(57)【要約】  筐体２３を備え、複数の細胞培養容器、特にマイクロタイター（MT）プレート２、において自動的に平行して細胞を培養する。筐体２３には、少なくとも一つの顕微鏡７及び少なくとも一つのカメラ６を有する観察ユニット３と、細胞培養容器を受けるレセプタクル装置４と、自動的に細胞培養容器、特にマイクロタイタープレート２のウェル１７を流体で、充填及び／又は空にする流体分散ユニット５と、が配置されており、装置中の気候条件、特にガス組成及び温度、が少なくとも細胞培養容器の領域における閉じた系において制御可能であり、筐体では、所望の温度及び／又は所定ガス組成が自動的に調整され、更に、細胞培養容器２を備えるレセプタクル装置４が少なくとも部分的に集積され、その筐体中には気候室２１が設けられている。
2012524527.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
筐体（２３）を備えて、複数の細胞培養容器、特にマイクロタイター（MT）プレート（２）、において自動的に平行して細胞を培養する装置であって、
前記筐体（２３）には、少なくとも一つの顕微鏡（７）及び少なくとも一つのカメラ（６）を有する観察ユニット（３）と、細胞培養容器を受けるレセプタクル装置（４）と、自動的に細胞培養容器、特にマイクロタイター（MT）プレート（２）のウェル（１７）を流体で、充填及び／又は空にする流体分散ユニット（５）と、が配置されており、
装置中の気候条件、特にガス組成及び温度、が少なくとも細胞培養容器の領域における閉じた系において制御可能であり、
前記筐体では、所望の温度及び／又は所定ガス組成が自動的に調整され、更に、前記細胞培養容器（２）を備えるレセプタクル装置（４）が少なくとも部分的に集積され、その筐体中には気候室（２１）が設けられている。
【請求項２】
制御されているガスフラスコからのガス流及び混合室へ導かれる一定量のガスである、好ましくはＯ２、ＣＯ２、及びＮ２である種々のガスを収容するガス容器が設けられており、このガス容器から生じるガス混合物が前記気候室へ導入され、前記気候室へ導入される前のガス混合物は、好ましくは所定の温度に設定されることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記細胞培養容器（２）は、前記気候室（２１）から及び前記気候室（２１）へ移動可能であり、好ましくはキャリッジ（１１）又はロボットアームにて自動的に観察ユニット（３）の領域及び／又は流体分散ユニット（５）の領域に移動可能であることを特徴とする請求項１又は２に記載の装置。
【請求項４】
前記観察ユニット（３）及び／又は前記流体分散ユニット（５）は、前記気候室（２１）の外に配置されることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の装置。
【請求項５】
前記レセプタクル装置（４）は少なくとも２つのレセプタクルユニット（１０）を備え、そのレセプタクルユニット（１０）は、好ましくは積層して配置されており、好ましくはＭＴプレート（２）を支持する凹部（１８）を備えることを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の装置。
【請求項６】
前記観察ユニット（３）の光学素子（カメラ（６）を含む顕微鏡（７））は移動可能であり、その移動は好ましくは制御されることを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載の装置。
【請求項７】
前記観察ユニット（３）の領域に位置する細胞培養容器（２ａ）は移動可能であり、その移動は好ましくは制御されることを特徴とする請求項１乃至６の何れか１項に記載の装置。
【請求項８】
前記顕微鏡（７）は、透過光顕微鏡及び／又は位相差顕微鏡及び／又は蛍光顕微鏡であることを特徴とする請求項１乃至７の何れか１項に記載の装置。
【請求項９】
前記流体分散ユニット（５）は、細胞溶液のような種々の流体、栄養分、染料、前記細胞培養容器（２ａ）へ所定量の流体を分注するマイクロディスペンサー（１２）を備える複数のレセプタクルを有し、このマイクロディスペンサーは好ましくはＭＴプレート（２）のウェル（１７）へ分注し、好ましくは前記細胞培養容器から流体を取り除き、好ましくはＭＴプレートのウェルから取り除き、前記マイクロディスペンサーの移動及び動作は好ましくは制御されていることを特徴とする請求項１乃至８の何れか１項に記載の装置。
【請求項１０】
前記細胞培養容器、特に前記ＭＴプレート（２）、及び、好ましくは前記ＭＴプレートのウェル（１７）は標識されていることを特徴とする請求項１乃至９の何れか１項に記載の装置。
【請求項１１】
前記細胞培養容器（２）は透過性を有することを特徴とする請求項１乃至１０の何れか１項に記載の装置。
【請求項１２】
全ての関連するパラメータ、特に温度、ＣＯ２濃度、Ｏ２濃度、Ｎ２濃度、湿度、及び／又は細胞培養容器、特にＭＴプレート（２）のウェル（１７）への流体の供給を検知するセンサー（２５，２６，２７，２９，３０，３１）を有することを特徴とする請求項１乃至１１の何れか１項に記載の装置。
【請求項１３】
下記のパラメータ又は工程のうち少なくとも１つ、好ましくは全てを自動的に検知及び制御するコンピュータによる検知及び制御システムを有することを特徴とする請求項１乃至１２の何れか１項に記載の装置。
ａ）温度、特に気候室（２１）内の温度；
ｂ）気体中のＯ２濃度、特に特に気候室内のＯ２濃度；
ｃ）気体中のＣＯ２濃度、特に気候室内のＣＯ２濃度；
ｄ）気体中のＮ２濃度、特に気候室内のＮ２濃度；
ｅ）選択された細胞培養容器の充填及び／又は空にすること、特に、選択されたＭＴプレート（２）の選択されたウェル（１７）を選択された量の選択された流体にて選択された回数だけ充填及び／又は空にすること；
ｆ）選択された細胞培養容器における細胞培養の微視的観察及び評価、特に、蛍光顕微鏡、透過光顕微鏡、又は位相差顕微鏡のような選択された技術により選択された回数にて選択されたＭＴプレートの選択されたウェルにおける細胞培養の微視的観察及び評価
【請求項１４】
細胞培養容器に蓋をする又は蓋を外すためのキャッパー／アンキャッパーを備えることを特徴とする請求項１乃至１３の何れか１項に記載の装置。
【請求項１５】
流体分散ユニット（５）において、使い捨ての又は複数の適用のためのピペットの制御された選択的使用が可能であることを特徴とする請求項１乃至１４の何れか１項に記載の装置。
【請求項１６】
複数の細胞培養容器、特に細胞培養システムに設けられたマイクロタイター（MT）プレート（２）、特に前記請求項１〜１５の何れかに記載された装置において、自動的に細胞を培養する方法であって、下記の工程を備える方法。
ａ）細胞培養容器（２）を備えるシステムを充填する；
ｂ）細胞培養媒体、細胞懸濁液、試験物質、染料のような用いられる流体を含有するレセプタクル（１５）を備えるシステムを充填する；
ｃ）用いられるＯ２、ＣＯ２、Ｎ２のようなガスを含むレセプタクル（２０）を備えるシステムを構成し、
ｄ）次のパラメータのうち少なくとも１つを自動的にセットするシステムをプログラムし、
−温度
−ガス中におけるＯ２濃度
−ガス中におけるＣＯ２濃度
−ガス中におけるＮ２濃度
ｅ）細胞培養容器、特に選択されたＭＴプレート（２）の選択されたウェル（１７）を選択された量の選択された流体にて選択された回数だけ自動的に充填及び／又は空にするシステムをプログラムし、
ｆ）選択された細胞培養容器における細胞培養の微視的観察及び評価、特に、蛍光顕微鏡、透過光顕微鏡、又は位相差顕微鏡のような選択された技術により選択された回数にて選択されたＭＴプレートの選択されたウェルにおける細胞培養の微視的観察及び評価のためのシステムをプログラムする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養容器、特にマイクロタイター（ＭＴ）プレートにおいて、自動的に細胞を培養する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
インビトロにおいて単離された細胞を培養することは、生物医学研究において再現可能なデータを確保するための価値あるツールとして認識されている。しかしながら、今日においてさえも、細胞培養は依然として主として手動によりなされている。手動の操作では大きな相違が避けられないため、適切な滅菌が損なわれることになり、再現性及び細胞の質−これらは成功適用に直接的に求められるもの、即ち、活性物質を発展させるのに必要−が損なわれる。これに加えて、特に多数の異なる細胞ラインを扱う際には、ヒトの要因は間違いのリスク又は不安定操作を常に構成する。品質を別にしても、手動による細胞培養の処理量は限定されるか、又は共同者のチームによってのみ拡張可能となる。
【０００３】
細胞培養は、しばしば製剤、化粧品、及びバイオテクノロジー工学、これらの間において、製剤における新しい活性メカニズム及び物質並びに必須となる農薬を求めて使用される。全ての細胞培養パラメータにつき信頼できる評価を有する標準化された自動的な細胞培養方法によってのみ、細胞培養培地開発及び活性物質の開発の分野における生物薬剤学工業での研究開発の本質的基礎を構成する、物質及びその活性メカニズムの長い期間の比較が可能となる。
【０００４】
広範且つ重大な試験に起因する手動操作の複雑性のため、従来から公知の細胞培養方法は、実証し再現することが困難であることが判明している。現在では、細胞培養における柔軟性及び自動化の欠如のため、培養条件における各々且つ全ての望ましい変化は、細胞培養の柔軟性及び自動化の欠如のためのヒト資源やユーザーに要するコストといった付加的且つ高価な出費となる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、特に従来技術の問題を解決する細胞培養容器、特にマイクロタイター（ＭＴ）プレートにおいて平行して自動的に細胞を培養する装置を提供することを目的とする。
【０００６】
この目的は、請求項１に記載されている特徴を備える装置によって達成される。
【０００７】
顕微鏡及びカメラを備える観察ユニットにより、細胞の成長及び細胞のモルフォロジーの継続的観察及び光学的評価が可能となる。
【０００８】
細胞培養容器は、細胞培養フラスコとすることが可能であり、好ましくはＭＴプレートである。
【０００９】
ＭＴプレートは自動的に流体分散ユニット（５）によって充填される。不要な又は古くなった流体は排除されるか又は補充される。
【００１０】
システムの各要素（観察ユニット、レセプタクル装置、気候室及び流体分散ユニット）は所定の筐体中に配置されており、筐体によりバクテリア汚染のリスクが最小化されるため、開いた流体及び培地を許可するいわゆる無菌ベンチとしての機能が供給される。
【００１１】
自動化としての完全な装置の機能、即ち、ＭＴプレートのウェルを充填及び空にし、微視的観察及び評価をする細胞培養のメインの操作工程は、全て自動的に行われるようにプログラムされており、それゆえ例えば系からＭＴプレートを除くことなしに、全ての工程が無菌ベンチの閉じた系中において実行される。装置における気候条件は閉じた系において制御されるため、気候（温度及び／又はガス混合）は細胞培養の要求なく導かれる。
【００１２】
本発明に係る装置は気候室を有しており、この気候室では望ましい気候、即ち望ましい温度及び／又は望ましい湿度又は所定のガス組成を備えており、好ましくはこの気候室では細胞培養容器、特にＭＴプレートを有するレセプタクル装置が少なくとも部分的に集積され、この気候室は筐体内に配置されている。気候室は、筐体内の限定された範囲野中でのみ所定の気候を産生することが可能である。概して、細胞培養そこに有する全ての細胞培養容器、特にＭＴプレートは、細胞培養のために最適化された所定の気候が設定された気候室内に配置される。温度は好ましくは２０〜４５℃の範囲に設定される。概して、ＣＯ２濃度は０〜２０％の範囲に設定され、一方で気候室内の酸素濃度は概して１０〜４０％の範囲に設定される。気候室内の気候の検知は、好ましくは気候室内の対応するセンサによってなされる。加えて、気候室により周囲からの細胞培養のための障壁形成を行う必要がなくなり、細胞培養容器中におけるバクテリア汚染による細胞培養のリスクが最小化される。
【００１３】
本発明に係る装置の所定の好ましい実施形態では、好ましくはＯ２、ＣＯ２、及びＮ２である種々のガスを有する分離ガス容器が設けられ、ガスフラスコからの各々のガス流は制御可能であり、各々のガスの所定量は混合室へ導入され、この混合室からは結果として生じるガス混合物が気候室へ導入される。このようにして正確に所定のガス混合物が産生され、混合室から気候室へ導入される前に、所望の組成に関して最初にアッセイされる。所定のガス組成を設定することは、細胞を培養することにおいて特に重要である。一方では、例えばより低酸素にて成長したガン細胞は雰囲気下では通常であり、他方では、例えば損傷した神経細胞はガン細胞よりも高酸素濃度にて評価される。混合室中におけるガス混合物の産生を促進することは、ガス混合物が気候室へ導かれる前の所定の温度によってもたらされ、この方法により種々の細胞が培養される最適条件が達成される。
【００１４】
レセプタクル装置により、複数のウェル（例えばＭＴＰあたり６，１２，２４，４８，９６，３８４のウェル）の点で異なるＭＴプレートが受け取られる。本実施形態に係る装置のある好ましい実施形態において、細胞培養容器、特にＭＴプレートは、好ましくは観察ユニットの領域及び／又は流体分散ユニットの領域において、気候室へ／気候室からキャリッジ又はロボットアームにて自動的に移動可能である。このようにして選択された細胞培養容器、特にＭＴプレートは、流体で充填するために気候室から短く移動することができる。所定の細胞培養容器もまた観察のために観察ユニットの領域へ移動される。気候室から細胞培養容器を短く移動させることは、気候室内の気候に悪い影響を及ぼさない。自動的に細胞培養容器を気候室へ／気候室から移動させることにより、汚染の高いリスクを有する系の中でＭＴプレートを手動にて移動させることは排除される。
【００１５】
好ましくは観察ユニット及び／又は流体分散ユニットは、気候室の外に配置される。これにより、例えば、これらのユニットに有害である高い湿度から保護し、加えて細胞培養の汚染を防止することにより、これらのユニットは気候室の気候の急激な変化に曝されないという利点がある。
【００１６】
有利なことに、レセプタクル装置は、好ましくは積層されて配置され、そして好ましくは特にＭＴプレートである細胞培養容器を支持する手段を備える、少なくとも２つのレセプタクルユニットを有する。レセプタクルユニットを積層することにより大きな空間を保つことができるので、システムのコストを軽減することができ、気候室内により多くの細胞培養容器を収容させることができる。これらの支持手段は、例えば特にＭＴプレートである細胞培養容器が収まる形状であるレセプタクルユニット内の凹部として構成される。
【００１７】
本発明の他の実施形態では、特にＭＴプレートである細胞培養容器は、移動可能に構成され、好ましくは観察ユニットの領域において制御されて移動可能に構成される。
【００１８】
有利なことに、観察ユニットの光学（カメラを含有する顕微鏡）及び／又は観察のための細胞培養容器は移動可能であり、カメラ又は細胞培養容器の動きは好ましくは制御可能である。
【００１９】
本発明に係る装置の光学にて使用される顕微鏡は、通常の顕微鏡（透過光）、又は、位相差顕微鏡、又は、その他、細胞を観察及び／又は分析する検知手段とすることが可能である。しかしながら、蛍光顕微鏡が本発明に係る装置に用いられることが好ましい。
【００２０】
本発明に係る装置の光学は、好ましくはオートフォーカスの特徴を有する。一概に、光学は対物レンズの自動変化の特徴を有する。
【００２１】
観察ユニットは、好ましくは形態的で機能的な細胞の反応及び成長をオンラインで評価するように構成されており、細胞培養のデータは一概に所定のソフトウエアを有するＰＣにて評価される。
【００２２】
本発明に係る装置の別の実施形態では、流体分散ユニットは、細胞溶液のような種々の流体、栄養分、染料、細胞培養容器へ所定量の流体を分注するマイクロディスペンサーを備える複数のレセプタクルを有し、このマイクロディスペンサーは好ましくはＭＴプレートのウェルへ分注し、好ましくは細胞培養容器から流体を取り除き、好ましくはＭＴプレートのウェルから取り除き、マイクロディスペンサーの移動及び動作は好ましくは制御されている。複数のレセプタクルを備える流体分散ユニットを構成することにより、例えばＭＴプレートの所定のウェルに複数のものが加えられる。例えば蛍光顕微鏡を要する操作が行われる場合、所定のウェルには細胞溶液及び栄養素に加えて染料が導入され、一方で、所定のウェルには栄養素が加えられていない場合、流体分散ユニットのマイクロディスペンサーによってこの導入がなされる。レセプタクルはマイクロディスペンサーユニットの円形の周囲に配置され、好ましくは、マイクロディスペンサーユニットは、個々のレセプタクルに位置するように、回転及び／又は上昇及び下降するように構成される。
【００２３】
有利なことに、特にＭＴプレートである細胞培養容器そして好ましくはそのウェルは、各々のプレートによって標識され、好ましくは各々のウェルは、システム特にソフトウエアによって認識されるインデックスによって署名される。
【００２４】
個々の工程の正確な制御のため、個々の培養容器へ細胞培養物質（例えば、細胞、流体）を正確に割り当てるため、そして個々の処理工程（流体工程、インキュベーション工程、光学工程）へ正確に割り当てるため、インデックスは好ましくは４つのフェーズから構成される。第１のインデックスフェーズでは、各々の培養容器は、内側のインデックス／ナンバー（例えばＭＴＰ１〜ＭＴＰ２４）を有することにより明確に標識され同定される。第２のインデックスフェーズでは、培養容器の各々のサブ容器（概ね、ＭＴプレートの各々のウェル）が標識される。第３のインデックスフェーズでは、レセプタクル装置の各々位置が明確な署名及び同定（例えばＭＴＰ１〜ＭＴＰ２４）によって標識される。第４のインデックスフェーズでは、全体としてのシステムの各々の工程が明確な署名、同定及び制御（例えば、流体工程＝１、レセプタクル工程＝２、光学工程＝３）によって標識される。
【００２５】
細胞培養容器は、全ての種類の顕微鏡、特には蛍光顕微鏡の適用を可能にするために透過性を有することが特に好ましい。使用されるＭＴプレートは薄く構成されることが好ましく、これにより顕微鏡の対物レンズは観察される細胞培養にできるだけ接近して配置されることになる。例えば薄いフィルムが底に設けられたＭＴプレートは、ガラスやプラスチックのような透過性を有する物質によって構成される。
【００２６】
上述したＭＴプレートや細胞培養容器に代替的なものとして、例えばＴ２５又はＴ７５又は似たようなオートフラスコのような細胞培養フラスコも使用可能である。一つの好ましい実施形態では、前述の種々の培養容器は択一的に又は組み合わせて使用可能であり、例えば細胞培養容器を受けるレセプタクル装置は、培養容器の異なる形状及びサイズに適合させるため、種々のアダプタを備える。
【００２７】
本発明に係る装置の別の好ましい実施形態では、全ての関連するパラメータ、特に温度、ＣＯ２濃度、Ｏ２濃度、Ｎ２濃度、湿度、及び／又は細胞培養容器、特にＭＴプレートのウェルへの流体の供給を検知するセンサーは、自動検知を基礎とし、気候条件及び細胞培養容器への流体の供給の制御によって特徴づけられる。
【００２８】
本発明に係る装置の他の好ましい実施形態では、コンピュータ化された検知、及び、自動化された検知の制御システムが設けられ、好ましくは下記のパラメータ又は工程を備える。
ａ）温度、特に気候室内の温度；
ｂ）気体中のＯ２濃度、特に特に気候室内のＯ２濃度；
ｃ）気体中のＣＯ２濃度、特に気候室内のＣＯ２濃度；
ｄ）気体中のＮ２濃度、特に気候室内のＮ２濃度；
ｅ）選択された細胞培養容器の充填及び／又は空にすること、特に、選択されたＭＴプレートの選択されたウェルを選択された量の選択された流体にて選択された回数だけ充填及び／又は空にすること；
ｆ）選択された細胞培養容器における細胞培養の微視的観察及び評価、特に、蛍光顕微鏡、透過光顕微鏡、又は位相差顕微鏡のような選択された技術により選択された回数にて選択されたＭＴプレートの選択されたウェルにおける細胞培養の微視的観察及び評価
好ましくは、システム操作における全てのパラメータ又は工程はセーブされ、例えば気候条件は、閉じたループにおいてシステムによって自動的に制御される。細胞培養サイクルのコースにおいてこれらセーブされた値から１つ又は複数のパラメータが外れた場合（即ち、ＭＴプレートを移動させるために気候室を少しあけた場合）は、セーブされた値に訂正されるように閉じたループの中で自動的に修正される。選択されたＭＴプレートの選択されたウェルを選択された量の選択された流体で充填するために、ＭＴプレート及び好ましくはそこにあるウェルは標識され、これによりそれらをシステムへ導入することが促進され、これは後にシステムにて認識される。光学手段の助けにより、細胞培養は好ましくは継続的にイメージ化され、システムにおいてセーブされる。システムは、操作における前述のパラメータ又は工程の閉じたループ制御を訂正することにより、このような変化に対応して細胞培養に対する所定の変化をも認識する。
【００２９】
本発明に係る装置の一つの好ましい実施形態では、細胞培養容器に蓋をする又は蓋を外すためのキャッパー／アンキャッパーを備えることにより特徴づけられ、好ましくは自動的になされる（図の説明も参照）。
【００３０】
本発明に係る装置の他の好ましい実施形態において、流体分散ユニットにおいて、使い捨ての又は複数の適用のためのピペットの制御された選択的使用が可能であり、これにより個々の培養容器とウェルの間でのクロス汚染を防止することができる。本発明に係る装置において、２つのタイプのピペットが使用され、第１のタイプは培養の間複数回の適用のために用いられるピペットであり、それは、本発明に係る装置における無菌ボックスの中でとどまるピペットである必要がある。流体分散ユニットの領域では、ロボットアームは作動無菌ピペットを受領ボックスから回収し、その後望ましい流体動作が細胞培養容器にて実行され、そして流体分散ユニットのロボットアームは作動無菌ピペットを受領ボックスへ返還する。細胞培養の間、この作動サイクルは複数回繰り返される。
【００３１】
ピペットの作動に加えて、細胞培養の間に一度のみ使用された使い捨てのピペットは、使い捨ての無菌のものを要し、使用済み後は安全に廃棄することを要する。使用済みのピペットは、流体工程の領域において無菌の廃棄ボックスに収容される。操作の間、流体ロボットアームはレセプタクル無菌ボックスから使用済みのピペットを拾い、その後所望の流体動作が特にＭＴプレートである細胞培養容器にて実行される。動作後は、ロボットアームは廃棄ボックスへ使用済みのピペットを排出する。この動作のサイクルは細胞培養の間で一度のみ発生する。
【００３２】
本発明は、複数の細胞培養容器、特に細胞培養システムに設けられたマイクロタイター（ＭＴ）プレート、特に請求項１〜１５の何れかに記載された装置において、自動的且つ同時に細胞を培養する方法にも関し、動作において下記工程を備える。
ａ）細胞培養容器を備えるシステムを充填する；
ｂ）細胞培養媒体、細胞懸濁液、試験物質、染料のような用いられる流体を含有するレセプタクルを備えるシステムを充填する；
ｃ）用いられるＯ２、ＣＯ２、Ｎ２のようなガスを含むレセプタクルを備えるシステムを構成し、
ｄ）次のパラメータのうち少なくとも１つを自動的にセットするシステムをプログラムし、
−温度
−ガス中におけるＯ２濃度
−ガス中におけるＣＯ２濃度
−ガス中におけるＮ２濃度
ｅ）細胞培養容器、特に選択されたＭＴプレートの選択されたウェルを選択された量の選択された流体にて選択された回数だけ自動的に充填及び／又は空にするシステムをプログラムし、
ｆ）選択された細胞培養容器における細胞培養の微視的観察及び評価、特に、蛍光顕微鏡、透過光顕微鏡、又は位相差顕微鏡、又は他の細胞を観察及び／又は分析するための検知手法のような選択された技術により選択された回数にて選択されたＭＴプレートの選択されたウェルにおける細胞培養の微視的観察及び評価のためのシステムをプログラムする
本発明に係る装置又は方法において、気候条件を一定に維持するため、閉じた回路制御の意味で、システムは自動的に気候条件を制御する。更にシステムは、顕微鏡のためにプログラムされた微視的評価を実行する。
【００３３】
光学評価のため、自由に選択可能な複数の興味点が各々の培養容器又はサブユニット（即ち、培養容器４のウェル２におけるＰＯＩ１〜１０）にて規定され、光学的方法（例えば、蛍光顕微鏡、透過光顕微鏡、又は位相差顕微鏡）にて評価される培養容器におけるＰＯＩに関して、所定の制御ソフトウエアがユニットにて自由に選択される。焦点をあわせ、イメージングし、評価及び記憶するために３つの軸（両平面軸及び鉛直軸）にて、移動ユニット（クロステーブル）によって、各々のＰＯＩは移動されるものであることが好ましい。三次元的にＰＯＩをイメージングし記憶する能力により、培養容器及びサブユニットにおける種々の平面にて焦点を合わせることが可能となる。
【００３４】
各々及び全てのＰＯＩは移動可能であり且つ１ミクロン以上の正確さにて評価可能であるが、単一のイメージの組み合わせにより、各々及び全てのＰＯＩの速度向上及び動力学評価を達成することができる。更に、光学的イメージ情報（例えば、細胞の数、動き及び形状、染料情報、蛍光顕微鏡細胞組成、染色された細胞の数）の自動分析が所定のソフトウエア及びユニットにて可能である。
【００３５】
更に、古くなった培地及び新鮮な培地が取り除かれ、システムから／システムへ各々加えられる。
【００３６】
細胞培養容器を備えるシステムを充填すること及び使用される流体を備えるレセプタクルを含有するシステムを充填することは概ね手動にてなされ、これは使用されるガスを含むレセプタクルを備えるシステムを構成することに適用され、この目的のために本発明に係る装置はガスフラスコを含む筐体を備える。
【００３７】
概して、とりわけ、本発明に係る装置及び方法は下記に示す利点を有する。
【００３８】
−全ての細胞培養パラメータ（例えば、温度、ＣＯ２濃度、Ｏ２濃度、Ｎ２濃度、湿度、流体支持、活性物質）の自動検知を備える全行程において、特にＭＴプレートである複数の細胞培養容器において同時且つ自動的に細胞を培養する；
−低コスト；
−高い再現性を有する新規な活性物質の効率的スクリーニング及び開発とともに、新規で改良された細胞ラインの開発の可能にする生物薬剤学のためのプラットホーム系解答を明らかにする；
−操作の個人スキルを向上させるため、コンパクトで均一で単純さを要する直感的操作；
−より高価な要素の使用のバリエーションを最小化するための経済性；
−高い生体適合性を特徴づける長寿命要素を備える単純で人間光学的なモジュール；
−同定可能な条件の下での種々の細胞の同時培養；
−継続的な顕微鏡観察、及び、促進された修正及び評価のための全ての関連データの文書化及び記憶化；
−培地組成に依存する可能性を有する培養条件の変化に起因する効果の直接的測定；
−高度の情報的結論に起因する開発品質の向上を備える形態変化の現在の認識；
−個々の物質の最適濃度及び培養条件における滑らかな変化の設定；
−並列化に起因する要因２〜４によって縮められた進行に要する時間（最適な培地に要する時間はこれまで１２ヵ月から３〜６ヵ月に減少する）；
−自動化に起因する要因２〜３によって減少した開発コスト（即ち、最適な培地に要するコストは、７５０００ＥＵＲから２５０００〜４００００ＥＵＲに減少する）；
−複雑な細胞培養の自動的な実行、例えば複数の動物試験を減少させる毒性のアッセイ；
本発明に係る装置及び方法に開かれた適用の場は、例えば下記に示される。
【００３９】
−無血清システムの開発；
−栄養素の最適化；
−幹細胞の研究；
−クローニング
−活性物質の研究；
−細胞の相互作用；
−組織のシミュレーション；
−細胞毒性試験；
−細胞プロセッシング；
−細胞に基づいた治療製剤の研究；
−動物実験の必要性を減少させる複雑型細胞培養の自動実現；
本発明の好ましい実施形態の下記の記述から、図面及びサブクレームと結びついた本発明の更なる特徴が読み取れ、各々の特徴は別々に又は組み合わせて理解される。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、本発明に係る装置の側面図である（筐体及び気候室は記載されていない）。
【図２】図２は、図１に示された装置の斜視図である。
【図３】図３は、図１に示された装置の上から下へ見下ろす図である。
【図４】図４は、気候室を備える図１に示された装置の斜視図である。
【図５】図５は、筐体を備える図４に示された装置の斜視図である。
【図６】図６は、本発明に係る装置の開及び閉ループ制御のダイアグラムである。
【図７】図７は、本発明に係る装置のキャッパー／アンキャッパーの斜視図である。
【図８】図８は、図７に示されたキャッパー／アンキャッパーの上から下へ見下ろす図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
図１を参照するに、本発明に係る装置の側面図が記載されており、本発明に係る装置は、観察ユニット３と、マイクロタイター（ＭＴ）プレート２を受けるレセプタクル装置４と、流体分散ユニット５と、を備え、複数のマイクロタイター（ＭＴ）プレート２において自動的に平行して細胞を培養する。観察ユニット３は、顕微鏡７及びＣＣＤカメラ６を有する。カメラ６及び顕微鏡７は支持部材８に配置されている。観察ユニット３は、更に、ＭＴプレート２を受けるレセプタクルテーブル９を備える。
【００４２】
レセプタクル装置４は、４つのレセプタクル板１０の積層体を備える。レセプタクル板１０は、ＭＴプレート２を載置するウェル（図示せず）を備えている。レセプタクル装置４は、上昇及び下降が可能である。レセプタクル装置４のレセプタクル板１０の中で、ＭＴプレート２は取り除かれる。この図では、ＭＴプレート２ａは、キャリッジ１１の助けにより、レセプタクル装置４から観察ユニット３の領域へ移動している。平面内においてＭＴプレート２を移動させると共にレセプタクル装置４の上下の移動により、目的のＭＴプレート２を例えば観察ユニット３又は流体分散ユニット５へ供給することが可能となる。
【００４３】
流体分散ユニット５は、部分的に回転し及び／又は上下に動く移動可能な分散アーム１３を備えるマイクロディスペンサー１２を有し、更に、固定されている又は取り換え可能なピペット１４を備えている。流体分散ユニット５は、更に、例えば細胞溶液、栄養素、染料等のような種々の流体を含む複数のレセプタクル１５を有している。レセプタクル１５はマイクロディスペンサー１２に対して所定の場所に位置しており、分散アーム１３の回転及び／又は上下の動きによって、及び／又は、分散アーム１３の上部１６に沿ったピペットの動きによって、ピペット１４は個々のレセプタクル１５に対応して位置する。ＭＴプレート２のウェル１７を充填するため、ＭＴプレート２はレセプタクル装置４によって流体分散ユニット５の領域へキャリッジにて自動的に移動される。この図で示されるように、ＭＴプレート２ａは、流体分散ユニット５の領域に配置されており、ここでマイクロディスペンサー１２により所定の流体が充填される。
【００４４】
図２を参照するに、図１に示された装置の斜視図が記載され、レセプタクル装置４のレセプタクル板１０が積層して配置されており、レセプタクル板１０は凹部１８を備えており、ＭＴプレート２はそこに受け入れられ保持される。
【００４５】
図３を参照するに、図１及び図２に示された装置の上から下へ見下ろす図が記載されている。筐体（図示されていない）の下にある作動空間に加えて、チャンバ１９はガスフラスコ２０を受け取るように設けられる。
【００４６】
図４を参照するに装置１が図示されており、ここではレセプタクル装置４が気候室２１内に設けられている。気候室２１の筐体２１ａは、透過性又は非透過性に構成される。筐体２１ａは実質的にレセプタクル装置４を気密保持するため、これによりＭＴプレートの汚染を避けることができる。気候室２１内では、例えば温度、Ｏ２濃度、ＣＯ２濃度、Ｎ２濃度、湿度を設定することにより、所定の気候が設定され、これにより所望される細胞培養を各々のケースにて実行することができる。観察ユニット３及び流体分散ユニット５は気候室２１の外に設けられており、これにより最適な細胞培養に必要な気候パラメータに曝されることはなく、一方で観察ユニット３又は流体分散ユニット５を、ＭＴプレート２に接近することで得られる汚染（例えば、潤滑油）から防止できる。筐体２１ａには２つの開口２２が設けられており、これにより気候室２１から及び／又は気候室２１へＭＴプレート２の移動が可能となる。開口２２は流体分散ニット５の領域のみならず観察ユニット３の領域において設けられており、ここでは開口２２が閉じられた後にプレート２の移動が可能となる。
【００４７】
図５を参照するに、完全に透明性を有しているか又は非透明性の筐体２３を備える装置１が図示されており、筐体１は−この実施形態では−ガラスディスクの形態の透過部２４を有し、透過部２４は開口できる窓として構成でき、必要な場合は筐体２３の内側へ開口した窓２４を通してアクセス可能である。完全な装置１はいわゆる“無菌ベンチ”として構成される。筐体２３は培養空間を実質的に気密に保持し、外界からゴミ、細菌等の内部への侵入を防ぐ。
【００４８】
気候室２１又は筐体２３の内側の各々及び全ての気候条件は、コンピュータ検知及び制御システムによって制御される。筐体２３の内側又は気候室２１の内側にあるセンサーは継続的に各々の空間における各々及び全ての条件に関する情報を提供し、検出及び制御ソフトウエアは所定のレベルにて気候条件を維持する。所定の流体を所定量にて所定のＭＴプレートのウェル１７へ充填することは、コンピュータ検知及び制御システムにより制御される。この目的のため、ＭＴプレート２とＭＴプレート２の個々のウェル１７とは、システムにより認識されるように標識される。コンピュータ検知及び制御システムはプログラムされ、これにより選択されたＭＴプレート２の所定のウェル１７は、所定量の所定の流体にて所定回数だけ充填される。
【００４９】
同じように、コンピュータ検知及び制御システムは、例えば蛍光顕微鏡、透過光顕微鏡又は位相差顕微鏡及び／又は細胞を観察及び／又は分析するためのその他の探知手段のような所定の技術により所定回数にて、所定のＭＴプレート２、特に所定のＭＴプレート２の所定のウェルにおける細胞培養の微視的観察及び評価するためプログラムされている。
【００５０】
図６を参照するに、気候室２１の内側又は筐体２３の内側における気候条件の開閉ループ制御のためのダイアグラムが図示される。ガスセンサー２５、即ちＣＯ２センサー２６、Ｎ２センサー２７、Ｏ２センサー（図示されず）が、気候室２１内に配置されており、他のガスを検出する更なるセンサーを設けることも可能である。ガスセンサーによって検出された濃度は気候室の閉ループコントローラ２８に送られる。湿度センサー２９は継続的に気候室２１内及び筐体２３内の湿度を検出する。更に、温度センサー３０は、継続的に温度を検出する。湿度センサー２９も温度センサー３０も両方ともその検出を気候室の閉ループコントローラ２８へ送る。更なる温度センサー３１は継続的に筐体２３内の温度を計測し、一方でいわゆる層流ヒーター３２は、好ましくは気候室内の温度に対応して筐体内の温度を設定し、これにより気候室の領域において凝集が形成することを防止できる。加湿器３３により、気候室の閉ループコントローラ２８は、気候室２１の内側の湿度を制御する。加湿器３３と気候室２１との間にてフィルタ部材３４は処理される。加えて、新鮮な空気３５が筐体２３と気候室２１の内側に導入される。気候室の閉ループコントローラ２８により、ガスフラスコ２０からのガス流は、ガス流制御により制御され、結果として混合室３６へ所定量のガスが導入されることになる。ガス循環ポンプ３７により、気候室の閉ループコントローラ２８により閉ループ内で制御されるのと同様に、所望のガス混合物は気候室２１へ導かれ、ガス混合物が導管ヒーター３８により所望の温度に設定される。
【００５１】
本発明に係る装置は、図示されている構成とは異なって構成されることも可能である。そのため、ＭＴプレートを受け入れる装置は、各々が独立して回転する複数のディスクの積層体として構成されることも可能である。レセプタクル装置の個々の要素は、ＭＴプレートと線状輸送部材とを線状に配列することにより形成されるコンベアーベルトのように構成することも可能である。
【００５２】
更に、気候室の壁を通して顕微鏡観察するために、気候室は少なくとも観察ユニットの領域において透過性を有するように構成することも可能であり、これにより気候室からＭＴプレートを動かす必要性がなくなる。この目的のため、気候室は、観察のためにＭＴプレートが載置される凹部を有しても良い。
【００５３】
実施形態にかかわりなく、ＭＴプレートの位置は、観察される同じ毎時間ごとに定められる必要がある。換言すれば、観察位置は、複数の操作において正確さを高めるため毎回設定される必要がある。システムの正確さは、ＭＴプレートの外側の面積の正確さによるが、種々の設計変更が可能である。ＭＴプレートにはフィルムが底に設けられることも可能であるが、Ｚ軸方向における所定の改変も可能である。ＭＴプレートのその他の実施形態では、ガラスディスクが設けられていることも可能であり、この場合はＺ軸方向に改変はあまりされない。
【００５４】
ＭＴプレートは光学特性を有する場合、ＭＴプレートにおける細胞の位置は、システムにおける平面偏差にて補償される必要があり、これはコンピュータ検知システムによってもなされうる。
【００５５】
図７を参照するに、本発明に係る装置の好ましい実施形態におけるキャッパー／アンキャッパー４０の斜視図が示されており、キャッパー／アンキャッパー４０はロボットアーム４１及びキャップホルダー４２を備えている。キャップホルダー４２の上から下へ見下ろす図は図８に示される。キャッパー／アンキャッパー４０は、キャップを閉じたインキュベーションのため、概ね気候室内にあるＭＴプレート２をキャップ及びアンキャップし、一方で、流体又は工学工程ではＭＴプレートはキャップなしで操作される。これは可能なかぎりキャッパー／アンキャッパー４０にてＭＴプレートは繰り返してキャップ及びアンキャップされる必要があるからである。例えば、ＭＴプレートがインキュベータから工学工程へ移動される際、ロボットアーム４１は対応するＭＴプレートを気候室内の選択された位置（“棚位置”）から取ってきて、その後ロボットアーム４１はキャップホルダー４２の方へ移動する。キャップホルダー４２は、スプリング又は機械的に移動可能なピンにより、水平方向に移動可能なクリップ４３を備えている。ＭＴプレート２をキャップホルダー４２へ持ち上げる際は、ＭＴプレート２のキャップ４４はキャップホルダー４２へ挿入され、クリップ４３によりその箇所にとめられている。そしてロボットアーム４１はＭＴプレート２の方へ下降し、キャップ４４はキャップホルダー４２に残る。キャッパー／アンキャッパー４０は、気候室２１内に位置する。
【００５６】
次にロボットアーム４１は気候室から観察ユニット（光学部）へ開いたＭＴプレート２を移動させる。ＭＴプレートは所定時間観察ユニット内に残り、キャップ４４はキャップホルダー４２内にとどまる。
【００５７】
光学工程の動作が一通り終了すると、ロボットアーム４１は開いたＭＴプレートを光学工程から気候室へ移動させ、そこでロボットアーム４１は開いたＭＴプレート２をキャップホルダー４２の方向へ上昇させキャップ４４と結合する。そして結果としてクリップ４３はキャップ４４を離しキャップはＭＴプレート２に戻され、これによりロボットアーム４１は所定の位置にてＭＴプレートを下降させる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年3月9日(2011.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
筐体（２３）を備えて、複数の細胞培養容器、特にマイクロタイター（MT）プレート（２）、において自動的に平行して細胞を培養する装置であって、
前記筐体（２３）には、少なくとも一つの顕微鏡（７）及び少なくとも一つのカメラ（６）を有する観察ユニット（３）と、細胞培養容器を受けるレセプタクル装置（４）と、自動的に細胞培養容器、特にマイクロタイター（MT）プレート（２）のウェル（１７）を流体で、充填及び／又は空にする流体分散ユニット（５）と、が配置されており、
装置中の気候条件、特にガス組成及び温度、が少なくとも細胞培養容器の領域における閉じた系において制御され、
前記筐体では、所望の温度及び／又は所定ガス組成が自動的に調整され、更に、前記細胞培養容器（２）を備えるレセプタクル装置（４）が少なくとも部分的に集積され、その筐体中には気候室（２１）が設けられており、
制御されているガスフラスコからのガス流及び混合室（３６）へ導かれる一定量のガスである、種々のガスを収容するガス容器が設けられており、このガス容器から結果として生じるガス混合物が前記気候室へ導入される。
【請求項２】
前記種々のガスは、Ｏ２、ＣＯ２、及びＮ２の群から選択され、前記気候室へ導入される前のガス混合物は、好ましくは所定の温度に設定されることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記細胞培養容器（２）は、前記気候室（２１）から及び前記気候室（２１）へ移動可能であり、好ましくはキャリッジ（１１）又はロボットアームにて自動的に観察ユニット（３）の領域及び／又は流体分散ユニット（５）の領域に移動可能であることを特徴とする請求項１又は２に記載の装置。
【請求項４】
前記観察ユニット（３）及び／又は前記流体分散ユニット（５）は、前記気候室（２１）の外に配置されることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の装置。
【請求項５】
前記レセプタクル装置（４）は少なくとも２つのレセプタクルユニット（１０）を備え、そのレセプタクルユニット（１０）は、好ましくは積層して配置されており、好ましくは細胞培養容器（２）を支持する凹部（１８）を備えることを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の装置。
【請求項６】
前記観察ユニット（３）の光学素子（カメラ（６）を含む顕微鏡（７））は移動可能であり、その移動は好ましくは制御されることを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載の装置。
【請求項７】
前記観察ユニット（３）の領域に位置する細胞培養容器（２ａ）は移動可能であり、その移動は好ましくは制御されることを特徴とする請求項１乃至６の何れか１項に記載の装置。
【請求項８】
前記顕微鏡（７）は、透過光顕微鏡及び／又は位相差顕微鏡及び／又は蛍光顕微鏡であることを特徴とする請求項１乃至７の何れか１項に記載の装置。
【請求項９】
前記流体分散ユニット（５）は、細胞溶液のような種々の流体、栄養分、染料、前記細胞培養容器へ所定量の流体を分注するマイクロディスペンサー（１２）を備える複数のレセプタクルを有し、このマイクロディスペンサーは好ましくはＭＴプレート（２）のウェル（１７）へ分注し、好ましくは前記細胞培養容器から流体を取り除き、好ましくはＭＴプレートのウェルから取り除き、前記マイクロディスペンサーの移動及び動作は好ましくは制御されていることを特徴とする請求項１乃至８の何れか１項に記載の装置。
【請求項１０】
前記細胞培養容器、特に前記ＭＴプレート（２）、及び、好ましくは前記ＭＴプレートのウェル（１７）は標識されていることを特徴とする請求項１乃至９の何れか１項に記載の装置。
【請求項１１】
前記細胞培養容器（２）は透過性を有することを特徴とする請求項１乃至１０の何れか１項に記載の装置。
【請求項１２】
全ての関連するパラメータ、特に温度、ＣＯ２濃度、Ｏ２濃度、Ｎ２濃度、湿度、及び／又は細胞培養容器、特にＭＴプレート（２）のウェル（１７）への流体の供給を検知するセンサー（２５，２６，２７，２９，３０，３１）を有することを特徴とする請求項１乃至１１の何れか１項に記載の装置。
【請求項１３】
下記のパラメータ又は工程のうち少なくとも１つ、好ましくは全てを自動的に検知及び制御するコンピュータによる検知及び制御システムを有することを特徴とする請求項１乃至１２の何れか１項に記載の装置。
ａ）温度、特に気候室（２１）内の温度；
ｂ）気体中のＯ２濃度、特に特に気候室内のＯ２濃度；
ｃ）気体中のＣＯ２濃度、特に気候室内のＣＯ２濃度；
ｄ）気体中のＮ２濃度、特に気候室内のＮ２濃度；
ｅ）選択された細胞培養容器の充填及び／又は空にすること、特に、選択されたＭＴプレート（２）の選択されたウェル（１７）を選択された量の選択された流体にて選択された回数だけ充填及び／又は空にすること；
ｆ）選択された細胞培養容器における細胞培養の微視的観察及び評価、特に、蛍光顕微鏡、透過光顕微鏡、又は位相差顕微鏡のような選択された技術により選択された回数にて選択されたＭＴプレートの選択されたウェルにおける細胞培養の微視的観察及び評価
【請求項１４】
細胞培養容器に蓋をする又は蓋を外すためのキャッパー／アンキャッパーを備えることを特徴とする請求項１乃至１３の何れか１項に記載の装置。
【請求項１５】
流体分散ユニット（５）において、使い捨ての又は複数の適用のためのピペットの制御された選択的使用が可能であることを特徴とする請求項１乃至１４の何れか１項に記載の装置。
【請求項１６】
複数の細胞培養容器、特に細胞培養システムに設けられたマイクロタイター（MT）プレート（２）、特に前記請求項１〜１５の何れかに記載された装置において、自動的に細胞を培養する方法であって、下記の工程を備える方法。
ａ）細胞培養容器（２）を備えるシステムを充填する；
ｂ）細胞培養媒体、細胞懸濁液、試験物質、染料のような用いられる流体を含有するレセプタクル（１５）を備えるシステムを充填する；
ｃ）用いられるＯ２、ＣＯ２、Ｎ２のようなガスを含むレセプタクル（２０）を備えるシステムを構成し、
ｄ）次のパラメータのうち少なくとも１つを自動的にセットするシステムをプログラムし、
−温度
−ガス中におけるＯ２濃度
−ガス中におけるＣＯ２濃度
−ガス中におけるＮ２濃度
ｅ）細胞培養容器、特に選択されたＭＴプレート（２）の選択されたウェル（１７）を選択された量の選択された流体にて選択された回数だけ自動的に充填及び／又は空にするシステムをプログラムし、
ｆ）選択された細胞培養容器における細胞培養の微視的観察及び評価、特に、蛍光顕微鏡、透過光顕微鏡、又は位相差顕微鏡のような選択された技術により選択された回数にて選択されたＭＴプレートの選択されたウェルにおける細胞培養の微視的観察及び評価のためのシステムをプログラムする。
【国際調査報告】
2012524527.tif 000011
2012524527.tif 000012
2012524527.tif 000013
2012524527.tif 000014