(57)【要約】  本発明は神経芽腫の治療方法に関する。本発明は、前記治療を必要とする患者に、7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンのポリマープロドラッグを投与することを含んでなる。【選択図】  図１
2012506380.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における神経芽腫の治療方法であって、有効量の式(I)の化合物：
【化１】
2012506380.tif 000023
［式中、
R1、R2、R3およびR4は独立してOHまたは
2012506380.tif 000024
であり、ここで、
Lは2官能性リンカーであり、
(m)は0または正の整数であり、(m)が2以上であるとき、各Lは同一であるか、または異なっており、そして
(n)は正の整数である；
ただし、R1、R2、R3およびR4がすべてOHであることはない］
またはその製薬上許容される塩を哺乳動物に投与することを含んでなる上記方法。
【請求項２】
(m)が約1である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
(n)が約28〜約341であり、その結果、前記化合物のポリマー部分の合計分子量が約5,000〜約60,000ダルトンの範囲である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
(n)が約114〜約239であり、その結果、前記化合物のポリマー部分の合計分子量が約20,000〜約42,000ダルトンの範囲である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
(n)が約227であり、その結果、前記化合物のポリマー部分の合計分子量が約40,000ダルトンである、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
式(I)の化合物が医薬組成物の一部であり、かつR1、R2、R3およびR4がすべて
2012506380.tif 000025
である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
式(I)の化合物が以下の化合物：
【化２】
2012506380.tif 000026
2012506380.tif 000027
からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
式(I)の化合物が以下の化合物：
【化３】
2012506380.tif 000028
である、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
式(I)の化合物を約0.5mg/m2体表面/回〜約50mg/m2体表面/回の量で投与する、ただし、前記量は式(I)の化合物に含まれる7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの重量である、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
式(I)の化合物を約1mg/m2体表面/回〜約18mg/m2体表面/回の量で投与する、ただし、前記量は式(I)の化合物に含まれる7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの重量である、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
式(I)の化合物を、約1.25mg/m2体表面/回〜約16.5mg/m2体表面/回の量で週1回3週間投与し、次の1週間は治療を休むプロトコルに従って投与する、ただし、前記量は式(I)の化合物に含まれる7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの重量である、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
週1回の投与量が約5mg/m2体表面/回であり、前記量が式(I)の化合物に含まれる7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの重量である、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌が転移性である、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌が固形腫瘍である、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
式(I)の化合物を第2の化学療法剤と組合せて、同時にまたは順次投与する、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
式(I)の化合物を投与し、続いて13-cis-レチノイン酸を投与する、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
式(I)の化合物を放射線療法と組合せて、同時にまたは順次投与する、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌が式(I)の化合物を含まない抗癌療法に対して抵抗性または難治性である、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌がカンプトテシン、CPT-11、上皮成長因子受容体アンタゴニスト、およびこれらの組合せから選択される抗癌剤に対して抵抗性である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
上皮成長因子受容体アンタゴニストがセツキシマブである、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物における神経芽腫の治療方法であって、有効量の次式の化合物：
【化４】
2012506380.tif 000029
［式中、(n)は約227である］
またはその製薬上許容される塩を哺乳動物に投与することを含んでなり、
その際、前記化合物を約1mg/m2体表面/回〜約18mg/m2体表面/回の量で投与する、ただし、前記量は式(I)の化合物に含まれる7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの重量である、上記方法。
【請求項２２】
前記化合物を、約1.25mg/m2体表面/回〜約16.5mg/m2体表面/回の量で週1回3週間投与し、次の1週間は治療を休むプロトコルに従って投与する、ただし、前記量は式(I)の化合物に含まれる7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの重量である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
週1回の投与量が約5mg/m2体表面/回であり、前記量が式(I)の化合物に含まれる7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの重量である、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
Lがアミノ酸またはアミノ酸誘導体であり、ここでアミノ酸誘導体は2-アミノアジピン酸、3-アミノアジピン酸、β-アラニン、β-アミノプロピオン酸、2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、ピペリジン酸、6-アミノカプロン酸、2-アミノヘプタン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノイソ酪酸、2-アミノピメリン酸、2,4-アミノ酪酸、デスモシン、2,2-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-エチルアスパラギン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ-イソロイシン、N-メチルグリシン、サルコシン、N-メチル-イソロイシン、6-N-メチル-リシン、N-メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、およびオルニチンからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項２５】
Lがグリシン、アラニン、メチオニンまたはサルコシンである、請求項1に記載の方法。
【請求項２６】
Lが：
【化５】
2012506380.tif 000030
2012506380.tif 000031
［式中、
R21-R29は、独立して、水素、アミノ、置換アミノ、アジド、カルボキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、シリルエーテル、スルホニル、メルカプト、C1-6アルキルメルカプト、アリールメルカプト、置換アリールメルカプト、置換C1-6アルキルチオ、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐アルキル、C3-8シクロアルキル、C1-6置換アルキル、C2-6置換アルケニル、C2-6置換アルキニル、C3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、C1-6ヘテロアルキル、置換C1-6ヘテロアルキル、C1-6アルコキシ、アリールオキシ、C1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、C2-6アルカノイル、アリールカルボニル、C2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、C2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、C2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、C2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、C2-6置換アルカノイルオキシ、および置換アリールカルボニルオキシからなる群より選択され；
(t)、(t')および(y)は、独立して、0または正の整数であり；そして
(v)は0または1である］
からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項２７】
(m)が約1〜約10である、請求項1に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンのポリマープロドラッグを用いて、神経芽腫を治療する方法に関する。特に、本発明は、7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンのポリエチレングリコールコンジュゲートを用いて、神経芽腫を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経芽腫(neuroblastoma)は神経組織から発生する癌である。神経芽腫は固形腫瘍であり、通常は乳児や5才未満の子供に発症し、年長の子供や成人にはめったに発症しない。神経芽腫はほとんどが副腎とその周辺に発生する。また、神経芽腫は腹部にも発生し、頸部、胸部および骨盤の神経組織（神経細胞が存在する）にも発生することがある。この癌は、リンパ節、骨、骨髄、眼、肝臓、皮膚、および脊髄を取り囲む組織など、他の身体部位に広がることが多い。
【０００３】
神経芽腫は小児において2番目に最も多く見られる固形腫瘍である。この疾患の進行期では、神経芽腫の治療の成功が患者の半数に満たない。実際、進行期または初期の微小な残存病変での神経芽腫の効果的な治療は、いまだに小児腫瘍学における大きな課題の一つである。その転移疾患の5年生存率は依然として60％より低く、それゆえに、新規な治療アプローチが必要とされる。
【０００４】
早期診断・治療を提供しようとして、神経芽腫についての乳幼児のスクリーニングが行われたが、役に立たなかった。ほとんどの場合、スクリーニングによって見つかった神経芽細胞（未熟な神経細胞）は消滅するか、または成熟して良性腫瘍となる。
【０００５】
現在、神経芽腫の治療には、シクロホスファミド(イホスファミド)、シスプラチン(カルボプラチン)、ビンクリスチン、ドキソルビシン、エトポシド、テニポシド、トポテカン、およびメルファランといった標準的な抗癌剤の組合せが併用されている。残念ながら、神経芽腫は一般にこのような従来の抗癌剤に抵抗性を示し、治療の終了後に癌が再発する。したがって、神経芽腫の代替治療が長年にわたって依然必要とされている。本発明はこの必要性に対処するものである。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の1つの態様においては、哺乳動物における神経芽腫の治療方法が提供される。前記治療は、有効量の式(I)の化合物：
【化１】
2012506380.tif 000003
【０００７】
［式中、
R1、R2、R3およびR4は独立してOHまたは
2012506380.tif 000004
【０００８】
であり、ここで、
Lは2官能性リンカーであって、(m)が2以上であるとき、各Lは同一であるか、または異なっており、
(m)は0または正の整数であり、そして
(n)は正の整数である；
ただし、R1、R2、R3およびR4がすべてOHであることはない］
またはその製薬上許容される塩を哺乳動物に投与することを含んでなる。
【０００９】
本発明の特定の態様において、本明細書に記載する治療のための7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンのポリマープロドラッグは、次の構造：
【化２】
2012506380.tif 000005
【００１０】
［式中、(n)は約28〜約341であり、好ましくは約114〜約239、より好ましくは約227である］
を有する4アームPEG-7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンコンジュゲートを使用する。
【００１１】
単なる例として、本発明の上記方法を実施するにあたり、式(I)の化合物は約0.5mg/m2体表面/回〜約50mg/m2体表面/回の量で投与され、さらに特定すると、式(I)の化合物は約1mg/m2体表面/回〜約18mg/m2体表面/回の量で投与され、より一層特定すると、式(I)の化合物は、約1.25mg/m2体表面/回〜約16.5mg/m2体表面/回を週1回3週間投与し、次の1週間は治療を休むプロトコルに従って投与される。特定の実施形態では、週1回の投与量が約5mg/m2体表面/回である。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、化学療法をはじめとする従来の抗癌療法に抵抗性または難治性である神経芽腫の治療方法を提供する。特定の態様では、前記治療がカンプトテシン(CPT)またはCPT-11関連療法に抵抗性または難治性の癌に対して有効である。もう1つの方法として、本発明は、トポイソメラーゼIが介在する抵抗性または難治性現象を示す神経芽腫の治療方法を提供する。さらに別の態様において、本発明は、CPTまたはCPT-11のポリマープロドラッグ形態（例えば、CPTまたはCPT-11のポリエチレングリコールコンジュゲート）の投与に関連した療法に抵抗性または難治性である神経芽腫の治療方法を提供する。
【００１３】
本発明による7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンのポリマープロドラッグは、治療の開始時に、または後続ラウンドの療法において抵抗性または難治性である神経芽腫を治療するのに効果的である。本発明は、CPT-11に対して感受性である難治性の神経芽腫（すなわち、第1ラウンドの治療では抑制されるようにみえるが、第2ラウンド以後の療法では治療に抵抗性になる神経芽腫）の治療を可能にする。7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンのポリマープロドラッグはさらに、治療を中止した後に再発する神経芽腫の治療にも有効でありうる。
【００１４】
本発明の1つの利点は、有効量の7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンのポリマープロドラッグを、相乗効果のために別の抗癌治療薬と組合せて、同時にまたは順次患者を治療できる点である。
【００１５】
本発明のさらに別の利点は、本明細書に記載するプロドラッグが、先行技術の抗癌剤と比較して、毒性が低く、かつ/または治療中に直面する他の困難を克服する点である。本発明に伴う非血液毒性は、従来の抗癌剤が関連する治療と比較して、管理しやすく、一過性である。例えば、よく用いられる薬剤ドキソルビシンは心臓毒性を引き起こす。神経芽腫の治療に用いられる白金系抗癌剤（例：シスプラチン、カルボプラチンなど）は腎障害を起こすことが知られている。Cancer Principles and Practice, DeVita et al., p384-385を参照されたい。さらに、従来の抗癌剤が関係する治療は白血球減少、好中球減少および/または血小板減少などの骨髄抑制を引き起こす。
【００１６】
一方、本発明による治療では骨髄抑制を比較的起こさない投与量が用いられるが、その理由は、一部には、ポリマープロドラッグが活性薬剤7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの成熟前の排出を防ぐからである。十分な量の活性薬剤がポリマープロドラッグから放出され、体内で利用されて治療効果を奏することができる。ポリマー形態はまた、免疫反応をなくすか、あるいは大幅に低減させる。本発明で用いる化合物は患者に安全に投与することができる。本発明で用いる化合物は他の抗癌剤と組合せて、同時にまたは順次投与することができる。また、本発明は他の種類の治療法（例えば、放射線療法）と一緒に行ってもよい。
【００１７】
本発明の利点は以下の説明および図面から明らかになるだろう。
【００１８】
本発明において、「残基」という語は、別の化合物による置換反応を受けた後に残存する化合物の部分を意味すると解され、それは例えば7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン、アミノ酸などをさす。
【００１９】
本発明において、「ポリマー含有残基」または「PEG残基」という語は、それぞれ、例えばアミノ酸、7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン含有化合物との反応を受けた後に残存する、ポリマーまたはPEGの部分を意味すると解される。
【００２０】
本発明において、「アルキル」とは、直鎖、分岐鎖および環式のアルキル基を含めた、飽和脂肪族炭化水素をさす。「アルキル」には、アルキル-チオ-アルキル、アルコキシアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、およびC1-6アルキルカルボニルアルキル基も含まれる。好ましくは、アルキル基は1〜12の炭素数である。より好ましくは、約1〜7の炭素数の低級アルキルであり、約1〜4の炭素数がより一層好ましい。アルキル基は置換されても、されなくてもよい。置換される場合、好ましくは置換基として以下が挙げられる：ハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル-チオ、アルキル-チオ-アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、シアノ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、C1-6ヒドロカルボニル、アリール、およびアミノの基。
【００２１】
本発明において、「置換される」とは、官能基または化合物内に含まれる1個以上の原子を、以下から選択される基の一部分で置き換えること、またはそのような基を追加することをさす：ハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル-チオ、アルキル-チオ-アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、シアノ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、C1-6アルキルカルボニルアルキル、アリール、およびアミノの基。
【００２２】
本発明において、「アルケニル」とは、直鎖、分岐鎖および環式の基を含めた、少なくとも1個の炭素-炭素二重結合を含む基をさす。好ましくは、アルケニル基は約2〜12の炭素数である。より好ましくは、約2〜7の炭素数の低級アルケニルであり、約2〜4の炭素数がより一層好ましい。アルケニル基は置換されても、されなくてもよい。置換される場合、置換基として以下が挙げられる：ハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル-チオ、アルキル-チオ-アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、シアノ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、C1-6ヒドロカルボニル、アリール、およびアミノの基。
【００２３】
本発明において、「アルキニル」とは、直鎖、分岐鎖および環式の基を含めた、少なくとも1個の炭素-炭素三重結合を含む基をさす。好ましくは、アルキニル基は約2〜12の炭素数である。より好ましくは、約2〜7の炭素数の低級アルキニルであり、約2〜4の炭素数がより一層好ましい。アルキニル基は置換されても、されなくてもよい。置換される場合、置換基として以下が挙げられる：ハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル-チオ、アルキル-チオ-アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、シアノ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、C1-6ヒドロカルボニル、アリール、およびアミノの基。「アルキニル」の例にはプロパルギル、プロピン、および3-ヘキシンが含まれる。
【００２４】
本発明において、「アリール」とは、少なくとも1個の芳香環を含む芳香族炭化水素環系をさす。場合により、芳香環は他の芳香族炭化水素環または非芳香族炭化水素環に縮合されてもよいし、別の方法で結合されてもよい。アリール基の例として、例えば、フェニル、ナフチル、1,2,3,4-テトラヒドロナフタレンおよびビフェニルが挙げられる。アリール基の好ましい例として、フェニルおよびナフチルが挙げられる。
【００２５】
本発明において、「シクロアルキル」とは、C3-8環式炭化水素をさす。シクロアルキルの例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。
【００２６】
本発明において、「シクロアルケニル」とは、少なくとも1個の炭素-炭素二重結合を含むC3-8環式炭化水素をさす。シクロアルケニルの例として、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、1,3-シクロヘキサジエニル、シクロヘプテニル、シクロヘプタトリエニル、およびシクロオクテニルが挙げられる。
【００２７】
本発明において、「シクロアルキルアルキル」とは、C3-8シクロアルキル基で置換されたアルキル基をさす。シクロアルキルアルキル基の例として、シクロプロピルメチルおよびシクロペンチルエチルが挙げられる。
【００２８】
本発明において、「アルコキシ」とは、酸素橋を介して親分子部分に結合される、所定の炭素原子数のアルキル基をさす。アルコキシ基の例として、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシおよびイソプロポキシが挙げられる。
【００２９】
本発明において、「アルキルアリール」基とは、アルキル基で置換されたアリール基をさす。
【００３０】
本発明において、「アラルキル」基とは、アリール基で置換されたアルキル基をさす。
【００３１】
本発明において、「アルコキシアルキル」基とは、アルコキシ基で置換されたアルキル基をさす。
【００３２】
本発明において、「アミノ」とは、アンモニアの1個以上の水素原子を有機基で置換することによってアンモニアから誘導された、当技術分野で知られるような窒素含有基をさす。例えば、「アシルアミノ」および「アルキルアミノ」とは、それぞれアシルおよびアルキル置換基をもつ特定のN-置換有機基をさす。
【００３３】
本発明において、「ハロゲン」または「ハロ」とは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素をさす。
【００３４】
本発明において、「ヘテロ原子」とは、窒素、酸素および硫黄をさす。
【００３５】
本発明において、「ヘテロシクロアルキル」とは、窒素、酸素および硫黄から選択される少なくとも1個のヘテロ原子を含む非芳香族環系をさす。場合により、ヘテロシクロアルキル環は他のヘテロシクロアルキル環および/または非芳香族炭化水素環に縮合されてもよいし、別の方法で結合されてもよい。好ましいヘテロシクロアルキル基は3〜7の環員数である。ヘテロシクロアルキル基の例として、例えば、ピペラジン、モルホリン、ピペリジン、テトラヒドロフラン、ピロリジン、およびピラゾールが挙げられる。好ましいヘテロシクロアルキル基としては、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、およびピロリジニルが挙げられる。
【００３６】
本発明において、「ヘテロアリール」とは、窒素、酸素および硫黄から選択される少なくとも1個のヘテロ原子を含む芳香族環系をさす。ヘテロアリール環は、1個以上のヘテロアリール環、芳香族もしくは非芳香族炭化水素環、またはヘテロシクロアルキル環に縮合されてもよいし、別の方法で結合されてもよい。ヘテロアリール基の例には、例えば、ピリジン、フラン、チオフェン、5,6,7,8-テトラヒドロイソキノリンおよびピリミジンが含まれる。ヘテロアリール基の好ましい例として、チエニル、ベンゾチエニル、ピリジル、キノリル、ピラジニル、ピリミジル、イミダゾリル、ベンゾイミダゾリル、フラニル、ベンゾフラニル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、イソチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピロリル、インドリル、ピラゾリル、およびベンゾピラゾリルが挙げられる。
【００３７】
いくつかの実施形態において、置換アルキルには、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、ヒドロキシアルキル、およびメルカプトアルキルが含まれる；置換アルケニルには、カルボキシアルケニル、アミノアルケニル、ジアルケニルアミノ、ヒドロキシアルケニル、およびメルカプトアルケニルが含まれる；置換アルキニルには、カルボキシアルキニル、アミノアルキニル、ジアルキニルアミノ、ヒドロキシアルキニル、およびメルカプトアルキニルが含まれる；置換シクロアルキルには、4-クロロシクロヘキシルのような基が含まれる；アリールには、ナフチルのような基が含まれる；置換アリールには、3-ブロモフェニルのような基が含まれる；アラルキルには、トリルのような基が含まれる；ヘテロアルキルには、エチルチオフェンのような基が含まれる；置換ヘテロアルキルには、3-メトキシ-チオフェンのような基が含まれる；アルコキシには、メトキシのような基が含まれる；そしてフェノキシには、3-ニトロフェノキシのような基が含まれる。
【００３８】
本発明において、「正の整数」という語は、1と等しいまたは1より大きい整数を含み、当業者には理解されるように、通常の技術者による合理性の範囲内であると解される。
【００３９】
本発明において、「連結される」という語は、ある基が別の基に(好ましくは)共有結合で、または非共有結合で、例えば化学反応の結果として、結合されることを含むと解される。
【００４０】
本発明において、「有効量」および「十分量」とは、当業者に理解されるような所望の効果または治療効果を達成する量を意味する。治療される各哺乳動物またはヒト患者のための有効量は、適正な実施基準に合致しない好ましくない作用を回避しながら、望ましい臨床応答を与える範囲内で、当業者が容易に決定することができる。用量範囲については以下で示す。
【００４１】
本発明において、「癌」および「腫瘍」という語は、他に指定しない限り、交互に交換して用いる。「癌」は、特に断らない限り、悪性および/または転移性の癌を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】実施例1〜2に記載される、4アームポリエチレングリコール酸を製造するための反応スキームを示す図である。
【図２】実施例3〜7に記載される、4アーム-PEG-Gly-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)を製造するための反応スキームを示す図である。
【図３】実施例8〜12に記載される、4アーム-PEG-Ala-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)を製造するための反応スキームを示す図である。
【図４】実施例13〜16に記載される、4アーム-PEG-Met-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)を製造するための反応スキームを示す図である。
【図５】実施例17〜21に記載される、4アーム-PEG-Sar-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)を製造するための反応スキームを示す図である。
【図６】実施例24に記載される、4アーム-PEG-Gly-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)の安定性を示す図である。
【図７】実施例24に記載される、4アーム-PEG-Gly-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)の安定性に対するpHの影響を示す図である。
【図８Ａ】実施例25に記載される、4アーム-PEG-Gly-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)の薬物動態プロファイルを示す図である。
【図８Ｂ】実施例25に記載される、4アーム-PEG-Gly-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)の薬物動態プロファイルを示す図である。
【図９Ａ】実施例26に記載される、疑似転移性(pseudometastatic)ヒト神経芽腫(HTLA-230)異種移植マウスの生存率に対する抗癌効果を示す図である。
【図９Ｂ】実施例26に記載される、疑似転移性(pseudometastatic)ヒト神経芽腫(HTLA-230)異種移植マウスの生存率に対する抗癌効果を示す図である。
【図１０】実施例27に記載される、同所性ヒト神経芽腫(GI-LI-N)異種移植マウスの生存率に対する抗癌効果を示す図である。
【図１１】実施例28に記載される、同所性ヒト神経芽腫(GI-LI-N)異種移植マウスにおける腫瘍退縮を示す図である。
【図１２Ａ】実施例27に基づいた、実施例29に記載される腫瘍マーカーの免疫組織化学的研究を示す図である。腫瘍切片を、神経芽腫細胞マーカーとしてのNB84と腫瘍細胞増殖マーカーとしてのKi-67について免疫染色した。
【図１２Ｂ】対照、CPT-11および化合物9でそれぞれ治療したマウスにおけるNB84およびKi-67陽性細胞の定量的測定を示す図である。
【図１３】実施例30に記載される、GI-LI-N異種移植マウスにおける、MTDでのCPT-11と比較した、化合物9で治療したマウスの生存率を示す図である。
【図１４Ａ】実施例31に記載される、5×104個のヒト神経芽腫細胞NXS2を異種移植したマウスにおける化合物9の抗腫瘍効果を示す図である。
【図１４Ｂ】実施例31に記載される、5×105個のヒト神経芽腫細胞NXS2を異種移植したマウスにおける化合物9の抗腫瘍効果を示す図である。
【図１５Ａ】異種移植したルシフェラーゼ発現神経芽腫細胞から測定される生物発光強度を比較した、SH-SY5Y異種移植マウスの写真を示す図である。もとの写真はカラーであるが（ここでは色が再現されていない）、腫瘍組織量の相関としての、本図面における発光の強度は見てすぐにわかる。
【図１５Ｂ】異種移植したルシフェラーゼ発現神経芽腫細胞から測定される生物発光に基づいて化合物9をカンプトサル(CAMPTOSAR)（医薬製剤としてのCPT-11）と比較した、SH-SY5Y異種移植マウスにおける時間依存性抗腫瘍効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
A.  概説
本発明は、哺乳動物における神経芽腫の治療方法に関する。この方法は、有効量の式(I)の化合物またはその製薬上許容される塩を、治療を必要とする哺乳動物に投与することを含んでなる。1つの態様において、式(I)の化合物は次の構造を有する：
【化３】
2012506380.tif 000006
【００４４】
［式中、
R1、R2、R3およびR4は独立してOHまたは
2012506380.tif 000007
【００４５】
であり、ここで、
Lは2官能性リンカーであって、(m)が2以上であるとき、各Lは同一であるか、または異なっており、
(m)は0または正の整数、例えば約1〜約10（例：1、2、3、4、5または6）、好ましくは1であり、そして
(n)は正の整数、好ましくは約28〜約341、より好ましくは約114〜約239、より一層好ましくは約227である；
ただし、R1、R2、R3およびR4がすべてOHであることはない］。
【００４６】
好ましい実施形態では、前記方法は、式(I)の化合物を医薬組成物の一部として含み、かつR1、R2、R3およびR4がすべて
2012506380.tif 000008
【００４７】
である。
【００４８】
より好ましい態様において、前記治療は次の構造：
【化４】
2012506380.tif 000009
【００４９】
［式中、(n)は約227であり、その結果、この化合物のポリマー部分は約40,000ダルトンの合計数平均分子量となる］
を有する化合物を投与することを含む。
【００５０】
B.  式(I)の化合物
1.  マルチアームポリマー
本明細書に記載する化合物のポリマー部分は、7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの20-OH基に結合されたマルチアームPEGを含む。本発明の1つの態様では、7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンのポリマープロドラッグが、コンジュゲーションに先立って、次の構造：
【化５】
2012506380.tif 000010
【００５１】
［式中、(n)は正の整数である］
を有する4アームPEGを含む。
【００５２】
マルチアームPEGは、NOF社のDrug Delivery System（薬物送達システム）カタログ, 第8版, 2006年4月に記載されるものであり、その開示内容を本明細書中で援用する。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態において、ポリマーの重合度(n)は約28〜約341（合計数平均分子量が約5,000 Da〜約60,000 Daのポリマーを与える）、好ましくは約114〜約239（合計数平均分子量が約20,000 Da〜約42,000 Daのポリマーを与える）である。(n)はポリマー鎖中の繰り返し単位の数を表し、ポリマーの分子量に依存する。本発明の特に好ましい実施形態では、(n)が約227であって、ポリマー部分の合計数平均分子量が約40,000 Daである。
【００５４】
2.  2官能性リンカー
本発明の特定の好ましい態様においては、2官能性リンカーとしてアミノ酸が挙げられる。公知の天然L-アミノ酸の中から選択されるアミノ酸は、例えば、いくつか挙げると、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、セリン、トレオニン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、および/またはこれらの組合せである。別の態様では、Lをペプチド残基とすることができる。ペプチドの大きさは、例えば、約2〜約10アミノ酸残基（例：2、3、4、5または6）の範囲でありうる。
【００５５】
天然アミノ酸の誘導体および類似体、ならびに当技術分野で知られた、疎水性または非疎水性の、各種の非天然アミノ酸(DまたはL)もまた、本発明の範囲内に入ると考えられる。単なる例として、アミノ酸の類似体および誘導体には以下が含まれる：
2-アミノアジピン酸、3-アミノアジピン酸、β-アラニン、β-アミノプロピオン酸、2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、ピペリジン酸、6-アミノカプロン酸、2-アミノヘプタン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノイソ酪酸、2-アミノピメリン酸、2,4-アミノ酪酸、デスモシン、2,2-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-エチルアスパラギン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ-イソロイシン、N-メチルグリシンまたはサルコシン、N-メチル-イソロイシン、6-N-メチルリシン、N-メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、その他多すぎて1つ1つ挙げられないが、米国連邦官報(63 Fed. Reg.), 29620, 29622（本明細書中で援用する）に載っているもの。いくつかの好ましいL基として、グリシン、アラニン、メチオニンまたはサルコシンが挙げられる。例えば、本化合物は以下のものでありうる：
【化６】
2012506380.tif 000011
【００５６】
限定ではなく、説明を容易にするため、4アームPEGのうち1本のアームだけが示される。4アームPEGの1本のアーム（最大4本のアーム）が7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンとコンジュゲート化される。
【００５７】
より好ましくは、本明細書に記載する治療は、リンカー基(L)としてグリシンを含む化合物を使用する。
【００５８】
本発明の別の態様において、ポリマーと7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンとの結合後のLは、以下の中から選択することができる：
【化７】
2012506380.tif 000012
【００５９】
2012506380.tif 000013
【００６０】
［式中、
R21-R29は、独立して、水素、アミノ、置換アミノ、アジド、カルボキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、シリルエーテル、スルホニル、メルカプト、C1-6アルキルメルカプト、アリールメルカプト、置換アリールメルカプト、置換C1-6アルキルチオ、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐アルキル、C3-8シクロアルキル、C1-6置換アルキル、C2-6置換アルケニル、C2-6置換アルキニル、C3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、C1-6ヘテロアルキル、置換C1-6ヘテロアルキル、C1-6アルコキシ、アリールオキシ、C1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、C2-6アルカノイル、アリールカルボニル、C2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、C2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、C2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、C2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、C2-6置換アルカノイルオキシ、および置換アリールカルボニルオキシの中から選択され；
(t)、(t')および(y)は、独立して、0または正の整数、好ましくは約1〜約10、例えば1、2、3、4、5および6から選択され；そして
(v)は0または1である］。
【００６１】
いくつかの好ましい実施形態では、Lとして以下を挙げることができる：
【化８】
2012506380.tif 000014
【００６２】
2012506380.tif 000015
【００６３】
2012506380.tif 000016
【００６４】
［式中、
(t)、(t')および(y)は、独立して、0または正の整数、好ましくは約1〜約10（例：1、2、3、4、5および6）から選択され；そして
(v)は0または1である］。
【００６５】
本発明のいくつかの態様において、式(I)の化合物は1〜約10単位（例：1、2、3、4、5または6単位）の2官能性リンカーを含む。本発明のいくつかの好ましい態様では、本化合物は1単位の2官能性リンカーを含み、それゆえ(m)は1である。
【００６６】
その他のリンカーはGreenwaldら(Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1998, 6:551-562)の表1に見られ、その内容を本明細書中で援用する。
【００６７】
3.  プロドラッグの合成
一般的に、治療に用いるポリマープロドラッグを製造するには、1当量以上の活性化マルチアームポリマーと、例えば活性部位あたり1当量以上のアミノ酸-(20)-7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンとを、アミノ基をポリマーのカルボン酸と効率よく反応させて結合を形成させるのに十分な条件下で反応させる。この合成の詳細は米国特許公開第2007/0197575号に記載されており、その内容をそのまま本明細書中で援用する。
【００６８】
さらに具体的には、前記方法は以下の工程を含む：
1)  利用可能な20-ヒドロキシル基を含む7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン1当量および利用可能なカルボン酸基を含む2官能性リンカー1当量以上を用意する工程；
2)  これら2つの反応物を、ジクロロメタン(DCM)[またはジメチルホルムアミド(DMF)、クロロホルム、トルエンまたはこれらの混合物]のような不活性溶媒中で、1-(3-ジメチルアミノプロピル)3-エチルカルボジイミド(EDC)［または1,3-ジイソプロピルカルボジイミド(DIPC)、任意の適当なジアルキルカルボジイミド、向山試薬(例：2-ハロ-1-アルキル-ピリジニウムハライド)、プロパンホスホン酸環状無水物(PPACA)など］のようなカップリング試薬および4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)のような適当な塩基の存在下に反応させて、7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン-2官能性リンカー中間体を形成させる工程；および
3)  活性部位あたり1当量以上(例えば、実施例では2当量)の得られたアミノ基含有中間体と1当量の活性化ポリマー(例えば、PEG-酸)とを、ジクロロメタン(DCM)[またはジメチルホルムアミド(DMF)、クロロホルム、トルエンまたはこれらの混合物]のような不活性溶媒中で、1-(3-ジメチルアミノプロピル)3-エチルカルボジイミド(EDC)、PPAC［または1,3-ジイソプロピルカルボジイミド(DIPC)、任意の適当なジアルキルカルボジイミド、向山試薬(例：2-ハロ-1-アルキル-ピリジニウムハライド)、プロパンホスホン酸環状無水物(PPACA)など］のようなカップリング試薬および4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)のような適当な塩基の存在下に、0℃〜22℃の温度にて反応させる工程（これらの試薬類は、例えばSigma Chemical社のような商業的供給元から入手可能であるか、公知の方法を用いて合成可能である）。
【００６９】
好ましい態様においては、工程1)に先立って、7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの10-ヒドロキシル基を保護する。
【００７０】
7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの芳香族OHである10-ヒドロキシル基を保護することが好適である理由は、その保護された7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン中間体が良好な溶解性を有し、高純度形態で効率的かつ効果的に精製できるからである。例えば、シリル含有保護基、例えばTBDPSCl (t-ブチルジフェニルシリルクロリド)、TBDMSCl (t-ブチルジメチルシリルクロリド)およびTMSCl (トリメチルシリルクロリド)を用いて、7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの10-ヒドロキシル基を保護することができる。
【００７１】
活性化ポリマー、すなわち、1〜4個の末端カルボン酸基を含むポリマーは、例えば、当業者によく知られた標準方法を用いて、NOF社製の末端OH基含有Sunbright型ポリマーを、対応するカルボン酸誘導体に変換することによって製造することができる。例えば、本明細書中の実施例1〜2、ならびに同一出願人による米国特許第5,605,976号および米国特許公開第2007/0173615号（それぞれの内容を本明細書中で援用する）を参照されたい。
【００７２】
1回目と2回目のカップリング剤は同一でも異なってもよい。
【００７３】
好ましい2官能性リンカー基の例にはグリシン、アラニン、メチオニン、サルコシンなどが含まれ、合成は実施例に記載される。
【００７４】
本発明によれば、投与される化合物として以下のものが含まれる：
【化９】
2012506380.tif 000017
【００７５】
2012506380.tif 000018
【００７６】
特に好ましい実施形態は、次の構造：
【化１０】
2012506380.tif 000019
【００７７】
［ここで、ポリマーの4本全てのアームは7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンにグリシンを介してコンジュゲート化されており、ポリマー部分は約40,000ダルトンの合計分子量を有する］
を有する化合物を投与することを含む。
【００７８】
C.  組成物/製剤
本発明のポリマーコンジュゲートを含有する医薬組成物は、当技術分野でよく知られた方法により、例えば、さまざまな公知の混合法、溶解法、造粒法、研和法、乳化法、カプセル化法、封入法または凍結乾燥法を用いて、製造することができる。本組成物は、医薬として使用できる製剤への活性化合物の加工処理を容易にする、1種以上の生理的に許容される担体（賦形剤および助剤を含む）とともに製剤化される。適切な製剤は選択される投与経路に依存する。本発明の多くの態様においては、非経口経路が好適である。
【００７９】
注射（静脈内、筋内および皮下注射を含むが、これらに限らない）用として、本発明の化合物は水溶液、好ましくは生理食塩水のような生理的に適合しうる緩衝液中に、または極性溶媒（ピロリドンまたはジメチルスルホキシドを含むが、これらに限らない）中に、製剤化される。
【００８０】
本明細書に記載する化合物はまた、例えばボーラス注射または持続注入による、非経口投与用に製剤化することもできる。注射用製剤は単位剤形で、例えばアンプルで、または複数回投与容器で、提供される。有用な組成物は、限定するものではないが、油性または水性賦形剤中の懸濁液、溶液またはエマルションを含み、懸濁化剤、安定剤および/または分散剤といった助剤を含んでもよい。非経口投与用の医薬組成物には、活性化合物の塩（塩が好ましいが、これに限らない）のような水溶性形態の水溶液が含まれる。さらに、活性化合物の懸濁液を親油性賦形剤中に調製することもできる。適当な親油性賦形剤には、ゴマ油のような脂肪油、オレイン酸エチルやトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームのような物質が含まれる。水性の注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を高める物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含みうる。場合により、懸濁液は、高濃度溶液の調製を可能にするために、適当な安定剤および/または化合物の溶解度を上げる物質を含んでもよい。あるいはまた、活性成分は、使用前に適当な賦形剤（例えば、発熱物質フリーの滅菌水）を用いて再調製するための粉末形態であってもよい。
【００８１】
経口投与用として、本化合物は、その活性化合物を、当技術分野でよく知られた製薬上許容される担体と組合せることによって、製剤化することができる。かかる担体は本発明の化合物を次のような剤形として製剤化することを可能にする：錠剤、丸剤、ロゼンジ剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、ペースト剤、スラリー剤、溶液剤、懸濁液剤、患者の飲料水で希釈するための濃厚な溶液剤および懸濁液剤、患者の食物で希釈するためのプレミックス剤、患者により経口摂取される同様の剤形。経口用の医薬製剤を製造するには、固形の賦形剤を使用し、場合により、得られた混合物を粉砕し、必要ならば他の適当な助剤を添加した後に、その混合物を顆粒に加工して錠剤または糖衣錠のコアを得る。有用な賦形剤は特に、充填剤、例えば乳糖、ショ糖、マンニトールまたはソルビトールのような糖類、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプンおよびジャガイモデンプンのようなセルロース調製物、その他の物質、例えばゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドン(PVP)である。必要に応じて、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸などを加えてもよい。アルギン酸ナトリウムのような塩を使用してもよい。
【００８２】
吸入投与用として、本発明の化合物は、加圧パックまたはネブライザー（吸入器）と適当な噴射剤を用いるエアゾールスプレーの形態で都合よく送達することができる。
【００８３】
本化合物はまた、例えばカカオバターや他のグリセリドなどの慣用の座薬用基剤を用いて、座薬または停留浣腸といった直腸組成物に製剤化することもできる。
【００８４】
先に記載した製剤に加えて、本化合物はデポー製剤として処方することも可能である。そのような長時間作用型製剤は埋め込み（例えば、皮下または筋肉内）によって、または筋内注射によって投与することができる。本発明の化合物は、この投与経路のために、適当なポリマーまたは疎水性物質を用いて（例えば、薬理学的に許容されるオイルを含むエマルションの形に）、イオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性の誘導体（例えば、難溶性の塩を含むが、これに限らない）として製剤化しうる。
【００８５】
その他の送達システム、例えばリポソームおよびエマルションを使用することもできる。
【００８６】
さらに、本化合物は、治療薬を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスのような持続放出系を用いて送達することもできる。さまざまな持続放出材料が開発されており、当業者によく知られている。持続放出カプセル剤は、その化学的性質に応じて、本化合物を数週間から100日以上にわたって放出しうる。特定の化合物の化学的性質と生物学的安定性に応じて、さらなる安定化戦略を採用することができる。
【００８７】
D.  投与量
治療に有効な量とは、7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン感受性疾患を予防、軽減または改善するのに有効な化合物の量をさす。治療に有効な量の決定は、特に本明細書中の開示を考慮すれば、当業者の能力の範囲内である。
【００８８】
本発明の方法で用いるいずれの化合物についても、治療に有効な量は、最初はin vitroアッセイから推定される。次に、その投与量を動物モデルで使用するために処方して、有効投与量を含む血中濃度範囲を得るようにする。その後、こうした情報を用いることによって、患者に有用な投与量をより正確に決定することができる。
【００８９】
例えばプロドラッグとして用いられる本組成物の投与量は、そこに含まれる親分子（この場合は、7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン）によって決まる。一般的には、治療法で用いるプロドラッグの量は、哺乳動物において望ましい治療結果を効果的に達成する量である。当然、各種プロドラッグ化合物の投与量は、親化合物、in vivo加水分解速度、ポリマーの分子量などに応じて、多少変化しうる。さらに、投与量は、言うまでもなく、剤形および投与経路に応じて異なることがある。
【００９０】
しかしながら、一般的には、本明細書に記載する7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンのポリマーエステル誘導体は、全身送達のために、約0.3〜約90mg/m2体表面、好ましくは約0.5〜約50mg/m2体表面/回、より好ましくは約1〜約18mg/m2体表面/回、より一層好ましくは約1.25mg/m2体表面/回〜約16.5mg/m2体表面/回の量で投与することができる。
【００９１】
本化合物は、約0.3〜約90mg/m2体表面/週、例えば約1〜約18mg/m2体表面/週の量で投与することができる。特定の実施形態においては、投薬計画として、例えば、5〜7mg/m2体表面を週1回3週間、4週サイクルで投与するか、1.25〜45mg/m2を3週ごとに1回注射するか、かつ/または1〜16mg/m2を週1回、4週サイクルで3回注射する。
【００９２】
好ましくは、本明細書に記載する化合物の量は約1〜約18mg/m2体表面/回の範囲である。より好ましくは、投与量は約1.25〜約16.5mg/m2体表面/回の範囲である。いくつかの好ましい用量として、次の用量が挙げられる：1.25、2.5、5、10および16.5mg/m2/回。1つの実施形態は5mg/m2体表面/回を含む。
【００９３】
治療プロトコルは、3週ごとに1回投与される単回投与に基づいてもよいし、複数週にわたる治療プロトコルの一部として投与される複数回投与に分割されてもよい。したがって、治療計画としては、各治療サイクルにつき3週ごとに1回投与すること、あるいは各サイクルにつき週1回3週間投与し、次の1週間は治療を休むことが含まれる。また、希望する臨床結果が得られるまで、治療を1サイクル以上行うことも意図される。
【００９４】
本発明において、上に示した重量は、治療に用いるPEGコンジュゲート化7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン中に存在する7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの重量を表す。PEGコンジュゲート化7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの実重量はPEGの負荷量（例えば、PEG1モルあたり、任意に1〜4モルの7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン）に応じて変化する。
【００９５】
上に示した範囲は例示的なものであり、当業者は選択したプロドラッグの最適投与量を臨床経験と治療適応に基づいて決定できるだろう。さらに、的確な製剤、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して、それぞれの医師が選択しうる。正確な用量は、当業者には理解されるように、疾患の病期（ステージ）および重症度、ならびに治療される患者の個別の特性に応じて異なってくる。
【００９６】
さらに、本明細書に記載する化合物の毒性および治療効果は、当技術分野でよく知られた方法を用いて、細胞培養または実験動物での標準的な薬学的手法により測定することができる。
【００９７】
いくつかの好ましい実施形態において、治療プロトコルは、約1.25〜約16.5mg/m2体表面/回の量を週1回3週間投与し、次の1週間は治療を休み、そして希望する結果が出るまで約3サイクル以上繰り返すことを含んでなる。各サイクルごとに投与される量は、より好ましくは、約2.5〜約16.5mg/m2体表面/回の範囲である。
【００９８】
ある特定の実施形態においては、7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンのポリマーエステル誘導体を、5または10mg/m2のような1回量で週1回3週間投与し、次の1週間は治療を休むことができる。2サイクル以上の治療を施す場合は、治療サイクルの投与量を漸増投薬計画として設定することができる。ポリマープロドラッグは静注(IV)により投与することが好ましい。
【００９９】
別の実施形態として以下のプロトコルに基づいた投薬計画が含まれる：小児患者の治療については、約1.85mg/m2体表面/回を1日1回、5日間、3週ごとに投与するプロトコル、約1.85〜約7.5mg/m2体表面/回を1日1回、3日間、25日ごとに投与するプロトコル、または約22.5mg/m2体表面/回を1回、3週ごとに投与するプロトコル、ならびに成人患者の治療については、約13mg/m2体表面/回を3週ごとに投与するプロトコル、または約4.5mg/m2体表面/回を週1回、4週間、6週ごとに投与するプロトコル。本明細書に記載する化合物は1種以上の抗癌剤と併用して投与することができる。1つの実施形態では、その併用療法が、第2の薬剤と組合せて、各サイクルにつき約0.75mg/m2体表面/回を1日1回、5日間投与するプロトコルを含む。
【０１００】
あるいはまた、投与される化合物の量は体重基準とすることができる。式(I)の化合物を哺乳動物に全身送達するための投与量範囲は、約1〜約100mg/kg/週であり、好ましくは約2〜約60mg/kg/週である。したがって、その量は約0.1mg/kg体重/回〜約30mg/kg体重/回、好ましくは約0.3mg/kg〜約10mg/kgの範囲である。例えば、10mg/kgをq2d x 5で投与する投薬計画（複数回投与）または30mg/kgを単回投与する投薬計画など、特定の用量を投与することができる。
【０１０１】
ポリマーコンジュゲートが投与される本発明のあらゆる態様において、上で挙げた投与量は、投与されるポリマーコンジュゲートの量ではなく、7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの量に基づくものである。希望する臨床結果が得られるまで、1サイクル以上の治療を行うことが意図される。本発明の化合物の正確な量、投与回数および投与期間は、当然ながら、患者の性別、年齢および病状、ならびに主治医により判定される疾患の重症度に応じて変化する。
【０１０２】
本発明のさらなる態様は、相乗または相加効果のために、本明細書に記載の化合物を他の抗癌療法と組合せることを含んでなる。
【０１０３】
E.  神経芽腫の治療
本発明は神経芽腫の治療方法を提供する。好ましい態様において、本発明は神経芽腫を有する患者の治療方法を提供する。本発明において、「治療」または「治癒」とは、腫瘍増殖、腫瘍組織量および転移の抑制、軽減、改善および予防、腫瘍の寛解、あるいは治療終了後の患者における腫瘍および/または腫瘍性増殖の再発の予防を意味すると解される。
【０１０４】
治療は、患者が肯定的な臨床結果を達成する場合に存在するとみなされる。例えば、神経芽腫の成功した治療は、本明細書に記載する治療の不在下で観察されるものと比較して、腫瘍増殖（当業者により検討される他の臨床マーカーを含む）の少なくとも20％、好ましくは30％、より好ましくは40％またはそれ以上（例えば、50％）の減少が実現される場合に存在するとみなされる。本明細書に記載の治療から生じる神経芽腫の臨床状態の変化を測定する他の方法として、以下が挙げられる：(1)ホモバニリン酸(HVA)、バニリルマンデル酸(VMA)、ドーパミンおよびノルエピネフリンなどのカテコールアミン代謝産物のレベルに関する血液および尿検査；(2)X線、コンピュータ断層撮影(CT、CATスキャン)、磁気共鳴イメージング(MRIスキャン)、超音波、ポジトロン放出断層撮影(PETスキャン)、MIBGスキャンなどのイメージング検査；(3)腫瘍生検、骨髄生検などの生検；(4)抗体、放射性同位体、色素を用いる免疫組織化学検査；および全血球算定(CBC)。
【０１０５】
さらなる/別の態様において、本発明は、疾患のない哺乳動物において観察されるレベルと比較して、MYCN（N-myc遺伝子増幅）と呼ばれる癌遺伝子のレベル上昇および/またはTrkA（神経成長因子受容体）と呼ばれる腫瘍抑制遺伝子のレベル低下と関連した神経芽腫を治療する方法を提供する。本発明はまた、ガングリオシドGD2のレベル上昇と関連した神経芽腫の治療にも関係する。
【０１０６】
本発明のさらなる態様においては、本明細書に記載する治療に続いてレチノイン酸療法を行うことができる。13-cis-レチノイン酸は、式(I)の化合物による治療が終了した後で投与される。レチノイン酸療法は、より多くの癌細胞をつくる癌の能力を低下させ、また、これらの細胞がどのように見え、どのように行動するかを変える。
【０１０７】
さらに他の態様において、式(I)の化合物を用いる療法は、放射線療法と同時にまたは連続して施行することができる。1つの実施形態では、MIBG (I-131またはI-123で放射性ヨウ素化されたメタ-ヨードベンジルグアニジン)のような放射性ヨウ素が内用および/または外用で投与される。さらに、放射線療法も意図される。
【０１０８】
本発明はまた、骨髄幹細胞移植、末梢血幹細胞移植、および他の療法（例えば、モノクローナル抗体療法）と共に行うこともできる。
【０１０９】
本発明のさらに他の態様において、本方法はトポイソメラーゼI関連神経芽腫に関係した神経芽腫の治療を包含する。本発明の他の態様は、CPT-11のような他の抗癌剤、上皮成長因子受容体アンタゴニスト（例えば、Erbitux(登録商標)セツキシマブ(cetuximab)またはC225）療法、およびこれらの組合せに対して抵抗性または難治性である神経芽腫の治療を包含する。
【０１１０】
［実施例］
以下の実施例は本発明のさらなる理解を提供するのに役立つものであり、本発明の有効範囲を制限するものでは決してない。実施例に記載した太字の数字（例えば、化合物番号）は図面に示したものに対応している。
【０１１１】
一般的手順
反応はすべて乾燥窒素またはアルゴン雰囲気下で実施した。市販の試薬はそれ以上精製することなく使用した。使用に先立って、全てのPEG化合物を真空下でまたはトルエンからの共沸蒸留により乾燥させた。13C NMRスペクトルは、特に他に指定しない限り、Varian社製Mercury(登録商標)300 NMRスペクトロメータを用いて、重水素化クロロホルムとメタノールを溶媒として75.46 MHzで取得した。化学シフト(δ)はテトラメチルシラン(TMS)から低磁場でppmとして記録される。
【０１１２】
HPLC法
反応混合物と、中間体および最終生成物の純度は、Beckman Coulter社製System Gold(登録商標)HPLC装置によりモニタリングした。これはZOBAX(登録商標)300SB C8逆相カラム(150 x 4.6mm)またはPhenomenex社製Jupiter(登録商標)300A C18逆相カラム(150 x 4.6mm)を多波長UV検出器と共に利用するもので、0.05％トリフルオロ酢酸(TFA)中のアセトニトリルの10〜90％勾配を1mL/分の流量で用いる。
【実施例１】
【０１１３】
40k 4アーム-PEG-tBuエステル (化合物2)
40k 4アーム-PEG-OH (12.5g, 1当量)を220mLのトルエンと共沸させて35mLのトルエン/水を除去した。その溶液を30℃に冷やして、t-ブタノール中の1.0Mカリウムt-ブトキシド(3.75mL, 3当量×4＝12当量)を加えた。その混合物を30℃で30分撹拌し、次にブロモ酢酸t-ブチル(0.975g, 4当量×4＝16当量)を加えた。この反応を30℃で1時間保持してから25℃に冷やした。150mLのエーテルを徐々に加えると、生成物が沈殿した。得られた懸濁液を17℃に冷やして、30分間17℃のままにしておいた。粗生成物を濾過し、湿ったケークをエーテルで2回(2 x 125mL)洗浄した。分離した湿ったケークを50mlのDCMに溶解し、350mlのエーテルを加えて生成物を沈殿させ、濾過した。湿ったケークをエーテルで2回(2 x 125mL)洗浄した。生成物を真空下に40℃で乾燥させた(収率＝98％, 12.25g)。  13C NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ27.71, 68.48-70.71 (PEG), 80.94, 168.97。
【実施例２】
【０１１４】
40k 4アーム-PEG酸 (化合物3)
40k 4アーム-PEG-tBuエステル(化合物2, 12g)を120mLのDCMに溶解し、次いで60mLのTFAを加えた。その混合物を室温で3時間撹拌してから、溶媒を真空下35℃で除去した。得られたオイル残留物を37.5mLのDCMに溶解した。375mLのエーテルを加えて粗生成物を沈殿させた。湿ったケークを30mLの0.5％NaHCO3に溶解した。生成物をDCMで2回(2 x 150ml)抽出した。有機層を一緒にして、2.5gのMgSO4で乾燥させた。溶媒を真空下に室温で除去した。得られた残留物を37.5mLのDCMに溶解し、300mLのエーテルを加えて生成物を沈殿させ、濾過した。湿ったケークをエーテルで2回(2 x 125mL)洗浄した。生成物を真空下に40℃で乾燥させた(収率＝90％, 10.75g)。  13C NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ67.93 - 71.6 (PEG), 170.83。
【実施例３】
【０１１５】
TBDPS-(10)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン) (化合物5)
100mLの無水DCM中の7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン(化合物4, 2.0g, 5.10mmol, 1当量)の懸濁液にEt3N (4.3mL, 30.58mmol, 6当量)とTBDPSCl(7.8mL, 30.58mmol, 6当量)を加えた。その反応混合物を一晩加熱還流し、その後0.2N HCl溶液(2 x 50mL)、飽和NaHCO3溶液(100mL)および食塩水(100mL)で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させた。残留物を無水DCMに溶解し、ヘキサンを添加して沈殿させた。DCM/ヘキサンによる沈殿を繰り返して過剰のTBDPSClを取り除いた。固形分を濾過し、真空下で乾燥させると、2.09gの生成物が得られた(収率65％)。  1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ0.90 (3 H, t, J = 7.6 Hz), 1.01 (3 H, t, J = 7.3 Hz), 1.17 (9H, s), 1.83-1.92 (2H, m), 2.64 (2H, q, 6.9 Hz), 3.89 (1 H, s, OH), 5.11 (2H, s), 5.27 (1H, d, J = 16.1 Hz), 5.72 (1H, d, J = 16.4 Hz), 7.07 (2 H, d, J = 2.63 Hz), 7.36-7.49 (7 H, m), 7.58 (1 H, s), 7.75-7.79 (4H, m), 8.05 (1 H, d, J = 9.4 Hz)。13C NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ7.82, 13.28, 19.52, 22.86, 26.48, 31.52, 49.23, 66.25, 72.69, 97.25, 110.09, 117.57, 125.67, 126.57, 127.65, 127.81, 130.02, 131.69, 131.97, 135.26, 143.51, 145.05, 147.12, 149.55, 149.92, 154.73, 157.43, 173.72。
【実施例４】
【０１１６】
TBDPS-(10)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(20)-Gly-Boc (化合物6)
100mLの無水DCM中にTBDPS-(10)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン) (化合物5, 3.78g, 5.99mmol, 1当量)とBoc-Gly-OH (1.57g, 8,99mmol, 1.5当量)を溶解した溶液（0℃）に、EDC (1.72g, 8.99mmol, 1.5当量)およびDMAP (329mg, 2.69mmol, 0.45当量)を加えた。その反応混合物を0℃で、HPLCが出発物質の完全な消失を示すまで（約1時間45分）撹拌した。有機層を0.5％NaHCO3溶液(2 x 50mL)、水(1 x 50mL)、0.1N HCl溶液(2 x 50 mL)および食塩水(1 x 50mL)で洗浄し、その後MgSO4で乾燥させた。濾過および真空下での蒸発後、4.94gの粗生成物(定量的収率)が得られた。固体の粗生成物をそれ以上精製することなく次の反応に使用した。1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ0.89 (3 H, t, J = 7.6 Hz), 0.96 (3 H, t, J = 7.5 Hz), 1.18 (9H, s), 1.40 (9H, s), 2.07-2.29 (3H, m), 2.64 (2H, q, 7.5 Hz), 4.01-4.22 (2H, m), 5.00 (1 H, br s), 5.01 (2H, s), 5.37 (1H, d, J = 17.0 Hz), 5.66 (1H, d, J = 17.0 Hz), 7.08 (1 H, d, J = 2.34 Hz), 7.16 (1H, s), 7.37-7.50 (7 H, m), 7.77 (4H, d, J = 7.6 Hz), 8.05 (1 H, d, J = 9.4 Hz)。13C NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ7.52, 13.30, 19.50, 22.86, 26.45, 28.21, 31.64, 42.28, 49.14, 67.00, 76.65, 79.96, 95.31, 110.13, 118.98, 125.75, 126.45, 127.68, 127.81, 130.03, 131.54, 131.92, 135.25, 143.65, 144.91, 145.19, 147.08, 1
49.27, 154.75, 155.14, 157.10, 166.98, 169.17。
【実施例５】
【０１１７】
TBDPS-(10)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(20)-Gly・HCl (化合物7)
5mLの無水ジオキサン中に溶解したTBDPS-(10)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(20)-Gly-Boc (化合物6, 1g, 1.27mmol)の溶液に、5mLの4M HClジオキサン溶液を加えた。その反応混合物を室温で、HPLCが出発物質の完全な消失を示すまで（1時間）撹拌した。反応混合物を50mLのエチルエーテルに加え、生じた固体を濾過した。その固体を50mLのDCMに溶解し、食塩水で洗った(飽和NaHCO3溶液を添加してpHを2.5に調整した)。有機層をMgSO4で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させた。残留物を5mLのDCMに溶解し、50mLのエチルエーテルを加えて沈殿させた。濾過後に、770mg (収率84％)の最終生成物が得られた。1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ0.84 (3 H, t, J = 7.6 Hz), 1.05 (3 H, t, J = 7.3 Hz), 1.16 (9H, s), 2.15-2.30 (3H, m), 2.59 (2H, q, 7.6 Hz), 4.16 (1H, d, J = 17.9 Hz), 4.26 (1H, d, J = 17.9 Hz), 5.13 (2H, s), 5.46 (1H, d, J = 17.0 Hz), 5.60 (1H, d, J = 17.0 Hz), 7.11 (1 H, d, J = 2.34 Hz), 7.30 (1H, s), 7.40-7.51 (6 H, m), 7.56 (1H, dd, J = 2.34, 9.4 Hz), 7.77 (4H, dd, J = 7.6, 1.6 Hz), 7.98 (1 H, d, J = 9.1 Hz)。13C NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ8.09, 13.72, 20.26, 23.61, 26.94, 31.83, 41.01, 50.71, 67.62, 79.51, 97.03, 111.65, 119.69, 127.13, 128.97, 128.99, 129.11, 131.43, 131.96, 133.00, 133.03,136.51, 145.62, 145.81, 147.24, 148.29, 150.58, 156.27, 158.68, 167.81, 168.34。
【実施例６】
【０１１８】
40k 4アーム-PEG-Gly-(20)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(10)-TBDPS (化合物8)
14mLの無水DCM中に溶解した40k 4アーム-PEGCOOH (化合物3, 1.4g, 0.036mmol, 1当量)の溶液に、TBDPS-(10)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(20)-Gly・HCl (化合物7, 207mg, 0.29mmol, 活性部位あたり2.0当量)、DMAP (175mg, 1.44mmol, 10当量)およびPPAC (0.85mLの50％EtOAc溶液, 1.44mmol, 10当量)を加えた。その反応混合物を室温で一晩撹拌し、その後真空下で蒸発させた。得られた残留物をDCMに溶解し、エーテルを加えて生成物を沈殿させ、濾過した。その残留物をDMF/IPAで再結晶すると、生成物(1.25g)が得られた。13C NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ7.45, 13.20, 19.39, 22.73, 26.42, 31.67, 40.21, 49.01, 66.83, 95.16, 110.02, 118.83, 125.58, 126.40, 127.53, 127.73, 129.96, 131.49, 131.76, 131.82, 135.12, 143.51, 144.78, 145.13, 146.95, 149.21, 154.61, 156.92, 166.70, 168.46, 170.30。
【実施例７】
【０１１９】
40k 4アーム-PEG-Gly(20)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン) (化合物9)
化合物40k 4アーム-PEG-Gly-(20)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(10)-TBDPS (化合物8, 1.25g)に、THFと0.05M HCl溶液の1：1混合液(12.5mL)中に溶解したTBAF (122mg, 0.46mmol, 4当量)の溶液を加えた。その反応混合物を室温で4時間撹拌し、その後DCMで2回抽出した。有機層を一緒にしてMgSO4で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させた。残留物を7mLのDMFに溶解し、37mLのIPAを加えて沈殿させた。固体を濾過してIPAで洗浄した。DMF/IPAによる沈殿を繰り返した。最後に残留物を2.5mLのDCMに溶解し、25mLのエーテルを加えて沈殿させた。その固体を濾過し、真空オーブンに入れて40℃で一晩乾燥させた(860mg)。13C NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ7.48, 13.52, 22.91, 31.67, 40.22, 49.12, 66.95, 94.82, 105.03, 118.68, 122.54, 126.37, 128.20, 131.36, 142.92, 144.20, 144.98, 147.25, 148.29, 156.44, 156.98, 166.82, 168.49, 170.39。このNMRデータはPEG-COOHの形跡を示さず、全てのCOOHが反応したことを示す。負荷量は、蛍光検出で測定して、3.9であることが判明し、これはポリマーの4本の分岐鎖のそれぞれへの7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの完全な負荷と一致する。この実験をさらに大きなスケールで繰り返し実施しても、一貫した結果が得られた。
【実施例８】
【０１２０】
Boc-(10)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン) (化合物10)
250mLの無水DCM中の7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン (化合物4, 2.45g, 1当量)の懸濁液にN2下に室温でジ-tert-ブチルジカーボネート(1.764g, 1.3当量)と無水ピリジン(15.2mL, 30当量)を加えた。その懸濁液を室温で一晩撹拌した。その濁った溶液をセライト(10g)を通して濾過し、濾液を0.5N HClで3回(3 x 150mL)、NaHCO3飽和溶液で1回(1 x 150ml)洗浄した。その溶液をMgSO4 (1.25g)で乾燥させた。溶媒を真空下30℃で除去した。生成物を真空下40℃で乾燥させた(収率＝82％, 2.525g)。 13C NMR (75.4 MHz, CDCl3) δ 173.53, 157.38, 151.60, 151.28, 150.02, 149.70, 147.00, 146.50, 145.15, 131.83, 127.19, 127.13, 124.98, 118.53, 113.88, 98.06, 84.26, 72.80, 66.18, 49.33, 31.62, 27.73, 23.17, 13.98, 7.90。
【実施例９】
【０１２１】
Boc-(10)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(20)-Ala-Bsmoc (化合物11)
無水CH2Cl2 (20mL)中に溶解したBoc-(10)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン) (化合物10, 0.85g, 1.71mmol)とBsmoc-Ala (0.68g, 2.30mmol)の溶液に、EDC (0.51g, 2.67mmol)とDMAP (0.065g, 0.53mmol)を0℃で加えた。その混合物をN2下に0℃で45分撹拌し、その後室温まで温めた。反応の完了をHPLCで確認してから、反応混合物を1％NaHCO3 (2 x 50ml)、H2O (50mL)および0.1N HCl (2 x 50mL)で洗浄した。有機層を無水MgSO4で乾燥させて、濾過した。溶媒を減圧下で除去した。得られた固体を真空下40℃以下で一晩乾燥させると、1.28gの生成物が得られた(収率95％)。13C NMR (75.4 MHz, CDCl3) δ : 171.16, 166.83, 157.16, 154.78, 151.59, 151.33, 149.82, 147.17, 146.68, 145.35, 145.15, 139.08, 136.88, 133.60, 131.83, 130.45, 130.40, 130.33, 127.40, 127.08, 125.32, 125.14, 121.38, 120.01, 114.17, 95.90, 84.38, 77.19, 76.64, 67.10, 56.66, 53.45, 49.96, 49.34, 31.7, 27.76, 17.94, 14.02, 7.53。ESI-MS, 786.20 [M + H]+。
【実施例１０】
【０１２２】
Boc-(10)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(20)-Ala (化合物12)
無水CH2Cl2 (200ml)中に溶解したBoc-(10)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(20)-Ala-Bsmoc (化合物11, 4.2g, 5.35mmol)と4-ピペリジノピペリジン(1.17g, 6.96mmol)の溶液を室温で5時間撹拌した。次にその混合物を0.1N HCl (2 x 40ml)で洗浄し、その後有機層を無水MgSO4で乾燥させた。この溶液を濾過し、溶媒を真空蒸留により除くと、2.8gの生成物が得られたが、これはHPLCで測定して93％の純度であった。この生成物をエーテルによるトリチュレーション(3 x 20ml)と、次に酢酸エチルによるトリチュレーション(4 x 20ml)を行ってさらに精製すると、純度97％の生成物が1.52g (2.70mmol)得られた。13C NMR (75.4 MHz, CDCl3) δ 168.39, 166.63, 156.98, 151.20, 151.15, 149.69, 146.67, 146.56, 145.37, 144.53, 131.66, 127.13, 124.99, 119.80, 113.82, 96.15, 84.21, 77.67, 67.16, 49.48, 49.06, 31.56, 27.74, 23.14, 15.98, 13.98, 7.57。
【実施例１１】
【０１２３】
40k 4アーム-PEG-Ala-(20)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(10)-Boc (化合物13)
無水CH2Cl2 (100mL)にBoc-(10)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(20)-Ala (化合物12, 1.50g, 2.5mmol)と4アームPEG-COOH (化合物3, 10.01g, 1.0mmol)を室温で加えた。その溶液を0℃に冷やしてから、EDC (0.29g, 1.5mmol)とDMAP (0.30g, 2.5mmol)を加えた。この混合物をN2下に0℃で1時間撹拌した。その後室温に一晩保持した。溶媒を減圧下で蒸発させた。残留物を40mLのDCMに溶解し、エーテル(300mL)を加えて粗生成物を沈殿させた。濾過から得られた湿った固体をDMF/IPA (60/240mL)の混合液中に65℃で溶解した。その溶液を2〜3時間以内に室温まで冷却させて、生成物を沈殿させた。その後固体を濾過し、エーテル(2 x 200mL)で洗浄した。湿ったケークを真空下40℃以下で一晩乾燥させると、8.5gの生成物が得られた。
【実施例１２】
【０１２４】
40k 4アーム-PEG-Ala-(20)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン) (化合物14)
無水CH2Cl2中の30％TFAの溶液(130mL)に室温で40k 4アーム-PEG-Ala-(20)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(10)-Boc (化合物13, 7.98g)を加えた。その混合物を3時間、または出発物質の消失がHPLCで確認されるまで、撹拌した。溶媒を真空下35℃でできるだけ多く除去した。残留物を50mLのDCMに溶解し、エーテル(350mL)を加えて粗生成物を沈殿させ、濾過した。湿った固体をDMF/IPA (50/200mL)の混合液中に65℃で溶解した。その溶液を2〜3時間以内に室温まで冷却させて、生成物を沈殿させた。その後固体を濾過し、エーテル(2 x 200mL)で洗浄した。湿ったケークを真空下40℃以下で一晩乾燥させると、6.7gの生成物が得られた。13C NMR (75.4 MHz, CDCl3) δ : 170.75, 169.30, 166.65, 157.00, 156.31, 148.36, 147.19, 145.03, 144.29, 143.00, 131.49, 128.26, 126.42, 122.47, 118.79, 105.10, 94.57, 78.08, 77.81, 77.20,  71.15, 70.88, 70.71, 70.33, 70.28, 70.06, 69.93, 69.57, 66.90, 49.14, 47.14, 31.53, 22.95, 17.78, 13.52, 7.46。
【実施例１３】
【０１２５】
Boc-(10)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(20)-Met-Bsmoc (化合物15)
無水CH2Cl2 (50mL)に溶解したBoc-(10)-7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン (化合物10, 2.73g, 5.53mmol)とBsmoc-Met (3.19g, 8.59mmol)の溶液に、0℃でEDC (1.64g, 8.59mmol)とDMAP (0.21g, 1.72mmol)を加えた。その混合物をN2下に0℃で45分撹拌し、次に室温まで温めた。反応の完了をHPLCで確認した後、反応混合物を1％NaHCO3 (2 x 100ml)、H2O (100mL)および0.1N HCl (2 x 100mL)で洗浄した。有機層を無水MgSO4で乾燥させて濾過した。溶媒を減圧下で除去した。得られた固体を真空下40℃以下で一晩乾燥させると、4.2gの生成物が88％の収率で得られた。13C NMR (75.4 MHz, CDCl3) δ: 170.3, 166.8, 157.1, 155.2, 151.4, 151.2, 149.7, 147.0, 146.6, 145.3, 145.1, 138.9, 136.6, 133.5, 131.7, 130.5, 130.3, 130.2, 127.3, 127.0, 125.3, 125.1, 121.2, 119.8, 114.1, 96.1, 84.3, 76.7, 67.0, 56.7, 53.5, 53.4, 49.3, 31.6, 31.0, 29.7, 27.7, 23.1, 15.4, 13.9, 7.4;  ESI-MS, 846.24 [M + H]+。
【実施例１４】
【０１２６】
Boc-(10)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(20)-Met-NH2・HCl (化合物16)
無水CH2Cl2 (200mL)に溶解したBoc-(10)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(20)-Met-Bsmoc (化合物15, 4.1g, 4.85mmol)と4-ピペリジノピペリジン(1.06g, 6.31mmol)の溶液を室温で5時間撹拌した。次にその混合物を0.1N HCl (2 x 40ml)で洗浄してから、有機層を無水MgSO4で乾燥させた。この溶液を濾過し、溶媒を真空蒸留により除去すると、2.8gの生成物が約97％の純度（HPLCにより測定）で得られた。この生成物をエーテルによるトリチュレーション(3 x 20ml)と、次に酢酸エチルによるトリチュレーション(4 x 20ml)を行ってさらに精製すると、純度97％の生成物が1.54g得られた。13C NMR (75.4 MHz, CDCl3) δ: 167.2, 166.5, 156.9, 151.12, 150.9, 149.8, 146.3, 145.9, 145.8, 144.9, 131.3, 127.2, 127.0, 125.1, 119.6, 113.8, 96.7, 84.3, 78.2, 67.0, 60.4, 52.2, 49.4, 31.4, 29.6, 29.1, 27.7, 23.2, 15.1, 13.9, 7.7。
【実施例１５】
【０１２７】
40k 4アーム-PEG-Met-(20)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(10)-Boc (化合物17)
無水CH2Cl2 (80mL)溶液に、Boc-(10)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(20)-Met (化合物16, 1.48g, 2.25mmol)と4アーム-PEG-COOH (化合物3, 9.0g, 0.9mmol)を室温で加えた。その溶液を0℃に冷却してから、EDC (0.26g, 1.35mmol)とDMAP (0.27g, 2.25mmol)を加えた。その混合物をN2下に0℃で1時間撹拌した。その後室温に一晩保持した。その反応混合物を70mlのCH2Cl2で希釈し、30mlの0.1N HCl/1M NaCl水溶液で抽出した。有機層をMgSO4で乾燥させた後、溶媒を減圧下で蒸発させた。残留物を40mLのCH2Cl2に溶解し、エーテル(300mL)を加えて粗生成物を沈殿させた。濾過から得られた湿った固体を270mLのDMF/IPAに65℃で溶解した。その溶液を2〜3時間以内に室温まで冷却させて、生成物を沈殿させた。その後固体を濾過し、エーテル(2 x 400mL)で洗浄した。上記のDMF/IPA中での結晶化の手順を繰り返した。湿ったケークを真空下40℃以下で一晩乾燥させると、7.0gの生成物が得られた。13C NMR (75.4 MHz, CDCl3) δ:169.8, 169.6, 166.5, 156.9, 151.2, 151.1, 149.9, 147.0, 146.6, 145.0, 131.7, 127,1, 126.8, 124.9, 119.7, 113.8, 95.5, 84.1, 70.1, 69.9, 66.9, 50.7, 49.2, 31.5, 31.2, 29.6, 27.6, 23.1, 15.3, 13.9, 7.5。
【実施例１６】
【０１２８】
40k 4アーム-PEG-Met-(20)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン) (化合物18)
無水CH2Cl2中の30％TFAの溶液(100mL)に、室温でジメチルスルフィド(2.5 mL)と4アーム-PEG-Met-(20)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(10)-Boc (化合物17, 6.0g)を加えた。その混合物を3時間、または出発物質の消失がHPLCで確認されるまで、撹拌した。溶媒を真空下35℃でできるだけ多く除去した。残留物を50mLのCH2Cl2に溶解し、エーテル(350mL)を加えて粗生成物を沈殿させ、濾過した。湿った固体をDMF/IPA (60/300mL)の混合液中に65℃で溶解した。その溶液を2〜3時間以内に室温まで冷却させて、生成物を沈殿させた。その後固体を濾過し、エーテル(2 x 200mL)で洗浄した。湿ったケークを真空下40℃以下で一晩乾燥させると、5.1gの生成物が得られた。13C NMR (75.4 MHz, CDCl3) δ :169.7, 166.6, 157.0, 156.3, 148.4, 147.3, 145.0, 144.4, 142.9, 131.5, 128.3, 126.4, 122.5, 118.7, 105.2, 94.7, 78.1, 67.0, 50.7, 49.2, 31.6, 31.3, 29.7, 23.0, 15.3, 13.5, 7.5; PEGに対する7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの比率: 2.1％(wt)。
【実施例１７】
【０１２９】
Boc-(10)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(20)-Sar-Boc (化合物19)
Boc-Sar-OH (432mg, 2.287mmol)を、75mLのDCMに溶解したBoc-(10)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン) (化合物10, 750mg, 1.52mmol)の溶液に加えて、0℃に冷やした。DMAP (432mg, 2.287mmol)とEDC (837mg, 0.686mmol)を加え、その反応混合物を0℃から室温で1.5時間撹拌した。その後反応混合物を0.5％NaHCO3 (75mL x 2)、水(75ml x 2)、最後に0.1N HCl (75mL x 1)で洗浄した。塩化メチレン層をMgSO4で乾燥させ、溶媒を真空下で蒸発させ乾燥させた。収量＝0.900mg(89％)。NMRでその構造を確認した。
【実施例１８】
【０１３０】
7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン-(20)-Sar・TFA (化合物20)
Boc-(10)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(20)-Sar-Boc (化合物19, 900mg, 1.357mmol)を4mLのTFAと16mLのDCMの溶液に加えて、室温で1時間撹拌した。その反応混合物をトルエンと共に30℃で蒸発させた。残留物を10mLのCHCl3に溶解し、エチルエーテルを加えて沈殿させた。生成物を濾過して乾燥させた。収量700mg (1.055mmol, 78％)。13C NMR (67.8 MHz, CDCl3) δ168.26, 167.07, 158.84, 158.71, 148.82, 147.94, 147.22, 146.34, 144.04, 131.18, 130.08, 128.97, 124.46, 119.78, 106.02, 97.23, 79.84, 79.34, 66.87, 50.84, 49.86, 31.81, 23.94, 15.47, 13.84, 8.08。
【実施例１９】
【０１３１】
TBDMS-(10)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(20)-Sar・HCl (化合物21)
無水DMF (30mL)に溶解した7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン-(20)-Sar・TFA (化合物20, 2.17g, 3.75mmol, 1当量)の溶液を200mLの無水DCMで希釈した。Et3N (2.4mL, 17.40mmol, 4.5当量)を加え、続いてTBDMSCl (2.04g, 13.53mmol, 3.5当量)を加えた。その反応混合物を室温で、HPLCが出発物質の消失を示すまで（約1時間）撹拌した。有機層を0.5％NaHCO3で2回、水で1回、食塩水で飽和させた0.1N HCl溶液で2回洗浄し、その後MgSO4で乾燥させた。濾過および真空下での溶媒の蒸発後、得られたオイルをDCMに溶解した。エーテルの添加により固体が得られ、その固体を微細なまたは中間のブフナー漏斗を用いて濾過した(2.00g, 収率87％)。その固体のHPLCは96％の純度を示した。1H NMRおよび13C NMRにより構造を確認した。1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ0.23 (6H, s), 0.96 (9H, s), 0.98 (3 H, t, J = 7.3 Hz), 1.30 (3 H, t, J = 7.6 Hz), 2.13-2.18 (2H, m), 2.67 (3H, s), 3.11 (2 H, q, J = 7.6 Hz), 4.10 (1H, d, J = 17.6 Hz), 4.22 (1H, d, J = 17.6 Hz), 5.23 (2 H, s), 5.40 (1 H, d, J = 16.7 Hz), 5.55 (1H, d, J = 16.7 Hz), 7.32 (1H, s), 7.38-7.43 (2H, m), 8.00 (1H, d, J = 9.1 Hz)。13C NMR (75.4 MHz, CD3OD): δ-4.14, 8.01, 14.10, 19.30, 23.98, 26.16, 31.78, 33.52, 49.46, 50.95, 67.66, 79.80, 97.41, 111.96, 119.99, 127.75, 129.28, 129.67, 131.57, 145.24, 146.86, 147.16, 148.02, 150.34, 156.69, 158.72, 167.02, 168.27。
【実施例２０】
【０１３２】
40K 4アーム-PEG-Sar-(20)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(10)-TBDMS (化合物22)
150mLの無水DCMに溶解した40K 4アーム-PEG-COOH (化合物3, 10g, 0.25mmol, 1当量)の溶液に、20mLの無水DMFに溶解したTBDMS-(10)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-Sar・HCl (化合物21, 1.53g, 2.5mmol, 2.5当量)の溶液を加え、その混合物を0℃に冷却した。この溶液にEDC (767mg, 4mmol, 4当量)とDMAP (367mg, 3mmol, 3当量)を加えて、反応混合物を徐々に室温へと温め、室温で一晩撹拌した。その後反応混合物を真空下で蒸発させ、残留物を最少量のDCMに溶解した。エーテルを加えると固体が形成され、その固体を真空下で濾過した。残留物を30mLの無水CH3CNに溶解し、600mLのIPAを加えて沈殿させた。その固体を濾過し、IPAとエーテルで洗浄して生成物(9.5g)を得た。その構造をNMRで確認した。
【実施例２１】
【０１３３】
40K 4アーム-PEG-Sar-(20)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン) (化合物23)
方法A 40K 4アーム-PEG-Sar-(20)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(10)-TBDMS (化合物22)を50％TFA水溶液(200mL)に溶解した。その反応混合物を室温で10時間撹拌し、その後100mLの水で希釈し、DCM (2 x 300mL)で抽出した。有機層を一緒にして水(2 x 100mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させた。残留物をヒートガンで穏やかに加熱した100mLの無水DMFに溶解し、400mLのDMFをゆっくり加えて沈殿させた。その固体を濾過し、エーテルおよびIPA中の20％DMFで洗浄した。その固体をDCMに溶解し、エーテルを加えて沈殿させた(6.8g)。その構造をNMRで確認した。
【０１３４】
方法B 40K 4アーム-PEG-Sar-(20)-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)-(10)-TBDMS (1g)を10mLの1N HCl溶液に溶解した。その反応混合物を室温で1時間撹拌し（HPLCで確認）、その後DCM (2 x 40mL)で抽出した。有機層をMgSO4で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させた。得られた鮮やかな黄色の残留物を10mLのDMF (ヒートガンで穏やかに加熱した)に溶解し、次に40mLのIPAを加えた。得られた固体を濾過し、真空オーブンに入れて40℃で一晩乾燥させた。その構造をNMRで確認した。
【０１３５】
［生物学的データ］
【実施例２２】
【０１３６】
毒性データ
ヌードマウスを用いて、実施例7（上記参照）で製造した4アームPEGコンジュゲート化7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン(化合物9)の最大耐量(MTD)を検討した。マウスを死亡数および病気の兆候について14日間モニタリングし、体重減少が処置前の体重の20％を上回ったときマウスを犠牲にした。
【０１３７】
下記の表2は、単回投与および複数回投与のための各化合物の最大耐量を示す。複数回投与の場合の各用量はマウスに1日おきに10日間投与し、マウスをさらに4日間（それゆえ、合計14日間）観察した。
【表１】
2012506380.tif 000020
【０１３８】
4アーム-PEG-Gly-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン) (化合物9)について判明したMTDは、単回投与の場合が30mg/kgで、複数回投与(q2d x 5)の場合が10mg/kgであった。
【実施例２３】
【０１３９】
PEGコンジュゲートの性質
下記の表3は、4種の異なるPEG-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)コンジュゲートの食塩水溶液中での溶解性を示す。4種すべてのPEG-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)コンジュゲートは、7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンに相当する最大4mg/mLの良好な溶解性を示した。ヒト血漿中では、7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンはPEGコンジュゲートから徐々に放出され、その際の倍加時間は22〜52分であった。放出は以下の実施例24に記載するようにpHと濃度に依存するようであった。
【表２】
2012506380.tif 000021
【０１４０】
PEG-7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンコンジュゲートは、室温において、食塩水および他の水性媒体中で最大24時間まで良好な安定性を示す。
【実施例２４】
【０１４１】
安定性に対する濃度およびpHの影響
本発明者らの以前の研究に基づくと、20-OH位でのアシル化は活性閉環形態のラクトン環を保護する。ラットおよびヒト血漿中での水安定性ならびに加水分解特性を、HPLC-UV法を用いてモニタリングした。4アームPEG-Gly-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)コンジュゲートを各サンプルと室温で5分間インキュベートした。
【０１４２】
緩衝液中のPEG-7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンコンジュゲートの安定性はpH依存性であった。図6は、さまざまなサンプル中での4アームPEG-Gly-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)の安定性を示す。図7は、PEG-Gly-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)からの7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの放出速度がpHの上昇につれて増加することを示す。
【実施例２５】
【０１４３】
薬物動態
腫瘍のないBalb/Cマウスに20mg/kgの4アームPEG-Gly-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)コンジュゲートを単回投与で注射した。いくつかの時点でマウスを犠牲にし、完全なコンジュゲートおよび放出された7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンについて血漿をHPLCで分析した。薬物動態解析はノンコンパートメント解析(non-compartmental analysis (WinNonlin))を用いて行った。詳細を以下の表4に示す。
【表３】
2012506380.tif 000022
【０１４４】
図8Aおよび8Bに示すように、7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンのPEG化は、血中半減期を長くし、親薬物7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンへの暴露を高くする。4アームPEG-Gly-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)コンジュゲートの腸肝循環が観察された。マウスにおけるPEG-Gly-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)の薬物動態プロファイルは2相性であり、最初の2時間の急速な血漿分布相と、これに続くコンジュゲートの18〜22時間の最終排泄半減期およびこれと同時に起こる7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの18〜26時間の最終排泄半減期を示す。
【０１４５】
さらに、4アームPEG-Gly-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)の薬物動態プロファイルはラットでも検討された。ラットには、3、10および30mg/kg (7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン相当物)の投与レベルを用いた。ラットにおける薬物動態プロファイルはマウスのそれと一致した。
【０１４６】
ラットでは、4アーム PEG-Gly-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)は循環からの2相性クリアランスを示し、12〜18時間の排泄半減期を有していた。4アームPEG-Gly-7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンコンジュゲートから放出された7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンは21〜22時間の見かけの排泄半減期を有していた。最大血漿中濃度(Cmax)および曲線下面積(AUC)はラットにおいて用量依存的に増加した。マウスまたはラットで4アームPEG-Glyコンジュゲートから放出された7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの見かけの半減期は、CPT-11から放出された7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの報告された見かけの半減期より著しく長く、また、4アームPEG-Gly-(7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン)から放出された7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの暴露は、CPT-11から放出された7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの報告された暴露より著しく高かった。親化合物のクリアランスはラットにおいて0.35mL/hr/kgであった。親化合物の推定される定常状態での分布容積(Vss)は5.49mL/kgであった。放出された7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンのクリアランスはラットにおいて131mL/hr/kgであった。放出された7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの推定Vssはラットにおいて2384mL/kgであった。放出された7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの腸肝循環がマウスとラットの両方で観察された。
【実施例２６】
【０１４７】
in vivoデータ - 疑似転移性ヒト神経芽腫(HTLA-230)異種移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果
実施例7の化合物9の抗腫瘍効果はHTLA-230ヒト神経芽腫を異種移植されたマウスの生存率により測定した。異種移植物は、マウスにヒト神経芽腫細胞(HTLA-230)をゼロ時点で静脈内注入することにより樹立した。
【０１４８】
4週齢の雌の無胸腺ヌード(nu/nu)マウスをHarlan Laboratories社(Harlan Italy-S.Pietro al Natisone, UD)から購入した。1群8匹のマウスに、ヒトNB細胞株HTLA-230 (HEPES緩衝生理食塩水200μl中に3.5×106個の細胞)を0日目に尾静脈内(i.v.)注入した。次にマウスを各試験群（1群8匹）に無作為に割り当てた。神経芽腫細胞を注入してから24時間または72時間が経過した後、化合物9で治療するマウス群には、q2d x 5にて(したがって、1、3、5および9日目; または3、5、7、9および11日目に) 10mg/kg体重(SN38に基づく)の化合物9を静脈内投与した。CPT-11で治療するマウスには、10mg/kg体重のCPT-11をq2d x 5にて投与した。対照群にはHEPES緩衝生理食塩水を投与した。マウスの体重減少を定期的にモニタリングした。生存時間が治療効果を判定するための基準として用いられた。
【０１４９】
全ての場合に、投与された化合物9の量は、投与されたポリマーコンジュゲートの量ではなく、7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの量に基づくものである。
【０１５０】
神経芽腫細胞を注入してから24時間および72時間後に化合物9で治療したマウスはどちらも、対照マウスまたはCPT-11で治療したマウスと比較して、著しく増加した生存期間を示した。神経芽腫細胞注入の24または72時間後の治療の生存率の結果を図9Aおよび図9Bに示す。
【０１５１】
これらの結果は、化合物9で治療したマウスが癌注入後150日経過しても生存率100％であったことを示している。対照マウスまたはCPT-11で治療したマウスはいずれも生き残らなかった。対照およびCPT-11治療マウスは、転移性癌のため、それぞれ癌注入から50日および85日以内に死亡した。
【０１５２】
HTLA-230細胞は病気が進行した患者から分離されたヒト神経芽腫細胞株である。この癌細胞の詳細はBogenmann, Int. J. Cancer, 1996, 67:379-85に見い出すことができ、その内容を本明細書中で援用する。
【０１５３】
HTLA-230を異種移植されたマウスは、この疾患の疑似転移期の神経芽腫と生物学的および臨床的に関係している。また、このモデルは、放射線療法や化学療法のようないくつかの療法で治療した後に存在する、又は生き残っている細胞を含む神経芽腫のステージにも関係している。
【０１５４】
HTLA-230神経芽腫細胞をマウスに静脈内注入する場合、この異種移植モデルは進行期NB患者において観察される転移性の広がりを模倣する。Bogenmann. E., 1996, Int. J. Cancer, 67: 381-386, 1996; およびPastorino F. et al., Cancer Res. 2003; 63: 86-92を参照されたい。
【０１５５】
大規模なコホートの患者で実施されたいくつかの研究は、血中を循環している神経芽腫細胞および最初の手術の際の骨髄における微小転移巣の存在が再発の強力な予測因子であることを示している。Moss, T. et al., 1991, New Engl. J. Med., 324: 219-226。骨髄の微小転移巣は全身に広がる腫瘍細胞の能力の直接的な尺度であるので、臨床的状況をよく模倣するこのモデルは、抗腫瘍療法のより現実的な評価を可能にし、それゆえ、神経芽腫の治療における化合物9の使用を支持する証拠を提供する。治療のスケジュールは、転移カスケード（すなわち、腫瘍細胞が血管内を循環中であって、内皮細胞への付着が起こる段階、または血管外遊出、間質浸潤およびコロニー形成が起こる段階）の間の治療効果の評価を可能にするように、意図的に選ばれた。Al-Mehbi, A. B. et al., Nature Med., 2000, 6: 100-102; およびChambers, A. F. et al., Nature Rev. Cancer, 2002, 2: 563-572を参照されたい。
【０１５６】
上記の結果は、本明細書に記載の化合物がCPT-11に基づく治療に比べて利点があることを示している。
【実施例２７】
【０１５７】
in vivoデータ - 同所性ヒト神経芽腫(GI-LI-N)異種移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果
化合物9の抗腫瘍効果は同所性ヒト神経芽腫異種移植マウスにおいて測定された。異種移植腫瘍はマウスの副腎にヒト神経芽腫細胞(GI-LI-N)を注入することにより樹立した。
【０１５８】
5週齢の雌の無胸腺ヌード(nu/nu)マウスを各試験群（1群8匹）に無作為に割り当てた。1群8匹のマウスに麻酔をかけ、ヒトNB細胞株GI-LI-N (HEPES緩衝液15μl中に1×106個の細胞)を、開腹後、左副腎の鞘に注入した。腫瘍発生の証拠、腫瘍サイズの測定、および腫瘍関連死亡の証拠についてマウスを週に少なくとも2回モニタリングした。腫瘍を20日間成長させると、平均体積が約200mm3になった。その後、腫瘍細胞注入後21、23、25、27および29日目に、化合物9で治療するマウス群には10mg/kg体重の化合物9を静脈内注射した。CPT-11で治療するマウスには、10mg/kg体重のCPT-11をq2d x 5にて注射した。対照群にはHEPES緩衝生理食塩水を投与した。動物の体重と一般的な身体状況を毎日観察し、どのマウスも腫瘍が1000〜1200mm3に達したときに終了した。生存時間が治療効果を判定するための基準として用いられた。
【０１５９】
これらの実験において、投与された化合物9の量は、投与されたポリマーコンジュゲートの量ではなく、7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの量に基づいていた。
【０１６０】
化合物9で治療したマウスは、対照マウスまたはCPT-11で治療したマウスと比較して、著しく増加した生存期間を示した。生存率の結果を図10に示す。
【０１６１】
これらの結果は、化合物9で治療したマウスが腫瘍細胞移植後100日経過しても生存率100％であったことを示している。対照マウスまたはCPT-11で治療したマウスはいずれも生き残らなかった。対照およびCPT-11治療動物はどちらも癌のため80日以内に死亡した。化合物9で治療したマウスは、対照マウスと比較して、原発腫瘍の増殖の劇的な停止および退縮を示した。
【０１６２】
GI-LI-Nを異種移植されたマウスは、巨大な腫瘍（固形腫瘍）および転移を伴う病期のヒト神経芽腫と臨床的に関係している。同所性移植モデルには、転移する大きな原発性塊の治療が含まれる。これらの結果は、本明細書に記載の治療が後期または進行期の神経芽腫の患者を治療するのに有用であることを示している。結果はまた、本明細書に記載の化合物がCPT-11に基づいた治療に代わるものであることを示している。
【０１６３】
GI-LI-N細胞異種移植モデルは、再現可能な、血管新生および転移性の同所性NBモデルである。このモデルはヒトNBの典型的な増殖パターンを反映している。なぜなら、NB細胞の同所注入によって、非常に血管形成性で、周囲の組織に局所侵襲的であり、離れた部位に転移する固形副腎腫瘍が生じるからである。さらに、巨視的転移巣が注入の3〜4週後に対側の副腎と肝臓に発生する一方で、微小転移巣が卵巣、右腎臓、肝臓および肺(6〜10個)に現われたことが報告されている。Pastorino F. et al., Cancer Res. 2003, 63: 7400-7409; Brignole C. et al., J Natl Cancer Inst. 2006, 98:1142-57; Marimpietri D. et al., Clin Cancer Res. 2007, 13: 3977-3988; Pastorino F. et al., Current Medicinal Chemistry 2007, 14:3070-8; およびPastorino F. et al., Clinical Cancer Research, 2008, 14:7320-7329を参照されたい。
【０１６４】
実施例26および27に記載した結果は、本明細書に記載の治療が神経芽腫のさまざまな病期において患者を治療するのに有用であることを示している。
【実施例２８】
【０１６５】
in vivoデータ - GI-LI-N異種移植マウスモデルにおける効果
実施例27に記載される、GI-LI-N神経芽腫細胞を異種移植したマウスにおいて、腫瘍の大きさを各時点で測定した。その結果を図11に示す。
【０１６６】
化合物9で治療した同所性神経芽腫異種移植マウスは、対照マウスまたはCPT-11治療マウスと比較して、原発腫瘍増殖の劇的な停止および退縮を示した。転移性癌の治療において化合物9はCPT-11よりもかなり効果的である。
【実施例２９】
【０１６７】
in vivoデータ - GI-LI-N異種移植マウスモデルにおける効果
実施例27に記載されるマウスで腫瘍の組織学的検査を行った。同所性神経芽腫を担持するマウスから50日目に腫瘍を摘出した。神経芽腫細胞マーカーとしてNB84、また、腫瘍細胞増殖マーカーとしてKi-67について腫瘍切片を免疫染色した。細胞核をDAPIで染色した。各群のマウスについて、免疫染色された腫瘍切片および陽性細胞を図12Aに示し、測定値を図12Bに示す。
【０１６８】
組織学的研究から、化合物9で治療したマウスには神経芽腫マーカー陽性細胞が存在しないか、ほとんど存在しないことが確認される。データからは、本明細書に記載の治療によって腫瘍細胞がマウスから消滅したことが確認される。
【実施例３０】
【０１６９】
in vivoデータ - GI-LI-N異種移植マウスモデルにおけるMTDのCPT-11との比較研究
実施例27に記載したように、ヒト神経芽腫細胞GI-LI-Nを免疫不全ヌードマウスの左副腎に移植した。腫瘍を20日間成長させると、平均体積が約200mm3になった。腫瘍細胞注入後21、23、25、27および29日目に、化合物9で治療するマウス群には10mg/kg体重の化合物9 (SN38に基づく)を静脈内注射した。CPT-11で治療したマウスには、10または40mg/kg体重(MTD)のCPT-11を21、23、25、27および29日目に注射した。対照群にはHEPES緩衝生理食塩水を投与した。
【０１７０】
化合物9で治療したマウスは、対照マウスまたはCPT-11で治療したマウスと比較して、著しく増加した生存期間を示した。生存率の結果を図13に示す。
【０１７１】
これらの結果は、化合物9で治療したマウスが腫瘍細胞移植後180日経過しても生存率100％であったことを示している。対照マウスまたは10mg/kg/回のCPT-11で治療したマウスはいずれも生き残らなかった。これらの動物は癌のため80日以内に死亡した。MTD (40mg/kg)のCPT-11による治療は生存率を若干向上させた。化合物9の治療効果はMTDのCPT-11を用いた治療よりもすぐれていた。
【実施例３１】
【０１７２】
in vivoデータ - NXS2異種移植マウスモデルにおける効果
化合物9の抗腫瘍効果はヒト神経芽腫細胞NXS2を異種移植されたマウスにおいて測定された。異種移植腫瘍は、ヒト神経芽腫細胞NXS2を副腎に注入することによって免疫応答性A/Jマウスに樹立した。
【０１７３】
免疫応答性マウスの左副腎に、別のヒトNB細胞であるNXS2を5×104個または5×105個注入した。腫瘍を2日間成長させると、平均体積が200mm3ほどになった。その後、化合物9で治療するマウス群には、腫瘍細胞注入後3、5、7、9および11日目に10mg/kg体重の化合物9を静脈内注射した。CPT-11で治療するマウスには、10または40mg/kg体重のCPT-11をq2d x 5にて注射した。対照群にはHEPES緩衝生理食塩水を投与した。治療効果を判定するための基準として生存時間を用いた。
【０１７４】
NXS2異種移植動物モデルは、急速な腫瘍成長に見られるように、非常に進行が速いヒト神経芽腫に相当する。結果は、化合物9が進行性神経芽腫の治療に有効であったことを示す。5×104個の腫瘍細胞をマウスに用いたとき、化合物9で治療したマウスは100％生存し、5×105個という高濃度の腫瘍細胞をマウスに用いたときにも、約40％のマウスがまだ生存していた。生存率の結果を図14Aおよび図14Bに示す。対照マウスまたは10mg/kg/回もしくはMTDのCPT-11で治療したマウスはどれも生き残らなかった。CPT-11で治療したマウスの生存率は対照群のそれと同じくらい低かった。10mg/kg/回またはMTDを用いたCPT-11療法はどちらも進行性神経芽腫の治療に効果がなかった。
【実施例３２】
【０１７５】
in vivoデータ - SH-SY5Y異種移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果
SH-SY5Y異種移植マウスモデルにおいて、化合物9の抗腫瘍効果をカンプトサル(CAMPTOSAR) (医薬製剤としてのCPT-11)と比較した。
【０１７６】
ヒト神経芽腫細胞SH-SY5YをSCIDマウスの右脇腹に0日目に皮下注入した。SH-SY5Y細胞はルシフェラーゼをトランスフェクションしたヒト神経芽腫細胞である。そのマウスを、10mg/kg/回のカンプトサルまたは等用量の化合物9 (SN38に基づく)を用いて腫瘍移植の1週間後に1日おきに合計5回治療した。
【０１７７】
ルシフェラーゼを発現する神経芽腫細胞は生物発光イメージング(BLI)により可視化した。腫瘍移植部位を示す横方向画像を0日目(T0)および時間の経過とともに(T12-50)に撮影した。
【０１７８】
12日目(T12)、21日目(T21)、42日目(T42)および50日目(T50)に撮ったBLI画像を図15Aに示す。各画像において、第1、第2および第3のスロットは、治療を一切受けなかったマウス、カンプトサルで治療したマウス、および化合物9で治療したマウスのために割り当てられる。BLIの強度は青から赤までのBLIのカラーグレードにつれて増加する。より少ない発光はマウスにおけるより少ない神経芽腫細胞を意味する。抗腫瘍効果を発光の変化により評価した。
【０１７９】
結果は、化合物9で治療したマウスには42日目と50日目に腫瘍細胞がほとんど存在しなかったことを示している。カンプトサルで治療したマウスでは50日目に発光神経芽腫細胞が減少していなかった。
【０１８０】
神経芽腫細胞を発光に基づいて定量化した。その結果を図15Bに示す。化合物9で治療したマウスには原発腫瘍の退縮が見られた。カンプトサルは腫瘍を治療しなかった。
【図１】
2012506380.tif 000032
【図２】
2012506380.tif 000033
【図３】
2012506380.tif 000034
【図４】
2012506380.tif 000035
【図５】
2012506380.tif 000036
【図６】
2012506380.tif 000037
【図７】
2012506380.tif 000038
【図８Ａ】
2012506380.tif 000039
【図８Ｂ】
2012506380.tif 000040
【図９Ａ】
2012506380.tif 000041
【図９Ｂ】
2012506380.tif 000042
【図１０】
2012506380.tif 000043
【図１１】
2012506380.tif 000044
【図１２Ａ】
2012506380.tif 000045
【図１２Ｂ】
2012506380.tif 000046
【図１３】
2012506380.tif 000047
【図１４Ａ】
2012506380.tif 000048
【図１４Ｂ】
2012506380.tif 000049
【図１５Ａ】
2012506380.tif 000050
【図１５Ｂ】
2012506380.tif 000051
【手続補正書】
【提出日】平成23年6月21日(2011.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における神経芽腫を治療するための医薬組成物であって、有効量の式(I)の化合物：
【化１】
2012506380.tif 000052
［式中、
R1、R2、R3およびR4は独立してOHまたは
2012506380.tif 000053
であり、ここで、
Lは2官能性リンカーであり、
(m)は0または正の整数であり、(m)が2以上であるとき、各Lは同一であるか、または異なっており、そして
(n)は正の整数である；
ただし、R1、R2、R3およびR4がすべてOHであることはない］
またはその製薬上許容される塩を哺乳動物に投与することを含んでなる上記医薬組成物。
【請求項２】
(m)が約1である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項３】
(n)が約28〜約341であり、その結果、前記化合物のポリマー部分の合計分子量が約5,000〜約60,000ダルトンの範囲である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項４】
(n)が約114〜約239であり、その結果、前記化合物のポリマー部分の合計分子量が約20,000〜約42,000ダルトンの範囲である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項５】
(n)が約227であり、その結果、前記化合物のポリマー部分の合計分子量が約40,000ダルトンである、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項６】
式(I)の化合物が医薬組成物の一部であり、かつR1、R2、R3およびR4がすべて
2012506380.tif 000054
である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項７】
式(I)の化合物が以下の化合物：
【化２】
2012506380.tif 000055
2012506380.tif 000056
からなる群より選択される、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項８】
式(I)の化合物が以下の化合物：
【化３】
2012506380.tif 000057
である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項９】
式(I)の化合物を約0.5mg/m2体表面/回〜約50mg/m2体表面/回の量で投与する、ただし、前記量は式(I)の化合物に含まれる7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの重量である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
式(I)の化合物を約1mg/m2体表面/回〜約18mg/m2体表面/回の量で投与する、ただし、前記量は式(I)の化合物に含まれる7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの重量である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
式(I)の化合物を、約1.25mg/m2体表面/回〜約16.5mg/m2体表面/回の量で週1回3週間投与し、次の1週間は治療を休むプロトコルに従って投与する、ただし、前記量は式(I)の化合物に含まれる7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの重量である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
週1回の投与量が約5mg/m2体表面/回であり、前記量が式(I)の化合物に含まれる7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの重量である、請求項11に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記癌が転移性である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記癌が固形腫瘍である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
式(I)の化合物を第2の化学療法剤と組合せて、同時にまたは順次投与する、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
式(I)の化合物を投与し、続いて13-cis-レチノイン酸を投与する、請求項15に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
式(I)の化合物を放射線療法と組合せて、同時にまたは順次投与する、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記癌が式(I)の化合物を含まない抗癌療法に対して抵抗性または難治性である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記癌がカンプトテシン、CPT-11、上皮成長因子受容体アンタゴニスト、およびこれらの組合せから選択される抗癌剤に対して抵抗性である、請求項18に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
上皮成長因子受容体アンタゴニストがセツキシマブである、請求項19に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
哺乳動物における神経芽腫を治療するための医薬組成物であって、有効量の次式の化合物：
【化４】
2012506380.tif 000058
［式中、(n)は約227である］
またはその製薬上許容される塩を哺乳動物に投与することを含んでなり、
その際、前記化合物を約1mg/m2体表面/回〜約18mg/m2体表面/回の量で投与する、ただし、前記量は式(I)の化合物に含まれる7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの重量である、上記医薬組成物。
【請求項２２】
前記化合物を、約1.25mg/m2体表面/回〜約16.5mg/m2体表面/回の量で週1回3週間投与し、次の1週間は治療を休むプロトコルに従って投与する、ただし、前記量は式(I)の化合物に含まれる7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの重量である、請求項21に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
週1回の投与量が約5mg/m2体表面/回であり、前記量が式(I)の化合物に含まれる7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシンの重量である、請求項22に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
Lがアミノ酸またはアミノ酸誘導体であり、ここでアミノ酸誘導体が2-アミノアジピン酸、3-アミノアジピン酸、β-アラニン、β-アミノプロピオン酸、2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、ピペリジン酸、6-アミノカプロン酸、2-アミノヘプタン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノイソ酪酸、2-アミノピメリン酸、2,4-アミノ酪酸、デスモシン、2,2-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-エチルアスパラギン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ-イソロイシン、N-メチルグリシン、サルコシン、N-メチル-イソロイシン、6-N-メチル-リシン、N-メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、およびオルニチンからなる群より選択される、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
Lがグリシン、アラニン、メチオニンまたはサルコシンである、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
Lが：
【化５】
2012506380.tif 000059
2012506380.tif 000060
［式中、
R21-R29は、独立して、水素、アミノ、置換アミノ、アジド、カルボキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、シリルエーテル、スルホニル、メルカプト、C1-6アルキルメルカプト、アリールメルカプト、置換アリールメルカプト、置換C1-6アルキルチオ、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-19分岐アルキル、C3-8シクロアルキル、C1-6置換アルキル、C2-6置換アルケニル、C2-6置換アルキニル、C3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、C1-6ヘテロアルキル、置換C1-6ヘテロアルキル、C1-6アルコキシ、アリールオキシ、C1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、C2-6アルカノイル、アリールカルボニル、C2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、C2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、C2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、C2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、C2-6置換アルカノイルオキシ、および置換アリールカルボニルオキシからなる群より選択され；
(t)、(t')および(y)は、独立して、0または正の整数であり；そして
(v)は0または1である］
からなる群より選択される、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
(m)が約1〜約10である、請求項1に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2012506380.tif 000061