(57)【要約】本発明は、ルテニウム化合物を使用して、増殖性疾患、特に癌を治療するための使用及び方法、並びにそれを含有する組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に許容しうる媒体中に、以下の一般式：
【化８】
2012531461.tif 000013
［式中、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３は、同一であるか又は異なり、窒素、酸素、リンもしくは硫黄原子を介する２個の電子のドナー配位子を表すか、又はハロゲン原子を表し、
Ｙ−は、対イオン（ｍ＝１である場合）であり、
ｍは、０又は１であり、
Ｘ１及びＸ２は互いに異なり、一方が窒素原子を表し、そして他方が炭素原子を表し、
曲線によって表されるＸ１とＸ２との間には、一連の原子が存在し、式中に表されるＸ１、Ｘ２及びＲｕと共に、５〜８個の原子で構成される環を形成し、そして、
別の曲線によって表されるＮとＸ１との間には、一連の原子が存在し、式中に表される窒素原子、Ｘ１、及びＲｕと共に、５〜８個の原子で構成される環を形成する］
で表される少なくとも１つの錯体ルテニウム化合物を含む医薬組成物。
【請求項２】
Ｌ１、Ｌ２及び／又はＬ３が、場合により、特に少なくとも１つの、ハロゲン原子、基：アルキル、アリール、ヒドロキシル、アルコキシル（Ｏ−アルキル）、アリールオキシ（Ｏ−アリール）、カルボン酸、エステル（ＣＯ２−アルキル）、チオール、チオエーテル（Ｓ−アルキル）、スルフィン酸、スルホン酸、ニトロ、ニトロキシル、アミン（Ｎ（アルキル又はアリール）ｘＨ２−ｘ［式中、ｘは、整数であり、０、１又は２であり得る］）、トリアルキルアンモニウム（Ｎ（アルキル又はアリール）ｙＨ３−ｙ＋［式中、ｙは、整数であり、０、１、２又は３であり得る］）、ヒドロキシルアミン（Ｎ（ＯＨ）ｚ（アルキル又はアリール）２−ｚ［式中、ｚは、整数であり、１又は２であり得る］）、ヒドラジン、アゾ（Ｎ＝Ｎ−（アルキル又はアリール））、ジアゾニウム、アミド（ＣＯ−ＮＨｗ（アルキル又はアリール）２−ｗ［式中、ｗは、整数であり、０、１、又は２であり得る］）又はシアノによって置換される、ピリジン、ビピリジン、フェナントロリン、又はテルピリジン基を表すことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
３つの基Ｌ１、Ｌ２及びＬ３が、場合により、少なくとも１つの、ハロゲン原子、基：アルキル、アリール、ヒドロキシル、アルコキシル（Ｏ−アルキル）、アリールオキシル（Ｏ−アリール）、カルボン酸、エステル（ＣＯ２−アルキル）、チオール、チオエーテル（Ｓ−アルキル）、スルフィン酸、スルホン酸、ニトロ、ニトロキシル、アミン（Ｎ（アルキル又はアリール）ｘＨ２−ｘ［式中、ｘは、整数であり、０、１、又は２であり得る］）、トリアルキルアンモニウム（Ｎ（アルキル又はアリール）ｙＨ３−ｙ＋［式中、ｙは、整数であり、０、１、２又は３であり得る］）、ヒドロキシルアミン（Ｎ（ＯＨ）ｚ（アルキル又はアリール）２−ｚ［式中、ｚは、整数であり、１又は２であり得る］）、ヒドラジン、アゾ（Ｎ＝Ｎ−（アルキル又はアリール）、ジアゾニウム、アミド（ＣＯ−ＮＨｗ（アルキル又はアリール）２−ｗ［式中、ｗは、整数であり、０、１、又は２であり得る］）、又はシアノによってピリジン環の１つ以上の炭素原子が置換される、窒素原子を介する２個の電子のドナー配位子、特にテルピリジン又は２−（２−ピリジル）−１，１０−フェナントロリンを形成することを特徴とする、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
テルピリジン又は２−（２−ピリジル）−１，１０−フェナントロリンが有する置換基が、アリール基、特にメチル又はメトキシによって置換されるフェニルであることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
Ｙ−が、ＢＦ４−、Ｂ（Ｃ６Ｈ５）４−、ＰＦ６−、ＣＦ３ＳＯ３−、トシラート（ｐ−トリルＳＯ３−）、メラレート（ＭｅＳＯ３−）、ＳＯ４２−、ＣＦ３ＣＯ２−、ＣＨ３ＣＯ２−、重炭酸イオン（ＨＣＯ３−）、ＣｌＯ４−又はＮＯ３−であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
ｍが１であることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
曲線が、一般式中のＸ１、Ｘ２及びＲｕと共にならびに／又はＸ１、Ｎ及びＲｕと共に、５又は６個の原子で形成される環を表すことを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
環の原子が全て炭素原子であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
一般式（Ｉ）中の２本の曲線を含む集合が以下の構造単位：
【化９】
2012531461.tif 000014
の１つを表すことを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
化合物が以下の錯体（１）〜（１２）：
【化１０】
2012531461.tif 000015
の中から選択されることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
化合物が式（１）で表される錯体であることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
細胞の過剰増殖に関連する疾患を治療することを目的とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
癌を治療することを目的とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
膠芽腫、前骨髄球性白血病、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、乳癌、消化管癌、特に、肝臓癌、膵臓癌、頭頸部癌、結腸癌、非ホジキンリンパ腫、又は黒色腫を治療することを目的とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
Ｇ０／Ｇ１期又はＧ２／Ｍ期に腫瘍細胞を蓄積させることによって、そして、場合により、アポトーシス又は他の種類の細胞死を誘導することによって、癌を治療することを目的とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
シスプラチン又は他の抗癌薬に対して耐性である癌を治療することを目的とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
放射線療法等の放射線を使用する抗癌治療と併用して癌を治療することを目的とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
パッケージ化され、そして、組み合わせて、別々に、又は順次投与される、少なくとも１つの他の抗癌化学剤と併用して癌を治療することを目的とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
化合物（８）及び（９）：
【化１１】
2012531461.tif 000016
の中から選択されることを特徴とするルテニウム化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ルテニウム化合物を使用して、増殖性疾患、特に癌を治療するための使用又は方法、及びそれを含有する組成物に関する。
【０００２】
白金錯体は、高い抗腫瘍活性を有することが知られている。白金錯体のうち最もよく知られているのはシスプラチンであり、これは、多くの癌の臨床治療に一般的に使用されている。いくらかの癌細胞の白金に対する耐性及び白金固有の毒性が、この化合物を使用するときに遭遇する問題のうちの１つである。７０年代以降、シスプラチンの代わりになり得る分子を見出すための研究が強化され、数年の間に、ルテニウムを含有する化合物が、白金を含有する化合物の代わりになり得る対象であるということが分かってきた。それによって、既にいくつかのルテニウム錯体が抗癌治療のための代替物となり得ると報告されている。
【０００３】
したがって、現在用いられている抗癌剤の代わりとなり得る新規抗癌剤が必要とされており、それは、有利には、より効果が高く及び／又は有害な副作用が少ない。
【０００４】
したがって、本発明は、特に興味のある抗腫瘍特性を示すルテニウム化合物について開示する。これらの化合物は有機金属化合物である、すなわち、前記化合物は少なくとも１つの炭素−金属共有結合（Ｃ−Ｍ、Ｍはルテニウムである）を含有する。更に、このＣ−Ｒｕ結合は、２つの他の分子内窒素−ルテニウム結合（Ｎ−Ｒｕ）によって安定化され、前記窒素原子は、炭素原子を介してルテニウムに結合している有機部分の元素である。
【０００５】
したがって、この種の原子配列では、ルテニウムは環状体に属し、そして、化合物のこのクラスは、この分野における化学者から一般にシクロメタル化化合物のクラスと呼ばれている。ルテニウムを含有する環状体は、メタロサイクルと呼ばれている。したがって、前記メタロサイクルにおいて、ルテニウムは、炭素−ルテニウム共有結合と２つのドナーアクセプター型（ルイス酸−塩基、又は配位結合）窒素−ルテニウム結合との両方を介して、有機配位子に結合している。有機金属分子における前記金メタロサイクルの存在は、特に、反応性及び熱力学的安定性の点で有機金属分子に特定の特性を付与する。様々な種類の炭素原子（芳香族、ベンジル、又は脂肪族）をメタル化することができ、ドナー原子（窒素）と炭素原子との間の結合の種類は複数の方法で変更することができる。
【０００６】
第１の局面によれば、本発明の目的は、薬学的に許容しうる媒体において、以下の一般式：
【化１】
2012531461.tif 000002
［（式（Ｉ）中、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３は、同一であるか又は異なり、各々、窒素、酸素、リンもしくは硫黄原子を介する２個の電子のドナー配位子を表すか、又はハロゲン原子を表し、Ｙ−は、対イオン（ｍ＝１である場合）であり、ｍは、０又は１であり、Ｘ１及びＸ２は互いに異なり、一方が窒素原子を表し、そして他方が炭素原子を表し、曲線によって表されるＸ１とＸ２との間には、一連の原子が存在し、式中に表されるＸ１、Ｘ２及びＲｕと共に、５〜８個の原子で構成される環を形成し、そして、別の曲線によって表されるＮとＸ１との間には、一連の原子が存在し、式中に表される窒素原子、Ｘ１、及びＲｕと共に、５〜８個の原子で構成される環を形成する］
で表される少なくとも１つの錯体ルテニウム化合物を含む医薬組成物である。
【０００７】
本発明においては、用語≪薬学的に許容しうる媒体≫は、医薬品を調製するために活性成分と組み合わせて従来から使用されている、賦形剤、溶剤、添加剤、緩衝液等の物質を意味する。前記媒体の選択は、本質的に、予定される投与経路に依存する。
【０００８】
本発明の化合物は、薬学的に許容しうる塩、溶媒和物及び／又はプロドラッグの形態であってもよい。プロドラッグは、本発明に係る一般式で表される化合物にインビボで変換され得る本発明の化合物の変異体である。
【０００９】
≪ハロゲン原子≫とは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素原子を指定することを意味する。ハロゲン原子は、有利には塩素原子である。
【００１０】
窒素、酸素又は硫黄原子による２個の電子のドナー配位子は、例えば、Ｈ２Ｏ、ジ（（Ｃ１−６）アルキル）Ｏ、ジ（（Ｃ１−６）アルキル）Ｓ、ジ（（Ｃ１−６）アルキル）Ｓ（Ｏ）、（Ｃ１−６）アルキルＳＯ３−、ジ（（Ｃ１−６）アルキル）Ｃ＝Ｏ、（Ｃ１−６）アルキルＣＯ２−を含む。
【００１１】
Ｌ１、Ｌ２及び／又はＬ３について他の可能な配位子は、特に、式（Ｃ１−６）アルキルＣＮ（特に、ＣＨ３ＣＨ）の配位子等のニトリル配位子及びピリジン配位子を含み、これらは、場合により、ピリジン環のうちの１つ以上の炭素原子が、ハロゲン原子、基：アルキル、アリール、ヒドロキシル、アルコキシル（Ｏ−アルキル）、アリールオキシル（Ｏ−アリール）、カルボン酸、エステル（ＣＯ２−アルキル）、チオール、チオエーテル（Ｓ−アルキル）、スルフィン酸、スルホン酸、ニトロ、ニトロキシル、アミン（Ｎ（アルキル又はアリール）ＸＨ２−ｘ［式中、ｘは、整数であり、０、１又は２であり得る］）、トリアルキルアンモニウム（Ｎ（アルキル又はアリール）ｙＨ３−ｙ＋［式中、ｙは、整数であり、０、１、２又は３であり得る］）、ヒドロキシルアミン（Ｎ（ＯＨ）Ｚ（アルキル又はアリール）２−ｚ［式中、ｚは、整数であり、１又は２であり得る］）、ヒドラジン、アゾ（Ｎ＝Ｎ−（アルキル又はアリール）、ジアゾニウム、アミド（ＣＯ−ＮＨＷ（アルキル又はアリール）２−ｗ［式中、ｗは、整数であり、０、１又は２であり得る］）又はシアノによって置換される。この段落において示される化学基の定義は、本願におけるこれらの用語の全ての使用に有効である。
【００１２】
他の配位子の中で、メチルアミン又はエチルアミン等の一級アミン：（Ｃ１−６）アルキルＮＨ２に、特に言及してもよい。
【００１３】
リン原子を介する２個の電子のドナー配位子は、ホスフィン型の配位子を含む。それらは有利には、式Ｐ（Ｐｈ）３ｘ（アルキル）ｘ［式中、ｘは、０、１又は２を表し、好ましくはｘは２を表し、そして、Ｐｈはフェニル基を表す］である。これらの配位子中で、Ｐ（Ｐｈ）（ＣＨ３）２に、特に言及してもよい。
【００１４】
本発明によれば、用語≪アルキル≫は、直鎖又は分岐鎖の、飽和又は不飽和の炭化水素基を意味し、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル等の、有利には１〜６つの炭素原子を有するものである。１〜４つの炭素原子を有する基が好ましい。アルキル基は、アリール基によって置換されてもよく、この場合、この基は、アリールアルキル基と呼ばれる。アリールアルキル基の例は、特にベンジル及びフェネチルである。アルキル基又はアリールアルキル基は、場合により、１つ以上の置換基を有してもよく、特に、ハロゲン原子、基：アルキル、アリール、ヒドロキシル、アルコキシル（Ｏ−アルキル）、アリールオキシ（Ｏ−アリール）、カルボン酸、エステル（ＣＯ２−アルキル）、チオール、チオエーテル（Ｓ−アルキル）、スルフィン酸、スルホン酸、ニトロ、ニトロキシル、アミン（Ｎ（アルキル又はアリール）ＸＨ２−ｘ［式中、ｘは、整数であり、０、１又は２であり得る］）、トリアルキルアンモニウム（Ｎ（アルキル又はアリール）ｙＨ３−ｙ＋［式中、ｙは、整数であり、０、１、２又は３であり得る］）、ヒドロキシルアミン（Ｎ（ＯＨ）Ｚ（アルキル又はアリール）２−ｚ）［式中、ｚは、整数であり、１又は２であり得る］）、ヒドラジン、アゾ（Ｎ＝Ｎ−（アルキル又はアリール））、ジアゾニウム、アミド（ＣＯ−ＮＨｗ（アルキル又はアリール）２−ｗ［式中、ｗは、整数であり、０、１又は２であり得る］）又はシアノの中から選択される。
【００１５】
≪アリール≫基は、単環の、二環の、又は三環の芳香族炭化水素であり、場合により、少なくとも１つのヘテロ原子（特にＯ、Ｓ又はＮ）によって分断される。好ましくは、アリール基は、６〜１８個の炭素原子、更に好ましくは６個の炭素原子を有する単環の又は二環の芳香族炭化水素系を含む。例えば、フェニル、ナフチル、及びビフェニル基に言及してもよい。ヘテロ原子によって分断される場合、アリール基は、ピリジル、イミダゾイル、ピロリル及びフラニル環を含む。アリール基は、場合により、１つ以上の置換基を有してもよく、特に、ハロゲン原子、基：アルキル、アリール、ヒドロキシル、アルコキシル（Ｏ−アルキル）、アリールオキシ（Ｏ−アリール）基、カルボン酸、エステル（ＣＯ２−アルキル）、チオール、チオエーテル（Ｓ−アルキル）、スルフィン酸、スルホン酸、ニトロ、ニトロキシル、アミン（Ｎ（アルキル又はアリール）ＸＨ２−ｘ［式中、ｘは、整数であり、０、１又は２であり得る］）、トリアルキルアンモニウム（Ｎ（アルキル又はアリール）ｙＨ３−ｙ＋［式中、ｙは、整数であり、０、１、２又は３であり得る］）、ヒドロキシルアミン（Ｎ（ＯＨ）ｚ（アルキル又はアリール）２−ｚ）［式中、ｚは、整数であり、１又は２であり得る］）、ヒドラジン、アゾ（Ｎ＝Ｎ（アルキル又はアリール））、ジアゾニウム、アミド（ＣＯ−ＮＨｗ（アルキル又はアリール）２−ｗ［式中、ｗは、整数であり、０、１又は２であり得る］）、又はシアノの中から選択される。
【００１６】
１つの具体的な態様によれば、基Ｌ１、Ｌ２及びＬ３のうちの２つ又は３つは、少なくとも１つの共有結合によって結合されてもよい。これに関して、ビピリジン、フェナントロリン、又はテルピリジン単位に特に言及してもよく、特に、少なくとも一つの、ハロゲン原子、基：アルキル、アリール、ヒドロキシル、アルコキシル（Ｏ−アルキル）、アリールオキシ（Ｏ−アリール）、カルボン酸、エステル（ＣＯ２−アルキル）、チオール、チオエーテル（Ｓ−アルキル）、スルフィン酸、スルホン酸、ニトロ、ニトロキシル、アミン（Ｎ（アルキル又はアリール）ｘＨ２−ｘ［式中、ｘは、整数であり、０、１又は２であり得る］）、トリアルキルアンモニウム（Ｎ（アルキル又はアリール）ｙＨ３−ｙ＋［式中、ｙは、整数であり、０、１、２又は３であり得る］）、ヒドロキシルアミン（Ｎ（ＯＨ）ｚ（アルキル又はアリール）２−ｚ［式中、ｚは、整数であり、１又は２であり得る］）、ヒドラジン、アゾ（Ｎ＝Ｎ−（アルキル又はアリール））、ジアゾニウム、アミド（ＣＯ−ＮＨｗ（アルキル又はアリール）２−ｗ［式中、ｗは、整数であり、０、１、又は２であり得る］）又はシアノによって、場合により置換されている。
【００１７】
好ましくは、本発明の化合物は、窒素原子を介する２個の電子のドナー配位子を表す１つ、２つ又は３つのＬ１、Ｌ２及びＬ３基を有する。
特に、Ｌ１、Ｌ２及び／又はＬ３は、単独で、又は２つずつで、又は３つで、ピリジン、ビピリジン、フェナントロリン又はテルピリジン基を表してもよく、前記基は、特に、少なくとも１つの、ハロゲン原子、基：アルキル、アリール、ヒドロキシル、アルコキシル（Ｏ−アルキル）、アリールオキシ（Ｏ−アリール）、カルボン酸、エステル（ＣＯ２−アルキル）、チオール、チオエーテル（Ｓ−アルキル）、スルフィン酸、スルホン酸、ニトロ、ニトロキシル、アミン（Ｎ（アルキル又はアリール）ｘＨ２−ｘ［式中、ｘは、整数であり、０、１又は２であり得る］）、トリアルキルアンモニウム（Ｎ（アルキル又はアリール）ｙＨ３−ｙ＋［式中、ｙは、整数であり、０、１、２又は３であり得る］）、ヒドロキシルアミン（Ｎ（ＯＨ）ｚ（アルキル又はアリール）２−ｚ［式中、ｚは、整数であり、１又は２であり得る］）、ヒドラジン、アゾ（Ｎ＝Ｎ−アルキル又はアリール）、ジアゾニウム、アミド（ＣＯ−ＮＨｗ（アルキル又はアリール）２−ｗ［式中、ｗは、整数であり、０、１又は２であり得る］）又は、シアノによって、場合により置換されている。
【００１８】
より具体的には、本発明の化合物は、３つの基Ｌ１、Ｌ２及びＬ３が共に窒素原子を介する２個の電子のドナー配位子を形成するような化合物であり、例えば、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は共に、場合により、少なくとも１つの、ハロゲン原子、基：アルキル、アリール、ヒドロキシル、アルコキシル（Ｏ−アルキル）、アリールオキシル（Ｏ−アリール）、カルボン酸、エステル（ＣＯ２−アルキル）、チオール、チオエーテル（Ｓ−アルキル）、スルフィン酸、スルホン酸、ニトロ、ニトロキシル、アミン（Ｎ（アルキル又はアリール）ｘＨ２−ｘ［式中、ｘは、整数であり、０、１、又は２であり得る］）、トリアルキルアンモニウム（Ｎ（アルキル又はアリール）ｙＨ３−ｙ＋［式中、ｙは、整数であり、０、１、２又は３であり得る］）、ヒドロキシルアミン（Ｎ（ＯＨ）ｚ（アルキル又はアリール）２−ｚ［式中、ｚは、整数であり、１又は２であり得る］）、ヒドラジン、アゾ（Ｎ＝Ｎ−（アルキル又はアリール））、ジアゾニウム、アミド（ＣＯ−ＮＨｗ（アルキル又はアリール）２−ｗ［式中、ｗは、整数であり、０、１、又は２であり得る］）、又はシアノによってピリジン環の１つ以上の炭素原子が置換される、テルピリジン又は２−（２−ピリジル）−１，１０−フェナントロリンを形成することができる。好ましくは、前記置換基は、アリール基、好ましくはフェニル、有利にはメチル又はメトキシ基によって置換されるそれ自体である。
【００１９】
本発明によれば、用語≪ビピリジン≫、≪フェナントロリン≫、≪テルピリジン≫及び≪２−（２−ピリジル）−１，１０−フェナントロリン≫は以下：
【化２】
2012531461.tif 000003
に定義されるようなものであり、それぞれ、配位子５、６、７及び８に対応する。
【００２０】
本発明の化合物におけるＹ−は対イオンであり、そしてルテニウム錯体が正電荷を有する場合にのみ化合物の中に存在する。Ｙ−は、求核性のほとんどないアニオンであり、好ましくは、ＢＦ４−、Ｂ（Ｃ６Ｈ５）４−、ＰＦ６−、ＣＦ３ＳＯ３−、トシラート（ｐ−トリルＳＯ３−）、メシラート（ＭｅＳＯ３−）、ＳＯ４２−、ＣＦ３ＣＯ２−、ＣＨ３ＣＯ２−、重炭酸イオン（ＨＣＯ３−）、ＣｌＯ４−又はＮＯ３−等であり、特に、ＰＦ６−である。
【００２１】
配位子Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、ルテニウムの配位球面を完成させるためにのみその存在が必要とされるいわゆる補助配位子である。その性質は、請求される化合物の生物活性に重大な影響はないと考えられ、このような活性は、メタロサイクルの種類に主に関係している。
【００２２】
本発明の１つの具体的な態様によれば、ｍは１である。
【００２３】
曲線は、一般式におけるＸ１、Ｘ２及びＲｕと共に、環を表す。この環は、一般に、５〜８つの原子（式（Ｉ）中、Ｘ１、Ｘ２及びＲｕによって表される原子を含む）、好ましくは５〜６つの原子、そして、更に好ましくは５つの原子で形成される。典型的に、前記環の原子（一般式中に表される原子以外）は、炭素、窒素、酸素及び硫黄原子から選択される。これらの原子は炭素原子のみであることが好ましい。これらの原子の各々は、前記環とは無関係に、飽和していようとしていまいと、直鎖又は環状の構造を形成し、そのための制限は特にない。
【００２４】
曲線は、一般式におけるＸ１、Ｎ及びＲｕと共に、第１の環とＲｕ−Ｘ１結合を共有する別の環を表す。この環は、一般に、５〜８つの原子［式（Ｉ）中、Ｘ１、Ｎ及びＲｕによって表される原子を含む］、好ましくは５〜６つの原子、そして、更に好ましくは５つの原子で形成される。典型的に、前記環の原子（一般式中に表される原子以外）は、炭素、窒素、酸素及び硫黄原子から選択される。これらの原子は炭素原子のみであることが好ましい。これらの原子の各々は、前記環とは無関係に、飽和していようとしていまいと直鎖又は環状の構造を形成し、そのための制限は特にない。
【００２５】
したがって、２つの曲線を含む構造単位の中でも、以下：
【化３】
2012531461.tif 000004
に示す２つの基に特に言及することができる。
【００２６】
また、本発明の化合物は、式（Ｉ）で表される化合物の、個別に又は混合物（特に、ラセミ化合物）として得られる光学異性体及び幾何異性体を含む。
【００２７】
一般式（Ｉ）に含まれる化合物の中でも、図１に例示される化合物（（１）〜（１２）の番号が付けられた化合物）に特に言及することができる。１つの具体的な局面によれば、本発明の化合物は、化合物（１）〜（１２）のうちの少なくとも１つを含む。
【００２８】
調製方法：
本発明の化合物を合成するためのいくつかの方法が存在する。最も有利なものは、Ｃ−Ｈ結合からのＣ−Ｒｕ結合の形成を直接導くいわゆる分子内ＣＨ活性化反応、又はシクロメタル化反応（A.D Ryabov, Chem. Rev. 1990, 90, 403-424を参照されたい）を使用する方法である。
【００２９】
別の方法は、例えば、対応するリガンドをｎ−ＢｕＬｉ等の強塩基と反応させることにより、そのリチウムが後にルテニウムによって置換される有機リチウムを導いて、ルテニウムに結合させることを意図する炭素を事前にメタル化することを含む。この第２の合成経路を用いて、化合物（１）に類似するが、配位子であるビス（２−ピリジル）−１，３−ベンゼンのピリジン基がＣＨ２ＮＭｅ２体によって置換されている化合物を得ることに成功している（Organometallics, 1996, 15, 941-948を参照されたい）。
【００３０】
刊行物：J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 8521-8522 and Inorg. Chem. 1993, 32, 4539-4543に記載のプロトコールに従い、以下の式：
【化４】
2012531461.tif 000005
による第１経路を使用して、化合物（１）を得た。
【００３１】
また、Eur. J. Inorg. Chem. 2000, 113-119に記載のプロトコールに従い、第１の経路を使用して、化合物（２）及び（３）を合成した。反応スキームを以下に示す：
【化５】
2012531461.tif 000006
【００３２】
Inorg. Chem, 2009, 5685-5696に記載されている類似の合成経路を使用して、化合物（４）〜（７）及び（１０）〜（１２）を合成した。
【００３３】
それぞれ、配位子である２，６−ビス（２’ピリジル）−４−カルボメトキシベンゼン及び２，６−ビス（２’ピリジル）−４−メチルベンゼンのメタル化によって化合物（８）及び（９）を合成した。
【００３４】
また、本発明は、化合物（８）及び（９）：
【化６】
2012531461.tif 000007
の中から選択されることを特徴とするルテニウム化合物に関する。
【００３５】
上述のように、本発明の組成物は、細胞の過剰増殖に関する疾患、特に癌を治療するために特に有益である。癌は、固形又は液体腫瘍を伴うものを含む。癌は、特に、膠芽腫、神経芽細胞腫、前骨髄球性白血病、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、乳癌、及び消化管癌、特に、肝臓癌、膵臓癌、頭頸部癌、結腸癌、非ホジキンリンパ腫及び黒色腫に関する。
【００３６】
本発明の更なる目的は、細胞の過剰増殖に関する疾患、特に癌の治療において使用するための、上に定義したような式（Ｉ）で表される化合物である。
【００３７】
本発明の更なる目的は、細胞の過剰増殖に関する疾患、特に癌を治療することを目的とする医薬組成物を調製するための、上に定義したような少なくとも１つの式（Ｉ）で表される化合物の使用である。
【００３８】
本発明の化合物は、腫瘍細胞に対して抗増殖性効果を有する。本発明の化合物は、Ｇ０／Ｇ１期又はＧ２／Ｍ期に腫瘍細胞を蓄積させることによって、そして、場合により、腫瘍細胞のアポトーシス又は他の種類の細胞死を誘導することによって、癌を治療するために特に有用である。
【００３９】
本発明に関するいずれの理論に縛られるものでもないが、本発明の化合物は、特に、Ｇ０／Ｇ１期又はＧ２／Ｍ期に腫瘍細胞を蓄積させることができるので、腫瘍細胞の細胞周期をブロックすることができると考えられるが、特に濃度が増加したとき、用量依存的な毒性の指標である急死を生じさせることもできると考えられる。
【００４０】
更に、本発明の化合物は、シスプラチン又は他の抗癌薬に対して耐性である腫瘍を治療するために特に有用である。
【００４１】
本発明の組成物は、様々な方法及び様々な形態で投与することができる。例えば、経口経路を介して、吸入又は注射を介して、例えば、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、経皮経路、動脈内経路等を介して全身に投与することができ、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、経口経路、及び、吸入経路が好ましい。注射する場合、前記組成物は、一般的に、例えば注射器又は点滴を使用して注射することができる液体懸濁液の形態である。これに関して、前記化合物は、一般的に、製薬用途に適合しており、そして、当業者に公知である生理食塩水、生理学的、等張、緩衝液等に溶解した状態である。したがって、本発明の組成物は、分散剤、可溶化剤、安定剤、保存剤等の中から選択される１つ以上の剤又は溶剤を含有してもよい。液体の及び／又は注射可能な製剤において使用することができる剤及び溶剤は、特にメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリソルベート８０、マンニトール、ゼラチン、ラクトース、植物油、アラビアゴム等である。
【００４２】
また、前記組成物は、場合により、ガレヌス製剤形態（galenic form）又は装置を用いることによって、ゲル、油、錠剤、坐剤、散剤、軟質カプセル剤、硬質カプセル剤、エアゾール剤等の形態で投与されて、確実に持続及び／又は遅延放出させることもできる。この種の製剤の場合、セルロース、炭酸塩又はデンプン等の物質を用いることが有利である。
【００４３】
明らかに、注射速度及び／又は注射される用量は、患者、関連する病状、投与方法等に関連して、当業者が適応させることができる。典型的には、本発明の化合物は、０．１μg〜１００mg／kg（体重）、より一般的には０．０１〜１０mg／kg、典型的には０．１〜１０mg／kgで変動し得る用量で投与される。更に、繰り返し注射してもよい。また、慢性処置については、持続放出系及び／又は遅延放出系が有利である場合もある。
【００４４】
また、本発明は、細胞の過剰増殖に関する病状、特に癌を治療するための方法であって、前記病状に罹患している個体に本発明に係る組成物を投与することを介する方法に関する。
【００４５】
本発明に従って治療され得ると意図される他の種類の細胞の過剰増殖の中でも、良性の腫瘍に言及してもよい。
本発明の状況において、用語≪治療≫は、予防的治療、根治的治療、対症療法、及び患者の管理（苦痛を低減する、寿命を延ばす、疾患の進行を遅らせる、腫瘍の増殖を低減する等）を指す。また、前記治療は、他の化学もしくは理学剤、又は治療（化学療法、放射線療法、遺伝子治療等）と組み合わせて行ってもよい。本発明の治療及び医薬品は、より具体的にはヒトを対象とする。
【００４６】
したがって、本発明の化合物は、放射線療法等の放射線を使用する抗癌治療と組み合わせて有利に使用することができる。
本発明の別の局面によれば、本発明の組成物は、以下の治療用化学剤：シスプラチン、カルボプラチン、タキソテール又はタキソール（有利には、タキソール）等の他の化学剤又は抗癌治療処置と共に用いてもよい。本発明の化合物は、好ましくは、パッケージ化されて、他の治療剤又は治療に対して、組み合わせて、別々に、又は順次投与される。
【００４７】
また、本発明は、腫瘍細胞の増殖をインビボ、インビトロ、又はエキソビボで阻害するための方法であって、本発明に係る組成物と前記腫瘍細胞とを接触させる工程を含む方法に関する。前記腫瘍細胞は、特に、上記の指定された病状の腫瘍細胞であってもよい。
【００４８】
以下の図及び実施例において、用語≪ＲＤＣ≫は、ルテニウムに由来する化合物（Ruthenium Derived Compound）を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】式（Ｉ）で表される化合物の例。
【図２】化合物１、２及び３のＡ１７２細胞に対するＭＴＴ試験の結果。グラフは、４つの実施された実験のうちの代表的な実験における８点の平均を標準偏差と共に示す。太い横線は、各グラフのＩＣ５０を示す。
【図３】化合物４〜１２のＡ１７２細胞に対するＭＴＴ試験の結果：関心化合物の濃度（μM）に対する細胞の生存率（％）。太い横線は、各グラフのＩＣ５０を示す。
【図４】様々な濃度の化合物８及び９で処理されたＨＣＴ１１６細胞の細胞周期のプロファイル。
【図５】参照化合物で処理された細胞と比較した、化合物８又は化合物９で処理されたＡ１７２腫瘍細胞のＣＨＯＰタンパク質の発現、及びセリン部位１３７におけるヒストンＨ２ＡＸのリン酸化。
【図６】Ｆ１０Ｂ１６腫瘍を有するマウスにおける、化合物９による処理日数に対する腫瘍体積（mm3）を示すグラフ。
【図７】Ｆ１０Ｂ１６腫瘍を有するマウスにおける、化合物８による処理日数に対する腫瘍体積（mm3）を示すグラフ。
【００５０】
本出願の他の曲面及び利点は、以下の実施例を読むことによって明らかになるが、これら実施例は、例示であり、限定するものではないと解釈すべきである。
【００５１】
実施例
実施例１：化合物８及び９の合成及び特性評価
シクロメタル化された化合物は、特にルテニウムによる配位子のメタル化段階において、空気中の酸素及び酸に対する感受性が高い。したがって、Schlenk管技術を使用して、制御雰囲気（窒素又はアルゴン）下で操作を実施することが望ましい。窒素（又はアルゴン）下で、溶媒をそれを使用する前に、乾燥及び蒸留させる。
【００５２】
化合物８の合成：
Schllenk管に、ＭｅＣＮ４mL中における２，６−ビス（２’ピリジル）−４−カルボメトキシベンゼン（Ｌ１Ｈ）（６２mg、０．２mmol）、［ＲｕＣｌ２（η（エータ）６−Ｃ６Ｈ６］２（５２mg、０．１mmol）、ＫＰＦ６（８０mg、０．４mmol）、フレーク状のＮａＯＨ（８mg、０．２mmol）を添加する。４５℃で１５時間この混合物を加熱する。標準化されたアルミナカラム（カラム長さ：直径２cmの管において１５cm）を用いて不活性雰囲気下で得られる橙色の溶液を濾過し、そして、この溶液を０．５mLになるまで体積を濃縮して減少させる。１０mLのＥｔ２０の添加によって、実験式［ＲｕＬ１（ＭｅＣＮ）３］＋ＰＦ６−（収量９１mg、収率６９％）を満たす橙色の生成物が沈殿する。
【００５３】
［ＲｕＬ１（ＭｅＣＮ）３］＋ＰＦ６−（１８mg、０．０２７mmol）、及び１，１０−フェナントロリン（５．４mg、０．０２７mmol）のＭｅＯＨ（２mL）溶液を、１２時間還流下で加熱する。次いで、真空内で溶媒を除去し、暗褐色の粉末を得る。ＭｅＣＮ５mLにこの粉末を溶解させ、溶出剤としてＭｅＣＮを使用して、標準化されたアルミナ（カラム長さ：直径２cmのチューブにおいて５cm）を通して濾過する。紫色の分画を回収し、そして、溶媒を真空内で蒸発させる。ペンタンがゆっくり拡散する最小体積のＣＨ２Ｃｌ２中で前述の粉末の溶液から暗紫色の結晶の形態の生成物８を得る（収量：１８mg、収率８８％）。
MS (ES, m/z): Calculated for C32H24F6O2Ru: 612.098 (M); Found: 612.109.
IR (cm-1): 2264 (vN≡C), 840 (vPF).
1H NMR (400.13 MHz, CD3CN, 300K): 10.02 (dd, 1H, 3J=5.1, 4J=1.8, H0), 8.81 (dd, 1H, 3J=8.3, 4J=1.3, Hp), 8.62 (s, 2H, H5), 8.35 (dd, 1H, 3J=8.1, 4J=4.9, Hm), 8.21 (d, 1H, 3J=8.8, Hphen), 8.20 (d, 2H, 3J=8.0, H1), 8.06 (dd, 3J=8.1, 4J=1.2, H0), 7.99 (d, 1H, 3J=8.9, Hphen), 7.70 (td, 2H, 3J=7.6, 4J=1.7, H2), 7.57 (d, 2H, 3J=7.57, H3), 7.32 (dd, 1H, 3J=5.5, 4J=1.2, Hp), 7.11 (dd, 1H, 3J=8.1, 4J=4.9, Hm), 6.81 (td, 1H, 3J=6.6, 4J=1.3, H4), 4.05 (s, 3H, CH3), 2.10 (s, 3H, NCCH3).
13C NMR (100.62 MHz, CD3CN, 300K): 169.2, 168.5, 155.3, 153.8, 151.2, 146.3, 145.4, 137.1, 136.1, 134.8, 131.7, 131.1, 128.7, 128.4, 127.0, 125.2, 124.4, 123.4, 120.7.
Anal: Calculated C32H24F6N5O2PRu: C, 50.80; H, 3.20; N, 9.26. Found: C, 50.02, H, 3.25; N, 9.26 %.
【００５４】
化合物９の合成：
今回の出発配位子が２，６−ビス（２’ピリジル）−４−メチルベンゼン（Ｌ２Ｈ）であったことを除いて、８を得るために用いた方法と同一の合成方法を用いた。暗紫色の結晶の形態の化合物９が得られ、その収率は、８について観察された収率と同程度であった。
MS(ES, m/z): Calculated: C31H24F6Ru: 568.108 (M). Found: 568.119.
IR (cm-1): 2265 (medium, vN≡C), 841 (strong, vPF).
IH NMR (300 MHz, CD3CN, 300K): 10.01 (dd, 1H, 3J=5.0, 4J=1.3, H0), 8.76 (dd, 1H, 3J=8.1, 4J=1, Hp), 8.31 (dd, 1H, 3J=8.1, 4J=5.0, Hphen), 7.99-8.04 (m, 3H, H0+, H1+ Hphen), 7.97 (s, 2H, H5), 7.65 (td, 2H, 3J=7.7, 4J=1.5, H2), 7.52 (m, 2H, H3), 7.37 (td, 1H, 3J=5.5, 4J=1.3, Hp), 7.14 (dd, 2H, 3J=5.4, 4J=2.7, Hm), 6.73 (td, 2H, 3J=6.6, 4J=1.3, H4), 2.66 (s, 3H, CH3), 2.09 (s, 3H, NCCH3).
13C NMR (100.62 MHz, CD3CN, 300K): 165.5, 155.4, 153.8, 151.1, 145.0, 136.8, 135.4, 134.0, 131.7, 131.1, 130.2, 128.7, 128.3, 126.9, 125.6, 124.9, 122.6, 120.1,
Anal.: Calculated for C31H24F6N5PRu:
C, 52.25; H, 3.39; N, 9.83. Found: C, 50.87; H, 3.21; N, 9.70 %.
【００５５】
実施例２：膠芽腫及び結腸癌のヒト細胞系の培養における、ルテニウムに由来する化合物の細胞増殖抑制及び細胞毒性効果の分析
ルテニウム由来化合物の抗癌効果の特性評価の第一段階は、培養によって保持されている腫瘍株に対する前記化合物の活性を試験し、そして、抗癌治療に対して異なる耐性を有する株に対する前記化合物の効果を比較することを含む。ヒトの膠芽腫株（Ａ１７２）及び結腸癌株（ＨＣＴ１１６）を使用して、本発明に係る化合物の細胞増殖抑制効果を試験した。比較のための細胞毒性剤としてシスプラチンを選択した。第１のアプローチとして、ＭＴＴ試験を使用してミトコンドリア酵素の活性を測定し、細胞の数を推定した。
【００５６】
結果
いくつかのルテニウムに由来する化合物は、試験した株Ａ１７２、ＨＣＴ１１６のうちの１つ以上の腫瘍細胞の数を低減した。最も活性の高い化合物（化合物（１）〜（１２））については、シスプラチンと同程度の濃度又はシスプラチンよりも低い濃度でこの効果がみられた。これらの実験に基づいて、対照条件と比較して存在する腫瘍細胞の量を半分に減少させるのに必要とされる濃度に対応するＩＣ５０値を推定した。これら結果を表１に要約する。
【００５７】
【表１】
2012531461.tif 000008
【００５８】
方法：ＭＴＴ試験
縦型クリーンベンチ下で実験を行った。細胞増殖培地は、ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）、ＨＥＰＥＳ、１０％のＦＣＳ（ウシ胎仔血清）、５％のＰＳ（ペニシリン、ストレプトマイシン）で構成されており、そして＋４℃にて、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ＝７．４）中で保存された。トリプシン−ＥＤＴＡ（１mMのＮａ４（ＥＤＴＡ）中０．２５％のトリプシン）及びＦＣＳを−１５℃で保存し、使用前に解凍した。ＭＴＴ（４，５−ジメチルチアゾール−２−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）はAldrichによって製造されている黄色の固体である。ＭＴＴを５mg/mLの濃度で無菌溶液に入れ、＋４℃で保存した。生細胞の染色剤として使用するとき、細胞培養培地で１０％に希釈した。
【００５９】
European Type Culture Collectionからヒトの結腸癌細胞（ＨＣＴ−１１６）又は膠細胞（Ａ−１７２）を購入し、１０mLの培地を含む円形のペトリ皿（直径１０cm）に入れて、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータ内に置いた。十分に多数になったとき（７０％コンフルエント）、周囲温度にてＰＢＳで洗浄し、次いで、１．５mLのトリプシン−ＥＤＴＡと混合して、ペトリ皿から前記細胞を分離させた。この細胞懸濁液を３７℃に加熱した培養培地に入れ、次いで、この溶液を９６−ウェル細胞培養プレート（１００μL／ウェル）に広げ、細胞が５０％コンフルエントに達するまで２４〜４８時間インキュベートした。前記培地を、３７℃で様々な濃度のＲＤＣ及びシスプラチンを含有する細胞培地に交換し、これをインキュベートした。４８時間後、前記培地を、培地中３７℃のＭＴＴ溶液に交換し、これを少なくとも１時間、又はＭＴＴの錯体形成による紫色結晶が各ウェルの底部で定量的に形成されるまでインキュベートした。最後に、周囲温度で前記培地をＨＣｌ／１ＰｒＯＨの０．０４Ｍ溶液（１００μL／ウェル）に交換し、結晶を溶解させた。得られた溶液の光学密度を読み取った。ＲＤＣ又はシスプラチンで処理されたウェルの光学密度を、未処理ウェル（対照）の光学密度と比較した。
【００６０】
操作は、４枚のプレート（３×ＲＤＣ及びシスプラチン）の処理を含んでいた。各プレートは、異なる濃度の単一の生成物を含有していた。５０、２０、１５、１０、７．５、５、２．５、１、及び０．２μMで９本のカラムを処理し、そして対照として３本のカラムを残した。プレートの各端に位置する対照カラムは、考慮に入れなかった。計算のために３番目の対照カラムは考慮に入れた。
【００６１】
Prism GraphPadソフトウェアｖ．４を使用して、ＩＣ５０の決定及び統計学的Newmann-Keuls分散検定を行った。
【００６２】
ＭＴＴ試験の結果：
Ａ１７２細胞についてのＭＴＴ試験の結果を図２及び３に示す。
【００６３】
Ａ１７２のウェルを、９６−ウェルプレートで１０％の子ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地中にて培養した。５０％コンフルエントで、シスプラチン（ｃｉｓｐ）、又は指定の濃度（１、５、１５、５０μＭ）の様々なルテニウム由来化合物を用いて細胞を処理した。ＭＴＴ試験（ＭＴＴ、Sigma）を使用してウェル中に存在する細胞の量を評価し、その反応生成物をElisaプレートリーダ（Metertech, USA）（４９０〜６５０nm）で定量した。得られた結果を対照状態（１００％生存率）の値と比較した。
【００６４】
実施例３：本発明の化合物による癌細胞の増殖の阻害に関する研究
化合物８及び９が癌細胞の増殖を阻害する能力について、既に記載したＭＴＴ方法を使用して研究し、これによって細胞の数を推定した。既に記載した培養条件下で、様々な起源（表２を参照）の癌株に対してこれらの研究を行った。各株についてＩＣ５０値（μM）を決定し、そして、参照であるルテニウム由来化合物について得られた値と比較した。実施した全ての実験において、WO 2006/016069に記載されており、そして以下の式：
【００６５】
【化７】
2012531461.tif 000009
を満たす参照化合物よりも本発明の２つの化合物の効果の方が高かった。
【００６６】
【表２】
2012531461.tif 000010
【００６７】
実施例４：本発明の化合物で処理した後の細胞周期のプロファイルに関する研究
ヨウ化プロピジウムで細胞を染色して、細胞ＤＮＡの量を可視化した後、ＦＡＣＳ技術（蛍光活性化細胞選別器、すなわちフローサイトメーターと細胞選別器とが接続された装置）を使用して細胞プロファイルに対する化合物８及び９の効果を研究した。これらの分析で、本発明の化合物で処理した後に細胞が蓄積する細胞周期相を可視化することができ、アポトーシスによる細胞死が誘導されているかどうかが分かる。
【００６８】
結果は、ＨＣＴ１１６株において、化合物８及び９が、用いられる薬剤の濃度に比例してＧ１期で細胞周期の停止を誘導するか、又は細胞死（Ｓｕｂ−Ｇ１期を特徴とする）を誘導することを示す（図４を参照されたい）。
【００６９】
この実験では、指定の用量（１μM及び５μM）でＨＣＴ１１６細胞を４８時間処理した。４８時間の処理時間後、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝生理食塩水）で細胞を３回洗浄し、そして９０％のエタノールで固定した。次いで、ヨウ化プロピジウム／RNasaの溶液で細胞を染色した。次いで、FACScanフローサイトメーター及びCellQuestソフトウェア（Becton Dickinson）を使用して染色された細胞（１つのサンプル当たり１００００個）をカウントし、ＤＮＡ含量及び細胞周期のプロファイルを決定した。
【００７０】
実施例５：本発明に係る化合物の急性毒性に関する研究
化合物８及び９によって誘導される急性毒性について、様々な濃度（１kg当たり２、７．５、１５、３０及び６０μmol）で単回用量の生成物を注射した後、８週齢のＢｌａｃｋ−６マウスにおいて研究した。５０％の死亡率を誘導する用量（ＬＤ５０）を計算し、以下の表３に示す。比較として、上記参照化合物の急性毒性を示す。この実験は、化合物８が参照化合物（５７．５μmol/kg）よりも高い毒性（２２．５μmol/kg）を有するが、一方、化合物９の毒性はより低い（＞６０μmol/kg）ことを示した。
【００７１】
この実験では、１用量当たり５匹の動物群に腹腔内経路を介して注入を行った。１５日間にわたって動物の体重及び生存を追跡した。
【００７２】
【表３】
2012531461.tif 000011
【００７３】
実施例６：本発明に係る化合物の作用機序に関する研究
どの作用機序を介して化合物８及び９が細胞増殖の遅延又は細胞死を導くことができるのかを決定するために、２つの特異的マーカーの活性化、すなわち、ＣＨＯＰタンパク質の発現、及びセリン部位１３７におけるヒストンＨ２ＡＸのリン酸化をモニタした。ＣＨＯＰタンパク質は、アポトーシス促進特性（細胞死の誘導）を有する。Ｈ２ＡＸヒストンのリン酸化は、アポトーシス促進特性又は細胞増殖を遅延させる特性を有するタンパク質であるｐ５３の活性化を導くＤＮＡ損傷のマーカーである。
【００７４】
結果は、化合物８及び９が参照化合物よりもＣＨＯＰタンパク質の発現及びＨ２ＡＸヒストンのリン酸化の誘導においてより効果的であることを示す（図５を参照）。
【００７５】
これらの実験では、２つの濃度（５μM及び１０μM）の前記化合物で腫瘍細胞Ａ１７２を６時間処理した。６時間の処理時間後、細胞を溶解させ、そして、３０ｇの可溶性タンパク質を１２％のポリアクリルアミドゲルで分離した。泳動後、ウェスタンブロット技術を使用して、ニトロセルロース上にタンパク質を転写した。次いで、特異的な一次抗体を使用して、タンパク質ＣＨＯＰ及びＨ２ＡＸを検出し、ＥＣＬキットを用いてそのペルオキシダーゼ活性が同定される対応する二次抗体によって前記タンパク質を認識した。
【００７６】
実施例７：本発明に係る化合物の抗腫瘍活性に関する研究
これらの分子の抗癌能を決定するために、Ｂｌａｃｋ−６マウスに移植されたインビボ黒色腫モデルＦ１０Ｂ１６を使用して、腫瘍増殖に対する化合物８及び化合物９の効果を分析した。これらの結果を参照化合物の結果と比較した。腫瘍を有するマウスにおける慢性処置（７．５μmol/kgで週２回）によって、腫瘍増殖が低減された。腫瘍増殖の低減（処理された腫瘍の体積／処理されていない腫瘍の体積：Ｔ／Ｃ）は、化合物８で約８０％、化合物９で約６０％であった（表４、図６及び７を参照）。
【００７７】
【表４】
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【００７８】
これらの実験では、８週齢のＢｌａｃｋ−６マウスにＦ１ＰＢ１６細胞（２００  ０００細胞）を皮下移植した。１条件当たり６匹のマウス群を形成した。腫瘍が約１００mm3の体積であることが明白になったとき、処置を開始した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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