(57)【要約】  本発明は、オルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体を有効成分として含有する表皮過増殖抑制用及び炎症性皮膚疾患改善用の皮膚外用剤組成物に関し、より詳細には、オルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体である４',６,７−トリヒドロキシイソフラボン、３',４',７−トリヒドロキシイソフラボンまたはこれらの混合物を含有することによって、Ｗｎｔ信号伝達を適宜制御するＤＫＫ３タンパク質及びＦＺＤ１タンパク質の発現を向上させて表皮の過度な増殖を抑制し、且つ表皮の過増殖による炎症性皮膚疾患を改善する表皮過増殖抑制用及び炎症性皮膚疾患改善用の皮膚外用剤組成物に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
オルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体である４',６,７−トリヒドロキシイソフラボン、３',４',７−トリヒドロキシイソフラボンまたはこれらの混合物を、有効成分として含有する表皮過増殖抑制用及び炎症性皮膚疾患改善用の皮膚外用剤組成物。
【請求項２】
上記オルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体が、組成物の全体重量に対して０．００１〜３０重量％の量で含有されることを特徴とする請求項１に記載の表皮過増殖抑制用及び炎症性皮膚疾患改善用の皮膚外用剤組成物。
【請求項３】
上記組成物が、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、アイクリーム、栄養クリーム、マッサージクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パウダー、エッセンスまたはパックの剤形を有する化粧料組成物であることを特徴とする請求項１に記載の表皮過増殖抑制用及び炎症性皮膚疾患改善用の皮膚外用剤組成物。
【請求項４】
上記組成物が、軟膏、ゲル、クリーム、パッチまたは噴霧剤の剤形を有する医薬組成物であることを特徴とする請求項１に記載の表皮過増殖抑制用及び炎症性皮膚疾患改善用の皮膚外用剤組成物。
【請求項５】
オルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体である４',６,７−トリヒドロキシイソフラボン、３',４',７−トリヒドロキシイソフラボンまたはこれらの混合物を、有効成分として含有する抗炎症治療剤。
【請求項６】
上記オルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体が、組成物の全体重量に対して０．００１〜３０重量％の量で含有されることを特徴とする請求項５に記載の抗炎症治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体を有効成分として含有する表皮過増殖抑制用及び炎症性皮膚疾患改善用の皮膚外用剤組成物に関し、より詳細には、オルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体である４’,６,７−トリヒドロキシイソフラボン、３',４',７−トリヒドロキシイソフラボンまたはこれらの混合物を含有することによって、Ｗｎｔ信号伝達（Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を適宜制御するＤＫＫ３タンパク質及びＦＺＤ１タンパク質の発現を向上させて表皮の過度な増殖を抑制し、表皮の過増殖による炎症性皮膚疾患を改善する表皮過増殖抑制用及び炎症性皮膚疾患改善用の皮膚外用剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚角質細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）は、適切な増殖と分化を通じて、皮膚保湿を維持し、皮膚障壁としての機能をする。しかし、皮膚角質細胞の増殖と分化に変異が生じれば、結局、皮膚障壁に損傷（ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）を誘発し、多様な皮膚疾患が現れるようになる。
【０００３】
例えば、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）は、不適切な皮膚角質細胞の増殖と分化によって現れる炎症性皮膚疾患であって、乾癬の原因の１つは、ベータ−カテニンというタンパク質で問題が起こった時に現れると知られている。ベータ−カテニンは、大きく２つの機能をするが、細胞と隣接細胞間の付着（ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）に寄与し、また、Ｗｎｔ信号伝達の媒介体である。Ｗｎｔリガンドは、正常な皮膚で発現され、一般的に皮膚細胞が成長と分化をする間に皮膚角質細胞の多くの世代にわたった増殖調節に利用される。しかし、Ｗｎｔリガンドが過多発現されるか、存在しない場合には、皮膚の恒常性調節に深刻な変異を起こすようになる。
【０００４】
臨床的実験において正常人及び乾癬患者から分離した皮膚細胞から、乾癬患者の場合には、Ｗｎｔ信号伝達体系の媒介体であるベータ−カテニンの発現が相当に大きく現れることが観察され、ベータ−カテニンによって調節される酵素にも影響を与えるものと観察された。したがって、不適切な皮膚分化が起きた場合に、その原因の１つとしてＷｎｔ信号伝達体系が連関していて、これを調節することによって、皮膚障壁を保護し、保湿を維持するのに寄与するものと予測することができる。Ｗｎｔ信号伝達を抑制するものと知られたＤＫＫ３（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ３）及びＦＺＤ１（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １）の発現を向上させる方法を考慮すれば、Ｗｎｔ信号伝達の機能を適宜制御する機能をするので、窮極的には、皮膚保湿を維持し、皮膚障壁を保護するものと期待される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、皮膚角質細胞の過度な増殖と分化によって現れる炎症性皮膚疾患の原因であるＷｎｔ信号伝達を適宜調節する素材を探すために研究した結果、オルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体である４',６,７−トリヒドロキシイソフラボンまたは３',４',７−トリヒドロキシイソフラボンが、Ｗｎｔ信号伝達の抑制剤であるＤＫＫ３タンパク質及びＦＺＤ１タンパク質の発現を向上させることによって、Ｗｎｔ信号伝達の調節効果に優れていることを知見し、本発明を完成した。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、Ｗｎｔ信号伝達を調節するＤＫＫ３タンパク質及びＦＺＤ１タンパク質の発現を向上させて表皮の過増殖を抑制し、且つ表皮の過増殖による炎症性皮膚疾患を改善する皮膚外用剤組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明では、オルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体である４',６,７−トリヒドロキシイソフラボン、３',４',７−トリヒドロキシイソフラボンまたはこれらの混合物を有効成分として含有する表皮過増殖抑制用及び炎症性皮膚疾患の改善用の皮膚外用剤組成物を提供する。
【０００８】
また、本発明では、オルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体である４',６,７−トリヒドロキシイソフラボン、３',４',７−トリヒドロキシイソフラボンまたはこれらの混合物を有効成分として含有する抗炎症治療剤を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明による皮膚外用剤組成物は、オルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体を有効成分として含有し、皮膚角質細胞の過増殖の原因となるＷｎｔ信号伝達を適宜に調節するＤＫＫ３タンパク質及びＦＺＤ１タンパク質の発現を向上させることによって、皮膚角質細胞の過度な増殖を抑制し、正常な角質細胞分化を誘導した。
【００１０】
また、本発明による皮膚外用剤組成物は、表皮過増殖に伴う炎症性皮膚疾患を改善及び治療する効果に優れていて、優れた皮膚改善効果を示した。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明のオルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体による角質細胞分裂の抑制能を測定した結果である。
【図２】図２は、本発明のオルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体によるＤＫＫ３の発現変化を測定した結果である。
【図３】図３は、本発明のオルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体によるＦＺＤ１の発現変化を測定した結果である。
【図４】図４は、本発明のオルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体による抗炎症効果を測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明をより詳しく説明する。
本発明は、オルソ−ジヒドロキシイソフラボン（ｏｒｔｈｏ−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ、ＯＤＩ）誘導体である４',６,７−トリヒドロキシイソフラボン（４',６,７−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ）、３',４',７−トリヒドロキシイソフラボン（３',４',７−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ）またはこれらの混合物を有効成分として含有する皮膚角質細胞の過増殖抑制用及び炎症性皮膚疾患の改善用の皮膚外用剤組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、オルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体である４',６,７−トリヒドロキシイソフラボン、３',４',７−トリヒドロキシイソフラボンまたはこれらの混合物を有効成分として含有する抗炎症治療剤を提供する。
【００１４】
本発明のオルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体は、抗酸化効果が他のイソフラボンに比べて高い。イソフラボンは、主に豆に含有された植物性化合物であって、イソフラボンをアグリコン（ａｇｌｙｃｏｎ）とする配糖体で存在し、発酵過程中に微生物の代謝によって非糖質形態に転換される。
【００１５】
本発明において有効成分として使用するオルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体は、４',６,７−トリヒドロキシイソフラボン（下記化学式１）または３',４',７−トリヒドロキシイソフラボン（下記化学式２）であり、Ｗｎｔ信号伝達の抑制剤であるＤＫＫ３（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ３）及びＦＺＤ１（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １）の発現を効果的に向上させて、皮膚角質細胞の過増殖を抑制し、正常な分化を誘導し、且つ皮膚角質細胞の過増殖に伴う炎症性皮膚疾患を改善及び治療する効果を示す。
【００１６】
【化１】
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【００１７】
【化２】
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【００１８】
本発明のオルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体である４',６,７−トリヒドロキシイソフラボン及び３',４',７−トリヒドロキシイソフラボンは、当業界によく知られた公知の方法でダイドゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）を生変換して製造することができるが、これに限定されず、通常的な任意の方法によって生産が可能である。
【００１９】
上記オルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体は、組成物全体重量に対して０．００１〜３０重量％の量で含有されることが好ましい。その含量が０．００１重量％未満なら、表皮過増殖抑制及び炎症性皮膚疾患の改善効果を得ることができず、３０重量％を超過すれば、効果の増加が大きくないため、非効率的であり、剤形安定性に問題が生じることができるからである。
【００２０】
本発明による皮膚外用剤組成物は、４',６,７−トリヒドロキシイソフラボン、３',４',７−トリヒドロキシイソフラボンまたはこれらの混合物をその有効量で含む医薬組成物の形態で製造されることができ、当業界で通常的に使用する１つ以上の無毒性で、薬剤学的に許容可能な運搬体、補助剤、希釈液または他の活性成分を含むことができる。本発明による皮膚外用剤組成物は、薬剤学的に許容可能な運搬体及び賦形剤を利用して公知の方法で製剤化されることができる。
【００２１】
具体的な例として、軟膏、ゲル、クリーム、パッチまたは噴霧剤などの外用剤などをはじめとして薬剤学的製剤に適したいずれの形態でも剤形化して使用することができ、これらの各剤形は、その剤形の製剤化に必要であり、適切な各種の基剤と添加剤を含有することができ、これら成分の種類と量は、当業者によって容易に選定されることができる。
【００２２】
また、本発明による皮膚外用剤組成物は、油性または水性媒質で溶液、懸濁液または乳化液の形態になるか、または使用する前に、無菌であり発熱物質が除去された水に溶解して使用する乾燥粉末の形態に剤形化されることができ、油中水型エマルションの形態とされることもできる。油相としては、オリーブ油のような植物性油または流動パラフィンのような鉱物性油であり、乳化剤としては、大豆レシチンなどの自然産リン脂質や、ソルビタンモノオレエートのように、ヘキシトール無水物や脂肪酸来由のエステルまたは部分エステルや、またはポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートのように、前述の部分エステルをエチレンオキシドと縮合した化合物を使用することができる。
【００２３】
本発明による皮膚外用剤組成物が化粧料に剤形化される場合、その剤形において特に限定されるわけではないが、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、アイクリーム、栄養クリーム、マッサージクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パウダー、エッセンスまたはパックなどの剤形を有することができる。
【実施例】
【００２４】
以下、製造例、実施例及び試験例により本発明をさらに具体的に説明する。これら実施例は、本発明の内容を理解するために提示されるものに過ぎず、本発明の権利範囲がこれら実施例に限定されるものではなく、当業界で通常的に周知された変形、置換及び挿入などを行うことができ、これも本発明の範囲に含まれる。
【００２５】
［製造例１］大豆抽出物の製造
大豆２ｋｇにヘキサン６Ｌを入れ、常温で３回撹拌抽出して脱脂させた後、脱脂された大豆１ｋｇに８０％メタノール４Ｌを入れて３回還流抽出し、１５℃で１日間浸漬した。次いで、濾過布を用いた濾過と遠心分離を通じて残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮した。得られた抽出物を水に懸濁した後、エーテル１Ｌで５回抽出して色素を除去し、水層を１−ブタノール５００ｍＬで３回抽出した。これにより得られた１−ブタノール層を減圧濃縮して１−ブタノール抽出物を得、これを少量のメタノールに溶解した後、大量のエチルアセテートを追加して生成された沈殿物を乾燥し、大豆抽出物３００ｇを得た。
【００２６】
［実施例１］大豆抽出物を利用した４',６,７−トリヒドロキシイソフラボンの製造
上記製造例１で収得した大豆抽出物１０ｇを１００ｍＬのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌して３０℃に冷却した後、あらかじめ培養されたアスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＫＣＣＭ１１８８５を、液体重量に対して５〜１０重量％で接種した。次いで、３７℃で７日間培養させた後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）を確認し、基質が完全に消失すれば反応を終了させた。培養液を５,０００〜１０,０００ｒｐｍで遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄し、さらに遠心分離して沈殿物を得た。その沈殿物にエタノール（２００ｍＬ）を加えて撹拌し（３回）、沈殿された塩を、濾過を通じて除去した後、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得した。上記収得された粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離し、４',６,７−トリヒドロキシイソフラボン０．２３ｇを得た。
【００２７】
［実施例２］ダイドジン（ｄａｉｄｚｉｎ）を利用した４',６,７−トリヒドロキシイソフラボンの製造
ダイドジン５ｇ（シグマ社）を１００ｍＬのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌して３０℃に冷却した後、あらかじめ培養されたアスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＫＣＣＭ１１８８５を、液体重量に対して５〜１０重量％で接種した。次いで、３７℃で７日間培養させた後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認し、基質が完全に消失すれば反応を終了させた。培養液を５,０００〜１０,０００ｒｐｍで遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄し、さらに遠心分離して沈殿物を得た。その沈殿物にエタノール（２００ｍＬ）を加えて撹拌し（３回）、沈殿された塩を、濾過を通じて除去した後、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得した。上記収得された粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離し、４',６,７−トリヒドロキシイソフラボン０．３４ｇを得た。
【００２８】
［実施例３］ダイドゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）を利用した４',６,７−トリヒドロキシイソフラボンの製造
ダイドゼイン３ｇ（シグマ社）を１００ｍＬのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌して３０℃に冷却した後、あらかじめ培養されたアスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＫＣＣＭ１１８８５を、液体重量に対して５〜１０重量％で接種した。次いで、３７℃で７日間培養させた後、反応を終了させた。培養液を５,０００〜１０,０００ｒｐｍで遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄し、さらに遠心分離して沈殿物を得た。その沈殿物にエタノール（２００ｍＬ）を加えて撹拌し（３回）、沈殿された塩を、濾過を通じて除去した後、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得した。上記収得された粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離し、４',６,７−トリヒドロキシイソフラボン０．４５ｇを得た。
【００２９】
［実施例４］大豆抽出物を利用した３',４',７−トリヒドロキシイソフラボンの製造
上記製造例１で収得した大豆抽出物１０ｇを１００ｍＬのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌して３０℃に冷却した後、あらかじめ培養された枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＫＣＣＭ１１７３２を、液体重量に対して５〜１０重量％で接種した。３０℃で７日間培養させた後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認し、基質が完全に消失すれば反応を終了させた。培養液を５,０００〜１０,０００ｒｐｍで遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄し、さらに遠心分離して沈殿物を得た。その沈殿物にエタノール（２００ｍＬ）を加えて撹拌し（３回）、沈殿された塩を、濾過を通じて除去した後、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得した。上記収得された粗生性物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離し、３',４',７−トリヒドロキシイソフラボン０．２３ｇを得た
【００３０】
［実施例５］ダイドジン（ｄａｉｄｚｉｎ）を利用した３',４',７−トリヒドロキシイソフラボンの製造
ダイドジン５ｇ（シグマ社）を１００ｍＬのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌して３０℃に冷却した後、あらかじめ培養された枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＫＣＣＭ１１７３２を、液体重量に対して５〜１０重量％で接種した。３７℃で７日間培養させた後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認し、基質が完全に消失すれば反応を終了させた。培養液を５,０００〜１０,０００ｒｐｍで遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄し、さらに遠心分離して沈殿物を得た。その沈殿物にエタノール（２００ｍＬ）を加えて撹拌し（３回）、沈殿された塩を、濾過を通じて除去した後、濾過された濾液を減圧濃縮し、粗生成物を収得した。上記収得された粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離し、３',４',７−トリヒドロキシイソフラボン０．４４ｇを得た。
【００３１】
［実施例６］ダイドゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）を利用した３',４',７−トリヒドロキシイソフラボンの製造
ダイドゼイン３ｇ（シグマ社）を１００ｍＬのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌して３０℃に冷却した後、あらかじめ培養された枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＫＣＣＭ１１７３２を、液体重量に対して５〜１０重量％で接種した。３７℃で７日間培養させた後、反応を終了させた。培養液を５,０００〜１０,０００ｒｐｍで遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄し、さらに遠心分離して沈殿物を得た。その沈殿物にエタノール（２００ｍＬ）を加えて撹拌し（３回）、沈殿された塩を濾過を、通じて除去した後、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得した。その後、上記収得された粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離し、３',４',７−トリヒドロキシイソフラボン０．４５ｇを得た。
【００３２】
［試験例１］オルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体の角質細胞分裂の抑制効果
ヒト角質形成細胞株であるＨａＣａＴ細胞に１０％牛胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｇｉｂｃｏ社１２１０−００３８）を添加し、２４孔平板培養器に７０％の密度で培養した。上記ＨａＣａＴ細胞に、４',６,７−トリヒドロキシイソフラボン及び３',４',７−トリヒドロキシイソフラボンを、それぞれ１、１０及び５０μＭの濃度で処理し、４８時間が経過後、ＢｒｄＵ分析法を行った。ＢｒｄＵ分析法を行う１２時間前にＢｒｄＵ標識を行った。ＢｒｄＵ分析は、ＢｒｄＵ比色分析ＥＬＩＳＡキット（ＢｒｄＵ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ社）を利用し、Ｒｏｃｈｅ社が提供する実験方法に従った。まず、培養液をＢｒｄＵ溶液で１２時間処理した後、培地を除去し、細胞を固定させ、ペルオキシダーゼが結合されたＢｒｄＵ抗体を添加した後、基質溶液で処理して発色反応を誘導し、ＥＬＩＳＡリーダーで発色程度を測定した。陽性対照群としては、皮膚角質分化に使用される公知の物質であるカルシウム及び細胞分裂を抑制し且つ分化を誘導すると報告されたトログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ；ＴＧＺ）を使用した。
【００３３】
図１から分かるように、本発明の４',６,７−トリヒドロキシイソフラボン及び３',４',７−トリヒドロキシイソフラボンは、イソフラボンの一種であるダイドゼインと比べて有意に高い皮膚角質細胞の分裂抑制効果を示し、５０μＭの濃度で処理する場合には、陽性対照群であるカルシウム及びトログリタゾンと類似しているか、さらに優れた効果を示した。また、本発明の４',６,７−トリヒドロキシイソフラボン及び３',４',７−トリヒドロキシイソフラボンは、濃度依存的に皮膚角質細胞の分裂を抑制する効果を示した。
【００３４】
［試験例２］オルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体のＤＫＫ３及びＦＺＤ１の発現促進効果
ヒト新生児角質皮膚細胞（ｈｕｍａｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌｓ）をウェルスキン（Ｗｅｌｓｋｉｎ  Ｃｏ、ソウル、韓国）から購入し、２５ｃｍ2  Ｔ−フラスコに継代培養し、ＣＯ2培養器（ＣＯ2 ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で３７℃、５％ＣＯ2条件の下で培養を行った。通常、実験は、細胞の２〜３世代継代培養後に行われる。細胞培養液は、ロンザ社（Ｌｏｎｚａ、Ｉｎｃ．  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）の方法によって、５００ｍＬのＫＢＭ−２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  ＣＣ−３１０３）培地に、ＫＧＭ−２  Ｂｕｌｌｅｔ  ｋｉｔ（牛の脳下垂体抽出物（２ｍＬ）、ヒト上皮細胞成長因子（０．５ｍＬ）、インスリン（０．５ｍＬ）、ヒドロコルチゾン（０．５ｍＬ）、トランスフェリン（０．５ｍＬ）、エピネフリン（０．５ｍＬ）、ゲンタマイシンスルフェート＋アムホテリシン−Ｂ（ＧＡ−１０００、０．５ｍＬ））を入れて使用した。細胞継代培養をしてから２日が経過し、５０％程度の細胞密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）を示す場合、血清を欠乏させた（ｓｅｒｕｍ  ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）。２４時間後、陰性対照群、トウキ抽出物（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｇｉｇａｓ  Ｎａｋａｉ  ｅｘｔｒａｃｔ、陽性対照群）、ダイドゼイン及び上記実施例１〜６をそれぞれ１０μＭの濃度で用いて、細胞を２４時間処理した。陰性対照群としては、非処理群を使用し、陽性対照群であるトウキ抽出物は、乾燥したトウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｇｉｇａｓ  Ｎａｋａｉ）５ｋｇを、メタノール５０Ｌに２４時間湧出させた後、残渣を分離濾過し、減圧濃縮乾燥して使用した。
【００３５】
次いで、トリゾル試薬（Ｔｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して細胞内のＲＮＡを分離した。分離したＲＮＡをキアゼン社のＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）できれいに精製した後、アジラント社のバイオアナライザ２１００機器（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してＲＮＡの質（ｑｕａｌｉｔｙ）を確認した。インビトロゼン社の逆転写キット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ）ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を利用して上記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これを実時間逆転写重合酵素連鎖反応（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）を通じて定量的に分析した。皮膚角質幹細胞で遺伝子の発現パターン変化を、アプライドバイオシステム社のＴａｑＭａｎ遺伝子発現システム（ＴａｑＭａｎR  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ３（ＤＫＫ３）−ＨＳ００２４７４２６＿ｍ１、及びＦｒｉｚｚｌｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １（ＦＺＤ１）−ＨＳ００２６８９４３＿ｓ１（ＴａｇＭａｎ  ｐｒｉｍｅｒ  ｃａｔａｌｏｇ  ｎａｍｅ）を利用して分析し、それによりＤＫＫ３及びＦＺＤ１の発現量を確認し、その結果を下記図２及び図３に示した。
【００３６】
図２及び図３から分かるように、本発明のオルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体で処理した場合には、陰性対照群及びジヒドロキシイソフラボンであるダイドゼインの場合と比べて、ＤＫＫ３及びＦＺＤ１の発現がさらに増加した。また、イソフラボンの一種であるダイドゼインで処理した群は、本発明によるオルソ−ジヒドロキシイソフラボンで処理した群に比べてＤＫＫ３及びＦＺＤ１の発現水準が顕著に低かった。したがって、本発明の４',６,７−トリヒドロキシイソフラボンまたは３',４',７−トリヒドロキシイソフラボンは、ＤＫＫ３及びＦＺＤ１の発現を効果的に促進させた。
【００３７】
［試験例３］オルソ−ジヒドロキシイソフラボン誘導体の抗炎症効果
ヒト角質形成細胞であるＨａＣａＴ細胞は、韓国細胞株銀行（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋ、ソウル、韓国）から分譲されて使用した。ＨａＣａＴ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを含むＤＭＥＭ培地に注入し、３７℃、５％ＣＯ2供給条件を備えた動物細胞培養器で培養した。孔（Ｗｅｌｌ）当たり１．５×１０6の濃度で用意したＨａＣａＴ細胞を、ＦＢＳが含まれていない培地で３時間適応させた。
【００３８】
４',６,７−トリヒドロキシイソフラボン、３',４',７−トリヒドロキシイソフラボン、ダイドゼイン及びＴＧＺをそれぞれ１０μＭの濃度で用いて、細胞の前処理を２時間行い、１μｇ／ｍＬ濃度の脂質多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）を添加し、８時間追加培養した。全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌＴＭ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して抽出し、−８０℃で保管した。
【００３９】
全ＲＮＡ１μｇを、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１ＭのＤＴＴ、１０ｍＭのｄＮＴＰ及び４０ユニット／μＬのＲＮａｓｅ阻害剤が含有された逆転写反応緩衝液２５μＬに入れた。０．５μｇ／μＬのオリゴ（ｄＴ）１６のプライマーと２００ユニットスーパースクリプトII（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  II、ギブコＢＲＬ（ＧｉｂｏＢＲＬ））の逆転写重合酵素とを添加し、４２℃で１時間反応させた後、逆転写反応溶液２．５μＬを、０．０４Ｕのアムプリタック（ＡｍｐｌｉＴａｑ）ＤＮＡ重合酵素（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｓｈｅｌｔｏｎ、ＣＴ）、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．３）、０．２５ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミン、３ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２５ｍＭのｄＮＴＰｓ、及びＳＹＢＲグリーンＩの１／５０,０００希釈液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）が含有されたＰＣＲ反応緩衝液５０Ｌに混合し、１０μＭのプライマーを添加し、ＰＣＲ反応をＰＣＲ増幅にかけた。ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング及び７２℃で１分間の伸長反応を３０サイクルすることから成る。
【００４０】
相対的なｍＲＮＡレベルは、アイサイクラ（ＩＣｙｃｌｅｒ）ソフトウェアを利用してＳＹＢＲグリーンＩの蛍光変化を測定することによって分析した。内部標準物質としてＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を使用して、ＴＮＦ−アルファ（ＴＮＦ−ａｌｐｈａ）遺伝子の定量的発現水準を補正し、図４に示した。
【００４１】
ＴＮＦ−アルファは、傷治療過程中の炎症期において重要な作用をする炎症関連因子であって、多数の実験論文でも炎症抑制の効能を確認するのに頻繁に使用されていて、脂質多糖類（ＬＰＳ）で誘導された炎症反応で多様に発現する遺伝子である。
【００４２】
図４の結果を見れば、本発明による４',６,７−トリヒドロキシイソフラボンまたは３',４',７−トリヒドロキシイソフラボンで処理した群では、ＴＮＦ−アルファ遺伝子の発現が強く抑制された。また、イソフラボンの一種であるダイドゼインを処理した群でも、炎症関連遺伝子の発現が多少抑制されたが、本発明によるオルソ−ジヒドロキシイソフラボンを処理した群に比べてその効果が顕著に低かった。
【００４３】
以上説明したように、本発明において有効成分として使用する４',６,７−トリヒドロキシイソフラボンまたは３',４',７−トリヒドロキシイソフラボンは、角質細胞分裂を効果的に抑制し、Ｗｎｔ信号伝達を適宜制御するＤＫＫ３タンパク質及びＦＺＤタンパク質の発現を向上させることによって、表皮の過増殖を抑制し、表皮の過増殖による炎症性疾患を改善する効能を有した。これにより、本発明は、４',６,７−トリヒドロキシイソフラボン、３',４',７−トリヒドロキシイソフラボンまたはそれらの混合物を有効成分として含有する表皮過増殖抑制剤または炎症性皮膚疾患改善剤を提供する。
【００４４】
［剤形例１］栄養化粧水
下記表１に記載した組成によって通常的な方法で栄養化粧水を製造した。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
［剤形例２］栄養クリーム
下記表２に記載した組成によって通常的な方法で栄養クリームを製造した。
【００４７】
【表２】
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【００４８】
［剤形例３］マッサージクリーム
下記表３に記載した組成によって通常的な方法でマッサージクリームを製造した。
【００４９】
【表３】
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【００５０】
［剤形例４］パック
下記表４に記載した組成によって通常的な方法でパックを製造した。
【００５１】
【表４】
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【００５２】
［剤形例５］軟膏
下記表５に記載した組成によって通常的な方法で軟膏を製造した。
【００５３】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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