(57)【要約】本発明は、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）関連疾患に対してブタにワクチン接種するための方法および組成物に関する。特に、本発明は、ＰＣＶ２オープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）タンパク質の短縮形態の分泌もしくは細胞膜発現を可能にする組換え発現ベクターに関する。特に、本発明は、プロモーターに作動可能に連結した改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターに関し、ここで上記改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２は、野生型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２の核局在シグナルが除去されるかもしくは改変されて、発現の際に短縮型ＯＲＦ２タンパク質の分泌が可能になったものであるか；または上記改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２は、上記核局在シグナルが、除去されかつ感染細胞の細胞表面上の上記ＰＣＶ２  ＯＲＦ２の発現を指向する疎水性シグナル配列と置換されたものである。
2012511896.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターに作動可能に連結した改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターであって、ここで
ａ．該改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２は、野生型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２の核局在シグナルが、除去もしくは改変されて、発現の際に短縮型ＯＲＦ２タンパク質の分泌が可能になったものであるか；または
ｂ．該改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２は、該核局在シグナルが、除去されかつ感染細胞の細胞表面上の該ＰＣＶ２  ＯＲＦ２の発現を指向する疎水性シグナルと置換されたものである、
組換え発現ベクター。
【請求項２】
前記ＯＲＦ２の核局在シグナルは、疎水性シグナル配列および切断部位と置換されている、請求項１に記載の組換え発現ベクター。
【請求項３】
前記ＯＲＦ２の核局在シグナルは、ニワトリγインターフェロン、ブタγインターフェロン、およびインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質からなる群より選択されるシグナル配列と置換される、請求項１に記載の組換え発現ベクター。
【請求項４】
前記ベクターは、ウイルスベクターである、請求項１に記載の組換え発現ベクター。
【請求項５】
前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクターからなる群より選択される、請求項４に記載の組換え発現ベクター。
【請求項６】
前記アデノウイルスベクターは、ＰＡｄＶ１、ＰＡｄＶ２、ＰＡｄＶ３、ＰＡｄＶ４、およびＰＡｄＶ５からなる群より選択されるブタアデノウイルスベクターである、請求項５に記載の組換え発現ベクター。
【請求項７】
前記ブタアデノウイルスベクターは、ＰＡｄＶ３である、請求項６に記載の組換え発現ベクター。
【請求項８】
前記ＰＡＶｄ３は、複製コンピテントＰＡｄＶ３である、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
前記改変型ＰＣＶ  ＯＲＦ２をコードする前記核酸配列は、ＰＡｄＶ３中の非必須配列に挿入される、請求項７に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１０】
前記ＰＡｄＶ−３の非必須配列は、Ｅ３領域、Ｅ４のＯＲＦ  １〜２および４〜７、Ｅ４の末端と該ブタアデノウイルスゲノムのＩＴＲとの間の領域からなる群より選択される、請求項９に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１１】
前記ＰＡｄＶ３は、該ＰＡｄＶ３に対してネイティブな線維遺伝子を含み、かつ該アデノウイルスに対して異種の第２の線維遺伝子をさらに含む組換えＰＡｄＶ３であり、該第２の線維遺伝子は、該第２の線維遺伝子を安定して発現する細胞株中での該組換えアデノウイルスの増殖によって、該組換えアデノウイルスによって獲得される、請求項７に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１２】
前記核酸は、配列番号１、配列番号３もしくは配列番号５の配列を含む、請求項１に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１３】
ブタにおいて免疫応答を惹起するための別の抗原をコードする核酸をさらに含む、請求項１に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１に記載の第１の組換え発現ベクター、およびブタにおいて免疫応答を惹起するためのさらなる抗原を含む第２の組換え発現ベクターを含む、組成物。
【請求項１５】
ブタにおけるブタサーコウイルス（ＰＣＶ２）感染に対して防御応答を惹起するためのワクチンであって、該ワクチンは、獣医学的に受容可能なビヒクルもしくは賦形剤、および請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換え発現ベクターを含む、ワクチン。
【請求項１６】
ブタにおけるＰＣＶ２感染に対する防御応答を惹起するためのワクチンであって、該ワクチンは、請求項１４に記載の組成物を含む、ワクチン。
【請求項１７】
ブタのワクチン接種のための１種以上のさらなる抗原をさらに含み、ここで該さらなる１種以上の抗原は、該ワクチンの獣医学的に受容可能なビヒクルもしくは賦形剤中にタンパク質成分として提供される、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１８】
ＰＣＶ−２  ＯＲＦ２によって引き起こされる疾患からブタを防御するためのワクチンであって、該ワクチンは、疎水性シグナル配列に作動可能に連結したプロモーターを含む組換えウイルスベクターを含み、該組換えウイルスベクターは、膜アンカードメインをコードする核酸、該疎水性シグナル配列とインフレームで改変型ＰＣＶ−２  ＯＲＦ２を挿入するためのマルチクローニング部位、ポリアデニル化シグナル；およびウイルスゲノムを含み、ここで該改変型ＰＣＶ−２  ＯＲＦ２は、核局在シグナルを欠いている、ワクチン。
【請求項１９】
前記ベクターは、改変型ＰＣＶ−２  ＯＲＦ２のための前記クローニング部位の直ぐ上流に、切断配列をさらに含み、ここで該ベクターからのＰＣＶ−２  ＯＲＦ  ２発現生成物は、可溶性の遺伝子生成物を生じる、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２０】
ＰＣＶ−２関連障害からブタを防御するためのワクチンであって、該ワクチンは、疎水性シグナル配列に作動可能に連結したプロモーターを含む組換えブタアデノウイルス３ベクターを含み、該組換えブタアデノウイルス３ベクターは、膜アンカードメインをコードする核酸、および該疎水性シグナル配列とインフレームで挿入されたＮＬＳ配列を欠いている短縮型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２をコードする核酸、ポリアデニル化シグナル；ならびにブタアデノウイルス３ゲノムを含む、ワクチン。
【請求項２１】
前記ワクチンは、エアロゾル投与のために処方される、請求項１７、１８または２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
前記ワクチンは、経口送達、経鼻送達、筋肉内送達、皮下送達もしくは皮内送達のために処方される、請求項１７、１８または２０に記載のワクチン。
【請求項２３】
ブタ被験体において免疫応答を惹起するための方法であって、該方法は、請求項１７、１８または２０に記載のワクチンを、該ブタ被験体において防御免疫応答を惹起するに有効な量で、該ブタ被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２４】
ブタにおけるブタサーコウイルス  ２（ＰＣＶ２）のウイルス負荷を軽減するための方法であって、該方法は、該ブタにおけるＰＣＶ２に対する免疫学的応答もしくは免疫原性応答を誘導する工程を包含し、該工程は、薬学的にもしくは獣医学的にもしくは医学的に受容可能なキャリアおよび請求項１〜１３のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む組成物を該ブタに投与する工程を包含する、方法。
【請求項２５】
前記投与する工程は、交配前に行われる、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ブタは、妊娠した雌性ブタである、請求項２３または２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
ブタサーコウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ（ＰＣＶ））は、ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ科の動物病原体であり、哺乳動物細胞において自律的に複製する最小のウイルスのうちのいくつかである。そのビリオンは、二十面体であり、エンベロープを有さず、直径１７ｎｍである。現在では、ＰＣＶの認識されたタイプが２種存在する：ブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）およびブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）。ＰＣＶ１は非病原性である一方で、ＰＣＶ２は、種々の疾患および症候群（離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）、ブタ皮膚炎腎症症候群（ＰＤＮＳ）、および先天性振戦（これらはまとめてブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）といわれ得る）が挙げられるが、これらに限定されない）と関連する。ＰＣＶ２によって引き起こされる疾患は、今や、世界の多くのブタ生産地域において大きな経済的衝撃を有すると認識されている。
【０００２】
特に商業的に重要なことには、ＰＭＷＳは、多くのブタ群において重大なレベルの死亡率およびブタ産業に対する重大な経済的損失を引き起こし得る。ＰＭＷＳは、成長遅延、皮膚の青白さ、呼吸困難、および増大した死亡率によって特徴付けられる、子ブタ（ｎｕｒｓｅｒｙ  ｐｉｇ）および肥育中のブタの疾患である。１９９１年にカナダでブタ群において最初に同定されたＰＭＷＳは、いまや世界のブタ産業の最も重大な問題のうちの１つと認識されている。種々の臨床研究から、ＰＣＶ２は、ＰＭＷＳにおいて病因論として重要であることが示された。
【０００３】
ＰＣＶ２は、２つの主要なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する約１．７６ｋｂの一本鎖環状ＤＮＡゲノムを含む（Ｍａｎｋｅｒｔｚら，２０００）。キャプシドタンパク質（Ｃａｐタンパク質）は、上記ウイルスゲノムのＯＲＦ２によってコードされ、上記ウイルスの主要な構造タンパク質であり、タイプ特異的エピトープを有する（Ｍａｈｅら，２０００；Ｎａｗａｇｉｔｇｕｌら，２０００）。中和モノクローナル抗体および中和ブタ血清は、上記キャプシドタンパク質と反応することが示された（Ｐｏｇｒａｎｉｃｈｎｙｙら，２０００；ＭｃＮｅｉｌｌｙら，２００１；Ｌｅｋｃｈａｒｏｅｎｓｕｋら，２００４）。ＰＣＶ２の免疫関連ＯＲＦ２エピトープは、ウイルス感染の血清学的マーカーとして同定された（Ｔｒｕｏｎｇら，２００１）。ＰＣＶ２の血清学的分析は、上記ウイルスが液性免疫を惹起し得ることを示した。受動免疫の期間がより長いことが、ＰＣＶ２感染に耐えるために子ブタにとって重要であり、よって、ＰＭＷＳの徴候を示す可能性は低くなる（Ｂｌａｎｃｈａｒｄら，２００３ａ）。このことは、先天免疫がなくなって、子ブタがＰＣＶ２に感染しやすくなる時点より前に子ブタに免疫を誘導するようにワクチン接種法が設計され得る場合に、ＰＣＶ２ワクチンアプローチを可能にする。しかし、利用可能な、有効なワクチンは存在しない。
【０００４】
ブタアデノウイルス（ＰＡｄＶ）発現系は、ＰＣＶ２ワクチンを生成するためのもうひとつの候補である。ブタアデノウイルスは、高力価へと効率的に複製し得；クローニング空間を提供し；ＰＡｄＶは、多くのブタ細胞株および組織において組換えタンパク質の発現を可能にし；同じ細胞株もしくは組織において複数の遺伝子を発現し；上記組換えタンパク質を正確に発現し改変する。いくつかの研究は、ヒトアデノウイルス発現系を使用することによって、ＰＣＶ２のＯＲＦ２タンパク質を発現し、マウスにおいて組換えアデノウイルスの免疫原性を実証した（Ｗａｎｇら，２００６）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
にもかかわらず、ＰＣＶＡＤに対する適切な防御免疫応答を惹起するように、ウイルスベクターに挿入されかつこれによって発現される上記ＰＣＶ２  ＯＲＦ２遺伝子を使用しようと、いくつかの試みがなされてきた一方で、このような試みは、商業的に実現可能なワクチンを生成できなかった。ＰＣＶ２のＯＲＦ２は、関連疾患の血清学的なマーカーである一方で、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２が、ワクチン接種目的でウイルスベクターによって発現される場合に、このようなワクチンは、疾患からブタを保護するための十分に適切な免疫応答を生成できないことが見いだされた。本発明は、この失敗をもたらす重大な要因を初めて同定し、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２を送達するウイルスベクターに基づいて、ＰＣＶＡＤワクチンを生成しようとする以前の試みと関連した課題を克服する組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、ブタを処置するためのワクチン接種の分野の必要性に対処する。特に、本発明者らは、ウイルスベクターもしくはサブユニットワクチン組成物において有効であるために、上記ＰＣＶ−２  ＯＲＦ２が、その感染細胞によって分泌されるかもしくは感染細胞の細胞表面で少なくとも発現されるかのいずれかであるように、提示されるべきであることを発見した。
【０００７】
特に、本発明は、プロモーターに作動可能に連結した改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターに関し、ここで上記改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２は、野生型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２の核局在シグナルが除去されるかもしくは改変されて、発現の際に短縮型ＯＲＦ２タンパク質の分泌が可能になったものであるか；または上記改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２は、上記核局在シグナルが、除去されかつ感染細胞の細胞表面上の上記ＰＣＶ２  ＯＲＦ２の発現を指向する疎水性シグナル配列と置換されたものである。
【０００８】
特定の実施形態において、上記組換え発現ベクターは、上記ＰＣＶ２  ＯＲＦ２の核局在シグナルが、疎水性シグナル配列および切断部位と置換されているものである。上記切断部位の存在は、発現生成物が分泌型生成物として放出されることを可能にする。特定の実施形態において、上記ＯＲＦ２の核局在シグナルは、例えば、ニワトリγインターフェロン、ブタγインターフェロン、およびインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質からなる群より選択される（が、これらに限定されない）シグナル配列と置換される。使用され得る多くの他のシグナル配列は、下記に記載され、当業者にも公知である。
【０００９】
上記使用されるウイルスベクターは、任意のウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクターが挙げられる）であり得る。特に、上記ウイルスベクターは、ブタウイルスベクターである。より具体的な実施形態において、上記アデノウイルスベクターは、ＰＡｄＶ１、ＰＡｄＶ２、ＰＡｄＶ３、ＰＡｄＶ４、およびＰＡｄＶ５からなる群より選択されるブタアデノウイルスベクターである。特定の好ましい実施形態において、上記ブタアデノウイルスベクターは、ＰＡｄＶ３である。上記ＰＡＶｄ３は、複製コンピテントＰＡｄＶ３であることが好ましい。他の実施形態において、上記改変型ＰＣＶ  ＯＲＦ２をコードする核酸配列は、ＰＡｄＶ３中の非必須配列に挿入される。
【００１０】
ＰＡｄＶ−３の例示的な非必須配列は、Ｅ３領域、Ｅ４のＯＲＦ  １〜２および４〜７、Ｅ４の末端と上記ブタアデノウイルスゲノムのＩＴＲとの間の領域からなる群より選択される。
【００１１】
他の実施形態において、上記ＰＡｄＶ３は、上記ＰＡｄＶ３に対してネイティブな線維遺伝子を含み、かつ上記アデノウイルスに対して異種の第２の線維遺伝子をさらに含む組換えＰＡｄＶ３であり、ここで上記第２の線維遺伝子は、上記第２の線維遺伝子を安定して発現する細胞株中での上記組換えアデノウイルスの増殖によって、上記組換えアデノウイルスによって獲得される。好ましい実施形態において、上記核酸は、配列番号１、配列番号３もしくは配列番号５の配列を含む。
【００１２】
さらに他の好ましい実施形態において、上記組換え発現ベクターは、ブタにおいて免疫応答を惹起するための別の抗原をコードする核酸をさらに含む。例えば、このようなさらなる抗原は、ＰＲＲＳウイルスの抗原、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｐｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの抗原、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの抗原、Ｅ．ｃｏｌｉの抗原、Ａｔｒｏｐｈｉｃ  Ｒｈｉｎｉｔｉｓの抗原、仮性狂犬病ウイルスの抗原、豚コレラの抗原、ブタインフルエンザの抗原、およびこれらの組み合わせから生る群より選択される、別のブタ病原体のさらなる抗原からなる群より選択され得る。好ましくは、上記抗原は、ＰＲＲＳウイルスの抗原、萎縮性鼻炎の抗原、仮性狂犬病ウイルスの抗原、豚コレラの抗原、ブタインフルエンザの抗原、およびこれらの組み合わせからなる群に由来する。
【００１３】
本発明は、上記の第１の組換え発現ベクター、およびブタにおいて免疫応答を惹起するためのさらなる抗原を含む第２の組換え発現ベクターを含む組成物を企図する。このような組成物を含む、ブタにおけるＰＣＶ２感染に対して防御応答を惹起するためのワクチンもまた、企図される。
【００１４】
本発明の他の局面は、ブタにおけるブタサーコウイルス（ＰＣＶ２）感染に対して防御応答を惹起するためのワクチンに関し、上記ワクチンは、獣医学的に受容可能なビヒクルもしくは賦形剤、およびプロモーターに作動可能に連結した改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを含み、ここで上記改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２は、野生型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２の核局在シグナルが除去もしくは改変されて、発現の際に短縮型ＯＲＦ２タンパク質の分泌が可能になったものであるか；または上記改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２は、上記核局在シグナルが、除去されかつ感染細胞の細胞表面上の上記ＰＣＶ２  ＯＲＦ２の発現を指向する疎水性シグナルと置換されたものである。いくつかの実施形態において、上記ワクチンは、有利なことには、ブタのワクチン接種のための１種以上のさらなる抗原をさらに含み得、ここで上記さらなる１種以上の抗原は、上記ワクチンの獣医学的に受容可能なビヒクルもしくは賦形剤中にタンパク質成分として提供される。
【００１５】
本発明は、具体的には、ＰＣＶ−２  ＯＲＦ２によって引き起こされる疾患からブタを防御するためのワクチンの調製および使用を企図し、上記ワクチンは、疎水性シグナル配列に作動可能に連結したプロモーターを含む組換えウイルスベクターを含み、上記組換えウイルスベクターは、膜アンカードメインをコードする核酸、上記疎水性シグナル配列とインフレームで改変型ＰＣＶ−２  ＯＲＦ２を挿入するためのマルチクローニング部位、ポリアデニル化シグナル；およびウイルスゲノムを含み、ここで上記改変型ＰＣＶ−２  ＯＲＦ２は、核局在シグナルを欠いている。特定の実施形態において、上記ベクターは、改変型ＰＣＶ−２  ＯＲＦ２のためのクローニング部位の直ぐ上流に切断配列をさらに含み、ここで上記ベクターからの上記ＰＣＶ−２  ＯＲＦ２発現生成物は、可溶性の遺伝子生成物を生じる。
【００１６】
ＰＣＶ−２関連障害からブタを保護するためのワクチンの調製および使用もまた企図され、上記ワクチンは、疎水性シグナル配列に作動可能に連結したプロモーターを含む組換えブタアデノウイルス３ベクターを含み、上記組換えブタアデノウイルス３ベクターは、膜アンカードメインをコードする核酸、および上記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入されるＮＬＳ配列を欠いている短縮型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２をコードする核酸、ポリアデニル化シグナル；ならびにブタアデノウイルス３ゲノムを含む。
【００１７】
上記ワクチンは、任意の投与経路（例えば、経口送達、経鼻送達、筋肉内送達、皮下送達もしくは皮内送達が挙げられる）のために処方され得る。好ましい実施形態において、上記ワクチンは、エアロゾル投与のために処方される。
【００１８】
本発明はまた、ブタ被験体における免疫応答を惹起するための方法を企図し、上記方法は、ブタ被験体における防御免疫応答を惹起するために有効な量で、本発明のワクチンを上記ブタ被験体に投与する工程を包含する。
【００１９】
特定の実施形態において、上記方法は、ブタにおけるブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）のウイルス負荷を軽減し、上記方法は、上記ブタにおけるＰＣＶ２に対する免疫学的応答もしくは免疫原性応答を誘導する工程を包含し、上記工程は、薬学的にもしくは獣医学的にもしくは医学的に受容可能なキャリアおよび発現ベクターを含む組成物をブタに投与する工程を包含し、上記ベクターは、プロモーターに作動可能に連結した改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２をコードする核酸配列を含み、ここで上記改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２は、野生型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２の核局在シグナルが、除去もしくは改変されて、発現の際に短縮型ＯＲＦ２タンパク質の分泌が可能になったものであるか；または上記改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２は、上記核局在シグナルが、除去されかつ感染細胞の細胞表面上の上記ＰＣＶ２  ＯＲＦ２の発現を指向する疎水性シグナルと置換されたものである。
【００２０】
特定の実施形態において、上記投与する工程は、交配前に行われる。さらに他の実施形態において、上記ワクチンを投与されるブタは、妊娠した雌性ブタである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明の組換えベクターの調製のための計画である。
【図２Ａ】図２は、Ｈｅｉｊｎｅ  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３３，１７−２１（１９８３）の図１から再現した真核生物シグナル配列の集まりである。上記配列は、アスタリスク（＊）で示される、それらの既知のもしくは推定される切断部位に基づいて並べられている。
【図２Ｂ】図２は、Ｈｅｉｊｎｅ  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３３，１７−２１（１９８３）の図１から再現した真核生物シグナル配列の集まりである。上記配列は、アスタリスク（＊）で示される、それらの既知のもしくは推定される切断部位に基づいて並べられている。
【図３】図３は、ＰＣＶ２ワクチン接種／チャレンジ試験：（１）ＰＡｄＶ３−ＰＣＶ２ＯＲＦ２全長；（２）ＰＡｄＶ３−ＰＣＶ２ＯＲＦ２短縮型；（３）ＰＡｄＶ３−ＰＣＶ２ＯＲＦ２分泌型；および（４）リン酸緩衝化生理食塩水（コントロール）で処置した群の各々における、チャレンジ後のブタからのパーセンテージウイルス単離である。
【図４】図４は、ＰＣＶ２ワクチン接種／チャレンジ試験：（１）ＰＡｄＶ３−ＰＣＶ２ＯＲＦ２全長；（２）ＰＡｄＶ３−ＰＣＶ２ＯＲＦ２短縮型；（３）ＰＡｄＶ３−ＰＣＶ２ＯＲＦ２分泌型；および（４）リン酸緩衝化生理食塩水（コントロール）で処置した群の各々における、全てのブタ（群中の）がいかなる有害な臨床徴候も有さない、チャレンジ後日数である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（例示的実施形態の説明）
ＰＣＶＡＤは、養豚産業において重大な経済的損害を引き起こす重篤な疾患である。上記疾患の原因論的マーカーがＰＣＶ２  ＯＲＦ２として同定されたのに対して、これまでは、これら疾患に対するウイルスベクターＰＣＶ２−ＯＲＦ２ベースのワクチンを生成する全ての試みは、商業的に意味のあるワクチンを生成できなかった。本発明は、ＰＣＶ２に対する免疫を提供する改変型ＰＣＶ  ＯＲＦ２を含むウイルスワクチン組成物を初めて提供する。
【００２３】
ＰＣＶ２  ＯＲＦ２の全長核酸配列は、以前に特徴付けされており、配列番号７に示される。この核酸は、配列番号８のタンパク質をコードする。配列番号７の最初の４２個のコドン（配列番号９に示される）は、ＰＣＶ  ＯＲＦ２の核局在シグナルをコードする（Ｌｉｕら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８５：９１−９９，２００１）。核標的化研究において、Ｌｉｕらは、緑色蛍光タンパク質とのＰＣＶ２  ＯＲＦ２融合タンパク質を調製し、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２のアミノ酸残基１〜４１のシグナルが除去された場合に、上記ＰＣＶ  ＯＲＦ２  ＧＦＰ融合タンパク質が細胞質性になることを示した。Ｌｉｕらは、残基１〜４２、および特に、１２〜１８位および３４〜４１位の塩基性残基が、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２の核局在化に必須であると、このように結論づけた。
【００２４】
本発明者らは、ネイティブ核局在配列（すなわち、配列番号８の残基１〜４２の配列）を除去し、これを、細胞からの上記ＰＣＶ２  ＯＲＦ２の分泌を引き起こすシグナル配列で置換することは、このような改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２コードする核酸を含む組成物を、ＰＣＶＡＤに対する免疫を生成するためのウイルスベクター化ワクチンとして有用にすることを見いだした。以下の議論は、このようなワクチンを作製および使用するための、ならびにこのようなワクチンでブタ集団を処置するための、方法および組成物を提供する。
【００２５】
本発明は、ブタの処置のための改善されたウイルスワクチンを構築するための従来技術に依る。上記ウイルスワクチンは、ブタに感染させるために使用され得る任意のウイルスベクターから構築され得、そしてアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター等が挙げられるが、これらに限定されないベクターを含み得る。例示的実施形態において、上記ウイルスベクターは、ブタアデノウイルスベクターである。ブタウイルスベクターで作製したワクチンは、当業者に公知である（例えば、米国特許第７，３２３，１７７号；同第７，２９７，５３７号；同第６，８５２，７０５号を参照のこと）。
【００２６】
本発明は、組換えウイルスワクチン組成物を調製するための方法およびその使用に関し、上記組成物は、ＰＣＶ−２によって引き起こされる任意の疾患に対する防御免疫のためにブタ集団に投与され得る。有利なことには、本発明のワクチン構築物は、上記ＰＣＶ−２  ＯＲＦ２の内部発現ではなく、感染細胞上の細胞外部位に送達されるＰＣＶ−２  ＯＲＦ２抗原の発現を指向する。本明細書で記載されるワクチンの場合において、上記免疫原は、従って、粘膜細胞（例えば、鼻経路、気道、胃腸管、腸粘膜などにおける粘膜細胞）の外側表面に送達され、それによって、適切な免疫応答機構と効率的に接触しないかもしれない上記細胞内における送達されたＰＣＶ−２  ＯＲＦ２免疫原の発現とは対照的に、免疫応答が急激に上昇し得る部位で上記免疫原を提示する。
【００２７】
既存のワクチンは、ＰＣＶ−２によって引き起こされる疾患に対する有効なワクチンについての当該分野で長期間感じられてきた必要性を満たしていない。ＰＣＶ−２関連疾患の既存の処置に伴う課題と闘うために、本発明者らは、ブタに防御免疫を付与するための新たなワクチンを開発した。上記ワクチンは、ウイルス発現系（ブタに感染する任意のウイルスが、送達ウイルスとして使用され得る）、例えば、サブユニットワクチンにおいてＰＣＶ−２  ＯＲＦの改変形態の発現を提供するブタアデノウイルス発現系に基づく。上記抗原は、疎水性シグナル配列とインフレームで発現され、上記ワクチンが投与されたブタのウイルス感染細胞の細胞表面に提示されるか、または代わりに、上記発現ベクターが、上記疎水性シグナル配列がまた切断シグナルを含むものである事象においてこのような感染動物の細胞外ドメインに分泌されるかのいずれかである。これら特徴および方法、ならびにＰＣＶ−２関連疾患のための組換えウイルスワクチンを使用するための組成物は、本明細書の以下にさらに詳細に記載される。
【００２８】
一般的に、本発明のワクチンは、ウイルスゲノムから作製されるウイルス発現ベクターから構成される。ブタアデノウイルスは、当業者に周知であり、広範囲にわたって特徴付けられている。特定の実施形態において、上記ブタアデノウイルス３は、本明細書中に記載される方法および組成物においてベクターとして使用される。しかし、本明細書で提供される教示を考慮すれば、当業者は、ブタに感染する任意のウイルスを使用して、本発明のワクチンを調製し得る。
【００２９】
本明細書で調製されるワクチンにおいて、上記使用されるプロモーターは、ウイルス構築物中の目的の異種ゲノムの発現を駆動し得る任意のプロモーターであり得る。このようなプロモーターとしては、トリアデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）、ＣＭＶｐ、ＰＧＫ−初期プロモーター、Ｅ１−初期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター（ＳＶＧ２）、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ−４０最初期プロモーター、Ｔ４後期プロモーター、およびＨＳＶ−Ｉ  ＴＫ（ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ）遺伝子プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）ＬＴＲ（長末端反復）およびＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）遺伝子プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。当業者に公知の多くの他の哺乳動物プロモーターもしくはトリプロモーターもまた、使用され得る。
【００３０】
本明細書に記載されるワクチンにおいて使用されるプロモーターは、ＰＣＶ−２  ＯＲＦ２をコードする核酸配列とインフレームで連結された疎水性シグナル配列のインフレーム融合物の発現を駆動する。上記疎水性シグナル配列は、上記発現ベクターに感染している宿主細胞の外膜へと、目的の核酸の発現を標的化するかもしくは具体的に指向するために使用され得る任意の配列であり得る。本発明において、上記ＰＡＶベースの発現ベクターは、ブタに感染することが意図される。上記ＦＡＶは、代表的には、粘膜細胞、肝臓および例えば、動物の腸管、気道もしくは胃腸管中に見いだされ得る上皮細胞に感染する。従って、上記疎水性シグナル配列は、これら粘膜細胞の細胞表面上に、ＰＣＶ−２  ＯＲＦ２発現生成物の発現を通させるものである。上記ＰＣＶ−２  ＯＲＦ２発現生成物を上記動物の粘膜細胞の細胞表面にこのように提示することによって、本発明のワクチンは、免疫応答の上昇を促進することにおいてあまり効率的ではないかもしれない動物の細胞内での発現とは対照的に、免疫応答が効率的に上昇し得る内部部位に上記抗原を最も効率的に送達し得る。
【００３１】
真核生物細胞において、分泌タンパク質は、疎水性シグナル配列によって小胞体膜に標的化される。本発明は、この特性を利用して、異種疎水性シグナル配列を使用し、ワクチン中の所定のタンパク質の発現を上記細胞表面に指向する。
【００３２】
本明細書において使用されるウイルスベクターは、野生型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２のネイティブ核局在シグナルが除去されかつシグナル配列および切断部位と置換されて、発現の際に短縮型ＯＲＦ２タンパク質の分泌（上記感染細胞からの）を可能にする、改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２をコードする核酸を含むポリヌクレオチド構築物を含むという点で、組換えベクターである。例えば、上記ＯＲＦ２のネイティブ核局在配列（ＮＬＳ）は、ニワトリγインターフェロン、ブタγインターフェロン、もしくはインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質に由来するシグナル配列と置換され得る。使用され得る他のシグナル配列としては、例えば、以下のシグナル配列が挙げられる：ホエイ  リンタンパク質シグナル配列；α−１酸性糖タンパク質；α−サイロトロピン；メクラウナギ由来のインスリン；アンコウ由来のインスリン；ヒトインスリン；ラットインスリンＩもしくはＩＩ；ヒツジβ−カゼイン；ヒツジχ−カゼイン；ヒツジα−ラクトアルブミン；ヒツジβ−ラクトグロブリン；ヒツジα−ｓｌカゼイン、およびヒツジα−ｓ２カゼイン；ＶＳウイルス糖タンパク質；オスニワトリＶＬＤＬ−１１；ハチメリチン；ラットラクチン（ｌａｃｔｉｎ）；ヒト胎盤性ラクトゲン；ヒトβ−絨毛性ゴナドトロピン；ヒトα−絨毛性ゴナドトロピン；ウサギウテログロビン；ラット成長ホルモン；ヒト成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；ウシ副甲状腺ホルモン；ラットリラキシン；ラット血清アルブミン；ヒト血清アルブミン；ラット肝臓アルブミン；ニワトリトロポエラスチンＢ；ニワトリオボムコイド；ニワトリリゾチーム；ニワトリコンアルブミン；ヒトα−１アンチトリプシン；ラット前立腺結合タンパク質；ラット前立腺結合タンパク質ｃ２；ＡＤウイルス糖タンパク質；ラットアポリポプロテインＡｌ；狂犬病ウイルス糖タンパク質；ヒトインフルエンザ  Ｖｉｃｔｏｒｉａヘマグルチニン；ヒトインフルエンザＪａｐヘマグルチニン；トリインフルエンザ  ＦＰＶヘマグルチニン；ヒト白血球インターフェロン；ヒト免疫インターフェロン；ヒト線維芽細胞インターフェロン；マウスχ−イムノグロブリン；マウスλ−イムノグロブリン；マウスχ−イムノグロブリン；マウスＨ鎖イムノグロブリン；マウス胚性ＶＨ−イムノグロブリン；マウスＨ鎖イムノグロブリン；イヌトリプシノゲン１；イヌトリプシノゲン２＋３；イヌキモトリプシノゲン２；イヌカルボキシペプチダーゼＡｌ；イヌアミラーゼ；マウスアミラーゼ；ラットアミラーゼ；ウサギα−ラクトアルブミン；ブタα−ラクトアルブミン；ラットカルボキシペプチダーゼＡ；ウシＡＣＴＨ−β−ＬＰＨ前駆体；ブタＡＣＴＨ−β−ＬＰＨ前駆体；ヒトＡＣＴＨ−β−ＬＰＨ前駆体；ブタガストリン；マウスレニン；トリパノソーマ糖タンパク質；ナマズソマトスタチン；アンコウソマトスタチン；ラットカルシトニン；ならびにアンコウグルカゴン。これらシグナル配列の各々は、ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅら  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３３  １７−２１（１９８３）の図１に示され、本明細書で使用するのに容易に適合され得る。前述の参考文献の図１からのシグナル配列は、本明細書で図２に再現されている。
【００３３】
所定のタンパク質についてのこれらおよび他のシグナルペプチド部位は、当業者に公知の方法を使用して容易に決定され得る。例えば、シグナルペプチド部位は、ＳｉｇｎａｌＰ  ３．０サーバーを使用して推定され得る（Ｂｅｎｄｔｓｅｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．，ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．＆Ｂｒｕｎａｋ，Ｓ．（２００４）  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＳｉｇｎａｌＰ  ３．０．  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０，７８３-７９５）。さらに、シグナル配列の決定を容易にする、利用可能なウェブサイトがあり、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／を参照のこと。使用される上記シグナル配列の正確な同一性は、上記シグナル配列が上記発現される生成物を上記細胞表面に移動させ得る疎水性配列である限りにおいて、重要ではない。
【００３４】
好ましい実施形態において、上記シグナル配列は、上記シグナル配列が切断されることを可能にし、かつその結合したタンパク質をこのような細胞の細胞外空間へと分泌することを可能にする切断部位を含む。特に好ましい実施形態において、本発明のこの局面は、以下の配列を含むニワトリγＩＦＮに由来するシグナル配列を使用して実証され：
【００３５】
【化１】
2012511896.tif 000003
ブタγＩＦＮの疎水性シグナル配列は、以下：
【００３６】
【化２】
2012511896.tif 000004
であり、ヒトインフルエンザウイルスＨ１Ｎ２の疎水性シグナル配列は、以下：
【００３７】
【化３】
2012511896.tif 000005
である。これら例示的配列の各々はまた、シグナルペプチダーゼが作用する切断部位を含み、目的の遺伝子の発現される遺伝子生成物の放出を生じる。図２からの配列の推定切断部位は、アスタリスク（＊）で印を付けている。
【００３８】
上記ポリヌクレオチド構築物は、好ましくは、送達されるべきタンパク質をコードするＤＮＡを含む。このようなＤＮＡは、ヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧから構成され得るが、このような塩基の任意のアナログもしくは改変形態をも含み得る。このようなアナログおよび改変塩基は、当業者に周知であり、これらとしては、メチル化ヌクレオチド、ヌクレオチド間改変（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（例えば、荷電していない連結およびチオエート）、糖アナログの使用、ならびに改変されたおよび／もしくは代替の骨格構造（例えば、ポリアミド）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
例示的実施形態において、上記ウイルスベクターは、ブタアデノウイルスベクターである。上記ブタアデノウイルスベクターは、標的細胞において複製コンピテントであってもよいし、複製欠損であってもよい。上記ベクターが複製欠損である場合、上記ベクターは、複製を促進するために、ヘルパー細胞もしくはヘルパーウイルスの使用を必要とし得る。複製欠損アデノウイルスベクターの複製を促進するためのヘルパー細胞もしくはヘルパーウイルスの使用は、当該分野で慣用的でありかつ周知である。代表的には、このようなヘルパー細胞は、複製欠損にするために上記組換えアデノウイルスベクターのノックアウトされた実体の機能を提供する。
【００４０】
複製コンピテントベクターは、他方で、これが、上記ベクターにおいて欠損している何かを供給するための第２のウイルスも細胞株も必要としないという点で、「ヘルパーなしのウイルスベクター」といわれ得る。上記のように、上記ＮＬＳを除去するための上記ＰＣＶ２  ＯＲＦ２の改変および切断部位を有するシグナル配列の付加は、上記ＯＲＦ２タンパク質を、核に局在しているものから、上記細胞から分泌されるものへと変換する。上記細胞からその細胞外空間への上記発現生成物の分泌は、上記改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２を含むワクチンを、上記ＮＬＳを含むＰＣＶ２  ＯＲＦ２を発現するワクチンより、抗体生成を刺激することにおいて有効にする。上記ＯＲＦ２発現生成物のこの細胞外分泌は、以前に記載されたワクチンを超える利点である。なぜなら、このことは、上記ワクチンが野生型ＮＬＳを有するＰＣＶ２  ＯＲＦ２で調製される場合に認められるものよりも大きな抗体免疫応答をもたらすからである。
【００４１】
上記改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２を含むウイルスベクターベースのワクチンの調製は、所定のウイルスゲノムの挿入物受容力（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｃａｐａｃｉｔｙ）および上記組換えウイルスベクターが上記挿入された異種配列を発現する能力によってのみ制限される。例えば、上記ベクターがアデノウイルスベクターである場合、アデノウイルスゲノムは、上記組換えアデノウイルスのサイズを、上記野生型ゲノム長の少なくとも１０５％へと増やす挿入物を受容し得、そして、ウイルス粒子へパッケージされる能力を保持し得る。このようなウイルスベクターの挿入物受容力は、非必須領域の欠失および／もしくは必須領域の欠失（例えば、Ｅｌ機能（次いで、その機能は、ヘルパー細胞株（例えば、Ｅｌ機能を提供する細胞株）によって提供され得る））によって増大し得る。いくつかの実施形態において、上記目的のタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチド（この場合、上記ＰＣＶ２  ＯＲＦ２および／もしくは上記ワクチンにおいて使用されるべき任意のさらなる治療用タンパク質）は、アデノウイルスＥ３遺伝子領域へと挿入される。他の実施形態において、上記Ｅ３領域の非必須部分は欠失させられ、上記目的のタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドは、欠失によって残されるそのギャップに挿入される。いくつかの好ましい実施形態において、上記組換えアデノウイルスベクターは、ブタアデノウイルス血清型３（ＰＡｄＶ−３）ベースのアデノウイルスベクター（ここで上記ＰＣＶ２  ＯＲＦ２コード核酸（および／もしくは他の核酸）を含む発現構築物が、ＰＡｄＶ−３  Ｅ３のポリアデニル化シグナルの後ろかつ上記ＰＡｄＶ−３線維遺伝子のＯＲＦの開始前に位置したＰＡｄＶ−３ゲノムの領域へと挿入される）である。
【００４２】
いくつかの実施形態において、挿入もしくは欠失後に挿入が、上記アデノウイルスのＥｌ遺伝子領域において存在するアデノウイルスが作製され、次いで、上記ベクターは、Ｅｌ機能を提供するヘルパー細胞株において増殖させられる。上記異種遺伝子が挿入され得るＰＡｄＶ−３の他の領域としては、Ｅ４領域が挙げられる。上記組換えアデノウイルスベクターがＰＡｄＶ−３ベースのベクターである場合、上記Ｅ４領域全体は、ＯＲＦ３をコードする領域を除いて、上記異種遺伝子のための余地を作り出すように欠失させられ得る。例えば、マップユニット９７−９９．５にある領域は、上記異種遺伝子の挿入に特に有用な部位である。Ｌｉら（Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０４  １８１−１９０（２００４））に示されるように、上記ゲノムの右側末端に位置する上記ＰＡｄＶ−３  Ｅ４領域は、左方向に転写され、７個の（ｐｌ−ｐ７）ＯＲＦをコードする能力を有する。これらのうち、ＯＲＦ  ｐ３のみが、複製に必須である。よって、上記Ｅ４領域の残りの全てではないかもしれないが多くは、上記ウイルス複製欠損の状態を引き起こさずに、容易に欠失され得、それによって、異種挿入物のためのさらなる余地を可能にする。本発明の一実施形態において、挿入は、所望の治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入が望ましい上記アデノウイルスゲノムの領域を含むプラスミドを構築することによって、達成され得る。次いで、上記プラスミドは、上記プラスミドの上記アデノウイルス部分における認識配列を有する制限酵素で消化され、異種ポリヌクレオチド配列が、制限消化部位に挿入される。挿入された異種配列を有する上記アデノウイルスゲノムの一部を含む上記プラスミドは、アデノウイルスゲノムもしくは上記アデノウイルスゲノムを含む直鎖状にされたプラスミドと共に、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ等）へと共形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）される。上記プラスミド間の相同組み換えは、挿入された異種配列を含む組換えアデノウイルスゲノムを生成する。これら実施形態において、上記アデノウイルスゲノムは、全長ゲノムであってもよいし、本明細書で議論されるように、１箇所以上の欠失を含んでいてもよい。
【００４３】
例えば、異種配列の挿入部位を提供するため、または異なる部位での挿入のためのさらなる受容能を提供するためのアデノウイルス配列の欠失は、当業者に周知の方法によって達成され得る。例えば、プラスミド中にクローニングされたアデノウイルス配列に関して、１種以上の制限酵素での消化（アデノウイルス挿入物中に少なくとも１つの認識配列を有する）、続いて、ライゲーションは、いくらかの場合においては、制限酵素認識部位の間の配列の欠失を生じる。あるいは、上記アデノウイルス挿入物内の単一の制限酵素認識部位での消化、続いて、エキソヌクレアーゼ処理、その後、ライゲーションは、上記制限部位に隣り合うアデノウイルス配列の欠失を生じる。上記に記載されるように構築される、１箇所以上の欠失を有する上記アデノウイルスゲノムの１つ以上の部分を含むプラスミドは、アデノウイルスゲノム（全長もしくは欠失されている）または全長ゲノムもしくは欠失されたゲノムのいずれかを含むプラスミドとともに細菌細胞へ共トランスフェクトされて、相同組み換えによって、１箇所以上の特定の部位において欠失を有する組換えゲノムを含むプラスミドを生成し得る。次いで、上記欠失を含むアデノウイルスビリオンは、哺乳動物細胞（本明細書に記載されるさらなる線維遺伝子を含む安定に形質転換された細胞が挙げられるが、これらに限定されない）の、上記組換えアデノウイルスゲノムを含むプラスミドでのトランスフェクションによって、得られ得る。上記挿入部位は、上記アデノウイルスにおける内因性プロモーターに隣り合ってかつ転写としては下流であり得る。「内因性」プロモーター、エンハンサー、もしくは制御領域は、アデノウイルスに対してネイティブであるかまたはアデノウイルスに由来する。挿入部位として使用され得る所定のプロモーターの下流にある制限酵素認識配列は、挿入が望ましいアデノウイルスゲノムの配列の一部もしくは全ての知識から、当業者によって容易に決定され得る。あるいは、種々のインビトロ技術は、特定の部位における制限酵素認識配列の挿入、または制限酵素認識配列を含まない部位における異種配列の挿入を可能にするために利用可能である。このような方法としては、１種以上の制限酵素認識配列の挿入のためのオリゴヌクレオチド媒介性ヘテロ二重鎖形成（例えば、Ｚｏｌｌｅｒら（１９８２）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００；Ｂｒｅｎｎａｎら（１９９０）  Ｒｏｕｘ’ｓ  Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９：８９−９６；およびＫｕｎｋｅｌら（１９８７）  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５４：３６７−３８２を参照のこと）およびより長い配列を挿入するためのＰＣＲ媒介法が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｚｈｅｎｇら（１９９４）  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：１６３−１８６を参照のこと。
【００４４】
内因性プロモーターの下流でない部位に挿入される異種配列の発現はまた、上記異種配列に、真核生物細胞において活性である転写調節配列を提供することによって達成され得る。このような転写調節配列としては、細胞プロモーター（例えば、（ＤＨＦＲプロモーター））、ウイルスプロモーター（例えば、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびパポバウイルスのプロモーター等）、ならびにレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）配列のＤＮＡコピーが挙げられ得る。このような実施形態において、上記異種遺伝子は、上記異種遺伝子がこのような転写調節要素に作動可能に連結される発現構築物中に導入される。
【００４５】
特定の例示的実施形態において、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２遺伝子は、構成的転写を提供するために、プロモーター（例えば、上記ＣＭＶプロモーター等）の制御下に配置される。ＰＡｄＶ３ベースのウイルスベクターにおいて、上記組換えＰＣＶ２  ＯＲＦ２  ｍＲＮＡの継続する翻訳は、上記ＰＣＶ２  ＯＲＦ２遺伝子を、上記ＰＡｄＶ−３  ＭＬＰ／ＴＰＬ配列の下流に配置することによって、達成され得る。上記組換えアデノウイルスベクターの調製が、プラスミドとしての上記クローニングされたアデノウイルスゲノムの増幅およびプラスミド含有細胞からの感染性ウイルスのレスキューを含むことが理解されるべきである。
【００４６】
ウイルス核酸の存在は、当業者に公知の技術（ハイブリダイゼーションアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応、および他のタイプの増幅反応が挙げられるが、これらに限定されない）によって検出され得る。同様に、タンパク質の検出のための方法は、当業者に周知であり、上記方法としては、種々のタイプのイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、酵素アッセイ、免疫組織化学などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のヌクレオチド配列を含む診断キットはまた、細胞破壊および核酸精製のための試薬、ならびにハイブリッドの形成、選択および検出のための緩衝液および溶媒を含み得る。本発明のポリペプチドもしくはアミノ酸配列を含む診断キットはまた、タンパク質単離のための試薬、ならびに免疫複合体の形成、単離、精製および／もしくは検出のための試薬を含み得る。
【００４７】
上記ＰＣＶ２  ＯＲＦ２に加えて、他の外因性（すなわち、外来の）ヌクレオチド配列は、上記アデノウイルスへと組み込まれ得る。これら他の外因性配列は、１種以上の目的の遺伝子もしくは遺伝子ではないが、治療目的の他の機能を有する他のヌクレオチド配列からなり得る。本発明の状況において、目的のヌクレオチド配列もしくは遺伝子は、アンチセンスＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、リボザイムもしくは目的のタンパク質へとその後翻訳されるｍＲＮＡのいずれかをコードし得る。このようなヌクレオチド配列もしくは遺伝子は、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）もしくは混合タイプ（ミニ遺伝子（ここで少なくとも１個のイントロンが欠失される））を含み得る。上記ヌクレオチド配列もしくは遺伝子は、調節機能もしくは治療機能、成熟タンパク質、成熟タンパク質の前駆体、特に、シグナルペプチドを含む前駆体、多様な起源の配列の融合から発生するキメラタンパク質、または改善されたかもしくは改変された生物学的特性を示す天然タンパク質の変異体をコードし得る。このような変異体は、上記天然のタンパク質をコードする上記遺伝子のうちの１もしくは数個のヌクレオチドの欠失、置換および／もしくは付加、または上記天然のタンパク質をコードする配列における任意の他のタイプの変化（例えば、転位もしくは反転等）によって、得られ得る。
【００４８】
上記ベクターによって送達される遺伝子は、宿主細胞におけるその発現に適した要素（ＤＮＡ制御配列）の制御下に配置され得る。適切なＤＮＡ制御配列は、遺伝子をＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡもしくはｍＲＮＡ）へ転写するため、およびｍＲＮＡをタンパク質へ翻訳するために必要とされる要素のセットを意味することが理解される。例えば、これら要素は、少なくともプロモーターを含む。上記プロモーターは、構成性プロモーターもしくは調節性プロモーターであり得、真核生物起源、原核生物起源もしくはウイルス起原およびさらにはアデノウイルス起原のうちの任意の遺伝子から単離され得る。あるいは、上記プロモー−ターは、上記目的の遺伝子の天然のプロモーターであり得る。概して、本発明において使用されるプロモーターは、調節性配列を含むように改変され得る。例示的プロモーターとしては、上記遺伝子が所定の組織型へと標的化されるべきである場合には、組織特異的プロモーターが挙げられ得る。使用され得る他の従来のプロモーターとしては、例えば、多数の細胞型において発現を可能にする、ＨＳＶ−Ｉ  ＴＫ（ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ）遺伝子プロモーター、アデノウイルスＭＬＰ（主要後期プロモーター）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）ＬＴＲ（長末端反復）、ＣＭＶ最初期プロモーター、ＳＶ−４０最初期プロモーター、およびＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）遺伝子プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
上記ウイルスベクター、または実際には、上記ウイルスベクターを含む薬学的組成物は、少なくとも１個のさらなるブタ病原体、例えば：ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、仮性狂犬病、豚コレラ、ブタインフルエンザ、およびブタパルボウイルス（ＰＰＶ）から少なくとも１種の免疫原をさらに含み得る。従って、ベクターベースの組成物は、少なくとも１種のさらなるブタ病原体からの少なくとも１種の免疫原（例えば、この病原体に由来する配列を発現するベクター）を含み得、ここで上記ベクターはまた、上記に記載されるＰＣＶ−２  ＯＲＦ２を発現し得る。あるいは、上記ワクチン組成物は、本明細書に記載されるＰＣＶ２  ＯＲＦ２を発現する１種のベクター成分および第２の免疫原を発現する組換えベクターであり得る第２の成分から作製され得、または、上記第２の成分は、別の供給源から単離された、単離された免疫原を含む組成物である。
【００５０】
この記載のうちの大部分は、例示的ワクチンベクターとしてブタアデノウイルスに関するものの、上記ベクターは、任意のウイルスベクター（例えば、ヘルペスウイルス（ブタヘルペスウイルス、オーエスキー病ウイルス（仮性狂犬病ウイルスとしても公知）が挙げられる）、アデノウイルス（任意の血清型のブタアデノウイルスもしくはヒトアデノウイルスを含む）、ポックスウイルス（ワクシニア・ウイルス、トリポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、アライグマポックスウイルス（ｒａｃｏｏｎｐｏｘ）、豚痘ウイルスなどが挙げられる）のようなウイルスが挙げられる）を含み得る。
【００５１】
特定の好ましい実施形態において、本発明のワクチンは、それら動物における、ＰＭＷＳ以外の疾患に対して、および、ＰＭＷＳに加えて、疾患に対して、ブタをワクチン接種するために調製される。例えば、上記ワクチンは、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２に加えて、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）  ｇｐ５０；伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）  Ｓ遺伝子；ブタロタウイルスＶＰ７遺伝子およびＶＰ８遺伝子；ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）の遺伝子；ブタ流行性下痢ウイルスの遺伝子；豚コレラウイルスの遺伝子；ブタパルボウイルスの遺伝子；および口蹄疫ウイルスの遺伝子；ブタインフルエンザウイルスの遺伝子；およびブタサーコウイルスと関連する他の遺伝子に関し得る。
【００５２】
いくつかの状況において、完全な遺伝子を上記ベクターに組み込むことは望ましいことであり得る一方で、野生型生物において見いだされるような完全な配列ではなく、使用され得る遺伝子のヌクレオチド配列の一部のみを含む他のベクターが構築され得ることが理解されるべきである（ここでこれらは、防御免疫応答もしくは特定の生物学的効果を生成するために十分である）。上記遺伝子が多数のイントロンを含む場合、ｃＤＮＡが好ましい可能性がある。
【００５３】
上記のように、上記遺伝子は、適切なプロモーターの制御下に挿入され得る。さらに、上記ベクターはまた、エンハンサー要素およびポリアデニル化配列を含み得る。哺乳動物細胞における外来遺伝子の成功裏の発現および発現カセットの構築を提供するプロモーターおよびポリアデニル化配列は、当該分野で（例えば、米国特許第５，１５１，２６７号（その開示は、本明細書に参考として援用される）において）公知である。
【００５４】
用語「発現カセット」とは、細胞において遺伝子もしくは遺伝的配列を発現し得る天然の核酸分子もしくは組換え生成された核酸分子に言及する。発現カセットは、代表的には、プロモーター（転写開始を可能にする）、および１種以上のタンパク質もしくはＲＮＡをコードする配列を含む。必要に応じて、上記発現カセットは、転写エンハンサー、非コード配列、スプライシングシグナル、転写終結シグナル、およびポリアデニル化シグナルを含み得る。ＲＮＡ発現カセットは、代表的には、翻訳開始コドン（翻訳開始を可能にする）、および１種以上のタンパク質をコードする配列を含む。必要に応じて、上記発現カセットは、翻訳終結シグナル、ポリアデノシン配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および非コード配列を含み得る。必要に応じて、上記発現カセットは、タンパク質へ翻訳されない遺伝子もしくは部分的遺伝子配列を含み得る。上記核酸は、上記標的細胞のＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列において変化をもたらし得る。これは、ハイブリダイゼーション、複数鎖核酸形成、相同組換え、遺伝子変換、ＲＮＡ干渉もしくは他の既に記載されている機構によって達成され得る。
【００５５】
上記ウイルスベクターは、１種より多くの外来遺伝子を含み得る。本発明の方法は、好ましくは、ブタにおけるＰＣＶ２関連疾患に対する防御を提供するために使用される。本発明の例示的実施形態は、上記異種ヌクレオチド（異種核酸とも本明細書において言及される）が、タンパク質をコードするものである一方で、上記異種ヌクレオチドが、実際には、細胞におけるその存在もしくは転写が望ましい配列を含む任意のポリヌクレオチドであり得ることが理解されるべきである。従って、上記ベクターは、例えば、配列特異的分解、または遺伝子の機能、転写もしくは翻訳の阻害を引き起こす任意のポリヌクレオチドを送達するために使用され得る。
【００５６】
上記改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２以外の免疫原組成物は、組換え生成され得るか、または天然供給源から抽出され得るか、または化学合成され得る。例えば、上記改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２以外の免疫原組成物は、感染細胞もしくはトランスフェクトした細胞から単離および／もしくは精製され得；例えば、ブタへの投与のための組成物を調製するために；しかし、特定の場合において、細胞からの発現生成物を単離および／もしくは精製しないことは、有利であり得る；例えば、上記細胞もしくはその一部が上記ポリペプチドの免疫原性効果を増強する場合。これを達成するために使用されるタンパク質精製および／もしくは単離技術は、当業者に周知であり、一般に以下が挙げられ得る：種々の塩濃度での上記目的のタンパク質の溶解度を利用することによる沈殿、有機溶媒、ポリマーおよび他の物質での沈殿、アフィニティー沈殿ならびに選択的変性；カラムクロマトグラフィー（高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィーもしくは色素−リガンドクロマトグラフィーが挙げられる）；免疫沈降、ゲル濾過、電気泳動法、限外濾過および等電点電気泳動、およびそれらの組み合わせ。
【００５７】
市販のＬａｒｇｅ  Ｗｈｉｔｅ  Ｐｉｇに、皮下経路もしくは経口経路によって投与した場合に、ＰＫ−ｌ５細胞中で増殖した改変型ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５は、皮下注射としてもしくは上記経口経路によって与えられた場合に、ＣＳＦＶでの致死的チャレンジからブタを完全に防御したことが、以前示された。本発明の状況において、同様のアプローチが、単独で、またはｇｐ５５もしくはいくつかの他の抗原と組み合わせてのいずれかで改変型ｒＰＡｄＶ−ＰＣＶ２  ＯＲＦ２を投与して、疾患に対する上記ブタの効率的免疫もしくはワクチン接種を付与するために、採用され得る。
【００５８】
上記ＰＣＶ２  ＯＲＦ２が、動物における可能な限り多くの組織によって取り込まれるか、または所定の組織を特異的に標的化することを可能にするために、上記ＰＡｄＶは、ＰＡｄＶの１つより多くの血清型に由来する線維遺伝子を含む（例えば、上記ＰＣＶ２  ＯＲＦ２を含む組換えワクチンはまた、ＰＡｄＶ３繊維およびＰＡｄＶ４繊維遺伝子を含む）ように改変され得る。このようにして、上記ＰＡｄＶ−３繊維タンパク質およびＰＡｄＶ−４繊維タンパク質の両方を含む改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ−２含有ワクチンは、改変されていないワクチンより広く種々のブタの組織を標的にし、結果として、上記宿主においてより完全な免疫応答を生成する。
【００５９】
本発明の方法に従って調製される、治療上有効な量の組換えアデノウイルスベクター、組換えアデノウイルスもしくは組換えタンパク質を、薬学的に受容可能なビヒクルおよび／もしくはアジュバントと組み合わせて含む薬学的組成物は、本明細書において具体的に企図される。このような薬学的組成物は、当該分野で周知の技術に従って調製され得、投与量が決定され得る。本発明の薬学的組成物は、任意の公知の投与経路によって投与され得る。上記投与経路としては、全身（例えば、静脈内に、気管内に、血管内に、肺内に、腹腔内に、鼻内に、非経口的に、腸に（ｅｎｔｅｒｉｃａｌｌｙ）、筋肉内に、皮下に、腫瘍内にもしくは頭蓋内に）、経口投与によって、エアロゾル化もしくは肺内注入によって、が挙げられるが、これらに限定されない。投与は、単一用量で行われ得るか、または特定の時間間隔後の、１回以上反復した用量で行われ得る。上記適切な投与経路および投与量は、状況（例えば、処置されている個体、処置されるべき障害、または上記目的の遺伝子もしくはポリペプチド）に従って変動するが、当業者によって決定され得る。
【００６０】
特定の実施形態において、雌性ブタは、少なくとも１種の治療用タンパク質（すなわち、発現される場合に、感染細胞の核に局在せず、むしろ核局在シグナルを欠いており、よって上記細胞の細胞質へと放出される改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２）を発現する核酸を含むウイルスベクター組成物が接種される。上記動物は、交配前に；および／もしくは種付け前に、および／もしくは妊娠（ｇｅｓｔａｔｉｏｎ）（もしくは妊娠（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ））期間の間に；および／または周産期もしくは分娩前に；ならびに／または心筋炎および／もしくは流産（ａｂｏｒｔｉｏｎ）および／もしくはＰＣＶ−２と関連する子宮内感染、ならびに離乳後多臓器性発育不良症候群およびＰＣＶ−２と関連する他の病的な続発症を予防するために生涯にわたって反復して；あるいは、ＰＣＶ−２に対する免疫原性応答もしくは防御応答を惹起するために、そしてそれによって、ＰＣＶ−２感染と関連するいかなる疾患をも予防するために、接種され得る。このような疾患としては、離乳後多臓器性発育不良症候群および／もしくはブタ皮膚炎腎症症候群および／もしくは心筋炎および／もしくは流産および／もしくはブタサーコウイルス−２と関連する子宮内感染および／もしくはＰＣＶ−２と関連する他の病的な続発症が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、現在「離乳後多臓器性発育不良症候群」といわれているものの処置によって例示されるが、本発明の組成物および方法が、ＰＣＶ−２感染に関連するいかなる疾患の処置にも有用であり、有益な結果が、その疾患と関連する症状（細菌感染により引き起こされる二次感染、例えば、グレーサー病（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、肺パスツレラ症、大腸菌症およびサルモネラ症などが挙げられる）のうちのいずれかの改善であることは、理解されるべきである。他の症状としては、リンパ節の拡大、間質性肺炎、および腎炎の病的な所見と合わせて、消耗、呼吸困難、および蒼白が挙げられる。リンパ組織および特定の器官におけるリンパ球枯渇および組織球性肉芽腫性炎症は、ＰＣＶ−２関連疾患において認められる主要な組織学的変化である。本発明の方法および組成物は、これら症状の影響を予防、阻害、もしくはそうでなければ軽減もしくは低下させるために使用される。
【００６１】
別の実施形態において、子ブタは、生後５週間以内に接種される（例えば、生後１週間および／もしくは２週間および／もしくは３週間および／もしくは４週間および／もしくは５週間で接種）。より好ましくは、子ブタは、生後１週間内もしくは生後３週間内に（例えば、離乳時期に）、最初に接種される。さらにより有利なことには、このような子ブタは、その後、２週間〜４週間後（最初に接種された後の）に追加免疫される。上記子ブタは、ワクチン接種した雌性に由来してもよいし、ワクチン接種していない雌性に由来してもよい。従って、両方の子孫、ならびに雌性ブタは、上記子ブタおよび彼らの母親の寿命を増すために、本発明の組成物が投与され得る。
【００６２】
本発明は、治療上有効な量の組換えアデノウイルスベクター（例えば、ＰＡｄＶ−３アデノウイルスベクター）が上記治療用抗原としてＰＣＶ２  ＯＲＦ２を含む処置方法をさらに提供する。
【００６３】
上記改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２と組み合わせて使用される、上記改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２以外の抗原は、ネイティブの抗原性ポリペプチドもしくはフラグメントであってもよいし、組換えの抗原性ポリペプチドもしくはフラグメントであってもよい。それらは、部分配列であってもよいし、全長配列であってもよいし、さらには、融合物（例えば、組換え宿主に適切なリーダー配列を有するか、または別の病原体についてのさらなる抗原配列を有する）であってもよい。本発明のウイルス系によって発現されるべき上記好ましい抗原性ポリペプチドは、抗原をコードする全長（もしくはほぼ全長）配列を含む。あるいは、抗原性である（すなわち、１個以上のエピトープをコードする）より短い配列が、使用され得る。上記より短い配列は、「中和エピトープ」をコードし得、上記中和エピトープは、インビトロアッセイにおいてウイルス感染性を中和する抗体を惹起し得るエピトープとして定義される。好ましくは、上記ペプチドは、上記宿主において「防御免疫応答」；すなわち、免疫した宿主を感染から防御する抗体媒介性および／もしくは細胞媒介性免疫応答を惹起し得る「防御エピトープ」をコードするべきである。
【００６４】
さらに、本発明のワクチンのいずれかはまた、アジュバントを含み得る。「アジュバント」は、上記ワクチンの免疫原性を増大させるためにワクチンに添加される任意の物質である。ワクチン組成物におけるアジュバントの使用は、当該分野で周知である：例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびキーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）。あるアジュバントは、上記抗原をゆっくりと放出することによって上記免疫応答を高めると考えられている一方で、他方のアジュバントは、それら自体が強く免疫原性であり、相乗的に機能すると考えられている。公知のワクチンアジュバントとしては、油および水のエマルジョン（例えば、完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバント）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、カルメット・ゲラン桿菌、水酸化アルミニウム、グルカン、デキストラン硫酸、酸化鉄、アルギン酸ナトリウム、Ｂａｃｔｏ−Ａｄｊｕｖａｎｔ、特定の合成ポリマー（例えば、ポリアミノ酸およびアミノ酸のコポリマー）、サポニン、「ＲＥＧＲＥＳＳＩＮ」（Ｖｅｔｒｅｐｈａｒｍ，Ａｔｈｅｎｓ，Ｇａ．）、「ＡＶＲＩＤＩＮＥ」（Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−プロパンジアミン）、パラフィンオイル、ムラミル・ジペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
挿入され得る所望の抗原の遺伝子もしくはそのコード配列としては、哺乳動物において疾患を引き起こす生物のもの、特に、ウシ病原体（例えば、口蹄疫ウイルス、ウシロタウイルス、ウシコロナウイルス、ウシヘルペスウイルス１型、ウシＲＳウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス３型（ＢＰＩ−３）、ウシ下痢ウイルス、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓなど）が挙げられる。ヒト病原体の抗原をコードする遺伝子はまた、本発明の実施において有用であり得る。外来遺伝子もしくはフラグメントを有する本発明のワクチンはまた、適切な経口キャリア（例えば、腸溶性コーティングされた投与形態）中で経口投与され得る。経口処方物は、例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンセルロースナトリウム、炭酸マグネシウムなどのような通常使用される賦形剤を含む。経口ワクチン組成物は、約１０％〜約９５％の活性成分、好ましくは、約２５％〜約７０％を含む、液剤、懸濁物、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性処方物、もしくは散剤の形態をとり得る。経口ワクチン接種および／もしくは鼻内ワクチン接種は、全身免疫と合わせて、粘膜免疫（これは、気道および胃・腸管に感染する病原体に対する防御において重要な役割を果たす）を惹起するために好ましいものであり得る。
【００６６】
さらに、上記ワクチンは、坐剤へと処方され得る。坐剤に関しては、上記ワクチン組成物は、伝統的な結合剤およびキャリア（例えば、ポリアルキレングリコール（ｐｏｌｙａｌｋａｌｉｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）もしくはトリグリセリド）を含む。このような坐剤は、約０．５％〜約１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは、約１％〜約２％の範囲内の上記活性成分を含む混合物から形成され得る。
【００６７】
本発明のワクチン組成物を動物に投与するためのプロトコルは、本開示に鑑みれば、当該分野の技術範囲内である。当業者は、上記抗原性フラグメントに対する抗体媒介性および／もしくはＴ細胞媒介性免疫応答、または別のタイプの治療効果もしくは予防効果を惹起するために有効な用量において、上記ワクチン組成物の濃度を選択する。広い制限内で、上記投与量は、重要であるとは考えられていない。投与のタイミングはまた、重要であり得る。例えば、初回接種の次に、好ましくは、必要であれば、その後の追加免疫接種が行われ得る。選択肢ではあるものの、最初の免疫から数週間〜数ヶ月後に、上記動物へ第２の追加免疫を投与することも好ましいことであり得る。持続した高レベルの疾患に対する防御を保証するために、規則的間隔で（例えば、数年ごとに１回）上記動物に追加免疫を再投与することは、役に立ち得る。あるいは、最初の用量は、経口投与され、続いて、後の接種が行われ得る（逆もまた同様）。好ましいワクチン接種プロトコルは、慣用的なワクチン接種プロトコル実験を介して確立され得る。
【００６８】
組換えウイルスワクチンのインビボでの投与の全ての経路に関する投与量は、種々の要因（宿主／患者の大きさ、防御が必要とされる感染の性質、キャリアなどが挙げられる）に依存し、当業者によって容易に決定され得る。非限定的例によれば、１０２ｐｆｕ〜１０１５ｐｆｕの間、好ましくは、１０４〜１０１３ｐｆｕの間、より好ましくは、１０５〜１０１１ｐｆｕの間の投与量などが、使用され得る。インビトロサブユニットワクチンと同様に、さらなる投与量が、関与する臨床的要因によって決定されるように与えられ得る。
【００６９】
本発明はまた、遺伝子欠損を制御するために、治療用遺伝子もしくはヌクレオチド配列を提供するために、および／または遺伝子変異を誘導もしくは矯正するために、哺乳動物（および特にブタ）への遺伝子送達を提供するための方法を包含する。上記方法は、例えば、遺伝性疾患、感染性疾患、心血管性疾患、およびウイルス感染が挙げられるが、これらに限定されない状態の処置において、使用され得る。これらの種の技術は、種々の疾患状態の処置のために、当業者によって現在使用されている。従来の遺伝子治療において使用するために組み込まれ得る外来遺伝子、ヌクレオチド配列もしくはその一部の例としては、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子遺伝子、ヒトミニジストロフィン遺伝子、α−１−アンチトリプシン遺伝子、心血管性疾患に関与する遺伝子などが挙げられる。
【００７０】
本発明の目的のために、本発明の方法によって調製されるベクター、細胞およびウイルス粒子は、エキソビボで（すなわち、上記患者から取り出された細胞で）またはインビボで処置されるべき身体へ直接、のいずれかで、被験体へ導入され得る。
【実施例】
【００７１】
実施例１：
図１は、本明細書で使用される組換えウイルスベクターに対する生成のための例示的プロトコルを示す。短縮型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２遺伝子を、５’遺伝子特異的プライマーおよび３’遺伝子特異的プライマーを使用して、テンプレートとしてプラスミド中にクローニングされた全長ＰＣＶ２  ＯＲＦ２遺伝子からＰＣＲ増幅した。上記５’  ＰＣＲプライマーを、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２遺伝子の開始の１２７ｂｐ下流に結合するように具体的に設計した（このことは、ＮＬＳの欠失を可能にする）。また、最終ＰＣＲ生成物の５’末端へインフレームで組み込まれるシグナル配列を導入した。上記生成物のクローニングを容易にするために、５’プライマーおよび３’プライマーの両方に、上記最終ＰＣＲ生成物に対してそれぞれ、制限部位ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを導入した。
【００７２】
次いで、シグナル配列を有する短縮型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２遺伝子を含む上記ＰＣＲ増幅生成物を、上記ＰＡＶ３  ＲＨＥプラスミド内の発現カセットの上記ＢｇｌＩＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。次いで、上記組換えＰＡＶ３  ＲＨＥプラスミドおよびＰＡＶ３  ＬＨＥプラスミドを、上記プラスミド骨格配列内で特異的に切断するが、ＰＡＶ３ゲノム配列もしくは上記挿入されたＤＮＡ内では切断しない制限酵素（酵素「Ｘ」および「Ｙ」）を使用して、直鎖状にした。
【００７３】
上記直鎖状にしたＰＡＶ３  ＬＨＥおよびＰＡＶ３  ＲＨＥプラスミドＤＮＡ（これらはともに、上記ＰＡＶ３ウイルスゲノムの一部を有する）を、ブタ細胞に共トランスフェクトした。両方のＤＮＡフラグメントは、上記挿入されたＤＮＡを有するコンピテント全長組換えＰＡＶ３ウイルスゲノムを再構成するように、相同組換えの発生を指向する相同性の重なり合うＰＡＶ３配列の約１ｋｂ領域を有する。
【００７４】
トランスフェクトされた細胞の連続的継代は、ウイルスプラークとして出現する感染性粒子の富化を生じる。これらのことは、シグナル配列を５’インフレームで有する短縮型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質を発現する組換えＰＡＶ３ウイルスを表す。
【００７５】
上記の実施例は、上記ＰＡＶ−３  ＲＨＥへの挿入を実証するが、上記ＰＡＶ３ゲノムの他の非必須領域において上記挿入物が作製されうることが理解されるべきである。
【００７６】
実施例２：
本発明のワクチンの効力を試験するために、子ブタの群に、本明細書に記載される改変型ＰＣＶ２−ＯＲＦ２に基づくワクチン、もしくは非改変型ＰＣＶ２−ＯＲＦ２を含むワクチンのいずれかを２用量与え、ＰＣＶ２でのチャレンジに対する上記ブタの感受性を決定した。さらに、経口経路によって投与された場合に、上記改変型ワクチンが中和抗体を誘導し、防御を与える能力を、試験する。
【００７７】
本実施例は、合成コンセンサス配列に由来するブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）のオープンリーディングフレーム２を含む３種の異なる組換えブタアデノウイルス血清型３ワクチン候補の２用量によって、防御が提供された離乳子ブタを評価するために設計した研究を記載する。親組換え体を、ｒＰＡＶ−３  ＰＣＶ２  ｍＯＲＦ２と称する。防御を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）  ＰＣＶ２分離株ＴＢＡでの、ワクチン接種した子ブタのチャレンジ後に評価し、ウイルス分離物、体重、チャレンジ後直腸温、リンパ節組織病理および剖検でのリンパ組織、腎臓、胸腺、肺およびパイエル板からのウイルス分離によって測定されるような、ウイルス血症に対する影響を測定する。
【００７８】
ＰＣＶ２がない群からの２１日齢の６０頭の子ブタの群を、上記研究に使用する。以下の表は、上記群の例示的ワクチン接種プロトコルを示す。
【００７９】
【表１】
2012511896.tif 000006
より具体的には、最近離乳した２１日（±４日）齢のブタを、ＰＣＶ１陰性およびＰＣＶ２ａ陰性およびＰＣＶ２ｂ陰性のブタ群から手に入れ、試験場所に移動させる。子ブタを、耳タグで個々に同定する。動物の排泄物をタンク中に集め、排水処理用の貯水池に放出する前に消毒する。子ブタに対する臨床的観察を、研究の最後まで１日に１回記録する。子ブタを、機能低下、嗜眠、増大した呼吸速度、呼吸困難、瀕死状態、および死亡について評価する。
【００８０】
０日目に、血液サンプル（２．０〜４．０ｍｌ／子ブタ）、体重および直腸温を、各子ブタから集める。処置群Ｔ１の子ブタに、プラセボを与え、Ｔ２の子ブタに、上記ｒＰＡＶ−３  ＰＣＶ２  ｍＯＲＦ２  Ｖ１を筋肉内経路でワクチン接種し、Ｔ３の子ブタに、ＩＭ経路で上記ｒＰＡＶ−３  ＰＣＶ２  ｍＯＲＦ２  Ｖ２をワクチン接種し、Ｔ４の子ブタに、ＩＭ経路で上記ｒＰＡＶ−３  ＰＣＶ２  ｍＯＲＦ２  Ｖ３をワクチン接種する。
【００８１】
１４日目に、血液サンプル（２．０〜４．０ｍｌ／子ブタ）、体重、および直腸温を、処置群Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３およびＴ４の各子ブタから集める。同様に、１４日目に、処置群Ｔ１の子ブタに、プラセボを与え、Ｔ２の子ブタに、筋肉内経路で上記ｒＰＡＶ−３  ＰＣＶ２  ｍＯＲＦ２  Ｖ１をワクチン接種し、Ｔ３の子ブタに、ＩＭ経路で上記ｒＰＡＶ−３  ＰＣＶ２  ｍＯＲＦ２  Ｖ２をワクチン接種し、Ｔ４の子ブタに、ＩＭ経路で上記ｒＰＡＶ−３  ＰＣＶ２  ｍＯＲＦ２  Ｖ３をワクチン接種する。
【００８２】
２８日目に、血液サンプル（２．０〜４．０ｍｌ／子ブタ）、体重、および直腸温を、処置群Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３およびＴ４の各子ブタから集める。同様に、２８日目に、処置群Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３およびＴ４の子ブタを、承認標的用量で、鼻内経路で、承認ＰＣＶ２ウイルス分離物のチャレンジ接種物１．０ｍｌに曝す。上記チャレンジ接種物を、チャレンジ前に力価測定し、ノートに記録して整理する。
【００８３】
３５日目に、血液サンプル（２．０〜４．０ｍｌ／子ブタ）、体重、および直腸温を、処置群Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３およびＴ４の各子ブタから集める。４２日目に、血液サンプル（２．０〜４．０ｍｌ／子ブタ）、体重、および直腸温を、処置群Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３およびＴ４の子ブタから集める。４９日目に、血液サンプル（２．０〜４．０ｍｌ／子ブタ）、体重、および直腸温を、処置群Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３およびＴ４の子ブタから集める。
【００８４】
同様に、４９日目に、処置群Ｔ１、Ｔ２、およびＴ３の全ての子ブタを、安楽死させ、剖検し、考えられる後の組織病理検査のためにリンパ節サンプルをホルマリン中に保存する。肺、腎臓、胸腺、リンパ組織およびパイエル板組織サンプルを、ＰＣＶ２ウイルス分離のために得る。
【００８５】
ＰＣＶ２ウイルス分離試験を、２８日目、３５日目、４２日目および４９日目のブタから集めた血清サンプルに対して行い、ウイルス分離によって、ＰＣＶ２ウイルスについて分析する。上記血清中の抗体レベルを、０日目、１４日目、２８日目、３５日目、４２日目および４９日目に子ブタから集めた血清サンプルに対して試験し、ＰＣＶ２ウイルスに対する抗体力価についてＥＬＩＳＡで分析する。０日目、１４日目、２８日目、３５日目、４２日目および４９日目の子ブタから集めた血清サンプルを、ＰＡＶ３ウイルスに対するＥＬＩＳＡ力価のための考えられる後の分析のために保存する。
【００８６】
ウイルス分離を、２８日目、３５日目、４２日目および４９日目に集めた血清サンプルで行う。０日目、１４日目、２１日目、２８日目、３５日目、４２日目および４９日目に子ブタから集めた上記血清サンプルを、市販のＩｇＧ  ＰＣＶ２−ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｇｅｚｉｍ  ＰＣＶ  ＩｇＧ（登録商標）（Ｉｎｇｅｎａｓａ，Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ））を使用することによって、ＰＣＶ２に対する抗体の存在について試験する。上記種々の血清サンプルをまた、ＰＣＲアッセイによるＰＣＶ２ゲノムの存在についての考えられるさらなる試験のために保存する。
【００８７】
０（正常）〜３（正常サイズの４倍）の範囲に及ぶリンパ節（浅、鼠径、縦隔部、気管気管支、および腸間膜）のサイズを、評価し、記録する。
【００８８】
上記改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２を含むワクチンが、上記非改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ−２ベースのワクチンが投与された場合に認められるものより強い免疫を生じることは、予測される。上記改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２を含むワクチンが、上記非改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２の投与量より少ない投与量で、ブタを完全に防御することが推定される。このような有益な効果は、皮下注射もしくは経口経路後にモニターされる。
【００８９】
実施例３：試験データ
改変型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２ベースのワクチンによって防御が提供された離乳子ブタを評価するために、試験を行った。この試験において、合成コンセンサス配列に由来するＰＣＶ２  ＯＲＦ２を含む３種の異なる組換えブタアデノウイルス血清型３ワクチン候補の２用量を、使用した。その親組換え体を、ｒＰＡＶ−３  ＰＣＶ２  ｍＯＲＦ２と称した。ＰＣＶ２での、ワクチン接種子ブタのチャレンジ後に防御を評価し、ウイルス分離および臨床徴候によって測定されるような、ウイルス血症に対する影響を測定した。
【００９０】
上記３種の候補ワクチンは、以下であった：
（１）ＰＡｄＶ３−ＰＣＶ２ＯＲＦ２全長（ここで上記ＰＣＶ２  ＯＲＦ  ３は改変されていない）；
（２）ＰＡｄＶ３−ＰＣＶ２ＯＲＦ２短縮型（ここで上記ＰＣＶ２  ＯＲＦ２核局在シグナルは、除去されている）；および
（３）ＰＡｄＶ３−ＯＣＶ２ＯＲＦ２分泌型（ここで上記ＰＣＶ２  ＯＲＦ２は、上記ＮＬＳが除去されておりかつ疎水性シグナル配列および切断部位によって置換されている）。
【００９１】
上記プロトコルにおいて、３週齢の子ブタに、（１）ＰＡｄＶ３−ＰＣＶ２ＯＲＦ２全長；（２）ＰＡｄＶ３−ＰＣＶ２ＯＲＦ２短縮型、（３）ＰＡｄＶ３−ＰＣＶ２ＯＲＦ２分泌型のいずれかを、またはリン酸緩衝化生理食塩水（コントロール）をワクチン接種した。５週齢において、全てのブタに、２回目の（追加免疫）ワクチン接種を与えた。上記ワクチン接種は全て、筋肉内（ＩＭ）であった。７週齢で、全てのブタを、ＰＣＶ２でチャレンジし、試験を、１０週齢で終えた。
【００９２】
この試験からのデータを、図３（ウイルス分離を示す）および図４（臨床症状の存在を示す）に示す。これら図面におけるデータから見られ得るように（ウイルス分離（チャレンジ後）および臨床症状の両方）、分泌型バージョン（上記の３番）は、ＰＣＶ２に対するワクチンとして最も有効であった。実際には、ＰＢＳ、全長ＰＣＶ２ＯＲＦおよび短縮型ＰＣＶＳ  ＯＲＦで処置した子ブタの群の各々において、上記子ブタは、１日以内にＰＣＶ２の臨床症状を発生させたのに対して、ＰＡｄＶ３−ＯＣＶ２ＯＲＦ２分泌型（ここで上記ＰＣＶ２  ＯＲＦ２は、上記ＮＬＳが除去されかつ疎水性シグナル配列および切断部位によって置換されている）をワクチン接種した上記ブタは、チャレンジ後７日目に、いかなる有害な臨床症状をも発生させなかった。
【００９３】
【化４】
2012511896.tif 000007
【００９４】
【化５】
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【００９５】
【化６】
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【００９６】
【化７】
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【００９７】
【化８】
2012511896.tif 000011
【図１】
2012511896.tif 000012
【図２Ａ】
2012511896.tif 000013
【図２Ｂ】
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【図３】
2012511896.tif 000015
【図４】
2012511896.tif 000016
【配列表】
2012511896000001.app
【国際調査報告】
2012511896.tif 000017
2012511896.tif 000018
2012511896.tif 000019