(57)【要約】  本発明は、グルタメート、サッカリド、及びポリマーの保存混合物を含む配合物である保存組成物に関する。この保存混合物は、生物学的合成物の保存に有利に用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタメート、サッカリド及びヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含む保存混合物であって、非還元性の単糖誘導体を含まない上記保存混合物。
【請求項２】
グルタメートが、グルタミン酸ナトリウムである、請求項１に記載の保存混合物。
【請求項３】
サッカリドが、単糖又は二糖であり、好ましくはスクロース及びトレハロースから選択される二糖である、請求項２に記載の保存混合物。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか一項に記載の保存混合物を含み、生物学的成分をさらに含む保存組成物。
【請求項５】
生物学的成分が、細胞、微生物、ウイルス、タンパク質又はこれらの誘導体である、或いはそれらを含む、請求項４に記載の保存組成物。
【請求項６】
グルタメートが約０．０５〜約６０％ｗ／ｖ、サッカリドが約０．０５〜約６０％ｗ／ｖ、またポリマーが約０．００５〜約５０％ｗ／ｖの範囲の量で存在する、請求項５に記載の保存組成物。
【請求項７】
グルタメートが約５〜約１０％、サッカリドが約１０〜約２０％の範囲、またポリマーが約１０％の量で存在する、請求項５又は６に記載の保存組成物。
【請求項８】
生物学的成分を保存する方法であって、次のステップ：
ａ）請求項４及び５のいずれか一項に記載の保存組成物を得るために、請求項１から３並びに請求項６及び７のいずれか一項に記載の保存混合物の成分の各々を、生物学的成分に加える、又はこれらの成分の各々と生物学的成分を混合するステップ、
ｂ）次に、得られた保存組成物を乾燥するステップ
を含む上記方法。
【請求項９】
乾燥するステップが凍結乾燥によって実施される、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルタメート、サッカリド、及びポリマーの保存混合物を含む配合物（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）である保存組成物に関する。この保存混合物は、生物学的合成物（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の保存に有利に用いられる。
【背景技術】
【０００２】
生物学的合成物の長期保存は、これらの合成物が、通常、壊れやすく、地球上では環境により傷つきやすいことを考えると、独特の課題を提起する。非常に短い期間を超えて、溶液として室温で、分離、精製及び保存されうるのに十分に安定な水和された生物学的合成物はほとんどない。
【０００３】
商業的にも実用的にも、乾燥状態での生物学的合成物の保存は、それに非常に大きな利点を伴う。うまく乾燥した試薬、材料及び組織は、それらの貯蔵寿命が増すにも関わらず、重量が減少し、保存のためのスペースは減少する。乾燥した材料の室温での保存は、さらに、低温保存の選択とそれに付随するコストに比べると、費用効率が高い。乾燥した生物学的合成物を生成するいくつかの現行技術がすでに存在する。最も古くて広く用いられている技術の１つが凍結乾燥である。長い間、凍結乾燥は、科学よりも技能と見られてきたので、科学的手法及び研究が妨げられた。
【０００４】
ＷＯ０１／３７６５６は、生物学的合成物を保存する方法を開示し、この方法では、非還元性の単糖誘導体が存在する。このような化合物は、ウイルス及び細胞のような生物学的合成物の保存にとって魅力的であると分かる。しかし、このような化合物の使用は、少なくとも２つの欠点を有する：このような化合物は、特別に化学合成されなければならず、このため高価である。さらに、このような化合物は、非常に低いガラス転移温度を有し、このことは、それらが、乾燥プロセスの間に化合物の結晶化（これは、生物学的合成物の安定性に影響を及ぼし得る）の危険を増すことを意味する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
驚くべきことに、本発明者等は、グルタメート、サッカリド又は糖アルコール及びポリマーのような、ありふれた材料の混合物が、どのような生物学的合成物に対しても、保存混合物として有利に使用され得ることを見出した。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
保存混合物
第１の態様において、グルタメート、サッカリド及びポリマーを含む保存混合物が提供され、ここで、サッカリドは、非還元性の単糖誘導体ではない。本発明に関連して、保存混合物は、生物学的合成物が存在する場合には、保存組成物と呼ばれる。
【０００７】
本明細書において用いられる場合、用語「保存」は、本明細書において特定される生物学的合成物の、例えば、化学的経路（例えば、酸化、加水分解又は酵素作用）及び物理的経路（例えば、変性、凝集、ゲル化）による劣化が、許容されるレベルを超えないことを好ましくは意味する。別の言い方をすると、生物学的合成物の意図される商業的利用にとって十分な、少なくともあるレベルの生物活性又は生存率、並びに／或いは、少なくともあるレベルの本来の機能又は構造が、乾燥及び／又はそれに続く保存の後で保持される。
【０００８】
本発明の好ましい実施形態において、保存混合物が、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はこれを超える生物活性又は生存率を保持することが、凍結乾燥、及びそれに続く３７℃での、１又は２又は３又は４日間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間或いはこれを超える保存の後、再水和で維持される。特定の生物学的合成物に応じて、当業者は、その生物学的合成物の活性を評価するために、どのアッセイが用いられるべきであるか分かるであろう。生存率は、３７℃で５週間のインキュベーション後に形成される、培地上のコロニーの数を数えることによる、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の決定によって、好ましくは評価される。
【０００９】
本発明の別の好ましい実施形態において、保存混合物が、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はこれを超える構造及び／又は機能を保持することが、３７℃での、１又は２又は３又は４日間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間或いはこれを超える保存の後、再水和で維持される。生物学的合成物の特性に応じて、当業者は、その生物学的合成物の構造及び／又は機能を評価するために、どのアッセイが用いられるべきであるか分かるであろう。抗原の構造は、好ましくは、ＥＬＩＳＡ又はＢｉａｃｏｒ分析によって評価される。２次及び／又は３次構造は、好ましくは、ＵＶ−、蛍光、フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）及び／又は円偏光２色性（ＣＤ）分光法によって評価される。免疫原性は、好ましくは、ネズミモデルを用いる、ｉｎ  ｖｉｖｏ分析によって評価される。
【００１０】
本発明に関連する範囲内で、「混合物」は、好ましくは、グルタメート、サッカリド及びポリマーのそれぞれが一緒に存在することを意味する。
【００１１】
本発明の保存混合物中に存在するサッカリドは、非還元性の単糖誘導体ではない。用語「非還元性の単糖誘導体」は、修飾された糖の一般類を表すために用いられている。修飾は、知られているどのような化学的修飾であってもよいが、メチル化、エチル化及び塩素化誘導体が好ましい。したがって、本発明のサッカリドは、メチル化された単糖、又はエチル化された単糖、又は塩素化された単糖ではない。より好ましくは、メチル化された単糖は、そのメチル化された単糖のα又はβ型ではない。より一層好ましくは、メチル化された単糖は、メチルα−ｄ−グルコピラノシドではない。このような特異的な非還元性の単糖誘導体の使用は、それらが、いくつかの欠点を有するので、除外される。このような化合物は、ウイルス及び細胞のような生物学的合成物の保存にとって魅力的であることが見出されたが、それらは、少なくとも２つの欠点を有する。それらは、特別に化学合成されなければならず、このため高価である。さらに、このような化合物は、非常に低いガラス転移温度を有し、このことは、それらが、乾燥プロセスの間に結晶化する傾向を増大させ得るので、保存される生物学的合成物の安定性に影響を及ぼすことを意味する。本発明の特に好ましい実施形態において、本明細書において前に定められた保存混合物が、提供され、ここで、この混合物は、メチルα−ｄ−グルコピラノシドを含まない。より好ましくは、混合物は、メチル化された単糖、又はエチル化された単糖、又は塩素化された単糖を含まない。より一層好ましくは、混合物は、非還元性の単糖誘導体を含まない。
【００１２】
如何なる理論にも拘束されようとは思わないが、本発明者等は、生物学的合成物の保存を最適化するためには、凍結乾燥及びそれに続く保存の間の保存混合物の成分の結晶化を避けるために、用いられる保存混合物が、高いガラス転移温度を有することが極めて重要であると考える。本発明に関連する範囲内で、「高い」ガラス転移温度（Ｔｇ）は、好ましくは、保存温度より高い、乾燥後のガラス転移温度を意味する。より好ましくは、高いガラス転移温度は、０℃より高い、又は１０℃より高い、又は１５℃より高い、又は２０℃より高い、又は２５℃より高い、又は２７℃より高い、又は２８℃より高い、又は２９℃より高い、又は３０℃より高い、又は３１℃より高い、又は３２℃より高い、又は３３℃より高い、又は３４℃より高い、又は３５℃より高い、又は３６℃より高い、又は３７℃より高い、又は３８℃より高い、又は３９℃より高い、又は４０℃より高い、又は４５℃より高い、又は５０℃より高い、又は５５℃より高い、又は６０℃より高い、又は６５℃より高い、又は７０℃より高い、又は７５℃より高い。ガラスは、最初は液体状態にあった材料の、かなりの過冷によって得ることができるアモルファス固体状態である。本発明において、ガラスは、本発明の保存混合物を用いる、生物学的合成物の凍結乾燥プロセスの間に得られる。ガラス化した材料、又はガラスにおける拡散は、極端に遅い速度で起こる（例えば、ミクロン／年）。結果的に、２つ以上の部分の相互作用を必要とする化学的又は生物学的変化は、実際上、完全に阻止される。ガラスは、通常、均一で、透明で、脆い固体として現れ、粉末へと粉砕又は破砕され得る。ガラス転移温度（Ｔｇ）として知られる温度より上では、粘度が急激に低下し、ガラスは、変形可能になり、その材料は、より一層高い温度で流体になる。本発明者等は、長期保存のためのガラス化の最高の利点は、Ｔｇが保存温度より高い条件下においてのみ、保証され得ると考える。Ｔｇは、ガラス中に存在する水の量に直接依存しており、その結果、水和レベルを制御することによって変更され得る；水が少ないほど、Ｔｇは高い。本発明者等は、グルタメート、サッカリド及びポリマーを含む保存混合物は、本明細書において先に定めた、魅力的な高いＴｇを有することを見出した。さらに、本発明者等は、このような高いＴｇを有する保存混合物の使用により、効率よく保存される生物学的合成物が獲得されるに至ることを、明瞭に、明白に実証した（実験の部を参照）。用語「保存される」の意味は、本明細書において先に定めた用語「保存」に対するものと同じである。さらに、凍結乾燥法のような乾燥法は、このような配合を用いて、より効率的である（すなわち、より短い時間では、プロセス温度は、より高くなり得る）ように考案され得る。本発明での凍結乾燥法は、本明細書において後に定められる。
【００１３】
本発明の保存混合物の各成分が、これから、下で、詳細に特定される。
【００１４】
グルタメート
グルタメートは、好ましくは、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、グルタミン酸アンモニウム、ジグルタミン酸カルシウム、ジグルタミン酸マグネシウム、グルタミン酸である。より好ましくは、グルタミン酸ナトリウムが用いられる。好ましい実施形態において、グルタメートは、約０．０５％ｗ／ｖと約６０％ｗ／ｖの間、より好ましくは約０．２と約５５％ｗ／ｖの間、より好ましくは約０．５と約５０％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約１と約４５％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約１．５と約４０％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約２と約４０％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約２と約３５％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約２と約３０％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約２と約２５％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約２と約２０％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約４と約１５％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約４と約１０％ｗ／ｖの間の範囲の量で、保存組成物中に存在する。非常に良好な結果は、約５％ｗ／ｖを用いて得られた（実施例を参照）。したがって、好ましい実施形態において、約５から約１０％ｗ／ｖのグルタミン酸ナトリウムが、保存組成物中に存在する。より好ましくは、５から１０％ｗ／ｖのグルタミン酸ナトリウムが、保存組成物中に存在する。如何なる理論にも拘束されようとは思わないが、本発明者等は、グルタメートは、乾燥プロセスの間、生物学的合成物及び本発明の保存混合物を含む組成物内に水を拘束することができ得ると考える。結果として、水は、後の段階で、及び／又は、凍結乾燥の間に比較的ゆっくりと、すなわち、真空下の昇華によって、除去され得る。水がより長い時間保持され得る、及び／又は、それが比較的ゆっくりとした仕方で除去され得るという事実は、何故このような保存混合物が非常に効果的であるかを説明し得る。
【００１５】
単糖、二糖又はオリゴ糖
サッカリドが、本発明の保存混合物中にさらに存在し、このサッカリドは、ＷＯ０１／３７６５６に記載の非還元性の単糖誘導体ではない。保存混合物中に存在するサッカリドは、単糖、二糖又はオリゴ糖であり得る。適切な単糖の例には、グルコース、マンノース、フルクトース、キシロース、ガラクトース、リブロース、アラビノースなどが含まれる。適切な二糖の例には、トレハロース、スクロース、ラクトース、マルトースなどが含まれる。適切なオリゴ糖の例には、フルクトオリゴ糖、ガラクト−オリゴ糖、マンナン−オリゴ糖などが含まれる。好ましくは、サッカリドは、単糖又は二糖である。より好ましくは、二糖が用いられる。より一層好ましくは、二糖としてトレハロースが用いられる。単糖及び二糖は、それらの分子が小さい（このため、所定の生体材料とより良好な相互作用を生じ得る）せいで、生体材料へのより良好な安定化作用を有すると考えられる。トレハロースは、それが比較的高いＴｇを有するので（純粋なトレハロースは約１２１℃のＴｇを有する）、二糖として非常に好ましい。
【００１６】
好ましい実施形態において、サッカリドは、約０．０５と約６０％ｗ／ｖの間、より好ましくは約３と約５５％ｗ／ｖの間、より好ましくは約５と約５０％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約５と約４５％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約５と約４０％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約５と約３５％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約５と約３０％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約５と約２５％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約５と約２０％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約６と約２０％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約７と約１５％ｗ／ｖの間の範囲の量で、保存組成物中に存在する。非常に良好な結果は、約７又は約２０％ｗ／ｖを用いて得られた（実施例を参照）。したがって、好ましい実施形態において、保存組成物は、約７又は約２０％ｗ／ｖのトレハロースを含む。より好ましくは、保存組成物は、７又は２０％ｗ／ｖのトレハロースを含む。
【００１７】
如何なる理論にも拘束されようとは思わないが、本発明者等は、サッカリドが、凍結乾燥プロセスの間に、先に説明したように、生物学的合成物及び本発明の保存混合物を含むマトリックス内に水を拘束するグルタメートの作用を強め得ると考える。
【００１８】
ポリマー
ポリマーが、本発明の保存混合物中に、さらに存在する。ポリマーの例には、多糖、ＰＶＰ、ＰＥＧが含まれる。好ましくは、ポリマーは多糖である。多糖は、デキストラン、ＨＥＳ（ヒドロキシエチルデンプン）、イヌリン、ＭＣＣ（微結晶性セルロース）、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、デキストリン、シクロデキストリンなどであり得る。好ましい多糖はＨＥＳである。本明細書で定められるポリマーは、それが比較的高いＴｇを有するので、保存混合物に用いられると有利である。好ましい実施形態において、ポリマーは、約０．００５％ｗ／ｖと約５０％ｗ／ｖの間、より好ましくは約０．２と約４５％ｗ／ｖの間、より好ましくは約０．５と約４０％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約１と約３５％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約５と約３０％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約５と約２５％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約５と約２０％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約５と約１５％ｗ／ｖの間、より一層好ましくは約５と約１０％ｗ／ｖの間の範囲、より一層好ましくは約１０％ｗ／ｖの量で、保存組成物中に存在する。非常に良好な結果が、約１０％ｗ／ｖを用いて得られた（実施例を参照）。したがって、好ましい実施形態において、保存組成物は、約１０％ｗ／ｖのＨＥＳを含む。より好ましくは、保存組成物は、１０％ｗ／ｖのＨＥＳを含む。
【００１９】
如何なる理論にも拘束されようとは思わないが、本発明者等は、ポリマーが、凍結乾燥プロセスの間に、先に説明したように、生物学的合成物及び本発明の保存混合物を含むマトリックス内に水を拘束するグルタメートの作用を強め得ると考える。
【００２０】
下に、３つの成分の組合せを一緒に定める、好ましい保存組成物を記載する。
【００２１】
好ましい保存混合物又は組成物は、グルタメートがグルタミン酸ナトリウムであり、また／或いは、サッカリドが単糖、二糖、オリゴ糖及び／又は多糖であり、また／或いは、ポリマーがＰＶＰ、ＰＥＧ及び／又は多糖である、保存混合物又は組成物である。より好ましい保存混合物又は組成物は、グルタメートがグルタミン酸ナトリウムであり、サッカリドが二糖であり、及び／又は、ポリマーが多糖である、保存混合物又は組成物である。より一層好ましい保存混合物又は組成物は、グルタメートがグルタミン酸ナトリウムであり、二糖がトレハロース及び／又はスクロースであり、また／或いは、多糖がデキストラン、ＨＥＳ、ＭＣＣ及び／又はデキストリンである、保存混合物又は組成物である。最も好ましい保存混合物又は組成物は、グルタメートがグルタミン酸ナトリウム、二糖がトレハロース、及び／又は、多糖がＨＥＳである、保存混合物又は組成物である。
【００２２】
好ましい保存組成物は、グルタメートが約０と約６０％ｗ／ｖ、サッカリドが約１と約６０％ｗ／ｖ、ポリマーが約０と約５０％ｗ／ｖの間の範囲の量で存在する、保存組成物である。より好ましい保存組成物は、グルタメートが約５と約１０％の間、サッカリドが約１０と約２０％の間の範囲、ポリマーが約１０％の量で存在する、保存組成物である。
【００２３】
保存組成物
さらなる態様において、本明細書において定められる保存混合物及び生物学的成分（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を含む保存組成物が提供される。
【００２４】
用語「生物学的成分」は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素及び補酵素、血清、細胞、リポソーム、アジュバント、ビタミン、抗体、及び抗体フラグメントを、包含する、又はこれらである、又は含む、又はこれらからなる。天然由来の又は精製された、また組換えにより産出された要素のどちらも、これらの用語に含まれる。この用語は、また、リポタンパク質、及び翻訳後に修飾された形、例えば、グリコシル化タンパク質も含む。類似体、誘導体、アゴニスト、アンタゴニスト、及びこれらのいずれかの薬学的に許容される塩は、これらの用語に含まれる。この用語は、また、修飾された、誘導体又はＤ−又はＬ−立体配置のアミノ酸を有する天然では産生されないペプチドも含む。
【００２５】
用語「生物学的成分」は、免疫反応を誘発できる任意の抗原物質を、さらに含む、又は包含する、又はそれからなる。より詳細には、抗原は、腫瘍の細胞外領域で発現されるタンパク質又はそのフラグメント（例えば、癌の治療のための）、アレルゲン、又は感染因子（例えば、ウイルス若しくは細菌）又はその一部（例えば、サブユニット、不活化全ウイルス、不活化細菌、ＶＬＰ、トキシン）であり得る。したがって、この用語は、病原体のエピトープを包含し、このエピトープは、免疫系によって認識されて、免疫反応を引き起こす。この用語はまたワクチンも包含する。ワクチンは、本明細書において先に定められたエピトープを含むペプチドを表し、特定のタイプの免疫法に用いられ、ここで、ペプチドは、感染因子（若しくはその何らかの部分）に由来する、又はそれから誘導され、これは、その因子によって引き起こされる感染症に対する抵抗を確立するために、哺乳動物に投与される。ワクチンは、ウイルス、細菌及び寄生虫、ウイルス粒子、並びに／或いは、ウイルス又は微生物（感染症因子又は病原体が含まれる）の何らかの部分（タンパク質及び／又は核酸が含まれる）を含み得るが、これらは、免疫を生じ得るので、ワクチンの配合に役立ち得る。好ましい細菌には、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、例えば、髄膜炎菌（Ｎ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、例えば、インフルエンザ菌（Ｈ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、例えば、百日咳菌（Ｂ．  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、例えば、連鎖球菌属血清型Ａ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、例えば、コレラ菌（Ｖ．  ｃｈｏｌｅｒａ）、グラム陰性腸病原体（Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｅｎｔｅｒｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ）（例えば、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）及びエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）が含まれる）、さらには、炭疽、癩、肺結核、ジフテリア、ライム病、梅毒、腸チフス及び淋疾を引き起こす細菌による病原体が含まれる。好ましい細菌は、ボルデテラ又はナイセリア属の種に属する。より好ましいボルデテラ属の種には、百日咳菌、パラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、又は気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）が含まれる。より好ましいナイセリア属の種には髄膜炎菌が含まれる。寄生虫は、原生動物、例えば、ウシバベシア症原虫（Ｂａｂｅｏｓｉｓ  ｂｏｖｉｓ）、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、及びトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、例えば、シャーガス病原虫（Ｔ．  ｃｒｕｚｉ）であり得る。他の病原体は真核生物であり得る。好ましい真核生物には真菌が含まれる。より好ましい真菌は、酵母菌又は糸状菌である。好ましい酵母菌の例はカンジダ属の種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）に属する。好ましい真菌には、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃ．  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、及びヒストプラスマ−カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）が含まれる。好ましいウイルスには、それには限らないが、哺乳動物に病状又は疾患を誘発できる任意のウイルスが含まれる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。ヒトのウイルスには、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；風疹ウイルス（ｒｕｂｅｌｌａｖｉｒｕｓ）；パラミクソウイルス科（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、例えば、パラインフルエンザウイルス（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、はしか、おたふく風邪、呼吸器合胞体（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルス、ヒト・メタニューモウイルス（ｈｕｍａｎ  ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）；フラビウイルス科（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、例えば、黄熱ウイルス、デングウイルス（ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ダニ媒介性脳炎、セントルイス脳炎又は西ナイル熱ウイルス；ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、例えば、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、エプスタイン・バール・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）；ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）；アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）；ハンタウイルス科（Ｈａｎｔａｖｉｒｉｄａｅ）、例えば、ハンターン（Ｈａｎｔａａｎ）；コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）；パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）、例えば、ヒトパピローマウイルス（ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、例えば、狂犬病ウイルス；コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、例えば、ヒトコロナウイルス；アルファウイルス科（Ａｌｐｈａｖｉｒｉｄａｅ）、アルテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、例えば、エボラウイルス（Ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスウイルス科（ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）、例えば、天然痘ウイルス、及びアフリカ豚コレラウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）が含まれる。はしかウイルス及びインフルエンザウイルスが好ましいウイルスである。
【００２６】
用語「生物学的成分」は、また、細胞の形質転換に有用な、ウイルス、細菌及び酵母菌由来ベクターを、包含する、又はこれらである、又は含む、又はこれらからなる。このようなベクターは、遺伝子治療に、さらには分子生物学及び遺伝子工学に用いられ得る。用語「生物学的成分」は、また、ウイルス様粒子、ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）、リポソーム、リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）を、包含する、又はこれらである、又は含む、又はこれらからなる。
【００２７】
最も好ましい態様において、用語「生物学的成分」は、また、ウイルス、原核生物及び真核生物の細胞を、包含する、又はこれらである、又は含む、又はこれらからなる。好ましい実施形態において、保存組成物は、生物学的成分として、微生物、ウイルス又はタンパク質を含む。
【００２８】
保存組成物において、生物学的成分は、好ましくは、１ｍｌ当たり１×１００と１×１０２５個との間の範囲の生及び／又は死粒子数（例えば、コロニー形成単位、プラーク形成単位、５０％組織培養感染量、血球凝集単位）の量で、及び／又は、好ましくは、１ｐｇ／ｍｌと１０ｇ／ｍｌの間の範囲の重量で、存在する。
【００２９】
方法
さらなる態様において、生物学的成分を保存する方法が提供され、ここで、この方法は、次のステップ：
ａ）保存組成物を得るために、本明細書において先に定められた保存混合物の成分の各々を、生物学的成分に加える、又はこれらの成分の各々を生物学的成分と混合するステップ、
ｂ）次に、得られた保存組成物を乾燥するステップ（例えば、噴霧乾燥、空気乾燥、凍結乾燥、噴霧凍結乾燥）、
を含む。
【００３０】
好ましい方法では、乾燥するステップは、空気乾燥、脱水乾燥、真空乾燥、凍結乾燥又はこれらの組合せによって実施される。より好ましくは、乾燥は凍結乾燥によって実施される。
【００３１】
ステップａ
先に特定された保存混合物の各成分は、保存組成物を得るために、生物学的成分を含めて、一緒に混合され得る。本明細書において定められた生物学的成分を含む保存混合物の任意の成分は、逐次、又は同時に加えられる、或いは一緒に混合され得る。混合物の成分の各々及び生物学的成分を加えるどのような順序も、前記方法のステップａに包含される。保存混合物の各成分が、生物学的成分に、逐次、添加されてもよい。保存混合物の各成分を、生物学的成分が存在する溶液又は懸濁液に添加することもまた包含される。
【００３２】
ステップｂ
次に、得られた保存組成物は乾燥される。知られているどのような乾燥方法が用いられてもよい。乾燥方法は、噴霧乾燥、真空／凍結乾燥、又は凍結乾燥であり得る。好ましい実施形態において、乾燥方法は凍結乾燥である。凍結乾燥法は、当業者に知られている。棚温度は、少なくとも−５０℃、又は少なくとも−４０℃、又は少なくとも−３０℃、又は少なくとも−２０℃であり得る。しかし、それは、好ましくは、約−４０、又は約−５０℃ですらある。保存組成物は、１００マイクロバール以下の圧力まで下げられ得る。設定圧力に達したら、棚温度は、約−４０℃、又は−３０℃、又は−２５℃、又は−２０℃に変えられ得る。乾燥の最初のステップは、圧力上昇がチャンバ内で認められない時に、好ましくは終わる。その時点で、棚は、好ましくは、２０℃、又は３０℃、又は４０℃まで加熱される。その温度は、好ましくは、圧力上昇が検出できなくなるまで、この値に保たれる。好ましい凍結乾燥法は、実施例に記載される。本発明者等は、保存組成物のいくつかの成分の高いＴｇのために、乾燥プロセスの効率は向上され得る（プロセスが短くなる）と考える。例えば、記載される実施例の１つにおいて、プロセスは、１０日間から９日間に、又は５日間にさえ短縮され得る。さらに、このプロセスを用いて凍結乾燥される生物学的成分は、少なくとも１つのその活性又はその生存率が、本明細書に定められるように保存されることが分かる。
【００３３】
この文書及びその特許請求の範囲において、動詞「含む」及びその活用型は、その非限定的な意味で用いられていて、その語に続く項目が含まれるが、具体的に挙げられていない項目は排除されないことを意味する。さらに、動詞「からなる」は、「から本質的になる」によって置き換えることができ、本明細書に定められる製品又は組成物又は保存混合物が、具体的に特定されたもの以外のさらなる成分（単数又は複数）を含んでいてもよく、このさらなる成分（単数又は複数）は本発明の特有の特性を変えないことを意味している。さらに、単数形による要素への言及は、前後の関係から１つで且つ唯一の要素が存在すべきであることが明らかに求められるのでなければ、２つ以上の要素が存在する可能性を除外しない。したがって、単数形は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。用語「ほぼ」又は「約」は、数値に結び付けて用いられる場合（ほぼ１０、約１０）、好ましくは、その値が、所定の値１０±（１０の５％）（境界値を含まない）であり得ることを意味する。
【００３４】
本明細書において引用される参照特許及び文献の全ては、参照によって、それらの全体がここに組み込まれる。
【００３５】
以下の実施例は、例示の目的でのみ与えられ、本発明の範囲を決して限定しようとするものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】プロセス段階（凍結乾燥器の棚温度；〜すでに安定化されたケーキの残留湿分含量を下げるために必要とされるエネルギー消費）の関数としての、様々な配合物のガラス転移温度（Ｑ１００示差熱量計（ＴＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で測定）及び残留湿分含量（ＲＭＣ；カール・フィッシャー電量滴定装置（Ｍｉｔｓｈｕｂｕｓｈｉ）で測定）を示す。長期の安定化のためには、一般に、３％より少ないＲＭＣが好ましい。
【図２】凍結分析装置による、ＨＥＳ／トレハロース／グルタメート／ＢＣＧ配合物の完全固化温度の分析。最初に、液体保存組成物が凍結分析装置内で凍結される。第２に、凍結分析装置内の温度を上げ、電気抵抗を測定する。抵抗が変化するその瞬間、その温度が完全固化の温度である。この場合、完全固化の温度は−２５℃である。
【図３】凍結乾燥後の様々な配合物のガラス転移温度（Ｔｇ）。水に１１％のグルコース、２．５％のポリゲリン及び０．００５％のＴｗｅｅｎ  ８０を含むＨＧＴ培地による配合物。５％のグルタミン酸ナトリウムを含む配合物。本発明の配合物であって、５％のグルタミン酸ナトリウム、１０％のＨＥＳ及び２０％のトレハロースを含む配合物。ガラス転移温度は、Ｑ１００示差熱量計（ＴＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用い、示差走査熱量測定によって求める。アルミニウム（ＤＳＣ）パンに、１〜２０ｍｇの粉末（凍結乾燥した配合物）を充填し、１０℃／ｍｉｎの走査速度でＤＳＣを実施した。Ｔｇは、ＴＡの分析ソフトウェアを用いて求めた。
【図４】ＢＣＧ生存率への容積の減少及びＢＣＧ濃度の影響。  Ａ）１×１０９ｃｆｕのＢＣＧ、５％のグルタミン酸ナトリウム、１０％のＨＥＳ及び２０％のトレハロースを含む１０ｍｌの量を、凍結乾燥し、ＢＣＧの生存率を求めた。  Ｂ）２×１０９ｃｆｕ（Ａに比べて２倍の濃度のＢＣＧ）のＢＣＧ、５％のグルタミン酸ナトリウム、１０％のＨＥＳ及び２０％のトレハロースを含む５ｍｌの量を、凍結乾燥し、ＢＣＧの生存率を求めた。  Ｃ）１×１０９ｃｆｕ（Ａに比べて２倍の濃度のＢＣＧ）のＢＣＧ、５％のグルタミン酸ナトリウム、１０％のＨＥＳ及び２０％のトレハロースを含む５ｍｌの容積を、凍結乾燥し、ＢＣＧの生存率を求めた。
【図５】凍結乾燥したＢＣＧ配合物の保存安定性。  凍結乾燥後、乾燥したＢＣＧ配合物を、４、２０及び３７℃で４週間保存した。再構成したＢＣＧ配合物のＣＦＵを、保存の前後で求めた。ＢＣＧ配合物の安定性は、相対生存率（乾燥したＢＣＧ配合物の元のＣＦＵのパーセンテージ）として表す。
【図６】破傷風菌（Ｃｌ．ｔｅｔａｎｉ）−シードロットの安定化。  破傷風菌の懸濁液をペレット化し、次に、望みの培地に再懸濁した。培地として、Ｓｕｐｅｒ  ｄｅ  Ｂｏｅｒによるスキムミルク（液体スキムミルク）、ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによるスキムミルク（溶かされたスキムミルク粉末、７％）、及び１０％のＨＥＳ＋２０％のトレハロース＋５％のＮａ−グルタメートを用いた。アンプル内の最終配合物は、０．３ｍｌの培地中、１〜４×１０５ｃｆｕの破傷風菌からなっていた。凍結乾燥前後のバイアルにおけるコロニー形成単位を求めた。次に、ｃｆｕの回復率を計算した。
【図７】ジフテリア菌（Ｃ．  ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ）−シードロットの安定化。ジフテリア菌の懸濁液をペレット化し、次に、望みの培地に再懸濁した。培地として、Ｓｕｐｅｒ  ｄｅ  ｂｏｅｒによるスキムミルク（液体スキムミルク）、ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによるスキムミルク（溶かされたスキムミルク粉末、７％）、及び１０％のＨＥＳ＋２０％のトレハロース＋５％のＮａ−グルタメートを用いた。アンプル内の最終配合物は、０．３ｍｌの培地中、１×１０８〜２×１０９ｃｆｕのジフテリア菌からなっていた。凍結乾燥前後のバイアルにおけるコロニー形成単位を求めた。次に、ｃｆｕの回復率を計算した。
【図８】凍結乾燥したジフテリア菌シードロットの増殖曲線。凍結乾燥したジフテリア菌（図７も参照）を再構成し、Ｓｔａｉｎｅｒ培地でインキュベートし、５９０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）を、最初の３０時間の間、測定した。
【図９】いくつかの配合物（１０％のＨＥＳ＋５％のＮａ−グルタメート＋２０％のトレハロース；２０％のトレハロース；２０％のスクロース；５％のＮａ−グルタメート；１０％のＮａ−グルタメート；Ｈ２Ｏ）によって安定化したＳｍｉｆｆ培地に懸濁し、凍結乾燥したベロ（Ｖｅｒｏ）細胞の、４℃で４週間の保存後の生存率。
【図１０】基準のＭｏａｂ（冷凍、−３０℃）及び凍結乾燥ｍｏａｂ（１０％のＨＥＳ＋５％のＮａ−グルタメート＋２０％のトレハロース、２０℃）を用い、Ｄ−抗原ＥＬＩＳＡによって求めた、ポリオワクチンのバッチＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの力価。
【図１１】様々な配合物（１０％のＨＥＳ＋５％のＮａ−グルタメート＋２０％のトレハロース；２０％のトレハロース；２０％のスクロース；５％のＮａ−グルタメート；１０％のＮａ−グルタメート；Ｈ２Ｏ）を用いて安定化され、凍結乾燥されたポリオワクチンのＤ−抗原含量（１型；２型；３型）の回復率。
【図１２】様々な配合物（２０％のトレハロース；２０％のスクロース；１０％のＨＥＳ＋５％のＮａ−グルタメート＋２０％のトレハロース；１０％のＨＥＳ＋５％のＮａ−グルタメート＋２０％のスクロース）を用いて安定化され、凍結乾燥されたポリオワクチンのＤ−抗原含量（１型；２型；３型）の回復率。
【実施例】
【００３７】
（例１）
点滴注入による、膀胱癌の免疫療法のためのＢＣＧ
確実に成功する免疫療法のためには、最低２×１０８個の生きたＢＣＧ細菌が必要とされる。本発明の配合物により、凍結乾燥後に、８０〜１００％の生存率が達成される。加えて、乾燥した製品（ケーキ）は、雰囲気温度（室温）及びより高温で、非常に安定（物理的安定性）である（図１を参照）。さらに、本発明の配合には、如何なる動物由来成分も含まれない。
【００３８】
１．ＢＣＧのために考案される配合の一般原則
凍結乾燥安定剤が、下記の組合せとして共通に存在する；
−バルキング（ｂｕｌｋｉｎｇ）剤（マンニトール、血清アルブミン、ＰＶＰ、ＣＭＣなど）［これは、さらなる機能を有し得る］
−ガラス生成体（ｇｌａｓｓｆｏｒｍｅｒ）、これは、大抵の場合、サッカリドである
−ウイルス及びタンパク質では、緩衝液が、凍結乾燥の前後、及びその間の正しいｐＨを保証するために必要である（凍結の間のｐＨの変化のゆえに）。
【００３９】
典型的な比率は、５から７％のガラス生成体、及び７から１０％のバルキング剤である。１０％のＨＥＳ＋２０％のトレハロース＋５％のグルタミン酸ナトリウムを含む保存混合物により、最良の結果が得られた。これは、５％の濃度のグルタミン酸ナトリウムが水に激しく結合するので、水が、凍結乾燥プロセスの後の段階において、凍結安定化されたマトリックスから出てくるという事実に恐らく起因する（図１を参照）。
【００４０】
２．方法
保存混合物の配合
重さ：１０ｇのＨＥＳ
５から２０ｇのトレハロース
５ｇのグルタミン酸ナトリウム
これらの成分の各々を一緒に混合した。得られた混合物に、１００ｍｌになるまで水を補充した。得られた混合物を蒸気滅菌した。滅菌した混合物は、不透明な溶液のように見えた。望みの量の微生物（この場合、約１×１０９個の生きたＢＣＧ細菌）を、この滅菌した混合物に加え、凍結乾燥のために望みの容器（例えば、アンプル、バイアル又はバルク（ｂｕｌｋ））に充填した。この混合物は、以後実施例において、本発明による保存組成物と呼ばれる。
【００４１】
凍結乾燥法
ＫＬＥＥ凍結乾燥器の棚温度を、−３０℃以下に設定した。しかし、比較的良好な結果は、−４０／−５０℃で得られた。凍結乾燥器の圧力は、１００マイクロバール以下に設定した。設定圧力に達したら、棚温度を、−２５℃に変えた。乾燥の最初のステップは、圧力上昇がチャンバ内で認められない時に終えた。その時点で、棚を、３０℃まで加熱した。温度は、圧力上昇が検出できなくなるまで、この値に保った。次に、容器を真空又は不活性ガスの下で閉じた。
【００４２】
凍結乾燥は、エネルギーを要し、費用の掛かるプロセスである：効率的に凍結乾燥するために、凍結乾燥は、通常、可能な最も高い製品温度で実施されなければならない。凍結分析装置による分析は、ＨＥＳ／トレハロース／グルタメート／ＢＣＧ配合物の安全温度（完全に固化する温度）は、−２５℃であり、この温度は、非常に理に適っており（比較的高い）、効率的な凍結乾燥に適していることを示した（図２を参照）。
【００４３】
３．ＢＣＧの力価の増加
凍結乾燥プロセスの短縮（図４）
本発明者等のＢＣＧ標準産生培地において、凍結乾燥後に必要な力価／バイアルに達するために、１０ｍｌ充填を用いる。本発明者等の標準配合により現在、凍結乾燥プロセスの後で力価の非常に大きな低下を経験する（図５参照）。１０ｍｌ充填では、凍結乾燥プロセスは１０日間になる。本発明により、５ｍｌ充填／バイアル及び２倍濃度（ｃｆｕ／ｍｌ）の生きたＢＣＧを用いることによって、凍結乾燥サイクルを短縮して同じ結果を得ることが可能である。図４は、本発明による保存組成物による、標準濃度での１０ｍｌ充填、２倍濃度での５ｍｌ充填、及びグルタミン酸ナトリウム単一での５ｍｌ充填の結果を示す。
【００４４】
本発明による保存組成物は、標準濃度、及び５ｍｌ充填／バイアルを用いる２倍濃度のいずれにおいても、１００％の保護をもたらすことが明らかである。しかし、９日間を要した、１０ｍｌ充填によるバイアルの凍結乾燥サイクルとは対照的に、５ｍｌ充填によるバイアルの凍結乾燥サイクルは、たった４日間を要しただけであった。５ｍｌ充填で標準濃度を有するグルタミン酸ナトリウム配合物は、妥当なＢＣＧ生存率をもたらしたが、凍結乾燥後に、「ケーキ」が残されなかった。
【００４５】
ＢＣＧ製品の物理的安定性の増加（図３）
ＢＣＧワクチンの標準配合（ＨＧＴ培地）、５％のグルタミン酸ナトリウム配合、及び本発明による保存組成物の間で、凍結乾燥後のガラス転移温度（すなわち、ケーキが物理的に安定である温度）を比較した。明らかに、標準配合は、本発明者等が実際に知っているように、室温での物理的安定性が劣る。グルタミン酸ナトリウムは十分に良好であるように見えるが、凍結乾燥後に「ケーキ」が残らず、再懸濁して均一な懸濁液にすることを不可能にしている点が不都合である。本発明による保存組成物は、通常の保存条件よりはるかに高い、＋７５℃の温度まで物理的に安定であり、このことは、通常好ましい。
【００４６】
長期安定性（図５）
次の実験で、本発明による保存組成物及び標準ＨＧＴ培地の長期安定性を比較した。凍結乾燥製品の安定性を昇温で評価することが通常行われる（いわゆる、加速安定性試験）。
【００４７】
この実験では、凍結乾燥直後のｃｆｕ、４℃、２０℃及び３７℃で４週間保存した後のｃｆｕの測定によって、標準配合が、１０ｍｌ充填、及び生きたＢＣＧの２倍濃度の５ｍｌ充填での本発明による保存組成物と比較される。高温での安定性の違いは明瞭である。凍結乾燥後の、標準ＨＧＴ培地での力価の低下は劇的であり、力価の低下は、製品が＋２０℃（室温）で４週間保存された時でも尚、比較的大きい。しかし、１０ｍｌでの標準濃度における、さらには２倍濃度の５ｍｌ充填における本発明による保存組成物では、力価の有意な低下は認められない。３７℃で４週間ですら、ワクチンの力価に影響するようには見えなかった。
【００４８】
ＢＣＧでの結論
１．高い（８０％）ＢＣＧ生存率で、１０％のＨＥＳ、２０％のトレハロース及び５％のＮａ−グルタメートの混合物は、安定なケーキ構造／生成によって目に見える、再現性のある結果を与えた。
２．これらの実験条件により、結果的に、残留湿分含量は＜３％となり、これは、ＷＨＯ（世界保健機関）の要件を満たす。
３．混合物中の最小５％のトレハロースにより、確固とした低い残留湿分含量（約１％）に達した。
４．少なくとも５５℃（熱帯地域に相当する）のガラス転移温度に達するために、≧３０℃の２次乾燥段階後の最終温度が必要である。
５．これらの条件は、ＷＨＯの安定性要件を満たす。
【００４９】
（例２）
ジフテリア菌／破傷風菌のシードロット
従来、ジフテリア菌及び破傷風菌のシードロットは、スキムミルクを用い、それらを凍結乾燥することによって調製される。しかし、スキムミルクは、動物由来であり、これは、現在の規制の観点から望ましくない。その結果、「動物由来のものを含まない（ａｎｉｍａｌ  ｆｒｅｅ）」、スキムミルクの代替が探し求められている。グルタメート、トレハロース及びヒドロキシエチルデンプンの混合物は、動物由来成分を含まない。本発明者等の研究室において、破傷風菌（Ｈａｒｖａｒｄ菌株４９２０５に由来するｙ−ＩＶ９）及びジフテリア菌（Ｐａｒｋ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ菌株に由来するＣＮ２０００）のシードロットが、この混合物を用い成功裏に凍結乾燥できて、スキムミルク（Ｓｕｐｅｒ  ｄｅ  Ｂｏｅｒによる液体スキムミルク；及びＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによるスキムミルク粉末から調製したスキムミルク）を用い凍結乾燥されたシードロットと同等又は一層大きい生存率を保持し得ることが見出された（結果及びさらなる詳細については図６及び７を参照）。さらに、グルタメート／トレハロース／ＨＥＳ混合物によって安定化されたジフテリア菌は、スキムミルクによって安定化されたジフテリア菌より短い誘導期を示した（図８）。
【００５０】
（例３）
ベロ細胞の凍結乾燥
通常、ベロ細胞バンクは冷凍保存される。本発明の保存混合物を用いる、乾燥状態におけるベロ細胞の安定化を調査した。他の配合物との比較が行われた。Ｓｍｉｆｆ培地に懸濁されたベロ細胞（１＊１０∧６個の細胞／ｍｌ）は、安定剤溶液により、１：１希釈し、その結果、０．５＊１０∧６個の細胞／ｍｌ、及び
・１０％のＨＥＳ＋５％のＮａ−グルタメート＋２０％のトレハロース
・２０％のトレハロース
・２０％のスクロース
・５％のＮａ−グルタメート
・１０％のＮａ−グルタメート
・Ｓｍｉｆｆ培地／Ｈ２Ｏ（１：１）
を含む溶液を得た。
【００５１】
次に、３ｍｌのバイアルに、５００μｌの得られた懸濁液（ＡからＦまで、０．５＊１０∧６個の細胞／ｍｌを含む）を充填し、凍結乾燥器の予め冷却した棚（−５０℃）に４時間置き、次いで、凍結乾燥した。
【００５２】
凍結乾燥後、乾燥したベロ細胞を、４℃で４週間保存し、次に、生存率について分析した。生存率は、乾燥したベロ細胞を、ＰＢＳ  １×（Ｇｉｂｃｏ  ＃２００１２  ｐＨ７．４）で再構成した後、生きている細胞のパーセンテージを計測することによって評価した。
【００５３】
図９に示すように、希釈Ｓｍｉｆｆ培地で凍結乾燥したベロ細胞の生存率は、生きているベロ細胞が完全に失われるという結果になった。５又は１０のＮａ−グルタメートを用いるベロ細胞の凍結乾燥は、生きているベロ細胞が、たった８又は２７％という結果になった。２０％のスクロース及び２０％のトレハロースは、５５％に達する生存率を保持できた。本調査において用いた保存混合物（１０％のＨＥＳ＋５％のＮａ−グルタメート＋２０％のトレハロース）は、凍結乾燥、及び４℃での４週間の保存後に、ベロ細胞の最高の生存率を示した。
【００５４】
（例４）
モノクローナル抗体の凍結乾燥
パイロット実験において、ポリオウイルスのＤ−抗原に対する３種のモノクローナル抗体（Ｍｏａｂ）を、ＨＥＳ、Ｎａ−グルタメート及びトレハロースを含む保存混合物を用い、凍結乾燥した。
【００５５】
０．１ｍｍｏｌ／ＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）及び１％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）に希釈したＭｏａｂを、次に、保存混合物により１：１希釈し、その結果、１０％のＨＥＳ＋５％のＮａ−グルタメート＋２０％のトレハロースを含むＭｏａｂ配合物を得た。それぞれ、１型ポリオウイルス、２型ポリオウイルス又は３型ポリオウイルスのＤ−抗原を対象とする３種のｍｏａｂを用いた。
【００５６】
これらのｍｏａｂを、異なるバッチの３価ポリオワクチンの力価（Ｄ−抗原単位、ＤＵ）を求めるために用いた。凍結乾燥したｍｏａｂ（２０℃で３週間保存）を用いて求めた効能力価を、−３０℃で保存した基準のｍｏａｂと比較した。
【表１】
2012506424.tif 000002
【００５７】
図１０及び表１に示すように、１０％のＨＥＳ＋５％のＮａ−グルタメート＋２０％のトレハロースを含むｍｏａｂ配合物は、凍結乾燥に耐性があり、凍結乾燥された時、２０℃で少なくとも３週間、Ｄ−抗原への結合の低下なしに、保存できる。
【００５８】
（例５）
不活性化ポリオワクチンの凍結乾燥
別のパイロット実験において、不活性化された３価ポリオワクチン（ＩＰＶ；５μｇ／ｍｌ；１型４１１ＤＵ／ｍｌ；２型８９ＤＵ／ｍｌ；２型３１４ＤＵ／ｍｌ）を凍結乾燥した。ＩＰＶを１：１希釈し、結果として、
・１０％のＨＥＳ＋５％のＮａ−グルタメート＋２０％のトレハロース
・２０％のトレハロース
・５％のＮａ−グルタメート
・１０％のＮａ−グルタメート
・Ｈ２Ｏ
を含むＩＰＶ配合物を得た。
【００５９】
凍結乾燥後、凍結乾燥した配合物を、分析まで４℃で保存した。凍結乾燥したワクチンの力価（Ｄ−抗原単位、ＤＵ）を、Ｄ−抗原ＥＬＩＳＡによって求め、基準の製剤と比較した。
【００６０】
図１１に示すように、ＩＰＶは、凍結乾燥のストレスに非常に敏感である。安定剤の添加なしでは、ＩＰＶの力価の７０〜９５％が失われる。トレハロース及びＮａ−グルタメートは、ある程度、回復率を増すことができた。しかし、最高の回復率は、１０％のＨＥＳ、５％のＮａ−グルタメート及び２０％のトレハロースを含む、試験されたＩＰＶ配合物で、見出された。
【００６１】
別のパイロット実験において、別の不活性化された３価ポリオワクチン（ＩＰＶ；５μｇ／ｍｌ）の凍結乾燥を、
・２０％のトレハロース
・２０％のスクロース
・１０％のＨＥＳ＋５％のＮａ−グルタメート＋２０％のトレハロース
・１０％のＨＥＳ＋５％のＮａ−グルタメート＋２０％のスクロース
を含む配合物を用いて評価した。
【００６２】
図１２に示すように、このＩＰＶロットもまた、凍結乾燥のストレスに非常に敏感である。トレハロース及びスクロースのいずれも、ある程度回復率を増すことができた。しかし、最高の回復率は、１０％のＨＥＳ、５％のＮａ−グルタメート及び２０％のスクロースを含む、試験されたＩＰＶ配合で、見出された。特に、これは、ＩＰＶ３型に対してであった。
【図１】
2012506424.tif 000003
【図２】
2012506424.tif 000004
【図３】
2012506424.tif 000005
【図４】
2012506424.tif 000006
【図５】
2012506424.tif 000007
【図６】
2012506424.tif 000008
【図７】
2012506424.tif 000009
【図８】
2012506424.tif 000010
【図９】
2012506424.tif 000011
【図１０】
2012506424.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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2012506424.tif 000016
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