(57)【要約】  グリコマクロタンパク質および付加的な添加物量のアルギニン、ロイシンおよび所望によりチロシンなどの他のアミノ酸を含有する医療食品が開示される。この医療食品は、フェニルケトン尿症などの代謝障害を有する患者に完全なタンパク質必要量を提供するために使用することができる。
2012530067.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコマクロペプチド（ＧＭＰ）と添加物量の２種類以上のアミノ酸を含んでなる代謝障害の管理のための医療食品であって、その添加アミノ酸の１つがアルギニンであり、医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸アルギニンの重量比がアルギニン約６０〜９０ミリグラム／総タンパク質グラムであり、添加アミノ酸の他の１つがロイシンであり、医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸ロイシンの重量比がロイシン約１００〜２００ミリグラム／総タンパク質グラムである、医療食品。
【請求項２】
添加物量のアミノ酸チロシンをさらに含んでなり、医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸チロシンの重量比がチロシン約６２〜９３ミリグラム／総タンパク質グラムである、請求項１に記載の医療食品。
【請求項３】
付加的な添加アミノ酸の総重量が、ＧＭＰ由来のタンパク質と添加アミノ酸を合わせた総重量の約２２％〜３８％である、請求項２に記載の医療食品。
【請求項４】
添加物量のアミノ酸トリプトファンおよびヒスチジンをさらに含んでなり、付加的な添加アミノ酸の総重量が、ＧＭＰ由来のタンパク質と添加アミノ酸を合わせた総重量の約２５％〜４２％である、請求項２に記載の医療食品。
【請求項５】
医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸アルギニンの重量比がアルギニン約７５ミリグラム／総タンパク質グラムである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医療食品。
【請求項６】
医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸ロイシンの重量比がロイシン約１００ミリグラム／総タンパク質グラムである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医療食品。
【請求項７】
医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸チロシンの重量比がチロシン約８５ミリグラム／総タンパク質グラムである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の医療食品。
【請求項８】
添加物量のアミノ酸チロシンを含有しない、請求項１に記載の医療食品。
【請求項９】
総タンパク質１グラム当たりのフェニルアラニンおよびチロシンの含有量が、合わせて２．０ミリグラム未満である、請求項８に記載の医療食品。
【請求項１０】
付加的な添加アミノ酸の総重量が、ＧＭＰ由来のタンパク質と添加アミノ酸を合わせた総重量の約１６％〜２９％である、請求項８または９に記載の医療食品。
【請求項１１】
添加物量のアミノ酸トリプトファンおよびヒスチジンをさらに含んでなり、付加的な添加アミノ酸の総重量が、ＧＭＰ由来のタンパク質と添加アミノ酸を合わせた総重量の約１９％〜３３％である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の医療食品。
【請求項１２】
飲料、バー、ウエハース、プディング、ゼラチン、クラッカー、フルーツレザー、ナッツバター、ソース、サラダドレッシング、クリスプ・シリアル・ピース、フレーク、パフ、ペレットまたは押出固体の形態である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医療食品。
【請求項１３】
（ａ）医療食品が製造中に熱処理され；
（ｂ）熱処理前の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸アルギニンの初期重量比がアルギニン約７５ミリグラム／総タンパク質グラムより大きく、かつ、熱処理前の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸ロイシンの初期重量比がロイシン約１００ミリグラム／総タンパク質グラムより大きく；かつ、
（ｃ）熱処理後の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸アルギニンの最終重量比がアルギニン約６０〜９０ミリグラム／総タンパク質グラムであり、かつ、熱処理後の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸ロイシンの最終重量比がロイシン約１００〜２００ミリグラム／総タンパク質グラムである、
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医療食品。
【請求項１４】
（ａ）医療食品が製造中に熱処理され；
（ｂ）熱処理前の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸チロシンの初期重量比がチロシン約８５ミリグラム／総タンパク質グラムより大きく、熱処理前の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸アルギニンの初期重量比がアルギニン約７５ミリグラム／総タンパク質グラムより大きく、かつ、熱処理前の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸ロイシンの初期重量比がロイシン約１００ミリグラム／総タンパク質グラムより大きく；かつ、
（ｃ）熱処理後の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸チロシンの最終重量比がチロシン約６２〜９３ミリグラム／総タンパク質グラムであり、熱処理後の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸アルギニンの最終重量比がアルギニン約６０〜９０ミリグラム／総タンパク質グラムであり、かつ、熱処理後の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸ロイシンの最終重量比がロイシン約１００〜２００ミリグラム／総タンパク質グラムである、
請求項２〜４または７のいずれか一項に記載の医療食品。
【請求項１５】
添加物量のアミノ酸トリプトファンおよびヒスチジンをさらに含んでなり、
（ａ）熱処理前の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸トリプトファンの初期重量比がトリプトファン約１２ミリグラム／総タンパク質グラムより大きく、かつ、熱処理前の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸ヒスチジンの初期重量比がヒスチジン約２３ミリグラム／総タンパク質グラムより大きく；かつ、
（ｂ）熱処理後の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸トリプトファンの最終重量比がトリプトファン約１２〜１４ミリグラム／総タンパク質グラムであり、かつ、熱処理後の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸ヒスチジンの最終重量比がヒスチジン約２０〜２４ミリグラム／総タンパク質グラムである、
請求項１４に記載の医療食品。
【請求項１６】
添加物量のアミノ酸メチオニンを含有しない、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の医療食品。
【請求項１７】
ＧＭＰが、ＧＭＰタンパク質１グラム当たり２．０ミリグラムを超えるフェニルアラニン混入物を含まないように精製される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の医療食品。
【請求項１８】
総タンパク質１グラム当たりのフェニルアラニンの含有量が１．５ミリグラム未満である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の医療食品。
【請求項１９】
代謝障害の管理のための医療食品を製造する方法であって、
（ａ）グリコマクロペプチド（ＧＭＰ）および添加物量の２種類以上のアミノ酸を供給する工程（ここで、添加アミノ酸の１つがアルギニンであり、供給された総タンパク質に対する供給されたアミノ酸アルギニンの重量比がアルギニン約６０〜９０ミリグラム／総タンパク質グラムであり、第二の添加アミノ酸がロイシンであり、供給された総タンパク質に対する供給されたアミノ酸ロイシンの重量比がロイシン約１００〜２００ミリグラム／総タンパク質グラムである）；
（ｂ）供給された材料と１種類以上の非タンパク質成分を混合して食品を製造する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２０】
添加物量の第三のアミノ酸チロシンが、供給された総タンパク質に対する供給されたアミノ酸チロシンの重量比がチロシン約６２〜９３ミリグラム／総タンパク質グラムとなるように、さらに供給される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
供給された総タンパク質に対する供給されたアミノ酸アルギニンの重量比がアルギニン約７５ミリグラム／総タンパク質グラムである、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
供給された総タンパク質に対する供給されたアミノ酸チロシンの重量比がチロシン約８５ミリグラム／総タンパク質グラムである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
供給された総タンパク質に対する供給されたアミノ酸ロイシンの重量比がロイシン約１００ミリグラム／総タンパク質グラムである、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＧＭＰタンパク質１グラム当たり２．０ｍｇを超えるフェニルアラニン混入物を含まないようにＧＭＰを精製する工程をさらに含んでなる、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＧＭＰタンパク質１グラム当たり２．０ｍｇを超えるフェニルアラニン混入物を含まないようにＧＭＰを精製する工程が、陽イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過およびダイアフィルトレーションからなる群の１以上の使用をさらに含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
精製されたＧＭＰを凍結乾燥または噴霧乾燥によって乾燥させる工程をさらに含んでなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
食品を固化させてプディング、ゼラチンまたはフルーツレザーの形態とする工程をさらに含んでなる、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
バー、クラッカー、フレーク、パフまたはペレットへ食品を成型する工程をさらに含んでなる、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
押出固体として食品を押し出す工程をさらに含んでなる、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
チロシンが供給されない、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
食品を熱処理する工程をさらに含んでなる、請求項１９〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
食品を熱処理する工程が食品を焼くことを含んでなる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）熱処理前の供給された総タンパク質に対する供給されたアミノ酸アルギニンの初期重量比がアルギニン約７５ミリグラム／総タンパク質グラムより大きく、かつ、熱処理前の供給された総タンパク質に対するアミノ酸ロイシンの初期重量比がロイシン約１００ミリグラム／総タンパク質グラムより大きく；かつ、
（ｂ）熱処理後の食品内の総タンパク質に対するアミノ酸アルギニンの最終重量比がアルギニン約６０〜９０ミリグラム／総タンパク質グラムであり、かつ、熱処理後の食品内の総タンパク質に対するアミノ酸ロイシンの最終重量比がロイシン約１００〜２００ミリグラム／総タンパク質グラムである、
請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
食品を熱処理する工程をさらに含んでなる、請求項２０または２２に記載の方法。
【請求項３５】
食品を熱処理する工程が食品を焼くことを含んでなる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
（ａ）熱処理前の供給された総タンパク質に対する供給されたアミノ酸ロイシンの初期重量比がロイシン約１００ミリグラム／総タンパク質グラムより大きく、熱処理前の供給された総タンパク質に対する供給されたアミノ酸チロシンの初期重量比がチロシン約８５ミリグラム／総タンパク質グラムより大きく、かつ、熱処理前の供給された総タンパク質に対するアミノ酸アルギニンの初期重量比がアルギニン約７５ミリグラム／総タンパク質グラムより大きく；かつ、
（ｂ）熱処理後の食品内の総タンパク質に対するアミノ酸ロイシンの最終重量比がロイシン約１００〜２００ミリグラム／総タンパク質グラムであり、熱処理後の食品内の総タンパク質に対するアミノ酸チロシンの最終重量比がチロシン約６２〜９３ミリグラム／総タンパク質グラムであり、かつ、熱処理後の食品内の総タンパク質に対するアミノ酸アルギニンの最終重量比がアルギニン約６０〜９０ミリグラム／総タンパク質グラムである、
請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
（ａ）添加物量のアミノ酸トリプトファンおよびヒスチジンもまた、熱処理前の供給された総タンパク質に対する供給されたアミノ酸トリプトファンの初期重量比がトリプトファン約１２ミリグラム／総タンパク質グラムより大きくなり、かつ、熱処理前の供給された総タンパク質に対する供給されたアミノ酸ヒスチジンの初期重量比がヒスチジン約２３ミリグラム／総タンパク質グラムより大きくなるように供給され；かつ、
（ｂ）熱処理後の食品内の総タンパク質に対するアミノ酸トリプトファンの最終重量比がトリプトファン約１２〜１４ミリグラム／総タンパク質グラムであり、かつ、熱処理後の食品内の総タンパク質に対するアミノ酸ヒスチジンの重量比がヒスチジン約２０〜２４ミリグラム／総タンパク質グラムである、
請求項３３または３６に記載の方法。
【請求項３８】
代謝障害を治療する方法であって、代謝障害を有するヒトに医療食品を投与することを含んでなり、該医療食品が、グリコマクロペプチド（ＧＭＰ）、添加物量のアミノ酸アルギニン（ここで、医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸アルギニンの重量比はアルギニン約６０〜９０ミリグラム／総タンパク質グラムである）、および添加物量のアミノ酸ロイシン（ここで、医療食品内の総タンパク質に対するロイシンの重量比はロイシン約１００〜２００ミリグラム／総タンパク質グラムである）を含んでなるものであり、代謝障害がフェニルアラニン代謝障害、チロシン代謝障害、トリプトファン代謝障害およびヒスチジン代謝障害から選択される、方法。
【請求項３９】
医療食品が、添加物量のアミノ酸チロシンを、医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸チロシンの重量比がチロシン約６２〜９３ミリグラム／総タンパク質グラムとなるようにさらに含んでなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
医療食品が添加物量のアミノ酸チロシンを含有しない、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
医療食品が含む総タンパク質１グラム当たりのフェニルアラニンおよびチロシンが、合わせて２．０ミリグラム未満である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
医療食品が添加物量のアミノ酸フェニルアラニンを含まず、代謝障害がフェニルアラニン代謝障害であるフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
医療食品が含む総タンパク質１グラム当たりのフェニルアラニンが、１．５ミリグラム未満である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
医療食品が投与されるヒトが少なくとも２歳である、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
代謝障害が、チロシン代謝障害であるＩ型チロシン血症、ＩＩ型チロシン血症、ＩＩＩ型チロシン血症／ホーキンシン尿症、およびアルカプトン尿症／組織黒変症からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
医療食品が添加物量のアミノ酸トリプトファンを含まず、代謝障害がトリプトファン代謝障害である高トリプトファン血症である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
医療食品が添加物量のアミノ酸ヒスチジンを含まず、代謝障害が、ヒスチジン代謝障害であるカルノシン血症、ヒスチジン血症およびウロカニン酸尿症からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００９年６月１２日に出願された米国仮出願第６１／１８６，６９０号の利益を主張するものであり、その全内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、次の機関：ＮＩＨ−助成番号ＤＫ０７１５３４によって授与された米国政府の助成を受けてなされたものである。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般に、フェニルケトン尿症などの代謝障害の栄養管理に用いられる医療食品に関する。特に、本発明は、付加量のアミノ酸アルギニン、ロイシンおよびチロシンを添加した、腫瘍タンパク源としてのグリコマクロペプチドを含有する医療食品に関する。
【０００４】
発明の背景
フェニルアラニン（Ｐｈｅ）は、代謝の正常な人において、酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ；ＥＣ１．１４．１６．１）によってチロシンに変換される不可欠アミノ酸である。年間産まれる１５，０００人の乳児に約１人がこの酵素を欠いているか、または機能不全であり、代謝障害フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）と診断される(Scriver C. R. 2001, The Metabolic & Molecular Bases of Inherited disease, 8th ed. New York: McGraw-Hill)。ＰＫＵを有する人の食事が生涯の最初の２０日以内に改善されなければ、Ｐｈｅおよびその分解産物が血中や脳に蓄積し、神経損傷や認知障害を引き起こす。
【０００５】
ＰＫＵの食事管理には、生存のために提案される低Ｐｈｅ食を必要とする。肉類、乳製品、豆類およびパンなどの食品はＰｈｅが高含量であるために、ＰＫＵを有する人は避けなければならない。低タンパクの自然食品には低Ｐｈｅ食に許容されるものがあるが（主として特定の果物および野菜）、標準的なＰＫＵ食における食事性タンパク質の大部分は一般にＰｈｅフリーアミノ酸配合物によって供給される。１９歳を超える成人の総Ｐｈｅ摂取量の毎日の記録は、女性では目標値２２０〜７７０ｍｇ／日または男性では２９０〜１，２００ｍｇ／日を超えてはならない(Acosta P & Yanicelli S. 2001, Protocol 1-Phenylketonuria (PKU), in Division, R. P., (editor), The Ross Metabolic Formula System Nutrition Support Protocols. 4th ed.: Ross Product Division)。
【０００６】
ＰＫＵのための標準アミノ酸処方物に基づく食事は、遵守が難しく、限定され、まずいものである。標準ＰＫＵ食に伴う一般的な問題である不履行は、重大な神経心理学的障害を招くおそれがある。よって、当技術分野では、この標準アミノ酸に基づく処方物よりも味が良く、かつ、血中および脳内において低Ｐｈｅレベルを有効に維持しつつ、必須アミノ酸を含む必要なタンパク質をＰＫＵ患者に提供する医療食品の必要性がある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ＰＫＵなどの代謝障害を有する人にとって食事のコンプライアンスと生活の質を高めるように設計された医療食品を提供する。一つの態様では、本発明は、代謝障害の管理のための医療食品を包含する。このような食品はグリコマクロペプチド（ＧＭＰ）と、アルギニンおよびロイシンを含む付加的な添加物量の特定のアミノ酸を含有する。好ましくは、医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸アルギニンの重量比は、アルギニン約６０〜９０ミリグラム／総タンパク質グラムであり、より好ましくは、その重量比はアルギニン約７５ミリグラム／総タンパク質グラムである。好ましくは、医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸ロイシンの重量比は、ロイシン約１００〜２００ミリグラム／総タンパク質グラムであり、より好ましくは、ロイシン約１００ミリグラム／総タンパク質グラムである。
【０００８】
特定の実施態様では、この医療食品は添加物量のアミノ酸チロシンをさらに含有する。好ましくは、医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸チロシンの重量比は、チロシン約６２〜９３ミリグラム／総タンパク質グラムであり、より好ましくは、チロシン約８５ミリグラム／総タンパク質グラムである。
【０００９】
いくつかの実施態様では、医療食品内の付加的な添加アミノ酸の総重量は、ＧＭＰ由来のタンパク質と添加アミノ酸を合わせた総重量の約２２％〜３８％である。これらの食品は、限定されるものではないがヒスチジンおよびトリプトファンを含む他のアミノ酸を付加的に添加してもよい。好ましくは、添加物量のアミノ酸トリプトファンおよびヒスチジンをさらに含有する実施態様では、付加的な添加アミノ酸の総重量は、ＧＭＰ由来のタンパク質と添加アミノ酸を合わせた総重量の約２５％〜４２％である。所望により、この医療食品はアミノ酸メチオニンを付加的に添加してもよい。
【００１０】
特定の実施態様では、本発明により包含される医療食品は、食品に含まれる付加的な添加アミノ酸の好ましい組合せを変えることによって特定の代謝障害を標的とすることができる。例えば、フェニルケトン尿症などのフェニルアラニン代謝障害の管理では、食品は好ましくは、ＧＭＰに加えて、添加物量のアミノ酸アルギニン、ロイシンおよびチロシンを含む。しかしながら、チロシン血症などのチロシン代謝障害の管理では、食品は添加物量のチロシンを含まない。
【００１１】
本発明により包含される医療食品は、一種の標準食品の形態であってもよい。好ましい形態としては、飲料、バー、ウエハース、プディング、ゼラチン、クラッカー、フルーツレザー、ナッツバター、ソース、サラダドレッシング、クリスプ・シリアル・ピース、フレーク、パフ、ペレットまたは押出固体が挙げられる。
【００１２】
特定の実施態様では、医療食品は、例えば、食品を焼くなどして、製造中に熱処理を行ってもよい。本発明者らは、熱処理中に、アミノ酸レベル、特に任意の添加トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、ロイシンまたはアルギニンのアミノ酸レベルが低下する場合があることを確認した。従って、このようないくつかの実施態様では、医療食品の製造に用いる最初の付加的な添加アミノ酸を、熱処理を行わない食品の場合よりも多くして、最終重量比が好ましい範囲に収まるようにする。限定されない例として、好ましい実施態様では、熱処理前の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸トリプトファンの初期重量比は、トリプトファン約１２ミリグラム／総タンパク質グラムより大きく、熱処理前の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸チロシンの初期重量比は、チロシン約８５ミリグラム／総タンパク質グラムより大きく、熱処理前の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸ヒスチジンの初期重量比は、ヒスチジン約２３ミリグラム／総タンパク質グラムより大きく、熱処理前の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸ロイシンの初期重量比は、ロイシン約１００ミリグラム／総タンパク質グラムより大きく、かつ／または熱処理前の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸アルギニンの初期重量比は、アルギニン約７５ミリグラム／総タンパク質グラムより大きい。
【００１３】
このような例示的実施態様では、医療食品内の初期アミノ酸レベルは、熱処理後の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸トリプトファンの最終重量比がトリプトファン約１２〜１４ミリグラム／総タンパク質グラムとなり、熱処理後の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸チロシンの最終重量比がチロシン約６２〜９３ミリグラム／総タンパク質グラムとなり、熱処理後の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸ヒスチジンの最終重量比がヒスチジン約２０〜２４ミリグラム／総タンパク質グラムとなり、熱処理後の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸ロイシンの最終重量比がロイシン約１００〜２００ミリグラム／総タンパク質グラムとなり、かつ／または熱処理後の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸アルギニンの最終重量比がアルギニン約６０〜９０ミリグラム／総タンパク質グラムとなるようなものであり得る。
【００１４】
ＰＫＵ管理食に用いられる本発明の医療食品は、極めて低いフェニルアラニンレベルでなければならない。従って、特定の好ましい実施態様では、医療食品中に含まれるＧＭＰは、ＧＭＰタンパク質１グラム当たり２．０ミリグラムを超えるフェニルアラニン混入物を含まない。このような純度のＧＭＰは商業的供給者によっても供給可能であるが、特定のこのような実施態様では、ＧＭＰは医療食品に含められる前に精製することができる。精製されたＧＭＰ中には含まれない添加物量のアミノ酸の食品への添加のために、特定の好ましい実施態様では、本発明の医療食品が含むフェニルアラニンは総タンパク質１グラム当たり１．５ミリグラム未満である。チョコレートなどの特定の非タンパク質成分が、医療食品に対する微量のフェニルアラニンの原因となるので、特定の実施態様では、医療食品は総タンパク質１グラム当たり約１．２〜約１．８ミリグラムのフェニルアラニンを含む。
【００１５】
チロシン代謝障害の管理に用いられる本発明の医療食品が含むフェニルアラニンおよびチロシンレベルは極めて低い。従って、このような実施態様は、添加物量のチロシンを含まない。好ましくは、チロシン代謝障害の管理のための実施態様では、医療食品が含む総タンパク質１グラム当たりのフェニルアラニンおよびチロシンは合わせて２．０ミリグラム未満である。
【００１６】
添加物量のアミノ酸アルギニンおよびロイシンを含む、チロシン代謝障害のためのいくつかの実施態様では、医療食品内の付加的な添加アミノ酸の総重量は、ＧＭＰ由来のタンパク質と添加アミノ酸を合わせた総重量の約１６％〜２９％である。チロシン代謝障害の管理のためのこのような実施態様のさらに他のものでは、ロイシンおよびアルギニンに加えて、医療食品は付加的な添加物量のアミノ酸ヒスチジンおよびトリプトファンを含有する。好ましくは、このような実施態様では、付加的な添加アミノ酸の総重量は、ＧＭＰ由来のタンパク質と添加アミノ酸を合わせた総重量の約１９％〜３３％である。チロシンの不在下で、他の添加アミノ酸の、推奨される添加レベルを維持するために、その医療食品に付加的ＧＭＰを加えてもよい。
【００１７】
第二の態様において、本発明は、従前に記載した医療食品の製造方法を包含する。この方法は、グリコマクロペプチド（ＧＭＰ）と、アルギニンおよびロイシンを含む付加的な添加物量の特定のアミノ酸を供給する工程、および供給された材料と１種類以上の非タンパク質成分を混合して食品を製造する工程を含む。好ましくは、供給された総タンパク質に対する供給されたアミノ酸アルギニンの重量比は、アルギニン約６０〜９０ミリグラム／総タンパク質グラム、より好ましくは、アルギニン約７５ミリグラム／総タンパク質グラムである。好ましくは、供給された総タンパク質に対する供給されたアミノ酸ロイシンの重量比は、ロイシン約１００〜２００ミリグラム／総タンパク質グラムであり、より好ましくは、この比はロイシン約１００ミリグラム／総タンパク質グラムである。
【００１８】
本方法のいくつかの好ましい実施態様では、添加物量のアミノ酸チロシンもまた供給される。好ましくは、供給された総タンパク質に対する供給されたアミノ酸チロシンの重量比はチロシン約６２〜９３ミリグラム／総タンパク質グラムであり、より好ましくは、この比はチロシン約８５ミリグラム／総タンパク質グラムである。いくつかのこのような実施態様では、付加的な添加アミノ酸の総重量は、ＧＭＰ由来のタンパク質と添加アミノ酸を合わせた総重量の約２２％〜３８％である。
【００１９】
特定の実施態様では、本発明により包含される方法は、添加アミノ酸の供給組合せを変えることによって、特定の代謝障害を標的とする医療食品を製造するように改変することができる。例えば、フェニルケトン尿症などのフェニルアラニン代謝障害の管理に用いる医療食品を製造するためには、ＧＭＰに加えて、添加物量のアミノ酸アルギニン、ロイシンおよびチロシンが供給される。しかしながら、チロシン血症などのチロシン代謝障害の管理に用いる医療食品を製造するためには、添加物量のチロシンは供給されない。
【００２０】
特定の好ましい実施態様では、本方法は、ＧＭＰタンパク質１グラム当たり２．０ｍｇを超えるフェニルアラニン混入物を含まないようにＧＭＰを精製する工程を含む。いくつかのこのような実施態様では、このＧＭＰを精製する工程は、以下の技術：陽イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過およびダイアフィルトレーションのうち１以上によって行うことができる。このような実施態様はまた、精製されたＧＭＰを凍結乾燥または噴霧乾燥によって乾燥させる付加的工程を含んでもよい。
【００２１】
特定の実施態様は、食品を固化させてプディング、ゼラチンまたはフルーツレザーの形態とする付加的工程を含んでもよい。他の実施態様は、バー、クラッカー、フレーク、パフもしくはペレットへ食品を成型する工程、または押出固体として食品を押し出す工程を含んでもよい。
【００２２】
特定の実施態様は、食品を製造する際に、供給された混合物を熱処理する付加的工程を含んでもよい。このような工程の限定されない例は、オーブンまたは他の加熱チャンバーで食品を焼くことである。本発明者らは、チロシン、トリプトファン、アルギニン、ロイシンおよびヒスチジンを含む特定のアミノ酸が熱処理中に損失または分解されることを確認した。従って、このような実施態様では、医療食品の製造に用いる付加的な添加アミノ酸の初期量を、熱処理を行わない食品の場合よりも高レベルに供給して、熱処理によってアミノ酸が損失又は分解されても最終重量比が好ましい範囲に収まるようにすることが好ましい。
【００２３】
限定されない例として、好ましい実施態様では、熱処理前の供給された総タンパク質に対する供給されたアミノ酸トリプトファン初期重量比は、トリプトファン約１２ミリグラム／総タンパク質グラムより大きくすればよく、熱処理前の供給された総タンパク質に対する供給されたアミノ酸チロシンの初期重量比は、チロシン約８５ミリグラム／総タンパク質グラムより大きくすればよく、熱処理前の医療食品内の供給された総タンパク質に対する供給されたアミノ酸ヒスチジンの初期重量比は、ヒスチジン約２３ミリグラム／総タンパク質グラムより大きくすればよく、熱処理前の医療食品内の供給された総タンパク質に対する供給されたアミノ酸ロイシンの初期重量比は、ロイシン約１００ミリグラム／総タンパク質グラムより大きくすればよく、かつ／または熱処理前の供給された総タンパク質に対する供給されたアミノ酸アルギニンの初期重量比は、アルギニン約７５ミリグラム／総タンパク質グラムより大きくすればよい。
【００２４】
熱処理中、食品内のこれらのアミノ酸レベルは低下することがある。熱処理後の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸トリプトファンの最終重量比は、トリプトファン約１２〜１４ミリグラム／総タンパク質グラムであり、熱処理後の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸チロシンの最終重量比は、チロシン約６２〜９３ミリグラム／総タンパク質グラムであり、熱処理後の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸ヒスチジンの最終重量比は、ヒスチジン約２０〜２４ミリグラム／総タンパク質グラムであり、熱処理後の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸ロイシンの最終重量比は、ロイシン約１００〜２００ミリグラム／総タンパク質グラムであり、かつ／または熱処理後の医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸アルギニンの最終重量比は、アルギニン約６０〜９０ミリグラム／総タンパク質グラムであることが好ましい。
【００２５】
第三の態様では、本発明は、限定されるものではないが、フェニルアラニン代謝障害、チロシン代謝障害、トリプトファン代謝障害またはヒスチジン代謝障害を含む代謝障害を治療する方法を包含する。これらの方法は、代謝障害を有するヒトにグリコマクロペプチド（ＧＭＰ）と、アルギニンおよびロイシンを含む付加的な添加物量の２種類以上のアミノ酸を含有する医療食品を投与する工程を含む。好ましくは、医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸アルギニンの重量比は、アルギニン約６０〜９０ミリグラム／総タンパク質グラムであり、より好ましくは、この比はアルギニン約７５ミリグラム／総タンパク質グラムである。好ましくは、医療食品内のタンパク質に対するアミノ酸ロイシンの重量比は、ロイシン約１００〜２００ミリグラム／総タンパク質グラムであり、より好ましくは、ロイシン約１００ミリグラム／総タンパク質グラムである。
【００２６】
このような実施態様では、医療食品にさらにチロシンが添加されない場合、この医療食品で治療されるヒトは、限定されるものではないが、Ｉ型チロシン血症、ＩＩ型チロシン血症、ＩＩＩ型チロシン血症／ホーキンシン尿症、またはアルカプトン尿症／組織黒変症を含むチロシン代謝障害を有していてもよい。このような実施態様では、好ましくは、医療食品が含むフェニルアラニンおよびチロシンは合わせて総タンパク質１グラム当たり２．０ミリグラム未満である。
【００２７】
さらに他の実施態様では、投与される医療食品は、添加物量のアミノ酸チロシンを付加的に含む。好ましくは、医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸チロシンの重量比は、チロシン約６２〜９３ミリグラム／総タンパク質グラムであり、より好ましくは、この比はチロシン約８５ミリグラム／総タンパク質グラムである。このような実施態様では、医療食品で治療されるヒトは、限定されるものではないがフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を含むフェニルアラニン代謝障害、限定されるものではないが高トリプトファン血症を含むトリプトファン代謝障害、または限定されるものではないがカルノシン血症、ヒスチジン血症もしくはウロカニン酸尿症を含むヒスチジン代謝障害を有してもよい。トリプトファン代謝障害を有するヒトが治療される実施態様では、投与される医療食品は添加物量のトリプトファンを含まない。ヒスチジン代謝障害を有するヒトが治療される実施態様では、投与される医療食品は添加物量のヒスチジンを含まない。
【００２８】
治療されるヒトがフェニルアラニン代謝障害を有する実施態様では、このヒトは好ましくは少なくとも２歳である。好ましくは、投与される医療食品が含むフェニルアラニンは総タンパク質１グラム当たり１．５ミリグラム未満である。
【００２９】
本発明のこれらの、またその他の特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面とともに考慮すれば当業者には明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】カゼイン、限定ＩＡＡを添加したＧＭＰ（適正ＧＭＰ）、またはＰｈｅを除く限定ＩＡＡを添加したＧＭＰ（Ｐｈｅを欠くＧＭＰ）を含有する餌を与えた離乳ＷＴマウスにおける、４２日間の体重を時間の関数として示す。値は平均±ＳＥＭ；ｎ＝１０である。ＧＭＰ  Ｐｈｅ欠乏群には、４日目から試験の終了時まで飲み水にＰｈｅ（１ｇ  Ｐｈｅ／Ｌ）を加えた。１４日目から４２日目まで、日々のＢＷ変化に有意差はなかった。
【図２】４７日間ＧＭＰまたはアミノ酸（ＡＡ）食を与えたＰＫＵマウスの脳、小脳、脳幹、視床下部、頭頂皮質および前部嗅皮質の５つの切片におけるＰｈｅ濃度を示す。値は平均±ＳＥＭ；ｎ＝８である。＊ＡＡとの差、Ｐ≦０．００１。
【図３】４７日間ＧＭＰまたはアミノ酸（ＡＡ）食を与えたＰＫＵマウスの小脳Ｐｈｅレベルを血漿トレオニン（Ｔｈｒ）＋イソロイシン（Ｉｓｏ）＋バリン（Ｖａｌ）レベルの関数として示す。
【図４】製品１００ｇ当たりのアミノ酸のｇとして表したグリコマクロペプチド(BioPURE-GMP; Davisco Foods International Inc., LeSueur, MN)およびカゼイン(ALACID; New Zealand Milk Products, Santa Rosa, CA)のアミノ酸特性を示す。
【図５】１５週間アミノ酸（ＡＡ）またはグリコマクロペプチド（ＧＭＰ）食を自由に与えた１個体のＰＫＵ被験体から、朝食前に一晩絶食させた後に得られた平均Ｐｈｅ濃度を示す。Ｐｈｅ含量が既知の食品だけを被験体に与えた場合の１５週間の試験期間のうち６週間のデータを示した：３週間および１５週間（ＡＡ食）、４週間、７週間、１１週間および１３週間（ＧＭＰ食）。血中および血漿中のＰｈｅ濃度は、Ｐｈｅの取り込みに関して補正し、Ｐｈｅの取り込み１００ｍｇ当たりのｍｍｏｌ  Ｐｈｅ／Ｌとして表した。Ｐｈｅ濃度は、２つの方法、すなわち、タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）を用いた血液スポット採取の分析およびＡＡ分析装置を用いた血漿Ｐｈｅの測定のうちの１つを用いて測定した。値は平均±ＳＥである；ＡＡ食（血漿Ｐｈｅ  ｎ＝４および血液Ｐｈｅ  ｎ＝４）、ＧＭＰ食（血漿Ｐｈｅ  ｎ＝４および血液Ｐｈｅ  ｎ＝８）。＊ＡＡ食との差、ｐ＜０．０５。
【図６】グリコマクロペプチド（ＧＭＰ）またはＡＡ食の摂取を行った食後血漿中の総アミノ酸（ＡＡ）および血中尿素窒素の濃度を示す。血漿は朝食摂取の２．５時間後に得た；ｎ＝６であった試験日数５日目および６日目の血中尿素窒素以外はｎ＝１１。総血漿ＡＡは、血漿で測定された総てのＡＡの合計を示す。値は平均±ＳＥＭである。ＡＡ食摂取の４日目に比べてＧＭＰ食摂取の場合には、総血漿ＡＡは増加し、血中尿素窒素は低下した。反復測定ＡＮＯＶＡにおいては、時間の有意な効果があった。＊４日目のＡＡ食との有意差、Ｐ＜０．０５（対応のあるｔ検定、被験体に対して対応有り）。
【図７】４日間、アミノ酸（ＡＡ）食またはグリコマクロペプチド（ＧＭＰ）食を摂取した後のフェニルケトン尿症を有する個々の被験体（ｎ＝１１）の血漿中のフェニルアラニン濃度を示す。血液は朝食摂取の２．５時間後に得、完全ＡＡ特性の分析のために血漿を単離した。被験体は、４日間ＡＡ食またはＧＭＰ食を摂取した後に一定範囲の血漿フェニルアラニン濃度を示した。ＡＡ食の最終日（４日目）とＧＭＰ食の最終日（８日目）を比べた場合、血漿中のフェニルアラニン濃度に有意差はなかった；被験体に対して対応がある、対応のあるｔ検定によればＰ＝０．１７３。群平均±ＳＥＭは６１９±８２μｍｏｌ／Ｌ（ＡＡ食）および６７６±９２μｍｏｌ／Ｌ（ＧＭＰ食）であった。血漿中のフェニルアラニン濃度の平均変化は５７±５２μｍｏｌ／Ｌであった。ｐｈｅはフェニルアラニン。
【図８】４日間アミノ酸（ＡＡ）食に比べ、グリコマクロペプチド（ＧＭＰ）を与えたフェニルケトン尿症被験体における絶食（絶食、一晩絶食）血漿に比べた食後（ＰＰ；朝食摂取の２．５時間後）のフェニルアラニン濃度を示す。群平均および個々の被験体の応答を示す；ｎ＝６（４日目と８日目の比較）。ＧＭＰ食を摂取した場合には、絶食とＰＰの濃度を比較しても血漿フェニルアラニン濃度に有意な変化はなかったが（Ｐ＝０．３４９）、ＡＡ食は、被験体に対して対応がある、対応のあるｔ検定によれば、血漿フェニルアラニンに有意な増加を示した（Ｐ＝０．０４８）。ｐｈｅはフェニルアラニン。
【図９】４日間（５日目〜８日目）グリコマクロペプチド（ＧＭＰ）食を摂取した後の食後血漿中のトレオニンおよびイソロイシン濃度を示す。値は、朝食２．５時間後に得た血漿の平均±ＳＥＭ；ｎ＝１１である。試験３日間および４日間は、総ての被験体にアミノ酸（ＡＡ）食を摂らせ、５〜８日目には、総てのＡＡ処方物をＧＭＰ食品に置き換えた。反復測定ＡＮＯＶＡにおいては、時間の有意な効果があった。＊ＡＡ食の最終日（４日目）との有意差、Ｐ＜０．０５（対応のあるｔ検定、被験体に対して対合有り）。＊＊ＡＡ食の最終日（４日目）との有意差、Ｐ＜０．０００１。５日後および７日後にそれぞれイソロイシンおよびトレオニンの血漿濃度にさらなる有意な増加はなかった。ｉｌｅはイソロイシン、ｔｈｒはトレオニン。
【図１０】アミノ酸処方物(Phlexy-10 Drink Mix, SHS North America, Rockville, Md., U.S.A.)と比較したＧＭＰストロベリープディングのアミノ酸特性を示す。値は平均±ＳＤである。サンプルサイズはｎ＝２であった。ＧＭＰストロベリープディングおよびアミノ酸バーの上の同じ文字は、値に統計学的な差がないことを示す（Ｐ＞０．０５）。
【図１１】本発明のＧＭＰ食品であるＢｅｔｔｅｒｍｉｌｋ(商標）および慣用アミノ酸処方物であるＰｈｅｎｅｘ−２（商標）の双方の４つの異なる判定基準（臭い、味、後味および総合）を用いた許容性評価を示す棒グラフである。これらの評価は、２７人の非ＰＫＵ成人（白いバー）および４人のＰＫＵ成人（影付きのバー）から平均をとったものである。値は平均±ＳＤである；＊ｐ≦０．０１、対応のあるｔ検定。許容性のランク付けは、１−極めて好ましくない、２−あまり好ましくない、３−好ましくない、４−やや好ましくない、５−やや好ましい、６−好ましい、７−非常に好ましい、および８−極めて好ましい。
【図１２】ＧＭＰ食およびアミノ酸食の場合の、ＰＫＵ被験体のグレリン、インスリンおよびアミノ酸の血漿濃度を示す棒グラフである。グレリンおよびインスリン値は、被験体ごとに、ＡＡ朝食の場合には３日目と４日目、ＧＭＰ朝食の場合には７日目と８日目からの血漿を等量合わせたものに相当する。ＡＡ食の最終日（４日目）とＧＭＰ食の最終日（８日目）の食後（ＰＰ）血漿ＡＡ値の合計。値は総て平均±ＳＥＭ；グレリン絶食値はｎ＝６。＊は、ＡＡ朝食の食後グレリンとの有意差を示す（ｐ＝０．０３、対応のあるｔ検定、被験体に対して対応有り；ｎ＝１０）。＊＊は、ＡＡ朝食の場合のインスリンとのやや有意差を示す（ｐ＝０．０５３、対応のあるｔ検定、被験体に対して対応有り；ｎ＝１０）。＊＊＊は、ＡＡ朝食の場合の血漿ＡＡの合計との有意差を示す（ｐ＝０．０４９、対応のあるｔ検定、被験体に対して対応有り；ｎ＝１１）。
【図１３】ＧＭＰ食（白丸）およびアミノ酸食（黒丸）の双方における、ＰＫＵ被験体に関する、朝食開始１８０分後の血漿グレリン濃度（ｘ軸）と朝食２時間後の満腹感（ｙ軸）の間の関係のグラフである。食後グレリンが低いほど、より大きな満腹感と関連していた。直線は、個々の食事療法データに当てはめた最小二乗回帰直線を表し、ＡＡ朝食は破線であり、ＧＭＰ朝食は実線である。これらの直線は有意に異なる。変数減少法を混合効果モデルとともに用いたところ、食後満腹スコアを推定する最良のモデルは食事療法、食後グレリンおよびグレリンと食事療法の間の相互作用を含んだ。
【発明の具体的説明】
【００３１】
Ｉ．概説
本材料および方法を記載する前に、本発明は記載される特定の方法論、プロトコール、材料および試薬は可変であるので、これらに限定されないと理解される。また、本明細書に用いられる用語は単に特定の実施態様を記載するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は、後の、仮出願ではない出願によってのみ限定されると理解すべきである。
【００３２】
本明細書および添付の特許請求の範囲に用いられているように、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈がそうではないことを明確に示していない限り、複数形も含むことに留意されたい。同様に、「a」（または「an」）、「１以上の」および「少なくとも１つの」という語は、本明細書では互換的に使用することができる。また、「含んでなる」、「含む」および「有する」という語も互換的に使用することができることに留意されたい。
【００３３】
そうではないことが定義されない限り、本明細書で用いられる総ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験には本明細書に記載されているものと同等または等価ないずれの方法および材料も使用可能であるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書に明示されている総ての刊行物および特許は、本発明に関連して使用可能な刊行物に報告されている化学薬品、機器、統計分析および方法論の記載および開示を含め、あらゆる目的で引用することにより本明細書の一部とされる。本明細書に引用されている参照文献は総て、当技術分野の技術水準を示すものと考えるべきである。本明細書において、本発明が先行発明の効力によってかかる開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈すべきではない。
【００３４】
本明細書において、「約」とは、示された値の１０％下〜１０％上の範囲を意味する。
【００３５】
本明細書において、「医療食品」とは、「医師の監督下で摂取または経腸投与されるべく処方され、特有の栄養要求が、認知されている科学的原理に基づき、医学的評価によって確立されているある疾患または症状の特別な食事管理のために意図される食品」を意味する（Orphan Drug Act, 21 U.S.C. 360ee (b) (3)第5節から）。医療食品は、医学的監督下で用いられ、ある疾患または症状の特別な食事管理を意図した、より広い特別用途食品のカテゴリーおよび医療食品が疾患または症状の特有の栄養要求を満たすことを意図したものであるという要件によって健康を増進するとされる食品とは区別される。
【００３６】
「医療食品」とは、病気の患者に与える総ての食品を指すのではない。医療食品は、重篤な病状の患者または主要な治療法としてその製品を要する患者のために特別に処方および加工された（そのままの状態で用いる自然食品ではない）食品である。医療食品とみなされるためには、製品は、最低限、以下の判定基準を満たさなければならない：その製品が経口栄養または経管栄養用の食品であること；その製品が、特有の栄養要求がある特定の医学的障害、疾患または症状の食事管理用のものであることが表示されていること、およびその製品が医学的監督下での使を意図したものであること(U.S. Food and Drug Administration, Guidance for Industry: Frequently Asked Questions About Medical Foods, Center for Food Safety and Applied Nutrition, May 2007から)。
【００３７】
本明細書において、「添加物量」のアミノ酸とは、（ａ）ＧＭＰタンパク質の微量の混入物、または（ｂ）非タンパク質産物に含まれる微量のアミノ酸に由来するもではない、混合物に加えられる、または食品中に含まれるアミノ酸の量を意味する。非タンパク質産物の限定されない例としてチョコレートがあり、これは微量のＰｈｅを含むが、タンパク質またはアミノ酸の重要な供給源とは認識されない。添加物量は、限定されるものではないが市販のアミノ酸添加物をはじめとする、有意な量の、所定のアミノ酸または該アミノ酸を含有するタンパク質を含むと認識されている他の任意の供給源に由来するものであり得る。
【００３８】
本明細書において、食品内の「総タンパク質」とは、その食品内のＧＭＰ由来のタンパク質とその食品内の付加的な添加アミノ酸に由来するタンパク質の凝集物を意味する。
【００３９】
本発明では次の省略形を用いる：ＡＡ、アミノ酸；Ａｌａ、アラニン；Ａｒｇ、アルギニン；Ａｓｎ、アスパラギン；Ａｓｐ、アスパラギン酸；ＢＷ、体重；Ｃｙｓ、システイン；ＤＲＩ、食事摂取基準；Ｇｌｎ、グルタミン；Ｇｌｕ、グルタミン酸；Ｇｌｙ、グリシン；ＧＭＰ、グリコマクロペプチド；Ｈｉｓ、ヒスチジン；ＩＡＡ、不可欠アミノ酸；ＩｓｏまたはＩｌｅ、イソロイシン；Ｌｅｕ、ロイシン；ＬＮＡＡ、大型中性アミノ酸；Ｍｅｔ、メチオニン；ＭＳ／ＭＳ、タンデム質量分析法；ＰＡＨ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ；ＰＥ、タンパク質等価物；Ｐｈｅ、フェニルアラニン；ＰＫＵ、フェニルケトン尿症；Ｐｒｏ、プロリン；ＳＥＭ、平均の標準誤差；Ｓｅｒ、セリン；Ｔｈｒ、トレオニン；Ｔｙｒ、チロシン；Ｔｒｐ、トリプトファン；Ｖａｌ、バリン；ＷＴ、野生型。
【００４０】
ＩＩ．本発明
今般、本発明者らは、付加量のアミノ酸アルギニン、ヒスチジン、ロイシン、および所望により他のアミノ酸を添加したグリコマクロペプチドタンパク質を食品中に含まれるアミノ酸／タンパク質源として用いて製造された医療食品が、ＰＫＵまたは他の代謝障害を有する人の食事における低Ｐｈｅの完全タンパク源を提供することを見出した。これらの食品は標準ＡＡ処方物よりも味が良く、血中および脳内のＰｈｅレベルを引き下げるＧＭＰを最適化する。よって、本発明は、医療食品、このような食品の製造方法、ＰＫＵなどの代謝障害を有する人にタンパク源としてこのような食品を投与する方法を提供する。
【００４１】
一つの態様において、本発明は、低Ｐｈｅの完全タンパク源を含有する医療食を提供する。本発明の医療食品の主要なタンパク源は、その純粋な形態でＰｈｅを含まない天然タンパク質であるグリコマクロペプチド（ＧＭＰ）である。ＧＭＰは、チーズの製造中に、キモシンがκ−カゼインを１０５〜１０６アミノ酸残基の間で特異的に切断する場合に形成される。パラ−κ−カゼイン（残基１〜１０５）は凝集してチーズカードを形成するが、ＧＭＰ（残基１０６〜１６９）は乳清中に残る。ＧＭＰは極性が高く、１以上のトレオニンアミノ酸部位でガラクトサミン、ガラクトースおよびο−シアル酸によってグリコシル化されている。
【００４２】
「ＧＭＰタンパク質」とは、グリコシル化部分を持たない純粋なＧＭＰポリペプチドを意味する。ＧＭＰタンパク質は、４７％（ｗ／ｗ）の不可欠アミノ酸を含むが、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アルギニン（Ａｒｇ）、システイン（Ｃｙｓ）またはＰｈｅを含まない。
【００４３】
いくつかの方法を用いて乳清からＧＭＰを単離することができる。精製方法の詳細な例は、例えば、米国特許第５，９６８，５８６号に見出せる。乳清からＧＭＰを単離するための現行の大規模技術は、イオン交換クロマトグラフィーまたは限外濾過を用いる。ＧＭＰはの等電点（ｐＩ）は３．８より小さいが、他の主要な乳清タンパク質のｐＩ値は４．３より大きい。ＧＭＰと他の乳清タンパク質の間のこの物理化学的違いは、乳清からＧＭＰを分離するための単離プロセスでよく用いられる。
【００４４】
市販のＧＭＰは、残留する乳清タンパク質由来のＰｈｅ混入物を含む。市販のＧＭＰ中のＰｈｅ混入物の量は幅広く異なる（すなわち、Ｐｈｅ５ｍｇ／製品ｇ、manufacturer literature, Davisco Foods Intl., Eden Prairie, Minn., U.S.A；Ｐｈｅ２．０ｍｇ／製品ｇ、Lacprodan cGMP-20 manufacturer literature, Arla Foods, Arhus, Denmark）。従来のアミノ酸処方物はＰｈｅフリーであり、ＰＫＵを有する人は自分の一日許容量を満たすようにＰｈｅを含有する自然食品を摂取することができる。本明細書で用いるのに好ましいＧＭＰは、Ｐｈｅ２．０ｍｇ／ＧＭＰｇ以下を含む。
【００４５】
特定の好ましい実施態様では、商業的に入手したＧＭＰを、本発明の医療食品で用いる前に精製してＰｈｅ混入物を除去することができる。可能性のある精製プロセスは当技術分野で周知であり、限定されるものではないが、未精製ＧＭＰ中の混入乳清タンパク質を陽イオン交換樹脂に吸着することにより捕捉すること、および通過画分中の精製されたＧＭＰを回収することを含む。ＧＭＰを濃縮し、ペプチド、塩および非タンパク質性窒素を洗浄するために、例えば、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）などの当技術分野で公知のさらなる技術を使用することもできる。精製および濃縮工程後、限定されるものではないが、凍結乾燥および噴霧乾燥を含む当技術分野で公知のいくつかの技術を用いて、精製、濃縮されたＧＭＰを乾燥させることもできる。
【００４６】
純粋なＧＭＰは、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、ＡｒｇまたはＰｈｅを含まず、ロイシン（Ｌｅｕ）が低い。Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、ＰｈｅおよびＬｅｕは総て不可欠アミノ酸である。ＴｙｒおよびＡｒｇは条件付き不可欠アミノ酸であり、これはＰｈｅがＴｙｒの前駆体であり、グルタミン酸、プロリンおよびアスパラギン酸がＡｒｇの前駆体であるためである。結果として、栄養的に完全なタンパク質を提供するには、食品中の主要タンパク源としてのＧＭＰに添加を行わなければならない。本発明者らは、当技術分野でこれまでに提案されているものとは異なる、添加物量のアミノ酸アルギニン、ロイシンおよびチロシンの最適範囲を決定した。
【００４７】
よって、特定の好ましい実施態様では、本発明は、医療食品がグリコマクロペプチド（ＧＭＰ）と、付加的な、至適化された添加物量のアミノ酸アルギニン、ロイシンおよび／またはチロシンを含む場合の、代謝障害の管理のための医療食品を含む。他のアミノ酸も本発明の医療食品に含めることができる。しかしながら、本発明者らはメチオニン添加の必要はなく、実際にことを決定付け、実際に医療食品の食味を悪くすることから、特定の好ましい実施態様では、本発明の医療食品は、付加的な添加物量のアミノ酸メチオニンを含まない。食品における使用が認可されているアミノ酸は、当技術分野で公知の様々な商業ソースから得ることができる。
【００４８】
医療食品内の各添加アミノ酸の好ましい重量比は、最終医療食品中の、総タンパク質１グラム当たりのアミノ酸ミリグラムの単位で表され、ここで、総タンパク質のグラムは、ＧＭＰ由来のタンパク質（窒素ｇ×６．２５）と付加的な添加アミノ酸由来のタンパク質（窒素ｇ×６．２５）の合計と定義される。特定の好ましい実施態様では、付加的な添加アミノ酸の総重量は、好ましくは、ＧＭＰ由来のタンパク質と加えた添加アミノ酸を合わせた総重量の約２２％〜３８％である。
【００４９】
好ましくは、医療食品内のタンパク質に対するアミノ酸アルギニンの重量比は、アルギニン約６０〜９０ミリグラム／総タンパク質グラムであり、より好ましくは、医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸アルギニンの重量比は、約７５ミリグラムアルギニン／総タンパク質グラムである。
【００５０】
医療食品内のタンパク質に対するアミノ酸ロイシンの好ましい重量比は、ロイシン約１００〜２００ミリグラム／総タンパク質グラムであり、より好ましくは、医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸ロイシンの重量比は、ロイシン約１００ミリグラム／総タンパク質グラムである。
【００５１】
添加物量のチロシンを含有する実施態様では、医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸チロシンの好ましい重量比は、チロシン約６２〜９３ミリグラム／総タンパク質グラムであり、より好ましくは、医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸チロシンの重量比は、チロシン約８５ミリグラム／総タンパク質グラムである。
【００５２】
特定の実施態様では、医療食品は所望により付加的な添加アミノ酸を含んでもよい。例えば、ヒスチジンおよび／またはトリプトファンが医療食品に含まれてもよい。ヒスチジン添加の場合、医療食品内の総タンパク質に対するヒスチジンの好ましい重量比は、ヒスチジン約２０〜２４ミリグラム／総タンパク質グラムであり、より好ましくは、医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸ヒスチジンの重量比は、ヒスチジン約２３ミリグラム／総タンパク質グラムである。
【００５３】
トリプトファン添加の場合、医療食品内の総タンパク質に対するトリプトファンの好ましい重量比は、トリプトファン約１２〜１４ミリグラム／総タンパク質グラムであり、より好ましくは、医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸トリプトファンの重量比は、トリプトファン約１２ミリグラム／総タンパク質グラムである。
【００５４】
特定の実施態様では、医療食品は必須ビタミンおよびミネラルを付加的に添加して、完全なタンパク源に加えて、必要な非タンパク質性の栄養添加を提供してもよい。さらに、医療食品は、従来の食品に一般に含まれている様々な低Ｐｈｅ物質（非タンパク質成分）を含んでもよい。
【００５５】
本発明はＰＫＵなどのＰｈｅ代謝障害の治療用の医療食品に限定されず、ＧＭＰには存在しない他のアミノ酸の代謝障害（すなわち、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅの代謝障害）の管理のための食品をさらに含む。チロシン血症などのチロシン代謝障害の管理に用いられる実施態様の場合には、最適な添加物量のアルギニンおよびロイシンが食品に組まれるが、添加物量のチロシンは含まれない。損失したチロシンを調整するために、ＧＭＰ量を増やすことができる。いくつかのこのような実施態様では、付加的な添加アミノ酸の総重量は、好ましくは、ＧＭＰ由来のタンパク質と加えた添加アミノ酸を合わせた総重量の約１６％〜２９％である。好ましくは、チロシンとフェニルアラニンを合わせた量は、このような実施態様では、総タンパク質１グラム当たり２．０ｍｇより少ない。
【００５６】
本発明の医療食品は、限定されるものではないが、処方物、飲料、バー、ウエハース、プディング、ゼラチン、クラッカー、フルーツレザー、ナッツバター、ソース、サラダドレッシング、フレーク、クリスプ・シリアル・ピース、パフ、ペレットまたは押出固体を含む、多様な食品種を包含する。これら、また、その他のあり得る食品種は当業者に容易に認識され、従来の製造方法を用い、本発明の成分を従来の食品に一般に用いられている他の低Ｐｈｅ物質とともに用いて本発明の医療食品を製造することができる。
【００５７】
本発明により包含される、いくつかのあり得る食品種は、製造中に熱処理を受ける。限定されない例としては、クラッカー、バーおよびクリスプ・シリアル・ピースは焼くことができる。押出固体は、押出し前に加熱してもよい。フルーツレザー、ソースおよびクリスプ・シリアル・ピースは、冷却前、また、場合によっては最終製品の乾燥前に混合物を加熱することによって製造することができる。よって、特定の実施態様では、本発明の医療食品は製造中に熱処理される。
【００５８】
本発明者らは、熱処理が付加的な添加アミノ酸の著しい損失を招き得ることを決定付けた。例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、ＬｅｕおよびＡｒｇなどの遊離アミノ酸はメイラード反応を受け得る。露光はＴｙｒの光分解反応を加速化する。熱処理または露光による付加的な添加アミノ酸の損失は、その医療食品に加えなければならない付加的な添加アミノ酸の量を引き上げる。従って、いくつかの好ましい実施態様では、各添加アミノ酸の初期重量比は、各添加アミノ酸の最終残存量が好ましい重量比の範囲内に収まるように、熱処理される食品では、熱処理されない食品の場合よりも高く設定される。
【００５９】
別の態様では、本発明は、ＰＫＵなどの代謝障害の管理のための医療食品を製造する方法を包含する。この方法は、グリコマクロペプチド（ＧＭＰ）と、アルギニンおよびロイシンを含む付加的な添加物量のアミノ酸を供給する工程、および供給された材料を他の物質と混合して食品を製造する工程を含む。本方法の特定の実施態様では、供給されたタンパク質に対する供給されたアミノ酸アルギニンの重量比は、ロイシン約６０〜９０ミリグラム／総タンパク質グラム、好ましくは、アルギニン約７５ミリグラム／総タンパク質グラムである。本方法の特定の実施態様では、供給された総タンパク質に対する供給されたアミノ酸ロイシンの重量比は、ロイシン約１００〜２００ミリグラム／総タンパク質グラム、好ましくは、ロイシン約１００ミリグラム／総タンパク質グラムである。
【００６０】
上記のように、従来の食品の製造に一般に用いられている非タンパク質成分をはじめとする様々な他の物質が本食品の製造に使用可能である。しかしながら、用いる他の物質は低ＰｈｅまたはＰｈｅフリー物質でなければならない。
【００６１】
いくつかの実施態様では、本法で用いる付加的な添加アミノ酸の総重量は、ＧＭＰ由来のタンパク質と添加アミノ酸を合わせた総重量の約２２％〜３８％であることが好ましい。本方法は、様々な食品種を製造するために用いられる従来技術を包含する。限定されない例として、本食品混合物は、固化させてプディング、ゼラチンまたはフルーツレザーを形成させてもよく、本食品混合物は、バー、クラッカー、フレーク、パフまたはペレットに成型してもよく、または本食品は押出固体として押し出してもよい。本方法のいくつかの実施態様では、本食品混合物は熱処理される。熱処理の例としては、限定されるものではないが、食品混合物を焼くこと、食品混合物の低温殺菌、加熱混合物の煮沸、または混合物への加熱押出の適用が挙げられる。
【００６２】
本方法の特定の実施態様では、供給されたタンパク質に対する供給されたアミノ酸チロシンの重量比は、チロシン約６２〜９３ミリグラム／総タンパク質グラム、好ましくは、チロシン約８５ミリグラム／総タンパク質グラムである。
【００６３】
本方法の特定の実施態様では、供給されたタンパク質に対する供給されたアミノ酸ヒスチジンの重量比は、ヒスチジン約２０〜２４ミリグラム／総タンパク質グラム、好ましくは、ヒスチジン約２３ミリグラム／総タンパク質グラムである。
【００６４】
本方法の特定の実施態様では、食品内のタンパク質に対するアミノ酸トリプトファンの重量比は、トリプトファン約１２〜１４ミリグラム／総タンパク質グラム、好ましくは、トリプトファン約１２ミリグラム／総タンパク質グラムである。
【００６５】
本方法はまた、ＧＭＰを、ＧＭＰタンパク質１グラム当たり２．０ミリグラムを超えるフェニルアラニン混入物を含まないように精製する工程を含み得る。限定されるものではないが、陽イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過およびダイアフィルトレーションの使用を含む、当技術分野で公知のいくつかの技術を用いてＧＮＰを精製することができる。精製されたＧＮＰは、限定されるものではないが、凍結乾燥または噴霧乾燥を含む、いくつかの既知の乾燥技術のいずれか１つを用いてさらに乾燥させてもよい。
【００６６】
さらに別の態様では、本発明は、代謝障害を治療する方法を包含する。この方法は、代謝障害を有する患者を選択する工程、およびその患者にグリコマクロペプチド（ＧＭＰ）と付加的な最適添加物量のアミノ酸アルギニンおよびロイシンを含んでなる医療食品を投与する工程を含む。好ましくは、医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸アルギニンの重量比は、アルギニン約６０〜９０ミリグラム／総タンパク質グラム、より好ましくは、アルギニン約７５ミリグラム／総タンパク質グラムである。好ましくは、食品中の総タンパク質に対するアミノ酸ロイシンの重量比は、ロイシン約１００〜２００ミリグラム／総タンパク質グラム、より好ましくは、ロイシン約１００ミリグラム／総タンパク質グラムである。
【００６７】
代謝障害は好ましくは、Ｐｈｅ代謝障害、Ｈｉｓ代謝障害、Ｔｒｐ代謝障害、Ｔｙｒ代謝障害またはＰｈｅ代謝障害の１つである。いくつかの実施態様では、投与される医療食品中の付加的な添加アミノ酸の総重量は、ＧＭＰタンパク質と添加アミノ酸を合わせた総重量の約２２％〜３８％である。
【００６８】
本方法の特定の実施態様では、医療食品はチロシンの添加はされず、選択された患者はチロシン代謝障害を有する。このような実施態様では、医療食品は好ましくは、総タンパク質１グラム当たり２．０ミリグラム未満のフェニルアラニンおよびチロシンを含有する。いくつかのこのような実施態様では、投与される医療食品中の付加的な添加アミノ酸の総重量は、ＧＭＰタンパク質と添加アミノ酸を合わせた総重量の約１６％〜２９％である。
【００６９】
本方法の特定の実施態様では、本法で用いる医療食品は、付加的な最適添加物量のアミノ酸チロシンをさらに含有する。好ましくは、医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸チロシンの重量比は、チロシン約６２〜９３ミリグラム／総タンパク質グラム、より好ましくは、チロシン約８５ミリグラム／総タンパク質グラムである。最適量のアルギニン、ロイシンおよびチロシンが含まれる場合、選択される患者はフェニルアラニン代謝障害、ヒスチジン代謝障害、またはトリプトファン代謝障害を有し得る。患者がヒスチジン代謝障害を有する場合、投与される医療食品は、添加物量のヒスチジンを含まない。患者がトリプトファン代謝障害を有する場合、投与される医療食品は、添加物量のトリプトファンを含まない。
【００７０】
上述の制限を条件として、本法で用いる医療食品に所望により他のアミノ酸が含まれてもよい。本方法の特定の実施態様では、医療食品内の総タンパク質に対するアミノ酸ヒスチジンの重量比は、ヒスチジン約２０〜２４ミリグラム／総タンパク質グラム、好ましくは、ヒスチジン約２３ミリグラム／総タンパク質グラムである。
【００７１】
本方法の特定の実施態様では、食品内の総タンパク質に対するアミノ酸トリプトファンの重量比は、トリプトファン約１２〜１４ミリグラム／総タンパク質グラム、好ましくは、トリプトファン約１２ミリグラム／総タンパク質グラムである。
【００７２】
特定の好ましい実施態様では、選択される患者は代謝障害ＰＫＵを有する。本発明の医療食品は従来のアミノ酸処方物よりも味が良く、血漿中および脳内の有害なＰｈｅレベルを低下させる助けをし、このような患者におけるタンパク質の保持を改善する助けをする。いくつかの実施態様では、本食品は少なくとも２歳のヒトに投与される。
【００７３】
特定の好ましい実施態様では、選択される患者は代謝障害ＰＫＵを有するが、本方法は他の代謝障害を有する患者への医療食品の投与を包含する。本発明の食品を投与することによって効果的に治療することができる他の代謝障害としては、チロシン代謝障害（Ｉ型チロシン血症、ＩＩ型チロシン血症、ＩＩＩ型チロシン血症／ホーキンシン尿症およびアルカプトン尿症／組織黒変症）；トリプトファン(Tyrptophan)代謝障害（高トリプトファン血症）；およびヒスチジン代謝障害（カルノシン血症、ヒスチジン血症およびウロカニン酸尿症）が挙げられる。
【００７４】
以下の実施例は単に例示のために示すものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。実際に、以上の記載および以下の実施例から、本明細書に示され、記載されているものの他、本発明の様々な改変が当業者には明らかとなり、これらも添付の特許請求の範囲内に含まれる。
【実施例】
【００７５】
ＩＩＩ．実施例
実施例１：ネズミＰＫＵモデルにおける添加グリコマクロペプチド食
本実施例で、本出願者らは、標準的なマウスＰＫＵモデルで、アミノ酸食に比べ、添加グリコマクロペプチド食が成長を助け、血漿中および脳内の双方のフェニルアラニン(phenyalanine)濃度を低下させることを実証する。ネズミＰＡＨ欠乏症モデルＰａｈｅｎｕ２マウス（ＰＫＵマウス）は、ＰＫＵを有するヒトと同様の高フェニルアラニン血症および認知欠陥を示すので、ＰＫＵの栄養管理の研究に好適なモデルである。さらに、食餌性タンパク質の大部分がアミノ酸によって供給されるヒト低Ｐｈｅ食と並行して、ＰＫＵマウスでの研究には、多くの場合Ｐｈｅフリーのアミノ酸に基づく食餌を用い、飲み水中にＰｈｅを供給した。本発明者らの目的は、唯一のタンパク源としてＧＭＰを含有する食餌の摂取がどのように成長を助け、野生型（ＷＴ）マウスおよびＰＫＵマウスの血漿中および脳内のアミノ酸、特にＰｈｅ濃度に影響を及ぼすかを評価することであった。結果は、アミノ酸食に比べ、ＧＭＰを摂取したＰＫＵマウスの好適な成長ならびに血漿中および脳内のＰｈｅ濃度の有意な低下を示した。
【００７６】
材料および方法
マウス
報告した動物施設およびプロトコールはウィスコンシン大学マディソン校所内動物実験委員会によって認可されたものである。体重１８〜２２ｇの雄および雌、４〜６週齢のＷＴマウスは、ＰＫＵマウスと同じバックグラウンドで交配されたものである（Ｃ５７Ｂｌ／６、Jackson Laboratories）。ＰＫＵマウスはＰａｈ突然変異に関して同型接合性であるが、交配の容易さを高めるために交配およびＣ５７Ｂｌ／６バックグラウンドとの戻し交配が行われたものであった。ＰＫＵマウスの交配ペアはCary O. Hard ing, Oregon Health and Science University, Portland, ORにより提供された。Ｐａｈｅｎｕ２突然変異の存在に関する遺伝子型分析は、エキソン７の増幅領域に対する尾の生検ＤＮＡのＰＣＲ分析によって行った。マウスは、２２℃、明暗周期１２時間：１２時間の室内の、ステンレス鋼、金網底のケージで個別に飼育し、水は自由に与えた。マウスの体重を毎日１０００で測定し、食物摂取量を毎日求めた。各試験の終了時には、麻酔器(IsoFlo, Abbott Laboratories)を介してイソフルランを用いてマウスを麻酔し、屠殺１時間前に食物を除去して０８００〜１０００の間で心臓穿刺／放血によって屠殺した。
【００７７】
食餌
精製食餌は、同等量のビタミン、ミネラル、エネルギーおよび多量要素を提供するように設計した（表１参照）。これらの食餌のタンパク源はカゼイン、遊離アミノ酸、ＧＭＰ(BioPURE GMP, Davisco Foods)、および残留Ｐｈｅ含量を低くするように処理されたＧＭＰ（Etzel M.R., J Nutr. 2004;134:S996-1002参照）によって提供された。ＧＭＰ食には、無傷なタンパク質に比べて吸収および分解の速いアミノ酸を補償するための以下の限定ＩＡＡ：アルギニン、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、トリプトファンおよびチロシンに関しては、ＮＲＣにより提案された必要量（NRC, Nutrient Requirements of the Mouse, in Nutrient Requirements of Laboratory Animals, 4th ed. Washington D.C.: National Academy Press;1995参照）の１．５倍を添加した。アミノ酸食およびＧＭＰ低Ｐｈｅ食の窒素含量はそれぞれ窒素２４．１ｇおよび２２．９ｇ／食餌ｋｇと同等であり、両食餌ともアミノ酸１７５ｇ／食餌ｋｇを供給した。食餌の完全アミノ酸分析はExperiment Station Chemical Laboratories, University of Missouri-Columbia (Columbia, MO)で行った（表２参照）。
【００７８】
【表１】
2012530067.tif 000003
【００７９】
【表２】
2012530067.tif 000004
【００８０】
試験計画
３種類の試験を行った。試験１では、４２日間餌を与えた４週齢の雄ＷＴマウスにおいて食物摂取および成長を助けるためのＩＡＡを添加したＧＭＰの適正量を試験した。３つの食餌療法群（ｎ＝１０／群）を含めた：カゼイン対照、総ての限定ＩＡＡを添加したＧＭＰ（適正ＧＭＰ）、および、Ｐｈｅが限定因子であることを確認するために、残留Ｐｈｅ低下処理を施し、Ｐｈｅを除く総ての限定ＩＡＡを添加したＧＭＰ（Ｐｈｅを欠くＧＭＰ）。Ｐｈｅを欠くＧＭＰを与えて３日後に食物摂取が上手く行かなかった場合には、４日目に飲み水にＰｈｅを加えた（Ｐｈｅ１ｇ／Ｌ）を加えた。
【００８１】
試験２では、雄および雌ＰＫＵマウス（５〜８週齢）において、２１日間Ｐｈｅを飲み水に供給した場合（Ｐｈｅ１ｇ／Ｌ）に成長を助けるアミノ酸およびＧＭＰ含有食の能力を試験した。３つの食餌療法群を含めた（ｎ＝１０／群）：Ｐｈｅを欠くＧＭＰ食を与えたＰＫＵマウス、Ｐｈｅを欠くアミノ酸食を与えたＰＫＵマウス、および適正ＧＭＰ食を与えたＷＴマウス。本発明者らは、毎日、ＰＫＵマウスの飲み水の摂取を測定し、Ｐｈｅの摂取量を決定するために蒸発に関して調整した。
【００８２】
試験３では、４７日間餌を与えた雄および雌ＰＫＵマウスにおいて最少量のＰｈｅ（試験２から決定した）を添加したアミノ酸およびＧＭＰ含有食の、成長を助け、血漿中および脳内のアミノ酸濃度に影響を与える能力を評価した。４つの食餌療法群を含めた：カゼイン（ｎ＝８）または適正ＧＭＰ食（ｎ＝７）を与えた６週齢のＷＴマウス、および低Ｐｈｅアミノ酸食（ｎ＝１０）または低Ｐｈｅ  ＧＭＰ食（ｎ＝１１）を与えた８〜１０週齢のＰＫＵマウス。各療法群における雄および雌マウスは同数であった。血液サンプルは、２１日間餌を与えた後にヘパリン処理毛細管を用いてアミノ酸分析用に眼窩採血によって得た（ｎ＝５／群）。４７日後にマウスを麻酔し、心臓放血によって屠殺し、断頭した。すぐに脳を摘出し、ドライアイスで冷却したガラス板の上に置いた。ビジュアルランドマークを用い、次の５領域：小脳、脳幹、視床下部、頭頂皮質および前部嗅皮質からサンプルを採取した。これらのサンプルを予め秤量したポリスチレン管に入れ、秤量してサンプル質量を求め、処理を行うまで−８０℃で保存した。
【００８３】
アミノ酸分析
血液を心臓穿刺により、終濃度２．７ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを含むシリンジに採取し、４℃、１７００ｘｇで１５分の遠心分離によって血漿を単離した。血漿中の遊離アミノ酸の特性を、ポストカラムニンヒドリン誘導体化を用いるイオンクロマトグラフィーシステムを備えたＢｅｃｋｍａｎｎ  ６３００アミノ酸分析装置を用いて決定した。これらのサンプルをスルホサリチル酸で除タンパクし、遠心分離し（１４，０００ｘｇ、５分）、０．２μｍシリンジシルターを通した後、内部標準を加えてカラムに注入した。
【００８４】
脳内の遊離アミノ酸の特性は、Amino Acid Analysis Laboratory, University of California-Davis, School of Veterinary Medicine (Davis, CA)にてＢｉｏｃｈｒｏｍ  ３０アミノ酸分析装置(Biochrom)を用いて測定した。脳サンプルからのアミノ酸の抽出手順は、内部標準としての１００μｍｏｌ／Ｌのノルロイシン(Sigma Chemicals)を含有する３％スルホサリチル酸を１：１０（ｗｔ：ｖ）の比率で添加すること、超音波ニードルで２分間ホモジナイズすること、４℃、１４，０００ｘｇで２０分間遠心分離すること、および上清を０．４５μｍシリンジドライブフィルターで濾過することを含んだ。濾液を０．４ｍｏｌ／ＬのＬｉＯＨでｐＨ２．２に調整し、０．０５ｍＬをカラムに注入した。値はｎｍｏｌアミノ酸／組織湿重として表す。
【００８５】
統計学
統計分析は、ＳＡＳバージョン８．２(SAS Institute)およびＲ(Universitat Wien, Vienna, Austria)を用いて行った。一般線形モデルを用いてデータを分析した。食餌療法群間の差は保護された最小有意差法によって決定した。いくつかのデータで見られたように、残差プロットが群間で不均等分散を示した場合には、対数変換したデータについて統計分析を行った。適当であれば、性差を共変量として含め、そのあり得る影響を調整した。療法群間の体重（ＢＷ）の変化は、試験１の反復測定分析を用いて評価した。ＰＫＵマウス間では、単純直線回帰を用いて、死亡４８時間前の食餌性アミノ酸摂取と血漿中および脳内のアミノ酸濃度の間の相関を調べた。値は総て平均±ＳＥとして表す。Ｐ≦０．０５を有意とみなした。
【００８６】
結果
試験１
３つの食餌療法群間で最初のＢＷと最終ＢＷに差はなかった（図１参照）。試験４２日間でカゼイン群と適正ＧＭＰ群を比較すると、食物摂取およびＢＷに差はなかった。マウスは３日後にＰｈｅを欠くＧＭＰ食を食べるのを止め、この際にＰｈｅを飲み水に加え、食物摂取が再開した。３つの食餌群には、１４日目〜４２日目に毎日のＢＷ変化における差はなかった。
【００８７】
血漿中のアミノ酸特性は、カゼインに比べＧＭＰ摂取では有意に影響を受けた。適正ＧＭＰまたはＰｈｅを欠く食餌を与えたＷＴマウスは、ＩＡＡ、トレオニン、イソロイシンおよびメチオニンの高い血漿濃度を示し、カゼイン食を与えたマウスにおける濃度のそれぞれ３倍、２．４倍および１．６倍であった（データは示されていない）。Ｐｈｅを欠くＧＭＰ食を与えたマウスは、適正ＧＭＰ群およびカゼイン群に比べて有意に低いＰｈｅおよびチロシン血漿濃度を示した。
【００８８】
試験２
最初のＢＷ（１６〜１８±１．４ｇ）および最終ＢＷ（１９〜２１±１．３ｇ）ならびに食物摂取（３．３〜４．１±０．３ｇ／日）に、２１日間、３つの療法群間で有意な有意な差はなかった。ＰＫＵマウスにおける平均Ｐｈｅ摂取量は、Ｐｈｅを欠くアミノ酸食の摂取でＰｈｅ６．５±０．５ｍｇ／日、およびＰｈｅを欠くＧＭＰ食の摂取でＰｈｅ５．９±０．３ｍｇ／日であった（Ｐ＞０．１０）。飲み水中にＰｈｅを供給する場合には成長が制限されることがあるという試験１および２からの本発明者らの所見を考慮して、本発明者らは、試験３では低Ｐｈｅアミノ酸食およびＧＭＰ食に、Ｐｈｅ２．５ｇ／食餌ｋｇを含むように添加を行うことにした。これにより、成長中のＰＫＵマウスの毎日のＰｈｅ摂取は７．５〜１０ｍｇ  Ｐｈｅとなった。
【００８９】
試験３
ＢＷ増、摂食量とＢＷ増の比率に基づく食物利用、およびタンパク質効率比には、４つの食餌療法群間で差はなかった（表３参照）。ＰＫＵマウスはＷＴマウスよりも約２ｇ重く（Ｐ＜０．０５）、これは前者が２週齢早いことと一致していた。試験の終了時において、両遺伝子型とも雌マウスは雄マウスよりも体重が軽かった（２０±１ｇと２５±１ｇ；ｎ＝１７〜１８；Ｐ＜０．０００１）。
【００９０】
【表３】
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【００９１】
相対的臓器質量は、食餌および性差による有意な差を示した。腎臓質量は、アミノ酸食を与えたＰＫＵマウスでは、他の群に比べ有意に重かった。心臓質量は、適正ＧＭＰ食を与えたＷＴマウスでは、他の群に比べて有意に重かった。アミノ酸食またはＧＭＰ食を与えたＰＫＵマウスは、ＷＴマウスに比べ、相対的肝臓質量が有意に重かった。両遺伝子型とも、雌マウスは、雄マウスに比べ、有意に軽い相対的腎臓質量と有意に思い相対的心臓質量を示した。
【００９２】
血漿中のアミノ酸特性は食餌および性差によって影響を受けた（表４参照）。
【００９３】
【表４】
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【００９４】
アミノ酸食または低ＰｈｅＧＭＰ食のいずれかを与えたＰＫＵマウスは、カゼイン食またはＧＭＰ食のいずれかを与えたＷＴマウスに比べて、１５倍高いＰｈｅ血漿濃度と、チロシンおよびプロリン血漿濃度における６０〜７０％の低下を示した。ＧＭＰ食を与えたＷＴマウスおよびＰＫＵマウスは双方とも、カゼイン食またはアミノ酸食を与えたＷＴマウスおよびＰＫＵマウスにおける値の約２倍のトレオニンおよびイソロイシン血漿濃度を示した（Ｐ＜０．００２）。ＧＭＰ食を与えたＷＴマウスおよびＰＫＵマウス（２７２±１１μｍｏｌ／Ｌ）では、カゼイン食またはアミノ酸食を与えたＷＴマウスおよびＰＫＵマウスに比べて低いリシンの血漿濃度が示された（４４３±３１μｍｏｌ／Ｌ；Ｐ＜０．０００１；ｎ＝１７〜１８）。両遺伝子型の雌マウスは、雄マウスに比べて高いチロシン（７４±６対５３±８μｍｏｌ／Ｌ）およびトリプトファン（１１３±５対８１±５μｍｏｌ／Ｌ）血漿濃度を示した（Ｐ＜０．０１；ｎ＝１７〜１８）。
【００９５】
アミノ酸食に比べてＧＭＰを与えたＰＫＵマウスは、血漿中のアミノ酸濃度に有意な差を示した。ＰＫＵマウスは、４７日間、アミノ酸に比べてＧＭＰを摂取した場合に、血漿中のＰｈｅ濃度に有意な１１％の低下を示し、この効果は２１日目には見られなかった。マウスを屠殺する前４８時間のＰｈｅ摂取は、ＰＫＵマウスの場合と同等であったが（Ｐｈｅ１６〜１８ｍｇ／４８時間）、ＷＴマウスに比べて有意に低かった（Ｐｈｅ５８〜６６ｍｇ／４８時間）。分枝型アミノ酸であるイソロイシン、ロイシンおよびバリンの血漿濃度の合計は、アミノ酸食に比べてＧＭＰ食を与えたＰＫＵマウスでは５０％増加したが、ロイシンの濃度は異ならなかった。ＰＫＵマウス間で、マウス屠殺前４８時間の食餌性アミノ酸摂取と血漿中のアミノ酸濃度は相関していた。最も高い正の相関（Ｐ＜０．０００１；ｎ＝１５）には、グリシン、Ｒ２＝０．８８；トレオニン、Ｒ２＝０．４５；イソロイシン、Ｒ２＝０．４４；およびバリン、Ｒ２＝０．３４が含まれる。
【００９６】
小脳内のアミノ酸特性は食餌によっては有意に異なったが、性差によっては異ならなかった（表５参照）。ＰＫＵマウスの小脳内のＰｈｅ濃度は、ＷＴマウスの値の３〜４倍であった（Ｐ＜０．０００１）。ＰＫＵマウスの小脳におけるチロシン濃度および分枝鎖アミノ酸の合計は、食餌に関係なく、ＷＴマウスの約５０％であった（Ｐ＜０．０００１）。ＧＭＰ食を与えたＰＫＵマウスは、アミノ酸食を与えたＰＫＵマウスに比べて小脳内のＰｈｅ濃度に２０％の低下を示した。
【００９７】
さらに、このＰｈｅ濃度の２０％の低下という応答は、採取した脳の５切片、すなわち、小脳、脳幹、視床下部、頭頂皮質および前部嗅皮質のそれぞれで示された（図２）。小脳内のトレオニンおよびイソロイシン濃度は、ＧＭＰ食を与えたＰＫＵマウスでは、アミノ酸食の場合よりも７０〜１００％増加した（Ｐ＜０．０００１）。ＧＭＰ食を与えたＰＫＵマウスの小脳では、アミノ酸食の場合よりもバリン濃度が高いという類似の傾向が示された（Ｐ＜０．１０）。ＰＫＵマウスの小脳内のＰｈｅ濃度は、血漿中のトレオニン、イソロイシンおよびバリン濃度、ならびに血漿中のトレオニン、イソロイシンおおよびバリン濃度の合計と逆相関していたＲ２＝０．６５〜０．７７（Ｐ＜０．０００１）（図３）。小脳内のグルタミン濃度は、食餌とは無関係に、ＷＴマウスに比べてＰＫＵマウスで１１％低かった（Ｐ＜０．０５）。神経伝達物質セロトニンの前駆体であるトリプトファンおよび脳のグリシン作動性神経伝達物質系の前駆体であるグリシンの小脳内の濃度は群間で異ならなかった。
【００９８】
【表５】
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【００９９】
考察
本試験では、ＩＡＡを添加したＧＭＰを唯一のタンパク源として含有する食餌の、ＰＫＵマウスの成長を助け、血漿中および脳内のアミノ酸濃度に影響を与える能力を評価する。ＰＫＵ食における低Ｐｈｅタンパク質の供給源としてのＧＭＰの利用を助ける上で、本発明者らは、アミノ酸食に比べてＧＭＰ食を与えたＰＫＵマウスの血漿中および脳内のＰｈｅ濃度が有意に低いながら同等の成長を観察した。
【０１００】
食餌性タンパク質の唯一の供給源として与える場合、ＧＭＰは、成長中のマウスでは、アルギニン、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、Ｐｈｅ、トリプトファンおよびチロシンを含む数種の限定量のＩＡＡを含む。本発明者らの結果は、これらの限定ＩＡＡを添加したＧＭＰを与えたマウスの十分な成長を示した。試験１では、カゼイン食または適正ＧＭＰ食を与えた離乳ＷＴマウスは、６週間にわたって事実上同じ成長を示した。試験３では、ＧＭＰ食またはアミノ酸食を与えた、同様のＰｈｅ摂取のＰＫＵマウスは、ＢＷ、食物効率およびタンパク質効率比の増加を示したが、これらは有意な差ではなかった。これらのデータは、限定ＩＡＡを添加したＧＭＰが、成長中のマウスに関して食餌性タンパク質の、栄養的に十分な供給源を提供することを示した。
【０１０１】
ＩＡＡを欠く食餌の摂取は、ラットにおいて食物摂取を低下させるとともに、血漿中および脳内の限定ＩＡＡ濃度を急速に低下させる(Harper, et al., Physiol Rev. 1970;50:428-39)。従って、試験１において、マウスがこの食餌のわずか３日後にＰｈｅを欠くＧＭＰ食を食べるのを止め、体重が低下したこと、および飲み水にＰｈｅを添加すると食物摂取が元に戻り、ＢＷが増加したことは驚くことではない。適正ＧＭＰ食を与えたＷＴマウスにおけるイソロイシンおよびトレオニンの血漿濃度は、カゼイン食を与えたＷＴマウスの２〜３倍であった。しかしながら、これらの血漿アミノ酸濃度の変化は、ひと度、Ｐｈｅの欠乏が補正されてしまえば、ＧＭＰを与えたマウスにおける食物摂取を損なうことはなかった。従って、本発明者らは、総ての限定ＩＡＡを添加したＧＭＰの摂取が、成長中のマウスにおける食物摂取を減退させずに血漿アミノ酸特性を変化させると結論付ける。
【０１０２】
他のＩＡＡとは対照的に、トレオニンの肝臓取り込みは低く、肝臓トレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．２．１．１６）によるトレオニンのＣＯ２への酸化は、ヒト(Darling et al., Am J Physiol Endocrinol Metab. 2000;278:E877-84)およびラット(Harper, et al., Physiol Rev. 1970;50:428-39)の双方に限定される。従って、総タンパク質の摂取を増加させずに食餌性トレオニンを増加させれば、食餌が通常レベルの１５倍未満のトレオニンを供給するのであれば、毒性なく、血漿トレオニンプールが拡大される。血漿中のトレオニン濃度は、３つの試験の総てでカゼイン食およびアミノ酸食に比べてＧＭＰ摂取の場合に最大の増加を示した。
【０１０３】
トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１０３）によるトレオニンのグリシンへの分解は、ラットにおいては主要な異化経路であるが、ヒトではそうではない(Darling, et al., Am J Physiol Endocrinol Metab. 2000;278:E877-84)。高いグリシンレベルは、神経インパルスの伝達を阻害または刺激することができグリシン作動性神経伝達物質系のために、脳において神経毒性を示す可能性がある(Spencer et al., J Neurosci. 1989;9:2718-36)。しかしながら、血漿および脳の双方においてグリシン濃度の増加はないという本発明者らの実証は、通常のトレオニン摂取の３倍を与えるＧＭＰ食の供給が脳内のグリシン濃度の改変に十分でないことを示唆する。これらの所見を考え合わせると、食餌性ＧＭＰの安全性の裏付けとなる。
【０１０４】
さらに、４７日間アミノ酸食に比べてＧＭＰを与えたＰＫＵマウスの血漿中のＰｈｅ濃度の１１％の低下は、ＰＫＵの栄養管理についてのプラスの所見である。ＰＫＵの管理およびＰｈｅの既知の神経毒性作用に最も関連のある所見は、アミノ酸食に比べてＧＭＰを与えたＰＫＵマウスは脳の５切片においてＰｈｅ濃度の２０％の低下を示したという本発明者らの所見である。脳内のＰｈｅ濃度は、ＰＫＵを有する個体の精神障害と最も高い相関がある(Donlon et al., Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, in Scriver et al., editors, 8th ed. 77th chapter, Hyperphenylalaninemia: Phenylalanine Hydroxylase Deficiency, New York: McGraw-Hill; 2007)。ＧＭＰを与えたＰＫＵマウスの脳内のＰｈｅ濃度が低いことの最も可能性の高い説明は、ＧＭＰの摂取によるＬＮＡＡの高い血漿レベルは、消化管に比べて脳におけるＫｍが有意に低いＬＮＡＡ担体タンパク質を介した血液脳関門のＰｈｅ輸送を競合的に阻害するということである。この結論は、より高いトレオニン、イソロイシンおよびバリン血漿濃度とより低いＰｈｅ脳濃度との間の有意な逆相関によって裏付けられる。興味深いことに、従前の研究では、イソロイシンはラット脳のＰｈｅ輸送を競合的に阻害するがトレオニンはそうではないことが示されている(Tovar et al., J Neurochem. 1988;51:1285-93)。
【０１０５】
まとめると、本発明者らは、アミノ食に比べてＩＡＡを添加した２０％ＧＭＰを含む食餌を与えたＰＫＵマウスは、同等の成長と低い血漿中および脳内Ｐｈｅ濃度を示すことを実証する。これらのデータにより、ＧＭＰは成長中のマウスにとって栄養的に十分な完全タンパク質へと処方することができることが確認され、長期摂食試験がＧＭＰ代謝へのさらなる洞察を与え得ることが示唆される。本発明者らの所見は、ヒトのＰＫＵの栄養管理におけるＧＭＰを用いて製造された食品および飲料の有効性を確認するための継続的研究を裏付けるものである。
【０１０６】
実施例２：ＧＭＰおよび添加ＡＡを用いて製造された食品の食味
本実施例において、本出願者らは、ＧＭＰを含む種々の味の良い低ｐｈｅ食品および飲料を製造し、ＰＫＵを有する人における摂取者官能検査を行うことによってその許容性を評価した。結果は、ＧＭＰを用いて製造された製品の許容性を示す。
【０１０７】
材料および方法
食品および飲料
ＧＭＰを含有するストロベリープディング、ストロベリーフルーツレザー、チョコレート飲料、スナッククラッカーおよびオレンジスポーツ飲料は、Food Applications Laboratory at the Wisconsin Center for Dairy Research (CDR), University of Wisconsin-Madison (UW)において本試験のために開発された。ＢｉｏＰＵＲＥ−ＧＭＰ(Davisco Foods International, Inc., LeSueur, MN)をＧＭＰ製品へと処方した。ＢｉｏＰＵＲＥ−ＧＭＰのアミノ酸特性をカゼインと比較して図４に示す。
【０１０８】
ＧＭＰ製品と現行でＰＫＵ食に用いられている製品の間の比較を得る他ために食味試験に、市販のアミノ酸に基づくチョコレート飲料および低タンパク質クラッカーを含めた。ＧＭＰおよびアミノ酸飲料の窒素濃度は同等であった。総ての供試食品のエネルギーおよびタンパク質含量を表６に示す。
【０１０９】
【表６】
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【０１１０】
食品および飲料の許容性を評価するための官能検査
官能検査のプロトコールは、the Social and Behavioral Sciences Institutional Review Board, UWによって認可されたものである。２００４年および２００５年のＰＫＵサマーキャンプに、また、２００５年のＰＫＵ家族会議に参加したＰＫＵ被験者（ｎ＝４９；年齢１２〜４２歳）で３つの官能検査を行った。これらの検査はSensory Analysis Laboratory, Department of Food Science, UWまたはWaisman Centerで行った。
【０１１１】
２０〜３０ｇの試験サンプルに３桁のブラインドコードを付けてバランスの取れた無作為な順序で被験者に与えた。食品および飲料は、５点の快適尺度（１＝極めて好ましくない、２＝好ましくない、３＝どちらでもない、４＝好ましい、５＝極めて好ましい）を用い、外観、臭い、味、食感および全体の許容性を含む５つの官能カテゴリーを評価した。
【０１１２】
統計分析
対応のあるｔ検定を行い、ＧＭＰチョコレート飲料およびアミノ酸チョコレート飲料の平均許容性スコアを分析した。群平均は、統計分析ソフトウエアパッケージ(SAS Institutes Inc., Version 9.1.3, Cary, NC, USA)を用いた両側ｔ検定で決定したところ、ｐ６  ０．０５で有意な差があるとみなされた。ＧＭＰスナッククラッカーおよび低タンパク質クラッカーの許容性スコアは、一般線形モデル法（ＰＲＯＣ  ＧＬＭ）、次いで平均分離のためのフィッシャーの最小二乗平均を用いて比較した。データは平均と標準偏差で示す。
【０１１３】
結果
ＰＫＵ被験者は、２００４年と２００５年のＰＫＵイベント中に計７品目を試食した（表６）。これらの食品および飲料で、ＧＭＰストロベリープディングが最も許容性が高く（総スコア４．２±０．９）、他の食品の全体的な許容性はＧＭＰスナッククラッカー（３．６±１．４）、ＧＭＰストロベリーフルーツレザー（３．４±１．０）、ＧＭＰチョコレート飲料（３．３±１．０）、ＧＭＰオレンジスポーツ飲料（３．３±１．１）および低タンパク質クラッカー（２．９±１．３）の順であった。アミノ酸チョコレート飲料は、最も許容性が低かった（２．５±１．４）。スコア３未満は、食品または飲料が特定のカテゴリーに関して許容されないことを示し、スコア３は、中立的な許容性を示す。
【０１１４】
ＰＫＵ被験者は、ＧＭＰチョコレート飲料の外観、臭い、味および全体的な許容性を、アミノ酸に基づく飲料に比べて有意に許容性が高いと評価した（ｐ≦０．０５、表６Ｂ）。ＧＭＰスナッククラッカーの外観、臭いおよび味は、低タンパク質クラッカーに比べて有意に許容性が高いと評価されたが（ｐ≦０．０５）、全体的な許容性には、この２種類のクラッカー間で有意な差がなかった（表６Ｃ）。
【０１１５】
考察
これらのデータは、ＧＭＰの機能特性が飲料およびプディングなどの半固形食品に用いるのに特に十分好適であることを証明する。例えば、ＧＭＰは、等電点が３．８未満の酸に可溶であり、ゲルまたはフォームを形成し、良好な熱安定性を有する。ＧＭＰは、チョコレートフレーバーはＧＭＰの乳製品臭をマスキングする助けをしたという付加的特徴をもって、飲料に用いられるチョコレートフレーバーを実際に増強した。これらのデータは、ＰＫＵ食における主要タンパク源として現在必要とされているアミノ酸処方物よりも味の良い飲料を製造するためにＧＭＰが使用可能であることを示唆する。
【０１１６】
実施例３：１０週間ＧＮＰ食後のＰＫＵ成人の事例研究
この実施例は、１０週間、ＧＭＰに基づく食品を唯一のタンパク源として用いたＰＫＵを有する２９歳の男性の事例報告である。この被験者は、ＧＭＰに基づく食品が標準アミノ酸処方物よりも良い味であると報告し、彼の血漿Ｐｈｅレベルは、ＧＭＰに基づく食事を摂取した１０週間は総じて低かった。
【０１１７】
食事性ＧＭＰの安全性および許容性の評価を目的とするＰＫＵ被験者における外来患者試験を行うための認可は、ウィスコンシン大学マディソン校のヘルスサイエンス治験審査委員会によって与えられた。遺伝子型Ｒ２６１ＱおよびＲ４０８Ｗを有する２９歳男性ＰＫＵ被験者を試験した。この被験者は、生まれた時から１２歳まで低Ｐｈｅ食を厳守してきたが、青年期に食事療法を止めたところ、痙性四肢不全麻痺および発作性疾患を発症し、これを抗痙攣薬療法で治療した。この被験者は、ＧＭＰと、食事性タンパク質の主要供給源としての自分の通常の処方アミノ酸処方物(Phenylade and Amino Acid Blend; Applied Nutrition, Cedar Knolls, NJ, USA)を比較する１５週間の試験を遂行した。
【０１１８】
このプロトコールは、試験の最初の３週間と最後の２週間は通常のアミノ酸処方物を摂取する食事からなった。試験の中間の１０週間は、アミノ酸処方物を総て被験者によって選択されたＧＭＰ食品に置き換え、これにはＧＭＰオレンジスポーツ飲料（２８ｏｚ／日；タンパク質２８ｇ）、ＧＭＰプディング（１．５カップ／日；タンパク質１５ｇ）およびＧＭＰスナックバー（１バー／日；タンパク質５ｇ）が含まれた。これらのＧＭＰ食品の栄養組成については表７を参照。
【０１１９】
試験６週間の間、Ｐｈｅ含量を厳密に管理して秤量小分けした食品を被験者宅に送った。食事のＰｈｅ含量は、選択された食品のアミノ酸含量に関する分析と、双方の食事において量およびパッキングロットを合致させ、残りの食品のＰｈｅ含量の計算によって求めた(US Department of Agriculture ARS (2005) USDA Nurient Database for Standard Reference, Release 18)。試験の残りの９週間では、被験者は、栄養士とともに計画を立てた献立を用い、自分で食品を購入し、秤量した。Ｐｈｅ摂取は１５週間十分に管理されたが、ここに示す血液および血漿中のＰｈｅ濃度に関する結果は、食品が被験者に供給された６週間に基づくものである。
【０１２０】
【表７】
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【０１２１】
アミノ酸食およびＧＭＰ食によって供給される多量要素特性は一定であり、１０８８０〜１１３００ｋＪ／日（２６００〜２７００ｋｃａｌ／日）、タンパク質から１０〜１１％のエネルギー（タンパク質０．８４ｇ／ｋｇ）、脂肪から２４〜２６％のエネルギー、および炭水化物から６３〜６６％のエネルギーを含んだ。被験者は試験中、８７ｋｇの体重を維持した。一日のＰｈｅ含量は、４週間はＰｈｅ１１００ｍｇであり、２週間はＰｈｅ１１８０ｍｇであり、これは体重１ｋｇ当たりおよそ１３ｍｇのＰｈｅを供給した。アミノ酸処方物およびＧＭＰ食品はそれぞれ体重１ｋｇ当たり０．６ｇのタンパク質を供給した。これらのＧＭＰ食品に、次の限定アミノ酸に関して、完全タンパク質のアミノ酸スコアリングパターンの１３０％、またはチロシンに関しては１５０％を供給するように添加を行った：ヒスチジン２３；ロイシン７２；トリプトファン９；およびチロシン７１（ＧＭＰタンパク質１ｇ当たりのアミノ酸のｍｇで表す）。アミノ酸処方物によって供給されるものと同等の摂取量を確保するために、マルチビタミン／ミネラル添加物、カルシウム／リン添加物および５００ｍｇのＬ−チロシンを１日に２回、ＧＭＰ食とともに摂取した。
【０１２２】
血液サンプルを、異なる値を得るために知られている２つの分析方法のうち１つ(Gregory et al (2007) Genet Med 9:761-765)を用いてＰｈｅ濃度の決定のために、一晩絶食後、朝食前に得た。０９：００〜０９：３０の間に被験者によって濾紙上に採取された血液スポットのＰｈｅ濃度の分析のためにはタンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）を用い(Rashed et al. (1995) Pediatr Res 38: 324-331)、１２：００〜１２：３０の間に診療施設現場で静脈穿刺によって得られた血漿アミノ酸特性の分析にはＢｅｃｋｍａｎ  ６３００アミノ酸分析装置を用いた(Slocum and Cummings (1991), Amino Acid Anaylsis of Physiological Samples, in Hommes, FA, ed., Techniques in Diagnostic Human Biochemical Genetics: A Laboratory Manual. New York: Wiley-Liss, 87?126)。
【０１２３】
アミノ酸食とＧＭＰ食期間の血液および血漿アミノ酸濃度の統計学的な差は、アミノ酸測定値が時間とは独立であったと仮定してｔ検定によって評価し、ｐ＜０．０５を有意とみなした。Ｐｈｅ含量が既知の食事の供給に基づき１００ｍｇのＰｈｅ摂取に対して表した場合、平均空腹時血漿および血液Ｐｈｅ濃度は、アミノ酸食に比べてＧＭＰ食を摂取した場合に有意に１３〜１４％低下した（図５）。血漿中のＰｈｅの絶対濃度は、アミノ酸食に比べてＧＭＰ食を摂取した場合にはおよそ１０％低下した（７３６から６６７ｍｍｏｌ／Ｌへ）（表８参照）。血漿チロシン濃度には、ＧＭＰ食とアミノ酸食で有意な差はなかった。健康診断、ならびに電解質、アルブミン、プレアルブミンおよび肝機能検査を含んだ血液化学検査の結果に基づけば、ＧＭＰ食の摂取に伴う悪影響は示されなかった。
【０１２４】
ＧＭＰのアミノ酸特性およびＰＫＵマウスでの試験（実施例１参照）と一致して、アミノ酸食に比べてＧＭＰ食を摂取した場合にＬＮＡＡの血漿濃度に有意な増加は示されなかった（表８）。トレオニンはＧＭＰ食の場合の２．６倍増加し、イソロイシンは１．７倍増加し、分枝鎖アミノ酸の合計は１６％増加した。興味深いことに、この被験者は、従前に不可欠ＬＮＡＡ混合物の添加治験(PreKUnil; NiLab, Korsoer, Denmark)を受けていたが、発作が悪化したことからこれを停止した。このＬＮＡＡ調製物は、トレオニンと分枝鎖アミノ酸の組合せから不可欠アミノ酸含量のおよそ８０％を含むＧＭＰよりも、チロシンおよびトリプトファン由来のアミノ酸割合が多く、トレオニンおよび分枝鎖アミノ酸由来の割合は少なかった。従って、ＧＭＰは、この被験者にとって安全な食事性ＬＮＡＡ源を提供するものと思われる。アミノ酸処方物に比べてＧＭＰではプロリン摂取が２倍に増えることに関連して、ＧＭＰ食でのプロリンの血漿濃度は４０％増加した。アミノ酸食に比べてＧＭＰ食ではグルタミンおよびシトルリンの血漿濃度に微増があったが、これは肝機能検査における変化とは関連しなかった。
【０１２５】
【表８】
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【０１２６】
全体として、被験者はＧＭＰ食を楽しみ、通常のアミノ酸食の場合よりも食事に注意を払っている感じがすると報告した。被験者はＧＭＰ食品を楽しんだことから、１日のうちにそれらを分配したいという気持ちが高まった。被験者は、アミノ酸処方物の場合は１日に１回であったのに対し、ＧＭＰ食品は１日に約３回摂取した。ＰＫＵ向けのアミノ酸医療食品では１日のうちに間隔をおくと、タンパク質合成のアミノ酸利用が改善されるために血中Ｐｈｅレベルが低下することはよく知られている。従って、ＧＭＰの摂取に伴う血中Ｐｈｅレベルの低下の１つの説明としては、１日を通じて十分量の高品質タンパク質を摂取することによるタンパク質合成の改善である。あるいは、ＧＭＰによるＬＮＡＡの摂取の増加は、血漿Ｐｈｅレベルの低下、特に高いトレオニン摂取（１日当たり体重１ｋｇ当たり約７０ｍｇ）に寄与する可能性がある。
【０１２７】
要するに、ＰＫＵの管理に必要とされる、制限の強い低Ｐｈｅ食のコンプライアンスは、青年期においても成人期においても依然として十分でなく、血中Ｐｈｅレベルが上昇し、神経心理学的な悪化、母性ＰＫＵの悲劇的な結果がもたらされる。Ｐｈｅ含量が元々低い豊富な食品成分である食事性ＧＭＰは、ＰＫＵの栄養管理を改善する革新的なアプローチを提供する。本実施例は、ＰＫＵ食にＧＭＰを用いて製造された低Ｐｈｅ食品および飲料を処方すると、食事の味、多様性および利便性が向上することを示す。より味がよく、用途のより広い低Ｐｈｅ食は、ＰＫＵを有する人にとっての食事のコンプライアンス、代謝管理、および最終的には生活の質の改善をもたらし得る。
【０１２８】
実施例４：ＰＫＵの栄養管理のための主要タンパク源としての、限定アミノ酸を添加したＧＭＰとアミノ酸処方物を比較する被験者１１人の臨床試験
本実施例は、限定アミノ酸を添加したＧＭＰをタンパク源として用いる食事が、ＰＫＵの栄養管理において合成ＡＡ処方物に代わる安全で許容性の高いものであることを示す。完全タンパク源として、ＧＭＰはＡＡに比べてタンパク質の保持およびフェニルアラニンの利用率を改善する。
【０１２９】
ＰＫＵ食におけるＧＭＰの利益の可能性をさらに評価するために、ＰＫＵを有する人において８日間の臨床試験を行った。この目的は、ＰＫＵを有する被験者における許容性、安全性、血漿ＡＡ濃度、およびタンパク質利用率の測定に関して、ＡＡ処方物の代わりにＧＭＰ食品を用いる効果を検討することであった。
【０１３０】
被験者および方法
被験者
２００６年３月から２００８年６月の間に本治験に参加した、ウィスコンシン大学マディソン校ウェイズマンセンターのバイオケミカル・ジェネティクス・プログラムで日常的に監視を受けていたＰＫＵを有する１２人の被験者。１人の被験者（１０歳）は、本プロトコールを遂行できなかったために、試験から除外した。従って、１１人の被験者からのデータ（年齢範囲：１１〜３１歳；男性７人、女性４人）を報告する（表９参照）。ウィスコンシン大学マディソン校ヘルスサイエンス治験審査委員会が本試験を認可した。
【０１３１】
参加基準は、従来型または変異型のＰＫＵの診断、およびＡＡ処方物の処方量の５０％以上摂取することに同意することを含んだ。しかしながら、血漿フェニルアラニン濃度の最適な管理は、参加の必要条件ではなかった。最適な管理には、フェニルアラニン濃度を、新生児から１２歳までは１２０〜３６０μｍｏｌ／Ｌの間、青年は１２０〜６００μｍｏｌ／Ｌの間、成人は９００μｍｏｌ／Ｌ未満に維持することが含まれる。ＰＫＵの診断は、幼児期に食事療法を開始する前に測定されたフェニルアラニン濃度に基づくものであり、従来型ＰＫＵは１２００μｍｏｌ／Ｌ以下のフェニルアラニン濃度を示す（表９参照）。変異型ＰＫＵであると診断された１人の被験者（被験者１）以外、本試験の被験者は総て従来型ＰＫＵと診断された。
【０１３２】
突然変異分析は、Guldberg et al. (Hum Mol Genet 1993;2:1703-7)によって設計されたプライマーを用い、ＰＡＨ遺伝子のＤＮＡ配列決定により各被験者について行った(Laboratory Service Section, Texas Department of State Health Services, Austin, TX)。総ての被験者が、ＰＡＨ突然変異に関して異型接合性の混合型であった（表９）。５人の被験者が、主として従来型の表現型を表すと思われる２コピーの突然変異を示し、６人の被験者が、従来型の突然変異と、変異型および／または非ＰＫＵ高フェニルアラニン血症突然変異を有するＰＫＵ患者に見られる突然変異を示した。
【０１３３】
各被験者の食事処方の正式な評価が２年の試験動員期間内に収まらなかったことから、総ての被験者のフェニルアラニン許容量は、試験開始前に決定した。この試験では、フェニルアラニン許容量は、血液スポットにおいて血中フェニルアラニン濃度を頻繁にモニタリングすることでフェニルアラニン摂取量の連続的な増加によって決定された一定血漿フェニルアラニン濃度（±５％分散）を考慮した食事性フェニルアラニン摂取量として定義した。各被験者の食事性フェニルアラニン許容量は、総ての食品、飲料および処方物を５日間供給し、各リハーサルの前と後に血液スポットのフェニルアラニン濃度を測定する１回以上の「リハーサル(dry runs)」を遂行することによって確認した。試験開始時の血漿フェニルアラニン濃度は１９２μｍｏｌ／Ｌ（被験者１０）〜１０１１μｍｏｌ／Ｌ（被験者２；表９）の範囲であった。これらの血漿フェニルアラニン濃度を維持するための、被験者の食事性フェニルアラニン許容量は５．８ｍｇ／ｋｇ（被験者１０）〜２６．７ｍｇ／ｋｇ（被験者２）であった。
【０１３４】
【表９】
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【０１３５】
試験プロトコール
本代謝試験では、各被験者は自分自身の対照としても用いられ、４日おきに２つの食事療法、すなわち、ＡＡ食（１〜４日）とＧＭＰ食（５〜８）を含んだ。ある２４時間の献立はＡＡ食で、別の２４時間の献立はＧＭＰ食で計画され、各食事療法の全日に同じ献立を繰り返した（表１０）。各食事において、ＡＡ処方物またはＧＭＰ製品は１日３回の食事のそれぞれに等しく分配した。１日のうちに等分のタンパク質を分布させると、タンパク質利用率が改善され、血漿フェニルアラニン濃度を低下させることができる。試験中、総ての食品、飲料、スナック、処方物およびＧＭＰ製品は、ウェイズマンセンターまたはウィスコンシン大学Clinical and Translational Research Core (UW-CTRC)で訓練を受けた食事療法スタッフによってグラム単位で秤量された。試験の全日で摂取量の同一化を図るために、被験者に総ての食品および飲料を摂取するように促した。被験者はこれを遂行できなかった。
【０１３６】
【表１０】
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【０１３７】
試験開始前２日間およびＡＡ食の１日目と２日目は、自宅で摂取するように総ての食品および処方物を各被験者に提供した。ＡＡ食の継続（３日目と４日目）および４日間のＧＭＰ食（５〜８日目）のために、２日目の夕食前に各被験者をＵＷ−ＣＴＲＣに収容した。ＵＷ−ＣＴＲＣ収容中の全日に健康診断を遂行した。総ての被験者に、日常に見合った活動レベルを考慮して日に２〜３回の歩行または運動の遂行を要求した。また、食事およびスナックのタイミングも各被験者の日常と同じにした。
【０１３８】
１日目と２日目に、各被験者は、フェニルアラニンおよびチロシン分析のために濾紙に血液スポットを採取した。ＵＷ−ＣＴＲＣ収容中には、血漿ＡＡ用に毎日採血し、プレアルブミン、アルブミン、総タンパク質、電解質、グルコース、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩、尿酸、総ビリルビンおよび直接ビリルビン、アルカリ性ホスファターゼならびに肝臓酵素（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ）の血清濃度を測定するために化学血液検査を自動で行った。食後血液サンプルは総て、朝食開始３時間後または朝食２．５時間後に毎日採取した（３〜８日目）。
【０１３９】
最初の５人の被験者が本プロトコールを完了した後、データ安全性監視委員会がプロトコールおよび試験進行を評価した。委員会の提案の結果として、残りの６人の被験者では、ＧＭＰ食の最初の２日（５日目と６日目）は血液化学検査用の採血を止め、ＡＡ食の最後の２日（３日目と４日目）およびＧＭＰ食の最後の２日（７日目と８日目）の朝食前の空腹時血液サンプルを追加した。総ての空腹時サンプルについて血漿ＡＡを分析した。空腹時と食後の双方の血液サンプルが得られた６人の被験者の平均年齢は２６±２歳であり、女性４人と男性２人（被験者６〜１１；表９）が含まれた。
【０１４０】
ＧＭＰ食品にはビタミンおよびミネラルを添加していなかったので、ＧＭＰ食中には、総ての被験者にミネラルを添加した完全マルチビタミン(Phlexy-Vits; Nutritia North America, Gaithersburg, MD) またはＴｈｅｒａｇｒａｎ  Ｍ(Walgreen Co, Deerfield, IL)とＴａｒｇｅｔ−Ｍｉｎｓ(Country Life, Hauppauge, NY)の組合せを与えた。ＡＡ食中にも、ビタミンおよびミネラルを含まない処方物を摂取した被験者には、ＧＭＰ食の場合に供給したものと同じ添加物を与えた。必要であれば、年齢別食事摂取基準(Dietary Reference Intake)（ＤＲＩ）(Institute of Medicine, Dietary Reference Intakes for Energy, Carbohydrates, Fiber, Fat, Protein and Amino Acids, Washington DC: National Academy Press, 2002)の奨励を満たすようにカルシウムの追加も行った。
【０１４１】
試験食
ＧＭＰ(Bio-Pure GMP; Davisco, Le Sueur, MN)のＡＡ含量は、ミズーリ大学Experimental Station Chemical Laboratoryで分析した。市販のＧＭＰのフェニルアラニン含量は、フェニルアラニン０．４ｇ／ＧＭＰ１００ｇであり、タンパク質含量は８６．０ｇ／ＧＭＰ１００ｇであった。このＧＭＰを、フェニルアラニン耐性の高い３人の被験者に用いた。フェニルアラニン耐性の低い９人の被験者では、ＧＭＰ原品をさらに精製して、フェニルアラニン含量を平均フェニルアラニン０．２１±０．０１ｇ／ＧＭＰ１００ｇ、平均タンパク質含量７５．０±０．７ｇ／ＧＭＰ１００ｇに引き下げた。ＧＭＰの精製はフェニルアラニン含量だけを低下させ、他のＡＡの割合は、市販のＧＭＰに比べ精製ＧＭＰでは変化していなかった。
【０１４２】
ＧＭＰに４つの限定ＡＡ、すなわち、ヒスチジン２３；ロイシン７２；メチオニン２８；およびトリプトファン９（ＧＭＰタンパク質１グラム当たりのＡＡ終濃度をミリグラムで表す）を添加した。これは、２００２ ＤＲＩ(Institute of Medicine, Dietary Reference Intakes for Energy, Carbohydrates, Fiber, Fat, Protein and Amino Acids, Washington DC: National Academy Press, 2002)に基づいて見積もられた必要量の１３０％相当である。ＰＫＵではチロシンが不可欠ＡＡであることから、チロシンを、終濃度７１ｍｇ／ＧＭＰタンパク質となるように見積もられた必要量の１５０％で添加した。ＧＭＰ食では、ほとんどの場合で、処方物のチロシン含量は見積もられた必要量よりも実質的に多かったことから、各被験者によって摂取された種々の処方物中に見られる添加チロシンの濃度を倍増させる試みは行わなかった。従って、総ての被験者で、ＡＡ食におけるチロシンの摂取量は、ＧＭＰ製品が置き換えられた場合に摂取されるチロシンよりも多かった。
【０１４３】
タンパク源としてＧＭＰを用いて製造された低フェニルアラニン食品は、本試験のためにウィスコンシン大学マディソン校のWisconsin Center for Dairy Researchによって開発された。試験の開始に、各被験者はＧＭＰを用いて製造された種々の食品を試食し、ＧＭＰ食の献立に含める２〜３品目を選択した。ＧＭＰ飲料および食品には、オレンジフレーバースポーツ飲料、チョコレートフレーバーまたはキャラメルフレーバー飲料、チョコレートまたはストロベリープディング、およびシナモンクランチバーが含まれた（実施例３と同様；表７参照）。ＧＭＰ食品中のフェニルアラニン含量の範囲はＧＭＰの純度ならびにこれらの食品および飲料を製造するために用いられる付加的成分によって異なるが、一般に、一食分のＧＭＰ食品はタンパク質５〜１０ｇおよびフェニルアラニン１５〜３０ｍｇを供給した。
【０１４４】
食餌組成
ＡＡ食およびＧＭＰ食は、各被験者のフェニルアラニン許容量の試験前評価に基づいて計算され、エネルギー、タンパク質、フェニルアラニンおよび脂肪に関して管理された（表１１参照）。ＡＡ食（１〜４日目）は被験者の通常のＡＡ処方物を含み、被験者ごとに異なった。ＧＭＰ食（５〜８日目）では、被験者のＡＡ処方物の総一日摂取量をＧＭＰ製品に置き換えた。献立を作るのに用いた食品のフェニルアラニン含量は、選択された食品のＡＡ分析によって、また、残りの食品のフェニルアラニン含量を計算することによって求めた。両食事とも、分析されなかった食品は量、銘柄およびパッキングロットを合致させ、フェニルアラニン含量が分析された食品は、ＧＭＰ製品のフェニルアラニン含量を考慮した様々な量で用いた。
【０１４５】
食品のフェニルアラニン含量を定量するためのデータが限定されているため、食事混成物をフェニルアラニン含量の計算値を確認するためのフェニルアラニン分析用に回収した。従って、ＡＡ食およびＧＭＰ食の双方において２日間、２４時間の間に各被験者によって摂取された総ての食品、処方物およびＧＭＰ食品を２回分採取した。この２回分をそれぞれ粉砕し、凍結乾燥させ、各混成物のアリコートをＡＡ分析のためにミズーリ大学へ送った。各被験者のこの混成物分析を比較すると、ＡＡ食とＧＭＰ食のフェニルアラニン含量は有意に異なっていた（Ｐ＝０．０６１）。
【０１４６】
【表１１】
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【０１４７】
測定
フェニルアラニン許容量を確定するために試験１日前および２日前に各被験者によって採取された血液スポットを、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ；データは示されていない）によってフェニルアラニンおよびチロシンに関して分析した。ＡＡ特性は、３〜８日目に採取した総ての空腹時および食後血漿サンプルについて、ポストカラムニンヒドリン誘導体化を用いるイオンクロマトグラフィーシステムを備えたＢｅｃｋｍａｎ  ６３００アミノ酸分析装置(Beckman-Coulter Inc, Fullerton, CA)を用いて得た。サンプルをスルホサリチル酸で徐タンパクし、遠心分離し（１４，０００ｘｇ；５分）、０．２μｍシリンジフィルターを通した後、内部標準を加え、これをカラムに注入した。
【０１４８】
血清化学特性は、the Clinical Laboratory, the University of Wisconsin-Madison Hospital and Clinicsにおいて、標準的技術を用いることにより分析した。血漿インスリンは食後サンプルにおいて、３日目と４日目および７日目と８日目で被験者内でプールしたサンプルに対して、ヒトインスリンに特異的なラジオイムノアッセイ(Linco Research, St Charles, MO)を用いることにより測定した。インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）は、４日目と８日目の食後血漿サンプルにおいて、ＩＧＦ結合タンパク質を除去した後にＨＰＬＣにより測定した。なお、ＩＧＦ−１の回収率は８５〜９０％であった。
【０１４９】
統計分析
統計分析は総て、Ｍａｃ  ＯＳ  Ｘバージョン１．１２用の統計プログラムＲ(R Project for Statistical Computing, Wirtschaftsuniversitat, Vienna, Austria)を用いて行った。食事混成物を分析した後、各被験者（ｎ＝２）について各食事内のＡＡ値の平均を求めた後、値を両食事間で、対応のあるｔ検定を用いることにより比較した。また、対応のあるｔ検定（被験者に対して対応有り）を行い、ＡＡ食の最終日（４日目）からＧＭＰ食の最終日（８日目）までの食後および空腹時双方のサンプルで血漿ＡＡ値を比較した。血液化学検査および肝機能検査の変化も、同じ方法を用いることにより比較した。さらに、対応のあるｔ検定を行い、空腹時血漿を得ることができた６人の被験者のサブセットにおいて各食事内の空腹時ＡＡ濃度と食後ＡＡ濃度を比較した。どの比較も、Ｐ≦０．０５であれば、統計的に有意であるとみなされた。ＡＡ食の最終日（４日目）の血漿フェニルアラニン濃度とＧＭＰ食の最終日（８日目）の血漿フェニルアラニン濃度を比較する主要エンドポイントに基づけば、達成されたサンプルサイズ（ｎ＝１１）は、血漿フェニルアラニン濃度の変化が１５０μｍｏｌ／Ｌであった場合に、Ｐ＝０．０５で検出力８０％を与えるのに十分なものであった。
【０１５０】
結果
食事の許容性とＡＡ組成
４日間ＧＭＰ食を摂取した後、１１人中１０人の被験者が、ＧＭＰ製品が通常のＡＡ処方物よりも感覚的品質が優れていると主張した。さらに、試験の結論として、７人中６人の成人被験者が、ＧＭＰが食事の選択肢として利用できるようになったとしたら、通常のＡＡ処方物よりもＧＭＰ製品を摂取するという強い好みを示した。
【０１５１】
現在の奨励と比較して、総ての不可欠ＡＡの分析された摂取量（アミノ酸ｍｇ／食事性タンパク質ｇ）はＡＡ食およびＧＭＰ食の双方とも要件を満たす(World Health Organization, Protein and Amino Acid Requirements in Human Nutrition, Geneva Switzerland: United Nations University, 2007)。しかしながら、食事混成物のＡＡ分析では、ＧＭＰ食に比べてＡＡ食を摂取する場合のＡＡ摂取量にいくつかの有意な差が示された（表１２参照）。ＧＭＰは高濃度のＬＮＡＡトレオニンおよびイソロイシンを含むことから、これらのＡＡの双方の平均摂取量は、ＡＡ食よりもＧＭＰ食で有意に高かった。ＧＭＰにチロシンをＤＲＩの１５０％で、ロイシン、ヒスチジン、トリプトファンおよびメチオニンをＤＲＩの１３０％で添加したにもかかわらず、これらのＡＡの摂取量は、メチオニン以外、ＡＡ食よりもＧＭＰで有意に低かった。ＡＡ食に比べてＧＭＰ食を摂取した場合に有意に低かった他のＡＡには、不可欠ＡＡであるリシン、ならびに可欠ＡＡであるアルギニン、アラニン、グリシンおよびタウリンが含まれた。
【０１５２】
【表１２】
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【０１５３】
健康診断および血液化学
被験者が４日間主要タンパク源としてＧＭＰを摂取した場合に、健康診断で検出された、または健康状態に悪影響を示すような被験者が訴えた身体の問題はなかった。ＧＭＰ食（８日目；表１３）に比べてＡＡ食の最終日（４日目）に測定されたタンパク質の状態の指標としてのアルブミン、プレアルブミンもしくは総タンパク質の血清濃度、または腎臓の状態の指標としてのクレアチニンに有意な差はなかった。しかしながら、肝臓の尿素生成の指標としてのＢＵＮは、４日目のＡＡ食よりも７日目および８日目双方のＧＭＰ食の摂取で有意に低かった（図６参照）。ＩＧＦ−Ｉの血漿濃度にはＡＡ食とＧＭＰ食で有意な差はなく、これは両食事とも十分なタンパク質栄養であることを示唆している。血漿インスリン濃度はＡＡ食に比べてＧＭＰ食で高く、わずかに有意であり（Ｐ＝０．０５３）、血清グルコース濃度には有意な差はなかった。血清二酸化炭素含量（主として重炭酸である）は、ＡＡ食に比べてＧＭＰ食で有意に高く、これは全身酸含量の低さと一致している。電解質および肝機能検査を含む他の標準化学の平均濃度は、両食事とも正常範囲内に留まっていた（データは示されていない）。例外は、発作性疾患のために抗痙攣薬の投薬中にあった被験者２で測定された種々の肝機能検査（アラニンアミノトランスフェラーゼおよびγ−グルタミルトランスペプチダーゼ）の高い濃度であった。しかしながら、本試験下で測定されたこの上昇に比べてＧＭＰ食の摂取に伴ってこれらの肝機能検査におけるさらなる上昇は検出されなかった。
【０１５４】
【表１３】
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【０１５５】
血漿ＡＡ濃度
朝食２．５時間後に測定した場合、ＡＡ食に比べてＧＭＰ食で、血漿中の総ＡＡの濃度は有意に高く、ＢＵＮの濃度は有意に低かった（図６参照）。これは、合成ＡＡに比べて無傷なタンパク質源からのＡＡの吸収が遅いこと、およびＧＭＰの摂取の場合のインスリン濃度の高さと一致している。
【０１５６】
フェニルアラニンおよびチロシン
ＧＭＰ食（８日目；図７）に比べてＡＡ食（４日目）の摂取では、血漿中のフェニルアラニンの平均食後濃度に有意な差はなかった（Ｐ＝０．１７３）。Ｔ血漿中のフェニルアラニン濃度における平均変化は、フェニルアラニン５７±５２μｍｏｌ／Ｌであった。個々の被験者間で、ＧＭＰ食の摂取に対する血漿フェニルアラニン濃度の応答は一様でなく、フェニルアラニン１７５μｍｏｌ／Ｌの低下からフェニルアラニン２５７μｍｏｌ／Ｌの増加までの範囲であった。全体として、ＧＭＰ食に比べてＡＡ食を摂取する場合の血漿中のｐｈｅ濃度の変化と性別、遺伝子型および年齢との間に一貫した関連はなかった。
【０１５７】
空腹時血漿と食後血漿の双方におけるフェニルアラニン濃度は、６人の成人被験者のサブセットに関して、４日目（ＡＡ食）および８日目（ＧＭＰ食）に得られた。ＧＭＰ食に対する食後応答は、このサブセット（ｎ＝６）では、最初の５人の被験者の場合よりも有意な差がなかった。４日間ＡＡ食を摂取すると、朝食２．５時間後に得た食後血漿中のフェニルアラニン濃度に比べて、一晩絶食後に得た血漿中のフェニルアラニン濃度には有意な１０％の増加が見られた（Ｐ＝０．０４８；図８参照）。これに対し、４日間ＧＭＰ食を摂取した場合には、空腹状態で得た血漿と食後状態で得た血漿を比べても、血漿中のフェニルアラニン濃度に有意な変化はなかった。
【０１５８】
チロシンは、不可欠であり、アドレナリン、ノルエピネフリン、メラニンおよびチロキシンの前駆体であることから、ＰＫＵ食において重要なＡＡである。食後または空腹時サンプルにおいて得られた血漿中チロシン濃度には、ＧＭＰ食またはＡＡ食の摂取で有意な差はなかった（表１４参照）。一晩絶食後の血漿中チロシン濃度は、ＧＭＰ食およびＡＡ食双方の摂取で、食後濃度に比べて低かったが、ＧＭＰ食は、正常範囲を下回る平均空腹時チロシン濃度をもたらした。
【０１５９】
付加的ＡＡ
ＡＡ食に比べてＧＭＰ食の摂取による、血漿中のＡＡ特性の最も劇的な変化は、無毒なＬＮＡＡであるイソロイシンおよびトレオニンの食後濃度における２．２５〜２．４７倍の増加であり、これにより、これらの値は正常臨床範囲を超えるものとなった（表１４参照）。ＧＭＰ食によるイソロイシンおよびトレオニンの血漿濃度の有意な増加は、ＧＭＰ食を摂取して２４時間以内に生じ、ＧＭＰ中のこれらのＡＡの高い濃度と一致していた（図９参照）。しかしながら、それぞれ５日後および７日後にイソロイシンおよびトレオニンの血漿濃度にはさらなる有意な増加は見られなかった。イソロイシン濃度は、一晩絶食後に得た血漿では差がなかったが、空腹時血漿中のトレオニン濃度は、ＡＡ食に比べてＧＭＰ食を摂取した場合には、依然として約２倍高かった。
【０１６０】
ＧＭＰ食混成物およびＡＡ食混成物のＡＡ特性と一致して、ＡＡ食に比べてＧＭＰ食を摂取した場合には、血漿中のオルニチンおよびトリプトファンの食後濃度が有意に低く、血漿中のイソロイシンおよびトレオニン濃度が有意に高かった。一晩絶食後、ＡＡ食に比べてＧＭＰ食では、アルギニンの血漿濃度が有意に低く、トレオニン濃度が有意に高かった（表１４参照）。
【０１６１】
【表１４】
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【０１６２】
これは、ＰＫＵの栄養管理に現在必要とされている合成ＡＡ処方物をＧＭＰ食品由来の無傷なタンパク質に置き換える有効性を検討するための最初の臨床試験である。ＰＫＵを有する被験者が、この管理された代謝食事試験において４日間主要タンパク源としてＧＭＰを摂取した場合、有害な健康問題は見られず、血液化学は正常内に留まった（表１３）。さらに、ＧＭＰ製品は被験者に好まれ、これにより、ＰＫＵを有する人においてＧＭＰ製品とＡＡ製品を比較する盲検食味試験の結果が確認される（実施例２参照）。従って、ＧＭＰを用いて製造された食品および飲料は双方ともＰＫＵ向けのフェニルアラニン制限食において用いるのに安全かつ許容性が高い。
【０１６３】
４日間にわたって、ＧＭＰ製品を摂取した場合、ＡＡ処方物に比べて血漿フェニルアラニン濃度に有意な差はなかった（図７）。無傷なタンパク源としてのＧＭＰは、合成ＡＡ源に比べてＡＡの吸収を遅延させ、フェニルアラニンおよびタンパク質合成のための他のＡＡを改善する。本試験では、ＡＡ食は、食後フェニルアラニン濃度に比べて有意に高い平均空腹時フェニルアラニン濃度を示したが（図８）、ＧＭＰ食の場合に明らかな空腹時および食後フェニルアラニン濃度の有意差はなかった（表１４）。このことは、ＧＭＰ食が２４時間にわたって、血漿中のフェニルアラニンの低い変動およびおそらくは低い平均濃度を誘導したことを示唆する。これは、ＡＡ処方物などの遊離型のＡＡ源に比べて、ＧＭＰなどの無傷なタンパク質である場合に、タンパク質保持の増大およびより緩慢なＡＡの吸収速度に関連したＡＡの酸化の低減と一致する。
【０１６４】
ＧＭＰ食の場合のタンパク質保持の向上の証拠はまた、ＡＡを含有する朝食に比べてＧＭＰを含有する朝食を食べた２．５時間後に測定した場合の、より低い血清ＢＵＮならびにより高い血漿インスリンおよび総ＡＡ濃度によっても示された（表１３、図６）。尿素は血漿ＡＡ濃度に応答して直線的に生産され、窒素バランスの制御は主として尿素生産によって調節される。尿素合成のためのＡＡの肝臓利用の指標としてのＢＵＮは、緩慢な内臓ＡＡ放出と相まって低いままであると思われる。従って、低いＢＵＮ濃度に関連して、無傷なタンパク源を用いた場合の血漿ＡＡ濃度のより緩慢な、より段階的な、持続的上昇は、主要タンパク質として合成ＡＡをＧＭＰに置き換えた場合に、尿素生産のために分解されるＡＡが少なく、その代わりにタンパク質合成のために保持されることを示唆する。
【０１６５】
イソロイシンおよびトレオニンを含む吸収後のＡＡ(Calbet et al., J Nutr 2002;132:2174-82)は、インスリン放出を刺激し、その後、タンパク質合成を刺激し、タンパク質分解を阻害することが知られている(Schmid, et al., Pancreas 1992;7:698-704)。ＧＭＰはより緩慢で長期のアミノ酸放出を誘導するので、インスリン応答と正味のタンパク質合成の刺激を増強することができる。さらに、乳清タンパク質は、他の乳汁タンパク質画分または他の無傷なタンパク源よりも高い程度でインスリン濃度を上昇させることが示されている(Nilsson et al., Am J Clin Nutr 2004;80:1246-53)。従って、ＧＭＰの、ＡＡ異化作用および尿素生成を遅延させる能力は、インスリン分泌促進薬として作用するトレオニンおよびイソロイシンの食後濃度の上昇ならびにＡＡ吸収の遅延を反映する。
【０１６６】
本試験では、２００２  ＤＲＩ推奨に基づいて、ＧＭＰに次の５つの限定ＡＡ、すなわち、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、トリプトファンおよびチロシンを添加した。ヒスチジン、ロイシンおよびトリプトファンの血漿濃度は正常範囲内に収まったが、このことは、ＧＭＰ食にこれらのＡＡが十分に添加されていることを示唆する（表１４）。これに対し、空腹状態で測定した場合、チロシンの血漿濃度は正常範囲を下回り（表１４）、このことは、ＧＭＰにさらなるチロシン添加が必要とされ得ることを示唆する。実際に、１０００ｍｇ／日を供給する添加からの付加的チロシンは、１０週間、主要タンパク源としてＧＭＰを摂取した１人の被験者に関して正常範囲内に収まるような血漿チロシン濃度を考慮したものである（実施例３参照）。要するに、本発明者らのデータは、ＰＫＵ食において完全な食事性タンパク質源を提供するには、ＧＭＰにアルギニン、ヒスチジン、ロイシン、トリプトファンおよびチロシンを添加しなければならないことを示唆する。
【０１６７】
生涯ＰＫＵ食を厳守することは極めて難しく、多くの場合、十分なコンプライアンスが得られず、高フェニルアラニン血症の神経心理学的帰結をもたらす。この研究は、合成ＡＡの代わりに無傷な低フェニルアラニンタンパク質ＧＭＰを用いて製造された味の良い食品および飲料の使用によって、新たな改良されたパラダイムを示す。限定不可欠ＡＡを添加した場合、ＧＭＰは、ＰＫＵの栄養管理のための主要タンパク源として合成ＡＡに代わる安全かつ許容性のある選択肢であるのが明らかである。無傷なタンパク質として、大部分の窒素をＡＡから供給する食事に比べて、ＧＭＰはＡＡの吸収を遅延させ、タンパク質の保持およびフェニルアラニンの利用を改良する。
【０１６８】
実施例５：ＧＭＰ純度の向上およびＧＭＰに基づく食品のアミノ酸添加に関する質量収支計算の使用
本実施例は、ＧＭＰに基づく食品において用いるＧＭＰの純度を高める方法を示す。さらに、本実施例は、ＧＭＰに基づく食品の不可欠アミノ酸添加の程度を決定するための質量収支計算の使用を示す。
【０１６９】
導入
１歳を超える人に関する不可欠アミノ酸の一日推奨摂取量(daily recommended intake)（ＤＲＩ）は、食品の窒素含量に基づいて設定されたものである（表１５参照）。
【０１７０】
【表１５】
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【０１７１】
アミノ酸のＤＲＩ値は、多くの場合、総窒素（Ｎ）×変換係数６．２５の定義に基づきタンパク質当量（ＰＥ）で表される(Inst. of Medicine 2005)。ほとんどのタンパク質は約１６％の窒素を含有し、変換係数６．２５（タンパク質１００ｇ／Ｎ  １６ｇ＝タンパク質６．２５ｇ／Ｎ  ｇ）が適当である(Nielsen SS 2003, Food Analysis, 3rd ed. New York : Kluwer Academic/Plenum Publishers)。しかしながら、この窒素／タンパク質変換係数は食品によって異なる。例えば、ほとんどの食事性タンパク質に用いられる窒素／タンパク質変換係数は６．３８である（同著）。ＧＭＰはヘテロなペプチドであり、ＧＭＰ分子にはグリコシル化されているものとされていないものがある。このために、ＧＭＰ分子の変換係数はグリコシル化の存在程度に応じて６．７０〜９．５５の範囲であり得る。(Dziuba and Minkiewicz 1996, Int Dairy J 6(11-2):1017-44)。タンパク質を表すには変換係数６．４７、ＧＭＰを表すには７．０７を持ち類似体ＧＭＰの製造業者によって、タンパク質質量の定義におけるあいまいさが示されている(Davisco Foods Intl.)。
【０１７２】
食品の実際のタンパク質含量は、正確な窒素／タンパク質変換係数が知られていない場合には、測定が困難である。タンパク質は非タンパク質性の窒素、または塩基性アミノ酸を含み得るが、これらは他のアミノ酸よりも窒素が高い。食事に推奨レベルの不可欠アミノ酸を供給するＧＭＰの場合、摂取される食品のタンパク質組成を、１ｇのタンパク質を構成するか明確な定義を用いて知らなければならない。本実施例では、１歳を超える人に関する不可欠アミノ酸のＤＲＩの設定に用いられたタンパク質のInst of Medicine (Inst. of Medicine. 2005)の定義に従って、変換係数６．２５を用いた（表１５参照）。
【０１７３】
乳清からＧＭＰを単離するための現行の大規模技術は、イオン交換クロマトグラフィーまたは限外濾過を用いる。ＧＭＰはの等電点（ｐＩ）は３．８より小さいが、他の主要な乳清タンパク質のｐＩ値は４．３より大きい。ＧＭＰと他の乳清タンパク質の間のこの物理化学的違いは、乳清からＧＭＰを分離するための単離プロセスでよく用いられる。イオン交換クロマトグラフィーによって単離された市販のＧＭＰは、一般に、残留する乳清タンパク質由来のＰｈｅ含量が多すぎるので、ＰＫＵ食品として十分な純粋がない（すなわち、Ｐｈｅ  ５ｍｇ／製品ｇ、製造業者の文献、Davisco foods Intl., Eden Prairie, Minn., U.S.A.)。従来のアミノ酸処方物はＰｈｅフリーであり、ＰＫＵを有する人は自分の一日許容量を満たすようにＰｈｅを含有する自然食品を摂取することができる。ＰＫＵ食においてアミノ酸処方物の代わりとしてＧＭＰを実現可能なタンパク質とするためには、ＧＭＰ純度を高め、Ｐｈｅ含量を低減する改良型のプロセスが必要とされる。
【０１７４】
ＰＫＵを有する人のためのＧＭＰ食品の安全性および実現可能性を試験すべくヒト臨床試験を行うために、４日間１５人に供給するのに十分な精製度の高いＧＭＰを調製するためのパイロットスケールプロセスを開発した。食品級の材料および食品に認可されている施設を用い、次の作業単位：（１）陽イオン交換クロマトグラフィー、（２）限外濾過およびダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）、および（３）凍結乾燥をこの順序で用いて、５ｋｇの精製ＧＭＰを製造した。さらに、アミノ酸置換に関して明確に定義された基準を設定するために質量収支計算を開発した。添加を行った精製ＧＭＰを用い、ヒト臨床試験で摂取されるＧＭＰ食品を調製した。
【０１７５】
材料および方法
このセクションは、３つのサブセクションに分けられている：（１）食品級の材料を用いて精製ＧＭＰを製造するために用いた作業単位、（２）ＧＭＰ回収率および精製ＧＭＰに添加するためのアミノ酸の質量を決定するために用いる質量収支計算、および（３）臨床試験および１患者応答において摂取されたＧＭＰ食品の調製および分析。
【０１７６】
ＧＭＰ精製プロセス
未精製ＧＭＰ(BioPure GMP, Davisco Foods Intl.)中の夾雑乳清タンパク質を陽イオン交換樹脂への吸着によって捕捉し、ＧＭＰをフロースルー画分中に回収した。限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）を用い、ＧＭＰを濃縮し、ペプチド、塩および非タンパク質性窒素を洗い流した。凍結乾燥を用い、精製、濃縮ＧＭＰを乾燥させた。
【０１７７】
陽イオン交換クロマトグラフィー
２０ｃｍ径クロマトグラフィーカラム(INdEX, GE Healthcare, Piscataway, N.J., U.S.A.)ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｉｇビーズ(GE Healthcare)を充填した。カラム体積（ＣＶ）は５．３４Ｌであり、ベッド高は１８ｃｍであった。
【０１７８】
フィード液（７５ｇ／Ｌ）は、未精製ＧＭＰ(BioPure GMP, Davisco Foods Intl.)と１０ｍＭ乳酸ナトリウムｐＨ４を混合し、０．４５μｍ孔径フィルター(Sartobran P, Sartorius, Edgewood, N.Y., U.S.A.)で濾過することによって調製した。平衡バッファーおよび溶出バッファーは、それぞれ食品級の５０ｍＭ乳酸ナトリウムｐＨ４、および１０ｍＭ  ＮａＯＨ  ｐＨ１２であった。平衡バッファーおよびＧＭＰフィード液は４℃に保持して、微生物の成長を抑えた。溶出バッファーは２２℃に保持した。流速は９５０ｍＬ／分であった。各陽イオン交換サイクルは４工程からなった：（１）２ＣＶの平衡バッファーを用いてカラムをｐＨ４とし、（２）０．５ＣＶのフィード液をカラムに適用し、（３）カラムを平衡バッファーですすぎ（この場合、まず、０．３ＣＶの流出液を廃棄し（カラム排除容積量）、次に、２ＣＶの精製ＧＭＰを回収しり）、（４）２．５ＣＶの溶出バッファーを用い、結合したタンパク質をカラムから脱着させた。５回の試みはそれぞれ９〜１１回の連続サイクルからなった。各試みから約１００Ｌの希釈ＧＭＰタンパク質溶液を作製した。陽イオン交換カラムを０．２Ｍ  ＮａＯＨを送り込むことで洗浄し、１時間保持した後、カラムを１０ｍＭ  ＮａＯＨ中で保存した。
【０１７９】
限外濾過およびダイアフィルトレーション
陽イオン交換体からのＧＭＰ流出液を、１Ｍ  ＮａＯＨを加えることでｐＨ７に調整し、中空繊維限外濾過膜（３ｋＤａ、３．３ｍ２、ＵＦＰ−３−Ｃ−５５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて６０℃で濃縮した。適用圧力は１．４バールであった。ＧＭＰ溶液を１００Ｌから１０Ｌに濃縮した後、２０Ｌの蒸留水を加え、この溶液を再び１０Ｌに濃縮した。この濃縮液を、０．４５μｍ孔径フィルター(Sartorius)を用いて清浄な容器中へ濾過し、４℃で保存した。使用する度にその前後に、ＵＦ膜を、１００ｐｐのＮａＯＣｌ（漂白剤）を含有する０．２Ｍ  ＮａＯＨを用い、５０℃で３０分間洗浄した。ＵＦ膜は１０ｐｐｍのＮａＯＣｌ中で保存した。
【０１８０】
凍結乾燥
濃縮し、濾過除菌したＧＭＰ溶液を１．２または２Ｌガラス凍結乾燥フラスコ上の薄膜として凍結させ、４８時間乾燥させた(Lyphlock6, Labconco, Kansas City, Mo., U.S.A.)。ＧＭＰ粉末を回収し、秤量し、一部を分析に用いた。
【０１８１】
組成分析
粗タンパク質分析（ＣＰ）および完全なアミノ酸プロファイリング（ＡＡＰ）は、Experiment Station Chemical Laboratories (Univ. of Missouri-Columbia, Columbia, Mo., U.S.A.)によって行った。ＡＡＰにはＡＯＡＣ公定法９８２．３０を用い、ＣＰにはＡＯＡＣ公定法９９０．０３を用いた([AOAC] Assn. of Official Analytical Chemists, Intl. 2005. Official methods of analysis of official analytical chemists. 18th ed. Gaithersburg , Md. : AOAC)。結果は、精製ＧＭＰ乾重１００ｇ当たりのグラムとして報告した。変換係数６．２５×総窒素を用いて、結果をＰＥに基づいて表した。全てのサンプルについて分析を２回行った。
【０１８２】
質量収支計算
質量収支計算は、（１）製造プロセスからのＧＭＰ回収率を決定するために用いる計算、（２）アミノ酸添加に用いるリシン基準、および（３）添加アミノ酸の必要量を決定するために用いる方法を表すために提案するものである。
【０１８３】
ＧＭＰ回収率
回収率は、ＰＥに基づいて計算した。フィード液中のＰＥのグラム（ＭＰＥ，ｆｅｅｄ）は、ＧＭＰ供給濃度（７５ｇ／Ｌ）に粉末１グラム当たりのＰＥグラム（ＣＰ分析から）を掛け、次に、処理されたフィード液の総容量を掛けることによって求めた。回収されたＰＥの総グラム（ＭＰＥ，ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ）は、精製ＧＭＰ粉末の質量と精製ＧＭＰ１グラム当たりのＰＥグラム（ＣＰ分析から）を掛けることによって得た。ＧＭＰ回収率（％）は、ＭＰＥ，ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ／ＭＰＥ，ｆｅｅｄ×１００に相当した。
【０１８４】
アミノ酸添加のためのリシン基準
精製ＧＭＰがＤＲＩおよび臨床試験によって設定された栄養目標値を満たすためには、アミノ酸添加が必要である。リシン（Ｌｙｓ）は目標値に最も近いため、添加の質量収支計算の基準として選択された（表１６参照、Ｃ欄とＤ欄を比較）。ＰＫＵに対しては、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＴｒｐおよびＴｙｒの５つの不可欠アミノ酸の添加だけを要した。可決の、条件による不可欠アミノ酸は添加しなかった。
【０１８５】
遊離アミノ酸は、無傷なタンパク質によって供給されるものよりも速く吸収および分解される。従って、臨床試験の目標アミノ酸組成はＤＲＩレベルを超えるように設定した。Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、ＭｅｔおよびＴｒｐの目標値はＤＲＩレベルの１３０％に設定した。アミノ酸処方物は高レベルのＴｙｒが富化されていることが多いので、Ｔｙｒは、ＤＲＩレベルの１５０％を添加した。ＤＲＩを満たすためのＧＭＰへの添加に関する表および図では、ＰｈｅとＴｙｒは、ＭｅｔとＣｙｓの場合と同様に一緒に示すが、これはＴｙｒとＣｙｓが、それぞれＰｈｅおよびＭｅｔから合成可能な、条件による可欠アミノ酸であるためである。しかしながら、ＰＫＵ患者では、ＴｙｒはＰｈｅから合成できない。
【０１８６】
【表１６】
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【０１８７】
アミノ酸添加計算
添加による試みは、精製ＧＭＰにアミノ酸を添加することは、分子（アミノ酸ｍｇ）と分母（ＰＥ  ｇ）の双方を変化させることによってアミノ酸目標値（アミノ酸ｍｇ／ＰＥ  ｇ）を変化させるということである。添加計算のための２つの方法を示す。一方は分母に変化を含み、他方は含まない。両方法とも分子の変化を考慮する。アミノ酸添加を計算するために用いるステップは、上の表１６に示されている。ＡＡＰに関する試験結果を用いて、精製ＧＭＰ１グラム当たりの各アミノ酸のミリグラムを得た（Ａ列）。ＣＰに関する試験結果（Ｂ列）をＡ列で割って、ＰＥ基準のＧＭＰアミノ酸組成を得た（Ｃ列）。精製ＧＭＰアミノ酸組成を臨床試験目標値に匹敵させるためには、ＰＥ基準への変換（Ｃ列）は必要であった（Ｄ列）。各臨床試験目標値から精製ＧＭＰのアミノ酸値を差し引いて、各添加アミノ酸の必要な質量を得た（Ｅ列）。必要なアミノ酸値（Ｅ列）を精製ＧＭＰアミノ酸値（Ｃ列）に加えることによって、添加を行ったＧＭＰの組成を計算した（Ｆ列）。添加計算のためのこの方法は、アミノ酸組成の分母にアミノ酸を加える影響を無視した（ｍｇ／ＰＥ  ｇ）。
【０１８８】
分母の変化を考慮するためには、添加による、精製ＧＭＰ１グラム当たりのＰＥグラムの増加を考慮に入れなければならない（表１６、ＧおよびＨ列）。このために、１ｇの精製ＧＭＰに対して必要とされる添加アミノ酸の総窒素寄与率を分子式から決定し、６．２５を掛けて、添加されたアミノ酸が寄与するＰＥの総グラムを求めた。添加アミノ酸由来のＰＥグラムを、精製ＧＭＰ１ｇ当たりのＰＥグラム（Ｂ列）に加え、精製ＧＭＰ１グラム当たりのＰＥグラム補正値を得た（Ｇ列）。添加を行った組成（Ｆ列）にＢ列を掛け、Ｇ列で割って、分母の変化を考慮した（Ｈ列）。
【０１８９】
添加を行ったＧＭＰ組成補正値は、補正前の組成と統計的な有意差はなかった（表１６、Ｈ列とＦ列を比較）（Ｐ＞０．０５）。従って、本試験において精製ＧＭＰに添加を行うために用いた計算方法では、添加されたアミノ酸の分母への寄与は無視できるものと思われた。
【０１９０】
ＧＭＰ食品の調製および分析
ＧＭＰストロベリープディングの調理法を表１７に示す。精製ＧＭＰ、添加アミノ酸およびコーヒーフレッシュ(Flavorite Non-Dairy Creamer, SuperValu, Eden Prairie, Minn., U.S.A.)は、ＧＭＰストロベリープディングにアミノ酸を与えた。精製ＧＭＰ、コーヒーフレッシュ、添加アミノ酸からのアミノ酸寄与を用いて、表１６で従前に示されている方法を用いて、プディングのアミノ酸組成をＰＥ基準で計算した。
【０１９１】
【表１７】
2012530067.tif 000019
【０１９２】
統計分析
統計分析は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）(Minitab Statistical Software, Release 13.32, State College, Pa., U.S.A.)を用いて行い、添加を行ったＧＭＰの組成を、分母を考慮に入れる場合と入れない場合で比較した（表１６）。信頼区間は、計算されたＧＭＰストロベリープディングの組成と見られた組成およびＤＲＩ値と比較するために設定した。９５％信頼水準を用いて信頼区間を設定し、統計的有意性をα＜０．０５で表した。
【０１９３】
結果
本試験の目的は、１５人のＰＫＵ被験者に８日間の臨床試験に参加している間にＧＭＰを供給するのに十分な量で、低Ｐｈｅの精製ＧＭＰを製造することであった。精製ＧＭＰには、ＧＭＰ食品で用いる栄養的に完全なタンパク源を提供するために、不可欠限定アミノ酸の添加が必要であった。ＰＫＵ食用の味の良いタンパク源としてのＧＭＰ食品の安全性および有効性を調べた。以下のセクションは、どのようにしてこれらの目的を満たしたかを述べるが、精製ＧＭＰの回収率およびＰｈｅ含量に対するパイロットプラントプロセスの影響、ＧＭＰストロベリープディングにおけるアミノ酸に関する質量収支、およびＧＭＰストロベリープディングのアミノ酸組成とＤＲＩおよびアミノ酸処方物の比較、およびＰＫＵ被験者の血漿アミノ酸レベルに対する精製、添加したＧＭＰ食品の影響に分けた。
【０１９４】
Ｐｈｅ含量およびＧＭＰ回収率に対する精製プロセスの影響
表１８は、Ｐｈｅ含量、回収率および各実験の陽イオン交換の回数を含む。未精製ＧＭＰ中のＰｈｅは、精製プロセスによって、４．７±０．５ｍｇ／ＰＥ  ｇから２．７±０．４ｍｇ／ＰＥ  ｇに、４７％低減された。平均ＧＭＰ回収率は５２±４％であった。このＧＭＰの低い回収率は、主として、ＧＭＰの一部が陽イオン交換カラムに結合し、フロースルー画分に回収されないためであった。市販のＧＭＰの純度を高めるために用いた精製プロセスは、一貫した、再現性のあるＰｈｅ濃縮を与え、５回の実験によって生産された精製ＧＭＰのＰｈｅ濃度間に統計的な差はなかった（Ｐ＞０．０５）。
【０１９５】
【表１８】
2012530067.tif 000020
【０１９６】
実験ごとのＵＦ膜を経たＧＭＰ伝達を表１９に示す。全体として、ＵＦ膜によるＧＭＰ保持は９６±２％であった。ＧＭＰの分子量は約７ｋＤａであるが、ｐＨ４以上では見掛けの分子量は４５ｋＤａである。ＧＭＰ溶液のｐＨは、３ｋＤａ膜を経たＧＭＰ伝達を最小にするために、ＵＦ／ＤＦ工程では７まで引き上げた。このことがおそらく、ＵＦ工程で見られた高い回収率を説明する。
【０１９７】
【表１９】
2012530067.tif 000021
【０１９８】
アミノ酸添加計算値およびＧＭＰ食品組成の比較
ＧＭＰストロベリープディングを分析し、組成を計算されたアミノ酸組成と比較した（表２０）。精製ＧＭＰ（表２０、Ａ列）に、コーヒーフレッシュ由来の添加アミノ酸の場合（Ｃ列）と同様に添加されたアミノ酸による分母の変化を無視した質量収支法を用いて決定したアミノ酸（Ｂ列）を添加した。Ａ、ＢおよびＣ列の合計は、分母の変化を無視するＧＭＰプディングの計算組成であった（Ｄ列）。
【０１９９】
【表２０】
2012530067.tif 000022
【０２００】
比較のため、ＧＭＰストロベリープディングのアミノ酸組成を、分母の変化を含めて計算した（表２０、Ｅ列）。分母の寄与を無視すると、観測値に比べてアミノ酸組成計算値が平均３０％の過大評価となった（表２０、Ｄ列とＦ列を比較）。分母の寄与を含めることで、アミノ酸組成の計算補正値は、Ｔｙｒ（Ｐ＜０．０５）を除き、組成観測値と有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）（表２０、Ｅ列とＦ列を比較）。ＧＭＰストロベリープディングのアミノ酸組成観測値（Ｆ列）は、全てのＤＲＩ目標値を満たすか、上回った（表１５）。
【０２０１】
ＧＭＰストロベリープディングのアミノ酸組成をアミノ酸処方物と比較した（図１０参照）。アミノ酸処方物はＧＭＰストロベリープディングよりも有意に多いＨｉｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ＋Ｃｙｓ、ＴｙｒおよびＴｒｐを含んでいた（Ｐ＜０．０５）。しかしながら、アミノ酸処方物およびＧＭＰストロベリープディングは双方とも、全ての不可欠アミノ酸に関するＤＲＩ目標値を満たすか、上回った（Ｐ＞０．０５、表１５）。
【０２０２】
考察
精製ＧＭＰの製造
ＧＭＰの総回収率の低さ（５２±４％）は、ＧＭＰと陽イオン交換カラムの間の相互作用にあり、ＧＭＰの一部のカラムへの結合が起こった。ＧＭＰのカラムへの結合は、ＧＭＰの不均質性によるものであった。ＧＭＰ分子の中には、操作ｐＨ４で他のものよりも負電荷が小さく、従って、陽イオン交換カラムに結合したものがある。それより高いｐＨで操作すると、ＧＭＰの負電荷が増すことにより、ＧＭＰのカラムへの結合が最小となってしまう。これは、残留する乳清タンパク質の正電荷が減るので、これらのタンパク質と陽イオン交換カラムの間の静電気力の低下も招く。操作ｐＨを４より大きくすると、純度が劣ってしまう。純度は、臨床試験において用いるＧＭＰの製造では、回収率よりも優先されるものであった。
【０２０３】
ＵＦ／ＤＦは、最終乾燥工程の前に、低分子量の溶質を除去し、ＧＭＰを濃縮した。ＵＦ／ＤＦはＡＬＡおよびＢＬＧなどの夾雑乳清タンパク質を除去することができないが、これはこれらのタンパク質が３ｋＤａの膜を透過するには大きい過ぎるためである。他方、乳清ペプチドなどの低分子量溶質は、ＵＦ／ＤＦによって除去されるのに十分小さく、Ｐｈｅを含み得る。
【０２０４】
凍結乾燥は、フレーバーまたは臭いがなく、水に溶けて透明となる微細な白色粉末を生産した（データは示されていない）。しかしながら、この乾燥法の欠点は、処理時間が長いことであった。このプロセスの他の各工程は１日で完了することができたが、凍結乾燥は完了に数日かかった。集中的に時間を要するにもかかわらず、凍結乾燥は、本試験で用いるための精製ＧＭＰを乾燥させるのに最も実際的な選択肢であった。噴霧乾燥は、ＧＭＰの損失の可能性があり、少量の製品を乾燥さあせる方法では制限があったので使用しなかった。大規模生産では、噴霧乾燥は方法の選択肢となる。
【０２０５】
製造されたＧＭＰのアミノ酸添加
ＧＭＰの添加に用いる計算方法は、分母において、添加されたアミノ酸由来のＰＥグラムを無視したが、容易に実装され、全ての不可欠アミノ酸のＤＲＩ目標値を満たすか、上回ったＧＭＰストロベリープディングが得られた（表２０）。ＧＭＰ単独では、添加されるアミノ酸からの分母の変化を無視すると、統計的に有意に異なるＧＭＰ組成は得られなかった（表１６、Ｆ列とＨ列を比較）。
【０２０６】
コーヒーフレッシュおよび添加アミノ酸の双方の添加からの分母の変化を無視すると、観測値に比べてアミノ酸が３０％過大評価され、９つのうち６つのアミノ酸が統計的に有意に観測値を下回った（表２０、Ｄ列とＦ列を比較）。他方、分母において添加されるアミノ酸によるＰＥを考慮した場合には、計算補正値は、Ｔｙｒ（Ｐ＜０．０５）以外は、観測値と一致した（Ｐ＞０．０５）（表２０、Ｅ列とＦ列を比較）。しかしながら、Ｔｙｒは、α＜０．０１（Ｐ＞０．０１）で観測値と比べて統計的に有意な差はなかった。Ｔｙｒ期待値よりも低いのは、Ｔｙｒ添加物の純度の低さによるものであった。Ｔｙｒの光分解が起こり得、製造または貯蔵中のいくつかの時点で起こることがあり、これにより期待される純度よりも低くなる。ＴｙｒのＤＲＩはＧＭＰ食品に見合っていたが、Ｔｙｒ添加を増すと、より高いＴｙｒレベルが得られる。
【０２０７】
ＧＭＰ単独の添加計算では、アミノ酸組成への影響を無視でき、実装形態が容易なために、簡単であることが合理的であるが、ＧＭＰ食品に対して質量収支計算を行う場合には、それを行うのは合理的ではなかった。ＧＭＰと添加アミノ酸はＧＭＰプディングの１５％（ｗ／ｗ）を構成するが、コーヒーフレッシュはプディングの４０％（ｗ／ｗ）近くを構成し、最終組成に有意な影響を有した。
【０２０８】
アミノ酸の栄養要求は静態的対象ではないが、本研究の質量収支計算法は一般に、最新の科学に基づくヒト食事の栄養要求を満たすか、上回るために、ＧＭＰ食品に添加を行うのは有用である。
【０２０９】
実施例６：ＡＡに基づく処方物に比べた場合の本発明のＧＭＰ食品の許容性
本実施例において、本発明者らは、Cambrooke Foods, LLC, Ayer, Massachusettsによって製造された本発明の医療食品Ｂｅｔｔｅｒｍｉｌｋ（商標）と、Abbott Nutrition, Columbus, Ohioによって製造されたＰＫＵ食用の従来のアミノ酸処方物Ｐｈｅｎｅｘ−２（商標）の許容性を比較するための官能検査を行った。Ｂｅｔｔｅｒｍｉｌｋは、ＧＭＰおよび添加物量のアミノ酸アルギニン、ロイシン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジンを含有した。両処方物にビタミンおよびミネラルを添加し、栄養的に完全な医療食品とした。これらの結果は、ＧＭＰ  Ｂｅｔｔｅｒｍｉｌｋは、ＰＫＵおよび非ＰＫＵ成人被験者の双方で、ＡＡに基づくＰｈｅｎｅｘ−２に比べて有意に許容性が高いことを示す。
【０２１０】
本試験において、２７人の非ＰＫＵ成人と４人のＰＫＵ成人がＢｅｔｔｅｒｍｉｌｋとＰｈｅｎｅｘ−２の双方を試食した。次に、参加者が１〜８の尺度で各製品の許容性を評価した。１−極めて好ましくない；２−あまり好ましくない；３−好ましくない；４−やや好ましくない；５−やや好ましい；６−好ましい；７−非常に好ましい；および８−極めて好ましい。結果を図１１に示す。示されたデータから分かるように、参加者は、総ての許容性判定基準（臭い、味、後味および全体）において、ＧＭＰ食品をＡＡ処方物よりもずっと高いと評価し、許容性の違いは、非ＰＫＵ参加者に比べてＰＫＵ参加者の方が実質的に大きかった。このことは、従来のアミノ酸処方物に比べて本発明のＧＭＰ医療食品の利点のさらなる証拠となる。
【０２１１】
実施例７：ＰＫＵを有する人におけるグレリンレベルに対する、アミノ酸に比べてのＧＭＰ食品の効果
満腹感を増進するＧＭＰ医療食品の可能性が与えられたことから、本試験の目的は、ＡＡに基づく朝食に比べてＧＭＰ医療食品の朝食を摂取したＰＫＵを有する人において、視覚的評価スケール（ＶＡＳ）を用いて満腹感を評価し、グレリンの血漿濃度を比較することであった。
【０２１２】
本試験では、上記の実施例４で報告された試験からの付加的データを用い、ＰＫＵを有する人において、ＡＡに基づく朝食に比べた場合の、ＧＭＰ食品の朝食の、満腹感を増進し、食欲刺激ホルモンであるグレリンの血漿濃度に影響を及ぼす能力を示す。実施例４で特徴を示した１１人のＰＫＵ被験者（成人８人と１１〜１４歳の少年３人）を、４日間２回の処置、すなわち、ＡＡに基づく食事の後に総てのＡＡ処方物をＧＭＰ食品に置き換えた食事を用いた入院患者代謝試験において、自身の対照として用いた。グレリンの血漿濃度を朝食前と１８０分後に得た。満腹感は、朝食前、朝食直後および１５０分後に視覚的評価スケール度を用いて評価した。食後グレリン濃度は、ＡＡに基づく朝食に比べてＧＭＰで有意に低く（ｐ＝０．０３）、空腹時グレリンには差はなかった。食後グレリン濃度の低さは朝食後の満腹感の高さと関連しており、ＧＭＰによる満腹感がＡＡに比べて高いことを示唆する。これらの結果は、持続的なグレリンの抑制を示し、ＧＭＰを含有する食事を摂取した場合の満腹感がＡＡを摂取した場合に比べて大きいことを示唆する。
【０２１３】
材料および方法
血漿グレリンの測定
食後血液サンプルは総て、朝食開始の１８０分後（完了から１５０分後）に採取した。最後の６人の被験者（被験者６〜１１）については、ＡＡ食の最後の２日（３日目と４日目）およびＧＭＰ食の最後の２日（７日目と８日目）の朝食前に空腹時血液サンプルも採取した。総血漿グレリンを、ラジオイムノアッセイ(Linco Research, St. Charles, MO)によって、空腹時サンプル（ｎ＝６）および食後サンプル（ｎ＝１１）で測定し、被験者ごとに、３日目＋４日目（ＡＡ食）および７日目＋８日目（ＧＭＰ食）で等量の血漿を合わせた（これらの日で血漿ＡＡ特性の安定性が見られたことで裏付けが得られたため）。被験者２の総グレリンは、その挿入値が標準曲線の最高濃度を大きく超えた明らかな統計的アウトライアーであったことから、分析から除外した。
【０２１４】
摂食動機付けＶＡＳ質問
各被験者は、４問の摂食動機付けＶＡＳ質問を、朝食前、朝食直後および朝食終了から２時間後の３回遂行し、食欲および満腹感の主観的尺度を評価した。各質問は、どちらかの端に反対の記述がある１００ｍｍの線からなった。被験者には、次の質問に関してその時の自分の感じを最もよく表す線の上に垂直のマークを付けて示してもらった：（１）どのくらい強く食べたいと思いますか、（２）どのくらい空腹を感じますか、（３）どのくらい満腹感を感じますか、および（４）どのくらいの食品を食べることができると思いますか（食品摂取見込み(prospective food consumption)、ＰＦＣ）。摂食動機付けＶＡＳ質問の４つの質問を反映する食欲スコアを質問ごとに、下式：食欲スコア（ｍｍ）＝［摂食欲求＋空腹感＋（１００−満腹感）＋ＰＦＣ］／４を用いて計算した。
【０２１５】
統計分析
統計分析は総て、Ｍａｃ  ＯＳ  Ｘバージョン２．９用統計プログラムＲ(R Project for Statistical Computing, Wirtschaftsuniversitat, Vienna, Austria)を用いて行った。一次分析は、対応のある両側ｔ検定（被験者に対して対応有り）を用いて行った。検定はｐ＜０．０５で有意とみなし、値は平均±ＳＥＭである。空腹時および食後血漿グレリン値を、各食事処置内（例えば、空腹時ＡＡと食後ＡＡ）および食事処置間（例えば、空腹時ＡＡと空腹時ＧＭＰ）で、対応のあるｔ検定（被験者に対して対応有り）を用いて比較した。ＡＡ食の最終日とＧＭＰ食の最終日の摂食動機付けＶＡＳ質問を、食事内（例えば、空腹時ＡＡと食後ＡＡ）および食時間（例えば、空腹時ＡＡと空腹時ＧＭＰ）で比較した。二次分析は、毎日のＶＡＳ質問への回答およびグレリン(gherlin)血漿値に対するＢＭＩ、食事処置、年齢、朝食時の多量要素摂取量、血漿ｐｈｅおよび血漿値（グレリン、インスリンおよび／または総ＡＡ）の影響を調べるために線形混合効果モデルを用い、ランダム被験者効果を管理した。被験者効果がなければ、固定された効果線形モデルを用いた。有意でない変数を除去する変数減少法を用いて、ベストモデルを見出した。
【０２１６】
結果
摂食動機付けＶＡＳ特性
摂食動機付けＶＡＳ特性は、いずれの時点でもＡＡ食（４日）とＧＭＰ食（８日）の間に有意な差はなかった。しかしながら、予想されたように、食欲特性は、ＡＡ朝食またはＧＭＰ朝食のいずれかを摂取する前、摂取直後、２時間後で有意に変化した（データは示されていない）。タンパク質摂取量は、混合効果統計モデルを用い、ＶＡＳ質問に関して最も一般的な有意変数であると確認された。朝食のタンパク質含量は、朝食直後の食欲スコアと有意な負の関係が示され（ｐ＝０．０１）、従って、朝食時にタンパク質摂取量が増すにつれ、食欲スコアは下がった。朝食直後の食欲スコアに関する最終モデルでは、タンパク質含量に加えて他の有意な因子として、ＢＭＩ、年齢および食事処置と試験日との相互作用が含まれた。混合効果モデル分析で、ＢＭＩは、総ての時点でＶＡＳ回答に有意に影響を及ぼした。ＢＭＩの高さは、摂食欲求、空腹感および食欲スコアの高さ、ならびに満腹感の低さと関連していた。
【０２１７】
血漿グレリン
一晩絶食後に得た血漿中のグレリン濃度にＡＡ食とＧＭＰ食の間で有意な差はなく（図１２参照）、空腹時血漿グレリン濃度と様々な変数の間に有意な関係はなかった。特に、この多様なサンプル集団において、空腹時グレリンとＢＭＩの間に直接的な関係は見られなかった。空腹時血漿における総ＡＡ濃度もまた、２つの食事間で有意な差はなかった（データは示されていない）。ＡＡ朝食の開始１８０分後に採取した食後血漿グレリン濃度は、ＡＡ朝食を摂る前の空腹時グレリンと差がなかった（図１２）。これに対し、ＧＭＰ朝食は、食事後に予想される応答である有意に低い食後血漿グレリン濃度を誘導した。さらに、ＧＭＰ朝食後の食後グレリンは、ＡＡ朝食後の食後グレリンよりも有意に低かった。食後グレリン濃度とＢＭＩの間に有意な関係はなかった。線形混合効果モデルを用いる変数減少法を使用したところ、ＧＭＰ朝食を用いた場合に食後血漿グレリンが低かったという意味で、食後グレリンを推定する唯一の因子が食事処置であった。食後血漿グレリン濃度は、朝食２時間後の満腹感の推定において有意な因子であった（図１３参照）。満腹スコアの高さは、食後グレリン濃度の低さ、食事処置およびグレリンと食事の相互作用と有意な関係があった。
【０２１８】
考察
食事にタンパク源が存在しないと、１日中空腹感が増すことになる。味および嗜好性の改良とＧＭＰによる多様な美味しい食品を製造する能力を組み合わせることで、ＧＭＰが、１日のうちにより容易に間隔をおくことができるタンパク源を提供することによってＰＫＵの食事管理を改良し得るという概念が裏付けられる。さらに、本発明者らは、合成ＡＡに比べて無傷なＧＭＰ由来のタンパク質を摂取すると、ＰＫＵを有する人の食後のグレリンが持続的に抑制されることを初めて報告する。
【０２１９】
グレリンは唯一知られている食欲促進ホルモンであり、空腹状態および食事前に最高濃度となり、食事後には濃度が抑えられる。本発明者らは、自身の対照として用いたＰＫＵを有する３人の小児（１１〜１４）と８人の成人においてＡＡ朝食とＧＭＰ朝食を比較したところ、空腹時グレリン濃度に差がないことを見出した。
【０２２０】
これらのデータは、食事に対するグレリンの応答についての新たな情報を提供する。本発明者らは、合成ＡＡに比べて無傷なタンパク質ＧＭＰを含有する等カロリー朝食処置が違ったグレリン応答を誘導することを実証する。グレリンレベルは食後、カロリー含量に比例して低下し、タンパク質および炭水化物は、タンパク質または炭水化物からの２０％以上のエネルギーの等カロリー置換を行った試験と同程度にグレリンを抑制した。従って、ＧＭＰ朝食において炭水化物によって供給されたより高い割合のエネルギー（７．８％）は、本試験で見られる示差的なグレリン応答を説明するものとは思えない。
【０２２１】
グレリン濃度は、空腹時および朝食開始１８０分後の２つの時点で測定したに過ぎないので、最下点は見逃した可能性がある。しかしながら、ＡＡの場合には見られなかったが、ＧＭＰ朝食を摂った場合のこれら２時点間のグレリン濃度に見られた有意な低下は、ＡＡ朝食の摂取が朝食１８０分後のグレリンの持続的抑制が可能でないことを示す。実際に、ＡＡ食事の３時間後のグレリン空腹シグナルは、１２時間絶食後と差がなかった。ＡＡに比べて無傷なタンパク質を用いた食事の後の、より高いグレリン抑制は、ＧＭＰに比べて合成ＡＡの吸収速度が変動したことによるものであり得る。血漿におけるＡＡの出現は、ＡＡ摂取の場合には１時間以内、そして匹敵する無傷なタンパク質を摂取した場合にはおよそ２時間以内に見られる。ＡＡの速い吸収は、ラットおよびヒトにおいてタンパク質の保持および利用に負の影響を及ぼすことが示されている。
【０２２２】
長期ＡＡ摂取の最も有意な結果はタンパク質保持の低下であり得るが、血漿ＡＡ濃度の急激な上昇も生理的な満腹シグナルに影響を及ぼす。アミノスタティック仮説によれば、血漿ＡＡ濃度の上昇に伴ってＧＩホルモンの刺激の上昇と食欲低下が起こり、その後、血漿ＡＡ濃度が低下すると食欲が戻るということが提案される(S.M. Mellinkoff, M. Frankland, D. Boyle, M. Greipel, Relationship between serum amino acid concentration and fluctuations in appetite. 1956, Obes. Res. 5 (1997) 381-384)。従って、ＧＭＰなどの乳清タンパク質は、急速な吸収と血漿ＡＡレベルの持続によって食欲を低下させ得るが、合成ＡＡは血漿ＡＡの急速な上昇を引き起こすものの、これは無傷なタンパク質に比べて血漿からより迅速に、高い程度で消失し、その結果、食事後短時間で食欲が高まる。この仮説を裏付けるように、ＧＭＰを含有する朝食は合成ＡＡに比べて高い総食後血漿ＡＡおよび低いグレリン濃度を誘導した。さらに、本発明者らのデータは低い食後グレリン濃度と大きな満腹感の間の関係を示し、ＧＭＰ食がＡＡに比べて満腹感を持続することを示唆する。
【０２２３】
グレリンの抑制はポストガストリック・フィードバック(postgastric feedback)によって調節され(D.L. Williams, D.E. Cummings, H.J. Grill, J.M. Kaplan, Meal-related ghrelin suppression requires postgastric feedback (Endocrinology 144 (2003) 2765-2767))、胃または十二指腸ではなく、遠位腸に管腔栄養を必要とする。ＡＡに基づく処方物を摂取した後の血漿ＡＡの急速な上昇は、より短時間で管腔栄養が存在し、従って、それらのグレリン抑制能が限られていることを示唆する。
【０２２４】
さらに、グレリンはインスリンとの相互様式で働く(D.E. Cummings, J.Q. Purnell, R.S. Frayo, K. Schmidova, B.E. Wisse, D.S. Weigle, A preprandial rise in plasma ghrelin levels suggests a role in meal initiation in humans, Diabetes 50 (2001) 1714-1719)。同様に、本発明者らの結果は、ＡＡに基づく朝食に比べてＧＭＰを含有する朝食の後には、食後血漿インスリン濃度が高く、グレリンが低いことを示す。従って、ＧＭＰ食品は、従来のアミノ酸食に比べて、ＰＫＵを有する人のインスリンおよびグレリンの調節、満腹シグナル伝達およびタンパク質保持を改善し得る。
【０２２５】
結論
ＰＫＵの栄養管理は、代謝管理を改善し、空腹を制御するために、１日を通じて低ｐｈｅタンパク源の摂取を助ける、合成ＡＡ以外の新たな食事選択肢の必要がある。これらの結果により、満腹感を向上させるための食事中のタンパク質摂取の重要性が確認され、ＧＭＰ朝食がＡＡ朝食に比べてより長い時間、満腹ホルモングレリンの血漿レベルを抑制するという新たな証拠を提供する。無傷な低ｐｈｅタンパク質ＧＭＰを用いて製造された食品は、食事の選択肢を改善し、タンパク質分布およびＰＫＵの代謝管理を助ける、生理学上より完全な食事を提供するための第一段階である。
【０２２６】
実施例８：本発明に推奨されるアミノ酸添加
この予備的実施例で、本発明者らは、本発明に推奨されるアミノ酸添加を提供する。特に、本発明者らは、これまでの実施例で用いた添加量からの推奨される変動を提供する。
【０２２７】
メチオニン
本発明者らは、本発明の医療食品にメチオニンが添加されることを推奨しない。最近、学童期の子供および成人に対するメチオニンとシステインの最小必要量がこれまでに考えられていたものよりもかなり低いことが決定付けられた(Turner, et al., Am J Clin Nutr 2006;83:619-23; Ball, et al., J Nutr 2006;136 (suppl 2):1682S-93S)。このことは、ＧＭＰが十分な量のメチオニンを含有すること、メチオニン添加が必要でないことを示唆する。メチオニンは味が好ましくない硫黄含有アミノ酸であるので、ＧＭＰに基づく食品にメチオニンを添加しないことが食品の味の良さをさらに高める。
【０２２８】
アルギニン
これまでに示された実施例とは対照的に、本発明者らは、本発明の医療食品におけるＧＭＰに付加的アルギニンを添加することを推奨する。具体的には、本発明者らは、本発明の医療食品にアルギニンを、食品内のタンパク質に対するアルギニンの総重量比が好ましくはアルギニン約６０〜９０ミリグラム／総タンパク質グラム、より好ましくはアルギニン約７５ミリグラム／総タンパク質グラムとなるように添加することを提案する。
【０２２９】
アルギニンは当技術分野において栄養的に可欠なアミノ酸として認識されているが(Tharakan et al., Clin Nutr 2008;27:513-22)、アルギニンは、タンパク質、尿素および酸化窒素（ＰＡＨの補因子であるテトラヒドロビオプテリンはまた、酸化窒素シンセターゼの補因子でもある）の合成の基質としての働きをはじめ、複数の非栄養的機能を持つ。アルギニンは、腎臓でグルタミンに由来する腸管シトルリンから合成され、尿素回路で酸化されたオルニチンとなる。ＧＭＰではアルギニンが最小限であることに一致して、実施例４の臨床試験で報告したアルギニンおよびオルニチンの血漿濃度は、ＡＡ食に比べてＧＭＰを摂取した場合に有意に低かった（表１４参照）。従って、本発明者らは、ＧＭＰに、ＰＫＵ食において利用されるアルギニンを添加すべきであると結論付ける。
【０２３０】
ロイシン
本発明者らは、本発明の医療食品に、公開されている推奨摂取必要量によって示されているものよりも、または上記の実施例のいずれかで用いられている量よりも実質的に多い量のロイシンを添加することを推奨する。具体的には、本発明者らは、本発明の医療食品にロイシンを、食品内のタンパク質に対するロイシンの総重量比が好ましくはロイシン約１００〜２００ミリグラム／総タンパク質グラム、より好ましくはロイシン約１００ミリグラム／総タンパク質グラムとなるように添加することを提案する。
【０２３１】
本発明者らは、ロイシンの高い血漿レベルが、特定の担体タンパク質を介して腸管粘膜および血液脳関門を通過するＰｈｅ輸送を競合的に阻害し得ると決定付けた。従って、栄養必要レベルを超えるロイシンを添加すると驚くことに、血漿およびＰｈｅがその神経毒性作用を発揮する主要な器官である脳の双方でＰｈｅレベルが低下する。そして、推奨されるものよりも高いロイシンレベルは、本発明のＧＭＰに基づく食品を用いるＰＫＵを有する人の血漿および脳のＰｈｅレベルに低下をもたらし得る。
【０２３２】
さらに、最近の証拠は、ロイシンがｍＲＮＡ訳開始率の増強によって骨格筋タンパク質の合成を刺激することを示している(Norton LE et al., J Nutr 2009; 139:1103-1109 and Crozier, SJ et al., J Nutr 2005; 135:376-382)。ＰＫＵを有する人において骨格筋タンパク質の合成を改善することで血中ｐｈｅレベルを低くし、除脂肪体重を増加させることができる。
【０２３３】
チロシン
添加物量のチロシンは、チロシン血症などのチロシン代謝障害の処置向けの医療食品には添加しない。ＰＫＵ食を含む他の適用では、本発明者らは、本発明の医療食品に、上記の実施例のいずれかで用いた量よりもいくらか多い量のチロシンを添加することを推奨する。具体的には、本発明者らは、本発明の非加熱処理医療食品にチロシンを、食品内のタンパク質に対するチロシンの初期総重量比が好ましくはチロシン約６２〜９３ミリグラム／総タンパク質グラム、より好ましくはチロシン約８５ミリグラム／総タンパク質グラムとなるように添加することを提案する。
【０２３４】
チロシンは、不可欠であり、アドレナリン、ノルエピネフリン、メラニンおよびチロキシンの前駆体であることから、ＰＫＵ食において重要なＡＡである。上記の実施例４において、本発明者らは、食後または空腹時サンプルにおいて得られた血漿中チロシン濃度には、ＧＭＰ食またはＡＡ食の摂取で有意な差はなかったことを見出した（上記の表１４参照）。一晩絶食後の血漿中チロシン濃度は、ＧＭＰ食およびＡＡ食双方の摂取で、食後濃度に比べて低かった。しかしながら、ＧＭＰ食は、正常範囲を下回る平均空腹時チロシン濃度をもたらした。従って、本発明者らは、実施例４で検討した食品の１５０％ＤＲＩ添加レベルを上回るチロシン添加を推奨する。
【０２３５】
さらに、上記の実施例５において、本発明者らは、分母において添加アミノ酸が寄与するＰＥを考慮した場合、Ｔｙｒ（Ｐ＜０．０５）以外の、測定した総てのアミノ酸の補正計算値が観測値と一致した（Ｐ＞０．０５）ことを見出した（上記の表２０、Ｅ列とＦ列を比較）。予想されたＴｙｒ値よりも低い値は、Ｔｙｒ製造または貯蔵プロセス中のいくつかの時点で分解したことを示唆する。ＴｙｒのＤＲＩはＧＭＰ食品に見合うものであったが（ＤＲＩの１５０％を添加）、Ｔｙｒ添加を増やすと、より高レベルのＴｙｒが得られる。
【０２３６】
トリプトファン
添加物量のトリプトファンは、高トリプトファン血症などのトリプトファン代謝障害の処置向けの医療食品には添加しない。ＰＫＵ食を含む他の適用では、本発明者らは、本発明の医療食品に所望によりトリプトファンを、食品内のタンパク質に対するトリプトファンの初期総重量比が好ましくはトリプトファン約１２〜１４ミリグラム／総タンパク質グラム、より好ましくはトリプトファン約１２ミリグラム／総タンパク質グラムとなるように添加することを提案する。
【０２３７】
実施例４において、本発明者らは、ＡＡ食に比べてＧＭＰ食で、食後血漿ｔｒｐレベルにおいて２９％の低下を見出した。ＧＭＰ食におけるｔｒｐレベルは、ＡＡ処方物のｔｒｐ範囲（ｔｒｐ  〜１５ｍｇ／タンパク質ｇ）より十分低かった。また、ｔｒｐは神経伝達物質セロトニンの合成に重要であるという証拠もある(Passcuchi et al., Intl J Neuropsychopharmacology (2009), 12:1067-79)。従って、これらの推奨レベルは、ＷＨＯによって発表されている推奨最小摂取量ガイドライン(World Health Organization, Protein and Amino Acid Requirements in Human Nutrition, Geneva, Switzerland: United Nations University, 2007)の１３０〜１６０％を用いて設定された範囲、または２００２  ＤＲＩ(Institute of Medicine, Dietary Reference Intakes for Energy, Carbohydrates, Fiber, Fat, Protein and Amino Acids, Washington, DC: National Academy Press, 2002)の１３０％に基づく推奨量の双方を有意に上回る。
【０２３８】
ヒスチジン
添加物量のヒスチジンは、ヒスチジン血症などのヒスチジン代謝障害の処置向けの医療食品には添加しない。ＰＫＵ食を含む他の適用では、本発明者らは、本発明の医療食品に所望によりヒスチジンを、食品内のタンパク質に対するヒスチジンの初期総重量比が好ましくはヒスチジン約２０〜２４ミリグラム／総タンパク質グラム、より好ましくはヒスチジン約２３ミリグラム／総タンパク質グラムとなるように添加することを提案する。好ましい範囲は、ＷＨＯによって発表されている推奨最小摂取量ガイドライン(World Health Organization, Protein and Amino Acid Requirements in Human Nutrition, Geneva, Switzerland: United Nations University, 2007)の１３０〜１６０％に基づくものである。より好ましい値は、２００２  ＤＲＩ(Institute of Medicine, Dietary Reference Intakes for Energy, Carbohydrates, Fiber, Fat, Protein and Amino Acids, Washington, DC: National Academy Press, 2002)の１３０％に基づくものである。他のアミノ酸の推奨とは異なり、ヒスチジンに関するこれらの推奨値は、実施例で用いたＧＭＰ医療食品に含まれるものとは変わらない。
【０２３９】
この実施例に示されているアミノ酸添加量に基づき、血漿および脳組織中のＰｈｅレベルを最小にする働きをするとともに、ＰＫＵを有する人に必要なタンパク質を供給するためのＧＭＰに基づく改良医療食品を製造することができる。
【０２４０】
当業者ならば、本明細書に記載の特定の材料および方法との多くの等価物を認識できるか、または慣例の実験だけを用いて確認することができよう。このような等価物も本発明の範囲内にあるとみなされ、特許請求の範囲に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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