(57)【要約】  本発明は、エプスタイン・バーウイルス誘発受容体−２(ＥＢＩ２)とコレスト−５−エン−３ｂ,７ｂ,２５−トリオール(７、２５−ジヒドロキシコレステロール)(“７,２５ＤＨＣ”)および／またはコレスト−５−エン−３ｂ,７ｂ−ジオール(７−ヒドロキシコレステロール)(“７ＨＣ”)２５−ジオール(２５−ヒドロキシコレステロール)(“２５ＨＣ”)、特にコレスト−５−エン−３ｂ,７ａ,２５−トリオール(７ａ,２５−ジヒドロキシコレステロール)(“７ａ,２５ＤＨＣ”)および／またはコレスト−５−エン−３ｂ,７ｂ,２５−トリオール(７ｂ,２５−ジヒドロキシコレステロール)(“７ｂ,２５ＤＨＣ”)立体異性体の間の相互作用のモジュレーターに関する。モジュレーターは小化学分子、抗体または他の治療用タンパク質であり得る。医学的治療方法およびモジュレーターの同定方法も記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣ(すなわちリガンド)とヒトＥＢＩ２の間の相互作用の単離されたモジュレーター。
【請求項２】
相互作用が７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣとヒトＥＢＩ２の間である、請求項１に記載のモジュレーター。
【請求項３】
相互作用が７ａ,２５ＤＨＣとヒトＥＢＩ２の間である、請求項２に記載のモジュレーター。
【請求項４】
該相互作用の阻害剤である、請求項１〜３のいずれかに記載のモジュレーター。
【請求項５】
小化学物質、抗体、アドネクチン、アンキリン、マキシボディ／アビマー、アフィボディ、アンチカリン、アフィリン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)から成る群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載のモジュレーター。
【請求項６】
７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２、好ましくは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２と結合し、リガンドとＥＢＩ２６の間の相互作用を阻害する、請求項１〜５のいずれかに記載のモジュレーター。
【請求項７】
７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２発現の内因性産生を調節する、好ましくは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２発現の内因性産生を調節する、請求項１〜５のいずれかに記載のモジュレーター。
【請求項８】
７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣの内因性産生の阻害剤である、好ましくは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣの内因性産生の阻害剤である、請求項７に記載のモジュレーター。
【請求項９】
７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣの内因性酵素仲介産生を阻害する、好ましくは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣの内因性酵素仲介産生を阻害する、請求項６に記載のモジュレーター。
【請求項１０】
７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣの直接前駆体からそれぞれ７,２５ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣへの、好ましくは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣの直接前駆体からそれぞれ７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣへの酵素仲介変換を阻害する、請求項９に記載のモジュレーター。
【請求項１１】
抗体または抗体フラグメントである、請求項１〜１０のいずれかに記載のモジュレーター。
【請求項１２】
抗体がヒト定常領域を含む、請求項１１に記載のモジュレーター。
【請求項１３】
抗体がＩｇＧアイソタイプ(例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４)を有する、請求項１１または１２に記載のモジュレーター。
【請求項１４】
抗体がキメラ、ヒトまたはヒト化である、請求項１１〜１３のいずれかに記載のモジュレーター。
【請求項１５】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＨＨドメインから成る群から選択される抗体フラグメントである、請求項１１に記載のモジュレーター。
【請求項１６】
ＥＢＩ２タンパク質発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡである、請求項１〜５のいずれかに記載のモジュレーター。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載のモジュレーターを薬学的に許容される希釈剤または担体と共に含み、場合によりその使用指示書を含んでよい、医薬組成物。
【請求項１８】
７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２、好ましくは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間の相互作用の調節に応答するヒト疾患または障害の処置方法であって、治療有効量の請求項１７に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１９】
７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２、好ましくは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間の相互作用の調節に応答するヒト疾患または障害の処置のための予防方法であって、治療有効量の請求項１７に記載の医薬組成物を投与する過程を含む、予防方法。
【請求項２０】
疾患または障害が；高血圧、狭心症、アテローム性動脈硬化症、鬱血性心不全、卒中、肥満、代謝症候群、自己免疫性疾患、例えば関節炎、(特にリウマチ性関節炎)および狼瘡、アトピー状態、例えば喘息およびアトピー性皮膚炎、ＣＯＰＤ、肺高血圧、ウイルス感染症、例えばＥＢＶ、ＨＩＶ、肝炎(ＡまたはＣ)、脂肪肝疾患、肝硬変(特にアルコール誘発肝硬変)、癌、異脂肪血症、糖尿病(特にII型)、移植拒絶反応、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、慢性炎症の疾患、アレルギー、乾癬、嚢胞性線維症、高コレステロール血症、腎臓疾患、多発性硬化症からなる群から選択される、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２、好ましくは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間の相互作用のモジュレーター、特に阻害剤の同定方法であって；
(ａ)  候補モジュレーターを準備し；
(ｂ)  工程(ａ)のモジュレーターと７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣおよびＥＢＩ２、好ましくは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣおよびＥＢＩ２をインキュベートし；
(ｃ)  ７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２、好ましくは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間の相互作用が該候補モジュレーターの存在下で、該候補モジュレーター非存在下の７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２、好ましくは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間の相互作用と比較して調節されているか否かを決定することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１. 発明の分野
本発明は、コレスト−５−エン−３ｂ,７ａ,２５−トリオール(７ａ,２５−ジヒドロキシコレステロール)(“７ａ,２５ＤＨＣ”)および／またはコレスト−５−エン−３ｂ,７ａ,２７−トリオール(７ａ、２７−ジヒドロキシコレステロール)(“７ａ,２７ＤＨＣ”)および／またはコレスト−５−エン−３ｂ,７ｂ,２５−トリオール(７ｂ,２５−ジヒドロキシコレステロール)(“７ｂ,２５ＤＨＣ”)および／またはコレスト−５−エン−３ｂ,７ｂ,２７−トリオール(７ｂ,２７−ジヒドロキシコレステロール)(“７ｂ,２７ＤＨＣ”)および／またはコレスト−５−エン−３ｂ,７ａ−ジオール(７ａ−ヒドロキシコレステロール)(“７ａＨＣ”)および／またはコレスト−５−エン−３ｂ,７ｂ−ジオール(７ｂ−ヒドロキシコレステロール)(“７ｂＨＣ”)、２５−ジオール(２５−ヒドロキシコレステロール)(“２５ＨＣ”)とエプスタイン・バーウイルス誘発受容体２(“ＥＢＩ２”)の間の相互作用のモジュレーター、特に阻害剤に関する。より具体的に本発明は、該モジュレーターを含む医薬組成物および該相互作用の調節に応答する疾患または障害の処置方法に関する。他の面において、本発明の目的および利益は、以下の記載から明らかである。
【背景技術】
【０００２】
２. 発明の背景
エプスタイン・バーウイルス(ＥＢＶ)誘発遺伝子２(ＥＢＩ２)は、ＧＰＲ１８３とも呼ばれ、Ｇタンパク質共役受容体(ＧＰＣＲ)としても知られるロドプシン様７ＴＭ受容体(七回膜貫通セグメント受容体)のスーパーファミリーに属する受容体に分類される。ＥＢＩ２、は、オーファンＧタンパク質共役受容体であり、それに対するリガンドは未知である。ＥＢＩ２は、１９９３年にエプスタイン・バーウイルス(ＥＢＶ)感染バーキットリンパ腫細胞における最も上方制御された遺伝子(＞２００倍)の一つとしてクローン化された(Birkenbach, M., et al. (1993)。Epstein-Barr virus-induced genes: first lymphocyte-specific G protein-coupled peptide receptors. J. Virol. 67, 2209-2220.)。ＥＢＩ２遺伝子は染色体１３ｑ３２.３に位置する。ＥＢＩ２は、鶏痘ウイルスＦＰＶ２０６とアミノ酸レベルで約３５％相同性を有し、Ｐ２Ｙ５およびＰ２Ｙ９受容体と３０〜３２％相同性を有する。ＥＢＩ２はまたオーファン７ＴＭ受容体ＧＰＲ１８および２個の脂質受容体システイニルロイコトリエン受容体１および２(ＣｙｓＬＴ１、および２)(それぞれ２５％および２８％相同性)と密接に関係する。
【０００３】
ＥＢＶ感染細胞のリアルタイムＰＣＲは、潜伏期ならびに溶菌性ウイルス複製期の間ＥＢＩ２の高発現を示した(Rosenkilde, et al. (2006) Molecular pharmacological phenotyping of EBI2 - An orphan seven-transmembrane receptor with constitutive activity. Journal of Biological Chemistry 281[19], 13199-13208.)。ＥＢＩ２遺伝子の極めて高い発現が末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)、リンパ系組織(脾臓およびリンパ節)および肺組織で報告された(Birkenbach, M., et al. (1993).; Rosenkilde, M. M. et al. (2006))。ＥＢＩ２発現はＢリンパ球で最も高く、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞が続き、単球で最低である(Rosenkilde, M. M. et al. (2006), Cahir-McFarland, E.D. et al., (2004). Role of NF-kappa B in cell survival and transcription of latent membrane protein 1-expressing or Epstein-Barr virus latency III-infected cells. J. Virol. 78, 4108-4119.)。ＥＢＩ２の発現プロファイルは、免疫系調節における役割を示唆する。最後に、ＥＢＩ２のＧαｉを介する構成的シグナリングおよび細胞表面局在化も証明された(Rosenkilde, M. M. et al. (2006))。
【０００４】
ＥＢＩ２のリガンドを同定することが、本発明の目的である。
【発明の概要】
【０００５】
３. 発明の要約
本発明は、少なくとも一部、７,２５ＤＨＣおよび７,２７ＤＨＣならびに７ＨＣおよび２５ＨＣがＥＢＩ２のリガンドであるとの発見に基づく。
【０００６】
本発明の第一の面によって、７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣ(すなわちリガンド)およびＥＢＩ２(例えばヒトＥＢＩ２)の間、好ましくは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣおよびＥＢＩ２(例えばヒトＥＢＩ２)の間、特に７ａ,２５ＤＨＣとＥＢＩ２(例えばヒトＥＢＩ２)の間の相互作用のモジュレーター(例えば阻害剤)が提供される。
【０００７】
この面の他の態様において、モジュレーターは７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２と、好ましくは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２と、より好ましくは７ａ,２５ＤＨＣおよび／またはＥＢＩ２と結合し、リガンドとＥＢＩ２の間の相互作用を阻害する。本阻害剤は治療用タンパク質、例えば抗体または抗体フラグメント、または小分子化学物質であり得る。
【０００８】
この面の他の態様において、モジュレーターは、７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣ産生の内因性産生を調節(例えば阻害)し、好ましくはモジュレーターは、例えば、７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣ産生の内因性酵素仲介産生を阻害することにより、７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣの内因性産生を調節(例えば阻害)し、好ましくはモジュレーターは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣの内因性酵素仲介産生を阻害する。モジュレーターは、７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣの直接前駆体から７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣへの、好ましくは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣの直接前駆体の前駆体から７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣへの変換を担う酵素の各々を阻害し得る。
【０００９】
この面の他のいくつかの態様において、モジュレーターは；小化学物質、抗体、アドネクチン、アンキリン、マキシボディ／アビマー、アフィボディ、アンチカリン、アフィリン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)から成る群から選択される。モジュレーターは抗体または抗体フラグメントであり得る。
【００１０】
モジュレーターが抗体であるとき、それはヒト定常領域を含んでよくおよび／またはＩｇＧアイソタイプ(例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４)を有してよくおよび／またはキメラ、ヒトまたはヒト化抗体であってよい。
【００１１】
モジュレーターが抗体フラグメントであるとき、抗体フラグメントは；Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＨＨドメインから成る群から選択される。
【００１２】
この面のさらに別の態様において、モジュレーターはＥＢＩ２発現の阻害剤である。かかる阻害剤は、生理学的条件下で、(ａ)ＥＢＩ２遺伝子の一部と安定な三本鎖を形成できる、または(ｂ)ＥＢＩ２遺伝子のｍＲＮＡ転写物の一部と安定な二本鎖を形成できる配列を本質的に含むか、またはこれから成るアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。これに代えて、またはこれに加えて、阻害剤はＥＢＩ２タンパク質の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)分子であり得る(例えばＥＢＩ２転写物の翻訳を妨害できる)。
【００１３】
本発明の第二の面において、上記第一の面のモジュレーターを薬学的に許容される担体または希釈剤と共に含む医薬組成物が提供される。
【００１４】
この第二の面のある態様において、医薬組成物は使用指示書を含んでよい。
【００１５】
本発明の第三の面において、７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣおよびＥＢＩ２の間、好ましくは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間の調節に応答する疾患または障害を有する哺乳動物患者、特にヒト患者の処置方法であって、治療有効量の上記医薬組成物を投与することを含む、方法が提供される。
【００１６】
本発明の第四の面において、７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣおよびＥＢＩ２の間、好ましくは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間の調節に応答する疾患または障害を有する哺乳動物患者、特にヒト患者の予防方法であって、治療有効量の上記の第二の面の医薬組成物を投与することを含む、方法が提供される。
【００１７】
これらの第三および第四の面の態様のいくつかにおいて、疾患または障害は；高血圧、狭心症、アテローム性動脈硬化症、鬱血性心不全、卒中、肥満、代謝症候群、自己免疫性疾患、例えば関節炎、(特にリウマチ性関節炎)および狼瘡、アトピー状態、例えば喘息およびアトピー性皮膚炎喘息、ＣＯＰＤ、肺高血圧、ウイルス感染症、例えばＥＢＶ、ＨＩＶ、肝炎(Ａ型またはＣ型)、脂肪肝疾患、肝硬変(特にアルコール誘発肝硬変)、癌、異脂肪血症、糖尿病(特にII型)、移植拒絶反応、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、慢性炎症の疾患、アレルギー、乾癬、嚢胞性線維症、高コレステロール血症、腎臓疾患、多発性硬化症から成る群から選択される。
【００１８】
第五の面において、上記第一の面のモジュレーターおよび第二の面の医薬組成物の製造方法が提供される。
【００１９】
本発明の第六の面において、７,２５ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間、好ましくは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間の相互作用のモジュレーター、特に阻害剤の同定方法であって、７,２５ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／またはＥＢＩ２、好ましくは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣおよびＥＢＩ２と、候補モジュレーターを接触させ、リガンドと受容体の間の調節を観察することを含む方法が提供される。
【００２０】
４. 発明の詳細な記載
明細書を通して、用語“７,２５ＤＨＣ、７,２７ＤＨＣ、２５ＨＣ”および“７ＨＣ”はその全ての鏡像体、立体異性体、ラセミ体混合物および光学的に純粋な異性体形態を含む。故に本明細書を通して、“７,２５ＤＨＣ”および／または“７,２７ＤＨＣ”および／または“７ＨＣ”および／または“２５ＨＣ”を述べる本発明の態様は、示されるリガンドのラセミ体混合物の個々の態様ならびに示されるリガンドの光学的に純粋な異性体形態の個々の態様を言うと解釈すべきである。用語“７ａ,２５ＤＨＣ”および“７ａ,２７ＤＨＣ”は、本明細書を通し、光学的に純粋なまたは実質的に光学的に純粋な異性体形態のみを示す。それ故に、用語“７ａ,２５ＤＨＣ”および“７ａ,２７ＤＨＣ”は示されるリガンドの、光学的に純粋な異性体形態の個々の態様を言うと解釈すべきである。同様に、用語“７ｂ,２５ＤＨＣ、７ｂ,２７ＤＨＣ、７ａＨＣ、７ｂＨＣ”および“２５ＨＣ”もまた示されるリガンドの光学的に純粋な異性体形態の個々の態様を言うと解釈すべきである。ここで記載する治療用タンパク質、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、単離された形態である。この明細書の第４章における“ＥＢＩ２”の記載は、特にことわらない限りヒトＥＢＩ２を意味する。同様に、疾患または障害の記載は、ヒト疾患または障害を意味する。
【００２１】
４.１  −  治療用タンパク質
本発明の治療用タンパク質は抗体、アドネクチン、アンキリン、マキシボディ／アビマー、アフィボディ、アンチカリン、またはアフィリンであり得る。
【００２２】
４.１.１.−  抗体
本発明の抗体は、当業者に既知の多様な形態のいずれでもよい。これらの形態は、インタクトな抗体、種々の抗体フラグメントおよび以下に記載する通り他の操作された形態を含む。好ましい形態において、本発明の抗体はモノクローナル集団として提供される。
【００２３】
４.１.１.１  −  インタクトな抗体
インタクトな抗体は、少なくとも２個の重鎖と２個の軽鎖を含むヘテロ多量体糖タンパク質を含む。ＩｇＭ以外、インタクトな抗体は通常、２個の同一の軽(Ｌ)鎖および２個の同一の重(Ｈ)鎖から成る約１５０KDaのヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的に、各軽鎖は、１個の共有結合的ジスルフィド結合により重鎖に結合し、他方、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は様々である。各重および軽鎖はまた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＨ)を有し、後に多くの定常領域がある。各軽鎖は、１個の可変ドメイン(ＶＬ)および他端に定常領域を有する；軽鎖の定常領域は重鎖の第一定常領域と協調し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと協調する。ほとんどの脊椎動物種からの抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づきカッパまたはラムダと呼ばれる２個のうち一方に割り当てることができる。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、ヒト抗体は５群、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに割り当てることができる。ＩｇＧおよびＩｇＡはさらにサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４；およびＩｇＡ１およびＩｇＡ２に細分できる。少なくともＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂを有するマウスおよびラットで、種間変異体が存在する。抗体の可変ドメインは、抗体に相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼ばれる特定の可変性を示すある領域との特異性を提供する。可変領域の最も保存された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。インタクトな重および軽鎖各々の可変ドメインは、３個のＣＤＲにより接続された４個のＦＲを有する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域により密接に結合され、他の鎖からのＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常領域は抗体の抗原への結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)、Ｆｃγｒ受容体への結合を介する食作用、新生児Ｆｃ受容体(ＦｃＲｎ)を介する半減期／クリアランス速度および補体カスケードのＣ１ｑ成分を介する補体依存性細胞傷害への関与を示す。
【００２４】
それ故に、本発明の一つの態様において、７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２に結合し、７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間の相互作用を阻害するインタクトな治療用抗体が提供される。好ましい本発明の態様において、インタクトな治療用抗体は７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２と結合し、７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間の相互作用を阻害する。かかる抗体は、典型的にＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４のヒト定常領域を有し、ヒト、ヒト化またはキメラであり得る。
【００２５】
４.１.１.１.１  ヒト抗体
ヒト抗体は、当業者に既知の多数の方法により製造できる。ヒト抗体は、ヒト骨髄腫またはマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株を使用してハイブリドーマ法により製造できる(Kozbor J. Immunol 133, 3001, (1984) and Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987)参照)。別の方法は、ヒトＶ領域レパートリーを利用するファージライブラリーまたはトランスジェニックマウスの使用を含む(Winter G, (1994), Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455, Green LL (1999), J. Immunol. Methods 231, 11-23参照)。
【００２６】
マウス免疫グロブリン座位がヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントで置き換えられている数系統のトランスジェニックマウスが、現在利用可能である(Tomizuka K, (2000) PNAS 97, 722-727; Fishwild DM (1996) Nature Biotechnol. 14, 845-851. Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15, 146-156参照)。抗原曝露により、かかるマウスはヒト抗体のレパートリーの産生ができ、そこから目的の抗体を選択できる。特に注目すべきは、ヒトリンパ球を照射マウスに移植するTrimeraTM system(Eren R et al, (1988) Immunology 93:154-161参照)、ヒト(または他種)リンパ球を、大量の貯留インビトロ抗体産生法に付し、その後デコンヴォルーション(deconvulated)、限界希釈および選択方法に付すSelected Lymphocyte Antibody System(SLAM, Babcook et al, PNAS (1996) 93: 7843-7848参照)およびXenomouseＴＭ(Abgenix Inc)である。別の方法は、MorphodomaTM技術を使用するMorphotek Inc.から利用可能である。
【００２７】
ファージディスプレイ技術をヒト抗体(およびそのフラグメント)の製造に使用できる(McCafferty; Nature, 348, 552-553 (1990)およびGriffiths AD et al (1994) EMBO 13: 3245-3260参照)。この技術に従い、抗体Ｖドメイン遺伝子を、糸状バクテリオファージ、例えばＭ１３またはｆｄのタンパク質遺伝子のメジャーまたはマイナーコートのフレーム内にクローン化し、ファージ粒子の表面上の機能抗体フラグメントとして提示させる(通常ヘルパーファージの助けを借りて)。抗体の機能特性に基づく選択が、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択となる。ファージディスプレイ技術を使用して、上記疾患または障害を有する個体から、または、未免疫ヒトドナーから採取したヒトＢ細胞で作られたライブラリーから抗原特異的抗体を選択できる(Marks; J Mol Bio 222, 581-591, 1991参照)。Ｆｃドメインを含むインタクトなヒト抗体が記載されているとき、所望の定常領域を含む哺乳動物発現ベクターにファージディスプレイ由来フラグメントを再クローンし、安定に発現する細胞株を確立することが必要である。
【００２８】
親和性成熟の技術(Marks; Bio/technol 10, 779-783 (1992))を使用して、結合親和性を提供でき、ここで、一次ヒト抗体に対する該親和性は、ＨおよびＬ鎖Ｖ領域と天然に存在する変異体を連続的に置換し、改善された結合親和性に基づき選択することにより改善されている。この技術の変法、例えば‘エピトープインプリンティング’が現在また利用可能である(ＷＯ９３／０６２１３参照)。Waterhouse; Nucl Acids Res 21, 2265-2266 (1993)もまた参照のこと。
【００２９】
それ故に、本発明の一つの態様において、７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２に結合し、７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の相互作用を阻害できるインタクトな治療用(ヒト)抗体が提供される。好ましい本発明の態様において、インタクトな治療用ヒト抗体は、７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２と結合し、７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間の相互作用を阻害する。典型的態様において、インタクトな治療用ヒト抗体は、ＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域を含む。
【００３０】
４.１.１.１.２  キメラおよびヒト化抗体
ヒト疾患または障害の処置におけるインタクトな非ヒト抗体の使用は、現在確立されている免疫原性の問題の可能性がつきものであり、すなわち、患者の免疫系が非ヒトインタクト抗体を非自己と認識し、中和応答を開始し得る。非ヒト抗体のヒト患者への多数回投与によりこれは特に明白である。この問題に打ち勝つために多くの技術がここ数年間で開発されており、そして一般に、免疫化動物、例えばマウス、ラットまたはウサギから非ヒト抗体を比較的容易に得られることを維持しながら、インタクトな抗体における非ヒトアミノ酸配列の組成を減少させることを含む。大まかに二つの方法がこれを達成するために使用されている。第一は、一般にヒト定常領域に融合した非ヒト(例えば齧歯類、例えばマウス)可変ドメインを含むキメラ抗体である。抗体の抗原結合部位が可変領域内に局在化しているため、キメラ抗体は、抗原に対するその結合親和性を維持するが、ヒト定常領域のエフェクター機能を獲得し、それ故に、上記したようなエフェクター機能を行うことができる。キメラ抗体は、典型的に組み換えＤＮＡ法を使用して製造される。抗体をコードするＤＮＡ(例えばｃＤＮＡ)を単離し、慣用法を使用して配列決定する(例えば本発明の抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子、例えば上記配列番号１、２、３、４、５および６をコードするＤＮＡに特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる)。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの典型的供給源である。単離したら、ＤＮＡを発現ベクターに入れ、それを、他の方法で抗体の合成をするための免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えばE. Coli、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞または骨髄腫細胞にトランスフェクトする。ＤＮＡを、ヒトＬ鎖およびＨ鎖のコーディング配列を、対応する非ヒト(例えばマウス)ＨおよびＬ定常領域に蹴ることにより修飾してよい(例えばMorrison; PNAS 81, 6851 (1984)参照)。
【００３１】
第二の方法は、抗体の非ヒト成分が可変領域のヒト化により減らされたヒト化抗体である。ヒト化のための二つの技が人気を博している。第一は、ＣＤＲグラフティングによるヒト化である。ＣＤＲは、抗体のＮ末端近くにループを形成し、そこで、フレームワーク領域により提供される足場に取り付けられた表面を形成する。抗体の抗原結合特異性は、主にトポグラフィーによりおよびそのＣＤＲ表面の化学特性により定義される。これらの特性が、次に個々のＣＤＲの構造により、ＣＤＲの相対的配置(disposition)により、およびＣＤＲを構成する残基の側鎖の性質および配置(disposition)により決定される。免疫原性の大きな減少は、非ヒト(例えばマウス)抗体(‘ドナー’抗体)のＣＤＲのみをヒトフレームワーク(‘アクセプターフレームワーク’)および定常領域にグラフティングすることにより達成できる(Jones et al (1986) Nature 321, 522-525 and Verhoeyen M et al (1988) Science 239, 1534-1536参照)。しかしながら、ＣＤＲグラフティングそれ自体抗原結合特性の完全な保持をもたらさないことがあり、顕著な抗原結合親和性を回復すべきであるならば、ドナー抗体のあるフレームワーク残基(‘逆突然変異’と呼ばれることもある)がヒト化化合物に保存される必要があることが頻繁に見られる(Queen C et al (1989) PNAS 86, 10, 029-10,033, Co, M et al (1991) Nature 351, 501-502参照)。この場合、ヒトフレームワーク(ＦＲ)を提供するために非ヒトドナー抗体に最大の配列相同性を示すヒトＶ領域を、データベースから選択する。ヒトＦＲの選択は、ヒトコンセンサスまたは個々のヒト抗体のいずれかでなし得る。そこで、ＣＤＲ構造を保存するために、ドナー抗体からの必要な重要な残基をヒトアクセプターフレームワークに置き換えて入れる。抗体のコンピュータモデリングをかかる構造的に重要な残基の同定を容易にするために使用し得る(ＷＯ９９／４８５２３参照)。
【００３２】
あるいは、ヒト化を、‘ベニアリング(veneering)’の方法により達成し得る。独特なヒトおよびマウス免疫グロブリン重および軽鎖可変領域の統計分析は、暴露された残基の厳密なパターンがヒト抗体とマウス抗体で異なり、ほとんどの個々の表面位置が少ない数の異なる残基に強い優先傾向を有することが確認されている(Padlan EA, et al; (1991) Mol Immunol 28, 489-498およびPedersen JT et al (1994) J Mol Biol 235; 959-973)。それ故に、通常ヒト抗体で見られるものと異なるフレームワーク領域内の暴露された残基を置き換えることにより、非ヒトＦｖの免疫原性を減らすことが可能である。タンパク質抗原性が表面到達性と相関するため、表面残基の置き換えは、マウス可変領域を、ヒト免疫系に対して‘不可視’とするのに十分であり得る(またMark GE et al (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology vol 113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, pp 105-134も参照のこと)。ヒト化のこの方法は、抗体の表面のみが変えられ、支持残基は影響を受けないままであるため‘ベニアリング’と呼ばれる。
【００３３】
それ故に、本発明の一つの態様において７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２と結合し、７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間の相互作用を阻害できるインタクトな治療用ヒト化抗体が提供される。好ましい本発明の態様において、インタクトな治療用ヒト化抗体は７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２と結合し、７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間の相互作用を阻害する。典型的態様において、インタクトな治療用ヒト抗体は、ＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域を含む。
【００３４】
４.１.１.１.３  二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２個の異なるエピトープに結合特異性を有する抗体である。かかる抗体の製造方法は当分野で既知である。伝統的に、二重特異性抗体の組み換え産生は、２個の免疫グロブリンＨ鎖−Ｌ鎖対の共発現に基づき、この２個のＨ鎖は異なる結合特異性を有する(Millstein et al, Nature 305, 537-539 (1983)、ＷＯ９３／０８８２９およびTraunecker et al, EMBO, 10, 1991, 3655-3659参照)。Ｈ鎖およびＬ鎖の無作為分類のために、１０種の異なる抗体構造の混合物が産生される可能性があり、その中の１個のみが所望の結合特異性を有する。別の方法は、所望の結合特異性を有する可変ドメインの、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域の部分を含む重鎖定常領域への融合である。融合物の少なくとも１個に存在する軽鎖結合に対して必要な部位を含むＣＨ１領域を有することが好ましい。これらの融合物および、望むならば、Ｌ鎖をコードする、ＤＮＡを、別の発現ベクターに入れ、適当な宿主生物に共トランスフェクトする。２個または全３個の鎖のためのコーディング配列を一つの発現ベクターに挿入することを考えることも可能である。一つの好ましい方法において、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有するＨ鎖を一つのアームに有し、そして他のアームに第二の結合特異性を提供するＨ−Ｌ鎖対を有する(ＷＯ９４／０４６９０参照)。またSuresh et al, Methods in Enzymology 121, 210, 1986も参照のこと。
【００３５】
本発明の一つの態様において、二重特異性治療用抗体が提供され、ここで、該抗体の少なくとも一つの結合特異性は７,２５ＤＨＣまたは７,２７ＤＨＣまたは７ＨＣまたは２５ＨＣに対してであり、第二の特異性はＥＢＩ２に対してである。好ましい本発明の態様において、二重特異性治療用抗体は、７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣに対して少なくとも一つの結合特異性およびＥＢＩ２に対して第二の特異性を有し、７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間の相互作用を阻害する。好ましい形態において、二重特異性抗体はＩｇＧ(例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４)アイソタイプの霊長類、例えばヒト抗体である。
【００３６】
４.１.１.１.４  抗体フラグメント
ある本発明の態様において、７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣとＥＢＩ２の間の相互作用を調節(例えば阻害する)治療用抗体フラグメントが提供される。かかるフラグメントは、インタクトおよび／またはヒト化キメラ抗体の機能的抗原結合フラグメント、例えば上記抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ１)２、Ｆｖ、ＳｃＦｖフラグメントである。
【００３７】
伝統的に、かかるフラグメントは、インタクトな抗体の例えばパパイン消化によるタンパク質分解消化により製造されるが(例えばＷＯ９４／２９３４８参照)、直接組み換えによりトランスフォームした宿主細胞から製造してよい。ＳｃＦｖの産生について、Bird et al; (1988) Science, 242, 423-426参照のこと。加えて、抗体フラグメントを、種々の下に記載する操作技術を使用して製造し得る。
【００３８】
ＦＶフラグメントは、Ｆａｂフラグメントよりもその２鎖の相互作用エネルギーが低いように見える。ＶＨドメインおよびＶＬドメインを安定化するために、それらをペプチド(Bird et al, (1988) Science, 242, 423-426, Huston et al, PNAS, 85, 5879-5883)、ジスルフィド架橋(Glockshuber et al, (1990) Biochemistry, 29, 1362-1367)および‘ノブ・イン・ホール’突然変異(Zhu et al (1997), Protein Sci., 6, 781-788)で架橋する必要がある。ＳｃＦｖフラグメントは、当業者に既知の方法により製造できる(Whitlow et al (1991), Methods companion Methods Enzymol, 2, 97-105およびHuston et al (1993) Int Rev Immunol 10, 195-217参照)。ＳｃＦｖは、細菌細胞、例えばE. Coli内で製造してよいが、より好ましくは真核細胞内で製造する。ＳｃＦｖの欠点の一つは、多価結合による結合活性の増加を妨げる生成物の単結合価、および短い半減期である。これらの欠点に打ち勝つ試みは、化学結合により(Adams et al (1993) Can Res 53, 4026-4034 and McCartney et al (1995) Protein Eng, 8, 301-314)または不対Ｃ末端システイン残基含有ＳｃＦｖの本態性部位特異的二量体化により(Kipriyanov et al (1995) Cell. Biophys 26, 187-204参照)、さらなるＣ末端システインを含むＳｃＦｖから製造した二価(ＳｃＦｖ’)２である。あるいは、ＳｃＦｖを、‘二重特異性抗体’を形成するためにペプチドリンカーを３および１２残基に短くすることにより多量体を形成させることができる(Holliger et al PNAS (1993), 90, 6444-6448参照)。リンカーの減少は、さらにＳｃＦＶ三量体(‘トリアボディ’、Kortt et al (1997) Protein Eng, 10, 423-433参照)および四量体(‘テトラボディ’、Le Gall et al (1999) FEBS Lett, 453, 164-168参照)をもたらし得る。二価(bialent)ＳｃＦＶ化合物の構築もまた遺伝子融合と、タンパク質二量体化モチーフを融合させて、‘ミニ抗体’(Pack et al (1992) Biochemistry 31, 1579-1584参照)および‘ミニボディ’(Hu et al (1996), Cancer Res. 56, 3055-3061参照)を形成することによっても達成できる。ＳｃＦｖ−Ｓｃ−Ｆｖタンデム((ＳｃＦＶ)２)もまた、２個のＳｃＦＶ単位を第三のペプチドリンカー(linger)により結合させることによっても製造し得る(Kurucz et al (1995) J Immunol, 154, 4576-4582参照)。二重特異性の二重特異性抗体は、短リンカーにより他方の抗体のＶＬドメインに結合した、一方の抗体由来のＶＨドメインから成る２個の一本鎖融合産物の非共有結合的結合によって製造できる(Kipriyanov et al (1998), Int J Can 77, 763-772)。かかる二重特異性の二重特異性抗体は、上に記載した通り、ジスルフィド架橋または‘ノブ・イン・ホール’突然変異の挿入により、または２個のハイブリッドＳｃＦｖフラグメントがペプチドリンカーを介して結合している一本鎖二重特異性抗体(ＳｃＤｂ)の形成により増強できる(Kontermann et al (1999) J Immunol Methods 226, 179-188参照)。四価二重特異性化合物は、例えばＳｃＦｖフラグメントをヒンジ領域を介してＩｇＧ化合物のＣＨ３ドメインに、またはＦａｂフラグメントに融合させることにより、利用可能である(Coloma et al (1997) Nature Biotechnol, 15, 159-163参照)。あるいは、四価二重特異性化合物は、二重特異性一本鎖二重特異性抗体の融合により製造されている(Alt et al (1999) FEBS Lett 454, 90-94参照)。小さい四価二重特異性化合物は、ＳｃＦｖ−ＳｃＦｖタンデムとヘリックス・ループ・ヘリックス・モチーフを含むリンカー(ＤｉＢｉミニ抗体、Muller et al (1998) FEBS Lett 432, 45-49参照)または４個の抗体可変ドメイン(ＶＨおよびＶＬ)を含む一本鎖化合物のいずれかとの、分子内対形成を妨げる配向での二量体化により形成できる(タンデム二重特異性抗体、Kipriyanov et al, (1999) J Mol Biol 293, 41-56参照)。二重特異性Ｆ９ａｂ’)２フラグメントは、Ｆａｂ’フラグメントの化学結合により、またはロイシンジッパーを介するヘテロ二量体化により製造できる(Shalaby et al (1992) J Exp Med 175, 217-225およびKostelny et al (1992), J Immunol 148 1547-1553参照)。また利用可能なのは単離ＶＨドメインおよびＶＬドメイン(Domantis plc)(ＵＳ６,２４８,５１６；ＵＳ６,２９１,１５８；ＵＳ６,１７２,１９７参照)および単離ＶＨＨドメイン抗体(ナノボディ)である。これらのドメインおよびナノボディは、半減期延長タンパク質、例えばヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)に対する一つの特異性を有する二重特異性であり得る。かかるドメインおよびナノボディは、両方とも本発明のＮＲＧ１タンパク質に対して一特性であり、さらに、半減期延長タンパク質、例えばＨＳＡに対する二重特異性が本発明によりにより特に意図される。
【００３９】
一つの態様において、７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２と結合し、リガンドと受容体の間の相互作用を阻害する、上に記載した治療用抗体フラグメント(例えばＳｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２)または操作された抗体フラグメントが提供される。好ましい本発明の態様において、治療用抗体フラグメントまたは操作された抗体フラグメントは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２と結合し、７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間の相互作用を阻害する。
【００４０】
４.１.１.１.５  ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の態様を形成する。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋法を使用して形成した２個の共有結合的に結合した抗体から成る。例えば、ＵＳ４,６７６,９８０参照。
【００４１】
４.１.１.１.６  他の修飾
抗体のＦｃ領域と種々のＦｃ受容体(ＦｃγＲ)の間の相互作用は、抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)、補体の固定、食作用、および抗体の半減期／クリアランスを含む、抗体のエフェクター機能を仲介すると考えられる。本発明の抗体のＦｃ領域に対する種々の修飾は、所望の特性に依存して行い得る。例えば、別の溶菌性抗体を得るためのＦｃ領域の特異的突然変異、非溶菌性はＥＰ０６２９２４０Ｂ１およびＥＰ０３０７４３４Ｂ２に詳述されており、または血清半減期を延長するために抗体にサルベージ受容体結合エピトープを挿入し得る(ＵＳ５,７３９,２７７参照)。現在５種の認識されているヒトＦｃγ、ＦｃγＲ(Ｉ)、ＦＣγＲIIｂ、ＦｃγＲIIIａおよび新生児ＦｃＲｎが存在する。Shields et al, (2001) J Biol Chem 276, 6591-6604は、共通のＩｇＧ１残基の組が全てのＦｃγＲの結合に関与し、一方ＦＣγＲIIおよびＦｃγＲIIIはこの共通の組の外の異なる部位を利用することを証明した。ＩｇＧ１残基の一群は、アラニン：Ｐｒｏ−２３８、Ａｓｐ−２６５、Ａｓｐ−２７０、Ａｓｎ−２９７およびＰｒｏ−２３９に改変したとき、全ＦｃγＲへの結合が減少する。全てＩｇＧ  ＣＨ２ドメイン内であり、ＣＨ１とＣＨ２を結ぶヒンジ周辺に群発する。一方ＦｃγＲＩは結合のためにＩｇＧ１残基の共通の組、ＦｃγＲIIおよびＦｃγＲIII(例えばＧｌｕ−２９３)しか使用しない。いくつかの変異体はＦｃγＲIIまたはＦｃγＲIIIへの結合が改善されているが、他の受容体への結合には影響しなかった(例えばＳｅｒ−２６７ＡｌａはＦｃγＲIIへの結合が改善されているが、ＦｃγＲIIIへの結合は影響を受けなかった)。他の変異体では、ＤｃγＲIIまたはＦｃγＲIIIへの結合が改善され、他の受容体への結合は減少した(例えばＳｅｒ２９８ＡｌａはＦｃγＲIIIへの結合が改善し、ＦｃγＲIIへの結合が減少した)。ＦｃγＲIIIａについて、最良の結合ＩｇＧ１変異体がＳｅｒ−２９８、Ｇｌｕ−３３３およびＬｓ−３３４でのアラニン置換と組み合わせた。新生児ＦｃＲｎ受容体は抗体クリアランスおよび組織を通過する経細胞輸送の両方に関与すると考えられる(Junghans RP (1997) Immunol Res 16, 2957およびGhetie et al (2000) Annu Rev Immunol 18, 739-766参照)。ヒトＦｃＲｎと直接相互作用することが決定されたヒトＩｇＧ１残基は、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４およびＨｉｓ４３５を含んだ。この章で記載するこれらのいずれかの位置でのスイッチは、本発明の抗体の血清半減期の延長および／またはエフェクター特性改変が可能であり、およびそれ故に本発明の態様を形成する。
【００４２】
他の修飾は、本発明の抗体の糖鎖付加変異体を含む。抗体の定常領域中の保存位置での糖鎖付加は、抗体機能、特に上に記載したようなエフェクター機能に顕著に影響することが知られている(例えば、Boyd et al (1996), Mol Immunol 32, 1311-1318参照)。１個以上の糖鎖が付加、置換、欠失または修飾された本発明の治療用抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする糖鎖(carbonhydrate moiety)付加変異体が意図される。アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−スレオニンモチーフの挿入は、糖鎖(carbonhydrate moiety)が酵素結合する可能性のある端を作り、それ故に抗体の糖鎖付加を操作するために使用し得る。Raju et al (2001) Biochemistry 40, 8868-8876において、ＴＮＦＲ−ＩｇＧイムノアドヘシンの末端シアル酸付加(sialyation)が、ベータ−１,４−ガラクトース転移酵素(galactrosyltransferace)および／またはアルファ,２,３−シアリルトランスフェラーゼを使用した再ガラクトシル化および／または再シアル酸付加の過程を通して増加した。末端シアル酸付加の増加は、免疫グロブリンの半減期を延長すると考えられる。抗体は、ほとんどの糖タンパク質と共通して、典型的にグリコフォームの混合物として産生する。この混合物は、抗体が真核、特に哺乳動物細胞で産生されたとき、特に明らかである。規定されたグリコフォームを製造するための種々の方法が開発されている(Zhang et al, Science (2004), 303, 371; Sears et al, Science (2001), 291, 2344; Wacker et al (2002), Science 298, 1790; Davis et al (2002), Chem Rev 102, 579; Hang et al (2001), Acc Chem Res 34, 727)。それ故に本発明は、規定の数(例えば７個以下、例えば５個以下、例えば２個または２個)のグリコフォームを含む、ここに記載した多数の(plurity)治療用(モノクローナル)抗体(これはＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１であり得る)または該抗体またはその抗原結合フラグメントを意図する。
【００４３】
さらに本発明の態様は、非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンに結合した本発明の治療用抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。タンパク質のＰＥＧへの結合は、タンパク質の半減期延長、ならびにタンパク質の抗原性および免疫原性減少のための確立された技術である。異なる分子量およびスタイル(直線状または分枝状)でのペグ化の使用は、インタクトな抗体ならびにＦａｂ’フラグメントで研究されている(Koumenis IL et al (2000) Int J Pharmaceut 198; 83-95参照)。
【００４４】
４.２  アドネクチン類  −  化合物治療学
アドネクチン足場は、フィブロネクチンIII型ドメイン(例えば、フィブロネクチンIII型の第１０モジュール(１０  Ｆｎ３ドメイン))に基づく。フィブロネクチンIII型ドメインは、２個のベータ・シートの間に分散する７個または８個のベータ・ストランドを有し、ベータ・シート自体、互いに包装されてタンパク質のコアを形成し、さらにベータ・ストランドを互いに接続し、溶媒曝露であるループ(ＣＤＲに類似)を含む。ベータ・シートサンドイッチの各端に少なくとも３個のかかるループが存在し、かかる端は、ベータ・ストランドの方向に垂直なタンパク質の境界である(ＵＳ６,８１８,４１８)。
【００４５】
これらのフィブロネクチンを利用した足場は免疫グロブリンではないが、全体的折りたたみは、重鎖の可変領域である最小機能的抗体フラグメントの折りたたみと密接に関係し、当該可変領域はラクダおよびラマＩｇＧにおける全体的抗原認識単位を構成する。この構造のため、非免疫グロブリン抗体は抗体と性質および親和性が類似する抗原結合特性を摸倣する。これらの足場は、インビボでの抗体の親和性成熟に似たインビトロでのループランダム化および混合戦略に使用できる。これらのフィブロネクチンを利用した化合物は、化合物のループ領域が標準クローニング技術を使用して本発明のＣＤＲに置き換えることができる足場として使用できる。従って、ある態様において、７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２と結合し、リガンドと受容体の間の相互作用を阻害するアドネクチン化合物が提供される。好ましい態様において、アドネクチン化合物は７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２と結合し、リガンドと受容体の間の相互作用を阻害する。
【００４６】
４.３  アンキリン−  Molecular Partners
この技術は、異なる標的に結合するために使用できる可変領域を担持するための足場としての、アンキリン由来反復モジュールを有するタンパク質の使用に基づく。アンキリン反復モジュールは、２個の逆平行α螺旋およびβターンから成る３３アミノ酸ポリペプチドである。可変領域の結合は、リボソームディスプレイを使用してほとんど最適化される。従って、ある態様において、７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２と結合し、リガンドと受容体の間の相互作用を阻害するアンキリン化合物が提供される。好ましい態様において、アドネクチン化合物は７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２と結合し、リガンドと受容体の間の相互作用を阻害する。
【００４７】
４.４  マキシボディ／アビマー−  Avidia
アビマーは、天然Ａドメイン含有タンパク質、例えばＬＲＰ−１に由来する。これらのドメインは、本来、タンパク質−タンパク質相互作用に使用され、ヒトでは２５０種を超えるタンパク質が、Ａドメインに基づく構造である。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して結合した多くの異なる“Ａドメイン”モノマー(２−１０)から成る。アビマーは、例えば、ＵＳ２００４０１７５７５６；ＵＳ２００５００５３９７３；ＵＳ２００５００４８５１２；およびＵＳ２００６０００８８４４に記載された方法を使用して、標的抗原に結合できるように製造できる。従って、ある態様において、７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２と結合し、リガンドと受容体の間の相互作用を阻害するマキシボディ化合物が提供される。好ましい態様において、マキシボディ化合物は７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２と結合し、リガンドと受容体の間の相互作用を阻害する。
【００４８】
４.５  プロテインＡ  −  アフィボディ
アフィボディ(登録商標)親和性リガンドは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの１個の足場に基づく３個のヘリックスバンドルから成る、小さく、単純なタンパク質である。プロテインＡは、細菌である黄色ブドウ球菌由来の表面タンパク質である。この足場ドメインは５８アミノ酸から成り、そのうち１３個は、多くのリガンド変異体を含むアフィボディ(登録商標)ライブラリーを作るために無作為化されている(例えば、ＵＳ５,８３１,０１２参照)。アフィボディ(登録商標)化合物は抗体を摸倣し、１５０kDaである抗体の分子量に対して、６kDaの分子量である。サイズが小さいにもかかわらず、アフィボディ(登録商標)化合物の結合部位は抗体の結合部位に類似する。従って、ある態様において、７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２と結合し、リガンドと受容体の間の相互作用を阻害するプロテインＡ−アフィボディ化合物が提供される。好ましい態様において、プロテインＡ−アフィボディ化合物は７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２と結合し、リガンドと受容体の間の相互作用を阻害する。
【００４９】
４.６  アンチカリン類−  Pieris
アンチカリン類(登録商標)は、Pieris ProteoLab AG社が開発した製品である。それらは、通常化学感受性または不溶性化合物の生理学的輸送または貯蔵に関与する、小さく、頑強なタンパク質の広い群であるリポカリン類に由来する。数種の天然リポカリン類はヒト組織または体液に存在する。
【００５０】
タンパク質構造は免疫グロブリン類を想起させ、強固なフレームワークの頂上に高頻度可変ループを有する。しかしながら、抗体またはその組み換えフラグメントとは対照的に、リポカリン類は、１６０〜１８０アミノ酸残基を有する単ポリペプチド鎖から成り、単免疫グロブリンドメインよりわずかに大きいだけである。
【００５１】
結合ポケットを構成する４個のループの組が顕著な構造柔軟性を示し、種々の側鎖に耐容性である。この結合部位は、それ故に異なる形の所定の標的化合物を、高親和性および特異性で認識するために、独自の工程で再構成される。
【００５２】
リポカリンファミリーの一タンパク質であるオオモンシロチョウ(Pieris Brassicae)のビリン結合タンパク質(ＢＢＰ)が、４個のループの組の変異誘発によるアンチカリン類の開発に使用されている。“アンチカリン類”を記載する特許の一例は、ＰＣＴ出願ＷＯ１９９９１６８７３である。
【００５３】
従って、ある態様において、７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２と結合し、リガンドと受容体の間の相互作用を阻害するアンチカリン化合物が提供される。好ましい態様において、アンチカリン化合物は７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２と結合し、リガンドと受容体の間の相互作用を阻害する。
【００５４】
４.７  アフィリン−  Scil Proteins
アフィリンＴＭ化合物は、タンパク質および小化合物に対する特異的親和性について設計された小非免疫グロブリンタンパク質である。新しいアフィリンＴＭ化合物は、各々異なるヒト由来足場タンパク質に基づく２個のライブラリーから非常に速く検索できる。アフィリンＴＭ化合物は、免疫グロブリンタンパク質に対していかなる構造相同性も示さない。Scil Proteinsは２個のアフィリンＴＭ足場を用い、その一方は、ヒト構造的眼水晶体タンパク質であるガンマクリスタリンであり、他方は“ユビキチン”スーパーファミリータンパク質である。両方のヒト足場とも非常に小さく、高い温度安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤にほとんど耐性である。この高い安定性は、大部分タンパク質の伸長したベータ・シート構造による。ガンマクリスタリン由来タンパク質の例はＷＯ２００１０４１４４に記載され、“ユビキチン様”タンパク質の例はＷＯ２００４１０６３６８に記載されている。従って、ある態様において、７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２と結合し、リガンドと受容体の間の相互作用を阻害するアフィリン化合物が提供される。好ましい態様において、アフィリン化合物は７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣおよび／またはＥＢＩ２と結合し、リガンドと受容体の間の相互作用を阻害する。
【００５５】
４.７.１  他の治療用モダリティ
先に記載した通り、本発明の他の治療用モダリティは、タンパク質発現前にその標的に対する効果を発揮するＥＢＩ２のモジュレーター(特に阻害剤)を含む。例は、(ａ)ＥＢＩ２の一部(特にＮＲＧ１β１)遺伝子と安定な三本鎖を形成できる、または(ｂ)生理学的条件下で、ＥＢＩ２遺伝子のｍＲＮＡ転写物の一部と安定な二本鎖を形成できる配列を含む(または基本的にこれから構成される)アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。他の例は、“ＲＮＡ干渉”の減少に関与できる分子を含む。ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)は、特定のタンパク質の産生を特異的に阻害するときに特に有用である。理論に縛られることを望まないが、Waterhouse et al. (1998)は、ｄｓＲＮＡ(二本鎖ＲＮＡ)をタンパク質産生の減少のために使用できる機構についてのモデルを提供している。好都合に、ｄｓＲＮＡは、組み換えベクターまたは宿主細胞において単プロモーターから製造でき、そこで、センス配列およびアンチセンス配列の横に無関係の配列があり、それがセンス配列およびアンチセンス配列がハイブリダイズして、該無関係の配列とｄｓＲＮＡ分子を形成し、ループ構造を形成することを可能にする。本発明のための好適なｄｓＲＮＡ分子の設計および製造は、特にWaterhouse et al. (1998)、Smith et al. (2000)、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ９９／５３０５０、ＷＯ９９／４９０２９、およびＷＯ０１／３４８１５を考慮して、当業者の能力の範囲内である。
【００５６】
一例として、不活性化する標的遺伝子と相同性を有する少なくとも部分的に二本鎖のＲＮＡ生成物の合成を指向するＤＮＡを挿入する。
【００５７】
ＤＮＡは、それ故に、ＲＮＡに転写されたとき、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ領域を形成できるセンス配列およびアンチセンス配列の両方を含む。好ましい態様において、センス配列およびアンチセンス配列は、ＲＮＡに転写されたとき、切り出されるイントロンを含むスペーサー領域を含む。この配置は高い効率で遺伝子サイレンシングをもたらすことが示されている。二本鎖領域は、１個または２個のＤＮＡ領域から転写された１個または２個のＲＮＡ分子を含み得る。二本鎖分子の存在は、標的哺乳動物遺伝子からの二本鎖ＲＮＡおよびまた相同ＲＮＡ転写物の両方を破壊し、標的遺伝子の活性を効率的に減少させ、または無くす内在性哺乳動物システムからの応答の引き金を引くと考えられる。
【００５８】
ハイブリダイズするセンス配列およびアンチセンス配列の長さは、各々少なくとも１９連続ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０または５０ヌクレオチド、およびより好ましくは少なくとも１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドでなければならない。全体的遺伝子転写物に対応する完全長配列を使用し得る。長さは、最も好ましくは１００−２０００ヌクレオチドである。標的転写物に対するセンス配列およびアンチセンス配列の同一性の程度は少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％およびより好ましくは９５−１００％でなければならない。ＲＮＡ分子は、当然該分子の安定化のために機能し得る無関係の配列を含み得る。ＲＮＡ分子はＲＮＡポリメラーゼIIまたはＲＮＡポリメラーゼＨＩプロモーターの制御下に発現し得る。後者の例はｔＲＮＡまたはｓｎＲＮＡプロモーターを含む。
【００５９】
好ましい低分子干渉ＲＮＡ(“ｓｉＲＮＡ”)分子は、標的ｍＲＮＡの約１９−２１連続ヌクレオチドと同一のヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ｓｉＲＮＡ配列はジヌクレオチドＡＡで始まり、約３０−７０％(好ましくは、３０−６０％、より好ましくは４０−６０％およびより好ましくは約４５％−５５％)のＧＣ含量を有し、そして、例えば標準ＢＬＡＳＴ探索で測定して、それを挿入する哺乳動物のゲノムの標的以外のヌクレオチド配列と高い同一性パーセンテージを有さない。
【００６０】
マイクロＲＮＡ制御は、慣用のＲＮＡｉ／ＰＴＧＳから逸脱し、遺伝子制御に対して発展されたＲＮＡサイレンシング経路の明確に特化された派生形態である。
【００６１】
マイクロＲＮＡは、特徴的逆方向反復に統合された遺伝子様エレメントで符号化される小ＲＮＡの特異的クラスである。転写されたとき、マイクロＲＮＡ遺伝子はステムループ前駆体ＲＮＡを生じ、そこからマイクロＲＮＡが処理される。マイクロＲＮＡは典型的に約２１ヌクレオチド長である。放出されたｍｉＲＮＡは、配列−特異的遺伝子抑制するArgonauteタンパク質の特定のサブセットを含むＲＩＳＣ様複合体に包含される(例えば、Millar and Waterhouse, 2005; Pasquinelli et al. 2005; Almeida and Allshire, 2005参照)。
【００６２】
４.８  産生方法
本発明の治療用タンパク質、および特に抗体はポリクローナル集団として製造してよいが、より好ましくはモノクローナル集団(すなわち特異的抗原結合部位に対する同一な抗体の実質的に均質な集団)として製造する。当然、当業者には集団が１個を超える抗体を意味することは明らかである。本発明の抗体はトランスジェニック生物、例えばヤギ(Pollock et al (1999), J. Immunol. Methods 231 :147-157参照)、ニワトリ(Morrow KJJ (2000) Genet. Eng. News 20:1-55参照)、マウス(Pollock et al参照)または植物(Doran PM, (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11, 199-204, Ma JK-C (1998), Nat.Med. 4; 601-606, Baez J et. al, BioPharm (2000) 13:50-54, Stoger E et al; (2000) Plant Mol. Biol. 42:583-590参照)で製造し得る。抗体を化学合成で製造してもよい。しかしながら、抗体および他の本発明の治療用タンパク質は、典型的に当業者に周知の組み換え細胞培養技術を使用して製造する。抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、複製可能ベクター、例えばプラスミドにさらなるクローニング(増幅)または発現のためにクローニングする。一つの有用な発現システムは、特に宿主細胞がＣＨＯまたはＮＳＯ(下記参照)であるときの、グルタメート・シンテターゼシステム(例えばLonza Biologiesにより販売)である。抗体をコードするポリヌクレオチドは、慣用の方法(例えばオリゴヌクレオチドプローブ)を使用して、容易に単離および配列決定される。使用し得るベクターはプラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ミニ染色体であり、プラスミドが典型的な態様である。一般にかかるベクターはさらに発現を容易にするために、軽および／または重鎖ポリヌクレオチドに実行可能(operably)に結合したシグナル配列、複製起点、１個以上のマーカー遺伝子、エンハンサー・エレメント、プロモーターおよび転写終止配列を含む。軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチドを別のベクターに挿入し、同じ宿主細胞にトランスフェクトするか、望むならば重鎖および軽鎖の両方を宿主細胞のトンラスフェクションのための同一ベクターに挿入できる。それ故に本発明の一面に従い、本発明の治療用抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする軽および／または重鎖をコードするベクターの構築方法であって、ベクターに、本発明の治療用抗体の軽鎖および／または重鎖のいずれかをコードするポリヌクレオチドを挿入する方法が提供される。
【００６３】
４.８.１  シグナル配列
本発明の抗体は、成熟タンパク質のＮ末端に特異的開裂部位を有する異種シグナル配列との融合タンパク質として製造してよい。シグナル配列は宿主細胞により認識され、処理されなければならない。原核宿主細胞について、シグナル配列はアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定性エンテロトキシンＩｌリーダーである。酵母分泌のために、シグナル配列は酵母インベルターゼ・リーダー、[アルファ]因子リーダーまたは酸ホスファターゼ・リーダーである(例えばＷＯ９０／１３６４６参照)。哺乳動物細胞系では、ウイルス分泌性リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルおよび天然免疫グロブリンシグナル配列が利用可能である。典型的に、シグナル配列を本発明の抗体をコードするＤＮＡのリーディングフレームにライゲートする。
【００６４】
４.８.２  複製起点
複製起点は当分野で既知であり、ｐＢＲ３２２がほとんどのグラム陰性細菌に好適であり、２μ  プラスミドがほとんどの酵母に好適であり、種々のウイルス起源、例えばＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶがほとんどの哺乳動物細胞に好適である。一般に、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターには必要ないが、初期プロモーターを含むためＳＶ４０を使用し得る。
【００６５】
４.８.３  選択マーカー
典型的選択遺伝子は、(ａ)抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに対する抵抗性を付与するまたは(ｂ)栄養要求性欠損を補うまたは複合培地から利用できない栄養素を供給するタンパク質をコードする。選択スキームは宿主細胞の増殖停止を含み得る。本発明の治療用抗体をコードする遺伝子での形質転換に成功した細胞は、例えば選択マーカーにより付与された薬剤抵抗性のために生存する。他の例は、形質転換体をメトトレキサート存在下で培養する、いわゆるＤＨＦＲ選択マーカーである。典型的な態様において、細胞を、目的の外来性遺伝子のコピー数を増やすためにメトトレキサート存在下で、その濃度を高めながら培養する。ＣＨＯ細胞が、ＤＨＦＲ選択のために特に有用な細胞株である。さらなる例は、グルタメート・シンテターゼ発現システム(Lonza Biologies)である。酵母で使用するための適当な選択遺伝子はｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb et al Nature 282, 38, 1979参照)。
【００６６】
４.８.４  プロモーター
本発明の抗体を発現するための好適なプロモーターを、抗体をコードするＤＮＡ／ポリヌクレオチドに実施可能なように結合する。原核宿主用プロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、ベータ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーターシステム、アルカリホスファターゼ、トリプトファンおよびハイブリッドプロモーター、例えばＴａｃを含む。酵母細胞での発現に好適なプロモーターは、３−ホスホグリセラートキナーゼまたは他の解糖酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド(glyceralderhyde)３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ビルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセラートムターゼおよびグルコキナーゼを含む。誘導型酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソサイトクロームＣ、酸ホスファターゼ、メタロチオネインおよび窒素代謝またはマルトース／ガラクトース利用を担う酵素を含む。
【００６７】
哺乳動物細胞系での発現のためのプロモーターは、ウイルスプロモーター、例えばポリオーマ、鶏痘およびアデノウイルス(例えばアデノウイルス２)、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス(特に最初期遺伝子プロモーター)、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、アクチン、ラウス肉腫ウイルス(ＲＳＶ)プロモーターおよび初期または後期サルウイルス４０を含む。当然プロモーターの選択は、発現に使用する宿主細胞との好適な適合性に基づく。
【００６８】
４.８.５  エンハンサー・エレメント
例えば高級真核細胞での発現のために、適当なとき、ベクター内でプロモーター・エレメントに実施可能なように結合したエンハンサー・エレメントを使用し得る。好適な哺乳動物エンハンサー配列は、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテインおよびインスリンからのエンハンサー・エレメントを含む。あるいは、真核細胞ウイルス、例えばＳＶ４０エンハンサー(ｂｐ１００−２７０で)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、polymaエンハンサー、バキュロウイルスエンハンサーまたはマウスｌｇＧ２ａ座位(ＷＯ０４／００９８２３参照)からのエンハンサー・エレメントを使用し得る。エンハンサーは、好ましくはプロモーターの上流部位でベクターに存在する。
【００６９】
４.８.６  宿主細胞
本発明の抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、原核、酵母または高級真核細胞である。好適な原核細胞は、真正細菌、例えば腸内細菌科、例えばエシェリキア属、例えばE. Coli(例えばATCC 31, 446; 31, 537; 27,325)、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア、例えば霊菌および赤痢菌ならびに桿菌、例えば枯草菌およびバチルス・リケニフォルミス(ＤＤ２６６７１０参照)、シュードモナス、例えば緑膿菌およびストレプトマイセスを含む。酵母宿主細胞の中で、出芽酵母、分裂酵母、クリベロマイセス(例えばATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500)、ヤロウイア属(ＥＰ４０２,２２６)、ピキア・パストリス(ＥＰ１８３,０７０、Peng et al J. Biotechnol. 108 (2004) 185-192も参照)、カンジダ、トリコデルマ・リーゼイ(Thchoderma reesia)(ＥＰ２４４,２３４Ｊ、ペニシリン、トリコデルマ・リーゼイ(Thchoderma reesia)およびアスペルギルス宿主、例えば偽巣性コウジ菌およびクロコウジカビも意図される。
【００７０】
原核および酵母宿主細胞が本発明により特に意図されるが、好ましくは、しかしながら、本発明の宿主細胞は高級真核細胞である。好適な高級真核宿主細胞は哺乳動物細胞、例えばＣＯＳ−１(ATCC No. CRL 1650)、ＣＯＳ−７(ATCC CRL 1651)、ヒト胚腎臓系２９３、ベビーハムスター腎臓細胞(ＢＨＫ)(ATCC CRL.1632)、ＢＨＫ５７０(ATCC NO:CRL 10314)、２９３(ATCC NO. CRL 1573)、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ(例えばＣＨＯ−Ｋ１、ATCC NO:CCL 61、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞株、例えばＤＧ４４(Urlaub et al, (1986) Somatic Cell Mol. Genet. 12, 555-556参照)、特に懸濁液培養に適するＣＨＯ細胞株、マウスセルトリ細胞、サル腎臓細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞(ATCC CRL-1587)、ＨＥＬＡ細胞、イヌ腎臓細胞(ATCC CCL 34)、ヒト肺細胞(ATCC CCL 75)、Ｈｅｐ  Ｇ２および骨髄腫またはリンパ腫細胞、例えばＮＳＯ(ＵＳ５,８０７,７１５参照)、Ｓｐ２／０、ＹＯである。それ故に本発明の一つの態様において、ここに記載する治療用抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖および／または軽鎖をコードするベクターを含む、安定に形質転換された宿主細胞を含む。好ましくはかかる宿主細胞は、軽鎖をコードする第一ベクターおよび重鎖をコードする第二ベクターを含む。
【００７１】
４.６.１  細菌発酵
細菌システムを使用して、上記の非免疫グロブリン治療用タンパク質を発現し得る。細菌システムはまた、抗体フラグメントの発現に特に適する。かかるフラグメントは細胞内、または周辺質内に局在化する。不溶性周辺質タンパク質を当業者に既知の方法に従い抽出し、再折りたたみして、活性タンパク質を形成できる(Sanchez et al (1999) J. Biotechnol. 72, 13-20およびCu pit PM et al (1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277参照)。
【００７２】
４.８.７  細胞培養方法
本発明の治療用抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするベクターで形質転換した宿主細胞を、当業者に既知の任意の方法により培養し得る。宿主細胞を、スピナ・フラスコ、ローラー・ボトルまたは中空繊維システムで培養できるが、大規模産生には、特に懸濁液培養のために撹拌タンク・リアクターを使用するのが好ましい。好ましくは撹拌タンカーは、例えばスパージャ、整流装置または低剪断羽根車を使用した通気に適する。バブルカラムおよび空輸リアクターに関して、空気または酸素バブルでの通気を使用し得る。宿主細胞を無血清培地で培養するとき、通気過程の結果としての細胞損傷を防止するために、細胞保護剤、例えばpluronic F-68を培地に添加するのが好ましい。宿主細胞特性によって、マイクロキャリアーを足場依存性細胞株のための増殖支持体として使用してよく、または細胞を懸濁液培養に適合させ得る(これが典型的)。宿主細胞、特に無脊椎動物の培養において、宿主細胞を種々の運用モードで、例えば流加、反復バッチ処理(Drapeau et al (1994) cytotechnology 15:103-109参照)、拡張バッチプロセスまたは灌流培養を使用し得る。組み換えによりトランスフォームした哺乳動物宿主細胞を血清、例えばウシ胎児血清(ＦＣＳ)含有培地で培養できるが、かかる宿主細胞をKeen et al (1995) Cytotechnology 17:153-163に記載されたような合成無血清培地、または市販の培地、例えばProCHO-CDMまたはUltraCHO(TM)(Cambrex NJ, USA)で培養するのが好ましく、必要であれば、エネルギー源、例えばグルコースおよび合成増殖因子、例えば組み換えインスリンを添加する。宿主細胞の無血清培養は、細胞が無血清条件に適合していることが必要であり得る。一つの適合方法は、かかる宿主細胞を血清含有培地で培養し、宿主細胞が無血清条件への適合を学習するようにその培養培地の８０％を繰り返し無血清培地に交換することである(例えばScharfenberg K et al (1995) in Animal Cell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery E.G. et al eds), pp619-623, Kluwer Academic publishers参照)。
【００７３】
培地に分泌された本発明の抗体または他の治療用タンパク質を、種々の技術を使用して、回収し、意図する使用に好適な純度まで精製し得る。例えばヒト患者の処置への本発明の治療用抗体の使用は、典型的に少なくとも９５％純度、さらに典型的に９８％または９９％以上の純度が要求される(粗培養培地と比較して)。第一の例において、培養培地からの細胞残骸を、典型的に遠心分離により除去し、続いて上清を例えば精密濾過法、限外濾過および／またはデプス濾過を使用して浄化する。種々の他の技術、例えば透析およびゲル電気泳動およびクロマトグラフィー技術、例えばヒドロキシアパタイト(ＨＡ)、親和性クロマトグラフィー(場合により親和性タグ付加システム、例えばポリヒスチジンを含む)および／または疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ、ＵＳ５,４２９,７４６参照)が利用可能である。一つの態様において、本発明の抗体を、種々の浄化工程後、プロテインＡまたはＧ親和性クロマトグラフィー、さらにクロマトグラフィー工程、例えばイオン交換および／またはＨＡクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換、分子ふるいクロマトグラフィーおよび硫酸アンモニウム沈殿を使用して補足する。典型的に、種々のウイルス除去工程も用いる(例えば例えばＤＶ−２０フィルターを使用したナノ濾過)。これらの種々の工程後、少なくとも７５mg／ml以上、例えば１００mg／ml以上の本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む精製した(好ましくはモノクローナル)調節物が提供され、それ故に本発明の態様を形成する。好適にはかかる調節物は、実質的に本発明の抗体凝集形態がない。
【００７４】
４.９  スクリーニング方法
他の態様において、７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間の相互作用のモジュレーターを同定するための方法が提供される。かかる方法は、一般に７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣを候補化合物の存在下で接触させ、候補化合物非存在下の同じ実験と比較したリガンド７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間の相互作用の調節(例えば阻害)を観察することを含む。好ましい本発明の態様において、リガンドは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣである。阻害特性を示す候補化合物の構造をさらに修飾して、臨床的にそれを必要とするヒト患者のために製剤および投与する前に、その標的に対するＩＣ５０を改善してよく、そして／または毒性プロファイルを改善してよい。
【００７５】
４.１０  医薬組成物
本発明は、薬学的に許容される担体と製剤された治療用タンパク質または低分子量化学物質を含む医薬組成物を提供する。組成物は、さらに、以下に記載するヒト疾患または障害の処置または予防に好適な他の治療剤を含んでよい。薬学的に担体は組成物を増強または安定化し、または組成物の製剤を容易にする。薬学的に許容される担体は生理学的に適合性の溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。
【００７６】
本発明の医薬組成物は、当分野で既知の種々の方法で投与できる。投与経路および／または様式は、所望の結果によって異なる。投与が静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下であるのが好ましく、または標的部位の近位に投与する。薬学的に許容される担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、脊髄または上皮投与(例えば、注射または輸液による)に適さなければならない。投与経路によって、活性化合物(特に低分子量化学物質)をコーティングして、化合物を不活性化し得る酸および他の天然条件の影響から化合物を保護し得る。
【００７７】
組成物は無菌であり、流体でなければならない。適当な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンの使用、分散の場合必要な粒子径の維持および界面活性剤の使用により維持できる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、ポリアルコール類、例えばマンニトールまたはソルビトール、および塩化ナトリウムを組成物に包含させるのが好ましい。注射可能組成物の長時間吸収は、吸収を遅延する薬剤、例えば、アルミニウムモノステアレートまたはゼラチンを組成物に包含することにより達成できる。
【００７８】
本発明の医薬組成物は当業者に周知であり、日常的に実施されている方法に従い、製造できる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; and Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978参照。医薬組成物は、好ましくはＧＭＰ条件下で製造する。典型的に、ここに記載するＮＲＧ１(例えばＮＲＧ１β１)のモジュレーター、例えばＮＲＧ１β１抗体の治療有効量または効果的量を本発明の医薬組成物に用いる。典型的にそれらを当業者に既知の慣用法により、薬学的に許容される投与形態に製剤する。投与レジメンを所望の最適応答(例えば、治療用応答)を提供するために調節する。例えば、単ボラスを投与してよく、数回に分けた分割投与量を経時的に投与してよく、または治療状況の緊急度によって示されるように投与量を比例的に減少または増加してよい。投与の容易さおよび投与量の均一さのために、非経腸組成物を投与単位形態に製剤するのが特に有利である。ここで使用する投与単位形態は、処置する対象への均一投与に適した物理的に分かれた単位である；各単位は、必要な医薬担体と共に、所望の治療効果を生じることが計算された予定量の活性化合物を含む。
【００７９】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与レベルは、患者に有害ではなく、特定の患者に所望の治療用応答を達成するのに有効な活性成分の量であり、組成物、および投与方式によって変わる。選択する投与レベルは、用いる特定の本発明の組成物、またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排泄速度、処置期間、用いる特定の組成物と組合せて使用する他の薬剤、化合物および／または物質、患者の年齢、性別、体重、状態、全体的健康および薬歴、および類似の因子を含む種々の薬物動態学的因子による。
【００８０】
医師または獣医師は、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルより少ない医薬組成物中の本発明の抗体を用いて投与を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加できる。一般に、ここに記載するアレルギー性炎症性障害の処置のための、本発明の組成物の有効量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるのか動物であるのか、他の投与されている医薬、および処置が予防であるのか、治療であるのかを含む、多くの種々の因子により異なる。処置投与量は、安全性および効果を最適化するために力価測定する必要がある。抗体の投与のために、約０.０００１〜１００mg／kg、より一般的に０.０１〜５mg／kgの宿主体重の範囲である。例えば投与量は、１mg／kg体重または１０mg／kg体重または１〜１０mg／kgの範囲内であり得る。例示的処置レジメンは、２週間に１回または１ヶ月に１回または３〜６ヶ月に１回の投与を必要とする。
【００８１】
抗体および他のタンパク質治療剤は、通常様々な機会に投与される。一投与の間の間隔は、週、月または年であり得る。間隔は、患者の治療用タンパク質の血液濃度の測定により決定されるように不定期でもあり得る。ある方法において、投与量を、１−１０００μg／mlの血漿抗体濃度となるように調節し、ある方法では２５−３００μg／mlである。あるいは、抗体または他のタンパク質治療剤を徐放製剤として投与でき、その場合必要な投与頻度が少ない。投与量および頻度は、患者中の抗体または他のタンパク質治療剤の半減期によって変わる。一般に、ヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体より半減期が長い。投与量および投与頻度は、処置が予防であるのかまたは治療であるのかによって変わり得る。予防適用において、相対的に低用量を、相対的に長い間隔で長時間にわたり投与する。ある患者は、存命中は処置を受け続ける。治療適用において、相対的に短い間隔での相対的に高投与量が、疾患の進行が抑制され、または止まるまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的なまたは完全な改善を示すまで必要であることがある。その後、患者に予防レジメで投与できる。
【００８２】
それ故に本発明は、７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間の相互作用のモジュレーターを薬学的に許容される担体または希釈剤と共に含む、医薬組成物に関する。好ましい態様において、医薬組成物は、７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間の相互作用のモジュレーターを含む。典型的に、かかるモジュレーターは、上に記載した阻害剤である。
【００８３】
４.１１  臨床使用
７,２５ＤＨＣおよび／または７,２７ＤＨＣおよび／または７ＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間の相互作用の、モジュレーター、特に阻害剤、好ましくは７ａ,２５ＤＨＣおよび／または７ｂ,２５ＤＨＣおよび／または７ａ,２７ＤＨＣおよび／または７ｂ,２７ＤＨＣおよび／または７ａＨＣおよび／または７ｂＨＣおよび／または２５ＨＣとＥＢＩ２の間の相互作用の阻害剤を含む本発明の医薬組成物は、この相互作用の調節に応答する疾患または障害に使用し得る。かかる疾患の例は、高血圧、狭心症、アテローム性動脈硬化症、鬱血性心不全、卒中、肥満、代謝症候群、自己免疫性疾患、例えば関節炎、(特にリウマチ性関節炎)、多発性硬化症、および狼瘡、ならびにアトピー状態、例えば喘息およびアトピー性皮膚炎、ＣＯＰＤ、肺高血圧、ウイルス感染症、例えばＥＢＶ、ＨＩＶ、肝炎(ＡまたはＣ)、脂肪肝疾患、肝硬変(特にアルコール誘発肝硬変)、癌、異脂肪血症、糖尿病(特にII型)、移植拒絶反応、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、慢性炎症の疾患、アレルギー、乾癬、嚢胞性線維症、高コレステロール血症、腎臓疾患を含む。
【００８４】
５. 例示
本発明を、ここで例示のみの目的で記載する。
図面は次の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】野生型ＣＨＯ−Ａｅｑに対するｈＥＢＩ２  ＣＨＯ−ＡｅｑクローンにおけるｈＥＢＩ２原形質膜発現のフローサイトメトリー分析。
【図２】ＥＢＩ２−特異的ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの一過性トランスフェクション(リポフェクタミン)後のＣＨＯ−Ａｅｑ細胞におけるｈＥＢＩ２原形質膜発現の減少。
【図３】エクオリン一次スクリーニング中のヒト敗血症性肝臓抽出における特異的ＥＢＩ２“活性”の同定。Ｘ軸＝フラクション数、Ｙ軸＝１０％の増加目盛りでの％ＡＴＰ。
【図４】ｈＥＢＩ２−ＣＨＯ−ＡｅｑＧｑｉ５細胞における、ＥＢＩ２ｓｉＲＮＡ(配列番号は以下の表２に定義する通り)での一過性トランスフェクション後の、ヒト肝臓抽出でのｈＥＢＩ２活性化の減少。左から右方向で：
【表１】
2012511536.tif 000002
【図５】プロテイナーゼＫで処理したまたは処理していない活性肝臓フラクションでのｈＥＢＩ２(エクオリン)の活性化。
【図６】活性肝臓フラクションおよび分子ふるいクロマトグラフィーを使用する、ＥＢＩ２リガンドの分子サイズの測定。
【図７】ヒト敗血症性肝臓抽出物からのｈＥＢＩ２天然リガンドの精製：５工程液体クロマトグラフィー法。
【図８】ヒツジ敗血症モデルからの肝臓抽出物におけるｈＥＢｉ−ＣＨＯ−ＡｅｑＧｑｉ５クローン７のエクオリンスクリーニング。
【図９】６連続液体クロマトグラフィー工程を用いるヒツジ敗血症性肝臓抽出からのｈＥＢＩ２天然リガンドの精製。Ｘ軸＝時間(分)；Ｙ軸＝ＡＵ(吸収単位)(Ａ)またはｍＡＵ(ミリ吸収単位)(Ｂ−Ｆ,)。工程１はパネル(Ａ)に対応し；工程２はパネル(Ｂ)に対応し；工程３はパネル(Ｃ)に対応し；工程４はパネル(Ｄ)に対応し；工程５はパネル(Ｅ)に対応し、そして工程６はパネル(Ｆ)に対応する。工程４のパネル(Ｄ)において、活性を１６.２５〜１６.７５分の間に検出する(図には示していない)。工程５のパネル(Ｅ)において、活性を２０.５０〜２１.５０分の間に検出する(図には示していない)。工程６のパネル(Ｆ)において、活性を３９〜４０分の間に検出する(図には示していない)。
【図１０】陽および陰イオンモードでのＥＢＩ２活性およびコントロールフラクションのＭＳ分析(Nano ESI-FTMS, Orbitrap)。(＊)は活性フラクションでのみ検出されたピークを示し(対コントロールフラクション)、一方、(＊＊)は、異なるＬＣ方法により集めた２個の活性フラクションの共通ピークを示す。
【図１１】７ｂ,２５ＤＨＣおよび７ｂＨＣは、ＣＨＯ−ＡｅｑＧｑｉ５(エクオリン)に安定に発現されたｈＥＢＩ２を活性化する。
【図１２】ＣＨＯ−ＡｅｑＧｑｉ５細胞に安定に発現されたヒトＥＢＩ２の７ｂ,２５ＤＨＣでの活性化は特異的である(エクオリンアッセイ)。
【図１３】異なるｈＥＢＩ２ＣＨＯ−ＡｅｑＧｑｉ５細胞株で確認したヒトおよびマウスＥＢＩ２の７ｂ,２５ＤＨＣでの活性化(エクオリンアッセイ)。
【図１４】ＣＨＯ−Ａｅｑ  Ｇα１６細胞における安定に発現されたヒトおよびマウスＥＢＩ２の７ｂ,２５ＤＨＣでの活性化(エクオリンアッセイ)。
【図１５】安定にトランスフェクトされたＣＨＯ−ＡｅｑＧα１６細胞における、ｈＥＢＩ２の７ａ,２５ＤＨＣおよび７ｂ,２５ＤＨＣによる活性化を測定するためのエクオリンアッセイ。
【図１６】安定にトランスフェクトされたＣＨＯ−ＡｅｑＧα１６細胞における、ｈＥＢＩ２の７ａ,２５ＤＨＣおよび７ｂ,２５ＤＨＣによる活性化を測定するためのｃＡＭＰアッセイ。
【図１７】７ａ,２５ＤＨＣおよび７ｂ,２５ＤＨＣによるｈＥＢＩ２の活性化を評価するためのβアレスチンPathhunterアッセイ。
【図１８】(Ａ)７ｂ,２５ＤＨＣから７ａ,２５ＤＨＣを分離するための液体クロマトグラフィー。(Ｂ)６個の異なる活性フラクションの保持時間マッチング。
【図１９】ＥＢＩ２天然リガンドと合成７ａ,２５ＤＨＣおよび７ｂ,２５ＤＨＣの保持時間の液体比較(計数対捕捉時間)。
【図２０】(Ａ)合成７ａ,２５ＤＨＣおよび(Ｂ)ブタ肝臓由来単離ＥＢＩ２天然リガンドの１Ｈ−ＮＭＲ。
【図２１】ホスホｐ４４／４２  ＭＡＰＫ特異的抗体を使用した、異なるオキシステロール類によるＥＢＩ２活性化５分間後のＭＡＰ／ＥＲＫリン酸化のウェスタンブロット分析。
【図２２】異なるＢ細胞サブセットにおける(Ａ)ヒトＥＢＩ２および(Ｂ)マウスＥＢＩ２のＤＮＡアレイ分析。
【図２３】７ａ,２５ＤＨＣに向かうＥＢＶ感染ヒトＢ細胞の遊走。
【図２４】(Ａ)９６トランスウェルアッセイにおける７ａ,２５ＤＨＣに向かうRS11846細胞の遊走。(Ｂ)百日咳毒素(ＰＴＸ)によるRS11846細胞のオキシステロール仲介走化性の阻害。
【図２５】異なるオキシステロール類に向かうRS11846細胞の遊走。
【図２６】ヒト免疫細胞におけるＥＢＩ２ｍＲＮＡ発現レベルのＱ−ＰＣＲプロファイリング。
【図２７】マウス骨髄由来樹状細胞の７ａ,２５ＤＨＣ仲介細胞遊走。
【図２８】野生型およびＥＢＩ２(−／−)マウスのＮＰ−ＣＧＧ曝露。７日後の(Ａ)抗ＮＰ  ＩｇＭ血清力価および(Ｂ)抗ＮＰ  ＩｇＧ１血清力価。
【実施例】
【００８６】
５.１  ＥＢＩ２組み換え細胞株
ヒトＥＢＩ２遺伝子を、ＨＬ−６０  ｃＤＮＡからのＲＴ−ＰＣＲを使用してクローン化し、Genbank受入番号NP_004942に対応した。ヒトＥＢＩ２を、ＥｃｏＲ１部位およびＸｂａｌ部位で、複数クローニング部位で、ｐＥＦＩＮ３ベクターに挿入した。マウスＥＢＩ２を、マウスゲノムＤＮＡからのＲＴ−ＰＣＲを使用してクローン化し、Genbank受入番号Q3U6B2に対応した。マウスＥＢＩ２を、ＥｃｏＲ１部位およびＸｂａｌ部位で、複数クローニング部位でｐＥＦＩＮ３ベクターに挿入した。ヒトおよびマウスＥＢＩ２を発現するプラスミドを、アポエクオリンを発現するＣＨＯ−Ｋ１およびＨＥＫ２９３細胞に安定にトランスフェクトした(ＣＨＯ−ＡｅｑおよびＨＥＫ−Ａｅｑ)(表１)。ＥＢＩ２遺伝子のｍＲＮＡ配列完全性を、ＣＨＯ細胞でＴ０およびＴ３０培養時間でＲＴ−ＰＣＲで確認した。
【００８７】
【表２】
2012511536.tif 000003
【００８８】
５.２  ヒトＥＢＩ２モノクローナル抗体
ｈＥＢＩ２モノクローナル抗体(Costagliola, S., et al. (2000). Genetic immunization of outbred mice with thyrotropin receptor cDNA provides a model of Graves' disease. J. Clin. Invest 105, 803-811)を使用して、フローサイトメトリーを使用して、組み換えＣＨＯ細胞中のｈＥＢＩ２の安定な原形質膜発現を確認した(図１)。
【００８９】
５.３  ヒトＥＢＩ２  ｓｉＲＮＡ
ｈＥＢＩ２に特異的な３種のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド配列を開発し、検証した(表２)。これらのｓｉＲＮＡのｈＥＢＩ２遺伝子発現に対する‘サイレンシング’作用を、フローサイトメトリーを使用してｈＥＢＩ２−ＣＨＯ−Ａｅｑ細胞においてｓｉＲＮＡ一過性トランスフェクション後に検証した。細胞表面でのｈＥＢＩ２受容体発現の顕著な減少が、ｈＥＢＩ２ｓｉＲＮＡでの細胞処置後に見られる(図２)。
【表３】
2012511536.tif 000004
【００９０】
５.４  ヒト敗血症性肝臓抽出物由来フラクションによるｈＥＢＩ２の特異的活性化
ｈＥＢＩ２ＣＨＯ−Ａｅｑ細胞株を、天然リガンドの専有ライブラリーおよび組織抽出物コレクションに対する発光エクオリン機能的アッセイでスクリーニングした。我々は、ヒト敗血症性肝臓由来フラクションでｈＥＢＩ２の特異的活性化を同定した(図３)。
【００９１】
この病理学的肝臓抽出物に対するＥＢＩ２の詳細な活性化プロファイルは、各々４８％、５０％および６０％アセトニトリル内で溶出する３個の活性ピークを示した。これらの‘生物学的活性’は病理学的肝臓状態(敗血症)で同定できたが、正常肝臓抽出物はＥＢＩ２を活性化しなかった。
【００９２】
５.５  ヒト肝臓抽出物でのＥＢＩ２活性化の特異性
肝臓組織抽出物からｈＥＢＩ２リガンドの精製を開始する前に、ｈＥＢＩ２活性化の特異性を確認し、全ての推定ＣＨＯ細胞内在性応答と区別することが必要であった。この目的のために、我々は、特異的ｈＥＢＩ２ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド配列を使用してｈＥＢＩ２遺伝子の発現を選択的に下方制御した。我々はｈＥＢＩ２−ＣＨＯ−ＡｅｑＧｑｉ５細胞内で、ｈＥＢＩ２ｓｉＲＮＡ(配列番号は表２に示す通り)の一過性トランスフェクションによるヒト肝臓抽出物でのＥＢＩ２活性化の継続的減少を確認した(図４)。
【００９３】
ＥＢＩ２リガンドの物理化学的特性および分子サイズ
ＥＢＩ２特異的‘活性’はプロテイナーゼＫ処理後に減少せず、ＥＢＩ２リガンドがペプチドではないことを示唆する(図５)。
【００９４】
ＥＢＩ２リガンドの分子サイズ
ＥＢＩ２リガンドの分子サイズを、活性肝臓フラクションおよび分子ふるいクロマトグラフィーを使用して概算した。ＥＢＩ２リガンドのサイズは、約４００ダルトンと概算された(図６)。
【００９５】
活性ヒト肝臓フラクションのＭＳ分析
１−  活性ヒト肝臓フラクションのＬＣ−ＭＳ分析を、ＥＢＩ２リガンドの正確な質量を決定するために、Quattro Premier XE質量分光計に接続したWaters UPLC(超高速液体クロマトグラフィー)およびＬＣＴ質量分光計に接続したWaters UPLCで行った。恐らく、ものが少量であったために、全体として明瞭な結果は得られなかった。
【００９６】
５.６  ヒト敗血症性肝臓由来ＥＢＩ２リガンドの精製
ヒト病理学的肝臓組織からＥＢＩ２リガンドを濃縮し、そして単離するために、我々は、ヒト敗血症由来の８個の肝臓を試験した。８個中２個の肝臓は、ＥＢＩ２の顕著な活性化を示した。我々は、以下の方法を使用して、１.８kgのヒト敗血症性肝臓を単離した：肝臓組織を７体積のメタノール−水−酢酸(９０：９：１)混合物中で均質化した。３０分間遠心分離(１０,０００ｇ、４℃)後、上清をワットマン紙で濾過した。濾液を、水＋０.１％ＴＦＡで３倍に希釈した。抽出物をDelta Pak C18カラム(４００×４０mm)に載せ、カラムを２０％ＭｅＣＮ＋０.１％ＴＦＡで洗浄した。８０％ＭｅＣＮ＋０.１％ＴＦＡ、１００mL／分で溶出した。続いて、我々はＥＢＩ２活性化を担う生物学的物質を精製するために、この抽出物を数回ＨＰＬＣ分画した(図７参照)。
【００９７】
５.７  ヒツジ敗血症性肝臓抽出物でのｈＥＢＩ２の特異的活性化
ヒト組織の入手の制限に打ち勝つために、我々は、‘活性’物質の供給源の可能性として、数種の敗血症動物モデルを試験した。我々は、腹膜炎ヒツジ敗血症モデル由来の肝臓抽出物によるＥＢＩ２の特異的活性化を検出した(図８)。それ故に、腹膜炎敗血症モデル由来のヒツジ肝臓は、ＥＢＩ２リガンドの精製のためのさらなる物質供給源とみなした。
【００９８】
５.８  ヒツジ敗血症肝臓由来ＥＢＩ２リガンドの精製
ヒト敗血症肝臓組織から精製したＥＢＩ２リガンドの同定が不成功に終わったため(活性物質の低回収率によりほとんど説明が付く)、我々は、ヒツジ敗血症モデル由来の肝臓抽出物でのｈＥＢＩ２受容体特異的活性化を先に確認して以来、ヒツジ敗血症肝臓からのＥＢＩ２リガンドの精製を開始した。
【００９９】
抽出および精製方法
２kgのヒツジ肝臓を、６工程の液体クロマトグラフィーの後に、抽出および分画した。我々はｈＥＢＩ２受容体を強く活性化する純粋フラクションを得た(図９Ａ−Ｆ)。
【０１００】
肝臓組織を７体積のメタノール−水−酢酸(９０：９：１)混合物内で均質化した。３０分間遠心分離(１０,０００ｇ、４℃)後、上清をワットマン紙で濾過した。次いで濾液を水＋０.１％ＴＦＡで３倍希釈した。抽出をDelta Pak C18カラム(４００×４０mm)に載せ、カラムを２０％ＭｅＣＮ＋０.１％ＴＦＡで洗浄した。８０％ＭｅＣＮ＋０.１％ＴＦＡ、１００mL／分で溶出した。
【０１０１】
第一ＨＰＬＣ分離カラム：
１９×１５０mm  Ｃ１８−３００  Symmetry、５μ  Waters；１９mL／分  ５０〜６５％ＭｅＣＮ＋０.１％ＴＦＡへの勾配。
【０１０２】
第二ＨＰＬＣ分離カラム：
７.７５×２５０mm  Ｃ８−３００、５μ、ＡＣＥ、３mL／分  第一ＬＣ分離からの活性フラクションを０.１％ＴＦＡで２倍希釈し、カラムに載せる。溶出勾配：４０  ｔｏ  ４６％ＭｅＣＮ＋０.１％ＴＦＡ、０.２％／分。
【０１０３】
第三ＨＰＬＣ分離カラム：
７.７５×２５０mm  Ｃ１８−３００、５μ、ＡＣＥ、２.８mL／分  第二ＬＣ分離からの活性フラクションを０.１％ＨＣＯＯＨで３倍希釈し、カラムに載せた。溶出勾配：３５〜６５％ＭｅＣＮ＋０.１％ＨＣＯＯＨ、１％／分。
【０１０４】
第四ＨＰＬＣ分離カラム：
４.６×１５０mm  ＨＳＦ５、３μ、Supelco、０.８mL／分  第三ＬＣ分離からの活性フラクションを水で３倍希釈し、カラムに載せた。４１％ＭｅＣＮで溶出した。
【０１０５】
第五ＨＰＬＣ分離カラム：
４.６×１５０mm  Symmetry-300、３.５μ、Waters、１.３mL／分  第四ＬＣ分離からの活性フラクションを水で３倍希釈し、カラムに載せた。４１％ＭｅＣＮで溶出した。
【０１０６】
第六ＨＰＬＣ分離カラム：
４.６×１５０mm  ジフェニル、５μ、Vydac、１.５mL／分  第五ＬＣ分離からの活性フラクションを０.１％酢酸アンモニウム１０mMで２倍希釈し、カラムに載せた。溶出勾配：２６〜３１％ＭｅＣＮ−酢酸アンモニウム１０mM(９：１)、０.１％／分。
【０１０７】
５.９  ヒツジ敗血症性肝臓抽出物中のＥＢＩ２リガンドの同定
ＥＢＩ２リガンドの同定：ＭＳ分析
１−  活性サンプル(工程５)の第一組のＭＳ分析は、恐らく純粋分子の量が少ないため、ＥＢＩ２リガンドの候補質量を明らかにできなかった。サンプル中に数種の汚染物質が存在し、特異的シグナルの同定を妨げた。加えて、活性サンプルとコントロールサンプルの間に明確な再は検出できなかった。
【０１０８】
２−  工程５由来のサンプルのさらなるＨＰＬＣ精製工程を行った(工程６)。ＭＳ分析前に、Ｃ１８  Ｚｉｐ−Ｔｉｐｓを使用してサンプルを濃縮し、かつ浄化した。８０％ＡＣＮ＋１０mM酢酸アンモニウムで最終溶出した。溶出サンプルを、NanoMate(Advion)装置を備えたOrbitrap MS(Thermo)に直接注入した。活性フラクションのＭＳ分析は工程５(活性１)および工程６(活性２)の両方で相当な強度であり、コントロールサンプルでは無視できる４個のピークを示した。質量ｍ／ｚ  ３８３.３３０３、４０１.３４０８、４４１.３３３２を有するイオンが陽イオンモードで観察され、一方質量ｍ／ｚ  ４７７.３５８２を有するイオンが陰イオンモードで観察された(図１０)。
【０１０９】
仮説：
陽モード：
４４１.３３３２＝＞[Ｃ２７Ｈ４６Ｏ３Ｎａ１]＋(質量精度(ppm)：−１.５)
４０１.３４０８＝＞[Ｃ２７Ｈ４５Ｏ２]＋(−１.５ppm)
３８３.３３０３＝＞[Ｃ２７Ｈ４３Ｏ１]＋(−１.５ppm)
陰モード：
４７７.３５８２[Ｃ２９Ｈ５０Ｏ５]−(＋１.５ppm)
【０１１０】
４個の元素組成が、良好な質量精度で、両方の活性フラクションで検出された４個の共通イオンシグナルから得られた。質量ｍ／ｚ  ４４１.３３３２に対応するイオンは、分子Ｃ２７Ｈ４６Ｏ３のナトリウム付加物(Ｍ)に割り当てられ、一方質量ｍ／ｚ  ４７７.３５８２は、Ｍのアセテート(ＣＨ３ＣＯＯ−またはＯＡｃ−)付加物に割り当てることができた。さらに、質量４０１.３４０８および３８３.３３０３を有するイオンは、プロトン化分子イオンからの、水１個および２個の損失にそれぞれ割り当てることができた。得られた仮説は、それ故に、４１８.３４４７の理論的質量を有する化合物Ｍ＝Ｃ２７Ｈ４６Ｏ３が：陽イオンモードでは[Ｍ＋Ｎａ]＋、[Ｍ＋Ｈ−Ｈ２Ｏ]＋および[Ｍ＋Ｈ−２Ｈ２Ｏ]＋として、そして陰イオンモードでは[Ｍ＋ＯＡｃ]−として検出されたということである。プロトン化[Ｍ＋Ｈ]＋イオンも、脱プロトン化[Ｍ−Ｈ]−イオンも検出されなかった。
【０１１１】
加えて、ＭＳ／ＭＳ実験を、４個の質量の活性フラクションで行った。ｍ／ｚ  ４４１.３３３２および４７７.３５８２からフラグメントは得られず、これらがそれぞれナトリウムおよびアセテート付加物に対応するとの仮説に対する信用を与えた。これは、ガス相衝突誘発解離が、分子の断片化ではなく、ナトリウムまたはアセテートイオンの脱離を主としてもたらすためである。Ｎａ＋およびＯＡｃ−イオンの両方とも、ＭＳ／ＭＳ実験における“低質量カットオフ”(機器特異的)のために検出できなかった。ｍ／ｚ  ３８３.３３０３のＭＳ／ＭＳにより数フラグメントを得た。これらの中で、ｍ／ｚ  ３６５.３２０５(０.７ppm)で１個の水損失が検出された。ｍ／ｚ  ３８３.３３０３のフラグメントでさらなる構造割り当ては試みなかった。ｍ／ｚ  ４０１.３４０８では、低強度のためにＭＳ／ＭＳは行わなかった。
【０１１２】
質量４１８.３４４７のデータベースクエリーは、主に酸化コレステロール(オキシステロール類)またはビタミンＤ誘導体を提供した。データベース分析から、以下のリガンド候補物が同定された：
【０１１３】
次のものから成る３９種のコレステロール誘導体：
８個のケト−ジオール類
２７個のトリオール類
２個の酸
１個のジオール＋エポキシ
１個のジオール＋アルデヒド
【０１１４】
エクオリンアッセイでＥＢＩ２活性化について試験した化合物
１        (２５Ｒ)−５−アルファ−スピロスタン
２        ５−アルファ−コレスタン−３,６−ジオン
３        ５−アルファ−コレスタン−２,３−ジオン
４        ５−アルファ−コレスタン−３,７−ジオン
５        コレスタ−４,６−ジエン−３−オン
６        ３−ベータ−ヒドロキシコレスト−４−エン−６−オン
７        ５−アルファ−ヒドロキシ−６−ケトコレステロール
８        コレスタ−３,５−ジエン−７−オン
９        ５−コレステン−３ｂ−オール−７−オン
１０      ４,５−エポキシ−３−コレスタノン
１１      ４−ベータ,５−エポキシ−５−ベータ−コレスタン−３−オン
１２      コレステロール
１３      ｂ−シトステロール
１４      ２５−ヒドロキシコレステロール
１５      ２２(Ｓ)−ヒドロキシコレステロール
１６      ２２(Ｒ)−ヒドロキシコレステロール
１７      １−アルファ,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３
１８      ２４(Ｒ),２５−ジヒドロキシビタミンＤ３
１９      ２５−ヒドロキシビタミンＤ３
【０１１５】
Ｃ２７Ｈ４６Ｏ３分子式を有する候補分子の一覧に優先順位を付け、ｈＥＢＩ２活性化について試験した。かかる優先リストは、コレステロール代謝経路中の中間体として同定されたコレステロール誘導体からおよび既知ビタミンＤ誘導体から確立した。この一覧は、分子式Ｃ２７Ｈ４６Ｏ３(質量４１８.３４４７)の１２個のコレステロール誘導体および５個のビタミンＤ誘導体を含んだ。
３個のオキシステロールおよび３個のビタミンＤ３化合物を、エクオリンアッセイでＥＢＩ２活性化について試験した。
【０１１６】
これらの候補分子の中で、２個の関連するオキシステロール類である、構造Ｉの化合物により表されるコレスト−５−エン−３ｂ,７ｂ,２５−トリオール(７ｂ,２５ＤＨＣ)、および構造IIの化合物により表されるコレスト−５−エン−３ｂ,７ｂ−ジオール(７ｂＨＣが、それぞれ５０nMおよび１５μMに近いＥＣ５０値でＥＢＩ２受容体の特異的活性化を誘発するが、構造IIIの化合物により表されるコレスト−５−エン−７−メトキシ,３ｂ−オールはＥＢＩ２を活性化せず(図１１)、構造−活性相関におけるアルコール基とその位置の関連を強調する。
【０１１７】
【化１】
2012511536.tif 000005
【０１１８】
５.１０  ＣＨＯおよびＨＥＫ細胞でのコレステロール由来リガンドによる特異的ＥＢＩ２活性化の確認
我々は、ＷＴ  ＣＨＯ−ＡｅｑＧｑｉ５細胞および無関係のＧＰＣＲｓ、例えばオーファンＨＣＲおよびＧＰＲ２３と比較して、コレスト−５−エン−３ｂ,７ｂ,２５−トリオール(７ｂ,２５ＤＨＣ)が、特異的にかつ選択的にｈＥＢＩ２を活性化することを証明した(図１２および１４)。我々はまた、異なるＣＨＯ−Ａｅｑ細胞バックグラウンド(Ｇｑｉ５およびＧα１６(＝ＷＴＡ１１))での７ｂ,２５ＤＨＣによるｈＥＢＩ２の活性化も証明した(図１４)。加えて、我々は、７ｂ,２５ＤＨＣでのマウスＥＢＩ２受容体の活性化を証明した(図１３および１４)。最後に、我々は、ｈＥＢｉ２−ＨＥＫ−ＡｅｑＧα１６細胞(ｐＣＡｅｑＧ９)およびＨＥＫ  Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトしたｈＥＢｉ２での７ｂ,２５ＤＨＣによるｈＥＢＩ２の活性化を確認した(データは示していない)。
【０１１９】
５.１１  ７,２５−ＯＨＣ標準化合物のＭＳ
合成標準サンプル７ａ２５−ＯＨＣおよび７ｂ２５−ＯＨＣを、５.９に記載したものと同じＭＳ方法で分析した。相対的に低い濃度で、酢酸アンモニウム存在下で[Ｍ＋Ｎａ]＋ｍ／ｚ  ４４１.３３３８(０.３ppm)、[Ｍ＋Ｈ−Ｈ２Ｏ]＋ｍ／ｚ  ４０１.３４１４０(０.５ppm)および[Ｍ＋Ｈ−２Ｈ２Ｏ]＋ｍ／ｚ  ３８３.３３０８４(０.０１ppm)のみが陽イオンモードで検出され、そして[Ｍ＋ＯＡｃ]−  ｍ／ｚ  ４７７.３５８５(０.２ppm)のみが陰イオンモードで検出された。プロトン化および脱プロトン化シグナルは検出されなかった。これらの観察は活性フラクションで得られたものに一致する。
【０１２０】
５.１２  結論
我々は、腹膜炎敗血症モデルから得たヒツジ肝臓からＥＢＩ２天然リガンドを精製した。ＥＢＩ２活性化はヒト敗血症性肝臓抽出物で最初に検出されたが、ヒト病理学的物質を得るのが困難であり、１.８kgのヒト敗血症性肝臓からのＥＢＩ２リガンドの精製で、ＭＳ分析により検出するために十分量の活性物質を単離することが不可能であった。
精製ヒツジ肝臓活性フラクションの質量分析により、候補質量４１８.３４４７および関連分子式Ｃ２７Ｈ４６Ｏ３の同定がもたらされた。かかる特徴を示す化合物は、本質的にコレステロールまたはビタミンＤ誘導体に対応する。
【０１２１】
ｈＥＢＩ２活性化のための候補選択およびスクリーニング(エクオリンアッセイ)後、我々は、コレスト−５−エン−３ｂ,７ｂ,２５−トリオール(７、２５−ジヒドロキシコレステロール)(“７ｂ,２５ＤＨＣ”)およびコレスト−５−エン−３ｂ,７ｂ−ジオール(７−ヒドロキシコレステロール)(“７ｂＨＣ”)を、ｈＥＢＩ２での２種の活性リガンドとして同定した。コレスト−５−エン−３ｂ,７ｂ,２５−トリオールは、約５０nMのＥＣ５０値でｈＥＢＩ２を強力に活性化し、ＡＴＰ応答(内在性Ｐ２Ｙ受容体)と比較して１００％より大きい効力を示す。
ｈＥＢＩ２に対するコレスト−５−エン−３ｂ,７ｂ,２５−トリオールの特異性および選択性を、ＷＴ  ＣＨＯ−Ａｅｑ細胞および無関係のＧＰＣＲと比較して証明した。
ｈ  コレスト−５−エン−３ｂ,７ｂ,２５−トリオールでのｈＥＢＩ２の活性化をＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＨＥＫ２９３細胞で証明した。
【０１２２】
５.１３  ＥＢＩ２受容体でのオキシステロール類の薬理学的プロファイル
ＥＢＩ２受容体での７ｂ,２５ＤＨＣおよび７ｂＨＣに対する活性が証明されたら、我々は、どれがインビボで活性化合物である可能性が最も高いかを決定することを試みた。７ｂ,２５ＤＨＣは、酵素反応により天然に産生される化合物ではなく、むしろ特異的条件下の自己酸化の生成物である。我々は、それ故に、オキシステロール類／ＥＢＩ２相互作用の薬理学的特徴付けを行った。
【０１２３】
方法論
化合物：
７ａ,２５ＤＨＣ(CAS No. 64907-22-8)および７ｂ,２５ＤＨＣ(CAS No. 64907-21-7)を、以下に記載する通り７−ケト前駆体から合成した。７ａ,２７ＤＨＣ(CAS No. 144300-24-3)、７ｂ,２７ＤＨＣ(CAS No. 240129-43-5)をAvanti Polar Lipids Inc.(Alabaster, AL, USA)から購入した。７ａＨＣ(CAS No. 566-26-7)を社内でバッチ合成した。７ｂＨＣ(CAS No. 566-27-8)、２５ＨＣ(CAS No. 2140-46-7)、およびコレステロール(CAS No. 57-88-5)をSigma-Aldrich(Buchs, Switzerland)から購入した。
【０１２４】
化合物製造
特にことわらない限り、化合物をＤＭＳＯまたはエタノール(コレステロール、２５ＭＤＣ)中１０mMで溶解した。連続希釈を９０％ＤＭＳＯ(FLIPR, GTPgS)またはアッセイ緩衝液(結合アッセイ)で行った。細胞使用アッセイについて、最終ＤＭＳＯ濃度を１％以下に維持する。疎水性化合物のアッセイプレートへの吸着を阻止するために、０.１％(２−ヒドロキシプロピル)−βシクロデキストリン(Aldrich, #33259-3)を添加する。
【０１２５】
細胞株
特にことわらない限り、リガンド同定に使用したＥ２と呼ばれる同じチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞株をこれらの実験で使用した。この細胞株は、(１)組み換えヒトＥＢＩ２受容体、(２)乱交雑Ｇｑｉ５タンパク質ならびに(３)アポエクオリンを発現する。
【０１２６】
ＦＬＩＰＲ
細胞を、黒色／透明底、ポリ−Ｄ−リシン被覆３８４ウェルプレートに、培養培地を使用して、１０,０００細胞／２５μL／ウェルの細胞密度で播種した。細胞を、２４時間、３７℃／５％ＣＯ２で培養した。培養培地を除去し、細胞負荷のために、２０μL／ウェルの負荷緩衝液(洗浄色素のないカルシウム−４)をウェルに分配し、プレートを６０分間、３７℃で５％ＣＯ２中インキュベートした。ＦＬＩＰＲピペッター内で、１０μLの異なる化合物を細胞に添加し、続いて蛍光変化を３分間モニターした。ＦＬＩＰＲソフトウェア・ツールを使用して、蛍光カルシウム応答の２つの値をエクスポートした：ピーク時の傾向であるＦｍａｘと化合物注入前の値に対応するＦｂａｓａｌ。これらの２つの値から、カルシウム応答を、ｄＦ／Ｆ＝(Ｆｍａｘ−Ｆｂａｓａｌ)／Ｆｂａｓａｌを使用してカルシウム・ベースライン値に対して標準化する。最大ｄＦ／ＦをＥｍａｘと呼ぶ。
【０１２７】
膜製造
ヒトＥＢＩ２(Ｅ２)を安定に発現するＣＨＯ細胞をローラー・ボトル(Corning #431191)でコンフルエンシーまで増殖させ、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で１回洗浄し、−８０℃に凍結した。凍結細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤カクテル(CompleteTM, Roche, # 05 056 489 001 - 14302200)を添加した氷冷均質化緩衝液(１０ml／ｇ、２０mM  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７.２)に再懸濁した。細胞懸濁液をDounceホモジナイザー(１０ストローク)を穴あけ機(driller)と共に用いて均質化した。１１００００×ｇで４５分間遠心分離し、上清を除去した後、ペレットをボルテックス処理によりスクロース緩衝液(５０mM  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７,２、２５０mM  スクロース、１０％グリセロール)に再懸濁した。懸濁液を再びDounceホモジナイザー(１０ストローク)を使用して均質化し、１０００００×ｇで４５分間回転させた。上清を廃棄し、ペレットをスクロース緩衝液に再懸濁し、タンパク質濃度を決定し、等分し、−８０℃で凍結した。これらの膜調節物を結合ならびにＧＴＰｇＳアッセイに使用した。
【０１２８】
ＧＴＰγＳアッセイ
反応を９６ウェルプレート(OptiプレートTM, Perkin Elmer #6005299)で行った。１０μgのＥＢＩ２膜を、１０μM  ＧＤＰを添加した４０μlの緩衝液Ａ(２０mM  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７.４、１００mM  ＮａＣｌ、１.５mM  ＭｇＣｌ２、サポニン１０μg／ml)に溶解する。２０μlシンチレーション近接アッセイ(ＳＰＡ)ビーズ(１００μg／ウェル、Amersham, RPNQ0001)添加後、成分を穏やかに混合し、ＲＴで１５分間インキュベートする。緩衝液Ａに希釈した２０μlの化合物および２０μlのＧＴＰγ３５Ｓ(Perkin Elmer NEG030X)を添加し、１時間、ＲＴでインキュベートする。プレートをTopCount(Perkin Elmer NXT HTSTM)に写し、計測し、カウントを分析し、標準ソフトウェア(PrismTM, GraphPad Software Inc.)を使用した活性化の最大の半分の濃度を測定するためにプロットする。
【０１２９】
結合アッセイ
物質
凍結乾燥小麦胚芽アグルチニンシンチレーション近接アッセイ(ＳＰＡ)ビーズ(RPNQ0001)をGE Healthcare(Buckinghamshire, UK)から購入した。１個のバイアル(５００mg)を、５mLの蒸留水の添加により再構成して、１００mg／mLの最終濃度とする。再構成したＳＰＡビーズは４℃で貯蔵しなければならないが、凍結させてはならない。[３Ｈ]−７ａ,２５−ＯＨＣを、３Ｈ−Ｌ−セレクトリドの存在下、７−ケト,２５ＤＨＣの還元により合成した。このプロトコルにより、等量の７ａ,２５ＤＨＣおよび７ｂ,２５−ＯＨＣが生じる(下記参照)。この実験に使用した[３Ｈ]−７ａ,２５ＤＨＣは、バッチRSE 436-2であり、１０２４GBq／mmolの比活性を有し、−２０℃で貯蔵した。ＥＢＩ２３８４ウェルプレート(Cat. No. 6007290、白色ポリスチレン、平な正方形の底)をPerkin Elmer(Boston, USA)から購入した。
【０１３０】
放射標識７,２５ＤＨＣの合成
トリチウム標識線上、排気した、二首フラスコ(Ｖ＝２mL)を３Ｈ２(９９％３Ｈ２、１７９.２５mmol、ｐ＝７２８mbar)下、２９６Ｋに置いた。続いて、ブチル−リチウムのヘキサン溶液(１６０μmol、１００μL、ｃ＝１.６Ｍ)およびテトラメチルエチレンジアミン(２００μmol、３０μL)を添加した。５５分間後、懸濁液を液体Ｎ２で冷却し、過剰の３Ｈ２を廃棄物貯蔵部に戻し、溶媒を蒸発させた。残留物をＮ２下に置き、ＴＨＦ(５００μL)を添加し、懸濁液をｓｅｃ−ブチル−ボランのＴＨＦ溶液(１６０μmol、１６０μL、ｃ＝１Ｍ)で希釈し、−９０℃に冷却した。この温度で、１(２４μmol、１０mg)のＴＨＦ(５００μL)溶液を１分間以内に添加し、反応混合物を９０分間撹拌し、その間、温度は−８０℃から−５０℃にゆっくり上昇した。この後、アセトン(１５０μL)を添加し、反応混合物をさらに９０分間撹拌し、その間、温度は−５０℃から−８℃にゆっくり上昇した。最後に、反応混合物を１.０Ｎ  ＮａＯＨ(２５０μL)および３０％Ｈ２Ｏ２(２５０μL)でクエンチし、１５分間、室温で撹拌した。続いて、反応混合物を液体窒素で凍結し、蒸発乾固し、エタノール(４×１mL)と共蒸発させた。残留物をＳｉＯ２(１ｇ)で濾過し、生成物をＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ９５：５で溶出して、８５１MBqの２および３の混合物(１４mLエタノールに溶解；α異性体／β異性体＝５８：４２)を得て、それを、MN Nucleodur Sphinx RPの分取逆相ＨＰＬＣ(５μm、８×１５０mm、Ｔ＝２０℃、λ＝２１０nm；溶離剤Ａ：水＋０.１％ＴＦＡ；溶離剤Ｂ：ＣＨ３ＣＮ＋０.１％ＴＦＡ)で分離した。続いて、各々、固体支持StrataX(２×１００mg)での抽出後、２(５９.９４MBq、α異性体／β異性体＝７０：３０)および３(１０８.０４MBq、α異性体／β異性体＝３８：６２)の２個の富化フラクションを得た。富化された、予め精製されたフラクションを、さらに、Water's SunFire C18の分取逆相ＨＰＬＣ(５μm、１０×２５０mm、Ｔ＝４０℃、λ＝２１０nm；溶離剤Ａ：Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ＝９５：５；溶離剤Ｂ：Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ＝５：９５)で精製して、５０.６MBqのジアステレオマー的に純粋な２(α異性体／β異性体＝９９.９：０.１)および５１.４MBqのジアステレオマー的に純粋な３(α異性体／β異性体＝０.１：９９.９)を得た。
【０１３１】
ＫＤ決定
ＫＤ決定を、固定濃度の膜およびビーズ(各々ウェルあたり２０μgおよび２００μg)および０.０５〜３００nMの濃度範囲の[３Ｈ]−ＢＹＸ９９８を使用して行った。これらの溶液を、５０mM  Ｔｒｉｓ；１００mM  ＮａＣｌ；５mM  ＭｇＣｌ２および０.１％シクロデキストリン含有緩衝液津に製造した。
特異的結合を１０μMの一定最終濃度の７ａ,２５ＤＨＣ(NVP-BYX998-NX-4)の存在下で測定し、対応する総結合を、NVP-BYX998-NX-4の変わりに緩衝液を用いて測定した。
【０１３２】
ＩＣ５０決定
ＳＰＡアッセイを、３８４ウェルポリスチレンOptiプレート中、５０μL／ウェルの最終体積で行った。成分を、次の通りウェルに添加した：
−  ５０mM  Ｔｒｉｓ中１０μL試験化合物；１００mM  ＮａＣｌ；５mM  ＭｇＣｌ２および０.１％シクロデキストリン。
総結合を、１０μLの５０mM  Ｔｒｉｓ；１００mM  ＮａＣｌ；５mM  ＭｇＣｌ２および０.１％シクロデキストリンの添加により決定し、非特異的結合を１０μL  NVP-BYX998-NX-4(最終濃度１０μM)の添加により決定した。
−  アッセイ緩衝液(５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００mM  ＮａＣｌ、５mM  ＭｇＣｌ２および０.１％シクロデキストリン)中、最終２０μLの１０nM  [３Ｈ]−ＢＹＸ９９８。
−  ２０μg膜／ウェルおよび２００μgビーズ／ウェルの最終濃度を得るための、アッセイ緩衝液中の２０μLの混合ビーズおよび膜懸濁液。
【０１３３】
プレートを密閉し、室温で１０分間振盪させ、室温で少なくとも１２時間静置した。プレートをPerkin Elmer TopCountリーダーを使用して計数し、各ウェルを１分間計数した。
各ＩＣ５０決定を１１個の濃度で行った。
【０１３４】
次の通り、標準データ削減アルゴリズムを使用して、試験化合物存在下の特異的結合を計算した：
((Ｂ−ＮＳＢ)／(合計−ＮＳＢ))×１００
〔式中、
Ｂ＝試験化合物存在下の結合(cpm)
ＮＳＢ＝過剰阻害剤存在下の非特異的結合(cpm)
合計＝試験化合物非存在下の結合(cpm)〕
【０１３５】
４パラメータロジスティックフィットを使用した正規化濃度応答曲線の曲線フィッティングをXLfit(ｖ.２またはｖ.４、IDBS, Guildford, UK)を使用して行う。使用する式は、一部位シグモイド用量応答曲線についての、XLfit式第２０５番である：Ｙ＝Ａ＋((Ｂ−Ａ)／(１＋((Ｃ／Ｘ)＾Ｄ)))(式中、Ａ＝分間、Ｂ＝ｍａｘ、Ｃ＝ＩＣ５０、Ｄ＝傾斜)。デフォルトでは、ｍｉｎは０に固定されているが、ｍａｘは固定されていない。
Ｋｉを、Cheng-Prusoff式(Cheng, Y. and Prusoff, W.H. (1973). Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108)に従い計算する：
【０１３６】
エクオリンアッセイ
エクオリンアッセイを使用して、我々は、７ａ,２５ＤＨＣがＣＨＯ細胞中で安定に発現されたＥＢＩ２を、１８.４nMのＥＣ５０で活性化し、それに対し、活性が低い７ｂ,２５ＤＨＣではＥＣ５０の３９８nMが測定されることを発見した(図１５)。
【０１３７】
方法論
ヒトＥＢＩ２(ｐｃＤＮＡ３.１ベクター中)およびＧα１６を発現する安定な細胞株を、アポエクオリンを安定に発現する親ＣＨＯ細胞を用いて産生した(Euroscreen CHO-A12細胞株)。細胞を３８４ウェル黒色透明底プレート(Greiner Bio-one)に、３％ＦＢＳ含有Ｆ１２培地中１０,０００細胞／２５μl／ウェルで播種し、一夜インキュベートした。セレンテラジン(最終２０μM)を、細胞プレートに２５μl／ウェルで添加した。細胞プレートを３時間インキュベーターに戻した。化合物を、Tyrode緩衝液(１３０mM  ＮａＣｌ、２mM  ＣａＣｌ２、５mM  ＮａＨＣＯ３、５mM  ＫＣｌ、１mM  ＭｇＣｌ２、２０mM  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４)で、中間プレートに１：２０で希釈した。１２.５μl／ウェルの予め希釈した化合物を細胞アッセイプレートに移し、点滅発光(flash luminescence)についてLumiLuxTM(Perkin Elmer)で読んだ。
【０１３８】
エクオリン動的データの分析のために曲線下面積(ＡＵＣ)に類似するアルゴリズムを社内で作り、それをSlope Threshold(Slope 100)と名付けた。本アルゴリズムは、各時点の強度と前の時点との差異を比較することにより発光強度ピークの開始と終点を規定し、該差異が、通常１００に設定した閾値を超えるか否かを決定する。超えれば、後の時点の強度をSlope Thresholdの合計に加える。
【０１３９】
ｃＡＭＰアッセイ
同様に、ｃＡＭＰアッセイにおいて、立体異性体７ａ,２５ＤＨＣ(ＥＣ５０＝１０.３nM)は立体異性体７ｂ,２５ＤＨＣ(ＥＣ５０＝１０.６μM)よりも有効であることが示される(図１６)。
【０１４０】
方法論
エクオリンアッセイに使用したのと同じ安定なＥＢＩ２細胞株をｃＡＭＰアッセイに使用した。１０,０００細胞(２５μl)を白色固体３８４ウェルプレートのウェル当たりに播種し、３７℃インキュベーターで一夜インキュベートした。５００nlの化合物を各アッセイウェルに移し、５μlのフォルスコリンを３０μMの最終濃度で添加した。細胞を３７℃インキュベーターに３０分間戻した。最後に、ウェル当たりそれぞれ１５μlのHiRange D2-cAMPおよび抗ｃＡＭＰクリプテートを分配した。＞１時間室温でインキュベーション後、データ収集を、EnvisionTMまたはViewLuxTM(Perkin Elmer)で時間分解ＦＲＥＴ(蛍光共鳴エネルギー移動)モードで行った。コンジュゲートしたｃＡＭＰと抗ｃＡＭＰ抗体の間のＦＲＥＴを表す、アクセプター蛍光シグナル(Ａ６６５nm)対ドナー蛍光シグナル(Ａ６２０nm)の比×１０４を計算し、Ｙ軸にプロットした。シグナルが高い程、サンプルの内在性ｃＡＭＰ濃度が低い。
【０１４１】
オキシステロール類(DiscoveRx)での活性化後のＥＢＩ２のベータアレスチン相互作用
多くのＧＰＣＲについて、受容体活性化が、Ｃ末端での残基のリン酸化およびβアレスチン動員をもたらすことが示されている。その後、ＧＰＣＲ／βアレスチン複合体がクラスリン被覆ピットに取り込まれ、それが小胞を含む受容体の内在化および受容体シグナリングの脱感作をもたらす。
【０１４２】
いくつかのアッセイ技術(TransfluorTM, (Ghosh,R.N., et al. (2005). Quantitative cell-based high-content screening for vasopressin receptor agonists using transfluor technology. J Biomol Screen 10.; Granas, C., at al. (2005). High content screening for G protein-coupled receptors using cell-based protein translocation assays. Comb Chem High Throughput Screen 8.); PathhunterTM, (Hammer, M.M., et al. (2007). A novel enzyme complementation-based assay for monitoring G-protein-coupled receptor internalization. Faseb J, 21; Wehrman, T.S., at al. (2005). Enzymatic detection of protein translocation. Nat Methods 2), TangoTM, (Barnea, G., et al. (2008))。ここで、我々は、PathhunterＴＭ方法(DiscoverRx)を適用して、ＥＢＩ２とＢアレスチンの相互作用を探った。このために、ＧＰＣＲ−prolink融合タンパク質産生のためにヒトＥＢＩ２をProlinkＴＭベクター(DiscoveRx)にクローン化した。βアレスチン２−β−ｇａｌ−ＥＡ融合タンパク質(ＨＥＫ２９３−ＢＡＥＡ)を安定に発現する親ＨＥＫ２９３細胞を脱離し、懸濁液モードでFugene 6トランスフェクション試薬を使用してｈＥＢＩ２−prolinkベクターで一過性にトランスフェクトした。アッセイ培地(１０％ＦＢＳ添加無フェノールレッドＤＭＥＭ)中のトランスフェクトした細胞を白色固体３８４ウェルプレートに１５,０００細胞／２５μl／ウェルで播種した。一夜インキュベーション後、２００nlの試験分子をPinToolＴＭ(GNF Systems)により細胞プレートに移し、１−２時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。Flash検出試薬を１２.５μl／ウェルで添加した。５分間−１時間室温インキュベーション後、細胞プレートの発光シグナルをCLIPRＴＭ(Perkin Elmer)またはAcquestＴＭ(Molecular Devices)で読んだ。結果は、７ａ,２５ＤＨＣ(式IVの化合物)および７ｂ,２５ＤＨＣ(式Ｖの化合物)が、ｈＥＢＩ２を、それぞれ８.０nMおよび８３７nM(４８％効率)のＥＣ５０で活性化することを示す(図１７)。
【０１４３】
【化２】
2012511536.tif 000006
【０１４４】
５.１４  ７ａ,２５−ＯＨＣは、組織抽出物から精製されたオキシステロールである
７ａ,２５ＤＨＣを、以下に記載する通り、既知方法の改変(合成方法１)(Li, D. & Spencer T. A. (2000) Synthesis of 7a-hydroxy derivatives of regulatory oxysterol, Steroids 65, 529-535)または一工程方法(合成方法２)により合成した。
【０１４５】
合成方法１
市販の５−コレステン−３ｂ,２５−ジオール(Steraloids, C6510-000)から、ジオール基をベンゾイルクロライドで保護し、１５０℃で４時間、マイクロ波照射下に、無水ベンゼンおよびモレキュラー・シーブ中、ピリジニウムクロロクロマートでＣ７酸化した。−７８℃でＴＨＦ中、Ｌ−セレクトリドが、Ｃ７カルボニルから７α−ヒドロキシ基へのジアステレオ−選択的還元(２０：１)を促進した。２個のジアステレオマーは、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(７５％酢酸エチルのヘキサン溶液からら１００％酢酸エチル)を使用して、好都合に単離できる。ジ−ベンゾイルエステルの脱保護により、最終生成物７ａ,２５ＤＨＣを全体として１４％収率(４工程)で得た。
【化３】
2012511536.tif 000007
【０１４６】
合成方法２
市販の５−コレステン−３β,２５−ジオール−７−オン(Steraloids, C6510-000)から、Ｃ７−カルボニル基を、Ｌ−セレクトリドを用いて、ＴＨＦ中、−７８℃で５時間、ジアステレオ選択的に(ｄｒ〜２０：１)還元し、後処理およびカラムクロマトグラフィー後、純粋７ａ,２５ＤＨＣを約５０％収率で１工程で得ることができる。この１工程方法は、放射標識(例えば３Ｈ標識)７ａ,２５ＤＨＣの合成に有用である。
【化４】
2012511536.tif 000008
【０１４７】
上の表３に示す通り、化合物７ａ,２５ＤＨＣは７ｂ,２５ＤＨＣよりも強力であることが証明されている。
オキシステロールの正確な性質を決定するために、我々はヒツジ肝臓から精製し、我々は液体クロマトグラフィーにより２種のオキシステロール立体異性体(７ａ,２５ＤＨＣと７ｂ,２５ＤＨＣ)を分離するための分析法を開発している。
【０１４８】
方法論
組織抽出物からの生理活性物質の７,２５ＤＨＣ立体化学を決定するために、我々は、最初に参照化合物を使用した２個のジアステレオマー７ａ,２５ＤＨＣおよび７ｂ,２５ＤＨＣを分離するための分析方法を確立した。第二工程において、参照化合物の保持時間を組織抽出物由来の生理活性物質と比較した。この実験に使用したサンプルは、２種のヒツジ肝臓調製物、Ｓ５およびＳ７であり、各調節物からの３種の生物学的に活性フラクションを精製の最後の工程で回収した。
【０１４９】
７ａ,２５ＤＨＣおよび７ｂ,２５ＤＨＣを、Thermo-Fischer Hypersil GoldTMカラム上での液体クロマトグラフィー(ＬＣ)により分離した。水(５mM  ＮＨ４Ａｃ)およびアセトニトリル(０.１％酢酸)を移動相に使用した。勾配は、１２分間にわたる２０％〜８５％アセトニトリルの範囲であった(図１８Ａ)。化合物を、２種の装置でエレクトロスプレー質量分析により選択学的に検出した。両方の場合、インソース・フラグメンテーション生成物(２  Ｈ２Ｏ  Ｃ２７Ｈ４７Ｏ３＋の損失−＞  Ｃ２７Ｈ４３Ｏ＋、３８３.３３０８Da)をモニターし、同時にその特異的イオンの２５３.２７および１５７.１８Daでの２個のＣＩＤ(衝突誘発減衰)フラグメントをモニターした。全３個のイオンが同時に観察されたときのみ、ＤＨＣが検出されたと結論付ける。
【０１５０】
第一に、Thermo Finnigan LTQTM機器を使用した。速いデータ収集が可能であり、液体クロマトグラフィー保持時間(ＲＴ)ピーク分離の完全な使用を可能とする。全６サンプルで、７ａ,２５ＤＨＣのみが検出され、７ｂ,２５ＤＨＣは検出されなかった(図１８Ｂ)。我々は、これらの結果を、高い質量解像度および精度を示すが、液体クロマトグラフィー解像度はわずかに低い第二の機器(Thermo LTQ-OrbitrapTM)で確認した。
【０１５１】
５.１５  ブタ肝臓からの天然ＥＢＩ２リガンドの単離
ＥＢＩ２の調節ができるオキシステロール類の広い薬理学的特徴付けと並行して、ブタ肝臓抽出物からの天然ＥＢＩ２リガンドの精製を試みている。
【０１５２】
抽出プロトコル
ブタ肝臓１０Kgを、肉挽き機で粉砕し、５００ｇの湿状態粉砕組織あたり５００mLの水を用いてvita mixを使用して均一化し、１：１  ヘキサンおよびイソプロパノール混合物２０Ｌで１時間抽出した。ペレットおよび２層の液体を、３０分間遠心分離(１５０００ｇ、４℃)することにより分離し、有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、薄い帯白色固体(〜１kg、完全には乾燥させていない)を得た。
【０１５３】
分画プロトコル
分画工程１：１kgの粗抽出を１０kgシリカゲル手動カラムクロマトグラフィーに載せ、２カラム体積(１６Ｌ)の１００％ヘキサン、ヘキサン中１０％、２５％、５０％および７５％ＥｔＯＡｃ、１００％ＥｔＯＡｃ、およびＭｅＯＨ中１０％ＥｔＯＡｃで連続的に溶出し、合計４０フラクションを回収した(４Ｌ／フラクション)。フラクションを減圧下、２５℃で、ロータリーエバポレーターにより乾燥させ、活性をDiscoverXベータアレスチンアッセイにより試験した。
【０１５４】
分画工程２：順相ＨＰＬＣ、２１×２５０シリカゲルカラム、溶出条件：１００％ヘキサンで５分間、１００％ヘキサン〜１００％ＥｔＯＡｃで６０分間、１００％ＥｔＯＡｃで１０分間、ＥｔＯＡｃ中０〜２０％メタノールで２０分間、カラムあたり１グラム負荷(１８個のデュプリケート試験)
【０１５５】
分画工程３：順相ＨＰＬＣ、４.６×２５０シリカゲルカラム、Ｆ３は、工程２再分画からのＥＢＩ２特異的であり、１８個の並行試験から集め、工程３順相ＨＰＬＣに、ジクロロメタン(ＤＣＭ)およびメタノール、５％ＤＣＭで５分間、メタノール中５〜５０％ＤＣＭを６０分間を溶媒として用い、５０％ＤＣＭで２０分間維持
【０１５６】
分画工程４：逆相Ｃ１８(４.６×２５０)ＨＰＬＣカラムクロマトグラフィー、４.６×２５０  Ｃ１８樹脂、溶出条件：ＴＦＡモディファイヤーなしで、Ｈ２Ｏ中５０−１００％アセトニトリル(ＡＣＮ)、１mL／分／分画
【０１５７】
分画工程５：逆相Ｃ４(２.０×２５０)ＨＰＬＣカラムクロマトグラフィー、０.３５mL／分／フラクション、５０％−１００％ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから溶出、２時間
【０１５８】
活性および不活性フラクションのＬＣ−ＭＳ分析を、Ｃ４カラム(２.０×５０mm、YMCTM Pro C4, S-5, 120A)を用いる逆相ＨＰＬＣを使用して、Agilent 1200シリーズで行った。ＭＳ獲得パラメータ：装置：Agilent 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS；ガス温度：３５０℃；乾燥ガス：１０ｌ／分；ネブライザー：４５psig；ＶＣａｐ：４０００Ｖ；キャピラリー：０.０４７μA；チャンバー：０.６３μA；フラグメンテーター：１７５Ｖ；スキマー：６５Ｖ  OCT 1 RF Vpp：７５０Ｖ；獲得質量範囲：５０−１５００；獲得速度：１スペクトル／秒；参照質量：１２１.０５０８７３および９２２.００９７９８(参照溶液を全体的ランタイム中注入した)。
【０１５９】
サンプルを、０.３５mL／分で、モディファイヤーとして０.１％ギ酸を含むＨ２Ｏ中３０〜１００％アセトニトリルの勾配で溶出した。カラムを３０℃に維持した。
【０１６０】
全イオンクロマトグラム(陽モード)で９.７７分の主ピークを有する純粋フラクションを同定した。質量ｍ／ｚ  ３６５.３２０２、３８３.３３１１、４０１.３４１１および４４１.３３３を有するイオンを陽イオンモードで観察し、Ｍ＋Ｈ−３Ｈ２Ｏ、Ｍ＋Ｈ−２Ｈ２Ｏ、Ｍ＋Ｈ−Ｈ２Ｏ、およびＭ＋Ｎａとして説明された。Ｍ＋Ｈは４１９.３で観察されなかった。これらのデータは、上の５.９章に示した発見をさらに確認し、かつ支持する。
【０１６１】
合成７ａ,２５ＤＨＣおよび７ｂ,２５ＤＨＣを、上記のブタ肝臓抽出物の分画により得た活性フラクションと比較した。合成化合物および活性フラクションを、液体クロマトグラフィーの保持時間およびＭＳ／ＭＳで分析した(図１９)。これらの結果は、ブタ肝臓抽出物から単離されたＥＢＩ２の天然リガンドが７ａ,２５ＤＨＣであることを確認する。
【０１６２】
７ａ,２５ＤＨＣ(図２０Ａ)およびブタ肝臓由来７ａ,２５ＤＨＣ単離ＥＢＩ２天然リガンド(図２０Ｂ)の１Ｈ−ＮＭＲをＮＭＲにより分析した。上に記載した分画に従うブタ肝臓(３５Kg規模)のスケール・アップ抽出／分画により、約１００μgの実質的に純粋なＥＢＩ２リガンドを得た。１Ｈ−ＮＭＲ分析は、さらに、ブタ肝臓から精製された天然ＥＢＩ２リガンドであることを７ａ,２５ＤＨＣ確認する。
【０１６３】
５.１６  結果
我々は、３位以外のヒドロキシル化７位および２５位のヒドロキシル化が、強力なＥＢＩ２活性化に必要であることを同定した。７位で、アキシャルなアルファ位が、エクアトリアルなベータ位よりはるかに優先する(式IVで表される化合物７ａ,２５ＤＨＣおよび式Ｖで表される化合物７ｂ,２５ＤＨＣ)。側鎖のヒドロキシル化は、２５位で好ましいが、２７化合物も良好な効果を示した。我々、種々のアッセイにおける種々のオキシステロール類の効果順は同じであることを発見した(表３)
【表４】
2012511536.tif 000009
【０１６４】
[３Ｈ]−７ａ,２５ＤＨＣを使用して、我々はヒトＥＢＩ２を安定に発現するＣＨＯ細胞由来の膜を使用した結合実験を行った。[３Ｈ]−７ａ,２５ＤＨＣのＥＢＩ２への結合は、高親和性(Ｋｄ＝２５±１０nM(ｎ＝３))で飽和可能であり、７ａ,２５ＤＨＣおよび他のオキシステロール類の濃度を蔵相させることにより置き換え可能である。他の立体異性体である[３Ｈ]−７ｂ,２５ＤＨＣを使用して、我々は、ＥＢＩ２膜への特異的結合を観察することができなかった(データは示していない)。
【０１６５】
５.１７  ＥＢＩ２の活性化は、ＭＡＰ／ＥＲＫ経路のリン酸化に至る
マイトージェン活性タンパク質キナーゼ類(ＭＡＰＫ)は、細胞外刺激に応答し、種々の細胞活性を制御するセリン／スレオニン特異的タンパク質キナーゼである。
【０１６６】
方法論
細胞(Ｅ２＝ＣＨＯ／ＡＥＱ／Ｇｑｉ５／ｈＥＢＩ２)を、１２ウェルプレート(TPP #92012)に２×１０５細胞／ウェルで播種し、３７℃／５％ＣＯ２で一夜インキュベートした。翌日培地を除去し、細胞を無血清培地で４時間涸渇させた。その後、化合物を５分間、ＲＴで添加し、細胞を溶解した(７０μl、０,５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、３００mM  ＮａＣｌ、５０mM  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７,５、CompleteTMプロテアーゼ阻害剤カクテルRoche#04693124001)。細胞溶解物を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(NuPageTM 4-12%, #NP0322Box)により分解し、ニトロセルロース(Invitrogen, #LC2001)へセミドライブロッティングにより移し、ホスホｐ４２／４４  ＭＡＰＫ(Ｔ２０２／Ｙ２０４)ウサギｍＡｂ(Cell Signaling #4376S)でプローブした。二次ヤギ抗ウサギ−ＨＲＰ(Pierce #41460)抗体で処理後、ブロットを化学ルミネセンス(SuperSignal West DuraTM, Pierce #34075)のために展開し、BioRad GEL DOCTM造影システムを使用して可視化した。
【０１６７】
我々は、ＥＢＩ２発現ＣＨＯ細胞株でＭＡＰ／ＥＲＫリン酸化について試験し、本発明に従う７ａ,２５ＤＨＣおよび他のオキシステロール類がｐ４４／４２  ＭＡＰキナーゼのリン酸化によりＭＡＰ／ＥＲＫシグナリング経路を強力に活性化できることを発見した(図２１)。コントロールとして、我々は、ヒトＥＢＩ２を発現しない親ＣＨＯ細胞株を使用した。さらに高い７ａ,２５−ＯＨＣ濃度でも、このコントロール細胞株ではＭＡＰ／ＥＲＫシグナルは活性化されない。
【０１６８】
５.１８  ７ａ,２５ＤＨＣおよび７ａ,２７ＤＨＣとＥＢＩ２との相互作用の特異性
現在まで、オキシステロール類は、種々の生理学的活性、すなわち、ステロールおよび脂肪代謝の両方に関与する遺伝子の発現の制御を有し、胆汁酸の合成の基質として働き、そして、ステロール類の末梢から肝臓への輸送における中間体であることが記されている(Russell,D.W. (2000). Oxysterol biosynthetic enzymes. Biochim. Biophys. Acta 1529, 126-135)。二つの最も強力なＥＢＩ２アゴニスト(７ａ,２５−ＯＨＣおよび７ａ,２７−ＯＨＣ)の相互作用の可能性を評価するために、それらを以下の核ホルモン受容体に対する一連のレポーター遺伝子アッセイで試験した：ＳＸＲ(NR1I2; ENSG00000144852)、ＥＲａ(NR3A1; ENSG00000091831)、ＦＸＲａ(NR1H4; ENSG00000012504)、ＧＲ(NR3C1; ENSG00000113580)、ＬＸＲａ(NR1H3; ENSG00000025434)、ＰＰＡＲｇ(NR1C3; ENSG00000132170)、ＲＸＲａ(NR2B1; ENSG00000078380)。我々は、これら２種のオキシステロール類が上記核ホルモン受容体を、最高１０μMまでの濃度で活性化させないことを発見した。我々はまた、同じ２種の化合物を、医薬開発中の化合物の評価に日常的に使用されている安全性パネルでも評価している。これは、２６種のＧＰＣＲへの結合アッセイ、９種のＧＰＣＲの機能的アッセイ、４０種のキナーゼアッセイ、ならびに選択したイオンチャネル、プロテアーゼ類、トランスポーターおよび酵素アッセイを含む。これらのアッセイのいずれでも、我々は、７ａ,２５ＤＨＣまたは７ａ,２７ＤＨＣと試験相手の間の顕著な相互作用を見ることはなかった(データは示していない)
【０１６９】
５.１９  オキシステロール７ａ,２５ＤＨＣは、免疫細胞の走化性因子として作用する
方法論
走化性アッセイを、MultiScreen-MICTM９６ウェルプレートで、５μm孔ポリカーボネートフィルター(Millipore #MAMI C5S10)を使用して行った。細胞懸濁液およびケモカイン希釈を、１％非必須アミノ酸(Invitrogen, #11140-035)、ピルビン酸ナトリウム(Invitrogen, #11360-039)、ペニシリン／ストレプトマイシン(Invitrogen, #15140-114)、５０μM  β−メルカプトエタノール(Invitrogen#31350-010)および０.５％ＢＳＡ(Gibco #15260)を補った、glutamaxTM(Invitrogen, #61870-010)を含むＲＰＭＩ１６４０中で製造した。
【０１７０】
Ｂ細胞(RS11846またはＥＢＶ感染ヒトＢ細胞)またはマウス骨髄由来樹状細胞を１回培地で洗浄し、１×１０６／mlに再懸濁した。１００μlのこの懸濁液をフィルタープレートのウェルに添加し、１５０μlのある化合物希釈を含むレシーバー・プレートに穏やかに入れた。最終ＤＭＳＯ濃度は０.１％未満であった。３時間、３７℃でインキュベーターで遊走後、フィルタープレートをレシーバー・プレートから注意深く外し、廃棄した。レシーバー・プレートに遊走した細胞を再懸濁し、、丸底９６ウェルプレートに移し、遠心分離し、２％ＦＣＳおよび０.１％ＮａＮ３含有１００μl  ＰＢＳ(ＦＡＣＳ緩衝液)に再懸濁した。投入細胞(１００μl)を同様に処理した。特異的遊走の計算のために、２０μl  ＦＡＣＳ緩衝液中一定数のビーズ(１００００；Invitrogen#PCB100))を添加し、懸濁液を、FACS機器PASTM(Partec)を使用したフローサイトメトリーにより分析した。細胞を、その前方散乱(ＦＳＣ)および側方散乱(ＳＳＣ)パターンに基づき同定した。走化性を全細胞数または投入細胞のパーセントとして示す。
【０１７１】
種々の生活環段階のＢ細胞からのＤＮＡ発現アレイは、異なるＥＢＩ２発現プロファイルを示す(図２２ＡおよびＢ)。未処理Ｂ細胞においてＥＢＩ２は明らかに発現しているが、リンパ節胚中心からのＢ細胞はＥＢＩ２発現を鋭く下方制御する(Gatto, D., at al. (2009) Guidance of B Cells by the Orphan G Protein-Coupled Receptor EBI2 Shapes Humoral Immune Responses. Immunity 31[2], 259-269; Pereira, J. P., et al. (2009) EBI2 mediates B cell segregation between the outer and centre follicle. Nature, 460)。親和性成熟が完了したら、Ｂ細胞は血漿Ｂ細胞または記憶Ｂ細胞に形質転換し、ＥＢＩ２発現は再び高い(図２０ＡおよびＢ)。このパターンはヒトおよびマウスＢ細胞サブセットで同じである(Longo, N.S., et al. (2009). Analysis of somatic hypermutation in X-linked hyper-IgM syndrome shows specific deficiencies in mutational targeting. Blood 113, 3706-3715; Luckey, C.J., et al. (2006). Memory T and memory B cells share a transcriptional program of self-renewal with long-term hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 3304-3309)。
【０１７２】
ＥＢＩ２は、元々、エプスタイン・バーウイルスに感染したＢ細胞における上方制御によって同定された(Birkenbach 1993)。抗ＥＢＩ２モノクローナル抗体(Eurocreen)を使用したＦＡＣＳ(蛍光標示式細胞分取)実験によって、我々は、ＥＢＶ感染ヒトＢ細胞株が高レベルのＥＢＩ２を細胞表面上に発現することを発見した。
【０１７３】
ＥＢＶ形質転換末梢Ｂリンパ球の産生の方法論
ヒト末梢Ｂリンパ球(ＰＢＬ)を、末梢血からFicoll plaque上の遠心分離により細胞懸濁液として調整した。ＰＢＬをＰＢＳで濯ぎ、完全ＲＰＭＩ１６４０培地(１０％ＦＣＳおよび抗生物質)に、２×１０７細胞／mlの濃度で再懸濁した。細胞を５００μl量に等分し、２４ウェルプレートに播種した。各ウェル(１０７ＰＢＬ)に、５００μlのＢ９５−８細胞株上清(エプスタイン・バーウイルス含有)を添加した。Ｂ９５−８細胞株は、ＥＢＶの製造に使用される細胞株である(American Type Culture Collection, Cat. CRL-1612)。０.８μg／mlシクロスポリンＡ(ＣｓＡ)を各ウェルに添加する。細胞を、培地の約半分を、０.８μg／ml  ＣｓＡを含む新鮮な培地に変えることにより週に１回給餌する。この処置を、増殖細胞の塊が見えるようになるまで３週間繰り返す。一つの塊を小培養フラスコに移し、形質転換細胞をさらに拡張させる。ほとんどの形質転換細胞はＢ細胞系統由来である。一定量の細胞を、細胞が十分に増殖するやいなや凍結する。凍結させた一定量(１ml、約１０７細胞)を融解し、ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＣＳ、５０μg／mlゲンタマイシンで希釈し、１／４から１／８に希釈することにより継代する。
【０１７４】
我々は、７ａ,２５ＤＨＣが、これらのＥＢＶ感染Ｂ細胞をトランスウェルアッセイシステムで強力に引きつけることができることを発見した。コントロールとして、７ａ,２５ＤＨＣの濃度は両区画で同一であった(図２３)。
【０１７５】
第二の実験として、我々は、RS11846と呼ばれるバーキットリンパ腫プレＢ細胞株を試験した(Dr. John C. Reed, Burnham Institute for Medical Research, La Jolla, USAから提供; Gauwerky, C.E., et al. (1988). Pre-B-cell leukemia with a t(8;14) and a t(14;18) translocation is preceded by follicular lymphoma. Oncogene 2, 431-435.; Reed, J.C. et al. (1993). Somatic point mutations in the translocated bcl-2 genes of non-Hodgkin's lymphomas and lymphocytic leukemias: implications for mechanisms of tumor progression. Leuk. Lymphoma 10, 157-163)。ＤＮＡアレイデータ(BioGPS)の試験は、この細胞株の内在性ＥＢＩ２が高発現レベルであることを示した。
【０１７６】
我々は、７ａ,２５ＤＨＣがRS11846細胞を強力に誘引することができ、この誘引は、ＧαｉサブユニットのＡＤＰリボシル化によりＧαｉ−共役受容体のシグナリングを遮断する試薬である百日咳毒素により遮断できる。古典的ケモカイン類と同由生に、我々は、ベル型活性曲線を発見し、これは高化合物濃度で誘引が減少することを示す(図２４ＡおよびＢ)。
【０１７７】
我々はまた、種々のオキシステロール類の組でRS11846細胞の細胞遊走実験を行った。結果(図２５)は、RS11846細胞を誘引するオキシステロール類の能力と、ＥＢＩ２の機能的活性化(ＦＬＩＰＲ、ＧＴＰｇＳ)またはＥＢＩ２放射性リガンド結合アッセイ(表３参照)についての細胞を利用したアッセイにおける化合物の有効性の間の明らかな相関を示す。
【０１７８】
オキシステロール仲介化学誘引はＢ細胞に限らず、ＥＢＩ２を発現する他の免疫細胞でも見ることができる。種々のヒト免疫細胞でのメッセンジャーＲＮＡ発現分析は、骨髄および形質細胞様樹状細胞が高度にＥＢＩ２を発現することを示す(図２６)。
【０１７９】
十分な数の樹状細胞(ＤＣ)を産生するために、我々は野生型およびＥＢＩ２欠損マウス(Deltagen)から骨髄を単離し、マウスＩＬ４およびマウスＧＭ−ＣＳＦで７〜８日間処理した。このプロトコルを使用して、樹状細胞の均質な集団を産生できた。我々は、野生型動物由来のＤＣが７ａ,２５ＤＨＣに向かって遊走するが、ＥＢＩ２(−／−)マウス由来のＤＣは７ａ,２５ＤＨＣに向かって遊走しないことを発見した。この結果は、７ａ,２５ＤＨＣの化学誘引物質特性がＥＢＩ２により仲介されることを示す(図２７)。
【０１８０】
ＥＢＩ２ノックアウトマウス(−／−)の免疫曝露
免疫細胞上のオキシステロール類の化学誘引物質特性の同定は、ＥＢＩ２のアブレーションが、種々の生理学的条件下のＥＢＩ２発現細胞の適切な通行に影響を与えるであろうことを示唆する。それ故に、我々は、野生型およびＥＢＩ２(−／−)マウスをニトロ−フェニルニワトリガンマグロブリン(ＮＰ−ＣＧＧ)およびミョウバンに暴露した。
【０１８１】
ニトロフェニル−ニワトリガンマグロブリン(ＮＰ−ＣＧＧ)でのＥＢＩ２(−／−)および野生型マウスの免疫化
方法論
ＮＰ−ＣＧＧのプレブリーディング後、ＥＢＩ−２ｋｏマウスまたは同腹子の免疫化を、ミョウバン(Serva; #12261)中、２００μlの５０μg  ＮＰ(１５)−ＣＧＧ(Biosearch Technologies, Inc.; # N-5055)の腹腔内注射により行った。７日後、血清を採り、ＮＰ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＭをＥＬＩＳＡで分析した。
【０１８２】
ニトロフェニル特異的免疫グロブリンのＥＬＩＳＡ測定
ＩｇＧ１およびＩｇＭ抗ＮＰ  ＥＬＩＳＡを、９６ウェルプレート(Costar; #9018)をＰＢＳ(Gibco; #14040-091)中１０μgml−１  ＮＰ(２３)ＢＳＡ(Biosearch Technologies, Inc.; #N-5050)で一晩、ＲＴでコーティングし、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で１時間、ＲＴで遮断することにより行った。血清サンプルを、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０  (＝試薬緩衝液)中１：５０で開始して、デュプリケートで連続希釈し(１：３)、２時間、２５℃でインキュベートし、ＮＰ結合ＩｇＧ１およびＩｇＭをビオチン接合ラット抗マウスＩｇＧ１(Zymed; #04-6140)またはビオチン接合ヤギ抗マウスＩｇＭ(Southern Biotech; #1020-08)、続いてEuropiumコンジュゲートストレプトアビジン(Wallac; #1244-360)を使用して検出した。各インキュベーション工程後、プレートを６時間、ＰＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄した。Europium関連発光を測定するために、Enhancement SolutionＴＭ(Wallac; #1244-105)を添加し、プレートをVictor 2 DeviceＴＭ(Wallac; 1420 Multilabel Counter)で、デフォルトEuropiumプログラムを使用して測定した。ＮＰ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＭ力価を、５０％ｍａｘで力価を決定することにより計算し、群を平均化し、力価５０％ｍａｘ±ＳＴＤでおよび中央値で示した。免疫曝露７日後、我々は免疫グロブリンレベルを測定した。ＩｇＭ発現レベルに変化はなかったが(図２８Ａ)、我々は、ＥＢＩ２(−／−)マウスが野生型動物に対して約半分の力価しか生じないＩｇＧ１応答の鈍りを発見した(図２８Ｂ)。
【０１８３】
５.２０  結果
我々の発見は、ＥＢＩ２のリンパ系臓器内へのＢ細胞局在化の促進における重要な役割を同定した最近の結果(Pereira, J. P., et al. (2009) EBI2 mediates B-cell segregation between the outer and centre follicle. Nature 460[7259], 1122-1; Gatto, D., et al (2009) Guidance of B Cells by the Orphan G Protein-Coupled Receptor EBI2 Shapes Humoral Immune Responses. Immunity 31[2], 259-269)およびオキシステロール類が適応性免疫応答を形作る機構を同定した実験(Bauman, D.R., et al., (2009). 25-Hydroxycholesterol secreted by macrophages in response to Toll-like receptor activation suppresses immunoglobulin A production. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 106, 16764-16769; Diczfalusy, U., et al. (2009). Marked up-regulation of cholesterol 25-hydroxylase expression by lipopolysaccharide. J. Lipid Res, 投稿中)との予期しない関連を提供し、これらの生理活性シグナリング分子についての新規な生理学的側面を確立する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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