(57)【要約】  本発明は、蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質で被覆した固相を使用して、分子被覆率が８から３０蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子／ｎｍ２の範囲である、試料中のホスホリパーゼＡ１またはＡ２活性を測定する新規の方法、および前記方法を行うためのキットに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子被覆率が８から３０蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子／ｎｍ２の範囲である蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質で被覆した固相。
【請求項２】
前記基質が、疎水性部分、リン酸部分、および疎水性部分に直接または任意の連結基経由で結合された蛍光性部分を含む、請求項１に記載の固相。
【請求項３】
前記基質がグリセロリン脂質である、請求項１または２に記載の固相。
【請求項４】
前記基質が、ｓｎ−１脂肪酸アシル鎖の末端におよび／またはｓｎ−２脂肪酸アシル鎖の末端に標識付けされている、請求項３に記載の固相。
【請求項５】
前記基質がベンゾ（ｄ，ｅ，ｆ）フェナントレンまたは４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンで標識付けされている、請求項１から４のいずれか一項に記載の固相。
【請求項６】
前記標識基質が、ドナー蛍光団でｓｎ−１脂肪酸鎖に、かつアクセプター蛍光団でｓｎ−２脂肪酸鎖に、または逆に標識付けされている、請求項１から４のいずれか一項に記載の固相。
【請求項７】
前記標識基質が、蛍光団でｓｎ−１脂肪酸鎖に、かつクエンチャーでｓｎ−２脂肪酸鎖に、または逆に標識付けされている、請求項１から４のいずれか一項に記載の固相。
【請求項８】
前記固相が微粒子である、請求項１から７のいずれか一項に記載の固相。
【請求項９】
前記固相がビーズである、請求項１から８のいずれか一項に記載の固相。
【請求項１０】
試料中のホスホリパーゼＡ１またはＡ２活性を測定する方法であって、
−請求項１から９のいずれか一項に記載の蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質で被覆した固相と前記試料を接触させること、
−時間の関数として蛍光発光を検出すること、
を含む方法。
【請求項１１】
キットであって、
−請求項１から９のいずれか一項に記載の蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質で被覆した標識基質を含む第１の容器、
−緩衝液を含む第２の容器、
を備えるキット。
【請求項１２】
対照および／または較正物質をさらに備える、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
請求項９に記載の方法に従って、対象からの試料中のＰＬＡ１またはＰＬＡ２酵素活性を測定することを含む、ＰＬＡ１またはＰＬＡ２活性関連疾患を有する、または有する危険がある、または発症している対象を識別する方法。
【請求項１４】
前記ＰＬＡ２活性関連疾患が心臓血管疾患および／または心血管系イベントである、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のホスホリパーゼ活性を定量するための酵素アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
リン脂質は生体膜の主要な構造成分である。この構造的な役割に加え、細胞のシグナル伝達プロセスにおける仲介物質としてのリン脂質の重要性はますます明白になっている。したがって、ホスホリパーゼの作用ならびに脂質の選別および輸送などの代謝過程についての研究が、急速に拡大している。
【０００３】
ホスホリパーゼは、ひとたび界面系内に存在すると触媒反応を示す最もなじみ深い界面酵素ファミリーの１つに属する。ホスホリパーゼはまた、加水分解酵素の種類にも属するが、水系中に存在するリン脂質のエステル連結を都合好く特異的に開裂し、ホスホリパーゼの種類に応じて、遊離脂肪酸、リゾリン脂質、グリセロリン脂質、ホスファチジン酸および遊離アルコールを生成する。これらの界面の酵素は、その酵素反応速度論的経路が１）組織化された基質への結合、２）触媒ステップ、の別個の２ステップからなるため、水相からその基質に直接接近する古典的な可溶性酵素ではない。
【０００４】
ホスホリパーゼは、リン脂質分子におけるこれらの作用部位によって分類される（図１）（１１）。
【０００５】
従って、ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）は、リン脂質の１−アシル基を加水分解する。すなわち、リン脂質の１位における脂肪酸とグリセリン残基の間の結合を加水分解する。ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）は、２−アシル（又は中央アシル）基を加水分解し、ホスホジエステラーゼとしても知られているホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）およびＤ（ＰＬＤ）は、リン酸ジエステル連結のそれぞれ相異なる側を開裂する。
【０００６】
ＰＬＡ１またはＰＬＡ２によるリン脂質の加水分解は、いわゆる「リゾリン脂質」の産生をもたらす。ＰＬＡ１でのリン脂質基質の選択的加水分解は２−アシルリゾリン脂質を産生し、ＰＬＡ２でのリン脂質の選択的加水分解は１−アシルリゾリン脂質の産生をもたらす。ホスホリパーゼ代謝物質は、シグナル伝達、宿主防御（抗菌効果を含む）、血小板活性化補助因子の形成、膜再形成および全体的な脂質代謝を含む多様な細胞プロセスに関与する。
【０００７】
分泌されるホスホリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ２）は、ジスルフィドに富む、１４ｋＤａで、Ｃａ２＋依存性の細胞外酵素である。これらは、ＰＡＦアセチル加水分解酵素としても知られているリポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２（Ｌｐ−ＰＬＡ２）とは、別のものである。ヒトでは９種の異なるｓＰＬＡ２遺伝子が記述されており、群ＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＤ、ＩＩＥ、ＩＩＦ、ＩＩＩ、Ｖ、ＸおよびＸＩＩに分類されている。群ＩＢおよびＩＩＡ酵素は最もよく特徴が判っているが、ファミリーの構成員の内でより最近発見されたものが果たす生物学的役割は、捉えがたいままである。
【０００８】
最近、独立した９つの大規模で国際的な臨床研究によって、臨床と非臨床の集団の両方において、ｓＰＬＡ２と動脈硬化性心血管疾患の間に強い正相関が有ることが実証された（１−９）。とりわけｓＰＬＡ２活性は、急性冠症候群管理におけるリスク層別化、急性冠症候群の診断、非徴候性患者における心臓血管リスク評価、ならびに心臓血管疾患での治療診断および治療法監視のための、新規で強力な手法であることが明らかになった。
【０００９】
ＰＬＡ２群はまた、細胞質ゾルのＰＬＡ２を含み、ＰＣ上のこの活性は、アラキドン酸、すなわちプロスタグランジンおよびロイコトリエンの生合成の前駆体および可能な細胞内の二次メッセンジャーを放出する。
【００１０】
ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）は、リン脂質を加水分解し、２−アシル−リゾリン脂質および脂肪酸を産生する酵素であり、広範囲の生命体中に貯えられている。哺乳動物にはインビトロでＰＬＡ１活性を示すいくつかの酵素がある。細胞外ＰＬＡ１は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）特異的ＰＬＡ１（ＰＳ−ＰＬＡ１）、膜結合型ホスファチジン酸（ＰＡ）選択的ＰＬＡ１Ｓ（ｍＰＡ−ＰＬＡ１αおよびｍＰＡ−ＰＬＡ１β）、肝性リパーゼ（ＨＬ）、内皮リパーゼ（ＥＬ）および膵臓リパーゼ関連タンパク質２（ＰＬＲＰ２）を含み、これらは全て膵臓リパーゼ遺伝子ファミリーに属する。前記三つのＰＬＡ１は、基質特異性、構造的特徴および遺伝子編成において他のものと異なり、膵臓リパーゼ遺伝子ファミリーのサブファミリーを形成する。ＰＳ−ＰＬＡ１、ｍＰＡ−ＰＬＡ１αおよびｍＰＡ−ＰＬＡ１βは、ＰＬＡ１活性のみを示すが、ＨＬ、ＥＬおよびＰＬＲＰ２は、ＰＬＡ１活性に加えてトリアシルグリセロール加水分解活性を示す。
【００１１】
血清ＰＬＡ２アッセイ（１３）は、蛍光性反応生成物の分析において液液相分配を利用した。これらのアッセイは、労力を要し、時間のかかる反応後の分析を必要とする。
【００１２】
米国特許出願公開第２００３／２１９８４９号明細書は、非蛍光ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールまたはホスファチジン酸から選択される非蛍光負電荷リン脂質ならびに蛍光標識されたホスファチジルコリンおよび蛍光標識された／負電荷のリン脂質の中から選択される蛍光標識分子を含む、リポソームの使用に基づくホスホリパーゼ活性を測定するための一般法を開示している。ホスホリパーゼによるリポソームのリン脂質成分の加水分解は、蛍光強度が変化する原因となる。ｓＰＬＡ２活性を求めるための一例は、ジオレオイルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロールおよび蛍光標識１，２−ビス−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インデセン−３−ウンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ビスボディピー（Ｂｉｓ−ＢＯＤＩＰＹ）ＦＬ  Ｃ１１−ＰＣ）を含む、リポソームの使用に基づいている。
【００１３】
米国特許出願公開第２００５／０２６２３５号明細書は、式：
【化１】
2012517219.tif 000003
（式中、Ｒ１は６から３０の炭素原子を有する飽和または不飽和アルキルであり、Ｒ２は６から３０の炭素原子を有する飽和または不飽和アルキルであり、Ｌは結合または連結基であり、かつ、Ｄは蛍光性の蛍光団である。）を有するミセルまたはリポソームの形態の蛍光標識ホスホリパーゼ基質を含む脂質複合体の使用に基づく、ホスホリパーゼ活性を求めるための別の一般法を開示している。
【００１４】
しかしながら、ホスホリパーゼの基質をリポソームまたはミセルの形態で有することはいくつかの欠点を示すことを、本発明者らは見出した。
【００１５】
実際、天然のグリセロ脂質またはグリセロリン脂質は事実上水への溶解性を持たず、また界面酵素は水可溶状態において存在することができるので、グリセロ脂質またはグリセロリン脂質の加水分解が生じるためには、酵素が基質膜界面に吸着しなければならない。一見簡単そうではあるが、グリセロ脂質またはグリセロリン脂質の二重層の加水分解は非常に複雑な、非平衡プロセスである。ホスホリパーゼによる脂肪酸または脂肪酸とリゾリン脂質の迅速な産生は、複雑な膜ダイナミクスを生み出し、次にそのことが自己を混乱させ、継続的な酵素作用に影響を与える。実際、ホスホリパーゼ活性は膜特性に敏感であり、リン脂質頭部基サイズ、頭部基電荷、リン脂質相状態、リン脂質ダイナミクスおよび膜曲率を含む多数の膜因子によって修飾される。
【００１６】
ｓＰＬＡ２活性を検出する別の方法も報告されている。（キットカタログ＃７６５００１  ｓＰＬＡ２  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ製品資料，Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，１２／１８／９７およびキット＃９０７−００２，ｓＰＬＡ２  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ，Ａｓｓａｙ  ｄｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．５７７７  Ｈｉｎｅｓ  Ｄｒｉｖｅ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ  ４８１０８  ＵＳＡ）。
【００１７】
これらのアッセイフォーマットには、重大な制約がある。例えば、酵素活性のみを測定するアッセイは、試験サンプル中に存在する他の酵素または物質による基質に対する競合的活性を受ける。例えば、ホスホリパーゼＡ２ファミリーの多くの構成員が、酸化したホスファチジルコリンに対して酵素活性を示す。
【００１８】
さらに、ＣａｙｍａｎおよびＡｓｓａｙ  ｄｅｓｉｇｎの活性アッセイは、ｓＰＬＡ２活性とは無関係に、基質を変換する血清中の物質によるバックグラウンド信号から影響を受ける。具体的には、これらのキットは方法論の一部として遊離チオールの検出を土台とする。Ｃａｙｍａｎのアッセイは実験室設定においてよく機能し得るが、Ｃａｙｍａｎのキットは遊離チオールを検出するため、ヒト試料中のｓＰＬＡ２測定への使用には適さない。ヒト組織、血漿または血清試料中に遊離チオールが豊富であるからである。さらに、既存のアッセイは、特異性の欠如によって高い活性を誤って検出し得る。臨床的背景における活性の誤った測定は、疾患の不適当な診断、または酵素活性の低減を意図する治療への患者の応答につながりかねない。
【００１９】
したがって、リポソーム／ミセルは溶液中では安定構造ではなく、多様な形態（小さいものから大きいものまで、多層小胞（他のリポソーム内のリポソーム）から単層小胞まで）で存在するため、基質をリポソーム／ミセルの形態で用いることは欠点を示す。
【００２０】
さらに、有機溶媒中の脂質溶液を水溶液中に滴下することによるリポソームの生成は再現性のないプロセスであり、生成されるリポソームの性質および組織において大きい変動をもたらす。したがって、基質がそのように調製されている場合、酵素にアクセス可能な基質（リポソームの外葉）の量は一定ではない。リポソームサイズを制御する難しさはまた、リポソーム調製の標準化を困難にする。
【００２１】
さらに、ヒト血清試料中に存在するいくつかの因子は、ホスホリパーゼ酵素アッセイにおいて基質として用いられるリポソームの構造に大きく影響し、それによってホスホリパーゼ活性の測定にも影響し得る。前記因子は、例えば、イオン強度、界面活性剤として働く脂質または分子の存在、または試料中の二価イオンの濃度である。
【００２２】
そのため、生物学的試料などの非常に複雑な試料を処理する場合、
１）ホスホリパーゼ活性独立因子の、基質への影響を最小限に抑えること、および、
２）ホスホリパーゼ活性独立因子をできるだけ正確に測定可能にし、またそれを界面酵素活性自体から基質化すること、が極めて重要である。
【００２３】
Ｃｈｏら（１２）は、放射性標識リン脂質で被覆したビーズの使用に基づく、ｓＰＬＡ２活性測定のためのアッセイを開示している。前記ビーズは、［３Ｈ］−ＰＯＰＧ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール）によって、１．３  １０−２分子／Ａ２（すなわち１．３分子／ｎｍ２）の平衡充填密度で、被覆される。このアッセイは以下の欠点を示す：（ｉ）放射性標識は診断用途に適さない、（ｉｉ）本発明の実施例において示されるように、１．３分子／ｎｍ２という充填密度は蛍光測定アッセイでの使用には適さない、および（ｉｉｉ）前記方法の検出限界は１ｎｇである。
【００２４】
リン脂質で被覆した固相の例は当技術分野でほとんど開示されていない。しかし、蛍光性のリン脂質の分子被覆率は、本明細書の後の実施例において示されるように、常に本発明より低値であった。また、前記被覆した固相は、ホスホリパーゼＡ１またはＡ２活性測定アッセイに使用するためには開示されなかった。Ｂａｙｅｒｌら（米国特許第６８６８３４３号明細書）は、両親媒性材料から作った界面と物質の相互作用の分析に関わり、それにより、この目的のために両親媒性分子で被覆した担体材料（ケイ酸塩構造）を開示している。実施例に記載の前記コーティングは、陰イオン帯電性  １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）  １０モル％、双性イオン性レシチン  １，２−ジエライドイル−ｓｎ−３−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）  ８９．９７モル％、および蛍光マーカー  １−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン  ０．０３モル％の混合物である。したがってこの担体材料上の蛍光分子の充填密度は、１蛍光ホスホリパーゼ基質分子／ｎｍ２未満であり、本発明での使用には適さない。
【００２５】
Ｂｒｉａｎら（１４）は、細胞障害性Ｔ細胞の同種異型刺激に関わり、この目的のために、７：２の割合のホスファチジルコリンとコレステロールおよび１モル％になるＮ−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミンの小胞懸濁液で被覆した平坦面（カバーグラス）を開示している。したがってこのカバーグラス上の蛍光分子の充填密度は１蛍光性ホスホリパーゼ基質分子／ｎｍ２未満であり、本発明での使用には適さない。
【００２６】
Ｄａｓら（１５）は、肺胞マクロファージによる肺界面活性剤除去に関わり、この目的のために、蛍光性と非蛍光性のジオレイルホスファチジルコリンを１：１０から１：１０００の割合で混合した物で被覆した石英またはカオリン粒子を開示している。したがって、これらの粒子上の蛍光分子の充填密度は、５蛍光ホスホリパーゼ基質分子／ｎｍ２未満であり、本発明での使用には適さない。
【００２７】
そのため、より正確なホスホリパーゼＡ１またはＡ２活性アッセイは、特に診断分野における複雑な試料を分析するために非常に興味深い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
したがって、より高感度で、再現可能で、特異的な新規のホスホリパーゼＡ１またはＡ２活性アッセイへのニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明の一目的は、分子被覆率が、蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質の８から３０分子／ｎｍ２の範囲にある蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質で被覆した固相である。
【００３０】
本発明の一実施形態において、前記基質は、疎水性部分、リン酸部分および疎水性部分に直接または任意の連結基を介して結合した蛍光性部分を備える。
【００３１】
本発明の別の実施形態において、基質はグリセロリン脂質である。
【００３２】
本発明の別の実施形態において、前記基質は、ｓｎ−１脂肪酸アシル鎖の末端および／またはｓｎ−２脂肪酸アシル鎖の末端に標識付けされている。
【００３３】
本発明の別の実施形態において、前記基質はベンゾ（ｄ，ｅ，ｆ）フェナントレンまたは４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンで標識付けされている。
【００３４】
本発明の別の実施形態において、標識基質は、ドナー蛍光団でｓｎ−１脂肪酸鎖に、およびアクセプター蛍光団でｓｎ−２脂肪酸鎖に、または逆に標識付けされている。
【００３５】
本発明の別の実施形態において、標識基質は、蛍光団でｓｎ−１脂肪酸鎖に、およびクエンチャーでｓｎ−２脂肪酸鎖に、または逆に標識付けされている。
【００３６】
本発明の別の実施形態において、前記固相は微粒子、好ましくはビーズである。
【００３７】
本発明の別の目的は、試料中のホスホリパーゼＡ１またはＡ２活性を評価する方法であって、
−ホスホリパーゼが蛍光標識ホスホリパーゼ基質を開裂可能にするのに効果的な条件下で本明細書上記の蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質で被覆した固相と試料を接触させること、
−時間の関数として蛍光発光を検出すること、を含む方法である。
【００３８】
本発明の別の目的は、
−本明細書上記の蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質で被覆した標識基質を含む第１の容器、
−緩衝液を含む第２の容器、を備えるキットである。
【００３９】
本発明の一実施形態において、前記キットは対照および／または較正物質をさらに備える。
【００４０】
本発明の別の目的は、本明細書上記の方法に従って対象からの試料中のＰＬＡ１またはＰＬＡ２酵素活性を測定することを含む、ＰＬＡ１またはＰＬ２活性関連疾患を有するまたは有する危険があるまたは発症している対象を確認する方法である。
【００４１】
本発明の一実施形態において、前記ＰＬＡ２活性関連疾患は心臓血管疾患および／または心血管系イベントである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明のホスホリパーゼ活性アッセイは、連続的、蛍光測定、反応速度論的活性のアッセイである。それは、固相（例えば微小球体、ビーズ）に被覆した蛍光色素標識基質の分子の、試料中に存在するホスホリパーゼによる加水分解の経時的測定に基づく。
【００４３】
本発明の一目的は、蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質で被覆した固相であって、分子被覆率は、１平方ナノメートル当たり８から３０蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子、好ましくは１平方ナノメートル当たり１５から３０蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子、より好ましくは１平方ナノメートル当たり２０から３０蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子、および一層好ましくは１平方ナノメートル当たり２０から２５蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子の範囲にある。
【００４４】
本明細書において使用される場合、用語「分子被覆率」は、１平方ナノメートル当たりの蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子の平均数または１個の蛍光色素標識基質分子によって保持される平方ナノメートルの数を指す。
【００４５】
分子被覆率は下記方法によって算定することができる：（１）蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子の数を算定する（例えば分光光度定量によって）、（２）固相の表面を算定する（平方ナノメートルで）、次いで、（３）蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子／固相表面の比の数を求める。
【００４６】
本発明者らは、固相（微粒子の場合）の消失がコーティング段階の間に生じないことを仮定して第１の計算を行った。本発明者らは、被覆率を求めるこの第１の方法によって１平方ナノメートル当たり８から１１蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子の分子被覆率が、本発明の方法を行うために必要であると判断した。
【００４７】
しかしながら、（１）固相として微粒子を使用する場合、コーティング工程の間に微粒子の消失があること；および（２）蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子の数字を求める場合に緩衝剤としてＮａＣｌを使用すると、恐らく緩衝液中で基質が沈澱するために基質分子の正確な数を過小評価することを、本発明者らは見出した。
【００４８】
そのような欠点を克服するために、本発明者らは先の方法に基づいて、本発明の固相の分子被覆率を算定する別の方法を開発した：すなわち
−固相が微粒子である場合、コーティング工程の間の消失をモニターし、それにより、さらなる精度で固相の表面を算定するために、微粒子の初めの数、およびコーティング工程後の微粒子の最終数を、Ｂｕｒｋｅｒ血球計数器を使用して集計する。
−分光光度計測定を使用して蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子の数を求める場合、沈澱を阻止しそれによりさらなる精度で蛍光性基質分子の数を算定するために、非陰イオン界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤をＮａＣｌ緩衝剤に添加する。
【００４９】
分子被覆率を求めるより正確なこの方法によって、本発明者らは、先の方法で算定された平方ナノメートル当たり８から１１蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子の分子被覆率は、算定された平方ナノメートル当たり８から３０蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子の分子被覆率に対応すると判断した。
【００５０】
したがって、本発明の一目的は、蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質で被覆した固相であり、ここで、分子被覆率は、１平方ナノメートル当たり８から３０蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子の範囲にあり、分子被覆率は、（１）基質の沈澱を阻止するためにＮａＣｌ緩衝剤に界面活性剤を用いて分光光度定量を使用して、蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子の数を算定すること、（２）固相が微粒子である場合、Ｂｕｒｋｅｒ血球計数器を使用して、コーティング工程後微粒子の数を求め、固相の表面を（平方ナノメートルで）算定すること、次いで、（３）蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子／固相表面の比の値を求めることにより求められる。
【００５１】
本発明の一実施形態において、固相は蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質のみで被覆される。
【００５２】
本発明の別の実施形態において、固相は、ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質の少なくとも９９％，９８％，９７％，９６％，９５％，９０％が蛍光色素で標識付けされたホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質の混合物で被覆されている。
【００５３】
本発明の別の実施形態において、固相は、分子被覆率が１平方ナノメートル当たり８から３０蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子の範囲にある、ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質の少なくとも８０％が蛍光色素で標識付けされたホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質の混合物で被覆されている。
【００５４】
本発明の別の実施形態において、固相は、分子被覆率が１平方ナノメートル当たり８から３０蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子の範囲にある、ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質の少なくとも７０％が蛍光色素で標識付けされたホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質の混合物で被覆されている。
【００５５】
本発明の別の実施形態において、固相は、分子被覆率が１平方ナノメートル当たり８から３０蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子の範囲にある、ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質の少なくとも６０％が蛍光色素で標識付けされたホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質の混合物で被覆されている。
【００５６】
本発明の別の実施形態において、固相は、分子被覆率が１平方ナノメートル当たり８から３０蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子の範囲にある、ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質の少なくとも５０％が蛍光色素で標識付けされたホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質の混合物で被覆されている。
【００５７】
本発明の別の実施形態において、固相は、分子被覆率が１平方ナノメートル当たり８から３０蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子の範囲にある、ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質の少なくとも４０％が蛍光色素で標識付けされたホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質の混合物で被覆されている。
【００５８】
本発明の別の実施形態において、固相は、分子被覆率が１平方ナノメートル当たり８から３０蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子の範囲にある、ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質の少なくとも３０％が蛍光色素で標識付けされたホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質の混合物で被覆されている。
【００５９】
本発明の別の実施形態において、固相は、分子被覆率が１平方ナノメートル当たり８から３０蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子の範囲にある、ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質の少なくとも２０％が蛍光色素で標識付けされたホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質の混合物で被覆されている。
【００６０】
本明細書において使用される場合、用語「〜で被覆した固相」は、基質が直接結合する（例えば被覆される、結合する、固定される、捕捉されるまたは取り込まれる）ことができるまたは、官能化して基質を受け入れる（間接結合）ことができる任意の支持体を指す。基質は、それが溶液中でホスホリパーゼに接近できるように被覆される。
【００６１】
固相は、ポリマー、樹脂、金属またはガラス、およびこれらの組み合わせなどの天然または合成物質、有機または無機の物質から構成することができる。
【００６２】
本発明によると、前記標識基質は固相に安定化される。一実施形態において、前記標識基質は、固相に非共有結合で結合されている。
【００６３】
固相の例は、これらに限定されないが、ラテックス（ポリスチレン）ビーズ、ガラスビーズ、磁気ビーズ、鉄ビーズ、金ビーズなどの微粒子；またはシート、マトリックスまたは試料容器を包含する。試料容器の例は試料ウェル、管、プレートまたはバイアルを包含する。
【００６４】
本発明の一実施形態において、前記標識基質は、ビーズ、好ましくはラテックスビーズに固定させる。
【００６５】
前記ビーズは普通の大きさ、例えば０．５から７μｍ、好ましくは１−６μｍ、好ましくは２−５．５μｍ、より好ましくは３−５μｍ、好ましくは４−４．５μｍである。
【００６６】
本発明によると、蛍光標識ホスホリパーゼ基質は、ホスホリパーゼＡ１およびホスホリパーゼＡ２から選択されるホスホリパーゼによって開裂し得る。
【００６７】
本発明の一実施形態において、前記基質は、疎水性部分、リン酸部分および疎水性部分に直接または任意の連結基を介して結合された蛍光性部分を含む。
【００６８】
本発明の一実施形態において、前記基質は陰イオン、陽イオンまたは中性であってもよいグリセロリン脂質である。好ましくは、前記グリセロリン脂質は陰イオンである。  
【００６９】
前記グリセロリン脂質は式：
【化２】
2012517219.tif 000004
を有する。
【００７０】
基質の疎水性部分は、Ｒ１およびＲ２などの１種以上の疎水性尾部を含むことができる。ただし、Ｒ１およびＲ２は同一または相異なっていてよい。各疎水性尾部の正確な長さおよび／または組成は、選択的に変化し得る。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ同一または相異なる飽和または不飽和のＣ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２２、Ｃ２４またはＣ２６ｎ−アルキル鎖であってよい。
【００７１】
各疎水性尾部は、アルキル、アリールもしくはアリールアルキル基またはそのような基の組み合わせを含んでよい。アルキル基、またはアリールアルキル基のアルキル部は、飽和または不飽和でもよく、コンフォメーションが直鎖、分枝もしくは環状、または直鎖、分枝および環状の組み合わせであってもよい。アリール基またはアリールアルキル基のアリール部は、単環式、多環式、または、二もしくは三環式などであってよい。疎水性部分は２つ、３つまたはさらに多くの疎水性尾部を含んでよい。疎水性部分を含む炭素原子は、様々な置換基で置換されていてよい。結果として得られる標識ホスホリパーゼ開裂基質が評価されている特定のホスホリパーゼによって開裂し得る限り、疎水性部分を含む鎖は、事実上任意の型の連結を介して分子の残りに結合されていてよい、
【００７２】
一実施形態において、ホスホリパーゼＡ１活性が評価されている場合、疎水性尾部Ｒ１はエステル結合によって分子の残りに結合されていなければならない。
【００７３】
別の実施形態において、ホスホリパーゼＡ２活性が評価されている場合、疎水性尾部Ｒ２はエステル結合によって分子の残りに結合されていなければならない。
【００７４】
本明細書において使用される場合、単独または別の置換基の一部としての「アルキル」は、親アルカン、アルケンまたはアルキンの単一炭素原子から１個の水素原子を除去することによって誘導される、明示された数の炭素原子（すなわち、Ｃ１−Ｃ６は１から６個の炭素原子を意味する）を有する飽和または不飽和の分枝、直鎖または環状の一価の炭化水素ラジカルを指す。典型的なアルキル基は、これらに限定されないが、メチル；エタニル、エテニル、エチニルなどのエチル；プロパン−１−イル，プロパン−２−イル、シクロプロパン−１−イル、プロパ−１−エン−１−イル、プロパ−１−エン−２−イル、プロパ−２−エン−１−イル、シクロプロパ−１−エン−１−イルなどのプロピル；シクロプロパ−２−エン−１−イル、プロパ−１−イン−１−イル、プロパ−２−イン−１−イルなど；例えば、ブタン−１−イル、ブタン−２−イル、２−メチル−プロパン−１−イル、２−メチル−プロパン−２−イル、シクロブタン−１−イル、ブタ−１−エン−１−イル、ブタ−１−エン−２−イル、２−メチル−プロパ−１−エン−１−イル、ブタ−２−エン−１−イル、ブタ−２−エン−２−イル、ブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１，３−ジエン−２−イル、シクロブタ−１−エン−１−イル、シクロブタ−１−エン−３−イル、シクロブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１−イン−１−イル、ブタ−１−イン−３−イル、ブタ−３−イン−１−イルなどのブチルを包含する。具体的なレベルの飽和が意図される場合、「アルカニル」、「アルケニル」および／または、「アルキニル」の命名法は以下に定義されるように使用される。いくつかの実施形態において、アルキル基は（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである。
【００７５】
本明細書において使用される場合、単独または別の置換基の一部としての「アリール」は、親芳香族環系の単一炭素原子から１個の水素原子を除去することによって誘導される、明示された数の炭素原子（すなわち、Ｃ５−Ｃ１５は５から１５個の炭素原子を意味する）を有する一価の芳香族炭化水素基を指す。代表的なアリール基は、これらに限定されないが、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、ヘキサンセン、ヘキサフェン、ヘキサレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、オクタセン、オクタフェン、オクタエレン、オバレン、ペンタ−２，４−ジエン、ペンタセン、ペンタレン、ペンタフェン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピラントオレン、ルビセン、トリフェニレン、トリナフタレンなど、および様々なこれらのヒドロ異性体に由来する基を包含する。いくつかの実施形態において、アリール基は（Ｃ５−Ｃ１５）アリールであり、より一層好ましいのは（Ｃ５−Ｃ１０）アリールである。特に好ましいアリールはシクロペンタジエニル、フェニルおよびナフチルである。
【００７６】
本明細書において使用される場合、単独または別の置換基の一部としての「アリールアルキル」は、通常、末端またはｓｐ３炭素原子である炭素原子に結合されている水素原子の１個がアリール基と置き換えられた非環式のアルキル基を指す。代表的なアリールアルキル基は、これらに限定されないが、ベンジル、２−フェニルエタン−１−イル、２−フェニルエテン−１−イル、ナフチルメチル、２−ナフチルエタン−１−イル、２−ナフチルエテン−１−イル、ナフトベンジル、２−ナフトフェニルエタン−１−イルなどを包含する。具体的なアルキル部分が意図される場合、アリールアルカニル、アリールアルケニルおよび／または、アリールアルキニルという命名法が使用される。いくつかの実施形態において、アリールアルキル基は（Ｃ６−Ｃ２１）アリールアルキルであり、例えば、アリールアルキル基のアルカニル、アルケニルまたはアルキニル部分は（Ｃ１−Ｃ６）であり、アリール部分は（Ｃ５−Ｃ１５）である。いくつかの実施形態において、アリールアルキル基は（Ｃ６−Ｃ１３）であり、例えばアリールアルキル基のアルカニル、アルケニルまたはアルキニル部分は（Ｃ１−Ｃ３）であり、アリール部分は（Ｃ５−Ｃ１０）である。
【００７７】
本発明の一実施形態において、Ｒ１およびＲ２鎖は、標識ホスホリパーゼ基質の疎水性部分が天然のリン脂質の疎水性部分に対応するようにリン脂質を含むと一般に知られているアルキル鎖の中から選択される。適切なｎ−アルキル鎖の限定されない例は、以下の脂肪酸などの一般に存在する脂肪酸から誘導されるものを包含する：ミリスチン酸（長さ−不飽和Ｃ−Ｃ結合の数：１４−０）、パルミチン酸（１６−０）、ステアリン酸（１８−０）、オレイン酸（１８−１  ｃｉｓΔ９）、リノール酸（１８−２  ｃｉｓΔ９’１２）、リノレン酸（１８−３  ｃｉｓΔ９’１２’１５）、アラキドン酸（２０−４  ｃｉｓΔ５’８’１１’１４）、エイコサペンタエン酸（２０−５  ｃｉｓΔ５’８’１１’１４’１７）。
【００７８】
本発明の一実施形態において、前記陰イオン性グリセロリン脂質は、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルメタノール、ホスファチジルセリンおよびホスファチジン酸の群において選択される。
【００７９】
本発明によると、基質は、ｓｎ−１脂肪酸アシル鎖の末端および／またはｓｎ−２脂肪酸アシル鎖の末端に蛍光団で標識付けされてもよい。本発明の一実施形態において、基質は蛍光団で直接標識付けされる。本発明の別の実施形態において、基質は連結基を介して蛍光団で標識付けされる。前記連結基には、例えばアルキル鎖などの疎水性連結基が好ましい。
【００８０】
本発明の一実施形態において、ホスホリパーゼＡ１活性が評価されている場合、基質は、少なくともｓｎ−１脂肪酸アシル鎖の末端に蛍光団で標識付けされる。
【００８１】
本発明の別の実施形態において、ホスホリパーゼＡ２活性が評価されている場合、基質は、ｓｎ−２脂肪酸アシル鎖の少なくとも末端に蛍光団で標識付けされる。
【００８２】
本発明によると、蛍光団は、アッセイ培体中で検出可能な蛍光発光シグナルを生成することができ、蛍光発光シグナルは「自己クエンチ」することができ、かつ水性媒体中で蛍光を発することができるという特性を有する任意の蛍光団であってもよい。
【００８３】
本明細書において使用される場合、「クエンチ」は、減少が達成されるメカニズムにかかわらず、特定の波長で測定される蛍光基の蛍光強度の減少を指す。具体的な例として、クエンチは、分子衝突、ＦＲＥＴなどのエネルギー移動、蛍光基の蛍光スペクトル（色度）の変化または他のメカニズムによってもよい。減少の量は重要でなく、広範囲にわたり変動してもよい。唯一の必要条件は、使用されている検出システムによって減少が測定可能であるということである。したがって、指定された波長でその強度が何らかの測定可能な量だけ減少する場合、蛍光発光シグナルは「クエンチされる」。
【００８４】
理論に束縛されることは好まないが、本発明者らは、基質が膜二重層に詰め込まれる場合、近隣のリン脂質から蛍光団が接近すると、モノマーの分子のものと比べて分光特性の変化をもたらす（エクシプレックス形成またはクエンチングのために）と述べている。蛍光団脂肪酸は、ホスホリパーゼ触媒反応によってグリセリン骨格から遊離する場合、水相中に存在するウシ血清アルブミンによって取り込まれる。これらの特色によって、モノマーアルブミン結合蛍光団脂肪酸の蛍光発光のモニターにより、敏感なホスホリパーゼアッセイが可能になる。この蛍光測定アッセイは生成物形成を間断なくモニターし、アッセイの感度は、放射性標識リン脂質を用いる従来の固定時間−点アッセイのそれに近づく。
【００８５】
そのような蛍光団の例は、フルオレセイン、ローダミンおよびロードールなどのキサンテン、シアニン、フタロシアニン、スクアライン（ｓｑｕａｉｒａｎｉｎｅｓ）、ボディピー色素、ピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドールもしくはベンズインドール、オキサゾールもしくはベンゾキサゾール、チアゾールもしくはベンゾチアゾール、カルボシアニン、カルボスチリル、ポルフィリン（ｐｒｏｐｈｙｒｉｎ）、サリチラート、アントラニラート、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、ボラポリアザインダセン、キサンテン、オキサジンもしくはベンゾキサジン、カルバジン、フェナレノン、クマリン、ベンゾフランまたはベンズフェナレノンである。
【００８６】
適切なローダミン色素の例は、これらに限定されないが、ローダミンＢ、５−カルボキシローダミン、ローダミンＸ（ＲＯＸ）、４，７−ジクロロローダミンＸ（ｄＲＯＸ）、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、４，７−ジクロロローダミン６Ｇ、ローダミン１１０（Ｒ１１０）、４，７−ジクロロローダミン１１０（ｄＲ１１０）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）および４，７−ジクロロテトラメチルローダミン（ｄＴＡＭＲＡ）を包含する。
【００８７】
フルオレセイン染料の例は、これらに限定されないが、４，７−ジクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）および６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）を包含する。
【００８８】
市販の蛍光色素の例は、これらに限定されないが、５−カルボキシフルオレセイン−ビス−（５−カルボキシメトキシ−２−ニトロベンジル）エーテル−アラニン−カルボキサミドスクシンイミジルエステル（ＣＭＮＢかご型カルボキシフルオレセイン（ＳＥ）；５−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（５−ＦＡＭ，ＳＥ）；５−（および−６）−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（５（６）−ＦＡＭ，ＳＥ）；５−（４，６−ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセイン（５−ＤＴＡＦ）；６−（フルオレセイン−５−カルボキサミド）ヘキサン酸スクシンイミジルエステル（５−ＳＦＸ）；６−（フルオレセイン−５−（および−６）−カルボキサミドヘキサン酸スクシンイミジルエステル（５（６）−ＳＦＸ）；６−（フルオレセイン−５−（および−６）−カルボキサミドヘキサン酸スクシンイミジルエステル（５（６）−ＳＦＸ）；フルオレセイン−５−ＥＸスクシンイミジルエステル；フルオレセイン−５−イソチオシアナート（ＦＩＴＣ、「異性体Ｉ」）；フルオレセイン−５−イソチオシアナート（ＦＩＴＣ、「異性体Ｉ」）；フルオレセイン−５−イソチオシアナート（ＦＩＴＣ、「異性体Ｉ」）；フルオレセイン−６−イソチオシアナート（ＦＩＴＣ、「異性体ＩＩ」）；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）スルホニルクロリド；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）スルホニルクロリド；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）−Ｘ、ＳＴＰエステル、ナトリウム塩；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）−Ｘスクシンイミジルエステル；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）−Ｘスクシンイミジルエステルを包含する。
【００８９】
本発明の一実施形態において、前記基質はベンゾ（ｄ，ｅ，ｆ）フェナントレンまたはボディピーＦＬ（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン）などのピレンで標識付けされる。
【００９０】
リン脂質は従来の合成法を使用して調製することができる。リン脂質の合成は、Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｇ．Ｃｅｖｃ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ（１９９３），Ｇ  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、ＳｕｂｒａｍａｎｉａｎらＡＲＫＩＶＯＣ  ＶＩＩ：１１６−１２５（２００２）に記載されている。例えば、リン脂質は、選択された脂肪酸無水物との３−置換ホスホグリセロ化合物の反応から調製することができる。代替として、リン脂質は、天然起源（例えば卵黄、脳または植物起源）から抽出することができるか、または（例えばＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから）購入することができる。適切なホスホグリセロ化合物の例は、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンおよびグリセリン−３−ホスホセリンを包含し、そのどちらかは購入（例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから）して得る、または天然起源から抽出によって得ることができる。脂肪酸無水物は脂肪酸から調製され、これは従来法によって合成する、天然起源から抽出するまたは購入することができる。
【００９１】
本発明の別の実施形態において、前記基質は、ｓｎ−１またはｓｎ−２脂肪酸鎖の一方に蛍光団で標識付けされ、かつ、クエンチャーは、残りのｓｎ−１またはｓｎ−２脂肪酸鎖に存在する。
【００９２】
理論に束縛されることは好まないが、本発明者らは、これらのリン脂質が膜二重層に詰め込まれる場合、近隣のリン脂質分子から分子内で２個の蛍光団が接近すると、モノマーの分子のものと比べて分光特性の変化をもたらす（クエンチング）と述べている。ＦＲＥＴ（Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動）は、初めの励起ドナーからアクセプターへの励起状態エネルギーの距離依存的移動であり、ドナー分子はアクセプターの吸収と重なる、より短い波長を、通常、放射する。ドナー（蛍光団）およびアクセプター（別の蛍光団またはクエンチャー）が所定距離、通常１０−１００Å内にある場合、ＦＲＥＴが発生する。エネルギー移動が５０％である、ドナーアクセプター距離はＦｏｒｓｔｅｒ半径（Ｒｏ）と呼ばれる。この距離内で、ドナーがクエンチャーにその共鳴エネルギーを移動させる場合、ドナー蛍光発光の減少が見られる。ドナーアクセプター距離がＦｏｒｓｔｅｒ半径を上回ると、ＦＲＥＴ効率は劇的に落ちる。
【００９３】
ｓｎ−１およびｓｎ−２脂肪酸アシル鎖に標識付けするために使用することができるＦＲＥＴドナーアクセプター対の例は、これらに限定されないが、７−ジエチルアミノ−３（（４−ヨードアセチル）アミノ（ＮＢＤ）（ドナー）とＮ−（７−ニトロ−２−１，３−ベンズオキサジアゾール−４−イル（アクセプター）または７−ジエチルアミノ−３（（４’ヨードアセチル）アミノ（ＮＢＤ）（ドナー）と９−ジエチルアミノ−５Ｈ−ベンゾ［アルファ］フェノキサジン−５−オン（ナイルレッド）（アクセプター）である。
【００９４】
ホスホリパーゼＡ２活性を求めるために使用される基質の例は、グリセロリン脂質であり、ここで、ＮＢＤ蛍光団は、非加水分解性のエーテル結合でｓｎ−１位で共有結合され、ナイルレッドはエステル結合でｓｎ−２位で結合されている。
【００９５】
ホスホリパーゼＡ２活性を求めるために使用される基質の別の例は、グリセロリン脂質であり、ここで、ボラポリアザインダセン蛍光団、好ましくは４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ−，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ボディピー）は、非加水分解性のエーテル結合でｓｎ−１位で共有結合され、エステル結合でｓｎ−２位で結合されている。
【００９６】
ホスホリパーゼＡ１活性を求めるために使用される基質の例は、グリセロリン脂質であり、ここで、ボラポリアザインダセン蛍光団（好ましくは４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ−，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ボディピー））は、ｓｎ−１位でエステル結合で共有結合され、ｓｎ−２位で非加水分解性のエーテル結合で結合されている。
【００９７】
本発明の別の実施形態において、ホスホリパーゼＡ１活性が評価されている場合、基質は、ｓｎ−２脂肪酸アシル鎖の末端に蛍光団として置換または無置換ピレンで、およびｓｎ−１脂肪酸アシル鎖にクエンチャーで標識付けされる。
【００９８】
本発明の別の実施形態において、ホスホリパーゼＡ２活性が評価されている場合、基質は、ｓｎ−１脂肪酸アシル鎖の末端に蛍光団として置換または無置換ピレンで、およびｓｎ−２脂肪酸アシル鎖にクエンチャーで標識付けされる。
【００９９】
これらの基質は蛍光団として置換または無置換ピレンを含むが、そのような蛍光発光はクエンチャーによってクエンチされるので、これらは蛍光性ではない。ホスホリパーゼＡ１またはＡ２の影響下で、クエンチャーは開裂され残りの基質から空間的に分離され、それによりホスホリパーゼＡ１またはＡ２活性に比例する蛍光強度の増加を可能にする。
【０１００】
蛍光団として使用されるピレンは、より低い極性、消光波長と発光波長間の大きな隔たり、水溶液中で機能する能力、ならびにより高い濃度でのエキシマーの形成およびより大きい波長への発光波長の同時シフトという利点を提供する。
【０１０１】
この実施形態によると、クエンチャーの例は、これらに限定されないが、１個以上の、特に２個のニトロ基、例えば２，４−ジニトロフェニル残基などで置換されたフェニル残基を包含する。
【０１０２】
この実施形態によると、蛍光団およびクエンチャーは連結基を介してｓｎ−１およびｓｎ−２脂肪酸アシル鎖に結合されている。
【０１０３】
一実施形態において、ｓｎ−１またはｓｎ−２脂肪酸アシル鎖に蛍光団を結合するために使用される連結基は、エーテル（Ｒ１−ＯＲ２）ｍ（式中、Ｒ１およびＲ２は独立して選択され、１から１２の炭素原子を有する炭化水素から誘導され、ｍは１から４の整数である。）から誘導することができる。好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、ｎが２から１２の整数である（ＣＨ２）ｎである。好ましい連結基の例は（ＣＨ２）４−Ｏ−（ＣＨ２）１０である。ＣＨ２鎖を含む連結基は、それらが特別の代謝安定性を有しているので特に好ましい。
【０１０４】
別の実施形態において、ｓｎ−１またはｓｎ−２脂肪酸アシル鎖に蛍光団を結合するために使用される連結基は、炭化水素Ｒ、好ましくは（ＣＨ２）Ｏ（式中、ｏは１から２０、特に２から６の整数である。）から誘導してもよい。これらの連結基もまた、代謝的に安定している。
【０１０５】
一実施形態において、ｓｎ−１またはｓｎ−２脂肪酸アシル鎖にクエンチャーを結合するために使用される連結基は、Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ＰまたはＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）Ｐ−ＮＨ（式中、ｐは１から２０、好ましくは２から６の整数である。）から誘導してもよい。好ましくは、前記連結基はＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）５−ＮＨである。これらの連結基は代謝的に安定しているので、特によく適合している。
【０１０６】
当業者は、本発明の基質を調製するために有機合成化学の従来の反応および方法を使用するであろう。
【０１０７】
固相に被覆することができる蛍光標識基質の実施例は下記の通りである：Ａｖｅｎｔｉによって商品化された蛍光グリセリン系脂質（ホスファチジルコリン（ＮＢＤ）、ホスファチジン酸（ＮＢＤ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＮＢＤ）、ホスファチジルグリセロール（ＮＢＤ）、ホスファチジルセリン（ＮＢＤ））；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓによって商品化された蛍光リン脂質（ホスホコリンボディピーＤ−３７９３、Ｄ−３７９５、ホスホコリンボディピーＦＬ  Ｄ−３７９２、Ｄ−３８０３およびＤ−３７７１ホスファチジン酸ボディピーＦＬ  Ｄ−３８０５、ホスホエタノールアミンボディピーＤ−３８１３、ホスホコリンボディピーＤ−３８０６、ホスホコリンＤＰＨ  Ｄ−４７６、ホスホコリンＮＢＤ  Ｎ−３７８６およびＮ−３７８７、ホスホコリンペリレンＨ−３７９０、ホスホコリンピレンＨ−３６１、Ｈ−３８１８、Ｂ−３７８１およびＢ−３７８２、ホスホエタノールアミンピレンＨ−３７８４、ホスホグリセリンピレンＨ−３８０９、ならびにホスホメタノールピレンＨ−３８１０およびＯ−７７０３）。
【０１０８】
本発明の一実施形態において、蛍光色素標識基質を含む溶液で固相を被覆する方法は、以下の通りである。蛍光色素標識基質を、ガラス容器内で１０％メタノール／９０％クロロホルム（体積／体積）中で超音波処理を使用して可溶化しストック溶液を調製する。
蛍光色素標識基質の正確なモル濃度を、５点の標準曲線（メタノールで１／１００および１／１６００に稀釈、階段式稀釈、係数２）を通る吸光度によって標準曲線の助けを借りて求める。ここで、蛍光色素標識基質は、１０％メタノール／９０％クロロホルム（体積／体積）溶液をメタノールで１／１００に稀釈したとして定義されたブランクを用いて超音波処理したストック溶液から調製する。
【０１０９】
固相が微粒子である場合、メタノール中の１０％微粒子懸濁液を、メタノールで稀釈（１：５体積／体積）し、続いて超音波処理することによって調製する。コーティング溶液は、メタノールに蛍光色素標識基質（ストック溶液からの）を添加することにより調製する。次いで、コーティング溶液は５０ｍＬガラス管中の微粒子メタノール懸濁液（１：１体積／体積）に添加し、次いで、溶媒は、緩やかに振盪（４００ｒｐｍ）しながら３７℃で終夜蒸発させる。被覆した微粒子は、微粒子の乾燥ペレットに１５０ｍＭ  ＮａＣｌを添加し、続いて超音波処理することにより１度好ましくは２度または３度洗浄する。被覆した微粒子を１日から５日間静置し、次いで、再洗浄する（４０００から８０００ｇ）。
【０１１０】
被覆した微粒子を遠心分離によって回収し、上澄みは吸光度測定（ブランク１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）によって収率を決定するために保管する。
【０１１１】
コーティングの収率（通常７５から８５％）は、微粒子に加えた初期のストック溶液から洗浄上澄み全体で検出された基質の量を減じることにより求めた。
【０１１２】
固相がプレートである場合、コーティング溶液はメタノール中の蛍光色素標識基質を添加することにより調製する。コーティング溶液はプレートに添加し、次いで、溶媒は、緩やかに振盪（４００ｒｐｍ）しながら３７℃で終夜蒸発させる。被覆したプレートは、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを添加することにより１度好ましくは２度または３度洗浄する。１から５日間被覆したプレートを静置させ、次いで、また洗浄する（４０００から８０００ｇ）。
【０１１３】
被覆したプレートを遠心分離によって回収し、上澄みは吸光度測定（ブランク１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）によって収率を決定するために保管する。
【０１１４】
コーティングの収率（通常７５から８５％）は、プレートに加えた初期のストック溶液から洗浄上澄み全体で検出された基質の量を減じることにより求めた。
【０１１５】
本発明の一目的は、試料中のホスホリパーゼＡ１またはＡ２活性を測定する方法であって、
−ホスホリパーゼが蛍光標識ホスホリパーゼ基質を開裂可能にするのに効果的な条件下で、本明細書上記の蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質で被覆した固相と試料を接触させること、
−時間の関数として蛍光発光を検出すること、
を含む方法である。
【０１１６】
本発明の一実施形態において、試料は、尿、血清、血漿試料、全血、気管支肺胞洗浄液、痰、関節液、羊水、腹腔液、脳脊髄液、胸水、囲心腔液および肺胞マクロファージから選択される生物学的試料である。
【０１１７】
本発明の文脈において「試料」は、細胞培養試料または対象から単離された生物学的試料であってよく、対象から得られた体液および／またはホモジネートまたは可溶化組織などの組織抽出物を、例として、限定されずに、包含することができる。組織抽出液は、組織生検および剖検材料からルーチン的に得られる。
【０１１８】
ホスホリパーゼが蛍光標識ホスホリパーゼ基質を開裂する効果的な条件は、当技術分野で周知であり、例えば２０から４０℃の温度である。
【０１１９】
本発明の別の実施形態において、本明細書の上記の本発明の方法はまた、細胞培養試料中のホスホリパーゼＡ１またはＡ２を測定するために使用されてもよい。
【０１２０】
本発明の別の目的はまた、試料中のカルシウム依存性ホスホリパーゼＡ１およびＡ２活性を測定するための改良方法である。
【０１２１】
カルシウム依存性ホスホリパーゼＡ２は分泌されたホスホリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ２）である。
【０１２２】
カルシウム依存性ホスホリパーゼＡ１は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）−特異的ＰＬＡ１（ＰＳ−ＰＬＡ１）、膜関連ホスファチジン酸（ＰＡ）−選択的ＰＬＡ１ｓ（ｍＰＡ−ＰＬＡ１アルファおよびｍＰＡ−ＰＬＡｌベータ）および内皮リパーゼ（ＥＬ）である。
【０１２３】
試料中のカルシウム依存性ホスホリパーゼＡ１またはＡ２活性を測定する前記方法は、
ａ）ホスホリパーゼＡ１またはＡ２酵素活性がブロックされる条件で標識基質を前記試料と接触させるステップ、
ｂ）経時的に蛍光発光を読み取るステップ、
ｃ）溶液を添加してホスホリパーゼＡ１またはＡ２酵素活性を発生させるステップ、
ｄ）経時的に蛍光発光を読み取るステップ、を含み、
ここで、標識基質は本明細書の上記の通りである。
【０１２４】
本発明の一実施形態において、本方法が行われる温度は、２０から４０℃、好ましくは２４から３６℃、より好ましくは２８から３２℃、最も好ましくは３０℃である。
【０１２５】
本発明の別の実施形態において、ステップａ）は、少なくとも１種の二価イオンキレート剤の存在下で実施される。
【０１２６】
前記二価のイオンキレート剤は、限定されないが、ジアミノエタンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）またはエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）を包含する。
【０１２７】
一実施形態において、前記二価イオンキレート剤はエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）である。
【０１２８】
本発明の別の実施形態において、二価イオンキレート剤の濃度は、１ｍＭから２０ｍＭ、好ましくは２ｍＭから１０ｍＭ、より好ましくは３ｍＭから６ｍＭである。
【０１２９】
本発明の別の実施形態において、蛍光発光は経時的に読み取る。例えば、３０秒から５分、好ましくは６０秒から３分、より好ましくは９０秒から２分である。蛍光発光は、使用する蛍光団によって判断した波長で読み取る。
【０１３０】
本発明の別の実施形態において、ホスホリパーゼＡ１またはＡ２酵素活性を発生させる溶液は、過剰のＣａ２＋二価イオンを含む。
【０１３１】
二価イオンの例は、これらに限定されないが、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、臭化カルシウム（ＣａＢｒ２）、硫酸カルシウム（ＣａＳＯ２）、フッ化カルシウム（ＣａＦ２）、ヨウ素酸カルシウム（ＣａＩ２Ｏ６）またはヨウ化カルシウム（ＣａＩ）を包含する。好ましくは、前記Ｃａ２＋イオンはＣａＣｌ２である。
【０１３２】
本発明の別の実施形態において、溶液中のＣａ２＋イオンの濃度は１から１０ｍＭ、好ましくは２ｍＭから８ｍＭ、より好ましくは４ｍＭから７ｍＭである。
【０１３３】
本発明の一実施形態において、ホスホリパーゼＡ１またはＡ２酵素活性を発生させる溶液は手作業で添加する。本発明の別の実施形態において、ホスホリパーゼＡ１またはＡ２酵素活性を発生させる溶液は自動的に添加される。
【０１３４】
本発明の別の実施形態において、反応のｐＨは、６から１０、好ましくは７から９、より好ましくは８から９である。
【０１３５】
本発明の別の目的は、
−本明細書の上記の固相に固定させた標識基質を含む第１の容器、
−少なくとも１種の緩衝液を含むアッセイ緩衝剤を含む第２の容器、
を備えるキットである。
【０１３６】
一実施形態において、前記キットは、
−本明細書の上記の固相に固定させた標識基質を含む第１の容器、
−少なくとも緩衝溶液、１種以上の二価イオンキレート剤およびウシ血清アルブミンを含むアッセイ緩衝剤を含む第２の容器、
−Ｃａ２＋二価のイオンを含むホスホリパーゼＡ１またはＡ２酵素活性を発生させる溶液を含む第３の容器、を備える。
【０１３７】
本発明の一実施形態において、固相に固定させた標識基質は、懸濁液、水溶液、乾燥した形態、または凍結乾燥した形態で存在する。
【０１３８】
本発明の一実施形態において、アッセイ緩衝剤は酢酸塩、ＡＤＡ、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、Ｂｉｃｉｎ、ビス‐トリスプロパン、グリシルグリシン、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、リン酸塩、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、タウリン、トリシンおよびトリエタノールアミンなどの緩衝液を含む。
【０１３９】
本発明の一実施形態において、アッセイ緩衝剤は、これらに限定されないが、ジアミノエタンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）またはエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）を包含する二価イオンキレート剤を含む。好ましくは、前記二価イオンキレート剤はエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）である。
【０１４０】
本発明の別の実施形態において、二価イオンキレート剤の濃度は、１ｍＭから２０ｍＭ、好ましくは２ｍＭから１０ｍＭ、より好ましくは３ｍＭから６ｍＭである。
【０１４１】
本発明の一実施形態において、アッセイ緩衝剤は、ウシ血清アルブミン、好ましくは脂肪酸を含まないウシ血清アルブミンを含む。
【０１４２】
一実施形態において、アッセイ緩衝剤中に存在するウシ血清アルブミンの範囲は、０．０５％から１０％、好ましくは０．０７５％から５％、より好ましくは０．１％から０．５％である。
【０１４３】
本発明の別の実施形態において、アッセイ緩衝剤はＮａＣｌをさらに含む。一実施形態において、アッセイ緩衝剤中に存在するＮａＣｌの濃度は、１０ｍＭから５００ｍＭ、好ましくは１００ｍＭから２５０ｍＭ、より好ましくは１３０ｍＭから１７０ｍＭである。
【０１４４】
本発明の一実施形態において、キットは少なくとも１種の較正物質および／または少なくとも１種の対照試料をさらに含む、または備える。
【０１４５】
ＰＬＡ１活性を測定する方法で使用される較正物質は任意のＰＬＡ１であってもよい。
【０１４６】
ＰＬＡ１較正物質の一例は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈからのヒト膵リパーゼ（膵液からの）ＢＣＲ６９３である。較正試料は、一般に、ＰＬＡ１酵素でスパイクをつけた、試験試料以外の同一の性質の試料である。
【０１４７】
ＰＬＡ２活性を測定する方法で使用される較正物質は任意のＰＬＡ２であってもよい。
【０１４８】
ｓＰＬＡ２較正物質の一例としては、試験試料以外の同一の性質のヒト試料にスパイクをつけたハチ毒（ｂｖ−ｓＰＬＡ２）から抽出されたｓＰＬＡ２が好ましい。例えば、試験試料が血漿または血清試料なら、較正物質は、ヒト血漿または血清にスパイクをつけたｓＰＬＡ２を含む試料になる。
【０１４９】
ＰＬＡ２較正物質の別の実施例には、哺乳動物血清、好ましくはウシ血清または血漿または血漿にスパイクをつけたハチ毒（ｂｖ−ｓＰＬＡ２）から抽出されるｓＰＬＡ２が好ましい。
【０１５０】
前記較正物質は相異なる濃度：例えば０．１５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．３５ｍｇ／ｍｌおよび０．４ｍｇ／ｍｌで準備してもよい。
【０１５１】
対照試料はネガティブおよび／またはポジティブコントロールであってもよい。
【０１５２】
ポジティブコントロールは、例えば、既知のＰＬＡ１またはＰＬＡ２活性を有する試料、または既知の濃度のＰＬＡ１またはＰＬＡ２を含む試料である。例えば、ｓＰＬＡ２活性を測定する方法において使用される正の対照はｂｖ−ｓＰＬＡ２の公知の濃度を含む試料である。較正物質に関しては、ポジティブまたはネガティブコントロールのために使用された試料は試験試料以外の同一の性質のものである。
【０１５３】
好ましくは、ポジティブな試料中に存在するＰＬＡ１またはＰＬＡ２の濃度は較正物質中に存在するＰＬＡ１またはＰＬＡ２の濃度とは異なる。例えば、ポジティブコントロールのｓＰＬＡ２の濃度は０．２７５ｍｇ／ｍｌであってもよい。
【０１５４】
ネガティブコントロールは、例えば実質的に健常の提供者からの試料である。本明細書において使用される実質的に健常の提供者とは、ＰＬＡ１またはＰＬＡ２活性関連疾患と診断されていない、または、ＰＬＡ１またはＰＬＡ２活性関連疾患の症状を示さない提供者を指す。
【０１５５】
本発明の方法の１つの特別の利点は、最小検出限界が約０．００１ｐｍｏｌのホスホリパーゼ酵素であるという、その感度である。
【０１５６】
本発明の別の目的は、本明細書の上記の本発明の方法に従って対象からの試料中のｓＰＬＡ２酵素活性を測定することを含む、ｓＰＬＡ２活性関連疾患を有する、有する危険がある、または発症する対象を確認する方法である。
【０１５７】
本発明の文脈において、「対象」は好ましくは哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、人類以外の霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであってもよいが、これらの例に限定されない。
【０１５８】
一実施形態において、前記ｓＰＬＡ２活性関連疾患の例としては、炎症性疾患、癌、敗血症、重度の火傷、重い外科手術または重傷領域を含む他の損傷、糖尿病性機能障害、急性肝不全、膵臓炎、神経変性疾患、自己免疫疾患、例えば、ＳＬＥ、変形性関節炎、リューマチ性関節炎、多発性硬化症、重症筋無力症、グレーヴズ病、尋常性乾癬、拡張型心筋症、糖尿病、ベヒテレフ病、炎症性胆汁疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、特発性血小板減少症紫斑病（ＩＴＰ）、プラスチック貧血、特発性の拡張型心筋症（ＩＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、動脈性および静脈性慢性炎症を包含するが、これらに限定されない。
【０１５９】
別の実施形態において、前記ｓＰＬＡ２活性関連疾患は心臓血管疾患および／または心血管系イベントである。
【０１６０】
前記心臓血管疾患および／または心血管系イベントの例は、メタボリックシンドローム、症候群Ｘ、アテローム性動脈硬化症、アテローム血栓症、冠動脈疾患、安定および不安定狭心症、卒中、大動脈およびその分枝の疾患（大動脈弁狭窄症、血栓症または大動脈瘤などの）、末梢動脈疾患、末梢血管疾患、脳血管疾患、および何らかの急性虚血性心血管系イベントを包含するが、これらに限定されない。
【０１６１】
一実施形態において、ｓＰＬＡ２活性関連疾患を有する危険があるまたは発症している対象は、実質的に健常な対象である。これは、対象が、虚血性症候または無症候性虚血を伴う若しくは虚血を伴わない無症候性冠動脈疾患などの疾患；安定性または労作性狭心症などの心筋壊死を伴わない慢性虚血障害；不安定狭心症などの心筋壊死を伴わない急性虚血障害；ＳＴ部分上昇型心筋梗塞または非ＳＴ部分上昇型心筋梗塞などの心筋壊死を伴う虚血障害を示さないことを意味する。
【０１６２】
別の実施形態において、ｓＰＬＡ２活性関連疾患を発症する危険がある対象は、虚血性症候または無症候性虚血を伴う若しくは虚血を伴わない無症候性冠動脈疾患などの疾患；安定性または労作性狭心症などの心筋壊死を伴わない慢性虚血障害；不安定狭心症などの心筋壊死を伴わない急性虚血障害；ＳＴ部分上昇型心筋梗塞または非ＳＴ部分上昇型心筋梗塞などの心筋壊死を伴う虚血障害を示す対象である。
【０１６３】
別の実施形態において、本明細書の上記の方法は、本明細書において上に定義される実質的に健常な対象であって、虚血性症候または無症候性虚血を伴う若しくは虚血を伴わない無症候性冠動脈疾患などの疾患；安定性または労作性狭心症などの心筋壊死を伴わない慢性虚血障害；不安定狭心症などの心筋壊死を伴わない急性虚血障害；ＳＴ部分上昇型心筋梗塞または非ＳＴ部分上昇型心筋梗塞などの心筋壊死を伴う虚血障害を示す対象のｓＰＬＡ２活性関連疾患を発症する危険性の判定を可能にする。
【０１６４】
最近公表された調査（参考文献１−９参照）は、第１三分位（調査集団の下位３３％）に対し、第２および第３三分位（調査集団の上位６７％）においてｓＰＬＡ２活性値に関連する心臓血管疾患（ＣＶＤ）の危険性の増加を示している。したがって、ｓＰＬＡ２に起因するＣＶＤの危険性が有意に増加する個体を識別するためのより保守的な手法は、集団の５０番目の百分位値であってもよい。
【０１６５】
現在のｓＰＬＡ２活性試験において、この閾値は、女性および男性それぞれについて、３９．７Ｕ／ｍＬおよび３３．５Ｕ／ｍＬに対応する。
【０１６６】
本発明の別の目的は、本明細書において上記の本発明の方法に従って対象からの試料中のＰＬＡ１酵素活性を測定することを含む、ＰＬＡ１活性関連疾患を有するまたは有する危険があるまたは発症している対象を識別する方法である。
【０１６７】
本発明の文脈において「対象」は、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物はヒト、人類以外の霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであってもよいが、これらの例に限定されない。
【０１６８】
一実施形態において、前記ＰＬＡ１活性関連疾患は、酸リパーゼ疾患、ウォルマン病またはコレステロールエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）を包含するが、これらに限定されない。
【０１６９】
本発明は、以下の限定されない実施例を考慮すればより完全に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】グリセロリン脂質の加水分解におけるホスホリパーゼ作用部位を示す図である。
【図２】リン脂質被覆ビーズの分子被覆率に対する４０５ｎｍでのバックグラウンド蛍光発光を示す図である。
【図３】ｓＰＬＡ２活性（起点での傾き）対リン脂質被覆ビーズの分子被覆率を示す図である。
【図４】リン脂質被覆ビーズにｂｖ−ｓＰＬＡ２量を増しながら添加した後に得られたプログレス曲線を示す図である。
【図５】リン脂質被覆ビーズに６６ｆｍｏｌのｂｖ−ｓＰＬＡ２を添加した後に得られたプログレス曲線を示す図である。
【図６】相異なる量のＢＳＡの存在下でリン脂質被覆ラテックスビーズの４０５ｎｍでの蛍光発光（平均＋／−ＳＤ）を示す図である。
【図７】本発明の方法によるｓＰＬＡ２活性測定におけるトリグリセリド干渉を示す図である。
【図８】本発明の方法によるｓＰＬＡ２活性測定におけるヘモグロビン干渉を示す図である。
【図９】本発明の方法によるｓＰＬＡ２活性測定におけるビリルビン干渉を示す図である。
【図１０】１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホメタノールリポソームへヒト血清試料３０μＬを添加した後のプログレス曲線を示す図である。
【図１１】公表された方法を使用したｂｖ−ｓＰＬＡ２標準曲線を示す図である。
【図１２】本発明の方法を使用したｂｖ−ｓＰＬＡ２標準曲線を示す図である。
【図１３】年齢４０−５９歳の男女のｓＰＬＡ２活性の累積比分布を示す図である。
【図１４Ａ】本発明の方法を使用したｂｖ−ｓＰＬＡ２標準曲線を示す図である。
【図１４Ｂ】ミカエリス−メンテンモデルをあてはめた本発明の方法を使用したｂｖ−ｓＰＬＡ２標準曲線を示す図である。
【図１５Ａ】Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｋｉｔを使用したｂｖ−ｓＰＬＡ２標準曲線を示す図である。
【図１５Ｂ】Ｃａｙｍａｎ  ｋｉｔを使用したｂｖ−ｓＰＬＡ２標準曲線を示す図である。
【図１５Ｃ】本発明の方法を使用したｂｖ−ｓＰＬＡ２標準曲線を示す図である。
【図１６】Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ法および本発明の方法を使用したヒト試料中のｓＰＬＡ２活性の比較を示す図である。
【０１７１】
実施例
１−本発明の方法によるリン脂質被覆固相の調製
【０１７２】
材料および試薬
β−ｐｙ−Ｃ１０−ホスホグリセリン（β−ｐｙ−Ｃ１０−ＰＧ）をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。φ４．１５μｍポリスチレン微小球体（ビーズ）はＭｅｒｃｋ／Ｅｓｔａｐｏｒから購入した。９６ウェルプレートをＮｕｎｃから購入した。他の全試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈｔから入手した。
【０１７３】
実験プロトコル
全ステップは光に直接暴露しないでガラス器具中で実施した。
【０１７４】
ガラス容器内で１０％メタノール／９０％クロロホルム（体積／体積）中で超音波処理を使用してβ−ｐｙ−Ｃ１０−ホスホグリセリンを可溶化した。β−ｐｙ−Ｃ１０−ホスホグリセリンの正確なモル濃度を、５点の標準曲線（メタノールで１／１００および１／１６００に稀釈、階段式稀釈、係数２）を通る３４２ｎｍでの吸光度によって標準曲線の助けを借りて求めた。ここで、標準曲線は、１０％メタノール／９０％クロロホルム（体積／体積）溶液をメタノールで１／１００に稀釈したとして定義されたブランクを用いて超音波処理したストック溶液から作製した。
【０１７５】
メタノール中の１０％ビーズ懸濁液を、メタノールで稀釈（１：５体積／体積）し、続いて超音波処理することによって調製した。コーティング溶液はメタノール中のβ−ｐｙ−Ｃ１０−ホスホグリセリン（ストック溶液からの）を添加することにより調製した。コーティング溶液は、５０ｍＬガラス管内のビーズメタノール懸濁液（１：１体積／体積）に、またはプレートのウェルに添加し、次いで、溶媒は８時間緩やかに振盪（４００ｒｐｍ）しながら３７℃で蒸発させた。次いで、ビーズおよびプレートは、ビーズ／リン脂質の乾燥ペレット又はウェルに１５０ｍＭ  ＮａＣｌを添加し、続いてビーズを超音波処理することにより３度洗浄した。ビーズおよびプレートを遠心分離によって回収し、上澄みは３４２ｎｍでの吸光度測定（ブランク１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）によって収率を決定するために保管した。上澄みで測定した３４２ｎｍでの吸光度が、全上澄みで測定した吸光度の合計の４％未満となるまで、洗浄ステップを繰り返した。コーティングの収率（通常７５から８５％）は、ビーズまたはプレートに加えた初期のストック溶液から洗浄上澄み全体で検出された基質の量を減じることにより求めた。分子被覆率は、ｎｍ２で表わす単位面積当たりの分子数として定義した。ビーズおよびプレートは、光から保護し、ガラス容器中に１ｍＬのアリコートで４℃で保管した。
【０１７６】
２−ｓＰＬＡ２活性アッセイにおけるリン脂質被覆ビーズの分子被覆率の影響
相異なる分子被覆率を有する１％のビーズ懸濁液１０μｌを、１９０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、０．５％ＢＳＡ、６ｍＭ  ＥＧＴＡおよび１００ｍＭ  ＮａＣｌに添加し、４０５ｎｍでの蛍光発光を３５５ｎｍで励起して、撹拌装置および３０℃に制御したサーモスタットを装備したＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ蛍光計で１８０秒間記録した。次いで、蛍光発光シグナル（任意単位）は、アッセイに添加したβ−ｐｙ−Ｃ１０−ホスホグリセリンのモル数に対して標準化した。この分析の結果の代表的な例は図２および表１に示される。
【０１７７】
【表１】
2012517219.tif 000005
【０１７８】
図２中に示されるように、標準化したバックグラウンドは、分子被覆率の増加とともに、７−１５分子／ｎｍ２の範囲の分子被覆率に対しおよそ２５００−３０００ＦＵの最小値に低下した。
【０１７９】
ヒト血清３０μｌにスパイクをつけた精製ハチ毒ｓＰＬＡ２（ｂｖ−ｓＰＬＡ２、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）６６０ｆｍｏｌを、１９０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５，０．５％ＢＳＡ，５ｍＭ  ＣａＣｌ２および１００ｍＭ  ＮａＣｌに添加した１％のビーズ懸濁液１０μｌと混合した。３５５ｎｍで励起した４０５ｎｍでの蛍光発光を撹拌装置および３０℃に制御されたサーモスタットを装備したＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ蛍光計で１８０秒間記録し、起点での傾き（ＦＵ／秒で表す）をプログレス曲線から抽出した。相異なる分子被覆率を比較するアッセイの結果の代表的な例は、図３、および表２に示される。
【０１８０】
【表２】
2012517219.tif 000006
【０１８１】
図３に示されるように、４分子／ｎｍ２未満の分子被覆率を有するリン脂質被覆ビーズを使用する場合は、ｓＰＬＡ２活性は認められなかった。この観察は、リン脂質がその濃度で適切な二重層として組織化されず、そのため酵素によって認識されないということによって説明することができる。
【０１８２】
次いで活性は、分子被覆率が４分子／ｎｍ２に達したときに認められ、被覆率が増加するにつれてわずかに増える。
【０１８３】
コーティング収率（データ示さず）とｓＰＬＡ２活性アッセイのバックグラウンドおよびシグナルとあいだのより良好な折衷は、１０分子／ｎｍ２に集中した。しかしながら、分子被覆率を求める方法は、特に分子数が１０より大きい場合、分子／ｎｍ２の数を過小評価に導いた。本発明の記載において説明される分子被覆率を求めるより正確な方法に従って、このように、ホスホリパーゼＡ１またはＡ２活性を求める本発明の方法において最も効果的であるためには、分子被覆率は８から３０蛍光リン脂質分子／ｎｍ２でなければならないと本発明者らは規定した。
【０１８４】
ヒト血清３０μｌにスパイクをつけた、５種の異なる量の精製ｂｖ−ｓＰＬＡ２（２５、３３、４１、５０および６６ｆｍｏｌ）を、１９０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、０．５％ＢＳＡ、５ｍＭ  ＥＧＴＡおよび１００ｍＭ  ＮａＣｌに添加した、１％ビーズ懸濁液（分子被覆率９１分子／ｎｍ２）１０μｌと混合した。３５５ｎｍで励起した４０５ｎｍでの蛍光発光を、撹拌装置および３０℃に制御したサーモスタットを装備したＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ蛍光計中で５０秒間記録した。５３秒で、１５０ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液２０μｌを混合物に添加し、３５５ｎｍで励起した４０５ｎｍでの蛍光発光はさらに１２５秒間記録した。
【０１８５】
これらのアッセイ中に得られたプログレス曲線の代表的な例を図４に示す。
【０１８６】
図４に示されるように、ｂｖ−ｓＰＬＡ２の量を増やしながら、リン脂質被覆ビーズに添加した後に得られたプログレス曲線は、アッセイが濃度のこの範囲において定量的であることを実証する、より急激な傾きを示す。
【０１８７】
ヒト血清３０μｌにスパイクをつけた、精製ｂｖ−ｓＰＬＡ２  ６６ｆｍｏｌを、１９０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．５、０．５％ＢＳＡ、５ｍＭ  ＥＧＴＡおよび１００ｍＭ  ＮａＣｌに添加した１％ビーズ懸濁液（それぞれ分子被覆率８．４および９．１分子／ｎｍ２）１０μｌと混合した。３５５ｎｍで励起した４０５ｎｍでの蛍光発光を、撹拌装置および３０℃に制御したサーモスタットを装備したＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ蛍光計で５０秒間記録した。５３秒で、１５０ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液２０μｌを混合物に添加し、３５５ｎｍで励起した４０５ｎｍでの蛍光発光はさらに１２５秒間記録した。
【０１８８】
これらのアッセイ中に得られたプログレス曲線の代表的な例は、図５に示す。
【０１８９】
図５中に示されるように、ｓＰＬＡ２活性（起点での傾きとして本明細書で説明される）は、アッセイにおいて使用される、リン脂質被覆ビーズの分子被覆率によって直接影響を受ける。従って、洗浄を包含する調製方法、分子被覆率の測定、およびアッセイに添加されるリン脂質被覆ビーズの量は、敏感なｓＰＬＡ２アッセイに対して重要である。
【０１９０】
３−ｓＰＬＡ２活性アッセイにおけるＢＳＡの影響
１％ビーズ懸濁液１０μｌを、１９０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、６ｍＭ  ＥＧＴＡおよび１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび相異なるＢＳＡ濃度（それぞれ１％、０．５％、０．２５％、０．１％、０．０５％および０．００１％）に添加した。３５５ｎｍで励起した４０５ｎｍでの蛍光発光を、撹拌装置および３０℃に制御したサーモスタットを装備をしたＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ蛍光計で１００秒間記録した。
この分析の蛍光発光平均値の代表的な例を図６に示す。
【０１９１】
図６に示すように、ＢＳＡの濃度は発明の方法の蛍光発光において主要な影響がある。ＢＳＡによるリン脂質被覆ビーズ複合体の再編成および／または架橋は、これらの観察について説明することができる。
【０１９２】
４−本発明の方法の性能特性
【０１９３】
材料および試薬
β−ｐｙ−Ｃ１０−ホスホグリセリン（β−ｐｙ−Ｃ１０−ＰＧ）はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。φ４．１５μｍポリスチレン微小球体（ビーズ）はＭｅｒｃｋ／Ｅｓｔａｐｏｒから購入した。他の全試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈｔから入手した。
【０１９４】
実験プロトコル
ｓＰＬＡ２活性は本発明の方法に従って測定した。
【０１９５】
９６−ウェルプレートにおいて３０℃で緩衝剤（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、０．５％ＢＳＡ、６ｍＭ  ＥＧＴＡおよび１００ｍＭ  ＮａＣｌ）２００μｌの存在下で、ラテックスビーズ（１％ビーズ懸濁液１０μＬ）に固定させた１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセリンに血清試料３０μｌを添加した。
【０１９６】
バックグラウンド蛍光発光は、撹拌装置および３０℃に制御したサーモスタットを装備したＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ蛍光計で、３５５ｎｍで励起した４０５ｎｍで９０秒間記録した。この反応は、ＣａＣｌ２溶液（５５ｍＭ）２０μｌの注入によって開始させ、蛍光計によって自動的に実施した。ＣａＣｌ２注入後に３５５ｎｍで励起した４０５ｎｍでの蛍光発光を９０秒間記録した。得られたプログレス曲線は非線形回帰を使用してあてはめた。バックグラウンドレベルの減算の後、１分の最終点を得られたあてはめ曲線式から求めた。標準検量線は、Ｘ軸上のｓＰＬＡ２濃度に対してＹ軸上の６つのｓＰＬＡ２較正物質のそれぞれについて得られた１分の最終点をプロットすることにより得られ、次いで、各試料の１分の最終点は標準検量線を使用して標準化した。  
【０１９７】
ｓＰＬＡ２活性は、標準化した蛍光発光値を１分で遊離した生成物の量（ｎｍｏｌ）に変換することにより、Ｕ／ｍｌとして表される。試料はすべて二重反復で試験した。
【０１９８】
４．１  アッセイのダイナミックレンジ
アッセイのダイナミックレンジを、既知の量の精製ハチ毒ｓＰＬＡ２（ｂｖ−ｓＰＬＡ２）でスパイクをつけたヒト対象からの血漿試料のアッセイから求めた。
【０１９９】
アッセイの直線性：＞０．９９（較正範囲にわたって）（二次多項式あてはめ）。線形応答は、ｓＰＬＡ２活性の血漿アッセイにスパイクをつけた連続希釈したｂｖ−ｓＰＬＡ２タンパク質から求めた。
【０２００】
アッセイ感度：
最小検出限界は１０Ｕ／ｍＬである（アッセイの比例領域において確実に測定することができる、ｂｖ−ｓＰＬＡ２酵素の最低濃度、すなわち０．０２５ｐｍｏｌから求めた。）。最大検出限界は、２５０Ｕ／ｍＬ（アッセイの比例領域において確実に測定することができる、ｂｖ−ｓＰＬＡ２酵素の最高濃度、すなわち０．５ｐｍｏｌから求めた。）である。
【０２０１】
別のアッセイを、ウシ血清（０．００１ｐｍｏｌから１６７ｐｍｏｌ）にスパイクをつけた広範囲の既知の量のｂｖ−ｓＰＬＡ２を使用して実施した。図１４Ａにおいて示されるように、１０Ｕ／ｍＬから２５０−２８０Ｕ／ｍＬの間の線形応答が観察された。全範囲のダイナミック曲線はミカエリス―メンテンモデルを使用して、最もよく適合した（図１４Ｂ）。このようにこの試験は、本発明の方法において観察された最小検出限界：ｓＰＬＡ２酵素の０．００１ｐｍｏｌの測定を可能にした。
【０２０２】
４．２−アッセイ繰り返し精度（アッセイ内のばらつき）
アッセイ内のばらつきは、同一日に単一ロットの試薬を使用し、同一のアッセイプレートでの１０回のアッセイランの較正範囲にわたって分布する、ヒト対象からの８つの血漿試料の％ＣＶから算定した平均％ＣＶによって評価した。
【０２０３】
表３に示すように、個々のヒト血漿試料のアッセイ内のＣＶは４．６１から１３．５９％の範囲であり、平均アッセイ内のＣＶは８．４６％であった。
【０２０４】
【表３】
2012517219.tif 000007
【０２０５】
４．３−アッセイ精度（アッセイ間のばらつき）
アッセイ間のばらつき
アッセイ内のばらつきは、アッセイ基質および試薬の２つの相異なるバッチを使用して、相異なる３日に相異なる２つの蛍光光度計で２人の作業者によって実施した、ヒト対象からの８つの血漿試料の％ＣＶから算定した平均％ＣＶによって評価した。（表４参照）。
【０２０６】
個々のヒト血漿試料の全アッセイ間のＣＶは１．０５から１３．０８％の範囲で、平均のアッセイ間のＣＶは５．２４％であった。
【０２０７】
【表４】
2012517219.tif 000008
【０２０８】
繰り返し精度検討：
ヒト対象からの１組６３個の血漿試料で行った繰り返し精度検討において、ある日に求めた結果を、別の日に実施した２つの連続的な測定からの結果の平均と比較した。
【０２０９】
試料のｓＰＬＡ２活性レベルは２２．１から２１３Ｕ／ｍＬの範囲であり、繰り返しの間の平均％ＣＶは５．１％であった。
【０２１０】
線形回帰分析において、相関係数ｒ＝０．９８７（傾き０．９７３および切片２．１Ｕ／ｍＬ）であり、第１の測定値は二重反復平均結果と非常に相関があった。
【０２１１】
４．４−凍結／解凍効果
４つの血漿試料を、４回の凍結／解凍サイクル（−８０℃から４℃）各々の後に分析した。
【０２１２】
表５に示されるように、ｓＰＬＡ２活性値に決定的な傾向は観察されなかった。つまり試料を４回凍結し解凍してもよいことを示す。
【０２１３】
【表５】
2012517219.tif 000009
【０２１４】
４．５−試料安定性検討：
２つの新たに収集したヒト血漿試料を、ベンチ上（室温）および４℃で保管し、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、７２時間および１８日後にアッセイした。
【０２１５】
表６に示されるように、１時間−７２時間にわたってｓＰＬＡ２活性値に決定的な傾向は観察されず、試料がその時間の間非常に安定していることを示した。
【０２１６】
【表６】
2012517219.tif 000010
【０２１７】
４．６−好ましいマトリックス
１０人の健常の提供者からの血液試料をドライ、ヘパリン、クエン酸塩およびＥＤＴＡの試料採取管に同一の日に収集し、標準手順に従って処理し−８０℃で保管した。
【０２１８】
ＥＤＴＡ血漿および血清に傾向が観察され、利用可能な場合これらの２つの試料採取管が好ましいことを示している（表７）。
【０２１９】
【表７】
2012517219.tif 000011
【０２２０】
４．７−干渉物質
溶血ｉｃｔｅｒｉａまたは脂肪血症による可能な干渉を、正常血清試料へのヘモグロビン、ビリルビンおよびトリグリセリドの添加により解析した。
【０２２１】
トリグリセリドを増やした試料は、２３ｍｍｏｌ／Ｌもの高いトリグリセリドに対して干渉を示さなかった（図７参照）。
【０２２２】
ヘモグロビンの吸収波長は、アッセイで使用する蛍光色素の吸収波長と部分的にオーバーラップする。ヘモグロビンを増やした試料は、ヘモグロビンとの部分的な干渉が２ｇ／Lから始まることを示した（図８参照）。
【０２２３】
ビリルビンを増やした試料は、５００μｍｏｌ／Ｌもの高いビリルビン濃度に対して測定可能な干渉を示さなかった（図９参照）。
【０２２４】
５−本発明の方法および先の公表された方法の間の比較
【０２２５】
材料および試薬
１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−Ｓ−ホスホメタノールはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。他の全試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈｔから入手した。
【０２２６】
実験プロトコル
ｓＰＬＡ２活性は下記に公表されたプロトコルに従って測定した。
【０２２７】
血清試料の３０μｌを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．７，０．１％ＢＳＡ，１０ｍＭ  ＣａＣｌ２の存在下で１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホメタノールリポソーム５ｍｍｏｌに添加した。蛍光発光を、撹拌装置および３０℃に制御したサーモスタットを装備したＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ蛍光計で、３５５ｎｍで励起して４０５ｎｍで６０秒間記録した。
【０２２８】
基質の１００％加水分解は、０．１Ｕのハチ毒ＰＬＡ２を用いて１分間で得られ、１分の反応終了時の蛍光発光の値（Ｆｍａｘ）は、したがって２ｎｍｏｌｅｓ／分（Ｖｍａｘ）の活性に対応する。試料（ｎｍｏｌ／ｍｌ／分で表す）の活性（Ａ）は、式：Ｖｍａｘ．ＦＡ＝Ｅ．Ｆｍａｘから与えられる。基質の加水分解が５０％を超えたら、試料を希釈する。血漿のない状態において基質の加水分解はネガティブコントロールとして使用し、ＰＬＡ２活性から演繹される。
【０２２９】
５．１−特異性
蛍光発光は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．７、０．１％ＢＳＡ、１０ｍＭＣａＣｌ２の存在下で１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホメタノールリポソーム５ｍｍｏｌに３０μＬヒト血清試料を添加した後、３５５ｎｍで励起して４０５ｎｍで経時的に記録した。図１０に示したように、これらの１１のヒト血清試料は、非常に緩慢な初速度が示すようにｓＰＬＡ２活性をほとんどまたはまったく示さなかった。
【０２３０】
しかしながら、これらの１１のヒト試料のプログレス曲線の最初の数秒間のバックグラウンド蛍光発光は非常に異なり、１６０００から３９０００蛍光発光単位の範囲であった。これらのデータは、ヒト血清試料中に存在する未知因子が、ホスホリパーゼ酵素アッセイの基質として使用されるリポソームの構造に非常に影響を及ぼす場合があり、そのため、ホスホリパーゼ活性の測定に影響を及ぼすという、明白な実証である。
【０２３１】
本発明の方法は、先の公表された方法より特異的である。なぜならば、バックグラウンドのレベルが、
●測定され、蛍光発光シグナルのレベルから減じられる、
●同一反応混合物中で、同一ウェル中で、同一試料の存在下で、バックグラウンドおよびシグナルが測定されるので、よりよく測定される、
●固相へのリン脂質基質の固定化により非常に減少させられる、
からである。
【０２３２】
５．２−感度および直線性
検出下限は、バックグラウンドの平均＋／−３ＳＤと定義され、本発明の方法では１０Ｕ／ｍＬである。既存の方法の検出下限は、同様に定義（バックグラウンドの平均＋／−３ＳＤ）され同一単位で表して、２００Ｕ／ｍＬの範囲にある（データ示さず）。
【０２３３】
本発明の方法は先の公表された方法よりはるかに敏感である。本発明の方法の感度の増加は、既存の方法と比較して１０から２０倍である。これは主として、酵素反応が試料の添加によって開始するので、自動注入が、先の公表された方法より１０−２０秒早く蛍光発光の検出を可能にすることによる。この主要な改善により、初速度がより高速の場合には、反応速度論プログレス曲線の早期時点への到達が可能になる。
【０２３４】
本発明の方法または公表された方法のどちらかを使用し、ｂｖ−ｓＰＬＡ２酵素を増やしながら（試験全体で同一の連続希釈）スパイクをつけた、ヒト血清（試験全体で同一の試料）３０μＬ中のｓＰＬＡ２活性を求めた。次いで、標準曲線を両方の試験のためにプロットした。図１１および１２に示すように、公表された方法の直線性は０．０３ｎＭのｂｖ−ｓＰＬＡ２までに限られたが、本発明の方法を用いたところ、試験全体のｓＰＬＡ２範囲内で直線性が観察された。
【０２３５】
５．３−再現性および繰り返し精度
公表された方法の再現性（アッセイ間のばらつき）および繰り返し精度（アッセイ内のばらつき）は実施例４において使用したものと同様のプロトコルを使用して求めた。
【０２３６】
個々のヒト血漿試料のアッセイ間のＣＶは２８．３％から３２．１％の範囲であり、平均で３０．２％のアッセイ間のＣＶであった。
【０２３７】
個々のヒト血漿試料のアッセイ内のＣＶは４．６％から４０．９％の範囲であり、平均で２５．０％のアッセイ内のＣＶであった。
【０２３８】
実施例４．３に示したように、平均のアッセイ間のおよびアッセイ内のばらつきは、それぞれ５．２４％および８．４６％である。
【０２３９】
したがって、本発明の方法は、それぞれ６倍および４倍の利得を持ち、先の公表された方法よりはるかに正確でより反復可能である。
【０２４０】
本発明の方法において、ピペットで移すステップの回数が少なく、反応を自動開始し、プログレス曲線を自動解析することが、先の公表された方法と比較してより良好な再現性および繰り返し精度を説明できる。
【０２４１】
５．４−Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  Ｋｉｔ（カタログＮｏ  ９０７−００２、Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｉｎｃ．５７７７  Ｈｉｎｅｓ  Ｄｒｉｖｅ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ  ４８１０８，ＵＳＡ）およびｓＰＬＡ２  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（カタログＮｏ．７６５００１））と本発明の方法の直接比較
これらの２つのアッセイキットは基質としてチオ−エステルリン脂質を使用する比色測定法である。ｓＰＬＡ２酵素はｓｎ−２位でチオエステル結合を加水分解し、遊離のチオールがＤＴＮＢを使用して検出される。前記キットの欠点は、
−生物学的試料中の高濃度の遊離チオールによる低い感度および
−遊離チオール汚染物質による不十分なロバストネスである。
【０２４２】
ｓＰＬＡ２活性は、本発明の方法を使用してまたはＳｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  Ｋｉｔ（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ、カタログＮｏ  ９０７−００２）およびｓＰＬＡ２  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（カタログＮｏ．７６５００１）を使用して、求めた。
【０２４３】
ｓＰＬＡ２標準を使用するｓＰＬＡ２活性の測定の比較
Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  Ｋｉｔ（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ）をキットに付属する説明書に従って操作した。ｓＰＬＡ２  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）をキットに付属する説明書に従って操作した。本発明の方法は上記プロトコルに従って実施した。
【０２４４】
Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｋｉｔで提供される１６００Ｕ／ｍＬ  ｓＰＬＡ２標準溶液を、ｓＰＬＡ２活性の独自の起源として使用し、この標準の連続希釈液は３つのアッセイすべてにおいて試験した。
【０２４５】
Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｋｉｔの説明書に従って、提供されるｓＰＬＡ２標準溶液は、それぞれ２０、４０、８０、１６０および３２０倍希釈であった。
【０２４６】
説明書（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｋｉｔ）に従ってキットを操作した後に得られた４０５ｎｍでの吸光度値および傾き（４０５ｎｍ／分での吸光度値、Ｃａｙｍａｎ  ｋｉｔ）を、表１０および表１１にそれぞれ示す。
【０２４７】
図１６に示すように、吸光度対ｓＰＬＡ２標準希釈を両方の比色測定に対してプロットすると、線形応答が観察された。Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｋｉｔの活性単位で表し、両方のアッセイに記載の感度に一致した場合、両方のアッセイの線形範囲は５から８０Ｕ／ｍＬの間に含まれる。
【０２４８】
【表８】
2012517219.tif 000012
【０２４９】
【表９】
2012517219.tif 000013
【０２５０】
本発明の方法の線形範囲にするためには、それぞれ３０００、６０００、１２０００、２４０００および４８０００倍の正確な同一ｓＰＬＡ２標準を希釈しなければならないが、Ａｓｓａｙ  ＤｅｓｉｇｎまたはＣａｙｍａｎ  ｋｉｔ（表１２）と比較した場合、本発明の方法は１５０倍高い感度を示す。
【０２５１】
【表１０】
2012517219.tif 000014
【０２５２】
このようにして、本発明者らは、Ａｓｓａｙ  ＤｅｓｉｇｎおよびＣａｙｍａｎキットと比較して、本発明の方法が１５０倍高感度であることを実証した。
【０２５３】
ヒト試料中のｓＰＬＡ２活性の測定の比較
本発明の方法の全ダイナミックレンジ（３１．６から２１３．６Ｕ／ｍＬ）を包含する、既知のｓＰＬＡ２活性の８つの相異なるヒト血清試料中のｓＰＬＡ２活性を、本発明の方法またはＳｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  Ｋｉｔ（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ）もしくはｓＰＬＡ２  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ）の使用のいずれかを使用して求めた。得られたｓＰＬＡ２活性値を、以下の表１３にリストし、図１６に示す。
【０２５４】
【表１１】
2012517219.tif 000015
【０２５５】
上の実施例に示すように、またＡｓｓａｙ  ＤｅｓｉｇｎまたはＣａｙｍａｎ  ｋｉｔ法の原理により予想されるように、Ａｓｓａｙ  ＤｅｓｉｇｎおよびＣａｙｍａｎからの比色定量キットは全くヒト血清試料中のｓＰＬＡ２の測定に適しておらず、すべての８つの試験試料は範囲外であった。
【０２５６】
チオエステル加水分解に基づく競合アッセイは、生物学的試料および環境中の高濃度の遊離チオールにより非常に低い感度および非常に不十分なロバストネスを示す。Ａｓｓａｙ  ＤｅｓｉｇｎおよびＣａｙｍａｎアッセイは、精製ｓＰＬＡ２について本発明の方法の１００から３００分の１の感度である。Ａｓｓａｙ  ＤｅｓｉｇｎおよびＣａｙｍａｎアッセイは、これらの試料中の高タンパク質ゆえの高濃度の遊離チオールのために、血清または血漿などの生物学的試料と適合しない。
【０２５７】
６−本発明の方法による見たところ健常の対象からの試料中のｓＰＬＡ２活性の測定
本発明者らは、４０−５９歳の臨床的に関連する年齢層において見たところ健常の男性（ｎ＝２４０）および見たところ健常の女性（ｎ＝１５０）からの合計３９０の試料において、その年齢、性別および民族性によるｓＰＬＡ２活性の分布を調査した。
【０２５８】
参照集団は黒人  ｎ＝２１５、白人  ｎ＝１０８、ヒスパニック  ｎ＝６５、他＝２という民族的背景によって表された。
【０２５９】
ｓＰＬＡ２活性は本発明の方法に従って測定した。
【０２６０】
９６−ウェルプレートにおいて３０℃で緩衝剤（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、０．５％ＢＳＡ。６ｍＭ  ＥＧＴＡおよび１００ｍＭ  ＮａＣｌ）２００μｌの存在下で、ラテックスビーズ（１％ビーズ懸濁液）に固定させた１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセリンに血清試料３０μｌを添加した。
【０２６１】
バックグラウンド蛍光発光は、撹拌装置および３０℃に制御したサーモスタットを装備したＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ蛍光計で９０秒間記録した。反応は、蛍光計によって自動的に実施し、ＣａＣｌ２溶液（５５ｍＭ）２０μｌの注入によって開始した。蛍光発光は９０秒間記録し、プログレス曲線は非線形回帰を使用してあてはめた。バックグラウンドレベルの減算の後、１分の最終点は得られたあてはめ曲線式から求めた。標準検量線は、Ｘ軸上のｓＰＬＡ２濃度に対してＹ軸上の６つのｓＰＬＡ２較正物質のそれぞれについて得られた１分の最終点をプロットすることにより得られ、次いで、各試料の１分の最終点は標準検量線を使用して標準化した。
【０２６２】
ｓＰＬＡ２活性は、標準化した蛍光発光値を１分で遊離した生成物の量（ｎｍｏｌ）に変換することにより、Ｕ／ｍｌとして表される。試料はすべて二重反復で試験した。
【０２６３】
解析した全集団において、ｓＰＬＡ２活性は１０．６から７９．９Ｕ／ｍＬの範囲であり、幾何平均ｓＰＬＡ２活性は３５．１Ｕ／ｍＬであり、メジアンは３６．９Ｕ／ｍＬであった。第９５および第９９百分位は、それぞれ男性で４６．１および５２．５であり、女性では６１．６および７２．４であった。
【０２６４】
年齢、性別および人種または民族性によるｓＰＬＡ２活性の百分位分布は表８に示される。解析した母集団中の母集団の年齢で補正した平均ｓＰＬＡ２活性は、表９に示される。
【０２６５】
試料（中央の９０％）から算定された基準範囲は、女性で２９．６−５４．０Ｕ／ｍＬおよび男性で１９．６−５１．２Ｕ／ｍＬであることが見出された。
【０２６６】
最近公表された調査（参考文献５、６、７および９参照）は、第１三分位（調査集団の下位３３％）に対し、第２および第３三分位（調査集団の上位６７％）においてｓＰＬＡ２活性値に関連する心臓血管疾患（ＣＶＤ）の危険性の増加を示している。したがって、ｓＰＬＡ２に起因するＣＶＤの危険性が有意に増加する個体を識別するためのより保守的な手法は、集団の５０番目の百分位値であってもよい。
【０２６７】
現在のｓＰＬＡ２活性試験において、この閾値は、女性および男性それぞれについて、３９．７Ｕ／ｍＬおよび３３．５Ｕ／ｍＬに対応する。
【０２６８】
【表１２】
2012517219.tif 000016
【０２６９】
【表１３】
2012517219.tif 000017
【０２７０】
男女の累積比分布は図１３に示される。
【０２７１】
参考文献
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３−  Ｋｕｇｉｙａｍａ  Ｋ，  Ｏｔａ  Ｙ，  Ｓｕｇｉｙａｍａ  Ｓ，  Ｋａｗａｎｏ  Ｈ，  Ｄｏｉ  Ｈ，  Ｓｏｅｊｉｍａ  Ｈ，  Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ｓ，  Ｏｇａｗａ  Ｈ，  Ｔａｋａｚｏｅ  Ｋ．  Ｙａｓｕｅ  Ｈ，  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｕｎｓｔａｂｌｅ  ａｎｇｉｎａ  ｐｅｃｔｏｒｉｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ，  ２０００  Ｏｃｔ  １：８６  （７）：７１８−２２．
４−  Ｌｉｕ  ＰＹ，  Ｌｉ  ＹＨ，  Ｔｓａｉ  ＷＣ，  Ｃｈａｏ  ＴＨ，  Ｔｓａｉ  ＬＭ．  Ｗｕ  ＨＬ，  Ｃｈｅｎ  ＪＨ．  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ．  Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．，  ２００３  Ｏｃｔ；２４  （２０）：  １８２４−３２．
５−  Ｍａｌｌａｔ  Ｚ，  Ｓｔｅｇ  ＰＧ，  Ｂｅｎｅｓｓｉａｎｏ  Ｊ，  Ｔａｎｇｕｙ  ＭＬ．  Ｆｏｘ  ＫＡ，  Ｃｏｌｌｅｔ  ＪＰ，  Ｄａｂｂｏｕｓ  ＯＨ．  Ｈｅｎｒｙ  Ｐ，  Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ  ＫＦ，  Ｄａｕｐｈｉｎ  Ａ，．  Ａｒｇｕｅｌｌｅｓ  ＣＳ，  Ｍａｓｌｉａｈ  Ｊ，  Ｈｕｇｅ！  Ｂ，  Ｍｏｎｔａｌｅｓｃｏｔ  Ｇ，  Ｆｒｅｙｓｓｉｎｅｔ  ＪＭ，  Ａｓｓｅｌａｉｎ  Ｂ，  Ｔｅｄｇｕｉ  Ａ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ．  Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．，  ２００５  Ｏｃｔ  ４：４６（７）：  １２４９−５７．
６−  Ｗ．  Ｋｏｅｎｉｇ，  ＣＹ．  Ｖｏｓｓｅｎ，  Ｚ．  Ｍａｌｌａｔ，  Ｈ．  Ｂｒｅｎｎｅｒ，  Ａ．  Ｔｅｄｇｕｉ．  Ｄ．  Ｒｏｔｈｅｎｂａｃｈｅｒ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｐｈｏｓｐｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  Ｐｌａｓｍａ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ｈｅａｒｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，  Ｍｕｎｉｃｈ．  Ｇｅｒｍａｎｙ．  ２００８．  Ｐ３６６４  
７−  Ｔａｂａｓｓｏｍｅ  Ｓｉｍｏｎ，  ｊｏｅｌｌｅ  Ｂｅｎｅｓｓｉａｎｏ，  Ｍｕｒｉｅｌｌｅ  Ｍａｒｙ  Ｋｒａｕｓｅ，  Ｅｖａ  Ｎｉｎｉｏ，  Ｇａｂｒｉｅｌ  Ｓｔｅｇ，  Ｇｕｅｒｅｔ  Ｐａｓｃａｌ，  Ｅｌｏｄｉｅ  Ｄｒｏｕｅｔ，  Ａｌａｉｎ  Ｔｅｄｇｕｉ，  Ｎｉｃｏｌａｓ  Ｄａｎｃｈｉｎ，  Ｚｉａｄ  Ｍａｌｌａｔ  ｏｎ  ｂｅｈａｌｆ  ｏｆ  Ｆａｓｔ−Ｍｉ  ｓｔｕｄｙ．  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ＰｈｏｓｐｈｏＬｉｐａｓｅ  Ａ２  （ｓＰＬＡ２）  ａｎｄ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  （Ｌｐ−ＰＬＡ２）  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｎ  ６  ｍｏｎｔｈｓ−ｓｕｒｖｉｖａｌ，  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ＡＭＩ  ａｎｄ  ｉｎｃｉｄｅｎｔ  ｓｔｒｏｋｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＡＭＩ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，  Ｍｕｎｉｃｈ．  Ｇｅｒｍａｎｙ．  ２００８．  Ｐｌ  ３１７
８−  Ｂｏｅｋｈｏｌｄｔ  ＳＭ．  Ｋｅｌｌｅｒ  ＴＴ．  Ｗａｒｅｈａｍ  ＮＪ．  Ｌｕｂｅｎ  Ｒ．  Ｂｉｎｇｈａｍ  ＳＡ．  Ｄａｙ  ＮＥ．  Ｓａｎｄｈｕ  ＭＳ．  Ｊｕｋｅｍａ  ＪＷ．  Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ  ＪＪ．  Ｈａｃｋ  ＣＥ．  Ｋｈａｗ  ＫＴ．  Ｓｅｒｕｍ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｆｕｔｕｒｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｍｅｎ  ａｎｄ  ｗｏｍｅｎ：  ｔｈｅ  ＥＰＩＣ−Ｎｏｒｆｏｌｋ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ．  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ．  ２００５  Ａｐｒ：２５（４）：８３９−４６．
９−  Ｍａｌｌａｔ  Ｚ，  Ｂｅｎｅｓｓｉａｎｏ  Ｊ，  Ｓｉｍｏｎ  Ｔ，  Ｅｄｅｒｈｙ  Ｓ，  Ｓｅｂｅｌｌａ−  Ａｒｇｕｅｌｌｅｓ  Ｃ，  Ｃｏｈｅｎ  Ａ，  Ｈｕａｒｔ  Ｖ，  Ｗａｒｅｈａｍ  ＮＪ．  Ｌｕｂｅｎ  Ｒ．  Ｋｈａｗ  ＫＴ．  Ｔｅｄｇｕｉ  Ａ．  Ｂｏｅｋｈｏｌｄｔ  ＳＭ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｉｎｃｉｄｅｎｔ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｍｅｎ  ａｎｄ  ｗｏｍｅｎ：  ｔｈｅ  ＥＰＩＣ−Ｎｏｒｆｏｌｋ  ｓｔｕｄｙ．  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ．，  ２００７  Ｍａｙ；２７  （５）：  １１７７−８３．  Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｆｅｂ  １５．
１０−  Ｔｓｉｒｎｉｋａｓ  Ｓ；  Ｍａｌｌａｔ  Ｚ．：  Ｐｈｉｌｉｐｐａ  Ｊ  Ｔａｌｍｕｄ；  Ｊｏｈｎ  Ｊ  Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ；  Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ｊ  Ｗａｒｅｈａｍ；  Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｒ  Ｍｉｌｌｅｒ：  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｌ  Ｗｉｔｚｔｕｍ；  Ｋａｙ−Ｔｅｅ  Ｋｈａｗ；  Ｂｏｅｋｈｏｌｄｔ  Ｓ．  Ｍ，  Ｅｌｅｖａｔｅｄ  Ｏｘｉｄｉｚｅｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ｏｎ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ−ＩＯＯ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｐｒｅｄｉｃｔ  ６−  Ｙｅａｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｃ−Ｎｏｒｆｏｌｋ  Ｓｔｕｄｙ：  Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｉｓｋ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  （Ｌｐ−ＰＬＡ２）  ａｎｄ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  （ｓＰＬＡ２）  Ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
１１−  Ｌａｍｂｅａｕ  Ｇ，  ＧｅＩｂ  ＭＨ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅｓ  Ａ２．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００８；７７：４９５−５２０．  Ｒｅｖｉｅｗ
１２−  Ｋｉｍ  Ｙ．，  Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇｏｖａ  Ｌ．，  Ｓｎｉｔｋｏ  Ｙ，  ａｎｄ  Ｃｈｏ  Ｗ．  Ａ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｉｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ−ｃｏａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｂｅａｄｓ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９７，  ２０５：  １０９−１１６．
１３−  Ｔｈｕｒｅｎ  Ｔ．，  Ｖｉｒｔａｎｅｎ  ＪＡ，  Ｌａｌｌａ  Ｍ，  Ｋｉｎｎｕｎｅｎ  ＰＫ．，  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆまたはｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ．  １９８５  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ３１：７１４−７
１４−  Ｂｒａｉｎ  Ａ．，  ａｎｄ  ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ  Ｈ．，  Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  ｐｌａｎａｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．  １９８４  ＰＮＡＳ  ８１：６１５９−６１６３．  １５．  Ｄａｓ  Ａ，  Ｃｉｌｅｎｔｏ  Ｅ，  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｏｃｙｔｉｚｅｄ  ｍｉｎｅｒａｌｓ．  ２０００，  Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １２：７６５．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2012517219.tif 000027
【図１１】
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【図１２】
2012517219.tif 000029
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年10月24日(2011.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子被覆率が８から３０蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質分子／ｎｍ２の範囲である蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質で被覆した固相。
【請求項２】
前記基質が、疎水性部分、リン酸部分、および疎水性部分に直接または任意の連結基経由で結合された蛍光性部分を含む、請求項１に記載の固相。
【請求項３】
前記基質がグリセロリン脂質である、請求項１または２に記載の固相。
【請求項４】
前記基質が、ｓｎ−１脂肪酸アシル鎖の末端におよび／またはｓｎ−２脂肪酸アシル鎖の末端に標識付けされている、請求項３に記載の固相。
【請求項５】
前記基質がベンゾ（ｄ，ｅ，ｆ）フェナントレンまたは４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンで標識付けされている、請求項１から４のいずれか一項に記載の固相。
【請求項６】
前記標識基質が、ドナー蛍光団でｓｎ−１脂肪酸鎖に、かつアクセプター蛍光団でｓｎ−２脂肪酸鎖に、または逆に標識付けされている、請求項１から４のいずれか一項に記載の固相。
【請求項７】
前記標識基質が、蛍光団でｓｎ−１脂肪酸鎖に、かつクエンチャーでｓｎ−２脂肪酸鎖に、または逆に標識付けされている、請求項１から４のいずれか一項に記載の固相。
【請求項８】
前記固相が微粒子である、請求項１から７のいずれか一項に記載の固相。
【請求項９】
前記固相がビーズである、請求項１から８のいずれか一項に記載の固相。
【請求項１０】
試料中のホスホリパーゼＡ１またはＡ２活性を測定する方法であって、
ａ）請求項１から９のいずれか１項に記載の蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質で被覆した固相と前記試料を接触させること、
ｂ）経時的に蛍光発光を読み取ること、
を含む方法。
【請求項１１】
ｃ）カルシウム依存性ホスホリパーゼＡ１またはＡ２酵素活性を発生させる溶液を添加すること、
ｄ）経時的に蛍光発光を読み取ること、
をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料が、尿、血清、血漿試料、全血、気管支肺胞洗浄液、痰、関節液、羊水、腹腔液、脳脊髄液、胸水、囲心腔液および肺胞マクロファージから選択される生物学的試料である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップａ）が少なくとも１種の二価イオンキレート剤の存在下で実施される、請求項１０から１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記二価イオンキレート剤の濃度が１ｍＭから２０ｍＭである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記カルシウム依存性ホスホリパーゼＡ１またはＡ２酵素活性を発生させる溶液が、過剰のＣａ２＋二価イオンを含む、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶液中のＣａ２＋二価イオンの濃度が１から１０ｍＭである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記基質が、疎水性部分、リン酸部分および疎水性部分に直接または任意の連結基を介して結合された蛍光性部分を含む、請求項１０から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記基質がグリセロリン脂質である、請求項１０から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記基質が、ｓｎ−１脂肪酸アシル鎖の末端におよび／またはｓｎ−２脂肪酸アシル鎖の末端に標識付けされている、請求項１０から１８のいずれか一項に記載の固相。
【請求項２０】
前記標識基質が、ドナー蛍光団でｓｎ−１脂肪酸鎖に、かつアクセプター蛍光団でｓｎ−２脂肪酸鎖に、または逆に標識付けされている、請求項１０から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記標識基質が、蛍光団でｓｎ−１脂肪酸鎖に、かつクエンチャーでｓｎ−２脂肪酸鎖に、または逆に標識付けされている、請求項１０から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
キットであって、
−請求項１から９のいずれか一項に記載の蛍光色素標識ホスホリパーゼＡ１またはＡ２基質で被覆した標識基質を含む第１の容器、
−緩衝液を含む第２の容器、
を備えるキット。
【請求項２３】
−１種以上の二価イオンキレート剤および牛アルブミン血清をさらに含む第２の容器、
−任意に、カルシウム依存性ホスホリパーゼＡ１またはＡ２酵素活性を発生させる、Ｃａ２＋二価イオンを含む溶液を含む第３の容器、並びに、
−任意に、対照および／または較正物質、
を備える、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
請求項１０から２１のいずれか１項に記載の方法に従って、対象からの試料中のＰＬＡ１またはＰＬＡ２酵素活性を測定することを含む、ＰＬＡ１またはＰＬＡ２活性関連疾患を有する、または有する危険がある、または発症している対象を識別する方法。
【請求項２５】
前記ＰＬＡ２活性関連疾患が心臓血管疾患および／または心血管系イベントである、請求項２４に記載の方法。
【国際調査報告】
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