(57)【要約】本発明は、鳥類コロニー刺激因子1受容体（CSF1R）に結合し、免疫調節性を示すタンパク質をコードする鳥類CSF1遺伝子を提供する。
2012530512.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２または４の核酸配列と少なくとも６０％同一または相同性の核酸配列を含む鳥類ＣＳＦ１遺伝子。
【請求項２】
配列番号６の核酸配列と少なくとも６０％同一または相同性の核酸配列を含む鳥類ＩＬ３４遺伝子。
【請求項３】
配列番号３または５のアミノ酸配列と少なくとも６０％同一または相同性のアミノ酸配列を含む、実質精製された鳥類ＣＳＦ１タンパク質。
【請求項４】
配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも６０％同一または相同性のアミノ酸配列を含む、実質精製された鳥類ＩＬ３４タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかの遺伝子／タンパク質のフラグメント、類似体、部分、変異体、変形、派生体および／または相同体／相同分子種。
【請求項６】
鳥類ＣＳＦ１遺伝子配列またはそのフラグメントまたは部分を含む、発現ベクター。
【請求項７】
鳥類のＩＬ３４遺伝子配列またはそのフラグメントまたは部分を含む、発現ベクター。
【請求項８】
請求項６または７の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
鳥類ＣＳＦ１またはＩＬ３４遺伝子および／またはタンパク質の、鳥類の成長および／または器官発達を調整するための使用。
【請求項１０】
鳥類ＣＳＦ１および／またはＩＬ３４遺伝子および／または鳥類ＣＳＦ１および／またはＩＬ３４タンパク質の、鳥類免疫システムを調整するための使用。
【請求項１１】
ワクチンのアジュバントとして使用するための、鳥類ＣＳＦ１およびＩＬ３４のタンパク質、またはそのフラグメント。
【請求項１２】
鳥類ＣＳＦ１および／またはＩＬ３４のタンパク質を含む、免疫原性組成物。
【請求項１３】
異常なＣＳＦ１／ＩＬ３４遺伝子／タンパク質発現をもたらすか、またはそれに関係する、炎症性の病気のような状況を処置するためにＣＳＦ１／ＩＬ３４遺伝子発現またはタンパク質生産を抑制することが可能な化合物。
【請求項１４】
化合物は、以下の、センスまたはアンチセンス核酸分子、鳥類ＣＳＦ１／ＩＬ３４遺伝子のフラグメント、部分または派生体、および抗体からなる群より選ばれる、請求項１３の化合物。
【請求項１５】
繁殖計画における潜在的組み入れのための、鳥類の種、特に農業上有意義か、または重要な鳥類の種を選別するための方法であって、以下のステップ、
ａ）鳥類の種から核酸サンプルを提供すること、および
ｂ）ＣＳＦ１および／またはＩＬ３４遺伝子（群）の発現のレベルを参照核酸試料または値と比較すること
を含み、
ＣＳＦ１および／またはＩＬ３４遺伝子発現のレベルを示し、および参照核酸試料に存在するものまたは値に対して上昇させる鳥類の種を、繁殖計画における組み入れのために選ぶことができる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鳥類コロニー刺激因子1受容体（CSF1R）に結合するタンパク質をコードする新しく識別された鳥類遺伝子に関する。CSF1Rとの結合を通して、これらのタンパク質は、鳥類免疫システムならびに細胞増殖、分化および/または増加、器官/組織発達およびワクチン有効性に対する影響を調整するために利用することができる免疫調節特性を示す。
【背景技術】
【０００２】
単核食細胞は、血中単球に分化し、そして次いで特定のニッチ（微小環境）を占有するために組織に入る骨髄において、前駆（祖先）細胞から導き出される〔Hume（ヒューム）ら2002年〕。それらは、病原体に対する防御の第一線を構成し、ホメオスタシス（恒常性）を維持し、そして骨の形態形成から性発達でのニューロンのパターニングまで、血管形成から脂肪生成までにわたる栄養に関する機能（trophic functions）を有する〔Pollard（ポラード）2009年〕。マクロファージ（大食細胞）コロニー刺激因子（CSF1）は、マクロファージの系列細胞（lineage cells）の通常の分化、増殖および生存のために必要とされる〔Sweet（スウィート）およびヒューム2003年；Chitu（チチュ）およびStanley（スタンリー）2006年；Bonifer（ボニファー）およびヒューム2008年〕。CSF1遺伝子で突然変異を有するマウスおよびラット（即ち、op/opマウスおよびtl/tlラット）は、単核食細胞欠損（mononuclear phagocyte deficiency）を示し、そしてそれらの重要な発生上の異常、たとえば、減少した体細胞成長（somatic growth）、周産期の死亡率、大理石骨病、神経学的および生殖の欠陥のようなものは、上記のマクロファージの栄養に関する役割の多くを強調する〔Marks（マークス）ら1992年；ポラード1997年、2009年；Ryan（ライアン）ら2001年〕。
【０００３】
CSF-1が多数のアイソフォーム（イソ型）で存在するが、大部分の生化学的研究は最小の生物学的に活性なフラグメント（断片）、即ち、154のN末端アミノ酸に集中し、すべてのアイソフォームに共通であった。全長のCSF1分子において、この受容体結合領域は、32-アミノ酸シグナル（信号）ペプチドだけ先行し、そして次いで可変的なスペーサー領域、24-アミノ酸貫膜領域および35-アミノ酸細胞質側末端（cytoplasmic tail）が続く。CSF1の活性なフラグメントの三次構造は、ベータシートの小さな領域（1および2）を有する短鎖の4つのらせん形の束（short-chain four-helical bundle）（A、B、CおよびD）を形成する。らせん体は、鎖間ジスルフィド結合によってA-CおよびB-Dに対にされる一方で、1つの鎖間ジスルフィド結合が2倍の回転軸を有する成熟したホモ二量体を生成する〔Pandit（パンディット）ら1992年〕。その受容体（レセプター）、CSF1Rに結合したマウスCSF1の結晶構造は最近、2.4Åの解像度に解析され、CSF1のN末端セグメント（残基6-15）、らせんB（残基55-66）およびらせんC（残基79-85）が受容体結合に関係することを示した。（PDBコード3EJJ）〔Chen（チェン）ら2008年〕。
【０００４】
すべてのCSF1の効果は、CSF1レセプター（CSF1R）、c-fmsプロトオンコジーンによってコード化される165kDaの糖タンパク質（グリコプロテイン）との結合を通して媒介される〔Dai（ダイ）ら2002年〕。CSF1Rは、PDGFRA、PDGFRBおよびc-キットと同様に、タイプIIIタンパク質チロシンキナーゼファミリーのメンバーであり、そして5つの免疫グロブリン様のドメイン（D1からD5まで）、単一の貫膜らせんおよび細胞内チロシンキナーゼドメインの特徴的細胞外領域を他のファミリーと共有する〔Rosnet（ロスネット）およびBirnbaum（バーンバウム）1993年〕。CSF-1は、2:2の化学量論においてしっかりレセプターと関連付けられる（KD=0.4nM、37℃）〔Guilbert（ギルベール）およびスタンリー1986年〕。この結合は、CDループ（残基141-151）およびD2のEFループ（残基168-173）、ならびにD3のBCおよびDEループ（それぞれ残基231-232および250-257）を含む〔Chen（チェン）ら2008年〕。
【０００５】
細胞表面の上のCSF1Rの発現は、マクロファージの分化系列決定（lineage commitment）で最も初期のイベントの間にあり、そして大部分は胚発生の間中ならびに成体においてこれらの細胞に制限される〔Lichanska（リチャンスカ）ら1999年〕。他の脊髄プロモーターと同様に、近位のCSF1Rプロモーターは古典的なTATAボックスおよびGCの豊富な配列が不足するが、AML1転写因子のための、そしてC/EBPおよびEtsのファミリーの転写因子のための認識部位を含み、脊髄に制限された転写因子PU.1が含まれる〔Reddy（レディ）ら1994年；Himes（ハイムズ）ら2005年；Bonifer（ボニファー）およびヒューム2008年〕。CSF1Rの発現は、FIRE〔Fms Intronic Regulatory Element（Fmsイントロン調節要素）〕の最初のイントロンでの高度に保存されたエンハンサーエレメントによってもコントロールされる〔Himes（ハイムズ）ら2001年；Sasmono（サスモノ）ら2003年〕。
【０００６】
器官発達における生殖欠陥および混乱（perturbations）を含むop/opマウスで見られる大部分の表現型の欠陥は、CSFJRノックアウトマウスでさらにより深刻である〔Dai（ダイ）ら2002年〕。第1に母系由来のCSF1の利用可能性に起因して、これらの観察結果は、人間（ヒト）のCSF1R、IL34と称されるもののために、単球生存能力上の活性とともに、第2のリガンドの最近の発見によって目下説明することができる。IL34は241-アミノ酸モノマーから構成されるホモ二量体として精製され、そして脳において大部分が発現されるが、また、心臓、脾臓、肺、肝臓、腎臓および胸腺を含む多くの他の組織の中にもあることが示された〔Lin（リン）ら2008年〕。
【０００７】
国際公開WO2008/031172号は、温血動物において、および特に早産のヒトの胎児/胚での器官発達を進めるために、CSF1の使用を記述する。さらにまた、WO03028752は、動物での免疫反応を調整するための方法および組成物を記述し、前記方法はCSF1活性を調整することを含む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第2008/031172号
【特許文献２】国際公開03028752号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ニワトリ（チキン）が、初期の胚性骨髄造血の研究において広く用いられた〔Lichanska（リチャンスカ）ら1999年；リチャンスカおよびヒューム2000年〕が、哺乳類の単核食細胞システムについての本発明者らの知識と比較して、鳥類のシステムについての本発明者らの知識はむしろ制限され、そしてWO2008/031172またはWO03028752のいずれも鳥類のCSF1遺伝子の存在を記述しない。実際に、2つの特徴付けられたコロニー刺激因子だけがニワトリに存在する。ニワトリGM-CSF（CSF2）は、クローニングされ、そしてニワトリ骨髄細胞の増加を推進することが示された〔Avery（アベリー）ら2004年〕。他の記述されたニワトリCSF、骨髄単球性の成長因子は、最近G-CSF（CSF3）のニワトリオルソログ（相同分子種）であることが示された〔Gibson（ギブソン）ら2009年〕。GM-CSF受容体アルファ鎖、およびβ鎖の見た目のオルソログは、IL3レセプターと共有され、ニワトリゲノム（Ensembl）でアノテートされる（注解される）。これまで、CSF1Rのための機能は鳥で例示されず、CSF1は鳥類のゲノムには無いものと信じられており、そしてIL34は認識されなかった〔Kaiser（カイザー）2007年〕。
【００１０】
ヒトでのCSF1およびIL34は明らかな相同性をほとんど有しないことが報告され、そして哺乳類において少なくとも、CSF1はむしろ速く進化した。単一のレセプターのための2つのリガンドの存在は、それらが互いに、そしてレセプターとは無関係に進化するならば、進化にわたって維持するのが困難である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、鳥類のコロニー刺激因子1受容体（レセプター）（CSF1R）に結合するタンパク質をコード化する新しい鳥類の遺伝子の識別に関する。とりわけ、本発明は、初めて、コロニー刺激因子1（CSF1）およびインターロイキン34（IL34）をコード化する鳥類の遺伝子の存在を説明する。これらの知見が、何らのCSF1等価物が鳥類のゲノムに存在しないというKaiser（カイゼル）（2007年）による説明に反する点に留意する必要がある。
【００１２】
さらにまた、本発明者は驚くべきことに、鳥類のCSF1Rがマクロファージによって発現されるということを発見した−このことは他の種、たとえば魚と対照的であり、そこでは、CSF1Rは他の細胞タイプにおいて発現される。
【００１３】
鳥類のCSF1R発現プロファイルを考慮すると、CSF1Rに結合することを通して、鳥類のCSF1およびIL34が、鳥類の免疫系ならびに細胞成長、分化および/または増殖、器官/組織発達およびワクチンの効力に対する影響を調整するために利用されうる免疫調節特性を示すということを、本発明者は発見した。
【００１４】
用語「鳥類」または「鳥類の種」への言及が、クラス（綱）、鳥綱（Aves）内のすべての種および特にオーダー（目）、Galliformes（キジ目）および/またはジーナス（属）、ガルス属（ニワトリ類）に属していると分類されるそれらの種を包含するように採用されなければならないことを理解すべきである。今回、CSF1およびIL34遺伝子を所有すると知られた鳥類の種は、たとえば、Gallus gallus（ガルス・ガルス、セキショクヤケイ）、別名で家禽（domestic chicken）および/または他の飼鳥類（poultry）またはファウル（鳥種）を含むことができる。他の具体化において、用語「鳥類」は、目、たとえば、フィンチ、特に、キンカチョウのような、スズメ目（Passeriformes）の範囲内で分類された種を含むと解釈されうる。概して、用語「鳥類のCSF1遺伝子」、「鳥類のIL34遺伝子」、「鳥類のIL34タンパク質」および「鳥類のCSF1タンパク質」には、ここで記載する鳥類種のゲノム中に存在し、またはそれによってコード化されるCSF1および/またはIL34遺伝子、タンパク質（そしてそのフラグメント）が包含される。
【００１５】
本発明者は、CSF1の一定の鳥類の形態の配列を確かめ、そして典型的なCSF1遺伝子で、ガルス・ガルスのゲノム中に存在するもののcDNA配列を、配列番号1として下記に与える。
配列番号1：
ATAAAGGGCAGCGCGGCGGCGACGGCGGACTCAGCCCGGCCCCGCTCCGCCGCCTTCTCCCGCACCGCCC
GACCCGCCGCAGCCCCGGCCCCACGGCAGCCCCCATGCCCCGCCTCGGATCCCAGGTGTCCCTGTTCCGC
TGCACCCTGCTCTCGTCCCTCCTCCTCGTCTGCAGCATCCATGAGACGGAGCAGAACAGCTACTGCCAGC
AGATCATCACCGAGCGGCACCTGGACCACCTGCAGGAGCTGGCGGACACGCAGATGCAGCAGCCGGGCAC
AGTGTCCTTCAGATTCATCAGCAAGATGCGGCTGAGCGACTCTGTCTGCTACGTGAAAGCCGCCTTCCCT
TTGCTGGGCACCATCCTGAACAGGACGACGTTCAAGGAGAACTCAACAAACGCCAACAAGATGAAGACGG
TGCGCAAGATGTACGAAAACATCGATGAGAACGTGGACCCCTGCATCAGGGACGAGGATGACAAGGAGCA
CGCGCTGTCCGAAATGTGCTTTGAGGAGTTCACCACGTCCCCCTACGAGATGCTGGTGCTGGTGAGGCAG
TTCTTCCAGGACATCAAACAGCTGCTGCAGAACAAGGAGACCTTCGAGAAGGACTGCAGCCAGGTGTACC
GCAGTGCGTGCGCGGGGCCCCGGCAGCACAGCTCCTCCCCAGGTGTGGGGACAGATCCTGACTGCAATTG
CCTGTCCCCTGCCCTCCCTTCTGCCACCCAGCCCTCCCTCTCCGCTGCCACCCGTGCCGGCAGGGACGTG
GCGCCCGCTAGCACCAGGGTCCCTTACCGCCAGCTCGGTGGCATCCTGGCTGAGTTAGGCAGCAGTGCCC
CGTCCGAGCCCCCCAGTAGCGTGGAGGGCAGCTCGGGGGCCGAGGAACTGCCAGGAGCCGGGCTCGGCGA
CGCGTCGGCGCCGTCCCCCACCATGCAGCAGACGCTTGGAGCCCTCCTGGATCCAGCCGCGAGCGCCGGC
CCGAAGGCTGAGGACGTATCCATCCCGTCCCACGGGATGCCGGAGGAGGGCGCCGGGACCCCCGCCCTCC
CACATCGGCTCCCTTCGCCGCGAGGGATCAGCGCGGCGATGCCGGCGGCGGTCCCCAGCAGCGGCTCTGC
GCAGCGCCGCGGGGTCGGGCGCCGTCCCACCGAGAGCCCCGAGCGGGTCACGCAGCTCCGCTTCCCCAGG
ATGGCTCCGCCGTTGCGGGGCCGGGCGGAGGGCGGCCCCGGGGACGGGGCGAGGGCGCGAGGCTGGGGGC
TGAGCCGGCTGCGGGAGCCCGAGGACGGCGGGGCCGGACCCAGCTTTGATTCGAGCTTTGTTCTGAGCGC
AGAGCAGCGCAGGAAGGAGCCGCCAGCCGCCAGCGGGGGGCACCGGGAGCTCCTGGTGTACGTCACGGTG
GCCAGCGTGGTGGCCGTGCTGCTGGCCATGGGCGGGCTGCTCTTCTACAAGTATAAGTCCAAGGTCCTGC
AGCGGGGAGCAGCGCTAAAAGAGGGGGGCTGCGACCCCGAGGAGCCGGAGAGCAGGGCGCTGCAGGGAGC
GCAGGGCTGCGCGGAGCTGGAGACGCAGGAGCTGTGAGGGCCCCCTGCGGGACGTGATGCTGCTCGGGGG
GACGGACGGGGACGCTCCTCGCTGGGCGACGGACGGCTGCTGCTCGGCCTCCCCCCGCCGCGATGACCCC
CAGGCCCTGTCCTGCAGCTGCAACCCACGGGTGAGGATGGCAGGACGGGGCGGTGCAGCCCTGCAGGACC
CCGGCGATGGGGCGGATGGCACCGAGGGGCTCCACGGGGACGGCATTGGGTGCCGCGAGTGGAACATCTC
CCCCCACCCATCCACGGTTCCCGTTGCTCCTCTCCCACCCCTGGCACGGGGGGACCCCCGGCGCCCCATG
GGGGGACCCCTCCCGCATCCCACCGGTGCCGAGGACCCAACGCCCGGCCTGCAAAGGGGGAAACCCTCAC
ACTGTGAATATTTAAGACCCGTGGTGCCGTCCCCATCCCGCGATCCCAAGCTGGCCTTGGGAGCTGCCCG
GCGCCGCTCTGCGCAGGAAGGCTCTCCACGAACGCGGTGGATAAACGCTTTTATCCAACAAATGCACTTG
GGGGGGGGGGTTCCCCCCTCCCTGCAGGGTTATTGCTGCGAGCTGGCCTCGCCCCAGACTGGATTTTGTT
GCTGGAGCACAGCACGGCAATGGGGCCGTGGCTGCAGTGTGGGGTTTGGGGGCTCAGCGGTACCCGGACT
GCGTCCCACCCCACACGGCATCCCTGCCCAGCGCCGCTCCCGGGGGGTCGGAAGTGTTATTTTTATATTA
CATGAGATGCAAACGGGACGGAGCACATTGGGGTGTGGTGGGGTTTTGTTTTTTAAAGCATTAGTATTGA
TTTTGGGGTTTTTTTTTCTATGCGTATTTATGGACTGCCAAAAAAAGAGGCGTTTCCTGGGGGTGATGGG
GGGGGGGGTGGAAGTGGGGTGCAGAGCCGGGCTGGGGCCGGAGCTGGTGCTGGCTCAGTATGTGGGGTGT
GGGTGAGGGGGGTTGGGGGGGGGGCAGCTTTTGGAGCTCTTTCTGCCTCTGTTGTCTCATTTTTTGTACA
GTGAAATGGTGAAATATTTTATACAAAGTCATTTAAAGAAGTCTATTTAAGGAAAATAATAGAAAACAGC
TTGTATATTTAATATTATTAATAAAGATGGACGTGCAAAAAAAAAAAAAAA
【００１６】
天然のCSF1、ガルス・ガルスの配列は8つのエクソンを含み、そして2つの転写物、1つは490のアミノ酸のタンパク質をコード化しているもの、他に270のアミノ酸のタンパク質を産生する。転写物は、より一層長い、490のアミノ酸のタンパク質をコード化し、配列番号2として以下に提供する。
配列番号2
ATGCCCCGCCTCGGATCCCAGGTGTCCCTGTTCCGCTGCACCCTGCTCTCGTCCCTCCTCCTCGTCTGCA
GCATCCATGAGACGGAGCAGAACAGCTACTGCCAGCAGATCATCACCGAGCGGCACCTGGACCACCTGCA
GGAGCTGGCGGACACGCAGATGCAGCAGCCGGGCACAGTGTCCTTCAGATTCATCAGCAAGATGCGGCTG
AGCGACTCTGTCTGCTACGTGAAAGCCGCCTTCCCTTTGCTGGGCACCATCCTGAACAGGACGACGTTCA
AGGAGAACTCAACAAACGCCAACAAGATGAAGACGGTGCGCAAGATGTACGAAAACATCGATGAGAACGT
GGACCCCTGCATCAGGGACGAGGATGACAAGGAGCACGCGCTGTCCGAAATGTGCTTTGAGGAGTTCACC
ACGTCCCCCTACGAGATGCTGGTGCTGGTGAGGCAGTTCTTCCAGGACATCAAACAGCTGCTGCAGAACA
AGGAGACCTTCGAGAAGGACTGCAGCCAGGTGTACCGCAGTGCGTGCGCGGGGCCCCGGCAGCACAGCTC
CTCCCCAGGTGTGGGGACAGATCCTGACTGCAATTGCCTGTCCCCTGCCCTCCCTTCTGCCACCCAGCCC
TCCCTCTCCGCTGCCACCCGTGCCGGCAGGGACGTGGCGCCCGCTAGCACCAGGGTCCCTTACCGCCAGC
TCGGTGGCATCCTGGCTGAGTTAGGCAGCAGTGCCCCGTCCGAGCCCCCCAGTAGCGTGGAGGGCAGCTC
GGGGGCCGAGGAACTGCCAGGAGCCGGGCTCGGCGACGCGTCGGCGCCGTCCCCCACCATGCAGCAGACG
CTTGGAGCCCTCCTGGATCCAGCCGCGAGCGCCGGCCCGAAGGCTGAGGACGTATCCATCCCGTCCCACG
GGATGCCGGAGGAGGGCGCCGGGACCCCCGCCCTCCCACATCGGCTCCCTTCGCCGCGAGGGATCAGCGC
GGCGATGCCGGCGGCGGTCCCCAGCAGCGGCTCTGCGCAGCGCCGCGGGGTCGGGCGCCGTCCCACCGAG
AGCCCCGAGCGGGTCACGCAGCTCCGCTTCCCCAGGATGGCTCCGCCGTTGCGGGGCCGGGCGGAGGGCG
GCCCCGGGGACGGGGCGAGGGCGCGAGGCTGGGGGCTGAGCCGGCTGCGGGAGCCCGAGGACGGCGGGGC
CGGACCCAGCTTTGATTCGAGCTTTGTTCTGAGCGCAGAGCAGCGCAGGAAGGAGCCGCCAGCCGCCAGC
GGGGGGCACCGGGAGCTCCTGGTGTACGTCACGGTGGCCAGCGTGGTGGCCGTGCTGCTGGCCATGGGCG
GGCTGCTCTTCTACAAGTATAAGTCCAAGGTCCTGCAGCGGGGAGCAGCGCTAAAAGAGGGGGGCTGCGA
CCCCGAGGAGCCGGAGAGCAGGGCGCTGCAGGGAGCGCAGGGCTGCGCGGAGCTGGAGACGCAGGAGCTG
TGA
【００１７】
本発明者は配列番号2が以下のアミノ酸配列をコード化することを確かめた（配列番号3として与える）。
配列番号3
MPRLGSQVSLFRCTLLSSLLLVCSIHETEQNSYCQQIITERHLDHLQELADTQMQQPGTVSFRFISKMRL
SDSVCYVKAAFPLLGTILNRTTFKENSTNANKMKTVRKMYENIDENVDPCIRDEDDKEHALSEMCFEEFT
TSPYEMLVLVRQFFQDIKQLLQNKETFEKDCSQVYRSACAGPRQHSSSPGVGTDPDCNCLSPALPSATQP
SLSAATRAGRDVAPASTRVPYRQLGGILAELGSSAPSEPPSSVEGSSGAEELPGAGLGDASAPSPTMQQT
LGALLDPAASAGPKAEDVSIPSHGMPEEGAGTPALPHRLPSPRGISAAMPAAVPSSGSAQRRGVGRRPTE
SPERVTQLRFPRMAPPLRGRAEGGPGDGARARGWGLSRLREPEDGGAGPSFDSSFVLSAEQRRKEPPAAS
GGHRELLVYVTVASVVAVLLAMGGLLFYKYKSKVLQRGAALKEGGCDPEEPESRALQGAQGCAELETQEL
【００１８】
第2の転写物はより一層短い、270のアミノ酸タンパク質をコード化し、そのものは、配列番号4として下記に与える。
配列番号4
ATGCCCCGCCTCGGATCCCAGGTGTCCCTGTTCCGCTGCACCCTGCTCTCGTCCCTCCTCCTCGTCTGCA
GCATCCATGAGACGGAGCAGAACAGCTACTGCCAGCAGATCATCACCGAGCGGCACCTGGACCACCTGCA
GGAGCTGGCGGACACGCAGATGCAGCAGCCGGGCACAGTGTCCTTCAGATTCATCAGCAAGATGCGGCTG
AGCGACTCTGTCTGCTACGTGAAAGCCGCCTTCCCTTTGCTGGGCACCATCCTGAACAGGACGACGTTCA
AGGAGAACTCAACAAACGCCAACAAGATGAAGACGGTGCGCAAGATGTACGAAAACATCGATGAGGACGT
GGACCCCTGCATCAGGGACGAGGATGACGAGGAGCACGCGCTGTCCGAAATGTGCTTTGAGGAGTTCACC
ACGTCCCCCTACGAGATGCTGGTGCTGGTGAGGCAGTTCTTCCAGGACATCAAACAGCTGCTGCAGAACA
AGGAGACCTTCGAGAAGGACTGCAGCCAGGTGTACCGCAGTGCGTGCGCGGGGCCCCGGCAGCACAGCTC
CTCCCCAGAGCAGCGCAGGAAGGAGCCGCCAGCCGCCAGCGGGGGGCACCGGGAGCTCCTGGTGTACGTC
ACGGTGGCCAGCGTGGTGGCCGTGCTGCTGGCCATGGGCGGGCTGCTCTTCTACAAGTATAAGTCCAAGG
TCCTGCAGCGGGGAGCAGCGCTAAAAGAGGGGGGCTGCGACCCCGAGGAGCCGGAGAGCAGGGCGCTGCA
GGGAGCGCAGGGCTGCGCGGAGCTGGAGACGCAGGAGCTGTGA
【００１９】
配列番号4は以下のアミノ酸配列をコード化する（配列番号5として与える）：
配列番号5
MPRLGSQVSLFRCTLLSSLLLVCSIHETEQNSYCQQIITERHLDHLQELADTQMQQPGTVSFRFISKMRL
SDSVCYVKAAFPLLGTILNRTTFKENSTNANKMKTVRKMYENIDEDVDPCIRDEDDEEHALSEMCFEEFT
TSPYEMLVLVRQFFQDIKQLLQNKETFEKDCSQVYRSACAGPRQHSSSPEQRRKEPPAASGGHRELLVYV
TVASVVAVLLAMGGLLFYKYKSKVLQRGAALKEGGCDPEEPESRALQGAQGCAELETQEL
【００２０】
上記に加え、本発明者は、鳥類のIL34遺伝子の配列を確かめ、そして典型的なIL34遺伝子で、ガルス・ガルスのゲノムに存在するものを、配列番号6として下記に与える。
配列番号6
ATGCACCAGGGCTGCGCGGCTGTCCTCTGTGTCCTGGCCGTGCTGGGGCTGGAGGTGGCTGCGCTGGGG
GAATGCGAGCTCGCCCGCCTGCTGCAGGACAAGCTGCGGTATGAGATGCGCCTGCAGTACATGAAGCAC
AACTTCCCCATTGACTACACTCTCCGGGTGCAGCACGAGGAGGTGCTGCGGACCGCCAACGTCACCCGC
CTGCGTGATGGGAAGGTGTCGGAGGCGTCGCTGCGCTACCTGTGGTTCCACGCCTGCTCCCAGGCGGTG
CTGCACATCCTCGAGGTGCTGCCGGAGAAGCACCCGTCCCGTGGGTACACGCAGGAGCTGAGCCAGCTT
TTGGATGCCCTGGGCGTGGAGTACAGTGGGTACCGGCAGAGCGATGTGGACGCGGTGGTGGCCGACCTG
GTGAAGCAGCTGCACAGCGGCGATAGCCGGCAGAAGGCCGTGCGCCCCAAAGCACTGCTGGACAACTGC
CTCAAGGTCCTGCGGATGCTCTTCGGGGCACACTGTCGGTGGGACTCCGCT
【００２１】
配列番号6は以下のアミノ酸配列をコード化する（配列番号7として与える）：
配列番号7
MHQGCAAVLCVLAVLGLEVAALGECELARLLQDKLRYEMRLQYMKHNFPIDYTLRVQHEEVLRTANVTR
LRDGKVSEASLRYLWFHACSQAVLHILEVLPEKHPSRGYTQELSQLLDALGVEYSGYRQSDVDAVVADL
VKQLHSGDSRQKAVRPKALLDNCLKVLRMLFGAHCRWDSA
【００２２】
そのようなものとして、最初の見地では、本発明は、配列番号1〜7で指定された配列に関するものであり、鳥類CSF1遺伝子（配列番号1、2および4）、鳥類IL34遺伝子（配列番号6）、鳥類CSF1タンパク質（配列番号3および5）および鳥類IL34タンパク質（配列番号7）がコードされる。更なる具体化において、本発明は、ここに説明する配列の任意のもののフラグメント（断片）、類似体、部分、変異体、変形（variant）、派生体および/または相同体（ホモログ）/相同分子種（オルソログ）を提供する。有利には、この発明により提供される断片、類似体、部分、変異体、変形、派生体および/または相同体/相同分子種は機能的または活性であってよく−すなわち、それらは野生型鳥類のCSF1およびIL34の遺伝子/タンパク質の機能を保持する。
【００２３】
用語「変異体」は、自然に存在する核酸またはタンパク質の変異体または1またはそれよりも多くの核酸またはアミノ酸の付加、欠失、置換または逆位の導入によって人工的につくられるそれらのものを含むことができる。
【００２４】
上で詳述される鳥類CSF1およびIL34核酸/タンパク質配列に相同な配列は、上述の種々の綱および目に属するそれらの種の各々を含め、多数の異なる鳥類の種で見出すことができる。相同的な配列がわずかおよそ20または30%の配列相同性または同一性を示すことができ、しかし、その他の場合、相同配列は、上記に与えられる種々の配列に対し、少なくとも40、50、60、65 70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%の相同性または同一性を示すことができることは熟練者が認めることである。そのようなものとして、他の鳥類種の相同性の形態は、この発明の範囲内に含まれることになる。
【００２５】
ここに説明する種々の核酸およびアミノ酸配列を用いて、この技術における熟練の者は、他の鳥類種において関連した配列をすぐに確認することができた。たとえば、特定の種から得られる核酸は、相同的な、または密接に関連した配列のために、ここに説明する配列の断片または部分を用いて探索することができる。他の方法において、他の鳥類種で相同的なタンパク質を探索するか、または結合するのに、ここに説明するCSF1またはIL34タンパク質に特異的か、またはそれに選択的な抗体が用いられうる。そのような抗体は以下に更に詳細に説明する。
【００２６】
任意の所定の種から分離されるCSF1およびIL34遺伝子またはタンパク質の配列の間には、たとえば、多型のために、自然な変形物（バリエーション）が存在することがあり；これらの変形は、参照配列（たとえば、上述の配列の任意のもの）と比較して1またはそれよりも多く（1以上）のアミノ酸/核酸の置換、付加、欠失および/または逆位を見せるタンパク質および/または遺伝子として明示されることがある。すべてのそのような変形、特に機能的であり、および/または望ましい活性を表示するものが、この発明の範囲内に含まれることになることは理解されるべきである。
【００２７】
その上、または代わりに、1以上の保存的なアミノ酸置換を一次配列に導入することによって、ここに説明する種々のアミノ酸配列（即ち、タンパク質またはペプチド）の類似体は作成されうる。用語「保存的な置換」が、類似した特性を有する代わりのアミノ酸で、タンパク質またはペプチドの1以上のアミノ酸を置き換えることの行為を受け入れることを意図し、そして、それは天然（または野生型）タンパク質の生理化学的な特性および/または構造または機能を実質的には変えないことは、この分野における熟練の者に理解される。このタイプの類似物はこの発明の範囲内に含まれる。
【００２８】
この技術でよく知られているように、遺伝暗号の縮重は一次アミノ酸配列を変えることなくコドンにおいて1以上の塩基の置換を許す。結果として、この出願で説明する配列が、鳥類CSF1およびIL34タンパク質をコード化するために知られているが、同じ一次アミノ酸配列をコード化する変形核酸配列を産生するために、コードの縮重を利用することができる。
【００２９】
一定の鳥類CSF1およびIL34遺伝子および/またはタンパク質配列の提供は、この分野の熟練の者が、鳥類CSF1およびIL34遺伝子および/またはタンパク質を発現および/または精製することを可能にする。一例として、標準的な実験技術は、組換え鳥類CSF1およびIL34遺伝子および/またはタンパク質を発現および/または精製するために使用することができる。1具体化において、本明細書に説明するCSF1およびIL34核酸配列（または実際に任意の断片またはその部分）は、ベクターシステム（ベクター系）に導入することができ、それは、内転（inturn）され、発現のために、原核生物および/または真核細胞に導入することができ-そのようなベクターは、真核生物/原核生物の発現ベクターとして知られていることがある。そのような技術で使用することができる方法およびベクターは、Sambrook（サムブルック）らにより詳細に記載されている〔Molecular Cloning: A Laboratory Manual（モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル）、CSHL、1989年〕。一例として、ここに説明する鳥類CSF1およびIL34遺伝子（またはそのフラグメント）は、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、ウイルスベクター、酵母人工染色体および/または細菌人工染色体を含む種々のベクター中にクローニングされてもよい。
【００３０】
CSF1およびIL34遺伝子および/またはタンパク質は、融合異種配列を有するか、または有しないで発現させることができる。CSF1またはIL34融合タンパク質は、クローニング部位のすぐ下流に、たとえば、ペプチドタグのような、異種のペプチド配列をコードする短い核酸配列を含むpETおよびpGEXタイプのベクターを用いて生成、および発現させることができる。このタイプのベクターは、たとえば、アフィニティー精製法によって、異種タンパク質の混合物から、容易に、除去され、分離（単離）または精製することができるタグが付けられたCSF1およびIL34タンパク質を生成させるために特に有用である。たとえば、タグ付き（融合）タンパク質として分離に適した方法は、それらのタグ付き、または短いペプチドに融合したもので、たとえば、ヒスチジンまたはグルタチオンs-トランスフェラーゼのモイエティ（分けられた一部）は、ニッケルカラムまたはグルタチオン-セファロース基材の使用が含まれる。他の技術は、サムブルックらに詳述されている（1989年）。
【００３１】
CSF1またはIL34の遺伝子（またはその断片）がクローニングされたベクターは、様々な技術を用いて、-そのような技術はさもなければ、トランスフェクションのプロトコルとも称され、細胞への導入またはトランスフェクト（形質移入）することができる。トランスフェクションプロトコルは、核酸などのような化合物に、細胞膜の透過性を可能にさせる条件を活用する。一例として、エレクトロポレーション、熱ショック、化学的複合物（化合物）で、例えば、リン酸カルシウム、ストロンチウム（stronitium）リン酸塩のようなもの、マイクロインジェクション技術および/または遺伝子銃を用いて、細胞への、発現ベクターを含むベクターのトランスフェクションを促進させることが可能であるかもしれない。
【００３２】
そのようなものとして、第2の見地において、本発明は、鳥類CSF1および/またはIL34遺伝子またはその断片を含むベクターを提供する。1具体化において、ベクターは、宿主細胞での発現を推進するための要素を含む発現ベクターであることができる。
【００３３】
第3の見地において、本発明は、この発明に従うベクターを用いトランスフェクトした細胞を提供する。一例として、宿主細胞は、たとえば、E. coli（エシェリキア・コリ、大腸菌）、シュードモナス属菌種およびバチルス属菌種からなる群より選ばれる1種のような細菌細胞、または、別の具体化では、酵母、カビ（真菌）、昆虫、植物または動物の細胞のような原核細胞または真核細胞であってもよい。
【００３４】
一定の具体化では、この発明によって提供される融合したか、または融合していない組換え鳥類CSF1および/またはIL34タンパク質は、組換え鳥類CSF1/IL34またはその断片に親和性を見せるか、またはそれに特異的であるか、またはそれについて選択的である抗体を生成させるために使用することができる。特に、組換え鳥類CSF1およびIL34のタンパク質は、ポリクローナル血清を生成するために動物（たとえば、げっ歯類など）を免疫化するために、あるいはモノクローナル抗体を生成するためにハイブリドーマと共に使用してもよい。このように、この発明の第4の見地は、結合性薬剤（binding agents）、たとえば、鳥類CSF1またはIL34タンパク質に存在する1以上のエピトープに特異的に（specifcally）（または選択的に）結合する抗体、たとえば、ここに記載するようなものを提供する。
【００３５】
鳥類宿主において様々な免疫学的な結果を履行するために、ここに説明した鳥類のCSF1/IL34遺伝子/タンパク質を利用することができる。たとえば、鳥類のCSF1/IL34遺伝子発現および/またはタンパク質レベルを調整する方法または化合物は、鳥類の細胞を調整するのに、たとえば、単球/マクロファージの、生産、増加、生存および/または分化に用いることができる。加えて、鳥類のCSF1/IL34遺伝子発現および/またはタンパク質濃度を調整する方法または化合物は、増殖、増加および/または組織および/器官の生存を調整するのに用いることができる。
【００３６】
CSF1/IL34遺伝子/タンパク質の調整は、成熟した鳥類マクロファージ/単球の機能の調整をもたらすことができる。特に、鳥類マクロファージ食細胞および本発明者らの殺腫瘍活性を、ここに説明する方法または化合物によって高めることができる。
【００３７】
他の具体化において、鳥類CSF1/IL34遺伝子/タンパク質の発現/レベルを調整する方法または組成物は、その後の活性化刺激のために一次鳥類免疫反応および/または主要な免疫系細胞（prime immune system cells）を規制するのに用いることができる。一例として、ここに説明する鳥類CSF1/IL34遺伝子/タンパク質を利用する方法/用途またはCSF1/IL34遺伝子/タンパク質（poteins）の発現またはレベルを調整する化合物によって、サイトカイン、たとえば、炎症誘発性サイトカインの生産を調整することができる。
【００３８】
上記を考慮して、この発明の第5の見地は鳥類の成長および/または器官発達を調整する方法を提供し、前記方法には、鳥類のCSF1またはIL34遺伝子の発現および/またはCSF1またはIl34のタンパク質のレベルを調整するステップが含まれる。
【００３９】
第6の見地では、本発明は、鳥類のCSF1またはIL34遺伝子および/またはタンパク質の使用を、鳥類の成長および/または器官発達を調整するために提供する。
【００４０】
哺乳類のシステムでは、骨髄からの循環血液中の単球（circulating monocyte）および組織マクロファージの生産は、CSF1およびIL34の活性に依存する。鳥類のゲノムもCSF1およびIL34遺伝子をコード化するという発見は、それによって鳥類の単球/マクロファージの発達が調整されうる手段を提供する。
【００４１】
そのようなものとして、第7の見地では、本発明は鳥類の免疫系を調整する方法を提供し、前記方法には、鳥類のCSF1および/またはIL34遺伝子の発現および/またはCSF1および/またはIL34タンパク質のレベルを調整するステップが含まれる。
【００４２】
第8の（eigth）の見地では、本発明は、鳥類のCSF1および/またはIL34遺伝子および/または鳥類のCSF1および/またはIL34タンパク質の使用を鳥類の免疫系を調整するために提供する。
【００４３】
鳥類のCSF1またはIL34遺伝子発現のレベルを上昇させることによって、マクロファージの発生を増加させることが可能でありうることは、この分野における熟練の者が認める。同様に、CSF1またはIL34の生体内（インビボ）レベルを上昇させることによって、単球/マクロファージの発達を調整することが可能でありうる。
【００４４】
飼育される間、鳥類の家畜（ストック）、たとえば飼鳥類（poulty）/ファウル（鳥種）の種が健康なままであることを確実にするために、商業的な、および国内の農業は、効果的ワクチンに依存する。ワクチンの効力はアジュバントの使用によって強化され、または改善することができることは確立されている。農業で使用するためにワクチンと組み合わせて使うことができるアジュバント（補助剤）は特に有用であり、およびこの関連で、鳥類のCSF1およびIL34タンパク質は、たとえば、ここに説明するガルス・ガルスCSF1およびIL34タンパク質（またはその断片）は、ワクチンのアジュバントとして用いることができる。そのように、ワクチンのアジュバントとして、この発明の第9の見地は、鳥類のCSF1およびIL34タンパク質、またはその断片を提供する。
【００４５】
第10の見地において、本発明は、鳥類のワクチンとして潜在的に有用な免疫原性組成物を提供し、前記免疫原性組成物は、鳥類CSF1および/またはIL34タンパク質を含む。
【００４６】
骨髄系細胞の発達を促進するためのCSF1またはIL34タンパク質の能力は、マクロファージおよび/または他の骨髄系細胞のインビトロ（生体外）での増殖を誘導または促進するために使用することができる薬剤として、ここに説明する鳥類CSF1および/またはIL34タンパク質のさらなる使用を提供する。骨髄系細胞の集団の生成を容易にするために、鳥類CSF1またはIL34タンパク質を使用することによって、研究で使用するために骨髄系細胞の集団を生成することが可能でありうる。
【００４７】
熟練の者は、遺伝子発現のレベルを、対象体にその遺伝子の1以上のコピーを投与することによって調整することができることを理解するであろう。一例として、鳥類CSF1および/またはIL34遺伝子（またはその機能的断片）のコピーは上記のもののような発現ベクターの形態において鳥類の対象体に投与することができる。他の具体化では、精製された鳥類CSF1および/またはIL34タンパク質（おそらく、組換え鳥類CSF1またはIL34タンパク質）は、循環CSF1および/またはIL34の量を増加させるために鳥類に投与することができる。1具体化では、鳥類CSF1またはIL34タンパク質または遺伝子（またはその機能的断片）は、特定の細胞タイプ、組織または器官に直接添加または投与することができる。たとえば、鳥類CSF1またはIL34タンパク質または遺伝子は、鳥類の骨髄に直接投与することができる。
【００４８】
用語 「調整する」または「調整」は、CSF1またはIL34遺伝子発現のレベルおよび/またはCSF1またはIL34タンパク質のレベルにおいて、たとえば、通常の、健康な（野生型）の鳥類対象体で観察された発現またはタンパク質のレベルと、比較しての、増加または減少に言及することが理解されるべきである。1具体化において、CSF1またはIL34遺伝子発現のレベルまたはCSF1またはIL34タンパク質のレベルは、インビボで調整されうる。
【００４９】
他の具体化では、鳥類CSF1および/またはIL34遺伝子の発現および/またはCSF1/IL34タンパク質のレベルを調整する化合物は、上記または任意の記載された方法で詳述されたいずれかの結果を達成するために使用することができる。このような化合物は、たとえば、有機小分子、核酸（センスおよびアンチセンスDNA/RNA配列を含む）および抗体および/またはその抗原結合フラグメントを含めることができる。1具体化では、ラクトフェリン濃度および/または発現を抑制することが可能な化合物には、たとえば、DNAまたはRNAオリゴヌクレオチド、なるべくなら、アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる場合がある。鳥類CSF1/IL34遺伝子および/またはタンパク質の発現のモジュレーター（修飾因子）として有用なオリゴヌクレオチドは、小/低分子干渉および/またはサイレンシングRNAとしてこの分野の熟練者に知られているRNA分子であってよく、そしてそれは以下にsiRNAと称する。このようなsiRNAオリゴヌクレオチドは、ネイティブ（自然）なRNA二本鎖またはヌクレアーゼ耐性であるように何らかの方法で（たとえば、化学修飾によって）修飾された二本鎖の形態をとることができる。さらに、または代わりにsiRNAオリゴヌクレオチドは、低分子ヘアピンRNA（shRNA）発現またはプラスミド構築物（コンストラクト）の形態を取ることができる。
【００５０】
熟練人は、容易にアンチセンスオリゴヌクレオチドが任意の所定の遺伝子の発現を調整する（たとえば、抑制、ダウンレギュレーションまたは実質的に除去する）ために使用することができることを理解するであろう。したがって、本発明によって提供される（アンチセンス）オリゴヌクレオチドは、調整する、すなわち、鳥類CSF1/IL34遺伝子および/またはそのタンパク質産物の発現および/または機能を阻害または中和することを設計することができる。
【００５１】
自然または野生型のラクトフェリン配列を分析することによって、およびBIOPREDsiなどのようなアルゴリズムの援助を用いて、この技術の熟練者が容易に、これらの遺伝子のために最適なノックダウン効果を有する核酸配列を決定または計算的に予測することができる（たとえば、http://www.biopredsi.org/start.html参照）。したがって、熟練人は、異なるオリゴヌクレオチドのアレイ（整列体）またはライブラリーを、それらが鳥類CSF1/IL34ラクトフェリン遺伝子および/またはタンパク質の発現または機能を調整することが可能かどうかを定めるために生成し、および試験することができる。
【００５２】
骨髄細胞の生産、増殖および/または分化の増加をもたらすために鳥類CSF1Rを結合する遺伝子の識別は、CSF1および/またはIL34遺伝子発現の増加したレベルまたはCSF1および/またはIL34タンパク質の増加したレベルを見せる個体のために鳥類をスクリーニングする方法において利用することができる。これらの表現型を有する鳥類は、たとえば、繁殖計画（ブリーディングプログラム）において特に有用でありうる。
【００５３】
そのようなものとして、第11の見地で、本発明は、鳥類の種、特に農業上有意義な、または重要な鳥類の種（たとえば、飼鳥類またはフォウルとして分類されるもの）の繁殖プログラムにおける潜在的な組み入れ（potential inclusion）のためのスクリーニング方法を提供し、前記方法は次のステップ、すなわち、
a）鳥類の種からの核酸試料（サンプル）を提供すること、および
b）CSF1および/またはIL34遺伝子（群）の発現レベルを参照核酸サンプルまたは値と比較すること
を含み、
そこでは、CSF1および/またはIL34遺伝子発現のレベルを示し、および参照核酸サンプルに存在するものまたは値に対して上昇させる鳥類の種を、繁殖計画における組み入れのために選ぶことができる。
【００５４】
1具体化では、参照核酸サンプルは、正常な、または野生型CSF1/IL34遺伝子発現を示す鳥類の個体から導き出すことができる。他の具体化では、参照核酸の値は、鳥類のCSF1/IL34遺伝子の発現の中間（mean）、平均または中央値のレベルを表すことができる。
【００５５】
第12（twelth）の見地において、本発明は、炎症性疾患などのような状況で、異常なCSF1/IL34遺伝子/タンパク質発現から生じるか、またはそれに関連付けられているものを処置するために、CSF1/IL34遺伝子発現またはタンパク質生産を抑制することが可能な化合物を提供する。また、本発明は、異常なCSF1/IL34遺伝子/タンパク質の発現によって生じ、またはそれに関係する鳥類の病気を処置する薬の製造のためのそのような化合物の使用および方法に拡げることができる。用語「化合物」は、有機小分子、天然鳥類CSF1/IL34タンパク質の断片、CSF1/IL34結合剤（たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメント）または核酸、たとえば、鳥CSF1/IL34遺伝子の発現を抑制するように設計されたアンチセンス配列を含むことができる（amy）。
詳細な説明
【００５６】
本発明を次に、以下の図を参照してより一層詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ニワトリ（チキン）CSF1の構造に基づく配列分析の図である。Aは、ニワトリ（左）およびマウス（右）のCSF1構造のリボン（ひも状物）の描写である。ニワトリCSF1のためのPDBファイルは、テンプレート（鋳型）（PDB 3ejj）としてマウスCSF1構造で3Djigsaw（3Dジグソー）を使って生じさせた。図は、Polyview（ポリビュー）-3DでPyMolによって描かれた。残基を親水性によって色付け、そこでは疎水性残基（A、C、F、G、I、L、M、P、V）のために黄色が、両親媒性残基（H、W、Y）のために濃い黄色、極性残基（N、Q、S、T）のためにオレンジ色、負に荷電された残基（D、E）のために赤、および正に荷電された残基（R、K）のために茶色が用いられる。鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインは、マウス構造上でラベルをつけられる。ニワトリ配列での付加されたアミノ酸の存在によってつくられるループは黒色の矢印によってマークされる。赤い矢印はマウスで記載されるCSF1Rに対する結合部位1の範囲内で非保存の置換を示す〔Chen（チェン）ら2008年〕。Bは、ニワトリCSF1（左）およびSCF（右）の二量体界面（インターフェース）である。残基をAでのように色付けする。ホモ二量体界面に存在するアミノ酸をそれらの原子を球と表現すること（rendering）によって強調する。
【図２】ニワトリIL34の構造に基づく配列分析の図である。Aは、ニワトリIL34（左）のリボンの描写である。ニワトリCSF1（中心）およびニワトリSCF（右）の構造を比較するために示す。ニワトリIL34のためのPDBファイルは、テンプレート（PDB 3ejj）としてマウスCSF1構造で3D-Jigsawを使って生じさせた。ニワトリSCFのためのPDBファイルは、テンプレート（PDB lexz）としてヒトSCF構造で3DJigsawを使って生じさせた。図はPolyview-3DでPyMolによって描かれた。残基は図1Aの場合のように色付ける。赤色矢印は、CSF1で受容体結合部位1（サイト1）を構成する対応する残基を強調する。Bは、ニワトリIL34の二量体界面を示す。Aでのように、残基を色付ける。ホモ二量体界面に存在するアミノ酸は、それらの原子を球と表現することによって強調する。
【図３Ａ】鳥類CSF1Rの特徴描写の図である。Aは、キンカチョウ（左）およびニワトリ（右）のCSF1RのCSFl-結合部位1のリボンの描写である。ニワトリおよびキンカチョウCSF1 RのためのPDBファイルは、テンプレート（PDB 3ejj）として、マウスCSF1 R構造を用い3D-Jigsaw（ジグソー）で作り出した。図はPolyview-3DでPyMolによって描かれた。残基は図1Aの場合のように色付ける。矢印は非保存のアミノ酸置換のいくつかを指す。
【図３Ｂ】CSF1 Rのキンカチョウ（左）およびニワトリ（右）D1-D3ドメインのそれらのそれぞれのCSF1リガンドによる重ね合わせを示す。2つのCSF1 R構造は、図3Aでと同じ角度から見られる。図1AからのニワトリCSF1構造は、ここにPolyview-3Dでの表面として描かれる。キンカチョウCSFl構造のためのPDBファイルはテンプレート（PDB 3ejj）としてマウスCSF1を用いて3D-Jigsaw（ジグソー）で作り出され、Polyview-3Dで描かれた。残基は図1Aの場合のように色付ける。
【図３Ｃ】鳥類のCSF1 R遺伝子の5'末端のPustell（パステル）DNAマトリクスの配列比較（アラインメント、alignment）を示す。2つの遺伝子は、最高で2.5kbの上流まで、そして最初のイントロンを通して一列に並べる。
【図３Ｄ】キンカチョウおよびニワトリのCSF1R遺伝子のプロモーター-エクソン1領域の配列アラインメントである。アラインメントは、MacVector（マックベクター）を使って実行した。PU.1, C/EBPおよびAML1のための結合部位が特定される。
【図３Ｅ】キンカチョウおよびニワトリのCSF1 R遺伝子のイントロンでの高度に保存されたセグメントのアラインメントである。Dでのようにアラインメントを実行した。PU.1、C/EBPおよびAML1のための結合部位が確認された。
【図３Ｆ】全載のインサイツ（インシトゥー）（whole mount In Situ）による20HHでのトリ胚におけるCSF1R mRNAの局在性を示す。図は、アンチセンス（左）およびセンスコントロールISH（右）を示す。
【図４Ａ】ニワトリCSF1およびIL34の発現および活性の図である。Aは、pEF6-cCSF1、pEF6-cIL34またはエンプティpEF6ベクターでトランスフェクションしたHEK293TによるニワトリCSF1およびIL34の発現および分泌である。細胞はリポフェクタミンを用いてトランスフェクションし、および72時間インキュベーションされた。細胞ライセート（可溶化物）および上清は、非還元および還元条件でSDS-ページゲル上で実行し（run）、および抗V5タグ抗体で探索した。矢印は、二重バンドをニワトリCSF1〔約（ca.）60kD〕およびIL34（ca. 25kDa）のために示し、そこでは上部バンドがこれらのタンパク質のグリコシル化された形態であり、それに対し、下部バンドはデ・非グリコシル化形態（de non-glycosylated forms）を構成する。
【図４Ｂ】pEF6（左）、pEF6-cCSF1（中心）およびpEF6-cIL34（右）でトランスフェクションしたHEK293Tからの20%の上清を用いた分化の10日目（Day10）でのニワトリ骨髄由来マクロファージを示す。
【図５Ａ】CSF1、IL34およびCSF1 Rの共進化の図である。Aは、CAPS、PERLベースのソフトウェア〔フェアス（Fares）およびマクナリー（McNally）2006a年〕によって実行した共進化分析の主要な結果をまとめる図表である。CAPSによって確認されるように、IL34（左、ピンク色で）およびCSF1 R細胞外ドメイン（右、青色で）の間の共同進化する残基が示される（フェアスおよびマクナリー2006a）。相関係数は2つの共進化するアミノ酸の間での線の色によって示され、およびこれらの部位で相関する進化的変動（evolutionary variation）を測定する。残基番号はヒト配列に言及する。
【図５Ｂ】共進化分析に基づくCSF1Rの推測したIL34結合モードを示す。ニワトリCSF1 R D1-D5のリボンの描写は、図3のために生産したニワトリCSF1R D1-D3モデルおよび3DジグソーでのテンプレートとしてのヒトのキットD1-D5（PDB 2e9w）を用いて作成されたニワトリCSF1R D4-D5モデルを重ね合わせることによってつくられた。ニワトリIL34モデルは、わずかに異なる角度だが図2の場合と同じである。すべてのモデルはPolyview-3Dで描かれた。残基は、青色で強調されたニワトリにおいて相同性残基と共に図1Aでの場合のように色付けられる。
【図６】IPTG誘発タンパク質発現のビス-トリスNuPAGE分析の図である。
【図７】濃縮単量体ニワトリCSF-1タンパク質のSDS-PAGE分析の図である。
【図８】親のBaF/3細胞系でのすべての3つのCSF1調製物のための用量反応（Dose-Reponses）データである。
【図９】ニワトリCSF1R発現BaF/3細胞でのすべての3つのCSF1調製物のための用量反応データである。
【図１０】ブタCSF1R発現BaF/3細胞でのすべての3つのCSF1調製物のための用量反応データである。
【実施例】
【００５８】
方法
バイオインフォマティク（生物情報学）分析
【００５９】
配列は、NCBIでのデータベースおよびサンタクルスおよびアンサンブルの大学からのゲノムリソース、すなわち、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/index.html、http://genome.ucsc.edu/およびhttp://www.ensembl.org/index.htmlを用いて同定した。キンカチョウCSF1 R遺伝子の翻訳は、GeneWise（ジーンワイズ）プログラムを用いて予測し（http://www.ebi.ac.uk/Tools/Wise2/index.html）およびニワトリIL34 ESTを、ESTscan（ESTスキャン）（http://www.ch.embnet.org/software/ESTScan2.html）を用いて分析した。
ニワトリおよびキンカチョウのcDNA遺伝子のクローニング
【００６０】
製造者〔Invitrogen（インビトロジェン社）、ペーズリー、英国〕により記載されるように、ニワトリのステージ20の胚およびキンカチョウの脳からのRNAを、TRIzol試薬を用いて抽出した。cDNAは、Superscript（スーパースクリプト）III逆転写酵素およびシークエンシング用のTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社、ペーズリー、英国）を用いてRT-PCRによりクローニングした。ニワトリおよびキンカチョウCSF1、およびキンカチョウIL34のcDNA末端（5'RACE）の5'迅速増幅を、First Choice（ファースト・チョイス）RLM-RACEキット〔Ambion（アンビオン社）、ウォリントン、英国〕を用いて行った。PCR産物をシークエンシング用のTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社、ペーズリー、英国）を用いてクローニングした。ニワトリCSF1の3'末端は、cDNA末端（3'RACE）技術、3'RACE LaNe〔Park（パーク）2004年〕の修飾した3'迅速増幅を使用してクローン化した。
CSF1を含むニワトリのBACsの分離
【００６１】
CSF1のためのニワトリのプローブは、プライム-ア-ジーン（Prime-a-gene）キット〔Promega（プロメガ社）、サウサンプトン、英国〕を用いて調製し、65℃で一晩10％PEG8000、7％SDS、1.5×SSCのニワトリCHORI-261 BACライブラリー（http://bacpac.chori.org/chicken261.htm）にハイブリダイズさせた。次いでフィルタを、2×SSC、0.1％SDSで2回および0.5×SSC、0.1％SDS、65℃で1回洗浄し、および室温で1週間、オートラジオグラフィーフィルムに曝露した。6つの陽性クローンが同定された：44-I16、68-D10、22-M13、171-K3、171-N10および172-O23. 44-I16、68-D10および171-N10を、PCRによって確認した。これらのクローンは、すべてエンドシークエンスされ、そしてChr26にマップするBlatで示された。
配列分析
【００６２】
クローンを、ABI 3730×1シーケンサーにてBigDye Terminator（ビックダイターミネーター）v3.1のサイクルシークエンシングキット〔Applied Biosystems（アプライドバイオシステムズ社）、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国〕を用いて配列決定した。
ニワトリCSF1の遺伝子マッピング
【００６３】
ニワトリCSF1の437bpのゲノム断片を、プライマー：ckcsfex4-forl：GCGACTCTGTCTGCTACGTGおよびckcsfex5-revl：CGAAGGTCTCCTTGTTCTGCによって増幅した。イーストランシング（East Lansing）の参照集団からの親のDNAの配列決定〔Crittenden（クリッテンデン）ら1993年〕はエクソン4でのSNP〔Red Jungle Fowl（赤色野鶏）の雄性でのG/A；白色レグホンの雌性でのA/A〕および確認されたCSF1から52の戻し交配のDNAsのChr26へのマッピングとしてのシークエンシングを同定した。連鎖解析は、Map Manager（マップマネージャー）プログラムを用いて行った〔Manly（マンリー）およびOlsen（オルセン）、1999年〕。
系統発生解析
【００６４】
様々な分類群からのアノテートされた（注釈付きの）CSF1、IL34およびCSF1R遺伝子のアミノ酸配列は、ClustalWのソフトウェア〔Thompson（トンプソン）ら1994年〕〔Gonnet（ゴネット）タンパク質重量マトリクス、末端ギャップ不活性化のない、デフォルト（初期値）のパラメータ〕を使用して整列させた。構造ベースのアラインメントに示す二次構造は、PSIPRED〔Jones（ジョーンズ）1999年〕、およびDomain Fishing（ドメインフィッシング）〔Contreras-Moreira（コントレラス・モレイラ）およびBates（ベイツ）2002年〕によって実行されたアライメントを用いて予測した。
インサイツ（in situ）ハイブリダイゼーションの全載（全体マウント）
【００６５】
受精させた白色レグホン卵を、毎週収集し、そして発育の3-6日の間のために38℃でインキュベートした。胚を、冷DEPC-PBS中に解剖〔Hamburger（ハンバーガー）およびHamilton（ハミルトン）1992年〕に従って段階分けし（staged）、そしてすぐに4％PFA/DEPC-PBSで一晩固定し、100％メタノールにグレード別のメタノール/PBSのステップに通して脱水し、そして-20℃で貯蔵した。胚での全載ISHを、〔Nieto（ニエト）ら、1996年〕に従って行った。CSF1RプローブをテンプレートのArK-Genomics（ゲノミクス）〔Roslin（ロスリン）、英国〕ためにクローン654を用いて作成した。
ニワトリCSF1およびIL34の発現
【００６６】
HEK293T細胞（ATCC）およびは、10％の熱不活化（HI）-FCS、2mMのL-グルタミン、0,1mMの非必須アミノ酸および抗生物質（100ug/mlのペニシリン、100ug/mlのストレプトマイシン）を補充したDMEM〔Sigma（シグマ社）〕で培養した。トランスフェクション前1日、8×105のHEK293T細胞を、6ウェルプレート中の抗生物質を伴わない2mlの増殖培地に蒔いて培養した。細胞を、製品の指示に従ってリポフェクタミン（Lipofectamoine）2000でトランスフェクトした。次に、細胞を、24時間CO2インキュベーター内で37℃にてインキュベートし、そして上清を採取して、2％SDS-10mMトリスバッファーで細胞を溶解する前に、別の48時間（抗生物質なしで）増殖培地の7mlを各々含む25cm2皿に移した。細胞抽出物および上清をその後DTT（5mM終濃度）の有または無のLaemli（レムリ、Laemmli）バッファーまたはB-メルカプトエタノール（5％終濃度）と混合し、4-12％の勾配（グラジエント）SDS-PAGEゲルにて動かし、そしてBio-Rad（バイオラッド社）装置の指示に従ってPVDF膜上に移した。膜を、マウス抗v5タグ抗体〔AbD Serotec（セロテック）〕および抗マウスIgG HRP複合体〔Cell Signaling Technology（セルシグナリングテクノロジー）〕を使用してブロットした。
骨髄分化
【００６７】
注射筒および鈍らせた針を用いPBSにより2つの大腿骨および2つの脛骨からの髄を洗浄することによって、ニワトリ骨髄細胞を取得した。条件ごとに、全細胞の1/250を、ペレット化し、そしてエンプティ（空）のpEF6-、pEF6-cCSF1-またはpEF6-cIL34をトランスフェクションしたHEK293Tからの20%の上清を含む4mlの完全なRPMI〔10%の熱不活化（HI）-FCS、2mMのL-グルタミン、100ug/mlのペニシリン、100ug/mlのストレプトマイシンを補充した〕の中に再懸濁させた。細胞を、60mmのBacteriological（バクテリオロジカル、細菌学上）のプレートで蒔いて培養し、そして12日の間CO2インキュベーターで37℃にてインキュベートした。
分子内および分子間共進化分析
【００６８】
共進化的なパターンを確認するために、本発明者らは、以前に刊行されたアミノ酸部位の間で相関した進化のパターンに基づくパラメトリック方法を用いた〔フェアスおよびTravers（トラヴァーズ）2006b〕。分析を実行するために、本発明者らは、この方法CAPSバージョン1.0を履行するソフトウェアを用いた（フェアスおよびマクナリー2006b）。この方法はいくつか（5または6くらい）の事例研究で、意味がある結果を与えることに成功することがわかり、それらには、膜タンパク質の共進化〔Fuchs（フックス）ら2007年〕、HIV gp120およびgp41タンパク質（トラヴァーズら2007年）ならびにHsp70-Hop-Hsp90システム（トラヴァーズおよびフェアス2007）の識別を目的とするものが含まれる。アミノ酸部位の間で、相関する進化のパターンの可能性および重要性を評価するために、本発明者らは、多数の無作為サンプリング（100万および1000万の無作為試料）および偽陽性率（タイプ1エラー）を最小にするために小さなアルファ値（0.001）を用いた。前に説明したように、CAPSも段階的に減少する順列の手順を、複数のテストを修正するために履行する〔Westfall（ウェストフォール）およびYoung（ヤング）1993年;トラヴァーズおよびフェアス2007年〕。アミノ酸置換のためのスコア（点数）は、本発明者らのタンパク質配列の類似性に従い、適切なブロック置換マトリクス（BLOSUM80）〔Henikoff（ヘニコフ）およびHenikoff 1992年〕を用いて得られた。共進化的な分析において報告したすべてのアミノ酸部位は、参照配列（ヒト）からのタンパク質での位置を呈示する。 
共進化的なネットワークの視覚化 
【００６９】
本発明者らは、ソフトウェアCytoscape（サイトスケープ、バージョン2.6.1）〔Shannon（シャノン）ら2003年〕を、CAPSによって識別された共進化的なネットワークを視覚化するために用いた。Cytoscapeを、当初、二分子の相互作用ネットワークを視覚化するために設計した。しかしながら、このツールは、対象物の間の相互作用を説明する任意のデータを視覚化するのに用いることができる。CAPSは、共進化的なネットワークおよび代償性変異（compensatory mutations）の情報を含んでいる4つのファイルを生産することができる。本発明者らは、共進化するアミノ酸間の相関関係のネットワークを生成するためにこのプログラムを用い、そしてノード（アミノ酸残基）の間で連結ラインの色彩パターンを決定するためにCAPSで生成する相関係数を用いた。
ニワトリCSF-1遺伝子のクローニング
【００７０】
ニワトリCSF-1
（NSYCQQIITERHLDHLQELADTQMQQPGTVSFRFISKMRLSDSVCYVKAAFP
LLGTILNRTTFKENSTNANKMKTVRKMYENIDENVDPCIRDEDDKEHALSEM
CFEEFTTSPYEMLVLVRQFFQDIKQLLQNKETFEKDCSQVYRSACAGPRQHSS
SP）の活性な断片に対応する配列は、大腸菌での発現のために最適化され、そしてBlue Heron Biotechnologies（ブルーヘロンバイオテクノロジーズ）〔ワシントン州（WA）、米国〕によって合成されたコドンであった。配列は5'末端でのBspHI制限部位および3'末端でのEcoRI制限部位で設計され、そして相補的な（complimentary）制限部位NcoIおよびEcoRIを用いた発現プラスミドpET-28(b)中にクローニングされた。得られるプラスミド、pTLW54は、製造者のプロトコル（インビトロゲン社、CA、USA）に従い、MAX Efficiency（R）〔マックスエフィシエンシー（商標）〕DH5αTM（商品名）Chemical Competent（ケミカルコンピテント）大腸菌に形質転換させた。カナマイシン耐性形質転換体を選定し、そしてプラスミドがエラーのないORFを確かめるために配列決定された。pTLW54プラスミドを、製造者の提言に従ってQIAprep（R）〔キアプレプ（商標）〕回転ミニプレプキット（spin miniprep kit ）〔Qiagen（キアゲン社）、CA、USA〕によって分離し、そしてOne Shot（R）〔ワンショット（商標）〕BL21 StarTM〔BL21スター（商品名）〕ケミカルコンピテント大腸菌（インビトロゲン社、CA、USA）中に形質転換した。pTLW54内のニワトリCSF-1遺伝子は、エラーのないORFを確かめるために再び配列決定された。
ニワトリCSF-1タンパク質の発現
【００７１】
37℃にて225rpmの振とうと共にインキュベートするpTLW54/One Shot（R）BL21 StarTM大腸菌の夜通しのLB/Kan50ブロス（ブイヨン）を、LB/Kan50ブロスの1L中に、1:10で回復（更新）させた。回復させた培養物を、中央対数期（mid-log phase）の増殖を確実にするために2時間37℃にて225rpmで振とうさせ、インキュベーションした。タンパク質発現を、1mMのIPTG、終濃度で、37℃にて、および225rpmの振とうで続けるインキュベーション条件を用いて誘発した。2時間の誘導の後、培養物を遠心分離し、そして大腸菌のペレットを-80℃で貯蔵した。遠心分離に先立ち、アリコートを非誘発のコントロールと比較したタンパク質の発現のために分析した。可溶性および非溶解性タンパク質のフラクション（画分）を、MESバッファーで動かす4-12%のBis-トリスNuPAGEゲル上で分析した。図6で示すように、誘発された培養物は、予想通りに非溶解性タンパク質においておよそ18.7kDaのバンドを生成した。
ニワトリCSF-1タンパク質の精製および処理
【００７２】
凍結細胞ペレットを解き、封入体をほぼ均一に洗浄した。単量体のニワトリCSF-1タンパク質を、50mMのトリス、pH8.5、5mmのEDTA、7Mグアニジンにおいて2.6×60cmのSuperose（スーパーローズ）12サイズ排除クロマトグラフィーカラム（SEC）を用いて精製した。溶出したニワトリCSF-1を、7Mグアニジンバッファーで10倍に希釈し、50mMトリス、pH8.5、100mMのNaCl、5mMのEDTA、1mMの酸化グルタチオン、2mMの還元グルタチオンのバッファの8つのステップを通しての添加による順次の透析を介し、0.15Mの最終的なグアニジン濃度が得られ、リフォールディングさせた。リフォールディングしたニワトリCSF-1を濃縮し、単量体の種を、PBSで駆動する1×30cmのスーパーローズSECカラムを用いて精製した。図7に示すように、単量体タンパク質を0.58mg/mlにまで濃縮し、BMEを伴って、および伴わずに16%のSDS-PAGEにより分析した。精製したニワトリCSF-1のアリコートを-80℃で貯蔵した。
結果
鳥類CSF1遺伝子の同定
【００７３】
ニワトリゲノムにおけるアノテートされた（注釈付きの）CSF1遺伝子は目下ないが、マウスCSF1遺伝子を含む領域は、ニワトリゲノムアセンブリにおいてギャップが存在することを示唆するニワトリと共にシンテニーを表示した。キンカチョウゲノム配列への特別許可された（privileged）アクセスに基づいて、明確なCSF1オルソログ（エクソン3において開始される）[Chr26:24187-27419、2008年7月アセンブリ]（GQ249405）を識別することが可能であった。このことは、引き続いて、ロスリン研究所でのニワトリのESTコレクションでの部分的CSF1配列の同定につながった。5'および3'RACEによって十分なCDSを定めるために、完全なORFを得られた。CSF1-含有BACsをも識別し、Chr.26へのマッピングを確認するために、エンド-配列決定した（end-sequenced）。CSF1座は確かに、ニワトリゲノムアセンブリ内のギャップであることが予測され、それは、キンカチョウにおいて隣接する遺伝子の順序は哺乳類と同じだからである。新たに同定された鳥類のCSF1遺伝子は、それぞれ8つのエクソンを含む。キンカチョウの遺伝子は489のアミノ酸のタンパク質をコードする。2つの転写物を、ニワトリで同定し、1つは490のアミノ酸のタンパク質をコード化し、そして他は270のアミノ酸を含む（GQ249403とGQ249404）。より一層短い転写物は、エクソン6のかなりの部分が欠落している。哺乳類では、このエクソンは、膜アンカー型の（membrane-anchored）前駆体からのCSF1の放出を可能にするタンパク質分解開裂部位を含む大きなドメインをコード化する。より一層短い転写物は、CSF1の膜アンカー型細胞表面の形態をコード化するであろうが、それは開裂させることができない。ニワトリCSF1のエキソン6はまた、哺乳動物の遺伝子に見出されるユニークなグリコサミノグリカン（コンドロイチン硫酸）付加部位（SGXG/A）が含まれる。したがって、可変な翻訳後修飾および別個の機能〔ダイら2004；Jang（チャン）ら2006；Nandi（ナンディ）ら、2006〕を有する分泌された、そして膜アンカー型の形態を含むCSF1の基本的な生物学は、ニワトリにおいて保存されると思われる。
鳥類CSF1の保存構造
【００７４】
識別された鳥類CSF1配列が、哺乳動物CSF1の機能的なオルソログかどうかを評定するために、種間で推定されるアミノ酸配列の多重アラインメントを、ClustalW（クラスタルダブル）のソフトウェアhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlを用いて実行した（トンプソンら、1994）（表1）。3つの分子内ジスルフィド結合（パンディットら1992）に関与する6つのシステイン残基は、鳥類に保存されているが、鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインは、ダイマー界面に位置し、そしてゼブラフィッシュおよび金魚を含むすべての生物種を通して保存されているが〔Hanington（ハニントン）ら2007年〕、鳥では保存されていない。システインのアラインメントおよび予測されたヘリックスは、マウスでの共結晶から推定されたCSF1Rに結合したCSF1の接触残基を強調し〔Chen（チェン）ら、2008年〕、そのうちのいくつかは明らかに鳥での相違（分岐）である。特に、Asp91および94、Glnl 13、Glul 14、およびAsnl 17（位置番号は表1でのマウス配列を参照する）は、保存されておらず、または半保存的置換を有する。これらの結合部位のすぐ下流で、鳥の配列は、哺乳類の配列中に存在していない追加のアミノ酸を有する。このアラインメントは、マウスのR111の置換を、ヒトでのQと共に強調し、それはヒトのリガンドがマウスの細胞で働き、その逆ではそうでない理由を説明することができる〔Bonifer（ボニファー）およびヒューム2008〕。
【００７５】
鳥類CSF1構造予測を確認するため、PDBフォーマットでの3D-モデルを、3D-ジグソーのhttp://bmm.cancerresearchuk.org/〜3djigsaw/と共に構造に基づくアラインメントを用いて生成した（ドメインフィッシングによって実行される）（ベイツら2001）。得られたPDBファイルは、Jmolのhttp://firstglance.jmol.orgでのFirstGlance（ファーストグランス）で、およびPolyview-3Dのhttp://polyview.cchmc.org/polyview3d.html〔Porollo（ポロロ）およびMeller（メラー）2007年〕を用いてPyMolによってもたらされるモデルにおいて考察された（viewed）。鳥類CSF1は、十分に説明された哺乳類CSF1（パンディットら1992）と同じ4本ヘリックスバンドル（束）構造を有することが予測される。図1Aでは、ニワトリCSF1モデルは、刊行されたマウスの構造（チェンら2008）と比較される。全体的なトポロジーは、哺乳動物から鳥まで通して保存されるが、配列アラインメントで見つかったすべての相違点は構造変化に変換される。したがって、ニワトリCSF1のCSF1R結合部位1は、マウス結合部位1とは異なる電荷を構成し、それは非保存アミノ酸置換が正確に受容体（赤矢印）と接触するように位置されるからである。また、ニワトリの配列で見出された余分な残基は結合部位1および2（黒矢印）の間で、正に帯電したArgl22スティックを作成する突起部分がつくりだされると予測される。前述したように、哺乳動物における鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン（マウスの構造上のラベルを付けられたCys）は、ニワトリCSF1に不存在であり、非共有結合的に関連したホモ二量体がもたらされる。これはまた、哺乳類で、ならびに鳥での密接に関連した幹細胞因子（SCF）の場合である（アラカワら1991）。これらのタンパク質は、安定した二量体を形成し、そしてモノダイマー（monodimers）の間での大きな接触表面積のために受容体の二量体化を誘導することができる〔Jiang（ジアン）ら2000年〕。興味深いことに、ニワトリCSF1二量体の間の接触面は、ニワトリSCFのものと非常に似ている。それらは双方とも、
図1Bに示すように、露出した疎水性残基を含み、そこでは二量体界面上に存在するアミノ酸は空間充填としてレンダリングされた。
鳥類IL34遺伝子の同定
【００７６】
ニワトリゲノムにおけるヒトIL34の明白なニワトリのオルソログが存在し、そして本発明者らは、染色体11にマップし、そして完全長IL34 CDS〔Genbank（ジェンバンク）アクセッション（受入れ）番号BX931154〕を含むARK-ゲノミクスコレクション（ロスリン、英国）内のニワトリcDNAを同定した。このニワトリ配列は、ゲノム配列内のオルソロガスなキンカチョウ遺伝子の同定について許容された[Chrl 1：5,575,502-5,577,560、2008年7月アセンブリー]（GQ249406）。鳥類遺伝子はそれぞれ6つのエクソン、178のアミノ酸のタンパク質をコード化するニワトリ遺伝子、および180のアミノ酸をコード化するキンカチョウ遺伝子が含まれる。
IL34の保存構造
【００７７】
アミノ酸配列のレベルで、IL34はCSF1（表2）よりも種間でかなり良好に保存されている。ヒトのIL34を記述した論文は、それが構造的に新しいと主張した（リンら2008）が、本発明者ら自身の分析は、IL34がちょうど十分に説明されたCSF1のような4つのらせん束タンパク質であることを示唆する〔パンディットら1992年、Taylor（テイラー）ら1994年、チェンら2008〕。IL34およびCSF1が弱い主要な相同性だけと共に互いに整列することができるが、しかし、それらは非常によく似た予測トポロジーを持つことは事実である。ニワトリIL34の3Dモデルは、3D-Jigsawのhttp://bmm.cancerresearchuk.org/〜3djigsaw/と共に構造に基づくアラインメントを用いて生成された（ドメインフィッシングによって実行される）（ベイツら2001年）。得られたPDBファイルは、Jmolのhttp://firstglance.jmol.orgでのFirstGlance（ファーストグランス）で、およびPolyview-3Dのhttp://polyview.cchmc.org/polyview3d.html（ポロロおよびメラー2007）を用いてPyMolによってもたらされるモデルにおいて考察された（図2A）。構造的な比較のために、ニワトリSCFのためのモデルは、同じ手順に従って作り出し、そして図1に示すニワトリCSF1モデルはまた、図に含まれた。導き出されたタンパク質配列のこの構造解析は、すべての7つの戦略的位置付けのシステインを欠く分子を予測する。IL34は、若干の概ね保存されたシステイン残基を含むが、これらは位置されず、そして鎖内ジスルフィド（disfulfide）結合を形成するために一緒に適合しない。鎖間ジスルフィド架橋の形成用に必要なシステインは、哺乳動物CSF1のように二量体界面上に見出されないが、その領域は露出した疎水性残基を含む（図2B）。CSF1上の受容体結合部位1を構成する対応するアミノ酸は、赤色矢印で指摘される。これらの残基は、IL34でのものとは大きく異なり、直ちにCSF1タンパク質のそれとは別の結合メカニズムが示唆される。
キンカチョウCSF1R遺伝子の同定
【００７８】
13番染色体上のニワトリゲノムでは、アノテートした（注釈付き）CSF1R遺伝子〔アンサンブル（Ensembl）ID：ENSGALG00000005725〕があり、哺乳類の場合と同じ位置が、密接に関連するPDGFRB遺伝子〔アンサンブル（Ensembl）ID：ENSGALG00000021313〕の3'に隣接して占有される。ニワトリ配列の利用可能性は、本発明者らによるキンカチョウのゲノムにオルソロガス配列の同定が可能になるようにした[Chrl3：6,954,381-6,972,446、2008年7月アセンブリー]（GQ249407）。この遺伝子はニワトリCSF1Rのように21のエクソンを含み、および967のアミノ酸のタンパク質をコードし、それは再びニワトリCSF1Rと同じ長さである。
CSF1Rの進化的保存
【００７９】
種にわたってのアミノ酸配列の新しいマルチプルアライメントは、鳥CSF1Rおよび哺乳類オルソログ間の相同性を調べるためにClustalWのソフトウェアを用いて実行された（表3）。予想されるように、受容体の細胞内チロシンキナーゼドメイン〔aa（アミノ酸）540から977まで〕は、鳥を含め、すべての種を通じて著しく保存される。ただし、残基の間で、保存されていないのはシステイン665であり（表3において矢印で示される）、それは唯一、鳥でアルギニンに置換される。この置換は、ニワトリCSF1誘発マクロファージ増殖がキナーゼインヒビター（抑制剤）、哺乳類CSF1R活性を抑制するGW580〔V Garceau（ガルセウ）、未刊行〕によってブロックされていない（アーバインら2006）という本発明者らの知見の根底にあることができる。マウスCSF1 R/CSF1の共結晶から推測されるCSF1結合部位1および2を構成する残基のほとんど（表3での「+」および「°」記号でそれぞれ標識される）は、2羽の鳥の間で保存されていない。2羽の鳥の間で観察されたアミノ酸置換の若干は、キンカチョウ（左）およびニワトリ（右）CSF1RのD2ドメイン上CSF1結合部位1の3Dモデルが提示される図3Aに示される。リガンドと同じように。モデルは3DジグソーおよびPolyview-3Dを用いて作り出された。それぞれCSF1分子の重ね合わせた構造を有するこれらの同じ受容体のD1-D3ドメインのより一層一般的な観察は、図3Bに示される。受容体は、図3Aでのように同じ角度から示され、ニワトリCSF1構造は、オリエンテーションのために標識された二量体界面と共に、下絵のかわりに表面としてレンダリングされる図1Aと同じモデルである。キンカチョウCSF1構造は同じ設定を使用して作製し、重ね合わせ角度はマウスCSF1：CSF1 R複合体の共構造（co-structure）に基づく（チェンら2008）。この図では、キンカチョウ（左）とチキン（右）の受容体のアミノ酸置換は、それらのそれぞれのCSF1リガンドにおいて存在するものと共に文脈中に置く（put in context with）。相違のこの高いレベルは驚くべきものではなく、それはキンカチョウおよびニワトリが、同じ分類上の目（taxonomic order）の一部ではないからである。霊長類（霊長目）およびげっ歯類（齧歯目）のCSF1と同様に、本発明者らは、キンカチョウCSF1が、結合部位における電荷密度の大幅な変化により、ニワトリの受容体を活性化しないが、またはその逆もないことを予測する。
鳥類CSF1Rの転写調節
【００８０】
哺乳類CSF1R座は、保存されたマクロファージ特異的プロモーター領域、および導入遺伝子のマクロファージ特異的発現に必要とされる最初のイントロンで殊のほか保存されたエンハンサー（FIRE）（サスモノら、2003）が含まれる。これらの要素は明らかに鳥に保存されていない。しかし、PU.1のようなマクロファージの遺伝子発現に必要な転写因子は、明確なニワトリのオルソログを有する。鳥におけるマクロファージレギュレータであるCSF-1 Rの可能性を評定するためには、まず、本発明者らはニワトリとキンカチョウ（zebrafinch）遺伝子の転写調節を評定した。スズメ目とキジ目は、げっ歯目とヒト（www.timetree.org）とほぼ同じで、進化の前後100M年で区切られる。この距離のため、進化上で保存された、非コード領域は、機能的プロモーターおよびエンハンサーの位置の強い兆候を提供し、哺乳類ではFIRE（fmsイントロン調節エレメント）はエクソンのどれよりも保存されている（ハイムズら2001）。鳥類CSF1Rのイントロン-エクソン構造は、第1エクソンに位置するATG開始コドンと共に、哺乳動物（www.ensembl.org）と同じである。哺乳類CSF1Rプロモーターのように、2つの鳥類CSF1R近位プロモーターは、高度に保存されないが、どちらもプリン豊富であり、TATAレスである。双方の種の鳥で、プロモーターの上流と下流に二つの非常に高度に保存された領域が存在する。これは図3CのPustell DNAマトリクスのアラインメントに示される。下流の要素は、哺乳動物のFIRE（ハイムズら、2001）の最初のイントロン内の同じ相対的な位置にある。候補の鳥類FIRE配列は、哺乳類のFIREに整列することができないが、同じ基本的な要素が含まれる。これらの領域は、PU.1および他のEts因子、AP1、C/EBP、Sp1およびAML1の候補結合部位を含む、哺乳動物CSF1RおよびFIREと共通のコンセンサス配列の複数の反復を含む（図3Dおよび3E）。これらの転写因子の各々は、ニワトリでの造血細胞に発現する〔Faust（ファウスト）ら1999、Bakri（バクリ）ら2005〕。これらの知見は、鳥類のCSF1Rが、シス作用の個々の要素の再集合であるにもかかわらず、哺乳類でのように、基本的に同じ方法で制御されていることを示唆する。
ニワトリ胚におけるCSF1Rの発現パターン
【００８１】
保存領域の分析は、ニワトリCSF1R座の候補エンハンサーを識別し、そして遺伝子がマクロファージに特異的に発現される可能性があることを示唆する。その予測を確認するため、本発明者らは、発達の20HHまたは3.5日目、ウイングバド（翼芽）ステージ（図3F）のニワトリ胚のインサイツハイブリダイゼーションの全載を行った。この段階はマウス胚での11.5dpcに対応している。マウスにおけるように（リチャンスカら1999）、およびXenopus（ツメガエル属）におけるマクロファージ分布と一致するように〔Tomlinson（トムリンソン）ら2008年〕、ニワトリcsflr mRNAは、膨大な数のマクロファージへの制限と一致し、本体のあらゆる器官においてすべての胚上に斑点模様で発現される（左パネル）。
CSF1およびIL34によるニワトリCSF1Rの活性化
【００８２】
細胞表面上のCSF1Rの発現は、マクロファージの分化系列決定での最も早い事象の中にあり〔Tagoh（タゴー）ら2002〕、そしてCSF1は普通にマウスの骨髄から、マクロファージの純粋な集団を成長させるために使用される（ボニファーおよびヒューム2008年）。したがって、双方のリガンドを、ニワトリ骨髄細胞の分化のために試験した。ニワトリCSF1（最初の6つのエクソン）およびIL34遺伝子をpEF6ベクターにクローニングし、それらに検出用のC末端タグを提供し、HEK293T細胞にトランスフェクトした。細胞および上清の内で発現されるタンパク質を、ウエスタンブロット法によって検出した（図4）。CSF1の場合、3つの見かけの分子実体は、非還元上清中に見られ、そして最低の見かけのMR（約60kD）が細胞内にほとんどで存在し、その分泌タンパク質は、ER（小胞体）で処理され、そして多分プロテオグリカンとしてさえ、グリコシル化されることが示唆される。IL34の場合には、タンパク質は、ダブレットとして細胞および上清中に検出され、より一層高い見かけのMRがより一層低いMRより豊富であることを伴い、IL34がこのシステムではグリコシル化されていることを示唆した。上清中に検出されたエピトープ-タグ付けされたcIL34の量は、細胞溶解物においてかなり少なかった。これは、分泌経路または媒体でのトリプシン様プロテアーゼによるC末端の若干のタンパク質分解的開裂が原因であるかもしれず、それは、一連の塩基性アミノ酸が、IL34のC末端、単にv5タグの上流に見出されたからである。トランスフェクションしたHEK293T細胞、またはベクターのみでトランスフェクションした細胞からの上清を、ニワトリの大腿骨から骨髄をフラッシングすることによって得られた骨髄細胞に添加し、そして細胞を10日間インキュベートした。およそ3日目に、ニワトリCSF1またはIL34の存在下で増殖する細胞は接着性となり、12日目までに、ディッシュは集密的であった。骨髄細胞は、エンプティのpEF6をトランスフェクションしたHEKからの上清を含むコントロールのディッシュに生き残らなかった。したがって、CSF1およびIL34の双方は、機能研究のために、ニワトリの骨髄からのマクロファージを増殖させる可能性を提供し、骨髄由来マクロファージはマウスにおけるマクロファージ機能に関する研究の主流となっている（ボニファーおよびヒューム2008）。共に、データはCSF1Rおよびその2つのリガンドの機能が鳥で保存されていることを示す。
CSF1R、CSF1およびIL34の共進化
【００８３】
CSF1でのように、CSF1Rの細胞外ドメインは、種の間で全く異なる。マウスおよびラットの間でさえ、IL34はかなりより一層良好に保存され、そしてまだCSF1と同一の受容体を活性化する。CSF1/CSF1Rの相違は、(a)CSF1がLPSのような生来の免疫刺激に応じて循環血において大規模に誘導可能であること、そして(b)CSF1 R細胞外ドメインは、TLRアゴニスト（作用薬）の範囲に応じた細胞での細胞表面から、ADAM14/TACEの動作を通して開裂されるという事実に関連がありえた〔Sester（セスター）ら1999年、Rovida（ロビダ）ら2001年〕。それで、ある者は、CSF1が効果的な生来の免疫反応のために必要とされ、そして従って免疫選択の下にあると主張するかもしれない。実際、エプスタインバーウイルスは溶解性CSF1Rアンタゴニスト、BARF1〔Strockbine（ストロックバイン）ら1998年〕をコード化する。これは、どのようにして正確に2つのリガンドが単一の受容体で進化することができたかの興味ある進化の問題を起こす。理論的には、そして全体的な構造が保存されるならば、リガンドでの接触残基の変更は、結合親和性を保存するために、受容体での変更によって補償されなければならず、そして十分に大きな試料内で、相関関係マトリクスがパートナー（相手）上のアミノ酸の間になければならない。表1、2および3において示されたアラインメント、およびCSF1/CSF1 Rのための刊行されたPDB構造を取り入れることで、相関係数を計算するために、機能的な共進化を系統発生上またはランダムな共変動（co-variation）と区別することが可能であった（フェアスおよびトラヴァーズ2006a）。CAPSソフトウェアは高い相関係数を有するアミノ酸部位を確認するのに用いられ（フェアスおよびマクナリー2006a）、そしてこれらの共進化する残基のネットワークは図5Aに示される。特定の部位の対のための相関係数の強さは、それらを連結する線の色によって示し、そしてアミノ酸位置の番号付けは、ヒト配列を参照として続けられる。予想外に、唯一の有意な相関関係は、CSF1Rおよび2つのリガンド、IL34のより一層保存されたものの間で見出された。さらに、内部タンパク質共進化の徴候は、3つのタンパク質の何れでも見出されなかった。
CSF1RのIL34結合モード
【００８４】
CSF1RでのCAPSによって識別される共進化するアミノ酸位置のどれも、D2およびD3ドメインにあるCSF1-結合部位内に位置しない（チェンら2008）。その代わりに、それらは、D3およびD4の間で接合部（ジャンクション）に集中される。同様の様式で、IL34での共進化する残基位置は、CSF1の対応するCSF1 R結合部位の外に位置する。図5Aのネットワークに見られるすべての共進化する残基は、ニワトリCSF1RおよびIL34構造上でマッピングされた（図5B）。ニワトリ受容体のために、3DJigsawによって生成する2つのPDBファイルのキメラとして、ニワトリCSF1R D1-D5構造が生じた。すなわち、鋳型（3ejj）としてマウスCSF1R構造を用いたD1-D3、および鋳型（2e9w）としてヒトKIT構造を用いたD1-D5である。それから、2つのモデルは、ニワトリCSF1R D1-D5構造を作り出すために重ね合わされた。ニワトリIL34モデルは図2でのものと同じもので、わずかに異なる角度で見える。ニワトリでの対応している共進化する残基位置は、表2でのアラインメントから推論され、次いでPolyview-3Dを用いて、青色で強調される。CSF1RおよびIL34の特定の部位の共進化は、この特徴のない新しいリガンドおよび受容体の間の可能な結合モードと解釈することができる。それゆえ、本発明者らは、そのIL34：CSF1R結合部位界面がIL34のCDループおよびCSF1RのD3-D4ジャンクションのまわりの領域からなることを推測することができる。
BaF/3細胞に基づくアッセイを介した生物活性の評価
【００８５】
組換え型ニワトリCSF1は、ニワトリCSF1RまたはブタCSF1Rを発現する要因依存的な親のBaF/3細胞およびBaF/3細胞に滴定されるとき、示される実証できる特定の生物活性を有する。RPMI 1640倍地+10%のHI FBS+GlutaMax（グルタマックス）+pen(ペニ)/strep（ストレプ）（20U/mLおよび20マイクログラム/mL）および10ng/mLの組換え型ネズミIL-3において培養された親のBaF/3細胞、ニワトリCSF1R発現BaF/3細胞またはブタCSF1R発現BaF/3細胞を収集し、洗浄し、および96ウェルのマイクロタイタープレートで、ウェルあたり20K細胞で蒔いて培養し（plated）、そして一晩培養した。次の日、組換え型ニワトリCSF1を、すべての3つの細胞系に対して滴定した。コントロールとして、組換え型ブタCSF1および組換え型ヒトCSF1（シグマ社6518）を、すべての3つの細胞系に対しても滴定した。次いで、細胞アッセイを更なる48時間インキュベートし、その後（afterwhich）、細胞の生き残り/増加をTireGlo（タイターグロ）アッセイシステムを使用して評価した〔Cell TiterGlo（セル・タイターグロ）;Promega（プロメガ社）G7571〕。CSF1の調製物のどれも、BaF/3の親の系統での残存または増加を促進しなかった（図8）。ブタおよびヒトのCSF1調製物は、ニワトリCSF1Rを発現するBaF/3細胞の残存（survial）/激増を促進しない一方、ニワトリCSF1R調製物は、ニワトリCSF1Rを発現するBaF/3系統上へ滴定されるとき、ローバストな（強い）残存および増加によって示されるニワトリCSF1Rを通して、生物活性（EC50=約20ng/mL）を示した（図9）。図10において示されるように、ブタおよびヒトCSF1調製物は双方とも生物活性であり、それはそれらがブタCSF1R発現BaF/3細胞系上で等モルの生物活性（EC50=30ng/mL）を有するからである。
議論
【００８６】
CSF-1、IL34およびCSF-1Rの間の相互作用の構造的基礎は、進化の点から科学的に興味ある現象を提示する。目下のゲノミクス（ゲノム科学）の試みは、今回リガンドおよび受容体の双方のために15よりも多くの種から配列を提供する。これらの配列から、相互作用が魚の範囲まで後ろに進化的に保存されることは明らかである。配列を整列させ、そして重要な位置で異なる残基の寛容を調べることによって、CSF-1またはIL34の所定の残基と関連して変動する受容体での特定のアミノ酸を識別することができる。1つの種からのCSF-1の、別の種からのマクロファージ（または受容体でトランスフェクションされた細胞）の増殖および残存を誘発する能力は、進化上の保存に基づく予測に重要性を加える。たとえば、マウスCSF-1はヒトCSF-1Rに結合することができず、それでもヒトCSF-1はマウスCSF-1Rに結合することができ、そして活性化させることができる〔Koths（ケーツ）1997年〕。実際、ヒトのCSF-1はすべての種からのCSF-1Rを活性化することができ、そのためにそれが試験され（ヒト、マウス、ネコ科、ヒツジおよびイヌ）、ところがマウスCSF-1は、試験されたすべての非霊長類CSF-1R（マウス、ネコ、ヒツジおよびブタ）を活性化させることができ、ヒトCSF-1Rはそうでない〔スタンリーおよびギルベール1981、Woolford（ウルフォード）ら1988年、タムラら1990年、Francey（フランシー）ら1992年、Ramsoondar（ラムスーンダー）ら1993年、ヨシハラら1998年、Abrams（エイブラムズ）ら2003年〕。哺乳類で保存されない唯一の接触アミノ酸は、マウスR111であり、それはヒトにおいてQであり、そして他の種では異なる。ウシ属のCSF-1はネズミ骨髄マクロファージの増殖を引き起こし、おそらくネズミCSF-1Rの活性化を通してである（ヨシハラら1998年）。ニワトリ〔またはついに（at last）ニワトリの細胞条件つき媒体でのM-CSF生物活性〕およびネコ科のCSF-1は、逆に言えば、ヒトおよびマウスCSF-1Rを活性化させることができず、それら自身の種の受容体を活性化させることに限られる（タムラら1990年、タムラら1991年）。
【００８７】
最近の研究はいくつかの魚種のCSF1遺伝子を識別し、そしてこれらの種での遺伝子の初期の複製の証拠を提供した〔Wang（ワング）ら2008年〕。魚の（piscine）CSF1遺伝子のすべては、マウスCSF1/CSF1R共結晶構造から意味された哺乳類の接触残基のほとんど完全な相違を有する。目下の研究で、本発明者らは、ニワトリCSF1およびIL34遺伝子を識別し、そして発現させ、CSF1Rが哺乳類でそのままにニワトリマクロファージにおいて発現されるという証拠を提供すること（そして、たぶん同様の様式においてコントロールされる（図3C-3F）、および組換え因子が純粋なマクロファージ培養物を骨髄前駆体から生産することの証拠を提供する。それゆえに、CSF1/IL34/CSF1R三つ組（triad）のバイオロジーは、脊椎動物、鳥の別のクラスでも保存される。分子モデリングは、CSF1が鳥および哺乳類での保存された構造を有することを示唆し、そして対照的には、刊行された研究（リンら2008）は、IL34がまた4つのらせん束（パンディットら1992）によって特徴付けられるそのトポロジーを共有することを示唆する。IL34が、CSF1において独特の鎖内ジスルフィド結合を形成するすべてのシステインを欠くという事実があるが、SCF、GM-CSFおよびGHなどのような他の増殖因子はすべて1つまたは2つの鎖内結合を有し、そしてまだ同じ4つのらせんのトポロジーを有する（パンディットら1992）。
【００８８】
IL34がCSF1Rに結合することはすでに知られており（リンら2008）、そしてCSF1のものに類似する構造の知見は、それらがCSF1R上の同じ結合部位の両方を共有したという結論につながる可能性がある。このことは、IL34の配列に適合性がなく、そこではCSF1/CSF1R共結晶構造から識別される接点が完全に変形である。ここで実行された共進化の研究は、新しい視点を明らかにした。タンパク質の3D構造で識別する場合は、CAPSによって暴露された共進化の残基の位置は、独特の領域で一緒にグループ化される。IL34では、それらのほとんどは、二量体界面への遠位端に配置され、特にらせん（ヘリックス）CおよびヘリックスDの間の柔軟なループ上である。共進化する残基のいずれも、CSF1上の対応する結合部位に位置する。CSF1R上で、それらの大半は、D3とD4のジャンクションに配置される。一緒にする場合、これら2つの結合部位は自然にお互いに合う。また、CSF1R D4は、ベータシートを接続し、そして柔軟性を有する可能性があるIg様ドメインの特徴的ジスルフィド結合を欠くことが知られている〔Blechman（ブレクマン）ら1995年〕。CSF1R二量体化および活性化のために最近刊行されたモデルは、IL34のための代わりの結合モードを収容することができる（チェンら2008）。興味深いことに、この結合モードは、それらの受容体への他の4つのヘリックス束因子（GH、GM-CSF、EPO）の結合、ヘリックス間の部位の関与、およびCSF1RのドメインD2/3のクレフト（裂け目）よりも形質膜（プラズマ細胞膜）にかなり近いドメイン内のクレフト内の結合を連想させる。CSF1/CSF1 Rの活性化モデルは、二量体化が、2つのドメインD4sの間の相互作用を可能にすることを示唆し、シグナリングを生成するコンフォメーション変化が導かれる（チェンら2008）。IL34は、それによって異なる信号を生成するでしょうか？GHRの場合には、コンフォメーションを変える細胞外ドメインにおける異なる変異は、トランスフェクションしたFDCP1細胞において特定のシグナリング経路の選択的損失を導くことがある〔Rowlinson（ローリンソン）ら2008年〕。GHRの細胞内ドメインに連結されたCSF1Rの細胞外ドメインは、CSF1依存的な増殖促進信号を、同じ因子依存性細胞に提供することができる〔MJ Water（ウォーターズ）、DAヒューム、未刊行〕。それで、2つのリガンドは、部分的にだけ重複する信号を生成するために、同じ受容体を介して信号を送ることができると考えられる。
【００８９】
CSF1およびIL34の異なる結合モードは、CSF1結合部位での電荷の変化が受容体結合部位での反対の電荷の変化によって調和されるにもかかわらず、それらの間には有意な相関係数が存在しないという事実によって暗示される。CSF1RへCSF1の弱い結合は塩の架橋に基づき、そして単にその部位での反対の電荷の存在が発生することが必要である。これは、アミノ酸の適合の厳密な共進化が関与する必要はない。CSF1Rに対するIL34の結合は、しかし、完全に相補性を必要とする水素結合、従って共進化性の（co-evolving）、残基に基づくことがある。
【００９０】
IL34およびCSF1Rのための代替結合部位を示唆することに加え、共進化の研究は、本発明者らにCSF1およびIL34の間の機能的な違いについてのヒントを与える。確かに、CSF1Rでの共変動の相関した進化が、IL34について検出することだけができるという事実は、後者がCSF1よりも強力な選択的な制約を受けていることを意味する。言い換えるなら、IL34の遺伝的組成の変化は必然的に受容体での相互の進化的変化を伴い、それは、活性の任意の損失の結果が、CSF1のための類似する損失よりも劇的だからである。さらにまた、それは、IL34よりも一層迅速に自由に進化でき、そしてそれと共に共進化する受容体を伴わないことを示唆する。これらの解釈は、CSF1に比べIL34のより一層良好な保存およびIL34のむしろ異なる発現パターンと一緒に採用され（www.biogps.orgを参照）、IL34がより多くの栄養に関する役割を果たすかもしれないことが示唆される。
【００９１】
マクロファージは胚発生の多くの明白な役割を有する（リチャンスカおよびヒューム2000、レイら2007）が、哺乳類でのそれらの機能の研究は、胚の近づき難さ、およびCSF1がマザー（母親）によって生産され、および胎盤を横切って伝達されるという事実よって制約された。今回、本発明者らは、鳥類の骨髄造血を制御する可能性があるキーの調節因子を確認し、そしてこれらの遺伝子の発現および機能を操作するために、胚内（in ovo）でニワトリの発達のアクセシビリティを活用することができるようになる。
【００９２】
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【図４Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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