(57)【要約】インフルエンザワクチンは、正常な用量と比較して増加した量のＨ３Ｎ２抗原を含む。一般的な実施形態では、ワクチンはＡ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株およびＢ株からの血球凝集素を含み、（ｉ）Ｈ３Ｎ２：Ｈ１Ｎ１血球凝集素の重量比は１を超え、（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２：Ｂ血球凝集素の重量比は１を超える。そのようなワクチンでは、Ｈ１Ｎ１：Ｂ血球凝集素の重量比は、通常１である。例えば、ワクチンは、Ａ／Ｈ１Ｎ１では１５μｇ、Ａ／Ｈ３Ｎ２では３０μｇ、Ｂでは１５μｇの血球凝集素を含有することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ／Ｈ１Ｎ１血球凝集素およびＡ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素を含み、Ｈ３Ｎ２：Ｈ１Ｎ１血球凝集素の重量比が１を超え、アジュバントを含むインフルエンザウイルスワクチン。
【請求項２】
Ａ／Ｈ１Ｎ１血球凝集素およびＢ血球凝集素を含み、Ｈ３Ｎ２：Ｂ血球凝集素の重量比が１を超え、アジュバントを含むインフルエンザウイルスワクチン。
【請求項３】
Ａ／Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株、Ａ／Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株およびインフルエンザウイルスＢ株からの血球凝集素を含み、（ｉ）Ｈ３Ｎ２：Ｈ１Ｎ１血球凝集素の重量比が１を超え、（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２：Ｂ血球凝集素の重量比が１を超える、請求項１または請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
その濃度が３２μｇ／ｍＬを超えるＡ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素を含み、アジュバントを含むインフルエンザウイルスワクチン。
【請求項５】
不活化ウイルスを含む、前述の請求項のいずれかに記載のワクチン。
【請求項６】
スプリットビリオンワクチンまたは精製された表面抗原ワクチンである、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素の濃度が約６０μｇ／ｍｌである、前述の請求項のいずれかに記載のワクチン。
【請求項８】
Ａ／Ｈ３Ｎ２以外のインフルエンザウイルス株の血球凝集素の濃度が１株につき０．２〜３０μｇ／ｍｌの範囲内にある、前述の請求項のいずれかに記載のワクチン。
【請求項９】
複数のインフルエンザウイルス株からの血球凝集素を含み、Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素の量が１株あたりの血球凝集素の平均量よりも多い、前述の請求項のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１０】
Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素の量がＡ／Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス以外の株からの血球凝集素の合わせた量と等しい、前述の請求項のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１１】
Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスＡ株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスＡ株およびインフルエンザＢウイルス株からの血球凝集素を含有する三価不活化ワクチンであり、前記血球凝集素の重量比が１：２：１（Ａ／Ｈ１Ｎ１：Ａ／Ｈ３Ｎ２：Ｂ）である、前述の請求項のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１２】
サブミクロンの油滴を有する水中油型エマルジョンアジュバントを含む、前述の請求項のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１３】
前記エマルジョンがスクアレン含有エマルジョンである、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記エマルジョンがスクアレン、ポリソルベート８０およびソルビタントリオレエートを含む、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記エマルジョンがスクアレン、ＤＬ−α−トコフェロールおよびポリソルベート８０を含む、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記エマルジョンがスクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの親水性非イオン性界面活性剤および疎水性非イオン性界面活性剤を含む、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１７】
１８ｍｇ／ｍＬ〜２２ｍｇ／ｍＬのスクアレンを有する、請求項１３から１６のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１８】
ヒト１用量あたり２ｍｇ〜８ｍｇのスクアレンを有する、請求項１３から１６のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１９】
患者の免疫応答を惹起する方法であって、前述の請求項のいずれかに記載のワクチンを前記患者に投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この特許出願は、２００９年２月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／２０７，３６８号（この完全な内容は、参考として本明細書に援用される）からの優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
この発明は、インフルエンザウイルス感染から保護するためのワクチン、特に、増加した量のインフルエンザＡウイルスＨ３抗原を含むワクチンの分野にある。
【背景技術】
【０００３】
現在の季節性インフルエンザワクチンは、２つのインフルエンザＡ株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）ならびに１つのインフルエンザＢ株からの抗原を一般的に含む。
【０００４】
参考文献１（非特許文献１）は、不活化スプリットビリオンインフルエンザワクチンＶＡＸＩＧＲＩＰ（商標）の２００５年の南半球製剤が、所望されるより低い血球凝集素濃度を含んでいたことを報告した。ワクチンはＡ／Ｈ１Ｎ１株およびＢ株の標準の１５μｇ用量を含んでいたが、Ａ／Ｈ３Ｎ２株については、それは９μｇだけしか含んでいなかった。そうであっても、そのワクチンが、欧州でのインフルエンザワクチンの年次許可下付の免疫原性基準を満たすことを著者らは見出した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｕｒｒｅｌｌら、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｖｉｒｕｓｅｓ（２００８）２（３）：９３〜９８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、季節性インフルエンザワクチンのさらなる改良された製剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
参考文献１と対照的に、本発明によると、インフルエンザワクチンは、正常な用量と比較して増加した量のＨ３Ｎ２抗原を含む。
【０００８】
したがって、本発明は、その濃度がヒト用量につき１６μｇを超えるＡ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素を含むインフルエンザウイルスワクチンを提供する。
【０００９】
本発明は、その濃度が３２μｇ／ｍＬを超えるＡ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素を含むインフルエンザウイルスワクチンも提供する。
【００１０】
本発明は、Ａ／Ｈ１Ｎ１血球凝集素およびＡ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素を含み、Ｈ３Ｎ２：Ｈ１Ｎ１血球凝集素の重量比が１を超えるインフルエンザウイルスワクチンも提供する。
【００１１】
本発明は、Ａ／Ｈ１Ｎ１血球凝集素およびＢ血球凝集素を含み、Ｈ３Ｎ２：Ｂ血球凝集素の重量比が１を超えるインフルエンザウイルスワクチンも提供する。
【００１２】
一般的な実施形態では、ワクチンはＡ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株およびＢ株からの血球凝集素を含み、（ｉ）Ｈ３Ｎ２：Ｈ１Ｎ１血球凝集素の重量比は１を超え、（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２：Ｂ血球凝集素の重量比は１を超える。そのようなワクチンでは、Ｈ１Ｎ１：Ｂ血球凝集素の重量比は、通常１である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ワクチンの調製
様々な形のインフルエンザウイルスワクチンが今日利用でき、ワクチンは、生ウイルスまたは不活化ウイルスに一般に基づく。不活化ワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオン、または精製された表面抗原に基づいてもよい。インフルエンザ抗原は、ビロゾームの形で提示されてもよい。本発明は、これらの種類のワクチンのいずれかと共に用いることができるが、一般的に不活化ワクチンと共に用いられる。
【００１４】
不活化ウイルスが用いられる場合、ワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオンまたは精製された表面抗原（血球凝集素を含み、ノイラミニダーゼも通常含む）を含むことができる。ウイルスを不活化する化学的手段には、以下の作用物質、すなわち界面活性剤、ホルムアルデヒド、βプロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミンまたはそれらの組合せの１つまたは複数の有効量による処理が含まれる。ウイルス不活化の非化学的方法は、例えば紫外線またはガンマ照射など、当技術分野で公知である。
【００１５】
ビリオンは、ウイルスを含有する流体から様々な方法によって収集することができる。例えば、精製方法は、ビリオンを破壊するための界面活性剤を含む線形ショ糖勾配溶液を用いる、ゾーン遠心法を含むことができる。次に任意選択の希釈の後、ダイアフィルトレーションによって抗原を精製することができる。
【００１６】
スプリットビリオンは、「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分割工程を含めて、精製されたビリオンを界面活性剤（例えばエチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコレート、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、トリトンＸ−１００、トリトンＮ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ９など）で処理してサブビリオン調製物を生成することによって得られる。インフルエンザウイルスを分割する方法は当技術分野で周知であり、例えば参考文献２〜７などを参照されたい。ウイルスの分割は、感染性または非感染性の全ウイルスを、分割剤の破壊濃度で破壊または断片化することによって一般的に実施される。破壊はウイルスタンパク質の完全または部分的可溶化を生じさせ、ウイルスの完全性を変化させる。好ましい分割剤は、非イオン性およびイオン性（例えば陽イオン性）の界面活性剤、例えばアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、ヘカメグ（Ｈｅｃａｍｅｇ）、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、第四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチル臭化アンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、セタブロン、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミンおよびＤＯＴ−ＭＡ、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えばトリトン界面活性剤、例えばトリトンＸ−１００またはトリトンＮ１０１）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。１つの有用な分割方法はデオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続作用を用い、分割は初期のビリオン精製中に（例えばショ糖密度勾配溶液で）起こることができる。したがって、分割工程は、ビリオン含有物質の浄化（非ビリオン物質を除去するため）、収集されたビリオンの濃縮（例えば、ＣａＨＰＯ４吸着などの吸着法を用いる）、非ビリオン物質からの全ビリオンの分離、密度勾配遠心工程（例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどの分割剤を含むショ糖勾配を用いる）での分割剤を用いるビリオンの分割、次に望ましくない物質を除去するためのろ過（例えば限外ろ過）を含むことができる。スプリットビリオンは、リン酸ナトリウム緩衝等張性生理食塩水に有効に再懸濁することができる。ＢＥＧＲＩＶＡＣ（商標）、ＦＬＵＡＲＩＸ（商標）、ＦＬＵＺＯＮＥ（商標）およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（商標）製品は、スプリットワクチンである。
【００１７】
精製された表面抗原ワクチンは、インフルエンザ表面抗原血球凝集素および、一般的にノイラミニダーゼも含む。精製された形のこれらのタンパク質を調製する方法は、当技術分野で周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮ（商標）、ＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）およびＩＮＦＬＵＶＡＣ（商標）製品が例である。
【００１８】
不活化インフルエンザ抗原の別の形は、ＩＮＦＬＥＸＡＬ  Ｖ（商標）およびＩＮＶＡＶＡＣ（商標）製品の場合のように、ビロゾーム［８］（無核酸ウイルス様リポソーム粒子）である。ビロゾームは、界面活性剤によるインフルエンザウイルスの可溶化と、続くヌクレオカプシドの除去およびウイルス糖タンパク質を含む膜の再構成によって調製することができる。ビロゾームを調製するための代替法は、ウイルス膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に加えて、それらの膜にウイルスタンパク質を有するリポソームを与えることを含む。
【００１９】
本発明で用いられる株は、野生型ウイルスで見出される天然のＨＡまたは改変ＨＡを有することができる。例えば、ウイルスを鳥類の種で高病原性にする決定因子（例えばＨＡ１／ＨＡ２切断部位のあたりの超塩基性領域）を除去するために、ＨＡを改変することが公知である。本発明で用いられるインフルエンザＢウイルスの血球凝集素は、好ましくはアミノ酸１９７にＡｓｎを有して、グリコシル化部位を提供する［９］。
【００２０】
本発明で用いられるインフルエンザウイルスは、リアソータント株であってもよく、逆方向遺伝学技法によって得られたものでもよい。逆方向遺伝学技法［例えば１０〜１４］は、プラスミドまたは他の人工ベクターを用いて、所望のゲノムセグメントを有するインフルエンザウイルスをｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製することを可能にする。一般的に、それは、（ａ）例えばｐｏｌＩプロモーターまたはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター由来の所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子、および（ｂ）例えばｐｏｌＩＩプロモーター由来のウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子を発現させることを含み、この結果、細胞内の両種のＤＮＡの発現が完全な無傷の感染性ビリオンの組立てをもたらす。ＤＮＡは好ましくはウイルスのＲＮＡおよびタンパク質のすべてを提供するが、ＲＮＡおよびタンパク質のいくつかを提供するためにヘルパーウイルスを用いることも可能である。各ウイルスＲＮＡを生成するために別々のプラスミドを用いる、プラスミドに基づく方法を用いることができ［１５〜１７］、これらの方法は、ウイルスタンパク質のすべてまたは一部（例えば、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびＮＰタンパク質だけ）を発現させるためのプラスミドの使用も含み、一部の方法では最高１２個のプラスミドが用いられる。必要なプラスミドの数を減少させるために、１つの手法［１８］は、同じプラスミド上の複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（ウイルスＲＮＡ合成のために）（例えば、１、２、３、４、５、６、７または全８個のインフルエンザＡ型ｖＲＮＡセグメントをコードする配列）を、および別のプラスミド上のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質コード領域と組み合わせる（例えば、１、２、３、４、５、６、７または全８個のインフルエンザＡ型ｍＲＮＡ転写産物をコードする配列）。参考文献１８の方法の好ましい態様は、（ａ）単一のプラスミド上のＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡのｍＲＮＡコード領域、ならびに（ｂ）単一のプラスミド上の全８個のｖＲＮＡコードセグメントを含む。１つのプラスミドの上にＮＡおよびＨＡセグメントを含み、別のプラスミドの上に他の６つのセグメントを含むことも、事を促進することができる。
【００２１】
ウイルスＲＮＡセグメントをコードするためにｐｏｌＩプロモーターを用いることの代わりに、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターを用いることが可能である［１９］。例えば、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ポリメラーゼのプロモーターを、都合よく用いることができる。ｐｏｌＩプロモーターの種特異性のために、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは多くの細胞型（例えばＭＤＣＫ）により便利であることができるが、細胞は、外因性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドによってもトランスフェクトされなければならない。
【００２２】
他の技術では、ウイルスＲＮＡおよび単一の鋳型からの発現可能なｍＲＮＡを同時にコードするために、二重のｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩプロモーターを用いることが可能である［２０、２１］。
【００２３】
したがって、インフルエンザＡウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスに由来する１つまたは複数のＲＮＡセグメントを含むことができる（一般的に、Ａ／ＰＲ／８／３４に由来する６個のセグメント、ＨＡおよびＮセグメントはワクチン株に由来する、すなわち６：２のリアソータント）。それは、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルス、またはワクチン製剤のためにリアソータントウイルスを生成するために有用な任意の他のウイルス株からの、１つまたは複数のＲＮＡセグメントを含むこともできる。インフルエンザＡウイルスは、ＡＡ／６／６０インフルエンザウイルス（Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０）からの６個未満（すなわち、０、１、２、３、４または５個）のウイルスセグメントを含むことができる。インフルエンザＢウイルスは、ＡＡ／１／６６インフルエンザウイルス（Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６）からの６個未満（すなわち、０、１、２、３、４または５個）のウイルスセグメントを含むことができる。一般的に、本発明は、ヒトからヒトへの感染が可能な株から保護し、したがってその株のゲノムは、哺乳動物（例えばヒト）のインフルエンザウイルスに由来した少なくとも１つのＲＮＡセグメントを通常含む。それは、鳥インフルエンザウイルスに由来したＮＳセグメントを含むことができる。
【００２４】
その抗原が組成物に含まれてもよい株は、抵抗性流行株を含め、抗ウイルス療法に抵抗性であってよい（例えば、オセルタミビル［２２］および／またはザナミビルに抵抗性）［２３］。
【００２５】
特に有用な株は、患者からの単離から細胞培養系での複製までの間のいかなる段階においても卵で継代されていないものである。ＭＤＣＫ細胞は、単離からウイルス複製までのすべての工程で排他的に用いることができる。
【００２６】
一部の実施形態では、本発明で用いる株は、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖と比較して、Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖への結合優先性を有する血球凝集素を有する。ヒトインフルエンザウイルスはＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖（ガラクトースに対するα−２，６連結シアル酸）を有する受容体オリゴ糖に結合するが、卵およびＶｅｒｏ細胞はＳｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有する受容体オリゴ糖を有する。ＭＤＣＫなどの細胞でのヒトインフルエンザウイルスの増殖は、卵での継代と異なって、本来のＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ結合を維持するように血球凝集素に選択圧を加える。
【００２７】
ウイルスが、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖と比較して、Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖への結合優先性を有するかどうかを決定するために、様々なアッセイを用いることができる。例えば、参考文献２４は、親和定数の高感度な定量測定値を与えるインフルエンザウイルス受容体結合活性のための、固相酵素結合アッセイを記載している。参考文献２５は、２つの異なるシアリル糖タンパク質へのウイルスの結合が評価された（Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ決定因子を有するオボムコイド、およびＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ決定因子を有するブタα２−マクログロブリン）固相アッセイを用い、さらに、２つの受容体類似体である遊離のシアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）および３’−シアリルラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）に対してウイルスの結合が評価されたアッセイを記載する。参考文献２６は、α２，３またはα２，６結合への受容体優先性を明らかに区別することができたグリカンアレイを用いるアッセイを報告する。参考文献２７は、Ｓｉａ（α２，６）ＧａｌまたはＳｉａ（α２，３）Ｇａｌを含むように酵素で改変されたヒト赤血球の凝集に基づくアッセイを報告する。アッセイの種類によって、ウイルス自体で直接に実施すること、またはウイルスから精製された血球凝集素で間接に実施することができる。
【００２８】
一部の実施形態では、本発明で用いるインフルエンザ株は、卵由来のウイルスと異なるグリコシル化パターンを有する糖タンパク質（血球凝集素を含む）を有する。したがって、糖タンパク質は、鶏卵で見られないグリコフォームを含む。
【００２９】
血球凝集素の投与
血球凝集素（ＨＡ）は現在の不活化インフルエンザワクチンでの主な免疫原であり、ワクチンの用量は、一般的にＳＲＩＤで測定されるＨＡレベルを参考にして標準化される。既存のワクチンは一般的に１株につき約１５μｇのＨＡを含有するが、例えば小児のために、または汎流行の状態において、またはアジュバントを用いる場合、または不注意により、より低い用量を用いることがある。より高い用量（例えば３×または９×用量［２８、２９］）が用いられていることと同様に、１／２（すなわち１株につき７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８などの分割用量が用いられている。
【００３０】
標準のインフルエンザワクチン容量は０．５ｍｌであり、したがってワクチン中の各株の標準ＨＡ濃度は３０μｇ／ｍｌである。しかし本発明によると、インフルエンザワクチンは、増加した量のＨ３Ｎ２抗原を含む。したがって、Ａ／Ｈ３Ｎ２由来のＨＡの濃度は、３２μｇ／ｍＬを超えることができる。例えば、それは３５μｇ／ｍｌを超えること、４０μｇ／ｍｌを超えること、４５μｇ／ｍｌを超えること、５０μｇ／ｍｌを超えること、５５μｇ／ｍｌを超えること、６０μｇ／ｍｌを超えること、６５μｇ／ｍｌを超えること、７０μｇ／ｍｌを超えることなどができる。濃度は、通常３００μｇ／ｍｌを超えず、すなわちそれは３２〜３００μｇ／ｍｌの範囲内にある。有用な一実施形態では、Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素の濃度は、約６０μｇ／ｍｌ、すなわち標準用量の２倍である。したがって、有用なワクチンは、６０μｇ／ｍｌのＡ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素を含むことができる。
【００３１】
したがって０．５ｍｌ容量では、単一用量中のＡ／Ｈ３Ｎ２  ＨＡの量は、１６μｇを超え、例えば１７．５μｇ、２０μｇ、２２．５μｇ、２５μｇ、２７．５μｇ、３０μｇ、３２．５μｇ、３５μｇなどを超えるが、その量は通常１５０μｇを超えない。有用な一実施形態では、用量は３０μｇのＡ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素を含む。
【００３２】
ワクチン中の他の株（例えばＡ／Ｈ１Ｎ１株およびインフルエンザＢウイルス株）については、１用量あたりのＨＡの量は、１株につき０．１〜１５０μｇの範囲、好ましくは０．１〜５０μｇ、例えば０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなどであってよい。特定の用量には、１株につき例えば約４５μｇ、約３０μｇ、約１５μｇ、約１０μｇ、約７．５μｇ、約５μｇ、約３．８μｇ、約１．９μｇ、約１．５μｇなどが含まれる。
【００３３】
しかし理想的には、Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素の量は、Ａ／Ｈ１Ｎ１  ＨＡの量およびインフルエンザＢウイルスＨＡの両方の量よりも多い。したがってＨ３Ｎ２：Ｈ１Ｎ１血球凝集素の重量比は１を超え、好ましくは少なくとも１．２５、例えば少なくとも１．５、１．７５、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０などである。同様に、インフルエンザＢウイルス血球凝集素に対するＨ３Ｎ２血球凝集素の重量比は１を超え、好ましくは少なくとも１．２５、例えば少なくとも１．５、１．７５、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０などである。Ａ／Ｈ１Ｎ１：Ｂ血球凝集素の重量比は、通常約１である。例えば、Ａ／Ｈ１Ｎ１については１５μｇ、Ａ／Ｈ３Ｎ２については３０μｇ、Ｂについては１５μｇの血球凝集素を含有するワクチンでは、Ａ／Ｈ１Ｎ１に対するＡ／Ｈ３Ｎ２の比は２：１であり、Ｂに対するＡ／Ｈ３Ｎ２の比も２：１であり、Ｂに対するＡ／Ｈ１Ｎ１の比は１である。
【００３４】
複数のヒトインフルエンザウイルス株（例えばＡ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２およびＢ）からの血球凝集素を含むワクチンについては、Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素の量は、好ましくは１株あたりの血球凝集素の平均（平均）量よりも多い。Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素の量は、平均の少なくとも１．２５倍、例えば少なくとも１．５、１．７５、２．０、２．２５、２．５倍などであってよい。例えば、Ａ／Ｈ１Ｎ１については１５μｇ、Ａ／Ｈ３Ｎ２については３０μｇ、Ｂについては１５μｇの血球凝集素を含有するワクチンでは、１株あたりのＨＡの平均量は２０μｇであり、したがってＡ／Ｈ３Ｎ２の量は平均の１．５倍である。
【００３５】
Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素の量は、Ａ／Ｈ１Ｎ１血球凝集素およびＢ血球凝集素の合わせた量と等しくてもよい。例えば、Ａ／Ｈ１Ｎ１については１５μｇおよびＢについては１５μｇの血球凝集素を含有するワクチンでは、Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素の量は３０μｇであってよい。
【００３６】
ワクチン組成物が複数のインフルエンザＢウイルス株からの血球凝集素を含む場合（例えば、参考文献３０は、２つのＡ株および２つのＢ株からのＨＡを有する４価ワクチンを開示する）、上の記載はそれらの株の１つに適用される。ワクチンがＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株の両方からのＨＡを含む場合、上の記載は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株またはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株のいずれかに適用される。これらの２系統は１９８０年代後期に出現し、抗原的および／または遺伝的に互いから区別することができるＨＡを有する［３１］。Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株は、「Ｌｅｅ４０」ＨＡ配列と比較して番号付けられたアミノ酸残基１６４に欠失を有するＨＡタンパク質をしばしば（常にではなく）有する［３２］。
【００３７】
ワクチン組成物は、季節性の株に加えて、流行関連株からの血球凝集素を含むことができる。例えば、参考文献３０は、Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２、Ａ／Ｈ５Ｎ１およびＢ抗原を含むワクチンを開示する。インフルエンザＡウイルスは、１６個のＨＡサブタイプ、すなわちＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６を現在提示する。流行関連インフルエンザ株の特性は、以下の通りである：（ａ）現在循環しているヒト株の血球凝集素と比較して新しい血球凝集素、すなわち１０年を超える間ヒト集団で明らかでなかったもの（例えばＨ２）、またはヒト集団でそれ以前に全く見られていないもの（例えば、鳥集団だけで一般に見出されているＨ５、Ｈ６もしくはＨ９）を含み、したがってワクチンのレシピエントおよび一般ヒト集団はその株の血球凝集素に対して免疫学的にナイーブである、（ｂ）ヒト集団で水平伝播することができる、ならびに（ｃ）ヒトに病原性である。本発明で使用するための流行関連インフルエンザウイルス株は、一般的にＨ２、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９のサブタイプ、例えばＨ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１またはＨ７Ｎ７を有する。Ｈ５Ｎ１株が好ましい。流行関連株は、Ｈ１サブタイプ（例えばＨ１Ｎ１）を有することもできる。例えば、そのＨＡは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／０９株と免疫学的に交差反応を起こすことができる。
【００３８】
上に述べたように、Ａ／Ｈ３Ｎ２  ＨＡの量は、Ａ／Ｈ５Ｎ１  ＨＡの量の１．５倍を超え、例えば２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍などである。
【００３９】
しかし一般的に、ワクチンは３つのインフルエンザウイルス株、すなわち、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスＡ株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスＡ株およびインフルエンザＢウイルス株だけに由来する抗原を含む。インフルエンザＢウイルス株は、通常Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様またはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株である。そのような三価ワクチンでのＨＡ重量比は、好ましくは１：２：１（Ａ／Ｈ１Ｎ１：Ａ／Ｈ３Ｎ２：Ｂ）である。
【００４０】
一部の実施形態では、Ｈ３株は、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９と交差反応性である。他の実施形態では、それはＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２と交差反応性である。
【００４１】
生ワクチン
上記のように、本発明は不活化ワクチンと通常用いられる。しかし一部の実施形態では、それを生ワクチンと用いることができる。ＨＡ含有量に関して標準化されるよりは、生ワクチンの投与は、メジアン組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）によって測定される。１株あたり１０６〜１０８（好ましくは１０６．５〜１０７．５）のＴＣＩＤ５０が一般的であり、したがって本発明によると、Ｈ３Ｎ２の用量は通常よりも高く、上記の比などがＨ３Ｎ２  ＴＣＩＤ５０に適用され、例えばＴＣＩＤ５０はＨ３Ｎ２については２ｘ１０７であるが、他の株については１ｘ１０７である。
【００４２】
インフルエンザウイルスは弱毒化されてもよい。
【００４３】
インフルエンザウイルスは温度感受性であってもよい。
【００４４】
インフルエンザウイルスは低温順応化されてもよい。
【００４５】
細胞系
本発明で使用するためのワクチンの製造では、ウイルス増殖のための基質としてＳＰＦ卵を用いることができ、その場合、ウイルスは鶏卵の感染尿膜腔液から収集される。しかし代わりに、インフルエンザウイルスの複製を補助する細胞系を用いてもよい。細胞系は、一般的に哺乳動物起源である。適する哺乳動物細胞起源には、それらに限定されないが、ハムスター、ウシ、霊長類（ヒトおよびサルを含む）ならびにイヌの細胞が含まれるが、霊長類細胞の使用は好ましくない。腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などの、様々な細胞型を用いることができる。適するハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣという名称の細胞系である。適するサル細胞は、Ｖｅｒｏ細胞系の場合のように、例えば腎臓細胞などのアフリカミドリザル細胞である［３３〜３５］。適するイヌ細胞は、ＣＬＤＫおよびＭＤＣＫ細胞系の場合のように、例えば腎臓細胞である。
【００４６】
したがって、適する細胞系には、それらに限定されないが、ＭＤＣＫ、ＣＨＯ、ＣＬＤＫ、ＨＫＣＣ、２９３Ｔ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＭＲＣ−５、ＰＥＲ．Ｃ６［３６］、ＦＲｈＬ２、ＷＩ−３８などが含まれる。適する細胞系は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［３７］から、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［３８］から、またはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広く入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、目録番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６およびＣＲＬ−１５８７で様々な異なるＶｅｒｏ細胞を提供し、目録番号ＣＣＬ−３４でＭＤＣＫ細胞を提供している。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０の下でＥＣＡＣＣから入手可能である。
【００４７】
最も好ましい細胞系は、哺乳動物型のグリコシル化を有するものである。哺乳動物細胞系に対するあまり好ましくない代替形態として、カモ（例えばカモ網膜）または雌鶏に由来する細胞系を含む鳥類の細胞系でウイルスを増殖させることができる［例えば、参考文献３９〜４１］。鳥類の細胞系の例には、鳥類の胚性幹細胞［３９、４２］およびカモ網膜細胞［４０］が含まれる。適する鳥類の胚性幹細胞には、ニワトリ胚性幹細胞に由来するＥＢｘ細胞系、ＥＢ４５、ＥＢ１４およびＥＢ１４−０７４が含まれる［４３］。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を用いてもよい。しかし鳥類の細胞を用いずに、哺乳動物の細胞を用いることは、ワクチンが鳥類のＤＮＡおよび卵タンパク質（例えばオボアルブミンおよびオボムコイド）を含まないようにすることができ、それによってアレルゲン性を低減させることを意味する。
【００４８】
インフルエンザウイルスを増殖させるために最も好ましい細胞系は、Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌの腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞系である［４４〜４７］。元のＭＤＣＫ細胞系は、ＡＴＣＣからＣＣＬ−３４として入手可能であるが、この細胞系の派生株および他のＭＤＣＫ細胞系を用いることもできる。例えば、参考文献４４は、懸濁培養での増殖に順応させたＭＤＣＫ細胞系を開示する（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託されている「ＭＤＣＫ３３０１６」）。同様に、参考文献４８は、無血清培養での懸濁で増殖するＭＤＣＫ由来の細胞系を開示する（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４４９として寄託されている「Ｂ−７０２」）。参考文献４９は、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を開示する。参考文献５０は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２０４２）を含む、感染に高い感受性を有するＭＤＣＫ細胞系を開示する。これらのＭＤＣＫ細胞系のいずれかを用いることができる。
【００４９】
ウイルスは、接着培養または懸濁の細胞上で増殖させることができる。微粒子担体培養を用いることもできる。一部の実施形態では、細胞をこのように懸濁での増殖のために順応させることができる。
【００５０】
細胞系は、好ましくは無血清培地および／またはタンパク質非含有培地で増殖させる。ヒトまたは動物起源の血清からの添加物がない本発明の状況において、培地は無血清培地と呼ばれる。そのような培養で増殖する細胞は当然タンパク質自体を含むが、タンパク質非含有培地は、細胞の増殖（例えば感染前の）が、タンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質を排除して起こるものを意味すると理解されているが、ウイルス増殖のために必要かもしれないトリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質を任意選択で含むことができる。
【００５１】
インフルエンザウイルスの複製を補助する細胞系は、ウイルス複製の間、好ましくは３７℃未満で増殖させる［５１］（例えば３０〜３６℃、または約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃）。
【００５２】
培養細胞でインフルエンザウイルスを増殖させる方法は、細胞培養物に増殖させる株の接種材料を接種するステップ、ウイルス増殖のために所望の時間、例えばウイルス力価または抗原発現の決定のように（例えば接種後の２４〜１６８時間）感染細胞を培養するステップ、および増殖させたウイルスを収集するステップを一般に含む。培養された細胞は、１：５００〜１：１、好ましくは１：１００〜１：５、より好ましくは１：５０〜１：１０のウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０によって測定）対細胞比で接種される。ウイルスは細胞懸濁液に加えられるかまたは細胞の単層に加えられ、ウイルスは、２５℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜３７℃で少なくとも６０分間、しかし通常３００分間未満、好ましくは９０〜２４０分間、細胞の上で吸収される。収集された培養上清のウイルス含有量を増加させるために、感染した細胞培養物（例えば単層）を凍結融解または酵素作用によって取り出すことができる。収集された流体は、次に不活化または凍結保存される。培養された細胞は、約０．０００１〜１０、好ましくは０．００２〜５、より好ましくは０．００１〜２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．」）で感染させることができる。さらにより好ましくは、細胞を約０．０１のｍ．ｏ．ｉで感染させる。感染細胞は、感染後３０〜６０時間で収集することができる。好ましくは、細胞は、感染後３４〜４８時間で収集される。さらにより好ましくは、細胞は、感染後３８〜４０時間で収集される。ウイルス放出を可能にするために細胞培養の間、プロテアーゼ（一般的にトリプシン）が一般に加えられ、プロテアーゼは、培養中の任意の適する段階で、例えば接種前、接種と同時、または接種後に加えることができる［５１］。
【００５３】
有用な実施形態では、特にＭＤＣＫ細胞では、細胞系は元の作業用細胞バンクから４０回の個体数倍加レベルを越えて継代培養されない。
【００５４】
ウイルス接種材料およびウイルス培養物は、単純ヘルペスウイルス、ＲＳウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルスおよび／またはパルボウイルスが好ましくは含まれない（すなわち、それによる汚染について検査され、陰性である）［５２］。単純ヘルペスウイルスの非存在が、特に好ましい。
【００５５】
宿主細胞ＤＮＡ
ウイルスを細胞系で増殖させた場合、ＤＮＡのあらゆる発癌活性を最小にするために、最終ワクチンに残留する細胞系ＤＮＡの量を最小にすることが標準慣行である。
【００５６】
したがって、好ましくは本発明によって調製されるワクチン組成物は、１用量につき１０ｎｇ未満（好ましくは１ｎｇ未満、より好ましくは１００ｐｇ未満）の残留性宿主細胞ＤＮＡを含むが、極微量の宿主細胞ＤＮＡが存在してもよい。
【００５７】
０．２５ｍｌ容量につき＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンのように、１５μｇの血球凝集素につき＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンが好ましい。０．５ｍｌ容量につき＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンのように、５０μｇの血球凝集素につき＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンがより好ましい。
【００５８】
任意の残留性宿主細胞ＤＮＡの平均長が、５００ｂｐ未満、例えば４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満などであることが好ましい。
【００５９】
混入ＤＮＡは、標準の精製手順、例えばクロマトグラフィーなどを用いて、ワクチン調製の間に除去することができる。残留性宿主細胞ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼによる処理、例えばＤＮアーゼを用いることによって増強することができる。先ずウイルス増殖の間用いることができるＤＮアーゼ（例えばベンゾナーゼ）を用い、次にビリオン破壊の間用いることができる陽イオン性界面活性剤（例えばＣＴＡＢ）を用いる二段階処理を含む、宿主細胞ＤＮＡの混入を減らすための便利な方法が、参考文献５３および５４に開示されている。βプロピオラクトン処理による除去を用いることもできる。
【００６０】
残留性宿主細胞ＤＮＡの測定は、今では生物学的製剤にとってはルーチンな規制要件で、当業技術者の通常の能力の範囲内である。ＤＮＡの測定に用いられるアッセイは、一般的には検証済みのアッセイである［５５、５６］。検証済みのアッセイの性能特性は、数学的および定量化可能な用語で記載することができ、その可能な間違いの原因は特定されていることになる。そのアッセイは、正確度、精度、特異性などの特性について、一般に検査されていることになる。アッセイが較正され（例えば宿主細胞ＤＮＡの既知の標準量に対して）、検査されると、定量的なＤＮＡ測定を常法により実施することができる。ＤＮＡ定量化のための３つの主な技術を用いることができる：サザンブロットまたはスロットブロットなどのハイブリダイゼーション方法［５７］、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）系などのイムノアッセイ方法［５８］、および定量的ＰＣＲ［５９］。これらの方法のすべては当業技術者によく知られているが、各方法の正確な特性は、問題の宿主細胞、例えばハイブリダイゼーションのためのプローブの選択、増幅のためのプライマーおよび／またはプローブの選択などによって決まるかもしれない。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤｅｖｉｃｅｓからのＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）系は、総ＤＮＡのピコグラムレベルの定量アッセイであり、生物薬剤中の混入ＤＮＡレベルを監視するために用いられている［５８］。一般的なアッセイは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ結合タンパク質、ウレアーゼ結合体化抗ｓｓＤＮＡ抗体およびＤＮＡの間での、反応複合体の非配列特異的形成を含む。すべてのアッセイ構成要素は、製造業者から入手可能な完全なＴｏｔａｌ  ＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔに含まれる。様々な商業的な製造者は、例えばＡｐｐＴｅｃ（商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ（商標）、Ａｌｔｈｅａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなど、残留性宿主細胞ＤＮＡを検出するための定量的ＰＣＲアッセイを提供する。ヒトウイルスワクチンの宿主細胞ＤＮＡ混入の測定についての、化学発光ハイブリダイゼーションアッセイおよび総ＤＮＡ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）系の比較を、参考文献６０に見ることができる。
【００６１】
医薬組成物
本発明で使用するためのワクチンは、インフルエンザ抗原に加えて成分を通常含み、例えばそれらは１つまたは複数の薬学的担体および／または賦形剤を一般的に含む。そのような成分の詳細な議論は、参考文献６１で入手可能である。多くの実施形態では、特に筋肉内注射によって投与されるワクチンについては、アジュバントも含まれてよい。
【００６２】
組成物は、投与時には一般に水性の形である。
【００６３】
組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含むことができる。ワクチンは、水銀物質を実質的に含むべきではないことが好ましく（例えば、＜１０μｇ／ｍｌ）、例えばチオメルサールを含むべきではないことが好ましい［６、６２］。水銀を含有していないワクチンがより好ましく、水銀化合物に代わるものとしてα−トコフェロールスクシネートが含まれてもよい［６］。保存剤を含まないワクチンが特に好ましい。
【００６４】
張度を調節するために、ナトリウム塩などの生理的塩を含むのが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、それは１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在することができる。存在することができる他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウムおよび／または塩化マグネシウムなどが含まれる。アジュバントが抗原とは別の容器にある場合、塩化ナトリウムは両方の容器に存在することができる。
【００６５】
組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、おそらく２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の重量オスモル濃度を有することができる。
【００６６】
組成物は、１つまたは複数の緩衝液を含むことができる。一般的な緩衝液には、以下が含まれる：リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液（特に水酸化アルミニウムアジュバントと一緒に）、またはクエン酸緩衝液。緩衝液は、一般的に５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。
【００６７】
組成物のｐＨは、一般に５．０〜８．１であり、より一般的には６．０〜８．０、例えば６．５および７．５、または７．０〜７．８である。
【００６８】
組成物は、好ましくは無菌である。組成物は好ましくは非発熱性であり、例えば１用量につき＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準の尺度）、好ましくは１用量につき＜０．１ＥＵしか含まない。組成物は、好ましくはグルテンを含まない。
【００６９】
本発明の組成物は、界面活性剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ」として公知である）、オクトキシノール（例えばオクトキシノール−９（トリトンＸ−１００）もしくはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）、または、特にスプリットワクチンもしくは表面抗原ワクチンのために、デオキシコール酸ナトリウムを含むことができる。界面活性剤は、極微量だけ存在してもよい。したがって、ワクチンは、オクトキシノール−１０およびポリソルベート８０の各々の１ｍｇ／ｍｌ未満を含むことができる。極微量の他の残留性成分は、抗生物質（例えばネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。アジュバントが抗原とは別の容器にある場合、この界面活性剤は抗原を含有する容器に通常存在する（例えば、抗原とポリソルベート８０およびオクトキシノール１０）。
【００７０】
組成物は１回の免疫化のための材料を含むことができ、または複数回の免疫化のための材料を含むことができる（すなわち、「多用量」キット）。多用量の配列では、保存剤の含有が好ましい。多用量組成物に保存剤を含むことの代わりに（またはそれに加えて）、組成物は、材料の取り出しのための無菌アダプターを有する容器に含まれてもよい。
【００７１】
インフルエンザワクチンは、一般的に約０．５ｍｌの投薬容量で投与されるが、特に小児には、半用量（すなわち約０．２５ｍｌ）を投与することもできる。より低い用量（例えば０．１ｍｌまたは０．２ｍｌ）も、皮内注射などの投与経路のために有益である。
【００７２】
ワクチンは、好ましくは２℃〜８℃で保存される。それらは、冷凍されるべきでない。それらは、理想的には直射光から保護されるべきである。
【００７３】
ワクチンは、即時投与のために、または投与前即席混合のための部品キットとして、例えば別々の抗原およびアジュバント成分として（ＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（商標）製品の場合のように）製剤化して、任意の適する容器で供給することができる。適する容器には、バイアル、注射器（例えば使い捨て注射器）、鼻内噴霧などが含まれる。これらの容器は無菌であるべきである。組成物／成分がバイアル内に置かれる場合、バイアルは、好ましくはガラスまたはプラスチック製の材料で作製される。バイアルは、好ましくは組成物がそれに加えられる前に滅菌される。ラテックス感受性患者の問題を回避するために、バイアルは好ましくはラテックスを含まないストッパーで密封され、すべての包装材料にラテックスが存在しないことが好ましい。バイアルは、ワクチンの単回用量を含むことができ、またはそれは複数用量（「多回用量」バイアル）、例えば１０回用量を含むことができる。好ましいバイアルは、無色のガラス製である。バイアルは、注射器をそのキャップに挿入することができるように適合されたキャップ（例えばルアーロック）を有することができる。バイアルは、特に多回用量バイアルの場合、その内容物の無菌取り出しを可能にするキャップを有することができる。成分が注射器に収容される場合、注射器はそれに装着される針を有することができる。針が装着されない場合、組立ておよび使用のために別の針を注射器と一緒に供給してもよい。そのような針は、ケースに入れてもよい。安全針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージおよび５／８インチ２５ゲージ針が一般的である。記録の保守を容易にするために、ロット番号、インフルエンザ流行期および内容物の有効期限を印刷することができる引き剥がしラベルを注射器とともに提供してもよい。吸引の間、プランジャーが偶発的に抜けることを予防するために、注射器のプランジャーは、好ましくはストッパーを有する。注射器は、ラテックスゴムのキャップおよび／またはプランジャーを有することができる。使い捨て注射器は、１回用量のワクチンを含む。注射器は針の装着前にチップを密封するためのチップキャップを一般に有し、チップキャップは好ましくはブチルゴム製である。
【００７４】
例えば小児への送達を容易にするために、半用量の容量を示す印を容器に付けてもよい。例えば、０．５ｍｌの量を含む注射器は、０．２５ｍｌ容量を示すマークを有することができる。
【００７５】
ガラス容器（例えば注射器またはバイアル）を用いる場合、ソーダ石灰ガラス製よりもホウ珪酸ガラス製の容器を用いるのが好ましい。
【００７６】
容器は、ワクチンの詳細、例えば投与の説明、ワクチン内の抗原の詳細などを含むリーフレットと同梱（例えば同じボックスに）してもよい。説明書は、例えばワクチン接種後のアナフィラキシー反応などの場合に容易に利用できるアドレナリン溶液を常備するための警告を含むこともできる。
【００７７】
アジュバント
使用時に、有利には、本発明のワクチンは、組成物を投与される患者で誘発される免疫応答（体液性および／または細胞性）を増強する働きをすることができるアジュバントを含むことができる。水中油型エマルジョンアジュバント（特にスクアレンを含むもの）の存在は、季節性［６３］および流行性［６４、６５］インフルエンザワクチンの免疫応答の株交差反応性を増強することがわかっている。
【００７８】
本発明で使用するための水中油型エマルジョンは、一般的に少なくとも１つの油および少なくとも１つの界面活性剤を含み、（１つまたは複数の）油および界面活性剤は、生物分解性（代謝性）および生体適合性である。エマルジョン中の油滴は、一般に直径５μｍ未満であり、サブミクロンの直径でさえも有することができ、これらの小さいサイズは、安定したエマルジョンを提供するマイクロフルイダイザーで達成される。２２０ｎｍ未満のサイズの液滴はろ過滅菌にかけることができるので、それらが好ましい。
【００７９】
本発明は、動物（例えば、魚）または植物源からのものなどの油と一緒に用いることができる。植物油の原料には、堅果、種子および穀類が含まれる。最も一般的に入手可能である落花生油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油が、堅果油の例である。ホホバ油を用いることができ、例えばホホバ豆から得ることができる。種子油には、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油などが含まれる。穀類群では、トウモロコシ油が最も容易に入手できるが、小麦、オート麦、ライ麦、米、テフ、ライ小麦などの他の穀物粒の油を用いることもできる。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油には天然に存在しないが、堅果油および種子油から始まる適当な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製することができる。哺乳動物の乳からの脂肪と油は代謝可能であり、したがって、この発明の実施で用いることができる。動物源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化の手順および他の手段は、当技術分野で周知である。ほとんどの魚は、容易に回収することができる代謝可能な油を含む。例えば、タラ肝油、鮫肝油および鯨蝋などの鯨油は、本明細書で用いることができる魚油のいくつかの例である。５炭素イソプレン単位でいくつかの分枝鎖油が生化学的に合成され、テルペノイドと一般に呼ばれている。鮫肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンとして公知である、分枝状不飽和テルペノイドを含む。スクアレンの飽和類似体スクアランを用いることもできる。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、商業的な供給源から容易に入手できるか、または当技術分野で公知である方法によって得ることができる。スクアレンが好ましい。
【００８０】
他の有用な油はトコフェロールであり、ビタミンＥは高齢患者（例えば、６０歳以上）で免疫応答に対して正の影響を有することが報告されているので、それらは、有利にはこの患者群で使用するためのワクチンに含まれる［６６］。それらは、エマルジョンの安定化を助けることができる抗酸化特性も有する［６７］。様々なトコフェロールが存在する（α、β、γ、δ、εまたはξ）が、αが通常用いられる。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである。α−トコフェロールスクシネートは、インフルエンザワクチンに適合し、水銀化合物に代わる有用な保存剤であることが公知である［６］。
【００８１】
油の混合物、例えばスクアレンおよびα−トコフェロールを用いることができる。２〜２０％（容積で）の範囲の含油率が一般的である。
【００８２】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性比）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、それらに限定されないが以下を含む界面活性剤と用いることができる：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；商品名ＤＯＷＦＡＸ（商標）で販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；反復するエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が異なることができるオクトキシノールであって、オクトキシノール−９（トリトンＸ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズなどの、ノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）などの、ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知である）；ならびに、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５）およびソルビタンモノラウレートなどのソルビタンエステル（通常、ＳＰＡＮとして公知である）。非イオン性界面活性剤が好ましい。エマルジョンに含めるのに最も好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；Ｔｗｅｅｎ８０）である。
【００８３】
界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物を用いることができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびオクトキシノールの組合せも適する。別の有用な組合せは、ラウレス９に加えてポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
【００８４】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ８０など）０．０１〜１％、より詳細には約０．１％；オクチルまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えばトリトンＸ−１００、またはトリトンシリーズの他の界面活性剤）０．００１〜０．１％、より詳細には０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、より詳細には０．１〜１％、または約０．５％である。
【００８５】
スクアレンを含有する水中油型エマルジョン、特にポリソルベート８０を含むものが好ましい。スクアレン：ポリソルベート８０の重量比は、１〜１０、例えば２〜９、例えば約２．２または約８．３であってよい。本発明で有用な具体的な水中油型エマルジョンアジュバントには、それらに限定されないが以下のものが含まれる。
【００８６】
・スクアレン、ポリソルベート８０およびソルビタントリオレエートのサブミクロンのエマルジョン。エマルジョンの組成は、容量で約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０および約０．５％のＳｐａｎ８５であってよい。重量では、これらの比は、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０および０．４８％のＳｐａｎ８５になる。参考文献７１の第１０章および参考文献７２の第１２章でさらに詳細に記載されるように、このアジュバントは「ＭＦ５９」［６８〜７０］として公知である。ＭＦ５９エマルジョンは、有利にはクエン酸イオン、例えば１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液を含む。
【００８７】
・スクアレン、トコフェロールおよびポリソルベート８０のサブミクロンのエマルジョン。これらのエマルジョンは、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロール、および０．３〜３％のポリソルベート８０を有することができ、スクアレン：トコフェロールの重量比は好ましくは≦１（例えば０．９０）であり、この比が、より安定したエマルジョンを提供することができる。スクアレンおよびポリソルベート８０は、約５：２の容量比、または約１１：５の重量比で存在することができる。そのようなエマルジョンの１つは、ＰＢＳにＴｗｅｅｎ８０を溶解させて２％溶液を与え、次にこの溶液の９０ｍｌを（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌスクアレン）の混合物と混合し、次にこの混合物を微流動化することによって作製することができる。生じるエマルジョンは、例えば１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径を有するサブミクロンの油滴を有する。エマルジョンは、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３ｄ−ＭＰＬ）を含むこともできる。この型の別の有用なエマルジョンは、ヒトの１用量につき０．５〜１０ｍｇのスクアレン、０．５〜１１ｍｇのトコフェロールおよび０．１〜４ｍｇのポリソルベート８０を含むことができる［７３］。
【００８８】
・スクアレン、トコフェロールおよびトリトン界面活性剤（例えばトリトンＸ−１００）のエマルジョン。エマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬを含むこともできる（下記参照）。エマルジョンは、リン酸緩衝液を含むことができる。
【００８９】
・ポリソルベート（例えばポリソルベート８０）、トリトン界面活性剤（例えばトリトンＸ−１００）およびトコフェロール（例えばα−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。エマルジョンは、これらの３つの成分を約７５：１１：１０の質量比（例えば７５０μｇ／ｍｌポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌトリトンＸ−１００および１００μｇ／ｍｌα−トコフェロールスクシネート）で含むことができ、これらの濃度は、これらの成分の抗原からのあらゆる寄与を含むべきである。エマルジョンは、スクアレンを含むこともできる。エマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬを含むこともできる。水相は、リン酸緩衝液を含むことができる。
【００９０】
・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１」）のエマルジョン。エマルジョンは、リン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４で製剤化することができる。このエマルジョンはムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルで、「ＳＡＦ−１」アジュバントで、スレオニル−ＭＤＰと用いられている［７４］（０．０５〜１％Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％スクアラン、２．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。「ＡＦ」アジュバント［７５］（５％スクアラン、１．２５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）の場合のように、それはＴｈｒ−ＭＤＰなしで用いることもできる。微流動化が好ましい。
【００９１】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの親水性非イオン性界面活性剤（例えばポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性の非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルまたはマンニドエステル、例えばソルビタンモノオレエートまたは「Ｓｐａｎ８０」）を含むエマルジョン。エマルジョンは好ましくは温度可逆的であり、および／または少なくとも９０％（容量で）の、２００ｎｍ未満のサイズの油滴を有する［７６］。エマルジョンは、以下の１つまたは複数を含むこともできる：アルジトール；凍結保護剤（例えば糖、例えばドデシルマルトシドおよび／またはスクロース）；ならびに／またはアルキルポリグリコシド。エマルジョンは、ＴＬＲ４アゴニストを含むことができる［７７］。そのようなエマルジョンは、凍結乾燥してもよい。
【００９２】
・スクアレン、ポロキサマー１０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン［７８］。アジュバント添加ワクチン中のこれらの成分の最終濃度（重量）は、５％スクアレン、４％ポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）および２％Ａｂｉｌ−Ｃａｒｅ８５（ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６  ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）である。
【００９３】
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献７９に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが有利である。
【００９４】
・非代謝性油（軽鉱油（ｌｉｇｈｔ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｏｉｌ）など）および少なくとも１つの界面活性剤（例えばレシチン、Ｔｗｅｅｎ８０またはＳｐａｎ８０）のサブミクロンの水中油型エマルジョン。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン親油性結合体（グルクロン酸のカルボキシル基を通してのデスアシルサポニンへの脂肪族アミンの添加によって生成される、参考文献８０に記載のＧＰＩ−０１００など）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドおよび／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどの添加剤が含まれてもよい。
【００９５】
・サポニン（例えばＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えばコレステロール）がらせんミセルとして会合するエマルジョン［８１］。
【００９６】
・鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［８２］。
【００９７】
・鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコールおよび非イオン性親油性界面活性剤（例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［８２］。
【００９８】
エマルジョンは、ワクチンの製造の間に（１つまたは複数の）抗原と組み合わせること、または送達の時に（ＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（商標）製品の場合のように）、別の抗原含有成分と即席的に混合するための別々の成分として供給することができる。これらの２つの成分が液体である場合、混合するための２つの液体の容量比は異なることができる（例えば５：１〜１：５の間で）が、一般的に約１：１である。
【００９９】
抗原およびアジュバントを混合した後、血球凝集素抗原は水溶液に一般に残るが、油／水界面の周辺に分布することがある。一般に、あるとしても少量しかない血球凝集素は、エマルジョンの油相に入る。
【０１００】
好ましい水中油型エマルジョンアジュバントは、スクアレンを含む。そのようなエマルジョンは、ＦＬＵＡＤ（商標）およびＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（商標）製品にすでに含まれている。ＦＬＵＡＤ（商標）ワクチンでは、ＨＡの総量は４５μｇ（３×１５μｇ）であり、スクアレンの総量は、０．５ｍｌの投薬容量中に９．７５ｍｇである。ＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（商標）ワクチンでは、ＨＡの総量は３．７５μｇ（一価）であり、スクアレンの総量は同じく０．５ｍｌの投薬容量中に１０．６８ｍｇである。本発明の一部の実施形態は、アジュバント効果を変わらずに保持しつつ、１用量あたりより少ない量、例えば≦８ｍｇ、≦５ｍｇ、≦３ｍｇ、≦２．５ｍｇなどのスクアレンを用いる。１用量あたり０．５ｍｇのスクアレンの最小量が好ましい（例えば、参考文献７３を参照）。１用量あたりの量の例には、５．３ｍｇ、４．９ｍｇ、２．７ｍｇ、２．４ｍｇなどが含まれる。
【０１０１】
治療およびワクチン投与の方法
本発明の組成物はヒト患者への投与に適し、本発明は、患者の免疫応答を惹起する方法であって、本発明のワクチンを患者に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１０２】
本発明は、医薬用としての本発明の組成物も提供する。
【０１０３】
本発明は、患者で免疫応答を惹起するための医薬の製造における、インフルエンザウイルスの少なくとも２つの株に由来する抗原の使用も提供し、前記株はインフルエンザＡウイルスのＨ３Ｎ２株を含み、前記医薬は上記の特性を有し、例えば、Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素の濃度はヒト１用量あたり１６μｇを超え、Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素の濃度は３２μｇ／ｍＬを超え、Ｈ３Ｎ２：Ｈ１Ｎ１血球凝集素の重量比は１を超え、Ｈ３Ｎ２：Ｂ血球凝集素の重量比は１を超える、などである。
【０１０４】
これらの方法および使用は、一般に抗体応答、好ましくは防御抗体応答を起こさせるために用いられる。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当技術分野で周知である。ヒト試験は、ヒトインフルエンザウイルスの血球凝集素に対する抗体力価が防御と相関することを示している（約３０〜４０の血清試料血球凝集阻害力価は、同種ウイルスによる感染からの約５０％の防御を与える）［８３］。抗体応答は、血球凝集阻止、微量中和、一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）、および／または一元放射溶血（ＳＲＨ）によって一般的に測定される。これらのアッセイ技術は、当技術分野において周知である。
【０１０５】
本発明の組成物は、様々な方法で投与することができる。最も好ましい免疫化経路は筋肉内注射（例えば腕もしくは脚）または皮内注射［８４、８５］によるものであるが、他の利用可能な経路には、皮下注射、鼻腔内［８６〜８８］、経口［８９］、口内、舌下、経皮、経真皮［９０］などが含まれる。
【０１０６】
本発明によって調製されるワクチンは、小児および成人の両者を治療するために用いることができる。インフルエンザワクチンは、６カ月の年齢以上の、小児および成人の免疫化で使用することが現在推奨されている。したがって、患者は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であってもよい。ワクチン投与に好ましい患者は、高齢者（例えば≧５０歳、≧６０歳および好ましくは≧６５歳）、年少者（例えば≦５歳）、入院患者、医療従事者、軍部および軍隊の人員、妊娠女性、慢性病患者、免疫不全患者、ワクチン投与の前７日間に抗ウイルス化合物（例えばオセルタミビルまたはザナミビル化合物、下記参照）を投与された患者、卵アレルギーのある者および海外旅行者である。しかしワクチンは、これらの群のためだけに適するのではなく、集団でより一般に用いることができる。
【０１０７】
本発明の好ましい組成物は、効力のＣＰＭＰ基準の１つ、２つまたは３つを満たす。成人（１８〜６０歳）では、これらの基準は以下の通りである：（１）≧７０％血清防御、（２）≧４０％セロコンバージョン、および／または（３）≧２．５倍のＧＭＴ増加。高齢者（＞６０歳）では、これらの基準は以下の通りである：（１）≧６０％血清防御、（２）≧３０％セロコンバージョン、および／または（３）≧２倍のＧＭＴ増加。これらの基準は、少なくとも５０人の患者の非盲検試験に基づく。
【０１０８】
治療は、単回用量スケジュールまたは多回用量スケジュールによることができる。多回用量は、一次免疫化スケジュールおよび／または追加抗原刺激免疫化スケジュールで用いることができる。多回用量スケジュールでは、同じであるかまたは異なる経路で、例えば非経口初回刺激（ｐｒｉｍｅ）および粘膜追加刺激（ｂｏｏｓｔ）、粘膜初回刺激および非経口追加刺激などによって様々な用量を与えることができる。免疫学的にナイーブな患者、例えばインフルエンザワクチンをこれまで投与されたことのない人々で、または新しいＨＡサブタイプを含むワクチンのために、一回より多い用量（一般的に、２用量）の投与が特に有用である。多回用量は、一般的に少なくとも１週間隔（例えば約２週、約３週、約４週、約６週、約８週、約１２週、約１６週など）で投与される。
【０１０９】
本発明によって生成されるワクチンは、他のワクチンと実質的に同じ時間に（例えば医療専門家またはワクチン接種施設への同じ診察または診療の間に）、例えば麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、複合Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅｂ型ワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌複合ワクチン（四価のＡ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチンなど）、ＲＳウイルスワクチン、肺炎球菌複合ワクチンなどと実質的に同じ時間に、患者に投与されてもよい。肺炎球菌ワクチンおよび／または髄膜炎菌ワクチンと実質的に同じ時間の投与は、高齢患者で特に有益である。
【０１１０】
同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、特にインフルエンザウイルスに有効な抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同じ時間に（例えば医療専門家への同じ診察または診療の間に）患者に投与されてもよい。これらの抗ウイルス薬には、そのエステル（例えばエチルエステル）およびその塩（例えばリン酸塩）を含む、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸などのノイラミニダーゼ阻害剤が含まれる。好ましい抗ウイルス薬は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、エチルエステル、リン酸塩（１：１）であり、リン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ（商標））としても公知である。
【０１１１】
一般
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えばＸを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘから排他的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ  ｏｆ）こと、または別のものを含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）こと、例えばＸ＋Ｙであることができる。
【０１１２】
単語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要な場合、単語「実質的に」は、本発明の定義から省略されてもよい。
【０１１３】
数値ｘに関しての用語「約」は、任意選択で用いられ、例えばｘ±１０％を意味する。
【０１１４】
特記されていない場合、２つ以上の成分を混合するステップを含む方法は、混合のいかなる特定の順序も要求しない。したがって、成分を任意の順序で混合することができる。３つの成分がある場合、２つの成分を互いと組み合わせ、次にその組合せを第三の成分と組み合わせること、などができる。
【０１１５】
動物（特にウシ）の材料を細胞の培養で用いる場合、それらは、伝染性の海綿状脳症（ＴＳＥ）が存在せず、特に牛海綿状脳症（ＢＳＥ）が存在しない原料から得るべきである。全体として、動物由来の物質が完全に存在しない中で細胞を培養することが好ましい。
【０１１６】
リアソートメントまたは逆方向遺伝学手順のために、またはウイルス増殖のために細胞基質を用いる場合、好ましくはそれは、例えばＰｈ  Ｅｕｒ  ｇｅｎｅｒａｌ第５．２．３章の場合のように、ヒトワクチンの製造での使用が承認されているものである。
【実施例】
【０１１７】
４５０人の患者（男性および女性、≧６５歳）を、１０群に分ける。各群に、三価インフルエンザワクチン（Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２、Ｂ）を投与する。５群は標準の抗原用量（筋肉内については３×１５μｇ、皮内については３ｘ６μｇ）を投与され、他の５群は倍用量のＨ３Ｎ２を有するワクチンを投与される。
【０１１８】
８群（Ａ〜Ｈ）は、水中スクアレンエマルジョンと一緒にまたはそれなしで、筋肉内注射（０．５ｍＬ）によってワクチンを投与される。ワクチンは、充填済み注射器で供給される。３つの異なるアジュバント量（希釈によって達成される）が検査される。
【０１１９】
他の２群（ＩＤ１およびＩＤ２）は、皮内経路によってアジュバント無添加ワクチンを投与される（０．２ｍＬ）。
【０１２０】
インフルエンザ株は、北半球でインフルエンザ流行期２００８〜２００９年に推奨された通りである：Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７様、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７様ウイルス、およびＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６様。
【０１２１】
被験体は単回用量を投与され、ベースライン（ワクチン接種前）、ワクチン接種の７日後（８日目）、および２１日後（２２日目）に収集される血液を分析することによって、インフルエンザ特異的免疫応答を評価する。血清試料は、インフルエンザ株Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２およびＢに対する株特異的血球凝集阻止（ＨＩ）アッセイによって評価される。細胞媒介性免疫アッセイも、実施される。
【０１２２】
したがって、１０群は以下の通りである。
【０１２３】
【表１】
2012517416.tif 000002
試験されたすべてのワクチンは、全３株のＣＨＭＰ基準を満たす。Ｈ３Ｎ２抗原への免疫応答だけに集中すると、抗体力価＞１：４０を有する患者の割合は、通常の用量を投与される群（Ａ群；９３％）と比較して、高いＨ３用量のアジュバント無添加ワクチンを投与される患者群（Ｂ群；８０％）で予想外により低い。対照的に、抗体力価＞１：４０を有する患者の割合は、高いＨ３用量が２．４４ｍｇスクアレンと組み合わされて投与される場合に９３％（Ｃ群）から９８％（Ｄ群）に増加し、高いＨ３用量が９．７５ｍｇスクアレンと組み合わされて投与される場合には９６％（Ｇ群）から１００％（Ｈ群）に増加する。より高いＨ３用量が４．８８ｍｇスクアレンと組み合わされて投与される群では小さな減少が観察される（Ｅ群の９０％に対してＦ群の９０％）が、アジュバント無添加ワクチンを皮内投与される群では８８％（ＩＤ１群）から９０％（ＩＤ２群）への増加が見られる。
【０１２４】
したがって驚くべきことに、高いＨ３用量がアジュバントなしで与えられる場合に見られる抗Ｈ３免疫応答の低下は、ワクチンを（ｉ）アジュバントと組み合わせて投与するか、または（ｉｉ）アジュバントなしで皮内投与することによって低減すること、または逆転させることさえできる。
【０１２５】
本発明は、ほんの一例として説明されたすぎず、本発明の範囲および精神の範囲に留まりながら修正を加えることができることが理解されよう。
【０１２６】
【化１】
2012517416.tif 000003
【０１２７】
【化２】
2012517416.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成23年11月7日(2011.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
一般的な実施形態では、ワクチンはＡ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株およびＢ株からの血球凝集素を含み、（ｉ）Ｈ３Ｎ２：Ｈ１Ｎ１血球凝集素の重量比は１を超え、（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２：Ｂ血球凝集素の重量比は１を超える。そのようなワクチンでは、Ｈ１Ｎ１：Ｂ血球凝集素の重量比は、通常１である。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
Ａ／Ｈ１Ｎ１血球凝集素およびＡ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素を含み、Ｈ３Ｎ２：Ｈ１Ｎ１血球凝集素の重量比が１を超え、アジュバントを含むインフルエンザウイルスワクチン。
（項目２）
Ａ／Ｈ１Ｎ１血球凝集素およびＢ血球凝集素を含み、Ｈ３Ｎ２：Ｂ血球凝集素の重量比が１を超え、アジュバントを含むインフルエンザウイルスワクチン。
（項目３）
Ａ／Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株、Ａ／Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株およびインフルエンザウイルスＢ株からの血球凝集素を含み、（ｉ）Ｈ３Ｎ２：Ｈ１Ｎ１血球凝集素の重量比が１を超え、（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２：Ｂ血球凝集素の重量比が１を超える、項目１または項目２に記載のワクチン。
（項目４）
その濃度が３２μｇ／ｍＬを超えるＡ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素を含み、アジュバントを含むインフルエンザウイルスワクチン。
（項目５）
不活化ウイルスを含む、前述の項目のいずれかに記載のワクチン。
（項目６）
スプリットビリオンワクチンまたは精製された表面抗原ワクチンである、項目５に記載のワクチン。
（項目７）
Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素の濃度が約６０μｇ／ｍｌである、前述の項目のいずれかに記載のワクチン。
（項目８）
Ａ／Ｈ３Ｎ２以外のインフルエンザウイルス株の血球凝集素の濃度が１株につき０．２〜３０μｇ／ｍｌの範囲内にある、前述の項目のいずれかに記載のワクチン。
（項目９）
複数のインフルエンザウイルス株からの血球凝集素を含み、Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素の量が１株あたりの血球凝集素の平均量よりも多い、前述の項目のいずれかに記載のワクチン。
（項目１０）
Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素の量がＡ／Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス以外の株からの血球凝集素の合わせた量と等しい、前述の項目のいずれかに記載のワクチン。
（項目１１）
Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスＡ株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスＡ株およびインフルエンザＢウイルス株からの血球凝集素を含有する三価不活化ワクチンであり、上記血球凝集素の重量比が１：２：１（Ａ／Ｈ１Ｎ１：Ａ／Ｈ３Ｎ２：Ｂ）である、前述の項目のいずれかに記載のワクチン。
（項目１２）
サブミクロンの油滴を有する水中油型エマルジョンアジュバントを含む、前述の項目のいずれかに記載のワクチン。
（項目１３）
上記エマルジョンがスクアレン含有エマルジョンである、項目１２に記載のワクチン。
（項目１４）
上記エマルジョンがスクアレン、ポリソルベート８０およびソルビタントリオレエートを含む、項目１３に記載のワクチン。
（項目１５）
上記エマルジョンがスクアレン、ＤＬ−α−トコフェロールおよびポリソルベート８０を含む、項目１３に記載のワクチン。
（項目１６）
上記エマルジョンがスクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの親水性非イオン性界面活性剤および疎水性非イオン性界面活性剤を含む、項目１３に記載のワクチン。
（項目１７）
１８ｍｇ／ｍＬ〜２２ｍｇ／ｍＬのスクアレンを有する、項目１３から１６のいずれか一項に記載のワクチン。
（項目１８）
ヒト１用量あたり２ｍｇ〜８ｍｇのスクアレンを有する、項目１３から１６のいずれか一項に記載のワクチン。
（項目１９）
患者の免疫応答を惹起する方法であって、前述の項目のいずれかに記載のワクチンを上記患者に投与するステップを含む方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ／Ｈ１Ｎ１血球凝集素およびＡ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素を含み、Ｈ３Ｎ２：Ｈ１Ｎ１血球凝集素の重量比が１を超え、アジュバントを含む不活化インフルエンザウイルスワクチン。
【請求項２】
Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素およびＢ血球凝集素を含み、Ｈ３Ｎ２：Ｂ血球凝集素の重量比が１を超え、アジュバントを含む不活化インフルエンザウイルスワクチン。
【請求項３】
Ａ／Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株、Ａ／Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株およびインフルエンザウイルスＢ株からの血球凝集素を含み、（ｉ）Ｈ３Ｎ２：Ｈ１Ｎ１血球凝集素の重量比が１を超え、（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２：Ｂ血球凝集素の重量比が１を超える、請求項１または請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
その濃度が３２μｇ／ｍＬを超えるＡ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素を含み、アジュバントを含む不活化インフルエンザウイルスワクチン。
【請求項５】
スプリットビリオンワクチンまたは精製された表面抗原ワクチンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項６】
Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素の濃度が約６０μｇ／ｍｌである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項７】
Ａ／Ｈ３Ｎ２以外のインフルエンザウイルス株の血球凝集素の濃度が１株につき０．２〜３０μｇ／ｍｌの範囲内にある、請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項８】
複数のインフルエンザウイルス株からの血球凝集素を含み、Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素の量が１株あたりの血球凝集素の平均量よりも多い、請求項１〜７のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項９】
Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素の量がＡ／Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス以外の株からの血球凝集素の合わせた量と等しい、請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１０】
Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスＡ株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスＡ株およびインフルエンザＢウイルス株からの血球凝集素を含有する三価不活化ワクチンであり、前記血球凝集素の重量比が１：２：１（Ａ／Ｈ１Ｎ１：Ａ／Ｈ３Ｎ２：Ｂ）である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１１】
サブミクロンの油滴を有する水中油型エマルジョンアジュバントを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記エマルジョンがスクアレン含有エマルジョンである、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記エマルジョンがスクアレン、ポリソルベート８０およびソルビタントリオレエートを含む、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記エマルジョンがスクアレン、ＤＬ−α−トコフェロールおよびポリソルベート８０を含む、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記エマルジョンがスクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの親水性非イオン性界面活性剤および疎水性非イオン性界面活性剤を含む、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１６】
１８ｍｇ／ｍＬ〜２２ｍｇ／ｍＬのスクアレンを有する、請求項１２から１５のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１７】
ヒト１用量あたり２ｍｇ〜８ｍｇのスクアレンを有する、請求項１２から１５のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１８】
患者の免疫応答を惹起するための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１９】
皮内不活化インフルエンザワクチンであって、前記ワクチンは、
（ａ）Ａ／Ｈ１Ｎ１血球凝集素およびＡ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素であって、ここで、Ｈ３Ｎ２：Ｈ１Ｎ１血球凝集素の重量比が１を超える、Ａ／Ｈ１Ｎ１血球凝集素およびＡ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素；
（ｂ）Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素およびＢ血球凝集素であって、Ｈ３Ｎ２：Ｂ血球凝集素の重量比が１を超える、Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素およびＢ血球凝集素；または
（ｃ）Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素であって、前記Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素の濃度が３２μｇ／ｍＬを超える、Ａ／Ｈ３Ｎ２血球凝集素、
を含む、ワクチン。
【請求項２０】
皮内に投与されることを特徴とする、請求項１９に記載のワクチン。
【国際調査報告】
2012517416.tif 000005
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