(57)【要約】  脂肪アルコールを生産するための方法および組成物（ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、および宿主細胞を含む）が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪アルコールを生産する方法であって、配列番号18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、264、266、268、270、または272のアミノ酸配列に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させること、および脂肪アルコールを宿主細胞から単離することを含む方法。
【請求項２】
脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の宿主細胞における発現を修飾することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、チオエステラーゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
アルコールデヒドロゲナーゼが、配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、または194のアミノ酸配列に対して少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルの脂肪酸分解酵素を発現するように遺伝子改変されている、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
脂肪酸分解酵素がアシルCoAシンターゼである、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
脂肪アルコールを生産する方法であって、配列番号16のアミノ酸配列に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させること、および脂肪アルコールを宿主細胞から単離することを含む方法。
【請求項９】
脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の宿主細胞における発現を修飾することをさらに含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、チオエステラーゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることをさらに含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１２】
アルコールデヒドロゲナーゼが、配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、または194のアミノ酸配列に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルの脂肪酸分解酵素を発現するように遺伝子改変されている、請求項8に記載の方法。
【請求項１４】
脂肪酸分解酵素がアシルCoAシンターゼである、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
脂肪アルコールを生産する方法であって、配列番号17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、263、265、267、269、または271のヌクレオチド配列に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む組換えベクターを宿主細胞内で発現させること、および脂肪アルコールを宿主細胞から単離することを含む方法。
【請求項１６】
脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の宿主細胞における発現を修飾することをさらに含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、チオエステラーゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることをさらに含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１９】
アルコールデヒドロゲナーゼが、配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、または194のアミノ酸配列に対して少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルの脂肪酸分解酵素を発現するように遺伝子改変されている、請求項15に記載の方法。
【請求項２１】
脂肪酸分解酵素がアシルCoAシンターゼである、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
脂肪アルコールを生産する方法であって、（i）配列番号15のヌクレオチド配列に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む組換えベクターを宿主細胞内で発現させること、および脂肪アルコールを宿主細胞から単離することを含む方法。
【請求項２３】
脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の宿主細胞における発現を修飾することをさらに含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、チオエステラーゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることをさらに含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２６】
アルコールデヒドロゲナーゼが、配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、または194のアミノ酸配列に対して約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルの脂肪酸分解酵素を発現するように遺伝子改変されている、請求項22に記載の方法。
【請求項２８】
脂肪酸分解酵素がアシルCoAシンターゼである、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
宿主細胞が、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、および細菌細胞からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３０】
脂肪アルコールが宿主細胞の細胞外環境から単離される、請求項1に記載の方法。
【請求項３１】
脂肪アルコールがC6〜C26脂肪アルコールを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３２】
脂肪アルコールが、C6、C8、C10、C12、C13、C14、C15、C16、C17、またはC18脂肪アルコールである、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
ヒドロキシル基が第1（C1）位にある、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
脂肪アルコールが不飽和脂肪アルコールである、請求項1に記載の方法。
【請求項３５】
不飽和脂肪アルコールが、C10：1、C12：1、C14：1、C16：1、またはC18：1である、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
脂肪アルコールがω7位において不飽和である、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
不飽和脂肪アルコールがシス二重結合を含む、請求項34に記載の方法。
【請求項３８】
脂肪アルコールが飽和脂肪アルコールである、請求項1に記載の方法。
【請求項３９】
該ポリペプチドの少なくとも1つの生物学的基質の存在下で宿主細胞を培養することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４０】
基質が脂肪酸である、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
脂肪酸がC6〜C26脂肪酸を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
脂肪酸が、C6、C8、C10、C12、C13、C14、C15、C16、C17、またはC18脂肪酸である、請求項40に記載の方法。
【請求項４３】
脂肪酸が不飽和脂肪酸である、請求項40に記載の方法。
【請求項４４】
脂肪酸が飽和脂肪酸である、請求項40に記載の方法。
【請求項４５】
請求項1に記載の方法によって生産される脂肪アルコール。
【請求項４６】
請求項45に記載の脂肪アルコールを含む界面活性剤。
【請求項４７】
脂肪アルコールが約-15.4またはそれ以上のδ13Cを有する、請求項46に記載の界面活性剤。
【請求項４８】
脂肪アルコールが少なくとも約1.003のfM14Cを有する、請求項46に記載の界面活性剤。
【請求項４９】
脂肪アルコールを生産する方法であって、配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、または194のアミノ酸配列に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させること、および脂肪アルコールを宿主細胞から単離することを含む方法。
【請求項５０】
脂肪アルコールを生産する方法であって、配列番号93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、または193のヌクレオチド配列に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む組換えベクターを宿主細胞内で発現させること、および脂肪アルコールを宿主細胞から単離することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、2008年10月28日に出願された米国仮特許出願第61/109,131号の利益を主張するものであり、前記出願の内容は全て引用により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
石油は、液体、気体、または固体の形態で地中に見いだされる、限られた天然資源である。石油は、主に炭素と水素からなる炭化水素を主たる構成要素としている。窒素、酸素または硫黄などといった他の元素もまた、さまざまな形態で相当量含有している。
【０００３】
石油は有用な資源であるが、石油製品は、金銭面でも環境面でも、かなりのコストをかけて開発される。まず最初に、石油源を発見しなければならない。石油探査は、多大な費用を要する、リスクの高い事業である。深海井を探査するコストは1億ドルを超える場合もある。その上、これらの井戸が石油を含んでいる保証はない。商用炭化水素を産出する生産井につながるのは、掘削された井戸の40％に過ぎないと見積もられている。経済的なコストだけでなく、石油探査には高い環境コストもかかる。例えば海洋探査は周辺の海洋環境を乱す。
【０００４】
生産井が発見されたら、莫大な費用をかけて地中から石油を採収しなければならない。一次回収では、地下の自然圧だけで井戸内の石油の約20％を採収することができる。この自然圧は低下するので、経済的に見合うのであれば、二次回収法が使用される。一般に、二次回収では、例えば水注入、天然ガス注入、またはガス・リフトなどによって、井戸の圧力を増加させる。二次回収法を使用することにより、さらに5％〜15％の石油が回収される。二次回収法を使い果たした後は、経済的に見合うのであれば、三次回収法を使用することができる。三次法では、石油を採収しやすくするために、石油の粘度を低下させる。三次回収法を使用することにより、さらに5％〜15％の石油が回収される。したがって、最も良い状況下でさえ、井戸内の石油の50％しか採収することができない。石油採収には環境コストもかかる。例えば石油採収は、地表まで上昇する大規模な石油浸出を引き起こす場合がある。その上、海洋掘削は、周囲の海洋環境を乱しまたは破壊する海底の浚渫を伴う。
【０００５】
石油鉱床は地球全体に一様に見いだされるわけではないので、石油産出地域から石油消費地域まで石油を遠距離輸送しなければならない。輸送コストに加えて、破壊的な油濁という環境リスクもある。
【０００６】
地中から採収された原油は、そのままの形態では、ほとんど商業用途がない。これは、さまざまな長さ及び複雑さを有する炭化水素（例えばパラフィン（またはアルカン）、オレフィン（またはアルケン）、アルキン、ナフテン（またはシクロアルカン）、脂肪族化合物、芳香族化合物など）の混合物である。また、原油は他の有機化合物（例えば窒素、酸素、硫黄などを含有する有機化合物）および不純物（例えば硫黄、塩、酸、金属など）も含有する。
【０００７】
したがって原油は、精製（refine）し、不純物を除去（purify）しなければ、商業的には使用できない。大半の石油は、そのエネルギー密度の高さおよびその輸送しやすさゆえに、燃料、例えば輸送燃料（例えばガソリン、ディーゼル燃料、航空燃料など）、暖房用油（heating oil）、液化石油ガスなどに精製される。
【０００８】
原油は、石油化学品（petrochemicals）を生産するための原料の一次供給源でもある。石油から誘導される原料の2つの主要クラスは、短鎖オレフィン（例えばエチレンおよびプロピレン）と芳香族化合物（例えばベンゼンおよびキシレン異性体）である。これらの原料は、原油中の長鎖炭化水素から、接触分解、水蒸気分解または接触改質などといったさまざまな方法を使用し、かなりの費用をかけて長鎖炭化水素を分解することによって誘導される。これらの原料は、原油から直接精製することができない石油化学品、例えばモノマー、溶媒、洗剤（detergent）、または接着剤などを作るために使用される。
【０００９】
原油から誘導される原料の一例はエチレンである。エチレンは、ポリエチレン、エタノール、エチレンオキシド、エチレングリコール、ポリエステル、グリコールエーテル、エトキシレート、酢酸ビニル、1,2-ジクロロエタン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、塩化ビニル、およびポリ塩化ビニルなどの石油化学品を生産するために使用される。原料のもう一つの例はプロピレンであり、これは、イソプロピルアルコール、アクリロニトリル、ポリプロピレン、プロピレンオキシド、プロピレングリコール、グリコールエーテル、ブチレン、イソブチレン、1,3-ブタジエン、合成エラストマー、ポリオレフィン、α-オレフィン、脂肪アルコール、アクリル酸、アクリルポリマー、塩化アリル、エピクロロヒドリン、およびエポキシ樹脂を生産するために使用される。
【００１０】
次に、これらの石油化学品を使って、プラスチック、樹脂、繊維、エラストマー、医薬品、潤滑剤、またはゲルなどの特殊化学品（specialty chemicals）を作ることができる。石油化学原料から生産することができる具体的特殊化学品には、脂肪酸、炭化水素（例えば長鎖、分岐鎖、飽和、不飽和など）、脂肪アルコール、エステル、脂肪アルデヒド、ケトン、潤滑剤などがある。
【００１１】
脂肪アルコールは多くの商業用途を有する。全世界における脂肪アルコールおよびその誘導体の年間売上高は、10億米ドルを超える。短鎖（shorter chain）脂肪アルコールは、化粧品産業および食品産業において、乳化剤、軟化剤（emollient）、および増粘剤（thickener）として使用される。脂肪アルコールは、その両親媒性ゆえに、洗剤など、パーソナルケア用品（personal care product）および家事用品（household product）に役立つ非イオン界面活性剤として挙動する。また、脂肪アルコールは、ワックス、ゴム、樹脂、医薬軟膏およびローション、潤滑油添加剤、布地（textile）用帯電防止剤および表面処理剤、可塑剤、化粧品、工業用溶剤、ならびに脂肪用の溶媒として使用される。
【００１２】
アルデヒドは、多くの特殊化学品を生産するために使用される。例えばアルデヒドは、ポリマー、樹脂（例えばベークライト）、染料、矯味矯臭剤（flavorings）、可塑剤、香料、医薬品その他の化学品を生産するために使用される。溶媒、保存剤、または消毒薬として使用されるものもある。ビタミンやホルモンなど、いくつかの天然化合物および合成化合物は、アルデヒドである。また、多くの糖類はアルデヒド基を含有する。
【００１３】
これらの特殊化学品を原油から得るには、かなりの資金投資と大量のエネルギーが必要である。これは非効率的なプロセスでもある。なぜなら、多くの場合、原油中の長鎖炭化水素を分解することで、より小さなモノマーが生産されるからである。次に、これらのモノマーは、より複雑な特殊化学品を製造するための原料として使用される。
【００１４】
石油の探査、採収、輸送及び精製に伴う問題に加えて、石油は、限りある、減少する資源でもある。世界の石油消費量の推定値の一つは年間300億バレルというものである。いくつかの推定によれば、現在の産出レベルでは、世界の石油埋蔵量は2050年を待たずに枯渇するかもしれないと予測されている。
【００１５】
最後に、石油ベース燃料の燃焼は、温室効果ガス（例えば二酸化炭素）および他の形態の大気汚染物質（例えば一酸化炭素、二酸化硫黄など）を放出する。世界の燃料需要が増加するにつれて、温室効果ガスおよび他の形態の大気汚染物質の放出量も増加する。大気圏における温室効果ガスの蓄積は、地球温暖化の増進につながりうる。したがって、局所的な環境破壊（例えば油濁、海洋環境の浚渫など）だけでなく、石油の燃焼は、環境を地球規模でも破壊する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
石油が提起する固有の難題ゆえに、石油のように探査し、採収し、長距離輸送し、または実質的に精製する必要のない、再生可能な石油源が必要とされている。また、石油産業および石油ベース燃料の燃焼によって引き起こされるタイプの環境破壊を生み出すことなく経済的に生産することができる再生可能な石油源も必要とされている。同様の理由で、典型的には石油から誘導される化学品の再生可能な供給源も必要とされている。
【００１７】
再生可能な石油を生産する方法の一つは、再生可能な石油製品を生産するように微生物を改変（engineer）することである。いくつかの微生物は、化学品を生産する自然の能力を有する。例えば酵母は、エタノール（例えばビール、ワインなど）の生産に、何世紀もの間、使用されてきた。近年、高度なバイオテクノロジーの開発により、今まで決して生産されたことのなかったバイオ製品（bioproduct）を生産するように、生物を代謝改変（metabolically engineer）することが可能になっている。これらの細胞活動によって得られる製品、例えば化学品は、バイオ製品と呼ばれている。これらの細胞活動によって生産される燃料はバイオ燃料と呼ばれている。バイオ燃料は、石油ベース燃料に代わる再生可能な代替燃料である。バイオ燃料は、あらゆる石油ベース燃料（例えばガソリン、ディーゼル燃料、航空燃料、暖房用油など）の代わりに使用することができる。バイオ燃料は、再生可能資源から、例えば植物質（plant matter）、動物質（animal matter）から、または廃棄物からでさえ、得ることができる。これらの再生可能資源はバイオマスと総称されている。石油ベース燃料と比較したバイオ燃料の利点の一つは、バイオ燃料が、多大な費用を要する、リスクの高い探査または採収を、必要としないことである。加えて、バイオ燃料は現地で生産することができる。したがってバイオ燃料は長距離輸送を必要としない。その上、バイオ燃料は、原油の精製で必要になるような多大な費用を要するエネルギー集約的な精製を必要とせず、直接的に生産することができる。状況によっては、バイオ燃料が、限定的で費用対効果の高い精製レベルを要求することもありうる。さらにまた、バイオ燃料の使用は、燃焼時に放出される、環境にとって有害な放出物（例えば温室効果ガス、大気汚染物質など）の量を削減することにより、環境を改善する。例えばバイオ燃料は再生可能な天然資源であるバイオマスから生産されるので、バイオ燃料は均衡のとれた炭素循環を維持する。バイオ燃料の燃焼は炭素を（例えば二酸化炭素として）放出するが、この炭素はバイオマスの生産（例えば作物の栽培）時に再利用され、その結果、石油ベース燃料とは違って炭素循環の平衡が保たれることになる。
【００１８】
同様の理由で、生物由来の化学品（biologically derived chemicals）には、石油ベース燃料に対するバイオ燃料の利点と同じ利点がある。生物由来の化学品は、石油化学品に代わる再生可能な代替物である。生物由来の化学品、例えば炭化水素（例えばアルカン、アルケン、またはアルキン）、脂肪アルコール、エステル、脂肪酸、脂肪アルデヒド、およびケトンは、大がかりな精製を伴わずに直接生産されるので、石油化学品より優れている。石油化学品とは異なり、生物由来の化学品は、原油のように原料を回収するための精製を必要としない（原油の場合は、回収した原料をさらに加工して、より複雑な石油化学品を作らなければならない）。生物由来の化学品はバイオマスから所望の化学製品へと直接的に変換される。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
発明の概要
本発明は、少なくとも一つには、脂肪アルデヒド（これは、引き続き、脂肪アルコールに変換することができる）を生産するために使用することができる、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドおよび脂肪アルコール生合成ポリペプチドをコードする遺伝子の同定に基づく。したがって、ある態様において、本発明は、脂肪アルコールの生産方法を特徴とする。本方法は、配列番号18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、264、266、268、270、または272のアミノ酸配列を含む脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドまたはその変異体をコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコールを宿主細胞から単離することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に存在する。一定の実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞の細胞外環境から単離される。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞から分泌される。他の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に輸送される。別の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に受動輸送される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドが、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換、付加、挿入、または欠失を有する配列番号18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、264、266、268、270、または272のアミノ酸配列を含み、該ポリペプチドがカルボン酸レダクターゼ活性を有する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは脂肪酸レダクターゼ活性を有する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、次に挙げる保存的アミノ酸置換の1つまたはそれ以上を含む：脂肪族アミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの、別の脂肪族アミノ酸による置換；スレオニンによるセリンの置換；セリンによるスレオニンの置換；酸性残基、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸の、別の酸性残基による置換；アミド基含有残基、例えばアスパラギンおよびグルタミンの、別のアミド基含有残基による置換；塩基性残基、例えばリジンおよびアルギニンの、別の塩基性残基との交換；ならびに、芳香族残基、例えばフェニルアラニンおよびチロシンの、別の芳香族残基による置換。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、またはそれ以上のアミノ酸置換、付加、挿入、または欠失を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドがカルボン酸レダクターゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが脂肪酸レダクターゼ活性を有する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の宿主細胞における発現を修飾（modify）することを含む。一定の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を増加させることを含む。他の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で減弱（attenuate）すること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を低減することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸シンターゼがチオエステラーゼである。特定の実施形態では、チオエステラーゼが、tesA、リーダー配列のないtesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA、またはfatA1によってコードされる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコール生合成ポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む。特定の実施形態では、脂肪アルコール生合成ポリペプチドが、配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、もしくは194のアミノ酸配列、またはその変異体を含む。
【００２４】
別の実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルの脂肪酸分解酵素を発現するように遺伝子改変（genetically engineer）される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルのアシルCoAシンターゼを発現するように遺伝子改変される。特定の実施形態では、宿主細胞が、fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p、またはタンパク質ZP_01644857をコードする遺伝子によってコードされるアシルCoAシンターゼを、減弱したレベルで発現する。一定の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞が、脂肪酸分解酵素をコードする1つまたはそれ以上の遺伝子（例えば上述のアシルCoAシンターゼ遺伝子）のノックアウトを含む。
【００２５】
さらに別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのデヒドラターゼ/イソメラーゼ酵素（例えばfabAによってコードされるか、図15に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、fabAまたは図15に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのケトアシルACPシンターゼ（例えばfabBによってコードされるか、図16に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。一定の実施形態では、宿主細胞が、fabBまたは図16に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。さらに別の実施形態では、宿主細胞が、修飾されたレベルの、デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子（例えばdesA）を発現するように遺伝子改変される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、細菌、植物、昆虫、酵母、真菌、または哺乳動物に由来する。
【００２７】
一定の実施形態では、ポリペプチドが、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、細菌細胞、または本明細書に記載する他の任意の生物に由来する。いくつかの実施形態では、細菌が、Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium abscessus、Mycobacterium avium、Mycobacterium bovis、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium leprae、Mycobacterium marinum、およびMycobacterium ulceransからなる群より選択されるマイコバクテリウムである。別の実施形態では、細菌が、Nocardia sp. NRRL 5646、Nocardia farcinica、Streptomyces griseus、Salinispora arenicola、またはClavibacter michiganenesisである。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドの少なくとも一つの生物学的基質の存在下で宿主細胞を培養することを含む。
【００２９】
もう一つの態様において、本発明は、脂肪アルコールの生産方法を特徴とする。本方法は、配列番号18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、264、266、268、270、または272のアミノ酸配列に対して少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列が、配列番号18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、264、266、268、270、または272のアミノ酸配列である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコールを宿主細胞から単離することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に存在する。一定の実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞の細胞外環境から単離される。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞から分泌される。他の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に輸送される。別の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に受動輸送される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の宿主細胞における発現を修飾することを含む。一定の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を増加させることを含む。他の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で減弱すること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を低減することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸シンターゼがチオエステラーゼである。特定の実施形態では、チオエステラーゼが、tesA、リーダー配列のないtesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA、またはfatA1によってコードされる。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコール生合成ポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む。特定の実施形態では、脂肪アルコール生合成ポリペプチドが、配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、もしくは194のアミノ酸配列、またはその変異体を含む。
【００３３】
別の実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルの脂肪酸分解酵素を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルのアシルCoAシンターゼを発現するように遺伝子改変される。特定の実施形態では、宿主細胞が、fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p、またはタンパク質ZP_01644857をコードする遺伝子によってコードされるアシルCoAシンターゼを、減弱したレベルで発現する。一定の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞が、脂肪酸分解酵素をコードする1つまたはそれ以上の遺伝子（例えば上述のアシルCoAシンターゼ遺伝子）のノックアウトを含む。
【００３４】
さらに別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのデヒドラターゼ/イソメラーゼ酵素（例えばfabAによってコードされるか、図15に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、fabAまたは図15に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのケトアシルACPシンターゼ（例えばfabBによってコードされるか、図16に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。一定の実施形態では、宿主細胞が、fabBまたは図16に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。さらに別の実施形態では、宿主細胞が、修飾されたレベルの、デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子（例えばdesA）を発現するように遺伝子改変される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、細菌、植物、昆虫、酵母、真菌、または哺乳動物に由来する。
【００３６】
一定の実施形態では、ポリペプチドが、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、細菌細胞、または本明細書に記載する他の任意の生物に由来する。いくつかの実施形態では、細菌が、Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium abscessus、Mycobacterium avium、Mycobacterium bovis、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium leprae、Mycobacterium marinum、およびMycobacterium ulceransからなる群より選択されるマイコバクテリウムである。別の実施形態では、細菌が、Nocardia sp. NRRL 5646、Nocardia farcinica、Streptomyces griseus、Salinispora arenicola、またはClavibacter michiganenesisである。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドの少なくとも一つの生物学的基質の存在下で宿主細胞を培養することを含む。
【００３８】
もう一つの態様において、本発明は、脂肪アルコールの生産方法を特徴とする。本方法は、配列番号17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、263、265、267、269、もしくは271のヌクレオチド配列の相補配列（complement）またはそのフラグメントにハイブリダイズするポリヌクレオチドを、宿主細胞内で発現させることを含み、ここで、該ポリヌクレオチドは、カルボン酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが脂肪酸レダクターゼ活性を有する。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコールを宿主細胞から単離することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に存在する。一定の実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞の細胞外環境から単離される。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞から分泌される。他の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に輸送される。別の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に受動輸送される。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドが、低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または超高（very high）ストリンジェンシー条件下で、配列番号17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、263、265、267、269、もしくは271のヌクレオチド配列の相補配列、またはそのフラグメントに、ハイブリダイズする。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の宿主細胞における発現を修飾することを含む。一定の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を増加させることを含む。他の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で減弱すること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を低減することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸シンターゼがチオエステラーゼである。特定の実施形態では、チオエステラーゼが、tesA、リーダー配列のないtesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA、またはfatA1によってコードされる。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコール生合成ポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む。特定の実施形態では、脂肪アルコール生合成ポリペプチドが、配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、もしくは194のアミノ酸配列、またはその変異体を含む。
【００４３】
別の実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルの脂肪酸分解酵素を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルのアシルCoAシンターゼを発現するように遺伝子改変される。特定の実施形態では、宿主細胞が、fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p、またはタンパク質ZP_01644857をコードする遺伝子によってコードされるアシルCoAシンターゼを、減弱したレベルで発現する。一定の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞が、脂肪酸分解酵素をコードする1つまたはそれ以上の遺伝子（例えば上述のアシルCoAシンターゼ遺伝子）のノックアウトを含む。
【００４４】
さらに別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのデヒドラターゼ/イソメラーゼ酵素（例えばfabAによってコードされるか、図15に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、fabAまたは図15に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのケトアシルACPシンターゼ（例えばfabBによってコードされるか、図16に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。一定の実施形態では、宿主細胞が、fabBまたは図16に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。さらに別の実施形態では、宿主細胞が、修飾されたレベルの、デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子（例えばdesA）を発現するように遺伝子改変される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、細菌、植物、昆虫、酵母、真菌、または哺乳動物に由来する。
【００４６】
一定の実施形態では、ポリペプチドが、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、細菌細胞、または本明細書に記載する他の任意の生物に由来する。いくつかの実施形態では、細菌が、Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium abscessus、Mycobacterium avium、Mycobacterium bovis、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium leprae、Mycobacterium marinum、およびMycobacterium ulceransからなる群より選択されるマイコバクテリウムである。別の実施形態では、細菌が、Nocardia sp. NRRL 5646、Nocardia farcinica、Streptomyces griseus、Salinispora arenicola、またはClavibacter michiganenesisである。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドの少なくとも一つの生物学的基質の存在下で宿主細胞を培養することを含む。
【００４８】
もう一つの態様において、本発明は、脂肪アルコールの生産方法を特徴とする。本方法は、配列番号16のアミノ酸を含む脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドまたはその変異体をコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコールを宿主細胞から単離することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に存在する。一定の実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞の細胞外環境から単離される。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞から分泌される。他の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に輸送される。別の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に受動輸送される。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換、付加、挿入、または欠失を有する配列番号16のアミノ酸配列を含み、ここで、該ポリペプチドはカルボン酸レダクターゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが脂肪酸レダクターゼ活性を有する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、次に挙げる保存的アミノ酸置換の1つまたはそれ以上を含む：脂肪族アミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの、別の脂肪族アミノ酸による置換；スレオニンによるセリンの置換；セリンによるスレオニンの置換；酸性残基、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸の、別の酸性残基による置換；アミド基含有残基、例えばアスパラギンおよびグルタミンの、別のアミド基含有残基による置換；塩基性残基、例えばリジンおよびアルギニンの、別の塩基性残基との交換；ならびに、芳香族残基、例えばフェニルアラニンおよびチロシンの、別の芳香族残基による置換。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、またはそれ以上のアミノ酸置換、付加、挿入、または欠失を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドがカルボン酸レダクターゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが脂肪酸レダクターゼ活性を有する。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の宿主細胞における発現を修飾することを含む。一定の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を増加させることを含む。他の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で減弱すること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を低減することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸シンターゼがチオエステラーゼである。特定の実施形態では、チオエステラーゼが、tesA、リーダー配列のないtesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA、またはfatA1によってコードされる。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコール生合成ポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む。特定の実施形態では、脂肪アルコール生合成ポリペプチドが、配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、もしくは194のアミノ酸配列、またはその変異体を含む。
【００５３】
別の実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルの脂肪酸分解酵素を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルのアシルCoAシンターゼを発現するように遺伝子改変される。特定の実施形態では、宿主細胞が、fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p、またはタンパク質ZP_01644857をコードする遺伝子によってコードされるアシルCoAシンターゼを、減弱したレベルで発現する。一定の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞が、脂肪酸分解酵素をコードする1つまたはそれ以上の遺伝子（例えば上述のアシルCoAシンターゼ遺伝子）のノックアウトを含む。
【００５４】
さらに別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのデヒドラターゼ/イソメラーゼ酵素（例えばfabAによってコードされるか、図15に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、fabAまたは図15に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのケトアシルACPシンターゼ（例えばfabBによってコードされるか、図16に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。一定の実施形態では、宿主細胞が、fabBまたは図16に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。さらに別の実施形態では、宿主細胞が、修飾されたレベルの、デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子（例えばdesA）を発現するように遺伝子改変される。
【００５５】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドの、少なくとも一つの生物学的基質の存在下で宿主細胞を培養することを含む。
【００５６】
もう一つの態様において、本発明は、脂肪アルコールの生産方法を特徴とする。本方法は、配列番号16のアミノ酸配列に対して少なくとも約70％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコールを宿主細胞から単離することを含む。一定の実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞の細胞外環境から単離される。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞から分泌される。
【００５８】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列が、配列番号16のアミノ酸配列に対して、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列が配列番号16である。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の宿主細胞における発現を修飾することを含む。一定の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を増加させることを含む。他の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で減弱すること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を低減することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸シンターゼがチオエステラーゼである。特定の実施形態では、チオエステラーゼが、tesA、リーダー配列のないtesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA、またはfatA1によってコードされる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコール生合成ポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む。特定の実施形態では、脂肪アルコール生合成ポリペプチドが、配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、もしくは194のアミノ酸配列、またはその変異体を含む。
【００６１】
別の実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルの脂肪酸分解酵素を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルのアシルCoAシンターゼを発現するように遺伝子改変される。特定の実施形態では、宿主細胞が、fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p、またはタンパク質ZP_01644857をコードする遺伝子によってコードされるアシルCoAシンターゼを、減弱したレベルで発現する。一定の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞が、脂肪酸分解酵素をコードする1つまたはそれ以上の遺伝子（例えば上述のアシルCoAシンターゼ遺伝子）のノックアウトを含む。
【００６２】
さらに別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのデヒドラターゼ/イソメラーゼ酵素（例えばfabAによってコードされるか、図15に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、fabAまたは図15に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのケトアシルACPシンターゼ（例えばfabBによってコードされるか、図16に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。一定の実施形態では、宿主細胞が、fabBまたは図16に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。さらに別の実施形態では、宿主細胞が、修飾されたレベルの、デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子（例えばdesA）を発現するように遺伝子改変される。
【００６３】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドの少なくとも一つの生物学的基質の存在下で宿主細胞を培養することを含む。
【００６４】
もう一つの態様において、本発明は、脂肪アルコールの生産方法を特徴とする。本方法は、配列番号15のヌクレオチド配列の相補配列またはそのフラグメントにハイブリダイズするポリヌクレオチドを、宿主細胞内で発現させることを含み、ここで、該ポリヌクレオチドは、カルボン酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが脂肪酸レダクターゼ活性を有する。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の宿主細胞における発現を修飾することを含む。一定の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を増加させることを含む。他の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で減弱すること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を低減することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸シンターゼがチオエステラーゼである。特定の実施形態では、チオエステラーゼが、tesA、リーダー配列のないtesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA、またはfatA1によってコードされる。
【００６６】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコール生合成ポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む。特定の実施形態では、脂肪アルコール生合成ポリペプチドが、配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、もしくは194のアミノ酸配列、またはその変異体を含む。
【００６７】
別の実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルの脂肪酸分解酵素を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルのアシルCoAシンターゼを発現するように遺伝子改変される。特定の実施形態では、宿主細胞が、fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p、またはタンパク質ZP_01644857をコードする遺伝子によってコードされるアシルCoAシンターゼを、減弱したレベルで発現する。一定の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞が、脂肪酸分解酵素をコードする1つまたはそれ以上の遺伝子（例えば上述のアシルCoAシンターゼ遺伝子）のノックアウトを含む。
【００６８】
さらに別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのデヒドラターゼ/イソメラーゼ酵素（例えばfabAによってコードされるか、図15に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、fabAまたは図15に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのケトアシルACPシンターゼ（例えばfabBによってコードされるか、図16に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。一定の実施形態では、宿主細胞が、fabBまたは図16に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。さらに別の実施形態では、宿主細胞が、修飾されたレベルの、デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子（例えばdesA）を発現するように遺伝子改変される。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコールを宿主細胞から単離することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に存在する。一定の実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞の細胞外環境から単離される。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞から分泌される。他の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に輸送される。別の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に受動輸送される。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または超高ストリンジェンシー条件下で、配列番号15のヌクレオチド配列の相補配列またはそのフラグメントにハイブリダイズする。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドの少なくとも一つの生物学的基質の存在下で宿主細胞を培養することを含む。
【００７２】
もう一つの態様において、本発明は、脂肪アルコールの生産方法を特徴とする。本方法は、図8に掲載するヌクレオチド配列に対して少なくとも約70％の配列同一性を有する脂肪アルデヒド生合成ヌクレオチド配列を含む組換えベクターを、宿主細胞内で発現させることを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列が、配列番号17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、263、265、267、269、または271のヌクレオチド配列に対して、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列が、配列番号17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、263、265、267、269、または271である。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコールを宿主細胞から単離することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に存在する。一定の実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞の細胞外環境から単離される。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞から分泌される。他の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に輸送される。別の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に受動輸送される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、組換えベクターが、ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。一定の実施形態では、プロモーターが、発生段階調節型（developmentally-regulated）プロモーター、細胞小器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または細胞特異的プロモーターである。
【００７５】
別の実施形態では、組換えベクターが、（a）ヌクレオチド配列に作動可能に結合した調節配列；（b）ヌクレオチド配列に作動可能に結合した選択マーカー；（c）ヌクレオチド配列に作動可能に結合したマーカー配列；（d）ヌクレオチド配列に作動可能に結合した精製部分（purification moiety）；（e）ヌクレオチド配列に作動可能に結合した分泌配列；および（f）ヌクレオチド配列に作動可能に結合したターゲティング配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、組換えベクターがプラスミドである。
【００７７】
いくつかの実施形態では、宿主細胞が、組換えベクターによってコードされるポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列が、宿主細胞のゲノムDNA中に安定に組み込まれ、ヌクレオチド配列の発現が、調節されたプロモーター領域の制御を受ける。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の宿主細胞における発現を修飾することを含む。一定の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を増加させることを含む。他の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で減弱すること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を低減することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸シンターゼがチオエステラーゼである。特定の実施形態では、チオエステラーゼが、tesA、リーダー配列のないtesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA、またはfatA1によってコードされる。
【００７９】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコール生合成ポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む。特定の実施形態では、脂肪アルコール生合成ポリペプチドが、配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、もしくは194のアミノ酸配列、またはその変異体を含む。
【００８０】
別の実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルの脂肪酸分解酵素を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルのアシルCoAシンターゼを発現するように遺伝子改変される。特定の実施形態では、宿主細胞が、fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p、またはタンパク質ZP_01644857をコードする遺伝子によってコードされるアシルCoAシンターゼを、減弱したレベルで発現する。一定の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞が、脂肪酸分解酵素をコードする1つまたはそれ以上の遺伝子（例えば上述のアシルCoAシンターゼ遺伝子）のノックアウトを含む。
【００８１】
さらに別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのデヒドラターゼ/イソメラーゼ酵素（例えばfabAによってコードされるか、図15に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、fabAまたは図15に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのケトアシルACPシンターゼ（例えばfabBによってコードされるか、図16に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。一定の実施形態では、宿主細胞が、fabBまたは図16に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。さらに別の実施形態では、宿主細胞が、修飾されたレベルの、デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子（例えばdesA）を発現するように遺伝子改変される。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドの、少なくとも一つの生物学的基質の存在下で宿主細胞を培養することを含む。
【００８３】
もう一つの態様において、本発明は、脂肪アルコールの生産方法を特徴とする。本方法は、配列番号15のヌクレオチド配列に対して少なくとも約70％の配列同一性を有する脂肪アルデヒド生合成ヌクレオチド配列を含む組換えベクターを、宿主細胞内で発現させることを含む。
【００８４】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコールを宿主細胞から単離することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に存在する。一定の実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞の細胞外環境から単離される。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞から分泌される。他の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に輸送される。別の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に受動輸送される。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列が、配列番号15のヌクレオチド配列に対して少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列が、配列番号15のヌクレオチド配列である。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の宿主細胞における発現を修飾することを含む。一定の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を増加させることを含む。他の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で減弱すること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を低減することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸シンターゼがチオエステラーゼである。特定の実施形態では、チオエステラーゼが、tesA、リーダー配列のないtesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA、またはfatA1によってコードされる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコール生合成ポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む。特定の実施形態では、脂肪アルコール生合成ポリペプチドが、配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、もしくは194のアミノ酸配列、またはその変異体を含む。
【００８８】
別の実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルの脂肪酸分解酵素を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルのアシルCoAシンターゼを発現するように遺伝子改変される。特定の実施形態では、宿主細胞が、fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p、またはタンパク質ZP_01644857をコードする遺伝子によってコードされるアシルCoAシンターゼを、減弱したレベルで発現する。一定の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞が、脂肪酸分解酵素をコードする1つまたはそれ以上の遺伝子（例えば上述のアシルCoAシンターゼ遺伝子）のノックアウトを含む。
【００８９】
さらに別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのデヒドラターゼ/イソメラーゼ酵素（例えばfabAによってコードされるか、図15に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、fabAまたは図15に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのケトアシルACPシンターゼ（例えばfabBによってコードされるか、図16に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。一定の実施形態では、宿主細胞が、fabBまたは図16に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。さらに別の実施形態では、宿主細胞が、修飾されたレベルの、デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子（例えばdesA）を発現するように遺伝子改変される。
【００９０】
いくつかの実施形態では、組換えベクターが、ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。一定の実施形態では、プロモーターが、発生段階調節型プロモーター、細胞小器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または細胞特異的プロモーターである。
【００９１】
別の実施形態では、組換えベクターが、（a）ヌクレオチド配列に作動可能に結合した調節配列；（b）ヌクレオチド配列に作動可能に結合した選択マーカー；（c）ヌクレオチド配列に作動可能に結合したマーカー配列；（d）ヌクレオチド配列に作動可能に結合した精製部分；（e）ヌクレオチド配列に作動可能に結合した分泌配列；および（f）ヌクレオチド配列に作動可能に結合したターゲティング配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態では、組換えベクターがプラスミドである。
【００９３】
いくつかの実施形態では、宿主細胞が、組換えベクターによってコードされるポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列が、宿主細胞のゲノムDNA中に安定に組み込まれ、ヌクレオチド配列の発現が、調節されたプロモーター領域の制御を受ける。
【００９４】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドの少なくとも一つの生物学的基質の存在下で宿主細胞を培養することを含む。
【００９５】
もう一つの態様において、本発明は、脂肪アルコールの生産方法を特徴とする。本方法は、（i）配列番号7、配列番号8、配列番号9、および配列番号10；（ii）配列番号11、配列番号12、配列番号13、または配列番号14；および/または（iii）配列番号7、配列番号9、配列番号10、および配列番号11、を含む脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含み、ここで、該ポリペプチドはカルボン酸レダクターゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが脂肪酸レダクターゼ活性を有する。
【００９６】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコールを宿主細胞から単離することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に存在する。一定の実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞の細胞外環境から単離される。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞から分泌される。他の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に輸送される。別の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に受動輸送される。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドが約1,000アミノ酸〜約2,000アミノ酸長である。一定の実施形態では、ポリペプチドが、約1,000アミノ酸長、約1,050アミノ酸長、約1,100アミノ酸長、約1,150アミノ酸長、約1,200アミノ酸長、約1,250アミノ酸長、約1,300アミノ酸長、約1,400アミノ酸長、約1,500アミノ酸長、約1,600アミノ酸長、約1,700アミノ酸長、約1,800アミノ酸長、約1,900アミノ酸長、または約2,000アミノ酸長である。別の実施形態では、ポリペプチドが、約2,000アミノ酸長まで、約1,900アミノ酸長まで、約1,800アミノ酸長まで、約1,700アミノ酸長まで、約1,600アミノ酸長まで、約1,500アミノ酸長まで、約1,400アミノ酸長まで、約1,300アミノ酸長まで、約1,250アミノ酸長まで、約1,200アミノ酸長まで、約1,150アミノ酸長まで、約1,100アミノ酸長まで、約1,050アミノ酸長まで、または約1,000アミノ酸長までである。別の実施形態では、ポリペプチドが約1,000アミノ酸より長いか、約1,050アミノ酸より長いか、約1,100アミノ酸より長いか、約1,150アミノ酸より長いか、約1,200アミノ酸より長いか、約1,250アミノ酸より長いか、約1,300アミノ酸より長いか、約1,400アミノ酸より長いか、約1,500アミノ酸より長いか、約1,600アミノ酸より長いか、約1,700アミノ酸より長いか、約1,800アミノ酸より長いか、約1,900アミノ酸より長いか、または約2,000アミノ酸より長い。
【００９８】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の宿主細胞における発現を修飾することを含む。一定の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を増加させることを含む。他の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で減弱すること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を低減することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸シンターゼがチオエステラーゼである。特定の実施形態では、チオエステラーゼが、tesA、リーダー配列のないtesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA、またはfatA1によってコードされる。
【００９９】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコール生合成ポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む。特定の実施形態では、脂肪アルコール生合成ポリペプチドが、配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、もしくは194のアミノ酸配列、またはその変異体を含む。
【０１００】
別の実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルの脂肪酸分解酵素を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルのアシルCoAシンターゼを発現するように遺伝子改変される。特定の実施形態では、宿主細胞が、fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p、またはタンパク質ZP_01644857をコードする遺伝子によってコードされるアシルCoAシンターゼを、減弱したレベルで発現する。一定の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞が、脂肪酸分解酵素をコードする1つまたはそれ以上の遺伝子（例えば上述のアシルCoAシンターゼ遺伝子）のノックアウトを含む。
【０１０１】
さらに別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのデヒドラターゼ/イソメラーゼ酵素（例えばfabAによってコードされるか、図15に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、fabAまたは図15に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのケトアシルACPシンターゼ（例えばfabBによってコードされるか、図16に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。一定の実施形態では、宿主細胞が、fabBまたは図16に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。さらに別の実施形態では、宿主細胞が、修飾されたレベルの、デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子（例えばdesA）を発現するように遺伝子改変される。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドの少なくとも一つの生物学的基質の存在下で宿主細胞を培養することを含む。
【０１０３】
もう一つの態様において、本発明は、脂肪アルコールの生産方法を特徴とする。本方法は、配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、または194のアミノ酸配列を含む脂肪アルコール生合成ポリペプチドまたはその変異体をコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコールを宿主細胞から単離することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に存在する。一定の実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞の細胞外環境から単離される。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞から分泌される。他の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に輸送される。別の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に受動輸送される。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、脂肪アルコール生合成ポリペプチドは、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換、付加、挿入、または欠失を有する配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、または194のアミノ酸配列を含み、該ポリペプチドはアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、次に挙げる保存的アミノ酸置換の1つまたはそれ以上を含む：脂肪族アミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの、別の脂肪族アミノ酸による置換；スレオニンによるセリンの置換；セリンによるスレオニンの置換；酸性残基、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸の、別の酸性残基による置換；アミド基含有残基、例えばアスパラギンおよびグルタミンの、別のアミド基含有残基による置換；塩基性残基、例えばリジンおよびアルギニンの、別の塩基性残基との交換；ならびに、芳香族残基、例えばフェニルアラニンおよびチロシンの、別の芳香族残基による置換。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、またはそれ以上のアミノ酸置換、付加、挿入、または欠失を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドがアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の宿主細胞における発現を修飾することを含む。一定の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を増加させることを含む。他の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で減弱すること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を低減することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸シンターゼがチオエステラーゼである。特定の実施形態では、チオエステラーゼが、tesA、リーダー配列のないtesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA、またはfatA1によってコードされる。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む。特定の実施形態では、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドが、配列番号18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、264、266、268、270、または272のアミノ酸配列、またはその変異体を含む。
【０１０８】
別の実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルの脂肪酸分解酵素を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルのアシルCoAシンターゼを発現するように遺伝子改変される。特定の実施形態では、宿主細胞が、fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p、またはタンパク質ZP_01644857をコードする遺伝子によってコードされるアシルCoAシンターゼを、減弱したレベルで発現する。一定の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞が、脂肪酸分解酵素をコードする1つまたはそれ以上の遺伝子（例えば上述のアシルCoAシンターゼ遺伝子）のノックアウトを含む。
【０１０９】
さらに別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのデヒドラターゼ/イソメラーゼ酵素（例えばfabAによってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのケトアシルACPシンターゼ（例えばfabBによってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。さらに別の実施形態では、宿主細胞が、修飾されたレベルの、デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子（例えばdesA）を発現するように遺伝子改変される。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、細菌、植物、昆虫、酵母、真菌、または哺乳動物に由来する。
【０１１１】
一定の実施形態では、ポリペプチドが細菌に由来する。いくつかの実施形態では、細菌が、Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium abscessus、Mycobacterium avium、Mycobacterium bovis、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium leprae、Mycobacterium marinum、およびMycobacterium ulceransからなる群より選択されるマイコバクテリウムである。別の実施形態では、細菌が、Nocardia sp. NRRL 5646、Nocardia farcinica、Streptomyces griseus、Salinispora arenicola、またはClavibacter michiganenesisである。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコール生合成ポリペプチドの少なくとも一つの生物学的基質の存在下で宿主細胞を培養することを含む。
【０１１３】
もう一つの態様において、本発明は、脂肪アルコールの生産方法を特徴とする。本方法は、配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、または194のアミノ酸配列に対して少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む脂肪アルコール生合成ポリペプチドをコードする遺伝子を、宿主細胞内で発現させることを含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列が、配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、または194である。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコールを宿主細胞から単離することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に存在する。一定の実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞の細胞外環境から単離される。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞から分泌される。他の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に輸送される。別の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に受動輸送される。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の宿主細胞における発現を修飾することを含む。一定の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を増加させることを含む。他の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で減弱すること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を低減することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸シンターゼがチオエステラーゼである。特定の実施形態では、チオエステラーゼが、tesA、リーダー配列のないtesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA、またはfatA1によってコードされる。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む。特定の実施形態では、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドが、配列番号18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、264、266、268、270、もしくは272のアミノ酸配列、またはその変異体を含む。
【０１１７】
別の実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルの脂肪酸分解酵素を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルのアシルCoAシンターゼを発現するように遺伝子改変される。特定の実施形態では、宿主細胞が、fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p、またはタンパク質ZP_01644857をコードする遺伝子によってコードされるアシルCoAシンターゼを、減弱したレベルで発現する。一定の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞が、脂肪酸分解酵素をコードする1つまたはそれ以上の遺伝子（例えば上述のアシルCoAシンターゼ遺伝子）のノックアウトを含む。
【０１１８】
さらに別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのデヒドラターゼ/イソメラーゼ酵素（例えばfabAによってコードされるか、図15に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、fabAまたは図15に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのケトアシルACPシンターゼ（例えばfabBによってコードされるか、図16に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。一定の実施形態では、宿主細胞が、fabBまたは図16に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。さらに別の実施形態では、宿主細胞が、修飾されたレベルの、デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子（例えばdesA）を発現するように遺伝子改変される。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、細菌、植物、昆虫、酵母、真菌、または哺乳動物に由来する。
【０１２０】
一定の実施形態では、ポリペプチドが、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、細菌細胞、または本明細書に記載する他の任意の生物に由来する。いくつかの実施形態では、細菌が、Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium abscessus、Mycobacterium avium、Mycobacterium bovis、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium leprae、Mycobacterium marinum、およびMycobacterium ulceransからなる群より選択されるマイコバクテリウムである。別の実施形態では、細菌が、Nocardia sp. NRRL 5646、Nocardia farcinica、Streptomyces griseus、Salinispora arenicola、またはClavibacter michiganenesisである。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコール生合成ポリペプチドの少なくとも一つの生物学的基質の存在下で宿主細胞を培養することを含む。
【０１２２】
もう一つの態様において、本発明は、脂肪アルコールの生産方法を特徴とする。本方法は、配列番号93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、または193のヌクレオチド配列の相補配列またはそのフラグメントにハイブリダイズするポリヌクレオチドを、宿主細胞内で発現させることを含み、ここで、該ポリヌクレオチドは、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコールを宿主細胞から単離することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に存在する。一定の実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞の細胞外環境から単離される。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞から分泌される。他の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に輸送される。別の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に受動輸送される。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または超高ストリンジェンシー条件下で、配列番号93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、または193のヌクレオチド配列の相補配列またはそのフラグメントにハイブリダイズする。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の宿主細胞における発現を修飾することを含む。一定の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を増加させることを含む。他の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で減弱すること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を低減することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸シンターゼがチオエステラーゼである。特定の実施形態では、チオエステラーゼが、tesA、リーダー配列のないtesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA、またはfatA1によってコードされる。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む。特定の実施形態では、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドが、配列番号18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、264、266、268、270、もしくは272のアミノ酸配列、またはその変異体を含む。
【０１２７】
別の実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルの脂肪酸分解酵素を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルのアシルCoAシンターゼを発現するように遺伝子改変される。特定の実施形態では、宿主細胞が、fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p、またはタンパク質ZP_01644857をコードする遺伝子によってコードされるアシルCoAシンターゼを、減弱したレベルで発現する。一定の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞が、脂肪酸分解酵素をコードする1つまたはそれ以上の遺伝子（例えば上述のアシルCoAシンターゼ遺伝子）のノックアウトを含む。
【０１２８】
さらに別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのデヒドラターゼ/イソメラーゼ酵素（例えばfabAによってコードされるか、図15に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、fabAまたは図15に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのケトアシルACPシンターゼ（例えばfabBによってコードされるか、図16に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。一定の実施形態では、宿主細胞が、fabBまたは図16に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。さらに別の実施形態では、宿主細胞が、修飾されたレベルの、デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子（例えばdesA）を発現するように遺伝子改変される。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、細菌、植物、昆虫、酵母、真菌、または哺乳動物に由来する。
【０１３０】
一定の実施形態では、ポリペプチドが、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、細菌細胞、または本明細書に記載する他の任意の生物に由来する。いくつかの実施形態では、細菌が、Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium abscessus、Mycobacterium avium、Mycobacterium bovis、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium leprae、Mycobacterium marinum、およびMycobacterium ulceransからなる群より選択されるマイコバクテリウムである。別の実施形態では、細菌が、Nocardia sp. NRRL 5646、Nocardia farcinica、Streptomyces griseus、Salinispora arenicola、またはClavibacter michiganenesisである。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドの少なくとも一つの生物学的基質の存在下で宿主細胞を培養することを含む。
【０１３２】
もう一つの態様において、本発明は、脂肪アルコールの生産方法を特徴とする。本方法は、配列番号93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、または193のヌクレオチド配列に対して少なくとも約70％の配列同一性を有する脂肪アルコール生合成ヌクレオチド配列を含む組換えベクターを、宿主細胞内で発現させることを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列が、配列番号93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、または193のヌクレオチド配列に対して、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列が、配列番号93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、または193のヌクレオチド配列である。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコールを宿主細胞から単離することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に存在する。一定の実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞の細胞外環境から単離される。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが宿主細胞から分泌される。他の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に輸送される。別の実施形態では、脂肪アルコールが細胞外環境に受動輸送される。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、組換えベクターが、ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。一定の実施形態では、プロモーターが、発生段階調節型プロモーター、細胞小器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または細胞特異的プロモーターである。
【０１３５】
別の実施形態では、組換えベクターが、（a）ヌクレオチド配列に作動可能に結合した調節配列；（b）ヌクレオチド配列に作動可能に結合した選択マーカー；（c）ヌクレオチド配列に作動可能に結合したマーカー配列；（d）ヌクレオチド配列に作動可能に結合した精製部分；（e）ヌクレオチド配列に作動可能に結合した分泌配列；および（f）ヌクレオチド配列に作動可能に結合したターゲティング配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列を含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、組換えベクターがプラスミドである。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、宿主細胞が、組換えベクターによってコードされるポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列が、宿主細胞のゲノムDNA中に安定に組み込まれ、ヌクレオチド配列の発現が、調節されたプロモーター領域の制御を受ける。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の宿主細胞における発現を修飾することを含む。一定の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を増加させることを含む。他の実施形態では、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を修飾することが、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を宿主細胞内で減弱すること、および/または宿主細胞における内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性を低減することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸シンターゼがチオエステラーゼである。特定の実施形態では、チオエステラーゼが、tesA、リーダー配列のないtesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA、またはfatA1によってコードされる。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させることを含む。特定の実施形態では、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドが、配列番号18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、264、266、268、270、もしくは272のアミノ酸配列、またはその変異体を含む。
【０１４０】
別の実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルの脂肪酸分解酵素を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、野生型宿主細胞と比較して減弱したレベルのアシルCoAシンターゼを発現するように遺伝子改変される。特定の実施形態では、宿主細胞が、fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p、またはタンパク質ZP_01644857をコードする遺伝子によってコードされるアシルCoAシンターゼを、減弱したレベルで発現する。一定の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞が、脂肪酸分解酵素をコードする1つまたはそれ以上の遺伝子（例えば上述のアシルCoAシンターゼ遺伝子）のノックアウトを含む。
【０１４１】
さらに別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのデヒドラターゼ/イソメラーゼ酵素（例えばfabAによってコードされるか、図15に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、fabAまたは図15に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。別の実施形態では、宿主細胞が、減弱したレベルのケトアシルACPシンターゼ（例えばfabBによってコードされるか、図16に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。一定の実施形態では、宿主細胞が、fabBまたは図16に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。さらに別の実施形態では、宿主細胞が、修飾されたレベルの、デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子（例えばdesA）を発現するように遺伝子改変される。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコール生合成ポリペプチドの少なくとも一つの生物学的基質の存在下で宿主細胞を培養することを含む。
【０１４３】
本明細書に記載する発明の諸態様のいずれにおいても、宿主細胞は、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、および細菌細胞からなる群より選択することができる。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、宿主細胞がグラム陽性細菌細胞である。別の実施形態では、宿主細胞がグラム陰性細菌細胞である。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、宿主細胞が、Escherichia属、Bacillus属、Lactobacillus属、Rhodococcus属、Pseudomonas属、Aspergillus属、Trichoderma属、Neurospora属、Fusarium属、Humicola属、Rhizomucor属、Kluyveromyces属、Pichia属、Mucor属、Myceliophtora属、Penicillium属、Phanerochaete属、Pleurotus属、Trametes属、Chrysosporium属、Saccharomyces属、Stenotrophamonas属、Schizosaccharomyces属、Yarrowia属、またはStreptomyces属から選択される。
【０１４６】
一定の実施形態では、宿主細胞が、Bacillus lentus細胞、Bacillus brevis細胞、Bacillus stearothermophilus細胞、Bacillus licheniformis細胞、Bacillus alkalophilus細胞、Bacillus coagulans細胞、Bacillus circulans細胞、Bacillus pumilis細胞、Bacillus thuringiensis細胞、Bacillus clausii細胞、Bacillus megaterium細胞、Bacillus subtilis細胞、またはBacillus amyloliquefaciens細胞である。
【０１４７】
別の実施形態では、宿主細胞が、Trichoderma koningii細胞、Trichoderma viride細胞、Trichoderma reesei細胞、Trichoderma longibrachiatum細胞、Aspergillus awamori細胞、Aspergillus fumigates細胞、Aspergillus foetidus細胞、Aspergillus nidulans細胞、Aspergillus niger細胞、Aspergillus oryzae細胞、Humicola insolens細胞、Humicola lanuginose細胞、Rhodococcus opacus細胞、Rhizomucor miehei細胞、またはMucor michei細胞である。
【０１４８】
さらに別の実施形態では、宿主細胞が、Streptomyces lividans細胞またはStreptomyces murinus細胞である。
【０１４９】
さらに別の実施形態では、宿主細胞がActinomycetes細胞である。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、宿主細胞がSaccharomyces cerevisiae細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞がSaccharomyces cerevisiae細胞である。
【０１５１】
特定の実施形態では、宿主細胞が、真核植物、藻類、シアノバクテリア、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、紅色非硫黄細菌、極限環境生物（extremophile）、酵母、真菌、その改変生物（engineered organism）、または合成生物（synthetic organism）に由来する細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、光依存性であるか、または炭素を固定する。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、光依存性であるか、または炭素を固定する。いくつかの実施形態では、宿主細胞が独立栄養活性を有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、光の存在下などで、光独立栄養活性を有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、光の非存在下で、従属栄養性または混合栄養性である。一定の実施形態では、宿主細胞が、Avabidopsis thaliana、Panicum virgatum、Miscanthus giganteus、Zea mays、Botryococcuse braunii、Chlamydomonas reinhardtii、Dunaliela salina、Synechococcus Sp. PCC 7002、Synechococcus Sp. PCC 7942、Synechocystis Sp. PCC 6803、Thermosynechococcus elongates BP-1、Chlorobium tepidum、Chloroflexus auranticus、Chromatiumm vinosum、Rhodospirillum rubrum、Rhodobacter capsulatus、Rhodopseudomonas palusris、Clostridium ljungdahlii、Clostridiuthermocellum、Penicillium chrysogenum、Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Pseudomonas fluorescens、またはZymomonas mobilisに由来する細胞である。
【０１５２】
別の実施形態では、宿主細胞が、CHO細胞、COS細胞、VERO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、Cv1細胞、MDCK細胞、293細胞、3T3細胞、またはPC12細胞である。
【０１５３】
さらに別の実施形態では、宿主細胞がE. coli細胞である。一定の実施形態では、E. coli細胞が、B株、C株、K株、またはW株のE. coli細胞である。
【０１５４】
もう一つの態様において、本発明は、脂肪アルコールの生産方法を特徴とする。本方法は、基質を、（i）配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、または194のアミノ酸配列を含む脂肪アルコール生合成ポリペプチドまたはその変異体、または（ii）配列番号93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、または193のヌクレオチド配列に対して少なくとも約70％の同一性を有するヌクレオチド配列またはその変異体によってコードされる脂肪アルコール生合成ポリペプチドと、接触させることを含む。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、脂肪アルコールを精製することを含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、脂肪アルコール生合成ポリペプチドは、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換、付加、挿入、または欠失を有する配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、または194のアミノ酸配列を含み、該ポリペプチドはアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、次に挙げる保存的アミノ酸置換の1つまたはそれ以上を含む：脂肪族アミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの、別の脂肪族アミノ酸による置換；スレオニンによるセリンの置換；セリンによるスレオニンの置換；酸性残基、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸の、別の酸性残基による置換；アミド基含有残基、例えばアスパラギンおよびグルタミンの、別のアミド基含有残基による置換；塩基性残基、例えばリジンおよびアルギニンの、別の塩基性残基との交換；ならびに、芳香族残基、例えばフェニルアラニンおよびチロシンの、別の芳香族残基による置換。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、またはそれ以上のアミノ酸置換、付加、挿入、または欠失を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドがアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、または194のアミノ酸配列に対して、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、配列番号94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、または194のアミノ酸配列を有する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列が、配列番号93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、または193のヌクレオチド配列に対して、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列が、配列番号93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、または193である。
【０１５９】
本明細書に記載する発明の諸態様のいずれにおいても、本方法は、C6〜C26脂肪アルコールを含む脂肪アルコールを生産することができる。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、またはC26脂肪アルコールを含む。特定の実施形態では、脂肪アルコールが、C6、C8、C10、C12、C13、C14、C15、C16、C17、またはC18脂肪アルコールである。一定の実施形態では、脂肪アルコールのヒドロキシル基が、第1（C1）位にある。
【０１６０】
別の実施形態では、脂肪アルコールが直鎖脂肪アルコールを含む。別の実施形態では、脂肪アルコールが分岐鎖脂肪アルコールを含む。さらに別の実施形態では、脂肪アルコールが環状部分を含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが不飽和脂肪アルコールである。別の実施形態では、脂肪アルコールがモノ不飽和脂肪アルコールである。一定の実施形態では、不飽和脂肪アルコールが、C6：1、C7：1、C8：1、C9：1、C10：1、C11：1、C12：1、C13：1、C14：1、C15：1、C16：1、C17：1、C18：1、C19：1、C20：1、C21：1、C22：1、C23：1、C24：1、C25:1、またはC26：1不飽和脂肪アルコールである。さらに別の実施形態では、脂肪アルコールがω7位において不飽和である。一定の実施形態では、不飽和脂肪アルコールがシス二重結合を含む。
【０１６２】
さらに別の実施形態では、脂肪アルコールが飽和脂肪アルコールである。
【０１６３】
本明細書に記載する発明の諸態様のいずれにおいても、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドの基質は脂肪酸であることができる。いくつかの実施形態では、脂肪酸がC6〜C26脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸が、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、またはC26脂肪酸を含む。特定の実施形態では、脂肪酸が、C6、C8、C10、C12、C13、C14、C15、C16、C17、またはC18脂肪酸である。
【０１６４】
別の実施形態では、脂肪酸が直鎖脂肪酸を含む。別の実施形態では、脂肪酸が分岐鎖脂肪酸を含む。さらに別の実施形態では、脂肪酸が環状部分を含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、脂肪酸が不飽和脂肪酸である。別の実施形態では、脂肪酸がモノ不飽和脂肪酸である。さらに別の実施形態では、脂肪酸が飽和脂肪酸である。
【０１６６】
もう一つの態様において、本発明は、遺伝子改変微生物であって、その微生物のゲノムDNA中、配列番号17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、263、265、267、269、または271のヌクレオチド配列に対して少なくとも約70％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの上流に、安定に組み込まれた外因性制御配列を含み、野生型微生物と比較して増加したレベルの脂肪アルコールを生産する微生物を特徴とする。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列が、配列番号17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、263、265、267、269、または271のヌクレオチド配列に対して、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列が、配列番号17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、263、265、267、269、または271である。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、その微生物にとって内在性である。
【０１６９】
別の実施形態では、修飾されたレベルの、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子が、宿主細胞において発現するように、微生物が遺伝子改変される。一定の実施形態において、微生物は、脂肪酸シンターゼをコードする組換え遺伝子を発現するか、または増加したレベルの内在性脂肪酸シンターゼを発現する。他の実施形態において、微生物は、減弱したレベルの、脂肪酸シンターゼをコードする遺伝子を、宿主細胞において発現し、かつ/または内在性脂肪酸シンターゼの発現または活性が減少している。いくつかの実施形態では、脂肪酸シンターゼがチオエステラーゼである。特定の実施形態では、チオエステラーゼが、tesA、リーダー配列のないtesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA、またはfatA1によってコードされる。
【０１７０】
別の実施形態では、微生物が、野生型微生物と比較して減弱したレベルの脂肪酸分解酵素を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、微生物が、野生型微生物と比較して減弱したレベルのアシルCoAシンターゼを発現する。特定の実施形態では、微生物が、fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p、またはタンパク質ZP_01644857をコードする遺伝子によってコードされるアシルCoAシンターゼを、減弱したレベルで発現する。一定の実施形態では、微生物が、脂肪酸分解酵素をコードする1つまたはそれ以上の遺伝子（例えば上述のアシルCoAシンターゼ遺伝子）のノックアウトを含む。
【０１７１】
さらに別の実施形態では、微生物が、減弱したレベルのデヒドラターゼ/イソメラーゼ酵素（例えばfabAによってコードされるか、図15に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、微生物が、fabAまたは図15に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。別の実施形態では、微生物が、減弱したレベルのケトアシルACPシンターゼ（例えばfabBによってコードされるか、図16に掲載する遺伝子によってコードされる酵素）を発現するように遺伝子改変される。一定の実施形態では、微生物が、fabBまたは図16に掲載する遺伝子のノックアウトを含む。さらに別の実施形態では、微生物が、修飾されたレベルの、デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子（例えばdesA）を発現するように遺伝子改変される。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、微生物が細菌である。一定の実施形態では、細菌がグラム陰性細菌またはグラム陽性細菌である。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、微生物が、Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium abscessus、Mycobacterium avium、Mycobacterium bovis、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium leprae、Mycobacterium marinum、およびMycobacterium ulceransからなる群より選択されるマイコバクテリウムである。
【０１７４】
別の実施形態では、微生物が、Nocardia sp. NRRL 5646、Nocardia farcinica、Streptomyces griseus、Salinispora arenicola、またはClavibacter michiganenesisである。
【０１７５】
もう一つの態様において、本発明は、本明細書に記載する方法のいずれかまたは本明細書に記載する微生物のいずれかによって生産される脂肪アルコール、または本明細書に記載する方法のいずれかまたは本明細書に記載する微生物のいずれかによって生産される脂肪アルコールを含む界面活性剤を特徴とする。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが約-15.4以上のδ13Cを有する。一定の実施形態では、脂肪アルコールが、約-15.4〜約-10.9または約-13.92〜約-13.84のδ13Cを有する。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが、少なくとも約1.003のfM 14Cを有する。一定の実施形態では、脂肪アルコールが、少なくとも約1.01または少なくとも約1.5のfM 14Cを有する。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールが、約1.111〜約1.124のfM 14Cを有する。
【０１７８】
本明細書に記載する諸態様のいずれにおいても、脂肪アルコールは、約25mg/L、約50mg/L、約75mg/L、約100mg/L、約125mg/L、約150mg/L、約175mg/L、約200mg/L、約225mg/L、約250mg/L、約275mg/L、約300mg/L、約325mg/L、約350mg/L、約375mg/L、約400mg/L、約425mg/L、約450mg/L、約475mg/L、約500mg/L、約525mg/L、約550mg/L、約575mg/L、約600mg/L、約625mg/L、約650mg/L、約675mg/L、約700mg/L、約725mg/L、約750mg/L、約775mg/L、約800mg/L、約825mg/L、約850mg/L、約875mg/L、約900mg/L、約925mg/L、約950mg/L、約975mg/L、約1000g/L、約1050mg/L、約1075mg/L、約1100mg/L、約1125mg/L、約1150mg/L、約1175mg/L、約1200mg/L、約1225mg/L、約1250mg/L、約1275mg/L、約1300mg/L、約1325mg/L、約1350mg/L、約1375mg/L、約1400mg/L、約1425mg/L、約1450mg/L、約1475mg/L、約1500mg/L、約1525mg/L、約1550mg/L、約1575mg/L、約1600mg/L、約1625mg/L、約1650mg/L、約1675mg/L、約1700mg/L、約1725mg/L、約1750mg/L、約1775mg/L、約1800mg/L、約1825mg/L、約1850mg/L、約1875mg/L、約1900mg/L、約1925mg/L、約1950mg/L、約1975mg/L、約2000mg/L、またはそれ以上の収量で生産される。
【０１７９】
もう一つの態様において、本発明は、本明細書に記載する脂肪アルコールの製造方法をを特徴とする。本方法は、本明細書に記載するように、低レベルの鉄を含む培地中、脂肪アルコールを生産するのに十分な条件下で、本明細書に記載する宿主細胞を培養することを含む。特定の実施形態では、培地が、約500μM未満の鉄、約400μM未満の鉄、約300μM未満の鉄、約200μM未満の鉄、約150μM未満の鉄、約100μM未満の鉄、約90μM未満の鉄、約80μM未満の鉄、約70μM未満の鉄、約60μM未満の鉄、約50μM未満の鉄、約40μM未満の鉄、約30μM未満の鉄、約20μM未満の鉄、約10μM未満の鉄、または約5μM未満の鉄を含有する。一定の実施形態では、培地が鉄を含有しない。
【０１８０】
本明細書に記載する諸態様のいずれにおいても、脂肪アルコールは、本明細書に記載する宿主細胞または微生物中で炭素源から生産される。
【０１８１】
以下の図面は、例示のために記載するに過ぎず、限定を意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】さまざまなプラスミドで形質転換された組換えE. coli株によって生産される脂肪アルコールのグラフ表示である。
【図２】さまざまなプラスミドで形質転換された組換えE. coli株によって生産される有機化合物の2つのGC/MSトレース（trace）のグラフ表示である。
【図３】新しい脂肪アルコール生産経路の概略図である。
【図４】MG1655野生型細胞、ΔfadD::cm細胞、およびΔfadD細胞からのPCR産物のゲル像である。
【図５】図5Aは、MG1655（DE3, ΔfadD）/pETDUet-1-tesA＋pHZ1.140B細胞における脂肪アルコール生産のGC/MSトレースである。図5Bは、MG16655（DE3, ΔfadD, yjgB::kan）/pETDUet-1-tesA＋pHZ1.140B細胞における脂肪アルコール生産のGC/MSトレースである。図5Cは、MG16655（DE3, ΔfadD, yjgB::kan）/pDF1＋pHZ1.140B細胞における脂肪アルコール生産のGC/MSトレースである。図5A、図5Bおよび図5C中の矢印は、C12：0脂肪アルデヒドが存在しないことを示す。
【図６】Nocardia sp. NRRL 5646 car遺伝子のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列のリストである。
【図７】CARホモログに関するアミノ酸配列モチーフのリストである。
【図８】carホモログ遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のリストである。
【図９】特定の基質の生産量を増加させるために発現させ、過剰発現させ、または減弱することができる代表的遺伝子を示す表である。
【図１０】アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のリストである。
【図１１】E. coliのさまざまな欠失突然変異体における脂肪アルコール生産のグラフ表示である。
【図１２】E. coliのさまざまな欠失突然変異体における脂肪アルコール生産のグラフ表示である。
【図１３】E. coliにおける飽和脂肪アルコール生産のGC/MSトレースである。
【図１４】図14Aは、さまざまなHu9培養培地における脂肪アルコール生産のグラフ表示である。図14Bは、さまざまなHu9培養培地における脂肪アルコール生産のグラフ表示である。
【図１５】fabA関連遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の表である。
【図１６】fabB関連遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の表である。
【図１７】本開示のさらなるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のリストである。
【発明を実施するための形態】
【０１８３】
発明の詳細な説明
別段の定義がない限り、本明細書において使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者が一般に理解している意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試験には本明細書に記載するものと類似するまたは等価な方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料を以下に説明する。本明細書において言及する刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、Genbankデータベース配列を含めていずれも、引用により、そのまま本明細書に組み込まれる。万一、矛盾が生じた場合には、定義を含めて、本明細書が優先される。また、材料、方法および実施例は単なる例示であって、限定を意図するものではない。
【０１８４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるだろう。
【０１８５】
定義
本明細書では、省略された遺伝子名またはポリペプチド名を使って言及する場合があるが、そのような省略された遺伝子名またはポリペプチド名は、遺伝子またはポリペプチドの類概念（genus）を表すと理解される。そのような遺伝子名は、同じポリペプチドおよび同じ生理機能を有する相同ポリペプチドをコードする全ての遺伝子を包含する。ポリペプチド名は、同じ活性を有する（例えば同じ基本化学反応を触媒する）全てのポリペプチドを包含する。
【０１８６】
別段の表示がない限り、本明細書において言及するアクセッション番号は、米国国立衛生研究所によって維持されているNCBIデータベース（国立バイオテクノロジー情報センター）による。別段の表示がない限り、アクセッション番号は2008年10月時点のデータベースに記載されているものである。
【０１８７】
EC番号は、国際生化学分子生物学連合の命名法委員会（NC-IUBMB）によって制定されている（http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/で利用することができる）。本明細書において言及するEC番号は、東京大学を後援機関の一つとするKEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics）Ligandデータベースによる。別段の表示がない限り、EC番号は2008年10月時点のデータベースに記載されているものである。
【０１８８】
「a」および「an」（ある/一つの）という冠詞は、本明細書では、1つの、または1つより多くの（すなわち少なくとも1つの）、その冠詞の文法上の対象物を指すために使用される。例えば、「ある要素（an element）」とは、1つの要素、または1つより多くの要素を意味する。
【０１８９】
「約」という用語は、本明細書では、所与の数値の±20％の値を意味するために使用される。したがって「約60％」とは60±（60の20％）（すなわち48〜70）の値を意味する。
【０１９０】
本明細書において使用する用語「アルコールデヒドロゲナーゼ」（EC 1.1.1.*）は、アルコール（例えば脂肪アルコール）への脂肪アルデヒドの変換を触媒する能力を有するペプチドである。また、一部のアルコールデヒドロゲナーゼが他の反応も同様に触媒するであろうことは、当業者には理解されるだろう。例えば、一部のアルコールデヒドロゲナーゼは、脂肪アルデヒドだけでなく他の基質も受け入れるだろう。したがって、そのような非特異的アルコールデヒドロゲナーゼも、この定義には包含される。アルコールデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列は当技術分野では知られており、そのようなアルコールデヒドロゲナーゼは公に入手可能である。代表的なGenBankアクセッション番号を図9に記載する。
【０１９１】
本明細書において使用する用語「減弱する（attenuate）」は、弱めること、低下させること、または減少させることを意味する。例えば、ポリペプチドは、その活性が低下するようにポリペプチドを修飾することにより（例えばポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を修飾することにより）、減弱することができる。
【０１９２】
本明細書において使用する用語「バイオディーゼル」は、石油から得られるディーゼル燃料の代替物になりうるバイオ燃料を意味する。バイオディーゼルは、「ニート（neat）」バイオディーゼルと呼ばれる純粋な形態で、または石油ベースのディーゼル燃料と共に任意の濃度の混合物として、内燃ディーゼル機関に使用することができる。バイオディーゼルは、エステルまたは炭化水素、例えばアルコールを含むことができる。
【０１９３】
本明細書において使用する用語「バイオ燃料」は、バイオマスから誘導される任意の燃料を指す。バイオ燃料は石油ベース燃料の代わりに使用することができる。例えば、バイオ燃料には、輸送燃料（例えばガソリン、ディーゼル燃料、ジェット燃料など）、暖房用油、および発電燃料が含まれる。バイオ燃料は再生可能エネルギー源である。
【０１９４】
本明細書において使用する用語「バイオマス」は、炭素源の元になる任意の生物材料を指す。いくつかの例では、バイオマスは、生物変換（bioconversion）に適した炭素源に加工される。別の例では、バイオマスは炭素源へのさらなる加工を必要としない。炭素源はバイオ燃料に変換することができる。バイオマス源の代表例の一つは、植物質（plant matter）または草木（vegetation）である。例えば、トウモロコシ、サトウキビ、またはスイッチグラスをバイオマスとして使用することができる。バイオマスのもう一つの限定的でない例は、代謝廃棄物、例えば牛糞堆肥などの動物質である。また、バイオマスには、藻類および他の海洋植物を含めることができる。バイオマスには、工業、農業、林業、および家庭から出る廃棄物も含まれる。バイオマスとして使用することができるそのような廃棄物の例は、発酵廃棄物、エンシレージ、わら、木材、下水、生ごみ、セルロース系都市廃棄物、および残飯である。バイオマスには、糖質（例えば単糖類、二糖類、または多糖類）などの炭素源も含まれる。
【０１９５】
本明細書において使用する「炭素源」という表現は、原核細胞の成長または単純な真核細胞の成長に炭素の供給源として使用するのに適した基質または化合物を指す。限定するわけではないが、炭素源は、ポリマー、糖質、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチド、および気体（例えばCOおよびCO2）などといった、さまざまな形態をとりうる。これらには、例えば、さまざまな単糖類、例えばグルコース、フルクトース、マンノース、およびガラクトース；オリゴ糖類、例えばフラクトオリゴ糖およびガラクトオリゴ糖；多糖類、例えばキシロースおよびアラビノース；二糖類、例えばスクロース、マルトース、およびツラノース；セルロース系材料、例えばメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム；飽和または不飽和脂肪酸エステル、例えばコハク酸エステル、乳酸エステル、および酢酸エステル；アルコール、例えばエタノール、メタノール、およびグリセロール、またはそれらの混合物が含まれる。炭素源は光合成の産物（例えば、限定するわけではないが、グルコース）であることもできる。好ましい炭素源はバイオマスである。もう一つの好ましい炭素源はグルコースである。
【０１９６】
ヌクレオチド配列は、もう一つのヌクレオチド配列に対して、それら2つの配列の塩基のそれぞれが対応（match）する（すなわちワトソン・クリック塩基対を形成することができる）のであれば、「相補的」である。「相補鎖」という用語は、本明細書では、用語「相補配列（complement）」と互換的に使用される。核酸鎖の相補配列はコード鎖の相補配列または非コード鎖の相補配列であることができる。
【０１９７】
本明細書にいう「曇点低下添加剤」は、溶液の曇点を降下または低下させるために組成物に加えられる添加剤である。
【０１９８】
本明細書において使用する「流体の曇点」という表現は、溶解した固形物がもはや完全には可溶性でなくなる温度を意味する。これより低い温度では、固形物がもう一つの相として沈殿し始め、その流体に曇った外観を与える。石油産業において、曇点は、それを下回る温度では、固化体（solidified material）または他の重炭化水素が、原油中、精製油中、または燃料中で結晶化して、曇った外観を形成する温度を指す。固化体の存在は、流体の流動挙動、流体が燃料フィルタやインジェクタなどを詰まらせる傾向、冷表面での固化体の蓄積（例えばパイプラインまたは熱交換器付着物）、およびその流体の水との乳化特性に影響を及ぼす。
【０１９９】
本明細書において使用する用語「発現を可能とするのに十分な条件」は、宿主細胞が所望の生成物（例えば本明細書に記載するポリペプチドまたは脂肪アルデヒド）を生産することを可能とする任意の条件を意味する。適切な条件には、例えば発酵条件が含まれる。発酵条件は、温度範囲、曝気のレベル、および培地組成など、数多くのパラメータを含むことができる。これらの条件のそれぞれは、個別に、また共同して、宿主細胞が成長することを可能とする。代表的な培養培地として、ブロスまたはゲルが挙げられる。一般に培地は、宿主細胞によって直接代謝されうるグルコース、フルクトース、セルロースなどの炭素源を含む。また、炭素源の動員（mobilization）（例えばデンプンまたはセルロースを発酵性糖に解重合すること）とそれに続く代謝を容易にするために、培地に酵素を使用することもできる。
【０２００】
条件が発現を可能とするのに十分であるかどうかを決定するために、宿主細胞を、例えば約4、8、12、24、36、または48時間にわたって培養することができる。培養中および/または培養後に試料を採取して分析することにより、その条件が発現を可能とするかどうかを決定することができる。例えば、試料中の宿主細胞、または宿主細胞を成長させた培地を、所望の生成物の存在について調べることができる。ある生成物の存在について調べる際には、例えば、限定するわけではないがTLC、HPLC、GC/FID、GC/MS、LC/MS、MSなどのアッセイを使用することができる。
【０２０１】
本明細書に記載するポリペプチドは、ポリペプチドの機能に実質的な影響を持たない追加の保存的または非必須アミノ酸置換を有することができると理解される。ある特定の置換が認容されるかどうか（すなわち、カルボン酸レダクターゼ活性などの所望の生物学的性質に有害な影響を及ぼすかどうか）は、Bowieら, Science (1990) 247:1306-1310に記載されているように、決定することができる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において規定されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β-分岐側鎖を有するアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）がある。
【０２０２】
本明細書にいう「制御要素」は、転写制御要素を意味する。制御要素にはプロモーターおよびエンハンサーが含まれる。「プロモーター要素」、「プロモーター」または「プロモーター配列」という用語は、ある遺伝子の発現を活性化するスイッチとして機能するDNA配列を指す。遺伝子が活性化されると、その遺伝子は、転写される、または転写に関与しているといわれる。転写ではその遺伝子からのmRNAの合成が起こる。したがってプロモーターは転写調節要素として役立ち、mRNAへの遺伝子の転写が開始される部位にもなる。制御要素は転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する（Maniatisら, Science 236:1237, 1987）。
【０２０３】
本明細書において使用する用語「脂肪酸」は、式RCOOHを有するカルボン酸を意味する。Rは、脂肪族基、好ましくはアルキル基を表す。Rは約4〜約22個の炭素原子を含むことができる。脂肪酸は、飽和、モノ不飽和、またはポリ不飽和であることができる。好ましい一実施形態では、脂肪酸が脂肪酸生合成経路から作られる。
【０２０４】
本明細書において使用する用語「脂肪酸生合成経路」は、脂肪酸を生産する生合成経路を意味する。脂肪酸生合成経路は、脂肪酸シンターゼ（脂肪酸を生産するために本明細書に記載するように改変することができ、またいくつかの実施形態では、所望の炭素鎖特徴を有する脂肪酸を生産するために追加の酵素と共に発現させることができるもの）を含む。
【０２０５】
本明細書において使用する用語「脂肪酸分解酵素」は、脂肪酸または脂肪酸誘導体の、別の生成物への分解または変換に関与する酵素を意味する。脂肪酸分解酵素の限定的でない一例はアシルCoAシンターゼである。本明細書には脂肪酸分解酵素の他の例も記載する。
【０２０６】
本明細書において使用する用語「脂肪酸誘導体」は、生産宿主生物の脂肪酸生合成経路を生成源の一つとする生成物を意味する。「脂肪酸誘導体」には、アシルACPまたはアシルACP誘導体を生成源の一つとする生成物も含まれる。脂肪酸生合成経路は、脂肪酸誘導体を生産するために本明細書に記載するように改変することができ、いくつかの例では、所望の炭素鎖特徴を有する脂肪酸誘導体を生産するために追加の酵素と共に発現させることができる、脂肪酸シンターゼ酵素を含む。代表的な脂肪酸誘導体として、例えば脂肪酸、アシルCoA、脂肪アルデヒド、短鎖および長鎖アルコール、炭化水素、脂肪アルコール、およびエステル（例えばワックス、脂肪酸エステル、または脂肪エステル（fatty esters））が挙げられる。
【０２０７】
本明細書において使用する用語「脂肪酸誘導体酵素」は、脂肪酸誘導体の生産において発現または過剰発現させることができる任意の酵素を意味する。これらの酵素は脂肪酸生合成経路の一部であることができる。脂肪酸誘導体酵素の限定的でない例には、脂肪酸シンターゼ、チオエステラーゼ、アシルCoAシンターゼ、アシルCoAレダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールアシルトランスフェラーゼ、脂肪アルコール形成性アシルCoAレダクターゼ、脂肪酸（カルボン酸）レダクターゼ、アシルACPレダクターゼ、脂肪酸ヒドロキシラーゼ、アシルCoAデサチュラーゼ、アシルACPデサチュラーゼ、アシルCoAオキシダーゼ、アシルCoAデヒドロゲナーゼ、エステルシンターゼ、およびアルカン生合成ポリペプチドなどがある。脂肪酸誘導体酵素は基質を脂肪酸誘導体に変換することができる。いくつかの例において、基質は、脂肪酸誘導体酵素によって異なる脂肪酸誘導体に変換される脂肪酸誘導体であることができる。
【０２０８】
本明細書にいう「脂肪酸酵素」は、脂肪酸生合成に関与する任意の酵素を意味する。宿主細胞では、脂肪酸を生産するために、脂肪酸酵素を修飾することができる。脂肪酸酵素の限定的でない例には、脂肪酸シンターゼおよびチオエステラーゼがある。本明細書には、脂肪酸酵素の他の例も記載する。
【０２０９】
本明細書にいう「脂肪酸シンターゼ」は、脂肪酸生合成に関与する任意の酵素を意味する。宿主細胞では、脂肪酸を生産するために、脂肪酸シンターゼを発現または過剰発現させることができる。脂肪酸シンターゼの限定的でない一例はチオエステラーゼである。本明細書には、脂肪酸シンターゼの他の例も記載する。
【０２１０】
本明細書にいう「脂肪アルデヒド」は、不飽和カルボニル基（C＝O）を特徴とする式RCHOを有するアルデヒドを意味する。好ましい一実施形態において、脂肪アルデヒドは、脂肪酸または脂肪酸誘導体から作られる任意のアルデヒドである。ある実施形態において、R基は、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20炭素長である。
【０２１１】
Rは直鎖または分岐鎖であることができる。分岐鎖は1つまたはそれ以上の分岐点を有することができる。また、分岐鎖は環状分岐も含みうる。
【０２１２】
さらにまた、Rは飽和または不飽和であることができる。不飽和である場合、Rは1つまたはそれ以上の不飽和位置を有することができる。
【０２１３】
ある実施形態では、脂肪アルデヒドが生合成的に生産される。
【０２１４】
脂肪アルデヒドは多くの用途を有する。例えば脂肪アルデヒドは多くの特殊化学品を生産するために使用することができる。例えば脂肪アルデヒドは、ポリマー、樹脂、染料、矯味矯臭剤、可塑剤、香料、医薬品、および他の化学品を生産するために使用される。溶媒、保存剤、または消毒薬として使用されるものもある。ビタミンやホルモンなど、いくつかの天然および合成化合物は、アルデヒドである。
【０２１５】
「脂肪アルデヒド生合成ポリペプチド」、「カルボン酸レダクターゼ」および「CAR」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【０２１６】
本明細書にいう「脂肪アルコール」は、式ROHを有するアルコールを意味する。好ましい一実施形態において、脂肪アルコールは、脂肪酸または脂肪酸誘導体から作られる任意のアルコールである。ある実施形態において、R基は、少なくとも約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20炭素長である。
【０２１７】
Rは直鎖または分岐鎖であることができる。分岐鎖は1つまたはそれ以上の分岐点を有することができる。また、分岐鎖は環状分岐も含みうる。
【０２１８】
さらにまた、Rは飽和または不飽和であることができる。不飽和である場合、Rは1つまたはそれ以上の不飽和位置を有することができる。
【０２１９】
ある実施形態では、脂肪アルコールが生合成的に生産される。
【０２２０】
脂肪アルコールは多くの用途を有する。例えば脂肪アルコールは多くの特殊化学品を生産するために使用することができる。例えば脂肪アルコールは、バイオ燃料として；脂肪、ワックス、ゴム、および樹脂用の溶剤として；医薬軟膏、軟化剤（emolient）およびローションに；潤滑油添加剤として；洗剤および乳化剤に；布地用帯電防止剤および表面処理剤として；可塑剤として；非イオン界面活性剤として；および化粧品に、例えば増粘剤として使用される。
【０２２１】
本明細書にいう「現代炭素分率（fraction of modern carbon）」または「fM」は、米国国立標準技術研究所（National Institute of Standards and Technology（NIST））標準物質（Standard Reference Material（SRM））4990Bおよび4990C（それぞれシュウ酸標準品HOxIおよびHOxIIと呼ばれている）によって定義されるものと同じ意味を有する。基本的定義はHOxIの14C/12C同位体比×0.95に関係する（西暦1950年を基準とする）。これは、減衰補正された産業革命前の木にほぼ等しい。現在の生体生物圏（植物材料）については、fMが約1.1である。
【０２２２】
本明細書にいう「遺伝子ノックアウト」は、無傷タンパク質の機能が低下しまたは排除されるように、ターゲットタンパク質をコードする遺伝子を修飾しまたは不活化する手法を指す。遺伝子の不活化は、UV照射もしくはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジンでの処理による突然変異生成、部位特異的突然変異生成、相同組換え、挿入−欠失突然変異生成、または「Redドリブンインテグレーション（Red-driven integration）」（Datsenkoら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 97:6640-45, 2000）などの一般法で行うことができる。例えば、ある実施形態では、宿主細胞における相同組換え事象について選択することが可能であるような形で、コンストラクトが宿主細胞中に導入される。当業者は、コンストラクトとの相同組換え事象を起こしたトランスフェクト細胞を効率よく選択するために陽性選択遺伝子と陰性選択遺伝子の両方を含むノックアウトコンストラクトを容易に設計することができる。宿主細胞における改変は、例えば、一重または二重交叉組換えにより、改変を含有するDNA配列で野生型DNA配列を置き換えることなどによって達成することができる。形質転換体を便利に選択するために、改変は、例えば抗生物質耐性マーカーをコードするDNA配列、または宿主細胞が有しうる栄養要求性を補完する遺伝子であることができる。突然変異には欠失−挿入突然変異が含まれるが、これに限るわけではない。そのような改変の一例として、遺伝子破壊、すなわち、通常はその遺伝子から生産される産物が機能的な形では生産されなくなるような遺伝子の摂動が挙げられる。これは、完全な欠失、選択マーカーの欠失および挿入、選択マーカーの挿入、フレームシフト突然変異、インフレーム欠失、または中途終止（premature termination）をもたらす点突然変異によるものであることができるだろう。いくつかの例では、その遺伝子のmRNA全体が存在しない。別の状況では、生成するmRNAの量が変化する。
【０２２３】
2つの配列間の「相同性」の計算は次のように行うことができる。配列を、最適な比較のために整列する（例えば最適なアライメントのために第1および第2のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較のために非相同配列を無視することができる）。好ましい一実施形態では、比較のために整列する基準配列の長さが、その基準配列の長さの少なくとも約30％、好ましくは少なくとも約40％、より好ましくは少なくとも約50％、さらに好ましくは少なくとも約60％、そしてさらに好ましくは少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または約100％である。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1配列中の位置が第2配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、その分子はその位置において同一である（本明細書にいうアミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と等価である）。2つの配列間の同一性率（percent identity）は、それら2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、それらの配列が共有する同一位置の数の関数である。
【０２２４】
2つの配列間の配列の比較と相同性率（percent homology）の決定は、数学的アルゴリズムを使って行うことができる。好ましい一実施形態では、2つのアミノ酸配列間の相同性率が、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムに組み込まれているNeedlemanおよびWunsch (1970), J.Mol.Biol. 48:444-453のアルゴリズムを使用し、Blossum62行列またはPAM250行列と、16、14、12、10、8、6、または4のギャップ・ウェイト（gap weight）および1、2、3、4、5、または6のレンクス・ウェイト（length weight）とを使って決定される。さらにもう一つの好ましい実施形態では、2つのヌクレオチド配列間の相同性率が、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを使用し、NWSgapdna.CMP行列と、40、50、60、70、または80のギャップ・ウェイトおよび1、2、3、4、5、または6のレンクス・ウェイトとを使って決定される。特に好ましいパラメータセット（そして、ある分子が請求項の相同性の範囲内にあるかどうかを決定するためにどのパラメータを適用すべきかについて、実施者が確信を持てない場合に使用すべきパラメータセット）は、Blossum62スコアリング行列と、ギャップ・ペナルティ（gap penalty）12、ギャップ・エクステンド・ペナルティ（gap extend penalty）4、およびフレームシフト・ギャップ・ペナルティ（frameshift gap penalty）5である。
【０２２５】
本明細書にいう「宿主細胞」は、本明細書に記載する生成物（例えば本明細書に記載する脂肪アルコール）を生産するために使用される細胞である。宿主細胞は、選ばれた遺伝子を発現または過剰発現するか、選ばれた遺伝子の発現が減弱するように修飾することができる。宿主細胞の限定的でない例として、植物、動物、ヒト、細菌、酵母、糸状菌細胞が挙げられる。
【０２２６】
本明細書において使用する用語「低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または超高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する条件を表す。ハイブリダイゼーション反応を実施するためのガイダンスは、「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons、N.Y. (1989)）の6.3.1-6.3.6に見いだすことができる。この参考文献には水性および非水性の方法が記載されており、どちらの方法も使用することができる。本明細書において言及する具体的ハイブリダイゼーション条件は、次のとおりである：1）低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）中、約45℃の後、0.2×SSC、0.1％SDS中、少なくとも50℃で2回洗浄（低ストリンジェンシー条件の場合、洗浄の温度は55℃まで上げることができる）；2）中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、6×SSC中、約45℃の後、0.2×SSC、0.1％SDS中、60℃で1回以上洗浄；3）高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、6×SSC中、約45℃の後、0.2×SSC、0.1％SDS中、65℃で1回以上洗浄；そして好ましくは、4）超高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、0.5Mリン酸ナトリウム、7％SDS、65℃の後、0.2×SSC、1％SDS、65℃で1回以上の洗浄である。超高ストリンジェンシー条件（4）は、別段の指定がない限り、好ましい条件である。
【０２２７】
DNAまたはRNAなどの核酸に関して本明細書において使用する「単離された」という用語は、それぞれ、その核酸の自然源に存在する他のDNAまたはRNAから分離された分子を指す。さらにまた、「単離された核酸」とは、フラグメントとして自然には存在せず、自然状態では見いだされないであろう、核酸フラグメントを包含するものとする。「単離された」という用語は、本明細書では、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを指すためにも使用され、精製ポリペプチドおよび組換えポリペプチドをどちらも包含するものとする。本明細書において使用する「単離された」という用語は、組換えDNA技法によって生産された場合に、細胞物質、ウイルス物質、または培養培地を実質的に含まない核酸またはペプチドも指す。本明細書において使用する「単離された」という用語は、化学合成された場合に、化学前駆体または他の化学品を実質的に含まない核酸またはペプチドも指す。脂肪アルコールなどの生成物に関して本明細書において使用する「単離された」という用語は、細胞コンポーネント、細胞培養培地、または化学前駆体もしくは合成前駆体から単離された生成物を指す。
【０２２８】
本明細書にいう「ある細胞における、ある遺伝子の発現のレベル」は、その細胞において、その遺伝子によってコードされる、mRNA、プレmRNA新生転写産物、転写産物プロセシング中間体、成熟mRNA、および分解産物のレベルを指す。
【０２２９】
本明細書において使用する用語「微生物（microorganism）」は、古細菌ドメイン、真正細菌ドメインおよび真核生物ドメインの原核微生物種および真核微生物種を意味し、真核微生物種には、酵母および糸状菌、原生動物（protozoa）、藻類、または高等原生生物（higher Protista）が含まれる。用語「微生物細胞（microbial cell）」（すなわち微生物（microbe）の細胞）および「微生物（microbe）」は互換的に使用され、顕微鏡の助けを借りなければ見ることができない細胞または小さな生物を指す。
【０２３０】
本明細書において使用する用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（DNA）や、しかるべき場合にはリボ核酸（RNA）などの、ポリヌクレオチドを指す。また、この用語は、ヌクレオチド類似体（analog）から作られるRNAまたはDNAの類似体、そして記載する実施形態に適用できる場合には、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチド、EST、染色体、cDNA、mRNA、ならびにrRNAを、等価物として包含すると理解されるべきである。
【０２３１】
本明細書において使用する用語「作動可能に連結された（operably linked）」は、選ばれたDNAの発現がプロモーターによって調節されうるように、その選ばれたヌクレオチド配列（例えば本明細書に記載のポリペプチドをコードするもの）がそのプロモーターの近傍にあることを意味する。また、プロモーターは、転写および翻訳の方向に関して、選ばれたヌクレオチド配列の上流に位置する。「作動可能に連結された」とは、適当な分子（例えば転写活性化タンパク質）が調節配列に結合した時に、遺伝子発現が可能になるような形で、ヌクレオチド配列と調節配列とがつながれていることを意味する。
【０２３２】
「または」という用語は、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、本明細書においては、用語「および/または」を意味するために使用され、用語「および/または」と互換的に使用される。
【０２３３】
本明細書にいう「過剰発現する」とは、ある細胞において、核酸、ポリペプチド、または炭化水素を、対応する野生型細胞において通常発現する濃度よりも高い濃度で発現すること、またはそのような発現を引き起こすことを意味する。例えば、あるポリペプチドが、組換え宿主細胞において、同じ種の非組換え宿主細胞におけるその濃度よりも高い濃度で存在する場合、そのポリペプチドは、その組換え宿主細胞において「過剰発現している」と言える。
【０２３４】
本明細書にいう「分配係数」または「P」は、有機相中の化合物の平衡濃度を水相（例えば発酵ブロス）における平衡時の濃度で割った値と定義される。本明細書に記載する二相系の一実施形態では、有機相が生産プロセス中に脂肪アルデヒドによって形成される。しかし、いくつかの例では、例えば生成物の分離を容易にするために、オクタンの層を設けることなどによって、有機相を設けることができる。二相系について述べる場合、化合物の分配特徴は、logPで記載することができる。例えば、logPが1である化合物は、有機相に、10：1に分配されるだろう。logPが-1である化合物は有機相に1：10に分配されるだろう。適当な発酵ブロスと有機相とを選択することにより、たとえ発酵槽における濃度が極めて低くても、高いlogP値を有する脂肪アルデヒドが有機相中に分離しうる。
【０２３５】
本明細書において使用する用語「精製する（purify)」、「精製された（purified）」または「精製（purification）」は、ある分子を、その環境から、例えば単離または分離によって、除去または単離することを意味する。「実質的に精製された」分子は、それらに付随する他の構成要素を、少なくとも60％含まない、好ましくは少なくとも約75％含まない、より好ましくは少なくとも約90％含まない。本明細書において使用するこれらの用語は、試料からの夾雑物の除去も指す。例えば、夾雑物の除去は、試料中の脂肪アルコールのパーセンテージの増加をもたらすことができる。例えば、脂肪アルコールが宿主細胞中で生産される場合、その脂肪アルコールは、宿主細胞タンパク質の除去によって精製することができる。精製後は、試料中の脂肪アルコールのパーセンテージが増加している。
【０２３６】
「精製する」、「精製された」または「精製」という用語は、絶対的純粋を必要としない。これらは相対的用語である。したがって例えば、脂肪アルコールが宿主細胞中で生産される場合、精製脂肪アルコールは、他の細胞コンポーネント（例えば核酸、ポリペプチド、脂質、糖質、または他の炭化水素）から実質的に分離された脂肪アルコールである。もう一つの例において、精製脂肪アルコール調製物は、脂肪アルコールが夾雑物（例えば発酵後に存在するかもしれないものなど）を実質的に含まない脂肪アルコール調製物である。いくつかの実施形態において、試料の少なくとも約50重量％が脂肪アルコールで構成される場合、その脂肪アルコールは精製されている。別の実施形態において、試料の少なくとも約60重量％、70重量％、80重量％、85重量％、90重量％、92重量％、95重量％、98重量％、もしくは99重量％またはそれ以上が脂肪アルコールで構成される場合、その脂肪アルコールは精製されている。
【０２３７】
本明細書において使用する用語「組換えポリペプチド」は、組換えDNA技法によって生産されるポリペプチドを指し、その組換えDNA技法では、一般に、発現させるタンパク質またはRNAをコードするDNAを適切な発現ベクター中に挿入し、次にそれを使って宿主細胞を形質転換することによって、そのポリペプチドまたはRNAが生産される。
【０２３８】
本明細書において使用する用語「実質的に同一」（または「実質的に相同」）は、第1および第2のアミノ酸またはヌクレオチド配列が類似する活性を有するように、第2のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対して十分な数の同一または等価（例えば類似する側鎖を有するもの、例えば保存的アミノ酸置換）アミノ酸残基またはヌクレオチドを含有する、第1のアミノ酸またはヌクレオチド配列を指すために使用される。
【０２３９】
本明細書において使用する用語「シンターゼ」は、合成プロセスを触媒する酵素を意味する。本明細書において使用するシンターゼという用語は、シンターゼ、シンテターゼ、およびリガーゼを包含する。
【０２４０】
本明細書において使用する用語「トランスフェクション」は、核酸を介した遺伝子導入（nucleic acid-mediated gene transfer）による、受容細胞（recipient cell）への核酸の（例えば発現ベクターによる）導入を意味する。
【０２４１】
本明細書にいう「形質転換」は、外因性のDNAまたはRNAを細胞が取り込んだ結果として細胞の遺伝子型が変化するプロセスを指す。これは、組換え型のRNAまたはポリペプチドを発現する形質転換細胞をもたらしうる。導入された遺伝子からのアンチセンス発現の場合は、天然型ポリペプチドの発現が妨害される。
【０２４２】
本明細書にいう「輸送タンパク質」は、細胞小器官および/または細胞に出入りする1つまたはそれ以上の化合物の動きを容易にするポリペプチドである。
【０２４３】
本明細書にいうポリペプチドXの「変異体（variant）」は、1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が変化しているペプチドXのアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。変異体は、保存的変化または非保存的変化を有することができる。生物学的活性に影響を及ぼさずにどのアミノ酸残基を置換し、挿入し、または欠失させることができるかの決定に関するガイダンスは、当技術分野で周知のコンピュータプログラム、例えばLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）などを使って見いだすことができる。
【０２４４】
ポリヌクレオチド配列との関連で使用される場合、「変異体」という用語は、ある遺伝子またはそのコード配列のポリヌクレオチド配列に関係するポリヌクレオチド配列を包含しうる。この定義は、例えば「対立遺伝子」変異体、「スプライス」変異体、「種」変異体、または「多型」変異体も包含しうる。スプライス変異体は、基準ポリヌクレオチドに対してかなりの同一性を有しうるが、mRNAプロセシング時のエキソンの選択的スプライシングゆえに、一般にポリヌクレオチドの数は増加または減少しているだろう。対応するポリペプチドは、追加の機能的ドメインを有するか、ドメインの欠如を示しうる。種変異体は、種間で異なるポリヌクレオチド配列である。結果として生じるポリペプチドは、一般に、互いにかなりのアミノ酸同一性を有するだろう。多型変異体は、所与の種の個体間に見られる、特定遺伝子のポリヌクレオチド配列の変動である。
【０２４５】
本明細書において使用する用語「ベクター」は、それに連結されているもう一つの核酸を輸送する能力を有する核酸分子を指す。有用なベクターの一タイプはエピソーム（すなわち染色体外複製能を有する核酸）である。有用なベクターは、自立的に複製する能力および/またはそれが連結されている核酸を発現させる能力を有するものである。それが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示する能力を有するベクターを、本明細書では「発現ベクター」という。一般に、組換えDNA技法で役立つ発現ベクターは「プラスミド」の形態をとることが多く、「プラスミド」という用語は一般に、ベクター型では染色体に結合しない環状二本鎖DNAループを指す。プラスミドは最もよく使用される形態のベクターであるから、本明細書において「プラスミド」と「ベクター」は互換的に使用される。しかし、等価な機能を果たし、今後、当技術分野において知られるようになる、他の形態の発現ベクターも包含される。
【０２４６】
本発明は、少なくとも一つには、E. coliにおける脂肪アルコール生合成のための新しい経路であって、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドをコードする遺伝子を一部に利用する経路を見出したことに基づいている。脂肪アルコールは、図3に図示する生合成経路によって生産することができる。この経路では、まず最初に、脂肪酸がATPによって活性化され、次にカルボン酸レダクターゼ（CAR）様酵素によって還元されて、脂肪アルデヒドを生成する。次に、その脂肪アルデヒドは、alrAadp1またはyjgBなどのアルコールデヒドロゲナーゼによって、脂肪アルコールへとさらに還元されうる。本明細書において実証するように、yjgBは、その基質に脂肪アルデヒド（例えばC10〜C18の炭素鎖長を有する脂肪アルデヒド）が含まれるアルコールデヒドロゲナーゼであると、推定することができる。
【０２４７】
脂肪アルデヒド生合成遺伝子、脂肪アルコール生合成遺伝子、および変異体 
本明細書に記載する方法は、脂肪アルコールを、例えば脂肪アルデヒドから生産するために使用することができる。いくつかの例では、図6および図8に掲載するヌクレオチド配列を有する脂肪アルデヒド生合成遺伝子、例えばカルボン酸レダクターゼ遺伝子（car遺伝子）ならびにそのポリヌクレオチド変異体を発現させることによって、脂肪アルデヒドが生産される。いくつかの例では、脂肪アルデヒド生合成遺伝子が、図7に図示するアミノ酸モチーフの1つまたはそれ以上をコードする。例えば、遺伝子は、配列番号7、配列番号8、配列番号9、および配列番号10；配列番号11；配列番号12；配列番号13；配列番号14；および/または配列番号7、配列番号9、配列番号10、および配列番号11を含むポリペプチドをコードすることができる。配列番号7はレダクターゼドメインを含み；配列番号8および配列番号14はNADP結合ドメインを含み；配列番号9はホスホパンテテイン付着部位を含み；配列番号10はAMP結合ドメインを含む。
【０２４８】
別の例では、脂肪アルコール生合成遺伝子（例えば図10に掲載するヌクレオチド配列を有するもの）またはその変異体を発現させることによって、脂肪アルコールが生産される。
【０２４９】
変異体は自然に存在するか、インビトロで作出することができる。特に、そのような変異体は、部位特異的突然変異生成、ランダムな化学的突然変異生成、エキソヌクレアーゼIII欠失法、または標準的クローニング技法などの遺伝子改変技法を使って作出することができる。あるいは、そのような変異体、フラグメント、類似体、または誘導体は、化学合成法または化学修飾法を使って作出することもできる。
【０２５０】
変異体を作製する方法は当技術分野ではよく知られている。それらには、自然分離株（natural isolate）から得た核酸配列を修飾して、工業的応用または実験的応用におけるそれらの価値を強化するような特徴を有するポリペプチドをコードする核酸を生成する手法が含まれる。そのような手法では、自然分離株から得られた配列と比較して1つまたはそれ以上のヌクレオチド差異を有する多数の変異体配列を生成し、特徴づける。通例、これらのヌクレオチド差異は、自然分離株からの核酸によってコードされるポリペプチドと比較して、アミノ酸変化をもたらす。
【０２５１】
例えば、変異体は、エラープローン（error prone）PCRを使って作出することができる（例えばLeungら, Technique 1:11-15, 1989、およびCaldwellら, PCR Methods Applic. 2:28-33, 1992を参照されたい）。エラープローンPCRでは、PCR産物の全長にわたって高い点突然変異率が得られるように、DNAポリメラーゼのコピー忠実度（copying fidelity）が低くなる条件下でPCRを行う。簡単に述べると、そのような手法では、突然変異させようとする核酸（例えば脂肪アルデヒド生合成ポリヌクレオチド配列）を、PCRプライマー、反応緩衝液、MgCl2、MnCl2、Taqポリメラーゼ、およびPCR産物の全長にわたって高い点突然変異率を得るのに適した濃度のdNTPと混合する。例えば、反応は、20fmolの突然変異させようとする核酸（例えば脂肪アルデヒド生合成ポリヌクレオチド配列）、30pmolの各PCRプライマー、50mM KCl、10mM Tris HCl（pH8.3）、および0.01％ゼラチンを含む反応緩衝液、7mM MgCl2、0.5mM MnCl2、5単位のTaqポリメラーゼ、0.2mM dGTP、0.2mM dATP、1mM dCTP、および1mM dTTPを使って行うことができる。PCRは、94℃で1分、45℃で1分、および72℃で1分を30サイクル行うことができる。しかし、これらのパラメータを適宜変更できることは理解されるだろう。次に、突然変異した核酸を適当なベクター中にクローニングし、突然変異した核酸によってコードされるポリペプチドの活性を評価する。
【０２５２】
変異体は、オリゴヌクレオチド指定突然変異生成（oligonucleotide directed mutagenesis）を使って、目的とする任意のクローン化DNA中に部位特異的突然変異を生成することによって作出することもできる。オリゴヌクレオチド突然変異生成は、例えばReidhaar-Olsonら, Science 241:53-57, 1988に記載されている。簡単に述べると、そのような手法では、クローン化DNA中に導入しようとする1つまたはそれ以上の突然変異を保持する複数の二本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、それらを突然変異させようとするクローン化DNA（例えば脂肪アルデヒド生合成ポリヌクレオチド配列）中に挿入する。突然変異したDNAを含有するクローンを回収し、それらがコードするポリペプチドの活性を評価する。
【０２５３】
変異体を生成するためのもう一つの方法は、アセンブリPCRである。アセンブリPCRでは、小さなDNAフラグメントの混合物からのPCR産物のアセンブリが行われる。多数の異なるPCR反応が同じバイアル中で並行して行われ、ある反応の産物が別の反応の産物をプライミングする。アセンブリPCRは、例えば米国特許第5,965,408号に記載されている。
【０２５４】
変異体を生成するさらにもう一つの方法は、セクシャルPCR突然変異生成である。セクシャルPCR突然変異生成では、DNA分子のランダムフラグメント化の結果として生じた、異なってはいるが類縁性の高いDNA配列のDNA分子間で、強制的な相同組換えが、配列相同性に基づき、インビトロで行われる。次に、PCR反応におけるプライマー伸長により、交叉の固定が行われる。セクシャルPCR突然変異生成は、例えばStemmer, PNAS, USA 91:10747-10751, 1994に記載されている。
【０２５５】
変異体は、インビボ突然変異生成によって作出することもできる。いくつかの実施形態では、DNA修復経路の1つまたはそれ以上に突然変異を保持するE. coli株などの細菌株中で配列を増幅することにより、核酸配列中にランダム突然変異を生成する。そのような「ミューテーター（mutator）」株は、野生型株よりも高いランダム突然変異率を有する。これらの株の一つでDNA配列（例えば脂肪アルデヒド生合成ポリヌクレオチド配列）を増幅すれば、最終的に、DNA内にランダム突然変異が生成することになる。インビボ突然変異生成での使用に適したミューテーター株は、例えばPCT公開番号WO 91/16427に記載されている。
【０２５６】
変異体はカセット突然変異生成を使って生成することもできる。カセット突然変異生成では、二本鎖DNA分子の小さな領域を、ネイティブな配列とは異なる合成オリゴヌクレオチド「カセット」で置き換える。オリゴヌクレオチドは、多くの場合、完全にかつ/または部分的にランダム化されたネイティブな配列を含有する。
【０２５７】
リカーシブ・アンサンブル（recursive ensemble）突然変異生成も、変異体を生成するために使用することができる。リカーシブ・アンサンブル突然変異生成は、アミノ酸配列が相違するメンバーからなる、表現型上関連する突然変異体の多様な集団を作製するために開発されたタンパク質改変（すなわちタンパク質突然変異生成）のためのアルゴリズムである。この方法では、フィードバック機序を使って、連続して行われる複数回のコンビナトリアルカセット突然変異生成を制御する。リカーシブ・アンサンブル突然変異生成は、例えばArkinら, PNAS, USA 89:7811-7815, 1992に記載されている。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、エクスポネンシャル・アンサンブル（exponential ensemble）突然変異生成を使って変異体が作出される。エクスポネンシャル・アンサンブル突然変異生成は、ユニークかつ機能的な突然変異体のパーセンテージが高いコンビナトリアルライブラリーを作製するためのプロセスであり、このプロセスでは、小さな残基群を並行してランダム化することにより、各改変位置で、機能的タンパク質をもたらすアミノ酸を同定する。エクスポネンシャル・アンサンブル突然変異生成は、例えばDelegraveら, Biotech.Res. 11:1548-1552, 1993に記載されている。ランダムおよび部位特異的突然変異生成は、例えばArnold, Curr.Opin.Biotech. 4:450-455, 1993に記載されている。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、シャフリング（shuffling）手法を使って変異体が作出される。この手法では、例えば米国特許第5,965,408号および同第5,939,250号に記載されているように、異なるポリペプチドをコードする複数の核酸の部分を一つに融合して、キメラポリペプチドをコードするキメラ核酸配列を作出する。
【０２６０】
ポリヌクレオチド変異体には、核酸類似体も含まれる。核酸類似体では、例えば核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度などを改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格を修飾することができる。塩基部分の修飾には、デオキシチミジンに対するデオキシウリジン、およびデオキシシチジンに対する5-メチル-2'-デオキシシチジンまたは5-ブロモ-2'-デオキシシチジン（doxycytidine）が含まれる。糖部分の修飾には、リボース糖の2'ヒドロキシルの修飾による2'-O-メチル糖または2'-O-アリル糖の形成が含まれる。デオキシリボースリン酸骨格を修飾して、各塩基部分が6員モルホリノ環に連結されているモルホリノ核酸や、デオキシリン酸（deoxyphosphate）骨格がシュードペプチド骨格で置き換えられ、4つの塩基が保持されているペプチド核酸を作製することができる（例えばSummertonら, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997) 7:187-195；およびHyrupら, Bioorgan.Med.Chem. (1996) 4:5-23を参照されたい）。また、デオキシリン酸骨格を、例えばホスホロチオエートもしくはホスホロジチオエート骨格、ホスホロアミダイト、またはアルキルホスホトリエステル骨格などで置き換えることもできる。
【０２６１】
図6および図8に掲載するホモログをコードする任意のポリヌクレオチド配列、またはその変異体は、本明細書に記載する方法において、脂肪アルデヒド生合成ポリヌクレオチドとして使用することができる。図10に掲載する任意のポリヌクレオチド配列、またはその変異体は、本明細書に記載する方法において、脂肪アルコール生合成ポリヌクレオチドとして使用することができる。
【０２６２】
脂肪アルデヒド生合成ポリペプチド、脂肪アルコール生合成ポリペプチド、および変異体
本明細書に記載する方法は、脂肪アルコールを、例えば脂肪アルデヒドから生産するためにも使用することができる。いくつかの例では、図6および図8に掲載するアミノ酸配列を有する脂肪アルデヒド生合成ポリペプチド、ならびにそのポリペプチド変異体によって、脂肪アルデヒドが生産される。いくつかの例では、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドが、図7に図示するアミノ酸モチーフの1つまたはそれ以上を含むものである。例えば、ポリペプチドは、配列番号7、配列番号8、配列番号9、および配列番号10のアミノ酸配列を含むことができる。別の状況では、ポリペプチドが、配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14の1つまたはそれ以上を含む。さらに別の例では、ポリペプチドが、配列番号7、配列番号9、配列番号10、および配列番号11のアミノ酸配列を含む。配列番号7はレダクターゼドメインを含み；配列番号8および配列番号14はNADP結合ドメインを含み；配列番号9はホスホパンテテイン付着部位を含み；配列番号10はAMP結合ドメインを含む。
【０２６３】
別の例では、図10に掲載するアミノ酸配列を有する脂肪アルコール生合成ポリペプチドならびにそのポリペプチド変異体を使って脂肪アルコールを生産するために、本明細書に記載する方法を使用することができる。
【０２６４】
生合成ポリペプチド変異体は、1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されている変異体であることができる。そのような置換アミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされるものであってもよいし、そうでなくてもよい。
【０２６５】
保存的置換は、ポリペプチド中の所与のアミノ酸が類似する特徴を有する別のアミノ酸で置換されるものである。典型的な保存的置換は次に挙げる置換である：脂肪族アミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの、別の脂肪族アミノ酸による置換；スレオニンによるセリンの置換またはその逆；酸性残基、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸の、別の酸性残基による置換；アミド基含有残基、例えばアスパラギンおよびグルタミンの、別のアミド基含有残基による置換；塩基性残基、例えばリジンおよびアルギニンの、別の塩基性残基との交換；および芳香族残基、例えばフェニルアラニンおよびチロシンの、別の芳香族残基による置換。
【０２６６】
別のポリペプチド変異体は、1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むものである。さらに別のポリペプチド変異体は、ポリペプチドを別の化合物、例えばそのポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えばポリエチレングリコール）と結合させたものである。
【０２６７】
さらなるポリペプチド変異体は、ポリペプチドに追加のアミノ酸、例えばリーダー配列、分泌配列、プロタンパク質配列、またはそのポリペプチドの精製、濃縮、または安定化を容易にする配列が融合されているものである。
【０２６８】
いくつかの例では、ポリペプチド変異体が、図6および図8に掲載するアミノ酸配列を有するポリペプチドと同じ生物学的機能（例えば、カルボン酸または脂肪酸レダクターゼ活性などの脂肪アルデヒド生合成活性）または図10に掲載するアミノ酸配列を有するポリペプチドと同じ生物学的機能（例えば、脂肪アルコールデヒドロゲナーゼ活性などの脂肪アルコール生合成活性）を保っていて、それと実質的に同一なアミノ酸配列を有する。
【０２６９】
別の例では、ポリペプチド変異体が、図6、図8、および/または図10に掲載するアミノ酸配列に対して、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％の相同性、または約95％を上回る相同性を有する。別の実施形態では、ポリペプチド変異体が、その少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、または150個の連続するアミノ酸を含むフラグメントを含む。
【０２７０】
ポリペプチド変異体またはそのフラグメントは、それらをコードする核酸を本明細書に記載する技法を使って単離するか、それらをコードする合成核酸を発現させることによって得ることができる。あるいは、ポリペプチド変異体またはそのフラグメントは、生化学的濃縮または精製手法によって得ることができる。ポリペプチド変異体またはフラグメントの配列は、タンパク質分解消化、ゲル電気泳動、および/またはマイクロシークエンシング（microsequencing）によって決定することができる。次に、ポリペプチド変異体またはフラグメントの配列を、本明細書に記載するプログラムのいずれかを使って、図6、図8、および/または図10に掲載するアミノ酸配列と比較することができる。
【０２７１】
ポリペプチド変異体およびそのフラグメントは、常法を使って、脂肪アルデヒド生産活性および/または脂肪アルコール生産活性についてアッセイすることができる。例えば、ポリペプチド変異体またはフラグメントを、基質（例えば脂肪酸、脂肪酸誘導体基質、または本明細書に記載する他の基質）と、そのポリペプチド変異体が機能することを可能とする条件下で接触させることができる。基質レベルの減少または脂肪アルデヒドレベルの増加を測定して脂肪アルデヒド生産活性を決定することができる。基質レベルの減少または脂肪アルコールレベルの増加を測定して脂肪アルコール生産活性を決定することができる。
【０２７２】
生合成ポリペプチドに対する抗体
本明細書に記載する脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドは、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドに対する抗体を作製するために使用することもできる。そのような抗体は、例えば、当技術分野で知られている方法を使って脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドまたは脂肪アルコール生合成ポリペプチドの発現を検出するために使用することができる。抗体は、例えばポリクローナル抗体；モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント；修飾抗体（modified antibody）、例えばキメラ抗体、再構成抗体（reshaped antibody）、ヒト化抗体、またはそのフラグメント（例えばFab'、Fab、F(ab')2）；または生合成抗体（biosynthetic antibody）、例えば単鎖抗体、単一ドメイン抗体（DAB）、Fv、単鎖Fv（scFv）などであることができる。
【０２７３】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製し使用する方法は、例えばHarlowら「Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol I」Cold Spring Harbor Laboratory（1998年12月1日）に記載されている。当技術分野では、修飾抗体および抗体フラグメント（例えばキメラ抗体、再構成抗体、ヒト化抗体、またはそのフラグメント、例えば、Fab'、Fab、F(ab')2フラグメント）；または生合成抗体（例えば単鎖抗体、単一ドメイン抗体（DAB）、Fv、単鎖Fv（scFv）など）を作製するための方法が知られており、例えばZola「Monoclonal Antibodies: Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives」Springer Verlag（2000年12月15日；第1版）に見いだすことができる。
【０２７４】
基質
本明細書に記載する組成物および方法は、脂肪アルコールを、例えば脂肪アルデヒド（この脂肪アルデヒドは、それ自体、適当な基質から生産することができる）から生産するために使用することができる。理論に束縛されることは望まないが、本明細書に記載する脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドは、還元反応機構によって、基質から脂肪アルデヒドを生成すると考えられる。いくつかの例では、基質が脂肪酸誘導体（例えば脂肪酸）であり、特定の分岐パターンおよび炭素鎖長を有する脂肪アルデヒドを、特定の脂肪アルデヒドをもたらすであろう特徴を有する脂肪酸誘導体から生産することができる。追加の反応機序により、脂肪アルデヒドは、所望の脂肪アルコールに（例えば本明細書に記載する脂肪アルコール生合成ポリペプチドによって）変換されうる。
【０２７５】
したがって、目的の基質を生産または過剰生産するように、脂肪酸誘導体基質の生産をもたらす生合成経路内の各段階を修飾することができる。例えば、宿主細胞において、脂肪酸生合成経路または脂肪アルデヒド経路に関与する既知の遺伝子を発現させるか、過剰発現させるか、減弱することにより、所望の基質を生産することができる（例えばPCT/US08/058788を参照されたい）。代表的な遺伝子を図9に記載する。
【０２７６】
基質の合成
脂肪酸シンターゼ（FAS）は、アシル鎖の開始および伸長を触媒するポリペプチド群である（Marrakchiら, Biochemical Society, 30:1050-1055, 2002）。アシルキャリアタンパク質（ACP）は、FAS経路内の酵素と共に、生産される脂肪酸誘導体の長さ、飽和度、および分岐を制御する。脂肪酸生合成経路は前駆体であるアセチルCoAおよびマロニルCoAを必要とする。この経路内の諸段階は、脂肪酸生合成（fab）遺伝子ファミリーおよびアセチルCoAカルボキシラーゼ（acc）遺伝子ファミリーの酵素によって触媒される（例えばHeathら, Prog.Lipid Res. 40(6):467-97 (2001)を参照されたい）。
【０２７７】
宿主細胞は、1つまたはそれ以上の脂肪酸シンターゼ遺伝子、例えばアセチルCoAシンターゼ遺伝子および/またはマロニルCoAシンターゼ遺伝子を組換え的に発現または過剰発現させることにより、脂肪酸誘導体基質を発現するように改変することができる。例えば、アセチルCoA生産量を増加させるために、次に挙げる遺伝子の1つまたはそれ以上を宿主細胞中で発現させることができる：pdh（aceEF（ピルビン酸および2-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体のE1pデヒドロゲナーゼコンポーネント、E2pジヒドロリポアミドアシルトランスフェラーゼコンポーネントをコードする）およびlpdを含む多酵素複合体）、panK、fabH、fabB、fabD、fabG、acpP、およびfabF。これらの遺伝子に関する代表的なGenBankアクセッション番号は次のとおりである：pdh（BAB34380、AAC73227、AAC73226）、panK（CoAとも呼ばれる、AAC76952）、aceEF（AAC73227、AAC73226）、fabH（AAC74175）、fabB（P0A953）、fabD（AAC74176）、fabG（AAC74177）、acpP（AAC74178）、fabF（AAC74179）。加えて、改変宿主細胞では、fadE、gpsA、ldhA、pflb、adhE、pta、poxB、ackA、および/またはackBの発現レベルを、対応する遺伝子のヌル突然変異または欠失突然変異を含有する条件付き複製可能型（conditionally replicative）プラスミドまたは非複製可能型プラスミドを使った形質転換によって、またはプロモーターもしくはエンハンサー配列を置換することによって、減弱またはノックアウトすることもできる。これらの遺伝子に関する代表的なGenBankアクセッション番号は次のとおりである：fadE（AAC73325）、gspA（AAC76632）、ldhA（AAC74462）、pflb（AAC73989）、adhE（AAC74323）、pta（AAC75357）、poxB（AAC73958）、ackA（AAC75356）、およびackB（BAB81430）。その結果得られる宿主細胞は、適当な環境で成長させると、増加したアセチルCoA生産レベルを有するだろう。
【０２７８】
宿主細胞中にaccABCD（例えばアクセッション番号AAC73296、EC 6.4.1.2）を導入することによって、マロニルCoA過剰発現に影響を及ぼすことができる。脂肪酸は、リパーゼ（例えばアクセッション番号CAA89087、CAA98876）をコードするDNA配列を宿主細胞中に導入することにより、宿主細胞において、さらに過剰発現させることができる。
【０２７９】
加えて、PlsBを阻害することも、長鎖アシルACPのレベルの増加をもたらすことができ、これは、経路の初期段階（例えばaccABCD、fabH、およびfabI）を阻害することになる。plsB（例えばアクセッション番号AAC77011）D311E突然変異は、利用可能な脂肪酸の量を増加させるために使用することができる。
【０２８０】
加えて、モノ不飽和脂肪酸の生産量を増加させる目的で、sfa遺伝子（fabAのサプレッサー、例えばアクセッション番号AAN79592）を過剰発現するように宿主細胞を改変することもできる（Rockら, J.Bacteriology 178:5382-5387, 1996）。
【０２８１】
選ばれたチオエステラーゼの発現を修飾することにより、脂肪酸誘導体基質の鎖長を選択することができる。チオエステラーゼは生産される脂肪酸の鎖長に影響を及ぼす。したがって、好ましい脂肪酸誘導体基質の生産量を増加させる目的で、1つまたはそれ以上の選ばれたチオエステラーゼについて、それを発現するか、それを過剰発現するか、その発現が減弱しているか、またはそれを発現しないように、宿主細胞を改変することができる。例えばC10脂肪酸は、C10脂肪酸を優先的に生産するチオエステラーゼを発現させ、C10脂肪酸以外の脂肪酸を優先的に生産するチオエステラーゼ（例えばC14脂肪酸を優先的に生産するチオエステラーゼ）を減弱することによって生産することができる。これは、炭素鎖長が10である脂肪酸の比較的均一な集団をもたらすだろう。別の例では、非C14脂肪酸を生産する内在性チオエステラーゼを減弱し、C14-ACPを使用するチオエステラーゼを発現させることによって、C14脂肪酸を生産することができる。いくつかの状況では、C12-ACPを使用するチオエステラーゼを発現させ、非C12脂肪酸を生産するチオエステラーゼを減弱することによって、C12脂肪酸を生産することができる。アセチルCoA、マロニルCoA、および脂肪酸の過剰生産は、当技術分野で知られている方法を使って、例えば細胞溶解に続いて、放射性前駆体、HPLC、またはGC-MSを使用することなどによって、確認することができる。本明細書に記載する方法で使用することができるチオエステラーゼの限定的でない例を表1に掲載する。
【０２８２】
【表１】
2012506715.tif 000002
* Mayerら, BMC Plant Biology 7:1-11, 2007
【０２８３】
別の例では、宿主細胞における脂肪酸レベルの増加をもたらす自然の突然変異を含有する脂肪アルデヒド生合成ポリペプチド、変異体、またはそのフラグメントを、宿主細胞中で発現させる。いくつかの例では、対応する野生型宿主細胞と比較して宿主細胞における脂肪酸のレベルが増加するように、宿主細胞が遺伝子改変される。例えば、対応する野生型宿主細胞と比較してアシルCoAシンターゼの発現レベルが低下するように、宿主細胞を遺伝子改変することができる。ある実施形態では、「ノックアウト」宿主細胞を遺伝子工学的に作出することによって、1つまたはそれ以上の遺伝子（例えばアシルCoAシンターゼ遺伝子）の発現レベルを減少させる。
【０２８４】
宿主細胞では、任意の既知アシルCoAシンターゼ遺伝子を低減またはノックアウトすることができる。アシルCoAシンターゼ遺伝子の限定的でない例として、fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3pまたはタンパク質ZP_01644857をコードする遺伝子が挙げられる。アシルCoAシンターゼ遺伝子の具体例には、M. tuberculosis H37RvのfadDD35［NP_217021］、M. tuberculosis H37RvのfadDD22［NP_217464］、E. coliのfadD［NP_416319］、E. coliのfadK［YP_416216］、Acinetobacter sp. ADP1のfadD［YP_045024］、Haemophilus influenza RdkW20のfadD［NP_438551］、Rhodopseudomonas palustirs Bis B18のfadD［YP_533919］、Bacillus halodurans C-125のBH3101［NP_243969］、Pseudomonas fluorescens Pfo-1のPfl-4354［YP_350082］、Comamonas testosterone KF-1のEAV15023［ZP_01520072］、B. subtilisのyhfL［NP_388908］、P. aeruginosa PAO1のfadD1［NP_251989］、Ralstonia solanacearum GM1 1000のfadD1［NP_520978］、P. aeruginosa PAO1のfadD2［NP_251990］、Stenotrophomonas maltophilia R551-3のタンパク質ZP_01644857をコードする遺伝子、Saccharomyces cerevisiaeのfaa3p［NP_012257］、Saccharomyces cerevisiaeのfaa1p［NP_014962］、Bacillus subtilisのlcfA［CAA99571］、またはShockeyら, Plant.Physiol. 129:1710-1722, 2002；Cavigliaら, J.Biol.Chem. 279:1163-1169, 2004；Knollら, J.Biol.Chem. 269(23):16348-56, 1994；Johnsonら, J.Biol.Chem. 269: 18037-18046, 1994；およびBlackら, J.Biol Chem. 267: 25513-25520, 1992に記載されているものが含まれる。
【０２８５】
分岐脂肪アルコールの形成
分岐脂肪酸誘導体を、本明細書に記載する脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドの基質として使用することにより、分岐点を含有する脂肪アルデヒドから、脂肪アルコールを生産することができる。例えば、E. coliは通常は直鎖脂肪酸（sFA）を生産するが、分岐した前駆体を与える遺伝子（例えばbkd、ilv、icm、およびfab遺伝子ファミリー）をE. coliに導入して、発現または過剰発現させることにより、分岐鎖脂肪酸（brFA）を生産するように、E. coliを改変することができる。加えて、brFAを伸長するためのタンパク質（例えばACP、FabFなど）をコードする遺伝子が発現または過剰発現するように、かつ/または、対応する宿主細胞遺伝子であって通常はsFAをもたらすものが欠失または減弱するように、宿主細胞を改変することもできる。
【０２８６】
brFAを形成させる際の第1段階は、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼによる対応するα-ケト酸の生産である。宿主細胞はそのような酵素をコードする遺伝子を内在性に含むかもしれないし、またはそのような遺伝子を組換え的に導入することもできる。例えばE. coliは、そのような酵素IlvE（EC 2.6.1.42；GenBankアクセッションYP_026247）を内在性に発現する。いくつかの宿主細胞では、異種分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼが発現しないかもしれない。しかし、内在性でないとしても、E. coli IlvE、または他の任意の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（例えばLactococcus lactisのIlvE（GenBankアクセッションAAF34406）、Pseudomonas putidaのIlvE（GenBankアクセッションNP_745648）、またはStreptomyces coelicolorのIlvE（GenBankアクセッションNP_629657））を導入することができる。
【０２８７】
もう一つの実施形態では、Atsumiら, Nature 451:86-89, 2008に記載されている方法を使って、α-ケト酸の生産を達成することができる。例えば2-ケトイソ吉草酸は、IlvI、IlvH、IlvC、またはIlvDをコードする遺伝子を過剰発現させることによって、生産することができる。もう一つの例では、IlvAおよびIlvI、IlvH（またはBacillus subtilisのAlsS）、IlvC、IlvD、またはそれらの対応するホモログをコードする遺伝子を過剰発現させることにより、2-ケト-3-メチル-吉草酸を生産することができる。さらにもう一つの実施形態では、IlvI、IlvH、IlvC、IlvDおよびLeuA、LeuB、LeuC、LeuD、またはそれらの対応するホモログをコードする遺伝子を過剰発現させることにより、2-ケト-4-メチル-ペンタン酸を生産することができる。
【０２８８】
第2段階は、α-ケト酸の、対応する分岐鎖アシルCoAへの、酸化的脱炭酸である。この反応は、E1α/β（デカルボキシラーゼ）サブユニット、E2（ジヒドロリポイルトランスアシラーゼ）サブユニットおよびE3（ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ）サブユニットからなる分岐鎖α-ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体（bkd；EC 1.2.4.4.）によって触媒されうる（Denoyaら, J.Bacteriol. 177:3504, 1995）。これらの分岐鎖α-ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体は、ピルビン酸およびα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体に類似している。brFAを有しかつ/または分岐鎖アミノ酸上で成長する微生物はいずれも、宿主細胞（例えばE. coli）中で発現させるためのbkd遺伝子の単離源として使用することができる。さらにまた、E. coliは、そのピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の一部としてE3コンポーネント（lpd、EC 1.8.1.4、GenBankアクセッションNP_414658）を有する。したがってE1 α/βおよびE2 bkd遺伝子だけを発現させれば足りるだろう。表2に、分岐鎖アシルCoA前駆体を与えるために組換え的に宿主細胞に導入し発現させることができる、いくつかの微生物のbkd遺伝子の限定的でない例を掲載する。
【０２８９】
【表２】
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【０２９０】
もう一つの例では、クロトニルCoAレダクターゼ（Ccr、EC 1.6.5.5、1.1.1.1）とイソブチリルCoAムターゼ（大サブユニットIcmA、EC 5.4.99.2；小サブユニットIcmB、EC 5.4.99.2）の共発現によって、宿主細胞（例えばE. coli）中で、イソブチリルCoAを生産することができる（HanおよびReynolds, J.Bacteriol. 179:5157, 1997）。クロトニルCoAは、E. coliおよび他の微生物における脂肪酸生合成の中間体である。選ばれた微生物のccrおよびicm遺伝子の限定的でない例を表3に掲載する。
【０２９１】
【表３】
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【０２９２】
bkd遺伝子の発現に加えて、brFA生合成の開始は、分岐鎖アシルCoAに対して特異性を有するβ-ケトアシルアシルキャリアタンパク質シンターゼIII（FabH、EC 2.3.1.41）を利用する（Liら, J.Bacteriol. 187:3795-3799, 2005）。そのようなFabH酵素の限定的でない例を表4に掲載する。任意のbrFA含有微生物の脂肪酸生合成に関与するfabH遺伝子を宿主細胞中で発現させることができる。天然にはbrFAを生産しない宿主細胞のBkd酵素およびFabH酵素は、brFA生産をサポートしないかもしれない。そこで、bkdおよびfabHを組換え発現させることができる。bkd遺伝子およびfabH遺伝子を含有するベクターを、そのような宿主細胞に挿入することができる。また、BkdおよびFabH生産の内在性レベルは、brFAを生産するには十分でないかもしれない。その場合は、それらを過剰発現させることができる。加えて、アシルキャリアタンパク質（ACP）およびβ-ケトアシルアシルキャリアタンパク質シンターゼII（fabF、EC 2.3.1.41）など、脂肪酸生合成経路の他の構成要素を、発現または過剰発現させることもできる（その候補の限定的でない例を表4に掲載する）。これらの遺伝子を発現させることに加えて、宿主細胞において、内在性脂肪酸生合成経路内のいくつかの遺伝子（例えばE. coli遺伝子fabH（GenBankアクセッション番号NP_415609）および/またはfabF（GenBankアクセッション番号NP_415613））を、減弱することもできる。
【０２９３】
【表４】
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【０２９４】
環状脂肪アルコールの形成
環状脂肪酸誘導体を、本明細書に記載する脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドの基質として使用することにより、環状脂肪アルコールを環状脂肪アルデヒドから生産することができる。環状脂肪酸誘導体基質を生産するには、環状前駆体からの脂肪酸生合成の開始が可能になるように、環状前駆体を与える遺伝子（例えばans、chc、およびplm遺伝子ファミリー）を宿主細胞中に導入して発現させることができる。例えば、E. coliなどの宿主細胞を、ω−環状脂肪酸（cyFA）を合成する能力を有するものに変換するには、環状前駆体であるシクロヘキシルカルボニルCoA（CHC-CoA）を与える遺伝子（Croppら, Nature Biotech. 18:980-983, 2000）を、宿主細胞に導入して発現させることができる。E. coliにおいてCHC-CoAを与える遺伝子の限定的でない例には、次に挙げるものがある：Streptomyces collinusのアンサトリエニン（ansatrienin）遺伝子クラスターのansJ、ansK、ansL、chcA、およびansM（Chenら, Eur.J.Biochem. 261:98-107, 1999）、またはStreptomyces sp. HK803のホスラクトマイシン（phoslactomycin）B遺伝子クラスターのplmJ、plmK、plmL、chcA、およびplmM（Palaniappanら, J.Biol.Chem. 278:35552-35557, 2003）と、S. collinus、S. avermitilis、またはS. coelicolorのchcB遺伝子（Pattonら, Biochem. 39:7595-7604, 2000）（表5参照）。次に、表4に掲載する遺伝子を発現させることで、ω−環状脂肪酸の開始と伸長を可能にすることができる。あるいは、cyFAを作る微生物から相同遺伝子を単離して、宿主細胞（例えばE. coli）中で発現させることもできる。
【０２９５】
【表５】
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*chcAだけがGenBankエントリーU72144でアノテーションされており、ansJKLMは、Chenら（Eur.J.Biochem. 261:98-107, 1999）による。
【０２９６】
表4に掲載した遺伝子（fabH、acp、およびfabF）は、広い基質特異性を有するので、ω−環状脂肪酸の開始および伸長を可能にする。これらの遺伝子のいずれかを表5に掲載した遺伝子と共発現させてもcyFAが得られない場合は、cyFAを作る微生物（例えば表6に掲載するもの）のfabH、acp、および/またはfabFホモログを（例えば縮重PCRプライマーまたは異種DNA配列プローブを使用することによって）単離し、共発現させることができる。
【０２９７】
【表６】
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*cyFA生合成の前駆体としてシクロヘプチルカルボニルCoAを使用し、シクロヘキシルカルボニルCoAは使用しない。
【０２９８】
脂肪アルコール飽和レベル
脂肪酸（これは、本明細書に記載するように、次に脂肪アルデヒドに変換することができ、次いで脂肪アルコールに変換することができる）の飽和度は、脂肪酸中間体の飽和度を調節することによって制御することができる。脂肪酸の飽和を制御するために、例えばsfa、gns、およびfab遺伝子ファミリーを発現させるか、過剰発現させるか、低下したレベルで発現させることができる。図9に、本明細書に記載する方法および宿主細胞で使用することができるこれら遺伝子ファミリーの遺伝子の限定的でない例を掲載する。
【０２９９】
例えば、fabBを過剰発現するように生産宿主を改変するか、生産宿主を低温（例えば37℃未満）で成長させることにより、不飽和脂肪酸を生産するように宿主細胞を改変することができる。FabBはcis-δ3デセノイル-ACPを好み、E. coliにおける不飽和脂肪酸生産をもたらす。fabBの過剰発現は、かなりのパーセンテージの不飽和脂肪酸の生産をもたらす（de Mendozaら, J.Biol.Chem. 258:2098-2101, 1983）。遺伝子fabBを、この遺伝子を自然には持たない宿主細胞中に挿入して、発現させることができる。次に、これらの不飽和脂肪酸を、脂肪アルデヒドなどの脂肪酸誘導体を生産するように改変された宿主細胞中で、中間体として使用することができる。
【０３００】
別の例では、脂肪酸生合成のリプレッサー、例えばfabR（GenBankアクセッションNP_418398）を欠失させることができ、これによっても、E. coliにおける不飽和脂肪酸生産の増加がもたらされるだろう（Zhangら, J.Biol.Chem. 277:15558, 2002）。類似する欠失を他の宿主細胞で行うこともできる。不飽和脂肪酸のさらなる増加は、例えば、fabM（trans-2,cis-3-デセノイル-ACPイソメラーゼ、GenBankアクセッションDAA05501）を過剰発現させることによって、およびE. coli fabI（trans-2-エノイル-ACPレダクターゼ、GenBankアクセッションNP_415804）を欠失させた上での、Streptococcus pneumoniaeのfabK（trans-2-エノイル-ACPレダクターゼII、GenBankアクセッションNP_357969）の制御された発現（Marrakchiら, J.Biol.Chem. 277:44809, 2002）によって、達成することができる。いくつかの例では、内在性fabF遺伝子を減弱することで、生産されるパルミトレイン酸（C16:1）のパーセンテージを増加させることができる。
【０３０１】
さらに別の例では、sfa、gns、および/またはfab遺伝子の発現を減少させることにより、飽和脂肪酸を生産するように宿主細胞を改変することができる。
【０３０２】
いくつかの例では、減弱したレベルのデヒドラターゼ/イソメラーゼおよび/またはケトアシルACPシンターゼを発現するように、宿主細胞を改変することができる。例えば、宿主細胞は、低下したレベルのfabAおよび/またはfabBを発現するように改変することができる。いくつかの例では、不飽和脂肪酸の存在下で宿主細胞を成長させることができる。別の例では、デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子を発現または過剰発現するように、宿主細胞をさらに改変することができる。デサチュラーゼの限定的でない一例は、B. subtilis DesA（AF037430）である。当技術分野では、デサチュラーゼ酵素（例えば、ヘキサデカノイルACPやオクタデカノイルACPなどのアシルACPを使用するデサチュラーゼ）をコードする他の遺伝子も知られており、それらは本明細書に記載する宿主細胞および方法で使用することができる。本明細書に記載するように、脂肪アルデヒドなどの脂肪酸誘導体を生産し、続いて飽和脂肪アルコールを生産するために、飽和脂肪酸を使用することができる。
【０３０３】
脂肪アルコールの生産
本明細書に記載する脂肪アルデヒドは、アルコールデヒドロゲナーゼによって、脂肪アルコールに変換されうる。いくつかの例では、本明細書に記載する脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドをコードする遺伝子を、その脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドによって生産される脂肪アルデヒドを対応する脂肪アルコールに変換する能力を有する内在性アルコールデヒドロゲナーゼを発現する宿主細胞中で、発現させることができる。別の例では、本明細書に記載する脂肪アルコール生合成ポリペプチド（例えば図10に掲載するアミノ酸配列またはその変異体）をコードする遺伝子を、宿主細胞中で発現させることができる。代表的な脂肪アルコール生合成遺伝子には、Acenitobacter sp. M-1のAlrAまたはAlrAホモログ；および内在性E. coliアルコールデヒドロゲナーゼ、例えばDkgA（NP_417485）、DkgB（NP_414743）、YjgB（AAC77226）、YdjL（AAC74846）、YdjJ（NP_416288）、AdhP（NP_415995）、YhdH（NP_417719）、YahK（NP_414859）、YphC（AAC75598）、およびYqhD（Q46856）などがあるが、これらに限るわけではない。別の例では、脂肪アルコール生合成ポリペプチドをコードする遺伝子と、本明細書に記載する脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドをコードする遺伝子とを、宿主細胞中で共発現させることができる。
【０３０４】
脂肪アルコールを生産するための宿主細胞の遺伝子改変 
本明細書に記載するようにさまざまな宿主細胞を使って脂肪アルコールを生産することができる。宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であることができる。例えば、本明細書に記載するポリペプチド（例えば脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドおよび/または脂肪アルコール生合成ポリペプチド）をコードする遺伝子は、細菌細胞（例えばE. coli）、昆虫細胞、酵母、または哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）細胞、COS細胞、VERO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、Cv1細胞、MDCK細胞、293細胞、3T3細胞、またはPC12細胞）で発現させることができる。他の代表的な宿主細胞には、Escherichia属、Bacillus属、Lactobacillus属、Rhodococcus属、Pseudomonas属、Aspergillus属、Trichoderma属、Neurospora属、Fusarium属、Humicola属、Rhizomucor属、Kluyveromyces属、Pichia属、Mucor属、Myceliophtora属、Penicillium属、Phanerochaete属、Pleurotus属、Trametes属、Chrysosporium属、Saccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Yarrowia属、またはStreptomyces属のメンバーの細胞がある。さらに別の代表的宿主細胞として、Bacillus lentus細胞、Bacillus brevis細胞、Bacillus stearothermophilus細胞、Bacillus licheniformis細胞、Bacillus alkalophilus細胞、Bacillus coagulans細胞、Bacillus circulans細胞、Bacillus pumilis細胞、Bacillus thuringiensis細胞、Bacillus clausii細胞、Bacillus megaterium細胞、Bacillus subtilis細胞、Bacillus amyloliquefaciens細胞、Trichoderma koningii細胞、Trichoderma viride細胞、Trichoderma reesei細胞、Trichoderma longibrachiatum細胞、Aspergillus awamori細胞、Aspergillus fumigates細胞、Aspergillus foetidus細胞、Aspergillus nidulans細胞、Aspergillus niger細胞、Aspergillus oryzae細胞、Humicola insolens細胞、Humicola lanuginose細胞、Rhizomucor miehei細胞、Mucor michei細胞、Streptomyces lividans細胞、Streptomyces murinus細胞、または放線菌細胞を挙げることができる。他の宿主細胞には、シアノバクテリア宿主細胞がある。
【０３０５】
好ましい一実施形態では、宿主細胞がE. coli細胞、Saccharomyces cerevisiae細胞、またはBacillus subtilis細胞である。より好ましい実施形態では、宿主細胞がE. coli B株、C株、K株、またはW株に由来する。他の適切な宿主細胞は当業者に知られている。
【０３０６】
本明細書に記載する方法で使用することができるさらなる宿主細胞が、WO2009/111513およびWO2009/111672に記載されている。
【０３０７】
脂肪アルコールを生産するように宿主細胞を遺伝子改変するには、当技術分野でよく知られているさまざまな方法を使用することができる。それらの方法は、本明細書に記載する脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドおよび/または脂肪アルコール生合成ポリペプチド、そのポリペプチド変異体またはフラグメントをコードする核酸を含有するベクター（好ましくは発現ベクター）の使用を含みうる。さまざまなウイルスベクター（例えばレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター）および非ウイルスベクターを本明細書に記載する方法で使用できることは、当業者には理解されるだろう。
【０３０８】
本明細書に記載する組換え発現ベクターは、本明細書に記載する核酸を、宿主細胞中でその核酸を発現させるのに適した形態で含む。組換え発現ベクターは、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される1つまたはそれ以上の制御配列を含むことができる。制御配列は、発現させようとする核酸配列に作動的に連結される。そのような制御配列は、例えばGoeddel「Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185」Academic Press, カリフォルニア州サンディエゴ（1990）に記載されている。制御配列には、多くのタイプの宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、および一定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば組織特異的調節配列）が含まれる。発現ベクターの設計が、形質転換させる宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベルなどといった因子に依存しうることは、当業者には理解されるだろう。本明細書に記載する核酸によってコードされるポリペプチド（融合ポリペプチドを含む）を生産するために、本明細書に記載する発現ベクターを宿主細胞中に導入することができる。
【０３０９】
組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞（例えばE. coliなどの細菌細胞、昆虫細胞（例えばバキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、または哺乳動物細胞）中で脂肪アルデヒド生合成ポリペプチド（または変異体）をコードする遺伝子および/または脂肪アルコール生合成ポリペプチドをコードする遺伝子が発現するように設計することができる。適切な宿主細胞は、Goeddel「Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185」Academic Press, カリフォルニア州サンディエゴ（1990）でさらに詳しく議論されている。あるいは、T7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを使用することなどにより、組換え発現ベクターをインビトロで転写および翻訳することもできる。
【０３１０】
原核生物、例えばE. coliにおける、ポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、ほとんどの場合、融合ポリペプチドまたは非融合ポリペプチドの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを使って行われる。融合ベクターは、そこにコードされているポリペプチドにいくつかのアミノ酸を（通常は組換えポリペプチドのアミノ末端に）付加する。そのような融合ベクターは、通例、（1）組換えポリペプチドの発現量を増加させること；（2）組換えポリペプチドの溶解度を増加させること；および（3）アフィニティー精製においてリガンドとして働くことにより、組換えポリペプチドの精製を助けること、という、3つの目的に役立つ。多くの場合、融合発現ベクターには、融合物部分と組換えポリペプチドの接合部にタンパク質分解切断部位が導入される。これにより、融合ポリペプチドの精製後に融合物部分から組換えポリペプチドを分離することが可能になる。そのような酵素およびそのコグネイト（cognate）認識配列の例には、第Xa因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼなどがある。代表的な融合発現ベクターには、pGEX（Pharmacia Biotech Inc；Smithら, Gene (1988) 67:31-40）、pMAL（New England Biolabs、マサチューセッツ州ベバリー）、およびpRITS（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカタウェイ）などがあり、これらはそれぞれ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合タンパク質、またはプロテインAを、ターゲット組換えポリペプチドに融合する。
【０３１１】
誘導性非融合E. coli発現ベクターの例には、pTrc（Amannら, Gene (1988) 69:301-315）およびpET 11d（Studierら「Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185」Academic Press、カリフォルニア州サンディエゴ (1990) 60-89）などがある。pTrcベクターからのターゲット遺伝子発現は、ハイブリッドtrp-lac融合プロモーターからの宿主RNAポリメラーゼ転写に依拠する。pET 11dベクターからのターゲット遺伝子発現は、共発現したウイルスRNAポリメラーゼ（T7 gn1）によって媒介されるT7 gn10-lac融合プロモーターからの転写に依拠する。このウイルスポリメラーゼは、宿主株BL21（DE3）またはHMS174（DE3）により、lacUV 5プロモーターの転写制御を受けるT7 gn1遺伝子を保因する常在性λプロファージから供給される。
【０３１２】
組換えポリペプチド発現量を最大化する戦略の一つは、組換えポリペプチドをタンパク質分解的に切断する能力が損なわれている宿主細胞中でポリペプチドを発現させることである（Gottesman「Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185」Academic Press、カリフォルニア州サンディエゴ (1990) 119-128参照）。もう一つの戦略は、各アミノ酸の個々のコドンが宿主細胞で優先的に利用されるものになるように、発現ベクター中に挿入する核酸配列を改変することである（Wadaら, Nucleic Acids Res. (1992) 20:2111-2118）。そのような核酸配列の改変は、標準的なDNA合成技法によって行うことができる。
【０３１３】
もう一つの実施形態では、宿主細胞が酵母細胞である。この実施形態では、発現ベクターが酵母発現ベクターである。酵母S. cerevisiaeにおける発現のためのベクターの例には、pYepSec1（Baldariら, EMBO J. (1987) 6:229-234）、pMFa（Kurjanら, Cell (1982) 30:933-943）、pJRY88（Schultzら, Gene (1987) 54:113-123）、pYES2（Invitrogen Corporation、カリフォルニア州サンディエゴ）、およびpicZ（Invitrogen Corp、カリフォルニア州サンディエゴ）などがある。
【０３１４】
あるいは、本明細書に記載するポリペプチドを、バキュロウイルス発現ベクターを使って昆虫細胞中で発現させることもできる。培養昆虫細胞（例えばSf9細胞）におけるタンパク質の発現に利用することができるバキュロウイルスベクターには、例えばpAc系列（Smithら, Mol.Cell Biol. (1983) 3:2156-2165）およびpVL系列（Lucklowら, Virology (1989) 170:31-39）などがある。
【０３１５】
さらにもう一つの実施形態では、本明細書に記載する核酸を、哺乳動物細胞発現ベクターを使って哺乳動物細胞中で発現させることができる。哺乳動物細胞発現ベクターの例には、pCDM8（Seed, Nature (1987) 329:840）およびpMT2PC（Kaufmanら, EMBO J. (1987) 6:187-195）などがある。哺乳動物細胞中で使用する場合、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節要素によって提供することができる。例えば、よく使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス40に由来する。原核細胞にも真核細胞にも適した他の発現系は、Sambrookら編「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第2版（Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989）の第16章および第17章に記載されている。
【０３１６】
ベクターは、従来の形質転換技法またはトランスフェクション技法によって、原核細胞または真核細胞中に導入することができる。本明細書において使用する用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈法、DEAE-デキストランによるトランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションなど、外来核酸（例えばDNA）を宿主細胞中に導入するための、当技術分野で認識されているさまざまな技法を指す。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、例えばSambrookら（前掲）に見いだすことができる。
【０３１７】
細菌細胞の安定形質転換に関して、使用する発現ベクターおよび形質転換技法により、発現ベクターを取り込んで複製する細胞は、わずかな割合にすぎないことが知られている。これらの形質転換体を同定し選択するために、選択可能マーカー（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を、目的の遺伝子と一緒に宿主細胞中に導入することができる。選択可能マーカーには、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリンなどの薬物に対する耐性を付与するものが含まれる。選択可能マーカーをコードする核酸は、本明細書に記載するポリペプチドをコードするベクターと同じベクターに乗せて宿主細胞中に導入するか、別個のベクターに乗せて導入することができる。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定することができる（例えば、選択可能マーカー遺伝子が取り込まれている細胞は生き残り、他の細胞は死滅する）。
【０３１８】
哺乳動物細胞の安定トランスフェクションに関して、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション技法により、外来DNAをそのゲノム中に組み込みうる細胞は、わずかな割合にすぎないことが知られている。これらの組込み体（integrant）を同定し選択するために、選択可能マーカー（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を、目的の遺伝子と一緒に宿主細胞中に導入することができる。好ましい選択可能マーカーには、G418、ハイグロマイシン、およびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与するものが含まれる。選択可能マーカーをコードする核酸は、本明細書に記載するポリペプチドをコードするベクターと同じベクターに乗せて宿主細胞中に導入するか、別個のベクターに乗せて導入することができる。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定することができる（例えば、選択可能マーカー遺伝子が取り込まれている細胞は生き残り、他の細胞は死滅する）。
【０３１９】
輸送タンパク質
輸送タンパク質（transport protein）は、ポリペプチドおよび有機化合物（例えば脂肪アルコール）を宿主細胞外に排出（export）することができる。多くの輸送タンパク質および流出タンパク質（efflux protein）は、多種多様な化合物を排泄（excrete）するのに役立ち、特定タイプの炭水化物に対して選択的になるように、自然の修飾を受けることができる。
【０３２０】
適切な輸送タンパク質の限定的でない例は、ATP結合カセット（ABC）輸送タンパク質、流出タンパク質、および脂肪酸トランスポータータンパク質（FATP）である。適切な輸送タンパク質のさらなる限定的でない例には、Caenorhabditis elegans、Arabidopsis thalania、Alkaligenes eutrophus、およびRhodococcus erythropolisなどの生物のABC輸送タンパク質などがある。使用することができる代表的ABC輸送タンパク質を図9に掲載する（例えばCER5、AtMRP5、AmiS2、およびAtPGP1）。宿主細胞は、有機化合物を分泌する内在的能力（endogenous ability）を理由として選択することもできる。有機化合物の生産と宿主細胞環境（例えば培養培地、発酵ブロス）への分泌の効率は、細胞内生成物対細胞外生成物の比として表すことができる。いくつかの例において、その比は、約5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、または1:5であることができる。
【０３２１】
発酵
脂肪アルコールの生産と単離は、有益な発酵技法を使用することによって強化することができる。コストを下げつつ生産量を最大化するための方法の一つは、炭化水素生成物に変換される炭素源のパーセンテージを増加させることである。
【０３２２】
通常の細胞ライフサイクルでは、炭素は、脂質、糖類、タンパク質、有機酸、および核酸の生産などといった細胞機能に使用される。成長関連活動に必要な炭素の量を低下させることで、生成物への炭素源変換の効率を増加させることができる。これは、例えば、まず最初に宿主細胞を望ましい密度（例えば対数増殖期のピーク時に達成される密度）まで成長させることによって達成することができる。そのような時点において、複製チェックポイント遺伝子を利用して、細胞の成長を停止させることができる。具体的に述べると、クオラムセンシング（quorum sensing）機構（Camilliら, Science 311:1113, 2006；Venturi FEMS Microbio.Rev. 30:274-291, 2006；およびReadingら, FEMS Microbiol.Lett. 254:1-11, 2006に概説されている）を使って、p53、p21などのチェックポイント遺伝子、または他のチェックポイント遺伝子を活性化することができる。
【０３２３】
活性化されて、E. coliにおける細胞の複製および成長を停止させることができる遺伝子に、umuDC遺伝子がある。umuDC遺伝子の過剰発現は定常期から指数増殖期への進行を停止させる（Murliら, J.of Bact. 182:1127, 2000）。UmuCは、非コード損傷（これは、ほとんどのUVおよび化学突然変異生成の機構的基礎である）を横切る損傷乗り越え合成を行うことができるDNAポリメラーゼである。umuDC遺伝子産物は損傷乗り越え合成のプロセスに関与し、DNA配列ダメージチェックポイントとしても機能する。umuDC遺伝子産物には、UmuC、UmuD、umuD'、UmuD'2C、UmuD'2、およびUmuD2が含まれる。同時に、生成物生産遺伝子を活性化して、脂肪アルデヒドが作られている間に複製および維持経路を使用する必要を最小限に抑えることができる。prpBCDEプロモーター系下にあるpBAD24中のE. coli由来umuCおよびumuDを、この遺伝子のデノボ合成により、適当な最終生成物生産遺伝子と共に発現するように、宿主細胞を改変することもできる。
【０３２４】
脂肪アルコールに変換される投入炭素のパーセンテージは、コスト要因（cost driver）になりうる。プロセスの効率がよいほど（すなわち、脂肪アルコールに変換される投入炭素のパーセンテージが高いほど）、そのプロセスは安価になるだろう。酸素含有炭素源（例えばグルコースおよび他の糖質ベースの炭素源）の場合は、酸素を二酸化炭素の形で放出しなければならない。酸素原子が2個放出される毎に、炭素原子も1個放出され、最大理論代謝効率は約34％（w/w）になる（脂肪酸由来生成物の場合）。しかし、他の有機化合物および炭素源では、この数字は変化する。文献における典型的な効率は約5％未満である。脂肪アルコールを生産するように改変された宿主細胞は、約1、3、5、10、15、20、25、および30％を上回る効率を有することができる。ある例において、宿主細胞は約10％〜約25％の効率を示すことができる。別の例において、そのような宿主細胞は、約25％〜約30％の効率を示すことができる。別の例において、宿主細胞は30％を上回る効率を示すことができる。
【０３２５】
PCT出願番号PCT/US2007/003736に記載されているような組換えセルロソームを発現するように、宿主細胞をさらに改変することができる。これらのセルロソームは、宿主細胞がセルロース系材料を炭素源として使用することを可能にすることができる。例えば、スクロースを炭素源として使用することができるように、インベルターゼ（EC 3.2.1.26）を発現するように宿主細胞をさらに改変することができる。同様に、宿主細胞がセルロース系材料を効率よく同化して炭素源として使用することができるように、米国特許第5,000,000号、同第5,028,539号、同第5,424,202号、同第5,482,846号、および同第5,602,030号に記載されている教示内容を使って宿主細胞を改変することもできる。
【０３２６】
ある例において、発酵チャンバーには、持続的還元を起こしている発酵を封入することができる。この例では安定な還元的環境を作り出すことができる。電子バランスは二酸化炭素（ガス状）の放出によって維持することができる。NAD/HおよびNADP/Hバランスを増強する努力も、電子バランスの安定化を容易にすることができる。NADH:NADPHトランスヒドロゲナーゼを発現するように宿主細胞を改変することによって、細胞内NADPHの利用可能性を強化することもできる。1つまたはそれ以上のNADH:NADPHトランスヒドロゲナーゼの発現は、解糖で生成するNADHを、脂肪アルコールの生産を強化することができるNADPHに変換する。
【０３２７】
小規模生産の場合は、改変宿主細胞を、例えば約100mL、500mL、1L、2L、5L、または10Lのバッチで成長させ、発酵し、適当なプラスミドにコードされている特異的遺伝子に基づいて、所望の脂肪アルデヒド生合成遺伝子および/またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現するように誘導することができる。大規模生産の場合は、改変宿主細胞を約10L、100L、1000L、10,000L、100,000L、1,000,000Lまたはそれ以上のバッチで成長させ、発酵し、適当なプラスミドにコードされている特異的遺伝子または宿主細胞のゲノムに組み込まれた特異的遺伝子に基づいて、所望の脂肪アルデヒド生合成遺伝子および/またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現するように誘導することができる。
【０３２８】
例えば、所望の遺伝子を含有するプラスミドを保持するか、その染色体に組み込まれた遺伝子を有する、E. coli細胞などの適切な生産宿主を、適切なリアクター（例えば1Lリアクター）中、2％グルコース、カルベニシリン、およびクロラムフェニコールを添加したM9培地において、37℃で20時間、インキュベートすることができる。培養物のOD600が0.9に達したら、生産宿主をIPTGアルコールで誘導することができる。インキュベーション後に、消費された培地を抽出し、GC-MSを使って脂肪アルコールの存在について有機相を調べることができる。
【０３２９】
いくつかの例では、誘導の最初の1時間後に、全細胞体積の約10％以下のアリコートを1時間ごとに取り出し、脂肪アルコールが表面に浮き上がって自発的な相分離または沈殿が起こりうるように、撹拌せずに静置することができる。次に、脂肪アルコールコンポーネントを収集し、水相を反応チャンバーに戻すことができる。反応チャンバーは連続的に稼働することができる。OD600が0.6未満に低下したら、細胞を、種培養から成長させた新しいバッチで置き換えることができる。
【０３３０】
無細胞法を使った脂肪アルコールの生産
本明細書に記載するいくつかの方法では、本明細書に記載する精製ポリペプチド（例えば脂肪アルコール生合成ポリペプチド）と、例えば本明細書に記載する方法などによって生産される基質（例えば脂肪アルデヒド）とを使って、脂肪アルコールを生産することができる。例えば、本明細書に記載する脂肪アルコール生合成ポリペプチドまたは変異体を発現するように宿主細胞を改変することができる。その宿主細胞を、当該ポリペプチドの発現を可能とするのに適した条件下で培養することができる。次に、既知の方法を使って無細胞抽出物を調製することができる。例えば、洗剤（detergent）を使って、または超音波処理によって、宿主細胞を溶解することができる。発現したポリペプチドは、既知の方法を使って精製することができる。無細胞抽出物を得た後、本明細書に記載する基質をその無細胞抽出物に加えて、脂肪アルコールへの基質（例えば脂肪アルデヒド）の変換を可能とする条件下に維持することができる。次に、既知の技法を使って、脂肪アルコールを分離し精製することができる。
【０３３１】
いくつかの例では、脂肪アルデヒドを、図10に掲載する脂肪アルコール生合成ポリペプチドまたはその変異体と接触させることにより、本明細書に記載する脂肪アルデヒドを脂肪アルコールに変換することができる。
【０３３２】
生産後処理
発酵中に生産された脂肪アルコールは発酵培地から分離することができる。水性培地から脂肪アルコールを分離するための既知の技法はどれでも使用することができる。代表的な分離プロセスの一つは、2相（two phase）（二相（bi-phasic））分離プロセスである。このプロセスでは、脂肪アルコールを生産するのに十分な条件下で遺伝子改変宿主細胞を発酵し、脂肪アルコールが有機相に集合することを可能とし、その有機相を水性発酵ブロスから分離する。この方法は、バッチ式発酵プロセスでも連続発酵プロセスでも実施することができる。
【０３３３】
二相分離では、脂肪アルコールの相対的不混和性（relative immiscibility）を使って分離を容易にする。不混和性（immiscible）とは、ある化合物が水に溶解する能力の相対的欠如を指し、その化合物の分配係数によって定義される。生産される脂肪アルコールが高いlogP値を有するように発酵ブロスと有機相とを選択することにより、たとえ発酵槽における濃度が極めて低くても、脂肪アルコールが有機相中に分離しうることは、当業者には理解されるだろう。
【０３３４】
本明細書に記載する方法によって生産される脂肪アルコールは、発酵ブロスにも、細胞質にも、比較的不混和性であることができる。したがって脂肪アルコールは細胞内または細胞外で有機相に集まることができる。有機相への生成物の集合は、脂肪アルコールが細胞機能に及ぼす影響を小さくすることができ、宿主細胞がより多くの生成物を生産することを可能にすることができる。
【０３３５】
本明細書に記載する方法は、生産される脂肪アルコールの少なくとも約60％、70％、80％、90％、または95％が、変動幅が約6炭素未満、約4炭素未満、または約2炭素未満である炭素鎖長を有する、均質な化合物の生産をもたらすことができる。これらの化合物は、比較的均一な不飽和度で生産することもできる。これらの化合物は、燃料、燃料添加剤、他の化学化合物（例えばポリマー、界面活性剤、プラスチック、布地、溶媒、接着剤など）を製造するための出発物質、またはパーソナルケア（personal care）用添加剤として、直接使用することができる。これらの化合物は、他の製品を作るために、例えば水素化、接触分解（例えば水素化によるもの、熱分解によるもの、またはその両者によるもの）などの後続反応のための供給原料として使用することもできる。
【０３３６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載する方法を使って生産される脂肪アルコールは、約50％〜約90％の炭素、または約5％〜約25％の水素を含有することができる。別の実施形態において、本明細書に記載する方法を使って生産される脂肪アルコールは、約65％〜約85％の炭素、または約10％〜約15％の水素を含有することができる。
【０３３７】
界面活性剤および洗剤組成物ならびにバイオ製品
本明細書に記載する脂肪アルコールは、界面活性剤または洗剤組成物として使用するか、界面活性剤または洗剤組成物に変換することができる。その界面活性剤または洗剤の意図する目的に応じて、異なる脂肪アルコールを生産し、使用しうることは、当業者には理解されるだろう。例えば、本明細書に記載する脂肪アルコールを界面活性剤製造または洗剤製造のための供給原料として使用する場合、脂肪アルコール供給原料の特徴が、製造される界面活性剤または洗剤の特徴に影響を及ぼすことになることは、当業者には理解されるだろう。したがって、界面活性剤製品または洗剤製品の特徴は、供給原料として使用するために特定の脂肪アルコールを生産することによって選択することができる。
【０３３８】
生物学的に生産された有機化合物を含むバイオ製品（例えば脂肪アルコール）、特に脂肪酸生合成経路を使って生物学的に生産された脂肪アルコールは、今まで、再生可能資源から生産されたことがなく、したがって新規組成物（new composition of matter）である。これらの新規バイオ製品は、石油化学炭素由来の有機化合物とは、二核種炭素同位体フィンガープリント法（dual carbon-isotopic fingerprinting）または14C年代測定法（14C dating）に基づいて区別することができる。さらに、生物起源の（biosourced）炭素の具体的供給源（例えばグルコース対グリセロール）を、二核種炭素同位体フィンガープリント法によって決定することもできる（例えば、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第7,169,588号を参照されたい）。
【０３３９】
バイオ製品を石油ベースの有機化合物と区別できることは、商業上、これらの材料を追跡するのに有益である。例えば、生物ベースの炭素同位体プロファイルと石油ベースの炭素同位体プロファイルの両方を含む有機化合物または化学品は、石油ベースの材料だけでできた有機化合物および化学品と区別することができる。したがって、本材料は、そのユニークな炭素同位体プロファイルに基づいて、商業上、追跡することができる。
【０３４０】
バイオ製品は、各燃料中の安定炭素同位体比（13C/12C）を比較することによって、石油ベースの有機化合物とは区別することができる。所与のバイオ製品における13C/12C比は、二酸化炭素が固定された時点の大気中の二酸化炭素における13C/12C比の結果である。またそれは厳密な代謝経路も反映する。地域的変動も起こる。石油、C3植物（広葉植物）、C4植物（イネ科草本）、および海洋炭酸塩は全て、13C/12Cおよび対応するδ13C値に有意な相違を示す。さらにまた、C3植物およびC4植物の脂質は、代謝経路の結果として、同じ植物の糖質コンポーネントから誘導される材料とは異なる分析結果を示す。
【０３４１】
測定精度内で、13Cは、同位体分別効果ゆえに大きな変動を示し、バイオ製品の場合、なかでも最も重要なのは、光合成機構である。植物における炭素同位体比の相違の主原因は、植物における光合成炭素代謝の経路の相違、特に一次カルボキシル化（すなわち大気CO2の最初の固定）時に起こる反応の相違と、密接に関連している。草木の二大クラスは、「C3」(またはカルビン・ベンソン）光合成回路が組み込まれているものと、「C4」(またはハッチ・スラック）光合成回路が組み込まれているものである。
【０３４２】
C3植物では、一次CO2固定またはカルボキシル化反応に、リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ酵素が関与し、最初の安定生成物は3炭素化合物である。C3植物、例えば、硬材（hardwoods）および針葉樹（confiers）は、温帯気候帯において優勢である。
【０３４３】
C4植物では、もう一つの酵素、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが関与するさらなるカルボキシル化反応が、一次カルボキシル化反応である。最初の安定炭素化合物は4炭素酸であり、それが後に脱炭酸される。こうして放出されたCO2は、C3回路によって再び固定される。C4植物の例は、暖地型牧草、トウモロコシ、およびサトウキビである。
【０３４４】
C4植物とC3植物はどちらも、ある範囲の13C/12C同位体比を示すが、典型的な値は、C4植物については約-7〜約-13パーミル、C3植物については約-19〜約-27パーミルである（例えばStuiverら, Radiocarbon 19:355, 1977を参照されたい）。石炭および石油は一般に後者の範囲に含まれる。13C測定尺度は、元は、ピーディー（Pee Dee）ベレムナイト（PDB）石灰石によって設定されたゼロ点によって定義されたものであり、この場合、値は、この材料からの千分の一偏位（parts per thousand deviations）で与えられる。「δ13C」値は、千分率（パーミル）（‰と略記）で表され、次のように計算される：
δ13C（‰）＝[(13C/12C)試料−(13C/12C)標準物質]/(13C/12C)標準物質×1000
【０３４５】
PDB標準物質（reference material；RM）が枯渇したので、IAEA、USGS、NIST、および他の選ばれた国際的同位体研究所と協同して、一連の代替RMが開発されている。PDBからのパーミル偏位の表記がδ13Cである。測定は、CO2に対し、高精度安定同位体比質量分析（high precision stable ratio mass spectrometry）（IRMS）により、質量44、45および46の分子イオンに関して行われる。
【０３４６】
本明細書に記載する組成物は、本明細書に記載する方法のいずれかによって生産されたバイオ製品を含む。具体的に述べると、バイオ製品は、約-28以上、約-27以上、-20以上、-18以上、-15以上、-13以上、-10以上、または-8以上のδ13Cを有することができる。例えば、バイオ製品は、約-30〜約-15、約-27〜約-19、約-25〜約-21、約-15〜約-5、約-13〜約-7、または約-13〜約-10のδ13Cを有することができる。別の例において、バイオ製品は、約-10、-11、-12、または-12.3のδ13Cを有することができる。
【０３４７】
バイオ製品は、各化合物における14Cの量を比較することによって、石油ベースの有機化合物と区別することもできる。14Cは5730年という核半減期を有するので、「古い（older）」炭素を含有する石油ベース燃料を、「新しい（newer）」炭素を含有するバイオ製品と区別することができる（例えばCurrie「Source Apportionment of Atmospheric Particles」Characterization of Environmental Particles, J. BuffleおよびH.P. van Leeuwen編, IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series（Lewis Publishers, Inc）のVol. Iの1（1992）3-74を参照されたい）。
【０３４８】
放射性炭素年代測定法における基本的前提は、大気中の14C濃度の不変性が生体における14Cの不変性をもたらすというものである。しかし、1950年以降の大気圏内核実験および1850年以降の化石燃料の燃焼により、14Cは、もう一つの地球化学的時間特性（geochemical time characteristic）を獲得した。大気CO2における（したがって生体生物圏（living biosphere）における）その濃度は、1960年代中頃の核実験のピーク時には、およそ2倍になった。それ以後は、7〜10年というおよその緩和「半減期」（relaxation "half-life"）で、約1.2×10-12という定常状態宇宙線起源（大気）ベースライン同位対比（14C/12C）へと、徐々に戻りつつある（この後者の半減期は文字通りに解釈してはならず、むしろ、核時代の幕開け以降の大気および生物圏14Cの変動を追跡するには、詳細な大気核投入/減衰関数（atomospheric nuclear input/decay function）を使用しなければならない）。
【０３４９】
近年の生物圏炭素の年代測定（annual dating）に裏付けを与えるのは、この後者の生物圏14C時間特性である。14Cは、加速器質量分析（AMS）によって測定することができ、その結果は「現代炭素分率（fraction of modern carbon）」（fM）という単位で与えられる。fMは、米国国立標準技術研究所（National Institute of Standards and Technology（NIST））標準物質（Standard Reference Material（SRM））4990Bおよび4990Cによって定義される。本明細書にいう「現代炭素分率」または「fM」は、米国国立標準技術研究所（NIST）標準物質（SRM）4990Bおよび4990C（それぞれシュウ酸標準品HOxIおよびHOxIIと呼ばれている）によって定義されるものと同じ意味を有する。基本的定義はHOxIの14C/12C同位体比×0.95に関係する（西暦1950年を基準とする）。これは、減衰補正された産業革命前の木にほぼ等しい。現在の生体生物圏（植物材料）については、fMが約1.1である。
【０３５０】
本明細書に記載する組成物は、少なくとも約1のfM 14Cを有することができるバイオ製品を含む。例えば、バイオ製品は、少なくとも約1.01のfM 14C、約1〜約1.5のfM 14C、約1.04〜約1.18のfM 14C、または約1.111〜約1.124のfM 14Cを有することができる。
【０３５１】
14Cのもう一つの測定値は、現代炭素パーセント（percent of modern carbon）pMCとして知られている。14C年代値を使用する考古学者または地質学者にとっては、西暦1950年が「0年前（zero years old）」に相当する。またこれは100pMCを表す。熱核兵器のピークであった1963年に、大気中の「爆弾由来炭素（bomb carbon）」は、正常レベルのほぼ2倍に達した。その出現以降、大気圏内でのその分布が近似されて、西暦1950年以降に生きる植物および動物については、100pMCを上回る値を示す。これは時間の経過と共に徐々に減少しており、現在の値は107.5pMC付近である。これは、トウモロコシなどの新鮮なバイオマス材料が107.5pMCに近い14C特性を与えるであろうことを意味する。石油ベースの化合物はpMC値がゼロであるだろう。化石炭素を現代炭素と混合すると、現代pMC含有量の希釈が起こることになる。107.5pMCが現代バイオマス材料の14C含有量を表し、0pMCが石油ベース製品の14C含有量を表すと仮定すると、その材料について測定されるpMC値は、それら2タイプの構成要素の比率を反映することになる。例えば現代の大豆に100％由来する材料は、107.5pMCに近い放射性炭素特性を与えるだろう。この材料を石油ベース製品で50％希釈したとすると、放射性炭素特性は約54pMCになるだろう。
【０３５２】
生物ベース炭素（biologically based carbon）含有量は、「100％」を107.5pMCに割り当て、「0％」を0pMCに割り当てることによって導き出される。例えば、99pMCと測定される試料は、93％の換算生物ベース炭素含有量（equivalent biologically based carbon content）を与えることになる。この値は、平均生物ベース炭素結果（mean biologically based carbon result）と呼ばれ、分析される材料内の全ての構成要素が現代生物材料または石油ベース材料のどちらか一方に由来すると仮定している。
【０３５３】
本明細書に記載するバイオ製品は、少なくとも約50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100のpMCを有することができる。別の例において、本明細書に記載するバイオ製品は、約50〜約100、約60〜約100、約70〜約100、約80〜約100、約85〜約100、約87〜約98、または約90〜約95のpMCを有することができる。さらに別の例において、本明細書に記載するバイオ製品は、約90、91、92、93、94、または94.2のpMCを有することができる。
【０３５４】
燃料添加剤は、燃料またはエンジンの性能を強化するために使用される。例えば燃料添加剤は、凝固/ゲル化点、曇点、潤滑性、粘度、酸化安定性、着火性、オクタンレベル、および/または引火点を変化させるために使用することができる。米国では、燃料添加剤は全て、環境保護局に登録しなければならない。燃料添加剤の名称とその燃料添加剤を販売する会社名は、EPAに問い合わせるか、当局のウェブサイトを閲覧することによって、公に入手することができる。所望の特性を付与するために、本明細書に記載する脂肪アルコール系バイオ燃料を、1つまたはそれ以上の燃料添加剤と混合しうることは、当業者には理解されるだろう。
【０３５５】
本明細書に記載する脂肪アルコール系界面活性剤および/または洗剤は、当技術分野において周知の他の界面活性剤および/または洗剤と混合することができる。
【０３５６】
いくつかの例において、上記混合物は、少なくとも約10重量％、15重量％、20重量％、30重量％、40重量％、50重量％、または60重量％の上記脂肪アルコールを含むことができる。別の例では、8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22炭素長の炭素鎖を含む脂肪アルコールを少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％または95％含む界面活性剤または洗剤組成物を製造することができる。そのような界面活性剤または洗剤組成物は、界面活性剤；マイクロエマルション；少なくとも約5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、または95％の、植物油または石油などの非微生物源に由来する界面活性剤または洗剤、から選択される少なくとも1つの添加剤を、さらに含むことができる。
【０３５７】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに例示する。これらの実施例は例示のために記載するにすぎない。決して、これらの実施例を、本発明の範囲または内容の限定であると解釈してはならない。
【実施例】
【０３５８】
［実施例1］
カルボン酸レダクターゼ（CAR）ホモログの同定
Nocardia sp. NRRL 5646株のカルボン酸レダクターゼ（CAR）は、アシルCoAシンターゼなどの別個の活性化酵素を利用することなく、カルボン酸（例えば脂肪酸）を、それぞれの対応するアルデヒドに還元することができる（Liら, J.Bacteriol. 179:3482-3487, 1997；Heら, Appl.Environ.Microbiol. 70:1874-1881, 2004）。
【０３５９】
NRRL 5646 CARアミノ酸配列（GenpeptアクセッションAAR91681）（配列番号16）をクエリー配列として使用するBLAST検索により、約20の相同配列が同定された。表7に掲載する3つのホモログを、E. coliで発現させた時にインビボで脂肪酸を脂肪アルデヒドに変換するその能力について評価した。
【０３６０】
ヌクレオチド配列レベルでは、carA（配列番号19）、carB（配列番号21）、およびfadD9（配列番号17）は、Nocardia sp. NRRL 5646のcar遺伝子（AY495697）（配列番号15）に対して、それぞれ62.6％、49.4％、および60.5％の相同性を示した。アミノ酸レベルでは、CARA（配列番号20）、CARB（配列番号22）、およびFadD9（配列番号18）は、Nocardia sp. NRRL 5646のCAR（配列番号16）に対して、それぞれ62.4％、59.1％および60.7％の同一性を示した。
【０３６１】
【表７】
2012506715.tif 000008
【０３６２】
［実施例2］
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の同定
リバースエンジニアリング
E. coliは、脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールの可逆的酸化還元を触媒する酵素（すなわち脂肪アルデヒドレダクターゼ/アルコールデヒドロゲナーゼ）を少なくとも１つは含有している。リバースエンジニアリングを使って、Synechococcus elongatusのアシルACPレダクターゼYP_400611（Synpcc7942_1594）（配列番号196）を発現するE. coli MG1655細胞における、そのような脂肪アルデヒドレダクターゼ/脂肪アルコールデヒドロゲナーゼを同定した。4つの3mL LB培養物を37℃で終夜成長させ、55μLの定常期培養物を使って、4つの独立した5.5mLのLBに接種した。次に、これらの5.5mL培養物を、0.8〜1.0のOD600まで成長させてから、それぞれ500mLのHu9最少培地が入っている対応する数の2Lバッフル付き振とうフラスコに接種した。誘導の20時間後に細胞を4,000×gで20分間ペレット化した。細胞ペレットを、1×Bacterial Protease Arrest（G Biosciences）を含む30mLの100mMリン酸緩衝液pH7.2に再懸濁した。フレンチプレスを使用し、15,000psiで、装置に2回通すことにより、細胞を溶解した。次に、10,000×gで20分間遠心分離することによって、細胞残渣を除去した。直列に接続した2本のHiTrapQカラム（GE Healthcare）に細胞溶解物をローディングした。次に挙げる緩衝液を使ってタンパク質を溶出した：（A）50mM Tris、pH7.5、および（B）1M NaClを含有する50mM Tris、pH7.5。各4mLのフラクションを収集しながら、0％Bから100％Bまでの勾配を、3mL/分の流速で5カラム体積にわたって流した。
【０３６３】
190μLのタンパク質フラクションを採取し、5μLの20mM NADPH（Sigma）溶液および5μLの20mMドデカナール（Fluka）/DMSO溶液を加えることにより、フラクションを、アルコールデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイした。反応を37℃で1時間インキュベートした。次に、それらを100μLの酢酸エチルで抽出し、GC/MSにより、ドデカノールについて分析した。350mM NaCl付近に溶出するフラクションがアルコールデヒドロゲナーゼ活性を含有していた。
【０３６４】
アルコールデヒドロゲナーゼ活性を含有するフラクションをプールし、1mL ResourceQカラム（GE Healthcare）にローディングした。各0.5mLのフラクションを集めた点以外は、HiTraｐQカラムに使用したものと同じ条件を使用した。次に、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すタンパク質フラクションをプールし、Amicon（Milipore）タンパク質濃縮器（10,000kDaカットオフ）を使って体積1mLまで濃縮した。次に、その溶液をHiPrep 200サイズ排除カラム（GE Healthcare）にローディングした。50mM Tris、pH7.5および150mM NaClを含有する緩衝溶液を、毎分0.3mLの速度でカラムに流した。各2mLのフラクションを集めた。2つのタンパク質フラクションがアルコールデヒドロゲナーゼ活性を含有していた。これら2つのフラクションと、それら2つのフラクションの前後のフラクションとを、ポリアクリルアミドゲルにローディングし、SimplySafe Commassie染色液（Invitrogen）で染色した。
【０３６５】
活性フラクションと不活性フラクションのバンドを比較したところ、不活性フラクションには見られない1本のタンパク質バンドが、活性フラクションに現れた。このタンパク質バンドをゲルから切り出し、LC/MS/MSタンパク質シークエンシングのために、スタンフォード質量分析施設（Stanford Mass Spectroscopy Facility）に付託した。この分析で同定されたタンパク質の一つがYahKだった。
【０３６６】
YahKが実際にアルコールデヒドロゲナーゼであることを検証するために、E. coli MG1655（DE3, ΔfadD, ΔyjgB）（対照株）（実施例4に記載）においてyahKをノックアウトした。ラムダred系（lamda red system）（実施例4に記載）を、次に挙げるプライマーと共に使用して、yahKノックアウトMG1655株（DE3, ΔfadD, ΔyjgB, ΔyahK）を構築した：
yahK_F（CATATCAGGCGTTGCCAAATACACATAGCTAATCAGGAGTAAACACAATG）（配列番号197）
および
yahK_R（AATCGCACACTAACAGACTGAAAAAATTAATAAATACCCTGTGGTTTAAC）（配列番号198）。
このΔyahK株と対照株（これらはどちらもアシルACPレダクターゼYP_400611を発現する）を、上述の条件下で培養した。両方の株から無細胞溶解物を調製し、各溶解物をアルコールデヒドロゲナーゼ活性について上述のようにアッセイした。
【０３６７】
ΔyahK株がドデカナールをドデカノールに変換しなかったのに対し、野生型基準株はこの活性を有していた。さらなる検証のために、各溶解物を上述のようにHiTrapQカラムに流した。野生型溶解物が350mM NaCl付近に溶出するフラクションにアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有していたのに対し、ΔyahK溶解物はこの領域にアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有していなかった。
【０３６８】
バイオインフォマティクス
E. coliにおいて考えうるアルコールデヒドロゲナーゼは、次に挙げる4つのタンパク質ファミリーのメンバーであると推論した：Zn依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（Pfam 00107および08240）、Fe依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（Pfam 00465）、アルドケトレダクターゼ（Pfam 00248）および短鎖デヒドロゲナーゼ（Pfam 00106）（Pfam＝"pfam.sanger.ac.uk"によるタンパク質ファミリー）。Pfamモチーフを使って、これら4つのタンパク質ファミリーの全てのメンバーが同定された（図10に掲載）。このリストから、次に挙げる8つの候補を実験解析のために選択した：yahK、yjgB、adhP、dkgA、dkgB、yhdH、ydjL、およびyqhD。
【０３６９】
これらの遺伝子が脂肪アルデヒドを脂肪アルコールに還元しうるかどうかを決定するために、これら8つの遺伝子をE. colitesAと一緒にpET-Duetベクター中にクローニングした。次に、これらの遺伝子を、E. coli（DE3）MG1655 ΔyjgBΔyahK細胞に形質転換した。次に、3mLの終夜スターター培養物を、カルベニシリン（carbanecillin）（100mg/L）を含むLB中、37℃で成長させた。候補アルコールデヒドロゲナーゼを欠く対照株も実験に含めた。1mLの各終夜培養物を使って、カルベニシリン（carbanecillin）を含む50mLの新鮮LBに接種した。OD600が0.8〜1に達するまで、培養物を37℃で振とうした。次に培養物を18℃に移し、1mM IPTGで誘導し、終夜振とうした。
【０３７０】
培養物を4,000×gで20分間遠心分離することにより、無細胞溶解物を調製した。次に、培養物を1mLのBugbuster（Novagen）に再懸濁し、室温で5分間穏やかに振とうした。15,000×gで10分間遠心することによって細胞残渣を除去した。得られた溶解物を、アルコールデヒドロゲナーゼ活性について、88μLの溶解物、2μLの40mM cis-11-ヘキサデセナール/DMSO、および10μLの20mM NADPHを混合することによってアッセイした。試料を37℃で30分間インキュベートした後、100μLの酢酸エチルで抽出した。GC/MSを使って抽出物を分析した。
【０３７１】
全てのタンパク質が、‘TesAのみの対照と比較して、有意に向上したcis-11-ヘキサデセナールからcis-11-ヘキサデカノールへの変換を示した（表8参照）。これらの結果は、cis-11-ヘキサデセナールの代わりにドデカナールを基質として使用するアッセイで確認された（表8参照）。
【０３７２】
これらの酵素が生産条件下のE. coliにおける脂肪アルコールデヒドロゲナーゼ活性にどの程度寄与しているかを調べるために、まず、MG1655（DE3, ΔfadD）におけるyjgB yahK二重ノックアウト株（上述）を、アシルACPレダクターゼYP_400611を発現するプラスミドで形質転換し、脂肪アルデヒド力価（fatty aldehyde titer）および脂肪アルコール力価（fatty alcohol titer）を分析することによって、試験した。試験株は、デカルボニラーゼを発現するプラスミドも含有した。この二重ノックアウト突然変異体は、いくつかの実験で、わずかに高い脂肪アルデヒド力価を示したことから（例えば図11参照）、これら2つの推定（putative）アルコールデヒドロゲナーゼは、生産条件下のE. coliにおける脂肪アルコールデヒドロゲナーゼ活性に寄与することが確認された（MG1655（DE3, ΔfadD ΔyjgB）株で得られた類似の結果に関して、実施例4も参照されたい）。次に、2つの追加遺伝子yncBおよびydjAを、yjgB yahK二重突然変異体において欠失させた。上記4つのタンパク質ファミリーのメンバーでないydjAは、わずかに上昇した脂肪アルデヒドレベルを示したことから（図11参照）、これも、生産条件下のE. coliにおける脂肪アルコールデヒドロゲナーゼ活性に寄与しうることが示された。
【０３７３】
さらにまた、表8の活性脂肪アルコールデヒドロゲナーゼも、MG1655（DE3, ΔfadD, ΔyjgB, ΔyahK）において欠失させ、上述のように試験した。これらの欠失株のいくつかは、わずかに上昇した脂肪アルデヒドレベルを示したことから、これらも、生産条件下のE. coliにおける脂肪アルコールデヒドロゲナーゼ活性に寄与しうることが示唆された（図12参照）。
【０３７４】
【表８】
2012506715.tif 000009
【０３７５】
［実施例3］
E. coliにおけるCARホモログおよびアルコールデヒドロゲナーゼの発現
A．CARプラスミドの構築
表7に掲載したCARホモログをコードする遺伝子を発現させるために、3つのE. coli発現プラスミドを構築した。まず最初に、Mycobacterium tuberculosis H37Rv（カナダ・ブリティッシュコロンビア州のブリティッシュコロンビア大学バンクーバー校から入手）のゲノムDNAから、プライマーfadD9FおよびFadDR（表9参照）を使って、fadD9を増幅した。そのPCR産物をまずPCR-blunt（Invitrogen）中にクローニングし、次に、NdeI-AvrIIフラグメントとして切り出した。次に、そのNdeI-AvrIIフラグメントをpACYCDuet-1（Novogen）のNdeI部位とAvrII部位の間にクローニングして、pACYCDuet-1-fadD9を作製した。
【０３７６】
carA遺伝子を、Mycobacterium smegmatis MC2 155（ATCCから入手（ATCC 23037D-5））のゲノムDNAから、プライマーCARMCaFおよびCARMCaRを使って増幅した（表9参照）。carB遺伝子を、Mycobacterium smegmatis MC2 155（ATCCから入手（ATCC 23037D-5））のゲノムDNAから、プライマーCARMCbFおよびCARMCbRを使って増幅した（表9参照）。各PCR産物をまずPCR-blunt中にクローニングし、次に、NdeI-AvrIIフラグメントとして切り出した。次に、それら2つのフラグメントのそれぞれを、pACYCDuet-1（Novogen）のNdeI部位とAvrII部位の間にサブクローニングして、pACYCDUET-carAおよびpACYCDUET-carBを作製した。
【０３７７】
【表９】
2012506715.tif 000010
【０３７８】
B．アルコールデヒドロゲナーゼプラスミドの構築
プラスミドpETDuet-1-‘tesA-yjgBは、‘tesAと、E. coli K12株のyjgB（推定アルコールデヒドロゲナーゼ；GenBankアクセッション番号NP_418690；GenPeptアクセッション番号AAC77226）を保持する。
【０３７９】
遺伝子yjgB（GenBankアクセッション番号NP_418690）は、E. coli K-12のゲノムDNAから、以下に挙げるプライマーを使って増幅した。
【０３８０】
yjgBインサートは、PCRにより、次に挙げるプライマーを使って作製した。
NcoI YjgBフォワード：
aatccTGGCATCGATGATAAAAAGCTATGCCGCAAAAG（配列番号199）
HindIII YjgBリバース：
ataaaagctTTCAAAAATCGGCTTTCAACACCACGCGG（配列番号200）。
次に、そのPCR産物を、pETDuet-1-‘tesAのNcoIおよびHindIII部位中にサブクローニングして、pETDuet-1-‘tesA-yjgBを作製した。
【０３８１】
プラスミドpETDuet-1-‘tesA-alrAadp1は、‘tesAと、Acinetobacter baylyi ADP1のalrAadp1（GenPeptアクセッション番号CAG70248.1）を保持する。
【０３８２】
遺伝子alrAadp1は、Acinetobacter baylyi ADP1のゲノムDNAから、2段階PCR法によって増幅した。1セット目のPCR反応では、次に挙げるプライマー対を使って、bp632〜636の内部NcoI部位を排除した。
ADP1 Alr mut1リバース：
5'-GACCACGTGATCGGCCCCCATAGCTTTGAGCTCATC（配列番号201）
ADP1 Alr1 mut1フォワード：
5'-GATGAGCTCAAAGCTATGGGGGCCGATCACGTGGTC（配列番号202）。
次に、そのPCR産物を、Qiagenゲル抽出キットを使って単離、精製し、第2PCR反応のインプット（input）として、次に挙げるプライマーと共に使用することにより、位置633にC→T突然変異を有する完全長AlrAadp1を作製した。
NcoI ADP1 Alr1フォワード：
5'-AATACCATGGCAACAACTAATGTGATTCATGCTTATGCTGCA（配列番号203）
HindIII ADP1 Alr1リバース：
5'-ATAAAAGCTTTTAAAAATCGGCTTTAAGTACAATCCGATAAC（配列番号204）。
Acinetobacter baylyi ADP1のホモログであるalrAadp1遺伝子（遺伝子locus-tag＝"ACIAD3612"）を、pETDuet-1-‘tesAのNcoIおよびHindIII部位に挿入することにより、プラスミドpETDuet-1-‘tesA-alrAadp1を作製した。
【０３８３】
B．脂肪アルデヒド生産および脂肪アルコール生産の評価
カルボン酸レダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼが脂肪アルコールの生産に及ぼす影響を評価するために、作製したプラスミドをさまざまな組み合わせてE. coli C41株（DE3, ΔfadE）（PCT/US08/058788に記載）に形質転換した。
【０３８４】
例えば、CARホモログcarAをコードするプラスミドpACYCDuet-1-carAを、pETDuet-1-‘tesA-alrAadp1と、同時形質転換した（例えば図1参照）。
【０３８５】
CARホモログcarBをコードするプラスミドpACYCDuet-1-carBを、pETDuet-1-‘tesAと、同時形質転換した。また、pACYCDuet-1-carBを、pETDuet-1-‘tesA-yjgBおよびpETDuet-1-‘tesA-alrAadp1とも、個別に同時形質転換した。対照として、pACYCDuet-1-carBを、空ベクターpETDuet-1と、同時形質転換した（例えば図1参照）。
【０３８６】
CARホモログfadD9をコードするプラスミドpACYCDuet-1-fadD9を、pETDuet-1-‘tesAと、同時形質転換した。さらに、pACYCDuet-1-fadD9を、pETDuet-1-‘tesA-yjgBおよびpETDuet-1-‘tesA-alrAadp1とも、個別に同時形質転換した。対照として、pACYCDuet-1-fadD9を、空ベクターpETDuet-1と、同時形質転換した（例えば図1参照）。
【０３８７】
もう一つの対照として、pETDuet-1-‘tesA-yjgBを、空ベクターpACYCDuet-1と、同時形質転換した。
【０３８８】
E. coli形質転換体を、カルベニシリン（100mg/L）およびクロラムフェニコール（34mg/L）を添加した3mLのLB培地中、37℃で成長させた。終夜成長させた後、カルベニシリンおよびクロラムフェニコールを添加した2mLの新鮮なLB培地に、15μLの培養物を移した。3.5時間成長させた後、2％グルコースならびにカルベニシリンおよびクロラムフェニコールを含む20mLのM9培地が入っている125mLフラスコに、2mLの培養物を移した。培養物のOD600が0.9に達したら、1mMのIPTGを各フラスコに加えた。37℃で20時間成長させた後、20mLの酢酸エチル（1％の酢酸（v/v）を含む）を各フラスコに加えて、発酵中に生産された脂肪アルコールを抽出した。粗酢酸エチル抽出物を本明細書に記載するようにGC/MSで直接分析した。
【０３８９】
測定された保持時間は、cis-5-ドデセン-1-オールが6.79分、1-ドデカノールが6.868分、cis-7-テトラデセン-1-オールが8.058分、1-テトラデカノールが8.19分、cis-9-ヘキサデセン-1-オールが9.208分、1-ヘキサデカノールが9.30分、そしてcis-11-オクタデセン-1-オールが10.209分だった。
【０３９０】
E. coliにおけるリーダーレス（leaderless）‘tesAと3つのcar遺伝子のいずれかとの共発現は、高力価の脂肪アルコールと、検出可能な脂肪アルデヒド生産をもたらした（図1、2、5）。carAまたはcarBとリーダーレスtesAおよびalrAadp1との発現は、700mg/Lを上回る脂肪アルコール力価と脂肪アルデヒド生産量の低下ををもたらした。同様に、リーダーレスtesAおよびalrAadp1と共発現したfadD9は、300mg/Lを超える脂肪アルコールをもたらした。リーダーレスtesAを伴わずに発現させた場合、carBとfadD9はどちらも、10mg/Lを上回る脂肪アルコール（おそらくは内在性tesAによる細胞における遊離脂肪酸の蓄積に起因する）をもたらさなかった。総合すると、このデータは、脂肪酸はこれらCARホモログの基質であること、および（アシルACPから脂肪酸を遊離させるための）‘tesAなどのチオエステラーゼの過剰発現によって脂肪アルコールの有意な生産が達成されることを示している。
【０３９１】
ある発酵では、pACYCDuet-1-carB＋pETDuet-1-tesAで同時形質転換されたE. coli C41（DE3, ΔfadE）が、平均695mg/Lの脂肪アルコールと120mg/Lの脂肪アルデヒドを生産した。多量の脂肪アルデヒドの存在は、CARがアルデヒド生成型の脂肪酸レダクターゼ（aldehyde-generating, fatty acid reductase；AFAR）であることと合致している。この機序は、JjFARに代表されるアルコール生成型の脂肪酸アシルCoAレダクターゼ（FAR）や、Acr1に代表される脂肪酸アシルCoAレダクターゼとは異なっている。
【０３９２】
上述のE. coli株における脂肪アルデヒドからの脂肪アルコールの生産は、内在性アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されたのだろう。E. coliは、さまざまな鎖長の脂肪アルデヒドを脂肪アルコールに変換する能力を有するアルコールデヒドロゲナーゼ（例えばyjgB）を産生する（Naccaratoら, Lipids 9:419-428 (1974)；Reiserら, J.Bacteriol. 179:2969-2975 (1997)；Venkitasubramanianら, J.Biol.Chem. 282:478-485 (2007)）。
【０３９３】
したがって、脂肪アルコール生合成経路ではカルボン酸レダクターゼだけでなくアルコールデヒドロゲナーゼも役割を果たしうる。例えば、yjgBまたはalrAadp1のどちらか一つが、carBおよびリーダーレスtesAと共に発現すると、yjgBもalrAadp1も過剰発現しない株と比較して、脂肪アルデヒドの蓄積量が有意に減少した（図2）。
【０３９４】
pACYCDuet-1-carBをE. coli C41株（DE3, ΔfadE）に形質転換した場合、発酵後に、白くて丸い円板状の沈着物が、組換えE. coli株による脂肪アルコール生産に使用したフラスコの底の中心に観察された。対照的に、carホモログを発現しない対照フラスコの底には、そのような沈着物が観察されなかった。酢酸エチル（1％の酢酸（v/v）を含む）に溶解した沈着物をGC/MS分析したところ、その沈着物は脂肪アルコール沈着物であることが明らかになった。
【０３９５】
C．異なるCARホモログによって生産される脂肪アルコールのタイプ
E. coli C41株（DE3, ΔfadE）において発現されるCARホモログに依存して、脂肪アルコールの異なる混合物が生産された。評価した3つのCARホモログの間で、組成の異なる脂肪アルコールが観察された（表10参照）。FadD9は、12より長い炭素差長を有する他の脂肪アルコールと比較して、より多くのC12脂肪アルコールを生産した。CarAとCarBはどちらも、FadD9を発現させた場合に観察されたものよりも広い範囲にわたる鎖長の脂肪アルコールを生産した。
【０３９６】
【表１０】
2012506715.tif 000011
*リーダーレスTesA。C12はC12：0脂肪アルコールとC12:1脂肪アルコールを含む。
【０３９７】
D．脂肪アルコールの定量および同定
GC-MSは、30m×0.25mm（0.10μmフィルム）のDB-5カラムを装着したAgilent 5975B MSDシステムを使って行った。カラム温度を100℃で3分間等温にした。20℃/分の速度で100℃から320℃まで昇温するようにカラムをプログラムした。最終温度に到達したら、カラムを320℃で5分間、等温に保った。注入体積は1μLとした。キャリアガスのヘリウムは1.3mL/分の流量で放出した。質量分析計には電子衝撃イオン化源を装着した。イオン化源温度は300℃に設定した。
【０３９８】
定量に先立ち、2つの方法を使ってさまざまなアルコールを同定した。まず最初に、各化合物のGC保持時間を、セチルアルコール、ドデカノール、テトラデカノール、オクタデカノール、およびcis-9-オクタデセノールなどの既知標準物質の保持時間と比較した。次に、化合物の質量スペクトルを質量スペクトルライブラリー中の標準物質の質量スペクトルと突き合わせることによって、各化合物の実体を確認した（例えばC12：0、C12：1、C13：0、C14：0、C14：1、C15：0、C16：0、C16：1、C17：0、C18：0およびC18:1アルコール）。
【０３９９】
［実施例4］
E. coli MG1655（DE3, ΔfadD）におけるCARホモログの異種発現による脂肪アルコールの生産
fadD欠失株の構築
以下に述べるように、ラムダred系（Datsenkoら, 2000, Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 97:6640-6645）を使って、E. coli MG1655のfadD遺伝子を欠失させた。プライマーfad1（5'-TAACCGGCGTCTGACGACTGACTTAACGCTCAGGCTTTATTGTCCACTTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3'）（配列番号205）、およびfad2（5'-CATTTGGGGTTGCGATGACGACGAACACGCATTTTAGAGGTGAAGAATTGCATATGAATATCCTCCTTTAGTTCC-3'）（配列番号206）を使って、pKD3のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を増幅した。このPCR産物をE. coli MG1655（pKD46）中にエレクトロポレーションした。細胞をL-クロラムフェニコール（30μg/mL）（L-Cm）上にプレーティングし、37℃で終夜成長させた。個々のコロニーを別のL-Cmプレートに拾い、42℃で成長させた。次に、これらのコロニーをL-CmおよびL-カルベニシリン（100mg/mL）（L-Cb）プレートにパッチング（patch）し、37℃で終夜成長させた。PCR産物が正しい部位に挿入されていることを保証するために、CmRかつCbSであるコロニーをPCRでさらに評価した。PCR検証は、プライマーfadF（5'-CGTCCGTGGTAATCATTTGG-3'）（配列番号207）およびfadR（5'-TCGCAACCTTTTCGTTGG-3'）（配列番号208）を使って、これらの細菌のコロニー溶解物で行った。ΔfadD::Cm欠失の予想サイズは約1200bpだった（図4）。Datsenkoら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640-6645 (2000)に記載されているように、FLPヘルパープラスミドを使って、クロラムフェニコール耐性遺伝子を排除した。欠失のPCR検証は、プライマーfadFおよびfadRを使って行った（図4）。MG1655 ΔfadD株は、M9＋オレイン酸寒天（oleate agar）プレート（炭素源としてのオレイン酸）では成長できなかった。これはM9＋オレイン酸液体培地でも成長できなかった。この成長欠損は、トランスに（pCL1920-Ptrcにのせて）供給されるE. coli fadD遺伝子によって補完された。
【０４００】
MG1655（DE3, ΔfadD）株の構築
T7応答性株を作製するために、λDE3溶原化キット（Lysogenization Kit）（Novagen）を利用した。これは、E. coli宿主染色体中にλDE3プロファージを部位特異的に組み込んで、T7発現ベクターにクローニングされたターゲット遺伝子を発現させるために溶原宿主を使用することができるようにするためのキットである。λDE3は、lacUV5の制御下にあるT7 RNAポリメラーゼのクローン化遺伝子を保持する組換えファージである。簡単に述べると、宿主株を、0.2％マルトース、10mM MgSO4、および抗生物質を添加したLB中、37℃で、OD600が0.5になるまで培養した。次に、108pfuのλDE3、108pfuのヘルパーファージ（Helper Phage）、および108pfuの選択ファージ（Selection Phage）を、10μLの宿主細胞と共にインキュベートした。ファージが宿主に吸着できるように、宿主/ファージ混合物を37℃で20分間インキュベートした。最後に、その混合物を、抗生物質を添加したLBプレート上にピペッティングした。プレーティングビーズ（plating beads）を使って、混合物を均等に塗り拡げ、プレートを上下逆さにして、37℃で終夜インキュベートした。
【０４０１】
λDE3溶原菌候補を、T7テスターファージ（Tester Phage）の成長を支持するその能力によって評価した。T7テスターファージは、活性なT7 RNAポリメラーゼが宿主細胞によって提供されない限り完全に欠損性であるT7ファージ欠失突然変異体である。T7テスターファージは、IPTGの存在下では、標準（authentic）λDE3溶原菌に、極めて大きなプラークを作り、一方、誘導物質の非存在下では、はるかに小さなプラークが観察される。IPTGの非存在下におけるプラークの相対的サイズは、溶原菌におけるT7 RNAポリメラーゼの基礎レベル発現の目安であり、異なる宿主バックグラウンド間で幅広く変動しうる。
【０４０２】
DE3溶原性の存在を確認するために、次に述べる手法を使用した。まず最初に、0.2％マルトース、10mM MgSO4、および抗生物質を添加したLB中、37℃で、OD600が0.5になるまで、候補コロニーを成長させた。次に、T7テスターファージのアリコート（aliquot）を、1×ファージ希釈緩衝液（Phage Dilution Buffer）に、力価が2×103pfu/mLになるように希釈した。2本1組のチューブで、100μLの宿主細胞を100μLの希釈ファージと混合した。プロファージが宿主に吸着できるように、宿主/ファージ混合物を室温で10分間インキュベートした。次に、宿主とファージが入っている各チューブに、3mLの溶融トップアガロースを加えた。2つの複製物のうち、一方の内容物をLBプレートにプレーティングし、もう一方は、T7 RNAポリメラーゼの誘導を評価するために0.4mM IPTG（イソプロピル-b-チオガラクトピラノシド）を添加したLBプレートにプレーティングした。トップアガロースが固化するまでプレートを5分間静置した。次に、プレートを、30℃で終夜、上下逆さにしておいた。
【０４０３】
MG1655（DE3, ΔfadD, yjgB::kan）株の構築
以下のラムダred系（Datsenkoら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640-6645 (2000)）を使って、yjgBノックアウト株MG1655（DE3, ΔfadD, yjgB::kan）を構築した。
【０４０４】
プライマーyjgBRn（5'-GCGCCTCAGATCAGCGCTGCGAATGATTTTCAAAAATCGGCTTTCAACACTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3'）（配列番号209）およびyjgBFn（5'-CTGCCATGCTCTACACTTCCCAAACAACACCAGAGAAGGACCAAAAAATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3'）（配列番号210）を使って、pKD13のカナマイシン耐性遺伝子を増幅した。次に、そのPCR産物をE. coli MG1655（DE3, ΔfadD）/pKD46中にエレクトロポレーションした。細胞をカナマイシン（50μg/mL）（L-Kan）上にプレーティングし、37℃で終夜成長させた。個々のコロニーを別のL-Kanプレートに拾い、42℃で成長させた。次に、これらのコロニーをL-Kanおよびカルベニシリン（100mg/mL）（L-Cb）プレートにパッチング（patch）し、37℃で終夜成長させた。PCR産物が正しい部位に挿入されていることを保証するために、kanRかつCbSであるコロニーをPCRでさらに評価した。PCR検証は、プライマーBF（5'-gtgctggcgataCGACAAAACA-3'）（配列番号211）およびBR（5'-CCCCGCCCTGCCATGCTCTACAC-3'）（配列番号212）を使って、これらの細菌のコロニー溶解物で行った。yjgB::kanノックアウトの予想サイズは約1450bpだった。
【０４０５】
MG1655（DE3, ΔfadD）株を使った脂肪アルコール生産に関するFadDの評価
実施例3では、E. coliにおける‘TesA、CARホモログ、および内在性アルコールデヒドロゲナーゼからの脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコール生産に、fadE欠失株を使用した。CARホモログがアシルCoAではなく脂肪酸を基質として使用することを実証するために、生産される脂肪酸がCoAによって活性化されないように、大腸菌においてアシルCoAシンターゼをコードしている遺伝子（fadD）を欠失させた。E. coli MG1655株（DE3, ΔfadD）を、pETDuet-1-‘tesAおよびpACYCDuet-1-carBで形質転換した。その形質転換体を、本明細書に記載する方法を使って、脂肪アルコール生産について評価した。これらの形質転換体は約360mg/Lの脂肪アルコール（ドデカノール、ドデセノール、テトラデカノール（tetredecanol）、テトラデセノール（tetredecenol）、セチル、ヘキサデセノール、およびオクタデセノール）を生産した。
【０４０６】
YjgBはアルコールデヒドロゲナーゼである
YjgBが、脂肪アルデヒドから対応する脂肪アルコールへの変換を担っているアルコールデヒドロゲナーゼであることを確認するために、pETDuet-1-‘tesAおよびpACYCDuet-1-fadD9を、MG1655（DE3, ΔfadD）またはMG1655（DE3, ΔfadD, yjgB::kan）に、同時形質転換した。同時に、MG1655（DE3, ΔfadD, yjgB::kan）を、pETDuet-1-‘tesA-yjgBとpACYCDuet-1-fadD9の両方で形質転換した。
【０４０７】
E. coli形質転換体を、カルベニシリン（100mg/L）およびクロラムフェニコール（34mg/L）を添加した3mLのLB培地中、37℃で成長させた。終夜成長させた後、カルベニシリンおよびクロラムフェニコールを添加した2mLの新鮮なLB培地に、15μLの培養物を移した。3.5時間成長させた後、2％グルコース、カルベニシリンおよびクロラムフェニコールを含む20mLのM9培地が入っている125mLフラスコに、2mLの培養物を移した。培養物のOD600が0.9に達したら、1mMのIPTGを各フラスコに加えた。37℃で20時間成長させた後、20mLの酢酸エチル（1％の酢酸（v/v）を含む）を各フラスコに加えて、発酵中に生産された脂肪アルコールを抽出した。粗酢酸エチル抽出物を本明細書に記載するようにGC/MSで直接分析した。
【０４０８】
yjgBノックアウト株は、ドデカナールの著しい蓄積と、低下した脂肪アルコール力価をもたらした（図5）。yjgBノックアウト株におけるプラスミドpETDuet-1-‘tesA-yjgBからのyjgBの発現は、ドデカナールの蓄積を効果的に除去した（図5）。このデータは、YjgBがドデカノールへのドデカナールの変換に関与していること、およびE. coliには他のアルコールデヒドロゲナーゼが存在して、他のアルデヒドをアルコールに変換しているであろうことを示している。ドデカナールはyjgBノックアウト株では蓄積したが、野生型基準株（MG1655（DE3, ΔfadD））や、yjgB発現プラスミドを有するyjgBノックアウト株では、これが観察されなかった。矢印（図5）は、ドデカナール（C12：0アルデヒド）のGCトレース（trace）を示す。
【０４０９】
［実施例5］
E. coliにおける飽和脂肪アルコールの生産
商業用の脂肪アルコールは飽和アルコールである。しかしE. coliは、通例、流動性を維持するために一定量（約20〜25％）の不飽和脂肪酸を、その膜内に有する。不飽和脂肪酸またはシクロプロパン脂肪酸を添加していない培地中で、もっぱら飽和脂肪酸を生産することができ、飽和脂肪アルコールを生産することができるE. coli株を、工学的に作出した。
【０４１０】
それぞれfabAおよびfabBによってコードされる2つの酵素、デヒドラターゼ/イソメラーゼおよびケトアシルシンターゼI（KASI）は、不飽和脂肪酸生合成に関与する。通常、FabAまたはFabBのどちらか一方を欠くE. coli株は、オレイン酸などの不飽和脂肪酸を添加しなければ生残しない。これを克服するために、E. coli宿主株からfabB遺伝子をノックアウトし、Bacillus subtilisの組換えデサチュラーゼ遺伝子（AF037430、DesAをコードする）を発現するように細胞を遺伝子改変したところ、その株は、不飽和脂肪酸を添加しなくても成長することができるようになった。desAを発現する株の第1世代は正常な成長のためにオレイン酸を要求したが、その後、その株をL寒天プレートに数回プレーティングすることにより、成長にオレイン酸を要求しない株がもたらされた。
【０４１１】
材料
E. coliJWC280細胞（Campbellら, Mol.Microbiol. 47:793-805 (2003)に記載）およびE. coli GRT23細胞（Morgan-Kissら, Arch.Microbiol. 190:427-437 (2008)に記載）は、John Cronanから得た。
【０４１２】
プラスミド構築
プライマーdelta5Fnおよびdelta5Rn（表11に掲載）を使って、Bacillus subtilis168株のゲノムDNAから、desA遺伝子（Δ5 desともいう）を増幅し、AvrIIおよびEcoRIで消化した。次に、そのdesA遺伝子を、AvrII-EcoRIで線状化しておいたpET-21(a)中にクローニングして、pET-21a-Δ5を作製した。次に、desA遺伝子をpET-21a-Δ5からNdeI-EcoRIフラグメントとして取り出し、trcプロモーターを保持するpACYC由来のプラスミドOP180のNdeI部位とEcoRI部位の間に挿入した。その結果得られたプラスミドをpACYC-Δ5と名付けた。
【０４１３】
desA_kan遺伝子カセットを、CDFDuet-1のAvrII-BamHI部位間にクローニングした。kan遺伝子カセットは、プライマーkanFおよびkanR（表11参照）を使って、テンプレートとしてのpKD13（pKD13は、The Coli Genetic Stock Center（イェール大学）から入手した。pKD13は、Datsenkoら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640-6645 (2000)に記載されている）から増幅したPCR産物のEcoRIおよびBamHI消化によって作製した。増幅したdesA遺伝子（上述）をAvrIIおよびEcoRIで消化した。次に、desA遺伝子のAvrII-EcoRIフラグメントと、kan遺伝子のEcoRI-BamHIフラグメントとを、pCDFDuet-1（EMD Chemicals、ニュージャージー州ギブズタウンから入手）のAvrII-BamHI部位間に挿入してプラスミドを作製し、それをpCDFDuet-1-Δ5-kanと名付けた。
【０４１４】
数回のサブクローニングステップにより、fabBをdesA_kanカセットで置き換えるために、p84.17fabBΔ5kanプラスミドを構築した。まず最初に、E. coli MG1655ゲノムDNAから、プライマーfabBLFおよびfabBLR（表11参照）を使って、fabBの上流領域に隣接するDNAフラグメント（L-fabB）を増幅し、プライマーfabBRFおよびfabBRR（表11参照）を使って、fabBの下流領域に隣接するDNAフラグメント（R-fabB）を増幅した。次に、L-fabBをXbaIおよびBglIIで消化し、R-fabBをNotIおよびBglIIで消化した。消化されたL-fabBおよびR-fabBフラグメントをアガロースゲルから精製し、XbaI-NotI線状化pKOVとライゲーションした。その結果得られたプラスミドをpHZ1.186と名付けた。次に、desA_kan遺伝子カセットをpCDFDuet-1-Δ5-kanからAvrII-BamHIフラグメントとして取り出し、pHZ1.186のAvrII部位とBglII部位の間に挿入することにより、L-fabBとR-fabBに挟まれたdesA_kan遺伝子カセットを得た。最後に、fabBLFおよびfabBRR（表11参照）を使って、pHZ1.186からL-fabB-desA_kan-R-fabBフラグメントを増幅し、pMOD-4-MCS（Epicentre Biotechnologies、ウィスコンシン州マディソン）の2つのPvuII部位間にクローニングした。最終プラスミドをp84.17fabBと名付けた。
【０４１５】
fabB::cmの約1kb上流から約1kb下流までにわたるDNAを、GRT23細胞のゲノムから、プライマーfabBupおよびfabBdowm（表11参照）を使って増幅した。次に、増幅したDNAフラグメントをPvuIIで消化し、pMOD-4-MCSの2つのPvuII部位間に挿入した。その結果得られたプラスミドをp84.15と名付けた。
【０４１６】
チオエステラーゼ(‘TesA）と脂肪酸レダクターゼ（CarB）をコードする遺伝子を、1つのオペロンとしてクローニングし、そのオペロンを、trcプロモーターおよびpCL1920ベクターの下に置いた。最終プラスミドをpCL-Ptrc-carB_‘tesAと名付けた（配列を図17に配列番号213として掲載する）。
【０４１７】
【表１１】
2012506715.tif 000012
【０４１８】
株構築
p84.15fabBをMG1655（ΔfadEΔfhuA）/pACYC-Δ5中に形質転換することにより、E. coli MG1655（ΔfadEΔfhuAfabB::cm）/pACYC-Δ5株を構築した。プラスミド p84.17fabBをMG1655（ΔfadEΔfhuAfabB::cm）/pACYC-Δ5中に形質転換して、MG1655（ΔfadEΔfhuAfabB::desA_kan）/pACYC-Δ5を作出した。各形質転換後に、形質転換体混合物を、1mM IPTGと適当な抗生物質（17mg/Lのクロラムフェニコールまたは50mg/Lのカナマイシン）を添加したL寒天プレート上にプレーティングした。
【０４１９】
MG1655（ΔfadEΔfhuAfabB::desA_kan）/pACYC-Δ5は、オレイン酸（カリウム塩、50mg/L）を添加したLブロス中で正常に成長した。50mg/Lのオレイン酸を添加したL寒天プレート上に細胞をプレーティングし、37℃で2日間インキュベートした。次に、コロニーを、50mg/Lのオレイン酸および100mg/Lのカルベニシリンを添加したL寒天プレート上にパッチングした。カルベニシリンに対する耐性は失ったがカナマイシン耐性は保っているコロニーの一つを、50mg/Lのカナマイシンを添加したがオレイン酸は添加していないL寒天プレートに画線した。そのプレートからコロニーの一つを選択し、ALC119Aと名付けた。
【０４２０】
脂肪アルコール経路を有するALC119Aはほとんど排他的に飽和脂肪アルコールを生産した
プラスミドpCL-Ptrc-carB_’tesAを、ACL119A株中に形質転換した。ALC119A/pCL-Ptrc-carB_'tesAの形質転換体3つを、37℃の振とう機において、100mg/Lのスペクチノマイシンを含む3mLのLブロス中で、終夜成長させた。15μLの終夜培養物を、100mg/Lのスペクチノマイシンと2μLの70％オレイン酸カリウムを含む2mLの新鮮なLブロスに移した。その新鮮接種物を37℃の振とう機に約3時間入れておいた。次に、2mLの培養物を、125mLバッフル付きフラスコ中の20mLのV9培地（塩化第二鉄を含まないHu9培地）に移した。培養物のOD600が約0.9に達した時に、1mMのIPTGを各フラスコに加えた。37℃で20時間成長させた後、20mLの酢酸エチル（1％の酢酸（v/v）を含む）を各フラスコに加えて、発酵中に生産された脂肪アルコールを抽出した。粗酢酸エチル抽出物を、WO 2008/119082に記載されているように、GC/MSで直接分析した。脂肪アルコールを定量するための参照物質（reference）としてセチルアルコールを使用した。
【０４２１】
図13に示すように、ALC119A/pCL-Ptrc-carB_’tesA株は、ドデカノール、テトラデカノールおよびヘキサデカノールを含む飽和脂肪アルコールを、ほとんど排他的に生産した。
【０４２２】
［実施例6］
シアノバクテリアSynechococcus sp. PCC7002における脂肪アルコールの生産
この実施例では、carB-‘tesA-yahK経路を使って（グルコースの代わりに）二酸化炭素から脂肪アルコールを生産するための光独立栄養性細菌の使用について説明する。まず最初に、Synechococcus sp. PCC7002プラスミドpAQ1（genbankアクセッションNC_0050525）中にpAQ1の位置3301〜3800および3801〜4300に対応する500bpの相同領域を使って相同組換えするためのベクターを構築する。選択可能マーカーとして、アミノグリコシド3'アデニリルトランスフェラーゼaadのプロモーター、遺伝子およびターミネーターを含有するスペクチノマイシン耐性カセット（プラスミドpCL1920由来）を、相同領域の間に付加する。遺伝子発現のために、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼaphのプロモーターおよびリボソーム結合部位（プラスミドpACYC177由来）を付加し、その後に、異種遺伝子またはオペロンを挿入するためのユニーククローニング部位NdeIおよびEcoRIが続くようにする。この組込みカセット全体を遺伝子合成によって構築し、維持および送達用のpUC19中にクローニングする。その結果得られるプラスミドpLS9-7002は、（i）外来遺伝子のクローニングおよび発現、ならびに（ii）Synechococcus sp. PCC7002プラスミドpAQ1への送達および安定なインビボ組込みを可能にする。
【０４２３】
Synechococcus sp. PCC7002で発現させるための脂肪アルコール経路は、次のように構築される。‘tesAの下流にyahKを付加し、次に、aphプロモーターおよびリボソーム結合部位の下流にあるpLS9-7002のNdeIおよびEcoRI部位中にクローニングすることにより、pCL-Ptrc-carB-‘tesA（実施例4に記載）のcarB-‘tesAオペロンを伸長する。その結果得られるプラスミドを、Stevensら（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 77:6052-6056 (1980)）によって記載されているように、Synechococcus sp. PCC7002中に形質転換する。安定な組込み体を、15μg/mLスペクチノマイシンを添加したATCC1047培地上で選択する。1LのATCC1047培地は、40mgのMgSO4・7H2O、20mgのCaCl2・2H2O、750mgのNaNO3、2mgのK2HPO4、3.0mgのクエン酸、3.0mgのクエン酸第二鉄アンモニウム、0.5mgのEDTA、20mgのNa2CO3、2.86mgのH3BO3、1.81mgのMnCl2、0.22mgのZnSO4、0.04mgのNa2MoO4、0.08mgのCuSO4、0.05mgのCo(NO3)2、0.02mgのビタミンB12、10gの寒天、および750mLの海水を含有する。スペクチノマイシン耐性コロニーを、スペクチノマイシンを含むATCC培地1047上に数回、再画線し、プライマーpAQ1-U（atgtctgacaaggggtttgacccct）（配列番号224）およびpAQ1-D（gcacatccttatccaattgctctag）（配列番号225）を用いるPCRにより、carB-‘tesA-yahKオペロンのアイソジェニック組込み（isogenic integration）について調べる。次に、完全なアイソジェニックcarB-‘tesA-yahK組込み体を、500mL振とうフラスコに入っているスペクチノマイシンを含む50mLの液体ATCC1047培地中、適当な曝気および照明下に、30℃で5〜7日間、成長させる。さまざまな時点で、培養物のアリコートを等体積の酢酸エチルで抽出し、抽出物を、実施例3で説明したように、脂肪アルコール生産について分析する。脂肪アルコールが生産される。
【０４２４】
［実施例7］
シアノバクテリアSynechococcus elongatus PCC7942における脂肪アルコールの生産
この実施例では、carB−‘tesA-yahK経路を使って（グルコースの代わりに）二酸化炭素から脂肪アルコールを生産するために光独立栄養性細菌を使用するもう一つの方法について説明する。まず最初に、Synechococcus elongatus PCC7942ゲノム（genbankアクセッションCP_000100）中にCP_000100の位置2577844〜2578659および2578660〜2579467に対応する800bpの相同領域を使って相同組換えするためのベクターを構築する。この染色体位置はニュートラルサイト1（neutral site one：NS1）と呼ばれている（Mackeyら, Meth.Mol.Biol. 362:115-129 (2007)）。選択可能マーカーとして、アミノグリコシド3’アデニリルトランスフェラーゼaadのプロモーター、遺伝子およびターミネーターを含有するスペクチノマイシン耐性カセット（プラスミドpCL1920由来）を、相同領域の間に付加する。さらに、異種遺伝子またはオペロンを挿入するためのユニーククローニング部位NdeIおよびEcoRIを付加する。この組込みカセットを遺伝子合成によって構築し、維持および送達用のpUC19中にクローニングする。その結果得られるプラスミドpLS9-7942_NS1は、（i）外来遺伝子のクローニングおよび発現、ならびに（ii）Synechococcus elongatus PCC7942ゲノムへの送達および安定なインビボ組込みを可能にする。
【０４２５】
carB-‘tesA-yahKオペロン全体（実施例6に記載）を、そのptrcプロモーターおよびリボソーム結合部位を含めて、pLS9-7942_NS1のNdeIまたはEcoRI部位にクローニングする。その結果得られるプラスミドを、Mackeyら, Meth.Mol.Biol. 362:115-129 (2007)によって記載されているように、S. elongatus PCC7942中に形質転換する。安定組込み体を、4μg/mLスペクチノマイシンを添加したBG-11培地上で選択する。1LのBG-11培地は、75mgのMgSO4・7H2O、36mgのCaCl2・2H2O、1.5gのNaNO3、40mgのK2HPO4、6.0mgのクエン酸、6.0mgのクエン酸第二鉄アンモニウム、1.0mgのEDTA、20mgのNa2CO3、2.86mgのH3BO3、1.81mgのMnCl2、0.22mgのZnSO4、0.04mgのNa2MoO4、0.08mgのCuSO4、0.05mgのCo(NO3)2、および10gの寒天を含有する。スペクチノマイシン耐性コロニーを、スペクチノマイシンを含むBG-11培地上に数回、再画線し、プライマーNS1-U（gatcaaacaggtgcagcagcaactt）（配列番号226）およびNS1-D（attcttgacaagcgatcgcggtcac）（配列番号227）を用いるPCRにより、carB-‘tesA-yahKオペロンのアイソジェニック組込みについて調べる。次に、完全なアイソジェニックcarB-‘tesA-yahK組込み体を、500mL振とうフラスコに入っているスペクチノマイシンを含む50mLの液体BG-11培地中、適当な曝気および照明下に、30℃で最長7日間、成長させる。さまざまな時点で、培養物のアリコートを等体積の酢酸エチルで抽出し、抽出物を、実施例3で説明したように、脂肪アルコール生産について分析する。脂肪アルコールが生産される。
【０４２６】
［実施例8］
E. coliにおける脂肪アルコールのマロニルCoA非依存的生産
Euglena gracilisなど一定の原生生物は、マロニルCoA非依存的に脂肪酸を生合成する能力を有する。この経路のための生合成機構はミトコンドリア内にあり、C8〜C18脂肪酸を生産するためのプライミング基質および伸長基質としてアセチルCoAを使用することにより、β-酸化を逆行するように進むと考えられている（Inuiら, Eur.J.Biochem. 142:121-126 (1984)）。関与する酵素はtrans-2-エノイルCoAレダクターゼ（TER）であり、これは、アシルCoAへのtrans-2-エノイルCoAの不可逆的還元を触媒することにより、本来可逆的である経路を、還元方向に駆動する（一方、β-酸化の場合はその反対であり、不可逆的アシルCoAデヒドロゲナーゼFadEが反応を酸化方向に駆動する）。E. gracilisに由来する1つのTER遺伝子と、他の真核生物ホモログおよび原核生物ホモログが知られている（Hoffmeisterら, J.Biol.Chem. 280:4329-4338 (2005)；Tucciら, FEBS Lett. 581:1561-1566 (2007)）。唯一知られているE. gracilis由来のTER酵素は、インビトロで、trans-2-ブテノイルCoA（C4）およびtrans-2-ヘキセノイルCoA（C6）をそれぞれのアシルCoAに還元することが示されている（より長鎖のtrans-2-エノイルCoAは調べられていない）。現在、E. gracilisにおける他の経路酵素については、ほとんどわかっていない。
【０４２７】
（Euglena gracilisミトコンドリアの場合のように）もっぱらアセチルCoA前駆体からアシルCoAへのフラックスを生成する経路は、次に挙げる4つの酵素活性を有するさまざまな酵素セットを使って、E. coli内に工学的に作出することができる：（i）非脱炭酸縮合チオラーゼ（non-decarboxylating, condensing thiolase）、（ii）3-ケトアシルCoAレダクターゼ（または3-ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ）、（iii）3-ヒドロキシアシルCoAヒドラターゼ（またはエノイルCoAデヒドラターゼ）および（iv）trans-2-エノイルCoAレダクターゼ。4つの酵素はいずれも、より長い鎖長（例えばC12またはC14）を有するアシルCoAの合成が可能となるよう、十分に緩い鎖長特異性を有することができる。
【０４２８】
4つの活性を全てコードするプラスミドを、次のように構築する。E. coli fadA（YP_026272）（図17に配列番号229として示す）（非脱炭酸チオラーゼ）およびfadB（NP_418288）（図17に配列番号231として示す）（3-ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼおよびエノイルCoAデヒドラターゼ）ならびにE. gracilis ter（Q5EU90）（図17に配列番号228として示す）（trans-2-エノイルCoAレダクターゼ、コドン最適化され、輸送ペプチドをコードするその5'配列を持たないもの）の合成オペロンを構築し、カルベニシリンまたはクロラムフェニコール耐性遺伝子を有するpACYCプラスミド中、ptrcプロモーターの下流にクローニングする。あるいは、E. coli fadAおよびfadB遺伝子の代わりに、E. coli fadI（NP_416844）（図17に配列番号223として示す）およびfadJ（NP_416843）（図17に配列番号235として示す）遺伝子（または他の生物の対応するオルソログ）を使用する。E. gracilis ter遺伝子の代替物として、他の生物の対応するオルソログまたはE. coli fabI（NP_415804）（図17に配列番号237として示す）遺伝子を使用する。FabIは通常、trans-2-エノイル-ACPを還元するが、これはtrans-2-エノイルCoAでも活性である（Berglerら, J.Biol.Chem. 269:5493-5496 (1993)）。
【０４２９】
pACYC-ptrc_fadAB-terプラスミドまたはpACYC-ptrc_fadAB-fabIプラスミドを、pCL-ptrc_carB-‘tesAプラスミド（実施例4に記載）と共に、E. coliΔfadE株に同時形質転換する。これらの株を培養し、抽出し、実施例3で説明したように、脂肪アルコール生産について分析する。これら2つの異なる株は、異なる鎖長分布を有する脂肪アルコールを生産する。
【０４３０】
これらの株は‘TesAを発現するので、生産される脂肪アルコールの一部は、マロニルCoA依存的アシルACP前駆体から誘導される。‘TesAは、アシルACPと比較するとアシルCoAに対して、より高い特異的活性を有するものの、E. coliにおいて過剰発現すると、アシルACPを効率よく加水分解する。マロニルCoA非依存的経路から誘導される脂肪アルコールの比率を高めるか、マロニルCoA非依存的経路から誘導される脂肪アルコールを排他的に生産するには、‘TesAの代わりに、アシルACPに対する加水分解活性が低い代替的チオエステラーゼを使用する。その一例は、E. coli TesB（NP_414986）である。これは、アシルACPよりアシルCoAを好み（Spencerら, J.Biol.Chem. 253:5922-5926 (1978)）、E. coliにおいて過剰発現しても、アシルACPを加水分解しない（Zhengら, App.Environ.Microbiol. 70:3807-3813 (2004)）。代替的方法では、TesAおよびTesBのオルソログまたは他のタンパク質ファミリーのチオエステラーゼであって、アシルCoAを高い効率で加水分解し、同時にアシルACPは低い効率で加水分解するものを使用する。
【０４３１】
ある方法では、‘tesA遺伝子をtesB遺伝子（NP_414986）（図17に配列番号239として示す）で置き換えることにより、実施例4で述べたように、pCL-ptrc_carB-‘tesBプラスミドを構築する。そのプラスミドを、pACYC-ptrc_fadAB-terプラスミドまたはpACYC-ptrc_fadAB-fabIプラスミドと共に、E. coli ΔfadE株中に同時形質転換する。これらの株を培養し、抽出し、実施例3で述べたように、脂肪アルコール生産について分析する。
【０４３２】
もう一つの方法では、pCL-ptrc_carB-‘tesAプラスミドを、Acinetobacter baylyi ADP1のアシルCoAレダクターゼAcr1（YP_047869）（図17に配列番号241として示す）を発現するpCL-ptrc_acr1プラスミドで置き換える。このレダクターゼは、アシルCoAを対応する脂肪アルコールに特異的に還元するが、アシルACPは還元しない（Reiserら, J.Bacteriol. 179:2969-2975 (1997)）。このプラスミドを、pACYC-ptrc_fadAB-terプラスミドまたはpACYC-ptrc_fadAB-fabIプラスミドと共に、E. coli ΔfadE株中に同時形質転換する。これらの株を培養し、抽出し、実施例3で述べたように、脂肪アルコール生産について分析する。これらの株は、マロニルCoAには依存せずに、脂肪アルコールを生産する。
【０４３３】
［実施例9］
脂肪アルコール生産の阻害剤としての鉄の同定
Hu9培地は、6g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1g/L NH4Cl、0.1mM CaCl2、1mM MgSO4、15g/L寒天、10mMグルコース、50mg/Lウラシル、および微量ミネラル（100μM FeCl3、500μM ZnCl2、200μM Na2Mo4、200μM CuSO4、200μM H3BO3を含有する）を含有する既知の発酵培地である。しかし、他の培地では脂肪アルコールを生産する能力を有する組換えE. coli株を、Hu9培地で成長させると、脂肪アルコールの生産量は著しく減少することが観察された。以下に詳述するように、さまざまな不完全Hu9培地において、E. coli株の脂肪アルコール生産能の欠如を測定したところ、鉄が培地中に存在すると、組換え細菌は脂肪アルコールを生産できないことがわかった。しかし、鉄の添加は、細菌の成長を阻害しなかった。
【０４３４】
脂肪アルコール生産の阻害に関与する構成要素を同定するために、さまざまな種類の不完全Hu9培地（そのうちの一部は、必ずしも必要でない成分を欠く）を調製し、脂肪アルコールの生産を評価した。
【０４３５】
第1ステップでは次に挙げる培地を調製した：完全Hu9培地、ウラシルを欠く不完全Hu9培地、および微量元素を欠く不完全Hu9培地。K6細胞（CARホモログcarBをコードするpACYCDuet-1-carBとpETDuet-1-‘tesAとを保持する組換え細菌C41株（DE3, ΔfadE））を、適当な抗生物質を含有する2mLのLBで培養した。ODが1.0に達した後、その2mL培養物を、125mL振とうフラスコ（上述したHu9培地の一つが入っているもの）において、体積22mLにスケールアップした。IPTGを最終濃度が1mMになるように加えることにより、培養物を誘導した。それらを37℃で20時間成長させた後、22mLの酢酸エチル（1％の酢酸（v/v）を含む）を各フラスコに加えて、発酵中に生産された脂肪アルコールを抽出した。粗酢酸エチル抽出物をGC/MSで直接分析し、総脂肪アルコール力価を定量した。
【０４３６】
図14Aに図示するように、脂肪アルコール生産は、不完全Hu9培地へのウラシルの添加よりも微量元素の添加によって、より強く阻害された。これにより、阻害性構成要素は微量ミネラル溶液の一部であることが示された。
【０４３７】
どの微量元素が脂肪アルコール生産阻害の原因であるかを解明するために、次に挙げるHu9培地を調製した：完全Hu9培地；FeCl3を欠くHu9；ZnCl2を欠くHu9；Na2Mo4を欠くHu9；CuSO4を欠くHu9；およびH3BO3を欠くHu9。これらの異なるHu9培地で成長させたK6細胞の脂肪アルコール生産を、上述の方法を使って評価した。
【０４３８】
図14Bに示すように、脂肪アルコール生産は、主として、培地への鉄の添加によって阻害された。したがって、培養培地中の鉄（例えばクエン酸第二鉄、塩化第二鉄、または硫酸第一鉄）を排除するか、その存在量を減少させることによって、脂肪アルコールを生産することができる。
【０４３９】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて記載したが、上記の説明は、添付の請求項の範囲によって規定される本発明の範囲を例示するものであって、限定するものではないことを理解すべきである。他の態様、利点、および変更実施形態は、下記請求項の範囲に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図８−９】
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【図８−１０】
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【図８−１１】
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【図８−１２】
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【図８−１３】
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【図８−１４】
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【図８−１５】
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【図８−１６】
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【図８−１７】
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【図８−１８】
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【図８−１９】
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【図８−２０】
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【図８−２１】
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【図８−２２】
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【図８−２３】
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【図８−２４】
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【図８−２５】
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【図８−２６】
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【図８−２７】
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【図８−２８】
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【図８−２９】
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【図８−３０】
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【図８−３１】
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【図８−３２】
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【図８−３３】
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【図８−３４】
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【図８−３５】
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【図８−３６】
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【図８−３７】
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【図８−３８】
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【図８−３９】
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【図８−４０】
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【図８−４１】
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【図８−４２】
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【図８−４４】
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【図８−４８】
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【図８−４９】
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【図８−５０】
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【図８−７７】
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【図８−７８】
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【図８−８０】
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【図８−８９】
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【図８−９０】
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【図８−９１】
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【図８−９２】
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【図８−９３】
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【図８−９４】
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【図８−９５】
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【図８−９６】
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【図８−９７】
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【図８−９８】
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【図８−９９】
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【図８−１００】
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【図８−１０１】
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【図８−１０２】
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【図８−１０３】
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【図８−１０４】
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【図８−１０５】
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【図８−１０６】
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【図８−１０７】
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【図８−１０８】
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【図８−１０９】
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【図８−１１０】
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【図８−１１１】
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【図８−１１２】
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【図８−１１３】
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【図８−１１４】
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【図８−１１５】
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【図８−１１６】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図９−９】
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【図９−１０】
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【図９−１１】
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【図９−１２】
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【図９−１３】
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【図９−１４】
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【図９−１５】
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【図９−１６】
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【図９−１７】
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【図９−１８】
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【図９−１９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−９】
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【図１０−１０】
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【図１０−１３】
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【図１０−１５】
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【図１０−１７】
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【図１０−１９】
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【図１０−２０】
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【図１０−２１】
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【図１０−２３】
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【図１０−２５】
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【図１０−２６】
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【図１０−２７】
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【図１０−３０】
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【図１０−３１】
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【図１０−３２】
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【図１０−３３】
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【図１０−３４】
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【図１０−３５】
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【図１０−３６】
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【図１０−３７】
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【図１０−３８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１５−７】
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【図１５−８】
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【図１５−９】
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【図１５−１０】
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【図１５−１１】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１６−６】
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【図１６−７】
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【図１６−８】
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【図１６−９】
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【図１６−１０】
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【図１６−１４】
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【図１６−１９】
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【図１６−２０】
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【図１７−１】
2012506715.tif 000231
【図１７−２】
2012506715.tif 000232
【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１７−５】
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【図１７−６】
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【図１７−７】
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【図１７−８】
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【図１７−９】
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【図１７−１０】
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【図１７−１１】
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【図１７−１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年6月23日(2011.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2012506715000001.app
【国際調査報告】
2012506715.tif 000243
2012506715.tif 000244
2012506715.tif 000245