(57)【要約】  場合によっては先に凍結乾燥が施されていない、治療的有効量の抗体と、ｐＨを約４．５〜約６．５の範囲に維持するバッファーと、任意成分の界面活性剤を含有してなる製剤を、このような製剤の用途と共に記載する。
2012519706.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ４．５〜６．５のヒスチジン-アルギニンバッファー中に治療的有効量の抗体を含有してなる製剤。
【請求項２】
バッファーがｐＨ５．０〜６．０の酢酸ヒスチジン-酢酸アルギニンバッファーであるか、又はバッファーがコハク酸ヒスチジン-コハク酸アルギニンのバッファーであり、ｐＨが５．０〜６．０である請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
バッファー中の酢酸ヒスチジン又はコハク酸ヒスチジンの濃度が約５ｍＭ〜約１００ｍＭである請求項２に記載の製剤。
【請求項４】
酢酸ヒスチジン又はコハク酸ヒスチジンの濃度が約２０ｍＭである請求項２に記載の製剤。
【請求項５】
バッファー中の酢酸アルギニン又はコハク酸アルギニンの濃度が約５０ｍＭ〜約５００ｍＭである請求項２に記載の製剤。
【請求項６】
酢酸アルギニン又はコハク酸アルギニンの濃度が約１５０ｍＭである請求項２に記載の製剤。
【請求項７】
界面活性剤をさらに含有する請求項１に記載の製剤。
【請求項８】
界面活性剤がポリソルベートである請求項７に記載の製剤。
【請求項９】
ポリソルベートがポリソルベート２０である請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
界面活性剤の濃度が０．０００１％〜約１．０％である請求項９に記載の製剤。
【請求項１１】
界面活性剤の濃度が０．０１％〜約０．１％である請求項１０に記載の製剤。
【請求項１２】
界面活性剤の濃度が０．０２％である請求項１１に記載の製剤。
【請求項１３】
抗体濃度が約１０ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌである請求項１に記載の製剤。
【請求項１４】
抗体濃度が約１００ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌである請求項１に記載の製剤。
【請求項１５】
抗体濃度が約１５０ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌである請求項１に記載の製剤。
【請求項１６】
抗体濃度が約２５ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌである請求項１に記載の製剤。
【請求項１７】
抗体に事前の凍結乾燥が施されない請求項１に記載の製剤。
【請求項１８】
メチオニンをさらに含有する請求項１に記載の製剤。
【請求項１９】
メチオニン濃度が５ｍｇ／ｍｌである請求項１８に記載の製剤。
【請求項２０】
ＥＤＴＡをさらに含有する請求項１に記載の製剤。
【請求項２１】
ＥＤＴＡ濃度が１ｍＭ ＥＤＴＡである請求項２０に記載の製剤。
【請求項２２】
バッファーが２０ｍＭの酢酸ヒスチジン及び１５０ｍＭの酢酸アルギニン、ｐＨ５．５であり、界面活性剤が約０．０１〜０．１％ｖ／ｖ量のポリソルベートであり、製剤が約２〜８℃の温度で少なくとも１２ヶ月安定しているか、又はバッファーが２０ｍＭのコハク酸ヒスチジン及び１５０ｍＭのコハク酸アルギニン、ｐＨ５．５であり、界面活性剤が約０．０１〜０．１％ｖ／ｖ量のポリソルベートであり、製剤が約２〜８℃の温度で少なくとも１２ヶ月安定している請求項７に記載の製剤。
【請求項２３】
製剤が薬学的製剤である請求項１に記載の製剤。
【請求項２４】
製剤が約２５℃での保存時に少なくとも１２ヶ月安定しているか、又は製剤が約５℃での保存時に少なくとも１２ヶ月安定しているか、又は製剤が約−２０℃での保存時に少なくとも１２ヶ月安定している請求項１に記載の製剤。
【請求項２５】
治療的有効量の抗体、約ｐＨ５．０〜約６．０の酢酸ヒスチジン-酢酸アルギニンのバッファー、及び界面活性剤を含有する水性薬学的製剤を収容する容器、又は治療的有効量の抗体、約ｐＨ５．０〜約６．０のコハク酸ヒスチジン-コハク酸アルギニンのバッファー、及び界面活性剤を含有する水性薬学的製剤を収容する容器を含む製造品。
【請求項２６】
治療的有効量の抗体、約ｐＨ５．０〜約６．０の酢酸ヒスチジン-酢酸アルギニンのバッファー、及び界面活性剤を組合せることにより、又は治療的有効量の抗体、約ｐＨ５．０〜約６．０のコハク酸ヒスチジン-コハク酸アルギニンのバッファー、及び界面活性剤を組合せることにより、水性薬学的製剤中において抗体を安定化させる方法。
【請求項２７】
(ａ)約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬの量の脱アミド化又は凝集しやすい完全長ＩｇＧ１抗体；(ｂ)酢酸ヒスチジン-酢酸アルギニンのバッファー、ｐＨ５．０〜６．０；及び(ｃ)約０．０１％〜約０．１％の量のポリソルベート２０を含有する薬学的製剤。
【請求項２８】
(ａ)約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬの量の脱アミド化又は凝集しやすい完全長ＩｇＧ１抗体；(ｂ)コハク酸ヒスチジン-コハク酸アルギニンのバッファー、ｐＨ５．０〜６．０；及び(ｃ)約０．０１％〜約０．１％の量のポリソルベート２０を含有する薬学的製剤。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
この出願は、その明細書の全体が出典明示によりここに援用される２００９年３月６日出願の米国仮出願第６１／１５８３３１号について優先権及びその利益を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
この発明は抗体を含有する製剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
過去何年かで、生物工学における進歩は、組換えＤＮＡ技術を使用する薬学的用途のための様々なタンパク質を製造することを可能にした。タンパク質は伝統的な有機及び無機薬剤よりも大きく、さらに複雑である(例えば、複雑な３次元構造に加えて、多数の官能基を有する)ため、このようなタンパク質の製剤化には特別な問題がある。タンパク質が生物学的に活性なままであるためには、タンパク質の多数の官能基を分解から保護すると同時に、タンパク質のアミノ酸の少なくともコア配列の立体構造の完全性をインタクトなままに保たなければならない。タンパク質の分解経路は、化学的不安定性(例えば、新規の化学物質を生じる結合形成又は切断によるタンパク質の修飾を含む任意のプロセス)、又は物理的不安定性(例えば、タンパク質の高次構造における変化)に関与しうる。化学的不安定性は、脱アミド化、ラセミ化、加水分解、酸化、ベータ脱離、又はジスルフィド交換から生じうる。物理的不安定性は、例えば変性、凝集、沈殿又は吸着から生じうる。３種の最も一般的なタンパク質分解経路は、タンパク質凝集、脱アミド化及び酸化である。Clelandら Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 (1993)。
【０００４】
薬学的用途に使用されるタンパク質に含まれるのは抗体である。治療に有用な抗体の例は酸化ＬＤＬに結合する抗体である。治療用途に適した抗体、例えば抗ｏｘＬＤＬ抗体を含有する安定した水性薬学的製剤が当該分野において必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、治療的有効量の抗体、約４．５〜約６．５の範囲にｐＨを維持するバッファー、及び場合によっては界面活性剤を含有する製剤を提供する。ある実施態様では、製剤は少なくとも１２ヶ月、約２〜８℃の温度で安定している。典型的には、これにより、例えば薬学的用途に使用される水性製剤が得られる。本発明のある種の実施態様では、製剤は安定した水性製剤である。ある種の実施態様では、製剤は安定した水性薬学的製剤である。
【０００６】
ここでの発明は、少なくとも部分的には、モノクローナル抗体、特に凝集しやすい完全長抗体を製剤化するのに特に有用なバッファーとして、ｐＨ４．５〜６．５のヒスチジン及びアルギニンの組合せの特定に関する。該製剤はその中の抗体製品の分解を遅延させる。本発明のある種の実施態様では、ヒスチジンとアルギニンのバッファーは、ｐＨ５．０〜６．０の酢酸ヒスチジン及び酢酸アルギニンのバッファーである。本発明のある種の実施態様では、ヒスチジンとアルギニンのバッファーは、ｐＨ４．５〜６．５のコハク酸ヒスチジン及びコハク酸アルギニンのバッファーである。本発明のある種の実施態様では、製剤は滅菌されている。
【０００７】
ここでのバッファーの製剤は、４．５〜６．５のｐＨ、例えば５．０〜６．０のｐＨ、ｐＨ５．２５〜５．７５、又はｐＨ５．３〜５．６を有する。本発明のある種の実施態様では、製剤は５．５又は約５．５のｐＨを有する。本発明のある種の実施態様では、製剤は５．６又は約５．６のｐＨを有する。
【０００８】
よって、一態様では、本発明は、ｐＨ４．５〜６．５の酢酸ヒスチジン及び酢酸アルギニンのバッファーにモノクローナル抗体を含有してなる製剤に関する。さらなる実施態様では、それは例えば安定な薬学的製剤である。
【０００９】
よって、一態様では、本発明は、ｐＨ４．５〜６．５のコハク酸ヒスチジン及びコハク酸アルギニンのバッファーにモノクローナル抗体を含有してなる製剤に関する。さらなる実施態様では、それは例えば安定な薬学的製剤である。
【００１０】
ある種の実施態様では、バッファー中の酢酸ヒスチジン又はコハク酸ヒスチジンの濃度は約５ｍＭ〜約１００ｍＭである。ある種の実施態様では、酢酸ヒスチジン又はコハク酸ヒスチジンの濃度は約２０ｍＭである。ある種の実施態様では、バッファー中の酢酸アルギニン又はコハク酸アルギニンの濃度は約５０ｍＭ〜約５００ｍＭである。ある種の実施態様では、酢酸アルギニン又はコハク酸アルギニンの濃度は約１５０ｍＭである。
【００１１】
ここでの製剤は、場合によっては界面活性剤を含有しうる。ある種の実施態様では、界面活性剤はポリソルベート(polysorbate)(例えば、ポリソルベート２０)である。ある種の実施態様では、界面活性剤の濃度は０．０００１％〜約１．０％である。ある種の実施態様では、界面活性剤の濃度は０．０１％〜約０．１％である。一実施態様では、界面活性剤の濃度は０．０２％である。製剤は、場合によってはメチオニン(例えば、約５ｍｇ／ｍｌ又は５ｍｇ／ｍｌの濃度で)を含有可能である。製剤は場合によってはキレート剤、例えばＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等を含有可能である。ある種の実施態様では、製剤におけるＥＤＴＡの濃度は１ｍＭ ＥＤＴＡである。
【００１２】
製剤は、典型的には約１０ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌの抗体濃度である。ある種の実施態様では、抗体濃度は約１００ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌである。ある種の実施態様では、抗体濃度は約１５０ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌである。ある種の実施態様では、抗体濃度は約２５ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌである。
【００１３】
他の態様では、本発明は、(ａ)約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬの量の脱アミド化又は凝集しやすい完全長ＩｇＧ１抗体；(ｂ)ｐＨ４．５〜６．５の酢酸ヒスチジン及び酢酸アルギニンのバッファー；及び(ｃ)約０．０１％〜約０．１％の量のポリソルベート２０を含有する薬学的製剤に関する。
【００１４】
他の態様では、本発明は、(ａ)約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬの量の凝集しやすい完全長ＩｇＧ１抗体；(ｂ)ｐＨ４．５〜６．５のコハク酸ヒスチジン及びコハク酸アルギニンのバッファー；及び(ｃ)約０．０１％〜約０．１％の量のポリソルベート２０を含有する薬学的製剤に関する。
【００１５】
ある種の実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。ある種の実施態様では、モノクローナル抗体は完全長抗体(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４等)である。ある種の実施態様では、モノクローナル抗体は抗体断片(例えば、抗原結合領域を含む)である。例えば、抗体断片はＦａｂ又はＦ(ａｂ')２断片である。ある種の実施態様では、モノクローナル抗体はヒト化抗体である。ある種の実施態様では、モノクローナル抗体は凝集しやすい。ある種の実施態様では、抗体には先の凍結乾燥は施されない。
【００１６】
ある種の実施態様では、モノクローナル抗体はｏｘ-ＬＤＬに結合する。さらなる態様では、本発明は、界面活性剤及び約４．５〜約６．５のｐＨのヒスチジン及びアルギニンのバッファー中にｏｘ-ＬＤＬに結合する抗体を含有る薬学的製剤に関する。ある種の実施態様では、ｏｘＬＤＬ抗体は、それぞれ図２の配列番号：３及び４の可変軽鎖及び可変重鎖アミノ酸配列、場合によってはそれぞれ図２の配列番号：６及び７の定常領域(Ｈ及びＬ)を有する。ある種の実施態様では、抗ｏｘＬＤＬ抗体は、図１の核酸によりコードされるＶＨ及びＶＬを有する(配列番号：１及び２)。
【００１７】
また本発明は、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの量のｏｘ-ＬＤＬ抗体、酢酸ヒスチジン及び酢酸アルギニンのバッファー、及びポリソルベート２０を含有する薬学的製剤であって、そのｐＨが約４．５〜約６．５である製剤に関する。
【００１８】
さらに本発明は、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの量のｏｘ-ＬＤＬ抗体、コハク酸ヒスチジン及びコハク酸アルギニンのバッファー、及びポリソルベート２０を含有する薬学的製剤であって、そのｐＨが約４．５〜約６．５である製剤に関する。
【００１９】
またさらに本発明は、治療的有効量の抗体、約４．５〜約６．５の範囲にｐＨを保持するバッファー、及び場合によっては界面活性剤を含有する、安定な水性薬学的製剤を収容する容器を含む製造品に関する。本発明のある種の実施態様では、バッファーは、ｐＨ５．０〜６．０の酢酸ヒスチジン及び酢酸アルギニンのバッファーである。本発明のある種の実施態様では、バッファーはｐＨ５．０〜６．０のコハク酸ヒスチジン及びコハク酸アルギニンのバッファーである。ある種の実施態様では、バッファーのｐＨは５．５である。ある種の実施態様では、バッファーのｐＨは５．６である。また本発明は、場合によっては凍結された形態で、バイアル又はタンクの内部に製剤を含有する、シリンジにより貫通可能なストッパーを具備するバイアル又はタンク(例えば、ステンレス鋼製タンク)に関する。ある種の実施態様では、バイアル又はタンクは、約２〜８℃で保存される。ある種の実施態様では、バイアルは３ｃｃ、２０ｃｃ又は５０ｃｃバイアルである。
【００２０】
さらに、本発明は、(ａ)モノクローナル抗体製剤を調製し；(ｂ)製剤中のモノクローナル抗体の物理的安定性、化学的安定性、又は生物学的活性を評価することを含む、薬学的製剤の作製方法を提供する。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、治療的有効量の抗体、約４．５〜約６．５の範囲にｐＨを保持するバッファー、及び場合によっては界面活性剤を組合せることにより、水性薬学的製剤中の抗体を安定化させる方法に関する。本発明のある種の実施態様では、バッファーは酢酸ヒスチジン及び酢酸アルギニンのｐＨ４．５〜６．５のバッファーである。本発明のある種の実施態様では、バッファーはコハク酸ヒスチジン及びコハク酸アルギニンのｐＨ４．５〜６．５のバッファーである。
【００２２】
また本発明は、酢酸ヒスチジン及び酢酸アルギニンのｐＨ４．５〜６．５のバッファー中で抗体を製剤化することを含む、治療用モノクローナル抗体の凝集を低減させる方法を提供する。さらに本発明は、コハク酸ヒスチジン及びコハク酸アルギニンのｐＨ４．５〜６．５のバッファー中で抗体を製剤化することを含む、治療用モノクローナル抗体の凝集を低減させる方法を提供する。
【００２３】
ここでの製剤及び方法のある種の実施態様では、製剤は安定である。一実施態様では、製剤は、少なくとも１２ヶ月、約２５℃での保存において安定である。一実施態様では、製剤は、少なくとも１２ヶ月、約５℃での保存において安定である。一実施態様では、製剤は、少なくとも１２ヶ月、約−２０℃での保存において安定である。一実施態様では、製剤は、少なくとも２４ヶ月、約５℃での保存において安定である。一実施態様では、製剤は、少なくとも２４ヶ月、約−２０℃での保存において安定である。
【００２４】
ここでの製剤及び方法のある種の実施態様では、製剤は、静脈内(ＩＶ)、皮下(ＳＱ)又は筋肉内(ＩＭ)投与用である。一例では、製剤はＩＶ投与用であり、抗体濃度は約１０ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌである。他の例では、製剤はＳＱ投与用であり、抗体濃度は約８０ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌである。
【００２５】
さらに、本発明は、疾患又は疾病を処置するのに有効な量で、被験者に製剤を投与することを含む、被験者における疾患又は疾病を治療する方法に関する。
【００２６】
さらなる他の態様では、本発明は、哺乳動物に、ここに開示の水性薬学的製剤を治療的有効量投与することを含む、哺乳動物を治療する方法であって、該哺乳動物が、製剤中の抗体での治療を必要とする疾病を患っている方法に関する。さらなる他の態様では、本発明は、アテローム性動脈硬化症を治療するのに有効な量の薬学的製剤を被験者に投与することを含む、被験者のアテローム性動脈硬化症を治療する方法を提供する。抗体がｏｘ-ＬＤＬに結合する場合、治療される疾患の例には、アテローム性動脈硬化症が含まれる。
【００２７】
本発明のこれら態様及びさらなる態様は当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、抗ｏｘＬＤＬ抗体の可変重鎖及び可変軽鎖をコードする核酸配列を示す。
【図２】図２は、抗ｏｘＬＤＬ抗体の可変重鎖及び可変軽鎖及び定常領域Ｈ及びＬのアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、実施例１のｐＨ研究におけるｐＨの関数としてのｉｃＩＥＦによる抗ｏｘＬＤＬ抗体の電荷変異体を示す。プロットは、Ｔ０(菱形)及び４０℃で４週間インキュベートした後(四角)のデータを示す。
【図４】図４は、４０℃でのｐＨの関数としての抗ｏｘＬＤＬ抗体のサイズ変異を示す。プロットは、Ｔ０(菱形)、１週間(四角)、２週間(三角)、及び４週間(丸)でのデータを示す(ｐＨ研究)。
【図５】図５は、４０℃で４週間インキュベートした抗ｏｘＬＤＬ抗体の主要ピークパーセントを示すＣＥ-ＳＤＳ ＵＶ(非還元)データを例証する(賦形剤研究)。
【図６】図６は、４０℃で４週間インキュベートした抗ｏｘＬＤＬ抗体試料を示すＥＬＩＳＡ結合データを示す。
【図７】図７Ａ及びＢは、（Ａ）ＳＥＣを使用しての様々な濃度での抗ｏｘＬＤＬ抗体の凝集体パーセント、及び（Ｂ）ｉｃＩＥＦを使用しての様々な濃度での抗ｏｘＬＤＬ抗体の酸性ピークパーセントを示す。
【図８】図８は、ＳＥＣを使用しての様々な酸化剤を用いた抗ｏｘＬＤＬ抗体の凝集体パーセントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
Ｉ．定義
本発明を詳細に記載する前に、この発明は、特定の組成物及び生物システムに限定されるものではなく、もちろん様々でありうることは理解されなければならない。また、ここで使用される用語は、特定の実施態様を記載するためだけを目的としており、限定することを意図するものではないことが理解されなければならない。この明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他の定義を示しているものでないならば、複数の指示対象を含む。よって、例えば「ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ」なる記載は、場合によっては２又はそれ以上のそのような分子の組合せ等を含む。
【００３０】
「薬学的製剤」なる用語は、活性成分の生物学的活性を有効であるようにする形態であり、製剤が投与されるであろう被験者に許容できない毒性のある付加的な成分を含んでいない調製物を意味する。このような製剤は滅菌されている。「薬学的に許容可能な」賦形剤(ビヒクル、添加剤)は、用いられる活性成分の有効量をもたらすために被験哺乳動物に合理的に投与されうるものである。
【００３１】
「滅菌」製剤は、無菌的又は全ての生存している微生物及びそれらの胞子を含まないか又は本質的に含まない。
【００３２】
ここで、「凍結」製剤は、０℃以下の温度でのものである。一般的に、凍結製剤はフリーズドライされていなし、前に又は続いて凍結乾燥が施されていない。ある種の実施態様では、凍結製剤は、保存(ステンレス鋼製タンクで)のための凍結薬剤物質、又は凍結薬剤製品(最終的なバイアル形態で)を含む。
【００３３】
「安定な」製剤は、保存の際にその中のタンパク質がその物理的安定性及び／又は化学的安定性及び／又は生物学的活性を本質的に保持しているものである。好ましくは、製剤は、保存時にその物理的及び化学的安定性、並びにその生物学的活性を本質的に保持している。保存期間は、一般的に製剤の意図される有効期間に基づき選択される。タンパク質安定性を測定するための様々な分析技術が当該分野において利用可能であり、例えば、Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee編, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) 及び Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)に概説されている。安定性は、選択された期間、選択された温度で測定することができる。ある種の実施態様では、製剤は約４０℃で少なくとも約２〜４週間安定しており、及び／又は約５℃で少なくとも３ヶ月安定しており、及び／又は約５℃で少なくとも６ヶ月安定しており、及び／又は約５℃で少なくとも１２ヶ月安定しており、及び／又は約−２０℃で少なくとも３ヶ月又は少なくとも１年安定している。ある種の実施態様では、製剤は約２５℃で少なくとも６ヶ月安定しており、及び／又は約２５℃で１２ヶ月安定しており、及び／又は約５℃で６ヶ月安定しており、及び／又は約５℃で１２ヶ月安定しており、及び／又は約−２０℃で少なくとも６ヶ月安定しており、及び／又は約−２０℃で少なくとも１２ヶ月安定しており、及び／又は５℃又は−２０℃で少なくとも２年安定している。ある種の実施態様では、製剤は、製剤の凍結(例えば−７０℃に)及び解凍の後、例えば凍結及び解凍の１、２又は３サイクルの後でも安定している。安定性は、凝集体形成の評価(例えば、サイズ排除クロマトグラフィーの使用、濁度の測定、及び／又は目視検査)；カチオン交換クロマトグラフィー、イメージキャピラリー等電点電気泳動(ｉｃＩＥＦ)又はキャピラリーゾーン電気泳動を使用する電荷不均一性の評価；アミノ末端又はカルボキシ末端配列分析；質量分析；還元型及びインタクト抗体を比較するＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析；ペプチドマップ(例えば、トリプシン又はＬＹＳ-Ｃ)分析；抗体の生物学的活性又は抗原結合機能の評価等を含む様々な異なる方法で定性的及び／又は定量的に評価することができる。不安定性は、凝集、脱アミド化(例えば、Ａｓｎ脱アミド化)、酸化(例えば、Ｍｅｔ酸化)、異性化(例えば、Ａｓｐ異性化)、クリッピング／加水分解／断片化(例えば、ヒンジ領域断片化)、スクシンイミド形成、不対システイン(類)、Ｎ末端伸長、Ｃ末端プロセシング、グルコシル化差異等の何れか一又は複数を含みうる。
【００３４】
タンパク質が、色調及び／又は透明度の目視検査において、又はＵＶ光散乱又はサイズ排除クロマトグラフィーで測定して、凝集、沈殿及び／又は変性の徴候を全く又はほとんど示さないならば、タンパク質は薬学的製剤中で「その物理的安定性を保持している」。
【００３５】
与えられた時間での化学的安定性が、タンパク質が以下に定めるような生物学的活性を尚も保持していると考えられるようならば、タンパク質は薬学的製剤中で「その化学的安定性を保持している」。化学的安定性は、タンパク質の化学的に変性した形態を検出し定量することにより評価することができる。化学的変化には、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び／又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析(ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ ＭＳ)を使用して評価可能なサイズ修飾(例えば、クリッピング)が含まれうる。他の種類の化学的変化には、例えばイオン交換クロマトグラフィー又はｉｃＩＥＦにより評価することができる荷電変化(例えば、脱アミド化の結果生じる)が含まれる。
【００３６】
与えられた時間での抗体の生物学的活性が、例えば抗原結合アッセイにおいて測定される場合、薬学的製剤が調製された時点で示された生物学的活性の約１０％以内(アッセイの誤差内)であるならば、抗体は薬学的製剤中において「その生物学的活性を保持している」。抗体についての他の「生物学的活性」アッセイは、以下にここで詳述される。
【００３７】
ここで、モノクローナル抗体の「生物学的活性」は、抗原に結合する抗体の能力を意味する。それは、抗体が抗原に結合し、インビトロ又はインビボで測定されうる測定可能な生物学的応答を生じる場合を含みうる。そのような活性はアンタゴニスト作用又はアゴニスト作用でありうる。
【００３８】
ここでの「脱アミド化した」モノクローナル抗体は、その一又は複数のアスパラギン残基が、例えばアスパラギン酸又はイソアスパラギン酸に誘導体化されたものである。
【００３９】
「脱アミド化しやすい」抗体は、脱アミド化する傾向にあることが見出されている一又は複数の残基を有するものである。
【００４０】
「凝集しやすい」抗体は、特に凍結及び／又は攪拌の際に、他の抗体分子(群)と凝集することが見出されているものである。
【００４１】
「断片化しやすい」抗体は、例えばそのヒンジ領域で、２又はそれ以上の断片に切断されることが見出されているものである。
【００４２】
「脱アミド、凝集、又は断片化を低減する」とは、様々なｐＨ又は様々なバッファー中において製剤化されたモノクローナル抗体に対して、脱アミド化、凝集又は断片化の量を意図的に防止し又は低減するものである。
【００４３】
製剤化される抗体は、好ましくは本質的に純粋で、望ましくは本質的に均一(例えば、汚染タンパク質を含まない等)である。「本質的に純粋」な抗体とは、組成物の全重量に基づき、少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも９５重量％の抗体を含む組成物を意味する。「本質的に均一な」抗体とは、組成物の全重量に基づき、少なくとも約９９重量％の抗体を含む組成物を意味する。
【００４４】
「等張」とは、関心ある製剤が、ヒトの血液と本質的に同じ浸透圧を有していることを意味する。等張な製剤は、一般的に約２５０〜３００ｍＯｓｍの浸透圧を有するであろう。等張性は、例えば蒸気圧又は氷-凍結型浸透圧計を使用して測定することができる。
【００４５】
ここで使用される場合、「バッファー」とは、その酸性ベースのコンジュゲート成分の作用により、ｐＨの変化に抗する緩衝液を意味する。この発明のバッファーは、約４．５〜約７．０、又は約４．５〜約６．５、又は約５．０〜約６．０の範囲のｐＨを有するか、又は約５．５のｐＨを有するか、又は５．５のｐＨを有するか、又は約５．６のｐＨを有するか、又は５．６のｐＨを有する。この範囲にｐＨをコントロールするバッファーの例には、アセテート、スクシネート、スクシネート、グルコネート、ヒスチジン、シトレート、グリシルグリシン、及び他の有機酸バッファーが含まれる。
【００４６】
「ヒスチジンバッファー」は、ヒスチジンイオンを含むバッファーである。ヒスチジンバッファーの例には、塩化ヒスチジン、酢酸ヒスチジン、リン酸ヒスチジン、硫酸ヒスチジン、コハク酸ヒスチジン等が含まれる。一実施態様では、ここでの実施例で特定されたヒスチジンバッファーは、酢酸ヒスチジンであることが見出された。その一実施態様では、酢酸ヒスチジンバッファーは、酢酸(液体)でＬ-ヒスチジン(遊離塩基、固体)を滴定することにより調製される。ある種の実施態様では、ヒスチジンバッファー又は酢酸ヒスチジンバッファーは、ｐＨ４．５〜６．５である。一実施態様では、バッファーはｐＨ５．５を有する。一実施態様では、ここでの実施例で特定されたヒスチジンバッファーは、コハク酸ヒスチジンであることが見出された。一実施態様では、コハク酸ヒスチジンバッファーはｐＨ４．５〜６．５である。一実施態様では、バッファーはｐＨ５．５を有する。一実施態様では、バッファーはｐＨ５．６を有する。
【００４７】
「ヒスチジンアルギニンバッファー」は、ヒスチジンイオンとアルギニンイオンを含むバッファーである。ヒスチジンバッファーの例には、塩化ヒスチジン-塩化アルギニン、酢酸ヒスチジン-酢酸アルギニン、リン酸ヒスチジン-リン酸アルギニン、硫酸ヒスチジン-硫酸アルギニン、コハク酸ヒスチジン-コハク酸アルギニン等が含まれる。一実施態様では、ここでの実施例で特定されたヒスチジン-アルギニンバッファーは、酢酸ヒスチジン-酢酸アルギニンであることが見出された。その一実施態様では、酢酸ヒスチジンバッファーは、酢酸(液体)でＬ-ヒスチジン(遊離塩基、固体)を滴定することにより、また酢酸(液体)でＬ-アルギニン(遊離塩基、固体)を滴定することにより、調製される。一実施態様では、ヒスチジン-アルギニンバッファーは、ｐＨ４．５〜６．５である。一実施態様では、バッファーはｐＨ５．５を有する。一実施態様では、ここでの実施例で特定されたヒスチジン-アルギニンバッファーは、コハク酸ヒスチジン-コハク酸アルギニンであることが見出された。一実施態様では、コハク酸ヒスチジン-コハク酸アルギニンバッファーは、ｐＨ４．５〜６．５である。一実施態様では、バッファーはｐＨ５．５を有する。一実施態様では、バッファーはｐＨ５．６を有する。
【００４８】
ここで、「界面活性剤」は、表面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤を意味する。ここで、界面活性剤の例には、ポリソルベート(例えば、ポリソルベート２０、及びポリソルベート８０)；ポロキサマー(例えば、ポロキサマー１８８）；トリトン；ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)；ラウリル硫酸ナトリウム；オクチルグリコシドナトリウム；ラウリル-、ミリスチル-、リノレイル-、又はステアリル-スルホベタイン；ラウリル-、ミリスチル-、リノレイル-、又はステアリル-サルコシン；リノレイル-、ミリスチル-、又はセチル-ベタイン；ラウロアミドプロピル-、コカミドプロピル-、リノレアミドプロピル-、ミリスタミドプロピル-、パルミドプロピル-、又はイソステアラミドプロピル-ベタイン(例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピル-、パルミドプロピル-、又はイソステアラミドプロピル-ジメチルアミン；ナトリウムメチルココイル-、又はジナトリウムメチルオレイル-タウレート；及びMONAQUATＴＭシリーズ（Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.）；ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、及びエチレンとプロピレングリコールのコポリマー(例えば、Pluronics、PF68等）等が含まれる。一実施態様では、ここでの界面活性剤はポリソルベート２０である。
【００４９】
薬理学的意味において、本発明の文脈中、抗体の「治療的有効量」とは、抗体が有効な疾患の予防又は治療において有効な量を意味する。「疾患」は、抗体での治療から恩恵をうる何らかの症状である。これには、当該疾患に哺乳動物を罹患させる病理状態を含む、慢性及び急性の疾患又は疾病が含まれる。
【００５０】
「保存料」は、場合によっては製剤に含有せしめられて、そこでの細菌の作用を本質的に低減させ、よって例えば多用途製剤の製造を容易にすることができる化合物である。可能ま保存料の例には、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム(アルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリドの混合物)、及び塩化ベンゼトニウムが含まれる。他の種類の保存料には、芳香族アルコール、例えばフェノール、ブチル及びベンジルアルコール、アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３-ペンタノール、及びｍ-クレゾールが含まれる。一実施態様では、ここでの保存料はベンジルアルコールである。
【００５１】
「ポリオール」は複数のヒドロキシル基を有する物質であり、糖類(還元及び非還元糖)、糖アルコール類、及び糖酸が含まれる。ポリオールは、場合によっては製剤中に含まれうる。ある種の実施態様では、ここでのポリオールは約６００ｋＤ未満(例えば、約１２０〜約４００ｋＤの範囲内)の分子量を有する。「還元糖」は、金属イオンを還元するか、又はタンパク質中のリジン及び他のアミノ基と共有的に反応しうるヘミアセタール基を含むものであり、「非還元糖」は還元糖のこれらの特性を有さないものである。還元糖の例はフルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース及びグルコースである。非還元糖にはスクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、及びラフィノースが含まれる。マンニトール、キシリトール、エリトリトール、スレイトール(threitol)、ソルビトール、及びグリセロールは、糖アルコールの例である。糖酸に関しては、これらにはＬ-グルコネート及びその金属塩が含まれる。製剤が凍結-解凍安定性であることが望まれる場合、製剤中の抗体を不安定化しないように、ポリオールは好ましくは凍結温度(例えば−２０℃)で結晶化しないものである。ある種の実施態様では、非還元糖、例えばスクロース及びトレハロースはポリオールの例であり、トレハロースの溶液安定性のために、トレハロースがスクロースよりも好ましい。
【００５２】
ここで使用される抗ＯｘＬＤＬ抗体は、(例えば、ＡｐｏＢ-１００等の)ＬＤＬ中のタンパク質抗原に結合する抗体である。例えば、ＩＥＩ-Ｅ３、ＬＤＯ-Ｄ４、ＫＴＴ-Ｂ８、及び２-ＤＯ３(例えば、国際公開第２００４／０３０６０７号)を参照。ＡｐｏＢ-１００は、ヒト血清中におけるコレステロールの主要な担体であるＬＤＬのタンパク質成分である。ＬＤＬの酸化は、アテローム生成粒子へのその転換における重要な工程であり、酸化的修飾により、最も早い可視可能な動脈硬化病変である脂肪線条の初期形成が促進される。
【００５３】
抗ｏｘＬＤＬ抗体の例は、酸化ＬＤＬに対して産生される完全なヒトモノクローナルＩｇＧ１抗体である２-ＤＯ３である。抗体２ＤＯ３の可変重鎖及び可変軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列を図１に与え、それぞれ配列番号：１及び配列番号：２を割り当てた。抗体２ＤＯ３の可変重鎖及び可変軽鎖のアミノ酸配列を図２に与え、それぞれ配列番号：３及び配列番号：４を割り当てた。定常領域Ｈ及びＬには、図２のように、配列番号：６及び７を割り当てた。また、２-ＤＯ３は、国際公開第２００４／０３０６０７号の図３に与えられたような少なくともＶＨ及びＶＬ配列を有し(又は米国特許第２００４０２０２６５３号の配列番号：２７及び２８)、及び国際公開第２００７／０２５７８１号の表２に列挙された抗体のＣＤＲ配列を有する抗体を意味する。
【００５４】
抗ｏｘＬＤＬ抗体の生物学的活性は、ｏｘ-ＬＤＬに結合し、場合によっては、例えばプラーク形成を阻害し、動脈硬化病変の発生を予防するであろう(例えば、Schiopuら, 2004の動物モデル；国際公開第２００４／０３０６０７号；米国特許第６７１６４１０号に記載)。他の活性には、処置の数週間後、大動脈において、既存の確立された動脈硬化プラークの退縮を活発に誘導することを含む(例えば、国際公開第２００７／０２５７８１号)。
【００５５】
アテローム性動脈硬化は、喫煙、高血圧、真性糖尿病、高コレステロール血症、高血漿低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)及びトリグリセリド、高フィブリノーゲン血症及び高血糖を含む、生化学的危険因子を呈する被験者に優先的に発病する多因子疾患である。アテローム性動脈硬化は、大及び中サイズの動脈の再内側層(内膜)の肥厚化を引き起こす慢性疾患である。それにより、血流量が減少し、罹患した血管から供給される器官において虚血及び組織破壊が引き起こされるかもしれない。動脈硬化病変は、ヒトにおいて数十年にわたって発達し、冠血管及び脳虚血及び血栓塞栓性疾患及び心筋及び大脳梗塞等の合併症に至る。
【００５６】
アテローム性動脈硬化は、急性心筋梗塞、脳卒中、及び末梢動脈疾患を含む循環器疾患の主要な原因である。該疾患は、血管の細胞外マトリックスに、リポタンパク質、主としてＬＤＬが蓄積することにより開始される。これらのＬＤＬ粒子が凝集し、酸化的修飾を受ける。酸化ＬＤＬは毒性であり、血管損傷を引き起こす。多くの点で、アテローム性動脈硬化は、炎症及び線維症を含むこの損傷に対する応答である。
【００５７】
「治療（処置）」とは、治療的処置及び予防又は防止手段の両方を意味する。治療の必要があるものには、既に疾患を患っているもの、並びに疾患が予防されるべきものが含まれる。
【００５８】
治療目的での「哺乳動物」は、ヒト、家庭用動物及び家畜、及び動物園、スポーツ又はペット用動物、例えばイヌ、ウシ、ネコ、ウシ等を含む、哺乳動物として分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００５９】
ここでの「抗体」なる用語は、最も広義に使用され、モノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生物学的活性を示す限り抗体断片を特に包含する。
【００６０】
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の研究、診断又は治療への使用に干渉する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれうる。いくつかの実施態様では、抗体は、（１）例えば、ローリー法で測定して抗体の９５重量％を越え、いくつかの実施態様においては９９重量％を超えるまで；（２）例えば、スピニングカップシークエネーターを使ったＮ末端又は内在するアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）例えば、クーマシーブルー又は銀染色を用いた還元又は非還元状態の下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで、精製される。単離された抗体は、抗体の自然環境の少なくとも一成分が存在しないことから、組換え細胞内のインサイツの抗体を含む。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製段階によって調製されるであろう。
【００６１】
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合する一方、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列され、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列されている。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００６２】
「定常ドメイン」なる用語は、抗原結合部位を含む免疫グロブリンの他の部分、つまり可変ドメインと比較してより保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を意味する。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン(集合的にＣＨ)、及び軽鎖のＣＨＬ(又はＣＬ)ドメインを含む。
【００６３】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを意味する。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と称されうる。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と称されうる。これらのドメインは、一般的に抗体の最も可変の部分であり、抗原結合部位を含む。
【００６４】
「可変」なる用語は、可変ドメインのある部分が、抗体間で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されるという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域(ＨＶＲ)と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造に連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する、３つのＨＶＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖のＨＶＲは、ＦＲ領域によって近接して保持され、他の鎖のＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害性への抗体の関与を示す。
【００６５】
任意の脊椎動物種由来の抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つを割り当てることができる。
【００６６】
ここで使用されるＩｇＧ「アイソタイプ」又は「サブクラス」なる用語は、それらの定常領域の化学的及び抗原特性により定まる免疫グロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。
【００６７】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体(免疫グロブリン)には異なるクラスを割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、さらにこれらのいくつかは、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られており、一般に、例えばAbbasら Cellular and Mol. Immunology, 第4版.(W. B. Saunders, Co., 2000)に記載されている。抗体は、抗体と一又は複数の他のタンパク質又はペプチドとの共有又は非共有結合により形成される大きな融合分子の一部でありうる。
【００６８】
「完全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」なる用語は、ここでは交換可能に使用され、以下に示すような抗体断片ではなく、その実質的にインタクトな形態にある抗体を意味する。本用語は、特にＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を意味する。
【００６９】
ここでの目的に対して「ネイキッド抗体」とは、細胞傷害性部分又は放射標識にコンジュゲートされていない抗体である。
【００７０】
「抗体断片」は、無傷抗体の一部、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００７１】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々が、単一の抗原結合部位と、その名前が直ぐに結晶化するその能力を反映している残りの「Ｆｃ」断片を含む。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、尚も抗原に架橋することができるＦ(ａｂ')２断片を生じる。
【００７２】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。一実施態様では、二本鎖Ｆｖ種は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)種において、一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖と重鎖が、二本鎖Ｆｖ種のものに類似した「二量体」構造で結合可能なように、可動性ペプチドリンカーにより共有的に結合されうる。各可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用して、ＶＨ-ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を画成するのは、この配置においてである。集合的に、６つのＨＶＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
【００７３】
Ｆａｂ断片は、重鎖及び軽鎖可変ドメインを含み、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)をまた含む。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基(群)が遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として元々は生産された。抗体断片の他の化学カップリングもまた知られている。
【００７４】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, (Springer-Verlag, New York：1994), pp. 269-315を参照のこと。
【００７５】
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ抗体断片を意味し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ-ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成ができないリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは、二価又は二重特異性であってもよい。ダイアボディは、欧州特許出願公開第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudsonら, Nat.Med., 9:129-134(2003); 及びHollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448(1993)に、さらに詳細に記載されている。トリアボディ及びテトラボディは、Hudsonら, Nat. Med., 9:129-134(2003)に記載されている。
【００７６】
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、例えば、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在しうる、例えば自然に生じる可能性がある突然変異を除いては同一である抗体を意味する。よって、「モノクローナル」との修飾語句は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。ある種の実施態様では、このようなモノクローナル抗体は、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、ここで、標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一標的結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスにより得られた。例えば選択プロセスは、複数のクローン、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールからの独特のクローンの選択とすることができる。選択された標的結合配列は、例えば標的に対する親和性を改善するため、標的結合配列をヒト化するため、細胞培養におけるその生産性を改善するため、インビボにおけるその免疫原性を低下させるため、多重特異的抗体を産生させる等のために、さらに改変され得、また改変された標的結合配列を有する抗体も、この発明のモノクローナル抗体であることが理解されなければならない。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物と比べて、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、他の免疫グロブリンによって典型的には汚染されていない点で有利である。
【００７７】
「モノクローナル」との修飾詞は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産することを必要としていると解してはならない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ法(例えば、Kohler and Milstein., Nature, 256:495-97(1975)；Hongoら, Hybridoma, 14(3):253-260(1995), Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版. 1988)；Hammerlingら: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, 563-681(Elsevier, N.Y., 1981))、組換えＤＮＡ法(例えば、米国特許第４８１６５６７号を参照)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clacksonら, Nature, 352: 624-628(1991)；Marksら, J. Mol. Biol., 222:581-597(1992)；Sidhuら, J. Mol. Biol., 338(2):299-310(2004)；Leeら, J. Mol. Biol., 340(5):1073-1093(2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(34):12467-12472(2004)；及びLeeら, J. Immunol. Methods, 284(1-2):119-132(2004)、及びヒト免疫グロブリン座位又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生させるための技術(例えば、国際公開第１９９８／２４８９３号；国際公開第１９９６／３４０９６号；国際公開第１９９６／３３７３５号；国際公開第１９９１／１０７４１号；Jakobovitsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551(1993)；Jakobovitsら, Nature, 362: 255-258(1993)；Bruggemannら, Year in Immunol., 7:33(1993)；米国特許第５５４５８０７号；同５５４５８０６号；同５５６９８２５号；同５６２５１２６号；同５６３３４２５号；及び同５６６１０１６号；Marksら, Bio/Technology, 10: 779-783(1992)；Lonbergら, Nature, 368:856-859(1994)；Morrison, Nature, 368:812-813(1994)；Fishwildら, Nature Biotechnol. 14:845-851(1996)；Neuberger, Nature Biotechnol. 14:826(1996)；及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol.13:65-93(1995)を参照)を含む様々な技術により作製することができる。
【００７８】
ここでのモノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来かあるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を特に含む(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。キメラ抗体は、抗体の抗原結合領域が、例えば関心ある抗体を用いてマカクザルを免疫化することにより産生される抗体から誘導されたものであるPRIMATIZED(登録商標)抗体を含む。
【００７９】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列をキメラ抗体である。一実施態様では、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲの残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び／又は能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＨＶＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するためになされうる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、全てあるいはほとんど全ての高度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jonesら, Nature 321, 522-525(1986)；Reichmannら, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照。またさらに、例えばVaswani andHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol., 1:105-115(1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions, 23:1035-1038(1995)；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech., 5:428-433(1994)；及び米国特許第６９８２３２１号及び米国特許第７０８７４０９号を参照。
【００８０】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここにおいて開示されたヒト抗体を作製するいずれかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む、当該分野で知られている様々な技術を使用して生産することができる。Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381(1991)；Marksら, J. Mol. Biol., 222:581(1991)。また、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用できるものは、Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, p. 77(1985)；Boernerら, J. Immunol., 147(1):86-95(1991)に記載の方法である。また、van Dijk及びvan de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74(2001)を参照。ヒト抗体は、抗原誘発に反応してそのような抗体を産生するように改変されているが、その内在性座位が無能にされている、例えば免疫化キセノマウスのようなトランスジェニック動物に抗原を投与することにより調製可能である(例えば、XENOMOUSETM技術に関し、米国特許第６０７５１８１号及び同６１５０５８４号を参照)。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して産生されるヒト抗体に関しては、例えばLiら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562(2006)を参照。
【００８１】
「種依存性抗体」は、第２の哺乳動物種からの抗原のホモログに対してよりも、第１の哺乳動物種からの抗原に対して、より強い結合親和性を有するものである。通常、種依存性抗体はヒト抗原に「特異的に結合する」(例えば、約１×１０-７Ｍ以下、好ましくは約１×１０-８Ｍ以下、及び最も好ましくは約１×１０-９Ｍ以下の結合親和性(Ｋｄ)値を有する)が、第２の非ヒト哺乳動物種からの抗原のホモログに対しては、ヒト抗原に対する結合親和性よりも、少なくとも約５０倍、又は少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１０００倍弱い結合親和性を有する。種依存性抗体は、上述した様々な種類の抗体のいずれであってもよいが、好ましくはヒト化又はヒト抗体である。
【００８２】
ここで使用される「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含む；つまり、ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲの最大の多様性を示し、特にＨ３は抗体に良い特異性を付与するのに独特の役割を果たすと考えられている。例えばXuら, Immunity 13:37-45 (2000)；Johnson及びWu, Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo編, Human Press, Totowa, NJ, 2003)を参照。確かに、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ抗体は軽鎖の不存在下で機能的で安定である。例えば、Hamers-Castermanら, Nature 363:446-448 (1993)及びSheriffら, Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)を参照。
【００８３】
多数のＨＶＲの描写がここで使用され、また包含される。カバット相補性決定領域(ＣＤＲｓ)は配列可変性に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ ＨＶＲは、カバットＨＶＲとChothia構造的ループの間の妥協を表し、オックスフォード・分子ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用されている。「接触」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の分析に基づいている。これらのＨＶＲのそれぞれからの残基を以下に記す。
カバットループ       AbM          Chothia      接触
L1   L24-L34       L24-L34        L26-L32      L30-L36
L2   L50-L56       L50-L56        L50-L52      L46-L55
L3   L89-L97       L89-L97        L91-L96      L89-L96
H1   H31-H35B      H26-H35B       H26-H32      H30-H35B(カバット番号付け)
H1   H31-H35       H26-H35        H26-H32      H30-H35(Chothia番号付け)
H2   H50-H65       H50-H58        H53-H55      H47-H58
H3   H95-H102      H95-H102       H96-H101     H93-H101
【００８４】
ＨＶＲは次の通り「伸展ＨＶＲ」を含みうる：ＶＬ中の２４−３６又は２４−３４（Ｌ１）、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７又は８９−９６(Ｌ３)と、ＶＨ中の２６−３５(Ｈ１）、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２又は９５−１０２(Ｈ３）。これらの定義の各々に対して上掲のカバットらに従って、可変ドメイン残基を番号付けする。
【００８５】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここで定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００８６】
「カバットにおける可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットにおけるアミノ酸位置番号付け」及びその変形は、上掲のKabatらにおける抗体の編集の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインについて使用される番号付けシステムを意味する。この番号付けシステムを使用すると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＨＶＲ又はＦＲの短縮化か、又はそこへの挿入に対応するより少ないか又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物(カバットに従い残基５２ａ)、及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入残基(例えば、カバットに従い残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等)を含む。残基のカバット番号付けは、「標準的な」カバット番号の配列を有する抗体の配列の相同領域で配列させることにより、与えられた抗体に対して決定されうる。
【００８７】
カバット番号付けシステムは、可変ドメイン中の残基(およそ軽鎖の残基１−１０７、及び重鎖の残基１−１１３)に言及する場合に一般的に使用される(例えば、Kabatら, Sequences of Immunological Interest. 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデクス」は、免疫グロブリン重鎖定常領域の残基を意味する場合に、一般的に使用される(例えば、上掲のカバットらにより報告されているＥＵインデクス)。「カバットのＥＵインデクス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを意味する。
【００８８】
「線形抗体」なる表現は、Zapataら(1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062)に記載された抗体を意味する。簡潔に述べると、これらの抗体は、相補的軽鎖ポリペプチドと共に、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデム型Ｆｄセグメント（ＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１）を含む。線形抗体は二重特異性又は単一特異性でありうる。
【００８９】
ここで使用される場合、「ライブラリー」は、複数の抗体又は抗体断片配列(例えば、本発明のポリペプチド)、又はこれらの配列をコードする核酸を意味し、配列は、本発明の方法によりこれらの配列に導入される変異体アミノ酸の組合せにおいて異なっている。
【００９０】
「ファージディスプレイ」は、変異ポリペプチドが、例えば糸状ファージのようなファージ粒子の表面にコートタンパク質の少なくとも一部に対する融合タンパク質としてディスプレイされる技術である。ファージディスプレイの有用性は、ランダム化タンパク質変異体の大きなライブラリーが、高親和性をもって標的抗原に結合する配列に対して、素早くまた効率的に選別されうるという点にある。ファージ上でのペプチド及びタンパク質ライブラリーのディスプレイは、特異的な結合特性を有するものについて何百万ものポリペプチドをスクリーニングするために使用されている。多価ファージディスプレイ法は、糸状ファージの遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩの何れかに対する融合を介して小さいランダムなペプチド及び小さいタンパク質をディスプレイするために使用されている。Wells及びLowman (1992) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:355-362及びそこに引用されている参考文献。一価ファージディスプレイにおいて、タンパク質又はペプチドライブラリーは遺伝子ＩＩＩ又はその一部に融合しており、ファージ粒子が融合タンパク質の一つのコピーを示すか又は何れも示さないように野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下で低レベルで発現される。結合活性効果は、選別が内因性のリガンド親和性に基づくように、多価ファージに対して低下し、ファージミドベクターが使用され、これがＤＮＡ操作を単純化する。Lowman及びWells (1991) Methods: A companion to Methods in Enzymology 3:205-0216。
【００９１】
「ファージミド」は、複製の細菌起点、例えばＣｏ１Ｅ１、及びバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターである。ファージミドは、糸状バクテリオファージ及びラムダバクテリオファージを含む、任意の既知のバクテリオファージで使用されうる。またプラスミドは、抗生物質耐性のための選択可能なマーカーを一般的に含むであろう。これらのベクターにクローニングされるＤＮＡのセグメントはプラスミドとして増殖されうる。これらのベクターを有する細胞に、ファージ粒子の生産に必要な全ての遺伝子が与えられると、プラスミドの複製態様はローリングサイクル複製に変化し、プラスミドＤＮＡの一本鎖のコピーを生成し、ファージ粒子をパッケージする。ファージミドは、感染性及び非感染性ファージ粒子を形成しうる。この用語は、ファージコートタンパク質遺伝子、又は異種ポリペプチドがファージ粒子の表面でディスプレイされるように、遺伝子融合として異種ポリペプチド遺伝子に結合したその断片を含むファージミドを含む。
【００９２】
ＩＩ．発明を実施するための形態
ここでの発明は抗体を含有する製剤に関する。製剤中の抗体は、抗体を製造するための当該分野で利用できる方法を使用して調製され、その例示的方法は次のセクションにさらに詳細に記載される。典型的には、製剤は安定な水性製剤である。ある種の実施態様では、それらは薬学的製剤である。
【００９３】
抗体は、関心ある抗原に対して産生される。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患を患っている哺乳動物への抗体の投与は、哺乳動物への治療的有益性をもたらしうる。しかしながら、非ポリペプチド抗原に対して産生される抗体もまた考慮される。
【００９４】
抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通分子(例えば、レセプター)又はリガンド、例えば増殖因子でありうる。例示的な抗原には、ｏｘ-ＬＤＬ；ｏｘ-ＡｐｏＢ１００；レニン；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α-１-アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；濾胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、及びフォン・ウィルブランド因子などの凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；プラスミノーゲン活性化剤、例えばウロキナーゼ又はヒト尿素又は組織型プラスミノーゲンアクチベータ(ｔ-ＰＡ)；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子-α及びβ；エンケファリン分解酵素；ＲＡＮＴＥＳ(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)；ヒトマクロファージ炎症タンパク質(ＭＩＰ-１-α)；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；ミューラー阻害物質；リラキシンＡ-鎖；リラキシンＢ-鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β-ラクタマーゼ等の微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ-４等の細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原(ＣＴＬＡ)；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)；ＶＥＧＦＲレセプター、ホルモン又は成長因子のレセプター；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)、ニューロトロフィン-３、-４、-５又は-６(ＮＴ-３、ＮＴ-４、ＮＴ-５、又はＮＴ-６)、又は神経成長因子、例えばＮＧＦ-β；血小板誘導増殖因子(ＰＤＧＦ)；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の線維芽細胞増殖因子；上皮増殖因子(ＥＧＦ)；ＴＧＦ-α、及びＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４、又はＴＧＦ-β５を含む、ＴＧＦ-β等のトランスフォーミング増殖因子(ＴＧＦ)；インシュリン様増殖因子-Ｉ及び-ＩＩ(ＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦ-ＩＩ)；ｄｅｓ(１-３)-ＩＧＦ-Ｉ(脳ＩＧＦ-Ｉ)、インシュリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９及びＣＤ２０等のＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質(ＢＭＰ)；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、例えば、Ｍ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、及びＧ-ＣＳＦ；インターロイキン(ＩＬ)、例えば、ＩＬ-１ないしＩＬ-１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス性抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ-４及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター；及び上に列挙したポリペプチドの何れかの断片が含まれる。
【００９５】
本発明のある種の実施態様では、本発明に包含される抗体についての分子標的には、ｏｘ-ＬＤＬが含まれる。一実施態様では、ここでの抗体は、ヒトｏｘ-ＬＤＬに結合するものである。一実施態様では、ここでの抗体は、ヒトｏｘ-ＡｐｏＢ１００に結合するものである。
【００９６】
Ａ．製剤の調製
関心ある抗体を調製後(ここで開示されるようにして製剤化されうる抗体を製造するための技術は以下に詳述され、当該分野で知られている)、それを含有する薬学的製剤が調製される。ある種の実施態様では、処方される抗体は事前の凍結乾燥にかけられておらず、ここで関心ある製剤は水性製剤である。ある種の実施態様では、抗体は完全長抗体である。一実施態様では、製剤中の抗体は抗体断片、例えばＦ(ａｂ')２であり、その場合、完全長抗体では生じないであろう問題(例えば、Ｆａｂに対する抗体のクリッピング)に対処する必要がある場合がある。製剤中に存在する抗体の治療的有効量は、例えば、所望される用量ボリューム又は投与態様を考慮して決定される。約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、又は約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、又は約５０ｍｇ／ｍＬ〜約１７５ｍｇ／ｍＬが製剤中の例示的な抗体濃度である。
【００９７】
ｐＨ緩衝溶液に抗体を含有する水性製剤が調製される。この発明のバッファーは、約４．５〜約６．５の範囲のｐＨを有する。ある種の実施態様では、ｐＨは、５．０〜６．０のｐＨ範囲、又はｐＨ５．２５〜５．７５の範囲、又はｐＨ５．３〜５．６の範囲である。本発明のある種の実施態様では、製剤は５．５又は約５．５のｐＨを有する。この範囲にｐＨをコントロールするバッファーの例には、アセテート(例えば、酢酸ヒスチジン、酢酸アルギニン、酢酸ナトリウム)、スクシネート(例えば、コハク酸ヒスチジン、コハク酸アルギニン、コハク酸ナトリウム)、グルコネート、シトレート、及び他の有機酸バッファー、及びその組合せが含まれる。バッファー濃度は、例えばバッファー及び製剤の所望の等張性に応じて、約１ｍＭ〜約６００ｍＭとすることができる。ある種の実施態様においては、約５ｍＭ〜１００ｍＭ濃度のヒスチジンを含み、アルギニンは５０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度である。一実施態様では、バッファーは、酢酸ヒスチジン(約２０ｍＭ)−酢酸アルギニン(約１５０ｍＭ)、ｐＨ５．５である。ある種の実施態様では、バッファーは、コハク酸ヒスチジン(約２０ｍＭ)−コハク酸アルギニン(約１５０ｍＭ)、ｐＨ５．５である。
【００９８】
界面活性剤が、場合によっては抗体製剤に添加されうる。例示的な界面活性剤には、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート(例えば、ポリソルベート２０、８０等)又はポロキサマー(例えば、ポロキサマー１８８)が含まれる。添加される界面活性剤の量は、処方される抗体の凝集が低減し、及び／又は製剤中の粒子の形成が最小となり、及び／又は吸着が低減されるような量である。例えば、界面活性剤は、約０．００１％〜約０．５％、好ましくは約０．００５％〜約０．２％、さらに好ましくは約０．０１％〜約０．１％の量で製剤に存在しうる。一実施態様では、製剤は界面活性剤を含有しない。
【００９９】
一実施態様では、製剤は、上で特定した薬剤(例えば、抗体、バッファー、及び／又は界面活性剤)を含んでおり、本質的に一又は複数の保存料、例えばベンジルアルコール、フェノール、ｍ-クレゾール、クロロブタノール、及びベンゼトニウムＣｌを含有しない。一実施態様では、製剤は保存料を含有しない。他の実施態様では、保存料は製剤中に含有せしめられてよく、特に製剤が複数用量製剤の場合にしかりである。保存料の濃度は約０．１％〜約２％、好ましくは約０．５％〜約１％の範囲でありうる。一又は複数の他の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A. Ed. (1980)に記載されているものも、それらが製剤の所望の特徴に悪影響を及ぼすものではない限り、製剤に含めることができる。許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、使用される用量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、付加的な緩衝剤；共溶媒；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体)；生物分解性ポリマー、例えばポリエステル類；及び／又は塩形成対イオンを含む。
【０１００】
ここでのキレート剤の様々な記載はしばしばＥＤＴＡに集中するが、他の金属イオンキレート剤も本発明の範囲に含まれることは理解されるであろう。金属イオンキレート剤は当業者によく知られており、アミノポリカルボキシレート、ＥＤＴＡ(エチレンジアミン四酢酸)、ＥＧＴＡ(エチレングリコール-ビス(ベータ-アミノエチルエーテル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-四酢酸)、ＮＴＡ(ニトリロ三酢酸)、ＥＤＤＳ(エチレンジアミンジスクシネート)、ＰＤＴＡ(１,３-プロピレンジアミン四酢酸)、ＤＴＰＡ(ジエチレントリアミン五酢酸)、ＡＤＡ(ベータ-アラニン二酢酸)、ＭＧＣＡ(メチルグリシン二酢酸)等が含まれるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。さらに、ここでのいくつかの実施態様には、ホスホネート類／ホスホン酸キレート剤も含まれる。ある種の実施態様では、製剤はメチオニンを含む。
【０１０１】
ここでの製剤はまた処置される特定の兆候に対して、必要ならば一以上のタンパク質、好ましくは他のタンパク質に悪影響を与えない相補的活性を有するものを含みうる。例えば、抗体が抗ｏｘＬＤＬ抗体である場合、他の薬剤(例えば、３-ヒドロキシ-３-メチリルグルタリル-コエンザイムＡ(ＨＭＧ-ＣｏＡ)レダクターゼのインヒビター、例えばスタチン)と組合せることができる。抗ｏｘＬＤＬ抗体と組合せることのできる分子の例には、限定されるものではないが、例えばアトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、プロバスタチン、ロスバスタチン、シムバスタチン等が含まれる。このようなタンパク質は、適切には、意図する目的に有効な量が組合せられて存在する。典型的には、スタチンは経口投与用に製剤化される。
【０１０２】
インビボ投与用に使用される製剤は滅菌されるべきである。これは、製剤の調製の前後に、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０１０３】
Ｂ．製剤の投与
製剤は、既知の方法に従い、例えばボーラスとして又は一定期間以上をかけて連続注入により静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内(intracerobrospinal)、皮下、関節内、滑膜内、包膜内、経口、局所、又は吸入経路により、抗体を用いた処置を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。一実施態様では、製剤は静脈内投与により、哺乳動物に投与される。このような目的では、製剤は、例えばシリンジを使用して、又はＩＶラインを介して注入されうる。一実施態様では、製剤は皮下投与により哺乳動物に投与される。
【０１０４】
抗体の適切な用量(「治療的有効量」)は、処置される病状、病状の重篤度及び経過、抗体が予防又は治療目的で投与されるか、以前の治療、患者の臨床病歴及び抗体に対する反応性、使用される抗体のタイプ、及び主治医の裁量に依存するであろう。抗体は、一回で又は一連の処置にわたって、患者に適切に投与され、診断後の任意の時点で患者に投与されうる。抗体は単独処置として、又は当該病状の処置に有用な他の薬剤又は治療法と併用して投与されうる。
【０１０５】
一般的な提案として、投与される抗体の治療的有効量は、一回又は複数回投与にかかわらず、患者の体重当たり約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、使用される抗体の典型的な範囲は、例えば毎日、又は例えば毎週、又は例えば二ヶ月毎に、約０．３〜約２０ｍｇ／ｋｇ、又は約０．３〜約１５ｍｇ／ｋｇ、又は約０．３〜約２５ｍｇ／ｋｇ、又は約０．３〜約３０ｍｇ／ｋｇである。しかしながら、他の投与レジメも有用でありうる。この治療法の進行は一般的な技術により、容易にモニターすることができる。
【０１０６】
本発明のある種の実施態様では、投与される製剤は抗ｏｘＬＤＬ抗体製剤である。動脈壁におけるほとんどのコレステロールの沈着は、ＬＤＬに由来する。ＬＤＬはヒト血清におけるコレステロールの主要キャリアであり、ＬＤＬの酸化はアテローム性粒子への転換における必須段階である。アテローム性動脈硬化の全ての段階で特徴的な炎症プロセスの活性化及び調節は、ＬＤＬの酸化形態に対する免疫応答に相関している。アテローム性動脈硬化は急性ＭＩ、脳卒中、及び末梢動脈疾患の主原因である。抗ｏｘＬＤＬ抗体の場合、アテローム性動脈硬化を処置するために治療的有効量の抗体が投与される。例えば、抗ｏｘＬＤＬ抗体は、ハイリスクの患者における心血管イベントの二次予防に、及び／又はアテローム性動脈硬化の致命的危険性を低減するために使用することができる。動脈壁におけるアテローム性付着物に直接起因するこれらの心血管イベントには、限定されるものではないが、急性心筋梗塞(ＭＩ)、脳卒中、及び末梢動脈疾患が含まれる。また、抗ｏｘＬＤＬ抗体は、さらに他の活性に対しても使用することができる。例えば、抗ｏｘＬＤＬ抗体は、プラーク形成を阻害し、動脈硬化病変の進行を防止することが示されており(例えば、Schiopuら, 2004の動物モデル；国際公開第２００４／０３０６０７号；米国特許第６７１６４１０号に記載)、処置の数週間後、大動脈に既存の確立している動脈硬化プラークの退行も積極的に誘導する（例えば国際公開第２００７／０２５７８１号）。
【０１０７】
Ｃ．抗体の調製
(ｉ)抗原の調製
場合によっては他の分子にコンジュゲートされていてもよい適切な抗原又はその断片を抗体を製造するための免疫原として使用することができる。レセプターのような膜貫通分子については、これらの断片(例えば、レセプターの細胞外ドメイン)を免疫源として使用することができる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞も、免疫源として使用することができる。このような細胞は天然源(例えば、癌細胞株)から誘導することができ、又は膜貫通分子を発現するように組換え技術により形質転換された細胞であってもよい。抗体を調製するために有用な他の抗原及びその形態は、当業者には明らかであろう。
【０１０８】
(ｉｉ)所定の抗体ベース法
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより動物において産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに、関連する抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基によるコンジュゲート)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲとＲ１が異なったアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを使用してコンジュゲートさせることが有用でありうる。
【０１０９】
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物に、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。数日ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物に、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物に、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合物として組換え細胞培養中で作製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために適切に使用される。
【０１１０】
本発明のモノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)に記載され、さらには、例えばHongoら, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版. 1988)；Hammerlingら, ：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), 及び Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)で、ヒト-ヒトハイブリドーマに関するものに記載されているハイブリドーマ法を使用して、作製することができる。さらなる方法には、例えばハイブリドーマ細胞系からのモノクローナルヒト天然ＩｇＭ抗体の生産に関する、米国特許第７１８９８２６号に記載されているものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術(トリオーマ技術)は、Vollmers 及び Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)、及びVollmers 及び Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載されている。
【０１１１】
様々な他のハイブリドーマ技術については、例えば米国特許第２００６／２５８８４１号；米国特許第２００６／１８３８８７号(完全ヒト抗体)、米国特許第２００６／０５９５７５号；米国特許第２００５／２８７１４９号；米国特許第２００５／１００５４６号；米国特許第２００５／０２６２２９号；及び米国特許第７０７８４９２号及び同７１５３５０７号を参照。ハイブリドーマ法を使用してモノクローナル抗体を生産するための例示的なプロトコルは次のように記載される。一実施態様では、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを免疫化し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。抗体は、本発明のポリペプチド又はその断片、及びアジュバント、例えばモノホスホリル脂質Ａ(ＭＰＬ)／トレハロースジクリノマイコラート(dicrynomycolate)(ＴＤＭ)(Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT)を、複数の皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射により、動物内に生じさせる。本発明のポリペプチド(例えば、抗原)又はその断片は、当該技術でよく知られている方法、例えば組換え方法を使用して調製することができ、そのいくつかがここにさらに記載される。免疫化された動物からの血清を抗抗原抗体について分析し、場合によっては追加免疫を投与する。抗抗原抗体を生成する動物から、リンパ球を単離する。また、リンパ球はインビトロで免疫化することもできる。
【０１１２】
次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる。例えば、Goding, Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press, 1986)を参照。効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である骨髄腫細胞が使用されうる。例示的な骨髄腫細胞には、限定されないが、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、USAから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、USAから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものが含まれる。ヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞系もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeurら, Monoclonal antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【０１１３】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、適切な培養培地、例えば融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を含有する培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠くならば、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。好ましくは、無血清ハイブリドーマ細胞培養法も、例えばEvenら, Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006)に記載されているように、動物由来血清、例えばウシ胎児血清の使用を減らすために使用される。
【０１１４】
ハイブリドーマ細胞培養の生産性を改善するためのツールとしてのオリゴペプチドは、Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005)に記載されている。すなわち、標準的な培養培地は、ある種のアミノ酸(アラニン、セリン、アスパラギン、プロリン)、又はタンパク質加水分解画分に富み、アポトーシスは、３〜６のアミノ酸残基から構成される合成オリゴペプチドにより、有意に抑制されうる。ペプチドはミリモル又はそれ以上の濃度で存在する。
【０１１５】
ハイブリドーマ細胞が生育している培養培地を、本発明の抗体に結合するモノクローナル抗体の産生についてアッセイしうる。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定することができる。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばスキャッチャード分析法によって測定することができる。例えば、Munsonら, Anal. Biochem., 107:220 (1980)を参照。
【０１１６】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる。例えば、上掲のGodingを参照。この目的に対して好適な培養培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような一般的な免疫グロブリン精製法により、培養培地、腹水、又は血清から適切に分離される。ハイブリドーマ細胞からタンパク質を単離するための一手順は、米国特許出願公開第２００５／１７６１２２号、及び米国特許第６９１９４３６号に記載されている。該方法は、結合過程において最少量の塩、例えば離液性塩を使用し、好ましくは溶出過程において少量の有機溶媒を使用することを含む。
【０１１７】
(ｉｉｉ)ある種のライブラリースクリーニング法
本発明の抗体は、所望の活性又は活性群を有する抗体をスクリーニングするためにコンビナトリアルライブラリーを使用して作製することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特性を有する抗体について、このようなライブラリをスクリーニングするための様々な方法が、当該分野で知られている。このような方法は、一般的にHoogenboomら Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brienら編, Human Press, Totowa, NJ, 2001)に記載されている。例えば、関心ある抗体を産生するための一方法は、Leeら, J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93に記載されているような、ファージ抗体ライブラリーの使用を介してなされる。
【０１１８】
原理的には、合成抗体クローンは、ファージコートクローンに融合した抗体可変領域(Ｆｖ)の様々な断片をディスプレイするファージを含むファージライブラリーをスクリーニングすることによって選択される。このようなファージライブラリーは、所望の抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによりパニングされる。所望の抗原に結合可能なＦｖ断片を発現するクローンを抗原に吸着させ、よってライブラリーにおける非結合クローンから分離される。ついで、結合クローンを抗原から溶出させ、抗原の吸着／溶出の付加的なサイクルにより、さらに濃縮されうる。本発明の抗体の何れも適切な抗原スクリーニング手順を設計し、続いて、Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3に記載された、適切な定常領域(Ｆｃ)配列と、関心あるファージクローンからのＦｖ配列を使用して、完全長抗体クローンの構築により得ることができる。
【０１１９】
ある種の実施態様では、抗体の抗原-結合ドメインは、各々軽鎖(ＶＬ)及び重鎖(ＶＨ)からのものであり、双方に３つの高頻度可変ループ(ＨＶＲ)又は相補性決定領域(ＣＤＲ)を呈する、約１１０のアミノ酸の２つの可変(Ｖ)領域から形成される。可変ドメインは、ＶＨ及びＶＬが短くて可動性のペプチドを介して共有結合している単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として、又はＦａｂ断片として、ファージに機能的に表示可能であり、Winterら, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されているように、それらは、それぞれ定常ドメインに融合し、非共有的に相互作用する。ここで使用される場合、ｓｃＦｖコード化ファージクローン及びＦａｂコード化ファージクローンは、「Ｆｖファージクローン」又は「Ｆｖクローン」と集合的に称される。
【０１２０】
ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により別々にクローニングされ、またファージライブラリーにおいてランダムに組換され得、これがついで、Winterら, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されているようにして、抗原-結合クローンについて検索されうる。免疫化源からのライブラリーにより、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対して高親和性抗体が提供される。あるいは、天然レパートリーは、Griffithsら, EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されているように、何らの免疫化をすることなく、広範囲の非自己及び自己抗原に対するヒト抗体の単一供給源を提供するためにクローニングされうる。最後に、天然レパートリーを、幹細胞からの再配置されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することで合成的に作製することができ、高頻度可変ＣＤＲ３領域をコードし、Hoogenboom 及び Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)により記載されているような、インビトロ再配置が達成される。
【０１２１】
ある種の実施態様では、糸状ファージは、少量のコートタンパク質ｐＩＩＩに融合することにより、抗体断片をディスプレイするのに使用される。抗体断片は、例えばMarksら, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)に記載されているように、ＶＨ及びＶＬドメインが可動性ポリペプチドスペーサーにより同じポリペプチド鎖に結合している単鎖Ｆｖ断片として、又は例えばHoogenboomら, Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)に記載されているように、一方の鎖がｐＩＩＩに融合し、他方が、細菌性宿主細胞ペリプラズムに分泌されるＦａｂ断片としてディスプレイされ得、Ｆａｂコートタンパク質構造のアセンブリが、野生型コートタンパク質のいくつかをディスプレイすることによってファージ表面にディスプレイされるようになる。
【０１２２】
一般的に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒト又は動物から収集された免疫細胞から得られる。抗抗原クローンにバイアスしたライブラリーが所望されるならば、被験者を抗原で免疫化して抗体反応を生じせしめ、ライブラリー構築のために、脾臓細胞及び／又は循環Ｂ細胞、他の末梢血リンパ球(ＰＢＬ)を回収する。一実施態様では、抗抗原クローンにバイアスされたヒト抗体遺伝子断片ライブラリーが、抗原免疫化が抗原に対してＢ細胞産生ヒト抗体が生じるように、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを担持する(及び機能的内在性抗体産生系を欠く)トランスジェニックマウスにおいて、抗抗原抗体反応を生じせしめることによって得られる。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの生成を以下に記載する。
【０１２３】
抗抗原反応性細胞集団についてのさらなる濃縮は、適切なスクリーニング手順を使用して、例えば抗原アフィニティークロマトグラフィーを使用する細胞分離又は蛍光色素標識抗原への細胞の吸着と、続いての蛍光標示式細胞分取(ＦＡＣＳ)によって、抗原特異性膜結合抗体を発現するＢ細胞を単離することによって、得ることができる。
【０１２４】
あるいは、免疫化されていないドナーからの脾臓細胞及び／又はＢ細胞又は他のＰＢＬを使用することにより、可能な抗体レパートリーのより良好な標示が提供され、抗原が抗原性ではない任意の動物(ヒト又は非ヒト)種を使用する抗体ライブラリーの構築が可能となる。インビトロ抗体遺伝子構築を導入するライブラリーについては、幹細胞を被験者から収集し、再配置されていない抗体遺伝子セグメントをコードする核酸が提供される。関心ある免疫細胞は様々な動物種、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ目、ルプリン(luprine)、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、及びトリ種等から得ることができる。
【０１２５】
抗体可変遺伝子セグメント（ＶＨ及びＶＬセグメントを含む）をコードする核酸を、興味ある細胞から回収して増幅する。再配列したＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリーの場合、所望されるＤＮＡは、Orlandi等，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)に記載されているように、リンパ球からのゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離し、再配列したＶＨ及びＶＬ遺伝子の５’及び３’末端と一致するプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることが可能であり、これによって発現のための多様なＶ遺伝子レパートリーを作製することができる。該Ｖ遺伝子は、Orlandi等, (1989)及びWard等，Nature, 341: 544-546(1989)に記載のように、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５’末端のバックプライマーとＪセグメントに基づいた順方向プライマーにより、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから増幅することが可能である。しかしながら、ｃＤＮＡからの増幅のためには、バックプライマーは、また、Jones等，Biotechnol., 9:88-89(1991)に記載のようにリーダーエクソンに、順方向プライマーは、Sastry等，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:5728-5732(1989)に記載のように定常領域内に基づくことが可能である。相補性を最大にするために、Orlandi等(1989)又はSastry等(1989)に記載のように、縮重をプライマーへ取り込むことが可能である。ある実施態様では、例えば、Marks等，J. Mol. Biol., 222: 581-597(1991)の方法に記載のように、又はOrum等，Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498(1993)の方法に記載のように、免疫細胞の核酸試料に存在する全ての入手可能なＶＨ及びＶＬ配置を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリーを標的にしたＰＣＲプライマーを用いて、そのライブラリーの多様性を最大にする。発現ベクターへの増幅ＤＮＡのクローニングに関しては、希な制限部位を、Orlandi等(1989)に記載のようにＰＣＲプライマー内の一端へタグとして、又はClackson等，Nature, 352: 624-628(1991)に記載のようにタグプライマーを用いた更なるＰＣＲ増幅によって、導入することができる。
【０１２６】
合成的に再配列したＶ遺伝子のレパートリーは、Ｖ遺伝子セグメントからインビトロで誘導することができる。殆どのヒトＶＨ遺伝子セグメントはクローニングされ、配列決定され(Tomlinsonら, J. Mol. Biol. 227: 776-798(1992)に報告されている)、マッピングがされている(Matsudaら，Nature Genet., 3: 88-94(1993))；これらのクローニングされたセグメント(Ｈ１及びＨ２ループの全ての主要なコンホメーションを含む)は、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、多様な配列と長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーによる多様なＶＨ遺伝子レパートリーを作製するのに用いられる。ＶＨレパートリーは、また、Barbasら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461(1992)に記載されているように、単一の長さの長いＨ３ループに焦点を合わせた全ての配列多様性を伴って作製することができる。ヒトＶκ及びＶλセグメントはクローニング及び配列決定がなされており(Williams及びWinter， Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461(1993)に報告)、合成軽鎖レパートリーを作製するのに使用することができる。ＶＨ及びＶＬフォールドの範囲及びＬ３及びＨ３の長さに基づく合成的Ｖ遺伝子レパートリーは、かなりの構造的多様性を有する抗体をコードするであろう。ＤＮＡをコードするＶ遺伝子の増幅に続いて、生殖系のＶ遺伝子セグメントを、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)の方法に従ってインビトロで再配列することができる。
【０１２７】
抗体断片のレパートリーは、幾つかの方法でＶＨ及びＶＬ遺伝子レパートリーを一緒に組み合わせることによって構築することができる。各レパートリーを異なるベクターで作製し、そのベクターを、例えばHogrefe等, Gene, 128: 119-126(1993)に記載のようにインビトロで、又はコンビナトリアル・インフェクション、例えばWaterhouse等, Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266(1993)に記載のｌｏｘＰ系によってインビボで作製することが可能である。このインビボの組換え手法では、大腸菌の形質転換効率によって強いられるライブラリーの大きさの限界を克服するために、二本鎖種のＦａｂ断片が利用される。ナイーブＶＨ及びＶＬレパートリーは、一方はファージミドへ、他方はファージベクターへと別々にクローニングされる。この２つのライブラリーは、その後、各細胞が異なる組み合わせを有し、そのライブラリーの大きさが、存在する細胞の数（約１０１２クローン）によってのみ限定されるように、ファージミド含有細菌のファージ感染によって組合わせられる。双方のベクターは、ＶＨ及びＶＬ遺伝子が単一のレプリコンへ組換えられ、ファージビリオンへ共にパッケージされるように、インビボの組換えシグナルを有する。これら巨大なライブラリーは、良好な親和性（約１０−８ＭのＫｄ−１）の多くの多様な抗体を提供する。
【０１２８】
別法として、該レパートリーは、例えばBarbasら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982(1991)に記載のように同じベクターへ連続してクローニングし、又はClaksonら, Nature, 352: 624-628(1991)に記載のようにＰＣＲによってアセンブリした後にクローニングすることができる。ＰＣＲアセンブリは、また、可動ペプチドスペーサーをコードしているＤＮＡとＶＨ及びＶＬ ＤＮＡを連結させて、単鎖のＦｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成することに使用することができる。さらに他の技術では、「細胞内ＰＣＲアセンブリ」が、Embletonら, Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837(1992)に記載のように、ＰＣＲによってリンパ球内のＶＨ及びＶＬ遺伝子を組み合わせて、その後、連結した遺伝子のレパートリーをクローニングするのに使用される。
【０１２９】
ナイーブライブラリー(天然又は合成のいずれか)によって産生された抗体は中程度の親和性（約１０６〜１０７Ｍ−１のＫｄ−１）である可能性があるが、上掲のWinterら(1994)に記載のように二次ライブラリーから構築して再選択することによって、親和性成熟をもインビトロで模倣することが可能である。例えば、Hawkinsら, J. Mol. Biol. 226: 889-896(1992)の方法、又はGramら, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580(1992)の方法においてエラー・プローンポリメラーゼ(Leungら, Technique, 1:11-15(1989)で報告されている)を利用することによって、突然変異をインビトロでランダムに導入することができる。さらには、一又は複数のＣＤＲをランダムに変異させることによって、例えば、選択した個々のＦｖクローンにおいて、対象のＣＤＲまで及ぶランダム配列を有するプライマーによるＰＣＲを利用して、より高い親和性クローンをスクリーニングすることで親和性成熟を行うことが可能である。国際公開第９６０７７５４号（１９９６年３月１４日に公開）は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域へ突然変異生成を誘導して軽鎖遺伝子のライブラリーを作製する方法を記載している。その他の有効な手法は、Marksら, Biotechnol. 10: 779-783(1992)に記載のように、非免疫化ドナーから得られた天然に生じるＶドメイン変異体のレパートリーによるファージディスプレイによって選択されたＶＨ又はＶＬドメインを組換えること、及び数回のチェーン・リシャッフリングにおいてより高い親和性についてスクリーニングすることである。この技術は、約１０−９Ｍ又はそれ未満の親和性の抗体及び抗体断片の産生を可能にする。
【０１３０】
ライブラリーのスクリーニングは当該分野で知られている様々な技術によって達成することができる。例えば、抗原を使用して吸着プレートのウェルをコーティングし、吸着プレートへ付着させた宿主細胞上で発現させるか又はセルソーティングで利用し、又はストレプトアビジンでコーティングしたビーズでの捕獲のためにビオチンにコンジュゲートさせ、又はファージディスプレイライブラリーをパニングするための任意の他の当該分野の方法において使用することが可能である。
【０１３１】
ファージ粒子の少なくとも一部分を吸着剤に結合させるのに適した条件下で、ファージライブラリーの試料を固定化抗原と接触させる。通常は、ｐＨ、イオン強度、温度等を含む条件を選択して、生理学的条件を模倣する。固相と結合したファージを洗浄し、その後、例えばBarbasら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982(1991)に記載されているように、酸で、又は例えばMarksら, J. Mol. Biol. 222: 581-597(1991)に記載にされているように、アルカリで、又は例えばClacksonら, Nature, 352: 624-628(1991)の抗原競合法に類似の手法である抗原競合によって溶出させる。ファージは、一回の選択で２０〜１０００倍に濃縮することが可能である。さらに、この濃縮されたファージを細菌培養液で増殖させ、さらなる回の選択に供することが可能である。
【０１３２】
選択の効率は、洗浄の間の解離の動態、及び単一のファージ上の複数の抗体断片が同時に抗原と関われるかどうかを含む多くの要因に依存する。速い解離動態(及び弱い結合親和性)を有する抗体は、短い洗浄、多価ファージディスプレイ及び固相の抗原の高いコーティング密度の使用によって保持することが可能である。高い密度は、多価相互作用を介してファージを安定化するだけでなく、解離したファージの再結合に有利に作用する。遅い解離動態(及び良好な結合親和性)を有する抗体の選択は、Bassら, Proteins, 8: 309-314(1990)及び国際公開第９２／０９６９０号に記載されているような長い洗浄と一価ファージディスプレイの利用、及びMarksら, Biotechnol., 10: 779-783(1992)に記載されているような抗原の低コーティング密度によって促進することが可能である。
【０１３３】
親和性に僅かな違いがあったとしても、抗原に対する異なる親和性のファージ抗体の中で選択することは可能である。しかしながら、選択した抗体のランダム変異(例えば、幾つかの親和性成熟の技術で行われているような)は、多くの変異体を生じやすく、その殆どが抗原と結合し、僅かがより高い親和性である。抗原を限定すると、希な高い親和性のファージが競合して除かれることが可能である。全てのより高い親和性の変異体を保持するため、ファージを、過剰のビオチン化抗原とインキュベートすることが可能であるが、抗原の標的モル濃度親和定数よりも低いモル濃度のビオチン化抗原と共にインキュベーションできる。ついで、高親和性結合ファージをストレプトアビジンでコーティングした常磁性体ビーズによって捕獲することが可能である。そのような「平衡捕獲」は、結合の親和性に従い、親和性の低い大過剰のファージから、僅かに２倍高い親和性の変異体クローンの単離を可能にする感度で抗体を選択することを可能にする。固相と結合したファージを洗浄するのに用いる条件を操作して、解離定数に基づいて識別することも可能である。
【０１３４】
抗抗原クローンは活性に基づいて選択されうる。ある種の実施態様では、本発明は、抗原を自然に発現する生存細胞に結合するか、又は遊離の浮遊抗原又は他の細胞構造に付着している抗原に結合している抗抗原抗体を提供する。このような抗抗原抗体に対応するＦｖクローンは、(１)上述したようなファージライブラリーから抗抗原クローンを単離し、場合によっては、適切な細菌宿主中で集団を増殖させることにより、ファージクローンの単離された集団を増幅し；(２)ブロック活性及び非ブロック活性がそれぞれ望まれる抗原及び第二タンパク質を選択し；(３)固定された抗原に抗抗原ファージクローンを吸着させ；(４)過剰の第二タンパク質を使用し、第二タンパク質の結合決定基とオーバラップするか又は共有される抗原結合決定基を認識する任意の望ましくないクローンを溶出させ；(５)工程（４）の後に吸着されたまま残ったクローンを溶出することにより選別することができる。場合によっては、所望のブロック及び／又は非ブロック特性を有するクローンを、ここに記載の選別手順を、一又は複数回繰り返すことによって、さらに濃縮することができる。
【０１３５】
本発明のファージディスプレイＦｖクローン又はハイブリドーマ誘導モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、ハイブリドーマの対象の領域をコードする重鎖及び軽鎖又はファージＤＮＡ鋳型を特異的に増幅するように設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌での組換え発現に関する概説論文には、Skerraら, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188(1992)が含まれる。
【０１３６】
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、重鎖及び／又は軽鎖定常領域をコードする既知のＤＮＡ配列(例えば好適なＤＮＡ配列は上掲のカバット等から得ることができる)と組み合わせて、完全長ないし部分長の重鎖及び／又は軽鎖をコードするクローンを形成できる。このために、何れかのアイソタイプの定常領域、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域を用いることができ、このような定常領域は任意のヒト又は動物種から得ることができることが理解されるであろう。ある動物(例えばヒト)種の可変ドメインＤＮＡから得て、ついで「ハイブリッド」である完全長重鎖及び／又は軽鎖のコード配列を形成するために他の動物種の定常領域ＤＮＡに融合したＦｖクローンは、ここで用いられる「キメラ」及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。ある実施態様では、ヒト可変ＤＮＡから得たＦｖクローンをヒト定常領域ＤＮＡに融合して、完全長又は部分長のヒト重鎖及び／又は軽鎖のコード配列を形成する。
【０１３７】
また、本発明のハイブリドーマ由来の抗抗原抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ハイブリドーマクローン由来の相同的マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を置換すること(例えばMorrisonら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:6851(1984)の方法)によって修飾することができる。ハイブリドーマ又はＦｖクローン由来の抗体又は断片をコードするＤＮＡは、免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の全て又は一部を共有結合させることによってさらに修飾することができる。このようにして、本発明のＦｖクローン又はハイブリドーマクローン由来の抗体の結合特異性を有する「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体が調製される。
【０１３８】
(ｉｖ)ヒト化及びヒト抗体
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が、当該分野で知られている。例えば、ヒト化抗体は非ヒトである供給源からその中に導入される一又は複数のアミノ酸残基を有している。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は、ヒト抗体の該当する配列を齧歯類ＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列で置換することにより、Winter及び共同研究者（Jonesら Nature, 321:522-525(1986)；Riechmannら  Nature, 332:323-327(1988)；Verhoeyenら  Science, 239:1534-1536(1988))の方法に従って本質的に実施できる。従って、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１３９】
ヒト化抗体を作るのに使用されるヒト可変ドメインの選択は、軽鎖でも重鎖でも、抗原性を低減させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット（best-fit）」法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーからスクリーニングされる。齧歯類の配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク(ＦＲ)として受容される(Simsら J. Immunol., 151:2296 (1993) ；Chothiaら J. Mol. Biol. 196:901 (1987))。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来した特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、幾つかの異なるヒト化抗体のために使用することができる(Carterら Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaら J.Immunol, 151:2623を (1993))。
【０１４０】
抗体は抗原への高親和性及び他の好ましい生物学的性質を保持したままヒト化されることがさらに重要である。この目標を達成するために、本方法の一実施態様では、ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスによって調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能で、当業者にはなじみが深い。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体構造を例証し表示するコンピュータプログラムを利用することができる。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能中で残基の可能な役割の分析、つまり、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大のような、所望の抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選び、組み合わせることができる。一般に、高頻度可変領域残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接的かつ最も実質的に関与している。
【０１４１】
本発明のヒト抗体は、上述したような、既知のヒト定常ドメイン配列(群)と、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列(群)とを組合せることにより構成することができる。また、本発明のヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ法によっても作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を生産するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞系は、例えばKozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)；Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及び Boernerら, J. Immunol., 147: 86 (1991)により記載されている。
【０１４２】
内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Jakobovitsら, Proc. Natl. Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovitsら, Nature 362:255-258 (1993)；Bruggermanら, Year in Immuno., 7:33 (1993)；及びDuchosalら Nature 355:258 (1992)を参照。
【０１４３】
また、非ヒト、例えば齧歯類抗体から、ヒト抗体を誘導するために、遺伝子シャフリングを使用することもでき、ここでヒト抗体は、出発する非ヒト抗体に類似した親和性及び特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも称されるこの方法に従えば、ここに記載したようなファージディスプレイ技術により得られた非ヒト抗体断片の重又は軽鎖可変領域のいずれかがヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと置き換えられ、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖ又はＦａｂキメラの個体群を生じる。抗原を用いた選択は、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖ又はＦａｂの単離を生じ、ここで、ヒト鎖は、初代ファージディスプレイクローンにおける、対応の非ヒト鎖の除去時に破壊される抗原結合部位を回復させる、すなわち、エピトープはヒト鎖パートナーの選択を支配(インプリント)する。残った非ヒト鎖を置き換えるために、プロセスが繰り返されると、ヒト抗体が得られる(１９９３年４月１日に公開された国際公開第９３／０６２１３号を参照)。ＣＤＲグラフトによる非ヒト抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技術により、非ヒト由来のＦＲ又はＣＤＲ残基を有さない完全なヒト抗体が得られる。
【０１４４】
(ｖ)抗体断片
抗体断片は伝統的な手段、例えば酵素消化、又は組換え技術により産生可能である。ある状況では、全抗体よりも抗体断片を使用する方が有利な場合もある。より小さいサイズの断片は、急速なクリアランスが可能であり、固形腫瘍への改善されたアクセスに至る可能性がある。ある種の抗体断片の概説については、Hudsonら (2003) Nat. Med. 9:129-134を参照。
【０１４５】
抗体断片を生産するための様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)；及びBrennanら, Science, 229:81 (1985)を参照)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は、全て大腸菌において発現せしめられ、分泌せしめられ得、よって多量のこれらの断片を容易に生産することが可能である。抗体断片は上で検討した抗体ファージライブラリーから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的にカップリングさせてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含むインビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ(ａｂ')２断片は、米国特許第５８６９０４６号に記載されている。抗体断片の生産のための他の技術は当業者には明らかであろう。ある種の実施態様では、抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照。Ｆｖ及びｓｃＦｖは、定常ドメインを欠く、インタクトな結合部位を有する唯一の種である；よって、それらはインビボ使用での間の、非特異的結合を低減させるのに適している。ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のいずれかにエフェクタータンパク質の融合を生じるように構築することができる。上掲のAntibody Engineering, Borrebaeck編を参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「線形抗体」であってもよい。このような線形抗体は単一特異性又は二重特異性でありうる。
【０１４６】
(ｖｉ)多重特異性抗体
多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有し、ここでエピトープは、通常異なる抗原からのものである。そのような分子は通常２つの異なるエピトープに結合するだけであるが（つまり二重特異性抗体、ＢｓＡｂｓ）、ここで使用される場合、三重特異性抗体のような更なる特異性を備えた抗体もこの表現に包含される。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
【０１４７】
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において知られている。伝統的には、完全長二重特異性抗体の生産は、二つの鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づく(Milsteinら, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常なされるが、むしろ煩雑で、産生物収率は低い。同様の手順が国際公開第９３／０８８２９号、及びTrauneckerら, EMBO J.,10:3655 (1991)に開示されている。
【０１４８】
異なるアプローチに従えば、所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、例えばヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一の融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在するのが典型的である。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、構築に使用される３つのポリペプチド鎖の不均一な比率が、最適収率をもたらす場合の実施態様では、３つのポリペプチド断片の相互割合の調節に、かなりの順応性が提供される。しかしながら、均一な比率で少なくとも２のポリペプチド鎖の発現が高収率でなされる場合、又は比率が特に重要でない場合は、一つの発現ベクターに、２つ又は３つ全てのポリペプチド鎖のコード化配列を挿入することができる。
【０１４９】
このアプローチ法の一実施態様では、二重特異性抗体は、一方のアームの第一の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生するさらなる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照。
【０１５０】
国際公開第９６／２７０１１号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセントを最大にすることができる。界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモ二量体のような不要の他の最終産物以上に、ヘテロ二量体の収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１５１】
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンにカップリングし、他方はビオチンにカップリングする。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞をターゲティングするために(米国特許第４６７６９８０号)、またＨＩＶ感染の治療のために提案されている(国際公開１９９１／００３６０号、国際公開第１９９２／００３７３号、及び欧州特許出願公開第０３０８９号)。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野においてよく知られており、多くの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
【０１５２】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science,229:81 (1985) はインタクトな抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。生産された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
【０１５３】
最近の進歩により、化学的にカップリングさせて二重特異性抗体を形成することができるＦａｂ'-ＳＨ断片を大腸菌から直接回収することが容易になった。Shalabyら, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の生産を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学カップリングを受けて二重特異性抗体を形成する。
【０１５４】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成する。この方法はまた抗体ホモ二量体の生成に対して使用することができる。Hollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供する。断片は、あまりに短くて同一鎖上の２つのドメイン間の対形成できないリンカーにより、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)二量体の使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照。
【０１５５】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuftら J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１５６】
(ｖｉｉ)単一ドメイン抗体
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、もしくは軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む、単一のポリペプチド鎖である。ある実施態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である(Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照)。一実施態様では、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部からなる。
【０１５７】
(ｖｉｉｉ)抗体変異体
いくつかの実施態様では、ここに記載された抗体のアミノ酸配列の修飾が考慮される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は生物学的特性を改善することが望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチドに適切な変化を導入して、又はペプチド合成により調製することができる。そのような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失型、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終構成物が所望する特徴を有していれば、欠失、挿入及び置換をどのように組合せてもよい。アミノ酸変化は、配列が作製されるときに、対象となる抗体アミノ酸配列に導入することができる。
【０１５８】
(ｉｘ)抗体誘導体
本発明の抗体は、当該分野で知られ、直ぐに利用できる付加的な非タンパク質部分を含むようにさらに修飾することができる。ある種の実施態様では、抗体の誘導体化に適切な部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１,３-ジオキソラン、ポリ-１,３,６-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸のコポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリルプロピレンオキシド／エチレンオキシドのコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール類(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中におけるその安定性のために、製造においては有利でありうる。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状又は非分枝状でありうる。抗体に結合するポリマーの数は変化し得、１を越えるポリマーが結合されるならば、それらは同じ又は異なる分子でありうる。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されるものではないが、抗体誘導体が定められた条件下で治療に使用されるかどうか等に関わらず、改善される抗体の特定の特性又は機能を含む考慮に基づき、決定することができる。
【０１５９】
(ｘ)ベクター、宿主細胞、及び組換え方法
抗体は、組換え方法を使用して産生することもできる。抗抗原抗体の組換え生産では、抗体をコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。抗体をコードするＤＮＡは容易に単離され、一般的な手順を使用して(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)、配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分としては、一般に、限定されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。
【０１６０】
シグナル配列成分
本発明の抗体は、直接的に組換え的に生産されるだけではなく、好ましくはシグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても生産されうる。選択された異種シグナル配列は、好ましくは宿主細胞により認識され、プロセシング(すなわち、シグナルペプチターゼによる切断)されるものである。天然抗体シグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核生物宿主細胞では、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置き換えられる。酵母菌の分泌では、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第９０／１３６４６号に記載されているシグナルにより置き換えられうる。哺乳動物細胞の発現では、哺乳動物シグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
【０１６１】
(ｂ)複製開始点
発現及びクローニングベクターは双方とも一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般的に、クローニングベクター中において、この配列は、染色体ＤＮＡとは独立してベクターの複製を可能にするものであり、複製開始点又は自己複製配列を含む。そのような配列は、様々な細菌、酵母菌及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製開始点の成分は哺乳動物発現ベクターに必要ではない(ＳＶ４０開始点は、それが初期プロモーターを含むためだけから、典型的に使用されうる)。
【０１６２】
(ｃ)選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能なマーカーとも称される選択遺伝子を含みうる。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０１６３】
選択スキームの一例では、宿主細胞の増殖を停止させる薬剤を利用する。異種遺伝子を用いて成功裏に形質転換されたそれらの細胞は、薬剤耐性が付与されたタンパク質を生成し、よって、選択レジメを生存する。このような優性選択の例では、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンが使用される。
【０１６４】
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、ＤＨＦＲ、グルタミンシンセターゼ(ＧＳ)、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン-Ｉ及び-ＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等、抗体をコードする核酸を取り込む細胞成分を同定することのできるものである。
【０１６５】
例えば、ＤＨＦＲ遺伝子を用いて形質転換された細胞は、メトトレキサート(Ｍｔｘ)、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストを含む培養培地において、形質転換体を培養することにより同定される。これらの条件下、ＤＨＦＲ遺伝子は、任意の他の同時形質転換された核酸と共に増幅される。内在性ＤＨＦＲ活性に欠けるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞株(例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ-９０９６)を使用することができる。
【０１６６】
あるいは、ＧＳ遺伝子で形質転換された細胞は、ＧＳのインヒビターのＬ-メチオニンスルホキシイミン(Ｍｓｘ)を含む培養培地中で形質転換体を培養することにより同定される。これらの条件下、ＧＳ遺伝子は、任意の他の同時形質転換された核酸と共に増幅される。ＧＳ選択／増幅系は、上述したＤＨＦＲ選択／増幅系と組合せて使用することができる。
【０１６７】
あるいは、関心ある抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲ遺伝子、及び他の選択可能なマーカー、例えばアミノグリコシド ３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)で形質転換した又は同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)を、例えばアミノグリコシド抗生物質、特にカナマイシン、ネオマイシン、又はＧ４１８等、選択可能なマーカーに対する選択剤を含む培地において細胞増殖させることによって選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照。
【０１６８】
酵母での使用に適した選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcombら, Nature, 282：39(1979))。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。ついで、酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１破壊の存在により、トリプトファンの不在下での増殖による、形質転換の検出に効果的な環境が提供される。同様に、Ｌｅｕ２-欠失酵母菌株(ＡＴＣＣ ２０６２２又は３８６２６)は、Ｌｅｕ２遺伝子を担持する既知のプラスミドによって補完される。
【０１６９】
さらに、１．６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１から誘導されたベクターは、クルイベロマイシス酵母の形質転換に使用することができる。あるいは、組換え仔ウシキモシンの大規模産生用の発現系は、クルイベロマイシス・ラクチスについて報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイベロマイシスの工業用菌株による成熟した組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定したマルチコピー発現ベクターもまた開示されている。Fleerら, Bio/Technology, 9:968-975 (1991)。
【０１７０】
(ｄ)プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは、一般的に、宿主生物によって認識され、抗体をコードする核酸に作用可能に結合したプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、β-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン(trp)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターが含まれる。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターも適している。細菌系で使用するプロモータもまた抗体をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン-ダルガーノ(S.D.)配列を含むであろう。
【０１７１】
真核生物についてもプロモーター配列が知られている。事実上、全ての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５から３０塩基対上流に位置してＡＴ-リッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から、７０から８０塩基対上流に見出される他の配列はＣＮＣＡＡＴ領域であり、ここでＮは任意のヌクレオチドとすることができる。多くの真核生物遺伝子の３'末端には、コード化配列の３'末端への、ポリＡ末尾の付加のためのシグナルであってよいＡＡＴＡＡＡ配列である。これら全ての配列は、真核生物発現ベクター中に適切に挿入される。
【０１７２】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例には、３-ホスホグリセラートキナーゼ、又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【０１７３】
他の酵母プロモーターとしては、増殖条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘導性プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースを利用する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に用いられる適切なベクターとプロモータは欧州特許出願公開第７３６５７号にさらに記載されている。また、酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。
【０１７４】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、サルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノム、又は異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞株に適合し得る限り制御されうる。
【０１７５】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製開始点をさらに含むＳＶ４０制限断片として、簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを使用する哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現する系は、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の修飾は米国特許第４６０１９７８号に記載されている。また、単純ヘルペスからのチミジンキナーゼプロモーターのコントロール下での、マウス細胞におけるヒトβ-インターフェロンｃＤＮＡの発現については、Reyesら, Nature 297:598-601 (1982)を参照。また、プロモーターとして、ラウス肉腫ウイルスの長い末端リピートを使用することもできる。
【０１７６】
(ｅ)エンハンサーエレメント成分
より高等な真核生物によるこの発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、しばしば、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のためのエレメントの増強については、Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)を参照。エンハンサーは、抗体をコードする配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【０１７７】
(ｆ)転写終結成分
また真核生物宿主細胞(酵母菌、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５'、時には３'の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。他の有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号及びそこに開示された発現ベクターを参照。
【０１７８】
(ｇ)宿主細胞の選択及び形質転換
ここのベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、上述した原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物、特に大腸菌類、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリ・スブチリス(B. subtilis)及びバシリ・リチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６７１０に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。好ましい大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ ３１４４６)であるが、他の菌株、例えば大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ ３１５３７)、及び大腸菌株Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ ２７３２５)も適している。これらの例は限定というよりは、例示的なものである。
【０１７９】
完全長抗体、抗体融合タンパク質、及び抗体断片は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でない場合、例えば治療用抗体が、腫瘍細胞破壊において、それ自体で有効性を示すことにより、細胞傷害剤(例えば毒素)にコンジュゲートする場合、細菌内で産生させることができる。全長抗体は、より長い循環半減期を有する。大腸菌では、より速く、より費用効果のよく産生される。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば最適な発現及び分泌についての翻訳開始領域(ＴＩＲ)及びシグナル配列を記載した、米国特許第５６４８２３７号 (Carterら)、米国特許第５７８９１９９号 (Jolyら)、米国特許第５８４０５２３号 (Simmonsら)を参照。また、大腸菌における抗体断片の発現を記載した、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254も参照。発現後、抗体は、可溶性画分において、大腸菌細胞ペーストから単離され、アイソタイプに応じて、例えばプロテインＡ又はＧカラムを通して精製することができる。最終的な精製は、例えばＣＨＯ細胞において発現する抗体を精製するためのプロセスに類似した形で実施することができる。
【０１８０】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。しかしながら、他の多くの属、種及び菌株、例えばシゾサッカロミセス・プロンブ(Schizosaccharomyces pombe)；クルベロミセス・ホスツ(Kluveromyces hosts)、例えばケーラクチス(K. lactis)、ケーフラギリス(K. fragilis)(ＡＴＣＣ １２４２４)、ケーブルガリクス(K. bulgaricus)(ＡＴＣＣ １６０４５)、ケーウィケラミイ(K. wickeramii)(ＡＴＣＣ ２４１７８)、ケーワルチイ(K. waltii)(ＡＴＣＣ ５６５００)、ケードロソフィラルム(K. drosophilarum)(ＡＴＣＣ ３６９０６)、ケーテルモトレランス(K. thermotolerans)及びケーマルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)(欧州特許出願公開第４０２２２６号)；ピッチャ・パストリス(Pichia pastoris)(欧州特許出願公開第１８３０７０号)；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)(欧州特許出願公開第２４４２３４号)；アカパンカビ；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(occidentalis)；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)、及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌及びクロコウジカビも、ここでは一般的に入手可能で有用である。治療用タンパク質の生成のための、酵母及び糸状菌の使用を論議する概説について、例えばGerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)を参照。
【０１８１】
ある種の真菌及び酵母菌株が選択され、グリコシル化経路で「ヒト化」され、部分的又は全体的なヒトグリコシル化パターンを有する抗体が生成される。例えば、Liら, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)(ピキア・パストリスにおけるグリコシル化経路のヒト化を記載)；及び上掲のGerngross等を参照。
【０１８２】
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は多細胞生物(無脊椎動物及び脊椎動物)から誘導される。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルスの菌株及び変異体、及び宿主、例えばヨトウガ(イモムシ)、ネッタイシマカ(蚊)、ヒトスジシマカ(蚊)、キイロショウショウバエ(ショウジョウバエ)、及びカイコからの対応する許容的昆虫宿主細胞が同定されている。形質移入用の様々なウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶのＬ-１変異体、及びカイコＮＰＶのＢｍ-５株も公に入手可能であり、このようなウイルスは、本発明では、特にヨウトガ細胞の形質移入用のウイルスとして使用されうる。
【０１８３】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、ウキクサ(ウキクサ科)、アルファルファ(M. truncatula)及びタバコの植物細胞培養体も、宿主として利用可能である。例えば、米国特許第５９５９１７７号、同６０４０４９８号、同６４２０５４８号、同７１２５９７８号、及び同６４１７４２９号 (トランスジェニック植物での抗体生産のためのPLANTIBODIESTM技術を記載)を参照。
【０１８４】
脊椎動物細胞も宿主として使用可能であり、培養体(組織培養)における脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順でなされる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１);ヒト胚腎臓細胞(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Grahamら, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ベビーハムスター腎臓細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ 1０)；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サル腎臓細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎臓細胞(ＶＥＲＯ-７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞(ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２)；イヌ腎臓細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４)；バッファロラット肝臓細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５); ヒト肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５); マウス乳房腫瘍(ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＴＣＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Matherら, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞腫(Ｈｅｐ Ｇ２)である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ-ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞(Urlaubら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；及び骨髄腫細胞株、例えばＮＳ０及びＳｐ２／０が含まれる。抗体生成に適したある種の哺乳動物宿主細胞の概説について、例えばYazaki 及び Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 255-268を参照。
【０１８５】
宿主細胞は、上述した、抗体生成用の発現又はクローニングベクターを用いて形質転換され、プロモーターを含むように適切に修飾された一般的な栄養培地において培養され、形質転換体を選択するか、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅させる。
【０１８６】
(ｈ)宿主細胞の培養
この発明の抗体の生成に使用される宿主細胞は、様々な培地で培養されてよい。商業的に入手可能な培地、例えばハム(Ｈａｍ)のＦ１０(Sigma)、最小必須培地((ＭＥＭ)、Sigma)、ＲＰＭＩ-１６４０(Sigma)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ)、Sigma)が、宿主細胞の培養に適している。さらに、Hamら, Meth. Enz. 58:44(1979)、Barnesら, Anal. Biochem.102:255(1980)、米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載されている任意の培地も、宿主細胞用の培養培地として使用可能である。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えばゲンタマイシンＴＭ剤)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１８７】
(ｘｉ)抗体の精製
組換え技術を使用する場合、抗体は細胞膜周辺腔で細胞内で産生されるか、あるいは直接培地へ分泌されるかである。第１の工程として、抗体が細胞内で産生される場合、粒子状デブリ、宿主細胞又は溶菌断片のいずれかは、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carterら, Bio/Technology 10:163-167 (1992)には、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される、単離された抗体のための手順が記載されている。簡単には、細胞ペーストは、酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ)の存在下、約３０分以上かけて解凍される。細胞片は遠心分離により除去することができる。抗体が培地に分泌される場合、このような発現システムからの上清は、一般的に商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はMillipore Pellicon 限外濾過ユニットを使用して濃縮される。プロテアーゼインヒビター、例えばＰＭＳＦは、タンパク質分解を阻害するために、先の工程のいずれかに含めることができ、抗生物質は不定汚染物質の増殖を防止するために含めることができる。
【０１８８】
細胞から調製された抗体組成物は、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製可能であり、アフィニティークロマトグラフィーは典型的には、好ましい精製工程の一つである。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、ヒトγ２、又はヒトγ４の重鎖(Lindmarkら, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))をベースにした抗体を精製するのに使用可能である。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３について推奨されている(Gussら, EMBO J. 5:15671575 (1986))。親和性リガンドが結合するマトリックスは最も多くはアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定したマトリックス、例えば制御多孔質ガラス又はポリ(スチレンジビニル)ベンゼンにより、アガロースで達成されるよりも、流速がより速くなり、プロセシング時間が短縮される。抗体がＣＨ３ドメインを含有している箇所においては、BAKERBOND ABXＴＭ樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)が精製に有用である。タンパク質を精製するための他の技術、例えばイオン交換カラムにおける分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカにおけるクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース(SEPHAROSE)ＴＭにおけるクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂におけるクロマトグラフィー(例えば、ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０１８９】
一般的に、研究、試験及び臨床で使用される抗体を調製するための様々な方法が、当該分野で確立され、上述した方法と一致しており、及び／又は関心ある特定の抗体に対して当業者によって適切と思われている。
【０１９０】
Ｄ．生物学的に活性な抗体の選択
上に記載されたようにして製造された抗体に、治療的観点から有益な特性を有する抗体を選択するために、一又は複数の「生物学的活性」アッセイを施すことができる。抗体は、それを生じさせる抗原に結合する能力についてスクリーニングすることができる。例えば、以下の実施例に示されるように、抗ｏｘＬＤＬ抗体では、抗体の抗原結合特性を、ＭＤＡ-ＡｐｏＢ１００に結合する能力を検出するアッセイにおいて評価することができる。ある種の実施態様では、抗体の抗原結合特性は、ｏｘペプチドＩＥＩＧＬＥＧＫＧＦＥＰＴＬＥＡＬＦＧＫ(配列番号：５)に結合する能力を検出するアッセイにおいて評価することができる。また、抗ｏｘＬＤＬ抗体は、プラーク形成を阻害し、動物モデルにおいて動脈硬化病変の進行を防止するものについてスクリーニングすることもできる(例えば、Schiopuら, 2004; 国際公開第２００４／０３０６０７号；米国特許第６７１６４１０号)。他の活性は、処置の数週間後、大動脈における既存の確立された動脈硬化プラークの退縮を活発に誘導することを含む。
【０１９１】
他の実施態様では、抗体の親和性は、例えば飽和結合；ＥＬＩＳＡ；及び／又は競合アッセイ(例えば、ＲＩＡ'ｓ)により測定することができる。
【０１９２】
また、抗体には、治療剤としてのその効能を評価するために、他の生物学的活性アッセイを施すことができる。このようなアッセイは当該分野で知られており、標的抗原及び抗体の意図された用途に依存する。
【０１９３】
関心ある抗原上の特定のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために(例えば、ｏｘＬＤＬへの実施例の抗ｏｘＬＤＬ抗体の結合をブロックするもの等)、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane (1988) に記載されているような常套的な交差ブロッキングアッセイを実施することができる。あるいは、例えばChampeら, J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995) に記載されているようなエピトープマッピングを実施して、抗体が関心あるエピトープに結合するかとうかを決定することができる。
【０１９４】
Ｅ．製造品
本発明の他の実施態様では、本発明の水性薬学的製剤を収容し、場合によっては、その使用のための使用説明書を提供する容器を具備する製造品が提供される。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、及びシリンジが含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されうる。例示的な容器は３−２０ｃｃの使い捨てガラスバイアルである。あるいは、多用量製剤用には、容器は３−１００ｃｃのガラスバイアルでありうる。容器は製剤を収容し、容器上の又はそれに付随したラベルは使用についての指示を示しうる。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書を含むパッケージ挿入物を含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含みうる。
【０１９５】
本発明は、次の実施例を参照することにより、さらに十分に理解されるであろう。しかしながら、それらは本発明の範囲を限定すると解してはならない。全ての文献及び特許引用文献は出典明示によりここに援用される。
【０１９６】
本明細書は、当業者が本発明を実施するには十分であると考えられる。ここに示し記載したものに加えて、本発明の様々な変形例が、前記の記載から当業者には明らかになり、添付の特許請求の範囲に入るものである。ここで引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、全ての目的に対して、それらの全体が出典明示によりここに援用される。
【実施例】
【０１９７】
ここに記載の実施例及び実施態様は例示目的のみのためであり、それに鑑みた様々な変更又は変形が当業者に示唆され、この出願の要旨及び範囲、及び添付の特許請求の範囲に含まれる。
【０１９８】
実施例１：安定な抗ｏｘＬＤＬ抗体の液体製剤，ｐＨ研究
これらの実施例は、約１０ｍｇ／ｍＬ−２００ｍｇ／ｍＬの範囲のタンパク質濃度で、抗ｏｘＬＤＬ抗体(図２に見出されるアミノ酸配列を有する)を含有する安定な液体製剤の開発及び安定性試験を記載する。抗体を、ヒトＡｐｏＢ-１００から誘導された酸化ペプチドに対して産生させたｎ-ＣｏＤｅＲ(登録商標)と呼ばれる組換え抗体断片ライブラリーから開発した(例えば、国際公開第０２／０８０９５４号)。抗ｏｘＬＤＬ抗体の安定性(例えば、凝集体形成、電荷変異体等)を、４．５〜６．５のｐＨの範囲内で、ヒスチジン、アルギニン、アセテート、塩化ナトリウム等からなる様々な液体製剤において研究した。抗ｏｘＬＤＬ抗体の安定性を、(濃度及び濁度については)ＵＶ、サイズ変異分析についてはサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)、電荷変異体分析についてはイメージキャピラリー等電点電気泳動(ｉｃＩＥＦ)、及び結合性を含むいくつかのアッセイによりモニターした。安定性試験の６ヶ月後、我々の結果は、抗ｏｘＬＤＬ抗体が、アルギニン含有バッファー中でｐＨ４．５とｐＨ６．５の間で安定であることを示している。
【０１９９】
抗ｏｘＬＤＬ抗体を、表１に列挙する様々な濃度を達成するために、Slide-a-Lyzerカセットを使用する透析により、様々なバッファーで製剤化した。各製剤を０．２２μｍのSterifilpフィルターユニットを用いて滅菌濾過し、オートクレーブされたバイアルに無菌的に充填し、栓をし、アルミニウム製の押上式シールで密封した。試料を−２０℃、２〜８℃、２５℃、３０℃、４０℃バイアル、及び−７０℃のコントロールバイアルに配し、選択された温度で６ヶ月まで安定性研究を実施した。
【０２００】
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【０２０１】
方法
ｐＨ：  ２００μＬ容量の各試料を、周囲温度で１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに配し、それらのｐＨを、Rossセミマイクロ電極を具備するThermo OrionのｐＨメーターを使用して測定した。Thermo Orionのバッファー標準液ｐＨ４．０、５．０及び７．０を使用し、ｐＨメーターを較正した。
【０２０２】
目視検査：  試料を、色、外観及び透明性(ＣＡＣ)について、周囲温度で白色及び黒色背景を用い、蛍光下で視覚的に分析した。
【０２０３】
濁度：  製剤試料の濁度を、SpectraMax M2eプレートリーダーを使用し、３６０ｎｍと４５０ｎｍの吸光度により測定した。１００μＬの未希釈試料を９６ウェルマイクロタイタープレートに充填し、水ブランクに対して濁度を測定した。異なるタンパク質濃度の製剤を比較するために、３６０ｎｍと４５０ｎｍの吸光度をタンパク質濃度で割り、存在するタンパク質量のみに起因する任意の影響に対して正規化した。
【０２０４】
浸透圧：  ５０ｍＯｓｍ／ｋｇ及び８５０ｍＯｓｍ／ｋｇの較正溶液を使用し、使用者用マニュアルに従い、浸透圧計を較正した。製剤を流す前に、Clinitrol２９０参照溶液を流すことにより、較正を確認した。
【０２０５】
タンパク質濃度-容積測定：  全ての製剤についての濃度を、Milli-Q水を用いて試料を０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈した後、２回測定した。希釈した試料を９６ウェルプレート(BD bioscience)に移し、吸光度スペクトルを、SpectraMaxプレートリーダーを使用して読み取った(Molecular Devices M2e)。読み取りはＤＩ水に対してブランクとし、平均化した。タンパク質濃度は、次の式に従い算出した：
濃度(mg/mL)＝{(Ａｍａｘ−Ａ３２０)×希釈因子(mL/mL)}／{ε×セル光路長(cm)}
抗ｏｘＬＤＬ抗体の測定された吸光係数(ε)は１．６２(ｍｇ／ｍＬ)−１ｃｍ−１である。
【０２０６】
粘度：  粘度を、Physica MCR 300 Modular Compact Rheometer, Anton Paarを使用することによって測定した。７５μＬの試料を、周囲温度で２５ｍｍの円錐平板レオメーター(角度１°；ＣＰ２５-１)に充填した。測定を１０００ｓｅｃ−１の一定の剪断速度で行った。
【０２０７】
活性：  抗ｏｘＬＤＬ抗体の生物学的活性を、ＥＬＩＳＡにおいて、ｏｘ-ＬＤＬへのその結合能力を測定することにより決定した。ＥＬＩＳＡ-結合アッセイは、抗ｏｘＬＤＬ抗体のマロンジアルデヒド(ＭＤＡ)酸化ＬＤＬペプチドに結合する能力を定量する。
【０２０８】
サイズ排除-高速液体クロマトグラフィー(ＳＥＣ)：  サイズ排除クロマトグラフィーを、凝集体及び断片を定量するために使用した。このアッセイは、TSK G3000 SWXLＴＭ、７．８×３００ｍｍカラムを利用しており、２５℃でHP 1100ＴＭＨＰＬＣシステムにおいて動作させた。移動相を用いて試料を２ｍｇ／ｍＬに希釈し、注入量は２５μＬであった。移動相は０．２ＭのＫ２ＨＰＯ４、０．２５ＭのＫＣｌ、ｐＨ６．２であり、タンパク質は、３０分、０．５ｍＬ／分の定常流量で溶出させた。溶出液の吸光度を２８０ｎｍでモニターした。積分をHP CHEMSTATIONMＴＭソフトウェアを使用して実施した。
【０２０９】
イメージキャピラリー等電点電気泳動(ｉｃＩＥＦ)：  ４０℃で保存された安定性試料と参照試料を、抗ｏｘＬＤＬ抗体安定性試料の電荷(酸性及び塩基性)変異体を定量するためにｉｃＩＥＦを使用してアッセイした。この技術は、Princeオートサンプラーを具備するFAST IEF分析器でフルオロカーボンコーティングされたキャピラリーを使用する。
【０２１０】
イオン交換クロマトグラフィー(ＩＥＸ)：  カチオン交換クロマトグラフィーを用いて、電荷変異体における変化を測定した。このアッセイは、HP 1100ＴＭＨＰＬＣシステムでDIONEX PROPAC WCX-10ＴＭカラムを利用する。５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５を含む移動相Ａを用いて、試料を２ｍｇ／ｍＬまで希釈した。ついで、２５μｌの希釈試料を、周囲温度(４０℃)に保持されたカラムに充填した。５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭの硫酸ナトリウム，ｐＨ７．５を含む移動相Ｂを使用し、ピークを溶出させた。溶出液を２８０ｎｍでモニターした。HP CHEMSTATION(登録商標)ソフトウエアを使用して、データを分析した。
【０２１１】
結果及び検討
この製剤ｐＨ研究では、抗ｏｘＬＤＬ抗体の安定性に対するタンパク質濃度、イオン強度及び溶液ｐＨの影響を調査した。ＳＥＣ、ＩＥＣ、ｉｃＩＥＦ及び濁度アッセイを使用し、リアルタイム及び促進保存条件での抗ｏｘＬＤＬ抗体の安定性をモニターした。タンパク質濃度、浸透圧、粘度、結合性及びＣＥ-ＳＤＳアッセイは、選択された時点で実施した。この研究は、ｐＨ４．５〜ｐＨ６．５のｐＨ範囲にわたって、アルギニンベースの製剤における様々な濃度の抗ｏｘＬＤＬ抗体の安定性(例えば、凝集体形成、電荷変異体等)を調査した。Ｌ-アルギニンを使用し、高イオン強度のバッファーを処方した。浸透圧、ｐＨ、タンパク質濃度、及び粘度を測定し、以下に示す(表２)。
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【０２１２】
全ての製剤を、−２０℃又は−７０℃のいずれかでの３回の凍結サイクルに暴露し、続いて周囲温度で冷却した。表１に列挙された製剤について、凍結が、−７０℃及び−２０℃での抗ｏｘＬＤＬ抗体の物理的特性を有意には変化させなかったことを、ＳＥＣで確認した(表２を参照)。
【０２１３】
４０℃での全製剤の結合活性：  試料の結合活性を、ｏｘＬＤＬに対するＥＬＩＳＡ-結合アッセイで測定した。アッセイにより、４０℃での４週間のインキュベーション後に試験した全製剤が、コントロール試料(＠Ｔ０)の〜２０％まで低下していることが示された(表３)。
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【０２１４】
ｐＨの影響：  サイズ、電荷変異体、及び濁度アッセイを使用し、様々な温度での抗ｏｘＬＤＬ抗体の経時的な安定性をモニターした。ＳＥＣを使用して、生じた凝集体、モノマー及び断片の量を測定する一方、ＩＥＣを使用して、安定性研究中に生じた酸性変異体、主要な変異体及び塩基性変異体を定量した(図３)。使用したＩＥＣ法は、試験された全ての抗ｏｘＬＤＬ抗体製剤についての安定性を示すアッセイではなく、よって、我々は、異なるメカニズムで電荷を分離させるｉｃＩＥＦを使用した。溶液ｐＨ４．５で、抗ｏｘＬＤＬ抗体はより多くの塩基性変異体を形成したが、より多くの酸性変異体がｐＨ６．５で形成された(図３)。
【０２１５】
これらの結果は、４０℃では抗ｏｘＬＤＬ抗体がｐＨ６．５で直ぐに凝集し、ｐＨ４．５で断片化することを示したＳＥＣ研究で補足した(図４)。ＳＥＣ及びＩｃＩＥＦデータは双方とも、４０℃で、抗ｏｘＬＤＬ抗体が、試験されたｐＨ４．５及びｐＨ６．５の試料と比較して、ｐＨ５．５でより安定していることを示唆している。
【０２１６】
試料の濁度を３６０ｎｍ及び４５０ｎｍの波長で測定し、タンパク質濃度に対して正規化させた。観察された正規化された試料濁度は、３０℃及び４０℃の時点でわずかに増加した；しかしながら、沈殿は観察されなかった。
【０２１７】
賦形剤及びイオン強度の影響：  抗ｏｘＬＤＬ抗体の安定性に対する様々な賦形剤の影響を調査した。調査した賦形剤の列挙には、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸ヒスチジン、及び酢酸アルギニンが含まれる。我々の結果は、塩化ナトリウムを含む製剤が、全ての他の製剤より速く凝集することを示している。
【０２１８】
抗ｏｘＬＤＬ抗体濃度の影響：  タンパク質濃度は、サイズ及び電荷変異体アッセイにより示唆されるように、抗ｏｘＬＤＬ抗体の安定性に対して強い効果を有していなかった。凝集は、９９ｍｇ／ｍｌと１８９ｍｇ／ｍｌの間の濃度にわずかに依存するように思われ、より高い濃度はわずかに凝集が多い。ＳＥＣを使用して、生じた凝集体、モノマー及び断片の量を定量する一方、ｉｃＩＥＣを使用して、安定性研究中に生じた酸性変異体、主要な変異体及び塩基性変異体を定量した。
【０２１９】
抗ｏｘＬＤＬ抗体の安定性を、様々なバッファー条件で評価した。製剤のスクリーニング研究から得られたデータは、抗ｏｘＬＤＬ抗体が、ｐＨ４．５とｐＨ６．５の間で酢酸ヒスチジン及び酢酸アルギニンバッファーにおいてより安定していることを示している。
【０２２０】
実施例２．安定な抗ｏｘＬＤＬ抗体液体製剤，賦形剤の研究
抗ｏｘＬＤＬ抗体の安定性を、様々な液体(酢酸ヒスチジン、硫酸ヒスチジン、コハク酸ヒスチジン、クエン酸ヒスチジン、及びＰＢＳ)製剤(表Ａ)において評価した。３ｃｃのガラスバイアルに各製剤を１ミリリットル入れたものを、６ヶ月間の期間まで、−７０、−２０、５、２５、３０及び４０℃で保存し、安定性を１、２、４、６、８、１２及び２４週間で評価した。抗ｏｘＬＤＬ抗体の安定性は、(濃度及び濁度については)ＵＶ、サイズ変異分析についてはサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)、電荷変異体分析についてはイメージキャピラリー等電点電気泳動(ｉｃＩＥＦ)、サイズ分布についてはＣＥ-ＳＤＳ、及び活性については結合アッセイを含むいくつかのアッセイによりモニターした。６ヶ月の安定性試験後、我々の結果は、抗ｏｘＬＤＬ抗体が、２０ｍＭの酢酸ヒスチジン、１５０ｍＭの酢酸アルギニン、０．０２％のポリソルベート２０，ｐＨ５．５において安定していることを示した。
【０２２１】
試料の調製：  抗ｏｘＬＤＬ抗体を、標的濃度を達成するために、Slide-a-Lyzerカセットを使用して透析し、ついでAmicon Ultra-15遠心分離器を使用してタンパク質を濃縮することにより、様々なバッファー中に製剤化した。ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、メチオニン、及びＥＤＴＡを添加し、表Ａに列挙した最終濃度を達成した。各製剤を０．２２μｍのSterifilpフィルターユニットを用いて滅菌濾過し、オートクレーブされたバイアルに無菌的に充填し、栓をし、アルミニウムの押上式シールで密封した。以下の製剤の全試料を液体として保持した。試料を−２０℃、２〜８℃、２５℃、３０℃、４０℃バイアル、及び−７０℃のコントロールバイアルに配し、選択温度で６ヶ月まで、安定性研究を実施した。
【０２２２】
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【０２２３】
方法
ｐＨ：  ２００μＬの各試料を、周囲温度で、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに配し、それらのｐＨを、Rossセミマイクロ電極を具備するThermo OrionのｐＨメーターを使用して測定した。Thermo Orionのバッファー標準液ｐＨ４．０、５．０及び７．０を使用し、ｐＨメーターを較正した。
【０２２４】
目視検査：  試料を、色、外観及び透明性(ＣＡＣ)について、周囲温度で白色及び黒色背景を用い、蛍光下で視覚的に分析した。
【０２２５】
濁度：  製剤試料の濁度を、SpectraMax M2eプレートリーダーを使用し、３６０ｎｍと４５０ｎｍの吸光度により測定した。１００μＬの未希釈試料と水(ブランク用)を９６ウェルマイクロタイタープレートに充填し、濁度を測定した。異なるタンパク質濃度の製剤を比較するために、３６０ｎｍと４５０ｎｍの吸光度をタンパク質濃度で割り、存在するタンパク質量のみに起因する任意の影響に対して正規化した。
【０２２６】
浸透圧：  ５０ｍＯｓｍ／ｋｇ及び８５０ｍＯｓｍ／ｋｇの較正溶液を使用し、使用者用マニュアルに従い、浸透圧計を較正した。製剤試料を流す前に、Clinitrol２９０参照溶液を流すことにより、較正を確認した。
【０２２７】
タンパク質濃度-容積測定：  全ての製剤についての濃度を、Milli-Q水を用いて試料を０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈した後、２回測定した。希釈した試料を９６ウェルプレート(BD bioscience カタログ番号353261)に移し、濃度をSpectraMaxプレートリーダーを使用して読み取った(Molecular Devices M2e)。読み取りはＤＩ水に対してブランクとし、平均化した。タンパク質濃度は、次の式に従い算出した：
濃度(mg/mL)＝{(Ａｍａｘ−Ａ３２０)×希釈因子(mL/mL)}／{ε×セル光路長(cm)}
抗ｏｘＬＤＬ抗体の測定された吸光係数(ε)は１．６２(ｍｇ／ｍＬ)−１ｃｍ−１である。
【０２２８】
粘度：  粘度を、Physica MCR 300 Modular Compact Rheometer, Anton Paarを使用することによって測定した。７５μＬの試料を、周囲温度で２５ｍｍの円錐平板レオメーター(角度１°；ＣＰ２５-１)に充填した。測定を１０００ｓｅｃ−１の一定の剪断速度で行った。
【０２２９】
結合アッセイ：  ４０℃で保存した４週間安定試料を、Milli-Q水を用いて０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈し、ＥＬＩＳＡにおいてｏｘＬＤＬ結合について試験した。熱分解過程を受けていない試料をアッセイコントロールとして使用した。
【０２３０】
ＣＥ-ＳＤＳ ＵＶ(非還元)：  ４０℃で保存した４週間安定試料及び参照試料を、ＣＥ-ＳＤＳ ＵＶ非還元法を使用してアッセイし、抗ｏｘＬＤＬ抗体安定試料のサイズ分布を評価した。
【０２３１】
サイズ排除-高速液体クロマトグラフィー(ＳＥＣ)：  サイズ排除クロマトグラフィーを、凝集体及び断片を定量するために使用した。このアッセイは、TSK G3000 SWXLＴＭ、７．８×３００ｍｍカラムを利用しており、HP 1100ＴＭＨＰＬＣシステムにおいて動作させた。移動相を用いて試料を２ｍｇ／ｍＬに希釈し、注入量は２５μＬであった。移動相は０．２ＭのＫ２ＨＰＯ４、０．２５ＭのＫＣｌ、ｐＨ６．２であり、タンパク質は、３０分、０．５ｍＬ／分の定常流量で溶出させた。溶出液の吸光度を２８０ｎｍでモニターした。積分をHP CHEMSTATIONMＴＭソフトウェアを使用して実施した。
【０２３２】
イメージキャピラリー等電点電気泳動(ｉｃＩＥＦ)：  ４０℃で保存された安定試料と参照試料を、抗ｏｘＬＤＬ抗体安定試料の電荷(酸性及び塩基性)変異体を定量するために、ｉｃＩＥＦを使用してアッセイした。この技術は、Princeオートサンプラーを具備するFAST IEF分析器において、フルオロカーボンコーティングされたキャピラリーを使用する。
【０２３３】
結果及び議論
この製剤賦形剤研究では、抗ｏｘＬＤＬ抗体の安定性に対する様々なバッファー対イオン、界面活性剤及び抗酸化剤の影響を調査した。ＳＥＣ、ｉｃＩＥＦ及び濁度アッセイを使用し、研究全体を通した抗ｏｘＬＤＬ抗体の安定性をモニターした。タンパク質濃度、浸透圧、粘度、効能、及びＣＥ-ＳＤＳアッセイを、選択された安定性試料及び時点で実施した。２０ｍＭ濃度で約ｐＨ５．５のバッファーを、先のｐＨ研究の結果に基づき選択した。全液体製剤のｐＨをバッファー交換後に測定した(表Ａ)。浸透圧、ｐＨ、タンパク質濃度、及び粘度を測定し、以下に示す(表Ｂ)。目視検査アッセイからの結果は、全ての試料が淡黄色の色調で透明に見えることを示している。
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【０２３４】
−２０℃及び−７０℃で保存された製剤のセットに、１週間にわたって３回の凍結解凍サイクルを施した。試料をそれぞれ−２０℃及び−７０℃で凍結させ、ついで周囲温度で解凍した。凍結解凍サイクルを受けた試料の物理特性を、サイズ排除クロマトグラフィーにより評価した。ＳＥＣアッセイは、凍結解凍が、試験された試料の凝集体又は断片の割合に影響を及ぼさないことを確認した。
【０２３５】
試料の濁度を３６０ｎｍ及び４５０ｎｍの波長で測定し、５℃で保存されたほとんどの製剤の濁度が経時的に実質的に変化しなかったことが示された。製剤試料の濁度は、温度(２５℃、３０℃及び４０℃)及び時間と共にわずかに増加した。
【０２３６】
ＣＥ-ＳＤＳ ＵＶは、タンパク質の共有結合性凝集体、断片及びモノマー、例えば抗体調製物中の遊離の軽鎖又は重鎖の見かけの分子量を推定するために使用される定量アッセイである。ＣＥ-ＳＤＳアッセイを、４０℃で４週間保存した安定性試料を使用する非還元条件で動作させた。結果は、試験された全試料に対する主要なピークの割合が、許容可能なアッセイ範囲内にあることを示している(図５)。
【０２３７】
試料の結合活性を、ＥＬＩＳＡ-結合アッセイを使用して測定した。ＥＬＩＳＡ-結合アッセイは、抗ｏｘＬＤＬ抗体のマロンジアルデヒド(ＭＤＡ)酸化ＬＤＬペプチドに結合する能力を定量する。該アッセイの結果は、４０℃で４週間のインキュベーション後に試験した全製剤が、＋／−２５％の許容可能なアッセイ範囲内にあることを示している(図６)。
【０２３８】
抗ｏｘＬＤＬ抗体濃度の影響：  ２０ｍＭの酢酸ヒスチジン、１５０ｍＭの酢酸アルギニン、０．０２％のＰＳ２０，ｐＨ５．５において製剤化され、４０℃で４週間まで保存された３通りの濃度(２５ｍｇ／ｍＬ(１)、５０ｍｇ／ｍＬ(２)、及び１５０ｍｇ／ｍＬ(３))をアッセイし、抗ｏｘＬＤＬ抗体の安定性に対する濃度の影響を調査した。結果は、２５ｍｇ／ｍＬ及び５０ｍｇ／ｍＬの製剤では、時間及び温度に凝集体形成が有意には依存しないが、１５０ｍｇ／ｍＬの製剤試料では凝集体形成の増加があることを示している。ｉｃＩＥＦアッセイの結果は、研究した３つ全ての濃度について、酸性変異体の増加が時間及び温度に依存していることを示している(図７Ａ及びＢ)。
【０２３９】
賦形剤の影響：  抗ｏｘＬＤＬ抗体の安定性に対する様々な賦形剤の影響を調査した。調査した賦形剤の列挙には、リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)、ヒスチジン塩酸塩、及びアルギニンに対する対イオン(アセテート、サルフェート、スクシネート、及びシトレート)が含まれる。結果は、その対イオンにかかわらず、アルギニン含有製剤について凝集体、断片化、及び塩基性変異体において有意な変化がないことを示している。ＰＢＳの存在下、研究した全ての温度において、凝集、断片化、及び酸性変異体が経時的に有意に増加した。
【０２４０】
界面活性剤：  界面活性剤は、攪拌誘発性凝集並びにタンパク質の吸着誘発性損失に対する保護を提供する。抗ｏｘＬＤＬ抗体の安定性に対する非イオン性界面活性剤の影響は、ポリソルベート２０(０．０２％及び０．２％)、及びポリソルベート８０(０．０５％)を使用することにより軽減された。結果は、０．０２％のポリソルベート２０がタンパク質を安定に保つのに十分であることを示している。ポリソルベート濃度を０．２％まで増加させるか、又は高分子量の界面活性剤のポリソルベート８０を使用しても、抗ｏｘＬＤＬ抗体に対して何らの安定性の利点がもたらされなかった(図８)。
【０２４１】
抗酸化剤：  メチオニン(５ｍｇ／ｍＬ)とＥＤＴＡ(１ｍＭ)を、製剤９及び１１のそれぞれに、抗酸化剤として使用した。ＥＤＴＡは金属イオンをキレートし、よって金属誘発性酸化を防止する一方、メチオニンは、酸化種を除去する能力を有している。ＳＥＣアッセイの結果は、ＥＤＴＡ及びメチオニンが、２〜８℃で、抗ｏｘＬＤＬ抗体の安定性をほんのわずかに改善することを示している(図８)。
抗ｏｘＬＤＬ抗体の安定性を、様々なバッファー条件で評価した。製剤スクリーニング研究から得られたデータは、抗ｏｘＬＤＬ抗体が、２０ｍＭの酢酸ヒスチジン、１５０ｍＭの酢酸アルギニン、０．０２％のポリソルベート２０，約ｐＨ５．５において、１５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で安定であることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年11月7日(2011.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
真核生物についてもプロモーター配列が知られている。事実上、全ての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５から３０塩基対上流に位置してＡＴ-リッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から、７０から８０塩基対上流に見出される他の配列はＣＮＣＡＡＴ（配列番号：８）領域であり、ここでＮは任意のヌクレオチドとすることができる。多くの真核生物遺伝子の３'末端には、コード化配列の３'末端への、ポリＡ末尾の付加のためのシグナルであってよいＡＡＴＡＡＡ（配列番号：９）配列である。これら全ての配列は、真核生物発現ベクター中に適切に挿入される。
【国際調査報告】
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