(57)【要約】本発明は、スモールＲＮＡを試料溶液から抽出および精製するための簡単かつ迅速な方法に関する。これに従い、試料をまず有機溶媒と混合して、溶媒を含有する混合物を調製する。ラージＲＮＡを結合させるために、この混合物を第１無機物支持体に適用する。結合していないスモールＲＮＡを含有する濾液を採集し、第２有機溶媒と混合して、第２溶媒を含有する第２混合物を調製する。スモールＲＮＡを結合させるために、この第２混合物を第２無機物支持体に適用する。洗浄工程の後、スモールＲＮＡを溶離する。ラージＲＮＡを第１無機物支持体から溶離することによりラージＲＮＡを単離する方法も提供される。さらに、総タンパク質が濾液中に存在し、これを常法により単離することができる。【選択図】図１
2012502632.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性試料溶液からスモールＲＮＡを単離するための方法であって、
ａ）水性試料を第１双極性非プロトン溶媒と混合して、より低いパーセントの第１溶媒を含有する混合物を調製し；
ｂ）２００ｎｔより大きいラージＲＮＡが第１無機物支持体に結合する条件下で、混合物を第１無機物支持体に適用し；
ｃ）スモールＲＮＡを含有するフロースルーを採集し；
ｄ）工程（ｄ）からのフロースルーを第２双極性非プロトン溶媒と混合して、より高いパーセントの第２溶媒を含有する第２混合物を調製し；
ｅ）スモールＲＮＡを結合させるために混合物を第２無機物支持体に適用し；
ｆ）第２無機物支持体を洗浄緩衝液で洗浄し；そして
ｇ）スモールＲＮＡを第２無機物支持体から溶離する
ことを含む方法。
【請求項２】
水性試料が、生物試料を細胞溶解溶液で細胞溶解することにより生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞溶解溶液が、カオトロピック塩、非イオン界面活性剤、および還元剤を含有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
カオトロピック塩が塩酸グアニジンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
非イオン界面活性剤が、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール、ソルビタリモノラウレート、Ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０およびポリソルベート８０、またはその組合わせから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
非イオン界面活性剤またはその組合わせが０．１〜１０％の範囲である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞溶解溶液が、１〜１０Ｍの塩酸グアニジン、０．１〜１０％のＴＷＥＥＮ（商標）２０、および０．１〜１０％のＮＰ−４０を含有する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
混合工程ｂ）の前に、さらに水性溶液のフェノール−クロロホルム抽出工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
第１無機物支持体および第２無機物支持体が多孔質または非孔質であり、金属酸化物または混合金属酸化物、シリカゲル、シリカ膜、ガラス粒子、粉末ガラス、石英、アルミナ、ゼオライト、二酸化チタン、または二酸化ジルコニウムからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第１無機物支持体および第２無機物支持体が、それぞれシリカ膜である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第１または第２双極性非プロトン溶媒が、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、メチルエチルケトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、およびジメチルスルホキシドから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
第１および第２双極性非プロトン溶媒が両方ともアセトンである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
工程ａ）において、より低いパーセントのアセトンが約３５％であり、一方、工程ｄ）において、より高いパーセントのアセトンが約５０％である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
スモールＲＮＡの収率が、アセトンの代わりにエタノールを用いて得られる収率より少なくとも１０％高い、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
生物試料が、培養細胞、微生物、植物および動物から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
同一試料からラージＲＮＡおよびスモールＲＮＡの両方を分離および単離するための方法であって、
ｉ）スモールＲＮＡを請求項１の工程に従って単離し；
ｉｉ）場合により、ラージＲＮＡを含有する請求項１の工程ｂ）からの第１無機物支持体を洗浄し；そして
ｉｉｉ）ラージＲＮＡを第１無機物支持体から溶離する
ことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引照
本出願は、米国仮特許出願番号６１／０９７，６０４、２００８年９月１７日出願、および６１／１４８，１２６、２００９年１月２９日出願に基づく優先権を主張する；それらの開示内容全体を本明細書に援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、核酸の単離法に関する。より詳細には、本発明はスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）および総ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）を抽出および精製するための簡単かつ迅速な方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
この３０年間、生物源から核酸およびタンパク質を単離および精製するための改良法の開発に多大な努力がなされてきた。これは主に、医療および生物科学における核酸およびタンパク質の用途が増していることによるものであった。血液、組織または培養細胞から単離したゲノムＤＮＡは幾つかの用途をもち、それにはＰＣＲ、配列決定、遺伝子型決定、比較ゲノムハイブリダイゼーションおよびサザンブロット法が含まれる。プラスミドＤＮＡは、配列決定、ＰＣＲ、ワクチンの開発、および遺伝子療法に利用されている。単離されたＲＮＡは多様な下流用途をもち、それにはインビトロ翻訳、ｃＤＮＡ合成、ＲＴ−ＰＣＲ、およびマイクロアレイ遺伝子発現分析が含まれる。タンパク質の分野では、ウェスタンブロット法および２Ｄ電気泳動によるタンパク質同定が、疾患研究および基礎研究において遺伝子発現を調べる際に、またウイルスタンパク質検出に例示されるように診断目的で特異的タンパク質を同定する際に、重要なツールとなった。
【０００４】
核酸およびタンパク質の分析およびインビトロ操作に先立って、一般に、その後の処理手法を妨げる可能性のある目的外混在物を試料から除去するための単離工程が行なわれる。研究および診断のための分子生物学における大部分の手法について、抽出した核酸およびタンパク質が第１段階として必要である。
【０００５】
ＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質の使用の増加により、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質を単離するための迅速で簡単な信頼性のある方法および試薬に対する要望が生じた。多くの用途において、これら３つの細胞成分（ＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質）を単一試料から同時に単離できれば、生物材料試料の採集およびその後のそれらの分析は実質的に簡単になるであろう。生検の場合のように試料サイズが小さいためＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質について個別の単離プロトコルを実施するために試料をより少量の試料に分離するのが不可能なとき、同時単離は特に重要である。
【０００６】
エピジェネティクスには、ＤＮＡおよびタンパク質の修飾（メチル化、アセチル化、リン酸化など）、ならびに遺伝子の発現を制御するたんぱく質−ＤＮＡ相互作用、ならびに細胞生物学に対する後続作用を調べることが含まれる。マイクロＲＮＡおよびｓｉＲＮＡなど小さい調節ＲＮＡもエピジェネティック機序により遺伝子を調節することが知られている。たとえば、クロマチンはこれらの修飾事象により修飾されてそれの構造を変化させ、これにより遺伝子を発現させることができる。クロマチン修飾とマイクロＲＮＡ発現の相互作用は、種々の癌における診断法および療法を提供する際に中枢的役割をもつと期待される。したがって、効率的なｍｉＲＮＡ単離法を入手できることがエピジェネティック分析の中心要素になると予想される。
【０００７】
さらに、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は遺伝子発現を調節し、ｍｉＲＮＡの調節異常が多数の疾患または状態に関与すると示唆されている。マイクロＲＮＡを総タンパク質、ゲノムＤＮＡ、および総ＲＮＡ（すなわち、ｍＲＮＡを含むラージＲＮＡ）と一緒に同一試料から単離できれば、それらの間の相互作用および作用を理解するのに明らかに有利である。マイクロＲＮＡを単離するのに有効な手段は、特に癌、神経学および心臓学の分野において、マイクロＲＮＡベースの診断法および療法の開発にも役立つであろう。
【０００８】
ｍｉＲＮＡの精製は、伝統的に有機抽出に続くアルコール沈殿に依存していた。時間のかかるこの方法では、多くのスモールＲＮＡ、たとえばｍｉＲＮＡがＲＮＡ集団から失われ、したがって非効率的である。数社が、有機抽出に続いて特殊な結合溶液および洗浄溶液を用いてシリカ繊維マトリックス上へスモールＲＮＡを簡単に結合および精製することに基づくｍｉＲＮＡ単離キットを開発した；たとえば、ｍｉｒＶａｎａ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）；ｍｉＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）；ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ）。これらのキットは、細胞および組織タイプを含む多様な試料源から、適度に高い収率のすべてのスモールＲＮＡ（長さ２００ヌクレオチド未満から長さ約１０ヌクレオチドまで）を提供する。
【発明の概要】
【０００９】
スモールＲＮＡの精製のための新規かつ有利な方法を本明細書に提示する。この方法をさらに拡張して、スモールＲＮＡを総ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび総タンパク質のうち1以上と同時に同一試料から単離することができる。
【００１０】
一般に本発明は、試料溶液、たとえば生物試料の細胞溶解液からスモールＲＮＡ（マイクロＲＮＡを含む）を抽出および精製するための簡単かつ迅速な方法を提供する。さらに、長さ２００ヌクレオチドを超えるラージＲＮＡをスモールＲＮＡから分離し、それらを単離することもできる。
【００１１】
スモールＲＮＡを単離するための１態様において、試料をまず有機溶媒と混合して混合物を調製する。この混合物をラージＲＮＡの結合のために第１無機物支持体に適用する。濾液を採集し、第２有機溶媒と混合して第２混合物を調製する。この第２混合物をスモールＲＮＡの結合のために第２無機物支持体に適用する。洗浄工程の後、スモールＲＮＡを溶離する。試料が生物細胞溶解液である場合、カオトロピック塩、非イオン界面活性剤、および還元剤を含有する細胞溶解溶液で試料を溶解することが好ましい。操作を容易にするために、第１無機物支持体と第２無機物支持体は通常は同一材料である。好ましくは、それらはそれぞれシリカ膜カラムである。好ましい第１および第２有機溶媒は双極性非プロトン溶媒である。最も好ましい有機溶媒はアセトンである。より低い溶媒濃度では、ラージＲＮＡは無機物支持体に結合するがスモールＲＮＡは結合しないことが見出された。溶媒の濃度を高めるとスモールＲＮＡが結合し、したがって試料中の他の混在物から分離される。アセトンの使用はスモールＲＮＡの選択的精製を可能にするだけでなくスモールＲＮＡの収率も先行技術方法より増大することが見出された。
【００１２】
この態様の変法において、第１無機物支持体に結合したラージＲＮＡを分離することもできる。したがって、第１無機物支持体を洗浄し、そしてラージＲＮＡを溶離する。
さらに、第２無機物支持体から出る濾液は試料からの総タンパク質を含有する。したがって、タンパク質単離のためのいずれか一般的な方法で、総タンパク質を濾液から単離することができる。
【００１３】
前記態様の他の変法において、第１溶媒との混合物を調製する前に、生物細胞溶解液にフェノール−クロロホルム抽出工程を施す。これにより、大部分の大きいゲノムＤＮＡおよびタンパク質が分離され、したがって単離されるスモールＲＮＡおよびラージＲＮＡの純度が改善される。
【００１４】
他の態様において、種々のワークフロー（ｗｏｒｋｆｌｏｗ）を用いてスモールＲＮＡおよびラージＲＮＡを単離するための組成物およびキットが提供される。
本発明の上記および他の特徴および利点は、以下の詳細な記述および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、試料細胞溶解後にフェノール−クロロホルム抽出工程を用いて、単一試料から富化された総ＲＮＡおよびスモールＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）を単離するための本発明の態様の模式図（ワークフロー−１）を示す。
【図２】図２は、試料細胞溶解後にフェノール−クロロホルム抽出工程を用いて、単一試料から富化されたスモールＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）を単離するための本発明の態様の模式図（ワークフロー−２）を示す。
【図３】図３は、試料細胞溶解後にフェノール−クロロホルム抽出工程を用いずに、単一試料から富化された総ＲＮＡおよびスモールＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）を単離するための本発明の態様の模式図（ワークフロー−３）を示す。
【図４】図４は、試料細胞溶解後にフェノール−クロロホルム抽出工程を用いずに、単一試料から富化されたスモールＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）を単離するための本発明の態様の模式図（ワークフロー−４）を示す。ワークフロー−４に示すようにフェノール−クロロホルム分離工程を除くことにより、スモールＲＮＡ単離のプロトコル時間が著しく短縮される。
【図５】図５は、本発明の特定の態様に従ってアセトンを用いて単離した総ＲＮＡおよびスモールＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）のゲルイメージを示す。アセトンの量を増加させるとスモールＲＮＡの収率が増大した。
【図６】図６は、ワークフロー−１を用いて得た予備調査実験結果を示す。結果は、ワークフロー−１に記載したプロトコルによって、富化された総ＲＮＡおよびスモールＲＮＡ（マイクロＲＮＡを含む）の単離に成功したことを示す。
【図７】図７は、ワークフロー−２に従ってより短いプロトコルを用いて、品質または収率を損なうことなくスモールＲＮＡの単離に成功できたことを示す。
【図８】図８は、４種類のマイクロＲＮＡについてｑＲＴ−ＰＣＲグラフから得た結果を示す；これにより、本発明の態様に従って単離したスモールＲＮＡ試料中に低コピー数および高コピー数のマイクロＲＮＡが共に存在することが確認される。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の最も広い観点において、本発明には試料溶液から実質的に純粋な分解していないスモールＲＮＡを単離するための方法が含まれる。これに従い、試料をまず有機溶媒と混合して、溶媒を含有する混合物を調製する。この混合物をラージＲＮＡの結合のために第１無機物支持体に適用する。結合していないスモールＲＮＡを含有するフロースルー（濾液）を採集し、第２有機溶媒と混合して、第２溶媒を含有する第２混合物を調製する。この第２混合物をスモールＲＮＡの結合のために第２無機物支持体に適用する。１または２回の洗浄工程の後、スモールＲＮＡを溶離する。
【００１７】
スモールＲＮＡは、本明細書において一般に長さ２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子を含むものとする。これらには、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなど多種多様なＲＮＡ種が含まれるが、より重要なものとしてマイクロＲＮＡなどの小さな調節ＲＮＡが含まれる。これに対し、２００ヌクレオチドを超えるＲＮＡ分子は、一般に第１無機物支持体に結合し、したがってスモールＲＮＡから分離される。この後者のグループのＲＮＡ分子を、本明細書においては互換性をもってビッグＲＮＡ、ラージＲＮＡ、または総ＲＮＡと呼ぶ。
【００１８】
特定の有機溶媒の存在下でＲＮＡは無機物支持体に結合することが見出された。さらに、異なる長さのＲＮＡ分子は有機溶媒の濃度に対して異なる応答をする。たとえば、より低い有機溶媒濃度ではラージＲＮＡのみが無機物支持体に結合し、一方、より高い濃度ではより小さなＲＮＡも無機物支持体に結合する。
【００１９】
一例として、極性プロトン溶媒、たとえば低級脂肪族アルコールは適切な有機溶媒である。好ましくは、有機溶媒は双極性非プロトン溶媒である。適切な双極性非プロトン溶媒にはアセトン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、メチルエチルケトン、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、有機溶媒はアセトンまたはアセトニトリルである。最も好ましくは、有機溶媒はアセトンである。
【００２０】
第１有機溶媒と第２有機溶媒は同一でも異なってもよい。一例としてアセトンを実験のセクションに用いるが、これは説明のためにすぎない。アセトンを用いる場合、ラージＲＮＡを結合するのに好ましい濃度は約３５％であり、一方、スモールＲＮＡを結合するのに好ましい濃度は約５０％であると判定された。第１有機溶媒と第２有機溶媒は同一種類である必要はないと思われる。さらに、ラージＲＮＡまたはスモールＲＮＡを結合するのに必要な有機溶媒濃度は溶媒の性質に基づいて変動するであろう。しかし、具体的な詳細は本明細書の開示内容の教示に従って容易に得ることができる。
【００２１】
それからスモールＲＮＡを単離する試料溶液は、スモールＲＮＡを含有するいかなる水性試料であってもよい。一例として、試料溶液は常法により精製したＲＮＡ試料である。他の例は、生物試料または生物材料の細胞溶解液である。用語“生物材料”または“生物試料”は広い意味で用いられ、核酸およびタンパク質を含有する多様な生物源を含むものとする。そのような生物源には、限定ではないが下記のものが含まれる；全組織：生検材料および吸引物を含む；インビトロ培養細胞：初代および二次細胞、トランスフォームした細胞系、ならびに組織細胞および血液細胞を含む；ならびに体液、たとえば尿、喀痰、精液、分泌液、眼の洗浄液および吸引液、肺の洗浄液および吸引液。真菌および植物の組織、たとえば葉、根、茎およびかさ（ｃａｐ）も本発明の範囲に含まれる。生物試料の上または中に存在する可能性のある微生物およびウイルスが本発明の範囲に含まれる。細菌細胞も本発明の範囲に含まれる。
【００２２】
生物試料または細胞を、カオトロピック物質および／または他の塩類を含有する水性細胞溶解系内で、最も簡単な例ではそれを細胞に添加することにより溶解する。本明細書中で用いる用語“カオトロピック”または“カオトロピック塩”は、たとえばタンパク質または核酸の二次、三次または四次構造を変化させることにより（これらに限定されない）タンパク質または核酸に障害を及ぼし、一次構造は無傷のまま残す物質を表わす。カオトロープの例には、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジニウム、チオシアンナトリウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウムおよび尿素が含まれるが、これらに限定されない。代表的な陰イオン性カオトロピックシリーズには下記のものが含まれる；カオトロピック強度が低下する順に示す：ＣＣｌ３ＣＯＯ−→ＣＮＳ−→ＣＦ３ＣＯＯ−→ＣｌＯ４−＞Ｉ−→ＣＨ３ＣＯＯ−→Ｂｒ−、Ｃｌ−、またはＣＨＯ２−。
【００２３】
前記の出発生物試料のうちあるもの、たとえば細菌は、それらの細胞壁の条件のためカオトロピック物質を含有する水性系内で直接に細胞溶解することができない。したがって、これらの出発材料は、本発明による方法に使用する前に、たとえば細胞溶解酵素で予備処理しなければならない。
【００２４】
ＲＮＡの単離に際して最も重要な観点のひとつは、単離操作中の分解を阻止することである。したがって、生物試料を細胞溶解するための本発明の試薬は、好ましくは大量のカオトロピックイオンを含有する溶液である。この細胞溶解緩衝液は、実質的にすべての酵素を直ちに不活性化して、ＲＮＡの酵素分解を阻止する。細胞溶解溶液は、０．１から１０Ｍまで、たとえば１から１０Ｍまでの濃度のカオトロピック物質を含有する。そのようなカオトロピック物質として、特に塩類、たとえば過塩素酸ナトリウム、塩化グアニジニウム、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジニウム／チオシアン酸グアニジニウム、、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、および／またはその組合わせを使用できる。
【００２５】
好ましくは、細胞溶解溶液は還元剤をも含有し、これはカオトロープによるＲＮａｓｅの変性を促進し、分解していないＲＮＡの単離を補助する。好ましくは、還元剤は２−アミノエタンチオール、トリス−カルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）、またはβ−メルカプトエタノールである。
【００２６】
場合により、細胞溶解溶液は非イオン性の界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ、すなわちｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）をも含有する。界面活性剤の存在は、無機物支持体へのゲノムＤＮＡの選択的結合を可能にする。非イオン界面活性剤の例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ（商標）ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（ＢＲＩＪ（商標）３０）、ソルビタリモノラウレート（Ｓｏｒｂｉｔａｒｉ  Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）（ＳＰＡＮ（商標）２０）、またはポリソルベート（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）ファミリーの化学物質、たとえばポリソルベート２０（すなわちＴＷＥＥＮ（商標）２０）。他の市販ポリソルベートには、ＴＷＥＥＮ（商標）４０、ＴＷＥＥＮ（商標）６０およびＴＷＥＥＮ（商標）８０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，、ミズーリ州セントルイス）が含まれる。これらおよび他の関連化学物質がいずれもＴＷＥＥＮ（商標）２０の代替として有効である。
【００２７】
ＲＮＡの選択的結合に有効な非イオン界面活性剤の量は、異なる界面活性剤間でわずかに変動する可能性がある。しかし、界面活性剤それぞれ（または界面活性剤の組合わせ）に最適な濃度は、ある簡単な実験で容易に確認できる。一般に、０．５％以上の最終濃度の界面活性剤が結合に有効であることが見出された。特定の態様において、有効濃度は０．５％〜約１０％である。好ましい態様において、濃度は１％〜８％である。界面活性剤の合計濃度が０．５％〜約１０％の範囲である限り、１種類より多い非イオン界面活性剤を組み合わせうることも明記する。
【００２８】
好ましい態様において、細胞溶解溶液はＮＰ−４０（ＩＧＥＰＡＬ（商標）ＣＡ−６３０）を含有する。最も好ましい態様において、細胞溶解溶液は塩酸グアニジン、ＴＷＥＥＮ（商標）２０、ＮＰ−４０およびβ−メルカプトエタノールを含有する。
【００２９】
本発明の細胞溶解溶液は、好ましくは溶液のｐＨを維持するのに十分な量の緩衝剤をも含有する。ｐＨを約５〜８の範囲に維持すべきである。細胞溶解溶液中に用いるのに好ましい緩衝剤には、トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、四ホウ酸ナトリウム−ホウ酸、およびグリシン−水酸化ナトリウムが含まれる。
【００３０】
第１および第２無機物支持体は、好ましくは多孔質または非孔質の金属酸化物または混合金属酸化物、シリカゲル、シリカ膜、主にガラスからなる材料、たとえば未改質ガラス粒子、粉末ガラス、石英、アルミナ、ゼオライト、二酸化チタン、二酸化ジルコニウムからなる。無機物支持体材料の粒度は０．１μｍから１０００μｍまでの範囲であり、細孔サイズは２から１０００μｍまでの範囲である。多孔質または非孔質の支持体材料は、ゆるく充填された形態で存在してもよく、あるいはガラス、石英もしくはセラミック製のフィルター層、および／またはシリカゲルを配置した膜、および／または無機物支持体製の粒子もしくは繊維、および石英もしくはグラスウールの布帛、ならびに官能基を含むかもしくは含まないラテックス粒子、またはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、特に超高分子量ポリエチレン、高密度ポリエチレン製のフリット材料の形態に統合されてもよい。
【００３１】
無機物支持体は、ゆるく充填された状態、２つの媒体間に固定された状態、またはカラムの中空ボディー内に配置された膜の形態で存在することができる。好ましくは、第１無機物支持体および第２無機物支持体は、それぞれシリカ膜である。
【００３２】
第１無機物支持体に吸着したラージＲＮＡおよび第２無機物支持体に吸着したスモールＲＮＡは両方とも、低いイオン強度の条件下または水で溶離できることが見出された。したがって、本発明の他の観点は、ラージＲＮＡとスモールＲＮＡの両方を同一試料から分離および精製するための方法を提供する。
【００３３】
無機物支持体を第１または第２液体混合物から分離した後、結合したＲＮＡを含む無機物支持体を、ラージＲＮＡまたはスモールＲＮＡそれぞれの溶離前に洗浄することが好ましい。高濃度の有機溶媒、たとえば低級脂肪族アルコールを含有する洗浄緩衝液を、第１および第２無機物支持体の両方の洗浄に用いて、目的ＲＮＡ以外の成分を分離することができる。
【００３４】
試料フロースルー（濾液）からの無機物支持体材料の分離、ならびに洗浄工程および溶離工程には、周知の方法が用いられる。後記に示す実施例では簡単な遠心分離工程を用いる。しかし、無機物支持体からの水性溶液の分離のための方法は周知である。これらには、遠心分離のほかに、真空または比重に基づく分離方法が含まれる。当業者は、その実験または工程の個々の要求に基づき、処理量および操作の容易さを特に考慮して、種々の方法の混合を容易に選択できる。
【００３５】
本発明の種々の観点を図１〜４に示す。したがって本発明の１観点は、ワークフロー−４（図４）に示すようにスモールＲＮＡを試料溶液から単離することに関する。本発明の他の観点をワークフロー−２（図２）に示す。この場合には、水性試料を第１無機物支持体に装填する前にフェノール−クロロホルム抽出工程が含まれる。この抽出工程により試料溶液中の大きいゲノムＤＮＡおよびタンパク質混在物が分離され、単離されたスモールＲＮＡの純度が向上する。これらのワークフローによるスモールＲＮＡの収率が一般的な商業プロトコルを用いて得られたものより高いことに注目するのが重要である。
【００３６】
本発明の第３および第４観点を、それぞれワークフロー−１（図１）およびワークフロー−３（図３）として示す。本質的にこれらの観点には、生物材料および試料から実質的に純粋な分解していないラージＲＮＡおよびスモールＲＮＡを単離するための方法が含まれる。ラージＲＮＡおよびスモールＲＮＡを、それぞれ第１および第２無機物支持体から溶離する。
【００３７】
これらのプロトコルに従い、前記の試薬および方法を用いてラージＲＮＡおよびスモールＲＮＡを３０分ほどの短時間で単離することができる。これらの結果は、個々のＲＮＡ成分を単離するための既存の方法より実質的に迅速である。
【００３８】
ワークフロー−１および２ならびに以下に詳述する実験条件を用いて、ラージＲＮＡおよびスモールＲＮＡを生物試料から精製するのに成功した。これらの実験から、現在の市販キットと比較して、ＱＰＣＲおよびマイクロアレイ実験などの下流用途に使用するのに適した高品質のＲＮＡが高い収率で得られる。
【００３９】
本発明は、ＲＮＡと共に総タンパク質を単離するための方法をも提供する。これに関して、ワークフロー−３および４において、第２無機物支持体からの濾液（フロースルー）は試料溶液（たとえば生物試料）からの総タンパク質を含有する。総タンパク質は、ＴＣＡ沈殿法などの常法を用いて容易に単離できる。
【００４０】
生物試料からラージＲＮＡおよびスモールＲＮＡを分離および／または精製するための組成物およびキットも提供される。このキットは下記のものを含む：生物試料を細胞溶解するための細胞溶解溶液；ラージＲＮＡを結合するための第１無機物支持体；スモールＲＮＡのための第２無機物支持体；ラージＲＮＡを第１無機物支持体から溶離するための溶離溶液；スモールＲＮＡを第２無機物支持体から溶離するための溶離溶液；および有機溶媒、たとえばアセトン。場合により、キットは、スモールＲＮＡが第２無機物支持に結合した後のフロースルーからタンパク質を単離するための手段、および利用者マニュアルをも含む。
【００４１】
好ましくは、キット内の細胞溶解溶液は、カオトロピック塩、非イオン界面活性剤、および還元剤を含有する。最も好ましくは、キット内の細胞溶解溶液は、塩酸グアニジン、ＴＷＥＥＮ（商標）２０、ＮＰ−４０およびβ−メルカプトエタノールを含有する。
【００４２】
本発明の他の利点は以下の実施例および特許請求の範囲から明らかであろう。
【実施例】
【００４３】
以下の実施例は、本発明の態様に従って総ＲＮＡおよびスモールＲＮＡを単離する方法を説明するためのものであり、限定のためのものではない。
試薬およびプロトコル
表１：使用する試薬およびキット
【００４４】
【表１】
2012502632.tif 000003
【００４５】
１．試料の破砕およびホモジナイゼーション
培養細胞の破砕およびホモジナイゼーション：
ａ．１ｘ１０６個の培養細胞を１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ内で８０００×ｇ、１分間の遠心によりペレット化する；
ｂ．上清を吸引によって完全に除去する；
ｃ．３５０μｌの細胞溶解緩衝液（β−ＭＥを含有）を添加する；
ｄ．ボルテックス攪拌して細胞ペレットを再懸濁する；
ｅ．細胞溶解物を、ＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅを含まない注射器に取り付けた２０ゲージの針に少なくとも５回通すことによりホモジナイズする；
ｆ．次の工程へ進む。
【００４６】
ＰＯＬＹＴＲＯＮ（登録商標）ホモジナイザー（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ  ＡＧ、スイス）を用いる組織破砕およびホモジナイゼーション：
ａ．１０ｍｇの組織を適切なサイズのチューブに入れる；
ｂ．３５０μｌの細胞溶解緩衝液（β−ＭＥを含有）を添加する；
ｃ．組織をＰＯＬＹＴＲＯＮ（登録商標）利用者マニュアルに従ってホモジナイズする；
ｄ．調製したホモジェネートを目視検査し、ホモジナイゼーションが十分なことを確認する；
ｅ．段階２もしくは３（フェノール／クロロホルム工程あり）または４もしくは５（フェノール／クロロホルム工程なし）へ進む。
【００４７】
２．同一試料から富化した総ＲＮＡおよびスモールＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）を単離するワークフロー−１のためのプロトコル；フェノール：クロロホルムあり
２．１  ＲＮＡの結合
ａ．３５０μｌの酸性フェノール：クロロホルムを、１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ内の３５０μｌのホモジェネートに添加し、１５秒間激しく振とうする；
ｂ．１２，０００×ｇで１５分間、＋４℃において遠心する；
ｃ．水層（上層）を新たな１．５ｍｌマイクロ遠心チューブへ移す；
ｄ．３５０μｌの７０％アセトンを添加する。数回の上下ピペッティングによって十分に混合する；
ｅ．新たなスピンカラムを新たなコレクションチューブに入れる；
ｆ．混合物全体をこのカラムへ移す；
ｇ．８０００×ｇで３０秒間、遠心する；
ｈ．スモールＲＮＡ単離のためにフロースルーを取っておく；
ｉ．カラムを新たな２ｍｌコレクションチューブへ移す。
【００４８】
２．２  カラムの洗浄
ａ．５００μｌの洗浄緩衝液をカラムに添加する；
ｂ．１１，０００×ｇで１分間、遠心する；
ｃ．フロースルーを廃棄する；
ｄ．カラムを、ＲＮａｓｅを含まない１．５ｍｌマイクロ遠心チューブへ移す。
【００４９】
２．３  総ＲＮＡの溶離
ａ．１００μｌの溶離緩衝液をカラムの中心に添加する；
ｂ．１１，０００×ｇで１分間、遠心する；
ｃ．カラムを廃棄し、純粋なＲＮＡを収容したチューブを必要になるまで−８０℃で保存する。
【００５０】
２．４  スモールＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）の単離
ａ．新たなスピンカラムを新たなコレクションチューブに入れる；
ｂ．工程２．１．ｈからのフロースルーに、４５０μｌの１００％アセトンを添加し、十分に混合する；
ｃ．数回の上下ピペッティングによって十分に混合する。混合物全体をカラムへ移す；
ｄ．８０００×ｇで３０秒間、遠心する；
ｅ．フロースルーを廃棄する；
ｆ．５００μｌの洗浄緩衝液を添加し、８０００×ｇで３０秒間、遠心する；
ｇ．５００μｌの８０％アセトンを添加し、８０００×ｇで２分間、遠心する；
ｈ．カラムを、ＲＮａｓｅを含まない１．５ｍｌマイクロ遠心チューブへ移す。
【００５１】
２．５  スモールＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）の溶離
ａ．ヌクレアーゼを含まない水１５μｌを添加する；
ｂ．８０００×ｇで１分間、遠心する；
ｃ．スモールＲＮＡを含有するフロースルーを採集する。
【００５２】
３．富化したスモールＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）を単離するワークフロー−２のためのプロトコル
このプロトコルは前記のワークフロー−１についてのプロトコルと同様である。唯一の例外は、工程２．１．ｉ、２．２および２．３を実施しないことである。
【００５３】
４．同一試料から総ＲＮＡおよびスモールＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）を単離するワークフロー−３のためのプロトコル；フェノール：クロロホルムなし
４．１  ＲＮＡの結合
ａ．３５０μｌの７０％アセトンを１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ内の３５０μｌの細胞溶解ホモジェネートに添加する。数回の上下ピペッティングによって十分に混合する；
ｂ．新たなスピンカラムを新たなコレクションチューブに入れる；
ｃ．混合物全体をこのカラムへ移す；
ｄ．８０００×ｇで３０秒間、遠心する；
ｅ．スモールＲＮＡ単離のためにフロースルーを取っておく；
ｆ．カラムを新たな２ｍｌコレクションチューブへ移す。
【００５４】
４．２  カラムの洗浄
ａ．５００μｌの洗浄緩衝液をカラムに添加する；
ｂ．１１，０００×ｇで１分間、遠心する；
ｃ．フロースルーを廃棄する；
ｄ．カラムを、ＲＮａｓｅを含まない１．５ｍｌマイクロ遠心チューブへ移す。
【００５５】
４．３  総ＲＮＡの溶離
ａ．１００μｌの溶離緩衝液をカラムの中心に添加する；
ｂ．１１，０００×ｇで１分間、遠心する；
ｃ．カラムを廃棄し、純粋なＲＮＡを収容したチューブを必要になるまで−８０℃で保存する。
【００５６】
４．４  スモールＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）の単離
ａ．新たなスピンカラムを新たなコレクションチューブに入れる；
ｂ．工程４．１．ｅからのフロースルーに、４５０μｌの１００％アセトンを添加し、数回の上下ピペッティングによって十分に混合する；
ｃ．混合物全体をカラムへ移す；
ｄ．８０００×ｇで３０秒間、遠心する；
ｅ．フロースルーを廃棄する；
ｆ．５００μｌの洗浄緩衝液をスピンカラムに添加し、８０００×ｇで３０秒間、遠心する；
ｇ．５００μｌの８０％アセトンを添加し、８０００×ｇで２分間、遠心する；
ｈ．カラムを、ＲＮａｓｅを含まない１．５ｍｌマイクロ遠心チューブへ移す。
【００５７】
４．５  スモールＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）の溶離
ａ．ヌクレアーゼを含まない水１５μｌを添加する；
ｂ．８０００×ｇで１分間、遠心する；
ｃ．スモールＲＮＡを含有するフロースルーを採集する。
【００５８】
５．試料から富化したスモールＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）を単離するワークフロー−４のためのプロトコル；フェノール：クロロホルムなし
このプロトコルは前記のワークフロー−３についてのプロトコルと同様である。唯一の例外は、工程４．１．ｆ、４．２および４．３を実施しないことである。
【００５９】
実施例１：アセトンを用いるＲＮＡ単離
ｍｉＲＮＡの精製にアセトンを使用できるかどうかを調べ、総ＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの精製に最適なアセトン濃度を確認するために、実験を行なった。
【００６０】
組織試料はラット肝組織からのものであり、一方、細胞培養した細胞は培養ＨｅＬａ細胞からのものである。前記の標準プロトコルに従って試料を破砕し、ホモジナイズした。試料を細胞溶解した後、溶解物を総ＲＮＡおよびスモールＲＮＡの精製のために処理した。第１に、一連のホモジナイズした細胞溶解物３５０μｌをそれぞれシリカ膜スピンカラムに装填した。１１，０００×ｇで１分間、遠心した後、ＲＮＡ単離のためにフロースルーを採集した（スピンカラムはゲノムＤＮＡを含み、これはＴＥ緩衝液を用いて溶離できた）。２５０μｌ、３００μｌ、３５０μｌまたは４００μｌの無水アセトンをフロースルーにそれぞれ添加した。３５０μｌの無水エタノールを他のひとつに対照として添加した。数回の上下ピペッティングによって十分に混合した。新たなスピンカラムを新たなコレクションチューブに入れた。混合物をそれぞれスピンカラムへ移し、１１，０００×ｇで１分間、遠心した。フロースルーを廃棄した；これはタンパク質を含有し、これをさらに精製することができた。カラムを新たなコレクションチューブへ移し、５００μｌの洗浄緩衝液をカラムに添加し、１１，０００×ｇで１分間、遠心した。コレクションチューブおよびそれの内容物であるフロースルーを廃棄した。スピンカラムを新たなコレクションチューブへ移した。１００μｌの溶離緩衝液（ｄｄ  Ｈ２Ｏ）をカラムの中心に添加し、１１，０００×ｇで１分間、遠心して、精製した総ＲＮＡを採集した。精製したＲＮＡを−８０℃で保存した。
【００６１】
精製したＲＮＡを０．８％アガロースゲルで分析した。図５に明らかなように、ＲＮＡ調製物はラージＲＮＡと共にスモールＲＮＡ分子の存在を示す。アセトンの量を増加させるとスモールＲＮＡの収率が増大した。アセトンを用いて単離したＲＮＡおよびスモールＲＮＡの品質および量は、標準的なエタノール沈殿法と同様またはより良好であると思われる。
【００６２】
実施例２：ワークフロー−１を用いる総ＲＮＡおよびスモールＲＮＡの単離
前記のワークフロー−１を用いてラット肝試料につき予備調査実験を行なった。エタノールまたは市販のＲＮＡ単離キット（総ＲＮＡ単離用Ｍｉｎｉ  ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ＫｉｔおよびスモールＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）単離用ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；両方ともＱｉａｇｅｎから）を用いて対照実験を行なった。
【００６３】
単離したＲＮＡ（ビッグおよびスモール）試料を０．８％アガロースゲル上で走行させた。結果は、ワークフロー−１に記載したプロトコルによりマイクロＲＮＡを含むスモールＲＮＡの単離に成功したことを示す（図６）。
【００６４】
実施例３：ワークフロー−２を用いるスモールＲＮＡの単離
より大きいＲＮＡを含まないスモールＲＮＡの単離により、総工程数が少なくなる（ワークフロー−２をワークフロー−１と比較）。試料（ラット肝）を細胞溶解緩衝液中で細胞溶解した後、スモールＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）精製のためにワークフロー−２のプロトコルを用いて溶解物を処理し、市販のＲＮＡ単離キット（ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）を用いて対照実験を同様に行なった。
【００６５】
単離したスモールＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）試料を０．８％アガロースゲル上で走行させた。結果は、ワークフロー−２に従ったより短いプロトコルによって、品質または収率を損なうことなく富化したスモールＲＮＡの単離に成功できたことを示す（図７）。さらに、ワークフロー−３および４に示すようにフェノール−クロロホルム抽出工程を除くことにより、総ＲＮＡおよびスモールＲＮＡの単離のための処理時間を著しく短縮することができる。さらに、スモールＲＮＡの収率は、アセトンの代わりにエタノールを用いる市販のキットと比較してより高い（表２）。
【００６６】
表２：市販製品と比較したワークフロー−１を用いたスモールＲＮＡの収率
【００６７】
【表２】
2012502632.tif 000004
【００６８】
実施例４：単離したスモールＲＮＡ試料中のマイクロＲＮＡの存在の確認
単離したスモールＲＮＡがマイクロＲＮＡを含有することを証明するために、種々のコピー数の４種類の異なるマイクロＲＮＡを用いて、マイクロＲＮＡ特異的ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを行なった。
【００６９】
異なる発現レベル（低度、中等度、および中程度に高度）をもつ４種類の異なるマイクロＲＮＡプライマーセットを、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ）に用いた。ワークフロー−１およびＱｉａｇｅｎ  ｍｉＲＮｅａｓｙキットから単離した試料を試験した。試料中の４種類すべてのマイクロＲＮＡの検出に成功した（図８）。
【００７０】
本明細書に挙げたすべての特許、特許公報、および他の公表された参考文献の全体を、それぞれが個別に詳細に本明細書に含まれるのと同様に、本明細書に援用する。本発明の好ましい具体的態様を記載したが、それらは説明のためだけに示したものであって限定ではなく、本発明をここに記載した態様以外で実施できることは当業者に認識されるであろう。本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
2012502632.tif 000005
【図２】
2012502632.tif 000006
【図３】
2012502632.tif 000007
【図４】
2012502632.tif 000008
【図５】
2012502632.tif 000009
【図６】
2012502632.tif 000010
【図７】
2012502632.tif 000011
【図８】
2012502632.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成23年5月27日(2011.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性試料溶液からスモールＲＮＡを単離するための方法であって、
ａ）水性試料を第１双極性非プロトン溶媒と混合して、より低いパーセントの第１溶媒を含有する混合物を調製し；
ｂ）２００ｎｔより大きいラージＲＮＡが第１無機物支持体に結合する条件下で、混合物を第１無機物支持体に適用し；
ｃ）スモールＲＮＡを含有するフロースルーを採集し；
ｄ）工程（ｃ）からのフロースルーを第２双極性非プロトン溶媒と混合して、より高いパーセントの第２溶媒を含有する第２混合物を調製し；
ｅ）スモールＲＮＡを結合させるために混合物を第２無機物支持体に適用し；
ｆ）第２無機物支持体を洗浄緩衝液で洗浄し；そして
ｇ）スモールＲＮＡを第２無機物支持体から溶離する
ことを含む方法。
【請求項２】
水性試料が、生物試料を細胞溶解溶液で細胞溶解することにより生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞溶解溶液が、カオトロピック塩、非イオン界面活性剤、および還元剤を含有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
カオトロピック塩が塩酸グアニジンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
非イオン界面活性剤が、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール、ソルビタリモノラウレート、Ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０およびポリソルベート８０、またはその組合わせから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
非イオン界面活性剤またはその組合わせが０．１〜１０％の範囲である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞溶解溶液が、１〜１０Ｍの塩酸グアニジン、０．１〜１０％のＴＷＥＥＮ（商標）２０、および０．１〜１０％のＮＰ−４０を含有する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
混合工程ａ）の前に、さらに水性溶液のフェノール−クロロホルム抽出工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
第１無機物支持体および第２無機物支持体が多孔質または非孔質であり、金属酸化物または混合金属酸化物、シリカゲル、シリカ膜、ガラス粒子、粉末ガラス、石英、アルミナ、ゼオライト、二酸化チタン、または二酸化ジルコニウムからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第１無機物支持体および第２無機物支持体が、それぞれシリカ膜である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第１または第２双極性非プロトン溶媒が、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、メチルエチルケトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、およびジメチルスルホキシドから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
第１および第２双極性非プロトン溶媒が両方ともアセトンである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
工程ａ）において、より低いパーセントのアセトンが約３５％であり、一方、工程ｄ）において、より高いパーセントのアセトンが約５０％である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
スモールＲＮＡの収率が、アセトンの代わりにエタノールを用いて得られる収率より少なくとも１０％高い、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
同一試料からラージＲＮＡおよびスモールＲＮＡの両方を分離および単離するための方法であって、
ｉ）スモールＲＮＡを請求項１の工程に従って単離し；
ｉｉ）場合により、ラージＲＮＡを含有する請求項１の工程ｂ）からの第１無機物支持体を洗浄し；そして
ｉｉｉ）ラージＲＮＡを第１無機物支持体から溶離する
ことを含む方法。
【国際調査報告】
2012502632.tif 000013