(57)【要約】本発明は、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）のエンベロープタンパク質Ｅ２の立体配座エピトープの同定および特徴付けを提供する。本発明は、Ｅ２の立体配座エピトープを認識するヒトモノクローナル抗体のパネルを提供する。抗体は、ＨＣＶに感染した患者に由来する。本発明は、ＨＣＶ抗体を治療、診断および／または予防薬として利用する方法を提供する。本発明は、完全な立体配座エピトープを有するミモトープおよびミモトープを用いる方法を提供する。本発明は、ＨＣＶに対する患者の反応に基づいて患者を層別化する方法を提供する。本発明は、１つまたは複数のＨＣＶ抗体を含む、ＨＣＶの予防および治療用の医薬組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）エンベロープ糖タンパク質２（Ｅ２）のアミノ酸５２３〜５４０の範囲内の立体配座エピトープに対する抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体ＨＣ−１である抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体ＨＣ−３である抗体。
【請求項４】
モノクローナル抗体ＨＣ−１１である抗体。
【請求項５】
モノクローナル抗体ＣＢＨ−２３である抗体。
【請求項６】
ＨＣ−１により認識されるエピトープに対する抗体。
【請求項７】
ＨＣ−３により認識されるエピトープに対する抗体。
【請求項８】
ＨＣ−１１により認識されるエピトープに対する抗体。
【請求項９】
ＣＢＨ−２３により認識されるエピトープに対する抗体。
【請求項１０】
ＨＣ−１と、そのエピトープへの結合について競合する抗体。
【請求項１１】
ＨＣ−３と、そのエピトープへの結合について競合する抗体。
【請求項１２】
ＨＣ−１１と、そのエピトープへの結合について競合する抗体。
【請求項１３】
ＣＢＨ−２３と、そのエピトープへの結合について競合する抗体。
【請求項１４】
モノクローナル抗体である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
ヒト化抗体である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
哺乳類抗体である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３からなる群から選択される抗体の断片であって、該断片は、全抗体の抗原結合活性を保持する、抗体の断片。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗体を発現する細胞系。
【請求項１９】
Ｂ細胞系である、請求項１８に記載の細胞系。
【請求項２０】
ヒト細胞系である、請求項１８に記載の細胞系。
【請求項２１】
哺乳類細胞系である、請求項１８に記載の細胞系。
【請求項２２】
真核細胞系である、請求項２１に記載の細胞系。
【請求項２３】
ハイブリドーマである、請求項１８に記載の細胞系。
【請求項２４】
ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３からなる群から選択される抗体、ならびに
薬学的に許容される賦形剤
を含む医薬組成物。
【請求項２５】
ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３からなる群から選択される抗体により認識されるエピトープを認識する抗体、ならびに
薬学的に許容される賦形剤
を含む医薬組成物。
【請求項２６】
ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３からなる群から選択される抗体の断片であって、該断片は全抗体の抗原結合活性を保持する、抗体の断片、ならびに
薬学的に許容される賦形剤
を含む医薬組成物。
【請求項２７】
少なくとも１つの追加の抗ウィルス薬をさらに含む、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの追加の抗ウィルス薬がインターフェロン、抗ＨＣＶモノクローナル抗体、抗ＨＣＶポリクローナル抗体、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、リバビリン、プロテアーゼ阻害剤、ＩＲＥＳ阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、アンチセンス化合物、短鎖干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーおよびリボザイムからなる群から選択される、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの追加の抗ウィルス薬がインターフェロンである、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの追加の抗ウィルス薬がリバビリンである、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの追加の抗ウィルス薬がインターフェロンとリバビリンの組合せである、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの追加の抗ウィルス薬が抗ＨＣＶモノクローナル抗体である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記抗ＨＣＶモノクローナル抗体がエンベロープ糖タンパク質２（Ｅ２）を認識する、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記抗体が同一ＨＣＶ遺伝子型のタンパク質に対するものである、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記抗体が２つ以上のＨＣＶ遺伝子型のタンパク質に対するものである、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
ＨＣＶに感染した、またはＨＣＶ感染に罹患しやすい患者を準備するステップ、および
請求項１から３５のいずれか一項に記載の抗体または医薬組成物を該患者に投与するステップ
を含むＨＣＶに感染した患者を治療する方法。
【請求項３７】
ＨＣＶに感染した、またはＨＣＶ感染に罹患しやすい患者を準備するステップ、および
請求項１から３５のいずれか一項に記載の抗体または医薬組成物を該患者に投与するステップ
を含むＨＣＶに曝露された患者を治療する方法。
【請求項３８】
治療上有効な量が前記対象におけるＨＣＶ感染を治療するのに十分な量である、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
治療上有効な量が前記対象におけるＨＣＶ感染の再発を低減させるのに十分な量である、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４０】
治療上有効な量が前記対象におけるＨＣＶ感染の発症を予防または遅延させるのに十分な量である、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記対象がＨＣＶ感染母から生まれた乳児である、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記対象が肝臓移植受容者である、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記対象がＨＣＶ感染に罹患しやすい個人である、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象がＨＣＶ感染に罹患している個人である、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４５】
薬学的に許容される賦形剤ならびに
（ａ）受託番号ＰＴＡ−９４１６のもとにＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系により分泌されるモノクローナル抗体ＨＣ−１；
（ｂ）受託番号ＰＴＡ−９４１７のもとにＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系により分泌されるモノクローナル抗体ＨＣ−３；
（ｃ）受託番号ＰＴＡ−９４１８のもとにＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系により分泌されるモノクローナル抗体ＨＣ−１１；
（ｄ）受託番号ＰＴＡ−９４１９のもとにＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系により分泌されるモノクローナル抗体ＣＢＨ−２３；および
（ｅ）全抗体の抗原結合特性を保持している（ａ）〜（ｄ）の抗体の断片
からなる群から選択されるヒトモノクローナル抗体を含む、有効量の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項４６】
ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３からなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＶ抗体；
該少なくとも１つのＨＣＶ抗体を対象に投与するための注射器、針またはアプリケータ；および
使用説明書
を含むキット。
【請求項４７】
ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３からなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＶ抗体を含む凍結乾燥粉末；
該粉末を再構成するのに用いられる希釈剤
を含むキット。
【請求項４８】
ＨＣ−１と同じエピトープに結合する小分子。
【請求項４９】
ＨＣ−３と同じエピトープに結合する小分子。
【請求項５０】
ＨＣ−１１と同じエピトープに結合する小分子。
【請求項５１】
ＣＢＨ−２３と同じエピトープに結合する小分子。
【請求項５２】
ＨＣ−１と、そのエピトープへの結合について競合する小分子。
【請求項５３】
ＨＣ−３と、そのエピトープへの結合について競合する小分子。
【請求項５４】
ＨＣ−１１と、そのエピトープへの結合について競合する小分子。
【請求項５５】
ＣＢＨ−２３と、そのエピトープへの結合について競合する小分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援
本願は、国立衛生研究所により授与された助成金番号ＨＬ０７９３８１の下、政府支援により成された。合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
全世界の１億７千万人以上がＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）に感染している。急性感染は通常無症状であるが、感染者の大多数が持続性感染症を発症する（非特許文献１；参照により本明細書に組み込まれている）。しかし、わずかな割合の急性感染においてウィルス血症が消失し、疾患の消失を伴う。頑健かつ持続的ＣＤ４＋Ｔ細胞反応が疾患の消失につながるウィルスのクリアランスに一時的に随伴するので、細胞性免疫が必要である（非特許文献２；参照により本明細書に組み込まれている）。
【０００３】
単独またはリバビリン（すなわち、ウィルスゲノム複製を妨げるヌクレオシド類似体）との併用で服用される抗ウィルス薬（例えば、インターフェロンまたはペグ化インターフェロン）は、慢性Ｃ型肝炎を有する人の治療に用いることができるが、治療の費用は非常に高い。インターフェロン単独による治療は、患者の約１０％〜２０％で有効であるが、インターフェロンとリバビリンとの併用は、患者の約３０％〜５０％で有効である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍａｊｏｒら、２００１年、「Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１１２７〜１１６２頁
【非特許文献２】Ｓｈｏｕｋｒｙら、２００４年、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５８巻、３９１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＨＣＶの予防、治療および／または診断に有用であり得る抗体を開発することができるという認識を含む。抗体に基づくワクチンの開発の重要な課題は、保存防御エピトープを明確にし、これらのエピトープを特異的に認識する抗体を発生させることである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、複数のＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）遺伝子型および／またはサブタイプに結合する、ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を提供する。そのような抗体は、ＨＣＶの予防、治療、診断および／または研究に有用である。特に、本発明は、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質Ｅ２の保存立体配座エピトープに結合するモノクローナル抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明によるＨＣＶ抗体は、多く、ほとんどまたはすべての症例のＨＣＶに結合することができる。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、様々な診断アッセイに用いられる。本発明によるＨＣＶ抗体は、感染者のウィルス負荷を減少させるための受動免疫療法に用いられる。本発明によるＨＣＶ抗体の使用は、標的細胞の感染も妨げる可能性がある。保存エピトープを認識する抗体は、ペプチドおよび立体配座的に定義されたエピトープ模倣体（例えば、有機化合物、有機金属化合物、無機化合物、小分子等）の合理的デザインのテンプレートとなるように用いることができる。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質およびその断片の保存領域を、治療、予防、診断および／または他の目的に用いるために提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本発明による抗体は、ＨＣＶのＥ２タンパク質の立体配座エピトープを標的とする。Ｅ２の立体配座および線状エピトープは、モノクローナル抗体のパネルおよびＥ２の一連の欠失構築物を用いて同定された。以前の試験（例えば、米国特許第６，６９２，９０８号ならびに米国特許公開２００６／０１０４９８０および２００６／０１８８５７１；すべてが参照により本明細書に組み込まれている）でＨＣＶ１ｂのＥ２アミノ酸４１１〜６４４間の立体配座エピトープに結合する抗体のクラスが報告された。このクラスの抗体は、Ｅ２とＣＤ８１との相互作用を阻害することが見いだされた。他のクラスの抗体は、ＨＣＶ１ｂのＥ２アミノ酸４７０〜６４４間の立体配座エピトープに結合することが見いだされた。第３のクラスの抗体は、ＨＣＶ１ｂのＥ２アミノ酸４７０〜６４４間の立体配座エピトープに結合するが、ＣＤ８１へのＥ２の結合を阻害しない。第４のクラスは、ＨＣＶ１ｂのＥ２アミノ酸６４４〜６６１間の立体配座エピトープに結合する。第５のクラスは、ＨＣＶ１ｂのＥ２アミノ酸２３０〜３１３間の立体配座エピトープに結合する。第６のクラスは、複数の遺伝子型に由来する線状ＨＣＶ  Ｅ１エピトープに結合する。第７のクラスは、ＨＣＶ１ａ  Ｅ２アミノ酸６５７〜６９８を一部含む立体配座エピトープに結合する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体が標的とする立体配座エピトープは、ＨＣＶ遺伝子型（例えば、遺伝子型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１および／またはそれらの組合せ）間で保存されている。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体が標的とする立体配座エピトープは、ＨＣＶサブタイプ（例えば、サブタイプ１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａ、３ｂ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、５ａ、６ａ、７ａ、７ｂ、８ａ、８ｂ、９ａ、１０ａ、１１ａおよび／またはそれらの組合せ）間で保存されている。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体が標的とする立体配座エピトープは、ＨＣＶ株間で保存されている。遺伝子型およびサブタイプ表示の後に数値表示（例えば、１、２、３等）が与えられている１００株以上のＨＣＶが存在すると推定されている。
【０００９】
本発明は、上述のエピトープのいずれよりも詳細に定義されているＨＣＶ  Ｅ２エピトープを認識するモノクローナル抗体を提供する。本発明による抗体は、一部の以前に記載された抗体と交差競合する（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｅ）。しかし、本発明による一部の抗体は、高い評価を得ているモデル系において以前に記載された抗体より大きい効力でＨＣＶを中和する。したがって、本発明は、本明細書で述べる新規同定の抗体は、以前に記載された抗体より大きい治療上および／または予防上の有用性を提供する可能性があるという認識を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、抗ＨＣＶ  Ｅ２抗体は、受託番号ＰＴＡ−９４１６のもとにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されたハイブリドーマ細胞系により分泌されるヒトモノクローナル抗体ＨＣ−１；受託番号ＰＴＡ−９４１７のもとにＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系により分泌されるヒトモノクローナル抗体ＨＣ−３；受託番号ＰＴＡ−９４１８のもとにＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系により分泌されるヒトモノクローナル抗体ＨＣ−１１；および受託番号ＰＴＡ−９４１９のもとにＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系により分泌されるヒトモノクローナル抗体ＣＢＨ−２３からなる群から選択される。
【００１１】
本発明による抗体は、医薬製剤を得るために薬学的に許容される賦形剤と混ぜ合わせることができる。本発明は、Ｃ型肝炎感染の治療、予防および／または診断用の医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明による医薬組成物は、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質Ｅ２に結合することができ、ＨＣＶ感染をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで中和することができるヒト抗体を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明による医薬組成物は、全抗体の抗原結合特性を実質的に保持するＨＣＶ抗体（例えば、ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１および／またはＣＢＨ−２３）の断片を含んでいてよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、当技術分野で周知の組換え法により産生されるＨＣＶ抗体を含んでいてよい。
【００１３】
本発明は、本発明によるＨＣＶ抗体の様々な治療上、予防上および／または診断上の使用を提供する。いくつかの実施形態では、ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３抗体を含む医薬組成物は、ＨＣＶ  Ｅ２に結合することができる、治療上有効量の抗体またはその断片を患者に投与することによる慢性および／または急性Ｃ型肝炎感染の治療に用いることができる。治療上有効量は、１つまたは複数の特定の生物学的効果を達成するのに十分な量である。治療上有効量は、単一用量で１回投与することができ、または複数の個別の用量（同じもしくは異なる大きさ）で経時的に分配することができ、または連続的送達（一定もしくは可変速度で）で投与することができる。特定の実施形態では、治療上有効量は、（ｉ）ＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を軽減すること、（ｉｉ）個人および／または個人の臓器のいずれか１つ（例えば、肝臓）における循環ウィルス粒子の数を減少させること；（ｉｉｉ）ＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状の再出現を予防し、再出現の可能性を減少させ、かつ／または再出現を遅延させること；かつ／または（ｉｖ）ＨＣＶ感染者および／または個人の臓器のいずれか１つ（例えば、肝臓）における循環ウィルス粒子の数の増加を予防し、増加の可能性を減少させ、かつ／または増加の開始を遅延させることを含むが、これらに限定されない１つまたは複数の所望の生物学的結果を達成するのに有効な量である。本発明による医薬組成物は、ＨＣＶ感染を予防し、その再発を減少させ、かつ／またはその発生を遅延させるために用いることができる。それらは、例えば、ＨＣＶに最近曝露された、もしくはＨＣＶに曝露するリスクのある人、ＨＣＶ陽性の母親から生まれた新生児、および／または肝臓移植患者（例えば、そのような患者における可能な再発性ＨＣＶ感染を予防するため）の受動免疫法に用いることができる。
【００１４】
本発明はまた、追加の有効成分としての少なくとも１つの他の抗ウィルス薬と配合した治療上有効量の本発明による抗体を含む医薬組成物を提供する。そのような薬剤は、インターフェロン（例えば、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンγ等）、抗ＨＣＶモノクローナル抗体、抗ＨＣＶポリクローナル抗体、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リバビリン、ＩＲＥＳ阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、免疫調節剤、アンチセンス化合物、短鎖干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、リボザイムおよびそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。
【００１５】
本発明による抗体は、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質における立体配座エピトープを定義するものであり、そのようなエピトープを含む組成物および化合物を提供する。例えば、本発明は、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の立体配座エピトープをタンパク質、ペプチドおよび小分子を提供する。ペプチドは、本発明による抗体により認識される１つまたは複数のエピトープを含む。特定の実施形態では、タンパク質は、少なくとも１つがＨＣＶの少なくとも１つの立体配座エピトープを含み、オプションの連結配列を有する連鎖状のペプチドのストリングである。該ストリングのペプチドは、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の異なる立体配座エピトープを含んでいてよい。あるいは、該ストリングのペプチドはすべて、同じエピトープを含んでいてよい。一般的に、該ストリングのペプチドは、天然で出現するのと実質的に同様に立体配座エピトープ（複数可）を示すために適切に折りたたまれていることが望ましい。そのようなタンパク質およびペプチドは、ワクチンの調合に用いるか、または診断試験に用いることができる。
【００１６】
本発明はまた、ＨＣＶに対する免疫応答に基づいて患者を層別化し、ＨＣＶ免疫療法によく反応する可能性がある患者を特定する方法を提供する。例えば、患者の血清を、ＨＣＶの特定のエピトープに対する抗体の存在について試験するのに用いることができる。患者がそのようなエピトープ、具体的にはＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の立体配座エピトープに対する十分なレベルの抗体を有さない場合、該エピトープに対するヒトモノクローナル抗体を該患者に投与することができる。患者自身の免疫応答は、本発明による抗体またはその組成物によって補うことができる。特定の実施形態では、免疫療法は、ＨＣＶウィルスのクリアランスおよび／またはＨＣＶ感染の消失を促進する。特定の実施形態では、本発明による免疫療法は、慢性ＨＣＶ感染を治療し、かつ／または予防する。
【００１７】
定義
アミノ酸：本明細書で用いているように、その最も広い意味での「アミノ酸」という用語は、ポリペプチド鎖に組み込むことができるあらゆる化合物および／または物質を意味する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般式Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、合成アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、Ｄ−アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然に存在するペプチドに一般的に見いだされる２０種の標準Ｌ−アミノ酸のいずれかを意味する。「非標準アミノ酸」は、合成により調製されるか、あるいは自然源から得られるかに関係なく、標準アミノ酸以外のあらゆるアミノ酸を意味する。本明細書で用いているように、「合成アミノ酸」は、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）および／または置換体を含むが、これらに限定されない化学的に修飾されたアミノ酸を含む。ペプチドにおけるカルボキシおよび／またはアミノ末端アミノ酸を含むアミノ酸は、それらの活性に有害な影響を及ぼすことなく、ペプチドの循環半減期を変化させることができるメチル化、アミド化、アセチル化、基の保護および／または他の化学基による置換により修飾することができる。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与してもよい。アミノ酸は、１つまたは複数の化学部分（例えば、メチル基、酢酸基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分等）との結合などの１つまたは複数の翻訳後修飾を含んでいてもよい。「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と同義で用いられ、遊離アミノ酸および／またはペプチドのアミノ酸残基を意味しうる。遊離アミノ酸を意味するのか、またはペプチドの残基を意味するのかは、該用語が用いられる文脈から明らかであろう。
【００１８】
動物：本明細書で用いているように、「動物」という用語は、動物界のメンバーを意味する。いくつかの実施形態では、「動物」は、いずれかの性であり、任意の発生段階にあるヒトを意味する。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発生段階のヒト以外の動物を意味する。特定の実施形態では、ヒト以外の動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類の動物および／またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物は、哺乳動物、鳥、爬虫類の動物、両生類の動物、魚、昆虫および／または虫を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、動物は、ＨＣＶによる感染に罹患しやすい。いくつかの実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子組換え動物および／またはクローンであってよい。
【００１９】
抗体：本明細書で用いているように、「抗体」という用語は、天然であるか、または完全もしくは部分的に合成により生産されたかを問わず、あらゆる免疫グロブリンを意味する。特異的結合能を維持しているそのすべての誘導体も該用語に含まれる。該用語は、免疫グロブリン結合ドメインと相同またはおおむね相同である結合ドメインを有するタンパク質も対象として含む。そのようなタンパク質は、自然源由来であるか、または完全もしくは部分的に合成により生産されてよい。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。抗体は、ヒトクラスのいずれかを含むいずれかの免疫グロブリンクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのメンバーであってよい。特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ免疫グロブリンクラスのメンバーであってよい。本明細書で用いているように、「抗体断片」または「抗体の特徴的部分」という用語は、同義で用いられ、全長より小さい抗体の誘導体を意味する。一般的に、抗体断片は、全長抗体の特異的結合能の少なくとも重要な部分を保持する。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖダイアボディーおよびＦｄ断片を含むが、これらに限定されない。抗体断片は、あらゆる手段により生産することができる。例えば、抗体断片は、完全な抗体の断片化により酵素的もしくは化学的に生産することができ、かつ／または部分的抗体配列をコードする遺伝子から組換えにより生産することができる。あるいはまたはさらに、抗体断片は、全体的または部分的に合成により生産することができる。抗体断片は、単鎖抗体断片を場合によって含んでいてよい。あるいはまたはさらに、抗体断片は、例えば、ジスルフィド結合により互いに連結した多重鎖を含んでいてよい。抗体断片は、多分子複合体を場合によって含んでいてよい。機能的抗体断片は、一般的に少なくとも約５０アミノ酸、より一般的には少なくとも約２００アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト抗体であってよい。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体であってよい。
【００２０】
おおよそ：本明細書で用いているように、「おおよそ」または「約」という用語は、対象の１つまたは複数の値に適用されるように、規定された基準値と同様の値であることを意味する。特定の実施形態では、「おおよそ」または「約」という用語は、特に断らない限り、または文脈から別の方法で明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）、規定された基準値のいずれかの方向（より大きいまたはより小さい）の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満の範囲内に入る値の範囲を意味する。
【００２１】
生物学的に活性な：本明細書で用いているように、「生物学的に活性な」という語句は、生物学的系（例えば、細胞培養、生物体等）において活性を有する物質の特性を意味する。例えば、生物体に投与したとき、当生物体に対して生物学的効果を有する物質は、生物学的に活性であるとみなされる。特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である場合、当タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有する当タンパク質またはポリペプチドの一部は、「生物学的に活性な」部分と一般的に呼ばれる。
【００２２】
特徴的な部分：本明細書で用いているように、最も広い意味での物質の「特徴的な部分」という用語は、物質全体について程度の配列または構造の同一性を共有するものである。特定の実施形態では、特徴的な部分は、完全な物質と少なくとも１つの機能特性を共有している。例えば、タンパク質またはポリペプチドの「特徴的な部分」は、タンパク質またはポリペプチドの特徴をともに示すアミノ酸の連続的連なりまたはアミノ酸の連続的連なりの集合を含むものである。いくつかの実施形態では、それぞれのそのような連なりは、一般的に少なくとも２、５、１０、１５、２０、５０個またはそれ以上のアミノ酸を含む。一般的に、物質（例えば、タンパク質、抗体等の）の特徴的な部分は、上で明記した配列および／または構造の同一性に加えて、関連する完全な物質と少なくとも１つの機能特性を共有しているものである。いくつかの実施形態では、特徴的な部分は、生物学的に活性であってよい。
【００２３】
発現：本明細書で用いているように、核酸配列の「発現」は、次の事象の１つまたは複数のものを意味する。（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の生成（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、エディティング、５’キャップ形成および／または３’末端形成による）；（３）ＲＮＡのポリペプチドもしくはタンパク質への翻訳；および／または（４）ポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾。
【００２４】
機能的：本明細書で用いているように、「機能的」生物学的分子は、それが特性を示す形態および／またはそれが特徴付けられる活性の生物学的分子である。
【００２５】
遺伝子：本明細書で用いているように、「遺伝子」という用語は、当技術分野で理解されている意味を有する。「遺伝子」という用語が遺伝子調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー等）および／またはイントロン配列を含むことは、当業者により十分理解されるであろう。遺伝子の定義が、タンパク質をコードせずに、ｔＲＮＡ、ＲＮＡｉ誘導物質等などの機能的ＲＮＡ分子をコードする核酸への言及を含むことは、さらに十分理解されるであろう。明確にする目的のために、我々は、本出願で用いているように、「遺伝子」という用語はタンパク質をコードする核酸の一部を一般的に意味することを指摘する。該用語は、当業者には文脈から明らかなように、調節配列を場合によって含みうる。この定義は、「遺伝子」という用語の非タンパク質コーディング発現ユニットへの適用を排除するものではなく、ほとんどの場合に、該用語が本文書で用いているようにタンパク質コーディング核酸を意味することを明確にするものである。
【００２６】
遺伝子産物または発現産物：本明細書で用いているように、「遺伝子産物」または「発現産物」という用語は、一般的に遺伝子から転写されたＲＮＡ（プロセシング前および／または後）あるいは遺伝子から転写されたＲＮＡよりコードされるポリペプチド（修飾前および／または後）を意味する。
【００２７】
相同性：本明細書で用いているように、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な同系性を意味する。いくつかの実施形態では、ポリマー分子の配列が少なくとも２５％、３０％，３５％，４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一である場合、ポリマー分子は互いに「相同」であるとみなされる。いくつかの実施形態では、ポリマー分子の配列が少なくとも２５％、３０％，３５％，４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％類似している場合、ポリマー分子は互いに「相同」であるとみなされる。
【００２８】
同一性：本明細書で用いているように、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な同系性を意味する。例えば、２つの核酸配列の同一性の割合の計算は、最適比較目的のために２つの配列を整列させること（例えば、最適整列のためにギャップを第１および第２の核酸配列の１つまたは両方に導入することができ、非同一配列を比較目的のために無視することができる）により行うことができる。特定の実施形態では、比較目的のために整列させた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または実質的に１００％である。次に対応するヌクレオチド位置におけるヌクレオチドを比較する。第１の配列におけるある位置が、第２の配列における対応する位置と同じヌクレオチドによって占められている場合、分子は当位置で同一である。２つの配列の間の同一性の割合は、２つの配列の最適な整列のために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列により共有された同一の位置の数の関数である。２つの配列の間の配列の比較および同一性の割合の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性の割合は、ＰＡＭ１２０重み残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを用いてＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に組み込まれたＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ、１９８９年、４巻、１１〜１７頁）を用いて決定することができる。２つのヌクレオチド配列間の同一性の割合は、あるいは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを用いたＧＣＧソフトウエアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを用いて決定することができる。
【００２９】
分離された：本明細書で用いているように、「分離された」という用語は、（１）。（天然においてかつ／または実験的状況においてかを問わず）最初に生産されたときにそれが結合していた成分の少なくとも一部から分離され、かつ／または（２）人の手により生産され、調製され、かつ／または製造された物質および／または実体に適用される。分離された物質および／または実体は、それらが最初に結合していた他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約９９％以上から分離されていてよい。いくつかの実施形態において、分離された物質は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約９９％以上純粋である。本明細書で用いているように、物質が他の成分を実質的に含まない場合、物質は「純粋」である。本明細書で用いているように、分離された物質および／または実体の純度パーセントの計算は、賦形剤（例えば、緩衝液、溶媒、水等）を含めるべきでない。
【００３０】
ミモトープ：本明細書で用いているように、「ミモトープ」という用語は、エピトープの構造を模倣した巨大分子を意味する。いくつかの実施形態では、ミモトープは、その対応するエピトープによって誘発されるものと同じまたは類似の抗体反応を誘発する。いくつかの実施形態では、エピトープを認識する抗体は、エピトープを模倣したミモトープも認識する。いくつかの実施形態では、ミモトープは、ペプチドである。いくつかの実施形態では、ミモトープは、小分子、炭水化物、脂質または核酸である。いくつかの実施形態では、ミモトープは、立体配座保存ＨＣＶエピトープのペプチドまたは非ペプチドミモトープである。いくつかの実施形態では、立体配座的に定義されたウィルスエピトープの構造を模倣することによって、ミモトープは、ＨＣＶウィルス粒子がその天然結合パートナー（例えば、ＨＣＶ標的受容体、Ｅ１タンパク質等）に結合する能力を、例えば、天然結合パートナー自体に結合することによって妨害する。
【００３１】
核酸：本明細書で用いているように、「核酸」という用語は、その最も広い意味で、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるまたは組み込むことができる化合物および／または物質を意味する。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合によりオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるまたは組み込むことができる化合物および／または物質である。いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を意味する。いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を意味する。本明細書で用いているように、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、同義で用いることができる。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡならびに一本および／または二本鎖ＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡを含む。さらに、「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」および／または同様な用語は、核酸類似体、すなわち、ホスホジエステル主鎖以外を有する類似体を含む。例えば、当技術分野で公知であり、主鎖にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内にあるとみなされる。「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド」という用語は、互いの縮重した型であり、かつ／または同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質をコードするヌクレオチド配列および／またはＲＮＡは、イントロンを含んでいてよい。核酸は、天然源から精製し、組換え発現システムを用いて生産し、場合によって精製し、化学的に合成する等ができる。適切な場合、例えば、化学的に合成された分子の場合、核酸は、化学的に修飾された塩基もしくは糖、主鎖修飾等を有する類似体のようなヌクレオシド類似体を含みうる。核酸配列は、特に示さない限り、５’→３’の方向で示す。「核酸セグメント」という用語は、より長い核酸配列の一部である核酸配列を指すために本明細書において用いる。多くの実施形態では、核酸セグメントは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシンおよびデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニルシチジン、Ｃ−５プロピニルウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアノシンおよび２−チオシチジン）；化学的に修飾された塩基；生物的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）；挿入塩基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ  ｂａｓｅｓ）；修飾糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノースおよびヘ���ソース）；および／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホルアミダイト結合）であるか、または含む。いくつかの実施形態では、本発明は、送達を促進または達成するために化学的に修飾されなかった核酸（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドを含むポリヌクレオチドおよび残基）を意味する「非修飾核酸」を特に対象とする。
【００３２】
タンパク質：本明細書で用いているように、「タンパク質」という用語は、ポリペプチド（すなわち、ペプチド結合により互いに結合した少なくも２つのアミノ酸のストリング）を意味する。タンパク質は、アミノ酸以外の部分（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカン等であってよい）を含んでいてよく、かつ／または他の方法でプロセシングもしくは修飾されていてよい。当業者は、「タンパク質」が細胞により産生された完全なポリペプチド鎖（シグナル配列を含むもしくは含まない）であり得るか、またはその特徴的部分であり得ることを十分に理解するであろう。当業者は、タンパク質が１つまたは複数のジスルフィド結合により連結された、または他の手段により結合された複数のポリペプチド鎖を時として含みうることを十分に理解するであろう。ポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸または両方を含んでいてよく、当技術分野で公知の様々なアミノ酸修飾または類似体のいずれかを含んでいてよい。有用な修飾は、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化等を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸およびそれらの組合せを含んでいてよい。「ペプチド」という用語は、一般的に約１００アミノ酸未満、約５０アミノ酸未満、２０アミノ酸未満または１０アミノ酸未満の長さを有するポリペプチドを指すのに用いられる。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体、抗体断片、その生物学的に活性な部分および／またはその特徴的な部分である。
【００３３】
再発性ＨＣＶ感染：本明細書で用いているように、「再発性ＨＣＶ感染」は、感染の臨床上および／または臨床検査上の証拠、例えば、感染の１つまたは複数の症状あるいは循環ＨＣＶ粒子および／または対象の肝臓におけるＨＣＶ粒子の存在の再発を意味する。いくつかの実施形態では、再発性ＨＣＶ感染は、以前にＨＣＶに感染したが、肝臓移植を受けた対象におけるそのような状態を意味する。
【００３４】
小分子：一般的に、「小分子」は、約２０００ｇ／モル未満、約１５００ｇ／モル未満、約１０００ｇ／モル未満、約８００ｇ／モル未満または約５００ｇ／モル未満である有機分子であると当技術分野で理解されている。いくつかの実施形態では、小分子は、ポリマーでない。いくつかの実施形態では、小分子は、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸でない。いくつかの実施形態では、小分子は、核酸またはヌクレオチドでない。いくつかの実施形態では、小分子は、糖または多糖でない。
【００３５】
対象：本明細書で用いているように、「対象」または「患者」という用語は、例えば、実験、診断、予防および／または治療の目的のために本発明の組成物を投与することができる生物を意味する。一般的な対象は、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト以外の霊長類の動物およびヒトなどの動物；昆虫；虫等）を含む。いくつかの実施形態では、対象は、ＨＣＶに感染し、苦しみ、かつ／またはその影響を受けやすい可能性がある。
【００３６】
実質的に：本明細書で用いているように、「実質的に」という用語は、問題としている特性または性質の完全またはほぼ完全な程度または度合を示す定性的状態を意味する。生物学分野の技術者は、生物学的および化学的現象が、もしあるとすれば、まれに完了まで進み、かつ／または完全な状態まで進み、あるいは絶対的結果を達成もしくは回避することを理解する。「実質的に」という用語は、したがって、多くの生物学的および化学的現象に固有の完全な状態の潜在的欠如をとらえるために本明細書で用いている。
【００３７】
に罹る（に苦しむ）：疾患、障害および／または状態（例えば、ＨＣＶ感染）に「罹って」いる個人は、疾患、障害および／または状態と診断され、かつ／または疾患、障害および／または状態の１つもしくは複数の症状を示す。
【００３８】
に罹りやすい：疾患、障害および／または状態（例えば、ＨＣＶ感染）に「罹りやすい」個人は、疾患、障害および／または状態と診断されなかった。いくつかの実施形態では、疾患、障害および／または状態に罹りやすい個人は、疾患、障害および／または状態の症状を示す可能性がある。いくつかの実施形態では、疾患、障害および／または状態に罹りやすい個人は、疾患、障害および／または状態の症状を示さない可能性がある。いくつかの実施形態では、疾患、障害および／または状態に罹りやすい個人は、疾患、障害および／または状態の症状を発現する。いくつかの実施形態では、疾患、障害および／または状態に罹りやすい個人は、疾患、障害および／または状態を発現しない。
【００３９】
治療上有効量：本明細書で用いているように、「治療上有効量」という用語は、疾患、障害および／または状態（例えば、ＨＣＶ感染）に罹患している、または罹りやすい対象に投与した場合に、疾患、障害および／または状態を治療、診断、予防する、かつ／またはその発症を遅延させるのに十分である発明の組成物の量を意味する。
【００４０】
治療薬：本明細書で用いているように、「治療薬」という語句は、対象に投与した場合、治療効果を有し、かつ／または所望の生物学的および／または薬理学的効果を発現させる薬剤を意味する。いくつかの実施形態では、治療薬は、ＨＣＶ感染の１つもしくは複数の症状もしくは特徴を軽減し、改善し、緩和し、抑制し、予防し、その発症を遅延させ、その重症度を低下させ、かつ／またはその発生率を低下させるのに用いることができる物質である。
【００４１】
治療：本明細書で用いているように、「治療する」、「治療」または「治療すること」という用語は、疾患、障害および／または状態（例えば、ＨＣＶ感染）の１つもしくは複数の症状もしくは特徴を部分的もしくは完全に軽減し、改善し、緩和し、抑制し、予防し、その発症を遅延させ、その重症度を低下させ、かつ／またはその発生率を低下させるために用いる方法を意味する。治療は、疾患、障害および／または状態の徴候を示さない対象に適用することができる。いくつかの実施形態では、治療は、疾患、障害および／または状態に関連する病状を発現するリスクを低減する目的のために疾患、障害および／または状態の初期の徴候のみを示す対象に適用することができる。
【００４２】
ベクター：本明細書で用いているように、「ベクター」は、それが結合している他の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。いくつかの実施形態では、ベクターは、真核および／または原核細胞などの宿主細胞中のそれらが結合している核酸の染色体外複製および／または発現を可能にする。作動可能に連結した遺伝子の発現を導くことができるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ぶ。
【００４３】
ＨＣＶ命名法
ＨＣＶ命名法が一般的にＨＣＶ遺伝子型を表すアラビア数字（例えば、「１」、「２」、「３」、「４」等）およびＨＣＶサブタイプを表す小文字（例えば、「ａ」、「ｂ」等）を用いることは、当業者により周知されている。命名の規則は当技術分野で一般的に受け入れられているが、当業者は、出版、発表、会話等において当業者が必ずしも厳格に命名の規則に従っていないことを認識している。したがって、当業者は、例えば、「ＨＣＶ１ａ」、「ＨＣＶ遺伝子型１ａ」および「ＨＣＶサブタイプ１ａ」は当業者により同義で用いることができることは暗黙的であり、３つの用語すべてがＨＣＶ遺伝子型１、サブタイプａを意味するものであることを認識するであろう。
【００４４】
本明細書で用いているように、アラビア数字（例えば、「１」、「２」、「３」、「４」等）は、ＨＣＶ遺伝子型を指すのに用い、小文字（例えば、「ａ」、「ｂ」等）は、ＨＣＶサブタイプを指すのに用いる。本明細書で特定の遺伝子型のＨＣＶに言及する場合、それが挙げられた遺伝子型のすべてのサブタイプを含むことを意味することも理解されるであろう。一例を示すと、「遺伝子型１」は、本明細書で遺伝子型１のすべてのサブタイプ（例えば、遺伝子型１、サブタイプａ；遺伝子型１、サブタイプｂ；等）を指すために用いる。
【００４５】
本明細書で用いているように、遺伝子型の後に存在するアラビア数字（例えば、「１」、「２」、「３」、「４」等）およびサブタイプ表示は、ＨＣＶ株を意味すると理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、間接免疫蛍光アッセイによる、異なるＨＣＶ遺伝子型に対する結合の図である。２９３Ｔ細胞に、遺伝子型１〜６のＥ１Ｅ２配列を有する構築物をトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞をスライド上に固定し、固定した細胞に対する抗体結合を蛍光顕微鏡で検出した。ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３は、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、４、５および６に結合した。
【図２】図２は、ヒトモノクローナル抗体ＶＬおよびＶＨのドメインＣＤＲ配列を、ｃＤＮＡ配列から翻訳した図である。分析により、各抗体が異なるＶＬおよびＶＨＣＤＲ配列を含むことが分かった。
【図３】図３は、ＩｇＧサブクラス分類の図である。ＨＣ−１はＩｇＧ２であるのに対してＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３はＩｇＧ１である。
【図４】図４は、異なるＨＣＶ遺伝子型を用いた中和反応の図である。異なるＨＣＶ遺伝子型を中和する能力について、各抗体を２０ｕｇ／ｍＬで試験した。数字は、抗体がない対照と比較した中和の百分率である。ＲＯ４は、ＨＣＭＶに対するアイソタイプ適合ヒトモノクローナル抗体であり陰性対照になる。
【図５】図５は、抗体競合アッセイの図である。代表的なビオチン標識したドメインＡ（ＣＢＨ−４Ｄ）、Ｂ（ＣＢＨ−５）およびＣ（ＣＢＨ−７）ＨＣＶ抗体を用いる競合分析を行った。ＨＣ−１およびＨＣ−１１が、ドメインＡおよびＣ抗体と最少の競合を示し、さらにＣＢＨ−５と６０％〜８０％の競合を示したことから、これらの新規な抗体により認識されるエピトープがドメインＢ内に位置することが示唆される。ＣＢＨ−２３が、ドメインＡおよびＢ抗体と最少の競合を示したあるいは競合せず、さらにＣＢＨ−７と９０％を超える競合を示したことから、このエピトープがドメインＣ内に位置することが示唆される。ＨＣ−３が、ドメインＡ、ＢおよびＣ抗体と最少の競合を示したあるいは競合しなかったことから、この抗体が新規な別のドメインを認識していることが示唆される。各対照抗体（すなわち、ＣＢＨ−４Ｄ、ＣＢＨ−５およびＣＢＨ−７）は、それ自体を阻害するが、その他の２つの抗体を最小限しか阻害しない。
【図６】図６は、ＣＤ８１に対するＥ２の結合をヒトモノクローナル抗体によって阻害する図である。１ｕｇ／ｍＬのＥ２を含む２９３Ｔにおいて発現する遺伝子型１ｂ  Ｅ１Ｅ２を、１０ｕｇ／ｍＬの各試験抗体と共にインキュベートし、次いでＣＤ８１で予め被覆したウェル上へ抗体−抗原複合体を添加した。ＣＤ８１に結合したＥ２の検出を、ビオチン化したＣＢＨ−４Ｄで測定した。ＣＢＨ−５を陽性対照として、およびＲＯ４を陰性対照として使用した。ＨＣ−１、ＨＣ−１１、ＣＢＨ−２３またはＣＢＨ−５とＥ２糖タンパク質を予めインキュベートすると、ＲＯ４陰性対照と比較して、ＣＤ８１に対するＥ２の結合が９０％より多く減少した。他のドメインＢまたはＣのＨＣＶ抗体と同様に、これらＨＣＶ抗体はＣＤ８１に対するＥ２の結合を妨害することによってＨＣＶを中和する。一方で、ＨＣ−３存在下でＥ２糖タンパク質をプレインキュベートしても、ＣＤ８１に対するＥ２の結合は減少しなかった。実験は、３個ずつ２回実施した。エラーバーは、平均値の標準偏差を示している。
【図７】図７は、アラニン置換によるＨＣ−１およびＨＣ−１１のエピトープマッピングの図である。遺伝子型１ａのＨ７７ｃ株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ００９６０６）由来Ｅ２に、部位特異的突然変異（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）、カリフォルニア州）によって、突然変異を導入した。変異したＥ２タンパク質を２９３Ｔ細胞中で発現させ、ＥＬＩＳＡによって分析した。変異したアミノ酸を、ｙ軸に表している。各ペプチドの初めの数字は、参照株Ｈのポリタンパク質における位置に相当している。各変異体に対して結合している（Ａ）ＨＣ−１および（Ｂ）ＨＣ−１１のＨＣＶ抗体量を、ＣＢＨ−１７の結合量で標準化し、その野生型に対して結合しているＨＣ抗体量で割った結合値の百分率としてｘ軸上に表している。
【図８】図８は、アラニン置換によるＨＣ−３のエピトープマッピングの図である。アラニン置換を、図７に示した通りに行った。
【図９】図９は、ＨＣＶｐｐ感染を抗体を媒介して中和する時間的経過を表す図である。侵入経路の中でＨＣ−３が阻害する段階を予測するために、ドメインＢおよびＣＤ８１に対する抗体と比較して、時間的経過実験を行った。抗−ＣＤ８１およびドメインＢ  ＨＣＶ抗体であるＨＣ−１１の両方で、ウィルスの侵入妨害にあたって類似した型の進行性の消失がある。このことから、ドメインＢのＨＣＶ抗体が、ＣＤ８１に対するＥ２の結合を妨害することによって、ウィルスの侵入を阻害すると予想される。これらの２つの抗体とＨＣ−３との傾向の類似性は、ＨＣ−３が、ＣＤ８１とウィルスの相互作用と時間的に近い段階でウィルスの侵入を阻害していることを示唆している。このことは、ＳＲ−Ｂ１などの異なるＨＣＶ共受容体とＥ２の相互作用、またはＣＤ８１の会合直後の段階を阻害している可能性を含んでいる。
【図１０】図１０は、ＨＣ−３エピトープが、Ｅ１−Ｅ２二量体化に関与することを表す図である。Ｈ７７ｃと比較して、ＨＣＶｐｐ変異体であるＲ６５７ＡおよびＤ６５８Ａ（およびより小さい程度で、Ｆ６７９Ａ）は、クッションペレットＨＣＶｐｐ中のＥ１の有意な減少を示した。このことは、これらの残基がＥ１とＥ２間のヘテロ二量体形成に関与していることを示唆している。これらの残基が、Ｅ１Ｅ２の二量体化に関与すると以前は同定されていなかった。類似の所見が、細胞溶解物由来のＥ１Ｅ２で観察された。Ｅ４３１Ａ変異体は、ヘテロ二量体形成に影響を及ぼされない突然変異の対照として役立つ。
【図１１】図１１は、ＨＣＶｐｐの感染力におけるＨＣ−３エピトープ突然変異生成の効果を表す図である。Ｒ６５７Ａ、Ｄ６５８ＡおよびＦ６７９Ａ、Ｌ６９２Ａ、Ｉ６９６ＡまたはＤ６９８Ａ突然変異を有するウィルスの感染力を定量した。各突然変異は、ウィルスに対して致死的である。Ｅ４３１Ａの対照突然変異は、変化を示さなかった。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明は、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）エンベロープ糖タンパク質２（Ｅ２）を認識する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ  Ｅ２抗体は、ヒトモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ  Ｅ２抗体は、１つまたは複数のＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）遺伝子型および／またはサブタイプに付随するＥ２に結合する。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ  Ｅ２抗体は、治療、診断および／または予防適用分野において有用である。本発明は、ＨＣＶ  Ｅ２抗体を含む医薬組成物およびＨＣＶ  Ｅ２抗体を用いて患者を治療する方法を提供する。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶ  Ｅ２抗体は、同定され、感染患者の血清から分離される。実施例で述べるように、高血清結合中和力価（ｈｉｇｈ  ｓｅｒｕｍ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｉｔｅｒｓ）を有する３人のＨＣＶ感染者の末梢Ｂ細胞からの１群のヒトモノクローナル抗体を産生させ、特徴付けした。ＨＣＶ  Ｅ２に対する４つのヒトモノクローナル抗体ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３が産生され、分離された。４つの抗体すべてがＨＣＶの遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、４、５および６に結合する（図１）。これらの抗体は、ウィルス型および遺伝子型にわたって保存されている立体配座エピトープに結合する。ＨＣ−１、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３は、Ｅ２タンパク質とヒトＣＤ８１との相互作用を阻害する（図６）。ＨＣ−３は、ＣＤ８へのＥ２の結合を阻害しない（図６）。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本発明によるＨＣＶ  Ｅ２抗体は、広範囲のＨＣＶ遺伝子型および／またはサブタイプの中和をもたらす。多数のＨＣＶ遺伝子型および／またはサブタイプに対する反応性の広さと感受性細胞へのＨＣＶビリオンの結合を妨害する能力の両方は、治療上有用な中和抗体について望ましい。本発明はまた、ＨＣＶエンベロープタンパク質のペプチドおよび非ペプチド構造模倣体のデザインを提供する。
【００５０】
Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）
Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）は、その遺伝情報が９．５ｋｂプラス鎖ＲＮＡゲノムにコードされている、エンベロープを有するウィルスである。３４１ｂｐの高度に保存された非コーディング領域がこのウィルスゲノムの５’末端に局在化しており、これに約３０１０アミノ酸のポリタンパク質をコードする長い読取り枠が続いている。２つの推定上のエンベロープ糖タンパク質Ｅ１（ｇｐ３５）およびＥ２（ｇｐ７２）がそれぞれ５または６および１１Ｎ−結合グリコシル化部位により同定された。高レベルの遺伝的変異性は、エンベロープ遺伝子に関連する。この変異性は、Ｅ２遺伝子の５’末端で高度に強められており、ここでのＨＶＲ１およびＨＶＲ２と呼ばれる２つの超可変領域が記載された。ＨＶＲ１に対する抗体は、細胞培養およびチンパンジー保護試験においてウィルス中和を媒介すると思われる（Ｆａｒｃｉら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９３巻、１５３９４〜１５３９９頁；およびＳｈｉｍｉｚｕら、１９９４年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６８巻、１４９４〜１５００頁；両方が参照により本明細書に組み込まれている）。ＨＶＲ１関連配列に対するより広い免疫応答の誘導に進歩があった（Ｐｕｎｔｏｒｉｅｒｏら、１９９８年、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１７巻、３５２１〜３５３３頁；参照により本明細書に組み込まれている）が、残念なことに、ＨＶＲ１に対する抗体は、分離株特異的である傾向があり、時間の経過により、既存の免疫応答が認識しない新たなウィルス変異体の複製が誘導される（Ｆａｒｃｉら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９１巻、７７９２〜７７９６頁；Ｗｅｉｎｅｒら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻、３４６８〜３４７２頁；およびＫａｔｏら、１９９３年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６７巻、３９２３〜３９３０頁；すべてが参照により本明細書に組み込まれている）。ＨＣＶエンベロープ抗原は、グリコシル化形で発現する場合に高度に免疫原性であるように思われる（ｄａ  Ｓｉｌｖａ  Ｃａｒｄｏｓｏら、１９９７年、Ａｎｎ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．、７４巻、１３５〜７頁；参照により本明細書に組み込まれている）。予備的データは、Ｅ２タンパク質内の保存エピトープの存在を示唆している（Ｌｅｓｎｉｅｗｓｋｉら、１９９５年、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｖｉｒｏｌ．、４５巻、４１５〜２２頁；参照により本明細書に組み込まれている）。感染患者からの血清中の中和抗体の存在が提唱された。
【００５１】
哺乳類細胞中で発現したＨＣＶ  Ｅ１−Ｅ２タンパク質を用いた試験で、感染者は本質的には立体配座および線状であるエピトープを一部含むＨＣＶ  Ｅ２に対する抗体反応を有することが示された（Ｈａｒａｄａら、１９９４年、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、７６巻、１２２３〜１２３１頁；参照により本明細書に組み込まれている）。ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に対するヒトモノクローナルまたは組換え抗体の分離に関連する試験で、これらの抗体の実質的な部分が立体配座エピトープを認識することが示された（ｄａ  Ｓｉｌｖａ  Ｃｏｒｄｏｓｏら、１９９８年、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｖｉｒｏｌ．、５５巻、２８〜３４頁；参照により本明細書に組み込まれている）。これらのドメインの生物学的機能に関しては、ウィルスはｉｎ  ｖｉｔｒｏでは成長できないので、研究者らは、ウィルスの中和への洞察を得るために代用アッセイを用いた（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、「Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ、Ｋｎｉｐｅ、Ｈｏｗｌｅｙ（編）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１０３５〜１０５８頁；参照により本明細書に組み込まれている）。１つの代用アッセイである結合の中和（ＮＯＢ）アッセイは、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質とヒトＴ細胞系との結合を妨げる所定の抗体または血清の能力を評価するものである（Ｒｏｓａら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９３巻、１７５９〜１７６３頁；参照により本明細書に組み込まれている）。ワクチン接種により保護されたチンパンジーから得られた血清抗体がＮＯＢアッセイにおいて強度に陽性であったという所見は、ウィルス中和活性の尺度としての該アッセイの妥当性を裏付けている（Ｒｏｓａら、前出；およびＩｓｈｉｉら、１９９８年、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２８巻、１１１７〜１１２０頁；両方が参照により本明細書に組み込まれている）。
【００５２】
ヒトテトラスパンニング（ｔｅｔｒａｓｐａｎｎｉｎｇ）細胞表面タンパク質ＣＤ８１（ＴＡＰＡ−１としても公知である；レビューについてはＬｅｖｙら、１９９８年、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６巻、８９〜１０９頁を参照；参照により本明細書に組み込まれている）は、ＮＯＢアッセイにおいてＨＣＶ  Ｅ２により結合される標的タンパク質である（Ｐｉｌｅｒｉら、１９９８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２巻、９３８〜９４１頁；参照により本明細書に組み込まれている）。さらに、ヒトＣＤ８１は、遊離ビリオンに結合し、その後に、ＨＣＶの可能な受容体である（Ｐｉｌｅｒｉら、前出）。しかし、異なる遺伝子型および／またはサブタイプのＨＣＶ  Ｅ２タンパク質における以前に同定されたＮＯＢ陽性抗体により認識されるエピトープの保存についてはほとんど知られていない。
【００５３】
ＨＣＶの検出およびＨＣＶからの防御への他のアプローチは、ペプチド模倣体の開発などである。例として、ＡおよびＣ型肝炎ウィルスタンパク質のペプチド模倣体は、検出アッセイおよびワクチン接種療法用のランダム発生合成およびファージディスプレイペプチドライブラリーの作製により創出された（Ｍａｔｔｉｏｌｉら、１９９５年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６９巻、５２９４〜５２９９頁；およびＰｒｅｚｚｉら、１９９６年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５６巻、４５０４〜４５１３頁；両方が参照により本明細書に組み込まれている）。しかし、これらのミモトープの有効抗体結合は、線状に定義されたウィルスエピトープのみと比較された。いくつかの線状に定義された免疫優性ＨＣＶエピトープの配列組換え融合が、診断アッセイ用に記載された（Ｃｈｅｉｎら、１９９９年、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３７巻、１３９３〜１３９７頁；参照により本明細書に組み込まれている）。しかし、線状エピトープからデザインされた多エピトープ融合抗原は、立体配座模倣体と同じ能力で機能するように作製されなかった。それは、標的受容体への結合を妨げるようにデザインされなかった。
【００５４】
ＨＣＶに関する背景情報を提供する参考文献は、すべてが参照により本明細書に組み込まれている、Ａｂｒｉｇｎａｎｉ、１９９７年、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１９巻、４７〜５５頁；Ｓｉｍｍｏｎｄｓ、１９９５年、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２１巻、５７０頁、５８３頁；およびＭａｈａｎｅｙら、１９９４年、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２０巻、１４０５〜１４１１頁などである。ＨＣＶゲノムの一部を有するワクシニアウィルスまたはバキュロウィルス構築物は、Ｒａｌｓｔｏｎら（１９９３年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６７巻、６７３３〜６７６１頁；参照により本明細書に組み込まれている）およびＬａｎｆｏｒｄら（１９９３年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９７巻、２２５〜２３５頁；参照により本明細書に組み込まれている）により記載されている。
【００５５】
ＨＣＶ抗体
ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質遺伝子は、遺伝子型およびサブタイプにわたるいくつかの最大レベルの遺伝的異質性を示し、Ｅ２がＥ１より大きい変異性を示す。Ｅ２のＮ末端に認められる超可変領域（ＨＶＲ１）は、高度に免疫原性であり、分離株特異的中和抗体反応の主要な決定因子である（Ｆａｒｃｉら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９３巻、１５３９４頁；およびＳｈｉｍｉｚｕら、１９９４年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６８巻、１４９４頁；両方が参照により本明細書に組み込まれている）。特定の患者から２６年間にわたり採取された血清試料から得られた連続ＨＣＶ分離株の試験で、血清抗体が同時点に存在する同時優性Ｅ１Ｅ２種を中和しなかったことが示された（ｖｏｎ  Ｈａｈｎら、２００７年、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１３２巻、６６７頁；参照により本明細書に組み込まれている）。逸脱（ｅｓｃａｐｅ）は、結合の低減につながるＨＶＲ１の突然変異およびこの患者から得られた最も初期の分離株に対して産生されたＨＶＲ１に対するモノクローナル抗体による中和に関連している。より広くは中和抗体は、通常Ｅ２内の立体配座エピトープに対するものである（Ａｌｌａｎｄｅｒら、２０００年、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、８１巻、２４５１頁；Ｂｕｇｌｉら、２００１年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７５巻、９９８６頁；Ｈａｂｅｒｓｅｔｚｅｒら、１９９８年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２４９巻、３２頁；Ｈａｄｌｏｃｋら、２０００年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７４巻、１０４０７頁；およびＩｓｈｉｉら、１９９８年、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２８巻、１１１７頁；すべてが参照により本明細書に組み込まれている）。
【００５６】
本発明者らは、遺伝子型１ｂＨＣＶに感染した人の末梢Ｂ細胞由来のＨＣＶ  Ｅ２上の立体配座エピトープに対する中和および非中和ヒトモノクローナル抗体のパネルを以前に記載した。交差競合分析により、異なる機能および特性を有するオーバーラップエピトープの３つの免疫原性クラスターが同定された（Ｋｅｃｋら、２００５年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７９巻、１３１９９頁；およびＫｅｃｋら、２００４年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７８巻、９２２４頁；両方が参照により本明細書に組み込まれている）。すべての非中和抗体は、ドメインＡと呼ばれる１つのクラスター内に含まれていた（Ｋｅｃｋら、２００５年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７９巻、１３１９９頁；参照により本明細書に組み込まれている）。中和抗体は、ドメインＢおよびＣと呼ばれる２つのクラスターに分かれ、ドメインＢ抗体は、ブロッキング遺伝子型２ａ伝染性細胞培養ウィルス（ＨＣＶｃｃ）感染においてドメインＣ抗体より大きい効力を有する（Ｋｅｃｋら、２００７年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８１巻、１０４３頁；参照により本明細書に組み込まれている）。すべてのドメインＢ抗体ならびにドメインＣ抗体は、宿主細胞へのＨＣＶｐｐおよびＨＣＶｃｃの侵入に必須であることが示されたＨＣＶの受容体であるＣＤ８１に対するＥ２の結合を阻害することが示された（Ｈｓｕら、２００３年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１００巻、７２７１頁；およびＴｓｃｈｅｍｅら、２００６年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８０巻、１７３４頁；両方が参照により本明細書に組み込まれている）。
【００５７】
ドメインＢ内のオーバーラップエピトープに対する４つの抗体が１人のＨＣＶ感染者から以前に分離されたが、Ｅ２上のドメインＢエピトープが免疫応答の主要な標的であるという程度まで、それは不明のままである。実施例１で以前のパネルからのドメインＢ抗体と交差競合し、したがって、このドメイン内のオーバーラップエピトープの数を拡大する、遺伝子型１ａＨＣＶ感染者からの２つの新規ヒトモノクローナル抗体ＨＣ−１およびＨＣ−１１の分離について述べる。これらの抗体は、すべての遺伝子型および／またはサブタイプ間で保存されている立体配座エピトープに対するものであり、ＨＣＶｐｐおよびＨＣＶｃｃを中和し、一部は、このドメインに対する他の抗体について以前に認められたものより大きい効力を有する。これらの抗体による中和のメカニズムは、ＣＤ８１へのＥ２の結合を阻害することによるものである。さらに、ＣＤ８１に関与するように定められた領域におけるＥ２上のアラニン置換試験（Ｏｗｓｉａｎｋａら、２００６年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８０巻、８６９５頁；参照により本明細書に組み込まれている）で、これらのＨＣＶ抗体エピトープ内のいくつかの接触残基がＣＤ８１へのＥ２の結合に必要な同じ接触残基であることが示されている。第３のヒトモノクローナル抗体であるＣＢＨ−２３は、遺伝子型１ｂＨＣＶ感染者から分離された。ＣＢＨ−２３は、ドメインＣに対する代表的な抗体と交差競合し、ＣＤ８１へのＥ２の結合を阻害することによって中和を媒介する。第４のヒトモノクローナル抗体ＨＣ−３は、遺伝子型１ｂＨＣＶ感染者から分離された。ＨＣ−３は、以前のパネルからの代表的なドメインＡ、ＢおよびＣ抗体と交差競合せず、したがって、Ｄと呼ばれる新たなドメインが示されている。ＨＣ−３は、ＣＤ８１へのＥ２の結合を阻害しない（図６）。本発明は、ＨＣ−３がウィルスの中和を媒介するメカニズムは、ウィルスがＣＤ８１と相互作用するときのウィルスの侵入時にほぼ同時に起こるという認識を含む。いずれか１つの特定の理論により束縛されることを望むものではないが、ＨＣ−３は、ＣＤ８１へのＥ２の結合の前に起こる、ウィルスの付着を阻害すること；Ｅ２がＣＤ８１に結合する直前または後に異なるコレセプターとのウィルスの相互作用を阻害すること；かつ／またはウィルスの侵入の成功に関与する１つもしくは複数のウィルスエンベロープ糖タンパク質における立体配座の変化を阻害することによってウィルスの中和を媒介する可能性がある。
【００５８】
抗体の様々な結合プロファイルに基づいて、汎抗ＨＣＶ抗体を提供するように、複数の種類および遺伝子型および／またはサブタイプを検出する診断アッセイを用いることができる。いくつかの実施形態では、抗体は、ＨＣＶのリスクのある人向けの防御療法としてのまたはＨＣＶに対する血清陽性である人向けの療法としての受動免疫法に用いることができる。
【００５９】
ＨＣＶに対する抗体の使用に関する参考文献は、すべてが参照により本明細書に組み込まれている、Ａｋａｔｓｕｋａら、１９９３年、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１８巻、５０３〜５１０頁；ＤｅＬａｌｌａら、１９９３年、Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．、１８巻、１６３〜１６７頁；Ｍｏｎｄｅｌｌｉら、１９９４年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６８巻、４８２９〜４８３６頁；Ｓｉｅｍｏｎｅｉｔら、１９９４年、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１３巻、９〜１３頁；およびＭｏｒａｄｐｏｕｒら、１９９６年、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｖｉｒｏｌ．、４８巻、２３４〜２４１頁などである。
【００６０】
本発明によるＨＣＶ抗体は、ＨＣＶに対する既存の抗体と比べていくつかの利点がある。非相同（ｎｏｎ−ｈｏｍｌｏｇｏｕｓ）一次アミノ酸配列は免疫学的に同一の３次元タンパク質構造を定義する可能性があるため、構造的に保存されたエピトープに結合する抗体は、天然立体配座における複数の連続的に非常に異なるＨＣＶ遺伝子型および／またはサブタイプを認識することができるが、線状または変性したエピトープのみを認識する抗体は、そうでない可能性がある。特に、Ｅ２の立体配座依存性エピトープを認識する抗体は、ＨＣＶウィルスとその細胞標的受容体との相互作用を効果的に妨げる可能性がある。標的細胞受容体（例えば、ＣＤ８１）に結合する天然ＨＣＶウィルスの能力を能動的に妨げるために立体配座依存性エピトープを認識する抗体を使用することは、特に最近の臓器移植受容者、腎臓透析を受けている人、ＨＣＶ感染母親から生まれた乳児および／または血友病もしくは他の血液凝固障害の治療を受けている感染者におけるウィルス負荷を低減し、かつ／または非感染者における臓器の感染もしくは再感染を予防する（例えば、（ｉ）種々のＨＣＶ遺伝子型および／またはサブタイプによりコードされるＨＣＶ  Ｅ２タンパク質を認識すること；（ｉｉ）ＨＣＶ粒子に結合すること；および／または（ｉｉｉ）ＨＣＶウィルス粒子のそれらの標的細胞への付着および侵入を予防することにより）ための特異的治療への適用分野を有する。いくつかの実施形態では、他の受容者は、最近ＨＣＶに曝露された人（例えば、ＨＣＶを含む体液への曝露による）を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体は、抗体が産生された対象であったＨＣＶの株と同一のＨＣＶの株を有する患者の治療に有用であり得る。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体は、抗体が産生された対象であったＨＣＶの株と異なるＨＣＶの株を有する患者の治療に有用であり得る。個々のＨＣＶ抗体およびいくつかのエピトープを認識するいくつかのＨＣＶ抗体のカクテルを用いることができる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体は、ＣＤ８１との直接的相互作用を妨げること以外のメカニズムによりＥ２結合ウィルス感染を妨げる可能性がある。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体は、コレセプタータンパク質へのＥ２の結合を妨げること、標的細胞結合に必要なＥ２タンパク質の立体配座変化を妨げること、Ｅ２媒介性の標的細胞へのウィルス融合を阻害すること、および／またはＨＣＶビリオンの脱外被を抑制することなどの多くの可能なメカニズムによりウィルス感染性を妨げる可能性がある。いくつかの実施形態では、ＣＤ８１へのＥ２の結合を直接妨げるＨＣＶ抗体は、他のメカニズムにより感染性を妨げるＨＣＶ抗体を効果的に補足する。
【００６２】
ウィルスエピトープを認識し、ウィルス／標的受容体相互作用を妨げる本発明によるＨＣＶ抗体およびそのような抗体に結合するウィルスエピトープは、ウィルスエピトープのペプチドおよび他の構造模倣体を合理的にデザインするための鋳型としても役立つ可能性がある。これらのＨＣＶ抗体により定義される構造分子模倣体は、標的受容体自体への結合により標的受容体への天然ウィルスの結合を阻止するそれらの能力に用いられる。
【００６３】
ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体を生産することにより、ＨＣＶに対するヒト免疫応答を直接的に分析することが可能である。場合によって、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体を用いることが望ましい。ヒトモノクローナル抗体を用いることにより、外来抗原としての抗体自体に対する免疫応答を最小限にすることができるが、ヒト以外の源から生産されるモノクローナル抗体は、外来抗原として認識されるので、それらに対する激しい免疫応答が一般的に発生する。保存ウィルス立体配座エピトープを認識するＨＣＶ抗体を選択することは、線状または変性エピトープのみに結合することができる抗体よりもＨＣＶ感染を改善または予防するためのこれらの試薬のより広くかつより有効な治療への適用を可能とする。本明細書で述べる抗体は、複数の異なる遺伝子型および／またはサブタイプの高度に保存されているＨＣＶ  Ｅ２タンパク質である立体配座エピトープを認識する。したがって、本明細書で述べる抗体は、多くの以前に記載された中和抗体より広い範囲のＨＣＶ分離株に対して強力であるという利点を有する。その他の利点は、本明細書で述べる抗体により認識されるエピトープの高度の保存が、これらの抗体がＨＣＶ  Ｅ２タンパク質内の機能および／または構造上の重要性を有する配列を認識することを示すものであることである。したがって、これらの抗体で分離されるペプチドまたは小分子は、ＨＣＶ  Ｅ２内の機能領域である高い確率を有する。
【００６４】
ＨＣＶ抗体の生産および特徴付け
対象ＨＣＶ抗体の開発に用いた全体的戦略を実施例１で述べる。手短に述べると、（１）ＨＣＶへの曝露の証拠を有する人を特定した；（２）それらの末梢血からの抗原特異的Ｂ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大し、活性化した；（３）これらの細胞を適切なマウス−ヒトヘテロミエローマを用いた電気融合により不死化した；（４）ハイブリドーマを分泌する適切なヒト抗体を同定した；および（５）クローニングにより適切なハイブリドーマを安定化した。この戦略は、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に特異的であり、ＨＣＶ遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、４、５および６のＥ２の立体配座エピトープに結合するＨＣＶ抗体の同定をもたらした（図１）。
【００６５】
実施例１で述べるように、ＨＣＶ１ａまたは１ｂ感染および高血清抗体中和活性を有する人からの末梢Ｂ細胞を用いて、ヒトモノクローナル抗体のパネルを生産し、特徴付けした。最初のスクリーニングでは、１ａ感染ドナー由来の抗体をスクリーニングするために遺伝子型１ｂのＥ２タンパク質を、または１ｂ感染ドナー由来の抗体をスクリーニングするために１ａＥ２タンパク質を利用した。このステップは、ドナーが遺伝子型１ａまたは１ｂ分離株に感染していたので、用いたスクリーニングアプローチを、遺伝子型１ａおよび１ｂ間で保存されていたエピトープに対する抗体の選択に偏らせるものであった。そのようなスクリーニングにより同定された抗体（すなわち、ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３）は、ウェスタンブロットによりＥ２タンパク質を認識しなかったが、免疫沈降によりＥ２タンパク質を認識した。これらの結果は、これらのＨＣＶ抗体が立体配座エピトープを認識することを示唆するものである。
【００６６】
ＨＣＶ抗体ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３はすべて、ＨＣＶ遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、４、５および６のＥ１Ｅ２に結合することができた（図１）。ＨＣ−１およびＨＣ−１１は、ＨＣＶ遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、４、５および６ＨＣＶｐｐ１ａ（図４）および２ａ感染、ならびにＨＣＶｃｃ１ａおよび１ｂ感染（図４）の大多数を中和する。ＨＣ−３は、ＨＣＶｐｐ１ａおよびＨＣＶｃｃ２ａを中和することができた。ＨＣ−３は、１ａＨＣＶｐｐおよび２ａＨＣＶｃｃを中和し（図４）、ＣＢＨ−２３は、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａＨＣＶｐｐおよび２ａＨＣＶｃｃを中和する（図４）。これらのデータから、４つのＨＣＶ抗体のすべてが複数のＨＣＶ遺伝子型を認識し、中和することができることが分かる。ＣＤ８１捕捉アッセイで、これらの４つの抗体のうちの３つ（すなわち、ＨＣ−１、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３）がＥ２とＣＤ８１との相互作用を阻害することができることが示されている（図６）。本発明は、ＨＣＶ  Ｅ２内のＣＤ８１結合部位と部分的または完全に重なるエピトープは、本質的に立体配座性であり、高度に保存されていることを示している。ＣＤ８１結合部位における高度な配列保存は、ＨＣＶ  Ｅ２とＣＤ８１との相互作用が生物学的に関連性があるという主張と一致する。本発明は、ＨＣ−３がＨＣＶ１ａおよび２ａを中和するが、ＣＤ８１へのＥ２の結合を阻害しないので、ＨＣ−３はウィルスの中和の別のメカニズムを利用していることになるという認識を含む。
【００６７】
ＨＣＶ  Ｅ２における同様な結合部位を有する抗体を明らかにするために、競合分析を用いた。ＨＣＶ  Ｅ２ドメインＡ、ＢまたはＣの１つを認識する以前に同定されたＨＣＶ抗体をビオチニル化し、漸増量の競合ＨＣＶ抗体（すなわち、ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３）の存在下でのＨＣＶ  Ｅ２に対するビオチニル化抗体の結合を測定した。ＨＣＶ抗体ＨＣ−１およびＨＣ−１１は、ドメインＢを認識する抗体と効果的に競合したが、ドメインＡまたはＣについてはそうでなかった。ＣＢＨ−２３は、ドメインＣを認識する抗体と効果的に競合したが、ドメインＡまたはＢについてはそうでなかった。ＨＣ−３は、ドメインＡ、ＢまたはＣ抗体と競合しなかった。
【００６８】
これらの結果から、ＨＣＶ  Ｅ２糖タンパク質内の立体配座エピトープは、異なるＨＣＶ遺伝子型および／またはサブタイプ間で高度に保存されていることが分かる。これらのエピトープを認識する抗体は、ＨＣＶ  Ｅ２の構造をより十分に明確にするための試薬として有用である。さらに、ヒトＣＤ８１へのＨＣＶビリオンの結合を阻害した抗体は、当技術分野で十分に受け入れられているＨＣＶモデルであるＨＣＶｐｐおよびＨＣＶｃｃモデルのウィルス中和を媒介することが示された。実際、当業者は、ＨＣＶｐｐおよび／またはＨＣＶｃｃの中和の成功がｉｎ  ｖｉｖｏでの治療活性を予測するものであることを認識している（例えば、Ｌａｖｉｅら、２００７年、Ｃｕｒｒ．  Ｉｓｓｕｅｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、９巻、７１〜８６頁；Ｂａｒｔｏｓｃｈら、２００３年、Ｊ．  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９７巻、６３３〜６４２頁；およびＬａｗら、２００８年、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、１４巻、２５〜２７頁を参照；すべてが参照により本明細書に組み込まれている）。
【００６９】
したがって、本発明は、ＨＣＶ  Ｅ２抗体ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１および／またはＣＢＨ−２３を提供する。本発明は、ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１および／またはＣＢＨ−２３と同じまたは類似のエピトープを認識する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、Ｅ２タンパク質への結合についてＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１および／またはＣＢＨ−２３と競合する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、Ｅ２タンパク質に結合するＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１および／またはＣＢＨ−２３を約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９５％を超えて減少させる抗体を提供する。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｅ２タンパク質への結合についてＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１および／またはＣＢＨ−２３と競合する物質（例えば、小分子、ペプチド、核酸、脂質、ナノ粒子等）を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、Ｅ２タンパク質に結合するＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１および／またはＣＢＨ−２３を約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９５％以上減少させる（例えば、小分子、ペプチド、核酸、脂質、ナノ粒子等）を提供する。
【００７１】
ＨＣＶｐｐ（ＨＣＶ偽型粒子）モデルは、非修飾ＨＣＶ  Ｅ１およびＥ２タンパク質を有する偽型の感染性レトロウィルス粒子を含む（例えば、Ｂａｒｔｏｓｃｈら、２００３年、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９７巻、６３３〜６４２頁；Ｄｒｕｍｍｅｒら、２００３年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、５４６巻、３８５〜３９０頁；Ｏｐ  Ｄｅ  Ｂｅｅｃｋら、２００４年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７８巻、２９９４〜３００２頁；およびＨｓｕら、２００３年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１００巻、７２７１〜７２７６頁を参照；すべてが参照により本明細書に組み込まれている）。ＨＣＶｐｐは、選択的にヒト肝細胞に感染し、抗Ｅ２抗体により中和され、ＨＣＶ感染患者血清により中和され、ウィルス侵入を含むＨＣＶ感染の初期段階を模倣する（Ｂａｒｔｏｓｃｈら、２００３年、前出；およびＬａｖｉｅら、２００７年、Ｃｕｒｒ．  Ｉｓｓｕｅｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、９巻、７１〜８６頁；両方が参照により本明細書に組み込まれている）。ＨＣＶｐｐに基づくアッセイは、ウィルスの侵入を観察し、ｉｎ  ｖｉｖｏ生理的条件と相関させるのに有用であり、新たな抗ウィルス療法の開発に適している（Ｂａｒｔｏｓｃｈら、２００３年、前出）。
【００７２】
ＨＣＶｃｃ（細胞培養ＨＣＶビリオン）モデルは、感染性で、完全に複製型のＨＣＶビリオンの生産を可能にする細胞培養システムを提供する（Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈら、２００５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０９巻、６２３〜６２６頁；Ｗａｋｉｔａら、２００５年、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、１１巻、７９１〜７９６頁；およびＺｈｏｎｇら、２００５年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０２巻、９２９４〜９２９９頁；すべてが参照により本明細書に組み込まれている）。ＨＣＶｃｃシステムは、劇症肝炎患者からクローニングした遺伝子型２ａＪＦＨ１株のゲノムＨＣＶ  ＲＮＡによるヒト肝癌細胞系Ｈｕｈ−７のトランスフェクションに基づいている。異なるＨＣＶ株間の比較試験を可能にするために、異なる遺伝子型からの構造タンパク質およびＪＦＨ１分離株からの非構造タンパク質をコードするキメラゲノムも作製した（Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎら、２００６年）。ＨＣＶｃｃモデルは、細胞培養においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、またチンパンジーにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで複製することができる（Ｗａｋｉｔａら、２００５年、前出）。ＨＣＶｃｃシステムは、完全ウィルスサイクル寿命の試験を可能にし、ＨＣＶｐｐシステムを用いて得られたデータを確認する。
【００７３】
ＨＣＶｃｃビリオンを用いて実施した実際上すべての実験の結果がＨＣＶｐｐビリオンを用いて実施した同様な実験の結果と一致することは十分に立証されている。Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈら、２００５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０９巻、６２３〜６２６頁；Ｌａｖｉｅら、２００７年、Ｃｕｒｒ．  Ｉｓｓｕｅｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、９巻、７１〜８６頁；Ｃｈａｐｅｌら、２００７年、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、８８巻、１１３３〜１１４３頁；Ｒｅｇｅａｒｄら、２００７年、ＦＥＢＳ  Ｊ．、２７４巻、４７０５〜４７１８頁；Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎら、２００６年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０３巻、７４０８〜７４１３頁；Ｗａｋｉｔａら、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１１巻、７９１〜７９６巻；Ｙｉら、２００６年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０３巻、２３１０〜２３１５頁；Ｚｈｏｎｇら、２００５年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０２巻、９２９４〜９２９９頁を参照のこと（すべてが参照により本明細書に組み込まれている）。
【００７４】
ＨＣＶを試験するための他の確立されたモデルは、「ＨＣＶ−トリメラ」マウスモデルである（Ｉａｎら、２００２年、Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．、１８５巻、１５３〜６１頁；参照により本明細書に組み込まれている）。ＨＣＶ−トリメラマウスモデルは、ＨＣＶにｅｘ  ｖｉｖｏで感染させたヒト肝断片を移植した重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス骨髄細胞で再構成された致死線量照射マウスを用いて開発された。ＨＣＶトリメラマウスは、候補ＨＣＶ治療および／または診断薬のｉｎ  ｖｉｖｏでの治療効力を評価するのに有用であり得る（Ｉｌａｎら、２００２年、Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．、１８５巻、１５３〜６１頁；Ｅｒｅｎら、２００６年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８０巻、２６５４〜２６６４頁；両方が参照により本明細書に組み込まれている）。
【００７５】
培養システムにおいてＨＣＶｃｃまたはＨＣＶｐｐを用いて実施された実験の結果がヒト肝臓−マウスキメラモデルを実施された動物実験の結果と一致することは、十分に立証されている（Ｅｒｅｎら、２００６年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８０巻、２６５４〜２６６４頁；およびＬａｗら、２００６年、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、１４巻、２５〜２７頁；両方が参照により本明細書に組み込まれている）。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイおよび拡大によるｉｎ  ｖｉｖｏ小動物ヒトマウスキメラモデル、例えば、トリメラマウスモデルにおけるＨＣＶ複製の抑制がヒト以外の霊長類の動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＨＣＶの阻害と相関することが立証された。例えば、チンパンジーにおける感染の予防における選択されるポリクローナルヒトＩｇＧ製剤の能力に一部焦点を合わせた試験において、ＨＣＶｐｐアッセイにより明らかにされた高い中和力価を有する製剤は防護的であったが、低い中和力価を有する製剤はそうでなかった。Ｙｕら、２００４年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０１巻、７７０５〜７７１０頁（参照により本明細書に組み込まれている）を参照のこと。
【００７６】
これらのモデルシステムの予測値を考慮すると、当業者は、ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１および／またはＣＢＨ−２３（あるいはＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１および／またはＣＢＨ−２３と同じエピトープを認識する抗体）はｉｎ  ｖｉｖｏでのＨＣＶの中和に成功裏で用いることができることを容易に認識するであろう。肝臓移植においてＢ型肝炎免疫グロブリンを用いて達成された成功（Ｄｉｃｋｓｏｎ、１９９８年、Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌ．  Ｓｕｒｇ．、４巻（５増補１）、Ｓ７３〜Ｓ７８頁；およびＭａｒｋｏｗｉｔｚら、１９９８年、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２８巻、５８５〜５８９頁；両方が参照により本明細書に組み込まれている）と同様に、１つの可能な適用は、広範に反応性の中和ヒトモノクローナル抗体を用いて肝臓移植受容者におけるＨＣＶ感染を抑制することである。
【００７７】
ヒトモノクローナル抗体を提供するが、他の源からの他の抗体は、本明細書で述べたヒト抗体に認識される同じエピトープを認識する可能性があり、用いることもできる。一般的にネズミ科源（例えば、マウス、ラット、ウサギ目等）および家畜動物（例えば、ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ウマ、ハムスター等）からの抗体が用いられる。遺伝子工学を用いた哺乳類源の保存領域を有し、本明細書で提供されるＨＣＶ抗体の定常領域を置換する抗体を製造することができ、あるいは動物を免疫化するために免疫原として下記のタンパク質を用い、次に得られるＢ細胞を不死化し、下記のように同様な広範囲の結合特異性を有するモノクローナル抗体を産生する不死化細胞についてスクリーニングすることができる。対象ＨＣＶ抗体との競合アッセイにおいてスクリーニングすることにより、非ヒト抗体が同じエピトープに結合するかどうかを判断することができる。
【００７８】
抗体の源としてハイブリドーマを用いる代わりに、ＨＣＶ抗体またはその一部をコードする遺伝子を分離し、適切な哺乳類宿主細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、２９３Ｔ、Ｈｕｈ７、Ｈｕｈ７．５、ＨｅＬａ、ＣＶ１または同様なものに導入することができる。適切な発現プラスミドは、ｐｃＤＮＡ３．１、Ｚｅｏ、ｐＩＮＤ（ＳＰ１）、ｐＲＥＰ８（すべてがＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから入手可能である）および同様なものなどである（実施例１参照のこと）。抗体遺伝子は、ＭＬＶベースのベクター、ワクシニアウィルスベースのベクター等により例示することができるウィルスまたはレトロウィルスベクターにより発現させることができる。同様に、抗体遺伝子は、復元して完全な抗体を形成することができる２つの独立した鎖としてのＭ１３ファージの表面上のｐＣＯＭＢシリーズを用いて発現させることができる。あるいは、抗体は、少なくとも可変領域を含む単鎖として発現させることができる。遺伝子は、宿主細胞の寿命に基づく既定の期間にわたり抗体の連続的または間欠的源を提供するために、抗体を構成的または誘導的に発現させ、分泌させることができる、リンパ球、筋肉細胞、線維芽細胞などの適切な細胞に遺伝子を導入することによって遺伝子治療に用いることができる。マーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性；蛍光標識；栄養素選択等）と連結した遺伝子は、対象から採取した細胞の細胞培養に導入し、マーカーにより改変細胞を選択し、マーカー付き細胞を宿主に戻すことができる。ＤＮＡは、２、３例を挙げると、種々のプラスミドＤＮＡ、裸のＤＮＡ、ＤＮＡウィルス構築物（例えば、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルスまたはワクシニアウィルス）および／またはＲＮＡウィルス（例えば、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウィルス、シンビスウィルスおよびセミリキホレストウィルス）を用いて細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ構築物は、転写因子が対象細胞に存在するまたは誘導もしくは導入することができるプロモーターおよびそのようなプロモーターの転写制御下にある遺伝子を有する。分泌のためのリーダー、エンハンサー、ＲＮＡ安定化配列等のような他の調節配列も存在してよい。
【００７９】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧクラスの抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２クラスの抗体である（図３）。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１クラスの抗体である。特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１κクラスの抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１γ、ＩｇＧ１δまたはＩｇＧ１λクラスの抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４クラスの抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭクラスの抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２クラスの抗体である。
【００８０】
抗体は、それらの天然形で用いることができ、あるいはＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片を提供するために切断することができる。重および軽鎖をコードする遺伝子は、多くの異なる方法で分離し、修飾することができる。好都合には、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、さらなる操作のための都合のよい構築における遺伝子のためのｃＤＮＡを得ることができる。重および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列を分離し、３ｎヌクレオチドの鎖を介して直接的または間接的に接合することができ、ここで、２つの可変領域の間のアミノ酸のリンカーとするために、少なくとも１で、約６０以下、通常約４０以下である。鎖の長さは、キレート化、表面または他の分子または同様なものへの結合のための最適な親和力および他の特性、例えば、メルカプト、カルボキシもしくはアミノ基を介しての結合を得るために経験的に決定することができる。
【００８１】
標識またはタグは、発現抗体の特異的親和性分離法、表面への付着、識別のための標識またはタグなどを可能にするために抗体をコードする遺伝子に取り付けることができる。標識またはタグは、分離抗体遺伝子の有用性を別な方法で改善することができる。いくつかの実施形態では、標識またはタグは、開裂性アーム、プロテアーゼ部位などのリンカーを介して抗体と結合している。いくつかの実施形態では、標識またはタグは、抗体、抗体をコードする遺伝子またはその断片に直接結合している（例えば、共有結合によりまたは非結合により）。
【００８２】
標識は、酵素、キレート基、リガンド結合タンパク質への結合のためのリガンド、例えば、ビオチン／ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン等、緑色蛍光タンパク質などを含んでいてよい。Ｅ．ｃｏｌｉビオチンカルボキシラーゼ担体タンパク質（ＢＣＣＰ）のビオチニル化配列は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現したタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏビオチニル化に用いるか、Ｅ．ｃｏｌｉの溶解物に導入することができる。固定化二価カチオンを含むカラムへの抗体の結合を可能にするのに適する６ヒスチジンの配列または交互ヒスチジンおよびアスパラギン酸の配列を用いることができる。ＦＬＡＧエピトープＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１）、Ｔ７タグ配列ＭＡＳＭＴＧＧＱＭＧ（配列番号２）、Ｓ−タグ配列ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ（配列番号３）またはその相関結合メンバーもしくはタンパク質試薬に対する高親和性結合をもたらす他の配列などの高親和性エピトープをコードする配列を用いることができる。融合タンパク質は、上で示したものの他に、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、肝細胞上に認められる細胞表面受容体に対するリガンド、Ｔ細胞または他の望ましい細胞標的を含む。そのような融合体は、通常、タンパク質の二官能性を促進する３〜５０アミノ酸のリンカー配列を介して結合している。
【００８３】
いくつかの実施形態では、標識は、蛍光、放射性、化学発光および／または酵素的に検出可能部分を含む。あるいは、抗体は、キレート化有毒重金属または放射性同位体（例えば、テクネチウム、放射性ヨウ素等）に結合させることができる。抗体は、発蛍光団または化学発光分子に化学的に結合させることができる。化学的結合は、システインと反応する、活性化カルボン酸基またはビオチンＣ１１−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いたビオチニル化；抗体を結合させるための様々なビーズ（セファロース、アガロース、磁性、ポリスチレン等）または表面のＣＮＢｒ活性化を使用することによる結合など；リシンもしくは他の塩基性残基を修飾することにより、または遊離スルフヒドリル基に特異的な試薬を用いることにより通常達成される、抗体を有用な化学部分に架橋させることを一般的に含むかなり多くの他の方法を含みうる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、標識は、マレイミド基を有するチオエーテルを生成するためのシステイン、金属をキレート化するためのポリヒスチジン／システインまたはポリヒスチジン／アスパラギン酸、還元的アミノ化（ａｎｉｍａｔｉｏｎ）反応におけるアルデヒドとの反応用のポリリシン等を備えていてよい。
【００８５】
いくつかの実施形態では、標識は、ジフテリア毒素、リシン、アブリンなどの毒素、リボソーム不活性化タンパク質、アポトーシスシグナリングタンパク質、細孔形成タンパク質（ペルホリン）等であってよい。
【００８６】
抗体重鎖および軽鎖可変領域（特に可変領域の超可変領域）の遺伝子は、抗体結合親和力を増大または反応性を拡大するために公知の方法により突然変異させることができる。ファージディスプレイ法、配列のランダムもしくは定方向突然変異誘発、または他の同様な方法を用いて最適結合抗体を同定するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択を用いることができる。あるいは、超可変領域のアラニンまたはグリシンウォークを用いて必須アミノ酸を同定し、次にそれらまたは他の部位のアミノ酸を変化させてエピトープの結合の改善を確認することができる。例えば、Ｇｒａｍら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  ＵＳＡ、８９巻、３５７６〜８０頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９３年、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１２巻、７２５〜３４頁；ｄｅ  Ｋｒｕｉｆら、１９９５年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２４８巻、９７〜１０５頁；Ｌｏｗら、１９９６年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２６０巻、３５９〜３６８頁；Ｈａｎｅｓら、２０００年、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８巻、１２８７〜１２９２頁；Ｂｏｄｅｒら、２０００年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  ＵＳＡ、９７巻、１０７０１〜１０７０５頁；Ｇｒａｆｆら、２００４年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌ．、１７巻、２９３〜３０４頁；Ｃｕｍｂｅｒｓら、２００２年、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０巻、１１２９〜１１３４頁；ＣｈｏｗｄｈｕｒｙおよびＤａｓｔａｎ、１９９９年、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７巻、５６８〜５７２頁；ＮｅｕｂｅｒｇｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９９５年、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７巻、２４８〜２５４頁；Ｊｏｌｌｙら、１９９６年、Ｓｅｍｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８巻、１５９〜１６８頁；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９９８年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．、１６２巻、１０７〜１１６、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、２００２年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．、３０巻、３４１〜３５０頁；Ｂｅｅｒｓら、２０００年、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６巻、２８３５〜２８４３頁；ならびにＳａｌｖａｔｏｒｅら、２００２年、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、８巻、９９５〜１００２頁（すべてが参照により本明細書に組み込まれている）を参照のこと。
【００８７】
ヒト抗体の生産に関する参考文献は、Ｆｏｕｎｇら、１９９０年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、７０巻、８３〜９０頁；およびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎら、１９９０年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３４巻、４３〜５０頁（両方が参照により本明細書に組み込まれている）などである。コンビナトリアルライブラリーを用いる修飾抗体の生産に関する参考文献は、ＢｕｒｔｏｎおよびＢａｒｂａｓ、Ｄｉｘｏｎ  ＦＪ（編）、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５７巻、Ｖｉ＋３９１ｐ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９１〜２８０頁、１９９４年；Ｐｌａｉｓａｎｔら、１９９７年、Ｒｅｓ．  Ｖｉｒｏｌ．、１４８〜１６９頁；ならびにＢａｒｂａｓおよびＢｕｒｔｏｎ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９９４年（すべてが参照により本明細書に組み込まれている）などである。修飾抗体は、突然変異誘発とそれに続く、標的抗原に対する親和性の増大またはより広いもしくはより狭い特異性などの望ましい特性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択によって生産することができる。抗体は、毒素または他の生物活性分子により修飾することができる。ＨＣＶ  Ｅ２に結合する抗体に関するアッセイは、Ｒｏｓａら（１９９６年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９３巻、１７５９〜１７６３頁；参照により本明細書に組み込まれている）により記載されている。
【００８８】
立体配座エピトープ
エピトープの特徴付け
抗体は、それらが結合するＥ２タンパク質上の構造的エピトープを同定するために用いることができる。立体配座エピトープを同定するためにモノクローナル抗体を用いる２つの基本的アプローチを用いることができる。第一に、ＨＣＶ分離株の天然変異体または突然変異分析を用いて、モノクローナル抗体により認識されるエピトープに関与する領域および最終的に個々のアミノ酸を同定することができる（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９９年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２８７巻、９８３〜９９９頁；参照により本明細書に組み込まれている）。抗体を多くの異なるＨＣＶ  Ｅ２分離株に対してスクリーニングし、個々の抗体と選択的に非反応性である分離株を同定する。次にキメラの一部が１つのＨＣＶ遺伝子型のＥ２タンパク質由来であり、他の部分が他のＨＣＶ遺伝子型のＥ２タンパク質由来である、「キメラ」Ｅ２エンベロープタンパク質を構築する。キメラＥ２タンパク質は、重複断片のＰＣＲ増幅により、かつ／または両Ｅ２タンパク質に共通な制限部位を用いることにより、構築する。代替法は、バイオテクノロジー会社ＭａｘｙＧｅｎにより開拓されたＤＮＡシャフリングである（Ｃｏｈｅｎ、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３巻、２３７頁；Ｌｏｃｈｅｒら、２００５年、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２４巻、２５６〜２６３頁；Ｌｏｃｈｅｒら、２００４年、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、４巻、５８９〜５９７頁；Ｌｏｃｈｅｒら、２００４年、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、６巻、３４〜３９頁；Ｋｕｒｔｚｍａｎら、２００１年、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１２巻、３６１〜３７０頁；ならびにＭｉｎｓｈｕｌｌおよびＳｔｅｍｍｅｒ、１９９９年、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、３巻、２８４〜２９０頁にレビューされている；すべてが参照により本明細書に組み込まれている）。各種キメラＥ２タンパク質と各種モノクローナル抗体との観測される結合反応性を調査することにより、立体配座エピトープの形成に関与するＥ２タンパク質におけるアミノ酸領域が同定される。関連する領域が同定されたならば、異なる遺伝子型間で異なる個々のアミノ酸を突然変異させて、反応性Ｅ２配列を構成する。完全な反応性を回復する突然変異体は、エピトープの形成に関与するアミノ酸を同定する。
【００８９】
立体配座エピトープを定義することに対する第二の基本的アプローチは、ＨＣＶ  Ｅ２の所望の配列をコードする長さが１０〜１５残基の一連の重複ペプチドを合成することである（例えば、Ｐｅｔｉｔら、２００３年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７８巻、４４３８５〜４４３９２頁；Ｍｏｓｋａｌｅｎｋｏら、２０００年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７４巻、１７６１〜１７６６頁；Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、１９９２年、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐ．、１６巻、１４９〜５３頁；Ｇｅｒｌｏｆｓ−Ｎｉｊｌａｎｄら、２００３年、Ｎｅｐｈｒｏｎ  Ｅｘｐ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．、９４巻、ｅ２５〜３４頁を参照のこと；すべてが参照により本明細書に組み込まれている）。次に高濃度の抗体（しばしば１００μｇ／ｍｌ以上）を用いて、ペプチドを抗体に対してスクリーニングする。完全な立体配座エピトープを含む個々の領域は、検出することができる抗体との残存結合活性をしばしば保持している。これらの領域が同定されたならば、それらは、ペプチドに照らして、または立体配座的に完全なＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に置き換えることにより、ペプチドの１０〜１５残基を対象とする突然変異試験を用いて確認することができる。この方法の変形形態は、Ｒｅｉｎｅｋｅら（１９９９年、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７巻、２７１〜２７５頁；参照により本明細書に組み込まれている）。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質における立体配座エピトープの定義を提供し、そのようなエピトープを含む組成物および化合物をさらに提供する。例えば、本発明は、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の立体配座エピトープを含む模倣物質（例えば、タンパク質、ペプチド、小分子、炭水化物、脂質、ナノ粒子、核酸、ミモトープ、有機化合物、有機金属化合物、無機化合物等）を提供する。ペプチド物質は、本発明の抗体により認識される１つまたは複数のエピトープを含んでいてよい。特定の実施形態では、タンパク質は、その少なくとも１本がＨＣＶ  Ｅ２の立体配座エピトープを含む、連鎖ペプチドのストリングである。該ストリングのペプチドは、ＨＣＶの異なる立体配座エピトープを含んでいてよく、あるいは該ペプチドは、同じエピトープを含んでいてよい。該ストリングのペプチドは、それが実質的に天然で出現するように立体配座エピトープを示すために、好ましくは適切に折りたたまれているべきである。そのようなタンパク質およびペプチドは、ワクチンを調合するのに用いることができ、あるいは診断試験に用いることができる。
【００９１】
本発明は、ＨＣＶに対する免疫応答に基づいて患者を層別化し、ＨＣＶ免疫療法によく反応する可能性がある患者を特定する方法を提供する。例えば、患者の血清を用いて、ＨＣＶ  Ｅ２の特定のエピトープに対する抗体の存在について試験することができる。患者がそのようなエピトープに対する十分なレベルの抗体を有さない場合、該エピトープに対するヒトモノクローナル抗体を患者に投与することができる。
【００９２】
ＨＣＶに対するワクチンを調合する際に、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の少なくとも１つの立体配座エピトープを模倣する物質を用いることができる。いくつかの実施形態では、ワクチンにおいて提示されるエピトープは、ウィルスの異なる遺伝子型間またはウィルスの異なる株間で保存されているものを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＶのＥ２の立体配座的に定義されたエピトープを含むペプチドまたはタンパク質を、ＨＣＶによる感染を予防またはＨＣＶ感染を治療するためのワクチンの調合に用いる。いくつかの実施形態では、ペプチドまたはタンパク質模倣体は、長さが５００未満、２００未満、１００未満、５０未満、４０未満、３０未満または２０未満アミノ酸であってよい。いくつかの実施形態では、ワクチンの調合に用いるペプチドは、ＨＣＶのＥ２タンパク質のペプチド断片である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、天然Ｅ２タンパク質におけるその折りたたみと同様な方法で折りたたまれ、それにより、立体配座エピトープの３次元構造を保存する。
【００９３】
ワクチンは、抗体に対して望ましい立体配座エピトープを有する連鎖ペプチドを提示するタンパク質も含んでいてよい。各ペプチドが異なるエピトープを含むように多量体を構成する数種のペプチドを用いてもよく、あるいは同じペプチドを多量体に複数回用いてもよい。
【００９４】
ペプチドは、メリフィールド固相化学を含む、当技術分野で公知のいずれかの方法を用いて合成することができる。ペプチドは、Ｅ１またはＥ２タンパク質の開裂および精製によっても得ることができる。ペプチドは、当分野で利用可能な技術を用いてＥ．ｃｏｌｉ、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）または哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において組換えにより調製し、産生させることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら；ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ、１９８７年；Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９８７年；それぞれが参照により本明細書に組み込まれている）。ペプチドは、免疫原性、水溶液中の溶解度を増大させるために、または正しく折りたたまれている傾向を増大させるために修飾することができる。例えば、ペプチドは、グリコシル化、ファルネシル化、ヒドロキシル化、還元、酸化などがされていてよい。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＨＣＶのＥ２タンパク質のアミノ酸６５７〜６９８を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＨＣＶのＥ２タンパク質のアミノ酸Ｄ６５８、Ｆ６７９、Ｌ６９２、１６９６またはＤ６９８の１つまたは複数を含む。当業者により理解されているように、ＨＣＶのいずれかの遺伝子型のＥ２タンパク質の類似のアミノ酸配列を用いることができる。類似の配列は、ＨＣＶの異なる株または遺伝子型のＥ２タンパク質の複数の配列を整列させることによって決定することができる。所望のエピトープを保存する相同配列もワクチンの調合に用いることができる。いくつかの実施形態では、配列は、ＨＣＶのＥ２タンパク質の天然配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはそれ以上相同である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本明細書で述べる全長ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質は、野生型ＨＣＶポリタンパク質由来である。いくつかの実施形態では、本明細書で述べる全長ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質は、非野生型ＨＣＶポリタンパク質由来である。種々のＨＣＶポリタンパク質（例えば、異なる遺伝子型、サブタイプ、分離株等）のアミノ酸配列は、当技術分野で公知であり、ＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースで利用可能である。複数のＨＣＶ遺伝子型、サブタイプおよび／または分離株の具体例としてのＨＣＶポリタンパク質配列を下の表１に示す。
【００９７】
【表１−１】
2012504602.tif 000002
【００９８】
【表１−２】
2012504602.tif 000003
【００９９】
【表１−３】
2012504602.tif 000004
【０１００】
【表１−４】
2012504602.tif 000005
【０１０１】
【表１−５】
2012504602.tif 000006
【０１０２】
【表１−６】
2012504602.tif 000007
【０１０３】
【表１−７】
2012504602.tif 000008
【０１０４】
【表１−８】
2012504602.tif 000009
具体例としてのＨＣＶポリタンパク質の配列を本明細書に示すが、Ｅ２タンパク質のエピトープの特性を有する配列を用いることができることは理解されるであろう。いくつかの実施形態では、本発明により使用するＨＣＶポリタンパク質は、配列番号４〜９からなる群から選択される配列と約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９１％同一、約９２％同一、約９３％同一、約９４％同一、約９５％同一、約９６％同一、約９７％同一、約９８％同一、約９９％同一または約１００％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、そのようなＨＣＶポリタンパク質は、１つまたは複数のＨＣＶ  Ｅ２抗体に結合する能力を保持している配列を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶポリタンパク質の一部は、配列番号４〜９からなる群から選択される配列の約５０個の連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＣＶポリタンパク質の一部は、配列番号４〜９からなる群から選択される配列の約５０個のアミノ酸の連続した連なりと約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９１％同一、約９２％同一、約９３％同一、約９４％同一、約９５％同一、約９６％同一、約９７％同一、約９８％同一、約９９％同一または約１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶポリタンパク質の一部は、配列番号４〜９からなる群から選択される配列の約４２個の連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＣＶポリタンパク質の一部は、配列番号４〜９からなる群から選択される配列の約４２個のアミノ酸の連続した連なりと約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９１％同一、約９２％同一、約９３％同一、約９４％同一、約９５％同一、約９６％同一、約９７％同一、約９８％同一、約９９％同一または約１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶポリタンパク質の一部は、配列番号４〜９からなる群から選択される配列の約４５個、約４０個、約３５個、約３０個、約２５個、約２０個、約１５個、約１０個または約５個の連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＣＶポリタンパク質の一部は、配列番号４〜９からなる群から選択される配列の約４５個、約４０個、約３５個、約３０個、約２５個、約２０個、約１５個、約１０個または約５個の連続したアミノ酸の連続した連なりと約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９１％同一、約９２％同一、約９３％同一、約９４％同一、約９５％同一、約９６％同一、約９７％同一、約９８％同一、約９９％同一または約１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１０８】
当業者は、表１に示したＨＣＶポリタンパク質はＨＣＶポリタンパク質の単に代表的な例であることを認識するであろう。ＨＣＶの様々な遺伝子型、サブタイプおよび／または分離株が存在し、同定され続けている。当業者ならば、別の遺伝子型、サブタイプおよび／または単離株の配列を用いるのに、本明細書に示す方法および組成物を適応できることを理解するであろう。そのような変異体は、予期され、本明細書に記載する方法および組成物の範囲内に含まれる。
【０１０９】
ミモトープ
ミモトープは、その最も広い意味では、エピトープの構造を模倣する巨大分子を意味する。いくつかの実施形態では、ミモトープは、その対応するエピトープにより誘発されるものと同じまたは同様な抗体反応を誘発する。いくつかの実施形態では、エピトープを認識する抗体は、そのエピトープを模倣するミモトープも認識する。いくつかの実施形態では、ミモトープは、ペプチドである。いくつかの実施形態では、ミモトープは、小分子、炭水化物、脂質または核酸である。
【０１１０】
本発明による抗体は、ミモトープをスクリーニングするのに用いることができる。ミモトープは、ファージディスプレイを用いて調製し、ペプチドを対象抗体を用いてスクリーニングすることができる（Ｌｉｖｎａｈら、１９９６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７３巻、４６４頁；およびＰｒｅｚｚｉら、１９９６年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５６巻、４５０４頁；両方が参照により本明細書に組み込まれている）。いくつかの実施形態では、ミモトープは、立体配座が保存されたＨＣＶエピトープのペプチドまたは非ペプチドミモトープである。立体配座が保存されたＨＣＶエピトープを認識する抗体は、立体配座エピトープまたはミモトープのペプチドまたは非ペプチド構造模倣体の合理的デザインのための鋳型として用いることができる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、立体配座的に定義されたウィルスエピトープの構造を模倣することにより、ミモトープは、例えば、天然結合パートナー自体に結合することにより、ＨＣＶウィルス粒子のその天然結合パートナー（例えば、ＨＣＶ標的受容体）に結合する能力を妨げる。例えば、モノクローナル抗体と腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）との接合部分を定義する溶解結晶構造（ｓｏｌｖｅｄ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の分析により、ＴＮＦ受容体に結合することによってＴＮＦの生物学的機能に拮抗することができる非ペプチド模倣体の妥当なデザインが可能であった（Ｔａｋａｓａｋｉら、１９９７年、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５巻、１２６６〜１２７０頁；参照により本明細書に組み込まれている）。ペプチド構造模倣体のデザインに用いる一次アミノ酸配列からタンパク質の折りたたみを合理的に推定するために用いることができる計算手法は、Ｔｅｉｃｈｍａｎｎら（１９９９年、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．、９巻。３９０〜３９９頁；参照により本明細書に組み込まれている）にレビューされている。立体配座が保存されたエピトープの構造的モデリングに用いるコンピュータプログラムの実際的適用は、Ｓｃｈｗａｒｔｚら（１９９９年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２８７巻、９８３頁；参照により本明細書に組み込まれている）により記載されている。抗体エピトープのペプチド構造模倣体を合理的に創出する代替法は、不連続の抗体結合部位の直線表示であるようにデザインされた合成ペプチドの系統的な置換を伴う（Ｒｅｉｎｃｋｅら、１９９９年、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７巻、２７１頁；参照により本明細書に組み込まれている）。
【０１１２】
ペプチドまたは他の小分子は、モノクローナル抗体に対する特異的親和性を有する可能性があり、立体配座的に完全なＥ２タンパク質のエピトープと競合的である可能性がある。あるいはまたはさらに、ペプチドまたは他の小分子は、モノクローナル抗体に対する特異的親和性を有する可能性があり、Ｅ１と複合したＥ２のエピトープと競合的である可能性がある。そのようなペプチドは、ワクチンとして、診断アッセイに、特定のＨＣＶエピトープに対する抗体の生産のための免疫付与に、遺伝子型および／またはサブタイプを定義するための競合的アッセイなどに用いることができる。例えば、Ｐｕｎｔｏｒｉｅｒｏら（１９９８年、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１７巻、３５２１〜３５３３頁；参照により本明細書に組み込まれている）、Ｍｅｏｌａら（１９９５年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４巻、３１６２〜３１７２頁；参照により本明細書に組み込まれている）およびＴａｆｉら（１９９７年、Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、３７８巻、４９５〜５０２頁；参照により本明細書に組み込まれている）を参照のこと。
【０１１３】
立体配座が保存されたＨＣＶエピトープの構造的模倣体を効率よく創出する他のアプローチは、立体配座的依存性ＨＣＶ抗体に対する抗イディオタイプ抗体を生産することである。抗イディオタイプ体は、天然ウィルスのその標的受容体との結合を効果的に阻害する可能性がある（Ｃｈａｎｈら、１９８７年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８４巻、３８９１〜３８９５頁；Ｋｏｐｅｃｋｙら、１９９９年、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌ．、４２巻、９〜１６頁；およびＸｕｅら、１９９３年、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、７４巻、７３〜７９頁；すべてが参照により本明細書に組み込まれている）。ＨＣＶ抗体ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３のいずれか１つの立体配座結合部位を認識する抗イディオタイプ抗体は、標的細胞タンパク質に対するＥ２の結合を妨げることによって、または標的細胞へのビリオンの付着を妨げることによってウィルス感染を予防することができるであろう。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、エピトープ模倣体（例えば、ミモトープ）は、薬物の発見のための手段としての役割を果たしうる。１つの例を示すと、ＨＣＶ抗体へのＥ２タンパク質の結合を模倣するエピトープ模倣体（例えば、ペプチド、小分子等）は、エピトープに結合する他の物質（例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、小分子等）をスクリーニングするのに用いることができる可能性がある。いくつかの実施形態では、そのような同定された物質は、ＨＣＶ  Ｅ２抗体が示すのと同様なＥ２エピトープに対する結合特異性および／または親和力を示す可能性がある。いくつかの実施形態では、そのような同定された物質は、ＨＣＶ  Ｅ２抗体が示すよりＥ２エピトープに対する高い結合特異性および／または親和力を示す可能性がある。
【０１１５】
適用
いくつかの実施形態では、本発明によるＨＣＶ抗体は、予防、治療および／または診断の目的のために用いることができる。いくつかの実施形態では、本発明によるＨＣＶ抗体は、ＨＣＶ感染、ＨＣＶ媒介性肝疾患、および／または他のＨＣＶ関連の状態を治療する（例えば、その１つもしくは複数の症状もしくは特徴を軽減し、改善し、緩和し、その発症を遅延させ、その進行を抑制し、その重症度を低下させ、かつ／またはその発生率を低下させる）のに用いることができる。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体は、様々な治療目的、例えば、免疫療法のために用いることができる。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体は、様々な予防目的および／または受動免疫のために、ＨＣＶのワクチンの開発のために用いることができる。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体は、様々な診断目的のために、例えば、ＨＣＶビリオンおよび／またはＥ２タンパク質を捕捉し、かつ／または同定するために用いることができる。ＨＣＶ抗体のこれらおよび他の使用は、以下の項でさらに詳細に述べる。いくつかの実施形態では、治療、診断および／または予防適用分野では、本明細書で述べるように、ＨＣＶ抗体および／またはその医薬組成物を利用する。本明細書で述べるように、抗体は、立体配座エピトープを標的とすることができることは十分に理解されるであろう。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶ  Ｅ２抗体は、将来新たなＨＣＶ遺伝子型が発見されたならば、１つのＨＣＶ遺伝子型、２つのＨＣＶ遺伝子型、３つのＨＣＶ遺伝子型、４つのＨＣＶ遺伝子型、５つのＨＣＶ遺伝子型、６つのＨＣＶ遺伝子型、７つのＨＣＶ遺伝子型、８つのＨＣＶ遺伝子型、９つのＨＣＶ遺伝子型、１０のＨＣＶ遺伝子型、１１のＨＣＶ遺伝子型、または１１を超えるＨＣＶ遺伝子型のＥ２エピトープを標的とすることができる。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶ  Ｅ２抗体は、将来新たなＨＣＶサブタイプが発見されたならば、１つのＨＣＶサブタイプ、２つのＨＣＶサブタイプ、３つのＨＣＶサブタイプ、４つのＨＣＶサブタイプ、５つのＨＣＶサブタイプ、６つのＨＣＶサブタイプ、７つのＨＣＶサブタイプ、８つのＨＣＶサブタイプ、９つのＨＣＶサブタイプ、１０のＨＣＶサブタイプ、１１のＨＣＶサブタイプ、１２のＨＣＶサブタイプ、１３のＨＣＶサブタイプ、１４のＨＣＶサブタイプ、１５のＨＣＶサブタイプ、１６のＨＣＶサブタイプ、１７のＨＣＶサブタイプ、１８のＨＣＶサブタイプ、１９のＨＣＶサブタイプ、２０のＨＣＶサブタイプ、２１のＨＣＶサブタイプ、または２１を超えるＨＣＶサブタイプのＥ２エピトープを標的とすることができる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶ  Ｅ２抗体は、将来新たなＨＣＶ株が発見されたならば、１つのＨＣＶ株、２つのＨＣＶ株、３つのＨＣＶ株、４つのＨＣＶ株、５つのＨＣＶ株、６つのＨＣＶ株、７つのＨＣＶ株、８つのＨＣＶ株、９つのＨＣＶ株、１０のＨＣＶ株、２０のＨＣＶ株、３０のＨＣＶ株、４０のＨＣＶ株、５０のＨＣＶ株、７５のＨＣＶ株、１００のＨＣＶ株、または１００を超えるＨＣＶ株のＥ２エピトープを標的とすることができる。
【０１１９】
治療への適用
本発明は、ＨＣＶ感染に罹患している、罹りやすい、および／またはその症状を示している患者を治療するためのシステムおよび方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＣＶ感染に罹患している、罹りやすい、および／またはその症状を示している患者を層別化するのに有用なシステムおよび方法を提供する。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、治療への適用は、治療上有効量の本発明による少なくとも１つのＨＣＶ抗体をそれを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象へのＨＣＶ抗体の投与は、ＨＣＶ感染の１つもしくは複数の徴候、症状および／または特徴を軽減し、改善し、緩和し、その発現を遅延させ、その進行を抑制し、その重症度を低下させ、かつ／またはその発生率を低下させる可能性がある。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体の投与は、対象におけるＨＣＶビリオンの循環のレベルを低下させる（例えば、新たな細胞を感染させることができるＨＣＶビリオン）。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体の投与は、対象における循環するＨＣＶビリオンのレベルを無処置対象と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％低下させる。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体は、対象におけるウィルス負荷をｉｎ  ｖｉｔｒｏで減少させるのに用いることができる。身体構成要素、特にＨＣＶに感染した患者の身体構成要素のウィルス負荷を減少させるために、患者の血液をＨＣＶビリオンを捕捉するための表面または固体担体に結合された抗体を含む装置に通す（例えば、米国特許第５，６９８，３９０号および第４，６９２，４１１号を参照；両方が参照により本明細書に組み込まれている）。文献に認められる他の様々な装置は、同様な結果を達成するために対象抗体とともに用いることができる。身体構成要素は、生体液（例えば、血液、血清等）、組織、肝臓などの臓器などであり得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、「対象における循環するＨＣＶビリオンのレベル」は、対象における循環するビリオンの絶対数を意味する。いくつかの実施形態では、「対象における循環するＨＣＶビリオンのレベル」は、対象の血液の単位容積（例えば、ミリリットル、リットル等）当たりのビリオン数を意味する。いくつかの実施形態では、「対象における循環するＨＣＶビリオンのレベル」は、ウィルス負荷および／またはＨＣＶ  ＲＮＡレベルを意味する。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体の投与は、例えば、非感染細胞の感染を阻止することにより、対象におけるＨＣＶビリオンの複製を抑制する。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体の投与は、対象におけるＨＣＶビリオンの複製を無処置対照と比較して約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１０００倍、約１００００倍、または約１００００倍を超えて抑制する。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体の投与は、対象におけるＨＣＶビリオンを殺滅し、かつ／または不活性化する。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体の投与は、無処置対照と比較して対象におけるＨＣＶビリオンの約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％殺滅し、かつ／または不活性化する。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体の投与は、細胞標的タンパク質へのウィルスの結合を抑制する。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体の投与は、少なくとも１つの細胞標的タンパク質へのウィルスの結合を無処置対照と比較して約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１０００倍、約１００００倍、または約１００００倍以上抑制する。１つの例を示すと、ＨＣＶ抗体の投与は、ＣＤ８１へのＨＣＶウィルスの結合を抑制する可能性がある。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体の投与は、ＣＤ８１へのＨＣＶ結合を無処置対照と比較して約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１０００倍、約１００００倍、または約１００００倍を超えて抑制する。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体の投与は、標的細胞とのウィルス媒介性融合を抑制する。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体の投与は、標的細胞とのウィルス媒介性融合を無処置対照と比較して約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１０００倍、約１００００倍、または約１００００倍を超えて抑制する。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体の投与は、ウィルスの侵入に関連する１つまたは複数のタンパク質の立体配座変化を抑制する。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体の投与は、ウィルスの侵入に関連する１つまたは複数のタンパク質の立体配座変化を無処置対照と比較して約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１０００倍、約１００００倍、または約１００００倍を超えて抑制する。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体の投与は、抗体媒介性補体活性化を促進する。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体の投与は、抗体媒介性補体活性化を無処置対照と比較して約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１０００倍、約１００００倍、または約１００００倍を超えて促進する。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体の投与は、食細胞によるクリアランスにつながる、ビリオンの抗体媒介性凝集を促進する。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体の投与は、ビリオンの抗体媒介性凝集を無処置対照と比較して約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１０００倍、約１００００倍、または約１００００倍を超えて促進する。
【０１３１】
チンパンジーは、ＨＣＶワクチンおよび治療薬をスクリーニングするための受け入れられている動物モデルである（例えば、Ｆａｒｃｉら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９３巻、１５３９４〜１５３９９頁；Ｆａｒｃｉら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９１巻、７７９２〜７７９６頁；Ｆａｒｃｉら、１９９２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８巻、１３５〜１４０頁；Ｋｒａｗｃｚｙｎｓｋｉら、１９９６年、Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．、１７３巻、８２２〜８２８頁；およびＢａｓｓｅｔｔら、１９９８年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７２巻、２５８９〜２５９９頁を参照；すべてが参照により本明細書に組み込まれている）。抗体の有効性は、定量的ＰＣＲ法を用いてＨＣＶ  ＲＮＡの存在および力価をモニターすることによって判断することができる。試験動物または対象におけるウィルス負荷の成功裡の減少または感染の予防は、血清中のＨＣＶ  ＲＮＡの減少または除去として反映される。アラニンアミノトランスフェラーゼもしくは他の肝酵素の測定などの酵素試験および／または連続針パンチ肝生検も有効性を試験するのにも用いることができ、これらの場合、いずれかの評価の改善がウィルス誘発性肝障害の低減を示す。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗体の投与は、細胞感染力に必要なウィルスエンベロープタンパク質の立体配座変化の妨げをもたらす。例えば、投与されたＨＣＶ抗体は、そのようなウィルスエンベロープタンパク質に結合し、それにより、細胞表面（例えば、細胞表面上のタンパク質、例えば、ＣＤ８１；脂質；炭水化物；受容体など）を認識し、かつ／またはそれと相互作用するエンベロープタンパク質の能力を阻害する。いくつかの実施形態では、投与されたＨＣＶ抗体は、そのようなウィルスエンベロープタンパク質に結合し、それにより、エンベロープタンパク質が細胞表面（例えば、細胞表面上のタンパク質、脂質、炭水化物、受容体）を認識し、かつ／またはそれと相互作用することを不可能にするような仕方で、エンベロープタンパク質の３次元配座を変化させる。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、治療方法は、治療を受ける個人に合わせて特に調整する。手短に述べると、治療する患者を準備し、患者から血清の試料を採取する。次に血清試料を特定の抗体、いくつかの例を示すと、中和抗体、ＨＣＶのタンパク質の特定の領域またはエピトープに結合する抗体等の存在について分析する。本願書で述べたものを含むが、それらに限定されない、当技術分野で公知の方法を用いて、検出すべき抗体の存在を確定することができる（例えば、ＥＬＩＳＡ、競合アッセイ、ウィルス結合中和アッセイ等）。患者の血清中の抗体のレベルに基づいて、当該患者について治療をデザインすることができる。例えば、天然受容体へのビリオンの結合を妨げることが公知である抗体を持たない患者は、この型のモノクローナル抗体で治療することができる。いくつかの実施形態では、患者（例えば、ＨＣＶ感染、ＨＣＶ媒介性肝疾患および／または他のＨＣＶ関連状態に罹り、罹りやすく、感染し、かつ／またはその症状を示している患者）からの血清は、１／１００以上、１／２００以上、１／３００以上、１／４００以上、１／５００以上、１／６００以上、１／７００以上、１／８００以上、１／９００以上、または１／１０００以上の患者の血清の希釈度でＥ２結合の５０％以上の阻害が得られる場合、競合抗体の存在について陽性とみなされる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、治療を受ける特定の個々の患者に合わせて治療が調整され、例えば、必要であり、患者によって天然で産生されない抗体のみが投与されるため、上述のような方法は有利である可能性がある。これによって、必要でない治療薬を投与することによる有害反応のリスクが回避または低減される。そのような方法は、そのような治療から利益を得ないような患者を治療する費用を不要にするものである。例えば、患者がＥ２の特定のエピトープに対する治療レベルの抗体を既に産生していた場合には、該エピトープに対して外生的に誘導されたヒトモノクローナル抗体を投与する必要はない。
【０１３５】
ＨＣＶ抗体による対象の治療は、他の治療の過程中、および／または他の抗ウィルス化合物の治療の中断後に単独で行うことができる。あるいはまたはさらに、ＨＣＶ抗体は、アポトーシスまたは他の細胞死過程を誘発することができる公知の毒素またはタンパク質に物理的に結合させる（例えば、共有結合または非共有結合により）ことができる。修飾ＨＣＶ抗体は、ＨＣＶ感染、ＨＣＶ媒介性肝疾患および／または他のＨＣＶ関連状態に罹り、罹りやすく、感染し、かつ／またはその症状を示している個人にＨＣＶ感染細胞を殺滅する手段として投与することができる。
【０１３６】
予防への適用
いくつかの実施形態では、本発明によるＨＣＶ抗体は、予防への適用に利用することができる。いくつかの実施形態では、予防への適用は、ＨＣＶ感染、ＨＣＶ媒介性肝疾患および／または他のＨＣＶ関連状態に罹りやすく、かつ／またはその症状を示している個人におけるＨＣＶ感染、ＨＣＶ媒介性肝疾患および／または他のＨＣＶ関連状態を予防し、その進行を抑制し、かつ／またはその発現を遅延させるシステムおよび方法を対象として含む。いくつかの実施形態では、予防への適用は、慢性肝疾患を予防し、その進行を抑制し、かつ／またはその発現を遅延させるシステムおよび方法を対象として含む。いくつかの実施形態では、予防への適用は、慢性肝疾患を予防し、その進行を抑制し、かつ／またはその発現を遅延させるシステムおよび方法を対象として含む。いくつかの実施形態では、予防への適用は、肝疾患を予防し、その進行を抑制し、かつ／またはその発現を遅延させるシステムおよび方法を対象として含む。いくつかの実施形態では、肝不全を予防し、その進行を抑制し、かつ／またはその発現を遅延させるシステムおよび方法を対象として含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶに対するワクチンは、受動免疫（すなわち、抗体を対象に投与する免疫処置）に用いることができる。いくつかの実施形態では、受動免疫用のＨＣＶに対するワクチンは、本明細書で述べる組成物のいずれかのように、ＨＣＶ抗体を含んでいてよい。いくつかの実施形態では、受動免疫は、妊娠中に抗体が母親から胎児に移される場合に起こる。いくつかの実施形態では、抗体を個人に直接的に投与する（例えば、注射により、経口的に等）。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、予防への適用は、ワクチンを投与することを含んでいてよい。いくつかの実施形態では、ワクチン接種は、個々の患者に合わせて調製される。例えば、上述のように、血清を患者から採取し、ＨＣＶ抗体の存在について試験することができる。いくつかの実施形態では、ワクチンは、患者に欠如していることが認められた抗体の産生を誘発するようにデザインすることができる。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物が、天然立体配座を有する抗原を含み、防御反応（例えば、補体活性化、ウィルス中和等）を媒介し、かつ／または強い抗体反応を誘発することができることが望ましい。いくつかの実施形態では、ワクチンは、エピトープまたはそのミモトープに対する抗体が個人において天然で産生されないエピトープまたはそのミモトープを含む。例えば、ＨＣＶ抗体（例えば、複数の遺伝子型および／サブタイプを認識するＨＣＶ抗体）により分離される合成ペプチドミモトープは、該ミモトープの最初の分離に用いられた抗体と同様な強力な免疫応答を誘発する可能性を有する。そのようなワクチンの投与は、患者の免疫系が投与されたエピトープに対する一組の抗体を産生することを開始させることを誘導するであろう。本発明によるミモトープ（またはエピトープ）は、単独で、あるいは組換えタンパク質、不活性化ＨＣＶウィルス、死滅ＨＣＶウィルスと組み合わせて、かつ／または数種のミモトープのカクテルとして用いることができることは十分に理解されるであろう。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶに対するワクチンを能動免疫（すなわち、微生物、タンパク質、ペプチド、エピトープ、ミモトープ等を対象に投与する免疫処置）に用いることができる。いくつかの実施形態では、ＨＣＶに対するワクチンは、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の少なくとも１つの立体配座エピトープを模倣する物質を含んでいてよく、用いることができる。例えば、該物質は、ペプチド、タンパク質、糖ペプチド、糖タンパク質、小分子、ミモトープ、有機化合物、脂質、糖、有機金属化合物、無機化合物等であってよい。いくつかの実施形態では、ワクチンにおいて提示されるエピトープは、感染を予防することが公知である抗体が標的とするものを含む。いくつかの実施形態では、本発明によるワクチンにおいて提示されるエピトープは、ウィルスの異なる遺伝子型および／またはサブタイプ間またはウィルスの異なる株間で保存されているものを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＶのＥ２の立体配座的に定義されたエピトープを含むペプチドまたはタンパク質を、ＨＣＶによる感染を予防、その発症を遅延させ、その症状を改善し、かつ／またはその重症度を低下させるワクチンの調合に用いる。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ  Ｅ２エピトープは、線状エピトープであってよい。いくつかの実施形態では、Ｅ２エピトープは、線状および立体配座エピトープの混合であってよい。いくつかの実施形態では、Ｅ２エピトープは、立体配座エピトープであってよい。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、長さが１００アミノ酸未満である。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、長さが５０未満、４０未満、３０未満、２０未満、または１０アミノ酸未満である。いくつかの実施形態では、ワクチンの調合に用いられるペプチドは、ＨＣＶのＥ２タンパク質のペプチド断片である。一般的に、天然Ｅ２タンパク質におけるその３次元の折りたたみと同様な様式で折りたたまり、それにより立体配座エピトープの３次元構造を保存しているペプチドを用いる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、抗体が望ましい１つまたは複数の立体配座エピトープを有する連鎖状ペプチドを示すタンパク質を含んでいてよい。各ペプチドが異なるエピトープを含むように多量体を構成する数種のペプチドを用いることができ、あるいは同じペプチドを多量体において複数回用いることができる。
【０１４１】
本発明によるペプチドは、メリフィールド固相化学を含む、当技術分野で公知のいずれかの方法を用いて合成することができる（例えば、ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＳｈｅｐｐａｒｄ、１９８９年、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＬＲ．  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ；ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、１９８４年、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６３年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、８５巻、２１４９〜２１５４頁を参照；すべてが参照により本明細書に組み込まれている）。あるいはまたはさらに、ペプチドは、Ｅ２の開裂および開裂生成物の場合による精製によって得ることができる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、当分野で利用可能な技術を用いてＥ．ｃｏｌｉ、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）および／または哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において組換えにより調製し、産生させることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら；ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ、１９８７年；Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９８７年；両方が参照により本明細書に組み込まれている）。いくつかの実施形態では、ペプチドは、それらの免疫原性、水溶液中の溶解度を増大させるために、および／または正しく折りたたまれている傾向を増大させるために修飾することができる。例えば、ペプチドは、グリコシル化、ファルネシル化、ヒドロキシル化、還元、酸化、メチル化などがされていてよい。
【０１４２】
特定の実施形態では、ペプチドは、ＨＣＶサブタイプ１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、４、５および／または６のＥ２タンパク質のアミノ酸５２３〜５４０であるか、または含む。当業者により理解されるように、ＨＣＶの他のサブタイプのＥ２タンパク質の類縁、相同、類似および／または同一アミノ酸配列を用いることができる。類縁配列は、ＨＣＶの異なる株またはサブタイプのＥ２タンパク質複数の配列を整列させることによって決定することができる。所望のエピトープを保存している相同、類似および／または同一配列もワクチンの調合に用いることができる。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、配列は、ＨＣＶ  １ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、４、５および／または６Ｅ２タンパク質の天然配列と約５０％相同、約６０％相同、約７０％相同、約８０％相同、約９０％相同、約９５％相同、約９９％相同、または約９９％以上相同である。いくつかの実施形態では、配列は、ＨＣＶ  １ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、４、５および／または６Ｅ２タンパク質の天然配列と約５０％類似、約６０％類似、約７０％類似、約８０％類似、約９０％類似、約９５％類似、約９９％類似、または約９９％以上類似である。いくつかの実施形態では、配列は、ＨＣＶ  １ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、４、５および／または６Ｅ２タンパク質の天然配列と約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９９％同一、または約９９％以上同一である。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、配列は、ＨＣＶ  １ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、４、５および／または６Ｅ２タンパク質の天然配列と少なくとも５０％相同、少なくとも６０％相同、少なくとも７０％相同、少なくとも８０％相同、少なくとも９０％相同、少なくとも９５％相同、少なくとも９９％相同、または実質的に１００％相同である。いくつかの実施形態では、配列は、ＨＣＶ  １ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、４、５および／または６Ｅ２タンパク質の天然配列と少なくとも５０％類似、少なくとも６０％類似、少なくとも７０％類似、少なくとも８０％類似、少なくとも９０％類似、少なくとも９５％類似、少なくとも９９％類似、または実質的に１００％類似である。いくつかの実施形態では、配列は、ＨＣＶ  １ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、４、５および／または６Ｅ２タンパク質の天然配列と少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または実質的に１００％同一である。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、少なくとも１つのアジュバントを含む。いかなるアジュバントも本発明により用いることができる。多数のアジュバントが公知であり、多くのそのような化合物の有用な一覧は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により作成されており、インターネット上に見いだすことができる（ｗｗｗ．ｎｉａｉｄ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄａｉｄｓ／ｖａｃｃｉｎｅ／ｐｄｆ／ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ．ｐｄｆ）。Ａｌｌｉｓｏｎ（１９９８年、Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  Ｓｔａｎｄ．、９２巻、３〜１１頁；参照により本明細書に組み込まれている）、Ｕｎｋｅｌｅｓｓら（１９９８年、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻、２５１〜２８１頁；参照により本明細書に組み込まれている）およびＰｈｉｌｌｉｐｓら（１９９２年、Ｖａｃｃｉｎｅ、１０巻、１５１〜１５８頁；参照により本明細書に組み込まれている）も参照のこと。数百種のアジュバントが当技術分野で公知であり、本発明の実施に際して用いることができるであろう。本発明により利用することができる具体例としてのアジュバントは、サイトカイン、ゲル型アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム等）；微生物アジュバント（例えば、ＣｐＧモチーフを含む免疫調節ＤＮＡ配列；モノホスホリル脂質Ａなどの内毒素；コレラ毒素、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性毒素および百日咳毒素などの外毒素；ムラミルジペプチド等）；油エマルジョンおよび乳化剤ベースのアジュバント（例えば、フロイントアジュバント、ＭＦ５９［Ｎｏｖａｒｔｉｓ］、ＳＡＦ等）；粒子状アジュバント（例えば、リポソーム、生分解性ミクロスフェア、サポニン等）；合成アジュバント（例えば、非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチド類似体、ポリホスファゼン、合成ポリヌクレオチド等）；および／またはそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。他の具体例としてのアジュバントとしては、ある種のポリマー（例えば、ポリホスファゼン；参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，５００，１６１号に記載されている）、Ｑ５７、ＱＳ２１、スクアレン、テトラクロロデカオキシド等がある。
【０１４６】
薬学的に許容される賦形剤は、「医薬組成物」と題する項でさらに詳細に述べる。
【０１４７】
診断への適用
いくつかの実施形態では、本発明によるＨＣＶ抗体は、診断への適用に用いる。例えば、ＨＣＶ抗体の結合プロファイルの多様性のため、サブトラクション分析により個々の遺伝子型および／またはサブタイプを同時に分析することができるようにしながら、汎ＨＣＶ抗体（ｐａｎ−ＨＣＶ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を提供するように、複数のＨＣＶ遺伝子型および／またはサブタイプを検出する診断アッセイを用いることができる。
【０１４８】
診断の目的のために、抗体は、Ｅ２タンパク質を検出し、ＨＣＶ遺伝子型および／またはサブタイプを識別し、ビリオンおよび抗体を検出するために様々な方式で用いることができる（例えば、米国特許第５，６９５，３９０号を参照；参照により本明細書に組み込まれている）。抗体は、個別に、あるいは対象群の他の抗体もしくは他の抗体と、あるいはＨＣＶエンベロープタンパク質（すなわち、Ｅ１またはＥ２）上に存在するグリコシル基に結合するレクチンおよび／またはＨＣＶ  Ｅ２と複合する他のタンパク質（例えば、ＨＣＶＥ１：ＨＣＶＥ２複合体）と組み合わせて用いることができる。診断の目的のために、大部分について以前に言及した、様々な標識を用いることができる。これらは、発蛍光団、化学発光部分、放射性同位体、酵素、粒子（例えば、コロイド炭素粒子、金粒子、ラテックス粒子等）、高親和性受容体が存在するリガンド、ならびに検出可能なシグナルを得るために活性化することができるプロラベルを含むが、これらに限定されない。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、表面を、遊離タンパク質（例えば、循環タンパク質）としてまたは完全もしくは部分的に完全なビリオンの一部としてＨＣＶ抗原に結合することができるタンパク質で被覆する。複数のＨＣＶ遺伝子型および／またはサブタイプあるいはレクチン（例えば、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓレクチン；「ＧＮＡ」）に結合する対象発明の抗体を用いることができる。ＨＣＶサブタイプ１、２、３、４、５および６に結合する本発明による抗体も用いることができる。いくつかの実施形態では、本発明による抗体は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは５つを超える異なる遺伝子型および／またはサブタイプに結合する。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、アッセイは、表面を遊離またはＨＣＶ結合タンパク質（複数可）を含む培地と接触させることを含んでいてよく、培地は、１つもしくは複数の遺伝子型および／またはサブタイプの公知のＥ２の試料もしくは溶液であってよい。インキュベートおよび非特異的に結合したタンパク質を除去するための洗浄の後、何をアッセイするかによって、様々な方法でアッセイを続行することができる。血清反応陽性と推定される血液試料をアッセイしている場合、試料をＥ２タンパク質の層に加え、インキュベートし、洗浄し、タンパク質層に結合したヒト抗体の存在を判断する。標識α−ヒト抗体（対象抗体を最初に用いた場合、対象抗体のイソタイプに対する以外）を用いることができる。血清反応陽性対象における抗体についてのアッセイでは、対象抗体を対照として用い、同じ試薬を用いて、そのような対象の血清中のヒト抗ＨＣＶ抗体を検出する。試料中の抗体の特異性は、抗ヒト抗体と異なった形で標識した対象抗体を用い、それらが試料中の抗体によってブロックされたかどうかを判定することによって確認することができる。
【０１５１】
試料をＨＣＶ  Ｅ２タンパク質についてアッセイする場合、検出に標識対象抗体を用いる。これは、遺伝子型の決定またはＥ２タンパク質の検出に関心があるかどうかによる選択である。非特異的に結合した抗体を洗い流した後、公知の手法に従って標識の存在を検出することにより、標識抗体の存在を確定する。あるいはまたはさらに、対象抗体が表面に結合している場合、Ｅ２の標識レクチンを用いてＥ２タンパク質の存在を検出する。
【０１５２】
本発明による抗体は、血清中の抗体、モノクローナル抗体、遺伝子操作の結果として発現した抗体等を含む他の抗体の反応性を測定するのに用いることができる。いくつかの実施形態では、完全なビリオンを用いる。いくつかの実施形態では、立体配座保存エンベロープタンパク質を用いる。ビリオン捕捉については、例えば、Ｋｉｍｕｒａら、１９９８年、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５６巻、２５〜３２頁；Ｍｏｒｉｔａら、１９９６年、Ｈａｐａｔｏ−Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、４３巻、５８２〜５８５頁；Ｓａｔａら、１９９３年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９６巻、３５４〜３５７頁；およびＨｉｊｉｋａｔａら、１９９３年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６７巻、１９５３〜１９５８頁；（すべてが参照により本明細書に組み込まれている）を参照のこと。１つのプロトコールは、固体担体をレクチン（例えば、ＧＮＡ）で被覆し、次いで表面を完全ＨＣＶビリオンを含む培地（例えば、血清反応陽性患者の血清）と接触させるステップを含む。ビリオンを破壊するような添加物は、通常避けるべきである（例えば、洗剤）。培地をインキュベートし、洗浄して非特異的に結合した培地成分を除去した後、ビリオンを本発明による抗体および試料の抗体と接触させることができる。これは、並行して、または試料を最初に加えた場合には連続して実施することができる。他の抗体による置換に敏感に反応する量の対象抗体を用いる。そのような量は経験的に決定することができ、一連の試験において異なる量の対象抗体を用いることを望む可能性がある。試料の不存在下および存在下で得られるシグナルを知ることによって、試料中の抗体の反応性または結合親和力を測定することができる。様々な手法を用いて、ビリオンに結合した対象抗体の量を測定することができる。対象抗体を例えば、ビオチンまたはジゴキシゲニンで標識する場合、発蛍光団または基質が検出可能なシグナルを発生する酵素で標識されたストプトアビジンまたは抗ジゴキシゲニンは、対象抗体の量を測定する役割を果たすことができる。
【０１５３】
標識対象抗体は、生検材料におけるＨＣＶの存在をアッセイするのに用いることができる。標識抗体は、肝臓切片などの固定化生検材料、１つまたは複数の対象標識抗体の溶液とともにインキュベートすることができる。非特異的に結合した抗体を洗い流した後、生検組織の細胞に結合した抗体の存在を標識の性質に従って検出することができる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本発明によるＨＣＶ抗体は、ＨＣＶ受容体を同定するのに用いることができる。当業者は、これを達成することができる数多くの方法を十分理解するであろう（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．およびＭａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９８７年；両方が参照により本明細書に組み込まれている）。一般的に、タンパク質およびペプチド受容体は、Ｅ２に対する抗体がＨＣＶ感染に罹患しやすい細胞へのＨＣＶビリオンの付着を抑制することができるかどうかを判断することによって同定することができる。したがって、この方法でＨＣＶ  Ｅ２タンパク質およびペプチドの受容体を同定することができる。感受性細胞をＨＣＶおよび抗ＨＣＶ  Ｅ２抗体の存在下でインキュベートし、細胞結合アッセイを用いて、抗体の存在下で付着が減少するかどうかを測定することができる。
【０１５５】
ＨＣＶの推定受容体を発現する細胞および／またはＨＣＶの推定受容体のライブラリーを、ＨＣＶに結合するそれらの能力についてスクリーニングすることができる。例えば、細胞の表面上の推定受容体へのＨＣＶタンパク質またはペプチドの結合を可能にするのに十分な時間および条件下で、推定ＨＣＶ受容体（例えば、ＨＣＶ  Ｅ２の受容体）を発現する細胞を、抗体の存在下でＨＣＶタンパク質またはペプチドと接触させることができる。あるいはまたはさらに、ＨＣＶタンパク質、ペプチドまたはビリオンは、細胞表面上の推定受容体と接触させる前に、抗体とプレインキュベートすることができる。結合は、当技術分野で公知のいずれかの手段、例えば、フローサイトメトリ等により検出することができる（ＡｕｓｕｂｅｌらまたはＳａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照）。抗体の不存在下での細胞の不存在下での結合と比較して抗体の存在下での細胞の表面への結合の減少は、ＨＣＶ受容体の同定を示すものである。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、ＨＣＶ受容体（例えば、Ｅ２受容体など）を同定する方法としては、ビーズなどの固体担体、カラムなどの使用などがある。例えば、ＨＣＶタンパク質およびペプチド（例えば、Ｅ２タンパク質および／またはその断片）の受容体および／またはＨＣＶビリオンは、ＨＣＶ抗体を固体担体に付着させ、次いで、ＨＣＶタンパク質またはペプチドが抗体に結合するのに十分な時間にわたり抗体をＨＣＶタンパク質またはペプチドと接触させることによって同定することができる。これは、ＨＣＶタンパク質またはペプチドへの受容体の結合を可能にするのに十分な時間および条件下で固体担体上の抗体：リガンド複合体と接触させることができる推定ＨＣＶ受容体のＨＣＶタンパク質リガンドを与える。タンパク質は、ライブラリーから発現させるか、または天然もしくは組換え細胞から細胞抽出物もしくは精製タンパク質調製物として得ることができる。ＨＣＶタンパク質ペプチド間の特異的結合複合体が生成したならば、非結合ＨＣＶタンパク質またはペプチド、例えば、ＨＣＶタンパク質またはペプチドに特異的に結合しなかったライブラリータンパク質またはペプチドを、例えば、標準的洗浄ステップにより除去する。結合タンパク質を溶離させ、例えば、ゲル電気泳動により同定する。
【０１５７】
投与
本発明のＨＣＶ抗体および本発明のその医薬組成物は、治療に有効な任意の量および任意の投与経路を用いて投与されてよい。
【０１５８】
必要とされる正確な量は、人種、年齢、および患者の全身状態、感染症の重症度、特定の組成、その投与様式、その活性様式などに応じて患者毎に異なることになる。投与を容易におよび用量を均一化するために、ＨＣＶ抗体は一般的に用量単位フォームに調製される。しかし、本発明の組成物の１日の全使用量が、適切な医学的判断に従って主治医により決定されることは理解されよう。任意の個別患者または生物に対する具体的な治療上有効な用量レベルは、その治療する病気およびその病気の重症度、使用する特定のＨＣＶ抗体の活性、投与する特定の医薬組成物、投与後の組成物の半減期、患者の年齢、体重、全体的な健康、性および食事、投与の時間、投与の経路および使用する特定の化合物の排出率、治療の継続期間、使用する特定の化合物と併用または同時に使用する薬剤、などの医療従事者に周知である要因を含めた様々な要因に左右されることになる。
【０１５９】
本発明の医薬組成物は、任意の経路により投与されてよい。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、経口的（ＰＯ）、静脈（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、動脈内、脊髄内、クモ膜下腔内、皮下（ＳＱ）、心室内、経皮的、皮膚間、皮内、直腸（ＰＲ）、経膣的、腹膜内（ＩＰ）、胃内（ＩＧ）、局所的（例えば粉末、軟膏、クリーム、ゲル類、ローションおよび／または滴下）、粘膜、鼻腔内、口内、経腸、硝子体、舌下を含めた様々な経路によって、気道内注入、気管支内挿管および／または吸入によって、口内スプレー、鼻腔用スプレーおよび／または噴霧器、および／または門脈カテーテルとして投与される。
【０１６０】
一般に、最適な投与の経路は、投与される薬剤の性質（例えば、消化管の環境におけるその安定性）、患者の状態（例えば、患者が特定の投与様式を許容できるかどうか）などを含めた様々な要因に左右されることになる。具体的な実施形態として、本発明に基づくＨＣＶ抗体および／またはその医薬組成物は、静脈内へ、例えば  静脈内点滴により投与されてよい。具体的な実施形態として、本発明のＨＣＶ抗体および／またはその医薬組成物は、筋内注射により投与されてよい。具体的な実施形態として、本発明のＨＣＶ抗体および／またはその医薬組成物は、皮下注射により投与されてよい。具体的な実施形態として、本発明のＨＣＶ抗体および／またはその医薬組成物は、門脈カテーテルを介して投与されてよい。しかし本発明は、薬物送達の学問において、見込まれる進歩を考慮した任意の適切な経路によって本発明のＨＣＶ抗体および／またはその医薬組成物を送達することを包含している。
【０１６１】
ある種の実施形態では、所望の治療効果を得るために、本発明のＨＣＶ抗体および／または本発明のその医薬組成物は、患者体重ｋｇにつき１日あたり約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な投与量レベルで投与されてよい。所望の投与量は、１日につき３回より多く、１日につき３回、１日につき２回、１日につき１回、１日おき、３日毎、毎週、２週間毎、３週間毎、４週間毎、２カ月毎、６カ月毎または１２カ月毎に与えられてよい。ある種の実施形態では、所望の投与量は、複数回の投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４またはより多くの投与）で与えられてよい。
【０１６２】
本発明のＨＣＶ抗体および／またはその医薬組成物が併用療法において使用され得ることはいうまでもない。併用レジメンにおいて、使用する特定の治療法の組合せ（例えば、治療法または手順）は、所望の治療法および／または手順と所望の達成されるべき治療効果の適合性を考慮することになる。使用するそれらの治療法は、同じ目的に対して所望の効果をもたらしてもよく（例えば、ＨＣＶ感染の発症の治療、予防および／または遅延に役立つＨＣＶ抗体は、ＨＣＶ感染の発症の治療、予防および／または遅延に役立つ他の薬剤と並行して投与されてよい）、またはそれらが異なる効果をもたらしてもよい（例えば、任意の副作用の制御）ことは、いうまでもない。本発明は、それらの生物学的利用能を向上させ、それらの代謝を減少および／または改善し、それらの排出を阻害し、および／または、それらの体内分布を改善する可能性がある薬剤と組み合わせた医薬組成物の送達を包含している。
【０１６３】
本発明の医薬組成物は、単独でまたは１つ以上の他の治療薬と組み合わせて投与されてよい。「と組み合わせて」によって、これら送達方法は本発明の範囲内であるが、これらの薬剤が同時に投与されなければならない、および／または同時に送達するために調合されなければならないということを意味するものではない。組成物は、１つ以上の他の所望の治療法または医療処置と同時に、前に、または後に投与できる。組み合わせて利用される治療効果のある薬剤は、単一の組成物として一緒に、または異なる組成物として別々に投与されてもよいことはいうまでもない。一般に、各薬剤は１服でおよび／またはその薬剤のために決められた時間割に基づいて投与されることになる。
【０１６４】
一般に、組み合わせて利用される薬剤は、それらが個別に利用されるレベルを超えないレベルで利用されることが期待される。いくつかの実施形態では、組合せで利用されるそのレベルは、個別に利用されるレベルより低くなることになる。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＣＶ  Ｅ２抗体（例えば、ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３）は、インターフェロンと、リバビリンと、またはインターフェロンとリバビリンの両方と一緒に投与されてよい。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、併用療法のための組成物は、単一の立体配座エピトープに対する複数の抗体を含むことができる。いくつかの実施形態では、併用療法のための組成物は、異なった立体配座エピトープ（例えば、その同じウィルスエンベロープタンパク質上の、または、異なるウィルスエンベロープタンパク質上の）を認識し、これによりその感染過程における複数の機序を同時に妨害する複数の抗体を含むことができる。
【０１６７】
ある種の実施形態では、本発明の組成物は、Ｅ２に対する厳密に１つの抗体（例えば、ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３）を含んでいる。ある種の実施形態では、組成物は、厳密に２種、厳密に３種、厳密に４種、厳密に５種、厳密に６種、または６種を超えるＨＣＶ  Ｅ２抗体を含んでいる。いくつかの実施形態では、組成物は、ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３のすべての可能な置換および組合せを含んでいる。ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３からなる群から選択した１つ、２つ、３つ、または４つの抗体を含む例示的な組成物を、表２に示している：
【０１６８】
【表２】
2012504602.tif 000010
いくつかの実施形態では、抗−ＨＣＶ  Ｅ２抗体を分泌する  ハイブリドーマ細胞系を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託した。例えば、ヒトモノクローナル抗体ＨＣ−１を分泌するハイブリドーマ細胞系を、受託番号ＰＴＡ−９４１６のもとに寄託し；ハイブリドーマ細胞系により分泌されるヒトモノクローナル抗体ＨＣ−３を、受託番号ＰＴＡ−９４１７のもとにＡＴＣＣに寄託し；ハイブリドーマ細胞系により分泌されるヒトモノクローナル抗体ＨＣ−１１を、受託番号ＰＴＡ−９４１８のもとにＡＴＣＣに寄託し；ハイブリドーマ細胞系により分泌されるヒトモノクローナル抗体ＣＢＨ−２３を、受託番号ＰＴＡ−９４１９のもとにＡＴＣＣに寄託した。
【０１６９】
Ｈ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３の任意の置換または組合せを、任意の他の抗体（例えば、Ｅ１、Ｅ２および／または他のエンベロープタンパク質を認識する抗体）と組み合わせて、複数の異なる抗体を含む組成物を調製できることは、当業者にとっていうまでもない。ある種の実施形態では、ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１および／またはＣＢＨ−２３は、次の以前に記載されているＥ２に対する任意の抗体と組み合わされることができる：ＣＢＨ−２、ＣＢＨ−４Ｇ、ＣＢＨ−５、ＣＢＨ−７、ＣＢＨ−８Ｃ、ＣＢＨ−８Ｅ、ＣＢＨ−９、ＣＢＨ−１１、それら断片、および／またはそれらの混合物（米国特許第６、６９２，９０８号、および米国特許出願公開第２００６／０１０４９８０号および第２００６／０１８８５１１号を参照；これらすべてを参照により本書に組み込む）。ある種の実施形態では、ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１および／またはＣＢＨ−２３は、Ｈ−１１１、Ｈ−１１４（その両方が、Ｅ１に対する以前に記載されている抗体である）、それらの断片および／またはそれらの混合物と組み合わされることができる（米国特許出願公開第２００３／１８０２８４号を参照；参照により本書に組み込む）。ある種の実施形態では、ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１および／またはＣＢＨ−２３は、ヒト化ＡＰ３３（Ｏｗｓｉａｎｋａら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７９巻：１１０９５〜１０４頁、２００５年；参照により本書に組み込む）、Ｆａｂ  ｅ１３７（Ｐｅｒｏｔｔｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８２巻：１０４７〜５２頁、２００８年；参照により本書に組み込む）、ｍＡｂ  １：７およびＡ８（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ、１０４巻：１６２６９〜７４頁、２００７年；参照により本書に組み込む）、ＡＲ３ヒトＭＡｂ（Ｌａｗら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、１４巻：２５〜２７頁、２００８年；参照により本書に組み込む）、その断片、および／またはその混合物と組み合わされることができる。
【０１７０】
医薬組成物
本発明は、少なくとも１つのＨＣＶ抗体および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含むＨＣＶ抗体および医薬組成物を提供する。このような医薬組成物は、１つ以上の追加の治療効果のある物質を任意に含んでよい。いくつかの実施形態によれば、それを必要としている患者に対しＨＣＶ抗体を投与することを含む医薬組成物を投与する方法が提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物はヒトに投与される。本開示の目的で、語句「活性成分」は、通常、本発明のＨＣＶ抗体を指している。ある種の実施形態では、ＨＣＶ抗体はＥ２エンベロープタンパク質を認識する抗体である。ある種の実施形態では、ＨＣＶ抗体はＥ２エンベロープタンパク質の立体配座エピトープを認識する抗体である。
【０１７１】
ＨＣＶ  Ｅ２抗体を投与するための医薬組成物は、無菌の注射可能な形態（例えば、皮下注射または静脈内点滴に適した形態）で提供されてよい。例えば、いくつかの実施形態では、抗体は、注射に適した液体剤形で提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、任意に真空下で凍結乾燥された無菌の粉末として提供され、これは注射の前に水性の希釈剤（例えば、水、緩衝液、食塩水、など）で再溶解される。いくつかの実施形態では、抗体は、水、塩化ナトリウム溶液、酢酸ナトリウム塩溶液、ベンジルアルコール溶液、リン酸緩衝生理食塩水、などで希釈および／または再溶解される。いくつかの実施形態では、粉末は、水性の希釈剤と穏やかに混合されなければならない（例えば、振らない）。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、抗体製剤は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤（例えば、防腐剤、不活性希釈剤、分散助剤、界面活性剤および／または乳化剤、緩衝薬剤など）を含んでいる。いくつかの実施形態では、抗体製剤は、１つ以上の防腐剤を含んでいる。いくつかの実施形態では、抗体製剤は防腐剤を含んでいない。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、抗体は冷蔵および／または冷凍できる形態で提供される。いくつかの実施形態では、抗体は冷蔵および／または冷凍できない形態で提供される。いくつかの実施形態では、再溶解された抗体溶液および／または液体剤形抗体は、再溶解後の一定期間（例えば、２時間、１２時間、２４時間、２日間、５日間、７日間、１０日間、２週間、１カ月間、２カ月間、またはより長く）保存されてよい。いくつかの実施形態では、指定した時間よりも長く抗体製剤を保管すると、抗体は分解する。
【０１７４】
液体剤形および／または再溶解された抗体溶液は、投与前に粒子状物質および／または変色を含む可能性がある。通常、変色または濁った場合、および／または濾過後に粒子状物質が残っている場合、溶液を使用してはならない。
【０１７５】
本明細書において、記載されている医薬組成物の製剤は公知のまたは薬理学の当業者に今後開発される任意の方法により調製されてよい。通常このような調製法は、活性成分を賦形剤および／または１つ以上の他の付属成分と関連させ、次いで、必要ならばおよび／または希望するならば、所望する１つのまたは複数の単位投与量に産物を成形および／または包装するステップを含んでいる。
【０１７６】
本発明の医薬組成物は、単一の単位投与量としておよび／または複数の単一の単位投与量として大量に調製され、包装され、および／または販売されてよい。本明細書において、使用しているように、「単位投与量」は、予め定めた量の活性成分を含んでいる別々の量の医薬組成物である。その活性成分の量は、通常患者に投与される活性成分の投与量に等しい、および／または例えばその投与量の２分の１または３分の１などその投与量に便利な分数である。
【０１７７】
本発明の医薬組成物中のその活性成分、その薬学的に許容される賦形剤および／または任意の追加成分の相対量は、同一性、サイズおよび／または治療されるその患者の状態に応じて、さらに組成物が投与されるその経路に応じて変化することになる。例えば、組成物は、０．１％〜１００％（重量／重量）の活性成分を含んでもよい。
【０１７８】
本発明の医薬製剤は、追加で、薬学的に許容される賦形剤を含んでもよく、本明細書で使用される通り、それは任意のおよびすべての溶剤、分散剤、希釈剤、あるいは他の液体賦形剤、分散または懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、防腐剤、固体結合剤、潤滑剤などを所望の特定の剤形に適するように含んでいる。レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）のＴｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ａ．  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ、（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ、ボルティモア、メリーランド州、２００６年）は、医薬組成物の調製において使用される様々な賦形剤およびそれらを調製するための公知の技術を開示している。何らかの有害な生物学的効果を生じることによって、さもなければ医薬組成物のいずれかの他の構成成分と有害な形で相互作用することによって、など、いずれかの通常の賦形剤が、材料またはその誘導体と適合しない場合を除いて、その使用は本発明の範囲内であると考えられる。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、その薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の純度である。いくつかの実施形態では、その賦形剤は、ヒト用におよび獣医用に承認されている。いくつかの実施形態では、その賦形剤は、アメリカ合衆国食品医薬品局により承認されている。いくつかの実施形態では、その賦形剤は、医薬品等級である。いくつかの実施形態では、その賦形剤は、アメリカ合衆国薬局方（ＵＳＰ）、ヨーロッパ薬局方（ＥＰ）、英国薬局方および／または国際薬局方の規格を満たしている。
【０１８０】
医薬組成物の製造において、使用される薬学的に許容される賦形剤としては、限定はされないが、不活性希釈剤、分散および／または粒状化剤、界面活性剤および／または乳化剤、崩壊剤、結合剤、防腐剤、緩衝剤、潤滑剤、および／または油類、が挙げられる。このような賦形剤は、任意で製剤に含まれてよい。例えばカカオバターおよび坐薬ワックス、着色剤、被覆剤、甘味料、香料および／または芳香剤などの賦形剤は、調剤者の判断に従ってその組成物中に含めることができる。
【０１８１】
典型的な希釈剤としては、限定はされないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、乳糖、ショ糖、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥澱粉、コーンスターチ、粉砂糖など、および／またはそれらの組合せが挙げられる。
【０１８２】
典型的な粒状化および／または分散化剤としては、限定はされないが、ジャガイモ澱粉、コーンスターチ、タピオカ澱粉、澱粉グリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、柑橘類のパルプ、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木製品、天然スポンジ、陽イオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋化したポリ（ビニル−ピロリドン）（クロスポビドン）、カルボキシメチル澱粉ナトリウム（澱粉グリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋化したカルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、予めゼラチン化した澱粉（澱粉１５００）、微結晶澱粉、水不溶性澱粉、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ、（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、第四級アンモニウム化合物など、および／またはそれらの組合せが挙げられる。
【０１８３】
典型的な界面活性剤および／または乳化剤としては、限定はされないが、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカントゴム、コンドラックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックスおよびレシチン）、コロイド粘土（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］およびＶＥＥＧＵＭ（登録商標）［ケイ酸アルミニウムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、トリアセチンモノステアリン酸、エチレングリコールジステアリン酸、グリセリルモノステアリン酸、およびプロピレングリコールモノステアリン酸、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、および  カルボキシビニルポリマー  ）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末状セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミテート［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、ソルビタンモノステアレート［ＳＰＡＮ（登録商標）６０］、ソルビタントリステアレート［ＳＰＡＮ（登録商標）６５］、グリセリルモノオレエート、ソルビタンモノオレエート［ＳＰＡＮ（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、ポリオキシエチレンモノステアリン酸［ＭＹＲＪ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシルヒマシ油、ポリオキシメチレンステアリン酸、およびＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標））、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウリン酸、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、エチルラウリン酸塩、ラウリル硫酸ナトリウム、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクサートナトリウムなど、および／またはそれらの組合せが挙げられる。
【０１８４】
典型的な結合剤としては、限定はされないが、澱粉（例えば、コーンスターチ、澱粉ペースト、など）ゼラチン、糖（例えば、ショ糖、ブドウ糖、Ｄ  形グルコース、デキストリン、糖蜜、乳糖、ラクチトール、マンニトール、など）、天然および合成ゴム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、トチャカ抽出物、パンワールガム、ガッチガム、イサポール皮粘着液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム［ＶＥＥＧＵＭ（登録商標）］、カラマツアラビノガラクタン、など）、アルギン酸塩、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、無機カルシウム塩、ケイ酸、ポリメタクリル酸、ワックス、水、アルコールなど、およびそれらの組合せが挙げられる。
【０１８５】
典型的な防腐剤としては、限定はされないが、酸化防止剤、キレート剤、抗菌性防腐剤、抗真菌性防腐剤、アルコール防腐剤、酸性防腐剤および／または他の防腐剤を含んでもよい。典型的な酸化防止剤としては、限定はされないが、αトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル（ａｃｏｒｂｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウムおよび／または亜硫酸ナトリウムが挙げられる。典型的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸および／またはエデト酸三ナトリウムが挙げられる。典型的な抗菌性防腐剤としては、限定はされないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコールおよび／またはチメロサールが挙げられる。典型的な抗真菌性防腐剤としては、限定はされないが、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウムおよび／またはソルビン酸が挙げられる。典型的なアルコール防腐剤としては、限定はされないが、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール合成物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾエートおよび／またはフェニルエチルアルコールが挙げられる。典型的な酸性防腐剤としては、限定はされないが、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、β−カロチン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸および／またはフィチン酸が挙げられる。他の防腐剤としては、限定はされないが、トコフェロール、酢酸トコフェロール、デターオキシムメシレート、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ナトリウムラウリルエーテルスルファート（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ＧＬＹＤＡＮＴ  ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＨＥＮＯＮＩＰ（登録商標）、メチルパラベン、ＧＥＲＭＡＬＬ（登録商標）１１５、ＧＥＲＭＡＢＥＮ（登録商標）ＩＩ、ＮＥＯＬＯＮＥ（登録商標）、ＫＡＴＨＯＮ（登録商標）および／またはＥＵＸＹＬ（登録商標）が挙げられる。
【０１８６】
典型的な緩衝剤としては、限定はされないが、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、Ｄ−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸水素カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、水酸化カルシウムリン酸塩、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱性物質除去水、等張食塩水、リンガー溶液、エチルアルコールなど、および／またはそれらの組合せが挙げられる。
【０１８７】
典型的な潤滑剤としては、限定はされないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、二酸化ケイ素、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル、硬化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムなど、およびそれらの組合せが挙げられる。
【０１８８】
典型的な油類としては、限定はされないが、アーモンド、杏仁、アボカド、ババス、ベルガモット、黒カシス種子油、ルリヂサ、ケード、カモミール、カノーラ、キャラウェー、ブラジルロウヤシ、ヒマシ油、シナモン、カカオバター、ココナッツ、タラ肝臓、コーヒー、トウモロコシ、綿実、エミュー、ユーカリ、マツヨイグサ、魚、亜麻仁、ゲラニオール、ヒョウタン、ブドウの種、ハシバミの実、ヤナギハッカ、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ油、ククイの実、ラバンジン、ラベンダー、レモン、リツェアクベバ、マカダミナナッツ（ｍａｃａｄｅｍｉａ）、ゼニアオイ、マンゴーの種、メドウフォームの種、ミンク、ナツメグ、オリーブ、オレンジ、オレンジラフィー、パーム、パームヤシの種、桃の実、ピーナッツ、ケシの実、カボチャの種、菜種、米糠、ローズマリ、ベニバナ、ビャクダン、サザンカ、セイボリー、シーバックソーン、ゴマ、シアバター、シリコーン、大豆、ヒマワリ、茶の木、アザミ、椿、ベチベルソウ、クルミおよび小麦麦芽油が挙げられる。典型的な油としては、限定はされないが、ステアリン酸ブチル、トリカプリルグリセリル、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコーン３６０、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーンオイルおよび／またはそれらの組合せが挙げられる。
【０１８９】
経口的および非経口的に投与するための液体剤形としては、限定はされないが、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルジョン剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤および／またはエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加えて液体剤形は、例えば水、あるいはエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実、落花生、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ油および胡麻油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルおよびそれらの混合物などの他の溶剤、可溶化剤および乳化剤など、当業者に一般に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。不活性希釈剤の他に、経口用組成物は、湿潤剤、乳化および懸濁剤、甘味料、香料、および／または芳香剤などの補助剤を含むことができる。非経口投与のためのある種の実施形態では、組成物はＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール類、油類、変性油類、グリコール類、ポリソルベート類、シクロデキストリン類、ポリマー類および／またはそれらの組合せなどの可溶化剤と混合される。
【０１９０】
例えば、無菌の注射可能な水溶性または油性懸濁剤の注射用製剤は、公知の技術に従って、適正な分散剤、湿潤剤、および／または懸濁剤を使用して調合されてよい。無菌注射用製剤は、毒性のない非経口的に許容できる希釈剤および／または溶剤（例えば１，３−ブタンジオールの溶剤として）の、無菌の注射可能な溶剤、懸濁剤および／または乳剤であってよい。使用され得る許容可能な賦形剤および溶剤には、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張塩化ナトリウム溶液がある。無菌の固定油類は、溶剤または懸濁媒剤として一般的に用いられている。このために、合成モノ−またはジグリセリドを含めた、任意の刺激の少ない固定油類を使用できる。オレイン酸などの脂肪酸は、注射可能薬剤の製剤に使用され得る。
【０１９１】
例えば、細菌保持フィルタで濾過することによって、および／または使用前に滅菌水または他の滅菌注射可能な媒体に溶解または分散させることが可能な滅菌固形組成物の形態で滅菌剤を入れることによって、注射可能製剤を滅菌できる。
【０１９２】
活性成分の効果を長くするために、しばしば皮下または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅らせることが望ましい。これは、水溶性が乏しい結晶質または非晶質材料の液体懸濁剤の使用によって、果たされてよい。薬剤の吸収速度はその溶解速度に依存し、その溶解速度は、今度は結晶のサイズおよび結晶の形態に依存する。あるいは、非経口的に投与される薬剤形態の遅延吸収は、油状賦形剤に薬剤を溶解または懸濁することによって果たされる。注射可能なデポー剤の形態は、ポリ乳酸−ポリグリコール酸などの生分解性ポリマー中に薬剤のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって得られる。薬剤対ポリマーの割合および使用される特定のポリマーの性質に依存して、薬剤の放出速度を調節できる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル類）およびポリ（無水物）が挙げられる。体組織に適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を封入することによって、注射可能なデポー製剤が調製される。
【０１９３】
直腸または膣投与用の組成物は、通常、周囲温度では固体だが体温では液体であり、そのため直腸または膣腔で溶解して、活性成分を放出するカカオバター、ポリエチレングリコールまたは坐薬ワックスなどの適切な非刺激性賦形剤と組成物を混合することによって調製できる坐薬である。
【０１９４】
経口投与用の固形の剤形としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤が挙げられる。このような固形の剤形において、その活性成分は少なくとも１つの不活性かつ薬学的に許容される、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの賦形剤、および／または充填材、または増量剤（例えば、澱粉、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、マンニトールおよびケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、ショ糖およびアカシア）、湿潤剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ澱粉、タピオカ澱粉、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）、溶液緩染剤（例えば、パラフィン）、吸収促進剤（例えば、第四級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）、吸収剤（例えば、カオリンおよびベントナイト粘土）、および潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、およびそれらの混合物などと混合される。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、その剤形は緩衝剤を含んでもよい。
【０１９５】
類似の型の固体組成物は、ラクトースすなわち乳糖および高分子量ポリエチレングリコール等の賦形剤を用いる軟質および硬質充填ゼラチンカプセル剤における充填剤として使用されてよい。錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、丸剤および顆粒剤の固体剤形は、腸溶性被覆および薬物調合技術分野で周知の他の被覆など、被覆および殻と一緒に調製されることができる。それらは任意で不透明化剤を含んでもよく、また任意に徐放方式で、腸管の特定の部分のみでまたは優先的に、その活性成分を放出する組成物であり得る。使用できる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックス類が挙げられる。類似の型の固体組成物は、ラクトースすなわち乳糖および高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いる軟質および硬質ゼラチンカプセル剤における充填剤として使用してもよい。
【０１９６】
本発明の化合物を局所的にまたは経皮的に投与するための剤形は、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、液剤、スプレー剤、吸入剤、および／またはパッチ剤を含んでよい。通常、必要に応じて活性成分は無菌条件下で薬学的に許容される賦形剤および／または任意の必要とされる防腐剤および／または緩衝剤と混合される。さらに、本発明は経皮パッチの使用を想定しており、このパッチにはしばしば身体への化合物の制御送達を提供するという付加的な利点がある。例えば適当な媒質にその化合物を溶解および／または分散させることによって、このような剤形は調製されてよい。あるいは、またはさらにその速度は、速度制御膜を提供することによって、および／あるいはポリマー基材および／またはゲル中にその化合物を分散させることによって制御されてよい。
【０１９７】
本明細書に記載の皮内用医薬組成物の送達に用いる適切な装置としては、米国特許第４、８８６、４９９号；米国特許第５，１９０，５２１号；米国特許第５，３２８，４８３号；米国特許第５，５２７，２８８号；米国特許第４，２７０，５３７号；米国特許第５，０１５，２３５号；米国特許第５，１４１，４９６号；および米国特許第５，４１７，６６２号に記載されているような短い針の装置が挙げられる。皮内用組成物は、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９９／３４８５０号に記載の装置など、皮膚への針の効果的な貫入長を制限する装置およびその機能的等価物により投与されてよい。液体ジェット式注射器を介して、および／または角質層を貫通し、真皮に届くジェットを生じる針を介して真皮に液体ワクチンを送達するジェット式注射装置は有用である。ジェット式注射装置は、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号；米国特許第５，５９９，３０２号；米国特許第５，３３４，１４４号；米国特許第５，９９３，４１２号；米国特許第５，６４９，９１２号；米国特許第５，５６９，１８９号；米国特許第５，７０４，９１１号；米国特許第５，３８３，８５１号；米国特許第５，８９３，３９７号；米国特許第５，４６６，２２０号；米国特許第５，３３９，１６３号；米国特許第５，３１２，３３５号；米国特許第５，５０３，６２７号；米国特許第５，０６４，４１３号；米国特許第５，５２０，６３９号；米国特許第４，５９６，５５６号；米国特許第４，７９０，８２４号；米国特許第４，９４１，８８０号；米国特許第４，９４０，４６０号；およびＰＣＴ公開ＷＯ  ９７／３７７０５号およびＰＣＴ公開ＷＯ  ９７／１３５３７号に記載されている。圧縮ガスを使用して皮膚の外層貫いて真皮へ粉末形態のワクチンを加速するバリスティック粉剤／粒剤送達装置は有用である。別法としてまたは付加的に、従前どおりのシリンジを皮内投与の古典的なマントー法に使用してよい。
【０１９８】
局所投与に適している製剤としては、限定はされないが、液剤および／または半液状剤、例えば塗布剤、ローション剤、水中の油剤および／または、油性乳剤中の水剤（例えば、クリーム剤、軟膏剤および／またはペースト剤など）、および／または溶剤および／または懸濁剤などが挙げられる。活性成分の濃度が、溶媒中の活性成分の溶解度限界と同程度の高さになってよいが、局所的に投与可能な製剤は、例えば、約１％〜約１０％（重量／重量）の活性成分を含んでもよい。局所投与用製剤は、さらに本明細書に記載の１つ以上の追加成分を含んでもよい。
【０１９９】
本発明の医薬組成物は、口腔を経由する肺投与に適している製剤として、調製、包装、および／または販売されてもよい。このような製剤は、活性成分を含みさらに約０．５ｎｍ〜約７ｎｍまたは約１ｎｍ〜約６ｎｍの範囲の直径の乾燥粒剤を含んでいてもよい。このような組成物は、推進剤の流れが向けられその粉末が拡散されてよい乾燥粉末貯蔵部を含む装置を使用する、および／または密封容器内で低沸点推進剤に溶解および／または懸濁された活性成分を含む装置のような自己推進溶液／粉末を調剤する容器を使用する、投与に都合の良い乾燥粉末の形態である。これらの粉末は、重量％で少なくとも９８％の粒子が０．５ｎｍより大きい直径を有し、数で少なくとも９５％の粒子が７ｎｍ未満の直径を有する粒子を含んでいる。あるいは、重量％で少なくとも９５％の粒子は１ｎｍより大きい直径を有し、数で少なくとも９０％の粒子は６ｎｍ未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、糖のような固体の微粉末希釈剤を含んでもよく、また簡便に単位用量形態で提供される。
【０２００】
低沸騰推進剤は、一般に、大気圧で華氏６５°Ｆ以下の沸点を有する液体推進剤を含んでいる。通常、この推進剤は組成物の５０％〜９９．９％（重量／重量）を構成してもよく、その活性成分は組成物の０．１％〜２０％（重量／重量）を構成してもよい。推進剤は、液体非イオン性および／または固体陰イオン性界面活性剤および／または固体の希釈剤（これはら活性成分を含む粒子と同じ桁の粒径を有してもよい）などの追加成分をさらに含んでもよい。
【０２０１】
肺送達用に調合される本発明の医薬組成物は、液体および／または懸濁液の滴剤の形で活性成分を提供してもよい。このような製剤は活性成分を含み、任意で無菌の水溶液剤および／または希釈したアルコール溶液剤および／または懸濁剤として調製、包装、および／または販売されてよく、任意の噴霧化および／または微粒化装置を使用して簡便に投与されてよい。このような製剤はさらに、限定はされないが、サッカリンナトリウム、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤などの賦香剤および／またはヒドロキシ安息香酸メチルなどの防腐剤を含めた１つ以上の追加の成分を含んでもよい。この投与経路により提供される滴剤は、約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均直径であってよい。
【０２０２】
肺送達に有用であるとして本明細書に記載の製剤は、医薬組成物を鼻腔内に送達するのに有用である。鼻腔内投与に適している他の製剤は、活性成分を含み約０．２μｍ〜５００μｍの平均粒子を有する粗末である。このような製剤は、嗅ぎタバコを吸う要領で、すなわち、鼻の近くに保持された粉剤の容器から鼻腔を通して素早く吸入することにより投与される。
【０２０３】
経鼻投与に適している製剤は、例えば、活性成分をわずか約０．１％（重量／重量）〜１００％（重量／重量）も含んでもよく、本明細書に記載の追加の成分を１つ以上含んでよい。本発明の医薬組成物は、口内投与に適した製剤として調製、包装および／または販売されてよい。このような製剤は、例えば、従来法を使用して作成する錠剤および／または、トローチ剤の形態であってよく、また例えば、０．１％〜２０％（重量／重量）の活性成分、その残りは経口で溶解性および／または分解性組成物、および任意で、本書に記載の追加成分を１つ以上含んでよい。あるいは、口内投与に適している製剤は、活性成分を含む散剤および／またはエアロゾル化および／または霧状化した液剤および／または懸濁剤を含んでもよい。このような粉末化および／またはエアロゾル化した製剤は、分散させたときに約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲のサイズ平均の粒子および／または液滴であってよく、さらに本書に記載の追加の成分を１つ以上含んでもよい。
【０２０４】
本発明の医薬組成物は、眼の投与に適した製剤として調製、包装および／または販売されてよい。このような製剤は、水性または油性液体賦形剤中に例えば活性成分が０．１／１．０％（重量／重量）の液剤および／または懸濁剤を含んでいる、例えば点眼薬の形態でよい。このような滴剤は、さらに緩衝剤、塩類および／または本書に記載の１つ以上の他の追加の成分を含んでもよい。有効なその他の点眼投与可能な製剤として、微結晶形態および／またはリポソーム調剤中に活性成分を含む滴剤が挙げられる。耳滴剤および／または点眼剤は、本発明の範囲内にあると意図される。
【０２０５】
医薬品の製剤化および／または製造において全体的に考慮すべき事柄は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ編、２００５年、に見られる。
【０２０６】
キット
本発明は、本発明による方法を簡便におよび／または効果的に実施するための様々なキットを提供する。キットは、一般的に本発明による１つ以上のＨＣＶ抗体（例えば、ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３）を含んでいる。いくつかの実施形態では、キットは、異なる目的（例えば、診断、治療および／または予防）に使用する異なるＨＣＶ抗体の一式を含んでいる。一般的に、キットは、使用者が患者に複数回の投与を実施できるようにおよび／または複数の実験を行えるように、十分な量のＨＣＶ抗体を含むことになる。いくつかの実施形態では、キットは、購入者により特定された１つ以上のＨＣＶ抗体を一緒にまたは含めて供給される。
【０２０７】
ある種の実施形態では、本発明で用いるキットは１つ以上の参照試料、説明書（例えば、試料を処理するための、試験を実施するための、結果を解釈するための、ＨＣＶ抗体を可溶化するための、ＨＣＶ抗体を貯蔵するための、など）、緩衝液、および／または試験を実施するために必要な他の試薬を含んでもよい。ある種の実施形態では、キットは抗体のパネルを含むことができる。キットの他の構成要素は、細胞、細胞培養培地、組織および／または組織培養培地を含んでもよい。
【０２０８】
キットは、使用説明書を含んでもよい。例えば、説明書は、ＨＣＶ抗体を含む医薬組成物を調剤するために適切な手順および／または患者に対して医薬組成物を投与するために適切な手順を使用者に通知してもよい。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、キットはＨＣＶ抗体を含む医薬組成物の多くの単位投与量を含んでいる。例えば数字、文字および／または他の印の形態で、および／またはカレンダ挿入物で投薬を行える治療計画の日／時を示して、記憶補助が提供されてよい。プラセボ投薬、および／またはカルシウム栄養補助食品は、医薬組成物の投薬に類似のまたは異なる形態で含められ、毎日投薬されるキットで提供されてよい。
【０２１０】
キットは、個々の構成要素または試薬が別々に収納されていることを確実にするために１つ以上の容器または入れ物を含んでもよい。キットは、例えば説明書、包装材料（例えば発泡スチロール）などが同封されてよいプラスチック箱など、委託販売するために、比較的厳重に閉じ込めて個々の容器を入れるための手段を含んでよい。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、キットは、ＨＣＶに罹患しているおよび／または感受性のある患者の治療、診断および／または予防に使用される。いくつかの実施形態では、これらのキットは（ｉ）少なくとも１つのＨＣＶ抗体、（ｉｉ）患者に少なくとも１つのＨＣＶ抗体を投与するための注射器、針、塗布用具など、（ｉｉｉ）使用説明書を含んでいる。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、キットは、ＨＣＶに罹患しているおよび／または感受性のある患者の治療、診断および／または予防に使用される。いくつかの実施形態では、これらのキットは、（ｉ）凍結乾燥粉末として提供される少なくとも１つのＨＣＶ抗体、および（ｉｉ）凍結乾燥粉末を再溶解するための希釈剤を含んでいる。これらのキットは、任意で、患者に少なくとも１つのＨＣＶ抗体を投与するための注射器、針、塗布用具など、および／または使用説明書を含んでよい。
【０２１３】
本発明は、少なくとも１つのＨＣＶ抗体を含むワクチンを生成するための試薬を含んでいるキットを提供する。いくつかの実施形態では、これらのキットは、（ｉ）ＨＣＶ抗体、その特徴的な部分および／またはその生物学的に活性な部分を発現している細胞、（ｉｉ）細胞増殖用培地、（ｉｉｉ）抗体精製に便利なカラム、樹脂、緩衝液、チューブおよび他の道具を含んでよい。いくつかの実施形態では、これらのキットは、（ｉ）ＨＣＶ抗体、その特徴的な部分および／またはその生物学的に活性な部分をコードしているヌクレオチドを含むプラスミド、（ｉｉ）ＶｅｒｏおよびＭＤＣＫ細胞系を含むがこれに限定されない哺乳動物細胞系など、このプラスミドを形質転換させることができる細胞、（ｉｉｉ）細胞増殖用培地、（ｉｖ）陰性対照としてＨＣＶ抗体をコードしているヌクレオチドを含まない発現プラスミド、（ｖ）抗体精製に便利なカラム、樹脂、緩衝液、チューブおよび他の道具、（ｖｉ）使用説明書を含んでよい。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、キットは１つ以上の試料中に存在するＨＣＶを検出するために使用される。これらの試料は、限定はされないが、血液、血清／血漿、末梢血単核細胞／末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ／ＰＢＬ）、痰、尿、排泄物、咽頭スワブ、真皮病変スワブ、脳脊髄液、頸管スミア、膿試料、食品マトリックスおよび脳、脾臓および肝臓など身体の様々な部分に由来する組織を含む病理学試料であってよい。これらの試料は、限定はされないが、土壌、水およびフローラを含む環境試料であってよい。記載されなかった他の試料も適用できる可能性がある。いくつかの実施形態では、これらのキットは、（ｉ）少なくとも１つのＨＣＶ抗体、（ｉｉ）陽性対照としてＨＣＶを含むことが公知の試料、（ｉｉｉ）  陰性対照としてＨＣＶを含まないことが公知の試料、（ｉｖ）  使用説明書を含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、キットは１つ以上の試料において、ＨＣＶを中和するために使用される。これらのキットは、少なくとも１つのＨＣＶ抗体を用いてＨＣＶを含んでいる試料を処理するために、および未処理の試料と比較して処理した試料が培養細胞に感染する能力を試験するために必要な材料を提供してよい。これらのキットは、（ｉ）少なくとも１つのＨＣＶ抗体、（ｉｉ）培養およびＨＣＶに感染させることができる細胞、（ｉｉｉ）陰性対照として、ＨＣＶに結合し中和する能力のない抗体、（ｉｖ）陽性対照として、ＨＣＶに結合し中和する能力がある抗体、（ｖ）陰性対照として、ＨＣＶを含まないことが公知の試料、（ｖｉ）陽性対照として、ＨＣＶを含むことが公知の試料、（ｖｉｉ）使用説明書を含んでよい。
【０２１６】
本発明のこれらのおよび他の態様は、以下の実施形態を考慮することによりさらに理解されることになり、それらの実施形態は本発明のある具体例を例示するものとするが、請求項に定義される通りその範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０２１７】
（実施例１）
ヒトモノクローナル抗体を中和することによるＨＣＶ  Ｅ２糖タンパク質上の保存されている免疫優性ドメインの定義付け
材料および方法
細胞および培養条件
２９３ＴおよびＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ＡＴＣＣから入手した。Ｈｕｈ７細胞をＭｉｃｈａｅｌ  Ｌａｉ博士（南カリフォルニア大学）から入手し、Ｈｕｈ７．５細胞をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｃｅ博士（ロックフェラー大学）から入手した。細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ、シグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州）および２ｍＭのグルタミンを補充したダルベッコ変法最小基本培地（ＤＭＥＭ、インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）中で増殖させた。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、Ｌ−グルタミンを含み１０％のＦＣＳを補充したＦ−１２カイグンズ（Ｋａｉｇｈｎ）培地（インビトロジェン、カタログ番号２１１２７−０２２）中で増殖させた。
【０２１８】
ウィルスおよびウィルスモデル
ＨＣＶｐｐ（遺伝子型１ａ）の産生および精製は、以前に記載されている（Ｂａｒｔｏｓｃｈら．、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９７巻：６３３〜４２頁、２００３年、およびＫｅｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７９巻：１３１９９〜２０８頁、２００５年；その両方を参照により本書に組み込む）。簡単に述べると、リン酸カルシウム法を使用して、２９３Ｔ細胞にＨＣＶｐｐプラスミドをトランスフェクションした。増殖の４８時間後に、孔径０．４５μｍのフィルタを使用して無細胞上清を採取した。
【０２１９】
感染性の遺伝子型２ａ  ＪＦＨ−１ウィルスＨＣＶｃｃを産生するために、（Ｗａｋｉｔａら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、１１巻：７９１〜９６頁、２００５年；参照により本書に組み込む）、ＸｂａＩで線状化したｐＪＦＨ−１プラスミドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写し（メガスクリプト（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ）、アンビオン、オースティン、テキサス州）、Ｈｕｈ７．５細胞に電気穿孔した。簡単に述べると、４ｍｍのキュベット中の１０μｇの仔ウシ肝臓ｔＲＮＡを含む無カルシウムＰＢＳ中のｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写した１０μｇのＪＦＨ−１  ＲＮＡを０．４×１０６個のＨｕｈ７．５細胞と混合し、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）ジーンパルサーシステムを使用して０．２７ｋＶで９６０μＦでパルスした。電気穿孔した細胞を、１０％のＦＣＳを含む１０ｍＬの完全ＤＭＥＭが入った１０ｃｍの細胞培養ディッシュに播種した。ＨＣＶ  Ｅ２の発現を、各継代の細胞において間接免疫蛍光法（ＩＦＡ）で確認した。ＪＦＨ−１ウィルスを産生するためにトランスフェクションした細胞を、新しい培養フラスコへ１：４〜１：５に分けて４〜５日の間隔で継代した。少量に分注した採取ウィルスを、−８０℃で貯蔵した。１ａ  ＨＪ３−５  ＨＣＶｃｃの産生は、以前に記載されている（Ｙｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ、１０３巻：２３１０〜１５頁、２００６年、およびＹｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８１巻：６２９〜３８頁、２００７年；その両方を参照により本書に組み込む）。
【０２２０】
抗体および試薬
ＨＣＶ  Ｅ２に対する抗体であるＣＢＨ−４Ｇは、以前に記載されている（Ｈａｄｌｏｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７４巻：１０４０７頁、２０００年、およびＫｅｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７９巻：１３１９９頁、２００５年；その両方を参照により本書に組み込む）。ｃ−ｍｙｃに対するマウスＭＡｂを、サンタクルズバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（サンタクルーズ、カリフォルニア州）から購入した。ＣＤ８１  ＬＥＬを、Ｓｈｏｓｈａｎａ  Ｌｅｖｙ博士（スタンフォード大学）から入手した。ＦＩＴＣ−コンジュゲートヤギ抗−ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的かつＲ−フィコエリトリン−コンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を、ジャクソンイムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（ウェストグローブ、ペンシルバニア州）から入手した。アルカリホスファターゼ−コンジュゲートヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）およびアルカリホスファターゼ−コンジュゲートヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を、プロメガ（マディソン、ウィスコンシン州）から購入した。Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓレクチン（ＧＮＡ）およびｐ−ニトロフェニルリン酸２ナトリウム六水和物（ホスファターゼ基質）を、シグマ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。
【０２２１】
モノクローナル抗体産生および精製
末梢血Ｂ細胞からの新規なＨＣＶ抗体の産出を、基本的にＨａｄｌｏｃｋら（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７４巻：１０４０７頁、２０００年；参照により本書に組み込む）に記載の通り実施した。目標抗原としてサブタイプ１ａまたは１ｂ  ＨＣＶｐｐに感染した細胞（ＧｅｎＢａｎｋ、受託番号ＡＦ３４８７０５）の溶解物を使用する間接免疫蛍光法（ＩＦＡ）によって特異的ＨＣＶ抗体を選択した。単一クローン性を限界希釈クローニング法よって達成し、ＩｇＧ遺伝子のＤＮＡ塩基配列決定（シークテック（Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ）、マウンテンビュー、カルフォルニア州）によって確認した。ＩｇＧ遺伝子のＶＬおよびＶＨドメインのクローニングおよび分析を、以前に記載されている通り実施した（Ｋｅｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７８巻：７２５７頁、２００４年；参照により本書に組み込む）。ＨＣＶ抗体の産生および精製を、基本的に以前に記載されている通り実施し、Ｈａｄｌｏｃｋら（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７４巻：１０４０７頁、２０００年；参照により本書に組み込む）、抗体のビオチン化を、製造業者（ピアースバイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）、ロックフォード、イリノイ州）の説明書に従って実施した。
【０２２２】
ＩｇＧサブクラスの分類
ＩｇＧサブクラスの分類を、ヒトＩｇＧサブクラスＳＤ  Ｃｏｍｂｉ  ＢＩＮＤＡＲＤＩＤキット（バインディングサイト（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｉｎｃ．）、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用して、製造業者の手順に従って実施した。
【０２２３】
間接免疫蛍光法
２９３Ｔ細胞に遺伝子型１〜６のＥ１Ｅ２配列を有する構築物をトランスフェクションし、トランスフェクションの４０〜４８時間後に、細胞をＨＴＣ  Ｓｕｐｅｒ  Ｃｒｕｄｅ２４スポットスライドガラス（セルラインアソシエート（Ｃｅｌ−Ｌｉｎｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）、ニューフィールド、ニュージャージー州）上に１００％アセトンを用いて室温で１０分間固定した。示した通りに、固定した細胞を抗体と一緒に３７℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で５分間洗浄した。次いで、エバンスブルー対比染色剤の０．００１％溶液およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−コンジュゲートヤギ抗−ヒトＩｇＧ（ジャクソンイムノリサーチラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ウェストグローブ、ペンシルバニア州）と一緒に、スライドを３７℃で３０分間インキュベートした。固定した細胞に結合した抗体を、記載されている通り、蛍光顕微鏡検査によって、明らかにした（Ｈａｄｌｏｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７１巻：５８２８〜４０頁、１９９７年；参照により本書に組み込む）。
【０２２４】
抗体の塩基配列決定
ヒトモノクローナル抗体ＶＬおよびＶＨドメインＣＤＲの配列決定を、記載の通り実施した（Ｋｅｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７８巻：７２５７〜６３頁、２００４年；参照により本書に組み込む）。基本的に、Ｈ−１１１の重鎖および軽鎖のすべての可変領域を配列決定し、ＦＲおよびＣＤＲ、生殖細胞系のＶ遺伝子対応部を同定して、Ｖドメインの成熟状態を定量した。以前に記載されている通り、ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３のＶＬおよびＶＨドメインを、対応するハイブリドーマ細胞より単離した細胞全ＲＮＡ（ＲＮｅａｓｙミニキット、キアゲン、バレンシア、カリフォルニア州）から、５’ファミリー特異的Ｖリーダープライマーおよび３’Ｊ領域プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲによって増幅した（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２９巻：１９３〜２０３頁、１９９２年、およびＣｈａｎら、Ｂｌｏｏｄ、９７巻：１０２３〜２６頁、２００１年；その両方を参照により本書に組み込む）配列を、ベクターＮＴＩ（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用して分析し、Ｖ−ＱＵＥＳＴおよびＶＢＡＳＥデータベースを使用して生殖細胞系配列と一緒に整列させた（ＣｏｏｋおよびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ、Ｉｍｍｕｎｏ．  Ｔｏｄａｙ、１６巻：２３７〜４２頁、１９９５年；参照により本書に組み込む）。
【０２２５】
競合アッセイ
以前に記載されている通りに、抗体交差競合実験を実施した（Ｋｅｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７８巻：９２２４頁、２００４年；参照により本書に組み込む）。簡単に述べると、１ｂ  ＨＣＶｐｐ細胞溶解物を、ＰＢＳ中のＧＮＡを用いて３７℃で１時間被覆した９６穴プレート上に捕捉した。洗浄およびブロッキング後に、各ウェルに２０μｇ／ｍＬの競合する抗体を添加して、室温で３０分間インキュベートし、続いて２μｇ／ｍＬのビオチン化試験抗体を添加した。室温で１．５時間インキュベートした後、アルカリホスファターゼ−コンジュゲートストレプトアビジン（Ｒ＆Ｄシステム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス、ミネソタ州）を使用し、続いて発色のためのｐ−ニトロフェニルリン酸をインキュベートすることによって、試験抗体を検出した。吸光度を、マルチウェルプレート読取機（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｖｉｃｅｓ）、サニーベール、カリフォルニア州）を用いて４０５ｎｍで測定し、５７０ｎｍで読んだバックグラウンドを差し引いた。競合抗体存在下でＥ２に対するビオチン化試験ＨＣＶ抗体で測定したその平均ＯＤ値を、競合抗体無しでＥ２に対するビオチン化試験ＨＣＶ抗体から測定したシグナルで割って、続いてＥ２に結合した試験抗体の百分率を得るために１００倍した。以前に記載されている通り、他の抗体と新規なＨＣＶ抗体の相関性を、算術平均を用いた変法非加重結合法によって定量した（Ｋｅｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７８巻：９２２４頁、２００４年；参照により本書に組み込む）。この方法は、競合抗体による二方向性阻害の範囲を、エピトープの重なりの範囲として推測する。一方向性の阻害または増大は、近位であるが重なり合わないエピトープであると解釈される。
【０２２６】
免疫沈降
１ｂ  ＨＣＶｐｐを産生している２９３Ｔ細胞を１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ−４０、２０ｍＭのα−ヨードアセトアミドおよびプロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液で溶解した。これを抗原の供給源として使用し、免疫沈降あたり約２２５のｎｇ／ｍＬのＥ２を使用した。２μｇ／ｍＬのＨＣＶ抗体を、抗原と共に４℃で１．５時間インキュベートし、その後に固定したプロテインＡ（ピアース、ロックフォード、イリノイ州）と共に４℃でさらに１．５時間インキュベートを続けた。各ステップの間に、ＩＰ溶解緩衝液でビーズを１回洗浄した。最終工程の後にこれらをＩＰ溶解緩衝液で３回、蒸留水で１回洗浄した。沈殿物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中にて７０℃で５分間加熱し、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで泳動して、ニトロセルロース膜に転写した。この膜を、マウスＭＡｂ  ＡＰ３３で免疫ブロットし（Ｏｗｓｉａｎｋａら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７９巻：１１０９５頁、２００５年；参照により本書に組み込む）、続けてＨＲＰ−コンジュゲート二次抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー、サンタクルーズ、カリフォルニア州）とインキュベートし、ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＥＣＬ  Ｐｌｕｓウェスタンブロット検出システムを使用して検出した。
【０２２７】
抗体親和性の測定
抗体親和性の測定を、１μｇ／ｍＬのＥ２糖タンパク質を含む１ａ  ＨＣＶｐｐ細胞溶解物を用いて実施した。５００ｎｇのＧＮＡで各ウェルを被覆することによって、マイクロタイタプレートを調製し、続けてＴＢＳＴ（２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）中の２．５％の脱脂粉乳および２．５％の正常ヤギ血清からなるＢＬＯＴＴＯを使用してこれらのウェルをブロッキングした。ブロッキング後に、細胞溶解物中のＥ２をＧＮＡによって、プレート上に捕捉し、後に０．０１μｇ／ｍＬ〜２００μｇ／ｍＬの範囲のＨＣＶ抗体を結合させた。結合したＨＣＶ抗体を、アルカリホスファターゼ−コンジュゲートヤギ抗−ヒトＩｇＧ（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州）と共にインキュベートし、続けて発色のためにｐ−ニトロフェニルリン酸をインキュベートした。吸光度を、４０５ｎｍおよび５７０ｎｍで測定した。プリズムソフトウェア（Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）、（グラフパッド、ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してデータを非線形回帰によって、分析し、抗体解離定数、Ｋｄおよび最大結合量であるＢｍａｘ（ＯＤ）を測定した。
【０２２８】
ＨＣＶ  ＲＮＡのトランスフェクションおよびウィルス産生
ＸｂａＩで線状化したｐＪＦＨ−１プラスミドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写し、（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ、アンビオン、オースティン、テキサス州）、Ｈｕｈ７．５細胞に電気穿孔した。簡単に述べると、１０μｇの仔ウシ肝臓ｔＲＮＡを含む無カルシウムＰＢＳ中の０．４×１０６個のＨｕｈ７．５細胞と１０μｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写したＪＦＨ−１ＲＮＡを４ｍｍのキュベット中で混合し、バイオラッドの遺伝子パルサーシステムを使用して０．２７ｋＶ、９６０μＦで電気パルスした。電気穿孔した細胞を、１０％のＦＣＳを含む１０ｍＬの完全ＤＭＥＭが入った１０ｃｍの細胞培養ディッシュに播種した。ＨＣＶ  Ｅ２の発現を、ＩＦＡによって各継代の細胞で確認した。ＪＦＨ−１ウィルスを産生するために、トランスフェクションした細胞を、新しい培養フラスコへ１：４〜１：５に分けて４〜５日の間隔で継代した。プールした培地のウィルス力価を、後述するようにフォーカス形成単位（ＦＦＵ）として測定し、少量に分注して、−８０℃に保った。
【０２２９】
第２の感染性のＨＣＶウィルスは、ＪＦＨ−１ウィルスゲノムのコア−ＮＳ２断片をサブタイプ１ａ  Ｈ７７ウィルスの相当する断片と置き換えることによって、作成した遺伝子型間のキメラウィルスである（Ｙｉ  ｅｔら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８１巻：６２９頁、２００７年；参照により本書に組み込む）。このキメラウィルスＨ−［ＮＳ２／ＮＳ３］−Ｊ／Ｙ３６１Ｈ／Ｑ１２５１Ｌ（以下「ＨＪ３−５」と記載する）は、細胞培養における増殖を促進する２箇所の補償的突然変異を含んでおり、示した通り、その１つがＥ１配列内（ポリタンパク質残基３６１）にある（Ｙｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８１巻：６２９頁、２００７年；参照により本書に組み込む）。ウィルスストックを、ＦＴ３−７細胞中に作成した（Ｂｌｉｇｈｔら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７６巻：１３００１頁、２００２年；参照により本書に組み込む）。
【０２３０】
ＨＣＶｐｐ中和アッセイ
以前に記載されている通りに、ＨＣＶｐｐの中和を実施した（Ｋｅｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８１巻：１０４３〜４７頁、２００７年、およびＫｅｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７９巻：１３１９９〜２０８頁、２００５年；その両方を参照により本書に組み込む）。簡単に述べると、Ｈｕｈ−７細胞を、感染の２４時間前に不透明な白色の９６穴プレートに１ウェルにつき８×１０３個細胞で播種した。感染培地を様々な濃度の抗体と３７℃で６０分間インキュベートし、抗体無しの対照としてＰＢＳを使用してＨｕｈ−７細胞に添加した。１５時間インキュベートした後、ＨＣＶｐｐ培地を、新しい完全培地と交換し、追加で７２時間インキュベートした。抗体中和活性を、ＰＢＳを含んでいる感染培地と比較したルシフェラーゼ活性の百分率の減少によって定量した。
【０２３１】
ＨＣＶｃｃ感染力アッセイ
ＨＣＶｃｃの中和を、免疫ブロット法により観察される通り感染した細胞におけるＮＳ３発現量の減少によって評価した。３５０μＬアリコートの２ａ  ＪＦＨ−１ウィルス（１０５ＦＦＵ／ｍＬ）または１ａ  ＨＪ３−５  ＨＣＶｃｃに感染した細胞培養上清を２０μｇ／ｍＬの抗体と３７℃で１時間インキュベートし、２４時間前に２４ウェルプレートの１ウェルにつき３２，０００個の細胞密度で播種したナイーブＨｕｈ  ７．５細胞上へ接種した。感染３時間後（ｈｐｉ）に、ＨＣＶ／抗体を含む培地を除去し、細胞をＰＢＳ洗浄して、新しい完全ＤＭＥＭに交換した。細胞を、ウェスタンブロット分析のために７２ｈｐｉに採取した。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中にて７０℃で５分間加熱し、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで泳動して、ニトロセルロース膜に転写した。膜を、抗−ＮＳ３抗体で免疫ブロットし、続けてＨＲＰ−コンジュゲート二次抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー、サンタクルーズ、カリフォルニア州）とインキュベートし、ＧＥヘルスケアのＥＣＬ  ＰＬＵＳウェスタンブロット検出システムを使用して検出した。画像を、バイオラッドゲルドキュメントシステムで取り込んだ。中和の百分率を、抗体無しの対照と比較した。ＲＯ４は、ＨＣＭＶに対するアイソタイプ適合性モノクローナル抗体であり、陰性対照として使用した。
【０２３２】
フォーカス形成単位（ＦＦＵ）減少アッセイ
６０μＬアリコートのストックＨＪ３−５またはＪＦＨ−１ウィルス（約１００ＦＦＵ）を等容量の希釈した抗体と混合し、３７℃で１時間インキュベートした後、１００ｕＬのウィルス／抗体混合物を２４時間前に８ウェルのチャンバースライド（登録商標）（ナルゲヌンク（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）ロチェスター、ニューヨーク州）に播種したＨｕｈ７．５細胞上へ接種した。培養物を、５％ＣＯ２環境にて３７℃で２４時間静置し、２００μＬの培地を追加で供給し、そして追加の４８時間再インキュベートした。記載されている通り、上清の液体を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、細胞を１：１のメタノール−アセトンを用いて固定し、コアタンパク質（アフィニティバイオリージェント（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ）、ゴールデン、コロラド州）に対して特異的な１：３００のＭＡｂ  Ｃ７−５０で標識した（Ｙｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８１巻：６２９頁、２００７年；参照により本書に組み込む）。徹底的に洗浄した後、１：１００の希釈のＦＩＴＣ−コンジュゲートヤギ抗−マウスＩｇＧ（カタログ番号１０１０−０２、サザンバイオテック（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、バーミンガム、アラバマ州）を用いて二次標識し、核をビスベンズイミドＨ（ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、フランクフルトアムマイン、ドイツ）で対比染色し、スライドを装着してツァイス（Ｚｅｉｓｓ）紫外蛍光顕微鏡で調べた。抗原に陽性な細胞のフォーカスを各スライドにおいて計数し、記載されている通り、コア抗原に対して陽性に染まった感染した細胞の各集団を、単一の感染性フォーカス形成単位（ＦＦＵ）を構成しているとみなした、（Ｙｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８１巻：６２９頁、２００７年、およびＹｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ、１０３巻：２３１０頁、２００６年；その両方を参照により本書に組み込む）。無関係な対照抗体であるＲＯ４とインキュベートしたウィルスと比較した中和の百分率を、ＦＦＵの減少として算出した。
【０２３３】
ＣＤ８１に対するＥ２の結合の妨害
示されている通り、１μｇ／ｍＬのＥ２を含んでいる２９３Ｔ中で発現している遺伝子型１ｂ  Ｅ１Ｅ２を、１０μｇ／ｍＬの各ＨＣＶ抗体と一緒に室温で１時間インキュベートし、次いで抗体−抗原複合体をＣＤ８１で予め被覆したウェル上へ添加した。ウェルを洗浄し、５μｇ／ｍＬのビオチン化ＣＢＨ−４Ｄと一緒に１時間インキュベートした。結合したＣＢＨ−４Ｄを、アルカリホスファターゼ−コンジュゲートストレプトアビジン（Ｒ＆Ｄシステム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス、ミネソタ州）を用いて、続けて発色のためにｐ−ニトロフェニルリン酸をインキュベートして検出した。モレキュラーデバイス（サニーベール、カリフォルニア州）のプレート読取機スペクトラマックス１９０を使用して、吸光度を４０５ｎｍで測定した。ＣＢＨ−５を、陽性対照としておよびＲＯ４を陰性対照として使用した。
【０２３４】
部位特異的突然変異によるエピトープマッピング
アラニンスキャン突然変異を、クイックチェンジＩＩ部位特異的突然変異キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラホヤ、カリフォルニア州）を使用して提供された手順に従って実施した。突然変異を、遺伝子型１ａ  Ｈ７７ｃ株のＥ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ００９６０６）に導入した。すべての変異体を配列決定して（シークテック、マウンテンビュー、カリフォルニア州）、これらのクローンが予想される突然変異だけを持つことを確認した。変異したＥ２タンパク質を、２９３Ｔ細胞中で発現させ、ＥＬＩＳＡによって分析した。簡単に述べると、マイクロタイタプレートを１ウェルにつき５００ｎｇのＧａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓレクチン（ＧＮＡ）で被覆し、続けてＴＢＳＴ（２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）中の２．５％の脱脂粉乳および２．５％の正常ヤギ血清からなるＢＬＯＴＴＯでブロッキングした。ブロッキングの後、ＢＬＯＴＴＯで希釈したトランスフェクションした細胞の溶解物を、プレートに添加した。結合した変異体Ｅ２タンパク質を、次いでＨＣ−１またはＨＣ−１１、続けてアルカリホスファターゼ−コンジュゲートヤギ抗−ヒトＩｇＧと一緒にインキュベートした。次いで試料をｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物を加えて可視化し、４０５ｎｍで吸光度を読み取った。結果を、図７に示す。変異体Ｅ２タンパク質について得た値を、次いで野生型Ｈ７７ｃ  Ｅ２について観察した値の百分率として示した。変異させたアミノ酸をｙ軸に表している。２つの置換したアミノ酸の間の数字は、参照株Ｈ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ００９６０６）のポリタンパク質における位置に相当する。各変異体に結合しているＨＣ−１  ＨＣ−１１  ＨＣＶ抗体量を、ＣＢＨ−１７（Ｅ２上の線形エピトープ対する抗体）の結合量によって標準化し、野生型に結合しているＨＣ抗体量で割った結合値の百分率としてｘ軸上に表している。
【０２３５】
ＥＬＩＳＡによるＥ２変異体に対するＨＣＶ抗体の結合
変異体Ｅ２糖タンパク質に対する抗体結合量を測定するためにＥＬＩＳＡを実施した。マイクロタイタプレートをウェル当たり５００ｎｇのＧＮＡで被覆し、続けてＢＬＯＴＴＯ（ＴＢＳＴ［２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０］中に２．５％の脱脂粉乳および２．５％の正常ヤギ血清）で１時間ブロッキングした。２９３Ｔ細胞の溶解物中で発現した野生型および変異体Ｅ２糖タンパク質を、ＧＮＡ被覆したプレート上へ捕捉させた。結合したＥ２を各抗体によって検出し、各ウェル中のＥ２の量を抗ｃ−ｍｙｃマウスＭＡｂを用いて標準化した。結合した抗体をアルカリホスファターゼ−コンジュゲートヤギ抗−ヒトＩｇＧとインキュベートし、続けて発色のためにｐ−ニトロフェニルリン酸をインキュベートした。４０５ｎｍおよび５７０ｎｍで吸光度を測定した。次に変異体Ｅ２タンパク質から得た値を、野生型Ｅ２に対して観察した値の百分率として示した。
【０２３６】
ＨＣＶｐｐ中和の時間的経過
吸着後の異なる時間間隔におけるＨＣＶｐｐ感染の抗体を媒介した中和を、基本的には記載の通り（Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４４６巻：８０１〜５頁、２００７年；参照により本書に組み込む）変更を加えて実施した。ＨＣＶｐｐを含んでいる２９３Ｔ細胞から採取した培養上清を０．４５μｍフィルタを用いて濾過し、４℃へ冷却した。Ｈｕｈ７．５細胞を、ポリ−Ｌ−リシンで被覆した２４ウェル組織培養プレートにウェル当たり３．２×１０４個播種し、２４時間後に感染させた。示した通り、Ｈｕｈ  ７．５細胞を４℃で予め冷却した後に、ｔ＝−１２０分で抗体の有り無しで、培地を４μｇ／ｍＬのポリブレンおよび５０ｍＭのＨｅｐｅｓを含む２００ｕＬのＨＣＶｐｐ上清と交換した。プレートを、４℃で１２０分間２１００ｒｐｍで遠心分離した。ｔ＝０分に、プレートを１ｍＬの冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで４μｇ／ｍＬポリブレンを含んでいる３７℃の新しい培地を、抗体の有り無しで添加して、続けて３７℃のＣＯ２インキュベーター中にプレートを静置した。異なる時間間隔で、指示した濃度で抗体を培地に添加した。感染後１８時間目に、培養培地を抗体のない新しい培地に交換した。感染後３日目に細胞を１００μＬの培養細胞溶解緩衝液中に採取し、ルシフェラーゼリポータの発現をプロメガ（マディソン、ウィスコンシン州）のブライトＧｌｏ（Ｂｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏ）試薬を１００μＬ添加して測定した。
【０２３７】
クッションペレットウィルスアッセイ
記載されている通り（Ｂａｒｔｏｓｃｈら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９７巻：６３３〜４２頁、２００３年および、Ｋｅｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７９巻：１３１９９〜２０８頁、２００５年；その両方を参照により本書に組み込む）、２９３Ｔ細胞にｅｎｖ欠損プロウィルスゲノムを含むプラスミドとＨＣＶ糖タンパク質（ｇｐｓ）をコードする発現プラスミドをコトランスフェクションすることによって、ＨＣＶの偽粒子（ＨＣＶｐｐ）を作成した。ここで、ＨＣＶｐｐは、ＨＣ−３がエピトープに結合するのに関与する６つの変異残基（Ｒ６５７Ａ、Ｄ６５８ａ、Ｆ６７９Ａ、Ｌ６９２Ａ、Ｉ６９６Ａ、Ｄ６９８Ａ）を各々有している。野生型のＨ７７ｃおよび／またはＥ４３１Ａ（ＨＣ−３エピトープより外側に位置する残基）が陽性対照である。ＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２を発現している細胞およびウィルスを含んでいる細胞外培地を、トランスフェクション後４８時間目に別々に採取した。溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス（ｐＨ  ７．５）、０．５％のデオキシコレート、１．０％のノニデット−Ｐ４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０）（登録商標）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍｇ／ｍＬのペファブロック、２μｇ／ｍＬのアプロチニン、２μｇ／ｍＬのロイペプチン、１μｇ／ｍＬのペプスタチン）を使用してＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２を発現している細胞を再懸濁することによって、細胞溶解物を調製した。１８，０００ｘｇで４℃で１０分間、遠心分離することによって、核をペレット化し、結果として得られた細胞質抽出物をウェスタンブロット解析用に採取した。先ず、ウィルスを含んでいる細胞外培地を０．４５μｍフィルタを通過させることによって細胞残屑から分離し、さらにフィルタを通した３０ｍＬの上清を、ベックマンコールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＳＷ  ２８ローターを使用する超遠心分離（２５，０００ｒｐｍ、４℃で２時間）による２０％のショ糖クッションによって処理することによりさらに濃縮した。クッションペレット化したウィルスを、１５０μＬのＮＴＥ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ  ７．４）中に再懸濁した。ウェスタンブロット法のために、等容量の２０％のショ糖クッションペレット懸濁液または２９３Ｔ細胞の溶解物を、等容量の２ｘＳＤＳ試料緩衝液と混合し、９５℃で５分間加熱して変性させた。すべての試料を、トリスＨＣｌクライテリオンゲル（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）（登録商標）（バイオラッドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を使用する１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、分離した。ゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。フィルタを、０．１％のＴ−ＴＢＳ（１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含んでいる２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、）中の５％の粉ミルクでブロッキングした。
【０２３８】
次の一次抗体および二次抗体の組を使用して、試料中のタンパク質の量を検出した：Ｅ１検出用に、２μｇ／ｍＬのＨ１１１（Ｋｅｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７８巻：７２５７〜６３頁、２００４年；参照により本書に組み込む）および抗−ヒトＩｇＧ  ＨＲＰ（１：５０００、ＧＥヘルスケア）、Ｅ２検出用に、２μｇのＡＰ３３（Ｏｗｓｉａｎｋａら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７９巻：１１０９５〜１０４頁、２００５年；参照により本書に組み込む）およびヤギ抗−マウスＩｇＧ（１：２０００、サンタクルーズバイオテクノロジー）、ヤギ抗−ＨＩＶ  ｐ２４（１：２５００、ウイロシュタット（ＶｉｒｏＳｔａｔ）、ポートランド、オレゴン州）およびウシ抗−ヤギＩｇＧ  ＨＲＰ（１：５０００、サンタクルーズバイオテクノロジー）。ＧＡＰＤＨおよびＰ２４タンパク質を、細胞タンパク質およびＨＣＶ粒子産生の内部対照としてそれぞれ使用し、マウス抗−ＧＡＰＤＨおよびヤギ抗−マウスＩｇＧ  ＨＲＰ（サンタクルーズバイオテクノロジー）によって検出した。このフィルタをＥＣＬ  Ｐｌｕｓとインキュベートし、化学発光画像をバイオラッドのケミ−ドク画像システムを使用して捕捉した。
【０２３９】
ＨＣＶｐｐの感染力アッセイ
先ず、ウィルスを含む培地中のウィルス量をクイックタイター（ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ）レンチウィルス力価キット（セルバイオラボラボラトリー（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｌａｂ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用して、製造業者の説明書に従って、ｐ２４の発現量で標準化した。その後、白色非透明な９６穴プレート中に予め播種したＨｕｈ−７．５細胞（８×１０３個細胞／ウェル）へ等量のウィルスを添加し、感染細胞を室温で２時間、７３０×ｇで遠心分離して、その後３７℃で５％のＣＯ２が入っている加湿した細胞培養容器中に置いた。結合していないウィルスを新しい完全培地で交換し、合計で７２時間インキュベートした。１００μＬの再構成したＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（プロメガ）を各ウェルに添加した後、続けて室温で２分間混合し、ルシフェラーゼ活性をベリタス（Ｖｅｒｉｔａｓ）マイクロプレート照度計、ターナーバイオシステムス、（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定した。ウィルスの感染力を、ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）として示している。
【０２４０】
結果
ＨＣＶ  Ｅ２糖タンパク質に対する新規なドメインＢ  ＨＣＶ抗体の単離
ＨＣＶ  Ｅ２は、異なった特性および生物学的機能を有する少なくとも３つの免疫原性立体配座領域を含んでいる（Ｋｅｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８１巻：１０４３頁、２００７年、Ｋｅｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７９巻：１３１９９頁、２００５年、およびＫｅｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７８巻：９２２４頁、２００４年；  それらすべてを参照により本書に組み込む）。各ドメインは、類似の特性および機能を有する複数の重なり合うエピトープを含んでいる。中和抗体のパネルを拡大するために、高い血清中和力価を有するＨＣＶに感染した３人の患者の末梢Ｂ細胞由来のヒトモノクローナル抗体の１群を作成し、特徴付けた。ＨＣＶ  １ａまたは１ｂに感染し高い血清中和抗体活性を有する患者由来の末梢Ｂ細胞を使用して、ヒトモノクローナル抗体のパネルを作成し特徴付けた。
【０２４１】
１ａに感染したドナーに対して遺伝子型１ｂ  Ｅ２タンパク質を、または１ｂに感染したドナーに対して１ａ  Ｅ２タンパク質を使用して第１のスクリーニングを行った。記載の通り、Ｂ細胞をエプスタインバーウィルスによって活性化し、ヒトハイブリドーマを作成するために使用した（Ｈａｄｌｏｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７４巻：１０４０７頁、２０００年；参照により本書に組み込む）。間接免疫蛍光測定法（ＩＦＡ、図１）によって、サブタイプ１ａ  ＨＣＶｐｐおよび１ｂ  Ｅ２に結合するが１ｂ  Ｅ１糖タンパク質に結合しない抗体を分泌しているＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３と命名した４つのハイブリドーマを選抜した。以前示したように、このスクリーニングにより保存されたエピトープに対するＨＣＶ抗体の選択が強調され、これらの抗体がＥ２に対するものであることが示された。（Ｋｅｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７８巻：９２２４頁、２００４年；参照により本書に組み込む）。
【０２４２】
記載の通り、２回の単一細胞のクローニングによりＩｇＧ遺伝子を配列決定することによって、確認したハイブリドーマのモノクローン性を確立した（Ｋｅｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７８巻：７２５７頁、２００４年；参照により本書に組み込む）。加えて、これら４つの抗体を配列決定し、各抗体の重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を決定した（図２）。加えて、４つすべての抗体の各ＩｇＧサブクラスを決定した（図３）。
【０２４３】
異なるＨＣＶ遺伝子型および／またはサブタイプに共通するエピトープの保存範囲を調べるために、ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３をサブタイプ１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、４、５および６ＨＣＶｐｐに感染したＨｕｈ７．５細胞に対するＩＦＡによって試験した、（Ｏｗｓｉａｎｋａら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、８９巻：６５３〜９頁、２００８年；参照により本書に組み込む、図４）。
【０２４４】
図４に要約されているように、ＨＣＶ抗体のＨＣ−１およびＨＣ−１１は、ＨＣ−１に対する遺伝子型４およびＨＣ−１１に対する遺伝子型５を除くすべてのＨＣＶｐｐ遺伝子型を中和することが可能であった。ＨＣ−１およびＨＣ−１１の両方が、ＨＣＶｃｃ  １ａおよび２ａを中和する。ＣＢＨ−２３は、ＨＣＶｐｐ  １ａおよび１ｂの感染およびＨＣＶｃｃ  ２ａの感染を中和することが可能であった。ＨＣ−３は、ＨＣＶｐｐ  １ａおよびＨＣＶｃｃ  ２ａを中和することが可能であった。一方で、ＣＭＶ特異的タンパク質に対する抗体であり、アイソタイプ適合性の対照であるＲＯ４は、いかなるＨＣＶｐｐ遺伝子型にも結合することができなかった。４つの抗体すべてがＥ２を免疫沈降させることが可能であったが（図１）、還元条件下ではＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット解析によって、Ｅ２を検出しなかったことは、ＨＣＶ抗体がＨＣＶ  Ｅ２糖タンパク質上の立体配座エピトープに対するものであることを示している。ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３ヒトハイブリドーマは、ＩｇＧ１抗体を分泌し、ＨＣ−１はＩｇＧ２を分泌する（図３）。抗体産生量は、使用した上清中に２０μｇ／ｍＬ〜６０μｇ／ｍＬであった。それらＩｇ遺伝子（ＶＬおよびＶＨ）の配列分析から、ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１および、ＣＢＨ−２３が、固有の組合せの重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および３領域を発現している独立したＢ細胞に由来することが明らかになった（図２）。
【０２４５】
初期のパネルとこれらの新規な抗体の関係を明確にするために、ビオチン標識した代表的なドメインＡ（ＣＢＨ−４Ｄ）、Ｂ（ＣＢＨ−５）およびＣ（ＣＢＨ−７）ＨＣＶ抗体を用いて競合分析を実施した（図５）。ＨＣ−１およびＨＣ−１１が、ドメインＡおよびＣの抗体と最少の競合をまた競合せず、またＣＢＨ−５と６０％〜８０％の競合を示したことから（図５）、これらの新規な抗体により認識されるエピトープがドメインＢ内に位置することが示唆される。ＣＢＨ−２３がドメインＡおよびＢ抗体と最少の競合を示すあるいは競合せず、またＣＢＨ−７と９０％を超える競合を示したことから、このエピトープがドメインＣ内に位置することが示唆される。ＨＣ−３がドメインＡ、ＢおよびＣの抗体と最少の競合または競合しなかったことから、この抗体が新規な別の領域を認識していることが示唆される。
【０２４６】
ドメインＢエピトープは、中和抗体を顕在化させる
領域内で重なり合うエピトープのモデルが、類似の特性および機能を有している場合、（Ｋｅｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７８巻：９２２４頁、２００４年；参照により本書に組み込む）、ＨＣ−１、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３は、初期のドメインＢおよびＣのＨＣＶ抗体で観察した通り、ＨＣＶも中和するはずである。２０μｇ／ｍＬの抗体の中和活性を、先ず１ａおよび１ｂ  ＨＣＶｐｐの感染を用いて測定したところ、各ＨＣＶ抗体は両方の分離株を中和した。１ｂ  ＨＣＶｐｐに対するこれらＨＣＶ抗体の平均的中和活性は、６４％でＣＢＨ−５と同等であった。一方で、１ａ  ＨＣＶｐｐ感染においては、ＣＢＨ−５が６０％であるのと比較して、すべてのＨＣＶ抗体で平均８０％の中和活性を観察した。実際、ＨＣ−１１を用いたより詳細な中和分析により、この抗体が０．９μｇ／ｍＬのＩＣ５０を有していることが明らかになった。この値は、１ａ  ＨＣＶｐｐの中和能において、ＣＢＨ−５の４．０ｕｇ／ｍＬよりもおよそ５倍高い。ＣＢＨ−５は１ｂに感染した患者から単離し、これらの新規なＨＣＶ抗体は１ａに感染した患者から単離したので、このことがサブタイプ間のそれらエピトープの差を反映している可能性がある。感染性サブタイプ１ａおよび２ａ  ＨＣＶｃｃを用いて中和をさらに試験した（図４）。２ａ  ＨＣＶｃｃについて中和活性を、２つのアッセイ、ウェスタンブロット解析によるＨｕｈ７．５感染細胞におけるＮＳ３タンパク質発現の阻害およびＦＦＵ減少によって測定した。１ａ  ＨＣＶｃｃ感染力に対する各抗体の効果を、ＦＦＵ減少によって定量した。図４に示した様に、ＨＣＶ  ＮＳ３発現によって測定した通り、各１０μｇ／ｍＬのＨＣＶ抗体のＨＣ−１、ＨＣ−３、およびＨＣ−１１を用いた２ａ  ＨＣＶｃｃに対する中和は完璧であった。一方で、２ａ  ＨＣＶｃｃの感染力は、陰性対照（すなわち、ＲＯ４抗体または抗体なし（ＰＢＳ）対照）による影響を受けなかった。内部対照として使用したβ−アクチンタンパク質のレベルは、異なる試料同士で同等であった。これらの結果は全体として、類似の機能を有するＥ２糖タンパク質上の異なる免疫原性領域内の重複立体配座エピトープモデルと整合性がある。ドメインＢに対するＨＣ−１およびＨＣ−１１の単離が成功したことから、ドメインＢのエピトープが高い免疫原性を持ち、強力な中和抗体を誘導するという確証が得られる。
【０２４７】
ドメインＢ抗体は、ＣＤ８１に対するＥ２の結合を阻害する
初期のドメインＢおよびＣ  ＨＣＶ抗体による中和の機序は、Ｅ２がＣＤ８１に結合することを阻害することによる。このことを、ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３を用いてＣＤ８１捕捉アッセイで実験した。図６に示すように、１５μｇ／ｍＬのＨＣＶ抗体ＨＣ−１、ＨＣ−１１、ＣＢＨ−２３またはＣＢＨ−５の存在下でＥ２糖タンパク質を予めインキュベートすると、Ｅ２のＣＤ８１への結合はＲＯ４陰性対照と比較して９０％以上減少した。他のドメインＢまたはＣ  ＨＣＶ抗体と同様に、これらのＨＣＶ抗体はＣＤ８１に対するＥ２の結合を妨害することによってＨＣＶを中和する。一方で、ＨＣ−３存在下でＥ２糖タンパク質を予めインキュベートしても、ＣＤ８１に対するＥ２の結合は減少しなかった。
【０２４８】
部位特異的突然変異によるＨＣ−１およびＨＣ−１２のエピトープマッピング
アラニンスキャニング突然変異生成を実施して、Ｅ２−ＣＤ８１相互作用に関わるＨＣＶ抗体エピトープ内の残基を明らかにした。５２３〜５４０の範囲のアミノ酸部位に変異のある一連のタンパク質を、部位特異的突然変異によって得た。この領域は、ＣＤ８１に対してＥ２が結合するための接触点の残基であるＴｙｒ５２７、Ｔｒｐ５２９、Ｇｌｙ５３０およびＡｓｐ５３５を含んでいる（Ｏｗｓｉａｎｋａら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８０巻：８６９５頁、２００６年；参照により本書に組み込む）。さらに、残基Ｇｌｙ５２３、Ｐｒｏ５２５、Ｇｌｙ５３０、Ａｓｐ５３５およびＡｓｎ５４０は、ＣＢＨ−５エピトープに関与している（Ｏｗｓｉａｎｋａら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、８９巻：６５３〜９頁、２００８年；参照により本書に組み込む）。これらの変異体について、ＨＣ−１結合に対する効果をＥ２−ｃ−ｍｙｃ融合タンパク質をコードしている変異体プラスミドをトランスフェクションした細胞由来のＥ２を使用して分析した。変異体Ｅ２タンパク質を、それらのＨＣ−１に対する反応性についてＥＬＩＳＡで評価した（図７）。この評価を、フロー分析によって確認した。ｃ−ｍｙｃはＣ末端タグなので、ＰＥ−抗−ｃ−ｍｙｃにより検出されたｃ−ｍｙｃの量をＥ２の発現レベルを標準化するための内部対照として使用した。変異体Ｅ２タンパク質に対するＨＣ−１結合の百分率を評価するために、Ｅ２／ｃ−ｍｙｃ比率を各変異体について計算し、野生型タンパク質で得た比率と比較した。非中和性抗体ＣＢＨ−４Ｇを対照として使用し、ＨＣ−１に特異的な残基を同定した。ＣＢＨ−４ＧおよびＨＣＶ抗体両方の置換部位における結合の欠如は、Ｅ２構造の全体的な変化または中和エピトープと非中和エピトープ間のある程度の重複を示唆した。我々は、以前Ｅ２に対する中和および非中和ＨＣＶ抗体の間のある程度の交差競合が、Ｅ２上のこれら免疫原性ドメインの空間的近さを示唆していることに注目した（Ｋｅｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７８巻：９２２４頁、２００４年；参照により本書に組み込む）。
【０２４９】
図７Ａに示すように、Ｔｒｐ５２９（列３）、Ｇｌｙ５３０（列４）およびＡｓｎ５４０（列１２）をアラニンで置換したときに、野生型と比較してＨＣ−１の結合が１０％にまたはそれより低く有意に減少したことに注目した。Ａｓｎ５４０変異体もＣＢＨ−４Ｇ結合に影響を及ぼしたので、この残基がＨＣ−１エピトープに関与するかどうかは不明である。位置Ａｓｐ５３５（列９）の突然変異により、ＨＣ−１結合は８０％を超えて減少した。図７Ｂに示すように、ＨＣ−１１についてはＧｌｙ５３０およびＡｓｐ５３５をアラニンで置換交換したときに、結合の有意な減少が観察された。
【０２５０】
突然変異Ｇｌｙ５３０（列４）は、ＨＣ−１結合を８０％を超えて減少させた。ＨＣ−１とは対照的に、Ｔｒｐ５２９（列３）の突然変異は、野生型と比較してＨＣ−１１結合を４４％だけ減少させた。両方の抗体について、Ｇｌｙ５２３（列１）の置換は６０％減少させた（図７Ａおよび７Ｂ）。Ｐｒｏ５２５（列２）、Ａｌａ５３１（列５）、Ａｓｎ５３２（列６）、Ａｓｐ５３３（列７）、Ｔｈｒ５３４（列８）の置換は、ＨＣ−１およびＨＣ−１２の結合に影響を及ぼさなかったかまたは＋／−２０％でわずかに及ぼした。Ｖａｌ５３６（列１０）、Ｐｈｅ５３７（列１１）およびＡｓｎ５４０（列１２）の置換はＨＣ−１  ＨＣ−１１の結合を７５〜９５％減少させたが、ＣＢＨ−４Ｇの結合も７０〜９５％減少させた。総括すると、これらの結果はＴｒｐ５２９、Ｇｌｙ５３０およびＡｓｐ５３５がＨＣ−１に対する接触残基であり、Ｇｌｙ５３０およびＡｓｐ５３５がＨＣ−１１に対する接触残基であることを示している。したがって、本発明は、ＨＣＶ抗体ＨＣ−１およびＨＣ−１１がＣＤ８１に対してＥ２が結合する接触点である残基を直接妨害することによって  ＨＣＶｐｐおよびＨＣＶｃｃの感染を中和する、という認識を包含している。いかなる１残基置換も結合を１００％ノックダウンしないという事実は、ＣＤ８１に対するＥ２の結合に直接関与している可能性があるまたは無い明確にすべき他の接触点で、ＨＣＶ抗体ＨＣ−１および−１１が不連続なエピトープに対して結合していることと整合している。
【０２５１】
ＨＣ−３のエピトープマッピングの結果、５３０〜５３５の間の残基は関与しないことが明らかになったが、残基Ｒ６５７、Ｄ６５８、Ｆ６７９、Ｌ６９２、Ｉ６９６およびＤ６９８で９０％を超える結合の減少が明らかになった（図８）。
【０２５２】
ＨＣ−３が侵入経路の間に阻害する段階を予測するために、ドメインＢおよびＣＤ８１に対する抗体と比較して時間的経過実験を実施した。感染性ＨＣＶｃｃを４℃に予め冷やしたＨｕｈ−７．５細胞とインキュベートし、ウィルスが吸着はできるが侵入はできないようにした。次いで、ウィルス−細胞複合体を３７℃のインキュベーター中に置いた後に、１５分間隔で試験抗体を添加した。図９に示すように、抗−ＣＤ８１およびドメインＢ  ＨＣＶ抗体であるＨＣ−１１の両方で、ウィルスの侵入妨害にあたって類似した型の進行性の消失がある。このことから、ＣＤ８１に対するＥ２の結合を妨害することによって、ドメインＢ  ＨＣＶ抗体がウィルスの侵入を阻害すると期待される。これら２つの抗体とＨＣ−３の型における類似性は、ＨＣ−３がＣＤ８１とウィルスの相互作用と時間的に近い段階でウィルスの侵入を阻害していることを示唆している。このことは、ＳＲ−Ｂ１などの異なるＨＣＶ共受容体とＥ２の相互作用またはＣＤ８１会合直後の段階を阻害する可能性を含んでいる。Ｒ６５７、Ｄ６５８、Ｆ６７９、Ｌ６９２、Ｉ６９６およびＤ６９８におけるＨＣ−３に対する接触残基の同定、および５３０〜５３５の間に接触残基が無いことは、ＨＣ−３がＣＤ８１に対するＥ２の結合を妨害するのとは異なる段階でウィルスの侵入を阻害しているというこれらの所見と整合する。
【０２５３】
それらもＥ１Ｅ２二量体化の媒介に関与しているかどうか調べるために、Ｅ２に対するＨＣ−３の結合に関与するアミノ酸を、クッションペレットアッセイで試験した。このアッセイにおいてＨＣＶｐｐは、ＨＣ−３  Ｅ２エピトープの一部である６つの変異残基（Ｒ６５７Ａ、Ｄ６５８ＡおよびＦ６７９Ａ、Ｌ６９２Ａ、Ｉ６９６ＡまたはＤ６９８Ａ）を各々保有している。これに対してＨＣＶｐｐは、野生型Ｈ７７ｃまたはＥ４３１Ａ突然変異（ＨＣ−３エピトープの外側に位置する残基）を陽性対照として保有している。ＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２を発現している細胞を、細胞外培地（ウィルスを含んでいる）から分離した。細胞溶解物およびクッションしたウィルスペレットを調製し、ウェスタンブロット用ゲルにロードした。
【０２５４】
Ｈ７７ｃと比較して、ＨＣＶｐｐ変異体Ｒ６５７ＡおよびＤ６５８Ａ（およびより小さい範囲で、Ｆ６７９Ａ）は、Ｅ１の有意な減少を示した（図１０）。このことは、これらの残基がＥ１とＥ２のヘテロ二量体形成に関与していることを示唆している。これらの残基は、Ｅ１Ｅ２の二量体化に関与するとまだ同定されていなかった。類似の所見が、細胞溶解物由来のＥ１Ｅ２で観察された（図１０）。Ｅ４３１Ａ変異体は、ヘテロ二量体形成に影響を及ぼさない突然変異の対照になる。
【０２５５】
ＨＣ−３に対する接触点に突然変異を有しているウィルスの感染力（すなわち、Ｒ６５７Ａ、Ｄ６５８ＡおよびＦ６７９Ａ、Ｌ６９２Ａ、Ｉ６９６ＡまたはＤ６９８Ａに突然変異を持つウィルスの感染力）を定量した。これらの実験の結果は、各突然変異がウィルスに対して致死的であることを示している（図１１）。Ｅ４３１Ａの対照突然変異は、変化を示さなかった。図１０における所見と合わせると、これらのデータは、Ｅ１Ｅ２ヘテロ二量体からウィルスが内部へ移行し、次に細胞質ゾルへ放出されるために必要な状態へと移行するのに影響を及ぼすことによって、ＨＣ−３が中和を仲介していることを示唆している。本発明は、これらのアミノ酸残基の１つ以上がＨＣ−３の効果を模倣し、この移行段階に影響を及ぼす可能性がある小分子の標的になり得るという認識を包含する。
【０２５６】
考察
ＨＣＶは、病原性ウィルス変異体の放出を引き起こす多種性を生成する特別な能力を有する。免疫封じ込めを回避するこの能力にもかかわらず、受動免疫療法を用いる動物防御の実証および広域中和抗体が感染した患者中に見つかるという所見は、これらの抗体を誘導する能力を備えているワクチン療法を支持する。良好なワクチンの開発には、異なる遺伝子型、サブタイプおよび／または株の間で広く保存されているウィルスの中和を媒介する免疫優性エピトープの特徴付けが必要になる。この実施例では、これらのＨＣＶ抗体（すなわち、ＨＣ−１、ＨＣ−３、ＨＣ−１１およびＣＢＨ−２３）は、サブタイプ１ａまたは１ｂに感染したＢ細胞ドナーに由来している。これらの抗体を２９３Ｔ細胞中で発現しているサブタイプ１ａまたは１ｂ  Ｅ２を使用するＩＦＡによって、スクリーニングし、保存されているエピトープに対するＨＣＶ抗体の選択に重点を置いた。４つのＨＣＶ抗体のうちの３つはＩｇＧ１であり、このことはＨＣＶ感染に対する抗体反応が主にＩｇＧ１サブクラスとしてであるという以前の所見と一致する  （Ｃｈｅｎら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１１６巻：１３５頁、１９９９年、およびＨａｄｌｏｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７４巻：１０４０７頁、２０００年；その両方を参照により本書に組み込む）。４つのＨＣＶ抗体は、ＩＦＡによって検出した通りサブタイプ１〜６全体で保存されているエピトープに結合し、ＨＣＶｐｐを免疫沈降することはできるがウェスタンブロット分析によってＥ２を検出することができないことから明らかな通り、立体配座エピトープに対する抗体である。変性した抗原に対して結合が消失することから、抗体が立体配座エピトープに対するものであることがさらに証明された。交差競合実験により、これらの抗体は関連のあるＨＣＶ抗体の初期群に分類され、密接に重なり合うエピトープの一群を含んでいるドメインＢと分類された。ドメインＢ  ＨＣＶ抗体の初期のセット内で、ＣＢＨ−５として表されるいくつかの抗体は、すべてのサブタイプおよびサブタイプＨＣＶｐｐに結合して中和するが、一方でＣＢＨ−８Ｃとして表される他の抗体は、いくつかのサブタイプ／サブタイプに結合または中和せず、より制限されている（Ｋｅｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７８巻：９２２４頁、２００４年、およびＯｗｓｉａｎｋａら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、８９巻：６５３〜９頁、２００８年；その両方を参照により本書に組み込む）。ＣＢＨ−５と同様に、ＨＣ−１およびＨＣ−１１は、１ａおよび１ｂ  ＨＣＶｐｐ、ならびに１ａおよび２ａ  ＨＣＶｃｃで実験した通り広域に中和する。達成された中和の範囲は、１ｂ  ＨＣＶｐｐに関してはＣＢＨ−５と同様であったが、いくつかのＨＣＶ抗体の１ａに対する中和効力は、ＣＢＨ−５とよりもはるかに大きかった。このことは、それらの接触残基におけるいくつかの差異を示唆しており、Ｂ細胞のドナーが１ａ  ＨＣＶ分離株に感染したという事実と整合している。ドメインＢ  ＨＣＶ抗体の拡大パネルの中で、中和効力は抗体の結合親和性と相関があった。サブタイプ１ａに対するＨＣＶ抗体の２．４〜６．６×１０−９Ｍ  Ｋｄの親和性と比較して、ＣＢＨ−５は、２．２×１０−７Ｍ  Ｋ���という低い抗体結合親和性を有している（Ｋｅｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７８巻：９２２４頁、２００４年；参照により本書に組み込む）。
【０２５７】
一般に、抗体を媒介するウィルス中和の主要機序は、ウィルス侵入の初期段階を阻害することによるものであり、大部分はＥ２糖タンパク質を対象にしているように見える。有力な証拠により、グリコサミノグリカン、リポタンパク質受容体スカベンジャー受容体クラスＢ型１、ＳＲ−Ｂ１およびＣＤ８１とＥ２との相互作用は、ＨＣＶｐｐおよびＨＣＶｃｃの侵入に関与していることが明らかになった。（Ｍｏｒａｄｐｏｕｒら、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５巻：４５３頁、２００７年に概説される；参照により本書に組み込む）。細胞接着分子の大きなファミリーの１つであり、最近ＣＤ８１に対するＥ２の結合に続く侵入に不可欠な段階であることが明らかになったクラウディン−１との相互作用など、Ｅ２が後の段階において重要であるかどうかは、依然として決定されないままである（Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４４６巻：８０１頁、２００７年；参照により本書に組み込む）。他のドメインＢ  ＨＣＶ抗体で明らかなように、ＨＣＶ抗体のうち各々が、ＣＤ８１に対するＥ２の結合を阻害する（Ｈａｄｌｏｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７４巻：１０４０７頁、２０００年；参照により本書に組み込む）。本明細書に記載のそれらの実験を遂行し、ドメインＢ  ＨＣＶ抗体が他のＨＣＶ受容体分子と一緒にＥ２の相互作用を阻害するかどうか解明できるということは、当業者には容易に認識されよう。
【０２５８】
ＣＤ８１結合に重要な特定の残基は、主にＥ２上の２つの不連続な配列に局在していた（Ｄｒｕｍｍｅｒら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８０巻：７８４４頁、２００６年、およびＯｗｓｉａｎｋａら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８０巻：８６９５頁、２００６年；その両方を参照により本書に組み込む）。それらは、ＨＶＲ１およびＨＶＲ２（アミノ酸４３６〜４４３）の間に位置する保存されているモチーフ、（Ｄｒｕｍｍｅｒら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８０巻：７８４４頁、２００６年；参照により本書に組み込む）およびすべてのサブタイプ／サブタイプ、Ｔｒｐ４２０、Ｔｙｒ５２７、Ｔｒｐ５２９、Ｇｌｙ５３０およびＡｓｐ５３５に保存されている特定の残基を含んでいる（Ｏｗｓｉａｎｋａら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８０巻：８６９５頁、２００６年；参照により本書に組み込む）。５２３〜５４０残基のこれら２領域のうちの１つ上におけるアラニン置換実験により、全群を代表するＨＣＶ抗体のうちの２つが重要な共有接触残基を現すことが明らかになった。ＨＣ−１はＴｒｐ５２９、Ｇｌｙ５３０およびＡｓｐ５３５を必要とし、ＨＣ−１２はＧｌｙ５３０およびＡｓｐ５３５を必要とする。これらの２パターンはＨＣ−１２を、Ｇｌｙ５３０およびＡｓｐ５３５と関与するがＧｌｙ５２３に少なくとも１つの異なる接触点を有するＣＢＨ−５エピトープに類似させる。（Ｏｗｓｉａｎｋａら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、８９巻：６５３〜９頁、２００８年；参照により本書に組み込む）。実際、競合実験でも、ＨＣ−１１エピトープがいずれのＨＣ−１に対してよりもＣＢＨ−５に対して空間的近いことが明らかになった。ＨＣ−１およびＨＣ−１１は両方ともＧｌｙ５２３のアラニン置換に結合するがＣＢＨ−５は結合を示さなかった。最近の実験では、サブタイプ２ｂに感染した患者から単離した組合せライブラリー由来の広域ヒト中和抗体も、Ｇｌｙ５２３、Ｔｒｐ５２９、Ｇｌｙ５３０およびＡｓｐ５３５を含んでいるエピトープを認識することが明らかになった（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ、１０４巻：１６２６９頁、２００７年；参照により本書に組み込む）。ＨＣ−１およびＨＣ−１２がＣＢＨ−５よりも、サブタイプ１ａに対して大きな中和能力を有する理由は、部分的には、サブタイプ１ａに対するＨＣ−１、ＨＣ−１２およびＫｄにして約２桁低いＣＢＨ−５の異なる抗体親和性に起因している可能性がある。これは、Ｋｄ値および中和活性の差異の原因となり得る５２３〜５４０より外側の接触残基上にあるそれらのエピトープの差異を反映している可能性がある。また、すべてのドメインＢ  ＨＣＶ抗体に重要な接触残基であるＨＣＶ  Ｅ２上のＧｌｙ５３０およびＡｓｐ５３５の位置は、ＨＣＶに対する中和抗体反応を調節するＥ２上の特定の糖鎖形成部位の追加的な証拠を提供している。２つの独立した実験において、Ａｓｎ５３２のグリカンが、ＨＣＶポリクローナル血清およびＨＣＶ特異的中和モノクローナル抗体の中和活性を減少させることが明らかになった（Ｆａｌｋｏｗｓｋａら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８１巻：８０７２頁、２００７年、およびＨｅｌｌｅ  ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８１巻：８１０１頁、２００７年；その両方を参照により本書に組み込む）。この残基をアラニンで置換した場合、変異体ＨＣＶｐｐはこれらの抗体による中和に対してより大きな感受性を示した。Ａｓｎ５３２における多糖の位置は、Ｇｌｙ５３０およびＡｓｐ５３５における２つの共有接触残基に対するすべてのドメインＢ  ＨＣＶ抗体の接近を減少させる可能性がある。Ａｓｎ４１７およびＡｓｎ６４５における他の２つの多糖も、ドメインＢ  ＨＣＶ抗体であるＣＢＨ−５の中和活性を減少させることが明らかになった（Ｈｅｌｌｅら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８１巻：８１０１頁、２００７年；参照により本書に組み込む）。追加実験により、これら２つの多糖の近傍にドメインＢ  ＨＣＶ抗体の他の接触点の証拠が得られる可能性がある。
【０２５９】
要約すると、ＨＣＶサブタイプ１ａ、１ｂまたは２ｂ分離株に感染した患者から、異なる研究室由来の３セットの関連した中和モノクローナル抗体を単離した（Ｈａｄｌｏｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７４巻：１０４０７頁、２０００年、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ、１０４巻：１６２６９〜７４頁、２００７年、およびＫｅｃｋら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８１巻：１０４３頁、２００７年；そのすべてを参照により本書に組み込む）。ＣＤ８１に対するＥ２の結合に関与するＨＣＶ  Ｅ２上の領域に対する交差競合実験およびエピトープマッピングにより、これらの抗体は異なるＨＣＶサブタイプおよびサブタイプ分離株の間で様々な保存度の重複しているエピトープであることが証明された。明らかに、ドメインＢは複数の重複するエピトープを含んでいるＨＣＶ  Ｅ２上の免疫優性領域である。Ａｓｎ５３２におけるＨＣＶｐｐアラニン置換変異体が、サブタイプ１ａ、１ｂ、２ｂ、３、４および５に感染した患者から入手した血清パネルにより中和されることに強い感受性を有するという事実が、これらの血清がこの領域に対する抗体を含んでいることを示しており、このことがさらにドメインＢ中のエピトープが免疫反応の選択的な標的であることを確信させている（Ｆａｌｋｏｗｓｋａら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８１巻：８０７２頁、２００７年；参照により本書に組み込む）。大半のドメインＢ  ＨＣＶ抗体は保存されているエピトープに対してであるが、ＣＢＨ−８ＣおよびＣＢＨ−１１などいくつかがサブタイプ１ａ分離株に対して結合しないことから、いくつかのドメインＢエピトープに対する抗体反応が逃避ウィルス変異体の原因となっている可能性があることが示唆される。有効なワクチン療法は、逃避変異体に関与するエピトープを除去すると共に、ＨＣＶ抗体に代表されるそれらのエピトープに対する抗体反応を誘発させることを含む場合がある。これは点変異よって、または最近、高頻度可変領域に対して示されたように、Ｅ２糖タンパク質の天然の構造を変えることのない欠失により達成され得る（ＭｃＣａｆｆｒｅｙら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、８１巻：９５８４頁、２００７年；参照により本書に組み込む）。最後に、ＨＣＶ抗体の生化学的および機能的な特徴付け、ドメインＢ  ＨＣＶ抗体の初期の群およびその記載された組換えヒト抗体は、類似の生物物理学的および機能的特性を有する領域内で関連したエピトープに対する抗体について提案されたモデルと整合している。
【０２６０】
（実施例３）
抗体生産
以下の実施形態は、ＨＣＶモノクローナル抗体を生産するために利用できる方法を提供する。
【０２６１】
プラスミドベクターに由来する抗体の発現および精製
完全長の抗体分子をコードしている遺伝子を、その親ハイブリドーマからＲＴ−ＰＣＴによって、増幅し、真核生物細胞系中で構成的または誘導可能な方法で抗体の発現を駆動する能力を有する異種発現カセットにクローニングすることができる。例えば、抗体遺伝子は、ｐｃＤＮＡ３．１  Ｚｅｏ、ｐＩＮＤ（ＳＰ１）、ｐＲＥＰ８（すべてインビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州、製）などの発現プラスミドおよび／または他の発現ベクター中で発現させることができる。あるいはまたはさらに、抗体遺伝子は、例えばＭＬＶに基づくベクター、牛痘ウィルスに基づくベクターおよび／またはアデノウィルスに基づくベクターなどのウィルスまたはレトロウィルスベクターを介して発現させることができる。同様に、抗体遺伝子は、バキュロウィルスベクターなどの昆虫ウィルスベクター中で発現させることができる。他のベクター、例えばｐＣＯＭＢ系列ベクターは抗体の重鎖および軽鎖の一対、あるいはＭ１３ファージの表面上または細菌で単鎖抗体の発現を可能にする。
【０２６２】
一旦発現させたら、例えばプロテインＡまたはプロテインＧセファロースを使用して抗体を精製することができ、精製した抗体を次のいずれかの方法で化学的にまたは酵素的に修飾できる：ビオチン化（例えば、ビオチン−Ｃ１１−ヒドロキシスクシンイミドエステル、など）、様々な形態のビーズとの結合（例えば、セファロース、アガロース、磁性、ポリスチレン、臭化シアンを用いて、など）、および／または有用な化学的部分の抗体の架橋（例えば、リシン残基の修飾によって、塩基性残基の修飾によって、および／または遊離スルフヒドリル基に特異的な試薬を用いて、など）。
【０２６３】
等価物および範囲
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の多くの等価物を  わずかな通常の実験を用いて、認識しまたは確認できる。本発明の範囲は、前記説明に制限されるものではなく、むしろ添付の請求項に記載した通りである。
【０２６４】
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の多くの等価物を  わずかな通常の実験を用いて、認識しまたは確認できる。本発明の範囲は、前記説明に制限されるものではなく、むしろ添付の請求項に記載した通りである。
【０２６５】
本請求項において、「ａ、」「ａｎ、」および「ｔｈｅ」などの冠詞は、それとは反対に記載されている、さもなければ前後関係から明白でない限り１または１より多くを意味することと、する。したがって、例えば、「ある抗体」の参照は、これら抗体の複数を含み、「その細胞」の参照は、当業者に公知の１つ以上の細胞の参照、などを含んでいる。１つ、１つより多く、またはその群の要素のすべてが、所与の産物または方法に含まれるか、使用されるか、さもなければ関連する場合、それとは反対に記載されているかさもなければ前後関係から明白でない限り、ある群の１つ以上の要素の間で「ｏｒ」を含む請求項または説明を、満足であるとみなす。本発明は、その群の正確に１つの要素が所与の産物または方法に含まれるか、使用されるか、さもなければ関連する実施形態を含んでいる。本発明は、１つより多くのまたはその群のすべての要素が所与の産物または方法に含まれるか、使用されるか、さもなければ関連する実施形態を含んでいる。さらにまた、本発明が  １つ以上の列挙した請求項に由来する１つ以上の制限、要素、条項、記述用語、などが別の請求項に組み込まれるすべての変化、組合せ、および置換を包含することは理解されよう。例えば、別の請求項に従属する任意の請求項は、同じ基礎請求項に従属する他の任意の請求項において、見られる１つ以上の制限を含むために修飾されることができる。さらにまた、請求項が組成物を列挙する場合、別段の指示がない限りまたは、矛盾または不一致が起こることが当業者に明白にならない限り、本明細書に開示されるためのいずれかについてその組成物を使用する方法が含まれること、および本明細書に開示される製造法のいずれか、または当該技術分野において、公知の他の方法によって、その組成物を製造する方法が含まれていることは理解されよう。
【０２６６】
要素を列挙して、例えば、マーカッシュ群形式（Ｍａｒｋｕｓｈ  ｇｒｏｕｐ  ｆｏｒｍａｔ）で示す場合、その要素の各サブグループも開示され、任意の要素がその群から除去される得ることは理解されよう。それが、一般に、本発明または本発明の態様が、特定要素、特徴、などを含むと称される場合、本発明の特定の実施形態または本発明の態様が、これらの要素、特徴、などから構成される、または、本質的には構成されることは理解されなければならない。簡素化するために、それらの実施形態は、本明細書において、この通りの言葉で具体的に記載されなかった。用語「を含む」は制限がなく、追加の要素またはステップを含めることができることに注意されたい。
【０２６７】
範囲が与えられる場合、端点は含まれる。さらに、別段の指示がない限り、さもなければ文脈および当業者の理解から明白でない限り、範囲として表される値は、本発明の別の実施形態において、定めた範囲内の任意の具体的な値または部分的な範囲を、文脈が明確に別の点を指示しない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１まで仮定し得ることは理解されよう。
【０２６８】
加えて、先行技術範囲に含まれる本発明の任意の具体な実施形態が、任意の１つ以上請求項から明示的に除外され得ることは理解されよう。これらの実施形態は当業者に公知であるとみなされるので、その除外が本明細書において、明示的に記載されていない場合であっても、それらは除外され得る。本発明の組成物の任意の具体的な実施形態（例えば、任意のＨＣＶ遺伝子型／サブタイプ、任意のＨＣＶ抗体、任意のエピトープ、任意の医薬組成物、任意の投与方法、任意の医療適用、など）は、先行技術の存在に関連するかどうかにかかわらず、何らかの理由で、１つ以上の任意の請求項から除外され得る。
【０２６９】
上記および本文全体で述べた刊行物は、本出願の出願日より前に、単にそれらの開示のためにだけに提供されている。本明細書のいずれも、発明者が、事前開示によるこれらの開示に先だつ権利を付与されないことを承認するものと解釈してはならない。
【０２７０】
他の実施形態
上記が単にある種の本発明の好ましい実施形態だけを表しているということが、当業者には容易に理解されよう。下記の請求項にて説明したように、本発明のその精神または範囲から逸脱することなく、上記の手順および組成物に対する様々な変更および修正を加えることができる。
【図１】
2012504602.tif 000011
【図２】
2012504602.tif 000012
【図３】
2012504602.tif 000013
【図４】
2012504602.tif 000014
【図６】
2012504602.tif 000015
【図９】
2012504602.tif 000016
【図１１】
2012504602.tif 000017
【図５】
2012504602.tif 000018
【図７】
2012504602.tif 000019
【図８】
2012504602.tif 000020
【図１０】
2012504602.tif 000021
【配列表】
2012504602000001.app
【国際調査報告】
2012504602.tif 000022
2012504602.tif 000023