(57)【要約】生物学的標本から核酸を抽出する為の方法及び関連した組み立て体及びキットが開示されている。方法は：（ａ）内表面，外表面，第１孔，そして第２孔を備え、内表面が変性されておらず滑らかなガラスから成り第１孔と第２孔との間の流体連通を提供している管状内腔を規定していて、内腔が断面において円形状，長円形状，又は楕円形状であり、そして内腔が核酸特定結合位置から本質的に自由である、装置を提供する工程；（ｂ）第１孔を介して装置の内腔中に核酸を包含している標本を導入する工程；（ｃ）標本中の核酸を変性されておらず滑らかなガラスに結合させることを許容する工程；そして、（ｄ）結合された核酸を洗浄する工程、を備えている。【選択図】  図２Ａ
2012508015.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内表面，外表面，第１孔，そして第２孔を備え、内表面が変性されておらず滑らかなガラスから成り第１孔と第２孔との間の流体連通を提供している管状内腔を規定していて、内腔が断面において円形状，長円形状，又は楕円形状であり、そして内腔が核酸特定結合位置から本質的に自由である、装置を提供する工程；
第１及び第２孔の１つを介して装置の内腔中に核酸を包含している標本を導入する工程；
標本中の核酸を変性されておらず滑らかなガラス表面に結合させて結合された核酸を産出することを許容する工程；そして、
結合された核酸を洗浄する工程、
を備えている、生物学的標本から核酸を抽出する為の方法。
【請求項２】
洗浄工程に続き、変性されておらず滑らかなガラス表面から結合された核酸を溶出させる工程をさらに備えている、請求項１の方法。
【請求項３】
溶出された核酸を増幅する追加の工程を備えている、請求項２の方法。
【請求項４】
前記増幅工程が等温増幅を備えている、請求項３の方法。
【請求項５】
溶出された核酸が、第１及び第２孔の前記１つを介して内腔から取り除かれる、請求項２の方法。
【請求項６】
結合された核酸が、核酸の存在により蛍光発光強度の変化を発揮する蛍光配合物を含有している緩衝剤により溶出される、請求項２の方法。
【請求項７】
内腔が、長手方向軸を伴っている線状内腔である、請求項１の方法。
【請求項８】
内腔の少なくとも一部分が、長手方向軸に沿いテーパーにされている、請求項７の方法。
【請求項９】
内腔が曲がりくねっている、請求項１の方法。
【請求項１０】
内腔が螺旋状である、請求項９の方法。
【請求項１１】
外表面が長手方向峰を備えている、請求項１の方法。
【請求項１２】
装置が内腔中に内方構成要素を備えており、内方構成要素が断面において凸状の変性されておらず滑らかなガラス表面を備えている、請求項１の方法。
【請求項１３】
細胞標本を溶解させて核酸を含有している標本を準備する工程をさらに備えている、請求項１の方法。
【請求項１４】
核酸を含有している標本がカオトロピズムの塩を備えている、請求項１の方法。
【請求項１５】
核酸を含有している標本が動物の核酸を備えている、請求項１の方法。
【請求項１６】
動物の核酸が人の核酸である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
核酸が微生物の核酸である、請求項１の方法。
【請求項１８】
核酸がＤＮＡである、請求項１の方法。
【請求項１９】
核酸が導入工程に先立って断片化されている、請求項１の方法。
【請求項２０】
内腔の少なくとも一部分を通過する液体の流れが乱流である、請求項１の方法。
【請求項２１】
洗浄工程が：
第１及び第２孔の前記一方を介して洗浄試薬を装置の内腔中に導入する工程；
洗浄試薬が結合された核酸に接触することを許容する工程；そして、
第１及び第２孔の前記一方を介して洗浄試薬を内腔から取り除く工程、
を備えている、
請求項１の方法。
【請求項２２】
内表面，外表面，第１孔，そして第２孔を備え、内表面が変性されておらず滑らかなガラスから成り第１孔と第２孔との間の流体連通を提供している管状内腔を規定していて、内腔が断面において円形状，長円形状，又は楕円形状であり、そして内腔が核酸特定結合位置から本質的に自由である、装置と；そして、
装置の内腔と流体連通しているポンプと、
を備えている組立体。
【請求項２３】
ポンプが装置の第２孔に連結されている、請求項２２の組立体。
【請求項２４】
ポンプが多岐管を介し装置の第２孔に連結されている、請求項２３の組立体。
【請求項２５】
ポンプとの流体連結において流体分配制御手段をさらに備えている、請求項２２の組立体。
【請求項２６】
夫々が、内表面，外表面，第１孔，そして第２孔を備え、内表面が変性されておらず滑らかなガラスから成り第１孔と第２孔との間の流体連通を提供している管状内腔を規定していて、内腔が断面において円形状，長円形状，又は楕円形状であり、そして内腔が核酸特定結合位置から本質的に自由である、複数の装置と；
夫々が、複数の装置の１つを受け入れ複数の孔の１つを介してその内腔中へと流体通路を提供するよう適用されている、複数の連結具を備えている多岐管と；そして、
多岐管と流体連結しているポンプと、
を備えていて、
複数の装置の夫々が多岐管の連結具に連結されている、
組立体。
【請求項２７】
内表面，外表面，第１孔，そして第２孔を備え、内表面が変性されておらず滑らかなガラスから成り第１孔と第２孔との間の流体連通を提供している管状内腔を規定していて、内腔が断面において円形状，長円形状，又は楕円形状であり、そして内腔が核酸特定結合位置から本質的に自由である、装置と；そして、
密閉されている容器中の、溶解緩衝剤，洗浄緩衝剤，又は溶出緩衝剤と、
を備えているキット。
【請求項２８】
緩衝剤が、核酸の存在により蛍光発光強度の変化を発揮する蛍光配合物を備えている溶出緩衝剤である、請求項２７のキット。
【請求項２９】
配合物がビス−ベンズイミダイン配合物である、請求項２８のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
生物学的標本から核酸を抽出する方法，その為の組立体，その為のキット。
【０００２】
関連している出願の相互参照
この出願は、２００８年１１月４日に提出された米国仮出願番号６１／１１１，０７９の利益を請求していて、それは参照によりその全体がここに組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
生物学的標本からの核酸の急速な分析は、細胞溶解産物及び他の資源から核酸を抽出することが可能な微小流体（microfluidic）技術の発展により進化している。血液，細胞組織，培養された細胞，又は他の生物学的材料の微小な標本から核酸の有用な量を提供する為に急速抽出方法学（Rapid extraction methodology）はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）の如き増幅（amplification）技術と組み合わされることが出来る。これらの微小流体（microfluidic）技術は、生物医学的調査研究施設において広く採用されていて、例えば、培養されたバクテリア又は他の宿主細胞（host cell）からのクローン化（cloned）されているＤＮＡの“ライブラリー（libraries）”の高い処理量のスクリーニング（screening）を許容する。
【０００４】
このような小さな尺度でＤＮＡを抽出する為の通常使用されている方法は、ＤＮＡを、シリカゲル（silica gel），シリカ膜（silica membrane），多孔性ガラス（porous glass），又は珪藻土（diatomaceous earth）の如き材料に結合させる傾向を発揮する。一つのこのようなシステムは、（“回転カラム（spin column）”として知られている）ＤＮＡ−結合媒体を含んでいる微小遠心チューブ（microcentrifuge tube）を提供している。標本は、チューブ中に装填され、そして回転され遠心がかけられ、これによりＤＮＡが獲得され、そして汚染物質を含んでいる液相がチューブの底に向かい通過する。このような手順は、例えば、サウアーその他（Sauer et al）に対する米国特許第６，８２１，７５７号中に開示されている。回転カラム（spin column）技術が研究社会により広く採用されているにしても、汚染物質の除去は不十分であり、結果としてＤＮＡはしばしば、ＰＣＲの如き下流での適用において使用する為には低い品質である。さらに、開口チューブ中へ複数の試薬をピペットする必要が、標本汚染の重大な危険性の結果となる。このような方法は、手動で行なわれた時には時間を多く費やし、そして自動化するには非常に高価である。
【０００５】
研究における急速ＤＮＡ抽出技術の成功した使用は、装置及び方法を開発することにおける興味をもたらし、これらを介してこの技術は、治療時点での診断（point-of-care diagnosis）又は血液成分の分析の如き医療適用において使用されることが出来る。より簡素でコンパクトな装置に向かう最近の進歩は、マリックその他（Malic et al）による工学における最近の特許（Recent Patents on Engineering）７：７１−８８，２００７により見ることが出来る。これらの近年の進歩にも関わらず、高品質ＤＮＡ及びＲＮＡを生物学的標本から急速にそして経済的に抽出することが出来る装置及び方法の必要が当該技術分野において存在している。 
【発明の概要】
【０００６】
この発明は、液体標本からの、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む、核酸の抽出の為に役立つ方法（processes），装置（devices），組立体（assemblies），そしてキット（kits）を提供する。
【０００７】
この発明の１つの概念は、生物学的標本から核酸を抽出する為の方法を提供する。この方法は：（ａ）内表面，外表面，第１孔，そして第２孔を備え、内表面が変性されておらず（unmodified）滑らかなガラスから成り第１孔と第２孔との間の流体連通を提供している管状内腔を規定していて、内腔が断面において円形状（circular），長円形状（oval），又は楕円形状（elliptical）であり、そして内腔が核酸特定結合位置（nucleic acid-specific binding site）から本質的に自由である、装置を提供する工程；（ｂ）第１及び第２孔の１つを介して装置の内腔中に核酸を包含している標本を導入する工程；（ｃ）標本中の核酸を変性されておらず滑らかなガラス表面に結合させることを許容する工程；そして、（ｄ）汚染物質を溶出させるために、結合された核酸を洗浄する工程、を備えている。１つの実施形態の範囲内では、方法はさらに、洗浄工程に続き、変性されておらず滑らかなガラス表面から結合された核酸を溶出させることを備えている。他の実施形態の範囲内においては、内腔は、長手方向軸を伴っている線状内腔である。関係している実施形態の範囲内においては、内腔の少なくとも一部分が長手方向軸に沿いテーパーにされている（tapered）。もう１つの実施形態の範囲内においては、内腔は曲がりくねっている。関係している実施形態の範囲内においては、内腔は螺旋である。もう１つの実施形態の範囲内においては、外表面が、長手方向峰（longitudinal ridge）を備えている。追加の実施形態の範囲内においては、装置は内腔内に内方構成要素を備えていて、内方構成要素は、断面において凸状である、変性されておらず滑らかなガラス表面を備えている。更なる実施形態の範囲内においては、方法はさらに、核酸を含有している標本を準備する為に細胞標本を溶解させる（lysing）ことを備えている。さらにもう１つの実施形態の範囲内においては、核酸を含有している標本が、カオトロピズムの塩（chaotropic salt）を備えている。更なる実施形態の範囲内においては、核酸を含有している標本が、動物の核酸，人の核酸，又は微生物の核酸を含有している。もう１つの実施形態の範囲内においては、核酸はＤＮＡである。追加の実施形態の範囲内においては、核酸は、導入工程の以前に、断片化されている（fragmented）。もう１つの実施形態の範囲内においては、結合された核酸が、核酸の存在により蛍光発光強度の変化を発揮する蛍光配合物（fluorescent compound）を含有している緩衝剤（buffer）により溶出される（eluted）。さらなる実施形態の範囲内においては、内腔の少なくとも一部分を通過する液体の流れが乱流である。追加の実施形態の範囲内においては、工程が、溶出された核酸を増幅させる追加の工程を備えている。増幅工程は、等温増幅（isothermal amplification）を備えて良い。もう１つの実施形態の範囲内においては、洗浄工程が、第１及び第２孔の１つを介し装置の内腔中に洗浄試薬（wash reagent）を導入すること、洗浄試薬が結合された核酸に接触することを許容すること、そして、第１及び第２孔の１つを介し内腔から洗浄試薬（wash reagent）を除去すること、を備えている。さらなる実施形態の範囲内においては、標本が内腔中に導入され、そして、溶出された核酸が同じ孔を介して内腔から除去される。
【０００８】
この発明の第２の概念の範囲内においては、（ａ）内表面，外表面，第１孔，そして第２孔を備え、内表面が変性されておらず滑らかなガラスから成り第１孔と第２孔との間の流体連通を提供している管状内腔を規定していて、内腔が断面において円形状，長円形状，又は楕円形状であり、そして内腔が核酸特定結合位置から本質的に自由である、装置と；そして、（ｂ）装置の内腔と流体連通しているポンプと、を備えている組立体が提供される。１つの実施形態の範囲内においては、ポンプは装置の第２孔に連結されている。関係している実施形態においては、ポンプは多岐管（manifold）を介し装置の第２孔に連結されている。更なる実施形態の範囲内においては、組立体はポンプとの流体連結において流体分配制御手段（fluid distribution control means）を備えている。
【０００９】
この発明の第３の概念の範囲内においては、（ａ）夫々が、内表面，外表面，第１孔，そして第２孔を備え、内表面が変性されておらず滑らかなガラスから成り第１孔と第２孔との間の流体連通を提供している管状内腔を規定していて、内腔が断面において円形状，長円形状，又は楕円形状であり、そして内腔が核酸特定結合位置から本質的に自由である、複数の装置と；（ｂ）夫々が、複数の装置の１つを受け入れ複数の孔の１つを介してその内腔中へと流体通路を提供するよう適用されている、複数の連結具を備えている多岐管（manifold）と；そして、（ｃ）多岐管と流体連結しているポンプと、を備えていて、複数の装置の夫々が多岐管の連結具に連結されている、組立体が提供される。
【００１０】
この発明の第４の概念の範囲内においては、（ａ）内表面，外表面，第１孔，そして第２孔を備え、内表面が変性されておらず滑らかなガラスから成り第１孔と第２孔との間の流体連通を提供している管状内腔を規定していて、内腔が断面において円形状，長円形状，又は楕円形状であり、そして内腔が核酸特定結合位置から本質的に自由である、装置と；そして、（ｂ）密閉されている容器中の緩衝剤（buffer）と、を備えているキット（kit）が提供される。緩衝剤は、溶解（lysis）緩衝剤，洗浄（wash）緩衝剤，又は溶出（elution）緩衝剤で良い。１つの実施形態の範囲内においては、緩衝剤は、溶出（elution）緩衝剤である。関係している実施形態の範囲内においては、緩衝剤は、ビス−ベンズイミダイン配合物（bis-benzimidine compound）の如き、核酸の存在により蛍光発光強度の変化を発揮する蛍光配合物（fluorescent compound）を備えている溶出緩衝剤である。
【００１１】
この発明のこれらの及び他の概念は、この発明の以下の詳細な記載及び添付されている図面を参照することにより明らかになる。
【００１２】
ここに引用された全ての引用文献は、引用によりそれらの全体が組み込まれる。ここで引用された数字の範囲は、終了点（endpoint）を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、核酸抽出装置及びポンプを備えている配置を図示している。
【図２Ａ】図２Ａは、複数の核酸抽出装置，多岐管，そしてポンプを備えている配置を図示している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、複数の核酸抽出装置，多岐管，そしてポンプを備えている配置を図示している。
【図３】図３は、アルキメデスの螺旋を図示している。
【図４】図４は、フェルマーの螺旋を図示している。
【図５】図５は、湾曲されているガラス表面から回収されたＤＮＡの増幅の結果を図示している。
【図６Ａ】図６Ａは、核酸抽出装置の一部を図示している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、核酸抽出装置の一部を図示している。
【図７Ａ】図７Ａは、核酸抽出装置の一部を図示している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、核酸抽出装置の一部を図示している。
【図８Ａ】図８Ａは、端キャップを備えている核酸抽出装置を図示している。
【図８Ｂ】図８Ｂは、端キャップを備えている核酸抽出装置を図示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
この発明は、生物学的標本からの、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ：deoxyribonucleic acid）及びリボ核酸（ＲＮＡ：ribonucleic acid）を含んでいる、核酸の抽出を提供する。ここで使用されている如く、陽後「生物学的標本（biological sample）」は、細胞又は細胞構成要素を包含している標本を意味していて、核酸を包含している、液体又は固体の、いかなる標本も含む。この発明の範囲内で使用されることが出来る適切な生物学的標本は、限定することなしで、細胞培養（cell culture），培養液（culture broth），細胞懸濁（cell suspension），組織標本（tissue sample），細胞溶解産物（cell lysate），清澄にされた細胞溶解産物（cleared cell lysate），全血（whole blood），血清（serum），軟膜（buffy coat），尿（urine），大便（feces），脳脊髄液（cerebrospinal fluid），精液（semen），唾液（saliva），傷口浸出液（wound exudate），ウイルス（virus），ミトコンドリア（mitochondria），そして葉緑体（chloroplast）を含む。１つの実施形態においては、標本は血液又は血液産出物（blood product）（例えば、血小板（platelet））であり、そして抽出された核酸は血液又は血液産出物中の汚染物質バクテリア病原体（contaminant bacterial pathogen）からのこれらである。
【００１５】
この発明を介して産出されたＤＮＡは、下流における利用（例えば、増幅）の為に高品質となることがわかっている。多孔性ガラス表面と比較すると、この発明において使用された滑らかなガラス表面は、ＰＣＲを基にした分析法（PCR-based assay）に影響を与えることが出来る、酵素（enzyme），金属（metal）（例えば、ヘム（heme）），そして他の蛋白汚染物質（protein contaminant）の洗浄除去をすることが容易である。ＰＣＲ収量（PCR yield）は改善され、そして変動可能性が減少された。この発明の装置はまた、抽出された核酸が濃縮されることを許容する。例えば、０．５ｍｌ標本から獲得されたＤＮＡは、装置の内腔を通して緩衝剤を寄せ集めることにより、溶出緩衝剤（elution buffer）の０．１ｍｌ中に濃縮されることが出来る。この濃縮効果は、改良された感度（sensitivity）を伴った希釈標本（dilute sample）又は病原体検出（pathogen detection）の為に価値がある。
【００１６】
現在広範囲で使用されている回転カラム（spin column）と比較すると、この発明は、外部環境から切り離されることが出来る核酸抽出装置と合体する。この発明は従って、標本及び試薬の導入，そして廃棄物（waste product），洗浄剤（wash），そして抽出された核酸の除去を許容する対処（provision）（例えば、密封可能孔又は取り付け部材（fitting））をシステムが備えるとはいうものの、抽出装置の内容物が環境から本質的に分離されている、システムを提供する。多くの適用の為に、このように閉鎖されたシステムは汚染に対し本質的に抵抗するので好ましい。
【００１７】
この発明の範囲内において使用される装置は、多孔性シリカ基板を採用している公知の装置よりも、非常により低い表面領域：容積比を有し、依然として液体標本からＤＮＡを効率よく抽出する。回転カラム（spin column）の如き円形状装置における多孔性シリカ基板は、空間容積（void volume）のμＬ当たり数百ｍｍ２のガラス表面積を有している。例えば、１０μｍ多孔性シリカビーズ（bead）が詰められている０．６ｍｍＸ５ｍｍ直径円柱は、略３６８４ｍｍ２のガラス面積及び５．６４１μＬの空間容積を有していて、６５３ｍｍ２／μＬの表面積：空間容積比の結果となっている。対照的に、この発明の装置は、０．１ｍｍ２／μＬから２０ｍｍ２／μＬまでの、より普通には０．２５ｍｍ２／μＬから１０ｍｍ２／μＬまでの、そして通常は０．５ｍｍ２／μＬから５ｍｍ２／μＬまでの、表面積：空間容積比を有する。この発明の範囲内において使用されることが出来る、典型的なパスツールピペット（Pasteur pipette）は、大きい方の端で略０．５７ｍｍ２／μＬ、そして小さい方の端で略４ｍｍ２／μＬの表面積：容積比を有している。
【００１８】
この発明の範囲内で使用される核酸抽出装置は、核酸を含有している標本をそこを介し導入することが出来るとともに、汚染物質及び抽出された核酸をそこを介して取り除くことが出来る、第１及び第２孔を備えている。装置はさらに、装置に内表面により規定されている管状内腔（tubular lumen）を備えていて、そこにおいては内表面が、変性されておらず滑らかなガラスで構成されている。断面において円形状，長円形状，又は楕円形状である内腔は、核酸特定結合位置（nucleic acid-specific binding site）から本質的に自由であるとともに、２つの孔と流体連通している。この発明の実施の範囲内においては、核酸は装置の内表面に結合されている。さらに、装置は、液体の塊（bolus）が、空気の泡が先端を貫通したり塊（bolus）中に取り込まれる（entrain）ようになること無しで装置を通って移動することを可能にするよう設計されている。装置は、異なった型の標本との性能（performance）を最適にするよう寸法付けされることが出来る。最適な性能（performance）において考慮されるパラメータは、内腔の直径及び長さを含む。例えば、内腔の容積は、標本の容積を基に選択されることが出来る。より幅広の直径の内腔は、より粘性が大きい（viscous）標本との流量を改良させる。
【００１９】
当該技術分野に習熟している人々は、含まれている製造方法を考慮して、装置の内表面が形状において不均一を示してよいと認識する。このような不均一は、例えば製造方法の人工物（artifact）として生じる。このような不均一は、実行可能な程度において最小にすることが一般的に望まれている。
【００２０】
この発明の１つの実施形態においては、内腔は線状（linear）内腔である。この実施形態の範囲内では、装置は通常、中央内腔を伴っている直線状チューブを備えている。別の例では、内腔はその長手方向軸に沿いテーパー加工（tapered）されていることが出来る。全内腔がテーパー加工されていることが出来るし、或いはテーパー加工は内腔の小さな領域に限定されていることが出来る。後者の配置を実現している装置がパスツールピペット（Pasteur pipette）である。
【００２１】
この発明の他の実施形態においては、内腔はその中心軸に沿い湾曲されている。多様な湾曲した構造が考えられている。代表的な湾曲している内腔は、限定されることなく、Ｃ又はＳ形状，そして、複数の折り曲げ（bend），渦巻き（spiral），そして螺旋（helical）コイルを備えている、より大規模に曲がりくねった内腔を含む。全体の装置容量に対する内腔容量の高度な割合は、３次元方向に内腔を湾曲させることにより得られることが出来る。この発明は従って、例えば、複数の平行な平面中に配列されている複数の曲がりくねった通路（channel）又は複数の同軸の螺旋通路を備えている内腔を含む。この形式の装置は、細管（capillary），ガスクロマトグラフィーカラム（gas chromatography column），コンデンサーチューブ（condenser tube），そして同様なものの如きガラスチューブの容易に入手可能な形状から従来のようにして構成される。
【００２２】
基本的な実施形態においては、装置は、内表面，外表面，第１孔，そして第２孔から成り、内表面が第１孔と第２孔との間の流体連通を提供する内腔を規定している。他の実施形態においては、装置は、内腔中に内方構成要素を備えていて、内方構成要素は、横断面において凸形状であり変性されていない（unmodified）滑らかなガラス表面を備えている。このような装置は、チューブ又は棒（rod）の如き本質的に同心的な結合構成要素の複数を備えていて、これにより装置の内腔中に変性されていない滑らかなガラス結合表面の複数を提供している。図６Ａ及び６Ｂは、このような装置の例を図示していて、そこでは同心的なガラスチューブ１３０及び１４０が２つの内腔１５０を規定している。外方内腔は凹状及び凸状壁の両方を有していて、内方内腔は凹状壁を有している。図７Ａ及び７Ｂは、同心的なチューブ１３０及び１４０に加えて、中央ガラス棒１６０を備えているもう１つの実施形態を図示している。この実施形態の範囲内においては、内方及び外方内腔１５０の両方が凹状及び凸状壁の両方を有している。チューブ及び／又は棒のこのような配列は、以下に記載されている如き保持構成要素の使用を介して安定されることが出来る。図８Ａ及び８Ｂ中に示されている如く、この配置は、保持構成要素に対する末端に端キャップ１７０を提供することによりさらに安定されることが出来る。保持構成要素及び端キャップは、装置の範囲内の全てのガラス表面に対するそれらを通過した流体流れを許容するよう構成される。
【００２３】
ガラスチューブがこの発明の範囲内において使用される時、チューブの端は入口及び出口孔を提供することが出来、中間部分は内腔を規定している。チューブの端（入口及び出口孔）には端キャップ又は他の取り付け部材（fitting）が適合されることが出来、これらを通して、以下により詳細に記載される如く、試薬が追加されそして回収される。このような取り付け部材はまた、装置を密封することが出来る。このような装置はさらに、取扱いを容易にするとともにチューブを破損から保護する為に、保護ハウジング，ガード（guard），取っ手（handle），又はこれらと同様なものを備える。これらの構成要素は、従来の如くポリマー材料（polymeric material）から構成されている。この技術分野において習熟している人々は、ガラスチューブがハウジングに対し適合されることができ、それによって入口及び出口孔がハウジングの表面を通過した開口として形成されてガラスチューブに対する流体の接近を提供する、ことを認識する。
【００２４】
一実施形態においては、内腔の少なくとも一部分の形状及び大きさの割合（proportion）は、そこを通過する液体の乱流を提供するよう選択されている。乱流は、内腔を通過する液体の混合を容易にできる。流れが乱流であろうと層流であろうと、そのレイノズル数（Ｒｅ）により特徴付けられることが出来る。レイノズル数は粘性力（viscous force）に対する慣性力（inertial force）の比として記載されることが出来、粘性力は速度に対する抵抗として考えられることが出来、そして慣性力は速度における変化に対する抵抗として考えられることが出来る。
【００２５】
Ｒｅ＝（ｐｘＶｓｘＬ）／（ｕ），ここでは：
ｐ＝流体密度（ｋｇ／ｍ３）
Ｖｓ＝平均流速（ｍ／ｓ）
Ｌ＝特性長さ（ｍ），パイプの場合はＤｈ＝流体直径（ｍ）
Ｄｈ＝（４ｘ面積）／（周囲長）、即ち、パイプの断面の面積及び周囲長
ｕ＝絶対速度（ｓＮ／ｍ２）
Ｒｅが２３００以下である時、流れは層流であると考えられ、そしてＲｅが４０００以上である時、流れは乱流であると考えられる。これら２つの値の間のいずれであっても遷移領域（transition region）であると考えられる。
【００２６】
典型的なパスツールピペット（Pasteur pipette）は、いずれかの端で、テーパーにされている（tapered）部分により連結されている２つの均一直径区域を有している、直径変更形式である。単純化の為に、２つの均一直径区域におけるレイノズル数は以下の如く計算される。狭い区域は０．９ｍｍの直径を有していて、より大きな区域は５ｍｍの直径を有している。流量は一般的に６００μＬ／秒を超えることがなく、典型的には略６０μＬ／秒である。上述した方程式を使用し、そしてその値は：
Ｌ＝０．０００９ｍ（小さな区域）又は０．００５ｍ（大きな区域）
Ｖｓ＝０．９４ｍ／ｓ（小さな区域、早い流れ）；０．０９４ｍ／ｓ（小さな区域、遅い流れ）；０．０３ｍ／ｓ（大きな区域、早い流れ）；０．００３ｍ／ｓ（大きな区域、遅い流れ）
Ｐ（水）＝１０００ｋｇ／ｍ３
ｕ（水）＝１／１０００ｓＮ／ｍ２
Ｒｅ＝１０００ｘ０．０９４ｘ０．０００９ｘ１０００＝８４．９，小さな区域における流量６０μＬ／秒で；そして、Ｒｅ＝１０００ｘ０．００３ｘ０．００５ｘ１０００＝１５．３，大きな区域における流量６０μＬ／秒で、である。６００μＬ／秒の流量では、小さな区域においてはＲｅ＝８４９であり、大きな区域においてはＲｅ＝１５３である。従って、上述した寸法を有している装置は、Ｒｅが遷移領域に接近する以前に１６２５μＬ／秒を超える流量を適用（accommodate）できる。
【００２７】
この発明の一実施形態の範囲内においては、内腔は曲がりくねった形状をしている。ここで使用されている時、「曲がりくねった（surpentine）」内腔は、２次元において折り曲げられている平坦な内腔を、その螺旋（helix）及び種々の（variant）形状を有している３次元通路とともに、含む。このような３次元構造は、装置全体の容積を減少させるために少なくとも一側に沿い周囲が平坦にされていることが出来る。曲がりくねった形状は、ガラスの大きな表面積に対する標本の露出を許容し、同時に内腔の断面及び装置全体を小さく維持している。内腔断面寸法を限定することは、内腔の範囲内における液体の塊（liquid bolus）の先端縁をするりと過ぎる（slipping past）空気の泡を阻止することに貢献する。曲がりくねった設計はまた、大きな表面積（high surface area）（ガラス−液体界面）と小さな断面との組み合わせがコンパクトな設置面積（footprint）の範囲内に存在することを許容する。上述した如く、（螺旋を含んでいる）曲がりくねった内腔は、円形状横断面及び他の形状を伴っているそれらを含む。
【００２８】
この発明の装置は、変性されていない（unmodified）滑らかなガラスから成る内表面を備えている。この表面は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含んでいる、核酸を結合する為に効果的である。ここで使用される時、「変性されていない滑らかなガラス表面（unmodified smooth glass surface）」は、標準的な顕微鏡スライド（microscope slide），パスツールピペット（Pasteur pipette），ガラス毛管（glass capillary），又はこれらと同様なものの滑らかさに対応している滑らかさを有しているガラス表面を意味していて、ここにおいて表面はその表面積を増大させるよう刻まれていたり（etched）、又は代わりのその他ではなく、そして、それは以下に記載されている如く核酸を特に結合する（bind）よう変性されていない。
【００２９】
「滑らかなガラス」から特に除外されるのは、通常はビーズ（bead），フリット（frit），または膜（membrane）形状である、核酸を獲得するよう当該技術分野において知られている多孔性ガラスである。このような多孔性ガラスは通常、０．１μｍ乃至３００μｍの範囲内に寸法付けされている多孔を有している。この発明の範囲内において使用の為に適したガラス材料は、ソーダ石灰ガラス（soda lime glass）（例えば、エリ  エレクトロベール  ガラス：エリ  サイエンティフィック  カンパニー，ポーツマス，ニューハンプシャー（Erie Electroverre Glass: Erie Scientific Company, Portsmouth, New Hampshire）），珪硼酸ガラス（borosilicate glass）（例えば、コーニング  ０２１１，ＰＹＲＥＸ（登録商標）  ７７４０；コーニング  インコーポレイテッド，コーニング，ニューヨーク（Corning 0211, PYREX(R) 7740; Corning Incorporated, Corning, New York）），亜鉛チタニアガラス（zinc titania glass）（Corning），そして石英ガラス（silica glass）（例えば、ＶＹＣＯＲ  ７９１３；コーニング  インコーポレイテッド（VYCOR 7913; Corning Incorporated））である。この発明の範囲内において使用の為に適切なのは、種々の寸法が容易に入手可能なガラスチューブである。特に興味深いのは、高価でなく、良好な表面：容積比を提供し、そして、内腔内に試薬の混合を容易にする大きな直径の領域を含む、パスツールピペット（Pasteur pipette）である。上で議論した如く、滑らかなガラス表面を有している、ガラス毛管（glass capillary），クロマトグラフィーカラム（chromatography column），濃縮チューブ（condenser tube），そしてこれらと同様なものも採用することが出来る。内腔は本質的に、結合されたオリゴヌクレオチド（immobilized oligonucleotide），微小溝結合薬剤（minor groove binding agent），内位添加薬剤（intercalating agent），又はこれらと同様なものにより提供された、装填表面（charged surface）又は結合位置（binding site）の如き、核酸特定結合位置（nucleic acid-specific binding site）から自由である。「核酸特定結合位置（nucleic acid-specific binding site）から本質的に自由である」内腔は、ガラスと比較して核酸結合における統計上大きな増大を与えるのに十分なこのような位置を含まないものである。
【００３０】
その最も単純な形状においては、この発明の範囲内において使用されている装置は、個々の端に孔を伴っているガラスチューブである。当該技術分野において習熟している人々は、他の構成を採用できること、そして、種々の形状のガラスチューブをより大きなそしてより複雑な装置中に組み込まれることが出来ること、を認識する。これらの他の装置は、例えば、自動化されている取り扱いを容易にし、壊れやすいガラス構成要素を保護することにより耐久性を増大させ、又は、標本の上流又は下流での取り扱いの為に使用される他の装置と連結するよう、構成されていることが出来る。このような装置の本体の残りは、好ましくは、核酸との低い自蛍光（auto-fluorescence）及び非常に低い結合を発揮する材料から形成されている。この材料はまた、使用中にこれらが接触するかもしれない試薬（例えば、エタノール）に対し不浸透性でなければならない。硬質（rigid）又は半硬質（semi-rigid），有機ポリマー材料が好ましい。このような材料の代表は、アクリル（acrylic）（高分子量硬質材料），ポリカーボネート（polycarbonate），ポリプロピレン（polypropylene）（低表面エネルギー薄膜），セルロースアセテート（cellulose acetate），ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ：polyethlene terephthalate），ポリ塩化ビニル（polyvinylchloride），そして、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ：high density polyethylene）を含み、ポリスチレン（polystyrene）を含まない。ポリマー材料を接合する為に適切な接着剤は、限定されることなく、３００ＬＳＥ接着フィルム（３Ｍ）；４６７アクリル接着フィルム（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ, Ｓｔ． Ｐａｕｌ， ＭＮ．）：８１４１アクリル接着フィルム（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ）；そして、トランシルシリコーン接着フィルム（Transil silicone adhesive film）を含む。装置製造後におけるある接着剤のガス発生は、ＤＮＡ収量を減少させるかもしれず、この問題を軽減する為に真空ガス除去を使用することが出来る。
【００３１】
この装置はさらに、それを介して液体を内腔中に導入できるか又は液体を内腔から取り除くことが出来る孔を備えている。従って、この孔は、装置の表面を貫通した開口を提供し内腔と流体連通する。最も単純な構成においては、チューブ端における開口の如き、装置中の開口として入口及び出口孔が提供されている。このような開口は、形状において円形状であることが便利であるが、形状は日常の設計選択事項である。ガラスチューブの端によって孔が提供されている装置は、以下により詳細に開示される如き多岐管（manifold）又は他の保持（retention）構成要素中に直接的に挿入されることが出来る。入口及び出口孔はさらに、標本及び他の試薬が種々の手段により装置中に導入されることを許容する追加の構成要素を備えている。例えば、手動入力を許容するようピークチューブ片（peek tubing stub）が装置に取り付けられることが出来る。手動による追加は、種々の緩衝剤（buffer）が、容量，培養時間（incubation time），そして流量の為に最適となることを許容する。代わりに、標準１−ｍｌポリプロピレン注射器又はプログラム設定可能蠕動ポンプ（peristaltic pump）をチューブ（tubing）及びルアー−固定アダプタ（Luer-lock adaptor）とともに使用することが出来る。もう１つの実施形態の範囲内においては、入口及び出口孔は、そこに挿入される針（例えば、鈍チップ（blunt tip），２２Ｇ注射針）を受け入れるよう寸法が決められている小さな直径の孔により提供されている。針に対する連結は、ルアー−固定取付部材（Luer-lock fitting）を使用して行われる。もう１つの実施形態においては、入口及び出口孔の夫々は、針又はカニューレ（cannula）が突き刺さることができる弾性隔膜又はキャップ（elastomeric septum or cap）を備えていて、それによって使用時まで密封されている装置を提供している。孔はさらに、Ｏ−リング，ガスケット，又はこれらと同様なものの包含により漏れに対し密閉されることが出来る。
【００３２】
図１は、装置１００及びポンプ３００を備えている、この発明の組立体を図示している。装置１００の第２孔１２０は保持構成要素（retention element）２００中に挿入されている。保持構成要素（retention element）２００は、射出成型の如き公知の方法により構成されている。保持構成要素（retention element）２００はポンプ３００に連結されていて、装置１００の内腔との流体連通の為に提供されている。この構成においては、ポンプ３００は吸引を適用でき、そして、第１孔１１０を介して装置１００中へ液体を引き入れることができる。或いは、液体は第２孔１２０を介して装置１００の内腔中に分配されることが出来る。図示されている実施形態においては、保持構成要素（retention element）２００は、装置１００をポンプ３００に対し安定した位置に保持するよう設計されている。当該技術分野において習熟している人々は、保持構成要素（retention element）２００が種々の別の方法で構成されていることが出来ることを認識する。例えば、保持構成要素（retention element）２００は、可撓性の又は硬いチューブから構成されていることが出来、そして装置１００はクランプ（clamp）又はそれと同様なものを使用して固定された位置に保持されることが出来る。図示されている例においては、０．２５インチ内径（0.25’’ i.d.）ポリウレタン（例えば、ＴＹＧＯＮ）チューブが、０．２７インチ外径（0.27’’ o.d.）のより大きな端を有している従来のパスツールピペット（Pasteur pipette）との緊密な密封を形成している。この寸法のチューブはまた、１ｍｌ−注射器又は手持ち（hand-held）ピペットの端に緊密に合致する。このような保持構成要素（retention element）は、３／８インチ長さに切断された薄壁（例えば、１／３２インチ）チューブを使用して容易に準備される。
【００３３】
図１の構成は、複数の装置１００の同時使用を提供するよう図２Ａ及び図２Ｂ中に示されている如く容易に変更される。組立体６００として示されている後者の配置においては、複数の装置１００が、薄壁ポリウレタンチューブから構成されている保持構成要素（retention element）２００を介して多岐管（manifold）２１０に連結されている。多岐管（manifold）２１０は次にポンプ３００に連結されていて、そしてポンプ３００と装置１００との間の流体連通を提供する。このような複数装置組立体は、複数の装置１００が、９６−溜り（well）板の如き、標準複数溜り（well）板の溜り（well）に対応して配置されているよう構成されることが出来る。図示されている組立体においては、８個の装置１００が、９６−溜り（well）板中の８つの溜りの一列に整列するよう整列板４００により所定位置に保持されている。このような配置においては、組立体は、このような板の１つまたは連続から流体を吸い上げることが出来、そしてこのような板の１つまたは連続中へと流体を排出することが出来る。標本及び試薬（例えば、洗浄及び溶出緩衝剤）は、単一板の異なった列に整列されることが出来、そして、板又は組立体のいずれかが装置の端を適切な溜り（well）中に挿入させるよう移動される。この方法は、手動により、又は自動により実行されることが出来る。複数溜り（well）板は、柔軟なシステムを提供するとともに薄められた標本からの核酸の濃縮を容易にする、溜り容量（well volume）の範囲内（例えば、２００μＬ，０．５ｍＬ，１．０ｍＬ，２．０ｍＬ）で利用可能である。当該技術分野における通常の技術の人々により認められる如く、チューブ（例えば、微小遠心分離チューブ（microcentrifuge tube）），板，又は皿の如き他の容器もまた使用されることが出来る。チューブは、複数溜り（well）板様式（format）により配置されることが出来る。ガラスチューブが使用された時、チューブの内部は、核酸獲得の為に使用されることができるさらなる滑らかなガラス表面を提供する。この配置においては、装置及びチューブのガラス表面から溶出された核酸は装置中に取集されもう一つの容器へと移送されることが出来るし、又はチューブ中に収集されることが出来る」。このような複数―装置組立体の為に、組立体中の個々の装置は個々に動作することが出来るし、又は組立体中の全ての装置が同時に動作することが出来る。
【００３４】
図２Ｂは、組立体の残りがそこに固定されている取扱い板５００をさらに備えている組立体を示している。取扱い板５００はさらに組立体６００の構成要素を安定させ、そして全組立体の３次元回転を許容する。典型的な核酸抽出方法においては、結合／溶解緩衝剤（binding/lysis buffer）内の核酸包含標本はプンプ３００により装置１００中に引き入れられ、そして核酸は装置の内壁に結合されることを許容される。装置中に液体を伴って、組立体６００は側方に任意に傾けられ（tipped）そして回転され、装置１００の上方（幅広）区域中における標本とガラスとの間の接触を最大にする。液体は次に排出され、そして第１洗浄緩衝剤が装置中に引き入れられる。この緩衝剤は、ポンプ３００の動作により装置の内腔内で上下に動かされる。この緩衝剤は次に排出され、そして、洗浄が要求に従い繰り返えされる。最終の洗浄の後、空気の流れが装置１００中を通過され結合されている核酸を乾燥させる。ポンプ３００の形式により、装置１００をポンプ３００から（多岐管２１０を伴い、又は伴わず）取り外し、それらを他の手段により提供された空気流に連結させることにより、空気乾燥が容易にされる。最後に、核酸が装置から溶出され、そして、９６−溜り（well）板，一組のチューブ，又はこれらと同様なものの中に移送される。ポンプ３００はまた、装置１００の内方表面を事前洗浄（pre-wash）又は事前処理（pre-treat）為に使用されることが出来る。
【００３５】
これらの組立体を、以下により詳細に開示されている如く、マイクロプロセッサーにより制御された複数通路ポンプ及び流体分配制御手段に連結されている弁機構に連結させることにより、更なる自動化が提供されることが出来る。このような組立体は、十分に自動化された標本取り扱いを提供するよう、標準的な実験室自動化システム（standard laboratory robotic system）と組み合わされることが出来る。
【００３６】
装置は通常はチューブの形状を取り、ここにおいては外方断面が内腔の断面と同じ形状である。装置のこの形状は、高価ではなく、貯蔵及び取扱いが容易であり、そして、使用における十分な柔軟性を提供する。
【００３７】
一つの実施形態の範囲内においては、装置の外表面が少なくとも１つの長手方向峰（longitudinal ridge）を備えている。峰が付けられている装置は、標本収集の間の組織の破壊（disrupt）及び／又は装置の内腔中への導入に先立つ標本の混合の為に使用されることが出来る。典型的な適用においては、核酸含有材料は緩衝剤とともにチューブ中に置かれ、峰が付けられている装置がチューブ中に挿入されて標本を混合するよう回転され、そして標本が装置中に引き込まれる。
【００３８】
もう１つの実施形態においては、上述された如きチューブ状装置が上に手短に記載されている如くより大きな構造内に収納されている。このような配置は、曲がりくねった内腔を伴っている装置を使用した時にガラスを破壊から保護し取扱いを容易にするのに特に有利である。例えば、螺旋形状毛管（spiral-shaped capillary）チューブは、接着剤，樹脂，エポキシ（epoxy），又は同様なものから準備されたカード状（card-like）又はブロック状（block-like）本体内に含められることが出来る。用語「螺旋（spiral）」はその通常の意味でここで使用され、それは、中心点の回りで連続して徐々に曲げられている形状に曲げられている平面湾曲である。適切な螺旋の例は、アルキメデス螺旋（Archimedean spiral）（図３）及びフェルマーの螺旋（Fermat’s spiral）（図４）を含み、とはいうものの他の形状も採用することが出来る。例えば、ウィキペディア（Wikipedia）（en. wikipedia.org/wiki/Spiral）を参照。ガラスチューブ（例えば、毛管（capillary）チューブ）は、真っ直ぐなガラス毛管（capillary）チューブをその軟化点まで加熱し、それをチューブの整列を保つよう設計されている側壁を伴っているリール（reel）上に巻きつけることにより所望の螺旋形状へと折り曲げることが出来る。螺旋は、単一面構造として、又は複数面（即ち、互いの上に平坦に載置されている２つ又はそれ以上の螺旋）に構成されていることが出来る。螺旋の端は螺旋の平面から僅かに上方を向き、そして突出し第１及び第２孔を提供するよう折り曲げられている。端は次に覆われ、そして本体材料（例えば、接着剤，樹脂，又はエポキシ（epoxy））が螺旋中に注がれるか、又は噴霧されて強度及び取り扱いの容易さを提供する。所望の形状を創出する為に型（mold）を使用することが出来、それは保持体又は多岐管（manifold）に対する装置の合致を容易にするよう整列孔，細長孔，又は突起を含むことが出来る。材料が硬化した後には、チューブ端（孔）は覆われない。典型的な実施形態においては、結果としての構造はその上方面上に第１及び第２孔を伴っている平坦な円板の形状である。孔には上に詳細に記載されていた如き追加の構成要素が設けられていることが出来る。本体材料中に孔を残すことにより観察窓が設けられて良い。
【００３９】
構成の代わりの方法は、当該技術分野における通常の技術の人々には明らかである。例えば、積層されているプラスチック構造は、リードその他（Reed et al.），米国２００９０２１５１２５ＡＩにより開示されている如く本質的に採用されることが出来る。手短かには、個々のポリマー層は、レーザー切断，ＣＮＣ引きずりナイフ（drag knife）切断，そして打ち抜き（die cutting）の如き公知の方法を使用して形状に切断される。接着剤層が乾燥プラスチックの層間に行くよう準備される。接着剤層は通常、プラスチックの為に使用されたのと同じ方法を使用して切断されることが出来る薄いフィルムとし）て入手可能な感圧接着剤である。接着剤は、接着剤（Adhesive）−担持体（Carrier）−接着剤（Adhesive）（ＡＣＡ）様式で使用されてよく、ここで担持体（Carrier）は装置の他の層において使用されているのと同じであることが好ましい。スクリーン印刷の如き、液体接着剤を適用する他の方法もまた採用されて良い。いくつかの層が互いに整合され（registered）そして共に押される。整列孔の如き、整合を助けるための構成が最終設計中に好ましくは組み込まれる。硬化作業周期（cure cycle）中の圧力及び温度は接着剤−従属であり；適切な状況の選択は当該技術分野における通常の技術の水準の範囲内である。代わりに、装置は、２００９０２１５１２５ＡＩ中に開示されている如き圧縮密封（compression seal）の使用を介して組み立てられることが出来る。積層は、上述した如き成型構成要素を組み込むことが出来る。
【００４０】
この発明はまた、ここに記載された如き装置及び装置の内腔と流体連結されているポンプを備えている組立体を提供する。用語「ポンプ（pump）」は、ここにおいては、手動で操作される装置（例えば、注射器及び複数通路ピペット（multi-channel pipettor））及び動力で操作される（例えば、電気）装置の両方を含むよう使用されている。この組立体は、ポンプが流体を孔の１つ又は両方を介して内孔中に分配し、そして内腔からそれらを取り除くことが出来るよう構成されている。ポンプはその能力が以下の尺度に合致するよう選択され：（１）２０μＬ乃至少なくとも１０００μＬ，そして好ましくは最大２．５ｍＬまで、の範囲内の容積を正確に吐出する能力；（２）液体と同様空気を効果的に押し出す能力；そして（３）逆にも操作できる能力、である。注射器型又は蛇腹型（bellows-type）ポンプはこれらの尺度を満足し、そして、装置が、第１及び第２孔の１つが全ての試薬の導入及び除去の為に使用される、従来のピペットの方法で動作されることを許容する。液体が両方の孔を介して移動される時、試薬の相互汚染（cross contamination）を最小にする低い又はゼロ無駄容積（dead volume）もまた提供し、そして、使用された種々の試薬（例えば、カオトロピズムの塩（chaotropic salt）及びエタノール）と共存可能な材料で形成された濡れた表面を有するポンプを使用することが好ましい。蠕動ポンプ（peristaltic pump）はこれらの特色の全てとの良好な動作組み合わせ提供するが、全てのポンプ付属品の最も正確な容積排出を提供しない。蠕動ポンプ（peristaltic pump）は、液体のより大きな容積が取り扱われる時に使用されることが好ましい。コンピュータにより制御された複数通路蠕動ポンプ（peristaltic pump）（例えば、ＩＳＭＡＴＥＣ  １２−通路ポンプ；イスマテック  ＳＡ，グラットブルグ，スイス（Ismatec SA, Glattbrugg, Switzerland））は、同時に複数の装置を収容し、そして、開始／停止／流量の変更又は流れの方向の逆転をプログラムされることが出来る。他のポンプ様式を採用した時には、複数のポンプが特定の機能の為に要求され、このような配置が全流体管理システムを複雑にする。
【００４１】
この発明の組立体はさらに、ポンプとの流体連通において流体分配制御手段を含んで良い。流体分配制御手段は、複数の流体が装置を介して連続してポンプ作用されることを許容する、典型的には弁−多岐管ブロックの形状をしている、１つ又はそれ以上の弁を備えている。多岐管入口及び出口が殺菌（sterile）フィルターを通過して弁−多岐管組立体を汚染から阻止し、そして、出口配管が逆止弁を有してポンプチューブから多岐管中への逆流を阻止することが好ましい。例示的な流体分配制御手段は、アップチャーチ  サイエンティフィク，オーク  ハーバー，ワシントン（Upchurch Scientific, Oak Harbor, Washington）により製造されているＶ−１２４１−ＤＣ型６位置７孔回転選択弁である。この選択弁は試薬間への空気隙間の導入を許容する。流体分配制御手段はさらに、外部から弁機構に、又はそれらと十分に一体化されているプログラム可能コンピュータを備えていて良い。この発明の或る実施形態においては、プログラム可能コンピュータはデスクトップ又はラップトップパーソナルコンピュータである。他の実施形態においては、プログラム可能コンピュータは専用マイクロプロセッサー装置である。例示的なシステムにおいては、流体分配の制御は、マイクロソフトエクセル用のビジュアルベーシック（Visual Basic for Microsoft Excel）により書かれていてパーソナルコンピュータ上で作動するアプリケーションを使用して複数通路蠕動ポンプとの組み合わせにおける上述した選択弁を使用して達成される。弁機構及びポンプの両方はＲＳ２３２制御インターフェースを特徴にしている（feature）。これ等の構成要素はコンピュータのＵＳＢポートを介したエクセル（Excel）又はＵＳＢ対シリアルコンバーター（USB-to-Serial converter）を使用してアドレス指定されている（addressed）。当該技術分野において習熟している人々により理解される如く、カスタムファームウェアソフトウェア（custom firmware software）もまた採用されて良い。
【００４２】
液体試薬が従来は、殺菌フィルター孔が備えられている隔膜（septum）−密封小瓶（vial）中に貯蔵されている。小瓶は、隔膜を通して挿入され微小孔チューブを介して多岐管入口に連通されている標準ルアー型（Luer-type）針を使用して、流体分配制御手段に連結されて良い。
【００４３】
組み立て後、装置は好ましくは、病原体（pathogen）を取り除く為に酸化エチレン（ethylene oxide）又はγ殺菌（gamma sterilization）により処理される。装置で使用される試薬は好ましくは、汚染を取り除く為に入口で２ミクロンセルロースフィルターを通過する。核酸増幅を妨げるかもしれない汚染を含む、汚染を取り除く他の方法は、リードその他（Reed et al.），ＷＯ２００８００２８８２により開示されている。装置上の試薬孔は、黄色又は青色ピペットチップ（pipette tip）に対するインターフェースを提供を提供して良い。針−隔膜（septum）インターフェースが設けられることが出来る。
【００４４】
液体標本は通常、略０．１ｎｉＬ／分乃至略５．０ｍＬ／分の流量で装置中に導入されるが、しかしながら、上述された如く、非常により大きな流量が使用されることが出来る。実際の流量は、流体通路の全容量及び内腔の形状を考慮に入れた設計従属である。
【００４５】
希釈又は濃縮された標本が、装置中への入力の為に準備されることが出来る。無傷な細胞（intact cell）の溶解（lysis）及び蒸解（digestion）は、残留タンパク質（例えば、ヒストン（histone））からＤＮＡ又はＲＮＡを解放する。或いは、固体標本（例えば、布上のバクテリア胞子（bacterial spore）又は乾燥した血液）又は半固体標本（例えば、マウスの尻尾又は痰／便（sputum/stool））は、装置中に入れられる前に均質化され（homogenized）そして溶解される（lysed）ことが出来、装置の内腔を通過して流れる均質化され、そして非粘性の標本を提供する。血液の如きより粘性の標本もまた使用されることが出来る。
【００４６】
核酸は、少なくとも０．５Ｍ乃至略２Ｍ又は溶解度に従いそれ以上の濃度の塩（例えば、ＫＣＩ）、又は、少なくとも１Ｍ乃至略６Ｍ又は溶解度の限度までの濃度のカオトロープ（chaotrope）（例えば、グアニジン（guanidine）ＨＣＩ又はグアニジンチオシアン酸塩（guanidine thiocyanate））の存在で、装置のガラス表面に結合される。核酸の結合は通常、略５乃至８、好ましくは略６のＰＨで行われる。内腔は次に、塩濃度を減少させる緩衝剤が入れられた溶液（buffered solution）を使用して洗浄される。塩濃度が減少するのに伴い、エタノールが洗浄溶液に加えられ、ガラス上に核酸を保持し、そして、核酸増幅の如き下流の工程と干渉するかもしれない汚染物質を取り除く。洗浄はＰＨ６〜９、通常はＰＨ６〜８、で行われる。核酸は、基本（basic）ＰＨ、通常はＰＨ８〜９、の低塩溶液により装置から溶出される（eluted）。
【００４７】
一般的には、生物学的標本中に細胞が存在している時には、それらは溶解されてそこから核酸が抽出される細胞溶解産物を提供する。細胞溶解の種々の方法が当該技術分野において知られていて、この発明の範囲内における使用の為に適している。細胞溶解方法の例は、（例えば、プロティナーゼ  Ｋ（proteinase K），プロナーゼ（pronase），又はサブチリシン（subtilisin）を使用した）酵素処置（enzymatic method），（例えば、音波破砕（sonication），高圧の適用，圧電ブザー（piezobuzzer）装置の使用，又はビーズ叩解（bead beating）による）機械的な破砕（mechanical disruption），又は、化学的な処理を含む。機械的な破砕（mechanical disruption）の為に使用されるビーズは、破砕状況の下で核酸と結合しない物質で作られていなければならない。適切な物質は、アクリル（acrylic），ポリカーボネート（polycarbonate），ポリプロピレン（polypropylene），セルロースアセテート（cellulose acetate），ポリエチレンテレフタレート（polyethlene terephthalate），ポリ塩化ビニル（polyvinylchloride），そして、高密度ポリエチレン（high density polyethylene）を含む。カオトロピズムの塩（chaotropic salt）の溶液により処理された標本中の溶解細胞は、特に好ましい。カオトロピズムの塩（chaotropic salt）を使用した細胞の溶解の為の方法及び試薬は、当該技術分野において知られていて、そして、試薬は商業的な供給者（commercial supplier）から購入することが出来る。特別な試薬構成及び反応条件は、溶解する細胞の型により一部が決められ、そしてこのような決定は当該技術分野における通常の技術の水準の範囲内である。適切なカオトロピズムの塩（chaotropic salt）は、グアニジンチオシアン酸塩（guanidine thiocyanate），グアニジン塩酸塩（guanidine hydrochloride），沃化ナトリウム（sodium iodide），そして、過塩素酸塩ナトリウム（sodium perchlorate）を含む。血液細胞を溶解させる為に好ましいグアニジン塩酸塩（guanidine hydrochloride）は、１Ｍ乃至１０Ｍ、普通は１Ｍ乃至５Ｍ、通常は１Ｍ乃至３Ｍ、の濃度で使用される。塩の飽和点（saturation point）（１２Ｍ）に近づく、沃化ナトリウム（sodium iodide）のより高度な濃度が要求されている。過塩素酸塩ナトリウム（sodium perchlorate）は、中間の濃度、普通は５Ｍ周辺、で使用されることが出来る。塩化カリウム（potassium chloride）及び塩化ナトリウム（sodium chloride）の如き中性塩（neutral salt）もまた、ガラス表面に対する核酸の結合を得るために使用されることが出来、そして、細胞溶解が要求されていないか、または他の手段により達成される時（例えば、バクテリア細胞分解の場合）、カオトロピズムの塩（chaotropic salt）の代わりに使用されて良い。中性塩（neutral salt）を使用する時、緩衝剤のイオン強度（ionic strength）は少なくとも０．２５Ｍでなければならない。例示的な分解緩衝剤は、ＰＨ６．４のグアニジンチオシアン酸塩（guanidine thiocyanate）（ＧｕＳＣＮ）緩衝剤の２Ｍ溶液である。カオトロピズムの塩（chaotropic salt）溶液中での溶解（lysis）はまた、ゲノムの（genomic）ＤＮＡからヒストンプロテイン（histone protein）を取り除き、そしてヌクレアーゼ（nuclease）を不活性にする。溶解緩衝剤は一般的にはまた、中性近傍乃至わずかに酸性のＰＨを維持するよう１つ又はそれ以上の緩衝剤を包含する。適切な緩衝剤はクエン酸塩ナト���ウム（sodium citrate）である。１つ又はそれ以上の洗浄剤も含まれることが出来る。適切な洗浄剤は、例えばポリオキシエチレンソルビタン（polyoxyethylenesorbitan）  モノラウレート（monolaurate）（ＴＷＥＥＮ２０），ｔ−オクチルフェノキシポリエソキシエタノール（t-octylphenoxypolyethoxyethanol）（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００），ドデシル硫酸塩ナトリウム（sodium dodecyl sulfate）（ＳＤＳ），ＮＰ−４０，ＣＴＡＢ，ＣＨＡＰＳ，そしてサーコシル（sarkosyl）を含む。アルコール、普通はエタノール、が、洗浄剤中の低下された塩濃度を補償する為に選択された実際の濃度により、分解及び洗浄溶液中に含まれている。塩の不在においては、アルコールは最終洗浄剤中に、少なくとも５０％、好ましくは７０％アルコールの濃度で含まれている。もし塩が試薬中に含まれているのであれば、アルコール濃度は通常１０％と８０％との間、しばしば１０％と６０％との間、通常は２０％と５０％との間、の範囲である。緩衝剤の最高活用化（optimization）は当該技術分野において通常の技術の水準の範囲内である。溶解は一般には、細胞の型に従い、室温と略９５℃との間で行われる。血液細胞は従来は室温で溶解された。シリカ微粒子（silica particle）は核酸と結合し抽出工程の効率を減少させるので、細胞溶解中でシリカ微粒子（silica particle）の使用を避けることは一般的に好ましい。必要ではないにも関わらず、ＤＮＡは、抽出装置中への溶解産出物（lysate）の装填に先立って、剪断されて（sheared）良い。ＤＮＡを剪断する（shearing）する為の方法は、当該技術分野において知られている。
【００４８】
核酸含有標本は、孔の１つを介して装置中に導入される。核酸は、上述した如く、塩又カオトロピズムの塩（chaotropic salt）の存在の下でガラス表面上に獲得される。ガラスに対する核酸の満足のいく結合は室温（１５°〜３０℃，普通は約２０℃）で達成されるが、抽出工程は、上限３７〜４２℃又は上限５６℃の如き、より高い温度で行うことが出来、とはいうものの、より高い温度は核酸の回収率（recovery）を減少させるかもしれない。標本はある時間装置中に放置されることが許容されて良く、そして標本溶液は内腔を通して前後に動かされて（pumped）良い。洗浄緩衝剤は次に１つの孔中に、蠕動ポンプ，注射器，またはピペット（pipetter）の使用による如く、送り込まれる。洗浄緩衝剤の選択は部分的には、標本装填溶液の組成（composition）に従属する。一般的には、塩濃度は洗浄工程の間に減少され、そしてＰＨはわずかに増大される。溶解緩衝剤がカオトロピズムの塩（chaotropic salt）を包含しているのであれば、最初の洗浄剤は、同じ又は幾分低い濃度の塩（例えば、１〜３ＭＧｕＳＣＮ）もまた普通は含む。最後の洗浄剤は、下流の工程における核酸増幅の抑制を最小にするために、エタノール濃度を５０％以下、好ましくは略１０％〜２０％まで、減少させなければならない。洗浄溶液のアルコール含有量は通常は２０％と８０％との間の範囲にある。少なくとも５０％エタノール、好ましくは略７０％エタノールを含有している洗浄溶液は、核酸獲得を向上させることが分かっている。装置の内腔からの最後の洗浄剤の完全な除去はまた、或る実施形態において必要である。最後の洗浄剤のこの除去の為の方法は、空気ポンプを使用して内腔の表面上に空気を１乃至３分間通過させることによる乾燥を含む。洗浄後は、核酸は最後の洗浄剤よりも高いＰＨの低塩緩衝剤により装置から溶出される。溶出緩衝剤は典型的にはＰＨ≧８．０の低イオン強度（ionic strength）の緩衝された（buffered）溶液であり、とはいうものの核酸は水によって装置から溶出されることが出来る。溶出は最大略５６℃までの周囲温度で実施することが出来る。
【００４９】
この装置の設計は、液体及び気体の両方を含んでいる流体が一方の開口から他方の開口へと装置を通過することを許容する。この方法においては、緩衝剤は、洗浄及び溶出の効率を向上させる為に内腔を通って前後に動かされる（pumped）ことが出来、そして空気は残留緩衝剤を取り除く為に洗浄剤の間を通って動かされる（pumped）ことが出来る。装置は、試薬の導入及び除去に関して種々の方法で構成されることが出来る。１つの配置においては、試薬は孔の１つを介して装置の内腔中に導入され、そして他の孔を介して除去される。第２の配置においては、１つの孔が試薬の為の入口及び出口の両方として働き、そして第２の孔は吸引及び加圧を提供するポンプに連結されている。この第２の配置は、ポンプ及び流体分配制御手段が試薬と接触することを避けさせ、そして、腐食性薬品又は強力な溶剤である試薬を使用するのであれば特に好ましい。第３の配置は、第１及び第２の配置を組み合わせて幾つかの流体が１つの孔から他の孔まで完全に装置を完全に通って通過し、そして他の流体が同じ孔を介して導入され除去されるようにする。例えば、核酸を含有している標本が第１の孔を介して内腔中に導入され、そして第２の孔を介して除去されることが出来、そして、洗浄及び溶出試薬が第１の孔を介して適用された吸引及び空気圧力を使用して第２を介し導入されそして除去される。当該技術分野に習熟している人々は、これらの基本的な配置における多くの変更が可能であることを認識する。
【００５０】
当該技術分野に習熟している人々により理解されている如く、実際の動作容量は、内腔容量を含む、装置の寸法により、いつもの経験設計によっても、決定される。パスツールピペット（Pasteur pipette）と比較しえる小容量装置の為には、容量は普通は略２０μＬから略５００μＬまでの範囲であるが、最大１ｍＬまでの又は２．５ｍＬと同じ量までのより大きな容量が使用されることが出来る。標本は、溶出緩衝剤の容量を減少させることにより濃縮されることが出来る。
【００５１】
抽出された核酸の計量（quantitation）は溶出緩衝剤内における蛍光配合物（fluorescent compound）の包含により容易にされ、これによって、抽出された核酸が装置内に依然としてある間に、抽出工程上での迅速な品質チェックを提供する。従って、この発明の一つの実施形態の範囲内においては、核酸が核酸の濃度に応じた蛍光発光強度を有している蛍光配合物（fluorescent compound）と接触され、そして蛍光配合物（fluorescent compound）の蛍光発光が測定される。核酸の濃度に応じた蛍光発光強度を有している蛍光配合物（fluorescent compound）は、核酸の存在により蛍光発光強度における適合−従属変化（conformation-dependent change）を発揮する蛍光配合物（fluorescent compound）である。役に立つ蛍光配合物（fluorescent compound）は、核酸の存在によりその強度を増加させる配合物を含む。代表的な蛍光配合物（fluorescent compound）は、ビス−ベンズイミダイン配合物（bis-benzimidine compound）の如き蛍光助剤微小溝結合薬剤（fluorogenic minor groove binder agent）及びエチジウムブロミド（ethidium bromide）の如き内位添加蛍光助剤薬剤（intercalating fluorogenic agent）、そして商業的に入手可能な蛍光染料（fluorescent dye）（例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ；インビトロゲン会社（Invitrogen Corp.））を含む。蛍光配合物（fluorescent compound）は、溶出緩衝剤内で装置中に導入されることが出来るし、又は内腔中で動けなくされていることが出来る。内腔中で蛍光配合物（fluorescent compound）を動けなくする為の方法及び役に立つ蛍光配合物（fluorescent compound）は、リードその他（Reed et al.），米国出願公報２００６０１６６２２３Ａ１中に記載されている。この発明の装置は、内腔中で蛍光配合物に対し励起エネルギーを伝達する為、そして内腔中で配合物からの蛍光発光放射強度（fluorescence emission intensity）を伝達する為に適した内腔の少なくとも一部分を有することにより、蛍光による内腔の調査（interrogation）を許容する。
【００５２】
第１には如何なる蛍光ＤＮＡ−結合染料もこの発明において使用されることが出来るが、ＰＣＲの如き下流の工程と矛盾しない染料（dye）を使用することが好ましい。好適な染料は、リードその他（Reed et al.），米国出願公報２００６０１６６２２３Ａ１により記載されているビス−ベンズイミダイン（bis-benzimidine）（ＢＢ）染料であり、これは３６０ｎｍ（４０ｎｍスリット幅）で励起された時に強力な蛍光発光信号（４６０ｎｍで検出，４０ｎｍフィルタースリット幅）を与える。ＢＢ染料はｄｓＤＮＡの為に選択されるが、ＲＮＡもまた検知できる。良く知られている緑蛍光発光染料、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ（インビトロゲン会社（Invitrogen Corp.））は、いわゆる「実時間（real time）」ＰＣＲ又は定量（quantitative）ＰＣＲにおいてしばしば使用されている。ＢＢ染料と大変似ていて、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎは、増幅前の抽出されたＤＮＡの計量（quantitate）及びＰＣＲの間の遺伝子−特定（gene-specific）増加の監視の両方の為に使用されることが出来る。ＮＡＳＢＡの如き等温核酸試験中における蛍光助剤（fluorogenic）ＤＮＡ染料又はＤＮＡプローブ（probe）の使用はまた知られている。
【００５３】
好適なビス−ベンズイミダイン（bis-benzimidine）染料は、いくつかのＤＮＡ−結合染料の如く敏感ではないものの、ＤＮＡ−豊富（rich）全血（whole blood）からの抽出後における標本のゲノムのＤＮＡ内容物の測定の為に良く適切であることが分かっている。微小溝−結合ＢＢ染料（minor groove−binding BB dye）は２重鎖状（double stranded）ＤＮＡの存在において青い蛍光を発し、そして、ＰＣＲ増幅緩衝剤に対し直接追加されることが出来る。反対に、ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（インビトロゲン（Invitrogen））の如き強力な結合ＤＮＡ染料はＰＣＲを阻止するかもしれない。
【００５４】
事前の証拠（preliminary evidence）は、ＰＣＲプライマー伸長法（primer extenson）がより高いアニーリング（annealing）温度（６１．５℃対６０℃）で行われるのであれば、ＢＢ染料が現存するＰＣＲ分析法（assay）において使用されることが出来ることを示している。溶出緩衝剤中におけるＢＢ染料の直接の包含は従って、遺伝子−特定（gene-specific）増幅以前，中，そして後においてＤＮＡが測定されることを許容する。ＢＢ染料の追加を要求するより高いプライマー伸長法（primer extenson）温度は、（ＰＣＲエンハンサー（enhancer）として作用する）ＰＣＲ分析法（assay）において好ましいかもしれない。ＭＧＢタックマン（TaqMan）システム（米国特許番号６，７２７、３５６）と大変似ていて、Ａ／Ｔ豊富（rich）プライマー／ターゲット（target）相互作用はＰＣＲ混合物（mix）においてＢＢにより安定され、そして増大された２倍の安定性（duplex stability）がより短い（より特定の）ＤＮＡプローブ（probe）が使用されることを許容する。青色発光ＭＧＢ染料は、２色蛍光助剤（fluorogenic）ＤＮＡプローブとともに広く使用されている緑〜赤蛍光波長を妨げることがない。
【００５５】
リボグリーン（Ribogreen）（蛍光プローブ及び研究生成物の分子プローブハンドブック（Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Product）、第９版、８章を参照）の如きＲＮＡ−選択染料もまた、装置又は溶出緩衝剤中において使用されることが出来る。ＲＮＡ−選択染料は、ＮＡＳＢＡの如き実時間ＲＮＡ分析法（real time RNA assay）の為に有利である。遺伝子−特定（gene-specific）ＤＮＡ又はＲＮＡ試験の抑制についての上述した警告（caveat）はまたＲＮＡ検出蛍光助剤（fluorogenic）染料にも適用される。
【００５６】
望むのであれば、装置は、洗浄による残留核酸及び／又は試薬の除去に引き続き、再使用されることが出来る。多くの場合において、満足の行く洗浄は、蒸留殺菌水（distrilled sterile water）の幾つか（典型的には５〜１０）の通路容積を内腔を通して走らせることにより達成されることが出来る。好適な方法においては、装置は最初に蒸留殺菌水（distrilled sterile water）の５〜１０の通路容積で洗浄され、続いて、７０％ＥｔＯＨの２〜３通路容積で洗浄され、次に、蒸留殺菌水（distrilled sterile water）による更なる２〜３の通路容積の洗浄により引き継がれる。洗浄溶液はポンプ（例えば、蠕動ポンプ），注射器，又はこれらと同様なものを使用し装置を通過して動かされることが出来る。清浄規約（cleaning protocal）は、自動化されているポンプを使用し多岐管を通じて実行されることが出来る。
【００５７】
結合された核酸は装置中に貯蔵され、試験結果の確認を含む後の試験において使用されることが出来る。装置はエタノールが豊富なリンス液（ethanol-rich rinse）によりすすがれ、そして乾燥される。貯蔵は室温で最大数日までであり、又は冷凍庫中でより長い期間である。
【００５８】
この発明はまた、上述した如き核酸抽出装置及び密閉された容器中の緩衝剤備えているキット（kit）を提供する。緩衝剤は、ここで一般的に述べられた如き溶解緩衝剤，洗浄緩衝剤，又は溶出緩衝剤であることが出来る。普通、装置は１つ以上の緩衝剤、一般には生物学的標本から核酸を抽出する為の緩衝剤の完全な一揃い（set）、とともに包装される。いくつかの適用の為に、溶出緩衝剤は、核酸の存在により蛍光発光強度における変化を発揮させる蛍光配合物（fluorescent compound）を備える。典型的なキットは、使用の為の印刷された指示書の一揃い（set）とともに、単一の包装中にこれらの構成部分を備えている。
【００５９】
この発明は、実験室研究（laboratory research），人及び獣医学，公衆健康及び衛生，犯罪科学，人類学研究，環境監視，そして工業において多数の適用を有する。このような適用は、限定されることなく、バクテリア及びウイルスの検知及び型決め（typing），微生物薬剤抵抗スクリーニング（screening），ウイルス負荷分析法（viral load assay），遺伝子型決定（genotyping），感染制御，そして（例えば、血液，組織，食物，化粧品，水，土，そして空気の）病原体（pathogen）スクリーニング，生薬ゲノム（pharmacogenomic），血漿（plasma）における細胞無し（cell-free）ＤＮＡの検出，白血球計数（white cell counting），そして、生物学的標本からのＤＮＡの準備及び分析が関係している他の分野を含む。上に記載されている如く、この発明の装置及び方法を使用して抽出された核酸は、増幅，ハイブリッド形成（hybridization），ブロッティング（blotting），そしてこれらの組み合わせを含む、種々の下流工程において容易に使用される。この発明の装置及び方法は、病気の病原体（pathogen）を特定する為に治療現場診断分析法（point-of-care diagnostic assay）内で採用されることが出来、そして、遺伝学上のスクリーニング（genetic screening）において使用されることが出来る。これらの装置及び方法はまた、犬，猫，馬，牛，羊，山羊，豚，その他の如き家畜及び伴侶動物（companion animal）を含む、動物の診断及び治療の為の獣医学の範囲内で使用されることが出来る。
【００６０】
核酸は、幅広い資源から抽出されることが出来る。研究及び医学適用の為に、適切な資源は、限定されることなく、痰（sputum），唾液（saliva），喉スワブ（throat swab），口内洗浄物（oral rinse），鼻咽頭スワブ（nasopharyngeal swab），鼻咽頭吸引物（nasopharyngeal aspirate），鼻スワブ（nasal swab），鼻洗浄液（nasal wash），粘液（mucus），気管支吸引物（bronchial aspiration），気管支肺胞洗浄流体（bronchoalveolar lavage fluid），
胸膜流体（pleural fluid），気管内吸引物（endotracheal aspirates），脳脊髄流体（cerebrospinal fluid），大便（feces），尿（urine），血液（blood），血漿（plasma），血清（serum），索血液（cord blood），血液構成要素（blood component）（例えば、血小板濃縮物（platelet concentrate）），血液培養（blood culture），抹消血液単核細胞（peripheral blood mononuclear cell），抹消血液白血球（peripheral blood leukocyte），血漿溶解産物（plasma lysate），白血球溶解産物（leukocyte lysate），緩衝剤被覆白血球（buffy coat leukocyte），肛門スワブ（anal swab），直腸スワブ（rectal swab），膣スワブ（vaginal swab），子宮頸管内（endocervical swab），精液（semen），生研標本（biopsy sample），リンパ系組織（lymphoid tissue）（例えば、扁桃（tonsil），リンパ節（lymph node）），骨髄（bone marrow），他の組織標本，バクテリア分離菌（bacterial isolate），硝子体液（vitreous fluid），羊膜流体（amniotic fluid），乳房乳（breast milk），そして細胞培養上澄み液（cell culture supernatant）を含む。核酸の抽出の為の他の出発材料は、水標本，空気標本，土標本，化粧品，食物，そして食物原料，医療品及び医療機器，そしてこれらと同様なものを含む。
【００６１】
この発明の方法及び組立体は、断片にされたＤＮＡの抽出及び分析の為に使用されることが出来る。ＤＮＡは、（制限エンドヌクリアーゼ（restriction endonuclease）及びデオキシリボヌクレアーゼ（DNase）による蒸解（digestion）を含んでいる）ヌクリアーゼ蒸解（nuclease digestion），音波粉砕（sonication），加熱，（剪断（shearing）又は渦巻き（vortexing）によるの如き）機械的な破砕（mechanical disruption），及び化学的な処理の如き、当該技術分野において知られている種々の方法により断片にされることが出来る。
【００６２】
適用可能な化学的な処理は、例えば、鉄の如き金属イオン（Zhang et al., Nucl.Acids Res. 29(13):e66, 2001），重硫酸塩（bisulfate）の如き酸化剤（Ehrich et al., Nucl.Acids Res. 35(5):e29, 2007），そして、ブレオマイシン（bleomycin）の如き抗生物質及び医薬品（Chen et al., Nucl.Acids Res. 3<5(II):3781-3790, 2008）の使用を含む。断片にされたＤＮＡの準備は寸法の或る範囲の断片を包含することが出来、又は、寸法の範囲が比較的制限されて良い。当該技術分野において習熟している人々は、断片の実際の寸法が選択された断片化方法及び使用された条件（例えば、処置の時間）の如き要因により決定されることを認識する。
【００６３】
この発明に従って準備された核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction）（ＰＣＲ）（例えば、ミュリス（Mullis），米国特許番号４，６８３，２０２参照）及び等温増幅方法を含む、当該技術分野において知られている方法により増幅されることが出来る。実時間ポリメラーゼ連鎖反応（real-time polymerase chain reaction）（ＲＴ−ＰＣＲ）が通常は使用されている。例えば、Cockerill, Arch. Pathol. Lab. Med. 127:1112-1120, 2002; and Cockerill and Uhl, "Applications and challenges of real-time PCR for the clinical microbiology laboratory," pp.3-27 in Reischl et al, eds., Rapid cycle real-time PCR methods and applications, Springer-Verlag, Berlin, 2002を参照。臨床細菌学（clinical microbiology）におけるＲＴ−ＰＣＲの使用の概観（review）の為には、Espy et al., Clin. Microbiol. Rev. 19:165-256, 2006を参照。ＰＣＲを実行する為の器具の使用（Instrumentation）及び化学（chemistry）は商業的に入手可能である。器具は、熱循環器（thermal cyclers）（例えば、生物系（Biosystem）に適用されたABI7000, 7300, 7500, 7700, and 7900, Foster City, CA; 科学（Science）に適用されたLIGHTCYCLER, Roche, Indianapolis, IN; SMARTCYCLER, Cepheid, Sunnyvale, CA; ICYCLER, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA; ROBOCYCLER and MX3000P, Stratagene, La Jolla, CA），蛍光発光プローブ（fluorescent probe）とともに使用される検出システム（detection system）（例えば、MYIQ and CHROMO4, Bio-Rad Laboratories, Inc.），核酸分析器（nucleic acid analyzer）（例えば、Rotor-Gene 6000, Corbett Life Science, Concorde, NSW, Australia），そして、増幅及び検出システム（amplification and detection system）（例えば、BD PROBETEC ET, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）。他のＰＣＲ技術は、定量（quantitative）ＰＣＲの為の蛍光発光染料（fluorescent dye）（例えば、SYBR, Invitrogen Corp.）、及び、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギートランスファー（fluorescent resonance energy transfer）ハイブリッド形成プローブ（hybridization probe）（Walker, Science 296:557-559, 2002），ＴＡＱＭＡＮプローブ（probe）（バイオシステムに適用された、 Foster City, CA; 参照，Kutyavin et al., Nucl. Acids. Res. 28:655-661, 2000），ＥＣＬＩＰＳＥプローブ（probe）（Nanogen, Bothell WA），そして分子ビーコン（molecular beacon）（米国特許番号５，９２５，５１７及び６，１５０，０９７）を含んでいるフッ素形成プローブ（fluorogenic probe）を含む。当該技術分野において知られている等温増幅方法は、核酸連鎖基礎増幅（nucleic acid sequence-based amplification）（ＮＡＳＢＡ）（Malek et al., 米国特許番号５，１３０，２３８；Compton, Nature 350:91-92, 1991; Deiman et al., Mol. Biotechnol. 20:163-179, 2002），分岐されたＤＮＡ（branched DNA）（Alter et al., J. Viral Hepat. 2:121-132, 1995; Erice et al., J. Clin. Microbiol. 38:2837-2845, 2000），転写仲介増幅（transcription mediated amplification）（Hill, Expert. Rev. Mol. Diagn. 1:445-455, 2001）， 鎖移動増幅（strand displacement amplification）（Walker, PCR Methods and Applications 3:1-6, 1993; Spargo et al., Mol. Cell Probes 10:247-256, 1996），ヘリケース−従属増幅（helicase-dependent amplification）（Vincent et al., EMBO Rep. 5:795-800, 2004）， 
ループ−仲介等温増幅（loop-mediated isothermal amplification）（Notomi et al., Nucl. Acids Res. 28:E63, 2000），ＩＮＶＡＤＥＲ分析法（INVADER assay）（Olivier et al., Nucl. Acids Res. 30:e53, 2002; Ledford et al., J. Mol. Diagn.2:97-104, 2000），循環プローブ技術（cycling probe technology）（Duck et al., BioTechniques 9:142-148, 1990; Cloney et al., Mol. Cell Probes 13:191-197, 1999），回転循環増幅（rolling circle amplification）（Fire and Xu, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92:4641-4645, 1995; Liu et al., J. Am. Chem. Soc.118:1587-1594, 1996），そして、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Q-beta replicase）（Shah et al., J. Clin. Microbiol. 32:2718-2724, 1994; Shah et al., J. Clin. Microbiol. 33:1435-1441, 1995）を含む。等温増幅方法の検討（review）の為には、Gill and Ghaemi, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 27:224-243, 2008を参照。
【００６４】
ＮＡＳＢＡは、標的（target）核酸連鎖（sequence）を増幅させる３つの酵素（enzyme）の協力した動作に従っている。２重鎖状ＤＮＡを増幅させることが出来る一方で、ＮＡＳＢＡは、ＲＮＡの増幅の為に特に適している。標的（target）ＲＮＡは第１プライマー（primer）に対する結合により作業周期（cycle）に入り、それは次に、ＤＮＡ／ＲＮＡ交雑（hybrid）を形成する為に逆転写酵素（reverse transcriptase）により伸展される（extended）。ＲＮＡ鎖はＲＮａｓｅの動作により除去されて単一鎖ｃＤＮＡを産出する。このｃＤＮＡは（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（polymerase）プロモータ連鎖（promoter sequence）を含む）第２プライマー（primer）と結合でき、そして次に逆転写酵素活動（reverse transcriptase activity）の動作により２重鎖中間体（intermediate）を形成する。中間体は次に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（polymerase）の動作により複数の単一鎖ＲＮＡ複写（copy）（テンプレート（template）の複写（copy）当たり１０〜１０００複写）中に複写される。これ等のＲＮＡ複写は次に作業周期（cycle）に入り、そして、自己持続法（self-sustained manner）によりより多くの複写を形成することを続ける。ＮＡＳＢＡ機構に基づいて、２つの産出物が検出されることが出来る：２重鎖ＤＮＡ中間体及び単一鎖ＲＮＡ産出物（product）である。
【００６５】
ＮＡＳＢＡは、等温（即ち、温度循環（temperature cycling）が要求されていない）なので、この発明の装置とともに使用するのに好都合である。ＤＮＡ標本が選択された時を除き、変性化（denaturation）工程は必要でない。この発明の装置においてＮＡＳＢＡが行われる時の２つの考慮すべきことは、熱伝達及びタンパク質吸着である。反応温度は３０℃〜５０℃の範囲内でなけれならず、通常は少なくとも３７℃、そして好ましくは４２℃であり、ここではプライマー結合（primer binding）がより効果的になる。室温はＮＡＳＢＡを支持せず、そして、通路温度は効果的に上げられなくてはならず、さもなければ反応は働かない。さらに、ＮＡＳＢＡ酵素（enzyme）の如きタンパク質はガラス及びいくつかの有機ポリマー材料に容易に付着し、それらを動かなくしてＮＡＳＢＡ作業周期（cycle）を停止させる。これらに向けられた２つの方法は、（１）血清アルブミン（serum albumin）の如き担体（carrier）をガラスに予め吸着（preadsorb）させておくこと、又は（２）十分な血清アルブミン（serum albumin）をＮＡＳＢＡ反応混合物（reaction mixture）に追加し酵素（enzyme）の損失を最小にすること、である。
【００６６】
核酸増幅のさらなる方法は当該技術分野において知られていて、この発明に従って準備されたＤＮＡに対し適用されることが出来る。このような方法の例は、リガーゼ連鎖反応（ligase chain reaction）（Wu and Wallace, Genomics 4:560-569, 1989; Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193, 1991），ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応（polymerase ligase chain reaction）（Garany, PCR Methods and Applic. 1:5-16, 1991），ギャプリガーゼ連鎖反応（gap ligase chain reaction）（Segev, WO 90/01069），修復連鎖反応（repair chain reaction）（Backman et al., 米国特許番号第５，７９２，６０７）． そして回転循環増幅（rolling circle amplification）（ＲＣＡ）（Lisby, Mol. Biotechnol. 12:75-99, 1999）を含む。
【００６７】
当該技術分野における通常の技術の人々により理解される如く、この発明に従い準備された核酸はまた、当該技術分野において知られている方法を使用して増幅することなく検出され及び／又は分析されることが出来る。適切な方法は、限定されることなく、蛍光剤（fluorescence）または免疫学的検定法（immunoassay）と連結されることが出来、オリゴヌクレオチド−ナノ微粒子共役（oligonucleotide-nanoparticle conjugate）へのハイブリッド形成（hybridization）（Park et al., 米国特許番号７，１６９，５５６）及びＤＮＡバーコード（DNA barcodes）（Mirkin et al.,米国出願公開番号２００６００４０２８６Ａ１）を含んでいるハイブリッド形成（hybridization）；ハイブリッド形成（hybridization），診断（diagnostic），遺伝子特定（gene identification），多型性分析（polymorphism analysis），そして核酸連鎖化（nucleic acid sequencing）によるプロファイリング（profiling）を発現（expression）させる為に使用されることが出来る、微小配列技術（microarray technology）；ハイブリッド形成保護分析法（hybridization protection assay）（Arnold et al., Clin. Chem. 35:1588-1594, 1989）；２重運動分析法（dual kinetic assay）（例えば、APTIMA COMBO 2 assay, Gen-Probe Incorporated）；そして、微小連鎖化（microsequencing）（例えば、MICROSEQ 500 16s rDNA bacterial identification kit, Applied Biosystems）を含んでいる連鎖化（sequencing）を含む。多型性検出（detecting polymorphisms）の方法は、血漿（plasma）ｍＲＮＡ分配（distributions）及び／又は血漿（plasma）ＤＮＡのメチル化（methylation）及びヒストン変異（histone modification）（Fan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:16266-16271, 2005）の如き細胞無し（cell-free）核酸の従来知られていない特徴を検出することが出来る巨大な平行ショットガン連鎖化（massively parallel shotgun sequencing）（Nature 437:326-327, 2005）を含む。当該技術分野における通常の技術の人々はさらに、これらの及び他の方法が核酸増幅との組み合わせにおいて使用されることが出来ることを認識する。
【００６８】
上述した如く、抽出された核酸は、バクテリア，ウイルス，菌門（fungi），そして寄生生物（parasite）を含む、病原体（pathogen）を検出する為の方法の範囲内で使用されることが出来る。さらには、抽出された核酸は、薬抵抗性（drug resistance）及び感染因子（infectious agent）の薬剤感受性（drug sensitivity）（例えば、ブドウ球菌アウレアス（staphylocccus aureus））におけるメチシリン（methicillin）又は他の抗生物質耐性（antibiotic resistance）を特徴付けする為に分析されることが出来る。多くのこのような方法が当該技術分野において知られていて、そして多数のこのような試験が人の診断の使用の為に米国食糧医薬局（U.S. Food and Drug Administration）により承認されている。例えば表１は、クラミジア（chlamydia）の為のＦＤＡ−認証試験の一覧表（list）である。追加の試験が、表２−１，２−２，２−３中に一覧表にされている（listed）。核酸を基礎とした試験が関係していることが知られている他の病原体（pathogen）は、血液生成病原体（bloodborne pathogen），コクシジオイデスイミット（Coccidioides immiti），クリプトコックス（Cryptococcus），膣ガルドネレラ（Gardnerella vaginalis），ヘモフィルス種（Haemophilus spp.），ヒストプラズマ被膜体（Histoplasma capsulatum），インフルエンザウイルス（influenza virus），マイコプラズマ種（Mycoplasma spp.），サルモネラ種（Salmonella spp.），赤痢菌種（Shigella spp.），そして膣トリコモナス（Trichomonas vaginalis）を含む。ＰＣＲを使用した、食物及び他の生産物の標本における、バクテリア，ウィルス，菌門（fungi），そして寄生生物（parasite）を含む微生物汚染の検出の為の方法は、例えばロミックその他（Romick et al.），米国特許番号６，４６８，７４３Ｂ１により開示されている。腸球菌種（Enterococcus species）の為の水標本試験におけるＰＣＲの使用は、Frahm and Obst, J. Microbiol. Methods 52:123-131, 2003により開示されている。
【表１】
2012508015.tif 000003
【表２−１】
2012508015.tif 000004
【表２−２】
2012508015.tif 000005
【表２−３】
2012508015.tif 000006
【００６９】
ウィルスの検出及び診断の為の試験はまた当該技術分野において知られている。このような試験の例が表３−１，３−２，そして３−３中に示されている。
【表３−１】
2012508015.tif 000007
【表３−２】
2012508015.tif 000008
【表３−３】
2012508015.tif 000009
【００７０】
真菌類病原体（fungal pathogen）の検出及び診断の為の試験の例が、表４中に示されている。
【表４】
2012508015.tif 000010
【００７１】
寄生生物（parasite）の検出及び診断の為の知られている試験の例が、表５中に示されている。
【表５】
2012508015.tif 000011
【００７２】
この発明に従って準備されたＤＮＡはまた、出生前スクリーニング（screening），病気疾病素質の予想（prediction of disease predisposition）（例えば、高血圧症（hypertension），骨粗しょう症（osteoporosis），早期発症アルツハイマー症（early onset Alzheimer's），Ｉ型糖尿病（type I diabetes），そして心臓血管病（cardiovascular disease）），毒物学（toxicology），薬有効性調査（drug efficacy studies），そして物質代謝調査（metabolic studies）の如き遺伝子型決め（genotyping）において使用されることが出来る。例は、腹腔の病気（celiac disease），嚢胞性繊維症（cystic fibrosis），ＨＬＡ−Ｂ２７，ナルコレプシー（narcolepsy），そしてテイ−サック病（Tay-Sachs disease）（Kimball Genetics Inc., Denver, CO）の為の試験を含む。薬有効性（drug efficacy）又は投薬（dosing）を予測する為の試験は、例えばＡＣＥ抑制応答者分析法（ACE inhibitor responder assays），薬物代謝（drug metabolism）の割合に影響しているＣＹＰ２Ｄ６＆ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子（gene）におけるＤＮＡ多型性（polymorphisms）の為のスクリーニング（screening），タモキシフェン代謝（tamoxifen metabolism）に影響している遺伝子（gene）の為のスクリーニング（screening），そしてイリノテカン投薬（irinotecan dosing）の為の遺伝的スクリーニング（genetic screening）を含む。単一ヌクレオチドエ多型性（single nucleotide polymorphisms）（ＳＮＰｓ）の遺伝子型決定（genotyping）は、ＰＣＲを基にした分析法（PCR-based assay）を使用したハスその他（Hsu et al.）, Clin. Chem. 47:1373-1377, 2001により、そして微小配列プラットフォーム（microarray platform）を使用したバオその他（Bao et al.），Nucl. Acids Res. 33(2):e15, 2005により開示されている。ＳＮＰｓは、複雑な遺伝的疾患（complex genetic disorder），薬応答性（drug response），そして他の遺伝的体質（genetic trait）の診断（diagnostic）となりえる。癌治療案内の為に使用される試験は、それらの遺伝子発現水準（expression level）を含む、ＢＲＣＡ−１，ＢＲＣＡ−２，そしてＨｅｒ−２／Ｎｅｕの為の試験を含む。ミンその他（Min et al. ）（Cancer Research 58:4581-4584, 1998）は、ＲＴ−ＰＣＲによる腫瘍マーカー（tumor marker）の発現（expression）の為の見張りリンパ節（sentinel lymph nodes）のスクリーニング（screening）の方法を開示している。核酸技術を使用した他の癌マーカー（cancer marker）の特定（Identification）は調査中である。さらなる遺伝的試験（genetic test）は表６−１及び６−２中に示されている。
【表６−１】
2012508015.tif 000012
【表６−２】
2012508015.tif 000013
【００７３】
この発明はまた、血漿（plasma）における細胞無し（cell-free）ＤＮＡの検出の為にも使用されることが出来る。細胞無し（cell-free）ゲノムのＤＮＡの増大された濃縮は、全身性の狼瘡エリストマーデス（systemic lupus erythematosus），肺塞栓症（pulmonary embolism），そして悪性疾患（malignancy）の症状（symptomatic）である。母系血漿（maternal plasma）又は血清（serum）における胎児の（fetal）ＤＮＡは、性（gender）及びアカゲザル状況（rhesus status）の決定，或る異常血色素症（haemoglobinopathies）の検出，そして、潜在性索状組織血液寄付（potential cord blood donation）の為の胎児（fetal）ＨＬＡ状態の決定の為に使用されて良い。例えば、リードその他（Reed et al.），骨髄移植（Bone Marrow Transplantation）29:527-529, 2002を見よ。循環している胎児のＤＮＡの異常に高い濃縮は、胎児におけるトリソミー２１（trisomy 21）（ロその他（Lo et al.）,Clin. Chem. 45:1747-1751, 1999）及び子癇前症（レビンその他（Levine et al.），Am. J. Obstet. Gynecol. 190:707-713, 2004）と対応している。母系血漿（maternal plasma）又は血清（serum）における胎児の（fetal）ＤＮＡを測定する為の方法は、当該技術分野において知られている。例えば、ロその他（Lo et al.），Lancet 350:485-487, 1997 及びロその他（Lo et al.），Am. J. Hum. Genet. 62:768-775, 1998を見よ。特に価値のある適用は、母系血漿（maternal plasma）を使用した胎児の（fetal）アカゲザルＤ状態（Rhesus D status）を決定する為の胎児の（fetal）ＤＮＡの遺伝子決定（genotyping）の使用である（ミュラーその他（Muller et al.），Transfusion 48: 2292-2301, 2008）。
【００７４】
この発明に従い準備されたＤＮＡはまた、ＲＴＣ−ＰＣＲによる血小板（platelet）濃縮における残留（residual）白血球（white blood cell）又はＷＢＣ断片（fragment）の計量（quantitation）の為に使用されることができる。例えば、リーその他（Lee et al.），Transfusion 42:87-93, 2002；モハマディその他（Mohammadi et al.），Transfusion 44:1314-1318, 2004；そしてディクストラ−ティクストラその他（Dijkstra-Tiekstra et al.）， Vox Sanguinis 87:250-256, 2004を参照。
【００７５】
この発明はまた、病気スクリーニング及び診断を含む、獣医学（veterinary medicine）に対しても適用可能である。例えば、オーストラリアへ輸入された馬は、ＰＣＲにより馬インフルエンザ（equine influenza）の為に試験されなければならない。馬インフルエンザは犬に伝染されることが出来る（クロフォードその他（Crawford et al.）Science 310:482-485, 2005）。
【００７６】
この発明は、以下の限定しない例によりさらに図示される。
【００７７】
例
例１
ＤＮＡの浄化（purification）の為に滑らかで湾曲されたガラス表面を使用することの可能性は、パスツールピペットの内表面を使用して試験された。血液溶解産物（blood lysate）が、１０μｌプロテイナーゼ（Proteinase）Ｋ（１０ｍｇ／ｍｌ），２００μｌ全血（whole blood），そして２００μｌ溶解（lysis）緩衝剤（６Ｍグアニジン（guanidine）ＨＣＩ，２０ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０ｍＭクエン酸ＰＨ６，１０％Ｔｗｅｅｎ−２０，３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を混合することにより準備された。１５分後、１００％エタノール（ethanol）の２００μｌが追加された。溶解産物（lysate）は次に、パスツールピペット中に引き上げられ、そして略１５分間留められることが許容された。溶解産物（lysate）は次に排出された。ピペットは次に洗浄（Wash）１（２Ｍグアニジン（guanidine）ＨＣＩ，７ｍＭ  ＥＤＴＡ，１７ｍＭクエン酸ＰＨ６，３３％エタノール）により３回洗浄され、そして洗浄（Wash）２（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＰＨ７．７０％エタノール）により４回洗浄された。余分なエタノールは、３０分間の真空の下で乾燥された。結合されたＤＮＡは、各々２００μｌＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  １ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）を使用した３回連続の溶出（elusion）においてガラス表面から溶出された。２μｌの個々の溶出は、商業的に入手可能な分析法（assay）（ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ分析法（assay）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して計量された（quantitated）。
【００７８】
浄化は３回行われ、そして、平坦ガラス核酸獲得表面（Ｓ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｃａｒｄ  Ｂ００２３；リードその他（Reed et al.），米国出願公開番号２００９０２１５１２５Ａ１参照）を備えている装置と比較された。計量（quantitation）の結果が表７中に示されている。
【表７】
2012508015.tif 000014
【００７９】
この実験においては、Ｓ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｃａｒｄは、第１溶出において２００μｌの血液から略９ｎｇのＤＮＡのみが回収された（recover）。対照的に、ピペットはより多くのＤＮＡ（標本１および３）を分離させた。標本２は計量（quantitation）から外された。その理由は知られていない。ピペット及びＳ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｃａｒｄの全表面積は決定されなかったが、ＤＮＡを浄化するにはピペットがより効率的であろう。
【００８０】
分離されたＤＮＡの機能性（functionality）を試験する為に、人ＧＡＰＤＨの為のプライマーを使用してＰＣＲが行われた。ＰＣＲ反応（５０−μｌ容量）が、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０，５０ｍＭ  ＫＣＩ，３ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２００μＭ  ｄＮＴＰｓ，１μＭの各クプライマー，０．２単位（unit）Ｔａｑポリメラーゼ（polymerase）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ），そして５μｌの希釈されていない標本を含んだ混合物において行われた。プライマーは、Ｇ３００１（ＧＡＧＡＴＣＣＣＴＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＧ；ＳＥＱ ＩＤ  ＮＯ：１）及びＧ３００２（ＣＡＡＡＧＴＴＧＴＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＣ；ＳＥＱ ＩＤ  ＮＯ：２）であった。熱循環（thermocyle）図表（profile）は、全３５サイクルの間に９４℃で１分，５４℃で１分，そして７２℃で１分であった。７．５μＬの個々の反応が、２μｌの標本緩衝剤（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と混合され、ＩＸ  ＴＡＥ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート（Acetate）ｐＨ８．３，１ｍｍ  ＥＤＴＡ）中の２％アガロースゲル（agarose gel）及び２μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド（ethidium bromide）上で行われた。バンド（band）は、短波長ＵＶ光の下で見ることが出来、そして写真に撮られた。
【００８１】
ＰＣＲ産出物のゲル（gel）分析は図５中に示されている。「Ｍ」で印をつけられたレーン（lane）は電気泳動の動きの標識（mobility marker）を含んでいる。「（−）」及び「（＋）」レーンは、テンプレート追加無し（no-template added）制御及び１０ｎｇの人ＤＮＡ（シグマ−アルドリッヒ（Shigma-Aldrich））の追加による積極（positive）制御の夫々を示しているＰＣＲ制御である。Ｂ００２３は、Ｓ−通路浄化（S-channel purified）ＤＮＡに関係している。次の９つのレーン（lane）は、第１，第２，そして第３溶出からのピペット分離（pipette-isolated）ＤＮＡである。パスツールピペットから分離（isolated）された全てのＤＮＡは、非常に効率よく増幅された。
【００８２】
これらの結果は、滑らかで湾曲されているガラス表面が複雑な生物学的標本（血液）からのＤＮＡの為の適切な分離（isolation）媒体であることを証明している。ＤＮＡは良い収量（yield）で分離されることができ、そしてＰＣＲ中で非常に効率よく増幅されることが出来る。
【００８３】
例２
ガラスパスツールピペット及びガラススライド（１インチＸ３インチ及び２インチＸ３インチ）が、ＤＮＡ結合の為のそれらの能力を比較された。使用された緩衝剤は例１中に開示されている。全ての場合における標本は、０．６ｍＬ結合緩衝剤（０．２ｍｌ溶解緩衝剤＋０．２ｍｌ水＋０．２ｍｌアルコール＋ＤＮＡ）中のＤＮＡ（５００ｎｇ又は１０００ｎｇ）であった。ＤＮＡ標本は、ガラススライド上に置かれ、そして３０分間静止される（layered）ことが許容された。スライドは次に洗浄（Wash）１により３回（3X）、そして洗浄（Wash）２により６回（6X）洗浄された。洗浄されたスライドは一晩中空気乾燥されることが許容された。結合されたＤＮＡはＴＥ緩衝剤の３つの０．２ｍｌアリコート（aliquot）中に溶出された。
【００８４】
ピペットの為に、標本の０．６ｍＬがピペット中に引かれ、そして、ピペットの上部が標本を所定位置に中に保持するよう密閉された。ピペットの幅広い部位が内腔のテーパーにされている部位の上方略１．８ｃｍまで内腔の幅広い部位中に満たされた。液体はまた、内腔の狭い部位中に６ｃｍ位置された。３０分後、結合混合物が排出され、そしてピペットが３回（3X）洗浄（Wash）１を、そして６回（6X）、そして洗浄（Wash）２をピペット中に引き上げることにより洗浄された。ピペットは一晩かけて空気乾燥されることが許容された。結合されたＤＮＡを溶出する為に、０．２ｍｌＴＥがピペット中に引かれて内表面をすすぎ、次に排出される。ピペットは、内表面上に形成されたＴＥのフィルムを回収する為に、小部分（a bit）が引かれることを許容された。溶出は２回以上繰り返された。
【００８５】
ピペットの表面は０．６９６ｃｍの幅広端の外直径と０．１２３ｃｍの狭い端の外直径を使用して評価された。表面積は次の式から計算された。表面積＝２ＸＰｉＸ半径Ｘ高さ（又は、ＰｉＸ直径Ｘ高さ）。計算目的の為に、テーパ―の半分が大きな直径の区域中に含まれ、そして半分が小さな直径の区域中に含まれている。ピペットの幅広端中及び狭い端中の液体により覆われた面積は計算され、そして、液体（結合混合物（binding mix））により覆われた全面積の為に合計された。計算された面積は６．２ｃｍ２であり、実際の内表面面積幾分少ないと考えられる。
【００８６】
ＤＮＡ収量（yied）は、スライド又はピペットのいずれかの表面積に統一化（normalize）された。結果は表８中に示されている。
【表８】
2012508015.tif 000015
【００８７】
結果は、表面積に統一化（normalize）されたとき、ＤＮＡ分離においてはガラススライドに比べピペットが略２倍効率的であったことを示した。上述した如く、ピペットの内表面面積は過大評価されると信じられ、その結果実際の結合容量は多分より大きい。パーセント収量（percent yield）はピペットにおいてより低く、しかし、より小さな表面面積のおかげで効率はより高い。
【００８８】
例３
２０μＬプロテイナーゼ（Proteinase）が２００μＬ全血と混合された。２００μＬ溶解剤（２８．７ｇグアニジン塩酸塩（guanidine hydrochloride），２５ｍＬ  ０．１Ｍ  クエン酸塩ナトリウム（sodium citrate）ＰＨ６．５，２．５ｍＬ  ０．２Ｍ  ＥＤＴＡ，１ｍＬ  ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００，３ｍＬ  ＴＷＥＥＮ−２０）が加えられた。溶液は良く混合され、そして５６℃で１５分間培養（incubate）された。溶液は次に冷やされ、そして２００μＬエタノールが加えられた。チューブの内容物は混合され、そしてチューブは回転降下（spin down）の為に遠心された。
【００８９】
一つの孔に連結された注射器を使用して、全標本が抽出装置中にゆっくりと装填された。標本は装置を通過して移動し、そして内腔が次に洗浄緩衝剤１（水の等しい容積により薄められ清浄剤（detergent）を伴っていない溶解緩衝剤及び１００％エタノール）により満たされた。緩衝剤は取り除かれ、そして洗浄が繰り返された。内腔は次に、（５０部（parts）洗浄剤２濃縮物（１０ｍＬ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ，５ｍＬ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ，そして５Ｎ  ＨＣＩによりｐＨ７．４に調節された２．９３ｇ  ＮＡＣＬ）を３０部の水及び２０部の１００％エタノールと混合させることにより準備された）洗浄緩衝剤２により満たされ、そして緩衝剤は３０秒乃至１２分放置されることが許容され、次に完全に取り除かれる。この洗浄は２回繰り返された。装置は次に、洗浄剤２の如何なる付着した滴（drop）を回収するよう前後にわずかに揺すられ、それらは注射器により取り除かれる。
【００９０】
結合されたＤＮＡを溶出させる為に、７５乃至１００μＬのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）が装置中に装填され、そして内腔を通してその末端までゆっくり掃き流され（swept）、次に戻される。この溶出物は計量（quantitation）の為に回収された。
【００９１】
例４
血液からＲＮＡを浄化する（purify）為に、商業的に入手可能な緩衝剤（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）が使用された。赤血球（erythrocyte）溶解溶液（緩衝剤  ＥＬ）の５容積が全血の標本に加えられた。この溶液は赤血球細胞を溶解し、そしてＲＮＡ−包含白血球細胞を無傷のままに残す。白血球細胞は次に、遠心によりペレットにされた（pelleted）。赤血球細胞汚染を取り除く為に１つの追加の洗浄の後に、白血球は（グアニジンチオシアン酸塩（guanidine thiocyanate）を包含している）緩衝剤ＲＬＴ中で溶解された。純粋エタノールが溶解物中に加えられ、それは次にチューブ状抽出装置中に注入された。装置は、ＲＮＡがガラス中に吸着されるよう２０分間静止（stand）されるよう放置された。吸着後、内腔は緩衝剤ＲＷ１及び（エタノールを含んでいる）緩衝剤ＲＰＥによりすすがれた。ＲＮＡは無菌水（sterile water）により内腔から溶出された。
【００９２】
前述したことから、この発明の特定の実施形態が図示の目的のためにここに記載されていたが、種々の実施形態をこの発明の精神及び範囲から逸脱することなく作られて良い。従って、発明は添付の請求の範囲による以外には限定されない。
【図１】
2012508015.tif 000016
【図２Ａ】
2012508015.tif 000017
【図２Ｂ】
2012508015.tif 000018
【図３】
2012508015.tif 000019
【図４】
2012508015.tif 000020
【図５】
2012508015.tif 000021
【図６Ａ】
2012508015.tif 000022
【図６Ｂ】
2012508015.tif 000023
【図７Ａ】
2012508015.tif 000024
【図７Ｂ】
2012508015.tif 000025
【図８Ａ】
2012508015.tif 000026
【図８Ｂ】
2012508015.tif 000027
【配列表】
2012508015000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年11月14日(2011.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内表面，外表面，第１孔，そして第２孔を備え、内表面が変性されておらず滑らかなガラスから成り第１孔と第２孔との間の流体連通を提供している管状内腔を規定していて、内腔が断面において円形状，長円形状，又は楕円形状であり、そして内腔が核酸特定結合位置から本質的に自由である、装置を提供する工程；
第１及び第２孔の１つを介して装置の内腔中に核酸を包含している標本を導入する工程；
標本中の核酸を変性されておらず滑らかなガラス表面に結合させて結合された核酸を産出することを許容する工程；そして、
結合された核酸を洗浄する工程、
を備えている、生物学的標本から核酸を抽出する為の方法。
【請求項２】
洗浄工程に続き、変性されておらず滑らかなガラス表面から結合された核酸を溶出させる工程をさらに備えている、請求項１の方法。
【請求項３】
溶出された核酸を増幅する追加の工程を備えている、請求項２の方法。
【請求項４】
内腔が、長手方向軸を伴っている線状内腔であり、任意に、内腔の少なくとも一部分が、長手方向軸に沿いテーパーにされている、請求項１乃至３のいずれか１項の方法。
【請求項５】
内腔が曲がりくねっている、請求項１乃至３のいずれか１項の方法。
【請求項６】
外表面が長手方向峰を備えている、請求項１乃至５のいずれか１項の方法。
【請求項７】
装置が内腔中に内方構成要素を備えており、内方構成要素が断面において凸状の変性されておらず滑らかなガラス表面を備えている、請求項１乃至４のいずれか１項の方法。
【請求項８】
細胞標本を溶解させて核酸を含有している標本を準備する工程をさらに備えている、請求項１乃至７のいずれか１項の方法。
【請求項９】
核酸を含有している標本がカオトロピズムの塩を備えている、請求項１乃至８のいずれか１項の方法。
【請求項１０】
核酸が導入工程に先立って断片化されている、請求項１乃至９のいずれか１項の方法。
【請求項１１】
内腔の少なくとも一部分を通過する液体の流れが乱流である、請求項１乃至１０のいずれか１項の方法。
【請求項１２】
洗浄工程が：
第１及び第２孔の前記一方を介して洗浄試薬を装置の内腔中に導入する工程；
洗浄試薬が結合された核酸に接触することを許容する工程；そして、
第１及び第２孔の前記一方を介して洗浄試薬を内腔から取り除く工程、
を備えている、
請求項１乃至１１のいずれか１項の方法。
【請求項１３】
内表面，外表面，第１孔，そして第２孔を備え、内表面が変性されておらず滑らかなガラスから成り第１孔と第２孔との間の流体連通を提供している管状内腔を規定していて、内腔が断面において円形状，長円形状，又は楕円形状であり、そして内腔が核酸特定結合位置から本質的に自由である、装置と；そして、
装置の内腔と流体連通しているポンプと、
を備えている組立体。
【請求項１４】
夫々が、内表面，外表面，第１孔，そして第２孔を備え、内表面が変性されておらず滑らかなガラスから成り第１孔と第２孔との間の流体連通を提供している管状内腔を規定していて、内腔が断面において円形状，長円形状，又は楕円形状であり、そして内腔が核酸特定結合位置から本質的に自由である、複数の装置と；
夫々が、複数の装置の１つを受け入れ複数の孔の１つを介してその内腔中へと流体通路を提供するよう適用されている、複数の連結具を備えている多岐管と；そして、
多岐管と流体連結しているポンプと、
を備えていて、
複数の装置の夫々が多岐管の連結具に連結されている、
組立体。
【請求項１５】
内表面，外表面，第１孔，そして第２孔を備え、内表面が変性されておらず滑らかなガラスから成り第１孔と第２孔との間の流体連通を提供している管状内腔を規定していて、内腔が断面において円形状，長円形状，又は楕円形状であり、そして内腔が核酸特定結合位置から本質的に自由である、装置と；そして、
密閉されている容器中の、溶解緩衝剤，洗浄緩衝剤，又は溶出緩衝剤と、
を備えているキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
前述したことから、この発明の特定の実施形態が図示の目的のためにここに記載されていたが、種々の実施形態をこの発明の精神及び範囲から逸脱することなく作られて良い。従って、発明は添付の請求の範囲による以外には限定されない。
なお、この発明は以下のようにも記載することが出来る。
１．内表面，外表面，第１孔，そして第２孔を備え、内表面が変性されておらず滑らかなガラスから成り第１孔と第２孔との間の流体連通を提供している管状内腔を規定していて、内腔が断面において円形状，長円形状，又は楕円形状であり、そして内腔が核酸特定結合位置から本質的に自由である、装置を提供する工程；
第１及び第２孔の１つを介して装置の内腔中に核酸を包含している標本を導入する工程；
標本中の核酸を変性されておらず滑らかなガラス表面に結合させて結合された核酸を産出することを許容する工程；そして、
結合された核酸を洗浄する工程、
を備えている、生物学的標本から核酸を抽出する為の方法。
２．洗浄工程に続き、変性されておらず滑らかなガラス表面から結合された核酸を溶出させる工程をさらに備えている、上記１の方法。
３．溶出された核酸を増幅する追加の工程を備えている、上記２の方法。
４．前記増幅工程が等温増幅を備えている、上記３の方法。
５．溶出された核酸が、第１及び第２孔の前記１つを介して内腔から取り除かれる、上記２の方法。
６．結合された核酸が、核酸の存在により蛍光発光強度の変化を発揮する蛍光配合物を含有している緩衝剤により溶出される、上記２の方法。
７．内腔が、長手方向軸を伴っている線状内腔である、上記１の方法。
８．内腔の少なくとも一部分が、長手方向軸に沿いテーパーにされている、上記７の方法。
９．内腔が曲がりくねっている、上記１の方法。
１０．内腔が螺旋状である、上記９の方法。
１１．外表面が長手方向峰を備えている、上記１の方法。
１２．装置が内腔中に内方構成要素を備えており、内方構成要素が断面において凸状の変性されておらず滑らかなガラス表面を備えている、上記１の方法。
１３．細胞標本を溶解させて核酸を含有している標本を準備する工程をさらに備えている、上記１の方法。
１４．核酸を含有している標本がカオトロピズムの塩を備えている、上記１の方法。
１５．核酸を含有している標本が動物の核酸を備えている、上記１の方法。
１６．動物の核酸が人の核酸である、上記１５の方法。
１７．核酸が微生物の核酸である、上記１の方法。
１８．核酸がＤＮＡである、上記１の方法。
１９．核酸が導入工程に先立って断片化されている、上記１の方法。
２０．内腔の少なくとも一部分を通過する液体の流れが乱流である、上記１の方法。
２１．洗浄工程が：
第１及び第２孔の前記一方を介して洗浄試薬を装置の内腔中に導入する工程；
洗浄試薬が結合された核酸に接触することを許容する工程；そして、
第１及び第２孔の前記一方を介して洗浄試薬を内腔から取り除く工程、
を備えている、
上記１の方法。
２２．内表面，外表面，第１孔，そして第２孔を備え、内表面が変性されておらず滑らかなガラスから成り第１孔と第２孔との間の流体連通を提供している管状内腔を規定していて、内腔が断面において円形状，長円形状，又は楕円形状であり、そして内腔が核酸特定結合位置から本質的に自由である、装置と；そして、
装置の内腔と流体連通しているポンプと、
を備えている組立体。
２３．ポンプが装置の第２孔に連結されている、上記２２の組立体。
２４．ポンプが多岐管を介し装置の第２孔に連結されている、上記２３の組立体。
２５．ポンプとの流体連結において流体分配制御手段をさらに備えている、上記２２の組立体。
２６．夫々が、内表面，外表面，第１孔，そして第２孔を備え、内表面が変性されておらず滑らかなガラスから成り第１孔と第２孔との間の流体連通を提供している管状内腔を規定していて、内腔が断面において円形状，長円形状，又は楕円形状であり、そして内腔が核酸特定結合位置から本質的に自由である、複数の装置と；
夫々が、複数の装置の１つを受け入れ複数の孔の１つを介してその内腔中へと流体通路を提供するよう適用されている、複数の連結具を備えている多岐管と；そして、
多岐管と流体連結しているポンプと、
を備えていて、
複数の装置の夫々が多岐管の連結具に連結されている、
組立体。
２７．内表面，外表面，第１孔，そして第２孔を備え、内表面が変性されておらず滑らかなガラスから成り第１孔と第２孔との間の流体連通を提供している管状内腔を規定していて、内腔が断面において円形状，長円形状，又は楕円形状であり、そして内腔が核酸特定結合位置から本質的に自由である、装置と；そして、
密閉されている容器中の、溶解緩衝剤，洗浄緩衝剤，又は溶出緩衝剤と、
を備えているキット。
２８．緩衝剤が、核酸の存在により蛍光発光強度の変化を発揮する蛍光配合物を備えている溶出緩衝剤である、上記２７のキット。
２９．配合物がビス−ベンズイミダイン配合物である、上記２８のキット。
【国際調査報告】
2012508015.tif 000028
2012508015.tif 000029
2012508015.tif 000030