(57)【要約】本発明は、誤って折り畳まれたプリオンタンパク質（ＰｒＰ、例えば、ＰｒＰＳｃ）に特異的な抗体および免疫原性ペプチドならびにその使用に関する。免疫原性ペプチドは、アミノ酸配列チロシン−メチオニン−ロイシン（ＹＭＬ）を含む。この抗体またはペプチドは、癌を始めとした、誤って折り畳まれたＰｒＰに関連する疾患または障害を処置または予防するために用いることができる。詳細には、ヒトＰｒＰの残基１２６〜１３２に対応する、配列ＧＧＹＭＬＧＳ（すなわち、配列番号８）からなるペプチドを用いて、「１Ａ１」と命名されたＩｇＭモノクローナル抗体を作出した。１Ａ１は、誤って折り畳まれたＰｒＰを認識するが正常なＰｒＰを認識しない。
2012519190.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誤って折り畳まれたＰｒＰのＹＭＬエピトープに結合する抗体またはその断片。
【請求項２】
ＰｒＰＳｃに選択的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＰｒＰＣに特異的に結合しない、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
前記エピトープが、ＧＧＹＭＬＧＳ、ＧＧＹＭＬＧ、ＧＹＭＬＧＳ、ＧＧＹＭＬ、ＹＭＬＧＳ、ＧＹＭＬおよびＹＭＬＧ（配列番号８〜１４）からなる群のうちの１つまたはそれより多くから選択される配列に存在する、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
モノクローナル抗体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
ポリクローナル抗体である、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＡである、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
受託番号２６０２１０−０１の下でＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａに寄託されているハイブリドーマを培養することによって産生される、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体、ならびにそれとコンジュゲートしている、検出可能な標識および細胞毒のうちの１つまたはそれより多くから選択される作用物質を含むイムノコンジュゲート。
【請求項１０】
誤って折り畳まれたＰｒＰに選択的に結合する抗体に対する免疫原性ペプチドであって、ＹＭＬ配列を含む、免疫原性ペプチド。
【請求項１１】
配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４の配列からなる群のうちの１つまたはそれより多くから選択される、請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
前記ペプチドの免疫原性を増強するための免疫原性担体をさらに含む、請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１３】
請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体を含む組成物。
【請求項１４】
請求項９に記載のイムノコンジュゲートを含む組成物。
【請求項１５】
請求項１０から１２のいずれか一項に記載のペプチドを含む組成物。
【請求項１６】
医薬組成物である、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
医薬用担体をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
誤って折り畳まれたＰｒＰに関連する疾患または障害の処置のための、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体、請求項９に記載のイムノコンジュゲート、請求項１０から１２のいずれか一項に記載のペプチド、または請求項１３から１７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１９】
誤って折り畳まれたＰｒＰに関連する疾患または障害の処置のための、請求項１０から１２のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項９に記載のイムノコンジュゲートを含むワクチンの使用。
【請求項２０】
ＰｒＰＳｃに関連する疾患または障害の処置のための、請求項１８または請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記疾患または障害が、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ）、家族性クロイツフェルトヤコブ病、散発性クロイツフェルトヤコブ病、医原性クロイツフェルトヤコブ病、変異型クロイツフェルトヤコブ病、致死性家族性不眠症、スクレイピー、クールー、海綿状脳症、伝達性ミンク脳症、慢性消耗病、ネコ海綿状脳症および外来性有蹄類脳症から選択される、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
誤って折り畳まれたＰｒＰを発現する腫瘍形成性細胞を含む腫瘍の処置のための、請求項１８または請求項１９に記載の使用。
【請求項２３】
前記腫瘍がＹＭＬ＋表現型を有する、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
誤って折り畳まれたＰｒＰに関連する疾患または障害を処置または予防する方法であって、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体、請求項９に記載のイムノコンジュゲート、請求項１０から１２のいずれか一項に記載のペプチド、または請求項１３から１７のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法。
【請求項２５】
誤って折り畳まれたＰｒＰに関連する疾患または障害を有するかまたはその危険性がある被験体を免疫する方法であって、請求項１０から１２のいずれか一項に記載のペプチドを含むワクチンの治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法。
【請求項２６】
前記疾患または障害がＰｒＰＳｃに関連する、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記疾患または障害が、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ）、家族性クロイツフェルトヤコブ病、散発性クロイツフェルトヤコブ病、医原性クロイツフェルトヤコブ病、変異型クロイツフェルトヤコブ病、致死性家族性不眠症、スクレイピー、クールー、海綿状脳症、伝達性ミンク脳症、慢性消耗病、ネコ海綿状脳症および外来性有蹄類脳症から選択される、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
誤って折り畳まれたＰｒＰを発現する腫瘍形成性細胞を含む腫瘍の処置のための、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記腫瘍がＹＭＬ＋表現型を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
誤って折り畳まれたＰｒＰのＹＭＬエピトープに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。
【請求項３１】
前記誤って折り畳まれたＰｒＰがＰｒＰＳｃである、請求項３０に記載のハイブリドーマ細胞系。
【請求項３２】
受託番号２６０２１０−０１の下でＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａに寄託されているハイブリドーマ、ならびにその後代および派生物である、請求項３０に記載のハイブリドーマ細胞系。
【請求項３３】
前記ＹＭＬエピトープが配列ＧＧＹＭＬＧＳ（配列番号８）に存在する、請求項３０に記載のハイブリドーマ細胞系。
【請求項３４】
生体試料中の誤って折り畳まれたＰｒＰを検出する方法であって、
（ａ）生体試料を、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体または請求項９に記載のイムノコンジュゲートと、該抗体または該イムノコンジュゲートと該誤って折り畳まれたＰｒＰとの複合体の形成を可能にする条件下で接触させること、および
（ｂ）該複合体を、誤って折り畳まれたＰｒＰが該生体試料に存在することの指標として検出すること、を含む方法。
【請求項３５】
前記複合体がイムノブロッティングによって検出される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記誤って折り畳まれたＰｒＰがＰｒＰＳｃである、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
誤って折り畳まれたＰｒＰのＹＭＬエピトープに結合する抗体を産生する方法であって、
（ａ）請求項３０から３３のいずれか一項に記載のハイブリドーマ細胞系を、培養上清に該抗体を放出する条件下で培養すること、および
（ｂ）該上清から該抗体を単離すること、を含む方法。
【請求項３８】
前記培養されるハイブリドーマが受託番号２６０２１０−０１を有するハイブリドーマである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
誤って折り畳まれたＰｒＰのＹＭＬエピトープに結合する抗体を産生する方法であって、
（ａ）請求項１０から１２のいずれか一項に記載のペプチドで被験体を免疫すること、および
（ｂ）該被験体の組織から、または該組織から調製されるハイブリドーマから、該抗体を単離すること、を含む方法。
【請求項４０】
生体試料中の誤って折り畳まれたＰｒＰの存在を検出するためのキットであって、
（ａ）誤って折り畳まれたＰｒＰのＹＭＬエピトープに特異的に結合する１つまたはそれより多くの抗体または抗血清、および
（ｂ）その使用のための説明書、を含むキット。
【請求項４１】
１つまたはそれより多くの検出試薬をさらに含む、請求項４０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、誤って折り畳まれたプリオンタンパク質に特異的な抗体およびエピトープに関する。より具体的には、本発明は、誤って折り畳まれたプリオンタンパク質のＹＭＬエピトープに特異的な抗体およびエピトープを提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
プリオン疾患（例えば、クロイツフェルトヤコブ病、牛海綿状脳症、ヒツジスクレイピーならびにシカおよびエルク（ｅｌｋ）の慢性消耗病）は、正常な細胞プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）から異常なプロテアーゼ耐性アイソフォーム（ＰｒＰＳｃ）への鋳型誘導変換（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）を一般に特徴とする。一部のプリオン疾患は遺伝することがあり、ＰＮＲＰ遺伝子の突然変異を含むことがあるが、他は散発性または感染性である。遺伝性の形の様々な突然変異が同定されており、突然変異は、ＰｒＰＣを、異常で疾患関連のＰｒＰＳｃの形への変化をより受けやすくすることがある。
【０００３】
ＰＮＲＰ遺伝子の翻訳産物は、一般にヒトでは２５３アミノ酸、ハムスターおよびマウスでは２５４、またはヒツジでは２５６アミノ酸からなり、いくつかの翻訳後修飾を経ることがある（例えば、非特許文献１）。例えば、ハムスターでは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーの添加により、２２アミノ酸のシグナルペプチドがＮ末端で切断され、２３アミノ酸がＣ末端から除去され、アスパラギン連結オリゴ糖が、ジスルフィド結合によって形成されるループの残基１８１および１９７に結合する（例えば、非特許文献２；非特許文献３）。プリオン関連の脳症では、ＰｒＰＣ（正常な細胞性アイソフォーム）は、例えば以下の特性の１つまたはそれより多くに基づいてＰｒＰＣから実験的に区別することができる、ＰｒＰＳｃと命名される変化した形に変換される：（１）ＰｒＰＳｃは生理的溶媒に不溶であり、凝集体を形成する；（２）ＰｒＰＣが完全に分解され、ＰｒＰ２７〜３０として公知のＮ末端が切断された形になる条件下で、プロテイナーゼＫ消化によってＮ末端の約６７アミノ酸だけが除去される点で、ＰｒＰＳｃは、プロテイナーゼＫによるタンパク分解性分解に部分的に耐性である；（３）ＰｒＰＳｃは、ＰｒＰＣのαらせんから、βシート二次構造に富む変化した形への、タンパク質立体構造の変化を有する（例えば、非特許文献４）。
【０００４】
構造がＰｒＰＣからＰｒＰＳｃアイソフォームへの変換に役割を果たすことは周知であるが、可溶化に関する困難およびＰｒＰＳｃ凝集体の不規則構造に一部起因して、ＰｒＰＳｃアイソフォームの構造の詳細を得るのには時間がかかっている。ヒトＰｒＰＣでは、構造エレメントには、β鎖１（残基１２８〜１３１）、αらせん１（残基１４４〜１５４）、β鎖２（残基１６１〜１６４）、αらせん２（残基１７３〜１９４）およびαらせん３（残基２００〜２２８）が含まれる（非特許文献５；非特許文献６）。非特許文献７は、いくつかの構造エレメントの相互作用および再配列を通したプリオンタンパク質のオリゴマー化の可能な機構を記載することによって、この知識体系を拡張した。
【０００５】
ＰｒＰＣアイソフォームとＰｒＰＳｃアイソフォームとは同じアミノ酸配列を共有するので、健康な個体で免疫応答を刺激すること、または両方のアイソフォームと相互作用する治療薬を提供することは、よくても無効果であり、場合によっては被験体に有害となり得る。プリオンタンパク質の正常な細胞性アイソフォーム（ＰｒＰＣ）は、免疫原性が不十分であると報告されている。さらに、ＰｒＰＣに対して優先的に反応性である抗体はｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでプリオン伝播を妨害することができるが、この事実上遍在する細胞表面タンパク質の免疫認識が有害になるかもしれないことが報告されている。
【０００６】
疾患におけるプリオンタンパク質の変換は、特定の分子表面エピトープの喪失、および他のものの獲得に関連する。非特許文献８は、トリペプチドモチーフＹＹＲを記載している。特許文献１は、哺乳動物プリオンタンパク質のＹＹＲエピトープに対する抗体を記載し、ＹＹＸエピトープについて述べている。特許文献２は、ウシＰｒＰの断片に対する抗体を記載している。特許文献３は、ファージディスプレイ方法によって産生される、天然のＰｒＰＳｃタンパク質に特異的な抗体を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第７０４１８０７号明細書
【特許文献２】米国特許第６７６５０８８号明細書
【特許文献３】米国特許第５８４６５３３号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｕｃｋｅｔ，  Ｃ．ら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．４９巻：３２０〜３２９頁（１９９１年）
【非特許文献２】Ｓｔａｈｌ，  Ｎ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９巻：５４０５〜５４１２頁（１９９０年）
【非特許文献３】Ｓａｆａｒ，  Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８７巻：６３７７頁（１９９０年）
【非特許文献４】Ｃｏｈｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４巻：５３０〜５３１頁（１９９４年）
【非特許文献５】Ｒｉｅｋら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ  ３８２巻：１８０頁
【非特許文献６】Ｚａｈｎ、２０００年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ９７巻：１４５〜１５０頁
【非特許文献７】Ｋｎａｕｓら、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８巻：７７０〜７７４頁
【非特許文献８】Ｐａｒａｍｉｔｈｉｏｔｉｓら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ２００３年、９巻：８９３〜８９９頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は、一部、誤って折り畳まれたプリオンタンパク質に特異的な抗体およびエピトープ、例えば、誤って折り畳まれたプリオンタンパク質のＹＭＬエピトープに特異的な抗体およびエピトープを提供する。
【００１０】
一態様では、本発明は、誤って折り畳まれたＰｒＰのＹＭＬエピトープに結合する抗体またはその断片を提供する。
【００１１】
代替実施形態では、抗体はＰｒＰＳｃに選択的に結合する。
【００１２】
代替実施形態では、抗体はＰｒＰＣに特異的に結合しない。
【００１３】
代替実施形態では、エピトープは、ＧＧＹＭＬＧＳ、ＧＧＹＭＬＧ、ＧＹＭＬＧＳ、ＧＧＹＭＬ、ＹＭＬＧＳ、ＧＹＭＬおよびＹＭＬＧ（配列番号８〜１４）からなる群のうちの１つまたはそれより多くから選択される配列に存在する。
【００１４】
代替実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。
【００１５】
代替実施形態では、抗体はポリクローナル抗体である。
【００１６】
代替実施形態では、抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＡである。
【００１７】
代替実施形態では、抗体は、受託番号２６０２１０−０１の下でＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａに寄託されているハイブリドーマを培養することによって産生することができる。
【００１８】
別の態様では、本発明は、誤って折り畳まれたＰｒＰのＹＭＬエピトープに結合する抗体またはその断片、ならびにそれとコンジュゲートしている、検出可能な標識および細胞毒のうちの１つまたはそれより多くから選択される作用物質（ａｇｅｎｔ）を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、誤って折り畳まれたＰｒＰに選択的に結合する抗体に対する、免疫原性ペプチドであって、ＹＭＬ配列を含む免疫原性ペプチドを提供する。
【００２０】
代替実施形態では、ペプチドは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４の配列からなる群のうちの１つまたはそれより多くから選択される誤って折り畳まれたＰｒＰに選択的に結合する抗体を生成するのに役立つことができる。
【００２１】
代替実施形態では、ペプチドは完全長ＰｒＰタンパク質でない。
【００２２】
代替実施形態では、ペプチドは、前記ペプチドの免疫原性を増強するための免疫原性担体をさらに含むことができる。
【００２３】
別の態様では、本発明は、誤って折り畳まれたＰｒＰのＹＭＬエピトープに結合する抗体またはその断片を含む組成物を提供する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、誤って折り畳まれたＰｒＰのＹＭＬエピトープに結合する抗体またはその断片、ならびにそれとコンジュゲートしている、検出可能な標識および細胞毒のうちの１つまたはそれより多くから選択される作用物質を含むイムノコンジュゲートを含む組成物を提供する。
【００２５】
別の態様では、本発明は、誤って折り畳まれたＰｒＰに選択的に結合する抗体に対するペプチドであってＹＭＬ配列を含むペプチドを含む組成物を提供する。代替実施形態では、このペプチドは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４の配列からなる群のうちの１つまたはそれより多くから選択することができる。
【００２６】
代替実施形態では、このペプチドは、前記ペプチドの免疫原性を増強するための免疫原性担体をさらに含むことができる。
【００２７】
代替実施形態では、組成物は医薬組成物であってよい。
【００２８】
代替実施形態では、組成物は医薬用担体をさらに含むことができる。
【００２９】
別の態様では、本発明は、誤って折り畳まれたＰｒＰに関連する疾患または障害の処置のための、抗体もしくはその断片、イムノコンジュゲート、ペプチドまたは組成物の使用を提供する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、誤って折り畳まれたＰｒＰに関連する疾患または障害の処置のための、ペプチドまたはイムノコンジュゲートを含むワクチンの使用を提供する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、ＰｒＰＳｃに関連する疾患または障害の処置のための、抗体もしくはその断片、イムノコンジュゲート、ペプチドまたは組成物の使用を提供する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、ＰｒＰＳｃに関連する疾患または障害の処置のための、ペプチドまたはイムノコンジュゲートを含むワクチンの使用を提供する。
【００３３】
代替実施形態では、疾患または障害は、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ）、家族性クロイツフェルトヤコブ病、散発性クロイツフェルトヤコブ病、医原性クロイツフェルトヤコブ病、変異型クロイツフェルトヤコブ病、致死性家族性不眠症、スクレイピー、クールー、海綿状脳症、伝達性ミンク脳症、慢性消耗病、ネコ海綿状脳症および外来性有蹄類脳症から選択することができる。
【００３４】
別の態様では、本発明は、誤って折り畳まれたＰｒＰを発現する腫瘍形成性細胞を含む腫瘍の処置のための、抗体もしくはその断片、イムノコンジュゲート、ペプチドまたは組成物の使用を提供する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、誤って折り畳まれたＰｒＰを発現する腫瘍形成性細胞を含む腫瘍の処置のための、ペプチドまたはイムノコンジュゲートを含むワクチンの使用を提供する。
【００３６】
代替実施形態では、腫瘍はＹＭＬ＋表現型を有することがある。
【００３７】
別の態様では、本発明は、誤って折り畳まれたＰｒＰに関連する疾患または障害を処置または予防する方法であって、抗体もしくはその断片、イムノコンジュゲート、ペプチドまたは組成物の治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法を提供する。
【００３８】
別の態様では、本発明は、誤って折り畳まれたＰｒＰに関連する疾患または障害を有するかまたはその危険性がある被験体を免疫する方法であって、ペプチドを含むワクチンの治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法を提供する。
【００３９】
代替実施形態では、疾患または障害は、ＰｒＰＳｃに関連する。
【００４０】
代替実施形態では、疾患または障害は、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ）、家族性クロイツフェルトヤコブ病、散発性クロイツフェルトヤコブ病、医原性クロイツフェルトヤコブ病、変異型クロイツフェルトヤコブ病、致死性家族性不眠症、スクレイピー、クールー、海綿状脳症、伝染ミンク脳症、慢性消耗病、ネコ海綿状脳症および外来性有蹄類脳症から選択される。
【００４１】
別の態様では、本発明は、誤って折り畳まれたＰｒＰを発現する腫瘍形成性細胞を含む腫瘍の治療のための方法であって、抗体もしくはその断片、イムノコンジュゲート、ペプチドまたは組成物の治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法を提供する。
【００４２】
代替実施形態では、腫瘍はＹＭＬ＋表現型を有することがある。
【００４３】
別の態様では、本発明は、誤って折り畳まれたＰｒＰのＹＭＬエピトープに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を提供する。
【００４４】
代替実施形態では、誤って折り畳まれたＰｒＰはＰｒＰＳｃである。
【００４５】
代替実施形態では、ハイブリドーマ細胞系は、受託番号２６０２１０−０１の下でＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａに寄託されているハイブリドーマ、ならびにその後代および派生物である。
【００４６】
代替実施形態では、ＹＭＬエピトープは、配列ＧＧＹＭＬＧＳ、ＧＧＹＭＬＧ、ＧＹＭＬＧＳ、ＧＧＹＭＬ、ＹＭＬＧＳ、ＧＹＭＬおよびＹＭＬＧ（配列番号８〜１４）に存在する。
【００４７】
別の態様では、本発明は、生体試料中の誤って折り畳まれたＰｒＰを検出する方法であって、（ａ）生体試料を、抗体もしくはその断片、またはイムノコンジュゲートと、前記抗体または前記イムノコンジュゲートと前記誤って折り畳まれたＰｒＰとの複合体の形成を可能にする条件下で接触させること、および（ｂ）前記複合体を、誤って折り畳まれたＰｒＰが前記生体試料に存在する指標として検出すること、を含む方法を提供する。
【００４８】
代替実施形態では、複合体はイムノブロッティングによって検出される。
【００４９】
代替実施形態では、誤って折り畳まれたＰｒＰはＰｒＰＳｃである。
【００５０】
別の態様では、本発明は、誤って折り畳まれたＰｒＰのＹＭＬエピトープに結合する抗体を産生する方法であって、（ａ）誤って折り畳まれたＰｒＰのＹＭＬエピトープに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を、培養上清に前記抗体を放出する条件下で培養すること、および（ｂ）前記上清から前記抗体を単離すること、を含む方法を提供する。
【００５１】
代替実施形態では、培養されるハイブリドーマは、受託番号２６０２１０−０１を有するハイブリドーマである。
【００５２】
別の態様では、本発明は、誤って折り畳まれたＰｒＰのＹＭＬエピトープに結合する抗体を産生する方法であって、（ａ）ペプチドで被験体を免疫すること、および（ｂ）前記被験体の組織から、または前記組織から調製されるハイブリドーマから前記抗体を単離すること、を含む方法を提供する。
【００５３】
別の態様では、本発明は、生体試料中の誤って折り畳まれたＰｒＰの存在を検出するためのキットであって、（ａ）誤って折り畳まれたＰｒＰのＹＭＬエピトープに特異的に結合する１つまたはそれより多くの抗体または抗血清、および（ｂ）その使用のための説明書、を含むキットを提供する。
【００５４】
代替実施形態では、キットは１つまたはそれより多くの検出試薬をさらに含むことができる。
【００５５】
本発明のこの概要は、必ずしも本発明のすべての特徴を記載するわけではない。本発明の他の態様、特徴および利点は、本発明の具体的な実施形態の以下の記載の精査により、当業者に明らかになる。
【００５６】
本発明のこれらの特徴および他の特徴は、添付の図を参照する以下の記載からより明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、磁気ビーズ結合ＰｒＰ特異的モノクローナル抗体および対照（プリオンタンパク質の両方のアイソフォームを認識する抗体およびプリオンタンパク質のいずれのアイソフォームも認識しない他の抗体を含む）を用いるマウスおよびハムスターの脳ホモジネートの免疫沈降、続く、ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃの両方を認識するモノクローナル抗体（ビオチンに結合している６Ｄ１１）を用いる検出を示す。ハムスターＷＴ：正常なハムスター脳のホモジネート、ＲＭＬ：ＲＭＬマウス順応プリオンに感染させたマウスからの脳ホモジネート、Ｔｇ２０：ＰｒＰＣを過剰発現するマウス株からの脳ホモジネート、Ｋ／Ｏ：ＰｒＰＣ−／−マウス株からの脳ホモジネート、ＷＴ：野生型（未感染、正常）マウスからの脳ホモジネート、２６３Ｋ：２６３Ｋハムスター順応プリオンに感染させたハムスターからの脳ホモジネート、対照：ＰｒＰＳｃタンパク質。８Ｂ４ビーズ：８Ｂ４抗体結合ビーズ（ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃの両方を認識する）で免疫沈降させた脳ホモジネート、１Ａ１ビーズ：１Ａ１抗体結合ビーズ（ＰｒＰＳｃタンパク質を認識する）で免疫沈降させた脳ホモジネート、４Ｅ４ビーズ：４Ｅ４抗体結合ビーズ（無関係なタンパク質を認識する）で免疫沈降させた脳ホモジネート、ＩｇＭアイソタイプビーズ：ＩｇＭアイソタイプ陰性対照抗体で免疫沈降させた脳ホモジネート、ビーズだけ：ビーズだけ（無抗体）で免疫沈降させた脳ホモジネート。
【図２】図２は、Ａ）ヒト、Ｂ）ヒツジ、Ｃ）マウス、Ｄ）ハムスター、Ｅ）ウシおよびＦ）エルクプリオンタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１〜６）を示す。
【図３】図３は、図２のヒト、ヒツジ、マウス、ハムスターおよびウシの配列のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメントを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、アイソタイプ対照抗体（濃い陰影）、またはＰｒＰ抗体６Ｄ１１もしくはＹＭＬ特異的抗体１Ａ１（黒線、示す通り）で探索した正常細胞および腫瘍細胞の結果のフローサイトメトリーヒストグラムを提供する。
【図４Ｂ】図４Ｂは、アイソタイプ対照抗体（濃い陰影）、またはＰｒＰ抗体６Ｄ１１もしくはＹＭＬ特異的抗体１Ａ１（黒線、示す通り）で探索した正常細胞および腫瘍細胞の結果のフローサイトメトリーヒストグラムを提供する。
【図５】図５は、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍を抱えるマウスに及ぼす、１Ａ１抗体による処置の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
詳細な説明
以下の記載では、いくつかの用語が広く用いられ、以下の定義は、本発明の様々な態様の理解を容易にするために提供される。用語の例を含む、本明細書での例の使用は、例示目的だけのためであり、本明細書の本発明の実施形態の範囲および意味を限定するものでない。数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。本明細書では、単語「含んでいる」は限定なしの用語として用いられ、句「含むが、これに限定されない」に実質的に同等であり、単語「含む」は対応する意味を有する。
【００５９】
「プリオン」は、単一のタンパク質、「プリオンタンパク質」または「ＰｒＰ」で大部分かつおそらく単独で構成される作用物質を指す。誤って折り畳まれたプリオンタンパク質（誤って折り畳まれたＰｒＰ）は、様々な疾患と関連付けられている。正常な細胞性プリオンタンパク質は一般にＰｒＰＣと呼ばれ、誤って折り畳まれたプロテアーゼ耐性アイソフォームはＰｒＰＳｃと呼ばれる。ＰｒＰは、哺乳動物および鳥類の種を含むいくつかの種で同定されている。例示的な哺乳動物のＰｒＰは、配列番号１〜６に記載されている。
【００６０】
用語「エピトープ」は、タンパク質中のアミノ酸の配列、またはそれへの修飾（例えばグリコシル化）を指す。アミノ酸は、タンパク質の一次配列などのように線状に配列することができ、またはタンパク質が部分的もしくは完全に構成されると、近接したアミノ酸の二次または三次配列であってもよい。エピトープは、抗体、抗体断片、ペプチド、ペプチド模倣物などが特異的に結合することができるか、またはリガンドが特異的に結合することができる。エピトープは様々なサイズを有することができ、例えば、線状エピトープは２アミノ酸のように小さくてもよく、または約３アミノ酸から約２０アミノ酸まで、より大きくてもよい。一部の実施形態では、エピトープは、長さが約５アミノ酸から約１０または約１５アミノ酸までであってよい。アミノ酸の二次または三次配列のエピトープは、わずか２つのアミノ酸を含むことができるか、または約３アミノ酸から約２０アミノ酸まで、より大きくてもよい。一部の実施形態では、二次または三次エピトープは、エピトープの中の一部または他に近接する約５アミノ酸から約１０または約１５アミノ酸までであってよい。
【００６１】
「アイソフォーム」は、同じタンパク質のいくつかの異なる形のいずれかである。変異形態は１つまたはそれより多くの一塩基多型（例えば、単一のアミノ酸変化を生じる）から生じることができるか、または、スプライシング変異体の結果、例えば翻訳されたタンパク質にアミノ酸配列を含むかもしくは排除することであってよい。変異体は、あるアイソフォームの３次元構造の中に「埋め込まれている」１つまたはそれより多くのエピトープが、タンパク質の別のアイソフォームで露出するように、タンパク質の折畳みの違いの結果として生じることもある。これらの折畳み変異体は、配列の差、翻訳後修飾または、特定のアイソフォームの存在などの、他の影響によることがある。プリオンタンパク質は、２つの構造的アイソフォーム、ＰｒＰＣ（「正常な」、「影響を受けていない」、「天然の」または「野生型の」アイソフォーム）およびＰｒＰＳｃアイソフォーム（「疾患状態」、「影響を受けている」、「誤って折り畳まれた」または「異常な」アイソフォーム）で提示される同じアミノ酸配列を有するタンパク質の例である。
【００６２】
プリオンタンパク質の誤った折畳み特異的エピトープの露出は、プリオンタンパク質のＰｒＰＣと、誤って折り畳まれたアイソフォーム、例えばＰｒＰＳｃアイソフォームとの識別を可能にする、１つまたはそれより多くのプリオン特異的エピトープを提供する。これらのエピトープは、診断標的として、例えば、プリオン関連の疾患または障害を有する、またはそれが疑われる被験体からの生体試料で実施される、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーに基づく診断方法で用いるために用いることができる。これらのエピトープは、治療標的または予防標的として用いることもできる。例えば、プリオン関連疾患または障害で見出されるプリオンの誤った折畳みの伝播を予防するために、１つまたはそれより多くのエピトープを、それが投与される被験体で免疫を誘導するための医薬組成物で用いることができる。別の例として、１つまたはそれより多くのエピトープに、抗体などの免疫分子が特異的に結合することができ、そこで免疫分子は、誤って折り畳まれたプリオンタンパク質を含む細胞または組織に治療薬を運ぶように修飾されている。
【００６３】
Ｐｒｕｉｓｎｅｒ  １９９３年（Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ  Ｓｔａｎｄ．８０巻：３１〜４４頁）は、動物およびヒトのいくつかのプリオンによる疾患および障害（あるいは、伝達性海綿状脳症と呼ばれる；ＴＳＥ）のレビューを提供している。プリオンタンパク質の誤った折畳みに関連する（「プリオン関連の」、または「プリオンの誤った折畳みに関連する」）ヒトまたは動物で見出される疾患または障害には、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ）、家族性クロイツフェルトヤコブ病、散発性クロイツフェルトヤコブ病、医原性クロイツフェルトヤコブ病、変異型クロイツフェルトヤコブ病、致死性家族性不眠症、スクレイピー（例えば、ヒツジまたはヤギのスクレイピー）、クールー、牛海綿状脳症（狂牛病）、伝達性ミンク脳症、慢性消耗病（例えばシカ、エルクおよびムースの慢性消耗病）、ネコ海綿状脳症、外来性有蹄類脳症（例えばニアラ、オオカモシカ、大クーズーの）、ダチョウの海綿状脳症が含まれるが、これらに限定されない。プリオンタンパク質の誤った折畳みに関連する疾患または障害には、癌、特にＹＭＬエピトープなどの誤って折り畳まれたＰｒＰに特異に関連する表面エピトープを最終的に提示することができる、ＰｒＰ＋表現型を有する細胞型に関連する癌がさらに含まれる。
【００６４】
２つのβ鎖が、ＰｒＰの球状ドメインに存在する。β１鎖（ヒト配列番号付けを用いて残基１２８〜１３１）は、ＹＭＬ（配列番号７）配列を含む。天然のＰｒＰＣアイソフォーム（天然構造のＰｒＰＣ）では、β鎖１は、ＰｒＰＣアイソフォームの３次元構造内に埋め込まれ、免疫細胞、抗体または他の分子との相互作用のために溶媒アクセス可能でない。任意の特定の仮説に束縛されることなく、誤って折り畳まれた形態をもたらす立体構造シフトの誘導により（例えば、低ｐＨ処理、ＰｒＰＳｃアイソフォームへの曝露、またはＰｒＰＣをＰｒＰＳｃ再配列に誘導する他の公知の方法による）、β鎖１を溶媒に曝露させることができ、免疫細胞、抗体または他の分子との相互作用に利用することが可能になる。
【００６５】
ＹＭＬ配列および哺乳動物のＰｒＰアミノ酸配列のβ鎖１を含むアミノ酸の一部または全部を含むアミノ酸配列、ならびに一部の実施形態では、β鎖１に隣接するさらなるアミノ酸をさらに含むアミノ酸配列の例として、それらに限定されないが、ＧＧＹＭＬＧＳ（配列番号８）、ＧＧＹＭＬＧ（配列番号９）、ＧＹＭＬＧＳ（配列番号１０）、ＧＧＹＭＬ（配列番号１１）、ＹＭＬＧＳ（配列番号１２）、ＧＹＭＬ（配列番号１３）、ＹＭＬＧ（配列番号１４）およびＹＭＬ（配列番号７）が挙げられる。
【００６６】
したがって、本発明は、配列番号７〜１４のアミノ酸配列の１つまたはそれより多くを含むペプチドを提供する。より一般的には、本明細書で有用なペプチドは、ＹＭＬに選択的に結合する抗体を生成するのに有用なエピトープとしてＹＭＬ配列を含み、提示するものである。そのようなペプチドには、完全長ＰｒＰタンパク質であるが、ＹＭＬエピトープが抗体産生宿主に提示されるように必然的に誤って折り畳まれている形のＰｒＰタンパク質が含まれてもよい。実際には、ＹＭＬを含有するペプチドは、通常約５０アミノ酸残基以下、例えば、約４０残基、３０残基、２０残基または１５残基以下からなり、最大残基数の選択は、その産生に関連する費用を最小にしつつ、免疫原性の形でＹＭＬエピトープを提示しようとする要望に基づいて決定される。ペプチドは、ＹＭＬ配列に加えて、抗体を生成することができる免疫原性エピトープとしてＹＭＬを提示するのに十分な、最小数の残基を含む。例えば、ＹＭＬを含有するペプチドは、一般的に少なくとも約５残基、６残基または７残基を必要とする。本明細書で指摘されるように、ペプチドは、抗体産生宿主でのその免疫原性を増強するために有用な任意の作用物質に結合してもよい。
【００６７】
配列番号７〜１４の１つまたはそれより多くを含むペプチドなどの、ＹＭＬエピトープを含む免疫原性ペプチドは、被験体で免疫応答を誘導するのに用いることができ、その免疫応答は、ＰｒＰＳｃアイソフォームなどの誤って折り畳まれたＰｒＰに特異的である。例えば、そのようなペプチドは、ＰｒＰＳｃアイソフォームなどの誤って折り畳まれたＰｒＰに特異的なポリクローナル（抗血清）抗体またはモノクローナル抗体の産生のために、マウスまたは別の動物を免疫するために用いることができる。そのような抗体は、例えば免疫学的アッセイで、生体試料中のＰｒＰＳｃなどの誤って折り畳まれたＰｒＰを検出するために用いることができる。そのようなペプチドは、医薬用製剤で提供されてもよい。
【００６８】
当業者に公知であるペプチド合成技術および方法の一般原理を示す標準の参考図書には、例えば以下のものが含まれる：Ｃｈａｎら、Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ、２００５年；Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｒｅｉｄ，  Ｒ．編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、２０００年；Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ、Ｗｅｓｔｗｏｏｄら編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ、２０００年；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ２００１年およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９９４年。
【００６９】
タンパク質またはポリペプチド、あるいはタンパク質またはポリペプチドの断片もしくは一部は、その配列を同じ系統学的種、属、科または目で見出される他のものから識別することができる場合に、特異的に同定される。そのような識別は、配列の比較によって同定することができる。１つまたはそれより多くの配列の比較は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら１００９年。Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２１５巻：４０３〜４１０頁）を用いて実行することができる。ＢＬＡＳＴ検索は、特定の配列または配列群との、または配列のより大きなライブラリーもしくはデータベース（例えばＧｅｎＢａｎｋまたはＧｅｎＰｅｐｔ）とのクエリー配列の比較を可能にし、１００％同一性を示す配列だけでなく、より低い程度の同一性を有するものも同定する。複数のアイソフォームを有するタンパク質については、１つのアイソフォームに存在して、１つまたはそれより多くの他のアイソフォームに不在であるかもしくは検出されない構造、配列またはモチーフの特異的検出によって、それが同じであるかまたは異なる種からの他のアイソフォームと識別される場合、アイソフォームを特異的に同定することができる。
【００７０】
配列中のアミノ酸の任意の数的呼称が特異的配列と関連することは、当業者によって理解される。また、配列が番号付けられ、配列が選択される方法によって、異なる数的呼称を同じ位置に割り当てることができる。さらに、挿入または欠失などの配列変化は、二次または三次構造の部位またはエレメントでの、およびその周辺での特定のアミノ酸の相対位置、および引き続き数的呼称を変えることができる。例えば、配列番号１〜６によって表される配列は、すべてヒト、マウス、ヒツジ、ウシ、ハムスターまたはエルクからの哺乳動物プリオンタンパク質のアミノ酸配列を表す。しかし、図３に例示されているように、それらの間に多少の配列差、番号付けの差が、またはそれらの間に配列および番号付けの差が存在することがある。プリオンタンパク質のエピトープ、配列および構造エレメントの相対位置が様々な種で同じであることも、当業者に明らかになる。野生型もしくは正常の、または一部のプリオンの誤った折畳みに関連する疾患もしくは障害に関連する突然変異を有するか有しないプリオンタンパク質配列を表す他の配列は、核酸試料またはタンパク質試料を（例えば、本明細書で引用されるものなどの標準の方法を用いて）配列決定することによって、あるいは、１つまたはそれより多くのプリオンアミノ酸または核酸配列（突然変異体または正常、完全、部分またはその断片）を含む配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、本明細書に記載の配列のいずれか、またはこれらのいずれかの断片を用いることによって同定することができる。ＢＬＡＳＴは、他の種でプリオンタンパク質配列を、またはプリオンタンパク質様配列を同定するために用いることもできる。
【００７１】
本発明のペプチド化合物を記載するために用いられる命名法は、アミノ基が各アミノ酸残基の左に示され、カルボキシ基が右に示される従来の慣行に従う。本発明の選択される具体的な実施形態を表す配列では、具体的に示されないが、アミノ末端基およびカルボキシ末端基は、特に明記しない限り、それらが生理的ｐＨ値においてとるであろう形であると理解される。各アミノ酸残基は、以下の表１に従って、アミノ酸の慣用名に対応する、１文字または３文字命名によって一般に表すことができる。
【００７２】
【表１】
2012519190.tif 000003
当業者に公知である免疫学の一般原理を示している標準の参考図書には、例えば以下のものが含まれる：ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．  Ｙ．（１９９９年）；ＨＡＲＬＯＷおよびＬＡＮＥ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＣＯＬＩＧＡＮら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９２〜２００６年）およびＲｏｉｔｔら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９９３年）。
【００７３】
当業者に公知である組換えＤＮＡ技術の一般原理を示す標準の参考図書には、例えば以下のものが含まれる：Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８年および２００１年への補遺）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９年）；Ｋａｕｆｍａｎら編、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（１９９５年）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１年）。
【００７４】
本明細書で用いるように、「抗体」には、任意の天然供給源に由来するポリクローナル抗体、ならびにクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの天然または組換えモノクローナル抗体、ハイブリッド派生物、ヒト化またはキメラ抗体、ならびにＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、およびＦａｂまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含む抗体断片が含まれる。抗体は天然に存在するもの、例えば、動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒトなど）から単離および／または精製されたものでよい。抗体は、単量体または重合体の形であってよい。抗体またはその抗原結合性部分は、検出可能な標識、例えばビオチン、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、または元素粒子（例えば、金粒子）を含むように修飾されてもよい。
【００７５】
誤った折畳みによって露出させたＹＭＬエピトープを介して、誤って折り畳まれたＰｒＰに「選択的に」結合する抗体および断片は、それらが天然構造のＰｒＰに結合する親和性よりも少なくとも１桁大きな（例えば、少なくとも２、３、４または５桁大きな）親和性で、誤って折り畳まれたＰｒＰに結合する。例えば、ＰｒＰＳｃに対するＹＭＬ抗体の結合親和性は、ＰｒＰＣタンパク質に対するその結合親和性よりも好ましくは少なくとも１桁大きい。相対的な結合親和性を決定することができ、ＹＭＬ抗体は、一般にこの目的のために当技術分野で十分に確立されているアッセイおよび技術に基づいて、そのように選択される。
【００７６】
モノクローナル抗体を作製するために、ハイブリドーマ法を用いることができる（ＫＯＨＬＥＲら（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ２５６巻：４９５頁）。あるいは、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、ＣＬＡＣＫＳＯＮら、（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ３５２巻：６２４〜６２８頁およびＭＡＲＬＴＳら、１９９１年Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２２２巻：５８１〜５９７頁に記載される技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。キメラまたはヒト化抗体を作製して、特徴づける方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５年。Ｍｅｔｈｏｄｓ３６巻：２５〜３４頁；Ｇｏｎｚａｌｅｓら、２００５年。Ｔｕｍｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ２６巻：３１〜４３頁に記載されている。誤って折り畳まれたＰｒＰに特異的な、例えばＰｒＰＳｃに特異的なハイブリドーマの産生では、ＰｒＰ０／０マウス（「ノックアウトマウス」）を使用することが有利であり得る（例えば、米国特許第６７６５０８８号によって提供される方法を参照）。
【００７７】
本発明者は、β鎖１で見出されるアミノ酸を含む配列を含むペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、配列番号８）を用いて、ハイブリドーマを作出し、１Ａ１と命名されるＩｇＭモノクローナル抗体を産生した。この配列は、それらに限定されないが、ヒト（配列番号１）、マウス（配列番号３）、ウシ（配列番号５）、ハムスター（配列番号４）、ヒツジ（配列番号２）およびエルク（配列番号６）を含むプリオン感受性種で保存されている（図３）。アイソタイプ対照抗体と比較すると、１Ａ１モノクローナル抗体は、プリオンタンパク質の疾患によって誤って折り畳まれたアイソフォームを特異的に認識する（図１）。
【００７８】
したがって、本発明は、哺乳動物のＰｒＰアミノ酸配列のＹＭＬ配列を含むエピトープに結合する抗体またはその断片を提供する。
【００７９】
本発明は、哺乳動物のＰｒＰアミノ酸配列のＹＭＬ配列を含むエピトープに結合し、天然構造のＰｒＰＣに特異的に結合しない抗体またはその断片をさらに提供する。
【００８０】
本発明は、哺乳動物のＰｒＰアミノ酸配列のβ鎖１の上にその全体または一部が見出されるエピトープに特異的に結合する抗体をさらに提供する。
【００８１】
本発明は、哺乳動物のＰｒＰアミノ酸配列のＹＭＬエピトープに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系をさらに提供する。
【００８２】
具体的な実施形態において、本発明は、２０１０年２月２６日に受託番号２６０２１０−０１の下で、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａにブダペスト条約の条項の下で寄託されたハイブリドーマ、ならびに寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子、またはその相補性決定領域をコードする配列を組み込む派生物を含む、そのすべての後代および派生物を提供する。
【００８３】
別の具体的な実施形態では、本発明は、上で引用したハイブリドーマの培養による産物として得られる、１Ａ１と命名されるモノクローナル抗体を提供する。１Ａ１抗体のＹＭＬ結合性断片も提供される。関連の実施形態では、本発明は、ＹＭＬエピトープとの結合をめぐって１Ａ１抗体と競合する抗体およびそれらの断片を提供および包含する。
【００８４】
本発明の様々な実施形態による抗体は、生体試料中のＰｒＰＳｃアイソフォームの存在、不在または相対量を決定するアッセイまたは試験で用いることができる。生体試料は、被験体から得ることができる。同様に、抗体は、それらの膜表面に誤って折り畳まれた形のＰｒＰを提示する腫瘍細胞の存在、不在または相対量を決定するアッセイまたは試験で用いることができる。
【００８５】
タンパク質またはタンパク質複合体は、当技術分野で公知である様々な方法によって特異的に同定および定量化することができ、単独でまたは組合せで用いることができる。免疫または抗体ベースの技術には、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット法、免疫蛍光法、マイクロアレイ、一部のクロマトグラフィー技術（すなわち免疫アフィニティークロマトグラフィー）、フローサイトメトリー、免疫沈降などが含まれる。そのような方法は、目的のタンパク質もしくはタンパク質複合体に関連する特定のエピトープまたはエピトープの組合せに対する１つまたはそれより多くの抗体の特異性に基づく。非免疫的方法には、タンパク質またはタンパク質複合体自体の物理的特性に基づくものが含まれる。そのような方法の例には、電気泳動、一部のクロマトグラフィー技術（例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど）、質量分析、配列決定、プロテアーゼ消化などが含まれる。そのような方法は、質量、電荷、疎水性または親水性に基づき、それは、タンパク質またはタンパク質複合体のアミノ酸補体、およびアミノ酸の特異的配列に由来する。タンパク質またはタンパク質複合体を同定するため、または特徴づけるために、免疫的および非免疫的方法を組み合わせてもよい。
【００８６】
本明細書に記載され、関連する分野の技術者に公知である標準の参考図書は、免疫的技術および非免疫的技術の両方、特定の試料型、抗体、タンパク質または分析へのそれらの適合性を記載する。
【００８７】
本発明の一部の実施形態では、ＰｒＰＳｃまたは誤って折り畳まれたＰｒＰＣの細胞結合形を含む組織抽出物またはホモジネートは、抗体とプリオンタンパク質とによる複合体形成を可能にする条件下で、ＰｒＰＳｃなどのＰｒＰのＹＭＬ提示形に結合する抗体と組み合わせて、相互作用させることができる。抗体を、支持体マトリックス、例えばプラスチックまたは磁気ビーズに結合させてもよい。結合したタンパク質複合体を収集し（例えば遠心分離、または磁気収集によって）、洗浄し、変性させ、ゲル電気泳動にかける。ゲル電気泳動の後、タンパク質をウェスタンブロット法にかけ、１つまたはそれより多くの対照、ＰｒＰＣアイソフォームに特異的な１つまたはそれより多くの抗体、およびＰｒＰＳｃアイソフォームに特異的な１つまたはそれより多くの抗体を含むことができる様々な抗体でブロットを探る。ＰｒＰＳｃアイソフォームが試料中に存在する場合、ＰｒＰＳｃ特異的抗体は、試料中のＰｒＰＳｃアイソフォームの存在を同定する。ＰｒＰＣアイソフォームも試料中に存在する場合、ＰｒＰＣアイソフォームだけを検出する抗体はＰｒＰＣアイソフォームの存在を同定する。一部の実施形態では、ＰｒＰＳｃおよびＰｒＰＣアイソフォームの検出は定量的または半定量的であり、このように、試料中のＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃの相対比の推定を得ることが可能となることができる。
【００８８】
実施形態では、検出がＰｒＰＳｃ関連の神経性疾患または血行性癌の診断を目的とする場合には、ＹＭＬ免疫活性のために調査される生体試料は、血液試料またはそのＹＭＬ抗体反応性分画である。代替形では、検出が固形癌の診断を目的とする場合には、生体試料は、腫瘍生検材料などの組織試料またはそのホモジネートである。
【００８９】
したがって、本発明は、生体試料中のＰｒＰＳｃを検出する方法であって、複合体の形成を可能にする条件下で、生体試料をＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃに結合する抗体と接触させることと、前記複合体中のＰｒＰＳｃアイソフォームの存在を検出することとを含む方法を提供する。同様に、本発明は、ＹＭＬ抗体と免疫反応性である、生体試料中のＰｒＰの任意の誤って折り畳まれた形態を検出するための方法を提供する。
【００９０】
一般に用語「被験体」または「患者」は、哺乳動物および他の動物、例えばヒトおよび他の霊長類、伴侶動物、動物園および農場の動物、例えば、それらに限定されないがネコ、イヌ、齧歯動物、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、エルクまたは他の有蹄動物、ヤギ、家禽などを指す。被験体には、プリオンタンパク質の誤った折畳みに関連する疾患または障害の予測、調査または診断のために検査される被験体、または検査された被験体が含まれる。被験体は、他の方法、例えば本明細書に記載のものまたは現在の医療で実施されるものを用いて以前に調査または診断されていてもよく、あるいは、一般集団（対照被験体）の一部として選択されてもよい。被験体は、ＰｒＰＣまたはＰｒＰＳｃアイソフォームを含むか、またはプリオンタンパク質の発現を欠く（例えば「ノックアウト」マウス）、遺伝子導入動物、例えばマウスなどの齧歯動物であってよい。例えば、被験体は正常なアイソフォーム（ＰｒＰＣ）を過剰発現する遺伝子導入マウスであってもよく、または疾患関連アイソフォーム（ＰｒＰＳｃ）に感染した野生型マウスもしくはハムスターであってもよい。
【００９１】
「生体試料」または「試料」は、一般に被験体からの体液または組織または器官試料を指す。例えば、生体試料は、脳脊髄液、血液、血漿、リンパ液、血清、尿または唾液などの体液であってよい。固形または半固形の組織または器官から得られるものなどの組織または器官試料は、消化、抽出すること、さもなければ液状にすることができる。そのような組織または器官の例には、培養された細胞、血球、脳、神経組織、皮膚、肝臓、心臓、腎臓、膵臓、ランゲルハンス島、骨髄、血液、血管、心臓弁、肺、腸管、腸、脾臓、膀胱、ペニス、顔、手、骨、筋肉、脂肪、角膜などが含まれ、それらの腫瘍形成性形態も含まれる。複数の生体試料が、一度に収集されてもよい。被験体がプリオンの誤った折畳みに関連する疾患または障害を診断されるかまたはそれを有することが疑われる前、プリオンの誤った折畳みに関連する疾患または障害の症状の処置または改善のための治療レジメンの間、被験体の死亡（原因または疑われる原因に関係なく）の後を含む、いかなる時期に、１つまたはそれより多くの生体試料を被験体から採取することができる。あるいは、生体試料には、集中血液供給組織または施設で治療中に、血液、血漿または血小板などの提供された体液または組織を含めることができる。あるいは、生体試料には、例えば屠殺場での屠殺時にとられる食用動物からの肉、血液または組織を含めることができる。
【００９２】
試料には、非限定的に、細胞培養において正常または改変細胞によって（例えば、組換えＤＮＡ技術を通して）産生されるＰｒＰＣまたはＰｒＰＳｃタンパク質アイソフォームを含めることもできる。試料は、被験体から直接に単離されない、実験条件の下で作り出される細胞または細胞系であってもよい。試料は、無細胞であっても、人工的に誘導または合成されてもよい。「対照」には、ベースライン、例えば、発現または活性または出現の決定で用いるために得られる、試料または標準が含まれる。したがって、対照は正常な細胞または組織から、例えば、プリオンの誤った折畳みに関連する疾患または障害に罹患していない被験体から、プリオンの誤った折畳みに関連する疾患または障害の危険性が疑われない被験体から、あるいは、そのような被験体に由来する細胞もしくは細胞系、またはその抽出物もしくはホモジネートから得ることができる。対照は、標準、例えばそれ以前に確立された標準であってもよい。したがって、本発明によって行われるいかなる試験またはアッセイも、標準と比較することができ、さらに、比較のたびに対照試料を得る必要がないこともある。
【００９３】
別の例では、本明細書に記載される抗体を、被験体におけるプリオンの誤った折畳みに関連する疾患または障害の処置、予防または改善のための医薬組成物で用いることができる。本発明の一部の実施形態による抗体の治療有効量および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を、プリオンの誤った折畳みに関連する疾患または障害を処置するために、被験体に投与することができる。抗体は、ＰｒＰＳｃ凝集体の形成を阻害すること、誤って折り畳まれたＰｒＰを通しての細胞間通信もしくは細胞内シグナル伝達を阻害すること、またはＰｒＰＳｃアイソフォームへのＰｒＰＣのさらなる変換をブロックすることができる。医薬組成物は、例えばＰｒＰＳｃの形成および／または凝集の神経毒性作用の低減に役立つことができる。医薬組成物は、脳血液関門の透過性を高める添加剤または作用物質をさらに含むことができる（血液中への投与のために）。
【００９４】
本発明の別の実施形態では、プリオンの誤った折畳みに関連する疾患または障害の処置のために、医薬の調製で抗体を用いることができる。抗体、または抗体を含む医薬もしくは医薬組成物は、プリオンの誤った折畳みに関連する疾患または障害を有するかまたはそれが疑われる被験体で、そのような疾患または障害の処置のために用いることができる。
【００９５】
別の例では、配列番号７〜１４の１つまたはそれより多くを含むペプチドは、被験体で免疫応答を誘導するための医薬用製剤で用いることができ、その免疫応答は、ＰｒＰＳｃアイソフォームに特異的である。医薬用製剤は、ワクチンとして有用であってよい。
【００９６】
本発明の別の実施形態では、プリオンの誤った折畳みに関連する疾患または障害の予防または処置のためのワクチン組成物の調製でペプチドを用いることができる。ペプチド、またはペプチドを含む医薬もしくはワクチン組成物は、プリオンの誤った折畳みに関連する疾患または障害を有するかまたはそれが疑われる被験体で、そのような疾患または障害の予防または処置療のために用いることができる。ＰｒＰＳｃアイソフォームに特異的な、宿主によって産生される抗体は、ＰｒＰＳｃの凝集を阻止することができ、またはＰｒＰＳｃへのＰｒＰＣの変換を阻止することができる。
【００９７】
ペプチドに対する宿主の免疫応答を促進または増強するために、ペプチドを担体に結合することができる。担体の例は、例えば本明細書で開示される標準の参考文献に記載されている。ワクチン組成物は、１つまたはそれより多くのアジュバント、賦形剤などをさらに含むことができる。アジュバントおよび賦形剤の例は本明細書に記載され、さらなる例は、例えば本明細書に記載される標準の参考文献に記載されている。
【００９８】
当業者に公知である医学生理学および薬理学の一般原理を示している標準の参考図書には、以下のものが含まれる：Ｆａｕｃｉら編、Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  Ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１４版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，  Ｉｎｃ．（１９９８年）。
【００９９】
本明細書で用いる抗体またはペプチドの「有効量」は、（１）レシピエントで誤って折り畳まれたＰｒＰの影響を減少させるために、例えばＰｒＰＳｃの神経毒性作用を減少させるため、または誤って折り畳まれたＰｒＰに陽性である腫瘍の増殖作用を減少させるために有用な医薬組成物中の抗体の量、および（２）被験体でＰｒＰＳｃアイソフォームまたは誤って折り畳まれたＰｒＰ提示腫瘍細胞に対する免疫応答を誘発する、医薬組成物中のペプチドの量を指す。有効量は質量／質量ベース（例えば被験体１キログラムにつきマイクログラムもしくはミリグラム）で計算してもよく、または質量／容量ベース（例えば濃度、１ミリリットルにつきマイクログラムもしくはミリグラム）で計算してもよい。質量／容量単位を用いると、抗体は、約０．１μｇ／ｍｌから約２０ｍｇ／ｍｌまでの量、またはその間の任意の量、例えば０．１、０．５、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、５０００、１００００、２００００μｇ／ｍｌ、またはその間の任意の量；あるいは、約１μｇ／ｍｌから約２０００μｇ／ｍｌまで、またはその間の任意の量、例えば１．０、２．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００μｇ／ｍｌ、またはその間の任意の量；あるいは、約１０μｇ／ｍｌから約１０００μｇ／ｍｌまで、またはその間の任意の量、例えば１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００μｇ／ｍｌ、またはその間の任意の量；あるいは、約３０μｇ／ｍｌから約１０００μｇ／ｍｌまで、またはその間の任意の量、例えば３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００μｇ／ｍｌで存在してもよい。
【０１００】
量および／または濃度は質量／質量ベース（例えば被験体１キログラムにつきマイクログラムもしくはミリグラム）で計算してもよく、または質量／容量ベース（例えば濃度、１ミリリットルにつきマイクログラムもしくはミリグラム）で計算してもよい。質量／容量単位を用いると、抗体またはペプチドは、約０．１μｇ／ｍｌから約２０ｍｇ／ｍｌまでの量、またはその間の任意の量、例えば０．１、０．５、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、５０００、１００００、２００００μｇ／ｍｌ、またはその間の任意の量；あるいは、約１μｇ／ｍｌから約２０００μｇ／ｍｌまで、またはその間の任意の量、例えば１．０、２．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００μｇ／ｍｌ、またはその間の任意の量；あるいは、約１０μｇ／ｍｌから約１０００μｇ／ｍｌまで、またはその間の任意の量、例えば１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００μｇ／ｍｌ、またはその間の任意の量；あるいは、約３０μｇ／ｍｌから約１０００μｇ／ｍｌまで、またはその間の任意の量、例えば３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００μｇ／ｍｌで存在してもよい。
【０１０１】
治療組成物を含む本発明の様々な実施形態による組成物は、抗体またはペプチドの有効量を含む用量として投与することができる。用量は、約０．１μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ（被験体の質量に基づく）までの量、例えば０．１、０．５、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、５０００、１００００、２００００μｇ／ｋｇ、またはその間の任意の量；あるいは、約１μｇ／ｋｇから約２０００μｇ／ｋｇまで、またはその間の任意の量、例えば１．０、２．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００μｇ／ｋｇ、またはその間の任意の量；あるいは、約１０μｇ／ｋｇから約１０００μｇ／ｋｇまで、またはその間の任意の量、例えば１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００μｇ／ｋｇ、またはその間の任意の量；あるいは、約３０μｇ／ｋｇから約１０００μｇ／ｋｇまで、またはその間の任意の量、例えば３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００μｇ／ｋｇを含むことができる。
【０１０２】
当業者は、被験体の質量、医薬組成物の濃度、個々の成分もしくはその組合せ、または医薬組成物、個々の成分もしくはその組合せの容量を考慮して、必要に応じて単位を所望の適用に適するフォーマットに相互変換することが容易に可能になる。
【０１０３】
それが投与される場合、投与される組成物の量、投与の方法およびそれが投与される時間枠は、観察される効果にすべて寄与することができる。例えば、組成物は、例えば静脈内投与で全身に投与され、有害または望ましくない影響を及ぼすことがあるが、皮下投与される同じ組成物が、同じ望ましくない影響を及ぼさないことがある。一部の実施形態では、皮下注射部位の近くのリンパ節の免疫細胞の局所刺激が有利なことがあるが、全身性の免疫刺激がそうではないことがある。
【０１０４】
本発明の様々な実施形態による医薬組成物は、しばしば注射用蒸留水、乳酸リンゲル液、等張性生理食塩水などの水性媒体で、様々な生理的または薬学的に許容される賦形剤のいずれかと一緒に製剤化することができる。そのような賦形剤には、例えば、塩、緩衝剤、抗酸化剤、錯化剤、張性剤、凍結保護物質、溶媒保護剤、懸濁剤、乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、抗微生物剤、保存剤、キレート化剤、結合剤、界面活性剤、湿潤剤、抗接着性剤、崩壊剤（ｄｉｓｅｎｔｅｇｒａｎｔ）、コーティング、滑走剤、解膠剤、抗核化剤、界面活性剤、安定化剤、非水性ビヒクル、例えば不揮発性油、持続性もしくは制御された放出のためのポリマーまたは封入剤、軟膏基材、脂肪酸、クリーム基材、緩和薬、乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）、増粘剤、保存剤、可溶化剤、湿潤剤、水、アルコールなどを含めることができる。例えば、Ｂｅｒｇｅら（１９７７年．Ｊ．  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．６６巻：１〜１９頁）またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ−  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版．Ｇｅｎｎａｒｏら編．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（その両方は、参照により本明細書に組み込まれている）を参照。
【０１０５】
本発明の様々な実施形態による抗体またはペプチドを含む組成物は、それらに限定されないが例えば、クモ膜下投与、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射、静脈内注射、表皮もしくは経皮投与、粘膜投与、経口、経鼻、直腸、局所、または経膣を含むいくつかの経路のいずれかによって投与することができる。あるいは、そのような組成物は、腫瘍に直接に、または腫瘍の近くのリンパ節に、または腫瘍の近くの器官もしくは組織に、または腫瘍細胞を含む器官もしくは組織に注入することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ−  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｇｅｎｎａｒｏら編．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照。担体製剤は、投与経路によって選択または改変することができる。
【０１０６】
本発明の様々な実施形態による組成物は、上皮表面に適用されてもよい。いくつかの上皮表面は、粘膜、例えば口内、歯肉、鼻、気管、気管支、胃腸、直腸、尿道、膣、子宮頸部、子宮などを含むことができる。いくつかの上皮表面は、角質化細胞、例えば、皮膚、舌、歯肉、口蓋などを含むことができる。
【０１０７】
本発明の様々な実施形態による組成物は、単位投薬量剤形で、または使用時の調合もしくは希釈に適するバルク形態で提供されてもよい。
【０１０８】
本発明の様々な実施形態による組成物は、単一用量で、または経時的に投与されるいくつかの用量で被験体に投与することができる。投与計画は、例えば、被験体の状態、年齢、性別、体重、投与経路、製剤または健康状態によって決めることができる。投与計画は被験体における吸着、分布、代謝、排出および毒性の測定から計算することができ、またはヒト被験体で使用するために、ラットまたはマウスなどの実験動物での測定から推定されてもよい。投薬および処置レジメンの最適化は、例えばＧｏｏｄｍａｎ  ＆  ＧｉｌｍａｎのＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ第１１版．２００６年．ＬＬ  Ｂｒｕｎｔｏｎ編。ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ−  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版．Ｇｅｎｎａｒｏら編．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａに述べられている。
【０１０９】
本発明の様々な実施形態によるワクチン組成物として用いる医薬組成物は、アジュバントをさらに含むことができ、記載のように投与することができる。例えば、ワクチン組成物に用いられるペプチドは、アジュバントと組み合わせることができ、アジュバントの例には、水酸化アルミニウム、ミョウバン、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（商標）（アルミニウム三水和物）または他のアルミニウム含有塩、ビロゾーム、ＣｐＧモチーフを含む核酸、スクアレン、油、ＭＦ５９、ＱＳ２１、様々なサポニン、ウイルス様粒子、モノホスホリル−脂質Ａ／トレハロースジコリノミコレート、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、ポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンなどのコポリマーなどが含まれる。
【０１１０】
本発明との関連で、本明細書で用いる用語「処置」、「処置すること」、「治療的使用」または「処置レジメン」は、互換的に用いることができ、本発明の組成物の投与の予防的、緩和的および治療的な様式を包含するものとし、炎症に基づく病状、感染性の疾患、アレルギー応答、過免疫応答または処置すべき他の疾患もしくは障害によって引き起こされる疾患状態、状態、症状、徴候または障害を治し、あるいは、それに関連する症状、徴候、状態または障害の進行を予防するか、妨げるか、遅らせるかまたは逆転させる、ここで特許請求される化合物のあらゆる使用を含む。
【０１１１】
他の実施形態
別の実施形態では、本発明は、プリオンの誤った折畳みに関連する疾患または障害の処置のための化合物を同定する方法を提供する。ＰｒＰＳｃアイソフォームまたは誤って折り畳まれたＰｒＰの他の形によって提示されるＹＭＬエピトープに特異的な抗体は、試験化合物の存在下および非存在下で、標的抗原、例えば本明細書に記載のＰｒＰＳｃを含む試料と組み合わされる。結合した抗体およびＰｒＰＳｃの複合体は収集され、複合体中のＰｒＰＳｃの相対量について本明細書で記載のように分析される。試験化合物の非存在下での結合レベルよりも低い、試験化合物の存在下でのＰｒＰＳｃ特異的抗体の結合レベルは、試験化合物が、プリオンの誤った折畳みに関連する疾患または障害の処置または改善のための可能性のある治療化合物であるかもしれないことを示す。一部の実施形態では、抗体は、配列番号７を含むエピトープに結合する。
【０１１２】
別の実施形態では、本発明は、被験体への移植、経口摂取もしくは投与を目的とする組織または組成物からＰｒＰＳｃを除去する方法を提供する。例えば、ＰｒＰＳｃアイソフォームが複合体内で抗体と結合するように、組成物または組織は、哺乳動物のＰｒＰＳｃアイソフォームに特異的な１つまたはそれより多くの抗体と組み合わされる。結合したアイソフォームおよび抗体の複合体は組織または組成物からその後切り離され、組織または組成物は意図した通りに使用することができる。
【０１１３】
製造物
包装材料、および哺乳動物のＰｒＰＳｃなどの誤って折り畳まれたＰｒＰに特異的な抗体または抗血清を含む組成物を含む製造物も提供される。組成物は、生理的または薬学的に許容される賦形剤を含み、包装材料は、組成物の有効成分（例えば抗血清または抗体）を示す表示を含むことができる。表示は、例えば本明細書に示すキットで用いられる診断試薬としての、組成物の使用目的をさらに含むことができる。
【０１１４】
包装材料、および本明細書で提供される１つまたはそれより多くのペプチドによるペプチドを含む組成物を含む製造物も提供される。組成物は、生理的または薬学的に許容される賦形剤を含むことができ、包装材料は、組成物の有効成分（例えばペプチド）を示す表示を含むことができる。表示は、例えば治療試薬もしくは予防試薬としての、または本明細書に示すキットで用いられる、哺乳動物のＰｒＰＳｃに特異的な抗血清もしくは抗体を産生する目的で、被験体で免疫応答を誘発する組成物としての組成物の使用目的をさらに含むことができる。
【０１１５】
キット
本明細書で提供される１つまたはそれより多くのペプチドを含む組成物を含むキットは、ＹＭＬ特異的抗体または抗血清の同定のための抗体の産生またはスクリーニングのための、化合物または組成物の使用説明書と共に提供される。キットはＹＭＬ特異的抗体または抗血清の産生および／または同定のために役立つことができ、説明書は、例えば、投与濃度、投与間隔、好ましい投与方法、免疫学的スクリーニングまたは試験の方法などを含むことができる。
【０１１６】
別の実施形態では、本明細書で提供される１つまたはそれより多くのペプチドを含む組成物をその使用のための説明書と一緒に含む、医薬の調製のためのキットが提供される。説明書は、医薬の調製のための一連の工程を含むことができ、医薬は、それが投与される被験体で治療的または予防的な免疫応答を誘導するのに有用である。キットは、プリオンの誤った折畳みに関連するか、またはプリオンの誤った折畳みが関連付けられる疾患または障害の１つまたはそれより多くの症状の処置、予防または改善のための、処置における医薬の使用説明書をさらに含むことができ、例えば、投与濃度、投与間隔、好ましい投与方法などを含む。
【０１１７】
別の実施形態では、プリオンの誤った折畳みに関連する疾患または障害を診断するためのキットが提供される。キットは、本明細書に記載の１つまたはそれより多くのＹＭＬ抗体または抗血清を、その使用のための説明書と共に含む。抗体は、検出試薬にさらに結合させることができる。検出試薬の例には、抗マウス抗体、抗ウサギ抗体などの二次抗体が含まれる。そのような二次抗体は、適する基質を備える場合、検出可能な比色反応または化学発光反応を提供する酵素と結合させることができる。キットは、プロテイナーゼＫなどの酵素、ブロッキング緩衝剤、ホモジナイゼーション緩衝剤、抽出緩衝剤、希釈緩衝剤などを含む、検出反応を実施するための試薬をさらに含むことができる。
【０１１８】
別の実施形態では、生体試料中のＰｒＰＳｃの存在を検出するためのキットが提供される。キットは、本明細書に記載の哺乳動物のＰｒＰのＰｒＰＳｃアイソフォームに特異的に結合する１つまたはそれより多くの抗体または抗血清を、その使用のための説明書と共に含む。抗体は、検出試薬にさらに結合させることができる。検出試薬の例には、抗マウス抗体、抗ウサギ抗体などの二次抗体が含まれる。そのような二次抗体は、適する基質を備える場合、検出可能な比色反応または化学発光反応を提供する酵素と結合させることができる。キットは、プロテイナーゼＫなどの酵素、ブロッキング緩衝剤、ホモジナイゼーション緩衝剤、抽出緩衝剤、希釈緩衝剤などを含む、検出反応を実施するための試薬をさらに含むことができる。
【０１１９】
ＹＭＬエピトープは、癌セラノスティクス（ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ）の標的としても有用である。本明細書で例示されるように、特定の腫瘍細胞系は、このエピトープに対して生成される抗体に反応性である抗原を提示する。これらは、ＹＭＬ抗体によって認識される誤って折り畳まれた形のＰｒＰを明らかに提示し、またＰｒＰ＋である細胞系である。したがって、本発明の抗体は、ＹＭＬ＋腫瘍細胞の検出および治療的ターゲッティングのために、それ自体、またはイムノコンジュゲートとして有用である。ＹＭＬを含有するワクチンも、癌処置のために同様に有用である。腫瘍細胞は、固形腫瘍および液性腫瘍を含む。本明細書で例示されるように、腫瘍標的はＹＭＬエピトープを提示するものであり、したがって、それらの表面にＰｒＰを提示するが、ＹＭＬエピトープを露出させる誤って折り畳まれた形のものである。そのような腫瘍は、「ＹＭＬ＋」と、またはＹＭＬ＋表現型を有するかもしくは含むと記載することができる。ＹＭＬを提示することが分かった腫瘍には、細胞系ＭＯＬＴ−４によって表される、リンパ系組織から生じるもの、および細胞系ＭＯ３．１３によって表されるオリゴデンドログリア系統、ならびに細胞系Ｂ１６によって表される黒色腫細胞から生じるものが含まれる。当然、ＹＭＬ抗体によって標的にすることができるさらに他の腫瘍は、上でおよび本明細書の実施例で記載されるＹＭＬ抗体スクリーニングを用いて先ず明らかにすることができる。
【０１２０】
用語「腫瘍細胞」は、本明細書では癌細胞、および無秩序な細胞成長を特徴とする、そのような細胞を含む腫瘍に関して用いられる。したがって腫瘍細胞は、悪性であろうが良性であろうが新生物性細胞の成長および増殖を特徴とし、液性および固形の腫瘍を含むすべての前癌性および癌性の細胞、ならびにそのような細胞を含む組織が含まれる。用語「腫瘍細胞」には、ヒト癌細胞、ならびにペット、およびウマ、ヒツジ、ウシおよび有蹄動物を含む家畜を含む他の哺乳動物からの癌細胞が含まれる。
【０１２１】
本処置方法は、ＹＭＬエピトープを提示する癌細胞の「成長または増殖」の阻害をもたらす。ｉｎ  ｖｉｔｒｏレベルで、そのような成長または増殖の阻害は、未処置の対照試料と比較して、処置される癌細胞の数、サイズ、生存度、成長速度、増殖速度または代謝活性の低減によって明らかにされる。ｉｎ  ｖｉｖｏレベルで、成長または増殖のそのような阻害は、標的エピトープを提示する癌細胞を抱える腫瘍の成長速度、サイズ、数または転移状態の低減としてさらに明らかにすることができる。これらのエンドポイントのすべては、この目的のための腫瘍学分野で十分に確立されているアッセイおよび手順を用いて、ならびに、本発明によって提供され、本明細書でさらに詳述される、標的エピトープを検出する作用物質の援用によって容易に決定することができることは理解されよう。
【０１２２】
それ自体を細胞毒としてのそれらの使用を可能にするために、ＹＭＬエピトープを提示する癌細胞の成長または増殖を直接に阻害するために、抗体は、補体媒介細胞傷害（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などの内因機構を通してそれらの抗癌活性を発揮することができる。この目的のために、ＹＭＬ抗体は、最適にはＩｇＧ１アイソタイプである。変化したエフェクター機能を有するように抗体を工学的に改変し、または選択して、癌の処置における有効性を増強することができることは理解されよう。鎖間ジスルフィド結合を形成させるために、例えばシステイン残基をＦｃ領域に導入することができる。生じるホモ二量体抗体は向上した内在化能力を有することができ、より重要なことに、増大された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および／またはＡＤＣＣ活性を有することができる。増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体は、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５３巻：２５６０〜２５６５頁（１９９３年）に記載のヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することもできる。あるいは、二重のＦｃ領域を有し、増強されたＣＤＣおよびＡＤＣＣ活性を有する抗体を工学的に改変することができる。
【０１２３】
本発明で有用な抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片を含む抗ＹＭＬ抗体のＹＭＬ結合性断片、抗体断片から形成されるダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子および多重特異的抗体が含まれる。Ｆｃ領域を組み込む抗体断片は、変化したエフェクター機能を提供するように上記の通り工学的に改変し、またはコンジュゲートして、それによってＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を増強することもできる。癌処置のために、ＹＭＬ抗体およびその結合性断片を、抗体または断片が細胞毒に結合しているイムノコンジュゲートとして提供し、用いることもできる。
【０１２４】
抗体を含むイムノコンジュゲートは、画像化で有用なものを含む検出可能な標識および細胞毒を含む薬物を含む、上記の様々な作用物質にコンジュゲートすることができる。実施形態では、コンジュゲートは、ＹＭＬエピトープに選択的に結合する細胞毒および作用物質を含む。「細胞毒」は、癌細胞の生存度を低下させるために、例えば癌細胞の成長および／または増殖を阻害するために治療的に有用である、化学療法または放射線治療の化合物などを含む化合物を指す。
【０１２５】
ＹＭＬ抗体および細胞毒は、非共有相互作用を通してコンジュゲートすることができるが、より望ましくは、共有結合によって直接に、またはより好ましくは、適するリンカーを通して結合する。好ましい実施形態では、コンジュゲートは、細胞毒およびＹＭＬ抗体を含み、イムノコンジュゲートを形成する。抗体および細胞毒のイムノコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート、イミノチオランなどの様々な二官能基のタンパク質結合剤、ジメチルアジピミデートＨＣＬなどのイミドエステルの二官能基誘導体、ジスクシンイミジルスベレートなどの活性エステル、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなどのビス−アジド化合物、トリエン２，６−ジイソシアネートなどのジイソシアネート、およびビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を用いて作製される。炭素１４標識１−イソチオシアノベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションに適するキレート化剤である。
【０１２６】
イムノコンジュゲートの細胞毒成分は、化学療法剤、毒素、例えば細菌、真菌、植物または動物起源の酵素活性毒素、またはその断片、または小分子毒素、あるいは２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅなどの放射性同位体、あるいは癌細胞の成長または増殖を阻害するのに有用な他の任意の作用物質であってよい。
【０１２７】
そのようなイムノコンジュゲートの作出に有用な化学療法剤には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン（ｃｙｔｏｘｉｎ）、タキソイド、例えばパクリタキセル、およびドセタキセル、タキソテール（ｔｏｘｏｔｅｒｅ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒａｘａｔｅ）、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド（ｉｆｏｓｇａｍｉｄｅ）、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン、５−ＦＵ、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、アクチノマイシンＤ、ＶＰ−１６、クロラムブシル、メルファランおよび他の関連するナイトロジェンマスタードが含まれる。また、タモキシフェンおよびオナプリストンなどの、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害する作用をするホルモン剤も含まれる。
【０１２８】
用いることができる毒素およびその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、コレラトキシン、ボツリヌス毒素、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａから）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ダイアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、Ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、サポリン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコスセンが含まれる。小分子毒素には、例えば、カリケアマイシン、マイタンシノイド、パリトキシンおよびＣＣ１０６５が含まれる。
【０１２９】
ＹＭＬ＋腫瘍を示す被験体の処置のために、投薬は、ＰｒＰＳｃ障害の処置について上で述べたように実施することができる。処置に適する被験体を特定するために、そのＹＭＬ＋表現型を確認するためにまた上に記載のように、腫瘍細胞を含む生体試料をスクリーニングすることができる。あるいは、ＹＭＬ抗体がテクネチウム同位体（例えば、Ｔｃ９９）、ガドリニウム同位体などの造影剤に結合しているイムノコンジュゲートの投与および蓄積の後、局所または全身の画像化によって被験体の画像をとることができる。
【０１３０】
ＹＭＬ＋腫瘍を示す被験体の良好な処置は、ＹＭＬ＋腫瘍負荷の減少として、例えばＹＭＬ＋腫瘍の数もしくは分布の減少、または特定のＹＭＬ＋腫瘍のサイズの減少として、および／あるいは全体的な患者生存期間の増加によって明らかにされる。
【０１３１】
他の治療レジメンを、本発明の抗癌剤、例えばワクチン、抗体またはコンジュゲートの投与と組み合わせてもよい。例えば、そのような抗癌剤で処置される患者は、外部ビーム放射線などの放射線療法も投与されてよい。あるいは、またはさらに、化学療法剤が患者に投与されてもよい。そのような化学療法剤のための調製および投薬スケジュールは、製造業者の説明書によって、または、熟練臨床医により経験的に決定される通りに用いることができる。そのような化学療法のための調製および投薬スケジュールは、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｍ．  Ｃ．  Ｐｅｒｒｙ編、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．（１９９２年）にも記載されている。化学療法剤は、抗腫瘍剤、例えば抗体の投与の前後でもよく、またはそれと同時に投与されてもよい。抗体は、タモキシフェンなどの抗エストロゲン化合物またはオナプリストンなどの抗プロゲステロンと（欧州特許第６１６８１２号を参照）、そのような分子で公知である投薬量で組み合わせることができる。
【０１３２】
他の腫瘍関連抗原に対して、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４または血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体などの抗体またはコンジュゲートを投与することが望ましい場合もある。あるいは、またはさらに、本明細書で開示されるその同じまたは２つ以上の異なる抗原に結合する２つ以上の抗体を、患者に同時投与することができる。時には、患者に１つまたはそれより多くのサイトカインを投与することも、有益なことがある。好ましい実施形態では、本明細書の抗体は、増殖阻害剤と同時投与される。例えば、増殖阻害剤を先ず投与し、続いて本発明の抗体を投与することができる。しかし、本発明の抗体の同時投与または先行投与も企図される。増殖阻害剤の適する投薬量は、現在用いられているものであり、増殖阻害剤および本明細書の抗体の組合せ作用（相乗効果）のために低下させることができる。さらに、ＹＭＬ抗体または断片は、ＹＭＬ抗体を生成するためのワクチンと組み合わせて投与されてもよく、レシピエントに能動および受動の免疫療法を提供する。
【０１３３】
本発明の配列番号一覧を、表２に示す。
【０１３４】
【表２】
2012519190.tif 000004
本発明は、以下の実施例でさらに例示される。しかし、これらの実施例は例示だけが目的であり、いかなる方法でも本発明の範囲を限定するために用いるべきでないことを理解すべきである。
【実施例】
【０１３５】
（実施例１）
方法
一般参考文献：２６３Ｋハムスター順応プリオンは、Ｋｉｍｂｅｒｌｉｎら、１９７８年によって記載されている。ＲＭＬマウス順応プリオンは、Ｃｈａｎｄｌｅｒ，  Ｒ．  Ｌ．（１９６１年）（Ｌａｎｃｅｔ１巻、１３７８〜１３７９頁）によって記載されている。これらは、当技術分野で公知の方法、例えばＢｕｅｌｅｒ  Ｈら、１９９３年（Ｃｅｌｌ７３巻：１３３９〜１３４７頁）、Ｏｌｄｓｔｏｎｅら、２００２年、またはＭｅａｄｅ−Ｗｈｉｔｅら、２００９年のものを用いて、マウスまたはハムスターを感染させるために用いることができる。Ｂｏｌｔｏｎら、１９８７年は、スクレイピー因子の単離および精製のために用いることができる方法を記載している。Ｃａｒｌｓｏｎら、１９８６年（Ｃｅｌｌ、４６巻：５０３〜５１１頁）は、マウスおよびハムスターでのスクレイピーの臨床診断のために用いることができる方法を記載している。ＰｒＰを過剰発現するか、部分的に発現するか、または発現しない様々な遺伝子導入マウスが、Ｆｉｓｃｈｅｒら、１９９６年（ＥＭＢＯ  Ｊ１５巻：１２５５〜１２６４頁）およびＷｅｉｓｓｍａｎｎら、２００３年（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ６６巻：４３〜６０頁）によって記載されている。
【０１３６】
脳および脾臓ホモジネートの調製
脳組織（正常およびスクレイピー感染マウスまたはハムスター）を、Ｆｉｓｃｈｅｒら２０００年（Ｎａｔｕｒｅ４０８巻：４７９〜４８３頁）によって改変された通りに処理し、分析した。簡潔には、ＰＢＳ、０．５％デオキシコール酸（Ｓｉｇｍａ）、０．５％ＮＰ−４０中で１０％ホモジネートを作製した。ホモジネート中の総タンパク濃度をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）で決定し、ホモジナイゼーション緩衝液で５ｍｇ／ｍｌに調節した。ＰＫ耐性物質の検出のために、ホモジネート１．５μｌを０．１５μｇのＰＫ（Ｓｉｇｍａ）と一緒に、またはそれなしで、３７℃で６０分間インキュベートした。２０ｍＭのＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ）の添加によって消化を停止した。
【０１３７】
磁気ビーズ抗体コンジュゲーションおよび免疫沈降
Ｐａｒａｍｉｔｈｉｏｔｉｓ、２００３年によって改変された通りに、抗体を磁気ビーズにコンジュゲートさせ、免疫沈降実験に用いた。簡潔には、７×１０８個の磁気ビーズ（１ｍｌのＰＢＳ中）（Ｄｙｎａｌ；Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を、製造業者の説明書に従って１Ａ１、８Ｂ４、４Ｅ４またはＩｇＭアイソタイプ対照に結合した。製造業者の推奨に従ってコンジュゲートしたビーズを洗浄およびブロックし、１ｍｌのＰＢＳに次に再懸濁させた。
【０１３８】
抗体結合ビーズ１０μＬを、６％洗剤（ＰＢＳ中に３％Ｔｗｅｅｎ２０および３％ＮＰ４０）中の１０％脳ホモジネート１μＬと一緒に、室温で３時間インキュベートした。磁石によって捕捉された免疫複合体を４％洗剤（ＰＢＳ中に２％Ｔｗｅｅｎ２０および２％ＮＰ４０）で３回洗浄し、還元剤なしで４％ＳＤＳ中にて沸騰させ、１５％トリスグリシンまたは４〜１２％ビス−トリスアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分解した。
【０１３９】
イムノブロッティング
記載されている通りに（Ｐａｒａｍｉｔｈｉｏｔｉｓら、２００３年）、イムノブロッティングを実施した。タンパク質を、ＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移した。５％（ｗ／ｖ）乾燥脱脂乳で膜をブロックした。ＴＢＳＴ（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）中ですべてのインキュベーションを実行した。化学発光、増強ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）またはスーパーＷｅｓｔ  Ｄｕｒａ（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）によってペルオキシダーゼ活性を検出した。
【０１４０】
（実施例２）
抗体作出
ヒトプリオンタンパク質のアミノ酸１２６〜１３２に対応するＫＬＨ結合ペプチドＧＧＹＭＬＧＳ（配列番号８）でＢａｌｂ／ｃマウスを免疫することによって、抗体を作出した。このペプチドは最初のβ鎖に位置しており、誤って折り畳まれたＰｒＰＳｃでは折り畳まれておらずにアクセスしやすいが、天然のＰｒＰＣではそうでないと予想されている。モノクローナル抗体は、標準のハイブリドーマ法によって作出した。ＢＳＡに結合した免疫原ペプチドへの結合（ＥＬＩＳＡによる）に基づいて抗体を選択した。
【０１４１】
より詳細には、周知の技術を用いてアミノ酸配列アセチル−Ｃｙｓ−ＧＧＹＭＬＧＳ−ＮＨ２を有するペプチドを合成し、ＫＬＨにコンジュゲートさせ、ウサギに筋内注射した。ペプチドとタンパク質担体とのコンジュゲーションを可能にするために、Ｎ末端システイン残基を加えた。ペプチドのアミノ基をアセチル化によってブロックし、ペプチドのカルボキシル基をアミド化によってブロックした。ペプチドは、固相ペプチド合成方法を用いて手動または自動（ＭＰＳ３９６ペプチドシンセサイザー、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）で合成した。アミノ酸残基の結合は、Ｆｍｏｃペプチド合成化学（Ｆｉｅｌｄｓら、１９９０年、ＩＪＰＰＲ３５巻、１６１頁）を用いて達成した。アミノ酸の完全な側鎖保護により、ＷａｎｇまたはアミドＲｉｎｋ樹脂の上で合成を実施した。合成の後、試薬Ｋを切断混合物、すなわち水（２．５％）、ＴＩＳ（２．５％）、ＥＤＴ（２．５％）、ＴＦＡ（９２．５％）として用いて、ペプチドを樹脂から切断した。次に、冷たいジエチルエーテルでペプチドを沈殿させた。沈殿物を遠心分離し、ジエチルエーテルで３回洗浄し、２０％〜５０％ＡｃＣＮ／水混合液に溶解し、凍結乾燥した。粗生成物の分析は、分析ＲＰ−ＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーＭＳを用いて実施した。未精製のペプチドは、アセトニトリルの１０〜５０％水溶液の直線濃度勾配を０．０６％ＴＦＡと用いて、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８カラム２．５×２５ｃｍ上で、Ｒｐ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）によって精製し（１％／分間勾配、１０ｍｌ／分間流速）、２１５ｎｍおよび２５４ｎｍのＵＶでモニタリングした。ペプチドを担体に、この場合キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合した。そのような結合に有用な他の担体には、それらに限定されないが、アルブミンもしくはオボアルブミン、８ｍａｐまたはリゾチームが含まれる。結合は、システインのメルカプト基へのチオエーテル結合を通して達成された。ＫＬＨへの結合は、以下の通りに実施した。ペプチド１０ｍｇを２ｍｌのリン酸緩衝液（１×ＰＢＳ）に溶解した。１ｍｌのＫＬＨ（ｐｉｅｒｃｅ製品＃７７１００）をペプチド溶液に加えて撹拌した（ペプチド１モル／５０アミノ酸）。ＫＬＨ濃度は、１０ｍｇ／ｍｌであった。２０μｌのグルタルアルデヒド（２５％水溶液）を一定の撹拌の下でペプチド／担体溶液に加え、１時間インキュベートし、その後、グリシン停止液を加えた。ペプチド／担体コンジュゲートは、ＰＢＳに対する透析によってペプチドから分離した。
【０１４２】
モノクローナル抗体の作出は、以下の通りに実施した。完全フロイントアジュバントにマウスＰｒＰ−ＡＰ融合タンパク質を含むバキュロウイルス上清でマウスを免疫し、次に不完全フロイントアジュバント中の同じ抗原で２週後にブーストした。その免疫の２週後に、１００μｇのＫＬＨ−ＣＧＧＹＭＬＧＳコンジュゲートをプラスしたＰｒＰ−ＡＰ上清の混合液でマウスをブーストした。特異的ハイブリドーマクローンを作出するために、これらのマウスからの脾細胞を、ＦＯマウスＢ細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６４６）に融合させた。
【０１４３】
マウスモノクローナル抗体を腹水として産生し、プロテインＡカラムキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を製造業者の説明書に従って用いて精製した。簡潔には、腹水の試料を１：１の最終比で結合緩衝液により希釈した。次に試料を、事前に結合緩衝液で平衡させたカラムの上に加え、マトリックスを通過させた。パススルー物質を収集し、カラムを５容の結合緩衝液で洗浄した。結合抗体をマトリックスから放出させるために、緩和な溶出緩衝液をカラムに加えた。すべての抗体を１ｍｌ分画で収集し、それを、総タンパク質含量を決定するためにＢＣＡによって、および抗体純度を確定するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分析した。所望の抗体を含む分画を、Ｄ塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）に通すことによって脱塩した。抗体分画を振り分け、ＰＢＳ中に−８０℃で保存した。
【０１４４】
１Ａ１と命名された、マウスのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａのブダペスト条約の条項の下、２０１０年２月２６日に受託番号２６０２１０−０１の下に寄託された。
【０１４５】
類似の方法で、抗体およびそれらを産生するハイブリドーマが、配列番号７および９〜１４を有するものを含む他のＹＭＬ含有ペプチドに対して生成される。
【０１４６】
（実施例３）
ＰｒＰＳｃの免疫沈降
免疫沈降させた試料は、６Ｄ１１−ビオチンを一次抗体（１：５０００）として、およびＳｔｒｅｐ−ＨＲＰを二次抗体（１：５０００）として、ウェスタンブロット法（図１）によって分析した。８Ｂ４ビーズは陽性対照として働き、ＰｒＰノックアウトマウス（Ｋ／Ｏ）を除くすべての脳ホモジネート試料からＰｒＰを免疫沈降させることができた。ビーズのみ、ＩｇＭアイソタイプビーズおよび４Ｅ４ビーズは陰性対照として働き、４Ｅ４によって免疫沈降したＲＭＬおよび２６３Ｋのレーンの２つの非常にかすかなバンドを除き、ＰｒＰは予想通り免疫沈降しなかった。１Ａ１、ＰｒＰのβ−１鎖に対して生成されたＩｇＭ抗体は、スクレイピータンパク質をＲＭＬ（マウススクレイピー株）および２６３Ｋ（ハムスタースクレイピー株）の両方から免疫沈降させることができた。おそらく過剰発現ＰｒＰマウス脳における誤って折り畳まれたＰｒＰの小さな発現のために、Ｔｇ２０レーンにかすかなバンドがある。我々のデータは、マウスおよびハムスターの両方の脳で、１Ａ１がスクレイピーＰｒＰだけを認識することができ、野生型ＰｒＰはできなかったことを示した。
【０１４７】
（実施例４）
ＹＭＬ腫瘍標的
１Ａ１抗体を、正常細胞および腫瘍細胞の両方に結合するその能力について試験した。対照として、各細胞型でのＰｒＰの発現レベルを特定するために、抗ＰｒＰＣ抗体６Ｄ１１を用いた。細胞に結合する抗体の能力は、正常細胞型としてＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮細胞）を用いて、フローサイトメトリーによって観察した。８つの型の腫瘍細胞への結合についてのデータを示す。試験した癌細胞の５つは、マウス（Ｂ１６−黒色腫、ＮＳＣ３４−モーターニューロン／神経芽細胞腫ハイブリッド）およびヒト（ＨＬ６０−前骨髄球白血病、ＭＯ３．１３−オリゴデンドロサイト／筋肉ハイブリッド、ＳｉＨａ−子宮頸癌腫）に由来する不死化細胞系である。試験した残りの癌細胞は、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｃａｎｃｅｒ  ＡｇｅｎｃｙのＬｉｖｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＬＴＬ）によって増殖された一次腫瘍細胞である。一次ヒト腫瘍は、免疫不全マウスの腎被膜下で増殖される。これは、当初の腫瘍構造および表現型が、当初収集された腫瘍との一貫性を維持することを可能にする。１Ａ１抗体への結合について試験された３つの腫瘍は、ＬＴＬ−０１３（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）、ＬＴＬ−２５７（結腸直腸肉腫）およびＬＴＬ−３２３（黒色腫）である。
【０１４８】
結果を、図４に示す。暗いヒストグラムは、アイソタイプ対照抗体で観察される染色であり、黒線として示されるヒストグラムは、特異的抗体６Ｄ１１または１Ａ１（示す通り）による染色である。ＰｒＰは、示す９つの細胞型すべてで発現される。１Ａ１抗体は、正常なＨＵＶＥＣ細胞および白血病細胞（ＨＬ６０）の両方に最小限の結合を示す。１Ａ１抗体は、示す他の７つの腫瘍細胞に対して検出可能な結合を示す。
【０１４９】
（実施例５）
腫瘍モデルでの効力
雌Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおけるマウスの黒色腫（Ｂ１６）の成長を変更するその能力について、１Ａ１抗体を試験した。試験の０日目に、３×１０５個の腫瘍細胞をマウス１２匹のわき腹に皮下移植した。マウスを２つの処置群に無作為に割り付けた。第１群は、ＰＢＳで処置した。第２群は、１０ｍｇ／ｋｇの１Ａ１抗体で処置した。マウスは、−１、２および５日目に処置した。
【０１５０】
２日目からキャリパーで腫瘍寸法を測定することによって、腫瘍の成長を監視した。腫瘍の長さおよび幅の測定値を得、腫瘍容積を方程式Ｌ×Ｗ２／２によって計算し、長さ（ｍｍ）は腫瘍の長軸を表す。腫瘍の負荷が高くなったならば、標準の動物管理手順によってマウスを屠殺した。図５は、両処置群での腫瘍成長の進行を示し、終了前の腫瘍容積は終わりまで持ち越されている。２つの群の間で腫瘍成長に有意差があり（対応のあるｔ検定＝０．０１２；Ｗｉｌｃｏｘｉｎ＝０．００７）、１Ａ１抗体の治療効果が生じたことを示している。
【０１５１】
すべての引用は、個々の刊行物が参照により本明細書に組み込まれることが具体的におよび個々に示されているかのように、ならびにそれが本明細書に完全に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書での参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明への先行技術であることを認めるものと解釈されても見なされてもならない。
【０１５２】
本発明の１つまたはそれより多くの現在好ましい実施形態が、例として記載された。本発明は、実質的に上で記載される、ならびに実施例および図面に関して記載される、すべての実施形態、修正および変更を含む。特許請求の範囲で定義される本発明の範囲を逸脱しない範囲で、いくつかの変更および修正を加えることができることは、当業者にとって明らかとなる。そのような修正の例には、実質的に同じ方法で同じ結果を達成するための、本発明の任意の態様への公知の同等物の置換が含まれる。
【図２】
2012519190.tif 000005
【図３】
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【図１】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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