(57)【要約】グリセロールまたは他の還元炭素源は、ある微好気性条件下で、化学製品の微生物生成のための供給原料として使用され得る。例えば、このような生成物は、電子受容体が、添加されるのと同様に迅速に、反応器中で消費される、微好気性または条件下で、生じ得る。このような反応において、反応生成物は、炭素源と少なくとも同程度に還元される。さらに、このような反応中、少なくともいくつかの炭素源を用いて、細胞集団を生じる。加えて、修飾されたゲノムを有する微生物が、本明細書の方法を実行するために提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物内で還元炭素源から酸化還元中性または酸化した化学製品を製造するための方法であって、
電子受容体は、それらが提供されるのと少なくとも同様に迅速に消費される速度で、前記微生物に電子受容体を提供することと、
前記酸化還元中性または酸化した生成物および少なくともいくつかの細胞集団が、前記還元炭素源から生じ、前記還元炭素源が、前記細胞集団よりもさらに還元されるように、前記微生物の供給原料として前記還元炭素源を提供することと、を含み、
前記還元炭素源の前記還元化学製品への変換のための還元バランスの度合いは、ゼロ以上であり、細胞集団の炭素源への変換のための還元バランスの度合いは、ゼロを超える、方法。
【請求項２】
前記還元炭素源はグリセロールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酸化還元中性または酸化した化学製品は、アルコール、有機酸、アミノ酸、またはラクトンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酸化還元中性または酸化した化学製品は、コハク酸、プロピオン酸、エタノール、乳酸、またはアラニンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記電子受容体は、大気、酸素、硝酸、亜硝酸、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記電子受容体は、１時間当たり細胞集団１グラムにつき酸素１ミリグラムから１時間当たり細胞集団１グラムにつき酸素１５ミリグラムの範囲内の速度で、前記微生物に提供される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物は、エシェリキア属、バシラス属、パエニバチルス属、またはサッカロミセス属に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記化学製品は、コハク酸を含み、前記微生物は、
ａ）アセチル−ＣｏＡのエタノールへの変換に関与する遺伝子の破壊、アセチル−ＣｏＡのアセチル−リン酸への変換に関与する遺伝子の破壊、ピルビン酸の酢酸への変換に関与する遺伝子の破壊、ピルビン酸の乳酸への変換に関与する遺伝子の破壊、ホスホエノールピルビン酸のオキサロ酢酸への変換に関与する遺伝子の破壊、ジヒドロキシアセトンのジヒドロキシアセトン−リン酸への変換に関与する遺伝子の破壊、ピルビン酸のアセチル−ＣｏＡへの変換に関与する遺伝子の破壊、ホスホエノールピルビン酸のピルビン酸への変換に関与する遺伝子の破壊、グリセロールのジヒドロキシアセトンへの変換に関与する遺伝子の破壊、グリセロール−３−リン酸のジヒドロキシアセトン−リン酸への変換に関与する遺伝子の破壊、グリセロールのグリセロール−３−リン酸への変換に関与する遺伝子の破壊、ジヒドロキシアセトン−リン酸のメチルグリオキサルへの変換に関与する遺伝子の破壊、および
ｂ）ジヒドロキシアセトンのジヒドロキシアセトン−リン酸への変換に関与する酵素を発現する外因性遺伝子（前記酵素は、補因子としてＡＴＰを使用し、副産物としてＡＤＰを生成する）、グリセロール−３−リン酸のジヒドロキシアセトン−リン酸への変換に関与する酵素を発現する外因性遺伝子（前記酵素は、フマル酸へ還元当量を渡す）、フマル酸のコハク酸への変換に関与する酵素を発現する外因性遺伝子（前記酵素は、グリセロール−３−リン酸の酸化からの還元当量を受容する）、ピルビン酸およびＣＯ２のオキサロ酢酸への変換に関与する酵素を発現する外因性遺伝子（前記酵素は、補因子としてＡＴＰを使用し、副産物としてＡＤＰを生成する）、ホスホエノールピルビン酸およびＣＯ２のオキサロ酢酸への変換に関与する酵素を発現する外因性遺伝子、ホスホエノールピルビン酸およびＣＯ２のオキサロ酢酸への変換に関与する酵素を発現する外因性遺伝子（前記酵素は、補因子としてＡＤＰを使用し、副産物としてＡＴＰを生成する）、または、ピルビン酸およびＣＯ２のリンゴ酸への変換に関与する酵素を発現する外因性遺伝子（前記酵素は、補因子としてＮＡＤＨを使用する）のうちの１つまたはそれ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記化学製品は、プロピオン酸を含み、前記微生物は、
ａ）アセチル−ＣｏＡのエタノールへの変換に関与する遺伝子の破壊、アセチル−ＣｏＡのアセチル−リン酸への変換に関与する遺伝子の破壊、ピルビン酸の酢酸への変換に関与する遺伝子の破壊、ピルビン酸の乳酸への変換に関与する遺伝子の破壊、ホスホエノールピルビン酸のオキサロ酢酸への変換に関与する遺伝子の破壊、ジヒドロキシアセトンのジヒドロキシアセトン−リン酸への変換に関与する遺伝子の破壊、ピルビン酸のアセチル−ＣｏＡへの変換に関与する遺伝子の破壊、ホスホエノールピルビン酸のピルビン酸への変換に関与する遺伝子の破壊、グリセロールのジヒドロキシアセトンへの変換に関与する遺伝子の破壊、グリセロール−３−リン酸のジヒドロキシアセトン−リン酸への変換に関与する遺伝子の破壊、グリセロールのグリセロール−３−リン酸への変換に関与する遺伝子の破壊、ジヒドロキシアセトン−リン酸のメチルグリオキサルへの変換に関与する遺伝子の破壊、および
ｂ）ジヒドロキシアセトンのジヒドロキシアセトン−リン酸への変換に関与する酵素を発現する外因性遺伝子（前記酵素は、補因子としてＡＴＰを使用し、副産物としてＡＤＰを生成する）、グリセロール−３−リン酸のジヒドロキシアセトン−リン酸への変換に関与する酵素を発現する外因性遺伝子（前記酵素は、フマル酸へ還元当量を渡す）、フマル酸のコハク酸への変換に関与する酵素を発現する外因性遺伝子（前記酵素は、グリセロール−３−リン酸の酸化からの還元当量を受容する）、ピルビン酸およびＣＯ２のオキサロ酢酸への変換に関与する酵素を発現する外因性遺伝子（前記酵素は、補因子としてＡＴＰを使用し、副産物としてＡＤＰを生成する）、ホスホエノールピルビン酸およびＣＯ２のオキサロ酢酸への変換に関与する酵素を発現する外因性遺伝子、ホスホエノールピルビン酸およびＣＯ２のオキサロ酢酸への変換に関与する酵素を発現する外因性遺伝子（前記酵素は、補因子としてＡＤＰを使用し、副産物としてＡＴＰを生成する）、または、ピルビン酸およびＣＯ２のリンゴ酸への変換に関与する酵素を発現する外因性遺伝子（前記酵素は、補因子としてＮＡＤＨを使用する）、スクシニル−ＣｏＡをメチルマロニル−ＣｏＡに、メチルマロニル−ＣｏＡをプロピオニル−ＣｏＡおよびＣＯ２に、ならびにプロピオニル−ＣｏＡおよびコハク酸をプロピオン酸およびスクシニル−ＣｏＡに変換する酵素をコードする、外因性遺伝子もしくは内在性遺伝子の過剰発現のうちの１つまたはそれ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記化学製品は、エタノールを含み、前記微生物は、
ａ）アセチル−ＣｏＡのアセチル−リン酸への変換に関与する遺伝子の破壊、ピルビン酸の酢酸への変換に関与する遺伝子の破壊、フマル酸のコハク酸への変換に関与する遺伝子の破壊、ジヒドロキシアセトンのジヒドロキシアセトン−リン酸への変換に関与する遺伝子の破壊、グリセロールのジヒドロキシアセトンへの変換に関与する遺伝子の破壊、グリセロール−３−リン酸のジヒドロキシアセトン−リン酸への変換に関与する遺伝子の破壊、グリセロールのグリセロール−３−リン酸への変換に関与する遺伝子の破壊、ギ酸のＣＯ２および水素への変換に関与する遺伝子の破壊、ピルビン酸の乳酸への変換に関与する遺伝子の破壊、ジヒドロキシアセトン−リン酸のメチルグリオキサルへの変換に関与する遺伝子の破壊、および
ｂ）グリセロールのジヒドロキシアセトンへの変換に関与する外因性遺伝子、ジヒドロキシアセトンのジヒドロキシアセトン−リン酸への変換に関与する外因性遺伝子もしくは内在性遺伝子の過剰発現、グリセロールのグリセロール−３−Ｐへの変換に関与する外因性遺伝子もしくは内在性遺伝子の過剰発現、またはグリセロール−３−Ｐのジヒドロキシアセトン−リン酸への変換に関与する外因性遺伝子もしくは内在性遺伝子の過剰発現、ピルビン酸のアセトアルデヒドおよびＣＯ２への変換に関与する外因性遺伝子、ピルビン酸のアセチル−ＣｏＡ、ＣＯ２、およびＮＡＤＨへの変換に関与する外因性遺伝子もしくは内在性遺伝子の過剰発現、ピルビン酸のアセチル−ＣｏＡおよびギ酸への変換に関与する外因性遺伝子もしくは内在性遺伝子の過剰発現、ギ酸のＣＯ２およびＮＡＤＨへの変換に関与する外因性遺伝子もしくは内在性遺伝子の過剰発現のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記化学製品は、乳酸を含み、前記微生物は、
ａ）アセチル−ＣｏＡのエタノールへの変換に関与する遺伝子の破壊、アセチル−ＣｏＡのアセチル−リン酸への変換に関与する遺伝子の破壊、ピルビン酸の酢酸への変換に関与する遺伝子の破壊、フマル酸のコハク酸への変換に関与する遺伝子の破壊、ピルビン酸のアセチル−ＣｏＡへの変換に関与する遺伝子の破壊、ジヒドロキシアセトン−リン酸のメチルグリオキサルへの変換に関与する遺伝子の破壊、ピルビン酸のＤ−乳酸への変換に関与する遺伝子の破壊、および
ｂ）グリセロールのジヒドロキシアセトンへの変換に関与する外因性遺伝子もしくは内在性遺伝子の過剰発現、ジヒドロキシアセトンのジヒドロキシアセトン−リン酸への変換に関与する外因性遺伝子もしくは内在性遺伝子の過剰発現、グリセロールのグリセロール−３−Ｐへの変換に関与する外因性遺伝子もしくは内在性遺伝子の過剰発現、グリセロール−３−Ｐのジヒドロキシアセトン−リン酸への変換に関与する外因性遺伝子もしくは内在性遺伝子の過剰発現、ピルビン酸のＬ−乳酸もしくはＤ−乳酸への変換に関与する外因性遺伝子もしくは内在性遺伝子の過剰発現のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記化学製品は、乳酸を含み、前記微生物は、
ａ）アセチル−ＣｏＡのエタノールへの変換に関与する遺伝子の破壊、アセチル−ＣｏＡのアセチル−リン酸への変換に関与する遺伝子の破壊、ピルビン酸の酢酸への変換に関与する遺伝子の破壊、フマル酸のコハク酸への変換に関与する遺伝子の破壊、ピルビン酸のアセチル−ＣｏＡへの変換に関与する遺伝子の破壊、ジヒドロキシアセトン−リン酸のメチルグリオキサルへの変換に関与する遺伝子の破壊、ピルビン酸のＤ−乳酸への変換に関与する遺伝子の破壊、および
ｂ）グリセロールのジヒドロキシアセトンへの変換に関与する外因性遺伝子もしくは内在性遺伝子の過剰発現、ジヒドロキシアセトンのジヒドロキシアセトン−リン酸への変換に関与する外因性遺伝子もしくは内在性遺伝子の過剰発現、グリセロールのグリセロール−３−Ｐへの変換に関与する外因性遺伝子もしくは内在性遺伝子の過剰発現、グリセロール−３−Ｐのジヒドロキシアセトン−リン酸への変換に関与する外因性遺伝子もしくは内在性遺伝子の過剰発現、ピルビン酸のアラニンへの変換に関与する外因性遺伝子もしくは内在性遺伝子の過剰発現のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ａｄｈＥ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｐｏｘＢ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｄｈαＫ遺伝子、
外因性シトロバクターフロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）ｄｈａＫＬ遺伝子、および
外因性アクチノバチルスサクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）ｐｃｋＡ遺伝子のうちの１つまたはそれ以上の破壊を含む、大腸菌株。
【請求項１４】
過剰発現されるｇｌｄＡ遺伝子または過剰発現されるｄｈａＫＬＭオペロン、
ｆｒｄＡ、ｆｒｄＢ、ｆｒｄＣ、またはｆｒｄＤ遺伝子のうちの少なくとも１つの破壊、および
ｐｔａ遺伝子の破壊またはｐｏｘＢ遺伝子の破壊を含む、大腸菌。
【請求項１５】
過剰発現されるｇｌｄＡ遺伝子または過剰発現されるｄｈａＫＬＭオペロン、および
ａｄｈＥ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｐｏｘＢ遺伝子；ｆｒｄＡ遺伝子、ｆｒｄＢ遺伝子、ｆｒｄＣ遺伝子、またはｆｒｄＤ遺伝子のうちの１つまたはそれ以上の破壊を含む、大腸菌。
【請求項１６】
代謝産物を生成するための細菌を培養する方法であって、
ａ．代謝産物を生成することができる細菌を用いて、供給原料としてグリセロールを含む培養培地を接種するステップと、
ｂ．前記グリセロールを代謝産物に変換するために前記反応器中で、＜２０ｍｇ  Ｏ２／Ｌ／時の微好気性であるが、好気性あるいは嫌気性でない条件下で、前記細菌を育てるステップであって、グリセロールの代謝産物への変換は、それが生成するよりもさらに還元当量を消費しない、ステップと、を含む、方法。
【請求項１７】
前記細菌は、Δｐｔａ、ΔｆｒｄＡ、ならびに過剰発現されるｇｌｄＡおよびｄｈａＫＬＭを含む大腸菌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記代謝産物は、エタノール、乳酸、コハク酸、プロピオン酸、アラニン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記代謝産物は、エタノール、乳酸、プロピオン酸、コハク酸、プロピオン酸、アラニン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００８年１０月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／１０９０１８号に対し優先権を主張し、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府によって資金供給された研究に関する記述
本発明は、国立科学財団によって与えられた認可番号ＣＢＥＴ−０６４５１８８の下、および米国農務省によって与えられた認可番号２００５−３５５０４−１６６９８の下での米国政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
近年、バイオディーゼルおよびバイオエタノール等のバイオ燃料の生成および使用に著しい増加があり、一般的には、植物油または動物性脂肪およびアルコールを用いるエステル交換によって生成されている。この反応の副産物は、グリセロールであり、現今、バイオ燃料工場で生成された余剰の廃棄グリセロールがある。
【０００４】
グリセロールは、処理するのが困難な粘稠液であり、概して、焼却または化学処理によって処分される。しかしながら、このような戦略は、バイオディーゼル燃料を用いる積極的な環境影響を否定する。例えば、グリセロールの焼却は、大気中に汚染物質を放出し得る。グリセロールを処分するよりはむしろ、グリセロールを別の化学的に有用な生成物に処理することがより良好であろう。
【０００５】
グリセロールは、生物学的変換である、微生物が、グリセロールをエタノールまたは乳酸等の特定の化学製品に酵素的に変換する処理において原料として使用することができる。グリセロールのエタノールまたは他の生成物への変換は、燃料または他の処理のための原料として価値があるため、有益である。
【０００６】
嫌気性発酵および好気性呼吸は、化学工業製品として使用され、グリセロールベースの培養用にこれまで適用されている２つの方法である。酸素富化呼吸は、非常に有効な細胞増殖（増殖率および収率）を提供し、二酸化炭素および細胞集団へ高率の炭素源を変換する（下表を参照）。一方、嫌気性発酵は、細胞増殖が不良であるが、高収率でいくつかの発酵生成物（例えば、乳酸、ギ酸、エタノール、プロピオン酸、コハク酸等）の合成をもたらす。
【０００７】
【数１】
2012506716.tif 000002
【０００８】
しかしながら、酸素富化工程によって化学物質を生成することは、２つの理由で嫌気性方法を用いるよりもさらに費用がかかる。まず、好気性発酵槽は、単位当たりコスト高であり、規模の利益の減少に伴って、より小規模な発酵槽が必要となるため、構築するにはさらに費用を要する。第２に、好気性発酵槽は、酸素の難溶解性により、それらの嫌気性対照物を動作するよりもさらに費用がかかり、これは、同様に、細胞への酸素の適切な供給を確実にするために高エネルギー投入を必要とする。これは、汎用化学物質の生成において、特に関連があり、発酵にかかる費用は、総製造費の５０〜９０％を示し得る。
【０００９】
したがって、嫌気性方法は、通常、可能であれば好ましく、好気的に細胞を大数に増殖することは典型的であり、次いで、所望の分子の生成のために嫌気性培養にそれらの細胞を切り替える。近年、別の嫌気性方法は、嫌気性条件下で、エタノールおよび他の化学物質にグリセロールを生物学的に発酵するように開発された。この方法は、同時係属の特許文献１に記載されており、参照することによって、全ての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。グリセロールの嫌気性発酵の利点は、所望の最終生成物の収率の増加であるが、不利点は、そのシステムにおいて酸素の欠如と関連する細菌増殖の遅さである。したがって、当技術分野において再度必要とされることは、高収率を得るために原料としてグリセロールを用いて、細菌を培養する、より良好なシステムである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００７／１１５２２８号パンフレット
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
低いが、測定可能な酸素を用いて、嫌気性培養の収率を向上するが、「微好気性」と称される、酸化還元バランスを維持するのに十分な、好気性発酵よりも費用がかからない、微好気性条件下で、細菌を増殖する方法を本明細書に提供する。供給原料としてグリセロールを用いて、最終的に、化学量論的に確定された経路において、基質の生成物への変換のための酸化還元バランスが、ゼロ以上であり、基質の一部を用いて、細胞集団を生じるように、低酸素条件下であるが、少量の酸素、または硝酸もしくは亜硝酸等の他の電子受容体を伴って、細菌を増殖する。
【００１２】
「微好気性」とは、１〜２０ｍｇ  Ｏ２／Ｌ／時またはその同等物を意味する。好ましくは、２〜１５  Ｏ２／Ｌ／時、さらに好ましくは、３〜１０または５ｍｇ  Ｏ２／Ｌ／時を使用する。
【００１３】
吸気流量の変化または吸気の組成に加えて、撹拌速度を低下させる（したがって、大量の培養の酸素化を低下させる）ことによって、または細胞密度（故に、より高い酸素必要量）を増加させるためにさらに供給原料を添加することによって、あるいはその組み合わせによって、微好気性条件を生成することもできる。
【００１４】
「欠失」（「Δ」）または「破壊」とは、適切な対照株の活性の１０％のみを保持するように、遺伝子またはタンパク質を変化させることを意味する。好ましくは、検出可能な活性は、保持しない。遺伝子は、不活性なタンパク質生成物を産出するために、部分的または完全に欠失する、または終止コドンを中断する、あるいは突然変異し得る。タンパク質はまた、阻害剤を用いて、または発現つまり翻訳等の抑制によって不活性化され得る。
【００１５】
「過剰発現」とは、適切な対照株と比較した際、少なくとも１５０％の活性をもたらすように、遺伝子またはタンパク質を変化させることを意味する。好ましくは、２、５、または１０倍の活性の増加を得る。過剰発現は、さらなる活性形態または阻害に耐性を示す形態を得るためにタンパク質を突然変異させることによって、阻害剤を除去することによって、または活性剤等を添加するによって達成することができる。過剰発現はまた、抑制剤を除去する、細胞に遺伝子の複数コピーを添加する、または内在性遺伝子等を上方調節することによって達成することもできる。
【００１６】
製品を生成するための条件を提供することを含む、微生物における化学製品を生成するための方法を提供し、化学量論的に確定された経路における、基質の生成物への変換のための還元バランスの度合いは、ゼロ以上であり、基質の細胞集団への変換のための還元バランスの度合いは、ゼロを超え、基質の一部分を用いて、細胞集団を生じる。加えて、基質の細胞集団への変換の還元バランスの度合いは、ゼロを超える。
【００１７】
このように生成された化学製品は、乳酸、エタノール、およびコハク酸であり得るが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本技術に従って、コハク酸、エタノール、乳酸、および酢酸を生成するためのグルコース、キシロース、またはグリセロールの代謝によって産生される還元当量の生成物を例示する。
【図２】グリセロール、グリセロールから生成された化学製品、および細胞集団の間の関係、ならびに本技術に従う還元当量の純生成物を例示する。
【図３】本技術に従って、グリセロールからコハク酸を生成するための経路を例示する。
【図４】本技術に従って、グリセロールからエタノールを生成するための経路を例示する。
【図５】本技術に従って、グリセロールから乳酸を生成するための経路を例示する。
【図６Ａ】微好気性条件および嫌気性条件下で、野生型の細菌株におけるグリセロールの発酵を比較するグラフである。
【図６Ｂ】微好気性条件下で、野生型の細菌株における溶解酸素、ＯＴＲ（酸素移動速度の容量）、および細胞増殖（ＯＤ５５０）の特性プロファイルを示すグラフである。
【図７】微好気性条件下で、野生型の細菌株におけるグリセロール（黒い棒）、グルコース（白抜きの棒）、およびキシロース（灰色の棒）の発酵の生成物およびバイオマスの収率を比較する棒グラフである。データはまた、「酸素収率」も示し、特異的な基質の代謝において消費された酸素の量を示す。
【図８Ａ】エタノールおよびギ酸の副産物用に改変された、株ＳＹ０４［ｐＺＳＫＬＭｇｌｄＡ］における、微好気性条件下（即ち、Δｐｔａ、ΔｆｒｄＡ、ΔｆｄｈＦ、ｇｌｄＡ＋、ｄｈａＫＬＭ＋）で、グリセロールからのエタノール、ギ酸、および有機酸の生成を比較するグラフである。
【図８Ｂ】エタノールおよび水素の副産物用に改変された、変異株ＥＨ０５（ｐＺＳＫＬＭｇｌｄＡ）(即ち、Δｐｔａ、ΔｆｒｄＡ、ΔｌｄｈＡ、ｇｌｄＡ＋、ｄｈａＫＬＭ＋）における、微好気性条件下で、グリセロールからのエタノール、ギ酸、およびコハク酸の生成を比較するグラフである。
【図９Ａ】野生型ＭＧ１６５５および微好気性条件下でＤ−乳酸の生成用に改変された、株ＬＡ０１（ｐＺＳｇｌｐＫｇｌｐＤ）（即ち、ΔｐｆｌＢ、ΔｆｒｄＡ、ｇｌｐＫ＋、ｇｌｐＤ＋）における、グリセロールの発酵の生成収率を比較する棒グラフである。
【図９Ｂ】野生型ＭＧ１６５５および微好気性条件下でＬ−乳酸の生成用に改変された、株ＬＡ２０（ｐＺＳｇｌｐＫｇｌｐＤ）（即ち、ΔｆｒｄＡ  Δｐｔａ  ΔａｄｈＥ  ΔｍｇｓＡ  ΔｌｄｈｚＡ（ｌｄｈｂｏｖｉｓ）、ｇｌｐＫ＋、ｇｌｐＤ＋）における、グリセロールの発酵の生成物の濃度を比較する棒グラフである。
【図９Ｃ】野生型ＭＧ１６５５および微好気性条件下でコハク酸の生成用に改変された、株ＳＡ２４（ｐＺＳｐｙｃ）（即ち、ΔａｄｈＥ  Δｐｔａ  ΔｐｏｘＢ  Δｐｐｃ、ｐｙｃ＋）における、グリセロールの発酵の生成物の濃度を比較する棒グラフである。
【図１０】本技術に従って、例示的な変異誘発の微生物における、グリセロールからコハク酸の生成用に改変された、経路を例示する。
【図１１】本技術に従って、例示的な変異誘発の微生物における、グリセロールからエタノールの生成用に改変された、経路を例示する。
【図１２】本技術に従って、例示的な変異誘発の微生物における、グリセロールから乳酸の生成用に改変された、経路を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ある炭素源からの微生物細胞集団の合成は、有用な化学製品を生成するための適切な条件下で、利用され得る。グリセロール等のバイオマスよりもさらに還元される炭素源から細胞集団の微生物合成は、還元当量の純産生を生じる代謝工程である。実質的には、電子受容体が使用できない反応条件下で（例えば、微呼吸または微好気性条件下で）、供給原料の一部の還元生成物への変換は、反応物が酸化還元バランスを維持することを可能にする。還元生成物へのこの変換の活性は、炭素源からの細胞集団の合成において生じる過剰還元当量を消費することによって得られる酸化還元バランスを促進する。多くの例において、酸化還元バランスシステムは、微生物の増殖の増加を可能にし、同様に、反応物が所望の化学製品の増加量の生成を可能にする。
【００２０】
本技術は、炭素源の細胞バイオマスへの取り込みによって課せられた酸化還元拘束を解除し得、代謝工程は、炭素源が、バイオマスよりもさらに還元される場合、還元当量の産生をもたらす。例えば、微好気性条件下で利用可能な低レベルの酸素は、過剰の還元当量のシンクとしての機能を果たし得、ひいては、酸化還元バランスを改善し、さらに大きな画分のグリセロールを細胞集団に取り込み、さらなるＡＴＰを産生する。本文脈において、「バイオマス」または「細胞集団」という用語は、既定の細胞培養、即ち、培地中で増殖する、つまり、活発に増殖している、あらゆる生物または生細胞の量に関する。一般に、細胞培養の細胞集団の収率は、培養培地の１リットル当たりで得られた細胞集団のグラムで測定され得る。
【００２１】
本技術は、どの好適な生成物の生成にも有用であり得ることが想定され、炭素源の化学製品への変換のための還元バランスの度合いが、ゼロ以上である、即ち、グリセロールの化学製品への変換は、それが生成するほど還元当量を消費しない。このような生成物は、アルコール、アルコール誘導体、糖アルコール（例えば、エタノール、プロパノール、ブタノール、ブタンジオール、アラビトール、キシリトール）、有機酸（例えば、ギ酸、コハク酸、プロピオン酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸、プロピオン酸、ピルビン酸）、アミノ酸（例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸）、またはラクトン（例えば、ガンマ−ブチロラクトン、カプロラクトン／ラクトン）を含み得る。
【００２２】
【表１】
2012506716.tif 000003
【００２３】
【表２】
2012506716.tif 000004
【００２４】
【表３】
2012506716.tif 000005
【００２５】
本技術は、グリセロール等の還元炭素源の嫌気性発酵およびグリセロールから化学製品の製造中に作製された副産物と関連する不利点に対処する。嫌気性条件下で、グリセロールの細胞集団への変換により、還元当量の純益が得られる（表１）。グリセロールのコハク酸または乳酸への変換は、例えば、グリセロールの細胞集団への変換によって生じた過剰の還元当量を消費せず、グリセロールを乳酸に変換する場合に、酸化還元バランスは、２つの還元当量の純益によって、さらに混乱される。この酸化還元電位のアンバランスは、グリセロールからの化学的副産物の１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤＯ）を通して改善され、２つの還元当量の純消費が得られる。しかしながら、グリセロールの１，３−ＰＤＯへの変換は、酸化還元バランスの取れた条件を促進することによって細胞増殖を可能にする一方、生成物の混合物から所望の標的化学品の有効な分離を妨害し得る望ましくない副産物も作製する。本明細書に提供される本技術は、グリセロールの細胞集団への取り込みによって生じる過剰な還元当量を消費する電子受容体の量を制限する使用を通して、望ましくない副産物の生成を削減もしくは排除し、および製品の収率の増加を可能にする。
【００２６】
提案されている戦略を、図３、４、および５に例示し、これらは、グリセロールからコハク酸、またはエタノールおよびギ酸（エタノールおよびＨ２に変換される）、または乳酸の生成を図式的に示す。グリセロールを用いる利点は、グルコース等の他の糖類の生成物の合成を考慮する場合、グルコース、キシロース、または同様の糖類の使用が、理論的収率を明らかに制限する還元当量の不足をもたらすため、明白である。それ故に、グリセロールからのコハク酸の理論的最大収率は、グルコース等の糖類からのものよりも少なくとも１５％高い。加えて、糖類からのエタノールの合成は、グルコースまたはキシロースが炭素源として使用されるか否かにかかわらず、理論的最大収率の約５１％  ｗ／ｗが得られる。したがって、炭素源としてグリセロールの使用は、コハク酸およびエタノール等の生成物の収率の増加を提供する。しかしながら、ある実施形態において、反応のための原料として他の還元炭素源を使用することは有用であり得る。
【００２７】
図６、図７、図８、および図９に示されるように、グリセロールは、野生型大腸菌によって、エタノール、乳酸、コハク酸を生成するために使用され得る。微好気性条件下で、野生型大腸菌株ＭＧ１６５５によるグリセロールの利用は、酢酸の量を、増加させたが、主要生成物として、還元化合物のエタノールおよびコハク酸の合成を生じた（図６および図７）。さらに、嫌気性条件下でのコハク酸生成物と比較した場合、より高濃度のコハク酸が、微好気性条件下で、得られ（図６）、生産収率が向上した（図７）。生産性に関して、１０ｇ／Ｌのグリセロールは、微好気性条件下で、約６０時間で、ＭＧ１６５５野生株によって完全に消費され、これは、コハク酸の嫌気性生産に対して、コハク酸の微好気性生産の生産性の約２倍の増加に相当する。
【００２８】
加えて、突然変異した細菌株は、生成物の合成が、還元当量の純産生または消費を生じない生成物を生成する能力について評価された。グリセロールのこれらの生成物への変換に関与する経路の還元分析の度合いは、還元バランスの度合いのΔκ＝０を得る。例えば、エタノールの生成（副産物のギ酸または水素と一緒に）は、このカテゴリーの生成物の１つである。組み換え株ＳＹ０３（ｐＺＳＫＬＭｇｌｄＡ＝Δｐｔａ、ΔｆｒｄＡ、＋ｇｌｄＡ、＋ｄｈａＫＬＭ）、酢酸（Δｐｔａ）、およびコハク酸（ΔｆｒｄＡ）の合成を低減する突然変異体を含む大腸菌株ＭＧ１６５５の誘導体、ならびに酵素のグリセロールデヒドロゲナーゼ（ｇｌｄＡ）およびジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫＬＭ）の過剰発現の評価は、エタノールが、理論的に近い最大収率で、主要な発酵生成物として生成されたことを示した（図８Ａ）。エタノールの収率は、利用したグリセロールの０．９６モル／モルであり、利用したグリセロールおよびエタノール合成の容積生産性はそれぞれ、４．６５モル／Ｌ／時および４．６１モル／Ｌ／時であった（図８Ｂ）。実現された高生産性は、嫌気性条件の使用で得られたものと比較して、微好気性条件下で、細胞濃度および比速度がともに高い結果であった。使用された微好気性条件は、５ｍｇ  Ｏ２／Ｌ／時の酸素移動速度の容積によって特徴付けられた。
【００２９】
本技術に従って、微好気性条件下で生じ得る別の群の生成物は、グリセロールまたは他の還元炭素源からの合成により、還元当量（Δκ＞０）の純産生を生じる、乳酸等のものである。このアプローチの実行可能性は、図９Ａ、９Ｂ、および９Ｃに例示され、適当な微好気性条件と特定の遺伝子操作の組み合わせによって、乳酸およびコハク酸の生産の増加を示す。これらの実験に使用された微好気性条件は、２０ｍｇ  Ｏ２／Ｌ／時の酸素移動速度の容積によって特徴付けられた。
【実施例】
【００３０】
実施例１：微生物
アスペルギルス属、サッカロミセス属、チゴサッカロミセス属、ピチア属、クリベロミセス属、カンジダ属、ハンゼヌラ属、ドナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、デバリオミケス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属、トリロプシス属（Ｔｏｒｙｌｏｐｓｉｓ）、バシラス属、パエニバシラス属、およびエシェリキア属のメンバーを含む、適切な微生物菌株のどの微生物菌株も、本技術を用いて使用され得ることが想定される。微生物合成工程のための好適な微生物菌株は、対象となる還元した化学化合物を生成することができるいずれの野生型株であり得る。加えて、好適な微生物菌株は、対象となる親株に古典的な突然変異処理または組み換えＤＮＡ技術を実施することによって、採取、および／または改善され得る。さらに、このような株は、その後、代謝進化の順次選択工程に供され得、子孫株は、所望の反応条件下で、改善された性能について評価される。例えば、このような株は、高性能生体触媒に基づいて選択され得る。子孫株の改善された性能のマーカーは、グリセロール供給原料からの所望の化学製品の製造つまり産出を増加し得る。一実施形態において、代謝進化は、酸素、硝酸、亜硝酸、または他の電子受容体の減量の存在下で実行される。
【００３１】
所望の化学製品の製造に正に影響を及ぼし得る遺伝子は、好適な宿主において発現し得る。例えば、野生型細胞において、現在、見出されるものよりもさらに高いレベルで、グリセロールからジヒドロキシアセトンへの経路および／または他の経路で、ある酵素を過剰に発現することは、非常に望ましいものであり得る。図８ＡおよびＢ、ならびに図９Ａ、９Ｂ、および９Ｃに示されるように、競合経路に関与する酵素の阻害と組み合わせて、好適な微生物宿主におけるｇｌｄＡの過剰発現は、コハク酸、エタノール、または乳酸の生成物を増加し得る。
【００３２】
１つまたはそれ以上の外因性ポリヌクレオチドコード配列、即ち、天然ではない、または内因性でない遺伝子配列を、宿主生物に発現するために遺伝的に改変されている組み換え生物はまた、本発明にも使用することができる。所望の遺伝子の過剰発現は、これらの酵素をコードする遺伝子を多コピープラスミドに選択的にクローニングすることよって、またはこれらの遺伝子を強力な誘導もしくは構成的プロモーターの下に置くことによって達成され得る。所望のタンパク質を過剰発現するための方法は、一般的であり、分子生物学の技術分野において公知である。表４に提供されるどの遺伝子も、微生物菌株において過剰発現され得ることが想定される。
【００３３】
【表４−１】
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【００３４】
【表４−２】
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【００３５】
例示された細胞に加えて、本方法は、所望の最終生成物の生成を強化するために特別に設計された単一または多重突然変異を有する細胞を使用することができるであろうことが企図される。非生産的経路に炭素原料を通常流用する、または著しい異化代謝産物抑制を示す細胞は、突然変異させ、これらの表現型の欠如を回避することができた。例えば、多くの野生型細胞は、培地中のグルコースおよび副産物から異化代謝産物抑制を受け、これらの野生型生物の突然変異株が、本技術のある実施形態において、特に有用であり得ることが企図される。特に、表５中のどの遺伝子も、本技術で用いる微生物において、単独で、あるいは他の遺伝子と組み合わせて、突然変異されえることが想定される。本明細書に定義されるように、表示された遺伝子を欠如する微生物は、その遺伝子が不活性化されている（その遺伝子のノックアウト）と考えられる。
【００３６】
【表５−１】
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【００３７】
【表５−２】
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【００３８】
例えば、上述のように、図１０は、本技術に従って、グリセロールからコハク酸またはプロピオン酸の生成の概略経路を示す。このような実施形態において、アセチル−ＣｏＡをエタノールに変換するための経路に関与する１つまたはそれ以上の遺伝子が、それらの遺伝子の触媒作用が還元されるようないくつかの方法において、突然変異または阻害される、生物を提供することは有利であり得る。特定の実施形態において、好適な微生物は、ａｄｈＥ遺伝子の突然変異を含み得る。さらなる突然変異は、酢酸形成に関与するｐｔａ、ａｃｋＡ、またはｐｏｘＢ遺伝子、ホスホエノールピルビン酸のオキサロ酢酸への変換に関与するｐｐｃ遺伝子、グリセロールのグリセロール−３−Ｐを経るジヒドロキシアセトンリン酸への変換に関与するｇｌｐＡＢＣオペロン、ｇｌｐＤ、もしくはｇｌｐＫ、またはジヒドロキシアセトンのジヒドロキシアセトンリン酸への変換に関与するｄｈａＫＬＭの突然変異に関与し得る。これらの突然変異またはそれらの組み合わせは、大腸菌に由来するｇｌｄＡおよび他の生物に由来する類似の遺伝子、シトロバクターフロインディイに由来するｄｈａＫＬｃ、アクチノバシラスサクシノゲネスに由来するｐｅｐｃｋ、またはリゾビウムエトリに由来するｐｙｃが挙げられるが、これらに限定されない、内因性または異種遺伝子のいずれか一方の遺伝子の過剰発現と組み合わせ得る。
【００３９】
別の実施形態において、図１１に示されるように、グリセロールからのエタノールの生成は、酢酸およびコハク酸の副産物を生成する競合経路の阻害を通して増加し得る。これらの突然変異は、酢酸形成に関与するｐｔａ、ａｃｋＡ、またはｐｏｘＢ遺伝子、コハク酸形成に関与するｆｒｄＡＢＣＤオペロン、グリセロールのジヒドロキシアセトンリン酸への変換に関与する、ｇｌｐＡＢＣオペロン、ｇｌｐＤ、もしくはｇｌｐＫの突然変異に関与し得る。これらの突然変異またはそれらの組み合わせは、大腸菌に由来するｇｌｄＡおよび他の生物に由来する類似の遺伝子、またはシトロバクターフロインディイに由来するｄｈａＫＬｃが挙げられるが、これらに限定されない、内因性または異種遺伝子のいずれか一方の遺伝子の過剰発現と組み合わせ得る。
【００４０】
さらなる実施形態において、図１２に示されるように、グリセロールからの乳酸の生成は、酢酸、コハク酸、およびエタノールの副産物を生成する競合経路の阻害を通して増加し得る。これらの突然変異は、酢酸形成に関与するｐｔａ、ａｃｋＡ、またはｐｏｘＢ遺伝子、コハク酸産生に関与するｆｒｄＡＢＣＤオペロン、エタノール形成に関与するａｄｈＥ遺伝子の突然変異に関与し得る。さらに、遺伝子変化は、グリセロールのジヒドロキシアセトンリン酸への変換に関与する、ｇｌｐＡＢＣオペロン、ｇｌｐＤ、またはｇｌｐＫの過剰発現に関与し得る。
【００４１】
変異体を作製する方法は、一般的であり、当技術分野において公知である。例えば、野生型細胞は、放射線または化学的突然変異誘発物質等の様々な薬剤に曝され、次いで、所望の表現型を求めてスクリーニングされる。放射線または化学剤を用いて変異体を作製するための特定の方法は、当技術分野において十分に立証されている。突然変異誘発が生じた後、所望の表現型を有する変異体は、様々な方法によって選択され得る。ランダムスクリーニングが、最も一般的であり、突然変異を起こした細胞が、所望の生成物を生成する能力に対して選択される。代替として、変異体の選択的単離は、抵抗性コロニーのみが生育できる選択的培地上に突然変異を起こした集団を増殖させることによって実施することができる。一実施形態において、細胞は、代謝進化のために選択する前、またはその間に、突然変異が誘発される可能性がある。組み換え技術による標的突然変異誘発はまた、別個に、またはランダム変異誘発技術と併用して採用され得る。
【００４２】
実施例２：培地および増殖条件
一部の細菌は、３５、３７、３９、または４１℃で、最適な温度を有するが、典型的に、細胞は、３７℃において適切な培地中で増殖される。本技術による好ましい増殖培地は、最少培地または最少塩培地を含み得る。例えば、好適な培地は、４−モルホリノプロパンスルホン酸培地（ＭＯＰＳ）を含み得る。ある実施形態において、培地中のリン酸塩は、ナトリウム塩と置き換えてもよい。グリセロール供給原料は、任意の好適な量で提供され得る。例えば、グリセロールは、１０ｇ／Ｌで提供され得る。
【００４３】
発酵に好適なｐＨは、ｐＨ５．０〜９．０の範囲であり得る。アルカリ性ｐＨは、ある生成物の収率向上に適し得る一方、酸性ｐＨは、他の生成物の収率向上に適し得ることが想定される。例えば、酸性ｐＨは、エタノールおよび水素の生成を促進し得る一方、アルカリ性ｐＨは、エタノールおよびギ酸の生成を促進し得る。
【００４４】
発酵は、あらゆる好適な微好気性または微呼吸発酵システムにおいて実行され得る。大気、酸素、および／または窒素は、病原菌の増殖率が、対数期に近づくにつれ、実質的には、培養液中で検出可能な電子受容体がないように、好適な量、かつ好適な速度で、提供され得ることが想定される。
【００４５】
本工程は、バッチ発酵法を採用し得る。本明細書で使用されるように、「発酵」とは、グリセロールからの還元化学製品の製造に適している微好気性または微呼吸条件下で、微生物の増殖を指し得る。古典的なバッチ発酵は、閉鎖システムであり得、そこでは、培地の組成が発酵の最初に設定され、発酵中に人為的変化を受けない。したがって、発酵の開始時に培地は、所望の生物を接種し、システムには何も添加しないで発酵を起こさせる。しかしながら、典型的には、「バッチ」発酵は、炭素源の添加に関するバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度等の因子の調節がなされることが多い。バッチシステムでは、システムの代謝産物およびバイオマス組成物は、発酵が停止する時点まで常に変化する。バッチ培養内で細胞は、静的な遅滞期から高い対数増殖期へ、そして最終的に成長率が減退または停止する静止期へと進む。
【００４６】
連続発酵工程はまた、本発明にも適しており、発酵の進行と共に基質が段階的に添加されること以外は、典型的なバッチシステムを含む。流加バッチ戦略は、例えば、有利であり得る。流加バッチ発酵は、開放システムであり、発酵開始時に確定された発酵培地を添加し、所望の生物を接種し、発酵を起こさせる。バッチ発酵において、ｐＨまたは酸素濃度に一般的になされる調節に加えて、例えば、流加バッチ発酵は、発酵工程中、発酵反応からの培養培地の除去がほとんどない、または全くない、炭素源およびあらゆる追加の栄養制限剤の周期的または連続添加を含む。
【００４７】
本技術はまた、持続的な発酵方法に適応し得ることも企図される。持続的な発酵は、開放システムであり、定義された発酵培地は、持続的に生物反応器に添加され、等量の条件付きの培地が、工程のために同時に除去される。持続的な発酵は、概して、細胞が主に対数増殖期にある培養を一定の高密度で維持する。持続的な発酵は、細胞増殖または最終生成物濃度に影響を及ぼす、１つの因子またはいくつもの因子のモジュレーションを可能にする。バッチ、流加バッチ、または持続的な工程のいずれかを用いて、本発明を実施すること、およびあらゆる既知の発酵様式が適することが企図される。さらに、細胞を、全細胞触媒として基質上に固定化し、グリセロールから還元した生成物の生成の発酵条件に曝し得ることが企図される。
【００４８】
本発明は、様々な修正および代替形態に影響を受けやすい一方、特定の実施形態は、図中の例によって示され、本明細書に詳細に記載されている。しかしながら、本発明は、開示される特定の形態に制限されることを意図しないことを理解すべきである。むしろ、本発明は、以下の添付の特許請求によって定義される本発明の趣旨および範囲内にある全ての修正、同等物、および代替物を網羅するものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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