａ−ＷＴ；ｐＥＣ５０＝７．３±０．２℃。（黒い三角）Ａ２Ａ−Ｌ４８Ａ；ｐＥＣ５０＝８．１±０．４℃。
【図７】アゴニストに結合した５ＨＴ２Ｃ受容体の熱安定性。Ｔｍ５ＨＴ２ｃ＝４３．３５℃ＴｍＭ９３Ａ＝４５．６℃及びＴｍＬ９５Ａ＝４８．８℃．
【図８】（Ａ）アンタゴニストに結合したＭ４受容体の熱安定性。ＴｍＭ４＝３４．０℃及びＴｍＬ７１Ａ＝３６．０℃；（Ｂ）アンタゴニストに結合した５ＨＴ２Ｃ受容体の熱安定性。Ｔｍ５ＨＴ２Ｃ＝３７．１℃及びＴｍＳ９４Ａ＝４８．９℃．
【図９】５ＣＨ２３３９０アゴニストに結合状態のＬ３６６Ａ変異体５ＨＴ２Ｃ受容体の熱安定性。
【図１０】Ｌ２．４６（Ｌｅｕ４８）と、Ｌ２．４６に隣接した残基及びＮＰｘｘＹ（配列番号１）モチーフの残基の両方との間の距離を示すアデノシンＡ２Ａ受容体の描写。
【図１１】ラットニューロテンシン受容体のアミノ酸配列（配列番号３１８）。
【図１２】ヒトＣＲＦ１のアミノ酸配列（配列番号３１９）。
【図１３】ヒトＯＸ２のアミノ酸配列（配列番号３２０）。
【図１４】クラス２ＧＰＣＲのＴＭ２領域のアラインメント（配列番号３２１−３６２）。保存された残基２．５９が強調表示される。残基２．５０もまた参考のため強調表示される。
【図１５】ＤＤＭで精製された、アンタゴニスト結合状態のＣＲＦ１−ＷＴ（三角）及びＣＲＦ１ Ｉ１６３Ａ変異体（円）。ＴｍＷＴ＝２６．８°Ｃ，ＴｍＩ１６３Ａ＝３０．７°Ｃ.
【図１６】アンタゴニストに結合したＯＸ２受容体の熱安定性。ＴｍＯＸ２  ＷＴ＝２８．４７℃，ＴｍＯＸ２  Ｙ９１Ｌ＝２９．６９℃。
【実施例】
【０１５４】
実施例１；受容体の熱安定性に対するアミノ酸残基２．４６及び周囲の残基を変異させることの影響
序論
クラス１のＧＰＣＲにおいて、２．４６はＴＭ２の最も保存された残基の一つである（およそＬが９６％、Ｍが２％、Ｉが１．５％及びＶ／Ｔが０．５％）。[非特許文献８及び９］。ＴＭ２の底に位置し、この残基の側鎖はヘリックスの束の方を向き、非常に良く保存された残基であるＴＭ７のＮＰＸＸＹ（配列番号１）モチーフのＮ７．４９、Ｐ７．５０及びＹ７．５３で構成される「マイクロスイッチ」に近接する。下記の通り、多くの異なる受容体についての我々の様々な研究は、この残基をアラニンに変異することがアゴニスト結合受容体の熱安定性を増加させることを明らかにした。意義深いことに、近傍の残基の幾つかを変異することはアゴニスト結合受容体の熱安定性を増加させる。従って、特にこの残基とその周囲の残基を変異させることは、異なるＧＰＣＲを安定化する一般的なアプローチの構成要素となる。残基によりアゴニスト型又はアンタゴニスト型の立体構造をとる受容体の熱安定性を増加させることが可能である。
【０１５５】
結果
アゴニスト結合Ａ２Ａの熱安定性に対するＬ２．４６Ａの影響
アゴニスト結合型の立体構造を安定化するために、フルアゴニストのＮＥＣＡに結合したＡ２Ａ受容体を安定化させ得る変異を同定するために、系統的なアラニンスキャンが実施された。このＡ２Ａアゴニスト結合実験において、Ｌ２．４６（Ｌ４８Ａ）は最も安定化させる単一変異体である。ＮＥＣＡが可溶化受容体に結合した場合、（Ａ２Ａ−Ｌ４８Ａにおいて）Ｌ４８側鎖を除くことでリガンド−受容体複合体の熱安定性を劇的に増加させ、結果として界面活性剤ＤＤＭ中の野生型受容体に比して１４℃の増加をもたらしている（図５ａ）。興味深いことに、この変異はアンタゴニストの結合を消滅させ（図５ｂ）、この側鎖を取り除くことが立体構造変化を誘導し、部分的に又は完全に受容体を活性な立体構造に固定し得ることを示唆している。我々はＡ２Ａ受容体のシグナル伝達の性質をＣＨＯ細胞中に受容体を過剰発現することで評価した。Ａ２Ａアゴニスト刺激は、Ｇｓ−三量体複合体を通じてシグナル伝達を引き起こし、細胞内ｃＡＭＰレベルを増加させる。細胞内ｃＡＭＰの増加は抗ｃＡＭＰ Ｍａｂ抗体競合アッセイを用いることで検出及び定量化可能である。Ａ２Ａ−ＷＴ受容体の効力は、発表されたデータのｐＥＣ５０＝７．２７±０．１９と良く一致する。本変異体はより高い効力（ｐＥＣ５０＝８．１０±０．３９）を示す。しかしながらシグナル伝達の有効性は３０％に減少する（図６）。
【０１５６】
アゴニスト結合５ＨＴ２Ｃの熱安定性に対するＬ２．４６Ａの影響
アゴニスト型の立体構造を安定化するために、アゴニストＳＣＨ２３３９０の存在下で、アラニンスキャンが５ＨＴ２Ｃ受容体において実施された。Ａ２Ａに類似して、Ｌ２．４６（５ＨＴ２ＣのＬ９５）をアラニンに変異させることは、この受容体に有意な安定性を与え、受容体のＴｍを増加させる（図７）。Ｌ９５に加えて近傍のＭ９３（Ｌ２．４６から２残基離れた）をアラニンに変異させることもまたアゴニスト結合受容体に安定性を与え、結果として２．９℃の増加をもたらすことは特記すべきである。
【０１５７】
アゴニスト結合Ｍ４のＬ２．４６領域の変異の影響及び５ＨＴ２Ｃの熱安定性
アンタゴニスト型の立体構造にあるＭ４ムスカリン受容体を安定化するために、ムスカリン性アンタゴニストのＮＭＳに結合した受容体を安定化する変異を同定するために、系統的なアラニンスキャンが実施された。Ｍ４のＬ２．４６残基をアラニンに変異させることはこの受容体の熱安定性を有意には変化させない（データ非開示）。しかしながら、Ｌ７１Ａ（Ｌ２．４６の３残基Ｎ末端側）が安定化変異として同定された。この変異はこの受容体のＴｍを約２℃増加させる（図８ａ）。
【０１５８】
同様に、５ＨＴ２Ｃ受容体のアンタゴニストアラニンスキャンはＬ２．４６をアラニンに変異させることがアゴニスト結合５ＨＴ２Ｃに如何なる安定性をも与えないことを明らかにしたが（データ非開示）、しかし近傍のＳ９４（Ｌ２．４６から一残基離れた）をアラニンに変異させることはアンタゴニスト結合受容体のＴｍを１１．７６℃だけ有意に増加させた（図８ｂ）。
【０１５９】
結論
我々が共有する異なる受容体から得たデータは、Ｌ２．４６及びその周囲の残基が受容体の異なる立体構造を安定化する重要な役割を果たしていることを明らかに示している。この領域の配列保存の高いレベルを考慮すると、この領域の残基の立体構造特異的な安定効果は異なるＧＰＣＲの一般的な特徴であるように見える。これらの変化がいかにして受容体の安定性を改良するのかは明らかでないが、これらの残基を変異させることはＲとＲ＊（活性及び不活性な状態）の間の平衡を変える可能性がある。受容体の基底状態を不安定化することは、アゴニスト結合受容体を安定化する方法の優れた第一工程であるかも知れない。逆に活性な立体構造の形成はR状態へ向けて平衡をシフトすることで、次々に基底状態を安定化する可能性がある。
【０１６０】
材料と方法
受容体の発現
Ａ２ＡＲ−（２−３１６）の発現はｐＲＧ／ＩＩＩ−ｈｓ−ＭＢＰ大腸菌発現ベクター及びＤＨ５α細胞を用いて行った。細胞は、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）及びグルコース（０．２％ｗ／ｖ）が補充された５００ｍＬの２×ＴＹ培地を含む２Ｌフラスコ中で、３７℃で増殖させた。ＯＤ６００がおよそ０．７にて、ＩＰＴＧとテオフィリンを最終濃度をそれぞれ０．５ｍＭと１００μＭとして添加し温度を２０℃へ下げた。２２から２４時間後に細胞を１４ｍＬの分量にて集菌し、３０分遠心分離し−２０℃で保管した。５ＨＴ２ＣとＭ４受容体は一時的にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にて、製造業者のガイドラインに従って使用したＧｅｎｅＪｕｉｃｅトランスフェクション試薬を用いて発現した。
【０１６１】
受容体の可溶化と精製及び熱安定性試験
野生型又は変異体Ａ２ＡＲ−（２−３１６）を発現する大腸菌細胞の一定分量（１４ｍＬ）が氷上で解凍され、細胞を５００μＬのバッファーＡ（完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤混合物（ロッシュ）が補充された、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｍＭ／ｐＨ７．４；０．４ＭのＮａＣｌ、２５０μｇ／ｍＬのリゾチーム（シグマ）、１ｍｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅ Ｉ（シグマ））に再懸濁され、４℃で１時間インキュベートした。試料は次いで、カップ−ホーンソニケーターを使用して超音波処理された。受容体は１％ＤＤＭを添加することで可溶化され４℃で１時間インキュベートした。不溶性物質はチューブを５分間１３０００ｇで４℃にて遠心分離により除去した。可溶化した受容体は一部がＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）により精製された。事前にバッファーＡにて平衡化された３００μＬのアガロースビーズを可溶化受容体７００μＬに添加した。界面活性剤の濃度を減らすために、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｍＭ／ｐＨ７．４；０．４Ｍ ＮａＣｌを最終体積が２ｍＬとなるまで添加した。４℃で２時間インキュベート後に、試料を１３０００ｇで１０秒間４℃で遠心分離し、バッファーＢ（Ｈｅｐｅｓ ２５ｍＭ／ｐＨ７．４ ＫＯＨ，０．０２５％ ＤＤＭ）にて３回洗浄し、５０ｍＭのヒスチジンを補充したバッファーＢにより４℃で３０分間溶出した。上清を直接放射性リガンド結合実験に使用した。具体的には、可溶化した受容体１０８μＬを４μＭ［３Ｈ］−ＮＥＣＡを１２μＬと混合し（最終濃度が４００ｎＭ）、又は１μＭ［３Ｈ］−ＺＭ２４１３８５を１２μＬと混合した（最終濃度が１００ｎＭ）。試料を４℃で４５分間、次いで特定温度で３０分間、その後４℃で３０分間インキュベートした。受容体結合及び遊離した放射性リガンドは９６穴プレートゲル濾過アッセイを用いて分離した。
【０１６２】
一時的に形質移入された哺乳動物細胞発現Ｍ４は形質移入後約４０時間で回収され、受容体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５／２５０ｍＭ ＮａＣｌ／１％ＤＤＭ／ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤混合物に４℃で１時間回転して可溶化した。可溶化した溶解物は次いで４℃で１５分間１３０００ｒｐｍで遠心分離により不要物が除去された。可溶化した受容体は次いでＮｉ−ＮＴＡビーズ上で精製され１００ｍＭヒスチジンで溶出した。溶出した受容体を放射性リガンド結合実験に用いた。Ｍ４の熱安定性は、１２ｎＭ［３Ｈ］−ＮＭＳを９５μＬ混合した（最終濃度１０ｎＭ）精製受容体２５μＬを用いて測定した。試料を４℃で６０分間、次いで特定温度で３０分間、その後４℃で３０分間インキュベートした。受容体結合及び遊離した放射性リガンドは９６穴プレートゲル濾過アッセイを用いて分離した。
【０１６３】
５ＨＴ２Ｃ受容体が、一時的に形質移入された哺乳動物細胞から５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＫＣｌ，０．５％ＤＤＭ（０．１％ＣＨＳ／０．６％ＣＨＡＰＳがＳＣＨ２３３９０アゴニストアッセイのために細胞に添加された）に可溶化された。Ｔｍ分析を直接可溶化溶解物に対して行った。Ｔｍは１０８μＬの溶解物を、最終濃度１７ｎＭの［Ｎ６−ｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ］メスレルギン放射性リガンドとともに、又は９ｎＭ［３Ｈ］ＳＣＨ２３３９０とともに４℃で１時間インキュベートすることで決定した。６つのリガンドのインキュベーションが次いで２５℃から５５℃の６つの異なる温度で３０分間インキュベートされた。受容体に結合及び遊離の放射性リガンドが９６穴プレートゲル濾過アッセイを用いて分離された。
【０１６４】
ｃＡＭＰ機能アッセイ
このアッセイは、クリプテートで標識された抗−ｃＡＭＰ Ｍａｂの存在下で色素ｄ２で標識されたｃＡＭＰを用いる均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）をうまく利用する。本方法は細胞により生産されたｃＡＭＰと色素ｄ２で標識されたｃＡＭＰの間の競合免疫測定法に基づく。ＣＨＯ細胞をＧｌｕｔａｍａｘ ＨａｍのＦ１２、透明な底と黒壁の９６穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中の１０％ＦＢＳを用いて増殖した。ウエルあたり１２５００細胞の密度で細胞が播種され、一晩増殖し、ＰＢＳで洗浄し、次いでウエルあたり０．３μＬのＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（ノバジェン）でプレインキュベートした、１００ｎｇのｐＣＤＮＡ−３−Ａ２Ａ（２−３１６）で形質移入した。受容体発現の４８時間後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、総量５０μＬ中ロリプラム（５０μＭ）とアデノシンデアミナーゼの存在下で３０分間異なるＮＥＣＡの濃度を用いることで刺激した。希釈は、血清無しで、製造元のプロトコールに従ってＨａｍｆのＦ１２／ｃＡＭＰ−ｄ２抱合体中で実現した。アゴニスト刺激の３０分後、抱合体と溶解バッファーで希釈した５０μLの抗−ｃＡＭＰ／クリプテートをウエルあたり添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、次いでＰｈｅｒａｓｔａｒ９６穴時分割蛍光プレートリーダー（Ｅｘ ３４０ｎｍ；Ｅｍ ６６５／６２０ｎｍ）を用いて読み取った。
【０１６５】
実施例２：受容体の安定性に対するアミノ酸残基２．４６と相互作用するＴＭ７中のアミノ酸を変異させることの影響
結果
アゴニスト結合Ａ２Ａの熱安定性に対するＮｐｘｘＹ（配列番号１）モチーフ中の残基を変異させることの影響
Ａ２Ａアゴニスト結合研究において、アラニンスキャンによる変異の影響を二点熱安定性測定により最初に決定した。これらの実験において、野生型受容体と単一変異を含む受容体を界面活性剤ＤＤＭに可溶化し、４℃で保持されるＮＥＣＡの量と、不安定化温度、例えば３０℃、を決定した。不安定化温度で野生型受容体と比較した変異体受容体に対するアゴニスト結合の１０％超の増加は、有意と見なされ、熱安定性の増加の指標となる。Ａ２Ａアゴニストスキャンにおいて、アスパラギン２８４残基（Ｎ２８４、Ｎ７．４９）の変異は、不安定化温度において、野生型と比べて増加したアゴニスト結合により示唆された通り、増加した熱安定性をもたらした。
【０１６６】
アゴニスト結合５ＨＴ２Ｃの熱安定性に対するＮｐｘｘＹ（配列番号１）モチーフ中の残基を変異させることの影響
アゴニスト型の立体構造を安定化するために、アゴニストＳＣＨ２３３９０の存在下、５ＨＴ２Ｃ受容体においてアラニンスキャンを実施した。Ａ２Ａと同様に、ＮＰｘｘＹ（配列番号１）モチーフ内とその周囲の残基を変異させることが熱安定性の増加をもたらした。二点の熱安定性試験において、残基７．４８（Ｉ３６３）及び７．５１（Ｌ３６６）のアラニンへの変異は、不安定化温度で野生型受容体と比較してアゴニスト結合の増加をもたらし、安定性の増加を示している。図９はＬ３６６（ＮＰＬＶＹ（配列番号３６３）モチーフのＬ）をアラニンへ変異させることが安定性を付与し、受容体のＴｍを４℃だけ増加させることを示している。
【０１６７】
アゴニスト結合ニューロテンシン受容体の熱安定性に対するＮＰｘｘＹ（配列番号１）モチーフ中の残基を変異させることの影響
アゴニスト型の立体構造を安定化するために、アゴニストのニューロテンシン存在下、ラットのニューロテンシン受容体ＮＴＳ１においてアラニンスキャンを実施した。２点の熱安定性試験において、ＮＰｘｘＹ（配列番号１）のＹを意味する残基７．５３（Ｙ３６９）のアラニンへの変異は、不安定化温度で野生型受容体と比較してアゴニスト結合の増加をもたらし、安定性の増加を示している。
【０１６８】
アンタゴニスト結合アデノシンＡ２Ａ及び５ＨＴ２Ｃ結合に対するＮＰｘｘＹ（配列番号１）領域の変異の影響
アラニンスキャンをアンタゴニストメスレルギンの存在下、５ＨＴ２Ｃ受容体とともにアデノシンＡ２Ａ受容体において同様に実施した。双方のアラニンスキャンはアンタゴニスト型の立体構造を更に安定化するために実施した。双方のスキャンにおいて、ＮＰｘｘＹ（配列番号１）モチーフ由来のアミノ酸をアラニンに変えた場合、アンタゴニスト結合が著しく減少するように見えたのは特記すべきことである（表１）。アデノシンＡ２ＡのモチーフはＮＰＦＩＹ（配列番号３６４）であり、５ＨＴ２ＣにおいてはＮＰＬＶＹ（配列番号３６３）である。従って、受容体のこの領域の変異はアゴニスト型の立体構造に特異的な変異を安定化することを含み、アンタゴニストの結合に悪影響を与える。
【０１６９】
2012530690.tif 000002
【０１７０】
アミノ酸残基２．４６のＣα原子と残基２．４６の両側の各々の４残基のＣα原子との間、及びアミノ酸残基２．４６のＣα原子とＮＰｘｘＹ（配列番号１）モチーフの残基のＣα原子との間の距離はアデノシンＡ２Ａ受容体において以下の通りである。
【０１７１】
2012530690.tif 000003
【０１７２】
材料と方法
５ＨＴ２Ｃ受容体は形質移入後約４０時間後に、一時的に形質移入した哺乳動物細胞から５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４／１００ｍＭ ＫＣｌ／０．５％ ＤＤＭ／（０．１％ＣＨＳ／０．６％ＣＨＡＰＳがＳＣＨ２３３９０アゴニストアッセイのために添加された)とプロテアーゼ阻害剤に可溶化された。細胞溶解物はローテータ上で４℃のままにし、次いで４℃で１３２００ｒｐｍにて２０分間の遠心分離で除かれた。熱安定性分析が可溶性溶解物において直接実施された。Ｔｍは１０８μＬの溶解物を、最終濃度１７ｎＭの［Ｎ６−ｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ］メスレルギン放射性リガンドとともに、又は９ｎＭ［３Ｈ］ＳＣＨ２３３９０とともに４℃で１時間インキュベートすることで決定した。６つのリガンドのインキュベーションが次いで２５℃から５５℃の６つの異なる温度で３０分間インキュベートされた。受容体に結合及び遊離の放射性リガンドがＧ２５セファデックススピンカラムを用いて分離された。
【０１７３】
アデノシンＡ２Ａ受容体は形質移入後約３６時間後に、一時的に形質移入した哺乳動物細胞から５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４／４００ｍＭ ＮａＣｌ／０．５％ ＤＤＭとプロテアーゼ阻害剤に可溶化された。細胞溶解物はローテータ上で４℃のままにし、次いで４℃で１３２００ｒｐｍで２０分間の遠心分離で除かれた。可溶化した受容体を次いでＮｉ−ＮＴＡビーズ上で精製し５０ｍＭのヒスチジンで溶出した。溶出した受容体を放射性リガンド結合実験に使用した。Ｔｍは溶出液の１０８μｌを最終濃度１００ｎＭのＺｍ２４１３８５放射性リガンドとともに４℃で１時間インキュベートすることで決定した。６つのリガンドのインキュベーションが次いで２０℃から５０℃の６つの異なる温度で３０分間インキュベートされた。受容体に結合及び遊離の放射性リガンドがＧ２５セファデックススピンカラムを用いて分離された。
【０１７４】
【非特許文献１】Ｓ．Ｈ．Ｗｈｉｔｅ（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １３，１９４８−１９４９．
【非特許文献２】Ｃ．Ｇ．Ｔａｔｅ（２００１）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５０４，９４−９８．
【非特許文献３】Ｒ．Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ，Ｃ．Ｇ．Ｔａｔｅ（１９９５）Ｑ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ２８，３１５−４２２．
【非特許文献４】Ｊ．Ｕ．Ｂｏｗｉｅ（２００１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １１，３９７−４０２．
【非特許文献５】Ｆ．Ｗ．Ｌａｕ，Ｓ．Ｎａｕｌｉ，Ｙ．Ｚｈｏｕ，Ｊ．Ｕ．Ｂｏｗｉｅ（１９９９）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９０，５５９−５６４．
【非特許文献６】Ｙ．Ｚｈｏｕ，Ｊ．Ｕ．Ｂｏｗｉｅ（２０００）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５，６９７５−６９７９．
【非特許文献７】Ｓ．Ｆａｈａｍ，Ｄ．Ｙａｎｇ，Ｅ．Ｂａｒｅ，Ｓ．Ｙｏｈａｎｎａｎ，Ｊ．Ｐ．Ｗｈｉｔｅｌｅｇｇｅ，Ｊ．Ｕ．Ｂｏｗｉｅ（２００４）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３５，２９７−３０５．
【非特許文献８】Ｍａｄａｂｕｓｈｉ Ｓ，Ｇｒｏｓｓ ＡＫ，Ｐｈｉｌｉｐｐｉ Ａ，Ｍｅｎｇ ＥＣ，Ｗｅｎｓｅｌ ＴＧ，＆Ｌｉｃｈｔａｒｇｅ Ｏ（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９，８１２６−８１３２．
【非特許文献９】Ｕｒｉｚａｒ Ｅ，Ｃｌａｅｙｓｅｎ Ｓ，Ｄｅｕｐｉ Ｘ，Ｇｏｖａｅｒｔｓ Ｃ，Ｃｏｓｔａｇｌｉｏｌａ Ｓ，Ｖａｓｓａｒｔ Ｇ，＆ Ｐａｒｄｏ Ｌ（２００５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０，１７１３５−１７１４１．
【０１７５】
実施例３：クラス２ＧＰＣＲの受容体熱安定性に対するＩ２．５８Ａ変異の影響
序論
クラス２ＧＰＣＲはクラス１に直接アラインメントしないがファミリーの範囲内においては構造の鍵となる役割を果たすであろう数多くの保存された残基がある。クラス２の残基Ｌ２．５９はＴＭ２においてクラス１のＬ２．４６に相当する場所に位置する（図１４）。この残基は最も保存された残基の一つである。
【０１７６】
下記の通り、ヒトＣＲＦ１の我々の研究は、この受容体のｉ−１の位置（Ｉ２．５８）をアラニンに変異させるとアンタゴニスト結合受容体（ＣＲＦ１）の熱安定性を増加させることを明らかにした。従って、クラス１ＧＰＣＲと同様に、受容体のこの領域の残基を変異させることはクラス２ＧＰＣＲを安定化するための一般的なアプローチを構成するとして妥当である。
【０１７７】
結果
アンタゴニスト結合ＣＲＦ１の熱安定性に対するＩ２．５８Ａの影響
アンタゴニスト型の立体構造のＣＲＦ１を安定化するために、アンタゴニストのリガンドＣＰ−３７６３９５に結合した受容体を安定化する変異を同定するために、系統的なアラニンスキャンが実施された。Ｉ２．５８をアラニンに変異させることは（Ｉ１６３Ａ）、ＣＲＦ１に有意な安定性を与え、熱安定性を３．９（±０．５）℃だけ増加させている（図１５）。
【０１７８】
材料と方法
受容体発現
ＣＲＦ１受容体は、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ形質移入試薬を製造元のガイドラインに従って使用し、一時的に１０ｃｍのプレート上のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に発現させた。
【０１７９】
受容体の可溶化、精製及び熱安定性試験
ＣＲＦ１を発現する細胞を形質移入後約４０時間後にＰＢＳにて収集し、９５０μｌの再懸濁バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２×完全ＥＤＴＡ−フリープロテアーゼ阻害剤混合物（ロッシュ）,ｐＨ７．５）に再懸濁した。細胞は５分間氷に移す前に、１２０ｎＭのＣＰ−３７６３９５及び３０ｎＭ［３Ｈ］−ＣＰ−３７６３９５により３７℃で２時間インキュベートした。受容体は１％のＤＤＭの添加により可溶化され、４℃で１時間、穏やかに攪拌してインキュベートした。不溶性物質は１６００×ｇで４℃で１０分間遠心分離して除去した。可溶化した受容体は、一部はＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂は平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２×完全ＥＤＴＡ−フリープロテアーゼ阻害剤混合物（ロッシュ），０．０２５％ ＤＤＭ，ｐＨ７．５）で平衡化し、４００μｌの５０：５０樹脂スラリーが個々の試料に添加された。樹脂スラリーは４℃で１時間３０分穏やかな攪拌によりインキュベートし、受容体と結合させた。樹脂スラリーは次いでバッチカラムフィルタープレート（Ｃｈｒｏｍａｂｏｎｄ）へ移し、１０００×ｇで１分間遠心分離し、素通り画分は廃棄した。樹脂は１ｍｌの洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２×完全ＥＤＴＡ−フリープロテアーゼ阻害剤混合物（ロッシュ），０．０２５％ ＤＤＭ，２０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ７．５）で２回洗浄し、その後１ｍｌの溶出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２×完全ＥＤＴＡ−フリープロテアーゼ阻害剤混合物（ロッシュ），０．０２５％ ＤＤＭ，１００ｍＭヒスチジン，３０ｎＭ［３Ｈ］−ＣＰ−３７６３９５，１２０ｎＭ ＣＰ−３７６３９５，ｐＨ７．５）で４℃で３０分間再懸濁して溶出した。溶出した試料を直接熱安定性試験に使用した。個々の試料の１２０μｌを氷に直接移す前に３０分間特定の温度でインキュベートした。受容体結合及び遊離の放射性リガンドを次いで９６穴プレートゲル濾過アッセイを用いて分離した。
【０１８０】
実施例４：アンタゴニスト結合ＯＸ２の熱安定性に関するＬ２．４６Ａ変異の影響
オレキシン２（ＯＸ２）は睡眠−覚醒サイクルとエネルギー恒常性の調節に関与するクラス１のＧＰＣＲである。
結果
アンタゴニスト結合ヒトＯＸ２の熱安定性に対するＬ２．４６Ａの影響
タンデムなアラニンとロイシンを系統的に変異導入する戦略が低分子アンタゴニストＥＭＰＡに結合したＯＸ２の熱安定性を増強する変異を同定するために用いられた。ＯＸ２のＬ２．４６（ＯＸ２のＬ９６）のアラニンへの置換は受容体の熱安定性にほとんど影響を及ぼさなかった。しかしながらＴｙｒ９１（Ｌ２．４６の５残基Ｎ末端側）の変異は増加した安定性を与えることが見いだされ、野生型ＯＸ２と比較しＴｍを１℃だけ上昇させた（図１６）。
【０１８１】
材料と方法
熱安定性試験はＭ４において記載された通り以下の修正を伴って、部分的に精製された受容体において実施された。細胞溶解物は１×完全ＥＤＴＡフリー阻害剤混合物（ロッシュ）を補填した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ ＤＤＭに可溶化した。放射性リガンド結合反応は、温度のポイントごとに２０ｎｍの３Ｈ−ＥＭＰＡ（最終濃度）と混合し１／１０量溶出した受容体を用いて設定された。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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