(57)【要約】配列番号１に記載のアミノ酸配列、又はアミノ酸の１０％までが挿入、欠失若しくは置換によって改変されているその変異体を有する、ポリペプチド。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列、又はアミノ酸の１０％までが挿入、欠失若しくは置換によって改変されているその変異体を有する、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする、特に配列番号２に記載の配列を有する、核酸。
【請求項３】
ストリンジェントな条件下で請求項２に記載の核酸とハイブリダイズする、核酸。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の核酸を含有する、ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含有する、形質転換生物。
【請求項６】
以下の工程を含む、テルペン炭化水素の酸化のための方法：
-請求項１に記載のポリペプチド又は請求項１に記載のポリペプチドを含有する酵素調製物にテルペン炭化水素を接触させること。
【請求項７】
前記酵素調製物が物理的、化学的又は酵素的消化によって担子菌の菌糸体から得られたものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
消化が分散、ボールミル処理又は高圧均質化によって達成される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記担子菌がヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔａｃｅａｅ）科に由来する、特に、プレウロタス・サピダス(Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｓａｐｉｄｕｓ)である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記テルペン炭化水素がバレンセンであり、かつ風味活性テルペンがヌートカトンである、請求項７から９の少なくとも１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テルペン炭化水素の酸化のための方法、及びそれに採用することができるポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
テルペン炭化水素は、望ましくない過剰成分として精油から取り除かれることが多い一方で、合成オキシ官能化誘導体は風味剤及び芳香剤として幅広い応用が見出されている。この不均衡は、経済的に関心のあるテルペノイドが植物供給源では微量にしか存在しないという事実と共に、微生物によるテルペン生体変換のこれまでの５０年の歴史の理由である（シュラダー(Schrader)及びバーガー(Berger) 2001）。（＋）−ヌートカトンは、柑橘類やグレープフルーツを思い起こす臭い、やや苦い味、及び１リットルの水当たり約１マイクログラムの極めて低い感覚閾値を有する（オーロフ(Ohloff) 1994）。特性のこの組み合わせによってヌートカトンは世界中の需要が高いバイオ製品となっている。
【０００３】
文献で言及されるバレンセンの最初の生体変換は、１９７３年まで経ち帰る（ダブリカー（Dhavlikar）及びアルブロシェイト（Albroscheit）1973）。２つの単離されたエンテロバクター(Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ)種によって最大収率１２％（ｗ／ｗ）にてバレンセンは（＋）−ヌートカトンに変換された。グレープフルーツ（シトラス・パラディシ(Ｃｉｔｒｕｓ  ｐａｒａｄｉｓｉ)）の細胞培養物によるバレンセンの生体変換は、６時間のインキュベートの後、約１ｍｇ／Ｌのヌートカトンの含量を生じた（ドラワートら(Drawert et al.), 1984）。デル・リオ(Ｄｅｌ  Ｒｉｏ)らはヌートカトンの生合成に異なったシトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）種を用い、シトラス・パラディシ(Ｃｉｔｒｕｓ  ｐａｒａｄｉｓｉ)からの９ヵ月齢のカルス培養によって最高のヌートカトンの収率を達成した（湿潤バイオマスのｇ当たり１．６μｇ）。１９９４年、ロドコッカス(Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ)株（ＫＳＭ−５７０６）によるヌートカトンの生合成が記載された（オクダら(Okuda et al.) 1994）が、収率はやはり低かった。
【０００４】
近年の新規のアプローチの中で、組換え微生物及び植物細胞培養物又は植物調製物を用いた実験が言及されるべきである。チコリ（チコリウム・インティバス・エル．(Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ  ｉｎｔｙｂｕｓ  Ｌ．)）の根からのミクロソーム調製物は副産物の無視できる形成を特徴とする（ボウミースターら(Bouwmeester et al.) 2007;デ・クラカーら(de Kraker et al.) 2003）が、予測できる将来において十分な量のこの生体触媒を得る実用的方法がない。シュードモナス・プチダ(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ)からの組換えＰ４５０cam酵素による最大収率９％（ｗ／ｗ）の（＋）−バレンセンのオキシ官能化は２００５年に公表された（ソウデンら(Sowden et al.) 2005）。組換えＰ４５０BM-3酵素による変換も記載されたが、（＋）−ヌートカトンに加えて多数のそのほかの生成物を生じた。
【０００５】
子嚢菌、ケトミウム・グロボーサム(Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｇｌｏｂｏｓｕｍ)の液内培養も（＋）−バレンセンからの（＋）−ヌートカトンの調製に採用された（カスペラら(Kaspera et al.) 2005）。変換の３日後、８ｍｇ／Ｌの（＋）−ヌートカトンが達成されたが、再び多数の揮発性及び非揮発性の副産物を伴った。さらに、ギノステマ・ペンタフィラム(Ｇｙｎｏｓｔｅｍｍａ  ｐｅｎｔａｐｈｙｌｌｕｍ)、カラガナ・チャムラグ(Ｃａｒａｇａｎａ  ｃｈａｍｌａｇｕ)及びハイビスカス・カナビナス(Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ)の植物細胞培養物は、（＋）−バレンセンからヌートカトンを合成することが可能である（サカマキら(Sakamaki et al.) 2005）。（＋）−ヌートカトンの最大収率はギノステマ・ペンタフィラム（Ｇｙｎｏｓｔｅｍｍａ  ｐｅｎｔａｐｈｙｌｌｕｍ）（ウリ科(Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ)）で達成されたが、変換の２０日後にすぎなかった（６００ｍｇ／Ｌ）。長いインキュベート時間はムコル・エスピー(Ｍｕｃｏｒ  ｓｐ．)及びクロレラ・ピレノイドサ(Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ)の液内培養でも必要だった（ハシモトら(Hashimoto et al.) 2003b, ハシモトら(Hashimoto et al.) 2003a; フルサワら(Furusawa et al.) 2005）。
【０００６】
無傷細胞の使用に伴う問題を回避するために、単離した酵素の使用が提案されている。スイスの風味剤製造者は、バレンセンへのリポキシゲナーゼと不飽和脂肪酸の添加を記載している（ミュラーら(Muller et al.) 1998）。ラッカーゼは合成補基質（ヒッチマンら(Hitchman et al.) 2005）又は第２の反応工程（加熱／重金属触媒）（フアングら(Huang et al.) 2001）を必要とする。良好な空時収率は、具体的な工程例を記載する関連の特許出願なしで、担子菌からの凍結乾燥物を用いて達成された（ミュラーら(Muller et al.) 2005）。
【０００７】
従って、高い効率でテルペン炭化水素を変換できる方法に対するニーズが未だに存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そのような方法を提供することが本発明の目的である。
【０００９】
この目的は、テルペン炭化水素の酸化に好適なポリペプチドを提供し、組換えにより酵素を調製するために必要な情報を提供することによって達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、本発明は先ず、配列番号１に記載のアミノ酸配列、又はアミノ酸の１０％までが挿入、欠失若しくは置換によって改変されているその変異体を有する、ポリペプチドに関する。
【００１１】
挿入は１つのアミノ酸の挿入を意味し、欠失は１つのアミノ酸の排除を意味する。置換では、１つのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換られる。
【００１２】
２０の天然に存在するアミノ酸に加えて、アミノ酸には、ヒドロキシプロリンなどのアミノ酸誘導体、カルボン酸のエステル化又はアミド形成などによって得ることができる誘導体が含まれる。天然のＬ−アミノ酸に加えて、Ｄ−アミノ酸も採用されてもよい。
【００１３】
好ましくは、アミノ酸の１０％未満、特に最大８％、最大５％、最大３％、さらに好ましくは最大１％が挿入、欠失又は置換によって改変されているペプチドが採用される。
【００１４】
実施形態の１つでは、ペプチドはＣ末端及び／又はＮ末端の欠失を有する。
【００１５】
タンパク質の好ましい実施形態は、配列番号２又はストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質である。
【００１６】
本発明に係るペプチドは酵素、すなわち、オキシゲナーゼの特性を示す。
【００１７】
酵素は、生化学的に、又は分子生物学的方法によって特徴付けられ、真菌又はそのほかの微生物に由来する以前から既知のオキシゲナーゼとは低い配列相同性を示す。
【００１８】
本発明はさらに、本発明に係るポリペプチドをコードする核酸に関するものであり、特に好ましいその実施形態は、配列番号２に記載の配列、又はストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズする配列である。
【００１９】
本発明はさらに、本発明に係る核酸を含有するベクター、及び本発明に係るベクターを含有する形質転換された生物に関する。
【００２０】
本発明はさらに、以下の工程を含む、テルペン炭化水素の酸化のための方法：
−請求項１に記載のポリペプチド又は請求項１に記載のポリペプチドを含有する酵素調製物にテルペン炭化水素を接触させること、に関する。
【００２１】
従って、利用される物質は、天然起源又は組換え製造からの精製された酵素であってもよいし、或いは酵素調製物であってもよい。後者は、物理的、化学的又は酵素的消化によって担子菌の菌糸体から得ることができる。
【００２２】
好ましくは、そのような消化は、分散、ボールミル処理又は高圧均質化によって達成される。
【００２３】
フリーズドライ又は凍結乾燥は、消化ではない。従って凍結乾燥だけでは所望の結果が得られない。従って、さらなる均質化の工程を伴わない凍結乾燥のみは除外される。
【００２４】
特に、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔａｃｅａｅ）科に由来する担子菌、特に、プレウロタス・サピダス(Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｓａｐｉｄｕｓ)は担子菌として好適である。
【００２５】
さらに好ましくは、本発明に係る方法は、バレンセンからヌートカトンを得るのに採用され得る。しかしながら、ほかのテルペン炭化水素も採用されてもよい。
【００２６】
本発明はさらに以下の実施例によって説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】消化した湿潤バイオマスによる（＋）−バレンセンの変換後；１．５ｍＬの５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５での湿潤バイオマス（消化された）による（＋）−バレンセン２μＬの１６時間の変換後の生成物収率を示す。
【図２】５０時間、１００ｍＬの５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５での消化した湿潤バイオマスによる（＋）−バレンセンの流加培養変換後の生成物収率を示す。
【図３】スーパーデックス２００カラム；ランニングバッファー：２００ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、流速：０．５ｍＬ／分、試料容量：２００μＬ、分画サイズ：１．０ｍＬにて分離した上清の３段階精製の第３段階でのＦＰＬＣクロマトグラムの一部を示す。
【図４】第３精製段階のＦＰＬＣ分画による変換後の生成物収率を示す；１．５ｍＬの容量における１μＬの（＋）−バレンセンの２０時間の変換；バッファー：２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５。
【図５】その後の銀染色を伴った、ＦＰＬＣによる３段階のタンパク質精製の後でのＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲル（１２％）を示す；ＭＷ＝分子量、Ｓｔｄ＝標準（１μＬ）。
【図６】図６Ａは、ヘム酵素／メタロ酵素（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）についての特異染色を伴った、ＦＰＬＣによる３段階のタンパク質精製の後でのＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲル（１２％）を示す；ＭＷ＝標準の分子量、Ｓｔｄ＝標準（４μＬ）、ＭＰＯ＝西洋ワサビペルオキシダーゼ（１５μＬ、３４５ｍＵ）、Ｕｅｂｅｒ＝分離した上清（１５μＬ）、ＧＦ＝第３精製段階からの合わせた活性分画（ゲル濾過、１５μＬ）、ＸＸＸ（図中、ＸＸＸは取り消し腺で表記されている）＝ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に９５℃にて５分間加熱した対応する試料。図６Ｂは、ヘム酵素／メタロ酵素についてのその後の染色を伴った、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲル（１２％）を示す；ＳＬＯＸ＝大豆からのリポキシゲナーゼ（２０μＬ、８５ｍＵ）。
【図７】クラスタル・ダブリュ（ＣｌｕｓｔａｌＷ）(トンプソンら(Thompson et al.) 1994)による、エー・フミガタス(Ａ．  Ｆｕｍｉｇａｔｕｓ)（ＸＰ＿７４６８４４．１）に由来するリポキシゲナーゼの配列とのピー・サピダス(Ｐ．  ｓａｐｉｄｕｓ)に由来するペプチド配列６６−１及び６６−３のアラインメントを示す。
【図８】ピー・サピダス(Ｐ．  ｓａｐｉｄｕｓ)に由来する、本発明に係るポリペプチドのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示すが、開始コドン及び終止コドンは肉太活字体で印を付けている。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２８】
実施例１：微生物及び培養
プレウロタス・サピダス(Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｓａｐｉｄｕｓ)（ＤＳＭＺ  ８２６６）は、ドイツ、ブラウンシュヴァイク(Braunschweig)の微生物細胞培養コレクション(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen)（ＤＳＭＺ）から入手した。
【００２９】
ａ）栄養溶液
個々の成分（表１）を蒸留水に溶解し、０．５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．０に調整した。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
【表２】
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【００３２】
ｂ）ストック培養
プレウロタス・サピダス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｓａｐｉｄｕｓ）の、ＳＮＬ−Ｈ寒天培地による寒天プレートでストック培養を開始した。菌糸体で過剰増殖した約１ｃｍ2の大きさの寒天片で寒天プレート１枚ごとに植菌し、パラフィルム（登録商標）で封止し、２４℃にてインキュベータで培養した（タウバートら(Taubert et al.), 2000）。プレートにて菌糸体で半分過剰増殖した後、培養物を４℃に保存した。これらのストック培養物は、同じ方法で少なくとも６ヵ月毎に継代した。
【００３３】
ｃ）予備培養
２００ｍＬのＳＮＬ−Ｈ培地を伴った三角フラスコ(エルレンマイヤーフラスコ)（５００ｍＬ）に、ストック培養物からの菌糸体で過剰増殖させた寒天片（約１ｃｍ2）を無菌スパーテルで移し、均質化し（ドイツ、シュタウヘン(Staufen)、ＩＫＡのウルトラ・ツラックス（Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ）ホモジナイザー、ＴＰ１８／１０、低回転速度で約２０秒間）、２４℃にて１５０ｒｐｍで４日間、インキュベートした。
【００３４】
ｄ）バイオマスの培養
撹拌されたタンク反応器にて、２．３ＬのＮＬＭＡ培地に、均質化した予備培養物２３０ｍＬを植菌した。４日後、撹拌されたタンク反応器の内容物を回収した。この目的のため、綿布にてそれを濾過した。得られたキノコの菌糸体を各４００ｍＬの蒸留水（ｍ／ｖ）で２回洗浄し、さらなる実験に用いた。クリーンベンチで培養を行い、用いた器具及び溶液は予め１２１℃にて２０分間オートクレーブにかけた。
【００３５】
実施例２：細胞の溶解
ａ）湿潤バイオマスの均質化
３ｇの湿潤バイオマスを５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）７ｍＬと混合し、その後、ウルトラ・ツラックス（Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ）ホモジナイザー（ＴＰ１８／１０、ＩＫＡ）を用いて氷上にて５分間、１５，６００ｒｐｍで処理した。その後、消化したキノコ菌糸体を同じバッファーで１６．７％（ｖ／ｖ）に希釈し、（＋）−バレンセンの変換に用いた。
【００３６】
ｂ）湿潤バイオマスの均質化−アップスケーリング
５０ｇの湿潤バイオマスを５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０ｍＬと混合し、その後、ウルトラ・ツラックス(Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ)ホモジナイザー（ＴＰ１８／１０、ＩＫＡ）を用いて氷上にて１５分間、２０，０００ｒｐｍで処理した。その後、消化したキノコ菌糸体を同じバッファーで２５％（ｖ／ｖ）に希釈し、（＋）−バレンセンの変換に用いた。
【００３７】
ｃ）高圧下での湿潤バイオマスの均質化
完全に脱塩した水におけるキノコ菌糸体の懸濁液を高圧均質化（LAB 60/60 TBS、ガウリン・エーピーブイ(Gaulin APV)、スイス）によって消化した。冷却した菌糸体を１〜３回（１５０／３０バール及び３００／６０バール）で消化し、生体変換反応に直接用いた。或いは、バレンセンを導入し、細胞溶解の間そのまま均質化した。
【００３８】
ｄ）凍結乾燥物の製造
１００ｇまでの湿潤バイオマスをガラス製のシャーレに秤量し、アルミホイルで覆って、−２０℃に急速冷凍した。３〜７日間凍結乾燥を行った（ＶａＣｏ２、ドイツ、バートグルント(Bad Grund)のジルバス・テクノロジー(Zirbus Technology）。トレイの温度は−２０℃であり、冷却コイルの温度は−４５℃だった。得られた凍結乾燥物を秤量し、ガラス棒で細かく砕き、無菌のファルコン(Falcon)（商標）チューブに移し、使用まで−７０℃で保存した。
【００３９】
実施例３：バレンセンの生体変換
ａ）消化したバイオマスによる変換
３００ｒｐｍ及び２４℃にて水平位置でネジ蓋のバイアル（４ｍＬ）中にて変換を行った。プレウロタス・サピダス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｓａｐｉｄｕｓ）（１．５ｍＬ）の湿潤バイオマスをウルトラ‐ツラックス(Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ)ホモジナイザーで処理し、２μＬの（＋）−バレンセン（デーラー(Ｄoｈｌｅｒ)、７０％）の変換に用いた。変換の完了後、抽出を行った。（＋）−ヌートカトンの測定された含量は２２１ｍｇ／Ｌだった（図１）。
【００４０】
ｂ）バレンセンの流加培養変換
９００ｒｐｍかつ室温で磁気撹拌器（バリオマグ・ポリ(Ｖａｒｉｏｍａｇ  Ｐｏｌｙ)１５，米国、マサチューセッツ州、ウォルサム(Waltham)のテルモフィッシャーサイエンティフィック(Thermo Fisher Scientific)）上にてガラス瓶中において変換を行った。１００ｍＬの細胞懸濁液（均質化した）に３３３μＬの（＋）−バレンセン（デーラー(Ｄoｈｌｅｒ)、≧７０％）を添加することによって変換を開始した。６、１２、１８、２４、３０、３６及び４２時間後、それぞれ１５６μＬ用量の（＋）−バレンセンを加えた。６、２３、４６及び５０時間後、それぞれ２×１．５ｍＬの試料を取り出し、抽出した。変換の５０時間後、（＋）−ヌートカトンの含量は６０３ｍｇ／Ｌだった（図２）。合計で、８９３ｍｇ／Ｌのα−、β−ヌートカトール及び（＋）−ヌートカトンが形成された。
【００４１】
ｃ）精製した酵素溶液による変換
０．５ｍＬの精製したタンパク質分画（分画０８、０９及び１２〜２２）を２０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）１．０ｍＬと混合した。その後、１μＬの（＋）−バレンセン（フルカ、≧９０％）を添加することによって変換を開始した。１５０ｒｐｍかつ２４℃にて水平位置でネジ蓋のバイアル（４ｍＬ）中にて変換を行った。変換の完了後、抽出を行った。分画１５及び１６との反応の後、有意な含量の変換生成物、α−、β−ヌートカトール及び（＋）−ヌートカトンが検出された（図４）。
【００４２】
ｄ）キャピラリーガスクロマトグラフィ（ＧＣ）−変換後の微量抽出
変換に使用したネジ蓋バイアルで直接微量抽出を行った。混合物を内部標準（６７ｍｇ／Ｌ及び２００ｍｇ／Ｌのチモール）及び２ｍＬのペンタンと混合し、１０秒間ボルテックスし、１５０ｒｐｍにて１０分間水平位置にて振盪した。遠心分離（１０分間、３３１３×ｇ、４℃）の後、有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ガスクロマトグラフィで調べた。
【００４３】
ｅ）キャピラリーガスクロマトグラフィ（ＨＲＧＣ）
冷却注入系及び極性カラムによって、ＦＩＤによるα−、β−ヌートカトール及び（＋）−ヌートカトンの定量を達成した。
【００４４】
【表３】
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【００４５】
実施例４:酵素精製
高速タンパク質液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）
不純物を分離するために、試料を遠心し（１０分間、１３，０００ｒｐｍ、１６，０６０×ｇ、４℃）、上清をＦＰＬＣに注入した（表４）。必要に応じて、試料をさらに膜濾過（０．４５μｍの孔サイズ、２５ｍｍ、ＰＥＴ、カールロス（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ）社）に供した。
【００４６】
ａ）ＦＰＬＣによる３段階精製
プレウロタス・サピダス(Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｓａｐｉｄｕｓ)から分離した上清５ｍＬを４回、それぞれＦＰＬＣに注入し、弱アニオン交換体ＤＥＡＥ  ＦＦによって分離した（表５を参照）。４回のＦＰＬＣの分画０５〜２４を合わせて（精製段階１、ＤＥＡＥプール）、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０（セントリコン・プラス(Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ)−７０、排除サイズ１０ｋＤａ）で再緩衝化し、２．５ｍＬに濃縮した。沈殿したタンパク質を遠心によって取り除いた。２ｍＬの再緩衝化したＤＥＡＥプールをＦＰＬＣに再び注入し、強カチオン交換体ＳＰセファロースＦＦによって分離した（表６を参照）。分画０７〜１１を合わせ（精製段階２、ＳＰ  ＦＦプール）、２００ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５（アミコン・ウルトラ(Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ)−１５、排除サイズ１０ｋＤａ）で再緩衝化し、３００μＬに濃縮した。２００μＬの再緩衝化したＳＰ  ＦＦプールをＦＰＬＣに注入し、スーパーデックス(Superdex)２００カラムでのゲル濾過によって分離した（表７）（精製段階３）。採用したカラムの較正の後、最大ピーク（３０分、図３）は５４ｋＤａの分子量に相当した。
【００４７】
ＳＤＳ分析については、分画１２〜１９をイー・ピュア(Ｅ−Ｐｕｒｅ)水で再緩衝化し、８０μＬに濃縮した（図５）。変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後の銀染色、非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のヘム酵素／メタロ酵素に特異的な染色（図６）、及び変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のクマシー染色後の選択したタンパク質バンドの配列決定にこれらの濃縮物を用いた。
【００４８】
【表４】
2012509660.tif 000006
【００４９】
イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＸ）
【表５】
2012509660.tif 000007
【００５０】
【表６】
2012509660.tif 000008
【００５１】
【表７】
2012509660.tif 000009
【００５２】
製造元の指示書に従って２つのゲル濾過較正キット（アマシャムファルマシアバイオテックの高分子量及び低分子量）の標準タンパク質を用いてゲル濾過カラムの較正を行った。
【００５３】
ｂ）変性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
１２％分離ゲルでタンパク質を分離し（ラエムリ(Laemmli), 1970に従って改変された）、クマシー染色又は銀染色によって視覚化した（ブラムら(Blum et al.), 1987）。双方の方法は当業者に知られている。
【００５４】
ｃ）非変性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
４ｂの項目と同様に非変性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施したが、ローディング・バッファーの組成（表８）は改変した。
【００５５】
【表８】
2012509660.tif 000010
【００５６】
ｄ）ヘム酵素及びメタロ酵素に対する染色（ヘム染色）
非変性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のみでヘム染色（トーマスら(Thomas et al.) 1976及びヘンら(Henne et al.) 2001に従って改変した）を行った。ヘム染色については、以下の溶液を用いた（表９）。
【００５７】
【表９】
2012509660.tif 000011
【００５８】
溶液ＩとＩＩＩはそれぞれ使用直前に調製した。
【００５９】
暗所にて４５分間〜１時間、溶液ＩＩＩにてＳＤＳゲルをインキュベートし、その後、最終濃度３０ｍＭのＨ2Ｏ2（３０％）を加えて１分間インキュベートした。イー・ピュア(Ｅ−Ｐｕｒｅ)水で各２０秒間、ゲルを３回洗浄した。プレウロタス・サピダス(Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｓａｐｉｄｕｓ)から分離された凍結乾燥物を、３つのクロマトグラフ段階にわたって精製された酵素試料と比較した（実施例３、３つのクロマトグラフ段階（ＩＥＸ、ＩＥＸ、ＧＦ）にわたっての精製を参照）。ヘムを含有する酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼと大豆由来のリポキシゲナーゼを陽性対照として用いた（図６Ｂ）。特異的染色のために、２つのタンパク質はメタロ酵素として特定され、それは、３段階にわたるクロマトグラフ精製の後、検出することもできた。適用前の試料の加熱は結果的に酵素活性の喪失を生じた。
【００６０】
実施例５：ペプチドの配列
実施例４ａと同様にして、プレウロタス・サピダス(Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｓａｐｉｄｕｓ)から分離された上清の３段階クロマトグラフ精製を行った。タンパク質の精製の後、ガスクロマトグラフィによる（＋）−バレンセンのインキュベーションにより精製した分画が活性を有するかどうかチェックした。変性条件下でのＳＤＳゲルにて最終的なゲル濾過の活性分画１５と１６を分離し、クマシー（登録商標）Ｒで染色した（図５における銀染色による類似のＳＤＳ−ＰＡＧＥを参照）。６６ｋＤａの算出分子量を持つ、意図された変換活性に関与するバンドをゲルから切り出し、トリプシン消化の後、「エレクトロスプレータンデム質量分析」（ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳ）による新規配列決定（de novoシーケンシング）に供した（表１０）。
【００６１】
【表１０】
2012509660.tif 000012
【００６２】
ｂｌａｓｔｐを用いたＮＣＢＩのＢｌａｓｔによるデータベース検索によって相同性の比較を行い（シュアッファーら(Schaffer et al.) 2001）、子嚢菌由来の種々のリポキシゲナーゼでヒットが見つかった。ペプチド配列６６−１及び６６−３とアスペルギルス・フミガタス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ)（ＸＰ＿７４６８４４．１；図７）由来のリポキシゲナーゼの配列との比較から、ディジェネレートプライマーを導き、ＰＣＲスクリーニング（実施例６、分子キャラクタリゼーション、ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲスクリーニング）に用いた。
【００６３】
実施例６：分子キャラクタリゼーション
ａ）ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲスクリーニング
オキシゲナーゼをコードするｃＤＮＡ配列をクローニングするために、ピー・サピダス（Ｐ．ｓａｐｉｄｕｓ）のｃＤＮＡを合成し、ポリメラーゼ鎖反応によってスクリーニングした。４日目の培養物からピー・サピダス（Ｐ．ｓａｐｉｄｕｓ）の菌糸体を回収した。トータルＲＮＡを単離するために、製造元の指示書に従ってＲＮｅａｓｙ植物ミニキット(RNeasy Plant Mini Kit)（ドイツ、ヒルデンのキアゲン）を用いた。変性ホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動と臭化エチジウムによる染色によって単離されたＲＮＡの質を調べた。ｃＤＮＡの合成のために、製造元の指示書に従って、ＳＭＡＲＴ（商標）ＰＣＲ  ｃＤＮＡ合成キット（フランス、サン・ジェルマン・アン・レーのクロンテック・タカラバイオヨーロッパ）を用いた。スーパースクリプト(ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ)（商標）ＩＩＲＮａｓｅＨ-（ドイツ、カールスルーエ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）のインビトロジェン）によって第１鎖を合成した。ユーロフィンズＭＷＧオペロン（ＥｕｒｏｆｉｎｓＭＷＧＯｐｅｒｏｎ）（ドイツ、エバースベルグ）によってＰＣＲプライマーを製造した。ＰＣＲについては、１ｘＣｏｒａｌＬｏａｄ  Ｐｕｆｆｅｒ（キアゲン）、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．４μＭのプライマー及び１．２５ＵのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン）と共に、約２０ｎｇのｃＤＮＡを鋳型として５０μＬ容量にて用いた。ＰＣＲマスター・サイクラー・パーソナル(ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｃｙｃｌｅｒ  ｐｅｒｓｏｎａｌ)（ドイツ、ハンブルグのエッペンドルフ）によって増幅を行った。ｃＤＮＡの全配列のために以下のプライマーを用いた：フォワード（５’＞ＡＡＡ  ＣＣＴ  ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＴＴＴ＜３’）；リバース（５’＞ＡＣＡ  ＧＧＡ  ＴＡＣ  ＧＧＴ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＴＧ＜３’）。
【００６４】
ｂ）ＰＣＲ産物のクローニング及び配列決定
ＴＡクローニングキット（インビトロゲン）によってＰＣＲ産物をベクターｐＣＲ（登録商標）２．１にクローニングした。配列決定は、Ｍ１３リバース及びフォワードのプライマーで行い、かつＭＷＧオペロン(ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ)によって実施した。互いに対するディジェネレート・プライマーを用いた場合のＰＣＲスクリーニングにおける予測された断片サイズは約４２９ｂｐ（１４３アミノ酸に相当する）だった。相当するバンドをアガロースゲルから単離し、一時的にベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングし、その後、配列決定した。得られた配列を再び、相同性比較に供し、オキシゲナーゼの断片として同定した。
【００６５】
プライマーウォーキングによって、１１９１ｂｐ又は３９６アミノ酸の長さを有するｃＤＮＡのコーディング配列を検出した（図８）。翻訳されたタンパク質配列は、担子菌であるラッカリア・ビカラー(Ｌａｃｃａｒｉａ  ｂｉｃｏｌｏｒ)に由来するオキシゲナーゼ（ｂｌａｓｔｐにより検出された、シュアッファーら(Schaffer et al.) 2001）と約５０％の相同性を示した。
【００６６】
（参照文献）
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【００６７】
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【００６８】
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【００７１】
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【００７２】
ハシモト・ティー；アサカワ・ワイ；ノマ・ワイ；ムラカミ・シー；タナカ・エム；カニサワ・ティー；エムラ・エム(Hashimoto, T.; Asakawa, Y.; Noma, Y.; Murakimi, C.; Tanaka, M.; Kanisawa, T.; Emura, M.) (2003b)、特許 JP 2002-51668 20020227.
【００７３】
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【図１】
2012509660.tif 000013
【図２】
2012509660.tif 000014
【図３】
2012509660.tif 000015
【図４】
2012509660.tif 000016
【図５】
2012509660.tif 000017
【図６】
2012509660.tif 000018
【図７】
2012509660.tif 000019
【図８】
2012509660.tif 000020
【配列表】
2012509660000001.app
【国際調査報告】
2012509660.tif 000021
2012509660.tif 000022
2012509660.tif 000023
2012509660.tif 000024
2012509660.tif 000025
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