(57)【要約】  多量体化の、例えば、３量体化のドメイン、及び少なくとも１つのＴＲＡＩＬ死受容体である、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合するポリペプチド配列を有するポリペプチドを含む、ＴＲＡＩＬ死受容体に対するアゴニスト。ＴＲＡＩＬ囮受容体に結合しないアゴニストを記載する。多量体化ドメインはヒトテトラネクチン由来であってよい。アゴニストは、ＴＲＡＩＬ死受容体を発現する病原細胞においてアポトーシスを誘発することができる。ＤＲ４及びＤＲ５を発現する細胞、例えば、腫瘍細胞に関連する疾患を治療するための薬物組成物を記載する。ポリペプチドを選択するための方法、及び多量体複合体を調製するための方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３量体化ドメイン、及び少なくとも１つのＴＲＡＩＬ死受容体に結合する少なくとも１つのポリペプチドを含む非天然のポリペプチド。
【請求項２】
３量体化ドメインが、１０位、１７位、２０位、２１位、２４位、２５位、２６位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、又は３５位に最高５個のアミノ酸置換を有する配列番号１０のポリペプチドを含み、３つの３量体化ドメインが３量体複合体を形成する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
３量体化ドメインが、ｈＴＲＡＦ３（配列番号）、ｈＭＢＰ（配列番号）、ｈＳＰＣ３００（配列番号）、ｈＮＥＭＯ（配列番号）、ｈキュビリン（ｈｃｕｂｉｌｉｎ）（配列番号）、ｈトロンボスポンジン（配列番号）、並びにヒトＳＰ−Ｄの頸部領域、（配列番号）、ウシＳＰ−Ｄの頸部領域（配列番号）、ラットＳＰ−Ｄの頸部領域（配列番号）、ウシコングルチニンの頸部領域：（配列番号）、ウシコレクチンの頸部領域：（配列番号）、及びヒトＳＰ−Ｄの頸部領域：（配列番号）からなる群から選択される３量体化ポリペプチドを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
少なくとも１つのＴＲＡＩＬ死受容体がＤＲ４又はＤＲ５である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＴＲＡＩＬ死受容体に結合する少なくとも１つのポリペプチドがＣ型レクチン様ドメイン（ＣＬＴＤ）を含み、ループセグメントＡ又はループセグメントＢのループ１、２、３、又は４の１つがＤＲ４及びＤＲ５の少なくとも１つに結合するポリペプチド配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ＴＲＡＩＬ死受容体に結合する少なくとも１つのポリペプチドがＤＲ４に結合し、ループ１及び４における配列の以下の組合せの１つを含むＣ型レクチン様ドメイン（ＣＬＴＤ）を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【表１−１】
2012504969.tif 000056
【表１−２】
2012504969.tif 000057
【請求項７】
ＴＲＡＩＬ死受容体に結合する少なくとも１つのポリペプチドがＤＲ５に結合し、ループ１及び４における配列の以下の組合せの１つを含むＣ型レクチン様ドメイン（ＣＬＴＤ）を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【表２−１】
2012504969.tif 000058
【表２−２】
2012504969.tif 000059
【請求項８】
ＴＲＡＩＬ死受容体に結合する少なくとも１つのポリペプチドがＴＲＡＩＬ囮受容体に結合しない、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ＴＲＡＩＬ囮受容体が、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、及び循環オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）の少なくとも１つである、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ポリペプチドが融合タンパク質である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
少なくとも１つのＴＲＡＩＬ死受容体に結合するポリペプチドがＤＲ５に結合し、以下の配列：ＡＣＦＰＩＭＴＬＨＣＧＧＧ（配列番号）を含む、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ＴＲＡＩＬ死受容体に結合する少なくとも１つのポリペプチドが、ＤＲ４に結合するポリペプチド及びＤＲ５に結合するポリペプチドを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
ＤＲ４及びＤＲ５の少なくとも１つに結合する第１のポリペプチドが３量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端の一方に位置付けられ、ＤＲ４及びＤＲ５の少なくとも１つに結合する第２のポリペプチドが３量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端の他方に位置付けられる、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの両方がＤＲ４に結合する、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの両方がＤＲ５に結合する、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの一方がＤＲ４に結合し、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの他方がＤＲ５に結合する、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの少なくとも１つがＣＴＬＤを含み、ループセグメントＡ又はループセグメントＢのループ１、２、３、又は４の１つが、ＤＲ４及びＤＲ５の少なくとも１つに結合するポリペプチドを含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
ＤＲ４又はＤＲ５に結合するポリペプチドが３量体化ドメインのＮ末端及びＣ末端の一方に位置付けられ、Ｎ末端及びＣ末端の他方に、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）に結合するポリペプチド配列をさらに含む、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
ポリペプチドが、ＤＲ４又はＤＲ５に結合するポリペプチドよりも少なくとも２倍大きな親和性で腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）に結合する、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
ＤＲ４又はＤＲ５に結合するポリペプチドが３量体化ドメインのＮ末端及びＣ末端の一方に位置付けられ、Ｎ末端及びＣ末端の他方に、Ｆｎ１４、ＦＡＳ受容体、ＴＮＦ受容体、及びＬＩＧＨＴ受容体からなる群から選択される受容体に結合するポリペプチド配列をさらに含む、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
ポリペプチドに共有結合している治療薬をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１に記載のポリペプチドを３つ含む３量体複合体。
【請求項２３】
３量体化ドメインがテトラネクチン３量体化構造要素である、請求項２２に記載の３量体複合体。
【請求項２４】
請求項２２に記載のポリペプチドを３つ含む３量体複合体であって、ＤＲ４に結合する同じでも異なってもよいポリペプチド配列を３つ含み、ＤＲ５に特異的に結合する同じでも異なってもよいポリペプチド配列を３つ含む、上記３量体複合体。
【請求項２５】
請求項１に記載のポリペプチドを含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項２５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２８】
細胞を請求項２２に記載の３量体複合体と接触させることを含む、ＤＲ４及びＤＲ５の少なくとも１つを発現する患者において腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘発する方法。
【請求項２９】
３量体複合体がカスパーゼ依存性アポトーシスを誘発する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
３量体複合体がカスパーゼ非依存性アポトーシスを誘発する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２２に記載の３量体複合体、及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む、薬剤組成物。
【請求項３２】
請求項３１に記載の薬剤組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌患者を治療するための方法。
【請求項３３】
治療薬を、同時又は逐次のいずれかで患者に投与することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項２２に記載の複合体を含む、ＤＲ４受容体アゴニスト。
【請求項３５】
請求項２２に記載の複合体を含む、ＤＲ５受容体アゴニスト。
【請求項３６】
ａ）ＤＲ４又はＤＲ５の一方に結合するがＴＲＡＩＬ囮受容体に結合しない第１のポリペプチドを選択するステップと、
ｂ）第１のポリペプチドを多量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端の一方と融合させるステップと
を含む、細胞におけるアポトーシスを誘発するポリペプチドを調製するための方法。
【請求項３７】
ａ）ＤＲ４及びＤＲ５の他方に特異的に結合する第２のポリペプチドを選択するステップと、
ｂ）第２のポリペプチドを多量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端の一方と融合させるステップと
をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（ａ）が、ＴＲＡＩＬ囮受容体に結合しないポリペプチドを選択するステップをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項３７に従って調製した３つのポリペプチドを３量体化することを含む、ＴＲＡＩＬに対する少なくとも１つの死受容体を発現する細胞においてアポトーシスを誘発するポリペプチド複合体を調製するための方法。
【請求項４０】
ａ）少なくとも１つのランダム化ループ領域を含むＣＴＬＤを含むポリペプチドのライブラリーを作り出すステップと、
ｂ）ＤＲ４又はＤＲ５の一方に結合する第１のポリペプチドをライブラリーから選択するステップと
を含む、腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘発するポリペプチドを調製するための方法。
【請求項４１】
（ｃ）選択されたポリペプチドを、多量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端に付着させるステップ
をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ステップ（ｂ）が、ＴＲＡＩＬ囮受容体に結合しないポリペプチドを選択するステップをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全文が本明細書に参照によって援用される、２００８年１０月１０日出願の米国仮特許出願第６１／１０４，５３８号の利益を主張するものである。
【０００２】
配列表は、本出願において電子様式においてのみ出願されるものであり、本明細書に参照によって援用される。テキストファイル「＿」に列挙する配列は、＿上に作り出されたものであり、サイズ＿バイトである。
【０００３】
本発明は、広く、癌及び他の障害の治療に関する。とりわけ、本発明は、ＴＲＡＩＬ死受容体に結合し、ＴＲＡＩＬ死受容体を発現する病原細胞におけるアポトーシスを誘発するポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００４】
ＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導性リガンド、文献においてなかでもＡｐｏ２Ｌ及びＴＮＦＳＦ１０とも呼ばれる）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属し、腫瘍細胞におけるプログラム細胞死、即ちアポトーシスの活性化因子として同定されている。ＴＲＡＩＬは、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、及び樹状細胞を含めた免疫系の細胞において発現され、細胞膜中に位置する。ＴＲＡＩＬはシステインプロテアーゼによってプロセシングされ、可溶型のタンパク質を産生することができる。ＴＲＡＩＬは、膜結合型及び可溶型の両方とも３量体として機能し、標的細胞上に位置するＴＲＡＩＬ受容体と相互作用することによってアポトーシスを引き起こすことができる。ヒトでは、５つの受容体がＴＲＡＩＬに対する結合活性を有すると同定されている。これら５つの受容体のうちの２つであるＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４、ＴＮＦＳＦ１０ａ）及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５、ＴＮＦＳＦ１０ｂ）は、死ドメイン（ＤＤ）と呼ばれる細胞質領域を含む。これら２つの受容体分子上の死ドメインは、ＴＲＡＩＬが受容体に結合する時に外因性アポトーシス経路のＴＲＡＩＬ活性化に必要とされる。残りの３つのＴＲＡＩＬ受容体（ＴＲＡＩＬ−Ｒ３（ＤｃＲ１、ＴＮＦＲＳＦ１０ｃ）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４（ＤｃＲ２、ＴＮＦＲＳＦ１０ｄ）、及び循環オステオプロテゲリン（ＯＰＧ、ＴＮＦＲＳＦ１１ｂ）と呼ばれる）は、囮受容体として働くと考えられている。これら３つの受容体は、機能的なＤＤを欠いており、ＴＲＡＩＬを隔絶することによって、又は生存促進性シグナルを刺激することによって、負に調節されたアポトーシスに主に関与すると考えられている。
【０００５】
ＴＲＡＩＬがＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）に結合すると、３量体化されている受容体は、死誘導シグナリング複合体（ＤＩＳＣ）を形成するいくつかの細胞基質タンパク質をリクルートし、これは引き続きカスパーゼ−８又はカスパーゼ−１０の活性化をもたらす。これは不可逆的な細胞死を引き起こす２つの異なる経路を誘発し、その１経路においてカスパーゼ−８はエフェクターカスパーゼ（カスパーゼ−３、−６、−７）を直接活性化し、細胞の分解をもたらし、他方の経路はプロデス（ｐｒｏ−ｄｅａｔｈ）Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質であるＢｉｄのカスパーゼ−８依存性切断に関与し、ミトコンドリア又は内因性の死の経路に従事する。
【０００６】
この細胞死活性を考慮し、いくつかのＴＲＡＩＬベースの治療の取組みが追求されている。いくつかの前臨床試験において、組換えの可溶性ＴＲＡＩＬは、白血病、多発性骨髄腫、及び神経芽細胞種、並びに肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、及び甲状腺癌に由来する広範囲のヒト腫瘍細胞系におけるアポトーシスを誘発した。腫瘍の増殖の投与量依存性の抑制が、複数の腫瘍異種移植片において観察されており、全身性の毒性は全く又は殆んどなかった（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ、１９９９年、Ｊｉｎ、２００４年）これらの試験において、高度に凝集した型のＴＲＡＩＬは肝毒性に関連していたので、組換えＴＲＡＩＬ製剤は、選択性及び抗腫瘍の性質にとって重要であると思われる。組換えＴＲＡＩＬは患者に安全に投与されている。
【０００７】
いくつかのＴＲＡＩＬ−Ｒ１又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２ヒトアゴニストモノクローナル抗体が開発中である。細胞系及びマウスモデルにおいて、これらの抗体はアポトーシスを強力に誘発した。少なくとも５つのモノクローナル抗体が、単剤療法として、又は小分子化学療法との併用のいずれかとして、現在臨床開発中である。少なくとも１つの試験において、抗−ＤＲ４又はＤＲ５モノクローナル抗体は全般的に安全であり、良好に耐容され、現在評価中である併用化学療法の試験で、数々の患者に安定な疾患をもたらした（即ち、これらはそれ自体十分な効力を欠く）。ＤＲ５に結合するモノクローナル抗体での前臨床試験は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは２次抗体との２次的な架橋によって（及びｉｎ  ｖｉｖｏではおそらく腫瘍部位の免疫細胞表面受容体に結合する抗体Ｆｃドメインによって）媒介される、ＴＲＡＩＬ受容体のスーパークラスター形成は、活性を増強すると思われると指摘している。
【０００８】
それでも上記に詳しく述べた治療の取組みにはいくつかの不備がある。例えば、天然／組換えのＴＲＡＩＬはＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２の両方（ＤＤは両方とも受容体を含む）に結合することができるが、囮受容体にも結合し、その活性を広く制限する。さらに、ＴＲＡＩＬの半減期は非常に短く、分単位であり、このためその効力がさらに制限される。どちらの抗体の取組みも、半減期のより長い分子を提供する一方で、単一の所与の受容体に特異的である。さらに、抗体のサイズが大きいと、抗体の腫瘍への浸透を制限することがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、当技術分野において、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合するさらなる分子、これらの分子を含む組成物、このような分子をスクリーニングするための方法、及び広範囲の癌の治療的処置においてこのような分子を用いるための方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、その最も広い態様において、３量体化ドメイン、及び少なくとも１つのＴＲＡＩＬ死受容体に結合する少なくとも１つのポリペプチドを含む非天然のポリペプチドに対するものである。
【００１１】
本発明の様々な態様において、３量体化ドメインは、１０位、１７位、２０位、２１位、２４位、２５位、２６位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、又は３５位に最高５個のアミノ酸置換を有する配列番号１０のポリペプチドを含み、３つの３量体化ドメインは３量体複合体を形成する。代替の一実施形態において、３量体化ドメインは、ｈＴＲＡＦ３（配列番号）、ｈＭＢＰ（配列番号）、ｈＳＰＣ３００（配列番号）、ｈＮＥＭＯ（配列番号）、ｈキュビリン（ｈｃｕｂｉｌｉｎ）（配列番号）、ｈトロンボスポンジン（配列番号）、並びにヒトＳＰ−Ｄの頸部領域、（配列番号）、ウシＳＰ−Ｄの頸部領域（配列番号）、ラットＳＰ−Ｄの頸部領域（配列番号）、ウシコングルチニンの頸部領域：（配列番号）、ウシコレクチンの頸部領域：（配列番号）、及びヒトＳＰ−Ｄの頸部領域：（配列番号）の１つから選択される３量体形成ポリペプチドを含む。
【００１２】
特定の一実施形態において、本発明の非天然のポリペプチドは、ＤＲ４及びＤＲ５の１つ又は両方のＴＲＡＩＬ死受容体に結合する。ＴＲＡＩＬ死受容体に結合するポリペプチドはＣ型レクチン様ドメイン（ＣＬＴＤ）であってよく、ループセグメントＡ又はループセグメントＢのループ１、２、３、又は４の１つがＤＲ４及びＤＲ５の一方又は両方に結合するポリペプチド配列を含む。
【００１３】
さらなる一態様において、本発明は、３量体化ドメイン、及びＴＲＡＩＬ死受容体ＤＲ４に結合するポリペプチドを有する非天然のポリペプチドに対するものであり、ＤＲ４に結合するポリペプチドは、ループ１及び４の配列のいくつかの可能な組合せの１つを含むＣ型レクチン様ドメイン（ＣＬＴＤ）を含む。類似の一実施形態において、本発明は、３量体化ドメイン、及びＴＲＡＩＬ死受容体ＤＲ５に結合するポリペプチドを有する非天然のポリペプチドに対するものであり、ＤＲ４に結合するポリペプチドは、ＣＬＴＤのループ１及び４における配列のいくつかの可能な組合せの１つを含むＣ型レクチン様ドメイン（ＣＬＴＤ）を含む。
【００１４】
一態様において、本発明の非天然のポリペプチドは、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、及び循環オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）などのＴＲＡＩＬ囮受容体に結合しない。
【００１５】
またさらに、本発明のポリペプチドは融合タンパク質の形態であってよい。
【００１６】
本発明の様々な態様において、ポリペプチドはＤＲ４及びＤＲ５の両方に結合し、又はポリペプチドは両方がＤＲ４に結合し、若しくは両方がＤＲ５に結合する２つの配列を有する。例えば、本発明のポリペプチドは、３量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端の一方に位置付けられるＤＲ４及びＤＲ５の少なくとも１つに結合する第１のポリペプチド、並びに３量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端の他方に位置付けられるＤＲ４及びＤＲ５の少なくとも１つに結合する第２のポリペプチドを有することができる。第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの両方がＤＲ４に結合してもよく、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの両方がＤＲ５に結合してもよい。或いは、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの一方がＤＲ４に結合し、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの他方がＤＲ５に結合する。
【００１７】
別の一態様において、本発明のポリペプチドは、３量体化ドメインのＮ末端及びＣ末端の一方に位置付けられるＤＲ４又はＤＲ５に結合する配列を含んでおり、次いで、Ｎ末端及びＣ末端の他方に、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）に結合するポリペプチド配列を有する。別の一態様において、ＤＲ４又はＤＲ５に結合するポリペプチドは３量体化ドメインのＮ末端及びＣ末端の一方に位置付けられ、Ｆｎ１４、ＦＡＳ受容体、ＴＮＦ受容体、及びＬＩＧＨＴ受容体からなる群から選択される受容体に結合するポリペプチド配列がＮ末端及びＣ末端の他方に位置付けられる。本発明のポリペプチドはポリペプチドに共有結合的に付着している治療薬（単数又は複数）も有することができる。
【００１８】
またさらに、本発明は、本発明の３つのポリペプチドの３量体複合体に対するものである。例えば、３量体化ドメインはテトラネクチン３量体化構造要素である。
【００１９】
本発明は、ＤＲ４及びＤＲ５の少なくとも１つを発現する患者において腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘発する方法にも対する。方法は、細胞を本発明の３量体複合体と接触させることを含む。
【００２０】
本発明は、３量体複合体及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤の薬学組成物にも対する。組成物を用いて癌患者を治療することができ、治療薬と同時又は逐次に投与することができる。
【００２１】
さらなる一態様において、本発明は、細胞におけるアポトーシスを誘発するポリペプチドを調製するための方法に対するものである。方法は、ＤＲ４又はＤＲ５の一方に結合するがＴＲＡＩＬ囮受容体には結合しない第１のポリペプチドを選択するステップと、第１のポリペプチドを多量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端の一方と融合させるステップとを含む。方法はまた、ＤＲ４及びＤＲ５の他方に特異的に結合する第２のポリペプチドを選択するステップと、第２のポリペプチドを多量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端の他方と融合させるステップとを含むことができる。この態様において、方法は、ＴＲＡＩＬ囮受容体に結合しないポリペプチドを選択するステップを含むことができる。
【００２２】
本発明のさらなる一態様は、３つの３量体化ポリペプチドを含む、ＴＲＡＩＬに対する死受容体の少なくとも１つを発現する細胞においてアポトーシスを誘発するポリペプチド複合体を調製するための方法を含む。
【００２３】
本発明の他の態様は、腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘発するポリペプチドを調製するための方法を含む。本態様の方法は、少なくとも１つのランダム化ループ領域を含むＣＴＬＤを含むポリペプチドのライブラリーを作り出すステップと、ＤＲ４又はＤＲ５の１つに結合する第１のポリペプチドをライブラリーから選択するステップとを含む。この態様は、選択されたポリペプチドを多量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端に融合するステップ、及びＴＲＡＩＬ囮受容体に結合しないポリペプチドを選択するステップも含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】既知の２次構造要素の表示を有する、ヒト（配列番号１００）及びマウス（配列番号）のテトラネクチンの成熟型のコード領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図２】テトラネクチンタンパク質ファミリーの３量体化構造要素のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。ヒトテトラネクチンのエキソン２、及びエキソン３の最初の３残基を含む残基Ｖ１７からＫ５２に対応するアミノ酸配列（１文字コード）（配列番号１）、マウステトラネクチン（配列番号）（Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、Ｇｅｎｅ、１５２巻、２４３〜２４５頁、１９９５年）、並びにリーフシャーク（ｒｅｅｆｓｈａｒｋ）軟骨から単離したテトラネクチン相同タンパク質（配列番号）（Ｎｅａｍｅ及びＢｏｙｎｔｏｎ、１９９２年、１９９６年）、並びにウシ軟骨から単離されたテトラネクチン相同タンパク質（配列番号）（Ｎｅａｍｅ及びＢｏｙｎｔｏｎ、データベース受諾番号ＰＡＴＣＨＸ：ｕ２２２９８）。７アミノ酸繰返しにおけるａ位及びｄ位の残基を太字体で列挙する。テトラネクチンタンパク質ファミリー３量体化構造要素の列挙したコンセンサス配列（配列番号１０）は、領域の他の保存残基の他に、図に示した７アミノ酸繰返しにおけるａ位及びｄ位に存在する残基を含む。「ｈｙ」は脂肪族疎水残基を意味する。
【図３Ａ】本発明の例示のポリペプチドと用いるためのテトラネクチン３量体化モジュール切断の例を示す図である。
【図３Ｂ】本発明の例示のポリペプチドと用いるためのテトラネクチン３量体化モジュール切断の例を示す図である。
【図３Ｃ】本発明の例示のポリペプチドと用いるためのテトラネクチン３量体化モジュール切断の例を示す図である。
【図３Ｄ】本発明の例示のポリペプチドと用いるためのテトラネクチン３量体化モジュール切断の例を示す図である。
【図４】既知の３Ｄ構造の１０個のＣＴＬＤのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。主な２次構造要素の配列位置は、αヘリックスのＮ番目を意味する「αＮ」及びβ鎖のＭ番目を意味する「βＭ」として連続の番号順において標識される示される上記の各配列である。ＣＴＬＤの保存されている２つのジスルフィド架橋の形成に関与する４個のシステイン残基が示され、それぞれ「ＣＩ」、「ＣＩＩ」、「ＣＩＩＩ」、及び「ＣＩＶ」として図に列挙される。保存されている２つのジスルフィド架橋は、それぞれＣＩ−ＣＩＶ及びＣＩＩ−ＣＩＩＩである。ヒトテトラネクチン配置における様々なループ１〜４及びＬＳＢ（ループ５）を下線付けして示す。１０個のＣ型レクチンは、ｈＴＮ：ヒトテトラネクチン（配列番号：ＸＸ）、ＭＢＰ：マンノース結合性タンパク質（配列番号：ＸＸ）；ＳＰ−Ｄ：サーファクタントタンパク質Ｄ（配列番号：ＸＸ）；ＬＹ４９Ａ：ＮＫ受容体ＬＹ４９Ａ（配列番号：ＸＸ）；Ｈ１−ＡＳＲ：ＨＩアシアロ糖タンパク質受容体のサブユニット（配列番号：ＸＸ）；ＭＭＲ−４：マクロファージマンノース受容体ドメイン４（配列番号：ＸＸ）；ＩＸ−Ａ（配列番号：ＸＸ）、及びＩＸ−Ｂ（配列番号：ＸＸ）：それぞれ凝固因子ＩＸ／Ｘ−結合性タンパク質ドメインＡ及びＢ；Ｌｉｔ：リソスタチン（ｌｉｔｈｏｓｔａｔｉｎｅ）（配列番号：ＸＸ）；ＴＵ１４：尾索動物Ｃ型レクチン（配列番号：ＸＸ）である。これらのＣＴＬＤはＴＵ１４を除いて全て、ヒトタンパク質由来である。
【図５】ヒト（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ｐ０５４５２）（配列番号：ＸＸ）、マウス（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ｐ４３０２５）（配列番号：ＸＸ）、ニワトリ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ｑ９ＤＤＤ４）（配列番号：ＸＸ）、ウシ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ｑ２ＫＩＳ７）（配列番号：ＸＸ）、タイセイヨウサケ（Ａｔｌａｎｔｉｃ  ｓａｌｍｏｎ）（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ｂ５ＸＣＶ４）（配列番号：ＸＸ）、カエル（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ｑ５Ｉ０Ｒ９）（配列番号：ＸＸ）、ゼブラフィッシュ（ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＸＰ＿７０１３０３）（配列番号：ＸＸ）、並びにウシ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ  ｕ２２２９８）（配列番号：ＸＸ）の軟骨から単離された関連のＣＴＬＤ相同体、及びリーフシャーク（ｒｅｅｆ  ｓｈａｒｋ）（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ  ｐ２６２５８）（配列番号：ＸＸ）から単離されたテトラネクチンからのいくつかのＣ型レクチンドメインのアラインメントを示す図である。
【図６】ＣＴＬＤにおいてランダム化ループを作り出すためのＰＣＲ戦略を示す図である。
【図７】クローニングのための制限部位を含むように修飾したヒトテトラネクチンＣＴＬＤのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示し、Ｃａ２＋結合部位を示す図である。制限部位を実線で下線付けする。ループを破線で下線付けする。カルシウム配位残基は太字のイタリックで、部位１：Ｄ１１６、Ｅ１２０、Ｇ１４７、Ｅ１５０、ＮＩ５１；部位２：Ｑ１４３、Ｄ１４５、Ｅ１５０、Ｄ１６５を含む。ＣＴＬＤドメインは、太字のアミノ酸Ａ４５から始まる（即ち、ＡＬＱＴＶＣＬ・・・）。天然テトラネクチン（ＴＮＣＴＬＤ）塩基配列への変更を、小文字で示す。制限部位を、天然のアミノ酸配列を変更しないサイレント変異を用いて作り出した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
様々な態様において、本発明は、多量体化ドメインを有するポリペプチド、及びＴＲＡＩＬ死受容体に結合する１つ又は複数のポリペプチドを含むＴＲＡＩＬ受容体アゴニストに対するものである。２つ、３つ、又はそれを超えるポリペプチドが多量体化して、ＴＲＡＩＬ死受容体に結合するポリペプチドを含む多量体複合体であるアゴニストを形成し得る。アゴニストがこのような受容体を提示する細胞上のＴＲＡＩＬ死受容体に結合すると、細胞のアポトーシスを誘発する。代替の一実施形態において、ポリペプチドは死受容体に結合するが受容体に対するアゴニストではなく、なかでも、ポリペプチドと会合している（例えば、ポリペプチドに共有結合している）アウリスタチン、メイタンシノイドなどの治療薬の標的化送達を可能にする。さらに、本発明は、対象にアゴニストを投与することによって、対象における癌及び他の障害を治療するための方法を提供する。ポリペプチドは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）の一方又は両方に特異的に結合し、好ましくはＴＲＡＩＬ囮受容体に結合しない１つ又は複数のポリペプチドを含む。
【００２６】
定義
本発明をさらに詳しく定義する前に、数々の用語を定義する。用語に対する詳しい定義が本明細書に提供されていない場合は、本開示にわたって用いられる用語及び語句は、当技術分野において通常理解される意味を有すると理解されたい。また、本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられる通り、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他の方法を明確に指示しなければ、複数の対象物を含む。
【００２７】
「ＴＲＡＩＬ」又は「ＴＲＡＩＬポリペプチド」は、配列番号６２、及び配列番号６２の生物学的に活性なフラグメントを意味する。フラグメントは、それだけには限定されないが、配列番号６２のアミノ酸残基約５個から約５０個、又はアミノ酸残基約５個から約２５個、又は約１０個から約２０個、又は約１２個から約２０個を有する配列を含む。任意選択で、ＴＲＡＩＬペプチドは、わずか２５個のアミノ酸残基（例えば、２５個、２３個、２１個、１９個、１７個、１５個、又はそれ未満のアミノ酸残基）からなる。
【００２８】
本明細書で用いられる「ＴＲＡＩＬ死受容体」の語は、ＴＲＡＩＬに結合し、ＴＲＡＩＬに結合すると腫瘍細胞におけるプログラム細胞死（アポトーシス）を活性化するタンパク質を意味する。ＴＲＡＩＬ死受容体のある種の非限定的な例には、通常ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）（配列番号４２）又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）（配列番号４３）と呼ばれる受容体タンパク質のいずれかが含まれる。
【００２９】
「ＤＲ４」、「ＤＲ４受容体」、及び「ＴＲＡＩＬ−Ｒ１」の語は本明細書において交換可能に用いられて、配列番号４２の全長のＴＲＡＩＬ受容体配列、並びにＰａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６巻、１１１〜１１３頁（１９９７年）；１９９８年７月３０日公開のＷＯ９８／３２８５６；２００２年１月２９日発行の米国特許第６，３４２，３６３号；及び１９９９年７月２９日公開のＷＯ９９／３７６８４に記載されている、可溶性の細胞外ドメイン型の受容体を意味する。
【００３０】
「ＤＲ５」、「ＤＲ５受容体」、及び「ＴＲＡＩＬ−Ｒ２」の語は本明細書において交換可能に用いられて配列番号４３の全長のＴＲＡＩＬ受容体配列、並びに各々その全文が参照によって本明細書に援用されるＳｈｅｒｉｄａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７巻、８１８〜８２１頁（１９９７年）；Ｐａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７巻、８１５〜８１８頁（１９９７年）、２０００年６月６日発行の米国特許第６，０７２，０４７号、；１９９８年１０月１９日公開の米国特許第６，３４２，３６９号、ＷＯ９８／５１７９３；１９９８年９月２４日公開のＷＯ９８／４１６２９；Ｓｃｒｅａｔｏｎら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、７巻、６９３〜６９６頁（１９９７年）；Ｗａｌｃｚａｋら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１６巻、５３８６〜５３８７頁（１９９７年）；Ｗｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１７巻、１４１〜１４３頁（１９９７年）；１９９８年８月２０日公開のＷＯ９８／３５９８６；１９９８年１０月１４日公開のＥＰ８７０，８２７；１９９８年１０月２２日公開のＷＯ９８／４６６４３；１９９９年１月２１日公開のＷＯ９９／０２６５３；１９９９年２月２５日公開のＷＯ９９／０９１６５；１９９９年３月１１日公開のＷＯ９９／１１７９１に記載されている、可溶性の細胞外ドメイン型の受容体を意味する。
【００３１】
本明細書で用いられる「ＴＲＡＩＬ囮受容体」の語は、ＴＲＡＩＬに結合し、ＴＲＡＩＬに結合したとき腫瘍細胞におけるプログラム細胞死（アポトーシス）を活性化しないタンパク質を意味する。したがって、ＴＲＡＩＬ囮受容体は、プログラム細胞死のシグナリングのトランスデューサーよりもむしろインヒビターとして機能すると考えられている。ＴＲＡＩＬ囮受容体のある種の非限定的な例には、各々その全文が参照によって本明細書に援用される、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３（ＤｃＲ１、ＴＲＩＤ、ＬＩＴ、又はＴＮＦＲＳＦ１０ｃと呼ばれる）［（Ｐａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６巻、１１１〜１１３巻（１９９７年）；Ｓｈｅｒｉｄａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７巻、８１８〜８２１頁（１９９７年）；ＭｃＦａｒｌａｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２巻、２５４１７〜２５４２０頁（１９９７年）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、４１６巻、３２９〜３３４頁（１９９７年）；Ｄｅｇｌｉ−Ｅｓｐｏｓｔｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８６巻、１１６５〜１１７０頁（１９９７年）；及びＭｏｎｇｋｏｌｓａｐａｙａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０巻、３〜６頁（１９９８）］（配列番号４４）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４（ＤｃＲ２、ＴＲＵＮＤＤ、及びＴＮＦＲＳＦ１０ｄとも呼ばれる）（配列番号４５）、［Ｍａｒｓｔｅｒｓら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、７巻、１００３〜１００６頁（１９９７年）；Ｐａｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、４２４巻、４１〜４５頁（１９９８年）；Ｄｅｇｌｉ−Ｅｓｐｏｓｔｉら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、７巻、８１３〜８２０頁（１９９７年）］、並びに循環オステオプロテゲリン（ＯＰＧ、ＴＮＦＲＳＦ１１ｂ）（配列番号４６）と通常呼ばれるあらゆる受容体タンパク質が含まれる。
【００３２】
「ＴＲＡＩＬ受容体アゴニスト」又は「アゴニスト」の語は広い意味において用いられ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、又はｉｎ  ｖｉｖｏで、ＤＲ４若しくはＤＲ５又はこれらの生物学的に活性な変異体の１つ又は複数の生物学的活性を、部分的又は完全に増強し、刺激し、又は活性化するあらゆる分子を含む。このような生物学的活性の例には、アポトーシス、及び文献においてさらに報告されているものが含まれる。アゴニストは直接的又は間接的に機能することができる。例えば、「ＴＲＡＩＬ死受容体アゴニスト」は、受容体の活性化又はシグナル伝達を引き起こすＤＲ４又はＤＲ５に直接結合した結果、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、又はｉｎ  ｖｉｖｏでＤＲ４又はＤＲ５の１つ又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に、増強、刺激、又は活性化するように機能することができる。ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストには、本明細書で定義するＴＲＡＩＬポリペプチド、及びＴＲＡＩＬポリペプチドとみなされないＴＲＡＩＬ受容体に結合するポリペプチド、例えば、ＴＲＡＩＬ死受容体に特異的に結合するが、本明細書で定義する方法を用いて同定するＴＲＡＩＬ囮受容体には結合しないポリペプチドが含まれる。
【００３３】
本明細書で用いられる「結合メンバー」の語は、相互に結合特異性を有する１対の分子のメンバーを意味する。結合対のメンバーは、天然由来であってよく、又は完全に若しくは部分的に合成的に生成されてもよい。対の分子の１メンバーはその表面上に領域、又は空洞を有し、それが、対の分子の他のメンバーの特定の空間的及び極性組織に結合し、したがってそれに対して相補的である。このように対のメンバーは、相互に特異的に結合する性質を有する。
【００３４】
本発明の様々な態様において、ＴＲＡＩＬ死受容体に対する結合メンバーはＴＲＡＩＬ受容体アゴニストである。これらのメンバーには、本明細書に記載するＴＲＡＩＬポリペプチド、並びにＴＲＡＩＬポリペプチド及び多量体化（例えば、３量体化）ドメインを含むポリペプチド、並びに本明細書にさらに記載する、多量体化ドメイン及びＴＲＡＩＬポリペプチドではないポリペプチドを含むがＴＲＡＩＬ死受容体に結合して刺激するポリペプチドが含まれる。他の態様において、本発明のポリペプチドはＴＲＡＩＬ死受容体に結合するが、受容体に対するアゴニストではない。
【００３５】
本明細書で用いられる「多量体化ドメイン」の語は、２つ又はそれを超える他のアミノ酸配列と会合して３量体又は他の多量体複合体を形成することができる機能性を含むアミノ酸配列を意味する。一例において、ポリペプチドは、他の２つの３量体化ドメインと３量体複合体を形成する「３量体化ドメイン」であるアミノ酸配列を含む。３量体化ドメインは、アミノ酸配列が同一である他の３量体化ドメインと会合することができ（ホモ３量体）、又はアミノ酸配列の異なる３量体化ドメインと会合することができる（ヘテロ３量体）。このような相互作用は、３量体化ドメインの成分間の共有結合によって、並びに水素結合力、疎水性力、ファンデルワールス力、及び塩橋によって引き起こされ得る。本発明の様々な実施形態において、多量体化ドメインは、２量体化ドメイン、３量体化ドメイン、４量体化ドメイン、５量体化ドメインなどである。これらのドメインは、本発明のポリペプチドの２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれを超えるポリペプチド複合体を形成することができる。
【００３６】
本発明のポリペプチドの３量体化ドメインは、その全文が参照によって援用される米国特許出願公開第２００７／０１５４９０１号（’９０１出願）に記載されているテトラネクチンに由来することができる。成熟ヒトテトラネクチン単鎖ポリペプチド配列は、本明細書に配列番号１００（例えば表１を参照されたい）として提供される。テトラネクチン３量体化ドメインの例には、配列番号１のアミノ酸１７から４９、１７から５０、１７から５１、及び１７〜５２が含まれ、これらは、ヒトテトラネクチン遺伝子のエキソン２によってコードされるアミノ酸、及び任意選択で遺伝子のエキソン３によってコードされるアミノ酸の最初の１個、２個、又は３個を表す。他の例には、アミノ酸１から４９、１から５０、１から５１、及び１から５２が含まれ、これらはエキソン１及び２の全て、並びに任意選択で遺伝子のエキソン３によってコードされるアミノ酸の最初の１個、２個、又は３個を表す。或いは、エキソン１によってコードされるアミノ酸配列の一部分だけが３量体化ドメインに含まれる。とりわけ、３量体化ドメインのＮ末端は、配列番号１の残基１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、及び１７のいずれかから始まってよい。特定の実施形態において、Ｎ末端がＩ１０又はＶ１７であり、Ｃ末端がＱ４７、Ｔ４８、Ｖ４９、Ｃ（Ｓ）５０、Ｌ５１、又はＫ５２（配列番号１による番号付け）である。さらに図３Ａ〜３Ｄは、ヒトテトラネクチン３量体化ドメインの潜在的な切断変異体の数を提供するものである。
【００３７】
本発明の一態様において、３量体化ドメインは、その全文が参照によって本明細書に援用されるＵＳ２００７／００１５４９０１により完全に記載されている、テトラネクチンファミリー３量体化構造要素のコンセンサス配列である配列番号１のアミノ酸配列を有するテトラネクチン３量体化構造要素（「ＴＴＳＥ」）である。図２に示す通り、ＴＴＳＥは、タンパク質のテトラネクチンファミリーの天然に存在するメンバーの変異体、とりわけ、αヘリックスのコイルドコイル３量体を形成するＴＴＳＥの能力に有害な影響を及ぼさずにアミノ酸配列があらゆる実質的な程度まで修飾されている変異体を包含する。本発明の様々な態様において、本発明による３量体ポリペプチドは、配列番号１０のコンセンサス配列に少なくとも６６％のアミノ酸配列の同一性を有する、例えば、配列番号１のコンセンサス配列に少なくとも７３％、少なくとも８０％、少なくとも８６％、又は少なくとも９２％の配列同一性を有する３量体化ドメインとしてＴＴＳＥを含む（規定された（Ｘではない）残基のみを数えて）。換言すれば、配列番号１における規定されたアミノ酸の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、又は少なくとも５個が置換されていてよい。
【００３８】
特定の一実施形態において、不必要な多量体化をもたらし得る不必要な鎖間ジスルフィド架橋の形成を避けるために、配列番号６３の５０位のシステイン（Ｃ５０）が、セリン、スレオニン、メチオニン、又はあらゆる他のアミノ酸残基に変異誘発されていると有利であり得る。他の知られている変異体には、あらゆる非ヘリックス開裂性アミノ酸残基によって置換されていてよいアミノ酸残基、第６、２１、２２、２４、２５、２７、２８、３１、３２、３５、３９、４１、及び４２番（配列番号６３による番号付け）から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基が含まれる。これらの残基は、天然のテトラネクチン単量体の３個のＴＴＳＥ間の３量体複合体を安定化する分子間相互作用に直接関与しないことが示されている。図２に示す一態様において、ＴＴＳＥは、式ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇ（ＮからＣ）を有する７アミノ酸繰返しを有し、この場合残基ａ及びｄ（即ち、２６位、３３位、３７位、４０位、４４位、４７位、及び５１位）は、あらゆる疎水性アミノ酸であってよい（配列番号１による番号付け）。
【００３９】
さらなる実施形態において、ＴＴＳＥ３量体化ドメインは、ポリヒスチジン配列及び／又はプロテアーゼ切断部位の組入れ、例えば、血液凝固因子Ｘａ又はグランザイムＢ（参照によって本明細書に援用されるＵＳ２００５／０１９９２５１を参照されたい）によって、並びにＣ末端のＫＧ又はＫＧＳ配列を含めることによって修飾されてよい。また、精製における助けのために、２位のプロリンをグリシンで置換してもよい。
【００４０】
ＴＴＳＥ切断及び変異体の特定の非限定的な例を図３Ａ〜３Ｄに示す。さらに、ヒトテトラネクチンの３量体化ドメインに実質的に相同性を有する（６６％を超える）数々の３量体化ドメインが知られている。
【表１−１】
2012504969.tif 000002
【表１−２】
2012504969.tif 000003
【００４１】
３量体化するのに知られている他のヒトポリペプチドには以下が含まれる。
【表２】
2012504969.tif 000004
【００４２】
３量体化ドメインの別の一例は、コレクチン頸部領域を含むポリペプチドを記載するＵＳ６，１９０，８８６（その全文が参照によって本明細書に援用される）に開示されている。次いで、３量体を、コレクチン頸部領域アミノ酸配列を含む３つのポリペプチドと好適な条件下で作成することができる。以下のものを含む、数々のコレクチンが同定されている。
ヒトＳＰ−Ｄのコレクチン頸部領域：ＶＡＳＬＲＱＱＶＥＡＬＱＧＱＶＱＨＬＱＡＡＦＳＱＹＫＫ（配列番号）
ウシＳＰ−Ｄのコレクチン頸部領域：ＶＮＡＬＲＱＲＶＧＩＬＥＧＱＬＱＲＬＱＮＡＦＳＱＹＫＫ（配列番号）
ラットＳＰ−Ｄのコレクチン頸部領域：ＳＡＡＬＲＱＱＭＥＡＬＮＧＫＬＱＲＬＥＡＡＦＳＲＹＫＫ（配列番号）
ウシコングルチニンのコレクチン頸部領域：ＶＮＡＬＫＱＲＶＴＩＬＤＧＨＬＲＲＦＱＮＡＦＳＱＹＫＫ（配列番号）
ウシコレクチンのコレクチン頸部領域：ＶＤＴＬＲＱＲＭＲＮＬＥＧＥＶＱＲＬＱＮＩＶＴＱＹＲＫ（配列番号）
ヒトＳＰ−Ｄの頸部領域：ＧＳＰＧＬＫＧＤＫＧＩＰＧＤＫＧＡＫＧＥＳＧＬＰＤＶＡＳＬＲＱＱＶＥＡＬＱＧＱＶＱＨＬＱＡＡＦＳＱＹＫＫＶＥＬＦＰＧＧＩＰＨＲＤ（配列番号）
【００４３】
ＭＢＰ３量体化ドメインの他の例は、その全文が参照によって援用される、ＷＯ２００９／０３６３４９として公開されたＰＣＴ出願第ＵＳ０８／７６２６６号に記載されている。この３量体化ドメインをさらにオリゴマー形成し、高次の多量体複合体を作り出してもよい。
【００４４】
現在の文脈における「３量体化ドメイン」は、他の、類似の、又は同一の３量体化ドメインと相互作用することができる。相互作用は、３量体のタンパク質又はポリペプチドを生成するタイプのものである。このような相互作用は、３量体化ドメインの成分間の共有結合によって、並びに水素結合力、疎水性力、ファンデルファールス力、及び塩橋によって引き起こされ得る。３量体化ドメインの３量体の効果は、他の２つの３量体化ドメインのコイルドコイル構造と相互作用して、比較的高い温度でも安定である３重のαヘリックスのコイルドコイル３量体を形成するコイルドコイル構造によって引き起こされる。様々な実施形態において、例えば、テトラネクチン構造要素をベースとする３量体化ドメインでは、少なくとも６０℃で、例えばいくつかの実施形態において少なくとも７０℃で、複合体は安定である。
【００４５】
「Ｃ型レクチン様タンパク質」及び「Ｃ型レクチン」の語は、あらゆる真核生物種のゲノムに存在し、又はゲノムにおいてコードされるあらゆるタンパク質を意味するために用いられ、このタンパク質は、１つ若しくは複数のＣＴＬＤ、又は炭水化物のリガンドに結合している、ＣＴＬＤのサブグループであるＣＲＤに属する１つ若しくは複数のドメインを含む。この定義には、膜に付着しているＣ型レクチン様タンパク質及びＣ型レクチン、機能的な膜貫通ドメインを欠く「可溶性の」Ｃ型レクチン様タンパク質及びＣ型レクチン、並びに１つ又は複数のアミノ酸残基がグリコシル化又はあらゆる他の合成後修飾によってｉｎ  ｖｉｖｏで変更されている変異型のＣ型レクチン様タンパク質及びＣ型レクチン、並びにＣ型レクチン様タンパク質及びＣ型レクチンの化学的修飾によって得られるあらゆる生成物が特に含まれる。
【００４６】
ＣＴＬＤは大まかに１２０個のアミノ酸残基からなり、２個又は３個の鎖内ジスルフィド架橋を含むのが特徴的である。様々なタンパク質からのＣＴＬＤ間のアミノ酸配列レベルの類似性は比較的低いが、数々のＣＴＬＤの３Ｄ構造は高度に保存されていることが見出されており、構造の可変性は最高５個のループによってしばしば規定される、いわゆるループ領域に本質的に限局される。いくつかのＣＴＬＤはカルシウムに対する１つ又は２ついずれかの結合部位を含んでおり、カルシウムと相互作用する側鎖の殆どはループ領域に位置する。
【００４７】
３Ｄ構造の情報が入手可能であるＣＴＬＤに基づいて、正規のＣＴＬＤは、β１、α１、α２、β２、β３、β４、及びβ５の順番において順次現れる７個の主要な２次構造要素（即ち、５個のβ鎖及び２個のαヘリックス）によって構造的に特徴付けられると推測されている。図４は、１０個のＣ型レクチンの既知の３次元構造のＣＴＬＤのアラインメントを説明するものである。３Ｄ構造が決定されている全てのＣＴＬＤにおいて、β鎖は、一方がβ１及びβ５からなり、他方がβ２、β３、及びβ４からなる２つの逆平行のβシートに配列される。さらなるβ鎖であるβ０は、配列においてしばしばβ１の前にあり、存在する場合には、β１、β５シートと統合するさらなる鎖を形成する。さらに、１つがα１とβ５とを接続し（ＣＩ−ＣＩＶ）、１つがβ３と、β４及びβ５を接続するポリペプチドセグメントとを連結する（ＣＩＩ−ＣＩＩＩ）２つのジスルフィド架橋は、現在までに特徴付けられている全てのＣＴＬＤに不変的に見出される。また、図５は、ヒトテトラネクチン及び他の９個のテトラネクチン又はテトラネクチン様ポリペプチドからのＣＴＬＤのアラインメントを示している。
【００４８】
ＣＴＬＤの３Ｄ構造において、これらの保存されている２次構造要素は、数々のループに対して密な骨格を形成し、これらは現在の状況において集合的に、コアから突出する「ループ領域」と呼ばれる。ＣＴＬＤの一次構造において、これらのループは、ループセグメントＡであるＬＳＡ及びループセグメントＢであるＬＳＢ２つのセグメントに組織化される。ＬＳＡは、しばしば規則的な２次構造を欠き、最高４つのループを含むβ２とβ３を連結する長いポリペプチドセグメントを表す。ＬＳＢは、β鎖のβ３とβ４を連結するポリペプチドセグメントを表す。ＬＳＡにおける残基は、β４における単一の残基と一緒に、テトラネクチンのＣＴＬＤを含むいくつかのＣＴＬＤのＣａ２＋結合性部位及びリガンド結合性部位を特定することが示されている。例えば、１つ又は少数の残基の置換を伴う変異の研究は、結合特異性、Ｃａ２＋感受性、及び／又は親和性における変化はＣＴＬＤドメインによって収容され得ることを示している。以下の非限定的な例を含めた数々のＣＴＬＤが知られている：テトラネクチン、リソスタチン、マウスマクロファージガラクトースレクチン、クッパー細胞受容体、ニワトリニューロカン、パールシン（ｐｅｒｌｕｃｉｎ）、アシアロ糖タンパク質受容体、軟骨プロテオグリカンコアタンパク質、ＩｇＥ  Ｆｃ受容体、膵炎関連タンパク質、マウスマクロファージ受容体、ナチュラルキラー群、幹細胞増殖因子、ＩＸ／Ｘ因子結合性タンパク質、マンノース結合性タンパク質、ウシコングルチニン、ウシＣＬ４３、コレクチン肝臓１、サーファクタントタンパク質Ａ、サーファクタントタンパク質Ｄ、ｅ−セレクチン、尾索動物ｃ型レクチン、ＣＤ９４  ＮＫ受容体ドメイン、ＬＹ４９Ａ  ＮＫ受容体ドメイン、ニワトリ肝臓レクチン、マスｃ型レクチン、ＨＩＶｇｐ１２０結合性ｃ型レクチン、及び樹状細胞免疫受容体。その全文が参照によって本明細書に援用される米国特許公開第２００７／０２７５３９３号を参照されたい。
【００４９】
「有効量」の表現は、同時に投与しても、又は逐次に投与しても、本発明の死受容体アゴニスト、及び細胞毒性薬又は免疫抑制薬の、一方又は両方の、問題の疾患若しくは状態を予防し、寛解し、若しくは治療するのに有効である量を意味する。特定の実施形態において、有効量は、細胞がアポトーシスを経験し、腫瘍体積を低減し、又は癌若しくは免疫関連疾患を有する哺乳動物の生存を延長する性向を（例えば、相乗的に）増強し、又は他の方法で増大するのに十分な組合せの、死受容体アゴニスト又は死受容体バインダー、及び細胞毒性薬又は免疫抑制薬の量である。
【００５０】
「治療薬」は、細胞毒性薬、化学療法薬、免疫抑制薬、免疫賦活薬、及び／又は増殖抑制薬を意味する。
【００５１】
補助的療法に対して本明細書で用いられる「免疫抑制薬」の語は、本明細書において治療する哺乳動物の免疫系を抑制し、又はマスクするように働く物質を意味する。これは、サイトカインの生成を抑制し、自己抗原の発現を下方制御若しくは抑制し、又はＭＨＣ抗原をマスクする物質を含む。このような薬剤の例には、それだけには限定されないが、２−アミノ−６−アリール−５−置換ピリミジン（米国特許第４，６６５，０７７号を参照されたい）、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、アザチオプリン、シクロホスファミド、ブロモクリプチン、ダナゾール、ダプソン、グルタールアルデヒド（米国特許第４，１２０，６４９号に記載されているようにＭＨＣ抗原をマスクする）、ＭＨＣ抗原及びＭＨＣフラグメントに対する抗イディオタイプ抗体、シクロスポリンＡ、グルココルチコステロイドなどのステロイド、例えば、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、及びヒドロコルチゾン、メトトレキセート（経口若しくは皮下）、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、レフルノミド；抗インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、−β、若しくは−α抗体、抗腫瘍壊死因子−α抗体（インフリキシマブ若しくはアダリムマブ）、抗ＴＮＦαイムノアドヘジン（エタネルセプト）、抗腫瘍壊死因子−β抗体、抗インターロイキン−２抗体、及び抗ＩＬ−２受容体抗体を含めたサイトカイン又はサイトカイン受容体アンタゴニスト；抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ−１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体、異種性の抗リンパ球グロブリン、ｐａｎ−Ｔ抗体、好ましくは抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体、ＬＦＡ−３結合性ドメインを含む可溶性ペプチド（１９９０年７月２６日公開のＷＯ９０／０８１８７）、ストレプトキナーゼ、ＴＧＦ−β、ストレプトドルナーゼ、宿主からのＲＮＡ若しくはＤＮＡ、ＦＫ５０６、ＲＳ−６１４４３、デオキシスペルグラリン、ラパマイシン、Ｔ細胞受容体（Ｃｏｈｅｎら、米国特許第５，１１４，７２１号）、Ｔ細胞受容体フラグメント（Ｏｆｆｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１巻、４３０〜４３２頁（１９９１年）；ＷＯ９０／１１２９４；Ｊａｎｅｗａｙ、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、４８２頁（１９８９年）；及びＷＯ９１／０１１３３）；並びにＴ１０Ｂ９などのＴ細胞受容体抗体（ＥＰ３４０，１０９）。
【００５２】
本明細書で用いられる「細胞毒性薬」の語は、細胞の機能を阻害若しくは防止し、及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。この語は放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、及びＬｕの放射性同位元素）、化学療法薬、並びに小分子毒素、或いは酵素的に活性な細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の毒素、又はこれらのフラグメントなどの毒素が含まれる。
【００５３】
「化学療法薬」は、癌の治療に有用な化学物質である。化学療法薬の例には、アルキル化剤、例えば、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド；アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、イムプロスルファン、及びピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；エチレンイミン及びメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）、例えば、アルテラミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンエチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、及びトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（ａｃｅｔｏｇｅｎｉｎ）（特に、ブラタシン、及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体のトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシンの合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン、デュオカルマイシン（合成の類似体であるＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロルホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン；抗生物質、例えば、エンジイン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンγ１１、及びカリケアマイシンω１１（例えば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３３巻、１８３〜１８６頁（１９９４年）を参照されたい）；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；ビスホスホネート、例えば、クロドロネート；エスペラマイシン；並びにネオカルジノスタチン発色団、及び関連のクロモプロテインエンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキセート、及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシタジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸塩、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗アドレナル、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；エリプチニウム酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド、例えば、メイタンシン、及びアンサミタシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ）（特に、Ｔ−２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡ、及びアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）クレモホール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）フリーのアルブミン操作したパクリタキセルのナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、並びにＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類似体、例えば、シスプラチン、及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキ��ート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ；イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸；カペシタビン；並びにあらゆる上記の薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体が含まれる。定義にやはり含まれるものに、プロテアソーム阻害薬、例えば、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）、ＢＣＬ−２阻害薬、ＩＡＰアンタゴニスト（例えば、Ｓｍａｃ模倣物／ｘＩＡＰ及びｃＩＡＰ阻害薬、例えば、ある種のペプチド、ピリジン化合物、例えば、（Ｓ）−Ｎ−｛６−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−１−［５−（４−フルオロ−ベンゾイル）−ピリジン−３−イルメチル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル｝−２−メチルアミノ−プロピオンアミド、ｘＩＡＰアンチセンス）、ＨＤＡＣ阻害薬（ＨＤＡＣＩ）、及びキナーゼ阻害薬（ソラフェニブ）がある。
【００５４】
この定義にやはり含まれるのは、抗エストロゲン薬及び選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）など、腫瘍に対するホルモンの作用を制御又は阻害するように働く抗ホルモン薬であり、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェン）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ−トレミフェン；副腎におけるエストロゲンの生成を制御する、酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害薬、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタニエ（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾール；並びに抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、とりわけ接着細胞の増殖に関係するシグナリング経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−α、Ｒａｌｆ、及びＨ−Ｒａｓ；リボザイム、例えば、ＶＥＧＦ発現阻害薬（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）、及びＨＥＲ２発現阻害薬；ワクチン、例えば、遺伝子治療ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害薬；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；並びにあらゆる上記の薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体がある。
【００５５】
「増殖阻害薬」は本明細書で用いられる場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで細胞の増殖を阻害する化合物又は組成物を意味する。このように増殖阻害薬は、Ｓ期においてこのような遺伝子を過剰発現する細胞のパーセント値を大幅に低減する薬剤である。増殖阻害薬の例には、Ｇ１期停止及びＭ期停止を引き起こす薬剤など、（Ｓ期以外の位置で）細胞周期の進行を阻止する薬剤が含まれる。古典的なＭ期阻止薬には、ビンカ（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、並びにトポＩＩ阻害薬、例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。ＤＮＡアルキル化剤（例えば、タモキシフェン）、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、及びａｒａ−Ｃなど、Ｇ１期を停止させる薬剤はまた、Ｓ期の停止に波及する。さらなる情報は「癌の分子的ベース（Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ）」、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ及びＩｓｒａｅｌ編集、第１章、Ｍｕｒａｋａｍｉら、「細胞周期制御、腫瘍遺伝子、及び抗新生物薬（Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ）」（ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９５年、１３頁）に見ることができる。
【００５６】
さらに、アルギニン枯渇薬（例えば、アルギナーゼ）など、細胞ストレスを誘発する薬剤が含まれる。
【００５７】
さらに、リツキシマブなどの標的化抗体が含まれる。さらに、ＴＲＡＩＬアゴニストの、アスピリン及びＮＦｋＢ経路の阻害薬との併用も有益であり得る。
【００５８】
本明細書で用いられる「相乗活性」、「相乗作用」、「相乗効果」、又は「相乗的効果量」は、ＴＲＡＩＬ死受容体アゴニスト及び治療薬の併用を用いた場合に観察される効果が（１）ＴＲＡＩＬ死受容体アゴニスト又は治療薬を単独で（若しくは個々に）用いた場合に達成される効果を超え、（２）ＴＲＡＩＬ死受容体アゴニスト又は治療薬に対する加えられた（相加）効果の合計を超える。このような相乗作用又は相乗効果は、当技術分野では知られている様々な手段によって決定することができる。例えば、ＴＲＡＩＬ死受容体アゴニスト及び治療薬の相乗効果は、腫瘍細胞数又は腫瘍塊の低減を試験するｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイフォーマットにおいて観察することができる。
【００５９】
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」の語は広い意味で用いられ、細胞質の濃縮、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解、又はミトコンドリア機能の喪失を含めた、１つ若しくは複数の特徴的な細胞の変化を典型的に伴う哺乳動物の細胞死の、秩序だった、又は制御された形態を意味する。この活性は、例えば、細胞生死判定アッセイ、ＦＡＣＳ分析又はＤＮＡ電気泳動、アネキシンＶの結合性、ＤＮＡの断片化、細胞の収縮、小胞体の拡大、細胞の断片化、及び／又は膜小胞の形成（アポトーシス小体と呼ばれる）によって、技術分野でよく知られている方法を用いて決定及び測定することができる。
【００６０】
「癌」、「癌性の」、及び「悪性」の語は、典型的に細胞の非制御の増殖を特徴とする、哺乳動物における生理状態を意味し、又は記載するものである。癌の例には、それだけには限定されないが、腺癌、リンパ腫、芽腫、メラノーマ、肉腫、及び白血病を含めた癌腫が含まれる。このような癌のより詳しい例には、扁平細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、消化器癌、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、神経膠芽腫、グリオーマ、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌（例えば、肝癌及び肝細胞癌）、膀胱癌、乳癌、大腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜癌、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、唾液腺癌、腎臓癌（例えば、腎細胞癌及びウイルムス腫瘍）、基底細胞癌、メラノーマ、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、並びに様々なタイプの頭部及び頸部の癌が含まれる。
【００６１】
「免疫関連疾患」の語は、哺乳動物の免疫系の構成成分が、哺乳動物における罹患を引き起こし、媒介し、又は他の方法で罹患に貢献する疾患又は障害を意味する。免疫反応の刺激又は介入が疾患の進行に対して寛解性の効果を有する疾患も含まれる。この語の中には、自己免疫疾患、免疫媒介性炎症性疾患、免疫非媒介性炎症性疾患、感染性疾患、及び免疫不全疾患が含まれる。そのいくつかは免疫細胞又はＴ細胞媒介性であり、本発明に従って治療することができる、免疫関連疾患及び炎症性疾患の例には、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、脊椎関節症、全身性強皮症（強皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）、自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介性血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、糖尿病、免疫媒介性腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢神経系及び末梢神経系の脱髄性疾患（例えば、多発性硬化症）、特発性脱髄性多発性ニューロパチー又はギランバレー症候群、並びに慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、肝胆道疾患、例えば、流行性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎、及び他の肝親和性のウイルス）、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫様肝炎、並びに硬化性胆管炎、炎症性及び線維性肺疾患、例えば、炎症性腸疾患（潰瘍性腸炎、クローン病）、グルテン過敏性腸炎、並びにウィップル病、水疱性皮膚疾患を含む自己免疫性又は免疫媒介性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬、アレルギー疾患、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫疾患、例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、移植片拒絶及び移植片対宿主病を含む移植関連疾患が含まれる。感染性疾患には、ＡＩＤＳ（ＨＩＶ感染）、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、及びＥ型肝炎、細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症、並びに寄生虫感染症が含まれる。
【００６２】
「Ｂ細胞悪性腫瘍」は、Ｂ細胞に関与する悪性腫瘍である。例には、リンパ球優位型ホジキン病（ＬＰＨＤ）を含むホジキン病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、濾胞性中心細胞（ＦＣＣ）リンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ又はＨＩＶ関連のリンパ腫、多発性骨髄腫、中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、移植後リンパ球増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（リンパ形質細胞性リンパ腫）、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、及び辺縁層リンパ腫／白血病が含まれる。
【００６３】
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）には、それだけには限定されないが、低悪性度／濾胞性ＮＨＬ、再発性又は難治性のＮＨＬ、前線（ｆｒｏｎｔ  ｌｉｎｅ）低悪性度ＮＨＬ、ステージＩＩＩ／ＩＶのＮＨＬ、化学療法抵抗性ＮＨＬ、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、びまん性大細胞型リンパ腫、侵襲性ＮＨＬ（侵襲性の前線ＮＨＬ及び高悪性度の再発性ＮＨＬを含む）、自己幹細胞移植後の再発性又は難治性のＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小非正円形細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬなどが含まれる。
【００６４】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異性抗原（ＴＳＡ）は、宿主における免疫反応を誘発することができる腫瘍細胞において生成される分子である。腫瘍関連抗原は腫瘍細胞上及び正常細胞上の両方に見出されるが発現レベルが異なり、一方腫瘍特異性抗原は専ら腫瘍細胞によって発現される。腫瘍細胞の表面上に示されるＴＡＡ又はＴＳＡには、それだけには限定されないが、なかでも、αフェトプロテイン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、グリピカン−３、腫瘍関連糖タンパク質−７２（ＴＡＧ−７２）、上皮腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＳＨ−１、ＭＡＧＥ−１、−２、−３、−１２、ＲＡＧＥ−ｌ、ＧＡＧＥ−１、−２、ＢＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、β−カテニン、ＣＤＣＰ−１、ＣＤＣ−２７、ＳＡＲＴ−１、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、乳房腫瘍関連抗原ＢＴＡ−１及びＢＴＡ−２、ＲＣＡＳ１（ＳｉＳｏ細胞上に発現される受容体結合性癌抗原）、胎盤（ＰＬＡＣｅｎｔａ）特異的１（ＰＬＡＣ−１）、シンデカン、ＭＮ（ｇｐ２５０）、イディオタイプが含まれる。腫瘍関連抗原には、また、血液型抗原、例えば、Ｌｅａ、Ｌｅｂ、ＬｅＸ、ＬｅＹ、Ｈ−２、Ｂ−１、Ｂ−２抗原が含まれる。（明細書最後の表ＸＸを参照されたい）。理想的には、本発明の目的では、ＴＡＡ又はＴＳＡの標的は、結合時に内部移行されない。
【００６５】
次に、より詳細に本発明に目を向けると、一態様において、本発明は少なくとも１つのＴＲＡＩＬ死受容体に結合する少なくとも１つのポリペプチド結合メンバーを含む、多量体化ドメインを含む非天然のポリペプチドに対するものである。本発明によると、結合メンバーは、多量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端いずれかのアミノ酸残基に連結することができる。また、ある実施形態において、単量体の多量体化ドメインのＮ末端及びＣ末端の両方に対する結合メンバーに連結し、それによってＴＲＡＩＬ死受容体に結合することができる結合メンバーを６個含む多量体化ポリペプチド複合体を提供するのが有利であり得る。本発明のポリペプチドは非天然のポリペプチド、例えば、多量体化ドメインとＴＲＡＩＬ死受容体に結合するポリペプチド配列との融合タンパク質である。非天然のポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸配列が、アミノ酸の付加、欠失、又は置換によって変更された、天然のポリペプチドであってもよい。このようなポリペプチドの例には、ドメインの１つ又は複数のループ領域が本明細書に記載するように修飾されているＣ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドが含まれる。天然に存在するＴＲＡＩＬ死受容体は、本発明の範囲内の非天然のポリペプチドではない。本発明のこの態様において、３量体化ドメインは、ＴＲＡＩＬ死受容体に結合する天然に存在するポリペプチドから得ることができる配列ではなく、天然に存在するポリペプチドに対する実質的な相同性を有さない。本発明の他の態様において、少なくとも１つのＴＲＡＩＬ死受容体に結合するポリペプチドは、死受容体に結合する天然のポリペプチドのフラグメント又は変異体であり、この場合、天然に存在するポリペプチド、変異体、又はフラグメントが多量体化ドメインに融合している場合、融合タンパク質はもはや天然に存在するポリペプチドではない。したがって、本発明は、本発明の融合タンパク質の一部分から、天然に存在するポリペプチド、そのフラグメント、又は変異体を除外するものではない。
【００６６】
本発明の様々な態様において、多量体化ドメインは、本明細書に記載する非限定的な例などの３量体化ドメインである。
【００６７】
本態様の一実施形態において、ポリペプチドは、腫瘍細胞におけるアポトーシスを活性化するＴＲＡＩＬ死受容体に結合する。一実施形態において、ポリペプチドは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）（配列番号４２）、又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）（配列番号４３）、又はこれらの保存的置換の変異体に結合する。特定の一実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１つのＴＲＡＩＬ囮受容体に特異的に結合しない。
【００６８】
様々な態様において、単量体のポリペプチドは少なくとも２つのセグメント：他の多量体化ドメインと多量体複合体を形成することができる多量体化ドメイン、及び少なくとも１つのＴＲＡＩＬ死受容体と結合するポリペプチド配列を含む。ＴＲＡＩＬ死受容体に結合する配列は、ドメインのＮ末端で、Ｃ末端で、又はＮ末端及びＣ末端の両方で、多量体化ドメインと融合していてよい。
【００６９】
一実施形態において、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）（配列番号４２）、又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）（配列番号４３）に結合する第１のポリペプチドは３量体化ドメインのＮ末端及びＣ末端の一方で融合しており、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）（配列番号４２）、又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）（配列番号４３）に結合する第２のポリペプチドは３量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端の他方で融合している。
【００７０】
さらなる一実施形態において、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの両方がＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）（配列番号４２）に結合し、又は第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの両方がＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）（配列番号４３）に結合する。さらなる一実施形態において、第１のポリペプチドがＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）（配列番号４２）に結合し、第２のポリペプチドがＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）（配列番号４３）に結合する。両方の受容体を標的にする二重特異性分子の利点は、ＤＲ４及びＤＲ５の両方を発現するある患者での発現と、一方又は他方のいずれかを発現する他の患者での発現との差により、効力が大きく、適用範囲が広いことである。また、分子の両終端上に腫瘍細胞が特異的に結合することにより、二重特異性分子はスーパークラスター形成の、即ち両方向において媒介されるスーパークラスター形成効果をもたらすことが予想される。
【００７１】
ＴＲＡＩＬ受容体は、ヒトの組織にわたって相当広範に発現されるので、本発明の別の一態様は、ドメインの一終端（Ｎ末端又はＣ末端のいずれか一方）に、ＤＲ４又はＤＲ５のいずれかに結合するポリペプチドを有し、他方の終端（Ｎ末端又はＣ末端の他方）に、腫瘍関連（ＴＡＡ）抗原又は腫瘍特異性（ＴＳＡ）抗原に結合するポリペプチドを有する３量体化ドメインを含む。ＴＡＡ又はＴＳＡに結合するドメインはペプチド、例えば、ＣＴＬＤ、単鎖抗体、又は所望の標的に特異的に結合するあらゆるタイプのドメインであってよい。これらの場合において、アポトーシスを促進する標的に対するアゴニスト活性は、所与の腫瘍細胞表面上のＴＡＡ又はＴＳＡに結合し、近傍の別の腫瘍細胞と相互作用する多数の３量体複合体によって媒介されるスーパークラスター形成で大幅に増強される。さらに、腫瘍特異的ペプチド結合性ドメインは、薬物（３量体複合体と結合している）を腫瘍部位に方向付けることにより、腫瘍死滅活性をより特異的のものにすることができ、腫瘍特異性によって標的の滞留時間を改善することができる。結合活性の利点（近接の結合アームが３本対２本）による標的滞留時間が改善されるとともに、抗体に比べて小さいサイズ（約７０ｋＤ対１５０ｋＤ）による腫瘍の浸透の改善により、さらなる有効性及び安全性の利点がもたらされると予想される。
【００７２】
特定の一取組みにおいて、正常組織に対する毒性の潜在的な危険性は、３量体化ドメインの一終端のＤＲ４又はＤＲ５結合性ポリペプチドによって媒介される弱いアゴニスト活性を有し、３量体化ドメインの第２の終端上の腫瘍特異的なポリペプチドによって媒介されるクラスター形成が改善されている分子をデザインすることによって低減することができる。様々な態様において、ポリペプチドは、ＴＡＡ又はＴＳＡに対するよりも低い親和性で死受容体に結合する。より詳しくは、ポリペプチドは、ＴＡＡ又はＴＳＡに少なくとも２倍大きな親和性で、例えば、ポリペプチドが死受容体に結合するよりも、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、１０、１５、２０、５０、及び１００倍大きな親和性で結合する。
【００７３】
腫瘍の抗原標的部位に対するより高い親和性は、ＴＲＡＩＬ受容体及びＴＡＡ又はＴＳＡ標的薬剤の両方に結合しながらＴＲＡＩＬ受容体の内部移行を防ぐことにより、潜在的に効力を増強することもある。同様に、死受容体アゴニストの、クロルプロマジンなど、内部移行を防止する薬剤との併用治療又は化学的連結は、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストの効力を増強することがある（Ｚｈａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００８年）６巻、１８６１〜７２を参照されたい）。
【００７４】
一態様において、本発明は、１つ又は複数のＴＲＡＩＬ死受容体に結合するが、受容体に対するアゴニストであるポリペプチドを対象とするものである。ＤＲ４／ＤＲ５に結合するがアゴニスト活性を欠くポリペプチドを用いてペイロードを送達し、それによって癌細胞を死滅させる。ＤＲ４／ＤＲ５受容体は内部移行されている（Ｋｏｈｌｈａａｓ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２００７年４月２７日、２８２巻（１７）、１２８３１〜４１頁）。
【００７５】
さらに、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストの効力は、３量体化ドメインの一終端にＤＲ４又はＤＲ５アゴニスト、及び３量体化ドメインの他方の終端上にＴＮＦ受容体アゴニスト、ＦＮ１４アゴニスト、ＦＡＳ受容体アゴニスト、ＬＩＧＨＴ受容体アゴニストを有する二重特異性分子を提供することによって、ＴＲＡＩＬ受容体と相乗的に働く死受容体を標的にすることによって増強され得る（明細書の終わりの表ＸＸを参照されたい）。
【００７６】
ＴＲＡＩＬ受容体結合性ポリペプチド（単数若しくは複数）、及びＴＡＡ又はＴＳＡ標的薬剤（単数若しくは複数）の両方を有する３量体複合体に対する徴候には、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸癌、卵巣癌、腎臓癌、膵臓癌、肉腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫、乳癌、前立腺癌、メラノーマ、神経膠芽腫、神経芽細胞腫が含まれる。
【００７７】
さらに、正常細胞は細胞表面上にホスファチジルセリンを提示しないが、アポトーシスを起こしている細胞は、表面上のホスファチジルコリンをホスファチジルセリンに切り替えている。したがって、アポトーシス細胞を、ホスファチジルセリン結合性薬剤によって標的にすることができる。ホスファチジルセリン結合性薬剤には、それだけには限定されないが、抗体、抗体フラグメント、例えば、Ｂｕｒｔｅａら（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．、２００９年９月１０日［印刷に先行してオンラインで発行された］によって記載されているＣＴＬＤ又はペプチドが含まれる。一終端上にＤＲ４及び／又はＤＲ５アゴニスト活性を有し、他方の終端にホスファチジルセリン標的ペプチドを有する分子は、ＤＲアゴニストのより良好な腫瘍標的をもたらし、及び架橋により潜在的に効力を増強する。
【００７８】
別の一態様において、ＴＲＡＩＬ死受容体に特異的に結合するポリペプチドは、ＣＴＬＤのループ領域中に含まれている。ポリペプチドはＴＲＡＩＬポリペプチドであってよく、又は本明細書に提供する通りに同定される配列であってよいが、天然に存在するＴＲＡＩＬ配列若しくはそのフラグメントではなく、本明細書に記載するＴＲＡＩＬポリペプチドではない。この態様において、配列はＣＴＬＤのループ領域中に含まれ、ＣＴＬＤは、直接又は好適なリンカーによってドメインのＮ末端又はＣ末端の３量体化ドメインに融合している。また、本発明のポリペプチドは、他方のＮ末端及びＣ末端で融合している第２のＣＬＴＤドメインを含むことができる。本態様の一変形において、ポリペプチドは、３量体化ドメインの末端の一方でＴＲＡＩＬ死受容体に、末端の他方でＣＬＴＤに結合するポリペプチドを含む。１つ、２つ、又は３つのポリペプチドが、ＴＲＡＩＬ死受容体に特異的な結合メンバーを最高６個含む３量体複合体の部分であってよい。
【００７９】
本発明のポリペプチドは、天然のＴＲＡＩＬ配列、又はランダム配列中に、ＴＲＡＩＬ囮受容体ではなく、ＤＲ４受容体又はＤＲ５受容体のいずれかに選択的な結合親和性を有する１つ又は複数のアミノ酸変異を含むことができる。別の一実施形態において、ＴＲＡＩＬ変異体又はランダム配列は、ＴＲＡＩＬ囮受容体ではなく、ＤＲ４及びＤＲ５の両方に選択的な結合親和性を有する。様々な実施形態において、配列はＤＲ４に選択的に結合するが、ＤＲ５及び囮受容体には結合しない。類似の一実施形態において、配列はＤＲ５に結合するが、ＤＲ４及び囮受容体には結合しない。
【００８０】
１つ又は複数のＴＲＡＩＬ死受容体に結合するポリペプチド配列は、天然のＴＲＡＩＬが死受容体（単数若しくは複数）に対して有する結合親和性におよそ等しいＤＲ４及び／又はＤＲ５に対する結合親和性を有することができる。ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、天然のＴＲＡＩＬが同じＴＲＡＩＬ死受容体（単数又は複数）に対して有する結合親和性より大きい、１つ又は複数のＴＲＡＩＬ死受容体（単数若しくは複数）に対する結合親和性を有する。
【００８１】
一態様において、本発明のＴＲＡＩＬ死受容体アゴニストは、ＤＲ４及びＤＲ５受容体に対して選択的である。例えば、このような結合メンバーのＤＲ４又はＤＲ５受容体に対する結合親和性が、天然配列のＴＲＡＩＬに比べて、およそ等しい（非変化）又はそれより大きい（増大）場合、及び結合メンバーの囮受容体に対する結合親和性が天然配列のＴＲＡＩＬに比べて低い、又はほぼ除去されている場合、本明細書の目的では、結合メンバーの結合親和性はＤＲ４又はＤＲ５受容体に対して「選択的である」とみなされる。別の一例において、死受容体に対する結合メンバーの親和性は同じ受容体に対するＴＲＡＩＬの親和性より低いが、囮受容体よりも死受容体に対して高い親和性を有すれば、結合メンバーは受容体に対して依然として選択的である。本発明の好ましいＤＲ４及びＤＲ５選択的アゴニストは、囮受容体に比べて死受容体に対して少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍大きい結合親和性を有し、さらにより好ましくは、囮受容体に比べて死受容体に対して少なくとも１００倍大きい結合親和性を有する。結合メンバーはＤＲ４及びＤＲ５に対して異なる結合親和性を有していてよい。
【００８２】
当技術分野では知られている、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び／又はＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって、アゴニストのそれぞれの結合親和性を決定することができ、天然のＴＲＡＩＬ、又はその一部分の結合の性質と比べることができる。本発明の好ましいＤＲ４及びＤＲ５選択的アゴニストは、少なくとも１タイプの哺乳動物細胞（例えば、癌細胞）においてアポトーシスを誘発し、このようなアポトーシス活性は、アラマー（ａｌａｍａｒ）ブルーアッセイ又はクリスタルバイオレットアッセイなど、技術分野では知られている方法によって決定することができる。
【００８３】
一実施形態において、ＴＲＡＩＬ死受容体アゴニストは、抗体又は抗体フラグメントを含む。現在の文脈において、「抗体」の語は、天然であっても、又は部分的に若しくは完全に合成的に生成されても、免疫グロブリンを記載するために用いられる。抗体は数々の方法で修飾することができるので、「抗体」の語は、所望の受容体特異性を有する結合性ドメインを有するあらゆる特異的な結合メンバー又は物質を網羅するものと解釈すべきである。したがって、この語は、天然であっても、又は完全に若しくは部分的に合成的であっても、免疫グロブリン結合性ドメインを含むあらゆるポリペプチドを含む、抗体のフラグメント、誘導体、機能的同等物、及び抗体の相同体を網羅するものである。別のポリペプチドに融合している、免疫グロブリン結合性ドメインを含むキメラの分子、又は同等物も、したがって含まれる。この語はまた、抗体模倣物など、抗体結合性ドメインである、又は抗体結合性ドメインと相同である結合性ドメインを有するあらゆるポリペプチド又はタンパク質を網羅する。これらは天然の供給源に由来していてよく、又はこれらは部分的に若しくは完全に合成的に生成されてもよい。抗体の例には、免疫グロブリンイソ型及びこれらのイソ型のサブクラス；Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄなどの抗原結合性ドメインを含むフラグメント；並びにダイアボディがある。
【００８４】
別の一態様において、本発明は、各々のポリペプチドが、多量体化ドメイン、及び少なくとも１つのＴＲＡＩＬ死受容体に結合するポリペプチドを少なくとも１つ含む、３つのポリペプチドの多量体複合体に対するものである。一実施形態において、多量体複合体は、ヒトテトラネクチン３量体化構造要素に実質的な相同性を有するポリペプチド、マンノース結合性タンパク質（ＭＢＰ）３量体化ドメインを含む他のヒト３量体ポリペプチド、コレクチン頸部ポリペプチド、及び他者から選択される多量体ドメインを有するポリペプチドを含む。多量体複合体は、多量体複合体のポリペプチドが、相互に会合して多量体を形成することができる多量体化ドメインを含む、本発明のあらゆるポリペプチドからなっていてよい。したがって、いくつかの実施形態において、多量体複合体は、同じアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるホモ多量体複合体である。他の実施形態において、多量体複合体は、例えば、異なる多量体化ドメイン、及び／又はＴＲＡＩＬ死受容体に結合する異なるポリペプチドなどの、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるヘテロ多量体複合体である。このような実施形態において、ＴＲＡＩＬ死受容体に特異的に結合するポリペプチドは、同じＴＲＡＩＬ死受容体を標的にすることができる。他の実施形態において、ＴＲＡＩＬ死受容体に特異的に結合するポリペプチドは、ＤＲ４及びＤＲ５など、異なるＴＲＡＩＬ死受容体を標的にする。したがって、ある実施形態において、多量体複合体は本発明のポリペプチドを含み、各ポリペプチドはＤＲ４に結合する少なくとも１つのポリペプチド及び／又はＤＲ５に結合する少なくとも１つのポリペプチドを含み、該ＤＲ４結合性ポリペプチドは同じでも異なってもよく、該ＤＲ５結合性ポリペプチドは同じでも異なってもよい。
【００８５】
さらに、一態様において、本発明は、（ａ）ＤＲ４又はＤＲ５に特異的に結合するがＴＲＡＩＬ囮受容体には結合しない第１のポリペプチド（単数又は複数）を選択すること、（ｂ）第１のポリペプチド（単数又は複数）をテトラネクチンＣＴＬＤの１つ又は２つのループ領域中にグラフトして第１の結合決定因子を形成すること、或いはポリペプチドをＴＴＳＥに直接融合すること、（ｃ）第１のＣＴＬＤをテトラネクチン３量体化構造要素のＮ末端又はＣ末端の１つと融合することを含む、ＴＲＡＩＬに対する少なくとも１つの死受容体を発現する細胞におけるアポトーシスを誘発するポリペプチドを調製するための方法に関する。この態様の別の一実施形態において、方法は、（ａ）第１のポリペプチドに比べて他のＤＲ４及びＤＲ５に特異的に結合するように選択される第２のポリペプチド（単数又は複数）を選択すること、（ｂ）第２のポリペプチド（単数又は複数）をテトラネクチンＣＴＬＤの１つのループ領域中にグラフトして第２の結合決定因子を形成すること、或いはポリペプチドをＴＴＳＥに直接融合すること、並びに（ｃ）第２のＣＴＬＤをテトラネクチン３量体化構造要素のＮ末端又はＣ末端の他方と融合することをさらに含む。
【００８６】
テトラネクチンＣＴＬＤは、その中にＴＲＡＩＬ死受容体に対する結合メンバーを挿入することができる最高５個のループ領域を有する。したがって、本発明のポリペプチドがＣＴＬＤを含む場合、ポリペプチドは、ＣＴＬＤによって３量体化ドメインに付着するＴＲＡＩＬ死受容体に対して最高４個の結合メンバーを有することができる。各々の結合メンバーは同じでもよく、又は異なっていてもよく、ＤＲ４若しくはＤＲ５のいずれか、又は両方に対するアゴニストであってもよい。
【００８７】
本発明のポリペプチドの他の態様において、受容体アゴニストは３量体化ドメインの１末端に結合することができ、１つ若しくは複数の治療薬が第２の末端に結合していてよい。薬剤は、直接結合していてよく、又は当業者であれば理解される好適なリンカーによって結合していてもよい。このような薬剤は、アゴニストと同じアポトーシス経路において働いてもよく、又は癌及び他の状態を治療するための異なる経路において働いてもよい。また、このような薬剤は、ＤＲ４及びＤＲ５の発現を上方制御することができる。ポリペプチドの末端の１つに結合していることの他に、薬剤は、３量体化ドメインにおける側鎖に対するペプチド結合によって、又はシステイン残基に対する結合によって３量体化ドメインに共有結合的に連結していてよい。薬剤をモジュールに共有結合的にカップリングする他の方法は、例えば、本明細書に参照によって援用されるＵＳ６，１９０，８８６において示す通りに用いることもできる。
【００８８】
ＴＲＡＩＬ死受容体に特異的なポリペプチド配列の同定
一態様において、ＴＲＡＩＬ死受容体に特異的な結合メンバーを、受容体に特異的に結合するライブラリーのメンバーを選択することによって、ポリペプチドのランダムライブラリーから得ることができる。推定上のリガンド結合部位を有する表現型をディスプレイするための数々のシステムが知られている。これらには、ファージディスプレイ（例えば、繊維状ファージｆｄ［Ｄｕｎｎ（１９９６年）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ及びＤｕｎｃａｎ（１９９８年）、Ｍａｒｋｓら（１９９２年）］、λファージ［Ｍｉｋａｗａら（１９９６年）］）、真核生物ウイルス上のディスプレイ（例えば、バキュロウイルスｂ［Ｅｒｎｓｔら（２０００年）］）、細胞ディスプレイ（例えば、細菌細胞上のディスプレイ［Ｂｅｎｈａｒら（２０００年）］、酵母菌細胞［Ｂｏｄｅｒ及びＷｉｔｔｒｕｐ（１９９７年）］、並びに哺乳動物細胞［Ｗｈｉｔｅｈｏｒｎら（１９９５年）］、リボソーム連結ディスプレイ［Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌら（１９９９年）］、並びにプラスミド連結ディスプレイ［Ｇａｔｅｓら（１９９６年）］が含まれる。
【００８９】
また、その全文が参照によって本明細書に援用されるＵＳ２００７／０２７５３９３は、ＣＴＬＤライブラリーを産生するためのディスプレイシステムを達成するための手順を詳しく記載している。一般的な手順は以下を含む：（１）３Ｄ構造などの情報が入手可能な場合には、選択したＣＴＬＤの３Ｄ構造を参照することによるループ領域の位置の同定、又は入手可能ではない場合は、やはり上記に開示した通り、β２及びβ３コンセンサス配列エレメント並びにβ４鎖の特徴に対応する配列エレメントの同定によるさらなる確証による助けで、既知の配列との配列アラインメントによるβ２、β３、及びβ４鎖の配列位置の同定、（２）β２、β３、及びβ４をコードする配列に近いエンドヌクレアーゼ制限部位を予め挿入した、又は予め挿入しない、タンパク質ディスプレイベクター系における、選択したＣＴＬＤをコードする核酸フラグメントのサブクローニング、並びに（３）受け入れ側のフレームワークをコードする核酸コンテクスト内への挿入後に、オリジナルのループ領域のポリペプチドフラグメントをコードする核酸フラグメントを、ランダムに選択した核酸フラグメントで置換する多数の核酸フラグメントからなる集合のランダムに選択されたメンバーで、選択したＣＴＬＤのループ領域の一部又は全てをコードする核酸フラグメントを置換すること。クローニングされた核酸フラグメントは各々、オリジナルのループセグメント又は全体のループ領域を置き換える新しいポリペプチドをコードしており、その新しい配列のコンテクスト内に決定された読み枠で解読される。
【００９０】
ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）受容体を通してシグナル伝達してアポトーシスを誘発する、ホモ３量体タンパク質として機能する複合体が形成され得る。ＴＲＡＩＬリガンドによるこれらの受容体の３量体化は、死誘導シグナリング複合体（ＤＩＳＣ）の形成及びその後のアポトーシスシグナリング経路の完全誘導に関与するので、ヒトテトラネクチンタンパク質の３量体構造は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２受容体に対する結合、並びに受容体及びアゴニスト活性の３量体化の誘発ができるメンバーを有するライブラリーを構築する独特に理想的な骨格を提示する。しかし、ＴＲＡＩＬ受容体結合活性を有するペプチドを最初に同定しなければならない。これを達成するには、結合活性が既知であるペプチドを用いてもよく、又はさらなる新しいペプチドをディスプレイライブラリーからのスクリーニングによって同定してもよい。それだけには限定されないがファージ、リボソーム、及び酵母菌のディスプレイなど、数々の異なるディスプレイ系が入手可能である。
【００９１】
結合活性を有する新しいペプチドを選択するため、ライブラリーを構築し、単一の単量体ＣＴＬＤドメイン、又はファージの表面上にディスプレイされた個々のペプチドのいずれかとして、単量体要素としてのＴＲＡＩＬ受容体への結合に対して最初にスクリーニングすることができる。ＴＲＡＩＬ受容体結合活性を有する配列が同定されたら、これらの配列を引き続きヒトテトラネクチンの３量体化ドメイン上にグラフトして、アゴニスト活性（アポトーシス）を誘発するための３量体複合体において３つの受容体を結合することができる潜在的なタンパク質治療薬を作り出す。
【００９２】
これらのファージディスプレイライブラリー及び３量体化ドメイン構築物の構築において、４つの主要な戦略を用いることができる。第１の戦略は、ランダムペプチドファージディスプレイライブラリーの構築及び／又は使用である。ジスルフィド制限ループとして構築されたランダムの直鎖状ペプチド及び／又はランダムペプチドが、ファージ粒子の表面上に個々にディスプレイされ、ファージディスプレイの「パニング」によって所望のＴＲＡＩＬ受容体に対する結合に関して選択される。ＴＲＡＩＬ受容体結合活性を有するペプチドクローンを得た後、これらのペプチドをヒトテトラネクチンの３量体化ドメイン上に、又はＣＴＬＤドメインのループ中にグラフトし、その後３量体化ドメイン上にグラフトし、アゴニスト活性に対してスクリーニングする。
【００９３】
ファージディスプレイライブラリー及び３量体化ドメイン構築物の構築に対する第２の戦略は、ＣＴＬＤ由来のバインダーを得ることを含む。ライブラリーは、ファージの表面上にディスプレイされるヒトテトラネクチンのＣＴＬＤ骨格内の５つの異なるループの１つ又は複数におけるアミノ酸をランダム化することによって構築することができる。ＴＲＡＩＬ受容体に対する結合を、ファージディスプレイのパニングによって選択することができる。ＴＲＡＩＬ受容体結合活性を示すペプチドループを有するＣＴＬＤクローンを得た後、次いで、これらのＣＴＬＤクローンをヒトテトラネクチンの３量体化ドメイン上にグラフトし、アゴニスト活性に対してスクリーニングすることができる。
【００９４】
ファージディスプレイライブラリー及び３量体化ドメイン構築物の構築に対する第３の戦略は、ＴＲＡＩＬ受容体に対する結合能力を有する既知の配列を選択すること、及びこれらをヒトテトラネクチンの３量体化ドメイン上に直接グラフトすること、及びアゴニスト活性に対してスクリーニングすることを含む。
【００９５】
第４の戦略は、ＴＲＡＩＬ受容体に対する結合能力が既知であるペプチド配列を用いて、ペプチドに隣接するランダム化されたアミノ酸、及び／又はペプチド内のランダム化された選択された内部アミノ酸を有する新しいライブラリーを作り出すことによってこれらの結合を最初に改善し、その後ファージディスプレイによって改善された結合を選択することを含む。親和性の改善されたバインダーを得た後、これらのペプチドのバインダーをヒトテトラネクチンの３量体化ドメイン上にグラフトし、アゴニスト活性に対してスクリーニングすることができる。この方法において、最初のライブラリーを、ファージ粒子の表面上にディスプレイされた遊離のペプチドとして、第１の戦略として（上述）、又はやはり上記で論じた第２の戦略におけるようにＣＴＬＤ骨格内の制限ループとしてのいずれかで構築することができる。親和性の改善されたバインダーを得た後、これらのペプチドのヒトテトラネクチンの３量体化ドメイン上へのグラフト、及びアゴニスト活性に対するスクリーニングを行う。
【００９６】
３量体化ドメインの切断されたバージョンを、Ｎ末端の最高１６残基（Ｖ１７）を除去するのに、又はＣ末端を変化させるのに用いることができる。Ｔｒｉｐ  Ｖ（配列番号）、Ｔｒｉｐ  Ｔ（配列番号）、Ｔｒｉｐ  Ｑ（配列番号）、及びＴｒｉｐ  Ｋ（配列番号）（図３を参照されたい）と呼ばれるＣ末端変異体により、３量体化ドメイン上のＣＴＬＤドメインの独特の提示が可能になる。Ｔｒｉｐ  Ｋ変異体は最長の構築物であり、ＣＴＬＤと３量体化ドメインの間に最長且つ最も柔軟なリンカーを含む。Ｔｒｉｐ  Ｖ、Ｔｒｉｐ  Ｔ、Ｔｒｉｐ  Ｑは、いかなる構造上の柔軟さなしに３量体モジュール上に直接ＣＴＬＤ分子の融合物を提示するが、ＣＴＬＤ分子をＴｒｉｐ  ＶからＴｒｉｐ  Ｔに、及びＴｒｉｐ  ＴからＴｒｉｐ  Ｑに１／３旋回させる。これは、これらのアミノ酸の各々がαヘリックスの旋回中にあり、完全に旋回させるには３．２ａａが必要とされるという事実による。第１、第３、及び第４の戦略において結合に選択された遊離のペプチドを、３量体化ドメインの上記のバージョンのいずれかの上にグラフトすることができる。次いで、得られた融合物をスクリーニングして、どのペプチドの組合せ、及びどの方向付けが最良の活性をもたらすかを見ることができる。テトラネクチンのＣＴＬＤのループ内に制限された結合に対して選択したペプチドを、全長の３量体化ドメインにグラフトすることができる。
【００９７】
より詳しくは、４つの戦略を以下に記載する。これらの戦略はファージディスプレイに注目しているが、ポリペプチドを同定する他の同等の方法を用いることができる。
【００９８】
戦略１
それだけには限定されないが、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｐｈ．Ｄ．Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔなどのペプチドディスプレイライブラリーキットが市販されており、ＴＲＡＩＬ受容体結合活性を有する新しい、新規なペプチドの選択における使用に購入することができる。Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓキットの以下の３つの形態が入手可能である：独立したクローンが２．８×１０９のライブラリーサイズの、アミノ酸長７個の直鎖状ランダムペプチドを含むＰｈ．Ｄ−７  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ、独立したクローンが１．２×１０９のライブラリーサイズの、アミノ酸長７個のランダムペプチドを有するジスルフィド制限ループとして構築されたペプチドを含むＰｈ．Ｄ−Ｃ７Ｃ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ、及び独立したクローンが２．８×１０９のライブラリーサイズの、アミノ酸長１２個の直鎖状ランダムペプチドを含むＰｈ．Ｄ−１２  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ。
【００９９】
或いは、類似のライブラリーを、これらのキット同様、ランダムアミノ酸を含むペプチドで新規に構築することができる。構築にはＮＮＫ又はＮＮＳの戦略のいずれかを用いてランダムヌクレオチドを産生するが、この場合ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、及びＴの４つの核酸塩基の等しい混合物を表す。Ｋは、Ｇ又はＴいずれかの等しい混合物を表し、ＳはＧ又はＣいずれかの等しい混合物を表す。これらのランダム化された位置を、ファージ又はファージミドのいずれかのディスプレイベクター系において遺伝子ＩＩＩタンパク質にクローニングすることができる。ＮＮＫ及びＮＮＳの戦略は両方とも、可能なアミノ酸２０個全て、及び１個の終止コドンを網羅し、コードされるアミノ酸の頻度はわずかに異なる。細菌の形質転換の効率に限界があるため、ファージディスプレイ用に産生されるライブラリーサイズは、前記に開始した順番であり、したがって最高７個のランダム化されたアミノ酸の位置を含むペプチドが産生され、それでも理論上の組合せの完全なレパートリーを網羅することができる（２０７＝１．２８×１０９）。ＮＮＫ又はＮＮＳの戦略のいずれかを用いてより長いペプチドライブラリーを構築することができるが、実際のファージディスプレイライブラリーのサイズは、細菌の形質転換に必要とされるため、このような長さに付随する可能な理論上のアミノ酸の組合せ全てを網羅しない可能性がある。
【０１００】
したがって、リボソームディスプレイライブラリーは、より大型の／より長いランダムペプチドが関与する場合に有益であり得る。ジスルフィド制限ライブラリーには、同様のＮＮＫ又はＮＮＳランダムヌクレオチドの戦略が用いられる。しかし、これらランダムの位置にはシステインアミノ酸残基が隣接して、ジスルフィド架橋の形成を可能にしている。Ｎ末端のシステインには、アラニンなどのさらなるアミノ酸が先行することがよくある。さらに、それだけには限定されないが、いくつかのグリシン残基を作り上げる柔軟なリンカーが、あらゆる上記のランダムペプチドライブラリーに対してペプチドと遺伝子ＩＩＩタンパク質の間のスペーサーとして働くことがある。
【０１０１】
戦略２
図１及び図４に示すヒトテトラネクチンＣＴＬＤは５つのループ（ＬＳＡに４ループ、及び１ループはＬＳＢを構成する）を含み、これらを様々なタンパク質標的に対してＣＴＬＤの結合を付与するように変更することができる。ランダムアミノ酸配列を１つ又は複数のこれらのループに配置して、それから所望の結合の性質を有するＣＴＬＤドメインを選択することができるライブラリーを作り出すことができる。ヒトテトラネクチンＣＴＬＤの５つのループのあらゆるもの又は全ての中に制限されているランダムペプチドを含むこれらのライブラリーの構築は、戦略１において上記に記載したＮＮＫ又はＮＮＳのいずれかを用いて（それだけには限定されないが）、遂行することができる。それによって７つのランダムペプチドをＴＮ  ＣＴＬＤのループ１中に挿入することができる方法の一例は、以下の通りである。
【０１０２】
フラグメントＡのＰＣＲは、ＣＴＬＤのＮ末端に結合するフォワードオリゴＦ１（５’−ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＡＣＧ  ＧＴＣ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＧＧ−３’；配列番号）；ループ１に対して５’のＤＮＡ配列に結合するリバースオリゴＲ１（５’−ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＧＣＣ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＧＧＣ  ＣＴＣ−３’、配列番号４９）を用いて行うことができる。フラグメントＢは、フォワードオリゴＦ２（５’−ＧＡＧ  ＧＣＣ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＡＡＣ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＧＧＣ  ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＡＴＣ−３’；配列番号）、及びリバースプライマーＲ２（５’−ＣＡＣ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＧＡＡ  ＣＴＧ  ＧＣＡ  ＧＡＴ  ＧＴＡ  ＧＧＧ−３’；配列番号）を用いて作り出すことができる。フォワードプライマーＦ２は、プライマーＲ１に相補的であり、ループ１の最初の７個のアミノ酸をランダムアミノ酸で置き換える５’末端を有し、ループ１の最後のアミノ酸及びその配列３’に結合する３’末端を含んでおり、一方、リバースプライマーＲ２は、ＣＴＬＤ配列の末端に相補的であり、結合する（図６を参照されたい）。フィデリティの高いポリメラーゼ又はｔａｑのブレンド、及び標準のＰＣＲサーモサイクル条件を用いて、ＰＣＲを行うことができる。次いで、フラグメントＡ及びＢをゲル単離し、次いで、上記に記載したプライマーＦ１及びＲ２を用いてオーバーラップエクステンションＰＣＲ用に組み合わせる。制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩ及びＰｓｔ  Ｉで消化すると、ＴＮ  ＣＴＬＤのループを含むフラグメントの単離が可能になり、遺伝子ＩＩＩに融合している、以下に示す修飾されたＣＴＬＤの制限を含むファージディスプレイベクター（例えば、ＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ）（クローニング用にＢｇｌ  ＩＩ及びＰｓｔ  Ｉで同様に消化される）中への引き続きライゲーションが可能になる（図７を参照されたい）。
【０１０３】
ランダム化されたアミノ酸で置換することによる他のループの修飾は、上記に示したように同様に行うことができる。ループ内の規定されたアミノ酸の、ランダム化されたアミノ酸での置換は、いかなる特定のループに制限されず、ループのオリジナルのサイズにも制限されない。同様に、ループ全体の置換は必要とされず、あらゆるループに対する部分的な置換が可能である。いくつかの場合において、図４に示すカルシウム配位アミノ酸など、ループ内のオリジナルのアミノ酸のいくつかの保持が望ましいことがある。これらの場合において、ランダム化されたアミノ酸での置換が、ループ内のより少ないアミノ酸のいずれかに起きてカルシウム配位アミノ酸を保持することがあり、又はさらなるランダム化されたアミノ酸がループに加えられてループのサイズ全体を増大することがあるが、これらのカルシウム配位アミノ酸は依然として保持される。ループ１及び２、又はループ３及び４などのループ領域を１つの大型の置換ループに組み合わせることによって、非常に大型のペプチドを収容し、試験することができる。さらに、それだけには限定されないが、ＭＢＬ  ＣＴＬＤなどの他のＣＬＴＤを、テトラネクチンのＣＴＬＤの代わりに用いることができる。ペプチドのこれらＣＴＬＤ中へのグラフトは、上記に記載した方法に類似の方法を用いて起こることができる。
【０１０４】
本発明の様々な例示の態様において、ＴＲＡＩＬ死受容体に結合するポリペプチドを、ＣＴＬＤバックボーンをベースにして、コンビナトリアルペプチドライブラリー、及びライブラリーのポリペプチドをコードする核酸配列のライブラリーを用いて同定することができるが、この場合、ポリペプチドのＣＴＬＤは、スキーム（ａ）〜（ｇ）として同定のみの目的に標識されている数々の例示のスキームに従って修飾されている。
（ａ）ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４ループのうち少なくとも１つにおける１つ又は複数の酸修飾（１つ又は複数のアミノ酸修飾はループ１における少なくとも１つのアミノ酸の挿入、及びループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換を含む）。
（ｂ）ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４ループのうち少なくとも１つにおける１つ又は複数のアミノ酸修飾（１つ又は複数のアミノ酸修飾はループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換、及びループ２内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む）。
（ｃ）ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４ループのうち少なくとも１つにおける１つ又は複数のアミノ酸修飾（１つ又は複数のアミノ酸修飾はループ１内の少なくとも７つのアミノ酸のランダム置換、及びループ４における少なくとも１つのアミノ酸の挿入を含む）。
（ｄ）ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４ループのうち少なくとも１つにおける１つ又は複数のアミノ酸修飾（１つ又は複数のアミノ酸修飾はループ３における少なくとも１つのアミノ酸の挿入、及びループ３内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む）。
（ｅ）ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４ループのうち少なくとも１つにおける１つ又は複数のアミノ酸修飾（１つ又は複数のアミノ酸修飾は２つのループを１本のループに合わせる修飾を含み、２つの組み合わされるループはループ３とループ４である）。
（ｆ）ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４ループのうち少なくとも１つにおける１つ又は複数のアミノ酸修飾（１つ又は複数のアミノ酸修飾はループ４における少なくとも１つのアミノ酸の挿入、及びループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む）。
（ｇ）ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）及びループセグメントＢ（ＬＳＢ）における５ループのうち少なくとも１つにおける１つ又は複数のアミノ酸修飾（１つ又は複数のアミノ酸修飾はループ３における５つのアミノ酸残基のランダム置換、及びループ５内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む）。
【０１０５】
したがって、一態様において、本発明は、修飾されたＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーのコンビナトリアルポリペプチドライブラリーに関し、修飾されたＣＴＬＤは、ＣＴＬＤ（ループ５）のＬＳＡ又はＬＳＢループにおける４ループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾を１つ又は複数含み、１つ又は複数のアミノ酸修飾は、ループ１における少なくとも１つのアミノ酸の挿入、及びループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換を含む。
【０１０６】
コンビナトリアルライブラリーのこの態様の実施形態において、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来である場合、ＣＴＬＤはまた、アルギニン−１３０のランダム置換を有する。ヒトテトラネクチンのＣＴＬＤ以外のＣＴＬＤでは、このペプチドは、Ｃ末端方向におけるループ２のＣ末端ペプチドにすぐ隣接して位置する。例えば、マウステトラネクチンにおいて、このペプチドはＧｌｙ−１３０である。ヒト又はマウスのテトラネクチンからのＣＴＬＤのコンビナトリアルライブラリーのこの態様の実施形態において、ＣＴＬＤはループ４におけるリシン−１４８からアラニンへの置換を含む。この態様のある実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは、ループ１における２つのアミノ酸挿入、ループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換、アルギニン−１３０、又はＣ末端方向におけるループ２の外側に、及びループ２に隣接して位置する他のアミノ酸のランダム置換、並びにループ４におけるリシン−１４８からアラニンへの置換を含む。
【０１０７】
一態様において、本発明は、修飾されたＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を含むポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーに関し、修飾されたＣＴＬＤはＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４ループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾を１つ又は複数含み、１つ又は複数のアミノ酸修飾はループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換、ループ２内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換、及びアルギニン−１３０又はＣ末端方向におけるループ２の外側に、及びループ２に隣接して位置する他のアミノ酸のランダム置換、並びにループ４におけるリシン−１４８からアラニンへの置換を含む。
【０１０８】
一態様において、本発明は、修飾されたＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を含むポリペプチドメンバーを含み、修飾されたＣＴＬＤはＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４ループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾を１つ又は複数含み、１つ又は複数のアミノ酸修飾はループ１内の少なくとも７つのアミノ酸のランダム置換、及びループ４における少なくとも１つのアミノ酸挿入を含む。
【０１０９】
この態様の実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは、ループ４内の少なくとも２つのアミノ酸のランダム置換をさらに含む。ある実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは、ループ１内の少なくとも７つのアミノ酸のランダム置換、ループ４における３つのアミノ酸挿入、及びループ４内の少なくとも２つのアミノ酸のランダム置換を含む。
【０１１０】
一態様において、本発明は、修飾されたＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を含むポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーに関し、修飾されたＣＴＬＤはＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４ループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾を１つ又は複数含み、１つ又は複数のアミノ酸修飾はループ３内の少なくとも６つ（例えば、３、４、５、６個若しくはそれを超える）のアミノ酸のランダム置換、及び任意選択で、ループ４におけるリシン−１４８からアラニンへの置換を含む。
【０１１１】
一態様において、本発明は、修飾されたＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を含むポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーに関し、修飾されたＣＴＬＤはＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４ループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾を１つ又は複数含み、１つ又は複数のアミノ酸修飾はループ３内の少なくとも１つのアミノ酸挿入及びループ３における少なくとも３つのアミノ酸のランダム挿入、並びにループ４におけるリシン−１４８からアラニンへの置換を含む。
【０１１２】
一態様において、本発明は、修飾されたＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を含むポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーに関し、修飾されたＣＴＬＤはＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４ループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾を１つ又は複数含み、１つ又は複数のアミノ酸修飾はループ３における少なくとも１つのアミノ酸挿入、及びループ３内の少なくとも６つのアミノ酸のランダム挿入、並びにループ４におけるリシン−１４８からアラニンへの置換を含む。
【０１１３】
この態様の実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは、ループ４における少なくとも１つのアミノ酸挿入をさらに含む。ある実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは、ループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換をさらに含む。ある実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは、ループ３における３つのアミノ酸挿入を含む。ある実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは、ループ４における３つのアミノ酸挿入をさらに含む。
【０１１４】
一態様において、本発明は、修飾されたＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を含むポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーに関し、修飾されたＣＴＬＤはＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４ループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾を１つ又は複数含み、１つ又は複数のアミノ酸修飾は２つのループを１本のループに合わせる修飾を含み、２つの組み合わされるループはループ３とループ４である。
【０１１５】
この態様の一実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは、配列ＮＷＥＸＸＸＸＸＸＸ  ＸＧＧＸＸＸＮ（配列番号）を含み、Ｘはあらゆるアミノ酸であり、アミノ酸配列は、ループ３とループ４が組み合わされ、修飾されたものからの１本のループを形成する。
【０１１６】
一態様において、本発明は、修飾されたＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を含むポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーに関し、修飾されたＣＴＬＤはＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４ループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾を１つ又は複数含み、１つ又は複数のアミノ酸修飾は、ループ４における少なくとも１つのアミノ酸修飾、及びループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む。
【０１１７】
この態様の一実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは、ループ４における４つのアミノ酸挿入、及びループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む。コンビナトリアルライブラリーがループ４領域に１つ又は複数のアミノ酸修飾を含む（単独で、若しくはＣＴＬＤの他の領域に対する修飾と組み合わせて）実施形態において、修飾（単数又は複数）は、ＣＴＬＤの金属イオン結合親和性を維持し、変調し、又は抑止するようにデザインされていてよい。このような修飾は、ＣＴＬＤのプラスミノーゲン結合活性に影響を及ぼし得る（例えば、Ｎｉｅｌｂｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４年、４３巻（２７）、８６３６〜８６４３頁；又はＧｒａｖｅｒｓｅｎ、１９９８年を参照されたい）。
【０１１８】
さらなる実施形態において、ＣＴＬＤループ領域を、以下の非限定的な実施例に詳述する例示の構築物を越えて伸長してもよい。所与のライブラリーにおける４つのＬＳＡループ及びＬＳＢループ（ループ５）のさらなるあらゆる組合せは、１つ又は複数のアミノ酸修飾（例えば、挿入、伸長、若しくはランダム化による）を含むことができる。したがって、あらゆる様々な実施形態において、修飾されたＣＴＬＤは、単独で、又は（ＬＳＡ）からのあらゆる１つ、２つ、３つ、若しくは４つのループ領域（ループ１〜４）と組み合わせて、ＬＳＢループ領域に対する１つ又は複数のアミノ酸修飾も含むことができる。
【０１１９】
一態様において、本発明は、修飾されたＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を含むポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーに関し、修飾されたＣＴＬＤはＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４ループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾を１つ又は複数、及びループセグメントＢ（ＬＳＢ、若しくはループ５）におけるアミノ酸修飾を１つ又は複数含み、１つ又は複数のアミノ酸修飾はＬＳＢアミノ酸残基のランダム化を含む。
【０１２０】
この態様の一実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは修飾されたループ３及び修飾されたループ５領域を含み、修飾されたループ３領域は５つのアミノ酸残基のランダム化を含み、修飾されたループ５領域はループ５を含む３つのアミノ酸残基のランダム化を含む。一実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは修飾されたループ３、修飾されたループ５領域、及び修飾されたループ４領域を含み、ループ４に対する修飾はプラスミノーゲン結合を抑止する。一実施形態において、ループ４に対する修飾はリシン１４８の置換を含む。
【０１２１】
本明細書に記載する様々な実施形態に従って、ＣＴＬＤ領域からのあらゆる２つ、３つ、４つ、又は５つのループは、１つ又は複数のアミノ酸修飾（例えば、２つのループ領域、３つのループ領域、４つのループ領域、若しくは５つ全てのループ領域に対するランダムなアミノ酸修飾のあらゆるランダムな組合せ）を含むことができる。修飾されたＣＴＬＤライブラリーは、αヘリックス又はβ鎖におけるなど、ＬＳＡ又はＬＳＢ領域の外側のＣＴＬＤの領域に対するさらなるアミノ酸修飾をさらに含むことができる（例えば、図４を参照されたい）。
【０１２２】
ある実施形態において、組換えのＣＴＬＤライブラリーを、体細胞超変異（例えば、参照によって援用される、米国特許公開第２００９／００７５３７８号を参照されたい）ランダムフラグメンテーションによるＤＮＡシャフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ、ＰＮＡＳ、１９９４年）、ループシャフリング（ｌｏｏｐ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）、ループウォーキング（ｌｏｏｐ  ｗａｌｋｉｎｇ）、エラープローンＰＣＲ変異誘発（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅＰＣＲ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、及び最適の結合活性を有する分子を産生するための配列多様性を作成するのに当技術分野では知られている他の方法を受けさせることができる。さらなる実施形態において、組換えＣＴＬＤライブラリーは、任意選択で、ループ領域におけるある種のＣａ２＋配位アミノ酸を保持していてよく、且つ／又はプラスミノーゲン結合活性が排除されていてもよい（下記を参照されたい）。
【０１２３】
戦略３
ＴＲＡＩＬ受容体に対する結合活性を有する数々のペプチドが同定されている。受容体と複合したＴＲＡＩＬリガンドの結晶構造により、結合の相互作用に関与するアミノ酸配列が同定されている（Ｓ．Ｇ．Ｈｙｍｏｗｉｔｚら、１９９９年；Ｓｕｎ−Ｓｈｉｎ  Ｃｈａら、２０００年）。さらに、ＤＲ５受容体に結合するペプチド及び抗体の配列分析により、共有トリペプチドモチーフが同定されている（Ｂ．Ｌｉら、２００６年）。これらのペプチドを、遊離の直鎖状ペプチドとして、又はシステインを用いたジスルフィド制限ループとして、Ｎ末端又はＣ末端終端いずれかの３量体化ドメイン上に直接クローニングすることができる。ＴＲＡＩＬ受容体に結合することができる単鎖抗体又はドメイン抗体を、３量体化ドメインのいずれかの終端上にクローニングしてもよい。さらに、結合の性質が知られているペプチドを、ＴＮ  ＣＴＬＤのあらゆる１つのループ領域中に直接クローニングしてもよい。ジスルフィド制限ループとして、又は抗体の相補性決定領域として選択されたペプチドは、ヒトテトラネクチンのＣＴＬＤのループ領域中に再配置するのが極めて容易であることがある。これらの構築物全てに対して、３量体化ドメインと融合する場合の、単量体としての結合、並びに３量体としての結合及びアゴニスト活性化を、次いで、試験することができる。
【０１２４】
戦略４
いくつかの場合において、結合活性を有するペプチドの直接的なクローニングが十分ではないことがあり、さらなる最適化及び選択が必要とされることがある。例として、それだけには限定されないが上記で言及したものなど、ＴＲＡＩＬ受容体に対する結合が知られているペプチドを、ヒトテトラネクチンのＣＴＬＤ中にグラフトすることができる。結合用のこれらのペプチドの最適な提示に対して選択するために、１つ又は複数の隣接するアミノ酸をランダム化し、その後結合に対してファージディスプレイを選択してもよい。さらに、単独で制限された結合、又は弱い結合を示すペプチドを、別のさらなるループのランダム化を含むＣＴＬＤライブラリーのループの１つの中にグラフトし、再びその後、結合及び／又は特異性の増大に対してファージディスプレイによって選択してもよい。さらに、特異的な相互作用／結合性のアミノ酸が知られている場合に結晶構造によって同定されるペプチドでは、非結合性のアミノ酸のランダム化を探索し、その後結合及び受容体の特異性の増大に対してファージディスプレイによって選択してもよい。結合を担うと同定されたＴＲＡＩＬリガンドの領域を、種をまたいで試験してもよい。保存されているアミノ酸は保持されていてよく、種に関係なく保存されている位置に対するランダム化及び選択を試験することができる。
【０１２５】
治療方法
本発明の別の一態様は、ＤＲ４及びＤＲ５の少なくとも１つを発現する腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘発する方法に関する。方法は、細胞を、３量体化ドメイン、及び少なくとも１つのＴＲＡＩＬ死受容体に特異的に結合するポリペプチドを少なくとも１つ含む本発明の死受容体アゴニストと接触させることを含む。この態様の一実施形態において、方法は、細胞を本発明の３量体複合体と接触させることを含む。本発明の様々な態様において、タンパク質及び複合体は、カスパーゼ依存性の、及びカスパーゼ非依存性のアポトーシスを誘発する。
【０１２６】
別の一態様において、本発明は、３量体化ドメイン、及び少なくとも１つのＴＲＡＩＬ死受容体に特異的に結合するポリペプチドを少なくとも１つ有するポリペプチドを含む死受容体アゴニストの治療有効量を対象に投与することによって、腫瘍を有する対象を治療する方法に関する。この態様の一実施形態において、方法は、本発明の３量体複合体を対象に投与することを含む。
【０１２７】
本発明の別の一態様は、併用治療に対するものである。本発明は、死受容体アゴニスト及び治療薬を含む製剤も提供する。このような製剤は、貯蔵に、及び治療上の投与にとりわけ適すると考えられる。製剤は、知られている技術によって調製されてよい。例えば、製剤を、ゲルろ過カラム上のバッファーを交換することによって調製することができる。
【０１２８】
本明細書に記載する死受容体アゴニスト及び治療薬は、様々な治療上の適用において用いることができる。これらの適用の中には、様々な癌を治療する方法がある。死受容体アゴニスト及び治療薬を、例えば、ボーラスとしての、又はある期間にわたる持続的注入による静脈内投与によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄液内、皮下、関節内、滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所、又は吸入の経路によって、知られている方法に従って投与することができる。任意選択で、投与を、様々な市販の機器を用いたミニポンプ注入によって行ってもよい。
【０１２９】
死受容体アゴニストを投与するのに有効な投与量及びスケジュールは経験的に決定することができ、このような決定を行うのは当業者の範囲内である。単回投与量又は複数回投与量を用いることができる。単独で用いる死受容体アゴニストの有効投与量又は有効量は、１日当たり約１μｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲、又はそれを超えてよいと現在考えられている。投与量の種間スケーリングを、当技術分野では知られている方法で、例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．、８巻、１３５１頁（１９９１年）に開示されている通りに行うことができる。
【０１３０】
死受容体アゴニストのｉｎ  ｖｉｖｏ投与を用いる場合、標準の投与量の量は、投与経路に応じて、１日当たり哺乳動物の体重当たり約１０ｎｇ／ｋｇから最高１００ｍｇ／ｋｇまで又はそれを超えて、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日まで変化することができる。特定の投与量及び送達の方法に関する指図は、文献において提供される（例えば、米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、又は第５，２２５，２１２号を参照されたい）。当業者であれば、様々な製剤が様々な治療用化合物及び様々な障害に有効であり、例えば、１つの器官又は組織を標的にする投与は、別の器官又は組織に対する投与とは異なる方法の送達を必要とし得ることを理解するであろう。当業者であれば、投与しなければならない死受容体アゴニストの投与量は、例えば、死受容体アゴニストを投与する哺乳動物、投与経路、及び哺乳動物に投与する他の薬物又は治療法に応じて変化することを理解するであろう。
【０１３１】
本方法においてまたさらなる治療法を用いることができることが企図される。１つ又は複数の他の治療法には、それだけには限定されないが、放射線治療、サイトカイン（単数又は複数）、増殖阻害薬（単数又は複数）、化学療法薬（単数又は複数）、細胞毒性薬（単数又は複数）、チロシンキナーゼ阻害薬、ｒａｓファルネシルトランスフェラーゼ阻害薬、血管新生阻害薬、及びサイクリン依存性キナーゼ阻害薬、又は当技術分野では知られている死受容体アゴニストによって死滅に対する癌細胞の感受性を増強するあらゆる他の薬剤の投与が含まれ得る。
【０１３２】
化学療法薬に対する調製及び投与のスケジュールを、製造元の指示に従って、又は当業者が経験的に決定した通りに用いることができる。このような化学療法に対する調製及び投与のスケジュールは、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ編集、Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＷｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．（１９９２年）にも記載されている。化学療法薬は、Ａｐｏ２Ｌ変異体の投与前若しくは投与後であってよく、又はそれと同時に投与してもよい。
【０１３３】
死受容体アゴニスト及び治療薬（及び１つ又は複数の他の治療法）は、同時に（一緒に）又は逐次に投与されてよい。特定の実施形態において、本発明の非天然のポリペプチド、又はその多量体（例えば、３量体）複合体、及び治療薬は同時に投与される。別の一実施形態において、ポリペプチド又は３量体複合体は、治療薬を投与する前に投与される。別の一実施形態において、治療薬は、ポリペプチド又は３量体複合体の前に投与される。投与後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで治療した細胞を分析することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏの治療が存在する場合、治療した哺乳動物を、当業者にはよく知られている様々な方法においてモニタリングすることができる。例えば、腫瘍組織を、病理学的に試験して細胞死に対してアッセイすることができ、又は血清を免疫系の反応に対して分析することができる。
【０１３４】
薬剤組成物
さらに別の一態様において、本発明は、治療有効量の本発明のポリペプチドを、薬学的に許容される担体又は賦形剤と一緒に含む薬剤組成物に関する。本明細書で用いられる「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される賦形剤」は、生理学的に適合性である、あらゆる全ての溶剤、分散媒体、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される担体又は賦形剤の例には、１つ又は複数の水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びこれらの組合せが含まれる。多くの場合において、等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましい。湿潤量又は少量の補助物質、例えば、抗体又は抗体部分の有効期間又は有効性を増強する、湿潤剤又は乳化剤、保存剤又はバッファーなどの薬学的に許容される物質も含まれていてよい。任意選択で、例えば、架橋したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はその塩、例えば、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤も含まれていてよい。賦形剤の他に、薬剤組成物は、１つ又は複数の以下のものを含むことができる：担体タンパク質、例えば血清アルブミン、バッファー、結合剤、甘味剤及び他の香味剤、着色剤及びポリエチレングリコール。
【０１３５】
組成物は、例えば、液体、半固形、及び固体の剤形、例えば、液剤（例えば、注射用液剤及び注入用液剤）、分散剤又は懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソーム、及び坐剤を含む様々な形態であってよい。好ましい形態は、意図する投与経路及び治療上の適用による。一実施形態において、組成物は、抗体でヒトを受動免疫するのに用いるのと同様の組成物など、注射用又は注入用液剤の形態である。一実施形態において、投与の様式は非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。一実施形態において、ポリペプチド（又は３量体複合体）を、静脈内注入又は注射によって投与する。別の一実施形態において、ポリペプチド又は３量体複合体を、筋肉内注射又は皮下注射によって投与する。
【０１３６】
薬剤組成物に適する他の投与経路には、それだけには限定されないが、直腸内、経皮、膣内、経粘膜、又は腸管投与が含まれる。
【０１３７】
治療用組成物は、典型的には無菌であり、製造及び貯蔵の条件下で安定である。組成物を、液剤、マイクロエマルジョン、分散剤、リポソーム、又は高濃度の薬物に適する他の秩序だった構造として調合することができる。滅菌の注射用液剤は、有効化合物（即ち、ポリペプチド、又は３量体複合体）を必要量の好適な溶媒中に、所望により先に列挙した成分の１つ又は組合せと組み入れ、その後ろ過滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散剤は、有効化合物を、分散基剤及び先に列挙したものからの必要とされる他の成分を含む無菌のビヒクル中に組み入れることによって調製される。無菌の注射用液剤を調製するための無菌の散剤の場合、好ましい調製方法は、有効成分プラス予め滅菌ろ過したその溶液からのあらゆるさらなる望ましい成分の粉末をもたらす、真空乾燥及び凍結乾燥である。例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合は必要とされる粒子サイズを維持することによって、及び界面活性剤の使用によって、溶液の適当な流動性を維持することができる。注射用組成物の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを含むことによってもたらすことができる。
【０１３８】
本明細書に記載する障害の治療に有用な死受容体アゴニスト及び治療薬を含むキットなどの製造品は、少なくとも容器及びラベルを含む。適切な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されていてよい。容器上の、又は容器に付随するラベルは、選択された状態を治療するために製剤が用いられることを示すものである。製造品は、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液などの薬学的に許容されるバッファーを含む容器をさらに含むことができる。これはさらに、他のバッファー、希釈剤、ろ紙、針、シリンジ、及び使用のための指示を有する包装挿入物を含めた、販売の及びユーザーの視点から望ましい他の材料を含むことができる。製造品は、先に記載した別の有効薬剤を有する容器も含むことができる。
【０１３９】
典型的には、好適な量の薬学的に許容される塩を製剤中に用いて、製剤を等張にする。薬学的に許容される担体の例には、食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液が含まれる。製剤のｐＨは、好ましくは約６から約９まで、より好ましくは約７から約７．５までである。当業者であれば、死受容体アゴニスト及び治療薬の投与経路及び濃度などに応じて、ある種の担体がより好ましいことがあることは明らかである。
【０１４０】
治療用組成物は、好適な純度を有する所望の分子を、任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤と混合することによって、凍結乾燥製剤、水性液剤、又は水性懸濁液剤の形態で調製することができる（「レミントンの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編集（１９８０年））。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、使用する投与量及び濃度でレシピエントに非毒性であることが好ましく、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコール又はベンジルアルコール；メチルパラベン又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾール）；低分子量（残基約１０個未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン；単糖、二糖、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む）；糖、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース、又はソルビトール；塩形成性の対イオン、例えば、ナトリウム；並びに／或いは非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。
【０１４１】
このような担体のさらなる例には、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、バッファー物質、例えば、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、及びセルロースベースの物質が含まれる。局所用又はゲルベースの形態用の担体には、多糖、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム又はメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロック重合体、ポリエチレングリコール、及びウッドワックスアルコール（ｗｏｏｄ  ｗａｘ  ａｌｃｏｈｏｌ）が含まれる。全ての投与に対して、従来のデポー形態が適切に用いられる。このような形態には、例えば、マイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、プラスター、吸入形態、鼻スプレー、舌下錠、及び徐放性調製物が含まれる。
【０１４２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与で用いるための製剤は無菌でなければならない。これは凍結乾燥及び再構成の前に、又は後に、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に行われる。製剤を、全身投与する場合には凍結乾燥形態又は液剤において貯蔵することができる。凍結乾燥形態における場合は、典型的には、使用時に好適な希釈剤で再構成するための他の成分と組み合わせて調合される。液体製剤の一例は、皮下注射用の単回投与量バイアル中に充填された、無菌の、澄明な、無色の新鮮な溶液である。
【０１４３】
治療用製剤は、一般的に、無菌のアクセスポート（ａｃｃｅｓｓ  ｐｏｒｔ）を有する容器、例えば、静脈内液剤用バッグ又は皮下注射針によって孔をあけることができるストッパーを有するバイアルの中に配置される。製剤を、繰り返し、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）の、注射若しくは注入として、又は経鼻若しくは肺内送達に適するエアロゾル製剤として投与するのが好ましい（肺内送達については、例えば、ＥＰ２５７，９５６を参照されたい）。
【０１４４】
本明細書に開示する分子は、徐放調製物の形態で投与することもできる。徐放調製物の適切な例には、タンパク質を含む固体の疎水性ポリマーの半透性のマトリクスが含まれ、このマトリクスは造形品（例えば、フィルム又はマイクロカプセル）の形態における。徐放マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、１５巻、１６７〜２７７頁（１９８１年）、及びＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．、１２巻、９８〜１０５頁（１９８２年）によって記載されているポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２２巻、５４７〜５５６頁（１９８３年））、非分解性のエチレン−酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、上述）、分解性の乳酸−グリコール酸共重合体、例えば、Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（乳酸−グリコール酸共重合体と酢酸ロイプロリドからなる注射用微粒子）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が含まれる。
【０１４５】
ポリペプチドの生成
本発明のポリペプチドは、ポリペプチドが発現される条件下で、ポリペプチドをコードするベクターで形質転換した宿主を培養することによって、あらゆる適切な標準タンパク質発現系中に発現されてよい。好ましくは、発現系は、そこから所望のタンパク質を単離するのが容易であり得る系である。一般的に、原核生物の発現系は、高い収量のタンパク質を得ることができ、効率的な精製及びリフォールディングの戦略がもたらされるので、利用可能である。したがって、好適な発現系（ベクター及び細胞型を含む）の選択は当業者の知識の範囲内である。同様に、本発明のポリペプチドに対するアミノ酸の一次配列が選択されれば、当業者であれば、選択された宿主におけるコドンバイアス、宿主における分泌シグナル配列の必要性、シグナル配列内のプロテイナーゼ切断部位の導入などの要因を考慮に入れて、所望のアミノ酸配列をコードする好適な組換えＤＮＡ構築物を容易にデザインすることができる。
【０１４６】
一実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、ＴＲＡＩＬ死受容体に特異的に結合するポリペプチド、及び３量体化ドメインをコードする。一実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、ＴＲＡＩＬ死受容体に特異的に結合する第１のポリペプチド、ＴＲＡＩＬ死受容体に特異的に結合する第２のポリペプチド、及び３量体化ドメインをコードする。ある実施形態において、ＴＲＡＩＬ死受容体（又は第１のポリペプチド及び第２のポリペプチド）並びに３量体化ドメインに特異的に結合するポリペプチドは、単一の近接するポリヌクレオチド配列にコードされている（遺伝子融合）。他の実施形態において、ＴＲＡＩＬ死受容体に特異的に結合するポリペプチド（又は第１のポリペプチド及び第２のポリペプチド）並びに３量体化ドメインは、近接しないポリヌクレオチド配列によってコードされている。したがって、いくつかの実施形態において、ＴＲＡＩＬ死受容体に特異的に結合する少なくとも１つのポリペプチド（又はＴＲＡＩＬ死受容体に特異的に結合する第１のポリペプチド及び第２のポリペプチド）並びに３量体化ドメインは、別々のポリペプチドとして発現され、単離され、及び精製され、一緒に融合されて本発明のポリペプチドを形成する。
【０１４７】
これらの組換えＤＮＡ構築物は、選択された宿主に好適な数々の発現ベクターのいずれかの中に、インフレームで挿入されてよい。ある実施形態において、発現ベクターは、組換えポリペプチド構築物の発現を制御する強力なプロモーターを含む。組換えの発現戦略を用いて本発明のポリペプチドを産生する場合、得られるポリペプチドを当技術分野ではよく知られている適切な標準的な手段を用いて単離及び精製することができ、任意選択で、例えば凍結乾燥などのさらなる処理を受けさせることができる。
【０１４８】
標準的な技術を、組換えＤＮＡ分子、タンパク質、及びポリペプチドの生成に、並びに組織培養及び細胞の形質転換に用いることができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（下記）、又は「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．及びＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９４年）を参照されたい。精製技術は、典型的には、製造元の仕様書に従って、又はＳａｍｂｒｏｏｋら（「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）に記載されているものなどの従来の手順を用いて当技術分野で通常行われている通りに、或いは本明細書に記載した通りに行われている。特定の説明がなければ、本明細書に記載される分子生物学、生化学、分析化学、及び薬剤／製剤化学に関する検査法及び技術に関連して利用される命名法は、当技術分野ではよく知られているものであり、通常用いられているものである。標準的技術を、生化学的合成、生化学的分析、薬剤調製、製剤、及び送達、並びに患者の治療に用いることができる。
【０１４９】
柔軟な分子リンカーは、任意選択で、特定の結合メンバーと３量体化ドメインの間に挿入してもよく、共有結合的に連結してもよいことが理解されよう。ある実施形態において、リンカーは、アミノ酸残基約１〜２０個のポリペプチド配列である。リンカーはアミノ酸１０個未満、最も好ましくは５個、４個、３個、２個、又は１個であってよい。ある場合において、アミノ酸９個、８個、７個、又は６個が適切であることがある。有用な実施形態において、リンカーは本質的に非免疫原性であり、タンパク質分解性の切断を起こしやすくなく、他の残基と相互作用することが知られているアミノ酸残基（例えば、システイン残基）を含まない。
【０１５０】
以下の記載は、１つ又は複数の化学基に共有結合的に付着している（以下「コンジュゲートしている」）ポリペプチド及び３量体複合体を生成する方法にも関する。このようなコンジュゲートにおいて用いるのに適する化学基は、著しく毒性又は免疫原性ではないのが好ましい。化学基は、貯蔵に適する条件下で貯蔵し、用いることができるコンジュゲートを生成するように、任意選択で選択される。ポリペプチドにコンジュゲートすることができる様々な例示の化学基が当技術分野では知られており、例えば、糖タンパク質、ポリグルタメート、及び非タンパク質性のポリマー上に天然に存在する炭水化物（例えば、ポリオール）などの炭水化物が含まれる（例えば、米国特許第６，２４５，９０１号を参照されたい）。
【０１５１】
例えば、ポリオールは、上記ＷＯ９３／００１０９に記載されているように、リシン残基を含む１つ又は複数のアミノ酸残基で、本発明のポリペプチドにコンジュゲートしていてよい。用いられるポリオールは、あらゆる水溶性ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーであってよく、直鎖又は分枝鎖を有することができる。適切なポリオールには、炭素を１個と４個の間有するアルキル基などの化学基で、１つ又は複数のヒドロキシル位が置換されているものが含まれる。典型的には、ポリオールは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリ（アルキレングリコール）であり、したがって、記載を易しくすると、考察の残りの部分は、用いられるポリオールがＰＥＧであり、ポリオールをポリペプチドにコンジュゲートする過程が「ペグ化」と呼ばれる例示の実施形態に関する。しかし、当業者であれば、例えば、ポリ（プロピレングリコール）及びポリエチレン−ポリプロピレングリコール共重合体などの他のポリオールを、ＰＥＧに対して本明細書に記載するコンジュゲートのための技術を用いて使用することができることを認める。
【０１５２】
Ａｐｏ−２Ｌのペグ化に用いられるＰＥＧの平均分子量は変化してよく、典型的に、約５００ダルトン（Ｄ）から約３００００ダルトンまでの範囲であってよい。好ましくは、ＰＥＧの平均分子量は約１０００Ｄから約２５０００Ｄまでであり、より好ましくは約１０００Ｄから約５０００Ｄまでである。一実施形態において、ペグ化は、平均分子量が約１０００ＤであるＰＥＧで行われる。任意選択で、ＰＥＧホモポリマーは非置換であるが、一終端がアルキル基で置換されていてもよい。好ましくはアルキル基がＣ１〜Ｃ４アルキル基であり、最も好ましくはメチル基である。ＰＥＧ調製物は市販されており、典型的には、本発明で用いるのに適するＰＥＧ調製物は、平均分子量に従って販売されている、非均質の調製物である。例えば、市販のＰＥＧ（５０００）調製物は、通常±５００Ｄである、分子量がわずかに変化する分子を典型的に含む。本発明のポリペプチドは、小分子化合物（例えば、化学療法薬）に対するコンジュゲート、シグナル分子（例えば、フルオロフォア）に対するコンジュゲート、特異的な結合対の分子（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン、抗体／抗原）に対するコンジュゲート、又はグリコシル化、ＰＥＧ化、若しくは安定化ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）に対するさらなる融合物による安定化など、当技術分野では知られている技術を用いてさらに修飾することができる。
【０１５３】
タンパク質をペグ化するための様々な方法が当技術分野では知られている。ＰＥＧにコンジュゲートしたタンパク質を生成する特定の方法には、米国特許第４，１７９，３３７号、第４，９３５，４６５号、及び第５，８４９，５３５号に記載されている方法が含まれている。典型的に、タンパク質は、主に反応条件、ポリマーの分子量などに応じて、タンパク質の１つ又は複数のアミノ酸残基によって、ポリマーの末端の反応基に共有結合している。反応基（単数又は複数）を有するポリマーは、本明細書では活性化ポリマーと呼ばれる。反応基は、タンパク質上の遊離アミノ基又は他の反応基と選択的に反応する。ＰＥＧポリマーは、ランダム又は部位特異的は方法のいずれかにおいて、タンパク質上のアミノ基又は他の反応基に連結していてよい。しかし、最適の結果を得るために、選択される反応基のタイプ及び量、並びに使用するポリマーのタイプは、タンパク質上の非常に多くの特定な活性化基と反応する反応基を有することを避けるために、使用される特定のタンパク質又はタンパク質変異体に依存する。これを完全に回避するのは可能ではないことがあるので、タンパク質濃度に応じて、タンパク質１モル当たり、一般的に約０．１モルから１０００モル、好ましくは２モルから２００モルの活性化ポリマーを用いることが推薦される。タンパク質１モル当たりの活性化ポリマーの最終量は、最適の活性を維持するバランスであるが、同時に、可能であれば、タンパク質の循環半減期を最適化する。
【０１５４】
「ポリオール」の語は、本明細書で用いる場合、多価アルコール化合物を広く意味する。ポリオールは、例えば、あらゆる水溶性のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーであってよく、直鎖又は分枝鎖を有していてよい。好ましいポリオールには、炭素を１個と４個の間有するアルキル基などの化学基で、１つ又は複数のヒドロキシル位が置換されているものが含まれる。典型的には、ポリオールは、ポリ（アルキレングリコール）、好ましくはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。しかし、当業者であれば、例えば、ポリ（プロピレングリコール）及びポリエチレン−ポリプロピレングリコール共重合体などの他のポリオールを、ＰＥＧに対して本明細書に記載するコンジュゲートのための技術を用いて使用することができることを認める。本発明のポリオールは、当技術分野ではよく知られているもの、及び市販の供給源などから公的に入手可能であるものが含まれる。
【０１５５】
さらに、血清アルブミン結合性ペプチド、ＩｇＧ結合性ペプチド、又はＦｃＲｎに結合するペプチドを含めた、半減期を延長する他の分子が３量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端に付着していてよい。
【０１５６】
セクションの表題は、本明細書において組織化の目的のみで用いられるものであり、記載する主題を限定するものであると決して解釈してはならないことに留意されたい。本明細書に引用した参照は全て、全ての目的でその全文が参照によって援用される。
【０１５７】
以下の実施例は、本発明のある実施形態を例示するものにすぎず、本発明を限定するものと解釈してはならず、本発明は添付の特許請求の範囲によって規定される。
【実施例】
【０１５８】
以下の実施例において論じるベクター（ｐＡＮＡ）は、先に記載したベクターに由来する（ＵＳ２００７／０２７５３９３を参照されたい）。ある種のベクター配列を配列リストに提供し、当業者であれば、本明細書に提供する記載にもたらすベクターを引き出すことができるであろう。ｐＰｈＣＰＡＢファージディスプレイベクター（配列番号２７３）は、ＡＬＱＴ（など）をコードするｈＴＮ配列に対するリンカーと融合しているｇＩＩＩシグナルペプチドコード領域を有する。ＣＴＬＤ領域のＣ末端終端は、リンカーによってｇＩＩＩ領域に融合している。ＣＴＬＤ領域内で、コード配列は変更しないが、変更されたループ領域を含むＰＣＲフラグメントをクローニングするのに適する制限部位を産生するヌクレオチド変異が産生された。全てのライブラリーファージが組換え型を発現することだけができ、野生型テトラネクチンを発現することができないように、これら制限部位間のループ領域の一部分が除去された。
【０１５９】
（例１）
ライブラリー構築：ループ１の変異及び伸長
ヒトテトラネクチンの配列、並びにループ１、２、３、４（ＬＳＡ）、及び５（ＬＳＢ）の部分を図１及び４に示す。ヒトテトラネクチンＣ型レクチン結合性ドメインの１〜２が伸長されたライブラリー（「ヒト１〜２Ｘ」）に対して、表１に示す配列をコードするようにループ１のコード配列を修飾し、５個のアミノ酸ＡＡＥＧＴ（配列番号）ヒト）を、ヌクレオチドＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（配列番号）（ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴを示し、ＫはＧ又はＴを示す）によってコードされる７個のランダムなアミノ酸で置換した。ループ２の直後のアミノ酸であるアルギニンを、コード鎖におけるヌクレオチドＮＮＫを用いることによってやはり完全にランダム化した。このアミノ酸は、アルギニンがループ１におけるアミノ酸に接触しているのでランダム化され、ループ１のランダム化によって達成できる配置を制約し得た。さらに、ループ４に対するコード配列は、プラスミノーゲン結合を抑止するために、リシン（Ｋ）の代わりにアラニン（Ａ）をコードするように変更されたが、これはループ４のリシンに依存することが示された（Ｇｒａｖｅｒｓｅｎら、１９９８年）。
【表３】
2012504969.tif 000005
【０１６０】
ヒトループ１伸長ライブラリーを、以下の方法でオーバーラップＰＣＲを用いて産生した（プライマー配列を表２に示す）。プライマー１Ｘｆｏｒ（配列番号）及び１Ｘｒｅｖ（配列番号）を混合し、ＰＣＲによって伸長し、プライマーＢｓｔＸ１ｆｏｒ（配列番号３）及びＰｓｔＢｓｓＲｅｖＣ（配列番号）を混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られたフラグメントをゲルから精製し、混合し、アウタープライマーＢｇｌｆｏｒ１２（配列番号５）及びＰｓｔＲｅｖ（配列番号）の存在下ＰＣＲによって伸長した。得られたフラグメントをゲル精製し、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩで切断し、ファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７中にクローニングした。ファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢはｐＣＡＮＴＡＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）由来であり、Ｍ１３遺伝子ＩＩＩタンパク質に融合しているヒトテトラネクチンＣＴＬＤの一部分を含んでいた。ＣＴＬＤ領域を、ループ１〜４に隣接するＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩ制限酵素部位を含むように修飾し、インフレームの挿入物のライゲーションなしに機能的な遺伝子ＩＩＩタンパク質がベクターから生成され得ないように、ストップコドンを含むように１〜４領域を変更した。ｐＡＮＡ２７は、ＢａｍＨＩからＣｌａＩ領域を配列番号２７４（ｐＡＮＡ２７）のＢａｍＨＩからＣｌａＩ配列で置換することによって、ｐＰｈＣＰＡＢに由来するものであった。これは、アンバー抑制可能ストップコドンをグルタミンコドンで置き換えるものであり、ベクターは遺伝子ＩＩＩの切断も含む。
【０１６１】
ライゲートした材料を、エレクトロポレーション用コンピテントＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に形質転換し、細胞４リットルから８リットルを一夜増殖させ、ＤＮＡを単離してパニング用のマスターのライブラリーＤＮＡストックを産生した。１．５×１０８のライブラリーサイズが得られ、試験したクローンは標的の領域において多様な配列を示した。
【表４−１】
2012504969.tif 000006
【表４−２】
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【表４−３】
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【０１６２】
（例２）
ライブラリーの構築：ループ１及び２の変異
ヒト及びマウステトラネクチンＣ型レクチン結合性ドメインのループ１−２ライブラリー（「ヒト１−２」）に対して、表１に示す配列をコードするようにループ１に対するコード配列を修飾し、５個のアミノ酸ＡＡＥＧＴ（配列番号；ヒト）を、ヌクレオチドＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（（配列番号）；ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴを意味し、ＫはＧ又はＴを意味する）によってコードされる５個のランダムアミノ酸で置換した。ループ２（隣接するアルギニンを含む）において、ヒトにおける４個のアミノ酸ＴＧＡＲを、ヌクレオチドＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（配列番号）によってコードされる４個のランダムアミノ酸で置換した。さらに、ループ４のリシンに依存することが示されているプラスミノーゲン結合を抑止するために、ループ４に対するコード配列を、ループにおけるリシン（Ｋ）の代わりにアラニン（Ａ）をコードするように変更した（Ｇｒａｖｅｒｓｅｎら、１９９８年）。
【０１６３】
ヒト１−２ライブラリーを、以下の方法でオーバーラップＰＣＲを用いて産生した（プライマー配列を表２に示す）。プライマー１−２ｆｏｒ（配列番号）と１−２ｒｅｖ（配列番号）を混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られたフラグメントをゲルから精製し、混合し、アウタープライマーＢｇｌｆｏｒ１２（配列番号）及びＰｓｔＲｅｖ１２（配列番号）の存在下ＰＣＲによって伸長した。得られたフラグメントをゲル精製し、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩで切断し、先に記載したように、同様に消化したファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７中にクローニングした。４．８６×１０８のライブラリーサイズが得られ、試験したクローンは標的の領域において多様な配列を示した。
【０１６４】
（例３）
ライブラリー構築：ループ１及び４の変異及び伸長
ヒトＣ型レクチン結合性ドメインのループ１−４ライブラリー（「ヒト１−４」）に対して、表１に示す配列をコードするようにループ１のコード配列を修飾し、７個のアミノ酸ＤＭＡＡＥＧＴ（配列番号）を、ヌクレオチドＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ（（配列番号）；ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴを意味し、ＳはＧ又はＣを意味し、ＫはＧ又はＴを意味する）によってコードされる７個のランダムアミノ酸で置換した。さらに、ループ４に対するコード配列を、表１に示す配列をコードするように修飾し、伸長し、ループ４の２個のアミノ酸であるＫＴを、ヒトではヌクレオチドＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ（配列番号）、又はマウスではＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（配列番号）によってコードされる５個のランダムアミノ酸で置換した。
【０１６５】
ヒト１〜４ライブラリーを、以下の方法でオーバーラップＰＣＲを用いて産生した（プライマー配列を表２に示す）。プライマーＢｇｌＢｓｓｆｏｒ（配列番号）とＢｓｓＢｇｌｒｅｖ（配列番号）を混合し、ＰＣＲによって伸長し、プライマーＢｓｓＰｓｔｆｏｒ（配列番号）とＰｓｔＢｓｓＲｅｖ（配列番号）を混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られたフラグメントをゲルから精製し、混合し、アウタープライマーＢｇｌｆｏｒ（配列番号）及びＰｓｔＲｅｖ（配列番号）の存在下ＰＣＲによって伸長した。得られたフラグメントをゲル精製し、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩ制限酵素で切断し、先に記載したように、同様に消化したファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７中にクローニングした。２×１０９のライブラリーサイズが得られ、パニングの前に試験した１２個のクローンは標的の領域において多様な配列を示した。
【０１６６】
（例４）
ライブラリー構築：ループ３及び４の変異及び伸長
ヒトテトラネクチンＣ型レクチン結合性ドメインのループ３−４伸長ライブラリー（「ヒト３−４Ｘ」）に対して、表１に示す配列をコードするようにループ３のコード配列を修飾し、３個のアミノ酸ＥＩＴテトラネクチンを、コード鎖におけるヌクレオチドＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（配列番号）によってコードされる（ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴを意味し、ＫはＧ又はＴを意味する）６個のランダムアミノ酸で置換した。さらに、ループ４において、３個のアミノ酸ＫＴＥを、ヌクレオチドＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（配列番号）によってコードされる６個のランダムアミノ酸で置換した。
【０１６７】
ヒト３〜４伸長ライブラリーを、以下の方法でオーバーラップＰＣＲを用いて産生した（プライマー配列を表２に示す）。プライマーＨ  Ｌｏｏｐ１−２−Ｆ（配列番号）とＨ  Ｌｏｏｐ３−４Ｅｘｔ−Ｒ（配列番号）を混合し、ＰＣＲによって伸長し、プライマーＨ  Ｌｏｏｐ３−４Ｅｘｔ−Ｆ（配列番号２９）とＨ  Ｌｏｏｐ５−Ｒ（配列番号）を混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られたフラグメントをゲルから精製し、混合し、さらなるＨ  Ｌｏｏｐ１−２−Ｆ（配列番号）及びＨ  Ｌｏｏｐ５−Ｒ（配列番号）の存在下ＰＣＲによって伸長した。得られたフラグメントをゲル精製し、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩ制限酵素で切断し、先に記載したように、同様に消化したファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７中にクローニングした。７．９×１０８のライブラリーサイズが得られ、試験したクローンは標的の領域において多様な配列を示した。
【０１６８】
（例５）
ライブラリー構築物：ループ３及び４及びループ間ＰＲＯの変異
ヒトテトラネクチンＣ型レクチン結合性ドメインのループ３〜４ｃｏｍｂｏライブラリー（「ヒト３〜４ｃｏｍｂｏ」）に対して、表１に示す配列をコードするようにループ３及び４のコード配列、並びにこれら２つのループ間のプロリンを変更し、ヒト配列ＴＥＩＴＡＱＰＤＧＧＫＴＥ（配列番号）を、アミノ酸１３個の配列ＸＸＸＸＸＸＸＸＧＧＸＸＸ（配列番号）で置換した（Ｘは配列ＮＮＫによってコードされるランダムアミノ酸を表す（ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴを意味し、ＫはＧ又はＴを意味する））。
【０１６９】
ヒト３−４ｃｏｍｂｏライブラリーを、以下の方法でオーバーラップＰＣＲを用いて産生した（プライマー配列を表２に示す）。プライマーＨ  Ｌｏｏｐ１−２−Ｆ（配列番号）とＨ  Ｌｏｏｐ３−４Ｃｏｍｂｏ−Ｒ（配列番号）を混合し、ＰＣＲによって伸長し、得られたフラグメントをゲルから精製し、混合し、さらなるＨ  Ｌｏｏｐ１−２−Ｆ（配列番号）及びＨ  Ｌｏｏｐ５−Ｒ（配列番号）の存在下ＰＣＲによって伸長した。得られたフラグメントをゲル精製し、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩ制限酵素で切断し、先に記載したように、同様に消化したファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７中にクローニングした。４．９５×１０９のライブラリーサイズが得られ、試験したクローンは標的の領域において多様な配列を示した。
【０１７０】
（例６）
ライブラリー構築：ループ４の変異及び伸長
ヒト及びマウスのテトラネクチンＣ型レクチン結合性ドメインのループ４伸長ライブラリー（「ヒト４」）に対して、表１に示す配列をコードするようにループ４のコード配列を修飾し、３個のアミノ酸ＫＴＥテトラネクチンを、ヌクレオチドＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（（配列番号）；ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴを意味し、ＫはＧ又はＴを意味する）によってコードされる７個のランダムアミノ酸で置換した。
【０１７１】
ヒト４伸長ライブラリーを、以下の方法でオーバーラップＰＣＲを用いて産生した（プライマー配列を表２に示す）。プライマーＨ  Ｌｏｏｐ１−２−Ｆ（配列番号）及びＨ  Ｌｏｏｐ３−Ｒ（配列番号）を混合し、ＰＣＲによって伸長し、プライマーＨ  Ｌｏｏｐ４Ｅｘｔ−Ｆ（配列番号）及びＨ  Ｌｏｏｐ５−Ｒ（配列番号）を混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られたフラグメントをゲルから精製し、混合し、さらなるＨ  Ｌｏｏｐ１−２Ｆ（配列番号）及びＨ  Ｌｏｏｐ５−Ｒ（配列番号）の存在下ＰＣＲによって伸長した。得られたフラグメントをゲル精製し、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩ制限酵素で切断し、先に記載したように、同様に消化したファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７中にクローニングした。２．７×１０９のライブラリーサイズが得られ、試験したクローンは標的の領域において多様な配列を示した。
【０１７２】
（例７）
ライブラリー構築：ループ３の伸長あり及びなしの変異
ヒトＣ型レクチン結合性ドメインのループ３変更ライブラリーに対して、表１に示す配列をコードするようにループ３のコード配列を修飾し、マウステトラネクチンの６個のアミノ酸ＥＴＥＩＴＡ（配列番号）を、ヌクレオチドＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（配列番号）、ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（配列番号１５５）、及びＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（配列番号）によってコードされる６個、７個、又は８個のランダムアミノ酸で置換した（ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴを意味し、ＫはＧ又はＴを意味する）。さらに、ループ４において、ヒトにおける３個のアミノ酸ＫＴＥを、ヌクレオチドＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（配列番号）によってコードされる６個のランダムアミノ酸で置換した。さらに、ループ４のリシンに依存することが示されている、プラスミノーゲン結合を抑止するために、ループ４に対するコード配列を、ループにおけるリシン（Ｋ）の代わりにアラニン（Ａ）をコードするように変更した（Ｇｒａｖｅｒｓｅｎら、１９９８年）。
【０１７３】
ヒトループ３変更ライブラリーを、以下の方法でオーバーラップＰＣＲを用いて産生した。プライマーＨ  Ｌｏｏｐ３Ｆ６、Ｈ  Ｌｏｏｐ３Ｆ７、及びＨ  Ｌｏｏｐ３Ｆ８（配列番号、それぞれ）をＨ  Ｌｏｏｐ４Ｒ（配列番号）と個々に混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られたフラグメントをゲルから精製し、混合し、オリゴＨ  Ｌｏｏｐ１−２Ｆ（配列番号）、ＨｕＢｇｌｆｏｒ（ＧＣＣ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＣＴＧ  Ａ（配列番号ＸＸＸ））、及びＰｓｔＲｅｖ（配列番号）の存在下ＰＣＲによって伸長した。得られたフラグメントをゲル精製し、ＢｇｌＩ及びＰｓｔＩ制限酵素で消化し、先に記載したように、同様に消化したファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７中にクローニングした。ライブラリー産生の後、３つのライブラリーをパニング用にプールした。
【０１７４】
（例８）
ループ３及び５の変異
ヒトテトラネクチンＣ型レクチン結合性ドメインのループ３及び５変更ライブラリーに対して、表１に示す配列をコードするようにループ３及び５に対するコード配列を修飾し、ヒトテトラネクチンの５個のアミノ酸ＴＥＩＴＡを、ヌクレオチドＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（配列番号ｘｘｘ）によってコードされる５個のアミノ酸で置換し、ヒトの３個のアミノ酸ＡＡＮを、ヌクレオチドＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫによってコードされる３個のアミノ酸で置換した。さらに、ループ４のリシンに依存することが示されている、プラスミノーゲン結合を抑止するために、ループ４に対するコード配列を、ループにおけるリシン（Ｋ）の代わりにアラニン（Ａ）をコードするように変更した（Ｇｒａｖｅｒｓｅｎら、１９９８年）。
【０１７５】
ヒトループ３及び５変更ライブラリーを、以下の方法でオーバーラップＰＣＲを用いて産生した。プライマーｈ３−５ＡＦ（配列番号）、及びｈ３−５ＡＲ（配列番号）を混合し、ＰＣＲによって伸長し、プライマーｈ３−５ＢＦ（配列番号）、及びｈ３−５ＢＲ（配列番号）を混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られたフラグメントをゲルから精製し、混合し、ｈ３−５ＯＦ（配列番号）、及びＰｓｔＲｅｖ（配列番号）の存在下ＰＣＲによって伸長した。得られたフラグメントをゲル精製し、ＢｇｌＩ及びＰｓｔＩ制限酵素で消化し、先に記載したように、同様に消化したファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７中にクローニングした。
【０１７６】
（例９）
ヒトライブラリー１−４のパニング及びスクリーニング
ヒトライブラリー１−４から産生したファージを、組換えＴＲＡＩＬ  Ｒ１（ＤＲ４）／Ｆｃキメラ、及びＴＲＡＩＬ  Ｒ２（ＤＲ５）／Ｆｃキメラ上にパニングした。ＥＬＩＳＡプレートアッセイを用いて３、４、及び／又は５ラウンドのパニングをした後、これらの結合パネルのスクリーニングによって、全ての場合における受容体特異的バインダーを同定した。
【０１７７】
（例１０）
ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４及びＤＲ５に対するアゴニストの選択及びスクリーニングのためのライブラリー及びクローンの構築
様々な長さの直鎖又は環状のランダム化ペプチドを発現するファージライブラリーは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）などの製造元から市販で購入することができる。或いは、ヒトテトラネクチンのＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）（配列番号）のループにおけるランダム化ペプチドを含むファージディスプレイライブラリーを産生することができる。ループ１、２、３、及び４を図４に示す。これらのループ内のアミノ酸を、ＮＮＳ又はＮＮＫがオーバーラップするＰＣＲ変異誘発の戦略を用いてランダム化することができる。あらゆる１つのループにおける１つから７つのコドンを、変異原性ＮＮＳ又はＮＮＫコドンによって置換してスクリーニング用のライブラリーを産生してもよく、或いは、変異誘発されたアミノ酸の数が置換された数を超えてもよい（例えば、より大型のランダム化ループを作成するために、２個のアミノ酸が５個のアミノ酸によって置換されていてもよい）。さらに、１つを超えるループが同時に変更されてよい。オーバーラップＰＣＲの戦略は、ループ２と３の間の最終のＤＮＡ構築物におけるいずれかのＫｐｎ１部位を産生することができ、これはループ間のアミノ酸の１つを変更し、スレオニンをオリジナルのアラニンに交換する。或いは、ＢｓｓＨ  ＩＩ部位を、オリジナルのアミノ酸配列を変更しないループ２と３の間に組み入れてもよい。
【０１７８】
（例１１）
ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４及びＤＲ５に対するアゴニストの選択及びスクリーニング
ファージを発現する細菌のコロニーを、ファージライブラリー又はライブラリーＤＮＡのグリセロールファージストックのいずれかを用いて、それぞれ、大腸菌ＴＧ−１又はＸＬ−１  Ｂｌｕｅなどの細菌の感染又は形質転換によって産生する。Ｏ．Ｄ．６００が１．０である、感染させた／形質転換した細菌５０ミリリットルを室温（ＲＴ）で１５分間増殖させ、その後、最終濃度４０％の選択可能な薬物マーカーを培養液に加え、３７℃で１時間インキュベートする。このインキュベート後、選択用の残りの薬物を加え、３７℃でさらに１時間インキュベートする。ヘルパーファージＶＣＳ  Ｍ１３を加え、２時間インキュベートする。カナマイシン（７０μｇ／ｍＬ）を培養液に加え、次いでこれを振盪しながら３７℃で一夜インキュベートする。ファージを遠心分離し、その後１／３容積の２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００／２．５Ｍ  ＮａＣｌで上清からファージを寒冷沈澱することによって収集する。プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡフリー）を含むバッファー中にファージを再懸濁し、引き続き滅菌ろ過する。大腸菌ＴＧ−１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、又は他の好適な細菌宿主におけるファージライブラリーを力価測定する。
【０１７９】
ファージを、ヒトＤＲ４及び／又はＤＲ５に対するポジティブ選択のラウンドにおいてパニングする。ヒトＤＲ４及びＤＲ５（ヒトＴＲＡＩＬ死受容体１及び２としても知られる）は、可溶型で（Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、又はＦｃとして（Ｇｅｎｗａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、又はＧＳＴ融合物として（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）市販されている。ＰＢＳ中可溶性ＤＲ４又はＤＲ５は、マイクロプレートウエル（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２Ｂ  ｐｌａｔｅｓ）の底部などの固体支持体に、又はＤｙｎａｂｅａｄｓなどの磁性ビーズに直接結合する。約２５０ｎｇから５００ｎｇの可溶性ＤＲ４又はＤＲ５は、４℃又はＲＴいずれかでＰＢＳ中一夜インキュベートすることによって固体の基体に結合する。次いで、プレート（又はビーズ）をＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中３回洗浄し、その後１％ＢＳＡ、ＰＢＳ中０．０５％アジ化ナトリウムなどのブロッキング剤を添加し、少なくとも０．５時間ＲＴでインキュベートして、将来のステップにおける非特異的な表面に対する材料の結合を防ぐ。３％脱脂粉乳又は煮沸カゼインを含むＰＢＳなどのブロッキング剤も用いることができる。
【０１８０】
代替の一プロトコールにおいて、ＤＲ４又はＤＲ５  Ｆｃ融合タンパク質に結合させるために、プレート又はビーズを最初に、ＰＢＳ中０．５〜１μｇの市販の抗Ｆｃ抗体とインキュベートする。プレート（又はビーズ）を先に記載した１％ＢＳＡ、ＰＢＳ中０．０５％アジ化ナトリウムで洗浄し、ブロックし、次いで５μｇ／ｍＬの死受容体融合タンパク質とインキュベートし、ＲＴで２時間インキュベートする。次いで、プレートを、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄する。
【０１８１】
濃度約１０１１又は１０１２ｐｆｕ／ｍＬのファージライブラリーを、死受容体に対する直接又は間接的な結合を含むウエル（又はビーズ）に加える。ファージを、ＲＴで少なくとも２時間インキュベートするが、様々な結合の性質をスクリーニングするために、インキュベート時間及び温度は変化してよい。ウエルを、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で少なくとも８回洗浄し、その後ＰＢＳで洗浄する（８×）。ウエルを、後の選択のラウンドにおいて、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ５．０、Ｔｒｉｓ  ｐＨ４．０、及びＴｒｉｓ  ｐＨ３．０など、酸性度の上がるバッファーで洗浄してもよい。結合しているファージをトリプシン消化によって溶出する（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬトリプシン１００μＬ、３０分間）。結合しているファージを、また、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．２を用いて溶出してもよい。或いは、死受容体に対する結合に関してＴＲＡＩＬと競合するＣＴＬＤ又はペプチドを選択するために、結合しているファージをＴＲＡＩＬ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃから市販されている）を用いて溶出することができる。さらに、結合しているファージを、死受容体の結合に関してＴＲＡＩＬと競合することが知られている化合物で溶出してもよい。
【０１８２】
溶出したファージを、ＯＤ６００が０．８である、新たに増殖させた細菌１０ｍＬで１５分間インキュベートし、感染した細菌を上記の通りに処理して第２ラウンドのパニング用のファージを産生する。さらなる２ラウンド又は３ラウンドのポジティブパニングを行う。
【０１８３】
基体に直接又は間接的に結合するＤＲ４及び／又はＤＲ５を用いる代わりとして、癌細胞系によって内因性に発現される、又は２９３細胞などのトランスフェクトした細胞によって発現されるＤＲ４及び／又はＤＲ５をポジティブ選択のラウンドにおいて用いてもよい。トランスフェクト細胞では、例えばＱｉａｇｅｎ  Ａｔｔｒａｃｔｅｎｅ（商標）プロトコール、及びＤＲ４若しくはＤＲ５を保有するｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＥＰ４、又はｐＣＥＰ５などの好適な発現プラスミドを用いてトランスフェクトを行った２日後、パニングする。細胞を非トリプシン解離バッファー中解離し、及び細胞６×１０６個をＩＭＤＭバッファー２ｍＬ中に再懸濁する。パニングするファージを透析し、その後細胞に加え、ＲＴで２時間インキュベートする。細胞をペレッティングによって洗浄し、ＩＭＤＭ中複数回再懸濁し、グリシンバッファーでファージを溶出する。
【０１８４】
ＤＲ４及び／又はＤＲ５に親和性を有するが囮受容体に親和性のないペプチドを選択するために、ネガティブ選択のラウンド、又はポジティブ選択に付随するネガティブ選択を行う。ネガティブ選択は、囮受容体ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、可溶性ＤｃＲ３、及び／又はオステオプロテゲリン（ＯＰＧ、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行う。ＯＰＧ及び可溶性ＤｃＲ３は市販されており（Ｇｅｎｅ  Ｔｅｘ、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）、ＦｃｏｒＧＳＴにコンジュゲートしているＤｃＲ１及びＤｃＲ２も市販されている（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）。ネガティブ選択のラウンドでは、囮受容体はプレート又はビーズに結合しており、ポジティブラウンドの選択では上記に記載したようにブロックされている。ビーズは、より大きな表面積のネガティブ選択分子がパニングされるライブラリーに曝露され得るので、より望ましい。プライマリーライブラリー又は他のラウンドのポジティブ選択からのファージを、室温で２時間、又は４℃で一夜、囮受容体とインキュベートする。次いで、非結合のファージを除去し、ポジティブラウンドの選択にかける。
【０１８５】
ネガティブ選択と同時にポジティブ選択も行う。可溶性ＤＲ４又はＤＲ５でコーティングしたウエル又はビーズをブロックし、プライマリーライブラリー、又は先に記載した選択のラウンドからのファージに曝露するが、ＤｃＲ１などの囮受容体が１０μｇ／ｍｌの濃度に含まれている。ＤＲ４又はＤＲ５に対する特異性及び親和性のより大きなファージを得るために、この戦略における溶出の前のインキュベート時間は４℃で２時間から数日まで延長することができる。ＤＲ５に特異的なバインダーを得るためにＤＲ４を用いたネガティブ選択、又はＤＲ４に特異的なバインダーを得るためにＤＲ５を用いたネガティブ選択を、上記に詳しく述べた取組みを用いて行ってもよい。
【０１８６】
１つ又は複数の囮受容体を発現する癌性細胞又はトランスフェクトした細胞に対して、ネガティブ選択をやはり行うことができる。ネガティブ選択は、上記に記載したポジティブ選択と同様に行うが、インキュベート後に細胞をスピンダウンした後の上清からファージを回収し、次いでポジティブ選択のラウンドにおいて用いることが異なる。
【０１８７】
（例１２）
３量体ＴＲＡＩＬ受容体アゴニスト及び３量体ＣＴＬＤ由来ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストのプラスミド構築
ファージディスプレイからの、又はペプチドをグラフトした、ペプチド−３量体化ドメイン（ＴＤ）融合物、ペプチド−ＴＤ−ＣＴＬＤ融合物、若しくはこれらの様々な組合せからの、３量体ＴＲＡＩＬ受容体アゴニスト及び３量体ＣＴＬＤ由来ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストの様々なバージョンを、小規模又は大規模の生成用に、細菌発現ベクター（ｐＴ７自社ベクター、又はｐＥＴ、ＮｏｖａＧｅｎ）及び哺乳動物発現ベクター（ｐＣＥＰ４、ｐｃＤＮＡ３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にサブクローニングする。
【０１８８】
プライマーを、例１からの様々な機能的なディスプレイベクターからのバインダー／アゴニストのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅するようにデザインする。５’末端に対するプライマーは、ＢａｍＨＩ制限部位と隣接しており、ベクターｐＴ７ＣＩＩＨ６におけるリーダー配列とインフレームである。５’プライマーも、プロテアーゼグランザイムＢ又はファクターＸａに対する切断部位と一緒に組み入れられていてよい。３’プライマーはＥｃｏＲＩ制限部位と隣接している。ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、次いで同じ酵素で消化したｐＴ７ＣＩＩＨ６中にライゲートして細菌発現ベクターｐＴ７ＣＩＩＨ６−ＴＲＡＩＬａを作り出す。
【０１８９】
ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストＤＮＡを、いかなるリーダー配列及び６×ＨｉｓなしでベクターｐＴ７ＣＩＩＨ６又はｐＥＴ２８ａ（ＮｏｖｏＧｅｎ）中にサブクローニングしてもよい。５’プライマーはＮｄｅＩ制限部位に隣接し、３’プライマーはＥｃｏＲＩ制限部位に隣接している。ＰＣＲ生成物をＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、同じ酵素で消化したベクター中にライゲートして発現ベクターｐＴ７−ＴＲＡＩＬａ及びｐＥＴ−ＴＲＡＩＬａを作り出す。
【０１９０】
ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストＤＮＡを、分泌シグナルペプチドと、ベクターｐＴ７ＣＩＩＨ６又はｐＥＴ２８ａ（ＮｏｖｏＧｅｎ）中にサブクローニングしてもよい。発現したタンパク質は細菌のペリプラズム中に搬出され、分泌シグナルペプチドはトランスロケーション中に除去される。５’プライマーはＮｄｅＩ制限部位と隣接しており、プライマーを細菌の分泌シグナルペプチドであるＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、又はＯｍｐＴ中に組み入れる。３’プライマーはＥｃｏＲＩ制限部位に隣接している。６×Ｈｉｓタグコード配列を、任意選択で３’プライマー中に組み入れてもよい。ＰＣＲ生成物をＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、同酵素で消化されるベクター中にライゲートして、発現ベクターｐＴ７−ｓＴＲＡＩＬａ、ｐＥＴ７−ＴＲＡＩＬａ、ｐＴ７−ＴＲＡＩＬａＨｉｓ、及びｐＥＴ−ｓＴＲＡＩＬＨｉｓを作り出す。
【０１９１】
ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストＤＮＡを、また、分泌シグナルペプチドと一緒に、哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４又はｐｃＤＮＡ３．１中にサブクローニングしてもよい。発現されたタンパク質は培地中に分泌され、分泌シグナルペプチドは分泌プロセス中に除去される。５’プライマーはＮｄｅＩ制限部位と隣接しており、プライマーをテトラネクチンの分泌シグナルペプチド、又は別の分泌シグナルペプチド（例えば、Ｉｇペプチド）中に組み入れる。３’プライマーはＸｈｏＩ制限部位に隣接している。６×Ｈｉｓタグを、任意選択で３’プライマー中に組み入れる。ＰＣＲ生成物をＮｈｅＩ／ＸｈｏＩで消化し、同じ酵素で消化されるベクター中にライゲートして、発現ベクターｐＣＥ４−ＴＲＡＩＬａ、ｐｃＤＮＡ−ＴＲＡＩＬａ、ｐＣＥＰ４−ＴＲＡＩＬａＨｉｓ、及びｐｃＤＮＡ−ＴＲＡＩＬａＨｉｓを作り出す。
【０１９２】
（例１３）
細菌からのＴＲＡＩＬ受容体アゴニストの発現及び精製
細菌の発現構築物を、細菌系統ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換する。新鮮プレート上のコロニー１個を、振盪フラスコ中２×ＹＴ培地１００ｍＬ中に接種する。フラスコを、２５０ｒｐｍで回転する振盪機中、３７℃で１２時間又は一夜インキュベートする。一夜培養物（５０ｍＬ）を用いて４Ｌ振盪フラスコ中２×ＹＴ  １Ｌを接種する。細菌をフラスコ中ＯＤ６００が約０．７になるまで培養し、そのとき最終濃度が１ｍＭになるまでＩＰＴＧを培養物に加える。誘導４時間後、細菌のペレットを遠心分離によって収集し、その後のタンパク質精製用に保存する。
【０１９３】
１０リットル発酵槽中、流加条件下で細菌の発酵を行う。複合発酵媒体１リットルは、酵母菌抽出物５ｇ、トリプトン２０ｇ、ＮａＣｌ０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４４．２５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４３Ｈ２Ｏ４．２５ｇ、グルコース８ｇ、Ｍｇ２ＳＯ４７Ｈ２Ｏ２ｇ、及び微量金属溶液３ｍＬ（２．７％ＦｅＣｌ３６Ｈ２Ｏ／０．２％ＺｎＣｌ２４Ｈ２Ｏ／０．２％ＣｏＣｌ２６Ｈ２Ｏ／０．１５％Ｎａ２ＭｏＯ４２Ｈ２Ｏ／０．１％ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ／０．１％ＣｕＣｌ２／０．０５％Ｈ３ＢＯ３／３．７％ＨＣｌ）を含む。発酵槽に１夜培養物を接種し（５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、ｐＨ６．９の一定の操作条件（水酸化アンモニウム及びリン酸で制御して）及び３０℃で増殖させる。４０％の最小溶解酸素レベルを維持するように空気流量及び撹拌を変化させる。培養物中のグルコースレベルが１ｇ／Ｌ未満になったらフィード（４０％グルコースで）を開始し、発酵の残りの間グルコースレベルを０．５ｇ／Ｌに維持する。ＯＤ６００が約６０に到達したらＩＰＴＧを培養物中に加えて最終濃度を０．０５ｍＭとする。誘導４時間後、細胞を回収する。細胞のペレットを遠心分離によって得、その後のタンパク質精製用に−８０℃で貯蔵する。
【０１９４】
可溶性であり、細菌細胞のペリプラズム中に分泌され、アフィニティタグ（例えば、６×Ｈｉｓタグ付けしたタンパク質）を含む、発現されたタンパク質を、当業者にはよく知られている、金属キレートクロマトグラフィー（例えば、Ｎｉアフィニティカラム）、陰イオン／陽イオンアフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、又はこれらのあらゆる組合せなどの標準のクロマトグラフィー方法を用いて精製する。
【０１９５】
発現されたタンパク質は、細菌細胞中に不溶性の封入体を形成することができる。これらのタンパク質を、最初の精製ステップにおいて変性の条件下で精製し、その後、精製クロマトグラフィーカラム上で行うことができるリフォールディングの手順を受けさせる。細菌のペレットを溶解バッファー（０．５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、及び１ｍＭＥＤＴＡ）中に懸濁し、超音波処理する。封入体を遠心分離によって回収し、引き続き６Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、及び０．１ＭＤＴＴを含む結合バッファー中に溶解する。可溶化した部分をＮｉアフィニティカラムに適用する。非結合の材料をカラムから洗浄した後、タンパク質を溶出バッファー（６Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２５０ｍＭイミダゾール）で溶出する。単離したタンパク質のバッファーを結合バッファーに交換し、Ｎｉ＋カラムに再適用して変性剤を除去する。カラム上にロードした後、タンパク質を、５Ｃ．Ｖ．（カラム容積）の変性剤を欠くバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、プラス２ｍＭＣａＣｌ２）を用いて直線勾配（０〜０．５ＭＮａＣｌ）によってリフォールディングする。タンパク質を、０．５ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、及び２５０ｍＭイミダゾールを含むバッファーで溶出する。融合タグ（６×Ｈｉｓ、ＣＩＩ６Ｈｉｓ）をファクターＸａ又はグアニジンＢで切断し、Ｎｉ＋−ＮＴＡアフィニティカラムを通過させることによってタンパク質試料から除去する。タンパク質を、バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、及び２ｍＭＣａＣｌ２）中１０Ｃ．Ｖ．を越える直線勾配（０〜０．５ＭＮａＣｌ）を用いてＱセファロース（ＧＥ）上イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製する。タンパク質を１×ＰＢＳバッファー中に透析する。任意選択で、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｅフィルター（ＰＡＬＬ）を通過させることによって、内毒素を除去する。
【０１９６】
ペリプラズムにおいて発現されたタンパク質に対する細菌細胞からの可溶性の抽出物を調製するために、細菌のペレットをローディングバッファー中（１０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．０）に懸濁し、超音波処理（又はその代わりにフレンチプレス）を用いて溶解する。不溶性の部分を遠心分離でスピンダウンした後、可溶性の抽出物をＳＰ  ＦＦカラム（ＧＥ）に適用する。ペリプラズムの抽出物を、また、浸透圧ショック又は「穏やかな」超音波処理によって調製する。分泌された、可溶性の６×Ｈｉｓでタグ付けされたタンパク質を、先に記載したようにＮｉ＋−ＮＴＡカラムによって精製する。粗製抽出物は、アフィニティカラムローディングバッファーに交換されたバッファーであり、次いで、ＳＰＦＦカラムに適用する。ローディングバッファー４Ｃ．Ｖ．で洗浄した後、タンパク質を、高塩濃度バッファー（１０ｍＭリン酸バッファー、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で８Ｃ．Ｖ．にわたって１００％勾配を用いて溶出する。溶出物をＭｕｓｔａｎｇＥフィルターを通過させることによってろ過して内毒素を除去する。部分的に精製したタンパク質のバッファーを１０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．４に交換し、次いでＱＦＦカラムにロードする。１０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．０と７Ｃ．Ｖ．洗浄後、高塩濃度バッファー（１０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．０、０．５ＭＮａＣｌ）で８Ｃ．Ｖ．にわたって１００％勾配を用いてタンパク質を溶出する。再びもう一度、ＭｕｓｔａｎｇＥフィルターを通過させることによって内毒素を除去する。
【０１９７】
（例１４）
哺乳動物細胞からのＴＲＡＩＬ受容体アゴニストの発現及び精製
各発現構築物に対するプラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏｆｒｅｅ  Ｍａｘｉ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて調製する。プラスミドを用いて、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を一過性にトランスフェクトする。トランスフェクト２〜４日後、組織培養物の上清をタンパク質精製用に収集する。
【０１９８】
大規模に生成するために、ＣＨＯ又はＰＥＲ．Ｃ６細胞における安定な細胞系を、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストを過剰発現するように開発する。細胞（５×１０８個）を、２０Ｌバイオリアクター（Ｗａｖｅ）中、培地２．５Ｌ中に接種する。細胞が２倍になったら新たな培地（１×開始体積）を加え、細胞が倍加して最終体積が１０Ｌに到達するまで添加し続ける。細胞の生存率が２０％に低下するまで約１０日間細胞を培養する。次いで、細胞培養物の上清を精製用に収集する。
【０１９９】
Ｈｉｓでタグ付けしたタンパク質の精製（Ｎｉ＋−ＮＴＡカラム）及び非タグのタンパク質の精製（イオン交換クロマトグラフィーによる）の両方を、先に記載した通りに用いる。
【０２００】
（例１５）
インシリコのモデリングによって支援されるＴＲＡＩＬ受容体アゴニストのアフィニティ成熟
インシリコのモデリングを用いて、ＣＴＬＤファージディスプレイライブラリーのスクリーニングから同定されるＴＲＡＩＬ受容体アゴニストをアフィニティ成熟する。アゴニスト相同性モデルを既知のテトラネクチンの３Ｄ構造に基づいて構築する。アゴニスト相同性モデルのループの立体配置を、ＬＯＯＰＥＲ（ＤＳ２．１、Ａｃｃｅｌｒｙｓ）及びその関連のアルゴリズムを用いて精錬し、最適化する。このプロセスは３つの基本的なステップ：１．ループバックボーンの残りのタンパク質との最適化した相互作用での１セットの可能なループ配座異性体の構築；２．ループ側鎖の構築及び構造の最適化、並びに全てのループ原子に適用されるエネルギーの最小化；３．ループ配座異性体の保持されている変異体の最終のスコアリング及びランク付けを含む。手操作と分子動力学ベースのドッキングの組合せを用いて、ＤＲ４／ＤＲ５細胞外ドメイン上に位置する潜在的な結合領域又はエピトープをアゴニストに対して同定する。結合性ドメインを、ＤＲ４／ＤＲ５細胞外ドメイン（単数若しくは複数）及びアゴニストの欠失又は点突然変異を用いて結合アッセイを行うことによって、さらに確認する。結合特異性の決定に関与するアミノ酸残基（又は配列）を、ＤＲ４／ＤＲ５及びＴＲＡＩＬ  ＣＴＬＤアゴニストの両方に対して規定する。様々な標的ポジションのランダム変異の組合せを、構造鋳型との適合性を決定するために構造ベースの算出を用いてスクリーニングする。見かけのパッキング欠陥の分析に基づいて、残基を変異原性に対して選択して、ファージディスプレイ用のライブラリーを構築する。
【０２０１】
ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストペプチド及びＤＲ４／ＤＲ５の３Ｄモデルを、ペプチドグラフト化ＣＴＬＤ及びＤＲ４／ＤＲ５モデリングを精錬するための参考として用いることができる。ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストペプチドがＣＴＬＤループ中にグラフトされる場合、ループの立体配置は、インシリコのモデリングを用いて隣接及び周囲のアミノ酸残基を変更することによって、アゴニストペプチド／ＤＲ４／ＤＲ５結合に適合するように最適化及びリサーフェシングされる。ペプチドをグラフトしたＣＴＬＤアゴニスト相同性モデルを、既知のテトラネクチン３Ｄ構造に基づいて構築する。アゴニストの相同性モデルのループの立体配置を、先に記載したように、ＬＯＯＰＥＲ（ＤＳ２．１、Ａｃｃｅｌｒｙｓ）及びこれらの関連のアルゴリズムを用いて精錬し、最適化する。様々な標的ポジションのランダム変異の組合せを、構造鋳型との適合性を決定するために、構造ベースの算出によってスクリーニングする。見かけのパッキング欠陥の分析に基づいて、ペプチドに隣接し、又は取り囲むアミノ酸残基を変異原性に対して選択して、ファージディスプレイ用のライブラリーを構築する。
【０２０２】
（例１６）
癌細胞の増殖の阻害
ＣＯＬＯ２０５（結腸直腸腺癌）、ＮＣＩ−Ｈ２１２２（非小細胞肺癌）、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２（膵癌）、ＡＣＨＮ（腎細胞癌）、ＷＭ７９３Ｂ（メラノーマ）、及びＵ２６６Ｂ１（リンパ腫）（全てＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）より購入）など、ＤＲ４及び／又はＤＲ５を発現するヒト癌細胞系を、各細胞系に好適な条件下で培養し、細胞密度５０００〜２００００細胞／ウエル（各癌細胞系に好適な増殖曲線によって決定した通り）で接種する。ＤＲ４／５アゴニスト分子を、０．０００１〜１００μｇ／ｍＬの範囲の濃度で添加する。任意選択で、ＤＲ４／ＤＲ５アゴニストを、化学療法（例えば、ボルテゾミブ）又は放射線照射によって予め感作させた細胞を含めた治療方法と組み合わせて、ＤＲ４若しくはＤＲ５を上方制御し、又はカスパーゼ活性を変化させる相乗効果を産生させる。生存細胞の数を、製造元の指示に従って、「ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ」（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて２４時間後及び４８時間後に評価し、ＤＲ４／ＤＲ５アゴニストに対するＩＣ５０濃度を決定する。
【０２０３】
（例１７）
癌細胞系におけるＤＲ５及びＤＲ４アゴニスト分子によるカスパーゼの活性化
ＣＯＬＯ２０５（結腸直腸腺癌）、ＮＣＩ−Ｈ２１２２（非小細胞肺癌）、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２（膵癌）、ＡＣＨＮ（腎細胞癌）、ＷＭ７９３Ｂ（メラノーマ）、及びＵ２６６Ｂ１（リンパ腫）（全てＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）より購入）など、ＤＲ４及び／又はＤＲ５を発現するヒト癌細胞系を、各細胞系に好適な条件下で培養し、細胞密度５０００〜２００００細胞／ウエル（各癌細胞系に好適な増殖曲線によって決定して）で接種する。ＤＲ４／５アゴニスト分子を、０．０００１〜１００μｇ／ｍＬの範囲の濃度で添加する。ＤＲ４／ＤＲ５アゴニストを、化学療法（例えば、ボルテゾミブ）又は放射線照射によって予め感作させた細胞などの他の治療方法と組み合わせて、このような組合せが、ＤＲ４若しくはＤＲ５の上方制御、又はカスパーゼ活性の変化に対して相乗効果を有するか否かを決定する。カスパーゼ活性を、製造元の指示に従って、「ＡＰＯ−ＯＮＥ  Ｃａｓｐａｓｅ  ａｓｓａｙ」（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて様々な時間点に決定する。
【０２０４】
ウエスタンブロットによるさらなる分析を、先に記載したように２×１０６個の腫瘍細胞をインキュベートすることによって行う。引き続き、ウエスタンブロット用に細胞可溶化物を調製する。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に移す。ｐｒｏ及び切断型のアポトーシスタンパク質であるＰＡＲＰ、カスパーゼ３、カスパーゼ８、カスパーゼ９、ｂｉｄ及びアクチンを認識する抗体とフィルターをインキュベートする。特異的なタンパク質に対応するバンドを、ＨＲＰコンジュゲートした２次抗体及び化学発光の増強によって検出する。
【０２０５】
（例１８）
腫瘍異種移植片モデルにおけるアゴニスト分子の評価
癌細胞系（例えば、ＨＣＴ−１１６、ＳＷ６２０、ＣＯＬＯ２０５）を、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス又はＳＣＩＤマウス中にｓ．ｃ．注射する。ノギスを用いて、腫瘍の長さ及び幅を週２回測定する。腫瘍が２５０ｍｍ３のサイズに到達したら、マウスを無作為化し、１０〜１００ｍｇ／ｋｇのＤＲ４又はＤＲ５アゴニストでｉ．ｖ．又はｓ．ｃ．処置する。処置は、化学療法（例えば、イリノテカン、ボルテゾミブ、若しくは５ＦＵ）、又は放射線照射処置などの他の治療法と組み合わせることができる。腫瘍サイズが１５００ｍｍ３に到達しなければ腫瘍サイズを３０日間観察し、到達した場合はマウスを屠殺しなければならない。
【０２０６】
（例１９）
ヒトＤＲ４及びＤＲ５上のヒトライブラリー１−４のパニング
１．ＤＲ４受容体上のパニング
１ウエル当たりＰＢＳ１００μＬ中に希釈した担体フリーの標的抗原２５０ｎｇから１μｇと結合した、前夜に新たに調製したＤＲ４／Ｆｃ抗原コーティングした（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）ウエル上、ヒトＣＴＬＤのループ１−４ライブラリーを用いてパニングを行った。抗原プレートを４℃で一夜、次いで３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で２回、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで３７℃で１時間、１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロックし、その後パニングした。各ラウンドにおいて６個のウエルを用い、ファージを、精製ファージ上清ストックを２つずつ、希釈なし、１：１０、及び１：１００希釈を用いて、３７℃で２時間、ウエルに結合させた。標的の抗原はＦｃ融合タンパク質として発現されたので、ファージ上清ストックは、可溶性競合物として作用する可溶性ＩｇＧ１  Ｆｃ１μｇ／ｍＬを含んでいた。さらに、標的抗原の結合の前に、Ｆｃバインダーを除去するために、ファージ上清物をヒトＩｇＧ１  Ｆｃと抗原のウエルに予備結合させた（予備結合の間、可溶性ＩｇＧ１  Ｆｃ競合物は存在しなかった）。
【０２０７】
パニングの最初のラウンド用のファージを生成するために、ライブラリーＤＮＡ１０μｇを、エレクトロコンピテントＴＧ−１細菌中に形質転換し、カルベニシリン４０μｇ／ｍＬ及びグルコース２％とともにＳＢを含む培養液１００ｍＬ中、３７℃で１時間増殖させた。次いで、カルベニシリンの濃度を５０μｇ／ｍＬに増大し、さらに１時間培養物を増殖させた。次いで、培養液の体積を５００ｍＬに増大し、５×１０９ｐｆｕ／ｍＬの感染効率（ＭＯＩ）で培養物にヘルパーファージを感染させ、３７℃でさらに１時間増殖させた。細菌をスピンダウンし、カルベニシリン５０μｇ／ｍＬ及びカナマイシン１００μｇ／ｍＬを含むＳＢ５００ｍＬ中に再懸濁し、２５０ｒｐｍで振盪しながら室温で一夜増殖させた。翌日、細菌を遠心分離して除き、ファージを氷上で１時間、最終濃度４％ＰＥＧ／０．５ＭＮａＣｌで沈澱させた。次いで、沈澱したファージを、４℃、１０５００ｒｐｍで２０分間スピンダウンした。ファージペレットを、Ｒｏｃｈｅ  ＥＤＴＡフリーコンプリートプロテアーゼインヒビターを含む１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に再懸濁した。次いで、再懸濁したファージを、微量遠心管中１３２００ｒｐｍで１０分間遠心し、０．２μＭフィルターを通過させて残りの細菌を除去した。
【０２０８】
１ウエル当たり５０μＬの精製ファージ上清ストックを、ＩｇＧ  Ｆｃでコーティングしたウエルに３７℃で１時間予備結合させ、次いで、先に記載したように、３７℃２時間、好適な濃度の標的の抗原でコーティングしたウエルに移した。次いで、ウエルをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で上下のピペッティングにより５分間洗浄した（ラウンド１に洗浄１回、ラウンド２に洗浄５回、並びにラウンド３及びラウンド４に洗浄１０回）。標的の抗原が結合したファージを１ウエル当たり６０μＬの酸溶出バッファー（グリシンｐＨ２）で溶出し、次いで、３．６μＬ／ウエルの２Ｍ  Ｔｒｉｓで中和した。次いで、溶出したファージを用いてＴＧ−１細菌を、室温で１５分間感染させた（ＯＤ６０００．８〜１．０で２ｍＬ）。培養物の体積を、カルベニシリン４０μｇ／ｍＬ及びグルコース２％を有するＳＢ中１０ｍＬにし、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１時間増殖させた。次いで、カルベニシリン濃度を５０μｇ／ｍＬに増大し、培養物をさらに１時間増殖させた。次いで、培養物の体積を１００ｍＬに増大し、５×１０９ｐｆｕ／ｍＬのＭＯＩで培養物にヘルパーファージを感染させ、３７℃でさらに１時間増殖させた。細菌をスピンダウンし、カルベニシリン５０μｇ／ｍＬ及びカナマイシン１００μｇ／ｍＬを含むＳＢ１００ｍＬ中に再懸濁し、２５０ｒｐｍで振盪しながら室温で一夜増殖させた。パニングのその後のラウンドを、培養物のより小体積に対して同様に調節し、後のラウンドにおける洗浄を増大して行った。クローンを、４ラウンド間、ＤＲ４／Ｆｃ上パニングし、ラウンド３及びラウンド４のスクリーニングからクローンを得た。
【０２０９】
２．ファージＥＬＩＳＡ
ＴＧ−１系統の細菌を用いて少なくとも４ラウンド間、パニングを行った。パニングの各ラウンドに、試料の力価を取り、カルベニシリン５０μｇ／ｍＬ及びグルコース２％を含むＬＢプレート上に塗抹した。ファージミドクローンの受容体標的に対する特異的な結合をスクリーニングするために、個々のコロニーをパニングの後のラウンドからのこれらのタイタープレートから選択し、上部に通気性の膜を有するポリプロピレン製９６ウエルプレートにおいて、グルコース２％及びカルベニシリン５０μｇ／ｍＬを含む２×ＹＴ培地２５０μＬ中、２５０ｒｐｍで振盪しながら室温で一夜増殖させた。翌日、先の一夜培養物３０μＬを、グルコース２％及びカルベニシリン５０μｇ／ｍＬを含む２×ＹＴ５００μＬに接種することによって、レプリカのプレートを深型９６ウエルプレート中にセットアップした。残余の一夜培養物を用いて、各ウエルに５０％グリセロール１００μＬを加え、−８０℃で貯蔵することによって、マスターストックプレートを作成した。レプリカの培養プレートを、およそ２時間２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で、ＯＤ６００が０．５〜０．７になるまで増殖させた。次いで、ウエルにＫ０７ヘルパーファージを感染させて５×１０９ｐｆｕ／ｍＬにし、混合し、振盪しないで３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃でさらなる３０分間インキュベートした。次いで、培養物を、２５００ｒｐｍ及び４℃で２０分間スピンダウンした。ウエルから上清を除去し、細菌細胞のペレットをカルベニシリン５０μｇ／ｍＬ及びカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含む２×ＹＴ５００μＬ中に再懸濁した。培養物のブロック上に通気性の膜を配置し、細胞を２５０ｒｐｍで振盪しながら室温で一夜増殖させた。
【０２１０】
３日目、培養物をスピンダウンし、ファージを含む上清を室温で１時間、３％ミルク／ＰＢＳでブロックした。１ウエル当たり７５〜１００ｎｇの抗原の結合を用いて、最初のファージＥＬＩＳＡを行った。１ウエル当たり７５〜１００ｎｇのヒトＩｇＧ１  Ｆｃを用いて非特異的な結合を測定した。１ウエル当たり１００μＬのＰＢＳ中に希釈した上記の量の抗原を結合することによって、ＤＲ４／Ｆｃ抗原（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングしたウエル及びＩｇＧ  Ｆｃでコーティングしたウエルを新たに前夜に調製した。抗原のプレートを４℃で一夜、次いで３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で２回、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで３％ミルク／ＰＢＳで３７℃で１時間ブロックし、その後ＥＬＩＳＡを行った。ブロックしたファージを、ブロックした抗原が結合したプレートに１時間結合させ、次いで０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで２回、次いでＰＢＳでさらに２回洗浄した。次いで、３％ミルク／ＰＢＳ中希釈した、ＨＲＰがコンジュゲートした抗Ｍ１３  ２次抗体を適用し、１時間結合させ、先に記載した通りに洗浄した。ＥＬＩＳＡシグナルをＴＭＢ基質９０μＬを用いて発生させ、次いで０．２Ｍ硫酸９０μＬで停止し、次いで４５０ｎＭでＥＬＩＳＡプレートを読んだ。２次ＥＬＩＳＡのスクリーニングを、同定したポジティブ結合のクローニング上で行い、さらなるＴＲＡＩＬ受容体及び囮受容体に対して特異性（ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１、及びＤｃＲ２）に関してスクリーニングして試験した。２次ＥＬＩＳＡのスクリーニングを、先に詳述したプロトコールと同様に行った。
【０２１１】
ＤＲ４特異的結合性クローン。ヒトＴＮ１〜４ライブラリーからＤＲ４受容体に対する特異的結合に関して選択したループ１及び４に対するアミノ酸配列の例を、以下の表４に詳しく記載する。
【表５−１】
2012504969.tif 000009
【表５−２】
2012504969.tif 000010
【０２１２】
３．ＤＲ５受容体上のパニング
ＤＲ４受容体に関して先に詳述したのと同様にＤＲ５受容体上のパニングを行ったが、パニングを５ラウンド行い、予備結合をＩｇＧ１  ＦｃではなくＢＳＡでコーティングしたウエル上で行ったことが異なった。しかし、ファージ上清ストックは、各ラウンド間にＦｃ結合に対する可溶性の競合物として働く可溶性ＩｇＧ１  Ｆｃを含んでいた。ＤＲ５に特異的な結合クローンを、ラウンド５からスクリーニングして得た。ＤＲ５に特異的な結合に対するクローンから得たループ１及び４に対するアミノ酸配列を、以下表５に示す。
【表６−１】
2012504969.tif 000011
【表６−２】
2012504969.tif 000012
【０２１３】
先に記載した通り、ループ１はスクリーニングしたライブラリー中にランダム化アミノ酸を７個含み、ループ４は天然アミノ酸の２位に５個のランダム化アミノ酸の挿入を有していた（表５における下線領域）。変更されたループ中にグルタミン（Ｑ）を有するいくつかのクローンでは、アンバー抑制可能ストップコドン（ＴＡＧ）はグルタミンをコードし、これは小文字の「ｑ」によって示される。パニングの間、これらの領域の外側に変化を含む少数のクローンが同定され、例えば、ループ４において、カルボキシに隣接するアミノ酸はいくつかの場合においてＥからＫに変更された。
【０２１４】
（例２０）
ヒトＤＲ４及びＤＲ５受容体に対するアトリマー（ａｔｒｉｍｅｒ）バインダーのサブクローニング及び生成
ループ領域のＤＮＡフラグメントが、ＢｇｌＩＩ及びＭｆｅＩ制限酵素での２重消化によってＤＲ４／ＤＲ５バインダーＤＮＡから放出され、細菌の発現ベクターｐＡＮＡ４、ｐＡＮＡ１０、又はｐＡＮＡ１９にライゲートして、大腸菌において分泌型アトリマーを生成した。
【０２１５】
発現構築物を大腸菌系統ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天上に細菌を塗抹した。新鮮なプレート上のコロニー１個を、アンピシリンを含む２×ＹＴ培地中に接種した。培養物を２００ｒｐｍの振盪機中３７℃で、ＯＤ６００が０．５に到達するまでインキュベートし、次いで室温に冷却した。アラビノシス（ａｒａｂｉｎｏｓｉｓ）を加えて最終濃度を０．００２〜０．０２％にした。室温で一夜、１２０〜１５０ｒｐｍで振盪して誘導を行い、その後、遠心分離によって細菌を収集した。浸透圧ショック又は穏やかな超音波処理によってペリプラズムタンパク質を抽出した。
【０２１６】
Ｎｉ＋−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーによって、６×Ｈｉｓでタグ付けしたアトリマーを精製した。簡潔に述べると、ペリプラズムタンパク質をＨｉｓ結合バッファー（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）中再構成し、Ｈｉｓ結合バッファーで予め平衡にしたＮｉ＋−ＮＴＡカラム上にロードした。カラムを結合バッファー１０×体積で洗浄した。タンパク質を溶出バッファー（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）で溶出した。精製したタンパク質をＰＢＳバッファー中に透析し、陰イオン交換によって細菌の内毒素を除去した。
【０２１７】
ステップＩＩ−タグ付けしたアトリマーをＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。簡潔に述べると、ペリプラズムタンパク質を１×結合バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中再構成し、結合バッファーで予め平衡にしたＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎカラム上にロードした。カラムを１０×体積の結合バッファーで洗浄した。タンパク質を溶出バッファー（２．５ｍＭデスチオビオチンを含む結合バッファー）で溶出した。精製したタンパク質を結合バッファー中に透析し、陰イオン交換によって細菌の内毒素を除去した。
【０２１８】
ループ領域のＤＮＡフラグメントを哺乳動物の発現ベクターｐＡＮＡ２及びｐＡＮＡ１１中にサブクローニングして、ＨＥＫ２９３一過性発現系中にアトリマーを生成した。ループ領域のＤＮＡフラグメントが、ＢｇｌＩＩ及びＭｆｅＩ制限酵素での二重消化によってＩＬ−２３ＲバインダーＤＮＡから放出され、ＢＧｌＩＩ及びＭｆｅＩで予備消化した発現ベクターｐＡＮＡ２及びｐＡＮＡ１１にライゲートした。発現プラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ  ＨｉＳｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によって細菌から精製した。ＨＥＫ２９３接着細胞では、一過性トランスフェクトを、製造元のプロトコールに従ってＱｉａｇｅｎ  ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によって行った。トランスフェクトの翌日、培地を除去し、２９３  Ｉｓｏｐｒｏ無血清培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に交換した。２日後、０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳ中２０％グルコースを培地に加えて最終濃度１％とした。組織培養物上清を、精製用にトランスフェクトした４〜７日後に収集した。ＨＥＫ２９３Ｆ懸濁細胞に対して、一過性トランスフェクトを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２９３Ｆｅｃｔｉｎ及びそのプロトコールによって行った。翌日、１×体積の新鮮な培地を培養物中に加えた。組織培養物上清を、精製用にトランスフェクトした４〜７日後に収集した。哺乳動物組織培養物上清からのＨｉｓ−又はＳｔｒｅｐＩＩ−でタグ付けしたアトリマーの精製を、上記に記載した通りに行った。
【０２１９】
ループ領域のＤＮＡフラグメントを、哺乳動物発現ベクターｐＡＮＡ５、ｐＡＮＡ６、ｐＡＮＡ７、ｐＡＮＡ８、及びｐＡＮＡ９中にサブクローニングして、ＨＥＫ２９３一過性発現系中、ＣＴＬＤを提示する配向の異なるアトリマーを生成した。ｐＡＮＡ５は、ヒトＴＮにおいてＣ末端Ｈｉｓ−タグ及びＶ４９欠失を含む、修飾されたｐＣＥＰ４ベクターである。同様に、ｐＡＮＡ６は、Ｔ４８欠失を有し、ｐＡＮＡ７はＴ４８及びＶ４９の欠失を有する。ｐＡＮＡ８は、野生型ＴＮより柔軟なＣＴＬＤを提供するためのＣ５０、Ｃ６０→Ｓ５０、Ｓ６０の二重変異を有する。ｐＡＮＡ９は、グリコシル化部位を除去するためのＥ１→Ｖ１７の欠失を有する。ループ領域のＤＮＡフラグメントが、ＢｇｌＩＩ及びＭｆｅＩ制限酵素での二重消化によってＩＬ−２３ＲバインダーＤＮＡから放出され、ＢＧｌＩＩ及びＭｆｅＩで予備消化した発現ベクターｐＡＮＡ５、ｐＡＮＡ６、ｐＡＮＡ７、ｐＡＮＡ８、及びｐＡＮＡ９にライゲートした。
【０２２０】
（例２１）
Ｂｉａｃｏｒｅを用いたヒトＤＲ４及びＤＲ５受容体バインダーの親和性のキャラクタリゼーション
３量体のＤＲ４及びＤＲ５バインダーの見かけの親和性を、それぞれ表６及び表７に提供する。標準のアミンカップリング化学反応を用いて抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ）のＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）への固定化を行い、この表面を用いて組換えヒトＤＲ４又はＤＲ５受容体Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を捕獲した。アトリマー希釈液（１〜５００ｎＭ）を３０μｌ／分でＩＬ−２３受容体表面にわたって注射し、速度定数をＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエア（バージョン３．１、Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いてセンサーグラムデータから引き出した。データ収集は、会合に３分及び解離に５分であった。抗ヒトＩｇＧの表面を３Ｍ塩化マグネシウムの３０秒のパルスで再生した。センサーグラムは全て、活性化及びブロックしたフローセル及びバッファー注射に対して二重基準としたものである。
【表７】
2012504969.tif 000013
【表８】
2012504969.tif 000014
【０２２１】
細胞アッセイの説明
Ｈ２１２２肺腺癌細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−５９８５）及びＡ２７８０卵巣癌細胞（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、＃９３１１２５１９）を、１×１０４細胞／ウエルで、９６ウエル白色不透明プレート（Ｃｏｓｔａｒ）において１０％ＦＢＳ／ＲＭＰＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、ＤＲ５アトリマー（２０μｇ／ｍＬ）又はＴＲＡＩＬ（０．２μｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とインキュベートした。対照のウエルには、培地とそれぞれのバッファー：ＤＲ５アトリマーにはＴＢＳ、及びＴＲＡＩＬにはＰＢＳを入れた。２０時間後、ＶｉａＬｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓ（Ｌｏｎｚａ）によって細胞の生存率を決定し、Ｇｌｏｍａｘルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）上で検出した。データは、それぞれのバッファー対照に対するパーセント細胞死として表した。３回測定した平均値及び標準誤差をＥｘｃｅｌを用いてプロットした。ＤＲ５アトリマーを５つ試験した：４ａ８ｃ、２ａ１ａ、１ａ７ｂ、９ｂ３ｄ、及び８ｂ６ｂ。ＤＲ５アトリマー３つ（４ａ８ｃ、１ａ７ｂ、及び８ｂ６ｂ）は両方の細胞系において５０％を超える死滅を示した。別の実験において同様のデータを得た。
【０２２２】
（例２２）
ヒトＤＲ５に対するＮＥＢペプチドライブラリーのパニング及びＤＲ５特異的ペプチドの同定
Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）Ｐｈ．Ｄ．Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓを用いてペプチドライブラリーのパニングを行った。１ウエル当たり１５０μＬの０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３ｐＨ８．６中に希釈した担体フリーの標的抗原３μｇと結合させ、前夜新たに調製した、ＤＲ５／Ｆｃ抗原コーティングした（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）ウエル上でパニングを行った。各ラウンドにおいてウエルを２つずつ用いた。抗原のプレートを４℃で一夜、次いで３７℃で１時間インキュベートした。抗原を除去し、次いでウエルを、ＰＢＳ中０．５％煮沸カゼインｐＨ７．４で、３７℃で１時間ブロックし、その後パニングした。次いでカゼインを除去し、次いでウエルをＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ）３００μＬで６回洗浄し、次いでファージを加えた。標的抗原はＦｃ融合タンパク質として発現されたので、標的抗原の結合の前に、ファージ上清液を１時間ヒトＩｇＧ１  Ｆｃを有する抗原ウエルと予備結合させてＦｃバインダーを除去した（ラウンド２からラウンド４の間）。Ｆｃ抗原が結合したウエルを、上記に記載したように、ＤＲ５／Ｆｃ抗原が結合したウエルと同様に調製した。
【０２２３】
パニングの最初のラウンドでは、ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ）１００μＬを各ウエルに加え、３つのＮＥＢペプチドライブラリー（Ｐｈ．Ｄ．−７、Ｐｈ．Ｄ．−１２、及びＰｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃ）を各々５ｕｌ、各ウエルに加えた。プレートを室温で１時間、穏やかに揺り動かし、次いでＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ）で１０回洗浄した。結合したファージを、濃度１００μｇ／ｍｌの可溶性ＤＲ５／Ｆｃ標的抗原を含むＰＢＳ１００μＬで溶出した。ファージを１時間、室温で揺り動かして溶出した。次いで、溶出したファージをウエルから除去し、これを用いてＯＤ６００ｎｍが０．０５から０．１のＥＲ２７３８細菌２０ｍｌに感染させ、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で４．５時間増殖させた。次いで、細菌を、４℃、１２Ｋ×Ｇで２０分間、培養物から遠心分離して除いた。細菌を新たな試験管に移し、再び遠心分離した。上清を再び新たな試験管に移し、６分の１容積の２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌを加えることによってファージを沈澱させた。ファージを４℃で一夜沈澱させた。翌日、沈澱したファージを４℃、１２Ｋ×Ｇで２０分間スピンダウンした。上清を捨て、ファージペレットをＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ）１ｍｌ中に再懸濁した。残余の細菌を、４℃、１３．２Ｋで１０分間、微量遠心管中遠心分離することによって除いた。次いで、ファージ上清を新たな試験管に移し、６分の１容積の２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌを加えることによって再沈澱し、氷上４℃で１時間インキュベートした。沈澱したファージを４℃、１３．２Ｋで１０分間、微量遠心管中スピンダウンした。上清を捨て、ファージペレットをＴＢＳ２００μＬ中に再懸濁した。パニングのその後のラウンドをラウンド１と同様に行ったが、Ｆｃをコーティングしたウエルにファージを１時間予備結合し、結合の間に先のラウンドからの増幅されたファージストック４μＬを１ウエルごとに用いたことが異なった。さらに、Ｔｗｅｅｎの濃度を、１０回の洗浄の間に用いたＴＢＳＴ中０．５％に増大した。
【０２２４】
ファージＥＬＩＳＡ
ＥＲ２７３８系統の細菌を用いて、少なくとも４ラウンド、パニングを行った。パニングの各ラウンドに試料の力価を取り、ＬＢ／Ｘｇａｌプレート上の上層寒天を用いて塗抹してプラークを得た。ファージクローンの受容体標的への特異的な結合をスクリーニングするために、個々のプラークを、パニングの後のラウンドからのこれらのタイタープレートから選択し、これを用いてＯＤ６００ｎｍが０．０５から０．１であるＥＲ２７３８細菌に感染させ、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で４．５時間増殖させた。次いで、一夜、４℃で貯蔵した。
【０２２５】
２日目、培養物を、４℃、１２×Ｇで２０分間スピンダウンし、ファージを含む上清を室温で１時間、３％ミルク／ＰＢＳでブロックした。１ウエル当たり７５〜１００ｎｇのＤＲ５／Ｆｃ抗原の結合を用いて、最初のファージＥＬＩＳＡを行った。１ウエル当たりヒトＩｇＧ１  Ｆｃ７５〜１００ｎｇを含むウエルを用いて非特異的な結合を測定した。１ウエル当たりＰＢＳ１００μＬ中に希釈した上記の量の抗原に結合することによって、ＤＲ５／Ｆｃ抗原（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングしたウエル及びＩｇＧ１  Ｆｃでコーティングしたウエルを前夜新たに調製した。抗原のプレートを４℃で一夜、次いで３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で２回、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで３％ミルク／ＰＢＳで３７℃、１時間ブロックし、その後ＥＬＩＳＡを行った。ブロックしたファージを、ブロックした抗原が結合したプレートに１時間結合させ、次いで０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで２回、次いでＰＢＳでさらに２回洗浄した。３％ミルク／ＰＢＳ中希釈したＨＲＰコンジュゲートした抗Ｍ１３  ２次抗体を次いで適用し、１時間結合させ、上記に記載した通りに洗浄した。ＥＬＩＳＡシグナルをＴＭＢ基質混合物９０μＬを用いて発生させ、次いで０．２Ｍ硫酸９０μＬで停止し、次いで４５０ｎＭでＥＬＩＳＡプレートを読んだ。２次ＥＬＩＳＡスクリーニングを、同定したポジティブ結合のクローニングに対して行い、さらなるＴＲＡＩＬ受容体及び囮受容体に対してスクリーニングして特異性（ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１、及びＤｃＲ２）に関して試験した。２次ＥＬＩＳＡスクリーニングを、先に詳述したプロトコールと同様に行った。
【０２２６】
ＤＲ５特異的結合性クローン。ＤＲ受容体に対する特異的結合に関して選択した、ＮＥＢ  Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃファージライブラリーからのペプチドのアミノ酸配列の例を、以下の表ＸＸに詳しく記載する。
【表９】
2012504969.tif 000015
【０２２７】
上記の実施例は、これらのライブラリーにおいて産生することができる変形の範囲を制限するものではない。様々な数のランダムの、又はより多くの標的アミノ酸を用いて存在するアミノ酸を置換する、他のライブラリーを産生することができ、様々な組合せのループを利用することができる。さらに、ランダムＰＣＲ変異誘発など、他の変異及び変異を産生する方法を利用して、パニングを受けさせることができる多様化したライブラリーを提供することができる。
【０２２８】
上記に記載した実施例は例示にすぎず、本発明の全ての可能な実施形態、応用、又は修飾を網羅的に列挙しようとするものではない。したがって、本発明の記載する方法及びシステムの様々な修飾及び変形は、当業者であれば本発明の範囲及び精神から逸脱せずに明らかであろう。本発明を特定の実施形態に関連させて記載してきたが、主張する通り本発明は、このような特定の実施形態に過度に制限されるべきではないことを理解されたい。実際、分子生物学、免疫学、化学、生化学、又は関連の分野における技術者には明らかである、本発明を実施するための記載された様式の様々な修飾は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【０２２９】
本明細書に記載する、特定の方法論、プロトコール、及び試薬などは当業者が認識するものとして変化し得るので、本発明は、これらに制限されるものではないことが理解される。本明細書で用いる専門用語は、特定の実施形態を記載する目的で用いるにすぎず、本発明の範囲を制限することを意図するものではないことも理解される。
【０２３０】
本発明の実施形態、並びにその様々な特徴及び有利な詳細を、非制限的な実施形態を参照して、より完全に説明し、且つ／又は添付の図面に例示し、且つ以下の記載に詳述してある。図面に例示する特徴は、必ずしも規模を描くものではなく、本明細書において明示的に述べてなくても、当業者であれば認識する通り一実施形態の特徴を他の実施形態とともに用いることができることに留意されたい。
【０２３１】
本明細書に列挙したあらゆる数値は、あらゆる低値とあらゆる高値の間が少なくとも２単位離れているならば、１単位の増加における低値から高値までの全ての値を含む。一例として、成分濃度、又はサイズ、角度のサイズ、圧力、時間など、プロセスの変数の値が、例えば、１から９０まで、詳しくは２０から８０まで、より詳しくは３０から７０までであると記載される場合、１５から８５まで、２２から６８まで、４３から５１まで、３０から３２までなどの値が、本明細書において明白に列挙されることが意図される。１未満の値に対して、１単位は適宜、０．０００１、０．００１、０．０１、又は０．１とみなされる。これらは、特に意図されるものの例にすぎず、列挙される最低値と最高値の間の数値の全ての可能な組合せが、同様に本出願において明白に記載されるものとみなされるべきである。
【０２３２】
特定の方法、装置、及び材料を記載するが、本明細書に記載するものと同様又は等価のあらゆる方法及び材料が、本発明の実践又は試験において用いられてよい。本明細書に列挙する全ての参考文献及び出版物の開示は、各々が参照によって個々に援用されるごとく同程度に、その全文が参照によって特に援用される。
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１１】
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【表１２−１】
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【表１２−２】
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【表１２−３】
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【表１２−４】
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【表１２−５】
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【表１２−６】
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【表１２−７】
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【表１２−８】
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【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１３−３】
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【表１３−４】
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【表１３−５】
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【表１３−６】
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【表１３−７】
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【表１３−８】
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【表１３−９】
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【表１３−１０】
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【表１３−１１】
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【表１３−１２】
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【表１３−１３】
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【表１３−１４】
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【表１３−１５】
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【表１３−１６】
2012504969.tif 000042
【表１３−１７】
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【表１３−１８】
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【表１３−１９】
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【表１３−２０】
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【表１３−２１】
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【表１３−２２】
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【表１３−２３】
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【表１３−２４】
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【表１３−２５】
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【表１３−２６】
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【表１３−２７】
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【表１３−２８】
2012504969.tif 000054
【表１３−２９】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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