(57)【要約】  インスリンアナログ（ここで、B25アミノ酸残基がHisまたはAsnであるが、ただしB25アミノ酸残基がHisである場合、B27アミノ酸残基はAspまたはGluであり、A14アミノ酸残基がGluとは異なる）は、肝臓選択的作用を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
B25アミノ酸残基がHis (H)またはAsn (N)であるが、ただしB25アミノ酸残基がHisである場合、B27アミノ酸残基はAsp (D)またはGlu (E)であり、A14アミノ酸残基がGlu (E)とは異なる、インスリンアナログ。
【請求項２】
A14Q, A22K, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16H, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16E, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16H, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16E, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16H, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16E, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16H, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16E, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16H, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16E, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16H, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16E, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30ヒトインスリン; B25N, B27E, desB30ヒトインスリン; A8H, B25N, B27E, desB30ヒトインスリン; B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; B1E, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A8H, B1E, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A8H, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; B25N, B27D, desB30ヒトインスリン; A8H, B25N, B27D, desB30ヒトインスリン; B25H, B27D, desB309ヒトインスリン; A8H, B25H, B27D, desB30ヒトインスリン; B25N,desB30ヒトインスリン及びA21G,B25N,desB30-ヒトインスリンとは異なる、請求項1に記載のインスリンアナログ。
【請求項３】
B25アミノ酸残基がHis (H)であり、B27アミノ酸残基がAsp (D)またはGlu (E)であり、A14アミノ酸残基がGlu (E)とは異なる、請求項1または2に記載のインスリンアナログ。
【請求項４】
B25アミノ酸残基がAsn (N)である、請求項1または2に記載のインスリンアナログ。
【請求項５】
B29及びB30の位置にアミノ酸残基を有しない（すなわち、desB29, desB30ヒトインスリンアナログである）、請求項1から4のいずれかの可能な一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項６】
B28, B29及びB30の位置にアミノ酸残基を有しない（すなわち、desB28, desB29, desB30ヒトインスリンアナログである）、請求項1から5のいずれかの可能な一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項７】
B27, B28, B29及びB30の位置にアミノ酸残基を有しない（すなわち、desB27, desB28, desB29, desB30ヒトインスリンアナログである）、請求項1から6のいずれかの可能な一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項８】
B27, B28, B29及びB30の位置にアミノ酸残基を有しない（すなわち、desB27, desB28, desB29, desB30ヒトインスリンアナログである）、請求項1から7のいずれかの可能な一項に記載のインスリンアナログであって、好ましくは、B鎖の位置26, 27または28におけるアミノ酸がAspまたはGluである、インスリンアナログ。
【請求項９】
[A8H, B25N, B27D]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27E]ヒトインスリン; [A8H, B25N]ヒトインスリン; [A8H, B25H, B27D]ヒトインスリン; [A8H, B25H, B27E]ヒトインスリン; [B25H, B27D]ヒトインスリン; [B25H, B27E]ヒトインスリン; [B25H]ヒトインスリン; [B25N, B27D]ヒトインスリン; [B25N, B27E]ヒトインスリン; [B25N]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27D, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27E, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25H, B27D, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25H, B27E, desB30]ヒトインスリン; [B25H, B27D, desB30]ヒトインスリン; [B25H, B27E, desB30]ヒトインスリン; [B25H, desB30]ヒトインスリン; [B25N, B27D, desB30]ヒトインスリン; [B25N, B27E, desB30]ヒトインスリン及び[B25N, desB30]ヒトインスリンからなる群から選択される、可能な限りにおいて請求項1から8のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項１０】
[A8H, B25H]ヒトインスリンまたは[A8H, B25H, desB30]ヒトインスリンである、可能な限りにおいて請求項1から8のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項１１】
[A8H, B25N, B27A, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27R, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27N, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27D, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27Q, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27E, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27G, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27H, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27I, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27L, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27M, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27F, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27P, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27S, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27W, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27Y, desB30]ヒトインスリン及び[A8H, B25N, B27V, desB30]ヒトインスリンからなる群から選択される、可能な限りにおいて請求項1から10のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
【請求項１２】
物に関する請求項1から11のいずれか一項に記載の化合物を治療上有効量でそれを必要とする対象に投与する工程を含む、糖尿病の治療方法。
【請求項１３】
物に関する請求項1から11のいずれか一項に記載のインスリンアナログを治療上有効量でそれを必要とする対象に投与する工程を含む、糖尿病の治療方法、及び同時に、ヒトインスリンと関連する糖尿病よりは低い、癌の発症リスクを知らせる方法。
【請求項１４】
物に関する請求項1から11のいずれか一項に記載の化合物が、請求項2に記載の化合物とは異なる、方法に関する請求項12または13に記載の方法。
【請求項１５】
本明細書に開示されるいずれかの新規特徴または特徴の組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規インスリンアナログに関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリンは、ヒトにおける血中グルコース濃度の制御並びにタンパク質及び脂質代謝の役割に関与する膵臓ホルモンである。インスリンは20世紀初頭に発見された。
【０００３】
初期の商業用インスリン（ブタ及びウシインスリン）は、ウシまたはブタの膵臓からの抽出に続く精製により得られた。80年代に、ヒトインスリンは市場に出された。ヒトインスリンを製造する一態様は組換えDNA技術によるものであった。まもなく、組換えDNA技術がさらに発達し、多くの異なるインスリンアナログが製造され、今やその一部は上市されている。前世紀に、多くの異なるインスリン製品が上市されており、それには、インスリン亜鉛懸濁液、例えば硫酸プロタミンとの、インスリン複合体、及び、例えばアシル化インスリンなどの、インスリン誘導体も含まれる。
【０００４】
糖尿病は地球上のほとんどすべての社会に影響を及ぼしており、人間が今日直面する最も差し迫った健康危機の一つである。現在、世界中で2億4600万人以上の人間がこの病気とともに生き、その数は19年内に3億8000万人にまで爆発的に増えると予測されている。
【０００５】
インスリン受容体(IR)は、IR遺伝子のエクソン11に関与するインスリン受容体mRNAの選択的スプライシングから生じる、2つのアイソフォーム、IR-A及びIR-Bとして発現する。IR-Aαサブユニットはエクソン11によりコードされるC末アミノ酸配列が欠如している。
【０００６】
インスリン受容体の2つのアイソフォームは異なって発現される。Bアイソフォームは肝臓で優性に発現する（90％）が、Aアイソフォームとともに多くの組織で広く発現する（〜50/50）。
【０００７】
健常人及び糖尿病患者において、肝臓は、グルコースを産生して低血糖を避ける。しかしながら、2型糖尿病患者では、肝臓グルコースの生産量の調節は、ほとんど制御されず、増加し、一晩の断食後には倍増し得る。さらに、皮下のインスリン投与は肝臓の前に末梢組織にインスリンを送達させるが、通常の生理学的な条件下では、肝臓が受け取るインスリン濃度が脂肪及び筋肉などの末梢組織におけるよりも3〜4倍高くなるような態様で、インスリンは膵臓から肝臓に直接送達される。糖尿病患者は肝臓選択的インスリンアナログで処置することにより、末梢組織にほとんど影響を与えずに肝臓のグルコース生産量を効果的に減らして、それによりグルコース制御の改善、低血糖症のリスクの減少、体重増加の減少、より良好な脂質プロファイル、及び心血管保護効果へと結びつく、恩恵を受けるであろう。それを追求する一態様は、インスリン受容体のBアイソフォームに対して選択性を有するインスリンアナログを開発することである。しかし、かかるアナログは現在は知られていない。報告によれば、ヒトインスリンは、インスリン受容体の、BアイソフォームよりもAアイソフォームに対して、わずかに高い親和性を有する（EMBO Journal 9 (1990), 2409-13を参照のこと）
【０００８】
インスリン受容体アイソフォームの発現のための時間次元(temporal dimension)もまた存在する。IR-Aは、胎児の発達期に主に発現し、その後、細胞分化はIR-Bの発現を上方に調節する。IR-Aは複数の腫瘍並びに乳癌及び大腸癌を含む癌細胞系において上方に調節され、IR-BよりもIR-Aに対して40〜50倍高い親和性を有する、IGF-IIの増殖促進作用のいくつかを媒介する。
【０００９】
WO 90/01038によると、HisB25ヒトインスリン; HisB25, AspB28, desB30ヒトインスリン及びHisB25ヒトインスリン B30アミドは高い生物学的活性を有する。EP 837,072 A2によると、 HisB25, des B26, desB30ヒトインスリンは溶液中での会合能力が低い。これらの文献において肝臓活性についての言及はない。WO 2008/034881によると、いくつかのA14E, B25H及びB25H, B27Tインスリンアナログはプロテアーゼに対して抵抗性を示す。WO 00/69901では、図5Aにおいて、「ヒトインスリンと比較して少なくとも約1〜20アミノ酸の置換を有するアミノ酸配列、特に6アミノ酸を有するIAタンパク質」と開示される。WO 00/69901における請求項9によると、アミノ酸N (Asn)は位置B25における起こり得る置換の一つであるが、請求項9は請求項8のみを参照しているので、B25N置換は、少なくとも5つの置換を含むIAタンパク質に対するうわべだけのものとして言及されている。
【００１０】
US 5,446,020では、アミノ残基A12、A14、A15及びA19で改変されているインスリンアナログが開示されている。WO 90/12814は、A13, A14, A15, A19及びB16の位置で置換されている肝臓特異的なインスリンアナログを開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】WO 90/01038
【特許文献２】EP 837,072 A2
【特許文献３】WO 2008/034881
【特許文献４】WO 00/69901
【特許文献５】US 5,446,020
【特許文献６】WO 90/12814
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】EMBO Journal 9 (1990), 2409-13
【非特許文献２】Greene and Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, 1999
【非特許文献３】EPOガイドラインC, III, 4.13
【非特許文献４】Kjeldsen et al., (1998), Prot. Expr. Pur. 14, 309-316
【非特許文献５】Kristensen et al., (1997), J. Biol. Chem. 20, 12978-12983
【非特許文献６】Glendorf et al. (2008), Biochemistry, 47, 4743-4751
【非特許文献７】Volund, A., (1978), Biometrics, 34, 357-365
【非特許文献８】Kohler, G & Milstein C. (1976), European J. Immunology, 6:511-19
【非特許文献９】Taggart RT et al (1983), Science 219:1228-30
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、先行技術の不利益の少なくとも1つを克服しまたは改善する、あるいは有用な代替手段を提供することである。
【００１４】
本発明の一態様は、インスリン受容体の、AアイソフォームよりもBアイソフォームに対して高い親和性を有するインスリンアナログの提供に関する。
【００１５】
本発明の別の態様は、グルコースの制御を改善するインスリンアナログの提供に関する。
【００１６】
本発明の別の態様は、低血糖のリスクを減少させるインスリンアナログの提供に関する。
【００１７】
本発明の別の態様は、全くまたはほとんど体重増加を提供しないインスリンアナログの提供に関する。
【００１８】
本発明の別の態様は、改善された脂質プロファイルの提供に関する。
【００１９】
本発明の別の態様は、心臓保護作用の提供に関する。
【００２０】
本発明の別の態様は、ヒトインスリンに関与する癌のリスクと比較して、癌のリスクを低減させるインスリンアナログの提供に関する。
【００２１】
本発明の別の態様は、肝臓選択的であるインスリンアナログの提供に関する。
【００２２】
定義
本明細書で使用される用語「インスリンアナログ」は、1または複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている、並びに/あるいは、1または複数のアミノ酸残基が欠失している、並びに/あるいは、1または複数のアミノ酸残基が追加されている、ヒトインスリンを意味する。
【００２３】
A1, A2及びA3などのような本明細書の用語は、インスリンのA鎖において（N末端から計算して）、それぞれ、位置1、2及び3などにおけるアミノ酸残基を示す。同様に、B1, B2及びB3などのような用語は、インスリンのB鎖において（N末端から計算して）、それぞれ、位置1、2及び3などにおけるアミノ酸残基を示す。アミノ酸残基をコードする一文字を使用した、A21A, A21G及びA21Qのような用語は、A21の位置におけるアミノ酸残基が、それぞれ、A、G及びQであることを示す。アミノ酸残基をコードする三文字を使用して、対応する表現は、それぞれ、A21Ala, A21Gly及びA21Glnである。
【００２４】
本明細書において用語A(0)及びB(0)は、A1及びB1に対するN末端側のアミノ酸残基の位置をそれぞれ示す。用語A(-1)及びB(-1)はA(0)及びB(0)に対するN末端側の最初のアミノ酸残基の位置をそれぞれ示す。このようにして、A(-2)及びB(-2)は、A(-1)及びB(-1)に対するN末端側のアミノ残基の位置をそれぞれ示し、A(-3)及びB(-3)は、A(-2)及びB(-2)に対するN末端側のアミノ酸残基の位置をそれぞれ示していき、その他同様である。
【００２５】
本明細書において、用語アミノ酸残基は、形式上、カルボキシ基からヒドロキシ基が除去されている、及び／または、形式上、アミノ基から水素原子が除去されている、アミノ酸である。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
簡潔には、本発明は、B25アミノ酸残基がHis (H)またはAsn (N)であるが、ただしB25アミノ酸残基がHisである場合、B27アミノ酸残基がAsp (D)またはGlu (E)であり、A14アミノ酸残基がGlu (E)とは異なる、インスリンアナログに関する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
隣接するB23Gly及びB27Thr残基とともに、B24Phe, B25Phe及びB26Tyrからなる芳香族化合物のトリプレットに関する解析により、一連の新しいクラスの受容体アイソフォーム選択的アナログが発見された。ヒトインスリンと比較して、インスリン受容体のAまたはBアイソフォームのいずれかに関する相対的な結合親和性において2〜4倍の差を有する複数のアナログにより、位置B25が受容体アイソフォーム選択性のための重要な決定因子であることの同定が可能になった。B25PheをAsnで置換することにより、受容体のAアイソフォームと比較してBアイソフォームに対して2倍以上高い相対的な結合親和性を有するアナログが得られたが、かかる位置にTyr残基を導入した場合には逆のことが観察された。位置B27での酸性アミノ酸残基は、B25N変異を含むアナログに対して、受容体Bアイソフォームに対する親和性をさらに2倍選択的に増加させた。さらに、B25HをB27DまたはB27Eのいずれかと組み合わせることにより、対応する単一突然変異アナログが相対的なアイソフォーム結合親和性において何らの差も示さないにも関わらず、Bアイソフォーム選択的アナログが得られることも発見された。これらの結果は、インスリン分子における位置B25単独での突然変異の一つまたは位置B27での突然変異との組み合わせが、インスリン受容体アイソフォーム選択性を与えることを示している。
【００２８】
インスリンアナログの製造
ポリペプチド、例えばインスリンの製造は、当該技術分野において周知である。本発明のインスリンアナログは、古典的なペプチド合成、例えば、t-BocまたはFmocケミストリーを用いた固相ペプチド合成、あるいは他のよく確立された技法（例えば、Greene and Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, 1999を参照）により、例えば製造可能である。本発明のインスリンアナログは、アナログをコードするDNA配列を含む宿主細胞を培養する工程を含み、インスリンアナログの発現を可能にする条件下で適当な栄養培地中でインスリンアナログを発現可能である方法によって、製造されてもよい。従って、簡潔に、本発明のインスリンアナログは、既知のインスリンアナログの製造に類似的に製造される。
【００２９】
適応：
糖尿病
用語「糖尿病」または「（真性）糖尿病」は、1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠性糖尿病（妊娠中）及び高血糖症を引き起こす他の状態を含む。かかる用語は、哺乳類、特にヒトにおける、膵臓が不十分な量のインスリンを産生する、あるいは体の細胞がインスリンに適切に応答できないので細胞がグルコースを吸収することができない代謝疾患のために使用される。結果として、グルコースが血中に増大する。
【００３０】
インスリン依存性糖尿病(IDDM)及び若年発症型糖尿病とも呼ばれる、1型糖尿病は、B細胞の破壊により生じ、それにより通常全くのインスリン欠損に陥る。
【００３１】
インスリン非依存性糖尿病(NIDDM)及び成人発症型糖尿病とも呼ばれる、2型糖尿病は、主にインスリン抵抗性、及びそれによる相対的なインスリン欠乏、並びに／あるいは、インスリン抵抗性を伴う主にインスリンの分泌欠陥と関連する。
【００３２】
他の適応
一実施態様において、本発明のインスリンアナログは、高血糖症、2型糖尿病、耐糖能異常、1型糖尿病、肥満、高血圧、X症候群、脂質異常症、認知障害、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、冠動脈性心疾患及び他の循環器疾患、炎症性腸疾患、消化不良、及び胃潰瘍の治療または予防のための医薬の製造のためにも使用される。
【００３３】
他の実施態様において、本発明のインスリンアナログは、2型糖尿病の病気の進行を遅らせるまたは防止するための医薬として使用される。
【００３４】
他の実施態様において、本発明のインスリンアナログは、食物摂取を減少させ、β細胞のアポトーシスを減少させ、β細胞の機能及びβ細胞の集団を増加させ、及び／または、β細胞に対するグルコース感受性を回復させるための医薬として使用される。
【００３５】
本発明の一実施態様において、本発明のインスリンアナログは、高血糖症、2型糖尿病、耐糖能異常、1型糖尿病、肥満、高血圧、X症候群、脂質異常症、認知障害、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、冠動脈性心疾患及び他の循環器疾患、脳卒中、炎症性腸疾患、消化不良、及び胃潰瘍を治療しまたは予防するための、あるいは2型糖尿病の病気の進行を遅らせるまたは防止するための、あるいは食物摂取を減少させ、β細胞のアポトーシスを減少させ、β細胞の機能及びβ細胞の集団を増加させるための、及び／または、β細胞に対するグルコース感受性を回復させるための医薬として使用するために提供される。
【００３６】
本発明のさらなる一実施態様において、高血糖症、2型糖尿病、耐糖能異常、1型糖尿病、肥満、高血圧、X症候群、脂質異常症、認知障害、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、冠動脈性心疾患及び他の循環器疾患、脳卒中、炎症性腸疾患、消化不良、及び胃潰瘍を治療しまたは予防するための、あるいは2型糖尿病の病気の進行を遅らせるまたは防止するための、あるいは食物摂取を減少させ、β細胞のアポトーシスを減少させ、β細胞の機能及びβ細胞の集団を増加させるための、及び／または、β細胞に対するグルコース感受性を回復させるための方法が提供され、該方法は、本発明のインスリンアナログのこのような治療に有効な量をこのような治療を必要とする患者に投与する工程を含む。
【００３７】
糖尿病の合併症用化合物
本発明のインスリンアナログを用いる治療は、例えば、抗糖尿病薬、抗肥満薬、食欲調節剤、抗高血圧剤、糖尿病から生じるもしくは糖尿病に関連する合併症の治療剤及び／または予防剤、並びに肥満から生じるもしくは肥満に関連する合併症及び疾患の治療剤及び／または予防剤から選択される、第2またはさらなる薬理活性物質と組み合わされてもよい。これらの薬理活性物質の例は：GLP-1及びGLP-1の誘導体及びアナログ、GLP-2及びGLP-2の誘導体及びアナログ、エキセンジン-4及びエキセンジン-4の誘導体及びアナログ、アミリン及びアミリンの誘導体及びアナログ、スルホニル尿素、ビグアニド、メグリチニド(meglitinide)、グルコシダーゼ阻害剤、グルカゴンアンタゴニスト、DPP-IV(ジペプチジルぺプチダーゼIV)阻害剤、糖新生及び／またはグリコーゲン分解の刺激に関与する肝酵素の阻害剤、グルコース摂取調節剤、HMG CoA阻害剤（スタチン）としての抗脂質異常症薬などの脂質代謝を改善する化合物、食物摂取を減少させる化合物、RXRアゴニスト、及びβ細胞のATP依存性（感受性）カリウムチャネルに作用する薬剤；コレスチラミン, コレスチポール, クロフィブラート, ゲンフィブロジル, ロバスタチン, プラバスタチン, シムバスタチン, プロブコール, デキストロチロキシン, ネテグリニド, レパグリニド；β遮断薬であって、アルプレノロール, アテノロール, チモロール, ピンドロール, プロプラノロール及びメトプロロールなど、ACE (アンジオテンシン変換酵素)阻害剤であって、ベナゼプリル, カプトプリル, エナラプリル, ホシノプリル, リシノプリル, アラトリオプリル, キナプリル及びラミプリルなど、カルシウムチャネル阻害剤であって、ニフェジピン, フェロジピン, ニカルジピン, イスラジピン, ニモジピン, ジルチアゼム及びベラパミルなど、並びにα遮断薬であって、ドキサゾシン, ウラピジル, プラゾシン及びテルアゾシンなど；CART(コカインアンフェタミン調節転写物)アゴニスト、NPY(ニューロペプチドY)アンタゴニスト、MC4(メラノコルチン4)アゴニスト、オレキシンアンタゴニスト、TNF（腫瘍壊死因子）アゴニスト、CRF(コルチコトロピン放出因子)アゴニスト、CRF BP(コルチコトロピン放出因子結合タンパク質)アンタゴニスト、ウロコルチンアゴニスト、β3アゴニスト、MSH(メラニン細胞刺激ホルモン)アゴニスト、MCH(メラニン細胞凝集ホルモン）アンタゴニスト、CCK (コレシストキニン)アゴニスト、セロトニン再摂取阻害剤、セロトニン及びノルアドレナリン再摂取阻害剤、セロトニン及びノルアドレナリン作動性化合物の混合物、5HT (セロトニン) アゴニスト、ボンベシンアゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、成長ホルモン、成長ホルモン放出化合物、TRH(チロトロピン放出ホルモン）アゴニスト、UCP2もしくは3(脱共役タンパク質2もしくは3）調節因子、レプチンアゴニスト、DAアゴニスト(ブロモクリプチン, ドプレキシン)、リパーゼ/アミラーゼ阻害剤、RXR (レチノイドX受容体)調節因子、TRβアゴニスト；ヒスタミンH3アンタゴニスト、ガストリン及びガストリンアナログ及び誘導体である。
【００３８】
1または複数の前述の化合物及び場合により1または複数のさらなる薬理活性物質の、本発明のインスリンアナログとのいずれの適当な組み合わせもが、本発明の範囲内にあるとみなされると理解されるべきである。
【００３９】
本発明の化合物の使用
投与経路は、非経口などで、例えば、皮下に、筋肉内に、または静脈内に、本発明のインスリンアナログを体の中の望ましいまたは適切な場所に効果的に輸送するいずれの経路であってもよい。あるいは、本発明のインスリンアナログは、経口的に、経肺的に、または経鼻的に投与され得る。
【００４０】
非経口投与に関して、本発明の化合物は、既知のインスリンの製剤と類似して製剤化される。さらに、非経口投与に関して、本発明の化合物は、既知のインスリンの投与と類似して投与され、医師はかかる処置に精通している。
【００４１】
非経口投与は、シリンジ、場合によりペン状のシリンジを用いて実施され得る。あるいは、非経口投与は点滴ポンプを用いて実施され得る。
【００４２】
本発明の化合物を含む注射用組成物は、望ましい最終製品を提供するのに適切な材料を溶解し混合させる工程に関わる医薬品産業の従来技術を用いて製造可能である。従って、一手段に従って、本発明の化合物は調製される組成物の最終体積より幾分少ない量の水に溶解される。等張剤、保存剤及び緩衝剤を必要に応じて添加し、必要に応じて、酸、例えば、塩酸、または、塩基、例えば、水酸化ナトリウム水溶液を用いて、必要があれば、溶液のpH値を調整する。最後に、溶液の体積を水で調整して、材料の望ましい濃度を得る。
【００４３】
より正確には、本発明のインスリン製剤、例えばそれらの溶液または懸濁液は、わずかに酸性の状態、例えば、約240から約1200 nモル/mlの範囲にある濃度で、水性媒体中に本発明の化合物を溶解させることによって製造されてよい。水性媒体は例えば塩化ナトリウムまたはグリセロールを用いて等張にされる。さらに、水性媒体は、インスリン活性の1ユニットあたり最大約20μｇのZn++の濃度で亜鉛イオン、酢酸塩及びクエン酸塩などの緩衝剤及びm-クレゾールまたはフェノールなどの保存剤を含んでもよい。溶液のpH値は、沈殿を避けるために、本発明の化合物の等電点にあまりに近づかせることなく中性に調整される。最終的なインスリン製剤のpH値は、本発明の化合物が使用される条件での、亜鉛イオンの濃度及び本発明の化合物の濃度に依存する。インスリン製剤は、例えば、滅菌用濾過により、滅菌される。
【００４４】
本発明のインスリン製剤は既知のインスリン製剤の使用に類似して使用される。
【００４５】
投与する本発明の化合物の量、本発明の化合物を投与する頻度の決定、及び場合により他の抗糖尿病用化合物とともに投与される本発明の化合物（単数または複数）の選択は、糖尿病の治療に精通している実務家による診察において決定される。
【００４６】
それ故に、本発明は、糖尿病の治療方法にも関し、該方法にはかかる治療を必要とする患者に有効量の本発明の化合物を投与する工程が含まれる。
【００４７】
本発明の好ましい特徴
上述の記載をまとめかつ補充するための、本発明の特徴は以下の節に記載の通りである：
【００４８】
1.  B25アミノ酸残基がHis (H)またはAsn (N)であるが、ただしB25アミノ酸残基がHisである場合、B27アミノ酸残基はAsp (D)またはGlu (E)であり、A14アミノ酸残基がGlu (E)とは異なるインスリンアナログであって、さらに、前記インスリンアナログが4つの位置より多くにおいてはヒトインスリンとは異ならないことを条件とするインスリンアナログ。
【００４９】
2.  B25アミノ酸残基がHis (H)またはAsn (N)であるが、ただしB25アミノ酸残基がHisである場合、B27アミノ酸残基はAsp (D)またはGlu (E)であり、A14アミノ酸残基がGlu (E)とは異なるインスリンアナログ。
【００５０】
3.  B25アミノ酸残基がHis (H)であり、B27アミノ酸残基がAsp (D)またはGlu (E)であり、A14アミノ酸残基がGlu (E)とは異なる、前述の節に記載の、インスリンアナログ。
【００５１】
4.  最大で5つまでのアミノ酸残基がヒトインスリンに存在するそれらと同一の位置で異なる、前述の二節に記載のインスリンアナログ。
【００５２】
5.  B25アミノ酸残基がAsn (N)である、節1に記載のインスリンアナログ。
【００５３】
6.  最大で5つまでのアミノ酸残基がヒトインスリンに存在するそれらと同一の位置で異なる、前述の節に記載のインスリンアナログ。
【００５４】
7.  前記アナログが、A14Q, A22K, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16H, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16E, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16H, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16E, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16H, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16E, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16H, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16E, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16H, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16E, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16H, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16E, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30ヒトインスリン及びA14D, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30ヒトインスリンとは異なる、前述のいずれか一節に記載のインスリンアナログ。
【００５５】
8.  前記アナログが、B25N, B27E, desB30ヒトインスリン; A8H, B25N, B27E, desB30ヒトインスリン; B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; B1E, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A8H, B1E, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A8H, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; B25N, B27D, desB30ヒトインスリン; A8H, B25N, B27D, desB30ヒトインスリン; B25H, B27D, desB30ヒトインスリン及びA8H, B25H, B27D, desB30ヒトインスリンとは異なる、前述のいずれか一節に記載のインスリンアナログ。
【００５６】
9.  前記アナログが、B25N, desB30ヒトインスリン及びA21G, B25N, desB30ヒトインスリンとは異なる、前述のいずれか一節に記載のインスリンアナログ。
【００５７】
10.  前記アナログが、A14Q, A22K, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16H, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16E, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16H, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16E, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30ヒトインスリン; A14Q, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16H, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16E, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16H, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16E, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30ヒトインスリン; A14P, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16H, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16E, B25H, B27E, B29R, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, B29R, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16H, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16E, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16E, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30ヒトインスリン; A14D, A22K, B16H, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30ヒトインスリン; B25N, B27E, desB30ヒトインスリン; A8H, B25N, B27E, desB30ヒトインスリン; B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; B1E, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A8H, B1E, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; A8H, B25H, B27E, desB30ヒトインスリン; B25N, B27D, desB30ヒトインスリン; A8H, B25N, B27D, desB30ヒトインスリン; B25H, B27D, desB309ヒトインスリン; A8H, B25H, B27D, desB30ヒトインスリン; B25N,desB30ヒトインスリン及びA21G,B25N,desB30-ヒトインスリンとは異なる、前述のいずれか一節に記載のインスリンアナログ。
【００５８】
11.  B25アミノ酸残基がAsn (N)であり、B27アミノ酸残基がLys (K)及びCys (C)とは異なる、節1または3に記載のインスリンアナログ。
【００５９】
12.  A8アミノ酸残基がHis (H)である、前述のいずれか一節に記載のインスリンアナログ。
【００６０】
13.  A14アミノ酸残基がTyr (Y)である、前述のいずれか一節に記載のインスリンアナログ。
【００６１】
14.  B27アミノ酸残基がE (Glu)またはD (Asp)である、前述のいずれかの可能な一節に記載のインスリンアナログ。
【００６２】
15.  B30の位置にアミノ酸残基が存在しない（すなわち、desB30ヒトインスリンアナログである）、前述のいずれかの可能な一節に記載のインスリンアナログ。
【００６３】
16.  B29及びB30の位置にアミノ酸残基が存在しない（すなわち、desB29, desB30ヒトインスリンアナログである）、前述のいずれかの可能な一節に記載のインスリンアナログ。
【００６４】
17.  B28, B29及びB30の位置にアミノ酸残基が存在しない（すなわち、desB28, desB29, desB30ヒトインスリンアナログである）、前述のいずれかの可能な一節に記載のインスリンアナログ。
【００６５】
18.  B27, B28, B29及びB30の位置にアミノ酸残基が存在しない（すなわち、desB27, desB28, desB29, desB30ヒトインスリンアナログである）、前述のいずれかの可能な一節に記載のインスリンアナログ。
【００６６】
19.  B鎖の位置26, 27または28におけるアミノ酸がAspまたはGluである、前述のいずれかの可能な一節に記載のインスリンアナログ。
【００６７】
20.  [A8H, B25N, B27D]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27E]ヒトインスリン; [A8H, B25N]ヒトインスリン; [A8H, B25H, B27D]ヒトインスリン; [A8H, B25H, B27E]ヒトインスリン; [B25H, B27D]ヒトインスリン; [B25H, B27E]ヒトインスリン; [B25H]ヒトインスリン; [B25N, B27D]ヒトインスリン; [B25N, B27E]ヒトインスリン; [B25N]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27D, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27E, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25H, B27D, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25H, B27E, desB30]ヒトインスリン; [B25H, B27D, desB30]ヒトインスリン; [B25H, B27E, desB30]ヒトインスリン; [B25H, desB30]ヒトインスリン; [B25N, B27D, desB30]ヒトインスリン; [B25N, B27E, desB30]ヒトインスリン及び[B25N, desB30]ヒトインスリンからなる群から選択される、可能な限りにおいて前述のいずれか一節に記載のインスリンアナログ。
【００６８】
21.  [A8H, B25N, B27D, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27E, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25H, B27D, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25H, B27E, desB30]ヒトインスリン; [B25H, B27D, desB30]ヒトインスリン; [B25H, B27E, desB30]ヒトインスリン; [B25N, B27D, desB30]ヒトインスリン; [B25N, B27E, desB30]ヒトインスリン及び[B25N, desB30]ヒトインスリンである、前述の節に記載のインスリンアナログ。
【００６９】
22.  [A8H, B25H]ヒトインスリンまたは[A8H, B25H, des B30]ヒトインスリンである、可能な限りにおいて前述のいずれか一節に記載のインスリンアナログ。
【００７０】
23.  [A8H, B25N, B27A, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27R, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27N, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27D, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27Q, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27E, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27G, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27H, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27I, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27L, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27M, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27F, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27P, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27S, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27W, desB30]ヒトインスリン; [A8H, B25N, B27Y, desB30]ヒトインスリン及び[A8H, B25N, B27V, desB30]ヒトインスリンからなる群から選択される、可能な限りにおいて前述のいずれか一節に記載のインスリンアナログ。
【００７１】
24.  以下の化合物[A8H, B25N, B27D, desB30]ヒトインスリン及び[A8H, B25N, B27E, desB30]ヒトインスリンのいずれでもない、可能な限りにおいて前述のいずれか一節に記載のインスリンアナログ。
【００７２】
25.  最大で5つまでのアミノ酸残基がヒトインスリンに存在するそれらと同一の位置で異なる、前述のいずれか一節に記載のインスリンアナログ。
【００７３】
26.  最大で4つまでのアミノ酸残基がヒトインスリンに存在するそれらと同一の位置で異なる、前述の節に記載のインスリンアナログ。
【００７４】
27.  最大で3つまでのアミノ酸残基がヒトインスリンに存在するそれらと同一の位置で異なる、前述の節に記載のインスリンアナログ。
【００７５】
28.  最大で2つまでのアミノ酸残基がヒトインスリンに存在するそれらと同一の位置で異なる、前述の節に記載のインスリンアナログ。
【００７６】
29.  最大で1つのアミノ酸残基がヒトインスリンに存在するそれと同一の位置で異なる、前述の節に記載のインスリンアナログ。
【００７７】
30.  インスリン受容体のIR-Aアイソフォームに対する親和性の少なくとも1.5倍である、インスリン受容体のIR-Bアイソフォームに対する親和性を有するインスリンアナログ。
【００７８】
31.  インスリン受容体のIR-Aアイソフォームに対する親和性の少なくとも2倍である、インスリン受容体のIR-Bアイソフォームに対する親和性を有する、前述の節に記載のインスリンアナログ。
【００７９】
32.  インスリン受容体のIR-Aアイソフォームに対する親和性の少なくとも2.5倍である、インスリン受容体のIR-Bアイソフォームに対する親和性を有する、前述の節に記載のインスリンアナログ。
【００８０】
33.  インスリン受容体のIR-Aアイソフォームに対する親和性の少なくとも3倍である、インスリン受容体のIR-Bアイソフォームに対する親和性を有する、前述の節に記載のインスリンアナログ。
【００８１】
34.  インスリン受容体のIR-Aアイソフォームに対する親和性の少なくとも3.5倍である、インスリン受容体のIR-Bアイソフォームに対する親和性を有する、前述の節に記載のインスリンアナログ。
【００８２】
35.  インスリン受容体のIR-Aアイソフォームに対する親和性の少なくとも4倍である、インスリン受容体のIR-Bアイソフォームに対する親和性を有する、前述の節に記載のインスリンアナログ。
【００８３】
36.ヒトインスリンのIR-B親和性に対するインスリンアナログのIR-B親和性を測定し、ヒトインスリンのIR-A親和性に対するインスリンアナログのIR-A親和性を測定し、これら二つの相対的な親和性間の比率を計算することを特徴とする、インスリンアナログがアイソフォーム選択的であるかどうかを評価する方法。
【００８４】
37.ヒトインスリンのIR-B親和性に対するインスリンアナログのIR-B親和性を測定し、ヒトインスリンのIR-A親和性に対するインスリンアナログのIR-A親和性を測定し、これら二つの相対的な親和性間の比率を計算することを特徴とする、インスリンアナログが肝臓選択的であるかどうかを評価する方法。
【００８５】
38.  特には実施例1〜4のいずれか一つである、特定の実施例などの、本明細書に具体的に開示される化合物のうちのいずれか一つである、前述の、物に関するいずれか一節に記載の化合物。
【００８６】
39.  B25N, desB30ヒトインスリン及びB25H, B27E, deB30ヒトインスリンである、前述の、物に関するいずれか一節に記載の化合物。
【００８７】
40.  医薬としての使用のため、または医薬における使用のための、前述の、物に関するいずれか一節に記載の化合物。
【００８８】
41.  糖尿病を治療するための前述の、物に関するいずれか一節に記載の化合物、または糖尿病の治療のための医薬の製造のための前述の、物に関するいずれか一節に記載の化合物の使用。
【００８９】
42.  糖尿病の治療のための医薬組成物の製造に関する前節を除いた前述の、物に関するいずれか一節に記載の化合物の使用。
【００９０】
43.  前述の、物に関するいずれか一節に記載の化合物を治療上有効量でそれを必要とする対象に投与する工程を含む、糖尿病の治療方法。
【００９１】
44.  前述のいずれか一節に記載のインスリンアナログを治療上有効量でそれを必要とする対象に投与する工程を含む、糖尿病の治療方法、及び同時に、ヒトインスリンと関連する糖尿病よりは低い、癌の発症リスクを知らせる方法。
【００９２】
45.  インスリンアナログが前記節10に記載のインスリンアナログのいずれとも異なる、前述の節に記載の方法。
【００９３】
46.  本明細書に開示されるいずれかの新規特徴または特徴の組み合わせ。
【００９４】
概論
本明細書に記載の1または複数の実施形態及び／または節の、場合により1または複数の請求項との組み合わせにより、さらなる実施形態が生まれ、本発明は、前述の実施形態及び請求項の可能なすべての組み合わせに関する。
【００９５】
本明細書で引用される刊行物、特許出願、及び特許を含むすべての参考文献が、（法により許容される最大の程度まで）各参考文献が個々に及び具体的に参照により援用されるものとして表示され、かつその全体が本明細書中で説明されるものであるように、それらの全体が、かつ同程度まで、参照により本明細書中に援用される。
【００９６】
すべての見出し及び小見出しは利便性のためのみに本明細書に使用され、いかなる態様でも本発明を限定するものとして解釈されてはならない。
【００９７】
本明細書において提供される、いずれの及びすべての実施例、または例示としての言語（例えば、「など」）の使用は、本発明をより良く例示するためにのみ意図され、特に主張されない限りは本発明の範囲に関して制限を課すものではない。本明細書において言葉がないことは、本発明の実施に本質的なものとしての任意の主張されていない要素を示すものとして解釈される。
【００９８】
本明細書における特許文書の引用及び取り込みは、利便性のためのみに行われるものであり、かかる特許文書の有効性、特許性、及び／または権利行使可能性のいずれの観点をも反映しない。参考文献の本明細書中への言及は、それらが先行技術を構成することを了承するものではない。
【００９９】
本明細書において、用語「含む(comprise)」は、「含む(include、containまたはcomprehend)」を概して意味するものとして解釈される(EPOガイドラインC, III, 4.13)。
【０１００】
本発明は、適用される法律により許容されるようにして、ここに添付される特許請求の範囲に記載の主題(subject matter)のあらゆる修正及び同等物を含む。
【実施例】
【０１０１】
以下の実施例が、制限によるのではなく、例示を目的として提供される。
[実施例１]
[A8H, B25N, desB30]ヒトインスリン
【０１０２】
【化１】
2012511506.tif 000002
【０１０３】
[実施例２]
[A8H, B25N, B27E, desB30]ヒトインスリン
【０１０４】
【化２】
2012511506.tif 000003
【０１０５】
使用されるすべての化学物質及び試薬は入手できる最高純度のものである。固定化されたAchromobachter lyticusプロテアーゼはノボノルディスクA/S由来のものである。
【０１０６】
インスリンアナログの精製及び消化(digestion)は、以下のように為されてよい：酵母の上清由来のインスリン前駆体を陽イオン交換により精製しかつ濃縮する（Kjeldsen et al., (1998), Prot. Expr. Pur. 14, 309-316）。単鎖のインスリン前駆体を、リジン特異的なAchromobachter lyticus (以降、ALPと示す)プロテアーゼで消化して2本鎖のインスリンに成熟させる (Kristensen et al., (1997), J. Biol. Chem. 20, 12978-12983)。インスリン前駆体を含む陽イオン交換クロマトグラフィーの工程から得た溶出液を水で希釈して、15〜20％のエタノール濃度にする。グルタミン酸ナトリウムを添加して15 mMの濃度にし、pHをNaOHにより調整して9.7にする。固定化ALP (4グラム/L)を1:100 (体積：体積)の割合で添加して、室温で一晩穏やかに攪拌しながら消化が進行するのを可能にする。消化反応をC18カラムを用いるWaters Acquity Ultra-Performance Liquidクロマトグラフィーシステムで分析用LCにより解析し、分子量をマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析法により確認する(Bruker Daltonics Autoflex II TOF/TOF)。固定化されたA. lyticusプロテアーゼを0.2μmのフィルターで濾過して除去する。2本鎖のインスリン分子を、アセトニトリル勾配を用いてC18カラム上で逆相HPLC (Waters 600 system)により精製する。望ましいA8H, B25N, B27E, desB30ヒトインスリン (5.11 g)を凍結乾燥により回収する。純度をC18カラムを用いるWaters Acquity Ultra-Performance Liquidクロマトグラフィーシステムで分析用LCにより決定し、分子量をマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析法により確認する。
【０１０７】
[実施例３]
[A8H, B25H, B27D, desB30]ヒトインスリン
【０１０８】
【化３】
2012511506.tif 000004
【０１０９】
[実施例４]
[A8H, B25H, B27E, desB30]ヒトインスリン
【０１１０】
【化４】
2012511506.tif 000005
【０１１１】
[実施例５]
[A8H, B25N, B27D, desB30]ヒトインスリン
【０１１２】
[実施例６]
[B25H, B27E, desB30]ヒトインスリン
【０１１３】
[実施例７]
[B25N, desB30]ヒトインスリン
【０１１４】
[実施例８]
（可溶化されたインスリン受容体上の）インスリン受容体結合アッセイ
ヒトインスリン受容体に対する本発明のインスリンの親和性は、（Glendorf et al. (2008), Biochemistry, 47, 4743-4751による）シンチレーション近接アッセイ(SPA)により決定される。競合結合実験を、ヒトIR-AまたはIR-Bの挿入物を含むpZemベクターで安定的にトランスフェクトした、baby hamster kidney (BHK)細胞よりコムギ胚芽凝集素により半精製した、可溶化したヒトIR (ホロレセプター(holoreceptor))を用いてエッペンドルフ社製のepMotion 5075ロボット上で96ウェルプレート(ポリスチレンOptiplate-96, パーキンエルマー)において実施した。2本鎖アナログ及びヒトインスリン基準(standard)を含む酵母の上清の希釈系列(dilution series)を作製してアッセイを開始した（それぞれ5倍した8つの希釈液、最初の希釈液43倍）。結合バッファー中に再懸濁されたSPAビーズ(SPA PVT抗体結合ビーズ, Anti-Mouse Reagent Cat. No. RPNQ0017, GEヘルスヘア)、抗IRモノクローナルマウス抗体(83-7), 可溶化したヒトIR (hIR-AまたはhIR-B), 及び [125I]A14Tyr標識化インスリンからなる試薬混合物を、適当なサンプルの希釈系列に添加した。[125I]A14Tyr標識化インスリンの最終濃度は7.5 pMであり、バッファーは、100 mM HEPES (pH 7.8), 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4, 及び 0.025% (v/v) Tween 20から成っていた。プレートを室温で24時間穏やかに振りながらインキュベートし、2000 rpmで2分間遠心分離し、TopCount NXTで3分間/ウェルでカウントした。SPAから得たデータを4つのパラメーターロジスティックモデルに従って解析し(Volund, A., (1978), Biometrics, 34, 357-365)、インスリンアナログの親和性を、ヒトインスリンのそれに対して表した。
【０１１５】
モノクローナルmIR抗体の製造
特定の抗体(F12または83-7)をモノクローナル技術により製造する：RBFマウスをFCAにおいて皮下に50μgの精製したmIRを注射し、続いて、FIAにおいて20μgのmIRを2回注射することによって免疫した。応答の高いマウスを25μgのmIRで静脈内投与によりブーストし、3日後に脾臓を収穫する。脾臓細胞を骨髄腫Fox細胞株と融合させる(Kohler, G & Milstein C. (1976), European J. Immunology, 6:511-19; Taggart RT et al (1983), Science 219:1228-30)。上清をmIR特異的ELISAにおける抗体産生用にスクリーニングする。陽性のウェルをクローニングし、ウェスタンブロッティングで試験する。
【０１１６】
以下の表において、desB30インスリンアナログの親和性を、hIR-AまたはhIR-Bのいずれかを使用したアッセイで、ヒトインスリンに対して表す。IR親和性を酵母上清において直接インスリンアナログを使用して評価した。desB30ヒトインスリンは、hIR-A及びhIR-Bに対して、それぞれ、98及び100％の相対的親和性を示す。
【０１１７】
以下の表において、見出し「hIR-A」がついているカラム中に与えられるデータは、ヒトインスリンのhIR-A親和性に対する試験された化合物のhIR-A親和性の比であり、見出し「hIR-B」がついているカラム中に与えられるデータは、ヒトインスリンのhIR-B親和性に対する試験された化合物のhIR-B親和性の比であり、見出し「比 B/A」がついているカラム中に与えられるデータは、それぞれ、見出し「hIR-B」及び「hIR-A」がついているカラム中に与えられる数字の比である。
【０１１８】
【表１】
2012511506.tif 000006
【０１１９】
この表から明らかであるように、ヒトインスリンと比較して、hIR-Bに対する相対的親和性は、ｈIR-Aに対する相対的親和性より最大で4倍高い。
【０１２０】
[実施例９]
下表における化合物を、実施例８に記載されるように試験した。この表において、見出し「比 B/A」がついているカラム中のデータを、実施例８に開示されるように計算する。
【０１２１】
【表２】
2012511506.tif 000007
【０１２２】
この表から明らかであるように、ヒトインスリンと比較して、hIR-Bに対する相対的親和性は、ｈIR-Aに対する相対的親和性の2から4.6倍の範囲にある。
【０１２３】
配列表
配列番号1は実施例1〜4のA鎖であり、配列番号2は実施例1のB鎖であり、配列番号3は実施例2のB鎖であり、配列番号4は実施例3のB鎖であり、配列番号5は実施例4のB鎖である。
【配列表】
2012511506000001.app
【国際調査報告】
2012511506.tif 000008
2012511506.tif 000009
2012511506.tif 000010
2012511506.tif 000011
2012511506.tif 000012