(57)【要約】  本明細書において、抗ＩＬ−１２抗体が開示され、これは、この抗原結合部分を包含する。試料母体から抗ＩＬ−１２抗体を単離および精製するための１つ以上の方法が示される。これらの単離された抗ＩＬ−１２抗体は、臨床現場および研究開発に使用することができる。単離された抗ＩＬ−１２抗体を含む医薬組成物も記載される。
2012506384.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体および少なくとも１つの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含む試料混合物からＨＣＰ減少型抗体調製物を生成するための方法であって、
（ａ）試料母体をｐＨの低下に供して一次回収試料を形成するステップであり、前記ｐＨの低下が３および４の間であるステップ、
（ｂ）前記一次回収試料を約４．５および６の間のｐＨに調整し、続いて前記一次回収試料をイオン交換樹脂に通し、イオン交換試料を収集するステップ、
（ｃ）前記イオン交換試料を疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）樹脂に通し、ＨＩＣ試料を収集するステップであり、前記ＨＩＣ試料が前記ＨＣＰ減少型抗体調製物を含むステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記ｐＨの低下が、適した酸と前記試料混合物とを混合することによって達成され、ならびに前記適した酸が、クエン酸、酢酸、カプリル酸などから成る群から選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
前記イオン交換樹脂が、陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂のいずれかである、請求項１の方法。
【請求項４】
前記イオン交換樹脂が陽イオン交換樹脂である、請求項３の方法。
【請求項５】
前記陽イオン交換樹脂が、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、リン酸（Ｐ）およびスルホン酸（Ｓ）から成る群から選択される、請求項４の方法。
【請求項６】
前記陽イオン交換樹脂がカルボキシメチルである、請求項５の方法。
【請求項７】
前記イオン交換樹脂が陰イオン交換樹脂である、請求項３の方法。
【請求項８】
前記陰イオン交換樹脂が、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、４級アミノエチル（ＱＡＥ）および４級アミン（Ｑ）基から成る群から選択される、請求項７の方法。
【請求項９】
前記陰イオン交換樹脂がＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅである、請求項８の方法。
【請求項１０】
前記イオン交換ステップが、第１のイオン交換ステップおよび第２のイオン交換ステップを含む、請求項１の方法。
【請求項１１】
前記第１のイオン交換ステップが陽イオン交換ステップであり、第２の陰イオン交換ステップが続く、請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記第１および前記第２のイオン交換ステップの間に起こる濾過ステップである中間ステップをさらに含む、請求項１０の方法。
【請求項１３】
前記濾過ステップが、捕獲限界濾過／透析濾過によって達成される、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記ＨＩＣが、１つ以上の疎水基を含むカラムを用いて達成される、請求項１の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上の疎水基が、アルキル基、アリル基およびこれらの組合せから成る群から選択される、請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記カラムが、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムなど）、Ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  Ｐｒｏｐｙｌ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  Ｐｈｅｎｙｌカラム、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）Ｍｅｔｈｙｌ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）ｔ−Ｂｕｔｙｌ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ、ＷＰ  ＨＩ−Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）（商標）カラムおよびＴｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）エーテル、フェニルまたはブチルカラムから成る群から選択される、請求項１４の方法。
【請求項１７】
前記カラムがＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを含む、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記ＨＩＣ試料を濾過に供してウイルス粒子を除去し、バッファー交換を促進させる、濾過ステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１９】
前記ＨＣＰ減少型抗体調製物が、抗ＩＬ−１２抗体またはこの抗原結合部分を含む、請求項１の方法。
【請求項２０】
前記抗ＩＬ−１２抗体またはこの抗原結合部分が、ヒト化抗体、キメラ抗体または多価抗体である、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記抗ＩＬ−１２抗体またはこの抗原結合部分がヒト化抗体である、請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記抗ＩＬ−１２抗体またはこの抗原結合部分が、共に表面プラズモン共鳴による測定にて約１×１０−８Ｍ以下のＫｄ速度定数および約１×１０−３ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離する単離されたヒト抗体である、請求項２０の方法。
【請求項２３】
前記抗ＩＬ−１２抗体またはこの抗原結合部分が、インビボおよびインビトロの両方でＩＬ−１２を中和する、請求項１９の方法。
【請求項２４】
前記調製物がＨＣＰを実質的に含まない、請求項１の方法。
【請求項２５】
抗体および少なくとも１つの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含む試料混合物からＨＣＰ減少型抗体調製物を生成するための方法であって、
（ａ）試料母体をｐＨの低下に供して一次回収試料を形成するステップであり、前記ｐＨの低下が約３．５までであるステップ、
（ｂ）前記一次回収試料を約４．９のｐＨに調整し、続いて前記一次回収試料を陽イオン交換樹脂に通し、陽イオン交換試料を収集するステップ、
（ｃ）前記陽イオン交換試料を陰イオン交換樹脂に通し、陰イオン交換試料を収集するステップ、ならびに
（ｄ）前記陰イオン交換試料を疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）樹脂に通し、ＨＩＣ試料を収集するステップであり、前記ＨＩＣ試料が、前記ＨＣＰ減少型抗体調製物を含むステップ
を含む、方法。
【請求項２６】
抗体および少なくとも１つの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含む試料混合物からＨＣＰ減少型抗体調製物を生成するための方法であって、
（ａ）試料母体をｐＨの低下に供して一次回収試料を形成するステップであり、前記ｐＨの低下が約３．５までであるステップ、
（ｂ）前記一次回収試料を約４．９のｐＨに調整し、続いて前記一次回収試料を陽イオン交換樹脂に通し、陽イオン交換試料を収集するステップ、
（ｃ）前記陽イオン交換試料を濾過に供し、濾過物を収集するステップ、
（ｄ）（ｃ）からの前記濾過物を陰イオン交換樹脂に通し、陰イオン交換試料を収集するステップ、ならびに
（ｅ）前記陰イオン交換試料を疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）樹脂に通し、ＨＩＣ試料を収集するステップであり、前記ＨＩＣ試料が、前記ＨＣＰ減少型抗体調製物を含むステップ
を含む、方法。
【請求項２７】
請求項１の方法によって生成されるＨＣＰ減少型抗体調製物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２８】
前記抗体が、抗ＩＬ−１２抗体またはこの抗原結合部分である、請求項２７の医薬組成物。
【請求項２９】
ＨＣＰを実質的に含まない、請求項２７の医薬組成物。
【請求項３０】
ＩＬ−１２によって促進される障害を中和するために使用される、請求項２７の医薬組成物。
【請求項３１】
前記障害が、関節リウマチ、骨関節炎、若年性慢性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー疾患、乾癬、皮膚炎  強皮症、アトピー性皮膚炎、移植片対宿主疾患、臓器移植拒絶、臓器移植に伴う急性または慢性免疫疾患、サルコイドーシス、粥状動脈硬化、播種性血管内凝固、川崎病、グレーブス病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ウェゲナー肉芽腫症、ヘノッホシェーンライン紫斑、腎臓の顕微鏡的血管炎、慢性活動性肝炎、ぶどう膜炎、敗血症性ショック、毒素性ショック症候群、敗血症症候群、悪液質、感染症、寄生虫病、後天性免疫不全症候群、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、心筋梗塞、アジソン病、散発性、多腺性欠乏症Ｉ型および多腺性欠乏症ＩＩ型、シュミット症候群、成人（急性）呼吸促迫症候群、脱毛症、円形脱毛症、血清反応陰性関節炎（ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｒｔｈｏｐａｔｈｙ）、関節症、ライター病、乾癬性関節症、潰瘍性大腸炎性関節症、腸疾患性滑膜炎、クラミジア、関節症に伴うエルシニアおよびサルモネラ、脊椎関節症、アテローム性疾患／動脈硬化症、アトピー性アレルギー、自己免疫性水疱症、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状ＩｇＡ病、自己免疫性溶血性貧血、クームス陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋痛性脳炎／ロイヤルフリー病、慢性粘膜皮膚カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、原因不明の自己免疫性肝炎、後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全関連疾患、Ｃ型肝炎、一般変異型免疫不全（分類不能型低ガンマグロブリン血症）、拡張型心筋症、女性不妊症、卵巣機能不全、早期卵巣機能不全、線維性肺疾患、原因不明の線維化肺胞炎、炎症後間質性肺疾患、間質性肺炎、間質性肺疾患に伴う結合組織病、肺疾患に伴う混合性結合組織病、間質性肺疾患に伴う全身性硬化症、間質性肺疾患に伴う関節リウマチ、肺疾患に伴う全身性エリテマトーデス、肺疾患に伴う皮膚筋炎／多発性筋炎、肺疾患に伴うシェーグレン病、肺疾患に伴う強直性脊椎炎、血管炎性びまん性肺疾患、肺疾患に伴うヘモシデリン沈着症、薬剤性間質性肺疾患、放射線線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後間質性肺疾患、痛風性関節炎、自己免疫性肝炎、１型自己免疫性肝炎（古典的自己免疫性またはルポイド肝炎）、２型自己免疫性肝炎（抗ＬＫＭ抗体肝炎）、自己免疫媒介型低血糖、黒色表皮腫を伴うＢ型インスリン抵抗性、副甲状腺機能低下症、臓器移植に伴う急性免疫疾患、臓器移植に伴う慢性免疫疾患、骨関節症、原発性硬化性胆管炎、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎疾患ＮＯＳ、糸球体腎炎、顕微鏡的腎血管炎、ライム病、円板状エリテマトーデス、男性不妊特発性またはＮＯＳ、精子自己免疫、多発性硬化症（全サブタイプ）、インスリン依存性糖尿病、交感性眼炎、結合組織病に対する二次的な肺高血圧症、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎の肺症状  、急性リウマチ熱、リウマチ性脊椎炎、スチル病、全身性硬化症、高安病／動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫自己免疫性甲状腺機能低下症（橋本病）、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、ぶどう膜炎、原発性血管炎ならびに白斑から成る群から選択される、請求項３０の医薬組成物。本発明のヒト抗体および抗体部分は、自己免疫疾患、特にリウマチ性脊椎炎、アレルギー、自己免疫性糖尿病および自己免疫性ぶどう膜炎が挙げられる、炎症を伴う疾患を治療するために使用することができる。
【請求項３２】
非ステロイド性またはステロイド性抗炎症薬をさらに含む、請求項２７の医薬組成物。
【請求項３３】
非ステロイド性抗炎症薬を含む、請求項３２の医薬組成物。
【請求項３４】
前記非ステロイド性抗炎症薬が、イブプロフェン、副腎皮質ステロイド、プレドニゾロンから成る群から選択される、請求項３３の医薬組成物、
【請求項３５】
ステロイド性抗炎症薬を含む、請求項３２の医薬組成物。
【請求項３６】
１つ以上の他の抗体またはこの抗原結合部分をさらに含む、請求項２７の医薬組成物。
【請求項３７】
医薬品をさらに含む、請求項２７の医薬組成物。
【請求項３８】
前記医薬品が、メトトレキサート、６−ＭＰ、アザチオプリンスルファサラジン、メサラジン、オルサラジンクロロキニン／ヒドロキシクロロキン、ペンシルアミン、金チオリンゴ酸、アザチオプリン、コチシン、副腎皮質ステロイド、β−２アドレナリン受容体アゴニスト（サルブタモール、テルブタリン、サルメテラル）、キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）、クロモグリク酸、ネドクロミル、ケトチフェン、イプラトロピウムおよびオキシトロピウム、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノレートモフェチル、レフルノミド、ホスホジエステラーゼ阻害薬、アデンソシンアゴニスト、抗血栓薬、補体阻害薬、アドレナリン系薬剤、ＴＮＦαまたはＩＬ−１などの炎症誘発性サイトカインによってシグナル伝達に干渉する薬剤（例えばＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼ阻害剤）、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤（例えばＶｘ７４０）、抗Ｐ７、ｐセレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤、キナーゼ阻害剤などのＴ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体およびその誘導体（例えば、可溶性ｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体および誘導体ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｅｎｂｒｅｌ（商標））およびｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ）、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、可溶性ＩＬ−１３受容体（ｓＩＬ−１３））および抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３およびＴＧＦβ）から成る群から選択される、請求項３７の医薬組成物。
【請求項３９】
前記ＨＣＰ減少型抗体調製物が、１つ以上の抗ＩＬ−１２抗体またはこの抗原結合部分を含み、ならびに標識される、請求項１、２５および２６の方法。
【請求項４０】
前記標識が放射性である、請求項３９の方法。
【請求項４１】
前記放射性標識が、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓおよび３Ｈから成る群から選択される、請求項４０の方法。
【請求項４２】
前記標識が非放射性である、請求項３９の方法。
【請求項４３】
前記ＨＣＰ減少型抗体調製物が、１つ以上の抗ＩＬ−１２抗体またはこの抗原結合部分を含み、ならびにペグ化される、請求項１、２５および２６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への参照）
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、２００８年１０月２０日に出願した米国仮出願第６１／１９６，７５２号の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ヒトインターロイキン１２（ＩＬ−１２）は、独特の構造および多面的作用を有するサイトカインとして特徴づけられた。ＩＬ−１２は、免疫および炎症応答に関わるいくつかの疾患に伴う病状に重要な役割を果たす。ＩＬ−１２、その生物活性および疾患におけるその役割の概説は、Ｇａｔｅｌｙら（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：４９５−５２１頁に見出すことができる。
【０００３】
構造的に、ＩＬ−１２は、両方がジスルフィド架橋により一緒になって結合される、３５ｋＤａのサブユニット（ｐ３５）および４０ｋＤａのサブユニット（ｐ４０）を含むヘテロ二量体タンパク質である（「ｐ７０サブユニット」と呼ばれる）。ヘテロ二量体タンパク質は、単球、マクロファージおよび樹状細胞などの抗原提示細胞によって主に産生される。これらの細胞型はまた、ｐ７０サブユニットと比べて過剰なｐ４０サブユニットを分泌する。ｐ４０およびｐ３５サブユニットは、一般的に関連はなく、ｐ４０ホモ二量体はＩＬ−１２アンタゴニストとして機能できるが、どちらも生物活性をもたないことが報告された。
【０００４】
機能的に、ＩＬ−１２は、抗原特異的なヘルパーＴ型（Ｔｈ１）および２型（Ｔｈ２）リンパ球の間のバランスを制御する中心的役割を果たす。Ｔｈ１およびＴｈ２細胞は、自己免疫障害の惹起および進行を支配し、ＩＬ−１２は、Ｔｈ１リンパ球の分化および成熟の制御に重要である。Ｔｈ１細胞によって放出されるサイトカインは炎症性であり、これは、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、ＩＬ−２およびリンホトキシン（ＬＴ）を包含する。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を分泌し、液性免疫、アレルギー応答および免疫抑制を促進する。
【０００５】
自己免疫疾患におけるＴｈ１応答の優勢およびＩＦＮγの炎症誘発活性と一致して、ＩＬ−１２は、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）およびクローン病などの多くの自己免疫および炎症性疾患に伴う病状に、主要な役割を果たし得る。
【０００６】
ＭＳを有するヒトの患者では、急性ＭＳのプラークにおけるｐ４０のｍＲＮＡレベルによって示されたように、ＩＬ−１２発現の増加が実証された。さらに、ＭＳ患者由来のＣＤ４０Ｌ発現性Ｔ細胞で抗原提示細胞をエクスビボで刺激することにより、対照のＴ細胞と比較してＩＬ−１２産生の増加が起こり、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用がＩＬ−１２の強力なインデューサーであるという観察と一致した。
【０００７】
ＩＬ−１２  ｐ７０の上昇したレベルは、健常な対照と比較して、ＲＡ患者の滑膜において検出された。ＲＡ滑膜におけるサイトカインのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）発現プロファイルにより、Ｔｈ１サイトカインが優勢に確認された。ＩＬ−１２は、クローン病（ＣＤ）に伴う病状にも重要な役割を果たすようである。ＩＦＮγおよびＩＬ−１２の増加した発現は、この疾患を有する患者の腸粘膜において観察された。ＣＤ患者の固有層由来のＴ細胞のサイトカイン分泌プロファイルは、非常に上昇したＩＦＮγレベルを含む、優勢的なＴｈ１応答の特徴を示す。その上、ＣＤ患者由来の大腸の組織切片では、豊富なＩＬ−１２発現性マクロファージおよびＩＦＮγ発現性Ｔ細胞が示される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｇａｔｅｌｙら（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：４９５−５２１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
様々なヒトの障害におけるヒトＩＬ−１２の役割のために、治療戦略が、ＩＬ−１２活性を阻害または相殺するように設計された。特に、ＩＬ−１２と結合し、これを中和する抗体が、ＩＬ−１２活性を阻害する手段として探求された。ＩＬ−１２に対する抗体を含む治療計画が、高純度のものであることが重要である。本発明は、プロテインＡカラムの使用または同等のプロテインＡベースの精製ステップなしに、この必要性に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
ある種の実施形態では、本発明は、ＩＬ−１２に結合する、精製され単離された抗体および抗体フラグメント、ならびにかかる抗体およびフラグメントを含む医薬組成物を対象とする。ある種の実施形態では、本発明は、ヒトＩＬ−１２に結合する、単離された抗体またはこの抗原結合部分に関する。本発明の単離された抗ＩＬ−１２抗体は、臨床現場および研究開発に使用することができる。ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１および２で確認される重鎖および軽鎖配列を含む抗ＩＬ−１２抗体を対象とする。
【００１１】
本発明のある種の実施形態は、それらが宿主細胞タンパク質（「ＨＣＰ」）を実質的に含まないようにするために、試料母体から抗ＩＬ−１２抗体またはこの抗原結合部分を精製する方法を対象とする。ある種の態様では、試料母体（または単に「試料」）は、本発明の抗ＩＬ−１２抗体を産生するために採用される細胞株を含む。特定の態様では、試料は、ヒト抗ＩＬ−１２抗体を産生するために使用される細胞株を含む。
【００１２】
本発明のある種の実施形態では、推定上の抗ＩＬ−１２抗体またはこの抗原結合部分を含む試料母体は、ｐＨ調整に供する。ある種の態様では、ｐＨは、約３．５に調整する。低ｐＨは、とりわけ、試料に混入し得るｐＨ感受性ウイルスの減少および／または不活性化を促進する。適した期間の後、ｐＨをおよそ５．０に調整し、試料をイオン交換クロマトグラフィに供して溶出液を生成する。ある種の態様では、イオン交換の溶出液を収集し、疎水性相互作用クロマトグラフィにさらに供して、溶出液を生成する。疎水性相互作用クロマトグラフィの溶出液は、次いでさらなる処理または使用のために収集することができる。
【００１３】
ある種の実施形態では、本発明は、とりわけ、細胞および細胞の残骸を除去するための一次回収ステップを含む、ＩＬ−１２抗体の精製方法を提供する。上記方法のある種の実施形態では、一次回収ステップは、１つ以上の遠心分離または深層濾過のステップを含む。例えば、限定するものではないが、かかる遠心分離ステップは、およそ７０００×ｇからおよそ１１，０００×ｇで行うことができる。さらに、上記方法のある種の実施形態は、デリピッド深層濾過ステップなどの深層濾過ステップを含む。
【００１４】
上記方法のある種の実施形態では、イオン交換ステップは、陽イオンもしくは陰イオン交換クロマトグラフィのいずれかまたは両方の組合せであってよい。このステップは、陽イオン交換ステップに続いて陰イオン交換ステップまたはその逆などの複数のイオン交換ステップを含むことができる。ある種の態様では、イオン交換ステップは、２つのステップのイオン交換工程を含む。かかる２つのステップの工程は、例えば、限定するものではないが、第１陽イオン交換ステップに続いて第２の陰イオン交換ステップによって達成することができる。典型的な陽イオン交換カラムは、固定相が陰イオン基を含む、ＣＭ  Ｈｙｐｅｒ  ＤＦ（商標）カラムなどのカラムである。このイオン交換捕獲クロマトグラフィステップは、一次回収の混合物からの抗ＩＬ−１２抗体の単離を促進する。適した陰イオン交換カラムは、固定相が陽イオン基を含むカラムである。かかるカラムの例は、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラムである。１つ以上のイオン交換ステップは、宿主細胞タンパク質およびＤＮＡ、適用できる場合は親和性基質タンパク質のような不純物を減少させることによって抗ＩＬ−１２抗体をさらに単離する。この陰イオン交換手順は、クロマトグラフィのフロースルー様式であり、抗ＩＬ−１２抗体は、陰イオン交換樹脂（または固相）と相互作用または結合しない。しかし、多くの不純物は、陰イオン交換樹脂と相互作用および結合する。
【００１５】
ある種の実施形態では、第１および第２のイオン交換ステップは、一次回収に続いて行う。かかる実施形態のある種のものでは、イオン交換試料は、第１のイオン交換ステップの前、２つのイオン交換ステップの間、または両方のいずれかで、中間濾過ステップに供する。ある種の態様では、この濾過ステップは、捕獲限外濾過／透析濾過（「ＵＦ／ＤＦ」）を含む。他の活動の中で、かかる濾過は、抗ＩＬ−１２抗体およびその抗原結合部分の濃縮およびバッファー交換を促進させる。
【００１６】
本発明のある種の実施形態は、１つ以上の疎水性相互作用クロマトグラフィ（「ＨＩＣ」）ステップを含む方法を提供する。適したＨＩＣカラムは、固定相が疎水基を含むものである。かかるカラムの非限定的な例は、Ｐｈｅｎｙｌ  ＨＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラムである。ある種の環境では、抗ＩＬ−１２抗体は、単離／精製工程の間に凝集体を形成する。１つ以上のＨＩＣステップを含むことにより、かかる凝集の減少または排除が促進される。ＨＩＣは、不純物の除去にも役立つ。ある種の実施形態では、ＨＩＣステップは、抗ＩＬ−１２抗体（またはその凝集）と疎水性カラムとの相互作用を促進するために、高塩濃度バッファーを採用する。抗ＩＬ−１２抗体は、次いでより低い濃度の塩を用いて溶出することができる。
【００１７】
ある種の実施形態では、ＨＩＣ溶出液は、これに限定されないが、Ｕｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ５０（商標）フィルター（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ、Ｎ．Ｙ．）などのウイルス性除去フィルターを用いて濾過する。Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（商標）フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓ．）、Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ＶＲ（商標）フィルター（ＣＵＮＯ；Ｍｅｒｉｄｅｎ、Ｃｏｎｎ．）およびＰｌａｎｏｖａ（商標）フィルター（旭化成ファーマ、Ｐｌａｎｏｖａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ、Ｉｌｌ．）などの代替的なフィルターも、かかる実施形態で使用することができる。
【００１８】
ある種の実施形態では、本発明は、単離された抗ＩＬ−１２抗体またはこの抗原結合部分および許容可能な担体を含む、１つ以上の医薬組成物を対象とする。１つの態様では、組成物は、抗ＩＬ−１２抗体に加えて、１つ以上の抗体またはこの抗原結合部分をさらに含む。別の態様では、組成物は、１つ以上の医薬品をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】非限定的な例の抗ＩＬ−１２抗体（ＡＢＴ−８４７）の重鎖および軽鎖の可変領域配列を開示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（発明の詳細な記述）
本発明は、ＩＬ−１２に結合する抗体を対象とする。１つの態様では、本発明は、ヒトＩＬ−１２に結合する、単離された抗体またはこの抗原結合部分に関する。本発明の単離された抗ＩＬ−１２抗体は、臨床現場および研究開発に使用することができる。本発明は、抗ＩＬ−１２抗体またはこの抗原結合部分を精製するための方法にも関する。本発明に関連して精製できる適した抗ＩＬ−１２抗体は、（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）米国特許第６，９１４，１２８号明細書に開示されており、これに限定されないが、その特許においてＪ６９５と同定され、続いてＡＢＴ−８７４と同定された抗ＩＬ−１２抗体が挙げられる。ＡＢＴ−８７４の重鎖および軽鎖の可変領域の配列は、図１ならびに配列番号１および２に示される。本発明は、本明細書で記載された、抗ＩＬ−１２抗体またはこの抗原結合部分を含む医薬組成物にも関する。
【００２１】
明確にするために、限定するものではないが、この詳細な記述は、次の従属部に分割される：
１．定義、
２．抗体の生成、
３．抗体の産生、
４．抗体の精製、
５．試料純度をアッセイする方法、
６．さらなる修飾、
７．医薬組成物および
８．抗体の使用
１．定義
本発明をより容易に理解するために、ある種の用語を最初に定義する。
【００２２】
用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖から成る免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖の可変領域（本明細書でＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）および重鎖の定常領域（ＣＨ）から成る。重鎖の定常領域は、３つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から成る。各軽鎖は、軽鎖の可変領域（本明細書でＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）および軽鎖の定常領域から成る。軽鎖の定常領域は、１つのドメイン、すなわちＣＬから成る。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存される領域が散在し、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される、超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に次の順番：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。
【００２３】
抗体の「抗原結合部分」（または「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ｈＩＬ−１２）と特異的に結合する能力を保持する抗体のフラグメントを含む。抗体の抗原結合の機能は、完全長抗体のフラグメントによって果たせることが示された。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合性フラグメントの例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを含む１価のフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわちヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含むＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインを含むＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインを含むｄＡｂフラグメント（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６頁）ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、すなわちＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を用いて連結されることができ、合成リンカーによって、ＶＬおよびＶＨ領域対により一価の分子を形成できる単一タンパク質鎖としてそれらをつくることが可能になる（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６頁およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３頁を参照されたい）。かかる単一鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることを意図する。二重特異性抗体などの単一鎖抗体の他の形態も包含される。二重特異性抗体は、２価の二重特異的な抗体であり、ＶＨおよびＶＬドメインが、単一ポリペプチド鎖上で発現するが、短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間で対にできないリンカーを用い、それによってドメインを別の鎖の相補性ドメインと対にさせ、２つの抗原結合部位がつくられる（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８頁；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３頁を参照されたい）。その上さらに、抗体またはこの抗原結合部分は、抗体または抗体部分と１つ以上の他のタンパク質またはペプチドと共有または非共有結合によって形成される、より大きな免疫接着分子の一部であってよい。かかる免疫接着分子の例には、ストレプトアビジンのコア領域を用いて四量体のｓｃＦｖ分子をつくること（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６；９３−１０１頁）、およびシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグを用いて２価のビオチン化ｓｃＦｖ分子をつくること（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８頁）が挙げられる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントなどの抗体部分は、全抗体のそれぞれに、パパインまたはペプシン消化などの従来技法を用いて、全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着分子は、本明細書に記載のような標準的な組換えＤＮＡ技法を用いて得ることができる。１つの態様では、抗原結合部分は、完全ドメインまたは完全ドメインの対である。
【００２４】
表現「ヒトインターロイキン１２」（本明細書でｈＩＬ−１２またはＩＬ−１２と省略される）は、本明細書で使用するとき、マクロファージおよび樹状細胞によって主に分泌されるヒトサイトカインを含む。用語は、ジスルフィド架橋により一緒になって連結される３５ｋＤのサブユニット（ｐ３５）および４０ｋＤのサブユニット（ｐ４０）を含むヘテロ二量体タンパク質を含む。ヘテロ二量体タンパク質は、「ｐ７０サブユニット」と呼ばれる。ヒトＩＬ−１２の構造は、例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（１９８９）Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７０：８２７−８４５頁；Ｓｅｄｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１０１８８−１０１９２；Ｌｉｎｇら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１５４：１１６−１２７；Ｐｏｄｌａｓｋｉら（１９９２）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９４：２３０−２３７にさらに記載され、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−１２をコードする核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００８８２として入手でき、ポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００８７３．２として入手することができる。用語ヒトＩＬ−１２は、標準的な組換え発現方法によって調製できる、組換えヒトＩＬ−１２（ｒｈＩＬ−１２）を含むことを意図する。
【００２５】
用語「Ｋａｂａｔの番号付け」、「Ｋａｂａｔの規定」および「Ｋａｂａｔの標識化」は、本明細書では互換的に使用される。当技術分野で認識されるこれらの用語は、抗体またはこの抗原結合部分の重鎖および軽鎖の可変領域における他のアミノ酸残基より可変的（すなわち、超可変的）であるアミノ酸残基を番号付けるシステムをいう（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｂａｔら（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１頁およびＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）。重鎖の可変領域について、超可変領域は、ＣＤＲ１についてはアミノ酸位置３１から３５、ＣＤＲ２についてはアミノ酸位置５０から６５、およびＣＤＲ３についてはアミノ酸位置９５から１０２に及ぶ。軽鎖の可変領域について、超可変領域は、ＣＤＲ１についてはアミノ酸位置２４から３４、ＣＤＲ２についてはアミノ酸位置５０から６５、およびＣＤＲ３についてはアミノ酸位置８９から９７に及ぶ。
【００２６】
用語「ヒト抗体」は、Ｋａｂａｔらによって記載されたような、ヒト生殖系列の免疫グロブリンの配列に対応する、可変および定常領域を有する抗体を含む（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい）。本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列の免疫グロブリンの配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発またはインビボでの体細胞変異によって導入される変異）を含むことができる。変異は、「選択的変異誘発アプローチ」を用いて導入することができる。ヒト抗体は、アミノ酸残基、例えば、ヒト生殖系列の免疫グロブリンの配列によってコードされない活性増強型アミノ酸残基と置換された、少なくとも１つの位置を有することができる。ヒト抗体は、ヒト生殖系列の免疫グロブリンの配列の一部ではないアミノ酸残基と置換された、最大２０個の位置を有することができる。他の実施形態では、最大１０、最大５、最大３または最大２つの位置が置換される。１つの実施形態では、これらの置換は、ＣＤＲ領域内である。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用するとき、ＣＤＲ配列が、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来し、ヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含まないことを意図する。
【００２７】
表現「選択的変異誘発アプローチ」は、少なくとも１つの適した選択的変異誘発位置、高頻度変異および／または接触位置で、ＣＤＲアミノ酸を選択し、個々に変異させることによって、抗体の活性を改善する方法を含む。「選択的に変異させた」ヒト抗体は、選択的変異誘発アプローチを用いて選択された位置での変異を含む抗体である。別の態様では、選択的変異誘発アプローチは、抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３（下文ではそれぞれＨ１、Ｈ２およびＨ３）または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３（下文ではそれぞれＬ１、Ｌ２およびＬ３という）において、選択された個々のアミノ酸残基を優先的に変異させる方法を提供することを意図する。アミノ酸残基は、選択的変異誘発位置、接触位置または高頻度変異位置から選択することができる。個々のアミノ酸は、軽鎖または重鎖の可変領域におけるそれらの位置に基づいて選択される。高頻度変異位置が、接触位置であってもよいことを理解されたい。１つの態様では、選択的変異誘発アプローチは、「標的型アプローチ」である。言葉「標的型アプローチ」は、標的法、例えば、「群に対する標的型アプローチ」または「ＣＤＲに対する標的型アプローチ」において、抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３において選択された個々のアミノ酸残基を変異させる方法を含むことを意図する。「群に対する標的型アプローチ」では、特定の群における個々のアミノ酸残基は、群Ｉ（Ｌ３およびＨ３を含む）、ＩＩ（Ｈ２およびＬ１を含む）およびＩＩＩ（Ｌ２およびＨ１を含む）を含む選択的変異について標的にされ、前記群は、標的の優先度の順番で載せる。「ＣＤＲに対する標的型アプローチ」では、特定のＣＤＲにおける個々のアミノ酸は、次のような標的の優先度の順番：Ｈ３、Ｌ３、Ｈ２、Ｌ１、Ｈ１およびＬ２で、選択的変異について標的にされる。選択されたアミノ酸残基は、例えば、少なくとも２つの他のアミノ酸残基に変異させ、抗体の活性への変異の効果を決定する。活性は、抗体の結合特異性／親和性、および／または抗体の中和効力における変化として測定する。選択的変異誘発アプローチは、ファージ提示、ヒトＩｇＧ生殖系列遺伝子を有するトランスジェニック動物、ヒトＢ細胞から単離したヒト抗体が挙げられる任意の供給源に由来する任意の抗体の最適化に使用することができることを理解されたい。選択的変異誘発アプローチは、ファージ提示技術を用いてさらに最適化できない抗体に置いて使用することができる。ファージ提示、ヒトＩｇＧ生殖系列遺伝子を有するトランスジェニック動物、ヒトＢ細胞から単離したヒト抗体が挙げられる任意の供給源由来の抗体を、選択的変異誘発アプローチの前または後に逆突然変異に供することができることを理解されたい。
【００２８】
表現「組換えヒト抗体」は、宿主細胞に形質移入した組換え発現ベクターを用いて発現した抗体、組換え体から単離した抗体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリ、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離した抗体（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５頁を参照されたい）または他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライスを含む任意の他の手段によって調製、発現、作成もしくは単離した抗体などの、組換え手段によって調製、発現、作成または単離するヒト抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列の免疫グロブリンの配列に由来する可変および定常領域を有する（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい）。しかし、ある種の実施形態では、かかる組換えヒト抗体は、インビトロでの変異誘発（または、ヒトＩｇ配列のトランスジェニック動物を使用するときは、インビボでの体細胞変異誘発）に供し、したがって組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨおよびＶＬ配列に由来および関連するが、インビボにおいて生殖系列のヒト抗体レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。しかし、ある種の実施形態では、かかる組換え抗体は、選択的変異誘発アプローチもしくは逆突然変異または両方の結果である。
【００２９】
「単離した抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を含む（例えば、ｈＩＬ−１２と特異的に結合する単離した抗体は、ｈＩＬ−１２以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。ｈＩＬ−１２と特異的に結合する単離した抗体は、他の種由来のＩＬ−１２分子と結合することができる。さらに、単離した抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含み得ない。
【００３０】
「中和抗体」（またはｈＩＬ−１２活性を中和した抗体）は、ｈＩＬ−１２との結合により、ｈＩＬ−１２の生物活性の阻害をもたらす抗体を含む。ｈＩＬ−１２の生物活性のこの阻害は、フィトヘマグルチニンの芽細胞増殖アッセイ（ＰＨＡ）におけるフィトヘマグルチニンのヒト芽細胞増殖の阻害またはヒトＩＬ−１２受容体結合アッセイにおける受容体結合の阻害などの、ｈＩＬ−１２の生物活性の１つ以上の指標を測定することによって評価することができる。ｈＩＬ−１２の生物活性のこれらの指標は、当技術分野で既知のインビトロまたはインビボにおける１つ以上のいくつかの標準的なアッセイによって評価することができる。
【００３１】
用語「活性」は、例えば、ＩＬ−１２抗原に結合する抗ｈＩＬ−１２抗体などの抗体の抗原に対する結合特異性／親和性、および／または例えば、ｈＩＬ−１２との結合により、ｈＩＬ−１２の生物活性を阻害する抗ｈＩＬ−１２抗体などの抗体の中和効力、例えば、ＰＨＡ芽細胞増殖の阻害またはヒトＩＬ−１２受容体結合アッセイにおける受容体結合の阻害などの活性を含む。
【００３２】
表現「表面プラズモン共鳴」は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによって、リアルタイムの生体特異的相互作用の解析を可能にする光学現象を含む。さらなる説明については、その全体の教示が本明細書に組み込まれる、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．ら（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６頁；Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．ら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７頁；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．ら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１頁およびＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．ら（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７頁を参照されたい。
【００３３】
用語「Ｋｏｆｆ」は、本明細書で使用するとき、抗体／抗原複合体からの抗体の解離についての解離速度定数をいうことを意図する。
【００３４】
用語「Ｋｄ」は、本明細書で使用するとき、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数をいうことを意図する。
【００３５】
表現「核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含む。核酸分子は、単一鎖または二重鎖でよいが、１つの態様では、二重鎖ＤＮＡである。
【００３６】
ｈＩＬ−１２と結合する（単離した抗体を含む）抗体または抗体部分（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に関して本明細書で使用するとき、表現「単離した核酸分子」は、抗体または抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、ｈＩＬ−１２以外の抗原と結合する抗体または抗体部分をコードする他のヌクレオチド配列を含まず、他の配列が、天然ではヒトゲノムＤＮＡにおける該核酸に隣接し得る、核酸分子を含む。したがって、例えば、抗ＩＬ−１２抗体のＶＨ領域をコードする本発明の単離した核酸は、ＩＬ−１２以外の抗原と結合する他のＶＨ領域をコードする他の配列を含まない。表現「単離した核酸分子」は、ＶＨおよびＶＬ領域が、二重特異性抗体の配列以外の他の配列を含まない二重特異性抗体などの、２価の二重特異的な抗体をコードする配列を含むことも意図する。
【００３７】
表現「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞を含む。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫もいうことを意図すると理解されたい。変異または環境の影響のいずれかにより、後の世代である種の改変が起こり得るため、かかる子孫は、実際には親細胞と同一ではあり得ないが、本明細書で使用するとき、用語「宿主細胞」の範囲内にやはり含まれる。
【００３８】
用語「改変」は、本明細書で使用するとき、抗体またはこの抗原結合部分における１つ以上のアミノ酸の変更をいうこと意図する。変更は、１つ以上の位置でアミノ酸を付加、置換または欠失させることによって生じさせることができる。変更は、ＰＣＲ変異誘発などの既知の技法を用いて生じさせることができる。
【００３９】
用語「約」は、本明細書で使用するとき、基準値よりおよそ１０−２０％大きいまたは小さい範囲をいうことを意図する。ある種の環境では、当業者は、基準値の性質のため、用語「約」は、その値から１０−２０％より多くまたは少なく逸脱することを意味できると理解する。
【００４０】
表現「ウイルスの減少／不活性化」は、本明細書で使用するとき、特定の試料中のウイルス粒子の数の低下（「減少」）および例えば、これに限定されないが、特定の試料中のウイルス粒子の感染力または複製能などの活性の低下（「不活性化」）をいうことを意図する。ウイルス粒子の数および／または活性のかかる低下は、およそ約１％から約９９％、好ましくは約２０％から約９９％、より好ましくは約３０％から約９９％、より好ましくは約４０％から約９９％、さらにより好ましくは約５０％から約９９％、さらにより好ましくは約６０％から約９９％、さらにより好ましくは約７０％から約９９％、さらにより好ましくは約８０％から約９９％、さらにより好ましくは約９０％から約９９％程度であってよい。ある種の非限定的な実施形態では、ウイルスの量は、精製した抗体産物中に少しでも存在すれば、そのウイルスについてＩＤ５０（標的集団の５０％に感染するウイルスの量）より少なく、好ましくはそのウイルスについてＩＤ５０より少なくとも１０倍少ない、より好ましくはそのウイルスについてＩＤ５０より少なくとも１００倍少ない、さらにより好ましくはそのウイルスについてＩＤ５０より少なくとも１０００倍少ない。
【００４１】
表現「接触位置」は、２６の既知の抗体−抗原構造のうち１つにおいて、抗原と接触するアミノ酸によって占められる抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３におけるアミノ酸位置を含む。２６の既知の解明された抗体−抗原複合体の構造のいずれかにおいて、ＣＤＲアミノ酸が抗原と接触すれば、そのときそのアミノ酸は接触位置を占めると考えることができる。接触位置は、抗原と接触するアミノ酸によって占められる確率が、非接触位置より高い。１つの態様では、接触位置は、２６の構造の３つより多い構造において抗原と接触するアミノ酸を含むＣＤＲ位置である（＞１．５％）。別の態様では、接触位置は、２５の構造のうち８つより多い構造において抗原と接触するアミノ酸を含むＣＤＲ位置である（＞３２％）。
【００４２】
２．抗体の生成
用語「抗体」は、このセクションで使用するとき、インタクトな抗体またはこの抗原結合フラグメントをいう。
【００４３】
本開示の抗体は、対象とする抗原による動物の免疫化を含む様々な技法に続き、従来のモノクローナル抗体方法論、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５頁の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技法によって生成させることができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が原則として好ましいが、モノクローナル抗体を産生するための他の技法、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換を採用することができる。
【００４４】
ハイブリドーマを調製するための１つの好ましい動物系は、マウス系である。ハイブリドーマの産生は、非常によく確立された手順である。免疫化プロトコールおよび融合のために免疫化した脾細胞を単離するための技法は、当技術分野で既知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順も既知である。
【００４５】
抗体は、好ましくは、ヒト、キメラまたはヒト化抗体であってよい。本開示のキメラまたはヒト化抗体は、上記のように調製された非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖および軽鎖の免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、対象とする非ヒトハイブリドーマから得ることができ、標準的な分子生物学的技法を用いて、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含むように操作することができる。例えば、キメラ抗体を作成するために、当技術分野で既知の方法を用いて、マウス可変領域を、ヒト定常領域に連結させることができる（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）。ヒト化抗体を作成するために、当技術分野で既知の方法を用いて、マウスＣＤＲ領域を、ヒトフレームワークに挿入することができる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒらの米国特許第５，２２５，５３９号明細書ならびにＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２および６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。
【００４６】
１つの非限定的な実施形態では、本開示の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。ＩＬ−１２を対象とするかかるヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりむしろヒト免疫系の部分を保有するトランスジェニックまたはトランスクロモソミックマウスを用いて生成させることができる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモソミックマウスは、ＨｕＭＡｂ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）、ＫＭ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）およびＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ）として本明細書で称されるマウスを含む。
【００４７】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替的なトランスクロモソミック動物系は、当技術分野で入手でき、本開示の抗ＩＬ−１２抗体を産生させるために使用することができる。例えば、「ＴＣマウス」として称される、ヒト重鎖トランスクロモソームおよびヒト軽鎖トランスクロモソームの両方を保有するマウスを使用でき、かかるマウスは、Ｔｏｍｉｚｕｋａら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７２２−７２７頁に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランスクロモソームを保有する雌ウシは、当技術分野で記載されており（例えば、Ｋｕｒｏｉｗａら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９−８９４頁およびＰＣＴ出願ＷＯ２００２／０９２８１２）、本開示の抗ＩＬ−１２抗体を産生するために使用することができる。
【００４８】
本明細書で開示される、抗ＩＬ−１２抗体もしくはその抗体結合性部分または抗ＩＬ−１２関連抗体を含む本発明の組換えヒト抗体は、コンビナトリアル組換え抗体ライブラリ、例えば、ヒトリンパ球に由来するｍＲＮＡから調製したヒトＶＬおよびＶＨｃＤＮＡを用いて調製したｓｃＦｖファージ提示ライブラリの選別によって単離することができる。かかるライブラリを調製および選別するための方法論は、当技術分野で既知である。ファージ提示ライブラリを作成するための市販のキット（例えば、その全体の教示が本明細書に組み込まれる、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージ提示キット、カタログ番号２４０６１２）に加えて、抗体提示ライブラリの作成および選別の使用に特に適した方法および試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５，２２３，４０９号明細書；ＫａｎｇらのＰＣＴ出願ＷＯ９２／１８６１９；ＤｏｗｅｒらのＰＣＴ出願ＷＯ９１／１７２７１；ＷｉｎｔｅｒらのＰＣＴ出願ＷＯ９２／２０７９１；ＭａｒｋｌａｎｄらのＰＣＴ出願ＷＯ９２／１５６７９；ＢｒｅｉｔｌｉｎｇらのＰＣＴ出願ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらのＰＣＴ出願ＷＯ９２／０１０４７；ＧａｒｒａｒｄらのＰＣＴ出願ＷＯ９２／０９６９０；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２頁；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５頁；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１頁；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４頁；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）ＪＭｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８頁；Ｇｒａｍら（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０頁；Ｇａｒｒａｒｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７頁およびＢａｒｂａｓら（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２頁で見出すことができ、その全体の教示が本明細書に組み込まれる。
【００４９】
本開示のヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体応答が免疫化において生成できるようにヒト免疫細胞を再構築したＳＣＩＤマウスを用いて調製することもできる。かかるマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらの米国特許第５，４７６，９９６および５，６９８，７６７号明細書に記載されている。
【００５０】
１つの実施形態では、本発明の方法は、抗ＩＬ−１２抗体および抗体部分、抗ＩＬ−１２関連抗体および抗体部分、ならびに低度の解離速度によるｈＩＬ−１２との高親和性結合および高中和能などの、抗ＩＬ−１２抗体と同等の特性を有するヒト抗体および抗体部分を含む。１つの態様では、本発明は、共に表面プラズモン共鳴による測定にて約１×１０−８Ｍ以下のＫｄ速度定数および１×１０−３ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数でｈＩＬ−１２から解離する単離されたヒト抗体またはこの抗原結合部分を用いる治療を提供する。具体的な非限定的な実施形態では、本発明に従って精製した抗ＩＬ１２抗体は、生理的条件下で、ＡＢＴ−８７４とＩＬ１２との結合を競合的に阻害する。
【００５１】
本発明のさらなる別の実施形態では、抗ＩＬ−１２抗体またはこのフラグメントは、変化させることができ、抗体の定常領域が、非改変の抗体と比較して、少なくとも１つの定常領域媒介性生物学的エフェクター機能を低下させるように改変される。本発明の抗体がＦｃ受容体との低下した結合性を示すように、それを改変するために、抗体の免疫グロブリンの定常領域セグメントを、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）相互作用に必要な特定の領域で変異させることができる（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、ＣａｎｆｉｅｌｄおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３−１４９１頁ならびにＬｕｎｄら（１９９１）Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７−２６６２頁を参照されたい）。抗体のＦｃＲ結合能の低下により、オプソニン作用および食作用および抗原依存性細胞毒性などの、ＦｃＲ相互作用に頼る他のエフェクター機能も低下させることができる。
【００５２】
３．抗体の産生
本発明の抗体を発現させるために、遺伝子が、転写および翻訳調節配列に操作的に連結されるように、部分的または完全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、１つ以上の発現ベクターに挿入される（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９１４，１２８号明細書を参照されたい）。この文脈では、用語「操作的に連結される」は、ベクター内の転写および翻訳調節配列が、それらが目的とする抗体遺伝子の転写および翻訳の制御機能を果たすように、抗体遺伝子がベクター中にライゲートされることを意味すると意図する。発現ベクターおよび発現調節配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体の軽鎖遺伝子および抗体の重鎖遺伝子は、別々のベクター中に挿入でき、またはより典型的には、両遺伝子は、同じ発現ベクター中に挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位がなければ平滑末端のライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。抗体または抗体関連軽鎖または重鎖配列の挿入の前に、発現ベクターは、抗体の定常領域配列を既に保有することができる。例えば、抗ＩＬ−１２抗体または抗ＩＬ−１２抗体関連ＶＨおよびＶＬ配列を、完全長抗体遺伝子に転換する１つのアプローチは、ＶＨセグメントが、ベクター内のＣＨセグメント（複数可）に操作的に連結し、ＶＬセグメントが、ベクター内のＣＬセグメントに操作的に連結するように、重鎖の定常および軽鎖の定常領域をそれぞれ既にコードする発現ベクター中にそれらを挿入することである。追加的または代替的には、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進させるシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクター中にクローニングさせることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンのシグナルペプチドまたは異種のシグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であってよい。
【００５３】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を調節する１つ以上の制御配列を保有することができる。用語「制御配列」は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を調節するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。かかる制御配列は、例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。制御配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子によって決められることは、当業者に理解されよう。哺乳動物宿主細胞の発現に適した制御配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、主要な後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳動物細胞における高いタンパク質発現レベルを指示するウイルス性エレメントを含む。ウイルス性制御エレメントおよびその配列のさらなる説明については、例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５，１６８，０６２号明細書、Ｂｅｌｌらによる米国特許第４，５１０，２４５号明細書およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許第４，９６８，６１５号明細書を参照されたい。
【００５４】
抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中のベクターの複製を制御する配列（例えば、複製開始点）などの１つ以上の追加の配列および／または選択可能なマーカー遺伝子を保有することができる。選択可能なマーカー遺伝子により、ベクターが導入された宿主細胞の選択が促進される（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、全てＡｘｅｌらによる米国特許第４，３９９，２１６、４，６３４，６６５および５，１７９，０１７号明細書を参照されたい）。例えば、典型的には、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞において、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を与える。適した選択可能なマーカー遺伝子には、（メトトレキサートの選択／増幅を用いるｄｈｆｒ宿主細胞の使用については）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子および（Ｇ４１８の選択については）ネオ遺伝子が挙げられる。
【００５５】
本発明の抗体または抗体部分は、宿主細胞における免疫グロブリンの軽鎖および重鎖遺伝子の組換え発現によって調製することができる。組換えで抗体を発現させるために、軽鎖および重鎖が、宿主細胞中で発現され、宿主細胞を培養する培地中に分泌され、抗体が培地から回収できるように、宿主細胞に、抗体の免疫グロブリンの軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡフラグメントを保有する１つ以上の組換え発現ベクターを形質移入する。抗体の重鎖および軽鎖遺伝子を得て、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組込み、ベクターを宿主細胞中に導入するために、標準的な組換えＤＮＡ方法論が使用され、これらは、その全体の教示が本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）ならびに米国特許第４，８１６，３９７および６，９１４，１２８号明細書などに記載されている。
【００５６】
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）は、標準的な技法によって宿主細胞中に形質移入される。用語「形質移入」の様々な形態は、原核または真核宿主細胞中への外来性ＤＮＡの導入に一般的に使用される幅広い様々な技法、例えば、電気穿孔法、カルシウム−リン酸沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン形質移入などを包含することを意図する。原核または真核宿主細胞のいずれかにおいて、本発明の抗体を発現させることは理論上可能であるが、かかる真核細胞、特に哺乳動物細胞は、原核細胞に比べて、正確にフォールドされた免疫学的な活性抗体を会合および分泌しやすいため、哺乳動物宿主細胞などの真核細胞中での抗体の発現が適している。抗体遺伝子の原核生物の発現は、活性抗体の高収率の産生に効果がないことが報告された（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、ＢｏｓｓおよびＷｏｏｄ（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ６：１２−１３頁）。
【００５７】
本明細書でベクターにおけるＤＮＡのクローニングまたは発現に適した宿主細胞は、上記の原核生物、酵母またはより高等な真核生物である。この目的に適した真核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真正細菌、例として、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのエシュリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、例えばサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などのサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えばセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）などのセラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）およびシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）などの腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）ならびにＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日に出版されたＤＤ２６６，７１０に開示されたＢ．リケニフォルミス４１Ｐ）などのバチリ属（Ｂａｃｉｌｌｉ）、Ｐ．アエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などのシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ならびにストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。Ｅ．コリＢ、Ｅ．コリＸ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）およびＥ．コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）などの他の菌株が適しているが、宿主をクローニングする１つの適したＥ．コリは、Ｅ．コリ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）である。これらの例は、限定というよりむしろ実例となるものである。
【００５８】
原核微生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物が、ベクターをコードするポリペプチドに適したクローニングまたは発現宿主である。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または一般的なパン酵母が、より下等な真核宿主微生物の中でもっとも一般的に使用される。しかし、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ブルガリカス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ウィケラミ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ワルティ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィララム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）およびＫ．マルキシアナス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）などのクリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主；ヤロウィア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・リーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ  ２４４，２３４）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；スクワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのスクワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）；ならびに例えば、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラミジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）ならびにＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主などの糸状菌などの多くの他の属、種および菌株が一般的に入手でき、本明細書に有用である。
【００５９】
グリコシル化された抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および変異体ならびにスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、アエデス・アエギプティ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、アエデス・アルボピクタス（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、ドロソフィラ・メラノガスタ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）およびボンビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）などの対応する許容昆虫宿主細胞が同定された。形質移入のための様々なウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体およびボンビクス・モリＮＰＶのＢｍ−５菌株が公的に利用でき、かかるウイルスは、本発明に従う本明細書でのウイルスとして、特に、スポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質移入のために使用することができる。ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。
【００６０】
本発明の組換え抗体の発現に適した哺乳動物宿主細胞には、（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１頁に記載のようなＤＨＦＲ選択可能なマーカーを用いて使用される、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（１９８０）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０頁に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを、哺乳動物宿主細胞中に導入する場合、宿主細胞中での抗体の発現または宿主細胞を増殖させる培養液中への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって、抗体は産生される。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されるサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎臓株（懸濁培養物中での増殖のためにサブクローニングした２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９頁（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６頁（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１頁（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８頁（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞種株（Ｈｅｐ  Ｇ２）であり、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６１】
宿主細胞は、抗体産生のために上記の発現またはクローニングベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に修正された従来の栄養培地で培養する。
【００６２】
抗体を産生するために使用する宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。ＨａｍのＦ１０（商標）（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびＤｕｌｂｅｃｃｏのＭｏｄｉｆｉｅｄ  ＥａｇｌｅのＭｅｄｉｕｍ（商標）（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞の培養に適している。さらに、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４頁（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５頁（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４；４，６５７，８６６；４，９２７，７６２；４，５６０，６５５または５，１２２，４６９号明細書；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許第Ｒｅ．３０，９８５号明細書に記載の任意の培地を、宿主細胞用の培養液として使用でき、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる。任意のこれらの培地は、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩など）、バッファー（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン薬など）、微量元素（通常マイクロモーラーの範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義する）およびグルコースまたは同等のエネルギー源を補充することができる。任意の他の必要な補充も、当業者に既知である適切な濃度で含むことができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に以前に使用したものであり、当業者には明白である。
【００６３】
宿主細胞は、ＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖ分子などの、インタクトな抗体の部分を産生するために使用することもできる。上記の手順のバリエーションが、本発明の範囲内であることは理解されよう。例えば、宿主細胞に、本発明の抗体の軽鎖または重鎖のいずれか（両方ではない）をコードするＤＮＡを形質移入することを所望することができる。ＩＬ−１２、具体的にはｈＩＬ−１２との結合に必要ではない軽鎖および重鎖のいずれかまたは両方をコードするいくらかまたは全てのＤＮＡを除去するために、組換えＤＮＡ技術を使用することもできる。かかる切断されたＤＮＡ分子から発現された分子も、本発明の抗体に包含される。さらに、標準的な化学的架橋法により、本発明の抗体と第２抗体を架橋することによって、一方の重鎖および一方の軽鎖が、本発明の抗体であり、他方の重鎖および軽鎖が、ＩＬ−１２以外の抗原に特異的である二機能性抗体を、産生することができる。
【００６４】
本発明の抗体またはこの抗原結合部分の組換え発現のための適した系では、抗体の重鎖および抗体の軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターは、リン酸カルシウム媒介型形質移入によって、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞中に導入される。組換え発現ベクター内では、抗体の重鎖および軽鎖遺伝子は、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーターの制御エレメントにそれぞれ操作的に連結して、遺伝子の高レベルの転写を駆動する。組換え発現ベクターは、ＤＨＦＲ遺伝子も保有し、これにより、メトトレキサートの選択／増幅を用いて、ベクターに形質移入したＣＨＯ細胞を選択することが可能になる。選択された形質転換体宿主細胞は、抗体の重鎖および軽鎖の発現を可能にするために培養され、インタクトな抗体は、培養液から回収される。組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞に形質移入し、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培養液から抗体を回収するために、標準的な分子生物学的技法が用いられる。
【００６５】
組換え技法を使用するとき、抗体は、細胞膜周辺腔中で細胞内に産生され得、または培地中に直接分泌され得る。１つの態様では、抗体が細胞内に産生されれば、第１ステップとして、（例えば、遠心分離の結果として生じた）粒状の残骸、宿主細胞または溶解した細胞のいずれかを、例えば、遠心分離または限界濾過によって除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合、かかる発現系からの懸濁液を、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限界濾過ユニットを用いて、まず濃縮することができる。
【００６６】
本発明の工程の前に、細胞の残骸から抗体を精製するための手順を、抗体の発現部位によって最初に決める。いくつかの抗体は、細胞から増殖培地の周辺に直接分泌され得、他の抗体は、細胞内につくられる。後者の抗体について、精製工程の第１ステップは、典型的には、機械的な剪断、浸透圧ショックまたは酵素処理が挙げられる様々な方法によって起こり得る細胞の溶解を伴う。かかる破壊により、細胞の全体の内容物が破砕物中に放出され、さらに、それらの小ささのために除去するのが難しい細胞内の断片が産生される。これらは、一般的に、異なる遠心分離によって、または濾過によって除去される。抗体が分泌される場合、かかる発現系からの懸濁液は、一般的に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限界濾過ユニットを用いて、まず濃縮される。抗体が培地中に分泌される場合、組換え宿主細胞は、例えば、接線流濾過によって、細胞培養液から分離することもできる。抗体は、本発明の抗体精製方法を用いて、培養液からさらに回収することができる。
【００６７】
４．抗体の精製
４．１  一般的な抗体の精製
本発明は、抗体および少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物から精製された（または「ＨＣＰ減少型」）抗体調製物を生成するための方法を提供する。本発明の調製工程は、上記の方法および当技術分野の従来の方法を用いて抗体を生成する場合、分離のステップで始まる。当技術分野において典型的には、最初の精製ステップとして、抗体−ＨＣＰ混合物をプロテインＡの捕獲（例えば、プロテインＡカラム）に供し、抗体はプロテインＡに結合する一方、ＨＣＰは通り抜けて流れる。本発明の精製方法は、精製方法における最初のステップまたは任意のステップとして、抗体および少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物を、プロテインＡの捕獲（例えば、プロテインＡカラム）に供する必要がないという利点を有する。表１に、精製計画の１つの実施形態をまとめる。この計画のバリエーションが想定され、これは本発明の範囲内である。
【００６８】
【表１】
2012506384.tif 000003
【００６９】
抗体を含む清澄化した溶液または混合物を得たらすぐに、細胞が産生したＨＣＰなどの他のタンパク質からの抗体の分離を、イオン交換分離ステップ（複数可）および疎水性相互作用分離ステップ（複数可）を含む異なる精製技法の組合せを用いて行う。分離ステップにより、それらの電荷、疎水性の程度または大きさに基づいて、タンパク質の混合物が分離される。本発明の１つの態様では、分離は、陽イオン、陰イオンおよび疎水性相互作用が挙げられるクロマトグラフィを用いて行う。いくつかの異なるクロマトグラフィ樹脂をこれらの各技法に利用でき、関連する特定のタンパク質に対する精製計画の正確な組立てを可能にする。各分離方法の本質は、タンパク質が、異なる速度でカラムを横切り落ちることにより、カラムをさらに通って落ちるにつれて物理的分離の増加が達成されること、または分離媒体に選択的に付着することにより、次いで異なる溶媒によって別個に抽出されることのいずれかをもたらせることである。いくつかの場合では、不純物がカラムに特異的に付着し、抗体が付着しない、すなわち抗体がフロースルー中に存在するとき、抗体は不純物から分離される。
【００７０】
上述のように、精製計画の正確な組立ては、精製するタンパク質の濃度に依存する。ある種の実施形態では、本発明の分離ステップは、１つ以上のＨＣＰから抗体を分離するステップが採用される。本明細書に記載の方法を用いてうまく精製できる抗体には、これに限定されないが、ヒトＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭ抗体が挙げられる。ある種の実施形態では、本発明の精製戦略は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィの使用を除外する。かかる実施形態は、ＩｇＧ３抗体が、プロテインＡに非効率に結合することが知られているため、特にＩｇＧ３抗体の精製に有用である。精製計画の具体的な組立てを可能にする他の因子には、これに限定されないが、（例えば、抗体のＦａｂフラグメントと比べて完全長抗体に関連する）Ｆｃ領域の存在または非存在、対象とする抗体の生成に採用する特定の生殖系列の配列および抗体のアミノ酸組成（例えば、抗体の一次配列および分子の全体の変化／疎水性）が挙げられる。１つ以上の特徴を共有する抗体は、その特徴を利用するように組み立てた精製戦略を用いて精製することができる。
【００７１】
４．２一次回収
本発明の精製方法の最初のステップは、清澄化の第１相および試料母体からの抗ＩＬ−１２抗体の一次回収に関連する。さらに、一次回収工程は、試料母体中に存在し得るウイルスを不活性化する時点であってもよい。例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，５３４，９７２号明細書のような、熱不活性化（低温殺菌）、ｐＨ不活性化、溶媒／洗剤処理、ＵＶおよびγ線照射ならびにβ−プロピオラクトンまたは例えば銅フェナントリンなどの追加のある種の化学的不活性剤が挙げられる、任意の１つ以上の様々なウイルス不活性化方法を、精製の一次回収相の間に使用することができる。本発明のある種の実施形態では、試料母体は、一次回収相の間にｐＨウイルス不活性化に供する。
【００７２】
ｐＨのウイルス不活性化の方法には、これに限定されないが、低ｐＨである期間混合物を温置するステップ、続いてｐＨを中和するステップ、および濾過によって粒子を除去するステップが挙げられる。ある種の実施形態では、混合物は、ｐＨ２から５、好ましくはｐＨ３から４、より好ましくはｐＨ３．５で温置する。試料母体のｐＨは、これに限定されないが、クエン酸、酢酸、カプリル酸が挙げられる任意の適した酸または他の適した酸によって低下させることができる。ｐＨレベルの選択は、主として抗体産物の安定性プロファイルおよびバッファー成分に依存する。低ｐＨのウイルス不活性化の間の標的抗体の質は、ｐＨおよび低ｐＨ温置の持続時間に影響を受けることが知られている。ある種の実施形態では、低ｐＨ温置の持続時間は、０．５時間から２時間、好ましくは０．５時間から１．５時間であり、より好ましくは、持続時間は１時間である。ウイルス不活性化は、タンパク質濃度に加えて、高濃度で不活性化を低下させ得るこれらのいくつかのパラメータに依存する。したがって、タンパク質濃度、ｐＨおよび不活性化の持続時間の適したパラメータは、ウイルス不活性化の所望のレベルを達成するように選択することができる。
【００７３】
ある種の実施形態では、ウイルスの不活性化は、適したフィルターの使用によって達成することができる。適したフィルターの非限定的な例は、Ｐａｌｌ社のＵｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ５０（商標）フィルターである。本発明のある種の実施形態は、一次回収相の間にかかる濾過を採用するが、他の実施形態では、それは、精製の最後から２番目または最終ステップのいずれかが挙げられる、精製工程の他の相で採用する。ある種の実施形態では、これに限定されないが、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（商標）フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓ．）；Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ＶＲ（商標）フィルター（ＣＵＮＯ；Ｍｅｒｉｄｅｎ、Ｃｏｎｎ．）およびＰｌａｎｏｖａ（商標）フィルター（旭化成ファーマ、Ｐｌａｎｏｖａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ、Ｉ１１．）などの代替的なフィルターが、ウイルスの不活性化に採用される。
【００７４】
それらの実施形態では、ウイルスの不活性化を採用する場合、必要に応じて、さらなる精製ステップのために、試料母体を調整することができる。例えば、低ｐＨのウイルス不活性化に続いて、試料母体のｐＨは、典型的には精製工程を続ける前に、より中性ｐＨ、例えば、約５．０から約８．５に調整する。さらに、混合物を注射用水（ＷＦＩ）で流して、所望の伝導性を得ることができる。
【００７５】
ある種の実施形態では、一次回収は、試料母体をさらに清澄化し、それによって抗ＩＬ−１２抗体の精製を助ける１つ以上の遠心分離ステップを含む。試料の遠心分離は、例えば、限定するものではないが、７，０００×ｇからおよそ１２，７５０×ｇで実行することができる。大規模な精製に関して、かかる遠心分離は、例えば、限定するものではないが、結果として生じる懸濁液において１５０ＮＴＵの濁度レベルに達成する流速設定によりオンラインで行うことができる。かかる懸濁液は、次いでさらなる精製のために収集することができる。
【００７６】
ある種の実施形態では、一次回収は、試料母体をさらに清澄化し、それによって抗ＩＬ−１２抗体の精製を助ける１つ以上の深層濾過ステップの使用を含む。深層濾過は、段階的密度を有する濾過媒体を含む。かかる段階的密度により、より大きい粒子はフィルターの表面付近で捕捉する一方、より小さい粒子はフィルターの表面のより大きく開いた部分を透過し、フィルターの中央により近いより小さい開きのみで捕捉することが可能になる。ある種の実施形態では、深層濾過ステップは、デリピッド深層濾過ステップであってよい。ある種の実施形態は、一次回収相の間のみ深層濾過ステップを採用するが、他の実施形態は、１つ以上の追加の精製の相の間にデリピッド深層濾過を含む深層濾過を採用する。本発明に関して使用できる深層濾過の非限定的な例には、Ｃｕｎｏ（商標）モデル３０／６０ＺＡ深層フィルター（３Ｍ社）および０．４５／０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ（商標）二重層フィルターカートリッジが挙げられる。
【００７７】
４．３  イオン交換クロマトグラフィ
ある種の実施形態では、本発明は、抗体を含む溶出液が得られるように、少なくとも１つのイオン交換分離ステップに混合物を供することによって、抗体および少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物からＨＣＰ減少型抗体調製物を生成するための方法を提供する。イオン交換分離は、２つの基質を、それらのそれぞれのイオン電荷の差に基づいて分離する任意の方法を含み、陽イオン交換物質または陰イオン交換物質のいずれかを採用することができる。
【００７８】
陽イオン交換物質対陰イオン交換物質の使用は、タンパク質の全体の電荷に基づく。したがって、陽イオン交換ステップの使用の前に陰イオン交換ステップ、または陰イオン交換ステップの使用の前に陽イオン交換ステップを採用することは、本発明の範囲内である。さらに、陽イオン交換ステップのみ、陰イオン交換ステップのみまたは２つの任意の連続的な組合せを採用することも、本発明の範囲内である。
【００７９】
分離の実行において、最初の抗体混合物は、任意の様々な技法を用いて、例えば、バッチ精製技法またはクロマトグラフィ技法を用いて、イオン交換物質と接触させることができる。
【００８０】
例えば、バッチ精製に関して、イオン交換物質は、所望の開始バッファー中で調製する、またはそれに平衡化する。調製または平衡化において、イオン交換物質のスラリーを得る。抗体溶液をスラリーに接触させて、分離する抗体をイオン交換物質に吸着させる。イオン交換物質に結合しないＨＣＰ（複数可）を含む溶液は、例えば、スラリーの定着を可能にし、懸濁液を除去することによって、スラリーから分離する。スラリーは、１つ以上の洗浄ステップに供することができる。必要であれば、スラリーを、より高い伝導性の溶液に接触させて、イオン交換物質に結合したＨＣＰを脱着させることができる。結合したポリペプチドを溶出するために、バッファーの塩濃度を上昇させることができる。
【００８１】
イオン交換クロマトグラフィは、イオン交換分離技法として使用することもできる。イオン交換クロマトグラフィは、分子の全体の電荷の間の差に基づいて分子を分離する。抗体の精製について、抗体は、結合するために、イオン交換物質、例えば樹脂に付着される官能基の電荷と反対の電荷をもたなければならない。例えば、一般的にそのｐＩより低いｐＨのバッファー中で、全体的に正電荷を有する抗体は、負に荷電した官能基を含む陽イオン交換物質によく結合する。
【００８２】
イオン交換クロマトグラフィにおいて、溶質の表面上の荷電したパッチは、クロマトグラフィのマトリックスに付着した反対の電荷によって誘引され、これにより周囲のバッファーのイオン強度は低くなる。溶出は、一般的にイオン交換マトリックスの荷電部位について溶質と競合するようにバッファーのイオン強度（すなわち、伝導性）を増加させることによって達成される。ｐＨを変更し、それにより溶質の電荷を変化させることは、溶質の溶出を達成する別のやり方である。伝導性またはｐＨの変更は、漸進的（勾配溶出）または段階的（段階溶出）であってよい。
【００８３】
陰イオンまたは陽イオン置換基は、クロマトグラフィのための陰イオンまたは陽イオン担体を形成するために、マトリックスに付着させることができる。陰イオン交換置換基の非限定的な例には、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、４級アミノエチル（ＱＡＥ）および４級アミン（Ｑ）基が挙げられる。陽イオン置換基には、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、リン酸（Ｐ）およびスルホン酸（Ｓ）が挙げられる。ＤＥ２３（商標）、ＤＥ３２（商標）、ＤＥ５２（商標）、ＣＭ−２３（商標）、ＣＭ−３２（商標）およびＣＭ−５２（商標）などのセルロースイオン交換樹脂は、Ｗｈａｔｍａｎ社、メイドストーン、ケント、Ｕ．Ｋ．から入手することができる。ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ベースのおよびロクロスリンク型イオン交換体も既知である。例えば、ＤＥＡＥ−、ＱＡＥ−、ＣＭ−およびＳＰ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ならびにＤＥＡＥ−、Ｑ−、ＣＭ−およびＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ならびにＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＡＢから全て入手することができる。さらに、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＤＥＡＥ−６５０ＳまたはＭおよびＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＣＭ−６５０ＳまたはＭなどのＤＥＡＥおよびＣＭ両方の誘導体化エチレングリコール−メタクリル酸コポリマーは、Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ社、フィラデルフィア、Ｐａ．から入手することができる。
【００８４】
抗体および不純物、例えばＨＣＰ（複数可）を含む混合物は、陽イオン交換カラムなどのイオン交換カラム上に負荷する。例えば、限定するものではないが、混合物は、使用するカラムに依存して、約８０ｇのタンパク質／Ｌ樹脂の負荷で負荷する。適した陽イオン交換カラムの例は、ベッドボリュームが約１１６Ｌであり、直径８０ｃｍ×長さ２３ｃｍのカラムである。この陽イオンカラム上に負荷された混合物は、続いて洗浄用バッファー（平衡バッファー）で洗浄することができる。抗体は、次いでカラムから溶出し、最初の溶出液を得る。
【００８５】
このイオン交換ステップにより、対象とする抗体の捕獲が促進される一方、ＨＣＰなどの不純物が減少する。ある種の態様では、イオン交換カラムは、陽イオン交換カラムである。例えば、限定するものではないが、かかる陽イオン交換カラムに適した樹脂は、ＣＭ  ＨｙｐｅｒＤＦ樹脂である。これらの樹脂は、Ｐａｌｌ社などの商業的供給源から入手することができる。この陽イオン交換手順は、室温またはその付近で行うことができる。
【００８６】
４．４  限界濾過／透析濾過
本発明のある種の実施形態は、抗ＩＬ−１２抗体試料をさらに精製および濃縮するために、限界濾過および／または透析濾過ステップを採用し、限界濾過は、「Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｌ．ＺｅｍａｎおよびＡ．Ｚｙｄｎｅｙ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９９６）および「Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｍｕｎｉｒ  Ｃｈｅｒｙａｎ（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９８６；ＩＳＢＮ  Ｎｏ．８７７６２−４５６−９）に詳細に記載されている。好ましい濾過方法は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログの表題「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ」、１７７−２０２頁（ベッドフォード、Ｍａｓｓ．、１９９５／９６）に記載のような接線流濾過である。限界濾過とは、一般的に０．１μｍより小さい孔径を有するフィルターを用いる濾過をいう。かかる小さい孔径を有するフィルターを採用することによって、試料の体積が、フィルターを通る試料バッファーの透過により減少できる一方、抗ＩＬ−１２抗体は保持される。
【００８７】
透析濾過は、塩、糖、非水溶媒の除去および交換、結合した種からの遊離した種の分離、低分子量の物質の除去またはイオンおよび／もしくはｐＨ環境の迅速な変化を引き起こすために、限界フィルターを用いる方法である。かかるマイクロ溶質は、限界濾過速度と同等の速度で限界濾過する溶液に溶媒を添加することによって、もっとも効率的に除去される。これにより、一定体積で溶液から微細種が洗浄され、保持された抗体が効率的に精製される。本発明のある種の実施形態では、透析濾過ステップは、場合によってさらなるクロマトグラフィまたは他の精製ステップの前に、および抗体調製物から不純物を除去するために、本発明に関連して使用される様々なバッファーを交換するために採用される。
【００８８】
４．５  疎水性相互作用クロマトグラフィ
本発明は、疎水性相互作用分離ステップをさらに含み、抗体および少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物からＨＣＰ減少型抗体調製物を生成するための方法も取り上げる。例えば、減少したレベルのＨＣＰを有する第２溶出液が得られるように、イオン交換カラムから得た最初の溶出液を、疎水性相互作用物質に供することができる。本明細書に記載されているものなどの疎水性相互作用クロマトグラフィステップは、一般的に抗体凝集体などのタンパク質凝集体および工程関連不純物を除去するために行う。
【００８９】
分離の実行において、試料混合物は、例えば、バッチ精製技法を用いて、またはカラムを用いてＨＩＣ物質と接触させる。ＨＩＣ精製の前に、例えば、混合物をプレカラムに通すことによって、任意のカオトロピック剤または非常に疎水的な物質を除去することを所望することができる。
【００９０】
例えば、バッチ精製に関して、ＨＩＣ物質は、所望の平衡バッファー中で調製する、またはそれに平衡化する。ＨＩＣ物質のスラリーを得る。抗体溶液をスラリーと接触させて、分離する抗体をＨＩＣ物質に吸着させる。ＨＩＣ物質に結合しないＨＣＰを含む溶液は、例えば、スラリーの定着を可能にし、懸濁液を除去することによって、スラリーから分離する。スラリーは、１つ以上の洗浄ステップに供することができる。必要であれば、スラリーをより低い伝導性の溶液と接触させて、ＨＩＣ物質に結合した抗体を脱着させることができる。結合した抗体を溶出するために、塩濃度を低下させることができる。
【００９１】
イオン交換クロマトグラフィは、抗体の電荷に依存してそれらを単離する一方、疎水性相互作用クロマトグラフィは、抗体の疎水性特性を用いる。抗体上の疎水基は、カラム上の疎水基と相互作用する。より疎水的なタンパク質ほど、より強くカラムと相互作用する。したがって、ＨＩＣステップにより、宿主細胞由来の不純物（例えば、ＤＮＡならびに他の高および低分子量産物関連種）が除去される。
【００９２】
疎水性相互作用は、高いイオン強度でもっとも強く、したがって、この分離の形態は、塩析またはイオン交換手順に続いて便利に行われる。ＨＩＣカラムへの抗体の吸着は、高い塩濃度が好ましいが、実際の濃度は、抗体の性質および選択された特定のＨＩＣリガンドに依存して、非常に広範にわたることができる。様々なイオンは、それらが疎水性相互作用を促進するか（塩析効果）、または水の構造を破壊し（カオトロピック効果）、疎水性相互作用の減退を引き起こすかどうかに依存する、いわゆる疎溶媒性系列において配置することができる。Ｂａ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｌｉ＋、Ｃｓ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、ＮＨ４＋のような陽イオンは、塩析効果の増加に関して位置づけられる一方、ＰＯ−−−、ＳＯ４−−、ＣＨ３ＣＯ３−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＮＯ３−、ＣｌＯ４−、Ｉ−、ＳＣＮ−のような陰イオンは、カオトロピック効果の増加に関して位置づけることができる。
【００９３】
一般的に、Ｎａ、ＫまたはＮＨ４の硫酸塩は、ＨＩＣにおけるリガンド−タンパク質相互作用を効果的に促進する。次の関係：（ＮＨ４）２ＳＯ４＞Ｎａ２ＳＯ４＞ＮａＣｌ＞ＮＨ４Ｃｌ＞ＮａＢｒ＞ＮａＳＣＮによって相互作用の強度に影響を与える塩を処方することができる。一般的に、約０．７５から２Ｍの間の塩濃度の硫酸アンモニウムまたは約１から４Ｍの間のＮａＣｌが有用である。
【００９４】
ＨＩＣカラムは、通常、疎水性リガンド（例えば、アルキルまたはアリル基）が共役する基盤マトリックス（例えば、架橋結合したアガロースまたは合成コポリマー物質）を含む。適したＨＩＣカラムは、フェニル基で置換されたアガロース樹脂を含む（例えば、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラム）。多くのＨＩＣカラムが、商業的に入手可能である。例には、これに限定されないが、低いまたは高い置換を有するＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＢ、スウェーデン）；Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＢ、スウェーデン）；Ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＢ、スウェーデン）；Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＰｒｏｐｙｌまたはＦａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  Ｐｈｅｎｙｌカラム（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）；Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）ＭｅｈｙｌまたはＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）ｔ−Ｂｕｔｙｌ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア）；ＷＰ  ＨＩ−Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）（商標）カラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、ニュージャージー）およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）フェニルまたはブチルいずれかのカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ、ＰＡ）が挙げられる。
【００９５】
４．６  模範的な精製戦略
ある種の実施形態では、一次回収は、産生バイオリアクターの収集物から細胞および細胞残骸（ＨＣＰを含む）を除去するために、ｐＨの低下、遠心分離および濾過のステップを連続的に採用することによって進行することができる。例えば、限定するものではないが、抗体、培地および細胞を含む培養物は、およそ１時間、約３．５のｐＨを用いてｐＨ不活性化に供することができる。ｐＨの低下は、クエン酸、例えば３Ｍのクエン酸などの既知の酸調製を用いて促進することができる。ｐＨ感受性ウイルス混入物を完全に排除しない場合、かかるｐＨの低下により、この混入物を減少および／または不活性化させ、いくらかの培地／細胞混入物を沈殿させる。かかる低下に続いて、水酸化ナトリウム、例えば３Ｍの水酸化ナトリウムなどの塩基を用いて、約２０から約４０分間、ｐＨを約４．９または５．０に調整する。この調整は、およそ２０℃で行うことができる。ある種の実施形態では、ｐＨ調製した培養物を、次いでおよそ７０００×ｇからおよそ１１，０００×ｇで遠心分離する。ある種の実施形態では、結果として生じる試料懸濁液を、多数の深層フィルターを含むフィルタートレインに通す。ある種の実施形態では、フィルタートレインは、およそ１２個の１６インチのＣｕｎｏ（商標）モデル３０／６０ＺＡ深層フィルター（３Ｍ社）および３つの３０インチの０．４５／２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ（商標）２フィルターカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を装着したおよそ３回転のフィルターハウジングを含む。清澄化した懸濁液は、事前に滅菌した収集容器などの容器中に収集し、およそ８℃で維持する。この温度は次いで、捕獲クロマトグラフィステップまたは以下に概説するステップの前に、およそ２０℃に調整する。当業者は、上述の条件を変えることができ、これも本発明の範囲内であることに注目されたい。
【００９６】
清澄化した懸濁液は、次いで陽イオン交換カラムを用いてさらに精製することができる。ある種の実施形態では、陽イオン交換カラムに使用する平衡化バッファーは、約５．０のｐＨを有するバッファーである。適したバッファーの例は、ｐＨ５．０の約２１０ｍＭの酢酸ナトリウムである。平衡化に続いて、カラムに、上記の一次回収ステップから調製した試料を負荷する。カラムに、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗなどの陽イオン交換樹脂を充填する。カラムを、次いで平衡化バッファーを用いて洗浄する。カラムは、次に平衡化または洗浄用バッファーと比較して、より大きいイオン強度を有するバッファーを用いて、溶出ステップに供する。例えば、適した溶出バッファーは、ｐＨ５．０の約７９０ｍＭの酢酸ナトリウムであってよい。抗ＩＬ−１２抗体を溶出し、ＯＤ２８０ｎｍでセットしたＵＶ分光光度計を用いてモニターすることができる。特定の実施例では、溶出収集物は、上側３ＯＤ２８０ｎｍから下側８ＯＤ２８０ｎｍであってよい。当業者は条件を変えることができ、これもさらに本発明の範囲内であることを理解されたい。
【００９７】
ある種の実施形態では、一次回収から得た清澄化した懸濁液は、代わりに陰イオン交換カラムを用いてさらに精製する。このステップに適したカラムの非限定的な例は、ベッドボリュームが約８５Ｌであり、直径６０ｃｍ×長さ３０ｃｍのカラムである。カラムに、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗなどの陰イオン交換樹脂を充填する。カラムは、約７つのカラム容積のトリス／塩化ナトリウムなどの適切なバッファーを用いて平衡化することができる。適した条件の例は、ｐＨ８．０の、２５ｍＭのトリス、５０ｍＭの塩化ナトリウムである。再び当業者は条件を変えられるが、これも本発明の範囲内である。カラムに、上記で概説した一次回収ステップから収集した試料を負荷する。別の態様では、カラムは、陽イオン交換の間に収集された溶出液から負荷する。カラムの負荷に続いて、カラムを平衡バッファー（例えば、トリス／塩化ナトリウムバッファー）で洗浄する。抗ＩＬ−１２抗体を含むフロースルーは、ＵＶ分光光度計を用いてＯＤ２８０ｎｍでモニターすることができる。この陰イオン交換ステップにより、核酸様ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質などの工程関連不純物が減少する。対象とする抗体が、カラムの固相、例えば、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）と相互作用も結合もしないが、多くの不純物が、カラムの固相と相互作用および結合するという事実により、分離は起こる。陰イオン交換は、約１２℃で行うことができる。
【００９８】
ある種の実施形態では、イオン交換ステップが最初に採用されることに依存して、陽イオン交換または陰イオン交換溶出液は、次に例えば１６インチのＣｕｎｏ（商標）デリピッドフィルターを用いて濾過する。デリピッドフィルターを用いるこの濾過に続いて、例えば、３０インチの０．４５／０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ（商標）二重層フィルターカートリッジを用いることができる。イオン交換溶出バッファーは、フィルター中に残る残留量を流すために使用でき、限界濾過／透析濾過のために調製することができる。
【００９９】
限界濾過／透析濾過ステップを遂行するために、濾過媒体は、可溶性バッファー、例えば、ｐＨ７．０の２０ｍＭのリン酸ナトリウム中で調製する。塩化ナトリウムなどの塩、例えば１００ｍＭ塩化ナトリウムを添加して、イオン強度を増加させることができる。この限界濾過／透析濾過ステップは、抗ＩＬ−１２抗体の濃縮、酢酸ナトリウムの除去およびｐＨの調整に役立つ。商業的なフィルターが、このステップを達成するために利用可能である。例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅは、３０ｋＤの分子量のカットオフ（ＭＷＣＯ）セルロース限界フィルターメンブレンカセットを製造している。この濾過手順は、室温またはその付近で行うことができる。
【０１００】
ある種の実施形態では、上記の捕獲濾過ステップからの試料を、第２のイオン交換分離に供する。好ましくは、この第２のイオン交換分離は、第１のイオン交換分離の反対の電荷に基づいた分離を含む。例えば、陰イオン交換ステップを一次回収後に採用すれば、第２のイオン交換クロマトグラフィステップは、陽イオン交換ステップである。反対に、一次回収ステップに続いて陽イオン交換ステップを行えば、そのステップに続いて陰イオン交換ステップを行う。ある種の実施形態では、第１のイオン交換の溶出を、適切なバッファーの条件に調整する場合、第１のイオン交換の溶出は、第２のイオン交換クロマトグラフィステップに直接供することができる。適した陰イオンおよび陽イオン分離の物質および条件は、上記に説明する。
【０１０１】
本発明のある種の実施形態では、抗ＩＬ−１２抗体を含む試料は、疎水性相互作用分離ステップを用いてさらに処理される。かかるステップに適したカラムの非限定的な例は、ベッドボリュームが約７５Ｌである、直径８０ｃｍ×長さ１５ｃｍのカラムであり、これに限定されないが、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデンのＰｈｅｎｙｌ  ＨＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）などのＨＩＣに使用される適切な樹脂を充填する。対象とする抗体を含む、前の陰イオン交換クロマトグラフィステップから得たフロースルー調製物は、ｐＨ７．０の同等量のおよそ１．７Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウムで希釈することができる。これを、次いで０．４５／０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ（商標）２二重層フィルターまたはその同等物を用いて、濾過に供することができる。ある種の実施形態では、疎水性クロマトグラフィ手順は、２つ以上のサイクルを含む。
【０１０２】
ある種の実施形態では、ＨＩＣカラムは、適したバッファーを用いて最初に平衡化する。適したバッファーの非限定的な例は、ｐＨ７．０の、０．８５Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウムである。当業者は、緩衝剤の濃度を変化させることによって、および／または同等のバッファーを代用することによって、平衡化バッファーを変えることができ、これも本発明の範囲内である。ある種の実施形態では、カラムに、次いで陰イオン交換のフロースルー試料を負荷し、複数回、例えば３回、硫酸アンモニウム／リン酸ナトリウムなどの適した緩衝系で洗浄する。適した緩衝系の例には、およそ７．０のｐＨを有する、１．１Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファーが挙げられる。場合によって、カラムは、さらなる洗浄サイクルを受けることができる。例えば、第２洗浄サイクルは、適切な緩衝系を用いて、例えば１から７回の複数のカラム洗浄を含むことができる。適した緩衝系の非限定的な例には、ｐＨ７．０の、０．８５Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウムが挙げられる。１つの態様では、負荷したカラムは、適切な緩衝系を用いて、第３洗浄をさらに受ける。カラムは、およそｐＨ７．０で、１．１Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウムなどの緩衝系を用いて、複数回、例えば１から３回洗浄することができる。再び当業者は緩衝条件を変えることができ、これも本発明の範囲内である。
【０１０３】
カラムは、適切な溶出バッファーを用いて溶出する。かかる溶出バッファーの適した例は、およそｐＨ７．０の０．５Ｍの硫酸アンモニウム、１５ｍＭのリン酸ナトリウムである。対象とする抗体は、ピークの上側３ＯＤ２８０ｎｍから下側３ＯＤ２８０ｎｍまで従来の分光光度計を用いて検出および収集することができる。
【０１０４】
本発明のある種の態様では、疎水性クロマトグラフィステップからの溶出液は、存在すれば、インタクトなウイルスを含むウイルス粒子の除去のために、濾過に供することができる。適した濾過の非限定的な例は、Ｐａｌｌ社のＵｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ５０（商標）フィルターである。他のウイルス用フィルターをこの濾過ステップに使用でき、当業者によく知られている。ＨＩＣ溶出液は、約０．１μｍの事前に湿らしたフィルターおよびおよそ３４ｐｓｉｇで２×３０インチのＵｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ５０（商標）フィルタートレインに通す。ある種の実施形態では、濾過工程に続いて、フィルターハウジング中に保持された任意の抗体を除去するために、例えばＨＩＣ溶出バッファーを用いて、フィルターを洗浄する。フィルターは、およそ１２℃で事前に滅菌した容器中に保管することができる。
【０１０５】
ある種の実施形態では、上記からの濾液を、再び限界濾過／透析濾過に供する。当業者の終点が、例えば医薬製剤における抗体の使用であれば、このステップは重要である。この工程を採用する場合、これにより、抗体の濃縮、事前に使用する緩衝塩の除去および特定の処方用バッファーとこれとの交換を促進することができる。ある種の実施形態では、処方用バッファーの複数容量、例えば２容量を用いる連続的な透析濾過を行う。適した処方用バッファーの非限定的な例は、ｐＨ５．９の、５ｍＭのメチオニン、２％のマンニトール、０．５％のショ糖のバッファー（Ｔｗｅｅｎは含まない）である。このダイアボリューム交換が完了すると、抗体は濃縮される。抗体が所定の濃度に達成されると、次いで当業者は、Ｔｗｅｅｎの最終濃度が約０．００５％（ｖ／ｖ）に達するように添加するべきである１０％のＴｗｅｅｎの量を計算することができる。
【０１０６】
本発明のある種の実施形態は、さらなる精製ステップを含む。イオン交換クロマトグラフィ方法の前、間または後に行うことができる追加の精製手順の例には、エタノール沈殿、等電点電気泳動、逆相ＨＰＬＣ、シリカにおけるクロマトグラフィ、ヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）におけるクロマトグラフィ、さらなる陰イオン交換クロマトグラフィおよび／またはさらなる陽イオン交換クロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティクロマトグラフィ（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体、特異的な基質、リガンドまたは捕獲剤としての抗原を用いる）が挙げられる。
【０１０７】
本発明のある種の実施形態では、抗ＩＬ−１２抗体は、図１に概説される重鎖および軽鎖の可変領域の配列を含むＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＭのアイソタイプの抗体である。好ましい実施形態では、抗ＩＬ−１２抗体は、図１に概説される重鎖および軽鎖の可変領域の配列を含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のアイソタイプの抗体であり、より好ましくは、抗ＩＬ−１２抗体は、図１に概説される重鎖および軽鎖の可変領域の配列を含むＩｇＧ１抗体である。
【０１０８】
５．試料純度のアッセイ方法
本発明は、単離／精製した抗体組成物中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の残留レベルを決定するための方法も提供する。上記のように、ＨＣＰは、望ましくは最終標的物質産物、すなわち抗ＩＬ−１２抗体から排除される。典型的なＨＣＰは、抗体産生の源から生じるタンパク質を含む。標的抗体からＨＣＰを同定し、十分に除去できなければ、低下した有効性および／または被験者の有害な反応を引き起こし得る。
【０１０９】
本明細書で使用するとき、用語「ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ」は、アッセイに使用する二次抗体が、抗体、すなわち抗ＩＬ−１２抗体を生成するために使用される細胞、例えばＣＨＯ細胞から産生されるＨＣＰに特異的である場合のＥＬＩＳＡをいう。二次抗体は、当業者に既知の従来の方法によって産生することができる。例えば、二次抗体は、見せかけの産生および精製の実行によって得られるＨＣＰを用いて、産生することができる、すなわち、対象とする抗体を産生するために使用する同じ細胞株を使用するが、細胞株に抗体ＤＮＡを形質移入しない。典型的な実施形態では、二次抗体は、最適な細胞発現系、すなわち、標的抗体を産生するために使用する細胞発現系において発現するＨＣＰと同様のものを用いて産生する。
【０１１０】
一般的に、ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡは、抗体の２つの層、すなわち一次抗体および二次抗体の間にＨＣＰを含む液体試料をサンドイッチするステップを含む。試料中のＨＣＰが一次抗体、例えばこれに限定されないが、アフィニティ精製したヤギ抗ＣＨＯ（Ｃｙｇｎｕｓ）によって捕獲される時間の間、試料を温置する。抗体を生成するために使用した細胞から精製したＨＣＰに特異的な、標識した二次抗体または抗体のブレンド、例えばビオチン化した抗ＣＨＯ  ＨＣＰを添加し、試料内のＨＣＰに結合させる。ある種の実施形態では、一次および二次抗体は、ポリクローナル抗体である。ある種の態様では、一次および二次抗体は、ＨＣＰに対して産生されたポリクローナル抗体のブレンド、例えば、これに限定されないが、ビオチン化ヤギ抗宿主細胞タンパク質混合物５９９／６２６／７４８である。試料中に含まれるＨＣＰの量は、二次抗体の標識に基づく適切な試験を用いて決定される。
【０１１１】
ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡは、上記のセクションＩＩＩに記載した方法を用いて得た溶出液またはフロースルーなどの抗体組成物中のＨＣＰのレベルを決定するために使用することができる。本発明は、抗体を含む組成物も提供し、ＨＣＰの酵素結合免疫吸着測定法（「ＥＬＩＳＡ」）によって決定するとき、前記組成物は、検出可能なレベルのＨＣＰを有さない。
【０１１２】
６．さらなる修飾
本発明の抗ＩＬ−１２抗体は、修飾することができる。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−１２抗体またはこの抗原結合フラグメントを化学的に修飾し、所望の効果をもたらす。例えば、本発明の抗体および抗体フラグメントのペグ化は、例えば、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる次の文献：Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ３：４−１０頁（１９９２）；ＥＰ０１５４３１６およびＥＰ０４０１３８４に記載のような、当技術分野で既知の任意のペグ化反応によって行うことができる。１つの態様では、ペグ化は、ポリエチレングリコール分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって行う。本発明の抗体および抗体フラグメントのペグ化のための適した水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。本明細書で使用するとき、「ポリエチレングリコール」は、モノ（Ｃｌ−ＣｌＯ）アルコキシまたはアリールオキシポリエチレングリコールなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用されるＰＥＧの任意の形態を包含することを意味する。
【０１１３】
本発明のペグ化された抗体および抗体フラグメントを調製するための方法は、一般的に（ａ）抗体または抗体フラグメントが、１つ以上のＰＥＧ基に付着するのに適した条件下で、抗体または抗体フラグメントと、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコールとを反応させるステップおよび（ｂ）反応生成物を得るステップを含む。既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて、最適な反応条件またはアシル化反応を選択することは、当業者に明らかである。
【０１１４】
ペグ化した抗体および抗体フラグメントは、一般的に本明細書に記載の抗ＩＬ−１２抗体および抗体フラグメントを投与することによって、本発明のＩＬ−１２関連障害を治療するために使用することができる。一般的に、ペグ化した抗体および抗体フラグメントは、非ペグ化抗体および抗体フラグメントと比較して、増加した半減期を有する。ペグ化した抗体および抗体フラグメントは、単独に、一緒にまたは他の医薬組成物との組合せで、採用することができる。
【０１１５】
本発明の抗体または抗体部分は、別の機能性分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に誘導体化または連結することができる。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、イムノアドへシン分子を含む、本明細書に記載の誘導体化および他のやり方で修飾したヒト抗ｈＩＬ−１２抗体の形態を含むことを意図する。例えば、本発明の抗体または抗体部分は、別の抗体（例えば、二重特異的な抗体または二重特異性抗体）、検出可能な薬剤、細胞毒性薬、医薬品および／または抗体もしくは抗体分子と（ストレプトアビジンのコア領域またはポリヒスチジンタグなどの）他の分子との会合を媒介できるタンパク質もしくはペプチドなどの１つ以上の分子要素に、（化学的共役、遺伝子的融合、非共有結合または他のやり方によって）機能的に連結することができる。
【０１１６】
誘導体化した抗体の１つのタイプは、（例えば、二重特異的な抗体を作成する、同じタイプまたは異なるタイプの）２つ以上の抗体と架橋結合することによって生成する。適したクロスリンカーは、適切なスペーサーによって明瞭に分離される２つの反応基を有するヘテロ二重機能的（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはホモ二重機能的（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）なものが挙げられる。かかるリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ロックフォード、ＩＬ．から入手することができる。
【０１１７】
本発明の抗体または抗体部分を誘導体化できる有用な検出可能な薬剤は、蛍光性化合物を含む。典型的な検出可能な蛍光性薬剤には、フルオレセン、フルオレセンイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルフォニルクロリド、フィコエリトリンなどが挙げられる。抗体は、アルカリンホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素で誘導体化することもできる。抗体を検出可能な酵素で誘導体化するとき、それは、酵素が検出可能な反応産物の生成に使用する追加の試薬を添加することによって検出することができる。例えば、検出可能な薬剤の西洋ワサビペルオキシダーゼが存在するとき、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加により、検出可能な有色の反応生成物がもたらされる。抗体は、ビオチンを用いて誘導体化することもでき、アビジンまたはスプレプトアビジン結合の直接的な測定によって検出することもできる。
【０１１８】
７．医薬組成物
本発明の抗体および抗体部分は、患者への投与に適した医薬組成物中に組み込むことができる。典型的に、医薬組成物は、本発明の抗体または抗体部分および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用するとき、「薬学的に許容される担体」は、生理的に適合性のある任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される担体の例には、１つ以上の水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなどおよびこれらの組合せが挙げられる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えばマンニトール、ソルビトールなどの糖、多価アルコールまたは塩化ナトリウムを含むことが望ましい。薬学的に許容される担体は、抗体または抗体部分の有効期間または効果を増強させる、少量の湿潤剤または乳化剤などの補助物質、保存剤またはバッファーをさらに含むことができる。
【０１１９】
本発明の抗体および抗体部分は、非経口投与に適した医薬組成物中に組み込むことができる。抗体または抗体部分は、例えば、０．１−２５０ｍｇ／ｍＬの抗体を含む注射可能な溶液として調製することができる。注射可能な溶液は、フリントまたはアンバーバイアル中の液体または凍結乾燥型投与形態、アンプルまたは事前に満たしたシリンジのいずれかから構成することができる。バッファーは、ｐＨ５．０から７．０（最適はｐＨ６．０）のＬ−ヒスチジンおよそ１−５０ｍＭ（最適は５−１０ｍＭ）であってよい。他の適したバッファーには、これに限定されないが、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムが挙げられる。塩化ナトリウムは、０−３００ｍＭの濃度（最適は液体型投与形態について１５０ｍＭ）で、溶液の毒性を修正するために使用することができる。抗凍結剤は、凍結乾燥型投与形態について、主に０−１０％のスクロース（最適は０．５−１．０％）を含むことができる。他の適した抗凍結剤には、トレハロースおよびラクトースが挙げられる。バルク剤は、凍結乾燥型投与形態について、主に１−１０％のマンニトール（最適は２４％）を含むことができる。安定化剤は、液体および凍結乾燥型投与形態の両方で使用でき、主に１−５０ｍＭのＬ−メチオニン（最適は５−１０ｍＭ）である。他の適したバルク剤には、グリシン、アルギニンが挙げられ、０−０．０５％のポリソルベート８０（最適は０．００５−０．０１％）として含むことができる。追加の界面活性剤には、これに限定されないが、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤が挙げられる。
【０１２０】
１つの態様では、医薬組成物は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇの投薬量で抗体を含む。別の態様では、抗体の投薬量には、１週間おきの投与でおよそ１ｍｇ／ｋｇまたは毎週の投与でおよそ０．３ｍｇ／ｋｇが挙げられる。当業者は、患者への投与のために適切な投薬量および投与計画を突き止めることができる。
【０１２１】
本発明の組成物は、様々な形態であってよい。これらには、例えば、液体溶液（例えば、注射および注入可能な溶液）、分散剤または懸濁液、錠剤、丸剤、粉末、リポソームおよび坐薬などの液体、半固体および固体の投与形態が挙げられる。形態は、例えば目的とする投与様式および治療の適用に依存する。典型的な組成物は、他の抗体によるヒトの受動免疫化に使用するものと同様の組成物などの、注射および注入可能な溶液の形態である。１つの投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。１つの態様では、抗体は、静脈内注射または注入によって投与する。別の態様では、抗体は、筋肉内または皮下注射によって投与する。
【０１２２】
治療用組成物は、典型的に、製品および貯蔵の条件下で無菌および安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散剤、リポソームまたは高い薬物濃度に適した他の整った構造として処方することができる。無菌の注射可能な溶液は、適切な溶媒中で必要とされる量の活性化合物（すなわち、抗体または抗体部分）に、上記に列挙される成分の１つまたは組合せを組み込むことによって調製することができ、必要に応じて、続いて濾過滅菌する。一般的に、分散剤は、基本的な分散剤媒体および上記の列挙からの必要とされる他の成分を含む無菌媒介物中に、活性化合物を組み込むことによって調製する。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌の凍結乾燥した粉末の場合、調製方法は、前に滅菌濾過したその溶液から、活性成分の粉末に加えて任意の追加の所望の成分を生成する、真空乾燥および噴霧乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散剤の場合に必要とされる粒子サイズの維持および界面活性剤の使用によって維持することができる。注射可能な組成物の遷延性吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアレート塩およびゼラチンを含むことによってもたらすことができる。
【０１２３】
本発明の抗体および抗体部分は、当技術分野で既知の様々な方法によって投与することができ、投与の１つの経路／様式は、皮下注射、静脈内注射または注入である。当業者に理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に依存して変わる。ある種の実施形態では、活性化合物は、移植、経皮パッチおよびマイクロカプセル化した送達系が挙げられる放出調節した製剤などの、迅速な放出に対して化合物を保護する担体とともに調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤を調製するための多くの方法は、特許を取られている、または一般的に当業者に既知である。例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８を参照されたい。
【０１２４】
ある種の態様では、本発明の抗体または抗体部分は、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な食用担体を用いて、経口的に投与することができる。化合物（および所望されれば他の成分）は、錠剤中に圧縮したまたは患者の食事の中に直接組み込んだ硬いまたは柔らかいゼラチンシェル中に封入することもできる。経口の治療用投与のために、組成物は、賦形剤とともに組み込むことができ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハーなどの形態で使用することができる。非経口投与以外によって本発明の化合物を投与するために、その不活性化を防ぐ物質で化合物をコートするまたはそれと化合物とを共投与することが必要になり得る。
【０１２５】
補充的な活性化合物も、組成物中に組み込むことができる。ある種の態様では、本発明の抗体または抗体部分は、ＩＬ−１２活性が有害である障害を治療するのに有用である１つ以上の追加の治療剤と共処方および／または共投与する。例えば、本発明の抗ｈＩＬ−１２抗体または抗体部分は、他の標的と結合する１つ以上の追加の抗体（例えば、他のサイトカインと結合するまたは細胞表面分子と結合する抗体）と共処方および／または共投与することができる。さらに、本発明の１つ以上の抗体は、２つ以上の前述の治療剤と組み合わせて使用することができる。かかる組合せ治療は、より低い投薬量の投与される治療剤を好都合に利用することができ、したがって可能性のある毒性または様々な単独治療に関連する合併症を回避することができる。本発明の抗体を、組合せ治療の一部として使用するとき、抗体を単独で患者に投与するときより、低い投薬量の抗体を所望することができることは当業者に理解される（例えば、相乗的な治療効果が、組合せ治療の使用によって達成でき、順により低い用量の抗体の使用により、所望の治療効果の達成が可能になる）。
【０１２６】
本発明の抗体またはこの抗原結合部分が、単独でまたは追加の薬剤、例えば治療剤と組み合わせて使用でき、前記追加の薬剤が、その意図する目的のために当業者によって選択されることは理解されたい。例えば、追加の薬剤は、本発明の抗体によって治療する疾患または状態を治療するのに有用であると当技術分野で認識されている治療剤であってよい。追加の薬剤は、治療用組成物に有益な貢献をもたらす薬剤、例えば、組成物の粘性に影響する薬剤であってもよい。
【０１２７】
本発明内に含まれ得る組合せが、それらの意図する目的に有用なそれらの組合せであることもさらに理解されたい。以下に示される薬剤は例示であり、限定することを意図していない。本発明の一部である組合せは、本発明の抗体および以下のリストから選択される少なくとも１つの追加の薬剤であってよい。組合せは、１つ以上の追加の薬剤、例えば、形成される組成物がその意図される機能を果たせるような組合せであれば、２または３つの追加の薬剤を含むこともできる。
【０１２８】
いくつかの組合せは、イブプロフェン様薬物を含むＮＳＡＩＤＳともいわれる非ステロイド性抗炎症薬（複数可）である。他の組合せは、プレドニゾロンを含む副腎皮質ステロイドであり、よく知られているステロイド使用の副作用は、本発明の抗ＩＬ−１２抗体と組み合わせて患者を治療するときに必要とされるステロイド用量を減らすことによって、低下または排除することさえできる。本発明の抗体または抗体部分と組み合わせることができる、関節リウマチ用の治療剤の非限定的な例には、次のもの：サイトカイン抑制性抗炎症薬（複数可）（ＣＳＡＩＤ）；他のヒトサイトカインまたは増殖因子、例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦに対する抗体またはこのアンタゴニストが挙げられる。本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ９０またはＣＤ１５４を含むそれらのリガンド（ｇｐ３９またはＣＤ４０Ｌ）などの細胞表面分子に対する抗体と組み合わせることができる。
【０１２９】
治療剤のいくつかの組合せは、自己免疫および続く炎症カスケードにおける異なる時点で干渉でき、例にはＴＮＦアンタゴニスト様キメラ、ヒト化またはヒトＴＮＦ抗体、Ｄ２Ｅ７、（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、１９９６年２月９日に出願された米国出願第０８／５９９，２２６号明細書）、ｃＡ２（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標））、ＣＤＰ５７１、抗ＴＮＦ抗体フラグメント（例えばＣＤＰ８７０）および可溶性ｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体、その誘導体、すなわちｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｅｎｂｒｅｌ（商標））またはｐ５５ＴＮＦＲ１ｇＧ（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ）、可溶性ＩＬ−１３受容体（ｓＩＬ−１３）およびＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤も挙げられ、同様にＩＬ−１阻害剤（例えば、Ｖｘ７４０またはＩＬ−１ＲＡなどのインターロイキン１変換酵素阻害剤）は、同じ理由から効果的であり得る。他の組合せは、インターロイキン１１、抗Ｐ７およびｐセレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）を含む。さらなる他の組合せは、ＩＬ−１２の機能に平行、依存または協調して働き得る自己免疫応答の他のキープレーヤーを含み、特に、ＩＬ−１８抗体もしくは可溶性ＩＬ−１８受容体またはＩＬ−１８結合タンパク質を含むＩＬ−１８アンタゴニストが含まれる。ＩＬ−１２およびＩＬ−１８は、オーバーラップを有するが、両方に対するアンタゴニストの異なる機能および組合せは、もっとも効果的であり得ることが示された。さらなる別の組合せは、非枯渇性抗ＣＤ４阻害剤を含む。さらなる他の組合せは、抗体、可溶性受容体またはアンタゴニストのリガンドを含む、同時刺激経路ＣＤ８０（Ｂ７．１）またはＣＤ８６（Ｂ７．２）のアンタゴニストを含む。
【０１３０】
本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、メトトレキサート、６−ＭＰ、アザチオプリンスルファサラジン、メサラジン、オルサラジンクロロキニン／ヒドロキシクロロキン、ペンシルアミン、金チオリンゴ酸（筋肉内および経口）、アザチオプリン、コチシン、副腎皮質ステロイド（経口、吸入および局所注射）、β−２アドレナリン受容体アゴニスト（サルブタモール、テルブタリン、サルメテラル）、キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）、クロモグリク酸、ネドクロミル、ケトチフェン、イプラトロピウムおよびオキシトロピウム、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノレートモフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤｓ、例えば、イブプロフェン、プレドニゾロンなどの副腎皮質ステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害薬、アデンソシンアゴニスト、抗血栓薬、補体阻害薬、アドレナリン系薬剤、ＴＮＦαまたはＩＬ−１などの炎症誘発性サイトカインによってシグナル伝達に干渉する薬剤（例えばＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼ阻害剤）、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤（例えばＶｘ７４０）、抗Ｐ７、ｐセレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤、キナーゼ阻害剤などのＴ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体およびその誘導体（例えば、可溶性ｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体および誘導体ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｅｎｂｒｅｌ．ＴＭ．）およびｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ）、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、可溶性ＩＬ−１３受容体（ｓＩＬ−１３））および抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３およびＴＧＦβ）などの薬剤と組み合わせることができる。いくつかの組合せは、メトトレキサートまたはレフルノミドを含み、中等度または重度の関節リウマチの場合、シクロスプリンを含む。
【０１３１】
本発明の抗体または抗体部分と組み合わせることができる炎症性腸疾患用の治療剤の非限定的な例には、次のもの：ブデノシド、上皮増殖因子、副腎皮質ステロイド、シクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチル酸、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ阻害薬、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化薬、トロンボキサン阻害剤、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体、抗ＩＬ−１６モノクローナル抗体、増殖因子、エラスターゼ阻害剤、ピリジニルイミダゾール化合物、他のヒトサイトカインまたは増殖因子、例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦに対する抗体またはこのアンタゴニストが挙げられる。本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０などの細胞表面分子またはそれらのリガンドに対する抗体と組み合わせることができる。本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、メトトレキサート、シクロスプリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノレートモフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤｓ、例えばイブプロフェン、プレドニゾロンなどの副腎皮質ステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害薬、アデノシンアゴニスト、抗血栓薬、補体阻害薬、アドレナリン系薬剤、ＴＮＦαまたはＩＬ−１などの炎症誘発性サイトカインによってシグナル伝達に干渉する薬剤（例えばＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼ阻害剤）、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤（例えばＶｘ７４０）、抗Ｐ７、ｐセレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、キナーゼ阻害剤などのＴ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体およびその誘導体（例えば、可溶性ｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、可溶性ＩＬ−１３受容体（ｓＩＬ−１３））および抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３およびＴＧＦβ）などの薬剤と組み合わせることができる。
【０１３２】
抗体または抗原結合部分と組み合わせることができるクローン病用の治療剤の例には、次のもの：ＴＮＦアンタゴニスト、例えば、抗ＴＮＦ抗体、Ｄ２Ｅ７（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、１９９６年２月９日に出願された米国出願第０８／５９９，２２６号明細書）、ｃＡ２（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標））、ＣＤＰ５７１、抗ＴＮＦ抗体フラグメント（例えばＣＤＰ８７０）、ＴＮＦＲ−Ｉｇ構築物（ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｅｎｂｒｅｌ（商標））およびｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ）、抗Ｐ７、ｐセレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）、可溶性ＩＬ−１３受容体（ｓＩＬ−１３）およびＰＤＥ４阻害剤が挙げられる。本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、副腎皮質ステロイド、例えば、ブデノシドおよびデキサメタソンと組み合わせることができる。本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、スルファサラジン、５−アミノサリチル酸およびオルサラジン、ならびにＩＬ−１などの炎症誘発性サイトカインの合成または作用に干渉する薬剤、例えばＩＬ−１変換酵素阻害剤（例えばＶｘ７４０）およびＩＬ−１ｒａとも組み合わせることができる。本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤６−メルカプトプリンとも使用することができる。本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、ＩＬ−１１と組み合わせることができる。
【０１３３】
本発明の抗体または抗体部分と組み合わせることができる多発性硬化症用の治療剤の非限定的な例には、次のもの：副腎皮質ステロイド、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、４−アミノピリジン、チザニジン、ＩＦＮβ１ａ（Ａｖｏｎｅｘ；Ｂｉｏｇｅｎ）、ＩＦＮβ１ｂ（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ；Ｃｈｉｒｏｎ／Ｂｅｒｌｅｘ）、コポリマー１（Ｃｏｐ−１、Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）、高圧酸素、静脈内免疫グロブリン、クラブリビン、他のヒトサイトカインまたは増殖因子、例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦに対する抗体またはこのアンタゴニストが挙げられる。本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９０またはそれらのリガンドなどの細胞表面分子に対する抗体と組み合わせることができる。本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、メトトレキサート、シクロスプリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノレートモフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤｓ、例えばイブプロフェン、プレドニゾロンなどの副腎皮質ステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害薬、アデノシンアゴニスト、抗血栓薬、補体阻害薬、アドレナリン系薬剤、ＴＮＦαまたはＩＬ−１などの炎症誘発性サイトカインによってシグナル伝達に干渉する薬剤（例えばＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼ阻害剤）、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤（例えばＶｘ７４０）、抗Ｐ７、ｐセレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）、ＴＡＣＥ阻害剤、キナーゼ阻害剤などのＴ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体およびその誘導体（例えば、可溶性ｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、可溶性ＩＬ−１３受容体（ｓＩＬ−１３））および抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３およびＴＧＦβ）などの薬剤と組み合わせることもできる。
【０１３４】
抗体またはこの抗原結合タンパク質と結合することができる多発性硬化症用の治療剤の例には、ＩＦＮβ、例えばＩＦＮβ１ａおよびＩＦＮβ１ｂ、コパキソン、副腎皮質ステロイド、ＩＬ−１阻害剤、ＴＮＦ阻害剤ならびにＣＤ４０リガンドおよびＣＤ８０に対する抗体が挙げられる。
【０１３５】
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体または抗体部分の「治療的有効量」または「予防的有効量」を含むことができる。「治療的有効量」とは、所望の治療結果を達成するために必要な投薬量および期間での効果的な量をいう。抗体または抗体部分の治療的有効量は、病態、年齢、性別および個人の体重などの因子ならびに個人において所望の応答を誘発する抗体または抗体部分の能力によって変えることができる。治療的有効量は、抗体または抗体部分の任意の毒性または有害な効果より、治療的に有益な効果が勝るものでもある。「予防的有効量」とは、所望の予防効果を達成するために必要な投薬量および期間での効果的な量をいう。典型的に、予防的用量は、疾患の初期段階より前またはそのときに患者において使用し、予防的有効量は、治療的有効量より少なくなる。
【０１３６】
投薬計画は、最適な所望の応答（例えば、治療または予防の応答）をもたらすように調整することができる。例えば、単回ボーラスを投与でき、いくつかの分割した用量を経時的に投与でき、または治療状況の緊急性が示されるとき、用量を比例的に減少または増加させることができる。ある種の実施形態では、各投与についての投薬単位形態および投与の均一性において、非経口組成物を処方することは特に好都合である。本明細書で使用するとき、投薬単位形態とは、治療する哺乳動物の患者に対する単一の投薬量として適した、物理的に別々の単位をいい、各単位は、必要とされる薬学的担体と関連して所望の治療効果をもたらすために計算された、活性化合物の所定の量を含む。本発明の投薬単位形態に関する規格は、（ａ）活性化合物の独特の特徴および達成すべき特定の治療または予防効果ならびに（ｂ）個人における感受性の治療のための、かかる活性化合物の配合の当技術分野における固有の制限によって決定され、およびこれに直接依存する。
【０１３７】
本発明の抗体または抗体部分の治療的または予防的有効量に関する典型的な非限定的範囲は、０．０１−２０ｍｇ／ｋｇまたは１−１０ｍｇ／ｋｇまたは０．３−１ｍｇ／ｋｇである。投薬量の値が、緩和すべき状態のタイプおよび重症度とともに変わり得ることに注目されたい。任意の特定の患者に関する具体的な投与計画は、個人の必要性および投与するまたは組成物の投与を監督する人の専門的な判断に従って、経時的に調整されるべきであり、本明細書に示される投薬量の範囲は、単に模範例であり、特許請求される組成物の範囲または実行を制限することを意図しないことをさらに理解されたい。
【０１３８】
８．本発明の抗体の使用
８．１  一般的な使用
ＩＬ−１２に結合するそれらの能力を所与とし、本発明の抗ＩＬ−１２抗体またはこの部分は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または組織の免疫組織化学などの従来のイムノアッセイを用いて、（例えば、試料母体、１つの態様では血清または血漿などの生物試料中の）ＩＬ−１２、１つの態様ではｈＩＬ−１２を検出するために使用することができる。本発明は、本発明の抗体または抗体部分と試料を接触させるステップおよびＩＬ−１２に結合した抗体（もしくはは抗体部分）または結合していない抗体（もしくは抗体部分）のいずれかを検出し、それによって試料中のＩＬ−１２を検出するステップを含む、生物試料中のＩＬ−１２を検出するための方法を提供する。抗体は、検出可能な物質で直接または間接的に標識し、結合したまたは結合していない抗体の検出を促進する。適した検出可能な物質には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が挙げられる。適した酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリンホスファターゼ、βガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適した補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、適した蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセン、フルオレセンイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例には、ルミノールが挙げられ、適した放射性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。試料中のＩＬ−１２の検出は、診断状況、例えば、増加したＩＬ−１２に関連する状態の診断に有用であり得、および／または抗ＩＬ−１２抗体での治療から恩恵を受け得る患者を同定するのに有用であり得る。
【０１３９】
抗体の標識の代替として、例えば、検出可能な物質で標識したｒｈＩＬ−１２基準物質および標識していない抗ｈＩＬ−１２抗体などの抗ＩＬ−１２抗体を利用して、競合的イムノアッセイによって試料中でＩＬ−１２をアッセイすることができる。このアッセイにおいて、試料、標識ｒｈＩＬ−１２標準物質および抗ｈＩＬ−１２抗体を組合せ、非標識抗体に結合した標識ｒｈＩＬ−１２標準物質の量を決定する。試料中のｈＩＬ−１２の量は、抗ｈＩＬ−１２抗体に結合した標識ｒｈＩＬ−１２標準物質の量に反比例する。
【０１４０】
本発明の抗体および抗体部分は、インビトロおよびインビボでのＩＬ−１２活性、１つの態様ではｈＩＬ−１２活性を中和することができる。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、例えば、ＩＬ−１２を含む細胞培養物中、ヒト患者中または本発明の抗体が架橋反応するＩＬ−１２を有する他の哺乳動物患者（例えば、ヒヒ、カニクイザルおよびアカゲザルなどの霊長類）中で、ＩＬ−１２活性を阻害するために使用することができる。１つの態様では、本発明は、ヒトＩＬ−１２ならびにヒヒＩＬ−１２、マーモセットＩＬ−１２、チンパンジーＩＬ−１２、カニクイザルＩＬ−１２およびアカゲザルＩＬ−１２から成る群から選択される少なくとも１つの追加の霊長類ＩＬ−１２の活性を中和するが、マウスＩＬ−１２の活性は中和しない、単離されたヒト抗体またはこの抗体結合部分を提供する。１つの態様では、ＩＬ−１２は、ヒトＩＬ−１２である。例えば、ｈＩＬ−１２を含むまたは含む疑いのある細胞培養物中で、本発明の抗体または抗体部分を培養液に添加し、培養物中のｈＩＬ−１２活性を阻害することができる。
【０１４１】
別の態様では、本発明は、ＩＬ−１２活性が有害である障害に苦しむ患者において、ＩＬ−１２活性を阻害するための方法を提供する。ＩＬ−１２は、幅広い様々な障害の病態生理において関連付けられた（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｉｎｄｈａｇｅｎら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１９８５−１９９６頁；Ｍｏｒｉｔａら（１９９８）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ．４１：３０６−３１４頁；Ｂｕｃｈｔら（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３：３４７−３６７頁；Ｆａｉｓら（１９９４）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ．１４：２３５−２３８頁；Ｐｙｒｒｏｎｃｈｉら（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５０：８２３−８３２頁；Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅら（１９９７）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１１２：１１６９−１１７８頁およびＢｅｒｒｅｂｉら（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ  １５２：６６７−６７２頁；Ｐｙｒｒｏｎｃｈｉら（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５０：８２３−８３２頁）。本発明は、かかる障害に苦しむ患者において、ＩＬ−１２活性を阻害するための方法を提供し、方法は、患者においてＩＬ−１２活性を阻害するように、本発明の抗体または抗体部分を患者に投与するステップを含む。１つの態様では、ＩＬ−１２はヒトＩＬ−１２であり、患者はヒトの患者である。あるいは、患者は、本発明の抗体が架橋反応するＩＬ−１２を発現する哺乳動物であってよい。よりさらなる患者は、（例えば、ｈＩＬ−１２の投与またはｈＩＬ−１２導入遺伝子の発現によって）ｈＩＬ−１２を導入した哺乳動物であってよい。本発明の抗体は、治療目的のためにヒト患者に投与することができる。その上、本発明の抗体は、獣医学の目的のため、またはヒト疾患の動物モデルとして、抗体が架橋結合するＩＬ−１２を発現する非ヒト哺乳動物に投与することができる。後者に関して、かかる動物モデルは、本発明の抗体の治療的有効性の評価に有用であり得る（例えば、投薬量の試験および投与の時間経過）。
【０１４２】
本明細書で使用するとき、表現「ＩＬ−１２活性が有害である障害」は、障害に苦しむ患者においてＩＬ−１２の存在が、障害または障害の悪化に寄与する因子のいずれかの病態生理の原因であることが示された、またはその疑いがある疾患および他の障害を含むことを意図する。したがって、ＩＬ−１２活性が有害である障害は、ＩＬ−１２活性の阻害により、障害の症状および／または進行が緩和することが期待される障害である。かかる障害は、例えば、障害に苦しむ患者の体液中のＩＬ−１２濃度の増加（例えば、患者の血清、血漿、滑液などにおけるＩＬ−１２濃度の増加）によって証明でき、例えば、上記のような抗ＩＬ−１２抗体を用いて検出することができる。ＩＬ−１２活性が有害である障害の例は多数ある。１つの態様では、抗体またはこの抗原結合部分は、本明細書に記載の疾患または障害を扱う治療に使用することができる。別の態様では、抗体またはこの抗原結合部分は、本明細書に記載の疾患または障害を治療するための医薬品の製造に使用することができる。数種の非限定的で具体的な疾患の治療における本発明の抗体および抗体部分の使用は、以下にさらに議論する。
【０１４３】
インターロイキン１２は、免疫および炎症の要素に関わる様々な疾患に関連する病理において、重要な役割を果たす。これらの疾患には、これに限定されないが、関節リウマチ、骨関節炎、若年性慢性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー疾患、乾癬、皮膚炎  強皮症、アトピー性皮膚炎、移植片対宿主疾患、臓器移植拒絶、臓器移植に伴う急性または慢性免疫疾患、サルコイドーシス、粥状動脈硬化、播種性血管内凝固、川崎病、グレーブス病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ウェゲナー肉芽腫症、ヘノッホシェーンライン紫斑、腎臓の顕微鏡的血管炎、慢性活動性肝炎、ぶどう膜炎、敗血症性ショック、毒素性ショック症候群、敗血症症候群、悪液質、感染症、寄生虫病、後天性免疫不全症候群、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、心筋梗塞、アジソン病、散発性、多腺性欠乏症Ｉ型および多腺性欠乏症ＩＩ型、シュミット症候群、成人（急性）呼吸促迫症候群、脱毛症、円形脱毛症、血清反応陰性関節炎（ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｒｔｈｏｐａｔｈｙ）、関節症、ライター病、乾癬性関節症、潰瘍性大腸炎性関節症、腸疾患性滑膜炎、クラミジア、関節症に伴うエルシニアおよびサルモネラ、脊椎関節症、アテローム性疾患／動脈硬化症、アトピー性アレルギー、自己免疫性水疱症、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状ＩｇＡ病、自己免疫性溶血性貧血、クームス陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋痛性脳炎／ロイヤルフリー病、慢性粘膜皮膚カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、原因不明の自己免疫性肝炎、後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全関連疾患、Ｃ型肝炎、一般変異型免疫不全（分類不能型低ガンマグロブリン血症）、拡張型心筋症、女性不妊症、卵巣機能不全、早期卵巣機能不全、線維性肺疾患、原因不明の線維化肺胞炎、炎症後間質性肺疾患、間質性肺炎、間質性肺疾患に伴う結合組織病、肺疾患に伴う混合性結合組織病、間質性肺疾患に伴う全身性硬化症、間質性肺疾患に伴う関節リウマチ、肺疾患に伴う全身性エリテマトーデス、肺疾患に伴う皮膚筋炎／多発性筋炎、肺疾患に伴うシェーグレン病、肺疾患に伴う強直性脊椎炎、血管炎性びまん性肺疾患、肺疾患に伴うヘモシデリン沈着症、薬剤性間質性肺疾患、放射線線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後間質性肺疾患、痛風性関節炎、自己免疫性肝炎、１型自己免疫性肝炎（古典的自己免疫性またはルポイド肝炎）、２型自己免疫性肝炎（抗ＬＫＭ抗体肝炎）、自己免疫媒介型低血糖、黒色表皮腫を伴うＢ型インスリン抵抗性、副甲状腺機能低下症、臓器移植に伴う急性免疫疾患、臓器移植に伴う慢性免疫疾患、骨関節症、原発性硬化性胆管炎、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎疾患ＮＯＳ、糸球体腎炎、顕微鏡的腎血管炎、ライム病、円板状エリテマトーデス、男性不妊特発性またはＮＯＳ、精子自己免疫、多発性硬化症（全サブタイプ）、インスリン依存性糖尿��、交感性眼炎、結合組織病に対する二次的な肺高血圧症、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎の肺症状  、急性リウマチ熱、リウマチ性脊椎炎、スチル病、全身性硬化症、高安病／動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫自己免疫性甲状腺機能低下症（橋本病）、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、ぶどう膜炎、原発性血管炎ならびに白斑が挙げられる。本発明のヒト抗体および抗体部分は、自己免疫疾患、特にリウマチ性脊椎炎、アレルギー、自己免疫性糖尿病および自己免疫性ぶどう膜炎が挙げられる、炎症を伴う疾患を治療するために使用することができる。
【０１４４】
ある種の態様では、本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病および乾癬を治療するために使用される。
【０１４５】
８．２  関節リウマチにおける使用
インターロイキン１２は、関節リウマチなどの炎症性疾患に役割を果たすことが関連付けられた。誘発性ＩＬ−１２ｐ４０のメッセージは、関節リウマチ患者由来の滑液中に検出され、ＩＬ−１２は、関節リウマチを有する患者由来の滑液中に存在することが示された（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｒｉｔａら（１９９８）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ４１：３０６−３１４頁を参照されたい）。ＩＬ−１２陽性細胞は、関節リウマチの滑膜の下内層中に存在することが見出された。本発明のヒト抗体および抗体部分は、例えば、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、ライム関節炎、リウマチ性脊椎炎、骨関節炎および痛風性関節炎を治療するために使用することができる。典型的に、抗体または抗体部分は、全身的に投与されるが、ある種の障害については、抗体または抗体部分の局所投与が有益であり得る。本発明の抗体または抗体部分は、自己免疫疾患の治療に有用な１つ以上の追加の治療剤とともに投与することもできる。
【０１４６】
関節リウマチ用のコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）マウスモデルにおいて、関節炎より前に、抗ＩＬ−１２ｍＡｂ（ラット抗マウスＩＬ−１２モノクローナル抗体、Ｃ１７．１５）でマウスを処置することにより、発症が大いに抑制され、疾患の発症率および重症度が低下した。関節炎の発症後、早期に抗ＩＬ−１２ｍＡｂで処置することにより、重症度は低下したが、疾患発症後に抗ＩＬ−１２ｍＡｂでマウスを処置する後者は、疾患重症度に最小の効果を有した。
【０１４７】
８．３  クローン病における使用
インターロイキン１２は、炎症性腸疾患、すなわちクローン病にも役割を果たす。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２の増加した発現が、クローン病を有する患者の腸粘膜において起こる（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆａｉｓら（１９９４）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ．１４：２３５−２３８頁；Ｐｙｒｒｏｎｃｈｉら（１９９７）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５０：８２３−８３２頁；Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅら（１９９７）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１２：１１６９−１１７８頁；Ｂｅｒｒｅｂｉら（１９９８）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５２：６６７−６７２頁を参照されたい）。抗ＩＬ−１２抗体は、大腸炎のマウスモデル、例えば、ＴＮＢＳ誘導型大腸炎ＩＬ−２ノックアウトマウスおよび最近ではＩＬ−１０ノックアウトマウスにおいて、疾患を抑制することが示された。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、炎症性腸疾患の治療に使用することができる。
【０１４８】
８．４  多発性硬化症における使用
インターロイキン１２は、多発性硬化症の主要なメディエーターとして関連付けられた。誘導性ＩＬ−１２ｐ４０のメッセージまたはＩＬ−１２自体の発現は、多発性硬化症を有する患者の病変において実際に示すことができる（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｉｎｄｈａｇｅｎら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １８２：１９８５−１９９６頁、Ｄｒｕｌｏｖｉｃら（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１４７：１４５−１５０頁）。多発性硬化症を有する慢性進行性の患者は、ＩＬ−１２の上昇した血中濃度を有する。多発性硬化症を有する患者由来のＴ細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いる研究により、Ｔｈ１型免疫応答を引き起こす進行性多発性硬化症の基礎として、免疫相互作用の自己永続的な一連が明らかになった。Ｔ細胞からのＩＦＮ−γの増加した分泌により、ＡＰＣによるＩＬ−１２の増加した産生が引き起こされ、Ｔｈ１型免疫活性化および疾患の慢性状態を引き起こす循環が永続化した（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｌａｓｈｏｖら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：５９９−６０３頁）。多発性硬化症におけるＩＬ−１２の役割は、マウスおよびラットの多発性硬化症の実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルを用いて研究した。マウスにおける多発性硬化症の再発寛解型ＥＡＥモデルにおいて、抗ＩＬ−１２ｍＡｂを用いて前処理することにより、麻痺が遅延され、臨床スコアが減少した。麻痺のピークで、または続く寛解期間の間に、抗ＩＬ−１２ｍＡｂで処理することにより、臨床スコアが減少した。したがって、本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、ヒトにおいて多発性硬化症に関連する症状を緩和させる働きをし得る。
【０１４９】
８．５  インスリン依存性糖尿病における使用
インターロイキン１２は、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の重要なメディエーターとして関連付けられた。ＩＤＤＭは、ＩＬ−１２の投与によってＮＯＤマウスにおいて誘発され、抗ＩＬ−１２抗体は、ＩＤＤＭの養子伝達モデルにおいて保護的であった。早期発症のＩＤＤＭ患者は、いくつかの残りの島細胞機能が維持される、いわゆる「ハネムーン期間」をしばしば経験する。これらの残りの島細胞は、インスリンを産生し、インスリン投与より優れた血中グルコース濃度を制御する。抗ＩＬ−１２抗体でこれらの早期発症患者を治療することにより、島細胞のさらなる破壊を防ぐことができ、それによってインスリンの内在性供給源が維持できる。
【０１５０】
８．６  乾癬における使用
インターロイキン１２は、乾癬における主要なメディエーターとして関連付けられた。乾癬は、ＴＨ１型サイトカイン発現プロファイルに関連する急性および慢性皮膚病変に関わる（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｍｉｄら（１９９６）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：２２５−２３１頁；Ｔｕｒｋａら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１：６９０−６９９頁）。ＩＬ−１２ｐ３５およびｐ４０のｍＲＮＡは、罹患したヒトの皮膚試料中に検出された。したがって、本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、慢性皮膚障害であるかかる乾癬を緩和させる働きをし得る。
【実施例】
【０１５１】
１．抗ＩＬ−１２抗体の単離／精製
この実施例は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および他の不純物から抗ＩＬ−１２抗体を精製する１つの計画を提供する。
【０１５２】
一次回収
ｐＨの低下による一次回収、遠心分離および濾過を、産生バイオリアクターの収集物から細胞および細胞残骸を除去するために用いた。対象とする抗体、培地および細胞を含む培養物を、１時間ｐＨ３．５にして不活性化し、３０００Ｌの産生バイオリアクターにおいて、可能性のあるｐＨ感受性ウイルス混入物を死滅させ、培地／細胞混入物を沈殿させた。培養物を次いでｐＨ４．９まで調整した。ｐＨの低下は、２０から４０分の経過にわたって３Ｍのクエン酸で達成した。ｐＨの上昇は、２０から４０分の経過にわたって３Ｍの水酸化ナトリウムを用いて行った。これらの操作は、２０℃の温度で起きた。ｐＨ不活性化後、培養物を、貯蔵タンクとして使用される別のバイオリアクター中に遠心分離した。遠心分離は、２８Ｌ／分の供給速度で１１，０００×ｇで実行した。排出間隔量を３００秒に設定し、１５０の低い濁度レベルを達成した。遠心分離フィルターを、１２個の１６インチのＣｕｎｏ（商標）モデル３０／６０ＺＡ深層フィルターおよび３つの３０インチの０．４５／０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ（商標）フィルターカートリッジを装着した３つの円形フィルターハウジングを含むフィルタートレインに通した。清澄化した懸濁液を、事前に滅菌した３０００Ｌの固定型収集タンク中に収集し、８℃で維持した。イオン交換クロマトグラフィの前に、温度を２０℃まで調整した。
【０１５３】
２８０８５ＢＩ、２８２０４ＢＩ、２８２０６ＢＩ、２８２０７ＢＩおよび３４１４２ＢＩと名付けた様々な試料について、収穫でのＡＢＴ−８７４の力価は、平均３．９１ｍｇ／ｍＬで３．７６から４．０５ｍｇ／ｍＬの範囲に及んだ。細胞培養ブロスのｐＨ低下の保持および続くｐＨ上昇ならびに収集物の遠心分離により、平均８２％および標準偏差２．７７で７７％から８４％の範囲に及ぶ大量の回収収率がもたらされた（表２および３を参照されたい）。抗体の定量化は、このステップ全体にわたって（当業者によく知られている）ＰｏｒｏｓＡ（商標）定量化アッセイを用いて決定した。
【０１５４】
【表２】
2012506384.tif 000004
【０１５５】
【表３】
2012506384.tif 000005
【０１５６】
陽イオン交換
陽イオン交換捕獲クロマトグラフィステップの目的は、深層濾過からの抗体の捕獲および工程関連不純物（例えば、低分子量種の抗体および培地成分に関連する宿主細胞タンパク質）の減少である。ＣＭ  ＨｙｐｅｒＤＦ（商標）樹脂（Ｐａｌｌ社）を、この工程ステップに利用した。ＣＭ  ＨｙｐｅｒＤＦ（商標）捕獲ステップは、外気温で行った。
【０１５７】
直径８０ｃｍ×長さ２３ｃｍのカラム（ベッドボリューム１１６Ｌ）を、この操作に使用した。事前の平衡化、平衡化、負荷、洗浄および再生カラムステップを、１６．０Ｌ／分（線速度＝１９１ｃｍ／時）で行った。溶出、取り除き、洗浄、中和、衛生化および貯蔵のカラムステップを、９．２Ｌ／分（線速度＝１１０ｃｍ／時）で行った。カラムを、ｐＨ５．０の２１０ｍＭ酢酸ナトリウムで平衡化した。平衡化に続いて、カラムに、ＵＳＰ精製水でインラインで希釈する清澄化した収集物を負荷した。カラムに、樹脂１リットルにつき最大８０ｇのタンパク質で負荷した（１サイクルにつき≦９２４８ｇ）。カラムを次いで洗浄して平衡バッファーでベースラインにした。産物を、ｐＨ５．０の７９０ｍＭの酢酸ナトリウムで溶出した。溶出の収集物は、抗体の溶出ピークの上側３ＯＤ２８０ｎｍから下側８ＯＤ２８０ｎｍまでであった。
【０１５８】
カラムを１Ｍの塩化ナトリウムで再生し、１Ｍの酢酸／２０％のイソプロピルアルコールで脂質洗浄し、ｐＨ５．０の７９０ｍＭの酢酸ナトリウムで洗浄し、０．５Ｍの水酸化ナトリウムに続いて７９０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で衛生化し、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、２０％のイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）で貯蔵した。
【０１５９】
ＣＭ  ＨｙｐｅｒＤＦ（商標）クロマトグラフィステップの１サイクルを、試験する各試料ロットについて行った。試料ロットについての平均負荷は、６５．２７から６８．６２ｇ／Ｌの範囲に及ぶ１．３７の標準偏差で、６７．３８ｇ抗体／Ｌ  ＣＭ  ＨｙｐｅｒＤＦ（商標）樹脂であった（表４および５を参照されたい）。産物の回収収率は、ロット２９００１ＢＦ、２９００８ＢＦ、３０００５ＢＦ、３０００６ＢＦおよび３５０３６ＢＦについて平均８８％および標準偏差５．１７で、８３％から９６％の範囲に及んだ。清澄化した収集物について、抗体の定量化を、ＰｏｒｏｓＡ（商標）定量化アッセイを用いて決定し、ＣＭ  ＨｙｐｅｒＤＦ（商標）溶出液について、Ａ２８０ｎｍの定量化を用いた。ＣＭ  ＨｙｐｅｒＤＦ（商標）の溶出産物ピークの下側についてのカッティング基準は、二重軽鎖の産物関連抗体種をカットして産物純度を達成するために高くした。これにより、全体のＣＭ  ＨｙｐｅｒＤＦ（商標）クロマトグラフィステップの収率の進行がおよそ９５％から中央８０％になった。
【０１６０】
５サイクルについて、サイズ排除（ＳＥ）ＨＰＬＣによる純度の有意差がなかったことに注目した。表１６は、標準偏差０．６７で単量体ＩｇＧについて９４．７６％の平均を示す。
【０１６１】
【表４】
2012506384.tif 000006
【０１６２】
【表５】
2012506384.tif 000007
【０１６３】
捕獲限界濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）
ＣＭ  ＨｙｐｅｒＤＦ（商標）溶出液を、デリピッド深層濾過（１×１６インチ、Ｃｕｎｏ（商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に続いて０．４５／０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ（商標）二重層フィルターカートリッジ（１×３０インチ）により濾過した。ＣＭ  ＨｙｐｅｒＤＦ（商標）溶出バッファーの７９０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０を、フィルターに残った残留量を流すために使用した。デリピッドのＣＭ  ＨｙｐｅｒＤＦ（商標）溶出液の限界濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）を、対象とする抗体を濃縮し、酢酸ナトリウムを除去し、ｐＨ７．０の１００ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのリン酸ナトリウム中の産物のバッファー交換をするために行った。３０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を用いるＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社の再生セルロース限界濾過型メンブレンカセットを、外気温でこのステップに使用した。
【０１６４】
産物の添加開始の前に、３０ｋＤの再生したセルロースメンブレンを、ｐＨ５．０の７９０ｍＬの酢酸ナトリウムで流した。デリピッドのＣＭ  ＨｙｐｅｒＤＦ（商標）溶出液を、入口圧力２０−３０ｐｓｉｇおよび出口圧力１０−１５ｐｓｉｇで、４０ｇ／Ｌタンパク質に濃縮し、残余分は速度５２Ｌ／分から１０４Ｌ／分で流した。最少でｐＨ７．０の、１００ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのリン酸ナトリウムの６容量を用いて連続的透析濾過を行った。ＵＦ系から、次いで標的濃度４２．５ｇ／Ｌタンパク質で産物を排出した。系を、透析濾過バッファーでリンスし、系において維持した産物を回収した。濃縮および洗浄を組み合わせて、透析濾過したＡＢＴ−８７４を生成した。このステップは、外気温で行った。試料母体を、ＯｐｔｉｃａｐＸＬＴ３０（商標）カプセルの２．０／１．２μｍのフィルターに続いて０．４５／０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ（商標）二重層フィルターカートリッジ（１×３０インチ）で濾過した。
【０１６５】
ＣＭ  ＨｙｐｅｒＤＦ（商標）溶出液のデリピッド濾過およびＵＦ／ＤＦステップにより、様々な試料ロット（すなわち、２９００１ＢＦ、２９００８ＢＦ、３０００５ＢＦ、３０００６ＢＦおよび３５０３６ＢＦ）について、８０％−９４％の範囲に及ぶ、平均産物回収収量５．９２Ｋｇがもたらされた（表６および７を参照されたい）。
【０１６６】
ＳＥ−ＨＰＬＣによる純度は、５サイクルについて許容可能であった。表１６は、標準偏差０．５７でＩｇＧについて平均９５．７９％を示す。
【０１６７】
【表６】
2012506384.tif 000008
【０１６８】
【表７】
2012506384.tif 000009
【０１６９】
陰イオン交換クロマトグラフィ
陰イオン交換クロマトグラフィにより、ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質などの工程関連不純物が減少した。この工程ステップは、主な抗体産物がＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）に結合しないが、不純物が結合する場合、フロースルー様式のクロマトグラフィである。このステップおよび続くステップは、捕獲ＵＦ／ＤＦ中間産物を、可動性密封タンク中の最終生成物一式に移行させた後、１２±２℃でＣｌａｓｓ１０，０００精製スーツにおいて行った。
【０１７０】
直径６０ｃｍ×長さ３０ｃｍのカラム（ベッドボリューム８５Ｌ）を使用した。カラムに、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ陽イオン交換クロマトグラフィ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデン）を充填した。全カラムステップは、３．５Ｌ／分で実行するカラムの保管を除いて、７．０Ｌ／分（線速度＝１５０ｃｍ／時）で行った。
【０１７１】
ｐＨ８．０の、５０ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのトリスの７つのカラム容積（ＣＶ）を用いて、カラムを平衡化した。このステップについての最大のタンパク質負荷は、樹脂１Ｌにつき５０ｇ（１サイクルにつき≦４２５０ｇ）であった。サイクル間に１Ｍの塩化ナトリウムの再生のみで、このカラムを２サイクル行った。捕獲ＵＦ／ＤＦ物質を、ｐＨ８．０の２５ｍＭのトリスで、およそ２倍希釈した。これにより、ｐＨ７．５から８．１、約７．０ｍＳ／ｃｍでのＱ負荷になった。希釈した捕獲ＵＦ／ＤＦ物質の負荷後、カラムを平衡バッファーで洗浄した。対象とする抗体を含むフロースルーを、負荷後に洗浄を含む、ピークの上側３ＯＤ２８０ｎｍから下側３ＯＤ２８０ｎｍを収集した。これは、Ｑフロースルーに加えて洗浄（Ｑ  ＦＴＷ）であった。
【０１７２】
第２サイクルの後、カラムを１Ｍの塩化ナトリウムで再生し、注射用水（ＷＦＩ）で洗浄し、１Ｍの水酸化ナトリウムで１時間衛生化し、ｐＨ７．０の、１Ｍの塩化ナトリウム、２５ｍＭのリン酸ナトリウムで洗浄してｐＨの低下をもたらし、次いで２５ｍＭのリン酸ナトリウム、２０％のＩＰＡで貯蔵した。
【０１７３】
Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラムの２サイクルを、生成した各試料ロットについて行った。１サイクルにつき平均の負荷は、３４．８および３１ｇ／Ｌ樹脂（それぞれサイクルＡおよびサイクルＢ）であり、２９．０１から３７．１３ｇ／Ｌの範囲に及んだ（表８および９を参照されたい）。両サイクルを含む全体のステップの収率は、標準偏差１７．８で９２％であった。このステップにより、典型的には９９から１０１％が生成された（試料ロット２９００１ＢＦ、２９００８ＢＦ、３０００５ＢＦおよび３０００６ＢＦ）。Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＴＷの全体の収量は、５つのバッチについて２５．８１ｋｇであった。Ｑ負荷のｐＨは、ロット３０００６ＢＦについて約６．０から６．７ｍＳ／ｃｍの伝導率でｐＨ７．５であった。
【０１７４】
５サイクルについてＳＥ−ＨＰＬＣによる純度は、標準偏差０．５３でＩｇＧについて平均９６．７５％を示す（表１６）。
【０１７５】
【表８】
2012506384.tif 000010
【０１７６】
【表９】
2012506384.tif 000011
【０１７７】
ＨＩＣクロマトグラフィ
疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）を、抗体凝集体および工程関連不純物の除去に使用し、最終産物の規格にする。このステップは、クロマトグラフィの結合および溶出の様式である。陰イオン交換産物（試料）を、高塩濃度バッファー（硫酸アンモニウム）中に入れ、カラムに結合させ、３回洗浄後にカラムから溶出した。
【０１７８】
直径８０ｃｍ×長さ１５ｃｍのカラム（ベッドボリューム７５Ｌ）をこの手順に使用した。カラムに、Ｐｈｅｎｙｌ  ＨＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）疎水性相互作用樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデン）を充填した。Ｑ  ＦＴＷ（推定的に対象とする抗体を含む）を、ｐＨ７．０の、同等量の１．７Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウムで希釈し、次いで０．４５／０．２μｍのＳａｒｔｐｏｒｅ（商標）二重層フィルター（１×３０インチ）に通して濾過した。Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰを、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰ樹脂１Ｌにつき４０ｇのＡＢＴ−８７４の最大の負荷で２サイクル実行した（１サイクルにつき≦３０００ｇ）。
【０１７９】
Ｐｈｅｎｙｌ負荷をカラム上に負荷し、ｐＨ７．０の、０．８５Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウムの５つのＣＶで平衡化した。産物の負荷に続いて、カラムを洗浄１（ｐＨ７．０の、１．１Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム）の３つのＣＶ、洗浄２（ｐＨ７．０の、８５Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム）の１から７つのＣＶ、次いで洗浄３（ｐＨ７．０の、１．１Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム）の３つのＣＶで洗浄した。
【０１８０】
カラムを、溶出バッファー、すなわちｐＨ７．０の、０．５Ｍの硫酸アンモニウム、１５ｍＭのリン酸ナトリウムで溶出した。試料産物を、ピークの上側３ＯＤ２８０ｎｍから下側３ＯＤ２８０ｎｍで収集した。
【０１８１】
平衡化、負荷、洗浄１、洗浄２および洗浄３は、６．２Ｌ／分（線速度＝７４ｃｍ／時）で行った。溶出、再生、ＷＦＩ洗浄、衛生化および貯蔵のカラムステップは、３．１Ｌ／分（線速度＝３７ｃｍ／時）で行った。
【０１８２】
カラムを、サイクル間で注射用水（ＷＦＩ）の４つのＣＶ、１ＭのＮａＯＨの３つのＣＶおよびサイクル間でＷＦＩの４つのＣＶで再生した。最終サイクルの後、カラムを貯蔵バッファー、すなわち２５ｍＭのリン酸ナトリウム、２０％のＩＰＡの５つのＣＶに供した。
【０１８３】
ＨＩＣの２サイクルを、各試料ロットについて行った。サイクルにつき平均の負荷は、３２．５４および３４．００ｇ／Ｌ樹脂（それぞれサイクルＡおよびサイクルＢ）であり、２１．７７から３７．７９ｇ／Ｌの範囲に及んだ（表１０および１１を参照されたい）。サイクルＡおよびＢを組み合わせた全体の産物回収収率は、試料ロット２９００１ＢＦ、２９００８ＢＦ、３０００５ＢＦ、３０００６ＢＦおよび３５０３６ＢＦについて、平均８４％、標準偏差１．８７で８１％から８６％の範囲に及んだ。合計２０．９４ＫｇのＡＢＴ−８７４が、全ての凝集性Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰクロマトグラフィステップにわたって精製された。
【０１８４】
ＰｈｅｎｙｌバッチについてのＳＥＣ−ＨＰＬＣによる純度は、標準偏差０．１１でＩｇＧについて平均９９．６３％を有した（表１６）。純度のパーセントは、抗体関連凝集体ＩｇＧおよび二重軽鎖（低分子量種）を減少させる、対象とする抗体の精製物を用いる疎水性クロマトグラフィ手順の間に上昇した。これは、洗浄２バッファー（ＳＲ−３４２：ｐＨ７の、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．８５Ｍの硫酸アンモニウム）で達成された。このバッファーは、二重軽鎖抗体の低分子量種を溶出し、Ａ２８０ｎｍがわずかに増加した後に実行され、負荷および洗浄１の流速の半分である流速（１分につき６．２から３．１Ｌの流速の低下）で、約１つのカラム体積で安定にする。凝集体は、カラムのＰｈｅｎｙｌ樹脂に結合し、抗体が溶出するときの０．５Ｍの硫酸アンモニウムバッファーの基準では溶出しないことによって除去された。
【０１８５】
【表１０】
2012506384.tif 000012
【０１８６】
【表１１】
2012506384.tif 000013
【０１８７】
ウイルス濾過
ＨＩＣステップからのＰｈｅｎｙｌ溶出液を、Ｕｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ５０（商標）ウイルス除去濾過ステップを用いて濾過した。Ｕｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ５０（商標）ステップにより、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰカラム溶出液中に存在し得る直径≧５０ｎｍの外来性ウイルスの物理的除去が可能になる。
【０１８８】
疎水性相互作用カラムの溶出液を、≦３４ｐｓｉｇで、事前に湿潤した０．１μｍのフィルターおよび２×３インチのＵｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ５０（商標）フィルタートレイン（Ｐａｌｌ社）に通した。濾過後、フィルターをＨＩＣ溶出バッファーで流し、フィルターハウジング中に保持された任意のＡＢＴ−８４７を除去した。Ｕｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ５０（商標）フィルターを、最終のＵＦ／ＤＦの処方ステップの前に、事前に滅菌したタンク中に１２℃±２℃で貯蔵した。
【０１８９】
ＤＶ５０（商標）濾過ステップからの産物回収収率は、様々な試料の実行について、平均収率１００％で９７％から１０２％の範囲に及んだ（表１２および１３を参照されたい）。抗体産物の総量２０．９９Ｋｇを、５つの試料ロットについて処理した。
【０１９０】
【表１２】
2012506384.tif 000014
【０１９１】
【表１３】
2012506384.tif 000015
【０１９２】
最終の限界濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）
最終のＵＦ／ＤＦステップは、抗体の濃縮、硫酸アンモニウムの除去およびｐＨ５．９の、５ｍＭのヒスチジン、５ｍＭのメチオニン、２％のマンニトール、０．５％のショ糖、０．００５％のＴｗｅｅｎ８０中の抗体産物の処方であった。３０ｋＤの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を用いるＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社の再生セルロース限界濾過型メンブレンカセットをこのステップに使用した。
【０１９３】
Ｕｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ５０（商標）濾過物を３０ｇ／Ｌタンパク質に濃縮した。ｐＨ５．９の、５ｍＭのメチオニン、２％のマンニトール、０．５％のショ糖のバッファー（Ｔｗｅｅｎは含まない）の２容量の連続的透析濾過を行った。産物を次いで４０ｇ／Ｌに濃縮すると、ほとんどの硫酸アンモニウムが除去された。ｐＨ５．９の、５ｍＭのメチオニン、２％のマンニトール、０．５％のショ糖のバッファー（Ｔｗｅｅｎは含まない）の６容量を用いる連続的透析濾過を行った。これらの６つのダイアボリュームの交換が完了すると、抗体は７５ｇ／Ｌに濃縮された。ＵＦ系は、次いで産物を排出し、透析濾過バッファーでリンスして、系に維持された産物を回収した。この濃縮および洗浄を組み合わせて、透析濾過したＡＢＴ−８７４を生成し、続いて追加の処方バッファーで≧６５ｇ／Ｌに調整した。標的濃度を確認するとすぐに、計算を行って、濃縮したＵＦ残余分に添加して薬物におけるＴｗｅｅｎ８０の最終濃度を０．００５％（ｖ／ｖ）にしなければならない１０％のＴｗｅｅｎ８０を含む処方バッファーの量を決定した。処方した薬物の最終濃度は、≧６５ｇ／Ｌであった。抗体試料を、ＯｐｔｉｃａｐＸＬＴ３０（商標）カプセル２．０／１．２μｍフィルターに続いて０．４５／０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ（商標）二重層フィルターから無菌容器中に濾過し、次いで最終の瓶詰めのために調製におけるＣｌａｓｓ１００領域に移行した。
【０１９４】
ＵＦ／ＤＦステップからの産物回収収率は、５つの実行について標準偏差２．２２、平均収率９７．０％で９４％から１００％の範囲に及んだ（表１４および１５を参照されたい）。この最終ＵＦ／ＤＦの最後に、総量２０．５１Ｋｇの抗体産物が存在した。全体として、ＵＦ／ＤＦ濾過ステップは、実行するのに非常に一貫した実行であった。１０ｋＤカットオフメンブレンよりむしろ３０ｋＤカットオフメンブレンを使用した方が、収率を犠牲にすることなく、より速い処理時間を可能にした。
【０１９５】
【表１４】
2012506384.tif 000016
【０１９６】
【表１５】
2012506384.tif 000017
【０１９７】
【表１６】
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【０１９８】
２．抗ＩＬ−１２抗体組成物における宿主細胞タンパク質濃度の決定
この手順では、抗ＩＬ−１２抗体試料中の残留宿主細胞タンパク質濃度を決定するための試験方法論を記載する。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、特異抗体の２つの層の間に宿主細胞タンパク質（抗原）をサンドイッチする。これに続いて、カゼインを用いて非特異的部位をブロックする。宿主細胞タンパク質を、次いで抗原分子が一次抗体に捕獲される間、温置する（抗原のコーティング）。抗原（宿主細胞タンパク質）に固定する二次抗体（ビオチン化した抗宿主細胞タンパク質）を次いで添加する。ビオチン化抗宿主細胞タンパク質に結合するＨＲＰコンジュゲート型ニュートラアビジンを添加する。これに続いてＫブルーサブストレートを添加する。青色を生成する発色性基質を、結合した酵素コンジュゲート型抗体によって加水分解する。色を黄色に変える２ＭのＨ３ＰＯ４で反応を止める。色の強度は、ウェル中の結合した抗原の量に直接的に比例する。
【０１９９】
ｐＨ９．４の５０ｍＭの重炭酸ナトリウム（コーティングバッファー）の調製。１Ｌのビーカーに、９００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑウォーター；４．２０ｇ±０．０１ｇの重炭酸ナトリウムを添加する。完全に溶解するまで撹拌する。１ＮのＮａＯＨでｐＨ９．４まで調整する。１Ｌのメスフラスコに移行し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑウォーターで体積を増やす。均一になるまで逆回転により混合する。０．２２μｍの無菌フィルターユニットに通して濾過する。調製の日から最大７日間、名目上４℃で貯蔵する。
【０２００】
０．１０４ＭのＮａ２ＨＰＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１．３７ＭのＮａＣｌ、０．０２７ＭのＫＣｌ、０．０１７６ＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝６．８−６．９（１０×ＰＢＳ）の調製。およそ４００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑウォーターをガラスビーカーに添加する。１３．９４ｇ±０．０１ｇのＮａ２ＨＰＯ４×７Ｈ２Ｏを添加する。４０．０ｇ±０．１ｇのＮａＣｌを添加する。１．００ｇ±０．０１ｇのＫＣｌを添加する。１．２０ｇ±０．０１ｇのＫＨ２ＰＯ４を添加する。均一になるまで撹拌する。５００ｍＬのメスフラスコに移行する。Ｍｉｌｌｉ−ＱウォーターでＱＳを５００ｍＬの体積にする。逆回転により混合する。０．２μｍの無菌フィルターユニットに通して濾過する。室温で最大７日間貯蔵する。
【０２０１】
１×ＰＢＳ＋０．１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ７．４０（プレート洗浄バッファー）の調製。４Ｌのメスシリンダー中で、４００ｍＬの１０×ＰＢＳ（ステップ５．２）と３５００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑウォーターを混合する。ｐＨを確認し、必要に応じて１ＮのＨＣｌまたは１ＮのＮａＯＨで７．４０±０．０５に調整する。Ｍｉｌｌｉ−Ｑウォーターで体積を増やす。シリンダーをパラフィルムできつく覆い、均一になるまで逆回転により混合する。４Ｌのボトルに移行する。４ｍＬの１×ＰＢＳを除去し、捨てる。４ｍＬのトリトンＸ−１００を３９９６ｍＬの１×ＰＢＳに添加する。撹拌プレート上に置き、完全に溶解するように撹拌する。希釈バッファーの調製に必要な量のプレート洗浄バッファーを、０．２２μｍの無菌フィルターユニットに通して濾過する。最大７日間、室温で貯蔵する。
【０２０２】
コーティング抗体混合物：アフィニティ精製したヤギ抗ＣＨＯ５９９／６２６／７４８（ロット＃Ｇ１１２０１＠１．５３４ｍｇ／ｍＬ）の調製。注意：バイアル中で名目上−８０℃で貯蔵した貯蔵物である。アリコートを調製する。使用時に１プレートにつき１アリコート取り出す。使用する前にすぐに、次のように冷たい５０ｍＭの重炭酸ナトリウム中で最終濃度４μｇ／ｍＬになるように抗体混合物を希釈する。例えば、３１μＬのコーティング抗体混合物を１１９６９μＬの冷たいコーティングバッファーに添加する。逆回転により穏やかに混合する。
【０２０３】
ビオチン化ヤギ抗宿主細胞タンパク質混合物、５９９／６２６／７４８（ロット＃Ｇ１１２０２＠０．８２２ｍｇ／ｍＬ）の調製。注意：バイアル中で名目上−８０℃で貯蔵した貯蔵物である。アリコートを調製する。使用時に１プレートにつき１アリコート取り出す。使用する前にすぐに、次のように３７℃±２℃のカゼイン中で最終濃度１μｇ／ｍＬになるようにビオチン化抗体混合物を希釈する。例えば、１４．６μＬのビオチン化抗体混合物を１１９８５μＬの３７℃±２℃のカゼインに添加する。逆回転により穏やかに混合する。
【０２０４】
ニュートラアビジン−ＨＲＰの調製。次のように新しいロット（２ｍｇ／バイアル）を１ｍｇ／ｍＬに再構築する。４００μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑウォーターをバイアルに添加し、次いで１６００μＬの１×ＰＢＳを添加し、全体で２ｍＬにする。混合するために穏やかにボルテックスする。名目上−２０℃で貯蔵する。１プレートにつき１アリコートを使用できるように、所望の体積のアリコートを調製する。ポリプロピレンチューブ中で調製する。新しいロットを限定して作業用濃度を決定する。調製の日から６カ月の終了を指定する。例えば、作業用濃度が０．２μｇ／ｍＬと決定されれば、次のように調製する。使用する前にすぐに、室温でニュートラアビジン−ＨＲＰのアリコートを解凍する。１ｍｇ／ｍＬのニュートラアビジン溶液を３７℃±２℃のカゼインで０．１ｍｇ／ｍＬ（１００μｇ／ｍＬ）に希釈する。例えば、×１０希釈し、５０μＬのニュートラアビジンを４５０μＬのカゼインに添加する。混合するために穏やかにボルテックスルする。１００μｇ／ｍＬ溶液を３７℃±２℃のカゼインで０．２μｇ／ｍＬにさらに希釈する。例えば、×５００希釈し、２４μＬのニュートラアビジン（１００μｇ／ｍＬ）を１１９７６μＬのカゼインに添加する。混合するために穏やかにボルテックスする。
【０２０５】
５．７２Ｍのリン酸（停止液）の調製。次のように濃縮したリン酸から２Ｍのリン酸溶液を調製する。ラベル上に提示された％リン酸、密度（１．６８５ｇ／ｍＬ）および式量（９８ｇ／モル）から、２Ｍのリン酸５００ｍＬを調製するのに必要な濃縮したリン酸の体積を計算する。上記で計算した濃縮したリン酸の体積をフラスコに添加する。Ｍｉｌｌｉ−Ｑウォーターで体積を増やし、均一になるまで逆回転により混合する。調製の日から最大６カ月間、外気温で貯蔵する。
【０２０６】
希釈溶液（ｐＨ７．４の１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ１００中で×１００希釈したカゼイン）の調製。（上記から得た）ｐＨ７．４の０．２２μｍの滅菌濾過した１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ１００中で３７℃±２℃のカゼインＸ１００を希釈する。例えば、１ｍＬの３７℃±２℃のカゼインを９９ｍＬの０．２２μｍの滅菌濾過した１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ１００、ｐＨ７．４に添加する。ウェルを混合する。各使用について新鮮に調製する。
【０２０７】
標準物質の調製。宿主細胞タンパク質標準物質（抗原標準物質）（ロット＃Ｇ１１２０３＠１．２１８ｍｇ／ｍＬ）。注意：７０μＬアリコート中で名目上−８０℃で貯蔵した貯蔵物である。室温でアリコートを解凍する。希釈バッファーを用いて、ポリプロピレンチューブ中で連続希釈を行う。
【０２０８】
試料の調製。ポリプロピレンチューブにおいて、希釈バッファー中で最終バルク試料を２４ｍｇ／ｍＬに希釈する。濃度を記録する。注意：スパイクした試料の調製および以下に参照の１２ｍｇ／ｍＬの溶液の調製のために以下の溶液を使用する。ポリプロピレンマイクロチューブにおいて、希釈バッファー中で２４ｍｇ／ｍＬの溶液を１２ｍｇ／ｍＬにさらに希釈する。全部で６ウェルについて、プレート上に１２ｍｇ／ｍＬの各溶液をトリプリケートでウェルに負荷する。
【０２０９】
スパイクの調製。ポリプロピレンマイクロチューブにおいて、希釈バッファーで２Ｘ希釈することによって、上記で調製した２０ｎｇ／ｍＬの標準物質から１０ｎｇ／ｍＬの宿主細胞タンパク質スパイクを調製する。１０ｎｇ／ｍＬのスパイク溶液をプレート上の３ウェルに負荷する。スパイク試料について、ステップ６．１から得た２０ｎｇ／ｍＬの標準溶液を使用する。
【０２１０】
スパイクした試料の調製。ポリプロピレンマイクロチューブにおいて、２４ｍｇ／ｍＬの各最終バルク溶液３００μＬを、３００μＬの２０ｎｇ／ｍＬのスパイク溶液（６．１）でスパイクする。全部で６ウェルについて、スパイクした各試料溶液をトリプリケートでウェルに負荷する。
【０２１１】
対照の調製。対照の範囲は、通例の試験で使用する前に、新しい対照貯蔵溶液ごとに設定しなければならない。対照貯蔵物は、１５０μＬのアリコートのバッチのＡＢＴ−８７４薬物濃度を調製し、最大３年間、名目上−８０℃で凍結貯蔵する。
【０２１２】
作業用対照の調製。対照のアリコートを室温で解凍する。ポリプロピレンチューブ中で、希釈バッファーで対照を２４ｍｇ／ｍＬに希釈する。ポリプロピレンマイクロチューブ中で、２４ｍｇ／ｍＬの対照溶液を希釈バッファーで１２ｍｇ／ｍＬにさらに希釈する。単一の希釈液を調製し、プレートの３ウェル中に対照を負荷する。
【０２１３】
ＥＬＩＳＡの手順。プレート洗浄ボトルをプレート洗浄バッファーで満たす（ステップ５．３を参照されたい。１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ−１００）。プレートウォッシャーを用意する。次のパラメータを確認する。パラメータは、プレートタイプ：各サイクルについて１（全部で５サイクル）、体積：４００μｌ、浸漬時間：１０秒、Ａｓｐ．時間：４秒に設定すべきである。
【０２１４】
アッセイの手順。冷たい５０ｍＭの重炭酸ナトリウム中の４μｇ／ｍＬのヤギコーティング抗体混合物を１００μＬ／ウェルでプレートにコートする。コーティング溶液が、ウェルの底を均一に覆うまで、プレートの側面をたたき、密封テープで覆い、プレートシェーカー（または同等物）上で、１８時間±１時間、スピード３で振動させながら、名目上４℃で温置する。一晩中温置した後、冷蔵庫からプレートを取り出し、室温に平衡化することができる。コーティングを振り落とす。ペーパータオル上でプレートをブロットする。３００μＬ／ウェルの３７℃±２℃のカゼインでブロックし、密封テープで覆い、Ｌａｂ−ｌｉｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎプレートシェーカー（または同等物）上で８０ｒｐｍ±５ｒｐｍで１時間、振動させながら、３７℃±２℃で温置する。ブロッキング温置の間、標準物質、試料、対照、スパイクおよびスパイクした試料を調製する。洗浄バッファーで５回プレートを洗浄する。ペーパータオル上でプレートをブロットする。８チャンネルピペットを用いて、１００μＬ／ウェルの標準物質、試料、スパイク、スパイクした試料およびコントロールを、プレートのトリプリケートのウェル中にピペットで入れる。１００μＬ／ウェルの希釈バッファーを、プレートの全て空のウェル中にピペットで入れ、ブランクとして役立てる。密封テープで覆い、Ｌａｂ−ｌｉｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎプレートシェーカー（または同等物）上で８０ｒｐｍ±５ｒｐｍで１時間、振動させながら、３７℃±２℃で温置する。鋳型を記入し、プレートに負荷するときにガイドとして使用する。
【０２１５】
プレートリーダーの設定。標準物質についての濃度を入力してテンプレートを設定する。試料、対照、スパイクまたはスパイクした試料についての希釈因子は入力しない。全ウェルから差し引く、ブランクとしての希釈液を含むウェルを指定する。プレートを洗浄バッファーで５回洗浄する。ペーパータオル上でプレートをブロットする。１００μＬ／ウェルのビオチン化ヤギ抗体を添加する。密封テープで覆い、Ｌａｂ−ｌｉｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎプレートシェーカー（または同等物）上で８０ｒｐｍ±５ｒｐｍで１時間、振動させながら、３７℃±２℃で温置する。プレートを洗浄バッファーで５回洗浄する。ペータータオル上でプレートをブロットする。１００μＬ／ウェルのニュートラアビジン−ＨＲＰコンジュゲート溶液を添加する。密封テープで覆い、Ｌａｂ−ｌｉｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎプレートシェーカー（または同等物）上で８０ｒｐｍ±５ｒｐｍで１時間、振動させながら、３７℃±２℃で温置する。プレートを洗浄バッファーで５回洗浄する。ペーパータオル上でプレートをブロットする。１００μＬ／ウェルの冷たいＫブルーサブストレートを添加し、密封テープで覆い、Ｌａｂ−ｌｉｎｅタイタープレートシェーカー（または同等物）上でスピード３で振動させながら、室温で１０分間温置する（基質を最初の列に添加したらすぐにタイマーを開始する）。１００μＬ／ウェルの２Ｍのリン酸を添加することによって反応を停止させる（ステップ５．７）。スピード３で３−５分間プレートシェーカー上にプレートを置く。４５０ｎｍでプレートを読み込む。
【０２１６】
データ解析および計算。注意：光学密度が標準曲線の実際的な定量化の限界内に入り、後述の％ＣＶまたは％差の基準を満たす、試料、スパイク、スパイクした試料および対照のみが許容可能である。試料のＯＤが、２．５ｎｇ／ｍＬの標準物質より下に入れば、結果は２．５ｎｇ／ｍＬ以下として報告すべきである。この値を次いで希釈した試料濃度（１２ｍｇ／ｍＬ）で割って、ｎｇ／ｍｇでの値を報告すべきである。上記の標準曲線となる非スパイクおよび／またはスパイクした試料を引き起こす宿主細胞濃度において試料が高ければ、＞１００ｎｇ／ｍＬとして値を報告する。この値を次いで希釈した試料濃度（１２ｍｇ／ｍＬ）で割って、ｎｇ／ｍｇでの値を報告すべきである。試料が、２．５ｎｇ／ｍＬの標準物質より下であるとき、スパイクリカバリー計算について試料の値をゼロと考える。
【０２１７】
標準曲線。標準物質の濃度は、プロトコールのテンプレート中に入力すべきである。二次曲線適合を用いる。決定係数は＝０．９９でなければならず、トリプリケートのウェル間の％ＣＶは＝２０％でなければならない。この基準が満たされなければ、１つの標準物質（１つの濃度、３ウェル）を滴下することができる。１．２５ｎｇ／ｍＬを滴下すれば、光学密度が２．５ｎｇ／ｍＬ内に入る、および１００ｎｇ／ｍＬ（維持標準曲線の点）の光学密度である試料およびスパイクした試料のみが許容可能である。さらに、各標準物質の濃度のトリプリケートについて、単一のウェルが明らかに汚染されているまたは低い結合性を示す場合、それを滴下することができる。標準物質の濃度でウェルに滴下すれば、維持複写は％差＝２０％をもたなければならない。プレートのバックグラウンド（ブランク）に近いＯＤ値を示すもっとも低い標準物質についての％ＣＶは、＝３０％であるべきである。１つのウェルに滴下すれば、維持複写の％差は＝３５％であるはずである。もっとも低い標準物質を滴下すれば、光学密度が維持標準曲線レベル光学密度内に入る試料およびスパイクした試料のみが許容可能である。
【０２１８】
試料。％ＣＶは、トリプリケートのウェル間で＝２０％であるべきである。トリプリケートのウェル間の％ＣＶを報告する。各試料希釈からの１つのウェルを滴下することができる。維持複写は＝２０％の％差をもたなければならない。注意：非スパイクの試料のＯＤが、２．５ｎｇ／ｍＬの標準物質のＯＤより下であれば、％差の基準は、非スパイクの結果に適用しない。上記の計算を参照する。
【０２１９】
ｎｇ／ｍｇにおける実際の宿主細胞濃度を、次のように平均（ｎｇ／ｍＬ）値から計算する：ＣＨＯ宿主細胞タンパク質（ｎｇ／ｍｇ）＝平均の「非スパイクの試料の結果（ｎｇ／ｍＬ）」＿希釈した試料濃度（１２ｍｇ／ｍＬ）。
【０２２０】
スパイク。％ＣＶは、トリプリケートのウェル間で＝２０％であるべきである。％ＣＶを報告する。スパイクからの１つのウェルを滴下することができる。維持点は％差＝２０％でなければならない。上記の計算を参照する。ｎｇ／ｍＬにおける宿主細胞濃度を報告する。この結果は、スパイクリカバリー計算に使用する。スパイクについての結果の濃度（ｎｇ／ｍＬ）は、理論上のスパイクの濃度の±２０％でなければならない。結果を報告し合否を示す。スパイクの結果が、理論上の２０％以内でなければ、アッセイは繰り返さなければならない。平均のスパイク濃度（ｎｇ／ｍＬ）×１００は、＝１００％±２０％  １０ｎｇ／ｍＬでなければならない。
【０２２１】
スパイクした試料。％ＣＶは、トリプリケートのウェル間で＝２０％であるべきである。トリプリケートのウェル間の％ＣＶを報告する。スパイクした各試料希釈からの１つのウェルを滴下することができる。維持複写は、％差＝２０％をもたなければならない。上記の計算を参照する。各希釈についてｎｇ／ｍＬで「スパイクした試料の結果」を報告する。デュプリケートの希釈物間での％差を報告する。希釈物間の％差は＝２５％でなければならない。これらの結果はスパイクリカバリー計算に使用する。
【０２２２】
以下の式を用いて、各希釈物セットについて％スパイクリカバリーを計算する：％スパイクリカバリー＝スパイクした試料の値−非スパイクの試料の値×１００スパイクの値。（１）非スパイク試料の値のＯＤが、２．５ｎｇ／ｍＬの標準物質より下に入れば、％スパイクリカバリー計算においてゼロと値を考えることに注目する。％スパイクリカバリーは、各試料の各希釈について、１００％±５０％（５０％−１５０％）でなければならない。結果および合否を報告する。
【０２２３】
対照。％ＣＶは、トリプリケートのウェル間で＝２０％であるべきである。％ＣＶ結果を報告する。対照からの１つのウェルを滴下することができる。維持複写は％差＝２０％をもたなければならない。上記の計算を参照する。ｎｇ／ｍＬにおける対照での宿主細胞濃度を報告する。次のようにｎｇ／ｍｇでの宿主細胞濃度を計算する：宿主細胞タンパク質（ｎｇ／ｍｇ）＝ｎｇ／ｍＬでの対照の宿主細胞タンパク質の結果。
【０２２４】
様々な文献が本明細書に引用され、その内容はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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