(57)【要約】【課題】抗生物質耐性マーカを持たないＢＣＧにおける異種抗原発現のための、より安定的なプラスミドベクターを開発する。【解決手段】本発明は、マンソン住血吸虫Ｓｍ１４タンパク質を発現する組換えＢＣＧマイコバクテリウム・ボビスのワクチン株（ＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４）に関する。本発明のワクチン株は、寄生虫（特に、マンソン住血吸虫）によって引き起こされる感染の制御に用いられる。ワクチン株は、コンストラクトｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４を用いた遺伝子組換え後にロイシンを相補するＢＣＧパスツール亜株によって得られるロイシン栄養要求性株である。本発明において、組換え型Ｓｍ１４抗原をインビボで発現することによってマンソン住血吸虫感染を制御するためのＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４株の有効性が示されている。【選択図】図１
2012519496.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンソン住血吸虫Ｓｍ１４タンパク質を発現するアミノ酸であるロイシンを相補する組換え型栄養要求性ＢＣＧパスツール株（ｒＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４）であって、
（ａ）ｐＡＵ５−Ｓｍ１４ベクターを鋳型として、プライマーＰＳｍ１４Ｆ（TAT ATA TAT ATA TAG GCG CCA CCA CAA CGA CGC GC）及びＰＳｍ１４Ｒ（CGC GGG CGC CTT AGG ATG ATC GTT TAT A）を用いて、改変ｈｓｐ６０＊プロモータを含むＳｍ１４発現カセットを含む断片をＰＣＲ増幅し、
（ｂ）ＰＣＲによって得られた８１６ｂｐのアンプリコン（ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４）を、Ｎａｒ１酵素を用いて消化し、
（ｃ）前記Ｎａｒ１酵素により消化されたｐＵＰ４１０ベクター内の前記ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４アンプリコンをクローニングしてコンストラクトｐＵＰ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４を作製し、
（ｄ）前記コンストラクトｐＵＰ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４がマイコバクテリウム・バッカエにおいてＳｍ１４タンパク質を発現する能力を評価し、
（ｅ）制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩによる消化によって、前記ｐＵＰ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４からカナマイシンに耐性を持つ遺伝子を除去し、
（ｆ）カナマイシンをコード化する遺伝子なしで前記ｐＵＰ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４コンストラクトを再環状化することによって、栄養要求性ＢＣＧパスツール株（ＢＣＧΔｌｅｕＤ）を形質転換するために用いられるｐＵＰ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４コンストラクトを作製し、マンソン住血吸虫Ｓｍ１４タンパク質を発現するアミノ酸であるロイシンを相補する組換え型栄養要求性ＢＣＧパスツール株（ＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４）を作製することによって得られる、ＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４株。
【請求項２】
マンソン住血吸虫などの寄生虫によって引き起こされるヒトの感染症を制御するための、請求項１に記載のＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４株の使用。
【請求項３】
肝蛭によって引き起こされる動物の感染症を制御するための、請求項１に記載のＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４株の使用。
【請求項４】
結核菌による感染症を制御するための、請求項１に記載のＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４株の使用。
【請求項５】
新生物を制御するための、請求項１に記載のＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４株の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンソン住血吸虫のＳｍ１４抗原を発現するマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧの組換え型ワクチン株に関する。本発明のワクチン株は、寄生虫（特に、マンソン住血吸虫）によって引き起こされる感染症を制御するために用いられる。ワクチン株は、ＢＣＧパスツール（BCG Pasteur）亜株の遺伝子改変によって得られるロイシン栄養要求性ＢＣＧ株である。
【背景技術】
【０００２】
人間に寄生する５つの住血吸虫属種のうちの１つに感染している人は少なくとも２億人いると推定されている。それ以外にも、さらに６億人が、この寄生虫による感染症のリスクにさらされている。
【０００３】
吸虫駆除剤プラジカンテルによる化学療法は、主な制御方法であるが、再感染率が高い［非特許文献１及び非特許文献２］。
【０００４】
従って、適切な化学療法と併用される有効なワクチンを開発できれば、効果的な長期制御戦略を示すことができよう［非特許文献３及び非特許文献４］。
【０００５】
世界保健機関（ＷＨＯ）は、抗住血吸虫ワクチン候補としてのヒト臨床試験用の優先標的分子として、マンソン住血吸虫脂肪酸結合タンパク質１４（Ｓｍ１４）及びビルハルツ住血吸虫由来の２８ｋＤａのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｓｈ２８−ＧＳＴ）を選択した［非特許文献５、非特許文献６及び非特許文献７］。Ｓｍ１４抗原の選択は、大腸菌内で産出された組換えＳｍ１４タンパク質が、げっ歯類モデル［非特許文献８及び非特許文献９］及びヒツジ［非特許文献１０］におけるチャレンジ感染（challenge）時の感染虫体数の減少によって決定されるようなマンソン住血吸虫（３５〜６０％）及び肝蛭に対する防御免疫を誘導したという観察結果に基づくものであった。さらに、このタンパク質のコード化遺伝子が、ＤＮＡワクチンとの関連で［非特許文献１１］、または弱毒化生組換え菌すなわちチフス菌（Salmonella enterica var. Typhimurium）を通して［非特許文献１２］、または世界的に用いられている結核ワクチンであるマイコバクテリウム・ボビスのＢＣＧ株（カルメット・ゲラン桿菌）の形質転換から得られるＢＣＧ組換え体として［非特許文献１３及び非特許文献１４］、投与されたときに、Ｓｍ１４の防御免疫原生が確認された。
【０００６】
幾つかの利点は、異種抗原提示系としてのｒＢＣＧの使用に関連している［非特許文献１５］。これに関連して、非特許文献１３には、マイコバクテリウム・フォーチュイタムのβラクタマーゼ（ｒＢＣＧ／ＰＬ７３−Ｓｍ１４）と融合させた、Ｓｍ１４を発現するｒＢＣＧ株を１用量用いてワクチン接種（免疫化）することにより、ｒＳｍ１４を３用量用いて得られるものと同等の、マンソン住血吸虫のセルカリア（有尾幼虫）によるチャレンジ感染に対する防御を与えることが既に報告されている［非特許文献１３］。このコンストラクトから得られたＳｍ１４発現の全体レベルは、同一または類似の発現ベクターを用いて他の抗原に対して記録されたレベルに比べて相対的に低かった［非特許文献１６］。しかし、ｒＢＣＧ株が防御免疫を誘発するために必要な最小レベルの抗原産出に関するコンセンサスはないが、低レベルの抗原発現は、潜在的制限要因の代表的なものであると考えられていたことに留意されたい［非特許文献１７及び非特許文献１８］。
【０００７】
この問題に対処するため、より高レベルの標的抗原を発現することができる２つの新たなｒＢＣＧコンストラクトが開発された［非特許文献１９］。これらのコンストラクトは、２つのプラスミドベクターｐＵＳ９７７及びｐＡＵ５を用いていた。
【０００８】
ｐＡＵ５ベクターは、非特許文献２０の中で開発された。ｐＡＵ５ベクターは、プラスミドｐＵＳ９７３の変化形態である［非特許文献２１及び非特許文献２２］。このプラスミド（ｐＡＵ５）は、ｈｓｐ６０プロモータ配列の第１の塩基対の消失と、プロモータ領域のすぐ上流での４つの塩基対の欠失とが原因で、派生元のｐＵＳ９７３に比べて安定性の増加を示していた。
【０００９】
これらのｒＢＣＧコンストラクトがスイスマウスにマンソン住血吸虫のセルカリアのチャレンジ感染に対する防御を与える能力は、２つの別々の実験で確認された［非特許文献１９］。この調査では、高レベル（ｐＡＵ５ベクターの場合にＰＬ７３−Ｓｍ１４により得られるものより約３２倍大きい）のＳｍ１４の発現で形質転換されたｒＢＣＧコンストラクトは、ｒＢＣＧ／ＰＬ７３−Ｓｍ１４コンストラクトを用いて記録されたものと比べて防御レベルの向上につながらなかったことが観察された。さらに、ｒＢＣＧ−／ｐＡＵ５−Ｓｍ１４及びｒＢＣＧｒ／ｐＵＳ９７７−Ｓｍ１４株はまた、組換えＳｍ１４タンパク質の細胞内位置に関して、ｒＢＣＧ／ＰＬ７３−Ｓｍ１４株と異なることに留意することが重要である。具体的には、タンパク質は、ｒＢＣＧ−／ｐＡＵ５−Ｓｍ１４の場合には、ｒＢＣＧ／ＰＬ７３−Ｓｍ１４の場合に見られるような膜結合融合タンパク質の形態ではなく、細菌細胞質内で産出された。
【００１０】
全体的に見ると、これらのデータは、コンストラクトｐＡＵ５−Ｓｍ１４に存在する改変ｈｓｐ６０プロモータによって発現が駆動されるような、ｒＢＣＧｒ細胞質内で産出される組換えＳｍ１４タンパク質が、住血吸虫症の予防手段（ｒＢＣＧ−／ｐＡＵ５−Ｓｍ１４）としての潜在能力を持っているという仮説を支持する。
【００１１】
これまでに開発されたプラスミドコンストラクトは全て、アミノグリコシド系抗生物質であるカナマイシンに対する耐性をコード化する遺伝子を含む染色体外環状プラスミドＤＮＡ分子に基づくものであった。カナマイシン遺伝子は、これらのコンストラクトに存在し、プラスミドをＢＣＧに導入した後に形質転換菌（形質転換体）を積極的に選択する手段を与える。この遺伝子の２次的機能は、実験ワクチンを作るために用いられるカナマイシンを含む培養液中の細菌の成長中に、プラスミドを確実に維持することである。
【００１２】
しかし、抗生物質に対する耐性をコード化する遺伝子の存在は、インビボでのプラスミドの維持のための選択を与えない。さらに、ヒトワクチン接種のために抗生物質への耐性コード化配列を含むプラスミドを持つ組換え型ＢＣＧを用いることは、安全上の懸念がある［非特許文献２３］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Al-Sherbiny M, Osman A, Barakat R, El Morshedy H, Bergquist R & Olds R (2003). In vitro cellular and humoral responses to Schistosoma mansoni vaccine candidate antigens. Acta Trop. 88: 117-130
【非特許文献２】Capron A, Riveau GJ, Bartley PB & McManus DP (2002). Prospects for a schistosome vaccine. Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord. 2: 281-290
【非特許文献３】Pearce EJ (2003) Progress towards a vaccine for schistosomiasis. Acta Trop. 86: 309-313
【非特許文献４】Bergquist NR (2002) Schistosomiasis: from risk assessment to control. Trends Parasitol. 18: 309-314.
【非特許文献５】Bergquist, Feb 2004, http://who.int/tdr/publication/tdrnews/news71/schisto.html)
【非特許文献６】Bergquist R, Al-Sherbiny M, Barakat R & Olds R. (2002) Blueprint for schistosomiasis vaccine development. Acta Trop. 82: 183-192
【非特許文献７】Bergquist NR (1998) Schistosomiasis vaccine development: progress and prospects. Mem Inst Oswaldo Cruz. 93 Suppl 1: 95-101.
【非特許文献８】Vilar, M. M.; Barrientos, F; Almeida, M; Garrat, R; Tendler, M. An Experimental Bivalent Peptide Vaccine against schistosomiasis and Fascioliasis with r-Sm14 peptides. Vaccine, v. 22, p. 137-144, 2003
【非特許文献９】Tendler M, Brito CA, Vilar MM, Serra-Freire N, Diogo CM, Almeida MS, et al. (1996) A Schistosoma mansoni fatty acid-binding protein, Sm14, is the potential basis of a dual purpose anti-helminth vaccine. Proc Natl Acad Sci USA. 93: 269-273.
【非特許文献１０】Almeida MS, Torloni H, Lee-Ho P, Vilar MM, Thaumaturgo N, Simpson AJ & Tendler M (2003) Vaccination against Fasciola hepatica infection using a Schistosoma mansoni defined recombinant antigen, Sm14. Parasite Immunol. 25: 135-137
【非特許文献１１】Nascimento E, Leao IC, Pereira VR, Gomes YM, Chikhlikar P, August T, et al (2002) Protective immunity of single and multi-antigen DNA vaccines against schistosomiasis. Mem Inst Oswaldo Cruz. 97 Suppl 1: 105-109
【非特許文献１２】Pacheco LG, Zucconi E, Mati VL, Garcia RM, Miyoshi A, Oliveira SC, et al., (2005) Oral administration of a live Aro attenuated Salmonella vaccine strain expressing 14-kDa Schistosoma mansoni fatty acid-binding protein induced partial protection against experimental schistosomiasis. Acta Trop. 95: 132-142.
【非特許文献１３】Varaldo PB, Leite LC, Dias WO, Miyaji EN, Torres FI, Gebara VC, et al (2004) Recombinant Mycobacterium bovis BCG expressing the Sm14 antigen of Schistosoma mansoni protects mice from cercarial challenge. Infect Immun. 72: 3336-3343
【非特許文献１４】Varaldo, P.B., Leite, L.c.c., Dias, W.O., Miyaj, E.N., Armoa, G.R.G., Campos, A.S., Vilar, M.M., McFadden, J., Almeida, M.S., Tendler, M and McIntosh, D. (2006). Mycobacterial codon optimization of the gene encoding the Sm14 gene of Schistosoma mansoni in recombinant Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin enhances protein expression but not protection against cercarial challenge in mice. FEMS Medical Microbiology and Immunology, 48, 132-139.
【非特許文献１５】Ohara N and Yamada T (2001) Recombinant BCG vaccines. Vaccine. 19: 4089-4098.
【非特許文献１６】Mederle I, Bourguin I, Ensergueix D, Badell E, Moniz-Pereira J, Gicquel B & Winter N ( 2002) Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70: 303-314.
【非特許文献１７】Kanekiyo M, Matsuo K, Hamatake M, Hamano T, Ohsu T, Matsumoto S, et al., (2005) Mycobacterial codon optimization enhances antigen expression and virus-specific immune responses in recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin expressing human immunodeficiency virus type 1 Gag. J Virol. 79: 8716-8723
【非特許文献１８】Kawahara M, Matsuo K, Nakasone T, Hiroi T, Kiyono H, Matsumoto S, et al (2002) Combined intrarectal/intradermal inoculation of recombinant Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin (BCG) induces enhanced immune responses against the inserted HIV-1 V3 antigen. Vaccine. 21: 158-166
【非特許文献１９】修士論文：Construcao do M. bovis BCG recombinate Sm14r e avaliacao da  sua capacidade contra esqistossomose no modelo murino. A.P.C. Argondizzo in 2005, in Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro, Brasil
【非特許文献２０】修士論文：Avaliacao da estabilidade estrutural e funcional de vetores plasmidiais recombinantes bifuncionais (Escherichia coli - Mycobacterium) em Mycobacterium bovis BCG, J.P.S Santos in 2002, Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro, oriented by Dr. Douglas McIntosh, visiting researcher of FIOCRUZ and Prof. Walter Martim R. Oelemann, teacher at Universidade Federal de Rio de Janeiro
【非特許文献２１】Medeiros, M., Dellagostin, O.A., Armoa, G.R.G, Degrave, W.M., Mendonca-Lima, L., Lopes, M.Q., Costa, J.F., McFadden, J. G.M.B.
【非特許文献２２】McIntosh, D. (2002) Comparative evaluation of Mycobacterium vaccae as a surrogate cloning host for use in the study of mycobacterial genetics. Microbiology 148, 1999-2009
【非特許文献２３】Burlein JE, Stover CK, Offcut S & Hanson, M.S. (1994) Expression of foreign genes in mycobacteria. Washington DC: ASM Press.
【非特許文献２４】Parish, T. & Stoker, N.G. (2000) [Use of a flexible cassette method to generate a double unmarked Mycobacterium tuberculosis tlyA plcABC mutant by gene replacement. Microbiology. 146: 1969-1975
【非特許文献２５】Medeiros, M., Dellagostin, O.A., Armoa, G.R.G., Degrave, W.M, Mendonca-Lima, L., Lopes, M.Q., Costa, J.F., McFadden, J. G.M.B., and McIntosh, D. (2002) Comparative evaluation of Mycobacterium vaccae as a surrogate cloning host for use in the study of mycobacterial genetics. Microbiology 148, 1999-2009
【非特許文献２６】Borsuk, S., et al. in Auxotrophic complementation as a selectable marker for stable expression of foreign antigens in Mycobacterium bovis BCG, Tuberculosis, Vol. 87, Magazine 6, pp 474-480, published online in September 24 2007
【非特許文献２７】Parish, T & Stoker, N.G (2000). Use of a flexible cassette method to generate a double unmarked Mycobacterium tuberculosis tlyA plcABC mutant by gene replacement. Microbiology. 146: 1969-1975
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
抗生物質耐性マーカを持たないＢＣＧにおける異種抗原発現のための、より安定的なプラスミドベクターを開発することができれば、それが望ましいことは明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、マンソン住血吸虫のＳｍ１４抗原を発現するＢＣＧマイコバクテリウム・ボビスの組換え型ワクチン株に関する。本発明のワクチン株は、寄生虫（特に、マンソン住血吸虫）によって引き起こされる感染症を制御するために用いられる。ワクチン株は、ＢＣＧパスツール亜株の遺伝子改変によって得られるロイシン栄養要求性ＢＣＧ株である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】相補ベクターｐＵＰ４１０の開発の概略を示す図である。
【図２】コンストラクトｐＡＵ５−Ｓｍ１４を鋳型ＤＮＡとして発現カセットｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４をＰＣＲ増幅した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、マンソン住血吸虫のＳｍ１４のインビボ発現に基づき、マンソン住血吸虫及び関連する寄生虫感染症の制御のためのワクチン株を得るための、ＢＣＧΔｌｅｕＤ株及び相補ベクターｐＵＰ４１０の使用に関する。
【００１８】
本発明の主目的は、選択可能なマーカとして栄養要求性の相補性を用いたＢＣＧにおけるＳｍ１４抗原の発現系の作製を通じて達成することができる。本発明に用いた発現系は、「ラテンアメリカにおける反芻動物の支配的な寄生虫病及び流行病のための組換えＢＣＧマルチワクチン及び相補的診断法の開発（Development of recombinant BCG multivaccine and complementary diagnostics for predominant parasitic and epizootic disease of ruminants in Latin America.）」という研究プロジェクトのために、英国サリー大学生物科学学部のジョンジョー・マックファーデン博士（Dr. Johnjoe Mcfadden）及びブラジル国ペロタス連邦大学バイオテクノロジーセンターのオディール・デラゴスティン博士（Dr. Odir Dellagostin）のグループによって開発された。
【００１９】
栄養要求性の相補性を用いたこのＢＣＧ系の構成要素及び特徴は、アミノ酸であるロイシンに対して栄養要求性であるＢＣＧパスツール株（ＢＣＧΔｌｅｕＤ）と、ロイシンに対するＢＣＧの栄養要求性を相補することができるＬｅｕＤ配列の産物をコード化するプラスミドベクターファミリーである。パリッシュ・Ｔ及びストーカーＮ．Ｇ．［非特許文献２４］によって報告されている方法を用いて、ＢＣＧパスツールのゲノムに存在するＬｅｕＤ配列の遺伝子置換によって、ロイシンを欠いた培地中で成長することができない栄養要求性ＢＣＧ株が得られた。相補ベクターは、ベクターｐＵＳ７７から得られるものであり［非特許文献２５］、栄養失調（栄養要求性）の相補体としても、選択可能なマーカとしても働き、ｐＡＮプロモータによって発現が駆動されるＬｅｕＤ遺伝子を含む。さらに、これらのベクターは、ベクターへの抗原発現カセットのクローニングを可能にする制限エンドヌクレアーゼのための固有の部位を持ち、また、大腸菌内での選択に必要なカナマイシン耐性遺伝子（制限酵素の消化及びそれに続くＢＣＧ形質転換前の再ライゲーションによって除去されることができる）も持っている。インビボと同様にインビトロ（ミドルブルック成長培地７Ｈ９ブロスまたは７Ｈ１０寒天）におけるロイシンの欠如は、ｒＢＣＧに相補プラスミドを維持させる一定の選択圧を与える。ＢＣＧΔｌｅｕＤ株及び一連の相補ベクターを作製するために用いた方法の詳細は、非特許文献２６に記載されている。相補ベクターファミリーから得られる相補ベクターｐＵＰ４１０の開発に含まれるステップを図１に示す。
【００２０】
図１に表されているステップによれば、ｐＵＰ４１０ベクターを得るためのステップは以下の通りである。
−プライマーｌｅｕＤＩ（5´-AAT CTA GAA CAG CTA GGG GAT C-3´）及びｌｅｕＤＩＩ（5´TCC TGCA GTT CTA CGC CTC A-3´）を用い、マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ Ｐ３（ＩＳＯＧＥＮ）ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法により(ｌｅｕＤ遺伝子コード配列を獲得し、
−酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩを用いて増幅断片（６１７ｂｐ）を消化し、
−続いて、ｐＵＳ７７プラスミド（非特許文献２５）をクローニングしてｐＵＰ４００と呼ばれるベクターを得る。
【００２１】
ＫｐｎＩ酵素［非特許文献２７］による消化によってＰＧＯＡＬ１９ベクターからｈｙｇＲ遺伝子（１５７５ｂｐ）を得、同じ酵素により消化されたｐＵ４００ベクターに結合させた。この手順により、ｐＵ４０１ベクターが得られた。ＨｉｎｄＩＩＩによる消化及びその後の再ライゲーションによってカナマイシン耐性遺伝子を除去するために、ＨｉｎｄＩＩＩ部位と酵素ＰａｃＩに適合する末端とを持つアダプタを合成した。１μｇのＡｄａｐ Ｆ（5´GAT ATC AAG CTT AAG ACG CGT TAA3´）及びＡｄａｐ Ｒ（5´TAA CGC GTC TTA AGC TTG ATA TCT A 3´）配列を、１分間煮沸し、その後室温で３時間インキュベートすることによって、ハイブリダイズした。その後、５００ナノグラム（ｎｇ）のオリゴヌクレオチドを用いて、ＰａｃＩにより消化されたｐＵＰ４０１ベクター２００ｎｇと結合反応させた。ライゲーション産物を７０℃で１０分間加熱し、すぐに１％アガロースゲル中で電気泳動で分離して切り出し、ゲルから溶出した。１つのハイブリダイゼーションバッファ（１０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ８．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）を溶出したＤＮＡに加え、８０℃で５分間加熱した。その後、ＤＮＡを３時間かけて室温まで冷まし、５μＬを大腸菌ＴＯＰ１０株の形質転換に用いた。ＨｉｎｄＩＩＩを用いた消化及びＤＮＡ配列決定により、組換えクローンを同定した。結果的に得られたコンストラクトをｐＵＰ４０２と名付けた。その後、Ｋｐｎ１の消化によってｈｙｇＲ遺伝子を除去し、ベクターｐＵＰ４１０を得た。
【００２２】
ここで、幾つかの例を参照しながら本発明について説明する。これらの例は、本発明を限定すると見なされるべきではない。
【００２３】
Ａ．ロイシン（ＢＣＧｒパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫａｎ−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４）を相補する栄養要求性ｒＢＣＧパスツールの作製
【００２４】
ベクターｐＡＵ５−Ｓｍ１４を鋳型として改変ｈｓｐ６０＊プロモータ及びＳｍ１４発現カセットのＰＣＲ増幅が行えるように、プライマーＰＳｍ１４Ｆ（TAT ATA TAT ATA TAG GCG CCA CCA CAA CGA CGC GC）及びＰＳｍ１４Ｒ（CGC GGG CGC CTT AGG ATG ATC GTT TAT A）を設計した。ＰＣＲ（図２）によって得られた８１６ｂｐアンプリコンを、酵素Ｎａｒ１を用いて消化し、その後、ベクターｐＵＰ４１０にクローニングして同じ酵素を用いて消化した。ＤＮＡ配列の解析により、発現カセットが所望の位置で挿入されることが確認された。図２においては、レーン１＝マーカφＸ１７４ＲＦ／ＨａｅＩＩＩ、レーン２＝ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４アンプリコンである。
【００２５】
代用クローニング宿主（マイコバクテリウム・バッカエ）において、Ｓｍ１４抗原を発現するコンストラクトｐＵＰ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４の能力を評価した。そのため、カナマイシンを含むプレート上で選択された５つの個別の形質転換体を用いて、培養液を作製し、これを、非特許文献２５に記載されているような免疫ブロット法による発現の解析に用いるために処理した。マウスポリクローナル抗Ｓｍ１４抗血清を使用し、二次抗体としてアルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧを使用して、抗原発現を検出した。５つのコロニー全てが、ｐＡＵ５−Ｓｍ１４（発現陽性対照）で形質転換されたマイコバクテリウム・バッカエに見られるレベルと等しいレベルでＳｍ１４を発現することが分かった。
【００２６】
その後、ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼによる消化によって、ｐＵＰ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４からカナマイシン耐性遺伝子を除去し、Ｔ４リガーゼを用いてベクターを再環状化することにより、コンストラクトｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４を生じさせ、これを用いてＢＣＧパスツールの栄養要求性株（ＢＣＧΔｌｅｕＤ）を形質転換した。得られた形質転換体を、ミドルブルック７Ｈ１０寒天（ロイシン不含）のプレート上で選択し、カナマイシンの存在下での成長能力をテストした。その後、カナマイシンに敏感な３つの個別の形質転換体がＳｍ１４タンパク質を発現する能力の観点からのインビトロ安定性について、ミドルブルック７Ｈ９ブロス（ロイシン不含）において６０世代後に、及び感染したヒト及びマウスの単球内で１０日後に、既に報告されている方法（Varaldo et al, 2002）を用いて評価した。
【００２７】
この目的のために、マウスまたはヒトの単球に、コンストラクトｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４でインビトロで形質転換された安定的なＢＣＧの２つのクローンを感染させた。ヘペス１０ｍＭ、Ｌ−グルタミン２ｍＭ及び１％のウシ胎児血清が補充されたＲＰＭＩ１６４０を培養手段として用い、マクロファージ（１ウェル当たり５×１０５）を２４ウェルのプレート上で前もって培養した。その後、１マクロファージ当たり約１０の細菌細胞の感染多重度（ＭＯＩ：multiplicity of infection）を得るために、細菌単層を、各ＢＣＧ組換え体に等しいレベルに暴露した。
【００２８】
光学顕微鏡法による直接計数に基づいて、対数増殖期に培養液を所望の濃度まで希釈することによって、マイコバクテリアの接種菌液を調製した。マクロファージをＢＣＧ組換え体に暴露した４時間後、２４時間後、５日後及び１０日後に、試料（１培養液当たり６ウェル）を採取した。単層を０．１％のトゥウィーン８０とともに蒸留水（１ウェル当たり２００μＬ）に溶解した後で採取し、続いて溶解物を段階希釈し、その後、寒天７Ｈ１０プレート上または同じ手段にカナマイシンを補充したものに接種した。
【００２９】
暴露から４時間後に採取した試料の分析から得たマイコバクテリアの成長のレベルを用いて、相対的な感染能力を計算した。他の点のコロニーを形成する単位（unit）の計数から得た値を用いて、細胞内残留性のレベルを計算した。既に説明されているプロトコル（非特許文献２５）に従って、免疫ブロット法によって機能的安定性（抗原Ｓｍ１４の発現）を解析した。
【００３０】
全ての場合において、形質転換体は、ｐＡＵ５−Ｓｍ１４（発現陽性対照）で形質転換されたマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧに見られるレベルと等しいレベルでタンパク質Ｓｍ１４を発現することが観察された。従って、非細胞手段と、マウス及びヒトの細胞の培養液との両者において、発現系の安定性が確認された。
【００３１】
Ｂ．ＢＣＧｒパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫａｎ−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４は、マンソン住血吸虫のセルカリアのチャレンジ感染からマウスを防御する
【００３２】
生きたマンソン住血吸虫のセルカリアからマウスを防御するｒＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫａｎ−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４の能力について、２つの別々の実験で評価した。各実験には、各群が２週齢のメスのスイスマウスを１０匹含む６つの実験群（表１）を用いた。ｒＢＣＧ−（ｐΔＫ２１−Ｓｍ１４）を１用量（１×１０６ｃｆｕ＝標準量、または１×１０２ｃｆｕ＝少量）のみ鼻腔内に投与した場合のワクチン接種の有効性を、非特許文献１３において既に説明されているように、同様に１用量のｒＢＣＧ−（ｐＡＵ５−Ｓｍ１４）または３用量のｒＳｍ１４タンパク質（１０μｇを水酸化アルミニウムとともに）を脚に投与して得られるものと比較した。ＢＣＧｒに基づくワクチン１用量の投与と同日に、組換えタンパク質の最後の用量を投与した。プロテクションアッセイのために、最初のワクチン接種から３０日後（実験１）または６０日後（実験２）に、マウスに１００匹のマンソン住血吸虫のセルカリアを皮下（ｓｃ）チャレンジ感染し、チャレンジ感染から４５日後に灌流した。非特許文献９の記載に従って、異なるチャレンジ群における寄生虫体数及び防御レベルを計算した。スチューデントのｔ検定により、統計的意義を評価した。
【表１】
2012519496.tif 000003
【００３３】
チャレンジ感染の結果を表２に示す。ワクチンを接種された群は全て、対照動物（生理食塩水群）に比べて寄生虫体数の著しい減少を示したことが認められる。この結果は、ワクチン接種の３０日後及び６０日後共にはっきりしていた。全体として、このデータは、ｒＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫａｎ−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４が３０日間防御免疫応答を誘発することができること、及びこの応答がワクチン接種後６０日間有効であることをはっきりと示している。その上、新たなワクチン株は、先行文献の上記記載に従うＢＣＧｒ／ｐＡＵ５−Ｓｍ１４株と同程度に防御性があった。最後に、鼻腔内に投与された１用量（１×１０６ｃｆｕ＝標準量及び１×１０２ｃｆｕ＝少量の両者）のＢＣＧｒパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫａｎ−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４により達成された防御レベルは、アジュバントとして水酸化アルミニウムを配合した３用量の組換えＳｍ１４タンパク質により得られるものと同等の防御レベルを与えることができた。
【表２】
2012519496.tif 000004
【００３４】
ここまでの報告及び説明に従って、本願出願人は、未変性のＳｍ１４抗原の発現に基づいて、マンソン住血吸虫及び関連する寄生虫感染の制御のためのワクチン株を得るための、ＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ株及び相補ベクターｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４の有効性を確認している。
【００３５】
本明細書に記載の発明及び上記した態様は、可能な実施形態と考えられるものである。しかしながら、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、当業者は、本明細書において紹介したいかなる特定の特性も、本発明の理解を容易にするための説明にすぎないと理解されるべきであることに留意されたい。
【図１】
2012519496.tif 000005
【図２】
2012519496.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成23年11月9日(2011.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】組換え型栄養要求性ＢＣＧパスツール株及び、寄生虫によって引き起こされるヒトの感染症を制御するための同株の使用
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンソン住血吸虫のＳｍ１４抗原を発現するマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧの組換え型ワクチン株に関する。本発明のワクチン株は、寄生虫（特に、マンソン住血吸虫）によって引き起こされる感染症を制御するために用いられる。ワクチン株は、ＢＣＧパスツール（BCG Pasteur）亜株の遺伝子改変によって得られるロイシン栄養要求性ＢＣＧ株である。
【背景技術】
【０００２】
人間に寄生する５つの住血吸虫属種のうちの１つに感染している人は少なくとも２億人いると推定されている。それ以外にも、さらに６億人が、この寄生虫による感染症のリスクにさらされている。
【０００３】
吸虫駆除剤プラジカンテルによる化学療法は、主な制御方法であるが、再感染率が高い［非特許文献１及び非特許文献２］。
【０００４】
従って、適切な化学療法と併用される有効なワクチンを開発できれば、効果的な長期制御戦略を示すことができよう［非特許文献３及び非特許文献４］。
【０００５】
世界保健機関（ＷＨＯ）は、抗住血吸虫ワクチン候補としてのヒト臨床試験用の優先標的分子として、マンソン住血吸虫脂肪酸結合タンパク質１４（Ｓｍ１４）及びビルハルツ住血吸虫由来の２８ｋＤａのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｓｈ２８−ＧＳＴ）を選択した［非特許文献５、非特許文献６及び非特許文献７］。Ｓｍ１４抗原の選択は、大腸菌内で産出された組換えＳｍ１４タンパク質が、げっ歯類モデル［非特許文献８及び非特許文献９］及びヒツジ［非特許文献１０］におけるチャレンジ感染（challenge）時の感染虫体数の減少によって決定されるようなマンソン住血吸虫（３５〜６０％）及び肝蛭に対する防御免疫を誘導したという観察結果に基づくものであった。さらに、このタンパク質のコード化遺伝子が、ＤＮＡワクチンとの関連で［非特許文献１１］、または弱毒化生組換え菌すなわちチフス菌（Salmonella enterica var. Typhimurium）を通して［非特許文献１２］、または世界的に用いられている結核ワクチンであるマイコバクテリウム・ボビスのＢＣＧ株（カルメット・ゲラン桿菌）の形質転換から得られるＢＣＧ組換え体として［非特許文献１３及び非特許文献１４］、投与されたときに、Ｓｍ１４の防御免疫原生が確認された。
【０００６】
幾つかの利点は、異種抗原提示系としてのｒＢＣＧの使用に関連している［非特許文献１５］。これに関連して、非特許文献１３には、マイコバクテリウム・フォーチュイタムのβラクタマーゼ（ｒＢＣＧ／ＰＬ７３−Ｓｍ１４）と融合させた、Ｓｍ１４を発現するｒＢＣＧ株を１用量用いてワクチン接種（免疫化）することにより、ｒＳｍ１４を３用量用いて得られるものと同等の、マンソン住血吸虫のセルカリア（有尾幼虫）によるチャレンジ感染に対する防御を与えることが既に報告されている［非特許文献１３］。このコンストラクトから得られたＳｍ１４発現の全体レベルは、同一または類似の発現ベクターを用いて他の抗原に対して記録されたレベルに比べて相対的に低かった［非特許文献１６］。しかし、ｒＢＣＧ株が防御免疫を誘発するために必要な最小レベルの抗原産出に関するコンセンサスはないが、低レベルの抗原発現は、潜在的制限要因の代表的なものであると考えられていたことに留意されたい［非特許文献１７及び非特許文献１８］。
【０００７】
この問題に対処するため、より高レベルの標的抗原を発現することができる２つの新たなｒＢＣＧコンストラクトが開発された［非特許文献１９］。これらのコンストラクトは、２つのプラスミドベクターｐＵＳ９７７及びｐＡＵ５を用いていた。
【０００８】
ｐＡＵ５ベクターは、非特許文献２０の中で開発された。ｐＡＵ５ベクターは、プラスミドｐＵＳ９７３の変化形態である［非特許文献２１及び非特許文献２２］。このプラスミド（ｐＡＵ５）は、ｈｓｐ６０プロモータ配列の第１の塩基対の消失と、プロモータ領域のすぐ上流での４つの塩基対の欠失とが原因で、派生元のｐＵＳ９７３に比べて安定性の増加を示していた。
【０００９】
これらのｒＢＣＧコンストラクトがスイスマウスにマンソン住血吸虫のセルカリアのチャレンジ感染に対する防御を与える能力は、２つの別々の実験で確認された［非特許文献１９］。この調査では、高レベル（ｐＡＵ５ベクターの場合にＰＬ７３−Ｓｍ１４により得られるものより約３２倍大きい）のＳｍ１４の発現で形質転換されたｒＢＣＧコンストラクトは、ｒＢＣＧ／ＰＬ７３−Ｓｍ１４コンストラクトを用いて記録されたものと比べて防御レベルの向上につながらなかったことが観察された。さらに、ｒＢＣＧ−／ｐＡＵ５−Ｓｍ１４及びｒＢＣＧｒ／ｐＵＳ９７７−Ｓｍ１４株はまた、組換えＳｍ１４タンパク質の細胞内位置に関して、ｒＢＣＧ／ＰＬ７３−Ｓｍ１４株と異なることに留意することが重要である。具体的には、タンパク質は、ｒＢＣＧ−／ｐＡＵ５−Ｓｍ１４の場合には、ｒＢＣＧ／ＰＬ７３−Ｓｍ１４の場合に見られるような膜結合融合タンパク質の形態ではなく、細菌細胞質内で産出された。
【００１０】
全体的に見ると、これらのデータは、コンストラクトｐＡＵ５−Ｓｍ１４に存在する改変ｈｓｐ６０プロモータによって発現が駆動されるような、ｒＢＣＧｒ細胞質内で産出される組換えＳｍ１４タンパク質が、住血吸虫症の予防手段（ｒＢＣＧ−／ｐＡＵ５−Ｓｍ１４）としての潜在能力を持っているという仮説を支持する。
【００１１】
これまでに開発されたプラスミドコンストラクトは全て、アミノグリコシド系抗生物質であるカナマイシンに対する耐性をコード化する遺伝子を含む染色体外環状プラスミドＤＮＡ分子に基づくものであった。カナマイシン遺伝子は、これらのコンストラクトに存在し、プラスミドをＢＣＧに導入した後に形質転換菌（形質転換体）を積極的に選択する手段を与える。この遺伝子の２次的機能は、実験ワクチンを作るために用いられるカナマイシンを含む培養液中の細菌の成長中に、プラスミドを確実に維持することである。
【００１２】
しかし、抗生物質に対する耐性をコード化する遺伝子の存在は、インビボでのプラスミドの維持のための選択を与えない。さらに、ヒトワクチン接種のために抗生物質への耐性コード化配列を含むプラスミドを持つ組換え型ＢＣＧを用いることは、安全上の懸念がある［非特許文献２３］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Al-Sherbiny M, Osman A, Barakat R, El Morshedy H, Bergquist R & Olds R (2003). In vitro cellular and humoral responses to Schistosoma mansoni vaccine candidate antigens. Acta Trop. 88: 117-130
【非特許文献２】Capron A, Riveau GJ, Bartley PB & McManus DP (2002). Prospects for a schistosome vaccine. Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord. 2: 281-290
【非特許文献３】Pearce EJ (2003) Progress towards a vaccine for schistosomiasis. Acta Trop. 86: 309-313
【非特許文献４】Bergquist NR (2002) Schistosomiasis: from risk assessment to control. Trends Parasitol. 18: 309-314.
【非特許文献５】Bergquist, Feb 2004, http://who.int/tdr/publication/tdrnews/news71/schisto.html)
【非特許文献６】Bergquist R, Al-Sherbiny M, Barakat R & Olds R. (2002) Blueprint for schistosomiasis vaccine development. Acta Trop. 82: 183-192
【非特許文献７】Bergquist NR (1998) Schistosomiasis vaccine development: progress and prospects. Mem Inst Oswaldo Cruz. 93 Suppl 1: 95-101.
【非特許文献８】Vilar, M. M.; Barrientos, F; Almeida, M; Garrat, R; Tendler, M. An Experimental Bivalent Peptide Vaccine against schistosomiasis and Fascioliasis with r-Sm14 peptides. Vaccine, v. 22, p. 137-144, 2003
【非特許文献９】Tendler M, Brito CA, Vilar MM, Serra-Freire N, Diogo CM, Almeida MS, et al. (1996) A Schistosoma mansoni fatty acid-binding protein, Sm14, is the potential basis of a dual purpose anti-helminth vaccine. Proc Natl Acad Sci USA. 93: 269-273.
【非特許文献１０】Almeida MS, Torloni H, Lee-Ho P, Vilar MM, Thaumaturgo N, Simpson AJ & Tendler M (2003) Vaccination against Fasciola hepatica infection using a Schistosoma mansoni defined recombinant antigen, Sm14. Parasite Immunol. 25: 135-137
【非特許文献１１】Nascimento E, Leao IC, Pereira VR, Gomes YM, Chikhlikar P, August T, et al (2002) Protective immunity of single and multi-antigen DNA vaccines against schistosomiasis. Mem Inst Oswaldo Cruz. 97 Suppl 1: 105-109
【非特許文献１２】Pacheco LG, Zucconi E, Mati VL, Garcia RM, Miyoshi A, Oliveira SC, et al., (2005) Oral administration of a live Aro attenuated Salmonella vaccine strain expressing 14-kDa Schistosoma mansoni fatty acid-binding protein induced partial protection against experimental schistosomiasis. Acta Trop. 95: 132-142.
【非特許文献１３】Varaldo PB, Leite LC, Dias WO, Miyaji EN, Torres FI, Gebara VC, et al (2004) Recombinant Mycobacterium bovis BCG expressing the Sm14 antigen of Schistosoma mansoni protects mice from cercarial challenge. Infect Immun. 72: 3336-3343
【非特許文献１４】Varaldo, P.B., Leite, L.c.c., Dias, W.O., Miyaj, E.N., Armoa, G.R.G., Campos, A.S., Vilar, M.M., McFadden, J., Almeida, M.S., Tendler, M and McIntosh, D. (2006). Mycobacterial codon optimization of the gene encoding the Sm14 gene of Schistosoma mansoni in recombinant Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin enhances protein expression but not protection against cercarial challenge in mice. FEMS Medical Microbiology and Immunology, 48, 132-139.
【非特許文献１５】Ohara N and Yamada T (2001) Recombinant BCG vaccines. Vaccine. 19: 4089-4098.
【非特許文献１６】Mederle I, Bourguin I, Ensergueix D, Badell E, Moniz-Pereira J, Gicquel B & Winter N ( 2002) Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70: 303-314.
【非特許文献１７】Kanekiyo M, Matsuo K, Hamatake M, Hamano T, Ohsu T, Matsumoto S, et al., (2005) Mycobacterial codon optimization enhances antigen expression and virus-specific immune responses in recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin expressing human immunodeficiency virus type 1 Gag. J Virol. 79: 8716-8723
【非特許文献１８】Kawahara M, Matsuo K, Nakasone T, Hiroi T, Kiyono H, Matsumoto S, et al (2002) Combined intrarectal/intradermal inoculation of recombinant Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin (BCG) induces enhanced immune responses against the inserted HIV-1 V3 antigen. Vaccine. 21: 158-166
【非特許文献１９】修士論文：Construcao do M. bovis BCG recombinate Sm14r e avaliacao da  sua capacidade contra esqistossomose no modelo murino. A.P.C. Argondizzo in 2005, in Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro, Brasil
【非特許文献２０】修士論文：Avaliacao da estabilidade estrutural e funcional de vetores plasmidiais recombinantes bifuncionais (Escherichia coli - Mycobacterium) em Mycobacterium bovis BCG, J.P.S Santos in 2002, Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro, oriented by Dr. Douglas McIntosh, visiting researcher of FIOCRUZ and Prof. Walter Martim R. Oelemann, teacher at Universidade Federal de Rio de Janeiro
【非特許文献２１】Medeiros, M., Dellagostin, O.A., Armoa, G.R.G, Degrave, W.M., Mendonca-Lima, L., Lopes, M.Q., Costa, J.F., McFadden, J. G.M.B.
【非特許文献２２】McIntosh, D. (2002) Comparative evaluation of Mycobacterium vaccae as a surrogate cloning host for use in the study of mycobacterial genetics. Microbiology 148, 1999-2009
【非特許文献２３】Burlein JE, Stover CK, Offcut S & Hanson, M.S. (1994) Expression of foreign genes in mycobacteria. Washington DC: ASM Press.
【非特許文献２４】Parish, T. & Stoker, N.G. (2000) [Use of a flexible cassette method to generate a double unmarked Mycobacterium tuberculosis tlyA plcABC mutant by gene replacement. Microbiology. 146: 1969-1975
【非特許文献２５】Medeiros, M., Dellagostin, O.A., Armoa, G.R.G., Degrave, W.M, Mendonca-Lima, L., Lopes, M.Q., Costa, J.F., McFadden, J. G.M.B., and McIntosh, D. (2002) Comparative evaluation of Mycobacterium vaccae as a surrogate cloning host for use in the study of mycobacterial genetics. Microbiology 148, 1999-2009
【非特許文献２６】Borsuk, S., et al. in Auxotrophic complementation as a selectable marker for stable expression of foreign antigens in Mycobacterium bovis BCG, Tuberculosis, Vol. 87, Magazine 6, pp 474-480, published online in September 24 2007
【非特許文献２７】Parish, T & Stoker, N.G (2000). Use of a flexible cassette method to generate a double unmarked Mycobacterium tuberculosis tlyA plcABC mutant by gene replacement. Microbiology. 146: 1969-1975
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
抗生物質耐性マーカを持たないＢＣＧにおける異種抗原発現のための、より安定的なプラスミドベクターを開発することができれば、それが望ましいことは明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、マンソン住血吸虫のＳｍ１４抗原を発現するＢＣＧマイコバクテリウム・ボビスの組換え型ワクチン株に関する。本発明のワクチン株は、寄生虫（特に、マンソン住血吸虫）によって引き起こされる感染症を制御するために用いられる。ワクチン株は、ＢＣＧパスツール亜株の遺伝子改変によって得られるロイシン栄養要求性ＢＣＧ株である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】相補ベクターｐＵＰ４１０の開発の概略を示す図である。
【図２】コンストラクトｐＡＵ５−Ｓｍ１４を鋳型ＤＮＡとして発現カセットｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４をＰＣＲ増幅した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、マンソン住血吸虫のＳｍ１４のインビボ発現に基づき、マンソン住血吸虫及び関連する寄生虫感染症の制御のためのワクチン株を得るための、ＢＣＧΔｌｅｕＤ株及び相補ベクターｐＵＰ４１０の使用に関する。
【００１８】
本発明の主目的は、選択可能なマーカとして栄養要求性の相補性を用いたＢＣＧにおけるＳｍ１４抗原の発現系の作製を通じて達成することができる。本発明に用いた発現系は、「ラテンアメリカにおける反芻動物の支配的な寄生虫病及び流行病のための組換えＢＣＧマルチワクチン及び相補的診断法の開発（Development of recombinant BCG multivaccine and complementary diagnostics for predominant parasitic and epizootic disease of ruminants in Latin America.）」という研究プロジェクトのために、英国サリー大学生物科学学部のジョンジョー・マックファーデン博士（Dr. Johnjoe Mcfadden）及びブラジル国ペロタス連邦大学バイオテクノロジーセンターのオディール・デラゴスティン博士（Dr. Odir Dellagostin）のグループによって開発された。
【００１９】
栄養要求性の相補性を用いたこのＢＣＧ系の構成要素及び特徴は、アミノ酸であるロイシンに対して栄養要求性であるＢＣＧパスツール株（ＢＣＧΔｌｅｕＤ）と、ロイシンに対するＢＣＧの栄養要求性を相補することができるＬｅｕＤ配列の産物をコード化するプラスミドベクターファミリーである。パリッシュ・Ｔ及びストーカーＮ．Ｇ．［非特許文献２４］によって報告されている方法を用いて、ＢＣＧパスツールのゲノムに存在するＬｅｕＤ配列の遺伝子置換によって、ロイシンを欠いた培地中で成長することができない栄養要求性ＢＣＧ株が得られた。相補ベクターは、ベクターｐＵＳ７７から得られるものであり［非特許文献２５］、栄養失調（栄養要求性）の相補体としても、選択可能なマーカとしても働き、ｐＡＮプロモータによって発現が駆動されるＬｅｕＤ遺伝子を含む。さらに、これらのベクターは、ベクターへの抗原発現カセットのクローニングを可能にする制限エンドヌクレアーゼのための固有の部位を持ち、また、大腸菌内での選択に必要なカナマイシン耐性遺伝子（制限酵素の消化及びそれに続くＢＣＧ形質転換前の再ライゲーションによって除去されることができる）も持っている。インビボと同様にインビトロ（ミドルブルック成長培地７Ｈ９ブロスまたは７Ｈ１０寒天）におけるロイシンの欠如は、ｒＢＣＧに相補プラスミドを維持させる一定の選択圧を与える。ＢＣＧΔｌｅｕＤ株及び一連の相補ベクターを作製するために用いた方法の詳細は、非特許文献２６に記載されている。相補ベクターファミリーから得られる相補ベクターｐＵＰ４１０の開発に含まれるステップを図１に示す。
【００２０】
図１に表されているステップによれば、ｐＵＰ４１０ベクターを得るためのステップは以下の通りである。
−プライマーｌｅｕＤＩ（5´-AAT CTA GAA CAG CTA GGG GAT C-3´ - SEQ ID NO:1）及びｌｅｕＤＩＩ（5´TCC TGCA GTT CTA CGC CTC A-3´- SEQ ID NO:2）を用い、マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ Ｐ３（ＩＳＯＧＥＮ）ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法により(ｌｅｕＤ遺伝子コード配列を獲得し、
−酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩを用いて増幅断片（６１７ｂｐ）を消化し、
−続いて、ｐＵＳ７７プラスミド（非特許文献２５）をクローニングしてｐＵＰ４００と呼ばれるベクターを得る。
【００２１】
ＫｐｎＩ酵素［非特許文献２７］による消化によってＰＧＯＡＬ１９ベクターからｈｙｇＲ遺伝子（１５７５ｂｐ）を得、同じ酵素により消化されたｐＵ４００ベクターに結合させた。この手順により、ｐＵ４０１ベクターが得られた。ＨｉｎｄＩＩＩによる消化及びその後の再ライゲーションによってカナマイシン耐性遺伝子を除去するために、ＨｉｎｄＩＩＩ部位と酵素ＰａｃＩに適合する末端とを持つアダプタを合成した。１μｇのＡｄａｐ Ｆ（5´GAT ATC AAG CTT AAG ACG CGT TAA3´）及びＡｄａｐ Ｒ（5´TAA CGC GTC TTA AGC TTG ATA TCT A 3´）配列を、１分間煮沸し、その後室温で３時間インキュベートすることによって、ハイブリダイズした。その後、５００ナノグラム（ｎｇ）のオリゴヌクレオチドを用いて、ＰａｃＩにより消化されたｐＵＰ４０１ベクター２００ｎｇと結合反応させた。ライゲーション産物を７０℃で１０分間加熱し、すぐに１％アガロースゲル中で電気泳動で分離して切り出し、ゲルから溶出した。１つのハイブリダイゼーションバッファ（１０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ８．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）を溶出したＤＮＡに加え、８０℃で５分間加熱した。その後、ＤＮＡを３時間かけて室温まで冷まし、５μＬを大腸菌ＴＯＰ１０株の形質転換に用いた。ＨｉｎｄＩＩＩを用いた消化及びＤＮＡ配列決定により、組換えクローンを同定した。結果的に得られたコンストラクトをｐＵＰ４０２と名付けた。その後、Ｋｐｎ１の消化によってｈｙｇＲ遺伝子を除去し、ベクターｐＵＰ４１０を得た。
【００２２】
ここで、幾つかの例を参照しながら本発明について説明する。これらの例は、本発明を限定すると見なされるべきではない。
【００２３】
Ａ．ロイシン（ＢＣＧｒパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫａｎ−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４）を相補する栄養要求性ｒＢＣＧパスツールの作製
【００２４】
ベクターｐＡＵ５−Ｓｍ１４を鋳型として改変ｈｓｐ６０＊プロモータ及びＳｍ１４発現カセットのＰＣＲ増幅が行えるように、プライマーＰＳｍ１４Ｆ（TAT ATA TAT ATA TAG GCG CCA CCA CAA CGA CGC GC - SEQ ID NO:3）及びＰＳｍ１４Ｒ（CGC GGG CGC CTT AGG ATG ATC GTT TAT A - SEQ ID NO:4）を設計した。ＰＣＲ（図２）によって得られた８１６ｂｐアンプリコンを、酵素Ｎａｒ１を用いて消化し、その後、ベクターｐＵＰ４１０にクローニングして同じ酵素を用いて消化した。ＤＮＡ配列の解析により、発現カセットが所望の位置で挿入されることが確認された。図２においては、レーン１＝マーカφＸ１７４ＲＦ／ＨａｅＩＩＩ、レーン２＝ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４アンプリコンである。
【００２５】
代用クローニング宿主（マイコバクテリウム・バッカエ）において、Ｓｍ１４抗原を発現するコンストラクトｐＵＰ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４の能力を評価した。そのため、カナマイシンを含むプレート上で選択された５つの個別の形質転換体を用いて、培養液を作製し、これを、非特許文献２５に記載されているような免疫ブロット法による発現の解析に用いるために処理した。マウスポリクローナル抗Ｓｍ１４抗血清を使用し、二次抗体としてアルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧを使用して、抗原発現を検出した。５つのコロニー全てが、ｐＡＵ５−Ｓｍ１４（発現陽性対照）で形質転換されたマイコバクテリウム・バッカエに見られるレベルと等しいレベルでＳｍ１４を発現することが分かった。
【００２６】
その後、ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼによる消化によって、ｐＵＰ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４からカナマイシン耐性遺伝子を除去し、Ｔ４リガーゼを用いてベクターを再環状化することにより、コンストラクトｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４を生じさせ、これを用いてＢＣＧパスツールの栄養要求性株（ＢＣＧΔｌｅｕＤ）を形質転換した。得られた形質転換体を、ミドルブルック７Ｈ１０寒天（ロイシン不含）のプレート上で選択し、カナマイシンの存在下での成長能力をテストした。その後、カナマイシンに敏感な３つの個別の形質転換体がＳｍ１４タンパク質を発現する能力の観点からのインビトロ安定性について、ミドルブルック７Ｈ９ブロス（ロイシン不含）において６０世代後に、及び感染したヒト及びマウスの単球内で１０日後に、既に報告されている方法（Varaldo et al, 2002）を用いて評価した。
【００２７】
この目的のために、マウスまたはヒトの単球に、コンストラクトｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４でインビトロで形質転換された安定的なＢＣＧの２つのクローンを感染させた。ヘペス１０ｍＭ、Ｌ−グルタミン２ｍＭ及び１％のウシ胎児血清が補充されたＲＰＭＩ１６４０を培養手段として用い、マクロファージ（１ウェル当たり５×１０５）を２４ウェルのプレート上で前もって培養した。その後、１マクロファージ当たり約１０の細菌細胞の感染多重度（ＭＯＩ：multiplicity of infection）を得るために、細菌単層を、各ＢＣＧ組換え体に等しいレベルに暴露した。
【００２８】
光学顕微鏡法による直接計数に基づいて、対数増殖期に培養液を所望の濃度まで希釈することによって、マイコバクテリアの接種菌液を調製した。マクロファージをＢＣＧ組換え体に暴露した４時間後、２４時間後、５日後及び１０日後に、試料（１培養液当たり６ウェル）を採取した。単層を０．１％のトゥウィーン８０とともに蒸留水（１ウェル当たり２００μＬ）に溶解した後で採取し、続いて溶解物を段階希釈し、その後、寒天７Ｈ１０プレート上または同じ手段にカナマイシンを補充したものに接種した。
【００２９】
暴露から４時間後に採取した試料の分析から得たマイコバクテリアの成長のレベルを用いて、相対的な感染能力を計算した。他の点のコロニーを形成する単位（unit）の計数から得た値を用いて、細胞内残留性のレベルを計算した。既に説明されているプロトコル（非特許文献２５）に従って、免疫ブロット法によって機能的安定性（抗原Ｓｍ１４の発現）を解析した。
【００３０】
全ての場合において、形質転換体は、ｐＡＵ５−Ｓｍ１４（発現陽性対照）で形質転換されたマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧに見られるレベルと等しいレベルでタンパク質Ｓｍ１４を発現することが観察された。従って、非細胞手段と、マウス及びヒトの細胞の培養液との両者において、発現系の安定性が確認された。
【００３１】
Ｂ．ＢＣＧｒパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫａｎ−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４は、マンソン住血吸虫のセルカリアのチャレンジ感染からマウスを防御する
【００３２】
生きたマンソン住血吸虫のセルカリアからマウスを防御するｒＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫａｎ−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４の能力について、２つの別々の実験で評価した。各実験には、各群が２週齢のメスのスイスマウスを１０匹含む６つの実験群（表１）を用いた。ｒＢＣＧ−（ｐΔＫ２１−Ｓｍ１４）を１用量（１×１０６ｃｆｕ＝標準量、または１×１０２ｃｆｕ＝少量）のみ鼻腔内に投与した場合のワクチン接種の有効性を、非特許文献１３において既に説明されているように、同様に１用量のｒＢＣＧ−（ｐＡＵ５−Ｓｍ１４）または３用量のｒＳｍ１４タンパク質（１０μｇを水酸化アルミニウムとともに）を脚に投与して得られるものと比較した。ＢＣＧｒに基づくワクチン１用量の投与と同日に、組換えタンパク質の最後の用量を投与した。プロテクションアッセイのために、最初のワクチン接種から３０日後（実験１）または６０日後（実験２）に、マウスに１００匹のマンソン住血吸虫のセルカリアを皮下（ｓｃ）チャレンジ感染し、チャレンジ感染から４５日後に灌流した。非特許文献９の記載に従って、異なるチャレンジ群における寄生虫体数及び防御レベルを計算した。スチューデントのｔ検定により、統計的意義を評価した。
【表１】
2012519496.tif 000007
【００３３】
チャレンジ感染の結果を表２に示す。ワクチンを接種された群は全て、対照動物（生理食塩水群）に比べて寄生虫体数の著しい減少を示したことが認められる。この結果は、ワクチン接種の３０日後及び６０日後共にはっきりしていた。全体として、このデータは、ｒＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫａｎ−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４が３０日間防御免疫応答を誘発することができること、及びこの応答がワクチン接種後６０日間有効であることをはっきりと示している。その上、新たなワクチン株は、先行文献の上記記載に従うＢＣＧｒ／ｐＡＵ５−Ｓｍ１４株と同程度に防御性があった。最後に、鼻腔内に投与された１用量（１×１０６ｃｆｕ＝標準量及び１×１０２ｃｆｕ＝少量の両者）のＢＣＧｒパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫａｎ−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４により達成された防御レベルは、アジュバントとして水酸化アルミニウムを配合した３用量の組換えＳｍ１４タンパク質により得られるものと同等の防御レベルを与えることができた。
【表２】
2012519496.tif 000008
【００３４】
ここまでの報告及び説明に従って、本願出願人は、未変性のＳｍ１４抗原の発現に基づいて、マンソン住血吸虫及び関連する寄生虫感染の制御のためのワクチン株を得るための、ＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ株及び相補ベクターｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４の有効性を確認している。
【００３５】
本明細書に記載の発明及び上記した態様は、可能な実施形態と考えられるものである。しかしながら、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、当業者は、本明細書において紹介したいかなる特定の特性も、本発明の理解を容易にするための説明にすぎないと理解されるべきであることに留意されたい。
【００３６】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  Fundacao Oswaldo Cruz
<120>  AUXOTROPHIC RECOMBINANT BCG STRAIN PASTEUR AND USE THEREOF FOR 
COMBATING HUMAN INFECTIONS CAUSED BY PARASITES
<130>  P1733
<150>  PCT/BR2010/000065
<151>  2009-03-10
<160>  4 
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Mycobacterium bovis
<400>  1
aatctagaac agctagggga tc 22
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Mycobacterium bovis
<400>  2
tcctgcagtt ctacgcctca 20
<210>  3
<211>  35
<212>  DNA
<213>  Schistosoma mansoni
<400>  3
tatatatata tataggcgcc accacaacga cgcgc 35
<210>  4
<211>  28
<212>  DNA
<213>  Schistosoma mansoni
<400>  4
cgcgggcgcc ttaggatgat cgtttata 28
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンソン住血吸虫Ｓｍ１４タンパク質を発現するアミノ酸であるロイシンを相補する組換え型栄養要求性ＢＣＧパスツール株（ｒＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４）であって、
（ａ）ｐＡＵ５−Ｓｍ１４ベクターを鋳型として、プライマーＰＳｍ１４Ｆ（TAT ATA TAT ATA TAG GCG CCA CCA CAA CGA CGC GC - SEQ ID NO:3）及びＰＳｍ１４Ｒ（CGC GGG CGC CTT AGG ATG ATC GTT TAT A - SEQ ID NO:4）を用いて、改変ｈｓｐ６０＊プロモータを含むＳｍ１４発現カセットを含む断片をＰＣＲ増幅し、
（ｂ）ＰＣＲによって得られた８１６ｂｐのアンプリコン（ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４）を、Ｎａｒ１酵素を用いて消化し、
（ｃ）前記Ｎａｒ１酵素により消化されたｐＵＰ４１０ベクター内の前記ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４アンプリコンをクローニングしてコンストラクトｐＵＰ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４を作製し、
（ｄ）前記コンストラクトｐＵＰ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４がマイコバクテリウム・バッカエにおいてＳｍ１４タンパク質を発現する能力を評価し、
（ｅ）制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩによる消化によって、前記ｐＵＰ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４からカナマイシンに耐性を持つ遺伝子を除去し、
（ｆ）カナマイシンをコード化する遺伝子なしで前記ｐＵＰ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４コンストラクトを再環状化することによって、栄養要求性ＢＣＧパスツール株（ＢＣＧΔｌｅｕＤ）を形質転換するために用いられるｐＵＰ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４コンストラクトを作製し、マンソン住血吸虫Ｓｍ１４タンパク質を発現するアミノ酸であるロイシンを相補する組換え型栄養要求性ＢＣＧパスツール株（ＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４）を作製することによって得られる、ＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４株。
【請求項２】
マンソン住血吸虫などの寄生虫によって引き起こされるヒトの感染症を制御するための、請求項１に記載のＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４株の使用。
【請求項３】
肝蛭によって引き起こされる動物の感染症を制御するための、請求項１に記載のＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４株の使用。
【請求項４】
結核菌による感染症を制御するための、請求項１に記載のＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４株の使用。
【請求項５】
新生物を制御するための、請求項１に記載のＢＣＧパスツールΔｌｅｕＤ／ｐΔＫ４１０−ｈｓｐ６０＊−Ｓｍ１４株の使用。
【国際調査報告】
2012519496.tif 000009
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