(57)【要約】  開示する発明は、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種ジェジュニ（ｊｅｊｕｎｉ）、コリ（ｃｏｌｉ）および／またはラリ（ｌａｒｉ）由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡターゲット核酸をターゲットとする１以上のオリゴマーを含む、組成物、キットおよび方法に関する。組成物には、増幅オリゴマー、検出プローブオリゴマーおよび／またはターゲット捕捉オリゴマーが含まれる。キットおよび方法は、これらのオリゴマーの少なくとも１つを含む。
2012508586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）ターゲット核酸を特異的に検出するための方法であって：
（ａ）少なくとも１つのカンピロバクター属ターゲット核酸を含有すると推測される試料を提供し；
（ｂ）前記試料を少なくとも２つの増幅オリゴマーと接触させ、ここで、第一の前記増幅オリゴマーは、長さ１５〜４５ヌクレオチドであり、そしてＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のヌクレオチド１０８〜１５０に対応するカンピロバクター属１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の領域中の配列をターゲットとするよう設定された、ターゲットハイブリダイズ配列を含み、そして第二の前記増幅オリゴマーは、長さ１５〜４５ヌクレオチドであり、そしてＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のヌクレオチド１７０〜２２６に対応するカンピロバクター属１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の領域中の配列をターゲットとするよう設定された、ターゲットハイブリダイズ配列を含む；
（ｃ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応を行い、ここで、前記試料中に存在するＣ．ジェジュニ（Ｃ．  ｊｅｊｕｎｉ）・ターゲット核酸、Ｃ．コリ（Ｃ．  ｃｏｌｉ）・ターゲット核酸およびＣ．ラリ（Ｃ．  ｌａｒｉ）・ターゲット核酸のいずれかが、増幅産物を生成するためのテンプレートとして用いられる；そして
（ｄ）前記増幅産物を検出する核酸検出反応を実行して、カンピロバクター属ターゲット核酸が前記試料中に存在するかどうかを決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
試料中のカンピロバクター属ターゲット核酸を特異的に検出するための方法であって：
（ａ）少なくとも１つのカンピロバクター属ターゲット核酸を含有すると推測される試料を提供し；
（ｂ）前記試料を、Ｃ．ジェジュニ・ターゲット核酸ならびにＣ．コリ、Ｃ．ラリまたはＣ．コリおよびＣ．ラリ・ターゲット核酸に安定してハイブリダイズする少なくとも２つの増幅オリゴマーと接触させ、ここで、第一の前記増幅オリゴマーは、長さ１５〜４５ヌクレオチドであり、そしてＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のヌクレオチド１０８〜１５０に対応するカンピロバクター属１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の領域中の配列をターゲットとするよう設定された、ターゲットハイブリダイズ配列を含み、そして第二の前記増幅オリゴマーは、長さ１５〜４５ヌクレオチドであり、そしてＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のヌクレオチド１７０〜２２６に対応するカンピロバクター属１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の領域中の配列をターゲットとするよう設定された、ターゲットハイブリダイズ配列を含む；
（ｃ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応を行い、ここで、前記試料中に存在するターゲット核酸が、増幅産物を生成するためのテンプレートとして用いられる；そして
（ｄ）前記増幅産物を検出する核酸検出反応を実行して、カンピロバクター属ターゲット核酸が前記試料中に存在するかどうかを決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項３】
前記の第一の前記増幅オリゴマーが：  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のヌクレオチド１１５〜１５０に対応する領域；  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のヌクレオチド１１５〜１３５に対応する領域；  およびＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のヌクレオチド１２５〜１５０に対応する領域からなる群より選択される、カンピロバクター属１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の領域中の配列をターゲットとするよう設定されたターゲットハイブリダイズ配列を含む、請求項１または２の方法。
【請求項４】
前記の第二の前記増幅オリゴマーが配列番号７を含む、請求項３の方法。
【請求項５】
前記の第二の前記増幅オリゴマーが：  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のヌクレオチド１７０〜２１２に対応する領域；  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のヌクレオチド１８４〜２１２に対応する領域；  およびＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のヌクレオチド１７０〜２０５に対応する領域からなる群より選択される、カンピロバクター属１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の領域中の配列をターゲットとするよう設定されたターゲットハイブリダイズ配列を含む、請求項１または請求項２の方法。
【請求項６】
前記の第一の前記増幅オリゴマーが、本質的に配列番号２７からなるターゲットハイブリダイズ配列を含み、そして５’プロモーター配列を場合によってさらに含む、請求項５の方法。
【請求項７】
前記の第一の前記増幅オリゴマーが配列番号２６を含む、請求項５の方法。
【請求項８】
前記の第一の前記増幅オリゴマーが、本質的に配列番号３３からなるターゲットハイブリダイズ配列を含み、そして５’プロモーター配列を場合によってさらに含む、請求項５の方法。
【請求項９】
前記の第一の前記増幅オリゴマーが配列番号３２を含む、請求項５の方法。
【請求項１０】
前記の第一の前記増幅オリゴマーが、配列番号１８〜３３および８４〜８８からなる群より選択され、ここで、配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３が５’プロモーター配列を場合によってさらに含む、請求項１または請求項２の方法。
【請求項１１】
前記の第二の増幅オリゴマーが、配列番号１〜１４からなる群より選択される、請求項１または請求項２の方法。
【請求項１２】
前記の第一の増幅オリゴマーが、本質的に配列番号２６からなる、請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記の第一の増幅オリゴマーが、本質的に配列番号３２からなる、請求項１１の方法。
【請求項１４】
前記の第二の増幅オリゴマーが、本質的に配列番号７からなる、請求項１または請求項２の方法。
【請求項１５】
前記の第一の前記増幅オリゴマーが、５’プロモーター配列をさらに含む、プロモーターに基づく増幅オリゴマーである、請求項１または請求項２の方法。
【請求項１６】
前記５’プロモーター配列が配列番号７５である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
工程ｂが、前記試料とブロッカーオリゴマーを接触させる工程をさらに含む、請求項１または請求項２の方法。
【請求項１８】
前記ブロッカーオリゴマーが、本質的に配列番号５０からなる、請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記検出反応が、前記増幅産物の部分にハイブリダイズするように設定された検出プローブオリゴマーと、前記増幅産物を接触させる工程を含む、請求項１または請求項２の方法。
【請求項２０】
前記検出がリアルタイム検出である、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記検出オリゴマーが配列番号６３〜６８からなる群より選択される、請求項１９の方法。
【請求項２２】
前記検出オリゴマーが、本質的に配列番号６７からなる、請求項１９の方法。
【請求項２３】
前記検出オリゴマーが、本質的に配列番号６８からなる、請求項１９の方法。
【請求項２４】
前記の第一の増幅オリゴマーが、配列番号２６、配列番号３２、および配列番号８４〜８８からなる群より選択され、そして前記の第二の増幅オリゴマーが配列番号７である、請求項１または請求項２の方法。
【請求項２５】
前記検出反応が、配列番号６７および配列番号６８からなる群より選択される検出プローブオリゴマーと、前記増幅産物を接触させる工程を含む、請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記の第一の増幅オリゴマーが配列番号２６であり、そして工程ｂが、本質的に配列番号５０からなるブロッカーと前記試料を接触させる工程をさらに含む、請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記の第一の増幅オリゴマーが配列番号３２であり、そして工程ｂが、本質的に配列番号５０からなるブロッカーと前記試料を接触させる工程をさらに含む、請求項２５の方法。
【請求項２８】
カンピロバクター属ターゲット核酸を含有すると推測される前記試料と、ターゲット捕捉オリゴマーを接触させる工程をさらに含む、請求項１または請求項２の方法。
【請求項２９】
前記ターゲット捕捉オリゴマーが、配列番号５８、７１および７３からなる群より選択される、請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記試料が、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．コリ、またはＣ．ラリに緊密に関連する１以上の細菌由来の核酸をさらに含有し、そして前記ターゲット核酸が、前記試料中で特異的に検出される、請求項１または請求項２の方法。
【請求項３１】
前記の１以上の細菌が：Ｃ．フィタス亜種フィタス（Ｃ．  Ｆｅｔｕｓ，  ｓｓｐ．  ｆｅｔｕｓ）、Ｃ．フィタス亜種ベネレアリス（Ｃ．  ｆｅｔｕｓ  ｓｓｐ  ｖｅｎｅｒｅａｌｉｓ）、Ｃ．ウプサリエンシス（Ｃ  ｕｐｓａｌｉｅｎｓｉｓ）、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、Ｃ．フェカリス（Ｃ．  ｆｅｃａｌｉｓ）、Ｓ．エンテリディス（Ｓ．  ｅｎｔｅｒｉｄｉｓ）、Ｈ．ピロリ（Ｈ．  ｐｙｌｏｒｉ）、Ｅ．ブルナリス（Ｅ．  ｖｕｌｎａｒｉｓ）、Ｅ．ヘルマニ（Ｅ．  ｈｅｒｍａｎｎｉｉ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、エドワージエラ・ホシナエ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ  ｈｏｓｈｉｎａｅ）、Ｐ．ミリバリス（Ｐ．  ｍｉｒｉｂａｌｉｓ）、シトロバクター・ブラキ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａｋｉｉ）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、Ａ．ブツレリ（Ａ．  ｂｕｔｚｌｅｒｉ）、Ｃ．フィタス亜種フィタス、Ｃ．フィタス亜種ベネレアリス、およびＣ．ウプサリエンシスの少なくとも１つである、請求項３０の方法。
【請求項３２】
工程ｃで、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．コリ、またはＣ．ラリに緊密に関連する１以上の細菌由来の核酸の存在下で、前記ターゲット核酸が特異的に増幅される、請求項１または請求項２の方法。
【請求項３３】
前記の１以上の細菌が：Ｃ．フィタス亜種フィタス、Ｃ．フィタス亜種ベネレアリス、Ｃ．ウプサリエンシス、大腸菌、Ｃ．フェカリス、Ｓ．エンテリディス、Ｈ．ピロリ、Ｅ．ブルナリス、Ｅ．ヘルマニ、エンテロバクター・クロアカ、エドワージエラ・ホシナエ、Ｐ．ミリバリス、シトロバクター・ブラキ、蛍光菌、シゲラ・フレックスネリ、エロモナス・ハイドロフィラ、Ａ．ブツレリ、Ｃ．フィタス亜種フィタス、Ｃ．フィタス亜種ベネレアリス、およびＣ．ウプサリエンシスの少なくとも１つである、請求項３２の方法。
【請求項３４】
Ｃ．ジェジュニ・ターゲット核酸ならびにＣ．コリ、Ｃ．ラリまたはＣ．コリおよびＣ．ラリ・ターゲット核酸に安定してハイブリダイズ可能である、少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む、カンピロバクター属ターゲット核酸増幅アッセイにおいて使用するための組成物であって、第一の前記増幅オリゴマーは、長さ１５〜４５ヌクレオチドであり、そしてＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のヌクレオチド１０８〜１５０に対応するカンピロバクター属１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の領域中の配列をターゲットとするよう設定された、ターゲットハイブリダイズ配列を含み、そして第二の前記増幅オリゴマーは、長さ１５〜４５ヌクレオチドであり、そしてＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のヌクレオチド１７０〜２２６に対応するカンピロバクター属１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の領域中の配列をターゲットとするよう設定された、ターゲットハイブリダイズ配列を含む、前記組成物。
【請求項３５】
前記の第一の前記増幅オリゴマーが：  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のヌクレオチド１１５〜１５０に対応する領域；  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のヌクレオチド１１５〜１３５に対応する領域；  およびＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のヌクレオチド１２５〜１５０に対応する領域からなる群より選択される、カンピロバクター属１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の領域中の配列をターゲットとするよう設定されたターゲットハイブリダイズ配列を含む、請求項３４の組成物。
【請求項３６】
前記の第二の前記増幅オリゴマーが配列番号７を含む、請求項３５の組成物。
【請求項３７】
前記の第二の前記増幅オリゴマーが：  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のヌクレオチド１７０〜２１２に対応する領域；  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のヌクレオチド１８４〜２１２に対応する領域；  およびＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のヌクレオチド１７０〜２０５に対応する領域からなる群より選択される、カンピロバクター属１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の領域中の配列をターゲットとするよう設定されたターゲットハイブリダイズ配列を含む、請求項３４の組成物。
【請求項３８】
前記の第一の前記増幅オリゴマーが、本質的に配列番号２７からなるターゲットハイブリダイズ配列を含み、そして５’プロモーター配列を場合によってさらに含む、請求項３７の組成物。
【請求項３９】
前記の第一の前記増幅オリゴマーが配列番号２６を含む、請求項３７の組成物。
【請求項４０】
前記の第一の前記増幅オリゴマーが、本質的に配列番号３３からなるターゲットハイブリダイズ配列を含み、そして５’プロモーター配列を場合によってさらに含む、請求項３７の組成物。
【請求項４１】
前記の第一の前記増幅オリゴマーが配列番号３２を含む、請求項３７の組成物。
【請求項４２】
前記の第一の前記増幅オリゴマーが、配列番号１８〜３３および８４〜８８からなる群より選択され、ここで、配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３が５’プロモーター配列を場合によってさらに含む、請求項３４の組成物。
【請求項４３】
前記の第二の増幅オリゴマーが、配列番号１〜１４からなる群より選択される、請求項３４の組成物。
【請求項４４】
前記の第一の増幅オリゴマーが、本質的に配列番号２６からなる、請求項４３の組成物。
【請求項４５】
前記の第一の増幅オリゴマーが、本質的に配列番号３２からなる、請求項４３の組成物。
【請求項４６】
前記の第二の増幅オリゴマーが、本質的に配列番号７からなる、請求項３４の組成物。
【請求項４７】
前記の第一の前記増幅オリゴマーが、５’プロモーター配列をさらに含む、プロモーターに基づく増幅オリゴマーである、請求項３４の組成物。
【請求項４８】
前記５’プロモーター配列が配列番号７５である、請求項４７の組成物。
【請求項４９】
ブロッカーオリゴマーをさらに含む、請求項３４の組成物。
【請求項５０】
前記ブロッカーオリゴマーが、本質的に配列番号５０からなる、請求項４９の組成物。
【請求項５１】
前記の少なくとも２つの増幅オリゴマーによって、ターゲット核酸から生成された増幅産物の部分にハイブリダイズするよう設定された検出オリゴマーをさらに含む、請求項３４の組成物。
【請求項５２】
前記検出オリゴマーが配列番号６３〜６８からなる群より選択される、請求項５１の組成物。
【請求項５３】
前記検出オリゴマーが、本質的に配列番号６７からなる、請求項５１の組成物。
【請求項５４】
前記検出オリゴマーが、本質的に配列番号６８からなる、請求項５１の組成物。
【請求項５５】
前記の第一の増幅オリゴマーが、配列番号２６、配列番号３２、および配列番号８４〜８８からなる群より選択され、そして前記の第二の増幅オリゴマーが配列番号７である、請求項３４の組成物。
【請求項５６】
配列番号６７および配列番号６８からなる群より選択される検出オリゴマーをさらに含む、請求項５５の組成物。
【請求項５７】
前記の第一の増幅オリゴマーが配列番号２６であり、そして前記組成物が配列番号５０をさらに含む、請求項５６の組成物。
【請求項５８】
前記の第一の増幅オリゴマーが配列番号３２であり、そして前記組成物が配列番号５０をさらに含む、請求項５６の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は、分子生物学的方法を用いることによる、試料中のカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）（Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．  ｊｅｊｕｎｉ））、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ）（Ｃ．ラリ（Ｃ．  ｌａｒｉ））、またはカンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）（Ｃ．コリ（Ｃ．  ｃｏｌｉ））細菌の存在の検出に関し、そして具体的には、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリ由来の核酸を増幅し、そして増幅された核酸配列を検出することによる、試料中のＣ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリの検出に関する。
【０００２】
関連出願に対するクロスリファレンス
[0002]本出願は、その全体が本明細書に援用される、２００８年１１月１４日出願の米国仮出願第６１／１１４，５４７号に対する優先権の恩典を請求する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]カンピロバクター属汚染は、食物由来の疾病の主要な原因の１つであり、そしてカンピロバクター症を導きうる。カンピロバクター属はまた、ヒトにおける下痢性疾病の主な原因でもあり、そして一般的に、世界中の胃腸炎の最も一般的な細菌性の原因と見なされている。米国において、カンピロバクター属は、年間２００万人の人々に影響を及ぼしていると概算される。伝染の一般的な経路は、汚染食物、水またはミルクの摂取、生肉の摂食、個人対個人の性的接触、および糞口伝染である。カンピロバクター属の感染性用量は、ヒト摂食研究によって示されるように、わずか４００〜５００個の細菌でありうるが、感染性用量および用量反応は、用いた株、ならびに個体の年齢および身体状態に依存する。症状は細菌を摂取した２〜１０日後に現れ、そしてこれには、発熱、痙攣性腹痛、および血性でありうる穏やかから重度の下痢が含まれる。大部分の感染は、ウシ、ブタ、および鳥類で一般的に見られ、これらの中では非病原性であるＣ．ジェジュニによって引き起こされるが、Ｃ．コリ（やはりウシ、ブタおよび鳥類において見られる）およびＣ．ラリ（特に海鳥に存在する）によってもまた、疾病が引き起こされうる。Ｃ．ジェジュニのいくつかの系統は、コレラ様内毒素を産生し、これは感染中に観察される水様性下痢において重要である。大部分のカンピロバクター属感染は、自然にまたは抗生物質の補助で一掃されるが、長期続発症には、反応性関節炎、ギラン・バレー症候群およびミラー・フィッシャー症候群が含まれる。
【０００４】
[0004]ニワトリ、ウシ、ペット、ヤギ、ヒツジおよび池水および河川水を含む非常に多様な供給源から、カンピロバクター属が単離可能であることが、研究によって示されてきている。ミルク、特に低温殺菌されていない（生の）ミルク、および鶏肉は、カンピロバクター属感染と関連する最も一般的な食品である。カンピロバクター属はまた、赤肉からも単離されうるが、汚染頻度は、一般的に、鶏肉よりもはるかに低い。この細菌は、通常、感染した食物中では増幅しないため、非常に少数しか存在しないことから、食物供給源からのカンピロバクター属の単離は困難である。培養法は、抗生物質を含有する強化ブロス、特殊な抗生物質含有プレート、２つの異なる温度でのインキュベーション、および二酸化炭素濃度が上昇した、微好気性大気を必要とする。単離には数日から数週間掛かりうる。現在のＵＳＤＡ検出法を用いたカンピロバクター属の同定には、２〜３日掛かりうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
汚染または感染供給源を正確に検出し、そして除去することが可能であるように、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリまたはＣ．コリを検出する、迅速で、感度が高く、そして正確な方法が必要である。感染個体を適切に治療して、罹患を限定し、そしてさらなる感染を防止することが可能であるように、ヒトにおけるＣ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリ感染の迅速でそして正確な診断を可能にする方法に関する必要もまたある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
[0005]本発明は、カンピロバクター属の一般的な病原性株、特に、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・コリ、およびカンピロバクター・ラリの検出において用いる組成物、キット、および方法に関する。本発明は、少なくとも部分的に、特定のカンピロバクター属配列が、カンピロバクター属の検出に驚くほど有効であるという発見に基づく。特定の側面および態様において、カンピロバクター属１６Ｓ  ｒＲＮＡの特定の領域は、特異性、感度、または検出速度ならびに他の利点に関連した改善を提供する、核酸増幅のために好ましいターゲットと同定されてきている。
【０００７】
[0006]したがって、１つの態様にしたがって、カンピロバクター属核酸増幅アッセイにおいて使用するための組成物であって、カンピロバクター属ターゲット核酸を増幅するための増幅オリゴマーである、前記組成物を提供する。特定の側面において、組成物には、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドが含まれ、これらはどちらも、Ｃ．ジェジュニ・ターゲット核酸ならびにＣ．コリ、Ｃ．ラリまたはＣ．コリおよびＣ．ラリ・ターゲット核酸に安定してハイブリダイズ可能であり；ここでＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８  １６Ｓ  ｒＲＮＡ（配列番号９１）のほぼ１４〜１５０の塩基に対応するカンピロバクター属核酸の領域中の配列をターゲットとするよう設定され、そしてプライマーオリゴヌクレオチドは、カンピロバクター属核酸の領域中の配列をターゲットとするよう設定される。一般の当業者は、増幅オリゴマーが増幅アッセイで使用可能であるように、参照配列に対して、増幅オリゴマーの一方がセンスに設定され、そして他方がアンチセンスに設定されることを理解するであろう。
【０００８】
[0007]別の態様において、本明細書に提供する組成物を含むキットを提供する。特定の側面において、キットには、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドが含まれ、これらはどちらも、Ｃ．ジェジュニ・ターゲット核酸ならびにＣ．コリ、Ｃ．ラリまたはＣ．コリおよびＣ．ラリ・ターゲット核酸に安定してハイブリダイズ可能であり、ここでＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８  １６Ｓ  ｒＲＮＡのほぼ１４〜１５０の塩基に対応するカンピロバクター属核酸の領域中の配列をターゲットとするよう設定され、そしてプライマーオリゴヌクレオチドはカンピロバクター属核酸の領域中の配列をターゲットとするよう設定される。一般の当業者は、増幅オリゴマーが増幅アッセイで使用可能であるように、参照配列に対して、増幅オリゴマーの一方がセンスに設定され、そして他方がアンチセンスに設定されることを理解するであろう。
【０００９】
[0008]別の態様において、本明細書に提供する組成物および／またはキットを用いて、試料中のカンピロバクター属の存在を検出するための方法を提供する。特定の側面において、方法は、Ｃ．ジェジュニ・ターゲット核酸ならびにＣ．コリ、Ｃ．ラリまたはＣ．コリおよびＣ．ラリ・ターゲット核酸に安定してハイブリダイズするＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを用い、そしてここでＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８  １６Ｓ  ｒＲＮＡのほぼ１４〜１５０の塩基に対応するカンピロバクター属核酸の領域中の配列をターゲットとするよう設定され、そしてプライマーオリゴヌクレオチドはカンピロバクター属核酸の領域中の配列をターゲットとするよう設定される。一般の当業者は、増幅オリゴマーが増幅アッセイで使用可能であるように、参照配列に対して、増幅オリゴマーの一方がセンスに設定され、そして他方がアンチセンスに設定されることを理解するであろう。
【００１０】
[0009]１つの側面において、Ｔ７プロバイダーは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８の塩基８３〜１５０に対応するカンピロバクター属核酸の領域中の配列をターゲットとするよう設定される。別の側面において、Ｔ７プロバイダーは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８の塩基１０８〜１５０に対応するカンピロバクター属核酸の領域中の配列をターゲットとするよう設定される。別の側面において、Ｔ７プロバイダーは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８の塩基１１５〜１５０に対応するカンピロバクター属核酸の領域中の配列をターゲットとするよう設定される。別の側面において、Ｔ７プロバイダーは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８の塩基１１５〜１３５に対応するカンピロバクター属核酸の領域中の配列をターゲットとするよう設定される。別の側面において、Ｔ７プロバイダーは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８の塩基１２５〜１５０に対応するカンピロバクター属核酸の領域中の配列をターゲットとするよう設定される。
【００１１】
[0010]１つの側面において、プライマーオリゴヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８（配列番号９１）のほぼ６２〜２２６の塩基に対応するカンピロバクター属核酸の領域中の配列をターゲットとするよう設定される。別の側面において、プライマーオリゴヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のほぼ１７０〜２２６の塩基に対応するカンピロバクター属核酸の領域中の配列をターゲットとするよう設定される。別の側面において、プライマーオリゴヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のほぼ１７０〜２１２の塩基に対応するカンピロバクター属核酸の領域中の配列をターゲットとするよう設定される。別の側面において、プライマーオリゴヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８の塩基１８４〜２１２に対応するカンピロバクター属核酸の領域中の配列をターゲットとするよう設定される。別の側面において、プライマーオリゴヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８の塩基１７０〜２０５に対応するカンピロバクター属核酸の領域中の配列をターゲットとするよう設定される。
【００１２】
[0011]１つの側面において、Ｔ７プロバイダーは、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、８４、８５、８６、８７、８８およびその相補体の配列より選択される。別の側面において、Ｔ７プロバイダーは、配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、およびその相補体の配列より選択されるターゲットハイブリダイゼーション配列を含み；そして；ＲＮＡポリメラーゼによって認識される転写プロモーター、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによって認識される転写プロモーター、配列番号７５および配列番号７６からなる群より選択されるプロモーターヌクレオチド配列をさらに含む。１つの側面において、プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１７およびその相補体の配列より選択される。
【００１３】
[0012]１つの好ましい態様において、Ｔ７プロバイダーは、配列番号１８、２０、２６、２８、３０、３２および４８の配列より選択される。他の好ましい態様において、プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号１、４、７、８、１０、１２の配列より選択される。１つの好ましい態様において、Ｔ７プロバイダーは配列番号２６の配列を有し、そしてプライマーオリゴヌクレオチドは配列番号７の配列を有する。１つの好ましい態様において、Ｔ７プロバイダーは配列番号３２の配列を有し、そしてプライマーオリゴヌクレオチドは配列番号８の配列を有する。
【００１４】
[0013]組成物、方法およびキットの特定の態様において、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、長さ２１〜３２ヌクレオチドであり、そしてＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８の塩基８３〜１５０に対応するカンピロバクター属核酸の領域中の配列に、少なくとも７０％；または７５％；または８０％；または８５％；または９０％；または１００％相補的である、ターゲットハイブリダイズ配列を含むよう設定される。組成物、方法およびキットの特定の態様において、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、長さ２１〜３２ヌクレオチドであり、そしてＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８の塩基８３〜１５０に対応するカンピロバクター属核酸の領域中の配列に相補的であるが、相補的であるＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８の部分と比較した際、１ミスマッチ；または２ミスマッチ；または３ミスマッチ；または５ミスマッチを有する、ターゲットハイブリダイズ配列を含むよう設定される。これらの特定の態様のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは；ＲＮＡポリメラーゼによって認識される転写プロモーター、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによって認識される転写プロモーター、配列番号７５および配列番号７６からなる群より選択されるプロモーターヌクレオチド配列をさらに含む。
【００１５】
[0014]組成物、キットおよび方法の特定の態様において、プライマーオリゴヌクレオチドは、長さ１９〜３５ヌクレオチドであり、そしてＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のほぼ１７０〜２２６の塩基に対応するカンピロバクター属核酸の領域中の配列に、少なくとも７０％；または７５％；または８０％；または８５％；または９０％、または１００％相補的である、ターゲットハイブリダイズ配列を含むよう設定される。特定の態様において、プライマーオリゴヌクレオチドは、長さ１９〜３５ヌクレオチドであり、そしてＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８のほぼ１７０〜２２６の塩基に対応するカンピロバクター属核酸の領域中の配列に同一であるが、相補的であるＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８の部分と比較した際、１ミスマッチ；または２ミスマッチ；または３ミスマッチ；または５ミスマッチを有する、ターゲットハイブリダイズ配列を含むよう設定される。
【００１６】
[0015]１つの態様において、増幅反応の１以上の側面を促進するかまたは改善するように働く、１以上のさらなるオリゴヌクレオチドタイプおよび／または他の増幅試薬が含まれてもよい。例えば、Ｔ７プロバイダーおよび／またはプライマーオリゴヌクレオチドに加えて、さらなるオリゴヌクレオチドには：検出オリゴヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチド、ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド等の１以上がさらに含まれてもよい。
【００１７】
[0016]１つの態様において、組成物、キット、および／または方法は、検出オリゴヌクレオチド、好ましくは直鎖またはヘアピン検出オリゴヌクレオチド、より好ましくはトーチオリゴヌクレオチドまたは分子ビーコンオリゴヌクレオチドをさらに含むかまたは用いてもよい。１つの側面において、検出オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載する少なくとも１つの増幅オリゴマーを用いて、そしてより好ましくは本明細書に記載する２つの増幅オリゴマーを用いて、カンピロバクター属ターゲット核酸から生成される増幅産物に安定にハイブリダイズする。１つの側面において、検出オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載する少なくとも１つの増幅オリゴマーを用いて、そしてより好ましくは本明細書に記載する２つの増幅オリゴマーを用いて、Ｃ．ジェジュニ・ターゲット核酸ならびにＣ．コリ、Ｃ．ラリまたはＣ．コリおよびＣ．ラリ・ターゲット核酸から生成される増幅産物に安定にハイブリダイズする。１つの側面において、検出オリゴヌクレオチドは、長さ１０〜７０ヌクレオチドであり、そして配列番号９１領域の「＋」または「−」鎖、あるいはそのＲＮＡ同等物に安定してハイブリダイズする。１つの側面において、検出オリゴヌクレオチドは、配列番号５９〜７０およびその相補体の配列より選択されるトーチオリゴヌクレオチドである。１つの側面において、検出オリゴヌクレオチドは、配列番号６２、６３、６５、６６、６７、および６８、ならびにその相補体の配列より選択されるトーチオリゴヌクレオチドである。１つの側面において、検出オリゴヌクレオチドは、配列番号６８、配列番号６７、およびその相補体の配列より選択されるトーチオリゴヌクレオチドである。１つの側面において、検出オリゴヌクレオチドは、配列番号６７またはその相補体の配列を有するトーチオリゴヌクレオチドである。
【００１８】
[0017]１つの態様において、組成物、キット、および／または方法は、ブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含むかまたは使用してもよい。１つの側面において、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、配列番号５０〜５７およびその相補体の配列より選択される。１つの側面において、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、配列番号５０、５３および５６、ならびにその相補体の配列より選択される。１つの側面において、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、配列番号５０またはその相補体の配列を有する。
【００１９】
[0018]１つの態様において、組成物、キット、および／または方法は、ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドをさらに含むかまたは使用してもよい。１つの側面において、ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号７１、７３、およびその相補体の配列より選択される。１つの側面において、ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号７３またはその相補体の配列を有する。
【００２０】
[0019]いくつかの側面において、組成物を転写仲介増幅アッセイ（本明細書において、以後、「ＴＭＡ」）で用いる。いくつかの側面において、転写仲介増幅アッセイを実行するためのキットを提供する。いくつかの側面において、転写仲介増幅アッセイを実行するための方法を提供する。特定の態様において、組成物、キット、および／または方法は：Ｔ７プロバイダー、プライマーオリゴヌクレオチド、検出オリゴヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチド、トーチオリゴヌクレオチド等の１以上のオリゴヌクレオチドを含むかまたは使用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】[0020]図１は、カンピロバクター・ジェジュニ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ＧＩ：２０３７８２０８（２００２年５月１日）の１６Ｓ  ｒＲＮＡヌクレオチド配列由来のヌクレオチド残基１〜４５０を示す。
【図２】[0021]図２は、配列番号９１でもある、カンピロバクター・ジェジュニ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３９３２０２．１、ＧＩ：２０３７８２０８（２００２年５月１日）の１６Ｓ  ｒＲＮＡヌクレオチド配列のヌクレオチド配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
[0022]試料中に存在する１以上のＣ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリ・ターゲット核酸を増幅し、そして検出するための組成物、キットおよび方法を開示する。これらのターゲット核酸は、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリの１以上由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび／または１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子である。好ましくは、試料は食物試料、水試料、産業試料、環境試料または生物学的試料である。組成物、キットおよび方法は、これらのターゲット核酸を特異的に認識するオリゴヌクレオチド配列を提供する。こうしたオリゴヌクレオチドを増幅オリゴヌクレオチドとして用いてもよく、これには、プライマー、プロモータープライマー、ブロック化オリゴヌクレオチド、およびプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドが含まれてもよく、これらの機能は先に記載されている（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号；第４，６８３，２０２号；第４，８００，１５９号；第５，３９９，４９１号；第５，５５４，５１６号；第５，８２４，５１８号；および第７，３７４，８８５号）。他のオリゴヌクレオチドを、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、および／またはＣ．コリの増幅された配列を検出するためのプローブとして用いてもよい。
【００２３】
[0023]増幅工程には、ターゲット核酸内のターゲット配列に対して特異的な１以上の増幅オリゴヌクレオチドと試料を接触させる工程が含まれる。増幅は、少なくとも１つの核酸ポリメラーゼを用いることによって、ターゲット配列またはその相補体のさらなるコピーを合成する。用いる増幅法および増幅オリゴマーの設定に応じて、増幅は、ターゲット配列またはその相補体に対応する相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を合成する。一般の当業者は、多様な増幅技術において使用される増幅プロセスを理解し、そして増幅産物鎖がテンプレート鎖に対してセンスまたはアンチセンスであり、そしてＲＮＡまたはＤＮＡ鎖であってもよいことを理解する。増幅された産物を検出するための１つの態様は、増幅された産物を、増幅産物の部分に特異的な少なくとも１つのプローブと接触させる工程を含む、ハイブリダイズ工程を使用する。いくつかの他の検出法には、数例を挙げると、ゲル電気泳動、色素染色、放射標識および質量分析が含まれる。
【００２４】
[0024]増幅反応が完了した後に検出工程を行ってもよいし、またはターゲット領域を増幅するのと同時に、例えばリアルタイム検出工程で行ってもよい。１つの態様において、検出工程は、均質な検出、例えばハイブリダイズしていないプローブの混合物からの除去を伴わない、ハイブリダイズしたプローブの検出を可能にする（例えば米国特許第５，６３９，６０４号および第５，２８３，１７４号）。増幅された産物を増幅工程終了間近または終了時に検出する態様において、直鎖プローブを用いて、増幅された産物に対するプローブのハイブリダイゼーションを示すシグナルを提供してもよい。リアルタイム検出を用いる他の態様において、プローブは、直鎖プローブ、例えばプローブの５’→３’エキソヌクレアーゼ分解に際して検出される二重標識ＴａｑＭａｎプローブであってもよいし、あるいはヘアピンプローブであって、増幅された産物に結合した際に検出されるレポーター部分で標識された前記ヘアピンプローブ、例えば分子ビーコン、分子トーチ、またはハイブリダイゼーションスイッチプローブであってもよい。こうしたプローブの多様な形式が、先に記載されている（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号；第５，２１０，０１５号；第５，３１２，７２８号；第５，５３８，８４８号；第５，９２５，５１７号；第６，１５０，０９７号；第６，８４９，４１２号；第６，８３５，５４２号；第６，５３４，２７４号；および第６，３６１，９４５号；ならびに米国公報第２００６００６８４１７Ａ１号；および米国公報第２００６０１９４２４０Ａ１号）。
【００２５】
[0025]開示の側面を理解するのを補助するため、本明細書で用いるいくつかの用語を、より詳細に記載する。本明細書で用いるすべての科学的用語および技術的用語は、相当する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同一の意味、例えば、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第２版（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，  １９９４，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク州ニューヨーク）、Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，  １９９１，  Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，  ニューヨーク州ニューヨーク）、および本明細書に引用する参考文献に提供されうるのと同一の意味を有する。別に言及しない限り、本明細書で使用するかまたは意図する技術は、分子生物学の技術分野の一般の当業者に周知の標準法である。
【００２６】
[0026]用語「単数の」（「ａ」または「ａｎ」）実体は、その実体の１以上を指す；例えば「単数の核酸」（「ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ」）は、１以上の核酸を示すと理解される。こうしたものとして、「単数の」、「１以上の」、および「少なくとも１つの」は、本明細書において交換可能に使用可能である。
【００２７】
[0027]「試料」には、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、および／またはＣ．コリあるいはその構成要素、例えば核酸または核酸断片を含有しうる、いかなる標本も含まれる。環境または製造供給源、例えば食物、水、土壌、スラリー、デブリ、液体の容器由来のバイオフィルム、空中粒子またはエアロゾル等から試料を得てもよく、これには、プロセシングされた試料、例えばろ過デバイス上でもしくはこうしたデバイスを通して試料を通過させるか、または遠心分離後に得られるもの、あるいは媒体、マトリックス、または支持体への付着によって得られるものが含まれてもよい。試料には、生存または死亡哺乳動物または生物から得られる任意の組織または材料、例えば気管支鏡検査などの呼吸組織または滲出液、気管支洗浄液、肺生検、痰、ミルク、末梢血、血漿、血清、リンパ節、胃腸組織、糞便、尿、あるいは他の体液または材料を含む、「生物学的試料」が含まれる。試料を処理して、物理的または機械的に組織凝集物または細胞を破壊し、こうしてターゲット核酸を含む細胞内構成要素を、他の構成要素、例えば酵素、緩衝剤、塩、界面活性剤等を含有してもよい溶液内に放出してもよい。
【００２８】
[0028]「核酸」は、窒素性複素環塩基、または塩基類似体を有する、２以上の共有結合したヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含み、該ヌクレオシドがホスホジエステル結合または他の連結によってともに連結されてポリヌクレオチドを形成している、多量体化合物を指す。核酸には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはキメラＤＮＡ−ＲＮＡポリマーまたはオリゴヌクレオチド、およびその類似体が含まれる。核酸「主鎖」は、多様な連結で構成されてもよく、該連結には、１以上の糖−ホスホジエステル連結、ペプチド−核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡ中、ＰＣＴ第ＷＯ  ９５／３２３０５号を参照されたい）、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結、またはそれらの組み合わせが含まれる。核酸の糖部分は、リボースまたはデオキシリボース、あるいは、既知の置換、例えば、２’メトキシ置換および２’ハロゲン化物置換（例えば２’−Ｆ）を有する同様の化合物であってもよい。窒素性塩基は、慣用的な塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その既知の類似体（例えばイノシン、５−メチルイソシトシン、イソグアニン；  Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ５−３６，  Ａｄａｍｓら監修，  第１１版，  １９９２、Ａｂｒａｈａｍら，  ２００７，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４３：６１７−２４）であってもよく、これにはプリン塩基またはピリミジン塩基の誘導体（例えば、Ｎ４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−またはアザ−プリンおよびデアザ−またはアザ−ピリミジン、５位または６位に置換基を有するピリミジン塩基、２位、６位および／または８位に改変された置換基または置換置換基を有するプリン塩基、例えば２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、およびＯ４−アルキル−ピリミジン、およびピラゾロ化合物、例えば未置換または３置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン；米国特許第５，３７８，８２５号、第６，９４９，３６７号、およびＰＣＴ第ＷＯ９３／１３１２１号）が含まれる。核酸には、主鎖が、１以上の残基に関して窒素性塩基を含まない、「無塩基性」残基が含まれてもよい（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡにおいて見られるような、慣用的な糖、塩基、および連結のみを含んでもよいし、または慣用的な構成要素および置換を含んでもよい（例えば２’メトキシ主鎖によって連結された慣用的な塩基、または慣用的な塩基および１以上の塩基類似体の混合物を含む核酸）。核酸には、１以上のヌクレオチド単量体が、ＲＮＡ模倣糖コンホメーションにロックされた二環フラノース単位を有する「ロック化核酸」（ＬＮＡ）が含まれてもよく、これは一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）中の相補配列に対するハイブリダイゼーションアフィニティを増進する（Ｖｅｓｔｅｒら，  ２００４，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３（４２）：１３２３３−４１）。核酸には、核酸の機能または振る舞いを改変する修飾塩基が含まれてもよく、例えば、さらなるヌクレオチドが核酸に付加されるのをブロックする��め、３’末端にジデオキシヌクレオチドが付加されてもよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸を作製するための合成法は、当該技術分野で周知であるが、ルーチンの技術を用いて、核酸を天然供給源から精製してもよい。
【００２９】
[0029]用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において、核酸鎖を指す。本出願全体を通じて、核酸は、５’末端から３’末端に示される。標準核酸、例えばＤＮＡおよびＲＮＡは、典型的には、「３’から５’」に、すなわち、成長中の核酸の５’末端へのヌクレオチドの付加によって合成される。
【００３０】
[0030]「ヌクレオチド」は、本明細書において、リン酸基、５炭糖および窒素性塩基からなる核酸サブユニットである。ＲＮＡ中で見られる５炭糖はリボースである。ＤＮＡにおいて、５炭糖は２’−デオキシリボースである。該用語にはまた、こうしたサブユニットの類似体、例えば、リボースの２’位でのメトキシ基（２’−Ｏ−Ｍｅ、または２’メトキシ）も含まれる。本明細書において、「Ｔ」残基を含有するメトキシオリゴヌクレオチドは、リボース部分の２’位にメトキシ基を有し、そしてヌクレオチドの塩基部分にウラシルを有する。
【００３１】
[0031]「非ヌクレオチド単位」は、本明細書において、ポリマーのハイブリダイゼーションに有意には関与しない単位である。こうした単位は、例えば、ヌクレオチドとのいかなる有意な水素結合にも関与してはならず、そして構成要素として、５つのヌクレオチド塩基またはその類似体の１つを有する単位を排除するであろう。
【００３２】
[0032]「ターゲット核酸」は、本明細書において、増幅されるべき「ターゲット配列」を含む核酸である。ターゲット核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、そして一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。ターゲット核酸には、ターゲット配列に加えて、増幅されなくてもよい他の配列も含まれてもよい。典型的なターゲット核酸には、ウイルスゲノム、細菌ゲノム、真菌ゲノム、植物ゲノム、動物ゲノム、ウイルス、細菌または真核細胞由来のｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはｍＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、あるいは染色体ＤＮＡが含まれる。本開示において、ターゲット核酸は、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリの１以上に由来する１６Ｓ  ｒＲＮＡまたは１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子である。
【００３３】
[0033]「単離」によって、ターゲット核酸が天然環境から取り出されることを意味するが、該用語は、いかなる度合いの精製も暗示しない。
[0034]用語「ターゲット配列」は、本明細書において、増幅しようとするターゲット核酸の特定のヌクレオチド配列を指す。ターゲット核酸が元来、一本鎖である場合、用語「ターゲット配列」はまた、ターゲット核酸中に存在するようなターゲット配列に対して相補的である配列も指す。ターゲット核酸が元来、二本鎖である場合、該用語「ターゲット配列」は、センス（＋）およびアンチセンス（−）鎖の両方を指す。ターゲット配列を選択する際に、当業者は、関連しない核酸または緊密に関連するターゲット核酸の間を区別するように、配列を選択すべきであることを理解するであろう。
【００３４】
[0035]カンピロバクター属核酸の領域に言及した用語「配列をターゲットとする（ｔａｒｇｅｔ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「ターゲット核酸をターゲットとする」または「配列をターゲットとする（ｔａｒｇｅｔｓ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、本明細書において、オリゴヌクレオチドが、本明細書に記載するような増幅および／または検出を可能にする方式で、ターゲット配列に安定してハイブリダイズするプロセスを指す。１つの態様において、オリゴヌクレオチドは、ターゲットとされるカンピロバクター属核酸配列に相補的であり、そしてミスマッチを含有しない。別の態様において、オリゴヌクレオチドは相補的であるが、ターゲットとされるカンピロバクター属核酸配列と、１；または２；または３；または４；または５のミスマッチを含有する。好ましくは、カンピロバクター属核酸配列に安定してハイブリダイズするオリゴヌクレオチドには、ターゲット配列に相補的な、少なくとも１０〜最大５０のヌクレオチドが含まれる。少なくとも１０および最大５０は、１０、５０、およびその間の各整数を含むような包括的範囲であると理解される。用語「配列をターゲットとするよう設定される」は、本明細書において、増幅オリゴヌクレオチドのターゲットハイブリダイズ領域が、言及されるカンピロバクター属領域の配列をターゲティング可能であるポリヌクレオチド配列を有するよう設定されることを意味する。こうした増幅オリゴヌクレオチドは、その配列のターゲティングのみに限定されず、むしろ、本明細書に記載するような、Ｃ．ジェジュニ・ターゲット核酸ならびにＣ．コリ、Ｃ．ラリまたはＣ．コリおよびＣ．ラリ・ターゲット核酸をターゲットとするためのキットまたは方法における組成物として有用である。用語「よう設定される」は、増幅オリゴヌクレオチドターゲットハイブリダイズ配列のポリヌクレオチド配列設定の実際の配置を指す。
【００３５】
[0036]用語「断片」は、本明細書において、カンピロバクター属ターゲット核酸配列に言及する際、隣接核酸片を指す。特定の態様において、断片には、カンピロバクター属種のターゲット核酸由来の隣接ヌクレオチドが含まれ、ここで、断片中の隣接ヌクレオチドの数は、全１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはそのコード遺伝子に関するものより短い。
【００３６】
[0037]用語「領域」は、本明細書において、全核酸より小さい核酸部分を指す。例えば、言及される核酸がオリゴヌクレオチドプロモータープロバイダーである場合、用語「領域」は、全オリゴヌクレオチドのより小さいプロモーター部分を指すよう用いられてもよい。同様に、そしてやはり例のみとして、核酸がターゲット核酸である場合、用語「領域」は、核酸のより小さい領域を指すよう用いられてもよい。
【００３７】
[0038]交換可能な用語「オリゴマー」、「オリゴ」および「オリゴヌクレオチド」は、一般的に１，０００ヌクレオチド（ｎｔ）残基未満を有する核酸を指し、約５ｎｔ残基の下限および約５００〜９００ｎｔ残基の上限を有する範囲のポリマーを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、約１２〜１５ｎｔの下限および約５０〜６００ｎｔの上限を有するサイズ範囲にあり、そして他の態様は、約１５〜２０ｎｔの下限および約２２〜１００ｎｔの上限を有する範囲にある。オリゴヌクレオチドを天然存在供給源より精製してもよいが、あるいは多様な周知の酵素的または化学的方法のいずれを用いて合成してもよい。用語オリゴヌクレオチドは、試薬に対するいかなる特定の機能も示さず；むしろ、一般的に、本明細書に記載するすべてのこうした試薬を含むように用いられる。オリゴヌクレオチドは、多様な異なる機能を提供してもよい。例えば、相補鎖に特異的であり、そしてハイブリダイズ可能であるならば、プライマーとして機能することも可能であり、そして核酸ポリメラーゼの存在下でさらに伸長されることも可能であるし、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される配列を含有するならば、プロモーターを提供することも可能であり、そして転写が可能になるし（例えばＴ７プロバイダー）、そして適切に位置づけられ、そして／または修飾されているならば、ハイブリダイゼーションを防止するかまたはプライマー伸張を妨害するよう機能することも可能である。
【００３８】
[0039]本明細書において、特定の配列群より選択される配列「を含む」かまたは該配列「からなる」かまたは該配列「から本質的になる」核酸配列を有するオリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドが、基本的なそして新規の性質として、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、列挙する核酸配列群の１つの正確な相補体を有する核酸に安定してハイブリダイズ可能であることを意味する。正確な相補体には、対応するＤＮＡまたはＲＮＡ配列が含まれる。
【００３９】
[0040]本明細書において、核酸は、明記する核酸に対して１００％同一であるかまたは相補的である場合に、該核酸に「対応する」。本明細書において、明記する核酸配列に「実質的に対応する」核酸は、言及されるオリゴヌクレオチドが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で同じターゲット核酸配列にハイブリダイズするであろう点で、参照核酸配列に対して類似のハイブリダイゼーション特性を有するように、参照核酸配列に十分に類似であることを意味する。実質的に対応する核酸は、明記する核酸配列と少なくとも１ヌクレオチド異なる。この変動は、核酸および明記する核酸間で同一であるかまたは相補的である割合に関して言及されてもよい。したがって、塩基同一性または相補性のこれらの割合が、１００％未満〜約８０％である場合、核酸は、参照核酸配列に実質的に対応する。好ましい態様において、割合は、１００％未満〜約８５％である。より好ましい態様において、この割合は、１００％未満〜約９０％であってもよく；他の好ましい態様において、この割合は、１００％未満〜約９５％である。当業者は、言及する範囲には、範囲のすべての整数および有理数（例えば９２％または９８．３７７％）が含まれることを理解するであろう。
【００４０】
[0041]「ヘルパーオリゴヌクレオチド」または「ヘルパー」は、例えば米国特許第５，０３０，５５７号に記載されるように、ターゲット核酸に結合して、そしてターゲットに異なる二次および／または三次構造を取らせて、検出プローブまたは他のオリゴヌクレオチドとターゲット核酸のハイブリダイゼーションの速度および度合いを増加させるよう設計されたオリゴヌクレオチドを指す。ヘルパーはまた、ターゲット核酸配列へのハイブリダイゼーション、ならびにプライマー、ターゲット捕捉および他のオリゴヌクレオチドの機能を補助するために使用されてもよい。
【００４１】
[0042]本明細書において、「ブロッキング部分」は、核酸ポリメラーゼによって効率的に伸長不能であるように、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸の３’末端を「ブロック」するよう用いられる物質である。
【００４２】
[0043]「増幅オリゴマー」は、少なくともその３’端がターゲット核酸に相補的であり（「ターゲットハイブリダイズ配列」）、そしてターゲット核酸またはその相補体にハイブリダイズし、そして核酸増幅反応に関与するオリゴマーである。増幅オリゴマーの例は、ターゲット核酸にハイブリダイズし、そして増幅プロセスにおいてポリメラーゼによって伸長される３’ＯＨ端を含有する「プライマー」である。増幅オリゴマーの別の例は、「プロモーターに基づく増幅オリゴマー」であり、該オリゴマーは、ターゲットハイブリダイズ配列、および適切なポリメラーゼによって転写を開始するためのプロモーター配列を含む。プロモーターに基づく増幅オリゴマーは、ターゲットハイブリダイズ配列の３’端がプライマーに基づく伸長を防止するよう修飾されている（例えば３’ブロック化端）かどうかに応じて、プライマーに基づく伸長において、ポリメラーゼによって伸長されてもまたはされなくてもよい。プライマーに基づく伸長を防止するよう修飾されていないターゲットハイブリダイズ領域を含む、プロモーターに基づく増幅オリゴヌクレオチドは、「プロモータープライマー」と呼ばれる。プライマーに基づく伸長を防止するように修飾されたターゲットハイブリダイズ領域を含む、プロモーターに基づく増幅オリゴヌクレオチドは、「プロモータープロバイダー」と呼ばれる。増幅オリゴヌクレオチドのサイズ範囲には、長さ約１０〜約７０ｎｔであるターゲットハイブリダイズ領域を含むものが含まれる。この範囲に含まれるのは、当業者に理解されるように、範囲のすべての整数（例えば１０、１１、１２、１３．．．６７、６８、６９および７０）である。増幅オリゴマーは、場合によって、厳密なＡ：Ｔ／Ｕ、Ｇ：Ｃの意味では、ターゲット核酸に相補的でない、修飾ヌクレオチドまたは類似体を含んでもよい。こうした修飾ヌクレオチドまたは類似体は、本明細書において、対応するターゲット配列にミスマッチしていると見なされる。
【００４３】
[0044]核酸ポリメラーゼによるプライマーに基づく伸長が意図されないオリゴマーには、増幅反応において酵素が仲介するオリゴマーの伸長を防止するため、３’ＯＨを置換するブロッカー基が含まれてもよい。例えば、増幅中に存在するブロック化増幅オリゴマーおよび／または検出プローブは、機能する３’ＯＨを持たず、そしてその代わり、３’端にまたはその近傍に位置する１以上のブロッキング基を含んでもよい。いくつかの態様において、３’端近傍のブロッキング基は、３’端の５残基以内にあってもよく、そしてオリゴマーへのポリメラーゼの結合を限定するのに十分に大きい。他の態様において、ブロッキング基は、３’末端に共有結合している。多くの異なる化学基、例えばアルキル基、非ヌクレオチドリンカー、アルカン−ジオール・ジデオキシヌクレオチド残基、およびコルジセピンを用いて、３’端をブロッキングしてもよい。
【００４４】
[0045]本明細書において、「プロモーター」は、特定の部位で核酸に結合し、そしてＲＮＡの転写を開始するシグナルとして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「トランスクリプターゼ」）によって認識される特異的核酸配列である。
【００４５】
[0046]本明細書において、「プロモータープロバイダー」または「プロバイダー」は、第一の領域および第二の領域を含み、そして３’末端からのＤＮＡ合成開始を防止するよう修飾されたオリゴヌクレオチドを指す。プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドの「第一の領域」は、ＤＮＡテンプレートにハイブリダイズする塩基配列を含み、ここで、ハイブリダイズ配列は、プロモーター領域の３’に位置するが、必ずしもこれに隣接しない。プロモーターオリゴヌクレオチドのターゲットハイブリダイズ部分は、典型的には、長さ少なくとも１０ヌクレオチドであり、そして長さ最長５０以上のヌクレオチドを伸長可能である。「第二の領域」は、ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター配列を含む。プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドは、好ましくは上記のように３’末端でブロッキング部分を含むことによって、ＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）によって伸長不能であるように設定される。この修飾は、プロモータープロバイダーをプロモータープライマーと区別する。好ましくは、プロモータープライマーまたはプロバイダーのプロモーター部分は、大腸菌、ならびにバクテリオファージＴ７、Ｔ３、およびＳＰ６由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターであるが、他のプロモーターまたはその修飾型もまた使用可能である。
【００４６】
[0047]本明細書において、「終結オリゴヌクレオチド」または「ブロッカーオリゴヌクレオチド」は、プライミングオリゴヌクレオチドを含む新生核酸のプライマー伸張を「終結」させ、それによって新生核酸鎖の定義された３’端を提供するように、ターゲット配列の５’端付近のターゲット核酸領域に相補的である塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである。
【００４７】
[0048]「増幅」は、ターゲット核酸配列あるいはその相補体または断片の多数のコピーを得るための任意の既知の方法を指す。多数のコピーは、アンプリコンまたは増幅産物と称されうる。「断片」の増幅は、完全なターゲット核酸またはその相補体より短いものを含有する増幅核酸の産生を指し、例えば、ターゲット核酸の内部位置にハイブリダイズし、そしてそこから重合を開始する増幅オリゴヌクレオチドを用いることによって産生される。既知の増幅法には、例えば、レプリカーゼ仲介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写仲介または転写関連増幅が含まれる。レプリカーゼ仲介増幅は、自己複製ＲＮＡ分子、およびＱＢ−レプリカーゼなどのレプリカーゼを用いる（例えば、米国特許第４，７８６，６００号）。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー対、および熱周期を用いて、ｄｓＤＮＡの２つの相補鎖またはｃＤＮＡから、多数のコピーを合成する（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号）。ＬＣＲ増幅は、多数の周期のハイブリダイゼーション、連結、および変性を用いることによって、４以上の異なるオリゴヌクレオチドを用いて、ターゲットおよびその相補鎖を増幅する（例えば、米国特許第５，４２７，９３０号および米国特許第５，５１６，６６３号）。ＳＤＡは、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマー、およびターゲット配列を含む半修飾ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖にニックを入れるエンドヌクレアーゼを用い、それによって一連のプライマー伸張および鎖置換工程で増幅が起こる（例えば、米国特許第５，４２２，２５２号；米国特許第５，５４７，８６１号；および米国特許第５，６４８，２１１号）。
【００４８】
[0049]「転写関連増幅」または「転写仲介増幅」（ＴＭＡ）は、ＲＮＡポリメラーゼを用いて、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を産生する核酸増幅を指す。これらの方法は、一般的に、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、およびプロモーター配列を含むテンプレート相補オリゴヌクレオチドを使用し、そして場合によって、１以上の他のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。ＴＭＡ法は、本明細書に記載するような、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリ・ターゲット配列を増幅し、そして検出するために用いる増幅法の態様である。転写関連増幅の変形は、先に詳細に開示されるように、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，８６８，１０５号；第５，１２４，２４６号；第５，１３０，２３８号；第５，３９９，４９１号；第５，４３７，９９０号；第５，５５４，５１６号；および第７，３７４，８８５号；ならびにＰＣＴ公報第ＷＯ  ８８／０１３０２号；第ＷＯ  ８８／１０３１５号および第ＷＯ  ９５／０３４３０号）。一般の当業者は、ポリメラーゼによるオリゴマー配列の伸長に基づく増幅法において、開示する組成物を用いてもよいことを認識するであろう。
【００４９】
[0050]本明細書において、用語「リアルタイムＴＭＡ」は、リアルタイム検出手段によって監視されるターゲット核酸の単一プライマー転写仲介増幅（「ＴＭＡ」）を指す。
[0051]用語「アンプリコン」または用語「増幅産物」は、本明細書において、ターゲット配列内に含有される配列に相補的であるかまたは相同である、増幅法中に生成される核酸分子を指す。これらの用語を用いて、一本鎖増幅産物、二本鎖増幅産物または二本鎖増幅産物の一方の鎖を指してもよい。
【００５０】
[0052]「プローブ」、「検出プローブ」または「検出オリゴヌクレオチド」は、ハイブリダイゼーションを促進してターゲット配列または増幅された核酸の検出を可能にする条件下で、核酸中または増幅された核酸中のターゲット配列に特異的にハイブリダイズする核酸オリゴマーを指す用語である。検出は、直接（例えばターゲット配列に直接ハイブリダイズするプローブ）または間接的（例えば中間分子構造を介して、ターゲットに連結されるプローブ）のいずれであってもよい。プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その類似体、またはその組み合わせであってもよく、そしてこれらは標識されていてもまたはされていなくてもよい。プローブの「ターゲット配列」は、一般的に、標準的塩基対形成によってプローブオリゴマーの少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする、より大きい核酸配列内のより小さい核酸配列を指す。プローブは、プローブの三次元コンホメーションに寄与するターゲット特異的配列および他の配列を含んでもよい（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号；第５，３１２，７２８号；第６，８４９，４１２号；第６，８３５，５４２号；第６，５３４，２７４号；および第６，３６１，９４５号；ならびに米国公報第２００６００６８４１７号）。
【００５１】
[0053]「安定」または「検出のため安定」によって、反応混合物温度が、核酸二重鎖の融解温度より少なくとも２℃低いことを意味する。
[0054]本明細書において、「標識」は、検出されるかまたは検出可能シグナルを導く、プローブに直接または間接的に連結された部分または化合物を指す。直接標識は、共有結合または非共有相互作用、例えば水素結合、疎水性およびイオン性相互作用、あるいはキレートまたは配位錯体の形成を含む、標識をプローブに連結する結合または相互作用を通じて起こってもよい。間接標識は、直接または間接的のいずれかで標識され、そして検出可能シグナルを増幅可能である、架橋部分または「リンカー」、例えば結合対メンバー、抗体またはさらなるオリゴマーの使用を通じて起こってもよい。標識には、任意の検出可能部分、例えば放射性核種、リガンド（例えばビオチン、アビジン）、酵素または酵素基質、反応性基、または発色団（例えば、色素、粒子、または検出可能な色を与えるビーズ）、発光化合物（例えば生物発光、燐光、または化学発光標識）、またはフルオロフォアが含まれる。標識は、混合物中の結合した標識プローブが、未結合標識プローブのものと異なる検出可能な変化、例えば不安定性または示差的な分解特性を示す、均質アッセイにおいて検出可能であってもよい。標識または標識プローブの未結合型から結合型を物理的に除去せずに、「均質検出可能標識」を検出してもよい（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号、第５，６５６，２０７号、および第５，６５８，７３７号）。標識には、化学発光化合物、例えば標準的ＡＥおよび誘導体を含むアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物が含まれる（例えば、米国特許第５，６５６，２０７号、第５，６５８，７３７号、および第５，６３９，６０４号）。合成、および核酸に標識を付着させ、そして標識を検出する方法が周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，  １９８９），第１０章；米国特許第５，６５８，７３７号、第５，６５６，２０７号、第５，５４７，８４２号、第５，２８３，１７４号、および第４，５８１，３３３号）。１より多い標識、および１より多い標識タイプが、特定のプローブ上に存在してもよいし、または検出は、検出可能シグナルを生じる化合物で各プローブが標識されている、プローブ混合物を用いてもよい（例えば、米国特許第６，１８０，３４０号および第６，３５０，５７９号）。
【００５２】
[0055]本明細書において、「分子トーチ」と称される構造は、連結領域（「ターゲット結合ドメイン」）によって連結される自己相補性である特徴的な領域（「閉鎖ドメイン」）を含み、そしてあらかじめ決定されたハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、互いにハイブリダイズするよう設計されている。ターゲット閉鎖ドメインを含むヌクレオチド配列のすべてまたは一部はまた、ターゲット結合ドメインとして機能してもよい。したがって、ターゲット閉鎖配列には、ターゲット結合配列、非ターゲット結合配列、およびその組み合わせが含まれてもよい。
【００５３】
[0056]本明細書において、「捕捉オリゴヌクレオチド」または「捕捉プローブ」は、標準的塩基対形成によって、ターゲット核酸中のターゲット配列に特異的にハイブリダイズして、そして固定されたプローブ上の結合パートナーに連結されて、ターゲット核酸を支持体に捕捉する核酸オリゴマーを指す。捕捉オリゴマーの一例には、２つの結合領域：ターゲットハイブリダイズ配列および固定化プローブ結合領域を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。この例の変形では、２つの領域が、１以上のリンカーによって一緒に連結された２つの異なるオリゴマー上に存在してもよい。捕捉オリゴマーの別の態様において、ターゲットハイブリダイズ配列は、ターゲット核酸に非特異的に結合し、そして該核酸を支持体上の固定化プローブに連結する、ランダムまたは非ランダム・ポリＧＵ、ポリＧＴ、またはポリＵ配列を含む配列である（ＰＣＴ公報第ＷＯ  ２００８／０１６９８８号）。固定化プローブ結合領域は、テールと称される核酸配列であってもよい。テールには、支持粒子または支持マトリックスに付着する相補固定化配列に結合する、約１０〜４０ヌクレオチドの実質的にはホモポリマーであるテール（例えばＡ１０〜Ａ４０）、または約１４〜３３ｎｔ（例えば、Ｔ３Ａ１４〜Ｔ３Ａ３０）が含まれる。捕捉オリゴマーの別の例は、２つの領域、ターゲットハイブリダイズ配列および核酸配列でない結合対メンバーを含む。
【００５４】
[0057]本明細書において、「固定化オリゴヌクレオチド」、「固定化プローブ」または「固定化核酸」は、捕捉オリゴマーを支持体に、直接または間接的に連結する核酸結合パートナーを指す。支持体に連結された固定化プローブによって、試料中の未結合物質から捕捉プローブに結合したターゲットを分離することが容易になる。固定化プローブの１つの態様は、試料中の未結合物質からの結合ターゲット配列の分離を容易にする、支持体に連結されるオリゴマーである。支持体には、既知の物質、例えばマトリックスおよび溶液中の遊離粒子が含まれてもよく、これは、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シラン、ポリプロピレン、金属、または他の組成物製であってもよく、１つの態様では、磁気誘引可能粒子である。支持体は、固定化プローブが直接（共有結合、キレート化、またはイオン性相互作用を介して）、または間接的に（１以上のリンカーを介して）連結される、単分散磁気球体（例えば均一サイズ±５％）であってもよく、この際、プローブおよび支持体間の連結または相互作用は、ハイブリダイゼーション条件中、安定である。
【００５５】
[0058]「相補的」によって、２つの一本鎖核酸の類似の領域または同じ一本鎖核酸の異なる領域のヌクレオチド配列が、ストリンジェントなハイブリダイゼーションまたは増幅条件下で、一本鎖領域がともにハイブリダイズして安定な二重鎖水素結合領域になるのを可能にする、ヌクレオチド塩基組成を有することを意味する。互いにハイブリダイズする配列は、標準的核酸塩基対形成によって、意図されるターゲット配列に、完全に相補的であってもまたは部分的に相補的であってもよい（例えばＧ：Ｃ、Ａ：ＴまたはＡ：Ｕ対形成）。「十分に相補的」によって、一連の相補塩基間の水素結合によって、別の配列にハイブリダイズ可能な隣接配列を意味し、これは標準的塩基対形成によって、配列中の各位で相補的であってもよいし、または標準的Ａ：Ｔ／ＵおよびＧ：Ｃ対形成によって相補的でない１以上の残基を含有してもよいし、または無塩基性残基、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドである。十分に相補的な隣接配列は、典型的には、オリゴマーが特異的にハイブリダイズすることが意図される配列に対して、少なくとも８０％、または少なくとも９０％相補的である（相補性範囲％には、すべての整数および有理数が含まれる）。「十分に相補的な」配列は、配列が完全に相補的でなかったとしても、適切なハイブリダイゼーション条件下で、ターゲット配列と核酸オリゴマーの安定なハイブリダイゼーションを可能にする。ＡがＵまたはＴと対形成し、そしてＣがＧと対形成するように、１つの一本鎖領域のヌクレオチドの隣接配列が、他の一本鎖領域のヌクレオチドの類似配列と、一連の「規範的な」水素結合塩基対を形成可能である場合、ヌクレオチド配列は「完全に」相補的である。
【００５６】
[0059]「優先的にハイブリダイズする」によって、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、オリゴヌクレオチドがターゲット配列、またはその複製物にハイブリダイズして、安定なオリゴヌクレオチド：ターゲット配列ハイブリッドを形成し、一方、同時に、安定なオリゴヌクレオチド：非ターゲット配列ハイブリッドの形成が最小限であることを意味する。例えば、プローブオリゴヌクレオチドは、非ターゲット配列よりも十分に高い度合いで、ターゲット配列またはその複製物に優先的にハイブリダイズして、当業者が、増幅中に形成されたターゲット配列のＲＮＡ複製物または相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を正確に検出するのを可能にする。プローブ、増幅、ターゲット捕捉、ブロッカーおよび他のオリゴヌクレオチドは、配列組成に基づいて予測可能であるし、またはルーチンの試験法を用いることによって決定可能であるため、適切なハイブリダイゼーション条件は当該技術分野に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，  １９８９）の§§  １．９０−１．９１、７．３７−７．５７、９．４７−９．５１および１１．４７−１１．５７、特に、§§  ９．５０−９．５１、１１．１２−１１．１３、１１．４５−１１．４７および１１．５５−１１．５７）。
【００５７】
[0060]「核酸ハイブリッド」または「ハイブリッド」または「二重鎖」によって、二本鎖の水素結合した領域を含有する核酸構造を意味し、ここで各鎖は他方に相補的であり、そして領域は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、限定されるわけではないが、化学発光または蛍光検出、オートラジオグラフィー、またはゲル電気泳動を含む手段によって検出するのに十分に安定である、核酸構造を意味する。こうしたハイブリッドは、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖分子を含んでもよい。
【００５８】
[0061]「試料調製」は、試料中に存在するＣ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリ核酸の続く増幅および／または検出のために試料を処理する任意の工程または方法を指す。試料は、ターゲット核酸が少量の構成要素である、構成要素の複雑な混合物であってもよい。試料調製には、より大きい試料体積から、構成要素、例えば微生物または核酸を濃縮する任意の既知の方法、例えばより大きい体積の試料からの空中または水中粒子のろ過による方法、あるいは標準的微生物学的方法を用いることによる、試料からの微生物の単離による方法が含まれてもよい。試料調製には、細胞内構成要素を実質的に水性のまたは有機性の相に放出する、細胞構成要素の物理的破壊および／または化学的溶解、ならびにろ過、遠心分離または吸着を用いることによるなどの破片の除去が含まれてもよい。試料調製には、選択的にまたは非特異的にターゲット核酸を捕捉し、そして該核酸を他の試料構成要素から分離する、核酸オリゴヌクレオチドの使用が含まれてもよい（米国特許第６，１１０，６７８号およびＰＣＴ公報第ＷＯ  ２００８／０１６９８８号に記載されるようなもの）。
【００５９】
[0062]「分離」または「精製」は、試料の１以上の構成要素を除去するかまたは他の試料構成要素から分離することを意味する。試料構成要素には、通常、一般的には水性の溶液相中のターゲット核酸が含まれ、溶液相にはまた、細胞性断片、タンパク質、炭水化物、脂質、および他の核酸も含まれてもよい。分離または精製は、他の試料構成要素から、ターゲット核酸の少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９５％を除去する。純度％の範囲には、範囲のすべての整数および有理数が含まれる。
【００６０】
[0063]本明細書において、「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡコピーを合成する酵素である。例は、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ、あるいはバクテリオファージＴ４、ファイ−２９、Ｍ２、またはＴ５由来のＤＮＡポリメラーゼである。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、細菌またはバクテリオファージから単離された天然存在酵素であってもよく、あるいは組換え的に発現されてもよく、あるいは、特定の所望の特性、例えば熱安定性、または多様な修飾テンプレート由来のＤＮＡ鎖を認識するか、もしくは合成する能力を所持するよう操作された、修飾または「発展」型であってもよい。すべての既知のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、合成を開始するために、相補的プライマーを必要とする。適切な状況下で、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡコピーを合成することも可能であることが知られる。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、典型的にはまた、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性も有する。
【００６１】
[0064]本明細書において、「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」または「トランスクリプターゼ」は、通常は二本鎖であるプロモーター配列を有する二本鎖または部分的二本鎖ＤＮＡ分子から多数のＲＮＡコピーを合成する酵素である。ＲＮＡ分子（「転写物」）は、プロモーターのすぐ下流の特定の位で始まり、５’から３’方向に合成される。トランスクリプターゼの例は、大腸菌、ならびにバクテリオファージＴ７、Ｔ３、およびＳＰ６由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。
【００６２】
[0065]本明細書において、「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」または「逆転写酵素」（「ＲＴ」）は、ＲＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡコピーを合成する酵素である。すべての既知の逆転写酵素はまた、ＤＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡコピーを作製する能力も有し；したがって、これらはＲＮＡおよびＤＮＡ両方に依存するＤＮＡポリメラーゼである。ＲＴはまた、ＲＮアーゼＨ活性も有しうる。ＲＮＡおよびＤＮＡテンプレートのどちらを用いた合成を開始するにも、プライマーが必要である。
【００６３】
[0066]本明細書において、「選択的ＲＮアーゼ」は、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分を分解するが、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡを分解しない酵素である。例示的な選択的ＲＮアーゼはＲＮアーゼＨである。ＲＮアーゼＨと同じかまたは類似の活性を所持する酵素もまた使用可能である。選択的ＲＮアーゼは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであってもよい。大部分の逆転写酵素は、ポリメラーゼ活性に加えて、ＲＮアーゼＨ活性を含有する。しかし、ＲＮアーゼＨの他の供給源は、関連するポリメラーゼ活性を伴わずに入手可能である。分解は、ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体からのＲＮＡの分離を生じうる。あるいは、選択的ＲＮアーゼは、ＲＮＡ部分が融解されるか、または酵素がＲＮＡ部分をほどくのを可能にするように、多様な位置で、単純にＲＮＡを切断する。本発明のＲＮＡターゲット配列またはＲＮＡ産物を選択的に分解する他の酵素は、一般の当業者に容易に明らかであろう。
【００６４】
[0067]用語「特異性」は、増幅系の背景において、本明細書において、配列およびアッセイ条件に依存して、ターゲットおよび非ターゲット配列の間を区別する能力を記載する、増幅系の特性を指すよう用いられる。核酸増幅に関して、特異性は、一般的に、副産物の数に対する、産生される特異的アンプリコンの数の比（例えばシグナル対ノイズ比）を指す。
【００６５】
[0068]用語「感度」は、本明細書において、核酸増幅反応が検出可能であるか定量化可能である正確さを指す。増幅反応の感度は、一般的に、増幅系において容易に検出されうるターゲット核酸の最小のコピー数の測定値であり、そして例えば、使用する検出アッセイ、および増幅反応の特異性、例えば特異的アンプリコン対副産物の比に応じるであろう。
【００６６】
[0069]本明細書において、「コロニー形成単位」（「ＣＦＵ」）は、試料中の生存微生物の測定値として用いられる。ＣＦＵは、固体培地上に可視コロニーを形成可能な個々の生存細胞であり、コロニーの個々の細胞は、１つの親細胞からの細胞分裂によって得られる。１ＣＦＵは、〜１０００コピーのｒＲＮＡに対応する。
【００６７】
[0070]本明細書において、「Ｔ時間」は、アッセイデータのリアルタイムプロットにおけるシグナルの閾値時間または出現時間である。Ｔ時間値は、リアルタイム増幅反応において、アンプリコン産生を示す特定の閾値を通過した時間を概算する。Ｔ時間、およびＴ時間値を計算し、そして用いるためのアルゴリズムが、米国公報第２００６／０２７６９７２号、段落［０５１７］〜［０５３８］に記載される。曲線適合法を適用して、データを標準化し、そしてバックグラウンド調整する。曲線適合は、あらかじめ決定した下限および上限の間のデータ部分のみに関して行う。データに適合する曲線を見つけた後の目的は、曲線またはその投影があらかじめ定義した閾値と交差する点に対応する時間を概算することである。１つの態様において、標準化データに対する閾値は０．１１である。多様な対照データセットに適合する曲線が、所定の閾値と関連する時間において、最低限の変動を示す範囲として、上限および下限を経験的に決定する。例えば、１つの態様において、下限は０．０４であり、そして上限は０．３６である。下限よりも低くなった最初のデータ点から、上限を超えた最初のデータ点まで広がるデータに対して、曲線を適合させる。次に、適合傾斜が統計的に有意であるかどうかの決定を行う。例えば、一次係数のｐ値が０．０５未満である場合、適合は有意であると見なされ、そしてプロセシングを続ける。そうでない場合、プロセシングを停止する。あるいは、Ｒ２値によって、データの有効性を決定してもよい。直線性曲線ｙ＝ｍｘ＋ｂの傾斜ｍおよび切片ｂを適合曲線用に決定する。この情報を用いて、Ｔ時間を以下のように決定可能である。
【００６８】
Ｔ時間＝（閾値−ｂ）／ｍ
[0071]本明細書において、用語「相対的蛍光単位」（「ＲＦＵ」）は、蛍光強度の測定値の恣意的単位である。ＲＦＵは、測定に用いた検出手段の特性に応じて多様である。
【００６９】
[0072]転写仲介増幅およびリアルタイム転写仲介増幅
[0073]ＴＭＡ増幅を用いる増幅法には、以下の工程が含まれる。簡潔には、増幅しようとしているターゲット配列を含有する一本鎖ターゲット核酸を提供する。当業者は、二本鎖核酸の慣用的な融解を用いて一本鎖ターゲット核酸を提供しうることを認識するであろう。ターゲット配列にハイブリダイズさせることによって、第一の増幅オリゴマーをターゲット核酸と接触させる。第一の増幅オリゴマーは、プライマーまたはプロモータープライマーであってもよい。次いで、適切な核酸ポリメラーゼが、ターゲット核酸ターゲット配列に相補的な核酸鎖増幅産物を生成する。ターゲット核酸がＲＮＡである場合、ＲＮＡは、典型的には、分解され、新規に生成された増幅産物のみを残し、これは、第二の増幅オリゴマーによるハイブリダイゼーションに利用可能である。第一の増幅オリゴマーとしてプライマーを用い、次いで、第二の増幅オリゴマーはプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。適切な核酸ポリメラーゼは、新規に生成された増幅産物を用い、これに、プロモーターに基づくオリゴマーがプライマーとしてハイブリダイズして、ハイブリダイズしていないプロモーター配列の相補鎖を作製する。第二の増幅オリゴマーがプロモータープライマーである場合、第二の増幅オリゴマーがハイブリダイズする増幅産物の相補的コピーもまた生成される。プロモーターに基づく増幅の、ここで二本鎖となったプロモーター配列は、適切なＲＮＡポリメラーゼによって用いられて、転写が開始し、そしてＲＮＡ転写物増幅産物が作製される。次いで、第一の増幅オリゴマープライマーが、転写された増幅産物にハイブリダイズすることも可能であり、そして工程は反復可能である。または、ターゲット核酸はＲＮＡであり、そして第一の増幅オリゴマーはプロモーターに基づく増幅オリゴマーである。ここで、プロモーターに基づく増幅オリゴマーはプロモータープライマーである。適切なポリメラーゼは、ＲＮＡターゲット配列に相補的な第一の増幅産物を作製する。ＲＮＡターゲット核酸が分解され、そして第二の増幅オリゴマーが増幅産物にハイブリダイズする。適切なポリメラーゼは相補鎖を作製し、それによって二本鎖プロモーター配列を生成する。転写が開始され、そしてＲＮＡが転写される。転写されたＲＮＡは、元来のターゲット核酸に相補的であり、したがって、第二の増幅オリゴマーが再びハイブリダイズし、そして転写されたＲＮＡを二本鎖にする。ＲＮＡは分解され、そして残ったＤＮＡ鎖には、第一の増幅オリゴマーがハイブリダイズする。増幅工程は反復可能である。ターゲット核酸がＤＮＡである場合、第一の増幅オリゴマーはプロモータープライマーであり、そして第二の増幅オリゴマーはプライマーである。増幅は、一般的に、上述のように、そして当該技術分野に記載されるように進行する。例えば、ＴＭＡおよび転写関連増幅の他の変形を記載する、米国特許第４，８６８，１０５号；第５，１２４，２４６号；第５，１３０，２３８号；第５，３９９，４９１号；第５，４３７，９９０号；第５，５５４，５１６号；および第７，３７４，８８５号；ならびにＰＣＴ公報第ＷＯ  ８８／０１３０２号；第ＷＯ  ８８／１０３１５号および第ＷＯ  ９５／０３４３０号を参照されたい。増幅された産物は、増幅中にリアルタイムで検出されてもよいし、または増幅反応終了時に検出されてもよい。検出は、いくつかの方法によって実行可能である。プローブに基づく検出法は、増幅産物中に含有されるターゲット配列に特異的に結合するターゲットハイブリダイズ配列を含む、オリゴヌクレオチドプローブを用いる。結合したプローブから生じるシグナルの検出は、試料中のターゲット核酸の存在を示す。
【００７０】
[0074]核酸検出
[0075]核酸検出を多様な方法によって達成してもよい。検出法は、増幅された産物の一部に相補的であるターゲットハイブリダイズ配列を含む核酸プローブを用いて、そしてプローブ：産物複合体の存在を検出してもよいし、または増幅された産物と会合する検出可能シグナルを増幅可能なプローブ複合体を用いることによってもよい（例えば米国特許第５，４２４，４１３号；第５，４５１，５０３号；および第５，８４９，４８１号）。増幅された産物と特異的に会合する直接または間接的に標識されたプローブは、試料中のターゲット核酸の存在を示す検出可能シグナルを提供する。例えば、ターゲット核酸がＣ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリ１６Ｓ  ｒＲＮＡである場合、増幅された産物は、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリ・ターゲット配列中のまたはこれらに相補的な配列を含有するであろう。プローブが、直接または間接的に、増幅産物の一部に直接または間接的に結合して、試験試料中のＣ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリの存在を示すように、プローブを設定する。
【００７１】
[0076]増幅された配列にハイブリダイズするプローブの態様には、分子内結合によって保持されるコンホメーションを実質的に形成しない、分子トーチおよび直鎖オリゴヌクレオチドなどのヘアピンオリゴヌクレオチドが示される。好ましくは、前記プローブには、標識が含まれていてもよい。直鎖プローブ態様には、標識としての化学発光化合物、例えばリンカーを通じてプローブ配列に付着された化学発光ＡＥ化合物が含まれてもよい（実質的に、米国特許第５，５８５，４８１号および第５，６３９，６０４号、特に第１０欄第６行〜第１１欄第３行、およびその中の実施例８に記載されるとおり）。標識位の例は、プローブオリゴマーの中央領域、およびＡ：Ｔ塩基対形成領域近傍、オリゴマーの３’または５’末端、および所望のターゲット配列でない既知の配列を含むミスマッチ部位またはその近傍である。ヘアピンまたは直鎖プローブは、多様な異なるタイプの相互作用標識のいずれで標識されていてもよく、ここで、１つの相互作用メンバーは、通常、プローブの５’端に付着し、そして他方の相互作用メンバーは、プローブの３’端に付着する。二重標識プローブ、単一標識プローブ、ＡＥ標識プローブ等を含む色素標識プローブが一般的に知られる。二重標識プローブは、一方の端で、特定の波長または範囲の光を吸収し、そして別の放出波長または範囲で光を放出する蛍光標識（「Ｆ」）で標識され、そしてもう一方の端で、フルオロフォアと近接した際に、励起したＦから放出されるシグナルを、部分的にまたは完全に弱らせる消光剤（「Ｑ」）で標識されてもよい。こうしたプローブは、蛍光／消光剤（Ｆ／Ｑ）対で標識されたと称されてもよい。ヘアピンプローブの１つの態様は、増幅された産物を検出して、ターゲット、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリ配列が、増幅工程後の試料中に存在するかどうかを示す「分子トーチ」である。分子トーチプローブは、上述のように、ターゲット結合ドメインおよび閉鎖ドメインを含む。これらのドメインは、トーチがターゲットに結合しているかどうかに応じて、分子トーチが開いたまたは閉じたコンホメーションで存在することを可能にする（また、米国特許第６，８４９，４１２号；第６，８３５，５４２号；第６，５３４，２７４号；および第６，３６１，９４５号も参照されたい）。別のヘアピンプローブ態様は、Ｔｙａｇｉら，  １９９８，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６：４９−５３、ならびに米国特許第５，１１８，８０１号；および第５，３１２，７２８号に一般的に記載される、「分子ビーコン」である。こうしたヘアピンプローブを用いて、ターゲット配列の存在を検出するための方法が当該技術分野に周知である。
【００７２】
[0077]Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリ配列を検出するための方法は、転写関連増幅および分子トーチを用いる。分子トーチは、増幅前または増幅中に付加され、他の試薬の付加を伴わずに検出が行われることを可能にする。例えば、ハイブリダイズしたターゲット結合領域および閉鎖領域複合体のＴｍが増幅反応温度より高くなるように、分子トーチを設計してもよく、したがって増幅されたターゲット配列にプローブが早期に結合するのを防止するように設計してもよい。増幅間隔後、混合物を加熱してトーチ領域を開放し、そしてターゲット結合領域が増幅産物の一部にハイブリダイズするのを可能にする。次いで、溶液を冷却して、プローブターゲット結合および閉鎖領域がハイブリダイズするのを可能にして、標識／消光剤対を有効に閉鎖することによって、増幅された産物に結合していないいかなるプローブも閉鎖する。次いで、増幅されたターゲット配列にハイブリダイズしたプローブのみからシグナルが生成され、そしてこれを検出するように、検出を実行する。例えば、Ｆ／Ｑ標識ヘアピンプローブを含有する混合物を適切な励起光で照射し、そして発光シグナルを測定する。他の態様において、増幅中に、増幅された産物がプローブのターゲット結合領域にハイブリダイズして、増幅中にヘアピンの開放コンホメーションへの変化を生じるように、ヘアピン検出プローブを設計し、そして間隔を空けて増幅反応混合物に照射して、増幅中、リアルタイムで、開放プローブから放出されるシグナルを検出する。
【００７３】
[0078]試料調製
[0079]Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリ配列の増幅および検出のための試料調製には、他の試料構成要素から、試料中に含有される生物を分離し、そして／または濃縮する方法、例えば空気、水または試料の他のタイプからの粒子状物質のろ過が含まれてもよい。試料調製には、細胞を破壊するかまたは細菌を溶解して、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリ１６Ｓ  ｒＲＮＡまたは１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子配列を含む細胞内内容物を放出するルーチンの方法が含まれてもよい。増幅前の試料調製には、他の試料構成要素からターゲット核酸を特異的にまたは非特異的に分離するターゲット捕捉の場合による工程が含まれてもよい。非特異的ターゲット捕捉法は、実質的に水性の混合物から核酸を選択的に沈降させ、核酸を支持体に付着させて、他の試料構成要素を洗い流す工程、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリ核酸および他の試料構成要素を含有する混合物から核酸を物理的に分離する他の方法を含んでもよい。
【００７４】
[0080]１つの態様において、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリ・ターゲット核酸は、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリ・ターゲット核酸を、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、および／またはＣ．コリに特異的な捕捉オリゴマーに特異的にハイブリダイズさせて、ターゲット配列：捕捉プローブ複合体を形成することによって、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリ・ターゲット核酸を他の試料構成要素から選択的に分離する。ターゲット：捕捉プローブ複合体を固定化プローブに結合させ、そして先に記載されるように、試料からターゲット：捕捉プローブ：固定化プローブ複合体を分離することによって、複合体を試料構成要素から分離する（米国特許第６，１１０，６７８号；第６，２８０，９５２号；および６，５３４，２７３号）。ターゲット捕捉は、ハイブリダイズ条件下で、通常、テール配列：固定化プローブ配列二重鎖のＴｍより高い温度でターゲット核酸に特異的にハイブリダイズする１以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含有する、溶液相混合物中で起こりうる。捕捉プローブテールが固定化プローブにハイブリダイズし、そして次いで、支持体上の全複合体が他の試料構成要素から分離されるように、ハイブリダイゼーション条件を調整することによって、ターゲット：捕捉プローブ複合体を捕捉する。付着した固定化プローブ：捕捉プローブ：ターゲット配列を伴う支持体を、１回以上洗浄して、他の試料構成要素をさらに除去してもよい。他の態様は、固定化プローブを特定の支持体、例えば常磁性ビーズに連結し、付着したターゲット：捕捉プローブ：固定化プローブ複合体を伴うビーズが洗浄溶液中に懸濁されて、そして磁気誘引を用いることによって、洗浄溶液から回収可能であるようにする。取り扱い工程数を限定するため、増幅オリゴヌクレオチドを伴う支持体上で複合体中のターゲット配列を単純に混合し、そして増幅工程を進行することによって、ターゲット核酸を増幅してもよい。
【００７５】
[0081]Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリの１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の増幅および検出に好ましいカンピロバクター属オリゴヌクレオチド
[0082]本明細書に記載するように、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・ラリおよびカンピロバクター・コリ核酸を選択的に増幅しそして検出するのに好ましい部位を開示する。好ましい部位は、他のカンピロバクター属種および他の細菌（本明細書において、「最近縁（ｎｅａｒ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ）生物」、「検証（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）生物」または「除外物（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎａｒｉｅｓ）」）の増幅および／または検出に対して区別するよう選択される。これらの好ましい部位は、カンピロバクター属１６Ｓ  ｒＲＮＡの領域内に見出される。感度、選択性および特異性が改善された、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・ラリおよびカンピロバクター・コリ１６Ｓ  ｒＲＮＡを増幅するために、これらの領域を含む特に好ましいオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドセットが同定されてきている。
【００７６】
[0083]いくつかのカンピロバクター属種（例えば、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、Ｃ．コリ、Ｃ．フィタス（Ｃ．  ｆｅｔｕｓ）、Ｃ．ウプサリエンシス（Ｃ  ｕｐｓａｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｃ．ヒオインテスティナリス（Ｃ．  ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、Ｃ．クルブス（Ｃ．  ｃｕｒｖｕｓ）、Ｃ．ホミニス（Ｃ．  ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．インスレニグレ（Ｃ．  ｉｎｓｕｌａｅｎｉｇｒａｅ）、Ｃ．ラニエネ（Ｃ．  ｌａｎｉｅｎａｅ）、Ｃ．ムコサリス（Ｃ．  ｍｕｃｏｓａｌｉｓ）、Ｃ．レクツス（Ｃ．  ｒｅｃｔｕｓ）、Ｃ．スプトルム（Ｃ．  ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、およびＣ．コンシスス（Ｃ．  ｃｏｎｃｉｓｕｓ））およびカンピロバクター目（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）内のいくつかの他の細菌種（例えば、アルコバクター属（Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、フレキシスピラ属（Ｆｌｅｘｉｓｐｉｒａ）、ゲオスピリルム属（Ｇｅｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、スルフロスピリルム属（Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、スルフリクルブム属（Ｓｕｌｆｕｒｉｃｕｒｖｕｍ）、およびヒドロゲニモナス属（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｉｍｏｎａｓ））の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列（または１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子配列）をまず、比較することによって、オリゴヌクレオチドを設計した。オリゴヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成し、そしていくつかの態様において、標準的実験室法を用いて、相補的ターゲット配列（合成または細菌由来の精製ｒＲＮＡ）と、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリ・オリゴマーのＴｍおよびハイブリダイゼーション特性を決定することによって、オリゴマーを性質決定してもよい。次いで、選択したオリゴマー配列を１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列に対してさらに試験した。この試験は、異なる組み合わせの増幅オリゴマー（表１に示すものより選択）を用いた。増幅反応には、溶解物由来の、または培養中で増殖させた多様なカンピロバクター属種から精製した１６Ｓ  ｒＲＮＡターゲットが含まれた。増幅反応は、多様な増幅オリゴ組み合わせを用いて、１６Ｓ  ｒＲＮＡターゲット配列の増幅効率を決定した。増幅オリゴマーには、プライマー、プロモータープライマー、およびプロモータープロバイダーオリゴマーとして機能しうるものが含まれる。一般的に、増幅された産物に標識プローブ（表２）を結合させ、そして作製された増幅産物の量を示すシグナルの相対量を検出することにより、増幅反応で増幅された産物を検出することによって、増幅オリゴマーの異なる組み合わせの相対的効率を監視した。
【００７７】
[0084]本発明で有用なプライマーのいくつかの例には、長さ約１０〜約７０ヌクレオチドであり、そして配列番号９１の領域の「＋」または「−」鎖のいずれかにハイブリダイズするよう設計されたヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが含まれ、ここで、配列番号９１の領域は、ほぼヌクレオチド６２〜ほぼヌクレオチド２２６であり；ほぼヌクレオチド１７０〜ほぼヌクレオチド２２６であり；ほぼヌクレオチド１７０〜ほぼヌクレオチド２０５であり、そしてプライマーには、ヌクレオチド１８４〜ヌクレオチド１９４にハイブリダイズする配列が含まれ；ほぼヌクレオチド１８４〜ほぼヌクレオチド２１２であり、そしてプライマーには、ヌクレオチド１９２〜ヌクレオチド２０５をターゲットとする配列が含まれ；ほぼヌクレオチド１７０〜ほぼヌクレオチド２１２であり；またはほぼヌクレオチド１７０〜ほぼヌクレオチド２２６であり、そしてプライマーにはヌクレオチド１８４〜ヌクレオチド１９４にハイブリダイズする配列、ヌクレオチド１９２〜ヌクレオチド２０５にハイブリダイズする配列、またはその両方が含まれる（配列番号７７〜８３を参照されたい）。さらに、配列番号９１の領域にハイブリダイズするよう設計されたプライマーオリゴ内に、欠失およびミスマッチが取り込まれてもよい。代表的なプライマーオリゴ配列を、配列番号１〜１７（プライマー）として、表１に示す。
【００７８】
[0085]プロモータープライマー／プロモータープロバイダーオリゴマーのターゲット特異的配列のいくつかの態様を表１に列挙し、そしてこれらのターゲット特異的配列は、任意の既知のプロモーター配列の３’端に付着してもよい。プロモータープライマー／プロモータープロバイダーのプロモーター配列を表１中、小文字で示す。バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼに特異的なプロモーター配列の例は、配列番号７５（５’−ａａｔｔｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａ）である。他のプロモーター配列もまた、プロモータープライマー／プロモータープロバイダーオリゴに有用である。プロモーターに基づく増幅オリゴマーターゲットハイブリダイズ配列のいくつかの例には、長さ約１０〜約５０ヌクレオチドであり、そして配列番号９１の領域の「＋」または「−」鎖のいずれかにハイブリダイズするよう設定されたヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。配列番号９１の１つの領域は、ほぼヌクレオチド１４〜ほぼヌクレオチド１５０である。１つの領域は、配列番号９１のほぼヌクレオチド１４〜ほぼヌクレオチド４１である。１つの領域は、配列番号９１のほぼヌクレオチド１４〜ほぼヌクレオチド４１であり、そしてターゲットハイブリダイズ配列は、配列番号９１のヌクレオチド２０〜ヌクレオチド３７に同一または相補的である配列を含有する。配列番号９１の１つの領域は、ほぼヌクレオチド５８〜ほぼヌクレオチド１０８である。配列番号９１の１つの領域は、ほぼヌクレオチド１０８〜ほぼヌクレオチド１５０である。配列番号９１の１つの領域は、ほぼヌクレオチド１０８〜ほぼヌクレオチド１５０であり、そしてターゲットハイブリダイズ配列は、配列番号９１のヌクレオチド１２５〜ヌクレオチド１３５に同一または相補的である配列を含有する。配列番号９１の１つの領域は、ほぼヌクレオチド５８〜ほぼヌクレオチド１５０である。配列番号９１の１つの領域は、ほぼヌクレオチド１１２〜ほぼヌクレオチド１３８である。配列番号９１の１つの領域は、ほぼヌクレオチド１１２〜ほぼヌクレオチド１３８であり、そしてターゲットハイブリダイズ配列は、配列番号９１のヌクレオチド１２５〜ヌクレオチド１３５に同一または相補的である配列を含有する。配列番号９１の１つの領域は、ほぼヌクレオチド１１２〜ほぼヌクレオチド１３８であり、そしてターゲットハイブリダイズ配列は、配列番号９１のヌクレオチド１１５〜ヌクレオチド１３５に同一または相補的である配列を含有する。配列番号９１の１つの領域は、ほぼヌクレオチド１１５〜ほぼヌクレオチド１５０である。配列番号９１の１つの領域は、ほぼヌクレオチド１１５〜ほぼヌクレオチド１５０であり、そしてターゲットハイブリダイズ配列は、配列番号９１のヌクレオチド１２５〜ヌクレオチド１３５に同一または相補的である配列を含有する。配列番号９１の１つの領域は、ほぼヌクレオチド１２５〜ほぼヌクレオチド１５０である。配列番号９１の１つの領域は、ほぼヌクレオチド８３〜ほぼヌクレオチド１５０である。配列番号９１の１つの領域は、ほぼヌクレオチド１０８〜ほぼヌクレオチド１５０であり、そしてターゲットハイブリダイズ配列は、５’−ＣＡＧＴＴＧに同一または相補的である配列を含有する（配列番号２７、３３および９２〜１０１を参照されたい）。付加、欠失およびミスマッチを、配列番号９１の領域にハイブリダイズするよう設定された、プロモータープライマー／プロモータープロバイダーオリゴマーのターゲットハイブリダイズ配列内に取り込んでもよい。表１において、いくつかのプロモータープライマー／プロバイダーオリゴマーに関する代表的なターゲットハイブリダイズ配列を大文字で示し、例示的なプロモーター配列を小文字で示す（Ｔ７プロバイダー／プライマー）。表１に、代表的なターゲットハイブリダイズ配列もまた示す（配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７および４９を参照されたい）。これらのターゲットハイブリダイズ配列は、プロモーターに基づく増幅オリゴマーのターゲットハイブリダイズ配列に限定されず、そしてプライマーまたは他の増幅オリゴマータイプとして使用可能である。
【００７９】
[0086]ブロッカーオリゴマーを単一プライマー転写関連増幅反応で用いてもよい。３’ブロッキングされたオリゴマーの態様には、配列の３’端が好ましくはブロッキングされて、プライマーに基づく核酸合成が生じることが防止されている、配列番号５０〜５７のものが含まれる（表１、ブロッカーを参照されたい）。
【００８０】
表１：  １６Ｓ  ｒＲＮＡ増幅オリゴヌクレオチド
【００８１】
【表１−１】
2012508586.tif 000003
【００８２】
【表１−２】
2012508586.tif 000004
【００８３】
【表１−３】
2012508586.tif 000005
【００８４】
[0087]本発明で有用ないくつかの例示的な検出プローブには、長さ約１０〜約７０ヌクレオチドであり、そして配列番号９１の「＋」または「−」鎖のいずれか、あるいはそのＲＮＡ同等物にハイブリダイズするよう設定されたターゲットハイブリダイズ配列を含む直鎖およびヘアピンオリゴヌクレオチドが含まれ、ここで、配列番号９１の領域は、ほぼヌクレオチド１４〜ほぼヌクレオチド２２６であり；ほぼヌクレオチド１０８〜ほぼヌクレオチド２２６であり；ほぼヌクレオチド１３４〜ほぼヌクレオチド１８１であり；ほぼヌクレオチド１５９〜ほぼヌクレオチド１８１であり；ほぼヌクレオチド１５９〜ほぼヌクレオチド１８１であり、そしてプローブは、配列番号９１のヌクレオチド１６７〜１８１に同一または相補的である配列を含有し；ほぼヌクレオチド１４７〜ほぼヌクレオチド１８１であり；ほぼヌクレオチド１６３〜ほぼヌクレオチド１８１であり；またはほぼヌクレオチド１６３〜ほぼヌクレオチド１８１であり、そしてプローブは、ヌクレオチド１６７〜１８１に同一または相補的である配列を含有する（配列番号１０２〜１０６を参照されたい）。場合によって、検出プローブオリゴは分子トーチであり、検出オリゴはまた、ターゲット閉鎖ドメインまたは他のヘアピン形成構造も含む。付加、欠失およびミスマッチを、配列番号９１の領域にハイブリダイズするよう設計された検出プローブオリゴ内に取り込んでもよい。代表的な検出プローブオリゴ配列を、配列番号５９〜７０（トーチ）として表２に示す。
【００８５】
[0088]表２に列挙する配列に関して、小文字は、閉鎖ドメインの一部を形成するが、ターゲット結合配列の一部ではない、配列中のヌクレオチドを示す。配列の一方の端で蛍光標識が付着し、そして配列のもう一方の端で消光剤化合物が付着する、ヘアピンプローブオリゴマーの態様を合成した。ヘアピンオリゴマーのいくつかの態様にはまた、配列内の選択された位での非ヌクレオチドリンカー部分も含まれる。こうした態様の例には、配列番号７０の残基６〜７の間、配列番号６８の残基１５〜１６の間、配列番号６１の残基１６〜１７の間、配列番号６７の残基１７〜１８の間、配列番号６９の残基１８〜１９の間、配列番号６６の残基２０〜２１の間、配列番号６３の残基２１〜２２の間、配列番号６２の残基２３〜２５の間、配列番号６５の残基２４〜２５の間、配列番号５９および６４の残基２５〜２６の間、ならびに配列番号６０の残基２６〜２７の間に無塩基性９−炭素（「Ｃ９」）リンカーを含むものが含まれる。先に記載されるように、標識されず、そして標識プローブのターゲットへの結合を促進する、ヘルパープローブとともに、検出プローブを用いてもよい（米国特許第５，０３０，５５７号）。
【００８６】
表２：  １６Ｓ  ｒＲＮＡプローブ
【００８７】
【表２】
2012508586.tif 000006
【００８８】
[0089]捕捉プローブオリゴマーを試料調製物中で用いて、他の試料構成要素から、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、および／またはＣ．コリ・ターゲット核酸を分離してもよい。例示的な捕捉プローブオリゴマーには、配列番号７１〜７４のターゲット特異的配列を含むものが含まれる。配列番号７１および７３は、配列番号７２および７４のターゲット特異的配列、ならびに核酸または非核酸結合パートナーであってもよい結合パートナーを含む、捕捉プローブ態様である。配列番号７２および７４には各々、ｄＴ３Ａ３０ポリマーである結合パートナーが含まれる（下線）。表３。
【００８９】
表３：捕捉オリゴ
【００９０】
【表３】
2012508586.tif 000007
【実施例】
【００９１】
実施例１．  アッセイ試薬、装置およびプロトコル
[0090]以下の例は、本明細書記載のリアルタイムＴＭＡ実験において用いられる、典型的なアッセイ試薬、装置、プロトコル、条件等を記載する。逆に明記されない限り、試薬調製、装置準備およびアッセイプロトコルは、本質的に以下に示すように行った。本開示を所有する一般の当業者は、試薬、状態、装置およびアッセイ法を変化させることも可能であり、そしてこうした変動は、本開示の範囲内である。
【００９２】
[0091]本明細書記載の実施例におけるターゲット捕捉および増幅工程で用いる試薬には、一般的に、以下の１以上が含まれた。プローブマトリックス溶解試薬は、０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、２０ｍＭコハク酸リチウム、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有した。溶解試薬は、ｐＨ６．５で、１％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２．５ｍＭコハク酸、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、および５００ｍＭ塩化リチウム（ＬｉＣｌ）を含有した。ターゲット捕捉試薬は、ｐＨ６．４で、３００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．８８Ｍ塩化リチウム、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、および共有結合した（ｄＴ）１４オリゴマーを伴う２５０μｇ／ｍｌの常磁性粒子（０．７〜１．０５ミクロン粒子、ＳＥＲＡ−ＭＡＧＴＭ  ＭＧ−ＣＭ、Ｓｅｒａｄｙｎ，  Ｉｎｃ．、インディアナ州インディアナポリス）を含有した。ターゲット捕捉中に用いられる洗浄溶液は、ｐＨ７．５で、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムを含有した。増幅試薬を他の反応構成要素と混合して、ｐＨ７．７で、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３３ｍＭ  ＫＣｌ、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各０．５ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、１０ｍＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＣＴＰ、１２．７ｍＭ  ＵＴＰ、２ｍＭ  ＧＴＰを含有する溶液を産生した。増幅オリゴヌクレオチド（プライマー０．１２５ｐｍｏｌ／μＬ、プロモータープライマー０．１２５ｐｍｏｌ／μＬ、ブロッカーオリゴヌクレオチド０．０１２５ｐｍｏｌ／μＬ、プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチド０．１２５ｐｍｏｌ／μＬ、および場合によるプローブ０．３ｐｍｏｌ／μＬ）を、増幅試薬中、反応混合物に添加するか、または増幅試薬から分離してもよい。酵素試薬は、ｐＨ７．０で、３６０ＲＴＵ／μｌのＭｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（ＲＴ）および約８０ＰＵ／μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、７５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１２０ｍＭ  ＫＣｌ、１０％  ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、１６０ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有し、ここで、ＲＴの１ＲＴＵは、３７℃２０分間で、１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込み、そして１ＰＵのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、３７℃２０分間で、５ｎｍｏｌのＲＮＡ転写物を産生する。
【００９３】
[0092]装置および材料には一般的に：  ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（登録商標）９６（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ、マサチューセッツ州ウォルサム）；  ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（登録商標）ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ、マサチューセッツ州ウォルサム）；  ＰＴＩ−ＦＰ−２（登録商標）ＦｌｕｏＤｉａプレート読み取り装置（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ニュージャージー州バーミンガム）；  ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｒ  ０２２６７０５６５（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社、ニューヨーク州ウェストベリー）；  硬シェル薄壁９６ウェル縁取り（Ｓｋｉｒｔｅｄ）ＰＣＲプレート、着色シェル／白色ウェル、カタログ番号：  ＨＳＰ−９６１５、ＨＳＰ−９６２５、ＨＳＰ−９６３５）（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュルス）；  ＤＷ磁石用のＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（登録商標）９６チップコーム（カタログ番号：  ９７００２５３４）Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ、マサチューセッツ州ウォルサム）；  ＤＷ  ９６プレート、Ｖ底、ポリプロピレン、無菌２５パック／ケース（Ａｘｙｇｅｎカタログ番号：  Ｐ−２ＭＬ−ＳＱ−Ｃ−Ｓ；  ＶＷＲカタログ番号４７７４９−８７４）；  ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（登録商標）９６  ＫＦプレート（２００マイクロリットル）（カタログ番号：  ９７００２５４０）；  ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（登録商標）ｍＬチップコーム（カタログ番号９７００２１１１）；およびＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（登録商標）ｍＬ試験管（カタログ番号  ９７００２１２１）が含まれた。
【００９４】
[0093]転写仲介増幅（ＴＭＡ）反応は、実質的に、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号に開示するような方法を用いる。単一プライマー転写関連増幅は、実質的に、米国特許第７，３７４，８８５号に詳細に開示する方法を用いる。ＴＡＧ増幅法は、米国公報第２００７０２８１３１７  Ａ１に開示されている。ターゲット配列を含むハイブリダイゼーション複合体を検出するための、ＡＥ標識プローブからのシグナルの使用および検出は、米国特許第５，２８３，１７４号；第５，６５６，７４４号；および第５，６５８，７３７号にすでに詳細に開示される方法を使用する。ヘアピンプローブを用いるための方法が周知であり、そしてこれには、米国特許第６，８４９，４１２号；第６，８３５，５４２号；第６，５３４，２７４号；および第６，３６１，９４５号にすでに詳細に開示されるものが含まれる。
【００９５】
[0094]増幅オリゴマーおよび標識検出プローブオリゴマーを含めて、本明細書に記載するオリゴマーの多様な組み合わせを用いることによって、試料が約１Ｅ２コピーのターゲット核酸を含有する場合、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、および／またはＣ．コリ・ターゲット核酸が特異的に検出された。以下の例は、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、および／またはＣ．コリ・ターゲット核酸の検出のための開示の態様のいくつかを例示する。
【００９６】
実施例２．  Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、およびＣ．コリ１６Ｓオリゴマー組み合わせセットの設計および最初の試験
[0095]Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、およびＣ．コリ・ターゲット核酸を区別可能に増幅し、そして検出するように、増幅および検出オリゴヌクレオチドを設定した。ＡＦ３９３２０２．１、ｇｉ：２０３７８２０８（配列番号９１）のヌクレオチド９〜８２およびヌクレオチド４４〜２２６に対応するカンピロバクター・ジェジュニ１６Ｓ  ｒＲＮＡの２つの重複領域を用いて、いくつかのＴ７プロバイダー、ブロッカー、プライマー、およびトーチが、本明細書に記載するように、前記参照配列のこれらの領域内のより小さい配列にハイブリダイズするように設定した。これらのオリゴマーのターゲット・ハイブリダイズ配列はまた、Ｃ．ジェジュニ・ターゲット核酸ならびにＣ．コリ、Ｃ．ラリまたはＣ．コリおよびＣ．ラリ・ターゲット核酸にもハイブリダイズする。さらに、この同じＣ．ジェジュニ１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基対３４１〜４２６に対応する領域を用いて、いくつかのターゲット捕捉オリゴを設計した（表１〜３を参照されたい）。Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、およびＣ．コリの異なる株の選択的検出が最大になり、他の生物との交差反応の可能性が減少するように、これらのオリゴを設計した。
【００９７】
[0096]マスタープレートスクリーニングアッセイを用いて、表１〜２由来のＴ７プロバイダー、ブロッカー、プライマーおよびトーチオリゴの総数９４２の異なる組み合わせをスクリーニングした。リアルタイム単一プライマー転写関連増幅を用いて、既知の量のＣ．ジェジュニ・ターゲット核酸を増幅した。以下の群の各々から１つのオリゴマーを選択して、この最初のスクリーニングで用いる増幅オリゴマーの組み合わせを生じた：第１群（配列番号１〜１７）；第２群（配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４６または４８）；第３群（配列番号５０〜５８）；および第４群（配列番号５９〜７０）。最終体積２００μＬ／反応ウェルで、増幅試薬中に０．５ｐＭ／μＬ  Ｔ７プロバイダー、０．５ｐＭ／μＬプライマー、および０．５ｐＭ／μＬブロッカーを含有するように、マスタープレートをセットアップした。各反応ウェルは、オリゴ組み合わせの１つを含有した。マスタープレートを２０℃で維持した。
【００９８】
[0097]一次オリゴスクリーニングには、１０μＬの各オリゴ組み合わせを９６ウェルプレートに移す工程が含まれた。Ｃ．ジェジュニ・ターゲット核酸（アメリカン・タイプ・セル・カルチャー、バージニア州マナサス、ＡＴＣＣ３３５６０）を、増幅試薬中、１Ｅ５コピー／２０μｌに希釈し、そして次いで、希釈したターゲットを９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、したがって、Ｃ．ジェジュニ・ターゲット核酸を１Ｅ５コピー／反応で試験した。ターゲットを含まずに、オリゴおよび増幅混合物を含有する陰性対照が、プレート上に含まれた。オリゴヌクレオチド、ターゲットおよび増幅試薬を含有する反応混合物を覆って、蒸発を防止し、６０℃で１０分間インキュベーションし、そして次いで、４２℃に冷却した。次に、酵素試薬を１０μＬ／ウェルで添加し、そして反応を混合し、そして４２℃でインキュベーションした。
【００９９】
[0098]増幅反応中、総数６３回の読み取りで、規則的な時間間隔（例えば７２秒ごと）で蛍光を測定した。各間隔で、２色を読み取った。リアルタイム蛍光検出系（例えばＢｉｏ−Ｒａｄ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＯｐｔｉｃｏｎＴＭまたはＣｈｒｏｍｏ４ＴＭまたはＦｌｕｏＤｉａ（登録商標）Ｔ７０装置）を用いて、監視を行った。リアルタイムアルゴリズムは当該技術分野に周知であり、その例は、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２００２  Ｊｕｎ  ７；２９４（２）：３４７−５３およびＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００４  ３２（２２）：ｅ１７８に記載される。陰性対照を試験して、バックグラウンド蛍光シグナルレベルを決定した。生データを集め、そして分析して、シグナル出現時間（Ｔ時間）を計算し、そして相対的蛍光単位（ＲＦＵ）の範囲を定めた（ｒａｎｇｅ）。次いで、Ｔ時間に基づいて、２３分未満のＴ時間であれば最適な組み合わせと見なし、２３分〜２９分の間のＴ時間であれば適切なオリゴ組み合わせとみなし、そして３０分以上のＴ時間であれば許容しえないとして、オリゴ組み合わせをグループ化した。陽性基準は用いた装置に依存した。例えば、ＭＪ  Ｃｈｒｏｍｏ４に関しては、陽性基準を０．０５ＲＦＵに設定し、そして６７分間の時間経過に渡って評価したが、一方、異なるプレート読み取り装置を用いた際、陽性基準を１０００ＲＦＵに設定し、そして７５分間の時間経過に渡って評価した。表４に列挙するオリゴマー組み合わせは、２３分以下のＴ時間を持つ、蛍光曲線を生じた。表５に列挙するオリゴマー組み合わせは、２３〜３０分の間のＴ時間を持つ蛍光曲線を生じた。表４および５から、二次スクリーニングのため、オリゴヌクレオチド組み合わせの好ましいセットを選択した。Ｔ時間に加えて、カンピロバクター属種に比較したミスマッチ核酸塩基の数、および組み合わせた各オリゴヌクレオチドに課される（ｐｌａｃｅｄ）特異性に関する負荷の度合いなどの設計上の欠点を検出するためにもまた、オリゴ組み合わせを調べた。二次スクリーニングのためのオリゴ組み合わせの選択に影響を及ぼす他の要因には、劣ったオリゴ適合性およびターゲットを増幅しそして／または検出する際の劣った成績が含まれた。
【０１００】
表４．  ２３分未満のカンピロバクター属オリゴマー組み合わせ
【０１０１】
【表４−１】
2012508586.tif 000008
【０１０２】
【表４−２】
2012508586.tif 000009
【０１０３】
【表４−３】
2012508586.tif 000010
【０１０４】
【表４−４】
2012508586.tif 000011
【０１０５】
【表４−５】
2012508586.tif 000012
【０１０６】
表５．  ２３〜２９分のカンピロバクター属オリゴマー組み合わせ
【０１０７】
【表５−１】
2012508586.tif 000013
【０１０８】
【表５−２】
2012508586.tif 000014
【０１０９】
【表５−３】
2012508586.tif 000015
【０１１０】
【表５−４】
2012508586.tif 000016
【０１１１】
[0099]次いで、最初のスクリーニングに基づいて、２２オリゴヌクレオチドセットに対して、二次スクリーニングを行った。二次スクリーニングのために選択したオリゴは以下の通りである：  Ｔ７プロバイダー、配列番号１８、２０、２４、２８、３０、３２および４８；  ブロッカー、配列番号５０、５３、５６および５７；  プライマー、配列番号４、７および１２；  ならびにトーチ、配列番号６２、６３、６５、６６、６７および６８（表６を参照されたい）。早期の出現時間、ならびにシグナルおよび曲線形状、および他の好ましい要因に基づいて、二次スクリーニングのために同定されるオリゴのこれらのセットを選択した。
【０１１２】
表６．  二次スクリーニングのための増幅オリゴヌクレオチド組み合わせ
【０１１３】
【表６】
2012508586.tif 000017
【０１１４】
＊２３分より優れた（ｈｉｇｈｅｒ）Ｔ時間を持つ、二次スクリーニングのために選択した組み合わせ。これらの組み合わせは、他の組み合わせでよく働いた、２つまたは３つのオリゴメンバーを含む。
【０１１５】
実施例３．  増幅オリゴマーセットの二次スクリーニング：  Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、およびＣ．コリ・ターゲット核酸に関する選択性
[00100]Ｃ．ウプサリエンシスおよびＣ．フィタスから区別する一方、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．コリおよびＣ．ラリ・ターゲット核酸に対する感度に関して、表６の増幅オリゴマーの組み合わせをさらに試験した。０、１Ｅ２、１Ｅ３および１Ｅ４コピーのＣ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、Ｃ．コリ、Ｃ．フィタス、またはＣ．ウプサリエンシス１６Ｓ  ｒＲＮＡを用いて、各組み合わせを試験した。増幅オリゴは、５．０ｐＭ  Ｔ７プロバイダー、０．５ｐＭブロッカー、５．０ｐＭプライマーおよび４．０ｐＭトーチで存在した。陽性基準は、ＰＴＩプレート読み取り装置を用いると、１０００ＲＦＵであった。増幅オリゴマー組み合わせは、わずか１Ｅ２コピーのＣ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、またはＣ．コリ・ターゲット核酸を増幅可能であった。Ｔ時間は、Ｃ．フィタス亜種フィタス、Ｃ．フィタス亜種ベネレアリスおよびＣ．ウプサリエンシスに関する増幅反応において、非常に低レベルでまたは非常に遅延してのいずれかで出現した。表７。オリゴ組み合わせ番号（２−８）および（２−２２）は、これらのオリゴ組み合わせを含むウェル中、この二次スクリーニングアッセイにおいて、Ｃ．フィタス種またはＣ．ウプサリエンシス種のいずれとも反応せず、そしてＣ．ジェジュニ、Ｃ．コリ、およびＣ．ラリの非常に優れた検出があったため、続くスクリーニングのために選択された。
【０１１６】
表７．  二次スクリーニング：選択性スクリーニング結果
【０１１７】
【表７】
2012508586.tif 000018
【０１１８】
[00101]表６由来のオリゴ組み合わせを用いて、さらなるスクリーニングを行って、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、およびＣ．コリに対する感度、ならびにＣ．ウプサリエンシスおよびＣ．フィタスに対する区別を伴うトーチを同定した。ＭＪ  Ｃｈｒｏｍ４装置上、陽性基準を０．０５ＲＦＵに設定した。反応あたり１Ｅ５コピーのターゲット生物に対して、これらのオリゴヌクレオチドセットを試験した。さらなるスクリーニングの結果によって、トーチオリゴヌクレオチド、配列番号６３および６５を含むオリゴ組み合わせが、Ｃ．フィタスと交差反応する一方、トーチ、配列番号６６を含むものは、Ｃ．フィタスに対して非常に低いシグナルしか持たないことが示された。配列番号６７〜６８を含むオリゴ組み合わせは、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、およびＣ．コリに対する非常に優れた感度、ならびにＣ．ウプサリエンシスおよびＣ．フィタスに対する区別を示した。
【０１１９】
実施例４：ターゲット捕捉の評価および内部対照組込み
[00102]配列番号７、３２、５０および６８増幅オリゴヌクレオチド組み合わせを用いて、３つのカンピロバクター属１６Ｓ  ｒＲＮＡターゲット捕捉オリゴヌクレオチド（ＴＣＯ）を試験した。ターゲット捕捉オリゴには、Ｃ．ジェジュニ１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列に基づく２つのカンピロバクター属ＴＣＯ（配列番号７１および７３）および１つのゆらぎＴＣＯ（配列番号５８）が含まれた。本アッセイにおいて、Ｃ．ジェジュニに基づくＴＣＯのハイブリダイゼーションを提供するため、最初の加熱工程が含まれた。ゆらぎＴＣＯは、加熱工程を必要としないが、３つすべてのＴＣＯに関して同等の条件を維持するため、該工程を含んだ。
【０１２０】
[00103]Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ９６で用いるターゲット捕捉法を表８に要約する。増幅および酵素試薬を再構成した。ＫＦプレートを２００μＬ／ウェルの洗浄溶液で満たすことによって洗浄プレートを調製した。別のＫＦ２００プレートを１００μＬ／ウェルの増幅試薬で満たすことによって増幅プレートを調製した。用いるまで、増幅および洗浄プレートの両方を覆っておいた。５０μＬ  ＴＣＲ／ウェルを２ｍＬ深底９６プレート（Ａｘｙｇｅｎ）に添加することによって、試料プレートを調製した。１０μＬ溶解溶液中に、反応あたり１Ｅ５コピーから反応あたり１Ｅ１コピーまで、ターゲットを力価決定した。アッセイにおいて、反応あたり１Ｅ５コピーで、Ｃ．フィタス、およびＣ．ウプサリエンシスを試験することによって、特異性が含まれた。陰性対照には、溶解試薬のみが含まれる。１ｍｌの溶解溶液を試料プレートの各ウェルに添加した。反復ピペッターを用いて、１０μＬのターゲット溶液を、適切な深底ウェルに添加した。深底ウェルチップコームを試料プレート中に入れた。洗浄プレートおよび増幅プレートのカバーを取り除いた。ＫＦ９６プロトコルを開始し、そしてすべてのアッセイプレートをＫＦ９６装置中に入れた。増幅プレートを位置４に入れ、洗浄プレートを位置３に入れ、そして試料（深底プレート）を位置１に入れた。ＫＦ９６装置中の位置２は、空のままにした。プレートを装填したら、ＫＦ装置はターゲット捕捉工程を開始した。ＫＦ９６運転が完了したら、プレートを取り除いた。増幅プレートから、マルチチャネルピペッターを用いて各ウェルから３０μＬを取り除き、そしてＭＪ  ９６ウェルＰＣＲプレートに移した。
【０１２１】
表８．  Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ９６プログラム
【０１２２】
【表８】
2012508586.tif 000019
【０１２３】
[00104]結果を表９に示し、そして配列番号７１および７３が、ターゲット捕捉に関して、配列番号５８と同等であることを示す。Ｃ．フィタスおよびＣ．ウプサリエンシスは検出されなかった。Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．コリおよびＣ．ラリは、すべてのターゲットレベルで、すべて検出された。さらなるカンピロバクター属検出アッセイのため、配列番号７３を選択した。
【０１２４】
表９．  ターゲット捕捉結果
【０１２５】
【表９−１】
2012508586.tif 000020
【０１２６】
【表９−２】
2012508586.tif 000021
【０１２７】
【表９−３】
2012508586.tif 000022
【０１２８】
＊４つの試料のうちの１つが、どちらの試験条件に関しても正のＴ時間を示した。
[00105]したがって、これらのアッセイから、ターゲット捕捉プローブ、配列番号７３を用いて、増幅オリゴセット、配列番号７、３２、５０および６８に対するさらなる試験を行うことを決定した。
【０１２９】
実施例５．  検出の感度、特異性、干渉および限界
[00106]感度試験。カンピロバクター・ジェジュニ（ＡＴＣＣ  ３３５６０）を反応あたり１Ｅ５コピーでアッセイした。溶解緩衝液を陰性対照として用いた。ターゲット捕捉のためにＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ９６装置を用い、プライマーをアニーリングさせ、そして酵素を添加するためにＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサーを用いて、２０の陽性（アッセイあたり１Ｅ５コピーのｒＲＮＡ）を試験し、そして検出のためにＰＴＩ−ＦＰ−２（登録商標）ＦｌｕｏＤｉａプレート読み取り装置を用いた。２０の陰性対照反応を含めた。ターゲット捕捉のためのインプットは１ｍＬであり、ターゲット捕捉のためのアウトプットは１００μＬであり、このうち３０μＬを増幅に用いた。陽性基準を１０００ＲＦＵに設定した。＞９５％陽性率で２０の複製物のうち１９が検出されるべきであった。最初の試験ラウンド後、１９未満の複製物が陽性である場合、４０のさらなる複製物が試験されるべきであった。この段階での感度に関する試験は、１００％の陽性率および１０％の偽陽性率を生じた。この段階で見られる偽陽性は、増幅プロセス中、非常に低レベルで、そして非常に遅延して出現した。陽性に関する１０００ＲＦＵ基準は最適化された基準ではなかったため、偽陽性は、真の偽陽性とは見なされない。これらの条件を、再び、さらなる周期の試験において評価した。結果を表１０に示す。
【０１３０】
表１０．  感度結果
【０１３１】
【表１０】
2012508586.tif 000023
【０１３２】
[00107]特異性試験。ターゲット生物に最近縁であるが、ｒＲＮＡ分析によって遺伝子型的に別個である生物を陰性として選択した。ターゲット捕捉のためにＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ  ｍＬ装置を用い、プライマーをアニーリングさせ、そして酵素を添加するためにＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサーを用いて、７つの検証生物を反応あたり１Ｅコピーで試験し、そして検出のためにＰＴＩ−ＦＰ−２（登録商標）ＦｌｕｏＤｉａプレート読み取り装置を用いた。検証生物は、Ｃ．フィタス亜種ベネレアリス；Ｃ．フィタス亜種フィタス；Ｃ．フェカリス；大腸菌；Ｃ．ウプサリエンシス；Ｓ．エンテリティディス（Ｓ．  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）；およびＨ．ピロリであった。陽性対照は、陽性対照反応あたり１Ｅ４コピーのＣ．ジェジュニ（ＡＴＣＣ３３５６０）であった。溶解溶液を陰性対照として用いた。すべての生物を複製反応中で試験した。陽性基準を１０００ＲＦＵに設定した。１４０反応のうち、陽性は７反応以下でなければならない。２８の陰性対照反応が含まれた。ターゲット捕捉のためのインプットは１ｍＬであり；ターゲット捕捉のためのアウトプットは１００μＬであり、このうち３０μＬを増幅に用いた。この段階での特異性に関する試験は、検証生物に対しての区別に際して、約９８％の成功率を生じ（３／１４０が陽性；すべて大腸菌反応ウェル）、そして偽陽性反応が、８４の陰性反応ウェルの２つで検出された。したがって、大腸菌ウェルにおける偽陽性率は、陰性対照ウェルにおけるものと同様であった。陽性対照は１００％陽性であった。表１１。
【０１３３】
表１１．  特異性結果
【０１３４】
【表１１】
2012508586.tif 000024
【０１３５】
[00108]干渉試験。本アッセイの目的は、０コピー（溶解溶液のみ）または１Ｅ７コピーの最近縁生物の存在下で、試料あたり１Ｅ３コピー（１ＣＦＵ）の濃度で、Ｃ．ジェジュニ１６Ｓ  ｒＲＮＡを検出することである。７つの最近縁検証生物を試験し、これらは以下の通りであった：Ｃ．フィタス亜種ベネレアリス；Ｃ．フィタス亜種フィタス；Ｃ．フェカリス；大腸菌；Ｃ．ウプサリエンシス；Ｓ．エンテリティディス；およびＨ．ピロリ。Ｃ．ジェジュニを１Ｅ３コピーでベースライン・ターゲットとして用いた。ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ９６およびＰＴＩ読み取り装置を用いて、アッセイを行った。１２の複製物中ですべての条件を試験し、陽性基準は１０００ＲＦＵであった。干渉試験は、Ｃ．フェカリス；大腸菌；Ｃ．ウプサリエンシス；Ｓ．エンテリティディス；およびＨ．ピロリの存在下で、Ｃ．ジェジュニの検出に関して１００％陽性を示した。しかし、Ｃ．フィタス亜種ベネレアリス；Ｃ．フィタス亜種フィタスの存在下で、Ｃ．ジェジュニの検出は、それぞれ、０％陽性および８．３％陽性を生じた。追跡アッセイにおいて、Ｃ．コリおよびＣ．ラリと組み合わせて、干渉Ｃ．フィタス種を同様に試験し、そしてＣ．フィタス種は、検出に干渉した。試験したＣ．フィタス種は、現在の増幅オリゴ組み合わせを用いたＣ．ジェジュニ、Ｃ．コリおよびＣ．ラリ・ターゲット核酸の検出に干渉する。
【０１３６】
実施例６．  多様なＴ７プロバイダーを用いたオリゴマーセットの試験
[00109]さらなるＴ７プロバイダーオリゴマーを調製し、そして試験した。Ｔ７プロバイダーを以下の表１２に示す。表１２中のＴ７プロバイダーを各々、配列番号７、５０および６８、ならびにＴ７プロバイダーの１つを含むオリゴマー組み合わせで用いた。１つの条件において、ブロッカー（配列番号５０）は含まれず、そしてしたがって、この反応における組み合わせは配列番号７、２６、６８であった。
【０１３７】
表１２．  多様なＴ７プロバイダー
【０１３８】
【表１２】
2012508586.tif 000025
【０１３９】
[00110]Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．コリおよびＣ．ラリ・ターゲット核酸に対する感度に関して、増幅オリゴ組み合わせをスクリーニングした。次いで、これらの組み合わせの増幅オリゴマーのサブセットを、最近縁種による干渉および交差反応性に関してスクリーニングした。本明細書に一般的に記載するように、感度アッセイをセットアップした。反応あたり、０、１Ｅ２、１Ｅ３または１Ｅ４コピーのレベルで、Ｃ．ジェジュニ（ＡＴＣＣ  ３３２９１）、Ｃ．コリ（ＡＴＣＣ  ３３５５９）およびＣ．ラリ（ＡＴＣＣ  ３５２２１）を試験した。陰性対照は、オリゴを含まない増幅試薬であった。陽性選択基準は、１Ｅ２反応に関しては、１０００ＲＦＵを有するのが、３試料のうち少なくとも２、そして１Ｅ４反応に関して、ＲＦＵ１０００に関して２０分以下のＴ時間を有するのが、３試料のうち３であった。これらの増幅オリゴ組み合わせは、感度試験のためによく働いた。
【０１４０】
[00111]干渉試験。次いで、以下の包含生物、Ｃ．ジェジュニ（ＡＴＣＣ  ３３２９１）、Ｃ．コリ（ＡＴＣＣ  ３３５５９）またはＣ．ラリ（ＡＴＣＣ  ３５２２１）の１つを、各々、以下の最近縁検証生物、Ｃ．フィタス亜種フィタス、Ｃ．フィタス亜種ベネレアリス、Ｃ．ウプサリエンシスまたはアルコバクター・ブルツレリ（Ａｒｃｈｏｂａｃｔｅｒ  ｂｌｕｔｚｌｅｒｉ）の１つと組み合わせて用いて、対照増幅オリゴ組み合わせ、および感度試験において最適に働いた３つの増幅オリゴ組み合わせを、干渉に関してさらに試験した。包含生物を反応あたり１Ｅ５コピーで試験し、そして検証生物を反応あたり１Ｅ８コピーで試験した。陽性対照は、検証生物を含まない、反応あたり１Ｅ５コピーのＣ．ジェジュニ（ＡＴＣＣ  ３３２９１）であった。陰性対照は、オリゴを含まない増幅試薬であった。ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ９６およびＰＴＩ読み取り装置を用いて、アッセイを行った。反応を１２の複製物中で実行し、そして陽性基準は１０００ＲＦＵであった。
【０１４１】
[00112]すべての陽性対照は適切に増幅され、そしてすべての陰性対照は偽陽性を示さなかった。配列番号７、３２、５０および６８、配列番号７、８６、５０および６８を含むオリゴマー組み合わせ、ならびにより低い度合いで、配列番号７、８４、５０および６８を含む組み合わせは、Ｃ．フィタス亜種フィタスおよびＣ．フィタス亜種ベネレアリスによってある程度の干渉を示した。増幅オリゴ組み合わせ配列番号７、２６、５０および６８では干渉は見られなかった。次いで、これらの増幅オリゴ組み合わせの３つすべてを交差反応性に関して試験した。
【０１４２】
[00113]交差反応性試験。Ｃ．フィタス亜種フィタス、Ｃ．フィタス亜種ベネレアリス、Ｃ．ウプサリエンシスおよびアルコバクター・ブルツレリの反応あたり１Ｅ８コピーに対して、増幅オリゴの交差反応性を試験した。陽性対照は、反応あたり１Ｅ５コピーのＣ．ジェジュニ（ＡＴＣＣ  ３３２９１）であった。陰性対照は、オリゴを含まない増幅試薬であった。反応を４つの複製物中で行い、そして陽性基準は１０００ＲＦＵであった。陽性対照は適切に増幅され、そして偽陽性は検出されなかった。増幅オリゴ組み合わせ、配列番号７、２６、５０および６８に関して、遅延した緩やかな傾斜の検出が見られた（平均Ｔ時間２９．４分）が、試験した他の増幅オリゴ組み合わせでは見られなかった。緩衝ペプトン水においては、純粋な培養溶解物を試験するため、オリゴマー組み合わせ、配列番号７、２６、５０および６８を用いた。
【０１４３】
実施例７．  純粋な培養溶解物中のターゲット核酸に関する、検出および分析試験の感度、特異性、限界。
[00114]緩衝ペプトン水（ＢＰＷ）中の純粋培養溶解物を試験するため、オリゴマー組み合わせを用いた。試料調製デバイスは含まれなかった。すべての陽性対照はＣ．ジェジュニ（ＡＴＣＣ  ３３５６０）であり、そしてすべての陰性対照は溶解／ＢＰＷであった。すべての試料は、７０：３０の溶解溶液：ＢＰＷ中である。増幅オリゴは、配列番号７、２６、５０および６８である。ターゲット捕捉オリゴは配列番号７３である。
【０１４４】
[00115]感度。カンピロバクター・ジェジュニ（ＡＴＣＣ  ３３５６０）、Ｃ．コリ（ＡＴＣＣ  ４３４７８）、およびＣ．ラリ（ＡＴＣＣ  ３５２２２）を反応あたり１Ｅ４〜５Ｅ４コピーでアッセイした。陰性対照として溶解緩衝液を用いた。ターゲット捕捉のためにＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ９６装置を用い、プライマーをアニーリングさせ、そして酵素を添加するためにＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサーを用いて、２０の陽性（アッセイあたり１Ｅ５コピーのｒＲＮＡ）を試験し、そして検出のためにＰＴＩ−ＦＰ−２（登録商標）ＦｌｕｏＤｉａプレート読み取り装置を用いた。２０の陰性対照反応を含めた。ターゲット捕捉のためのインプットは１ｍＬであり、ターゲット捕捉のためのアウトプットは１００μＬであり、このうち３０μＬを増幅に用いた。陽性基準を１０００ＲＦＵに設定した。＞９５％陽性率で２０の複製物のうち１９が検出されるべきであった。最初の試験ラウンド後に１９より少ない複製物が陽性であった場合、４０のさらなる複製物が試験されるべきであった。この段階での感度に関する試験は、１００％の陽性率および１０％の偽陽性率を生じた。
【０１４５】
[00116]特異性。最近縁除外生物を用いて、増幅オリゴ組み合わせの特異性を検証した。ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ９６およびＰＴＩ検出装置を用いて、反応あたり１Ｅ６コピーで、除外生物を試験した。除外生物は、Ｃ．フィタス亜種ベネレアリス；Ｃ．フィタス亜種フィタス；Ｃ．フェカリス；大腸菌；Ｃ．ウプサリエンシス；Ｓ．エンテリティディス；およびＨ．ピロリであった。陽性対照は、陽性対照反応あたり、１Ｅ５コピーのＣ．ジェジュニ（ＡＴＣＣ  ３３５６０）であった。溶解溶液を陰性対照として用いた。すべての生物を複製反応で試験した。陽性基準を１０００ＲＦＵに設定した。特異性試験は、検証生物に対する区別に際して、１００％の成功率を生じた。大腸菌反応は、０の偽陽性を生じ、したがって、先の試験で現れた偽陽性率を示さなかった。陽性対照は１００％陽性であった。陰性対照は偽陽性を示さなかった。
【０１４６】
[00117]検出限界。Ｃ．ジェジュニ（ＡＴＣＣ  ３３５６０および４９３５１）、Ｃ．コリ（ＡＴＣＣ  ４３４７８および４３４８８）、およびＣ．ラリ（ＡＴＣＣ  ３５２２２および４３６７５）を１Ｅ３〜１Ｅ４コピーのＲＮＡ／アッセイ（およそ１〜１０ＣＦＵ）のレベルで試験した。各カンピロバクター属種に関する実際のアッセイインプットは、５Ｅ３コピーであった。ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ９６上でターゲット捕捉を行い、そしてＰＴＩ読み取り装置上で検出を行った。各種を２０の複製物で試験し、このうち１つの３０μＬ複製物を増幅した。このセクションに関する陽性基準は１０００ＲＦＵであり、そして陽性と見なされるためには、２０の複製物のうち１９がこの基準に到達しなければならない。ＡＴＣＣ  ３３５６０が陽性対照であり、そして試験に必要な株でもあると見なされることに注目されたい。該株は、プレート上に陽性対照として含まれ、この場合は５Ｅ３コピー／アッセイで試験されなかった。結果はこれらのカンピロバクター属種の各々を検出するために１００％成功率（２０の複製物のうち２０）を示した。偽陽性はなかった。
【０１４７】
[00118]分析試験。検出用の２５の生物および１５の検証生物を含むように、試験する生物の数を拡大した。生物を１Ｅ５コピー／アッセイ（およそ１００ＣＦＵ）で試験した。ターゲット捕捉のためにＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ９６装置上で、そして検出のためにＰＴＩ読み取り装置上で、試験を行った。すべて、３つの複製反応中で試験し、このうち１つの３０μＬ複製物を増幅した。包含生物に関しては、陽性読み取り値は、３つの複製物のうち少なくとも２つであり、そして除外生物に関しては、３つの複製物のうち陽性は１以下でなければならない。これらの基準がいかなる生物に関しても満たされない場合、その種／株に関する試験を１２の複製物において反復する。試験した包含生物は、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ジェジュニ亜種ドイレイ（ｄｏｙｌｅｉ）、Ｃ．コリ、およびＣ．ラリである。試験した除外生物は、大腸菌、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、Ｅ．ブルナリス（Ｅ．  ｖｕｌｎａｒｉｓ）、Ｅ．ヘルマニ（Ｅ．  ｈｅｒｍａｎｎｉｉ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、Ｓ．エンテリディティス、エドワージエラ・ホシナエ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ  ｈｏｓｈｉｎａｅ）、Ｐ．ミラバリス（Ｐ．  ｍｉｒａｂａｌｉｓ）、シトロバクター・ブラキ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａｋｉｉ）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、アルコバクター・ブツレリ（Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ  ｂｕｔｚｌｅｒｉ）、カンピロバクター・ウプサリエンシスおよびカンピロバクター・フィタス亜種フィタスである。陽性対照は、Ｃ．ジェジュニ（ＡＴＣＣ  ３３５６０）であった。包含生物はすべて、試験した１６のＣ．ジェジュニ株のうち２つ（ＡＴＣＣ  ３５９２０および３５９２５）を除いて、１００％陽性検出を生じた。Ｃ．ジェジュニのこれらの２つの株は、３つのうち０の陽性を生じた。除外生物はいずれも、いかなる陽性結果も生じなかった。陽性対照は１００％であり、そして偽陽性はなかった。
【０１４８】
実施例８．  多様なトーチを用いたオリゴマーセットの試験。
[00119]Ｃ．ジェジュニ種ＡＴＣＣ  ３５９２５およびＡＴＣＣ  ３５９２０（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）は、上記分析試験では検出されなかった。Ｃ．ジェジュニのこれらの株に関するターゲット配列内の関心対象の領域の配列決定に基づいて、各株が、トーチ・ハイブリダイゼーション領域に対応するヌクレオチド配列中に単一の点突然変異を含有することが決定された。点突然変異の位置は、各株で異なった（配列番号８９〜９０）。
【０１４９】
[00120]感度。二次スクリーニングプロセス中、その時点の特異性および感度条件に基づいて、多数の候補トーチが、許容されうると見なされた。この追跡実験のため、代替トーチ、配列番号６７または元来のトーチ、配列番号６８を含む増幅オリゴ組み合わせを、再び、反応あたり１Ｅ５コピーのＣ．ジェジュニ、ＡＴＣＣ  ３５９２５および３５９２０に対してスクリーニングした。用いたオリゴ組み合わせは：配列番号７、３２、５０および６７；配列番号７、３２、５０および６８；配列番号７、２６、５０および６７；ならびに配列番号７、２６、５０および６８であった。Ｃ．ジェジュニ（ＡＴＣＣ  ３３５６０）を陽性対照として用い、そして溶解溶液のみを陰性対照として用いた。ターゲット捕捉のためにＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ９６装置を、そして検出のためにＰＴＩ読み取り装置を用いた。許容されうる代替増幅オリゴ組み合わせは、最近縁種をなお排除しつつ、Ｃ．ジェジュニ、ＡＴＣＣ  ３５９２０および３５９２５を検出するであろう。陽性基準を１０００ＲＦＵにセットした。
【０１５０】
[00121]対照Ｃ．ジェジュニ、ＡＴＣＣ  ３３５６０は、トーチ、配列番号６７または配列番号６８を有する増幅オリゴ組み合わせを用いて、１００％陽性率で検出された。配列番号６７アッセイは、配列番号６８アッセイよりもより低い平均ＲＦＵを示した。偽陽性はなかった。Ｃ．ジェジュニ、ＡＴＣＣ  ３５９２０の検出に関して、配列番号６７の増幅オリゴ組み合わせは１００％陽性であった。配列番号６８の組み合わせは、バックグラウンドを超えて、Ｃ．ジェジュニを検出することは不能であった。すべての増幅オリゴ組み合わせは、単一の偽陽性結果を有した。Ｃ．ジェジュニ、ＡＴＣＣ  ３５９２５の検出のため、配列番号６７および配列番号６８の増幅オリゴ組み合わせはどちらも１００％陽性であった；が、配列番号６７は、配列番号６８よりもより高い平均ＲＦＵを生じた。次いで、除外生物に対する区別に関して、配列番号６７を含む増幅オリゴ組み合わせを試験した。
【０１５１】
[00122]選択性。配列番号６７を含む増幅オリゴ組み合わせ、および第一のアッセイでは１２の除外生物を、その後、第二のアッセイでは３つの除外生物を用いて、除外種に関する２つの分析試験を行った。第二のアッセイを行って、第一のアッセイで同定された偽陽性を再試験した。第一のアッセイに関して、除外生物は反応あたり１Ｅ５コピーで提供され、そしてこれには、Ａ．ブツレリ、Ｃ．フェカリス、Ｃ．フィタス亜種フィタス、Ｃ．フィタス亜種フィタス、Ｃ．フィタス亜種ベネレアリス、Ｃ．ウプサリエンシス、Ｃ．ウプサリエンシス、大腸菌、Ｅ．フェカリス、Ｅ．フェシウム（Ｅ．  ｆａｅｃｉｕｍ）、蛍光菌およびＳ．エンテリティディスが含まれた。陽性対照は、Ｃ．ジェジュニ、ＡＴＣＣ  ３３５６０の反応あたり１Ｅ５コピーであり、そして陰性対照は溶解溶液であった。すべての反応は３つの複製物中であった。試験した除外生物に関しては、３つの反応のうち陽性は１以下でなければならない。Ｃ．ウプサリエンシス、Ｅ．フェカリスおよびＳ．エンテリティディスを除いて、すべての除外生物が１００％陰性であった；これらの各々が、３つのうち１つの偽陽性反応を有した。
【０１５２】
[00123]３つのうち１つの偽陽性は陰性反応の基準を満たすが、単一の偽陽性結果を示した各種に対して、第二のアッセイを行った。このアッセイにおいて、反応あたり１Ｅ５コピーで、除外生物を提供し、そしてこれには、Ｃ．ウプサリエンシス、Ｅ．フェカリスおよびＳ．エンテリティディスが含まれた。陽性対照は、反応あたり１Ｅ５コピーのＣ．ジェジュニ、ＡＴＣＣ  ３３５６０であり、そして陰性対照は溶解溶液であった。すべての反応は８つの複製物中であった。試験した除外生物に関して、８つの反応のうち陽性は１以下でなければならない。すべての除外生物は、８つの反応のうち７つに関して陰性であった。トーチ、配列番号６７を含む増幅オリゴ反応は、配列番号６８を用いた際に上記で見られた、Ｃ．ジェジュニ、ＡＴＣＣ  ３５９２０および３５９２５に関する感度の喪失を克服した。
【０１５３】
実施例９．  鶏肉洗浄液（ｒｉｎｓａｔｅ）試験
[00124]原型カンピロバクター属アッセイの機能性を試験するため、２０の鶏肉洗浄液を調製した。４００ｍＬの緩衝ペプトン水（ＢＰＷ）を含む大きな密封可能プラスチック袋に、羽を除いたニワトリ全身死体（およそ２〜５ポンド）を入れることによって、洗浄液を得た。袋を振り、そして手で袋の外から押すことによって、ＢＰＷをニワトリ全体に行き渡らせた。すべての反応を４つの複製物中で行った。増幅オリゴ組み合わせ、配列番号７、２６、５０および６７、ならびにターゲット捕捉オリゴ、配列番号７３を用いて、５００μＬの洗浄液をアッセイすることによって、カンピロバクター属の直接検出を行った。カンピロバクター属および内部対照増幅オリゴを以下の濃度で用いた：  ５ｐＭ  Ｔ７プロバイダー、０．５ｐＭブロッカー、５ｐＭプライマーおよび８ｐＭトーチ。比較のため、ＵＳＤＡ推奨培養法と実質的に類似の培養法を用いてもまた、洗浄液をアッセイした。カンピロバクター・ジェジュニ、ＡＴＣＣ  ３３２９１は、反応あたり１Ｅ５コピーで、陽性対照であった。溶解緩衝液を陰性対照として用いた。アッセイは、ターゲット捕捉のためにＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ９６装置を用い、プライマーをアニーリングし、そして酵素を添加するためにＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサーを用い、そして検出のためにＰＴＩ−ＦＰ−２（登録商標）ＦｌｕｏＤｉａプレート読み取り装置を用いた。ターゲット捕捉のためのインプットは５００μＬであり、ターゲット捕捉のためのアウトプットは１００μＬであり、このうち３０μＬを増幅に用いた。陽性基準を１０００ＲＦＵに設定した。カンピロバクター属の増幅は、すべての洗浄液に関して、１８．７分の平均および中央値Ｔ時間で見られた。偽陽性はまったく検出されなかった。表１３。ＵＳＤＡ培養法を用いると、これらの洗浄液のいずれにおいても、カンピロバクター属種の検出はなかった。
【０１５４】
表１３．  洗浄液平均Ｔ時間
【０１５５】
【表１３】
2012508586.tif 000026
【０１５６】
[00125]要約すると、リアルタイムＴＭＡ技術は、食物由来病原体の迅速で非常に高感度な検出に適していた。該アッセイは、望ましい種、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．コリおよびＣ．ラリに対して、５Ｅ３ターゲット核酸コピー／アッセイ（およそ１０ＣＦＵ）の感度を有しつつ、一方、１Ｅ７ターゲット核酸コピー／アッセイ（およそ１０，０００ＣＦＵ）の多様な最近縁種、および潜在的に同時混入するフロラを除外した。これらのデータは、単一の８時間作業シフト内で、カンピロバクター属に関して、食物試料をスクリーニングすることを可能にする、迅速な試験形式を示した。
【０１５７】
[00126]本明細書に言及されるかまたは引用される論文、特許、および特許出願、ならびにすべての他の文書および電子的に入手可能な情報の内容は、各個々の刊行物が具体的にそして個々に本明細書に援用されると示されるのと同じ度合いに、完全に本明細書に援用される。出願者らは、いかなるこうした論文、特許、特許出願、または他の物理的および電子的文書からのあらゆる材料および情報も、本出願に物理的に援用する権利を保持する。
【０１５８】
[00127]本明細書に例示的に記載される方法は、本明細書に具体的に開示されない、任意の単数または複数の要素、単数または複数の限定の非存在下で、適切に実施可能である。したがって、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等は、拡大して、そして限定なしに解釈されなければならない。さらに、本明細書で使用する用語および表現は、説明のために用いられており、そして限定のためではなく、そしてこうした用語および表現を使用して、示しそして記載する特徴の任意の同等物またはその一部を排除する意図はない。請求する発明の範囲内で、多様な修飾が可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい態様および場合による特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示する、そこに具現される本発明の修飾および変動が、当業者によって復元可能であり、そしてこうした修飾および変動が、本発明の範囲内であると見なされることが理解されなければならない。
【０１５９】
[00128]本発明は、本明細書において、広く、そして一般的に記載されている。一般的な開示内に属する、より狭い種および亜属グループ分けもまた、各々、方法の一部を形成する。これには、除去される材料が本明細書に具体的に列挙されているかどうかにかかわらず、属から任意の材料を除去する条件つきまたは負の制限つきでの、方法の一般的な説明が含まれる。
【０１６０】
[00129]他の態様が以下の請求項内にある。さらに、方法の特徴または側面が、マーカッシュ群に関して記載されている場合、当業者は、本発明がまた、それによって、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの亜群に関しても記載されることを認識するであろう。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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