(57)【要約】  本発明は、発生経路に対する化学物質の効果を予測するための方法及びキットに関する。特に本発明は、ヒト発生経路に対する化学物質の毒性を予測するための方法及びキットに関する。本発明の方法及びキットは、ヒト胎児発生中における細胞バイオマップ又は発生経路の変化を予測するために使用できる。【選択図】図２【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の発生経路に対する化学物質の毒性を予測する方法であって、
（ｉ）試料中の対照未分化幹細胞集団を作用因子で処理して第１の発生経路中に第１の対照分化細胞集団を生成する段階、
（ｉｉ）前記対照未分化幹細胞集団及び／又は前記第１の対照分化細胞集団において発現される２以上のバイオマーカーのレベルを測定して対照発現レベルを決定する段階であって、前記バイオマーカーの１以上は発生経路及び／又は分化の早期ステージで発現され、前記バイオマーカーの１以上は発生経路及び／又は分化の後期ステージで発現される段階、
（ｉｉｉ）前記作用因子で処理する前又は後において、前記試料中の試験未分化幹細胞集団を化学物質に暴露して第１の発生経路中に第１の試験分化細胞集団を生成する段階、
（ｉｖ）前記試験未分化幹細胞集団及び／又は前記第１の試験分化細胞集団における前記２以上のバイオマーカーのレベルを測定して試験発現レベルを決定する段階、並びに
（ｖ）前記対照発現レベルを前記試験発現レベルと比較する段階
を含んでなり、前記化学物質への暴露後における発現レベルの差が前記発生経路に対する化学物質の毒性を表す、方法。
【請求項２】
段階（ｉ）が未分化幹細胞集団を作用因子で処理してｎ番目の発生経路中にｎ番目の分化細胞集団を生成する段階を含み、次いで段階（ｉｉ）〜（ｖ）を繰り返して前記ｎ番目の集団における対照発現レベルと試験発現レベルとの差を決定し、化学物質への暴露後における発現レベルの差が前記ｎ番目の発生経路に対する化学物質の毒性を表す、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１の発生経路及び前記ｎ番目の発生経路がネットワーク化された発生経路である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
段階（ｉ）が未分化幹細胞集団を作用因子で処理して複数の発生経路中に複数の分化細胞集団を生成する段階を含み、次いで段階（ｉｉ）〜（ｖ）を繰り返して前記複数の集団における対照発現レベルと試験発現レベルとの差を決定し、化学物質への暴露後における発現レベルの差が前記複数の発生経路に対する化学物質の毒性を表す、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記複数の発生経路がネットワーク化された発生経路である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記幹細胞が多分化能性幹細胞である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記多分化能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
多分化能性幹細胞が誘導多分化能性幹細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
多分化能性幹細胞が始原生殖細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記幹細胞が成体幹細胞である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
幹細胞がヒト幹細胞である、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
未分化幹細胞が２以上のバイオマーカーと機能的に連結した相異なるレポーター遺伝子を含み、２以上のバイオマーカーのレベルが相異なる遺伝子産物の測定によって定量化される、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記レポーター遺伝子が、ニトロレダクターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、ルシフェラーゼ及び蛍光タンパク質レポーター遺伝子からなる群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
２以上のバイオマーカーのレベルが、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、定量的免疫細胞化学、表面プラズモン共鳴及びマイクロアレイ分析からなる群から選択される方法によって定量化される、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
さらに、段階（ｉｉｉ）後に細胞増殖を測定する段階を含む、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
当該方法が多重方法である、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
請求項１乃至請求項のいずれか１項記載の方法を用いて、ヒト胎児発生中における細胞バイオマップ又は発生経路の変化を予測する方法。
【請求項１８】
請求項１乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法を実施するためのキットであって、２以上のバイオマーカーを定量化するための手段及び前記方法を実施するための取扱説明書を含んでなるキット。
【請求項１９】
前記手段が、抗体、酵素基質及びオリゴヌクレオチドプライマーからなる群から選択される、請求項１８記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞生物学、毒物学及び薬物スクリーニングの分野に関する。特に本発明は、発生経路に対する化学物質の毒性を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、化学的傷害後におけるヒトの細胞／組織又は胎児発生に関する情報を提供するように設計された方法を記載する。それは、インビボでの細胞／組織発生を模倣するための手段として、既知の刺激に応答したヒト幹細胞株のインビトロ分化を利用する。さらなる実施形態には、ｉ）広範囲の細胞／組織マーカーの使用並びにｉｉ）早期及び後期細胞／組織マーカーの使用が含まれる。これらを総合して、いかなる発生経路がどの段階で破壊されるかを示すことができる。
【０００３】
前駆細胞の分化中に、細胞は化学物質、薬物、化粧品又は催奇形物質に暴露され、発生過程に対する効果は分化の程度をモニターすることで評価される。実際、Ｓｕｔｅｒ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２００６，  １０，  ３６２−３６６）は、医薬品安全性評価のための標準的な（非幹細胞）インビトロ試験の予測的価値及び限界を記載している。現行試験の多くは、既存方法の特異性欠如のために大きな欠点を有している。実際、多くの既存方法は時間がかかり、情報量が少なく、しばしば多数の実験動物の使用を必要とする。したがって、多量のデータ／情報を与えるヒト発生毒性アプローチの使用は、消費者及び患者の安全を損なうことなしに試験動物の数及び費用を低減させる可能性をもった、従来方法に対する魅力的な代替手段である。
【０００４】
最近の発表では、発生中の胎児に対する化学物質の効果がハイライトされている。すべての生産児の約５％は発生上及び行動上の欠陥を有するが、その多くは化学的傷害に帰因させ得ると推定されている。さらに、欧州連合はＲＥＡＣＨ（化学物質の登録、評価及び認証）と呼ばれる新しい化学物質規則を制定した（２００７年）が、これはこれまでに制定された最も複雑で包括的な規制努力であることを約束している。この法規中では、生殖毒物学及び発生毒物学に関する要求条件が極めて重要である。これらは、最高の資金投資要件及び実験動物の必要性をもたらすからである。加えて、生殖上及び発生上の配慮から、現在広く使用されている多くの物質が制限されることがある。ＲＥＡＣＨは実験動物研究に関する厳格な要件を有しているものの、法規は試験における脊椎動物の使用を控えさせ、実験室が代替方法を考慮することを要求している。確立された代替動物方法の多くにはしばしば問題があり、したがってヒトの胎児及び／又は生殖発生に対する化学的傷害の結果を正確に予測できる一層良好で改良された実験室的方法に対する大きなニーズがある。このように、ヒトの発生に対する化学物質の潜在的な毒性効果を評価するための新しい細胞ベースの方法の導入及び有効性確認に対するニーズが存在している。
【０００５】
幹細胞
ヒトの発生中、毒性傷害を最も受け易い組織には、神経系、肝臓、腎臓、肺、皮膚などがある。したがって、細胞／組織特異的マーカーと共に前駆細胞株を使用するアッセイは、特定の化学物質が毒性であるか否かばかりでなく、細胞／組織が影響を受けるか否かを確認するために役立つであろう。さらに、この特許明細書中に記載されるアプローチは、早期及び後期の細胞分化マーカー（例えば、Ｎｋｘ２．５及びαＭＨＣはそれぞれ早期及び後期心臓マーカーである）を識別する能力を有するので、追加の能力付与特徴を有している。
【０００６】
胚性幹（ＥＳ）細胞は、例えばニューロン細胞に分化させることができる。分化後、胚性幹細胞マーカーの発現レベル及び分化細胞マーカーの発現レベルを定量化することができる。ここでは、胚性幹細胞の分化が胎児／細胞発生を反映するための手段として使用される（例えば、図１を参照されたい）。
【０００７】
化学的傷害後、発現レベルが破壊されたマーカーの同定は、どの細胞発生経路が影響を受けたかを同定することを容易にする。加えて、早期及び後期細胞マーカーの定量化は、特定の細胞タイプ（例えば、それぞれ早期及び後期マーカーであるｏｌｉｇ２及びＭＯＧを用いる乏突起膠細胞）の発生に対する一層徹底的な問いかけを可能にする。したがって、すべての特異的細胞マーカーの定量化は、細胞発生／分化経路全体に対する問いかけを容易にするであろう。かくして、本明細書中に記載される発明は、例えば胎児発生に関して毒性プロファイル又は毒性バイオマップを構築するために使用できる。
【０００８】
幹細胞は、（すべてではないにせよ）大抵の多細胞生物において見出される細胞である。これらは、有糸細胞分裂によって自己を更新すると共に、様々な範囲の特殊化細胞タイプに分化する能力によって特徴づけられる。哺乳動物幹細胞の２つの大別されたタイプには、胚盤胞の内部細胞塊から単離される胚性幹細胞、及び成体組織中に見出される成体幹細胞がある。発生中の胚では、幹細胞はすべての特殊化胚組織に分化し得る。成体生物では、幹細胞及び前駆細胞は特殊化細胞を補給する身体の修復系として作用するばかりでなく、血液、皮膚又は腸組織のような再生器官の正常な代謝回転も維持する。現在、細胞培養によって幹細胞を増殖させ、筋肉又は神経のような各種組織の細胞と一致した特性を有する特殊化細胞に変換することができる。成体幹細胞は、神経細胞から血液細胞へのように、発生的に無関係の細胞タイプに分化することができる。幹細胞の運命は内因性及び外因性シグナルの両方によって調節され、これらのシグナルの一部は同定されている（Ｗａｔｔ  ＆  Ｈｏｇａｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，  ２８７，  １４２７−１４３０）。
【０００９】
臍帯血及び骨髄を含む各種供給源からの成体幹細胞は、医学療法において日常的に使用されている。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、胚盤胞として知られる初期ステージの胚の内部細胞塊から導かれる幹細胞である。ヒトの胚は受精後４〜５日で胚盤胞に到達し、その時点でこれは５０〜１５０個の細胞からなる。胚性幹（ＥＳ）細胞は多分化能性である。これは、かかる細胞が３つの一次胚葉（即ち、外胚葉、内胚葉及び中胚葉）のすべての誘導体に分化し得ることを意味する。これらは、成体における２２０以上の細胞タイプの各々を含んでいる。多分化能性は、成体において見出される多能性前駆細胞からＥＳ細胞を区別する。即ち、前者は限られた数の細胞タイプのみを形成する。分化のための刺激が与えられない場合（即ち、インビトロで増殖させた場合）、ＥＳ細胞は多数回の細胞分裂を通して多分化能性を維持する。多分化能性成体幹細胞の存在は科学的議論の的となっている。しかし、研究の結果、成体線維芽細胞培養物から多分化能性幹細胞を直接に生成できることが証明されている。その組織形成性及び潜在的に無制限の自己更新能力のため、ＥＳ細胞療法は傷害又は疾患後における再生医療及び組織置換のために提唱されている。しかし、現在まで、胚性幹細胞研究から導かれた承認済みの医学療法は存在していない。これまでのところ、成体幹細胞及び臍帯血幹細胞が何らかの疾患を治療するため成功裡に使用された唯一の幹細胞であった。
【００１０】
これらの非胚性幹細胞で治療された疾患には、多数の血液及び免疫系関連遺伝的疾患、癌及び障害、若年型糖尿病、パーキンソン病、失明及び脊髄損傷がある。幹細胞療法に関する１つの技術的問題は、アロジェニック幹細胞移植に関連する移植細胞対宿主病の問題である。しかし、宿主適合性に関連するこの問題は、自己提供の成体幹細胞の使用又は治療用クローニングの経由によって解決できる。幹細胞の実用的定義は、寿命期間にわたって組織を再生する可能性をもった細胞という機能的定義である。例えば、骨髄又は造血幹細胞（ＨＳＣ）に関するゴールドスタンダード試験は、１個の細胞を移植し、ＨＳＣのない個体を救い得ることである。この場合、幹細胞は新しい血液細胞及び免疫細胞を産生して効力を証明することが可能でなければならない。また、移植された個体から幹細胞を単離し、それ自体をＨＳＣのない別の個体に移植し、幹細胞が自己更新可能であることを証明できなければならない。幹細胞の性質は、単一の細胞をその分化及び自己更新能力によって特徴づけるクローン原性アッセイのような方法を用いてインビトロで示すことができる。さらに、細胞表面マーカーの特有のセットに基づいて幹細胞を単離することができる。
【００１１】
先行技術
幹細胞に関しては多くの公表された特許及び特許出願が存在している。許容される場合、以下に列挙した文献の内容は援用によって本明細書の一部をなす。
【００１２】
米国特許第５８４３７８０号及び同第６２００８０６号（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｌｕｍｎｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）は、霊長類の胚性幹細胞を単離するための方法を記載している。
【００１３】
国際公開第２００７／１２０６９９号（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｌｕｍｎｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）は、発生毒性を予測することができる低分子量細胞代謝産物（１０〜１５００ダルトン）のバイオマーカープロファイル、並びにヒト胚性幹細胞を用いて医薬品、リード薬物や候補薬物化合物及び他の化学物質を含む化合物をスクリーニングする方法を記載している。
【００１４】
Ｓｔｕｍｍａｎ他（２００９，  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ２５７（３）  １１７−１２６）は、ニューロン細胞に変わる胚性幹細胞を用いて、メチル水銀の胚毒性危険性の評価を記載している。この論文には、特にメチル水銀の胚毒性のインビトロ予測を向上させることを目的とする発生毒性化合物用のツールとして胚性幹細胞試験が記載されている。Ｓｔｕｍｍａｎ他は、３つの決定点（即ち、細胞毒性アッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ及び免疫組織化学）に基づく予測モデルを記載している。
【００１５】
国際公開第２００７／０６３３１６号（Ｐｌａｓｔｉｃｅｌｌ社）は、細胞シグナリング経路の潜在的モジュレーターを同定するための方法であって、（ａ）第１の細胞タイプを２以上の反応条件に順次に暴露することで前駆細胞を介して第２の細胞タイプに分化させ得る第１の細胞タイプの細胞を用意する段階、（ｂ）前駆細胞が暴露された２以上の反応条件に加えて又はその１以上に代えて、潜在的モジュレーターを含む１以上の反応条件に暴露する段階、及び（ｃ）第１の細胞タイプの分化をモニターして第２の細胞タイプの形成を判定する段階を含んでなる方法を開示している。
【００１６】
Ｂｕｅｓｅｎ他（２００９，  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １０８（２）  ３８９−４００）は、単一の試料からのただ１つのバイオマーカー（細胞毒性）の測定を記載している。
【００１７】
国際公開第２００４／０１３３１６号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｕｒｈａｍ）は、細胞集団から単離された個々の哺乳動物多分化能性幹細胞から導かれるクローン性多分化能性幹細胞の１種以上の組成物を製造する方法であって、哺乳動物多分化能性幹細胞のマーカーを発現する個々の細胞を認識して結合する一定量のタグに不均質な細胞集団を暴露する段階を含んでなり、タグが回収手段を含む方法を開示している。
【００１８】
国際公開第２００７／００２５６８号（Ｇｅｒｏｎ社）は、インビトロで培養された細胞集団中の標的組織タイプに対する薬理学的効果を迅速に判定するための系を記載している。細胞は、スクリーニングすべき薬剤によって引き起こされる毒物学的変化又は代謝変化を反映するプロモーター−レポーター構築物を含んでいる。
【００１９】
米国特許第７０４１４３８号（Ｇｅｒｏｎ社）は、フィーダー細胞の不存在下で霊長類多分化能性幹細胞を培養するための改良系を開示している。
【００２０】
米国特許出願公開第２００６／０２７５８１６号（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ＆  Ｃｈｅａｔｈａｍ）は、バイオマーカーを用いて薬理学及び毒物学の機序の同定を可能にするマイクロアッセイ及び細胞ベーススクリーニング方法を記載している。
【００２１】
米国特許出願公開第２００４／０２５４７３６号（Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ  ＆  Ｂａｎｇｓ）は、コンピューターモデリング及び生物学的プロセスを用いて生物学的系における潜在的毒性を同定するための方法及び装置を開示している。
【００２２】
米国特許出願公開第２００２／０１９２６７１（Ｃａｓｔｌｅ  ＆  Ｅｌａｓｈｏｆｆ）は、物質の毒性を評価するための方法であって、２以上の遺伝子を該物質に暴露し、コントラスト分析を用いて各遺伝子についての該物質に対する応答の分散を分析し、遺伝子セット中の各遺伝子について要約スコアを作成し、要約スコアに関してロジスティック回帰分析を実施し、ロジスティック回帰分析の結果を用いて物質の毒性に関する予測モデルを得ることを含んでなる方法を記載している。
【００２３】
米国特許第７３５４７３０号（ＨｅｍｏＧｅｎｉｘ社）は、造血幹細胞及び前駆細胞増殖の高スループットアッセイを開示している。
【００２４】
米国特許第７２０２０８１号（Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ社）は、増殖している哺乳動物細胞試料を試験系として用いて物質の細胞増殖阻害活性及び細胞毒性（細胞死の誘発）を同時測定するための方法を記載している。
【００２５】
米国特許第６９９８２４９号（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ社）は、所定化合物のインビボ毒性を予測するための方法を開示している。かかる方法は、３以上の相異なるアッセイを並行して実施することで所定の標的細胞における化学物質の細胞毒性の３つの相異なるパラメーターに関する情報を得ることを含み、この情報がインビボ細胞毒性を予測するために有用である。かかる方法は、幹細胞又は多重化を含む技法を記載していない。
【００２６】
米国特許第６００７９９３号（Ｉｎｓｉｔｕｔ  ｆｕｒ  Ｐｆｌａｎｚｅｎｇｅｎｅｔｉｋ  ｕｎｄ  Ｋｕｌｔｕｒｐｆｌａｎｚｅｎｆｏｒｓｃｈｕｎｇ）は、始原生殖細胞から得られた胚性生殖（ＥＧ）細胞を用いてマウス及びラットからの分化した多分化能性胚性幹（ＥＳ）細胞に基づく胚毒性／催奇形性スクリーニングを行う目的で、胚発生及び分化に対する化学的に誘導された効果を検出するためのインビトロ試験方法を記載している。提唱された試験方法は、組織特異的プロモーター及びレポーター遺伝子を含む安定したトランスジェニックＥＳ又はＥＧ細胞クローンが選択され、特定の時点で作用する胚毒性物質の存在下でＥＳ細胞を様々な発芽経路誘導体に分化させた後に組織特異的遺伝子の分化依存性発現が実施されることを特徴とする。これは、胚発生を調節する組織特異的遺伝子の化学的に誘導された活性化、抑制又は変調を検出することで追跡される。
【００２７】
米国特許出願公開第２００８／０２８０３００号（Ｐｌａｓｔｉｃｅｌｌ社）は、細胞シグナリング経路の潜在的モジュレーターを同定するための方法であって、（ａ）第１の細胞タイプを２以上の反応条件に順次に暴露することで前駆細胞を介して第２の細胞タイプに分化させ得る第１の細胞タイプの細胞を用意する段階、（ｂ）前駆細胞が暴露された２以上の反応条件に加えて又はその１以上に代えて、潜在的モジュレーターを含む１以上の反応条件に暴露する段階、及び（ｃ）第１の細胞タイプの分化をモニターして第２の細胞タイプの形成を判定する段階を含んでなる方法を開示している。
【００２８】
米国特許出願公開第２００８／０２４８５０３号は、毒性並びにリンパ造血系の残留増殖及び分化能力を予測するための化合物スクリーニング方法を記載している。
【００２９】
米国特許出願公開第２００８／０１３２４２４号は、増殖に関するＡＴＰ測定を用いるヒト胚盤胞由来の幹細胞及び前駆細胞に基づく毒性アッセイを開示している。
【００３０】
米国特許出願公開第２００７／０２４８９４７号（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｌｕｍｎｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）は、低分子量細胞代謝産物のバイオマーカープロファイル、並びにヒト胚性幹細胞又はそれから生成される系統特異的細胞を用いて医薬品、リード薬物や候補薬物化合物及び他の化学物質を含む化合物をスクリーニングする方法を記載している。かかる方法は、上記化合物の毒性（特に発生毒性）を試験すると共に、その催奇形効果を検出するためのものである。米国特許出願公開第２００７／０２４８９４７号は、本明細書中に記載されるような多重方法又は細胞バイオマーカーを記載していない。
【００３１】
米国特許第７５４１１８５号（Ｃｙｔｈｅｒａ社）は、内胚葉細胞集団中の細胞を、腸管由来の組織及び／又は器官を形成し得る細胞に分化させるのに有用である１以上の分化因子を同定するための方法を開示している。米国特許第７５１０８７６号（Ｃｙｔｈｅｒａ社）は、ヒト内胚葉細胞を生成するためのインビトロ方法を記載している。
【００３２】
Ｃｅｚａｒ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．  Ｍｅｄ，  ２００６，  ２０，  １０７−１１４）は、疾患及び毒性応答のインビトロモデルの生成における幹細胞技術のための重要な機会を総説している。Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ＆  Ｈａｓｋｉｎｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２００７，  ３５６，  ４１５−４２５）は、化合物がヒト毒性を引き起こす可能性を評価するためのマルチパラメーター、生細胞かつ致死前細胞毒性ハイコンテントスクリーニングアッセイを記載している。Ｂｒｅｍｅｒ  ＆  Ｈａｒｔｕｎｇ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ，  ２００４，  １０，  ２７３３−２７４７）は、国際盲検共同試験におけるインビボでの結果と比較した胚性幹細胞試験の有効性確認を総説している。
【００３３】
Ｓｔｕｍｍａｎｎ他（Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ２００７  ２４２，  １３０−４３）は、胚性幹細胞を用いて、メチル水銀及びクロムの胚毒性危険性の評価を記載している。この論文には、特にメチル水銀の胚毒性のインビトロ予測を向上させることを目的とする発生毒性化合物用のツールとして胚性幹細胞試験が記載されている。Ｓｔｕｍｍａｎ他は、３つの決定点（即ち、胚性幹細胞の心臓分化アッセイに加えてマウス胚性幹細胞及び３Ｔ３線維芽細胞による細胞毒性アッセイ）に基づく予測モデルを記載している。しかし、この論文には、特定の細胞発生経路に関する早期又は後期分化バイオマーカーに対する毒素又は催奇形物質の効果が、胎児又は細胞発生を反映するための手段として記載されていない。
【００３４】
Ｃｌａｒｋｅ他（Ｒｅｇｅｎ．  Ｍｅｄ．  ２００７，  ２，  ９４７−９５６）は、ハイコンテント情報を得るために各種造血組織からの一次細胞を使用することを開示している。Ｐａｑｕｅｔｔｅ他（Ｒｅｐｒｏｄ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ２００８，  ８３，  １０４−１１１）は、製薬業界において胚性幹細胞試験を発生毒性化合物用のツールとして適用及び使用することを記載している。
【００３５】
Ｌｉ他（Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００８，  ３８９，  １６９−１７７）は、成体幹細胞株の脂肪生成分化を阻害する有害薬剤（ダイオキシン）の効果を記載している。Ｍｉｒａｎｄａ他（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ２００８  ４４７，  １５１−１５６）は、齧歯類胎児大脳皮質由来の神経幹細胞を実験モデルとして使用することを記載し、以後のニューロン成熟に対する先行エタノール暴露の効果を決定している。
【００３６】
Ａｄｌｅｒ他（Ａｌｔｅｒｎ  Ｌａｂ  Ａｎｉｍ．  ２００８  ３６，  １２９−４０）は、様々な発生成熟度を表すヒト細胞タイプ（即ち、包皮線維芽細胞、ヒト胚性幹細胞由来の前駆細胞、及びヒト胚性幹細胞）に基づく細胞生存度アッセイを開示している。
【００３７】
Ａｄｌｅｒ他（Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，  ２００８  ２２，  ２００−２１１）は、ヒト胚性幹細胞及び多数のマーカー遺伝子に基づく発生毒性試験方法を記載している。
【００３８】
Ａｈｕｊａ他（Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ２００７  ２３１，  １−１０）は、特定の細胞タイプを化学的又は物理的作用因子で処理することを記載している。その応答を測定することは、成体生物の各種器官系における毒性を試験するための近道を提供する。
【００３９】
技術的問題
上述した通り、冗長で費用のかかる動物試験への復帰なしにヒト発生に対する化学物質の毒性を予測するために使用でき、しかもモデル動物系に頼るよりも綿密にヒト発生を反映する新しいアッセイに対するニーズが存在している。特に、いずれの発生経路及びいずれの組織が化学物質によって影響を受けるかを予測するアッセイに対する未達成のニーズが存在している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００４０】
国際公開第２００８／１０７９１２号パンフレット
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００４１】
本発明の第１の態様では、試料中の発生経路に対する化学物質の毒性を予測する方法であって、
（ｉ）試料中の対照未分化幹細胞集団を作用因子で処理して第１の発生経路中に第１の対照分化細胞集団を生成する段階、
（ｉｉ）前記対照未分化幹細胞集団及び／又は前記第１の対照分化細胞集団において発現される２以上のバイオマーカーのレベルを測定して対照発現レベルを決定する段階であって、前記バイオマーカーの１以上は発生経路及び／又は分化の早期ステージで発現され、前記バイオマーカーの１以上は発生経路及び／又は分化の後期ステージで発現される段階、
（ｉｉｉ）前記作用因子で処理する前又は後において、前記試料中の試験未分化幹細胞集団を化学物質に暴露して第１の発生経路中に第１の試験分化細胞集団を生成する段階、
（ｉｖ）前記試験未分化幹細胞集団及び／又は前記第１の試験分化細胞集団における前記２以上のバイオマーカーのレベルを測定して試験発現レベルを決定する段階、並びに
（ｖ）前記対照発現レベルを前記試験発現レベルと比較する段階
を含んでなり、前記化学物質への暴露後における発現レベルの差が前記発生経路に対する化学物質の毒性を表す方法が提供される。
【００４２】
当業者には容易に理解される通り、疑問を避けるため、本発明で使用するための未分化幹細胞は全能性幹細胞を含まない。
【００４３】
好ましい態様では、本方法の段階（ｉ）は未分化幹細胞集団を作用因子で処理してｎ番目の発生経路中にｎ番目の分化細胞集団を生成する段階を含み、次いで段階（ｉｉ）〜（ｖ）を繰り返して前記ｎ番目の集団における対照発現レベルと試験発現レベルとの差を決定し、化学物質への暴露後における発現レベルの差が前記ｎ番目の発生経路に対する化学物質の毒性を表す。
【００４４】
一態様では、第１の発生経路及びｎ番目の発生経路はネットワーク化された発生経路である。
【００４５】
一態様では、本方法の段階（ｉ）は未分化幹細胞集団を作用因子で処理して複数の発生経路中に複数の分化細胞集団を生成する段階を含み、次いで本方法は段階（ｉｉ）〜（ｖ）を繰り返して前記複数の集団における対照発現レベルと試験発現レベルとの差を決定することを含み、化学物質への暴露後における発現レベルの差が前記複数の発生経路に対する化学物質の毒性を表す。
【００４６】
好適には、複数の発生経路はネットワーク化された発生経路である。
【００４７】
一態様では、幹細胞は多分化能性幹細胞である。多分化能性幹細胞は、胚性幹細胞、誘導多分化能性幹細胞又は始原生殖細胞であり得る。
【００４８】
別の態様では、幹細胞は成体幹細胞である。
【００４９】
好ましくは、幹細胞はヒト幹細胞である。
【００５０】
一態様では、バイオマーカーの１以上が胚性幹細胞バイオマーカーである。
【００５１】
別の態様では、バイオマーカーの１以上が始原生殖細胞バイオマーカーである。
【００５２】
さらに別の態様では、バイオマーカーの１以上が成体幹細胞バイオマーカーである。
【００５３】
好適には、胚性幹細胞バイオマーカーは、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ４、Ｏｃｔ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ１３３、Ａ２  Ｂ５、ＰＡＸ６、インテグリンβ１、ＣＥＡ、Ｔｎｋ１、ＥＲＡＳ及びＳＴＥＬＬＡＲからなる群から選択される。
【００５４】
好適には、始原生殖細胞バイオマーカーは、ＤＤＸ４、Ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｓｔｅｌｌａ及びＮＡＮＯＳ２からなる群から選択される。
【００５５】
一態様では、バイオマーカーの１以上が中胚葉バイオマーカーである。好ましくは、中胚葉バイオマーカーは、ブラキュリ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）、Ｔｂｘ６、ＴＢＲ２、ＥＯＭＥＳ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＲＲＸ１、ＰＲＲＸ２、ＭＥＳＤＣ２、Ｍｅｓｐ１、Ｍｅｓｐ２、ＭＩＥＲ１、ＭＩＥＲ３及びＳＮＡＩＬからなる群から選択される。
【００５６】
別の態様では、バイオマーカーの１以上が外胚葉バイオマーカーである。好ましくは、外胚葉バイオマーカーは、ＥＥＤ、ＴＩＦ１  ｇａｍｍａ、ＫＬＨ２５、ＥＤＡ、ＧＪＢ６、ＥＮＣ１、ＥＤＡＲ、ＳＯＳＴＤＣ１、ＮＣＡＭ及びＣＤ９９からなる群から選択される。
【００５７】
さらに別の態様では、バイオマーカーの１以上が内胚葉バイオマーカーである。好ましくは、内胚葉バイオマーカーは、Ｋｉ６７、Ｒｂ、カリン１、カリン２、カリン３、サイクリンＥ及びサイクリンＥ２からなる群から選択される。
【００５８】
一態様では、バイオマーカーの１以上が心臓幹細胞バイオマーカーである。好ましくは、心臓幹細胞バイオマーカーは、ヒアルロナンシンターゼ１、ＯＳＲ１及びＳｃａ１からなる群から選択される。
【００５９】
別の態様では、バイオマーカーの１以上が心筋細胞前駆細胞バイオマーカーである。好ましくは、心筋細胞前駆細胞バイオマーカーは、ＡＬＰＫ３、ペリオスチン及びＭｅｓｐ１からなる群から選択される。
【００６０】
一態様では、早期バイオマーカーは、発生経路及び／又は分化の早期ステージで発現される心筋細胞バイオマーカーである。好ましくは、早期心筋細胞バイオマーカーは、Ｎｋｘ２．５、ミオカルディン、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＨＡＮＤ１、ＩＲＸ４、ＴＢＸ５、ＴＢＸ２０及び転写因子２５からなる群から選択される。
【００６１】
別の態様では、後期バイオマーカーは、発生経路及び／又は分化の後期ステージで発現される心筋細胞バイオマーカーである。好ましくは、後期心筋細胞バイオマーカーは、心臓トロポニンＴ抗体、心臓トロポニンＩ抗体、重鎖心臓ミオシン抗体、ミオシン軽鎖抗体、心臓ＦＡＢＰ抗体及びαサルコメアアクチ抗体からなる群から選択される。
【００６２】
さらに別の態様では、後期バイオマーカーは心室バイオマーカーである。好ましくは、心室バイオマーカーは、ＢＭＰ１０、ＨＡＮＤ２及び血清応答因子からなる群から選択される。
【００６３】
一態様では、早期バイオマーカーは、発生経路及び／又は分化の早期ステージで発現される神経幹細胞バイオマーカーである。好ましくは、早期神経幹細胞バイオマーカーは、アグリカンＡＲＧｘｘｘ、ＣＤ１３３、ＥＭＸ２、ネスチン及びＮｅｕｒｏＤ１からなる群から選択される。
【００６４】
別の態様では、後期バイオマーカーは、発生経路及び／又は分化の後期ステージで発現される神経幹細胞バイオマーカーである。好ましくは、後期神経幹細胞バイオマーカーは、ＢＲＮ３Ａ、Ｍｕｓａｓｈｉ  １、Ｍｓｉ１、ＮＲ２Ｅ１、Ｔａｉｌｌｅｓｓ、ヌクレオステミン、Ｏｃｔ６、Ｐａｘ２、ＳＯＸ２、ＳＯＸ４、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ１１、ＳＯＸ２２、ビメンチン及びＣＤｗ３３からなる群から選択される。
【００６５】
さらに別の態様では、バイオマーカーの１以上が神経堤細胞バイオマーカーである。好ましくは、神経堤細胞バイオマーカーは、ニューロゲニン１、ニューロゲニン２、ニューロゲニン３及びＭＡＳＨ１からなる群から選択される。
【００６６】
一態様では、バイオマーカーの１以上が星状膠細胞バイオマーカーである。
【００６７】
別の態様では、バイオマーカーの１以上がグリア細胞又は小グリア細胞バイオマーカーである。
【００６８】
さらに別の態様では、バイオマーカーの１以上がプルキンエ細胞バイオマーカーである。
【００６９】
一態様では、バイオマーカーの１以上がニューロン又は神経細胞バイオマーカーである。好ましくは、神経細胞バイオマーカーは、海馬ニューロン、終脳ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、感覚ニューロン、侵害受容ニューロン、運動ニューロン、錐体ニューロン、乏突起膠細胞、神経内分泌細胞、軸索、シュワン細胞、樹状突起、成長円錐、体細胞及びシナプス細胞からなる群から選択される。
【００７０】
別の態様では、バイオマーカーの１以上が脂肪細胞バイオマーカーである。
【００７１】
一態様では、２以上のバイオマーカーのレベルは、標識抗体との反応及び結合ラベルの測定によって定量化される。好ましくは、２以上のバイオマーカーのレベルは定量的免疫細胞化学を用いて定量化される。
【００７２】
別の態様では、未分化幹細胞は２以上のバイオマーカーと機能的に連結した相異なるレポーター遺伝子を含み、２以上のバイオマーカーのレベルは相異なる遺伝子産物の測定によって定量化される。好ましくは、レポーター遺伝子は、ニトロレダクターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、ルシフェラーゼ及び蛍光タンパク質レポーター遺伝子からなる群から選択される。
【００７３】
さらに別の態様では、２以上のバイオマーカーのレベルは、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、定量的免疫細胞化学、表面プラズモン共鳴及びマイクロアレイ分析からなる群から選択される方法によって定量化される。
【００７４】
一態様では、本方法はさらに段階（ｉｉｉ）後に細胞増殖を測定する段階を含む。
【００７５】
好ましい態様では、本方法は多重方法である。
【００７６】
本発明の第２の態様では、上述した方法を用いて、ヒト胎児発生中における細胞バイオマップ又は発生経路の変化を予測する方法が提供される。
【００７７】
本発明の第３の態様では、上述した方法を実施するためのキットであって、２以上のバイオマーカーを定量化するための手段及び該方法を実施するための取扱説明書を含んでなるキットが提供される。好ましい態様では、バイオマーカーを定量化するための手段は、抗体、酵素基質及びオリゴヌクレオチドプライマーからなる群から選択される。
【００７８】
定義
本明細書中で使用される「幹細胞」は、様々な範囲の特殊化細胞タイプに分化する能力によって特徴づけられる細胞として定義される。哺乳動物幹細胞の２つの大別されたタイプには、胚盤胞の内部細胞塊から単離される胚性幹細胞、及び成体組織中に見出される成体幹細胞がある。発生中の胚では、幹細胞はすべての特殊化胚組織に分化し得る。成体生物では、幹細胞及び前駆細胞は特殊化細胞を補給する身体の修復系として作用するばかりでなく、血液、皮膚又は腸組織のような再生器官の正常な代謝回転も維持する。
【００７９】
本明細書中で使用される「胚盤胞」は、初期胚形成において、胞胚腔の形成後かつ着床前に形成される構造体である。本明細書中で使用される「前駆細胞」は、特定タイプの細胞に分化しる能力を有する細胞として定義される。多くの前駆細胞は単能性又は多能性として記載される。
【００８０】
本明細書中で使用される「発生経路」は、細胞分化のための経路（又は細胞分化経路）として定義され、前駆細胞が一層専門化された細胞タイプになる過程である。多細胞生物は単一の接合体から組織及び細胞タイプの複雑な系に変化するので、分化は該生物の発生中に多数回起こる。分化はまた、成体においても普通の過程である。即ち、成体幹細胞は組織修復中及び正常な細胞代謝回転中に分裂して完全に分化した娘細胞を生み出す。
【００８１】
本明細書中で「分化経路」に関連して使用される「ネットワーク化された」は、２以上の細胞タイプへの分化が可能な前駆細胞を含むネットワークとして定義され、これらの細胞タイプ自体はさらに分化する能力を有し得る。この過程は、最終分化細胞タイプが生成されるまで継続される。
【００８２】
本明細書中で使用される「発生生物学」は、生物が成長及び発育する過程の研究として定義される。発生生物学は、細胞増殖、分化及び形態形成の遺伝的制御、即ち組織、器官及び解剖学的構造を生じる過程を研究する。
【００８３】
本明細書中で使用される「形態形成」は、生物にその形状を生じさせる生物学的過程として定義される。それは、細胞増殖、細胞分化及び細胞発生の制御と並んで、発生生物学の３つの基本的側面の１つである。形態形成過程は、生物の胚発生及び胎児発生中における細胞の組織化された空間分布を制御する。形態形成応答は、生物においては、ホルモンにより、他の生物が産生する物質から誘導化学物質又は放射性核種、汚染物質及び他の毒性薬剤にまでわたる環境化学物質により、或いは細胞の空間パターン化で誘導される機械的ストレスにより誘導され得る。形態形成は、胚、成熟生物、細胞培養物又は腫瘍細胞塊の内部において起こり得る。
【００８４】
本明細書中で使用される「多分化能性」は、３つの胚葉のいずれか、即ち（例えば、胃内層、胃腸管、肺、肝臓、胸腺、上皮小体及び甲状腺を生じる）内胚葉、（例えば、筋肉、骨、血液及び尿生殖器細胞を生じる）中胚葉又は（例えば、表皮組織及び神経系を生じる）外胚葉に分化する可能性を有する幹細胞として定義される。
【００８５】
本明細書中で使用される「誘導多分化能性幹細胞」は、ある種の遺伝子の偏在的発現を誘発することで、非多分化能性細胞（通例は成体体細胞）からから人工的に導かれるタイプの多分化能性幹細胞として定義される。
【００８６】
本明細書中で使用される「バイオマーカー」は、タンパク質のような細胞分子であるが、低分子量代謝産物とは異なり、生物学的状態の指標として使用されるものとして定義される。それは、正常な生物学的過程、病理学的過程、或いは治療学的介入又は毒性薬剤に対する薬理学的応答の指標として客観的に測定及び評価される特性又は分子である。細胞生物学では、バイオマーカーは特定の細胞タイプによって発現される分子である（例えば、タンパク質Ｏｃｔ−４は胚性幹細胞を同定するためのバイオマーカーとして使用される）。バイオマーカーは、マイクロアレイ分析、レポーター遺伝子アッセイ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ又は定量的免疫細胞化学のような、当業者にとって公知の各種技法によって測定できる。
【００８７】
本明細書中で使用される「早期」又は「後期」バイオマーカーは、それぞれ細胞培養又は増殖の早期又は後期段階で発現される細胞バイオマーカーとして定義される。これらのバイオマーカーは、培養又は増殖のこれら様々な段階においてアップレギュレート又はダウンレギュレートされることがある。
【００８８】
本明細書中で使用される「多重アッセイ」又は「多重化」は、単一の試料からの複数の検体、分子又はバイオマーカーを測定するタイプの実験室的方法として定義される。即ち、この技法は生きている細胞に対する複数の問いかけを可能にし、高含有量の情報の生成を可能にする。多重アッセイは、単一の検体又は単一のバイオマーカーを測定する方法と区別される。
【００８９】
本明細書中で使用される「ｎ番目」は、２から１０００までの正の整数（例えば、２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目、８番目、９番目、１０番目、…１０００番目）を意味する。
【００９０】
本明細書中で使用される「作用因子」は、未分化幹細胞の分化を誘発する物理的刺激（例えば、光、熱、放射）又は化学的処理である。化学的処理は、ホルモン、増殖因子などの化学物質の混合物を含み得る。作用因子は一般に、潜在的な毒物として評価される「化学物質」と異なっている。作用因子及び化学物質が同一のものである場合、これらは本発明の方法では相異なる濃度で使用される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、発生経路ネットワーク（バイオマーカーをカッコ内に示す）への幹細胞の分化を示す模式図である。
【図２】図２は、化学物質（２０）の効果が、刺激又は作用因子（３０）での処理後における未分化幹細胞（１０）から分化細胞（４０）への分化に関して評価される本発明方法の一実施形態を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
幹細胞及び胚性生殖細胞マーカー
幹細胞は、ｉ）インビトロで非限定的に分裂しかつｉｉ）各種の成熟細胞タイプに分化する能力によって特徴づけられる未分化細胞である。これらは、全部で３つの胚性胚葉（即ち、外胚葉、中胚葉及び内胚葉）の細胞タイプを生成し得る多分化能性幹細胞として類別できる。これらには、（生殖隆起から導かれる）胚性始原生殖細胞及び再プログラムされた誘導多分化能性幹細胞がある。成体幹細胞は多能性であって、特定の発生経路に沿って分化する。
【００９３】
これから現れる技術は、幹細胞分化の様々な段階に対するマーカーを同定するための手段を提供することを約束している。幹細胞を含む各細胞タイプは、細胞特異的な遺伝子の発現をもたらす細胞特異的な転写調整機構によって維持される特異なシグナリングネットワークを有している。したがって、体内の２７４のタイプは、人体内に存在する約２５０００の遺伝子の組合せ発現によって定義される（Ａｈｎ，  Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，  ２００８  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ８，  ４９４６−４９５７）。
【００９４】
胚性幹細胞分化の初期ステージは３つの胚性胚葉（即ち、外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞）の生成を含み、すべての最終分化細胞はこれら３つの細胞タイプから導かれる。図１は、発生経路ネットワークへの幹細胞の分化を示している。バイオマーカーは、図中のカッコ内に示されている。即ち、Ｏｃｔ４は胚性幹細胞に関するバイオマーカーである一方、Ｎａｇｇｉｎは神経幹細胞に関するバイオマーカーである。また、早期及び後期バイオマーカーも図示されている。即ち、ＤＳＳ３はニューロン発生の早期ステージで発現されるバイオマーカーである一方、ＮｅｕＮはニューロン発生の後期ステージで発現される。
【００９５】
幹細胞集団によって示される初期分化度を評価するためには、以下の胚葉マーカーを使用できる。
【００９６】
分化の後期ステージでは、一層多くの細胞／組織特異的マーカーが使用される。
【００９７】
胚性幹細胞マーカー
［１］Ｎａｎｏｇ（抗体ａｂ２１６０３）−早期胚並びにマウス及びヒトの胚性幹（ＥＳ）細胞及び胚性生殖（ＥＧ）細胞を含む多分化能性幹細胞に対して特異的である。
【００９８】
［２］ＳＯＸ２（抗体ａｂ１２８３０）−胚性幹細胞マーカー。
【００９９】
［３］ＳＳＥＡ４（抗体ａｂ１６２８７）−ステージ特異的な胚性抗原４は、胚発生の早期及び多分化能性幹細胞で発現される。
【０１００】
［４］Ｏｃｔ４（抗体ａｂ２７９８５）−未分化胚性幹細胞及び胚性生殖細胞によって発現される転写因子。
【０１０１】
［５］ＴＲＡ−１−６０（抗体ａｂ１６２８８）−ヒトテトラカルシノーマの表面並びに胚性遺伝子及び幹細胞で発現される抗原と反応する。
【０１０２】
［６］ＴＲＡ−１−８１（抗体ａｂ１６２８９）−ヒトの胚性幹細胞、生殖細胞及びカルシノーマ細胞のマーカー。
【０１０３】
［７］Ｃｒｉｐｔｏ（抗体ａｂ１９９１７）−ＥＳ細胞及び胚発生の早期に発現される。
【０１０４】
［８］ＣＤ１３３（抗体ａｂ１９８９８）−神経幹細胞及び胚性幹細胞を含む幹細胞及び前駆細胞に対するマーカー。
【０１０５】
［９］Ａ２Ｂ５（抗体ａｂ５３５２１）−Ａ２Ｂ５は、発生中の上皮細胞、乏突起膠細胞前駆細胞及び神経内分泌細胞で発現される細胞表面ガングリオシドエピトープである。
【０１０６】
［１０］ＰＡＸ６（抗体ａｂ５７９０）−眼、鼻、中枢神経系及び膵臓の発生で重要な転写因子。
【０１０７】
［１１］インテグリンβ１（抗体ａｂ５１８５）−幹細胞マーカー。
【０１０８】
［１２］ＣＥＡ  Ｃａｒｃｉｎｏ胚性抗原（抗体ａｂ４６５３８）−胎児腸発生中に発現される。
【０１０９】
［１３］Ｔｎｋ１（抗体ａｂ７０４０２）−胚性幹細胞のキナーゼ。
【０１１０】
［１４］ＥＲＡＳ（抗体ａｂ６７６９６）−胚性幹（ＥＳ）細胞で発現され、そのインビトロ増殖及び腫瘍化を促進する。
【０１１１】
［１５］ＳＴＥＬＬＡＲ（抗体ａｂ７８５５９）−生殖細胞及び胚性幹細胞で富化されたタンパク質。
【０１１２】
始原幹細胞マーカー
［１］ＤＤＸ４（抗体ａｂ１３８４０）−卵巣及び睾丸で発現される始原生殖細胞マーカー。
【０１１３】
［２］Ｆｒａｇｉｌｉｓ（抗体ａｂ１５５９２）−生殖系列細胞の運命に関係している。
【０１１４】
［３］Ｓｔｅｌｌａ（抗体ａｂ１９８７８）−始原生殖細胞、卵母細胞、着床前胚及び多分化能性細胞で特異的に発現される始原生殖細胞マーカー。
【０１１５】
［４］ＮＡＮＯＳ２（抗体ａｂ１５７３１）−無脊椎動物及び脊椎動物の両方において生殖細胞発生に関係する始原生殖細胞マーカー。
【０１１６】
中胚葉マーカー
［１］ブラキュリ（抗体ａｂ２０６８０）中胚葉マーカー−中胚葉形成の最も早期の指標。中胚葉分化のマーカーとして使用される。
【０１１７】
［２］Ｔｂｘ６（抗体ａｂ３０９４６）−原始線条及び前体節中胚葉で発現される。
【０１１８】
［３］ＴＢＲ２／Ｅｏｍｅｓ（抗体ａｂ２３３４５）−Ｔボックスブレイン２は、発生中に中間前駆細胞によって発現される転写因子である。
【０１１９】
［４］ＰＨＯＸ２Ａ及び２Ｂ（それぞれ抗体ａｂ５４８４７及びａｂ１２０４７）−複数の主ニューロン集団の発生に関係するホメオボックス様転写因子。
【０１２０】
［５］ＰＲＲＸ１及び２（抗体ａｂ６７６３１及びａｂ７７６５５）−対をなすホメオボックスタンパク質ファミリーのメンバー。
【０１２１】
［６］ＭＥＳＤＣ２（抗体ａｂ６８８０９）−マウス胚極性の特定のために不可欠。
【０１２２】
［７］Ｍｅｓｐ１及び２（それぞれ抗体ａｂ７７０１３及びａｂ２３７３３）−Ｍｅｓｏｄｅｒｍ  ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  １／２は、前部前体節中胚葉における分節／パターン化に役割を有する転写因子である。
【０１２３】
［８］ＭＩＥＲ１及び３（それぞれ抗体ａｂ２６２５４及びａｂ６９８７７）−中胚葉誘導早期応答遺伝子ファミリーのメンバー。
【０１２４】
［９］ＳＮＡＩＬ（抗体ａｂ１７７３２）−中胚葉形成のために不可欠の転写因子。
【０１２５】
外胚葉マーカー
ＥＥＤ（抗体ａｂ４４６９）−遺伝子の転写抑制状態の維持に関係するポリコーム（Ｐｏｌｙｃｏｍｂ）グループファミリー。ＥＳ細胞の分化中に発現される。
【０１２６】
ＴＩＦ１  ｇａｍｍａ（抗体ａｂ３３３４７５）−細胞分化及び発生において機能し、造血細胞の分化で役割を果たす。
【０１２７】
ＫＬＨ２５（抗体ａｂ５５９５３）−外胚葉神経皮質タンパク質。
【０１２８】
ＥＤＡ（ａｂ５４３８６）−外胚葉器官の発生中における細胞−細胞シグナリングに関与する腫瘍壊死因子ファミリーに属する。
【０１２９】
ＧＪＢ６（抗体ａｂ５９９２７）−欠損は、外胚葉由来の組織に影響を及ぼす１群の発生障害を構成する外胚葉性異形成の原因となる。
【０１３０】
ＥＮＣ１（抗体ａｂ５６３４８）−外胚葉神経皮質タンパク質１。
【０１３１】
ＥＤＡＲ（抗体ａｂ５６８０３）−エクトジスプラシンＡ受容体。
【０１３２】
ＳＯＳＴＤＣ１（抗体ａｂ５６０７９）−着床に対する子宮内膜受容性／脱落膜細胞反応に対する増感の開始に関与する。
【０１３３】
ＮＣＡＭ（抗体ａｂ６１２３）−網膜芽細胞腫、髄芽細胞腫、星状細胞腫及び神経芽細胞腫のような神経外胚葉由来細胞株、組織及び新生物上で発現される。
【０１３４】
ＣＤ９９（抗体ａｂ８８５５）−ＣＤ９９の発現は、初生末梢神経外胚葉腫瘍由来の細胞の特性である。
【０１３５】
内胚葉マーカー
［１］Ｋｉ６７（抗体ａｂ８３３）−Ｋｉ６７抗原は、活性細胞周期のすべての段階において増殖中の細胞により発現される原型の細胞周期関連核タンパク質である。
【０１３６】
［２］Ｒｂ（抗体２Ｇ５、ａｂ１１１６）−細胞周期の負の調節体としてとして機能する腫瘍抑制遺伝子。
【０１３７】
［３］カリン１、２及び３（それぞれ抗体ａｂ１８６８、ａｂ１８７０及びａｂ１８７１）−中胚葉マーカー。
【０１３８】
［４］サイクリンＥ及びＥ２（それぞれ抗体ａｂ１１０８及びａｂ１１１０）−サイクリンＥはＣｄｋ２の調節サブユニットであり、哺乳動物の細胞周期中にＧ１／Ｓ転移を制御する。
【０１３９】
心筋細胞分化
ｉ）分化を達成するためのプロトコル、ｉｉ）阻害剤の詳細及びｉｉｉ）心筋細胞マーカー
前駆細胞から心筋細胞への分化は、ＭｃＢｕｒｎｅｙ，  Ｍ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ（１９８２）  Ｎａｔｕｒｅ  ２９９，  １６５−１６７、Ｓｍｉｔｈ，  Ｓ．Ｃ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １３１，  ７４−８４及びＰｕｃｅａｔ，  Ｍ．  ２００８，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ４５，  １６８−１７１に記載されたもののような、十分に特徴つけられかつ公表されたプロトコルを用いて可能である。これらのプロトコルを用いれば、胚性カルシノーマ細胞及び幹細胞のような多分化能性及び多能性前駆細胞から心筋細胞を生成することが可能である。
【０１４０】
心筋細胞分化−マウスＰ１９由来の心筋細胞
Ｐ１９細胞は、ＤＭＳＯの存在下で増殖させた場合、インビトロで収縮する心筋細胞に分化するマウス多能性胚性カルシノーマ細胞である［ＭｃＢｕｒｎｅｙ，  Ｍ．Ｗ．（１９９３）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ３７，  １３５−１４０］。この分化は、ＭｃＢｕｒｎｅｙ，  Ｍ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ（１９８２）  Ｎａｔｕｒｅ  ２９９，  １６５−１６７及びＳｍｉｔｈ，  Ｓ．Ｃ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １３１，  ７４−８４に記載された方法を用いて達成できる。Ｐ１９細胞は、ＡＴＣＣ（カタログ番号ＣＲＰ−１８２５）から商業的に入手できる。
【０１４１】
ＭｃＢｕｒｎｅｙ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ（１９８２）に記載された「バルク培養」方法は、簡単に述べれば、１５％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０単位／ｍｌペニシリン、β−メルカプトエタノール（１００ｎＭ）及びピルビン酸塩（１ｍＭ）を含むＲＰＭＩ培地中において水飽和雰囲気（５．０〜７．５％ＣＯ2）下でＰ１９細胞を３７℃で増殖させることを含んでいる。対数増殖している細胞を、１００ｍｍ  Ｕｌｔｒａ低結合細胞培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、カタログ番号３２８２）内において２×１０4細胞／ｍｌで分化培地（２０％熱不活性化ウシ胎児血清を含みかつ1％ＤＭＳＯを補充した増殖培地）中に継代培養する。４日後、細胞凝集物を、ＤＭＳＯを含まない新鮮な分化培地を含む１００ｍｍ  Ｆａｌｃｏｎ組織培地皿（カタログ番号３５３００３）に移す。分化培地及びＤＭＳＯに暴露してから約６日後、凝集物中に拍動する心筋細胞が現れる。
【０１４２】
Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ（１９８７）に記載された、Ｐ１９細胞を心筋細胞に分化させるための「懸滴」方法は、ＭｃＢｕｒｎｅｙ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ（１９８２）のバルク培養方法に類似している。しかし、分化培地及びＤＭＳＯに暴露した後、少量の細胞を１００ｍｍ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｕｌｔｒａ低結合細胞培養皿のルーフに移す。細胞を給湿雰囲気中に維持するため、細胞をＰＢＳ溶液の上方にさかさに配置する。４日目に分化培地を交換し、約６日目に拍動する心筋細胞が現れる。
【０１４３】
心筋細胞分化−胚性幹細胞由来の心筋細胞
マウス胚性幹細胞株ＣＧＲ８、Ｒ１及びＢＳ１の分化のためのプロトコルは、Ｐｕｃｅａｔ，Ｍ．  ２００８，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ４５，  １６８−１７１によって以前に記載されている。ＣＧＲ８及びＲ１は、それぞれＥＣＡＣＣ（カタログ番号０７０３２９０１）及びＡＴＣＣ（カタログ番号ＳＣＲＣ−１０１１）から商業的に入手できる。ＢＳ１細胞株は、Ｚｅｉｎｅｄｄｉｎｅ，Ｄ．ｅｔ  ａ！．，  ２００６，  Ｄｅｖ．  Ｃｅｌｌ  １１，  ５３５−５４６に記載されかつ特性決定された。
【０１４４】
本プロトコルは、分化を開始させるための細胞凝集物（胚様体としても知られる）の生成、及び心臓系統への分化効率を高めるための増殖因子の使用を含んでいる。本プロトコルは、マウス及びヒト胚性幹細胞の両方の分化に適用できる。マウス及びヒト胚性幹細胞の増殖に関する大きな相違点は、マウス細胞／が白血病抑制因子の存在下で線維芽細胞フィーダー細胞なしに増殖させ得るのに対し、ヒト細胞は伝統的に多分化能性を維持するためフィーダー細胞及びＦＧＦ２を必要とすることである。
【０１４５】
分化過程を開始させる２４時間前に、対数増殖しているマウス胚性幹細胞を増殖培地中で２．５ｎｇの組換えヒトＢＭＰ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に暴露する。増殖培地は、ＢＨＫ２１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（５０単位／ｍｌ）、非必須アミノ酸（１ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、グルタミン（１ｍＭ）、メルカプトエタノール（１００ｎＭ）、ウシ胎児血清（７．５％ｖ／ｖ）及び組換え白血病抑制因子（１単位／ｍｌ）からなっている。継代培養後、（胚様体の生成を容易にするため）細胞を分散させ、低速遠心によって回収し、組換え白血病抑制因子を含まずかつ２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補充した増殖培地からなる分化培地中に２５０００細胞／ｍｌで再懸濁する。すべての細胞操作は、３７℃及び５〜７．５％ＣＯ2で実施する。
【０１４６】
細胞（５００個）を１００ｍｍ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｕｌｔｒａ低結合細胞培養皿の下面に２０μｌアリコートとして配置する。蒸発を防止するため、底部にＰＢＳを配置する。胚様体の形成を４８時間進行させる。その後、すべての胚様体を１０ミリの分化培地中に静かに再懸濁し、さらに７２時間インキュベートする。５日目、胚様体を０．１％ゼラチンでコートしたＦａｌｃｏｎ  １００ｍｍ組織培地皿にプレーティングする。約７日後に拍動するマウス心筋細胞が現れるはずである。
【０１４７】
ヒト胚性幹細胞由来の心筋細胞の生成では、次の増殖培養−メルカプトエタノール（１００ｎＭ）、グルタミン（１ｍＭ）、非必須アミノ酸（１ｍＭ）、１５％（ｖ／ｖ）ＫＯＳＲ血清代替品（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及び１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＦＧＦ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を補充したＫＯ−ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、下記の対数増殖しているＩ−６ヒト胚性幹細胞（Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ−Ｉｓｒａｅｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＥ１４マウス胚性繊維芽細胞上で培養する。Ｉ−６ヒト胚性幹細胞株はＮＩＨによって承認されている。
【０１４８】
Ｉ−６細胞を心筋細胞に分化させるため、低下したＫＯＳＲ血清代替品濃度（５％ｖ／ｖ）を有しかつＦＧＦ２を含まないが１０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ２を補充した増殖培地及びＦＧＦ２受容体阻害剤ＳＵ５４０２（１μＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社カタログ番号５７２６３０）に細胞を４８時間暴露する。
【０１４９】
マウス細胞を分化させるために設計されたものと同様なプロトコルを用いて、上述したようにヒト胚様体を生成する。コラゲナーゼＣＬＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＩ−６細胞を酵素的に解離させた後、５％  ＫＯＳＲ血清代替品、メルカプトエタノール（１００ｎＭ）、グルタミン（１ｍＭ）及び非必須アミノ酸（１ｍＭ）を補充したＫＯ−ＤＭＥＭ培地中に細胞を再懸濁し、細胞凝集を容易にするため、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｕｌｔｒａ低結合細胞培養皿に移す。約２週間後に拍動するヒト心筋細胞が認められる。
【０１５０】
最近、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ２及びｈＥＳ３）をマウス内胚葉様ＥＮＤ２細胞と共培養することに基づく無血清懸濁培養方法が、Ｍｕｍｍｅｒｙ  Ｃ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，  ２００７  Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １  Ｕｎｉｔ  １Ｆ．２及びＭｕｍｍｅｒｙＣ．Ｌ．  （２００７）  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓに記載されている。Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ４，ｐｐ  ９３−１０６（Ｅｄｓ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  Ｒ．Ｉ．，  Ｓｔａｃｅｙ，Ｇ．Ｎ．  ａｎｄ  Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｊ．Ｍ．）では、ＥＮＤ２細胞調整培地の使用のため、この方法はさらにＧｒａｉｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ７６  ３５７−３７０によって改変されている。いずれの方法も、前述のようにして胚様体を生成することを含んでいる。
【０１５１】
心筋細胞分化の阻害剤
マウスＨＳＰ２５の発現は、Ｐ１９細胞の心筋細胞分化のために重要である。ｐ３８経路によるＨＳＰ２５のリン酸化は、その機能の一部にとって重要であることが知られている。特異的阻害剤ＳＢ２０３５８０（１０μＭ）によるｐ３８経路の阻害は、マウスＰ１９細胞から心筋細胞への分化を妨げることが示されている［Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．  ＆  Ｎｏｒａｎｇｅ，Ｍ．  （２０００）  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ，  ２１８，  １４６−１６０］。この研究では、分化は、単一の心臓マーカー（心臓アクチン）の存在を免疫組織化学によってモニターすると共に、心臓アクチン及び心房ナトリウム排泄ペプチドの発現をＲＴ−ＰＣＲによってモニターすることで評価された。
【０１５２】
ＳＢ２０３５８０［４−（４’−フルオロフェニル）−２−（４’−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４’−ピリジル）イミダゾール］は、Ｐｒｏｍｅｇａ社（カタログ番号Ｖ１１６１）から商業的に入手できる。それは、ＭＡＰキナーゼ相同体ｐ３８α、ｐ３８β及びｐ３８β２の特異的な細胞透過性阻害剤である。ＳＢ２０３５８０は、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８γ又はｐ３８δの活性に対して顕著な効果を示さない。
【０１５３】
Ｇｒａｉｃｈｅｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ（２００８）  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，  ７６，  ３５７−３７０は、１〜１０μＭのＳＢ２０３５８０が実際にヒト胚性幹細胞からの心筋細胞生成を増強することを証明した。しかし、濃度を１５μＭに高めると心筋細胞の数は劇的に減少し、２５μＭでは分化が完全に阻止された。したがって、ＳＢ２０３５８０の機能は種及び用量の両方に依存すると思われる。これらの著者はまた、別のｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤ＳＢ２０２１９０についても同様な濃度効果を証明した。彼らはまた、ヒト胚性幹細胞の心筋細胞分化の阻害剤として、ＳＢ２１６７６３（１０〜２５μＭ、ＧＳＫ−３阻害剤）、ＰＤ０９８０５９（５〜２５μＭ、ＭＡＰＫＫ阻害剤）、アニソマイシン（０．０１〜１００μＭ、ＪＮＫ／ＳＡＰＫ及びｐ３８活性化剤）、ＡＴＡ（０．０１〜１００μＭ、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５活性化剤）、ＦＴＴ（０．０１〜１００μＭ、ＰＫＣ活性化剤）及びＯＡＧ（０．０１〜１００μＭ、Ｃａ2+依存性ＰＫＣ）も報告した。
【０１５４】
心筋細胞分化の他の阻害剤には以下のものがある。ナトリウム／プロトン交換体１（ＮＨＥ１）阻害剤ＥＭＤ８７５８０は、Ｌｅｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ（２００８）  Ｓｈｅｎ  Ｗｕ  Ｇｏｎｇ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ，  ２４（１０）  １７９０−１７９５により、ＤＭＳＯ誘導中におけるマウスＰ１９胚性カルシノーマ細胞の心筋細胞分化を阻害することが証明された。Ｌｉ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ（２００９）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １９６，  １，  １５９−１７０は、マウス胚性幹細胞株ＣＧＲ８において同様な結果を証明した。ＰＩ−３キナーゼＬＹ２９４００２（５０μＭ）は、マウス胚性幹細胞から心筋細胞への分化を阻止する［Ｋｌｉｎｚ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ（１９９９）  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，  ２４７（１）  ７９−８３］。
【０１５５】
これらの阻害剤の大部分は商業的に入手できる。例えば、ＳＢ２０２１９０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社カタログ番号１９−１３４）、ＬＹ２９４００２（Ｐｒｏｍｅｇａ社Ｖ１２０１）、ＳＢ２１６７６３及びアニソマイシン（それぞれＴｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社カタログ番号１６１６及び１２９０）の通りである。
【０１５６】
心臓発生に対するＳＢ２０３５８０などの阻害剤（及び化学物質、薬物又は化粧品）の効果は、前駆幹細胞の分化中にモニターすることができる。前駆細胞を阻害剤に暴露した後、当業者にとって公知である定量的免疫細胞化学のような技法により分化細胞タイプに関連する細胞／組織特異的マーカーの発現を測定して分化の程度をモニターすることで細胞発生過程に対する効果が評価される。
【０１５７】
図２は、刺激又は作用因子（３０）で処理した後、２以上のバイオマーカー（１５、４５及び４７）のレベルを測定することにより、未分化幹細胞（１０）から分化細胞（４０）への分化に対する化学物質（２０）の効果を評価する本発明方法の一実施形態を示している。幹細胞（１０）は、分化を誘発する刺激又は作用因子（３０）への暴露前又は暴露後に化学物質（２０）に暴露することができる。かくして、例えば心筋細胞発生に関して言えば、幹細胞（１５）又は心筋細胞（４５、４７）中に存在する２以上のバイオマーカーのレベルを測定することにより、幹細胞（１０）から心筋細胞（４０）への分化に対する化学物質（２０）の潜在的な効果を測定できる。
【０１５８】
心臓発生を表すマーカーには以下のものがある（Ａｂｃａｍ社から商業的に入手できる抗体の起源も記載されている）。
【０１５９】
心臓幹細胞マーカー
［１］ヒアルロナンシンターゼ１（抗体ａｂ７５３２９）−心臓発生に関係する。
【０１６０】
［２］ＯＳＲ１（抗体ａｂ７６６８９）−中内胚葉で、続いて内胚葉及び中間中胚葉で発現される転写因子。
【０１６１】
［３］Ｓｃａ１（抗体Ｄ７、ａｂ２５０３１）−これは多能性造血幹細胞上で発現される。
【０１６２】
心筋細胞前駆細胞のマーカー
［１］ＡＬＰＫ３（抗体ａｂ５７５２６）−心筋細胞分化で役割を果たす。
【０１６３】
［２］ペリオスチン（抗体ａｂ１４０４１）−胚及び胎児心臓で発現され、最終的に原始心臓管を４室に区分する心臓内隆起に局在する。
【０１６４】
［３］Ｍｅｓｐ１（抗体ａｂ７７０１３）−Ｍｅｓｐ１は心臓血管系の前駆細胞の多くで発現され、心臓形態形成の過程で役割を果たすことが知られている。
【０１６５】
心筋細胞−早期マーカー
［１］Ｎｋｘ２．５（Ａｂｃａｍ社−ａｂ３５８４２）−心筋層及び心内膜の両方で発現される。
【０１６６】
［２］ミオカルディン抗体（Ａｂｃａｍ社−ａｂ２２６２１）−ミオカルディンは、１組の心筋及び平滑筋特異的遺伝子の発現を調節する。それは、心臓発生及び平滑筋細胞系統の分化で決定的な役割を果たす。
【０１６７】
［３］ＧＡＴＡ４抗体（Ａｂｃａｍ社−ａｂ６１１７０）−心臓発生に関与する転写因子であって、心筋及び平滑筋細胞タイプにおける基礎遺伝子、アゴニスト遺伝子又はストレス誘発遺伝子の発現を調節することで役割を果たす。
【０１６８】
［４］ＭＥＦ２Ｃ（抗体ａｂ４３７９６）−心臓形態形成及び筋形成を制御する転写活性化剤であって、血管発生にも関与する。それはまた、神経形成及び皮質構造の発生にも関与する。
【０１６９】
［５］ＨＡＮＤ１（抗体ａｂ５２７６７）−早期心臓形態形成で本質的な役割を果たす転写調節剤である。成体では、それは心臓特異的遺伝子の発現のために必要である。
【０１７０】
［６］ＩＲＸ４（抗体ａｂ５６０３２）−発生中に心臓で発現される。
【０１７１】
［７］ＴＢＸ５（抗体ａｂ１８５３１）−ＴＢＸ５は、心臓発生で役割を果たすことができる。
【０１７２】
［８］Ｔｂｘ２０（抗体ａｂ４２４６８）−発生中の心臓で発現される。
【０１７３】
［９］転写因子２５（抗体ａｂ６７７６２）−インビトロでＳＲＦの転写抑制剤として作用し、したがって心臓発生で役割を果たすことができる。
【０１７４】
心筋細胞−後期マーカー
［１］心臓トロポニンＴ抗体（Ａｂｃａｍ社−１Ｃ１１、ａｂ８２９５）−心筋層のみで発現され、心臓トロポニンＴはトロポニン複合体のトロポミオシン結合サブユニットである。
【０１７５】
［２］心臓トロポニンＩ抗体（Ａｂｃａｍ社−２８４１９Ｃ７、ａｂ１９６１５）−トロポニンＩは、骨格筋及び心筋収縮の調節で重要な役割を果たすヘテロマー複合体の一部である。
【０１７６】
［３］重鎖心臓ミオシン抗体（Ａｂｃａｍ社−３−４８、ａｂ１５）−心臓ＭＨＣは、２つの異性体（α−心臓ＭＨＣ及びβ−心臓ＭＨＣ）として存在する。いずれもヒト心臓で発現され、β−心臓ＭＨＣが優勢な形態である。
【０１７７】
［４］ミオシン軽鎖抗体（＆１ＬＣ−１４、ａｂ５００８０）−ミオシンは、２本の重鎖及び４本の軽鎖からなっている。心室ミオシン軽鎖１（Ａｂｃａｍ社−ＭＬＭ５２７、ａｂ６８０）及び心臓ミオシン軽鎖１（１ＬＣ−１４、ａｂ５００８０）。
【０１７８】
［５］ミオシン軽鎖２抗体（Ａｂｃａｍ社−ａｂ４８００３）−ミオシン軽鎖２は心臓ミオシンβ重鎖と会合している。
【０１７９】
［６］心臓ＦＡＢＰ抗体（Ａｂｃａｍ社−６７Ｄ３、ａｂ１６９１６）−心筋組織で発現され、骨格筋ではそれより顕著に低い濃度で発現される。
【０１８０】
［７］αサルコメアアクチン抗体（５Ｃ５、ａｂ７７９９）−αアクチンは、アクチンのイソフォームの１つである。脊椎動物では、３群のアクチンイソフォーム、即ちα、β及びγが存在している。αアクチンは筋肉組織中に見出され、収縮装置の主成分である。この抗体はα−心筋アクチンと反応する。
【０１８１】
心室マーカー
［１］ＢＭＰ１０（抗体ａｂ３４９６２）−心室発生中において心筋細胞の増殖及び成熟を変調する際の必須成分。
【０１８２】
［２］ＨＡＮＤ２（抗体ａｂ５６５９０）−発生中の心室で発現され、心臓形態形成で本質的な役割を果たす。
【０１８３】
サルコメアマーカー
［１］サルコメアαアクチニン抗体（Ａｂｃａｍ社−ＥＡ−５３、ａｂ９４６５）−ＡＣＴＮ２は、骨格筋及び心筋の両方で発現される筋肉特異的なαアクチニンイソフォームをエンコードする。心筋及び骨格筋における筋管の張力繊維中のＺ線及びＺ点に位置している。
【０１８４】
［２］血清応答因子（抗体ａｂ３６７４７）−心臓での拍動するサルコメアの出現のために必要な心臓富化転写因子。
【０１８５】
他の心臓マーカー
［１］ＨＥＹ２（抗体ａｂ７０１３３）−哺乳動物の心臓発生の重要な決定子である転写因子。
【０１８６】
［２］ＫＬＦ１３（抗体ａｂ１５７０１）−心臓発生のために必要な転写因子。
【０１８７】
［３］ＭＥＦ２ファミリーの転写因子
ＭＥＦ２Ａ（抗体ａｂ５５５４７）−心筋及び骨格筋の発生に重要な役割を有する。
【０１８８】
ＭＥＦ２Ｂ（抗体ａｂ５５５６５）−発生中に多くの筋肉関連遺伝子の発現を調節する。ある種の神経形成細胞の分化に関与する。
【０１８９】
ＭＥＦ２Ｄ（抗体ａｂ４３７９７）−未分化の筋芽細胞中に存在していて、筋発生の非常に早期のステージで役割を果たし得ることを示唆している。筋形成細胞及び若干の神経形成細胞の分化に関与する。
【０１９０】
［４］ホスホランバン抗体（Ａｂｃａｍ社−２Ｄ１２、ａｂ２８６５）−心臓筋小胞体（ＳＲ）のカルシウムポンプを調節する。
【０１９１】
上述した方法及びその変法は、胚性幹細胞及びカルシノーマ細胞のような前駆細胞を心筋細胞に分化させるため日常的に使用されている。この分化過程は、ＳＢ２９３５８０のような化学物質によって阻害することができる。様々な分化方法、特性決定された阻害剤及び抗体を組み合わせることは、化学的傷害後の哺乳動物細胞／組織発生に対する効果を評価するための多重定量的免疫細胞化学方法の基盤となろう。
【０１９２】
神経分化
ｉ）分化を達成するためのプロトコル、ｉｉ）阻害剤の詳細及びｉｉｉ）神経マーカー
前駆細胞から神経系統への分化は、下記に記載されるもののような、十分に特徴つけられかつ公表されたプロトコルを用いて可能である。これらのプロトコルを用いれば、胚性カルシノーマ細胞及び幹細胞のような多分化能性及び多能性前駆細胞からニューロン細胞を生成することが可能である。
【０１９３】
胚性幹（ＥＳ）細胞及びカルシノーマ（ＥＣ）細胞は、いずれも迅速に分裂してニューロンを含む各種の細胞タイプに分裂し得るので、ニューロン分化を研究するための基準の多くを満足する。ＥＳ細胞は多分化能性であるが、しばしばフィーダー細胞又は高価な増殖因子を必要とする厳しい培養条件を要求する。しかし、ＥＣ細胞は培養が容易であり、フィーダー細胞を必要とせず、比較的簡単な培地中で維持できる。ＥＣ細胞の欠点は、これらが腫瘍細胞であり、遺伝的に異常であり、限られた分化能力を示すことである。しかし、これらは分化研究のための簡単で頑強な系を提供する。
【０１９４】
ＥＣ細胞株ＮＴＥＲＡ２はニューロン分化を研究するために使用されており、レチノイン酸への暴露により、培養中の一次ニューロンによって生成されるものと同様なニューロンが信頼可能に生成される。レチノイン酸暴露は、Ｏｃｔ４、ＳＳＥ３、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１のような幹細胞マーカーの喪失並びにＮｅｕｒｏＤ１、β−III、チューブリン及びニューロフィラメントのような神経マーカーのアップレギュレーションをもたらす。この分化過程は非常に予測可能であって一貫している。レチノイン酸への暴露及び有糸分裂阻害剤の存在下における細胞の再播種は、本質的に純粋なニューロン集団の生成を容易にする（Ｌｅｙｐｏｌｄｔ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ７６，  ８０６−８１４）。これらは本質的に機能的に成熟していて、コリン作動性、ＧＡＢＡ作動性及びセロトニン作動性受容体のようなシナプス及び神経伝達物質表現型を発現する（Ｈａｒｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｊ．  Ｃｏｍｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．，  ４０７，  １−１０）。
【０１９５】
前駆細胞の神経分化
Ｌｅｙｐｏｌｄｔ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，２００１（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ７６，  ８０６−８１４）によって実施されたＮＴＥＲＡ２細胞の神経分化は、簡単に述べれば以下の通りである。５％ウシ胎児血清を補充したＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）培地中において、細胞を３７℃及び５％ＣＯ2で日常的に維持した。１０％ウシ胎児血清を補充した高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含む細菌学的皿内において細胞凝集法（１×１０6細胞／ｍｌ）を実施した。一晩後、培地に１μＭトランス−レチノイン酸を添加した。培地及び培養皿は３日毎に交換した。レチノイン酸の存在を２１日間維持した後、［有糸分裂阻害剤シトシン−Ｄ−アラビノフラノシド（１０μｇ／ｍｌ）及びウリジン（１μｇ／ｍｌ）を補充した］凝集培地を含む、ポリ−Ｄ−リシン及びラミニン（共に１０μｇ／ｍｌ）でコートした細胞培養処理皿に細胞凝集物を移した。これらの条件を約７日間継続し、培地は２〜３日毎に交換した。（約４週間続く）この長期プロトコルは、高率のＮＴＥＲＡ２細胞をニューロンに効率よく分化させることを容易にする。
【０１９６】
ＮＴＥＲＡ２細胞からは、機能的なシナプスを発現するニューロン細胞も生成された。Ｈａｒｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，（Ｊ．  Ｃｏｍｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．，  ４０７，  １−１０）はＮＴＥＲＡ２細胞を一次星状膠細胞と共培養したところ、得られたニューロンはグルタミン酸作動性及びＧＡＢＡ作動性シナプスを生成した（加えてそのインビトロ生存度は１年超に延びた）。一次星状膠細胞は、Ｃａｄｅｌｌｉ，Ｄ．Ｓ．ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｂ，Ｍ．Ｅ．，１９９１，（Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．，  Ｓｃｉ．，  ６３３，  ２３４−２４０）の方法に従って１８〜２１日ラット胚の大脳半球から単離した。ＮＴＥＲＡ２ニューロン（１×１０5）をポリ−Ｄ−リシン及びＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でコートしたカバースリップ上に播種し、３５ｍｍ細胞培養処理皿内においてコンフルエントな星状膠細胞と共に（しかし接触はさせずに）共培養した。共培養物は、高グルコースを補充したＤＭＥＭと星状膠細胞調整培地との１：１混合物中に維持した。６週間後、電子顕微鏡写真はシナプスの存在を示し、シナプシンＩの発現が免疫組織化学によって証明された。グルタミン酸作動性、ＧＡＢＡ作動性及びＮＭＤＡ伝達が、それぞれ選択的アンタゴニストＣＮＱＸ（１０μｇ／ｍｌ）、ビククリン（２０μｇ／ｍｌ）及びＡＰＶ（１００μＭ）を用いた電気生理学によって確認された。
【０１９７】
（ＮＴＥＲＡ２細胞のような）未分化ヒトＥＳ細胞はマーカーＯｃｔ４、ＳＳＥ３、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１を発現するが、これらはすべて分化後にダウンレギュレートされる。レチノイン酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はヘキサメチレンビスアセトアミドによるニューロン分化後、誘導ＥＳ細胞はＥＳマーカーのダウンレギュレーション並びに神経ガングリオシド糖脂質ＧＤ２、ＧＤ３及びＡ２Ｂ５の発現増加を示す（Ｄｒａｐｅｒ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ａｎａｔ．，２００，２４９−２５８）。これらの細胞表面マーカーは、早期分化中の細胞から見込みのある神経前駆細胞を単離するためにしばしば使用される。神経系統から細胞を単離するための他の有用なマーカーには、Ｎ−ＣＡＭ、ｎｅｕｒｏＤ１、ＮＳＥ、ネスチン、β−チューブリン及びＭｕｓａｓｈｉ  １がある。乏突起膠細胞は、マーカーＯｌｉｇ−１、−２、−３及び−４を用いて同定できる（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｊ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，２００７，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＥＣ  ａｎｄ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｎ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｅｄｓ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  Ｒ．Ｉ．，  Ｓｔａｃｅｙ，Ｇ．Ｄ．  ＆  Ａｕｅｒｂａｃｈ  Ｊ．Ｍ．  Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社）。
【０１９８】
前駆細胞の神経分化を促進するための方法には細胞凝集法がある。この方法は、（ＮＴＥＲＡ２、Ｐ１９及びＰＣ１２細胞を含む）ＥＳ及びＥＣ細胞の分化を誘導するため日常的に使用されている。細胞凝集法は細胞の接触を増加させ、インビボ発生及びインビトロ分化の重要な側面である細胞間シグナリングを促進する。初期の神経分化技法は血清含有培地中でレチノイン酸を使用したが、現在ではこれらは一層良好に定義された無血清方法によって置き換えられている。
【０１９９】
神経分化−無血清限定培地
無血清限定培地を使用する細胞凝集技法によるＥＣ及びヒトＥＳ細胞からの神経球の生成は、ＮＴＥＲＡ２細胞からラジアルグリア細胞を生成することが示された（Ｍａｒｃｈａｌ−Ｖｉｔｏｒｉｏｎ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２４，  １９８−２１３）。これはマルチステージプロセスであり、神経球は培地にＦＧＦ−２を補充すれば無期限に維持できる。ヒトＥＳ細胞を用いれば、ＦＧＦ−２の除去後に神経球は星状膠細胞、ニューロン及び乏突起膠細胞に分化する（Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９，１１２９−１１３０）。
【０２００】
神経球を生成するため、Ｍａｒｃｈａｌ−Ｖｉｔｏｒｉｏｎ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２４，１９８−２１３は、Ｎ２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、グルタミン（２ｍＭ）、グルコース（０．６％ｗ／ｖ）、インスリン（２０μｇ／ｍｌ）、ヘパリン（２μｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）及びＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充した無血清限定培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含む２５ｃｍ2フラスコ（１×１０5細胞／ｍｌ）内で増殖させたＮＴＥＲＡ２細胞を使用した。神経分化を誘導するためには、得られた細胞凝集物又は神経球を解離させ、ポリ−Ｄ−リシンでコートした皿上に５×１０5細胞／ｃｍ2で播種し、増殖因子を除去した血清限定培地中でさらに１０日間培養した。その後、これらのＮＴＥＲＡ２神経球は乏突起膠細胞系統の細胞と共に高率（約５０％）の未熟ニューロンを生成することが示された。
【０２０１】
不活性化されたマウス胚性線維芽細胞フィーダー層上で増殖させたヒトＥＳ細胞株Ｈ１及びＨ９を用いて、Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，（Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９，  １１２９−１１３０）は、血清の不存在下だがＦＧＦ−２の存在下で神経様構造を示す神経前駆細胞を生成した。ＦＧＦ−２の除去後、これらはニューロン、星状膠細胞及び乏突起膠細胞に分化した。ＥＳ／線維芽細胞共培養物の日常的維持は、２０％ｖ／ｖ血清代替培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、β−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）、ヘパリン（２μｇ／ｍｌ）及びＥＧＦ−２（４ｎｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地からなるＥＳ細胞培地中で実施した。分化を誘導するためには、Ｄｉｓｐａｓｅ（商標）（０．１ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＥＳ細胞コロニーを取り出し、ＦＧＦ−２を除去した限定ＥＳ細胞培地中に再懸濁した。２５ｃｍ2細胞培養フラスコ内において細胞を浮遊胚様体として培養し、培地を毎日交換した。４日後、インスリン（２５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１００μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン（２０ｎＭ）、プトレッシン（６０ｎＭ）、亜セレン酸ナトリウム（３０ｎＭ）、ヘパリン（２μｇ／ｍｌ）及びＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２中に胚様体を再懸濁した。分化中の胚様体を約１０日間培養し、次いで付着を防ぐためにポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）でコートした新しいフラスコに移した。
【０２０２】
乏突起膠細胞を生成するためには、Ｎ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びＰＤＧＦ−１（２ｎｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ中においてＥＳ細胞由来の神経前駆細胞をＦＧＦ−２の不存在下で培地した。約２週間後、典型的な乏突起膠細胞形態を有するｏｌｉｇ４陽性細胞が認められた。
【０２０３】
ニューロン分化は、ＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｃＡＭＰ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）からなる培地中において細胞をオルニチン／ラミニン上で培養することで実施した。約１０日後、付着性の球体から発する線維突起が認められた。大部分の細胞はニューロンマーカーＭＡＰ２ａｂ及びβ−チューブリンを発現した。
【０２０４】
神経分化−共培養
ＥＳ及びＥＣ神経分化の効率を高めようという追加の努力では、他の細胞株（例えば、ＰＡ６間質細胞）との共培養が使用された（Ｓｃｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．，  １４，  ５１７−５３４）。著者らは、ＰＡ６細胞のコンフルエントな単層上においてＮＴＥＲＡ２細胞を（２０００細胞／ｍｌで）共培養した。ＰＡ６細胞は、１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンで不活性化した。共培養物は、前述した分化培地（Ｌｅｙｐｏｌｄｔ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ７６，  ８０６−８１４）と同様な分化培地中に維持した。２２日後、８６％のＮＴＥＲＡ２ニューロンにおいてチロシンヒドロラーゼを検出したが、これは成熟したドーパミン作動性表現型の存在を表していた。分化過程を容易にする因子がまだ完全には特徴づけられていないので、ＰＡ６間質細胞調整培地の使用はドーパミン作動性表現型を生成するのにあまり効果的でないことが示された。
【０２０５】
神経分化−単層
他の神経分化方法は、単層中におけるヒトＥＳ細胞の分化に基づいていた（Ｇｅｒｒａｒｄ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２３，１２３４−１２４１）。これらの研究は、ＢＭＰ阻害剤ノギンをＥＳ細胞培養物に添加すると神経前駆細胞の生成が生じることを示した。かかる方法では、ＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）を補充したマウス胚性線維芽細胞調整培地中においてＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）上でＥＳ細胞を増殖させた。神経分化のためには、コンフルエントなＥＳ細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのノギンを補充したＮ２Ｂ２７神経分化培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で培養した。継代３で細胞を単一細胞に解離させ、ＦＧＦ−２を補充したＮ２Ｂ２７中で培養した。このプロトコルは、約９７％の細胞が神経マーカームサシを発現する神経前駆細胞の生成をもたらした。Ｎ２Ｂ２７処理細胞をポリ−Ｌ−リシン／ラミニンでコートした皿上に播種し、ソニックヘッジホッグ（３００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−８（１００ｎｇ／ｍｌ）及びアスコルビン酸（１６０μＭ）を補充したＮ２Ｂ２７培地中で２週間培養することで、チロシンヒドロラーゼを発現するニューロン及び神経前駆細胞が生成された。２週間後、ソニックヘッジホッグを除去し、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＧＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（１６０μＭ）及びラミニン（５００ｎｇ／ｍｌ）で置換した。
【０２０６】
この文書に記載された多くの神経分化方法のいくつかについては、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｊ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＥＣ  ａｎｄ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ（Ｉｎ，  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｅｄｓ．，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  Ｒ．Ｉ．，  Ｓｔａｃｅｙ，Ｇ．Ｄ．  ＆  Ａｕｅｒｂａｃｈ  Ｊ．Ｍ．Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社）中に詳細な説明が示されている。例示的なプロトコルには、レチノイン酸によるヒトＥＣ細胞神経分化の誘導、胚様体におけるヒトＥＳ細胞の神経分化、並びにヒトＥＳ細胞からの神経球の誘導及び分化がある。
【０２０７】
例１−レチノイン酸によるヒトＥＣ細胞神経分化の誘導
ＮＴＥＲＡ２細胞を３７℃及び空気中１０％ＣＯ2で増殖培地（ＤＭＥＭ、４．５ｇ／ｌグルコース及び１０％ｖ／ｖウシ胎児血清）中に維持する。ＮＴＥＲＡ２細胞を分化培地（１０μＭレチノイン酸を補充した増殖培地）中に７５ｃｍ2フラスコ当たり１×１０6細胞で播種する。ＮＴＥＲＡ２細胞は２〜３日以内に神経分化を受け、約１０日後にニューロンが現れる。
【０２０８】
例２−胚様体（細胞凝集物）におけるヒトＥＳ細胞の神経分化
対数増殖しているＥＳ細胞を胚様体（ＥＢ）培地（ノックアウトＤＭＥＭ、２０％ノックアウト血清リプレースメント、１％非必須アミノ酸、１ｍＭ  β−メルカプトエタノール及び１ｍＭグルタミン）中に再懸濁し、細胞付着を防止するための１００ｍｍ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｕｌｔｒａ低結合細胞培養皿又は細菌培養皿内において３７℃及び空気中５％ＣＯ2で培養する。培地は１日置きに交換する。懸濁状態で約２１日後、分化したＥＢが現れる。これらをＥＢ培地中のゼラチンコート表面上に２５ｃｍ2当たり５０の胚様体密度でプレーティングする。再プレーティングから約２４時間後、付着した胚様体からの成長物として神経分化が見られる。
【０２０９】
例３−ヒトＥＳ細胞からの神経球の誘導及び分化
コンフルエントなＥＳ細胞をＥＢ培地中に再懸濁し、２５ｃｍ2細胞培養フラスコ内において３７℃及び空気中５％ＣＯ2で４日間培養する。培地は毎日交換する。約４日後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２サプリメント、ＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（２０μｇ／ｍｌ）及びヘパリン硫酸ナトリウム塩（２μｇ／ｍｌ）からなる神経球培地中にＥＢを入れ、ゼラチンでコートした２５ｃｍ2フラスコ内にプレーティングする。培地は１日置きに交換する。約１０日後、神経ロゼットが見られる。バチルス由来の神経メタロプロテアーゼＤｉｓｐａｓｅ（商標）（１００μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて脱凝集した神経ロゼットを分離し、これらを神経球培地中に再懸濁し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２でコートしたフラスコ内において１％アガロース上に分配する。神経球を５日毎に新鮮な神経球培地で処理し、２〜３週間毎に継代培養する。分化試験のためには、神経球を神経球培地中においてゼラチンでコートしたフラスコ上に播種し、数回の継代後には神経球由来の細胞が培養物中において最も優勢な細胞タイプになる。これらの細胞は、通常、Ｍｕｓａｓｈｉ  １及びネスチンのような早期神経マーカーに対して陽性である。次いで、上記に略述された方法、即ちＭａｒｃｈａｌ−Ｖｉｔｏｒｉｏｎ  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，２００３，（Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２４，  １９８−２１３）及びＺｈａｎｇ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，（Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９，  １１２９−１１３０）の方を用いて神経球を効率的に分化させることができる。
【０２１０】
神経分化の阻害剤
［１］アデノシンジアルデヒド
Ｓ−アデノシルメチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）は、ＤＮＡメチル化を含む広範囲の生物学的メチル化反応用の普遍的なメチル供与体である。遺伝子はＣｐＧ部位のメチル化によって転写的に不活性化することができ、これは時には細胞分化過程に関連する。例えば、神経分化はステージ特異的な遺伝子活性を制御する遺伝的プログラムのカスケートを要求する。これらの活性は、転写レベルばかりでなく、ＤＮＡメチル化を含む後成的修飾によっても制御される。
【０２１１】
ＡｄｏＭｅｔ依存性メチルトランスフェラーゼによって実施されるメチル化反応は、２種の生成物、即ちメチル化基質及び副生物Ａｄｏ−ホモシステイン（ＡｄｏＨｃｙ）を生成するが、後者はそれ自体がＡｄｏＭｅｔ依存性メチルトランスフェラーゼの強力な阻害剤である。ＡｄｏＨｃｙは、酵素Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ＳＡＨＨ）によりさらに分解されてアデノシン及びホモシステインになる。したがって、ＳＡＨＨの阻害はメチルトランスフェラーゼ阻害剤ＡｄｏＨｃｙの蓄積をもたらす。アデノシンジアルデヒド（ＡＤＯｘ）はＳＡＨＨの強力な阻害剤であり、したがって間接的にＡｄｏＭｅｔ依存性メチルトランスフェラーゼ、ひいてはニューロン分化の強力な阻害剤である。
【０２１２】
Ｐ１９は胚性カルシノーマ細胞であり、前述したようにレチノイン酸の存在下での細胞凝集方法でニューロンに分化させることができる。しかし、分化過程の初日に細胞をＡＤＯｘ（１μＭ）に暴露すると、ｉ）観測される神経突起の数並びにｉｉ）ニューロンマーカーβ−チューブリン、ＮｅｕｒｏＤ１及びｍａｓｈ１の発現レベルが減少した。したがって、ＡＤＯｘはＡｄｏＭｅｔ依存性メチルトランスフェラーゼの間接阻害によってＰ１９細胞のニューロン分化を遮断する（Ｈｏｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｍ．，  ３７７，  ９３５−９４０）。
【０２１３】
［２］Ｄ−テオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（Ｄ−ＰＤＭＰ）
ガングリオシドは神経発生に関係していた。Ｐ１９  ＥＣ細胞に関するインビトロニューロン分化モデルを用いて、Ｌｉｏｕｒ  Ｓ．Ｓ．＆  Ｙｕ  Ｒ．Ｋ．，２００２，（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓ．  ２７，  １５０７−１５１２）は、ガングリオシド生合成阻害剤であるＤ−テオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（Ｄ−ＰＤＭＰ）が神経突起の成長を阻害し、結局はＰ１９由来ニューロンの死を引き起こすことを証明した。
【０２１４】
Ｐ１９  ＥＣ細胞（１×１０6細胞／皿）を、２．５％ウシ胎児血清及び５％仔ウシ血清を補充したα−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で培養した。これらを細菌グレード皿内において５μＭレチノイン酸の存在下で４日間分化誘導した後、レチノイン酸を除いた増殖培地中に分散させ、ポリリシンでコートした細胞培養皿上にプレーティングした。培地は約３日毎に交換した。レチノイン酸処理の３日前に、ガングリオシド阻害剤Ｄ−ＰＤＭＰ（５０μＭ）を添加し、分化過程全体を通じて維持した。結果は、Ｄ−ＰＤＭＰがｉ）細胞死の徴候なしに未分化Ｐ１９  ＥＣ細胞の増殖を減少させ、かつｉｉ）神経突起の伸長を阻止した（注−神経突起は生じたが、正しく成長しなかった）ことを示した。他のガングリオシド阻害剤を使用することで、著者らは、ニューロン分化に対するＤ−ＰＤＭＰの効果が単にガングリオシド生合成の阻害に関係するだけではないことを証明することができた。
【０２１５】
［３］インドカルバゾスタチン
インドカルバゾスタチンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種によって生成され、すべてがラットＰＣ１２細胞のＮＧＦ誘導ニューロン分化の阻害剤であることが証明されている（Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ５５，  ３５５−３６２及びＦｅｎｇ，  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ５７．  ６２７−６３３）。簡単に述べれば、０．３５％グルコース、１０％ウシ胎児血清及び１０％ウマ血清を補充したＤＭＥＭ中でＰＣ１２細胞を増殖させた。ＰＣ１２細胞を９６ウェルのコラーゲンタイプ１でコートしたプレートのウェル中にプレーティングした。１２時間後、インドカルバゾスタチンを添加し、１２時間後にＮＧＦを添加した。神経突起の生成を観察することでニューロン分化をモニターした。
【０２１６】
［４］インドロカルバゾール
ラットＰＣ１２細胞のＮＧＦ誘導ニューロン分化のインドカルバゾスタチン仲介阻害に関して上記に記載したものと同様な実験において、インドロカルバゾールＫ−２５２ａ及びｂも神経分化の有効な阻害剤であることが証明された（Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ５５，  ３５５−３６２）。これらの化合物は、明らかに、ｐ１４０  ｔｒｋチロシンキナーゼＮＧＦ受容体を阻害することで神経突起伸長の阻害を仲介する。
【０２１７】
［５］２’−アミノ−３’−メトキシフラボン（ＰＤ９８０５９）
ＰＤ９８０５９は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ１（ＭＡＰキナーゼキナーゼ１又はＭＥＫ１）の強力な細胞透過性かつ選択的阻害剤である。それはＭＥＫ１の活性化を阻止し、したがってそれに続くＭＡＰキナーゼのリン酸化及び活性化を阻害する。Ｐａｎｇ，  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，  １９９５（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０，  １３５８５−１３５８８）は、ＰＤ９８０５９が細胞生存度に影響を及ぼすことなしにＰＣ１２細胞におけるＮＧＦ誘導神経突起形成を完全に阻止することを証明した。これは、ＭＡＰキナーゼ経路がＰＣ−１２細胞におけるＮＧＦ誘導ニューロン分化のために決定的に重要であるように思われることを示している。
【０２１８】
［６］［７−（ベンゾリルアミノ）−４，９−ジヒドロ−４−メチル−９−オキソ−ピラゾロ［５，１−ｂ］キナゾリン−２−カルボン酸］ＰＤ９０７８０
置換ピラゾロキナゾリノンＰＤ９０７８０はＮＧＦと相互作用し、それによってｐ１４０  ｔｒｋチロシンキナーゼＮＧＦ受容体及び共通ニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲに対するそれの結合を妨げる。ＮＧＦの結合を阻害することは、ＰＣ１２細胞のＮＧＦニューロン分化を阻止する（Ｓｐｉｅｇｅｌ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２１７，  ４８８−４９４）。
【０２１９】
［７］ＡＧ８７０
ＡＧ−８７９は、チルホスチン（ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ）ファミリーのチロシンキナーゼ阻害剤の一員である。それは、ＥＧＦ又はＰＤＧＦ受容体のリン酸化を阻害することなく、ｐ１４０  ｔｒｋチロシンキナーゼＮＧＦ受容体の自己リン酸化を選択的に阻害する（ＩＣ５０＝１０μＭ）。上記の化学物質と同じく、ＡＧ−８７９はＰＣ１２細胞におけるＮＧＦ誘導神経突起成長も阻害する（Ｏｈｍｉｃｈｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４，  ３２  ４６５０−４６５８）。
【０２２０】
神経発生に対する上記のもののような阻害剤（及び化学物質、薬物又は化粧品）の効果は、前駆幹細胞の分化中にモニターすることができる。前駆細胞を阻害剤に暴露した後、分化の程度をモニターすることで細胞発生過程に対する効果が評価される。これは、定量的免疫細胞化学のような技法により、分化細胞タイプに関連する細胞／組織特異的マーカーの発現を測定することで達成できる。
【０２２１】
神経発生を表す特異的な神経細胞マーカーには以下のものがある（Ａｂｃａｍ社から商業的に入手できる抗体の詳細も記載されている）。
【０２２２】
神経幹細胞マーカー−早期マーカー
［１］アグリカンＡＲＣｘｘ（抗体ＢＣ−３、ａｂ３７７３）−神経前駆細胞で検出される。
【０２２３】
［２］ＣＤ１３３（抗体３２ＡＴ１６７２、ａｂ５５５８）−神経幹細胞及び胚性幹細胞に対するマーカー。
【０２２４】
［３］Ｄｌｘ５（抗体ａｂ５４７２９）−神経発生中における転写調節剤。
【０２２５】
［４］ＥＭＸ２（抗体ａｂ１１８４９）−Ｅｍｘ２は、ＣＮＳの発生中の大脳皮質においてＯｔｘ１／２と関係して細胞の運命を規定するホメオボックスタンパク質である。
【０２２６】
［５］ネスチン（抗体１０Ｃ２、ａｂ２２０３５）−早期胚性神経上皮幹細胞で発現される。ネスチンは、幹細胞／前駆細胞、神経膠腫細胞に対するマーカーとして広く使用されている。
【０２２７】
［６］ＮｅｕｒｏＤ１抗体（ａｂ６０７０４）−神経形成における重要な分化因子。
【０２２８】
神経幹細胞マーカー−後期マーカー
［１］ＢＲＮ３Ａ（抗体ａｂ３０８８０）−ニューロン遺伝子の調節に関係する転写因子。
【０２２９】
［２］ＢＲＮ３Ｂ（抗体ａｂ３２２６４）−神経節細胞の亜集団内の網膜中に見出され、視覚系細胞の部分集合の正体を決定する。
【０２３０】
［３］Ｍｕｓａｓｈｉ  １／Ｍｓｉ１（抗体ａｂ６０６００）−神経幹細胞で発現される。
【０２３１】
［４］ＮＲ２Ｅ１／Ｔａｉｌｌｅｓｓ（抗体ａｂ６６１２５）−脳で発現される。
【０２３２】
［５］ヌクレオステミン（抗体ａｂ５２７８４）−胚性及び成体ＣＮＳ幹細胞中に見出される。
【０２３３】
［６］Ｏｃｔ６（抗体ａｂ７２６８１）−胚性幹細胞及び発生中の脳で発現される、早期胚形成及び神経形成に関与する転写因子。
【０２３４】
［７］Ｐａｘ２（抗体ａｂ５５４９０）−中脳、後脳、脊髄、眼、耳を含む神経系の発生中に必要な転写因子。
【０２３５】
［８］ＳＯＸ２（抗体５７ＣＴ２３．３．４、ａｂ７５４８５）−発生中の神経系で発現される転写活性化剤。
【０２３６】
［９］ＳＯＸ４（抗体１５４Ｃ４ａ、ａｂ７０５９８）−ＣＮＳで発現される転写因子。発現は発生中のＣＮＳで増加する。
【０２３７】
［１０］ＳＯＸ１０（抗体ａｂ２７６５５）−神経堤及び末梢神経系発生のために重要な核細胞質シャトルタンパク質として作用する転写活性化剤。
【０２３８】
［１１］ＳＯＸ１１（抗体ａｂ５０１９４）−ＳＯＸ１１は、発生中の神経系において重要である。
【０２３９】
［１２］ＳＯＸ２２（抗体８６Ｃ２ａ、ａｂ５４３７１）−胚の脳及び腎臓並びに成体の心臓で発現される転写活性化剤。
【０２４０】
［１３］ビメンチン（抗体ＲＶ２０２、ａｂ８９７８）−神経幹細胞マーカー。
【０２４１】
［１４］ＣＤｗ３３８（抗体ＢＸＰ−２１、ａｂ３３８０）−造血細胞／神経幹細胞マーカー。
【０２４２】
神経堤細胞−マーカー
［１］ニューロゲニン１（抗体ａｂ６６４９８）−明確な前駆細胞集団で発現される転写因子。それはニューロン発生及び分化を調節する。
【０２４３】
［２］ニューロゲニン２（抗体ａｂ５７５６０）−新皮質発生を調節する転写因子。細胞増殖から神経形成への移行にはニューロゲニン２を必要とする。
【０２４４】
［３］ニューロゲニン３（抗体ａｂ５４７４３）−移動性神経堤細胞からの神経形成において重要な役割を果たす転写因子。
【０２４５】
［４］ＭＡＳＨ１（抗体ａｂ７６９８７）−神経細胞の早期発生で発現される。脊髄、中央前脳及び腹側前脳の神経上皮に見出される。後には脳に見出される。
【０２４６】
星状膠細胞−マーカー
［１］星状膠細胞（抗体１０Ｅ４／Ｒ５、ａｂ３２６８）−星状膠細胞マーカー。
【０２４７】
［２］ＣａＭＫII（ａｂ６３３７７）−ＣＮＳのキナーゼであって、長期増強及び神経伝達物質放出で機能する。
【０２４８】
［３］ＥＡＡＴ１（抗体ａｂ４１６）−前頭皮質、海馬及び基底核で発現される。
【０２４９】
［４］早期ＣＤ１５抗体（２８、ａｂ２０１３７）−星状膠細胞及びある種の上皮細胞で発現される。
【０２５０】
［５］ガングリオシドＧＤ３（抗体ＭＢ３．６、ａｂ７８３６１）−すべての星状膠細胞腫がＧＤ３抗原を発現する。
【０２５１】
［６］ＧＦＡＰ（抗体ＧＦ５、ａｂ１００６２）星状膠細胞マーカー−星状膠細胞、大グリア細胞、末梢神経節中の衛星細胞、シュワン細胞及び神経幹細胞で発現される。
【０２５２】
［７］Ｓ１００（抗体４Ｃ４．９、ａｂ４０６６）星状膠細胞マーカー−星状膠細胞、シュワン細胞、上衣細胞腫及び大グリア細胞腫に局在する。
【０２５３】
［８］サービビン（抗体３２．１、ａｂ９１７８）−星状膠細胞及び若干のニューロゲニンで発現される。
【０２５４】
［９］他の星状膠細胞マーカーには下記のものがある。
ＡＢＣＡ１抗体（ＨＪ１、ａｂ６６２１７）及びＡＢＣＡ７抗体（７Ａ１−１４４、ａｂ４８２６５）
ＡＬＤＨ１Ｌ１抗体（ａｂ５６７７７）
トロンボスポンジン抗体（Ａ４．１、ａｂ３１３１）
グリア細胞及び小グリア細胞−早期マーカー
［１］ＣＮＴＦ（抗体４−６８、ａｂ７８２６９）−ＣＮＳ及びＰＮＳ内のグリア細胞で発現される。ＣＮＴＦは各種の神経細胞タイプの分化を刺激する。
【０２５５】
［２］ツイスト（抗体２Ｃ１ａ、ａｂ５０８８７）−ツイストは、神経膠腫で発現される転写因子である。それはＣＮＳ発生及び血管形成において役割を有し得る。
【０２５６】
グリア細胞及び小グリア細胞−後期マーカー
［１］ｃＣＤ１１ｂ（抗体ａｂ８８７９）−神経組織で小グリア細胞マーカーとして常用されている。
【０２５７】
［２］Ｉｂａ１／ＡＩＦ１（抗体ａｂ５４７４９）−小グリア細胞によって発現されるＣａ2+結合ペプチド。
【０２５８】
［３］ＭＲＰ８（抗体２Ｃ５／４、ａｂ１９８６０）−小グリア細胞によって発現される。
【０２５９】
［４］Ｎｆａｓｃ１５５抗体（ａｂ７７９５１）−Ｎｆａｓｃ１５５はグリア中の無髄軸索にある。
【０２６０】
［５］ＰＡＸ６（抗体ＡＤ２．３８、ａｂ７８５４５）−眼、鼻、中枢神経系及び膵臓の発生に関与する転写因子。
【０２６１】
［６］ＢＬＢＰ（抗体ａｂ２７１７１）−ＢＬＢＰは、ラジアルグリア（主神経前駆細胞タイプ及びニューロン移動を支持する足場）用の分子マーカーとして使用できる。
【０２６２】
プルキンエ細胞−早期マーカー
［１］Ｌ１ＣＡＭ（抗体２Ｃ２、ａｂ２４３４５）−神経外胚葉組織で発現される。軸索成長、神経移動及びニューロン分化の仲介に関与する。
【０２６３】
プルキンエ細胞−後期マーカー
［１］ＰＴＰζ（抗体ａｂ７８０１９）−脳で発生的に調節され、ＣＮＳで発現される。そこでは、小脳のプルキンエ細胞層、歯状回、及び側脳室の前角の上衣下層に局在している。
【０２６４】
［２］ＮＳＭａｓｅ２（抗体ａｂ６８７３５）−ニューロン、プルキンエ細胞、錐体細胞、歯状回顆粒層のニューロン、及び橋核中のニューロンに限定される。また、視床下部核、梨状皮質中のニューロン、及び脳幹の核にも存在している。
【０２６５】
［３］アルドラーゼ（抗体１Ｆ８、ａｂ６７２０４）−アルドラーゼＣは、脳及び神経で発現される。
【０２６６】
［４］プレセレベリン（抗体ａｂ３６９０９）−脳特異的セレベリンの前駆細胞。活性形は、小脳プルキンエ細胞の後シナプス構造及び背部蝸牛神経核のカートホイールニューロンに富化されている。
【０２６７】
［５］カルビンジン（抗体ＣＬ−３００、ａｂ９４８１）−小脳プルキンエ細胞に対するマーカー。
【０２６８】
ニューロン−早期マーカー
［１］ＰＲＯＸ１（抗体ａｂ５７７４６）−ＣＮＳの早期発生において基本的な役割を果たす。それは、有糸分裂後で未分化の若いニューロンの遺伝子発現及び発生を調節する。
【０２６９】
［２］ＣＤ９０（抗体１．ＢＢ．７３０、ａｂ６２００９）−神経細胞、Ｔ細胞、早期造血前駆細胞、線維芽細胞、ニューロン及びクッパー細胞で発現される。
【０２７０】
［３］ＵＣＨＬ１／３（抗体ａｂ７５２７５）−ニューロン発生の調節に役割。
【０２７１】
［４］ＰＬＡＧＬ１（抗体ａｂ５５６５９）−早期脳発生中にニューロン上皮で発現される。
【０２７２】
［５］ＨＬＢＸ９（抗体ＥＰＲ３３４２、ａｂ７９５４１）−発生中の脊椎動物ＣＮＳの運動ニューロンによって選択的に発現されるホメオボックス遺伝子であり、ニューロンの運命を発生的に調節する。
【０２７３】
［６］ＮｅｕｒｏＤ２抗体（ａｂ６６６０７）−ニューロン分化及び生存を誘導する。
【０２７４】
［７］ＮＥＵＲＯＤ４抗体（ａｂ６７１６８）−ニューロン分化を仲介する。
【０２７５】
［８］ＮＥＵＲＯＤ６抗体（ａｂ７７９９８）−ニューロン分化及び成熟に関与する。
【０２７６】
ニューロン−中間マーカー
［１］ＮＮＰＴＸ２（抗体ａｂ６９８５８）−興奮性シナプス形成で役割を果たすニューロンの即時初期遺伝子。
【０２７７】
［２］ニューログリカンＣ（抗体ａｂ５６９４１）−ＣＮＳにおけるニューロン回路形成に関与する。
【０２７８】
［３］ＴＢＲ２（抗体ａｂ５８２２５）−発生中に中間前駆細胞によって発現される転写因子。ＩＰＣは脳室帯（ＶＺ）又は脳室下帯（ＳＶＺ）内で分裂し、厳密なニューロン集団を生成する。
【０２７９】
ニューロン−後期マーカー
［１］ＳＩＲＰ（抗体ＯＸ−４１、ａｂ９２９５）−骨髄細胞及びニューロンによって発現される。
【０２８０】
［２］アタキシン７（抗体ａｂ１１４３４）−正常脳ニューロンの細胞質中及び核膜上に位置している。
【０２８１】
［３］ＧＩＲＫ２（抗体ａｂ３０７３８）−ニューロン性ＧＩＲＫ２チャンネルはニューロンの興奮性の調節に関与し、静止電位に寄与し得る。
【０２８２】
［４］プロフィリン２（抗体ａｂ５５６１１）−プロフィリン２はニューロン特異的である。
【０２８３】
［５］ＡＰ１８０（抗体ＡＰ１８０−Ｉ、ａｂ１１３２９）−ニューロン起源の細胞に限定される発現。
【０２８４】
［６］ＰＧＰ９．５（抗体ａｂ２７０５３）ニューロンマーカー−ＰＧＰ９．５の発現は、ニューロン並びに拡散性神経内分泌系の細胞及びその腫瘍に対して極めて特異的である。
【０２８５】
［７］ＳｏｒＣＳ１（抗体ａｂ１６６４１）ニューロンマーカー−ＳｏｒＣＳ１の免疫反応性は、脳全体のニューロン集団中に広く行きわたっている。
【０２８６】
［８］Ｎｏｖａ１（抗体ａｂ７７９２６）−Ｎｏｖａ１はニューロン特異的ＲＮＡ結合タンパク質である。
【０２８７】
［９］ＮＳＥ（抗体ａｂ９４４）−ニューロン特異的エノラーゼは、主としてニューロン、正常神経内分泌細胞及び腫瘍神経内分泌細胞で発現される。
【０２８８】
［１０］ＨＢ  Ｈｕタンパク質（抗体１６Ａ１１、ａｂ１４３７０）−Ｈｕファミリーの脊椎動物ニューロンタンパク質のメンバー中に存在する保存ペプチドエピトープと特異的に結合する。
【０２８９】
［１１］ＥＬＡＶＬ４（抗体１６Ｃ１２、ａｂ１４３６９）−ニューロン特異的なＲＮＡプロセシングにおいて役割を果たし得る。それは脳組織に局在している。
【０２９０】
［１２］ＳＡＰＡＰ３（抗体ａｂ６７２２４）−ニューロン細胞中のシナプス後領域に位置している。
【０２９１】
［１３］早期Ｋｉ６７抗体（ＰＰ−６７、５２６）−Ｋｉ６７はニューロンマーカーとして日常的に使用されている。
【０２９２】
［１４］ＭＡＰ２（抗体ＨＭ−２、ａｂ１１２６７）−ＭＡＰ２は脳組織の主な微小管結合タンパク質である。
【０２９３】
［１５］ミエリン塩基性タンパク質（抗体ＭＢＰ１０１、ａｂ６２６３１）−ミエリン膜の豊富なタンパク質成分。早期脳発生において役割を有し得る。
【０２９４】
［１６］キネシン（抗体ａｂ２５７１５）、キネシン２（抗体Ｋ２．４、ａｂ２４６２６）及びキネシン５Ａ（抗体ａｂ５６２８）−ニューロン細胞における小胞輸送に関与する。５Ａはニューロン特異的である。
【０２９５】
［１７］ＮｅｕＮ（抗体Ａ６０、ａｂ７７３１５）−ニューロン特異的核タンパク質はニューロンに対するマーカーである。ＮｅｕＮは、神経系全体、小脳、大脳皮質、海馬、視床及び脊髄に見出される。
【０２９６】
［１８］Ｎｆａｓｃ１８６３（抗体ａｂ３１７１９）−ランヴィエ絞輪にあるニューロンで発現される。
【０２９７】
［１９］Ｐｉｎ１（抗体ａｂ１２１０７）−アルツハイマー病の基礎にあるタウ病態に関係している。Ｐｉｎ１は、正常ニューロン機能の維持にとって枢要であり得る。
【０２９８】
［２０］ニューロリギン３（抗体ａｂ５７３７５）−ニューロリギン３はニューロン細胞表面タンパク質である。
【０２９９】
［２１］ＰＤＧＦβ受容体（抗体Ｙ１２、ａｂ３２５７０）−ニューロンで発現される。
【０３００】
［２２］コフィリン（抗体ａｂ５４５３２）−コフィリンは遍在しているが、特にニューロンで発現される。
【０３０１】
海馬ニューロン
［１］ＳｙｎＧＡＰ（抗体ＥＰＲ２８８３Ｙ、ａｂ７７２３５）−もっぱら海馬ニューロンのシナプスで発現される。
【０３０２】
終脳ニューロン
［１］シナプトポジン（抗体ａｂ５０４８５）−終脳ニューロンのスパイン装置の形成のために不可欠である。シナプス可塑性に関係している。
【０３０３】
ドーパミン作動性ニューロン−早期マーカー
［１］ＰＩＴＸ３（抗体ａｂ３０７３４）−この転写因子はドーパミン作動性ニューロンの分化を調節する。
【０３０４】
［２］Ｎｕｒｒ１（抗体ａｂ１２２６１）−胚性腹側中脳で発現される転写因子。ドーパミンニューロンの発生及び維持のため決定的に重要である。
【０３０５】
［３］ＡＭＳＸ１（抗体４Ｆ１１、ａｂ７３８８３）−中脳のドーパミン作動性前駆細胞ドメインを確立するためにＷｉｎｔ１と並行して作用し、ニューロン集団を生じる。
【０３０６】
ドーパミン作動性ニューロン−後期マーカー
［１］チロシンヒドロキシラーゼ（抗体１８５、ａｂ１０３７２）ニューロンマーカー−ＴＨはアドレナリン作動性ニューロンの生理学において役割を有し、ドーパミン作動性ニューロンに対するマーカーとして常用される。
【０３０７】
［２］ドーパミンＤ２受容体（抗体ａｂ３０７４３）−下垂体及び脳で発現される。
【０３０８】
ＡＬＤＨ１Ａ１（抗体ａｂ２３３７５）−背側網膜、腹側中脳（ドーパミン作動性ニューロン）及び造血幹細胞で発現される。
【０３０９】
［３］ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ（抗体ａｂ３９０５）−神経伝達物質（即ち、ドーパミン及びセロトニン）の合成に関係する酵素。
【０３１０】
コリン作動性ニューロン
［１］コリンアセチルトランスフェラーゼ（抗体ａｂ５４５９９）−末梢神経系及び中枢神経系の両方においてコリン作動性ニューロンに対する特異的マーカーとして役立つ。
【０３１１】
感覚ニューロン
［１］シンタキシン及び２（抗体４Ｈ２５６、それぞれａｂ１８０１０及びａｂ１２３６９）−感覚ニューロン及び小血管に達する神経の末端に局在するニューロンシンタキシン。
【０３１２】
侵害受容ニューロン
［１］ペリフェリン（抗体２Ｑ１３５、ａｂ１７９９９）侵害受容（痛覚）ニューロンマーカー−末梢神経節のニューロン及びその突起に見出される。
【０３１３】
運動ニューロン
［１］イスレット１（抗体ａｂ２０６７０）神経幹細胞マーカー−神経管運動ニューロン分化及び膵島細胞の胚形成において役割を果たす転写因子。
【０３１４】
［２］イスレット２（抗体ａｂ２６１１７）神経幹細胞マーカー−運動ニューロンのサブクラスを定義する転写因子。
【０３１５】
錐体ニューロン−早期マーカー
［１］Ｅｍｘ１（抗体ａｂ３２９２５）−錐体ニューロンで特異的に発現されるホメオボックス遺伝子。Ｅｍｘ１は、錐体ニューロン及び錐体細胞系統の信頼できるマーカーである。
【０３１６】
［２］ＴＢＲ１（抗体ａｂ５６９９４）−大脳皮質で発現される。早期胚形成中、それは旧皮質、辺縁皮質及び新皮質ドメインを区別する。
【０３１７】
錐体ニューロン−後期マーカー
［１］ヒッポカルシン（抗体ａｂ２４５６０）−ＣＮＳに限定され、海馬ＣＡ１領域の錐体細胞に最も豊富である。
【０３１８】
乏突起膠細胞−早期マーカー
［１］Ａ２Ｂ５（抗体２Ｑ１６２、ａｂ６８３８５）−発生中の乏突起膠細胞前駆細胞神経内分泌細胞で発現される細胞表面ガングリオシドエピトープ。
【０３１９】
［２］ＰＤＧＦα受容体（抗体Ｙ９２、ａｂ３２５７０）−乏突起膠細胞前駆細胞で発現されるαサブユニット。
【０３２０】
［３］Ｏｌｉｇ１（抗体ａｂ２１９４３）−Ｏｌｉｇ１は乏突起膠細胞の形成を促進する。
【０３２１】
［４］Ｏｌｉｇ２（抗体ａｂ５６６４３）−乏突起膠細胞、脊髄運動ニューロン、及び後脳における体性運動ニューロンの発生のために必要な転写因子。
【０３２２】
［５］ＯＳＰ（抗体ａｂ７４７４）乏突起膠細胞マーカー−発生中に発現が高度に調節され、乏突起膠細胞の増殖及び分化において役割を果たし得る。
【０３２３】
［６］Ｏｌｉｇ３抗体（ａｂ７８００６）−Ｏｌｉｇ３は、胚性中枢神経系の様々なタイプの前駆細胞で一過的に発現される。
【０３２４】
乏突起膠細胞−中間マーカー
［１］ソルチリン（抗体ａｂ１６６４０）−脳、脊髄及び筋肉で発現される。ソルチリンは、ニューロテンシンに対する受容体として作用する。ソルチリンは胚形成中に発現される。
【０３２５】
乏突起膠細胞−後期マーカー
［１］ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（抗体Ｆ３−８７−８、ａｂ２４０２２）−ＭＯＧは、ミエリン化中の乏突起膠細胞の表面に見出される。
【０３２６】
［２］ＣＮＰａｓｅ（抗体１１−５Ｂ、ａｂ６３１９）−乏突起膠細胞及びシュワン細胞によって発現される。
【０３２７】
［３］ミエリンＰＬＰ（抗体ｐｉｐｃ１、ａｂ９３１１）−ＣＮＳ中に最も多く存在するミエリンタンパク質。乏突起膠細胞の発生及び軸索の生存に関与する。
【０３２８】
［４］ＣａＭＫII（抗体ａｂ６３３７７）−シナプス後膜肥厚の主成分として脳内に豊富な遍在性キナーゼ。
【０３２９】
神経内分泌細胞
クロモグラニンＡ（抗体２３Ａ１、ａｂ３６９９７）−神経内分泌細胞で発現される。
【０３３０】
軸索
［１］ニューロフィラメントは、ニューロン軸索、交感神経節細胞及び樹状突起の主構造要素をなしている。
２００ｋＤニューロフィラメント重鎖（抗体ａｂ８１３５）。
１６０ｋＤニューロフィラメント中鎖（抗体３Ｈ１１、ａｂ７２５６）。
１４５ｋＤニューロフィラメント（抗体２Ｅ３０、ａｂ３５９５３）。
６８ｋＤニューロフィラメント（抗体ＤＡ２、ａｂ４５７２）。
【０３３１】
［２］１４−３−３（抗体２Ｑ２４８、ａｂ１４１２１）−ニューロンに局在し、神経末端に軸索輸送される。
【０３３２】
［３］Ｆｅｚ１（抗体ａｂ５３５６２）−細胞形態及び軸索誘導機構を調節する分子のネットワークの成分として軸索成長に関与する。
【０３３３】
［４］ダイネイン重鎖（抗体４４０．４、ａｂ６３０５）及び中鎖１（抗体７０．１、ａｂ６３０４）−微小管で発現される。ダイネインは、軸索輸送に関係していた。
【０３３４】
［５］ギガキソニン（抗体ａｂ２７０４１）−遍在的に発現され、ニューロンの機能及び生存のために不可欠である。
【０３３５】
［６］リンゴ１（抗体ａｂ２３６３１）−マウス及びヒトの脳で発現される。
【０３３６】
［７］ＭＡＰ１ａ＋ＭＡＰ１ｂ（抗体ＨＭ−１、ａｂ６６０２１）、ＭＡＰ２（抗体ａｂ３２４５４）、ＭＡＰ１Ｂ（抗体３Ｇ５、ａｂ３０９５）、ＭＡＰ２ａ＋ＭＡＰ２ｂ抗体（ＡＰ２０、ａｂ３０９６）−微小管はチューブリン及び微小管関連タンパク質から構成される。ＭＡＰ１はニューロン特異的である。
【０３３７】
［８］ネトリンＧ１リガンド（抗体ａｂ３１９８３）−線条及び大脳皮質中の視床軸索で高度に発現される。ＮＧＬ１は軸索成長の促進に関係する。
【０３３８】
［９］プレキシンＢ２（抗体ａｂ４１０９８）−この受容体は軸索誘導において重要な役割を有する。
【０３３９】
［１０］Ｒｏｂｏ２（抗体ａｂ７２９７２）−Ｓｌｉｔ２及びＳｌｉｔ１に対する受容体であって、ニューロン発生中に神経管のニューロン走行を誘導する。
【０３４０】
［１１］タウ（抗体ａｂ８７６３）ニューロンマーカー−タウは、主として軸索上に見出されるニューロン微小管関連タンパク質である。
【０３４１】
［１２］チューブリン（抗体ＹＯＬ１／３４、ａｂ６１６１）微小管マーカー−チューブリンファミリーは微小管の組織化に関与する。
【０３４２】
シュワン細胞
［１］ＮＧＦ受容体（抗体ＭＬＲ２、ａｂ６１４２５）−シュワン細胞及びニューロンで発現される。発生中、ＮＧＦＲはニューロン成長、移動、分化及び細胞死を調節する。
【０３４３】
［２］ミエリン（抗体ｐｍ４３２Ｂ５、ａｂ５８５１３）−ミエリンは、ＣＮＳ中の乏突起膠細胞及び末梢神経系中のシュワン細胞によって産生される。
【０３４４】
［３］グリオメジン（抗体ａｂ２４４８３）−ミエリン化中のシュワン細胞によって発現され、発生中に各ミエリンセグメントの縁部に蓄積する。
【０３４５】
［４］Ｌｇｉ４（抗体ＫＴ１８、ａｂ６３２８９）−シュワン細胞で発現される。
【０３４６】
［５］ミエリンタンパク質ゼロ（抗体ａｂ３１８５１）−ＭＰＺの発現はシュワン細胞に限定される。それは末梢ミエリン及び神経の主構造タンパク質である。
【０３４７】
［６］Ｌｇｉ４（抗体ＫＴ１８、ａｂ６３２８９）−Ｌｇｉ４はシュワン細胞で発現され、軸索分離及びミエリン形成を制御する。
【０３４８】
樹状突起−早期マーカー
Ａｒｇ３．１（抗体ａｂ２３３８２）−脳内に富化された即時早期遺伝子であって、発現はニューロン活性によって誘導される。海馬、扁桃、視床下部、線条及び皮質中の樹状突起で発現される。
【０３４９】
樹状突起−後期マーカー
［１］ＰＲＩＭＳ３（抗体ａｂ５０１９８）−ニューロン樹状突起及びシナプス後膜肥厚に局在している。
【０３５０】
［２］ドレブリン（抗体Ｍ２Ｆ６、ａｂ１２３５０）−ドレブリンは、アクチン動力学及びニューロン形態形成の制御に関与する主ニューロンＦ−アクチン結合タンパク質である。
【０３５１】
［３］ニューロン特異的βIIIチューブノン（抗体ａｂ１８２０７）−ＣＮＳ及びＰＮＳに豊富であって、胎児発生及び生後発育中に発現される。
【０３５２】
［４］ＳＡＰ１０２（抗体７Ｄ３ｍＡｂ１１９、ａｂ６９７３８）−シナプス関連タンパク質１０２は、非対称タイプ１シナプスの樹状シャフト及びスパインで検出される。
【０３５３】
［５］その他
濾胞樹状細胞マーカー（抗体ａｂ８１３８）。
樹状細胞抗体（抗体ａｂ８１７１）。
【０３５４】
成長円錐−早期マーカー
［１］ＣＲＭＰ１（抗体ａｂ７６９９５）、ＣＲＭＰ２（抗体ａｂ５４５４６）、ＣＲＭＰ５（抗体ａｂ７７１５８）−コラプシン応答メディエータータンパク質は、神経分化並びに神経発生中の軸索及び成長円錐誘導に関与する。
【０３５５】
［２］ＮＲＰ２（抗体９６００９、ａｂ５０２０５）−ＮＲＰ２はニューロピリンファミリーの受容体タンパク質の一員であり、心臓血管発生及び軸索誘導において役割を果たし得る。
【０３５６】
成長円錐−後期マーカー
［１］アグリン（抗体ＡＧＲ１３１、ａｂ１２３６２）−神経筋接合部における発生中のニコチン性アセチルコリン受容体（及びその他）のクラスタリングを促進する。
【０３５７】
［２］ＢＡ１１関連タンパク質２イソ形態３（抗体ａｂ７９１）−脳特異的な血管形成阻害剤。
【０３５８】
［３］ＢＡＩＡＰ２（抗体ａｂ５６５８８）−ニューロン成長円錐誘導に関与する、脳特異的な血管形成阻害剤。
【０３５９】
［４］ＢＡＳＰ１（抗体ａｂ７９３４９）−脳で豊富に発現されるタンパク質。
【０３６０】
［５］ダブルコルチン（抗体ａｂ２８９４１）−細胞体中に見出され、移動するニューロンの突起及び分化中のニューロンの軸索を導く微小管結合タンパク質。
【０３６１】
［６］Ｅｐｈ受容体Ａ１タンパク質（抗体ａｂ５５９００）、Ａ２（抗体ＲＭ−００５１−８Ｆ２１、ａｂ７３２５４）、Ａ３（抗体６Ｃ１Ｂ６、ａｂ７６３６１）、Ａ４（抗体７Ｄ３Ｄ４、ａｂ７０４０３）、Ａ５（抗体ａｂ５４６３３）、Ａ６（抗体ａｂ５８０２２）、Ａ７（抗体ａｂ５４６４０）、Ａ８（抗体ａｂ１０６１５）、Ｂ１（抗体５Ｆ１０Ａ４、ａｂ６６３２６）、Ｂ２（抗体ａｂ５４６５０）、Ｂ３（抗体ａｂ５４７１７）、Ｂ４（抗体４Ａ１２Ｇ８、５Ｇ２Ｆ８、ａｂ６６３３６）及びＢ６（抗体２Ａ６Ｂ９、ａｂ６６３２５）−ＥＰＨ関連受容体は、神経組織発生イベントの仲介に関係していた。発生中及び成体の神経組織は、Ｅｐｈ受容体及びエフリンリガンドのすべてを発現する。ＥＰＨ受容体の役割は、軸索誘導及び神経堤細胞移動を仲介することにある。
【０３６２】
［７］エフリンＡ１（抗体ａｂ７０４０）、Ａ２（抗体ａｂ６５０４１）、Ａ３（抗体ａｂ６６１５０）、Ａ４（抗体ａｂ５３０６２）、Ｂ２（抗体ａｂ７５８６８）及びＢ３（抗体ａｂ５３０６３）−エフリンは、神経系における発生イベントの仲介に関係するＥｐｈ受容体のリガンドである。
【０３６３】
［８］ＧＡＰ４３（抗体ＧＡＰ−７Ｂ１０、ａｂ５０６０８）−ニューロン成長円錐タンパク質。
【０３６４】
［９］ＧＰＲＩＮ１（抗体ａｂ７４５７７）−ＧＰＲＩＮ１は神経突起成長に関与する。
【０３６５】
［１０］ＬＩＭキナーゼ（抗体ａｂ５１２００）−脳及び脊髄において活性であり、そこでは神経細胞の発生に関与すると考えられている。
【０３６６】
［１１］ＮＣＡＭ（抗体１２３Ｃ３、ａｂ２８３７７）−大抵の神経外胚葉由来細胞で発現される。
【０３６７】
［１２］ニューロセルピン（抗体ａｂ５５５８７）−主として発生中の脳及び成体脳のニューロンによって発現される。このセルピンはＣＮＳ及びＰＮＳの軸索成長円錐から分泌される。
【０３６８】
体幹
［１］ＡＬＫ（抗体ＡＬＫｃ、ａｂ６５０）−ＡＬＫは神経系中に見出され、前脳ニューロンで発現される。
【０３６９】
［２］メンブラリン（抗体ａｂ２１８１８）−中枢神経系で発現される。
【０３７０】
［３］ネクジン（抗体ａｂ５５５０１）−脳特異的な成長抑制剤。
【０３７１】
［４］ＳＴＥＰ（抗体２３Ｅ５、ａｂ１６９６７）−神経特異的なタンパク質−チロシンホスファターゼ。
【０３７２】
シナプス−早期マーカー
シンテニン（抗体ａｂ１９９０３）−ニューロンにおける発生プロファイルを調節し、激しい成長及びシナプス形成の期間に最も豊富である。
【０３７３】
シナプス−後期マーカー
［１］ＥＡＡＴ２（抗体ａｂ７７０３９）−グルタミン酸塩のシナプス後作用を終わらせるために不可欠である。
【０３７４】
［２］ニューレキシンIIα（抗体ａｂ３４２４５）、ニューレキシンＩβ（抗体ａｂ７７５９６）及びＮＲＸＮ３（抗体ａｂ１８５２３）−シナプス形成中に細胞付着分子として機能するニューロンタンパク質。
【０３７５】
［３］アンフィフィシン（抗体Ｃ１４−２３、ａｂ１６７７０）−シナプス小胞の細胞質表面に関連している。
【０３７６】
［４］バスーン（抗体ＳＡＰ７Ｆ４０７、ａｂ１３２４９）−シナプス前神経末端に局在している。
【０３７７】
［５］ＳＡＰ１０２（抗体ａｂ１２０８６）−非対称タイプ１シナプスの樹状シャフト及びスパインで検出されるシナプスタンパク質。
【０３７８】
［６］ＣＡＳＫ（抗体ａｂ１１３４３）−ニューロンシナプスに局在している。
【０３７９】
［７］ＣＰＬＸ１（抗体ａｂ１５８５５）−シナプス小胞のエキソサイトーシスで機能するサイトゾルタンパク質。
【０３８０】
［８］ＣＲＩＰＴ（抗体ａｂ１６４２２）−脳全体にわたり興奮性シナプスのシナプス後膜肥厚にＰＳＤ９５と共局在するが、抑制性シナプスでは検出されない。
【０３８１】
［９］ＣＳＰ（抗体ａｂ７９３４６）−シナプス小胞の細胞質表面に局在している。
【０３８２】
［１０］ＣＴＢＰ２（抗体ａｂ６７１６１）−特殊化シナプスに対する足場として作用する。
【０３８３】
［１１］ジストロブレビンα（抗体ａｂ７２７９３）−筋細胞膜に局在し、シナプスの形成及び安定性に関与し得る。
【０３８４】
［１２］ＨＯＭＥＲ２（抗体ａｂ７５０３７）−グルタミン酸作動性シナプスにおける可塑性の維持に重要な役割を果たす。
【０３８５】
［１３］ＨＯＭＥＲ３（抗体ａｂ７５０３８）−シナプス後膜肥厚の足場となるタンパク質。
【０３８６】
［１４］ＩＣＡ１（抗体ａｂ５５２５３）−神経伝達物質の分泌に役割を果たし、膵臓、心臓及び脳で豊富に発現される。
【０３８７】
［１５］Ｍｕｎｃ１３（抗体ａｂ２７０７７）−シナプス小胞のプライミングに関与する。
【０３８８】
［１６］Ｍｕｎｃ１８（抗体ａｂ３４５１）−シナプス小胞のドッキング及び融合を調節する。それは神経伝達のために不可欠であり、シンタキシンと結合する。
【０３８９】
［１７］ニューログリカンＣ（抗体ａｂ３１９４６）−中枢神経系で発現される。
【０３９０】
［１８］ニューロリギン１（抗体ａｂ５６８８２）、ニューロリギン２（抗体ａｂ３６６０２）−ニューロリギンはシナプス細胞付着分子である。
【０３９１】
［１９］ＰＳＤ９３（抗体ａｂ１２０９７）シナプスマーカー−シナプスにおいてＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）を集合させる。
【０３９２】
［２０］ＰＳＤ９５（抗体６Ｇ６−１Ｃ９、ａｂ２７２３）−シナプス後部位に位置して、受容体、イオンチャンネル及び関連シグナリングタンパク質のクラスタリングのための足場を形成する。
【０３９３】
［２１］ピッコロ（抗体ａｂ２０６６４）シナプスマーカー−シナプス接合部のシナプス前側に濃縮したシナプス前サイトマトリックスタンパク質。
【０３９４】
［２２］ＲＩＣ８（抗体ａｂ２４３８３）−シナプス伝達を正に調節する。
【０３９５】
［２３］ＳＡＰ９７（抗体ＲＰＩ１９７．４、ａｂ６９７３７）−膜関連シナプスタンパク質はシナプス末端におけるイオンチャンネルクラスタリングを容易にする。
【０３９６】
［２４］ＳＡＰＡＰ３（抗体ａｂ６７２２４）−ニューロン細胞のシナプス後膜肥厚（ＰＳＤ）に局在している。
【０３９７】
［２５］ＳＮＡＰ２３（抗体ａｂ５７９６１）−シナプトソーム関連タンパク質は、細胞内小胞トラフィッキングにおける膜融合過程で重要な役割を果たす。
【０３９８】
［２６］ＳＮＡＰ２５（抗体ａｂ６６０６６）−シナプス小胞融合及びエキソサイトーシスで本質的な役割を果たすシナプス前神経末端タンパク質。
【０３９９】
［２７］ＳＮＡＰ２９（抗体ａｂ５６５６６）−膜トラフィッキング段階に関与し、シンタキシンと結合する。
【０４００】
［２８］ＳＮＡＰＩＮ（抗体ａｂ３７４９６）−シナプス小胞ドッキング及び融合のために必要なＳＮＡＲＥ複合体の成分。
【０４０１】
［２９］ＳＶ２Ａ（抗体１５Ｅ１１、ａｂ４９５７２）、ＳＶ２Ｂ（抗体ａｂ６８０２５）及びＳＶ２Ｃ（抗体ａｂ３３８９２）−すべてのシナプス小胞に存在する内在性膜糖タンパク質。
【０４０２】
［３０］ＳＹＮＰＲ（抗体ａｂ７５０５３）−シナプス小胞膜の成分であって、シナプス小胞トラフィッキングにおいて重要な役割を果たすと考えられる。
【０４０３】
［３１］シナプシンＩ、II及びIII、それぞれ（抗体ａｂ５７４６８）、（抗体ＥＰＲ３２７７、ａｂ７６４９４）及び（抗体ａｂ６８８４９）。シナプシンは、シナプス小胞の細胞質表面に結合するニューロンリンタンパク質である。
【０４０４】
［３２］シナプトブレビン（抗体４Ｅ２４０、ａｂ１８０１３）−シナプス小胞とシナプス前膜とのドッキング及び／又は融合に関与している。
【０４０５】
［３３］シナプトジャニン（抗体ａｂ１９９０４）−神経系で発現される。
【０４０６】
［３４］シナプトフィシン（抗体４Ｅ２０６、ａｂ１８００８）−脳、脊髄、網膜、副腎髄質の小胞、神経筋接合部におけるニューロンシナプス前小胞の膜に存在している。
【０４０７】
［３５］シナプトタグミン（抗体ＡＳＶ３０、ａｂ１３２５９）−シナプス小胞の内在性膜タンパク質。
【０４０８】
［３６］ウトロフィン（抗体ＤＲＰ３／２０Ｃ５、ａｂ４９１７４）−神経筋シナプス及び筋腱接合部に位置し、シナプス後膜の維持及び受容体のクラスタリングに関係する。
【０４０９】
［３７］ＶＡＭＰ２（抗体クローン３Ｅ５、ａｂ５３４０７）−特にニューロンのシナプス小胞中に見出される小さい内在性膜タンパク質。
【０４１０】
［３８］シナプトタグミンXII（抗体ａｂ７６２６１）−神経系における伝達物質放出の調節に関与し、小胞トラフィッキング及びエキソサイトーシスにおいてＣａ（２＋）センサーとして役立つ。
【０４１１】
他の神経マーカー
［１］ＭＥＦ２Ａ（抗体ａｂ５５５４７）−シナプス形成全体を通じて小脳皮質の顆粒化ニューロン中に豊富である。また、心臓及び骨格筋発生においても重要な役割を有する。
【０４１２】
［２］ＭＥＦ２Ｂ（抗体ａｂ５５５６５）−発生中に筋肉関連遺伝子の発現を調節する。また、ある種の神経形成細胞の分化にも関与する。
【０４１３】
［３］ＭＥＦ２Ｃ（抗体ａｂ４３７９６）−心臓形態形成及び筋形成を制御する。また、神経形成及び皮質構造の発生にも関与し得る。
【０４１４】
［４］ＭＥＦ２Ｄ（抗体ａｂ４３７９７）−筋形成細胞及び一部の神経形成細胞の分化に関与する。
【０４１５】
脂肪細胞分化
ｉ）分化を達成するためのプロトコル、ｉｉ）阻害剤の詳細及びｉｉｉ）脂肪細胞マーカー
前駆細胞から脂肪細胞への分化は、Ｄａｎｉ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１０，  １２７９−１２８５に記載されたもののような、十分に特徴つけられかつ公表されたプロトコルを用いて可能である。このプロトコル及び関連するプロトコルを用いれば、多分化能性及び多能性前駆幹細胞から脂肪細胞を生成することが可能である。
【０４１６】
胚性幹細胞は多分化能性細胞であり、白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在下で未分化状態に維持することができる。ＬＩＦを除去し、適当な分化剤を添加すれば、ＥＳ細胞は脂肪細胞、心臓細胞、骨格筋細胞及びニューロンを含む各種の細胞タイプへの拘束が生じる。脂肪細胞は中胚葉幹細胞、筋細胞用の共通前駆細胞、軟骨細胞及び骨細胞から生み出される。ひとたび脂肪細胞系統に拘束されると、前脂肪細胞は分化過程の最終ステージ中に成熟して脂肪細胞になる。
【０４１７】
したがって、脂肪生成には２つの明確な段階が存在する。即ち、ｉ）胚様体形成から２〜５日後の段階であって、レチノイン酸を必要とし、ＥＳ細胞由来の脂肪生成に対する拘束ステージである段階、及びｉｉ）終末分化ステージに対応する段階である。後者の段階では、脂肪生成因子ＰＰＡＲγが要求される。脂肪生成の後期ステージに関連する機構を研究するためには、３Ｔ３Ｌ１及び３Ｔ３Ｆ４４２Ａのような前脂肪細胞株が使用され、結果としていくつかの脂肪細胞特異的遺伝子が同定され単離された。したがって、脂肪生成の早期ステージはレチノイン酸依存性であり、後期ステージはＰＰＡＲγ依存性である。
【０４１８】
ＥＳ細胞由来の脂肪細胞は、レチノイン酸への早期暴露、次いで古典的な脂肪生成誘導剤の適用後に生成し得る。これらの条件下では、７０〜８０％の胚様体において成熟脂肪細胞の大きなクラスターが存在している。レチノイン酸は、ＥＳ細胞分化のパターンに対して時間及び濃度依存的に影響を及ぼす。脂肪細胞分化中には、レチノイン酸処理は脂肪細胞に対するＥＳ細胞の早期拘束を刺激するが、前脂肪細胞成熟の後期ステージでは阻害剤として作用する。この後期阻害効果は、重要な脂肪細胞転写調節遺伝子ＰＰＡＲδ及びＣ／ＥＢＰの発現に対するレチノイン酸の抑制作用に原因している（Ｓｈａｏ，Ｄ．  ａｎｄ  Ｌａｚａｒ，Ｍ．Ａ．，  １９９７，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７２，  ２１４７３−２１４７８）。
【０４１９】
レチノイン酸及びＰＤ９８０５９  ９（ＥＲＫ経路の特異的阻害剤）によるＥＳ細胞の共処理は脂肪細胞形成を妨げるので、ＥＲＫシグナリングは脂肪生成にとって重要であるように思われる。ＰＤ９８０５９の適用は、ＥＳ細胞からニューロン又は心筋細胞への分化には効果を及ぼさない（Ｂｏｓｔ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，  ２００２  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，  ３６１，  ６２１−６２７）。
【０４２０】
インビトロでの胚性幹細胞から脂肪細胞への分化
Ｄａｎｉ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１０，  １２７９−１２８５は、マウス胚性幹細胞株ＺＩＮ４０、Ｅ１４ＴＧ２ａ及びＣＧＲ８を用いて脂肪細胞を生成した。簡単に述べれば、この方法は、ゼラチンでコートしたプレート上において、未分化細胞株を培養培地（０．２５％重炭酸ナトリウム、×１  ＭＥＭ必須アミノ酸、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸塩、１００μＭメルカプトエタノール及び１０％ｖ／ｖウシ胎児血清を含むＭＥＭ／ＢＨＫ２１培地）中で無フィーダー条件下で培養することを含んでいた。分化を阻害するために白血病抑制因子（１００単位／ｍｌ）を添加した。ＥＳ細胞を脂肪細胞に分化させるためには、細胞を胚様体中の凝集物として培養した。各懸滴は２０μｌの培養培地中に１０００個の細胞を含んでいた。これらを、ＰＢＳを満たした細菌学的プレートの蓋上に２日間維持した。形成された胚様体を、レチノイン酸（０．１％ｖ／ｖ）を補充した培養培地中に再懸濁し、細菌学的プレートの蓋上に維持した。胚様体を数日間維持し、次いでゼラチンでコートしたプレート上に沈降させ、８５ｎＭインスリン、２ｎＭトリヨードチロニン及び１０％ウシ胎児血清を補充した培養培地からなる分化培地中に再懸濁した。
【０４２１】
１０〜１５日後、脂質小滴で満たされた細胞クラスターが現れる。これらはオイルレッドＯ（トリグリセライド用の特異的染料）を用いて染色できる。結果は、脂肪生成マーカーであるアディプシン及びＰＰＡＲγの発現で測定したところ、６０％の胚様体が脂肪細胞陽性コロニーを形成したことを示した。
【０４２２】
Ｒｏｓｅｎ，Ｅ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ．４，６１１−６１７は、対照マウス及びＰＰＡＲγ欠損マウスから導かれたＥＳ細胞（２日齢）の分化に際して、Ｄａｎｉ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｃｅｌｌ  ＳｃＬ，１１０，１２７９−１２８５の方法の変法を使用した。実際の改変プロトコルは、簡単に述べれば、レチノイン酸を含む培地中で培養した胚性幹細胞から胚様体を生成することを含んでいた。次いで、胚様体をゼラチンでコートした６ウェルプレートに移し、５μｇ／ｍｌのインスリンに暴露した。１７日目、胚様体をデキサメタゾン（４００ｎｇ／ｍｌ）及びＰＤＥ阻害剤メチルイソブチルキサンチン（５００ｎＭ）に２日間暴露した。その後、胚様体をインスリン含有培養培地中にさらに１０日間再懸濁した。このプロトコルによれば、中性脂質のオイルレッドＯ染色で測定したところ、胚様体中の細胞の７０〜９０％が脂肪細胞表現型を示した。野生型ＥＳ細胞は、分化過程の開始から４日後に早期マーカーアディプシン及びＰＰＡＲγを発現した。
【０４２３】
マウス胚性幹細胞及びヒト成体幹細胞から脂肪細胞への分化に関する包括的な指針が、Ｗｄｚｉｅｋｏｎｓｋｉ  Ｂ，Ｖｉｌｌａｇｅｏｉｓ  Ｐ，ａｎｄ  Ｄａｎｉ（２００７）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ  ２３：Ｕｎｉｔ  ２３．４に記載されている。これには、マウス、ヒト多能性脂肪組織由来幹細胞及びヒト中胚葉幹細胞を分化させるために必要なプロトコルが含まれている。
【０４２４】
脂肪生成の阻害剤
［１］ＥＲＫシグナリング阻害剤
細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）は、細胞増殖及び分化のような多数の細胞機能を調節するシグナリングカスケードに関与している。ＰＰＡＲγのＥＲＫ仲介リン酸化は、明らかに脂肪生成を阻害する。ＰＤ９８０５９はＭＥＫ１（ＥＲＫ活性化を引き起こす酵素）の特異的阻害剤である。発生中のＥＳ細胞をレチノイン酸及びＰＤ９８０５９で共処理すれば、脂肪細胞形成及びＥＳ細胞における脂肪生成マーカーの発現が共に妨げられる（Ｂｏｓｔ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｂｉｏｃｈｍｅ  Ｊ．，  ３６１，  ６２１−６２７）。
【０４２５】
［２］ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤
ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤を用いる療法は、脂肪代謝の変化に関連している。Ｌｅｎｈａｒｄ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ（２０００）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，４７，１２１−１２９は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２間葉幹細胞を用いて脂肪細胞分化に対するこれらの阻害の効果を研究した。これらの細胞では、脂肪生成は２００ｎＭのインスリン並びに１μＭのＰＰＡＲγとＲＸＲアゴニストＢＲＬ４９６５３及びＬＧＤ１０６９をそれぞれ添加することで誘導された。
【０４２６】
これらの条件下では、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤ネルフィナビル、サキナビル及びリトナビルは、脂質生成、オイルレッドＯ染色並びに脂肪細胞マーカーＡＰ２及びＬＰＬの発現の減少で測定したところ、間葉幹細胞の脂肪細胞分化を低減させた。
【０４２７】
Ｖｅｒｎｏｃｈｅｔ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ（２００３）ＡＩＤＳ，１７，２１７７−２１８０はこの研究を拡張し、４種のマウス前脂肪細胞株（３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ、３Ｔ３−Ｌ１、Ｏｂ１７７１及び胚性幹細胞）の脂肪細胞分化に対する同様な範囲のＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の効果を評価した。分化方法は、Ｄａｎｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１１０，１２７９−１２８５に記載されたものと同様であった。
【０４２８】
プロテアーゼ阻害剤ネルフィナビル及びロピナビルは試験したすべての細胞において脂肪細胞分化を阻害したが、インディナビル、サキナビル及びリトナビルは３Ｔ３−Ｌ１及び３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞のみの分化を阻害した。著者らは、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤は使用する細胞モデル系に応じて脂肪細胞分化を阻害すると結論づけた。
【０４２９】
［３］グリコーゲンシンターゼキナーゼ３阻害剤
脂肪生成経路に対する幹細胞の拘束に関与するシグナリングイベントは、まだ完全には特徴づけられていない。最近、Ｍｏｉｎｔｅｉｒｏ，Ｍ．Ｃ，ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．，１８，４５７−４６３は、マウス胚性幹細胞及びレチノイン酸の早期処理を用いて、レチノイン酸の活性化は脂肪細胞分化に対するＥＳ細胞の拘束にとって必要かつ十分であることを示した。著者らはまた、ＥＳ細胞におけるレチノイン酸受容体β誘導脂肪生成がＧＳＫ３阻害剤によって阻止し得ることも証明した。
【０４３０】
脂肪細胞発生に対する上記のＨＩＶプロテアーゼ阻害剤などの阻害剤（及び化学物質、薬物又は化粧品）の効果は、前駆幹細胞の分化中にモニターすることができる。前駆細胞を阻害剤に暴露した後、分化の程度をモニターすることで細胞発生過程に対する効果が評価される。これは、定量的免疫細胞化学のような技法により、分化細胞タイプに関連する細胞／組織特異的マーカーの発現を測定することで達成できる。
【０４３１】
脂肪細胞発生を表すマーカーには以下のものがある（Ａｂｃａｍ社から商業的に入手できる抗体の起源も記載されている）。
【０４３２】
脂肪細胞−早期マーカー
Ｃ２０ｏｒｆ３（抗体ａｂ６９１６２）−脂肪細胞分化に関与している。
【０４３３】
ＦＮＤＣ３Ｂ（抗体ａｂ６９８５４）−脂肪生成の正の調節剤。
【０４３４】
アディポネクチン（抗体１９Ｆ１、ａｂ２２５５４）−脂肪細胞は脂肪細胞分化中にアディポネクチンを産生して分泌する。
【０４３５】
ＮＯＣ３Ｌ（抗体ａｂ７４１５１）−脂肪細胞分化促進因子として機能する。
【０４３６】
ＡＥ結合タンパク質１（抗体ａｂ５４８２０）−脂肪細胞エンハンサー１調節配列に結合する転写抑制剤である脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１。
【０４３７】
ＰＰＡＲα（抗体ａｂ８９３４）、γ（抗体ａｂ１２４０９）及びδ（抗体ａｂ２３６７３）−いずれも脂肪細胞分化に関与すると考えられる。
【０４３８】
ＣＥＢＰα（抗体ＥＰ７０８Ｙ、ａｂ４０７６１）及びβ（抗体Ａ１６、ａｂ１８３３６）−重要な脂肪細胞転写調節遺伝子。
【０４３９】
アディプシン／因子Ｄ（抗体ａｂ８８４１）−脂肪細胞特異的である。
【０４４０】
脂肪細胞−後期マーカー
レプチン（抗体ａｂ３５８３）−脂肪細胞はレプチンを産生して分泌する。
【０４４１】
リポタンパク質リパーゼ（抗体ＬＰＬ．Ａ４、ａｂ２１３５６）−脂肪細胞によって産生され分泌される。
【０４４２】
ＡＥＢＰ２（抗体２０１２Ｃ４ａ、ａｂ７４５１７）−ＡＥ（脂肪細胞エンハンサー）結合タンパク質２。
【０４４３】
ＦＡＢＰ４（抗体ａｂ３７４５８）−脂肪細胞中に見出される主脂肪酸結合タンパク質。
【０４４４】
ＦＡＢＰ５（抗体ａｂ３７２６７）−脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ４及びＦＡＢＰ５は密接に関係しており、脂肪細胞で発現される。
【０４４５】
ＦＤＥ３Ｂ（抗体ａｂ４２０９１）−脂肪細胞組織で発現される。
【０４４６】
ＫＩＡＡ１８８１（抗体ａｂ７８６０２）−脂肪細胞へのトリアシルグリセロールパッケージングに関与する。
【０４４７】
レシスチン（抗体ａｂ３４２３）−脂肪細胞分泌因子であって、脂肪細胞によって特異的に分泌されるサイトカインである。
【０４４８】
ペリリピンＡ（抗体ａｂ６１６８２）−もっぱら脂肪細胞及びステロイド生成細胞中の脂質小滴の表面に見出される。
【０４４９】
ペリリピンＢ（抗体ａｂ３５２７）−発現は脂肪細胞及びステロイド生成細胞に限定される。
【０４５０】
グルコース輸送体ＧＬＵＴ４（抗体ａｂ６５４）−脂肪組織におけるインスリンによるグルコース取込みの刺激には、ＧＬＵＴ４細胞内部位が細胞表面に転位することが必要である。
【０４５１】
ＴＵＧ（抗体４Ａ１１Ａ６Ｇ１１、ａｂ３２００７）−ＧＬＵＴ４分布を変調する推定上のテザー（ｔｅｔｈｅｒ）。
【０４５２】
グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ抗体（ａｂ３４４９２）−最終分化脂肪細胞によって発現される。
検出及び定量化
細胞イメージング
セルイメージャー（例えば、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を多重化モードで使用すれば、様々な特異的抗体に係留された様々な蛍光体（例えばシアニン色素、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を検出することができる。これらの蛍光体を用いることで、ＥＳが特定の経路に沿って分化を受けるのに従い、複数の標的分子が検出及び測定される。このように機器を使用することで、定量的免疫細胞化学を用いて同一試料からの最大３種のマーカーに対する毒性化学物質の効果を測定し、かくして該化学物質の毒性プロファイルを作成することができる。さらに、この文書に記載された方法は、当業者にとって公知の技法（例えば、定量的免疫細胞化学、レポーター遺伝子アッセイ、ＲＴ−ＰＣＴ及びマイクロアレイ分析）を用いて早期及び後期胚性幹細胞選択的バイオマーカーを識別するという追加の特徴を有している。
【０４５３】
前駆細胞が分化を受けるのに従い、これらのレポーターは、分化した細胞タイプばかりでなく元の前駆細胞にも存在している複数の細胞／組織特異的分子を同時に検出し測定することができる。加えて、（免疫細胞化学又はレポーターアッセイなどのいずれから導かれるにせよ）定量的データを生成し得る能力は、致死量以下の用量レベルの決定を可能にする。これは、薬剤開発又は化粧品産業にとって大きな価値を有し得る。
【０４５４】
以上、様々な態様及び好ましい実施形態に従って本発明を説明してきたが、本発明の技術的範囲はそれのみに限定されると考えられないことを理解すべきであり、それのあらゆる変形物及び同等物も添付特許請求の範囲の技術的範囲内に含まれることが出願人の意図である。
【符号の説明】
【０４５５】
１０  未分化幹細胞
１５  バイオマーカー
２０  化学物質
３０  刺激又は作用因子
４０  分化細胞
４５  バイオマーカー
４７  バイオマーカー
【図１】
2012530502.tif 000002
【図２】
2012530502.tif 000003
【国際調査報告】
2012530502.tif 000004
2012530502.tif 000005
2012530502.tif 000006