(57)【要約】本発明は、細菌感染、特にブドウ球菌による感染を処置または予防するための方法および組成物に関する。本発明は、細菌に対する免疫反応を刺激するための方法および組成物を提供する。ある種の態様において、これらの方法および組成物には、Eap、Empおよび／もしくはAdsAアミノ酸配列、またはそれらに結合しそれらを阻害する薬剤が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 単離されたEmp抗原、またはその免疫原性断片と、
(b) 単離されたClfA、ClfB、Eap、EsaB、EsxA、EsxB、EsaC、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SasB、SdrC、SdrD、SdrE、SasH、Ebh、Coa、vWa、HlaおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片と
を含む抗原組成物であって、
該抗原が、免疫反応をそれを必要とする被験体において刺激できる薬学的に許容される組成物に含まれる、前記抗原組成物。
【請求項２】
V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および／または多糖類細胞内付着因子(PIA)の一つまたは複数をさらに含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および／または多糖類細胞内付着因子(PIA)がタンパク質担体に抱合される、請求項2記載の組成物。
【請求項４】
タンパク質担体が破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)プロテインD、肺炎球菌溶血素およびα毒素からなる群より選択される、請求項3記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原が単離されたClfB、Eap、EsxA、EsxB、IsdAおよびSrdDからなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原が単離されたIsdA抗原である、請求項1記載の組成物。
【請求項７】
ClfB、Eap、EsxA、EsxB、H1aおよびSdrDからなる群より選択される一つまたは複数のさらなるブドウ球菌抗原をさらに含む、請求項6記載の組成物。
【請求項８】
V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および／または多糖類細胞内付着因子(PIA)の一つまたは複数をさらに含む、請求項7記載の組成物。
【請求項９】
V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および／または多糖類細胞内付着因子(PIA)がタンパク質担体に抱合される、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
タンパク質担体が破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197、インフルエンザ菌プロテインD、肺炎球菌溶血素およびα毒素からなる群より選択される、請求項9記載の組成物。
【請求項１１】
他のブドウ球菌成分による1%重量／重量未満の混入を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１２】
一つまたは複数の単離された抗原がアジュバントにカップリングされる、請求項1記載の組成物。
【請求項１３】
Emp抗原がSEQ ID NO:2の少なくとも5、10、15または20個の連続アミノ酸を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１４】
Emp抗原がSEQ ID NO:2に対して少なくとも70%、80%、90%、95%または98%同一である、請求項1または13記載の組成物。
【請求項１５】
Emp抗原がSEQ ID NO:2に対して少なくとも90%同一である、請求項1または13記載の組成物。
【請求項１６】
Emp抗原がSEQ ID NO:2に対して少なくとも95%同一である、請求項1または13記載の組成物。
【請求項１７】
Emp抗原がSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１８】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１９】
カップリングされて多量体抗原を形成している、ClfA、ClfB、Eap、Emp、EsaB、EsxA、EsxB、EsaC、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SasH、Ebh、Coa、vWa、Hla、SasB、SdrC、SdrD、SdrEおよびSpA抗原のうちの二つまたはそれ以上を含む抗原。
【請求項２０】
化学的にカップリングされている、請求項19記載の抗原。
【請求項２１】
二つまたはそれ以上の抗原を含む融合タンパク質である、請求項19記載の抗原。
【請求項２２】
少なくとも二つの抗原のそれぞれの間にリンカー部分をさらに含む、請求項21記載の抗原。
【請求項２３】
請求項1〜22の組成物およびアジュバントを含む免疫原性組成物。
【請求項２４】
被験体においてブドウ球菌感染を減弱できる、薬学的に許容される組成物の中に、Emp抗原またはその断片に結合する、単離抗体またはその断片を含む治療用組成物。
【請求項２５】
抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項24記載の組成物。
【請求項２６】
抗体がモノクローナル抗体またはその断片である、請求項24記載の組成物。
【請求項２７】
抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項26記載の組成物。
【請求項２８】
抗体が一本鎖抗体またはその断片である、請求項24記載の組成物。
【請求項２９】
抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項28記載の組成物。
【請求項３０】
単離されたClfA、ClfB、Eap、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、Hla、IsdA、IsdB、IsdC、SasB、SasF、SasH、Ebh、Coa、vWa、SdrC、SdrD、SdrEおよびSpA抗原からなる群より選択される抗原、またはその断片に結合する少なくとも一つのさらなる単離抗体をさらに含む、請求項24記載の組成物。
【請求項３１】
(a) 単離されたEmp抗原、またはその免疫原性断片と、
(b) 単離されたClfA、ClfB、Eap、EsaB、EsxA、EsxB、EsaC、Hla、SasB、SasH、Ebh、Coa、vWa、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SdrC、SdrD、SdrEおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片と
を含む組成物の有効量を被験体に投与する段階を含む、被験体においてブドウ球菌に対する免疫反応を誘発させるための方法。
【請求項３２】
i) 単離された抗原、または
ii) 該抗原をコードする少なくとも一つの単離された組み換え核酸分子
を含む組成物を被験体に投与することにより、単離された抗原の有効量を被験体に提供する、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
被験体にアジュバントも投与する、請求項31記載の方法。
【請求項３４】
一つまたは複数の抗原がアジュバントにカップリングされる、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
一つまたは複数の抗原がアジュバントに共有結合的にカップリングされる、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
Emp抗原がSEQ ID NO:2の少なくとも5、10、15または20個の連続アミノ酸を含む、請求項31記載の方法。
【請求項３７】
Emp抗原がSEQ ID NO:2に対して少なくとも70%、80%、90%、95%または98%同一である、請求項31または36記載の方法。
【請求項３８】
Emp抗原がSEQ ID NO:2に対して少なくとも90%同一である、請求項31または36記載の方法。
【請求項３９】
Emp抗原がSEQ ID NO:2に対して少なくとも95%同一である、請求項31または36記載の方法。
【請求項４０】
Emp抗原がSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む、請求項31記載の方法。
【請求項４１】
ブドウ球菌が黄色ブドウ球菌(S. aureus)である、請求項31記載の方法。
【請求項４２】
ブドウ球菌が薬物耐性菌である、請求項31記載の方法。
【請求項４３】
ブドウ球菌が黄色ブドウ球菌である、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
組成物を二回以上被験体に投与する段階をさらに含む、請求項31記載の方法。
【請求項４６】
組成物が経口的に投与される、請求項31記載の方法。
【請求項４７】
組成物が吸入または吸引によって投与される、請求項31記載の方法。
【請求項４８】
組成物が非経口的に投与される、請求項31記載の方法。
【請求項４９】
組成物が皮下に、筋肉内にまたは静脈内に投与される、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
組み換え核酸分子が異種プロモーターを含む、請求項32記載の方法。
【請求項５１】
組み換え核酸分子がベクターである、請求項32記載の方法。
【請求項５２】
ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
組成物が、単離されたEmp抗原、またはその免疫原性断片、ならびに単離されたClfA、ClfB、Eap、EsaB、EsxA、EsxB、EsaC、Hla、SasB、SasH、Ebh、Coa、vWa、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SdrC、SdrD、SdrEおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片を発現する組み換え非ブドウ球菌を含む、請求項31記載の方法。
【請求項５４】
組み換え非ブドウ球菌がサルモネラ菌(Salmonella)である、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
被験体が哺乳類である、請求項31記載の方法。
【請求項５６】
被験体がヒトである、請求項31記載の方法。
【請求項５７】
免疫反応が防御免疫反応である、請求項31記載の方法。
【請求項５８】
(a) 単離されたEmp抗原、またはその免疫原性断片と、
(b) 単離されたClfA、ClfB、Eap、EsaB、EsxA、EsaC、Hla、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SasB、SasH、Ebh、Coa、vWa、SdrC、SdrD、SdrEおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片と
を含む組成物を、ブドウ球菌感染の予防または処置を必要とする患者投与する段階を含む、ブドウ球菌感染を予防または処置する方法。
【請求項５９】
単離されたEmp抗原、またはその免疫原性断片と、単離されたClfA、ClfB、Eap、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SdrC、SasB、SasH、Ebh、Coa、vWa、Hla、SdrD、SdrEおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片とを含む組成物でレシピエントを免疫する段階、およびレシピエントから免疫グロブリンを単離する段階を含む、ブドウ球菌感染の予防または処置で用いる免疫グロブリンを調製する方法。
【請求項６０】
請求項59記載の方法によって調製された免疫グロブリン。
【請求項６１】
請求項60記載の免疫グロブリンと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項６２】
単離されたClfA、ClfB、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SdrC、SasB、SasH、Ebh、Coa、vWa、Hla、SdrD、SdrEおよびSpA抗原からなる群より選択される一つもしくは複数の単離された抗原、またはその免疫原性断片に結合する、抗体、または一つもしくは複数の抗体を産生する抗体産生細胞を単離する段階を含む、ブドウ球菌感染の予防または処置で用いる抗体を調製する方法。
【請求項６３】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
モノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体である、請求項63記載の方法。
【請求項６５】
モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項63記載の方法。
【請求項６６】
抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項62記載の方法。
【請求項６７】
一つまたは複数の単離された抗体でレシピエントを免疫する段階をさらに含む、請求項62記載の方法。
【請求項６８】
単離された抗原がClfA、ClfB、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SdrC、SasB、SasH、Ebh、Coa、vWa、Hla、SdrD、SdrEまたはSpAポリペプチドの5、10、15、20個またはそれ以上の連続アミノ酸を含む、請求項62記載の方法。
【請求項６９】
請求項62記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項７０】
(a) 単離されたEmp抗原、またはその免疫原性断片、
(b) 単離されたClfA、ClfB、Eap、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SasB、SasH、Ebh、Coa、vWa、SdrC、SdrD、SdrE、HlaおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片、および
(c) 薬学的に許容される賦形剤
を混合する段階を含む、ワクチンを作出する方法。
【請求項７１】
請求項70記載のワクチンの有効量を被験体に投与する段階を含む、ブドウ球菌感染の処置または予防のための方法。
【請求項７２】
ブドウ球菌感染を有するもしくは有することが疑われる、または発症するリスクがある被験体に、単離されたEmp抗原、またはその免疫原性断片、ならびに単離されたClfA、ClfB、Eap、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasB、SasH、Ebh、Coa、vWa、SasF、SdrC、SdrD、SdrE、HlaおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片の有効量を提供する段階を含む、被験体においてブドウ球菌の膿瘍形成および／または存続を制限するための方法。
【請求項７３】
(a) 単離されたEap抗原、またはその免疫原性断片と、
(b) 単離されたClfA、ClfB、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SdrC、SdrD、SdrE、SasH、Ebh、Coa、vWa、SasB、HlaおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片と
を含む抗原組成物であって、
該抗原が、免疫反応をそれを必要とする被験体において刺激できる薬学的に許容される組成物に含まれる、前記抗原組成物。
【請求項７４】
V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および／または多糖類細胞内付着因子(PIA)の一つまたは複数をさらに含む、請求項73記載の組成物。
【請求項７５】
V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および／または多糖類細胞内付着因子(PIA)がタンパク質担体に抱合される、請求項74記載の組成物。
【請求項７６】
タンパク質担体が破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197、インフルエンザ菌プロテインD、肺炎球菌溶血素およびα毒素からなる群より選択される、請求項75記載の組成物。
【請求項７７】
少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原が単離されたClfB、Emp、EsxA、EsxB、IsdA、HlaおよびSrdDからなる群より選択される、請求項73記載の組成物。
【請求項７８】
少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原が単離されたIsdA抗原である、請求項73記載の組成物。
【請求項７９】
ClfB、Emp、EsxA、EsxB、H1aおよびSdrDからなる群より選択される一つまたは複数のさらなるブドウ球菌抗原をさらに含む、請求項78記載の組成物。
【請求項８０】
V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および／または多糖類細胞内付着因子(PIA)の一つまたは複数をさらに含む、請求項79記載の組成物。
【請求項８１】
V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および／または多糖類細胞内付着因子(PIA)がタンパク質担体に抱合される、請求項80記載の組成物。
【請求項８２】
タンパク質担体が破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197、インフルエンザ菌プロテインD、肺炎球菌溶血素およびα毒素からなる群より選択される、請求項81記載の組成物。
【請求項８３】
他のブドウ球菌成分による1%重量/重量未満の混入を含む、請求項73記載の組成物。
【請求項８４】
アジュバントをさらに含む、請求項73記載の組成物。
【請求項８５】
一つまたは複数の単離された抗原がアジュバントにカップリングされる、請求項84記載の組成物。
【請求項８６】
EapペプチドがSEQ ID NO:4の少なくとも5、10、15または20個の連続アミノ酸を含む、請求項73記載の組成物。
【請求項８７】
Eap抗原がSEQ ID NO:4に対して少なくとも70%、80%、90%、95%または98%同一である、請求項73または86記載の組成物。
【請求項８８】
Eap抗原がSEQ ID NO:4に対して少なくとも90%同一である、請求項73または86記載の組成物。
【請求項８９】
Eap抗原がSEQ ID NO:4に対して少なくとも95%同一である、請求項73または86記載の組成物。
【請求項９０】
Eap抗原がSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む、請求項73記載の組成物。
【請求項９１】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項73記載の組成物。
【請求項９２】
請求項73〜91の組成物およびアジュバントを含む免疫原性組成物。
【請求項９３】
被験体においてブドウ球菌感染を減弱できる、薬学的に許容される組成物の中に、Eap抗原またはその断片に結合する、単離抗体またはその断片を含む治療用組成物。
【請求項９４】
抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項93記載の組成物。
【請求項９５】
抗体が一本鎖抗体またはその断片である、請求項93記載の組成物。
【請求項９６】
抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項95記載の組成物。
【請求項９７】
単離されたClfA、ClfB、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SasH、Ebh、Coa、vWa、SasB、SdrC、SdrD、SdrE、HlaおよびSpA抗原からなる群より選択される抗原、またはその断片に結合する少なくとも一つのさらなる単離抗体をさらに含む、請求項93記載の組成物。
【請求項９８】
(a) 単離されたEap抗原、またはその免疫原性断片と、
(b) 単離されたClfA、ClfB、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SasH、Ebh、Coa、vWa、SasB、SdrC、SdrD、SdrE、HlaおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片と
を含む組成物の有効量を被験体に投与する段階を含む、被験体においてブドウ球菌に対する免疫反応を誘発させるための方法。
【請求項９９】
i) 単離された抗原、または
ii) 該抗原をコードする少なくとも一つの単離された組み換え核酸分子
を含む組成物を被験体に投与することにより、単離された抗原の有効量を被験体に提供する、請求項98記載の方法。
【請求項１００】
被験体にアジュバントも投与する、請求項98記載の方法。
【請求項１０１】
一つまたは複数の抗原がアジュバントにカップリングされる、請求項100記載の方法。
【請求項１０２】
一つまたは複数の抗原がアジュバントに共有結合的にカップリングされる、請求項101記載の方法。
【請求項１０３】
Eap抗原がSEQ ID NO:4の少なくとも5、10、15または20個の連続アミノ酸を含む、請求項98記載の方法。
【請求項１０４】
Eap抗原がSEQ ID NO:4に対して少なくとも70%、80%、90%、95%または98%同一である、請求項98または103記載の方法。
【請求項１０５】
Eap抗原がSEQ ID NO:4に対して少なくとも90%同一である、請求項98または103記載の方法。
【請求項１０６】
Eap抗原がSEQ ID NO:4に対して少なくとも95%同一である、請求項98または103記載の方法。
【請求項１０７】
Eap抗原がSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む、請求項98記載の方法。
【請求項１０８】
ブドウ球菌が黄色ブドウ球菌である、請求項98記載の方法。
【請求項１０９】
ブドウ球菌が薬物耐性菌である、請求項98記載の方法。
【請求項１１０】
ブドウ球菌が黄色ブドウ球菌である、請求項109記載の方法。
【請求項１１１】
黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性である、請求項110記載の方法。
【請求項１１２】
組成物を二回以上被験体に投与する段階をさらに含む、請求項98記載の方法。
【請求項１１３】
組成物が経口的に投与される、請求項98記載の方法。
【請求項１１４】
組成物が吸入または吸引によって投与される、請求項98記載の方法。
【請求項１１５】
組成物が非経口的に投与される、請求項98記載の方法。
【請求項１１６】
組成物が皮下に、筋肉内にまたは静脈内に投与される、請求項115記載の方法。
【請求項１１７】
組み換え核酸分子が異種プロモーターを含む、請求項99記載の方法。
【請求項１１８】
組み換え核酸分子がベクターである、請求項99記載の方法。
【請求項１１９】
ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである、請求項99記載の方法。
【請求項１２０】
組成物が、単離されたEap抗原、またはその免疫原性断片と、単離されたClfA、ClfB、EsaB、EsaC、Emp、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SasH、Ebh、Coa、vWa、SasB、SdrC、SdrD、SdrE、HlaおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片を発現する組み換え非ブドウ球菌とを含む、請求項118記載の方法。
【請求項１２１】
組み換え非ブドウ球菌がサルモネラ菌である、請求項120記載の方法。
【請求項１２２】
被験体が哺乳類である、請求項98記載の方法。
【請求項１２３】
被験体がヒトである、請求項98記載の方法。
【請求項１２４】
免疫反応が防御免疫反応である、請求項98記載の方法。
【請求項１２５】
(a) 単離されたEap抗原、またはその免疫原性断片と、
(b) 単離されたClfA、ClfB、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasH、Ebh、Coa、vWa、SasB、SasF、SdrC、SdrD、SdrE、HlaおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片と
を含む組成物を、ブドウ球菌感染の予防または処置を必要とする患者に投与する段階を含む、ブドウ球菌感染を予防または処置する方法。
【請求項１２６】
単離されたEap抗原、またはその免疫原性断片と、単離されたClfA、ClfB、Emp、EsaB、EsxA、EsxB、EsaC、IsdA、IsdB、IsdC、SasB、SasH、Hla、Ebh、Coa、vWa、SasF、SdrC、SdrD、SdrEおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片とを含む組成物でレシピエントを免疫する段階、およびレシピエントから免疫グロブリンを単離する段階を含む、ブドウ球菌感染の予防または処置で用いる免疫グロブリンを調製する方法。
【請求項１２７】
請求項126記載の方法によって調製された免疫グロブリン。
【請求項１２８】
請求項127記載の免疫グロブリンと、薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
【請求項１２９】
(a) 単離されたEap抗原、またはその免疫原性断片、
(b) 単離されたClfA、ClfB、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasB、SasH、Ebh、Coa、vWa、SasF、SdrC、SdrD、SdrE、HlaおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片、および
(c) 薬学的に許容される賦形剤
を混合する段階を含む、ワクチンを調製する方法。
【請求項１３０】
請求項129記載のワクチンの有効量を被験体に投与する段階を含む、ブドウ球菌感染の処置または予防のための方法。
【請求項１３１】
ブドウ球菌感染を有するもしくは有することが疑われる、または発症するリスクがある被験体に、単離されたEap抗原、またはその免疫原性断片、ならびに単離されたClfA、ClfB、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasH、Ebh、Coa、vWa、SasB、SasF、SdrC、SdrD、SdrE、HlaおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片の有効量を提供する段階を含む、被験体においてブドウ球菌の膿瘍形成および／または存続を制限するための方法。
【請求項１３２】
単離されたブドウ球菌AdsAペプチド、またはその免疫原性断片を含むペプチド組成物であって、該ペプチドが、免疫反応をそれを必要とする被験体において刺激できる薬学的に許容される組成物に含まれる、前記ペプチド組成物。
【請求項１３３】
単離されたClfA、ClfB、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、Hla、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SasB、SdrC、SdrD、SdrEおよびSpaペプチドからなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片をさらに含む、請求項132記載の組成物。
【請求項１３４】
V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および／または多糖類細胞内付着因子(PIA)の一つまたは複数をさらに含む、請求項132記載の組成物。
【請求項１３５】
V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および／または多糖類細胞内付着因子(PIA)がタンパク質担体に抱合される、請求項134記載の組成物。
【請求項１３６】
タンパク質担体が破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197、インフルエンザ菌プロテインD、肺炎球菌溶血素およびα毒素からなる群より選択される、請求項135記載の組成物。
【請求項１３７】
少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原が単離されたClfB、Eap、Emp、EsxA、EsxB、IsdA、SasBおよびSrdDからなる群より選択される、請求項133記載の組成物。
【請求項１３８】
少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原が単離されたIsdA抗原である、請求項137記載の組成物。
【請求項１３９】
ClfB、Eap、Emp、EsxA、EsxB、Hla、SasBおよびSdrDからなる群より選択される一つまたは複数のさらなるブドウ球菌抗原をさらに含む、請求項138記載の組成物。
【請求項１４０】
V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および／または多糖類細胞内付着因子(PIA)の一つまたは複数をさらに含む、請求項139記載の組成物。
【請求項１４１】
V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および／または多糖類細胞内付着因子(PIA)がタンパク質担体に抱合される、請求項140記載の組成物。
【請求項１４２】
タンパク質担体が破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197、インフルエンザ菌プロテインD、肺炎球菌溶血素およびα毒素からなる群より選択される、請求項141記載の組成物。
【請求項１４３】
他のブドウ球菌成分による1%重量/重量未満の混入を含む、請求項132記載の組成物。
【請求項１４４】
一つまたは複数の単離されたペプチドがアジュバントにカップリングされる、請求項132記載の組成物。
【請求項１４５】
AdsAペプチドがSEQ ID NO:36の少なくとも5、10、15または20個の連続アミノ酸を含む、請求項132記載の組成物。
【請求項１４６】
AdsAペプチドがSEQ ID NO:36に対して少なくとも70%、80%、90%、95%または98%同一である、請求項132または145記載の組成物。
【請求項１４７】
AdsAペプチドがSEQ ID NO:36に対して少なくとも90%同一である、請求項132または145記載の組成物。
【請求項１４８】
AdsAペプチドがSEQ ID NO:36に対して少なくとも95%同一である、請求項132または145記載の組成物。
【請求項１４９】
AdsAペプチドがSEQ ID NO:36のアミノ酸配列を含む、請求項132記載の組成物。
【請求項１５０】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項132記載の組成物。
【請求項１５１】
請求項132〜150の組成物およびアジュバントを含む免疫原性組成物。
【請求項１５２】
被験体において細菌感染を減弱できる、薬学的に許容される組成物の中に、細菌AdsA活性の阻害剤を含む組成物。
【請求項１５３】
細菌AdsAがブドウ球菌AdsAである、請求項152記載の組成物。
【請求項１５４】
細菌感染がブドウ球菌感染である、請求項152記載の組成物。
【請求項１５５】
ブドウ球菌が黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌(S. epidermidis)である、請求項154記載の組成物。
【請求項１５６】
細菌感染が炭疽菌(Bacillus anthracis)感染である、請求項152記載の組成物。
【請求項１５７】
阻害剤が抗AdsA抗体である、請求項152記載の組成物。
【請求項１５８】
抗AdsA抗体がAdsAの細胞外ドメインに結合する、請求項157記載の組成物。
【請求項１５９】
抗体がモノクローナル抗体またはその断片である、請求項157記載の組成物。
【請求項１６０】
抗体がAsdAの触媒活性を低減する、請求項157記載の組成物。
【請求項１６１】
阻害剤が小分子である、請求項152記載の組成物。
【請求項１６２】
小分子がアデノシン類似体である、請求項161記載の組成物。
【請求項１６３】
単離されたAdsAペプチド、またはその免疫原性断片を含む組成物の有効量を被験体に投与する段階を含む、被験体においてブドウ球菌に対する免疫反応を誘発させるための方法。
【請求項１６４】
単離されたClfA、ClfB、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、Hla、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SasB、SdrC、SdrD、Ebh、Coa、vWa、SdrEおよびSpaペプチドからなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片の有効量を提供する段階をさらに含む、請求項163記載の方法。
【請求項１６５】
(i) 単離されたAdsAペプチド、または
(ii) 該ペプチドをコードする少なくとも一つの単離された組み換え核酸分子
を含む組成物を被験体に投与することにより、単離されたAdsAペプチドの有効量を被験体に提供する、請求項163記載の方法。
【請求項１６６】
被験体にアジュバントも投与する、請求項163記載の方法。
【請求項１６７】
ペプチドがアジュバントにカップリングされる、請求項166記載の方法。
【請求項１６８】
ペプチドがアジュバントに共有結合的にカップリングされる、請求項167記載の方法。
【請求項１６９】
AdsAペプチドがSEQ ID NO:36の少なくとも5、10、15または20個の連続アミノ酸を含む、請求項163記載の方法。
【請求項１７０】
AdsAペプチドがSEQ ID NO:36に対して少なくとも70%、80%、90%、95%または98%同一である、請求項163または169記載の方法。
【請求項１７１】
AdsAペプチドがSEQ ID NO:36に対して少なくとも90%同一である、請求項163または169記載の方法。
【請求項１７２】
AdsAペプチドがSEQ ID NO:36に対して少なくとも95%同一である、請求項163または169記載の方法。
【請求項１７３】
AdsAペプチドがSEQ ID NO:36のアミノ酸配列を含む、請求項163記載の方法。
【請求項１７４】
ブドウ球菌が黄色ブドウ球菌である、請求項163記載の方法。
【請求項１７５】
ブドウ球菌が薬物耐性菌である、請求項163記載の方法。
【請求項１７６】
ブドウ球菌が黄色ブドウ球菌である、請求項175記載の方法。
【請求項１７７】
黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性である、請求項176記載の方法。
【請求項１７８】
組成物を二回以上被験体に投与する段階をさらに含む、請求項163記載の方法。
【請求項１７９】
組成物が経口的に投与される、請求項163記載の方法。
【請求項１８０】
組成物が吸入または吸引によって投与される、請求項163記載の方法。
【請求項１８１】
組成物が非経口的に投与される、請求項163記載の方法。
【請求項１８２】
組成物が皮下に、筋肉内にまたは静脈内に投与される、請求項181記載の方法。
【請求項１８３】
組み換え核酸分子が異種プロモーターを含む、請求項165記載の方法。
【請求項１８４】
組み換え核酸分子がベクターである、請求項165記載の方法。
【請求項１８５】
ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである、請求項184記載の方法。
【請求項１８６】
組成物が、単離されたAdsAペプチド、またはその免疫原性断片を発現する組み換え非ブドウ球菌を含む、請求項163記載の方法。
【請求項１８７】
非ブドウ球菌が、単離されたClfA、ClfB、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、Hla、IsdA、IsdB、IsdC、SasB、SasF、SdrC、SdrD、SdrEおよびSpaペプチドからなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片を発現する、請求項186記載の方法。
【請求項１８８】
組み換え非ブドウ球菌がサルモネラ菌である、請求項186記載の方法。
【請求項１８９】
被験体が哺乳類である、請求項163記載の方法。
【請求項１９０】
被験体がヒトである、請求項163記載の方法。
【請求項１９１】
免疫反応が防御免疫反応である、請求項163記載の方法。
【請求項１９２】
抗生物質を被験体に投与する段階をさらに含む、請求項163記載の方法。
【請求項１９３】
単離されたAdsAペプチド、またはその免疫原性断片を含む組成物を、ブドウ球菌感染の予防、改善、または処置を必要とする患者に投与する段階を含む、ブドウ球菌感染を予防する、改善する、または処置する方法。
【請求項１９４】
組成物が、単離されたClfA、ClfB、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、Hla、IsdA、IsdB、IsdC、SasB、SasF、SdrC、SdrD、Ebh、Coa、vWa、SdrEおよびSpaペプチドからなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片を含む、請求項193記載の方法。
【請求項１９５】
単離されたAdsAペプチド、またはその免疫原性断片を含む組成物でレシピエントを免疫する段階を含む、ブドウ球菌感染の予防または処置で用いる免疫グロブリンを調製する方法。
【請求項１９６】
組成物がさらに、単離されたClfA、ClfB、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、Hla、IsdA、IsdB、IsdC、SasB、SasF、SdrC、SdrD、Ebh、Coa、vWa、SdrEおよびSpaペプチドからなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片を含み、かつ免疫グロブリンをレシピエントから単離する段階を含む、請求項195記載の方法。
【請求項１９７】
抗体産生細胞を収集する段階をさらに含む、請求項195記載の方法。
【請求項１９８】
請求項195記載の方法によって調製された免疫グロブリン。
【請求項１９９】
請求項198記載の免疫グロブリンと、薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
【請求項２００】
(a) 単離されたAdsAペプチド、またはその免疫原性断片、および
(b) 薬学的に許容される賦形剤
を混合する段階を含む、ワクチンを作出する方法。
【請求項２０１】
単離されたClfA、ClfB、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、Hla、IsdA、IsdB、IsdC、SasB、SasF、SdrC、SdrD、SdrE、Ebh、Coa、vWaおよびSpaペプチドからなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片を混合する段階をさらに含む、請求項200記載の方法。
【請求項２０２】
請求項200記載のワクチンの有効量を患者に投与する段階を含む、ブドウ球菌感染の処置または予防のための方法。
【請求項２０３】
細菌感染を有するもしくは有することが疑われる、または発症するリスクがある被験体に、単離されたAdsAペプチド、その免疫原性断片、または細菌AdsA活性の阻害剤の有効量を提供する段階を含む、被験体において細菌の貪食排除を増強するための方法。
【請求項２０４】
細菌感染が菌血症である、請求項203記載の方法。
【請求項２０５】
単離されたAdsAペプチド、その免疫原性断片、または細菌AdsA活性の阻害剤が経脈管的に投与される、請求項203記載の方法。
【請求項２０６】
細菌AdsA活性の阻害剤が抗体である、請求項203記載の方法。
【請求項２０７】
抗体がモノクローナル抗体またはその断片である、請求項206記載の方法。
【請求項２０８】
単離されたAdsAペプチド、またはその免疫原性断片がブドウ球菌AdsAである、請求項203記載の方法。
【請求項２０９】
ブドウ球菌AdsAが黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌AdsAである、請求項208記載の方法。
【請求項２１０】
細菌AdsAが炭疽菌AdsAである、請求項203記載の方法。
【請求項２１１】
(a) 試験薬剤の存在下および非存在下でのAdsAポリペプチドの活性を評価する段階; および
(b) 試験薬剤の存在下および非存在下でのAdsA活性の相違に基づいてAdsA活性の修飾因子を同定する段階
を含む、細菌AdsAの修飾因子をスクリーニングする方法。
【請求項２１２】
試験薬剤がアデノシン類似体である、請求項211記載の方法。
【請求項２１３】
AdsAポリペプチドが細胞によって発現される、請求項211記載の方法。
【請求項２１４】
細胞が細菌細胞である、請求項213記載の方法。
【請求項２１５】
インビトロで行われる、請求項211記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
I. 発明の分野
本出願は、2008年10月6日付で出願された米国仮特許出願第61/103,196号、2008年10月6日付で出願された米国仮特許出願第61/103,190号および2009年4月20日付で出願された米国仮特許出願第61/170,779号の優先権の恩典を主張するものであり、これらの内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は広くは、免疫学、微生物学、および病理学の分野に関する。より具体的には、本発明は、細菌に対する免疫反応を引き出すためにまたは受動免疫療法を提供するために使用できる細菌タンパク質を伴う方法および組成物に関する。このタンパク質には、Eap、Emp、細菌アデノシンシンターゼA (AdsA)、ならびに/またはEap、Empおよび／もしくはAdsAアミノ酸配列を含むペプチドもしくはタンパク質、かつそれらに結合する抗体が含まれる。
【背景技術】
【０００３】
II. 背景
市中獲得型および病院獲得型の両感染の数はここ数年増えている。病院獲得型の(院内)感染は罹病率および死亡率の主な原因である。米国では、病院獲得型の感染は毎年2百万人超の患者に影響を与えている。最も頻度が高い感染は、尿管感染(感染の33%)であり、次いで肺炎(15.5%)、外科手術部位感染(14.8%)および主要血流感染(13%)が続く(Emorl and Gaynes, 1993)。
【０００４】
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、血液凝固酵素陰性ブドウ球菌(ほとんどが表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis))、腸球菌(enterococcus spp.)、大腸菌(Escherichia coli)および緑濃菌(Pseudomonas aeruginosa)は、主な院内病原菌である。それらの病原菌はほぼ同数の感染を引き起こすが、これらが生み出しうる障害の重症度と、抗生物質耐性分離菌の頻度を考え合わせると、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌を最も重要な院内病原菌とする順位になる。
【０００５】
表皮ブドウ球菌は、通常の皮膚共生生物であり、これは、正常に機能しない医療機器の感染および手術部位での感染に関わる重要な日和見病原菌でもある。表皮ブドウ球菌が感染する医療機器には、心臓ペースメーカー、髄液シャント、持続携帯式腹膜透析カテーテル、整形外科用機器および人工心臓弁が含まれる。
【０００６】
黄色ブドウ球菌は、有意な罹病率および死亡率を有する院内感染の最も一般的な原因である。これは骨髄炎、心内膜炎、敗血性関節炎、肺炎、膿瘍および毒素性ショック症候群を引き起こすことがある。黄色ブドウ球菌は、乾いた表面上で生き延び、感染の機会を高めることができる。いずれの黄色ブドウ球菌感染もブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群、つまり血流に吸収された外毒素に対する皮膚反応を引き起こすことがある。これは、命にかかわりうる膿血症と呼ばれる敗血症の一種を引き起こすこともある。問題となるのは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)が病院獲得型の感染の主な原因になっていることである。
【０００７】
黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌感染は典型的には、抗生物質で処置され、ペニシリンが選択薬であるが、メチシリン耐性分離株にはバンコマイシンが使用される。抗生物質に対して幅広い耐性を示すブドウ球菌株の割合は、ますます広まっており、有効な抗菌療法にとって脅威となっている。さらに、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌株が最近出現したことが、いかなる有効な治療も利用できないMRSA株が出現し蔓延しているという恐怖心をかき立てている。
【０００８】
黄色ブドウ球菌を標的とするまたは黄色ブドウ球菌が産生する細胞外タンパク質(exoprotein)を標的とする第一世代のワクチンでは大した成果がなかった(Lee, 1996)。ブドウ球菌感染に対する有効なワクチンを開発する必要がまだある。ブドウ球菌感染を処置するためのさらなる組成物も必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
黄色ブドウ球菌は入院個体および健常個体での菌血症および軟部組織感染症の唯一の最多原因であり、死亡率の劇的な増加は、抗生物質治療に感受性のないことが多いメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)株の蔓延によるものである(Klevens et al., 2007; Klevens et al., 2006)。特徴的な線維素析出および広範な免疫細胞浸潤を伴う膿瘍は、ブドウ球菌感染の病理学的背景因子(pathological substrate)となる(Lowy, 1998)。ブドウ球菌性膿瘍の中心にある生物膜様の構造を観察するために、走査電子顕微鏡法が用いられている。遺伝子解析によって、インビトロでの生物膜の形成がブドウ球菌の膿瘍形成能と関連していることを明らかとし、本発明者らは、両方の過程に不可欠な外膜タンパク質を同定した。マウスの免疫のために精製し使用した場合、EmpおよびEapはブドウ球菌感染に対する防御免疫を与える。Eapに結合する抗体またはEmpに結合する抗体を用いた受動免疫法も治療効果を示す。
【００１０】
本出願では、一つの態様において、細菌感染および／またはブドウ球菌感染の処置のための方法および組成物における、Empおよび／もしくはEap、またはEmpもしくはEapの全部もしくは一部に結合する抗体の使用について記述する。本出願では、Empおよび／もしくはEap抗原またはその免疫原性断片を含む免疫原性組成物も提供する。さらに、本発明は、細菌感染の処置(例えば、被験体におけるブドウ球菌性膿瘍形成および／または存続の限定)または予防のために使用できる方法および組成物を提供する。場合によっては、免疫反応を刺激するための方法は、Empおよび／またはEapポリペプチドまたは抗原、ならびにある種の局面において他の細菌タンパク質の全部または一部を含むまたはコードする組成物の有効量を被験体に投与する段階を伴う。他の細菌タンパク質には、(i) 分泌病毒性因子および／もしくは細胞表面タンパク質もしくはペプチド、または(ii) 分泌病毒性因子および／もしくは細胞表面タンパク質もしくはペプチドをコードする組み換え核酸分子、および／または(iii) 多糖類などが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００１１】
別の局面において、Empおよび／またはEapに結合する抗体(例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体もしくは一本鎖抗体またはその断片)のような、Empおよび／またはEap修飾因子を被験体に投与することができる。Empおよび／またはEap修飾因子は、直接的にEmpおよび／またはEapに結合することができる。Empおよび／またはEap修飾因子は、Empおよび／またはEapに結合する抗体または細胞であることができる。抗体は抗体断片、ヒト化抗体、ヒト抗体および／またはモノクローナル抗体などであることができる。ある種の局面において、Empおよび／またはEap修飾因子は、被験体または供給源の被験体(例えば、ドナー)においてEmpおよび／またはEapに結合する抗体の産生をもたらすEmpおよび／またはEapペプチドを提供することにより誘発される。Empおよび／またはEap修飾因子は、典型的には、薬学的に許容される組成物に処方される。Empおよび／またはEap修飾因子組成物は、少なくとも一つのブドウ球菌抗原もしくはその免疫原性断片、またはそれに結合する抗体(例えば、EsxA、EsxB、EsaB、EsaC、SdrC、SdrD、Hla、SdrE、IsdA、IsdB、SpA、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasH (AdsA、Ebh、Coa、vWaまたはSasF)をさらに含むことができる。Empおよび／またはEap修飾因子と組み合わせて使用できるさらなるブドウ球菌抗原には、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質が含まれるが、これらに限定されることはない。ブドウ球菌抗原または抗体をEmpおよび／またはEap修飾因子と同時に投与することができる。ブドウ球菌抗原または抗体ならびにEmpおよび／またはEap修飾因子を同じ組成物中で投与することができる。
【００１２】
ある種の態様は、被験体においてブドウ球菌感染を減弱できる、薬学的に許容される組成物の中に、Empおよび／もしくはEap抗原またはその断片に結合する、単離抗体またはその断片を含む治療用組成物に関する。抗体はヒト抗体またはヒト化抗体であることができる。ある種の局面において、抗体はポリクローナル抗体、もしくはモノクローナル抗体、もしくは一本鎖抗体、またはその断片である。抗体組成物は、単離されたClfA、ClfB、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、Hla、IsdA、IsdB、IsdC、SasB、SasF、SasH (AdsA)、Ebh、Coa、vWa、SdrC、SdrD、SdrEおよびSpA抗原からなる群の一つまたは複数より選択される抗原、またはその断片に結合する少なくとも一つのさらなる単離抗体をさらに含むことができる。Empおよび／またはEap修飾因子と組み合わせて使用できるブドウ球菌抗原に対するさらなる抗体には、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質に対する抗体が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００１３】
Empおよび／またはEap修飾因子は、Empおよび／またはEapペプチドをコードする組み換え核酸分子であってもよい。組み換え核酸分子は、Empおよび／またはEapペプチドならびに少なくとも一つのブドウ球菌抗原または免疫原性断片をコードすることができる。核酸がEap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfB、SasB、SasF、SasH (AdsA)、Ebh、Coa、vWa、SpAまたはその変種の全部または一部の一つまたは複数のうちの2、3、4、5、6、7、8、9、10種またはそれ以上を含むいくつかの抗原をコードしてもよく、またはポリペプチドがそれらを含んでもよい。核酸は、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質を含むが、これらに限定されないさらなるブドウ球菌抗原をコードすることができる。
【００１４】
ある種の態様において、本方法および組成物では、Empおよび／またはEapポリペプチド、ペプチドまたは抗原の全部または一部、ならびにそれらに結合する抗体を使用するか、または含むか、またはコードする。他の局面において、Empおよび／またはEapをEsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、SasH (AdsA)、Ebh、Coa、vWa、SpAの全部もしくは一部、もしくはその免疫原性断片またはその組み合わせのような、他のブドウ球菌因子または細菌因子と組み合わせて用いることができる。Empおよび／またはEap修飾因子と組み合わせて使用できるさらなるブドウ球菌抗原には、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質が含まれるが、これらに限定されることはない。ある種の態様において、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfB、SasB、SasF、SasH (AdsA)、Ebh、Coa、vWaまたはSpAの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種またはそれ以上が本発明の方法、組成物または処方物から明確に除外されてもまたは含まれてもよい。明示的に除外されうるさらなるブドウ球菌抗原には、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００１５】
本発明の態様は、細菌を含有するまたは含有しない組成物を含む。組成物は、弱毒化されたまたは生存可能なまたはインタクトなブドウ球菌または他の細菌を含んでもまたは含まなくてもよい。ある種の局面において、組成物は、ブドウ球菌ではない細菌を含むか、またはブドウ球菌を含有しない。ある種の態様において、細菌組成物は、単離されたもしくは組み換え発現されたEmpおよび／もしくはEapポリペプチドまたはそれをコードするヌクレオチドを含む。さらなる局面において、単離されたEmpおよび／またはEapポリペプチドは多量体化される、例えば、二量体化される。本発明のある種の局面において、組成物は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種またはそれ以上の単離された細胞表面タンパク質またはそのセグメントの多量体を含む。さらなる局面において、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、SasH (AdsA)、Ebh、Coa、vWaもしくはSpAまたはその免疫原性断片を含むが、これらに限定されない、他のポリペプチドまたはペプチドが細菌組成物において発現されてもまたは含まれてもよい。細菌組成物において発現されまたは含まれうるさらなるブドウ球菌ポリペプチドには、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質が含まれるが、これらに限定されることはない。あるいは、組成物は、分泌病毒性因子または細胞表面タンパク質に関して細菌を特異的に変化させることを含むようなやり方で変化されている、組み換え発現されたブドウ球菌抗原であってもまたはそれを含んでもよい。例えば、細菌は、未修飾ならば発現すると考えられるよりも多くの病毒性因子または細胞表面タンパク質を発現するように組み換えによって修飾されてもよい。
【００１６】
「Empポリペプチド」または「Eapポリペプチド」という用語は、ブドウ球菌から単離された野生型EmpまたはEapタンパク質、ならびにブドウ球菌EmpまたはEapタンパク質に対する免疫反応を刺激する変種およびセグメントまたは断片を含むポリペプチドをいう。同様に、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hla、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、SasH (AdsA)、Ebh、Coa、vWaまたはSpAタンパク質という用語は、ブドウ球菌から単離された野生型EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、SasH (AdsA)またはSpAポリペプチド、ならびにブドウ球菌EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、SasH (AdsA)、Ebh、Coa、vWaまたはSpAタンパク質に対する免疫反応を刺激する変種、セグメントまたは断片を含むタンパク質をいう。さらに、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質という用語は、ブドウ球菌から単離された野生型の52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質、ならびにブドウ球菌の52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質に対する免疫反応を刺激する変種、セグメントまたは断片を含むタンパク質をいう。免疫反応は、生物における体液性反応、細胞性反応、または体液性および細胞性反応の両方をいう。免疫反応は、タンパク質もしくは細胞表面タンパク質を特異的に認識する抗体の存在もしくは量を測定するアッセイ法、T細胞活性化もしくは増殖を測定するアッセイ法、および／または一つもしくは複数のサイトカインの活性もしくは発現に関しての修飾を測定するアッセイ法を含むが、これらに限定されないアッセイ法によって測定することができる。
【００１７】
本発明の態様には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種またはそれ以上の抗原またはそのセグメント/断片の有効量を被験体に提供する段階を含む、被験体においてブドウ球菌に対する免疫反応を誘発させるための方法が含まれる。ブドウ球菌抗原には、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、SasH (AdsA)、Ebh、Coa、vWaもしくはSpA、またはそのセグメント、断片もしくは免疫原性断片が含まれるが、これらに限定されることはない。さらなるブドウ球菌抗原には、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００１８】
ある種の態様において、Empおよび／もしくはEapポリペプチドまたはその免疫原性断片をEsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、SasH (AdsA)、Ebh、Coa、vWaまたはSpAの一つまたは複数の抗原または免疫原性断片の一つまたは複数と組み合わせて提供することができる。52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質のさらなる抗原または免疫原性断片を用いることもできる。
【００１９】
本発明の態様には、5、10、15、20、50、100、200またはそれ以上の連続アミノ酸にわたり、その間の全ての値および範囲を含め、Emp、Eap、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、SasH (AdsA)、Ebh、Coa、vWa、SpA、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性もしくは類似性を有する、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性もしくは類似性を有するポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含みうる組成物が含まれる。本発明のさらなる態様において、組成物は、Empポリペプチド(SEQ ID NO:2、50〜53)および／もしくはEapポリペプチド(SEQ ID NO:4)またはEmp核酸(SEQ ID NO:1)および／もしくはEap核酸(SEQ ID NO:3)に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含みうる。ある種の局面において、EmpポリペプチドまたはEapポリペプチドは、それぞれ、(SEQ ID NO:2)または(SEQ ID NO:4)のアミノ酸配列を有するであろう。類似性または同一性は、同一性が好ましいが、当技術分野において公知であり、いくつかの異なるプログラムを用いて、タンパク質(または核酸)が公知の配列に対して配列同一性または類似性を有するかどうかを特定することができる。配列同一性および／または類似性は、Smith & Waterman (1981)の局所配列同一性アルゴリズムを含むが、これに限定されない、当技術分野において公知の標準的な技術を用いて、Needleman & Wunsch (1970)の配列同一性アライメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman (1988)の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータでの実行(Wisconsin Genetics Software Package中のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)により、Devereux et al. (1984)によって記述されているBest Fit配列プログラムにより、好ましくは初期設定を用いて、または検査により判定される。好ましくは、同一性の割合は当業者にとって、公知のかつ容易に確認できるアライメントツールを用いることにより計算される。
【００２０】
「AdsAポリペプチド」という用語は、単離された野生型細菌AdsAタンパク質を含むポリペプチド、例えば、ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌SEQ ID NO:36)または桿菌(炭疽菌(B. anthracis) SEQ ID NO:41)、ならびにAdsAタンパク質の変種およびセグメントまたは断片をいう。ある種の局面において、AdsAポリペプチドは細菌AdsAタンパク質に対する免疫反応を刺激する。
【００２１】
本発明のさらなる態様において、組成物は、EsxAタンパク質に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含みうる。ある種の局面において、EsxAタンパク質はSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有するであろう。
【００２２】
本発明のさらなる態様において、組成物は、EsxBタンパク質に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含みうる。ある種の局面において、EsxBタンパク質はSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有するであろう。
【００２３】
本発明のさらなる態様において、組成物は、SdrDタンパク質に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含みうる。ある種の局面において、SdrDタンパク質はSEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有するであろう。
【００２４】
本発明のさらなる態様において、組成物は、SdrEタンパク質に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含みうる。ある種の局面において、SdrEタンパク質はSEQ ID NO:12のアミノ酸配列を有するであろう。
【００２５】
本発明のさらなる態様において、組成物は、IsdAタンパク質に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含みうる。ある種の局面において、IsdAタンパク質はSEQ ID NO:14のアミノ酸配列を有するであろう。
【００２６】
本発明のさらなる態様において、組成物は、IsdBタンパク質に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含みうる。ある種の局面において、IsdBタンパク質はSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を有するであろう。
【００２７】
本発明の態様には、SpAタンパク質に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含む組成物が含まれる。ある種の局面において、SpAタンパク質はSEQ ID NO:18のアミノ酸配列を有するであろう。
【００２８】
本発明のさらなる態様において、組成物は、ClfBタンパク質に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含みうる。ある種の局面において、ClfBタンパク質はSEQ ID NO:20のアミノ酸配列を有するであろう。
【００２９】
本発明のさらなる態様において、組成物は、IsdCタンパク質に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含みうる。ある種の局面において、IsdCタンパク質はSEQ ID NO:22のアミノ酸配列を有するであろう。
【００３０】
本発明のさらなる態様において、組成物は、SasFタンパク質に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含みうる。ある種の局面において、SasFタンパク質はSEQ ID NO:24のアミノ酸配列を有するであろう。
【００３１】
本発明のさらなる態様において、組成物は、SdrCタンパク質に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含みうる。ある種の局面において、SdrCタンパク質はSEQ ID NO:26のアミノ酸配列を有するであろう。
【００３２】
本発明のさらなる態様において、組成物は、ClfAタンパク質に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含みうる。ある種の局面において、ClfAタンパク質はSEQ ID NO:28のアミノ酸配列を有するであろう。
【００３３】
本発明のさらなる態様において、組成物は、EsaBタンパク質に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含みうる。ある種の局面において、EsaBタンパク質はSEQ ID NO:30のアミノ酸配列を有するであろう。
【００３４】
本発明のさらなる態様において、組成物は、EsaCタンパク質に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含みうる。ある種の局面において、EsaCタンパク質はSEQ ID NO:32のアミノ酸配列を有するであろう。
【００３５】
本発明のさらなる態様において、組成物は、SasBタンパク質に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含みうる。ある種の局面において、SasBタンパク質はSEQ ID NO:34のアミノ酸配列を有するであろう。
【００３６】
本発明のさらなる態様において、組成物は、SasH (AdsA)タンパク質に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含みうる。ある種の局面において、SasH (AdsA)タンパク質はSEQ ID NO: 36またはSEQ ID NO:41のアミノ酸配列を有するであろう。
【００３７】
本発明のさらなる態様において、組成物は、Hlaタンパク質に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含みうる。ある種の局面において、Hlaタンパク質はSEQ ID NO: 37のアミノ酸配列を有するであろう。ある種の局面において、変種Hlaはアミノ酸置換、あるいはD24C、H35C、H35K、H35L、R66C、E70CもしくはK110Cまたはその任意の組み合わせ(一文字表記を用いて表現したアミノ酸)を含む。
【００３８】
本発明のさらなる態様において、組成物は、Ebhタンパク質に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含みうる。ある種の局面において、Ebhタンパク質はSEQ ID NO:38のアミノ酸配列を有するであろう。
【００３９】
本発明のさらなる態様において、組成物は、Coaタンパク質に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含みうる。ある種の局面において、Coaタンパク質はSEQ ID NO:39のアミノ酸配列を有するであろう。
【００４０】
本発明のさらなる態様において、組成物は、vWaタンパク質に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含みうる。ある種の局面において、vWaタンパク質はSEQ ID NO:40のアミノ酸配列を有するであろう。
【００４１】
ある種の局面において、ポリペプチドまたはセグメント/断片は、参照ポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%またはそれ以上同一である配列を有することができる。「類似性」という用語は、参照ポリペプチドと同一であるか、または参照ポリペプチドと保存的置換を構成するかのいずれかの、アミノ酸の一定の割合を有する配列を持ったポリペプチドをいう。
【００４２】
本明細書において記述されるポリペプチドまたはセグメントもしくは断片は、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41またはSEQ ID NO:41の、以下の、または少なくとも、またはせいぜい
2012504660.tif 000002
個もしくはそれ以上の連続アミノ酸、またはその中で導出される任意の範囲を含みうる。
【００４３】
さらなる態様において、組成物は、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、SasH (AdsA)、SpA、Ebh、Coa、vWa、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質の1つ、2つ、3つ、4つまたはそれ以上をコードする組み換え核酸分子を含む。
【００４４】
さらなる態様には、(i) Empおよび／もしくはEapポリペプチドもしくはそのペプチド、または(ii) Empおよび／もしくはEapポリペプチドもしくはそのペプチドをコードする核酸分子を含む組成物の有効量を被験体に投与する段階、または(iii) 本明細書において記述される細菌タンパク質または多糖類の任意の組み合わせまたは順列でEmpおよび／またはEapポリペプチドを投与する段階を含む、ブドウ球菌に対する防御的または治療的免疫反応を被験体において刺激するための方法が含まれる。
【００４５】
さらなる態様には、単離されたEmpおよび／もしくはEapポリペプチド、もしくはそのセグメントもしくは断片、または記述されているその他任意の組み合わせまたは順列のタンパク質もしくはペプチドまたは多糖類を有する薬学的に許容される組成物であって、ブドウ球菌に対する免疫反応を刺激できる該組成物を含むワクチンが含まれる。ワクチンは、単離されたEmpおよび／もしくはEapポリペプチド、ならびに／または記述されているその他任意の組み合わせまたは順列のタンパク質もしくはペプチドまたは多糖類を含みうる。本発明のある種の局面において、単離されたEmpおよび／またはEapポリペプチド、あるいは記述されているその他任意の組み合わせまたは順列のタンパク質もしくはペプチドまたは多糖類は多量体化、例えば二量体化、される。
【００４６】
さらなる局面において、ワクチン組成物には約10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.25、0.05% (またはその中で導出される任意の範囲)未満の他のブドウ球菌タンパク質が混入している。組成物は、単離された非Empおよび／または非Eapポリペプチドをさらに含みうる。典型的には、ワクチンはアジュバントを含む。ある種の局面において、本発明のタンパク質またはペプチドはアジュバントに連結され(共有結合的にまたは非共有結合的にカップリングされ)、好ましくはアジュバントはタンパク質に化学的に抱合される。
【００４７】
さらなる態様において、ワクチン組成物は、全部もしくは一部のEmpおよび／もしくはEapポリペプチド、および／または記述されているその他任意の組み合わせもしくは順列のタンパク質もしくはペプチドをコードする組み換え核酸を有する薬学的に許容される組成物であって、ブドウ球菌に対する免疫反応を刺激できる該組成物である。ワクチン組成物は、全部もしくは一部のEmpおよび／もしくはEapポリペプチド、および／または記述されているその他任意の組み合わせもしくは順列のタンパク質もしくはペプチドをコードする組み換え核酸を含みうる。ある種の態様において、組み換え核酸は異種プロモーターを含む。好ましくは、組み換え核酸はベクターである。より好ましくは、ベクターはプラスミドまたはウイルスベクターである。
【００４８】
さらなる態様には、(i) EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、SasH (AdsA)、SpA、Ebh、Coa、vWa、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／もしくはビトロネクチン結合タンパク質のポリペプチドまたはそのセグメントもしくは断片; または(ii) それらをコードする核酸分子の一つまたは複数を含むEmpおよび／もしくはEapポリペプチドまたはそのセグメント／断片の組成物の有効量を被験体に投与する段階を含む、ブドウ球菌に対する防御的または治療的免疫反応を被験体において刺激するための方法が含まれる。本発明の方法にはまた、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、SasH (AdsA)、SpA、Ebh、Coa、vWa、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種またはそれ以上をさまざまな組み合わせで含んだEmpおよび／またはEap組成物が含まれる。ある種の局面において、ワクチン処方物はIsdAポリペプチドまたはそのセグメントもしくは断片を含む。
【００４９】
さらなる局面において、本発明は、Empおよび／もしくはEapポリペプチドならびに／またはEsaBポリペプチドを欠いたブドウ球菌を含む。そのような細菌は長期的または持続的膿瘍形成および／または生物膜形成に関して制限または減弱されるであろう。この特徴を用いて、ブドウ球菌感染または関連疾患のための処置またはワクチンの調製で用いる弱毒化細菌の産生用の細菌株を提供することができる。さらなる局面において、Empおよび／またはEapを弱毒化細菌中で過剰発現させて、免疫反応またはワクチン処方物をさらに増強または補完することができる。
【００５０】
本発明の一つの局面に関して論じられているいずれの態様も、同様に本発明の他の局面に当てはまる。具体的には、Empおよび／またはEapペプチドまたは核酸との関連で論じられているいずれの態様も、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、SasH (AdsA)、SpA、Ebh、Coa、vWa、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／もしくはビトロネクチン結合タンパク質もしくは核酸またはそれらに結合する抗体に関して実施することが可能であり、逆の場合も同じである。
【００５１】
本発明者らは、血中での貪食除去を回避する黄色ブドウ球菌の能力を調べ、アデノシンシンターゼA (AdsA)、つまりアデノシン一リン酸をアデノシンに変換する細胞壁固定型酵素を、重要な病毒性因子として同定した。ブドウ球菌による血中アデノシン合成、貪食除去からの回避、およびその後の臓器膿瘍形成はどれもadsAに左右され、アデノシンの外生的供給に助けられることもあった。炭疽病原菌にてAdsA相同体が同定され、アデノシン合成は、炭疽菌(Bacillus anthracis)が貪食除去を回避することも可能にした。まとめると、これらの結果は、ブドウ球菌および他の細菌性病原菌が宿主免疫反応を回避するためにアデノシンの免疫修飾性を利用することを示唆している。本発明のある種の態様は、シグナル伝達分子アデノシンの合成が免疫抑制性であり、その合成活性の修飾を治療目的に利用できるという発見に基づく。
【００５２】
本出願では、一つの態様において、細菌感染および／またはブドウ球菌感染の処置のための方法および組成物におけるAdsA、またはAdsAの全部もしくは一部に結合する抗体、またはAdsA活性の阻害剤の使用について記述する。本出願では、AdsA抗原またはその免疫原性断片を含む免疫原性組成物も提供する。さらに、本発明は、細菌感染の処置(例えば、細菌の貪食取込みの修飾)または予防のために使用できる方法および組成物を提供する。場合によっては、免疫反応を刺激するための方法は、細菌AdsAポリペプチドまたは抗原、ならびにある種の局面において他の細菌タンパク質および細菌多糖類の全部または一部を含むまたはコードする組成物の有効量を被験体に投与する段階を伴う。他の細菌タンパク質には、(i) 分泌病毒性因子および／もしくは細胞表面タンパク質もしくはペプチド、または(ii) 分泌病毒性因子および／または細胞表面タンパク質もしくはペプチドをコードする組み換え核酸分子が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００５３】
別の局面において、AdsAに結合する抗体(例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体もしくは一本鎖抗体またはその断片)またはAdsA活性もしくは安定性を阻害する小分子のような、AdsA修飾因子を被験体に投与することができる。AdsA修飾因子は、直接的にAdsAに結合することができる。AdsA修飾因子は、AdsAに結合する抗体または細胞であることができる。抗体は抗体断片、ヒト化抗体、ヒト抗体および／またはモノクローナル抗体などであることができる。ある種の局面において、AdsA修飾因子は、被験体においてAdsAに結合する抗体の産生をもたらすAdsAペプチドまたはそれを発現する細菌を提供することにより誘発される。AdsA修飾因子は、典型的には、薬学的に許容される組成物に処方される。AdsA修飾因子組成物は、少なくとも一つのブドウ球菌抗原もしくはその免疫原性断片、またはそれに結合する抗体(例えば、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SasB、SdrC、SdrD、SdrE、Hla、IsdA、IsdB、Spa、ClfA、ClfB、IsdC、Coa、Ebh、vWaまたはSasF)をさらに含むことができる。ブドウ球菌抗原または抗体をAdsA修飾因子と同時に投与することができる。抗原および／または抗体および／または抗生物質、ならびにAdsA修飾因子を同じ組成物中で投与することができる。
【００５４】
ある種の態様は、薬学的に許容される組成物の中に、AdsAタンパク質もしくは抗原またはその断片に結合する、単離された抗体またはその断片を含む治療用組成物であって、被験体でのブドウ球菌感染を弱毒化できる、例えば、細菌の貪食取込みを修飾できる該組成物に関する。修飾因子はアデノシン類似体のような、小分子であることができる。抗体はヒト抗体またはヒト化抗体であることができる。ある種の局面において、抗体はポリクローナル抗体、もしくはモノクローナル抗体、もしくは一本鎖抗体、またはその断片である。
【００５５】
抗体組成物は、単離されたClfA、ClfB、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、Hla、IsdA、IsdB、IsdC、SasB、SasF、SdrC、SdrD、Coa、Ebh、vWa、SdrEおよびSpA抗原からなる群より選択される抗原、またはその断片に結合する少なくとも一つのさらなる単離抗体をさらに含むことができる。
【００５６】
AdsA修飾因子は、AdsAペプチドをコードする組み換え核酸分子であってもよい。組み換え核酸分子は、AdsAペプチドおよび／または少なくとも一つのブドウ球菌抗原もしくは免疫原性断片をコードすることができる。核酸がAdsA (SasH)、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Coa、Ebh、vWa、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasFまたはSpAの全部または一部の一つまたは複数のうちの2、3、4、5、6、7、8、9、10種またはそれ以上を含むいくつかの抗原をコードしてもよく、あるいはポリペプチドがそれらを含んでもよい。
【００５７】
AdsA修飾因子は、AdsAペプチドをコードする組み換え核酸分子であってもよい。組み換え核酸分子は、AdsAペプチドおよび／または少なくとも一つのブドウ球菌抗原もしくは免疫原性断片をコードすることができる。核酸がAdsA (SasH)、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Coa、Ebh、vWa、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasFまたはSpAの全部または一部の一つまたは複数のうちの2、3、4、5、6、7、8、9、10種またはそれ以上を含むいくつかの抗原をコードしてもよく、あるいはポリペプチドがそれらを含んでもよい。
【００５８】
本発明の態様は、細菌を含有するまたは含有しない組成物を含む。組成物は、弱毒化されたまたは生存可能なまたはインタクトなブドウ球菌または他の細菌を含んでもまたは含まなくてもよい。ある種の局面において、組成物は、ブドウ球菌ではない細菌を含むか、またはブドウ球菌を含有しない。ある種の態様において、細菌組成物は、単離されたもしくは組み換え発現されたAdsAポリペプチドまたはそれをコードする核酸を含む。さらなる局面において、単離されたAdsAポリペプチドは多量体化される、例えば、二量体化される。本発明のある種の局面において、組成物は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種またはそれ以上の単離された細胞表面タンパク質またはそのセグメントの多量体を含む。さらなる局面において、AdsA、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、Coa、Ebh、vWa、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasFまたはSpAあるいはその免疫原性断片を含むが、これらに限定されない、他のポリペプチドまたはペプチドが細菌組成物において発現されてもまたは含まれてもよい。あるいは、組成物は、分泌病毒性因子または細胞表面タンパク質に関して細菌を特異的に変化させることを含むようなやり方で変化されている、組み換え発現されたブドウ球菌抗原であってもまたはそれを含んでもよい。例えば、細菌は、未修飾ならば発現すると考えられるよりも多くの病毒性因子または細胞表面タンパク質を発現するように組み換えによって修飾されてもよい。
【００５９】
同様に、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hla、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、Coa、Ebh、vWa、SasFまたはSpAタンパク質という用語は、ブドウ球菌から単離された各野生型ポリペプチド、およびそれらに対する免疫反応を刺激する変種、セグメントまたは断片を含むタンパク質をいう。免疫反応は、生物における体液性反応、細胞性反応、または体液性および細胞性反応の両方をいう。免疫反応は、タンパク質もしくは細胞表面タンパク質を特異的に認識する抗体の存在もしくは量を測定するアッセイ法、T細胞活性化もしくは増殖を測定するアッセイ法、および／または一つもしくは複数のサイトカインの活性もしくは発現に関しての修飾を測定するアッセイ法を含むが、これらに限定されないアッセイ法によって測定することができる。細菌AdsAポリペプチドには、以下の細菌(アクセッション番号): 黄色ブドウ球菌(ref|YP_001573948、ref|YP_184935、ref|YP_039500、ref|NP_373261、ref|NP_370547、ref|YP_042156、ref|NP_644838、ref|YP_415541、dbj|BAA82250); スタフィロコッカスヘモリチカス(Staphlyococcus hemolyticus) (ref|YP_254367); ストレプトコッカスサンギニス(Streptococcus sanguinis) (ref|YP_001035187); ストレプトコッカスゴルドニ(Streptococcus gordonii) (ref|YP_001450531); エンテロコッカスフェカリス(Enterococcus faecalis) (ref|NP_813870); ストレプトコッカススイス(Streptococcus suis) (dbj|BAB83980、ref|YP_001200571、ref|YP_001198366); ストレプトコッカスミュータンス(Streptococcus mutans) (ref|NP_721592); ストレプトコッカスサーモフィルス(Streptococcus thermophilus) (ref|YP_141373、ref|YP_139455); アルカリフィルスメタリレジゲンス(Alkaliphilus metalliredigens) (ref|YP_001321391); ボツリヌス菌(Clostridium botulinum) (ref|YP_001887045、ref|YP_001921966); パエニバチルス(Paenibacillus) (ref|ZP_02846642); アルカリフィルスオレムランジイ(Alkaliphilus oremlandii) (ref|YP_001512463); バチルスクラウシイ(Bacillus clausii) (ref|YP_174466); バチルスハロデュランス(Bacillus halodurans) (ref|NP_240892); クロストリジウムディフィシレ(Clostridium difficile) (ref|ZP_03126518、ref|ZP_02748384、ref|YP_001089051、ref|ZP_02726436、ref|ZP_01801990); クロストリジウムセルロリティカム(Clostridium cellulolyticum) (ref|ZP_01574143); およびアナエロツルンカスコリホミニス(Anaerotruncus colihominis) (ref|ZP_02441436)のアミノ酸配列の全部または一部が含まれるが、これらに限定されることはなく、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。ある種の局面において、AdsAポリペプチドはSEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:41に対して、少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、99%の同一性を、または40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、99%超の同一性を、その間の全ての値および範囲を含めて、有することができる。
【００６０】
本発明のさらなる態様において、組成物は、AdsAポリペプチド(SEQ ID NO:36)またはAdsA核酸(SEQ ID NO:35)に対して70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似である、または少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含むことができ、ある種の局面において、AdsAポリペプチドは(SEQ ID NO:36)のアミノ酸配列を有するであろう。類似性または同一性は、同一性が好ましいが、当技術分野において公知であり、いくつかの異なるプログラムを用いて、タンパク質(または核酸)が公知の配列に対して配列同一性または類似性を有するかどうかを特定することができる。配列同一性および／または類似性は、Smith & Waterman (1981)の局所配列同一性アルゴリズムを含むが、これに限定されない、当技術分野において公知の標準的な技術を用いて、Needleman & Wunsch (1970)の配列同一性アライメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman (1988)の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータでの実行(Wisconsin Genetics Software Package中のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)により、Devereux et al. (1984)によって記述されているBest Fit配列プログラムにより、好ましくは初期設定を用いて、または検査により判定される。好ましくは、同一性の割合は当業者にとって、公知のかつ容易に確認できるアライメントツールを用いることにより計算される。
【００６１】
組成物は薬学的に許容される組成物に処方されてもよい。本発明のある種の局面において、ブドウ球菌は黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌である。別の局面において、細菌は桿菌または炭疽菌である。
【００６２】
AdsAの阻害剤としての化合物の活性は、当業者に公知の方法ならびに本明細書において記述される方法を用いて評価することができる。スクリーニングアッセイ法には、アッセイ成分の適切な操作の較正および確認の目的で対照を含めてもよい。反応物質の全てを含有するが化学的ライブラリの成員を含有しないブランクウェルが、通常は含まれる。別の例として、AdsAの公知の阻害剤(または活性剤)をアッセイサンプルの一つとともにインキュベートし、得られる酵素活性の減少(または増加)を比較器または対照として用いてもよい。修飾因子を酵素活性剤または阻害剤と組み合わせて、そうしなければ公知の酵素修飾因子の存在によっては引き起こされない酵素活性化または抑制を阻害する修飾因子を見出すこともできることが理解されよう。本明細書において用いられる「高処理スクリーニング」または「HTS」という用語は、タンパク質の機能に及ぼす効果に関しての何千種もの分子(または試験化合物)の試験をいう。基転移反応酵素の場合、その触媒活性に及ぼす効果に関して多くの分子を試験することができる。HTS法は当技術分野において公知であり、それらはマルチウェルプレート中で自動液体処理および検知機器により一般に行われるが、本発明の方法はマイクロアレイ上でまたはマイクロ流体システム中で実践できるものと想定される。本明細書において用いられる「ライブラリ」または「薬物ライブラリ」という用語は、AdsAの修飾因子としての可能性を有する複数の化学分子(試験化合物)、複数の核酸、複数のペプチドまたは複数のタンパク質、およびその組み合わせをいう。スクリーニングが高処理スクリーニング技術によって行われる場合、この技術ではマルチウェルプレートまたはマイクロ流体システムが利用される。
【００６３】
AdsA活性を評価するためのアッセイ/キットの一例としては、Diazyme Enzyme反応キットが挙げられるが、これに限定されることはない。このキットは、ヒト血清サンプル中の5'-NT活性の決定に通常用いられる5'-ヌクレオチダーゼ(5'-NT)アッセイキットである。5'-NTアッセイは、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP)によってヒポキサンチンに変換されるイノシンを形成するための5'一リン酸(5'-IMP)の酵素加水分解に基づく。ヒポキサンチンは次いで、キサンチンオキシダーゼ(XOD)により尿酸および過酸化水素(H2O2)に変換される。H2O2はペルオキシダーゼ(POD)の存在下でN-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メチルアニリン(EHSPT)および4-アミノアンチピリン(4-AA)とさらに反応してキノン色素を生成し、これを動態的にモニターする。この方法は迅速であるが、放射能アッセイ法ほど感受性ではない。
【００６４】
阻害剤および阻害剤候補には以下のものの誘導体または類似体が含まれるが、これらに限定されることはない: α, β-メチレンアデノシン5'-二リン酸(AOPCP)、つまり5'-エクトヌクレオチダーゼ(細菌AdsAのヒト相同体)の阻害剤、この阻害剤はハトトリコモナス(Trichomonas gallinae)の栄養体から分泌された5'-ヌクレオチダーゼを阻害しない(Borges et al., 2007); ヌクレオチシジンならびにメラノシジンAおよびB、これらの化合物はラット肝膜およびヘビ毒由来の5'-ヌクレオチダーゼに対する強力な阻害活性を示した(Uchino et al., 1986); ポリフェノール化合物、これらの化合物は抗腫瘍活性を保有し、種々の供給源由来の5'-ヌクレオチダーゼを阻害し、ビンロウ(Areca catechu)(ビンロウジ)の種子およびブドウから単離されている(Iwamoto et al., 1988; Uchino et al., 1988; Toukairin et al., 1991)。
【００６５】
さらなる態様において、組成物は、AdsAポリペプチドまたはそのセグメント/断片をコードする組み換え核酸分子を含む。典型的には、AdsAポリペプチドをコードする組み換え核酸分子は、異種プロモーターを含む。
【００６６】
ある種の局面において、本発明の組み換え核酸分子はベクターであり、他の局面においてベクターはプラスミドである。ある種の態様において、ベクターはウイルスベクターである。本発明の局面には、さらに1、2、3、4、5、6、7、8種またはそれ以上のポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸をさらに含む組成物が含まれる。
【００６７】
ある種の局面において、組成物は、本明細書において記述される一つまたは複数のポリペプチド、例えば、AdsAポリペプチドを含有するまたは発現する組み換え非ブドウ球菌を含む。特定の局面において、組み換え非ブドウ球菌はサルモネラ菌(Salmonella)または別のグラム陽性細菌である。組成物は、典型的には、ヒト被験体のような、哺乳類に投与されるが、免疫反応を誘発できる他の動物への投与が企図される。さらなる局面において、AdsAポリペプチドを含有するまたは発現するブドウ球菌は黄色ブドウ球菌である。さらなる態様において、免疫反応は防御的および／または治療的免疫反応である。
【００６８】
さらなる態様には、(i) AdsAポリペプチドもしくはそのペプチド、または(ii) AdsAポリペプチドもしくはそのペプチドをコードする核酸分子を含む組成物の有効量を被験体に投与する段階、あるいは(iii) 本明細書において記述される細菌タンパク質または多糖類の任意の組み合わせまたは順列でAdsAポリペプチドを投与する段階を含む、ブドウ球菌に対する防御的または治療的免疫反応を被験体において刺激するための方法が含まれる。
【００６９】
さらなる態様には、単離されたAdsAポリペプチド、そのセグメントもしくは断片、または記述されているその他任意の組み合わせもしくは順列のタンパク質もしくはペプチドを有する薬学的に許容される組成物であって、ブドウ球菌に対する免疫反応を刺激できる該組成物を含むワクチンが含まれる。ワクチンは、単離されたAdsAポリペプチド、および／または記述されているその他任意の組み合わせもしくは順列のタンパク質、ペプチドもしくは多糖類を含みうる。本発明のある種の局面において、単離されたAdsAポリペプチド、または記述されているその他任意の組み合わせもしくは順列のタンパク質もしくはペプチドは多量体化される、例えば、二量体化される。
【００７０】
さらなる局面において、ワクチン組成物には約10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.25、0.05% (またはその中で導出される任意の範囲)未満の他のブドウ球菌タンパク質が混入している。組成物は、単離された非AdsAポリペプチドをさらに含みうる。典型的には、ワクチンはアジュバントを含む。ある種の局面において、本発明のタンパク質またはペプチドはアジュバントに連結され(共有結合的にまたは非共有結合的にカップリングされ)、好ましくはアジュバントはタンパク質に化学的に抱合される。
【００７１】
さらなる態様において、ワクチン組成物は、全部もしくは一部のAdsAポリペプチド、および／または本明細書において記述されているその他任意の組み合わせもしくは順列のタンパク質もしくはペプチドをコードする組み換え核酸を有する薬学的に許容される組成物であって、ブドウ球菌または桿菌に対する免疫反応を刺激できる該組成物である。ワクチン組成物は、全部もしくは一部のAdsAポリペプチド、および／または記述されているその他任意の組み合わせもしくは順列のタンパク質もしくはペプチドをコードする組み換え核酸を含みうる。ある種の態様において、組み換え核酸は異種プロモーターを含む。好ましくは、組み換え核酸はベクターである。より好ましくは、ベクターはプラスミドまたはウイルスベクターである。
【００７２】
さらなる態様において、ワクチン組成物は、AdsAタンパク質もしくは抗原またはその断片に結合する、単離された抗体またはその断片を含む薬学的に許容される組成物であって、被験体でのブドウ球菌感染を弱毒化できる、例えば、細菌の貪食取込みを修飾できる該組成物である。抗体はヒト抗体またはヒト化抗体であることができる。ある種の局面において、抗体はポリクローナル抗体、もしくはモノクローナル抗体、または一本鎖抗体、あるいはその断片である。
【００７３】
ワクチン組成物は、単離されたClfA、ClfB、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、Hla、IsdA、IsdB、IsdC、Emp、Eap、SasB、SasF、SdrC、SdrD、Coa、Ebh、vWa、SdrEおよびSpA抗原からなる群より選択される抗原、またはその断片に結合する少なくとも一つのさらなる単離抗体をさらに含むことができる。
【００７４】
さらなる態様には、(i) Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、IsdC、Spa、ClfA、ClfB、Coa、Ebh、vWa、IsdC、SasB、SasFまたはSpAのポリペプチドあるいはそのセグメントまたは断片; または(ii) それらをコードする核酸分子の一つまたは複数を含むAdsAポリペプチドまたはそのセグメント/断片の組成物の有効量を被験体に投与する段階を含む、ブドウ球菌に対する防御的または治療的免疫反応を被験体において刺激するための方法が含まれる。本発明の方法にはまた、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、Coa、Ebh、vWa、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、IsdC、SpA、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasFまたはSpaの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種またはそれ以上をさまざまな組み合わせで含んだAdsA組成物が含まれる。ある種の局面において、ワクチン処方物はIsdAポリペプチドまたはそのセグメントもしくは断片を含む。
【００７５】
さらなる局面において、本発明は、AdsAポリペプチドを欠いたブドウ球菌を含む。そのような細菌は食細胞取込みおよび／または認識を回避するその能力に関して制限または減弱されるであろう。この特徴を用いて、ブドウ球菌感染または関連疾患のための処置またはワクチンの調製で用いる弱毒化細菌の産生用の細菌株を提供することができる。さらなる局面において、AdsAを弱毒化細菌中で過剰発現させて、免疫反応またはワクチン処方物をさらに増強または補完することができる。
【００７６】
本発明の一つの局面に関して論じられているいずれの態様も、同様に本発明の他の局面に当てはまる。具体的には、AdsAペプチドまたは核酸との関連で論じられているいずれの態様も、他の分泌病毒性因子および／もしくは細胞表面タンパク質、例えばEap、Emp、EsaB、EsaC、Coa、Ebh、vWa、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasFまたはSpAタンパク質、または核酸あるいはそれらに結合する抗体に関して実施することが可能であり、逆の場合も同じである。
【００７７】
「提供する」または「投与する」という用語は、その通常の意味にしたがって「使用のために供給するまたは与えること」を示すように用いられる。いくつかの態様では、タンパク質を投与することによってタンパク質は直接的に提供されるが、他の態様では、タンパク質をコードする核酸を投与することによってタンパク質は効果的に提供または投与される。ある種の局面において、本発明は、さまざまな組み合わせの抗体、核酸、抗原、ペプチド、エピトープおよび／または多糖類などを含む組成物を企図する。
【００７８】
被験体は、典型的には、ブドウ球菌感染を有する(例えば、持続性ブドウ球菌感染と診断されている)、ブドウ球菌感染を有することが疑われる、またはブドウ球菌感染を発症するリスクがあるであろう。本発明の組成物には、意図した目的(例えば、感染の処置または予防)を達成するのに有効な量で抗原またはエピトープが含有されている免疫原性組成物が含まれる。より具体的には、有効量とは、免疫反応を刺激するもしくは誘発させるのに、または感染に対する耐性、感染の改善もしくは感染の緩和をもたらすのに必要な活性成分の量を意味する。より具体的な局面において、有効量は、疾患もしくは感染の症状を阻止する、軽減するもしくは改善する、または処置される被験体の生存を引き延ばす。有効量の判定は十分に、とりわけ本明細書において提供される詳細な開示に照らして、当業者の能力の範囲内である。本発明の方法において用いられるどの調製物についても、有効な量または用量は、インビトロ、細胞培養および／または動物モデルアッセイ法から最初に推定することができる。例えば、所望の免疫反応または循環抗体の濃度もしくは力価を達成するため、動物モデルにおいて用量を処方することができる。そのような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に判定することができる。
【００７９】
本明細書において用いられる場合、「修飾する」または「修飾」という用語は「増強する」または「阻害する」という単語の意味を包含する。活性の「修飾」は活性の増加または減少のどちらであってもよい。本明細書において用いられる場合、「修飾因子」という用語は、タンパク質、核酸、遺伝子、生物などの上方制御、阻害、刺激、増強、阻害、下方制御または抑制を含めて、部分の機能をもたらす化合物をいう。
【００８０】
「単離される」という用語は、その起源の細胞物質、細菌物質、ウイルス物質もしくは培地(組み換えDNA技術により産生されもしくは天然生物から単離される場合)、または化学的前駆物質もしくは他の化学物質(化学的に合成される場合)を実質的に含んでいない核酸またはポリペプチドもしくはペプチドをいうことができる。さらに、単離化合物とは、単離された化合物として被験体に投与できるものをいい; 換言すれば、化合物は、カラムに付着されているなら、またはアガロースゲルに埋め込まれているなら単純に「単離されている」と考えられない。さらに、「単離核酸断片」または「単離ペプチド」とは、断片として天然には存在しないおよび／もしくは機能しない、ならびに/または典型的には機能的な状態にない、核酸またはタンパク質断片である。
【００８１】
抗体、ポリペプチド、ペプチド、抗原または免疫原などの、本発明の部分をアジュバント、タンパク質、ペプチド、支持体、蛍光部分または標識などの、他の部分に共有結合的または非共有結合的に抱合または連結させることができる。「抱合体」または「免疫抱合体」という用語は、一つの部分と他の薬剤との機能的結合を定義するように広く用いられており、任意のタイプの機能的結合を単にいうようには意図されておらず、化学的「抱合」に特に限定されることはない。組み換え融合タンパク質が特に企図される。本発明の組成物はアジュバントまたは薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。アジュバントは本発明のポリペプチドまたはペプチドに共有結合的または非共有結合的にカップリングされてもよい。ある種の局面において、アジュバントはタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに化学的に抱合される。さらなる局面において、アジュバントは組み換えタンパク質の一部であり、一つまたは複数の関心対象の抗原を含む融合タンパク質に含まれる。
【００８２】
組成物は薬学的に許容される組成物に処方されてもよい。本発明のある種の局面において、ブドウ球菌は黄色ブドウ球菌である。
【００８３】
本発明のさらなる局面において、組成物は、二回以上被験体に投与されてもよく、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20回またはそれ以上の回数で投与されてもよい。組成物の投与は、吸入または吸引を含めて、鼻腔投与、胸膜投与、経口投与、非経口投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、またはその各種組み合わせを含むが、これらに限定されることはない。
【００８４】
さらなる態様において、組成物は、Emp、Eapおよび／またはAdsAポリペプチドまたはそのセグメント/断片をコードする組み換え核酸分子を含む。典型的には、Emp、Eapおよび／またはAdsAポリペプチドをコードする組み換え核酸分子は、異種プロモーターを含む。
【００８５】
ある種の局面において、本発明の組み換え核酸分子はベクターであり、他の局面においてベクターはプラスミドである。ある種の態様において、ベクターはウイルスベクターである。本発明の局面には、さらに1、2、3、4、5、6、7、8種またはそれ以上のポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸をさらに含む組成物が含まれる。
【００８６】
ある種の局面において、組成物は、本明細書において記述される一つまたは複数のポリペプチド、例えば、Emp、Eapおよび／またはAdsAポリペプチドを含有するまたは発現する組み換え非ブドウ球菌を含む。特定の局面において、組み換え非ブドウ球菌はサルモネラ菌または別のグラム陽性細菌である。組成物は、典型的には、ヒト被験体のような、哺乳類に投与されるが、免疫反応を誘発できる他の動物への投与が企図される。さらなる局面において、Emp、Eapおよび／またはAdsAポリペプチドを含有するまたは発現するブドウ球菌は黄色ブドウ球菌である。さらなる態様において、免疫反応は防御免疫反応である。
【００８７】
本発明の組成物は、典型的には、ヒト被験体に投与されるが、ブドウ球菌に対する免疫反応を誘発できる他の動物、特にトランスジェニック動物(例えば、ヒト抗体を発現するように操作された動物)を含む、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジおよび他の家畜、すなわち、哺乳類への投与が企図される。
【００８８】
さらなる局面において、本発明の方法および組成物は、組織または腺、例えば、乳腺の感染、特に乳腺炎および他の感染を予防する、改善する、軽減するまたは処置するために用いることができる。他の方法は、感染の兆候を呈していない被験体、特に標的細菌に侵されていると疑われるまたは標的細菌に侵されるリスクのある被験体、例えば、入院、処置および／または回復の間に感染のリスクまたは影響のあるまたはありうる患者における細菌負荷の予防的軽減を含むが、これに限定されることはない。
【００８９】
本明細書において提供されるいずれのリストも、リストのいずれか1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の成員を明確に除外するまたは含むことができる。
【００９０】
実施例の項における態様は、本発明の全ての局面に適用可能な本発明の態様であると理解される。
【００９１】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物だけをいうように明記されていない限りまたは代替物が相互排他的でない限り「および／または」を意味するように用いられるが、本開示では、代替物のみと「および／または」とをいうという定義を支持する。「または」という用語を用いて記載されているどんなものでも明確に除外できることも企図される。
【００９２】
本出願の全体を通じて、「約」という用語は、値にはその値を決定するために利用される装置または方法に対しての誤差の標準偏差が含まれることを示すために用いられる。
【００９３】
長年にわたる特許法にしたがって、「一つの(a)」および「一つの(an)」という単語は、特許請求の範囲または明細書において「含む(comprising)」という単語とともに用いられる場合、特に断りのない限り、一つまたは複数を意味する。
【００９４】
本発明の他の目標、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体的な例は、本発明の特定の態様を示しているが、この詳細な説明から当業者には本発明の趣旨および範囲のなかで種々の変更および修正が明らかになると考えられるので、単なる例示として与えられるものと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
本発明の上記の特徴、利点および目標、ならびにこれ以外に明らかになるものをつかみ、詳細に理解できるように、上記に簡単に要約した本発明の、より具体的な説明およびある種の態様を添付図面に示す。これらの図面は明細書の一部をなす。しかしながら、添付図面は本発明のある種の態様を示すものであり、それゆえ、その範囲を限定するものと見なされるべきではないことに留意されたい。
【００９６】
【図１】黄色ブドウ球菌における膿瘍形成の検査。(図1A) Newman感染腎の写真。(図1B) srtA変異体感染腎の写真。(図1C) Newman感染腎のH&E組織切片。(図1D) ΔSrtA感染腎の組織切片。(図1E) Newman感染腎の接近写真。(図1F) ΔSrtA感染腎の接近写真。(図1G) Newman膿瘍の走査電子顕微鏡法。(図1H) ΔSrtA感染腎のSEM。
【図２】ネズミ腎膿瘍スクリーニング。各変異株に感染した腎臓から回収されたコロニー形成単位(CFU)。
【図３Ａ】生物膜スクリーニング。インビトロ生物膜成長のための96ウェルプレートアッセイ。
【図３Ｂ】生物膜スクリーニング。SEM Newmanインビトロ生物膜。
【図３Ｃ】生物膜スクリーニング。ΔsrtA生物膜。
【図３Ｄ】生物膜スクリーニング。ΔEmp生物膜。
【図３Ｅ】生物膜スクリーニング。ΔIcaA生物膜。
【図３Ｆ】生物膜スクリーニング。ΔIsdB生物膜。
【図３Ｇ】生物膜スクリーニング。ΔSdrD生物膜。
【図４Ａ】Emp病毒性。Newman、ΔEap、ΔEmp、ΔSrtA、ΔEap/ΔSrtA、ΔEmp/ΔSrtAに対して回収されたCFU。
【図４Ｂ】Emp病毒性。各菌株に対する病理組織診断。
【図５Ａ】Eap、Empワクチン接種。Newman、ΔSrtA、ΔIsdB、ΔIcaA、ΔEap、ΔEmp、ΔSaeRのSDS抽出。
【図５Ｂ】Eap、Empワクチン接種。Eap (70kDa)およびEmp (45kDa)のタンパク質精製。
【図５Ｃ】Eap、Empワクチン接種。PBS、EapまたはEmpでワクチン接種され、Newmanで攻撃されたマウスから回収されたCFU。
【図５Ｄ】Eap、Empワクチン接種。ワクチン接種マウスのELISA IgG力価。
【図５Ｅ】Eap、Empワクチン接種。ワクチン接種マウスの病理組織診断。
【図６Ａ】Ica病毒性。Newman、DIcaA、DIcaB、DIcaC、DIcaD、DIcaR、DIca:tet (全オペロン欠失)に感染したマウスから回収されたCFU。
【図６Ｂ】Ica病毒性。感染マウスの病理組織診断。
【図７−１】マウスの静脈内感染後のブドウ球菌膿瘍形成。(A) BALB/cマウスに眼窩後部注射によって1×107コロニー形成単位(CFU)の黄色ブドウ球菌Newmanを感染させた。マウス5匹のコホートを血中細菌負荷について定時間隔で心穿刺により調べた; サンプルアリコットを寒天培地上にプレーティングし、血液1 mlあたりのCFUを数えた。これらの観察結果の平均を黒棒によって示す。(B) 末梢器官組織への黄色ブドウ球菌Newmanの播種および病原菌の複製をマウス(動物10匹のコホート)の腎臓において、これをCFUのためにホモジナイズし寒天培地上にプレーティングし、定時間隔で測定した。(C) 膿瘍病変部の直径を感染腎の薄切片ヘマトキシリン・エオシン染色組織において定時間隔で測定した。
【図７−２】マウスの静脈内感染後のブドウ球菌膿瘍形成。(D〜K) 薄切片ヘマトキシリン・エオシン染色組織において分析した定時間隔の感染腎の画像。矢印は膿瘍病変部を指し示す。
【図８】ブドウ球菌膿瘍群集の病理組織診断。BALB/cマウスに眼窩後部注射によって黄色ブドウ球菌Newmanを感染させた。感染後2日目(ABC)および5日目(DEF)の感染腎の薄切片ヘマトキシリン・エオシン染色組織を光学顕微鏡検査によって分析し、撮像した。2日目には、細胞内ブドウ球菌(C中の黄矢印)を時に伴う多形核顆粒球(PMN)の大量の浸潤物(A中の青矢印)が早期感染病変部に特有である。5日目までに、ブドウ球菌膿瘍群集が中心の病巣として現れた(D、黒矢印)。ブドウ球菌は無定形の好酸球性偽被膜(黒枠)で囲まれ、死滅PMN帯(白枠)、見掛けは正常なPMN帯(赤枠)および壊死性PMNの縁(緑枠)に取り囲まれ、健常腎組織から好酸球性の層によって分離されていた。
【図９−１】ソルターゼAは宿主組織における膿瘍形成およびブドウ球菌の存続に必要とされる。黄色ブドウ球菌Newman、その同質遺伝子ソルターゼA変異体(ΔsrtA)またはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌USA300に感染したBALB/cマウス(動物10匹のコホート)の腎臓を植菌から5日(d5)および15日(d15)後の動物死体解剖中に取り除いた。腎臓を表面膿瘍がないか検査し(A、F、K)、またはホルマリン中で固定し、包埋し、薄片にし、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。病理組織診断像を光学顕微鏡検査により倍率10倍(B、G、L、D、I、N)および100倍(C、H、M、E、J、O)で得た。(P) 腎臓組織におけるブドウ球菌の複製および存続を感染から5日および15日後に測定した。感染マウスから死体解剖中に腎臓を取り除き、コロニーの形成および数え上げのために組織をホモジナイズし、寒天培地上にプレーティングした。
【図９−２】図９−１の続き。
【図９−３】図９−２の続き。
【図１０】膿瘍病変部の中心にあるブドウ球菌群集。黄色ブドウ球菌Newman (野生型)、その同質遺伝子ソルターゼA変異体(ΔsrtA)またはMRSA株USA300に感染したマウス由来の腎臓組織を走査電子顕微鏡法のため切片にし、固定し、脱水し、80%白金/20%パラジウムでスパッタコートした。(A) 野生型病原菌は、無定形の偽被膜(白矢じり)内に含まれる膿瘍中心にある、密に結び付いた菌叢、ブドウ球菌膿瘍群集(staphylococcal abscess community; SAC)として組織化され、SACと白血球のカフ(cuff)とが分離されている。赤血球はブドウ球菌の間に位置していた(R)。(B) ソルターゼ変異体(ΔsrtA、矢印)はSACを形成せず、分離ブドウ球菌は健常腎組織において見出された。(C) 黄色ブドウ球菌Newmanと同様に、MRSA株USA300も、偽被膜(白矢じり)内に含まれるSACを形成した。
【図１１Ａ】ブドウ球菌膿瘍群集の形成には特異的な表面タンパク質が必要になる。(A) 表面タンパク質遺伝子の中にブルサアウレアリス(bursa aurealis)の挿入がある黄色ブドウ球菌Newman変種を、ホモジナイズ腎組織における細菌負荷についてBALB/cマウス(動物20匹のコホート)の感染から5日後に調べた。
【図１１Ｂ】ブドウ球菌膿瘍群集の形成には特異的な表面タンパク質が必要になる。(B) 感染腎のヘマトキシリン・エオシン染色薄片を光学顕微鏡検査および膿瘍病変部(白矢印)の場合には10倍の倍率により調べた。
【図１２−１】ブドウ球菌膿瘍病変部におけるEmpおよびEap。empまたはeapの中にブルサアウレアリスの挿入を保有する黄色ブドウ球菌Newman変種に感染したBALB/cマウスの腎臓を植菌から5日(d5)および15日(d15)後に取り除いた。腎臓をヘマトキシリン・エオシンで染色し、病理組織診断像を光学顕微鏡検査により倍率10倍(A、C、E、H)および100倍(B、D、F、I)で得た。野生型黄色ブドウ球菌Newmanの膿瘍病変部におけるEap (J)およびEmp (K)の発現を、多形核白血球の核を検出するためにHoechst色素(青)で染色した腎組織においてウサギ抗Empまたは抗Eapおよび二次Alexafluor-647標識抗体(赤)で、ならびにBODIPY-バンコマイシン(緑)で検出してブドウ球菌膿瘍群集を明らかにした。(L) 腎臓組織におけるブドウ球菌の複製および存続を静脈内接種から5、15および30日後に測定した。感染マウス(動物10匹のコホート)から腎臓を取り除き、コロニーの形成および数え上げのために組織をホモジナイズし、寒天培地上にプレーティングした。
【図１２−２】図１２−１の続き。
【図１３Ａ】Eapによる能動および受動免疫はブドウ球菌攻撃からの防御をもたらす。(A) BALB/cマウスを精製EapもしくはEmpで免疫し、またはアジュバントのみでモック処置し、血清IgG力価をELISAによって分析した。
【図１３Ｂ】Eapによる能動および受動免疫はブドウ球菌攻撃からの防御をもたらす。免疫から3週間後に、ブドウ球菌の静脈内接種によって動物を攻撃した。感染から5日後、腎臓を死体解剖中に取り除き、腎組織をブドウ球菌負荷または病理組織診断に向けて分析した。
【図１３Ｃ】Eapによる能動および受動免疫はブドウ球菌攻撃からの防御をもたらす。EapまたはEmpに対して作製されたウサギ抗体を親和性クロマトグラフィーによって精製し、腹腔内注射によってマウスへ受動的に移入した。24時間後に、受動的に免疫された動物の血清IgG力価をELISAによって分析した。
【図１３Ｄ】Eapによる能動および受動免疫はブドウ球菌攻撃からの防御をもたらす。EapまたはEmpに対する精製抗体で受動的に免疫された動物およびモック処置動物をその後、黄色ブドウ球菌Newmanで攻撃し、細菌負荷を4日目に数え上げた。
【図１３Ｅ】Eapによる能動および受動免疫はブドウ球菌攻撃からの防御をもたらす。腎臓における膿瘍形成を、薄片にし、ヘマトキシリン・エオシン染色した組織において検出した。
【図１４】宿主組織におけるブドウ球菌の膿瘍形成および存続に関する動作モデル。段階I- 静脈内接種後、黄色ブドウ球菌は血流中で生存し、脈管構造を介して末梢器官組織へ広がる。段階II- 腎組織において、ブドウ球菌は多形核白血球および他の免疫細胞の大量の浸潤物を引き付ける。段階III- 膿瘍は、中心の病原菌の蓄積(ブドウ球菌膿瘍群集-SAC)が、好酸球性偽被膜で囲まれて成熟する。SACは死滅PMN帯、見掛けは正常なPMNそして縁に好酸球性物質がある死滅PMNの外側帯に取り囲まれている。段階4- 膿瘍は器官表面上で成熟し破裂し、それによってブドウ球菌を循環血中に放出し、新たなラウンドの膿瘍発現を開始する。ブドウ球菌膿瘍発現の特定の段階に必要とされる細菌外膜成分に対する遺伝子は、これらの遺伝子が機能する対応段階の下部に赤で印刷されている。
【図１５Ａ】AdsAは血中での生存に不可欠な細胞壁結合タンパク質である。BALB/cマウス(図15A)またはSprague-Dawleyラット(図15D)由来の血液中での野生型黄色ブドウ球菌Newman (WT)および同質遺伝子srtA変種の生存の比較。データは、3回の独立分析からの平均および標準誤差(±SEM)である。血中でのブドウ球菌の生存のためのソルターゼA固定細胞壁表面タンパク質の相対寄与を評価するために、表示遺伝子の中にトランスポゾンの挿入がある同質遺伝子変種を60分間マウス(図15B)またはラット(図15E)由来の血液中でインキュベートした。padsAの発現はマウス(図15C)、ラット(図15F)またはヒト志願者(図15G)由来の血液中でのブドウ球菌adsA変種生存をレスキューする。ギムザ染色したヒト血液サンプルにおけるWT、adsAおよびadsA (padsA)ブドウ球菌と食細胞との可視化(図15H)。矢印は細胞外結合黄色ブドウ球菌と好中球結合黄色ブドウ球菌の両方を示す。データは、異なる2人のドナーでの2回の独立分析の代表である。
【図１５Ｂ】図１５Ａに記載のとおり。
【図１５Ｃ】図１５Ａに記載のとおり。
【図１５Ｄ】図１５Ａに記載のとおり。
【図１５Ｅ】図１５Ａに記載のとおり。
【図１５Ｆ】図１５Ａに記載のとおり。
【図１５Ｇ】図１５Ａに記載のとおり。
【図１５Ｈ】図１５Ａに記載のとおり。
【図１６】AdsAは、インビボでブドウ球菌複製および膿瘍形成を可能にする病毒性因子である。黄色ブドウ球菌Newman野生型およびadsA変異体(図16A)またはUSA300野生型およびadsA変異体(図16C)によるBALB/cマウス10匹のコホートの感染後の腎臓におけるブドウ球菌負荷(NewmanおよびUSA300の両方の感染に対しP < 0.03、対応のないt検定)。黄色ブドウ球菌Newman野生型およびadsA変異体(図16B)または黄色ブドウ球菌USA300野生型およびadsA変異体(図16D)に感染したマウスの死体解剖後に得られた倍率10倍(上パネル)および100倍(下パネル)でのヘマトキシリン・エオシン染色腎組織の顕微鏡像。黒矢印はブドウ球菌およびPMN浸潤物の中心集中を意味する。データは、2回の独立分析および細菌株あたり動物5匹のコホートの代表的サンプルである。(図16E) 細菌負荷を30分または90分間の、野生型(WT)、adsAまたはadsA:padsA黄色ブドウ球菌Newmanのいずれかの眼窩後部注射によって感染したBALB/cマウスから得た血液500 μlあたりのCFUとして測定した。データは、各時点に動物10匹のコホートを用いた2回の独立分析の代表である。対応のないt検定を統計分析に用いた。
【図１７Ａ】AdsAは5'-ヌクレオチダーゼ活性を示し、AMPを加水分解する。表示した細菌株由来リソスタフィン細胞壁抽出物を放射標識[14C]AMPとともにインキュベートし、[14C]Ado (アデノシン)の生成を薄層クロマトグラフィー(TLC)によって測定した。(図17A) TLC後の[14C]AMPおよび[14C]Adoに対する放射性シグナルをPhosphorImagerによって捕捉した。(図17B) (a)からの放射性[14C]Adoシグナルを定量化し、黄色ブドウ球菌Newmanにおけるアデノシンシンターゼ活性(100%)に対して較正し、％量として表示した。データは3回の独立分析の平均であり、誤差棒はSEMを表す。(WT vs. adsAに対しP<0.05)。(図17C) 放射性[14C]AMPを5 mMの各種金属イオンの存在下または非存在下で精製AdsA1-400 (2 μM)の存在下または非存在下においてインキュベートした。TLC後の[14C]AMPおよび[14C]Adoに対する放射性シグナルをPhosphorImagerによって捕捉した。(図17D) (c)からの放射性[14C]Adoシグナルを定量化し、塩化マンガン(Mn2+)の存在下におけるアデノシンシンターゼ活性(100%)に対して較正し、％量として表示した。表示データは2回の独立分析の平均であり、誤差棒はSEMを表す。(Zn+2 vs Mn+2およびCu+2 vs Mn+2に対しP<0.05)。(図17E) GST-AdsAを組み換え大腸菌から精製し、トロンビンで切断してAdsA1-400を生成し、精製タンパク質をクマシー染色SDS-PAGEによって分析した。(図17F) 可変濃度のアデノシンの存在下または非存在下におけるラット血中でのadsAブドウ球菌の生存。
【図１７Ｂ】図１７Ａに記載のとおり。
【図１７Ｃ】図１７Ａに記載のとおり。
【図１７Ｄ】図１７Ａに記載のとおり。
【図１７Ｅ】図１７Ａに記載のとおり。
【図１７Ｆ】図１７Ａに記載のとおり。
【図１８】ブドウ球菌AdsAは血中でアデノシンを合成する。(図18A) 逆相高性能液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)によるアデノシンの定量化(左パネル、100 μMアデノシン)およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析によるそのモノアイソトピックイオンの同定(MALDI-MS、右パネル)。マウス血液を黄色ブドウ球菌Newman野生型(WT)なし(図18B)もしくはあり(図18C)またはその同質遺伝子adsA変種あり(図18D)で1時間インキュベートした。血漿を除タンパクし、ろ過し、RP-HPLCに供してアデノシンを定量化し(左パネル)、MALDI-MSによってそのモノアイソトピックイオンを同定した(右パネル)。精製アデノシン対照から外挿された血中アデノシンの計算上の存在量は、1.1 μM (18B、ブドウ球菌なし)、13.2 μM (18C、WT黄色ブドウ球菌Newman)および2.1 μM (18D、adsA変異体ブドウ球菌)であった。
【図１９Ａ】5'-ヌクレオチダーゼ活性は炭疽菌生存を増強する。(図19A) 炭疽菌株Sterne (WT、野生型)またはadsA (basA)変異体桿菌由来のムタノリシン抽出物を放射性[14C]AMPとともにインキュベートし、アデノシンの生成をTLCによって測定した。(図19B) ムタノリシン抽出物由来のタンパク質を、アデノシン産生に関与していない対照タンパク質の、BasAに対して作製された抗血清(αBasA)またはBasCに対して作製された抗血清(αBasC)で分析した。(図19C) BasAに対する抗血清(上パネル)または非反応性血清(NRS)およびCy3標識二次抗体(赤)で染色した野生型(WT)炭疽菌Sterneおよびその同質遺伝子adsA変異体ならびに核酸のHoechst染色(青)の蛍光顕微鏡像。(図19D) 放射性[14C]AMPを5 mMの可変形の金属陽イオンの存在下において精製BasA (2 μM)とともにインキュベートし、[14C]Ado (アデノシン)の生成を薄層クロマトグラフィー(TLC)およびPhosphorImagerによって測定した。データは3回の独立分析の代表である。(図19E) 寒天プレート上のコロニー形成単位として測定された経時(分)のラット血中での野生型およびadsA/basA変異体の炭疽菌株Sterneの生存。データは2回の独立分析の平均であり、誤差棒はSEMを表す。
【図１９Ｂ】図１９Ａに記載のとおり。
【図１９Ｃ】図１９Ａに記載のとおり。
【図１９Ｄ】図１９Ａに記載のとおり。
【図１９Ｅ】図１９Ａに記載のとおり。
【図２０】adsA破壊およびpadsA補完の可視化。AdsAの可視化を可能にするため、本発明者らは、プロテインA欠損(Δspa)黄色ブドウ球菌株SEJ2を用いた。これは、プロテインAが抗体のFcドメインに特異的に結合し、免疫ブロッティング分析の妨げになるからである。野生型Δspa SEJ2細胞(レーン1)、Δspa、adsA:ermB細胞(レーン2)またはpadsAで形質転換されたΔspa、adsA:ermB細胞由来の細胞壁抽出物をSDS-PAGEによって分離し、GST-AdsA1-400に対して作製された抗血清で免疫ブロッティング分析を行った。＊は非特異的反応種を意味する。
【図２１】USA300に感染したマウスから単離された腎臓の組織学的検査。黄色ブドウ球菌USA300野生型(下パネル)およびadsA変異体(下パネル)で4日間感染されたマウスの死体解剖後に得られた10倍でのヘマトキシリン・エオシン染色腎組織の顕微鏡像。黒矢印は、ブドウ球菌およびPMN浸潤物の中心濃度を意味する。データは、2回の独立分析および細菌株あたり動物5匹のコホートの代表的サンプルである。
【発明を実施するための形態】
【００９７】
発明の詳細な説明
生物膜は分泌された細胞外マトリックスの中に組み込まれた微生物群集である(Hall-Stoodley et al., 2004; Kolter and Greenberg, 2006)。多くの細菌種は、プランクトン様の増殖から生物膜の形成へと切り替わり、それによって抗生物質耐性の増大(Drenkard and Ausubel, 2002)、宿主免疫防御からの回避(Singh et al., 2002)を示すことができ、ヒトでの慢性感染の確立をいっそう巧みに行う(Brady et al., 2008)。ブドウ球菌種の生物膜は、心内膜炎(Xiong et al., 2005)、骨髄炎(Brady et al., 2006)、ならびに導尿カテーテル、人工心臓弁および人工関節を含むさまざまなインプラント媒介感染(Cassat et al., 2007)を含めていくつかの疾患と関連している。これは、特に、インビトロおよびインビボで生物膜をしきりに形成する日和見病原菌である表皮ブドウ球菌に当てはまる(Mack et al., 1996)。表皮ブドウ球菌での生物膜を形成する能力と病毒性との間には明らかな関連があるが、このような相関関係は、黄色ブドウ球菌の場合にはまだ実証されていない(Cassat et al., 2007)。
【００９８】
黄色ブドウ球菌は、ヒト皮膚および鼻孔の片利共生生物であり、血流および皮膚/軟組織感染の主因である(Klevens et al., 2007)。ブドウ球菌感染の発病は、外傷、手術創傷または医療装置を介して細菌が皮膚または血流に侵入する際に始まる(Lowy, 1998)。ブドウ球菌のなかには食細胞性死によって血流から除去されるものもあるが、免疫防御を回避するブドウ球菌は、器官組織において感染の種をまき、マクロファージ、好中球および他の食細胞からのサイトカインおよびケモカインの放出によって媒介される炎症促進性反応を誘導する(Lowy, 1998)。その結果として起こる感染部位への免疫細胞の浸潤には、微生物のまん延を阻止し壊死組織残屑の除去を可能にしようとし中央液化壊死および末梢線維壁の形成が付随して起こる(Lowy, 1998)。そのような病変部は顕微鏡検査により壊死組織、白血球および中央の細菌病巣を含む富細胞性域として観察することができる。器官膿瘍が感染から2日以内に起こり(未発表データ)、ブドウ球菌疾患の特徴となる。
【００９９】
I. ブドウ球菌抗原
黄色ブドウ球菌Ess経路は、特殊化した運搬成分(Ess)、補助因子(Esa)および同族分泌基質(Esx)を備えた分泌モジュールと見なすことができる。EssA、EssBおよびEssCはEsxAおよびEsxBの分泌に必要とされる。EssA、EssBおよびEssCは膜貫通タンパク質であると予測されるので、これらのタンパク質は分泌装置を形成するものと考えられる。ess遺伝子クラスタにおけるタンパク質のなかには分泌基質を(モーターとして働き)能動的に運搬するものもあるが、運搬を調節するもの(調節因子)もある。調節は分泌ポリペプチドに対する転写機構もしくは翻訳後機構、特異的基質の規定部位(例えば、細胞外培地もしくは宿主細胞)への選別、または感染中の分泌事象のタイミングによって達成されうるが、これらに限定される必要はない。現時点では、分泌Esxタンパク質の全てが毒素として機能するか、または発病に間接的に寄与するかどうかは不明である。
【０１００】
ブドウ球菌は免疫防御からの回避に向けた戦略として表面タンパク質を介した宿主細胞への接着または組織浸潤に依っている。さらに、黄色ブドウ球菌は感染中に表面タンパク質を利用して、宿主から鉄を隔離する。ブドウ球菌発病に関わる表面タンパク質の大部分はC末端局在化シグナルを保有しており、すなわち、それらはソルターゼによって細胞壁外膜に共有結合的に連結される。さらに、表面タンパク質の固定に必要な遺伝子、すなわち、ソルターゼAおよびBを欠くブドウ球菌株は、いくつかの異なる疾患マウスモデルにおいて病毒性の劇的な欠損を示す。このように、表面タンパク質抗原は、その対応遺伝子がブドウ球菌疾患の発現に不可欠であり、本発明のさまざまな態様において利用可能であるため、有効なワクチン標的になる。ソルターゼ酵素スーパーファミリーは、表面タンパク質病毒性因子をペプチドグリカン細胞壁層に固定するのに関わるグラム陽性トランスペプチダーゼである。黄色ブドウ球菌において2つのソルターゼアイソフォームSrtAおよびSrtBが同定されている。これらの酵素は基質タンパク質中のLPXTGモチーフを認識することが示されている。SrtBアイソフォームはヘム鉄獲得および鉄恒常性において重要であるように思えるが、SrtAアイソフォームは細胞壁ペプチドグリカンへの接着タンパク質および他のタンパク質の共有結合的固定を介して細菌が宿主組織に付着する能力を修飾することによりグラム陽性細菌の発病において重要な役割を果たす。
【０１０１】
本発明の態様には、Empおよび／またはEapに関連する組成物および方法が含まれるが、これらに限定されることはない。ある種の態様において、Empおよび／またはEapをEsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、SasH (AdsA)、Ebh、Coa、vWaおよび／またはSpAタンパク質のような、他のブドウ球菌タンパク質と組み合わせて用いることができる。Emp (SEQ ID NO:2)またはEap (SEQ ID NO:4)はブドウ球菌ポリペプチドである。他のEmpおよび／またはEapポリペプチドの配列は、タンパク質データベースのなかで見出すことができ、Empの場合にはアクセッション番号YP_185731、NP_371337、NP_645584、CAB75985、YP_416239、YP_040269およびNM0758ならびにEapの場合にはアクセッション番号YP_500650、CAB94853、YP_186825、CAB51807、NP_646697、YP_041404、NM1872を含むが、これらに限定されることはなく、これらの各々が本出願の優先日の時点で参照により本明細書に組み入れられる。さらなるブドウ球菌抗原には、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質が含まれる。
【０１０２】
哺乳類では、アデノシンは先天性および後天性免疫反応の調節において不可欠な役割を担う(Thiel et al., 2003)。例えば細菌感染に応じた、強力または過剰な宿主免疫反応は、侵入病原菌によって生じた組織損傷を悪化させる(Thiel et al., 2003)。微生物の免疫クリアランスの成功には、それゆえ、前炎症性メディエータと抗炎症性メディエータとの均衡が必要になる。サイトカインIL-4、IL-10、IL-13およびTGF-βは過剰な炎症を抑えるが、アデノシンだけが免疫反応を完全に抑制することができる(Nemeth et al., 2006)。アデノシンの免疫調節性は4種の膜貫通アデノシン受容体: A1、A2A、A2BおよびA3によって媒介される(Hasko and Pacher, 2008)。Tリンパ球は高親和性A2A受容体および低親和性A2B受容体を発現する(Thiel et al., 2003)。マクロファージおよび好中球は、その活性化状態に応じて、全4種のアデノシン受容体を発現するが、B細胞はA2Aだけを持つ(Thiel et al., 2003)。A2Aの結合は単球(Khoa et al., 2001)および樹状細胞(Panther et al., 2001)においてIL-12産生を阻害し、IL-10を増大し、好中球において細胞傷害性およびケモカイン産生を低減する(McColl et al., 2006; Cronstein et al., 1986)。炎症、低酸素症、臓器障害および外傷性ショックの部位でのアデノシンの生成は、二つの逐次的酵素によって媒介される。エクトATPジホスホヒドロラーゼ(CD39)は循環血中のアデノシン三リン酸(ATP)およびアデノシン二リン酸(ADP)を5'アデノシン一リン酸(AMP)に変換する(Eltzshig et al., 2003)。内皮細胞(Deussen et al., 1993)およびT細胞のサブセット(Thompson et al., 1989; Thompson et al., 1987; Yang et al., 2005)の表面に発現されるCD73が次いで、5'-AMPをアデノシンに変換する(Zimmermann, 1992)。
【０１０３】
細胞外アデノシンは炎症の抑制に不可欠であるが、過剰なアデノシンの蓄積は有害でもある。これは、アデノシンデアミナーゼ(ADA)、つまりアデノシンをイノシンに変換する酵素の欠損がある患者において例証される(Giblett, et al., 1972)。ADA欠損症は、細胞性免疫障害および免疫グロブリン産生の重度の低下を伴う重症免疫不全症候群(severe compromised immunodeficiency syndrome; SCID)を引き起こす(Buckley et al., 1997)。細胞外アデノシンの調節は免疫恒常性の維持に極めて重要であるので、アデノシンレベルの撹乱は感染の間の宿主免疫反応に影響を与える可能性が高い。本発明者らは本明細書において、細菌、例えば、黄色ブドウ球菌および炭疽菌がアデノシン合成を用いて宿主免疫反応を回避することを記述し、細菌感染、例えば、菌血症の処置および／または予防に向けてこの情報を利用するための方法および組成物を提供する。
【０１０４】
本発明のある種の態様は、免疫反応の誘導、AdsAに対する抗体の提供、またはAdsAの阻害に関する。AdsA (SEQ ID NO:55)はブドウ球菌ポリペプチドである。他のAdsAポリペプチドの配列は、タンパク質データベースのなかで見出すことができ、黄色ブドウ球菌(ref|YP_001573948、ref|YP_184935、ref|YP_039500、ref|NP_373261、ref|NP_370547、ref|YP_042156、ref|NP_644838、ref|YP_415541、dbj|BAA82250); スタフィロコッカスヘモリチカス(ref|YP_254367); ストレプトコッカスサンギニス(ref|YP_001035187); ストレプトコッカスゴルドニ(ref|YP_001450531); エンテロコッカスフェカリス(ref|NP_813870); ストレプトコッカススイス(dbj|BAB83980、ref|YP_001200571、ref|YP_001198366); ストレプトコッカスミュータンス(ref|NP_721592); ストレプトコッカスサーモフィルス(ref|YP_141373、ref|YP_139455); アルカリフィルスメタリレジゲンス(ref|YP_001321391); ボツリヌス菌(ref|YP_001887045、ref|YP_001921966); パエニバチルス(ref|ZP_02846642); アルカリフィルスオレムランジイ(ref|YP_001512463); バチルスクラウシイ(ref|YP_174466); バチルスハロデュランス(ref|NP_240892); クロストリジウムディフィシレ(ref|ZP_03126518、ref|ZP_02748384、ref|YP_001089051、ref|ZP_02726436、ref|ZP_01801990); クロストリジウムセルロリティカム(ref|ZP_01574143); アナエロツルンカスコリホミニス(ref|ZP_02441436)を含むが、これらに限定されることはなく、これらの各々が本出願の優先日の時点で参照により本明細書に組み入れられる。ある種の局面において、AdsAポリペプチドはSEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:41に対して、少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、99%の同一性を、または40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、99%超の同一性を、その間の全ての値および範囲を含めて、有することができる。
【０１０５】
本発明のある種の局面には、ポリペプチド、ペプチド、このようなポリペプチドおよびペプチドに結合する抗体、あるいはEmpおよび／またはEapならびに他のブドウ球菌抗原、例えばEsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、SasH (AdsA)、Ebh、Coa、vWa、SpA、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質あるいはその組み合わせをコードする核酸を含むタンパク質性組成物に関する方法および組成物が含まれる。これらのタンパク質は欠失、挿入および／または置換によって修飾されてもよい。
【０１０６】
本発明のある種の局面には、ポリペプチド、ペプチド、ならびに/またはこのようなポリペプチドおよびペプチドに結合する抗体、あるいはAdsAならびに他のブドウ球菌抗原、例えばEap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、SasH (AdsA)、Ebh、Coa、vWa、SpA、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質あるいはその組み合わせをコードする核酸を含むタンパク質性組成物に関する方法および組成物が含まれる。これらのタンパク質は欠失、挿入および／または置換によって修飾されてもよい。
【０１０７】
これらのポリペプチドはブドウ球菌属における細菌由来のタンパク質のアミノ酸配列を含む。この配列は黄色ブドウ球菌などの、特定のブドウ球菌種由来であってよく、Newmanなどの、特定の菌株由来であってよい。
【０１０８】
ソルターゼ基質ポリペプチドはブドウ球菌属における細菌由来のSdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、SpA、ClfA、ClfB、IsdCまたはSasFタンパク質のアミノ酸配列を含むが、これらに限定されることはない。ソルターゼ基質ポリペプチド配列は黄色ブドウ球菌などの、特定のブドウ球菌種由来であってよく、Newmanなどの、特定の菌株由来であってよい。ある種の態様において、SdrD配列は菌株N315由来であり、参照により組み入れられるGenBankアクセッション番号NP_373773.1 (gi|15926240)を用いてアクセスすることができる。他の態様において、SdrE配列は菌株N315由来であり、参照により組み入れられるGenBankアクセッション番号NP_373774.1 (gi|15926241)を用いてアクセスすることができる。他の態様において、IsdA配列は菌株Mu50由来のSAV1130 (これはNewmanの場合と同じアミノ酸配列である)であり、参照により組み入れられるGenBankアクセッション番号NP_371654.1 (gi|15924120)を用いてアクセスすることができる。他の態様において、IsdB配列は菌株Mu50由来のGenBankアクセッション番号SAV1129 (これはNewmanの場合と同じアミノ酸配列である)であり、参照により組み入れられるGenBankアクセッション番号NP_371653.1 (gi|15924119)を用いてアクセスすることができる。さらなる態様において、Ess経路により運搬されまたはソルターゼによりプロセッシングされる他のポリペプチドを用いることができ、当業者はデータベースおよびインターネットアクセス可能な情報源を用いてその配列を同定することができる。
【０１０９】
本発明の関連において使用できるさまざまなタンパク質の例は、各々が参照により組み入れられるアクセッション番号NC_002951 (GI:57650036およびGenBank CP000046)、NC_002758 (GI:57634611およびGenBank BA000017)、NC_002745 (GI:29165615およびGenBank BA000018)、NC_003923 (GI:21281729およびGenBank BA000033)、NC_002952 (GI:49482253およびGenBank BX571856)、NC_002953 (GI:49484912およびGenBank BX571857)、NC_007793 (GI:87125858およびGenBank CP000255)、NC_007795 (GI:87201381およびGenBank CP000253)を含むが、これらに限定されない細菌ゲノムのデータベース寄託物の分析によって同定することができる。
【０１１０】
本明細書において用いられる場合「タンパク質」または「ポリペプチド」とは、少なくとも10個のアミノ酸残基を含む分子をいう。いくつかの態様において、タンパク質またはポリペプチドの野生型が利用されるが、しかし、本発明の多くの態様において、免疫反応を生じさせるために修飾されたタンパク質またはポリペプチドが利用される。上記の用語は互換的に用いることができる。「修飾タンパク質」または「修飾ポリペプチド」とは、その化学構造、特にそのアミノ酸配列が野生型のタンパク質またはポリペプチドに対して改変されているタンパク質またはポリペプチドをいう。いくつかの態様において、修飾されたタンパク質またはポリペプチドは少なくとも一つの修飾された活性または機能を有する(タンパク質またはポリペプチドが複数の活性または機能を持ちうることを認識して)。具体的には、修飾されたタンパク質またはポリペプチドは一つの活性または機能に関して改変されうるが、それでも免疫原性のような、その他の点では野生型の活性または機能を保持しているものと考えられる。
【０１１１】
ある種の態様において、(野生型または修飾)タンパク質またはポリペプチドのサイズは、
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もしくはそれ以上の、およびその中で導き出せる任意の範囲のアミノ分子、または本明細書において記述されるもしくは参照される対応アミノ配列の派生体を含むことができるが、これらに限定されることはない。ポリペプチドを切断によって突然変異させ、それらを、対応するその野生型よりも短くさせてもよいが、それらを(例えば、標的化または局在化のために、免疫原性の増強のために、精製目的のために、など)特定の機能を有する異種タンパク質配列に融合または結合させることによって変化させることもできると考えられる。
【０１１２】
本明細書において用いられる場合、「アミノ分子」とは、当技術分野において公知の任意のアミノ酸、アミノ酸誘導体またはアミノ酸模倣体をいう。ある種の態様において、タンパク質性分子の残基は逐次的であり、アミノ分子残基の配列を中断するいかなる非アミノ分子も含まれない。他の態様において、その配列は一つまたは複数の非アミノ分子部分を含むことができる。特定の態様において、タンパク質性分子の残基の配列は一つまたは複数の非アミノ分子部分によって中断されることができる。
【０１１３】
したがって、「タンパク質性組成物」という用語は、天然に合成されたタンパク質における20種の共通アミノ酸の少なくとも一つ、または少なくとも一つの修飾もしくは異常アミノ酸を含むアミノ分子配列を包含する。
【０１１４】
タンパク質性組成物は、(i) 標準的な分子生物学的技術を通じたタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの発現、(ii) 天然源からのタンパク質性化合物の単離、または(iii) タンパク質性物質の化学的合成を含めて、当業者に公知の任意の技術により作出することができる。さまざまな遺伝子に対するヌクレオチドならびにタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド配列がこれまでに開示されており、公認のコンピュータ化されたデータベースにおいて見出される可能性がある。そのようなデータベースの一つが全米バイオテクノロジー情報センターのGenbankおよびGenPeptデータベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/の)である。これらの公知の遺伝子に対するコード領域は、本明細書において開示される技術を用いてまたは当業者に周知であるように、増幅されおよび／または発現されうる。
【０１１５】
EmpまたはEapまたはAdsAならびに本発明の他のポリペプチド、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、Ebh、Coa、vWa、SpA、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質のアミノ酸配列変種は置換変種、挿入変種または欠失変種でありうる。本発明のポリペプチドにおける修飾は野生型と比べて、ポリペプチドの
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またはそれ以上の非連続または連続アミノ酸に影響を与えうる。
【０１１６】
本発明の抗原は、抗原のアミノ酸
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個またはそれ以上(その間の全ての値および範囲を含む)からアミノ酸
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個またはそれ以上(その間の全ての値および範囲を含む)を含む本明細書において記述される抗原(AdsA、Emp、Eap、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、Ebh、Coa、vWa、SpA、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質)のセグメントまたは断片を、その間の全てのセグメントまたは断片を含めて、含むことができる。本発明のある種の局面は、上記の断片またはセグメントの一つまたは複数に結合する抗体に関する。
【０１１７】
欠失変種は、典型的には、天然または野生型タンパク質の一つまたは複数の残基を欠損している。個々の残基を欠失させてもよく、またはいくつかの隣接アミノ酸を欠失させてもよい。終止コドンを(置換または挿入により)コード化核酸配列に導入して、切断型タンパク質を作出することができる。挿入変異体は、典型的には、ポリペプチドにおける非末端点での物質の付加を伴う。これには一つまたは複数の残基の挿入を含めることができる。融合タンパク質と呼ばれる、末端付加体を作出することもできる。
【０１１８】
置換変種は、典型的には、タンパク質内の一つまたは複数の部位での一つのアミノ酸と別のアミノ酸との交換を含み、他の機能または特性を失うかまたは失うことなく、ポリペプチドの一つまたは複数の特性を修飾するようにデザインされてもよい。置換は保存的であってもよく、すなわち、一つのアミノ酸が類似の形状および電荷のアミノ酸に置換されてもよい。保存的置換は当技術分野において周知であり、これには、例えば、アラニンのセリンへの、アルギニンのリジンへの、アスパラギンのグルタミンまたはヒスチジンへの、アスパラギン酸塩のグルタミン酸塩への、システインのセリンへの、グルタミンのアスパラギンへの、グルタミン酸塩のアスパラギン酸塩への、グリシンのプロリンへの、ヒスチジンのアスパラギンまたはグルタミンへの、イソロイシンのロイシンまたはバリンへの、ロイシンのバリンまたはイソロイシンへの、リジンのアルギニンへの、メチオニンのロイシンまたはイソロイシンへの、フェニルアラニンのチロシン、ロイシンまたはメチオニンへの、セリンのトレオニンへの、トレオニンのセリンへの、トリプトファンのチロシンへの、チロシンのトリプトファンまたはフェニルアラニンへの、およびバリンのイソロイシンまたはロイシンへの変化が含まれる。あるいは、置換はポリペプチドの機能または活性が影響を受けるように非保存的であってもよい。非保存的変化は、典型的には、非極性または非荷電アミノ酸の代わりに極性または荷電アミノ酸を用いるような、およびその逆のような、一つの残基を化学的に異なる残基に置換することを伴う。
【０１１９】
（表１） 黄色ブドウ球菌株の例示的な表面タンパク質
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【０１２０】
本発明のタンパク質は組み換えであっても、またはインビトロで合成されてもよい。あるいは、非組み換えまたは組み換えタンパク質を細菌から単離してもよい。そのような変種を含有する細菌を、本発明の組成物および方法のなかで実践できることも考えられる。結果的に、タンパク質は単離されなくてもよい。
【０１２１】
「機能的に同等なコドン」という用語は、アルギニンまたはセリンに対する6種のコドンのような、同じアミノ酸をコードするコドンをいうように本明細書において用いられ、同様に、生物学的に同等のアミノ酸をコードするコドンもいう(以下の表２を参照のこと)。
【０１２２】
（表２） コドン表
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【０１２３】
アミノ酸および核酸配列は、タンパク質の発現が関与している生物学的タンパク質活性の維持を含めて、上記の基準を満たす限り、それぞれ、さらなるN末端もしくはC末端アミノ酸、または5'もしくは3'配列のような、さらなる残基を含むこともあり、それでも本質的には、本明細書において開示されている配列の一つに記載の通りでありうることも理解されよう。末端配列の付加は核酸配列に特に当てはまり、例えば、コード領域の5'または3'部分のどちらかに隣接する種々の非コード配列を含むことができる。
【０１２４】
以下は、同等の、さらには改善された、第二世代の分子を作出するためにタンパク質のアミノ酸を変化させることに基づく考察である。例えば、ある種のアミノ酸を、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位のような構造との相互作用結合能をさほど失わずにタンパク質構造中の他のアミノ酸の代わりに用いることができる。タンパク質の生物学的機能活性を規定するのはタンパク質の相互作用能および性質であることから、タンパク質配列の中に、およびその基礎となるDNAコード配列の中にある種のアミノ酸置換を施し、それでも、類似の特性を有するタンパク質を産生させることができる。このように、遺伝子のDNA配列においてその生物学的有用性または活性、例えば、免疫原性をさほど失わずに種々の変化を施すことができるものと本発明者らは企図している。
【０１２５】
そのような変化を施す際に、アミノ酸の疎水性親水性指標(hydropathic index)を考慮することができる。タンパク質に相互作用性の生物学的機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、当技術分野において広く理解されている(Kyte and Doolittle, 1982)。アミノ酸の相対的な疎水性親水性(hydropathic character)は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これがタンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原などとの相互作用を規定することが認められている。
【０１２６】
同様に、類似のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に施せることも当技術分野において理解されている。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,554,101号には、タンパク質の最大の局所平均親水性が、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるため、タンパク質の生物学的特性と相関することが述べられている。アミノ酸を、類似の親水性値を有する別のアミノ酸の代わりに用い、それでも、生物学的に同等なおよび免疫学的に同等なタンパク質を産生できることが理解されよう。
【０１２７】
上記のように、アミノ酸置換は、一般的に、アミノ酸側鎖の置換基の相対的類似性、例えばその疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。さまざまな上述の特徴を考慮に入れた例示的な置換は、周知であり、アルギニンおよびリジン、グルタミン酸塩およびアスパラギン酸塩、セリンおよびトレオニン、グルタミンおよびアスパラギン、ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンを含む。
【０１２８】
本発明の組成物においては、1 mlあたり約0.001 mg〜約10 mgの総ポリペプチド、ペプチド、および／またはタンパク質が存在することが企図される。したがって、組成物中のタンパク質の濃度は約、少なくとも約またはせいぜい約0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0 μgもしくはmg/mlまたはそれ以上(またはその中で導き出せる任意の範囲)でありうる。このうち、約、少なくとも約、またはせいぜい約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%がEmp、Eap、および／またはAdsAであってよく、本明細書において記述される他のポリペプチド配列と組み合わせて用いられてもよい。
【０１２９】
本発明はまた、組み合わせた場合に、ブドウ球菌感染の処置または予防に有効である免疫原性組成物の作出につながる、ブドウ球菌抗原の組み合わせについて開示する。ブドウ球菌感染はいくつかの異なる段階を経て進行する。例えば、ブドウ球菌の生活環には、片利共生定着、隣接する組織もしくは血流に接近することによる感染の開始、血液中での嫌気的増殖、黄色ブドウ球菌病原性決定因子と宿主防御機構との間の相互作用、ならびに心内膜炎、転移性膿瘍形成および敗血症候群を含む合併症の誘発が含まれる。細菌表面上の異なる分子が感染サイクルの異なる段階に関与する。ある種の抗原の組み合わせによって、多段のブドウ球菌感染を防御する免疫反応が引き起こされる可能性がある。免疫反応の有効性は動物モデルアッセイ法においておよび／またはオプソニン作用アッセイ法を用いて測定することができる。
【０１３０】
A. ポリペプチドおよびポリペプチド産生
本発明は、本発明のさまざまな態様で用いるためのポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質ならびにそれらの免疫原性断片について記述する。例えば、特定のポリペプチドを、免疫反応を誘発させるかアッセイし、または免疫反応を誘発させるために用いる。特定の態様において、本発明のタンパク質の全部または一部を、従来の技術にしたがって溶液中でまたは固体支持体上で合成することもできる。各種の自動合成機が市販されており、それらを公知のプロトコルにしたがって用いることができる。例えば、Stewart and Young, (1984); Tarn et al., (1983); Merrifield, (1986); およびBarany and Merrifield (1979)を参照されたく、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。あるいは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、これを適切な宿主細胞に形質転換または形質移入し、これを発現に適した条件の下で培養する組み換えDNA技術を利用することもできる。
【０１３１】
本発明の一つの態様では、タンパク質の産生および／または提示のための、微生物を含む、細胞への遺伝子移入の使用を含む。関心対象のタンパク質に対する遺伝子を適切な宿主細胞に移入し、引き続いて適切な条件下での細胞の培養を行うことができる。ほとんどすべてのポリペプチドをコードする核酸を、利用することができる。組み換え発現ベクターの作出、およびそのベクターに含まれる要素は、本明細書において論じられている。あるいは、産生されるタンパク質は、タンパク質の産生に使われる細胞によって通常合成される内因性タンパク質であってもよい。
【０１３２】
本発明の別の態様では、免疫原産物、より具体的には、免疫原性活性を有するタンパク質を発現するウイルスベクターにより形質移入された、自己Bリンパ球細胞株を用いる。哺乳類宿主細胞株の他の例としては、VeroおよびHeLa細胞、CEM、721.221、H9、Jurkat、Rajiなどの、他のB細胞株およびT細胞株、ならびにチャイニーズハムスター卵巣細胞株、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RINおよびMDCK細胞が挙げられるが、これらに限定されることはない。さらに、挿入された配列の発現を修飾する、または所望とされる様式で遺伝子産物を修飾およびプロセッシングする宿主細胞株を選択することもできる。タンパク質産物のそのような修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセッシング(例えば、切断)は、タンパク質の機能にとって重要でありうる。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセッシングおよび修飾の特徴的かつ特異的な機構を有する。発現される外来タンパク質の的確な修飾およびプロセッシングを確実とするために、適切な細胞株または宿主系を選択することができる。
【０１３３】
tk-、hgprt-またはaprt-細胞での、それぞれ、HSVチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むが、これらに限定されない、いくつかの選択系を用いることができる。同様に、選択の基礎として抗代謝物耐性: トリメトプリムおよびメトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr; ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt; アミノグリコシドG418に対する耐性を付与するneo; ならびにハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygroを用いることもできる。
【０１３４】
動物細胞はインビトロにおいて二つの様式で、つまり培養の大半を通じて浮遊状態で増殖する非足場依存性細胞として、または増殖のためには固体基材への付着を要する足場依存性細胞として増殖させることができる（つまり、単層型の細胞増殖）。
【０１３５】
連続樹立細胞株由来の非足場依存性培養または浮遊培養は、細胞および細胞産物の、最も広く使われている大規模産生手段である。しかしながら、浮遊培養細胞には、腫瘍形成能および接着細胞よりも低いタンパク質産生のような制限がある。
【０１３６】
タンパク質を本明細書において具体的に述べる場合、それは、好ましくは、天然もしくは組換えタンパク質、または場合により任意のシグナル配列が除去されたタンパク質への言及である。タンパク質は、ブドウ球菌株から直接単離されてもよく、または組換えDNA技術によって産生されてもよい。タンパク質の免疫原性断片を本発明の免疫原性組成物に含めてもよい。これらは、タンパク質のアミノ酸配列から連続的に取り出される、少なくとも10アミノ酸、20アミノ酸、30アミノ酸、40アミノ酸、50アミノ酸、または100アミノ酸を、その間の全ての値および範囲を含めて、含む断片である。さらに、そのような免疫原性断片は、ブドウ球菌タンパク質に対して作製された抗体と免疫学的に反応性であり、またはブドウ球菌による哺乳類宿主の感染によって作出された抗体と免疫学的に反応性である。免疫原性断片はまた、有効量で(単独でまたは担体に結合されたハプテンとしてのいずれかで)投与される場合に、ブドウ球菌感染に対する防御免疫反応を誘発させる断片も含み、ある種の局面において、それは黄色ブドウ球菌および／または表皮ブドウ球菌感染を防ぐ。そのような免疫原性断片は、例えば、N末端リーダー配列、ならびに/あるいは膜貫通ドメインおよび／またはC末端アンカードメインを欠損するタンパク質を含むことができる。好ましい局面において、本発明による免疫原性断片は、断片配列の全長にわたって選択される配列に対し、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、または少なくとも97〜99%の同一性を、その間の全ての値および範囲を含めて、有するタンパク質の細胞外ドメインの実質的に全てを含む。
【０１３７】
本発明の免疫原性組成物の中に同様に含まれるのは、ブドウ球菌タンパク質またはブドウ球菌タンパク質の免疫原性断片から構成される融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、組換えによって作出することができ、少なくとも2、3、4、5または6種のブドウ球菌タンパク質の一部分を含むことができる。あるいは、融合タンパク質は、少なくとも1、2、3、4または5種のブドウ球菌タンパク質の複数部分を含むこともできる。これらは、異なるブドウ球菌タンパク質および／または同一のタンパク質もしくはタンパク質断片の複数のもの、あるいは同一タンパク質におけるその免疫原性断片を組み合わせることができる。あるいは、本発明はまた、T細胞エピトープまたは精製タグの供与体のような異種配列、例えばβガラクトシダーゼ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、エピトープタグ、例えばFLAG、mycタグ、ポリヒスチジン、またはウイルス表面タンパク質、例えばインフルエンザウイルス赤血球凝集素、または細菌タンパク質、例えば破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197との融合タンパク質としての、ブドウ球菌タンパク質またはその免疫原性断片の個々の融合タンパク質も含む。
【０１３８】
II. 治療法
ワクチンによる能動免疫法および免疫グロブリンによる受動免疫法は、古典的な小分子(例えば、抗生物質)による治療の代替法としての見込みがある。かつて、広範な病気、障害および死をもたらした少数の細菌性疾患は、現在では、ワクチンの使用によって防ぐことができる。ワクチンは、弱められた(弱毒化された)細菌もしくは死細菌、細菌表面の成分または不活化毒素に基づく。ワクチンにより生じた免疫反応は、免疫系によって能動的に処理される、細菌上の免疫原性構造、つまり限られた数のタンパク質または糖構造を主に対象とする。
【０１３９】
本発明の方法は、細菌性病原菌、例えば、ブドウ球菌または桿菌によって引き起こされるまたはそれらに関連する疾患または状態の処置を含む。免疫原性ポリペプチド、および／またはそれに結合する抗体を、細菌に感染しているまたは細菌に曝露されていることが疑われる者において治療反応を誘導するまたは提供するために与えることができる。ブドウ球菌もしくは桿菌への曝露で陽性となった個体、または曝露の可能性に基づいて感染のリスクがあると思われる個体について、それらの方法を利用することができる。
【０１４０】
本発明は、ブドウ球菌感染、特に病院獲得型の院内感染の処置の方法を包含する。具体的には、本発明は、細菌感染、特に菌血症の処置の方法を包含する。本発明の治療用組成物およびワクチンは、待期的手術の場合に特に好都合である。そのような患者は、前もって手術日を承知しており、前もって予防接種または処置することができよう。本発明の免疫原性組成物およびワクチンはまた、医療従事者、第一応答者などを予防接種する際に好都合である。
【０１４１】
いくつかの態様において、処置はアジュバントもしくは担体または他のブドウ球菌抗原の存在下において施される。さらに、いくつかの例では、処置は一種または複数種の抗生物質などの、細菌感染に対してよく用いられる他の薬剤の投与を含む。
【０１４２】
A. ワクチン
本発明は、ブドウ球菌感染、特に病院獲得型の院内感染を予防または改善するための方法を含む。したがって、本発明は、能動免疫法と受動免疫法の両方の態様で用いるためのワクチンを企図する。ワクチンとして用いるのに適当であると提唱されている免疫原性組成物は、全長のEmp、Eapおよび／またはAdsA抗原またはその免疫原性断片のような、免疫原性のEmp、Eapおよび／またはAdsAポリペプチドから調製することができる。他の態様において、Emp、Eapおよび／またはAdsAを、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、Ebh、Coa、vWa、SpA、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質、あるいは当業者に公知の他のブドウ球菌抗原、ペプチドまたはタンパク質を含めて、他の分泌毒性タンパク質、表面タンパク質またはその免疫原性断片と組み合わせて用いることができる。抗原材料は、望ましくない低分子量分子を除去するために十分に透析され、および／または所望の媒体へのより容易な処方のために凍結乾燥されることが好ましい。
【０１４３】
タンパク質/ペプチドに基づくワクチンのための他の実行可能かつ重要な選択肢は、DNAワクチンとしての、抗原をコードする核酸の導入を伴う。この点で、最近の報告によれば、隣接する10個の最小のCTLエピトープ(Thomson, 1996)、またはいくつかの微生物由来のB細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)およびTヘルパー(Th)エピトープの組み合わせ(An, 1997)を発現する組み換えワクシニアウイルスの構築、ならびに防御免疫反応に抗原刺激を与えるためにそのような構築体を用いてマウスを免疫することの成功について記述されている。このように、文献の中には、防御免疫反応の効率的なインビボ抗原刺激のためにペプチド、ペプチドパルス抗原提示細胞(APC)、およびペプチドをコードする構築体を利用することの成功に関する十分な証拠が存在している。ワクチンとしての核酸配列の使用は、米国特許第5,958,895号および同第5,620,896号に例示されており、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４４】
活性成分としてポリペプチドまたはペプチド配列を含むワクチンの調製は一般的に、米国特許第4,608,251号、同第4,601,903号、同第4,599,231号、同第4,599,230号、同第4,596,792号、および同第4,578,770号によって例示されるように、当技術分野において十分に理解されており、それらの特許の全てが参照により本明細書に組み入れられる。典型的には、そのようなワクチンは、液体溶液または液体懸濁液のいずれかとして注射用剤として調製される: 注射前の液体溶液または液体懸濁液に適した固体剤形を調製することもできる。調製物は乳化されてもよい。活性な免疫原性成分は、薬学的に許容されるかつ活性成分と適合性である、賦形剤と混合されることが多い。適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびその組み合わせである。さらに、必要に応じて、ワクチンは、湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤、またはワクチンの有効性を増強するアジュバントのような補助物質の量を含んでもよい。特定の態様において、ワクチンは、米国特許第6,793,923号および同第6,733,754号に記述されるように、物質の組み合わせを用いて処方され、それらの特許は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４５】
ワクチンは、通常、吸入によりまたは注射により非経口的に、例えば、皮下にまたは筋肉内に投与されうる。他の投与方法に適したさらなる処方物は、坐剤および、場合により、経口処方物を含む。坐剤の場合、従来の結合剤および担体は、例えば、ポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドを含むことができ; そのような坐剤は、活性成分を約0.5%〜約10%、好ましくは約1%〜約2%の範囲内で含有する混合物から形成されることができる。経口処方物は、例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常利用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性処方物または粉末の形態をとり、約10%〜約95%の、好ましくは約25%〜約70%の活性成分を含有する。
【０１４６】
ポリペプチド、ペプチドおよびペプチドをコードするDNA構築体は、中性型または塩型としてワクチンに処方することができる。薬学的に許容される塩は、酸付加塩(ペプチドの遊離アミノ基と形成される)および、例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸と形成されるものを含む。また、遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、もしくは水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基に由来することができる。
【０１４７】
典型的には、ワクチンは、投与処方物に適合する様式で、および治療的に有効かつ免疫原性であるような量で投与される。投与される量は、個体の免疫系の抗体合成能および望ましい防御の程度を含め、処置される被験体に依る。投与されるのに必要な活性成分の的確な量は、医師の判断に依る。しかしながら、適切な投与量範囲は、ワクチン接種1回あたり数百マイクログラムの活性成分の次数のものである。初回投与および追加免疫の接種に適したレジメも同様に多様であるが、初回投与後にその後の接種または他の投与を行うことが典型的である。
【０１４８】
適用の様式は広く異なってもよい。ワクチンの投与のための従来の方法のいずれも適用可能である。これらには、固体の生理学的に許容される基剤上でのまたは生理学的に許容される分散液中での経口適用、非経口的に、注射により、などが含まれると考えられる。ワクチンの投与量は投与経路に依るであろうし、被験体のサイズおよび健康状態によって異なるであろう。
【０１４９】
多くの場合、通常はせいぜい6回のワクチン接種、より通常は4回のワクチン接種、少なくとも6回のワクチン接種、より通常は4回のワクチン接種または6回のワクチン接種を超えない、より通常は4回のワクチン接種を超えない、ワクチンの複数回の投与が有ること、および典型的には1回または複数回、通常は少なくとも約3回のワクチン接種が有ることが望ましいであろう。ワクチン接種は、通常、以下の間の全ての値および範囲を含めて、1、2、3、4、5、6〜5、6、7、8、9、10、11〜12週間の間隔であり、より通常は3〜5週間の間隔であろう。典型的には、抗体の防御レベルを維持するには、1〜5年の間隔、通常は3年の間隔での定期的な追加免疫が望ましいであろう。前記のように、免疫過程の後に、抗原に対する抗体のアッセイを行ってもよく、米国特許第3,791,932号、同第4,174,384号および同第3,949,064号はこれらのタイプのアッセイ法の実例となる。
【０１５０】
ワクチン接種のためにペプチドを用いるには、通常、B型肝炎表面抗原、キーホールリンペットヘモシアニンもしくはウシ血清アルブミンなどの、免疫原担体タンパク質、またはアジュバントとのペプチドの抱合が必要になる。この抱合を行うための方法は、当技術分野において周知である。
【０１５１】
1. 担体
所与の組成物はその免疫原性が異なる場合がある。それゆえ、宿主免疫系を追加免疫することが必要になることが多く、これはペプチドまたはポリペプチドを担体にカップリングさせることにより達成することもできる。担体は、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)およびウシ血清アルブミン(BSA)を含むが、これらに限定されることはない。卵白アルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンなどの他のアルブミンを担体として用いることもできる。ポリペプチドを担体タンパク質に抱合させるための手段は、当技術分野において周知であり、グルタルアルデヒド、m-マレイミドベンゾイル(maleimidobencoyl)-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビスジアゾ化(bis-biazotized)ベンジジンを含む。
【０１５２】
2. アジュバント
ポリペプチドまたはペプチド組成物の免疫原性は、アジュバントとして公知の、免疫反応の非特異的刺激物質を用いることによって増強することができる。適当なアジュバントはサイトカイン、毒素または合成組成物などの、許容される全ての免疫刺激性化合物を含む。
【０１５３】
Emp、Eapおよび／もしくはAdsAペプチドまたは本明細書において記述されるその他任意の抗原に対する抗体反応を増強するために、いくつかのアジュバントを用いることができる。他の態様において、Emp、Eapおよび／またはAdsAを、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、Ebh、Coa、vWa、および／またはSpAペプチドまたはタンパク質と組み合わせて用いることができる。アジュバントは、(1) 抗原を体内に捕捉して持続放出を引き起こすこと; (2) 免疫反応に関わる細胞を投与部位に引き付けること; (3) 免疫系細胞の増殖もしくは活性化を誘導すること; または(4) 被験体の体全体に抗原を広げるのを改善することができる。
【０１５４】
アジュバントは、水中油型乳濁液、油中水型乳濁液、無機塩類、ポリヌクレオチド、および天然物質を含むが、これらに限定されることはない。使用できる具体的なアジュバントはIL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ-インターフェロン、GMCSP、BCG、アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムまたは他のアルミニウム化合物、thur-MDPおよびnor-MDPなどのMDP化合物、CGP (MTP-PE)、脂質A、ならびにモノホスホリル脂質A (MPL)を含む。細菌から抽出された三種の成分、つまりMPL、トレハロースジマイコレート(TDM)および細胞壁骨格(CWS)を2%スクアレン/Tween 80乳濁液中に含有するRIBIを用いることもできる。MHC抗原をさらに使用することができる。他のアジュバントまたは方法は、各々が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,814,971号、同第5,084,269号、同第6,656,462号に例示されている。
【０１５５】
ワクチンのアジュバント作用を達成するさまざまな方法には、それぞれ、一般的に約0.05〜約0.1%のリン酸緩衝生理食塩水溶液として用いられる水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム(ミョウバン)のような作用物質を用いること、約0.25%の溶液として用いられる合成糖重合体(Carbopol(登録商標))とともに混合すること、約70℃〜約101℃の範囲の温度で30秒〜2分間の熱処理によってワクチンにおけるタンパク質を凝集させることが含まれる。アルブミンに対するペプシン処理抗体(Fab)での再活性化による凝集、細菌細胞(例えば、C.パルブム(C. parvum))、グラム陰性菌の内毒素もしくはリポ多糖類成分との混合物、生理学的に許容される油性媒体中の乳濁液(例えば、マンニドモノ-オレエート(Aracel A)); またはブロック代用物として用いられる20%のペルフルオロカーボン溶液との乳濁液(Fluosol-DA(登録商標))を利用して、アジュバント作用をもたらすこともできる。
【０１５６】
典型的なアジュバントは、フロイントの完全アジュバント(結核菌(Mycobacterium tuberculosis)死菌を含む免疫反応の非特異的な刺激物質)、フロイントの不完全アジュバント、および水酸化アルミニウムである。
【０１５７】
いくつかの局面において、Th1またはTh2型の反応のいずれかの選択的誘発物質となるようにアジュバントを選択することが好ましい。高レベルのTh1型サイトカインは、所与の抗原に対する細胞性免疫反応の誘導に有利に働く傾向があるのに対し、高レベルのTh2型サイトカインは、抗原に対する体液性免疫反応の誘導に有利に働く傾向がある。
【０１５８】
Th1およびTh2型免疫反応の区別は絶対的ではない。実際には、個体は、主にTh1または主にTh2とされている免疫反応を支持する。しかし、多くの場合、MosmannおよびCoffman (Mosmann, and Coffman, 1989)によりネズミCD4+ T細胞クローンにおいて記述されているものに関してサイトカインのファミリーを考えることが好都合である。伝統的には、Th1型反応は、Tリンパ球によるINF-γおよびIL-2サイトカインの産生と関連している。IL-12のような、Th1型免疫反応の誘導に直接関連することが多いその他のサイトカインは、T細胞によって産生されない。対照的に、Th2型反応は、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10の分泌に関連する。
【０１５９】
アジュバントの他に、生体反応修飾物質(BRM)を同時投与して、免疫反応を増強することが望ましいかもしれない。BRMは、T細胞免疫を上方制御するまたはサプレッサー細胞活性を下方制御することが示されている。そのようなBRMは、シメチジン(CIM; 1200 mg/d) (Smith/Kline, PA); または低用量シクロホスファミド(CYP; 300 mg/m2) (Johnson/Mead, NJ)およびγインターフェロン、IL-2もしくはIL-12のようなサイトカイン、またはB-7のような、免疫ヘルパー機能に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含むが、これらに限定されることはない。
【０１６０】
B. 抗体および受動免疫法
受動免疫法ともいわれる、治療用免疫グロブリンの直接投与は、患者由来の免疫反応を必要とせず、それゆえ、即時防御をもたらす。さらに、受動免疫法は、免疫原性ではない、かつ生物に対して特異性が低い細菌構造を対象とすることができる。病原生物に対する受動免疫法は、ヒトまたは非ヒトドナーの血清に由来する免疫グロブリンに基づいている。
【０１６１】
本発明の一つの局面は、レシピエントを本発明のワクチンで免疫する段階およびレシピエントから免疫グロブリンまたは抗体を単離する段階を含む、ブドウ球菌感染の予防または処置で用いる免疫グロブリンを調製する方法である。この方法によって調製される免疫グロブリンは、本発明のさらなる局面である。本発明の免疫グロブリンおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物は、ブドウ球菌疾患の処置または予防のための薬物の製造において使用できる本発明のさらなる局面である。本発明の薬学的調製物の有効量を患者に投与する段階を含むブドウ球菌感染の処置または予防のための方法は、本発明のさらなる局面である。
【０１６２】
ポリクローナル抗体の産生のための接種材料は、典型的には、抗原組成物を、生理食塩水またはヒトへの使用に適した他のアジュバントなどの生理学的に許容される希釈剤に分散させて、水性組成物を形成することにより調製される。免疫刺激量の接種材料を哺乳類に投与し、接種を受けた哺乳類をその後、抗原組成物が防御抗体を誘導するのに十分な時間維持する。この抗体を親和性クロマトグラフィーなどの周知の技術によって所望とされる程度まで単離することができる(Harlow and Lane, 1988)。
【０１６３】
抗体には、種々の一般に用いられる動物、例えば、ヤギ、霊長類、ロバ、ブタ、ウマ、モルモット、ラット、またはヒト由来の抗血清調製物を含めることができる。これらの動物から採血し、血清を回収する。
【０１６４】
本発明によって産生される免疫グロブリンは、全抗体、抗体断片または抗体小断片を含むことができる。抗体は、全免疫グロブリン、キメラ抗体または本発明の二種もしくはそれ以上の抗原に対して二重特異性を有するハイブリッド抗体であることができる。それらはハイブリッド断片を含めて、断片、例えば、F(ab')2、Fab'、Fab、Fvなどであってもよい。免疫グロブリンはまた、特異的な抗原と結合して複合体を形成することにより抗体のように作用する、天然タンパク質、合成タンパク質または遺伝子操作されたタンパク質も含む。本明細書において用いられる「免疫グロブリン」という用語は、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgM、ならびにそれらのサブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含む当技術分野において公知の全ての免疫グロブリンクラスおよびサブクラスを含む。好ましくは、本発明の免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。また、免疫グロブリンの断片を含む抗原結合ドメインおよび／または可変ドメインも意味する。抗原結合断片は、とりわけ、Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv、dAb、Fd、相補性決定領域(CDR)断片、一本鎖抗体(scFv)、二価の一本鎖抗体、一本鎖ファージ抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、(ポリ)ペプチドに対する特異的な抗原結合性を与えるのに十分な少なくとも免疫グロブリン断片を含んだ(ポリ)ペプチドなどを含む。
【０１６５】
本発明の抗原組成物またはワクチンをレシピエントに投与することができ、このレシピエントが、特定のワクチンによる曝露に応じて産生される免疫グロブリンの供給源として働く。このようにして処置された被験体は、従来の血漿分画法によって過免疫グロブリンが得られうる血漿を提供するであろう。過免疫グロブリンは、ブドウ球菌感染に対する耐性を与えるためにまたはブドウ球菌感染を処置するために別の被験体に投与されよう。本発明の過免疫グロブリンは、幼児、免疫不全個体におけるブドウ球菌疾患の処置もしくは予防に特に有用であり、または処置が必要とされ、かつワクチン接種に応じて抗体を産生する時間が個体にない場合に特に有用である。
【０１６６】
本発明のさらなる局面は、グラム陽性細菌、好ましくはブドウ球菌、より好ましくは黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌による感染を処置または予防するために使用できる、本発明の免疫原性組成物の構成要素に対して反応性の一種または複数種のモノクローナル抗体(またはその断片; 好ましくはヒトまたはヒト化モノクローナル抗体)を含む薬学的組成物である。このような薬学的組成物は、本発明の抗原に対して特異性を有するいずれかのクラスの全免疫グロブリン、例えばIgG、IgM、IgA、IgDもしくはIgE、キメラ抗体またはハイブリッド抗体でありうるモノクローナル抗体を含む。それらはハイブリッド断片を含めて、断片、例えば、F(ab')2、Fab'、Fab、Fvなどであってもよい。
【０１６７】
モノクローナル抗体を作出する方法は、当技術分野において周知であり、脾細胞と骨髄腫細胞との融合を含むことができる(Kohler and Milstein, 1975; Harlow and Lane, 1988)。あるいは、適当なファージディスプレイライブラリをスクリーニングすることによってモノクローナルFv断片を得ることもできる(Vaughan et al., 1998)。モノクローナル抗体は、ヒトのもの、公知の方法によってヒト化されたもの、または部分的にヒト化されたものであることができる。
【０１６８】
C. 併用療法
本発明の組成物および関連する方法、特に、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、Ebh、Coa、vWa、SpA、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質のペプチドまたはタンパク質の一つまたは複数との組み合わせでのEmp、AdsAおよび／またはEapのポリペプチドまたはペプチドを含む、ブドウ球菌抗原の患者/被験体への投与を、従来の治療の施行と併せて用いることもできる。これらには、ストレプトマイシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、アンピシリン、テトラサイクリン、または抗生物質の各種組み合わせなどの抗生物質の投与が含まれるが、これらに限定されることはない。一つの局面において、ポリペプチドワクチンおよび／または治療をAdsA活性の小分子または非ペプチド阻害剤と併せて用いることが企図される。
【０１６９】
一つの局面において、ポリペプチドワクチンおよび／または治療を、抗細菌処置とともに用いることが企図される。あるいは、治療は数分から数週間に及ぶ間隔だけ、他剤での処置に先行するまたは続くこともできる。他の薬剤および／またはタンパク質もしくはポリヌクレオチドが別々に投与される態様において、薬剤および抗原組成物が依然として、有利に組み合わさった効果を被験体に及ぼすことができるように、一般に、各送達時間の間にかなりの時間が経ってしまわないことを確実にする。そのような場合、双方の様式を互いに約12〜24時間以内に、より好ましくは、互いに約6〜12時間以内に施すことができると企図される。場合によっては、投与の期間をかなり延ばすことが望ましい場合もあるが、その場合には各投与の間隔は数日(2、3、4、5、6または7日)から数週間(1、2、3、4、5、6、7または8週間)である。
【０１７０】
例えば抗生物質治療を「A」とし、抗原またはAdsA修飾因子などの、免疫治療レジメの一部として投与される、免疫原性分子または抗体を「B」とし、種々の組み合わせを利用することができる。
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
【０１７１】
患者/被験体への本発明の免疫原性組成物の投与は、もしあれば、Emp、Eap、および／もしくはAdsA組成物、あるいは本明細書において記述されるその他任意の抗原または抗原の組み合わせの組成物の毒性を考慮に入れながらも、そのような化合物の投与に関する一般的なプロトコルに従う。処置周期は必要に応じて繰り返されるものと期待される。同様に、水和などの、種々の標準的な治療を記述の治療と併せて適用できるものと企図される。
【０１７２】
III. 薬学的組成物
いくつかの態様において、薬学的組成物が被験体に投与される。本発明の種々の局面では、被験体に組成物の有効量を投与することを伴う。本発明のいくつかの態様において、Emp、Eapおよび／またはAdsA抗原を、Ess経路の成員と併せておよびEsaまたはEsxクラスのポリペプチドまたはペプチドを含めて、ならびに/あるいはソルターゼ基質の成員、ならびに/あるいは分泌病毒性因子および／または多糖類を患者に投与して、一種または複数種のブドウ球菌病原菌による感染を防ぐまたは処置することができる。あるいは、一つまたは複数のそのようなポリペプチドまたはペプチドをコードする発現ベクターを、予防的処置として患者に与えることもできる。さらに、そのような化合物を抗生物質と併せて投与することもできる。そのような組成物は一般に、薬学的に許容される担体または水媒体中に溶解または分散される。
【０１７３】
本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という用語は、正しい医学的判断の範囲内にあり、妥当な損益比に応じて過度の毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症なしにヒトおよび動物の組織と接触させて用いるのに適した化合物、材料、組成物、および／または剤形をいう。「薬学的に許容される担体」という用語は、化学剤の運搬または輸送に関わる、液体もしくは固体の増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料のような、薬学的に許容される材料、組成物または媒体を意味する。薬学的に許容される担体とは、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合であるような場合を除き、免疫原性組成物および治療用組成物でのその使用が企図される。他の抗菌剤などの、補助的な活性成分も組成物に組み入れることができる。
【０１７４】
静脈内注射または筋肉内注射のためのものなどの、非経口投与のために処方される化合物に加えて、他の薬学的に許容される形態には、例えば、錠剤または経口投与のための他の固形物; 徐放カプセル; およびクリーム、ローション、洗口液、吸入薬などを含む、現在用いられているその他任意の形態が含まれる。
【０１７５】
本発明の活性化合物は、非経口投与のために処方することができ、例えば、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、またはさらに腹腔内経路による注射のために処方することができる。
【０１７６】
遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液をヒドロキシプロピルセルロースなどの、界面活性剤と適当に混合された水の中で調製することができる。分散液を同様に、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物の中でならびに油中で調製することができる。保存および使用の通常の状況下では、これらの調製物は微生物の増殖を防ぐよう保存剤を含む。
【０１７７】
注射可能な用途に適した薬学的形態は、無菌の水溶液または分散液; ごま油、落花生油または水性プロピレングリコールを含む処方物; および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製用の無菌の粉末を含む。いかなる場合でも、この形態は無菌でなければならず、容易に注射可能となる程度に流動性でなければならない。それは製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの、微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。
【０１７８】
タンパク質性組成物は、中性型または塩型で処方されてもよい。薬学的に許容される塩は、酸付加塩(タンパク質の遊離アミノ基と形成される)および、例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸と形成されるものを含む。また、遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、もしくは水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基に由来することができる。
【０１７９】
また、担体は、例えば、水、エタノール、多価アルコール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、適当なそれらの混合物、ならびに植物油を含有する溶媒または分散媒とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によりおよび界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の予防はさまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中での使用によってもたらすことができる。
【０１８０】
無菌の注射可能な溶液は、必要な量の活性化合物を適切な溶媒の中に、必要に応じて、上に列挙したさまざまなその他の成分とともに組み入れ、その後ろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散媒はさまざまな滅菌活性成分を、基礎の分散媒および上に列挙したものより必要とされるその他の成分を含む無菌の媒体の中に組み入れることによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に加え任意の付加的な望ましい成分の粉末を、予めろ過滅菌されたその溶液から得る真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１８１】
本発明による組成物の投与は、典型的には、任意の共通の経路によるであろう。これには、経口投与、鼻腔投与または口腔投与が含まれるが、これらに限定されることはない。あるいは、投与は同所性の、皮内の、皮下の、筋肉内の、腹腔内の、鼻腔内の、または静脈内の投与によるものであってもよい。ある種の態様において、ワクチン組成物は吸入することができる(例えば、参照により具体的に組み入れられる米国特許第6,651,655号)。そのような組成物は、通常、薬理学的に許容される担体、緩衝液または他の賦形剤を含む薬学的に許容される組成物として投与される。
【０１８２】
水溶液での非経口投与の場合、例えば、溶液を、必要ならば、適当に緩衝化し、液体希釈剤を最初に、十分な生理食塩水またはグルコースを用いて等張にしなければならない。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与のために特に適している。これに関連して、利用できる無菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に公知であろう。例えば、一投与量を等張NaCl溶液に溶解し、皮下注入液に加えるか、または提案される注入部位に注射してもよい(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990を参照のこと)。若干の投与量のばらつきは被験体の状態に応じて必然的に生じると考えられる。いずれにしても、投与責任者が個々の被験体に適した用量を判定すると考えられる。
【０１８３】
治療用または予防用組成物の有効量は、意図する目的に基づいて判定される。「単位用量」または「投与量」という用語は、被験体での使用に適した物理的に異なる単位をいうが、各単位はその投与、すなわち、適切な経路および投与計画に関連する上記の所望の反応を生じるように算出された所定の量の組成物を含有する。処置回数および単位用量の両方によって投与される量は、望まれる防御に依る。
【０１８４】
また、組成物の的確な量は医師の判断に依り、各個体に特有のものである。用量に影響する要因には、被験体の身体的および臨床的状態、投与経路、意図する処置の目的(症状の緩和対治癒)、ならびに特定の組成物の効力、安定性および毒性が含まれる。
【０１８５】
処方によって、溶液は、投与量処方物と適合する様式でおよび治療的にまたは予防的に有効であるような量で投与される。処方物は上記の注射可能な溶液のタイプなどの、種々の投与量形態で容易に投与される。
【０１８６】
A. インビトロ、エクスビボまたはインビボ投与
本明細書において用いられる場合、インビトロ投与という用語は、培養細胞を含むが、これに限定されない、動物から取り出されたまたは動物の体外の細胞に対して行われる操作をいう。エクスビボ投与という用語は、インビトロにおいて操作されており、その後で、生きている細胞に投与される細胞をいう。インビボ投与という用語は、動物の体内で行われる全ての操作を含む。
【０１８７】
本発明のある種の局面において、組成物はインビトロで、エクスビボで、またはインビボで投与することができる。ある種のインビトロの態様において、自己Bリンパ球細胞株を、本発明のウイルスベクターと24〜48時間インキュベートするか、Emp、Eapおよび／またはAdsA、ならびに/あるいはEsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、SpA、vWa、Coa、Ebh、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質(あるいはその任意の組み合わせ)とインキュベートする。次いで形質導入細胞を、インビトロでの分析に、あるいはエクスビボ投与に用いることができる。
【０１８８】
ともに参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,690,915号および同第5,199,942号には、治療用途で用いるための血中単核細胞および骨髄細胞のエクスビボ操作のための方法が開示されている。
【０１８９】
B. 脂質成分および部分
ある種の態様において、本発明は、核酸またはポリペプチド/ペプチドと結び付いた一つまたは複数の脂質を含む組成物に関する。脂質は水に不溶な、かつ有機溶媒で抽出可能な物質である。本明細書において具体的に記述するもの以外の化合物は、当業者により脂質と理解され、本発明の組成物および方法によって包含される。脂質成分および非脂質は、共有結合的または非共有結合的に、互いに付着されてもよい。
【０１９０】
脂質は天然の脂質または合成脂質であってもよい。しかしながら、脂質は、通常、生物学的物質である。生物学的脂質は、当技術分野において周知であり、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド、エーテルかつエステル結合した脂肪酸を有する脂質および重合可能な脂質、ならびにその組み合わせを含む。
【０１９１】
脂質と会合した、核酸分子またはポリペプチド/ペプチドを、脂質を含有する溶液に分散させ、脂質によって溶解させ、脂質によって乳化させ、脂質と混合させ、脂質と組み合わせ、脂質に共有結合させ、脂質中の懸濁液として含有させ、または他の方法で脂質と会合させてもよい。本発明の脂質会合組成物は、任意の特定の構造に限定されない。例えば、それらを単純に溶液中に散在させ、おそらくサイズまたは形状のどちらかが均一ではない凝集体を形成させてもよい。別の例において、それらは二層構造で、ミセルとして、または「崩壊した」構造で存在してもよい。別の非制限的な例において、リポフェクトアミン(Gibco BRL)またはSuperfect (Qiagen)複合体も企図される。
【０１９２】
ある種の態様において、組成物は約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、約20%、約21%、約22%、約23%、約24%、約25%、約26%、約27%、約28%、約29%、約30%、約31%、約32%、約33%、約34%、約35%、約36%、約37%、約38%、約39%、約40%、約41%、約42%、約43%、約44%、約45%、約46%、約47%、約48%、約49%、約50%、約51%、約52%、約53%、約54%、約55%、約56%、約57%、約58%、約59%、約60%、約61%、約62%、約63%、約64%、約65%、約66%、約67%、約68%、約69%、約70%、約71%、約72%、約73%、約74%、約75%、約76%、約77%、約78%、約79%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、またはその間の任意の範囲の、特定の脂質、脂質型、あるいはアジュバント、抗原、ペプチド、ポリペプチド、糖、核酸または本明細書に開示されるもしくは当業者に公知であるような他の材料などの非脂質成分を含むことができる。非限定的な例において、組成物は約10%〜約20%の中性脂質、および約33%〜約34%のセレブロシド、および約1%のコレステロールを含むことができる。別の非限定的な例において、リポソームは、ミセルの約1%が特にリコペンであって、リポソームの約3%〜約11%が他のテルペンを含んだままの、約4%〜約12%のテルペン、ならびに約10%〜約35%のホスファチジルコリン、および約1%の非脂質成分を含むことができる。このように、本発明の組成物は、任意の組み合わせまたは百分率の範囲で脂質、脂質型または他の成分のいずれを含んでもよいと企図される。
【０１９３】
IV. 多糖類
本発明の免疫原性組成物は、PIA (PNAGとしても公知)の一つもしくは複数を含む莢膜多糖類、ならびに/または黄色ブドウ球菌V型および／もしくはVIII型莢膜多糖類、ならびに/または表皮ブドウ球菌I型および／もしくはII型および／もしくはIII型莢膜多糖類をさらに含むことができる。
【０１９４】
A. PIA (PNAG)
現在では、PS/A、PIAおよびSAAとして同定されたブドウ球菌表面多糖類の各種形態は同じ化学的実体、つまりPNAGであることが明らかである(Maira-Litran et al., 2004)。それゆえ、PIAまたはPNAGという用語は、これらの全ての多糖類またはそれらに由来するオリゴ糖を包含する。
【０１９５】
PIAは多糖類細胞間付着因子であり、N-アセチルおよびO-スクシニル構成要素で置換されたβ-(1→6)結合グルコサミンの重合体から構成される。この多糖類は黄色ブドウ球菌にも表皮ブドウ球菌にもともに存在し、どちらの供給源からも単離することができる(Joyce et al., 2003; Maira-Litran et al., 2002)。例えば、PNAGは黄色ブドウ球菌株MN8mから単離することができる(WO04/43407)。表皮ブドウ球菌から単離されるPIAは、生物膜の複合的構成要素である。それは細胞間接着の媒介に関与しており、おそらく、成長中のコロニーを宿主の免疫反応から守る働きもする。
【０１９６】
ポリ-N-スクシニル-β-(1→6)-グルコサミン(PNSG)として既知の多糖類は、最近になって、N-スクシニル化の同定が間違いであったため、予想された構造を有するものではないことが示された(Maira-Litran et al., 2002)。それゆえ、正式にはPNSGとして公知の、かつ現在では、PNAGであることが分かっている多糖類もPIAという用語に包含される。PIA (またはPNAG)は、400 kDaを超えるものから、75〜400 kDaまで、10〜75 kDaまで、最大で30までの(N-アセチルおよびO-スクシニル構成要素で置換されたβ-(1→6)結合グルコサミンの)反復単位から構成されるオリゴ糖まで、さまざまなサイズのものでありうる。任意のサイズのPIA多糖類またはオリゴ糖を本発明の免疫原性組成物に用いることができるが、40 kDa超のサイズが好ましい。サイジングは、当技術分野において公知の任意の方法により、例えばマイクロ流動化、超音波照射または化学的切断により行うことができる(WO 03/53462、EP497524、EP497525)。PIA (PNAG)の好ましいサイズ範囲は40〜400 kDa、40〜300 kDa、50〜350 kDa、60〜300 kDa、50〜250 kDaおよび60〜200 kDaである。
【０１９７】
PIA (PNAG)は酢酸塩によるアミノ基上の置換によって異なるアセチル化度を持ちうる。インビトロで産生されるPIAは、アミノ基上でほぼ完全に(95〜100%)置換されている。あるいは、60%未満、好ましくは50%、40%、30%、20%、10%未満のアセチル化を有する脱アセチル化PIA (PNAG)を用いることができる。PNAGの非アセチル化エピトープはオプソニンによるグラム陽性細菌、好ましくは黄色ブドウ球菌および／または表皮ブドウ球菌の殺傷の媒介で効率的であるため、脱アセチル化PIA (PNAG)の使用が好ましい。より好ましくは、PIA (PNAG)は、40 kDa〜300 kDaのサイズを有し、60%、50%、40%、30%または20%未満のアミノ基がアセチル化されているように脱アセチル化される。脱アセチル化PNAG (dPNAG)という用語は、60%、50%、40%、30%、20%または10%未満のアミノ基がアセチル化されているPNAG多糖類またはオリゴ糖をいう。
【０１９８】
一つの態様において、天然の多糖類を化学的に処理することにより、PNAGを脱アセチル化してdPNAGを形成する。例えば、天然PNAGを、pHが10超まで上昇するように塩基性溶液で処理する。例えば、PNAGを0.1〜5 M、0.2〜4 M、0.3〜3 M、0.5〜2 M、0.75〜1.5 Mまたは1 MのNaOH、KOHまたはNH4OHで処理する。処理は、20〜100℃、25〜80℃、30〜60℃もしくは30〜50℃または35〜45℃の温度で少なくとも10〜30分間、または1、2、3、4、5、10、15もしくは20時間である。dPNAGはWO 04/43405に記述されているように調製することができる。
【０１９９】
本発明の免疫原性組成物に含まれる多糖類は、好ましくは、下記のように担体タンパク質と結合され、あるいは非結合とされる。
【０２００】
B. 黄色ブドウ球菌由来の5型および8型多糖類
ヒトでの感染を引き起こす黄色ブドウ球菌の大部分の菌株が5型または8型多糖類のいずれかを含む。およそ60%のヒト菌株が8型であり、およそ30%が5型である。5型および8型莢膜多糖類抗原の構造はMoreauら、1990およびFournierら、1984に記述されている。どちらもその反復単位の中にFucNAcpと、スルフヒドリル基を導入するのに使用できるManNAcAとを有する。それらの構造は:
5型 →4)-β-D-ManNAcA(3OAc)-(1→4)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
8型 →3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
として報告されており、
最近(Jones, 2005)では、NMR分光法によってそれらの構造は:
5型 →4)-β-D-ManNAcA-(1→4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
8型 →3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-α-D-FucNAc(1→
に訂正されている。
【０２０１】
多糖類は公知の方法、米国特許第6,294,177号を用いて、適切な黄色ブドウ球菌株から抽出することができる。ATCC 12902は5型黄色ブドウ球菌株であり、ATCC 12605は8型黄色ブドウ球菌株である。
【０２０２】
多糖類は天然のサイズのものであり、あるいは、例えばマイクロ流動化、超音波照射または化学的処理によってサイジングされてもよい。本発明の免疫原性組成物に含まれる5型および8型多糖類は、好ましくは、下記のように担体タンパク質と結合され、あるいは非結合とされる。本発明の免疫原性組成物は、あるいは、5型または8型多糖類のどちらかを含む。
【０２０３】
C. 黄色ブドウ球菌336抗原
一つの態様において、本発明の免疫原性組成物は、米国特許第6,294,177号に記述されている黄色ブドウ球菌336抗原を含む。336抗原は、β結合ヘキソサミンを含み、O-アセチル基を含まず、ATCC 55804の下で寄託された黄色ブドウ球菌336型に対する抗体と特異的に結合する。一つの態様において、336抗原は多糖類であり、これは天然のサイズのものであり、あるいは、例えばマイクロ流動化、超音波照射または化学的処理によってサイジングされてもよい。本発明はまた、336抗原に由来するオリゴ糖を網羅する。336抗原は、本発明の免疫原性組成物に含まれる場合、好ましくは、下記のように担体タンパク質と結合され、あるいは非結合とされる。
【０２０４】
D. 表皮ブドウ球菌由来のI型、II型およびIII型多糖類
表皮ブドウ球菌の菌株ATCC-31432、SE-360およびSE-10は、それぞれ、異なる三種の莢膜I型、II型およびIII型を特徴とする(Ichiman and Yoshida, 1981)。表皮ブドウ球菌の各血清型から抽出される莢膜多糖類は、I型、II型およびIII型多糖類を構成する。多糖類は、米国特許第4,197,290号に記述されている方法を含めていくつかの方法によりまたはIchiman et al., 1991に記述されているように抽出することができる。
【０２０５】
本発明の一つの態様において、免疫原性組成物は、表皮ブドウ球菌由来のI型および／またはII型および／またはIII型多糖類またはオリゴ糖を含む。
【０２０６】
多糖類は天然のサイズのものであり、あるいは、例えばマイクロ流動化、超音波照射または化学的切断によってサイジングされてもよい。本発明はまた、表皮ブドウ球菌株から抽出されたオリゴ糖を網羅する。これらの多糖類は、非結合とされ、または好ましくは下記のように結合される。
【０２０７】
E. 多糖類の結合
ワクチン接種に多糖類を用いることに付随する問題の中には、多糖類それ自体が不十分な免疫原であるという事実がある。本発明において利用される多糖類をそのようなタンパク質担体に連結させて、免疫原性を改善することが好ましい。多糖類免疫原と結合されうるそのような担体の例としては、ジフテリアおよび破傷風トキソイド(それぞれDT、DT CRM 197およびTT)、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ならびにツベルクリン精製タンパク質誘導体(PPD)、緑膿菌エキソプロテインA (rEPA)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)由来のプロテインD、肺炎球菌溶血素またはこれらのうちのいずれかの断片が挙げられる。用いるのに適した断片には、Tヘルパーエピトープを包含する断片が含まれる。特に、インフルエンザ菌由来のプロテインD断片は、そのタンパク質のN末端側の3分の1を含むことが好ましいであろう。プロテインDは、インフルエンザ菌由来のIgD結合タンパク質であり(EP 0 594 610 B1)、潜在的な免疫原である。さらに、ブドウ球菌タンパク質/抗原を本発明の多糖類結合体における担体タンパク質として用いることができる。
【０２０８】
ブドウ球菌ワクチンに関して用いるのに特に有利であるものと考えられる担体タンパク質は、ブドウ球菌αトキソイドである。結合の過程で毒性が低減するので、この天然形態を多糖類と結合させてもよい。残留毒性がより低いことから、His35LeuまたはHis35Arg変種のような、遺伝学的に解毒されたα毒素が担体として用いられることが好ましい。あるいは、架橋試薬ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドでの処理によって、α毒素を化学的に解毒する。
【０２０９】
多糖類は、いずれかの公知の方法(例えば、米国特許第4,372,945号、同第4,474,757号および同第4,356,170号)によって担体タンパク質に連結させることができる。
【０２１０】
CDAP結合化学反応が行われることが好ましい(WO95/08348参照)。CDAPでは、シアニル化試薬1-シアノ-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート(CDAP)が多糖類-タンパク質結合体の合成に用いられることが好ましい。シアニル化反応は、アルカリ感受性多糖類の加水分解を回避するような比較的穏やかな条件の下で行うことができる。この合成により、担体タンパク質への直接的なカップリングが可能である。
【０２１１】
多糖類を水または生理食塩水溶液に溶解する。CDAPはアセトニトリルに溶解し、すぐに多糖類溶液に添加する。CDAPは多糖類のヒドロキシル基と反応して、シアン酸エステルを形成する。活性化段階の後、担体タンパク質を添加する。リジンのアミノ基は活性化多糖類と反応して、イソ尿素共有結合を形成する。カップリング反応の後、大過剰のグリシンを添加して、残りの活性化官能基をクエンチする。次いで生成物をゲル浸透カラムに通して、未反応の担体タンパク質と残りの試薬とを除去する。
【０２１２】
結合には担体タンパク質と多糖類との間の直接的な連結の作出が含まれることが好ましい。任意で、スペーサー(アジピン酸ジヒドリド(adipic dihydride; ADH)のような)が担体タンパク質と多糖類との間に導入されてもよい。
【０２１３】
V. 免疫反応およびアッセイ法
上記のように、本発明は、被験体においてEmp、Eapおよび／またはAdsAポリペプチドに対する免疫反応を惹起または誘導することに関係する。他の態様では、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、SpA、Ebh、Coa、vWa、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質、あるいはその他任意のブドウ球菌ペプチドまたはタンパク質を含めて、他のペプチドまたは抗原に対する免疫反応を惹起または誘導することができる。一つの態様において、免疫反応は、感染または関連する疾患、とりわけブドウ球菌に関連する疾患を有する、有することが疑われる、または発症するリスクがある被験体を防御または処置すること(例えば膿瘍存続を限定すること)ができる。本発明の免疫原性組成物の使い方の一つは、入院処置の前に被験体を予防接種または処置することによって、院内感染を予防することである。
【０２１４】
A. 免疫アッセイ法
本発明は、Emp、Eapおよび／またはAdsAならびに本明細書において記述されるその他任意のポリペプチドまたはペプチド薬剤によって免疫反応が誘導または惹起されるかどうかを評価するための血清学的アッセイ法の実施を含む。実施されうる多くのタイプの免疫アッセイ法が存在する。本発明により包含される免疫アッセイ法には、米国特許第4,367,110号に記述されているもの(二重モノクローナル抗体サンドイッチアッセイ法)および米国特許第4,452,901号に記述されているもの(ウエスタンブロット)が含まれるが、これらに限定されることはない。他のアッセイ法には、インビトロおよびインビボの両方での、免疫細胞化学および標識リガンドの免疫沈降が含まれる。
【０２１５】
免疫アッセイ法は一般に、結合アッセイ法である。ある種の好ましい免疫アッセイ法は、当技術分野において公知のさまざまなタイプの酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)および放射免疫アッセイ法(RIA)である。組織切片を用いる免疫組織化学的検出もまた特に有用である。一例を挙げれば、抗体または抗原をポリスチレンマイクロタイタープレート中のウェル、ディップスティック、またはカラム支持体などの、選択した表面に固定化する。次いで、臨床サンプルなどの、所望の抗原または抗体を含有すると疑われる試験組成物をウェルに加える。結合および非特異的に結合した免疫複合体を除去するための洗浄の後、結合した抗原または抗体を検出することができる。検出は一般に、検出可能な標識に連結されている、所望の抗原または抗体に特異的な、別の抗体の添加によって達成される。このタイプのELISAは「サンドイッチELISA」として公知である。検出は、所望の抗原に特異的な二次抗体の添加の後、該二次抗体に対して結合親和性を有する三次抗体であって、検出可能な標識に連結されている該三次抗体の添加によって達成することもできる。
【０２１６】
ELISA技術の変化形が当業者に公知である。そのような変化形の一つでは、標的抗原または抗体を含むことが疑われるサンプルをウェル表面に固定化し、その後、本発明の抗体または抗原と接触させる。結合および適切な洗浄の後、結合した免疫複合体を検出する。最初の抗原特異的抗体が、検出可能な標識に連結されている場合、免疫複合体を直接的に検出することができる。この場合も先と同様に、免疫複合体を、最初の抗原特異的抗体に対して結合親和性を有する二次抗体であって、検出可能な標識に連結されている該二次抗体を用いて検出することができる。
【０２１７】
試験サンプルが既知量の標識抗原または抗体と結合で競合する、競合ELISAも実行の可能性がある。未知サンプル中の反応性種の量は、コーティングされたウェルとのインキュベーションの前または間に、該サンプルと既知の標識種とを混合することによって測定される。サンプル中の反応性種の存在は、ウェルへの結合に利用可能な標識された種の量を低下させるように作用し、したがって最終的なシグナルを減少させる。
【０２１８】
利用される形式に関係なく、ELISAはコーティング、インキュベーティングまたは結合、非特異的に結合された種を除去するための洗浄、および結合された免疫複合体の検出などの、ある種の特徴を共通して有する。
【０２１９】
ELISAでは、直接的手順よりはむしろ二次または三次検出手段を用いることが通例である。したがって、ウェルとの抗原または抗体の結合、バックグラウンドを減らすための非反応性材料でのコーティング、および非結合材料を除去するための洗浄の後に、固定化表面を、免疫複合体(抗原/抗体)形成を可能とするのに有効な条件の下で、試験される臨床サンプルまたは生体サンプルと接触させる。次いで免疫複合体の検出には、標識された二次結合リガンドもしくは抗体、または標識された三次抗体もしくは第三の結合リガンドと併せて二次結合リガンドもしくは抗体が必要とされる。
【０２２０】
ELISAでの全インキュベーション段階の後、非複合体形成材料を除去するために、接触表面を洗浄する。洗浄にはPBS/Tween溶液、またはホウ酸緩衝液での洗浄が含まれることが多い。試験サンプルと元々結合されている材料との間の特異的な免疫複合体の形成と、それに続く洗浄の後、ごく微量の免疫複合体の発生を測定することができる。
【０２２１】
検出手段を供与するため、第二または第三の抗体は、検出を可能とするよう結合標識を有することができる。ある種の局面において、この標識は、適切な発色性基質とインキュベートすることで着色をもたらす酵素であろう。したがって、例えば、第一または第二の免疫複合体を、さらなる免疫複合体形成の発生に好ましい時間および条件の下でウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたは水素ペルオキシダーゼ結合抗体と接触させるかまたはインキュベートすること、例えば、PBS TweenなどのPBS含有溶液中で室温にて2時間のインキュベーションが望まれよう。
【０２２２】
標識抗体とのインキュベーション後、および未結合の材料を除去するための洗浄に引き続いて、標識の量を、例えば、尿素およびブロモクレゾールパープルまたは、酵素標識としてのペルオキシダーゼの場合、2,2'アジノ-ジ(3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸[ABTS]およびH2O2などの発色性基質とのインキュベーションにより定量化する。次いで発色度を、例えば、可視スペクトル分光光度計を用いて測定することにより、定量化を達成する。あるいは、標識は化学発光標識であってもよい(米国特許第5,310,687号、同第5,238,808号および同第5,221,605号を参照のこと)。
【０２２３】
B. 細菌感染の診断
上記の感染を処置または予防するためのタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチド、ならびにこれらのポリペプチド、タンパク質および／またはペプチドに結合する抗体の使用に加え、本発明は、ブドウ球菌の存在の検出、ならびに患者内であれ医療機器上であれ、同様に感染しうる感染症を診断することを含む、種々の様式でのこれらのポリペプチド、タンパク質、ペプチドおよび／または抗体の使用を企図する。本発明によれば、感染の存在を検出する好ましい方法は、個体から、例えば、個体の血液、唾液、組織、骨、筋肉、軟骨または皮膚から採取されたサンプルのような、一種または複数種のブドウ球菌種または菌株に感染していることが疑われるサンプルを得る段階を含む。サンプルの単離に続き、本発明のポリペプチド、タンパク質、ペプチドおよび／または抗体を利用する診断アッセイ法を行ってブドウ球菌の存在を検出することができ、サンプル中でのそのような存在を判定するためのそのようなアッセイ技術は当業者に周知であり、放射免疫アッセイ法、ウエスタンブロット分析およびELISAアッセイ法などの方法を含む。概して、本発明によれば、ブドウ球菌に感染していることが疑われるサンプルを本発明によるポリペプチド、タンパク質、ペプチド、抗体またはモノクローナル抗体に加え、サンプル中の、ポリペプチド、タンパク質および／もしくはペプチドに結合する抗体、または抗体に結合するポリペプチド、タンパク質および／もしくはペプチドによってブドウ球菌が示される、感染を診断する方法が企図される。
【０２２４】
したがって、本発明による抗体は、ブドウ球菌の感染の予防のために、進行中の感染の処置のために、または研究ツール用として用いることができる。本明細書において用いられる「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、サル化抗体およびヒト化抗体または霊長類化抗体、ならびにFab免疫グロブリン発現ライブラリの産物を含め、抗体の結合特異性を維持している断片のような、Fab断片を含む。したがって、本発明は、抗体の可変重鎖および軽鎖のような一本鎖の使用を企図する。これらのタイプのいずれの抗体または抗体断片の作出も当業者に周知である。細菌タンパク質に対する抗体の作出の具体例は、参照により全体が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第20030153022号のなかで見出すことができる。
【０２２５】
上記のポリペプチド、タンパク質、ペプチドおよび／または抗体のいずれも、ブドウ球菌の同定および定量のために、検出可能な標識で直接的に標識することができる。免疫アッセイ法で用いるための標識は一般に、当業者に公知であり、コロイド金またはラテックスビーズのような着色粒子を含めて、酵素、放射性同位体、ならびに蛍光物質、発光物質および発色物質を含む。適当な免疫アッセイ法はELISAを含む。
【０２２６】
C. 防御免疫
本発明のいくつかの態様において、タンパク質性組成物は被験体に防御免疫を付与する。防御免疫とは、免疫反応が起こる作用因子を伴った特定の疾患または状態を被験体が発症することを防ぐ特異的な免疫反応を開始する身体の能力をいう。免疫原性上有効な量は、被験体に防御免疫を付与することができる。
【０２２７】
本明細書においておよび付随する特許請求の範囲において用いられる場合、ポリペプチドおよびペプチドという用語は、ペプチド結合を介してお互いに共有結合的に連結された一続きのアミノ酸をいう。異なるポリペプチドは、本発明による異なる機能性を有する。一つの局面によれば、ポリペプチドは、レシピエントにおいて能動免疫反応を誘導するようにデザインされた免疫原に由来するが、本発明の別の局面によれば、ポリペプチドは、例えば動物での、能動免疫反応の誘発後に生じる、かつレシピエントにおいて受動免疫反応を誘導する働きのできる、抗体に由来する。しかしながら、どちらの場合も、ポリペプチドは、任意の可能なコドン用法にしたがってポリヌクレオチドによりコードされることができる。
【０２２８】
本明細書において用いられる場合、「免疫反応」またはその等価語「免疫学的反応」という語句は、レシピエント患者での本発明のタンパク質、ペプチド、糖鎖またはポリペプチドに向けられた体液性(抗体を介した)反応、細胞性(抗原特異的T細胞もしくはその分泌産物によって媒介される)反応、または体液性反応と細胞性反応の両方の発生をいう。そのような反応は、免疫原の投与によって誘導された能動反応または抗体、抗体を含有する材料もしくは初回抗原刺激を受けたT細胞の投与によって誘導された受動反応でありうる。
【０２２９】
細胞性免疫反応はクラスIまたはクラスII MHC分子と結び付いたポリペプチド抗原またはエピトープの提示により誘発されて、抗原特異的なCD4 (+) Tヘルパー細胞および／またはCD8 (+)細胞傷害性T細胞を活性化する。反応には単球、マクロファージ、NK細胞、好塩基球、樹状細胞、星状細胞、小膠細胞、好酸球または先天性免疫の他の成分も伴われうる。
【０２３０】
本明細書において用いられる場合、「能動免疫」とは、抗原の投与によって被験体に付与される任意の免疫をいう。
【０２３１】
本明細書において用いられる場合、「受動免疫」とは、被験体への抗原の投与なしで被験体に付与される任意の免疫をいう。「受動免疫」はそれゆえ、免疫反応の細胞メディエータまたはタンパク質メディエータ(例えば、モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体)を含めた活性化免疫エフェクタの投与を含むが、これらに限定されることはない。
【０２３２】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体組成物は、抗体によって認識される抗原を持つか、またはその抗原に曝露されうる生物による感染の予防または処置のための受動免疫付与に用いることができる。抗体組成物は、さまざまな生物と関連しうる種々の抗原に結合する抗体を含むことができる。抗体成分はポリクローナル抗血清であることができる。ある種の局面において、抗体は動物または抗原を接種された第二の被験体から親和性精製される。あるいは、ブドウ球菌を含むがこれに限定されない、グラム陽性菌、グラム陰性菌などの、同一の、関連の、または別の微生物または生物に存在する抗原に対するモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体の混合物である、抗体混合物を用いることもできる。
【０２３３】
受動免疫は、免疫グロブリン(Ig)、および／またはドナーもしくは周囲の免疫反応性を有する他の非患者供給源から得られる他の免疫因子を患者に投与することによって、患者または被験体に与えることができる。他の局面において、本発明の抗原組成物は、ブドウ球菌または他の生物に対して作製された抗体を含んだ、抗原組成物での攻撃に反応して産生されるグロブリン(「過免疫グロブリン」)の供給源もしくはドナーとしての役割を果たす被験体に投与することができる。このように処置された被験体は、過免疫グロブリンを、従来の血漿分画法により得て、ブドウ球菌感染に対する耐性を与えるためにまたはブドウ球菌感染を処置するために別の被験体に投与できる、血漿を提供することができる。本発明による過免疫グロブリンは、免疫不全の個体に、侵襲的処置を受けている個体に、または個体がワクチン接種に反応して自身の抗体を産生できる時間のない個体にとりわけ有用である。受動免疫に関連した例示的な方法および組成物は、米国特許第6,936,258号、同第6,770,278号、同第6,756,361号、同第5,548,066号、同第5,512,282号、同第4,338,298号、および同第4,748,018号を参照されたく、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２３４】
ある種の局面において、方法には上記の抗原に結合する抗体のような、抗体組成物を、それを必要としている被験体に投与することにより感染を処置または予防することが含まれる。感染の処置および予防の標的患者集団には、細菌性病原菌に感染しているまたは感染するリスクがある、ヒトのような、哺乳類が含まれる。一つの態様において、処置または予防される感染は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌もしくはα毒素を産生する黄色ブドウ球菌の感染を含む、黄色ブドウ球菌感染、または表皮ブドウ球菌感染である。
【０２３５】
一つの態様によれば、本発明は、一種または複数種の黄色ブドウ球菌AdsA、Emp、Eap、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、SpA、Ebh、vWa、Coa、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質抗体ならびに薬学的に許容される担体を含む組成物を用いて黄色ブドウ球菌感染を処置または予防するための方法を提供する。黄色ブドウ球菌抗体は、上述したそれらの抗原のいずれかに結合することができる。一つの態様において、抗体組成物は抗体組成物または過免疫組成物である。別の態様において、抗体は組み換え抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である。別の態様において、抗体はモノクローナル抗体またはその断片である。
【０２３６】
当技術分野において日常的である方法によって、抗体組成物の治療的または予防的有効量を決定することができる。その量が組成物内の特定の抗体、組成物中の抗体の濃度、投与の頻度、処置または予防される感染の重症度、ならびに年齢、体重および免疫状態などの被験体詳細に応じて変わりうることを当業者は認識するであろう。いくつかの態様において、投与量は、体重キログラムあたり少なくとも1、5、10、25、50または100 μgまたはmgの抗体組成物(mg/kg)であり、少なくとも100 mg/kg、少なくとも150 mg/kg、少なくとも200 mg/kg、少なくとも250 mg/kg、少なくとも500 mg/kg、少なくとも750 mg/kgおよび少なくとも1000 mg/kgを含む。モノクローナル抗体組成物の投与量は、典型的にはより低く、例えば抗体組成物の投与量の1/10、例えば少なくとも約1、5、10、25または50 μgまたはmg/kg、少なくとも約10 mg/kg、少なくとも約15 mg/kg、少なくとも約20 mg/kgまたは少なくとも約25 mg/kgであることができる。投与経路は、受動性ワクチンに適した任意のものであることができる。したがって、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、吸入、および他の投与経路が想定される。上述のように、抗体の治療的または予防的有効量は、治療的または予防的に有益な効果を達成するのに十分な量である。
【０２３７】
防御抗体組成物は、感染を中和および／または予防することができる。防御抗体組成物は、そのままでは防御的ではないが、組み合わせで、防御抗体組成物を生じる、AdsA、Emp、Eap、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、SpA、Ebh、Coa、vWa、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質抗体の量を含むことができる。
【０２３８】
併用療法において、抗体組成物を、抗感染剤、抗生物質剤、および／または抗菌剤と組み合わせて投与してもよい。抗感染剤はバンコマイシンおよびリゾスタフィンを含むが、これらに限定されることはない。抗生物質剤および抗菌剤は、バンコマイシン、リゾスタフィン、ペニシリンG、アンピシリン、オキサシリン、ナフシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、セファロチン、セファゾリン、セファレキシン、セフラジン、セファマンドール、セフォキシチン、イミペネム、メロペネム、ゲンタマイシン、テイコプラニン、リンコマイシンおよびクリンダマイシンを含む、ペニシリナーゼ耐性ペニシリン、セファロスポリンおよびカルバペネムを含むが、これらに限定されることはない。これらの抗生物質の投与量は当技術分野において周知である。例えば、Merck Manual Of Diagnosis And Therapy, § 13, Ch. 157, 100th Ed. (Beers & Berkow, eds., 2004)を参照されたい。抗感染剤、抗生物質剤および／または抗菌剤を投与前に組み合わせてもよいし、または本明細書において記述される能動もしくは受動免疫療法と同時にもしくは連続的に投与してもよい。
【０２３９】
いくつかの態様において、1または2回用量などの比較的少ない用量の抗体組成物を投与し、かつ一般的に数日または数週の期間にわたって複数回の用量を伴う、慣用的抗生物質療法を利用する。したがって、抗生物質を、少なくとも5日間、10日間もしくはもっと言えば14日間またはそれ以上など、ある期間にわたって、毎日1回、2回もしくは3回またはそれ以上投与してもよく、一方、抗体組成物は、通常、1回または2回しか投与されない。しかし、当業者が、異なる投与量、投与時期、ならびに相対量の抗体組成物および抗生物質を選択および調整してもよい。
【０２４０】
本明細書および添付の特許請求の範囲のために「エピトープ」および「抗原決定基」という用語は、Bおよび／またはT細胞が反応するまたは認識する抗原上の部位をいうように互換的に用いられる。B細胞エピトープは、タンパク質の三次元の折り畳みが並置した隣接アミノ酸からも非隣接アミノ酸からも形成されることができる。隣接アミノ酸から形成されたエピトープは、通常、変性溶媒に曝されても保持されるのに対し、三次元の折り畳みによって形成されたエピトープは、通常、変性溶媒を用いた処理によって失われる。エピトープは、通常、固有の空間的構造の中に少なくとも3個、より通常には、少なくとも5個または8〜10個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的構造を決定する方法は、例えば、x線結晶学および2次元核磁気共鳴を含む。例えば、Epitope Mapping Protocols (1996)を参照されたい。同じエピトープを認識する抗体は、ある抗体が標的抗原への別の抗体の結合を遮断する能力を示す、単純な免疫アッセイ法において特定することができる。T細胞はCD8細胞の場合およそ9アミノ酸の、またはCD4細胞の場合およそ13〜15アミノ酸の連続エピトープを認識する。エピトープを認識するT細胞は、エピトープに反応して、初回抗原刺激を受けたT細胞がする3H-チミジンの取り込み(Burke et al., 1994)により、抗原依存的な死滅化(細胞傷害性Tリンパ球アッセイ法, Tigges et al., 1996)により、またはサイトカイン分泌により決定されるように、抗原依存的な増殖を測定するインビトロでのアッセイ法により特定することができる。
【０２４１】
細胞を介した免疫学的反応の存在は、増殖アッセイ法(CD4 (+) T細胞)またはCTL (細胞傷害性Tリンパ球)アッセイ法により決定することができる。免疫原の防御効果または治療効果に対する体液性および細胞性反応の相対的寄与は、免疫した同系動物からIgGおよびT細胞を個別に単離し、第二の被験体において防御効果または治療効果を測定することにより、識別することができる。
【０２４２】
本明細書においておよび特許請求の範囲において用いられる場合、「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、互換的に用いられ、動物またはレシピエントの免疫反応の一部として機能する構造的に関連したタンパク質のいくつかのクラスのいずれかをいい、それらのタンパク質にはIgG、IgD、IgE、IgA、IgMおよび関連タンパク質が含まれる。
【０２４３】
正常な生理学的条件の下で、抗体は、血漿および他の体液中にならびにある種の細胞の膜中に見られ、B細胞と表示されるタイプのリンパ球またはその機能的等価体によって産生される。IgGクラスの抗体は、ジスルフィド結合によってともに連結された四本のポリペプチド鎖で構成されている。インタクトなIgG分子の四本の鎖は、H鎖といわれる二本の同一の重鎖およびL鎖といわれる二本の同一の軽鎖である。
【０２４４】
ポリクローナル抗体を産生するために、ウサギ、ヤギ、ヒツジまたはヒトなどの宿主を、一般的にアジュバントとともにおよび、必要なら、担体にカップリングされた、抗原または抗原断片で免疫する。その後、抗原に対する抗体を宿主の血清から回収する。ポリクローナル抗体を単一特異性にする抗原に対して、ポリクローナル抗体を親和性精製することができる。
【０２４５】
モノクローナル抗体を産生するために、抗原による適切なドナー、一般にマウスの過免疫化を行う。次いで脾臓の抗体産生細胞の単離を行う。これらの細胞を、骨髄腫細胞などの、不死によって特徴付けられる細胞に融合して、培地中で維持できる、かつ、必要とされるモノクローナル抗体を分泌する融合細胞雑種(ハイブリドーマ)をもたらす。次いでこれらの細胞を大量に培養し、モノクローナル抗体を使用培地から回収する。定義上、モノクローナル抗体は単一のエピトープに特異的である。このためにモノクローナル抗体は、多くの場合、類似の抗原に対して作製されたポリクローナル抗体よりも低い親和性定数を有する。
【０２４６】
モノクローナル抗体は、脾細胞の初代培養物または脾臓に由来する細胞株の使用によりエクスビボで産生することもできる(Anavi, 1998)。組み換え抗体を産生するために(一般的にはHuston et al., 1991; Johnson et al., 1991; Mernaugh et al., 1995を参照のこと)、動物の抗体産生Bリンパ球またはハイブリドーマ由来の伝令RNAを逆転写して相補DNA (cDNA)を得る。完全長または部分長であってよい抗体cDNAを増幅し、ファージまたはプラスミドにクローニングする。cDNAは、リンカーによって分離または連結された、重鎖および軽鎖cDNAの部分長であってよい。抗体、または抗体断片を適当な発現系により発現させて、組み換え抗体を得る。適切な発現ライブラリをスクリーニングすることにより、抗体cDNAを得ることもできる。
【０２４７】
抗体は固体支持体基材に結合させても、もしくは検出可能な部分と抱合させてもよく、または当技術分野において周知であるように結合も抱合もさせてもよい。蛍光部分または酵素部分の抱合の一般的な考察は、Johnstone et al. (1982)を参照されたい。固体支持体基材への抗体の結合は同様に、当技術分野において周知である(Harlow et al., 1988; Borrebaeck, 1992)。
【０２４８】
本明細書においておよび特許請求の範囲において用いられる場合、「抗体の免疫学的部分」という語句は、抗体のFab部分、抗体のFv断片、抗体の重鎖、抗体の軽鎖、抗体の重鎖および軽鎖の非会合混合物、抗体の重鎖および軽鎖からなるヘテロ二量体、抗体の重鎖の触媒ドメイン、抗体の軽鎖の触媒ドメイン、抗体の軽鎖の可変断片、抗体の重鎖の可変断片、ならびにscFvとしても公知の、抗体の一本鎖変種を含む。さらに、この用語は、異なる種に由来する融合遺伝子の発現産物であるキメラ免疫グロブリンも含む。種の一つはヒトであることができ、その場合、キメラ免疫グロブリンはヒト化されているといわれる。典型的には、抗体の免疫学的部分は、それを得たインタクトな抗体と、抗原への特異的結合で競合する。
【０２４９】
任意で、抗体または好ましくは抗体の免疫学的部分は、他のタンパク質との融合タンパク質に化学的に抱合されても、またはその融合タンパク質として発現されてもよい。本明細書および添付の特許請求の範囲のために、そのような全ての融合タンパク質は、抗体または抗体の免疫学的部分の定義のなかに含まれる。
【０２５０】
本明細書において用いられる場合、「免疫原性作用物質」または「免疫原」または「抗原」という用語は、アジュバントとともに、単独で、またはディスプレイ媒体上に提示された状態で、レシピエントに投与することにより、それ自体に対する免疫学的反応を誘導できる分子を記述するよう互換的に用いられる。
【０２５１】
VI. 核酸
ある種の態様において、本発明は、本発明のタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドに関する。Emp、EapまたはAdsA、ならびにEsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、Ebh、Coa、vWa、SpA、Coa、vWa、Ebh、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質を含むが、これらに限定されない、他の細菌タンパク質の核酸配列が含まれる。
【０２５２】
本出願において用いられる場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、組み換えであるか、全ゲノム核酸がない状態で単離されているかのどちらかの核酸分子をいう。「ポリヌクレオチド」という用語のなかに含まれるのは、オリゴヌクレオチド(長さが核酸100残基またはそれ以下の)、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含む、組み換えベクターである。ポリヌクレオチドは、ある種の局面において、天然の遺伝子またはタンパク質コード配列から実質的に単離されている、調節配列を含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖(コーディングもしくはアンチセンス)または二本鎖であってよく、RNA、DNA (ゲノム、cDNAもしくは合成)、その類似体、またはその組み合わせであってよい。ポリヌクレオチドのなかにさらなるコーディングまたは非コーディング配列が存在してもよいが、存在しなくてもよい。
【０２５３】
この点において、「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸(適切な転写、翻訳後修飾または局在化に必要とされる任意の配列を含む)をいうように用いられる。当業者に理解されるように、この用語はゲノム配列、発現カセット、cDNA配列、mRNA配列、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質および変異体を発現するまたは発現するように適合されうる、遺伝子操作されたもっと小さな核酸セグメントを包含する。ポリペプチドの全部または一部をコードする核酸は、以下の長さの、そのようなポリペプチドの全部または一部をコードする隣接核酸配列: 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000またはそれ以上の、本発明のポリペプチドのヌクレオチド、ヌクレオシドまたは塩基対を含むことができる。また、特定のポリペプチドは、わずかに異なる核酸配列を有するが、それでも、同じまたは実質的に類似のタンパク質をコードする、変種を含んだ核酸によってコードされうることも考えられる(上記の表2を参照のこと)。
【０２５４】
特定の態様において、本発明は、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、Ebh、Coa、vWa、SpA、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質との組み合わせであってもよい、Emp、Eapおよび／またはAdsAをコードする核酸配列を組み入れた、単離核酸セグメントおよび組み換えベクターに関する。したがって、単離核酸セグメントまたは核酸セグメントを含んだベクターは、例えば、免疫原性である、Emp、Eapおよび／またはAdsA、ならびに/あるいはEsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、Ebh、Coa、vWa、SpA、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質をコードすることができる。「組み換え」という用語は、ポリペプチドまたは特定のポリペプチド名とともに用いることができ、これは一般に、インビトロにおいて操作されている核酸分子、またはこのような分子の複製産物である核酸分子から産生されたポリペプチドをいう。
【０２５５】
他の態様において、本発明は、被験体において免疫反応を生じさせるペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列を組み入れた、単離核酸セグメントおよび組み換えベクターに関する。さまざまな態様において、本発明の核酸は遺伝子ワクチンに用いることができる。
【０２５６】
本発明において用いられる核酸セグメントは、コード核酸それ自体の長さに関係なく、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなどのような、他の核酸配列と組み合わせることができ、したがってその全長はかなり変化することがある。それゆえ、ほぼすべての長さの核酸断片を利用することができ、その全長は精製の容易さおよび意図した組み換え核酸プロトコルでの用途によって制限されることが好ましいものと考えられる。場合によっては、核酸配列は、例えば、ポリペプチドの精製、輸送、分泌、翻訳後修飾を可能にするための、または標的化もしくは効力のような治療的有用性を可能にするための、さらなる異種コード配列を有するポリペプチド配列をコードすることができる。先に論じられるように、タグまたは他の異種ポリペプチドを、修飾されたポリペプチドをコードする配列に付加することができ、ここで「異種」とは、修飾されたポリペプチドと同じものではないポリペプチドをいう。
【０２５７】
ある種の他の態様において、本発明は、配列内にSEQ ID NO:1 (Emp)、SEQ ID NO:3 (Eap)、SEQ ID NO:5 (EsxA)、SEQ ID NO:7 (EsxB)、SEQ ID NO:9 (SdrD)、SEQ ID NO:11 (SdrE)、SEQ ID NO:13 (IsdA)、SEQ ID NO:15 (IsdB)、SEQ ID NO:17 (SpA)、SEQ ID NO:19 (ClfB)、SEQ ID NO:21 (IsdC)、SEQ ID NO:23 (SasF)、SEQ ID NO:25 (SdrC)、SEQ ID NO:27 (ClfA)、SEQ ID NO:29 (EsaB)、SEQ ID NO:31 (EsaC)、SEQ ID NO:33 (SasB)もしくはSEQ ID NO:35 (Sas)由来の隣接核酸配列、または分泌病毒性因子および／もしくは表面タンパク質をコードするその他任意の核酸配列を含んだ単離核酸セグメントおよび組み換えベクターに関する。
【０２５８】
ある種の態様において、本発明は、本明細書において開示される配列に対して実質的同一性を有するポリヌクレオチド変種、つまり本明細書において記述される方法(例えば、標準パラメータによるBLAST解析)を用い本発明のポリヌクレオチド配列と比べて、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%またはそれ以上の配列同一性を、その間の全ての値および範囲を含めて、含むものを提供する。ある種の局面において、本発明の単離ポリヌクレオチドは、本発明のアミノ酸配列に対し、配列の全長にわたって少なくとも90%、好ましくは95%およびそれ以上の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または該単離ポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含むであろう。
【０２５９】
本発明はまた、上述した全てのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの使用を企図する。
【０２６０】
本発明はまた、被験体に投与される場合に、ポリヌクレオチドと同じ免疫原性特性を有する本発明のポリヌクレオチド断片の使用を提供する。
【０２６１】
本発明はまた、先に定義した本発明のタンパク質の免疫学的断片をコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
【０２６２】
A. ベクター
本発明のポリペプチドは、ベクター中に含まれる核酸分子によってコードされてもよい。「ベクター」という用語は、異種核酸配列を、複製され発現されうる細胞へ導入するために、挿入できる担体核酸分子をいうように用いられる。核酸配列は「異種」であってよく、これは文脈中で、ベクターが導入されている細胞にとって、または核酸配列が組み入れられる核酸にとって核酸配列が異質であることを意味し、これには、細胞または核酸中の配列と同種であるが、しかし通常は見られない、宿主細胞または核酸内の位置にある配列が含まれる。ベクターにはDNA、RNA、プラスミド、コスミド、ウイルス(バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス)、ならびに人工染色体(例えば、YAC)が含まれる。当業者は、標準的な組み換え技術(例えば、ともに参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., 2001; Ausubel et al., 1996)を通じてベクターを構築するのに必要なものを十分に持っているであろう。Emp、EapまたはAdsAポリペプチドをコードすることに加えて、ベクターはEsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、Ebh、Coa、vWa、SpA、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質、あるいはその他任意のブドウ球菌ペプチドまたはタンパク質をコードすることができ、ベクターはタグまたは免疫原性増強ペプチドなどのポリペプチド配列をコードしてもよい。そのような融合タンパク質をコードする有用なベクターには、pINベクター(Inouye et al., 1985)、一続きのヒスチジンをコードするベクター、ならびに後の精製および分離または切断に向けたグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)可溶性融合タンパク質の作出で用いるpGEXベクターが含まれる。
【０２６３】
本発明のベクターを宿主細胞において用いEmpまたはEapまたはAdsAポリペプチドを産生することができる。ある種の局面において、ベクターは、被験体へ投与するために後で精製されうるEsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、Ebh、Coa、vWa、SpA、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質、あるいはその他任意のブドウ球菌ペプチドまたはタンパク質を産生してもよく、ベクターは、被験体におけるタンパク質の発現を目的に被験体へ直接投与するために精製されてもよい。
【０２６４】
「発現ベクター」という用語は、転写されうる遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターをいう。場合によっては、次にRNA分子をタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳する。発現ベクターは、特定の宿主生物において機能的に連結されたコード配列の転写およびおそらく翻訳にとって必要な核酸配列をいう種々の「制御配列」を含みうる。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能も果たす、かつ本明細書において記述する核酸配列を含んでもよい。
【０２６５】
1. プロモーターおよびエンハンサー
「プロモーター」は制御配列である。プロモーターは、典型的には、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である。これには、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子のような、調節タンパク質および分子が結合しうる遺伝要素を含めてもよい。「機能的に配置された」、「機能的に連結された」、「制御下」および「転写制御下」という語句は、プロモーターが核酸配列との関連で、その配列の転写開始および発現を制御するのに正しい機能的位置および／または方向にあることを意味する。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関わるシス作用調節配列をいう「エンハンサー」とともに用いられても用いられなくてもよい。
【０２６６】
プロモーターは、コードセグメントまたはエキソンの上流に位置する5'非コード配列を単離することによって得ることができるように、遺伝子または配列と天然に結び付いているものであってもよい。そのようなプロモーターは「内因性」ということができる。同様に、エンハンサーは、核酸配列と天然に結び付き、その配列の下流または上流のどちらかに位置したものであってよい。あるいは、核酸配列とその天然の環境においては通常結び付いていないプロモーターをいう組み換えまたは異種プロモーターの制御下に、コード核酸セグメントを配置することによって一定の利点が得られよう。組み換えまたは異種エンハンサーはまた、その天然の状態においては核酸配列と通常結び付いていないエンハンサーをいう。そのようなプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、およびその他任意の原核細胞、ウイルス、または真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「天然に存在する」ことのないプロモーターまたはエンハンサー、すなわち、異なる転写調節領域の異なる要素および／または発現を変化させる変異を含んだプロモーターまたはエンハンサーが含まれてもよい。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成により産生することに加え、本明細書において開示される組成物に関連して、組み換えクローニングおよび／またはPCR (商標)を含む核酸増幅技術を用いて配列を産生してもよい(それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,683,202号、米国特許第5,928,906号を参照のこと)。
【０２６７】
当然、発現用に選択された細胞種または生物においてDNAセグメントの発現を効率的に指令するプロモーターおよび／またはエンハンサーを利用することが重要でありうる。分子生物学の当業者は、タンパク質を発現させるためにプロモーター、エンハンサー、および細胞種の組み合わせを用いることを一般的に承知している(参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., 2001を参照のこと)。利用されるプロモーターは構成的、組織特異的または誘導的であってよく、ある種の態様において、組み換えタンパク質またはペプチドの大規模産生などの特定条件の下で、導入されたDNAセグメントの高レベル発現を指令しうる。
【０２６８】
遺伝子の発現を調節するために本発明との関連で種々の要素/プロモーターが用いられてもよい。特定の刺激に反応して活性化されうる核酸配列の領域である、そのような誘導性要素の例としては、免疫グロブリン重鎖(Banerji et al., 1983; Gilles et al., 1983; Grosschedl et al., 1985; Atchinson et al., 1986, 1987; Imler et al., 1987; Weinberger et al., 1984; Kiledjian et al., 1988; Porton et al.; 1990)、免疫グロブリン軽鎖(Queen et al., 1983; Picard et al., 1984)、T細胞受容体(Luria et al., 1987; Winoto et al., 1989; Redondo et al.; 1990)、HLA DQαおよび／またはDQβ(Sullivan et al., 1987)、βインターフェロン(Goodbourn et al., 1986; Fujita et al., 1987; Goodbourn et al., 1988)、インターロイキン-2 (Greene et al., 1989)、インターロイキン-2受容体(Greene et al., 1989; Lin et al., 1990)、MHCクラスII 5 (Koch et al., 1989)、MHCクラスII HLA-DRα(Sherman et al., 1989)、β-アクチン(Kawamoto et al., 1988; Ng et al.; 1989)、筋クレアチニンキナーゼ(MCK) (Jaynes et al., 1988; Horlick et al., 1989; Johnson et al., 1989)、プレアルブミン(トランスチレチン) (Costa et al., 1988)、エラスターゼI (Ornitz et al., 1987)、メタロチオネイン(MTII) (Karin et al., 1987; Culotta et al., 1989)、コラゲナーゼ(Pinkert et al., 1987; Angel et al., 1987)、アルブミン(Pinkert et al., 1987; Tronche et al., 1989, 1990); α-フェトプロテイン(Godbout et al., 1988; Campere et al., 1989)、γ-グロビン(Bodine et al., 1987; Perez-Stable et al., 1990)、β-グロビン(Trudel et al., 1987)、c-fos (Cohen et al., 1987)、c-Ha-Ras (Triesman, 1986; Deschamps et al., 1985)、インスリン(Edlund et al., 1985)、神経細胞接着分子(NCAM) (Hirsh et al., 1990); α1-アンチトリペイン(Latimer et al., 1990); H2B (TH2B)ヒストン(Hwang et al., 1990); マウスおよび／またはI型コラーゲン(Ripe et al., 1989)、グルコース調節タンパク質(GRP94およびGRP78) (Chang et al., 1989)、ラット成長ホルモン(Larsen et al., 1986)、ヒト血清アミロイドA (SAA) (Edbrooke et al., 1989)、トロポニンI (TN I) (Yutzey et al., 1989)、血小板由来増殖因子(PDGF) (Pech et al., 1989)、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(Klamut et al., 1990)、SV40 (Banerji et al., 1981; Moreau et al., 1981; Sleigh et al., 1985; Firak et al., 1986; Herr et al., 1986; Imbra et al., 1986; Kadesch et al., 1986; Wang et al., 1986; Ondek et al., 1987; Kuhl et al., 1987; Schaffner et al., 1988)、ポリオーマ(Swartzendruber et al., 1975; Vasseur et al., 1980; Katinka et al., 1980, 1981; Tyndell et al., 1981; Dandolo et al., 1983; de Villiers et al., 1984; Hen et al., 1986; Satake et al., 1988; Campbell et al., 1988)、レトロウイルス(Kriegler et al., 1982, 1983; Levinson et al., 1982; Kriegler et al., 1983, 1984a, b, 1988; Bosze et al., 1986; Miksicek et al., 1986; Celander et al., 1987; Thiesen et al., 1988; Celander et al., 1988; Choi et al., 1988; Reisman et al., 1989)、乳頭腫ウイルス(Campo et al., 1983; Lusky et al., 1983; Spandidos and Wilkie, 1983; Spalholz et al., 1985; Lusky et al., 1986; Cripe et al., 1987; Gloss et al., 1987; Hirochika et al., 1987; Stephens et al., 1987)、B型肝炎ウイルス(Bulla et al., 1986; Jameel et al., 1986; Shaul et al., 1987; Spandau et al., 1988; Vannice et al., 1988)、ヒト免疫不全ウイルス(Muesing et al., 1987; Hauber et al., 1988; Jakobovits et al., 1988; Feng et al., 1988; Takebe et al., 1988; Rosen et al., 1988; Berkhout et al., 1989; Laspia et al., 1989; Sharp et al., 1989; Braddock et al., 1989)、サイトメガロウイルス(CMV) IE (Weber et al., 1984; Boshart et al., 1985; Foecking et al., 1986)、テナガザル白血病ウイルス(Holbrook et al., 1987; Quinn et al., 1989)が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０２６９】
誘導性要素にはMT II-ホルボルエステル(TFA)/重金属(Palmiter et al., 1982; Haslinger et al., 1985; Searle et al., 1985; Stuart et al., 1985; Imagawa et al., 1987, Karin et al., 1987; Angel et al., 1987b; McNeall et al., 1989); MMTV (マウス乳腺腫瘍ウイルス)-グルココルチコイド(Huang et al., 1981; Lee et al., 1981; Majors et al., 1983; Chandler et al., 1983; Lee et al., 1984; Ponta et al., 1985; Sakai et al., 1988); β-インターフェロン-ポリ(rI)x/ポリ(rc) (Tavernier et al., 1983); アデノウイルス5 E2-E1A (Imperiale et al., 1984); コラゲナーゼ-ホルボルエステル(TPA) (Angel et al., 1987a); ストロメリシン-ホルボルエステル(TPA) (Angel et al., 1987b); SV40-ホルボルエステル(TPA) (Angel et al., 1987b); ネズミMX遺伝子-インターフェロン、ニューカッスル病ウイルス(Hug et al., 1988); GRP78遺伝子-A23187 (Resendez et al., 1988); α-2-マクログロブリン-IL-6 (Kunz et al., 1989); ビメンチン-血清(Rittling et al., 1989); MHCクラスI遺伝子H-2κb-インターフェロン(Blanar et al., 1989); HSP70-E1A/SV40ラージT抗原(Taylor et al., 1989, 1990a, 1990b); プロリフェリン-ホルボルエステル/TPA (Mordacq et al., 1989); 腫瘍壊死因子-PMA (Hensel et al., 1989); および甲状腺刺激ホルモンα遺伝子-甲状腺ホルモン(Chatterjee et al., 1989)が含まれるが、これらに限定されることはない。
【０２７０】
本発明のペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を制御するために利用される特定のプロモーターは、標的細胞、好ましくは細菌細胞においてポリヌクレオチドを発現できる限り、決定的に重要であるものとは考えられない。ヒト細胞が標的化される場合、ポリヌクレオチドコード領域を、ヒト細胞において発現されうるプロモーターの近傍かつ制御下に位置付けることが好ましい。一般的に言えば、そのようなプロモーターは細菌プロモーター、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターのいずれかを含みうる。
【０２７１】
さまざまな態様において、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)前初期遺伝子プロモーター、SV40初期プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス末端反復配列を用いて、Emp、AdsAおよび／またはEapポリヌクレオチドの高レベル発現を得ることができる。他の態様において、Emp、Eapおよび／またはAdsAをEsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、SpA、vWa、Coa、Ebh、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および／またはビトロネクチン結合タンパク質、あるいはその他任意の細菌ポリペプチドと組み合わせて発現させることができる。ポリヌクレオチドの発現を達成するために、当技術分野において周知である、他のウイルスプロモーターまたは哺乳類細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターを用いることも企図される。
【０２７２】
タンパク質の発現のため被験体にベクターが投与される態様において、ベクターとともに用いるのに望ましいプロモーターは、サイトカインによって下方制御されないもの、またはたとえ下方制御されても、免疫反応を誘発させるのに有効な量のEmp、Eapおよび／もしくはAdsAポリペプチドを産生するのに十分に強力なものであることが企図される。これらの非限定的な例はCMV IEおよびRSV LTRである。他の態様において、サイトカインの存在下で上方制御されるプロモーターが利用される。MHC Iプロモーターは、IFN-γの存在下で発現を増大する。
【０２７３】
特に発現が樹状細胞またはマクロファージのような、抗原の発現を所望とする細胞中であるなら、組織特異的プロモーターを用いることができる。哺乳類MHC IおよびMHC IIプロモーターは、そのような組織特異的プロモーターの例である。
【０２７４】
2. 開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位(IRES)
特異的開始シグナルもコード配列の効率的な翻訳に必要とされうる。これらのシグナルには、ATG開始コドンまたは隣接配列が含まれる。ATG開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルを提供する必要がありうる。当業者は容易にこれを決定して、必要なシグナルを提供することができるであろう。開始コドンは、挿入断片全体の翻訳を確実とするために所望のコード配列の読み取り枠と「インフレーム」でなければならないことは周知である。外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは天然または合成のどちらであってもよく、細菌または哺乳類細胞において機能的でありうる。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素を含めることによって増強されうる。
【０２７５】
本発明のある種の態様では、内部リボソーム進入部位(IRES)要素を用いて、多重遺伝子の、または多シストロン性の伝達暗号を作出する。IRES要素は、5'メチル化Cap依存的翻訳のリボソーム走査モデルを迂回して、内部部位で翻訳を開始することができる(Pelletier and Sonenberg, 1988)。ピコルナウイルス科の二つの成員(ポリオおよび脳心筋炎ウイルス)からのIRES要素(Pelletier and Sonenberg, 1988)とともに、哺乳類の伝達暗号からのIRES(Macejak and Sarnow, 1991)が記述されている。IRES要素は異種の読み取り枠に連結させることができる。IRESによって各々が隔てられた多数の読み取り枠をともに転写し、多シストロン性の伝達暗号を作出することができる。IRES要素によって、各読み取り枠は、効率的な翻訳に向けてリボソームに近づくことができる。単一のプロモーター/エンハンサーを用いて多数の遺伝子を効率的に発現させ、単一の伝達暗号を転写させることができる(参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,925,565号および同第5,935,819号を参照のこと)。
【０２７６】
3. 多クローニング部位
ベクターには、多数の制限酵素部位を含む核酸領域であって、そのうちのどれを標準的な組み換え技術と併せて用いベクターを消化してもよい、多クローニング部位(MCS)が含まれうる(参照により本明細書に組み入れられる、Carbonelli et al., 1999、Levenson et al., 1998およびCocea, 1997を参照のこと)。ベクターは、外因性の配列をベクターに核酸連結できるように、MCS内で切断を行う制限酵素を用いて直線化または断片化されることが多い。制限酵素および核酸連結反応を伴う技術は、組み換え技術の当業者に周知である。
【０２７７】
4. スプライシング部位
転写された真核生物RNA分子の大部分がRNAスプライシングを受けて、一次転写産物からイントロンを除去するであろう。ゲノム真核生物配列を含むベクターは、タンパク質の発現に適した転写産物のプロセッシングを確実とするためにドナーおよび／またはアクセプタースプライシング部位を必要としうる(参照により本明細書に組み入れられる、Chandler et al., 1997を参照のこと)。
【０２７８】
5. 終結シグナル
本発明のベクターまたは構築体は一般に、少なくとも一つの終結シグナルを含むであろう。「終結シグナル」または「ターミネータ」は、RNAポリメラーゼによるRNA転写産物の特異的終結に関わるDNA配列から構成される。したがって、ある種の態様では、RNA転写産物の産生を終了させる終結シグナルが企図される。ターミネータは、望ましい伝達暗号レベルを達成するのにインビボで必要となりうる。
【０２７９】
真核生物系において、ターミネータ領域は、ポリアデニル化部位を曝露するために、新たな転写産物の部位特異的切断を可能にする特異的DNA配列を含んでもよい。これは特異的な内因性ポリメラーゼにシグナルを送って、転写産物の3'末端に一続きの約200個のA残基(ポリA)を付加する。このポリA尾部で修飾されたRNA分子は、さらに安定なように思われ、さらに効率的に翻訳される。このように、真核生物を含む他の態様において、ターミネータは、RNAの切断のためのシグナルを含むことが好ましく、ターミネータシグナルは、伝達暗号のポリアデニル化を促進することがより好ましい。
【０２８０】
本発明において用いるために企図されるターミネータには、例えば、ウシ成長ホルモンターミネータ、またはSV40ターミネータのようなウイルス終結配列を含むが、これらに限定されない、本明細書において記述されているまたは当業者に知られている任意の公知の転写ターミネータが含まれる。ある種の態様において、終結シグナルは、配列の切断によるような、転写可能なまたは翻訳可能な配列の欠如であってもよい。
【０２８１】
6. ポリアデニル化シグナル
発現において、特に真核生物発現において、典型的には、転写産物の適切なポリアデニル化をもたらすためにポリアデニル化シグナルを含めるであろう。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実践の成功にとって決定的に重要であるものとは考えられず、および／またはそのようないかなる配列を利用してもよい。好ましい態様にはさまざまな標的細胞において好都合のおよび／または十分に機能することが公知の、SV40ポリアデニル化シグナルおよび／またはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化は転写産物の安定性を増大し、または細胞質輸送を促進しうる。
【０２８２】
7. 複製起点
宿主細胞においてベクターを増殖させるために、ベクターは、複製が開始される特異的核酸配列である一つまたは複数の複製起点部位(「ori」と呼ばれることが多い)を含んでもよい。あるいは宿主細胞が酵母であれば、自己複製配列(ARS)が利用されてもよい。
【０２８３】
8. 選択可能およびスクリーニング可能なマーカー
本発明のある種の態様において、本発明の核酸構築体を含む細胞は、発現ベクターの中にスクリーニング可能または選択可能なマーカーをコードすることによってインビトロまたはインビボで同定することができる。転写され翻訳される場合、マーカーは同定可能な変化を細胞に付与し、発現ベクターを含んだ細胞の容易な同定を可能にする。一般的に、選択可能なマーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。陽性選択可能なマーカーは、マーカーが存在することでその選択が可能になるものであるのに対し、陰性選択可能なマーカーは、マーカーが存在することでその選択が妨害されるものである。陽性選択可能なマーカーの例は、薬物耐性マーカーである。
【０２８４】
通常、薬物選択マーカーを含めることは形質転換体のクローニングおよび同定に役立ち、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシンまたはヒスチジノールに対する耐性を付与するマーカーは、有用な選択可能なマーカーである。条件の実行に基づいて形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、他のタイプのマーカーには比色分析用のGFPなどのスクリーニング可能なマーカーが含まれる。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(tk)またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)のようなスクリーニング可能な酵素が利用されてもよい。当業者はまた、FACS分析とともに使用できる免疫学的マーカーを利用する方法を承知しているであろう。使用されるマーカーは、本発明のタンパク質をコードする核酸と同時に発現されうる限り、重要であるものとは考えられない。選択可能およびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
【０２８５】
B. 宿主細胞
本明細書において用いられる場合、「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」という用語は互換的に用いることができる。これらの用語の全てが、任意のおよび全ての次世代の、その子孫も含む。故意または偶然の変異により全ての子孫が同一ではないことがあると理解されよう。異種核酸配列を発現するという文脈において、「宿主細胞」とは、原核細胞または真核細胞をいい、これには、ベクターを複製できるまたはベクターによってコードされる異種遺伝子を発現できる、任意の形質転換可能な生物が含まれる。宿主細胞はベクターまたはウイルスのレシピエントとして、使用されることができ、使用されている。宿主細胞は「形質移入」または「形質転換」されてもよく、それらは組み換えタンパク質をコードする配列などの、外因性の核酸が宿主細胞に移入または導入される過程をいう。形質転換細胞には、初代被験細胞およびその子孫が含まれる。
【０２８６】
ベクターの複製または核酸配列の一部もしくは全部の発現のための細菌、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞を含め、宿主細胞は原核生物または真核生物に由来することができる。多数の細胞株および培養物が宿主細胞用として利用可能であり、それらは、生きている培養物および遺伝物質のための保管庫としての機能を果たす機構であるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC) (www.atcc.org)を通じて入手することができる。当業者はベクター骨格および所望の結果に基づいて適切な宿主を判定することができる。例えば、プラスミドまたはコスミドを、多くのベクターの複製またはコードされるタンパク質の発現のために原核宿主細胞に導入することができる。ベクターの複製および／または発現用の宿主細胞として用いられる細菌細胞には、ブドウ球菌株、DH5α、JM109およびKC8、ならびにSURE(登録商標) Competent CellsおよびSOLOPACK(商標) Gold Cells (STRATAGENE(登録商標), La Jolla, CA)のような、いくつかの市販の細菌宿主が含まれる。あるいは、大腸菌LE392などの細菌細胞をファージウイルスの宿主細胞として用いることもできる。適切な酵母細胞にはサッカロマイセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・ポンベ(Saccharomyces pombe)およびピチア・パストリス(Pichia pastoris)が含まれる。
【０２８７】
ベクターの複製および／または発現用の真核宿主細胞の例としては、HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、SaosおよびPC12が挙げられる。さまざまな細胞型および生物由来の多くの宿主細胞が利用可能であり、当業者に公知であろう。同様に、ウイルスベクターを真核または原核宿主細胞のどちらか、特にベクターの複製または発現に許容性である細胞と併せて用いることもできる。
【０２８８】
ベクターのなかには原核細胞でも真核細胞でもともに複製および／または発現されることを可能にする制御配列を利用できるものもある。当業者なら、上記の宿主細胞のどれについてもインキュベートしてそれらを維持するための、かつベクターの複製を可能にするための条件をさらに理解するであろう。同様に理解され知られているのは、ベクターの大規模産生、ならびにベクターによってコードされる核酸およびその同源のポリペプチド、タンパク質またはペプチドの産生を可能にしうる、技術および条件である。
【０２８９】
C. 発現系
先に論じた組成物の少なくとも一部または全部を含む多数の発現系が存在する。原核生物および／または真核生物に基づく系を本発明で用いるために利用して、核酸配列、またはその同源のポリペプチド、タンパク質およびペプチドを産生することができる。そのような多くの系が市販されており、広く利用可能である。
【０２９０】
昆虫細胞/バキュロウイルス系は、ともに参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,871,986号、同第4,879,236号に記述されているように、異種核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現をもたらすことができ、例えば、INVITROGEN(登録商標)からMAXBAC(登録商標) 2.0の名称で、およびCLONTECH(登録商標)からBACPACK(商標) BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEMの名称で購入することができる。
【０２９１】
本発明の開示の発現系に加え、発現系の他の例としては、合成エクダイソン誘導性受容体またはそのpET発現系、つまり大腸菌発現系を伴う、STRATAGENE(登録商標)のCOMPLETE CONTROL(商標) Inducible Mammalian Expression Systemが挙げられる。誘導性発現系の別の例はINVITROGEN(登録商標)から入手可能で、T-REX (商標) (テトラサイクリン調節発現)系、つまり全長CMVプロモーターを用いた誘導性の哺乳類発現系を有するものである。INVITROGEN(登録商標)は、メチロトローフ酵母ピチアメタノリカ(Pichia methanolica)における組み換えタンパク質の高レベル産生のためにデザインされた、Pichia methanolica Expression Systemと呼ばれる酵母発現系も提供している。当業者なら、発現構築体のようなベクターを発現させる方法、核酸配列またはその同源のポリペプチド、タンパク質もしくはペプチドを産生する方法を承知しているであろう。
【０２９２】
D. 核酸の増幅
増幅の鋳型として用いられる核酸は、標準的な方法論(Sambrook et al., 2001)にしたがって細胞、組織または他のサンプルから単離されてもよい。ある種の態様において、鋳型核酸を実質的に精製することなく、サンプルに関して分析を行う。核酸はゲノムDNAであってもよい。RNAが用いられる場合には、RNAを相補的DNAに最初に変換することが望ましいかもしれない。
【０２９３】
本明細書において用いられる「プライマー」という用語は、鋳型依存的過程において新生核酸の合成をプライミングできる任意の核酸を包含することを意味する。典型的には、プライマーは、長さが10〜20および／または30塩基対のオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列を利用することができる。プライマーは二本鎖および／または一本鎖型で提供されてもよいが、一本鎖型が好ましい。
【０２９４】
本明細書において同定された遺伝子の配列に対応する核酸と選択的にハイブリダイズするようにデザインされたプライマー対を、選択的ハイブリダイゼーションを可能にする条件の下で鋳型核酸と接触させる。所望の用途に応じて、プライマーと完全に相補的である配列とのハイブリダイゼーションだけを可能にしうる高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件が選択されてもよい。他の態様において、ハイブリダイゼーションは、プライマー配列と一つまたは複数のミスマッチを含んだ核酸の増幅を可能とするように低減されたストリンジェンシーの下で行われてもよい。ハイブリダイズしたら、鋳型依存的な核酸合成を促進する一つまたは複数の酵素と鋳型-プライマー複合体を接触させる。十分量の増幅産物が産生されるまで、「サイクル」とも呼ばれる多数ラウンドの増幅を行う。
【０２９５】
所与の鋳型サンプルに存在するオリゴヌクレオチド配列を増幅するのに、いくつかの鋳型依存的過程が利用可能である。最もよく知られている増幅法の一つは、それぞれの全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号および同第4,800,159号、ならびにInnis et al., 1988に詳細に記述されているポリメラーゼ連鎖反応(PCR(商標)といわれる)である。
【０２９６】
本発明の実践において使用できる標的核酸配列の増幅のための代替的方法は、それぞれの全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,843,650号、同第5,846,709号、同第5,846,783号、同第5,849,546号、同第5,849,497号、同第5,849,547号、同第5,858,652号、同第5,866,366号、同第5,916,776号、同第5,922,574号、同第5,928,905号、同第5,928,906号、同第5,932,451号、同第5,935,825号、同第5,939,291号、および同第5,942,391号、英国特許出願第2 202 328号、ならびにPCT出願番号PCT/US89/01025号に開示されている。
【０２９７】
E. 遺伝子移入法
本発明の組成物の発現をもたらすのに適した核酸送達の方法は、本明細書において記述されるようにまたは当業者に公知であるように、核酸(例えば、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含む、DNA)を細胞、組織または生物に導入できる実質的にいかなる方法も含むものと考えられる。そのような方法には、微量注入(参照により本明細書に組み入れられる、Harland and Weintraub, 1985; 米国特許第5,789,215号)を含む注入(それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,994,624号、同第5,981,274号、同第5,945,100号、同第5,780,448号、同第5,736,524号、同第5,702,932号、同第5,656,610号、同第5,589,466号および同第5,580,859号)による; 電気穿孔(参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,384,253号)による; リン酸カルシウム沈殿(Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990)による; DEAEデキストランの後にポリエチレングリコールを用いること(Gopal, 1985)による; 直接超音波負荷(Fechheimer et al., 1987)による; リポソーム媒介トランスフェクション(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991)による; または微小発射物衝突(それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、PCT出願番号WO 94/09699および95/06128; 米国特許第5,610,042号; 同第5,322,783号、同第5,563,055号、同第5,550,318号、同第5,538,877号および同第5,538,880号)によるような、DNAの直接送達が含まれるが、これらに限定されることはない。これらのような技術の適用によって、オルガネラ、細胞、組織または生物は、安定的または一過的に形質転換されうる。
【実施例】
【０２９８】
VII. 実施例
以下の実施例は、本発明のさまざまな態様を例証する目的で与えられており、いかなる形においても本発明を限定することを意図するものではない。本発明は本明細書の中にある目標、目的および利点のほかに、言及されている、目標を実行するために、かつ目的および利点を得るために十分に適していることを当業者は容易に理解するであろう。本実施例は、本明細書において記述される方法とともに、目下、好ましい態様を代表するものであり、例示するものであり、本発明の範囲に対する限定と意図するものではない。その変更および特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨のなかに包含されるその他の用途が、当業者には思い浮かぶであろう。
【０２９９】
実施例1 膿瘍形成およびワクチン防御と関連する外膜タンパク質
A. 結果
本発明者らは、ブドウ球菌膿瘍形成の発病を研究し、この病変部内でのブドウ球菌の生存および増殖を可能にする細菌因子を同定しようとした。本研究では、マウスに致死未満量の黄色ブドウ球菌を感染させ、持続的感染を発現させるネズミ腎膿瘍モデル(Burts et al., 2005)を用いた。感染後5日目にマウスを殺処理し、その腎臓を切除し、薄切片ヘマトキシリン・エオシン染色組織の病理組織診断に供し、または、コロニー形成単位(CFU)に向けた組織ホモジネートのプレーティングによるブドウ球菌負荷の数え上げに供した。野生型の臨床分離ブドウ球菌Newman (Baba et al., 2008)と比べて、ソルターゼAに対する構造遺伝子の中にトランスポゾンの挿入がある同質遺伝子変種は、膿瘍を形成できなかった(図1B、1Dおよび1F)。細胞壁外膜にLPXTGモチーフ選別シグナルを有する広範な表面タンパク質を固定するソルターゼAは、多くの異なる病毒性因子の表面提示に関与している(Mazmanian et al., 2000; Mazmanian et al., 1999)。膿瘍形成を定量化するために、腎臓を目視検査し、各個々の器官に1 (表面膿瘍あり)または0 (なし)のスコアをつけた。最終の合計を腎臓の総数で割って小数値を得た。さらに、無作為に選択した3つの右側腎臓を終夜10%ホルマリンに入れ、包埋し、薄片を作り、およびヘマトキシリン・エオシンで染色した。腎臓ごとに、200 μMの間隔で4つの矢状断面を顕微鏡で見た。いずれの検査面にも病変部が観察されたなら、その器官を膿瘍形成陽性と判断した。3×107 CFU/mlの黄色ブドウ球菌Newmanに感染したマウスは、腎臓16/20に可視病変部(表面膿瘍80%)を呈し、病理組織診断について調べた腎臓3/3で膿瘍形成が陽性であった（表３）。対照的に、ΔsrtA変異体に感染したマウスは表面膿瘍0%および組織学的病変3中0 (0/3)を示した（表３）。
【０３００】
（表３） 回収された標準誤差付きのCFU、Newmanに対してのlog低下、P値(スチューデントt検定)、観察された表面膿瘍割合％、#観察された組織学的膿瘍
2012504660.tif 000010
a攻撃菌株あたりBALB/cマウス15匹のコホートにおいて感染から5日後のホモジナイズ腎組織でlog10 CFU g-1として計算されたコロニー形成単位(CFU)におけるブドウ球菌負荷の平均。平均の標準誤差(±SEM)が示してある。
b統計的有意性をスチューデントt検定で計算し、P値を記録した。
clog10 CFU g-1として計算された細菌負荷の低下。
c感染から5日後の腎臓組織における膿瘍形成を、動物3匹からヘマトキシリン・エオシン染色し、薄切片にした組織の顕微鏡検査(%陽性)および病理組織診断によって測定し、それによって陽性組織を小数値(3/n)として記録した。
回収された標準誤差付きのCFU、Newmanに対してのlog低下、P値(スチューデントt検定)、観察された表面膿瘍%、#観察された組織学的膿瘍。
【０３０１】
走査電子顕微鏡法を用いて感染組織を調べた
腎臓を切片にし、固定し、ヘキサメチルジシラザン(HMDS)中で脱水し、観察の前に80%Pt/20%Pdでスパッタコートした。黄色ブドウ球菌Newmanに感染した腎臓組織は、膿瘍の中心領域内に細菌を含んでいた。野生型ブドウ球菌は、密に結び付いた菌叢に見られ(図1G)、さらに大きな線維嚢内部の線維構造に被包されていた。これらのブドウ球菌巣は白血球を欠いており、接着性の細胞外マトリックスによって埋め込まれているように思われる。srtA変異体に感染した腎臓組織もブドウ球菌を含んでいたが、細菌は健常腎組織中に分散しており、野生型と比べて数が著しく低下していた(図1H)。
【０３０２】
膿瘍形成に関与する特異的なソルターゼA基質を同定するために、17種のソルターゼ基質遺伝子におけるブルサアウレアリスの挿入(Bae et al., 2004)を黄色ブドウ球菌Newmanへ形質導入し、病毒性欠陥を目的にそれらの変種をスクリーニングした。sdrD、isdB、clfB、isdA、sasBおよびsasDにおける変異は、著しく低下した細菌負荷(P<0.05)を引き起こした(図2)。さらに、sdrD、isdBおよびisdAにおける変異は、巨視的および微視的技術によって分析した場合、より少ない膿瘍を呈した（表３）。本発明者らは、<30%の表面膿瘍および<1/3の組織学的スコアを有する変異体が膿瘍形成の有意な欠陥を示すものと考えた。不整合な表面組織学的スコアを有する変異体は、欠陥とカウントしなかった; むしろ、それはスクリーニング誤差によるものである。興味深いことに、clfBおよびsasBにおける変異は、ブドウ球菌負荷の欠陥を示したが、膿瘍形成の欠陥は示さなかったのに対し、プロテインAにおける変異は負荷の増大を呈したが、膿瘍形成の欠陥も呈した。腎組織における膿瘍形成および生存の欠陥は、これらの変異体が機能的な生物膜を形成できないことによるものではないかと本発明者らは考えた。換言すれば、膿瘍形成の欠陥はインビトロでの生物膜成長の欠陥によるものかもしれない。これについて調べるため、本発明者らは、96ウェルアッセイプレート中でまたはカバースリップ上でブドウ球菌を培養し、405 nmでの吸光度によってサフラニン染色された生物膜を測定した。黄色ブドウ球菌Newmanは実験用ブロス中で生物膜を形成しないが、Morrisseyおよびその仲間らは、鉄枯渇RPMIおよび5%大気CO2中での生物膜の増殖を報じている(Johnson et al., 2008)。これらの条件を用い、ここで試験した変異株は全て、同じようによく増殖した(データ不掲載)が、srtA、isdB、sdrDまたはisdAにおける変異は生物膜形成の有意(P<0.05)な欠陥を示した。これらの結果は走査電子顕微鏡実験(図3B、3C、3D、3E、3F、3Gおよび表4)によって裏付けられ、このなかで黄色ブドウ球菌Newmanは、粒状の細胞外マトリックスに埋め込まれた多細胞複合体として増殖した(図3B)。srtA、isdBまたはsdrDにおける変異、つまりマウスにおいて膿瘍形成を同様に消失させた同一の変異を有するブドウ球菌では多細胞複合体が低減され、細胞外マトリックスが減弱される。したがって、インビトロでの生物膜形成を実際に、ブドウ球菌が膿瘍を形成する能力と関連付けることができる。本発明者らは、ポリ-N-アセチルグルコサミン(ica遺伝子の産物により合成されるPNAG/PIA) (Heilmann et al., 1996; Gotz, 2002)ならびに細胞壁結合タンパク質Eap (Scriba et al., 2008; Xie et al., 2006)およびEmp (Hussain et al., 2001)を含め、ブドウ球菌における他の外膜因子の合成を抑止する遺伝子における変異についても試験した。ブドウ球菌の病毒性に対する修飾因子: saeR (Novick and Jiang, 2003)、sarA (Cheung et al., 1992)、mgrA (Chen et al., 2006)、agrCおよびagrA (Novick, 2003)についても調べた。empにおける変異は、サフラニン吸光度の86%低下および走査EMによる多細胞複合体の存在なしと、生物膜形成の最大の欠陥、つまりJohnsonら(2008)の類似の研究と一致する結果を示した。対照的に、Eap変異体は生物膜形成のわずかな、しかし有意な欠陥を示した(図3A、表4)。EmpおよびEapは、ブドウ球菌と宿主細胞外マトリックスタンパク質のフィブロネクチン、ビトロネクチン(vibronectin)およびコラーゲンとの間の相互作用を媒介する外膜付着因子である(Scriba et al., 2008; Xie et al., 2006; Hussain et al., 2001)。配列決定された黄色ブドウ球菌株の全てが両タンパク質に対する遺伝子を持っており、これらは二成分系SaeRSおよび包括的転写因子SarAによって正に調節され、その変異も生物膜形成に影響を与える(Harraghy et al., 2005) (図3A、表4)。
【０３０３】
（表４） 96ウェルプレートでのインビトロ生物膜アッセイ。標準誤差付きの450 nmでの平均吸光度、Newmanの吸光度からの分数低下率、P値(スチューデントt検定)
2012504660.tif 000011
【０３０４】
Empが膿瘍形成に必要であるかどうか調べるために、マウスをemp変異体ブドウ球菌で攻撃し、感染から5日後に腎臓を分析した。emp変異体ブドウ球菌は腎臓組織から野生型の親株と類似の存在量で分離された(図4A)が、これらの変異体は膿瘍を形成することができず、その代わりに、腎臓組織中に分散したままであった(図4B)。これらの結果は、Empを、インビトロおよびインビボでの膿瘍および生物膜の形成に一意的に必要な外膜因子と同定するものである。PNAG合成を媒介する(Heilmann et al., 1997)、ica遺伝子(icaABCDR)における変異は、生物膜形成のほんのわずかな減少しか示さなかったことに留意されたい。ica変異体は、エキソ多糖類を産生できないが、電子顕微鏡法によって検出できる細胞外マトリックスを作出することができた。さらに、ica変異体は、膿瘍形成または細菌負荷のインビボでの欠陥を示すことができなかった(図6A、6B、表5)。これらのデータはそれゆえ、黄色ブドウ球菌Newman生物膜の細胞外マトリックスがPNAGで構成されていないことを示唆している。EmpおよびEapは細胞壁結合表面タンパク質であり、その産生は、ブドウ球菌のSDS抽出およびクマシー染色PAGE上での分離によって検出することができる(図5A)。このアッセイ法により、黄色ブドウ球菌Newmanが大量のEapおよびEmpを産生することが認められた。srtAまたはisdBにおける変異は、膿瘍および生物膜の形成において観察されたsrtAおよびisdB変異体の欠陥がEapおよびEmpに対する二次的影響によるものではないという推測に一致して、EmpおよびEapの産生または細胞壁結合に影響を与えない。注目すべきは、empにおける変異はEapの存在量に影響を与え、Empの外膜沈着がEapの表面提示に影響を与えうるものと推定される。
【０３０５】
（表５） Ica病毒性
平均回収CFU、Newmanからのlog低下、P値(スチューデントt検定)、観察された表面膿瘍%、#組織学的膿瘍
2012504660.tif 000012
【０３０６】
どちらのタンパク質もブドウ球菌表面に顕著に提示されるので、本発明者らは、EmpおよびEapがブドウ球菌疾患を予防するのに適したワクチン抗原になるものと考えた。各タンパク質に対する構造遺伝子をpET15bにクローニングし、組み換え産物を変性条件の下でN末端His-6タグを介して親和性クロマトグラフィーにより精製した。精製の後、Eapは折り畳み可能となり、可溶性産物を再生用緩衝液中で第二ラウンドのNi-NTAクロマトグラフィーにより精製した。精製Empは再折り畳み不能となり、それからは、8 M尿素中に保持された(図5B)。PBS、完全フロインドアジュバント(CFA)中で乳化されたEapまたはEmpでマウスを免疫し、マウスを3×107 CFUの黄色ブドウ球菌Newmanで攻撃した。図5Cは、EmpまたはEapによる免疫がブドウ球菌感染に対して有意な防御(P<0.05)を与えたことを示している。Eapをワクチン接種したマウスは、ブドウ球菌負荷の2 logの低下を示したのに対し、Emp免疫マウスは2.5 logの低下を示した。Eap (24,000分の1)またはEmp (>64,000)で免疫されたマウスは、高力価の反応性IgGを発現した(図5D)。予想通り、PBSでモック免疫された動物は表面膿瘍70%および組織学的膿瘍5中4 (4/5)を発現した。対照的に、EapおよびEmpで免疫されたマウスは、表面膿瘍<20%および組織学的病変5中1 (1/5)を呈した(図5E)。このように、EapまたはEmpによる免疫は、ブドウ球菌に対する特異的な体液性免疫反応および防御免疫を生み出す。
【０３０７】
いくつかの研究から、感染宿主組織におけるブドウ球菌の生物膜成長と膿瘍形成能との間の関連性が明らかにされている。以前の研究から、生物膜はコロニー形成および移植された医療装置の持続感染に必要であり、抗生物質、抗体および食細胞からの防御を可能にすることが確立されている。ここで提示される証拠は、生物膜が効果的な播種および器官組織内でのブドウ球菌の持続的増殖に必要であることを示唆するものである。3つのソルターゼ基質遺伝子、つまり膿瘍形成、感染組織でのブドウ球菌負荷およびインビトロでの生物膜成長の組み合わせ欠陥を示したsdrD、isdBおよびisdAが同定された。特に、これらの表面タンパク質遺伝子の産物はまた、ブドウ球菌ソルターゼ固定表面タンパク質の比較評価において最初のワクチン候補と同定された(Stranger-Jones et al., 2006)。現在、そのような特質はまた、二つの細胞壁結合因子EmpおよびEapに広げることができる。少なくともempは膿瘍形成および生物膜成長に必要であり、Emp産物での免疫によってブドウ球菌疾患に対する防御免疫が得られる。このように、これらの研究は、黄色ブドウ球菌のヒト感染を予防するのに適したワクチン候補のリストを広げて細胞壁固定タンパク質および細胞壁結合タンパク質を選択するものであり、その複合処方物は全てのブドウ球菌株に対して強力な防御免疫を与えるはずである。
【０３０８】
ブドウ球菌膿瘍形成および持続感染の動物モデル
黄色ブドウ球菌膿瘍形成の発病を特徴付けるために、腎膿瘍モデルを改変し(Albus et al., 1991)、このなかでBALB/cマウスに静脈内注射によって1×107 CFUのヒト臨床分離株の黄色ブドウ球菌Newmanを感染させた(Baba et al., 2007)。感染後6時間以内に、99.999%のブドウ球菌が血流から消失し、脈管構造を介して行き渡った(図7A)。末梢組織へのブドウ球菌の播種は、腎臓および他の末梢器官組織における細菌負荷が最初の3時間以内に1×105 CFU g-1に達したことから、急速に起こった(図7B)。腎臓組織におけるブドウ球菌の負荷は、24時間以内に1.5 log CFUまで増加した(図7B)。感染から48時間後に、マウスはヘマトキシリン・エオシン染色し、薄切片にした腎臓組織の光学顕微鏡検査によって検出可能な、多器官における播種性膿瘍を発現した(図7D〜K)。初期の膿瘍直径は524 μM (± 65 μM)であった。病変部は病初では多形核白血球(PMN)の流入が目立ち、識別可能なブドウ球菌組織化がなく、その大部分はPMN内に存在するものと思われた(図8A〜C)。感染5日目に、膿瘍はサイズが増大し、好酸球性の無形性物質の層および大きなPMNカフで囲まれた、中心のブドウ球菌集団を含んでいた(図8D〜F)。病理組織診断によって、膿瘍病変部の中心にあるブドウ球菌巣のすぐ近くでのPMNの大量壊死および一面の正常食細胞が明らかになった(図8D〜F)。正常腎組織を感染病変部から分離していた好酸球性の無形性物質に隣接する、膿瘍病変部周辺の壊死PMNの縁も観察された(図8D〜F)。膿瘍は15または36日目に≧ 1,524 μMの直径に最終的に達した(図7K)。もっと後の時間間隔で、ブドウ球菌負荷は104〜106 CFU g-1まで増大し、成長中の膿瘍病変部は器官被膜の方へ移動した(図7J〜K)。末梢病変部は裂けやすく、それによって壊死物質およびブドウ球菌を腹膜腔または後腹膜腔へ放出した。これらの事象は菌血症および膿瘍の第二波を引き起こし、最終的には、これらの感染の致死的転帰を招いた(データ不掲載)。
【０３０９】
ブドウ球菌膿瘍群集は偽被膜に囲まれている
腎組織における細菌負荷を数え上げるために、動物を殺処理し、その腎臓を切除し、コロニー形成のため組織ホモジネートを寒天培地上に広げた。感染5日目に、黄色ブドウ球菌Newmanに対して平均1×106 CFU g-1腎組織が観察された(図9P)。膿瘍形成を定量化するために、腎臓を目視検査し、各個々の器官に1 (図9A)または0 (図9F)のスコアをつけた。最終の合計を腎臓の総数で割って%表面膿瘍を計算した（表６）。さらに、無作為に選択した腎臓をホルマリン中で固定し、包埋し、薄片を作り、およびヘマトキシリン・エオシンで染色した。腎臓ごとに、200 μMの間隔で4つの矢状断面を顕微鏡で見た(図9)。病変部の数を切片ごとにカウントし平均して、腎臓内の膿瘍の数を定量化した。黄色ブドウ球菌Newmanは腎臓あたり4.364±0.889個の膿瘍を引き起こし、腎臓20個のうち14個(70%)で表面膿瘍が観察された（表６）。
【０３１０】
腎臓を切片にし、固定し、脱水し、走査電子顕微鏡法のために白金／パラジウムでスパッタコートした。図10Aは、膿瘍の中心にある密に結び付いた菌叢中の黄色ブドウ球菌Newmanを示す。ブドウ球菌は、細菌を膿瘍白血球のカフから分離していた無定形の偽被膜(白矢じり、図10A)に被包されていた。これら中心のブドウ球菌巣の中に免疫細胞は認められなかったが、時折、赤血球が細菌の間に位置していた(R、図10A)。ブドウ球菌膿瘍群集(SAC)と名付けた、膿瘍中心の細菌集団は、均質に見え、電子密度の高い顆粒状物質によって被膜されていた。感染病変部の外観の動態および黄色ブドウ球菌Newmanによって形成された膿瘍の形態的特質は、黄色ブドウ球菌USA300 (LAC)、つまり米国において現在まん延している市中獲得型メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(CA-MRSA)クローン(Diep et al., 2006)によるマウスの感染後に観察されたものに類似していた(図9K〜Oおよび10C)。
【０３１１】
（表６） マウスにおける黄色ブドウ球菌Newmanの膿瘍形成に対する遺伝的要件
2012504660.tif 000013
a攻撃菌株あたりBALB/cマウス15匹のコホートにおいて感染から5日後のホモジナイズ腎組織でlog10 CFU g-1として計算されたブドウ球菌負荷の平均。平均の標準誤差(±SEM)が示してある。
b統計的有意性をスチューデントt検定で計算し、P値を記録した; P値<0.05を有意と見なした。
clog10 CFU g-1として計算された細菌負荷の低下。
d感染から5日後の腎臓組織における膿瘍形成を巨視的検査(%陽性)により測定した。
e動物8〜10匹からヘマトキシリン・エオシン染色し、薄切片にした腎臓の病理組織診断; 腎臓あたりの平均膿瘍数を記録し、最終平均(±SEM)を目的に再び平均化した。
f統計的有意性をスチューデントt検定で計算し、P値を記録した。P値<0.05を有意と見なした。
【０３１２】
ソルターゼ変異体は膿瘍病変部を樹立できず、存続できない
ソルターゼAは、黄色ブドウ球菌株Newmanの外膜中に19種の表面タンパク質を固定化するトランスペプチダーゼである(Mazmanian et al., 1999; Mazmanian et al., 2000)。以前の研究では、多数の動物モデル系においてソルターゼAを病毒性因子と同定しているが、膿瘍の形成または存続へのこの酵素およびその固定表面タンパク質の寄与はまだ明らかにされていない(Jonsson et al. 2002; Weiss et al., 2004)。野生型の親株と比べて(Baba et al., 2007)、同質遺伝子srtA変種(ΔsrtA)は2、5または15日目に肉眼検査または病理組織学的検査のいずれに関しても膿瘍病変部を形成できなかった(図9F〜Jおよび表6)。strA変異体に感染したマウスでは、感染5日目に腎臓組織から1×104 CFU g-1しか回収されず、これは野生型の親株と比べて2.046 log10 CFU g-1の低下である(P=6.73×10-6) (図9P)。類似の欠陥はMRSA株USA300のsrtA変異体にも観察された(データ不掲載)。走査電子顕微鏡法から、srtA変異体(矢じり)が、その他の点では健常な腎組織において高度に分散し、多くの場合、白血球と結び付いていることが示された(図10B)。感染後15日目に、srtA変異体は、腎組織から除去され、野生型と比べて≧ 3.5 log10 CFU g-1の低下であった(図9P)。このように、ソルターゼA固定表面タンパク質は、宿主組織において膿瘍病変部の形成および細菌の存続を可能にし、その場所でブドウ球菌は、細胞外マトリックスに埋め込まれ、かつ無定形の偽被膜により周囲の白血球から保護された群集として複製する。
【０３１３】
ブドウ球菌表面タンパク質に対する遺伝的要件
ソルターゼAは、LPXTGモチーフ選別シグナルを有する広範なタンパク質を細胞壁外膜に固定し、それによって多くの病毒性因子の表面提示を可能にする(Mazmanian et al., 2002)。ブドウ球菌膿瘍形成に必要な表面タンパク質を同定するために、LPXTGモチーフタンパク質を有するポリペプチドをコードする遺伝子の5'コード配列の中にブルサアウレアリスの挿入を導入し(Bae et al., 2004)、これらの変異を黄色ブドウ球菌Newmanへ形質導入した。マウスの静脈内感染および腎膿瘍モデルを通じた分析の後、観察された病毒性欠陥の重度を、ブドウ球菌CFU g-1平均のlog10の低下としてランク付けした(図11および表6)。sdrD、isdB、clfB、isdA、clfAおよびisdCにおける変異は、細菌負荷の低下を引き起こした（表６）。本発明者らは、表面膿瘍が<30%またはそれ以下および組織学的膿瘍平均がP<0.05の変異体を、膿瘍形成の欠陥について有意と考え、これには、sdrD、isdBおよびisdAにおいて変異を有する変種が含まれた（表６）。興味深いことに、clfAおよびclfBにおける変異は、ブドウ球菌負荷の欠陥を示したが、膿瘍形成の欠陥は示さなかった(図11)。これらの病毒性の所見は、クランピング因子タンパク質がフィブリノゲン結合および貪食排除に対する耐性、つまり血中での病原菌の生存および播種に必要な特質を媒介するということを示唆している過去の研究と一致している(McDevitt et al., 1994; Ni Eidhin et al. 1998)。プロテインAは、免疫グロブリンのFc成分に結合することによって食作用を妨害し(Uhlen et al., 1984; Jensen et al., 1958)、フォン・ヴィレブランド因子を介して血小板凝集を活性化し(Hartleib et al., 2000)、VH3を持つIgMのFab領域を捕捉することによってB細胞超抗原として機能し(Roben et al., 1995)、および、そのTNFR1活性化を通じて、ブドウ球菌性肺炎を引き起こすことができる(Gomez et al., 2004)。プロテインA変異体(spa)は、ブドウ球菌負荷の中程度の低下を示した(5日目)が、野生型、clfAおよびclfB菌株とは対照的に、spa変種が膿瘍を形成する能力は減少した(図11および表6)。
【０３１４】
ブドウ球菌の糖鎖および外膜結合タンパク質
黄色ブドウ球菌は二つの糖鎖構造、つまり莢膜多糖類(CPS) (Jones 2005)およびポリ-N-アセチルグルコサミン(PNAG) (Gotz 2002)を作り出す。黄色ブドウ球菌NewmanおよびUSA300は、5型CPSを合成し、これは繰り返し三糖類サブユニット[→4)-β-D-ManAcA-(1→4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→]から構成される(Baba et al., 2007)。cap5遺伝子クラスタのヌクレオチド配列は16個の遺伝子オペロン(capA-P)を含み、その二つの産物CapPおよびCapOはUDP-N-アセチルマンノサミン酸(UDP-ManNAcA)の合成においてエピメラーゼおよびデヒドロゲナーゼとして機能する(O'Riordan and Lee, 2004; Sau et al., 1997)。予想通り、capOへのブルサアウレアリスの挿入はCPS5合成を抑止した(データ不掲載)。直鎖状のβ(1-6)結合グルコサミノグリカンPNAG (またはPIA)は、2-デオキシ-2-アミノ-D-グルコピラノシル残基から構成され、そのうち80〜85%がN9アセチル化されている(Mack et al., 1996)。残りのグルコサミン残基はプラスに帯電しており、多糖類と細菌外膜との結合を促進する(Vuong et al., 2004)。PNAGは、細胞間付着因子遺伝子座(icaADBC)の産物によって合成される(Heilmann et al., 1996; Cramton et al., 1999)。どちらの黄色ブドウ球菌糖鎖構造も動物感染の発病にとって必要でなかった。というのは、capOおよびicaADBCまたは調節因子icaRにおける変異が5日目の細菌負荷、つまりブドウ球菌群集の確立または腎膿瘍の形成に影響を与えなかったからである（表６）。ブドウ球菌膿瘍形成への外膜結合タンパク質の寄与も調べた。外膜結合タンパク質の特徴は、それらを熱SDS中で煮沸することによって抽出できるということである。この方法を用いて、黄色ブドウ球菌Newmanの外膜におけるそのような二つのタンパク質EapおよびEmpの沈着を検出した。empの中にブルサアウレアリスの挿入がある変異体は、膿瘍の形成の顕著な欠陥および宿主組織内での細菌存続の顕著な欠陥に加えて、感染5日目に腎臓組織における細菌負荷の低減を示した(図12、表6)。eap変異体には膿瘍形成の低下が認められなかったのに対し、5日目および15日目の細菌負荷の低下は、宿主組織内での細菌存続(peristence)の欠陥を示唆している(図12、表6)。感染中のEmpおよびEapの発現は免疫蛍光実験で検出された(図12J〜K)。Eapは偽被膜内に沈着していることが分かったのに対し、Empはブドウ球菌膿瘍群集中に検出された。これらの観察結果は、Empが、膿瘍病変部を引き起こすブドウ球菌群集の形成に寄与し、その一方で偽被膜におけるEapの沈着が宿主組織中での細菌存続を促進するというモデルを支持している。
【０３１５】
ワクチン抗原としての外膜結合タンパク質
以前の研究では、ブドウ球菌疾患に対する防御免疫を誘発させる能力がないか精製ソルターゼA基質を調べることによって黄色ブドウ球菌ワクチン抗原を特徴付けようとした(Stranger-Jones et al., 2006)。個々のサブユニットワクチン抗原として使用された場合、表面タンパク質はさまざまな程度の防御を生み出した; SdrD、IsdA、IsdB、SdrE、SpA、ClfAおよびClfBによる免疫は細菌負荷の有意な低下を達成したが、これらのワクチンのどれも完全な防御を与えられなかった。対照的に、4つの抗原の組み合わせによっては、いくつかの異なる黄色ブドウ球菌株での致死的攻撃または膿瘍形成に対するはるかに強いワクチン防御をもたらした(Stranger-Jones et al., 2006)。組み換えEapおよびEmpを大腸菌から精製し、これらのタンパク質を用いて、黄色ブドウ球菌Newmanでの後の攻撃のためにBALB/cマウスを免疫した(図13)。免疫の後、マウスは両方の外膜結合タンパク質に対する体液性免疫反応を発現した(図13A)。Empでの免疫は腎臓組織内でのブドウ球菌負荷の中程度0.959 log10 CFU g-1の低下を引き起こした(P=0.5114)のに対し、Eapでは顕著なレベルの防御が達成された(細菌負荷の1.939 log10 CFU g-1の低下、P=0.0079) (図13B)。EmpまたはEap特異的な抗体がブドウ球菌の攻撃に対する防御を提供できるかどうか試験するために、ウサギを免疫し、EmpおよびEap特異的な抗体を親和性クロマトグラフィーによって精製した。
【０３１６】
未処置BALB/cマウスの腹膜腔への5 mg kg-1 (動物1匹あたり85 μg)の精製抗体による受動免疫は、移入から24時間後に低い、しかし検出可能なレベルの血清IgGを生じた(Eapの場合1,000±110およびEmpの場合1,124±236の抗体力価、図13C)。同時に、受動的に免疫された動物を黄色ブドウ球菌Newmanの静脈内接種によって攻撃し、これは、モック対照と比べた場合、Eap免疫動物(n=10)では4日目にブドウ球菌負荷の1.36 log10 CFU g-1の低下(P=0.0085)および形成された膿瘍数の低下(モック処置 4.64±1.09個の膿瘍／腎臓-1 vs. Eap免疫 1.40±0.48個、P=0.028、n=14および10、13D〜E)をもたらした。
【０３１７】
Emp特異的抗体を受けた動物(n=9)は、4日目にブドウ球菌負荷の1.20 log10 CFU g-1の低下(P=0.0132)を示したが、形成された膿瘍数はわずかに低下しただけであった(2.0±0.98、P=0.1362、図13D〜E)。要約すれば、ソルターゼ固定表面タンパク質と同様に、外膜結合因子に対する抗体は、マウスにおいてブドウ球菌感染に対する防御を生み出すことができる。
【０３１８】
B. 材料および方法
細菌株および増殖
ブドウ球菌はトリプトソイ寒天またはブロスにて37℃で培養した。大腸菌株DH5αおよびBL21(DE3)はルリア寒天またはブロスにて37℃で培養した。アンピシリン(100 μg/ml)およびエリスロマイシン(10 μg/ml)をそれぞれ、プラスミドおよびトランスポゾン変異体の選択に用いた。
【０３１９】
トランスポゾン突然変異誘発
Phoenixライブラリ由来の挿入変異をヒト臨床分離株黄色ブドウ球菌Newmanに導入した。各変異体は、関心対象の遺伝子の中にエリスロマイシン耐性カセットを含むトランスポゾン・ブルサアウレアリスを保有する。変異は既報(Bae et al., 2004)のように検証した。手短に言えば、染色体DNAを抽出(Promega Wizard Kit)し、AciI (NEB)で消化し、T4リガーゼ(Promega)で再び核酸連結して個々のプラスミドを形成させ、トランスポゾン・ブルサアウレアリスに特異的なプライマーを用いてPCR増幅した。これらの産物を配列決定して、標的遺伝子中のトランスポゾン挿入部位を検証した。
【０３２０】
クローニング、精製および抗体作製
EapおよびEmpのコード配列は黄色ブドウ球菌Newman鋳型DNAを用いてPCR増幅した(Baba et al., 2007)。PCR産物をpET15bにクローニングして、N末端His6タグ融合を有する組み換えタンパク質を発現させた。細菌をFrenchプレス中で破壊し、膜および不溶性成分を超遠心によって沈降した。Hisタグ付きEmpを親和性クロマトグラフィーによりその天然状態で精製した。Eapを含有する抽出物を8 M尿素、50 mM Tris-HCl pH 8.0中にて室温で4〜5時間可溶化し、その後、10,000×gで遠心分離した。変性タンパク質を含有する上清をニッケル-ニトリロ三酢酸(Ni-NTA)親和性クロマトグラフィー(Promega)に供した。タンパク質を、逐次的に高い濃度のイミダゾール(100〜500 mM)を含有するPBS-8M尿素中で溶出した。Eap陽性の溶出液画分をプールし、PBS-1 M尿素中に希釈し、第二のNi-NTAカラムに通した。再び折り畳まれたEapを、イミダゾールを含有するPBS緩衝液で溶出した。タンパク質濃度を280 nmでの吸光度によって決定した。ウサギ(6ヶ月齢のNew-Zealandホワイト、雌性、Charles River Laboratories)に初回免疫の場合CFA (Difco)または24日目および48日目の追加免疫の場合IFA中で乳化されたタンパク質500 μgを免疫した。60日目に、ウサギを採血し、免疫ブロッティング、免疫蛍光顕微鏡検査または受動移入実験のために血清を回収した。
【０３２１】
走査電子顕微鏡法
感染腎(右側)を8%グルタルアルデヒド中4℃で24〜48時間固定し、2〜5 mm片の薄片を作って内部組織または膿瘍を曝露した。これらのサンプルを次いで、25、50、75、90、100%エタノール、引き続き100% HMDS中での連続的なインキュベーションにより脱水した。脱水の後、サンプルをマウントし、80%Pt/20%Pdで8 nmにスパッタコートした後にFei NovaNano SEM200走査電子顕微鏡下で観察した。生物膜アッセイの場合、ブドウ球菌をカバースリップ上、5% CO2中にて鉄枯渇RPMI中で増殖させ、PBS中で3回洗浄した。カバースリップをエタノールおよびHMDS中でのインキュベーションによって連続的に脱水し、マウントし、スパッタコートした後に走査電子顕微鏡下で観察した。
【０３２２】
生物膜形成
黄色ブドウ球菌株は、10% RPMI1640および1%カザミノ酸(Difco)を補充したChelex (Sigma)処理RPMI 1640 (Gibco)中で増殖させた。終夜培養物を6% CO2中にて37℃で増殖させ、次に新鮮培地を含有する96ウェル平底組織培養プレート(Costar)へ四つ組として10分の1で植菌した。これらのプレートを24時間6% CO2中にて37℃で静的にインキュベートした。ウェルを1×PBSで3回洗浄し、37℃で2時間乾燥し、1%サフラニンで染色した。450 nmでの吸光度を測定して生物膜形成を定量化した。各菌株を少なくとも3回の個別の実験で試験し、両側スチューデントt検定を用いて変異体を野生型と比較した。
【０３２３】
腎膿瘍
黄色ブドウ球菌Newmanの終夜培養物を新鮮なトリプトソイブロスへ100分の1で植菌し、37℃で2時間増殖させた。ブドウ球菌を沈降し、1×PBSで洗浄し、多量のPBSに懸濁して0.6のA600 (3×108 CFU/ml)を得た。植菌液をプレーティングおよびコロニーの数え上げによって検証した。マウスを体重1キログラムあたり100 mg/mlのケタミンおよび2 mg/mlのキシラジンの腹腔内注射によって麻酔した。6〜8週齢の雌性BALB/cマウス(Charles River Laboratories)に眼窩後部注射によって100 μlの細菌懸濁液(3×107 CFU)を感染させた。ブドウ球菌株あたりマウス10または20匹のコホートを感染させた。感染後5日目に、マウスをCO2吸入によって殺処理し、解剖し、腎臓を切除し、超音波処理器を用い0.01% Triton X-100中でホモジナイズした。CFUの決定のためアリコット(20 μl)を連続的に希釈し、プレーティングした。各コホートのマウス由来の3〜4個の右腎を室温で24時間10%ホルマリン中で固定した。組織をパラフィン包埋し、薄片にし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、顕微鏡検査した。3〜4週齢雌性BALB/cマウスを存続試験に用いた。
【０３２４】
免疫
後肢への筋肉内注射により精製タンパク質でBALB/cマウス(24日齢雌性、1群あたりマウス8〜10匹、Charles River Laboratories, Wilmington, MA)を免疫した。抗原(動物1匹あたり精製タンパク質25 μg)を0日目(完全フロインドアジュバントで1:1に乳化)および11日目(不完全フロインドアジュバントで1:1に乳化)に投与した。マウスを20日目に眼窩周囲から採血し、引き続いて21日目に107 CFU/mlの細菌で反対の眼に眼窩後部攻撃を行った。マウスを25日目に殺処理し、腎膿瘍モデルにしたがって処理した。
【０３２５】
免疫蛍光顕微鏡検査
感染動物の腎臓を解剖し、氷上の1×PBS中に入れ、その後、クリオモールド内のTissue Tek OCT Compound中で急速冷凍した。サンプルを薄切り(4 μmの厚さ)にし、スライドにマウントし、-80℃で貯蔵した。染色の前に、スライドを30分間室温にまで加温し、10分間氷冷アセトン中で固定し、氷冷PBSで2回洗浄した。スライドを振盪しながら室温で1時間3% BSA、20分の1のヒトIgG (Sigma)、1×PBS、0.1% Tween-80中でブロッキングした。特異的ウサギ抗体(2,000分の1)を混合物に加え、スライドをさらに1時間インキュベートさせた。溶液をデカントし、スライドグラスをPBSおよび各10分のインキュベーションで3回洗浄した。スライドを3% BSA、1×PBS、0.1% Tween-80、200分の1のAlexaFluor-647マウス抗ウサギ二次抗体中に入れ、振盪しながら、暗所中にて室温でインキュベートさせた。溶液をデカントし、スライドをPBSで3回洗浄し、1,000分の1のHoechst色素(Invitrogen)および1 μg/mlのBODIPY-バンコマイシンを含有するPBS中に入れ、振盪しながら5分間暗所中でインキュベートさせた。スライドをもう一度PBSで洗浄し、Nプロピル没食子酸中でマウントし、Leica SP5 AOBSスペクトル二光子共焦点顕微鏡下で観察した。
【０３２６】
能動および受動免疫法
BALB/cマウス(n=15)を0、11日目に精製EapもしくはEmpまたはPBSで免疫した。免疫後20日目に、マウス5匹を採血し血清を得て抗体力価を決定し、21日目に、全てのマウスを1×107 CFUの黄色ブドウ球菌Newmanで攻撃した。感染から5日後、死体解剖中に腎臓を取り出し、腎組織をブドウ球菌負荷または病理組織診断のために分析した。
【０３２７】
ウサギEapまたはEmp抗体を親和性クロマトグラフィー(セファロースに共有結合的に連結された精製EapまたはEmp)によって精製し、マウスへの腹腔内注射によって移入した。受動的に免疫された動物を24時間後に、眼窩後部注射により1×107 CFUの黄色ブドウ球菌Newmanで攻撃した。能動的にまたは受動的に免疫された動物の血清IgG力価をELISAによって分析した。感染から４日後、死体解剖中に腎臓を取り出し、腎組織をブドウ球菌負荷または病理組織診断のために分析した。
【０３２８】
実施例2 黄色ブドウ球菌は宿主免疫反応を回避するためにアデノシンを合成する
A. 結果
AdsAは血中でのブドウ球菌の生存に必要である
先天性免疫反応からの回避に必要なブドウ球菌遺伝子を同定するため、BALB/cマウスまたはSprague-Dawleyラット由来の全血中で生存する黄色ブドウ球菌株Newmanの能力を、寒天培地上でのコロニーの形成を介し定時間隔で細菌負荷を記録することによって調べた(図15)。予想通り、ブドウ球菌に特異的な抗体のない、未処置マウスおよびラットの血液内の免疫細胞(データ不掲載)は、黄色ブドウ球菌Newmanを食菌および死滅化することができなかった(図15Aおよび15D)。野生型株とは対照的に、ソルターゼA (srtA)に対する構造遺伝子を欠いた変種は、食細胞性死からのブドウ球菌の回避の欠陥を示した(P<0.05) (図15Aおよび15D)。ソルターゼAは、ペプチド転移機構および表面タンパク質C末端のLPXTGモチーフ選別シグナルを用いて、ブドウ球菌外膜中の広範な種々のポリペプチドを固定する(Mazmanian et al., 2002)。食細胞性死からのブドウ球菌の回避へのこれらの表面タンパク質の寄与について調べるために、本発明者らは、表面タンパク質遺伝子におけるブルサアウレアリスの挿入(Bae et al., 2004)を野生型株の黄色ブドウ球菌Newmanへ形質導入し、血中でのブドウ球菌変種の生存を測定した(図15Bおよび15E)。clfA、および以後adsAとするsasH (Staphylococcus aureus surface protein; 黄色ブドウ球菌表面タンパク質)における変異は、恒常的な生存欠陥を示した。clfA変異体の表現型は期待した結果を示す。これは、コードされるクランピング因子A (ClfA)が線維素を沈殿させ、マクロファージおよび好中球の食作用を妨害することが公知だからである(Palmqvist et al., 2004; Higgins et al., 2006)。発病へのAdsAの寄与は分かっていない。AdsAは、二つの特徴的配列ILHTnDiHGrL (残基番号124-134)およびYdamaVGNHEFD (残基番号189-201)を有する5'-ヌクレオチダーゼドメインを持っており、このタンパク質が5'-AMPからのアデノシンの合成を触媒できることを示唆している。ブドウ球菌病毒性におけるadsAの重要性をさらに調べるために、本発明者らは、全adsA遺伝子および上流プロモーター配列を発現ベクターpOS1にクローニングすることによってadsA遺伝子を補完し、padsAを作出した。padsAでのadsA変異体ブドウ球菌の形質転換は、マウスまたはラット血中で生存するその能力を回復したことから、観察された病毒性欠陥がadsA発現のないことで実際に引き起こされることが示された(図15Cおよび15F、ならびに図20)。黄色ブドウ球菌の生存をヒト志願者の血液でも調べた。ネズミ血液と同様に、adsA変異体ブドウ球菌の数が減少し、好中球によるブドウ球菌貪食が野生型株の黄色ブドウ球菌Newmanと比べて増加した(図15Gおよび15H)。
【０３２９】
AdsAはブドウ球菌病毒性および膿瘍形成に必要である
侵襲的ブドウ球菌疾患におけるadsAの寄与について調べるために、107コロニー形成単位(CFU)の野生型黄色ブドウ球菌Newmanまたはその同質遺伝子asdA変種での静脈内接種によってBALB/cマウスを感染させた。動物を感染後5日目に殺処理し、両方の腎臓を取り除いた。右腎をホモジナイズし、ブドウ球菌負荷を寒天上でのプレーティングおよびコロニー形成によって数え上げた(図16A)。左腎をグルタルアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、薄片にし、組織診断によって分析した(図16B)。予想通り、野生型黄色ブドウ球菌Newmanは、器官組織1グラムあたり107 CFUの平均細菌負荷で腎臓組織中に膿瘍を形成した。対照的に、adsA変異体ブドウ球菌は、膿瘍を形成することができず、野生型と比べて、細菌負荷の10倍超の低下を示した(図16A)。
【０３３０】
米国の市中で獲得されたMRSA株(CA-MRSA)による感染症は、パルスフィールドゲル電気泳動およびDNA配列決定によって特徴付けられている。現在、主要なCA-MRSAクローンは、皮膚および軟部組織感染症ならびに菌血症の主な原因(Carleton et al., 2004)のUSA300 (McDougal et al., 2003)である。USA300の病毒性に対するadsAの寄与を評価するために、同質遺伝子adsA変異体を、ファージ形質導入および黄色ブドウ球菌株LAC (USA300)を用いて分離した(Bae et al., 2004)。BALB/cマウスを血流へのブドウ球菌の眼窩後部注射によって感染させた。攻撃から5日後に、ホモジナイズした腎臓組織においてブドウ球菌を数え上げ、この器官のヘマトキシリン・エオシン染色薄片において膿瘍の病理組織を可視化した(図16C)。黄色ブドウ球菌Newmanと同様に、本発明者らは、黄色ブドウ球菌USA300のadsA変異体に感染した動物の腎臓から回収されたCFUの1 logの低減を認めた。さらに、adsA変種に感染したマウスの腎臓において、より少ない膿瘍およびより小さい病変部が観察された(図16Dおよび図21)。ともにこれらの結果は、2つの臨床分離株、黄色ブドウ球菌株NewmanおよびUSA300における病毒性にadsAが必要なことを実証している。
【０３３１】
感染マウスの腎臓由来の膿瘍形成およびCFU回収の相違は、少ない細菌しか末梢器官組織に到達させない、血流における細菌排除の増強から生じているかもしれない。あるいは、adsAは膿瘍および感染巣の形成において直接的な役割を果たし得た。これらの可能性を見定めるために、BALB/cマウスを眼窩後部植菌により感染させ、末梢血を心穿刺により定時間隔でサンプリングした。インビトロでのadsA変異体ブドウ球菌の排除増強の所見に一致して、顕著に少ないCFUのadsA変異体ブドウ球菌が野生型親株の黄色ブドウ球菌Newmanと比べて、感染後90分に回収された。さらに、padsAによるadsA変異体株の形質転換は、静脈内攻撃後に血液中で生存するその能力を回復した(図16E)。本発明者らは、adsAも特に膿瘍形成に寄与するという可能性を除外することはできないが、これらのデータは、adsA変異体ブドウ球菌の病毒性の低減が血液中でのその生存低下から生じていることを示唆している。
【０３３２】
AdsAを介したアデノシン合成は血液中でのブドウ球菌生存と相関する
AdsAが5'ヌクレオチダーゼ特徴的配列を持つことを考慮し、AdsAがAMPからアデノシンを合成できるかどうかを問いかけた。黄色ブドウ球菌の野生型、adsAおよびisdB (鉄表面決定因子B; iron surface determinant B、AMP加水分解に寄与しない遺伝子) (Mazmanian et al., 2003)変異体株、ならびにadsA:padsA株の細胞壁ペプチドグリカンをリソスタフィン(Schindler and Schuhardt, 1964)で分解し、細胞壁抽出物を放射標識[14C]AMPとともにインキュベートした。アデノシンの生成を薄層クロマトグラフィー(TLC)によってモニターした。adsA変異体ブドウ球菌のリソスタフィン抽出物は、顕著に低減したアデノシンシンターゼ活性(野生型のおよそ25%)を示した。アデノシンシンターゼ活性は、adsA変異体にpadsAを形質転換すると、野生型のレベルにまで回復した(図17A)。isdBの破壊は、対照的に、黄色ブドウ球菌によるアデノシンの生成に影響を与えなかった。
【０３３３】
AdsAの酵素活性を特徴付けるために、本発明者らは、大腸菌から可溶性組み換え型AdsAを発現させ、精製した。精製AdsAは[14C]AMPを切断してアデノシンを生成し、他のアデノシンシンターゼの金属要求性と同様に、5 mM MgCl2または5 mM MnCl2の存在下で最大活性(KM = 44 nM)を認めた(Zimmermann, 1992)。他方で、[14C]AMP添加前の5 mM ZnCl2または5 mM CuSO4とのAdsAのインキュベーションによって、アデノシンシンターゼ活性が完全に阻害された(図17B、レーン6および7)。二価金属イオンのキレート剤であるEDTAをAdsAに添加すると、同様の阻害作用が認められ、AdsAがインビトロでのアデノシンシンターゼ活性に二価陽イオンを要することを実証している。
【０３３４】
ブドウ球菌はアデノシンを合成することによって血液中での貪食排除を回避するものと考えられた。血液中でのadsA変異体ブドウ球菌の生存欠陥は、アデノシンの外生的供給によってレスキューすることができた。これについて調べ、1〜100 μMアデノシンの添加によるadsA変異体ブドウ球菌の生存の用量依存的な増加が明らかになった(図17F)。生理学的条件下で、細胞外環境におけるAMPの濃度はナノモル範囲にあるものと推定される。しかしながら、免疫学的損傷または組織傷害はAMPの放出を引き起こし、その濃度は100 μMまで増加することもある。それゆえ、これらのAMPの貯蔵物はブドウ球菌感染中にアデノシンに変換されうることはもっともらしく思える。ブドウ球菌感染中のアデノシンの相対存在量を評価するため、マウス血液に60分間黄色ブドウ球菌を感染させた。血漿を回収し、タンパク質を除去し、サンプルを逆相高圧液体クロマトグラフィー(rpHPLC)に供した。較正のため、商業的に精製されたアデノシンをrpHPLCによって分離し、溶出液中のその分子量を決定した(図18A)。非感染血液のクロマトグラフィーによってアデノシン吸収ピークが明らかとなり、その同一性を質量分析によって確認した(図18A)。血液におけるアデノシンピークは黄色ブドウ球菌Newmanの感染後に10倍に増大した(図18C)のに対し、同質遺伝子adsA変異体による感染ではアデノシンの増加が2倍に満たなかった(図18D)。注目すべきは、細胞外アデノシンは血液細胞によって迅速に移入される(半減期 < 1分) (Thiel et al., 2003)。したがって、黄色ブドウ球菌感染中に観察された血中アデノシンの10倍の増加は、このシグナル伝達分子のかなりの蓄積、およびブドウ球菌が宿主免疫に対抗する重要な病毒性戦略を表す。
【０３３５】
炭疽菌は血液中で生存しアデノシンを合成する
他の病原菌もアデノシンシンターゼを利用して貪食排除からの回避を促進するかどうか調べるために、AdsAのアデノシンシンターゼドメインを持つ産物がないか細菌ゲノム配列を探索し、いくつかの異なる遺伝子を同定した（表３）。炭疽菌のゲノムは、5'-ヌクレオチダーゼ特徴的配列(YdvisLGNHEFN、残基番号131-142)およびC末端LPXTG選別シグナルを有するBasA (炭疽菌表面; Bacillus anthracis surfaceタンパク質、NCBI遺伝子座タグBAS4031)をコードしており、この表面タンパク質が同様に、細胞壁外膜においてソルターゼAにより沈着されることを示唆している(Gaspar et al. 2005)。BasAがアデノシンシンターゼとして機能し、先天性免疫反応からの回避に寄与するかどうかを判定するため、本発明者らは、対立遺伝子置換によってbasAの欠失変異体を構築した(図19)。ムタノリシン、つまりペプチドグリカン内のN-アセチルムラミル-(β1→4)-N-アセチルグルコサミンを切断する壁溶解酵素(Yokigawa et al., 1974)を用いて、細胞壁溶解物を作出した。野生型桿菌由来の細胞壁抽出物はアデノシンシンターゼ活性を持っていたが、basA変異体桿菌に由来する抽出物はこの活性の低減を示した(図19A)。構造遺伝子basAの欠失は炭疽菌におけるBasAの発現(図19B)および表面提示(図19C)を消失させ、アデノシンを合成する桿菌の能力を低減した(図19A)。残存するAMP加水分解量は他のホスファターゼ、例えばアルカリホスファターゼに起因しうる。本発明者らは、大腸菌からタグ付きBasAを発現し親和性精製した。黄色ブドウ球菌AdsAと同様に、BasAの至適アデノシンシンターゼ活性は5 mM MnCl2の存在下で観察された(KM = 2.01 nM)のに対し、5 mM MgCl2では活性の低減が示された(図19D)。マウス血液に植菌した場合、野生型の親炭疽菌Sterneと比べて、basA変異体の貪食排除の増大が観察された(図19E)。ともにこれらの実験は、ブドウ球菌と同様に、炭疽菌もAdsAを利用してアデノシンを合成し、先天性免疫反応を回避することを示唆している。
【０３３６】
（表７） 推定上の5'-ヌクレオチダーゼを有する他の微生物
2012504660.tif 000014
【０３３７】
推定上の5'-ヌクレオチダーゼを有する他の微生物は周知の病原菌に当たり（表７）、本発明者らは、アデノシンを合成するその能力を分析しようとした。黄色ブドウ球菌および炭疽菌由来の細胞壁抽出物と同様に、エンテロコッカスフェカリスおよび表皮ブドウ球菌はともに、AMPからアデノシンを合成したのに対し、非病原微生物の枯草菌(Bacillus subtilis)は合成しなかった(データ不掲載)。本発明者らは、アデノシンを合成し、かつこの免疫抑制化合物を宿主組織へ放出する細菌性病原菌の能力が普遍的な病毒性戦略に当たりうるものと結論付ける。
【０３３８】
B. 材料および方法
細菌株
黄色ブドウ球菌株をTSB中にて37℃で増殖させた。黄色ブドウ球菌株USA300は黄色ブドウ球菌での抗菌薬耐性に関するネットワーク(NARSA, NIAID)を通じて得た。この試験に用いた全ての変異体はPhoenix (ΦΝΞ)ライブラリ(Bae et al., 2004)から得た。各Phoenix分離株は示したように臨床分離株Newman (Duthie and Lorenz, 1952)またはUSA300 (Carleton et al., 2004)の派生株である。ブルサアウレアリスの挿入は全て、バクテリオファージφ85を用いて野生型黄色ブドウ球菌NewmanまたはUSA300に形質導入し、PCR分析によって検証した。padsAによるプラスミドおよび対立遺伝子選択の場合にはクロラムフェニコールを10 mg l-1で用いた。黄色ブドウ球菌Newmanにおける対立遺伝子選択の場合には10 mg l-1でおよびUSA300における対立遺伝子選択の場合には50 mg l-1でエリスロマイシンを用いた。炭疽菌株Sterneの変異体は、温度感受性複製起点を含んだpLM4で作出した。変異のそれぞれの側に隣接する1 kbのDNA配列を有するプラスミドを、炭疽菌に形質転換し、形質転換体をLBブロス(20 μg ml-1のカナマイシン)中にて30℃ (許容温度)で増殖させた。培養物を100分の1に希釈し、終夜43℃(制限温度)でLB寒天(20 μg ml-1のカナマイシン)上にプレーティングした。単一のコロニーを抗生物質なしのLBブロスに植菌し、30℃で終夜増殖させた。pLM4に基づくプラスミドの欠損を確実にするため、これらの培養物を抗生物質圧なしの新鮮LBブロスへ4倍希釈し、30℃で増殖させた。培養物を希釈し、LB寒天上にプレーティングし、コロニーをカナマイシン耐性について調べた。カナマイシン感受性コロニー由来のDNAを変異体対立遺伝子の有無についてPCRにより分析した。
【０３３９】
プラスミド
以下のプライマーをPCR増幅反応に利用した。
2012504660.tif 000015
pOS1 (EcoRI)へのFP10/RP10 (adsA + 開始部位より上流の700 bp) PCR産物の核酸連結によってpadsAを作出した。pLM4 (EcoRI、SacIおよびXmaI部位)へのP55/P56 (basA 1 kb 5'隣接配列)およびP57/P58 (basA 1 kb 3'隣接配列) PCR産物の核酸連結によってpJK34を作出した。このプラスミドを用いてbasAコード配列を欠失させた。核酸連結産物を大腸菌DH5αに形質転換し、プラスミドDNAを大腸菌K1077 (dam-、dcm-)に形質転換し、以前に開発されたプロトコル(Gaspar et al., 2005)にしたがって精製(非メチル化)プラスミドDNAを炭疽菌に形質転換した。pGEX-2T (GE Healthcare)へのFP3C/RPB (シグナルペプチドの後の5'側で始まるadsAの1.2 kbの切断) PCR産物の核酸連結によってadsA発現ベクターpVT1を作出し、このプラスミドを大腸菌BL21に形質転換した。
【０３４０】
動物実験
全ての実験プロトコルはシカゴ大学の施設内生物安全委員会(IBC)および動物実験委員会(IACUC)の規制監督下で検討され、承認され、実施された。BALB/cマウスはCharles River Laboratoriesから購入し、Sprague-DawleyラットはHarlanから購入した。黄色ブドウ球菌株の終夜培養物を新鮮TSB中に100分の1希釈し、37℃で3時間増殖させた。ブドウ球菌を遠心分離し、2回洗浄し、PBSに希釈してOD600 0.5 (1×108 CFU ml-1)を得た。ブドウ球菌生菌をトリプトソイ寒天プレート上でのコロニー形成により数え上げて感染用量を定量化した。マウスを体重1キログラムあたり80〜120 mgのケタミンおよび3〜6 mgのキシラジンの腹腔内注射によって麻酔した。細菌懸濁液100マイクロリットル(1×107 CFU)をBALB/cマウス(6週齢雌性)へ眼窩後部注射によって静脈内に投与した。5日目に、マウスを圧縮CO2の吸入によって殺処理した。腎臓を取り除き、1% Triton X-100を含有するPBS中でホモジナイズした。CFUを三つ組で測定するためにホモジネートのアリコットを希釈し、寒天培地上にプレーティングした。統計分析のためにPrizmソフトウェアを用いてスチューデントt検定を行った。病理組織診断のため、腎臓組織を24時間10%ホルマリン中にて室温でインキュベートした。組織をパラフィン包埋し、薄片にし、ヘマトキシリン・エオシンで染色し、顕微鏡検査した。
【０３４１】
血液中でのブドウ球菌の生存を測定するために、6週齢雌性BALB/cマウスに眼窩後部注射によって1×107 CFUのブドウ球菌を感染させた。30分または90分の時点で、マウスを圧縮CO2の吸入によって殺処理し、25ゲージの注射針を用いて心穿刺により血液を採取した。アリコットを0.5%サポニン/PBSの終濃度にて30分間氷上でインキュベートして、宿主真核細胞を溶解した。異なる2時点での生存CFUの数え上げのためTSA上に希釈液をプレーティングした。
【０３４２】
化学物質
ムタノリシン(Sigma)は、1 mM PMSFを含有する100 mMリン酸ナトリウム, pH 6.0に5,000単位ml-1の濃度で懸濁し、-20℃で貯蔵した。[14C]AMPおよび[14C]アデノシンはMoravek Biochemicalsから購入した。リソスタフィンはAMBIから購入し、精製アデノシンはSigmaから購入した。
【０３４３】
血液中での細菌の生存
黄色ブドウ球菌株の終夜培養物を新鮮TSB中に100分の1希釈し、37℃で3時間増殖させた。ブドウ球菌を遠心分離し、2回洗浄し、PBSに希釈してOD600 0.5 (1×108 CFU ml-1)を得た。全血をSprague-DawleyラットまたはBALB/cマウスの心穿刺によって採取し、5 μg ml-1のレピルジン抗凝固剤をすぐに加えた。105 CFU ml-1の細菌100 μlをラットまたはマウス血液900 μlと混合した。ヒト血液試験の場合、108 CFU ml-1の細菌100 μlを新たに採血した血液900 μlと混合した。次に試験管を、表示した時点の間ゆっくり回転させながら37℃でインキュベートし、その時点でアリコットを0.5%サポニン/PBSの終濃度にて30分間氷上でインキュベートして、真核細胞を溶解した。生存CFUの数え上げのためTSA上にブドウ球菌の希釈液をプレーティングした。ヒト志願者由来の血液を用いた実験では、シカゴ大学の施設内治験審査委員会(IRB)の規制監督下で検討され、承認され、実施されたプロトコルを伴った。
【０３４４】
アデノシンシンターゼ活性
黄色ブドウ球菌株の終夜培養物を新鮮TSB中に100分の1希釈し、37℃で3時間増殖させた。ブドウ球菌を遠心分離し、PBSで2回洗浄した。細胞3 mlをスピンダウンし、TSM緩衝液(50 mM Tris-HCL pH 7.5、10 mM MgCl2および0.5 Mスクロース) 100 μLに再懸濁し; 次いでリソスタフィン2 μlを加え、37℃で30分間インキュベートさせた。次いで溶液を10k rpmで5分間スピンダウンし、放出された細胞表面タンパク質を含有する懸濁液を集めた。次いでリソスタフィン抽出物15 μlを37℃で30分間3 μCi [14C]AMPとともにインキュベートした。次いでサンプルをシリカプレートにスポットし、その後、(75:25のイソプロパノール:ddH2O) 0.2 M重炭酸アンモニウム溶媒を用いTLCによる分離を行った。ムタノリシンで消化された黄色ブドウ球菌、E.フェカリス(E. faecilis)、炭疽菌および表皮ブドウ球菌の細胞壁抽出物の場合、リソスタフィンの代わりにムタノリシンを用い、製造元の推奨条件で用いた。精製タンパク質でのアッセイ時には、2 μMの精製AdsAまたはBasAをTSM緩衝液中にて表示した金属陽イオンの存在下、3 μCi [14C]AMPとともに15 μlの終容量でインキュベートした。
【０３４５】
血液中のアデノシン濃度
ブドウ球菌による全血死滅アッセイは、上記のように行った。血漿の抽出は記述(Mo and Ballard, 2001)のように行った。手短に言えば、全血死滅アッセイの結論の後、血液サンプルを5分間13 k rpmで遠心分離し、非細胞性血漿を集めた。次いで血漿600 μlを75 μlの過塩素酸(1.5 M)および1 mM EDTAで抽出した。13 k rpmで5分間の遠心分離の後に上清(500 μl)を取り除き、4 M KOH 29 μlで中和した。10分間氷冷した後に、サンプルを再び、5分間13 k rpmで遠心分離した。上清のpHを6〜7に最終的に調整し、PBSで4分の1希釈し、逆相高性能液体クロマトグラフィー(rpHPLC)の前に0.22 μmのシリンジフィルタでろ過した。
【０３４６】
HPLCおよび質量分析
アデノシン産生の存在をrpHPLCによって決定した。サンプルを250 mm×3 mmのカラム(BDS Hypersil C18、粒径5 μm、Thermoscientific)にてクロマトグラフィー法で分離した。移動相は溶液A (dH2O:0.1%トリフルオロ酢酸)および溶液B (アセトニトリル:0.1%トリフルオロ酢酸)からなった。溶液Bを1〜100%の勾配で5〜50分流して、アデノシンを溶出させた。溶媒の流速は0.5 ml/分であった。ピークを280 nmでのそのUV吸光度によって検出した。HPLCクロマトグラムにおけるアデノシンのピークは、その保持時間と、標準サンプルとして用いた精製アデノシン(Sigma)の保持時間との比較によって同定した。次いでアデノシンを含有する画分をマトリックス(α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸)とともにスポットし、反射器ポジティブ条件の下でMALDI-MSに供した。
【０３４７】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載のものを補完する例示的な手順のまたはその他の詳細を提供する程度に、参照により本明細書に特に組み入れられる。
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１５Ｈ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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