(57)【要約】  本発明は、ジフテリア、破傷風、全細胞百日咳及びポリオ等の疾患を防ぐ、抗原の混合物を含む混合ワクチンに関する。本発明はまた、ワクチンの投与が、一つより多くの病原体に対して同時に対象を免疫化し得るように、インフルエンザ菌、肝炎ウイルス、及び他の病原体に起因する感染症を防ぐ、当該混合ワクチンにおける一つ以上の抗原の包含に関する。本発明は特に、上記のような抗原を含む完全に液体安定な混合ワクチン及び当該ワクチンの製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジフテリア（Ｄ）抗原、破傷風（Ｔ）抗原、全細胞百日咳（ｗＰ）抗原、及びＩＰＶ抗原を含み、かつ、インフルエンザ菌（Ｈｉｂ）及び肝炎（Ｈｅｐ）の群から選択される一つ以上の抗原を随意に含む、完全に液体安定な混合ワクチン。
【請求項２】
前記Ｄ抗原及び前記Ｔ抗原が、リン酸アルミニウムに吸着されている、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記ＩＰＶ抗原が、１型マホニー、２型ＭＥＦ及び３型ソーケットの群から選択されるソールク株、又はセービン１もしくは２の群から選択されるセービン株である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
Ｈｉｂが、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７及び髄膜炎菌の外膜タンパク質もしくはそれらの任意の同等物を含む群から選択される担体タンパク質、又は任意の他の公知の担体にコンジュゲート化されている、請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
前記Ｈｉｂ抗原が、任意のアジュバントに実質的に吸着されていない、請求項１に記載のワクチン。
【請求項６】
前記Ｈｉｂ抗原が、Ｈｉｂ  ｂ株の莢膜多糖体に由来する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項７】
前記Ｈｅｐ抗原が、リン酸アルミニウムに吸着されている、請求項１に記載のワクチン。
【請求項８】
前記Ｈｅｐ抗原が、Ｈｅｐ  Ｂ株の表面抗原に由来する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項９】
前記ワクチンが、組成物中の保存剤として２−フェノキシエタノール（２−ＰＯＥ）をさらに含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１０】
Ｄ、Ｔ、ｗＰ、Ｈｉｂ  ｂ並びにＩＰＶ（１型マホニー、２型ＭＥＦ及び３型ソーケット）を含み、ここでＤが約１〜４０Ｌｆの量で存在し、Ｔが約１〜２５Ｌｆの量で存在し、ｗＰが約１〜３０ＩＯＵ毎０．５ｍｌの量で存在し、かつＨｉｂ  ｂが約１〜２０μｇ毎０．５ｍｌの量で存在し、かつ１型マホニー、２型ＭＥＦ及び３型ソーケット株が、それぞれ約１〜５０ＤＵ、１〜１５ＤＵ及び１〜５０ＤＵ毎０．５ｍｌの量で存在する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１１】
Ｄ、Ｔ、ｗＰ、Ｈｉｂ  ｂ並びにＩＰＶを含み、ここでＤが約２０Ｌｆの量で存在し、Ｔが約７．５Ｌｆの量で存在し、ｗＰが約１６ＩＯＵ毎０．５ｍｌの量で存在し、かつＨｉｂ  ｂが約１０μｇ毎０．５ｍｌの量で存在し、かつ１型マホニー、２型ＭＥＦ及び３型ソーケット株が、それぞれ約４０ＤＵ、８ＤＵ及び３２ＤＵ毎０．５ｍｌの量で存在する、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
Ｄ、Ｔ、ｗＰ、Ｈｉｂ  ｂ、Ｈｅｐ  Ｂ並びにＩＰＶ（１型マホニー、２型ＭＥＦ及び３型ソーケット）を含み、ここでＤが約１〜４０Ｌｆの量で存在し、Ｔが約１〜２５Ｌｆの量で存在し、ｗＰが約１〜３０ＩＯＵ毎０．５ｍｌの量で存在し、かつＨｉｂ  ｂが約１〜２０μｇ毎０．５ｍｌの量で存在し、かつＨｅｐ  Ｂが約１〜２０μｇ毎０．５ｍｌの量で存在し、かつ１型マホニー、２型ＭＥＦ及び３型ソーケット株が、それぞれ約１〜５０ＤＵ、１〜１５ＤＵ及び１〜５０ＤＵ毎０．５ｍｌの量で存在する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１３】
Ｄ、Ｔ、ｗＰ、Ｈｉｂ  ｂ、Ｈｅｐ  Ｂを含み、ここでＤが約２０Ｌｆの量で存在し、Ｔが約７．５Ｌｆの量で存在し、ｗＰが約１６ＩＯＵ毎０．５ｍｌの量で存在し、Ｈｉｂ  ｂが約１０μｇ毎０．５ｍｌの量で存在し、かつＨｅｐ  Ｂが約１０μｇ毎０．５ｍｌの量で存在し、かつ１型マホニー、２型ＭＥＦ及び３型ソーケット株が、それぞれ約４０ＤＵ、８ＤＵ及び３２ＤＵ毎０．５ｍｌの量で存在する、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
Ｄ、Ｔ、Ｐ、Ｈｉｂ、Ｈｅｐ又はＩＰＶの群から選択される任意の抗原に対する免疫応答の誘導方法であって、免疫学的に活性な量の請求項１に記載の混合ワクチンを対象に投与することを含む、方法。
【請求項１５】
ワクチンがＤ抗原、Ｔ抗原、ｗＰ抗原、Ｈｉｂ  ｂ抗原及びＨｅｐ  Ｂ抗原を含み、かつ保存剤として２−フェノキシエタノールを含み、ワクチンがＩＰＶ抗原を含まないことを条件とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１６】
Ｄが約１〜４０Ｌｆの量で存在し、Ｔが約１〜２５Ｌｆの量で存在し、ｗＰが約１〜３０ＩＯＵ毎０．５ｍｌの量で存在し、Ｈｉｂ  ｂが約２〜２０μｇ毎０．５ｍｌの量で存在し、かつＨｅｐ  Ｂが約１〜２０μｇ毎０．５ｍｌの量で存在する、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
Ｄが約２０Ｌｆの量で存在し、Ｔが約７．５Ｌｆの量で存在し、ｗＰが約１６ＩＯＵ毎０．５ｍｌの量で存在し、Ｈｉｂ  ｂが約１０μｇ毎０．５ｍｌの量で存在し、かつＨｅｐ  Ｂが約１０μｇ毎０．５ｍｌの量で存在する、請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
請求項１に記載の完全に液体安定な混合ワクチンの製造方法であって、
ａ）ｉ）ジフテリア（Ｄ）抗原、ｉｉ）破傷風（Ｔ）抗原及びｉｉｉ）全細胞百日咳（ｗＰ）抗原の混合物を含む成分Ｉを、反応容器中で調製する工程、
ｂ）随意に、アルミニウム塩に吸着されたＨｅｐを含む成分ＩＩを調製する工程、
ｃ）随意に、成分Ｉに前記成分ＩＩを混合して混合物を得る工程、
ｄ）［ａ）又はｃ］において得られた］上記混合物をＨｉｂ抗原に添加し、次いでＩＰＶ抗原を添加する工程、
を含む、方法。
【請求項１９】
前記Ｄ抗原及び前記Ｔ抗原がリン酸アルミニウムに吸着されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、保存剤として２−フェノキシエタノール（２−ＰＯＥ）を前記成分Ｉに添加する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記成分Ｉの調製が、以下の工程：
ａ）リン酸アルミニウムゲルを容器内へと移動させる工程、
ｂ）破傷風抗原調製物を上記容器内へと撹拌下で移動させる工程、
ｃ）ジフテリア抗原調製物を当該容器内へと移動させる工程、
ｄ）２−フェノキシエタノールを当該容器中に撹拌下で移動させる工程、
ｅ）塩化ナトリウム溶液を上記当該容器へと移動させる工程
ｆ）ｐＨを確認し、ｐＨを６．０〜６．５の範囲中に調節する工程、
ｇ）ｗＰ抗原調製物を撹拌下で移動させる工程、
ｈ）ｐＨを確認し、ｐＨを６．５〜７．５の範囲中に調節する工程、
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記成分ＩＩの調製が、以下の工程：
ａ）リン酸アルミニウムゲルを容器内へと移動させる工程、
ｂ）肝炎抗原（Ｈｅｐ）調製物を上記容器内へと撹拌下で移動させる工程、
ｃ）塩化ナトリウム溶液を同容器内へと移動させる工程、
ｄ）２−フェノキシエタノール調製物を上記当該容器へと移動させる工程、
ｅ）ｐＨを確認し、ｐＨが６．０〜７．０の範囲中に収まるように調節する工程、
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記成分Ｉと前記成分ＩＩとの混合が、成分ＩＩの内容物を前記成分Ｉへと移動させて、反応容器中に混合物を得る工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｈｉｂ抗原及び前記ＩＰＶ抗原の添加が、以下の工程：
ａ）Ｈｉｂ抗原調製物に、請求項１８の工程ａ）又は工程ｃ）において得られた混前記合物を移動させて、混合物を得る工程、
ｂ）上記混合物、次いで食塩水を、ＩＰＶ抗原調製物へと移動させる工程、
ｃ）ｐＨを確認し、ｐＨを６．５〜７．５の範囲中に調節する工程、
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１５に記載の完全に液体安定な混合ワクチンの製造方法であって、
ａ）ｉ）ジフテリア（Ｄ）抗原、ｉｉ）破傷風（Ｔ）抗原及びｉｉｉ）全細胞百日咳（ｗＰ）抗原の混合物を含む成分Ｉを調製する工程、
ｂ）アルミニウム塩に吸着されたＨｅｐ  Ｂを含む成分ＩＩを調製する工程、
ｃ）成分Ｉに前記成分ＩＩを混合して混合物を得る工程、
ｄ）上記混合物をＨｉｂ抗原に添加する工程、
を含む、方法。
【請求項２６】
前記Ｄ抗原及び前記Ｔ抗原がリン酸アルミニウムに吸着されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記成分Ｉの調製が、以下の工程：
ａ）リン酸アルミニウムゲルを容器内へと移動させる工程、
ｂ）破傷風抗原調製物を上記容器内へと撹拌下で移動させる工程、
ｃ）ジフテリア抗原調製物を当該容器内へと移動させる工程、
ｄ）２−フェノキシエタノールを移動させる工程、
ｅ）塩化ナトリウム溶液を上記当該容器へと移動させる工程
ｆ）ｐＨを確認し、ｐＨを６．０〜６．５の範囲中に調節する工程、
ｇ）ｗＰ抗原調製物を同容器内へと移動させる工程、
ｈ）ｐＨを確認し、ｐＨを６．５〜７．５の範囲中に調節する工程、
を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記成分ＩＩの調製が、以下の工程：
ａ）リン酸アルミニウムゲルを容器内へと移動させる工程、
ｂ）Ｈｅｐ  Ｂ抗原調製物を上記容器内へと移動させる工程、
ｃ）塩化ナトリウム溶液を同容器内へと移動させる工程、
ｄ）２−フェノキシエタノール調製物を上記当該容器へと移動させる工程、
ｅ）ｐＨを確認し、ｐＨが６．０〜７．０の範囲中に収まるように調節する工程、
を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記成分Ｉと前記成分ＩＩとの混合が、成分ＩＩの内容物を前記成分Ｉへと移動させて混合物を得る工程を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
以下の工程：
ａ）得られた前記混合物を、前記Ｈｉｂ抗原調製物へと移動させる工程、
ｂ）ｐＨを確認し、ｐＨを６．５〜７．５の範囲中に調節する工程、
をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジフテリア、破傷風、百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）及びポリオ等の疾患を防ぐ、抗原の混合物を含む混合ワクチンに関する。本発明はまた、ワクチンの投与が、一つより多くの病原体に対して同時に対象を免疫化し得るように、インフルエンザ菌、肝炎ウイルス、及び他の病原体に起因する感染症を防ぐ、当該混合ワクチンにおける一つ以上の抗原の包含に関する。本発明は特に、上記のような抗原を含む完全に液体安定な混合ワクチン及び当該ワクチンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンの抗原
ジフテリア抗原及び破傷風抗原
ジフテリア及び破傷風は、それぞれジフテリア菌（Ｃｏｒｎｙｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）及び破傷風菌に起因する急性感染症である。これらの細菌の毒素は、それぞれの疾患の主要な原因である。これらの細菌からの防御を提供するワクチンは、その感染力を失うようにトキソイド化されたこれらの毒素を含有する。トキソイド［ジフテリアトキソイド（ＤＴ）及び破傷風トキソイド（ＴＴ）］を作製するために、毒素は、ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒド等の化学物質を用いて処理される。変異ジフテリア毒素であるＣＲＭ１９７もまた、一定のワクチンにおいて使用されている。
【０００３】
百日咳抗原
百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ）疾患又は百日咳は、百日咳菌に起因する。これは、死にさえもつながり得る、衰弱性で重篤な疾患である。疾患に対する初期のワクチンは、細胞を殺して毒性物質を不活性化するためにホルムアルデヒド等の化学物質で処理された、全細胞に基づいていた。不活化全細胞百日咳ワクチンの開発に向けた努力は、１９０６年に百日咳菌が純粋培養で生育されてから間もなく開始された。１９２０年代には、Ｌｏｕｉｓ  Ｗ．  Ｓａｕｅｒ博士が、百日咳のためのワクチンを開発した。１９２５年には、デンマーク人の医師であるＴｈｏｒｖａｌｄ  Ｍａｄｓｅｎが初めて、全細胞百日咳ワクチンの大規模な試験を行った。１９４２年には、アメリカ人の科学者であるＰｅａｒｌ  Ｋｅｎｄｒｉｃｋが、全細胞百日咳ワクチンと、ジフテリアトキソイド及び破傷風トキソイドとを組み合わせ、初めてのＤＴＰ混合ワクチンを生成した。「全細胞（ｗＰ）ワクチン」と呼ばれるこれらのワクチンは、非常に効果的であった。
【０００４】
「成分ワクチン」と呼ばれるその後のワクチンは、より少ない数の高度に生成された抗原を含んだ。多くの病原性関連因子が、成分ワクチンと比較してより定義されていない「無細胞ワクチン」中への包含について提案されてきた。ＰＴのみを含むワクチンは部分的に防御的であったのに対し、ＰＴ／ＦＨＡの組み合わせを含むワクチンはより効果的であったが、それでもｗＰワクチンよりも低い免疫原性を有した。
【０００５】
灰白髄炎（Ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）抗原
２つの異なる種類のワクチンが利用可能である：
・アルバート・セービン（Ａｌｂｅｒｔ  Ｓａｂｉｎ）博士によって１９６１年に開発された弱毒生（衰弱させた）経口ポリオワクチン（ＯＰＶ）。セービン株を含むＯＰＶは、経口投与される。
・ジョナス・ソールク（Ｊｏｎａｓ  Ｓａｌｋ）博士によって１９５５年に開発された不活化（死菌（ｋｉｌｌｅｄ））ポリオワクチン（ＩＰＶ）。ソールク株を含むＩＰＶは、注射として投与される。
【０００６】
弱毒生（ＯＰＶ）及び不活化（ＩＰＶ）ポリオワクチンの両方とも、世界中のポリオ疾患を抑制することに効果を挙げてきた。ポリオワクチンは、ソールク株又はセービン株を含み得る。灰白髄炎疾患に対するワクチンにおいて使用されてきたソールク株は、１型マホニー（Ｍａｈｏｎｅｙ）、２型ＭＥＦ及び３型ソーケット（Ｓａｕｋｅｔｔ）である。セービン株としては、セービン１株及びセービン２株が挙げられる。
【０００７】
インフルエンザ菌（Ｈｉｂ）抗原
インフルエンザ菌は、上気道細菌叢の通常の部分である、グラム陰性球桿菌である。インフルエンザ菌ｂ型（Ｈｉｂ  ｂ）は、幼児における髄膜炎侵襲性血液媒介感染症（ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂｌｏｏｄｂｏｒｎｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）の主要な原因であり、人生の最初の２年間における髄膜炎の主要な原因である。インフルエンザ菌に対する免疫化は、１９８７年に多糖体ワクチン［ポリリボースリビトールリン酸（ｐｏｌｙｒｉｂｏｓｅ  ｒｉｂｉｔｏｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＰＲＰ）］を使って、カナダで始まった。Ｈｉｂのポリリボシルリビトールリン酸（ｐｏｌｙｒｉｂｏｓｙｌｒｉｂｉｔｏｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＰＲＰ）カプセルは、その生物体の主要な病原性因子である。ＰＲＰに対する抗体が、血清殺菌活性への主な貢献者であり、抗体レベルの上昇が、侵襲性疾患の減少と関連している。ＰＲＰはＴ細胞非依存性抗原であり、したがって、ａ）１８ヶ月未満の乳幼児における弱い抗体応答の誘導、ｂ）Ｔ細胞依存性抗原で見られる抗体応答よりも変動的かつ定量的に小さい抗体応答、ｃ）より高い割合の免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の生産、及びｄ）ブースター応答の誘導不能、によって特徴づけられる。
【０００８】
ＰＲＰ成分のみに基づく初期のワクチンは、乳児においては効果がないことが分かった。ＰＲＰが、髄膜炎菌の外膜タンパク質、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド及びＣＲＭ１９７等の、担体タンパク質と呼ばれるタンパク質とコンジュゲート化している、ＰＲＰコンジュゲート化ワクチンに対するさらなる努力が向けられた。
【０００９】
肝炎（Ｈｅｐ）抗原
肝炎ウイルスには種々の株がある。Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に起因する疾患であり、ヒトを含むヒト上科の肝臓に感染し、肝炎と呼ばれる炎症を引き起こす。肝炎は、数週間にわたる（急性の）軽度の病気から、肝臓疾患又は肝臓癌をもたらし得る重篤で長期的な（慢性の）病気まで、重症度に幅がある。その疾患に対するワクチンは、ウイルスのエンベロープタンパク質の一つである、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含有する。ＦＤＡに承認されたＨｅｐ  Ｂ含有ワクチンは、メルクによるＲｅｃｏｍｂｉｖａｘ  ＨＢ（登録商標）及びＣｏｍｖａｘ（登録商標）、グラクソ・スミスクライン・バイオロジカルズによるＥｎｇｅｒｉｘ−Ｂ（登録商標）及びＰｅｄｉａｒｉｘ（登録商標）である。
【００１０】
他の抗原
人類に関係する他の抗原としては、インフルエンザ菌（ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ血清型及び莢膜非保有株）、肝炎（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ株）、髄膜炎Ａ、Ｂ又はＣ、インフルエンザ、肺炎連鎖球菌、連鎖球菌、炭疽菌、デング熱、マラリア、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、ＢＣＧ、日本脳炎、ロタウイルス、天然痘、黄熱、腸チフス、シングルス（Ｓｉｎｇｌｅｓ）、水痘ウイルス、などが挙げられる。
【００１１】
混合ワクチン
ワクチンの分野における数十年にわたる研究にもかかわらず、感染症は人類にとっての脅威であり続けている。種々の疾患を防ぐ混合ワクチンは、注射の回数を減らし、投与及び製造コストを低減し、その上患者コンプライアンスを向上させるので、非常に望ましい。そのような混合ワクチンは一般的に、よりよく受け入れられている。
【００１２】
しかしながら、文書で十分に立証された現象である抗原競合が、多価ワクチンの開発を複雑にし、邪魔してきた。この現象は、複数の抗原を一緒に投与すると、しばしば一定の抗原に対して、それらの抗原を別個に投与した場合の免疫応答と比較して、低下した応答をもたらす、という知見をいう。
【００１３】
初期の研究は、異なる疾患及び感染症に向けられた、多価のワクチンの開発に焦点がおかれてきた。そのような周知のワクチンの組み合わせの一つは、ジフテリア（Ｄ）抗原、破傷風（Ｔ）抗原及び全細胞百日咳（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）（ｗＰ）抗原を含み、ＤＴｗＰワクチンを提供する。
【００１４】
そのような混合ワクチンに、肝炎ウイルス（Ｈｅｐ）、インフルエンザ菌（Ｈｉｂ）及びポリオウイルス（ＩＰＶ）に起因する疾患を防ぐ他の抗原を追加することが望ましい。上記当該混合ワクチンに、他の疾患を防ぐ抗原を追加することもまた望ましい。
【００１５】
グラクソ・スミスクライン・バイオロジカルズによって生産されるＱｕｉｎｔａｎｒｉｘは、ＤＴｗＰ抗原、Ｈｉｂ抗原及びＨｅｐ  Ｂ抗原を含む混合ワクチンであり、保存剤としてチオメルサールを含む。このワクチンは、市販される前に取り下げられた。グラクソ・スミスクライン・バイオロジカルズによって生産されるＺｉｌｂｒｉｘ（登録商標）は、ＤＴｗＰ及びＨｅｐ  Ｂを含有する。グラクソ・スミスクライン・バイオロジカルズによって生産されるＺｉｌｂｒｉｘ  Ｈｉｂ（登録商標）は、ＤＴｗＰ及びＨｅｐ  Ｂ及Ｈｉｂを含有し、ここでＨｉｂは、他の抗原成分を含有しない別個のバイアル中で販売されている。
【００１６】
グリーンクロスワクチン（Ｇｒｅｅｎ  Ｃｒｏｓｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ）による特許文献１は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、全細胞百日咳及びＢ型肝炎表面抗原を含む四価の混合ワクチンを提供する。当該発明は、Ｈｅｐ  ＢをＤＴｗＰと組み合わせるワクチン調製物に関するが、Ｈｉｂ又はＩＰＶ等の他の抗原の包含については言及していない。
【００１７】
グラクソ・スミスクライン・バイオロジカルズによる特許文献２は、低用量のＩＰＶを含むワクチンの作製方法に関する。しかしながら、それは、Ｄ抗原、Ｔ抗原、ｗＰ抗原、ＩＰＶ抗原、Ｈｉｂ抗原及びＨｅｐ抗原を、全てを一緒に単一のバイアル中に、完全に液体形態で含む完全に液体であるワクチンであって、Ｈｉｂが任意のアジュバントに実質的に吸着していないワクチン、の調製は教示していない。
【００１８】
スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルズによる特許文献３は、ＨＢｓＡｇを含む多価ワクチンに関する。当該発明は、ＨＢｓＡｇがリン酸アルミニウムに吸着した混合ワクチンに関する。しかしながら、ＤＴｗＰ−ＩＰＶを、Ｈｉｂ及びＨｅｐ等の他の抗原とともに完全に液体形態で含む、混合ワクチンの具体的な開示はない。
【００１９】
コンノート・ラボラトリース（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｌａｂ）による特許文献４は、宿主において、百日咳菌、破傷風菌、ジフテリア菌、ポリオウイルス及び／又はインフルエンザ菌による感染に起因する疾患を防ぐ、多価の免疫原性組成物を提供する。明細書によれば、ワクチンのＨｉｂ  ｂ成分は、凍結乾燥された成分であり、ワクチンの他の成分と混合する前に再構成されなければならない。したがって、明細書中に当該抗原を全て含む完全に液体である混合ワクチンに関連した教示はない。
【００２０】
フリーズドライとも呼ばれる凍結乾燥は、非常に費用がかかり、またタンパク質に対して多くのストレスを引き起こす方法である。ワクチンの任意の成分が凍結乾燥されている場合、ワクチンの投与時には、凍結乾燥物を別の液体又は混合ワクチンの液体成分と混合する必要がある。このことは、専門家にとって追加の制約を意味し、それが下手に実施されるリスクを与える。次いで、凍結乾燥された成分が一つの区画にあり、ワクチンの液体成分が他の区画にある多区画注射器が提案された。しかしながら、ワクチンの投与時にその内容物が混合され得るそのような注射器は、生産費の低減という段階、及び専門家によって実施される作業の段階では、満足に機能しない。
【００２１】
したがって、このフリーズドライの工程を回避し、全成分が一緒に、完全に液体形態で存在する混合ワクチンを提供することが望ましい。このことは、ワクチンの投与を容易にし、患者コンプライアンスを向上させ、また生産費を低減させるだろう。したがって、Ｈｉｂ抗原をワクチンの液体成分に追加し、結果として完全に液体である多価ワクチンを与えることが望ましい。
【００２２】
グラクソ・スミスクライン・バイオロジカルズによる特許文献５は、Ｈｉｂ  ｂ多糖体を含むワクチンに関する。その出願は、混合ワクチンの成分の単純な混合は、全ての抗原が効果的に一緒に混合され得ないという事実によって、複雑化されると述べている。その出願は、ＤＴＰワクチンの水酸化アルミニウムとＰＲＰとの間に干渉があると述べている。特許文献５における発明は、ＰＲＰが事前にリン酸アルミニウム上に吸着された即時調製型の混合ワクチンにおけるこの干渉を、最小化することを目的とする。発明はさらに、免疫干渉からある程度保護されるような、ＰＲＰを含む免疫原性組成物、ワクチン及び混合ワクチンを提供する。発明者らは、ポリアニオン系ポリマー添加剤を、ＰＲＰを含むワクチンに組み込むことによって、上記が達成され得ることを見出した。
【００２３】
しかしながら、ワクチン製剤におけるポリアニオン系ポリマーの使用は、ワクチンの製剤化の費用を増加させ得るために、望ましくないかもしれない。また、ワクチンは最終的にはヒトへの使用が意図されるため、ワクチンは可能な限り最小限の成分を含むことが理想的である。追加の原料の使用は、身体が反応して抗体を生産し得る物質を、製剤へ添加することを意味する。そのような身体の反応が、免疫調製物のそのような成分と接触することは、望ましくないかもしれない。
【００２４】
パストゥール・メリユ・セリュム（Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｍｅｒｉｅｕｘ  Ｓｅｒｕｍｓ）による特許文献６は、インフルエンザ菌ｂ型の莢膜多糖体又は破傷風アナトキシンに共役した高分子量ポリリボシルリビトールリン酸（ＰＲＰ）、及びアルミニウムベースのアジュバントを含むワクチン組成物に関する。その発明において使用されるアルミニウムベースのアジュバントは、およそ７．２未満の電荷ゼロ点を有する。しかしながら、その特許は特に、ＤＴｗＰ−ＩＰＶを、Ｈｉｂ及びＨｅｐのような他の抗原とともに完全に液体形態で含む混合ワクチンの調製を教示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２５】
【特許文献１】国際公開第０２／００５８４６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０８／０２８９５７号パンフレット
【特許文献３】米国特許第６０１３２６４号明細書
【特許文献４】国際公開第１９９８／０００１６７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０４／１１０４８０号パンフレット
【特許文献６】米国特許第６３３３０３６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
数々の疾患を防ぐであろう種々の抗原を含む多価ワクチンの作製のための研究が進行しているものの、それらは、ＤＴｗＰ抗原及びＩＰＶ抗原を、Ｈｉｂ及びＨｅｐ等の他の抗原とともに完全に液体の剤形で含む、安定な混合ワクチンを提供する必要性については取り組んでいない。混合ワクチン及びＨｉｂワクチンの別個での投与及び同時投与によって免疫化された子供における、特定の抗原に対する抗体応答に関して、対照的な報告が入手可能である。そのような結果には種々の理由があり得、その理由としては、それらワクチンが、それらの抗原の内容、トキソイド化の方法、アジュバント化の方法又は使用された保存剤において非同一であることが挙げられる。
【００２７】
現在公知であり、入手可能な混合ワクチンは、数々の疾患に対して、感受性ヒト集団において望まれるレベルの効果及び免疫原性を一回の注射で達成するために適当な免疫原性形態での、適当な抗原の適当な製剤を、含有していないかもしれない。種々の感染症を防ぎ、かつ液体形態である多成分ワクチンが、投与の容易性及び費用対効果の低減を与えるために必要とされる。ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、破傷風菌、百日咳菌、ポリオウイルス、肝炎ウイルス及びインフルエンザ菌に起因する感染症に起因する疾患に対する、安定かつ効果的な多価ワクチンを提供することが望ましいだろう。そのようなワクチンが効果的であるためには、ワクチンの各抗原に対する血清抗体保有（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）基準が満たされていなければならない。このためには、抗原競合及び抗原干渉によってもたらされる障害物及び挑戦を解消する必要がある。本発明は、複数の疾患を防ぐ完全に液体である混合ワクチン製剤を提供することによって、従来技術の制限を解消し、関連する問題を解決する。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明は、ワクチンの投与が、一つより多くの病原体に対して同時に対象を免疫化し得るように、ジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）（Ｄ）、破傷風（Ｔ）、全細胞百日咳（ｗＰ）、及びＩＰＶを含み、かつ、インフルエンザ菌（Ｈｉｂ）及び肝炎（Ｈｅｐ）の群から選択される一つ以上の抗原を随意に含む完全に液体安定な混合ワクチンに関する。本発明は特に、上記のような抗原を含む完全に液体安定な混合ワクチン及び当該ワクチンの製造方法に関する。
【００２９】
本発明はさらに、複数のワクチン成分の各々に対する血清抗体保有基準を満たす、複数の疾患状態の予防、改善及び治療に適切な該複数のワクチン成分を含む混合ワクチンに関する。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、複数のワクチン成分の各々に対する血清抗体保有基準を満たす、複数の疾患状態の予防、改善及び治療に適切な該複数のワクチン成分を含む、完全に液体安定な混合ワクチンに関する。
【００３１】
本発明の利点としては、幅広い範囲の疾患及び感染症からの防御を、安全で効果的な様式で与え得る多価ワクチンが挙げられる。本発明のワクチンは、ワクチン中に存在する任意の抗原のいかなる干渉もなく、種々の疾患及び感染症への免疫原性を提供する。したがって、一度の注射が、種々の疾患及び感染症に対する免疫原性を与え、ワクチンの患者コンプライアンスをより向上させるであろう。一度の注射が、数々の感染症及び疾患に対する免疫を与えるであろうから、ワクチン接種の費用は低減されるであろう。本発明のワクチンは、ワクチン接種センターへの訪問の回数を低減させ、また数々の異なる疾患及び感染症に対して行われるべき注射の回数も低減させるという意味では、有益であるだろう。本発明のこの側面は、特に数多くの感染症及び疾患への免疫を与えるためにワクチン接種する必要がある若年人口で、より有用かつ有利となるだろう。したがって、本発明は、より許容可能なワクチンを提供する。
【００３２】
定義
本明細書で、本発明のワクチンを記述するために使用される用語「完全に液体である」とは、ワクチンの全ての成分が液体状態にあり、ワクチンのいかなる成分も、その成分が対象へ投与される前にワクチンの他の成分と混合されることを必要とする凍結乾燥又は任意の他の形態で提供されることがない、ワクチンの状態をいう。
【００３３】
本明細書で、ワクチンにおいて使用される莢膜多糖体（Ｈｉｂ）がコンジュゲート化されたタンパク質成分を記述するために使用される用語「担体タンパク質」は、Ｔ細胞非依存性多糖類をＴ細胞依存性抗原へ変換するためにコンジュゲート化されている。
【００３４】
本明細書で、用語「アジュバント」は、抗原に対して生成される免疫応答の種類及び質に影響することで、抗原と免疫系との間の接触を容易にすることによってワクチンの抗原の免疫応答を増強する、ワクチンの非抗原性成分を記述するために使用される。アジュバントは、抗原に対する免疫応答の延長をもたらし、また一定の抗原の毒性を低減させるか又は一定の抗原への溶解性を提供する働きもし得る。
【００３５】
本明細書で、本発明のワクチンを記述するために使用される用語「安定」とは、ワクチンを５±３℃で少なくとも１ヶ月、好ましくは１２ヶ月、もっとも好ましくは２４ヶ月インキュベーションした後、ワクチン組成物の各抗原が通常の許容限界（ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ  ｌｉｍｉｔ）として設定されるよりも高い力価／免疫原性を有することを意味する。
【００３６】
本明細書で、「Ｈｉｂは、任意のアジュバントに実質的に吸着されていない」という表現において、任意のアジュバントへのＨｉｂの吸着又は共役の量を記述するために使用される用語「実質的に」とは、任意のアジュバントへのＨｉｂの吸着が１５％未満であり、好ましくは１０％未満であることを意味する。Ｈｉｂ抗原は、それが任意のアジュバントへ意図的に吸着されるようないかなる工程にも供されない；起こっているかもしれない吸着の量は、抗原とアジュバントとの間の接触のためであり得、計画的ではない。
【００３７】
本明細書で、本発明のワクチン中に存在する成分の各々の量を記述するために使用される用語「約〜の（ｏｆ  ａｂｏｕｔ）」とは、該ワクチン成分の量であって、その特定の成分について述べられた量の好ましくは±２０％、より好ましくは±１０％、もっとも好ましくは±５％の量で存在する、該ワクチン成分の量を意味する。
【００３８】
本明細書で、本発明のワクチンの調製の過程中で混合物の成分の撹拌時間を記述するために使用される用語「約」は、述べられた値の好ましくは±２０％、より好ましくは±１０％、もっとも好ましくは±５％である。
【００３９】
本明細書で、本発明の混合ワクチンと関連して使用される用語「免疫学的に活性な」とは、ワクチンが対象に投与された場合、ワクチン接種された対象をそれぞれの疾患又は感染症から防御するように、当該組合せの抗原の各々に対する抗体を誘発することができることを意味する。
【００４０】
本明細書で、本発明の混合ワクチンの抗原と関連して使用される用語「共役している又は吸着される」とは、抗原とアジュバントとの間の任意の形態の物理的結合をいう。
【００４１】
本発明のワクチン
本発明は、ジフテリア抗原（Ｄ）、破傷風抗原（Ｔ）、全細胞百日咳抗原（ｗＰ）、及びポリオウイルス抗原（ＩＰＶ）を含み、かつ、インフルエンザ菌（Ｈｉｂ）及び肝炎（Ｈｅｐ）の群から選択される一つ以上の抗原を随意に含む、完全に液体安定な混合ワクチンを提供する。
【００４２】
本発明の一態様は、ワクチンの全ての成分が一緒に、液体形態で単一のバイアル中に存在する、混合ワクチン組成物を提供する。
【００４３】
本発明のさらなる一態様は、ＤＴｗＰ抗原、Ｈｉｂ抗原及びＩＰＶ抗原を含む、完全に液体安定な五価のワクチンに関する。
【００４４】
本発明の別の態様は、ＤＴｗＰ抗原、Ｈｉｂ抗原、Ｈｅｐ抗原及びＩＰＶ抗原を含む、完全に液体安定な六価のワクチンを提供する。
【００４５】
本発明はさらに、ジフテリア（Ｄ）抗原及び破傷風（Ｔ）抗原が、リン酸アルミニウムに吸着されていると規定する。
【００４６】
本発明の他の一態様によれば、ＩＰＶ株は、１型マホニー、２型ＭＥＦ及び３型ソーケットの群から選択され得る一つ以上のソールク株、又は１型セービンもしくは２型セービンの群から選択される一つ以上のセービン株である。
【００４７】
本発明のさらなる態様によれば、Ｈｉｂ抗原は、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、ＣＲＭ１９７及び髄膜炎菌の外膜タンパク質もしくはそれらの任意の同等物を含む群から選択される担体タンパク質、又は任意の他の公知の担体にコンジュゲート化されている。
【００４８】
本発明の別の態様によれば、Ｈｉｂ抗原は、任意のアジュバントに実質的に吸着されていない。
【００４９】
本発明の別の一態様によれば、本発明のワクチンにおけるＨｉｂ抗原は、Ｈｉｂ  ｂ株の莢膜多糖体に由来する。
【００５０】
本発明の一態様は、Ｈｅｐ抗原が、リン酸アルミニウムに吸着されていると規定する。
【００５１】
本発明のさらなる一態様は、Ｈｅｐ抗原がＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、すなわち、Ｈｅｐ  Ｂ株の表面抗原、に由来することに関する。
【００５２】
本発明の別の態様は、本発明のワクチンが、製剤中の保存剤として２−フェノキシエタノールを含むと規定する。
【００５３】
本発明の別の一態様によれば、ワクチンは、Ｄ抗原、Ｔ抗原、ｗＰ抗原、Ｈｉｂ  ｂ抗原及びＨｅｐ  Ｂ抗原を含んで五価のワクチンを与え、かつ製剤中の保存剤として２−フェノキシエタノールが使用され、ワクチンがＩＰＶ抗原を含まないことを条件とする。
【００５４】
さらに、本発明の他の態様は、本発明の混合ワクチンの製造方法に関する。
【００５５】
本発明の他の一態様は、各抗原が、該抗原に対する防御免疫応答を誘発するような量でワクチン中に存在するような、本発明の混合ワクチンの組成物に関する。
【００５６】
本発明のワクチンの抗原
ジフテリアは、グラム陽性で胞子形成しない好気性菌である、ジフテリア菌に起因する。この生物は、プロファージによってコード化されるＡＤＰリボシル化外毒素（「ジフテリア毒素」）を発現し、これは（例、ホルムアルデヒド使用して）処置されてトキソイドを与え得る。このトキソイドは、もはや毒性はないが、依然として抗原性を保持し、注射後に特定の抗毒素抗体の生産を刺激することができる。本発明のワクチンにおいて使用されるジフテリア抗原調製物は、好ましくはジフテリアトキソイドを含む。
【００５７】
破傷風は、グラム陽性で胞子形成する桿菌である、破傷風菌に起因する。この生物は、エンドペプチダーゼ（「破傷風毒素」）を発現し、これは処置されて、もはや毒性のないトキソイドを与え得る。しかしながら、トキソイドは依然として抗原性を保持し、注射後に特定の抗毒素抗体の生産を刺激することができる。本発明のワクチンにおいて使用される破傷風抗原調製物は、好ましくは破傷風トキソイドを含む。
【００５８】
百日咳又は百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ）は、百日咳菌に起因する。本発明の全細胞百日咳（ｗＰ）抗原は、感染症を引き起こす可能性がある百日咳菌株から調製され得る。本発明のｗＰ抗原は、化学物質の使用等の数々の方法によって不活化され得る。しかしながら、本発明のワクチン組成物において使用される不活化百日咳菌（ｗＰ）は、好ましくは、５６±１℃で、３０分間加熱して不活化される。本発明のワクチンにおいて使用されるｗＰ抗原調製物は、好ましくは百日咳菌１３４、５０９及び１０５３６から産生される。株１０５３６、５０９及び１３４の単一の集菌物は、それらの乳白度に基づいて、好ましくは１：１：１比の割合で混合される。
【００５９】
インフルエンザ菌は、グラム陰性の球桿菌であり、侵襲性血液媒介感染症及び髄膜炎を引き起こす。本発明の一実施態様によれば、莢膜多糖体に由来するＨｉｂ抗原は、担体タンパク質とコンジュゲート化又は共役していてもよい。Ｈｉｂ抗原のコンジュゲート化に使用される担体タンパク質は、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、ＣＲＭ１９７及び髄膜炎菌の外膜タンパク質又はそれらの任意の同等物を含む中から選択され得る。他の適切な担体タンパク質としては、合成ペプチド、熱ショックタンパク質、百日咳タンパク質、サイトカイン、リンホカイン、ホルモン、成長因子、Ｎ１９等の種々の病原体由来抗原由来の複数のヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質、インフルエンザ菌由来のプロテインＤ、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ、ニューモリシン、鉄取り込みタンパク質、クロストリジウム・ディフィシル由来の毒素Ａ又はＢ及びストレプトコッカス・アガラクチアタンパク質が挙げられるが、それらに限定されない。本発明のワクチンにおいて使用されるＨｉｂ抗原調製物は、好ましくは破傷風トキソイドとコンジュゲート化又は共役したＨｉｂ抗原を含む。
【００６０】
多糖類コンジュゲートは、任意の公知の共役技術によって調製され得る。例えば、多糖類は、チオエーテル結合を介して共役され得る。このコンジュゲート化方法は、シアン酸エステルを形成する、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）での多糖類の活性化に依存する。活性化多糖類はしたがって、担体タンパク質上のアミノ基へと直接又はスペーサー基を介して共役され得る。コンジュゲートはまた、直接還元的アミノ化方法によっても調製され得る。別の方法は、アジピン酸ヒドラジド（ＡＤＨ）で誘導体化された臭化シアン（ＣＮＢｒ）活性化多糖類のタンパク質担体への、カルボジイミド縮合による共役を伴う。任意の他の公知の方法が、本発明のワクチンにおいて使用される多糖類コンジュゲートを調製するために使用され得る。
【００６１】
本発明のある実施態様によれば、Ｈｉｂ抗原は任意のアジュバントに実質的に吸着されていない；好ましくは、アジュバントへのＨｉｂ抗原の吸着の程度は、１５％以下である；より好ましくは、アジュバントへのＨｉｂ抗原の吸着の程度は、１０％以下である。
【００６２】
本発明の別の実施態様によれば、Ｈｉｂ抗原が、任意のアジュバントへの計画的又は意図的な吸着に供されないことに関する。
【００６３】
本発明の別の好ましい実施態様によれば、Ｈｉｂ抗原は、Ｈｉｂ  ｂ株の莢膜多糖体に由来する。
【００６４】
肝炎は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧ等の、種々の肝炎株に起因する。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ウイルス性肝炎を引き起こす主要な因子の一つである。ＨＢＶウイルス粒子は、外部のタンパク質膜又はキャプシドによって囲まれている内部コアからなる。キャプシドの主要成分は、ＨＢＶ表面抗原、又は、より一般には「ＨＢｓＡｇ」、として知られるタンパク質である。この抗原が、ワクチン接種の対象へ投与された場合、抗原は、ＨＢＶ感染を防ぐ抗ＨＢｓＡｇ抗体の生産を刺激する。本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明のワクチンにおいて使用される肝炎（Ｈｅｐ）抗原調製物は、Ｂ型肝炎株の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に由来するＨｅｐ抗原を含む。
【００６５】
ワクチン製造のためには、ＨＢｓＡｇは、慢性Ｂ型肝炎キャリアの血漿から微粒子形態で抗原を精製する（これは、ＨＢＶ感染の間、大量のＨＢｓＡｇが肝臓で合成されて血流へと放出されるためである）か、又は組換えＤＮＡ法によってタンパク質を発現させることによって、産生され得る。本発明のワクチンにおいて使用されるＨＢｓＡｇは、いずれの方法によって調製されてもよい。
【００６６】
灰白髄炎は、ポリオウイルスに起因する。本発明のワクチンは、ポリオウイルスのセービン（セービン１及び／もしくはセービン２）株又はソールク株を含み得る。本発明の一つの好ましい実施態様によれば、本発明のワクチンは、ソールク株を含む。３種類のソールク株が、灰白髄炎を引き起こし得る。その３種類は類似しており、同一の症状を引き起こすが、それらは抗原的には非常に異なり、１種類による感染は、他の種類による感染からは防御しない。ソールクポリオウイルスとしては３つの株−１型（例、マホニー株）、ポリオウイルス２型（例、ＭＥＦ−Ｉ株）及びポリオウイルス３型（例、ソーケット株）−が挙げられる。本発明のある好ましい実施態様によれば、本発明のワクチンは、一つ以上の該ソールク株を含み得る。
【００６７】
ポリオウイルスは、細胞培養中で生育され得る。サルの腎臓に由来する連続細胞株であるベロ細胞株が、ポリオウイルスを生育するために使用され得る。生育後、ウイルス粒子は既知の技術を用いて精製され得る。ウイルスの不活化がなされ得る。ポリオウイルスの量は典型的には、「ＤＵ」単位（「Ｄ抗原単位」）で表される。本発明のワクチンの製造に使用されるＩＰＶ抗原調製物は好ましくは、ワクチンの製造において使用される一つ以上の株を含むように調製される。このバルク調製物が、次いで本発明のワクチンを処方するために使用される。
【００６８】
ワクチンの非抗原性成分
抗原性成分に加え、ワクチンは医薬的に許容可能な添加剤である数々の非抗原性成分を含み得る。これらとしては、ｐＨ調整剤、緩衝剤、アジュバント、保存剤、担体及び浸透圧調整剤が挙げられるが、それらに制限されない。
【００６９】
アジュバント
最終製剤の抗原は、アジュバントに吸着されていても、吸着されていなくてもよい。アジュバントは、ワクチン成分に対する免疫の生産を刺激するよう機能し、ワクチンをより効果的にする。
【００７０】
アジュバントは：
・抗原を免疫系と接触させ、生産される免疫の種類及び免疫応答の質（規模及び持続時間）に影響を与える；
・一定の抗原の毒性を低減する；並びに
・いくつかのワクチン成分に対して溶解性を提供する
という働きをし得る。
【００７１】
多くのアルミニウム含有ワクチンは、アジュバントを含まない同等のワクチンよりも、より高くかつ延長された抗体応答を引き起こすことが研究で示されている。アジュバントの利益は通常、ブースター投与よりもむしろ初期の免疫化シリーズの間に観察されてきた。
【００７２】
アルミニウムベースのアジュバントは、最も一般的に使用されているアジュバントである。これらのアジュバントはまた、ワクチンにおける使用について、ＦＤＡによって承認されている。３つの一般的な種類のアルミニウム含有アジュバントがある：
・水酸化アルミニウム
・リン酸アルミニウム
・硫酸アルミニウムカリウム（しばしば「ミョウバン」と呼ばれる）
【００７３】
本発明の一実施態様は、ワクチンの一定の抗原がリン酸アルミニウムに吸着され、ワクチンの一定の抗原が水酸化アルミニウムに吸着されることに関する。本発明の一定の抗原は、任意のアジュバントに吸着されていないか、又は実質的に吸着されていなくてもよい。該抗原の吸着についてのアジュバントの優先度が、本発明のワクチンに、その特性を与える。吸着の優先度は、以下の「本発明のワクチンの製造方法」の節において、より詳しく記述されている。
【００７４】
保存剤
ワクチンは、細菌による汚染を起こしやすい。したがって、偶然の汚染の場合にワクチンに組み込まれて導入され得る、有害な微生物での、潜在的に生命を脅かすような汚染を回避するために、ワクチンを処方する間に、保存剤がワクチンの組成物中に含まれ得る。使用されてきた保存剤としては、塩化ベンゼトニウム（フェメロール（Ｐｈｅｍｅｒｏｌ））、チオメルサール（ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌ）、フェノール及び２−フェノキシエタノール（２−ＰＯＥ）が挙げられる。
【００７５】
チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）は、多くのワクチンにおいて保存剤として使用されてきた、水銀含有の有機化合物（有機水銀化合物）である。チオメルサールに対し、注射部位における発赤及び腫れを含む、主に遅延型の局所的な過敏反応の形態である一定のアレルギー反応に関する報告がある。自閉症と水銀とを関連付ける、矛盾する報告もまたある。
【００７６】
２−フェノキシエタノール（２−ＰＯＥ）はまた、「ｌ−ヒドロキシ−２−フェノキシエタン」、「２−ヒドロキシエチルフェニルエーテル」、「エチレングリコールフェニルエーテル」等としても知られる。２−フェノキシエタノールの安全性プロファイルは、水銀保存剤（例、チオメルサール）の安全性プロファイルよりもすぐれている。したがって、ワクチンにおいてチオメルサールを回避し、２−フェノキシエタノールを使用する必要がある。
【００７７】
したがって、本発明の別の好ましい実施態様は、ワクチン組成物における保存剤としての２−フェノキシエタノールの使用に関する。本発明の別の好ましい実施態様によれば、２−フェノキシエタノールの濃度は、ワクチンに関して５ｍｇ／ｍｌである。
【００７８】
浸透圧調整剤
ワクチン組成物の浸透圧を調節するために、ワクチン製剤中に浸透圧調整剤を含めることが好ましい。これらの剤としては、塩（例−ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２）、糖（例−ブドウ糖、マンニトール、乳糖）、アミノ酸（例−アルギニン、グリシン、ヒスチジン）及びポリオール（例−ショ糖、グリセロール、ソルビトール）が挙げられるが、それらに限定されない。より好ましい実施態様において、ナトリウム塩等の生理的食塩が、ワクチン製剤において使用される。最も好ましくは、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が、本発明のワクチン組成物中に含まれる。
【００７９】
ｐＨ調整剤及び／又は緩衝剤
水酸化ナトリウム又は塩酸等の、当業者に公知の種々のｐＨ調整剤が、ワクチン組成物のｐＨを望まれるように調節するために使用され得る。リン酸ナトリウム、リン酸カリウム及びクエン酸緩衝剤等の種々の緩衝剤が、本発明の製剤において使用され得る。
【００８０】
本発明のワクチンの組成物
本発明のワクチン組成物は、本発明のワクチンが、ワクチン中に含有される各抗原の量によって免疫原性とされるものである。本発明のワクチン中の各抗原は好ましくは、混合ワクチンが対象に投与された場合に、対象において組成物の該抗原に対する免疫応答を誘発するような量で存在する。本発明の混合ワクチンは、ジフテリア（Ｄ）抗原、破傷風（Ｔ）抗原、全細胞百日咳（ｗＰ）抗原及びポリオ（ＩＰＶ）抗原を含み、かつインフルエンザ菌（Ｈｉｂ）及び肝炎（Ｈｅｐ）の群から選択される他の抗原を随意に含む。
【００８１】
本発明の一実施態様によれば、ワクチンはＤ、Ｔ、ｗＰ、Ｈｉｂ  ｂ並びにＩＰＶ（１型マホニー、２型ＭＥＦ及び３型ソーケット）を含み、ここでＤは約１〜４０Ｌｆの量で存在し、Ｔは約１〜２５Ｌｆの量で存在し、ｗＰは約１〜３０ＩＯＵ毎０．５ｍｌの量で存在し、かつＨｉｂ  ｂは約１〜２０μｇ毎０．５ｍｌの量で存在し、かつ１型マホニー、２型ＭＥＦ及び３型ソーケット株は、それぞれ約１〜５０ＤＵ、１〜１５ＤＵ及び１〜５０ＤＵ毎０．５ｍｌの量で存在して、安定で、免疫原性であり、完全に液体製剤の形態である五価のワクチンを形成する。
【００８２】
本発明の一つの好ましい実施態様によれば、本発明の五価のワクチンは、Ｄ、Ｔ、ｗＰ、Ｈｉｂ  ｂ並びにＩＰＶを含み、ここでＤは約２０Ｌｆの量で存在し、Ｔは約７．５Ｌｆの量で存在し、ｗＰは約１６ＩＯＵ毎０．５ｍｌの量で存在し、かつＨｉｂ  ｂは約１０μｇ毎０．５ｍｌの量で存在し、かつ１型マホニー、２型ＭＥＦ及び３型ソーケット株は、それぞれ約４０ＤＵ、８ＤＵ及び３２ＤＵ毎０．５ｍｌの量で存在する。そのようなワクチンは、完全に液体である混合ワクチンを与えるように処方され、対象に投与された場合に安定で免疫原性であるだろう。
【００８３】
本発明の別の実施態様によれば、六価のワクチンは、Ｄ、Ｔ、ｗＰ、Ｈｉｂ  ｂ、Ｈｅｐ  Ｂ並びにＩＰＶ（１型マホニー、２型ＭＥＦ及び３型ソーケット）を含み、ここでＤは約１〜４０Ｌｆの量で存在し、Ｔは約１〜２５Ｌｆの量で存在し、ｗＰは約１〜３０ＩＯＵ毎０．５ｍｌの量で存在し、Ｈｉｂ  ｂは約１〜２０μｇ毎０．５ｍｌの量で存在し、かつＨｅｐ  Ｂは約１〜２０μｇ毎０．５ｍｌの量で存在し、かつ１型マホニー、２型ＭＥＦ及び３型ソーケット株は、それぞれ約１〜５０ＤＵ、１〜１５ＤＵ及び１〜５０ＤＵ毎０．５ｍｌの量で存在して、対象に投与された場合に免疫原性である、完全に液体である安定な混合ワクチンを与える。
【００８４】
本発明の別の好ましい実施態様によれば、六価のワクチンは、Ｄ、Ｔ、ｗＰ、Ｈｉｂ  ｂ、Ｈｅｐ  Ｂを含み、ここでＤは約２０Ｌｆの量で存在し、Ｔは約７．５Ｌｆの量で存在し、ｗＰは約１６ＩＯＵ毎０．５ｍｌの量で存在し、Ｈｉｂ  ｂは約１０μｇ毎０．５ｍｌの量で存在し、かつＨｅｐ  Ｂは約１０μｇ毎０．５ｍｌの量で存在し、かつ１型マホニー、２型ＭＥＦ及び３型ソーケット株は、それぞれ約４０ＤＵ、８ＤＵ及び３２ＤＵ毎０．５ｍｌの量で存在する。そのようなワクチンは、対象に投与された場合に、組成物の全ての抗原に対する防御免疫応答を誘発することができる、安定なワクチンであるだろう。
【００８５】
本発明のいま一つの態様は、ＤＴｗＰ、Ｈｉｂ  ｂ及びＨｅｐ  Ｂを含む五価のワクチンに関し、ここでＤは約１〜４０Ｌｆの量で存在し、Ｔは約１〜２５Ｌｆの量で存在し、ｗＰは約１〜３０ＩＯＵ毎０．５ｍｌの量で存在し、Ｈｉｂ  ｂは約２〜２０μｇ毎０．５ｍｌの量で存在し、かつＨｅｐ  Ｂは約１〜２０μｇ毎０．５ｍｌの量で存在して、完全に液体安定かつ免疫原性である混合ワクチンを与える。
【００８６】
本発明の一つの好ましい態様によれば、五価のワクチンは、ＤＴｗＰ、Ｈｉｂ  ｂ及びＨｅｐ  Ｂを含み、ここでＤは約２０Ｌｆの量で存在し、Ｔは約７．５Ｌｆの量で存在し、ｗＰは約１６ＩＯＵ毎０．５ｍｌの量で存在し、Ｈｉｂ  ｂは約１０μｇ毎０．５ｍｌの量で存在し、かつＨｅｐ  Ｂは約１０μｇ毎０．５ｍｌの量で存在する。そのようなワクチンは、安定であり、完全に液体製剤の形態である。そのようなワクチンは、対象に投与された場合に、組成物の全ての抗原に対する防御免疫応答を誘発することができる、安定なワクチンであるだろう。
【００８７】
本発明はさらに、免疫学的に活性な量の本発明のワクチンを投与することを含む、Ｄ、Ｔ、Ｐ、Ｈｉｂ、Ｈｅｐ又はＩＰＶの群から選択される任意の抗原への免疫応答を誘導する方法に関する。
【００８８】
本発明の別の態様によれば、本発明のワクチン中のアルミニウム含量（Ａｌ＋３）は、好ましくは２ｍｇ毎０．５ｍｌ以下、より好ましくは１ｍｇ毎０．５ｍｌ以下、最も好ましくは０．６ｍｇ毎０．５ｍｌ以下であり得る。
【００８９】
本発明の一つの別の態様によれば、本発明の混合ワクチン中の２−フェノキシエタノールの好ましい量は、５ｍｇ／ｍｌであり得る。
【００９０】
本発明のワクチンの製造方法
本発明の態様の一つは、本発明のワクチンの製造方法に関する。免疫原性組成物における抗原の免疫原性、安定性及び正しい形態の保持は、組成物が処方された方法に依存し得る。これは、抗原の添加の順序、一定の抗原のための特定のアジュバントの使用、並びに撹拌、温度及びｐＨを含む種々のパラメータの使用を含み得る。
【００９１】
本発明の実施態様の一つは、ジフテリア（Ｄ）、破傷風（Ｔ）、全細胞百日咳（ｗＰ）、及びＩＰＶを含み、かつ、インフルエンザ菌（Ｈｉｂ）及び肝炎（Ｈｅｐ）の群から選択される一つ以上の抗原を随意に含む、完全に液体である混合ワクチンの製造方法に関し、方法は：
ａ）ｉ）ジフテリア（Ｄ）抗原、ｉｉ）破傷風（Ｔ）抗原及びｉｉｉ）全細胞百日咳（ｗＰ）抗原の混合物を含む成分Ｉを調製する工程、
ｂ）随意に、アルミニウム塩に吸着されたＨｅｐを含む成分ＩＩを調製する工程、
ｃ）随意に、成分Ｉに前記成分ＩＩを混合して混合物を得る工程、
ｄ）［ａ）又はｃ］において得られた］上記混合物をＨｉｂ抗原に添加し、次いでＩＰＶ抗原を添加する工程、
を含む。
【００９２】
本発明の一つの好ましい実施態様によれば、Ｄ抗原及びＴ抗原は、リン酸アルミニウムに吸着されている。
【００９３】
本発明の一つの別の好ましい実施態様は、以下の工程を含む、成分Ｉの調製に関する：
ａ）リン酸アルミニウムゲルを容器内へと移動させる工程、
ｂ）破傷風抗原調製物を上記容器内へと移動させる工程、
ｃ）ジフテリア抗原調製物を当該容器内へと撹拌下で移動させる工程、
ｄ）２−フェノキシエタノールを当該容器中に移動させる工程、
ｅ）塩化ナトリウム溶液を上記当該容器へと、常時撹拌下で移動させる工程
ｆ）ｐＨを確認し、ｐＨを６．０〜６．５の範囲中に調節する工程、
ｇ）ｗＰ抗原調製物を撹拌下で、同容器内へと移動させる工程、
ｈ）ｐＨを確認し、ｐＨを６．５〜７．５の範囲中に調節する工程。
【００９４】
方法はさらに、以下の工程を含む、成分ＩＩの調製を含む：
ａ）リン酸アルミニウムゲルを容器内へと移動させる工程、
ｂ）肝炎抗原調製物を上記容器内へと撹拌下で移動させる工程、
ｃ）塩化ナトリウム溶液を同容器内へと撹拌下で移動させる工程、
ｄ）２−フェノキシエタノール調製物を上記当該容器へと移動させる工程、
ｅ）ｐＨを確認し、ｐＨが６．０〜７．０の範囲中に収まるように調節する工程。
【００９５】
方法はさらに、前記成分Ｉと前記成分ＩＩとの混合が、成分ＩＩの内容物を前記成分Ｉへと移動させて、混合物を得る工程を含む。
【００９６】
方法はさらに、以下の工程を含む、Ｈｉｂ抗原及びＩＰＶ抗原への上記混合物の混合を含む：
ａ）Ｈｉｂ抗原調製物に、上記混合物を撹拌下で移動させて、別の混合物を得る工程、
ｂ）上記混合物、次いで食塩水を、ＩＰＶ抗原へと移動させる工程、
ｃ）ｐＨを確認し、ｐＨを６．５〜７．５の範囲中に調節する工程。
【００９７】
本発明の別の好ましい実施態様は、以下の工程を含む、Ｈｉｂ抗原及びＩＰＶ抗原への成分Ｉの添加に関する：
ａ）Ｈｉｂ抗原調製物に、成分Ｉを撹拌下で移動させて、混合物を得る工程、
ｂ）上記混合物、次いで食塩水を、ＩＰＶ抗原調製物へと移動させる工程、
ｃ）ｐＨを確認し、ｐＨを６．５〜７．５の範囲中に調節する工程。
【００９８】
本発明の別の好ましい態様は、以下の工程を含む、ワクチンの調製に関する：
ａ）ｉ）ジフテリア（Ｄ）抗原、ｉｉ）破傷風（Ｔ）抗原及びｉｉｉ）全細胞百日咳（ｗＰ）抗原の混合物を含む成分Ｉを調製する工程、
ｂ）アルミニウム塩に吸着されたＨｅｐを含む成分ＩＩを調製する工程、
ｃ）成分Ｉに前記成分ＩＩを混合して混合物を得る工程、
ｄ）上記混合物をＨｉｂ抗原に添加する工程。
【００９９】
方法はさらに、以下の工程を含む、成分Ｉの調製を含む：
ａ）リン酸アルミニウムゲルを容器内へと移動させる工程、
ｂ）破傷風抗原調製物を上記容器内へと撹拌下で移動させる工程、
ｃ）ジフテリア抗原調製物を当該容器内へと移動させる工程、
ｄ）当該容器中で２−フェノキシエタノールを移動させる工程、
ｅ）塩化ナトリウム溶液を上記当該容器へと撹拌下で移動させる工程
ｆ）ｐＨを確認し、ｐＨを６．０〜６．５の範囲中に調節する工程、
ｇ）ｗＰ抗原調製物を同容器内へと移動させる工程、
ｈ）ｐＨを確認し、ｐＨを６．５〜７．５の範囲中に調節する工程。
【０１００】
方法はさらに、以下の工程を含む、成分ＩＩの調製に関する：
ａ）リン酸アルミニウムゲルを容器内へと移動させる工程、
ｂ）肝炎抗原調製物を上記容器内へと移動させる工程、
ｃ）塩化ナトリウム溶液を同容器内へと移動させる工程、
ｄ）２−フェノキシエタノール調製物を上記当該容器へと撹拌下で移動させる工程、
ｅ）ｐＨを確認し、ｐＨが６．０〜７．０の範囲中に収まるように調節する工程。
【０１０１】
方法はさらに、成分Ｉと成分ＩＩとの混合に関し、成分ＩＩの内容物を前記成分Ｉへと移動させて混合物を得る工程を含む。
【０１０２】
方法はさらに、以下の工程を含む：
ａ）上記混合物を、前記Ｈｉｂ抗原調製物へと移動させる工程、
ｂ）ｐＨを確認し、ｐＨを６．５〜７．５の範囲中に調節する工程。
【０１０３】
本発明の一つの好ましい実施態様によれば、上記の任意の工程において述べられた撹拌は、１５０ｒｐｍで、２５±２℃にて、約３０分から２時間行われる。
【０１０４】
以下の実施例は、本発明及びその利点をさらに例証するために使用される。以下の具体的な実施例は、これらが例証を意図し、本発明の範囲を制限するものではないという理解のもと、提供される。
【実施例１】
【０１０５】
本実施例は、本発明の態様の一つの通り、六価のワクチン組成物及び製造方法を与える。
【０１０６】
Ａ］本発明による六価のワクチン組成物は、以下のとおりである：
０．５ｍｌのワクチンの各々が、以下を含む：
【０１０７】
【表１】
2012506420.tif 000002
【０１０８】
Ｂ］本発明による六価のワクチンの製造方法は、以下のとおりである：
成分Ｉの処方手順
リン酸アルミニウムゲルを容器内へと移動させ、次いで破傷風抗原及びジフテリア抗原を撹拌下で移動させて混合物を得た。次に、当該容器中で２−フェノキシエタノールと上記混合物とを混合した。次に、塩化ナトリウム溶液を上記へと添加した。混合物のｐＨを確認し、６．０〜６．５の範囲中に収まるように調節した。次に、ｗＰ抗原を同容器内へと移動させた。次に、混合物のｐＨを確認し、６．５〜７．５の範囲中に収まるように調節した。
【０１０９】
成分ＩＩの処方手順
リン酸アルミニウムゲル、次いでＢ型肝炎抗原を容器内へと移動させた。次に、塩化ナトリウム溶液、次いで２−フェノキシエタノールを同容器内へと移動させた。混合物のｐＨを確認し、６．０〜７．０の範囲中に収まるように調節した。
【０１１０】
成分Ｉと成分ＩＩとの混合
本工程は、成分ＩＩの内容物を成分Ｉへと移動させて、混合物を得ることによって実施された。
【０１１１】
Ｈｉｂ  ｂ及びＩＰＶバルクの添加
さらに、成分Ｉと成分ＩＩとの上記混合物を、Ｈｉｂ  ｂ抗原調製物と混合して、混合物を得た。これをさらにＩＰＶ抗原へと添加して混合物を得、生理食塩水を上記混合物へと添加して六価のワクチンを得、ｐＨを確認し、６．５〜７．５の範囲中に収まるように調節した。
【実施例２】
【０１１２】
本実施例は、本発明の態様の一つの通り、五価のワクチン組成物及び製造方法を与える。
【０１１３】
Ａ］本発明による五価のワクチン組成物は、以下のとおりである：
０．５ｍｌのワクチンの各々が、以下を含む：
【０１１４】
【表２】
2012506420.tif 000003
【０１１５】
Ｂ］本発明による五価のワクチンの製造方法は、以下のとおりである：
成分Ｉの処方手順
リン酸アルミニウムゲルを容器内へと移動させ、次いで破傷風抗原及びジフテリア抗原を撹拌下で移動させて混合物を得た。次に、当該容器中で２−フェノキシエタノールと上記混合物とを混合した。次に、塩化ナトリウム溶液を上記へと添加した。混合物のｐＨを確認し、６．０〜６．５の範囲中に収まるように調節した。次に、ｗＰ抗原を同容器内へと移動させた。次に、混合物のｐＨを確認し、６．５〜７．５の範囲中に収まるように調節した。
【０１１６】
Ｈｉｂ  ｂ及びＩＰＶバルクの添加
成分Ｉを、Ｈｉｂ  ｂ抗原へと添加して混合物を得、これを次にＩＰＶ抗原調製物及び生理食塩水と混合して、五価のワクチンを得た。混合物のｐＨを、６．５〜７．５の範囲中に収まるように調節した。
【実施例３】
【０１１７】
本実施例は、本発明の態様の一つの通り、五価のワクチン組成物及び製造方法を与える。
【０１１８】
Ａ］本発明による五価のワクチン組成物は、以下のとおりである：
０．５ｍｌのワクチンの各々が、以下を含む：
【０１１９】
【表３】
2012506420.tif 000004
【０１２０】
Ｂ］本発明による五価のワクチンの製造方法は、以下のとおりである：
成分Ｉの処方手順
リン酸アルミニウムゲルを容器内へと移動させ、次いで破傷風抗原及びジフテリア抗原を撹拌下で移動させて混合物を得た。次に、当該容器中で２−フェノキシエタノールと上記混合物とを混合した。次に、塩化ナトリウム溶液を上記へと添加した。混合物のｐＨを確認し、６．０〜６．５の範囲中に収まるように調節した。次に、ｗＰ抗原を同容器内へと移動させた。次に、混合物のｐＨを確認し、６．５〜７．５の範囲中に収まるように調節した。
【０１２１】
成分ＩＩの処方手順
リン酸アルミニウムゲル、次いでＢ型肝炎抗原調製物を容器内へと移動させた。次に、塩化ナトリウム溶液、次いで２−フェノキシエタノール調製物を同容器内へと移動させて、混合物を得た。ｐＨを、６．０〜７．０の範囲中に収まるように調節した。
【０１２２】
成分Ｉと成分ＩＩとの混合
本工程は、成分ＩＩの内容物を成分Ｉへと移動させて、混合物を得ることを含んだ。
【０１２３】
Ｈｉｂ  ｂバルクの添加
次に、成分Ｉと成分ＩＩとの上記混合物を、Ｈｉｂ  ｂ抗原調製物と混合して、五価のワクチンを得た。得られた混合物のｐＨを確認し、６．５〜７．５の範囲中に収まるように調節した。
【実施例４】
【０１２４】
本実施例は、ジフテリア抗原、破傷風抗原、全細胞百日咳抗原、インフルエンザ菌（Ｈｉｂ）ｂ型抗原、Ｂ型肝炎抗原及び不活化ポリオ抗原について実施されたｉｎ−ｖｉｖｏ力価試験の概要並びにそれらの安定性データ又は力価を与える。
Ａ］ジフテリア抗原、破傷風抗原、全細胞百日咳抗原、インフルエンザ菌（Ｈｉｂ）ｂ型抗原、Ｂ型肝炎抗原及び不活化ポリオ抗原について実施されたｉｎ−ｖｉｖｏ力価試験
【０１２５】
１．ジフテリアトキソイド
必要な動物種：モルモット
１つのバッチにつき必要な動物数：１１６匹（試験用に４８匹、参照用に４８匹及びＬＤ５０用に２０匹）
ワクチンの投与経路：皮下
注射量：１．０ｍｌ
動物が収容される日数：２８
ジフテリアトキソイドの力価を、モルモットにおける致死的チャレンジ法によって決定した。この方法では、試験及び参照ワクチン各々につき、中間の希釈物が試験動物の少なくとも５０％以上を救うＥＤ５０用量を含有するよう、３つの希釈物を調製した。試験ワクチン及び参照ワクチンの希釈物毎に、１６匹のモルモットに注射をし、２８日後に１００  ＬＤ５０を含有するジフテリア毒素で、試験動物を皮下チャレンジした。２０匹のモルモットの群を、ジフテリア毒素の力価測定のために未免疫で保ち、このモルモットの群に、異なる希釈のジフテリア毒素を、希釈ごとに５匹のモルモットとなるよう接種した。試験は、３３日間で完了した。さらなる計算は、ＰＲＯＢＩＴを使用して行った。試料は、それが≧３０ＩＵ／ヒト単回用量を含有する場合に、ジフテリア力価試験に合格する。
−試験ワクチンは、参照ワクチンとの直線性及び平行性を満たすべきである。
−推定力価の信頼限界は、５０〜２００％間にあるべきである。
−推定力価は３０Ｉ．Ｕ．毎ヒト単回用量未満であるべきではない。
−力価の推定値の９５％信頼区間の限界は、推定力価の９５％信頼区間の下限限界が３０Ｉ．Ｕ．毎用量よりも大きい場合を除き、５０〜２００％の範囲内にあるべきである。
【０１２６】
２．破傷風トキソイド
必要な動物種：スイスアルビノマウス
１つのバッチにつき必要な動物数：１１６匹（試験用に４８匹、参照用に４８匹及びＬＤ５０用に５０匹）
ワクチンの投与経路：皮下
注射量：０．５ｍｌ
動物が収容される日数：２８
破傷風トキソイドの力価を、スイスマウスにおける致死的チャレンジ法によって決定した。試験では、試験及び参照ワクチン各々につき、中間の希釈物が試験動物の少なくとも５０％以上を救うＥＤ５０用量を含有するよう、３つの希釈物を調製した。試験ワクチン並びに参照ワクチンの希釈物毎に、１６匹のスイスマウスの群に注射をし、収容２８日後に１００  ＬＤ５０を含有する破傷風毒素で、試験動物をチャレンジした。２０匹のスイスマウスの群を、破傷風毒素の力価測定のために未免疫で保ち、ＬＤ５０力価測定の４つの希釈物について、５匹ずつのマウスとなるように注射した。試験は、３３日間で完了した。さらなる計算は、ＰＲＯＢＩＴを使用して行った。力価試料は、それが≧６０ＩＵ／ヒト単回用量を含有する場合に、破傷風力価試験に合格する。
−試験ワクチンは、参照ワクチンとの直線性及び平行性を満たすべきである。
−推定力価の信頼限界は、５０〜２００％間にあるべきである。
−推定力価は６０Ｉ．Ｕ．毎ヒト単回用量未満であるべきではない。
−力価の推定値の９５％信頼区間の限界は、推定力価の９５％信頼区間の下限限界が６０Ｉ．Ｕ．毎用量よりも大きい場合を除き、５０〜２００％の範囲内にあるべきである。
【０１２７】
３．全細胞百日咳抗原
必要な動物種：スイスマウス
１つのバッチにつき必要な動物数：１９４匹（試験用に７２匹、参照用に７２匹及びＬＤ５０用に５０匹）
ワクチンの投与経路：腹腔内
注射量：０．５ｍｌ
動物が収容される日数：１４
百日咳抗原の力価試験を、スイスマウスにおけるマウス感染防御試験（Ｍｏｕｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）によって実施した。この方法では、試験及び参照ワクチン各々につき、中間の希釈物が試験動物の少なくとも５０％以上を救うＥＤ５０用量を含有するよう、３つの希釈物を生理食塩水中で調製した。各希釈物毎に２４匹のスイスマウスの群を免疫化し、次に、全ての免疫化動物を、１４日目に、０．０３ｍｌのチャレンジ用量（およそ１００，０００生物体毎０．０３ｍｌ）で脳内チャレンジする。チャレンジ後、試験動物を１４日間観察し、試験動物の死亡及び生存を記録した。チャレンジ後の最初の３日間中に起こった死亡は、非特異的として扱った。さらなる計算は、ＰＲＯＢＩＴを使用して行った。試料は、それが≧４ＩＵ／ヒト単回用量（ＳＨＤ）を含有し、下限信頼限界が２ＩＵ／ＳＨＤ以上である場合に、百日咳力価試験に合格する。
【０１２８】
４．インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）（Ｈｉｂ）ｂ型抗原
必要な動物種：スイスマウス
１つのバッチにつき必要な動物数：１６匹（免疫用に８匹、対照として８匹）
ワクチンの投与経路：皮下
注射量：０．５ｍｌ
動物が収容される日数：３５
Ｈｉｂ  ｂ抗原の力価試験を、スイスマウスにおいてＥＬＩＳＡ法によって実施した。この試験では、各８匹ずつのスイスマウスの２つの群（試験及び対照群）を選択した。試験群の各マウスに、１：４で希釈したワクチン０．５ｍｌを皮下注射し、対照群は未接種のままにした。１０日目及び２０日目にブースター用量を与え、最終的な採血を３５日目に行う。血清試料を、ＥＬＩＳＡ法によって、Ｈｉｂに対する抗体について試験した。試料は、試験群におけるマウスの≧５０％がセロコンバージョンした場合に、Ｈｉｂ力価試験に合格する。
【０１２９】
５．Ｂ型肝炎表面抗原
必要な動物種：Ｂａｌｂ  Ｃマウス
１つのバッチにつき必要な動物数：１１０匹（試料用に５０匹、参照用に５０匹、プラセボ用に１０匹）
ワクチンの投与経路：腹腔内
注射量：１．０ｍｌ
動物が収容される日数：２８
Ｂ型肝炎表面抗原の力価試験を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおいて実施した。この試験では、参照及び試験ワクチン各々につき５段階の２倍希釈物を調製し、各希釈につき１０匹のマウスに腹腔内接種した。１０匹のマウスに希釈剤を接種し、プラセボとした。接種されたマウスを、接種の２８日目に出血させ、溶血が起こらないように注意しながら、血清を分離した。血清試料をＥＬＩＳＡ法によって、Ｂ型肝炎に対する抗体価について試験した。試料は、その相対力価の上限が≧１の場合に、Ｂ型肝炎力価試験に合格する。
【０１３０】
６．不活化ポリオワクチン（ＩＰＶ）
必要な動物種：ウィスターラット
１つのバッチにつき必要な動物数：１００匹（試験ワクチン用に５０匹、参照ワクチン用に５０匹）
ワクチンの投与経路：筋肉内
注射量：０．５ｍｌ
動物が収容される日数：２１
ＩＰＶの力価試験を、ＲＩＶＭ  ＴＯＸラットにおいて実施した。参照及び試験ワクチン各々につき５段階の３倍希釈物を調製し、各希釈物を０．５ｍｌずつ、１０匹のラットに筋肉内注射した。免疫化２１日後に試験動物を出血させ、ＲＢＣの溶解を避けながら、血清試料を慎重に採取した。各血清試料を、血清中和試験によって、ポリオウイルスの１型、２型及び３型血清型に対する抗体価について試験した。試験は：
−試験及び参照ワクチン両方の５０％有効量（ＥＤ５０）が、動物に与えられた最少量と最大量との間にあり；
−統計解析が、直線性又は平行性からの有意な逸脱を示さず；
−推定相対力価の信頼限界が、推定力価の２５％と４００％との間にある；
場合を除き、無効である。
【０１３１】
Ｂ］本発明のワクチン中の抗原の安定性データ又は力価
１）実施例１の六価のワクチンの全ての抗原について、実施例４  Ａ］において記述したように試験を実施した。結果は、以下の表にしたとおりである。
【０１３２】
【表４】
2012506420.tif 000005
【０１３３】
したがって、５±３℃でのワクチンの長期保管後でも、ワクチン抗原は依然として許容限界を超える力価を有し／免疫原性を有することが分かる。
【０１３４】
２）実施例２の五価のワクチンの全ての抗原について、実施例４  Ａ］において記述したように試験を実施した。結果は、以下の表にしたとおりである。
【０１３５】
【表５】
2012506420.tif 000006
【０１３６】
したがって、５±３℃でのワクチンの長期保管後でも、ワクチン抗原は依然として許容限界を超える力価を有し／免疫原性を有することが分かる。
【国際調査報告】
2012506420.tif 000007
2012506420.tif 000008
2012506420.tif 000009