(57)【要約】  本発明は、クプレドキシン（1種類以上）またはクプレドキシンのバリアント、誘導体および構造同等物であり得る化学予防剤、ならびに少なくとも1つの他の化学予防剤を含む組成物ならびに方法に関する。具体的に、これらの組成物は、緑膿菌由来のアズリンおよび/またはアズリンの50〜77残基領域（p28）を含み得る。少なくとも1つの他の化学予防剤は、タモキシフェンなどの抗エストロゲンを含み得る。本発明の組成物は、哺乳動物細胞、組織および動物における前悪性病変の発生を予防して、それにより癌を予防するために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アズリンの切断体である第1の化学予防剤、該切断体は配列番号：2および配列番号：25からなる群より選択されるアミノ酸配列の1つ以上を含む；ならびに
第2の化学予防剤
を含む医薬組成物。
【請求項２】
第2の化学予防剤が抗エストロゲンである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
第2の化学予防剤が、タモキシフェン、フェンレチニド、およびアロマターゼ阻害薬からなる群より選択される、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
該切断体が、アミノ酸1〜17、24〜31、80〜276、および297〜305からなる群より選択されるp53の1つ以上の結合部位に結合する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
該切断体がp53のN末端結合ドメインに結合する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項６】
該切断体がp53のDNA結合ドメインに結合する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
該切断体が配列番号2を含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項８】
該切断体が配列番号2からなる、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項９】
該切断体が、配列番号：26、配列番号：27、配列番号：28、配列番号：29、配列番号：30、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：34および配列番号：35からなる群より選択される配列を含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１０】
さらに、薬学的に許容され得る担体を含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１１】
薬学的に許容され得る担体が静脈内投与に適当である、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
該切断体が配列番号：2を含む、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１３】
該切断体が配列番号：2からなる、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１４】
患者に治療有効量の請求項１０記載の組成物を投与することによる哺乳動物患者の治療方法。
【請求項１５】
患者がヒトである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
患者が一般集団よりも癌が発生するリスクが高い、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
癌が、黒色腫、乳癌、膵臓癌、グリア芽腫、星状細胞腫、肺癌、結腸直腸癌、頭頚部癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌、および子宮頚癌から選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
患者が、喫煙、不充分な食事、アルコール摂取、ホルモン補充療法、高いボディマス指数、未経産、ビンロウジの使用、頻繁なマウスウォッシュの使用、ヒト乳頭腫ウイルスへの曝露、小児期および慢性の日光曝露、低年齢での最初の性交、多数の性交渉相手、経口避妊薬の使用、癌の家族歴、BRCA1およびBRCA2の遺伝子キャリア状態、乳房の新形成の前歴、家族性腺腫性ポリポーシス（FAP）、遺伝性非ポリポーシス性大腸直腸癌（HNPCC）、赤毛またはブロンドヘアおよび色白肌表現型、色素性乾皮症、ラドン、多環式芳香族炭化水素、ニッケル、クロム酸塩、ヒ素、アスベスト、クロロメチルエーテル、ベンゾ[a]ピレン、放射線への曝露またはゴムもしくは塗料由来の芳香族アミンへの職業性曝露、気道閉塞を伴う慢性閉塞性肺疾患、慢性膀胱感染、住血吸虫症、高齢、ならびに免疫無防備状態からなる群より選択される少なくとも1つのハイリスクの特徴を有する、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
患者が前悪性病変を有する、請求項１４記載の方法。
【請求項２０】
患者が、癌または前悪性病変が治癒している、請求項１４記載の方法。
【請求項２１】
医薬組成物は、 静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、吸入、局所投与、経皮パッチ、坐剤、硝子体注射および経口からなる群より選択される様式で投与される、請求項１４記載の方法。
【請求項２２】
該様式が静脈内注射である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
バイアル内に請求項１０記載の組成物を含むキット。
【請求項２４】
哺乳動物患者に、アズリンの切断体である第1の化学予防剤を投与する工程、ここで、該切断体は配列番号：2および配列番号：25からなる群より選択されるアミノ酸配列の1つ以上を含む；ならびに
該哺乳動物患者に第2の化学予防剤を投与する工程
を含む方法。
【請求項２５】
第2の化学予防剤が抗エストロゲンである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
第2の化学予防剤が、タモキシフェン、フェンレチニド、およびアロマターゼ阻害薬からなる群より選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
該切断体が、アミノ酸1〜17、24〜31、80〜276、および297〜305からなる群より選択されるp53の1つ以上の結合部位に結合する、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
該切断体がp53のN末端結合ドメインに結合する、請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
該切断体がp53のDNA結合ドメインに結合する、請求項２４記載の方法。
【請求項３０】
該切断体が配列番号2からなる、請求項２４記載の方法。
【請求項３１】
該切断体が配列番号：2を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項３２】
該切断体が、配列番号：26、配列番号：27、配列番号：28、配列番号：29、配列番号：30、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：34および配列番号：35からなる群より選択される配列を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項３３】
任意の順で、細胞にアズリンの切断体である少なくとも1種類の化学予防剤を投与する工程、ここで、該切断体は配列番号：2および配列番号：25からなる群より選択されるアミノ酸配列の1つ以上を含む、ならびに抗エストロゲンを投与することにより、乳房細胞でのp53の発現を増大させる工程を含む方法。
【請求項３４】
抗エストロゲンが、タモキシフェン、フェンレチニド、およびアロマターゼ阻害薬からなる群より選択される、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
該切断体が、アミノ酸1〜17、24〜31、80〜276、および297〜305からなる群より選択されるp53の1つ以上の結合部位に結合する、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
該切断体がp53のN末端結合ドメインに結合する、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
該切断体がp53のDNA結合ドメインに結合する、請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
該切断体が配列番号：2からなる、請求項３３記載の方法。
【請求項３９】
該切断体が配列番号：2を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項４０】
該切断体が、配列番号：26、配列番号：27、配列番号：28、配列番号：29、配列番号：30、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：34および配列番号：35からなる群より選択される配列を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項４１】
任意の順で、哺乳動物患者にタモキシフェンの治療有効用量を投与すること、ならびに該患者に、アズリンの切断体である少なくとも1種類の化学予防剤の治療有効用量を投与することにより、タモキシフェンの用量関連毒性を、その化学予防効果を減少させることなく低減させる工程を含み、ここで、該切断体は配列番号：2および配列番号：25からなる群より選択されるアミノ酸配列の1つ以上を含む、方法。
【請求項４２】
タモキシフェンの用量および該切断体の用量が同時またはほぼ同時に投与される、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
該切断体が、アミノ酸1〜17、24〜31、80〜276、および297〜305からなる群より選択されるp53の1つ以上の結合部位に結合する、請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
該切断体がp53のN末端結合ドメインに結合する、請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
該切断体がp53のDNA結合ドメインに結合する、請求項４１記載の方法。
【請求項４６】
該切断体が配列番号：2からなる、請求項４１記載の方法。
【請求項４７】
該切断体が配列番号：2を含む、請求項４１記載の方法。
【請求項４８】
該切断体が、配列番号：26、配列番号：27、配列番号：28、配列番号：29、配列番号：30、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：34および配列番号：35からなる群より選択される配列を含む、請求項４１記載の方法。
【請求項４９】
任意の順で、哺乳動物細胞に、アズリンの切断体である少なくとも1種類の化学予防剤を投与すること、ならびに抗エストロゲンを投与することにより、哺乳動物細胞においてp53へのエストロゲン受容体の結合を減少させる工程を含み、ここで、該切断体は配列番号：2および配列番号：25からなる群より選択されるアミノ酸配列の1つ以上を含む、方法。
【請求項５０】
抗エストロゲンが、タモキシフェン、フェンレチニド、およびアロマターゼ阻害薬からなる群より選択される、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
該切断体が、アミノ酸1〜17、24〜31、80〜276、および297〜305からなる群より選択されるp53の1つ以上の結合部位に結合する、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
該切断体がp53のN末端結合ドメインに結合する、請求項４９記載の方法。
【請求項５３】
該切断体がp53のDNA結合ドメインに結合する、請求項４９記載の方法。
【請求項５４】
該切断体が配列番号：2からなる、請求項４９記載の方法。
【請求項５５】
該切断体が配列番号：2を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５６】
該切断体が、配列番号：26、配列番号：27、配列番号：28、配列番号：29、配列番号：30、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：34および配列番号：35からなる群より選択される配列を含む、請求項４９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、35 U.S.C. §§ 119および120の優先権を主張し、2006年9月14に出願された米国特許仮出願第60/844,358号の優先権を主張する、2007年9月13日に出願された米国特許出願第11/854,654号の一部継続出願である2008年12月17日に出願された米国特許出願第12/337,167号の一部継続出願であり、2005年5月13日に出願された米国特許仮出願第60/680,500号および2004年10月7日に出願された米国特許仮出願第60/616,782号の優先権を主張する、2005年10月6日に出願された米国特許出願第11/244,105号の一部継続出願である。これらの先行出願の全内容は、参照により本明細書に充分に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、癌関連療法、具体的には哺乳動物の細胞、組織および動物における前癌状態病変の発症の阻害に使用されるクプレドキシンのバリアント、誘導体および構造同等物、ならびに化学予防療法のための少なくとも1つの他の化学予防剤を含む組成物に関する。本発明はまた、クプレドキシンならびにクプレドキシンのバリアント、誘導体および構造同等物、かつ化学予防療法における少なくとも1つの他の化学予防剤の使用および/または投与、および/または前癌状態病変、最終的には癌の発症を阻害するための哺乳動物における化学予防剤としての使用および/または投与に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
癌の化学予防は、侵入性の癌への癌性進行を逆転、抑制または予防するための天然、合成または生化学的薬剤の使用である。ハイリスク集団における癌の予防の最近の臨床試験により、化学予防療法は、ハイリスク患者のための現実的な治療であることが示唆されている。化学予防療法は、多病巣領域の発癌および多段階発癌の概念に基づくものである。発癌の分野において、該組織領域への一般的な発癌物質の曝露により、組織中での広汎性の上皮傷害および変異細胞の単一的増殖が生じる。該領域のこれらの遺伝的変異により、1つ以上の前癌状態または悪性病変が該領域で発症する可能性が増加する。これらの遺伝的かつ表現型的変化の段階的な蓄積において多段階的な発癌が起こる。多段階発癌の1つ以上のステップを停止することにより、癌の発生が妨げられるかまたは予防される。一般的にTsao et al., CA Cancer J Clin 54:150-180 (2004)参照。
【０００４】
アズリンおよび他のクプレドキシンは、癌細胞に対して特異的に細胞毒性である。アズリンは、J774肺癌細胞にアポトーシスを誘導する。Yamada et al., PNAS 99(22):14098-14103 (2002)。アズリンはJ774肺癌細胞に侵入して、細胞質および核画分に局在し、腫瘍抑制タンパク質p53と複合体を形成することにより、安定化し、細胞内レベルを高める、同上。アズリン媒介性アポトーシスの誘導はJ774細胞に限定されない。アズリンは、ヒト黒色腫UISO-Mel-2、ヒト乳癌MCF-7細胞および骨肉種などの癌細胞にも侵入し得る。Yamada et al., Infect Immun. 70:7054-7062 (2002); Punj et al., Oncogene. 23:2367-2378 (2004)。アズリンは、細胞内p53レベルを増加させ、Bax形成およびかかる細胞におけるアポトーシスの誘導を引き起こした。最も興味深いことに、異種移植されたMel-2またはMCF-7ヒト癌を有するヌードマウスにおけるアズリンの腹腔内注射により、かかる癌の統計学的に有意な低下がもたらされた、同上。
【０００５】
マウス乳腺器官培養物（MMOC）モデルは、乳腺発生および上皮細胞形質転換のホルモン調節の効果を研究するために、かなり、充分に確立されている。MMOCアッセイは、乳腺のホルモン誘導性構造分化および乳腺におけるDMBA誘導性の前新生物過形成性胞状結節様病変の発生の両方における潜在的化学予防剤の阻害効果を評価するために使用され得る。器官培養物において、乳腺はホルモンに応答して胞状構造に分化するか、またはカゼインおよびa-ラクトアルブミンの発現を誘導する。インスリン(I)+プロラクチン(P)+アルドステロン(A)の存在下で6日間インキュベーションした場合、若い処女動物由来の乳腺は、充分に成長した腺に分化し得る。これらの腺は、形態学的に妊娠マウスから得られた腺と似ている。アルドステロンは、エストロゲン(E)+プロゲステロン(Pg)に置き換えることができる。培地にヒドロコルチゾン(H)を含ませることにより、乳腺の機能的分化が刺激される。Mehta and Banerjee, Acta Endocrinol. 80:501 (1975); Mehta and Moon, Breast Cancer: Treatment and Prognosis 300, 300 (Basil A Stoll ed., Blackwell Press 1986)。したがって、この培養系で見られるホルモン誘導性の構造的および機能的分化は、動物の種々の生理学的段階の間に観察されるホルモンへの応答を模倣する。
【０００６】
マウスは、MMOCにおいて癌形成の前に、明確な新生物発生前の段階を示す。かかる新生物発生前の病変は、C3Hマウスではマウス乳腺腫瘍ウイルスにより、BALB/cマウスではDMBAにより誘導される。増殖期の3〜4日目の間に腺を2μg/ml DMBAに曝露し、その後インスリンのみを含む培地中で腺を2〜3週間回復させると、乳腺胞状病変（MAL）の形成が生じる。Hawthorne et al., Pharmaceutical Biology 40:70-74 (2002); Mehta et al., Methods in Cell Science 19:19-24 (1997)。さらに、DMBA誘導乳腺病変を含む腺から調製した上皮細胞の同系の宿主への移植により、乳腺癌の発症がもたらされた。Telang et al., PNAS 76:5886-5890 (1979)。病理学的に、これらの腫瘍は、同じ系統のマウスにDMBAを投与した際にインビボで観察されたものと同様のものであった、同上。
【０００７】
MMOCにおけるDMBA誘導性乳腺病変の形成は、レチノイドなどの種々の化学予防剤により阻害することができる。これらの薬剤としては、ブラシニンおよびレスベラトロール、チオール、抗酸化剤などの天然産物、OFMOおよびデグエリンなどのオルニチンでカルボキシラーゼのインヒビター、プロスタグランジン合成のインヒビター、Ca調節因子等由来の化学予防剤が挙げられる。Jang et al., Science 275:218-220 (1997); Mehta, Eur. J. Cancer 36:1275-1282 (2000); Metha et al., J. Natl. Cancer Inst. 89:212-219 (1997)。これらの試験は、この器官培養系により乳癌発生に対する化合物の有効性を調べるためのユニークなモデルが提供されることを明確に示す。結果は、かかる化合物のインビボ投与により得られた阻害と密接に対応していると予想することができる。
【０００８】
アルドステロンおよびヒドロコルチゾンの存在下、かつエストロゲンおよびプロゲステロンの非存在下で、MMOCを、エストロゲン非依存性MALを発症するように誘導することができる。また、MMOCを、乳管病変（MDL）を形成するように誘導することができる。MDLは、アルドステロンおよびヒドロコルチゾンの代わりにエストロゲンおよびプロゲステロンを培地に含ませる場合に誘導することができる。卵巣ステロイドの存在下での胞状構造は非常に小さいが、組織病理学的切片中で管内病変が観察される。Mehta et al., J. Natl. Cancer Inst. 93:1103-1106 (2001)。卵巣ホルモン依存的ER+乳癌において選択的に作用するタモキシフェンなどの抗エストロゲンは、MDL形成を阻害したがMALは阻害しなかった。そのため、従来のMAL誘導プロトコルに加えてこの改変された培養モデルは、MALおよびMOLの両方における化学予防剤の効果を評価するために使用され得る。
【０００９】
化学的に変形された実験的MMOCモデルにおいて、p53はほとんど変異を受けないかまたは改変されないが、p53の不活性化により、腫瘍の異数性の増加がもたらされる。C3(1)-Tagトランス遺伝子を有するマウスにおけるさらなる研究により、p53機能の阻害は癌遺伝子の存在下においても、腫瘍形成に決定的な事象であり得ることが示唆された。該研究は、p53がエストロゲンにより不活性化または抑制されることを示した。従って、このモデルは、前癌状態病変の発症におけるアズリンの効果および乳腺上皮細胞におけるp53発現を調節するアズリンの能力を評価するために使用され得る。このモデルは、アズリンと組み合わせたエストロゲンレセプター（ER）阻害化合物の効果を評価するためにも使用され得る。
【発明の概要】
【００１０】
態様の概要
本発明は、前癌状態病変および/または癌において化学予防効果を有するクプレドキシン（1つまたは複数）またはクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断物もしくは構造同等物であり得るペプチドを含む組成物に関する。具体的に、これらの組成物は、緑膿菌由来のアズリン、および/またはアズリンの50〜77残基領域(p28、配列番号:2)および/またはアズリンの50〜67残基領域(p18、配列番号:25)を含み得る。
【００１１】
本発明はさらに、化学予防効果を有するクプレドキシン（1つまたは複数）および/またはクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断物もしくは構造同等物を含み得る組成物に関する。これらの組成物は、特に単離ペプチドまたは医薬組成物であり得る。本発明の組成物は、哺乳動物患者における前癌状態病変および/または癌の発症を予防、阻害、予防、抑制、逆転または遅延するために使用され得る。
【００１２】
本発明はさらに、クプレドキシンおよび/またはクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断物もしくは構造同等物を含む1つ以上の化学予防剤、ならびに少なくとも1つの他の化学予防剤を含む医薬組成物に関する。
【００１３】
本発明のいくつかの態様において、クプレドキシンは、アズリン、シュードアズリン、プラストシアニン、ラスチシアニン、Laz、オーラシアニン（auracyanin）、ステラシアニンおよびキュウリ塩基性タンパク質からなる群より選択される。さらなる態様において、クプレドキシンはアズリンである。他の態様において、クプレドキシンは、緑膿菌、アルカリゲネス フェカーリス、アクロモバクター キシロスオキシダンス、気管支敗血症菌、メチロモナス種、髄膜炎菌、淋菌、蛍光菌、シュードモナス クロロラフィス、ビアス病菌および腸炎ビブリオからなる群より選択される生物由来である。特定の態様において、クプレドキシンは、緑膿菌由来である。他の態様において、クプレドキシンは緑膿菌由来のアズリンである。
【００１４】
本発明の医薬組成物のいくつかの態様において、第1化学予防剤はアズリンの切断物であり、該切断物は、配列番号:2および配列番号:25からなる群より選択されるアミノ酸配列の1つ以上を含む。さらなる態様において、該切断物は、配列番号:2を含む。別の態様において、該切断物は、配列番号:2からなる。他の態様において、該切断物は、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:31、配列番号:32、配列番号:33、配列番号:34および配列番号:35からなる群より選択される配列を含む。他の態様において、該切断物は、約10アミノ酸より大きく約100アミノ酸以下である。さらなる態様において、該切断物は、18〜28アミノ酸、28〜50アミノ酸、18〜100アミノ酸または28〜100アミノ酸である。いくつかの態様において、該切断物は、アミノ酸1〜17、24〜31、80〜276および297〜305からなる群より選択されるp53の1つ以上の結合部位に結合する。他の態様において、該切断物は、p53のN末端結合ドメインまたはp53のDNA結合ドメインに結合する。
【００１５】
本発明の医薬組成物のいくつかの態様において、少なくとも1つの他の化学予防剤（または「第2化学予防剤」）は、エストロゲンおよび/またはプロゲステロンの結合を妨げる、またはエストロゲンおよび/またはプロゲステロンの産生を妨げる抗エストロゲンである。さらなる態様において、抗エストロゲンは、タモキシフェン、フェンレチニドまたはアロマターゼインヒビターである。
【００１６】
本発明はまた、クプレドキシンおよび/またはクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断物もしくは構造同等物を含む1つ以上の化学予防剤、ならびに薬学的に許容され得る担体をさらに含む少なくとも1つの他の化学予防化学物を含む医薬組成物に関する。さらなる態様において、薬学的に許容され得る担体は、静脈投与に適する。さらなる態様において、組成物の第1の化学予防剤は、緑膿菌、アルカリゲネス フェカーリス、アクロモバクター キシロスオキシダンス、気管支敗血症菌、メチロモナス種、髄膜炎菌、淋菌、蛍光菌、シュードモナス クロロラフィス、ビアス病菌および腸炎ビブリオからなる群より選択される生物由来のクプレドキシンである。いくつかの態様において、クプレドキシンは緑膿菌由来である。他の態様において、化学予防剤は、配列番号:2および配列番号:25からなる群より選択されるアミノ酸配列の1つ以上を含むアズリンの切断物である。さらなる態様において、該切断物は配列番号:2を含む。別の態様において、該切断物は、配列番号:2からなる。
【００１７】
本発明はさらに、哺乳動物患者に、アズリンの切断物である第1の化学予防剤、第2の化学予防剤、および薬学的に許容され得る担体を含む治療有効量の上述の組成物を投与する工程を含み得る、該患者の治療方法に関し、該切断物は、配列番号:2および配列番号:25からなる群より選択されるアミノ酸配列の1つ以上を含む。さらなる態様において、該哺乳動物患者はヒトである。別の態様において、該哺乳動物患者は、一般集団よりも高い癌発症のリスクを有する。さらなる態様において、癌は、黒色腫、乳房、膵臓、グリア芽腫、星状細胞腫、肺、結腸直腸、頚部および頭部、膀胱、前立腺、皮膚ならびに子宮頚部の癌から選択される。別の態様において、該患者は、喫煙、不充分な食事、アルコール消費、ホルモン補充療法、高いボディーマスインデックス、未産、ビンロウジ使用、マウスウォッシュの高頻度使用、ヒト乳頭腫ウイルスへの曝露、幼児期および慢性日光曝露、早期の最初の性交、複数の性的パートナー、経口避妊薬の使用、癌の家族歴、BRCA1およびBRCA2の遺伝子保有状態、乳房新生組織形成の前歴、家族性腺腫性ポリポーシス（FAP）、遺伝性非ポリポーシス性大腸直腸癌（HNPCC）、赤毛または金髪および色白肌の表現型、色素性乾皮症、ラドン、多環式芳香族炭化水素、ニッケル、クロム酸塩、砒素、アスベスト、クロロメチルエーテル、ベンゾ[a]ピレン、放射線への曝露、またはゴムもしくは塗装従事曝露由来の芳香族アミンへの曝露、気道閉塞を伴う慢性閉塞性肺疾患、慢性膀胱感染症、住血吸虫症、高齢、ならびに免疫無防備状態からなる群より選択される少なくとも1つのハイリスク特徴を有する。他の態様において、患者は前悪性病変を有するか、または癌もしくは前悪性病変が治っている。さらに別の態様において、医薬組成物は、静脈内注射、筋内注射、皮下注射、吸入、局所投与、経皮パッチ、坐剤、硝子体注射および経口からなる群より選択される様式により投与される。さらなる態様において、投与形態は、静脈内注射によるものである。
【００１８】
本発明はさらに、クプレドキシンおよび/またはクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断物もしくは構造同等物である1つ以上の化学予防剤、少なくとも1つのほかの化学予防化合物ならびに薬学的に有効な担体をバイアル中に含むキットに関する。一態様において、化学予防剤は、アズリンの切断物であり、該切断物は、配列番号:2および配列番号:25からなる群より選択されるアミノ酸配列の1つ以上を含む。さらなる態様において、該キットはさらに、静脈内投与に適した薬学的に許容され得る担体を含む。
【００１９】
本発明はまた、クプレドキシンまたはクプレドキシンの切断物、誘導体もしくは構造同等物である第1の化学予防剤を投与すること、ならびに第2の化学予防剤を投与することにより、哺乳動物患者を治療する工程を含む方法に関する。いくつかの態様において、第1の化学予防剤はアズリンの切断物であり、該切断物は、配列番号:2および配列番号:25からなる群より選択されるアミノ酸配列の1つ以上を含む。さらなる態様において、該切断物は、配列番号:2を含む。別の態様において、該切断物は配列番号:2からなる。さらなる態様において、該切断物は、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:31、配列番号:32、配列番号:33、配列番号:34および配列番号:35からなる群より選択される配列を含む。いくつかの態様において、該切断物は、アミノ酸1〜17、24〜31、80〜276および297〜305からなる群より選択されるp53の1つ以上の結合部位に結合する。他の態様において、該切断物は、p53のN末端結合ドメインまたはp53のDNA結合ドメインに結合する。いくつかの態様において、他の化学予防剤は、タモキシフェン フェンレチニドまたはアロマターゼインヒビターなどの抗エストロゲンである。他の態様において、化学予防剤は、アズリン、シュードアズリン、プラストシアニン、ラスチシアニン、Laz、オーラシアニン、ステラシアニンおよびキュウリ塩基性タンパク質からなる群より選択されるクプレドキシンである。さらなる態様において、クプレドキシンはアズリンである。他の態様において、該化学予防剤は、緑膿菌、アルカリゲネス フェカーリス、アクロモバクター キシロスオキシダンス、気管支敗血症菌、メチロモナス種、髄膜炎菌、淋菌、蛍光菌、シュードモナス クロロラフィス、ビアス病菌および腸炎ビブリオからなる群より選択される生物由来のクプレドキシンである。一態様において、該化学予防剤は緑膿菌由来である。
【００２０】
本発明はまた、任意の順序で、クプレドキシンまたはクプレドキシンの切断物、誘導体、もしくは構造同等物であり得る少なくとも1つの化学予防剤を投与する工程、および抗エストロゲンを投与する工程を含む、哺乳動物細胞においてp53の発現を増大させることを含む方法に関する。いくつかの態様において、化学予防剤はアズリンの切断物であり、該切断物は配列番号:2および配列番号:25からなる群より選択されるアミノ酸配列の1つ以上を含む。さらなる態様において、該切断物は配列番号:2を含む。別の態様において、該切断物は配列番号:2からなる。さらなる態様において、該切断物は、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:31、配列番号:32、配列番号:33、配列番号:34および配列番号:35からなる群より選択される配列を含む。いくつかの態様において、該切断物は、アミノ酸1〜17、24〜31、80〜276および297〜305からなる群より選択されるp53の1つ以上の結合部位に結合する。他の態様において、該切断物は、p53のN末端結合ドメインまたはp53のDNA結合ドメインに結合する。いくつかの態様において、抗エストロゲンは、タモキシフェン、フェンレチニドまたはアロマターゼインヒビターである。いくつかの態様において、該化学予防剤は、アズリン、シュードアズリン、プラストシアニン、ラスチシアニン、Laz、オーラシアニン、ステラシアニンおよびキュウリ塩基性タンパク質からなる群より選択されるクプレドキシンである。さらなる態様において、クプレドキシンはアズリンである。他の態様において、クプレドキシンは、緑膿菌、アルカリゲネス フェカーリス、アクロモバクター キシロスオキシダンス、気管支敗血症菌、メチロモナス種、髄膜炎菌、淋菌、蛍光菌、シュードモナス クロロラフィス、ビアス病菌および腸炎ビブリオからなる群より選択される生物由来である。さらなる態様において、クプレドキシンは、緑膿菌由来である。
【００２１】
本発明はまた、任意の順序で治療有効用量のタモキシフェンを投与すること、およびクプレドキシンまたはクプレドキシンのバリアント、切断物、誘導体もしくは構造同等物などの少なくとも1つの化学予防剤の治療有効用量を投与することにより、タモキシフェンの化学予防効果を低下させることなく、タモキシフェンの用量関連毒性を低減させる工程を含む方法に関する。いくつかの態様において、化学予防剤はアズリンの切断物であり、該切断物は配列番号:2および配列番号:25からなる群より選択されるアミノ酸配列の1つ以上を含む。さらなる態様において、該切断物は配列番号:2を含む。別の態様において、該切断物は配列番号:2からなる。さらなる態様において、該切断物は、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:31、配列番号:32、配列番号:33、配列番号:34および配列番号:35からなる群より選択される配列を含む。いくつかの態様において、該切断物は、アミノ酸1〜17、24〜31、80〜276および297〜305からなる群より選択されるp53の1つ以上の結合部位に結合する。他の態様において、該切断物は、p53のN末端結合ドメインまたはp53のDNA結合ドメインに結合する。別の態様において、タモキシフェンの用量および化学予防剤の用量は、同時にまたはほぼ同時に投与される
【００２２】
他の態様において、該化学予防剤は、アズリン、シュードアズリン、プラストシアニン、ラスチシアニン、Laz、オーラシアニン、ステラシアニンおよびキュウリ塩基性タンパク質からなる群より選択されるクプレドキシンである。いくつかの態様において、クプレドキシンはアズリンである。クプレドキシンは、緑膿菌、アルカリゲネス フェカーリス、アクロモバクター キシロスオキシダンス、気管支敗血症菌、メチロモナス種、髄膜炎菌、淋菌、蛍光菌、シュードモナス クロロラフィス、ビアス病菌および腸炎ビブリオからなる群より選択される生物由来であり得る。いくつかの態様において、クプレドキシンは、緑膿菌由来である。
【００２３】
本発明はまた、哺乳動物細胞に、任意の順序でクプレドキシンまたはクプレドキシンのバリアント、切断物、誘導体もしくは構造同等物である少なくとも1つの化学予防剤を投与すること、および抗エストロゲンを投与することにより、哺乳動物細胞においてp53へのエストロゲンレセプターの結合を低減することを含む方法に関する。いくつかの態様において、化学予防剤はアズリンの切断物であり、該切断物は配列番号:2および配列番号:25からなる群より選択されるアミノ酸配列の1つ以上を含む。さらなる態様において、該切断物は配列番号:2を含む。別の態様において、該切断物は配列番号:2からなる。さらなる態様において、該切断物は、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:31、配列番号:32、配列番号:33、配列番号:34および配列番号:35からなる群より選択される配列を含む。いくつかの態様において、該切断物は、アミノ酸1〜17、24〜31、80〜276および297〜305からなる群より選択されるp53の1つ以上の結合部位に結合する。他の態様において、該切断物は、p53のN末端結合ドメインまたはp53のDNA結合ドメインに結合する。他の態様において、抗エストロゲンはタモキシフェン、フェンレチニドまたはアロマターゼインヒビターである。いくつかの態様において、該化学予防剤は、アズリン、シュードアズリン、プラストシアニン、ラスチシアニン、Laz、オーラシアニン、ステラシアニンおよびキュウリ塩基性タンパク質からなる群より選択されるクプレドキシンである。さらなる態様において、クプレドキシンはアズリンである。他の態様において、クプレドキシンは、緑膿菌、アルカリゲネス フェカーリス、アクロモバクター キシロスオキシダンス、気管支敗血症菌、メチロモナス種、髄膜炎菌、淋菌、蛍光菌、シュードモナス クロロラフィス、ビアス病菌および腸炎ビブリオからなる群より選択される生物由来である。さらなる態様において、クプレドキシンは、緑膿菌由来である。
【００２４】
本発明のこれらおよび他の局面、利点ならびに特徴は、以下の図面および具体的な態様の詳細な説明から明らかであろう。
【００２５】
配列の説明
配列番号:1. 緑膿菌由来のアズリンのアミノ酸配列（Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys）。
【００２６】
配列番号:2. p28、緑膿菌アズリン残基50〜77のアミノ酸配列（Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp）。
【００２７】
配列番号:3. ホルミジウム ラミノサム（Phormidium laminosum）由来のプラストシアニンのアミノ酸配列(Glu Thr Phe Thr Val Lys Met Gly Ala Asp Ser Gly Leu Leu Gln Phe Glu Pro Ala Asn Val Thr Val His Pro Gly Asp Thr Val Lys Trp Val Asn Asn Lys Leu Pro Pro His Asn Ile Leu Phe Asp Asp Lys Gln Val Pro Gly Ala Ser Lys Glu Leu Ala Asp Lys Leu Ser His Ser Gln Leu Met Phe Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Glu Ile Thr Phe Ser Ser Asp Phe Pro Ala Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Cys Ala Pro His Arg Gly Ala Gly Met Val Gly Lys Ile Thr Val Glu Gly)。
【００２８】
配列番号:4. チオバチルス フェロオキシダンス（Thiobacillus ferrooxidans）由来のラスチシアニンのアミノ酸配列(Gly Thr Leu Asp Thr Thr Trp Lys Glu Ala Thr Leu Pro Gln Val Lys Ala Met Leu Glu Lys Asp Thr Gly Lys Val Ser Gly Asp Thr Val Thr Tyr Ser Gly Lys Thr Val His Val Val Ala Ala Ala Val Leu Pro Gly Phe Pro Phe Pro Ser Phe Glu Val His Asp Lys Lys Asn Pro Thr Leu Glu Ile Pro Ala Gly Ala Thr Val Asp Val Thr Phe Ile Asn Thr Asn Lys Gly Phe Gly His Ser Phe Asp Ile Thr Lys Lys Gly Pro Pro Tyr Ala Val Met Pro Val Ile Asp Pro Ile Val Ala Gly Thr Gly Phe Ser Pro Val Pro Lys Asp Gly Lys Phe Gly Tyr Thr Asp Phe Thr Trp His Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Tyr Val Cys Gln Ile Pro Gly His Ala Ala Thr Gly Met Phe Gly Lys Ile Val Val Lys)。
【００２９】
配列番号:5. アクロモバクター サイクロクラステス由来のシュードアズリンのアミノ酸配列(Ala Asp Phe Glu Val His Met Leu Asn Lys Gly Lys Asp Gly Ala Met Val Phe Glu Pro Ala Ser Leu Lys Val Ala Pro Gly Asp Thr Val Thr Phe Ile Pro Thr Asp Lys Gly His Asn Val Glu Thr Ile Lys Gly Met Ile Pro Asp Gly Ala Glu Ala Phe Lys Ser Lys Ile Asn Glu Asn Tyr Lys Val Thr Phe Thr Ala Pro Gly Val Tyr Gly Val Lys Cys Thr Pro His Tyr Gly Met Gly Met Val Gly Val Val Gln Val Gly Asp Ala Pro Ala Asn Leu Glu Ala Val Lys Gly Ala Lys Asn Pro Lys Lys Ala Gln Glu Arg Leu Asp Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly Asn)。
【００３０】
配列番号:6. アルカリゲネス フェカーリス由来のアズリンのアミノ酸配列(Ala Cys Asp Val Ser Ile Glu Gly Asn Asp Ser Met Gln Phe Asn Thr Lys Ser Ile Val Val Asp Lys Thr Cys Lys Glu Phe Thr Ile Asn Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Lys Ala Ala Met Gly His Asn Val Val Val Ser Lys Lys Ser Asp Glu Ser Ala Val Ala Thr Asp Gly Met Lys Ala Gly Leu Asn Asn Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Glu Arg Val Ile Ala His Thr Ser Val Ile Gly Gly Gly Glu Thr Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Asp Tyr Ala Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ser Ile Met Lys Gly Thr Ile Glu Leu Gly Ser)。
【００３１】
配列番号:7. アクロモバクター キシロスオキシダンス亜種デントリフィカンスI由来のアズリンのアミノ酸配列(Ala Gln Cys Glu Ala Thr Ile Glu Ser Asn Asp Ala Met Gln Tyr Asn Leu Lys Glu Met Val Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val His Leu Lys His Val Gly Lys Met Ala Lys Val Ala Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Glu Ala Asp Lys Gln Gly Val Ala Thr Asp Gly Met Asn Ala Gly Leu Ala Gln Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val Ile Ala His Thr Lys Val Ile Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Ala Tyr Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Met Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Ser Asn)。
【００３２】
配列番号:8. 気管支敗血症菌由来のアズリンのアミノ酸配列(Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Ala Gly Thr Asp Gln Met Gln Phe Asp Lys Lys Ala Ile Glu Val Ser Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Arg Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val Leu Ala His Thr Lys Val Leu Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ala Lys Leu Ala Ala Gly Asp Asp Tyr Thr Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Val Asp)。
【００３３】
配列番号:9. メチロモナス種 J由来のアズリンのアミノ酸配列(Ala Ser Cys Glu Thr Thr Val Thr Ser Gly Asp Thr Met Thr Tyr Ser Thr Arg Ser Ile Ser Val Pro Ala Ser Cys Ala Glu Phe Thr Val Asn Phe Glu His Lys Gly His Met Pro Lys Thr Gly Met Gly His Asn Trp Val Leu Ala Lys Ser Ala Asp Val Gly Asp Val Ala Lys Glu Gly Ala His Ala Gly Ala Asp Asn Asn Phe Val Thr Pro Gly Asp Lys Arg Val Ile Ala Phe Thr Pro Ile Ile Gly Gly Gly Glu Lys Thr Ser Val Lys Phe Lys Val Ser Ala Leu Ser Lys Asp Glu Ala Tyr Thr Tyr Phe Cys Ser Tyr Pro Gly His Phe Ser Met Met Arg Gly Thr Leu Lys Leu Glu Glu)。
【００３４】
配列番号:10. 髄膜炎菌Z2491由来のアズリンのアミノ酸配列(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile Gln Val Ser Lys Ala Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys Thr Ser Met Gly His Asn Ile Val Ile Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp Gly Ile Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Gly Gly Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Glu Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly Lys Val Thr Leu Val Asp)。
【００３５】
配列番号:11. 蛍光菌由来のアズリンのアミノ酸配列(Ala Glu Cys Lys Thr Thr Ile Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn Thr Lys Ala Ile Glu Ile Asp Lys Ala Cys Lys Thr Phe Thr Val Glu Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Leu Val Ile Ser Lys Gln Ala Asp Met Gln Pro Ile Ala Thr Asp Gly Leu Ser Ala Gly Ile Asp Lys Asn Tyr Leu Lys Glu Gly Asp Thr Arg Val Ile Ala His Thr Lys Val Ile Gly Ala Gly Glu Lys Asp Ser Leu Thr Ile Asp Val Ser Lys Leu Asn Ala Ala Glu Lys Tyr Gly Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Ile Ser Met Met Lys Gly Thr Val Thr Leu Lys)。
【００３６】
配列番号:12. シュードモナス クロロラフィス由来のアズリンのアミノ酸配列(Ala Glu Cys Lys Val Asp Val Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn Thr Lys Glu Ile Thr Ile Asp Lys Ser Cys Lys Thr Phe Thr Val Asn Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Lys Ser Ala Asp Met Ala Gly Ile Ala Thr Asp Gly Met Ala Ala Gly Ile Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Gly Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Ile Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Ala Gly Glu Ser Tyr Glu Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Asn Ser Met Met Lys Gly Ala Val Val Leu Lys)。
【００３７】
配列番号:13. ビアス病菌9a5c由来のアズリンのアミノ酸配列(Lys Thr Cys Ala Val Thr Ile Ser Ala Asn Asp Gln Met Lys Phe Asp Gln Asn Thr Ile Lys Ile Ala Ala Glu Cys Thr His Val Asn Leu Thr Leu Thr His Thr Gly Lys Lys Ser Ala Arg Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Thr Thr Asp Met Gln Ala Val Ala Leu Ala Gly Leu His Ala Thr Leu Ala Asp Asn Tyr Val Pro Lys Ala Asp Pro Arg Val Ile Ala His Thr Ala Ile Ile Gly Gly Gly Glu Arg Thr Ser Ile Thr Phe Pro Thr Asn Thr Leu Ser Lys Asn Val Ser Tyr Thr Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Asn Phe Gly Gly)。
【００３８】
配列番号:14. キュウリ由来のステラシアニンのアミノ酸配列(Met Gln Ser Thr Val His Ile Val Gly Asp Asn Thr Gly Trp Ser Val Pro Ser Ser Pro Asn Phe Tyr Ser Gln Trp Ala Ala Gly Lys Thr Phe Arg Val Gly Asp Ser Leu Gln Phe Asn Phe Pro Ala Asn Ala His Asn Val His Glu Met Glu Thr Lys Gln Ser Phe Asp Ala Cys Asn Phe Val Asn Ser Asp Asn Asp Val Glu Arg Thr Ser Pro Val Ile Glu Arg Leu Asp Glu Leu Gly Met His Tyr Phe Val Cys Thr Val Gly Thr His Cys Ser Asn Gly Gln Lys Leu Ser Ile Asn Val Val Ala Ala Asn Ala Thr Val Ser Met Pro Pro Pro Ser Ser Ser Pro Pro Ser Ser Val Met Pro Pro Pro Val Met Pro Pro Pro Ser Pro Ser)。
【００３９】
配列番号:15. クロロフレクサス オーランチアカス（Chloroflexus aurantiacus）由来のオーラシアニンAのアミノ酸配列(Met Lys Ile Thr Leu Arg Met Met Val Leu Ala Val Leu Thr Ala Met Ala Met Val Leu Ala Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro Val Thr Ile Glu Ile Gly Ser Lys Gly Glu Glu Leu Ala Phe Asp Lys Thr Glu Leu Thr Val Ser Ala Gly Gln Thr Val Thr Ile Arg Phe Lys Asn Asn Ser Ala Val Gln Gln His Asn Trp Ile Leu Val Lys Gly Gly Glu Ala Glu Ala Ala Asn Ile Ala Asn Ala Gly Leu Ser Ala Gly Pro Ala Ala Asn Tyr Leu Pro Ala Asp Lys Ser Asn Ile Ile Ala Glu Ser Pro Leu Ala Asn Gly Asn Glu Thr Val Glu Val Thr Phe Thr Ala Pro Ala Ala Gly Thr Tyr Leu Tyr Ile Cys Thr Val Pro Gly His Tyr Pro Leu Met Gln Gly Lys Leu Val Val Asn)。
【００４０】
配列番号:16. クロロフレクサス オーランチアカス由来のオーラシアニンBのアミノ酸配列(Ala Ala Asn Ala Pro Gly Gly Ser Asn Val Val Asn Glu Thr Pro Ala Gln Thr Val Glu Val Arg Ala Ala Pro Asp Ala Leu Ala Phe Ala Gln Thr Ser Leu Ser Leu Pro Ala Asn Thr Val Val Arg Leu Asp Phe Val Asn Gln Asn Asn Leu Gly Val Gln His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp Thr Pro Asn Ala Leu Ala Trp Thr Ala Met Leu Asn Ala Gly Glu Ser Gly Ser Val Thr Phe Arg Thr Pro Ala Pro Gly Thr Tyr Leu Tyr Ile Cys Thr Phe Pro Gly His Tyr Leu Ala Gly Met Lys Gly Thr Leu Thr Val Thr Pro)。
【００４１】
配列番号:17. キュウリ由来のキュウリ塩基性タンパク質のアミノ酸配列(Ala Val Tyr Val Val Gly Gly Ser Gly Gly Trp Thr Phe Asn Thr Glu Ser Trp Pro Lys Gly Lys Arg Phe Arg Ala Gly Asp Ile Leu Leu Phe Asn Tyr Asn Pro Ser Met His Asn Val Val Val Val Asn Gln Gly Gly Phe Ser Thr Cys Asn Thr Pro Ala Gly Ala Lys Val Tyr Thr Ser Gly Arg Asp Gln Ile Lys Leu Pro Lys Gly Gln Ser Tyr Phe Ile Cys Asn Phe Pro Gly His Cys Gln Ser Gly Met Lys Ile Ala Val Asn Ala Leu)。
【００４２】
配列番号:18. 淋菌F62由来のLazのアミノ酸配列(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Gly Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile Gln Val Ser Lys Ala Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys Ala Ser Met Gly His Asn Leu Val Ile Ala Lys Ala Glu Asp Met Asp Gly Val Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Gly Gly Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Asp Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly Lys Val Thr Leu Val Asp)。
【００４３】
配列番号:19. 腸炎ビブリオ由来のアズリンのアミノ酸配列(Met Ser Leu Arg Ile Leu Ala Ala Thr Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ser Phe Gly Ala Gln Ala Ser Ala Glu Cys Glu Val Ser Ile Asp Ala Asn Asp Met Met Gln Phe Ser Thr Lys Thr Leu Ser Val Pro Ala Thr Cys Lys Glu Val Thr Leu Thr Leu Asn His Thr Gly Lys Met Pro Ala Gln Ser Met Gly His Asn Val Val Ile Ala Asp Thr Ala Asn Ile Gln Ala Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys Pro Asp Asp Glu Arg Val Tyr Ala His Thr Lys Val Val Gly Gly Gly Glu Ser Thr Ser Ile Thr Phe Ser Thr Glu Lys Met Thr Ala Gly Gly Asp Tyr Ser Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Ile Met Gln Gly Lys Phe Glu Phe Lys)。
【００４４】
配列番号:20. クロロフレクサス オーランチアカス由来のオーラシアニンBのアミノ酸57〜89のアミノ酸配列(His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp)。
【００４５】
配列番号:21. シュードモナス シリンゲアズリンのアミノ酸51〜77のアミノ酸配列(Ser Lys Lys Ala Asp Ala Ser Ala Ile Thr Thr Asp Gly Met Ser Val Gly Ile Asp Lys Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp)。
【００４６】
配列番号:22. 髄膜炎菌Lazのアミノ酸89〜115のアミノ酸配列(Ile Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp Gly Ile Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp)。
【００４７】
配列番号:23. 腸炎ビブリオアズリンのアミノ酸52〜78のアミノ酸配列(Ala Asp Thr Ala Asn Ile Gln Ala Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys Pro Asp Asp)。
【００４８】
配列番号:24. 気管支敗血症菌アズリンのアミノ酸51〜77のアミノ酸配列(Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp)。
【００４９】
配列番号:25. p18、緑膿菌アズリン残基50〜67のアミノ酸配列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly)。
【００５０】
配列番号:26. p19、緑膿菌アズリン残基50〜68のアミノ酸配列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu)。
【００５１】
配列番号:27. p20、緑膿菌アズリン残基50〜69のアミノ酸配列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp)。
【００５２】
配列番号:28. p21、緑膿菌アズリン残基50〜70のアミノ酸配列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys)。
【００５３】
配列番号:29. p22、緑膿菌アズリン残基50〜71のアミノ酸配列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp)。
【００５４】
配列番号:30. p23、緑膿菌アズリン残基50〜72のアミノ酸配列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr)。
【００５５】
配列番号:31. p24、緑膿菌アズリン残基50〜73のアミノ酸配列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu)。
【００５６】
配列番号:32. p25、緑膿菌アズリン残基50〜74のアミノ酸配列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys)。
【００５７】
配列番号:33. p26、緑膿菌アズリン残基50〜75のアミノ酸配列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro)。
【００５８】
配列番号:34. p27、緑膿菌アズリン残基50〜76のアミノ酸配列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp)。
【００５９】
配列番号:35. 緑膿菌アズリン残基36〜88のアミノ酸配列(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly)。
【００６０】
配列番号:36および83. p53のプライマーのヌクレオチド配列（フォワード: 5- GATGACTGCCATGGAGGAG -3' リバース: '-GTCCATGCAAGGTGATG -3')。
【００６１】
配列番号:37および84. 18Sのプライマーのヌクレオチド配列(フォワード5'-CATGCCCGTTCTTAGTTGGT-3' リバース: 5'-GAACGCCACTTGTCCCTCTA-3')。
【００６２】
配列番号:38. p18b、緑膿菌アズリン残基60〜77のアミノ酸配列(Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００６３】
配列番号:39. p28、緑膿菌アズリン残基66〜77のC末端12アミノ酸の配列(Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００６４】
配列番号:40. p28、緑膿菌アズリン残基68〜77のC末端10アミノ酸の配列(Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００６５】
配列番号:41. p28、緑膿菌アズリン残基67〜77のC末端11アミノ酸の配列(Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００６６】
配列番号:42は、アズリン切断物p28のバリアントのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Ala Val Val Thr Asp Thr Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００６７】
配列番号:43は、アズリン切断物p28のバリアントのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Leu Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Leu Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００６８】
配列番号:44は、アズリン切断物p28のバリアントのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Val Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Val Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００６９】
配列番号:45は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Asp Asp Pro Lys Leu Tyr Asp Lys Asp Leu Gly Ser Ala Met Gly Asp Thr Val Val Gly Gln Met Asp Ala Ala Thr Ser Leu)。
【００７０】
配列番号:46は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(アセチル化- Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp-アミド化)。
【００７１】
配列番号:47は、ヘキサペプチドのアミノ酸配列である(Val Ser Pro Pro Ala Arg)。
【００７２】
配列番号:48は、ヘキサペプチドのアミノ酸配列である(Tyr Thr Pro Pro Ala Leu)。
【００７３】
配列番号:49は、ヘキサペプチドのアミノ酸配列である(Phe Ser Phe Phe Ala Phe)。
【００７４】
配列番号:50は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Thr Pro Gly Cys)。
【００７５】
配列番号:51は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Cys Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００７６】
配列番号:52は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Cys Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００７７】
配列番号:53は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Cys Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００７８】
配列番号:54は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Thr Met Gln Cys Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００７９】
配列番号:55は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Thr Met Gln Gly Cys Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００８０】
配列番号:56は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asn Thr Gln Gly Cys Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００８１】
配列番号:57は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asn Thr Gln Gly Val Cys Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００８２】
配列番号:58は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Thr Ala Val Cys Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００８３】
配列番号:59は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Thr Ala Val Val Cys Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００８４】
配列番号:60は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Thr Val Val Cys Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００８５】
配列番号:61は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Thr Val Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００８６】
配列番号:62は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Ala Thr Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００８７】
配列番号:63は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Ala Thr Val Thr Asp Cys Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００８８】
配列番号:64は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Thr Ala Asp Cys Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００８９】
配列番号:65は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Thr Ala Asp Gly Cys Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００９０】
配列番号:66は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asn Gly Cys Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００９１】
配列番号:67は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Ala Thr Met Gly Ser Gly Leu Cys Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００９２】
配列番号:68は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Leu Thr Ala Ser Gly Leu Cys Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００９３】
配列番号:69は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００９４】
配列番号:70は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００９５】
配列番号:71は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Trp Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００９６】
配列番号:72は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００９７】
配列番号:73は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００９８】
配列番号:74は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Trp Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【００９９】
配列番号:75は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【０１００】
配列番号:76は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Trp Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【０１０１】
配列番号:77は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Thr Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【０１０２】
配列番号:78は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Trp Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【０１０３】
配列番号:79は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Trp Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
【０１０４】
配列番号:80は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(X1 Ser X2 Ala Ala Asp X3 X4 X5 Val Val X6 Asp X7 X8 Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp X9 )。
【０１０５】
配列番号:81は、修飾クプレドキシン由来ペプチドのアミノ酸配列である(X1 Asp Pro Lys Leu Tyr Asp Lys Asp Leu Gly Ser Ala X2 X3 Asp X4 Val Val X5 X6 X7 Asp Ala Ala X8 Ser X9 )。
【０１０６】
配列番号:82は、カチオンペプチドArg8のアミノ酸配列である(Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg)。
【０１０７】
配列番号85. p53と相互作用し得るアミノ酸の配列(Ser Gly Leu Asp Lys Asp)。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１−１】図1は、p28およびアズリンの効果について評価された腺の写真を表す。図1Aは、DMBA処理した腺の胞状病変の代表的な写真およびそれとDMBAと共に化学予防剤で処理した腺との比較を表す。図1B〜1Gは、胞状病変の発症におけるp28の効果の代表的な写真を表す。
【図１−２】図1B〜1Gは、胞状病変の発症におけるp28の効果の代表的な写真を表す。
【図１−３】図1B〜1Gは、胞状病変の発症におけるp28の効果の代表的な写真を表す。
【図１−４】図1B〜1Gは、胞状病変の発症におけるp28の効果の代表的な写真を表す。
【図１−５】図1B〜1Gは、胞状病変の発症におけるp28の効果の代表的な写真を表す。
【図１−６】図1B〜1Gは、胞状病変の発症におけるp28の効果の代表的な写真を表す。
【図１−７】図1B〜1Gは、胞状病変の発症におけるp28の効果の代表的な写真を表す。
【図２】図2は、DMBA誘導乳腺胞状病変に対するp28の効果を示す写真を表す。
【図３】図3は、管状病変の代表的な切片の写真およびp28の効果を表す。
【図４】図4は、DMBA誘導管状病変に対するp28の効果を示すグラフを表す。
【図５】図5は、p28ペプチド領域（配列番号2）を太字で記したアズリンの全体3D構造を表す。
【図６】図6Aは、乳腺胞状病変の代表的な切片の写真および乳腺胞状病変の発症に対するp28の効果を表す。図6Bは、乳腺病変の代表的な切片の写真およびその病変に対するp28の効果を表す。図6Cは、乳腺病変に対するp28およびタモキシフェンの効果を示すグラフを表す。
【図７−１】図7Aは、エストロゲンおよびプロゲステロンの存在下または非存在下でインキュベートした乳腺におけるp53の発現を比較したグラフを表す。図7Bは、p53発現に対するp28、タモキシフェンおよび該2つの組合せの効果を示すグラフを表す。図7Cは、MMOCの乳腺の代表的な切片におけるp53およびKi67の免疫組織化学染色の写真を表す。
【図７−２】図7Dは、マウス乳腺の代表的な切片の写真ならびに前記乳腺中のp53およびKi67に対するアズリン、p28およびタモキシフェンの効果を表す。
【図８】図8は、MMOCモデルにおけるMALの発症に対するフェンレチニドおよびp28の組合せの効果を示すグラフを表す。
【図９】図9は、MMOCモデルにおけるMDLの発症に対するタモキシフェンおよびp28の組合せの効果を示すグラフを表す。
【図１０−１】図10A〜Lは、マウス乳腺の代表的な切片の写真ならびにこれらの乳腺におけるフェンレチニドおよびp28を単独および組み合わせた効果を表す。
【図１０−２】図10A〜Lは、マウス乳腺の代表的な切片の写真ならびにこれらの乳腺におけるフェンレチニドおよびp28を単独および組み合わせた効果を表す。
【図１０−３】図10A〜Lは、マウス乳腺の代表的な切片の写真ならびにこれらの乳腺におけるフェンレチニドおよびp28を単独および組み合わせた効果を表す。
【図１０−４】図10A〜Lは、マウス乳腺の代表的な切片の写真ならびにこれらの乳腺におけるフェンレチニドおよびp28を単独および組み合わせた効果を表す。
【図１０−５】図10A〜Lは、マウス乳腺の代表的な切片の写真ならびにこれらの乳腺におけるフェンレチニドおよびp28を単独および組み合わせた効果を表す。
【図１０−６】図10A〜Lは、マウス乳腺の代表的な切片の写真ならびにこれらの乳腺におけるフェンレチニドおよびp28を単独および組み合わせた効果を表す。
【図１１−１】図11A〜Cは、アズリン由来ペプチドp18およびp28の、多様な組織形成を有する癌細胞株およびそれらの正常対応物への侵入を示す写真を表す。(A) 37℃で2時間後のAlexafluor 568で標識したp28またはp18侵入を示す写真。対照としてカチオンArg8 (配列番号:82)を使用した。
【図１１−２】(B) 37℃で2時間後のAlexafluor 568で標識したp28またはp18の同じ細胞株への侵入のフローサイトメトリー解析を表すグラフ。
【図１１−３】(C) 正常細胞の蛍光に対する増加倍数を表すグラフ。4種類の黒色腫細胞株へのp28またはp18の侵入の同様の観察は、正常細胞の蛍光に対して数倍の増加を示す。
【図１２】図12AおよびBは、癌細胞および正常細胞へのazu 60〜77(p18b)およびazu 66〜77(p12)の侵入を示す写真を表す。37℃で2時間、細胞をalexafluor 568で標識したp18b (A)またはp12 (B)とインキュベートして、共焦点顕微鏡検査により画像を記録した。
【図１３】図13AおよびBは、アズリンおよびそのペプチドの細胞膜毒性を表すグラフである。(A) 種々の濃度のp28、p18およびアズリンに37℃で10分間曝露したUISOMel-2細胞のLDH漏れアッセイ。標準的な溶解バッファ（cytotox-one試薬）を陽性対照として含めた。曝露後の蛍光の変化をk,x 560nmおよびkem 590nmで測定した。溶解バッファを100% LDH放出と規定した。データは、対照の陽性蛍光の%を表す。データは平均±SEMで示す。(B) p28、p18およびアズリンとインキュベートしたヒト赤血球からのヘモグロビン漏れ。ヒト赤血球を37℃で30分間ペプチドとインキュベートして、540nmで吸光度を測定した。0.1% Triton X-100後のヘモグロビン放出を100%ヘモグロビン放出と規定した。データは3回測定の平均±SEMを表す。
【図１４】図14A〜Dは、p28およびp18のUISO-Mel-2細胞への温度依存的かつ競合的な内在化を示す写真を表す。Alexafluor 568で標識したp28(A)またはp18 (B)の2011Mでの侵入を、異なる温度で、共焦点顕微鏡検査により評価した。(C)および(D) 未標識ペプチド存在下/非存在下（200倍過剰）での、Alexafluor 568で標識したp28(C)またはp18(D) 5μMの、37℃で30分後のUISO-Mel-2細胞への侵入の共焦点解析。
【図１５−１】図15A〜D. (A) 硫酸ヘパリン（100μg/ml）の存在下/非存在下での、28、p18(20μM)およびArg8(配列番号:82)(10μM)の、37℃で1時間後のUISO-Mel-2細胞への侵入の共焦点解析を示す写真を表す。
【図１５−２】(B) インヒビターの存在下でのp28またはp18の侵入のフローサイトメトリー解析を示すグラフ。インヒビター非存在下（対照）での細胞蛍光強度を100%とした。
【図１５−３】(C) インヒビターの存在下でのp28またはp18の線維芽細胞への侵入のFRCS解析を表すグラフ。
【図１５−４】(D) p18およびp28とカベオリンIとの共局在を示す写真を表す（パネル1）。UISO-Mel-2細胞を、Alexafluor 568で標識したp18もしくはp28(20μM)または培地と37℃で2時間インキュベートした。細胞を固定して、抗-カベオリン1免疫染色についての処理を行った。37℃で2時間後のAlexafluor 568で標識したp18またはp28(20μM)のUISO-Mel-2細胞への侵入後、抗golgin 97抗体の共焦点解析（パネル2）。Alexafluor 568で標識したアズリン、p28およびp18（赤）とmitotracker（緑）（パネル3）およびLysotracker（緑）（パネル4）色素のUISO-Mel-2細胞中の共局在。細胞を、20μMアズリン、p28、p18または培地単独と37℃でインキュベートした。90分のインキュベーション後、mitotracker/lysotrackerプローブを添加して、細胞を30分間インキュベートした。細胞をDAPI（青）で対比染色した。アズリン、p28またはp18の共局在は蛍光の黄色に見える。
【図１６】図16AおよびB. 高濃度のアズリン、p28またはp18と37℃で72時間インキュベートしたUISO-Mel-2細胞を表すグラフ。MTT (A)；直接細胞カウント(B)。対照ウェル中の細胞生存率(MTT)または細胞数を100%とした。データは平均±SEMを表す。
【図１７】図17. p28によるヒト乳癌細胞の成長阻害を表すグラフ。MCF-7細胞を37℃で24、48および72時間p28（0〜200μM）とインキュベートした。細胞数(A)およびMTTアッセイ(B)。陽性対照としてドキソルビシン（10μM）を使用した。対照ウェルの細胞数また生存率を100%とした。データは、対照の平均% ± SEMを表す。*、p<0.05。(C) p28によるMCF-7異種移植片の増殖の阻害。集団あたり最小で10匹のマウスを、10、14、21および25日目に15μmol/kg i.p.パクリタキセルで、または30日間毎日、5もしくは10mg/kg p28 i.p.で処理した。バーは、平均±SEMを表す。*、p<0.05。
【図１８】図18. (A)および(B)は、p28による乳癌細胞の細胞周期および侵入のFACS解析を表すグラフである。MCF-7(A)およびMDD2細胞(B)を、48および72時間、p28(50μM)で処理した。細胞をヨウ化プロピジウムで染色して、Yamada, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101:4770-4775 (2004)に記載されるようにフローサイトメトリーで解析した。G1、S、G2/Mおよびsub-G1（アポトーシス）期の細胞の割合を示す。(C)は、20μMのp28または10μMのカチオン（陽性対照）ペプチド、オクタアルギニン(Arg8、配列番号:82)で、37℃で2時間処理して、フェノールレッド非含有MEM中で一晩、カバースリップ上で培養したMCF-7およびMDD2細胞を表す写真を含む。赤-Alexa fluor 568標識p28、青-DAPI（核）。
【図１９】図19. (A)〜(D)は、細胞中の53およびp28レベルを表す写真である。(A) p28とのインキュベーション後のMCF-7細胞中の経時的p53レベル。処理直前のp53レベルに対する(%)増加（0時間を100%とする）。(B) GST-p28およびp53の複合体形成を示すGSTプルダウンアッセイ。左から右に、GST-p28（10および20μg/反応）、GST-MDM2およびGST単独。抗p53抗体を使用したイムノブロッティング（IB）によりp53を検出した。(C) モル過剰p28（上段）の存在下でGST-MDM2によりp53をプルダウンした。3種類の異なる抗p53抗体、Pab 1801（32〜79aa）、ab 2433（277〜296aa）およびPab1802（306〜393aa）が、p28の存在下でGST-p53固定ビーズと反応した。抗p28抗体を使用したIBにより検出されたp28（下段）。(D) モル過剰p28断片p12、p18およびp18bによるGST-p53へのp28結合についての競合。相対的な結合量（p28単独を100%と表した）。M：p28マーカー。(E) は、p28またはアズリンへの曝露後のMCF-7核抽出物中のp53 DNA結合を表すグラフである。H2O2処理MCF-7細胞の核抽出物を内部対照とした。p53-オリゴヌクレオチド複合体をp53に対するモノクローナル抗体で定量した。データは、3回の平均±SEMを表す。
【図２０】図20. p28によるサイクリン（CDKおよびCDKI）カスケードの誘導を表す写真。MCF-7(A)およびMDD2細胞(B)を、24、48および72時間、p28(50μM)に曝露し、タンパク質レベルをイムノブロッティングで測定した。p21(C)およびB1(D)の細胞内局在および相対レベル。MCF-7細胞を72時間、p28とカバースリップ上で培養した。p21およびサイクリンBを対応する特異的抗体で染色した。(E) 抗p-cdc2抗体（Santa Cruz Biotechnology, CA）でリン酸化cdc2を推定した。全ての結果は、内部対照としてのアクチンで標準化した。
【発明を実施するための形態】
【０１０９】
発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用する場合、用語「細胞」には、具体的に「単一の細胞」と記載されない限り、該用語の単数と複数のいずれも含まれる。
【０１１０】
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基の多量体を示すために互換的に使用される。該用語は、1つ以上のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的な化学アナログであるアミノ酸ポリマーに適用される。該用語は、天然のアミノ酸ポリマーにも適用される。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、限定されないが、グリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のγカルボキシル化、水酸基化およびADPリボシル化などの修飾物も含む。ポリペプチドは常に全体が直鎖ではないことが理解されよう。例えば、ポリペプチドはユビキチン化の結果として分岐していてもよく、天然のプロセッシングの事象および自然には起こらない人為的な操作によって起こる事象などの一般的に翻訳後の事象の結果として環状（分岐ありまたはなし）であってもよい。環状、分岐および分岐環状ポリペプチドは、天然の非翻訳プロセスおよび完全に合成による方法などにより合成され得る。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、用語「薬理活性」は、生物系における薬物または他の化学物質の効果を意味する。化学物質の効果は有益（治療的）または有害（毒性）であり得る。純粋な化学物質または混合物は、天然起源であり得るか（植物、動物もしくは無機物）または合成化合物であり得る。
【０１１２】
本明細書で使用する場合、用語「前癌状態」は、前癌状態または制御できない異常な細胞分裂前を意味する。
【０１１３】
本明細書で使用する場合、用語「抗エストロゲン」は、エストロゲンの活性を阻害するかそうでなければ細胞のエストロゲンの作製または使用を妨げる物質を意味する。
【０１１４】
本明細書で使用する場合、「ER」は、エストロゲンレセプターを意味する。
【０１１５】
本明細書で使用する場合、用語「病変」は、異常な組織の領域を意味する。
【０１１６】
本明細書で使用する場合、用語「病理学的状態」は、生体動物またはその一部の正常な状態の欠陥を構成する正常からの解剖学的および生理学的な逸脱を含み、生体機能の性能を遮断または改変し、種々の因子（栄養不良、公害または気候など）、特定の感染因子（ぜん虫、寄生性原生動物、細菌またはウイルスなど）、生物の遺伝的欠損（遺伝的異常など）またはこれらの因子の組合せに対する応答である。
【０１１７】
本明細書で使用する場合、用語「状態」は、生体機能の性能を遮断または改変する、生体動物またはその一部の正常な状態の欠陥を構成する正常からの解剖学的および生理学的な逸脱を含む。
【０１１８】
本明細書で使用する場合、用語「苦しむ」は、病理学的状態から回復して、または病理学的状態から回復した症状が観察されなくても、病理学的状態が現存していること、病理学的状態を有することを含む。
【０１１９】
本明細書で使用する場合、用語「化学予防」は、前癌状態病変および/または癌のリスクを低減、その発症もしくは再発を予防、抑制、逆転または遅延しようとする、生物物質または化学物質である得る薬物、ビタミン、または他の天然もしくは合成薬剤の使用である。
【０１２０】
本明細書で使用する場合、用語「第二の化学予防剤」は、前癌状態病変および/または癌のリスクを低減、その発症もしくは再発を予防、抑制、逆転または遅延しようとする生物物質または化学物質である得る、アズリン以外の薬物、ビタミン、または他の天然もしくは合成薬剤のことをいう。
【０１２１】
本明細書で使用する場合、用語「治療」は、治療対象の状態に関連する状態おまたは症状の進行または重症度を予防、低下、停止または逆転することを含む。このように、用語「治療」は、必要に応じて、医学的および/または予防的な投与を含む。治療はまた、前癌状態病変または癌などの状態の発生の予防または低下を含み得る。
【０１２２】
本明細書で使用する場合、用語「細胞増殖の阻害」は、細胞分裂および/または細胞増殖の遅延または停止を意味する。この用語はまた、細胞発生の阻害または細胞死の増加を含む。
【０１２３】
「治療有効量」は、被験体が治療されている特定の状態の既存の症状の発症の予防、低下、停止または逆転あるいはその部分的または全体的な改善に効果的な量である。治療有効量の決定は、充分に、当業者の能力の範囲内である。
【０１２４】
本明細書で使用する用語「実質的に純粋」は、本発明のタンパク質または他の細胞産物を修飾するために使用される場合、例えば、培養培地または細胞含有物から単離された、他のタンパク質および/または他の化合物を実質的に含まない形態または純度が高い形態のタンパク質のことをいう。用語「実質的に純粋」は、単離画分中、乾燥重量で少なくとも約75％、または少なくとも「75％の実質的に純粋」な量の要素のことをいう。より具体的には、用語「実質的に純粋」は、単離画分中、乾燥重量で少なくとも約85％、または少なくとも「85％実質的に純粋」な化合物のことをいう。最も具体的には、用語「実質的に純粋」は、単離画分中、乾燥重量で少なくとも約95％、または少なくとも「95％実質的に純粋」な化合物のことをいう。用語「実質的に純粋」はまた、例えば合成タンパク質が合成反応の試薬および副産物から単離された場合、本発明の合成により作製されたタンパク質または化合物を修飾するためにも使用され得る。
【０１２５】
本明細書で使用される用語「医薬等級」は、本発明のペプチドまたは化合物について言及する場合、天然の状態中に見られる物質に通常付随する合成産物および副産物を含む成分から実質的にまたは本質的に単離され、医薬としてその使用を損なう化合物から実質的または本質的に単離されるペプチドまたは化合物である。例えば、「医薬等級」ペプチドは、任意の発癌物質から単離され得る。いくつかの例において、「医薬等級」は、実質的または本質的に患者への静脈投与に不適切な組成物である任意の物質から単離されたペプチドまたは化合物を特定するために、「静脈内医薬等級」などの目的の投与方法により修飾され得る。例えば、「静脈内医薬等級」ペプチドは、SDSなどの界面活性剤およびアジ化物などの抗菌剤から単離され得る。
【０１２６】
用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋」は、天然状態で見られる材料に通常付随する成分を実質的または本質的に含まない材料のことをいう。したがって、本発明の単離されたペプチドは、好ましくは、インサイチュ環境下のペプチドに通常付随する材料を含まない。ポリペプチドの「単離された」領域は、該領域が由来するポリペプチドの全配列を含まない領域のことをいう。「単離された」核酸、タンパク質またはその断片は、限定されないが、塩基配列決定、制限酵素消化、部位特異的突然変異誘発および核酸断片の発現ベクターへのサブクローニング、ならびに実質的に純粋な量でのタンパク質またはタンパク質断片の獲得などの当業者に操作され得るようなインビボ環境から実質的に取り除かれている。
【０１２７】
用語「バリアント」は、ペプチドに関して本明細書で使用する場合、野生型ポリペプチドと比較してアミノ酸が置換、欠失または挿入されたアミノ酸配列バリアントをいう。バリアントは野生型ペプチドの切断物であり得る。「欠失」は、ポリペプチドからの1つ以上のアミノ酸の除去であり、「切断物」はポリペプチドの一方または両方の末端からの1つ以上のアミノ酸の除去である。従って、バリアントペプチドは、該ポリペプチドをコードする遺伝子の操作により作製され得る。バリアントは、ポリペプチドの薬理活性の少なくとも一部ではなく塩基組成または特性を改変することにより作製され得る。例えば、アズリンの「バリアント」は、前癌状態哺乳動物細胞の発生を阻害する能力が残っている変異型アズリンであり得る。いくつかの場合、バリアントペプチドは、ε-(3,5-ジニトロベンゾイル)-Lys残基などの非天然アミノ酸により合成される。Ghadiri & Fernholz, J. Am. Chem. Soc., 112:9633-9635 (1990)。いくつかの態様において、バリアントは、野生型ペプチドまたはその一部と比較して、20以下の置換、欠損または挿入されたアミノ酸を有する。いくつかの態様において、バリアントは、野生型ペプチドまたはその一部と比較して、15以下の置換、欠損または挿入されたアミノ酸を有する。いくつかの態様において、バリアントは、野生型ペプチドまたはその一部と比較して、10以下の置換、欠損または挿入されたアミノ酸を有する。いくつかの態様において、バリアントは、野生型ペプチドまたはその一部と比較して、6以下の置換、欠損または挿入されたアミノ酸を有する。いくつかの態様において、バリアントは、野生型ペプチドまたはその一部と比較して、5以下の置換、欠損または挿入されたアミノ酸を有する。いくつかの態様において、バリアントは、野生型ペプチドまたはその一部と比較して、3以下の置換、欠損または挿入されたアミノ酸を有する。
【０１２８】
用語「アミノ酸」は、本明細書で使用する場合、任意の天然または非天然または合成アミノ酸残基を含むアミノ酸部分、すなわち、1つ、2つ、3つ以上の炭素原子、典型的には1つの(α)炭素原子により直接連結された少なくとも1つのカルボキシル残基および少なくとも1つのアミノ残基を含む任意の部分を意味する。
【０１２９】
用語「誘導体」は、ペプチドに関して本明細書で使用される場合、目的のペプチドに由来するペプチドのことをいう。誘導体は、ペプチドが依然として基本的な活性の一部を残しているようなペプチドの化学修飾を含む。例えば、アズリンの「誘導体」は、例えば、哺乳動物細胞において血管形成を阻害する能力を残している化学修飾されたアズリンであり得る。目的物の化学修飾としては、限定されないが、ペプチドのアミド化、アセチル化、硫酸化、ポリエチレングリコール（PEG）修飾、リン酸化またはグリコシル化が挙げられる。また、誘導ペプチドは、ポリペプチドまたはその断片と、限定されないが、別のペプチド、薬物分子または他の治療剤または薬剤または検出可能なプローブなどの化合物との融合物であり得る。
【０１３０】
用語「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」は、2つの配列を整列した場合の、候補配列中のアミノ酸残基と同じであるポリペプチド中のアミノ酸残基のパーセンテージと規定される。%アミノ酸同一性を決定するために、配列を整列し、必要があれば、ギャップを導入して、最大%配列同一性を達成するが、保存置換は配列同一性の一部とは見なさない。%同一性の決定のためのアミノ酸配列整列の手順は、当業者に周知である。しばしば、BLAST、BLAST2、ALIGN2またはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの一般に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用してペプチド配列が整列される。具体的な態様において、長複雑性フィルター（long complexity filter）、期待値10、ワードサイズ3、存在度11および伸長1のデフォルトパラメーターを使用して、Blastp（国立バイオテクノロジー情報センター、Bethesda MDから入手可能)が使用される。
【０１３１】
アミノ酸配列を整列する場合、所定のアミノ酸配列Bへの、該配列との、または該配列に対する所定のアミノ酸配列A（代替的に、所定のアミノ酸配列Bへの、該配列とのまたは該配列に対する一定の%アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所定のアミノ酸配列Aと称され得る）の%アミノ酸配列同一性は：
%アミノ酸配列同一性=X/Y*100
（式中、
XはAおよびBの配列整列プログラムまたはアルゴリズム整列により同一適合として数えられたアミノ酸の数であり、
YはB中の全アミノ酸残基の数である）
として計算され得る。
【０１３２】
アミノ酸配列Aの長さが、アミノ酸配列Bの長さと同じでない場合、A対Bの%アミノ酸配列同一性はB対Aの%アミノ酸配列同一性と同じではない。長い配列と短い配列を比較する場合、短い配列が「B」配列である。例えば、切断ペプチドと対応野生型ペプチドを比較する場合、切断ペプチドが「B」配列となる。
【０１３３】
一般概要
本発明は、クプレドキシン、ならびにクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断物および構造同等物を含む組成物、ならびに哺乳動物における癌の発症の予防方法を提供する。本発明はまた、化学予防クプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、切断物および構造同等物、ならびに他の化学予防剤を含む組成物を提供する。
【０１３４】
本発明はまた、哺乳動物における癌の発症または再発を予防する能力を有するクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断物および構造同等物も提供する。本発明はまた、緑膿菌アズリン、アズリンのバリアント、誘導体、切断物および構造同等物を含む組成物、ならびに患者、特に一般の集団よりも癌の発症のリスクが高い患者の治療のためのその使用を提供する。最終的に、本発明は、前癌状態病変の前または後に哺乳動物細胞と、クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断物もしくは構造同等物を接触させること、および前癌状態および/または悪性細胞の発生を観察することにより、哺乳動物細胞、組織および動物中の癌の発症を研究する方法を提供する。これらの態様のそれぞれについて、本発明は、クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断物および構造同等物と別の化学予防剤の組合せまたは共投与を提供する。
【０１３５】
細胞への優先的な侵入
緑膿菌（Pseudomonas aerugisnosa）により合成されたレドックスタンパク質、クプレドキシンアズリンは、正常細胞には侵入せず、J774肺癌細胞に選択的に侵入してアポトーシスを誘導する。Zaborina et al., Microbiology 146:2521-2530 (2000)。アズリンはまた、ヒト黒色腫UISO-Mel-2またはヒト乳癌MCF-7細胞にも選択的に侵入して傷害し得る。Yamada et al., PNAS 99:14098-14103 (2002); Punj et al., Oncogene 23:2367-2378 (2004)。従って、アズリンは、癌細胞を標的化するが、正常細胞には侵入できないために正常細胞は標的化しない。Fialho et a.l, Recent Patents Anticancer Drug Discov. 2: 224-234 (2007)。
【０１３６】
緑膿菌由来のアズリンは、J774マウス細網肉腫細胞に選択的に侵入し、腫瘍サプレッサータンパク質p53と複合体を形成して安定化し、p53の細胞内濃度を高めてアポトーシスを誘導する。Yamada et al., Infection and Immunity 70:7054-7062 (2002)。アズリン分子の種々のドメインの詳細な研究により、アミノ酸50〜77(p28)(配列番号:2)は、内在化およびその後のアポトーシス活性に重要なタンパク質形質導入ドメイン（PTD）を表すことが示された。Yamada et al., Cell. Microbial. 7:1418-1431 (2005)。
【０１３７】
エンドサイトーシス成分を細胞侵入に裏付けるカチオン性の細胞侵入ペプチド（「CPP」）の温度依存的侵入は、アズリンおよびaa断片50〜77(p28、配列番号:2)の侵入に反映される。 Yamada, T., et al., Cell Microbiol 7: 1418-1431 (2005)。アズリンの50〜67(p18、配列番号:25)の正常細胞および悪性細胞への侵入は、p28と比較して増強されていると思われる。p18の低いKmおよび高いVmaxは、アズリンの実際のもにより近いPTDを示すaa 50〜67が、リン脂質メンバーと結合した場合、両親媒性構造を規定することを示唆する。しかしながら、エネルギー依存性エンドサイトーシスプロセスまたは孔関連プロセスは、これらのペプチドに利用可能な侵入機構だけではない。例えば、カチオン性ペプチドの侵入を阻害する、代謝インヒビターおよび膜電位インヒビターのアジ化ナトリウムおよびウアバイン（Na+ K+ ATPアーゼインヒビター）は、p18またはp28のUISO-Mel-2細胞または線維芽細胞への侵入を阻害せず（図15B、C）、いずれのペプチドも細胞膜に直接侵入し得ることが示唆された。
【０１３８】
p18、p28およびアズリンは、ダイナミン非依存的クラスリニン依存的担体媒介様式と記載される様式で、細胞膜に侵入して、カベオラに結合している後期エンドソーム、リソソームおよびゴルジ体に到達する。Kirkham, M. and Parton, R.G., Biochem Biophys Acta 1746: 349-363 (2005)。ノコダゾールによる侵入の阻害およびアクチンフィラメントを分解するサイトカラシン-Dによる関連のある阻害の欠如は、カベオラ媒介性の侵入を支持する。この侵入経路は、全体的な細胞表面成分および外見上異なる分子、すなわちデキストランについて、ならびに古典的なエンドサイトーシス経路を迂回するためにもカベオラを利用する広範囲の病原体またはそれらの産物について記載されている。脂質運搬体（raft）を破壊するため、膜構成要因を分離するためおよび膜を区分するための流体プラットフォームを提供する細胞膜ドメインを破壊するためのβ-メチルシクロデキストラン（methylcylodextran）、フィリピンまたはナイスタチンによる細胞膜からのコレステロールの枯渇により、p18(50%)およびp28(約60%)のUISO-Mel-2細胞および線維芽細胞への侵入が大きく阻害され（35%および42%、それぞれ）、p18およびp28の大部分（約60%）が、カベオラを介して細胞膜に侵入することが示された。カベオラは、シグナル伝達の調節因子として機能するカベオリン特異的タンパク質(カベオリン-1、-2または-3)の存在により規定される、細胞膜の脂質運搬陥入体の50〜100nmオメガ型サブセットである。
【０１３９】
ブレフェルジンAはゴルジ装置を破壊し、p18蓄積を阻害するので、この経路はp18およびp28の侵入ならびに細胞内輸送にも利用されている。カベオラを介したp18およびp28の細胞侵入は、N-グリコシル化のインヒビターが、UISO-Mel-2細胞中で約60%ならびに線維芽細胞中で25%および35%それぞれ、細胞侵入を低減することの証拠を示す。p18とp28の侵入の間のパーセントの差は、癌対正常細胞のN-グリコシル化膜構造の数ならびにp28およびp18のこの機構を介した関連のある侵入経路に関連する。図15B、C。
【０１４０】
アズリン、p28およびp18は全て、多くのほかの潜在的抗癌ペプチドに対して高い親和性および高い能力で癌細胞に結合する。結合後、このタンパク質/レセプター複合体は、カベオラに局在し、内在化され、最終的に（caveosomeを介して）ゴルジ体、ERおよび核へと移動すると考えられている。カベオラ媒介性の侵入に加えて、動態解析によっても、p28およびp18は、非クラスリンカベオラ媒介性プロセスで細胞膜に侵入することが示されている。クラスリンおよびカベオリン非依存的経路は、インターロイキン2レセプターおよび特定のグリコシル-ホスファチジルイノシトール（GPI）アンカータンパク質についてなどの構成的内在化機構としても存在し得る。Lamaze, C., et al., Mol Cell 7: 661-671 (2001); Sabharanjak, S., et al., Dev Cell, 2: 411-423 (2002)。
【０１４１】
正常細胞に対する癌細胞内のカベオリン-1発現の増加は、アズリン、p28およびp18の癌細胞への優先的な侵入のためだけではないようである。線維芽細胞および多くの他の正常細胞はまた、その表面に非常に多くのカベオラを有する。この所見は実施例6-12に反映され、アズリンのaa 50〜67および50〜77は、癌細胞についての選択性について現在の全てのCCPと比べて特有であること、ならびにp28のC末端10〜12アミノ酸、アズリンのaa 50〜77は、細胞周期阻害およびアポトーシス活性のためのドメインを含むことを示す。
【０１４２】
化学予防
アズリン、およびアズリン由来のペプチド、例えばp28(配列番号:2)は、化学予防特性を有する。アズリンおよびp28は、マウス乳腺および器官培養物において、前癌状態の新生物発生前の病変の形成を予防する。マウスの乳腺器官培養物モデルにおいて、50μg/mlのアズリンは、胞状病変の形成を67%阻害することが見出された。同様に、25μg/mlのp28は、胞状病変の形成を67%阻害することが見出された。実施例1参照。さらに、50μg/mlのアズリンは、管状病変の形成を79%阻害することが見出され、25μg/mlのp28は、管状病変の形成を71%阻害した。実施例1参照。共焦点顕微鏡検査およびFACにより、アズリンおよびp28は、正常マウス乳腺上皮細胞(MM3MG)および乳腺癌細胞(4T1)に侵入することが示された。p28はまた、温度、時間および濃度依存的な様式でヒト臍帯静脈上皮細胞（HUVEC）に侵入し、用量依存的な様式で、Matrigel(登録商標)にプレーティングされたHUVECの毛細管形成を阻害した。
【０１４３】
クプレドキシンのバリアント、誘導体および構造同等物、具体的にアズリンおよびp28の前癌状態の新生物発生前の病変の形成の予防における効果のさらなる裏づけが実施例2〜4に見られる。アズリンおよびp28の両方は、乳腺胞状病変およびMMOCにおける卵巣ホルモン依存的乳管病変の発生を阻害した。p28は、用量依存的様式でMALおよびMDLの発生および多様性を阻害した。該阻害は、これらの腺におけるKi67発現の低下から明らかなように、抗増殖効果のためであった。エストロゲンおよびプロゲステロン処理した腺は、ERおよびPRを発現したが、アルドステロンおよびヒドロコルチゾンとインキュベートした腺は、免疫組織化学で解析した場合、ステロイド受容体について染色されなかった。p28およびアズリンは、ホルモン依存的MALおよびエストロゲンプロゲステロン依存的MDLの両方の発生を阻害したので、アズリンおよびp28の作用は、完全にエストロゲンおよびプロゲステロンレセプターに依存的ではなく、ホルモン非依存的および依存的病変の両方に効果的であり得ると結論付けることができる。
【０１４４】
新生物発生前の病変の阻害におけるアズリンおよびp28の最も起こり得る機構が以下の実施例に開示される。剛体タンパク質ドッキングのコンピューター的手法およびクラスター解析を使用して、p53とアズリンの結合を徹底的に調べてコンピューター突然変異誘発アプローチを使用して構造結果を検証した。Apivo et al., Biochem Biophys Res Commun. 332: 965-968 (2005)参照。後の報告は、腫瘍細胞成長の抑制におけるアズリン作用のメカニズムは、p53との物理的相互作用により媒介されることを、本明細書に記載のように強く示唆している。乳癌におけるp53発現の状態は、ほぼ50〜60%の乳癌が野生型p53を含んでいることを示唆している。Junk et al., Neoplasia. 10: 450-461 (2008); Gasco et al., Breast Cancer Res. 4(2):70-76 (2002)。ある研究者により、p53の不活性化は、ヒトの癌における高頻度で有意な事象の1つであることも報告されている。Kastan, Cell. 128: 837-840 (2007)。
【０１４５】
p53の不活性化またはその作用の抑制は、エストロゲンレセプター（ER）陽性乳癌細胞において観察されている。MCF 7細胞において、ERαは、p53に直接結合して、その機能を不活性化する。Sengupta et al., Ann N Y Acad Sci. 1024: 54-71 (2004); Konduri et al., Cancer Res. 2007; 67: 7746-7755 (2007)。これらの研究は、ERα-媒介性細胞増殖およびp53媒介性アポトーシス抑制の機構の明確な可能性を示す。このERαとp53の相互作用は、ChIPアッセイにより説明されている。放射線は、安定なp53の回復に効果的であることが示されており、これらの細胞における生存発現を抑制する。放射線により作用が媒介される機構は充分には理解されていないが、これは、放射線療法によるERα-p53の結合の破壊の直接的な効果であろう。Liu et al., J. Biol. Chem. 281: 9837-9340 (2006)。
【０１４６】
ここで、p28は乳腺細胞において核p53の蓄積を増加するだけでなく、p53 RNAの発現も誘導することが知られている。本明細書の実施例2〜4に開示される結果は、エストロゲンによるp53の阻害は哺乳動物細胞におけるp53発現の低下をもたらし得ることを示す。しかしながら、エストラジオールの存在下のDMBAにより誘導される管状病変の阻害およびp53の核蓄積の増加後のp28処理により、これらの腺におけるMDL形成の抑制はp28によるp53安定化のためで得ることが示される。
【０１４７】
ここで、p28はp53の発現を増強して、前癌状態の新生物発生前の病変の形成に阻害効果を有するということも分かった。例えば実施例13〜17参照。実施例4に記載される結果により、エストロゲンの存在は、p28媒介性p53 mRNAの誘導を阻害するが、おそらくERおよびp28に対してp53タンパク質上の結合部位が異なるために、p53/p28相互作用は影響を受けないことが示される。別の興味深い観察は、p53 mRNA発現におけるアズリンとp28の作用の相違であった。
【０１４８】
従って、ここで、クプレドキシンならびにクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断物および構造同等物、具体的にはp28などのアズリンならびにアズリンのバリアント、誘導体、切断物および構造同等物は、前癌状態の新生物発生前の病変の形成、従って、癌、具体的には哺乳動物患者における乳癌の発生を阻害、抑制、遅延、予防、および/または逆転するために使用され得ることが知られている。
【０１４９】
実施例3および4に示すように、p28またはアズリンは、タモキシフェンと組み合わせると、前癌状態の新生物発生前の病変の形成、従って癌の発症において予期しない高い阻害効果を有する。タモキシフェンは、ER陽性である乳癌患者の治療において成功裡に使用される。乳癌予防治験における使用も承認されている。タモキシフェンは、哺乳動物管状病変（MDL）の発症を阻害する。タモキシフェンの作用は、エストロゲンレセプター経路に媒介されることが確立されている。タモキシフェンをクプレドキシンおよび/またはクプレドキシンのバリアント、誘導体もしくは構造同等物、例えばアズリンと組み合わせると、前癌状態の新生物発生前の病変の形成において相乗効果を有することは予想されていなかった。
【０１５０】
ER-p53複合体は、p53の発現を予防する。タモキシフェン治療により、ERのp53への結合が予防されて、そのためタモキシフェンの存在下で腺をp28とインキュベーションすることにより、これらの腺においてp53の発現が増強または増大される。実施例4および図7Aに示すように、線とタモキシフェンおよびp28のインキュベーションにより、p28単独で処理した腺と比べて予期せずに120倍のp53 mRNAの発現の増加がもたらされた。
【０１５１】
クプレドキシン間の程度の高い構造類似性のために、他のクプレドキシンおよび/またはクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断物もしくは構造同等物が哺乳動物における前癌状態病変の形成を阻害し、アズリンおよびp28がタモキシフェンと組み合わされると前癌状態病変および癌の形成に相乗的な効果を有する可能性がある。かかるクプレドキシンは、例えば細菌または植物中に見られ得る。いくつかのクプレドキシンは、緑膿菌由来のアズリンと同等の薬物動態的活性を有することが知られている。例えば、チオバチルス フェロオキシダンス由来のラスチシアニンは、マクロファージにも侵入してアポトーシスを誘導し得る。Yamada et al., Cell Cycle 3:1182-1187 (2004); Yamada et al., Cell. Micro. 7:1418-1431 (2005)。ホルミジウム ラミノサム由来のプラストシアニンおよびアクロモバクター サイクロクラステス由来のシュードアズリンもマクロファージに対して細胞毒性である。2006年2月23日に公開された米国特許公開公報第20060040269号。従って、他のクプレドキシンが本発明の組成物および方法に使用され得ることが企図される。さらに、哺乳動物において癌の形成を阻害する能力を有するクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断物および構造同等物も本発明の組成物および方法に使用され得る。これらのバリアントおよび誘導体としては、限定されないが、クプレドキシンの切断物、アミノ酸の保存置換物およびタンパク質修飾物、例えばPEG付加物およびαヘリックスの全ての炭水化物安定化物が挙げられ得る。
【０１５２】
p53による癌増殖の抑制
アズリンのアミノ酸50〜77(p28、配列番号:2)およびp53の相互作用を試験して、以下の実施例13〜17に記載する。本明細書で開示されるように、p28はヒト乳癌細胞に侵入して、ストレスに応答して機能的に活性になり、細胞周期の停止または細胞死を誘導する腫瘍抑制タンパク質であるp53に媒介される抗増殖効果を発揮する。一連のGSTプルダウンアッセイ、グリセロール勾配遠心分離、マイクロ測熱実験、単一分子力スペクトル測定およびコンピューターモデリングを使用した実験により、アズリンがp53のN末端またはDNA結合ドメインのいずれかに結合して、その細胞内レベルを増加することが示された。本明細書の実施例13〜17に記載される結果により、aa 1〜17、24〜31、80〜276または297〜305中のp28、p53のN末端およびDNA結合ドメインについての結合部位が精密になる。
【０１５３】
p53についてのアズリン結合ドメインがアズリンMet44およびMet64で記載される疎水性パッチを含むという示唆は、破壊された疎水性パッチ変異体(変異体アズリンM44KM64E)は、wtアズリンよりもヒト黒色腫(Mel-2)細胞に対する毒性が低いという証拠により裏付けられる。このことは、アズリン分子のp53結合ドメインが疎水性パッチの周囲に存在することを示す。近年のドッキング擬似試験により、野生型アズリンとの変異複合体の相互作用遊離エネルギーにおいて、約75kJ/molの有意な減少が示され、残基Met44およびMet64の周囲にあるアズリンの疎水性パッチがp53との相互作用に重要であるということが改めて示された。p28のp53結合部位中のMet64残基（p28のaa 15）のように、競合アッセイ、変異体試験およびドッキング実験により、これはp53に結合するアズリンドメインであることが示された。
【０１５４】
腫瘍抑制タンパク質p53は、主に、細胞周期進行のインヒビターである21kDaタンパク質p21/Waf1/Cip1などの、多くの遺伝子の転写調節因子として機能する核タンパク質である。p28を用いたMCF-7細胞の処理により、p53レベルが増加し、p21、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）活性の強力なインヒビター、特にG1およびG2/Mで細胞周期進行を調節するcdc2およびCDK2のそれぞれの高い細胞内レベルがもたらされた。G2/M期を通る進行において、cdc2およびCDK2キナーゼはそれぞれ、主にサイクリンBおよびサイクリンAと関連して活性化される。CDKインヒビターp21は、G2/Mに停止された細胞中で、サイクリンAと有効に結合するが、同じ条件下では、サイクリンB1はp21とは結合せず、サイクリンB1のレベルは連続的に上がる。これにより、MCF-7細胞におけるp28誘導G2/M停止は、CDK2およびサイクリンAの阻害と関連があることが示される（図20A）。
【０１５５】
MCF-7細胞におけるp21のp28誘導増加はまた、Cip/Kip CDKIファミリーの別のメンバーであるp27の時間依存的な増加も伴った。近年、Hsu et al., 2008には、p53の誘導により、ルシフェラーゼアッセイで測定した場合、p21およびp27プロモーター活性の両方が増加されたことが示されている。Cellular and Molecular Life Sciences (CMLS), 2008。また、p21およびp27プロモーターのp53 DNA結合活性は、p53インデューサー、プロゲステロンにより活性化され、この事は、p21だけでなくp27もp53により転写調節されていることを意味する。集合的に、データは、p53レベルのp28増強はその後、p21およびp27を上方制御し、MCF-7細胞内において細胞内CDK2およびサイクリンAレベルの有意な減少、ならびにG2/Mでの細胞周期の阻害を誘導することを示す（図20A）。報告されたサイクリンB1とp21の間の効果的でない結合の欠如は、サイクリンB/cdc2活性の増加を示唆し、その後p28への曝露は、p28誘導性のp21の増加が後に続く同様のパターンを反映する。リン酸化cdc2（不活性型）のp28への曝露後の増加は、サイクリンB1の細胞レベルの増加を伴い、cdc2-サイクリンB複合体の増加は、cdc2リン酸化の増加によって反映されることを示唆する。高レベルの細胞質サイクリンB1を伴うMCF-7およびMDA-MB-468ヒト乳癌細胞における同様のG2停止は、微小管の破壊因子であることが知られているノコダゾールならびにp21の転写および翻訳アクチベーターにより誘導される。オールトランス型レチノイン酸（ATRA）および酪酸ナトリウム（SB）などの分化因子は、増殖阻害の同様の現象および口内扁平上皮癌におけるG1停止を生じ、これはG1期細胞周期調節タンパク質CDK6、p21およびp27の誘導、ならびにG2期細胞周期調節タンパク質CDK2の阻害に対応する。p28はMDD2細胞においてp21を増強せず、p27はこれらの細胞中に存在しなかったので、CDK2およびサイクリンAのレベルは、有意に変化せず（図20B）、細胞周期の阻害は生じなかった。ヒト細胞におけるcdc2活性の中心的な調節因子であるCDK2およびサイクリンA複合体のp28誘導性の減少がG1停止およびG2/M停止を引き起こすことのさらなる証拠は、G2/Mでの細胞周期停止を引き起こすCDK2-サイクリン複合体を不活性化するHeLa細胞へのサイクリンA RNAiの導入後のG2遅延に見られる。
【０１５６】
Cip/Kipファミリータンパク質、例えばp21およびp27はサイクリンA依存的CDK2の潜在的インヒビターであるが、それらはサイクリンD依存的キナーゼの正の調節因子としても機能する。Cip/Kipファミリータンパク質は、CDK4およびCDK6を安定化し得る。CDK4は、乳癌、神経膠腫、肉腫および子宮頚部の腺癌などの種々の腫瘍において増幅および過剰発現され、一方でCDK6遺伝子は、扁平上皮癌、神経膠腫およびリンパ腫などの特定の種類の悪性腫瘍で増幅される。初期または制御レベルのCDK6は、CDK4よりも低いが、CDK4ではなくCDK6レベルは、p28に曝露されたMCF-7細胞において連続的に増加する。再度、p28に応答してp53およびp21が増加しなかったMDD2細胞において、CDK4およびCDK6に変化はなかった（図20B）。CDKIのInk4グループ、p16Ink4a、p15Ink4b、p18Ink4cおよびp19Ink4dはCDK4およびCDK6に特異的に結合して阻害し、細胞周期の進行をG1で調節する。MCF-7細胞においてp16Ink4a遺伝子は相同に欠失しているので、実質的に安定なCDK4レベルの存在下でCDK6の増加が観察される場合、Ink4 CDKIタンパク質は、CDK4よりも低いCDK6に対する阻害効果を示すはずである。
【０１５７】
集合的に、これらの結果により、p28がp53に結合して、p53レベルが増加し、その後CDK2-サイクリンA複合体のp21およびp27の不活性化により抗増殖活性が増幅され、インビトロで、MCF-7乳癌細胞においてG2/M細胞周期の停止が生じ、胸腺除去マウスにおいて、MCF-7異種移植片増殖の阻害が起こるということが示される。
【０１５８】
本発明の組成物
本発明は、クプレドキシンおよび/またはクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断物もしくは構造同等物などの化学予防剤を単独または少なくとも1つのほかの化学予防剤と組み合わせた化学予防剤を提供する。いくつかの態様において、第一の化学予防剤は、クプレドキシンまたはその切断物である。いくつかの態様において、第一の化学予防剤は、アズリンの切断物であり、ここで該切断物は、配列番号:2および配列番号:25からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む。該少なくとも1つのほかの化学予防剤は、タモキシフェンまたはフェンレチニドなどのエストロゲンまたはプロゲステロンの活性を阻害するもの、あるいはエキセメスタン、アナストロゾールおよびレトロゾールなどのアロマターゼインヒビター、または抗エストロゲンあるいは同様の特性を有するほかの化合物などであり得る。
【０１５９】
本発明はさらに、クプレドキシンのバリアント、誘導体切断物または構造同等物である化学予防剤を提供する。いくつかの態様において、該化学予防剤は単離される。いくつかの態様において、該化学予防剤は、実質的に純粋であるかまたは薬学等級である。他の態様において、該化学予防剤は、該化学予防剤を含むかまたは実質的に該化学予防剤からなる組成物中にある。他の態様において、化学予防剤は、化学予防剤および少なくとも1つのほかの化学予防剤の両方を含む組成物中にある。別の具体的な態様において、化学予防剤は、哺乳動物、具体的にはヒトにおいて非抗原性であり、免疫応答を引き起こさない。いくつかの態様において、化学予防剤は、完全長クプレドキシンよりも短く、クプレドキシンの薬理活性の一部を有する。具体的に、いくつかの態様において、化学予防剤は、マウス乳腺器官培養物において前癌状態病変の発生を阻害する能力を有し得る。
【０１６０】
本発明はまた、クプレドキシン、またはクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断物、もしくは構造同等物である化学予防剤の少なくとも1つを含む組成物、具体的には医薬組成物単独または、少なくとも1つのほかの化学予防剤と組み合わせた医薬組成物を提供する。具体的な態様において、該医薬組成物は、特定の投与形態、例えば限定されないが、経口、腹腔内、静脈内の投与のために設計される。かかる組成物は、水中で水和され得るか、または後の水和のために（凍結乾燥によるなどで）乾燥され得る。かかる組成物は、水以外の溶媒、例えば限定されないがアルコール中に存在し得る。
【０１６１】
クプレドキシン間の高い構造相同性のために、クプレドキシンが、アズリンおよびp28と同じ化学予防特性を有することが企図される。いくつかの態様において、クプレドキシンは、限定されないが、アズリン、シュードアズリン、プラストシアニン、ラスチシアニン、オーラシアニン、ステラシアニン、キュウリ塩基性タンパク質またはLazである。特定の具体的な態様において、アズリンは、緑膿菌、アルカリゲネス フェカーリス、アクロモバクター キシロスオキシダンス亜種デントリフィカンスI、気管支敗血症菌、メチロモナス種、髄膜炎菌、淋菌、蛍光菌、シュードモナス クロロラフィス、ビアス病菌、ウルバ ペルツシス（Ulva pertussis）または腸炎ビブリオ由来である。具体的な態様において、アズリンは緑膿菌由来である。他の具体的な態様において、クプレドキシンは、配列番号:1〜19および25であるアミノ酸配列を含む。
【０１６２】
本発明は、野生型クプレドキシンと比較して、アミノ酸置換、欠失、または挿入を有するクプレドキシンのアミノ酸配列バリアントである化学予防剤を提供する。本発明のバリアントは、野生型クプレドキシンの切断物であり得る。いくつかの態様において、本発明の化学予防剤は、全長野生型ポリペプチドよりも短いクプレドキシンの領域を含む。いくつかの態様において、本発明の化学予防剤は、約10残基より大きい、約15残基より大きい、または約20残基より大きい切断クプレドキシンを含む。いくつかの態様において、化学予防剤は、約100残基以下、約50残基以下、約40残基以下、約30残基以下、または約20残基以下の切断クプレドキシンを含む。いくつかの態様において、クプレドキシンは、化学予防剤、より具体的には配列番号:1〜19および25に対して、ならびに本発明の化学予防剤に対して、少なくとも約70%のアミノ酸配列同一性、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性または少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１６３】
具体的な態様において、化学予防剤は、緑膿菌のアズリン残基50〜77(p28、配列番号:2)、アズリン残基50〜67(p18、配列番号:25)、アズリン残基50〜68(p19、配列番号:26)、アズリン残基50〜69(p20、配列番号:27)、アズリン残基50〜70(p21、配列番号:28)、アズリン残基50〜71(p22、配列番号:29)、アズリン残基50〜72(p23、配列番号:30)、アズリン残基50〜73(p24、配列番号:31)、アズリン残基50〜74(p25、配列番号:32)、アズリン残基50〜75(p26、配列番号:33)、アズリン残基50〜76(p27、配列番号:34)またはアズリン残基36〜88(配列番号:35)を含む。他の態様において、化学予防剤は、緑膿菌のアズリン残基50〜77(配列番号:2)、アズリン残基50〜67(配列番号:25)、アズリン残基50〜68(配列番号:26)、アズリン残基50〜69(配列番号:27)、アズリン残基50〜70(配列番号:28)、アズリン残基50〜71(配列番号:29)、アズリン残基50〜72(配列番号:30)、アズリン残基50〜73(配列番号:31)、アズリン残基50〜74(配列番号:32)、アズリン残基50〜75(配列番号:33)、アズリン残基50〜76(配列番号:34)またはアズリン残基36〜88(配列番号:35)からなる。他の具体的な態様において、化学予防剤は、アズリン以外のクプレドキシンの同等な残基からなる。他のクプレドキシンバリアントがアズリン残基50〜77(配列番号:2)またはアズリン残基36〜88(配列番号:35)と同等な薬理活性を有するように設計され得ることも企図される。これを行うために、目的のクプレドキシンアミノ酸配列は、BLAST、BLAST2、ALIGN2またはMegalign (DNASTAR)を使用して緑膿菌のアズリン配列と整列され、緑膿菌のアズリンアミノ酸配列上に位置する関連のある残基、および目的のクプレドキシン配列上に見られる同等の残基、および同等のペプチドが設計される。
【０１６４】
本発明の一態様において、化学予防剤は、クロロフレクサス オーランチアカスのオーラシアニンBの少なくともアミノ酸57〜89(配列番号:20)を含む。本発明の別の態様において、化学予防剤は、シュードモナス シリンゲのアズリンの少なくともアミノ酸51〜77(配列番号:21)を含む。本発明の別の態様において、化学予防剤は、髄膜炎菌のLazの少なくともアミノ酸89〜115(配列番号:22)を含む。本発明の別の態様において、化学予防剤は、腸炎ビブリオのアズリンの少なくともアミノ酸52〜78(配列番号:23)を含む。本発明の別の態様において、化学予防剤は、気管支敗血症菌のアズリンの少なくともアミノ酸51〜77(配列番号:24)を含む。
【０１６５】
化学予防剤はまた、非天然の合成アミノ酸で作製されたペプチドを含み得る。例えば、血流中での組成物の半減期を伸長または最適化するために、非天然アミノ酸が化学予防剤に組み込まれてもよい。かかる化学予防剤としては、限定されないが、D,L-ペプチド(ジアステレオマー)、（例えば、Futaki et al., J. Biol. Chem. 276(8):5836-40 (2001); Papo et al., Cancer Res. 64(16):5779-86 (2004); Miller et al, Biochem. Pharmacol. 36(1):169-76, (1987).；通常にはないアミノ酸を含むペプチド（例えば、Lee et al., J. Pept. Res. 63(2):69-84 (2004))、オレフィン含有非天然アミノ酸の後に炭化水素ステープリング（stapling）（例えば、Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470 (2004)）、およびε-(3,5-ジニトロベンゾイル)-Lys残基を含むペプチドが挙げられる。
【０１６６】
他の態様において、本発明の化学予防剤は、クプレドキシンの誘導体である。クプレドキシンの誘導体は、ペプチドの化学修飾物であり、該ペプチドは基本的な活性の一部を依然として有する。例えば、アズリンの「誘導体」は、哺乳動物細胞、組織または動物において前癌状態病変の発生を阻害する能力を有する化学修飾されたアズリンであり得る。本発明の化学修飾としては、限定されないが、ペプチドの炭化水素安定化、アミド化、アセチル化、硫酸化、ポリエチレングリコール(PEG)修飾、リン酸化およびグリコシル化が挙げられ、該方法および技術は本明細書に開示される。また、誘導体ペプチドは、クプレドキシンまたはクプレドキシンのバリアント、誘導体もしくは構造同等物と、限定されないが別のペプチド、薬物分子または他の治療剤もしくは薬剤、または検出可能なプローブなどの化合物との融合体であり得る。本発明の誘導体としては、血流中の本発明のペプチドおよび組成物の半減期が、当該技術分野に周知のいくつかの方法によるなどして伸長または最適化され得る化学修飾物、限定されないが環状化ペプチド（例えば、Monk et al., BioDrugs 19(4):261-78, (2005); DeFreest et al., J. Pept. Res. 63(5):409-19 (2004))、NおよびC末端修飾物（例えば、Labrie et al., Clin. Invest. Med. 13(5):275-8, (1990)）、およびオレフィン含有非天然アミノ酸に炭化水素ステープリングがつながれたもの（例えば、Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470 (2004)）などが挙げられる。
【０１６７】
いくつかの態様において、クプレドキシンは、限定されないがペプチドの加水分解を低減する、ペプチドの脱アミノ化を低減する、酸化を低減する、免疫原性を低減する、および/またはペプチドの構造安定性を増大することが挙げられる方法を使用して、変形され得る。本明細書に記載される2つ以上の修飾を1つの修飾クプレドキシン由来ペプチドに組み合わせ得ること、ならびに薬学特性を向上させるために、当該技術分野に周知の本明細書に記載される1つ以上の修飾を、他の修飾と組み合わせることが企図される。かかるバリアントおよび誘導体を設計するための多くの方法が当該技術分野に周知である。
【０１６８】
生体内変化
化学予防剤、具体的にアズリンの切断物などのクプレドキシン由来ペプチドの薬物動態特性を向上させるための1つのアプローチは、生体内変化に対して感受性の低いクプレドキシン由来ペプチドのバリアントおよび誘導体を作製することである。生体内変化により、ペプチドの薬理活性が低減し得、患者の体内から排出される速度が増加し得る。これを達成する1つの方法は、最も生体内変化されやすいアミノ酸および/またはアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらのアミノ酸を、特定の変化プロセスに感受性でないものと置き換えることである。
【０１６９】
いくつかの態様において、クプレドキシン由来ペプチドは、非天然アミノ酸または修飾アミノ酸を含み得る。いくつかの態様において、特定の非天然アミノ酸を導入することでクプレドキシン由来ペプチドの薬物動態特性が高められる。かかる導入は、部位特異的であり得、インビボにおける特定の生化学的変形を回避するためになされ得る。例示的な非天然アミノ酸としては、b-アミノ酸（例えば、b3およびb2）、ホモアミノ酸、環状アミノ酸、芳香族アミノ酸、ProおよびPyr誘導体、3-置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環置換PheおよびTyr誘導体、直鎖コアアミノ酸ならびにジアミノ酸が挙げられる。かかる非天然アミノ酸は、部位直接修飾、リボソーム翻訳またはペプチドの化学合成によりペプチドに取り込まれ得る。これらの方法のそれぞれは、クプレドキシン由来ペプチドの合成に適用され得る。
【０１７０】
例えば、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、非天然クプレドキシンバリアントの作製のために非天然アミノ酸構築を用いて、野生型アミノアシル-tRNAシンテターゼ（AARS）を使用して合成され得る。Hartman, et al., PLoS One, 2(10): e972 (2007); Miranda, et al., J. Am. Chem. Soc. 129: 13153-13159 (2007)参照。リボソーム翻訳の特異性は、リボソーム翻訳を使用してペプチドに取り込まれ得る非天然アミノ酸の多様性を制限する。AAR基質である、側鎖および主鎖アナログを含む90を超える非天然構築ブロックは、カバーされていない。Hartman, et al., PLoS One, 2(10): e972 (2007)。全酵素翻訳系を使用して、高い効率で、50を超える非天然アミノ酸がペプチドに取り込まれ得、ペプチドは13個までの異なる非天然アミノ酸を含む。Hartman, et al., PLoS One, 2(10): e972 (2007)。いくつかの態様において、かかるアミノ酸がクプレドキシン由来ペプチドに取り込まれ得る。
【０１７１】
他の修飾としては、光学的に活性なα-アミノ酸の使用が挙げられ得る。光学的に活性なα-アミノ酸およびその誘導体の使用は、医薬、農薬においてキラルリガンドとしての使用にまで拡張される。特に、キラルグリシンおよびアラニン同等物は、重要な役割を果たすであろう。所定の立体化学において鏡像的に純粋な（enantiopure）α-アミノ酸を可能にするα-アミノ酸を構築するための少なくとも1つの立体選択的戦略が提唱されている。Lu, et al. 「Asymmetric Synthesis of α-amino acids: Preparation and alkylation of monocyclic iminolactones derived from α-Methyl trans-cinnamaldehyde」、2008年9月11日に公開（J. Org. Chem.に公開予定）、その開示は参照により本明細書中に援用される。修飾されたクプレドキシン由来ペプチドは、鏡像的に富化された反復を作製するために、光学的に活性なα-アミノ酸を使用して合成され得る。
【０１７２】
加水分解は、一般的に、アスパラギン酸含有ペプチドにおいて問題となる。アスパラギン酸は、脱水されて、環状イミド中間体になりやすく、潜在的に不活性なイソアスパラギン酸アナログに変換され、最終的にペプチド鎖から切断される。例えば、ペプチド配列中に、アスパラギン酸--プロリンが存在する場合、環状イミド中間体を形成する酸触媒により、ペプチド鎖が切断され得る。同様に、ペプチド配列中にアスパラギン酸--グリシンが存在する場合、環状中間体は、元のアスパラギン酸形態（無害）またはイソアスパラギン酸アナログのいずれかに加水分解され得る。実際に全てのアスパラギン酸の形態は、イソアスパラギン酸アナログに完全に転換され得る。同様に、セリンを有する配列も、加水分解されて、ペプチド鎖を切断し得る環状イミド中間体を形成し得る。該ペプチドの切断により、ペプチドの血漿半減期の低下および特定の薬理活性の低下がもたらされ得る。
【０１７３】
クプレドキシン由来ペプチドの配列中のアスパラギンおよび/またはセリンを他のアミノ酸で置換することにより、ペプチドの長い血漿半減期および増加した薬理活性の特異的な活性などの向上した薬物動態特性を有するペプチドがもたらされ得ることが企図される。1つの企図されたバリアントにおいて、クプレドキシン由来ペプチドの1つ以上のアスパラギン残基は、別のアミノ酸残基、具体的にはグルタミン酸残基で置換され得る。別の企図されたバリアントにおいて、クプレドキシン由来ペプチドの1つ以上のセリン残基は、別のアミノ酸残基、具体的にはトレオニン残基で置換されてもよい。クプレドキシン由来ペプチドのいくつかのバリアントにおいて、1つ以上のアスパラギン残基および1つ以上のセリン残基が置換される。いくつかの態様において、保存置換がなされる。他の態様において、非保存置換がなされる。
【０１７４】
アミノ酸残基の脱アミド化は、生体内変化における具体的な問題である。この塩基触媒反応は、しばしばアスパラギン--グリシンまたはグルタミン--グリシンを含む配列中に起こり、上述のアスパラギン酸--グリシン配列と同様の機構が可能になる。アスパラギン--グリシン配列の脱アミド化は、環状イミド中間体を形成し、その後加水分解されて、アスパラギン酸またはアスパラギンのイソアスパラギン酸アナログが形成される。また、環状イミド中間体は、アスパラギンのD-アスパラギン酸またはD-イソアスパラギン酸アナログへのラセミ化を引き起こし得、それらは全て潜在的にペプチドの不活性化形態を生じ得る。
【０１７５】
クプレドキシンペプチドにおける脱アミド化は、クプレドキシンのアスパラギン--グリシンまたはグルタミン--グリシン配列のグリシン、アスパラギンおよび/またはグルタミンを、別のアミノ酸で置換することにより防がれ得、ペプチドの長い血漿半減期および増加した薬理活性の特異的な活性などの薬物動態特性が向上したペプチドが生じ得る。いくつかの態様において、クプレドキシン由来ペプチドの1つ以上のグリシン残基を別のアミノ酸残基で置換する。特定の態様において、クプレドキシン由来ペプチドの1つ以上のグリシン残基をトレオニンまたはアラニン残基で置換する。いくつかの態様において、クプレドキシン由来ペプチドの1つ以上のアスパラギンまたはグルタミン残基を、別のアミノ酸残基で置換する。特定の態様において、クプレドキシン由来ペプチドの1つ以上のアスパラギンまたはグルタミン残基を、アラニン残基で置換する。他の特定の態様において、緑膿菌のアズリン(配列番号:1)の残基58および/または63のグリシン、または他のクプレドキシンの同等のグリシンを、アラニンまたはトレオニンで置換する。他の特定の態様において、緑膿菌のアズリン(配列番号:1)の残基59のメチオニンまたは別のクプレドキシン由来ペプチドの同等のメチオニン残基をアラニン残基で置換する。他の特定の態様において、緑膿菌のアズリン(配列番号:1)の残基63のグリシン、または別のクプレドキシン由来ペプチドの同等のグリシン残基をトレオニン残基で置換する。いくつかの態様において、保存置換がなされる。他の態様において、非保存置換がなされる。特定の態様において、本発明の修飾クプレドキシン由来ペプチドは、以下の配列
LSTAADMQAVVTDTMASGLDKDYLKPDD (配列番号:42).
（式中、下線が引かれたアミノ酸は、野生型緑膿菌p28配列に置換されている）を含む。
【０１７６】
可逆的および不可逆的なアミノ酸の酸化は、クプレドキシン由来ペプチドの薬理活性および/または血漿半減期が低減され得る問題も提示し得るほかの生体内変化プロセスである。システインおよびメチオニン残基は、可逆的酸化を受ける優先的な残基である。システインの酸化は、高pHで加速され、チオールはより簡単に脱プロトン化され、容易に鎖内または鎖間ジスルフィド結合を形成する。これらのジスルフィド結合は、ジチオトレイトール(DTT)またはトリス(2-カルボキシエチルホスフィン)ヒドロクロリド(TCEP)を用いた処理により、インビトロで容易に逆転され得る。化学的および光化学的経路の両方により、メチオニンは酸化されて、メチオニンスルフォキシドさらにメチオニンスルホンを形成するが、それらはどちらもほとんど逆転することが不可能である。
【０１７７】
クプレドキシン由来ペプチドの酸化は、メチオニンおよび/またはシステイン残基を他の残基で置換することにより防ぎ得ることが企図される。いくつかの態様において、クプレドキシン由来ペプチドの1つ以上のメチオニンおよび/またはシステイン残基を別のアミノ酸残基で置換する。特定の態様において、メチオニン残基をロイシンまたはバリン残基で置換する。他の特定の態様において、緑膿菌アズリン(配列番号:1)の残基56および64のメチオニン、または他のクプレドキシン由来ペプチドの同等のメチオニン残基の1つ以上をロイシンまたはバリンで置換する。いくつかの態様において、保存置換がなされる。他の態様において、非保存置換がなされる。特定の態様において、本発明のクプレドキシンペプチドは、以下の配列：
LSTAADLQGVVTDGLASGLDKDYLKPDD (配列番号:43)または
LSTAADVQGVVTDGVASGLDKDYLKPDD (配列番号:44)
（式中、下線が引かれたアミノ酸は野生型緑膿菌p28に置換されている）
の1つを含む。
【０１７８】
クプレドキシン由来ペプチドの薬理活性、血漿半減期および/または免疫原性に影響を及ぼし得る別の生体内変化プロセスは、ジケトピペラジンおよびピログルタミン酸形成である。ジケトピペラジン形成は、通常、N末端から3番目がグリシンである、特に、1位または2位がプロリンまたはグリシンである場合に起こる。該反応は、第2および第3アミノ酸の間のアミドカルボニル上のN末端の求核攻撃を伴い、これはジケトピペラジンの形態の最初の2つのアミノ酸の切断を生じる。一方で、ピログルタミン酸形成は、N末端がグルタミンであり場合にほぼ必ず起こる。これは、N末端窒素がグルタミンの側鎖カルボニル炭素を攻撃して脱アミド化ポリグルタマイルペプチドアナログを形成する反応と類似している。この変換は、N末端にアスパラギンを含むペプチドにも起こるが、程度はかなり低い。
【０１７９】
ジケトピペラジンおよびピログルタミン酸形成は、ペプチドのN末端から1位、2位または3位のグリシン、N末端から3位のプロリンまたはN末端のアスパラギンを別のアミノ酸残基で置換することによりクプレドキシン由来ペプチド中で低減され得ることが企図される。いくつかの態様において、クプレドキシン由来ペプチドのN末端から1位、2位または3位のグリシンを別のアミノ酸で置換する。特定の態様において、グリシン残基は、トレオニンまたはアラニン残基で置換される。別の態様において、クプレドキシン由来ペプチドのN末端から3位のプロリンを別のアミノ酸残基で置換する。特定の態様においてプロリンはアラニン残基で置換される。別の態様において、N末端のアスパラギンを別のアミノ酸残基で置換する。特定の態様において、アスパラギン残基をグルタミン残基で置換する。いくつかの態様において、保存置換がなされる。他の態様において、非保存置換がなされる。
【０１８０】
クプレドキシン由来ペプチドの薬理活性、血漿半減期および/または免疫原性に影響を及ぼし得る別の生体内変化プロセスは、ラセミ化である。該用語は、アミノ酸またはペプチドのキラル完全性の全体的な消失のことをいうためにあいまいに使用される。ラセミ化は、アミノ酸の1つのエナンチオマー（通常L型）のL-およびD-エナンチオマーの1:1混合物への塩基触媒変換を伴う。一般的にペプチドの安定性を向上するための1つの方法は、レトロインベルソ（retro-inverso）（D-異性体）ペプチドを作製することによる。ペプチド構造の二重逆転は、しばしば側鎖の表面位相を完全な状態で残し、生物学的に活性なペプチドを広範囲に安定化するために使用されている。Snyder et al., PLoS Biol. 2:0186-0193 (2004)。D-アミノ酸置換TatはL-アミノ酸ペプチドと同様に、細胞内に内在化される。Futaki et al., J. Biol. Chem. 276:5836-5840 (2001); Huq et al., Biochemistry 38:5172-5177 (1999)。いくつかの態様において、クプレドキシン由来ペプチドの1つ以上のアミノ酸残基は、該アミノ酸残基のD-異性体で置換される。他の態様において、クプレドキシン由来ペプチドの全てのアミノ酸残基が該残基のD-異性体で置換される。一態様において、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、クプレドキシンペプチドのレトロインベルソ（D-異性体）型である。特定の態様において、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、
DDPKLYDKDLGSAMGDTVVGQMDAATSL (配列番号:45)
である。
【０１８１】
クプレドキシン由来ペプチドを生体内変化による分解から保護するための他の方法は、N-アセチル化およびC-アミド化である。これらの誘導体は、該ペプチドを分解から保護し、クプレドキシン由来ペプチドを、天然タンパク質中のαアミノ基およびカルボキシル基の帯電状態に近いものにし得る。Nアセチル化および/またはC-アミド化を有するペプチドは、一般の供給業者により提供され得る。本発明の一態様において、クプレドキシン由来ペプチドのN末端はアセチル化され得る。本発明の別の態様において、クプレドキシン由来ペプチドのC末端はアミド化され得る。1つの特定の態様において、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、
アセチル化-LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD-アミド化(配列番号:46)
である。
【０１８２】
環化は、本明細書に記載されるクプレドキシンなどの治療ペプチドに有益であり得る生体内変化のさらなる様式である。環状化により、治療ペプチドが安定化され得、長期間の保存が可能になり、低用量で投与され、低頻度で投与され得る。環状化によりペプチドがペプチダーゼおよびプロテアーゼ分解から保護されることが示されている。環状化は、化学的または酵素的になされ得る。一般に、化学環状化は領域および立体特異性を欠くことがあり、環状化の代わりに多量体化を生じ、複雑な多段階プロセスを必要とすることがあるので、酵素環状化は、化学環状化よりも問題が少ない。実際に、チオエーテル環状化は、タンパク質溶解酵素に対してジスルフィド結合よりも保護的で安定であることが示されている。
【０１８３】
酵素環状化は、ランチビオティクス-(メチル（mehtlyl）)ランチオニン-含有細菌ペプチドにおいて示されている。例えば、R. Rink, et al., 「Lantibiotic Structures as Guidelines for the Design of Peptides That Can Be Modified by Lantibioitic Enzymes」 44 Biochem., 8873-82 (2005); R. Rink, et al., 「Production of Dehydroamino Acid-Containing Peptides by Lactococcus lactis」 73:6 Applied and Environmental Microbiology, 1792-96 (2007); R. Rink, et al., 「NisC, the Cylcase of the Lantibiotic Nisin, Can Catalyze Cyclization of Designed Nonlantibiotic Peptides」 46 Biochem., 13179-89 (2007)（それぞれは、その全体において参照により本明細書に援用される）。ランチビオティクスは、グラム陽性菌により産生され、グラム陽性菌の増殖を阻害する。ランチビオティクスにおいて、デヒドロアラニンおよびデヒドロブチリンは、セリンおよびトレオニン残基の酵素媒介脱水により生じる。次いで、システインが酵素により脱水セリンおよびトレオニン残基に結合されて、チオエーテル環状化が形成される。天然に存在するランチビオティクスは、残基間が19残基まで離れるようなチオエーテル結合を介したカップリングを示す。チオエーテル環形成は、リーダーペプチドに依存する。環の位置は、シクラーゼ媒介位置および立体特異的な閉環ならびに脱水性セリンおよびトレオニン残基の位置に依存する。
【０１８４】
最も良好に特徴付けられたランチビオティクスは、ナイシン-ラクトコッカス ラクチスにより産生される5環式ペプチド抗生物質である。ナイシンは、4つのメチルランチオニン、1つのランチオニン、2つのデヒドロアラニン、1つのデヒドロブチリンおよび26個の未修飾アミノ酸からなる。ナイシンの5つのチオエーテル架橋は、システイン残基をセリンおよびトレオニンに由来するデヒドロアラニンおよびデヒドロブチリン残基への付加により形成される。ナイシンは、膜結合酵素複合体により翻訳後に導入されるチオエーテル含有アミノ酸を含む。該酵素複合体としては、トランスポーターNisT、セリンおよびトレオニン脱水酵素NisBおよびシクラーゼNisCが挙げられる。NisBはセリンおよびトレオニン残基を脱水し、デヒドロアラニンおよびデヒドロブチリンのそれぞれに転換する。その後、NisCが、システインの形成された脱水残基への対称選択性カップリングを触媒する。NisTは、修飾プレナイシンの排出を促進する。別の酵素NisPは、プレナイシンからナイシンリーダーペプチドを切断する。
【０１８５】
シクラーゼNisCは、充分に特徴付けられている。Li et al, 「Structure and Mechanism of the Lantibiotic Cylclase Involved in Nisin Biosynthesis」 311 Science, 1464-67 (2006) (その全体において、参照により本明細書に援用される)。
【０１８６】
ランチビオティクスにおける環状化の解析により、環状化を助けるペプチドのアミノ酸配列および特性の同定がなされている。NisB酵素は、特定のアミノ酸がセリンおよびトレオニン残基の隣にある場合により高頻度で脱水することが示されている。環状化は、ランチビオティクスプロペプチドにおいて、疎水性、非芳香族残基がセリンおよびトレオニン残基の近位にある場合により高頻度で起こることが示されている。典型的に、修飾システインの隣にある残基は、修飾トレオニンおよびセリンの隣にある残基よりも疎水性が低い。ヘキサペプチドVSPPAR(配列番号:47)、YTPPAL(配列番号:48)およびFSFFAF(配列番号:49)などで例外が見られる。該ヘキサペプチドは、3または4位にプロリンが存在すること、または両隣にフェニルアラニンを有することにより脱水が妨げられることを示唆する。典型的に、環は、脱水残基とC末端に位置するシステインを結合することにより形成される。しかしながら、環は、脱水残基をN末端に位置するシステインに結合することにより形成されることもある。
【０１８７】
ナイシン脱水および輸送酵素はナイシンに特異的ではなく、実際は非ナイシンペプチド（および非ランチビオティクスペプチド）を修飾するために使用され得ることが示されている。NisBは、ヒトペプチドホルモンなどのペプチドが、そのN末端でランチビオティックリーダーペプチドに融合している場合に、該ペプチド中のセリンおよびトレオニン残基を脱水することが示されている。非ランチビオティックペプチドにおいて、同様の環形成特性が適用される；すなわち脱水の程度は、脱水性セリンおよびトレオニン残基の隣にある領域のアミノ酸により制御され得る。セリンおよびトレオニンの周囲に疎水性隣接残基（例えばアラニンおよびバリン）が存在することにより、充分な脱水が可能になり、そのためにチオエーテル環形成が増強される。N末端アスパラギン酸およびC末端隣接アルギニンが存在することで脱水が妨げられた。プロリン残基およびフェニルアラニン残基が存在することは脱水には好ましくないということも示されている。一般的に、親水性隣接残基が存在すると、セリンおよびトレオニン残基の脱水が阻害される。疎水性隣接は脱水に好ましく、親水性隣接は脱水に好ましくない。研究により、脱水が生じる場合、セリンおよびトレオニンの隣接残基の平均疎水性は正--N末端側で.40およびC末端側で.13であることが示された。また、脱水されないセリンおよびトレオニンに隣接する残基の平均疎水性は、負--N末端側で-.36およびC末端側で-1.03である。一連の隣接トレオニン残基が存在することで脱水は制限されず、ナイシンリーダーペプチドと脱水される残基の間の距離で制限されない。
【０１８８】
NisCは、天然に存在するランチビオティクスに関連しないペプチド中のチオエーテル環の位置特異的な形成を触媒することが示されている。一般的に、かかるペプチドはナイシンリーダーペプチドに融合しているはずである。いくつかの場合、例えばデヒドロアラニンがシステインから2アミノ酸離れている場合、チオエーテル環は、自発的に形成され得る。自発的な環状化とは異なり、NisCが触媒する環状化は、脱水されるプレ-ナイシンに立体特異的である。結果的に、ナイシン中のメチルランチオニンおよびランチオニンは、DL立体配置にある。非ランチビオティックペプチドの環状化も立体特異的であると考えられる。
【０１８９】
これらの原理は、クプレドキシンならびにそのバリアントおよび切断物などの本明細書に記載の化合物に適用され得る。
【０１９０】
チオエーテル架橋
天然では、ランチビオティック酵素誘導チオエーテル架橋（bridge）は、未架橋の19までのアミノ酸とで生じる。未架橋の2〜4個のアミノ酸とのチオエーテル架橋が豊富である。
【０１９１】
いくつかの態様において、本発明の化学予防剤、具体的にはクプレドキシンおよびクプレドキシンの誘導体、バリアント、切断物または構造同等物、例えば切断アズリンは、構造中にチオエーテル架橋を導入することにより修飾され得る。例えば、アズリン切断物p28（配列番号:2）は、この方法を使用して修飾され得る。ソフトウェアパッケージGROMACS（www.gromacs.org）を使用した拡張分子ダイナミクスシミュレーション（70ns）により、6〜16位のp28αヘリックスの領域は37℃で不安定であること、およびペプチドはβシート立体構造をとる傾向があることが示唆される。このことは、p53との相互作用の原因であると推定される分子の一部は溶媒に曝露されたままであるという事実と共に、p28のこの領域にチオエーテル架橋を導入することで、その機能は影響を受けないということを示唆する。
【０１９２】
2012512259.tif 000002
構造1：αヘリックス構造を有するアズリン切断物
【０１９３】
2012512259.tif 000003
構造2：70nsシミュレーションの結果
【０１９４】
p28のアミノ酸配列は、配列番号:2(LSTAADMQGVVIDGMASGLDKDYLKPDD)である。p18として知られるアミノ酸配列は配列番号:25(LSTAADMQGVVTDGMASG)である。配列SGLDKD(配列番号85)は、p53と相互作用し得る。チオエーテル架橋は、N側のSer/ThrからC側のCysの間に形成され得る。セリン/トレオニンは脱水され、その後システインに結合される。トレオニンはセリンよりも容易に脱水されるので好ましい。一般的に、トレオニンに対する疎水性隣接領域（少なくとも1つ）は、脱水の程度強めるので好ましい。隣接残基である負に帯電したアミノ酸のグルタミン酸およびアスパラギン酸は、脱水に対して強い負の効果を有する。一般的に、親水性隣接残基、特にグリシンは、脱水には好ましくない。Cysの前は、帯電した親水性残基、特にグルタミン酸/アスパラギン酸がわずかに好ましい。チオエーテル環の大きさに応じて、環の一員となるアミノ酸のかさ高さは重要である。
【０１９５】
一態様において、切断アズリン配列はLSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLTPGC(配列番号:50)である。p28の25位および28位の間にチオエーテル架橋が形成され、カルボキシペプチダーゼから充分に保護される。2、3および25位は脱水されるが、いずれも重要な配列でなく、p53との相互作用に関連のあると考えられる配列でなく、チオエーテル環の導入により改変される。このように、ペプチド活性を、変化させるべきではない。トレオニンは二つの疎水性アミノ酸の間にあるので、特異的なガイドラインに従って、脱水酵素NisBにより充分に脱水されると考えられる。Rink et al., Biochemistry 2005参照。同じガイドラインによって、特にアスパラギン酸がシステインの前に位置するので、シクラーゼNisCによる25位および28位に関連する環状化も予想される。
【０１９６】
別の態様において、切断アズリン配列はLSTAADCQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(配列番号:51)であり、3位と7位の間にチオエーテル架橋が形成される。3位と7位の間の環は、ナイシンの環Aを模倣し、2位に存在するトレオニンを利用する。6位のアスパラギン酸が環状化に好ましい。
【０１９７】
別の態様において、切断アズリン配列はLSTAACMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(配列番号:52)であり、チオエーテル架橋の形成に2位のトレオニンが利用される。
【０１９８】
別の態様において、先の段落に記載された切断アズリン中の2つ以上のチオエーテル環を1つのペプチドに合わせる。
【０１９９】
別の態様において、硫黄架橋下で1つのランチオニンおよび2〜3のさらなるアミノ酸の環を有するペプチドを解析することにより、トレオニン環について、多くの切断アズリン配列を作製してスクリーニングすることができる。これは、以下の配列：
LSTACDMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD (配列番号:53)
LSTAATMQCVVTDGMASGLDKDYLKPDD (配列番号:54)
LSTAATMQGCVTDGMASGLDKDYLKPDD (配列番号:55)
LSTAANTQGCVTDGMASGLDKDYLKPDD (配列番号:56)
LSTAANTQGVCTDGMASGLDKDYLKPDD (配列番号:57)
LSTAADMTAVCTDGMASGLDKDYLKPDD (配列番号:58)
LSTAADMTAVVCDGMASGLDKDYLKPDD (配列番号:59)
LSTAADMQTVVCDGMASGLDKDYLKPDD (配列番号:60)
LSTAADMQTVVTCGMASGLDKDYLKPDD (配列番号:61)
LSTAADMQATVTCGMASGLDKDYLKPDD (配列番号:62)
LSTAADMQATVTDCMASGLDKDYLKPDD (配列番号:63)
LSTAADMQGVTADCMASGLDKDYLKPDD (配列番号:64)
LSTAADMQGVTADGCASGLDKDYLKPDD (配列番号:65)
LSTAADMQGVVTNGCASGLDKDYLKPDD (配列番号:66)
の1つまたはその組合せを含み得る。
【０２００】
実務的アプローチは、多くのかかる配列を遺伝的に作製し、修飾の程度および産生のレベルに基づいて精製のための集団を選択することである。
【０２０１】
別の態様において、p28(配列番号:2)の12位のトレオニンと該ペプチドのC末端の間にチオエーテル架橋が形成される。13位のCαと28位のアスパラギン酸の距離は17.52Åであり得、1.5ナノメートルより大きく、ペプチドの構造の有意な変化が示唆される。
【０２０２】
2012512259.tif 000004
構造3：シミュレーションした構造中のCα原子間の距離に基づくチオエーテル架橋位置の測定。
【０２０３】
別の態様において、ペプチド配列はLSTAADMQGVVTATMGSGLCKDYLKPDD(配列番号:67)であり、14位から2位のチオエーテル架橋の距離は4.38Åである。13位のアスパラギン酸のアラニンへの変異は、14位のトレオニンの脱水に好ましい。16位のアラニンのグリシンへの変異は、17位のセリンの脱水を完全に妨げ環状化を増強する。
【０２０４】
別の態様において、ペプチド配列は、LSTAADMQGVVTDLTASGLCKDYLKPDD(配列番号:68)であり、15位から20位のチオエーテル架橋の距離は5.83Åである。この状況で、14位のグリシンのロイシンへの変異は、15位のトレオニンの脱水に好ましい。
【０２０５】
三次構造安定化
クプレドキシン由来ペプチドの三次構造の安定性は、特に薬理活性、血漿半減期、および/または免疫原性などの薬物動態のほとんどの局面に影響を及ぼす。Kanovsky et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 52:202-208 (2003); Kanovsky et al., PNAS 23:12438-12443 (2001)参照。ペプチドヘリックスは、しばしばランダムコイルに分解されて、プロテアーゼ攻撃に対して感受性が高くなり、細胞膜を充分に通過できなくなる。Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000)。そのため、ペプチドの全体の構造を安定化するための1つの方法は、ペプチドのαヘリックス構造を安定化することである。ヘリックス形成に関連する分子間水素結合は、極性アミド主鎖の露出を減らし、それにより、輸送ペプチドにおける膜通過に対する障壁を低減して、関連のある薬理活性を高め、プロテアーゼ切断に対するペプチドの抵抗性を高める、同上。緑膿菌アズリン(配列番号:1)は、残基53〜56、58〜64および68〜70にαヘリックスを有する。
【０２０６】
αヘリックスを安定化するための1つの方法は、αヘリックス切断アミノ酸残基、例えばグリシン、プロリン、セリンおよびアスパラギン酸、またはヘリックス中性アミノ酸残基、例えばアラニン、トレオニン、バリン、グルタミン、アスパラギン、システイン、ヒスチジン、リジンもしくはアルギニン中でαヘリックスを、ヘリックス形成残基、例えばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、チロシン、トリプトファンおよびメチオニン、またはヘリックス好適アミノ酸残基置換基、例えばα-アミノ-イソ酪酸（Aib）で置換することである。Miranda et al., J. Med. Chem., 51, 2758-2765 (2008)参照、その開示は参照により本明細書中に援用される。クプレドキシン由来ペプチドのαヘリックスは、1つ以上のグリシン、プロリン、セリンおよび/またはアスパラギン酸残基を他のアミノ酸で置換することにより安定化され得ることが企図される。特定の態様において、グリシン、プロリン、セリン、アスパラギン酸、アラニン、トレオニン、バリン、グルタミン、アスパラギン、システイン、ヒスチジン、リジンおよび/またはアルギニン残基が、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、チロシン、トリプトファン、Aibおよび/またはメチオニン残基で置換される。Lee et al., Cancer Cell Intl. 11:21 (2005)参照。他の特定の態様において、クプレドキシン由来ペプチドのαヘリックス中の1つ以上のセリンまたはグルタミン残基が置換され得る。さらにより具体的な態様において、緑膿菌アズリン(配列番号:1)の残基53〜56、58〜64および68〜70中のセリンおよび/またはグルタミン残基、または他のクプレドキシン由来ペプチドの同等な残基が置換され得る。別の具体的な態様において、緑膿菌アズリン(配列番号:1)のアミノ酸残基57のグルタミン残基、または別のクプレドキシン由来ペプチドの同等残基が置換され、より具体的にはトリプトファンで置換される。別の具体的な態様において、緑膿菌アズリン(配列番号:1)のアミノ酸残基52のトレオニン残基、または別のクプレドキシン由来ペプチドの同等な残基が置換され得、より具体的には、トリプトファンで置換され得る。別の具体的な態様において、緑膿菌アズリン(配列番号:1)のアミノ酸残基61のトレオニン残基、または別のクプレドキシン由来ペプチドの同等な残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。別の具体的な態様において、緑膿菌アズリン(配列番号:1)のアミノ酸残基63のグリシン残基、または別のクプレドキシン由来ペプチドの同等の残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。別の具体的な態様において、緑膿菌アズリン(配列番号:1)のアミノ酸残基52、57、61もしくは63の1つ以上のトレオニン、グルタミンもしくはグリシン残基、または別のクプレドキシン由来ペプチドの同等な残基が置換され得、より具体的にはトリプトファンで置換され得る。特定の態様において、クプレドキシンペプチドは、以下の配列：
LSWAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD (配列番号:69); 
LSTAADMWGVVTDGMASGLDKDYLKPDD (配列番号:70); 
LSTAADMQGVVWDGMASGLDKDYLKPDD (配列番号:71);
LSTAADMQGVVTDWMASGLDKDYLKPDD (配列番号:72);
LSWAADMWGVVTDGMASGLDKDYLKPDD (配列番号:73);
LSWAADMQGVVWDGMASGLDKDYLKPDD (配列番号:74);
LSWAADMQGVVTDWMASGLDKDYLKPDD (配列番号:75);
LSTAADMWGVVWDGMASGLDKDYLKPDD (配列番号:76);
LSTAADMWGVVTDWMASGLDKDYLKPDD (配列番号:77);
LSTAADMQGVVWDWMASGLDKDYLKPDD (配列番号:78); または
LSWAADMWGVVWDWMASGLDKDYLKPDD (配列番号:79)
（式中、下線が引かれたアミノ酸は、野生型緑膿菌p28配列に置換される）
の1つを含む。他の態様において、他のクプレドキシン由来ペプチド中の同等なアミノ酸をトリプトファンで置換する。
【０２０７】
αヘリックス三次構造を安定化するための別の方法は、π-スタッキング（π-stacking）が可能な非天然のアミノ酸残基を使用することを含む。例えば、Andrews and Tabor (Tetrahedron 55:11711-11743 (1999))では、ε-(3,5-ジニトロベンゾイル)-Lys残基のペアが異なる間隔でペプチドのαヘリックス領域に置換された。全体の結果から、i,(i+4)間隔が最も効果的な安定化配置であることが示された。水の割合を90％まで上げることで、ペプチドのヘリックス含有量が増加した。同様のi,(i+4)間隔において、ε-アシル-Lys残基のペアは、安定化効果を有さず、安定化の大部分はπ-π相互作用から生じたことが示された。一態様において、クプレドキシン由来ペプチドは、リジン残基がε-(3,5-ジニトロベンゾイル)-Lys残基で置換されるように修飾され得る。特定の態様において、リジン残基は、i,(i+4)間隔でε-(3,5-ジニトロベンゾイル)-Lysにより置換され得る。
【０２０８】
αヘリックス三次構造を安定化するための別の方法には、αヘリックス内の側鎖間の静電的相互作用が使用される。His-CysまたはHis-His残基のペアがi,(i+4)配置でペプチドに置換された場合、ペプチドは、Cu、ZnまたはCdイオンの付加の際に、約50％ヘリックスから約90％ヘリックスへと変化した。His-Hisペプチドにルテニウム（Ru）塩を付加した場合、変換不活性複合体、マクロ環状シス-[Ru-(NH3)4L2]3+複合体（式中、L2は、2つのヒスチジンの側鎖である）が形成され、ヘリックス安定性が向上した。Ghadiri and Fernholz, J. Am. Chem. Soc. 112, 9633-9635 (1990)。いくつかの態様において、クプレドキシン由来ペプチドは、マクロ環状シス-[Ru-(NH3)4L2]3+複合体（式中、L2は、2つのヒスチジンの側鎖である）を含み得る。いくつかの態様において、1つ以上のヒスチジン-システイン残基またはヒスチジン-ヒスチジン残基のペアは、i,(i+4)間隔で、クプレドキシン由来ペプチドのα-ヘリックスに置換され得る。他の態様において、1つ以上のヒスチジン-システイン残基またはヒスチジン-ヒスチジン残基のペアは、緑膿菌アズリン(配列番号:1)の残基53〜56、58〜64および68〜70、または他のクプレドキシン由来ペプチドの同等の残基中、i,(i+4)配置で置換され得る。いくつかの態様において、クプレドキシン由来ペプチドはさらに、Cu、Zn、Cdおよび/またはRuイオンを含み得る。
【０２０９】
α-ヘリックス三次構造を安定化するための別の方法は、α-ヘリックスの側鎖間のジスルフィド結合形成を含む。ペプチド配列中で間隔があけられた残基間の正式な（formal）共有結合によりヘリックス構造を安定化することも可能である。一般的に使用される天然の方法は、ジスルフィド結合を使用することである。Pierret et al., Intl. J. Pept. Prot. Res., 46:471-479 (1995)。いくつかの態様において、1つ以上のシステイン残基ペアをクプレドキシン由来ペプチドのα-ヘリックスに置換する。他の態様において、1つ以上のシステイン残基ペアを緑膿菌アズリン(配列番号:1)の残基53〜56、58〜64および68〜70または他のクプレドキシン由来ペプチドの同等の残基で置換する。
【０２１０】
α-ヘリックス三次構造を安定化するための別の方法は、側鎖ラクタム架橋の使用を含む。ラクタムは、アミノ酸の環状化から形成され得る環状アミドである。側鎖同士の架橋は、種々のペプチド、ならびに両親媒性ペプチドまたはモデルα-ヘリックスペプチド、オキシトシンアンタゴニスト、メラノプトロピン（melanoptropin）アナログ、グルカゴンおよびSDF-1ペプチドアナログなどのペプチドアナログの制限（constraint）として成功裡に使用されている。例えば、グルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)は、特定のヘリックス好適条件化で徐々にヘリックスコンホメーションを呈し、ラクタム架橋を用いて安定化され得る。Miranda et al., J. Med. Chem., 51, 2758-2765 (2008)。これらのラクタム架橋は、大きさ、効果的な安定性および結合親和性が異なり得る、同上。かかる修飾により、血漿中の化合物の安定性が向上した、同上。環状化部位の間隔および残基の選択に応じて、ターンコンホメーションまたはヘリックスコンホメーションを誘導および安定化するためにラクタム架橋が使用され得る。いくつかの態様において、クプレドキシンまたはバリアントアナログの1つ以上は、近くのアミノ酸間をラクタムで架橋して作製される（例えば、i対i+4グルタミン酸-リジン制限）。いくつかの態様において、クプレドキシン由来ペプチドは、α-ヘリックス含有量を高めるためにかかる修飾を含み得る。
【０２１１】
αヘリックス三次構造を安定化するための別の方法は、全炭素架橋法である。全炭化水素架橋法は、ヘリックス構造、プロテアーゼ耐性および細胞透過性の安定性を高めることが明らかにされている。Walensky et al., Science, 305, 1466-1470 (2004)。オレフィン含有結合（tether）を含むα,α-二置換非天然アミノ酸をペプチドに組み込む。ルテニウム触媒オレフィン複分解により、全炭化水素「ステープル（staple）」が作製されてヘリックスが架橋される。Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc., 122, 5891-5892 (2000); Walensky et al.,同上。オレフィン含有結合を含む非天然アミノ酸は、Schafmeister et al. (同上)およびWilliams and Im (J. Am. Chem. Soc., 113:9276-9286 (1991)) に記載される方法により合成され得る。いくつかの態様において、クプレドキシン由来ペプチドは、全炭化水素ステープルにより安定化される。特定の態様において、天然アミノ酸に対応するオレフィン含有結合を含むα,α-二置換非天然アミノ酸の1つ以上のペアは、クプレドキシン由来ペプチドのα-ヘリックスに置換される。他の態様において、天然アミノ酸に対応するオレフィン含有結合を含むα,α-二置換非天然アミノ酸の1つ以上のペアは、緑膿菌アズリン(配列番号:1)の残基53〜56、58〜64および68〜70、または他のクプレドキシン由来ペプチドの同等の残基に置換される。
【０２１２】
いくつかの態様において、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、X1SX2AADX3X4X5VVX6DX7X8ASGLDKDYLKPDX9(配列番号:80)（式中、X1はLまたはアセチル化Lであり、X2はTまたはWであり、X3はM、LまたはVであり、X4はQまたはWであり、X5はGまたはAであり、X6はTまたはWであり、X7はG、TまたはWであり、X8はM、LまたはVであり、X9はDまたはアミド化-Dである）を含み得る。他の態様において、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、X1SX2AADX3X4X5VVX6DX7X8ASGLDKDYLKPDX9  (配列番号:80)（式中、X1はLまたはアセチル化-L、X2はTまたはWであり、X3はM、LまたはVであり、X4はQまたはWであり、X5はGまたはAであり、X6はTまたはWであり、X7はG、TまたはWであり、X8はM、LまたはVであり、X9はDまたはアミド化-Dである）からなり得る。他の態様において、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、X1DPKLYDKDLGSAX2X3DX4VVX5X6X7DAAX8SX9 (配列番号:81)（式中、X1はDまたはアセチル化-Dであり、X2はM、LまたはVであり、X3はG、TまたはWであり、X4はTまたはWであり、X5はGまたはAであり、X6はQまたはWであり、X7はM、LまたはVであり、X8はTまたはWであり、X9はLまたはアミド化-Lである）を含み得る。他の態様において、修飾クプレドキシン由来ペプチドは、X1DPKLYDKDLGSAX2X3DX4VVX5X6X7DAAX8SX9 (配列番号:81)（式中、X1はDまたはアセチル化-D、X2はM、LまたはVであり、X3はG、TまたはWであり、X4はTまたはWであり、X5はGまたはAであり、X6はQまたはWであり、X7はM、LまたはVであり、X8はTまたはWであり、X9はLまたはアミド化-Lである）からなり得る。本発明の具体的なペプチドを表3に列挙する。
【０２１３】
PEG化
治療または診断的に重要なPEGと薬物との共有結合は、インビボにおける薬物の延長した血漿半減期、および/または低下した免疫原性および抗原性を有する。Harris and Chess, Nature Reviews Drug Discovery 2:214-221 (2003)。例えば、PEG付加により、特にインターロイキン（Kaufman et al., J. Biol. Chem. 263:15064 (1988); Tsutsumi et al., J. Controlled Release 33:447 (1995)）、インターフェロン（Kita et al., Drug Des. Delivery 6:157 (1990)）、カタラーゼ（Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252:3582 (1977)）、スーパーオキシドジスムターゼ（Beauchamp et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983)）およびアデノシンデアミナーゼ（Chen et al., Biochem. Biophys. Acta 660:293 (1981)）などの多くの治療タンパク質の薬物動態的特性が向上した。FDAは、食品、化粧品ならびに注射、局所、直腸および経鼻用の製剤を含む医薬におけるビヒクルまたはベースとしての使用のためのPEGを承認した。PEGはほとんど毒性を示さず、体内から腎臓（PEG＜30kDa）によりまたは便中（PEG＞20kDa）に排除される。PEGは、水に高度に可溶性である。
【０２１４】
化学予防剤、特にアズリンの切断物などのクプレドキシン由来ペプチドのPEG化は、腎臓の限外ろ過を低減することにより体内からの薬物の排出を低減して、患者の血流中のペプチドの寿命を増加するために使用され得る。電荷マスキング（charge masking）は、腎臓透過性に影響し得る。電荷マスキングは、タンパク質イオン性官能基、すなわちアミンまたはカルボキシルのパラムケミカル（paramchemical）修飾の結果であり得る。特に、タンパク質-PEG誘導体の作製のための最も一般的な方法は、タンパク質アミノ基の、結果的に正の電荷を消失するアミドへの転換を伴い、これによりタンパク質限外ろ過が変化し得る。アニオン性巨大分子は、腎臓限外ろ過により、中性または正のものよりもゆっくりと除去されることが分かっており、アミノ基へのPEGコンジュゲーションにより血流中のPEG化ペプチドの耐久性が延長されると予想できる。
【０２１５】
分子の大きさおよび球状限外ろ過はまた、治療ペプチドの腎臓限外ろ過に影響を及ぼし得る。天然の球状タンパク質の腎臓除去のための分子量カットオフは、約70kDaと考えられており、これは血清アルブミンの分子量に近い。従って、70kDaを超える分子量を有するタンパク質は、主に腎臓限外ろ過以外の経路、例えば免疫系による肝臓取り込み、タンパク質溶解性消化および免疫系による除去により体内から除去される。そのため、PEG化により治療ペプチドの大きさを増加することで、患者の血流からのペプチドの腎臓限外ろ過が低減され得る。
【０２１６】
また、ペプチドのPEG化により、ペプチドの免疫原性が低減され得、ペプチドが、タンパク質溶解性酵素、貪食細胞および治療ペプチドとの直接接触を必要とするほかの因子から保護され得る。特に、傘状構造の分岐PEGは、タンパク質溶解性酵素、抗体、貪食細胞などへの接近について、直鎖PEGよりも良好な保護をもたらすことがわかっている。Caliceti and Veronese, Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:1261-12778 (2003)。
【０２１７】
いくつかの態様において、クプレドキシン由来ペプチドは、システイン分子に共有結合により結合した1つ以上のPEG分子を有するように修飾される。共有結合することは、PEG分子からクプレドキシン由来ペプチドへの直接的な共有結合であることを必ずしも必要としないが、互いに共有結合するおよび/またはクプレドキシン由来ペプチドに共有結合する1つ以上のリンカー分子と共有結合し得る。いくつかの態様において、クプレドキシン由来ペプチドは、部位特異的なPEG化を有する。特定の態様において、PEG分子（1つ以上）は、緑膿菌アズリン(配列番号:1)のシステイン残基3、26および/または112に共有結合し得る。他の態様において、1つ以上のシステイン残基は、クプレドキシン由来ペプチドに置換され得、PEG化される。いくつかの態様において、クプレドキシン由来ペプチドをPEG化するための方法は、特にNHS、還元型アミノ化（reductive animation）、マリミドまたはエポキシドであり得る。他の態様において、クプレドキシン由来ペプチドは、1つ以上のリジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、またはチロシン、またはN末端アミノ基もしくはC末端カルボン酸でPEG化され得る。より具体的な態様において、クプレドキシン由来ペプチドは、1つ以上のリジンまたはN末端アミノ基でPEG化され得る。他の態様において、1つ以上のリジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、またはチロシン残基は、クプレドキシン由来ペプチドに置換され、PEG化される。他の態様において、クプレドキシン由来ペプチドは1つ以上のアミノ基でPEG化され得る。他の態様において、クプレドキシン由来ペプチドを、ランダムに、部位非特異的様式でPEG化し得る。いくつかの態様において、クプレドキシン由来ペプチドは、約200ダルトン〜約100,000ダルトン、約2,000 ダルトン〜約20,000ダルトンまたは約2,000ダルトン〜約5,000ダルトンのPEGベースポリマーの平均分子量を有し得る。他の態様において、クプレドキシン由来ペプチドは、1つ以上の分岐したPEG分子、具体的には約50kDaである分岐したPEG分子で構成され得る。他に態様において、クプレドキシン由来ペプチドは、1つ以上の直鎖PEG分子、具体的には約5kDaである直鎖PEG分子を含み得る。
【０２１８】
別の態様において、化学予防剤は、クプレドキシン、またはそのバリアント、構造同等物もしくは誘導物であり、該剤は、Pep42、環状13量体オリゴペプチドのコンジュゲートであり、グルコース調節タンパク質78（GRP78）に特異的に結合し、癌細胞に内在化される。クプレドキシンまたはクプレドキシンのバリアント、構造同等物もしくは誘導体は、Yoneda et al., 「A cell-penetrating peptidic GRP78 ligand for tumor cell-specific prodrug therapy」、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 18: 1632-1636 (2008)（その開示は、その全体において本明細書に援用される）に開示される合成方法によってPep42とコンジュゲートし得る。
【０２１９】
別の態様において、化学予防剤は、クプレドキシンの構造同等物であるペプチドである。クプレドキシンと他のタンパク質の間の有意な構造相同性を決定する研究の例としてはToth et al.（Developmental Cell 1:82-92 (2001)）が挙げられる。具体的に、クプレドキシンと構造同等物の間の有意な構造相同性は、VASTアルゴリズムを使用して決定され得る。Gibrat et al., Curr Opin Struct Biol 6:377-385 (1996); Madej et al., Proteins 23:356-3690 (1995)。具体的な態様において、構造同等物に対するクプレドキシンの構造比較によるVAST p値は、約10-3未満、約10-5未満または約10-7未満であり得る。他の態様において、クプレドキシンと構造同等物の間の有意な構造相同性は、DALIアルゴリズムを使用して決定され得る。Holm & Sander, J. Mol. Biol. 233:123-138 (1993)。具体的な態様において、対構造比較のためのDALI Zスコアは、少なくとも約3.5少なくとも約7.0または少なくとも約10.0である。
【０２２０】
本発明の組成物の化学予防剤、特にペプチドは、クプレドキシンのバリアント、誘導体および／または構造的同等物の1種類以上であり得ることが企図される。例えば、ペプチドは、PEG化され、したがって、バリアントおよび誘導体の両方となったアズリンの切断体であり得る。一態様において、本発明のペプチドは、オレフィン含有結合(tether)を含むα,α-二置換非天然アミノ酸の後、ルテニウム触媒オレフィン複分解による全炭化水素「ステイプル」を用いて合成される。Scharmeister et al.，J. Am. Chem. Soc. 122：5891-5892（2000）；Walensky et al.，Science 305：1466-1470（2004）。さらに、アズリンの構造的同等物であるペプチドを他のペプチドに融合し、したがって、構造的同等物および誘導体の両方であるペプチドとしてもよい。これらの例は単なる例示であって、本発明を限定しない。クプレドキシンのバリアント、誘導体または構造的同等物は銅に結合しても結合しなくてもよい。
【０２２１】
いくつかの態様において、クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体もしくは構造的同等物である化学予防剤は、緑膿菌アズリン、具体的にはp28の薬理学的活性のいくつかを有する。特定の態様において、クプレドキシンならびにクプレドキシンのバリアント、誘導体および構造的同等物は、哺乳動物細胞、組織または動物、具体的には限定されないが、乳腺細胞において前悪性病変の発生を阻害または予防し得る。また、本発明は、哺乳動物の前悪性病変、具体的には限定されないが、黒色腫、乳癌、膵臓癌、グリア芽腫、星状細胞腫、肺癌、結腸直腸癌、頭頚部癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌および子宮頚癌細胞の発生を阻害する能力を有し得るクプレドキシンならびにクプレドキシンのバリアント、誘導体および構造的同等物を提供する。癌細胞の発生の阻害は、対照治療と比べて統計学的に有意な前悪性病変の増加速度の任意の減少、または低減、前悪性病変の発生の低減である。
【０２２２】
ここに、クプレドキシンが哺乳動物細胞、組織または動物、具体的には乳房細胞、より具体的にはマウス乳腺細胞において前悪性病変および最終的には癌の発生を阻害し得ることがわかったため、この化学予防活性を保持するクプレドキシンのバリアントおよび誘導体を設計することが可能になった。かかるバリアント、誘導体および構造的同等物は、例えば、クプレドキシンおよびクプレドキシン由来ペプチドの種々のバリアント、誘導体および構造的同等物の「ライブラリー」を作製し、次いで、それぞれを、実施例1の例示的な方法などの当該技術分野で公知の多くの方法の1つを用いて、化学予防活性、具体的にはマウス乳腺器官培養物において化学予防活性について試験するにより作製され得る。化学予防活性を有する得られたクプレドキシンのバリアント、誘導体および構造的同等物は、アズリンまたはp28の代わり、またはそれに加えて本発明の方法において使用され得ることが企図される。
【０２２３】
いくつかの特定の態様において、クプレドキシンのバリアント、誘導体または構造的同等物は、マウス乳腺器官培養物（MMOC）における7,12-ジメチルベンズ（a）アントラセン（DMBA）誘導性前悪性病変の発生を、非治療対照と統計学的に異なる程度まで阻害し得る。ペプチドは、実施例1に記載されたMMOCモデル系を使用することにより、またはMehta et al.（J Natl Cancer Inst 93：1103-1106（2001））およびMehta et al.（Meth Cell Sci 19：19-24（1997））のようにして、この活性について試験され得る。癌の発生がさらに(another)阻害されるかどうかを調べるための他の方法は当該技術分野で周知であり、同様に使用され得る。
【０２２４】
いくつかの特定の態様において、クプレドキシンのバリアント、誘導体または構造的同等物は、MMOCモデルにおいて乳腺胞(mammary alveolar)病変（MAL）の発生を、非治療対照と統計学的に異なる程度まで阻害する。いくつかの特定の態様において、クプレドキシンのバリアント、誘導体または構造的同等物は、MMOCモデルにおいて乳管の病変（MDL）の発生を、非治療対照と統計学的に異なる程度まで阻害する。ペプチドは、これらの活性について、実施例1に記載のように、DMBAによって前悪性病変を形成するように誘導されたMMOCモデル系を使用することにより試験され得る。MMOCモデル系における前悪性病変の発生の評価は、実施例1に示したようにして、体型測定解析または組織病理学的解析によって行なわれ得る。
【０２２５】
クプレドキシン
この小さい青色銅タンパク質（クプレドキシン）は、細菌の電子伝達系に参加する電子伝達タンパク質（10〜20kDa）であるか、または未知の機能のものである。銅イオンがタンパク質マトリックスによって単独で結合される。銅の周りの2つのヒスチジンと1つのシステインリガンドに対する特別な歪んだ三角面配置は、金属部位の非常に特殊な電子特性と強い青色をもたらす。いくつかのクプレドキシンは、中度から高度の解像度で結晶学的に特徴付けられる。
【０２２６】
クプレドキシンは、一般に、配列相同性は低いが、構造相同性高い。Gough & Clothia、Structure 12：917-925（2004）；De Rienzo et al.，Protein Science 9：1439-1454（2000）。例えば、アズリンのアミノ酸配列は、オーラシアニンBのものと31%、ラスチシアニンのものと16.3%、プラストシアニンのものと20.3%、およびシュードアズリンのものと17.3%同一である。表1参照。しかしながら、これらのタンパク質の構造類似性は、より顕著である。アズリンとオーラシアニンBの構造の比較のVAST p値は10-7.4であり、アズリンとラスチシアニンでは10-5であり、アズリンとプラストシアニンでは10-5.6であり、アズリンとシュードアズリンでは10-4.1である。
【０２２７】
すべてのクプレドキシンは、8本鎖Greekキーβ-樽型またはβ-サンドイッチ折り畳みを有し、高度に保存された部位構造を有する。De Rienzo et al.，Protein Science 9：1439-1454（2000）。メチオニンおよびロイシンなどの長鎖脂肪族残基が多く存在することによる顕著な疎水性パッチ(patch)は、アズリン、アミシアニン、藍色細菌のプラストシアニン、キュウリ塩基性タンパク質、ならびに程度は低いが、シュードアズリンおよび真核生物のプラストシアニンの銅部位周囲に存在する。同著。疎水性部分は、程度は低いが、ステラシアニンおよびラスチシアニン銅部位にも見られるが、異なる特徴を有する。同著。
【０２２８】
2012512259.tif 000005
【０２２９】
1整列長さ：2つの構造間に積載(superimpose)されたC-α原子の同等ペアの数、すなわち、どれだけ多くの残基が3D重ね合わせを計算するために使用されたか。
【０２３０】
2P-VAL：VAST p値は、確率で示される、比較の有意性の尺度である。例えば、p値が0.001ならば、純粋に偶然にこの量の適合が見られないオッズは1に対して1000である。VASTによるp値は、MMDBデータベースには500の独立した無関連の型のドメインが存在するという仮定を用いて多重比較の効果に対して調整される。したがって、示されるp値は、各ドメインペアのペアでの比較のp値を500で割ったものに対応する。
【０２３１】
3スコア：VAST構造類似性スコア。この数は、積載された二次構造要素の数およびその重ね合わせの量に関連する。高VASTスコアは、高類似性と相関している。
【０２３２】
4RMSD：重ね合わせ残差(residual)(オングストローム)の2乗平均平方根。この数は2つの構造の最適重ね合わせ後に、等価なC-α原子の距離の平均2乗の平方根として計算される。RMSD値は構造的整列の程度に伴って増減すること、およびこのサイズは、RMSDを全体構造類似性の記述子として使用する場合に考慮されるべきであることに注意のこと。
【０２３３】
5 C. elegans主要精子タンパク質は、卵母細胞成熟におけるエフリンアンタゴニストであることが示された。Kuwabara、Genes and Development 17：155-161（2003）。
【０２３４】
アズリン
アズリンは、ある種の細菌における電子伝達に関与するクプレドキシンファミリーに属する128アミノ酸残基の銅含有タンパク質である。アズリンとしては、緑膿菌（PA）（配列番号：1）、A. xylosoxidans、およびA. denitrificans由来のものが挙げられる。Murphy et al.， J. Mol. Biol. 315：859-871（2002）。アズリン間のアミノ酸配列同一性は60〜90%の間で異なり、これらのタンパク質は強い構造相同性を示した。すべてのアズリンは、Greekキーモチーフを有する特徴的なβ-サンドイッチを有し、単一の銅原子が常に、タンパク質の同じ領域に配置されている。また、アズリンは、銅部位を囲む本質的に中性の疎水性部分を有する。同著。
【０２３５】
プラストシアニン
プラストシアニンは、1分子あたり1分子の銅を含み、酸化形態では青色になる藍色細菌、藻類および植物の可溶性のタンパク質である。これは葉緑体中に存在し、そこで電子運搬体としても機能を果たす。1978年のポプラプラストシアニンの構造の決定以来、藻類（セネデスムス、アオノリ、コナミドリムシ）および植物（サヤインゲン）のプラストシアニンの構造が、結晶学的またはNMR法のいずれかによって決定され、ポプラ構造は1.33Å解像度まで精密化された。配列番号：3は、好熱性の藍色細菌であるホルミジウムラミノサム由来のプラストシアニンのアミノ酸配列を示す。目的の別のプラストシアニンは、ウルベペルツシス由来のものである。
【０２３６】
藻類および維管束植物（例えば、コナミドリムシとポプラタンパク質間の配列同一性62%）プラストシアニン間の配列多様性にもかかわらず、3次元構造は保存されている（例えば、コナミドリムシとポプラタンパク質間のCα位置において0.76Årms偏差）。構造的特徴としては、8本鎖の逆平行のβ-樽型の一端のねじれた四面体の銅結合部位、顕著な負電荷部分、および平坦疎水性表面が挙げられる。銅部位は、その電子伝達機能のために最適化され、負電荷で疎水性部分は、生理学的反応パートナーの認識に関与していると提案されている。化学修飾、架橋、および部位特異的変異誘発実験により、シトクロムfとの結合相互作用において、負電荷で疎水性部分の重要性が確認され、プラストシアニンが関与する2つの機能的に重要な電子伝達経路のモデルが検証された。推定電子伝達経路の一方は、比較的短く（ほぼ4Å）、疎水性部分内の溶媒曝露銅リガンドHis-87を伴うが、他方は、より長く（ほぼ12〜15Å）、負電荷部分内のほぼ保存された残基Tyr-83を伴う。Redinbo et al.，J. Bioenerg. Biomembr. 26：49-66（1994）。
【０２３７】
ラスチシアニン
ラスチシアニンは、チオバチルス（現在は、アシジチオバチルスと称される）から得られる青色銅含有単鎖ポリペプチドである。チオバチルスフェロオキシダンス（配列番号：4）由来の極めて安定で高度に酸化性のクプレドキシン ラスチシアニンの酸化形態のX線結晶構造が、多波長の異常回折によって決定され、1.9Å解像度まで精密化された。ラスチシアニンは、6-および7本鎖b-シートで構成されたコアβ-サンドイッチ折り畳みで構成されている。他のクプレドキシンと同様、銅イオンは、ねじれた四面体に配置された4つの保存された残基（His 85、Cys138、His143、Met148）の群に配位されている。Walter、R.L. et al.，J. Mol. Biol. 263：730-51（1996）。
【０２３８】
シュードアズリン
シュードアズリンは、青色銅含有単鎖ポリペプチドファミリーである。アクロモバクターサイクロクラステスから得られたシュードアズリンのアミノ酸配列を配列番号：5に示す。シュードアズリンのX線構造解析により、これが、アズリンと類似した構造を有するが、これらのタンパク質間の配列相同性は低いことを示す。シュードアズリンとアズリンの全体構造間には2つの大きな違いが存在する。シュードアズリンには、アズリンと比べて、2つのα-ヘリックスからなるカルボキシ末端伸長が存在する。中央ペプチド領域には、アズリンは、短いα-ヘリックスを含む垂下体を形成する伸長されたループを含むが、シュードアズリンでは短い。銅原子部位に唯一の大きな違いは、MET側鎖のコンホメーションとMet-S銅結合長さであり、該結合長さは、アズリンよりもシュードアズリンの方が有意に短い。
【０２３９】
フィトシアニン
フィトシアニンとして同定され得るタンパク質としては、限定されないが、キュウリ塩基性タンパク質、ステラシアニン、マビシアニン、ウメシアニン、キュウリ剥皮クプレドキシン、エンドウ豆の鞘内の推定青色銅タンパク質、およびArabidopsis thaliana由来の青色銅タンパク質が挙げられる。キュウリ塩基性タンパク質とエンドウ豆の鞘タンパク質以外すべてにおいて、通常、青色銅部位に見られる軸性メチオニンリガンドがグルタミンで置換されている。
【０２４０】
オーラシアニン
オーラシアニンA、オーラシアニンB-1、およびオーラシアニンB-2で指定される3種類の小さい青色銅タンパク質が好熱性緑色滑走性光合成細菌クロロフレクサス オーランチアカスから単離された。2つのB形態は糖タンパク質であり、互いにほぼ同一の性質を有するが、A形態とは異なる。ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、見かけ上のモノマー分子量は14（A）、18（B-2）、および22（B-1）kDaが示される。
【０２４１】
オーラシアニンAのアミノ酸配列は決定されており、オーラシアニンAが139 残基のポリペプチドであることが示された。Van Dreissche et al.，Protein Science 8：947-957（1999）。His58、Cys123、His128、およびMet132は、公知の小さい銅タンパク質プラストシアニンおよびアズリンの場合のように、進化的に保存された金属リガンドかもしれないことが推定されるような様式で間隔が開いている。また二次構造の推定は、オーラシアニンは、緑膿菌由来のおよびポプラ葉由来のプラストシアニンのものと類似した一般的なβ-樽型構造を有することを示している。しかしながら、オーラシアニンは、両方の小さい銅タンパク質の配列クラスの配列特性を有するようである。アズリンのコンセンサス配列との全体的な類似性は、プラストシアニンのコンセンサス配列のものとほぼ同じ、すなわち30.5%である。オーラシアニンのN末端配列領域1〜18には、グリシンおよびヒドロキシアミノ酸が著しく多く含まれる。同著。クロロフレクサス オーランチアカス由来のオーラシアニンのA鎖については、例示的なアミノ酸配列配列番号：15を参照のこと（NCBI Protein Data Bank 受託番号AAM12874）。
【０２４２】
オーラシアニンB分子は、標準的なクプレドキシンフォールドを有する。クロロフレクサス オーランチアカス由来のオーラシアニンBの結晶構造が研究された。Bond et al.，J. Mol. Biol. 306：47-67（2001）。さらなるN末端鎖があることを除き、分子は、細菌のクプレドキシン、アズリンのものと非常に類似している。他のクプレドキシンの場合と同様、Cuリガンドの1つがポリペプチドの第4鎖上に存在しており、その他の3つは第7鎖と第8鎖の間の大きなループ上に存在している。Cu部位の幾何学構造は、後者の3つのリガンド間のアミノ酸のスペーシングに関して記載する。結晶学的に特徴付けられたオーラシアニンBのCu結合ドメインは、おそらく、いくつかの他の膜関連電子伝達タンパク質における公知の結合と有意な配列同一性を示すN末端テイルによってペリプラスム側の細胞膜に結合されている。B形態のアミノ酸配列は、McManus et al. J. Biol. Chem. 267：6531-6540（1992）に示されている。クロロフレクサス オーランチアカス由来のオーラシアニンのB鎖については、例示的なアミノ酸配列配列番号：16を参照のこと（NCBI Protein Data Bank 受託番号1QHQA）。
【０２４３】
ステラシアニン
ステラシアニンは、偏在性の植物プレドキシンファミリーであるフィトシアニンのサブクラスである。ステラシアニンの例示的な配列を、本明細書に配列番号：14として含める。西洋ワサビの根由来のウメシアニン、ステラシアニン（Koch et al.，J. Am. Chem. Soc. 127：158-166（2005））およびキュウリステラシアニン（Hart el al.，Protein Science 5：2175-2183（1996））の結晶構造もまた公知である。該タンパク質は、その他のフィトシアニンと類似した全体的フォールドを有する。エフリンB2タンパク質エクトドメインの三次構造は、ステラシアニンと有意な類似性を有する。Toth et al.，Developmental Cell 1：83-92（2001）。ステラシアニンの例示的なアミノ酸配列は、National Center for Bio技術 Information Protein Data Bankに受託番号1JER、配列番号：14
として見られる。
【０２４４】
キュウリ塩基性タンパク質
キュウリ塩基性タンパク質の例示的なアミノ酸配列を本明細書に配列番号：17として含める。1型青色銅タンパク質であるキュウリ塩基性タンパク質（CBP）の結晶構造は1.8Å解像度で精密化された。分子は、他の青色銅タンパク質と、樽型の一方側が開放されており、「β-サンドイッチ」または「β-タコ(taco)」と記載する方がよいであろうこと以外、Greekキーβ-樽型構造を有する点で類似している。Guss et al.，J. Mol. Biol. 262：686-705（1996）。エフリンB2タンパク質エクトドメインの三次構造は、キュウリ塩基性タンパク質と高い類似性を有する（50個のα炭素についてrms偏差1.5Å）。Toth et al.，Developmental Cell 1：83-92（2001）。
【０２４５】
Cu原子は、通常の青色銅NNSS’配位を有し、結合長さCu-N（His39）= 1.93 A、Cu-S（Cys79）= 2.16 A、Cu-N（His84）= 1.95 A、Cu-S（Met89）= 2.61 Aである。ジスルフィド結合（Cys52）-S-S-（Cys85）は、分子構造の安定化に重要な役割を果たしているようである。ポリペプチドのフォールドは、青色銅タンパク質（フィトシアニン）のサブファミリーならびに、CBPと高度の配列同一性を有する非金属タンパク質であるブタクサアレルゲンRa3のものに典型的である。現在フィトシアニンと同定可能なタンパク質はCBP、ステラシアニン、マビシアニン、ウメシアニン、キュウリ剥皮クプレドキシン、エンドウ豆の鞘内の推定青色銅タンパク質、およびArabidopsis thaliana由来の青色銅タンパク質である。CBPおよびエンドウ豆の鞘タンパク質以外はすべて、通常青色銅部位に見られる軸性メチオニンリガンドは、グルタミンで置き換えられている。キュウリ塩基性タンパク質の例示的な配列はNCBI Protein Data Bank 受託番号2CBP、配列番号：17に見られる。
【０２４６】
抗エストロゲン
本発明の組成物および方法に使用され得る抗エストロゲンとしては、限定されないが、エストロゲンまたはプロゲステロンが受容体に結合するのを妨げる化合物、例えば、タモキシフェン、トレミフェン、エストラジオール、ラロキシフェン、EM-652、アルゾキシフェン、ラソホキシフェン、ICI-164,384、GW7604、およびトクリス(Tocris)（ICI-182,780）などが挙げられる。また、エストロゲンおよびエストロゲン受容体の活性を標的化またはブロックする化合物としては、フルベストラント(fulvestrant)、ならびにKatzenellenbogen、B.S. and Frasor、J.，Seminars in Oncology、Vol 31、No. 1、Suppl. 3 28-38（2004）（その開示は参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載の他の化合物が挙げられ得る。
【０２４７】
また、本発明の組成物および方法に使用され得る抗エストロゲンとしては、限定されないが、エストロゲンまたはプロゲステロンの生成を妨げる化合物、例えば、ステロイド系であっても非ステロイド系であってもよいアロマターゼ阻害薬、例えば限定されないが、アナストラゾール、エキセメスタン、およびレトロゾール、ならびにEisen、A.，et al.，Cancer Treatment Reviews、34：157-174（2008）（その開示は参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示または記載されている他の化合物が挙げられ得る。毎日20mgのタモキシフェン、毎日1mgのアナストラゾール、毎日2.5mgのレトロゾール、および毎日25mgのエキセメスタンなどのEisenの論文に開示された投薬量もまた、本明細書に開示した本発明の組成物および方法に使用され得る。
【０２４８】
使用方法
化学予防治療は、発癌に関与するプロセスの中断により、癌の発生が予防されるか、または少なくとも遅滞されるという証拠に基づく。クプレドキシン緑膿菌アズリン（配列番号：1）、アズリンのアミノ酸50〜77を示す切断型アズリンペプチドp28（配列番号：2）、およびアズリンのアミノ酸50〜57を示す切断型アズリンペプチドp18（配列番号：25）は、現在、前悪性病変の初期形成を阻害するか、または存在する前悪性病変を死滅させるか、もしくはその増殖を阻害するかのいずれかによって前悪性病変の発生を阻害することが知られている。したがって、前悪性病変の発生のリスクを阻害、抑制、予防、逆転、遅延または低減させる能力を有する本明細書に記載のクプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物は、前悪性病変に苦しむ患者、癌に苦しむ患者、またはその他の場合の健常患者において、化学予防的治療に、単独または1種類以上の他の化学予防剤と組み合わせて使用され得ることが企図される。かかるその他の場合の健常患者は、いくつかの態様において、一般集団よりも癌が発生するリスクが高い患者である。本発明の組成物での治療によって治療または予防され得る癌としては、限定されないが、黒色腫、乳癌、膵臓癌、グリア芽腫、星状細胞腫、肺癌、結腸癌、頭頚部癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌、および子宮頚癌が挙げられる。いくつかの態様において、患者はヒトであり得る。他の態様において、患者ヒトではなく、例えば、非ヒト哺乳動物である。
【０２４９】
本発明は、p18（配列番号：25）またはp28（配列番号：2）などのアズリンの切断体であり得る第1の化学予防剤、抗エストロゲンなどの第2の化学予防剤、および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を、患者に投与することを含む、哺乳動物細胞および／または患者において前悪性病変および癌に対して化学予防効果を有する方法を提供する。
【０２５０】
また、本発明は、クプレドキシンまたは上記のようなそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物である少なくとも1種類の化学予防剤を、単独または抗エストロゲンなどの1種類以上の他の化学予防剤と組み合わせて投与することにより、哺乳動物患者を治療するための方法、あるいは哺乳動物細胞および／または患者において化学予防効果を有する方法を提供する。本発明の方法に使用される抗エストロゲンとしては、タモキシフェン、フェンレチニド、およびアロマターゼ阻害薬が挙げられ得る。実施例3および4に示すように、アズリン切断体p28などのタモキシフェンおよびクプレドキシンは、癌性病変に対して相乗的阻害効果を有する。
【０２５１】
さらに、本発明は、細胞または患者に、任意の順で、例えばp18（配列番号：25）またはp28（配列番号：2）などのアズリンの切断体であり得る少なくとも1種類の化学予防剤を投与すること、および抗エストロゲンを投与することにより、哺乳動物細胞および哺乳動物患者においてp53の発現を増大させる方法を含む。実施例4に示すように、エストロゲンの活性をブロックするタモキシフェンまたは別の抗エストロゲンが存在する場合、p28は哺乳動物細胞においてp53の発現を増大させ得る。
【０２５２】
さらに、本発明は、任意の順で、哺乳動物細胞または患者に、例えばp18（配列番号：25）またはp28（配列番号：2）などのアズリンの切断体であり得る少なくとも1種類の化学予防剤を投与すること、および抗エストロゲンを投与することにより、哺乳動物細胞または哺乳動物患者において、p53へのエストロゲン受容体の結合を減少させる方法を含む。本明細書に記載のように、エストロゲン受容体（「ER」）-p53複合体はp53の発現を妨げる。タモキシフェンでの治療により、ERがp53に結合することが妨げられる。実施例3および4に示すように、タモキシフェンの存在下でのp28との腺のインキュベーションにより、哺乳動物細胞においてp53の発現が増強または増大される。
【０２５３】
さらに、本発明は、哺乳動物患者または哺乳動物細胞に、例えば、p18（配列番号：25）またはp28（配列番号：2）などの切断型アズリンであり得る化学予防剤を、ある用量のタモキシフェンと組み合わせて投与することにより、タモキシフェンの用量関連毒性を低減する方法を含む。実施例3に示されるように、前悪性病変および癌の阻害は、低用量のタモキシフェンと低濃度のp28を組み合わせることにより行なわれ得る。いくつかの態様において、p28などの化学予防剤と、タモキシフェンなどの抗エストロゲンが任意の順で、同時またはほぼ同時に投与され得る。
【０２５４】
さらに、本発明は、発癌物質での誘導前または後の哺乳動物細胞を、単独または1種類以上の他の化学予防剤と組み合わせた、クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物を含む組成物と接触させること、および細胞の発生を観察することを含む、癌の発生の試験方法を含む。いくつかの態様において、細胞はマウス乳腺細胞であるが、別の場合では、哺乳動物において悪性となり得る他の細胞である。
【０２５５】
本明細書に開示する方法は、前悪性病変を有する患者、癌を有する患者、および／または一般集団よりも癌が発生するリスクが高い患者を治療するために使用され得る。一般集団よりも癌が発生するリスクが高い患者は、ハイリスクの特徴を有する患者、前悪性病変を有する患者、および初期癌が治癒した患者または前悪性病変を完全に治療した患者であり得る。一般的には、Tsao et al.，CA Cancer J Clin 54：150-180（2004）を参照のこと。ハイリスクの特徴は、患者の行動的、遺伝的、環境的または生理学的因子であり得る。患者に種々の形態の癌の素因をつくる行動的因子としては、限定されないが、喫煙、食事、アルコール摂取、ホルモン補充療法、高いボディマス指数、未経産、ビンロウジ(betal nut)の使用、頻繁なマウスウォッシュの使用、ヒト乳頭腫ウイルスへの曝露、小児期および慢性の日光曝露、低年齢での最初の性交、多数の性交渉相手、および経口避妊薬の使用が挙げられる。患者に種々の形態の癌の素因をつくる遺伝的因子としては、限定されないが、癌の家族歴、BRCA1およびBRCA2の遺伝子キャリア状態、乳房の新形成の前歴、家族性腺腫性ポリポーシス（FAP）、遺伝性非ポリポーシス性大腸直腸癌（HNPCC）、赤毛またはブロンドヘアおよび色白肌表現型、色素性乾皮症、ならびに民族が挙げられる。患者に種々の形態の癌の素因をつくる環境的特徴としては、限定されないが、ラドン、多環式芳香族炭化水素、ニッケル、クロム酸塩、ヒ素、アスベスト、クロロメチルエーテル、ベンゾ[a]ピレン、放射線への曝露またはゴムもしくは塗料由来の芳香族アミンへの職業性曝露が挙げられる。患者に種々の形態の癌の素因をつくる他の種々雑多な因子としては、限定されないが、気道閉塞を伴う慢性閉塞性肺疾患、慢性膀胱感染、住血吸虫症、高齢、ならびに免疫無防備状態が挙げられる。
【０２５６】
さらに、癌が発生するリスクが高い患者は、特定の種類の癌に対して開発された種々のリスクモデルの使用によって決定され得る。例えば、乳癌に素因のある患者は、とりわけ、GailリスクモデルまたはClausモデルを用いて決定され得る。Gail et al.，J Natl Cancer Inst 81：1879-1886（1989）；Cuzick、Breast 12：405-411（2003）；Huang et al.，Am J Epidemiol 151：703-714（2000）を参照のこと。
【０２５７】
前悪性病変を有する患者は一般集団よりも癌が発生するリスクが高い。患者における前悪性病変の存在は、当業者に周知の多くの方法によって決定され得る。前悪性病変に由来する中間体マーカーまたはバイオマーカーは、患者において、患者が前悪性病変を有するかどうかを調べるために測定され得る。癌患者のほとんどでは、腫瘍細胞および隣接する組織学的に正常な組織において染色体異常が発生する。染色体異常の進行は、前悪性病変から侵襲性の癌への表現型の進行と並行する。Thiberville et al.，Cancer Res. 55：5133-5139（1995）。したがって、癌と関連する染色体異常は、患者において前悪性病変を検出するための中間体マーカーとして使用され得る。癌と関連する一般的な染色体異常としては、限定されないが、3p（FHITなど）、9p（p16INK4、p15INK4B、およびp19ARFの9p21）、17p（p53遺伝子などの17p13）および13q（網膜芽腫遺伝子Rbなどの13q14）などの腫瘍抑制遺伝子における対立遺伝子欠失またはヘテロ接合性（LOH）低下が挙げられる。3pおよび9pにおける欠失は、喫煙および肺癌の初期段階と関連する。Mao et al.，J. Natl. Cancer Inst. 89：857-862（1997）。3p、5q、8p、17pおよび18qに影響を及ぼす欠失は、上皮癌における一般的な変化である。一般的に、Tsao et al.，CA Clin. Cancer J. Clin. 54：153（2004）を参照のこと。癌と関連する他の染色体の変異としては、癌遺伝子を活性化させるものが挙げられる。その存在が中間体マーカーとして使用され得る癌遺伝子としては、限定されないが、Ras、c-myc、上皮増殖因子、erb-B2ならびにサイクリンE、D1およびB1が挙げられる。一般的に、同著154参照。
【０２５８】
他の中間体マーカーは、前悪性細胞および癌細胞において上方調節された遺伝子の産物であり得る。前悪性細胞において上方調節され得る遺伝子としては、限定されないが、シクロオキシゲナーゼCOX-1およびCOX-2、テロメラーゼが挙げられる。癌細胞およびいくつかの前悪性細胞の他のバイオマーカーとしては、限定されないが、p53、上皮増殖因子 受容体（GFR）、増殖細胞核抗原（PCNA）、RAS、COX-2、Ki-67、DNA異数性、DNAポリメラーゼ-α、ER、Her2neu、E-カドヘリン、RARβ、hTERT、p16INK4a、FHIT（3p14）、Bcl-2、VEGF-R、HPV感染、LOH 9p21、LOH 17p、p-AKT、hnRNP A2/B1、RAF、Myc、c-KIT、サイクリンD1、EおよびB1、IGF1、bcl-2、p16、LOH 3p21.3、LOH 3p25、LOH 9p21、LOH 17p13、LOH 13q、LOH 8p、hMSH2、APC、DCC、DPC4、JV18、BAX、PSA、GSTP1、NF-kB、AP1、D3S2、HPV感染、LOH 3p14、LOH 4q、LOH 5p、膀胱腫瘍抗原（BTA）、BTK TRAK（Alidex，Inc.，Redmond WA）、尿路マトリックスタンパク質 22、フィブリン分解生成物、オートドリン(autodrine)移動因子受容体、BCLA-4、サイトケラチン20、ヒアルロン酸、CYFRA 21-1、BCA、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ならびに組織ポリペプチド抗原（TPA）が挙げられる。一般的に、同著155〜157参照。
【０２５９】
初期癌が治癒した患者または前悪性病変を完全に治療した患者もまた、一般集団よりも癌が発生するリスクが高い。第2の原発腫瘍は、癌の前歴を有するヒトにおける新たな原発性癌をいう。第2の原発腫瘍は、頭頚部癌の死亡率の主原因である。同著150。第2の原発腫瘍と転移は、前者が新たに発生したものであるのに対して、後者は、既に存在する腫瘍から発生したものである点で異なる。乳房、頭頚部、肺および皮膚の癌または前悪性病変が治癒した患者は、第2の原発腫瘍が発生するリスクが特に高い。
【０２６０】
クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤を含む組成物は、患者に、当業者に周知の多くの経路によって多くの計画で投与され得る。特定の態様において、クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口または吸入によって投与される。該組成物は、患者に、該組成物を、患者内の癌が発生するリスクのある部位に送達する任意の手段によって投与され得る。特定の態様において、クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤は静脈内投与される。
【０２６１】
一態様において、該方法は、例えば、前悪性病変または前悪性病変が発生するリスクを有する患者に、クプレドキシンまたはクプレドキシンのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物を含む組成物1単位用量と、別の化学予防薬を含む組成物1単位用量を、いずれかの順で共投与する工程を含み得、これらは、ほぼ同時、または他方の投与後、ほぼ所定の時間以内、例えば、他方の薬物の投与後、約1分〜約60分以内、または他方の薬物の投与後、約1時間〜約12時間以内に投与する。対象の化学予防薬としては、限定されないが、タモキシフェンなどの抗エストロゲン、ならびにレトロゾール、エキセメスタンおよびアナストラゾール（Arimidex(登録商標)）などのアロマターゼ阻害薬、N-[4-ヒドロキシフェニル]レチンアミド（4-HPR、フェンレチニド）などのレチノイド、アスピリンおよびスリンダクなどの非ステロイド系抗炎症剤（NSAID）、セレコキシブ（COX-2阻害薬）、デフルオロメチルオルニチン(ornithing)（DFMO）、ウルソデオキシコール酸、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素阻害薬、EKI-785（EGFR阻害薬）、ベバシツマブ（VEGF受容体に対する抗体）、セツキシマブ（EGFRに対する抗体）、ビタミンA、β-カロテン、13-シスレチノイン酸、イソトレチノインおよびパルミチン酸レチニルなどのレチノール、α-トコフェロール、インターフェロン、癌溶解性(oncolytic)アデノウイルスdl1520（ONYX-015）、ゲフィチニブ、エトレチネート、フィナステリド、インドール-3-カルビノール、レスベラトロール、クロロゲン酸、ラロキシフェン、ならびにオルチプラツが挙げられる。
【０２６２】
クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤を含む医薬組成物
クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤を含む医薬組成物は、任意の従来の様式で、例えば、従来の混合、溶解、増粒、糖衣錠作成、乳化、カプセル封入、捕捉または凍結乾燥プロセスによって製造され得る。実質的に純粋な、または医薬等級のクプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体および構造的同等物ならびに1種類以上の他の化学予防剤は、当該技術分野で周知の薬学的に許容され得る担体と容易に合わされ得る。かかる担体により、調製物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化することが可能になる。また、適当な担体または賦形剤としては、例えば、充填剤およびセルロース調製物が挙げられ得る。他の賦形剤としては、例えば、フレーバー剤、着色剤、粘着防止剤、増粘剤、および他の許容され得る添加剤、アジュバント、または結合剤が挙げられ得る。いくつかの態様において、医薬調製物は保存料を実質的に含まない。他の態様において、医薬調製物は、少なくとも1種類の保存料を含み得る。医薬投薬形態に関する一般な方法論は、Ansel et al.，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems（Lippencott Williams & Wilkins、Baltimore MD（1999））に見られる。
【０２６３】
本発明に使用されるクプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤を含む組成物は、種々の様式で、例えば、注射（例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内など）、吸入、局所投与、坐剤によって、経皮パッチを使用することによりまたは口から投与され得る。薬物送達系に関する一般的な情報は、Ansel et al.，同著に見られ得る。いくつかの態様において、クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤を含む組成物は、とりわけ、皮下および静脈内注射のための注射用剤として直接製剤化および使用され得る。特に、注射用製剤は、化学予防治療に適切な患者を治療するために有利に使用され得る。また、クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤を含む組成物は、プロピレングリコールなどの保護剤または類似したコーティング剤と混合した後、経口摂取され得る。
【０２６４】
投与が注射による場合、クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤は、水溶液中で、具体的には、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理生理食塩水バッファーなどの生理学的に適合性のあるバッファー中で製剤化され得る。溶液は、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含み得る。代替的に、クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤は、使用前に適当なビヒクル、例えば、滅菌発熱原無含有水で構成される粉末形態であり得る。いくつかの態様において、医薬組成物は、アジュバントまたは該ペプチドによって刺激される免疫応答を増強するために添加される任意の他の物質を含まない。いくつかの態様において、医薬組成物は、該ペプチドに対する免疫応答を阻害する物質を含む。
【０２６５】
投与が静脈内液による場合、クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤の投与に使用される静脈内液は、クリスタロイドまたはコロイドで構成され得る。本明細書で使用する場合のクリスタロイドは、無機塩類または他の水溶性分子の水溶液である。本明細書で使用する場合のコロイドは、ゼラチンなどの大きな不溶性分子を含むものである。静脈内用液は滅菌されたものであり得る。
【０２６６】
静脈内投与に使用され得るクリスタロイド液としては、限定されないが、表2に記載のような、通常の生理食塩水（0.9%濃度の塩化ナトリウム溶液）、乳酸加リンゲルまたはリンゲル溶液、およびD5Wと称されることもある5%デキストロースの水溶液が挙げられる。
【０２６７】
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【０２６８】
投与が吸入による場合、クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤は、適当な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、二酸化炭素または他の適当なガスの使用を伴う加圧パックまたはネブライザーからのエーロゾルスプレーの形態で送達され得る。加圧エーロゾルの場合、投薬単位は、定量を送達する弁を設けることによって決定され得る。吸入器または注入器における使用のための、例えばゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、タンパク質と適当なラクトースまたはデンプンなどの粉末基剤との粉末混合物を含むように製剤化され得る。
【０２６９】
投与が局所投与による場合、クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤は、当該技術分野で周知の溶液、ゲル、軟膏、クリーム、ジェル、懸濁液などとして製剤化され得る。いくつかの態様において、投与は、経皮パッチによるものである。投与が坐剤（例えば、直腸または膣用）による場合、クプレドキシンまたはそのバリアント、切断体および誘導体ならびに1種類以上の他の化学予防剤の組成物はまた、従来の坐剤基剤を含む組成物に製剤化され得る。
【０２７０】
投与が経口である場合、クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤は、クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤を、当該技術分野で周知の薬学的に許容され得る担体と合わせることにより容易に製剤化され得る。マンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウムなどの固形担体が使用され得る。かかる担体により、クプレドキシンおよびそのバリアント、誘導体または構造的同等物を、治療対象の被検体による経口摂取の錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化することが可能になる。例えば、粉末、カプセルおよび錠剤などの経口固形製剤について、適当な賦形剤としては、糖類などの充填剤、セルロース調製物、造粒剤、および結合剤が挙げられる。
【０２７１】
また、当該技術分野で周知の他の簡便な担体としては、細菌の莢膜多糖などの多価担体、デキストランまたは遺伝子操作されたベクターが挙げられる。また、クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤を含む徐放製剤は、徐放製剤でなければ、治療効果が発揮または増強される前にクプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤は被検体の系から排除されるであろう、および／または例えば、プロテアーゼや単純に加水分解によって分解されるであろうような長期間にわたるクプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤の放出を可能にする。
【０２７２】
本発明のペプチドおよび1種類以上の他の化学予防剤の血流中の半減期は、当業者に周知のいくつかの方法によって長くすること、または最適化することができる。本発明のペプチドバリアントおよび1種類以上の他の化学予防剤は、限定されないが、安定性、比活性、血流中での長時間の存在を増大させ得る、および／またはクプレドキシンの免疫原性を減少させ得るが、哺乳動物細胞、組織および動物において前悪性病変の発生を阻害するペプチドおよび1種類以上の他の化学予防剤の能力は保持する種々のバリアントを含み得る。かかるバリアントとしては、限定されないが、該ペプチドおよび1種類以上の他の化学予防剤の加水分解を減少させるもの、該ペプチドおよび1種類以上の他の化学予防剤の脱アミド化を減少させるもの、酸化を減少させるもの、免疫原性を減少させるもの、該ペプチドの構造的安定性を増加させるもの、または該ペプチドおよび1種類以上の他の化学予防剤のサイズを増加させるものが挙げられる。また、かかるペプチドとしては、環状化ペプチド（Monk et al.，BioDrugs 19（4）：261-78,（2005）；DeFreest et al.，J. Pept. Res. 63（5）：409-19（2004）参照）、D,L-ペプチド（ジアステレオマー）、Futaki et al.，J. Biol. Chem.  Feb 23；276（8）：5836-40（2001）；Papo et al.，Cancer Res. 64（16）：5779-86（2004）；Miller et al.，Biochem. Pharmacol. 36（1）：169-76,（1987））；通常でないアミノ酸を含むペプチド（Lee et al.，J. Pept. Res. 63（2）：69-84（2004）参照）、N-およびC-末端修飾（Labrie et al.，Clin. Invest. Med. 13（5）：275-8,（1990）参照）、炭化水素ステイプリング(stapling)（Schafmeister et al.，J. Am. Chem. Soc. 122：5891-5892（2000）；Walenski et al.，Science 305：1466-1470（2004）参照）ならびにPEG化が挙げられる。
【０２７３】
種々の態様において、医薬組成物は、担体および賦形剤（例えば、限定されないが、バッファー、炭水化物、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤、懸濁剤、増粘剤および／または保存料）、水、油類、生理食塩水溶液、水性デキストロースおよびグリコール溶液、適切な生理学的条件必要に応じて、緩衝剤、等張性調整剤、湿潤剤などの他の薬学的に許容され得る補助物質などを含む。本発明の組成物を投与するのに、当業者に公知の任意の適当な担体が使用され得るが、担体の型は投与様式に応じて異なることは認識されよう。また、化合物は、周知の技術を用いてリポソーム内にカプセル封入してもよい。また、生分解性ミクロスフィアも、本発明の医薬組成物のための担体として使用され得る。適当な生分解性ミクロスフィアは、例えば、米国特許第4,897,268号；同第5,075,109号；同第5,928,647号；同第5,811,128号；同第5,820,883号；同第5,853,763号；同第5,814,344号；および同第5,942,252に開示されている。
【０２７４】
医薬組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得るか、または滅菌濾過され得る。得られる水溶液は、そのまま使用するためにパッケージングされ得るか、または凍結乾燥され得、凍結乾燥調製物は投与前に滅菌溶液と合わせる。
【０２７５】
クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤の投与
クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤は、医薬組成物として投与され、製剤化され得、任意の適当な経路によって、例えば、経口、口腔内、吸入、舌下、経直腸、経膣、経尿道、経鼻、局所、経皮、すなわち、経真皮もしくは非経口（例えば、静脈内、筋肉内、皮下および冠動脈内）または硝子体投与によってによって投与され得る。その医薬用製剤は、その意図される目的が達成されるのに有効な任意の量で投与され得る。より具体的には、組成物は治療有効量で投与される。特定の態様において、治療有効量は、一般的に、約0.01〜20mg/日/kg体重である。
【０２７６】
クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物を含む化合物は、単独または他の化学予防剤と組み合わせて癌の予防に有用である。適切な投薬量は、もちろん、例えば、使用されるクプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体もしくは構造的同等物の化合物、共投与（する場合は）に選択される他の化学予防剤の型、宿主、投与様式ならびに潜在する癌の性質および重症度に応じて異なる。しかしながら、一般に、ヒトにおける満足な結果は、約0.01〜20mg/kg体重の日投薬量で得られることが示されている。ヒトにおいて示された日投薬量は、例えば、日用量、週用量、月用量および／または連続投与で簡便に投与されるクプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体もしくは構造的同等物の化合物の約0.7mg〜約1400mgの範囲である。日用量は、1日1〜12回の個々の投薬量であってもよい。代替的に、用量は、1日おき、3日おき、4日おき、5日おき、6日おき、毎週、および同様に1日ずつ増やして31日おきまで、またはそれ以上の間隔で投与され得る。代替的に、投薬は、パッチ、i.v.投与などを用いて連続的であり得る。
【０２７７】
厳密な製剤化、投与経路および投薬量は、担当医師により、患者の状態に鑑みて決定される。投薬の量および期間は、活性クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤の治療効果が維持されるのに充分である血漿レベルが提供されるように個々に調整され得る。一般的に、所望のクプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の他の化学予防剤は、意図される投与経路および標準的な医薬実務に関して選択される医薬用担体と混合して投与される。
【０２７８】
一局面において、クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および、場合によっては、1種類以上の他の化学予防剤は、該ポリペプチドがインサイチュで作製されるようにDNAとして送達される。一態様において、DNAは、例えば、Ulmer et al.,（Science 259：1745-1749（1993））に記載され、Cohen（Science 259：1691-1692（1993））に概説されている「ネイキッド」である。ネイキッドDNAの取込みは、DNAを担体、例えば、生分解性ビーズ上にコーティングし、次いで、これを細胞内に効率的に輸送することにより増大され得る。かかる方法において、DNAは、当業者に公知の任意の種々の送達系、例えば、核酸発現系、細菌およびウイルスの発現系内に存在し得る。DNAをかかる発現系内に組み込むための技術は当業者に周知である。例えば、WO90/11092、WO93/24640、WO 93/17706、および米国特許第5,736,524号参照のこと。
【０２７９】
遺伝物質を生物から生物にシャトル輸送するために使用されるベクターは、2つの一般的な種類に分けられ得る。クローニングベクターは、適切な宿主細胞内での増殖に必須であり、外来DNAが挿入され得る領域を有する複製性プラスミドまたはファージである。外来DNAは、あたかもベクターの一成分であるかのように複製および増殖される。発現ベクター（プラスミド、酵母、または動物ウイルスゲノムなど）は、クプレドキシンのDNAなどの外来DNAを転写および翻訳するため、外来遺伝物質を宿主細胞または組織を導入するために使用される。発現ベクターでは、導入されたDNAは、宿主細胞に、挿入されたDNAを高度転写するようにシグナルするプロモーターなどのエレメントに作動可能に連結される。特定の因子に応答して遺伝子の転写を制御する誘導プロモーターなどのいくつかのプロモーターは、非常に有用である。クプレドキシンならびにそのバリアントおよび誘導体と1種類以上の他の化学予防剤を誘導プロモーターに作動可能に連結することにより、特定の因子に応答して、クプレドキシンならびにそのバリアント、切断体および誘導体と1種類以上の他の化学予防剤の発現が制御され得る。古典的誘導プロモーターの例としては、α-インターフェロン、熱ショック、重金属イオンに応答性のもの、ならびにグルココルチコイドなどのステロイド（Kaufman、Methods Enzymol. 185：487-511（1990））およびテトラサイクリンに応答性のものが挙げられる。他の望ましい誘導プロモーターとしては、構築物が導入される細胞に内因性でないが、誘導剤を外因的に供給すると該細胞に応答性であるものが挙げられる。一般に、有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドである。しかしながら、ウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス およびアデノ随伴ウイルス）などの他の形態の発現ベクターも企図される。
【０２８０】
ベクターの選択は、使用される生物または細胞およびベクターの所望の運命によって決定される。一般に、ベクターは、シグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子、ポリリンカー部位、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列を含む。
【０２８１】
クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物および1種類以上の化学予防剤を含むキット
一局面において、本発明は、パッケージまたは容器内に、以下のもの：（1）少なくとも 1種類のクプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物を含む薬理学的に活性な組成物；（2）1種類以上の他の化学予防剤、および（3）例えば、シリンジ、ネブライザーなどの、該生物学的に活性な組成物を患者に投与するための装置の1種類以上を含む、計画またはキットを提供する。
【０２８２】
キットを供給する場合、組成物の異なる成分は、適切な場合は別々の容器内にパッケージングされ得、使用直前に混合され得る。成分のかかるパッケージングは、個々に、活性成分の機能を失うことなく、長期保存が可能であり得る。
【０２８３】
キット内に含める試薬は、任意の種類の容器内に、異なる成分の寿命が保存され、容器の材質に吸着または改変されないように供給され得る。例えば、密封ガラスアンプルには、凍結乾燥クプレドキシンならびにそのバリアント、誘導体および構造的同等物、または窒素などの中性の非反応性ガス下にパッケージングされたバッファーが含まれ得る。アンプルは、ガラス、例えば、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属などの任意の適当な材質、または同様の試薬を保持するために典型的に使用される任意の他の物質からなるものであり得る。適当な容器の他の例としては、アンプルと同様の材質から作製された単純なボトル、アルミニウムまたは合金などのホイル裏付き内部構造を備え得る包装材料が挙げられる。他の容器としては、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジなどが挙げられる。容器は、皮下注射針が貫通し得る栓を有するボトルなどの、滅菌アクセスポートを有するものであってもよい。他の容器は、取り外すと成分の混合が可能になる容易に取り外し可能な膜によって分離された2つの区画を有するものであってもよい。取り外し可能な膜は、ガラス、プラスチック、ゴムなどであり得る。
【０２８４】
また、キットに、使用説明資料を供給してもよい。使用説明書は紙または他の基材に印刷されたものであり得る、および／または例えば、フロッピーディスク、CD-ROM、DVD-ROM、Zipディスク、ビデオテープ、録音テープ、フラッシュメモリデバイスなどの電子可読媒体として供給され得る。詳細な使用説明書は、キットと物理的に結合していなくてもよい。代わりに、ユーザーが、キットの製造業者もしくは流通業者に指示された、または電子メールで供給されたインターネットウェブサイトから指示されてもよい。
【０２８５】
クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物の修飾
クプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、切断体もしくは構造的同等物は、上記で説明したバリアントおよび誘導体が作製されるように、化学修飾または遺伝的に改変され得る。かかるバリアント、切断体および誘導体は、標準的な技術によって合成され得る。
【０２８６】
クプレドキシンの天然の対立遺伝子バリアントに加えて、コードされたクプレドキシンのアミノ酸配列内に改変をもたらし、クプレドキシンが前悪性病変の発生を抑制する能力を有意に改変しないクプレドキシンコード配列内の変異によって変更を導入することができる。「非必須」アミノ酸残基は、薬理学的活性を改変することなくクプレドキシンの野生型配列から改変され得る残基であるが、「必須」アミノ酸残基は、かかる薬理学的活性に必要とされる。例えば、クプレドキシン間で保存されているアミノ酸残基は特に改変されにくく、「必須」であると推測される。
【０２８７】
ポリペプチドの薬理学的活性を変化させない保存的置換が行なわれ得るアミノ酸は当該技術分野で周知である。有用な保存的置換を表3の「好ましい置換」に示す。ある種類のアミノ酸が同じ型の別のアミノ酸で置き換えられる保存的置換
は、該置換によって化合物の薬理学的活性が著しく改変されない限り、本発明の範囲に含まれる。
【０２８８】
2012512259.tif 000007
【０２８９】
（1）β-シートもしくはα-ヘリックスコンホメーションなどのポリペプチド主鎖の構造、（2）電荷、（3）疎水性、または（4）標的部位の側鎖の嵩に影響を及ぼす非保存的置換により薬理学的活性が調整され得る。残基は、表4に示すような共通する側鎖の性質に基づいて分類される。非保存的置換は、これらのうちの1種類の構成員を別の種類で交換することを伴う。置換は、保存的置換部位に、またはより具体的には非保存部位に導入され得る。
【０２９０】
2012512259.tif 000008
【０２９１】
バリアントポリペプチドは、オリゴヌクレオチド媒介性（部位特異的）変異誘発、アラニスキャニング、およびPCR変異誘発などの当該技術分野で公知の方法を用いて作製され得る。部位特異的変異誘発（Carter、Biochem J. 237：1-7（1986）；Zoller and Smith、Methods Enzymol. 154：329-350（1987））、カセット変異誘発、制限選択変異誘発（Wells et al.，Gene 34：315-323（1985））または他の公知の技術は、クローニングされたDNAに対して行なわれ、クプレドキシンバリアントDNAが作製され得る。
【０２９２】
また、クプレドキシンの既知の変異を用いて、本発明の方法に使用されるバリアントクプレドキシンを作製することもできる。例えば、アズリンのC112DおよびM44KM64E変異体は、天然アズリンと異なる細胞傷害性の増殖停止活性を有することが知られており、かかる改変された活性は本発明の治療方法に有用であり得る。
【０２９３】
本発明のより完全な理解は、以下の具体的な実施例を参照することにより得られ得る。実施例は、単なる例示の目的で記載しており、本発明の範囲の限定を意図しない。状況によって適切であると示唆または適切であるとされる場合は、形態の変更および等価物の置き換えが企図される。本明細書において特定の用語を使用しているが、かかる用語は説明的意味を意図し、限定する目的のためでない。本明細書において先に記載した発明の修正および変形は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく行なわれ得る。
【実施例】
【０２９４】
実施例
実施例1.  MMOCモデルのDMBA誘導性乳房病変に対するペプチドp28の効果
マウス乳腺器官（MMOC）培養物モデルは、乳房発癌に対する潜在的化学予防剤を同定するために成功裡に使用されている。MMOCにおけるインビトロ有効性と実験的発癌モデルでのインビボ有効性との間に75%の陽性相関が観察される。Mehta and Pezzuto、Curr. Oncol. Rep 4：478-486（2002）。
【０２９５】
MMOCモデルにより、DMBAに応答した乳腺胞病変（MAL）または乳管の病変（MDL）の発生に対する潜在的に化学予防性の薬剤の有効性を評価することが可能である。適切なインキュベーション条件下でのDMBAは、培地中のホルモン環境に基づいてMALまたはMDLのいずれかを形成する。Hawthorne et al.，Pharmaceutical Biology 40：70-74（2002）；Mehta et al.，J. Natl. Cancer Inst. 93：1103-1106（2001）。エストロゲンおよびプロゲステロン処理培養腺は管病変が発生するが、アルドステロンおよびヒドロコルチゾン処理腺はエストロゲンおよびプロゲステロン非依存性胞病変を形成する。発癌物質または化学予防剤に曝露しない乳腺は、成長促進ホルモンの非存在下で構造的後退を受けるが、3日目と4日目の間のDMBAでの24時間の処理により、ホルモンの枯渇によって引き起こされる構造の後退が抑制される。これは、腺が正常なホルモン応答性を失い、発達過程が改変されたためであると推測される。形質転換細胞を同系マウスに移植することによって乳腺癌腫を生成させると、これらの非抑制領域において前悪性の新生物発生前の性質が示された。
【０２９６】
胸部のペアの乳腺を各Balb/cマウスから無菌的に切除し、腺をいくつかの群に分けた。p28の効果を、培地中4つの異なる希釈度で評価した。試験薬剤なしの発癌物質処理腺を、化学予防剤の非存在下での発生割合を測定する尺度として供した。化学予防剤の陽性対照に供するために、さらなる対照を含めた。アズリンは培地中に50μg/ml濃度で含めた。胞病変（MAL）について、染色された腺を病変の発生（所与の処理群の腺の総数と比べた任意の病変を含む腺）について評価した。管病変（MDL）では、同様のプロトコルを採用したが、以下に方法のセクションで示すように、ホルモンの組合せは胞病変と管病変で異なる。腺をホルマリン中に固定し、次いで、組織病理学のために処理した。切片はエオシンおよびヘマトキシリン(hematoxelene)で染色し、顕微鏡下で評価する。ここで、対照と処理群間の管病変の多重度を比較する。
【０２９７】
器官培養手順。試験に使用した実験動物は、Charles River、Wilmington、MAから入手した3〜4週齢の幼獣バージンBALB/c雌マウスであった。1μg エストラジオール-17β＋1mg プロゲステロンでの皮下注射によってマウスを毎日9日間治療した。この治療は、ステロイドで前処理していない動物がインビトロでホルモンに応答しない限り、先行必要条件である。全培養手順を詳細に記載する。Jang et al.，Science 275：218-220（1997）；Mehta，Eu. J. Cancer 36：1275-1282（2000）；Mehta et al.，J. Natl. Cancer Inst. 89：212-219（1997）；Mehta et al.，J. Natl. Cancer Inst. 93：1103-1106（2001）。
【０２９８】
簡単には、頚部脱臼によって動物を死亡させ、胸部のペアの乳腺をシルクラフト上に取り出し、無血清Waymouth MB752/1培地中で10日間インキュベートした（5つの腺/5ml/皿）。乳腺胞病変（MAL）を誘導するプロトコルでは、培地に、培地1mlあたりグルタミン、抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン 100単位/ml培地）ならびに成長促進ホルモン、5μg インスリン（I）、5μg プロラクチン（P）、1μg アルドステロン（A）ならびに1μg ヒドロコルチゾン（H）を添加した。管病変（MDL）の誘導では、培地は、5μg/ml、5μg/ml P、0.001μg/mlエストラジオール17βおよび1μg/mlプロゲステロン（Pg）を含むものであった。Mehta et al.，J. Natl. Cancer Inst. 93：1103-1106（2001）。3日目と4日目の間に、発癌物質DMBA（2μg/ml）を培地に添加した。本試験のため、DMBAをDMSO中に4mg/mlの終濃度で溶解させ、50μgのIを100mlの培地に添加し、2μg/mlの終濃度にした。対照皿にはビヒクルとしてDMSOを含めた。
【０２９９】
4日目、腺を新鮮培地中ですすぎ、DMBAなしの新鮮培地を含む新しい皿に移すことにより、DMBAを培地から除去する。10日間のインキュベーション後、腺を、Iのみ（5μg/ml）を含む培地中に、さらに14日間維持した。全培養期間中、腺を37℃で95%O2および5%CO2の環境下に維持した。化学予防剤は、最初の10日間の成長促進期に培地中に含めた。試験ペプチドp28を、12.5μg/ml〜100μg/mlの範囲の4つの濃度で評価した。アズリンは、培地中、50μg/mlで評価した。ペプチドは、使用前に滅菌水中に溶解させ、濾過した。培地を週3回交換した（月曜日、水曜日および金曜日）。曝露終了時、腺をホルマリン中に固定した。
【０３００】
結果をカイ2乗解析およびフィッシャーの正確検定によって解析した。
【０３０１】
MALの形態学的解析。MALの検査のため、腺をミョウバンカーマイン中で染色し、病変の存在について評価した。腺を、乳房病変の有無、腺ごとの病変の重症度、および薬剤の毒性についてスコア化した。キシレン中に保存した腺を、解剖顕微鏡下で、各腺での乳房病変の有無、発生率および重症度について評価した。乳腺を乳房病変について陽性または負電荷として記録し、発生割合を、群内の病変を示す腺と腺の総数の比率として測定した。化学予防剤での治療による管の拡張または乳房構造の崩壊を毒性効果とみなした。データを、発生率に関する統計学的解析に供し、潜在的化学予防剤の有効性を調べた。
【０３０２】
図1Aは、DMBA処理腺における胞病変の代表的な写真および化学予防剤とともにDMBAで処理した腺との比較を示す。胞病変の発生に対するp28の効果を図1B〜1Gに示し、図2にまとめる。ペプチドp28は、25μg/ml濃度でMAL形成を67%阻害した。濃度をさらに100μg/mlまで増大させたが、ペプチドの有効性は増大しなかった。ペプチドとアズリンとの比較により、MAL発生に対してp28がアズリンと同等に有効であることが示された。アズリンでは50μg/ml濃度で67%阻害がもたらされた。統計学的解析により、p28の効果は、12.5μg/mlより高い濃度のDMBA対照と比べて、統計学的に有意であることが示された（p＜0.01、フィッシャーの正確検定；カイ2乗解析）。
【０３０３】
MDLの組織病理学的評価。MDLでは、腺を組織病理学的評価のために処理した。腺を縦方向に5ミクロン切片に細分し、エオシンヘマトキシリン(hematoxeline)で染色した。各腺の縦方向の切片をいくつかの領域に分け、各領域を管病変について評価した。Mehta et al.，J. Natl. Cancer Inst. 93：1103-1106（2001）。簡単には、腺全体をスコープ下で評価する；小さい腺は、大きい腺と比べて領域の総数が少ない。したがって、各腺は不定数の領域を有する。しばしば、管の切片数も腺ごとに異なる。これにより、群ごとの数の違いがもたらされる。管の過形成または異型性を含む領域を測定し、各腺の評価した領域の総数と比較した。過形成または異型性と重度に閉塞された腺との区別はしない。任意のこれらの組織学的パターンを含む任意の領域を病変について陽性とみなした。治療群を対照と重症度について比較し、阻害割合を計算した。
【０３０４】
図3は代表的な管病変を示す。DMBAは、過形成から異型性に変化して管を完全に閉塞させる管病変を誘導する。管切片の管病変/総数の比率を調べた。再度、12.5μg/ml濃度のp28は、MDL形成の15%しか抑制しなかった。しかしながら、25μg/mlでは、50μg/mlのアズリンで観察されたものと同等の病変の有意な阻害があった。12.5μg/mlより高い濃度のp28の有効性は統計学的に有意であった（p＜0.01、フィッシャーの正確検定）。この結果を図4にまとめる。しばしば、化学予防剤の効果は、MALとMDL間で異なることがある。例えば、タモキシフェンはMDLの発生を阻害したが、MAL発生は阻害しなかった。アズリンおよびp28は、エストロゲンおよびプロゲステロン依存性管病変 ならびに非依存性の胞病変の両方を阻害したことに注目することは興味深い。
【０３０５】
この実施例は、p28とアズリンの両方が、乳房組織における前癌性病変の発生を予防し得ることを示す。したがって、p28およびアズリンは、哺乳動物患者において化学予防剤として使用され得る。
【０３０６】
実施例2：MMOCモデルにおける乳腺胞病変の誘導に対するアズリンおよびペプチドp28の効果
化学薬品：アズリンおよび他の合成ペプチド：大腸菌JM109を、緑膿菌株PA01のアズリンコード遺伝子（azuA）の発現のための宿主株として使用した。組換え大腸菌株は、50μgのアンピシリン/ml、0.1mM IPTG、および0.5mM CUSO4を含む2YT培地中で16時間37℃で培養した（31）。アズリン（配列番号1）を組換え大腸菌JM109株のペリプラスム画分から単一のバンドになるまで、Wang et al.，Biochem Biophys Res Commun. 349：1117-1124（2006）に以前に記載されたとおりに精製し、内毒素がないことを調べた。p28の配列はLSTAADMQGVVTDGMASG LDKDYLKPDD（配列番号2）であり、C S Bio Inc.（Menlo Park、CA）によって＞95%純度まで化学合成されたものである。アズリンおよびp28を等分し、乾燥させ、デシケータ内で-20℃にてきれいな滅菌バイアル内に保存した。すべての化合物は、使用直前に培養培地に溶解させ、濾過（0.22μpm）滅菌した。
【０３０７】
乳腺器官培養（MMOC）：MMOCの手順は、以前に詳細に記載されている。Mehta et al.，J. Natl. Cancer Inst. 92：418-423（2000）。簡単には、胸部乳腺を、エストロゲンおよびプロゲステロンで前処理した4週齢雌Balb/cマウスから無菌的に切除し、成長促進ホルモンを含有する化学的に規定されるWeymouth 752/MB培養培地中に外植する。卵巣ホルモン非依存性成長のため、腺をインスリン（5μg/ml）、プロラクチン（5μg/ml）、アルドステロン(aldeosterone)（1μg/ml）およびヒドロコルチゾン（1μg/ml）とともにインキュベートした。ホルモン依存性病変では、腺をインスリン、プロラクチンおよびエストラジオール17β（0.001μg/ml）およびプロゲステロン（1μg/ml）とともに10日間インキュベートした。発癌物質7,12ジメチルベンズ（a）アントラセン（DBMA）（2μg/ml）を3日目に24時間導入した。腺を10日間インキュベートし、次いでインスリンのみの存在下で、さらに14日間後退させた。したがって、典型的に、乳房病変の発生のための培養期間は24日間である。腺を、胞病変（エストロゲン非依存性）および組織病理学的に同定される管病変（エストロゲン依存性病変）についてミョウバンカーマインで染色する。腺は、最初の10日間の培養中だけ、アズリン、p28またはタモキシフェンで処理した。p28とp53の相互作用を調べるため、腺を4日間、ホルモンおよびp28とともにインキュベートした。PCRと免疫組織化学の両方による発現を48時間後に測定した。
【０３０８】
免疫組織化学：乳腺を成長促進ホルモンとともに4日間、アズリンまたはp28の存在下または非存在下でインキュベートした。DMBAは、3日目に24時間、培地中に含めた。ホルマリン固定し、パラフィン埋埋した組織切片を脱パラフィンし、水和させた。p53では、予備加温した（95℃）10mMクエン酸バッファー中およびマイクロ波中にスライドを3分間入れることにより抗原回復を行なった。次いで、スライドを95〜1000の炉内でクエン酸バッファー中に1時間入れた。ER/PgRおよびKi-67免疫染色のため、圧力チャンバを用いて、10mMクエン酸バッファー中で6分間、抗原回復を行なった。PBSですすいだ後、スライドを5%ゼラチン中、続いてアビジンおよびビオチン（Zymed Laboratories、South California、CA）中でインキュベートすることにより、非特異的染色をブロックした。切片を、一次抗体（p53、Vector/novacastra-VP-P956、PGR、ERおよびKi-67、Labvision、Freemont CA、Ki-67 Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz、CA）、マウス血清で予備吸収させる）とともに室温で90分間インキュベートした。PBSで洗浄（3回）後、切片を、適切なビオチン化ヤギ抗ウサギ/抗マウス抗体とともに、次いでABC試薬（Vectashield Elite ABCキット）とともにインキュベートし、DAB（ジアミノベンジジン、Sigma、St Louis、MO）を、免疫反応性を可視化するための色原体として使用した。ギルの#1ヘマトキシリンを用いて、切片を対比染色した。
【０３０９】
RNA抽出およびリアルタイムPCR：個々の乳腺を、Tissue Tearor（Biospec Product，Inc.，Racine、WI）を使用することによりホモジナイズした。核酸は水相中に分離され、タンパク質は低級有機相中に溶出されるフェノール：クロロホルム抽出手順を用いてRNAを抽出した。水相を、イソプロパノールによってさらに精製し、DEPC水中で調製した氷冷70%エタノールによってRNAを沈殿させる。RNAをDEPCに溶解させ、分光測光法によって解析した。Bio-RadサーマルサイクラーPCR機を用いてRNAをcDNAに変換した。
【０３１０】
MyiQリアルタイムPCR検出システム（Bio-Rad、Hercules、CA）において1μLの逆転写産物を使用し、iQ SYBR Green PCR Supermix（Bio-Rad）を製造業者のガイドラインに従って使用することにより、リアルタイムPCRを以前に記載のとおりに行なった。p53の発現を測定した。2つのハウスキーピング遺伝子18SミトコンドリアDNAおよびCAPMの発現をデータ解析に使用した。p53では、リアルタイムPCRに使用したプライマーは、（フォワード：5-GATGACTGCCATGGAGGAG-3’リバース：’-GTCCATGCAAGGTGATG-3’）（配列番号：36および83）、リボソーム18S（フォワード5’-CATGCCCGTTCTTAGTTGGT-3’リバース：5’-GAACGCCACTTGTCCCTCTA-3’）（配列番号37および84）であった。
【０３１１】
統計学的解析：対照群と化学予防剤治療群間のMALおよびMDLの発生の統計学的有意性を評価するため、カイ2乗解析を行なった。
【０３１２】
アズリンおよびp28：図5に示されるように、アズリンは、好気性細菌によって生成される128個のアミノ酸の14kD銅含有タンパク質である。p28を作製し、細胞内への侵入について評価した。結果により、GSTに融合させた28アミノ酸ペプチドであるazu 55-77（図5）は、GSTをJ774細胞内に輸送し得ることが示された。しかしながら、GSTそれ自体では内在化され得なかった。この結果により、アズリンの28アミノ酸（aa 50〜77、配列番号2）構築物を、起こり得るアズリン作用のための活性ペプチドとして選択することの妥当な理論的解釈が示され、p28と指定した。したがって、アズリンを用いて初期実験を行ない、その後の試験ではp28を使用し、アズリンは陽性対照として維持した。
【０３１３】
乳腺胞病変（MAL）の誘導に対するアズリンおよびp28の効果：3つの異なる濃度（10、20および50μg/ml）のアズリンの効果を評価し、各群に15個の腺を含めた。結果により、DMBA対照群の腺ではMALの発生率が71.4%であることが示され、3つの濃度アズリンで、それぞれ、発生の16、20および63%阻害が観察された。50μg/ml濃度では、MAL発生のアズリン媒介性阻害は統計学的に有意であった（p＜0.05）。また、MAL発生に対するp28の有効性も、10〜100μg/mlの濃度範囲のp28を評価することにより調べた。ペプチドは、乳腺発達の成長期の最初の10日間に培地中に添加した。
【０３１４】
図6Aおよび6Bは、対照群およびp28（50μg/ml）処理群のMALを有する腺の代表的な全載物を示す。図6Aに関して、乳腺は、DMBAまたはDMBAおよびp28のいずれかとともにMAL発生の成長促進期中の10日間インキュベートした。24日間の培養期間後、腺をミョウバン(alumn)カーマインで染色した。p28処理腺ではMAL数の減少が観察される。具体的には、図6Aは、50μgのp28の非存在下または存在下のいずれかでの乳腺胞病変の組織病理学を示す。25μgのp28 では、MAL発生の＞60%阻害がもたらされ（p＜0.05）、これは、アズリンで得られる阻害と同等である。いずれの処理群でも管の拡張は観察されなかったため、任意の濃度のp28と関連する毒性はなかった。
【０３１５】
図6Bに関して、管病変は、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した組織病理学的切片において確認した。代表的な切片は、DMBA処理腺において乳管が閉塞されていることを示すが、p28治療により乳管の正常な組織学が示される。
【０３１６】
この実施例は、p28とアズリンの両方とも、乳房組織において前癌性病変の発生を予防し得ることをさらに示す。したがって、p28およびアズリンは、哺乳動物患者において化学予防剤として使用され得る。
【０３１７】
実施例3.MMOCモデルにおけるDMBA誘導性乳房病変に対するペプチドp28およびタモキシフェンの併用の効果
MMOC系は、エストロゲンおよびプロゲステロン依存性とホルモン非依存性のDMBAによって誘導される病変を識別することができる。エストロゲンおよびプロゲステロンの存在下で発生する病変はMDLであり、これは、ヒトDCIS/管癌と比較され得る。エストロゲンの非存在下で発生する明確な胞病変と異なり、エストロゲンの存在下およびアルドステロンの非存在で形成される胞構造は非常に小さく、このことが、エストロゲン依存性病変の胞構造に対する化学予防剤の効果を測定することを困難にする。選択的にMDLを阻害し得る抗エストロゲンであるタモキシフェンは、このモデルではMALを阻害できない。
【０３１８】
MDL発生に対するp28およびタモキシフェンの効果を、上記の実施例2に記載の実験的手順に基づいて評価した。図6Cは、MALおよびMDLに対するp28、またはMDLに対する1μg/mlのタモキシフェンとのp28のいずれかの効果を示す。1群あたり10個の腺を、種々の治療薬と、MALではIPAFまたはMDLではIPEPgのいずれかとともにインキュベートした。腺は、MALではミョウバンカーマインで染色するか、またはMDLでは組織学的に処理した。実験用薬剤の効果を、MALの発生（実験群と比べた治療群におけるMALを有する腺の数）またはMDLについては多重度（実験群と比べた対照における領域1つあたりのMDLを有する管の数）のいずれかに関して評価した。
【０３１９】
結果により、p28は、50μg/mlでMDLの発生を阻害することが示された（図6C）。25μg/mlではMDLの70%阻害であったのに対して、12.5μg/mlでは30%しが阻害しなかった。濃度を100μg/mlに増大させたが、MDLの予防はさらに増強されなかった。タモキシフェン（1μM）治療単独では、MDL形成は約50%阻害された。しかしながら、非有効濃度のp28（12.5μg/ml）と1μMのタモキシフェンの併用により、有効性は70%に増大した（図6C）。タモキシフェン治療を低濃度のp28と併用することにより、タモキシフェンの用量関連毒性が有意に低減され得るため、この併用の劇的な効果は、臨床的に変換性の価値を有し得る。対照と比べてp28処理乳腺切片ではKi67の発現の低減が観察されたため（図3）、p28によるMALとMDLの両方の形成の抑制は細胞増殖の阻害によるものであった。
【０３２０】
この結果は、エストロゲン依存性前癌性乳管の病変の発生に対する保護の増強のための、タモキシフェンと低濃度のp28を併用することの変換的恩恵を示す。
【０３２１】
実施例4：MMOCモデルにおけるp53の誘導に対するペプチドp28およびタモキシフェンの効果
先の試験では、アズリンとp53間に起こり得る相互作用の証拠がいくつか示された。しかしながら、この相互作用またはアズリンによるp53の安定化の機能的重要性は報告されていない。MMOC実験の設計によって、2つの別個のホルモン条件下でのp53発現を比較することにより、エストロゲンおよびプロゲステロンとp53との相互作用的役割が確認され得るため、ステロイドホルモンがp53発現に対して選択的な役割を有するかどうかを調べるための一組の試験を行なった。アルドステロン/ヒドロコルチゾンおよびエストロゲン/プロゲステロンは、独立して、乳腺内に胞構造の発生を誘導するが、これらの2つのホルモン環境下で形成されるDMSA誘導性病変は異なる。さらに、新生物発生前病変の発生は後期事象である。培養期間中のずっと早期に腺を発癌物質に曝露しても、24日後に病変は形成される。したがって、前悪性病変の発生に主要な役割を果たし得る早期細胞シグナル伝達事象は、最初の数日間の培養中にモニタリングされ得る。
【０３２２】
図7Aは、エストロゲンおよびプロゲステロンの存在下または非存在下でインキュベートした乳腺におけるp53 mRNA発現の比較を示す。腺を4日間、アルドステロン＋プロゲステロンまたはエストラジオール＋プロゲステロンとともに化学的に規定される培地中で培養した後、全RNAを各群において個々に4つの腺から単離した。RNAをcDNAに変換し、MyiQリアルタイムPCR検出システムにおいて1μLの逆転写産物を使用し、iQ SYBR Green PCR Supermixを使用することにより、リアルタイムPCRを行なった。p53の発現を測定した。2つのハウスキーピング遺伝子18SミトコンドリアDNAおよびGAPDHの発現をデータ解析に使用した。p53発現を対照に対して標準化した。
【０３２３】
図7Aに示されるように、IPAF（非存在）またはIPEPg（存在）とともにインキュベートした乳腺は、p53の有意なmRNA発現を有しなかった。これらの対照腺を1に標準化し、p28によって引き起こされる相対的な増加または減少を測定した。結果により、エストロゲン＋プロゲステロンの非存在下でp28とともにインキュベートした腺は、p53 mRNA発現の12倍の増大を示すが、エストロゲンおよびプロゲステロンの存在下で腺をp28とともにインキュベートした場合、p53の発現の増強は観察されないことが示された。
【０３２４】
しかしながら、p28処理腺では、免疫組織化学によって測定されたように、培養条件（エストロゲンの存在/非存在）とは無関係に、p53発現の増強が観察された。図7Cは、MMOCでの乳腺におけるp53（写真a〜f）およびKi67（写真g〜l）の免疫組織化学的染色を示す。マウス乳腺を、DMBA単独（a、d、g、j）またはp28の存在下（b、e、h、k）またはアズリン（c、f、i、l）のいずれかとともに4日間インキュベートした。パラフィン埋埋切片を、p53（a〜f）およびKi67（g〜l）の免疫組織化学的染色のために処理した。これらの腺の一部を、エストロゲン/IPAFの非存在下でインキュベートし（a、b、c、g、h、i）、他の一部をエストロゲン/IPEPgの存在下でインキュベートした（d、e、f、j、k、l）。
【０３２５】
免疫組織化学によるKi67染色を調べることによって測定された細胞増殖活性により、さらに、p28とアズリンはどちらも細胞増殖を阻害することが示唆された。ホルモン治療の成長促進効果により、上皮細胞において強いKi67染色がもたらされた（図7C）が、腺をアズリンで処理した場合、Ki67発現の有意な減少があった。したがって、p28は、アズリンおよびp28の抗増殖効果のp53タンパク質の再構築を安定化することが考えられる。
【０３２６】
最近の文献により、エストロゲンは乳癌細胞においてp53の作用を妨げることが示されているため、エストロゲンおよびプロゲステロンで処理した乳腺におけるp53の発現を調べた。図7Dは、免疫組織化学によるp53およびKi67タンパク質発現に対するアズリンおよびp28の効果を示す。マウス乳腺のパラフィン埋埋切片を、IPEPg含有培地、対照（a、e、i）；IPEPg＋50μgのp28（b、f、j）；IPEPg +10μMのタモキシフェン（c、g、k）；およびIPEPg＋タモキシフェン＋50μg/ml p28（d、h、1）とともに4日間、上記の実施例2に記載した方法で示したとおりにインキュベートした。4日後、腺を緩衝ホルマリン中に固定し、パラフィン切片作製のために処理した。抗原回復手順後、p53（a〜d）およびKi-67（e〜h）の免疫組織化学的染色を行なった。タモキシフェンおよびタモキシフェン＋p28の存在下でインキュベートした腺では、乳房上皮細胞において核内p53発現（i〜1）が観察された。同様に、タモキシフェンおよびタモキシフェン＋p28処理腺では、Ki-67の減少が観察された。HおよびE切片を示す。
【０３２７】
結果により、エストロゲンおよびプロゲステロンで処理した腺において、p53発現の抑制が示された。エストロゲン媒介性のp53発現の抑制がタモキシフェンによって克服され得るかどうかを調べるため、抗エストロゲンであるタモキシフェンで処理した腺におけるp53発現を測定した。図7Bに示されるように、p28またはタモキシフェンは、低濃度のp28とタモキシフェンの組合せの存在下で、乳腺においてp53の発現に個々には影響しなかったが、p53 mRNA発現において予想外の125倍の増大があった。これらの試験は、乳腺におけるp53のp28媒介性誘導は、グルココルチコイドとともにインキュベートした腺に選択的でないが、p28は、エストロゲン機能をブロックした場合、エストロゲンおよびプロゲステロンで処理した腺において等しくp53を誘導し得ることを明白に示した。免疫組織化学的試験により、この所見をさらに確認した。結果により、エストロゲンおよびプロゲステロンで処理した腺またはホルモンとp28またはタモキシフェンで個々に処理した腺は、核p53タンパク質を発現しないことが示された。しかしながら、腺をp28とタモキシフェンの組合せとともにインキュベートした場合、p53タンパク質の核発現において驚くべき増大が観察された（図7、l）。また、免疫組織化学的解析により、エストラジオールとともにインキュベートした乳腺では、該腺においてERおよびPRの上方調節が誘導されることが示された。
【０３２８】
したがって、p53の誘導を増強し、それにより前悪性病変および腫瘍の発生を阻害するためにタモキシフェンおよび低濃度のp28を併用することは、有意な、これまでに予測されなかった恩恵がある。
【０３２９】
実施例5-フェンレチニドおよびタモキシフェンと併用したペプチドp28のDMBA誘導性乳房病変に対する効果
マウス乳腺器官培養物（MMOC）アッセイを用いて乳腺のホルモン誘導性構造的分化および該腺におけるDMBA誘導性新生物発生前過形成胞結節様病変の発生の両方に対する潜在的化学予防剤の阻害効果を評価した。幼獣バージン動物由来の乳腺は、インスリン（I）＋プロラクチン（P）＋アルドステロン（A）の存在下で6日間インキュベートした場合、充分成長した腺に分化し得る。これらの腺は、妊娠マウスから得られる腺と形態学的に類似している。アルドステロンをエストロゲン（E）＋プロゲステロン（Pg）と置き換えてもよい。ヒドロコルチゾン（H）を培地に含めることにより、腺は機能的分化のために刺激される。Mehta，R. G.，and Banerjee，M. R、Acta Endocrinol.，80：501（1975）；Mehta，R. G.，and Moon、R C.，Can Maturation Be Induced in Breast Cancer、In：Breast Cancer：Treatment and Prognosis、Basil A. Stoll（編）、Blackwell Press、300、1986。したがって、この培養系で観察されたホルモン誘導性構造的および機能的分化は、動物の種々の生理学的段階で観察されるホルモンに対する応答を模倣する。
【０３３０】
2種類の公知の化学予防性化合物を選択した。MAL発生には、フェンレチニド（4-HPR、N-4-ヒドロキシフェニルレチンアミド）を選択した。フェンレチニドは、MAL発生を＞60%阻害し、高リスク閉経前女性において乳癌の発生に対して臨床有効性を示した。Veronesi、U.，et al、Ann. Oncol. 17：1065-1071（2006）。本プロジェクトに対して選択した第2の化学予防剤は、MDLに対するタモキシフェンであった。タモキシフェンは、乳癌患者の予防および治療のために臨床使用されている。これは、自身の抗エストロゲンとしての作用を媒介し、MMOCにおけるMDL発生に対して有効であるため、これを、p28との組合せで、MMOCにおけるMDL発生の予防について評価した。MALについて2つおよびMDLについて2つの4つの実験を行なった。MALでは、4-HPRを有効濃度で、単独または増大濃度のp28との組み合わせのいずれかで使用した。同様に、MDL実験では、タモキシフェンを単一濃度で、単独または増大濃度のp28の存在下のいずれかで使用した。試料プロトコルを表5に示す。
【０３３１】
2012512259.tif 000009
【０３３２】
p28の効果を、4つの異なる濃度（12.5、25、50および100μg/ml）で、単独または4-HPRもしくはタモキシフェンいずれかとの組み合わせのいれかで評価した。試験薬剤なしの発癌物質処理腺を、化学予防剤の非存在下での発生割合を測定する尺度として供した。化学予防剤の陽性対照に供するために、さらなる対照アズリン（50μg/ml）を含めた。胞病変について、染色された腺を病変の発生（所与の処理群の腺の総数と比べた任意の病変を含む腺）について評価した。管病変では、同様のプロトコルを採用したが、ホルモンの組合せは胞病変と管病変で異なる。MDLに対するP28およびタモキシフェンの効果を調べるためのプロトコルを表6に示す。
【０３３３】
2012512259.tif 000010
【０３３４】
腺をホルマリン中に固定し、次いで、組織病理学のために処理した。切片はエオシンおよびヘマトキシリンで染色し、顕微鏡下で評価する。
【０３３５】
器官培養手順：試験に使用した実験動物は、Charles River、Wilmington、MAから入手した3〜4週齢の幼獣バージンBALB/c雌マウスであった。これらのマウスは容易に入手可能であり、過去の試験のほとんどで、BALB/cマウスが使用されている。1μg エストラジオール-17β＋1mg プロゲステロンでの皮下注射によってマウスを9日間、毎日治療した。この治療は、ステロイドで前処理していない動物がインビトロでホルモンに応答しない限り、先行必要条件である。全培養手順は、Mehta，R.G. and Banerjhee，M.，Acta Endocrinol. 80：501（1975）およびMehta，R.G. et al.，JNCI 93：1103-1106（2001）に詳細に記載されている。
【０３３６】
簡単には、頚部脱臼によって動物を死亡させ、胸部のペアの乳腺をシルクラフト上に取り出し、無血清Waymouth MB752/1培地中で10日間インキュベートした（5つの腺/5ml/皿）。乳腺胞病変（MAL）を誘導するプロトコルでは、培地に、培地1mlあたりグルタミン、抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン100単位/ml培地）ならびに成長促進ホルモン、5μg I、5μg P、1μg Aならびに1μg Hを添加した。管病変（MDL）の誘導では、培地は、5μg/ml I、5μg/ml P、0.001μg/ml エストラジオール-17β、および1μg/ml プロゲステロン（Pg）を含む（14）。3日目と4日目の間に、発癌物質DMBA（2μg/ml）を培地に添加した。本発明の試験のため、DMBAをDMSO中に4mg/mlの終濃度で溶解させ、50μgのIを100mlの培地に添加し、2μg/mlの終濃度にした。対照皿にはビヒクルとしてOMSOを含めた。4日目、腺を新鮮培地中ですすぎ、OMBAなしの新鮮培地を含む新しい皿に移すことにより、OMBAを培地から除去する。10日間のインキュベーション後、腺を、Iのみ（5μg/ml）を含む培地中に、さらに14日間維持した。全培養期間中、腺を3℃で95%O2および5%CO2の環境下に維持した。化学予防剤は、最初の10日間の成長促進期に培地中に含めた。試験ペプチドp28を、12.5μg/ml〜100μg/mlの範囲の4つの濃度で評価した。フェンレチニド（MAL試験の場合）およびタモキシフェン（MDL試験の場合）は、（エタノール中に溶解）1μM濃度で含めた。アズリンは、培地中、50μg/mlで評価した。p28ペプチドは、使用前に滅菌水中に溶解させ、濾過した。培地を週3回交換した（月曜日、水曜日および金曜日）。曝露終了時、腺をホルマリン中に固定した。MALの検査のため、腺をミョウバンカーマイン中で染色し、病変の存在について評価した。腺を、乳房病変の有無、腺ごとの病変の重症度、および薬剤の毒性についてスコア化した。MDLでは、腺を組織病理学的評価のために処理し、腺を縦方向に5ミクロン切片に細分し、エオシンヘマトキシリンで染色した。
【０３３７】
化学予防剤：薬剤アズリンおよびp28は、CDG Therapeutics Inc.によって供給された。薬剤は安定であり、純粋とみなした。
【０３３８】
形態学的解析：キシレン中に保存した腺を、解剖顕微鏡下で、各腺での乳房病変の有無、発生率および重症度について評価した。乳腺を乳房病変について陽性または負電荷として記録し、発生割合を、群内の病変を示す腺と腺の総数の比率として測定した。化学予防剤での治療による管の拡張または乳房構造の崩壊を毒性効果とみなした。データを、発生率に関する統計学的解析に供し、潜在的化学予防剤の有効性を調べた。
【０３３９】
MDLの組織病理学的評価：各腺の縦方向の切片をいくつかの領域に分け、各領域を管病変について評価した。簡単には、腺全体をスコープ下で評価する；小さい腺は、大きい腺と比べて領域の総数が少ない。したがって、各腺は不定数の領域を有する。しばしば、管の切片数も腺ごとに異なる。これにより、群ごとの数の違いがもたらされる。管の過形成または異型性を含む領域を測定し、各腺の評価した領域の総数と比較した。過形成または異型性と重度に閉塞された腺との区別はしない。任意のこれらの組織学的パターンを含む任意の領域を病変について陽性とみなした。治療群を対照と重症度について比較し、阻害割合を計算した。
【０３４０】
統計学的解析：1群あたり15個の腺を使用した場合、化学予防剤が60%以上の阻害を示す場合、これは、結果が統計学的に有意である（p＜0.05）とする。結果はフィッシャーの正確検定によって解析した。
【０３４１】
結果および考察：MMOCモデルにより、DMBAに応答した乳腺胞病変または管病変の発生に対する潜在的に有効な化学物質の有効性を評価することが可能である。適切なインキュベーション条件下でのDMBAは、培地中のホルモン環境に基づいてMALまたはMDLのいずれかを形成する。Mehta，R.G. et al.，JNCI 93：1103-1106（2001）。エストロゲンおよびプロゲステロン処理培養腺は管病変が発生するが、アルドステロンおよびヒドロコルチゾン処理腺はエストロゲンおよびプロゲステロン非依存性胞病変を形成する。発癌物質または化学予防剤に曝露しない乳腺は、成長促進ホルモンの非存在下で構造的後退を受けるが、3日目と4日目の間のDMBAでの24時間の処理により、ホルモンの枯渇によって引き起こされる構造の後退が抑制される。これは、腺が正常なホルモン応答性を失い、発達過程が改変されたためであると推測される。先に示されたとおり、形質転換細胞を同系マウスに移植することによって乳腺癌腫を生成させると、これらの非抑制領域の新生物発生前の性質が示された。
【０３４２】
p28および4-HPRの効果：p28および4-HPRの単独ならびに組合せでの胞病変の発生に対する効果を表7および図8にまとめる。
【０３４３】
2012512259.tif 000011
【０３４４】
すべての腺を写真撮影し、写真を図10に示す。ペプチドp28は25μg/ml濃度で、MAL形成を67%阻害した。p28の濃度を、さらに100μg/mlまで増大させると、80%までの阻害がもたらされた。化学予防剤の併用試験により、4-HPRは、予測どおり、MAL発生を67%阻害することが示された。アズリンはMAL発生を約70%抑制した。統計学的解析により、p28（＞25μg/ml）、4-HPRおよびすべての組合せの効果は、DMBA対照と比べて統計学的に有意であることが示された（p＜0.01、フィッシャーの正確検定）。
【０３４５】
p28およびタモキシフェンの効果-表8および図9に、P28およびタモキシフェンとの組合せによるMDLの化学的予防の結果をまとめる。
【０３４６】
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【０３４７】
p28（12.5μg/ml）はMDL形成の32%を抑制したが、タモキシフェンは単独で、該病変のほぼ50%を阻害した。低P28およびタモキシフェンの併用により、阻害は71%に増大した。すべての化学予防剤は、すべての濃度において、DMBA単独と比べて統計学的に有意であった。同時に、p28（12.5μg/ml）またはタモキシフェン単独もまた、併用治療と比べて有意に異なった。結果は、p28がMAL発生とMDL発生の両方を抑制し得ることを示す。タモキシフェンと併用したp28（12.5μg/ml）は、いずれかの薬剤単独と比べて有意に増強された化学予防活性をもたらす。アズリンおよびp28は、エストロゲンプロゲステロン依存性の管病変および非依存性の胞病変の両方を阻害した。
【０３４８】
細胞内への優先的侵入の機構
実施例6-ヒト細胞株へのp18およびp28の侵入
細胞培養および細胞株：ヒトの癌および非癌（不死化および非不死化）細胞株を、ATCCから入手した[肺癌（A549およびNCI-H23腺癌腫）、正常肺（CCD-13Lu）、前立腺癌（DU145およびLN-CAP）、正常前立腺（CRL11611）、乳癌（MCF-7）、正常乳房（MCF-10A）、結腸癌（HCT116）、正常結腸（CCD33Co）、線維肉腫（HT1080）、ならびに卵巣癌（SK-OV3腺癌腫）]。皮膚から単離した正常線維芽細胞を確立した。正常卵巣細胞（HOSE6-3）は、S. W. Tsao博士（香港大学）からご提供頂いた。黒色腫株（UISO-Mel-2、23、29）を確立し、特性評価した。UISO-Mel-2以外、すべての細胞は、10%熱不活性化ウシ胎児血清（Atlanta Biological Inc.，Lawrenceville、GA）、100単位/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを添加したMEM-E（Invitrogen、Carlsbad、CA）中、37Cで5%CO2中または大気中で培養した。
【０３４９】
増殖アッセイ/細胞増殖：黒色腫細胞を、平底24ウェルプレート（Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ）内に、12×103細胞/ウェルの密度で播種した（4回反復）。24時間後、培地を交換し、新鮮p18、p28、アズリンまたはペプチドなしの同様の容量の培地（8回反復）を毎日72時間添加した。次いで、細胞をBeckman Coulter（Z 1コールター粒子計数器）にて計数した。値を4回反復の平均±SDで示す。
【０３５０】
MITTアッセイ：黒色腫細胞を平底96ウェルプレート（Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ）内に2000細胞/ウェルの密度で播種し、24時間結合させた。次いで、新たに調製したペプチド（10μ1）または培養培を各ウェルに添加した。24時間後、培地を交換し、p18、p28またはアズリンを毎日添加した。72時間のインキュベーション後、10μlのMTT試薬（Trevigen、Gaithersburg、MD）を、各ウェルに添加し、試料を3時間インキュベートし、RT/sig 100μlの洗剤を各ウェルに添加し、試料を37℃でさらに3時間インキュベートした。SpectraMax 340プレートリーダー（Molecular Devices Corporation、Sunnyvale、CA）を用いて吸光度を測定し、非処理対照と比べた処理細胞での570nmにおける吸光度の変化割合を調べた。値は平均±-SDを示す。対照群と治療群間の有意性はスチューデントのt-検定によって決定した。
【０３５１】
ペプチド合成：p18、Leu50-Gly67 LSTAADMQGVVTDGMASG（配列番号25）、p28 Leu50-Asp77 LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD（配列番号2）、p18b Val60-Asp77 VTDGMASGLDKDYLKPDD（配列番号38）、MAP、Mastoparan-7、およびポリアルギニン（Arg8、配列番号：82）を含む、すべてのアズリン由来ペプチドは、C S Bio，Inc.（Melo Park、CA）によって合成した。ペプチドは、凍結乾燥粉末として受け取り、等分し、気密デシケータ内で-20℃にて保存した。続いて、すべてのペプチドは、質量分析および逆相HPLCによって＞95%の純度および物質収支として解析された。
【０３５２】
アズリンペプチドの推定モデル設計：GENETYXソフトウェア（バージョン6.1）を用いてアズリン由来ペプチドのRobson構造モデルを作製した。Gamier，J.，Osguthorpe、D. J.，and Robson，B.，J Mol Biol、120：97-120（1978）。強い膜接触点に関する所与のタンパク質の構造を推定し、かかる接触点を最も形成しそうなタンパク質表面領域を規定するために、MAPAS Softwareを使用した。Sharikov，Y. et al、Nat Methods、5：119（2008）。タンパク質、すなわちアズリンが膜親和性残基スコア（MRS）＞3、膜親和性領域スコア（MAS）＞60%、膜親和性非対称性係数（Kmpha）＞2.5を有する場合、該タンパク質が真の膜接触領域を有する確率が高い。
【０３５３】
ペプチド/タンパク質標識：ペプチドを、Alexafluor 568 色素（Molecular Probes、Eugene、OR）と混合した1mlのPBSに、タンパク質：色素の比1：2で溶解させ、100μlの重炭酸ナトリウムを添加し、混合物を、連続的に撹拌しながら4℃で一晩インキュベートした。p12ではSlide-A-Lyzerg Dialysis Cassettes 1000 MWCO、およびその他（Pierce Biotechnology、Rockford、IL）では2000 MWCOを使用し、冷PBSに対して透析することにより標識ペプチドを遊離色素から分離した。
【０３５４】
細胞透過共焦点(fconfocal)解析：細胞を、ガラスカバースリップ上に播種し、5%CO2下、37℃で一晩接着させた。細胞を、新鮮培地ですすぎ、37℃で2時間、Alexafluor 568標識アズリンペプチド（20μM）もしくはArg8（配列番号：82）（5μM）を含有する予備加温培地中、または単独培地中でインキュベートした。インキュベーション後、カバースリップをPBSで3回すすぎ、細胞を2.5%ホルマリン中に5分間固定し、PBS中で2回、d.i. H2O中で1回洗浄し、カバースリップを、核対比染色のために1.5μg/mlのDAPI（VECTASHIELD(登録商標) Vector Laboratories、Burlingame CA）を含有する培地中に入れた。細胞内取込みおよび分布を、倒立共焦点レーザー走査顕微鏡（’Model LC510、Carl Zeiss Inc.，Gottingen、Germany）下で写真撮影した。
【０３５５】
リソソームまたはミトコンドリアとのペプチドの共局在を、ガラスカバースリップ上で増殖中の細胞をAlexafluor 568標識アズリンまたはペプチドとともに37°で2時間インキュベートすることにより調べた。ミトロトラッカー(mitrotracker)（MitroTracker(登録商標) Green FM Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA）またはリソトラッカー(lysotracker)（LysoTracker(登録商標) Green DND-26 Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA）を、インキュベーションの最後の30分間に添加した（終濃度1μM）。細胞をPBSで3回すすぎ、2.5%ホルマリン中で5分間固定し、PBS中で2回洗浄し、0.1%Triton-X100を含むPBS中で15分間インキュベートした。次いで、細胞を、1%BSAを含むPBS 中、1μg/mlのウサギ 抗ヒトゴルジン(golgin)97または抗ヒトカベオリン(caveolin)I（Abcam、Cambridge、MA）とともにインキュベートした。4℃で1時間のインキュベーション後、カバースリップをPBSで1回を洗浄し、Alexafluor 468コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体を含有するPBS中で10分間インキュベートし、PBS中で2回およびd.i.H20中で1回洗浄した。次いで、カバースリップを、核対比染色のために、1.5μg/mlDAPIを含有する培地中に入れた。Alexafluor 568（赤）とAlexafluor 468（緑）の共局在（黄色）を解析し、写真撮影した。
【０３５６】
カバースリップ上のUISO-Mel-2細胞を、100μg/mlの硫酸ヘパリン（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO）を含有するMEM-E中で30分間プレインキュベートし、p18、p28またはArg8（配列番号：82）を添加し、終濃度を20μMにした。1時間後、上記のようにしてカバースリップを洗浄し、固定し、解析した。
【０３５７】
FFACSによる細胞透過：細胞（1.0×106/500μlのPBS）を37℃で2時間、Alexafluor 568標識p18もしくはp28（20μM）、Arg8（配列番号：82）（5μM）とともに、または単独培地とともにインキュベートし、PBS中で3回洗浄し、2.5%ホルマリン中で5分間固定し、PBS中で2回洗浄し、200μlのPBS中に再懸濁し、スクリーンに通し、単一の細胞懸濁液を得た。MoFlo Cell Sorter（Dako、Glostrup、Denmark）λex568nmおよびλem 603nmを用いて試料を解析し、バックグラウンドレベルに対する平均蛍光強度の増大倍数を計算した。結果を、3回の個々の実験の平均蛍光で示す。
【０３５８】
侵入阻害薬：フェノールレッドなしの無血清MEM-E中に37℃で維持したUISO-Mel-2細胞（3×105/300μl）を、クロロプロマジン（クラスリン媒介性エンドサイトーシスの阻害薬、10μg/ml、60分間）；アミロリド（マクロピノサイトーシス阻害薬、50μM、30分間）；ナイスタチン（50μg/ml、30分間）；メチル-β-シクロデキストリン（MβCD、5mM、60分間）；フィリピン（小胞媒介性エンドサイトーシスの阻害薬、3μg/ml、60分間）；タキソール（微小管安定剤、20μM、30分間）；スタウロスポリン（細胞周期阻害薬、250nM、10分間）；アジ化ナトリウム（代謝阻害薬、1mM、60分間）；オアウアベイン(Oauabain)（ATPase依存性Na+/K＋ポンプ阻害薬、50mM、60分間）；ブレフェルジンA（BFA；Golgi装置破壊薬、100μM、60分間）；ウォルトマニン（早期エンドソーム阻害薬、100nM、30分間）；モネンシン（後期にエンドソーム/リソソームを阻害する、10μM、60分間）；ノコダゾール（カベオソーム(caveosome)形成を阻害する、10μM、60分間）；サイトカラシンD（アクチンフィラメントおよび微小管破壊薬、5μM、30分間）；ベンジル2-アセトアミド-2-デオキシ-α-D-ガラクトピラノシド（BnGalNac；O-結合グリコシル化阻害薬、3mM、48 時間）；ツニカマイシン（N-結合グリコシル化阻害薬、20μg/ml、48時間）；ならびにノイラミニダーゼ（タンパク質からシアリン酸残基を切断する、IU/ml、30min）を含む阻害薬で前処理した。終濃度は、個々の阻害薬の用量応答曲線から誘導した。次いで、Alexafluor 568標識p18またはp28（20μM）を添加し、1時間インキュベートし、上記のようにして、細胞を洗浄し、固定し、フローサイトメトリー解析の準備をした。
【０３５９】
細胞膜毒性アッセイ/LDH漏出アッセイ：LDH漏出アッセイを、100μlのUISO-Mel-2細胞（5×103）を用いて、製造業者の使用説明書（CytoTox-One、Promega、WI）に従って行なった。ペプチド/タンパク質なしの細胞を負電荷対照として使用した。実験は3回反復して行なった（データは平均±SEMを示す）。
【０３６０】
血液溶解アッセイ：ヒト全血試料（2〜3ml）を1000×g で10分間遠心分離し、ペレットをPBSで1回およびHKRバッファーpH7.4で1回洗浄した（18）。次いで、細胞ペレットを4%赤血球までHKRバッファー中に再懸濁し、50μlを、HRKバッファー中に950μlのペプチド、アズリン（5、50および100μM）または0.1%Triton X-100を有する1.5mlチューブに移し、RBC膜を完全に破壊した。MAPおよびMastoparan7（Bachem California，Inc.，Torrance、CA）を陽性対照として使用した。回転させながら37℃で30分間のインキュベーション後、チューブを1000×gで2分間遠心分離し、300μlの上清みをに移し、吸光度を540nmで記録した。
【０３６１】
侵入の速度論：1.5mlのチューブ内のUISO-Mel-2細胞（5×105細胞）をフェノールレッドなしのMEME 培地中に懸濁させた。0、10、20、50、100、150および200μMのAlexa fluor 568コンジュゲートp18を5、10、15および20秒間添加すること、または1、10、25、50、100、150および200μMのAlexafluor 568コンジュゲートp28を30、60、90および120秒間添加することのいずれか（氷上）によって反応を開始させた。インキュベーション後、1mlの冷PBS を、250μlの混合反応液に添加した。細胞を、600×g で2分間4℃にて2回遠心分離した。少なくとも10,000個の固定細胞を各反応液中でフローサイトメトリーによって解析し、そのバックグラウンドおよび相対蛍光を計算した。
【０３６２】
アズリンのI125標識および競合アッセイ：ペプチドの結合および侵入を、完全細胞アッセイを用いて測定し、HEPES溶液中のUISO-Mel-2細胞（50,000細胞/ml）を、増大濃度（0〜175nM）の放射性標識アズリン(a zurin)とともに、1000倍過剰の非標識p18、p28またはアズリンの存在/非存在下で、37℃で30分間インキュベートし、次いで、氷冷PBSで3回洗浄し、細胞ペレット中に残留する放射能を、γカウンターを用いて計数した。I125アズリン単独とともにインキュベートした細胞中の放射能を総結合とみなし、非標識アズリン、p18またはp28の存在下での放射能を非特異的結合とみなした。総結合から非特異的結合を差し引くことにより特異的結合を測定し、Scatchardプロットを作成した。
【０３６３】
実施例7-癌細胞内への優先的侵入の一因となるp28のドメイン
ペプチド-GST構築物の初期データにより、アズリンのaa 50-77を細胞透過のために推定PTDと規定した。これは、アズリン分子を安定化させるアズリンの残基54〜67を包含するα-ヘリックス領域の構造的証拠とよく適合する。共焦点解析により、最初に、p28/アズリン（図11A）のp28とp18は、ヒト黒色腫、前立腺、肺、乳房および卵巣癌細胞には、比較的同様の効率で浸透するが、組織学的に適合する正常細胞株には同程度に浸透しないことが示唆された（図11A）。1つの例外は、肺線維芽細胞に由来の細胞株であるCCD13-Luであった。カチオン性Arg8（配列番号：82）は、線維芽細胞（図11A）および試験した他のすべての正常細胞株（データ示さず）内に迅速かつ効率的に取り込まれた。
【０３６４】
これらの観察は、本質的に、より感度の高いACs解析によって確認された（図11B）が、p28蛍光は、肺癌を除いて、対応する正常細胞株よりも約0.5〜6倍、p18は約0.5〜3倍高かった。
組織病理学サブタイプである黒色腫において、細胞内蛍光強度に同様のパターンが観察されたが、p18の相対強度は、p28で観察されたもののほぼ50%であった（図11C）。また、バックグラウンドと比べた蛍光強度も、p28よりもp18に曝露した正常細胞および癌細胞のペアの方が一貫して低かった（データ示さず）、再度、個々の細胞に侵入したp18が少ないことが示唆された。すべての場合において、癌細胞または正常細胞いずれかへのp18およびp28侵入の程度は、Arg8（配列番号82）観察されたものよりも有意に低く、この場合、侵入の優先性が観察されなかった（図11A）。p18の推定されるRobson構造（データ示さず）により、C末端アミノ酸が部分β-シートを形成していることが示唆される。p28の親水性C末端の10アミノ酸（aa 68〜77）（配列番号：40）がないこのp18の長さが短いことは、アズリンの推定PTDとしてのp18が、非エンドサイトーシスプロセスによって、エンドサイトーシスまたは膜受容体媒介性プロセスよりも、癌細胞および正常細胞内へのより急速な侵入を有し得ることを示唆する。MAPASデータ（MRS 3.74、MAS 87.1、Kmpha 2.37）により、アズリンのaa 69、70、75、76、85が膜接触点の最良の機会を提供することが予測され、p18ではなくp28に存在するC末端領域（aa 50〜67）が、細胞の状態とは無関係に、細胞膜上の特定の残基に最も接触する可能性が高いことを示す。
【０３６５】
p18およびp28の優先的透過は、同じ細胞株をアズリン60〜77（p18b）、またはaa 66〜77（配列番号：39）、p28のC末端の12個のaaに曝露することにより確認した（図12A、B）。ここで、p18とp28で観察された優先的透過は完全に排除された。p18b（理論pI 4.13）は、短いα-ヘリックスおよび部分β-シートを有し、極めて親水性であり、これらのことが一緒になって、優先的侵入を無効にしているのかもしれない。p12（理論pI 4.33）には、二次α-ヘリックス構造がないが、これも親水性であり、全体的な親水性が、細胞透過の選択性の減少に対する主要な寄与因子であり得ることを示唆する。
【０３６６】
実施例8-細胞透過は膜破壊の結果ではない
アズリン、p28、およびp18による細胞透過は、膜破壊によるものではない。5〜100μMのp28、p18またはアズリンの存在下でUISO-Mel-2細胞を用いたLDH漏出アッセイ（図13A）により、原形質膜完全性を改変することにより、ペプチドもアズリンも細胞に侵入しないことが示唆された。膜破壊がないことは、両親媒性α-ヘリックスとして細胞膜に移行し、活性化させるヘテロ三量体Gタンパク質である受容体模倣体MAPおよびマスト細胞脱顆粒ペプチドマストパラン7に対して、アズリン、p28、およびp18の溶血活性を、ヒト赤血球において測定することにより確認した。マストパラン7は、25μMで完全な細胞溶解を引き起こしたが、アズリン、p28、およびp18は対照と比べて（ペプチドなし）溶血効果はなかった（図13B）。
【０３６７】
実施例9-p18/p28透過は、エネルギー依存性および飽和性である
UISO-Mel-2細胞内へのp28（図14A）およびp18（図14B）の透過は温度依存性である。細胞透過および細胞内輸送は、4℃では3時間かけて比較的ゆっくりと行なわれるが、種々の区画を介する侵入および細胞内輸送は、曝露後2時間以内はp18とp28がUISO-Mel-2細胞の核内に存在したため、22および37℃では急速である。200倍過剰の非標識ペプチドの存在下で30分後のUISO-Mel-2細胞内への5μMのp28（図14C）またはp18（図14D）の透過は、大きく削減され、侵入が飽和性プロセスであり、特定の受容体または細胞表面タンパク質または特定の残基が少なくとも一部、初期侵入の一因であることを示す。
【０３６８】
実施例10-p28およびp18の速度論
ヒト線維芽細胞と比べたUISO-Mel-2細胞内へのp28およびp18侵入の速度論を細胞を固定した場合のインキュベーション後に計算し、平均蛍光強度（MFI）を測定した。速度（MFI/秒）に対してペプチド濃度（μM）をプロットすることにより、またはScatchard解析によって各ペプチドのKmおよびVmaxを計算した。アズリン断片50〜67（pl8：Vmax 2.46、Km 101.6）および50〜77（p28：Vmax 1.87、Km 159.1）の癌細胞および正常細胞内への透過（それぞれ、Vmax 2.88、Km 102.1およびVmax 1.89、Km 166.0）は互いに有意に異なり、p18の侵入は約42%速いが、正常細胞および癌細胞内への各ペプチドの侵入速度は事実上同一である。癌細胞をp28に曝露後のp18と比べた蛍光の量の増大は、おそらく、悪性細胞内に侵入したp28の量の増大によるものである。125Iアズリンおよびp18はUISO-Mel-2細胞に、同様の親和性で結合した。対照的に、より高い温度（37℃対4℃）でより長時間（20分間対2分間）曝露すると、p18（Kd 18分間、Bmax 0.51 pm）またはアズリン（Kd 10nmおよび0.48 pm）のいずれかよりも有意に多くのp28（Kd 2.5μm、Bmax 3.0 pm）がUISO-Mel-2細胞に、より高い親和性で結合した。この結果は、アズリン、p28およびp18がすべて、侵入前は癌細胞および正常細胞表面上の部位に対して比較的高い親和性および能力で結合するが、1つより多くの機構によって侵入し得ること示す。
【０３６９】
実施例11-p18/p28透過は小胞およびゴルジ複合体を伴う
ペネトラチン、トランスポートラン、Tat（アミノ酸47〜57または48〜60）、およびモデル両親媒性ペプチドMAPなどの細胞透過性ペプチド（CPP）または細胞-送達ベクター（CDV）と称されるペプチドは、短い、両親媒性およびカチオン性のペプチドおよびペプチド誘導体であり、通常、多数のリジンおよびアルギニン残基を含む。Fischer，P. M.，Med Res Rev、27：755-795（2007）。これらは、遺伝子治療における、およびデコイペプチドとして種々の負荷物、例えば、細胞傷害の薬物、アンチセンスオリゴ-ヌクレオチド、タンパク質、およびペプチドのための潜在的輸送体薬剤または送達媒体として大きな注目を集めている小分子の一類型を構成している。Hallbrink，M. et al. Biochim. Biophys. Acta 1515：101-109（2001）；Lindgren，M.，et al. Trends Pharmacol. Sci. 21：99-103（2000）；Gusarova，et al，J Clin Invest、117：99-111（2007）；Melnick，A.，Biochem Soc Trans、35：802-806（2007）；Astriab-Fisher et al.，Pharm Res、19：744-754（2002）；El-Andaloussi et al.，J Gene Med、8：1262-1273（2006）；Cashman et al.，Mol Ther、6：813-823（2002）。
【０３７０】
一類型として、pTatなどのカチオン性CPPとArg8（配列番号：82）は、エンドサイトーシスの前に、最初にアニオン性の硫酸化プロテオグリカンに結合することにより細胞内に侵入する。100μg/mlの亜硫酸ヘパリン（HS）の存在/非存在下、無血清条件下、p28およびp18およびArg8（配列番号82）とUISO-Mel-2細胞とのインキュベーションにより、細胞内Arg8（配列番号82）の量が有意に減少したが、p28の侵入もp18の侵入も改変されなかった（図15A）。O-結合グリコシル化の特異的阻害薬であるBnGalNac、およびシアリン酸残基を切断するノイラミニダーゼ(neruaminidase)の存在下または非存在下でのp18およびp28のUISO-Mel-2細胞内への透過をさらに特徴付けした（図15B）が、透過の阻害は観察されなかった。しかしながら、N-結合グリコシル化の阻害薬であるツニカマイシンは、細胞膜のp18とp28の透過を有意に低減させた。
【０３７１】
また、UISO-Mel-2細胞内へのp18およびp28の侵入を、エネルギー依存性輸送機構、すなわちATPの阻害薬を用いて解析した。アジ化ナトリウム（図15B）およびウアバイン（Na+K＋ATPaseポンプ）は、いずれのペプチドの透過も有意に阻害せず、エンドサイトーシス経路もこれらのペプチドの透過に関与していないであろうことを示唆する。クラスリン媒介性エンドサイトーシスの特異的阻害薬であるクロロプロマジン（CPZ）もまた、透過に対して効果はなく、マクロピノサイトーシス阻害薬アミロライドもそうであった（図15B）。タキソールでの微小管の安定化は、透過に対して効果はなかったが、サイトカラシンDでのアクチンフィラメントおよびマクロピノサイトーシスの破壊により、p18およびp28の透過の少量（約20%）の再現性のある阻害がもたらされた。アミロライドの効果がないことは、サイトカラシンDの阻害活性が、おそらく、そのアクチンフィラメントに対する効果によるものであることを示唆する。
【０３７２】
スタウロスポリンによる細胞周期の阻害により透過はブロックされず、これは、透過が細胞周期特異的でなかったことを示唆する。また、p18およびp28の癌細胞原形質膜の透過に対してスタウロスポリンの効果がないことも、Srcキナーゼ/チロシンキナーゼ依存性経路は、透過に関与しておらず、ダイナミン非依存性であり、したがって、小胞出芽に無関係であることを示唆する。p18もp28も、原形質膜およびエンドサイトーシス中間体の特定の集団に存在するタンパク質であるフロチリン-1と共局在しなかった（データ示さず）、内在化におけるフロチリンおよびダイナミンの役割に対して議論された。対照的に、カベオラ輸送体を破壊し、コレステロール流動の阻害薬、したがって、カベオラ媒介性エンドサイトーシスの阻害薬であるノコダゾールは透過を50〜65%阻害した。
【０３７３】
次いで、p18およびp28の細胞内沈着を、早期エンドソーム形成の阻害薬であるウォルトマニン、後期エンドソーム/リソソームを阻害するモネンシン、およびゴルジ装置の破壊薬であるブレフェルジンA（BFA）を用いて解析した。ウォルトマニンは、p18またはp28のいずれの細胞内蓄積もブロックせず、コレラ毒素とは異なり、早期エンドソーム経路に対するカベオラがp18およびp28の細胞内輸に関与していないことを示唆する。また、p18およびp28の細胞内輸送において早期エンドソームの関与がないことも、クラスリン媒介性エンドサイトーシスは、これらのペプチドの内在化に関与していないことを示唆する。
【０３７４】
しかしながら、モネンシン（図15B）およびBFAは、両方のペプチドの細胞内蓄積を低減させ、p18（約10%）よりもp28（約30%）に対する阻害効果の方が大きかった（図15B）。また、線維芽細胞内へのp28およびp18の透過もMβCD、ノコダゾール、モネンシンおよびツニカマイシンによって阻害されたが、アミロライド、アジ化ナトリウム、およびCPZでは阻害されなかった（図15C）。これは、癌細胞および正常細胞内への少なくとも1つの侵入機構は類似しているかもしれないが、癌細胞へのさらなる優先的蓄積は、共通の膜受容体または構造、すなわち、カベオラの数の関数であり得ることを示唆する（図15D、パネル1、2）。Alexafluor 568標識p18とp28は、カベオリン-1およびゴルジン97抗体（図15Dパネル1,2）と共局在した。これにより、これらの小器官はp18およびp28の細胞内輸に関与していることが確認される。興味深いことに、アズリンはミトコンドリア特異的蛍光と共局在したが、p18もp28も共局在しなかった（図15Dパネル3）。対照的に、p28およびアズリンはリソソームと共局在したが、p18はしなかった（図15Dパネル4）。
【０３７５】
実施例12 - p28とp18の機能的解析
アズリンは、いくつかのヒト癌細胞株の増殖をインビトロおよびインビボで阻害する。図16AおよびBは、MTTおよび細胞計数で測定したときの、アズリンおよびデカルバジン（DTIC）と比べたp18およびp28のUISO-Mel-2細胞に対する効果を示す。72時間の曝露後、アズリンは、100および200μMで、細胞の生存を約15%減少させた（p＜0.05）（図15A）。p28は、100および200μMで細胞の生存を、それぞれ14および22%阻害した（p＜0.05）。対照的に、p18は効果はなかったが、デカルバジン（DTIC）は、UISO-Mel-2生存に対して有意な用量関連減少をもたらした。また、アズリンおよびp28（200μM）も、UISO-Mel-23および29細胞の生存を有意に減少させた。p18は、UISO-Mel-2細胞増殖に対して効果はなかった。
【０３７６】
直接細胞計数により測定したときの、黒色腫細胞増殖のp28およびアズリン阻害における見かけ上の増大（約30〜35%；UISO-Mel-2）は、阻害効果は、主に、なんらかの遅延後にアポトーシスを伴う細胞周期レベルで存在し得ることを示唆する。p18は、p28と異なり、癌細胞を優先的に透過するが、事実上、細胞増殖に対して阻害活性はなかった。この結果は、p28の細胞増殖抑制性活性および細胞傷害活性は、おそらく、配列のC末端の10〜12 aaに存在することを示す。
【０３７７】
実施例13-アズリン由来ペプチドを用いたp53による癌の増殖の阻害：
材料および方法
細胞培養。ATCC（Manassas、VA）から取得したヒト乳癌細胞株MCF-7（p53 wt）およびAndrei V. Gudkov博士（Lerner Research Institute、Cleveland、Ohio）からのMDD2（p53ドミナントネガティブ）を、2mM L-グルタミン、0.1mM 必須アミノ酸を含有し、10%熱不活化ウシ胎児血清、100単位/mlのペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを加えたMEM-E（Invitrogen、Carlsbad、CA）中で培養した。
【０３７８】
細菌の培養およびアズリンの単離。大腸菌JM109を、野生型アズリン生成のための宿主株として使用した。培養条件およびタンパク質精製工程は、Yamada，et al.，Infect Immun、70：7054-7062（2002）およびGoto，et al.，Mol Microbiol、47：549-449（2003）に記載のとおりとした。
【０３７９】
ペプチド合成。p18、Leu50-Gly67 LSTAADMQGVVTDGMASG（配列番号：25）、p28 Leu50-Asp77 LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD（配列番号：2）p18b  Val60-Asp77 VTDGMASGLDKDYLKPDD（配列番号：38）、p12 Gly66-Asp77SGLDKDYLKPDD（配列番号：39）、およびポリアルギニン（Arg8）（配列番号82）を含む、すべてのアズリン由来ペプチドは、CS Bio，Inc.（Menlo Park、CA）により＞95%の純度および物質収支で合成された。
【０３８０】
増殖アッセイ。細胞を12×103細胞/ウェルの密度で、24ウェルプレート（Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ）内のMEM-E中に4重で播種し、5、50、100および200μMのp28の存在下で24、48および72時間インキュベートした。培地を毎日交換した。対照ウェルには、p28なしのMEM-Eを入れた（8重）。ドキソルビシン（10μM）を陽性対照として使用した（Z1コールター；Beckman Coulter Inc.，Fullerton、CA）。値は対照に対する（%）を示す。対照群と治療群間の有意性はスチューデントのt-検定によって決定した。
【０３８１】
MTTアッセイ：MCF-7細胞を2000細胞/ウェルの密度で播種し（4重）、24時間接着させ、新たに調製したペプチド（10μl）またはMEM-Eを各ウェルに添加した。24時間後、培地およびp18、p28、アズリンまたはドキソルビシン を毎日添加した。インキュベーション後、10μlのMTT試薬（Trevigen、Gaithersburg、MD）を各ウェルに添加し、試料を室温で3時間インキュベートし、100μlの洗剤を各ウェルに添加し、さらに3時間 37℃でインキュベートした。吸光度（570nm）を測定し（SpectraMax 340プレートリーダー、Molecular Devices Corporation、Sunnyvale、CA）、処理細胞の変化割合を測定した。対照群と治療群間の有意性（p＜0.05）はスチューデントのt-検定によって決定した。
【０３８２】
異種移植片モデル。エストラジオール前治療（0.72mg/ペレット、60日間放出；Innovative Research、Sarasota、FL）雌胸腺欠損マウス（Harlan；4-5週齢）に、右側部に3×106のMCF-7細胞をs.c.投与した。治療前に対照群および実験群に無作為化した。対照動物にはPBS/ヒマシ油をi.p.投与した。パクリタキセルをPBS/ヒマシ油中15μmol/kgで腫瘍細胞接種後10、14、21および25日目にi.p.注射するか、またはp28を、滅菌PBS中5または10mg/kgで30日間毎日i.p.注射した。腫瘍体積を3回/週測定した。体重を週2回測定した。31日目にマウスを剖検し、すべての腫瘍を組織病理学および免疫細胞化学のために採取した。対照群と治療群間の有意性（p＜0.05）はスチューデントのt-検定によって決定した。
【０３８３】
免疫細胞化学。50mg/kg体重のBrdUを、剖検の2時間前にi.p.注射した。BrdUで標識した腫瘍細胞核を、抗BrdUモノクローナル抗体（Beckon Dickinson、Franklin Lakes、NJ）を用いて同定した。加圧調理器内で6分間、10mMクエン酸バッファーで処理したホルマリン固定した5μパラフィン切片において、p53発現を定量した。内因性ペルオキシダーゼをブロックするため、冷却したスライドを3%H2O2で10分間処理し、ブロック血清で10分間覆い、p53抗体（DO-1、Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA）に室温で2時間に曝露した。ラット抗マウスIgG2aを二次抗体として使用した。p53を発現する細胞を、Vectastain Elite ABCキット（Vector Laboratories、Burlingame、CA）および3,3’-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（Sigma Aldrich、St. Louis、MO）を用いて同定した。スライドをヘマトキシリンで対比染色した。各腫瘍周縁部の10個の非重複領域（250細胞/領域）をp53標識細胞についてスクリーニングした（40回）。
【０３８４】
共焦点顕微鏡検査：細胞をガラスカバースリップ上で37℃で5%CO2下、一晩播種し、新鮮培地ですすぎ、Alexa Fluor 568標識ペプチド（20μM）、Arg8（配列番号82）（5μM）、または単独培地を含有する予備加温培地中で37℃にて2時間インキュベートした。インキュベーション後、カバースリップをPBSで3回すすぎ、2.5%ホルマリン中で5分間固定し、PBS中で2回、d.i.H2O中で1回洗浄し、1.5μg/mlのDAPIを含有する培地中に入れ、核を対比染色した（VECTASHIELD(登録商標)、Vector Laboratories）。サイクリンB1およびp21染色を固定細胞において調べ、メタノールおよびアセトンによって透過性にし、PBSで洗浄し、1：200希釈の抗p21またはサイクリンB（Santa Cruz Biotechnology）とともにインキュベートした。二次抗体コンジュゲートAlexa Fluor 568は、1：100希釈で使用した。倒立共焦点レーザー走査顕微鏡（Model LC510、Carl Zeiss Inc.，Gottingen、Germany）を用いて細胞内取込みおよび細胞内分布を調べた。
【０３８５】
速度論：MCF-7およびMDD2細胞（3×105細胞）をフェノールレッドなしのMEM-E中に懸濁した。1、10、25、50、100、150および200μMのAlexa fluor 568コンジュゲートp28を氷上で30、60、90および120秒間添加することによって反応を開始させた。インキュベーション後、1mlの冷PBSを反応混合物に添加し、細胞を、600×g で2分間4℃にて2回遠心分離した。少なくとも10,000 固定細胞を各反応時点で解析し、濃度をフローサイトメトリーによって解析し、そのバックグラウンドおよび相対蛍光を計算した。
【０３８６】
細胞周期の解析。MCF-7およびMDD2細胞を50μMのp28とともに37℃で48および72時間インキュベートし、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄し、-20℃にて70%エタノールで固定した。固定細胞をPBSで2回洗浄し、20μg/mlのRNase Aを含有するPBS中の50μg/mlのヨウ化プロピジウム（PI）によって染色した。フローサイトメトリー（EPICS Elite ESP、Beckman Coulter、Fullerton、CA）を用いてDNA含有量を測定した。各実験では、最低1万個の細胞を収集した。
【０３８７】
イムノブロッティング。MCF-7およびMDD2細胞を50μMのp28とともに0、24、48および72時間培養し、完全細胞溶解物は、先に記載の方法（3）に従って調製した。リン酸化cdc2（p-cdc2）のための細胞溶解物は、10mM NaF、137mM NaCl、1mM NaVO4、10mM EDTA、1%NP-40、1mM DTTおよびプロテイナーゼ阻害薬（Sigma Aldrich）中で調製した。p53、p27、CDK、サイクリン（Santa Cruz Biotechnology）、p21（Invitrogen）に対する抗体を、供給元の使用説明書に従って使用した。モノクローナルアクチン抗体（Santa Cruz Biotechnology）を用いてアクチン発現を測定し、ECL試薬（Santa Cruz Biotechnology）を用いてタンパク質バンドを可視化した。
【０３８８】
抗p28抗体。p28のN-末端にシステインを導入し（CS Bio Inc.，Menlo Park、CA）、次いで、ペプチドを、システイン残基のチオール基によってスカシガイヘモシアニンとコンジュゲートし、 複合体を皮内および皮下に接種し、ウサギ（New Zealand White、Covance、MI）のp28の11〜28aa（アズリンの60〜77aa）に特異的なポリクローナル抗体を生成させた。p28（0-3μg/ウェル）を用いた直接ELISAによって抗体力価を測定した。96ウェルプレート（Nunc、Rochester、NY）を1μg/ウェルのp28でコーティングした場合、25℃で基質（1工程PNPP、Pierce、Rockford、IL）とともに15分間のインキュベーション後、450nmで0.5の吸光度に再現性のある変化がもたらされるのに、1：140,000の抗体希釈で充分であった。
【０３８９】
GSTプルダウンアッセイ。p53に対するp28結合を、GSTプルダウンアッセイを用いて、本質的にPunj，et al，Oncogene 23：2367-2378（2004）に記載のようにしてアッセイした。精製GST-p28（10および20μg/反応）、GST-MDM2（20μg/反応）およびGST単独（20μg/反応）を、Glutathione Sepharose 4Bビーズ（GE Healthcare、NJ）に結合させ、PBSで2回洗浄することにより非結合ペプチドを除去した。MCF-7細胞の完全細胞溶解物は、氷上で15分間、プロテイナーゼ阻害薬カクテル（Sigma-Aldrich）を含有するPBS/0.1%Triton X-100を用いて作製し、14000r.p.m.で30分間4℃にて遠心分離した。得られた上清みをビーズと混合し、4℃で2時間インキュベートし、PBSで2回洗浄し、非結合細胞溶解物を除去し、次いで、SDS-試料バッファー中で煮沸した後、10%SDS-PAGE上に負荷した。膜を、TBST（Tris/0.05%Tween20）中スキムミルク（5%）および5%スキムミルク中ポリクローナルp53抗体（FL-393、Santa Cruz Biotechnology）とともに4℃でインキュベートし、TBSTで3回洗浄し、ウサギIgG-HRP二次抗体（Sigma-Aldrich）を添加し、室温（r/t）で1時間インキュベートし、TBSTで3回洗浄した。
【０３９０】
p53上の潜在的結合部位は、以下のようにして同定した。p53のMDM2 結合部位（18〜23aa）における相互作用を、p28（10〜50モル過剰）の存在下でGSTプルダウンアッセイを用いて解析し、イムノブロッティング（IB）によってp53バンドを検出した。利用可能なp53タンパク質を最も広く包含する3つの異なる抗p53抗体、Pab 1801（32〜79 aa；Santa Cruz Biotechnology）、ab 2433（277〜296aa；Abcam Inc.，Cambridge、MA）およびPab1802（306〜393aa；Santa Cruz Biotechnology）を、各々、p28の存在下、GST-p53固定化ビーズと反応させた。インキュベーション後、試料をPBSで2回洗浄して非結合p28を除去し、未処理PAGE試料バッファー（Tri/グリセロール/BPB）中で煮沸し、5%Native-PAGE上に負荷した。エレクトロブロッティング（0.2Amp 1時間）によって試料をPVDF膜に移し、TBST中スキムミルク（5%）で膜をブロックし、5%スキムミルク中p28（1：5000希釈）に対するポリクローナル抗体とともに4℃でインキュベートした。TBSTで洗浄後、HRPコンジュゲートウサギ抗IgG抗体（1：7000希釈、Santa Cruz Biotechnology）を適用した。ECL試薬を用いてp28バンドを可視化した。Glutathione Sepharose 4Bビーズ上に固定化したGST-p53（20μg/反応）についてp28とp28断片p12、p18およびp18bとの間の競合アッセイを用いてp28上の結合ドメインを同定し、反応液を4℃で2時間インキュベートし、PBSで2回洗浄して非結合p28を除去し、次いで、未処理PAGE試料バッファー（Tri/グリセロール/BPB）中で煮沸し、5%Native-PAGE上に負荷した。タンパク質をエレクトロブロッティング（0.2 Amp 1時間）によってPVDF膜に移し、ブロックし、p28に対するポリクローナル抗体とともに4℃で16時間インキュベートした。p28バンドをECL試薬で可視化した。Gel & Graph Digitizing Software、UN-SCAN-ITTM（Silk Scientific Inc.，Orem、Utah）を用いてバンド強度を測定し、特異的タンパク質/アクチン比を計算した。以下に示した各タンパク質バンドの値は、治療直前のタンパク質バンド(babd)強度の相対割合である（0時間を100%で表示）。
【０３９１】
p53 DNA結合活性。製造業者の使用説明書に従って、核画分（Nuclear Extractionキット、Active Motif、Carlsbad、CA）を、50μMのp28またはアズリンのいずれかとの24時間のインキュベーション後、MCF-7細胞から単離した。核抽出物の上清みを、14,000rpmで4℃にて10分間の遠心分離によって収集した。タンパク質濃度は、Bradford方法を用いて測定した。p53のDNA結合活性は、TransAM p53キット（Active Motif）を用いて測定した。簡単には、p53 コンセンサスオリゴヌクレオチドに対する非特異的結合を抑制するために、DTTおよびポリ[d（I-C）]を含有する40μlの結合バッファーを各ウェルに導入した。核抽出物を各ウェルに適用し、H2O2処理またはバッファーのみをそれぞれ、陽性対照および負電荷対照とし、r/tで1時間インキュベートした。ウェルを3回洗浄し、100μlのp53抗体（1：1000希釈）を適用し、r/tで1時間インキュベートした。洗浄後、HRPとコンジュゲートした二次抗体を添加し、試料を1時間インキュベートし、暗所で3分間発色させた。450および655nmでの吸光度によってDNAに対するp53結合を測定した。
【０３９２】
実施例14-ヒト癌細胞の増殖に対するp28治療のインビトロおよびインビボでの効果
アズリンは、その抗癌活性を、p53媒介性アポトーシスの誘導によって発揮すると考えられる。図18AおよびBは、直接細胞計数およびMTTアッセイによって測定したときの、wt p53（陽性）MCF-7細胞に対するp28およびドキソルビシンの効果を示す。p28は、最初はMCF-7細胞の増殖を、用量および時間関連様式でインビトロ（図17A）で阻害し、24時間の曝露後、5μMで約23%および50〜200μMで約36%の細胞数の有意な減少（p＜0.05）をもたらした。ドキソルビシン（DNAインターカレート剤）もまた、時間依存的様式で細胞増殖を有意に阻害した。MTTアッセイによって測定された細胞の生存は、p28によって有意に改変されなかったが、ドキソルビシンは、MCF-7細胞の生存の有意な時間関連減少を示した（図17B）。また、p28も、30日間の毎日i.p.曝露にすると、胸腺欠損マウスの異種移植片MCF-7細胞の体積に有意な用量関連減少をもたらし（図17C）、腫瘍体積（p＜0.05）が体重減少または行動的変化のいずれも誘導することなく、パクリタキセル(登録商標)で観察されたものまで減少した。30日目までに、10mg/kgのp28の毎日のi.p.によりMCF-7増殖は、腫瘍細胞接種後10、14、21および25日目、15μmol/kg パクリタキセル(登録商標) よりも大きな程度（約20%）まで阻害された。BrdU標識の減少は腫瘍体積のp28誘導性減少と関連し、細胞周期が阻害されたことを示唆した（表9）。対照的に、BrdU標識および腫瘍体積の減少は対照と比べて、核p53染色のp28群においてのわずかな増大およびパクリタキセル(登録商標) 治療群において有意な増大を伴った（表9）。
【０３９３】
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【０３９４】
実施例15-p28による細胞周期の進行の阻害
2つの同系識乳癌細胞株MCF-7（p53 wt）およびMDD2（p53ドミナントネガティブ）の細胞周期解析により、p28への48〜72時間曝露、続いてMCF-7細胞における72時間目のアポトーシスの誘導後、G2/M期において、細胞集団の増大が示された（図19A）。本質的に、p28処理MDD2細胞において細胞周期の進行の阻害またはアポトーシスはなかった（図18B）。p28処理MDD2細胞において細胞周期の阻害およびアポトーシスがないことは（図18B）、MDD2細胞内へのp28侵入の差（図18C）またはVmax（MCF-7：1.83 MFI/秒、MDD2：2.21 MFI/秒）もしくはKm（MCF-7：144.3μM、MDD2：147.9μM）の差によるものではなかった。
【０３９５】
実施例16-p53レベルはp28によって上昇する
アズリンは、MCF-7細胞において、p53と複合体を形成し、細胞内p53レベルを上昇させる。MCF-7細胞内のp53の細胞内レベルもまた、p28への曝露後、時間とともに有意に増大した（図19A）。GSTプルダウンアッセイにより、p28がp53に結合することが示された（図19B）。ここで、GST-p28およびGST-MDM2は、MCF-7細胞溶解物からp53を成功裡にプルダウンしたが、GST単独はしなかった。p28モルの増大は、GST-MDM2との結合について競合せず（図19C）、p53のaa 18〜23がp28の好ましい結合部位ではないことを示唆した。p53タンパク質の異なるモチーフ（aa 32〜79、277〜296および306〜393）を認識するp53抗体の存在下または非存在下でのさらなるGSTプルダウンアッセイでは、p53に対するp28結合はブロックされず、p28がこれらの認識部位以外のp53領域に結合すること示唆した（図19C）。
【０３９６】
GST-p53タンパク質を固定化したSepharose 4B-グルタチオンビーズを、p28およびアズリンのaa 66〜77、aa 50〜67、またはaa 60〜77（p28 断片p12、p18およびp18b）のいずれかととともに、それぞれインキュベートすると、有意な量のp28 がp18およびp18bで置き換えらたが、p12を競合因子として使用した場合は、弱い程度にすぎなかった（図19D）。この結果は、p53に対する最大結合は、p28のaa 11〜28（アズリンのaa 60〜77）内で起こること示す。
【０３９７】
p28は、p53の細胞内レベルを増強するため、p28またはアズリンで処理したMCF-7細胞核抽出物から得たp53 のDNA結合活性もまた調べた。p28およびアズリンによって処理したMCF-7細胞内の核画分におけるp53 DNA結合活性は、対照よりも1.8倍および2.3倍高かった（p＞0.1、アズリンに対してp28）。変異体ではなくp53 wtコンセンサスオリゴヌクレオチド配列は、p53のp28誘導性増大を完全にブロックし、MCF-7細胞の核抽出物中のp53が、wt p53のコンセンサスオリゴヌクレオチド配列に特異的に結合することが確認される（図19E）。
【０３９８】
実施例17-p28による細胞周期関連タンパク質の調節
CDK阻害薬（CDKI）p21およびp27の上方調節により細胞周期進行がブロックされる。p28は、MCF-7細胞において、曝露後、時間とともにp21、p27、CDK6およびサイクリンB1細胞内レベルを対照よりも増大させた（図20A）。有糸分裂プロセスにおける必須タンパク質であるCDK2およびサイクリンAのレベルは、その後、p28処理MCF-7細胞において曝露後、時点とともに減少した（図20A）。対照的に、p53、cdc2、CDK2、CDK4およびCDK6は、本質的に、MDD2細胞において一定のままであった（図20B）が、サイクリンAおよびサイクリンB1（48時間）はわずかに増大した。p21は、MDD2細胞内のp53非依存性経路によって発現され得るため、p21は検出可能なままであった。しかしながら、p28はp21のレベルを改変しなかった（図20B）。対照的に、p27は、未処理またはp28曝露MDD2細胞では検出可能でなかった。イムノブロッティングによって検出された、p28に応答したMCF-7細胞におけるp21およびサイクリンB1のレベルの増大は、それぞれ、核区画および細胞質ゾル区画におけるその増大によって反映される（図20CおよびD）。また、p28に対するMCF-7細胞の曝露によっても、cdc2の不活性形態であるリン酸化cdc2（p-cdc2）の蓄積が誘導された。p28に対するMDD2細胞の曝露後、p-cdc2のレベルは増大しなかった（図20E）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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