(57)【要約】  汎用性の高い中和抗体、すなわち広範なＡ型インフルエンザウイルス株に対して反応性がある抗体を誘導するために使用することのできる抗原ペプチドが提供される。該抗原ペプチドは配列番号３４（EKEVLVLWG）、配列番号２（KFDKLYIWG）、配列番号７１（QEDLLVLWG）、配列番号５１（EGRINYYWTLLEP）、配列番号３（PSRISIYWTIVKP）及び／又は配列番号８２（SGRMEFFWTILKP）に対応し得る。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンＨＡ１領域内のβシート構造の上方領域及び／又は下方領域のアミノ酸配列を少なくとも含む抗原ペプチド。
【請求項２】
前記上方領域のアミノ酸配列が、Ａ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２のヘマグルチニンＨＡ１領域内のアミノ酸残基１７３〜１８１（配列番号２）に対応し、前記下方領域のアミノ酸配列が、Ａ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２のヘマグルチニンＨＡ１領域内のアミノ酸残基２２７〜２３９（配列番号３）に対応する、請求項１に記載の抗原ペプチド。
【請求項３】
前記上方領域のアミノ酸配列が配列番号３４（EKEVLVLWG）、配列番号２（KFDKLYIWG）、配列番号７１（QEDLLVLWG）、並びに配列番号３４、配列番号２又は配列番号７１の１つ又は２つのアミノ酸の置換、挿入、付加及び／又は欠失によって修飾されたアミノ酸配列からなる群から選択され、前記下方領域のアミノ酸配列が配列番号５１（EGRINYYWTLLEP）、配列番号３（PSRISIYWTIVKP）、配列番号８２（SGRMEFFWTILKP）、並びに配列番号５１、配列番号３又は配列番号８２の１つ又は２つのアミノ酸の置換、挿入、付加及び／又は欠失によって修飾されたアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の抗原ペプチド。
【請求項４】
前記上方領域及び／又は前記下方領域のアミノ酸配列がヒト、ブタ又はトリ宿主に由来する全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型において保存されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原ペプチド。
【請求項５】
Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンＨＡ１領域内のβシート構造の前記上方領域を含む上方部分、及び／又はＡ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンＨＡ１領域内のβシート構造の前記下方領域を含む下方部分のアミノ酸配列を少なくとも含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原ペプチド。
【請求項６】
前記上方部分がＡ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２のヘマグルチニンＨＡ１領域内のアミノ酸残基１６７〜１８７（配列番号４）に対応し、前記下方部分がＡ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２のヘマグルチニンＨＡ１領域内のアミノ酸残基２２５〜２４１（配列番号５）に対応する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗原ペプチド。
【請求項７】
前記Ａ型インフルエンザウイルスがＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５及び／又はＨ１６亜型を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗原ペプチド。
【請求項８】
前記Ａ型インフルエンザウイルスがＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ１−ｐｄｍ、Ｈ３Ｎ２及び／又はＨ５Ｎ１亜型を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗原ペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原ペプチドをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原ペプチドを少なくとも１つ含む、Ａ型インフルエンザウイルスに対するワクチン。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原ペプチドを少なくとも１つ含む、インフルエンザ試験用の試薬。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原ペプチドを少なくとも１つ含む、インフルエンザ試験用の試薬キット。
【請求項１３】
Ａ型インフルエンザウイルス亜型のヘマグルチニンＨＡ１領域内のβシート構造の上方領域及び／又は下方領域のアミノ酸配列を認識する抗体を選択する方法。
【請求項１４】
前記上方領域がＡ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２のヘマグルチニンＨＡ１領域内のアミノ酸残基１７３〜１８１（配列番号２）に対応し、前記下方領域がＡ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２のヘマグルチニンＨＡ１領域内のアミノ酸残基２２７〜２３９（配列番号３）に対応する、請求項１３に記載の抗体を選択する方法。
【請求項１５】
前記上方領域のアミノ酸配列が配列番号３４（EKEVLVLWG）、配列番号２（KFDKLYIWG）、配列番号７１（QEDLLVLWG）、並びに配列番号３４、配列番号２又は配列番号７１の１つ又は２つのアミノ酸残基の置換、挿入、付加及び／又は欠失により修飾されたアミノ酸配列からなる群から選択され、前記下方領域のアミノ酸配列が配列番号５１（EGRINYYWTLLEP）、配列番号３（PSRISIYWTIVKP）、配列番号８２（SGRMEFFWTILKP）、並びに配列番号５１、配列番号３又は配列番号８２の１つ又は２つのアミノ酸残基の置換、挿入、付加及び／又は欠失により修飾されたアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項１３又は１４に記載の抗体を選択する方法。
【請求項１６】
前記上方領域及び／又は前記下方領域のアミノ酸配列がヒト、ブタ、又はトリ宿主に由来する全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型において保存されている、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の抗体を選択する方法。
【請求項１７】
前記抗体がＡ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンＨＡ１領域内のβシート構造の前記上方領域を含む上方部分、及び／又はＡ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンＨＡ１領域内のβシート構造の前記下方領域を含む下方部分のアミノ酸配列を認識する、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の抗体を選択する方法。
【請求項１８】
前記上方部分がＡ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２のヘマグルチニンＨＡ１領域内のアミノ酸残基１６７〜１８７（配列番号４）に対応し、前記下方部分がＡ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２のヘマグルチニンＨＡ１領域内のアミノ酸残基２２５〜２４１（配列番号５）に対応する、請求項１７に記載の抗体を選択する方法。
【請求項１９】
前記Ａ型インフルエンザウイルスがＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５又はＨ１６亜型を含む、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の抗体（単数又は複数）を選択する方法。
【請求項２０】
前記Ａ型インフルエンザウイルスがＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ１  ｐｄｍ、Ｈ３Ｎ２又はＨ５Ｎ１亜型を含む、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の抗体（単数又は複数）を選択する方法。
【請求項２１】
抗体を抗原ペプチドと共にインキュベートし、該抗体と該抗原ペプチドとの間の結合を検出することを含み、該抗原ペプチドがＡ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンＨＡ１領域内のβシート構造の前記上方領域及び／又は前記下方領域のアミノ酸配列を含む、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の抗体（単数又は複数）を選択する方法。
【請求項２２】
抗体を抗原ペプチドと共にインキュベートし、該抗体と該抗原ペプチドとの間の結合を検出することを含み、該抗原ペプチドがＡ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンＨＡ１領域内のβシート構造の前記上方部分及び／又は前記下方部分のアミノ酸配列を含む、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の抗体を選択する方法。
【請求項２３】
前記選択される抗体が前記抗原ペプチドの中和を示す、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の抗体を選択する方法。
【請求項２４】
前記選択される抗体が血球凝集の阻害活性（ＨＩ）を示す、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドを使用して抗体を作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインフルエンザウイルスに由来する抗原ペプチド、該抗原ペプチドを含むインフルエンザウイルスに対するワクチン、及び抗インフルエンザウイルス抗体を選択する方法に関する。
【０００２】
本願は、２００９年６月１７日付けで出願された先願の米国仮特許出願第６１／１８７，７０２号（その全体が参照により本明細書中に援用される）の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザの大流行は稀ではあるが、周期的に起こる現象である。そのような大流行は、ヒト集団が免疫を有しない新型のインフルエンザウイルスの発生と関連している。高病原性のトリＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１が、次の大流行の原因となる候補である可能性が最も高いと広く信じられていた（非特許文献１、非特許文献２）。しかしながら、新たなブタ由来の流行性Ａ型インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１）ウイルス（その後Ｈ１Ｎ１  ｐｄｍウイルスと名付けられた）が２００９年４月に発生し、ヒトでの大流行の可能性を秘めている（非特許文献３、非特許文献４）。Ａ型インフルエンザウイルスのどの株が次の大流行を引き起こす可能性があるか事前には分からないため、交差反応性の免疫応答を広く誘導することのできるプレパンデミックワクチンが必須である。
【０００４】
インフルエンザウイルスは抗原変化を高い確率で受け、新型のインフルエンザ株（複数可）を生み出す。Ａ型インフルエンザウイルスは、それらのヘマグルチニン（ＨＡ）分子及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）分子の抗原性に基づいて亜型（すなわち１６種のＨＡ（Ｈ１〜Ｈ１６）亜型及び９種のＮＡ（Ｎ１〜Ｎ９）亜型）に分類される（非特許文献５、非特許文献６）。ヒトＡ型インフルエンザウイルスの少なくとも３種のＨＡ亜型（Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）は重要な病原体として発生した。現在、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２は季節的に広まり（circulating）、ヒト感染を引き起こしている。２００３年には、トリ由来のインフルエンザウイルス亜型Ｈ５がヒト病原体として発生したが、これは以前の株よりもはるかに致死性が高い（非特許文献７）。近年では、２００９年４月に新型のインフルエンザウイルスとしてＨ１Ｎ１ウイルスが発生し、ヒト集団において急速に蔓延している。
【０００５】
インフルエンザ感染は、心臓疾患患者又は高齢者といった或る特定の個体群にとってより危険であり得る。したがって、インフルエンザに対するワクチンが非常に望まれている。Ａ型インフルエンザウイルスは、免疫原性が高いが、非常に変異しやすい２つのタンパク質、ＨＡ及びＮＡをその膜中に含有している。ＨＡ中の可変ペプチドは非特許文献９及び非特許文献１０に開示されている。
【０００６】
ＨＡ及びＮＡの可変性のために、インフルエンザに対して広域スペクトルのワクチンはこれまでに開発されていない。膜タンパク質Ｍ２及びＨＡ２サブユニットのアミノ酸残基（ａａ）１６〜２３は、特許文献１及び特許文献２において広域スペクトルのワクチンに使用される免疫防御性抗原として開示されている。幅広い保護をもたらすために使用することのできるインフルエンザタンパク質中の新たなエピトープが、ワクチン開発のために長く待ち望まれていた。
【０００７】
下記に挙げる参照文献及び本明細書中で言及される全ての刊行物は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−２２１８６号公報
【特許文献２】国際公開第９９／０７８３９号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Carter, N.J., Plosker, G.L., 2008, "Prepandemic influenzavaccine H5N1 (split virion, inactivated, adjuvanted) [Prepandrix]: a review ofits use as an active immunization against influenza A subtype H5N1 virus,"BioDrugs 22, 279-292.
【非特許文献２】Pappaioanou, M., 2009, "Highly pathogenic H5N1 avian influenzavirus: cause of the next pandemic?" Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis.32, 287-300.
【非特許文献３】Novel Swine-Origin Influenza A (H1N1) Virus Investigation Team,2009, "Emergence of a novel swine-origin influenza A (H1N1) virus inhumans," New Engl. J. Med. 361, June 18, 2009, pp.2605-2615
【非特許文献４】Shinde, V., Bridges, C.B., Uyeki, T.M., Shu, B., Balish, A., Xu, X.,Lindstrom, S., Gubareva, L.V., Deyde, V., Garten, R.J., Harris, M., Gerber, S.,Vagoski, S., Smith, F., Pascoe, N., Martin, K., Dufficy, D., Ritger, K.,Conover, C., Quinlisk, P., Klimov, A., Bresee, J.S., Finelli, L., 2009,"Triple-reassortant swine influenza virus A (H1) in humans in the UnitedStates, 2005-2009," New Engl. J. Med., June 18, 2009 pp.2616-2625
【非特許文献５】Fouchier, R.A., Munster, V., Wallenstein, A., Bestebroer, T.M.,Herfst, S., Smith, D., Rimmelzwaan, G.F., Olsen, B., Osterhaus, A.D., 2005,"Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16)obtained from black-headed gulls," J. Virol. 79, 2814-2822.
【非特許文献６】Webster, R.G., Bean, W.J., Gorman, O.T., Chambers, T.M., Kawaoka,Y., 1992, "Evolution and ecology of influenza A viruses," Microbiol.Rev. 56, 152-179.
【非特許文献７】Webby, R.J., Webster, R.G. 2003, "Are we ready for pandemicinfluenza?" Science 302, 1519-1522.
【非特許文献８】Webster, R.G., Laver, W.G., 1980, "Determination of the numberof nonoverlapping antigenic areas on Hong Kong (H3N2) influenza virushemagglutinin with monoclonal antibodies and the selection of variants withpotential epidemiological significance," Virology 104, 139-148.
【非特許文献９】Wiley, D.C., Wilson, I.A., Skehel, J.J., 1981, "Structuralidentification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenzahaemagglutinin and their involvement in antigenic variation," Nature 289,373-378.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
解決すべき課題は、新たな免疫防御性抗原ペプチド及び該ペプチドを含むワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は汎用性の高い（global）中和抗体、すなわち広範なＡ型インフルエンザウイルス株に対して反応性がある抗体を誘導するために使用することのできる抗原ペプチドに関する。該抗原ペプチドは上方領域及び／又は下方領域、例えば配列番号２及び／又は配列番号３を含み得る。配列番号２及び配列番号３はＨ３Ｎ２亜型のＨＡ中に存在し、広範なＨ３Ｎ２ウイルス株において高度に保存された配列であり得る。さらに、これら２つのエピトープ領域に対応する配列は、同じ亜型に属する全てのＡ型インフルエンザウイルスにおいて高度に保存されたものであり得る。例えば、ヒトＨ３Ｎ２の上記２つのエピトープ領域に対応する、ヒト、ブタ及び／又はトリに由来するＨ１Ｎ１（Ｈ１Ｎ１  ｐｄｍを含む）及びＨ５Ｎ１等の他のＡ型インフルエンザ亜型における配列は、同じ亜型において保存されたものであり得る。これらの配列は、異なる宿主、例えばヒト、ブタ又はトリに由来する株間で保存されたものであり得る。特に、或る特定の亜型内の或る特定の株の２つのエピトープ領域に反応する抗体は、同じ亜型内の他の株を中和することが期待される。Ｈ３Ｎ２だけでなく、Ｈ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１等の他の亜型の２つのエピトープ領域も、汎用性の高い中和抗体を誘導するのに重要なヒトエピトープとして機能することができる。
【００１２】
したがって、本発明の特徴は、汎用性の高い中和抗体を誘導するための抗原ペプチドを提供することである。
【００１３】
本発明の別の特徴は、少なくとも１種の抗原ペプチドを含む、Ａ型インフルエンザウイルスに対するワクチンを提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる特徴は、Ａ型インフルエンザ亜型を認識することのできる抗体（単数又は複数）を選択することである。
【００１５】
本発明のさらなる特徴及び利点は以下の明細書において一部説明され、明細書から一部明らかであるか、又は本発明の実施によって理解することができる。本発明の目的及び他の利点は、明細書及び添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素及び組み合わせを用いて実現及び達成される。
【００１６】
これら及び他の利点を達成するために、本明細書中に具体化され、概説される本発明の目的に従うと、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンＨＡ１領域内のβシート構造の上方領域及び／又は下方領域のアミノ酸配列を少なくとも含む抗原ペプチドに関する。
【００１７】
本発明は、本発明の抗原ペプチドをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子に更に関する。
【００１８】
本発明は、抗原ペプチドを少なくとも１つ含むＡ型インフルエンザウイルスに対するワクチン、抗原ペプチドを少なくとも１つ含むインフルエンザ試験用の試薬、抗原ペプチドを少なくとも１つ含むインフルエンザ試験用の試薬キット、及びＡ型インフルエンザウイルス亜型のヘマグルチニンＨＡ１領域内のβシート構造の上方領域及び／又は下方領域を認識する抗体を選択する方法に更に関する。
【００１９】
上述の概要及び以下の詳細な説明は例示及び説明のみを目的とし、クレームされる本発明のさらなる説明を提供することを意図することが理解されよう。
【００２０】
本願に援用され、本願の一部を構成する添付の図面は、本発明の態様を例示し、本明細書と共に本発明の原理を説明する働きをするものである。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のペプチドは強い免疫原性を有する。具体的には、ペプチドは、該ペプチドに対する反応性を有し、ヒトＰＢＭＣを刺激してインフルエンザウイルスを中和する抗体をｉｎ  ｖｉｖｏで惹起することができる。特に、或る亜型内の或る株に由来するペプチドによって惹起される抗体は、同じ亜型に属する他の株を中和することが期待される。本発明のペプチドを含むワクチンは、生体内の免疫系を効果的に刺激可能であることが期待される。本発明の選択方法によって得られる抗体は、生体をインフルエンザウイルスから効果的に保護することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ヒトＡ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２の既知の中和エピトープＡ〜Ｅの配列ロゴを示す図である。
【図２Ａ】種々の宿主に由来するＨ１Ｎ１の上方領域及び下方領域での配列の変異率及び累積率を示す図である。
【図２Ｂ】種々の宿主に由来するＨ３Ｎ２及びＨ５Ｎ１の上方領域及び下方領域での配列の変異率及び累積率を示す図である。
【図３】Ａ型インフルエンザウイルスの様々な亜型の上方領域及び下方領域の配列ロゴを示す図である。
【図４】ＭＥ法による、Ａ型インフルエンザウイルスの様々な亜型のＨＡ１領域並びに上方領域及び下方領域の進化的関係を示す図である。
【図５】図５Ａは、Ｈ３Ｎ２亜型の様々な株に由来する上方領域、及び上方領域を含む上方部分（アミノ酸配列ａａ１６７〜１８７）を示す図である。図５Ｂは、Ｈ３Ｎ２亜型の様々な株に由来する下方領域、及び下方領域を含む下方部分（アミノ酸配列ａａ２２５〜２４１）を示す図である。
【図６Ａ】Ｈ１Ｎ１の上方ペプチド又は下方ペプチドに対する抗血清の反応を示す図である。
【図６Ｂ】Ｈ３Ｎ２の上方ペプチド又は下方ペプチドに対する抗血清の反応を示す図である。
【図６Ｃ】Ｈ５Ｎ１の上方ペプチド又は下方ペプチドに対する抗血清の反応を示す図である。
【図７Ａ】Ｈ３Ｎ２の上方部分のペプチドに対するウサギ免疫血清の抗体力価を示す図である。
【図７Ｂ】Ｈ３Ｎ２の下方部分のペプチドに対するウサギ免疫血清の抗体力価を示す図である。
【図７Ｃ】ＨＡワクチンに対するウサギ免疫血清の抗体力価を示す図である。
【図８】合成ペプチドによる中和阻害を示す図である。
【図９】合成ペプチドで刺激したヒトＰＢＭＣの培養上清を用いた中和試験を示す図である。
【図１０】合成ペプチドで刺激したヒトＰＢＭＣの培養上清を用いた中和試験を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、広範なインフルエンザウイルス株に対して反応性がある中和抗体を誘導するために使用することのできる抗原ペプチド又はポリペプチドに関する。本発明における抗原ペプチドは、Ａ型インフルエンザウイルス亜型のＨＡ１領域内のβシート構造の上方領域及び／又は下方領域に対応するアミノ酸配列を含む。本発明の抗原ペプチドは、上方領域若しくは下方領域のいずれか、又は両方の領域を含み得る。
【００２４】
Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ１領域内のβシート構造の「上方領域」とは、配列番号１のアミノ酸配列（Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）株のＨＡ）中のａａ１７３〜１８１（配列番号２）に対応するアミノ酸配列の領域を意味する。Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ１領域内のβシート構造の「下方領域」とは、配列番号１のアミノ酸配列（Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）株のＨＡ）のアミノ酸配列中のａａ２２７〜２３９（配列番号３）に対応するアミノ酸配列の領域を意味する。上方領域は、Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）株のＨＡ（配列番号１）中のａａ１７３〜１８１、他の株における対応領域、他の亜型における対応領域及びそれらの変異体からなる群から選択される。下方領域は、Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）株のＨＡ（配列番号１）中のａａ２２７〜２３９、他の株における対応領域、他の亜型における対応領域及びそれらの変異体からなる群から選択される。例えば、上方領域はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ０８７１６（Ａ／Ｇｕｉｚｈｏｕ／５４／１９８９株）のアミノ酸配列中のａａ１７９〜１８７、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＴ０８０００（Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／２００３株）のアミノ酸配列中のａａ１８９〜１９７、又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣＣ６６６８５（Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／５５／２００４株）のアミノ酸配列中のａａ１７３〜１８１に対応し、下方領域はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ０８７１６（Ａ／Ｇｕｉｚｈｏｕ／５４／１９８９株）のアミノ酸配列中のａａ２３３〜２４５、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＴ０８０００（Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／２００３株）のアミノ酸配列中のａａ２４３〜２５５、又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣＣ６６６８５（Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／５５／２００４株）のアミノ酸配列中のａａ２２７〜２３９に対応する。
【００２５】
Ｈ３Ｎ２の上方領域及び／又は下方領域は、広範なＨ３Ｎ２ウイルス株において高度に保存された配列であり得る。さらに、他の亜型におけるこれら２つの領域に対応する配列は、同じ亜型に属する全てのＡ型インフルエンザウイルスにおいて高度に保存されたものであり得る。例えば、ヒトＨ３Ｎ２の上記２つの領域に対応する配列を、ヒト、ブタ及び／又はトリに由来するＨ１Ｎ１（Ｈ１Ｎ１  ｐｄｍを含む）及びＨ５Ｎ１等の他のＡ型インフルエンザ亜型において同定することができる。Ａ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２のＨＡ内の上方領域及び下方領域は逆平行βシート構造を形成し、Ｈ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１等の他の亜型は同様の構造を有する対応領域を有し得る。したがって、ヒトＨ３Ｎ２のこれらのエピトープ領域に対して反応性がある抗体は、Ｈ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１等の他のＡ型インフルエンザウイルスを中和することが期待される。特に、或る亜型に属する或る株の２つのエピトープ領域に対して反応性がある抗体は、同じ亜型に属する他の株を中和することが期待される。Ｈ３Ｎ２だけでなく、Ｈ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１等の他の亜型の２つのエピトープ領域も、個々の亜型の中和抗体を誘導するのに重要なヒトエピトープとして機能することができる。
【００２６】
抗原ペプチドは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２のＨＡ内の逆平行βシート上方領域を形成するａａ１７３〜１８１（配列番号２）、及び／又はＡ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２のＨＡ内の逆平行βシート下方領域を形成するａａ２２７〜２３９（配列番号３）に対応するアミノ酸配列を含み得る。上方領域のアミノ酸配列は、配列番号３４（EKEVLVLWG）（Ｈ１Ｎ１）、配列番号２（KFDKLYIWG）（Ｈ３Ｎ２）、配列番号７１（QEDLLVLWG）（Ｈ５Ｎ１）又はそれらの変異体を含み得る。下方領域のアミノ酸配列は、配列番号５１（EGRINYYWTLLEP）（Ｈ１Ｎ１）、配列番号３（PSRISIYWTIVKP）（Ｈ３Ｎ２）、配列番号８２（SGRMEFFWTILKP）（Ｈ５Ｎ１）又はそれらの変異体を含み得る。配列番号２を含む領域の変異体としては、例えば配列番号３４〜配列番号５０（Ｈ１Ｎ１）、配列番号８〜配列番号２０（Ｈ３Ｎ２）、配列番号７１〜配列番号８１（Ｈ５Ｎ１）、配列番号１７７（Ｈ１Ｎ１）、配列番号１７９（Ｈ３Ｎ２）及び配列番号１８１（Ｈ５Ｎ１）から選択されるアミノ酸配列が挙げられる。配列番号３を含む領域の変異体としては、例えば配列番号５１〜配列番号７０（Ｈ１Ｎ１）、配列番号２１〜配列番号３３（Ｈ３Ｎ２）、配列番号８２〜配列番号９６（Ｈ５Ｎ１）、配列番号１７８（Ｈ１Ｎ１）、配列番号１８０（Ｈ３Ｎ２）及び配列番号１８２（Ｈ５Ｎ１）から選択されるアミノ酸配列が挙げられる。
【００２７】
上方領域及び／又は下方領域のアミノ酸配列に対する抗体は、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型を中和することが期待される。Ａ型インフルエンザウイルスはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５又はＨ１６亜型を含み得る。Ａ型インフルエンザウイルスはＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ１  ｐｄｍ、Ｈ３Ｎ２又はＨ５Ｎ１亜型を含み得る。各々の亜型はＨＡ領域の可変性のために、多くの異なる株を含む。例えば、Ｈ３Ｎ２亜型は、Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ５０１６６０）、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８株、Ａ／Ｇｕｉｚｈｏｕ／５４／１９８９株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ４９９６３）、Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／２００３株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５３１０３３）、Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／５５／２００４株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ５０１４８６）を含む。上方領域及び／又は下方領域のアミノ酸配列に対する抗体は、同じ亜型に属する、ヒト、ブタ、トリ又は他の宿主に由来する全てのＡ型インフルエンザウイルス株を中和することが期待される。
【００２８】
Ａ型インフルエンザウイルス亜型の上方部分のアミノ酸配列は上方領域を含む。Ａ型インフルエンザウイルス亜型の下方部分のアミノ酸配列は下方領域を含む。本発明の抗原ペプチドは上方部分若しくは下方部分のいずれか、又は両方の部分を含み得る。
【００２９】
上方領域を含む上方部分とは、配列番号１のアミノ酸配列（Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）株のＨＡ）中のａａ１６７〜１８７（配列番号４）に対応するアミノ酸配列の部分を意味する。下方領域を含む下方部分とは、配列番号１のアミノ酸配列（Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）株のＨＡ）中のａａ２２５〜２４１（配列番号５）に対応するアミノ酸配列の部分を意味する。上方部分は、Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）株のＨＡ（配列番号１）中のａａ１６７〜１８７、他の株における対応部分、他の亜型における対応部分、及びそれらの変異体からなる群から選択される。下方部分は、Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）株のＨＡ（配列番号１）中のａａ２２５〜２４１、他の株における対応部分、他の亜型における対応部分、及びそれらの変異体からなる群から選択される。配列番号４又は配列番号５の変異体としては、Ｈ１Ｎ１又はＨ５Ｎ１等の他の亜型における上方部分又は下方部分のアミノ酸配列が挙げられる。配列番号４又は配列番号５の変異体は、例えば配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列を含み得る。
【００３０】
上方部分は、Ａ型インフルエンザウイルスのヒトＨ３Ｎ２のＨＡ１領域におけるＮ末端からの位置に存在するａａ１６７〜１８７（配列番号４）に対応するアミノ酸配列であり得る。Ａ型インフルエンザヒトＨ３Ｎ２ウイルスの下方部分は、Ａ型インフルエンザウイルスのヒトＨ３Ｎ２のＨＡ１領域におけるＮ末端からの位置に存在するａａ２２５〜２４１（配列番号５）であり得る。
【００３１】
本発明は、本明細書中に特定した抗原ペプチドを少なくとも１つ含む、Ａ型インフルエンザウイルスに対するワクチンにも関する。抗原ペプチドは既知の方法、例えば大腸菌及びレトロウイルス等の既知の宿主を利用する遺伝子組み換え技法、又は一般的なペプチド化学において既知の方法によって得ることができる。"Peptide Synthesis， Maruzen， 1975"及び"Peptide Synthesis， Interscience， New York 1996"を例示することができるが、既知の方法が広く利用可能である。本発明によるペプチドは、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオンカラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の組み合わせによって認識特性を用いて精製／回収することができる。ペプチドを該ペプチドに対して作製されたポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体によって特異的に吸着／回収する方法を使用するのがより好ましい。
【００３２】
抗原ペプチドは広範なインフルエンザウイルス株に対して反応性がある中和抗体を誘導することができる。本発明のワクチンは、本発明によるポリペプチドを合成又は単離すること、並びに該ポリペプチドを媒体中に溶解又は分散させること、並びに任意で他のインフルエンザウイルス抗原、及び／又はキャリア、ビヒクル及び／又はアジュバント物質を添加することによって調製することができる。本発明によるワクチンは、少なくとも２つの異なる抗原ペプチド又はポリペプチド断片を含み得る。ワクチンは好ましくは上方領域を含む抗原ペプチド及び下方領域を含む抗原ペプチド、より好ましくは上方部分を含む抗原ペプチド及び下方部分を含む抗原ペプチドを含む。
【００３３】
ペプチドを活性成分として含有するワクチンの調製は、米国特許第４，６０８，２５１号、同第４，６０１，９０３号、同第４，５９９，２３１号、同第４，５９９，２３０号、同第４，５９６，７９２号及び同第４，５７８，７７０号（全て参照により本明細書中に援用される）によって例示されるように、当該技術分野において一般によく理解されている。通常、かかるワクチンは液体の溶液又は懸濁液のいずれかの注射剤として調製される。注射の前に液体の溶液又は液体の懸濁液とするのに好適な固体形態も調製することができる。調製物は乳化することもできる。免疫原性のある活性成分は、薬学的に許容可能な、活性成分と相溶性のある賦形剤と混合されることが多い。好適な賦形剤は、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、及びそれらの組み合わせである。加えて、ワクチンは必要に応じて少量の補助物質、例えば湿潤剤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、又はワクチンの有効性を高めるアジュバントを含有してもよい。
【００３４】
不活化インフルエンザウイルスを製造するための種ウイルス、例えばＡ型インフルエンザＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２ウイルス、並びにＢ型インフルエンザウイルスは、孵化鶏卵の尿膜腔内で十分に複製する天然のウイルス株である。さらに、病原性の高いＨ５Ｎ１ウイルスに対する同様のワクチンを、ニワトリ胚におけるＨ５ウイルスの十分な増殖を可能にするために高収量株の内在遺伝子を用いて、Ｈ５Ｎ１由来のＨＡ遺伝子及びＮＡ遺伝子の逆遺伝学によって調製することができた（非特許文献１、Takahashi, Y., Hasegawa, H., Hara, Y., Ato, M., Nonomiya, A.,Takagi, H., Odagiri, T., Sata, T., Tashiro, M., Kobayashi, K., 2009,"Protective immunity afforded by inactivated H5N1 (NIBRG-14) vaccinerequires antibodies against both hemagglutinin and neuraminidase in mice,"J. Infect. Dis. 199, 1629-1637）。本発明のペプチドは、上記の方法によって得られる不活化ウイルスから単離してもよい。
【００３５】
ワクチンは通常、注射、例えば皮下注射又は筋内注射によって非経口的に投与することができる。他の投与形態に好適なさらなる製剤としては、坐剤、場合によっては経口製剤が挙げられる。坐剤については、従来の結合剤及びキャリアとして、例えばポリアルキレングリコール又はトリグリセリドを挙げることができる。かかる坐剤は、活性成分を製剤の全重量の０．５６重量％〜１０重量％、好ましくは１重量％〜２重量％の範囲で含有する混合物から作製することができる。経口製剤としては、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の通常用いられる賦形剤が挙げられる。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、持続放出製剤又は粉末の形態をとり、製剤の全重量の１０重量％〜９５重量％、好ましくは２５重量％〜７０重量％の活性成分を含有する。
【００３６】
ポリペプチド又はタンパク質は、中性形態又は塩形態としてワクチンに配合することができる。薬学的に許容可能な塩としては、（ペプチドの遊離アミノ基により形成される）酸付加塩が挙げられ、これは例えば塩酸若しくはリン酸等の無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸により形成される。また、遊離カルボキシル基により形成される塩は、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄等の無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基に由来し得る。
【００３７】
ワクチンは投与製剤に適合する形で、治療的に有効で、免疫原性となるような量で投与される。投与すべき量は、例えば免疫応答を開始する（mount）個体の免疫系の能力、及び所望の保護の程度等、治療対象の被験体ごとに異なる。好適な投与量範囲は、１回のワクチン接種につき数百マイクログラム程度の活性成分という量であり、好ましい範囲は約０．１マイクログラム〜１０００マイクログラム、例えば約１マイクログラム〜３００マイクログラムの範囲、特に約１０マイクログラム〜５０マイクログラムの範囲である。同様に、初回投与及び追加投与（booster shots）に好適な計画は変化し得るが、初回投与に続く後続の接種又は他の投与が典型的である。
【００３８】
適用方法は幅広く変化し得る。従来のワクチンの投与方法はいずれも適用可能である。これらは生理学的に許容可能な固体基剤中、又は生理学的に許容可能な分散液中での経口適用、注射等による非経口的適用を含むと考えられる。ワクチンの投与量は投与経路によって決まり、ワクチン接種を受ける者の年齢に応じて異なり、程度は少ないが、ワクチン接種を受ける者の体格に応じて異なる。
【００３９】
ワクチンのポリペプチドによってはワクチン中で十分に免疫原性であるものがあるが、ワクチンがアジュバント物質を更に含む場合、その免疫応答が高められるものもある。
【００４０】
ワクチンに対するアジュバント効果を達成する様々な方法としては、一般に０．０５％〜０．１％のリン酸緩衝生理食塩水溶液として使用される、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム（アラム）等の薬剤の使用、０．２５％溶液として使用される糖の合成ポリマー（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）との混合、７０℃〜１０１℃の範囲の温度でそれぞれ３０秒間〜２分間の熱処理によるワクチン中のタンパク質の凝集が挙げられる。アルブミンに対するペプシン処理（Ｆａｂ）抗体での再活性化による凝集、クリプトスポリジウム・パルバム（C. parvum）等の細菌細胞、又はグラム陰性細菌のエンドトキシン若しくはリポ多糖成分との混合、マンニドモノオレエート（Ａｒａｃｅｌ  Ａ）等の生理学的に許容可能な油性ビヒクル中での乳化、又は遮断代替物（block substitute）として使用されるペルフルオロカーボン（Ｆｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ）の２０％溶液での乳化も採用することができる。本発明によると、ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）がアジュバントの一例である。フロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント、並びにＱｕｉｌＡ及びＲＩＢＩをアジュバントとして使用することができる。さらなる例は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）及びムラミルジペプチド（ＭＤＰ）である。
【００４１】
アジュバント効果を達成する別の方法は、Gosselin et al., 1992（参照により本明細書中に援用される）中に記載される技法を採用することである。手短に述べると、本発明の抗原等の関連抗原の提示は、該抗原を単球／マクロファージ上のＦｃｚ受容体に対する抗体（又は抗体の抗原結合断片）に結合させることによって高めることができる。特に、抗原と抗ＦｃｅＲＩとの複合体は、ワクチン接種を目的とした免疫原性を高めることが実証されている。
【００４２】
他の方法は、上記に言及されるアジュバントと組み合わせた、リンホカイン（例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＩＬ−１２）等の免疫調節物質又はポリＩ：Ｃ等の合成ＩＦＮ−γ誘導因子の使用を伴う。
【００４３】
ワクチンの複数回投与、一般には６回を超えないワクチン接種、より一般には４回を超えないワクチン接種、好ましくは１回以上、一般には少なくとも約３回のワクチン接種を使用することができる。ワクチン接種は通常２週間〜１２週間の間隔、より一般には３週間〜５週間の間隔を置くが、他の間隔を使用してもよい。１年間〜５年間、例えば３年間の間隔を置いた周期的な追加免疫が、所望のレベルの防御免疫を維持するのに望ましい場合がある。免疫付与過程に続いて、本発明のポリペプチドと共培養したＰＢＬ（末梢血リンパ球）又はＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖アッセイ、特に初回抗原刺激を受けたリンパ球から放出されたＩＦＮレベルの測定を行ってもよい。アッセイは放射性核種、酵素、蛍光物質（fluorescers）等の従来の標識を用いて行うことができる。これらの技法は既知であり、これらのタイプのアッセイの例示として種々の特許、例えば米国特許第３，７９１，９３２号、同第４，１７４，３８４号及び同第３，９４９，０６４号に見ることができる。
【００４４】
遺伝的変異のために、個々の個体は同じポリペプチドに対し、様々な強度の免疫応答で反応し得る。したがって、本発明によるワクチンは、免疫応答を増大させるために幾つかの異なるポリペプチド（１つ又は複数の異なるポリペプチド）を含んでいてもよい。ポリペプチドは、それら自身の免疫原性によって作用することも、又は単にアジュバントとして作用することもできる。
【００４５】
本発明は、ヒト等の動物を免疫付与する方法であって、該動物に本発明のポリペプチド又は本発明のワクチン組成物を投与することを含む、方法にも関する。好ましい投与経路は、非経口経路（静脈内経路及び動脈内経路等）、腹腔内経路、筋肉内経路、皮下経路、皮内経路、経口経路、口腔内経路、舌下経路、経鼻経路、経直腸経路又は経皮経路である。
【００４６】
本発明は、上記抗原ペプチドをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子にも関する。例えば、ヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ５０１６６０（Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５株）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ４９９６３（Ａ／Ｇｕｉｚｈｏｕ／５４／１９８９株）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５３１０３３（Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／２００３株）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ５０１４８６（Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／５５／２００４株）から選択される。ヌクレオチド配列は、下記に記載の上方領域及び／又は下方領域をコードするヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。
（１）上方領域をコードするヌクレオチド配列
（ｉ）AAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGG（配列番号１７３）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ５０１４８６のヌクレオチド配列中の５１７〜５４３）
（ｉｉ）AAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGG（配列番号１７３）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５３１０３３のヌクレオチド配列中の５６５〜５９１）
（ｉｉｉ）AAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGG（配列番号１７３）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ４９９６３のヌクレオチド配列中の５３７〜５６３）
（ｉｖ）AAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGG（配列番号１７３）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ５０１６６０のヌクレオチド配列中の５１７〜５４３）
（２）下方領域をコードするヌクレオチド配列
（ｉ）TCCAGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCG（配列番号１７４）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５３１０３３のヌクレオチド配列中の７２７〜７６５）
（ｉｉ）TCTAGTAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCG（配列番号１７５）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ４９９６３のヌクレオチド配列中の６９９〜７３７）
（ｉｉｉ）CCCAGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCG（配列番号１７６）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ５０１６６０のヌクレオチド配列中の６７９〜７１７）
（ｉｖ）CCCAGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCG（配列番号１７６）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ５０１４８６のヌクレオチド配列中の６７９〜７１７）
【００４７】
本発明は、少なくとも１種の抗原ペプチドを含むインフルエンザ試験用の試薬にも関する。試薬は、該試薬がインフルエンザ試験に使用される限りにおいて、抗原ペプチドに加えて任意の成分を含み得る。
【００４８】
本発明は、少なくとも１種の抗原ペプチドを含むインフルエンザ試験用の試薬キットにも関する。試薬キットは、該試薬キットがインフルエンザ試験に使用される限りにおいて、抗原ペプチドに加えて任意の成分、試薬及び／又は器具を含み得る。
【００４９】
本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ１領域内のβシート構造の上方領域及び／又は下方領域を認識する抗体（単数又は複数）を選択する方法にも関する。上方領域は、Ａ型インフルエンザウイルスのヒトＨ３Ｎ２のＨＡ１領域におけるＮ末端からの位置に存在するａａ１７３〜１８１（配列番号２）に対応し得る。下方領域は、Ａ型インフルエンザウイルスのヒトＨ３Ｎ２のＨＡ１領域におけるＮ末端からの位置に存在するａａ２２７〜２３９（配列番号３）に対応し得る。上方領域のアミノ酸配列は配列番号３４（EKEVLVLWG）、配列番号２（KFDKLYIWG）及び／又は配列番号７１（QEDLLVLWG）を含み得る。下方領域のアミノ酸配列は配列番号５１（EGRINYYWTLLEP）、配列番号３（PSRISIYWTIVKP）及び／又は配列番号８２（SGRMEFFWTILKP）を含み得る。上方領域及び／又は下方領域のアミノ酸配列は、ヒト、ブタ又はトリ宿主に由来する全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型において高度に保存されたものであり得る。抗体は、ヒトＨ３Ｎ２ウイルスの上方部分に由来するヒトＨ３Ｎ２ウイルスの上方領域を、及び／又はヒトＨ３Ｎ２ウイルスの下方部分に由来するヒトＨ３Ｎ２ウイルスの下方領域を認識することができる。上方部分は、Ａ型インフルエンザウイルスのヒトＨ３Ｎ２のＨＡ１領域におけるＮ末端からの位置に存在するａａ１６７〜１８７に対応し得る。下方部分は、Ａ型インフルエンザウイルスのヒトＨ３Ｎ２のＨＡ１領域におけるＮ末端からの位置に存在するａａ２２５〜２４１に対応し得る。Ａ型インフルエンザウイルスはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５又はＨ１６亜型を含み得る。Ａ型インフルエンザウイルスはＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ１  ｐｄｍ、Ｈ３Ｎ２又はＨ５Ｎ１亜型を含み得る。抗体（単数又は複数）を選択する方法は、候補である抗体をペプチドと共にインキュベートし、該抗体と該ペプチドとの間の結合を検出する、インキュベートすることを含み得るが、ここで該ペプチドは、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ１領域内のβシート構造の上方領域及び／又は下方領域のアミノ酸配列を含み得る。抗体（単数又は複数）を選択する方法は、候補である抗体をペプチドと共にインキュベートし、該抗体と該ペプチドとの間の結合を検出する、インキュベートすることを含み得るが、ここで該ペプチドは、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ１領域内のβシート構造の上方部分及び／又は下方部分のアミノ酸配列を含み得る。選択される抗体はインフルエンザウイルスの中和を示し得る。選択される抗体は血球凝集の阻害活性（ＨＩ）を示し得る。
【００５０】
逆平行βシート構造を形成する、Ａ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２のＨＡ内のａａ１７３〜１８１（配列番号２）及びａａ２２７〜２３９（配列番号３）のエピトープ配列は、ＨｕＭＡｂ（Ｂ−１及びＤ−１）によって認識することができる（Kubota-Koketsu, R., Mizuta, H., Ohshita, M., Ideno, S., Yunoki, M.,Kuhara, M., Yamamoto, N., Okuno, Y., Ikuta, K., "Broad neutralizing humanmonoclonal antibodies against influenza virus from vaccinated healthydonors,"２００９年６月１９日に提出、７月４日に公開）。特に、ＨｕＭＡｂを産生する２つのハイブリドーマ細胞クローンに由来するＨｕＭＡｂは、広範なＨ３Ｎ２ウイルス株に対して高い中和活性を有し得る。Ｈ３Ｎ２中、ａａ１７３〜１８１（配列番号２）及びａａ２２７〜２３９（配列番号３）に２つのエピトープ領域を有する又は含むβシート領域の有意な保存が存在し得る。Ｈ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１等の他の亜型は、同様の構造を有する対応領域を有し得る。２つの領域はこれらの亜型の受容体結合部位の下部に位置し得る。米国立生物工学情報センターのインフルエンザウイルスリソースから利用可能な配列を用いた、これらの領域の解析によって、これらの配列が既知の中和エピトープＡ〜Ｅと比較して、ヒトＨ３Ｎ２（ｎ＝２５９４）及びブタＨ１Ｎ１（ｎ＝１８８）及びＨ３Ｎ２（ｎ＝９５）において相当に保存されており、ヒトＨ１Ｎ１（ｎ＝１１７１）及び最近のブタ由来Ｈ１Ｎ１  ｐｄｍ（ｎ＝３１２）、並びにヒトＨ５Ｎ１（ｎ＝２２４）及びトリＨ５Ｎ１（ｎ＝１５３４）において高度に保存されていることが明らかとなった。これらの領域についての系統樹では、由来する宿主とは無関係に、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２及びＨ５Ｎ１について明らかに分類可能なクラスターが形成された。これらの領域を使用して、広範なインフルエンザウイルス株に対して反応性がある中和抗体を誘導することのできるワクチンを開発することができる。
【００５１】
コンピューターによるＨ３Ｎ２ウイルスの特性化からも、２つのエピトープ領域の比較的高度な保存が明らかとなった。さらに、本発明者らは、種々の宿主のＨ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１等のインフルエンザウイルスにおいて対応配列を同定したが、これらはＨ３Ｎ２における保存よりもはるかに高度の保存をそれらの配列において示した。これらのデータは、広範なウイルス株を中和し得るＡ型インフルエンザウイルスに対する代替ワクチンを可能にする。
【００５２】
本発明者らは、Ｂ−１及びＤ−１  ＨｕＭＡｂによって認識される、ヒト由来Ｈ３Ｎ２のＨＡ内の逆平行βシート構造を形成する上方領域及び下方領域に着目した。興味深いことに、ＨＡのアミノ酸配列全体は亜型間であまり保存されていないが、かかるＨＡの構造及び機能は個々の亜型において高度に保存されている。このことは、進化及び配列変異が極端なレベルまで進行した場合であっても、構造及び機能が保存されたままであることを示唆する（Palese, P., Shaw, M.L., 2007, Chapter 47, "Orthomyxoviridae:The viruses and their replication," In: Knipe, D.M., Howley, P.M.,Griffin, D.EA., Lamb, R.A., Martin, M.A., Roizman, B., Straus, S.E., (Ed.),Fields Virology; Wolters Kluwer: Lippincott Williams & Wilkins, 5thedition, pp. 1647-1689）。主要な中和エピトープの大部分は、前者と関連することが示された。受容体結合領域の下部にある逆平行βシート構造はヒト中和エピトープの１つであるが、この領域は後者のカテゴリーを満たすこともできる。この領域が比較的高度に保存されていることが見出されたため、この構造はウイルス感染に関与し得る。
【００５３】
本明細書中に記載されるアミノ酸配列はいずれも、それに対して少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の相同性（例えば９５％〜９８％、９８％〜９９％、又は約９９％の相同性）を有する任意の配列を更に含み得ることを理解されたい。さらに、本発明のペプチドは、本明細書中に記載されるペプチドの断片、及び／又は１つ又は複数のアミノ酸（例えば１個〜２５個、２個〜２０個、３個〜１５個、５個〜１０個のアミノ酸）の欠失、挿入若しくは置換等のペプチドにおける、自然発生的な又は人為的に誘導した、無作為の又は対象を絞った（in a targeted fashion）突然変異を含み得る。例えば、ペプチドは、システインがそのＮ末端又はＣ末端に付加したペプチドの断片を含み得る。本発明において、「変異体」とは上記のようなペプチドを意味する。
【００５４】
Ｂ−１及びＤ−１  ＨｕＭＡｂによって認識される、ヒト由来Ｈ３Ｎ２のＨＡ内の逆平行βシート構造を形成するヒトエピトープ領域（上方領域及び下方領域）は、この亜型の広範な株に対して中和活性を示し得るが、Ｈ１Ｎ１及びＢ亜型とは交差反応性ではない（Kubota-Koketsu et al.）。２つの領域間の配列保存率を調べるために、ヒトＨ３Ｎ２に由来する２５９４個の完全ＨＡ配列（２００９年５月１５日時点で米国立生物工学情報センターのインフルエンザウイルスリソースから利用可能であった）を入手した（Bao, Y., Bolotov, P., Dernovoy, D., Kiryutin, B., Zaslavsky, L.,Tatusova, T., Ostell, J., Lipman, D., 2008, "The Influenza Virus Resourceat the National Center for Biotechnology Information," J. Virol. 82,596-601）。これらのうち、上方領域及び下方領域に対してそれぞれ１６個及び２６個の変異体が検出された。このことから、下記表１に示されるように、これらの領域においてそれぞれ１６２．１個及び９９．８個の株につき１つの変異体が生じることが示唆される。
【００５５】
【表１】
2012530486.tif 000003
【００５６】
対照的に、同じ２５９４個の配列から抽出した既知の中和エピトープＡ〜Ｅ（非特許文献８、非特許文献９）の配列は、特にエピトープＡ及びＢ２において、はるかに変異しやすい（すなわち、それぞれ１５．０個及び３４．１個の株につき１回の変異体発生）（表１）。エピトープＣ２及び下方領域は、変異体発生について同じ頻度を示した。しかしながら、このエピトープＣ２がわずか５個のアミノ酸からなっていたのに対し、下方領域は１３個のアミノ酸からなっていたため、この下方領域の配列におけるはるかに高い保存が示される。
【００５７】
表２では、既知の中和エピトープＡ〜Ｅにおける上位１０個の変異体及び個々の変異体の割合を相対的に示す。
【００５８】
【表２−１】
2012530486.tif 000004
【表２−２】
2012530486.tif 000005
【００５９】
本発明は、本発明の例示を意図するものである以下の実施例によって更に明らかにされる。
【実施例】
【００６０】
実施例１：Ａ型インフルエンザＨＡ配列の収集、並びにＨＡ１領域及び２つの独立したＨｕＭＡｂ（Ｂ−１及びＤ−１）によって認識されるエピトープ領域の抽出
ヒト由来、ブタ由来及びトリ由来のＡ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１（Ｈ１Ｎ１  ｐｄｍを含む）、Ｈ３Ｎ２及びＨ５Ｎ１のＨＡの完全長タンパク質配列を、米国立生物工学情報センターのインフルエンザウイルスリソース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html）（Bao et al., 2008）から入手した。次いで、ＨＡ配列をｍａｆｆｔ  ｖ６．２４０を用いてアラインメントした（Katoh, K., Toh, H., 2008, "Recent developments in the MAFFTmultiple sequence alignment program," Brief. Bioinform. 9, 286-298）。ＨＡ１領域を決定するために、切断点の直後のパリンドローム配列を同定した（ｎ’−GLFGAIAGFI−ｃ’の位置が確認された、パリンドローム領域に下線を引いた）（Skehel, J.J., Waterfield, M.D., 1975, "Studies on the primarystructure of the influenza virus hemagglutinin," Proc. Nat. Acad. Sci. USA72, 93-97）。
【００６１】
予め２つのＨｕＭＡｂ（Ｂ−１及びＤ−１）を、Ａ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２の広範な（global）株に対して強い中和活性を示した２人のワクチン接種済ボランティアから別個に作製した。エピトープ領域を、ヒトＨ３Ｎ２のＨＡ１領域のａａ１〜３２９にわたる合計１５８セットの１５残基ペプチド（１３アミノ酸が重複する）を用いて同定した：４個のペプチド（ａａ１６７〜１８１、ａａ１６９〜１８３、ａａ１７１〜１８５及びａａ１７３〜１８７）（配列番号１６７〜配列番号１７０）との陽性反応によるａａ１７３〜１８１（配列番号２）、並びに２個のペプチド（ａａ２２５〜２３９及びａａ２２７〜２４１）（配列番号１７１、配列番号１７２）との陽性反応によるａａ２２７〜２３９（配列番号３）（Kubota-Koketsu et al.）。Ａ型インフルエンザウイルスのヒトＨ３Ｎ２のＨＡ１領域におけるＮ末端からの位置にあるａａ１６７〜１８７の配列は、Ａ型インフルエンザウイルスのヒトＨ３Ｎ２の「上方部分」に対応し、Ａ型インフルエンザウイルスのヒトＨ３Ｎ２のＨＡ１領域におけるＮ末端からの位置にあるａａ２２５〜２４１は、Ａ型インフルエンザウイルスのヒトＨ３Ｎ２の「下方部分」に対応する。Ａ型インフルエンザウイルスの様々な亜型がヒトＨ３Ｎ２の「上方部分」、「下方部分」、「上方領域」及び「下方領域」に対応するアミノ酸配列を含むことを理解されたい。ヒトＨ３Ｎ２の上方領域及び下方領域に対応する配列を同様に、種々の宿主由来のウイルス株、又は米国立生物工学情報センターのインフルエンザウイルスリソース（Bao et al., 2008）から得た他のＡ型インフルエンザウイルス亜型に属するウイルス株から抽出した：ヒト及びブタに由来するＨ１Ｎ１、並びにヒトに由来するＨ１Ｎ１  ｐｄｍ、ヒト及びブタに由来するＨ３Ｎ２、並びにヒト及びトリに由来するＨ５Ｎ１。
【００６２】
既知の中和エピトープＡ〜Ｅ（非特許文献８、非特許文献９）を、同様に米国立生物工学情報センターのインフルエンザウイルスリソース（Bao et al., 2008）のヒトＨ３Ｎ２配列から対照配列として抽出した。
【００６３】
配列比較
Ｂ−１及びＤ−１によって認識されるエピトープ配列、並びにヒト由来、ブタ由来及びトリ由来のウイルスにおける対応配列についての配列ロゴをｗｅｂｌｏｇｏを用いて構築した（Crooks, G.E., Hon, G., Chandonia, J.M., Brenner, S.E., 2004,"WebLogo: A sequence logo generator," Genome Res. 14, 1188-1190）。
【００６４】
進化的関係を最小進化（ＭＥ）法（Rzhetsky, A., Nei, M., 1992, "A simple method for estimatingand testing minimum evolution trees," Mol. Biol. Evol. 9, 945-967）を用いて推定した。系統樹は、系統樹を推定するために用いられる進化距離と同じ単位の枝の長さを使用して一定の縮尺で描く。進化距離は１つの部位当たりのアミノ酸置換の数という単位であり、ポアソン補正（Poisson correction）法（Zuckerkandl, E.,Pauling, L., 1965, "Evolutionary divergence and convergence in proteins.In Evolving Genes and Proteins," (V. Bryson, H.J. Vogel, Ed.), pp. 97-166,Academic Press, New York）を用いてコンピューターで計算した。ＭＥ樹を最近隣交換（Close-Neighbor-Interchange）アルゴリズム（Nei, M., Kumar, S., 2000, "Molecular Evolution andPhylogenetics," Oxford University Press, New York.）を用いて検索レベル１で検索した。近隣結合（Neighbor-joining）アルゴリズム（Saitou, N., Nei, M.,1987, "The neighbor-joining method: A new method for reconstructingphylogenetic trees," Mol. Biol. Evol. 4, 406-425）を用いて初期系統樹を作成した。ギャップ及び欠測データを含有する全ての位置をデータセットから除外した（完全削除（Complete deletion）オプション）。系統発生解析はＭＥＧＡ４（Tamura,K., Dudley, J., Nei, M., Kumar, S., 2007, "MEGA4: Molecular EvolutionaryGenetics Analysis (MEGA) software version 4.0," Mol. Biol. Evol. 24,1596-1599）において行った。
【００６５】
図１は既知の中和エピトープＡ〜Ｅの配列ロゴを示す。ヒトＨ３Ｎ２における既知の中和エピトープＡ〜Ｅの配列を、米国立生物工学情報センターのインフルエンザウイルスリソースから抽出し、変異部位及びそれらの比率の解析のために配列ロゴを付した。個々のエピトープ領域におけるこれら全ての変異体（表１）を用いた配列ロゴ解析は、これら既知の中和エピトープ、特にエピトープＡ及びＢ２、並びにＢ１における高い不均一性（heterogeneity）を支持するものでもあった（図１）。
【００６６】
ＨＡ分子における対応βシート領域の検出可能性を、Ａ型インフルエンザウイルスの他の亜型において調べた。ヒト（Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ１  ｐｄｍ、Ｈ３Ｎ２及びＨ５Ｎ１）、ブタ（Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２）及びトリ（Ｈ５Ｎ１）Ａ型インフルエンザウイルスに由来する、合計４３０１個、２８３個及び１５３４個の完全長ＨＡ配列を、２００９年５月１５日に（２００９年６月１２日のＨ１Ｎ１  ｐｄｍを除く）米国立生物工学情報センターのインフルエンザウイルスリソース（Bao et al., 2008）からそれぞれ入手した。Ｈ３Ｎ２の上方領域及び下方領域に対応する配列も、種々の宿主に由来するＨ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１の完全長ＨＡ配列から抽出した。変異体を生じる効率は、ヒト由来よりもブタ由来のインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２においてはるかに高かった（表１）。特にＨ１Ｎ１  ｐｄｍは、３１２個の単離体のうち、下方領域においては１種の変異体を除いて完全な保存を示した（表１）。
【００６７】
上方領域及び下方領域における上位１０個の変異体及び個々の配列の割合を下記表３に示す。Ｈ３Ｎ２の上方領域及び下方領域における個々の配列、並びに他のＡ型インフルエンザウイルス亜型におけるＨ３Ｎ２の上方領域及び下方領域に「対応する」配列が表３中に示されることに留意されたい。
【００６８】
【表３−１】
2012530486.tif 000006
【表３−２】
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【００６９】
表３中のデータは、図２Ａ及び図２Ｂ中の個々の変異体の比率をまとめ、例示として示したものである。図２Ａ及び図２Ｂは、上方配列及び下方配列での配列並びに配列の変異率及び累積率を示す。表３に示されるようなヒト及びブタに由来するＨ１Ｎ１、並びにＨ１Ｎ１  ｐｄｍ；ヒト及びブタに由来するＨ３Ｎ２；並びにヒト及びトリに由来するＨ５Ｎ１における上方領域及び下方領域での上位１０個の配列を図２Ａ及び図２Ｂに示す。割合の最も高い配列をコンセンサスとして使用し、次の割合の配列を続けて挙げた。本願の表においては、次の割合の配列において使用されるピリオド（．）は、同じアミノ酸残基を示す。ヒトＨ１Ｎ１及びＨ１Ｎ１  ｐｄｍ中の配列は、上方領域及び下方領域の両方において高度に保存されていた。ヒト及びトリのＨ５Ｎ１の場合、どちらの領域の配列も比較的高度に保存されていた。ヒトＨ３Ｎ２の下方領域は相当に保存されており、この亜型の上方領域は下方ペプチドよりも高度に保存されていた。
【００７０】
図３中に示される、全ての変異体（表１）を用いた配列ロゴ解析は、この結論を支持するものであった。図３は、Ａ型インフルエンザウイルスの様々な亜型の上方領域及び下方領域の配列ロゴを示す。上方領域及び下方領域は、米国立生物工学情報センターのインフルエンザウイルスリソースから抽出した：ヒトＨ１Ｎ１（ｎ＝１１７１）、ブタＨ１Ｎ１（ｎ＝１８８）及びＨ１Ｎ１  ｐｄｍ（ｎ＝３１２）;ヒトＨ３Ｎ２（ｎ＝２５９４）及びブタＨ３Ｎ２（ｎ＝９５）；並びにヒトＨ５Ｎ１（ｎ＝２２４）及びトリＨ５Ｎ１（ｎ＝１５３４）。種々の宿主に由来する個々の亜型の変異体を全て、この配列ロゴ解析に使用した。Ｈ３ナンバリングによるアミノ酸残基を配列の上部に示す。変異体の出現はほとんどの場合、主として限定的なアミノ酸残基における変異によるものであった：ヒトＨ３Ｎ２における残基１７３及び２２７；ブタＨ３Ｎ２における残基１７３、１７９、２２９及び２３０；ブタＨ１Ｎ１における残基１７３、１７９、２３７、２３８及び２３９；並びにヒト及びトリのＨ５Ｎ１における残基１７８、１７９、２３１及び２３９。したがって、上方領域及び下方領域はヒトＨ１Ｎ１及びＨ１Ｎ１  ｐｄｍにおいて高度に保存されていた。
【００７１】
種々の宿主のウイルス株に由来する領域の系統樹解析から、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２及びＨ５Ｎ１亜型におけるそれらの独立したクラスター化が明らかとなった（図４）。したがって、中和ＨｕＭＡｂによって認識されるＨ３Ｎ２領域、並びにＨ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１における対応領域は、別個に進化したようである。
【００７２】
ヒト由来及びトリ由来のＨ５Ｎ１における両方の領域の保存について明白な差はなく、トリにおいて生じた幾つかの変異体がヒトへ伝播することが示される。Ｈ１Ｎ１  ｐｄｍにおける上方領域及び下方領域の３１２個の配列は、上方領域における２つの配列を除いて完全に同じであった。ブタ由来のＡ型インフルエンザＨ１Ｎ１の単一の株のみがヒトへ伝播する能力を獲得したとすれば、この結果は合理的である。
【００７３】
図５Ａ及び図５Ｂは、ＨＡ１領域の配列、ａａ１６７〜１８７及びａａ２２５〜２４１のアミノ酸配列（配列番号４及び配列番号５）を含む一連の重複ペプチドとのＢ−１及びＤ−１  ＨｕＭＡｂの反応性に基づく広範な（broadly）中和ＨｕＭＡｂの抗原領域を示す。どちらのＭＡｂも、合成ペプチドに対して同じ応答性、すなわちそれぞれ重複領域ａａ１７３〜１８１（配列番号２）及びａａ２２７〜２３９（配列番号３）にわたる、４個のペプチド（ａａ１６７〜１８１、ａａ１６９〜１８３、ａａ１７１〜１８５及びａａ１７３〜１８７）（配列番号１６７〜配列番号１７０）及び２個のペプチド（ａａ２２５〜２３９及びａａ２２７〜２４１）（配列番号１７１及び配列番号１７２）による２つの領域に対する有意な応答性を示した。どちらのＨｕＭＡｂも、新たなヒトエピトープであるＨＡ１の三次元構造において互いに近接して位置する２つの別個の領域（ａａ１７３〜１８１（配列番号２）及びａａ２２７〜２３９（配列番号３））を認識した。この結果は、Ｂ−１及びＤ−１が立体構造エピトープを認識することを示唆するものであった。
【００７４】
実施例２:合成ペプチドで刺激したヒトＰＢＭＣの培養上清を用いた中和試験
合計４人の健常ボランティアを、合成ペプチド（配列番号４（上方領域を含む上方部分）及び配列番号５（下方領域を含む下方部分））で刺激したヒトＰＢＭＣの培養上清による中和を試験するためのＰＢＭＣを得るために選択した。１０ミリリットル又は２０ミリリットルの血液を個々のボランティアから採取した。ＰＢＭＣを、５２０×ｇで４０分間のＦｉｃｏｌｌ  Ｐａｃｋ  Ｐｌｕｓ（GE Healthcare，Uppsala，Sweden）による遠心分離によって調製した。細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０培養培地で洗浄し、１０％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２環境で１日インキュベートした。細胞を１０％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中に２×１０６細胞／ｍＬの濃度で懸濁し、マイトジェンＰＷＭ（１ミリリットル当たり５マイクログラム）を添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２環境で１日インキュベートした。刺激した細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０培養培地で洗浄し、１０％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁し、合成ペプチド（１ミリリットル当たり１０マイクログラム）又は混合ペプチド（それぞれ１ミリリットル当たり５マイクログラム）を添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２環境で７日間インキュベートした。刺激した細胞の培養上清を回収し、ＲＤＥ（ＩＩ）（デンカ生研株式会社、日本）で処理した後、ＰＢＳ（−）で１０倍に希釈した。希釈した培養上清をマイクロウイルス中和（ＶＮ）試験（Y. Okuno, K. Tanaka, K. Baba, A. Maeda, N. Kunita, S. Ueda, Rapidfocus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtitersystem, J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 1308-1313）に使用した。ウイルスはＡ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）株であった。ＶＮ活性はフォーカス減少率（％）及びＮ比によって示した。Ｎ比は、（合成ペプチドで刺激したＰＢＭＣの培養上清のＶＮ活性）／（合成ペプチドを用いずに刺激したＰＢＭＣの培養上清のＶＮ活性）に等しい。
【００７５】
実施例３：マウスにおけるエピトープペプチドの抗原性の評価
マウスの免疫付与
ヒトＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２及びＨ５Ｎ１のＨＡにおいて高度に保存される上方領域及び下方領域に対応するペプチドを、下記に記載されるように合成した。
（ａ）Ｈ１Ｎ１、上方ペプチド：CKEVLVLWG（配列番号１７７）、配列番号３４のＮ末端にアミノ酸を１つ欠く配列のＮ末端にシステインを付加する。
（ｂ）Ｈ１Ｎ１、下方ペプチド：CGRINYYWTLLEP（配列番号１７８）、配列番号５１のＮ末端にアミノ酸を１つ欠く配列のＮ末端にシステインを付加する。
（ｃ）Ｈ３Ｎ２、上方ペプチド：CFDKLYIWG（配列番号１７９）、配列番号１のａａ１７４〜１８１のＮ末端にシステインを付加する（ａａ１７４〜１８１の配列は、配列番号２のＮ末端にアミノ酸を１つ欠いている）。
（ｄ）Ｈ３Ｎ２、下方ペプチド：CSRISIYWTIVKP（配列番号１８０）、配列番号１のａａ２２８〜２３９のＮ末端にシステインを付加する（ａａ２２８〜２３９の配列は、配列番号３のＮ末端にアミノ酸を１つ欠いている）。
（ｅ）Ｈ５Ｎ１、上方ペプチド：QEDLLVLWGC（配列番号１８１）、ａａ１７３〜１８１（配列番号７１）のＣ末端にシステインを付加する。
（ｆ）Ｈ５Ｎ１、下方ペプチド：SGRMEFFWTILKPC（配列番号１８２）、ａａ２２７〜２３９（配列番号８２）のＣ末端にシステインを付加する。
キャリアをペプチドに結合させるためにシステインを付加した。これらのペプチドをＫＬＨと結合し、免疫原として混合した。ペプチドとフロイント完全アジュバント（１：１）との混合物２５マイクロリットルの懸濁液を、１日目、７日目及び１４日目にマウスに注射した。最後の注射の１週間後に、マウスから血液を採取した。
【００７６】
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）
マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ１ミリリットル当たり１マイクログラムのペプチドで４℃で一晩コーティングし、５％のＢＳＡを含有するＰＢＳで４℃で一晩ブロッキングした。ブロッキング溶液を捨てた後、ＰＢＳで幾つかの濃度に血清を希釈し、各ウェルに添加し、室温で１時間置いた。次いで、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで３回洗浄し、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＭＢＬ、コードＮｏ．３３０）を各ウェルに添加し、室温で１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで３回洗浄した後、基質試薬を各ウェルに添加した。２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止した。最後に、吸光度を測定した。図６Ａ〜図６Ｃは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２及びＨ５Ｎ１の上方ペプチド又は下方ペプチドに対する抗血清の反応を示す。結果として、各々の血清が下方ペプチドよりも上方ペプチドと強く反応したことが確認された。
【００７７】
実施例４：ウサギにおけるエピトープペプチドの抗原性の評価
ウサギの免疫付与
上方部分のペプチド（TMPNNEKFDKLYIWGVHHPGT）（配列番号４）又は下方部分のペプチド（NIPSRISIYWTIVKPGD）（配列番号５）をＫＬＨと結合するか、又は８分岐ＭＡＰ（多重抗原性ペプチド）形態として合成した。ニュージランドホワイトウサギを、以下のようにして皮下免疫した：１）ＫＬＨと結合した上方部分及び下方部分のペプチドを含むカクテルによって免疫付与した；２）ＭＡＰ形態の上方部分及び下方部分のペプチドを含むカクテルによって免疫付与した；並びに３）ＫＬＨと結合した上方部分又は下方部分のペプチドで免疫付与した。各々のプロトコルについて２匹のウサギを免疫付与した。最初の免疫付与（ウサギ１匹当たり１ｍｇのペプチド）については、抗原をフロイント完全アジュバントと共に投与し、その後１ヶ月間、２週間に一度の割合で３回追加免疫（ウサギ１匹当たり０．５ｍｇのペプチド）をフロイント不完全アジュバントを用いて行った。最後の免疫付与の１週間後に血液を採取し、抗血清を調製した。
【００７８】
抗エピトープペプチド抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ
ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  Ｔ２０  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Thermo）１ミリリットル当たり１マイクログラムまで希釈したＮ末端ビオチン化エピトープペプチドを、９６ウェルストレプトアビジンプレコートマイクロプレート（Nunc）のウェル（５０マイクロリットル）に添加した。マイクロプレートを室温で３０分間インキュベートした後、ビオチン化ペプチド溶液を捨てた。３％スキムミルクを含有するＰＢＳ（−）溶液を室温で少なくとも１時間それに添加した。マイクロプレートを水で３回洗浄した。３％スキムミルクを含有するＰＢＳ（−）溶液で希釈した抗血清をウェルに添加し、室温で１．５時間インキュベートした。マイクロプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（−）で洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ  Ｔ２０で４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ（ＣＥＬＬ  ＬＡＢ）５０ｕＬをウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。マイクロプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（−）で洗浄し、１００マイクロリットルのペルオキシダーゼ基質溶液（ＳＵＭＩＬＯＮ）をウェルに添加し、室温で２０分間インキュベートした。その後、１００マイクロリットルの反応停止液（ＳＵＭＩＬＯＮ）をウェルに添加し、４９０ｎｍでの吸光度をプレートリーダーを用いて測定した。抗血清の吸光度から免疫前血清の吸光度を差し引いて、特異反応性を求めた。
【００７９】
抗ＨＡ抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ
Ａ／Ｂｒｉｓｂｅｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２）及びＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６を含有するＨＡワクチンを、ＰＢＳ（−）中に溶解し（各々１ミリリットル当たり３０マイクログラム超）、ＰＢＳ（−）で３０倍に希釈した。希釈したＨＡワクチン溶液を９６ウェルマイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Nunc）のウェル（５０マイクロリットル）に添加した。マイクロプレートを５℃で一晩インキュベートした後、ＨＡ溶液を捨てた。３％スキムミルクを含有するＰＢＳ（−）溶液を室温で少なくとも１時間それに添加した。マイクロプレートを水で３回洗浄した。３％スキムミルクを含有するＰＢＳ（−）溶液で希釈した抗血清をウェルに添加し、室温で１．５時間インキュベートした。マイクロプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（−）で洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ  Ｔ２０で４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ（ＣＥＬＬ  ＬＡＢ）５０マイクロリットルをウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。マイクロプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（−）で洗浄し、１００マイクロリットルのペルオキシダーゼ基質溶液（ＳＵＭＩＬＯＮ）を各々のウェルに添加し、室温で２０分間インキュベートした。その後、１００マイクロリットルの反応停止液（ＳＵＭＩＬＯＮ）をウェルに添加し、４９０ｎｍでの吸光度をプレートリーダーを用いて測定した。抗血清の吸光度から免疫前血清の吸光度を差し引いて、特異反応性を求めた。
【００８０】
抗体検出の結果
図７Ａ及び図７Ｂに示されるように、上方領域及び下方領域のペプチドの両方が、ウサギにおいて抗体を惹起することができた。上方領域ペプチドは下方領域ペプチドと比べて高い抗原性を示した。ＫＬＨ−ペプチド複合体、及びＫＬＨと結合した上方領域ペプチドでのカクテル免疫によって惹起された抗体は、図７Ｃに示されるようにＨＡと確かに反応した。この結果から、エピトープペプチドでの免疫付与がＨＡ反応性抗体を惹起することができるという可能性が示された。図７Ａ〜図７Ｃ中で使用される略号は、以下のように理解されたい：ＫＬＨ−Ｕ−１：ＫＬＨ−上方部分ペプチドで免疫付与したウサギ１；ＫＬＨ−Ｕ−２：ＫＬＨ−上方部分ペプチドで免疫付与したウサギ２；ＫＬＨ−Ｌ−１：ＫＬＨ−下方部分ペプチドで免疫付与したウサギ１；ＫＬＨ−Ｌ−２：ＫＬＨ−下方部分ペプチドで免疫付与したウサギ２；ＭＡＰ−Ｃ−１：ＭＡＰ−上方部分ペプチド及びＭＡＰ−下方部分ペプチドのカクテルで免疫付与したウサギ１；ＭＡＰ−Ｃ−２：ＭＡＰ−上方部分ペプチド及びＭＡＰ−下方部分ペプチドのカクテルで免疫付与したウサギ２；ＫＬＨ−Ｃ−１：ＫＬＨ−上方部分ペプチド及びＫＬＨ−下方部分ペプチドのカクテルで免疫付与したウサギ１；ＫＬＨ−Ｃ−２：ＫＬＨ−上方部分ペプチド及びＫＬＨ−下方部分ペプチドのカクテルで免疫付与したウサギ２。
【００８１】
実施例５：
モノクローナル抗体Ｄ−１（Kubota-Koketsu et al.）及びＡ型インフルエンザウイルスを、合成ペプチド（ペプチド１（配列番号４）及びペプチド２（配列番号５））と共にインキュベートした。ペプチドによるＤ−１の中和活性の阻害を測定した。結果を図８Ａ及び図８Ｂに示す。ペプチド１による中和阻害率は約５０％、ペプチド２による阻害率は約２０％であった。これらの結果から、ペプチド１及びペプチド２がＤ−１抗体との反応性を有することが示される。したがって、ペプチド１及びペプチド２はヒトの体内において免疫原として中和抗体を誘導することができる。
【００８２】
実施例６：
ヒトに由来するＰＢＭＣを、合成ペプチド（ペプチド１（Ｐ１）（配列番号４）及びペプチド２（Ｐ２）（配列番号５））と共にインキュベートした。培養上清のインフルエンザウイルスに対する中和活性を実施例２の方法に従って測定した。結果を図９及び図１０に示す。ＨＡワクチン（Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５株（大阪大学微生物病研究所）の精製ＨＡワクチン抗原）を陽性対照として使用した。図９及び図１０から、混合ペプチド（ペプチド１＋ペプチド２（Ｐ１＋Ｐ２））によって刺激したＰＢＭＣが、高いウイルス中和活性を有することが示された。これらの結果は、混合ペプチドでの免疫付与が、ヒトの体内において中和抗体を効果的に誘導することを示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
免疫原性を有するペプチドを含むインフルエンザに対するワクチンは、同じ亜型に属する種々の株にわたって広域スペクトルを有することが期待される。有利なことには、該ワクチンが種々の亜型にわたって、より広域のスペクトルを有する可能性がある。本発明は、インフルエンザウイルスの可変性によって影響されないワクチンを提供することができる。また、本発明の選択方法によって得られる抗体はより広い交差反応性を有することが期待される。したがって、本発明はインフルエンザの有効な治療及び／又は予防を可能にし、医療において利益をもたらす。
【００８４】
出願人は、引用した全ての参照文献の全内容を本開示に具体的に援用する。さらに、量、濃度又は他の値若しくはパラメータが、範囲、好ましい範囲、又は上位の好ましい値と下位の好ましい値との一覧として与えられる場合、任意の上限値又は上位の好ましい値と任意の下限値又は下位の好ましい値との任意の組からなる全ての範囲を、この範囲が別個に開示されているか否かにかかわらず、具体的に開示しているものとして理解すべきである。数値範囲が本明細書中に列挙される場合、特に指定のない限り、この範囲はその端点並びにその範囲内の全ての整数及び分数を含むことが意図される。範囲を規定する場合、本発明の範囲が列挙される特定の値に限定されることは意図されない。
【００８５】
本発明の他の実施形態は、本明細書を検討すること、及び本明細書中に開示されている本発明を実施することにより当業者に明らかである。本明細書及び実施例が単に例示的なものであると見なされ、本発明の真の範囲及び精神は添付の特許請求の範囲及びその均等物によって示されることが意図される。
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年2月3日(2012.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
インフルエンザ感染は、心臓疾患患者又は高齢者といった或る特定の個体群にとってより危険であり得る。したがって、インフルエンザに対するワクチンが非常に望まれている。Ａ型インフルエンザウイルスは、免疫原性が高いが、非常に変異しやすい２つのタンパク質、ＨＡ及びＮＡをその膜中に含有している。ＨＡ中の可変ペプチドは非特許文献８及び非特許文献９に開示されている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
ヒト由来及びトリ由来のＨ５Ｎ１における両方の領域の保存について明白な差はなく、トリにおいて生じた幾つかの変異体がヒトへ伝播することが示される。Ｈ１Ｎ１  ｐｄｍにおける上方領域及び下方領域の３１２個の配列は、下方領域における２つの配列を除いて完全に同じであった。ブタ由来のＡ型インフルエンザＨ１Ｎ１の単一の株のみがヒトへ伝播する能力を獲得したとすれば、この結果は合理的である。
【国際調査報告】
2012530486.tif 000024
2012530486.tif 000025