(57)【要約】  セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システムが、血液中のＣＴＣの計数を行うシステムを提供する。このシステムは、上皮細胞を免疫磁気的に濃縮し、細胞に蛍光標識し、かつＣＴＣの識別及び定量を行う。腫瘍を有する場合に末梢血に検出されるＣＴＣの絶対数は、部分的に、生存率の予測、病状進行の時間、及び治療に対する反応における因子である。循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の前臨床研究は、動物モデルにおいてＣＴＣを繰り返し監視することが不可能であることにより、制限されてきた。本発明は、患者におけるＣＴＣの定量のためのインビトロ診断システムに類似したプロトコルを用い、生きたマウスから採取した血液検体におけるＣＴＣの計数を行う方法を提供する。したがって、この技法は、ヒト乳癌のマウス異種移植腫瘍モデルにおいてＣＴＣの連続的監視用に適合させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
前臨床腫瘍異種移植マウスモデルにおける転移性循環稀少細胞を分析するための方法において、
ａ）異種移植マウスモデルから１００μＬの血液試料を得ることであって、前記試料が、前記稀少細胞を含むことが疑われる混ざり合った細胞群を含む、血液試料を得ることと、
ｂ）前記試料の画分を濃縮することであって、前記画分が前記稀少細胞を含む、画分を濃縮することと、
ｃ）前記稀少細胞の構造的完全性が無傷であることを確認することと、
ｄ）前記無傷の稀少細胞を分析することと、
ｅ）疾患の進行を評価するためにａ〜ｄのステップを繰り返すことと、を含む、方法。
【請求項２】
前記異種移植マウスモデルが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＳＵＭ−１５９細胞、ＳＫＢＲ−３細胞及びこれらの組み合わせの同所腫瘍異種移植片からＣＴＣが循環内に自発的に異物侵入するマウスに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記異種移植マウスモデルが、マウスに臨床的な乳癌の分離物を移植することによって作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記マウスが、持続放出性１７−β−エストラジオールの皮下ペレット投与を受けた、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記血液試料が、心臓穿刺によって採取される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記画分が、前記稀少細胞に特異的に結合する生物学的特異的なリガンドに結合する常磁性体粒子を、他の群を実質的に除外して、区別するよう、外部的に印加される磁場を用いた免疫磁気的な濃縮によって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記構造的完全性が、免疫細胞化学的手順、ＦＩＳＨ手順、フローサイトメトリー手順、画像サイトメトリー手順、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される手順によって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記試料に存在する前記無傷の稀少細胞の数の増加が、疾患の進行に対応する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記稀少細胞が、転移性乳癌細胞、転移性前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、転移性結腸癌細胞、及びこれらの組み合わせからなる群に由来する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔関連出願の相互参照〕
本出願は、米国特許仮出願第６１／００１，４１８号（出願日２００７年１１月１日）に対する優先権を主張する非仮出願である。上記の出願は、参照により全文が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
〔背景〕
〔発明の分野〕
本発明は一般に、形態学的に完全な形状の血液中の循環癌細胞（ＣＴＣ）の存在に基づき、転移性癌患者の癌の疾患進行を監視及び評価することに関する。より具体的には、動物モデルにおいて循環癌細胞の評価を行うための方法、試薬及び装置について記述される。
【０００３】
〔背景技術〕
１５０年以上前に乳癌患者の血液中において非血液原性の上皮腫瘍細胞が初めて確認された。それ以来、ＣＴＣは原発癌（治癒が可能な疾患段階）と転移疾患（多くの悪性腫瘍において死亡の主要因であり続けている）との間の重要な関連を示すものになっている。臨床研究により、ＣＴＣは転移性乳癌において予後及び予測の強力なバイオマーカーであることが示されており、前立腺癌及び結腸直腸癌においても同様の結果が報告されている。このデータから、ＣＴＣは潜在する生物学的促進性転移癌を表わすことが示されており、これらの細胞を更に細胞分析及び分子分析することにより、転移の分子調節並びに治療に対する反応について、新しい洞察を明らかにできることが示唆されている。
【０００４】
転移におけるＣＴＣの役割に関する研究と、薬物動態学的及び薬力学的研究におけるバイオマーカーとしてのそれらの利用拡大は、薬剤開発の臨床段階に制限されてきた。多くの癌患者は、原発腫瘍によって死亡するのではなく、転移によって死亡することが広く認識されており、広がった複数の腫瘍コロニーは、元の腫瘍から分離し、体内を（しばしば遠い部位まで）移動した悪性細胞によって形成される。癌において最も好結果が得られる治療戦略は、器官内に留まっているうちに、腫瘍を早期に発見し外科的に除去することである。癌の早期発見は、特に、子宮頸癌のパップスメア検査、乳癌のマンモグラフィー、及び前立腺癌の血清前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）などの適切な診断検査が存在するような、一部の癌については実行可能であることが証明されている。しかしながら、早期段階に発見された癌は、多くの場合、外科的切除の前に微小転移が起こっている。このように、癌の悪性潜在性を早期かつ正確に検出することが、適切な治療法を選択する際には重要である。
【０００５】
原発腫瘍が十分早期に発見されていれば、しばしば、外科手術、放射線、若しくは化学療法、又は幾つかのこれらの治療の組み合わせによって除去することが可能である。残念なことに、転移コロニーは発見及び除去が難しく、しばしば、すべてのコロニーをうまく治療することは不可能である。したがって、転移は癌の自然な進行において最終的な事象であると見なすことができる。更に、転移能力は、悪性腫瘍を固有に特徴付ける特性である。
【０００６】
癌及び癌転移の複雑さと、何年にもわたる癌患者治療のフラストレーションに基づき、転移又は再発に対する治療の指針となり、かつそのような治療の効果を監視するための診断検査を開発しようと、数多くの試みが行われている。
【０００７】
腫瘍診断の有用な検査を開発する初期の試みの１つは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のイムノアッセイの処方である。この抗原は胎児の細胞に見られ、特定の癌の腫瘍細胞に再び現われるものである。ＣＥＡ並びに数多くの「腫瘍」抗原、例えば組織検体又は血液のいずれかにおいて可溶性の細胞破片の形で見出される、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＣＡ  １５．３、ＣＡ  １２５、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＡ  ２７．２９、ｐ２７の有用性を評価するため、数多くの取組みが行われている。
【０００８】
癌患者において腫瘍の進行を予測するのに使用される他の検査では、生検採取した腫瘍検体におけるテロメラーゼ活性などの関連する酵素の指標に注目している（米国特許第５，６９３，４７４号、同第５，６３９，６１３号）。この種の分析において酵素活性を評価するには、ゲル電気泳動又はウェスタンブロット分析などの時間のかかる検査手順が含まれ得る。また、検体分析における信号対ノイズ比及び感度は、腫瘍の発生源によって変動する。このような欠点にもかかわらず、血液中の特異的可溶性腫瘍マーカーは、治療の初期に治療戦略を開発するための迅速かつ効果的なアプローチを提供することができる。例えば、転移性乳癌患者における血清ＨＥＲ−２／ｎｅｕ及び血清ＣＡ  １５−３の検出は、転移性乳癌の予後因子となることが示されている（アリ（Ali）Ｓ．Ｍ．、ライツェル（Leitzel）Ｋ．、チンチリ（Chinchilli）Ｖ．Ｍ．、イングル（Engle）Ｌ．、ディマーズ（Demers）Ｌ．、ハーヴィー（Harvey）Ｈ．Ａ．、カーニー（Carney）Ｗ．、アラード（Allard）Ｊ．Ｗ．及びリプトン（Lipton）Ａ．、「転移性乳癌患者における血清ＨＥＲ−２／ｎｅｕ及び血清ＣＡ１５−３の関係（Relationship of Serum HER-2/neu and Serum CA 15-3 in Patients with Metastatic Breast Cancer）」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４８（８）巻、１３１４〜１３２０頁（２００２年））。ＨＥＲ−２／ｎｅｕの増加は、ホルモン治療に対する反応の低下をもたらし、ホルモン受容体陽性の転移性乳癌に対する反応の予測において、顕著な予後因子である。このように、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ腫瘍形成遺伝子生成物が関連する悪性腫瘍において、濃度増加に基づいて治療監視又はリスク評価を行う方法が記述されている（米国特許第５，８７６，７１２号）。しかしながら、いずれの場合においても、緩解状態、又はたとえ健康な標準状態においても、基準濃度が比較的高く、患者に見出される濃度に重なり合うことがあるため、患者依存性の基準及びカットオフ濃度を確立するために複数の検査及び監視が必要となることがある。
【０００９】
前立腺癌においては、血清中のＰＳＡ濃度が早期発見に有用であることが証明されている。ＰＳＡ試験は、追跡健康診断及び生検と共に使用することにより、前立腺癌の早期段階（治療に最適）での発見が改善されている。
【００１０】
しかしながら、ＰＳＡ又はこれに関連するＰＳＭＡ検査は、かなり改善の余地がある。例えば、ＰＳＡ濃度の増加は、疾患段階との弱い関連性があるのみで、腫瘍の転移性能力の信頼すべき指標にはならないと見られる。これは一部分、ＰＳＡが正常な前立腺組織及び良性の前立腺過形成（ＢＨＰ）組織の構成成分であるという事実によるものであり得る。更に、局部的前立腺癌を有すると見られ、これに対応して低い血清ＰＳＡ濃度を有している患者のうち約３０％が、転移性疾患を有している可能性がある（モレノ（Moreno）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５２巻、６１１０頁（１９９２年））。
【００１１】
遺伝子マーカー：
悪性前立腺腫瘍細胞の存在を判定するためのアプローチの１つが、血中のＰＳＡからのメッセンジャーＲＮＡ発現を検査することである。これは、血液検体から全ｍＲＮＡを分離し、逆転写酵素ＰＣＲを実施する検査手順によってなされる。血液中に剥落した腫瘍細胞の存在と、より強い治療によってどの患者が利益を得られるかを判断する能力との間には、明らかな相関関係は記述されていない（ゴメラ（Gomella）ＬＧ．、Ｊ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ、１５８巻、３２６〜３３７頁（１９９７年））。加えて、この技法を用いると、偽陽性がしばしば観察される。他にも欠点があり、すなわち、検体サイズにより、この技法の感度には有限の実際的な限度が存在する。この検査は典型的には、干渉する赤血球から分離された１０５〜１０６個の細胞について実施されるが、これは、信号を検出するのに、血液０．１ｍＬあたり腫瘍細胞１個（血液１ｍＬあたり腫瘍細胞約１０個）の実際的な感度下限に対応している。血液から分離された腫瘍細胞におけるｈＫ２  ＲＮＡを検出することによって、より高い感度が得られることが示唆されている（米国特許第６，４７９，２６３号、同第６，２３５，４８６号）。
【００１２】
血液系のヌクレオチドマーカーを用いた定量ＲＴ−ＰＣＲに基づく研究を使用して、手術前血液中でＣＥＡ  ｍＲＮＡ陽性の患者が疾患なしで生存する可能性は、ＣＥＡ  ｍＲＮＡが陰性の患者よりも低くなることが示されている（ハーディンガム（Hardingham）Ｊ．Ｅ．、ヒューイット（Hewett）Ｐ．Ｊ．、セイジ（Sage）Ｒ．Ｅ．、フィンチ（Finch）Ｊ．Ｌ．、ナッタル（Nuttal）Ｊ．Ｄ．、コタゼル（Kotasel）Ｄ．及びダブロビッチ（Dovrovic）Ａ．、「結腸直腸癌患者及び良性腸疾患患者における血中上皮細胞の分子検出（Molecular detection of blood-borne epithelial cells in colorectal cancer patients and in patients with benign bowel disease）」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８９巻、８〜１３頁（２０００年）：タニグチ（Taniguchi）Ｔ．、マキノ（Makino）Ｍ．、スズキ（Suzuki）Ｋ．、カイバラ（Kaibara）Ｎ．、「結腸直腸癌腫患者の腫瘍ドレナージ血及び末梢血における癌胎児性抗原ｍＲＮＡ濃度の逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応測定の予後における意義（Prognostic significance of reverse transcriptase-polymerase chain reaction measurement of carcinoembryonic antigen mRNA levels in tumor drainage blood and peripheral blood of patients with colorectal carcinoma）」、Ｃａｎｃｅｒ、８９巻、９７０〜９７６頁（２０００年））。この終点の予後値は、ＣＥＡ  ｍＲＮＡ濃度に依存するが、これもまた、Ｇ−ＣＳＦ、サイトカイン、ステロイド、又は環境要因によって健康な個体において誘導される。ゆえに、ＣＥＡ  ｍＲＮＡマーカーは特異性に欠如しており、明らかに、循環結腸直腸癌細胞に対して固有なものではない。
【００１３】
上記の研究は、実験条件下では予後を示すものであるように見られるが、長期的な追跡期間での、又は満足な特異性を有する一貫したデータを提供するものではない。したがって、これらの取組みは、血中に抗原のｍＲＮＡが出現することが一般に多くの癌を示唆するものとはなっておらず、しばしば、患者にほとんど希望が残されていない段階で検出されるため、ある意味で無駄であることが証明されている。
【００１４】
それにもかかわらず、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、循環腫瘍細胞の定量的検出と患者の予後とを関連付けると報告されている、これまでで唯一の方法である。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、結腸直腸癌患者の末梢血におけるＣＥＡ  ｍＲＮＡの定量に使用されている（イトウ（Ito）Ｓ．、ナカニシ（Nakanishi）Ｈ．、ヒライ（Hirai）Ｔ．、カトウ（Kato）Ｔ．、コデラ（Kodera）Ｙ．、フェン（Feng）Ｚ．、カサイ（Kasai）Ｙ．、イトウ（Ito）Ｋ．、アキヤマ（Akiyama）Ｓ．、ナカオ（Nakao）Ａ．、及びテラマツ（Tatematsu）Ｍ．、「ライトサイクラー上でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いた、結腸直腸癌患者の手術中の末梢血中におけるＣＥＡ発現遊離腫瘍細胞の定量的検出（Quantitative detection of CEA expressing free tumor cells in the peripheral blood of colorectal cancer patients during surgery with real-time RT-PCR on a Light Cycler）」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１８３巻、１９５〜２０３頁（２００２年））。これらの結果から、腫瘍細胞は剥落して血流に入り（可能性としては手術中に、又は手術時にすでに存在している微小転移により）、結腸直腸癌患者に良くない患者予後をもたらすことが示唆されている。この検査の感度は、従来のＲＴ−ＰＣＲに対する感度と同様の、再現可能な検出可能範囲を提供した。前述のように、この検出範囲は、生成物を増幅して腫瘍細胞数に換算するという不確かな方法に基づいている。外挿された細胞数には、転移性増殖ができない、損傷したＣＴＣも含まれ得る。更に、ＰＣＲによる検査は、検体汚染の可能性があること、並びに腫瘍細胞を定量することが不可能であることから、限定的である。更に重要なこととして、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、細胞質酵素及び循環腫瘍抗原に基づく方法は、基本的な形態学的情報を提供することができず、推定されるＣＴＣが有する転移能力の根拠となる構造的完全性を確認することができないため、したがって、一部本発明で実施されている高い感度の画像手法に比べ、機能的により信頼性の低い代替検査を構成することになる。
【００１５】
血液中の無傷の腫瘍細胞を検出することにより、原発腫瘍の切除を受けた癌患者における転移疾患の再発に対する直接的な関連性が提供される。残念ながら、悪性細胞の広がりは、従来の腫瘍段階判別手順と同様、依然として見逃される。最近の研究では、癌患者の骨髄中に１つでも癌腫細胞が存在することが、転移再発に関する独立した予後因子であることが示されている（ディール（Diel）ＩＪ、カウフマン（Kaufman）Ｍ、ゴアナー（Goerner）Ｒ、コスタ（Costa）ＳＤ、カウル（Kaul）Ｓ、バスタート（Bastert）Ｇ．「原発乳癌患者の骨髄中の腫瘍細胞の検出：遠位転移の予後因子（Detection of tumor cells in bone marrow of patients with primary breast cancer: a prognostic factor for distant metastasis）」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、１０巻、１５３４〜１５３９頁、１９９２年）。しかしながら、これらの侵襲的手法は、血中に散った上皮腫瘍細胞を検出するのに比べ、日常的手順又は複数回実施する臨床検査としては望ましくないか、又は受け入れがたいと考えられる。
【００１６】
別のアプローチでは、免疫磁気分離技術を取り入れ、無傷の循環癌細胞の明白な検出という点で、より大きな感度と特異性を提供している。記述されているように（米国特許第６，３６５，３６２号、同第６，５５１，８４３号、同第６，６２３，９８２号、同第６，６２０，６２７号、同第６，６４５，７３１号、国際特許第ＷＯ  ０２／０７７６０４号、同第ＷＯ  ０３／０６５０４２号、同第ＷＯ  ０３／０１９１４１号）、この単純ながら感度の高い診断ツールは、ＣＴＣを列挙するための前臨床動物モデルを提供するため、本発明において使用されている。
【００１７】
この検査は、患者から採取した保存血液検体の取得に依存している。癌患者からの血液検体（国際特許第ＷＯ  ０３／０１８７５７号）は、上皮細胞表面抗原、例えばＥｐＣＡＭ、に対する抗体でコーティングされた磁気ビーズと共にインキュベートされる。抗ＥｐＣＡＭコーティング磁気ナノ粒子で標識した後、この磁気で標識された細胞は、磁気分離器を使用して分離される。免疫磁気的に濃縮された画分は更に、続いて行われる免疫細胞化学的分析（downstream immunocytochemical analysis）又は画像サイトメトリー（例えば、セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システム（ヴェリデックス社（Veridex LLC）、ニュージャージー州））用に処理される。この磁気画分は、続いて行われる免疫細胞化学的分析、ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ、ＦＩＳＨ、フローサイトメトリー、又はその他のタイプの画像サイトメトリーに使用することもできる。
【００１８】
セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システムは、免疫磁気的な選択及び分離を利用し、全血検体に存在する任意の上皮細胞を高度に濃縮（enrich and concentrate）することができる。捕捉された細胞は、検出可能なように、白血球特異性マーカーと、１つ以上の腫瘍細胞特異性蛍光モノクローナル抗体とで標識され、これにより捕捉されたＣＴＣの識別と計数が可能になり、機械的又は視覚的に標的外細胞の混入と明確に区別することができる。この検査により、腫瘍重量が少ない早期段階においても、腫瘍細胞の検出が可能になる。本発明の実施形態は、このセルトラックス（CellTracks）（登録商標）システムに限定されるものではなく、匹敵する感度と特異性を有する任意の分離及び画像プロトコルが含まれる。
【００１９】
現在利用可能な前臨床プロトコルは、転移性乳癌（ＭＢＣ）の進行の評価においてＣＴＣを反復監視するための一貫して信頼できる方法を提示してはいない。癌研究において診断及び治療の進歩を評価するための信頼できるマウスモデルが開発されれば、これらの分野の更なる研究開発に手段をもたらし得る。このように、ＭＢＣだけでなく、一般的な転移性癌の、転移能力を備えた癌細胞の正確な検出には、明らかなニーズが存在する。加えて、このニーズは所与の患者に最も有効な治療を選択するというニーズによって更に強調される。
【００２０】
乳癌及び他の癌の前臨床動物モデルにおいて利用できる少量の血液では、ＣＴＣを反復監視することができないため、末梢血採取から得られる検体を分析する利用は制限されている。このことから、マウスなどの生きた動物モデルにおける腫瘍の進行及び治療中のＣＴＣの一時的変化の研究は確立されていない。しかしながら、マウスにおいてＣＴＣを連続的に検査するこの技術を使用すれば、ＣＴＣの評価を前臨床並びに臨床研究に組み込むことが可能になる。これらの細胞についての特異的分子マーカーの更なる特徴付けにより、標的を絞った治療のための「コンパニオン」となる診断用検査の早期開発が可能になり、これにより、新しい検査プロトコルを患者での臨床試験に、ひいては臨床利用に移行させるのが加速され得る。
【００２１】
〔発明の概要〕
本発明は、セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システムなどの臨床分析ツールを組み込むことにより、異種移植マウスにおける癌転移の前臨床モデリングのための方法及び手段を提供するものであり、転移性癌患者の循環上皮細胞の絶対数、変化、又はその両方の組み合わせに基づくものである。このシステムは免疫磁気的に上皮細胞を濃縮し、その細胞を蛍光標識し、ヒト乳癌の異種移植腫瘍モデルにおける陽性計数のための、ＣＴＣの識別及び定量を行う。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ヒト腫瘍細胞として捕捉された対象物を確認するのに使用されるセルトラックス（CellTracks）（登録商標）蛍光分析プロファイル。チェックマークは、合成画像に基づく陽性腫瘍細胞を意味する。合成画像は、上皮細胞マーカー（ＥＣ−ＰＥ）及び核染料（ＮＡＤＹＥ）の陽性の選択から得られる。白血球マーカー（Ｌ−ＡＰＣ）及び対照（ＣＮＴＬ）については陰性の選択も必要。
【図２】マウス血液検体中のヒト乳癌細胞の定量。ＧＦＰの安定的な形質導入がない、又は形質導入がある、ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、腫瘍異種移植されていないマウスから採取した血液検体１００μＬに加えた。検体を固定し、上皮細胞を、上皮細胞接着分子に対する抗体を使用した免疫磁気ビーズ分離によって濃縮した。回収した細胞を、サイトカイン（８、１８、及び１９）に対する抗体で染色し、上皮細胞を識別し、ＣＤ４５で染色された白血球からも区別した。有核細胞は、蛍光核酸染料４，２−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）での染色によって識別された。癌細胞上のＧＦＰは、ＦＩＴＣチャンネルで検出された。回収された乳癌細胞の代表的な画像を示す。
【図３】マウス血液検体中のヒト乳癌細胞の定量。ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の異種移植を受けたマウスの末梢血検体を、心臓穿刺によって取得し、ＣＴＣの分析を行った。ＣＴＣの数が、キャリパーで測定した腫瘍体積に対してプロットされている。
【図４】マウスにおけるＣＴＣの連続的分析。マウスには、ヒト乳癌細胞ＳＵＭ−１５９（Ａ）又はＳＫＢＲ−３（Ｂ）の同所腫瘍異種移植を行い、腫瘍負荷のためマウスが安楽死されるまで、ほぼ毎週の間隔での心臓穿刺により、約１００μＬの血液検体におけるＣＴＣが測定された。ＣＴＣデータは体積１００μＬに標準化され、それぞれの腫瘍体積に対してプロットされている。ＣＴＣの平均値は、３０日目において、それ以前の日に比べて顕著に大きくなった（ｐ＜０．０５）。
【００２３】
〔発明の詳細な説明〕
血液中のＣＴＣを分離、濃縮、及び分析するための、いかなる効果的なメカニズムも適切であるが、循環腫瘍細胞を採取するための１つの方法では、最初の血液採取の後、免疫磁気的濃縮技法、免疫蛍光標識技法と、適切な分析プラットフォームとを組み合わせる。付随する検査は、全血の検体中のそれらの稀少細胞を検出するため、並びに上皮由来の悪性腫瘍における疾患の臨床経過におけるそれら細胞の役割を調べるための、感度及び特異性を有していることが示されている。全血の検体から、稀少細胞は、動物モデルにおける疾患進行のモデリングにおいてそれらを採取及び使用することが可能になるような感度と特異性をもって、検出される。
【００２４】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、検出可能な量で血液中に存在することが示されている。これにより、癌患者の末梢循環血における上皮由来細胞の意味を調べるためのツールが製作されている（レイシラ（Racila）Ｅ．、ユーハス（Euhus）Ｄ．、ワイス（Weiss）Ａ．Ｊ．、ラオ（Rao）Ｃ．、マカネル（McConnell）Ｊ．、タースタッペン（Terstappen）Ｌ．Ｗ．Ｍ．Ｍ．及びウーア（Uhr）Ｊ．Ｗ．、「血液中癌細胞の検出と特徴付け（Detection and characterization of carcinoma cells in the blood）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５巻、４５８９〜４５９４頁（１９９８年））。この研究では、これらの血液由来細胞が、癌の病理生理学において重要な役割を有している可能性が示された。患者血液５ｍＬあたり上皮細胞１個の検出感度を有するこの検査は、検体の迅速かつ感度の高い分析のために、免疫磁気検体濃縮及び蛍光モノクローナル抗体染色、続いてフローサイトメトリーが組み込まれた。
【００２５】
以前は、ヒト血液検体から循環上皮腫瘍細胞を分離及び計数するためにセルサーチ（CellSearch）（商標）システム（ヴェリデックス社（Veridex LLC）、ニュージャージー州））が使用されていた２。これは、磁気ビーズに結合させた上皮細胞接着分子に対する抗体を用いて、上皮細胞を濃縮する自動システムである。分離した細胞を次に、蛍光核酸染料４，２−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）で染色し、有核細胞を識別する。回収された細胞を続いて、ＣＤ４５（ＡＰＣチャンネル）及びサイトケラチン８、１８、１９（ＰＥチャンネル）に対する蛍光で識別されたモノクローナル抗体で染色し、上皮細胞と白血球とを区別する。有核上皮細胞を次に、循環腫瘍細胞として定量する。標準のセルサーチ（CellSearch）（商標）検査の一部ではないＦＩＴＣのための追加の蛍光チャンネルも存在し、これを腫瘍細胞の更なる特徴付けに使用することが可能である。
【００２６】
実施例１に示すように、この検査は更に、画像サイトメトリー分析のために構成され、これにより免疫磁気的に濃縮された検体が、セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システムによって分析される。これは蛍光による顕微鏡画像解析システムであり、フローサイトメトリー分析とは対照的に、事象の視覚化を可能にし、更に対象物を識別するための形態学的特徴の評価を行う。
【００２７】
（実施例１）
循環サイトケラチン陽性細胞の計数
セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システムは、血液から分離された細胞の自動計数のための自動蛍光顕微鏡システムを指す。このシステムには、一体化したコンピュータ制御蛍光顕微鏡と、使い捨て検体カートリッジを保持する磁気ヨークアセンブリを備えた自動化ステージとが含まれる。磁気ヨークは、検体チャンバー内にある磁性流体標識された腫瘍細胞の候補を、顕微鏡観察のために検体カートリッジの上部観測表面に磁気的に集めることを可能にするよう設計されている。ソフトウェアは、サイトケラチンに対する抗体で標識され、かつ上皮由来である疑わしい癌細胞を、最終選択のためにオペレーターに提示する。
【００２８】
セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システムのための腫瘍細胞の分離は、当該技術分野において既知である任意の方法によって達成することができるが、１つの実施形態では、生体の検体から腫瘍細胞を分離するために、免疫磁気的濃縮が使用される。上皮細胞特異性の磁気粒子を加え、２０分間インキュベートする。磁気的分離後、免疫磁気的に結合した抗体に結合した細胞は、試験管の壁に磁気的に保持される。結合していない検体を吸引除去し、等張液を加えて、検体を再懸濁させる。核酸染料、サイトケラチンに対するモノクローナル抗体（上皮細胞のマーカー）及びＣＤ４５（広域スペクトルの白血球マーカー）を検体と共にインキュベートする。磁気分離後、結合していない画分を再び吸引除去し、結合かつ標識された細胞を０．２ｍＬの等張液に再懸濁させる。検体は細胞観察チャンバー内で懸濁され、磁気装置内に配置され、この装置の磁場が、磁気的に標識された細胞を、セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システムで蛍光顕微鏡検査のために位置付ける。細胞はセルトラックス（CellTracks）（登録商標）システム内で自動的に識別され、循環腫瘍細胞の候補が、チェックリスト計数のためにオペレーターに提示される。計数チェックリストは、完全な細胞を構成する既定の形態学的基準からなる。
【００２９】
サイトケラチン陽性細胞は、ヒトから採取した全血の検体７．５ｍＬを使用して、免疫磁気的濃縮によって分離される。上皮細胞特異性の免疫磁性流体を加え、２０分間インキュベートする。２０分間の磁気的分離後、免疫磁気的に結合した抗体に結合した細胞は、試験管の壁に磁気的に保持される。結合していない検体を吸引除去し、等張液を加えて、検体を再懸濁させる。核酸染料、サイトケラチンに対するモノクローナル抗体（上皮細胞のマーカー）及びＣＤ４５（広域スペクトルの白血球マーカー）を検体と共に１５分間インキュベートする。磁気分離後、結合していない画分を再び吸引除去し、結合かつ標識された細胞を０．２ｍＬの等張液に再懸濁させる。検体は細胞観察チャンバー内で懸濁され、磁気装置内に配置され、この装置の磁場が、磁気的に標識された細胞を、セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システムで蛍光顕微鏡検査のために位置付ける。細胞は、セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システム内で自動的に識別され、対照細胞がシステムによって計数され、循環腫瘍細胞候補はオペレーターに提示され、オペレーターが図１に示すチェックリストを使用して計数を行う。
【００３０】
（実施例２）
ヒト上皮細胞のインビトロでの回収
これを実施するために、５００個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞を、腫瘍のないマウスから採取した血液検体１００μＬに接種した。臨床の場での検査では、血液を、抗凝固剤と防腐剤の両方が入った独自の真空管（セルセーブ（CellSave）管など）に採取する必要があるため、その分に比例して量が減少したセルセーブ溶液が、検体に加えられた。次に接種した検体を調製し、ＣＴＣの定量が行われ、パーセント回収率が計算された。陽性対照として、ＧＦＰを安定的に形質導入したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を使用した追加検体が調製された。ＧＦＰからの蛍光がシステムのオープンチャンネル（ＦＩＴＣ）で検出され、これにより、マウス血液に添加された２３１−ＧＦＰ細胞に対応する上皮細胞として全細胞が定量されたことが確認された。陰性対照として、癌細胞を含まないマウス血液検体が採取され、同じ方法で処理され、分析が行われた。マウス血液（ｎ＝４検体）に加えられた５００個の細胞のうち、検体あたり４８２〜５２６個の細胞が回収され、これはこの濃度での接種実験について希釈誤差の範囲である（図２）。２３１−ＧＦＰ細胞を使用した検体について、上皮細胞として識別された全ての細胞はまた、ＧＦＰも発現し、これらがヒト乳癌細胞であること、混入したマウス上皮細胞ではないことが確認された。正常なマウス血液からは上皮細胞は回収されず、この検査の特異性が確認された。
【００３１】
（実施例３）
マウスの異種移植片からのＣＴＣの回収
ヒト乳癌のマウスモデルにおいてＣＴＣを連続的に監視するための好ましい方法には、セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システムの使用が組み込まれる。上記で論じたように、このシステムでは、血液からの上皮細胞の免疫磁気的分離と、更に白血球から上皮癌細胞を差別化するための免疫蛍光染色が使用される。セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システムは本来、７．５〜３０ｍＬのヒトの血液を処理するよう開発されたものであるため、この検査を用いて少量のマウス血液からヒト上皮乳癌細胞が十分な信頼性で回収されるようにすることが必要である（実施例２を参照）。
【００３２】
このシステムは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の同所腫瘍異種移植片から循環内に自発的に異物侵入する（intravasate）ＣＴＣを識別するために使用された。マウスを１０週時点で腫瘍負荷のために安楽死させた時点で、左心室の穿刺によって各マウスから０．７〜１ｍＬの血液検体を採取した。ＣＴＣの合計数は、血液１ｍＬあたり細胞数が約１００〜１０００個の範囲であった（図３）。腫瘍異種移植されていないマウスから採取された血液検体からは、ＣＴＣは回収されなかった（データの図示なし）。ＣＴＣの数は、原発腫瘍の大きさとの相関関係はなかった。これらのデータから、ＣＴＣの数は、さまざまな原発腫瘍の根底にある生物学的条件を反映したものであることが示されており、これは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が、転移能力の変化を伴う部分母集団を含むというこれまでの研究に一致している。同じ方法を使用して、ＣＴＣはＭＣＦ−７の腫瘍異種移植をしたマウスにおいても検出可能であり、ＭＣＦ−７細胞は線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＳＵＭ−１５９、及びＳＫＢＲ−３細胞株に安定に取り込まれていた。
【００３３】
このシステムでは、血液を採取するのに心臓穿刺を用いてＣＴＣを検出するのに成功したが、この手順は、マウスの血液検体を他の部位から採取するのに比べて侵襲的である。本発明の１つの態様では、ＣＴＣの分析のために血液検体が繰り返し採取され、血液検体は外側尾部静脈及び眼窩静脈叢から得られ、これにより心臓穿刺の侵襲的な性質が回避される。同所ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍異種移植を受けているマウス又は受けていないマウスが、直接心臓検体採取と比較された。腫瘍異種移植片の存在に依存せず、外側尾部静脈のいずれの検体においても、上皮細胞は検出されなかった。腫瘍を有するマウスにおいてＣＴＣを検出するのに失敗したことについて、１つの可能な説明としては、外側尾部静脈から採取できた血液が少量（２５μＬ以下）であったことが挙げられる。眼窩静脈叢からはより多くの血液（５０〜７５μＬ）を得ることができたが、腫瘍のないマウスにおいて、この部位から採取した３つの血液検体のうち３つに、上皮細胞（５〜５００個）が含まれていた。これらの混入細胞は、血液採取中に毛細血管によって剥がれた正常なマウス上皮細胞であった。このように、眼窩静脈叢を経由した検体採取では、腫瘍を有するマウスにおいてＣＴＣを高い信頼性で識別することが不可能になり得る。比較により、腫瘍異種移植を受けていないマウスの心臓穿刺によって得た血液検体にはＣＴＣが存在しなかったが、ＣＴＣは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植を受けたマウスの左心室心臓穿刺によって得た血液には検出され得た。
【００３４】
（実施例４）
マウスにおけるＣＴＣの一時的分析
検査及び血液採取経路の検証を行った後、ＳＵＭ−１５９（ｎ＝３）又はＳＫＢＲ−３（ｎ＝４）細胞の同所腫瘍異種移植を受けたマウスを使用して、ＣＴＣの一時的変化検出の実行可能性を調べた。腫瘍負荷のためマウスを安楽死させるまでの１ヶ月間、血液検体７５〜１００μＬを週に約１回採取した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＳＫＢＲ−３ヒト乳癌細胞を、１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ−グルタミン、０．１％ペニシリン／ストレプトマイシンと共にＤＭＥＭ中で培養した。ＳＵＭ−１５９細胞を、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５μｇ／ｍＬインスリン、１μｇ／ｍＬハイドロコルチゾン、及び０．１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したハム（Ｈａｍ）Ｆ１２培地（インビトロゲン（Invitrogen）中で培養した。細胞は３７℃で、５％ＣＯ２のインキュベーター内に保持された。選択された実験について、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＧＦＰを安定して発現する細胞を確立するため、レンチウイルスベクターｐＳｉｃｏで形質導入された。形質導入の効率は、位相差及び蛍光顕微鏡によって測定され、１００％であった。
【００３５】
マウスに腫瘍異種移植を行う際は、５〜６週齢のメスのＮｃｒヌード（タコニック（Taconic））又はＳＣＩＤ（ジャクソン（Jackson））マウスが使用された。細胞株由来のヒト乳腫瘍異種移植は、当該技術分野において既知の方法によって、１×１０６個の細胞をマウスの両側の鼠経乳房脂肪帯に同所的に注入した。ヒト乳癌細胞の臨床的分離物での腫瘍異種移植については、マウスの第四鼠経乳房脂肪帯に１〜５×１０５個の細胞を移植した。乳癌の臨床的分離物を移植したマウスはまた、１錠の６０日間持続放出性１７−β−エストラジオールの皮下ペレット（イノベーティブ・リサーチ・オブ・アメリカ（Innovative Research of America））も投与された。腫瘍の体積は、２次元でのキャリパー測定の積として定量され、幅（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×長さ（ｍｍ）×０．５２の式によって計算された。ＣＴＣの連続的検査については、図の凡例に示されているように、ほぼ毎週の間隔で、血液検体が左心室から採取された。
【００３６】
検査結果では、初期の検体（８〜２３日目）ではＣＴＣ濃度が低く（細胞０〜７個）（図４）、３０日目には、腫瘍体積の増加に対応して、７匹のマウスのうち６匹においてＣＴＣの数が顕著に増加した（細胞２６〜５５個）（ｐ＜０．０５）ことが示される。これらの研究から、乳癌のマウスモデルにおいてＣＴＣの連続的検査について、検査を首尾良く使用できることが確立された。
【００３７】
異種移植を受けたマウスにおけるＣＴＣの測定すべてについて、原発乳癌細胞は、患者の生検標本から入手された。血液検体（２００μＬ〜８００μＬ）は、腫瘍負荷のためマウスを安楽死させた時点で、心臓穿刺によって採取された。６人の異なる患者から得た乳癌細胞はマウスにおいて腫瘍を形成し、これらの腫瘍すべてがＣＴＣを生成した。ＣＴＣの数は血液１ｍＬあたり細胞４〜８０５個の範囲であり、平均値は細胞１１８個±６７個（ｎ＝６）であった。特に、これらの動物のいずれも、明らかな転移、又は組織学的に検出可能な転移は起こさず（データの図示なし）、これは原発の臨床標本によって作成されたＣＴＣの大半は、マウス又はヒトのいずれにおいても、転移を形成する能力がない可能性を示唆している。これらのデータは、乳癌臨床分離物の異種移植はマウスにおいてＣＴＣを作成することができ、これにより、転移に関与するヒト乳癌細胞の特性及び部分母集団を研究するためのモデルシステムを提供することができることを示している。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態の特定のものは、上記の記述で具体的に例示されているが、本発明がこれらの実施形態に限定されることを意図するものではない。本発明の本質から逸脱することなく、さまざまな修正をこれに行うことが可能であり、この改良の全範囲が、下記の請求項に明確に記述されている。
【００３９】
〔実施の態様〕
（１）  前臨床腫瘍異種移植マウスモデルにおける転移性循環稀少細胞を分析するための方法において、
ａ）異種移植マウスモデルから１００μＬの血液試料を得ることであって、前記試料が、前記稀少細胞を含むことが疑われる混ざり合った細胞群を含む、血液試料を得ることと、
ｂ）前記試料の画分を濃縮することであって、前記画分が前記稀少細胞を含む、画分を濃縮することと、
ｃ）前記稀少細胞の構造的完全性が無傷であることを確認することと、
ｄ）前記無傷の稀少細胞を分析することと、
ｅ）疾患の進行を評価するためにａ〜ｄのステップを繰り返すことと、を含む、方法。
（２）  前記異種移植マウスモデルが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＳＵＭ−１５９細胞、ＳＫＢＲ−３細胞及びこれらの組み合わせの同所腫瘍異種移植片からＣＴＣが循環内に自発的に異物侵入する（intravates）マウスに由来する、実施態様１に記載の方法。
（３）  前記異種移植マウスモデルが、マウスに臨床的な乳癌の分離物を移植することによって作製される、実施態様１に記載の方法。
（４）  前記マウスが、持続放出性１７−β−エストラジオールの皮下ペレット投与を受けた、実施態様３に記載の方法。
（５）  前記血液試料が、心臓穿刺によって採取される、実施態様１に記載の方法。
（６）  前記画分が、前記稀少細胞に特異的に結合する生物学的特異的なリガンドに結合する常磁性体粒子を、他の群を実質的に除外して、区別するよう、外部的に印加される磁場を用いた免疫磁気的な濃縮によって得られる、実施態様１に記載の方法。
（７）  前記構造的完全性が、免疫細胞化学的手順、ＦＩＳＨ手順、フローサイトメトリー手順、画像サイトメトリー手順、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される手順によって測定される、実施態様１に記載の方法。
（８）  前記試料に存在する前記無傷の稀少細胞の数の増加が、疾患の進行に対応する、実施態様１に記載の方法。
（９）  前記稀少細胞が、転移性乳癌細胞、転移性前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、転移性結腸癌細胞、及びこれらの組み合わせからなる群に由来する、実施態様１に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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