(57)【要約】本発明は、ネクチン−４の発現レベルを検出することによって、癌を診断するか、または肺癌患者の予後を評価もしくは判定する方法を特徴とする。本発明はまた、ネクチン−４遺伝子に対する二本鎖分子、それらをコードするベクター、それらを含む組成物、およびそれらを対象に投与する段階を含む方法を特徴とし、これらは癌を治療または予防するのに有用である。また、ネクチン−４ポリペプチド、またはネクチン−４遺伝子を発現する細胞を用いて、癌を治療および予防するための候補化合物を同定する方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、ネクチン−４過剰発現に関連する癌を診断するための方法：
（ａ）  対象由来の生物学的試料中のネクチン−４のレベルを決定する段階；および
（ｂ）  段階（ａ）で決定したネクチン−４のレベルを正常対照の該レベルと比較する段階であって、正常対照と比較して該生物学的試料中のネクチン−４のレベルが高いことにより、該対象が癌に罹患していることが示される段階。
【請求項２】
前記癌が肺癌、膀胱癌、および子宮頸癌である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的試料が血液試料である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記血液試料が、全血、血清、および血漿からなる群より選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ネクチン−４の前記レベルが、血清中のネクチン−４タンパク質を検出することによって決定される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ネクチン−４タンパク質がイムノアッセイによって検出される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記イムノアッセイがＥＬＩＳＡ法である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記イムノアッセイが、ネクチン−４の細胞外ドメインに対して産生された抗体を用いて行われる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
以下の段階をさらに含む、請求項３記載の方法：
（ｃ）  同一対象由来の血液試料中のＣＥＡのレベルを決定する段階；
（ｄ）  段階（ｃ）で決定されたＣＥＡのレベルを正常対照の該レベルと比較する段階；ならびに
（ｅ）  ネクチン−４の前記レベルおよび／またはＣＥＡの該レベルが対照レベルよりも高い場合に、該対象が癌に罹患していると判断する段階。
【請求項１０】
以下の段階をさらに含む、請求項３記載の方法：
（ｃ）  同一対象由来の血液試料中のＣＹＦＲＡのレベルを決定する段階；
（ｄ）  段階（ｃ）で決定されたＣＹＦＲＡのレベルを正常対照の該レベルと比較する段階；ならびに
（ｅ）  ネクチン−４の前記レベルおよび／またはＣＹＦＲＡの該レベルが対照レベルよりも高い場合に、該対象が癌に罹患していると判断する段階。
【請求項１１】
前記癌が肺癌である、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
前記肺癌が腺癌または扁平上皮癌である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
以下の段階を含む、ネクチン−４過剰発現に関連する癌を有する患者の予後を評価または判定するための方法：
（ａ）  患者由来の生物学的試料中のネクチン−４遺伝子の発現レベルを決定する段階；
（ｂ）  段階（ａ）における発現レベルを対照レベルと比較する段階；および
（ｃ）  段階（ｂ）の比較に基づいて該患者の予後を判定する段階。
【請求項１４】
前記癌が、肺癌、膀胱癌、および子宮頸癌からなる群より選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記対照レベルが予後良好対照レベルであり、該対照レベルと比較した前記発現レベルの上昇が予後不良と判定される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記患者由来の生物学的試料が血液試料であり、ネクチン−４遺伝子の前記発現レベルが該血液試料中のネクチン−４のレベルとして決定される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記血液試料が、全血、血清、および血漿からなる群より選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ネクチン−４の前記レベルが、血清中のネクチン−４タンパク質を検出することによって決定される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記ネクチン−４タンパク質がイムノアッセイによって検出される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記イムノアッセイがＥＬＩＳＡ法である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記イムノアッセイが、ネクチン−４の細胞外ドメインに対して産生された抗体を用いて行われる、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
以下からなる群より選択される試薬を含む、癌を診断するため、または癌を有する患者の予後を評価もしくは判定するためのキットであって、該癌がネクチン−４過剰発現に関連する、キット：
（ａ）  ネクチン−４  ｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）  ネクチン−４遺伝子によってコードされるタンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）  ネクチン−４タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
【請求項２３】
前記癌が、肺癌、膀胱癌、および子宮頸癌からなる群より選択される、請求項２２記載のキット。
【請求項２４】
予後良好対照試料をさらに含む、予後を評価または判定する場合の請求項２２記載のキット。
【請求項２５】
陽性対象試料をさらに含む、請求項２２記載のキット。
【請求項２６】
前記試薬が、ネクチン−４遺伝子によってコードされるタンパク質を検出するためのイムノアッセイ試薬である、請求項２２記載のキット。
【請求項２７】
前記イムノアッセイ試薬が、ネクチン−４の細胞外ドメインに対して産生された抗体を含む、請求項２６記載のキット。
【請求項２８】
血液試料中のＣＥＡおよび／またはＣＹＦＲＡのレベルを決定するためのイムノアッセイ試薬をさらに含む、請求項２２記載のキット。
【請求項２９】
ＣＥＡおよび／またはＣＹＦＲＡの陽性対照試料をさらに含む、請求項２８記載のキット。
【請求項３０】
細胞に導入されるとネクチン−４の発現および細胞増殖を阻害する、単離された二本鎖分子であって、該分子がセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成し、該センス鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：１に相当するオリゴヌクレオチド配列を含み、該二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチドの長さを有する、単離された二本鎖分子。
【請求項３１】
前記センス鎖が、標的配列としてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０または１１のヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列を含む、請求項３０記載の二本鎖分子。
【請求項３２】
２または３ヌクレオチドからなる少なくとも１つの３’オーバーハングを有する、請求項３０記載の二本鎖分子。
【請求項３３】
介在一本鎖によって連結された前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドからなる、請求項３０記載の二本鎖分子。
【請求項３４】
一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有し、［Ａ］は前記センス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなる前記介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含む前記アンチセンス鎖である、請求項３３記載の二本鎖分子。
【請求項３５】
請求項３０〜３４のいずれか一項記載の二本鎖分子をコードするベクター。
【請求項３６】
請求項３０〜３４のいずれか一項記載の単離された二本鎖分子の少なくとも１つまたはそれらをコードするベクターを含む、癌を治療または予防するための組成物であって、該癌がネクチン−４過剰発現に関連する、組成物。
【請求項３７】
前記癌が、肺癌、膀胱癌、および子宮頸癌からなる群より選択される、請求項３６記載の組成物。
【請求項３８】
請求項３０〜３４のいずれか一項記載の単離された二本鎖分子の少なくとも１つまたはそれらをコードするベクターを投与する段階を含む、癌を治療または予防するための方法であって、該癌がネクチン−４過剰発現に関連する、方法。
【請求項３９】
前記癌が、肺癌、膀胱癌、および子宮頸癌からなる群より選択される、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
以下の段階を含む、癌を治療または予防するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、該癌がネクチン−４過剰発現に関連する、方法：
（ａ）  試験化合物を、ネクチン−４のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）  該ポリペプチドと該試験化合物との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）  該ポリペプチドに結合する化合物を候補化合物として選択する段階。
【請求項４１】
以下の段階を含む、癌を治療または予防するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、該癌がネクチン−４過剰発現に関連する、方法：
（ａ）  試験化合物を、ネクチン−４のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）  段階（ａ）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）  試験化合物の非存在下で検出されたネクチン−４の該ポリヌクレオチドによってコードされる該ポリペプチドの生物学的活性と比較して、該ポリペプチドの生物学的活性を抑制する該試験化合物を候補化合物として選択する、段階。
【請求項４２】
以下の段階を含む、癌を治療または予防するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、該癌がネクチン−４過剰発現に関連する、方法：
（ａ）  候補化合物を、ネクチン−４遺伝子を発現している細胞と接触させる段階；および
（ｂ）  試験化合物の非存在下で検出されたネクチン−４の発現レベルと比較して、該発現レベルを低下させる候補化合物を候補化合物として選択する段階。
【請求項４３】
以下の段階を含む、癌を治療または予防するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、該癌がネクチン−４過剰発現に関連する、方法：
（ａ）  候補化合物を、ネクチン−４遺伝子の転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と接触させる段階；
（ｂ）  該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）  対照と比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性のレベルを低下させる候補化合物を候補化合物として選択する段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は２００８年１２月１２日に出願した米国仮特許出願第６１／２０１，８１１号の恩典を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、生物科学の分野、より具体的には癌研究、癌診断、および癌治療の分野に関する。特に本発明は、癌を検出および診断する方法、ならびに肺癌を治療および予防する方法に関する。さらに本発明は、癌を治療および／または予防するための薬剤をスクリーニングするための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、世界中の癌死の原因の第１位である（Ahmedin J, et al. 2007. CA Cancer J Clin 2007;57:43-66（非特許文献１））。ＮＳＣＬＣを有すると診断された患者の約３０％は根治的切除術を受けることができるが、疾患の進行した残りの患者は、単独のまたは局所治療法と併用した化学療法により主に治療される（Parkin DM. Lancet Oncol 2001;2:533-43（非特許文献２））。放射線療法および化学療法などの様々な補助療法と組み合わせた最新の外科技術を用いているにもかかわらず、ＮＳＣＬＣ患者の全５年生存率はいまだにわずか１５％のままである（Naruke T, et al. Ann Thorac Surg 2001; 71: 1759-64（非特許文献３）、Schiller JH, et al. N Engl J Med 2002; 346:92-8（非特許文献４））。第ＩＩ相および第ＩＩＩ相試験においてベバシズマブ、セツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ソラフェニブ、およびスニチニブなどのいくつかの標的療法が進行ＮＳＣＬＣ患者の一部に対して有効であることが示され、それらのうちのいくつかは既に診療所で用いられている（Thatcher N. Lung Cancer 2007;57 Suppl 2:S18-23（非特許文献５）、Sandler A, et al. N Engl J Med 2006;355:2542-50（非特許文献６）、Shepherd FA, et al. N Engl J Med 2005;353:123-32（非特許文献７）、Thatcher N, et al. Lancet 2005;366:1527-37（非特許文献８）、Cesare G, et al. The Oncologist 2007;12:191-200（非特許文献９））。しかしながら、毒性の問題により、これらの治療レジメンは選ばれた患者に限定される。加えて、たとえ利用可能な治療を全種類適用したとしても、良好な反応を示す患者の割合は未だ限られている。
【０００４】
マイクロアレイ技術を用いたゲノム全域にわたる遺伝子発現解析は、発癌の経路に関与する新規分子、または抗癌療法に対する有効性に関連する新規分子を同定するための有効なアプローチである；そのような遺伝子の一部またはそれらの遺伝子産物は、新規療法を開発するための優れた標的分子および／または腫瘍バイオマーカーとなり得る（Daigo Y, Nakamura Y. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53（非特許文献１０））。そのような分子を同定するため、レーザーマイクロダイセクションによる腫瘍細胞の濃縮と組み合わせた、２７，６４８種の遺伝子およびＥＳＴを含むｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、１０１例の肺癌のゲノム全域にわたる発現プロファイル解析が行われた（Kikuchi T, et al. Oncogene 2003;22:2192-205（非特許文献１１）、Kakiuchi S, et al. Mol Cancer Res 2003;1:485-99（非特許文献１２）、Kakiuchi S, et al. Hum Mol Genet 2004;13:3029-43（非特許文献１３）、Kikuchi T, et al. Int J Oncol 2006; 28:799-805（非特許文献１４）、Taniwaki M, et al. Int J Oncol 2006;29:567-75（非特許文献１５））。各遺伝子産物の生物学的および臨床病理学的な意義を検証するため、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）アッセイに加えて、臨床肺癌材料の腫瘍組織マイクロアレイ解析が行われた（Suzuki C, et al. Cancer Res 2003;63:7038-41（非特許文献１６）、Ishikawa N, et al. Clin Cancer Res 2004;10:8363-70（非特許文献１７）、Kato T, et al. Cancer Res 2005;65:5638-46（非特許文献１８）、Furukawa C, et al. Cancer Res 2005;65:7102-10（非特許文献１９）、Ishikawa N, et al. Cancer Res 2005;65:9176-84（非特許文献２０）、Suzuki C, et al. Cancer Res 2005;65:11314-25（非特許文献２１）、Ishikawa N, et al. Cancer Sci 2006;97:737-45（非特許文献２２）、Takahashi K, et al. Cancer Res 2006;66:9408-19（非特許文献２３）、Hayama S, et al. Cancer Res 2006;66:10339-48（非特許文献２４）、Kato T, et al. Clin Cancer Res 2007;13:434-42（非特許文献２５）、Suzuki C, et al. Mol Cancer Ther 2007;6:542-51（非特許文献２６）、Yamabuki T, et al. Cancer Res 2007;67:2517-25（非特許文献２７）、Hayama S, et al. Cancer Res 2007; 67:4113-22（非特許文献２８）、Kato T, et al. Cancer Res 2007; 67:8544-53（非特許文献２９）、Taniwaki M, et al. Clin Cancer Res 2007;13:6624-31（非特許文献３０）、Ishikawa N, et al. Cancer Res 2007;67:11601-11（非特許文献３１）、Mano Y, et al. Cancer Sci 2007;98:1902-13（非特許文献３２）、Suda T, et al. Cancer Sci 2007;98:1803-8（非特許文献３３）、Kato T, et al. Clin Cancer Res 2008;14:2363-70（非特許文献３４）、Mizukami Y, et al. Cancer Sci 2008;99:1448-54（非特許文献３５）、Harao M, et al. Int J Cancer 2008; 123:2616-25（非特許文献３６））。この体系的アプローチから、非小細胞肺癌においてネクチン−４（Nectin-4）（「ＰＶＲＬ  ４；ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ４」とも称される）はトランス活性化されていることが明らかになった（ＷＯ２００４／０３１４１３（特許文献１））。
【０００５】
ネクチンファミリーは、同種親和的および異種親和的にトランス相互作用しかつ細胞間接着において役割を果たすと考えられている、４つのメンバー（ネクチン−１、−２、−３、および−４）からなるＣａ２＋非依存的免疫グロブリン様分子である。ネクチンは、アクチンフィラメント（Ｆ−アクチン）結合タンパク質であるアファディンとその細胞質尾部を介して結合し、アクチン細胞骨格と連結することが示唆されており、かつ他の細胞接着分子および細胞表面膜受容体と協調して、運動、分化、分極、およびウイルス侵入などの多くの他の細胞活動を調節することができる（Takai Y, et al. Nat Rev Mol Cell Biol 2008;9:603-15（非特許文献３７））。ネクチン−２およびＰＶＲはネクチン−３およびＤＮＡＭ−１／ＣＤ２２６と相互作用するのに対して、ネクチン−１はネクチン−３およびネクチン−４と相互作用する（Reymond N, et al. J Biol Chem 2001;276:43205-15（非特許文献３８）、Bottino C, et al. J Exp Med 2003;198:557-67（非特許文献３９））。ネクチン１、２、および３は成人組織において広範に発現しているが、ネクチン−４は胚および胎盤において特異的に発現した（Reymond N, et al. J Biol Chem 2001;276:43205-15（非特許文献３８）、Fabre S, et al. J Biol Chem 2002;277:27006-13（非特許文献４０））。近年、ネクチン−４が乳癌において過剰発現していることが示された（Fabre-Lafay S, et al. J Biol Chem 2005;280:19543-50（非特許文献４１）、Fabre-Lafay S, et al. BMC Cancer 2007;7:73（非特許文献４２））。
【０００６】
癌におけるネクチン−４過剰発現の最近の証拠にもかかわらず、ヒトの癌の進行におけるネクチン−４活性化の生物学的意義、および治療標的としてのその臨床的可能性は十分に説明されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０３１４１３
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ahmedin J, et al. 2007. CA Cancer J Clin 2007;57:43-66
【非特許文献２】Parkin DM. Lancet Oncol 2001;2:533-43
【非特許文献３】Naruke T, et al. Ann Thorac Surg 2001; 71: 1759-64
【非特許文献４】Schiller JH, et al. N Engl J Med 2002; 346:92-8
【非特許文献５】Thatcher N. Lung Cancer 2007;57 Suppl 2:S18-23
【非特許文献６】Sandler A, et al. N Engl J Med 2006;355:2542-50
【非特許文献７】Shepherd FA, et al. N Engl J Med 2005;353:123-32
【非特許文献８】Thatcher N, et al. Lancet 2005;366:1527-37
【非特許文献９】Cesare G, et al. The Oncologist 2007;12:191-200
【非特許文献１０】Daigo Y, Nakamura Y. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53
【非特許文献１１】Kikuchi T, et al. Oncogene 2003;22:2192-205
【非特許文献１２】Kakiuchi S, et al. Mol Cancer Res 2003;1:485-99
【非特許文献１３】Kakiuchi S, et al. Hum Mol Genet 2004;13:3029-43
【非特許文献１４】Kikuchi T, et al. Int J Oncol 2006; 28:799-805
【非特許文献１５】Taniwaki M, et al. Int J Oncol 2006;29:567-75
【非特許文献１６】Suzuki C, et al. Cancer Res 2003;63:7038-41
【非特許文献１７】Ishikawa N, et al. Clin Cancer Res 2004;10:8363-70
【非特許文献１８】Kato T, et al. Cancer Res 2005;65:5638-46
【非特許文献１９】Furukawa C, et al. Cancer Res 2005;65:7102-10
【非特許文献２０】Ishikawa N, et al. Cancer Res 2005;65:9176-84
【非特許文献２１】Suzuki C, et al. Cancer Res 2005;65:11314-25
【非特許文献２２】Ishikawa N, et al. Cancer Sci 2006;97:737-45
【非特許文献２３】Takahashi K, et al. Cancer Res 2006;66:9408-19
【非特許文献２４】Hayama S, et al. Cancer Res 2006;66:10339-48
【非特許文献２５】Kato T, et al. Clin Cancer Res 2007;13:434-42
【非特許文献２６】Suzuki C, et al. Mol Cancer Ther 2007;6:542-51
【非特許文献２７】Yamabuki T, et al. Cancer Res 2007;67:2517-25
【非特許文献２８】Hayama S, et al. Cancer Res 2007; 67:4113-22
【非特許文献２９】Kato T, et al. Cancer Res 2007; 67:8544-53
【非特許文献３０】Taniwaki M, et al. Clin Cancer Res 2007;13:6624-31
【非特許文献３１】Ishikawa N, et al. Cancer Res 2007;67:11601-11
【非特許文献３２】Mano Y, et al. Cancer Sci 2007;98:1902-13
【非特許文献３３】Suda T, et al. Cancer Sci 2007;98:1803-8
【非特許文献３４】Kato T, et al. Clin Cancer Res 2008;14:2363-70
【非特許文献３５】Mizukami Y, et al. Cancer Sci 2008;99:1448-54
【非特許文献３６】Harao M, et al. Int J Cancer 2008; 123:2616-25
【非特許文献３７】Takai Y, et al. Nat Rev Mol Cell Biol 2008;9:603-15
【非特許文献３８】Reymond N, et al. J Biol Chem 2001;276:43205-15
【非特許文献３９】Bottino C, et al. J Exp Med 2003;198:557-67
【非特許文献４０】Fabre S, et al. J Biol Chem 2002;277:27006-13
【非特許文献４１】Fabre-Lafay S, et al. J Biol Chem 2005;280:19543-50
【非特許文献４２】Fabre-Lafay S, et al. BMC Cancer 2007;7:73
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ネクチン−４に関し、かつこれが発癌において果たす役割に関する。したがって本発明は、癌を検出、診断、治療、および／または予防するための新規の組成物および方法、ならびにしたがって有用な薬剤をスクリーニングするための方法に関する。
【００１０】
詳細には、本発明は、対象由来の生物学的試料（例えば、血液試料）中のネクチン−４のレベルを決定する段階、およびこのレベルを参照試料、典型的には正常対照中に見出されるレベルと比較する段階を含む方法などの、対象において癌を診断するための方法を提供する。試料中のネクチン−４のレベルが高いことによって、該対象が癌に罹患しているかまたはその発症リスクを有することが示される。
【００１１】
さらなる局面において、本発明は、ネクチン−４の高い発現レベルが低い生存率と相関するという発見に関する。したがって本発明は、癌患者の予後を評価または判定するための方法を提供し、これは、ネクチン−４の発現レベルを検出する段階、それを所定の参照発現レベルと比較する段階、およびそれらの間の違いから患者の予後を判定する段階を含む。
【００１２】
さらに別の局面において、特に本発明は、特異的配列（例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および１１）からなる二本鎖分子が、癌細胞の細胞増殖を阻害するのに有効であるという発見に起因する。具体的には、本発明により、ネクチン−４遺伝子を標的とする二本鎖分子（例えばｓｉＲＮＡ）が提供される。これらの二本鎖分子は単離された状態で用いてもよく、またはベクターにコードさせて、該ベクターから発現させることもできる。したがって、そのような二本鎖分子、ならびに、それらを発現するベクターおよび宿主細胞を提供することは、本発明の目的である。
【００１３】
１つの局面において、本発明は、本発明の二本鎖分子またはベクターをそれを必要とする対象に投与することにより、癌細胞の増殖および／もしくは細胞浸潤を阻害するためならびに／または肺癌を治療および／もしくは予防するための方法を提供する。そのような方法は、１つまたは複数の該二本鎖分子またはベクターからなる組成物を対象に投与する段階を包含する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、本発明の二本鎖分子またはベクターの少なくとも１つを含む、癌を治療および／もしくは予防するためならびに／または癌細胞の増殖および／もしくは細胞浸潤を阻害するための組成物を提供する。
【００１５】
さらなる局面において、本発明は、肺癌を治療および／もしくは予防するためならびに／または癌細胞の増殖および／もしくは細胞浸潤を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。そのような候補化合物は、ネクチン−４ポリペプチドと結合するか、ネクチン−４の生物学的活性を低下させるか、または、ネクチン−４遺伝子もしくはネクチン−４遺伝子の代わりとなるレポーター遺伝子の発現を低下させるであろう。
【００１６】
本発明の１つまたは複数の局面はある特定の目的を満たすことができ、その他の１つまたは複数の局面はその他のある特定の目的を満たすことができることが、当業者によって理解されるであろう。各目的は、本発明の全ての局面に、そのすべての点で、同等に当てはまるとは限らない。そのため、先の目的は、本発明のいずれか１つの局面に関して、別の選択肢において考慮され得る。以下の詳細な説明を添付の図面および以下の実施例と共に参照することにより、本発明のこれらおよびその他の目的および特色が、より完全に明白になるであろう。しかしながら、上記の発明の概要および以下の詳細な説明は、いずれも、好ましい態様のものであって、本発明または本発明のその他の別の態様を限定するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
以下の図面の簡単な説明、ならびに本発明およびその好ましい態様の詳細な説明を考慮することにより、当業者には本発明の様々な局面および用途が明白になるであろう。
【図１Ａ−Ｄ】肺癌におけるネクチン−４の発現および細胞局在。Ａ、上パネル、１０例の臨床非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）における、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより調べたネクチン−４の発現。下パネル、２０種の肺癌細胞株における、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより調べたネクチン−４の発現。Ｂ、抗ネクチン−４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）および４種の肺癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ２１７０、ＮＣＩ−Ｈ３５８、Ａ５４９、およびＳＢＣ−５）を用いた、細胞表面上の内因性ネクチン−４タンパク質レベルのフローサイトメトリー解析。緑色のピークは、抗ネクチン−４  ｍＡｂによって検出された蛍光強度（Ｙ軸）を示し；黒色のピークは、陰性対照としての非免疫化マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇと共にインキュベーションした細胞の蛍光強度を示す。ネクチン−４は、ネクチン−４を発現するＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞、ＮＣＩ−Ｈ３５８細胞の細胞表面上で検出されたが、ネクチン−４を発現しないＡ５４９細胞およびＳＢＣ−５細胞では検出されなかった。Ｃ、内因性ネクチン−４タンパク質の細胞内局在。ネクチン−４は、ＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞、ＮＣＩ−Ｈ３５８細胞の細胞表面および細胞質において主に染色されたが、Ａ５４９細胞およびＳＢＣ−５細胞では染色されなかった。Ｄ、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、ＮＣＩ−Ｈ３５８、Ａ５４９、およびＳＢＣ−５細胞に由来する培養培地中でＥＬＩＳＡにより検出した、分泌された内因性ネクチン−４タンパク質のレベル。
【図１Ｅ−Ｆ】Ｅ、上および中央パネル、１４例のＮＳＣＬＣ（Ｔ；臨床肺腺癌７例および臨床肺扁平上皮癌７例）および対応する正常肺組織（Ｎ）における、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより調べたネクチン−４の発現。下パネル、２０種の肺癌細胞株および正常気管支上皮細胞における、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより調べたネクチン−４の発現。Ｆ、ネクチン−４発現ベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞（左パネル）およびモック形質転換細胞（右パネル）における、ネクチン−４に対するモノクローナル抗体（クローン１９−３３および６６−９７）による免疫沈降解析。これらの形質転換細胞をネクチン−４に対する２種類のモノクローナル抗体（クローン１９−３３および６６−９７）のいずれかにより免疫沈降させ、抗ｍｙｃ抗体を用いて免疫ブロットした。
【図２Ａ】正常組織および肺腫瘍におけるネクチン−４の発現、ならびにＮＳＣＬＣ患者の予後不良とのその関連性。Ａ、代表的な肺腺癌（ＡＤＣ）および６種の正常組織；心臓、肺、肝臓、腎臓、気管、および胎盤におけるネクチン−４タンパク質の免疫組織化学的評価（原倍率×１００）。
【図２Ｂ】Ｂ、上パネル、組織マイクロアレイに対して抗ネクチン−４抗体を用いた、代表的な肺ＡＤＣにおけるネクチン−４タンパク質の免疫組織化学染色。肺ＡＤＣにおけるネクチン−４の強発現、弱発現、および発現なしの例（原倍率×１００）。中央パネル、８例の代表的な肺腫瘍および隣接する正常肺組織における、抗ネクチン−４抗体（クローン１９−３３）を用いたネクチン−４タンパク質の免疫組織化学染色（原倍率×１００）。下パネル、ネクチン−４発現による、ＮＳＣＬＣ患者における生存についてのカプラン・マイヤー解析（Ｐ＜０．０００１；ログランク検定）。
【図３Ａ−Ｂ】ＮＳＣＬＣ患者におけるネクチン−４の血清濃度、および進行ＮＳＣＬＣ患者の予後不良とのその関連性。ＮＳＣＬＣ患者および健常ボランティアまたはＣＯＰＤを有する非腫瘍性肺疾患患者における、ＥＬＩＳＡにより決定したネクチン−４タンパク質の血清濃度。Ａ、左パネル、肺ＡＤＣ患者または肺ＳＣＣ患者に由来する血清ネクチン−４レベル（ユニット／ｍｌ）。ＡＤＣ患者と健常ボランティアの間で（マンホイットニーのＵ検定によりＰ＜０．０００１）、およびＳＣＣ患者と健常ボランティアの間で（マンホイットニーのＵ検定によりＰ＜０．０００１）、差は有意であった。健常ボランティアとＣＯＰＤを有する良性肺疾患との差は有意ではなかった（Ｎ．Ｓ．として表示）。右パネル、様々な臨床病期の肺癌患者に由来する血清中のネクチン−４の分布。Ｂ、左パネル、ＮＳＣＬＣの血清腫瘍バイオマーカーとしてのネクチン−４（赤色）、ＣＥＡ（黄色）、およびＣＹＦＲＡ２１−１（緑色）の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析（Ｘ軸、１−特異度；Ｙ軸、感度）。右パネル、ＮＳＣＬＣ患者における手術前および手術後（手術後日数２カ月）の血清ネクチン−４レベル。
【図３Ｃ−Ｄ】Ｃ、同一ＮＳＣＬＣ患者における、血清ネクチン−４レベル（ユニット／ｍｌ）および原発腫瘍組織でのネクチン−４の発現レベル。スコアは、材料および方法の項に記載した基準を用いて評価した、ネクチン−４染色の強度を示す（原倍率×１００）。Ｄ、診断時の血清ネクチン−４陽性度に従った、新たに診断されこれまでに治療を受けていない進行ＮＳＣＬＣ（ＩＩＩＢ〜ＩＶ期）患者８８名における、２剤併用による初回標準化学療法後の生存についてのカプラン・マイヤー解析（Ｐ＝０．００４２；ログランク検定）。
【図３Ｅ】Ｅ、上パネル、血清ネクチン−４陽性度に従った、Ｉ期ＮＳＣＬＣ患者９５名における手術後の生存についてのカプラン・マイヤー解析。下パネル、血清ネクチン−４陽性度に従った、ＩＩＩＢ〜ＩＶ期ＮＳＣＬＣ患者６２名における、２剤（カルボプラチンおよびパクリタキセル）の併用による初回化学療法後の生存についてのカプラン・マイヤー解析。
【図４Ａ−Ｂ】ネクチン−４に対するｓｉＲＮＡによるＮＳＣＬＣ細胞の増殖の阻害。Ａ、上パネル、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した、ｓｉ−ネクチン−４−＃１、ｓｉ−ネクチン−４−＃２、または対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＬＵＣおよびｓｉ−ＣＮＴ）で処理したＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞およびＮＣＩ−Ｈ３５８細胞におけるネクチン−４の発現。中央パネル、ネクチン−４特異的ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞およびＮＣＩ−Ｈ３５８細胞のコロニー形成アッセイの画像。下パネル、ネクチン−４特異的ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞およびＮＣＩ−Ｈ３５８細胞のＭＴＴアッセイ。アッセイはすべて、３つ組ウェルで３回実施した。Ｂ、上パネル、ウエスタンブロット解析により検出した、ＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるネクチン−４の一過性発現。ｍｙｃ／Ｈｉｓタグ付ネクチン−４検出のための抗ｍｙｃ抗体または抗ＡＣＴＢ抗体により免疫ブロッティングを行った。中央および下パネル、ヒトネクチン−４の発現プラスミドをトランスフェクトした後の、マトリゲル基質におけるＮＩＨ−３Ｔ３細胞およびＣＯＳ−７細胞の浸潤性を実証するアッセイ。ギムザ染色（中央パネル；倍率、×１００）、およびマトリゲルコーティングフィルターを通して遊走する細胞の相対数（下パネル）。アッセイは３つ組ウェルで３回実施した。
【図４Ｃ−Ｄ】Ｃ、ネクチン−４発現プラスミドの一過性トランスフェクションから４８時間後の、ｍｙｃ／Ｈｉｓタグ付ネクチン−４を検出するためのＡｌｅｘａ４８８結合二次抗体およびＡｌｅｘａ５９４結合ファロイジンによって検出した、ＣＯＳ−７細胞（上パネル）およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞（下パネル）における外因性のネクチン−４およびＦ−アクチンの細胞内局在性。Ｄ、ネクチン−４過剰発現がＲａｃ１の活性化に与える効果。ＣＯＳ−７細胞（左パネル）およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞（右パネル）に、ｍｙｃ／Ｈｉｓタグ付ネクチン−４発現プラスミドまたはモックベクターをトランスフェクトした。抗Ｒａｃ１抗体、ｍｙｃ／Ｈｉｓタグ付ネクチン−４に対する抗ｍｙｃ抗体、または抗ＡＣＴＢ抗体を用いて、免疫ブロッティングを行った（下３つのパネル）。細胞溶解物のアリコートをＰＡＫ−ＲＢＤアガロースビーズと共にインキュベーションし、プルダウンアッセイに供し、その後抗Ｒａｃ１による免疫ブロッティングに供した（上パネル）。
【図４Ｅ−Ｆ】Ｅ、外因性ネクチン−４を安定して発現するＰＣ−１４細胞のインビトロにおける増殖の増大。上パネル、ウエスタンブロッティングにより調べた、Ｍｙｃ／Ｈｉｓタグ付ネクチン−４発現ベクターまたはモックベクターをトランスフェクトしたＰＣ−１４細胞におけるネクチン−４タンパク質の発現。下パネル、Ｍｙｃ／Ｈｉｓタグ付ネクチン−４発現ベクターまたはモックベクターをトランスフェクトしたＰＣ−１４細胞のＭＴＴアッセイ。Ｆ、ネクチン−４を安定して発現するＰＣ−１４細胞のインビボにおける迅速な増殖。上パネル、細胞移植の２０日後にウエスタンブロット解析により検出した、ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕマウスの後背部に皮下注射したＰＣ−１４細胞におけるネクチン−４タンパク質の発現。中央パネル、細胞移植から２０日後の、移植した腫瘍におけるネクチン−４発現の免疫組織化学的評価（原倍率×２００）。下パネル、ＰＣ−１４−ネクチン−４＃Ｂ細胞（丸で表示；ｎ＝３匹のマウス）またはＰＣ−１４−モック−＃Ｂ細胞（四角で表示；ｎ＝３）の接種後のヌードマウスにおける腫瘍増殖曲線。平均腫瘍体積±１ＳＥをプロットした。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
態様の説明
本明細書に記載されたものと類似しているかまたは等価である方法および材料を本発明の態様の実施または試行において使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。しかしながら、本明細書に記載された特定の分子、組成、方法論、またはプロトコルはルーチンの実験法および最適化に従い変動し得るので、本発明はこれらに限定されないことを理解されたい。また、明細書中で使用される用語は、特定の形式または態様を記載するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図していないことも理解されたい。
【００１９】
特記しない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が現在理解しているのと同じ意味を有する。しかしながら、矛盾が生じる場合には、定義を含め本明細書に照らし合わせる。したがって、本発明の文脈において、以下の定義が適用される。
【００２０】
定義：
本明細書で用いる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という語は、特記しない限り「少なくとも１つの」を意味する。
【００２１】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、核酸残基のポリマーを指すよう本明細書において互換的に用いられ、かつ特記しない限り、その一般に認められている１文字コードで呼ばれる。本用語は、１つまたは複数の核酸がエステル結合によって結合している核酸（ヌクレオチド）ポリマーに適用される。核酸ポリマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組み合わせからなってよく、天然および非天然の核酸ポリマーの両方を包含する。
【００２２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すよう本明細書において互換的に用いられる。本用語は、天然アミノ酸ポリマーのみならず、１つまたは複数のアミノ酸残基が修飾残基、または対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００２３】
ネクチン−４遺伝子：
本発明におけるネクチン−４の核酸配列およびポリペプチド配列は当業者に公知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋ（商標）などのウェブサイト上の遺伝子データベースから得られる。ネクチン−４遺伝子の例示的な核酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３０９１６）に示され、ネクチン−４ポリペプチドの例示的なアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿１１２１７８．２）に示される。当業者は、ネクチン−４配列がこれらの配列に必ずしも限定されないこと、および以下に記載するように本発明において変異体（例えば、機能的同等物および対立遺伝子変異体）が用いられ得ることを認識するであろう。
【００２４】
本発明の１つの局面によれば、機能的同等物もまた上記の「ポリペプチド」であるとみなされる。本明細書において、ポリペプチドの「機能的同等物」とは、該ポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチドである。すなわち、その生物学的活性を保持する任意のポリペプチドを、本発明においてそのような機能的同等物として用いることができる。本発明におけるポリペプチドは、その産生のために使用した細胞もしくは宿主または使用した精製法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態において差異を有し得る。
【００２５】
そのような機能的同等物には、タンパク質の天然アミノ酸配列に対して１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたものが含まれる。あるいは、該ポリペプチドは、各タンパク質の配列に対して少なくとも約８０％の相同性（配列同一性とも称する）を有する、より好ましくは少なくとも約９０％〜９５％の相同性を有する、アミノ酸配列から構成されてもよい。他の態様において、該ポリペプチドは、遺伝子の天然ヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【００２６】
「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、典型的には核酸の複合的な混合物中で、核酸分子がその標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とは検出可能な程度にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況下では異なる。配列が長いほど、特異的にハイブリダイズする温度はより高くなる。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)において見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度  ｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で該標的配列と（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度の下で）ハイブリダイズする温度である（標的配列が過剰に存在するため、Ｔｍにおいては、プローブの５０％が平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。選択的または特異的ハイブリダイゼーションに関して、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には、以下のものが含まれる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、または、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーション、ならびに０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、５０℃での洗浄。
【００２７】
本発明の文脈において、上記のヒトタンパク質と機能的に同等のポリペプチドをコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者によって規定通り選択され得る。例えば、「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液」（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ）を用いて６８℃で３０分間以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを添加し、６８℃で１時間以上加温することにより、ハイブリダイゼーションを行うことができる。それに続く洗浄工程は、例えば低ストリンジェント条件下で行い得る。例示的な低ストリンジェント条件には、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが含まれ得る。高ストリンジェント条件の使用が好ましいことが多い。例示的な高ストリンジェント条件には、２×ＳＳＣ、０．０１％ＳＤＳにおける室温で２０分間の洗浄を３回行った後に、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける３７℃で２０分間の洗浄を３回行い、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける５０℃で２０分間の洗浄を２回行うことが含まれ得る。しかしながら、温度および塩濃度などのいくつかの要素がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与え得るため、当業者は必要なストリンジェンシーを達成するためにこれらの要素を適切に選択することができる。
【００２８】
一般的に、タンパク質中の１つまたは複数のアミノ酸の改変は、該タンパク質の機能に影響しないことが知られている。実際、変異タンパク質または改変タンパク質、すなわち特定のアミノ酸配列のアミノ酸残基の１つもしくは複数の置換、欠失、挿入、および／もしくは付加によって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、元の生物学的活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984)；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982)；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)）。したがって当業者は、単一のアミノ酸もしくはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、もしくは置換、またはタンパク質の変化により類似の機能を有するタンパク質がもたらされる「保存的改変」であるとみなされるものが、本発明の文脈において許容されることを認識するであろう。
【００２９】
タンパク質の活性が維持されている限り、アミノ酸変異の数は特に限定されない。しかしながら、アミノ酸配列の５％以下を変更することが一般的に好ましい。したがって、好ましい態様において、このような変異体において変異させるアミノ酸の数は一般的に、３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下、より好ましくは１０アミノ酸以下、より好ましくは６アミノ酸以下、およびさらにより好ましくは３アミノ酸以下である。
【００３０】
変異されるアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の特性が保存された別のアミノ酸に変異されることが好ましい（保存的アミノ酸置換として知られるプロセス）。アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、および共通して以下の官能基または特徴を有する側鎖である：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基を含有する側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子を含有する側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミドを含有する側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基を含有する側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；および芳香族を含有する側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。機能的に類似したアミノ酸を規定する保存的置換表は当技術分野で周知である。例えば、以下の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）  アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）  アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）  アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）  アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）  イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）  フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）  セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）  システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい）。
【００３１】
このように保存的に改変されたポリペプチドが本発明のタンパク質に含まれる。しかしながら、本発明はこれらに限定されず、タンパク質は、該タンパク質の少なくとも１種類の生物学的活性が保持されている限り、非保存的改変を含む。さらに、改変タンパク質は、多型変異体、種間ホモログ、およびこれらのタンパク質の対立遺伝子によりコードされるものも含む。
【００３２】
さらに、本発明の遺伝子は、タンパク質のそのような機能的同等物をコードするポリヌクレオチドを包含する。上記の配列情報に基づき合成されたプライマーを用いて、タンパク質と機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するために、ハイブリダイゼーションに加え、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用することができる。ヒトの遺伝子およびタンパク質とそれぞれ機能的に同等なポリヌクレオチドおよびポリペプチドは通常、元のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して高い相同性を有する。「高い相同性」とは典型的に、４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％から９５％またはそれ以上の相同性を指す。特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性は、「Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)」のアルゴリズムに従って決定することができる。
【００３３】
癌を診断するための方法：
本発明は、対象におけるネクチン−４の発現レベルを決定することにより癌を診断するための方法を提供する。本発明の文脈において、ネクチン−４過剰発現に関連する任意の癌を診断することができ、かつ、診断されるべき癌は好ましくは肺癌、膀胱癌、または子宮頸癌であり、より好ましくは肺癌であり、さらにより好ましくは、肺腺癌（ＡＤＣ）および肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）を含む非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。
【００３４】
本発明によれば、対象の状態を検査するための中間的な結果を提供することができる。そのような中間的な結果は、医師、看護師、またはその他の実務者が、対象が疾患に罹患していることを決定するのを補助するため、付加的な情報と組み合わせられてもよい。すなわち、本発明は、癌を検査するための診断マーカーネクチン−４を提供する。あるいは、本発明は、対象由来の肺組織試料、膀胱組織試料、または子宮頸部組織試料における癌細胞を検出または同定する方法を提供し、該方法は、対象由来の生物学的試料におけるネクチン−４遺伝子の発現レベルを決定する段階を含み、該遺伝子の正常対照レベルと比較した発現レベルの増加は、該組織における癌細胞の存在または疑いを示す。
【００３５】
そのような結果は、対象が疾患に罹患していると診断する上で、医師、看護師、またはその他の医療実務者を補助するため、付加的な情報と組み合わせられてもよい。換言すると、本発明は、対象が疾患に罹患していると診断するために有用な情報を、医師に提供することができる。例えば、本発明によれば、対象から入手された組織における癌細胞の存在に関して疑いがある場合、組織病理学、公知の血中腫瘍マーカーのレベル、および対象の臨床経過等を含む、疾患の異なる局面に加えて、ネクチン−４遺伝子の発現レベルを考慮することにより、臨床的な決定に到達することができる。例えば、幾つかの周知の血中診断用肺腫瘍マーカーは、IAP、ACT、BFP、CA19-9、CA50、CA72-4、CA130、CEA、KMO-1、NSE、SCC、SP1、Span-1、TPA、CSLEX、SLX、STN、およびCYFRAである。あるいは、IAP、SCC、およびTPAなどの血中診断用膀胱腫瘍マーカーも周知である。あるいは、CA130、CEA、IAP、SCC、SLX、およびTPAなどの血中診断用子宮頸部腫瘍マーカーも周知である。すなわち、本発明のこの特定の態様において、遺伝子発現分析の結果は、対象の疾患状態のさらなる診断のための中間的な結果として役立つ。
【００３６】
詳細には、本発明は以下の［１］〜［１０］の方法を提供する：
［１］（ａ）  生物学的試料におけるネクチン−４のアミノ酸配列をコードする遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
（ｂ）  該遺伝子の正常対照レベルと比較して検出された該発現レベルの増加を、疾患の存在と関連付ける段階
を含む、肺癌を診断するための方法。
［２］  発現レベルが正常対照レベルを少なくとも１０％上回る、［１］記載の方法。
［３］  発現レベルが、
（ａ）  ネクチン−４の配列を含むｍＲＮＡの検出、
（ｂ）  ネクチン−４のアミノ酸配列を含むタンパク質の検出、および
（ｃ）  ネクチン−４のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物学的活性の検出
の中から選択される方法によって検出される、［１］記載の方法。
［４］  肺癌がＮＳＣＬＣである、［１］記載の方法。
［５］  発現レベルが、遺伝子の遺伝子転写物に対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することにより決定される、［３］記載の方法。
［６］  発現レベルが、遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体の結合を、該遺伝子の発現レベルとして検出することにより決定される、［３］記載の方法。
［７］  生物学的試料が生検標本、痰、または血液を含む、［１］記載の方法。
［８］  対象由来の生物学的試料が肺組織を含む、［１］記載の方法。
［９］  対象由来の生物学的試料が上皮細胞を含む、［１］記載の方法。
［１０］  対象由来の生物学的試料が癌性上皮細胞を含む、［１］記載の方法。
【００３７】
肺癌を診断する方法を、以下でより詳細に説明する。
【００３８】
本明細書で用いる「生物学的試料」という用語は、生物全体、またはその組織、細胞、もしくは構成部分（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜臍帯血、尿、膣液、および精液を含むがこれらに限定されない体液）のサブセットを指す。「生物学的試料」はさらに、生物全体またはその細胞、組織、もしくは構成部分のサブセットから調製された、ホモジネート、溶解物、抽出物、細胞培養物、または組織培養物、あるいはその画分もしくは一部を指す。最後に、「生物学的試料」は、タンパク質またはポリヌクレオチドなどの細胞成分を含む、その中で生物が増殖したニュートリエントブロスまたはゲルなどの培地を指す。
【００３９】
本方法によって診断される対象は、好ましくは、哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
診断を実施するためには、診断すべき対象から生物学的試料を収集することが好ましい。ネクチン−４の目的の転写産物または翻訳産物を含む限り、任意の生物学的材料を、決定のための生物学的試料として使用することができる。生物学的試料には、生検標本、体組織、ならびに血液、痰、および尿などの体液が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、生物学的試料には、上皮細胞、より好ましくは、癌性上皮細胞、または癌性であることが疑われる組織に由来する上皮細胞を含む細胞集団が含まれる。さらに、必要であれば、得られた体組織および体液から細胞を精製し、次いで、それを生物学的試料として使用してもよい。
【００４１】
本発明によると、対象由来の生物学的試料におけるネクチン−４の発現レベルが決定される。当技術分野で公知の方法を使用して、転写（核酸）産物レベルで、発現レベルを決定することができる。例えば、ネクチン−４のｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）によってプローブを使用して定量することができる。検出は、チップ上またはアレイ上で実施されてもよい。アレイの使用は、ネクチン−４を含む複数の遺伝子（例えば、様々な癌に特異的な遺伝子）の発現レベルを検出するために好ましい。当業者は、ネクチン−４の配列情報（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０３０９１６）を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ネクチン−４のｃＤＮＡをプローブとして使用することができる。必要であれば、色素、蛍光、および同位体などの好適な標識によりプローブを標識し、ハイブリダイズした標識の強度として、遺伝子の発現レベルを検出してもよい。
【００４２】
さらに、増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）により、プライマーを使用して、ネクチン−４の転写産物を定量することもできる。そのようなプライマーも、利用可能な遺伝子の配列情報に基づき調製され得る。例えば、実施例で使用されるプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３および４）が、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロットによる検出のために利用され得るが、本発明はそれらに限定されない。
【００４３】
特に、本発明の方法のために使用されるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、または低ストリンジェントな条件の下で、ネクチン−４のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で使用される場合、「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーが、その標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高い温度で観察される。一般的に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列と（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度の下で）ハイブリダイズする温度である。標的配列は一般に過剰に存在するので、Ｔｍにおいては、プローブの５０％が平衡状態で占有される。典型的には、ストリンジェントな条件とは、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（またはその他の塩）であり、温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）の場合には少なくとも約３０℃であり、より長いプローブまたはプライマーの場合には少なくとも約６０℃であるものである。ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加によっても、ストリンジェントな条件を達成することができる。
【００４４】
あるいは、本発明の診断のために、翻訳産物を検出することもできる。例えば、ネクチン−４タンパク質の量を決定することができる。翻訳産物として該タンパク質の量を決定する方法には、該タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が含まれる。抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。さらに、断片がネクチン−４タンパク質との結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または修飾物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）を、検出のために使用することができる。タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法は、当技術分野で周知であり、本発明においては、そのような抗体およびそれらの等価物を調製するために、任意の方法を利用することができる。
【００４５】
翻訳産物に基づきネクチン−４遺伝子の発現レベルを検出する別の方法として、ネクチン−４タンパク質に対する抗体を使用した免疫組織化学分析を介して染色の強度を観察することができる。すなわち、強い染色が観察されることにより、タンパク質の存在量の増加、および同時に、ネクチン−４遺伝子の高い発現レベルが示される。
【００４６】
さらに、診断の正確性を改善するために、ネクチン−４遺伝子の発現レベルに加えて、他の癌関連遺伝子、例えば、肺癌において差次的に発現されることが公知の遺伝子の発現レベルも測定することができる。
【００４７】
生物学的試料におけるネクチン−４遺伝子を含む癌マーカー遺伝子の発現レベルは、対応する癌マーカー遺伝子の対照レベルから、例えば、１０％、２５％、もしくは５０％増加している場合；または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上に増加している場合、増加していると見なされ得る。
【００４８】
疾患状態（癌性であるか非癌性であるか）が既知である対象から以前に収集され保管されていた試料を使用することによって、試験生物学的試料と同時に対照レベルを決定することができる。あるいは、疾患状態が既知である対象由来の試料において、以前に決定されたネクチン−４遺伝子の発現レベルを分析することによって得られた結果に基づき、統計学的方法によって対照レベルを決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞からの発現パターンのデータベースであってもよい。さらに、本発明の１つの局面によると、複数の参照試料から決定された複数の対照レベルと、生物学的試料におけるネクチン−４遺伝子の発現レベルを比較してもよい。患者由来の生物学的試料のものと類似した組織型に由来する参照試料から決定された対照レベルを使用することが好ましい。さらに、疾患状態が既知である集団におけるネクチン−４遺伝子の発現レベルの標準値を使用することが好ましい。標準値は、当技術分野で公知の任意の方法によって入手され得る。例えば、平均値±２Ｓ．Ｄ．または平均値±３Ｓ．Ｄ．の範囲を、標準値として使用することができる。
【００４９】
本発明の文脈において、癌性でないことが既知の生物学的試料から決定された対照レベルは、「正常対照レベル」と呼ばれる。他方、対照レベルが癌性生物学的試料から決定される場合、それは「癌性対照レベル」と呼ばれる。
【００５０】
ネクチン−４遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して増加しているか、または癌性対照レベルと類似している場合、対象は、癌に罹患しているかまたは癌を発症するリスクを有すると診断され得る。さらに、複数の癌関連遺伝子の発現レベルが比較される場合、試料と癌性である参照との間の遺伝子発現パターンが類似していることは、対象が、癌に罹患しているかまたは癌を発症するリスクを有することを示す。
【００５１】
試験生物学的試料の発現レベルと対照レベルとの間の相違は、細胞の癌性状態または非癌性状態によって発現レベルが異ならないことが既知である対照核酸、例えば、ハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して標準化され得る。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、およびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
癌の血清学的診断：
本発明はまた、新規の血清学的癌マーカーとしてのネクチン−４を提供する。すなわち、対象由来の血液試料中のネクチン−４のレベルを測定することにより、対象においてネクチン−４を発現する癌の存在またはその発症素因を決定することができる。
【００５３】
本発明の文脈において、ネクチン−４過剰発現に関連する任意の癌を診断することができ、診断されるべき癌は好ましくは肺癌、膀胱癌、または子宮頸癌であり、より好ましくは肺癌であり、さらにより好ましくは、肺腺癌（ＡＤＣ）および肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）を含む非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。
【００５４】
したがって本発明は、血液試料中のネクチン−４のレベルを決定する（例えば、測定する）ことを含む。本発明において、癌を診断するための方法はまた、癌を検査または検出するための方法も含む。あるいは本発明において、癌を診断することとは、対象における癌の疑い、リスク、もしくは可能性を示すこと、または癌マーカーとしてネクチン−４を使用することも指す。
【００５５】
あるいは、対象由来の血液試料中のネクチン−４のレベルを測定することにより、対象においてネクチン−４を発現する癌の存在またはその発症素因を決定することができる。したがって本発明は、血液試料中のネクチン−４のレベルを決定する（例えば、測定する）ことを含む。本発明において、癌を診断するための方法は、癌を検査または検出するための方法も含む。あるいは、本発明において、癌を診断することとは、対象における癌の疑い、リスク、または可能性を示すことも指す。
【００５６】
試料中でネクチン−４を検出することができる限り、ネクチン−４のレベルを決定するために任意の血液試料を用いることができる。好ましくは、血液試料は、全血、血清、および血漿を含み、より好ましくは血清を含む。
【００５７】
本発明において、「血液試料中のネクチン−４のレベル」とは、全血中の血球体積を補正した後の、血液中に存在するネクチン−４の濃度を指す。当業者は、血液中の血球体積の割合が個体間で大きく異なることを認識するであろう。例えば、全血中の赤血球の割合は男性と女性との間で非常に異なる。さらに、個体間の差も無視できない。したがって、血球成分を含む全血中の物質の見かけの濃度は、血球体積の割合に応じて大きく異なる。例えば、血清中の濃度が同じであったとしても、大量の血球成分を有する試料の測定値は、少量の血球成分を有する試料の値よりも低くなる。したがって、血液中の成分の測定値を比較するためには、血球体積を補正した値が通常用いられる。
【００５８】
例えば、全血から血液細胞を分離することによって得られた血清または血漿を試料として用いて血液中の成分を測定することにより、血球体積の影響が除外された測定値を得ることができる。したがって、本発明におけるネクチン−４のレベルは通常、血清または血漿中の濃度として決定できる。あるいは、これを全血中の濃度として最初に測定してもよく、その後、血球体積の影響を補正してもよい。全血試料中の血球体積を測定するための方法は公知である。
【００５９】
本発明の方法に従って癌を診断される対象とは、好ましくは哺乳動物であり、これにはヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれる。本発明の好ましい対象とはヒトである。
【００６０】
本発明において、対象は、癌を有することが疑われる患者または健常個体であってよい。該患者は、臨床的な意志決定を容易にするために本発明により診断され得る。別の態様において、本発明はまた、癌をスクリーニングするために健常個体に適用されてもよい。
【００６１】
さらに、対象の状態を調べるための中間的な結果もまた提供され得る。そのような中間的な結果を付加的な情報と組み合わせて、対象が疾患に罹患していると医師、看護師、または他の医療実務者が診断するのを補助してもよい。あるいは、本発明を用いて血液試料中の癌マーカーとしてのネクチン−４を検出し、該血液試料が由来する対象が疾患に罹患していると診断するのに有用な情報を医師に提供してもよい。換言すれば、本発明は、癌性細胞を有する対象に由来する血液試料を決定するための血清学的癌マーカーを提供し得る。
【００６２】
本発明の１つの態様において、ネクチン−４のレベルは、血液試料中のネクチン−４タンパク質の量または濃度を測定することによって決定される。血液試料中のネクチン−４タンパク質の量を決定する方法には、イムノアッセイ法が含まれる。イムノアッセイ法は好ましくはＥＬＩＳＡであってよく、該イムノアッセイ法に用いられるべき抗体は好ましくは、ネクチン−４の細胞外ドメインに対して産生された抗体であってよい。
【００６３】
本発明の診断法において、癌を検出するために、ネクチン−４の血中濃度に加えてＣＥＡまたはＣＹＦＲＡ  ２１−１の血中濃度を測定してもよい。したがって本発明は、ネクチン−４の血中濃度またはＣＥＡもしくはＣＹＦＲＡ  ２１−１の血中濃度のいずれかまたはその両方が健常個体と比較して高い場合に癌が検出される、癌を診断するための方法を提供する。
【００６４】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、肺癌を含む癌の腫瘍マーカーとしてしばしば研究されている。
【００６５】
サイトケラチン−１９フラグメント（ＣＹＦＲＡ  ２１−１）は、肺癌、特に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）における有用なマーカーである。本発明の記載において、ＣＹＦＲＡ  ２１−１はＣＹＦＲＡとして示される。上記のように、ＣＥＡまたはＣＹＦＲＡは、肺癌を診断または検出するための血清学的マーカーとして既に使用されている。しかしながら、肺癌のマーカーとしてのＣＥＡまたはＣＹＦＲＡの感度は、肺癌を完全に検出するには幾分不十分である。したがって、肺癌診断の感度を向上させることが必要である。
【００６６】
本発明において、肺癌に対する新規の血清学的マーカーであるネクチン−４を提供する。後述の実施例に示す通り、ネクチン−４は従来の血清学的マーカーであるＣＥＡおよびＣＹＦＲＡよりも高い感度を示し、よって本発明により肺癌の診断法または検出法の感度の向上が達成され得る。すなわち、本発明は、
（ａ）  診断されるべき対象から血液試料を採取する段階；
（ｂ）  血液試料中のネクチン−４のレベルを決定する段階；および
（ｃ）  段階（ｂ）で決定されたネクチン−４レベルを正常対照の該レベルと比較する段階であって、該正常対照と比較して血液試料中のネクチン−４レベルが高いことにより、該対象が肺癌に罹患していることが示される段階
を含む、対象における癌を診断するための方法を提供する。
【００６７】
別の態様において、本発明の方法は以下の段階をさらに含み得る：
（ｄ）  血液試料中のＣＥＡのレベルを決定する段階；
（ｅ）  段階（ｄ）で決定されたＣＥＡレベルを正常対照の該レベルと比較する段階；ならびに
（ｆ）  ネクチン−４のレベルおよび／またはＣＥＡのレベルが対照レベルよりも高い場合に、対象が癌に罹患していると判断する段階。
【００６８】
ネクチン−４とＣＥＡの組み合わせにより、癌、特に肺癌の検出感度が有意に向上し得る。より詳細には、ネクチン−４とＣＥＡの組み合わせを好ましくはＮＳＣＬＣに、より好ましくは腺癌（ＡＤＣ）に適用する。例えば、後述の実施例において解析した群では、肺癌に関するネクチン−４およびＣＥＡの陽性率は、それぞれ約５４．５％および４２．３％である。これに比べて、ＣＥＡとネクチン−４の組み合わせの陽性率は６５．０％まで上昇する。本発明において、「ＣＥＡとネクチン−４の組み合わせ」とは、マーカーとして用いられるＣＥＡおよびネクチン−４のレベルのいずれかまたは両方を指す。好ましい態様において、ＣＥＡまたはネクチン−４のいずれか一方が陽性である患者は、癌のリスクが高いと判断され得る。癌の血清学的マーカーとしての、ネクチン−４とＣＥＡの組み合わせの使用は新規である。
【００６９】
別の態様において、本発明は以下の段階をさらに含み得る：
（ｄ）  血液試料中のＣＹＦＲＡのレベルを決定する段階；
（ｅ）  段階（ｄ）で決定されたＣＹＦＲＡレベルを正常対照の該レベルと比較する段階；ならびに
（ｆ）  ネクチン−４のレベルおよび／またはＣＹＦＲＡのレベルが対照レベルよりも高い場合に、対象が癌に罹患していると判断する段階。
【００７０】
ネクチン−４とＣＹＦＲＡとを組み合わせることにより、癌、特に肺癌の検出感度が有意に向上し得る。より詳細には、ネクチン−４とＣＹＦＲの組み合わせを好ましくはＮＳＣＬＣに、より好ましくは扁平上皮癌（ＳＣＣ）に適用する。例えば、後述の実施例において解析した群では、肺癌に関するネクチン−４およびＣＹＦＲＡの陽性率は、それぞれ約５１．２％および５３．７％である。これに比べて、ＣＹＦＲＡとネクチン−４の組み合わせの陽性率は６８．３％まで上昇する。本発明において、「ＣＹＦＲＡとネクチン−４の組み合わせ」とは、マーカーとして用いられるＣＹＦＲＡおよびネクチン−４のレベルのいずれかまたは両方を指す。好ましい態様において、ＣＹＦＲＡおよびネクチン−４のいずれかが陽性である患者は、肺癌のリスクが高いと判断され得る。肺癌の血清学的マーカーとしてのネクチン−４とＣＹＦＲＡの組み合わせの使用は、本発明の新規発見である。
【００７１】
したがって、本発明により、ＣＥＡまたはＣＹＦＲＡのみの測定結果に基づく判定と比較して、癌患者の検出感度を大きく向上させることができる。この向上の背後には、ＣＥＡ陽性またはＣＹＦＲＡ陽性の患者群とネクチン−４陽性の患者群とが完全に一致するわけではないという事実が存在する。
【００７２】
例えば、ＣＥＡまたはＣＹＦＲＡの測定結果として基準値よりも低い値を有する（すなわち、癌を有さない）と判定された患者の中には、癌を有する患者が実際にはある程度の割合で存在する。そのような患者は、ＣＥＡまたはＣＹＦＲＡ偽陰性患者と称される。ＣＥＡまたはＣＹＦＲＡに基づく判定とネクチン−４に基づく判定とを組み合わせることにより、ネクチン−４値が基準値よりも高い患者を、ＣＥＡ偽陰性またはＣＹＦＲＡ偽陰性の患者の中から見つけることができる。すなわち、本発明は、ＣＥＡまたはＣＹＦＲＡの血中濃度が低いために「陰性」であると誤って判定された患者の中から、実際には癌を有する患者を同定する手段を提供する。したがって、癌患者の検出感度が本発明によって向上する。一般に、複数のマーカーを使用した判定の結果を組み合わせるだけで検出感度は上昇し得るが、一方で特異度が低下することが多い。しかしながら本発明は、感度と特異度の間の最良のバランスを決定することによって、特異度を損なうことなく検出感度を上昇させ得る特徴的な組み合わせを決定した。
【００７３】
本発明においては、ＣＥＡまたはＣＹＦＲＡの測定結果を同時に考慮するために、例えば、上述したネクチン−４の測定値と基準値との比較と同じ様式で、ＣＥＡまたはＣＹＦＲＡの血中濃度を測定し、これを基準値と比較することができる。例えば、ＣＥＡまたはＣＹＦＲＡの血中濃度を測定して、それを基準値と比較する方法は既知である。さらに、ＣＥＡまたはＣＹＦＲＡのためのＥＬＩＳＡキットは市販もされている。公知の報告に記載されたこれらの方法は、癌を診断または検出するための本発明の方法において用いることができる。
【００７４】
本発明において、ネクチン−４の血中濃度の基準値は統計学的に決定することができる。例えば、健常個体におけるネクチン−４の血中濃度を測定して、ネクチン−４の標準的な血中濃度を統計学的に決定することができる。統計学的に十分な集団を集めた場合、平均値から標準偏差（Ｓ．Ｄ．）の２倍または３倍の範囲内にある値を基準値として用いる場合が多い。したがって、平均値＋２×Ｓ．Ｄ．または平均値＋３×Ｓ．Ｄ．に対応する値を基準値として用いることができる。記載通りに設定された基準値は理論的には、それぞれ健常個体の９０％および９９．７％を含む。
【００７５】
あるいは、癌患者におけるネクチン−４の実際の血中濃度に基づいて、基準値を設定することもできる。一般に、このように設定される基準値は偽陽性の割合を最小化し、検出感度を最大にし得る条件を満たす値の範囲から選択される。この場合、基準値は通常「カットオフ値」と称される。本明細書において、偽陽性の割合とは、健常個体の中で、ネクチン−４の血中濃度が基準値（カットオフ値）よりも高いと判断される患者の割合を指す。一方、健常個体の中で、ネクチン−４の血中濃度が基準値（カットオフ値）よりも低いと判断される患者の割合は、特異度を示す。すなわち、偽陽性の割合と特異度の合計は常に１である。検出感度とは、癌の存在が判定されている個体群における全癌患者の中で、ネクチン−４の血中濃度が基準値（カットオフ値）よりも高いと判断される患者の割合を指す。
【００７６】
さらに、本発明において、基準値（カットオフ値）よりも高いネクチン−４濃度を有すると判断された患者の中の癌患者の割合は、陽性予測値を表す。一方、基準値（カットオフ値）よりも低いネクチン−４濃度を有すると判断された患者の中の健常個体の割合は、陰性予測値を表す。これらの値の間の関係を表１に要約する。以下に示した関係から示されるように、肺癌の診断精度を評価するための指標である感度、特異度、陽性予測値、および陰性予測値の値はそれぞれ、ネクチン−４の血中濃度のレベルを判断するための基準値（カットオフ値）に応じて変動する。
【００７７】
【表１】
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【００７８】
前述の通り、基準値（カットオフ値）は通常、偽陽性率が低くかつ感度が高くなるように設定される。しかしながら、上に示した関係からも明らかなように、偽陽性率と感度とはトレードオフがある。すなわち、基準値（カットオフ値）が低下すると検出感度が上昇する。しかしながら、偽陽性率も上昇するため、「低い偽陽性率」を有するための条件を満たすことは困難である。この状況を考慮して、例えば以下の予測結果を与える値を、本発明における好ましい基準値（カットオフ値）として選択することができる。
偽陽性率が５０％以下である基準値（カットオフ値）（すなわち、特異度が５０％以上である基準値（カットオフ値））。
感度が２０％以上である基準値（カットオフ値）。
【００７９】
本発明において、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて基準値（カットオフ値）を設定することができる。ＲＯＣ曲線とは、縦軸に検出感度を示し、横軸に偽陽性率（すなわち、「１−特異度」）を示すグラフである。本発明において、ネクチン−４の血中濃度の程度の高さ／低さを判定するための基準値（カットオフ値）を連続的に変動させた後に得られた感度および偽陽性率の変化をプロットすることによって、ＲＯＣ曲線を得ることができる。
【００８０】
ＲＯＣ曲線を得るための「基準値（カットオフ値）」とは、統計学的解析のために一時的に用いられる値である。ＲＯＣ曲線を得るための「基準値（カットオフ値）」は一般に、選択可能な全基準値（カットオフ値）を網羅できる範囲内で連続的に変動させることができる。例えば、基準値（カットオフ値）を、解析集団内の最小および最大のネクチン−４測定値の間で変動させることができる。
【００８１】
得られたＲＯＣ曲線に基づいて、本発明において使用すべき好ましい基準値（カットオフ値）を、上記の条件を満たす範囲から選択することができる。あるいは、基準値（カットオフ値）を、ネクチン−４測定値の大部分を含む範囲から、基準値（カットオフ値）を変動させることによって作成されたＲＯＣ曲線に基づいて選択することができる。本発明において、ネクチン−４血中濃度の基準値（カットオフ値）は、例えば０．６〜２．０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．７〜１．８  ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは０．８〜１．５  ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは０．９〜１．２  ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１．０  ｎｇ／ｍｌに設定され得る。
【００８２】
血液中のネクチン−４は、タンパク質を定量できる任意の方法によって測定され得る。本発明においては、例えばイムノアッセイ、液体クロマトグラフィー、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、質量分析等を使用することができる。質量分析では、適切な内部標準を使用することにより、タンパク質を定量することができる。例えば、同位体標識したネクチン−４を内部標準として使用することができる。血液中のネクチン−４の濃度は、血液中のネクチン−４のピーク強度および内部標準のピーク強度から決定することができる。一般に、タンパク質の質量分析には、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）法が用いられる。質量分析または液体クロマトグラフィーを使用する解析法により、ネクチン−４を他の腫瘍マーカー（例えば、ＣＥＡまたはＣＹＦＲＡ）と同時に解析することもできる。
【００８３】
本発明におけるネクチン−４の好ましい測定法はイムノアッセイである。ネクチン−４のアミノ酸配列は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３０９１６）に示され、それをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される。したがって当業者は、ネクチン−４のアミノ酸配列に基づいて必要な免疫原を合成することにより、抗体を調製することができる。免疫原として用いるペプチドは、ペプチド合成装置を用いて容易に合成することができる。合成ペプチドを担体タンパク質に連結することによって、これを免疫原として使用することができる。
【００８４】
キーホールリンペットヘモシアニン、ミオグロビン、アルブミン等を担体タンパク質として使用することができる。好ましい担体タンパク質は、ＫＬＨ、ウシ血清アルブミン等である。合成ペプチドを担体タンパク質に連結するためには、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル法（以下、ＭＢＳ法と略称する）等が一般に用いられる。
【００８５】
具体的には、システインを合成ペプチドに導入し、システインのＳＨ基を用いてＭＢＳにより該ペプチドをＫＬＨに架橋させる。システイン残基は、合成ペプチドのＮ末端またはＣ末端に導入され得る。
【００８６】
あるいは、ネクチン−４のヌクレオチド配列またはその一部を用いて、ネクチン−４を調製することができる。ネクチン−４発現組織から調製されたｍＲＮＡを用いて、必要なヌクレオチド配列を含むＤＮＡをクローニングすることができる。あるいは、市販のｃＤＮＡライブラリーをクローニング源として用いることもできる。得られたネクチン−４の遺伝子組換え体またはその断片もまた、免疫原として用いることができる。この様式で発現されたネクチン−４組換え体は、本発明において用いられる抗体を得るための免疫原として好ましい。
【００８７】
本発明においては、完全なネクチン−４ポリペプチドに加えて、完全なネクチン−４ポリペプチドに起因する免疫学的に活性な断片、例えばエピトープペプチドもまた、免疫原として用いることができる。免疫原として使用される免疫学的に活性な断片は、該断片が抗体を産生させる能力を保持している限り限定されず、例えばその細胞外ドメインまたは断片が好ましく用いられ得る。
【００８８】
この様式で得られた免疫原を適切なアジュバントと混合して、動物を免疫化するために用いる。公知のアジュバントには、フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）および不完全アジュバントが含まれる。抗体価の上昇が確認されるまで、免疫化手順を適切な間隔で繰り返す。本発明において、免疫化する動物は特に制限されない。具体的には、マウス、ラット、またはウサギなど、免疫化のために通常用いられる動物を使用することができる。
【００８９】
モノクローナル抗体として抗体を入手する場合には、その産生に関して有利な動物を使用することができる。例えばマウスでは、細胞融合のための多くの骨髄腫細胞株が公知であり、高い確率でハイブリドーマを樹立するための技法が既に周知である。したがって、マウスは、モノクローナル抗体を得るための望ましい免疫化動物である。
【００９０】
さらに、免疫化処理はインビトロ処理に限定されない。培養した免疫担当細胞をインビトロで免疫学的に感作するための方法もまた使用することができる。これらの方法によって得られた抗体産生細胞を形質転換し、クローニングする。モノクローナル抗体を得るために抗体産生細胞を形質転換するための方法は、細胞融合に限定されない。例えば、ウイルス感染によりクローニング可能な形質転換体を得るための方法が知られている。
【００９１】
本発明において用いられるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、ネクチン−４に対するその反応性に基づいてスクリーニングすることができる。具体的には、まず、免疫原として使用したネクチン−４またはそのドメインペプチドに対する結合活性を指標として用いることにより、抗体産生細胞を選択する。このスクリーニングにより選択された陽性クローンを、必要に応じてサブクローニングする。
【００９２】
樹立されたハイブリドーマを適切な条件下で培養しかつ産生された抗体を回収することによって、本発明において用いられるモノクローナル抗体を得ることができる。ハイブリドーマがホモハイブリドーマである場合には、これを同系の動物に腹腔内接種することによって、インビボで培養することができる。この場合、モノクローナル抗体は腹水として回収される。ヘテロハイブリドーマを使用する場合には、宿主としてヌードマウスを用いて、これらをインビボで培養することができる。
【００９３】
インビボ培養に加えて、ハイブリドーマはまた一般に、適切な培養環境においてエクスビボでも培養される。例えば、ＲＰＭＩ  １６４０およびＤＭＥＭなどの基本培地を、ハイブリドーマ用の培地として通常用いる。抗体産生能を高レベルに維持するために、動物血清などの添加物をこれらの培地に添加することができる。ハイブリドーマをエクスビボで培養する場合、モノクローナル抗体は培養上清として回収することができる。培養後に細胞から分離することによって、または中空糸を使用する培養装置を用いて培養しながら連続的に回収することによって、培養上清を回収することができる。
【００９４】
本発明において使用するモノクローナル抗体は、飽和硫安沈殿によって免疫グロブリン画分を分離し、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー等によってさらに精製することにより、腹水または培養上清として回収したモノクローナル抗体から調製される。加えて、モノクローナル抗体がＩｇＧである場合には、プロテインＡまたはプロテインＧカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーに基づく精製法が有効である。
【００９５】
一方、本発明において使用する抗体をポリクローナル抗体として得るために、免疫化後に抗体価が上昇した動物から採血し、血清を分離して抗血清を得る。本発明において使用する抗体を調製するために、公知の方法により抗血清から免疫グロブリンを精製する。ネクチン−４をリガンドとして使用する免疫アフィニティークロマトグラフィーを免疫グロブリン精製と組み合わせることにより、ネクチン−４特異的抗体を調製することができる。
【００９６】
ネクチン−４に対する抗体をネクチン−４と接触させると、抗体は、抗原−抗体反応を介して抗体が認識する抗原決定基（エピトープ）に結合する。抗原に対する抗体の結合は、種々のイムノアッセイ原理により検出することができる。イムノアッセイは、ヘテロジニアス解析法とホモジニアス解析法に大別され得る。イムノアッセイの感度および特異度を高レベルに維持するためには、モノクローナル抗体を使用することが望ましい。種々のイムノアッセイ形式によりネクチン−４を測定するための本発明の方法を、本明細書においてさらに詳細に説明する。
【００９７】
最初に、ヘテロジニアスイムノアッセイを使用して物質（ネクチン−４）を測定する方法について記載する。ヘテロジニアスイムノアッセイでは、物質に結合しなかった抗体から物質に結合した抗体を分離した後に該抗体を検出するための機構が必要である。
【００９８】
分離を容易にするため、固定化試薬が一般に用いられる。例えば、物質を認識する抗体が表面に固定化されている固相をまず調製する（固定化抗体）。該物質をこれらに結合させ、二次抗体をさらにそれと反応させる。
【００９９】
固相を液相から分離させ、必要に応じてさらに洗浄すると、二次抗体が該物質の濃度に比例して固相上に残存する。二次抗体を標識することによって、標識に由来するシグナルを測定することにより、該物質を定量することができる。
【０１００】
抗体を固相に結合させるために、任意の方法を用いることができる。例えば、抗体を、ポリスチレンなどの疎水性材料に物理的に吸着させることができる。あるいは抗体を、その表面上に官能基を有する種々の材料に対して化学的に結合させることができる。さらに、結合リガンドで標識した抗体を、該リガンドの結合パートナーを用いて捕捉することによって固相に結合させることもできる。結合リガンドとその結合パートナーの組み合わせには、アビジン−ビオチン等が含まれる。一次抗体と物質との反応と同時にまたはその前に、固相と抗体を結合させることができる。
【０１０１】
同様に、二次抗体を直接標識する必要はない。すなわち二次抗体は、抗体に対する抗体を用いて、またはアビジン−ビオチンなどの結合反応を用いて、間接的に標識することができる。
【０１０２】
試料中の物質の濃度は、既知濃度の物質を有する標準試料を用いて得られたシグナル強度に基づいて決定される。
【０１０３】
物質を認識する抗体またはその抗原結合部位を含む断片である限り、任意の抗体を、上記のヘテロジニアスイムノアッセイのための固定化抗体および二次抗体として使用することができる。したがって、これはモノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でも、または両者の混合物もしくは組み合わせであってもよい。例えば、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の組み合わせは、本発明における好ましい組み合わせである。あるいは、両抗体がモノクローナル抗体である場合には、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体を組み合わせることが好ましい。
【０１０４】
測定すべき抗原を抗体によって挟み込むため、このようなヘテロジニアスイムノアッセイはサンドイッチ法と称される。サンドイッチ法は測定感度および再現性に優れているため、本発明における好ましい測定原理である。
【０１０５】
また、競合阻害反応の原理を、ヘテロジニアスイムノアッセイに適用することもできる。これは具体的には、既知濃度の物質と抗体との間の結合を、試料中の該物質が競合的に阻害する現象に基づくイムノアッセイである。既知濃度の該物質を標識して、抗体と反応した（または反応しなかった）該物質の量を測定することにより、試料中の該物質の濃度を決定することができる。
【０１０６】
既知濃度の抗原と試料中の抗原とが同時に抗体と反応するならば、競合反応系が確立される。さらに、抗体が試料中の抗原と反応し、その後に既知濃度の抗原が反応するならば、阻害反応系による解析が可能である。いずれの種類の反応系においても、試薬成分として用いられる既知濃度の抗原または抗体のいずれか一方を標識成分として設定し、他方を固定化試薬として設定することにより、操作性に優れた反応系を構築することができる。
【０１０７】
放射性同位体、蛍光物質、発光物質、酵素活性を有する物質、肉眼で観察可能な物質、磁気的に観察可能な物質等が、これらのヘテロジニアスイムノアッセイにおいて用いられる。これらの標識物質の具体例を以下に示す。
酵素活性を有する物質：
ペルオキシダーゼ、
アルカリホスファターゼ、
ウレアーゼ、カタラーゼ
グルコースオキシダーゼ、
乳酸デヒドロゲナーゼ、または
アミラーゼ等。
蛍光物質：
フルオレセインイソチオシアネート、
テトラメチルローダミンイソチオシアネート、
置換ローダミンイソチオシアネート、または
ジクロロトリアジンイソチオシアネート等。
放射性同位体：
トリチウム、
１２５Ｉ、または
１３１Ｉ等。
【０１０８】
これらのうち、酵素などの非放射性標識は、安全性、操作性、感度等の点で有利な標識である。酵素標識は、過ヨウ素酸法またはマレイミド法などの公知の方法によって、抗体またはネクチン−４に連結させることができる。
【０１０９】
固相としては、ビーズ、容器の内壁、微粒子、多孔質担体、磁性粒子等が用いられる。ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリル酸、ラテックス、ゼラチン、アガロース、ガラス、金属、セラミック等の材料を用いて形成された固相を使用することができる。抗体等を化学的に結合させるための官能基が上記固体材料の表面上に導入された固体材料もまた、公知である。ポリ−Ｌ−リジンまたはグルタルアルデヒド処理などの化学的結合、および物理的吸着を含む公知の結合法を、固相および抗体（または抗原）に適用することができる。
【０１１０】
本明細書において例示するすべてのヘテロジニアスイムノアッセイにおいて、液相から固相を分離する段階および洗浄段階が必要であるが、これらの段階はサンドイッチ法の変形である免疫クロマトグラフィー法を用いて容易に実施することができる。
【０１１１】
具体的には、固定化すべき抗体を、毛管現象によって試料溶液を輸送することができる多孔質担体上に固定化し、次に物質（ネクチン−４）を含む試料と標識抗体との混合物をこの毛管現象により内部に展開させる。展開中に該物質は標識抗体と反応し、これがさらに固定化抗体と接触した場合にはその位置で捕捉される。該物質と反応しない標識抗体は、固定化抗体に捕捉されることなく通過する。
【０１１２】
結果として、固定化抗体の位置に残存する標識抗体のシグナルを指標として用いて、物質の存在を検出することができる。標識抗体が多孔質担体内の上流で予め維持されている場合、試料溶液を滴下するだけで全反応を開始し完了することができ、よって極めて簡便な反応系が構築され得る。免疫クロマトグラフィー法では、着色粒子のような肉眼で識別可能な標識成分を組み合わせて、特殊な読取装置さえも必要ない分析装置を構築することができる。
【０１１３】
さらに、免疫クロマトグラフィー法において、物質の検出感度を調整することができる。例えば、後述するカットオフ値の近傍に検出感度を調整することによって、カットオフ値を超えた場合に上記の標識成分が検出され得る。このような装置を使用することで、対象が陽性であるか陰性であるかを非常に簡便に判断することができる。肉眼による標識の識別を可能にする構成を採用することにより、単に血液試料を免疫クロマトグラフィーの装置にアプライするだけで、必要な試験結果を得ることができる。
【０１１４】
免疫クロマトグラフィー法の検出感度を調整するための種々の方法が、当技術分野で公知である。例えば、検出感度を調整するための第２の固定化抗体を、試料がアプライされる位置と固定化抗体との間に配置することができる（特開平０６−３４１９８９）。試料中の物質は、該試料がアプライされた位置から標識検出用の第１の固定化抗体の位置へと展開しながら、第２の固定化抗体に捕捉される。第２の固定化抗体が飽和した後、該物質は、下流に位置する第１の固定化抗体の位置へと到達することができる。結果として、該試料中に含まれる該物質の濃度が所定の濃度を超える場合、標識抗体に結合した該物質は、第１の固定化抗体の位置で検出される。
【０１１５】
次に、ホモジニアスイムノアッセイについて説明する。上記のように反応液の分離を必要とするヘテロジニアス免疫学的アッセイ法とは対照的に、ホモジニアス解析法を用いて物質（ネクチン−４）を測定することもできる。ホモジニアス解析法では、抗原−抗体反応生成物を反応液から分離することなく検出できる。
【０１１６】
代表的なホモジニアス解析法とは、抗原−抗体反応後に生成された沈殿物を調べることにより抗原性物質を定量的に解析する免疫沈降反応である。免疫沈降反応には一般的に、ポリクローナル抗体が用いられる。モノクローナル抗体を適用する場合には、物質の別々のエピトープに結合する複数種類のモノクローナル抗体を使用することが好ましい。免疫反応後の沈降反応の生成物は、肉眼で観察することができるか、または数値データへの変換のために光学的に測定することができる。
【０１１７】
抗体を感作した微粒子の抗原による凝集を指標として用いる免疫学的粒子の凝集反応は、一般的なホモジニアス解析法である。この方法においても、上記の免疫沈降反応と同様に、ポリクローナル抗体または複数種類のモノクローナル抗体の組み合わせを使用することができる。微粒子は、抗体混合物を用いる感作により抗体を用いて感作することができ、または各抗体を用いて別々に感作された粒子を混合することによって調製することができる。この様式で得られた微粒子は、物質との接触に際してマトリクス様の反応生成物を生じる。該反応生成物は、粒子の凝集として検出することができる。粒子の凝集は、肉眼で観察してもよく、または数値データへの変換のために光学的に測定することもできる。
【０１１８】
ホモジニアスイムノアッセイとして、エネルギー移動および酵素チャネリング（ｅｎｚｙｍｅ  ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ）に基づく免疫学的解析法が知られている。エネルギー移動を利用する方法では、ドナー／アクセプター関係をもつ別々の光学標識を、抗原上の隣接したエピトープを認識する複数の抗体に連結させる。免疫反応が起こると、２つの部分が接近してエネルギー移動現象が起こり、これによって消光または蛍光波長の変化といったシグナルが生じる。一方、酵素チャネリングでは、隣接したエピトープに結合する複数の抗体に対する標識が利用されるが、ここで該標識は、一方の酵素の反応生成物が他方の基質となるような関係にある酵素の組み合わせである。免疫反応により２つの部分が接近すると、酵素反応が促進され；よって酵素反応速度の変化としてそれらの結合を検出することができる。
【０１１９】
本発明において、ネクチン−４を測定するための血液は、患者から採血した血液から調製することができる。好ましい血液試料は血清または血漿である。血清試料または血漿試料は、測定前に希釈することができる。あるいは、全血を試料として測定してもよく、血清濃度を決定するために得られた測定値を補正することができる。例えば、同一血液試料中の血球体積の割合を決定することにより、全血中の濃度を血清濃度へと補正することができる。
【０１２０】
好ましい態様において、イムノアッセイはＥＬＩＳＡを含む。本発明者らは、肺癌患者における血清ネクチン−４を検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡを確立した。
【０１２１】
次に、血液試料中のネクチン−４レベルを、正常対照試料などの参照試料に関連するネクチン−４レベルと比較する。「正常対照レベル」という語句は、それぞれ肺癌に罹患していない集団の血液試料において典型的に認められるネクチン−４のレベルを指す。参照試料は、試験試料と類似の特性を有することが好ましい。例えば、試験試料が患者血清を含む場合、参照試料もまた血清であるべきである。対照および試験対象に由来する血液試料中のネクチン−４レベルを同時に決定してもよく、あるいは代替的に、以前に対照群から採取された試料中のネクチン−４のレベルを解析することによって得られた結果に基づき、統計学的方法により正常対照レベルを決定してもよい。
【０１２２】
ネクチン−４レベルはまた、肺癌の治療経過をモニターするために使用することもできる。この方法において、試験血液試料は、肺癌の治療を受けている対象から提供される。治療前、治療中、および／または治療後を含む様々な時点で、対象から複数の試験血液試料を得ることが好ましい。次に、治療後試料中のネクチン−４のレベルを、治療前試料のネクチン−４のレベルあるいは代替的に参照試料（例えば、正常対照レベル）と比較することができる。例えば、治療後ネクチン−４レベルが治療前ネクチン−４レベルよりも低いならば、該治療は有効であったと結論づけることができる。同様に、治療後ネクチン−４レベルが正常対照ネクチン−４レベルと同様であるならば、同じく該治療は有効であったと結論づけることができる。
【０１２３】
「有効」な治療とは、対象においてネクチン−４のレベルの低下、または肺癌の大きさ、有病率、もしくは転移能の減少をもたらす治療である。治療が予防的に適用される場合、「有効」とは、治療によって肺癌の発生が遅延されるか妨げられる、または肺癌の臨床症状が軽減されることを意味する。肺癌の評価は、標準的な臨床プロトコルを用いて行うことができる。さらに、肺癌を診断または治療するための任意の公知の方法に関連して、治療の有効性を判定することができる。例えば、病理組織学的に、または症候性異常を同定することによって、肺癌は規定通りに診断される。
【０１２４】
肺癌の血清学的診断のためのキット：
本発明に従って癌の診断を行うために用いられるコンポーネントを予め組み合わせて、試験キットとして提供することができる。したがって本発明は、
（ｉ）  血液試料中のネクチン−４のレベルを決定するためのイムノアッセイ試薬
を含む、ネクチン−４過剰発現に関連した癌を検出するためのキットを提供する。好ましい態様において、本発明のキットは、
（ｉｉ）  ネクチン−４の陽性対照試料
をさらに含み得る。好ましい態様において、本発明のキットは、
（ｉｉｉ）  血液試料中のＣＥＡまたはＣＹＦＲＡのレベルを決定するためのイムノアッセイ試薬
をさらに含み得る。好ましい態様において、本発明のキットは、
（ｉｖ）  ＣＥＡおよび／またはＣＹＦＲＡの陽性対照試料
をさらに含み得る。
【０１２５】
本発明のキットは、好ましくは肺癌、膀胱癌、および子宮頸癌に適用可能であり、より好ましくは肺癌、さらにより好ましくはＮＳＣＬＣに適用可能である。
【０１２６】
本発明のキットを構成するイムノアッセイのための試薬は、上記の種々のイムノアッセイに必要な試薬を含み得る。具体的には、イムノアッセイのための試薬には、測定すべき物質を認識する抗体が含まれる。抗体は、イムノアッセイのアッセイ形式に応じて修飾することができる。本発明の好ましいアッセイ形式として、ＥＬＩＳＡを用いることができる。ＥＬＩＳＡでは、例えば、固相上に固定化された一次抗体および標識を有する二次抗体が一般に用いられる。
【０１２７】
したがって、ＥＬＩＳＡのためのイムノアッセイ試薬は、固相担体上に固定化された一次抗体を含み得る。微粒子または反応容器の内壁を固相担体として用いることができる。磁性粒子を微粒子として使用することができる。あるいは、９６ウェルマイクロプレートなどのマルチウェルプレートを反応容器として用いることが多い。９６ウェルマイクロプレートよりも容量の小さなウェルを高密度で備えた、多数の試料を処理するための容器もまた知られている。本発明では、これらの反応容器の内壁を固相担体として使用することができる。
【０１２８】
ＥＬＩＳＡのためのイムノアッセイ試薬は、標識を有する二次抗体をさらに含み得る。ＥＬＩＳＡのための二次抗体は、酵素が直接的または間接的に連結している抗体であってよい。酵素を抗体に化学的に連結させる方法は公知である。例えば、免疫グロブリンを酵素的に切断して、可変領域を含む断片を得ることができる。これらの断片中に含まれる−ＳＳ−結合を−ＳＨ基に還元して、二官能性リンカーを結合させることができる。酵素を予め二官能性リンカーに連結しておくことにより、酵素を抗体断片に連結することができる。
【０１２９】
あるいは、酵素を間接的に連結させるために、例えばアビジン−ビオチン結合を使用することができる。すなわち、ビオチン化抗体と、アビジンを結合させた酵素とを接触させることにより、酵素を抗体に間接的に連結させることができる。加えて、二次抗体を認識する酵素標識抗体である三次抗体を用いて、酵素を該二次抗体に間接的に連結させることができる。例えば、上記で例示したような酵素を、抗体を標識するための酵素として使用することができる。
【０１３０】
本発明のキットは、ネクチン−４の陽性対照を含む。ネクチン−４の陽性対照には、濃度が予め決定されたネクチン−４が含まれる。好ましい濃度とは、例えば、本発明の試験法において基準値（例えば、カットオフ値としての１．０  ｎｇ／ｍｌ）として設定された濃度である。あるいは、より高い濃度を有する陽性対照を組み合わせることもできる。本発明におけるネクチン−４の陽性対照には、濃度が予め決定されたＣＥＡおよび／またはＣＹＦＲＡがさらに含まれ得る。ネクチン−４、ＣＥＡ、および／またはＣＹＦＲＡを含む陽性対照は、本発明の陽性対照として好ましい。
【０１３１】
したがって本発明は、正常値よりも高い濃度のネクチン−４ならびにＣＥＡおよび／またはＣＹＦＲＡを含む、癌を検出するための陽性対照を提供する。あるいは、本発明は、癌を検出するための陽性対照の作製における、正常値よりも高い濃度のネクチン−４ならびにＣＥＡおよび／またはＣＹＦＲＡを含む血液試料の使用に関する。ＣＥＡおよび／またはＣＹＦＲＡが癌の指標として役立ち得ることは知られているが；ネクチン−４が肺癌の指標として役立ち得ることは、本発明によって得られた新規知見である。したがって、ＣＥＡおよび／またはＣＹＦＲＡに加えてネクチン−４を含む陽性対照は新規である。本発明の陽性対照は、基準値よりも高い濃度のＣＥＡおよび／またはＣＹＦＲＡならびにネクチン−４を血液試料に添加することによって調製することができる。例えば、基準値よりも高い濃度のＣＥＡおよび／またはＣＹＦＲＡならびにネクチン−４を含む血清は、本発明の陽性対照として好ましい。
【０１３２】
本発明における陽性対照は、好ましくは液体形態である。本発明では、試料として血液試料が用いられる。したがって、対照として用いられる試料もまた液体形態である必要がある。あるいは、乾燥した陽性対照を使用時に所定量の液体で溶解することにより、試験濃度を付与する対照を調製することができる。乾燥した陽性対照と共に、それを溶解するのに必要な量の液体を封入することによって、使用者はそれらを混合するだけで必要な陽性対照を得ることができる。陽性対照として用いられるネクチン−４は天然由来のタンパク質であってよく、組換えタンパク質であってもよい。本発明のキットにおいて、陽性対照だけでなく陰性対照も組み合わせることができる。陽性対照または陰性対照は、イムノアッセイによって示された結果が正しいことを検証するために用いられる。
【０１３３】
癌の予後を評価するための方法：
本発明は、ネクチン−４発現が、癌患者の予後不良（ｐｏｏｒｅｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）に有意に関連しているという新規の発見に関連する。したがって本発明は、患者の生物学的試料におけるネクチン−４遺伝子の発現レベルを検出し；検出した発現レベルを対照レベルと比較し；かつ該対照レベルに対して増大した発現レベルを予後不良（低い生存率）を示すと判定することによって、癌、特に肺癌を有する患者の予後を判定するまたは評価するための方法を提供する。
【０１３４】
本明細書中で、「予後」という用語は、疾患の見込み転帰、ならびに症例の性質および症状によって示されるような疾患からの回復の予想に関する予測を指す。したがって、好ましくない、陰性の、不良である予後は、治療後生存期間または生存率が低いことによって定義される。反対に、陽性、良好な、または好ましい予後は、治療後生存期間または生存率が高いことによって定義される。
【０１３５】
「予後を評価する」という用語は、患者の癌の今後の転帰（例えば悪性度、癌の治癒見込み、生存見込み等）を予測するまたは、所定の検出または測定と関連付ける能力を指す。例えば、ネクチン−４の発現レベルの経時的な測定により、患者に対する転帰（例えば悪性度の増減、癌の進行度（grade）の増減、癌の治癒見込み、生存率等）の予測が可能となる。
【０１３６】
本発明の文脈において、「予後を評価する（または判定する）」という語句は、癌の進行、特に癌の再発、転移拡散、および疾患再発の予測および見込み解析を包含することが意図される。本発明の予後評価法は、治療的介入、病期分類などの診断基準、ならびに腫瘍性疾患の転移または再発に関する疾患モニタリングおよび監視を含む治療様式について結論を出す際に、臨床的に使用されることが意図される。
【０１３７】
本方法で用いられる、患者由来の生物学的試料は、該試料中でネクチン−４遺伝子が検出可能である限り、該対象に由来するいかなる試料であってもよい。好ましくは、生物学的試料は、肺細胞（肺から得られる細胞）である。さらに、生物学的試料には、生検標本、体液、例えば痰、血液、血清、または血漿が含まれ得る。さらに、試料は組織から精製された細胞であってもよい。生物学的試料は、治療前、治療中および／または治療後を含む様々な時点で、患者から得ることができる。
【０１３８】
本発明によると、患者由来の生物学的試料中で測定されたネクチン−４遺伝子の発現レベルが高いほど、治療後の寛解、回復、および／または生存に関する予後がより悪くかつ臨床転帰不良の可能性がより高いことが示された。したがって、本発明の方法によれば、比較に用いられる「対照レベル」とは例えば、何らかの種類の治療後に癌の良好なまたはポジティブな予後を示した個体または個体群における、該治療の前に検出されたネクチン−４遺伝子の発現レベルであってよく、これは本明細書において「予後良好対照レベル」と称する。代替的に、「対照レベル」とは、何らかの種類の治療後に癌の不良なまたはネガティブな予後を示した個体または個体群において、該治療の前に検出されたネクチン−４遺伝子の発現レベルであってよく、これは本明細書において「予後不良対照レベル」と称する。「対照レベル」とは、単一の参照集団に由来するまたは複数の発現パターンに由来する、単一の発現パターンである。したがって対照レベルは、疾患状態（予後良好または予後不良）が判明している癌患者または該患者群における何らかの種類の治療の前に検出されたネクチン−４遺伝子の発現レベルに基づいて決定することができる。好ましくは、癌は肺癌、膀胱癌、および子宮頸癌であり、より好ましくは肺癌、さらにより好ましくはＮＳＣＬＣである。疾患状態が判明している患者群におけるネクチン−４遺伝子の発現レベルの基準値を用いることが好ましい。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値±２Ｓ．Ｄ．または平均値±３Ｓ．Ｄ．の範囲を基準値として用いることができる。あるいは、ＲＯＣ曲線に基づいて基準値を得ることができ、この様式で得られた基準値は通常「カットオフ値」と称される。ネクチン−４遺伝子の発現レベルが血液試料中のネクチン−４のレベルとして検出される場合、カットオフ値は、例えば０．６〜２．０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．７〜１．８  ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは０．８〜１．５  ｎｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは０．９〜１．２  ｎｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは１．０  ｎｇ／ｍｌに設定され得る。
【０１３９】
何らかの種類の治療を行う前の、疾患状態（良好な予後または不良な予後）が既知である癌患者（複数可）（対照または対照群）から以前に採取および保存されていた試料（複数可）を使用することによって、試験される生物学的試料と同時に対照レベルを決定することができる。
【０１４０】
代替的に、対照レベルは、対照群から以前に採取および保存された試料におけるネクチン−４遺伝子の発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計学的方法によって決定してもよい。さらに対照レベルは、以前に検証された細胞由来の発現パターンのデータベースであり得る。
【０１４１】
さらに、本発明の１つの局面によれば、生物学的試料におけるネクチン−４遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定した複数の対照レベルと比較してもよい。患者由来の生物学的試料と類似した組織型に由来する参照試料から決定した対照レベルを用いることが好ましい。
【０１４２】
本発明に従って、ネクチン−４遺伝子の発現レベルが予後良好対照レベルと類似していることにより、患者のより好ましい予後が示され、該発現レベルが予後良好対照レベルに対して増加していることにより、治療後の寛解、回復、生存、および／または臨床転帰に関してより好ましくない不良な予後が示される。一方、ネクチン−４遺伝子の発現レベルが予後不良対照レベルに対して減少していることにより、患者のより好ましい予後が示され、該発現レベルが予後不良対照レベルと類似していることにより、治療後の寛解、回復、生存、および／または臨床転帰に関してより好ましくない不良な予後が示される。
【０１４３】
生物学的試料におけるネクチン−４遺伝子の発現レベルは、対照レベルと比べて１．０倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、またはそれ以上異なる場合に、変化したとみなされ得る。
【０１４４】
試験される生物学的試料と対照レベルとの間の発現レベルの相違は、対照、例えばハウスキーピング遺伝子に対して標準化することができる。例えば、癌性細胞と非癌性細胞との間で発現レベルが異ならないことが知られるポリヌクレオチド、例えばβアクチン、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、およびリボソームタンパク質Ｐ１をコードするポリヌクレオチドを用いて、ネクチン−４遺伝子の発現レベルを標準化してもよい。
【０１４５】
発現レベルは、当技術分野で周知の技術を用いて患者由来の生物学的試料における遺伝子転写産物を検出することによって、決定してもよい。本発明の方法によって検出される遺伝子転写産物には、転写産物および翻訳産物の両方、例えばｍＲＮＡおよびタンパク質が含まれる。
【０１４６】
例えば、ネクチン−４遺伝子の転写産物は、遺伝子転写産物に対するネクチン−４遺伝子プローブを使用するハイブリダイゼーション、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション解析によって検出することができる。検出はチップまたはアレイ上で行ってもよい。ネクチン−４遺伝子を含む複数の遺伝子の発現レベルの検出に関しては、アレイの使用が好ましい。別の例として、検出のために、増幅ベースの検出法、例えばネクチン−４遺伝子特異的なプライマーを使用する逆転写ベースのポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用してもよい（実施例を参照されたい）。ネクチン−４遺伝子特異的なプローブまたはプライマーは、ネクチン−４遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の配列全体を参照することにより、従来の技術を用いて設計および調製されうる。例えば、実施例で使用するプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および４）は、ＲＴ−ＰＣＲによる検出に利用され得るが、本発明はそれらに限定されない。
【０１４７】
詳細には、本発明の方法で使用されるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、または低ストリンジェントな条件下でネクチン−４遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で使用される「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な状況下で異なる。長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般的に、ストリンジェントな条件の温度は、規定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列に関する熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度で）標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度である。一般的にＴｍでは標的配列が過剰に存在するので、プローブの５０％が平衡状態で占有される。典型的に、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１Ｍ〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）である条件であり、該温度は、短いプローブまたはプライマー（例えば１０個〜５０個のヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、より長いプローブまたはプライマーについては少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加によっても達成され得る。
【０１４８】
あるいは、本発明の評価のために翻訳産物を検出してもよい。例えば、ネクチン−４タンパク質の量を決定することができる。翻訳産物としてタンパク質の量を決定するための方法には、ネクチン−４タンパク質を特異的に認識する抗体を用いるイムノアッセイ法が含まれる。抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよい。さらに、抗体の任意の断片または修飾物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）を、該断片がネクチン−４タンパク質への結合能を保持している限り検出に用いることもできる。タンパク質を検出するためのこれらの種類の抗体を調製する方法は当技術分野において周知であり、そのような抗体およびその同等物を調製するために、本発明において任意の方法を使用することができる。
【０１４９】
ネクチン−４遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、ネクチン−４タンパク質に対する抗体を用いた免疫組織化学的解析により、染色強度を観察することができる。すなわち、強力な染色が観察されることは、ネクチン−４タンパク質の高い存在を示し、同時にネクチン−４遺伝子の高い発現を示す。
【０１５０】
あるいは、血液試料（例えば、血清）中のネクチン−４のレベルは予後と有意に相関するため、ネクチン−４遺伝子の発現レベルを患者由来の血液試料中のネクチン−４レベルとして検出してもよい。血液試料中のネクチン−４のレベルは、癌の血清学的診断の項で上記した方法によって測定することができる。
【０１５１】
さらに、ネクチン−４タンパク質は細胞増殖活性を有することが知られている。したがって、そのような細胞増殖活性を指標として用いて、ネクチン−４遺伝子の発現レベルを決定することができる。例えば、ネクチン−４を発現する細胞を調製し、生物学的試料の存在下で培養し、その後、増殖速度を検出することにより、または細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することにより、該生物学的試料の細胞増殖活性を決定することができる。
【０１５２】
代替的に、本発明に従って、対象の予後を評価するための他の試験結果に加えて、中間的な結果も与えられ得る。そのような中間的な結果は、医師、看護師、または他の実施者が対象の予後を評価、判断または推測する助けとなりうる。予後を評価するために本発明によって得られる中間的な結果と組み合わせて考慮することができる付加的情報としては、対象の臨床症状および身体状態が挙げられる。
【０１５３】
本方法に従って癌の予後を評価される患者は哺乳動物であることが好ましく、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれる。
【０１５４】
癌を診断するためまたは癌の予後を評価するためのキット：
本発明は、癌を診断するためまたは癌の予後を評価するためのキットを提供する。好ましくは、癌は肺癌、膀胱癌、および子宮頚癌であり、より好ましくは肺癌であり、さらにより好ましくはＮＳＣＬＣである。詳細には、本キットは、患者由来の生物学的試料においてネクチン−４遺伝子の発現を検出するための試薬を少なくとも１種類含み、該試薬は、
（ａ）  ネクチン−４遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬、
（ｂ）  ネクチン−４タンパク質を検出するための試薬、および
（ｃ）  ネクチン−４タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬
からなる群より選択され得る。
【０１５５】
ネクチン−４遺伝子のｍＲＮＡを検出するための好適な試薬には、ネクチン−４のｍＲＮＡの一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドなどの、ネクチン−４のｍＲＮＡに特異的に結合するかまたはネクチン−４のｍＲＮＡを特異的に同定する核酸が含まれる。これらの種類のオリゴヌクレオチドの例は、ネクチン−４のｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブである。当技術分野で周知の方法に基づき、これらの種類のオリゴヌクレオチドを調製することができる。必要であれば、ネクチン−４のｍＲＮＡを検出するための試薬を、固体マトリックス上に固定化してもよい。さらに、ネクチン−４のｍＲＮＡを検出するための複数の試薬が、キットに含まれていてもよい。
【０１５６】
他方、ネクチン−４タンパク質を検出するための好適な試薬には、ネクチン−４タンパク質に対する抗体が含まれる。抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。さらに、断片がネクチン−４タンパク質との結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または修飾物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）を、試薬として使用することができる。タンパク質の検出のためのこれらの種類の抗体を調製する方法は、当技術分野で周知であり、本発明においては、そのような抗体およびそれらの等価物を調製するために、任意の方法を利用することができる。さらに、直接結合または間接標識技術を介して、シグナル生成分子によって抗体を標識してもよい。標識、および抗体を標識して抗体とその標的との結合を検出する方法は、当技術分野で周知であり、任意の標識および方法を本発明のために利用することができる。さらに、ネクチン−４タンパク質を検出するための複数の試薬が、キットに含まれていてもよい。
【０１５７】
さらに、生物学的試料において、例えば、発現されたネクチン−４タンパク質による細胞増殖活性を測定することによって、生物学的活性を決定してもよい。例えば、細胞を、患者由来の生物学的試料の存在下で培養し、次いで、増殖のスピードを検出するか、または細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することによって、生物学的試料の細胞増殖活性を決定することができる。必要であれば、ネクチン−４のｍＲＮＡを検出するための試薬を、固体マトリックス上に固定化してもよい。さらに、ネクチン−４タンパク質の生物学的活性を検出するための複数の試薬が、キットに含まれていてもよい。
【０１５８】
キットは、前記試薬を複数含有していてもよい。さらに、キットは、ネクチン−４遺伝子に対するプローブまたはネクチン−４タンパク質に対する抗体を結合させるための固体マトリックスおよび試薬、細胞を培養するための培地および容器、陽性および陰性の対照試薬、ならびにネクチン−４タンパク質に対する抗体を検出するための二次抗体を含んでいてもよい。例えば、予後良好または予後不良の患者から入手された組織試料が、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットは、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器、および使用のための説明を含む添付文書（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業的見地および使用者の見地から望ましいその他の材料をさらに含んでいてもよい。これらの試薬等は、ラベルを有する容器に含まれ得る。好適な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。容器は、ガラス、またはプラスチックなどの多様な材料から形成されていてよい。
【０１５９】
本発明の１つの態様として、試薬がネクチン−４のｍＲＮＡに対するプローブである場合、少なくとも１つの検出部位が形成されるよう、該試薬を多孔質ストリップなどの固体マトリックスの上に固定化することができる。多孔質ストリップの測定領域または検出領域は、核酸（プローブ）を各々が含有している複数の部位を含んでいてもよい。テストストリップは、陰性対照および／または陽性対照のための部位も含有していてもよい。あるいは、対照部位は、テストストリップから分離されたストリップの上に位置していてもよい。任意で、異なる検出部位は、異なる量の固定化された核酸を含有していてもよい。すなわち、より多い量を第１の検出部位に含有し、より少ない量をその後の部位に含有していてもよい。試験試料の添加時、検出可能シグナルを示す部位の数が、試料中に存在するネクチン−４のｍＲＮＡの量の定量的な指標を提供する。検出部位は、任意の適切に検出可能な形で配置され得、典型的には、テストストリップ幅にわたるバーまたはドットの形である。
【０１６０】
本発明のキットは、さらに、陽性対照試料またはネクチン−４標準試料を含んでいてもよい。ネクチン−４陽性試料を収集することにより本発明の陽性対照試料を調製してもよく、次いで、これらのネクチン−４レベルを分析する。あるいは、精製されたネクチン−４タンパク質またはネクチン−４ポリヌクレオチドを、陽性試料またはネクチン−４標準物を形成するよう細胞にトランスフェクトしてもよい。
【０１６１】
別の態様において、本発明のキットは陰性対照試料をさらに含み得る。本発明の陰性対照試料とは、非ネクチン−４発現細胞または組織である。
【０１６２】
別の態様において、予後を評価または判定する場合の本キットは、予後良好対照試料および／または予後不良対象試料をさらに含み得る。予後良好対照試料は、何らかの種類の治療後に良好なまたは正の予後を示したことが既知である、該治療前の患者に由来する生物学的試料から調製することができる。一方、予後不良対照試料は、何らかの種類の治療後に不良なまたは負の予後を示したことが既知である、該治療前の患者に由来する生物学的試料から調製することができる。対照試料を調製すべき生物学的試料は、これらに限定されるわけではないが好ましくは肺組織試料、または血清などの血液試料である。代替的に、ネクチン−４遺伝子の転写産物または翻訳産物の基準値を含む試料が、対照試料として好ましく用いられ得る。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値±２Ｓ．Ｄ．または平均値±３Ｓ．Ｄ．の範囲を基準値として用いてよい。あるいは、ＲＯＣ曲線に基づいて基準値を得ることができ、この様式によって得られた基準値は通常「カットオフ値」と称される。ネクチン−４遺伝子の発現レベルが血液試料中のネクチン−４のレベルとして検出される場合、カットオフ値は、例えば０．６〜２．０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．７〜１．８  ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは０．８〜１．５  ｎｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは０．９〜１．２  ｎｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは１．０  ｎｇ／ｍｌに設定され得る。
【０１６３】
好ましい態様において、血液試料中のネクチン−４のレベルは、ネクチン−４遺伝子の発現レベルの指標として検出してもよい。したがって、本発明のキットは、好ましくは、血液試料中のネクチン−４のレベルを検出するためのイムノアッセイ試薬を含む。イムノアッセイのための好ましい試薬は、「肺癌の血清学的診断のためのキット」の項で上記されている。
【０１６４】
二本鎖分子：
本明細書で使用される「単離された二本鎖分子」という用語は、標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を指し、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、例えば二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））および低分子干渉ＤＮＡ／ＲＮＡ（ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ、例えばＤＮＡとＲＮＡとの二本鎖キメラ（ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ）またはＤＮＡとＲＮＡとの低分子ヘアピンキメラ（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ））を含む。
【０１６５】
本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ」という用語は、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨害する二本鎖ＲＮＡ分子を指す。ＲＮＡが転写される鋳型をＤＮＡとした技術を含む、ｓｉＲＮＡを細胞に導入する標準的な技術を用いる。ｓｉＲＮＡは、ネクチン−４センス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、ネクチン−４アンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）、またはその両方を含む。単一の転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列および相補的なアンチセンス核酸配列との両方を有するように、例えばヘアピンのように、ｓｉＲＮＡを構築してもよい。ｓｉＲＮＡはｄｓＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのいずれかであり得る。
【０１６６】
本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡ」という用語は、互いに相補的な配列からなり、且つ二本鎖ＲＮＡ分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、２つのＲＮＡ分子のコンストラクトを指す。２本の鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ＲＮＡだけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子も含み得る。
【０１６７】
本明細書で使用される「ｓｈＲＮＡ」という用語は、互いに相補的である第１の領域および第２の領域、即ちセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる、ステム−ループ構造を有するｓｉＲＮＡを指す。領域の相補性および配向性の程度は、塩基対形成が領域間で起こるのに十分であり、第１の領域および第２の領域がループ領域によって連結され、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠失によって生じる。ｓｈＲＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
【０１６８】
本明細書で使用される「ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、ＲＮＡとＤＮＡの両方からなる二本鎖ポリヌクレオチド分子を指し、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリッドおよびキメラを含み、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨害する。本明細書中で、ハイブリッドとは、ＤＮＡからなるポリヌクレオチドとＲＮＡからなるポリヌクレオチドとが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する分子を示し、一方キメラとは、二本鎖分子を構成する鎖の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡを含有し得るものを示す。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡは、ネクチン−４センス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、ネクチン−４アンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）またはその両方を含む。単一の転写産物が、標的遺伝子由来のセンス核酸配列および相補的アンチセンス核酸配列の両方を有するように、例えばヘアピンのように、ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを構築してもよい。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのいずれかであり得る。
【０１６９】
本明細書で使用される「ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに相補的な配列からなり、且つ二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、２つの分子のコンストラクトを指す。２つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」のポリヌクレオチド配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含み得る。ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡを構築する２つの分子の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡの両方から構成される（キメラ分子）か、あるいは代替的に、一方の分子がＲＮＡから構成され、もう一方がＤＮＡから構成される（ハイブリッド二本鎖）。
【０１７０】
本明細書で使用される「ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに相補的である第１の領域および第２の領域、即ちセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる、ステム−ループ構造を有するｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを指す。領域の相補性および配向性の程度は、領域間で塩基対形成が起こるのに十分であり、第１の領域および第２の領域がループ領域によって連結し、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠失によって生じる。ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
【０１７１】
本明細書で用いられる「単離された核酸」とは、その元の環境（例えば、天然由来である場合には天然の環境）から取り出され、かつしたがってその天然状態から合成的に改変された、核酸である。本発明において、単離された核酸の例には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびこれらの誘導体が含まれる。
【０１７２】
標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする、ネクチン−４に対する二本鎖分子は、該遺伝子の通常は一本鎖のｍＲＮＡ転写産物に結合し、それにより翻訳に干渉し、かつしたがってタンパク質の発現を阻害することによって、ネクチン−４遺伝子でコードされるネクチン−４タンパク質の産生を低減または阻害する。本明細書において実証されるように、肺癌細胞株におけるネクチン−４の発現は、ｄｓＲＮＡによって阻害された（図４Ａ）。
【０１７３】
したがって本発明は、ネクチン−４を発現している細胞に導入されると該遺伝子の発現を阻害できる、単離された二本鎖分子を提供する。二本鎖分子の標的配列は、後述のものなどのｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムによって設計され得る。
【０１７４】
ネクチン−４標的配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０または１１のヌクレオチド配列を含む。
【０１７５】
具体的には、本発明は、以下の二本鎖分子［１］〜［１９］を含む：
［１］  細胞に導入されるとネクチン−４の発現および細胞増殖を阻害する、単離された二本鎖分子であって、センス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖からなり、該鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成し、該センス鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に相当するオリゴヌクレオチドまたはその断片を含む、二本鎖分子；
［２］  前記センス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および１１の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、［１］記載の二本鎖分子；
［３］  約１００ヌクレオチド未満の長さを有する、［２］記載の二本鎖分子；
［４］  約７５ヌクレオチド未満の長さを有する、［３］記載の二本鎖分子；
［５］  約５０ヌクレオチド未満の長さを有する、［４］記載の二本鎖分子；
［６］  約２５ヌクレオチド未満の長さを有する、［５］記載の二本鎖分子；
［７］  約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［６］記載の二本鎖分子；
［８］  介在一本鎖によって連結されたセンス鎖とアンチセンス鎖との両方を有する単一のポリヌクレオチドからなる、［１］記載の二本鎖分子；
［９］  一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有し、［Ａ］は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および１１の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、センス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、［Ａ’］は、［Ａ］と相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［８］記載の二本鎖分子；
［１０］  ＲＮＡからなる、［１］記載の二本鎖分子；
［１１］  ＤＮＡおよびＲＮＡの両方からなる、［１］記載の二本鎖分子；
［１２］  ＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１１］記載の二本鎖分子；
［１３］  センス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡからなる、［１２］記載の二本鎖分子；
［１４］  ＤＮＡとＲＮＡとのキメラである、［１１］記載の二本鎖分子；
［１５］  アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、または、センス鎖の５’末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡである、［１４］記載の二本鎖分子；
［１６］  隣接領域が９個〜１３個のヌクレオチドからなる、［１５］記載の二本鎖分子；ならびに
［１７］  ３’オーバーハングを含有する、［１］記載の二本鎖分子；
［１８］  ［１］記載の二本鎖分子を発現するベクター；
［１９］  前記二本鎖分子が一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有し、［Ａ］は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および１１の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、センス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、［Ａ’］は、［Ａ］と相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［１８］記載のベクター。
【０１７６】
本発明の二本鎖分子は以下でより詳細に説明される。
【０１７７】
細胞内の標的遺伝子発現を阻害する能力をもつ二本鎖分子を設計する方法が知られている（例えば、その全体が本明細書中で参照により組み入れられる米国特許第６，５０６，５５９号を参照されたい）。例えば、ｓｉＲＮＡを設計するためのコンピュータプログラムは、Ambionのウェブサイトから入手可能である（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）。
【０１７８】
コンピュータプログラムは、以下のプロトコルに基づき、二本鎖分子に対する標的ヌクレオチド配列を選択する。
【０１７９】
標的部位の選択：
１．  転写産物のＡＵＧ開始コドンから始めて、ＡＡジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として、個々のAAの出現とその３’側に隣接する１９ヌクレオチドを記録する。Tuschl et al.は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および３’非翻訳領域および開始コドン近傍（７５塩基以内）の領域に対してｓｉＲＮＡを設計することを避けることを推奨している。これらの領域は調節タンパク質結合部位がより多く存在する可能性があり、ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体が、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉する可能性があるためである。
【０１８０】
２．  潜在的な標的部位と、適当なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラット等）とを比較し、他のコード配列に対して有意な相同性を有する任意の標的配列を考慮から外す。基本的には、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/におけるＮＣＢＩサーバー上のＢＬＡＳＴを用いる（Altschul SF et al., Nucleic Acids Res 1997 Sep 1, 25(17): 3389-402）。
【０１８１】
３．  合成用の適格な標的配列を選択する。遺伝子の長さに従って標的配列をいくつか選択して評価するのが一般的である。
【０１８２】
上記プロトコルを用い、本発明の単離された二本鎖分子の標的配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および１１として設計した。
【０１８３】
上述の標的配列を標的とする二本鎖分子をそれぞれ、該標的遺伝子を発現する細胞の増殖を抑制する能力に関して調べた。したがって本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および１１からなる群より選択される配列のいずれか１つを標的とする二本鎖分子を提供する。
【０１８４】
本発明の二本鎖分子は単一の標的ネクチン−４遺伝子配列を対象としてもよく、または複数の標的ネクチン−４遺伝子配列を対象としてもよい。
【０１８５】
ネクチン−４遺伝子の上述の標的配列を標的とする本発明の二本鎖分子としては、標的配列の核酸配列および／または標的配列に相補的な配列のいずれかを含む単離されたポリヌクレオチドが挙げられる。ネクチン−４遺伝子を標的とするポリヌクレオチドの例として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０もしくは１１の配列を含むものおよび／またはこれらのヌクレオチドに相補的な配列が挙げられる。しかしながら本発明はこれらの例に限定されず、改変分子がネクチン−４遺伝子の発現を抑制する能力を保持している限り、上述の核酸配列における軽微な改変が許容可能である。本明細書において核酸配列に関連して用いられる「軽微な改変」という語句は、該配列に対する１つ、２つまたはいくつかの核酸の置換、欠失、付加または挿入を示す。
【０１８６】
本発明の文脈において、核酸の置換、欠失、付加および／または挿入に適用される「いくつかの」という用語は、３〜７個の、好ましくは３〜５個の、より好ましくは３〜４個の、さらにより好ましくは３個の核酸残基を意味しうる。
【０１８７】
本発明によれば、本発明の二本鎖分子は、実施例で利用される方法を用いて、その能力に関して試験することができる。本明細書で後述する実施例では、ネクチン−４遺伝子のｍＲＮＡの様々な部分のセンス鎖またはそれに相補的なアンチセンス鎖からなる二本鎖分子を、標準的な方法に従い、（例えば、ＮＣＩ−Ｈ２１７０またはＮＣＩ−Ｈ３５８を用いて）肺癌細胞株におけるネクチン−４遺伝子産物の産出を低減させる能力に関してインビトロで試験した。さらに例えば、候補分子の非存在下で培養した細胞に比べて、候補二本鎖分子と接触させた細胞におけるネクチン−４遺伝子産物の低減は、例えば、実施例１「半定量的ＲＴ−ＰＣＲ」の項で言及されたネクチン−４  ｍＲＮＡに対するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより検出することができる。インビトロ細胞ベースのアッセイにおいてネクチン−４遺伝子産物の産生を低減する配列を、次に、細胞増殖に対するこれらの阻害効果に関して試験することができる。その後、インビトロ細胞ベースのアッセイにおいて細胞増殖を阻害する配列を、癌を有する動物、例えばヌードマウス異種移植片モデルを用いてこれらのインビボでの能力に関して試験し、ネクチン−４産物の産生の低減および癌細胞増殖の低減を確認することができる。
【０１８８】
単離されたポリヌクレオチドがＲＮＡまたはその誘導体である場合、ヌクレオチド配列において塩基「ｔ」は「ｕ」に置き換えるものとする。本明細書で使用される「相補的」という用語は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド単位間のワトソンクリック型またはフーグスティーン型の塩基対形成を指し、「結合」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の物理的なまたは化学的な相互作用を意味する。ポリヌクレオチドが修飾ヌクレオチドおよび／または非リン酸化ジエステル結合を含む場合、これらのポリヌクレオチドもまた同じように互いに結合し得る。一般的に、相補的なポリヌクレオチド配列は、適当な条件下でハイブリダイズして、ほとんどまたは全くミスマッチを含まない安定な二重鎖を形成する。さらに、本発明の単離されたポリヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖分子またはヘアピンループ構造を形成することができる。１つの好ましい態様において、このような二重鎖は１０個のマッチあたりわずか１個のミスマッチしか含有しない。特に好ましい態様では、二重鎖の鎖が完全に相補的である場合、このような二重鎖はミスマッチを含有しない。
【０１８９】
ネクチン−４については、ポリヌクレオチドが２７４４ヌクレオチド長未満であることが好ましい。例えば、ポリヌクレオチドは、全ての遺伝子については５００ヌクレオチド長、２００ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、または２５ヌクレオチド長未満である。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ネクチン−４遺伝子に対する二本鎖分子を形成するのに、または二本鎖分子をコードする鋳型ＤＮＡを調製するのに有用である。ポリヌクレオチドが二本鎖分子を形成するのに使用される場合、ポリヌクレオチドは１９ヌクレオチドより長くてよく、好ましくは２１ヌクレオチドより長く、より好ましくは約１９〜２５ヌクレオチド長である。したがって本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子を提供し、該センス鎖は、標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む。好ましい態様において、センス鎖は標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズして、１９〜２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する。
【０１９０】
本発明の二本鎖分子は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／または非リン酸化ジエステル結合を含有し得る。当技術分野において周知である化学修飾は、二本鎖分子の安定性、利用可能性および／または細胞取り込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子に組み込まれ得る他の種類の化学修飾も認識するであろう（国際公開公報第０３／０７０７４４号、国際公開公報第２００５／０４５０３７号）。１つの態様では、分解耐性の向上または取り込みの改善を与えるために、修飾を用いることができる。このような修飾の例としては、ホスホロチオエート結合、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（特に二本鎖分子のセンス鎖上で）、２’−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、「普遍的塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）」ヌクレオチド、５’−Ｃ−メチルヌクレオチド、および逆デオキシ脱塩基残基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｅｏｘｙｂａｓｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅ）の組み込み（ＵＳ２００６０１２２１３７）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【０１９１】
別の態様では、二本鎖分子の安定性を向上させるために、または標的化効率を増大させるために修飾を用いることができる。そのような修飾の例としては、二本鎖分子の相補鎖２つの間の化学架橋結合、二本鎖分子の鎖の３’末端または５’末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および／または骨格修飾、２−フルオロ修飾リボヌクレオチドおよび２’−デオキシリボヌクレオチドが挙げられる（国際公開公報第２００４／０２９２１２号）が、これらに限定されるわけではない。別の態様において、標的ｍＲＮＡにおけるおよび／または相補的二本鎖分子鎖における相補的ヌクレオチドに対する親和性を増減するために修飾を用いることができる（国際公開公報第２００５／０４４９７６号）。例えば、非修飾ピリミジンヌクレオチドを２−チオピリミジン、５−アルキニルピリミジン、５−メチルピリミジン、または５−プロピニルピリミジンに置換することができる。さらに、非修飾プリンを７−ジアザプリン、７−アルキルプリン、または７−アルケニルプリンに置換することができる。別の態様では、二本鎖分子が３’オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、３’末端のヌクレオチドが突出したヌクレオチドを、デオキシリボヌクレオチドで置換してもよい（Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15（2）: 188-200）。さらに詳細には、ＵＳ２００６０２３４９７０などの公開文献が利用可能である。本発明は、これらの例には限定されず、得られる分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持している限り、任意の既知の化学修飾を本発明の二本鎖分子に対して利用することができる。
【０１９２】
さらに、本発明の二本鎖分子はＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含み得る（例えばｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）。特に、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドポリヌクレオチドまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは、安定性の増大を示す。ＤＮＡとＲＮＡとの混合、即ちＤＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）とＲＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）とからなるハイブリッド型二本鎖分子、一本鎖（ポリヌクレオチド）の一方または両方にＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むキメラ型二本鎖分子等を、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成してもよい。
【０１９３】
ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドは、標的遺伝子を発現している細胞に導入した場合に該遺伝子の発現を阻害できる限り、センス鎖がＤＮＡでありアンチセンス鎖がＲＮＡであるか、またはその反対のいずれであってもよい。好ましくは、センス鎖のポリヌクレオチドはＤＮＡであり、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドはＲＮＡである。また、キメラ型二本鎖分子は、遺伝子を発現する細胞に導入した場合に標的遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖とアンチセンス鎖の両方がＤＮＡおよびＲＮＡからなってもよく、またはセンス鎖とアンチセンス鎖のいずれか一方がＤＮＡおよびＲＮＡからなってもよい。二本鎖分子の安定性を向上させるために、該分子は可能な限り多くのＤＮＡを含有する方が好ましいが、標的遺伝子発現の阻害を誘導するためには、発現の十分な阻害を誘導する範囲内で分子がＲＮＡであることが必要である。
【０１９４】
キメラ型二本鎖分子の好ましい例としては、二本鎖分子の上流部分領域（即ちセンス鎖またはアンチセンス鎖内の標的配列またはその相補配列に隣接する領域）がＲＮＡである。好ましくは、上流部分領域とは、センス鎖の５’側（５’末端）およびアンチセンス鎖の３’側（３’末端）を示す。あるいは、センス鎖の５’末端に隣接する領域および／またはアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域を、上流部分領域と称する。即ち、好ましい態様では、アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、または、センス鎖の５’末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域との両方がＲＮＡからなる。例えば、本発明のキメラまたはハイブリッド型二本鎖分子は以下の組み合わせを含む。
センス鎖：
５’−［−−−ＤＮＡ−−−］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’
：アンチセンス鎖、
センス鎖：
５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’
：アンチセンス鎖、および
センス鎖：
５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（−−−ＲＮＡ−−−）−５’
：アンチセンス鎖。
【０１９５】
好ましくは上流部分領域は、二本鎖分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖内で、標的配列またはこれに対する相補配列の末端から数えて９〜１３ヌクレオチドからなるドメインである。さらに、そのようなキメラ型二本鎖分子の好ましい例としては、少なくともポリヌクレオチドの上流半分の領域（センス鎖では５’側領域およびアンチセンス鎖では３’側領域）がＲＮＡでありかつもう半分がＤＮＡである、１９〜２１ヌクレオチド鎖長を有するものが挙げられる。そのようなキメラ型二本鎖分子では、アンチセンス鎖全体がＲＮＡである場合、標的遺伝子の発現を阻害する効果がかなり高くなる（ＵＳ２００５０００４０６４）。
【０１９６】
本発明において、二本鎖分子は、ヘアピン、例えばショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および、ＤＮＡとＲＮＡからなるショートヘアピン（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）を形成してもよい。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするのに使用することができる緊密なヘアピンターンを作製する、ＲＮＡの配列またはＲＮＡとＤＮＡの混合物の配列である。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、一本鎖上にセンス標的配列とアンチセンス標的配列とを含み、これらの配列はループ配列によって分かれている。一般的に、ヘアピン構造は細胞機構によって切断されてｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡとなり、続いてＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡの標的配列に一致するｍＲＮＡと結合し、これを切断する。ヘアピンループ構造を形成するために、任意のヌクレオチド配列からなるループ配列を、センス配列とアンチセンス配列との間に配置することができる。したがって、本発明は、一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有し、［Ａ］は標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は介在一本鎖であり、［Ａ’］は［Ａ］に対する相補配列を含むアンチセンス鎖である、二本鎖分子も提供する。標的配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および１１のヌクレオチドの中から選択され得る。
【０１９７】
本発明はこれらの例には限定されず、［Ａ］における標的配列は、標的となるネクチン−４遺伝子の発現を抑制する能力を該二本鎖分子が保持する限り、これらの例に由来する改変配列であってもよい。領域［Ａ］は領域［Ａ’］とハイブリダイズし、領域［Ｂ］からなるループを形成する。介在一本鎖部分［Ｂ］、即ちループ配列は、好ましくは３〜２３ヌクレオチド長であり得る。例えばループ配列は以下の配列の中から選択することができる（http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html）。さらに、２３個のヌクレオチドからなるループ配列もまた活性なｓｉＲＮＡを提供する（Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435-8, Epub 2002 Jun 26）：
ＣＣＣ、ＣＣＡＣＣ、またはＣＣＡＣＡＣＣ：Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435- 8, Epub 2002 Jun 26；
ＵＵＣＧ：Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100（4）: 1639-44, Epub 2003 Feb 10；および
ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ：Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4（6）: 457-67。
【０１９８】
ヘアピンループ構造を有する本発明の二本鎖分子の好ましい例を以下に示す。以下の構造では、ループ配列は、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣおよびＵＵＣＡＡＧＡＧＡの中から選択することができるが、本発明はこれらに限定されない：
ＡＣＡＧＵＵＡＣＣＡＣＧＵＣＵＧＡＧＧ−［Ｂ］−ＣＣＵＣＡＧＡＣＧＵＧＧＵＡＡＣＵＧＵ（標的配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）；および
ＡＡＵＧＧＵＵＣＡＵＧＧＣＣＵＧＵＵＵ−［Ｂ］−ＡＡＡＣＡＧＧＣＣＡＵＧＡＡＣＣＡＵＵ（標的配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）。
【０１９９】
さらに、二本鎖分子の阻害活性を高めるために、ヌクレオチド「ｕ」を３’オーバーハングとして標的配列のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端に付加することができる。付加される「ｕ」の数は少なくとも２個、一般に２〜１０個、好ましくは２〜３個である。二本鎖分子が単一のポリヌクレオチドからなりヘアピンループ構造となっている場合、３’オーバーハング配列は該単一ポリヌクレオチドの３’末端に付加されてもよい。
【０２００】
二本鎖分子を調製するための方法は特に限定されないが、当技術分野で既知の任意の化学合成法を使用することが好ましい。化学合成法に従って、一本鎖のセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチドを別々に合成した後、それらを適当な方法により共にアニーリングして二本鎖分子を得る。アニーリングに関する特定の例には、合成した一本鎖ポリヌクレオチドを好ましくは少なくとも約３：７のモル比で、より好ましくは約４：６のモル比で、最も好ましくは実質的に等モル量（即ち約５：５のモル比）で混合することが含まれる。次に、混合物を二本鎖分子が解離する温度まで加熱した後、徐々に冷ます。アニーリングした二本鎖ポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の通常利用される方法によって精製することができる。精製法の例としては、アガロースゲル電気泳動を利用する方法、または、残存する一本鎖ポリヌクレオチドが任意で、例えば適当な酵素を用いる分解によって取り除かれる方法が挙げられる。
【０２０１】
その発現を独立して、あるいは時間的または空間的な様式で調整することができるように、ネクチン−４配列に隣接する調節配列は同一であってもまたは異なっていてもよい。ネクチン−４遺伝子鋳型を、例えば低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来のＲＮＡポリＩＩＩ転写ユニットまたはヒトＨ１  ＲＮＡプロモーターを含有するベクターにクローニングすることによって、二本鎖分子を細胞内で転写することができる。
【０２０２】
本発明の二本鎖分子を含有するベクター：
本明細書に記載の二本鎖分子を１つまたは複数含有するベクター、およびそのようなベクターを含有する細胞も、本発明に包含される。
【０２０３】
本発明において、以下のベクター［１］〜［１０］が特に関心対象となる：
［１］  細胞に導入されるとネクチン−４のインビボ発現および細胞増殖を阻害する二本鎖分子をコードするベクターであって、該分子がセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖からなり、該鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成する、ベクター。
［２］  前記センス鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０または１１の標的配列に相当する配列を含む、［１］記載のベクター；
［３］  前記センス鎖が前記標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約１００ヌクレオチド対未満の長さの該二本鎖分子を形成する、該二本鎖分子をコードする［２］記載のベクター；
［４］  前記センス鎖が前記標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約７５ヌクレオチド対未満の長さの該二本鎖分子を形成する、該二本鎖分子をコードする［３］記載のベクター；
［５］  前記センス鎖が前記標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約５０ヌクレオチド対未満の長さの該二本鎖分子を形成する、該二本鎖分子をコードする［４］記載のベクター；
［６］  前記センス鎖が前記標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約２５ヌクレオチド対未満の長さの該二本鎖分子を形成する、該二本鎖分子をコードする［５］記載のベクター；
［７］  前記センス鎖が前記標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約１９〜約２５ヌクレオチド対の長さの該二本鎖分子を形成する、該二本鎖分子をコードする［６］記載のベクター；
［８］  ２または３ヌクレオチドからなる３’オーバーハングを少なくとも１つ有しかつ請求項３０の二本鎖ヌクレオチドをコードする、［１］記載のベクター；
［９］  前記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結された前記センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一ポリヌクレオチドからなる、［１］記載のベクター；ならびに
［１０］  一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有する二本鎖分子をコードし、［Ａ］はセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に対する相補的配列を含むアンチセンス鎖である、［９］記載のベクター。
【０２０４】
本発明のベクターは、発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードすることが好ましい。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、細胞に導入されると、ベクターが該分子を発現することを示す。好ましい態様において、ベクターは、二本鎖分子の発現に必要な調節エレメントを含む。本発明のそのようなベクターは、本発明の二本鎖分子を産生させるために用いることができ、または癌を治療するための有効成分として直接用いることができる。
【０２０５】
本発明のベクターは、例えば、調節配列が（ＤＮＡ分子の転写によって）両方の鎖の発現を可能にする様式で機能的にネクチン−４配列に連結されるように、ネクチン−４配列を発現ベクターにクローニングすることによって作製することができる（Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5）。例えば、ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子が第１のプロモーター（例えばクローニングされるＤＮＡの３’末端に隣接するプロモーター配列）によって転写され、該ｍＲＮＡに対するセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（例えば該クローニングされるＤＮＡの５’末端に隣接するプロモーター配列）によって転写される。センス鎖とアンチセンス鎖とがインビボでハイブリダイズして、遺伝子をサイレンシングするための二本鎖分子コンストラクトを生成する。代替的に、二本鎖分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれコードする２つのベクター構築物を利用してセンス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ発現させた後、二本鎖分子コンストラクトを形成させる。さらに、クローニングした配列は、二次構造（例えばヘアピン）を有するコンストラクトをコードすることができる；即ちベクターの単一の転写産物が標的遺伝子のセンス配列および相補的アンチセンス配列の両方を含有する。
【０２０６】
本発明のベクターはまた、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するためのものを包含してもよい（例えば相同的組換えカセットベクターの説明に関しては、Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8、米国特許第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号、同第５，８０４，５６６号、同第５，７３９，１１８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，６７９，６４７号、および国際公開公報第９８／０４７２０号を参照されたい。ＤＮＡベースの送達技術の例としては、「ネイキッドＤＮＡ」、促進性（ブピバカイン、ポリマー、ペプチドに媒介される）送達、カチオン性脂質複合体、および、粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が挙げられる（例えば米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
【０２０７】
本発明のベクターは、例えばウイルス性または細菌性のベクターを含む。発現ベクターの例としては、牛痘ウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が挙げられる（例えば米国特許第４，７２２，８４８号を参照されたい）。このアプローチは、例えば二本鎖分子をコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとしての、牛痘ウイルスの使用を伴う。標的遺伝子を発現する細胞に導入されると、組換え牛痘ウイルスが分子を発現し、それにより該細胞の増殖を抑制する。使用することのできるベクターの別の例としてはカルメット・ゲラン桿菌（Bacille Calmette Guerin；ＢＣＧ）が挙げられる。ＢＣＧベクターはStover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載される。広範な他のベクターが、二本鎖分子の治療的投与および生成に有用である。例としては、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Salmonella typhi）ベクター、無毒化炭疽菌毒素ベクター等が挙げられる。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71、Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806、およびHipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【０２０８】
本発明の二本鎖分子を用いて癌細胞の増殖を阻害または低減する方法および癌を治療する方法：
本発明においては、２種類の異なるｄｓＲＮＡを、細胞増殖を阻害する能力に関して試験した。２種類のｄｓＲＮＡは肺癌細胞株における該遺伝子の発現を効果的にノックダウンし、これは細胞増殖の抑制と一致した（図４Ａ）。
【０２０９】
したがって本発明は、ネクチン−４の発現阻害を介してネクチン−４遺伝子の機能不全を誘発することによって癌細胞増殖を阻害するための方法を提供する。ネクチン−４遺伝子の発現は、ネクチン−４遺伝子を特異的に標的とする上述の本発明の二本鎖分子、または該二本鎖分子のいずれかを発現できる本発明のベクターのいずれによっても、阻害することができる。
【０２１０】
本発明の二本鎖分子およびベクターが癌性細胞の細胞増殖をそのように阻害できることは、これらが、癌を治療するための方法に使用可能であることを示す。ネクチン−４遺伝子は正常器官においてほとんど検出されなかったので（図２Ａ）、したがって本発明は、有害作用を伴わずに、該遺伝子に対する二本鎖分子または該分子を発現するベクターを投与することによって、肺癌を有する患者を治療するための方法を提供する。本発明において、肺癌とは好ましくは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。
【０２１１】
特に本発明は、以下の方法［１］〜［２２］を提供する：
［１］  癌細胞の増殖を阻害するためまたは癌を治療するための方法であって、該癌細胞または該癌がネクチン−４遺伝子を発現し、該方法が、少なくとも１つの単離された二本鎖分子を投与する段階を含み、該分子が、センス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖からなり、該鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成し、該センス鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に相当するオリゴヌクレオチドまたはその断片を含む、方法。
［２］  前記センス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および１１の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、［１］記載の二本鎖分子。
［３］  治療される前記癌が肺癌である、［１］記載の方法；
［４］  前記肺癌がＮＳＣＬＣである、［２］記載の方法；
［５］  複数種類の二本鎖分子を同時に投与する、［１］記載の方法；
［６］  前記二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［２］記載の方法；
［７］  前記二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［６］記載の方法；
［８］  前記二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［７］記載の方法；
［９］  前記二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［８］記載の方法；
［１０］  前記二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［１０］記載の方法；
［１１］  前記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結された前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドからなる、［１］記載の方法；
［１２］  前記二本鎖分子が一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有し、［Ａ］はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および１１の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［１１］記載の方法；
［１３］  前記二本鎖分子がＲＮＡである、［１］記載の方法；
［１４］  前記二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む、［１］記載の方法；
［１５］  前記二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、［１４］記載の方法；
［１６］  前記センス鎖ポリヌクレオチドおよびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドがそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡからなる、［１５］記載の方法；
［１７］  前記二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡのキメラである、［１５］記載の方法；
［１８］  前記アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５’末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡからなる、［１７］記載の方法；
［１９］  前記隣接領域が９〜１３個のヌクレオチドからなる、［１８］記載の方法；
［２０］  前記二本鎖分子が３’オーバーハングを含む、［１］記載の方法；
［２１］  ［１］記載の二本鎖分子をコードする少なくとも１つの単離されたベクターを投与する段階を含む、癌細胞の増殖を阻害するためまたは癌を治療するための方法であって、該癌細胞または該癌がネクチン−４遺伝子を発現する、方法
［２２］  前記二本鎖分子またはベクターが、該分子に加えてトランスフェクション増強剤および薬学的に許容される担体を含む組成物中に含まれる、［１］および［２１］記載の方法。
【０２１２】
さらに、ネクチン−４の外因性過剰発現によって、腫瘍増殖および細胞浸潤の増強がもたらされ（図４Ｂ〜Ｆ）、ネクチン−４が細胞浸潤に関与することが実証される。したがって、ネクチン−４遺伝子の機能不全を誘導することにより、癌細胞浸潤を阻害すると期待される。よって本発明はまた、本発明の単離された二本鎖分子の少なくとも１つまたはそれをコードするベクターを対象に投与する段階を含む、癌細胞浸潤を阻害するための方法も提供する。
【０２１３】
本発明の方法は、好ましくは肺癌、膀胱癌、および子宮頸癌、より好ましくは肺癌、さらにより好ましくはＮＳＣＬＣに適用可能である。本発明の方法を以下でより詳細に説明する。
【０２１４】
ネクチン−４遺伝子を発現している細胞の増殖は、ネクチン−４遺伝子に対する二本鎖分子、該分子を発現するベクター、またはこれを含む組成物に該細胞を接触させることによって阻害され得る。該細胞を、さらにトランスフェクション剤に接触させてもよい。好適なトランスフェクション剤は当技術分野で既知である。「細胞増殖の阻害」という語句は、該分子に曝露されていない細胞に比べて、細胞の増殖速度がより遅くなるか、または生存率が低減することを示す。細胞増殖は、例えばＭＴＴ細胞増殖アッセイを使用して、当技術分野で既知の方法によって測定されうる。
【０２１５】
ネクチン−４を発現または過剰発現している限り、いずれの種類の細胞の増殖も本発明に従って抑制され得る。例示的な細胞としては、肺癌細胞、特にＮＳＣＬＣが挙げられる。
【０２１６】
したがって、ネクチン−４に関連する疾患を患うまたはその発症リスクを有する患者は、少なくとも１つの本発明の二本鎖分子、少なくとも１つの該分子を発現する少なくとも１つのベクター、または少なくとも１つの該分子を含む少なくとも１つの組成物を投与することによって、治療され得る。例えば、肺癌患者は本方法に従って治療され得る。癌の種類は、診断されるべき特定の種類の腫瘍に従って、標準的な方法によって同定され得る。肺癌は、例えば肺癌マーカーとしてＣＥＡ、ＣＹＦＲＡなどを用いて、あるいは胸部Ｘ腺撮影および／または喀痰細胞診を用いて診断され得る。より好ましくは、本発明の方法によって治療される患者は、ＲＴ−ＰＣＲまたはイムノアッセイによって該患者由来の生検材料におけるネクチン−４の発現を検出することによって、選択される。好ましくは、本発明の治療の前に、当技術分野で既知の方法、例えば免疫組織化学解析またはＲＴ−ＰＣＲによって、対象由来の生検標本をネクチン−４遺伝子過剰発現に関して確認する。
【０２１７】
細胞増殖を阻害してそれにより癌を治療するための本方法によれば、複数種類の二本鎖分子（またはこれを発現するベクターまたはこれを含有する組成物）を投与する場合。
【０２１８】
細胞増殖を阻害するために、本発明の二本鎖分子を、該分子に対応するｍＲＮＡ転写産物との結合を達成するための形態で細胞内に直接導入してもよい。代替的に、上記のように、二本鎖分子をコードするＤＮＡを、ベクターとして細胞に導入してもよい。二本鎖分子およびベクターを細胞内に導入するために、ＦｕＧＥＮＥ（Roche diagnostics）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Invitrogen）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Invitrogen）およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（和光純薬工業株式会社）などのトランスフェクション増強剤を利用してもよい。
【０２１９】
ネクチン−４遺伝子発現の低減または対象における癌のサイズ、有病率もしくは転移能の低下などの臨床的利点がもたらされる場合、治療は「有効」であると見なされる。治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、癌の形成を遅らせる若しく妨害すること、または癌の臨床症状を予防もしくは緩和することを意味する。有効性（Efficaciousness）は、特定の腫瘍型を診断または治療するための任意の既知の方法に関連して決定される。
【０２２０】
本発明の二本鎖分子は、準化学量論的な量でネクチン−４  ｍＲＮＡを分解することが理解される。いずれかの理論に束縛されるわけではないが、本発明の二本鎖分子は、触媒的な様式で標的ｍＲＮＡの分解を引き起こすと考えられる。したがって、標準的な癌治療に比べて、治療効果を発揮するために癌部位またはその近くに送達されねばならない二本鎖分子は、有意に少ない。
【０２２１】
当業者は、対象の体重、年齢、性別、疾患の種類、症状および他の状態；投与経路；ならびに投与が局所的であるのか全身的であるのかなどの要素を考慮することにより、所定の対象に投与されるべき本発明の二本鎖分子の有効量を、容易に決定することができる。概して、本発明の二本鎖分子の有効量は、癌部位またはその近傍での細胞間濃度約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭである。より多いまたはより少ない量の二本鎖分子も投与可能であることが意図される。特定の状況に関して必要とされる正確な投与量は、当業者によって容易かつ規定通りに決定され得る。
【０２２２】
本発明の方法を用いて、ネクチン−４を発現している癌；例えば肺癌、特にＮＳＣＬＣの増殖または転移を阻害することができる。具体的には、ネクチン−４の標的配列（すなわちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０または１１）を含む二本鎖分子が、肺癌の治療のために特に好ましい。
【０２２３】
癌を治療するために、本発明の二本鎖分子を該二本鎖分子とは別の薬剤と組み合わせて対象に投与することもできる。代替的に、本発明の二本鎖分子を、癌を治療するために設計された別の治療法と組み合わせて対象に投与することができる。例えば、本発明の二本鎖分子は、癌の治療または癌転移の予防に現在利用されている治療法（例えば放射線療法、外科的手術、および化学療法剤を用いた治療）と組み合わせて投与することができる。
【０２２４】
本方法において、二本鎖分子を、送達試薬と組み合わせたネイキッド二本鎖分子として、または該二本鎖分子を発現する組換えプラスミドもしくはウイルスベクターとして、対象に投与することができる。
【０２２５】
本発明の二本鎖分子と組み合わせて投与するのに適した送達試薬としては、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えばポリリシン）またはリポソームが挙げられる。好ましい送達試薬はリポソームである。
【０２２６】
リポソームは、網膜または腫瘍組織などの特定の組織への二本鎖分子の送達に役立ち、かつまた該二本鎖分子の血中半減期も増大させ得る。本発明における使用に好適なリポソームは標準的な小胞形成脂質から形成され、これは一般に、中性のまたは負に帯電したリン脂質および、コレステロールなどのステロールを含む。一般に脂質の選択は、所望のリポソームのサイズおよび血流中におけるリポソームの半減期などの要素を考慮して導かれる。リポソームの調製に関しては、例えばSzoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467、および米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号（その開示全体が参照により本明細書に引用される）に記載されたような様々な方法が知られている。
【０２２７】
好ましくは、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、該リポソームを癌部位に送達することができるリガンド分子を含む。腫瘍または小胞内皮細胞に広まった受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍抗原または内皮細胞表面抗原と結合するモノクローナル抗体が、好ましい。
【０２２８】
特に好ましくは、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、例えばその構造の表面に結合したオプソニン化阻害部分を有することによって、単核マクロファージおよび網内系によるクリアランスを回避するように修飾される。１つの態様では、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分およびリガンドの両方を含み得る。
【０２２９】
本発明のリポソームを調製するのに用いるオプソニン化阻害部分は典型的に、リポソーム膜と結合する巨大な親水性ポリマーである。本明細書で使用されるように、オプソニン化阻害部分は、化学的にまたは物理的にリポソーム膜に付着すると、例えば脂質可溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、または膜脂質の活性基への直接結合によって、リポソーム膜と「結合」する。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、例えばその開示全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，９２０，０１６号に記載されるように、マクロファージ−単球系（「ＭＭＳ」）および網内系（「ＲＥＳ」）によるリポソームの取り込みを有意に低減する保護表面層を形成する。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは非修飾リポソームよりもずっと長く循環中に残存する。このため、そのようなリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることもある。
【０２３０】
ステルスリポソームは、多孔性または「漏出性（leaky）」の微小血管系が流れ込む組織内に蓄積することが知られている。したがって、そのような微小血管系欠損を特徴とする標的組織、例えば固形腫瘍では効率的にこれらのリポソームが蓄積する。Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53を参照されたい。さらに、ＲＥＳによる取り込みの低減は、肝臓および脾臓への有意な蓄積を妨害することによってステルスリポソームの毒性を低下させる。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾された本発明のリポソームは、本発明の二本鎖分子を腫瘍細胞に送達することができる。
【０２３１】
リポソームを修飾するのに適したオプソニン化阻害部分は、好ましくは分子量が約５００ダルトン〜約４００００ダルトン、より好ましくは約２０００ダルトン〜約２００００ダルトンの水溶性ポリマーである。そのようなポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えばメトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびステアリン酸ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＰＧ；ポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドンなどの、合成ポリマー；直鎖、分岐鎖またはデンドリマーのポリアミドアミン；ポリアクリル酸；多価アルコール、例えば、カルボン酸基またはアミノ基が化学結合したポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシドＧＭ１などのガングリオシドが挙げられる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧもしくはメトキシＰＰＧのコポリマー、またはそれらの誘導体も好適である。さらに、オプソニン化阻害ポリマーはまた、ＰＥＧと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであり得る。オプソニン化阻害ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン；アミノ化多糖またはオリゴ糖（直鎖または分岐鎖）；あるいは、たとえばカルボン酸基の連結が得られたカルボン酸の誘導体と反応させた、カルボキシル化多糖またはカルボキシル化オリゴ糖でもあり得る。好ましくは、オプソニン化阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれることもある。
【０２３２】
オプソニン化阻害部分は、多くの既知の技術のいずれか１つによってリポソーム膜と結合させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーと結合し、続いて膜と結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３および溶媒混合物、例えば比率３０：１２のテトラヒドロフランと水を用いる６０℃での還元アミノ化によって、ステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。
【０２３３】
本発明の二本鎖分子を発現するベクターが上記で述べられた。本発明の二本鎖分子を少なくとも１つ発現するそのようなベクターもまた、直接、または、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＬＴ１脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えばポリリシン）またはリポソームを含む好適な送達試薬と組み合わせて、投与することができる。本発明の二本鎖分子を発現する組換えウイルスベクターを患者の癌領域に送達する方法は当技術分野内である。
【０２３４】
本発明の二本鎖分子は、該二本鎖分子を癌部位に送達するのに適した任意の手段によって、対象に投与することができる。例えば二本鎖分子は、遺伝子銃、電気穿孔法、または他の好適な非経口投与経路もしくは腸内投与経路によって投与することができる。
【０２３５】
好適な腸内投与経路としては、経口送達、直腸送達、または鼻腔内送達が挙げられる。
【０２３６】
好適な非経口投与経路としては、静脈内投与（例えば静脈ボーラス注射、静脈注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および血管系へのカテーテル点滴注入）；組織周囲および組織内注射（例えば腫瘍組織周囲注射および腫瘍内注射）；皮下注入を含む皮下注射または皮下沈着（例えば浸透圧ポンプによる）；例えばカテーテルもしくは他の留置装置（placement device）（例えば、多孔質、非孔性またはゼラチン様の材料を含む、坐剤またはインプラント）による癌部位の領域またはその近傍への直接適用；ならびに吸入が挙げられる。二本鎖分子またはベクターの注射または注入は、癌部位またはその近傍で行われることが好ましい。
【０２３７】
本発明の二本鎖分子は、単回投与量または複数回投与量で投与することができる。本発明の二本鎖分子の投与が注入による場合、該注入は、単回の持続投与量であってもよく、または複数回の注入によって送達することもできる。組織内への薬剤の直接注射とは、好ましい癌部位またはその近傍である。癌部位またはその近傍の組織への薬剤の複数回注射が特に好ましい。
【０２３８】
当業者はまた、本発明の二本鎖分子を所定の対象に投与するための適当な投与レジメンを容易に決定することもできる。例えば二本鎖分子を、例えば癌部位またはその近傍での単回注射または沈着として、対象に一回で投与することができる。代替的に、二本鎖分子を、約３日〜約２８日、より好ましくは約７日〜約１０日の期間にわたり、１日１回または２回、対象に投与することができる。好ましい投与レジメンでは、二本鎖分子を７日間、１日１回、癌部位またはその近傍に注射する。投与レジメンに複数回投与が含まれる場合、対象に投与される二本鎖分子の有効量は、投与レジメン全体を通して投与される二本鎖分子の総量を含むことができることが理解される。
【０２３９】
本発明の二本鎖分子を含む組成物：
上記に加えて、本発明は、本発明の二本鎖分子または該分子をコードするベクターの少なくとも１つを含む医薬組成物も提供する。具体的には、本発明は以下の組成物［１］〜［２２］を提供する：
［１］  ネクチン−４の発現および細胞増殖を阻害する少なくとも１つの単離された二本鎖分子を含む、癌細胞の増殖を阻害するためまたは癌を治療するための組成物であって、該癌細胞および該癌がネクチン−４遺伝子を発現し、該分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖からなり、該センス鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に相当するオリゴヌクレオチドまたはその断片を含む、組成物。
［２］  前記二本鎖分子、前記センス鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および１１の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、［１］記載の組成物。
［３］  治療される前記癌が肺癌である、［１］記載の方法；
［４］  前記肺癌がＮＳＣＬＣである、［３］記載の方法；
［５］  複数種類の二本鎖分子を含む、［１］記載の組成物；
［６］  前記二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［２］記載の組成物；
［７］  前記二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［６］記載の組成物；
［８］  前記二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［７］記載の組成物；
［９］  前記二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［８］記載の組成物；
［１０］  前記二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［９］記載の組成物；
［１１］  前記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結された前記センス鎖および前記アンチセンス鎖を含む単一ポリヌクレオチドからなる、［１］記載の組成物；
［１２］  前記二本鎖分子が一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有し、［Ａ］はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および１１の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖配列であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［１１］記載の組成物；
［１３］  前記二本鎖分子がＲＮＡである、［１］記載の組成物；
［１４］  前記二本鎖分子がＤＮＡおよび／またはＲＮＡである、［１］記載の組成物；
［１５］  前記二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、［１４］記載の組成物；
［１６］  前記センス鎖ポリヌクレオチドおよびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドがそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡからなる、［１５］記載の組成物；
［１７］  前記二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡのキメラである、［１４］記載の組成物；
［１８］  前記アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５’末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡからなる、［１７］記載の組成物；
［１９］  前記隣接領域が９〜１３個のヌクレオチドからなる、［１８］記載の組成物；
［２０］  前記二本鎖分子が３’オーバーハングを含む、［１］記載の組成物；
［２１］  癌細胞の増殖を阻害するためまたは癌を治療するための組成物であって、該癌細胞および該癌がネクチン−４遺伝子を発現し、該組成物が、［１］に記載されかつ該組成物中に含まれる二本鎖分子をコードする少なくとも１つの単離されたベクターを含む、組成物；ならびに
［２２］  トランスフェクション増強剤および薬学的に許容される担体を含む、［１］および［２１］記載の組成物。
【０２４０】
本発明の組成物を、癌細胞浸潤を阻害するために適用してもよい。好ましくは、本発明の組成物は肺癌、膀胱癌、および子宮頸癌、より好ましくは肺癌、さらにより好ましくはＮＳＣＬＣに適用可能である。
【０２４１】
本発明の適切な組成物を、以下でさらに詳細に説明する。
【０２４２】
本発明の二本鎖分子は、当技術分野で既知の技術に従って、対象に投与する前に医薬組成物として製剤化することが好ましい。本発明の医薬組成物は、少なくとも無菌であり且つパイロジェンフリーであることを特徴とする。本明細書で使用される「医薬組成物」とは、ヒトおよび獣医学的用途のための組成物を含む。本発明の医薬組成物を調製する方法は、例えばその開示全体が参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)に記載のように、当技術分野の技術の範囲内である。
【０２４３】
本発明の医薬組成物は、生理学的に許容可能な担体媒体と混合した、本発明の二本鎖分子またはこれをコードするベクターの少なくとも１つ（例えば０．１重量％〜９０重量％）、または該分子の生理学的に許容可能な塩を含む。好ましい生理学的に許容可能な担体媒体は例えば、水、緩衝水、生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等である。
【０２４４】
本発明によれば、本組成物は複数種類の二本鎖分子を含有してもよく、該分子のそれぞれが、ネクチン−４に指向性を有し得る。
【０２４５】
さらに本発明の組成物は、１つまたは複数の二本鎖分子をコードするベクターを含有してもよい。例えば該ベクターは、１種類、２種類または複数種類の二本鎖分子をコードしてもよい。代替的に本発明の組成物は、複数種類のベクターを含有してもよく、該ベクターのそれぞれが別々の二本鎖分子をコードする。
【０２４６】
その上、本発明の二本鎖分子は、本発明の組成物中にリポソームとして含有され得る。リポソームの詳細は上述のとおりである。
【０２４７】
本発明の医薬組成物はまた、従来の医薬賦形剤および／または添加剤も含み得る。好適な医薬賦形剤としては、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝液およびｐＨ調整剤が挙げられる。好適な添加剤としては、生理学的に生体適合性がある緩衝液（例えば塩酸トロメタミン）、（例えばＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアミドなどの）キレート剤（chelant）の添加またはカルシウムキレート錯体（例えばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）、あるいは任意でカルシウム塩またはナトリウム塩の添加（例えば塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムまたは乳酸カルシウム）が挙げられる。本発明の医薬組成物は、液体形態での使用のために包装されていても、または凍結乾燥されていてもよい。
【０２４８】
固体組成物については、従来の非毒性固体担体、例えば医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を使用することができる。
【０２４９】
例えば、経口投与用の固体医薬組成物は、上記で列挙された任意の担体および賦形剤と、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の１つまたは複数の本発明の二本鎖分子とを含むことができる。エアロゾル（吸入）投与のための医薬組成物は、上記のようにリポソーム内に封入された、０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％の１つまたは複数の本発明の二本鎖分子と、噴霧剤とを含むことができる。所望に応じて、担体、例えば鼻内送達用のレシチンを含むことができる。
【０２５０】
上記に加えて、本発明の組成物は、本発明の二本鎖分子のインビボ機能を阻害しない限り、他の薬学的に活性な成分を含有してもよい。例えば本組成物は、癌を治療するのに従来使用される化学療法剤を含有してもよい。
【０２５１】
別の態様において、本発明は、ネクチン−４の発現に特徴づけられる肺癌を治療するための医薬組成物の製造における、本発明の二本鎖核酸分子の使用も提供する。例えば本発明は、ネクチン−４を発現する肺癌の治療用の医薬組成物を製造するための、細胞内のネクチン−４の中から選択される遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子の使用に関し、ここで該分子は、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および１１の中から選択される配列を標的とする。
【０２５２】
代替的に本発明は、ネクチン−４の発現に特徴づけられる肺癌の治療用の医薬組成物を製造するための方法またはプロセスをさらに提供し、ここで該方法またはプロセスは、有効成分としての、ネクチン−４を過剰発現する細胞内で該遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子と共に薬学的または生理学的に許容可能な担体を製剤化する段階を含み、該分子は、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および１１の中から選択される配列を標的とする。
【０２５３】
別の態様において、本発明はまた、ネクチン−４の発現に特徴づけられる肺癌の治療用の医薬組成物を製造するための方法またはプロセスを提供し、ここで該方法またはプロセスは、有効成分と薬学的または生理学的に許容可能な担体とを混和させる段階を含み、該有効成分は、ネクチン−４を過剰発現する細胞内で該遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子であり、該分子は、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および１１の中から選択される配列を標的とする。
【０２５４】
抗肺癌化合物のスクリーニング：
本発明の文脈において、本スクリーニング法により同定される薬剤は任意の化合物であってもよく、複数の化合物を含む組成物であってもよい。さらに、本発明のスクリーニング法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験薬剤は、単一の化合物であってもよく、化合物の組み合わせであってもよい。本方法において化合物の組み合わせを使用する場合、該化合物を連続的にまたは同時に接触させることができる。
【０２５５】
本発明のスクリーニング法によってスクリーニングされる化合物は、癌の治療および／または予防、癌細胞増殖および／または癌細胞浸潤の阻害に適した候補化合物でありうる。本発明において、癌はネクチン−４過剰発現と関連している。したがって、スクリーニングされた化合物は、好ましくはネクチン−４過剰発現と相関または関連する癌に適用されうる。好ましい態様において、ネクチン−４過剰発現と相関または関連する癌は、肺癌、膀胱癌、および子宮頸癌であり、より好ましくは肺癌、さらにより好ましくはＮＳＣＬＣである。
【０２５６】
本発明のスクリーニング法においては、任意の試験薬剤、例えば細胞抽出物、細胞培養物上清、発酵微生物の生成物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物（核酸構築物、例えばアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、およびアプタマー等、あるいは抗体を含む）、および天然化合物を使用することができる。本発明の試験薬剤はまた、（１）生物学的ライブラリ法、（２）空間的にアドレス可能なパラレル固相ライブラリ法または溶液相ライブラリ法、（３）デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法、（４）「一ビーズ一化合物」ライブラリ法、および（５）アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法を含む、当技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリ法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることもできる。アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、他の４つのアプローチは化合物のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、または低分子ライブラリにも適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67）。分子ライブラリを合成する方法の例は、当技術分野において見つけることができる（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13、Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6、Zuckermann et al., J Med Chem 37: 2678-85, 1994、Cho et al., Science 1993, 261: 1303-5、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061、Gallop et al., J Med Chem 1994, 37: 1233-51）。化合物のライブラリは、溶液中（Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21を参照されたい）、または、ビーズ（Lam, Nature 1991, 354: 82-4）、チップ（Fodor, Nature 1993, 364: 555-6）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号、同第５，４０３，４８４号、および同第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9）、もしくはファージ（Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90、Devlin, Science 1990, 249: 404-6、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10、米国特許出願第２００２１０３３６０号）の表面に提供され得る。
【０２５７】
本スクリーニング法のいずれかによってスクリーニングされた化合物の構造の一部が付加、欠失、および／または置換により変換された化合物は、本発明のスクリーニング法により得られる薬剤に含まれる。
【０２５８】
さらに、スクリーニングした試験薬剤がタンパク質である場合、該タンパク質をコードするＤＮＡを得るために、該タンパク質の全アミノ酸配列を決定して該タンパク質をコードする核酸配列を推定してもよく、または得られた該タンパク質の部分アミノ酸配列を分析し、該配列に基づいてオリゴＤＮＡをプローブとして調製し、該プローブを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、該タンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡは、癌を治療または予防するための候補である試験薬剤の調製において、その有用性が確認される。
【０２５９】
本明細書中に記載されるスクリーニングにおいて有用な試験薬剤とは、ネクチン−４タンパク質または元のタンパク質の生物学的活性が欠如したその部分ペプチドにインビボで特異的に結合する、抗体でもあり得る。
【０２６０】
試験薬剤ライブラリの構築は当技術分野で周知であるが、以下本明細書において、本発明のスクリーニング法に関する試験薬剤の同定およびそのような薬剤のライブラリの構築についてのさらなるガイダンスを提供する。
【０２６１】
（ｉ）分子モデリング：
試験薬剤ライブラリの構築は、求められる特性を有することが既知である化合物の分子構造、および／または、阻害すべき標的分子すなわちネクチン−４タンパク質の分子構造を知ることでより容易になる。さらなる評価に適した試験薬剤を予備スクリーニングするための1つのアプローチは、試験薬剤とネクチン−４タンパク質との間の相互作用のコンピュータモデリングである。
【０２６２】
コンピュータモデリング技術により、選択した分子の三次元原子構造の可視化、および該分子と相互作用すると考えられる新たな化合物の合理的設計が可能になる。三次元の構築は典型的に、選択した分子のＸ線結晶解析またはＮＭＲイメージングのデータに依存する。分子ダイナミクスは力場データを必要とする。コンピュータグラフィックシステムによって、新たな化合物が標的分子にどのように結合するかを予測することが可能になり、該化合物および該標的分子の構造の実験的操作が結合特異度を改善できるようになる。軽微な変化を一方または両方に加えた場合に、分子−化合物間の相互作用がどうなるのかを予測するには、通常は分子設計プログラムと使用者との間にユーザーフレンドリーなメニュー形式のインターフェースを備えた、分子力学ソフトウェアおよび計算集約型（computationally intensive）コンピュータが必要である。
【０２６３】
上記に概説される分子モデリングシステムの例には、ＣＨＡＲＭｍプログラムおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Polygen Corporation，Waltham，Mass）が含まれる。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子ダイナミクスの機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフィックモデリング、および分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡにより、互いに対する分子のインタラクティブな構築、修飾、可視化、および挙動分析が可能になる。
【０２６４】
多数の論文、例えばRotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66、Ripka, New Scientist 1988, 54-8、McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22、Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93、Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62、および核酸成分のモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90で、特異的タンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングが概説されている。
【０２６５】
化学物質をスクリーニングおよび図式化する他のコンピュータプログラムは、BioDesign, Inc.（Pasadena，Calif.）、Allelix, Inc（Mississauga，Ontario，Canada）、およびHypercube, Inc.（Cambridge，Ontario）等の企業から市販されている。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9、Meng et al., J Computer Chem 1992, 13: 505-24、Meng et al., Proteins 1993, 17: 266-78、Shoichet et al., Science 1993, 259: 1445-50を参照されたい。
【０２６６】
推定インヒビターが同定されたら、後述のように、コンビナトリアル化学技術を用いて、同定された推定インヒビターの化学的構造に基づいて任意の数の変異体を構築することができる。得られた推定インヒビターまたは「試験薬剤」のライブラリを、本方法を用いてスクリーニングし、肺癌を治療または予防する試験薬剤を同定してもよい。
【０２６７】
（ｉｉ）コンビナトリアル化学合成：
試験薬剤のコンビナトリアルライブラリは、既知のインヒビター中に存在するコア構造の知識を含む合理的薬物設計プログラムの一部として作成してもよい。このアプローチにより、適当なサイズにライブラリを維持することが可能になり、これによってハイスループットスクリーニングが容易になる。代替的に、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を単に合成することにより、単純な、特に短い重合体分子ライブラリを構築してもよい。この後者のアプローチの一例は、全ペプチドが６アミノ酸長のライブラリである。そのようなペプチドライブラリは６アミノ酸ごとの配列順列を含み得る。このタイプのライブラリは、線形コンビナトリアル化学ライブラリと称される。
【０２６８】
コンビナトリアル化学ライブラリの調製は当業者に周知であり、化学合成または生物学的合成のいずれによって作成してもよい。コンビナトリアル化学ライブラリとしては、ペプチドライブラリ（例えば米国特許第５，０１０，１７５号、Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93、Houghten et al., Nature 1991, 354: 84-6を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。化学的多様性ライブラリを作成するための他の化学を使用することもできる。そのような化学としては、ペプチド（例えば国際公開公報第９１／１９７３５号）、コード化ペプチド（例えば国際公開公報第９３／２０２４２号）、ランダムバイオオリゴマー（random bio-oligomer）（例えば国際公開公報第９２／０００９１号）、ベンゾジアゼピン（例えば米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチド等のダイバーソマー（diversomer）（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13）、ビニローグ（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568）、グルコース骨格を有する非ペプチド性（nonpeptidal）ペプチド模倣体（Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8）、低分子化合物ライブラリの類似有機合成（Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661）、オリゴカルバメート（oligocarbamate）（Cho et al., Science 1993, 261: 1303）、および／またはペプチジルホスホネート（peptidylphosphonate）（Campbell et al., J Org Chem 1994, 59: 658）、核酸ライブラリ（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照されたい）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば米国特許第５，５３９，０８３号を参照されたい）、抗体ライブラリ（例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14(3): 309-14、および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７号を参照されたい）、糖質ライブラリ（例えば、Liang et al., Science 1996, 274: 1520-22、米国特許第５，５９３，８５３号を参照されたい）、ならびに有機低分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン（Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6(6): 624-31.）、イソプレノイド（米国特許第５，５６９，５８８号）、チアゾリジノンおよびメタチアゾノン（metathiazanone）（米国特許第５，５４９，９７４号）、ピロリジン（米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号）、モルホリノ化合物（米国特許第５，５０６，３３７号）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）等を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６９】
（ｉｉｉ）ファージディスプレイ：
別のアプローチは、ライブラリを作成するために組換えバクテリオファージを使用する。この「ファージ法」（Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6）を用いて、非常に大きなライブラリを構築することができる（例えば１０６個〜１０８個の化学物質）。第２のアプローチは、主として化学的な方法を使用するが、Geysenの方法（Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15、Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74）、およびFodor et al.の方法（Science 1991, 251: 767-73）がその例である。Furka et al.（14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93）、Houghten（米国特許第４，６３１，２１１号）、およびRutter et al.（米国特許第５，０１０，１７５号）は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験可能なペプチドの混合物を生成する方法を記載している。
【０２７０】
コンビナトリアルライブラリを調製するための装置は市販されている（例えば、３５７  ＭＰＳ、３９０  ＭＰＳ（Advanced Chem Tech，Louisville KY）、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Rainin，Woburn，MA）、４３３Ａ（Applied Biosystems，Foster City，CA）、９０５０  Ｐｌｕｓ（Millipore，Bedford，MA）を参照されたい）。また、多数のコンビナトリアルライブラリ自体も市販されている（例えば、ComGenex（Princeton，N.J.）、Tripos, Inc.（St. Louis，MO）、3D Pharmaceuticals（Exton，PA）、Martek Biosciences（Columbia，MD）等を参照されたい）。
【０２７１】
ネクチン−４結合化合物のスクリーニング：
本発明において、正常器官では発現しないにもかかわらず、肺癌ではネクチン−４の過剰発現が検出された（図１および２Ａ）。したがって本発明は、ネクチン−４遺伝子、該遺伝子によりコードされるタンパク質を用いて、ネクチン−４に結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。癌におけるネクチン−４の発現により、ネクチン−４に結合する化合物は癌細胞の増殖を抑制し、かつしたがって癌を治療または予防するために有用であると予測される。したがって本発明はまた、ネクチン−４ポリペプチドを用いて、癌細胞の増殖を抑制する候補化合物をスクリーニングする方法、および癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法も提供する。具体的には、このスクリーニング法の１つの態様は以下の段階を含む：
（ａ）  試験化合物を、ネクチン−４のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）  該ポリペプチドと該試験化合物との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）  該ポリペプチドに結合する試験化合物を選択する段階。
【０２７２】
本発明の文脈において、治療効果は、試験薬剤または化合物とネクチン−４タンパク質との結合レベルと相関し得る。例えば、試験薬剤または化合物がネクチン−４タンパク質に結合する場合には、該試験薬剤または化合物を、必要な治療効果を有する薬剤または化合物の候補として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物がネクチン−４タンパク質に結合しない場合には、該試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を有さない薬剤または化合物として同定することができる。
【０２７３】
本発明の方法を以下でより詳細に説明する。
【０２７４】
スクリーニングに使用されるネクチン−４ポリペプチドは、天然ポリペプチドまたはその部分ペプチドに由来する組換えポリペプチドまたはタンパク質であり得る。試験化合物と接触させるポリペプチドは例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
【０２７５】
例えば、ネクチン−４ポリペプチドを用いてネクチン−４ポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法として、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。そのようなスクリーニングは例えば、特に以下の様式の、免疫沈降法によって実施することができる。ネクチン−４ポリペプチドをコードする遺伝子を外来遺伝子のための発現ベクター、例えばｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳおよびｐＣＤ８に挿入することによって、該遺伝子を宿主（例えば、動物）細胞等において発現させる。
【０２７６】
発現に使用するプロモーターは、一般的に使用可能な任意のプロモーターであってよく、例えばＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson（ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141（1982））、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 91: 217-23（1990））、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 108: 193(1991)）、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704(1987)）、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466(1988)）、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9(1987)）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94(1982)）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946(1989)）、ＨＳＶ  ＴＫプロモーター等が挙げられる。
【０２７７】
外来遺伝子を発現させるために、任意の方法、例えば電気穿孔法（Chu et al., Nucleic Acids Res 15: 1311-26(1987)）、リン酸カルシウム法（Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52(1987)）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-17(1984)、Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1641-3(1984)）、リポフェクチン法（Derijard B., Cell 76: 1025-37(1994)、Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30(1993)、Rabindran et al., Science 259: 230-4(1993)）等に従って、宿主細胞への遺伝子の導入を実施することができる。
【０２７８】
ネクチン−４遺伝子によってコードされるポリペプチドを、特異性が明らかになっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を該ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に導入することによって、モノクローナル抗体のエピトープを含む融合タンパク質として発現させることができる。市販のエピトープ−抗体システムを用いることができる（Experimental Medicine 13: 85-90（1995））。その複数のクローニング部位を使用することによって、例えばβ−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等との融合タンパク質を発現することができるベクターが、市販されている。また、融合によってネクチン−４ポリペプチドの特性が変わらないように、数アミノ酸〜１２アミノ酸からなる小さなエピトープのみを導入することによって調製された、融合タンパク質も報告されている。ポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶタグ）、Ｅタグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）等のエピトープ、およびこれらを認識するモノクローナル抗体は、ネクチン−４ポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ−抗体システムとして使用することができる（Experimental Medicine 13: 85-90（1995））。
【０２７９】
免疫沈降において、適当な界面活性剤を使用して調製された細胞溶解物にこれらの抗体を加えることによって、免疫複合体が形成される。免疫複合体は、ネクチン−４ポリペプチドと、該ポリペプチドとの結合能を含むポリペプチドと、抗体とからなる。上記エピトープに対する抗体の使用に加えて、ネクチン−４ポリペプチドに対する抗体を使用して免疫沈降を実施することもできる。抗体がマウスＩｇＧ抗体である場合、例えばプロテインＡセファロースまたはプロテインＧセファロースによって免疫複合体を沈降させることができる。ネクチン−４遺伝子によってコードされるポリペプチドを、ＧＳＴなどのエピトープとの融合タンパク質として調製する場合、免疫複合体は、ネクチン−４ポリペプチドに対する抗体の使用と同じように、これらのエピトープと特異的に結合する物質、例えばグルタチオン−セファロース４Ｂを用いて形成することができる。
【０２８０】
免疫沈降は、例えば文献（Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York（1988））の方法に従ってまたは準じて実施することができる。
【０２８１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは免疫沈降タンパク質の解析に一般的に使用され、結合したタンパク質を、適当な濃度のゲルを用いて該タンパク質の分子量によって解析することができる。ネクチン−４ポリペプチドに結合したタンパク質は、クマシー染色または銀染色などの一般的な染色法では検出が困難であるため、放射性同位体、３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインを含有する培養培地中で細胞を培養する段階、細胞中のタンパク質を標識する段階、該タンパク質を検出する段階により、該タンパク質に対する検出感度を向上させることができる。タンパク質の分子量が明らかである場合、標的タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから直接精製することができ、その配列を決定することができる。
【０２８２】
ネクチン−４ポリペプチドを用いて該ポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法として、例えばウェスト−ウェスタンブロット解析（Skolnik et al., Cell 65: 83-90（1991））を使用することができる。具体的には、ファージベクター（例えばＺＡＰ）を用いて、ネクチン−４ポリペプチドと結合するタンパク質を発現していると予想される培養細胞からｃＤＮＡライブラリを調製する段階、ＬＢ−アガロース上で該タンパク質を発現させる段階、発現した該タンパク質をフィルター上に固定する段階、精製および標識したネクチン−４ポリペプチドを上記のフィルターと反応させる段階、ならびに、標識に従って、ネクチン−４ポリペプチドと結合するタンパク質を発現したプラークを検出することによって、ネクチン−４ポリペプチドと結合するタンパク質を得ることができる。本発明のポリペプチドは、ビオチンとアビジンとの結合を利用することによって、またはネクチン−４ポリペプチドと特異的に結合する抗体、またはネクチン−４ポリペプチドと融合したペプチドもしくはポリペプチド（例えばＧＳＴ）を利用することによって、標識してもよい。放射性同位体または蛍光色素等を使用する方法を使用してもよい。
【０２８３】
代替的に、本発明のスクリーニング方法の別の態様において、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用してもよい（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」（Clontech）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Stratagene）、「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612（1992）」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92（1994）」を参照されたい）。
【０２８４】
ツーハイブリッドシステムにおいて、本発明のポリペプチドを、ＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域に融合させ、酵母細胞内で発現させる。本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を発現することが予想される細胞から発現したらＶＰ１６またはＧＡＬ４の転写活性化領域と融合するように、ｃＤＮＡライブラリを調製する。次に、該ｃＤＮＡライブラリを上記の酵母細胞に導入し、検出された陽性クローン（本発明のポリペプチドと結合するタンパク質が酵母細胞で発現すると、両者の結合がレポーター遺伝子を活性化し、これにより陽性クローンが検出可能となる）から、該ライブラリに由来するｃＤＮＡを単離する。上記で単離されたｃＤＮＡを大腸菌に導入する段階および該タンパク質を発現させる段階によって、該ｃＤＮＡによってコードされたタンパク質を調製することができる。ＨＩＳ３遺伝子に加えて、レポーター遺伝子として、例えばＡｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を用いることができる。
【０２８５】
ネクチン−４遺伝子によってコードされるポリペプチドと結合する化合物を、アフィニティークロマトグラフィを用いてスクリーニングすることもできる。例えば、本発明のポリペプチドをアフィニティーカラムの担体上に固定化してもよく、本発明のポリペプチドと結合可能なタンパク質を含有する試験化合物を該カラムにアプライする。本明細書における試験化合物は例えば、細胞抽出物、細胞溶解物等であり得る。試験化合物をロードした後、カラムを洗浄し、本発明のポリペプチドと結合した化合物を調製することができる。試験化合物がタンパク質である場合、得られたタンパク質のアミノ酸配列を解析し、該配列に基づきオリゴＤＮＡを合成し、プローブとして該オリゴＤＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、該タンパク質をコードするＤＮＡを得る。
【０２８６】
表面プラズモン共鳴現象を用いるバイオセンサが、本発明における結合化合物を検出または定量するための手段として使用され得る。そのようなバイオセンサを使用する場合、本発明のポリペプチドと試験化合物との相互作用は、標識を用いることなく微量のポリペプチドだけを用いて、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Pharmacia）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅなどのバイオセンサを用いて、本発明のポリペプチドと試験化合物との結合を評価することが可能である。
【０２８７】
ネクチン−４タンパク質と結合するタンパク質だけでなく化学物質（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）も単離するための、固定化ネクチン−４ポリペプチドを合成化学物質、または天然物質バンクまたはランダムファージペプチド提示ライブラリに曝露した場合に結合する分子をスクリーニングする方法、および、コンビナトリアル化学技術に基づきハイスループットを用いてスクリーニングする方法（Wrighton et al., Science 273: 458-64（1996）、Verdine, Nature 384: 11-13（1996）、Hogan, Nature 384: 17-9(1996)）は、当業者に既知である。
【０２８８】
ネクチン−４の生物学的活性を抑制する化合物のスクリーニング：
本発明において、ネクチン−４タンパク質は肺癌細胞の細胞増殖（図４Ａ）、細胞浸潤活性（図４Ｂ）、細胞外分泌（図１Ｄ）、およびＲａｃ１活性化（図４Ｄ）を促進する活性を有する。本発明は、これらの生物学的活性を用いて、肺癌細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法、および肺癌を治療または予防する化合物をスクリーニングする方法を提供する。したがって本発明は、以下の段階を含む方法を提供する：
（ａ）  試験化合物を、ネクチン−４のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）  段階（ａ）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）  試験化合物の非存在下での生物学的活性と比較して、生物学的活性を抑制している試験化合物を選択する段階。
【０２８９】
本発明に従って、細胞増殖を促進する活性の抑制に対する試験化合物の治療効果、またはネクチン−４に関連する癌（例えば肺癌、膀胱癌、または子宮頚癌）を治療もしくは予防するための候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、以下の段階を含む、ネクチン−４ポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞増殖を抑制するための候補化合物、またはネクチン−４に関連する癌を治療もしくは予防するための候補化合物をスクリーニングする方法も提供する：
（ａ）  試験化合物を、ネクチン−４ポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる段階；
（ｂ）  段階（ａ）の該ポリペプチドまたは断片の生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）  （ｂ）の生物学的活性を試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
【０２９０】
本発明の文脈において、治療効果はネクチン−４ポリペプチドまたはその機能的断片の生物学的活性と相関し得る。例えば、試験薬剤または化合物が、該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ネクチン−４ポリペプチドまたはその機能的断片の生物学的活性を抑制または阻害する場合には、該試験薬剤または化合物を、治療効果を有する候補薬剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物が、該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ネクチン−４ポリペプチドまたはその機能的断片の生物学的活性を抑制も阻害もしない場合には、該試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を有さない薬剤または化合物として同定することができる。
【０２９１】
本発明の方法を以下でより詳細に記載する。
【０２９２】
ネクチン−４タンパク質の生物学的活性を含む限り、任意のポリペプチドをスクリーニングに用いることができる。そのような生物学的活性には、細胞増殖活性、細胞浸潤活性、細胞外分泌、およびＲａｃ１活性化が含まれる。例えば、ネクチン−４タンパク質を用いることができ、これらのタンパク質と機能的に同等なポリペプチドもまた用いることができる。そのようなポリペプチドは、細胞によって内因的または外因的に発現され得る。
【０２９３】
別の局面において、本発明はまた、ネクチンー４結合化合物のスクリーニングの項で記載された方法に続いて、
ａ）  試験薬剤をネクチン−４ポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；
ｂ）  該ポリペプチドまたは断片と該試験薬剤との間の結合を検出する段階；
ｃ）  該ポリペプチドに結合する試験薬剤を選択する段階；
ｄ）  段階ｃ）で選択された試験薬剤をネクチン−４ポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；
ｅ）  該ポリペプチドまたは断片の生物学的活性を、該薬剤の非存在下で検出された生物学的活性と比較する段階；および
ｆ）  該ポリペプチドの生物学的活性を抑制する薬剤を、肺癌を治療または予防するための候補薬剤として選択する段階
を含む、スクリーニング法を提供する。
【０２９４】
このスクリーニングにより単離された化合物は、ネクチン−４遺伝子によってコードされるポリペプチドのアンタゴニストの候補である。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによってその機能を阻害する分子を指す。該用語はまた、ネクチン−４をコードする遺伝子の発現を低下させるまたは阻害する分子を指す。さらに、このスクリーニングによって単離された化合物は、ネクチン−４ポリペプチドと分子（ＤＮＡおよびタンパク質を含む）とのインビボ相互作用を阻害する化合物の候補である。
【０２９５】
本発明の方法において検出されるべき生物学的活性が細胞増殖である場合には、例えば、ネクチン−４ポリペプチドを発現する細胞を調製し、該細胞を試験化合物の存在下で培養し、かつ、細胞増殖速度を決定すること、細胞周期等を測定することによって、および例えば図４Ａに示すコロニー形成活性を測定することによって、検出が可能である。ネクチン−４ポリペプチドを発現した細胞の増殖速度を、化合物で処理していない細胞と比べて低下させ、かつ、該ポリペプチドをほとんどまたは全く発現していない細胞と比べて該速度を維持している該化合物を、肺癌を治療または予防するための候補化合物として選択する。
【０２９６】
本発明の方法において検出すべき生物学的活性が細胞浸潤活性である場合には、例えば、ネクチン−４ポリペプチドを発現する細胞を調製し、例えば図４Ｂに示すマトリゲル浸潤アッセイを用いて測定して浸潤細胞の量を決定することによって、これを検出することができる。ネクチン−４ポリペプチドを発現した浸潤細胞の量を、化合物で処理していない細胞のそれと比べて減少させる化合物、および、ネクチン−４ポリペプチドをほとんどまたは全く発現しない細胞と比べてその量を維持している化合物を、肺癌を治療または予防するための候補化合物として選択する。
【０２９７】
本発明の方法において検出すべき生物学的活性が細胞外分泌である場合には、例えば、ネクチン−４ポリペプチドを発現する細胞を調製し、該細胞を試験化合物の存在下で培養し、かつ、例えば図１Ｄに示すＥＬＩＳＡを用いて測定して、培養培地中のこれらのポリペプチドの分泌タンパク質の量を決定することによって、これを検出することができる。ネクチン−４ポリペプチドを発現した細胞からの分泌タンパク質の量を、化合物で処理していない細胞またはネクチン−４のそれと比べて減少させる化合物、および、ネクチン−４ポリペプチドをほとんどまたは全く発現しない細胞と比べてその量を維持している化合物を、肺癌を治療または予防するための候補化合物として選択する。
【０２９８】
本発明の方法において検出すべき生物学的活性がＲａｃ１活性化である場合には、例えば、ネクチン−４ポリペプチドを発現する細胞または細胞溶解物を調製し、例えば図４Ｄに示すウエスタンブロットを用いて測定して、Ｒａｃ１活性化のレベルを決定することによって、これを検出することができる。「Ｒａｃ１活性化」という用語は、ＧＴＰ結合型のＲａｃ１の増加を意味する。ネクチン−４ポリペプチドを発現した細胞におけるＲａｃ１活性化のレベルを、化合物で処理していない細胞のそれと比べて低下させる化合物、および、ネクチン−４ポリペプチドをほとんどまたは全く発現しない細胞と比較してその量を維持している化合物を、肺癌を治療または予防するための候補化合物として選択する。
【０２９９】
例えば、Ｒａｃ１は肺癌細胞においてネクチン−４と共発現すること、およびグアニル酸シクラーゼの生理的基質である可能性が高いことが確認され、これにより、ネクチン−４はＲａｃ１の活性化を介して肺癌細胞において細胞遊走機能を有し得ることが示唆された（図４Ｄ）。したがって、ネクチン−４機能の阻害を介してＲａｃ１の活性化を阻害する化合物は、肺癌細胞の増殖を抑制することが予測され、よってこれは肺癌、特にＮＳＣＬＣを治療または予防するのに有用である。したがって本発明はまた、肺癌細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングするための方法、および肺癌、特にＮＳＣＬＣを治療または予防するための化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
【０３００】
より具体的には、本方法は、
（ａ）  候補化合物を、ネクチン−４を過剰発現する細胞溶解物または細胞と接触させる段階；
（ｂ）  活性化型のＲａｃ１を測定する段階；および
（ｃ）  対照と比較して活性化型のＲａｃ１を減少させる候補化合物を選択する段階
を含む。
【０３０１】
好ましくは、Ｒａｃ１の活性化は、Ｒａｃ１の活性化を認識する抗体を用いる免疫学的技法によって評価することもできる。例えば、ＧＴＰ結合型のＲａｃ１を認識する抗体をそのような目的のために用いることができる。好ましい態様において、比較すべき対照レベルは、試験条件（候補化合物の存在下）と同じ条件の下で、候補化合物の非存在下で検出されたＲａｃ１の活性化レベルであってよい。
【０３０２】
本発明において、所与のタンパク質と機能的に同等なポリペプチドを調製するための方法は当業者に周知であり、これには、タンパク質中に変異を導入する公知の方法が含まれる。一般的に、タンパク質中の１つまたは複数のアミノ酸の改変は、該タンパク質の機能に影響しないことが知られている（Mark DF et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6;Zoller MJ & Smith M, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500;Wang A et al., Science 1984, 224:1431-3;Dalbadie-McFarland G et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13）。実際のところ、変異タンパク質または改変タンパク質、すなわち特定のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加によって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、元の生物学的活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984);Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982);Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)）。したがって当業者は、単一アミノ酸もしくはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、もしくは置換、または、タンパク質の変化により類似の機能を有するタンパク質が生じる「保存的改変」とみなされるものが、本発明の文脈において意図されていることを認識するであろう。
【０３０３】
本明細書において定義される「生物学的活性を抑制する」とは、化合物の非存在下と比較した、ネクチン−４の生物学的活性の好ましくは少なくとも１０％の抑制、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の抑制、および最も好ましくは９０％の抑制である。
【０３０４】
ネクチン−４の発現を改変する化合物のスクリーニング：
本発明において、ｓｉＲＮＡによるネクチン−４の発現の低下は癌細胞増殖の阻害をもたらす（図４Ａ）。したがって本発明は、ネクチン−４の発現を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。ネクチン−４の発現を阻害する化合物は、肺癌細胞の増殖を抑制すると予測され、よって肺癌の治療または予防に有用である。したがって本発明はまた、肺癌細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングするための方法、および肺癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法も提供する。本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば以下の段階を含み得る：
（ａ）  ネクチン−４を発現している細胞と候補化合物を接触させる段階；および
（ｂ）  対照と比較して、ネクチン−４の発現レベルを低下させる候補化合物を選択する段階。
【０３０５】
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験薬剤もしくは化合物の治療効果、またはネクチン−４関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、癌細胞の増殖を抑制する候補薬剤または化合物をスクリーニングする方法、およびネクチン−４関連疾患を治療または予防するための候補薬剤または化合物をスクリーニングする方法も提供する。
【０３０６】
本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば以下の段階を含み得る：
ａ）  試験薬剤または化合物を、ネクチン−４遺伝子を発現している細胞と接触させる段階；
ｂ）  ネクチン−４遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
ｃ）  ｂ）の発現レベルを試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
【０３０７】
本発明において、治療効果はネクチン−４遺伝子の発現レベルと相関し得る。例えば、試験薬剤または化合物が、該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ネクチン−４遺伝子の発現レベルを低下させる場合には、該試験薬剤または化合物を、治療効果を有する候補薬剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物が、該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ネクチン−４遺伝子の発現レベルを低下させない場合には、該試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を有さない薬剤または化合物として同定することができる。
【０３０８】
本発明の方法を以下でより詳細に記載する。
【０３０９】
ネクチン−４を発現する細胞には、例えば肺癌から樹立された細胞株が含まれる；そのような細胞株を、本発明の上記スクリーニングに用いることができる（例えば、PC9、NCI-H1666、NCI-H358、およびNCI-H2170）。発現レベルは、当業者に周知の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫染色、およびフローサイトメトリー解析によって推定することができる。本明細書において定義される「発現レベルを低下させる」とは、化合物の非存在下における発現レベルと比較した、ネクチン−４の発現レベルの好ましくは少なくとも１０％の低下、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％のレベル低下、および最も好ましくは９５％のレベル低下である。本明細書の化合物には化学物質、二本鎖ヌクレオチド等が含まれる。二本鎖ヌクレオチドの調製は、上記で記載されている。スクリーニング法においては、ネクチン−４の発現レベルを低下させる化合物を、肺癌の治療または予防に用いられる候補化合物として選択することができる。
【０３１０】
あるいは、本発明のスクリーニング法は以下の段階を含み得る：
（ａ）  候補化合物を、ネクチン−４の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とを含むベクターを導入した細胞と接触させる段階；
（ｂ）  該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階；および
（ｃ）  該レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる候補化合物を選択する段階。
【０３１１】
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験薬剤もしくは化合物の治療効果、またはネクチン−４関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、肺癌細胞の増殖を抑制する候補薬剤または化合物をスクリーニングする方法、およびネクチン−４関連疾患を治療または予防するための候補薬剤または化合物をスクリーニングする方法も提供する。
【０３１２】
本発明の文脈において、そのようなスクリーニングには、例えば以下の段階が含まれ得る：
ａ）  試験薬剤または化合物を、ネクチン−４遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とからなるベクターが導入された細胞と接触させる段階；
ｂ）  該レポーター遺伝子の発現または活性を検出する段階；ならびに
ｃ）  ｂ）の発現レベルを該試験薬剤または化合物の治療効果と関連付ける段階。
【０３１３】
本発明の文脈において、治療効果はレポーター遺伝子の発現または活性と相関し得る。例えば、試験薬剤または化合物が、該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる場合には、該試験薬剤または化合物を、治療効果を有する候補薬剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験薬剤または化合物が、該試験薬剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性を低下させない場合には、該試験薬剤または化合物を、有意な治療効果を有さない薬剤または化合物として同定することができる。
【０３１４】
適切なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野で周知である。例えば、レポーター遺伝子はルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、イソギンチャクモドキ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．）赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｌａｃＺ、およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）であり、宿主細胞はＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ等である。スクリーニングに必要なレポーターコンストラクトは、レポーター遺伝子配列をネクチン−４の転写調節領域に連結することにより調製することができる。本明細書におけるネクチン−４の転写調節領域とは、開始コドンから少なくとも５００  ｂｐ上流まで、好ましくは１０００  ｂｐまで、より好ましくは５０００または１００００  ｂｐ上流までの領域である。転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリーから単離することができ、またはＰＣＲによって増幅することができる。スクリーニングに必要なレポーターコンストラクトは、レポーター遺伝子配列をこれらの遺伝子のいずれか１つの転写調節領域に連結することにより調製することができる。転写調節領域を同定する方法と、同じくアッセイプロトコールも、周知である（Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。
【０３１５】
前記レポーターコンストラクトを含むベクターを宿主細胞に感染させ、該レポーター遺伝子の発現または活性を、当技術分野で周知の方法により（例えば、ルミノメーター、吸光分光計、フローサイトメーター等を用いて）検出する。本明細書において定義される「発現または活性を低下させる」とは、化合物非存在下と比較した、レポーター遺伝子の発現または活性の好ましくは少なくとも１０％の低下、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の低下、および最も好ましくは９５％の低下を指す。
【０３１６】
本発明の文脈において、癌を治療または予防する可能性を有する候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物の治療可能性は、癌の治療剤を同定するための二次スクリーニングおよび／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。例えば、ネクチン−４タンパク質に結合する化合物が癌の上記活性を阻害する場合には、そのような化合物はネクチン−４特異的治療効果を有すると結論づけることができる。
【０３１７】
本発明の局面を以下の実施例において記載するが、これらは添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０３１８】
特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本発明を実施または試験の際には、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を用いることができるが、適切な方法および材料を後述する。本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これらは添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０３１９】
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これらは添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【０３２０】
［実施例１］
一般的方法
細胞株および臨床組織試料
本研究で用いた２０種のヒト肺癌細胞株は以下の通りである：Ａ５４９、ＬＣ３１９、Ｈ１７８１、ＰＣ−３、ＰＣ−９、ＰＣ１４、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ１６６６、ＮＣＩ−Ｈ３５８、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＥＢＣ−１、ＬＵ６１、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ６４７、ＬＸ１、およびＳＢＣ−５。ヒト気管支上皮細胞であるＢＥＡＳ−２Ｂを、本研究で用いた一連の細胞に含めた。細胞はすべて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充した適切な培地中で単層で培養し、５％  ＣＯ２を含む加湿大気雰囲気下、３７℃で維持した。腫瘍切除術の前に抗癌治療を受けていなかった患者由来の原発性肺癌試料および切除端に隣接するそれらの対応する正常組織は、インフォームドコンセントを得て以前に入手していた（Kikuchi T, et al. Oncogene 2003;22:2192-205）。腫瘍標本の組織学的分類は、ＷＨＯ基準に基づいた（Travis WD, et al. World Health Organization International Histological Classification of Tumors, 3rd edn. Berlin: Springer, 1999）。腫瘍はすべて、ＵＩＣＣのｐＴＮＭ病理学的分類に基づいて病期分類した（国際対がん連合；表２（Sobin L, Wittekind Ch. TNM Classification of Malignant Tumours, 6th edition. New York: Wiley-Liss;2002)）。腺癌（ＡＤＣ）２６５例、扁平上皮癌（ＳＣＣ）１１６例、大細胞癌（ＬＣＣ）２８例、腺扁平上皮癌（ＡＳＣ）１３例を含む原発性ＮＳＣＬＣ計４２２例および隣接する正常肺組織のホルマリン固定試料は、埼玉県立がんセンター（埼玉、日本）において手術を受けた患者から、臨床病理学的データと共に先に入手していた。本研究およびすべての臨床材料の使用は、個々の施設内倫理委員会によって承認された。
【０３２１】
血清試料
対照としての健常ボランティア１３１名（男性８８名および女性４３名；年齢中央値（±１ＳＤ）５５．５歳±９．６、範囲３１〜８３歳；表６）から、および、日本のオーダーメイド医療実現化プロジェクト（ＢｉｏＢａｎｋ  Ｊａｐａｎ）の一部として登録されているかまたは広島大学およびその提携病院に入院している、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有する非腫瘍性肺疾患患者８６名（男性７６名および女性１０名；年齢中央値（±１ＳＤ）６６．４歳±５．６、範囲５４〜７３歳；表７）から、インフォームドコンセントを得て血清試料を入手した。これらのＣＯＰＤ患者は全員、現喫煙者および／または元喫煙者であった（パックイヤー指数（ＰＹＩ）の平均値［±１ＳＤ］は６６．７±４４．４であった；ＰＹＩは、１日に消費したタバコの箱数［２０本／１箱］に年数を乗算した数として定義された）。広島大学病院および神奈川県立がんセンターに入院しているＮＳＣＬＣ患者１６４名（ＡＤＣ  １２３例およびＳＣＣ  ４１例）（男性１２２名および女性４２名；年齢中央値（±１ＳＤ）６４．５歳±１０．４、範囲３０〜８５歳；表４）から、インフォームドコンセントを得て血清試料を入手した。血清ネクチン−４の予後値を調べるため、治療後の正確な経過観察記録を有する追加の２セットの血清試料もまた入手した；群１：早期ＮＳＣＬＣ患者（Ｉ期）９５名（男性４８名および女性４７名；年齢中央値（±１ＳＤ）６６．８歳±９．６、範囲３８〜８４歳）から、神奈川県立がんセンターにおける根治的外科切除術の前にインフォームコンセントを得て入手した血清試料；群２：広島大学病院に入院している、カルボプラチンおよびパクリタキセルの両方を用いた初回化学療法と同一のプロトコールで後に治療を受けた進行期ＮＳＣＬＣ患者（ＩＩＩＢ〜ＩＶ期）６２名（男性４６名および女性１６名；年齢中央値（±１ＳＤ）６１．７歳±１０．２、範囲３５〜７９歳）から、インフォームドコンセントを得て診断時に入手した血清試料。患者試料は、本研究のために以下の基準に基づいて選択した：（１）患者は新たに診断され、以前に治療を受けておらず、かつ（２）患者の腫瘍はＮＳＣＬＣ（Ｉ〜ＩＶ期）と病理学的に診断された。診断時点で血清を得て、−１５０℃で保存した。
【０３２２】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析
製造業者のプロトコールに従ってＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、培養細胞および臨床組織から全ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡおよび正常ヒト組織ポリＡ  ＲＮＡをＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で処理し、次にオリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）を用いて逆転写した。ネクチン−４遺伝子特異的合成プライマー（５’−ＧＴＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴＴＧＡＡＣＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）および５’−ＧＧＡＴＴＣＡＡＡＧＣＡＧＧＣＡＣＡＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４））、または内部対照としてのβ−アクチン（ＡＣＴＢ）特異的プライマー（５’−ＡＴＣＡＡＧＡＴＣＡＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）および５’−ＣＴＧＣＧＣＡＡＧＴＴＡＧＧＴＴＴＴＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６））を用いて、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。全てのＰＣＲ反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）における、９４℃２分間の最初の変性と、続いて、９４℃３０秒間、５４℃または６０℃で３０秒間、および７２℃６０秒間を２２サイクル（ＡＣＴＢの場合）または３５サイクル（ネクチン−４の場合）含んだ。β−アクチン（ＡＣＴＢ）発現レベルを定量的対照として考慮することにより、臨床肺癌試料のｍＲＮＡから調製した各一本鎖ｃＤＮＡの適切な希釈物を調製した。
【０３２３】
ノーザンブロット解析
ヒト多組織ブロット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ネクチン−４の３２Ｐ標識ＰＣＲ産物とハイブリダイズさせた。ネクチン−４のＰＣＲ産物は、プライマー５’−ＣＡＧＧＧＧＧＴＴＡＡＴＴＣＣＴＧＴＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）および５’−ＣＡＡＣＴＡＡＴＧＧＡＡＡＧＧＧＣＡＡＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を用いて、逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によりプローブとして調製した。供給業者の推奨に従って、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄を行った。増感スクリーンを用いて、−８０℃で７日間、ブロットのオートラジオグラフィーを行った。
【０３２４】
マウス抗ネクチン−４モノクローナル抗体の作製
可溶性組換えタンパク質（ネクチン−４細胞外ドメイン）２０μｇをマウスに連続して腹腔内注射した後に、標準法を用いて抗ネクチン−４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製した。内因性ネクチン−４を高レベルで発現するかまたはネクチン−４を発現しない肺癌細胞株を用いた、培養培地に関する免疫細胞化学、フローサイトメトリー、およびＥＬＩＳＡにより、ならびにネクチン−４発現ベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を用いた免疫沈降により、ネクチン−４に対する２種類のモノクローナル抗体（クローン１９−３３および６６−９７）が内因性ヒトネクチン−４に対して特異的であることが判明した。ＣＯＳ−７細胞において外因的に発現させたｍｙｃタグ付ネクチン−４タンパク質を、ネクチン−４に対する２種類のモノクローナル抗体（クローン１９−３３および６６−９７）のいずれかにより免疫沈降させ、抗ｍｙｃ抗体で免疫ブロットした。これらのモノクローナル抗体（クローン１９−３３および６６−９７）は、ｍｙｃタグ付ネクチン−４を過剰発現している細胞においてネクチン−４タンパク質を特異的に免疫沈降させることができたが、モック形質転換細胞では免疫沈降できず、このことは、これらの抗体が天然ネクチン−４を特異的に認識する能力を有することを示唆するものである。
【０３２５】
フローサイトメトリー
２×１０５個の細胞を、２．５μｇ／ｍｌのマウス抗ネクチン−４  ｍＡｂ（組換えネクチン−４に対して作製された；上記を参照されたい）または対照マウスＩｇＧ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）と共に４℃で３０分間インキュベーションし、洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８結合抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共に４℃で３０分間インキュベーションすることによって明らかにした。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）で解析し、ＭｏｄＦｉｔソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈｏｕｓｅ，  Ｉｎｃ．）によって解析した。
【０３２６】
免疫細胞化学的解析
培養細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液中で１０分間室温で固定したあと、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ（−）で２分間、透過性を付与した。一次抗体反応の前に、非特異的抗体結合をブロッキングするため、細胞をＣＡＳ  Ｂｌｏｃｋで７分間覆った。細胞を、内因性ネクチン−４を検出するための１０μｇ／ｍｌのマウス抗ネクチン−４  ｍＡｂ（組換えネクチン−４に対して作製された）、またはｍｙｃタグ付ネクチン−４に対する２μｇ／ｍｌのマウス抗ｍｙｃ  ｍＡｂ（９Ｅ１０；ＳａｎｔａＣｒｕｚ）と共にインキュベーションした後、ネクチン−４を明らかにするためにＡｌｅｘａ４８８結合ヤギ抗マウス二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を添加した。核を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。二次抗体とのインキュベーション後に、Ｆ−アクチンフィラメントを可視化するためにＡｌｅｘａ５９４結合ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を添加した。染色した細胞を、レーザー共焦点顕微鏡（ＴＳＣ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ；Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で観察した。
【０３２７】
免疫組織化学および組織マイクロアレイ
他所に記載された通りに（Chin SF, et al. Mol Pathol 2003; 56: 275-9, Callagy G, et al. Diagn Mol Pathol 2003; 12: 27-34, Callagy G, et al. J Pathol 2005;205:388-96）、ホルマリン固定した原発性ＮＳＣＬＣ４２２例を用いて腫瘍組織マイクロアレイを構築した。簡潔に説明すると、スライド上の対応するＨＥ染色切片を用いた視覚的位置合わせに基づいて、試料採取用の組織領域を選択した。ドナー腫瘍ブロックから採取された３つ、４つ、または５つの組織コア（直径０．６  ｍｍ；高さ３〜４  ｍｍ）を、組織マイクロアレイヤー（Ｂｅｅｃｈｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、レシピエントのパラフィンブロック中に配置した。各症例から正常組織のコアを打ち抜き、得られたマイクロアレイブロックの５μｍ切片を免疫組織化学的解析に使用した。
【０３２８】
パラフィンブロック内に包埋した臨床肺癌試料中のネクチン−４タンパク質の状態を調べるため、該切片を以下の様式で染色した。簡潔に説明すると、内在性ペルオキシダーゼおよびタンパク質のブロッキング後、１６．２５μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトネクチン−４抗体（組換えネクチン−４に対して作製された）を添加した。二次抗体としてのＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧと共に切片をインキュベーションした。基質−色原体を添加し、標本をヘマトキシリンで対比染色した。各腫瘍組織コア内の染色強度は大部分が均一であったため、ネクチン−４染色強度は、臨床病理学的データの事前知識を持たない３名の独立した研究者により、以下の基準を用いて半定量的に評価した：強陽性（スコア２＋）、細胞膜および細胞質を完全に不明瞭化する５０％超の腫瘍細胞における暗褐色染色；弱陽性（１＋）、腫瘍細胞の細胞膜および細胞質中で認識可能である任意のより低度の褐色染色；なし（スコア０）、腫瘍細胞中の染色は認識不可能。３名全ての評価者が独立に強陽性と分類した場合にのみ、当該症例を強陽性と規定した。
【０３２９】
統計学的解析
分割表を用いて、組織または血清におけるネクチン−４発現レベルとＮＳＣＬＣ患者の臨床病理学的変数の関係を解析した。手術日または診断日から死亡時点までの、または最後の経過観察時点までの、生存曲線を算出した。各関連変数に関して、および肺癌におけるネクチン−４発現または血清ネクチン−４レベルに関して、カプラン・マイヤー曲線を算出し；ログランク検定を用いて、患者サブグループ間の生存期間の差を解析した。Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルを用いて単変量解析および多変量解析を行い、臨床病理学的変数と癌関連死亡率との関連性を判定した。最初に、死亡と、年齢、性別、組織型、ｐＴ分類、およびｐＮ分類を含む、可能性のある予後因子との関連性を、一度に１因子を考慮して解析した。次に、多変量Ｃｏｘ解析を、Ｐ値０．０５未満の開始レベルを満たした任意の全ての変数と共に、常にネクチン−４発現を強制的にモデルに当てはめる逆方向の（段階的な）手法に適用した。モデルが因子を付加し続ける限り、独立因子はＰ＜０．０５の終了レベルを超えなかった。
【０３３０】
ＥＬＩＳＡにおいて、腫瘍群と健常対照との間のネクチン−４、ＣＥＡ、およびＣＹＦＲＡ２１−１の血清レベルの差を、マンホイットニーのＵ検定により解析した。
【０３３１】
ＥＬＩＳＡ
ネクチン−４の血清レベルは、マウス抗ヒトネクチン−４抗体（組換えネクチン−４に対して作製された；上記を参照されたい）を用いて独自に開発されたサンドイッチ型ＥＬＩＳＡにより測定した。簡潔に説明すると、血清中のネクチン−４を検出するため、９６ウェルフレキシブルマイクロタイタープレート（４３９４５４；ＮＡＬＧＥ  ＮＵＮＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、ネクチン−４に対する５μｇ／ｍｌの捕捉モノクローナル抗体（クローン１９−３３）で一晩コーティングした。１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）３００μｌを用いてウェルを２時間ブロッキングした後、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）で３倍希釈した血清試料と共に２時間インキュベーションした。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）で洗浄した後、ウェルを１０  ｎｇ／ｍｌのビオチン結合モノクローナル抗ネクチン−４抗体（クローン６６−９７）と共に２時間インキュベーションし、続いて基質試薬（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてアビジン結合ペルオキシダーゼ（Ｐ３４７；Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）との反応を行った。２  Ｎ硫酸５０μｌを添加することにより、呈色反応を停止させた。波長４５０  ｎｍにおいて、参照波長を５７０  ｎｍとして、光度計により呈色強度を測定した。可溶性の組換えネクチン−４タンパク質（ネクチン−４細胞外ドメイン）を用いて、各プレートについて検量線を作成した。参照として組換えネクチン−４タンパク質の希釈物（０．１  ｎｇ／ｍｌ〜３００  ｎｇ／ｍｌの範囲）を用いて、ネクチン−４の血清レベルを算出した。血清中の癌胎児抗原（ＣＥＡ）のレベルは、市販の酵素試験キット（Ｈｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を供給業者の推奨に従って用いて、ＥＬＩＳＡにより測定した。血清中のサイトケラチン１９フラグメント（ＣＹＦＲＡ  ２１−１）のレベルは、市販のキット（ＤＲＧ）を用いてＥＬＩＳＡにより測定した。腫瘍群と健常対照群との間のネクチン−４、ＣＥＡ、およびＣＹＦＲＡ  ２１−１のレベルの差を、マンホイットニーのＵ検定により解析した。最適な診断精度および尤度比を有するカットオフレベルを決定するため、ネクチン−４、ＣＥＡ、およびＣＹＦＲＡ  ２１−１のレベルを受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析によりさらに評価した。ネクチン−４とＣＥＡ／ＣＹＦＲＡ  ２１−１との間ならびにＣＥＡとＣＹＦＲＡ  ２１−１との間の相関係数を、スピアマンの順位相関を用いて算出した。有意性をＰ＜０．０５と定義した。
【０３３２】
ＲＮＡ干渉アッセイ
肺癌細胞におけるネクチン−４の生物学的機能を評価するため、標的遺伝子に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用した。ＲＮＡｉのための合成オリゴヌクレオチドの標的配列は以下の通りであった：
対照１（非特異的対照オリゴ［ＣＮＴ］；Ｄｈａｒｍａｃｏｎカタログ番号Ｄ−００１８１０−０１−０５）；対照２（ルシフェラーゼ［ＬＵＣ］：フォチナス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ遺伝子）、５’−ＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）；ｓｉＲＮＡ−ネクチン−４−＃１、５’−ＡＣＡＧＵＵＡＣＣＡＣＧＵＣＵＧＡＧＧＵＵ−３’（標的配列としてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ｓｉＲＮＡ−ネクチン−４−＃２、５’−ＡＡＵＧＧＵＵＣＡＵＧＧＣＣＵＧＵＵＵＵＵ−３’（標的配列としてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）。
【０３３３】
肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２１７０およびＮＣＩ−Ｈ３５８を１０ｃｍディッシュにプレーティングし（細胞１×１０６個／ディッシュ）、製造業者の説明書に従って３０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（１００  ｎＭ）のいずれかをトランスフェクトした。５日間インキュベーションした後、これらの細胞をギムザ液で染色してコロニー形成を評価し、細胞計数キット−８溶液（ＤＯＪＩＮＤＯ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）を用いる３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイにより細胞数を評価した。
【０３３４】
ネクチン−４を安定して発現するＰＣ−１４細胞の樹立
ネクチン−４を安定して発現するＰＣ−１４細胞を樹立するため、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、内因性ネクチン−４を発現しないＰＣ−１４細胞にＭｙｃ／Ｈｉｓタグ付ネクチン−４発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１  ｍｙｃ／Ｈｉｓ−ネクチン−４）またはモックベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／Ｈｉｓ）をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、０．６  ｍｇ／ｍＬネオマイシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む培養培地中で１４日間インキュベーションした。次に、コロニー５０個をトリプシン処理し、限界希釈アッセイによって安定なトランスフェクタントをスクリーニングした。ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロッティング、および免疫細胞化学染色により、各クローンにおけるネクチン−４の発現を判定した。２つの安定したクローン（ＰＣ−１４−ネクチン−４−＃Ａおよび−＃Ｂ）および２つの対照クローン（ＰＣ１４−モック−＃Ａおよび−＃Ｂ）の細胞生存度を、７日間、ＭＴＴアッセイで定量した。アッセイはすべて、３つ組ウェルで独立して３回実施した。
【０３３５】
腫瘍細胞移植
ネクチン−４過剰発現によるインビボ腫瘍増殖促進を調べるため、上記で樹立された、ネクチン−４を安定して発現しているＰＣ−１４細胞、またはモックプラスミドをトランスフェクトしたＰＣ−１４細胞（３×１０５個細胞）を、ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕマウス６匹（雌、６週齢）の後背部に皮下注射した。以下の式：Ｖ＝０．５×（長径）×（短径）２により、２０日間にわたって腫瘍体積を測定し、評価した。動物実験は、実験動物の管理と使用に関する施設および国の指針に従って実施し、施設内動物使用委員会によって承認された。
【０３３６】
マトリゲル浸潤アッセイ
ヒトネクチン−４を発現するｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／ＨｉｓプラスミドまたはモックプラスミドのいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中でコンフルエント近くまで増殖させた。細胞をトリプシン処理によって回収し、血清もプロテイナーゼインヒビターも添加していないＤＭＥＭで洗浄し、細胞１×１０５個／ｍＬの濃度でＤＭＥＭ中に懸濁した。細胞懸濁液を調製する前に、マトリゲル基質（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）の乾燥層をＤＭＥＭを用いて室温で２時間再水和した。１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（０．７５  ｍＬ）を２４ウェルマトリゲル浸潤チャンバーの各下部チャンバーに添加し、細胞懸濁液０．５  ｍＬ（細胞５×１０４個）を上部チャンバーの各インサートに添加した。インサートのプレートを３７℃で２２時間インキュベーションした。インキュベーション後、チャンバーを処理し；供給業者（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）の指示通りに、マトリゲルを通して浸潤する細胞を固定し、ギムザで染色した。
【０３３７】
Ｒａｃ１活性化アッセイ
ネクチン−４過剰発現によるＲａｃ１の活性化を、Ｒａｃ１活性化アッセイキット（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて供給業者の推奨に従って検出した。最初に、ネクチン−４発現ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／ＨｉｓプラスミドまたはモックプラスミドをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞を４８時間培養し、洗浄し、氷冷１×アッセイ緩衝液で溶解した。１４，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、各溶解物を、ｐ２１活性化プロテインキナーゼ（ＰＡＫ）のｐ２１結合ドメイン（ＰＢＤ）−アガロースビーズと４℃で１時間混合した。ビーズを１×アッセイ緩衝液で３回洗浄した。ＰＡＫ−ＰＢＤ／ＧＴＰ−Ｒａｃ１（活性化Ｒａｃ１）複合体を含むプルダウン沈降物を洗浄し、試料緩衝液と共に煮沸して、抗Ｒａｃ１抗体を用いるウエスタンブロット解析に供した。
【０３３８】
［実施例２］
肺腫瘍および正常組織におけるネクチン−４発現
ＮＳＣＬＣの治療剤および／または診断バイオマーカーを開発するための新規標的分子を探索するため、ｃＤＮＡマイクロアレイにより解析したＮＳＣＬＣの大多数で正常細胞の５倍よりも高いレベルの発現を癌細胞において示した遺伝子を、最初にスクリーニングした。スクリーニングした２７，６４８種の遺伝子およびＥＳＴの中で、ＮＳＣＬＣの８７．５％において５倍よりも高いレベルの発現を示した優れた候補としてネクチン−４転写産物が同定された。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験により、さらなるＮＳＣＬＣ組織１０例のうち９例において、および肺癌細胞株２０例のうち７例において、そのトランス活性化が確認された（図１Ａ）。さらに、別の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験では、さらなるＮＳＣＬＣ症例１４例のうち１１例（腺癌（ＡＤＣ）７例のうち６例；扁平上皮癌（ＳＣＣ）７例のうち５例）において、および肺癌細胞株２０例のうち７例において、そのトランス活性化が確認された（図１Ｅ）。続いて、ヒトネクチン−４に特異的な独自のマウスモノクローナル抗体を作製することにより、２種類の独立したクローン、１９−３３および６６−９７を得た。ネクチン−４はＩ型膜タンパク質であることが示されていたため、抗ネクチン−４モノクローナル抗体（クローン１９−３３）を用いたフローサイトメトリーを使用して、肺癌細胞の表面上のネクチン−４発現を検証することを試みた。この解析により、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによりネクチン−４タンパク質が高レベルで検出されていたＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞およびＮＣＩ−Ｈ３５８細胞の細胞膜では、ネクチン−４タンパク質が強く発現しかつ局在していたが、内因性ネクチン−４が発現していなかったＡ５４９細胞およびＳＢＣ−５細胞の細胞膜では発現および局在していなかったことが示された（図１Ｂ）。抗ネクチン−４モノクローナル抗体（クローン１９−３３）による同一セットの肺癌細胞の免疫細胞化学染色により、ＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞およびＮＣＩ−Ｈ３５８細胞の細胞膜および細胞質においてはネクチン−４が検出されたが、Ａ５４９細胞およびＳＢＣ−５細胞では検出されなかったことが示された（図１Ｃ）。ネクチン−４の細胞外ドメイン（４３．５  ｋＤａ）はその細胞外部分の切断によって分泌されることが示唆されていたため（Fabre-Lafay S, et al. J Biol Chem 2005;280:19543-50）、ＥＬＩＳＡを適用して、肺癌細胞株の培養培地中のその存在を調べた。培養培地中の検出可能なネクチン−４の量は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、フローサイトメトリー、および免疫蛍光解析によって検出されたネクチン−４の発現レベルと一致し（図１Ｄ）、このことは、ネクチン−４に対する該モノクローナル抗体の特異的結合親和性をさらに支持するものである。２種類のモノクローナル抗体（クローン１９−３３および６６−９７）を用いるウエスタンブロッティングにより、ＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞株およびＮＣＩ−Ｈ３５８細胞株における内因性ネクチン−４タンパク質レベルを測定するという試みでは、ウエスタンブロット上のバンドを全く検出することができず、このことは、これらの抗体が天然型のネクチン−４の認識に使用可能であることを示すものである。２種類のモノクローナル抗体（１９−３３および６６−９７）は、ｍｙ���タグ付ネクチン−４を過剰発現しているＣＯＳ−７細胞においてネクチン−４タンパク質を特異的に免疫沈降させ得たが（図１Ｆ、左パネル）モック形質転換体ＣＯＳ−７細胞ではできなかった（図１Ｆ、右パネル）ことがさらに確認され、これにより、これらの抗体が天然ネクチン−４を特異的に認識する能力を有することが示唆された。プローブとしてネクチン−４  ｃＤＮＡを用いるノーザンブロッティングにより、調べた２３種の正常ヒト組織の中で、胎盤において非常にかすかなシグナルとして、および気管においてより低い程度で３．７ｋｂ転写産物が同定され（データは示さず）、これは以前の報告と一致した（Reymond N, et al. J Biol Chem 2001;276:43205-15）。続いて、抗ネクチン−４モノクローナル抗体を用いて、６種の正常組織（心臓、肺、肝臓、腎臓、気管、および胎盤）および肺癌においてネクチン−４タンパク質の発現を調べたところ、前者５種の組織におけるネクチン−４タンパク質の発現はほとんど検出不可能であったが、胎盤および肺腫瘍組織では陽性ネクチン−４染色が見られたことが明らかになった。肺癌におけるネクチン−４タンパク質の発現レベルは、胎盤における発現よりも有意に高かった（図２Ａ）。
【０３３９】
［実施例３］
ネクチン−４発現とＮＳＣＬＣ患者の臨床転帰不良との関連性
ネクチン−４の生物学的および臨床病理学的な意義をさらに検証するため、外科切除術を受けた４２２名の患者由来のＮＳＣＬＣ組織からなる組織マイクロアレイによって、ネクチン−４タンパク質の発現を調べた。組織アレイについて、ネクチン−４発現のパターンをなし／弱（スコア０〜１＋）から強（２＋）の範囲に分類した（図２Ｂ、上パネル）。調べたＮＳＣＬＣ４２２例のうち、ネクチン−４は２４５例で強く染色され（５８．１％；スコア２＋）、１１９例で弱く染色され（２８．２％；スコア１＋）、５８例では染色されなかった（１３．７％；スコア０）のに対して、その隣接する正常肺組織は染色されなかった（図２Ｂ、中央パネル）。次いで、ネクチン−４状態と臨床病理学的パラメータとの関連性を評価した。表２に示したように、組織型（ＡＤＣでより高い；フィッシャーの正確確率検定によりＰ＝０．００５９）およびｐＴ因子（Ｔ２〜Ｔ４でより高い；フィッシャーの正確確率検定によりＰ＝０．００４８）は、強いネクチン−４陽性度（スコア２＋）と有意に関連していた。
【０３４０】
【表２】
2012511305.tif 000003
ＡＤＣ、腺癌；ＳＣＣ、扁平上皮癌
その他、大細胞癌（ＬＣＣ）および腺扁平上皮癌（ＡＳＣ）
＋ＡＤＣ  対  非ＡＤＣ
＊＊Ｐ＜０．０５（フィッシャーの正確確率検定）
【０３４１】
強いネクチン−４発現を示した腫瘍を有するＮＳＣＬＣ患者は、ネクチン−４発現なし／弱のＮＳＣＬＣ患者よりも短い生存期間を示した（ログランク検定によりＰ＜０．０００１；図２Ｂ、下パネル）。患者の予後と、年齢（＜  ６５歳  対  ６５歳≧）、性別（女性  対  男性）、組織型（ＡＤＣ  対  非ＡＤＣ）、ｐＴ分類（Ｔ１  対  Ｔ２〜４）、ｐＮ分類（Ｎ０  対  Ｎ１＋Ｎ２）、喫煙歴（非喫煙者  対  喫煙者）、およびネクチン−４発現状態（スコア０＋、１＋  対  ２＋）を含むその他の因子との関連性を評価するために、単変量解析も適用した。これらのパラメータの中で、強いネクチン−４陽性度（Ｐ＜０．０００１）、高齢（Ｐ＝０．００７９）、男性（Ｐ＝０．００１１）、非ＡＤＣ（Ｐ＝０．０２０８）、進行ｐＴ期（Ｐ＜０．０００１）、および進行ｐＮ期（Ｐ＜０．０００１）が予後不良と有意に関連していた。これらの予後因子の多変量解析により、強いネクチン−４発現、高齢、大きな腫瘍サイズ、およびリンパ節転移はＮＳＣＬＣ患者の独立予後因子であることが明らかになった（それぞれ、Ｐ＜０．０００１、０．０００６、０．０００６、＜０．０００１；表３）。
【０３４２】
【表３】
2012511305.tif 000004
ＡＤＣ、腺癌、＊Ｐ＜０．０５
【０３４３】
［実施例４］
ＮＳＣＬＣ患者におけるネクチン−４の血清レベル
インビトロの知見により、ネクチン−４を用いる肺癌の血清バイオマーカーの開発の可能性が示唆されたため（図１Ｄ）、ネクチン−４がＮＳＣＬＣ患者の血清中に分泌されるかどうかを調べた。ＥＬＩＳＡ実験により、ＮＳＣＬＣ患者１６４名の大多数に由来する血清試料中でネクチン−４が検出され（図３Ａ）；ＮＳＣＬＣ患者におけるネクチン−４の血清レベルは、４．０±４．９ユニット／ｍｌ（２．０±２．５  ｎｇ／ｍｌ）（平均値±１ＳＤ）であった。対照的に、１３１名の健常ボランティアにおけるネクチン−４の血清レベル平均値（±１ＳＤ）は、１．１±０．７ユニット／ｍｌ（０．６±０．４  ｎｇ／ｍｌ）であり、現喫煙者および／または元喫煙者である８６名のＣＯＰＤ患者における該レベルは、０．６±０．９  ｎｇ／ｍｌであった。ＮＳＣＬＣ患者と健常ボランティアの間の血清ネクチン−４タンパク質のレベルの差は有意であり、Ｐ値＜０．０００１（マンホイットニーのＵ検定）であった。健常ボランティアとＣＯＰＤ患者の間の差は有意ではなかった（マンホイットニーのＵ検定によりＰ＝０．１０３）。組織型に従って分類した場合、ＡＤＣ患者におけるネクチン−４の血清レベルは４．０±５．０ユニット／ｍｌ（２．０±２．５  ｎｇ／ｍｌ）であり、ＳＣＣ患者における３．９±４．６ユニット／ｍｌ（２．０±２．３  ｎｇ／ｍｌ）であった（図３Ａ、左パネル）。早期腫瘍（Ｉ〜ＩＩＩＡ期）を有する患者においてさえも、高レベルの血清ネクチン−４が検出された（図３Ａ、右パネル）。これらのＮＳＣＬＣ患者１６４名および健常ドナー１３１名のデータにより作成された受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて（図３Ｂ、左パネル）、ネクチン−４に関する最適な診断精度および尤度比（偽陰性および偽陽性の結果が最も少ない）を提供するような、本アッセイにおけるカットオフレベル、すなわち２．０ユニット／ｍｌ（１．０  ｎｇ／ｍｌ）を設定し、感度は５３．７％（ＮＳＣＬＣ  ８８例／１６４例；Ｉ期腫瘍２４例のうち６例（２５％）、ＩＩ〜ＩＩＩＡ期腫瘍２０例のうち１０例（５０％）、およびＩＩＩＢ〜ＩＶ期腫瘍１２０例のうち７２例（６０％））でありかつ特異度は９７．７％（１２８例／１３１例）（２．３％  （３例／１３１例））であった（表４）。
【０３４４】
【表４】
2012511305.tif 000005
【０３４５】
癌特異的バイオマーカーとしての血清ネクチン−４レベルの可能性を評価するため、血清ネクチン−４陽性度と患者または健常個体の特徴との関係を調べた（表５〜７）。ＮＳＣＬＣ患者において、血清ネクチン−４陽性度は、ｐＴ因子と有意に関連していた（Ｔ２〜Ｔ４でより高い；フィッシャーの正確確率検定によりＰ＝０．００３９）（表５）。重要なことに、肺癌、ＣＯＰＤ、および健常ボランティアの個体群において、血清ネクチン−４陽性度は喫煙歴、性別、および年齢と関連していなかった（表５〜７）。さらにＣＯＰＤ患者において、その陽性度と呼吸機能との有意な関連性は認められなかった（表７）。腫瘍検出バイオマーカーとして血清ネクチン−４レベルを用いることの実現可能性を評価するため、ＮＳＣＬＣ患者に関して、ＥＬＩＳＡにより癌患者および対照個体に由来する同一セットの血清試料における２つの従来の腫瘍マーカー（ＣＥＡおよびＣＹＦＲＡ  ２１−１）の血清レベルもまた測定した。ＲＯＣ解析（図３Ｂ、左パネル）により、ＮＳＣＬＣ検出に関するＣＥＡのカットオフ値は２．５  ｎｇ／ｍｌである（感度４２．７％（ＮＳＣＬＣ  ７０例／１６４例；Ｉ期腫瘍２４例のうち４例（１６．７％）、ＩＩ〜ＩＩＩＡ期腫瘍２０例のうち３例（１５％）、およびＩＩＩＢ〜ＩＶ期腫瘍１２０例のうち６３例（５２．５％））、および特異度９７．７％）ことが割り出され、同じくＣＹＦＲＡ  ２１−１のカットオフ値は２．０  ｐｇ／ｍｌであることが割り出され、感度は３９．０％（ＮＳＣＬＣ  ６４例／１６４例；Ｉ期腫瘍２４例のうち１例（４．２％）、ＩＩ〜ＩＩＩＡ期腫瘍２０例のうち３例（１５％）、およびＩＩＩＢ〜ＩＶ期腫瘍１２０例のうち６０例（５０％）、および特異度は９６．２％であった（表４）。血清ネクチン−４値のＲＯＣ曲線下の総面積は、血清ＣＥＡまたはＣＹＦＲＡ２１−１の総面積よりも大きく、これによりＮＳＣＬＣに関する診断バイオマーカーとしての、より優れたネクチン−４の特異度および見込みが示唆された。
【０３４６】
【表５】
2012511305.tif 000006
ＡＤＣ、腺癌；ＳＣＣ、扁平上皮癌
＊Ｐ＜０．０５（フィッシャーの正確確率検定）
【０３４７】
【表６】
2012511305.tif 000007
＊＊フィッシャーの正確確率検定
＋マンホイットニーのＵ検定
＋＋現喫煙者および元喫煙者  対  喫煙未経験者
【０３４８】
【表７】
2012511305.tif 000008
＊＊フィッシャーの正確確率検定
＋マンホイットニーのＵ検定
【０３４９】
次に、ＣＥＡおよびＣＹＦＲＡ  ２１−１と組み合わせて、腫瘍検出バイオマーカーとして血清ネクチン−４レベルを用いることの実現可能性を評価した。血清中のネクチン−４およびＣＥＡの両方を測定することにより、肺ＡＤＣの検出に関する全体の感度は６５．０％まで向上し得る（ＡＤＣの診断に関して、ＣＥＡのみの感度は４２．３％であり、ネクチン−４の感度は５４．５％である）。健常ボランティア（対照群）１３１名における２つの腫瘍マーカーいずれかについての偽陽性結果は４．６％（６例／１３１例）に達したのに対し、同じ対照群におけるＣＥＡおよびネクチン−４についての偽陽性率はそれぞれ２．３％（３例／１３１例）であった。一方、血清中のネクチン−４およびＣＹＦＲＡ２１−１により、肺ＳＣＣの検出に関する全体の感度は６８．３％まで向上した（ＳＣＣの診断に関して、ＣＹＦＲＡ２１−１のみの感度は５３．７％であり、ネクチン−４の感度は５１．２％である）。健常ボランティア（対照群）１３１名における２つの腫瘍マーカーいずれかについての偽陽性結果は６．１％（８例／１３１例）に達したのに対し、同じ対照群におけるＣＹＦＲＡ２１−１およびネクチン−４の偽陽性率はそれぞれ３．８％（５例／１３１例）および２．３％（３例／１３１例）であった。
【０３５０】
その後、手術前と手術後（手術後２カ月）のＮＳＣＬＣ患者由来の血清試料の対を用いてＥＬＩＳＡ実験を実施し、同一患者における血清ネクチン−４のレベルをモニターした。血清ネクチン−４の濃度は、原発腫瘍の外科切除術後に低下した（図３Ｂ、右パネル）。ネクチン−４の血清レベルを、同一セットの、手術前に血清を採取してあったＮＳＣＬＣ症例１２例（ネクチン−４陽性腫瘍を有する患者６名およびネクチン−４陰性腫瘍を有する患者６名）の原発腫瘍におけるネクチン−４の発現レベルとさらに比較した。ネクチン−４の血清レベルは、原発腫瘍におけるネクチン−４の発現レベルと良好な相関関係を示した（図３Ｃ）。この結果から、血清ネクチン−４は肺腫瘍から分泌されていることが確証された。
【０３５１】
［実施例５］
血清ネクチン−４陽性度とＮＳＣＬＣ患者の臨床転帰不良との関連性
原発腫瘍におけるネクチン−４タンパク質の強い発現がＮＳＣＬＣ患者の予後不良と関連していたため、次に、予後に影響を与える臨床病理学的バックグラウンドがほぼ同一であり正確な経過観察記録のあるＮＳＣＬＣ患者に由来する血清試料を用いて、肺癌患者の血清ネクチン−４レベルの生物学的重要性を判定した。新たに診断されかつ以前に治療を受けていない進行ＮＳＣＬＣ（ＩＩＩＢ〜ＩＶ期）患者８８名における診断のためにＥＬＩＳＡにより血清ネクチン−４レベルを調べたところ、ネクチン−４陽性度は、２剤併用による初回標準化学療法（Schiller JH, et al. N Engl J Med 2002; 346:92-8）後の臨床転帰と相関していた。進行ＮＳＣＬＣを有する血清ネクチン−４陽性患者の生存期間中央値は、血清ネクチン−４陰性患者の生存期間中央値よりも短かった（生存期間中央値２４２日  対  ５８４日、Ｐ＝０．００４２；図３Ｄ）。単変量解析により、血清ネクチン−４陽性度（陽性  対  陰性：Ｐ＝０．００５６）、全身状態不良（ＰＳ  ２〜４  対  ０〜１；Ｐ＜０．０００１）、および臨床病期進行（ＩＶ  対  ＩＩＩＢ；Ｐ＝０．０１８３）は、新たに診断された進行ＮＳＣＬＣ患者の予後不良と有意に関連することが示された（表８）。多変量解析により、血清ネクチン−４陽性度（Ｐ＝０．０１５９）および全身状態不良（Ｐ＝０．０００６）は進行ＮＳＣＬＣ患者の独立予後因子であることが確認された。これらの結果から、早期癌を検出するためおよび該疾患の早期進行を予測するためのバイオマーカーとしての血清ネクチン−４の特異度の高さおよび有用性が独立して支持される。
【０３５２】
【表８】
2012511305.tif 000009
ＡＤＣ、腺癌、＊Ｐ＜０．０５
【０３５３】
血清ネクチン−４陽性度と予後不良との関連性をさらに確認するため、新たに診断されかつ以前に治療を受けておらず、予後に影響を与える臨床病理学的バックグラウンドがほぼ同一である、さらなるＩ期ＮＳＣＬＣ患者９５名において根治的手術の前に、およびさらなる進行ＮＳＣＬＣ（ＩＩＩＢ〜ＩＶ期）患者６２名において診断時に、ＥＬＩＳＡにより血清ネクチン−４レベルを調べたところ、血清ネクチン−４陽性度と臨床転帰との相関関係が見出された。血清ネクチン−４が陽性である、根治的手術後のＩ期ＮＳＣＬＣ患者または同一プロトコールの化学療法で治療された進行ＮＳＣＬＣ患者の生存期間中央値は、血清ネクチン−４が陰性である該患者の生存期間中央値よりも短かった（ログランク検定によりそれぞれＰ＝０．０２１９および０．０２６９；図３Ｅ、上および下パネル）。患者の予後と、年齢、性別、組織型、病期、喫煙歴、および血清ネクチン−４陽性度を含むその他の因子との関連性を評価するために単変量解析も適用した。単変量解析により、血清ネクチン−４陽性しか、手術後の早期ＮＳＣＬＣ患者の予後不良とは有意に関連しないことが示された（Ｐ＝０．０３０１；表９）。進行ＮＳＣＬＣでは、単変量解析により、血清ネクチン−４陽性度（陽性  対  陰性；Ｐ＝０．０３６）、全身状態不良（ＰＳ  ２〜４  対  ０〜１；Ｐ＝０．０００４）、および臨床病期進行（ＩＶ期  対  ＩＩＩＢ期；Ｐ＝０．０１８３）が、新たに診断された進行ＮＳＣＬＣ患者の予後不良と有意に関連することが示された（表１０）。多変量解析により、血清ネクチン−４陽性度および全身状態不良（Ｐ＝０．０００６）の両方が進行ＮＳＣＬＣ患者の独立予後因子であることが確認された（それぞれＰ＝０．０３９４および０．０００４；表１０）。これらの結果から、早期癌を検出するためおよび該疾患の早期進行を予測するためのバイオマーカーとしての血清ネクチン−４の高い特異度および有用性が、独立して支持される。
【０３５４】
【表９】
2012511305.tif 000010
ＡＤＣ、腺癌、＊Ｐ＜０．０５
【０３５５】
【表１０】
2012511305.tif 000011
ＡＤＣ、腺癌、＊Ｐ＜０．０５
2012511305.tif 000012
ＡＤＣ、腺癌、＊Ｐ＜０．０５
【０３５６】
［実施例６］
ネクチン−４  ｓｉＲＮＡがＮＳＣＬＣ細胞の増殖に与える効果
ネクチン−４の上方制御が肺癌細胞の増殖および／または生存において重要な役割を果たすかどうかを評価するため、内因性ネクチン−４を過剰発現する肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２１７０およびＮＣＩ−Ｈ３５８に、ネクチン−４に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ネクチン−４に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ネクチン−４−＃１および−＃２）をトランスフェクトした該細胞におけるネクチン−４発現のレベルは、２つの対照ｓｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした該細胞と比較して有意に低下した（図４Ａ、上パネル）。ｓｉ−ネクチン−４−＃１および−＃２がネクチン−４発現に与える抑制効果と一致して、コロニー数、および３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイによって測定された細胞生存度も有意に減少したが（図４Ａ、中央および下パネル）、２つの対照ｓｉＲＮＡではそのような効果は認められなかった。
【０３５７】
肺癌細胞の増殖に対するネクチン−４の効果をさらに調べるため、ネクチン−４を発現するように設計されたプラスミドまたはモックプラスミドを、内因性ネクチン−４を発現しないＰＣ−１４細胞にトランスフェクトし、外因性ネクチン−４を過剰発現する２つの独立したＰＣ−１４細胞株（ＰＣ−１４−ネクチン−４−＃Ａおよび−＃Ｂ）および２つの対照細胞（ＰＣ−１４−モック＃Ａおよび−＃Ｂ）を樹立した。２つのＰＣ−１４−ネクチン−４細胞の増殖は、対照ＰＣ−１４−モック細胞と比較して有意な程度に促進されたことが、ＭＴＴアッセイから明らかになった（図４Ｅ）。インビボ腫瘍増殖におけるネクチン−４の可能性のある役割を調べるため、ＰＣ−１４−ネクチン−４−＃Ｂ細胞またはＰＣ−１４−モック−＃Ｂ細胞のいずれかをＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕマウスの皮下に移植した。２０日間の観察中に、ＰＣ−１４−ネクチン−４−＃Ｂ細胞を個別に移植された３匹のマウスはすべて、ＰＣ−１４−モック−＃Ｂ細胞を移植された独立したマウス３匹と比較して、有意により迅速な腫瘍増殖を示した（図４Ｆ）。これらの知見から、ネクチン−４のインビボおよびインビトロにおける増殖促進効果が示唆される。
【０３５８】
［実施例７］
ネクチン−４の過剰発現による細胞浸潤の増強
ネクチン−４強陽性腫瘍を有するＮＳＣＬＣ患者がネクチン−４陰性または弱陽性の腫瘍を有するＮＳＣＬＣ患者よりも短い生存期間を示すことが、組織マイクロアレイにおける免疫組織化学的解析から示されたため、哺乳動物のＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞を用いるマトリゲルアッセイにより、細胞の遊走および浸潤においてネクチン−４が果たし得る役割を調べた。図４Ｂに示すように、ｍｙｃ／Ｈｉｓタグ付ネクチン−４発現プラスミドをトランスフェクトした細胞は、モックベクターをトランスフェクトした細胞と比較して、マトリゲルを通した有意な浸潤活性を示した。
【０３５９】
次に、ｍｙｃ／Ｈｉｓタグ付ネクチン−４発現プラスミドをＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞にトランスフェクトすることにより、細胞形態に対するネクチン−４の効果を調べた。外因性ネクチン−４に対する抗ｍｙｃ抗体およびＦ−アクチンに対するファロイジンを用いる免疫細胞化学的解析により、ファロイジンによって強く染色される膜突出がネクチン−４のトランスフェクション後に有意に増加したことが、明確に検出された（図４Ｃ、上および下パネル）。モックベクターをトランスフェクトした細胞では、そのような効果は認められなかった。興味深いことに、これらの突出において外因性ネクチン−４が強く染色され、Ｆ−アクチンと部分的に共局在していた。上記結果から、ネクチン−４の過剰発現によりこれらの細胞において膜状仮足形成が誘導されたことが示唆される。
【０３６０】
［実施例８］
ネクチン−４の過剰発現によるＲａｃ１の活性化
細胞運動性には突出の伸長、例えば膜状仮足が必須であり、膜状仮足の形成には低分子ＧＴＰａｓｅであるＲａｃ１の活性化が必要である（Takai Y, et al. Physiol Rev 2001; 81:153-208）。したがって、Ｒａｃ１活性化がネクチン−４依存的細胞運動性に関与し得るかどうかを調べた。他の低分子ＧＴＰａｓｅと同様に、Ｒａｃ１は、不活性ＧＤＰ結合型と活性ＧＴＰ結合型の間を循環することにより分子事象を調節する。その活性（ＧＴＰ結合）状態において、Ｒａｃ１は、ｐ２１活性化プロテインキナーゼ（ＰＡＫ）のｐ２１結合ドメイン（ＰＢＤ）に特異的に結合して、下流のシグナル伝達カスケードを制御する。この機構に基づいて、ネクチン−４発現プラスミドまたはモックプラスミドをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞からの溶解物を、ＧＴＰ−Ｒａｃ１（活性型）を含むタンパク質複合体をアフィニティー沈降させるためのＰＡＫ−ＰＢＤアガロースビーズと混合して用い、ネクチン−４過剰発現によるＲａｃ１活性化の可能性を調べた。ネクチン−４発現プラスミドをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるＧＴＰ−Ｒａｃ１のレベルは、モックベクターをトランスフェクトした該細胞と比較して上昇した（図４Ｄ）。これらの結果から、ネクチン−４が、おそらくはＲａｃ１の活性化を通して、膜状仮足形成および細胞浸潤を増強し得たことが示される。
【０３６１】
考察
ネクチン−４タンパク質は大多数のＮＳＣＬＣにおいて過剰発現していたが、胎盤を除く正常組織ではほとんど発現していなかった。ネクチン−４強発現は短い生存期間と関連していた。ｓｉＲＮＡによりネクチン−４発現を抑制することによって肺癌細胞の増殖は効果的に抑制された。加えて、ネクチン−４発現は、Ｒａｃ１を活性化することによって哺乳動物細胞の膜状仮足形成および浸潤能を増加させた。ネクチン−４トランス活性化と肺発癌との詳細な機能的関連性はいまだ不明であるが、総合的な結果から、ネクチン−４はＲａｃ１シグナル伝達を介して腫瘍の悪性度の高い表現型に寄与すること、および、ネクチン−４経路のターゲティングは、有害事象のリスクが最小限でありかつ癌に対して強力な生物学的活性を有すると予測される、核酸薬による配列特異的遺伝子サイレンシング、モノクローナル抗体、および癌ワクチンなどの新しい種類の治療薬の開発に有用であることが、確証される。
【０３６２】
本発明に従って、ネクチン−４の血清レベルを測定するために２種類のマウスモノクローナル抗体により独自のＥＬＩＳＡ系が確立され、それにより血清ネクチン−４レベルは健常ボランティアよりも肺癌患者において有意に高いことが見出された。これは、診療所における実用的かつ標準的な診断キットを開発するのに非常に有利である。ネクチン−４の細胞外ドメインの切断が、癌の進行にとって重要な何らかのシグナルをもたらしている可能性がある。重要なことには、本発明者らが十分に検証したＥＬＩＳＡ系により測定された血清ネクチン−４の値は、臨床診療で用いられているＮＳＣＬＣに対する従来の血清腫瘍マーカー（ＣＥＡまたはＣＹＦＲＡ２１−１）よりも高い感度および特異度（それぞれ５３．７％および９７．７％）を示した（表４）。さらに、手術可能な病期のＮＳＣＬＣ患者における血清ネクチン−４もまた、血清ＣＥＡ（病期Ｉで１６．７％；病期ＩＩ〜ＩＩＩＡで１５％）またはＣＹＦＲＡ２１−１（病期Ｉで４．２％；病期ＩＩ〜ＩＩＩＡで１５％）よりも高い感度を示した（病期Ｉで２５％；病期ＩＩ〜ＩＩＩＡで５０％）。ネクチン−４と該マーカーのいずれかを組み合わせたアッセイ（ネクチン−４＋ＣＥＡ、またはネクチン−４＋ＣＹＦＲＡ２１−１）により、ＮＳＣＬＣに対する感度は、ＣＥＡまたはＣＹＦＲＡ２１−１単独の感度よりも有意に高い約６５％〜６８％まで上昇し、一方、誤って陽性と診断された健常ボランティアは４．６％〜６．１％であった。さらに、血清ネクチン−４の存在は、ＮＳＣＬＣ患者の短い生存期間と有意に関連していた。本明細書に示したデータから、癌の早期検出、腫瘍の悪性度の予測、および任意の抗癌治療後の疾患管理状態モニタリングなどの臨床診療において広く用いられ得る、ＮＳＣＬＣに対する血清学的バイオマーカーとしてのネクチン−４の臨床的有用性が実証される。最後に、ネクチン−４の活性化は、膀胱癌および子宮頸癌といった一連の他の種類の癌の半分超でも認められ、このことはネクチン−４の広範な腫瘍への診断適用および治療適用を示すものである。
【０３６３】
要約すると、ネクチン−４の活性化は、癌細胞における増殖活性および浸潤活性にとって必須の寄与因子であることが示された。さらに、ネクチン−４は、該分子を過剰発現する任意の種類の癌に対する分子標的薬および免疫療法などの治療アプローチを開発するのに有用な標的である。
【０３６４】
［産業上の利用可能性］
本明細書において実証する通り、細胞増殖は、ネクチン−４遺伝子を特異的に標的とする二本鎖分子によって抑制される。したがって、これらの新規二本鎖分子は抗癌剤として有用である。例えば、ネクチン−４タンパク質の発現を阻止しかつ／またはその活性を妨害する薬剤は、抗癌剤、具体的には肺癌の治療用の抗癌剤として、より具体的にはＮＳＣＬＣの治療用の抗癌剤として、治療的に有用である。
【０３６５】
ネクチン−４の発現は、正常器官と比較して肺癌で顕著に増大する。したがってこれらの遺伝子は、肺癌の診断マーカーとして便利に使用することができ、これによってコードされるタンパク質は、肺癌の診断アッセイにおいて有用である。
【０３６６】
さらに、本明細書に記載した方法は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む肺癌の診断、ならびにこれらの疾患を有する患者の予後不良の予測にも有用である。さらに本発明は、肺癌を含む癌を治療するための新規治療アプローチを提供する。
【０３６７】
１つの局面において、本発明は、ネクチン−４レベルが正常対照と比較して肺癌患者の血清中で上昇しているという発見に関する。したがって、ネクチン−４タンパク質は、診断マーカー、特に肺癌に対する血清学的マーカーとしての有用性を有する。ネクチン−４の血清レベルを指標として用いることにより、本発明は、癌患者を診断するための方法、および癌患者において癌治療の進行をモニターするための方法を提供する。先行技術は、肺癌に対する適切な血清学的マーカーを提供できていない。本発明の新規の血清学的マーカーであるネクチン−４は、肺癌の検出感度を向上させ得る。加えて、ネクチン−４とＣＥＡまたはＣＹＦＲＡの併用は、肺癌の検出感度の上昇に寄与する。
【０３６８】
さらに、ネクチン−４ポリペプチドは抗癌剤を開発するための有用な標的である。例えば、ネクチン−４と結合するかまたはネクチン−４の発現を阻止するかまたはその活性を妨害する剤は、抗癌剤、特に肺癌治療用の抗癌剤として、治療的有用性を見出し得る。
【０３６９】
本明細書で引用した出版物、データベース、配列、特許、および特許出願はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。
【０３７０】
本発明をその特定の態様に関して詳細に説明してきたが、その境界が添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、その範囲内で様々な変更および改変がなされ得ることは、当業者にとって明白であろう。
【図１Ａ】
2012511305.tif 000013
【図１Ｂ】
2012511305.tif 000014
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
2012511305.tif 000016
【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
2012511305.tif 000019
【図２Ｂ】
2012511305.tif 000020
【図３Ａ】
2012511305.tif 000021
【図３Ｂ】
2012511305.tif 000022
【図３Ｃ】
2012511305.tif 000023
【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
2012511305.tif 000025
【図４Ａ】
2012511305.tif 000026
【図４Ｂ】
2012511305.tif 000027
【図４Ｃ】
2012511305.tif 000028
【図４Ｄ】
2012511305.tif 000029
【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【国際調査報告】
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2012511305.tif 000033
2012511305.tif 000034
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