(57)【要約】  本発明は、脂肪幹細胞組成物、前記組成物の製造方法、前記組成物を含んでなるキット、および疾患の治療における前記組成物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
最大寸法が約1μmと約1000μmの間にあり、脂肪由来幹細胞および一またはそれ以上の接着剤を含んでなる、三次元構造体。
【請求項２】
前記接着剤が第一の架橋ポリマー性網状構造である、請求項１に記載の三次元構造体。
【請求項３】
前記第一の架橋ポリマー性網状構造がアルギン酸塩である、請求項２に記載の三次元構造体。
【請求項４】
前記脂肪由来幹細胞が、前記の一またはそれ以上の接着剤に埋設されてなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三次元構造体。
【請求項５】
第二の架橋ポリマー性網状構造をさらに含んでなり、前記第二の架橋ポリマー性網状構造が第一の架橋網状構造をカプセル化しているものである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の三次元構造体。
【請求項６】
前記第二の架橋ポリマー性網状構造がキトサンである、請求項５に記載の三次元構造体。
【請求項７】
脂肪幹細胞の微粒子を得る方法であって、
(i)  脂肪幹細胞の懸濁液と架橋可能なポリマーの溶液とを混合し、
(ii)  工程(i)で得た混合物を断片化し、
(iii)  工程(ii)で形成した断片を、架橋可能なポリマーの架橋ポリマー性網状構造への転換を促進するのに適切な条件下に置き、
(iv)  工程(iii)で得た粒子を回収する工程を含んでなる、方法。
【請求項８】
前記架橋可能なポリマーがアルギン酸塩である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
工程(iv)で得た微粒子を、第二の架橋可能なポリマーの存在下で、前記ポリマーの架橋に適切な条件下に置く工程を更に含んでなる、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第二の架橋可能なポリマーがキトサンである、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一のポリマー性網状構造および場合によって前記第二のポリマー性網状構造から、架橋剤を除去し、脂肪幹細胞を放出するのに適切な条件下に、前記微粒子を置くことを更に含んでなる、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法によって得られた、微粒子。
【請求項１３】
薬学担体を更に含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の三次元構造体または請求項１２に記載の微粒子。
【請求項１４】
医薬として用いられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の三次元構造体、請求項１２に記載の微粒子、または前記から解離した脂肪幹細胞。
【請求項１５】
治療を必要とする患者に、請求項１〜６のいずれか一項に記載の三次元構造体、請求項１２に記載の微粒子、またはそれらから解離した脂肪幹細胞を投与することを含んでなる、炎症性疾患または自己免疫疾患の治療方法。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の三次元構造体、または請求項１２に記載の微粒子、および所望ならばＣＯ2または空気雰囲気中で構造体または微粒子から幹細胞を解離する手段を含んでなる、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪幹細胞、該細胞の保存方法、該保存細胞を含んでなるキット、および疾患の治療における前記組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
〔幹細胞治療〕  間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）は、間葉系細胞（脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨細胞）、さらに、筋細胞、神経細胞、内皮細胞、星状細胞および上皮細胞へも分化することができる多能性成人幹細胞である。ＭＳＣｓは、最初正常な成人骨髄について報告されたが（ＢＭ−ＭＳＣｓ）、その他の供給源、たとえば臍帯血、末梢血および脂肪組織、から得ることもできる。
【０００３】
脂肪組織は、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ｈＡＳＣ）と呼ばれるＭＳＣｓの一つの供給源であり、吸引された脂肪組織から単離され、長時間拡大培養される。ｈＡＳＣｓは、髄質におけるこれらのカウンターパートと、いくつかの特長、たとえば分化能、低免疫原性および免疫応答を抑制する能力を共有している。双方の細胞型を比較した最近の研究によれば、ｈＡＳＣとＢＭ−ＭＳＣが、類似性を共有している一方で、実際のところ全く相違していることを示唆する、転写レベルおよびプロテオミクスレベルでの相違が報告されている。ｈＡＳＣｓが仲介する免疫抑制に内在する特異的なメカニズムは、これまでのところあまり研究されてきていない。近年、ｈＡＳＣｓが、その少なくとも一部でプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の分泌を必要とするメカニズムにより、リンパ球増殖を阻害する可能性があることが報告されている。しかしながら、これらの研究は、（ｉ）免疫抑制のメカニズムに関与するその他の細胞因子もしくは可溶性因子、（ｉｉ）単離されたＴ細胞サブセットに対する免疫抑制効果、または（ｉｉｉ）ｈＡＳＣｓおよびＰＢＭＣｓ双方の共培養における表現型の変化に関する情報を提供していない。
【０００４】
これらの生物学的な能力によって、ｈＡＳＣｓを含むＭＳＣｓは、細胞療法および再生のための興味深い手段となる。このことは、ＢＭ−ＭＳＣｓが、同種移植の拒絶反応、移植片対宿主病、実験的自己免疫性脳脊髄炎、コラーゲン誘導関節炎および自己免疫性心筋炎を軽減することを示す研究によって一層裏付けられる。さらに、マウスＡＳＣｓ（ｍＡＳＣｓ）は、インビボマウスモデルにおける同種移植後の移植片対宿主病に対する保護において非常に有効であることが最近報告されている。加えて、ＭＳＣｓは、それらの免疫調節のおよび抗炎症性の能力に焦点を合わせた幾つかの臨床試験において使用されている。脂肪幹細胞療法は、組織再生から免疫性および／または炎症性の疾患に及ぶ様々な種類の疾患の治療において有望と思われる。これらの疾患を治療するために複数の方法が利用できるにもかかわらず、多くの現在の治療は十分な結果を提供できておらず、さらに重大な副作用の危険性を伴う。新たな緊急の治療方針の中でも、細胞療法に基礎をおく治療方針は、多くの疾患を治療する可能性ある手段をもたらすと思われる。それゆえ、現在、上記目的を達成するために、研究者によって懸命な努力が行われている。
【０００５】
〔自己免疫疾患〕  自己免疫疾患は、人体をバクテリア、ウイルスおよび他のいかなる外来物質から防衛することになっている、人体の免疫系が機能不全となり、健常な組織、細胞および器官に対する病的反応を生じるときに起こる。
【０００６】
Ｔ細胞およびマクロファージは有益な防衛を提供するが、同時に有害なまたは致命的な免疫応答を引き起こす。自己免疫疾患は、臓器特異的または全身性であり、そして様々な発症メカニズムによって誘発され得る。全身性自己免疫疾患は、多クローン性Ｂ細胞活性化および免疫調整Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体およびＭＨＣ遺伝子の異常を伴う。臓器特異的自己免疫疾患の例は、糖尿病、甲状腺機能亢進症、自己免疫副腎機能不全、真性赤血球性貧血、多発性硬化症およびリウマチ性心臓炎である。代表的な全身性自己免疫疾患としては、全身性エリテマトーデス（全身性紅斑性狼瘡）、慢性炎症、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎および強皮症が挙げられる。
【０００７】
自己免疫疾患の現在の治療は、コルチゾン、アスピリン誘導体、ヒドロキシクロロキン、メトトレキサート、アザチオプリンもしくはシクロホスファミドまたはこれらの組合せ等免疫抑制剤の投与を伴う。しかしながら、免疫抑制剤が投与されるときに直面するジレンマは、自己免疫疾患が効果的に治療されればされるほど、患者は益々無防備になり、その結果感染症からの攻撃にさらされ、くわえて腫瘍が発生する影響も益々受けやすくなるということである。それゆえ、自己免疫疾患の治療のための新たな治療法に対する強い希求が存在する。
【０００８】
〔炎症性疾患〕  炎症は、それにより人体の白血球および分泌因子が我々の人体をバクテリアやウイルス等の外来物質による感染から防衛する一連のプロセスであり、自己免疫疾患における通常のプロセスである。サイトカインやプロスタグランジンとして知られている分泌因子は、このプロセスを制御し、秩序ある自己限定的なカスケードにおいて、血液中または罹患組織に分泌される。一般的には、慢性炎症性疾患のための現在の治療は、非常に限られた効率しか有さず、これらの多くが副作用の高いおそれを有し、疾患の進行を完全に抑止することができない。今までのところ、理想的な治療法は無く、これらのタイプの病理のための治療薬もない。それゆえ、炎症性疾患の治療のための新たな治療法に対する強いニーズがある。
【０００９】
〔ASC貯蔵〕  ASCは疾患治療に大いに有望であるが、ASCの使用はそれらの貯蔵寿命によって限定されている。室温で培地に保存されたASCの貯蔵寿命は限定されており、現在のところ、ASCの長期保存の唯一の方法は低温保存である。幹細胞の低温保存は費用がかかり、専用装置を必要とし、幹細胞生育力に重大な影響を与える。従って、改良されたASC貯蔵の方法が当該技術分野で長い間必要と感じられている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、脂肪幹細胞が懸濁されているポリマー網状構造で構成される組成物、並びに該組成物の製造方法、前記組成物を含んでなるキット、および疾患の治療におけるそれらの使用を提供する。
【００１１】
〔定義〕
本明細書の理解を容易にするために、本発明の文脈におけるいくつかの用語や語句の意味が以下に説明される。さらなる定義は必要に応じて明細書に沿って盛り込まれる。
【００１２】
本明細書で用いられる「マイクロカプセル化したASC」という用語は、最大寸法が約1μm−約1000μmでありかつ脂肪由来幹細胞と1種類以上の接着剤から構成される三次元構造体を意味するものと理解すべきである。
【００１３】
「接着剤」という用語は、脂肪由来幹細胞およびマイクロカプセル化したASCの任意の他の成分を一緒に保持する任意の薬剤を意味するものとする。
【００１４】
本明細書において「同種異系の」という用語は、同種の異なる個体由来であることを意味するものとする。１以上の遺伝子座に存在する遺伝子が同一でないとき、２以上の個体は互いに同種異系であるといわれる。
【００１５】
本明細書において「自己の」という用語は、同一の個体由来であることを意味するものとする。
【００１６】
本明細書において用いられる「フロー・フォーカシング」という表現は、流体力の応用と系の特定の形状を組み合わせて、必要な特性を有する断片を生成させるキャピラリー・フォーカシング系を表す。断片は、固化に適当な条件下で処理して、ナノおよびマイクロメートルサイズの球形をしており粒度分布が極めて狭くかつ再現性がある粒子を生じることがある。
【００１７】
「自己免疫疾患」という用語は、被検体のそれ自身の細胞、組織および／または器官（臓器）に対する免疫学的反応により引き起こされる細胞、組織および／または器官（臓器）損傷によって特徴付けられる被検体における疾患をいうものとする。本発明の免疫調節細胞で治療され得る自己免疫疾患の説明に役立つ、非制限的な実例としては、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック病（セリアックスプルー皮膚炎）、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、クレスト症候群、寒冷凝集素症、円板状ループス（紅斑性狼瘡）、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛  線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、Ｉ型または免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変症、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、サルコイドーシス、強皮症、全身性進行性硬化症、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス（紅斑性狼瘡）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎性血管炎等の血管炎、白斑、ウェゲナー肉芽腫症、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質症候群、神経系の自己免疫疾患、家族性地中海熱、ランバート・イートン筋無力症候群、交感性眼炎、多腺性内分泌障害、乾癬等が挙げられる。
【００１８】
「炎症性疾患」という用語は、慢性炎症等の炎症によって特徴付けられる被検体における疾患をいうものとする。炎症性疾患の説明に役立つ、非制限的な実例としては、セリアック病、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ぜんそく、脳炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性骨溶解、アレルギー性疾患、敗血症性ショック、肺線維症（たとえば、特発性肺線維症）、炎症性脈管炎（たとえば、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、高安動脈炎、側頭動脈炎およびリンパ腫様肉芽腫症）、外傷後血管形成術（たとえば、血管形成術後の再狭窄）、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、慢性肝炎、および慢性のウイルスのまたは細菌の感染の結果として生ずる慢性炎症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
「被検体」という用語は、動物、好ましくは非霊長類（たとえば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットまたはマウス）および霊長類（たとえば、サルまたはヒト）を含む哺乳類をいうものとする。好ましい実施態様において、被検体はヒトである。
【００２０】
本明細書において細胞表面マーカーに関して用いられる「陰性である」または「−」は、細胞集団において、２０％、１０％未満、好ましくは９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％未満の細胞が上記マーカーを発現しているか、または上記マーカーを発現する細胞がないことを意味するものとする。細胞表面マーカーの発現は、慣用の方法および装置（たとえば、市販の抗体および当技術分野で知られている標準プロトコルとともに用いられるべクトン・ディッキンソン  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒシステム）を用いて、たとえばある特定の細胞表面マーカーのためのフローサイトメトリーによって決定され得る。
【００２１】
本明細書において「脂肪幹細胞（本明細書において「ＡＳＣ」とも呼ばれる。）」という用語は、元々脂肪細胞由来の多能性細胞型を意味するものとする。「幹細胞」という用語は、連続的な分裂によって特殊化された細胞を生ずることができる細胞を意味するものとする。多能性幹細胞は、多様な種類の特殊細胞を生ずることができる。
【００２２】
本明細書において用いられるように、「埋設した」(本明細書では均一に分散したまたは懸濁したとも表される)という用語は、三次元構造体に関する脂肪幹細胞を指すときには、実質的な割合の細胞が三次元構造体の周囲のマスに封入されていることを意味するものとする。この空間的構成は、通常はこの三次元構造体が細胞を接着剤に懸濁したものを架橋することによって形成されるときに生じ、三次元構造体が形成された後にこの構造体に細胞を播種することによって得られる三次元構造体とは識別すべきものである。三次元構造体に封入されている細胞を指すときには、「実質的な割合」という用語は、細胞の少なくとも５%、少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、少なくとも９１%、少なくとも９２%少なくとも９３%、少なくとも９４%、少なくとも９５%、少なくとも９６%、少なくとも９７%、少なくとも９８%、少なくとも９９%またはそれ以上が三次元構造の平均細孔径より粒径が大きな試薬に接近することができないことを意味するものと理解すべきである。例えば、トリパンブルーで染色することができる細胞の割合を、三次元構造体の表面上にあるまたは三次元構造体中に封入/埋設している細胞の数の指示薬として用いることができる。
【００２３】
本明細書において「顕著な発現」という表現またはこれに相当する用語である「陽性である」および「＋」は、細胞集団において、２０％超、好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％超、またはすべての細胞が前記マーカーを発現していることを意味するものとする。
【００２４】
細胞表面マーカーの発現は、慣用の方法および装置（たとえば、市販の抗体および当技術分野で知られている標準プロトコルとともに用いられるべクトン・ディッキンソン  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒシステム）を用いて決定され、この方法および装置は、たとえばある特定の細胞表面マーカーを目的とするフローサイトメトリー、慣用の方法および装置（たとえば、市販の抗体および当技術分野で知られている標準プロトコルとともに用いられるべクトン・ディッキンソン  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒシステム）を用いたバックグランドシグナルを越えて特定の細胞表面マーカーに対するシグナルをフローサイトメトリーにおいて示す。上記バックグランドシグナルは、慣用のＦＡＣＳ解析において、それぞれの表面マーカーを検出するために用いられる特異抗体と同一のアイソタイプである非特異抗体によって与えられるシグナル強度として定義される。マーカーをポジティブと考えるには、観察される特異的シグナルは、通常の方法および装置（例えば、市販の抗体および当該技術分野で知られている標準的プロトコルと共に用いられるべクトン・ディッキンソン  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒシステム）を用いるバックグラウンドシグナル強度より２０％を超え、好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、５００％、１０００％、５０００％、１００００％以上強いものである。
【００２５】
本明細書において、患者または被検体に関して直接的に用いられるとき、「治療する」、「治療」および「治療用」という用語は、炎症性疾患、自己免疫性疾患または移植された臓器もしくは組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患を含むが、これらに限定されない、疾患に関連する一以上の症状の改善を意味するものとし、ここで、上記改善は上記治療を必要としている被検体に対する本発明の免疫調節細胞またはこれを含んでなる医薬組成物の投与に起因する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明による組成物
本発明者らは、ASCを架橋ポリマー性マトリックスにカプセル化すると、通常の保管方法と比較して細胞の貯蔵寿命が驚異的に増加する(3倍程度)ことを観察した。従って、一つの態様によれば、本発明は、最大寸法が約1μm−約1000μmでありかつ脂肪由来幹細胞および1種類以上の接着剤を含んでなる三次元構造体を提供する。本発明の構造体は、以下では「マイクロカプセル化したASC」とも表す。
【００２７】
前記接着剤はポリマーであるのが特に好ましく、最も好ましくは架橋ポリマー性網状構造である。前記接着剤がゲルであることも好ましい。特に好ましいものは、体積が流体によって膨張された弾性架橋ポリマー性網状構造から構成されるポリマーゲルである。
【００２８】
一つの態様によれば、前記マイクロカプセル化したASCは、更に脂肪幹細胞を含んでなる架橋ポリマー性網状構造を含んでなる。一つの態様によれば、前記ASCは、完全にまたは部分的に前記網状構造中に、または前記網状構造によって、カプセル化されている。脂肪由来幹細胞はポリマー性網状構造中に埋設されており、ポリマー微粒子の表面にはないことが特に好ましい。もう一つの態様では、前記ASCは、完全にまたは部分的に前記架橋ポリマー性網状構造の表面上に位置している。もう一つの態様では、前記マイクロカプセル化したASCは、更にASCを含んでなる前記第一の架橋ポリマー性網状構造を封入している第二の架橋ポリマー性網状構造を含んでなる。
【００２９】
マイクロカプセル化したASCの三次元構造体は、好ましくは最大寸法が約25μm−約500μmであり、更に好ましくは80μm−約200μmである。前記構造体は、形状が球形、円錐形、円筒形、管状、卵形、立方形、矩形、または不規則形状であることも好ましい。ASCは、前記構造中に実質的に均一に分散しているのも好ましい。前記ASCが前記構造中に懸濁しているのもまた好ましい。ポリマー性網状構造体は、ヒドロゲルまたは天然ポリマーであるのが好ましい。天然ポリマーとしては、炭水化物、タンパク質、核酸および/または脂質から構成されるものが挙げられ、それらのいずれかは合成的に製造してもよい。ポリマー性網状構造体は、1種類以上の炭水化物、好ましくはアルギン酸塩、キトサン、アガロース、並びにそれらの誘導体および配合物からなる群から選択されるものを含んでなることが特に好ましい。前記ポリマー性網状構造は、アルギン酸塩またはその誘導体を含んでなるのが更に好ましい。
【００３０】
原則として、ヒドロゲルを形成することができる任意のアルギン酸塩は、本発明による組成物での使用に適している。従って、組成物は、主にマヌロン酸(Mブロック)、グルクロン酸残基(Gブロック)またはマヌロン酸とグルクロン酸の混合物を示す領域(MGブロック)によって形成されるアルギン酸塩を含んでなることがある。様々なウロン酸の割合および分布は、アルギン酸塩の供給源によって変化し、アルギン酸塩の特性に寄与する。アルギン酸塩を得るための適当な供給源としては、Laminaria hyperborea、Letonia nigrescens、Lessonia trabeculata、Durvillaea antarctica、Laminaria digitata、Eclonia maxima、Macrocystis pyrifera、Ascophyllum nodosumおよび/またはLaminaria japonica並びに mixtures ofGG、MMおよびGMブロックの所望な含量が得られるように配合した様々な供給源からのアルギン酸塩の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。GGブロックはヒドロゲルの剛性に寄与し、一方、MMブロックは破断に対して大きな抵抗を示す。従って、アルギン酸塩ポリマーの適当な配合物を選択することによって、適当な弾性率を示し、同時に適当な取扱いおよび細胞固定ができるようにするのに十分に低い粘度を有する溶液を提供するアルギン酸塩を得ることができる。従って、本発明は、GGアルギン酸塩、MMアルギン酸塩、またはGG対MMアルギン酸塩の割当量が90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80または10:90のそれらの混合物の使用に関する。
【００３１】
あるいは、本発明は、アルギン酸塩構成ブロックを修飾することができる酵素で修飾した天然に存在するアルギン酸塩から得られたアルギン酸塩の使用に関する。従って、MブロックをGブロックに転換することができるC5−エピメラーゼ並びにMブロックをMGブロックに転換するAzotobacter vinelandii由来のAlgE4を用いてアルギン酸塩を処理することができる。更に、様々な種類の物理的処理、特にWasikiewicz, J.M. et al.によって報告されているγ線、超音波およびUV紫外線によって修飾されたアルギン酸塩を用いることが可能である(Radiation Physics and
Chemistry, 2005, 73:287−295)。
【００３２】
本発明で用いられるアルギン酸塩としては、FMC Protanal LF 10/60のようなGブロック65−75%とMブロック25−35%を含んでなるアルギン酸塩、およびFMC Protanal LF 10/60 LSのようなGブロック35−45%とMブロック55−65%を含んでなるアルギン酸塩が挙げられる。
【００３３】
ポリマー性網状構造体が1種類以上の炭水化物から構成されている場合には、ポリマー性網状構造体は1重量%を上回る量の炭水化物を含んでなるのが好ましい。一つの態様によれば、この量は、ポリマー溶液の約70重量%−約1重量%であり、あるいは前記量は約50%−約1%、または約30%−約1%、または約10%−約1%、または約5%−1%である。ポリマー性網状構造体は、炭水化物約1.05%−約1.25%を含んでなるのが特に好ましい。
【００３４】
一つの態様によれば、本発明によるマイクロカプセル化したASCは、更にマイクロカプセル化したASCを封入している第二のポリマー性網状構造体を含んでなる。上で定義したいずれの生物適合性ポリマーを、本発明の第二のポリマーとして用いてもよい。好ましい態様では、第二のポリマー性網状構造体は、キトサンまたはキトサン様材料である。ここで、キトサンとは、海洋甲殻類の殻や真菌の細胞壁に普通に見出される高分子量の、二番目に存在量の多い天然バイオポリマーである。キトサンは、β(1l−4)的に連結したグルコサミンとN−アセチルグルコサミンから構成される線状多糖類であり、グルコサミン/N−アセチルグルコサミン比はアセチル化度と呼ばれる。キトサンは、小エビの殻のキトサン(85%脱アセチル化)であることがある。キトサンは、制御放出工程を用いてヒドロゲルを形成するためのpH架橋することができる材料の一例である。キトサンのゾル−ゲル変化は、グルコサミン残基のC−2位における第一アミンの存在による。低pHでは、これらのアミンはプロトン化されて正に帯電しており、キトサンは水溶性のカチオン性高分子電解質である。高pH(約6.5を上回る)では、キトサンアミンは脱プロトン化し、ポリマーはその電荷を失って不溶性になる。ポリマー間会合(例えば、液晶ドメイン(液体 crystalline domains)または網状構造接合体)は、ヒドロゲルを形成する。
【００３５】
本発明によるマイクロカプセル化したASCは、それぞれ好ましくは総容積1ml当たり約20 x 106−約1 x 106の脂肪幹細胞を含んでなる。更に好ましい態様では、本発明による前記三次元構造体は、それぞれ好ましくは総容積1ml当たり約11 x 106−約5 x 106の脂肪幹細胞を含んでなる。
【００３６】
もう一つの態様によれば、本発明によるマイクロカプセル化したASCは、更に細胞生育力を保持しまたは促進する環境または薬剤を含んでなる。このような薬剤の例は当業者に知られており、適当な培地が挙げられるが、これらに限定されない。このような培地は、ダルベッコの改良イーグル培地(DMEM)、抗生物質(例えば、 100単位/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン)、グルタミン(例えば、約2mM)、ウシ胎児血清(FBS)、例えば、約2%−約20%の濃度を含んでいてもよい。培地および/または培地補給物の濃度を必要に応じて修正しまたは調節することは、当業者の技術の範囲内にある。細胞生育力を保持しまたは促進する他の一般に用いられる薬剤としては、ヒト血清、ヒト血清アルブミン(HSA)、FBS、ウシ血清(BS)、子ウシ血清(CS)、ウシ胎児血清(FCS)、新生子ウシ血清(NCS)、ヤギ血清(GS)、ウマ血清(HS)、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清およびラット血清(RS)などの血清が挙げられるが、これらに限定されない。細胞生育力を保持しまたは促進する他の一般に用いられる薬剤としては、抗生物質または抗糸状菌化合物、例えば、ペニシリン/ストレプトマイシン、アンホテリシン、アンピシリン、ゲンタマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシンおよびマイトマイシンのような抗微生物薬が挙げられるが、これらに限定されない。もう一つの態様では、前記薬剤は、D−アルドステロン、ジエチルスチルベストロール(DES)、デキサメタゾン、b−エストラジオール、ヒドロコルチゾン、インスリン、プロラクチン、プロゲステロンおよびソマトスタチン/ヒト生長ホルモン(HGH)のようなホルモンでよいが、これらに限定されない。
【００３７】
もう一つの態様によれば、本発明によるマイクロカプセル化したASCは、更に ASCを未分化形態に保持する環境または薬剤を含んでなる。このような薬剤の例は、当業者に知られている。
【００３８】
本発明によるマイクロカプセル化したASCの接着剤がポリマーゲルである場合には、前記ゲルの流体は、本明細書に記載の培地などこれらに限定されない細胞生育力を保持しまたは促進する薬剤を少なくとも約10重量%、20重量%含んでなるのが特に好ましい。
【００３９】
レシピエントに関し、本発明の方法において用いられるＡＳＣは、同種異型（ドナー）由来または自己（移植）（被検体）由来いずれのものでもよい。この方法の一つの実施形態において、上記ＡＳＣは同種異型由来のものである。
【００４０】
ASCは、任意の適切な起源の脂肪組織に由来し得るが、起源のなかでもっとも好ましいのはヒトである。上記細胞群は、好ましくは出生後の、非病的な哺乳類（たとえば、齧歯動物、霊長類）の起源から得られるのが好ましいが、特に好ましいのは、皮下脂肪組織または脂肪組織を結合した臓器（たとえば、心臓、肝臓、腎臓または膵臓）である。ASCは、好ましくは(i)APCに特異的なマーカーを発現せず、(ii)IDOを構成的に発現せず、(iii)IFN−γによる刺激によりIDOを発現し、(iv)少なくとも2つの細胞系に分化する能力を示すことを特徴とする。
【００４１】
ASCマーカー  ASCは、次のＡＰＣｓ系統のための特異的マーカーであるＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、およびＨＬＡＩＩの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または好ましくはすべてに対して好ましくは陰性である
【００４２】
更に、ASCは、次の細胞表面マーカー：ＣＤ３１、ＣＤ３４およびＣＤ１３３の少なくとも１つ、２つ、または好ましくはすべてに対して好ましくは陰性である。本明細書において、細胞表面マーカーに関して「陰性」であるとは、慣用の方法および装置（たとえば、市販の抗体および当技術分野で知られている標準プロトコルとともに用いられるベックマン・コールター  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ  ＦＡＣＳシステム）を用いて、ＡＳＣを含む細胞集団において、１０％未満、好ましくは９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％未満の細胞が、フローサイトメトリーにおいて、バックグランドシグナルを超える特定の細胞表面マーカーのためのシグナルを発現しているか、または当該シグナルを発現している細胞がないことを意味するものとする。特定の実施形態において、ＡＳＣは、それらが次の細胞表面マーカー：ＣＤ９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または好ましくはすべてを発現する、すなわちＡＳＣは上記細胞表面マーカー（ＣＤ９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９０およびＣＤ１０５）の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または好ましくはすべてに陽性である、という点で特徴づけられる。好ましくは、ＡＳＣは、それらが上記細胞表面マーカー（ＣＤ９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９０およびＣＤ１０５）の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または好ましくはすべてに顕著な発現レベルを有するという点で特徴づけられる。本明細書において、「顕著な発現」という表現は、慣用の方法および装置（たとえば、市販の抗体および当技術分野で知られている標準プロトコルとともに用いられるベックマン・コールター  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ  ＦＡＣＳシステム）を用いて、ＡＳＣを含む細胞集団において、１０％超、好ましくは２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％超、またはすべての細胞が、フローサイトメトリーにおいて、バックグランドシグナルを超える特定の細胞表面マーカーのためのシグナルを発現していることを意味する。上記バックグランドシグナルは、慣用のＦＡＣＳ解析において、各表面マーカーを検出するために用いられる特異抗体と同一のアイソタイプである非特異抗体によって与えられるシグナル強度として定義される。それゆえ、陽性と考えられているマーカーとして観測される特異的シグナルは１０％より強く、好ましくは２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、５００％、１０００％、５０００％、１００００％以上、慣用の方法および装置（たとえば、市販の抗体および当技術分野で知られている標準プロトコルとともに用いられるベックマン・コールター  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ  ＦＡＣＳシステム）を用いたバックグランドシグナル強度より強い。
【００４３】
場合によって、ＡＳＣは細胞表面マーカーＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）に対して陰性でもある。そのような細胞の例は、本明細書において、特定の脂肪組織由来間質幹細胞である。上記細胞表面マーカー（たとえば、細胞受容体および膜貫通タンパク）に対する市販のおよび知られているモノクローナル抗体をＡＳＣを同定するために使用することができる。
【００４４】
ＩＤＯの発現  本発明においてＡＳＣは構成的にＩＤＯを発現しないが、ＩＦＮ−γでの刺激に応答してＩＤＯを発現する。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）を５０ｎｇ／ｍｌの濃度で用い、またはエンドトキシン  ＬＰＳ（リポ多糖）を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で用い、インターロイキン−１（ＩＬ−１）等の他の消炎症メディエーターを３ｎｇ／ｍｌの濃度で用いて刺激した上記細胞群は、慣用のＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロット解析によって測定したところ、ＩＤＯ発現を誘導しなかった。たとえば３ｎｇ／ｍｌ以上のＩＦＮ−γを用いた刺激は、ＡＳＣでＨＬＡＩＩの発現をも誘導することができ、その結果ある細胞表面マーカーのための本明細書において定義する陽性シグナルを与える。上記発現は、特異的タンパクの発現の検出を可能とする任意の既知の技術を用いる当業者によって検出され得る。好ましくは、上記技術は細胞サイトメトリー技術である。
【００４５】
ASC分化  ASCは、好ましくは増殖して、少なくとも2、更に好ましくは3、4、5、6、7以上の細胞系に分化する能力を示す。ASCが分化することができる細胞系の説明用の非制限的例としては、骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、腱細胞、筋細胞、心筋細胞、造血支持間質細胞、内皮細胞、ニューロン、星状細胞、および肝細胞が挙げられる。ASCは、増殖して他の系の細胞に分化することができ、通常の方法によって誘導して増殖、分化することができる。分化細胞を同定した後、それらの未分化細胞から単離する方法は、当該技術分野で周知の方法によって行うことができる。
【００４６】
ASCは、エクス・ビボで拡張させることもできる。すなわち、単離後に、ASCを保持してエクス・ビボで培地中で増殖させることができる。このような培地は、例えば、抗生物質(例えば、100単位/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン)および2mMグルタミンを含みまたは抗生物質を含まず、2−20%ウシ胎児血清(FBS)を補足したダルベッコの改良イーグル培地(DMEM)から構成される。培地および/または培地補給物の濃度を必要に応じて修正しまたは調節することは、当業者の技術の範囲内にある。血清は、生育力および拡張に必要な細胞および非細胞因子および成分を含むことが多い。血清の例としては、FBS、ウシ血清(BS)、子ウシ血清(CS)、ウシ胎児血清(FCS)、新生子ウシ血清(NCS)、ヤギ血清(GS)、ウマ血清(HS)、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、ラット血清(RS)などが挙げられる。ASCがヒト起源のものであるときには、細胞培地にヒト血清、好ましくは自系起源のものの補足も考えられる。補体カスケードの成分を不活性化することが必要と思われるときには、血清を55−65℃で熱不活性化することができることは言うまでもない。血清濃度の調節、血清の培地からの回収を用いて、1種類以上の所望な細胞型の生存を促進することもできる。好ましくは、ASCは、約2%−約25%のFBS濃度から利益を得る。もう一つの態様では、ASCは、血清が、血清アルブミン、血清トランスフェリン、セレン、および当該技術分野で知られているインスリン、血小板由来の生長因子(PDGF)、および塩基性線維芽細胞生長因子(bFGF)などこれらに限定されない組換えタンパク質の組合せによって置換されている一定の組成の培地で拡張させることができる。
【００４７】
多くの細胞培地は、既にアミノ酸を含むが、幾つかは細胞を培養する前に補足を必要とする。このようなアミノ酸としては、L−アラニン、L−アルギニン、L−アスパラギン酸、L−アスパラギン、L−システイン、L−シスチン、L−グルタミン酸、L−グルタミン、L−グリシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
抗微生物薬は、典型的には細菌、マイコプラズマおよび真菌汚染を軽減する目的で細胞培養にも用いられる。典型的には、用いられる抗生物質または抗糸状菌化合物は、ペニシリン/ストレプトマイシンの混合物であり、アンフォテリシン（ファンギゾン、登録商標）、アンピシリン、ゲンタマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、マイトマイシンなども挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
ホルモンも細胞培養において有利に用いられ、D−アルドステロン、ジエチルスチルベストロール(DES)、デキサメタゾン、b−エストラジオール、ヒドロコルチゾン、インスリン、プロラクチン、プロゲステロン、ソマトスタチン/ヒト生長ホルモン(HGH)などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
ASCの保持条件は、細胞を未分化形態のままにする細胞因子を含むこともできる。分化の前に、細胞の分化を阻害する補給物を培地から除去しなければならないことは当業者には明らかである。総ての細胞がこれらの因子を必要とする訳ではないことも明らかである。実際に、これらの因子は、細胞型によっては望ましくない効果を誘発することがある。
【００５１】
本発明による組成物の製造方法
本発明は、微粒子の製造方法、または脂肪幹細胞の微粒子を得る方法を提供し、該方法は、
(i)  脂肪幹細胞の懸濁液と架橋可能なポリマーの溶液とを混合し、
(ii)  工程(i)で得た混合物を断片化し、
(iii)  工程(ii)で形成した断片を、架橋可能なポリマーの架橋ポリマー性網状構造への転換を促進するのに適切な条件下に置き、
(iv)  工程(iii)で得た粒子を回収する工程を含んでなる。
【００５２】
本発明による方法の工程(i)は、複数のASCをヒドロゲルを形成することができるポリマー溶液と接触または混合して、以後、前駆体溶液と呼ばれる混合物を形成し、前記前駆体溶液を三次元微細構造に成形することを含んでなる。本明細書で用いられる「前駆体溶液」という用語は、1種類以上のポリマーおよび/またはポリマー前駆体およびASCを含んでなる溶液を表す。
【００５３】
本発明による組成物に用いられるASCは、当該技術分野で知られている任意の方法を用いて単離することができる。一つの態様によれば、これは以下の工程を含む：
(i)  脂肪サンプルから細胞懸濁液を調製し、
(ii)  前記細胞懸濁液から細胞を回収し、
(iii)  細胞が固体表面に接着し、増殖することを許容する条件下で、適切な細胞培地中固体表面上で前記細胞をインキュベートし、
(iv)  インキュベーション後、非接着細胞を除くために上記固体表面を洗浄し、
(v)  前記培地で少なくとも２回継代された後、上記固体表面に接着したままの細胞を選別し、そして
(vi)  選別された細胞集団が目的の表現型を提示するか確認する。
【００５４】
本明細書で用いられる「固体表面」という用語は、ASCが接着することができる任意の材料を表す。特定態様では、前記材料は、その表面への哺乳類細胞の接着を促進するように処理した可塑性材料、例えば、場合によってはポリ−D−リシンまたは他の試薬をコーティングした市販のポリスチレンプレートである。
【００５５】
工程(i)−(vi)は、当該技術分野で知られている通常の手法によって行うことができる。簡単に説明すれば、ASCは、前記のような任意の適当な動物由来の結合組織の任意の適当な供給源から通常の手段によって得ることができる。典型的には、ヒト脂肪細胞は、外科的または吸引による脂肪切除術のようなよく認識されているプロトコルを用いて生きているドナーから得られる。実際に、脂肪吸引手続きは極めて広く行われているので、脂肪吸引流出液はASCを誘導することができる特に好ましい供給源である。従って、特定態様では、ASCは、脂肪吸引によって得られたヒト脂肪組織の間質画分由来のものである。
【００５６】
組織は、ASCを材料の残りから分離する目的で加工処理する前に洗浄するのが好ましい。1つの一般に用いられるプロトコルでは、組織の試料を生理学的に適合性の塩溶液(例えば、リン酸緩衝食塩水(PBS))で洗浄した後、激しく攪拌して沈澱させ、組織から遊離物質(例えば、損傷を受けた組織、血、赤血球など)を除去する段階である。従って、洗浄および沈澱段階は、一般的には上清に破片が比較的なくなるまで繰り返す。残っている細胞は、通常は様々なサイズの凝集塊凝集塊に含まれており、プロトコルは、細胞自身の損傷を最小限にしながら全体構造を分解する目的で決定した段階を用いて行われる。この目的を達成する1つの方法は、洗浄した細胞塊を細胞同士の結合を弱めまたは破壊する酵素(例えば、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、トリプシンなど)で処理することである。このような酵素処理の量および期間は用いる条件によって変化するが、このような酵素の使用は、当該技術分野で一般に知られている。このような酵素処理の代わりにまたはと共に、細胞塊は、機械的攪拌、音波エネルギー、熱エネルギーなどのような他の処理を用いて分解することができる。分解を酵素的方法によって達成するときには、適当な期間の後に酵素を中和して、細胞に対する有害な影響を最小限にすることが望ましい。
【００５７】
分解工程は、典型的には凝集細胞と通常は遊離の間質細胞(例えば、赤血球、平滑筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および幹細胞)を含む流体画分のスラリーまたは懸濁液を生じる。分離工程における次段階では、ASCから凝集細胞を分離する。これは、遠心分離によって行うことができ、これにより細胞は上清によって被覆されたペレットとなる。次いで、上清を廃棄し、ペレットを生理学的に適合性の流体に懸濁することができる。更に、懸濁した細胞は、典型的には赤血球を含んでおり、ほとんどのプロトコルではそれらを溶解するのが望ましい。赤血球を選択的にリーシスする方法は、当該技術分野で知られており、任意の適当なプロトコル(例えば、高張または低張性媒質でのインキュベーション、塩化アンモニウムを用いるリーシスなど)を用いることができる。勿論、赤血球をリーシスするときには、残りの細胞を例えば、濾過、沈殿法または密度分画化によって溶解物から分離すべきである。
【００５８】
赤血球がリーシスされているかどうかには関係なく、懸濁した細胞は1回以上連続的に洗浄し、再遠心分離し、再懸濁して、純度を高めることができる。あるいは、細胞は、細胞表面マーカープロフィールに基づいてまたは細胞サイズおよび粒度に基づいて分離することができる。
【００５９】
最終的単離および再懸濁の後、細胞を培養し、所望ならば、数および生育力を分析して収率を評価することができる。好ましくは、細胞は、適当な細胞密度と培養条件では、適当な細胞培地を用いて固体表面で分化することなく培養される。従って、特定態様では、細胞は、ペトリ皿または細胞培養フラスコのような通常は可塑性材料からなる固体表面で適当な細胞培地[例えば、典型的にはウシ胎児血清またはヒト血清などの適当な血清を5−15%(例えば、10%)補足したDMEM]の存在下で分化することなく培養され、細胞が固体表面に付着して増殖することができる条件下でインキュベーションされる。インキュベーションの後、細胞を洗浄して、非接着細胞および細胞断片を除去する。細胞を、適当なコンフルエンス、典型的には約70%、約80%または約90%の細胞コンフルエンスに達するまで、同一培地で同一条件下にて、必要ならば細胞培地を換えて培養を維持する。所望な細胞コンフルエンスに達した後、細胞は、トリプシンのような脱着剤を用い、新しい細胞培養表面に適当な細胞密度(通常は2,000−10,000個/cm2)で播種する連続継代によって拡張させることができる。従って、細胞を、次に前記培地中で分化させることなく、発生表現型を保持したまま少なくとも2回継代培養し、更に好ましくは、細胞を発生表現型を失うことなく少なくとも10回(例えば、少なくとも15回、または少なくとも20回)継代培養することができる。典型的には、細胞は、約100細胞/cm2−約100,000細胞/cm2(例えば、約500細胞/cm2−約50,000細胞/cm2、または更に詳細には約1,000細胞/cm2−約20,000細胞s/cm2)のような所望の密度で培養される。低めの密度(例えば、約300細胞/cm2)で培養すると、細胞は一層容易にクローニングにより単離することができる。例えば、数日後には、前記のような密度で培養した細胞は、均一な母集団に増殖する。特定態様では、細胞密度は2,000−10,000細胞/cm2である。
【００６０】
少なくとも2回の継代を含んでなる処理の後に固体表面に付着したままの細胞を選択し、目的とする表現型を通常の方法によって分析し、下記に説明されるようにしてASCの密度を確認する。第一継代の後に固体表面に付着したままの細胞は、異種起源のものであり、従って、前記細胞は少なくとももう1回継代しなければならない。前記の方法の結果、目的とする表現型を有する同種細胞母集団が得られる。少なくとも2回の継代後の固体表面への細胞の付着は、ASCを選択するための本発明の好ましい態様を構成している。目的とする表現型の確認は、通常の手段を用いることによって行うことができる。
【００６１】
好ましくは、前記拡張は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15または少なくとも20回の前記母集団の倍化または三倍化によって行われる。もう一つの態様では、前記拡張は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15または少なくとも20回の継代にわたって行われる。
【００６２】
細胞表面マーカーは、通常は陽性／陰性選択に基づく任意の適当な通常の手法によって同定することができ、例えば、細胞における存在/非存在を確認すべきである細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体を用いることができるが、他の手法を用いることもできる。従って、特定態様では、CD11b、CD11c、CD14、CD45、HLAII、CD31、CD34およびCD133の1、2、3、4、5、6、7個、好ましくは総てに対するモノクローナル抗体を用いて、選択された細胞における前記マーカーの非存在を確認し、またCD9、CD44、CD54、CD90およびCD105の1、2、3、4個、または好ましくは総てに対するモノクローナル抗体を用いて、それらの存在、または前記マーカーの少なくとも1個、好ましくは総ての検出可能な発現レベルを確認する。前記モノクローナル抗体は知られており、市販されているか、または当業者であれば通常の方法によって得ることができる。
【００６３】
選択された細胞におけるIFN−γ−誘発性IDO活性は、任意の適当な通常の分析法によって決定することができる。例えば、選択された細胞はIFN−γで刺激し、IDO発現について分析することができ、次に、IDOタンパク質発現について通常のウェスタンブロット分析を行うことができ、選択された細胞をIFN−γ刺激の後にIDO酵素活性を、例えば、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)分析と読み出しとしての上清におけるキヌレニン濃度の光度測定を用いてトリプトファン−キヌレニン転換によって測定することができる。ASCは一定条件下でIDOを発現するので、IFN−γ刺激後にIDO活性を検出することができる任意の適当な手法を用いてASCを選択することができる。産生するIDOの量は細胞数/cm2によって変化し、細胞数は好ましくは5000個/cm2以上のレベルであるが、この濃度に限定されず、IFN−γの濃度は、理想的には3ng/ml以上であるが、この濃度に限定されない。記載条件下で産生したIDOの活性により、24時間以上の後にはμM範囲でキヌレニンが検出可能なほどに産生する。
【００６４】
選択された細胞が少なくとも2つの細胞系へ分化する能力は、当該技術分野で知られている通常の方法によって分析することができる。
【００６５】
ASCは、所望ならば、細胞母集団をクローニングする適当な方法を用いてクローニングによって拡張することができる。例えば、増殖した細胞母集団を物理的に選択して、別々の表面(または多ウェルプレートのウェル)に播種することができる。あるいは、細胞を、それぞれのウェルに単一細胞を置きやすくするための統計比(例えば、約0.1−約1細胞/ウェル、更には約0.25−約0.5細胞/ウェル、例えば0.5細胞/ウェル)で多ウェルプレートにサブクローニングすることができる。細胞を、低密度(例えば、ペトリ皿または他の適当な基質中)で培養し、クローニングリングのような器具を用いてそれらを他の細胞から単離することによってクローニングすることができることは勿論である。クローン母集団の産生は、任意の適当な培地で拡張することができる。いずれにせよ、単離細胞は、それらの発生上の表現型を評価することができる適当な時点まで培養することができる。
【００６６】
分化の誘発なしのASCのエクス・ビボ拡張は、例えば、特別にスクリーニングした適当な血清(例えば、ウシ胎児血清またはヒト血清)のロットを用いることによって長時間行うことができる。生育力および収率を測定する方法は、当該技術分野で知られている(例えば、トリパンブルー色素排除法)。細胞本発明の細胞母集団の細胞を単離する段階および手続きはいずれも、所望な場合には手動で行うことができる。あるいは、このような細胞を単離する方法は、1以上の適当な器具であって、それらの例は当該技術分野で知られているものによって促進しおよび/または自動化することができる。
【００６７】
好ましくは、前記微細構造の形成は、前記前駆体溶液の架橋または重合によって行うことができる。好ましくは、前記ポリマー溶液は、1種類以上のポリマーおよび/またはポリマー前駆体を含んでなる。更に好ましくは、前記ポリマーは、架橋および重合によってヒドロゲルを形成するのに適するものである。ポリマー性網状構造が1種類以上の炭水化物を含んでなることが特に好ましい。前記炭水化物は、好ましくはアルギン酸塩、キトサン、アガロース、並びにそれらの誘導体および配合物からなる群から選択される。前記ポリマー性網状構造は、アルギン酸塩またはその誘導体を含んでなるのが更に好ましい。
【００６８】
ポリマー溶液におけるポリマーの量は、前駆体溶液の重合によってヒドロゲルを形成するのに十分なものとされる。一つの態様によれば、この量は、ポリマー溶液の約70%−約1重量%であり、あるいは前記量は約50%−約1%、または約30%−約1%、または約10%−約1%、または約5%−1%である。この方法の特に好ましい態様では、ポリマー溶液におけるポリマーの割合は約1.05%−約1.25%である。
【００６９】
ポリマー溶液は、炭水化物、タンパク質、核酸、脂質などの天然に存在するポリマーを含んでなることがあるが、これらに限定されない。好ましい態様では、前記ポリマーは、アルギン酸塩、キトサン、アガロース、並びにそれらの誘導体および配合物などの炭水化物であるが、これらに限定されない。前記ポリマーはアルギン酸塩であるのが好ましい。
【００７０】
前記前駆体溶液は、20 x 106−約1 x 106個/mlの脂肪幹細胞を含んでなる。更に好ましい態様では、前記前駆体溶液は、好ましくは約11 x 106−約5 x 106個/mlの脂肪幹細胞を含んでなる。前記ASCは、前駆体溶液中に均一に分布または懸濁していることも好ましい。
【００７１】
前駆体溶液は、更に細胞生育力を保持しまたは促進する追加の薬剤を含んでいてもよい。このような薬剤の例は、当業者に知られており、適当なASC培地が挙げられるが、これらに限定されない。このような培地は、ダルベッコの改良イーグル培地(DMEM)、抗生物質(例えば、100単位/mlペニシリンおよび100μg/mストレプトマイシン)、グルタミン(例えば、約2mMの濃度)、ウシ胎児血清(FBS)、例えば約2%−約20%の濃度のものが含まれる。培地および/または培地補給物の濃度を必要に応じて変更しまたは調節することは、当業者の技術の範囲内にある。細胞生育力を保持しまたは促進する他の一般に用いられる薬剤としては、ヒト血清、FBS、ウシ血清(BS)、子ウシ血清(CS)、ウシ胎児血清(FCS)、新生子ウシ血清(NCS)、ヤギ血清(GS)、ウマ血清(HS)、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清およびラット血清(RS)が挙げられるが、これらに限定されない。細胞生育力を保持しまたは促進する他の一般に用いられる薬剤としては、抗生物質または抗糸状菌化合物、例えば、ペニシリン/ストレプトマイシン、アンホテリシン、アンピシリン、ゲンタマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシンおよびマイトマイシンのような抗微生物薬が挙げられるが、これらに限定されない。もう一つの態様では、前記薬剤は、D−アルドステロン、ジエチルスチルベストロール(DES)、デキサメタゾン、b−エストラジオール、ヒドロコルチゾン、インスリン、プロラクチン、プロゲステロンおよびソマトスタチン/ヒト生長ホルモン(HGH)のようなホルモンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
もう一つの態様によれば、本発明によるマイクロカプセル化したASCは、更にASCを未分化形態に保持する環境または薬剤を含んでなる。このような薬剤の例は、当業者に知られている。
【００７３】
本発明による方法の工程(ii)は、工程(i)で得られた混合物の断片化を含んでなる。断片化工程は、任意の手段によって行うことができる。マイクロカプセル化細胞は当業者に知られており、適当にサイジングした型または前駆体溶液を好ましいサイズの断片に分散した後の重合の使用が挙げられる。細胞懸濁液から断片の形成は、静電ビーズ発生装置またはフロー・フォーカシングの使用など当該技術分野で知られている任意の方法を用いて行うことができる。しかしながら、好ましい態様では、本発明による組成物は、フロー・フォーカシングを用いて調製される。
【００７４】
フロー・フォーカシングの基礎となる基本的手法は、第一の流体を第二の流体によって加圧室へ導入するシステムを基礎とする。第一の流体は液体または気体であることができ、第二の流体は液体である。好ましくは、両流体は互いに十分に異なる液体であり、供給端から加圧室の出口点へ動く第一流体の、安定なマイクロジェットを外部に生成させることができるものである。気体−液体および液体−液体のいずれの可能な組合せも可能であるが、ASCは、第一の流体が加圧空気であり、第二の流体が架橋前のポリマー化合物を含んでなるASC懸濁液である気体−液体系を用いてマイクロカプセル化される。
【００７５】
マイクロジェットの形成、その促進および最終的な粒子の生成は、室を加圧する第一の流体の、加圧室の出口孔を通過するときの、急な加速による急激な圧力低下により生じることに基づいている。これによって、両流体間に高い圧力差が生じ、これは孔付近の第二の流体の表面において高い彎曲領域の出現をもたらし、孔が吸い込むのと同じ量の液体が供給されるならば、安定なマイクロジェットがそこから流れ出るピーク点が得られる。従って、加圧室における流体は、それをフォーカシングする第一の流体を取り巻き、直径が室の出口孔の直径よりずっと小さく、目詰まりせず、安定なマイクロジェットを生成する。
【００７６】
当業者であれば、フロー・フォーカシング手法の1以上のパラメーターを変更して生成する微粒子を最適にすることができることを理解するであろう。一例として、様々な粘度、フォーカシング流体およびフォーカシングした溶液の流速、供給端直径、出口孔の寸法などのフォーカシングされた細胞懸濁液を用いることができる。本発明によるフロー・フォーカシングの好ましい条件としては、フォーカシング気体の20ミリバール圧力およびフォーカシングした細胞懸濁液の流速65ml/時の流速が挙げられる。これらの条件下では、生成粒子の平均サイズは、約140μmである。
【００７７】
このシステムは、ほとんど総ての液体(動粘度10−4−1kg.m−1s−1)に適用して、供給管から生じるキャピラリーマイクロジェットが絶対的に安定でありかつ不安定なマイクロジェット解離工程が上流で生じないようにすることができる。下流において、マイクロジェットは、キャピラリー不安定性(例えば、Rayleigh著「ジェットの不安定性」Ｐｒｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  Ｍａｔｈ．Ｓｏｃ，４−１３，１８７８)によって規則的なサイズの断片に単純に壊れる。
【００７８】
マイクロジェットは流動している流体内部に生じ、それはマイクロジェットが予測したサイズの類似の断片に壊れるときにエマルションが生成することで生じる。既知の方法のによって溶媒を抽出/蒸発した後、フロー・フォーカシング理論によって予測されるように、ナノおよびマイクロメートルサイズの球形をしており粒度分布が極めて狭くかつ再現性がある粒子が得られる。
【００７９】
工程(iii)は、粒子を架橋可能なポリマー中で架橋形成に適する条件下に置くことを含んでなる。当業者であれば、架橋条件は、用いたポリマーの種類によって異なることを理解する。従って、ポリマーがアルギン酸塩であるときには、架橋は、断片をCa2+、Sr2+、Ba2+のような二価カチオンまたはポリ−L−リシンのようなポリマー性カチオンを含んでなる溶液中に入れることによって行われる。アルギン酸塩溶液のゲル化は、本質的に透析/拡散ゲル化法または内部ゲル化法によって行われる。所望ならば、二価イオンを錯体形成し、弱酸性条件下で錯体から徐々に放出されるようにする。ポリマーがアガロースであるときには、高温のアガロース溶液から温度を下げることによってゲル化が起こる。ポリマーがキトサンであるときには、溶液のpHを変更することによってゲル化が起こる。
【００８０】
本発明による方法の工程(iv)は、形成した微粒子の回収を含む。微粒子の回収は、遠心分離、濾過、浮選など当業者に知られている任意の方法によって行うことができる。
【００８１】
好ましい態様によれば、本発明によるマイクロカプセル化したASCを、更に架橋可能なポリマーの架橋に適当な条件下で追加の前記ポリマーと接触させることによって、マイクロカプセル化したASCを封入しているカプセルを形成することができる。好ましい態様によれば、第二の架橋可能なポリマーはキトサンである。
【００８２】
本発明によるマイクロカプセル化したASCは、好ましくは密封した保管容器のような封入環境に保管される。マイクロカプセル化したASCの保管に適当な密封性容器は、当該技術分野で知られている。好ましくは、密封容器中のマイクロカプセル化したASCは、気体環境に保持されている。密封容器中のマイクロカプセル化したASCが気体環境に保持されている場合には、前記環境が本質的に二酸化炭素または空気(好ましくは、医薬品質)から構成されているのが好ましい。好ましくは、マイクロカプセル化細胞は、約4℃−約25℃の温度に保持され、もう一つの態様によれば、前記マイクロカプセル化細胞は室温で保管されることがある。従って、本発明は、本発明によるマイクロカプセル化細胞を含む密封容器を提供する。この方法の一つの態様によれば、前記容器は約105−約109個のASCを含む。この方法の一態様では、前記容器は約105−約108個のASCを含む。この方法の一態様では、前記容器は約106−約107個のASCを含む。
【００８３】
好ましい態様によれば、マイクロカプセル化細胞に含まれるASCは、任意の適当な溶媒または他の薬剤によって前記細胞から解離させることができる。好ましくは、前記薬剤はEDTAおよび/またはクエン酸ナトリウム二水和物である。簡潔にのべれば、ASCは、ポリマーを溶解、減成あるいは分解してそこからASCを解離させかつASCを放出するのに十分な条件下で、マイクロカプセル化細胞を適当な溶媒または薬剤と接触させることによって解離させることができる。場合によっては、溶媒は、混合しあるいは物理攪拌して、前記解離を助けることができる。次いで、解離したASCを、遠心分離、濾過、浮選など当業者に知られている標準的手段によって混合物から単離することができる。
【００８４】
もう一つの態様によれば、本発明は、本発明による方法を用いて調製したASCを含んでなる微粒子に関する。微粒子を含んでなるポリマー性網状構造タイプに関する更なる詳細は、本発明による組成物に関するときには第二のポリマー性網状構造が詳細に記載されており、本発明による方法によって得られた微粒子にも応用可能である。
【００８５】
本発明による組成物の医療用途
本発明による三次元構造体またはマイクロカプセル化したASC、またはそこから解離したASCを用いて、疾患状態に関連した1種類以上の症状を予防し、治療しまたは改善することができる。 これらのものとしては、創傷治癒、組織損傷、アレルギー反応、免疫疾患、自己免疫疾患、免疫介在疾患、炎症性疾患、慢性炎症性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。前記の使用は、本発明のもう一つの態様を構成する。
【００８６】
従って、別の態様によれば、本発明によるマイクロカプセル化したASCまたはそこから解離したASCは、薬剤として用いられる。特定態様では、本発明によるマイクロカプセル化したASCまたはそこから解離したASCから構成される薬剤を用いて、移植免疫寛容を誘発し、または自己免疫または炎症性疾患の症状、または前記障害または疾患のいずれかに罹っている患者における移植臓器および組織の拒絶反応などの免疫介在疾患を治療することによって緩和することができる。従って、本発明によるマイクロカプセル化したASCまたはそこから解離したASCを用いて、免疫、自己免疫または炎症性疾患のいずれかに罹っている患者の前記疾患の症状を治療的または予防的に治療することによって緩和し、または前記疾患に罹っている患者の免疫介在疾患の症状を緩和することができる。
【００８７】
本発明によるマイクロカプセル化したASCまたはそこから解離したASCは、自己免疫疾患、炎症性疾患または免疫介在疾患の治療に有用である。治療することができる前記疾患および障害の説明用の非制限的例は、「定義」という見出しで前記したものである。特定態様では、前記炎症性疾患は、例えば、セリアック病、多発性硬化症、乾癬、IBDまたはRAなどの慢性炎症性疾患である。もう一つの態様では、本発明は、自己免疫疾患、炎症性疾患、および移植臓器および組織の拒絶反応などの免疫介在疾患などそれらに限定されない患者の免疫系の調節が有益な疾患に関連した1種類以上の症状を予防し、治療しまたは改善するための薬剤を調製する目的での本発明によるマイクロカプセル化したASCまたはそこから解離したASCの使用に関する。従って、本発明は、免疫反応を抑制し、または移植免疫寛容を誘発し、または自己免疫疾患を治療し、または炎症性疾患を治療するための薬剤の調製を目的とする本発明によるマイクロカプセル化したASCまたはそこから解離したASCの使用にも関する。前記自己免疫疾患および炎症性疾患の例は、以前に報告されている。特定態様では、疾患は、慢性炎症性疾患、例えば、セリアック病、多発性硬化症、乾癬、IBDまたはRAのような炎症性疾患である。
【００８８】
本発明は、患者の免疫系の調節が有益な疾患に関連した1種類以上の症状の治療、予防および改善を目的とする医薬組成物を提供する。これらには、自己免疫疾患、炎症性疾患、および移植臓器および組織の拒絶反応などの免疫介在疾患が含まれる。
【００８９】
従って、もう一つの態様では、本発明は、本発明によるマイクロカプセル化したASCまたはそこから解離したASC、および薬学担体を含んでなる医薬組成物に関する。もう一つの態様では、 本発明は、ASCおよび/または本発明によるマイクロカプセル化したASCまたはそこから解離したASC、および薬学担体を含んでなる医薬組成物を提供する。
【００９０】
本発明による医薬組成物は、1種類以上の予防または治療薬(すなわち、本発明によるマイクロカプセル化したASCまたはそこから解離したASC)の予防または治療上有効量と薬学担体を含んでなる。上記有効量は、投薬単位形態（剤形）、投与法、および当技術分野において知られている他の因子に依存する。
【００９１】
適切な医薬担体は当技術分野において知られており、好ましくは、動物における、および特にヒトにおける使用に対して、米連邦もしくは州政府の管理機関によって承認されているもの、または合衆国もしくは欧州薬局方、もしくは他の一般に認められている薬局方に収載されているものである。「担体」という用語は、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルをいい、これらとともに治療薬が投与される。組成物は、望まれるならば、少量のｐＨ緩衝剤を含むこともできる。適切な医薬担体の例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｅ  Ｗ  Ｍａｒｔｉｎ著）に記載されている。そのような組成物は、予防的にまたは治療的に有効な量の予防薬または治療薬を、好ましくは精製された形態で、適量の担体とともに含んでおり、その結果被検体に適正な投与形態を提供する。剤形は、投与方法に適合するべきである。好ましい実施形態によれば、医薬組成物は滅菌されており、被検体、好ましくは動物被検体、より好ましくは哺乳類被検体、最も好ましくはヒト被検体への投与のために適合した形態にある。
【００９２】
本発明の医薬組成物は様々な形態であることができる。これらの形態としては、たとえば、固体、半固体および液体の剤形、たとえば凍結乾燥製剤、液剤または懸濁剤、注射剤および浸剤等が挙げられる。好ましい形態は、目的とする投与方法および治療用途に依存する。
【００９３】
もう一つの態様では、本発明は、本発明によるマイクロカプセル化したASCまたはそこから解離したASC、または本明細書に開示された医薬組成物を、疾患状態に関連した1種類以上の症状の予防、治療または改善に有効な量で投与することによる、治療を必要とする患者の治療方法を提供する。
【００９４】
もう一つの態様では、 本発明は、本発明によるマイクロカプセル化したASCまたはそこから解離したASCを、疾患に関連した1種類以上の症状の予防、治療または改善に有効な量で投与することによる、治療を必要とする患者の治療方法を提供する。本発明によるマイクロカプセル化したASCまたはそこから解離したASC、または本発明による医薬組成物の投与を必要とする患者への投与は、通常の手段によって行うことができる。特定態様では、前記細胞母集団は、本発明によるマイクロカプセル化したASCまたはそこから解離したASCを所望な組織へのイン・ビトロ(例えば、内移植または移植前の移植片として)またはイン・ビボでの、またはイン・シテューでの組織への移動を含む方法によって患者に投与される。本発明によるマイクロカプセル化したASCまたはそこから解離したASCは、任意の適当な方法によって所望な組織に移動させることができ、この方法は、一般的には組織型によって変化する。例えば、細胞は、細胞を含む培地に移植片を浸すことによって移植片に移動させることができる。あるいは、細胞を組織内の所望な部位に播種して、母集団を形成することができる。本発明によるマイクロカプセル化したASCまたはそこから解離したASCは、例えば、細胞懸濁液の点滴によって全身投与することもできる。本発明によるマイクロカプセル化したASCまたはそこから解離したASCは、カテーテル、トロカール、カニューレ、ステント(細胞を播種することができる)などの器具を用いてイン・ビボでの部位に移動させることができる。
【００９５】
本発明によるマイクロカプセル化したASC、そこから解離したASCおよび本発明による医薬組成物を、併用療法に用いることができる。特定態様では、併用療法は、1種類以上の抗炎症薬に無反応性の炎症性疾患の患者に投与される。もう一つの態様では、併用療法は、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、ステロイド性抗炎症薬、β−作動薬、抗コリン作動薬、およびメチルキサンチンなどこれらに限定されない他の型の抗炎症薬と共に用いられる。NSAIDの例としては、イブプロフェン、セレコキシブ、ジクロフェナック、エトドラック、フェノプロフェン、インドメタシン、ケトララック、オキサプロジン、ナブメントン、スーンダック(suhndac)、トルメチン、ロフェコキシブ、ナプロキセン、ケトプロフェン、ナブメトンなどが挙げられるが、これらに限定されない。このようなNSAIDは、シクロオキシゲナーゼ酵素(例えば、COX−Iおよび/またはCOX−2)を阻害することによって機能する。ステロイド性抗炎症薬の例としては、糖質コルチコイド、デキサメタゾン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、トリアンシノロン、アズルフ[イオタ]ジン(azulf[iota]dine)、およびトロンボキサンのようなエイコサノイド、およびロイコトリエンが挙げられるが、これらに限定されない。インフリキシマブのようなモノクローナル抗体も、用いることができる。
【００９６】
上記実施形態において、本発明の併用療法は、そのような抗炎症薬の投与の前に、と同時に、または後に用いられる。さらに、そのような抗炎症薬は、本明細書でリンパ組織誘導細胞および/または免疫調節薬としての特徴を有する薬剤を包含しない。
【００９７】
もう一つの態様では、本発明は、自己免疫疾患、炎症性疾患、および移植臓器および組織の拒絶反応などの免疫介在疾患などこれらに限定されない患者の免疫系の調節が有益な疾患に関連した1種類以上の症状の予防、治療または改善を目的とする医薬組成物または薬剤を調製または製造するための、本発明によるマイクロカプセル化したASCまたはそこから解離したASCの使用に関する。
【００９８】
本発明によるキット
別の態様によれば、本発明は、ASC療法による患者の治療で使用するキットを提供する。一つの態様によれば、前記キットは、i)本発明によるマイクロカプセル化したASC、およびii)前記のマイクロカプセル化したASCから、ASCを解離するための薬剤を含んでなる。前記薬剤は、好ましくはEDTAおよび/またはクエン酸ナトリウム二水和物である。
【００９９】
一つの態様によれば、前記キットは、i)本発明によるマイクロカプセル化したASCまたはそこから解離したASCまたは本発明による医薬組成物と、ii)前記細胞を投与するための器具を含んでなる。 前記器具としては、注射器、注入器具、カテーテル、トロカール、カニューレおよびステントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
一つの態様によれば、前記キットは、i)本発明によるマイクロカプセル化したASC、ii)前記マイクロカプセル化したASCからASCを解離させるための薬剤(前記薬剤は、好ましくはEDTAおよび/またはクエン酸ナトリウム二水和物)、およびiii)前記細胞を投与するための器具を含んでなる。前記器具としては、注射器、注入器具、カテーテル、トロカール、カニューレおよびステントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
本発明によるキットで提供されるマイクロカプセル化したASCは、好ましくは本質的に空気(好ましくは医薬品質)または二酸化炭素を含んでなる環境において密封容器中に含まれる。
【０１０２】
もう一つの態様によれば、本発明によるキットは、患者の治療に使用するための使用説明書を含んでなる。
【０１０３】
本発明によるマイクロカプセル化したASC、そこから解離したASC方法、本発明による医薬組成物およびキットは、患者の免疫系の調節が有益な疾患状態に関連した1種類以上の症状の予防、治療または改善に用いることができる。これらの疾患としては、自己免疫疾患、炎症性疾患、および移植臓器および組織の拒絶反応などの免疫介在疾患が挙げられる。これらのものとしては、組織損傷、アレルギー性反応、免疫疾患、自己免疫疾患、免疫介在疾患、炎症性疾患、慢性炎症性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。このような疾患の具体例は、「定義」の節に開示されている。前記使用は、本発明の追加の態様を構成する。
【実施例】
【０１０４】
本発明を、下記の実施例で更に説明するが、本発明はそれらの例に限定されるものではない。
【０１０５】
実施例１
ASCの調製
脂肪組織を脂肪吸引によって得た。平滑末端を有するカニューレを、小臍周切開(直径0.5cm未満)により皮下に導入した。腹壁下に位置した脂肪組織区画に沿ってカニューレを移動させることによって吸引を行い、脂肪組織の機械的崩壊を促進した。血液の損失を最小限に抑えるため、塩水およびエピネフリン溶液を血管収縮薬として注射した。80〜100mlの脂肪吸引細胞を、この手法を用いてそれぞれの患者から得た。
【０１０６】
次に、脂肪吸引液を、リン酸および塩類溶液(PBS)で洗浄した。次いで、脂肪組織を、コラゲナーゼII型の塩類溶液(5 mg/ml)と共に細胞外マトリックスを37°で30分間消化することによって崩壊させ、細胞画分を放出した。コラゲナーゼを、等容の10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地を加えることによって不活性化した。細胞懸濁液を250gで10分間遠心分離し、細胞沈澱物を得た。細胞を、10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地に再懸濁した。NH4Clを0.16Mの最終濃度で加え、細胞を室温で10分間インキュベーションし、含まれている赤血球をリーシスした。懸濁液250−400gで遠心分離し、1%アンピシリン−ストレプトマイシンを含むDMEM−10% FBSに再懸濁した。最後に、細胞を、20−30,000細胞/cm2の割合で皿に接種した。
【０１０７】
細胞を、5% CO2を含む雰囲気で37°にて20−24時間培養した。24時間インキュベーションした後、皿をPBSで洗浄して、付着しなかった細胞および細胞残存物を除去した。
【０１０８】
実施例２
フロー・フォーカシング
1%(w/v)アルギン酸塩溶液から約50−250μmの均一粒径の微粒子を得る目的で、最適圧力および流速条件を決定するための実験を行った。実験は、Protanal LF 10/60 (FMC)、Protanal LF 10/60S LS (FMC)およびFLUKAアルギン酸塩を用いて、いずれも15(w/v)で行った。溶液の粘度および表面張力は表1に示されるとおりであった。
【０１０９】
【表１】
2012512846.tif 000002
【０１１０】
フロー・フォーカシングは、本体、プレートおよびキャピラリー(capilar)を有するAVANTネブイライザーを用いて行った。このネブライザーの本体は、キャピラリーに接続されている室であって、このキャピラリーを通ってフォーカシングされる流体が室にはいるものと、フォーカシング流体(医薬品級加圧空気)が室に入るのに通るポリマー性材料のチューブとを含んで構成される。次いで、フロー・フォーカシングを、様々なフォーカシング流体の圧力およびフォーカシング溶液の流速で行った。粒子の粒径をImage Jによって決定した後、予想直径と比較した。結果は表2に示されるとおりであった。
【０１１１】
【表２】
2012512846.tif 000003
【０１１２】
実施例３
アルギン酸塩微粒子でのASCのマイクロカプセル化
ASC細胞を培養皿から取り出して、遠心分離し、5%ヒト血清アルブミン(HSA)を含むDMEM−Hepesに再懸濁し、最終的濃度を20%(v/v)とした。次に、細胞懸濁液1.15%(w/v)ポリマー性アルギン酸塩分散液(PRONOVA
UP LVG)に再懸濁し、混合物をフロー・フォーカシング装置に加えた。生成する微粒子を、次に3%(w/v)塩化カルシウム溶液中で15分間攪拌した。試料中の細胞の濃度は、5x106個/mlであった。
【０１１３】
実施例４
キトサンコーティングした微粒子でのASCのマイクロカプセル化
実施例3で調製した細胞を、次に300rpmでの遠心分離し、PBSで洗浄した。粒子を0.5%(w/v)キトサン溶液中で2分間攪拌しながらインキュベーションした。
【０１１４】
実施例５
微粒子からASCの放出
カルシウムの存在下でアルギン酸塩でカプセル化した微粒子を、2%(w/v)クエン酸塩溶液で数秒間処理した。この処理は、0.1%(w/v)アルギン酸塩(0.8%(w/v)最終的濃度)を用いて得た粒子並びに1.15%(w/v)(0.9%(w/v)最終的濃度)を用いて得た粒子で有効であった。
【０１１５】
キトサンをコーティングしたマイクロカプセルを、2%、3%および5%(w/v)クエン酸塩溶液を用いて様々な時間(0'、2'、5'、10'、20'および30')処理した。キトサンコーティングしたアルギン酸塩粒子におけるASCは、クエン酸塩の存在下ではクエン酸塩濃度およびインキュベーション時間を最高にしても放出することはできなかった。細胞生育力は、Trypan Blueが粒子の内部に拡散しないので、評価することができなかった。
【０１１６】
実施例６
キトサン−アルギン酸塩またはアルギン酸塩中のマイクロカプセル化細胞の安定性
実施例2と同様にして得られたアルギン酸塩中でマイクロカプセル化した細胞または実施例3と同様にして得られたアルギン酸塩中でカプセル化して様々な濃度のキトサン(0.1%(w/v)または0.2%(w/v))でコーティングした細胞を、空気雰囲気中様々な粒子濃度(30%(v/v)または10%(v/v))で22 ℃に最長26日間保持した。
【０１１７】
微粒子を光学顕微鏡法によって観察し、粒子の形状および粒径、細胞カプセル化の効率、およびマイクロカプセル化細胞の生育力を決定した。細胞生育力は、遠心分離およびPBSによる洗浄段階により粒子を回収した後のゲル化段階の直後にTrypan Blue染色を用いて直接測定した。
【０１１８】
様々な保管条件における生長可能な細胞の割合を、表3および4に示す。
【０１１９】
【表３】
2012512846.tif 000004
【０１２０】
【表４】
2012512846.tif 000005
【０１２１】
キトサンが含まれていると、キトサン中に保持されていなかった細胞と比較して、細胞生育力が向上する。
【０１２２】
培地濃度を高くする(粒子/培地比を低くする)と、特に、培地が限定的であるときには10日間の保管移行の生育力が若干改善する。
【０１２３】
様々な試験した細胞濃度では、生育力に実質的な差は見られなかった。しかしながら、キトサンが含まれていると、高細胞濃度に関連した微粒子の脆性が低下する。この効果は、試験した最低キトサン濃度でも明らかである。
【０１２４】
様々な保管条件を比較して、マイクロカプセルが0.1%キトサンでコーティングされ、高細胞密度を含み、22℃の温度でCO2雰囲気中で保管するときに、最良の生育力の結果が見られる。
【０１２５】
温度は、粒子の安定性に影響するとは思われないが、細胞生育力には劇的に影響する。4℃でカプセル化して保管した細胞の100%が、カプセル化の7日後に死滅した。22℃で保管した細胞は、同じ期間で60−75%の生育力比を示し、19日後には約45%である。
【０１２６】
異なる大気(空気およびCO2)は、マトリックス安定性に影響しないが、CO2中における細胞生存は、特に培地が未だ限定的でないときには、第一週中に若干高くなる。
【０１２７】
ゲル化段階中のキトサンの使用は、保管時間が短ければ細胞生育力に影響しない。しかしながら、10日以後は、影響が大きくなる。
【０１２８】
キトサンコーティング(0.1%(w/v))の使用は、長期保管後の微粒子安定性に関してカルシウムイオンコーティングと比較して若干有利であると思われる。
【国際調査報告】
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