(57)【要約】  本発明のいくつかの実施態様は、マイクロＲＮＡ（これは、マイクロＲＮＡ−１２４、マイクロＲＮＡ−１３７及び／又はマイクロＲＮＡ−９＊を含むが、これらに限定されない）、これらのマイクロＲＮＡの発現産物、及びこれらのマイクロＲＮＡの機能的要素を含む分子及び組成物の適用を通じて多能性ストローマ細胞のニューロン分化をインビトロ又はインビボのいずれにおいても選択的に誘導する方法、システム及び組成物を含む。また、本発明のいくつかの実施態様は、哺乳動物の損傷及び疾患（これらは、減少された細胞又はシステム機能を生じうる神経系の損傷又は疾患を含むが、これらに限定されない）を治療するためのかかる誘導された細胞の治療的投与及び使用を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むことを特徴とする、哺乳動物からの多能性ストローマ細胞のニューロン分化を刺激する方法：
マイクロＲＮＡ−１２４を含む組成物を準備する工程；及び
多能性ストローマ細胞の哺乳動物集団におけるニューロン分化を刺激するために前記組成物の医薬的に有効な量を前記集団に投与する工程。
【請求項２】
哺乳動物がヒトであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下の工程を含むことを特徴とする、哺乳動物からの多能性ストローマ細胞のニューロン分化を刺激する方法：
マイクロＲＮＡ−１３７を含む組成物を準備する工程；及び
多能性ストローマ細胞の哺乳動物集団におけるニューロン分化を刺激するために前記組成物の医薬的に有効な量を前記集団に投与する工程。
【請求項４】
哺乳動物がヒトであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
以下の工程を含むことを特徴とする、哺乳動物からの多能性ストローマ細胞のニューロン分化を刺激する方法：
マイクロ−ＲＮＡ９＊を含む組成物を準備する工程；及び
多能性ストローマ細胞の哺乳動物集団におけるニューロン分化を刺激するために前記組成物の医薬的に有効な量を前記集団に投与する工程。
【請求項６】
哺乳動物がヒトであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物の多能性ストローマ幹細胞のニューロン分化を刺激するための医薬におけるマイクロＲＮＡ−１２４の使用。
【請求項８】
哺乳動物がヒトであることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
哺乳動物の間葉幹細胞のニューロン分化を刺激するための医薬におけるマイクロＲＮＡ−１３７の使用。
【請求項１０】
哺乳動物がヒトであることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
哺乳動物の多能性ストローマ幹細胞のニューロン分化を刺激するための医薬におけるマイクロＲＮＡ−９＊の使用。
【請求項１２】
哺乳動物がヒトであることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
以下の工程を含むことを特徴とする、神経系の損傷又は疾患に罹患している哺乳動物を治療する方法：
多能性ストローマ細胞をインビトロでマイクロＲＮＡ−１２４、マイクロＲＮＡ−１３７又はマイクロＲＮＡ−９＊のそれぞれに、又はこれらの組み合わせに暴露することによって前記細胞のニューロン分化を刺激する工程；及び
かかるニューロン分化した細胞を哺乳動物に投与する工程。
【請求項１４】
哺乳動物がヒトであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
以下の工程を含むことを特徴とする、神経系の損傷又は疾患に罹患している哺乳動物を治療する方法：
多能性ストローマ細胞をインビトロでマイクロＲＮＡ−１２４、マイクロＲＮＡ−１３７又はマイクロＲＮＡ−９＊のそれぞれで、又はこれらの組み合わせでトランスフェクトする工程；及び
かかるトランスフェクトされた細胞を哺乳動物に投与する工程。
【請求項１６】
哺乳動物がヒトであることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
以下の工程を含むことを特徴とする、神経系の損傷又は疾患に罹患している哺乳動物を治療する方法：
多能性ストローマ細胞を、マイクロＲＮＡ−１２４、マイクロＲＮＡ−１３７又はマイクロＲＮＡ−９＊のそれぞれを、又はこれらの組み合わせをコードする一種以上のヌクレオチドを含むベクターでトランスフェクトする工程、ただし、ベクター中でのかかるヌクレオチドの発現はプロモーターによって誘導可能である；
かかるトランスフェクトされた細胞を哺乳動物に投与する工程；及び
プロモーターを哺乳動物に投与することによって哺乳動物内でのヌクレオチドの発現を誘導し、マイクロＲＮＡ−１２４，マイクロＲＮＡ−１３７又はマイクロＲＮＡ−９＊を生産させる工程。
【請求項１８】
哺乳動物がヒトであることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の特定の実施態様は、限定されないが、哺乳動物の神経系の損傷及び疾患の治療のための細胞タイプの誘導及び適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
中枢神経系又は末梢神経系を冒す特定の神経系損傷、自己免疫疾患、及び神経変性疾患は、特定の細胞の喪失、又は既存の神経細胞の異常な機能によって特徴付けられ、これらは、様々な神経学的徴候及び症状を患者に発現させ、そして神経機能の潜在的に不可逆的な喪失を生じる。一例として、ある患者は、発作、脊髄損傷、又は他の神経損傷、及び機能的細胞タイプの変性経験喪失、又はパーキンソン病やアルツハイマー病のような神経学的症状に罹患し、それらは、全身機能の喪失又は全身機能の異常を生じる。かかる細胞及び全身機能を治療して回復させるための現在の治療選択肢は、限られている。従って、失われた又は損傷された神経系細胞、組織及び機能を置換することに向けられた治療を含む方法、システム、及び付加的な治療を促進する組成物に対する要求が存在する。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書に記載された実施態様のみに限定されることなしに、及び棄権することなしに、本発明のいくつかの実施態様は、マイクロＲＮＡ（これは、マイクロＲＮＡ−１２４、マイクロＲＮＡ−１３７及び／又はマイクロＲＮＡ−９＊を含むが、これらに限定されない）、これらのマイクロＲＮＡの発現産物、及びこれらのマイクロＲＮＡの機能的要素を含む分子及び組成物の適用を通じて多能性ストローマ細胞のニューロン分化をインビトロ又はインビボで選択的に誘導する方法、システム及び組成物を含む。また、本発明のいくつかの実施態様は、哺乳動物の損傷及び疾患（これらは、減少した細胞又は全身機能を生じる神経系損傷又は疾患を含むが、これらに限定されない）を治療するための、かかる誘導された細胞の治療投与及び使用も含む。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
以下、添付の図面を参照して、本発明のいくつかの実施態様が、例示の目的のためのみに、及び他の実施態様を棄権することなしに記述される。
【０００５】
【図１】図１は、成長因子で処理された又はコントロールのマイクロＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ-１２４又はマイクロＲＮＡ−１３７で３，５及び９日間トランスフェクトされたＭＳＣの明視野像を示す。
【０００６】
【図２】図２は、マイクロＲＮＡ−１２４、マイクロＲＮＡ−１３７及びマイクロＲＮＡ−９＊がＭＳＣにおいてニューロンマーカーを誘導することを示すデータ表示である。
【０００７】
【図３】図３は、試験されたマイクロＲＮＡでの細胞のトランスフェクション又はＤＭＥＭでの細胞の処理後のウェスタンブロットの結果を示す。
【０００８】
【図４】図４は、コントロールのマイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ−１２４又はマイクロＲＮＡ−１３７での脂肪及び臍帯由来のＭＳＣのトランスフェクションの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書に記載された実施態様のみに限定されることなしに、及びいかなる実施態様も棄権することなしに、本発明のいくつかの実施態様は、マイクロＲＮＡ（これは、マイクロＲＮＡ−１２４及び／又はマイクロマイクロＲＮＡ−１３７及び／又はマイクロＲＮＡ−９＊を含むが、これらに限定されない）、これらのマイクロＲＮＡの発現産物、及びこれらのマイクロＲＮＡの機能的要素を含む分子及び組成物の適用を通じて多能性ストローマ細胞（ＭＳＣ）のニューロン分化をインビトロ又はインビボで選択的に誘導する方法、システム及び組成物を含む。また、本発明のいくつかの実施態様は、哺乳動物の損傷及び疾患（これらは、減少した細胞又は全身機能を生じる神経系損傷又は疾患を含むが、これらに限定されない）を治療するための、かかる誘導された細胞の治療投与及び使用も含む。いくつかの実施態様では、分化したＭＳＣのかかる誘導、及び／又は結果として生じた細胞は、治療的に有効な量の関心のあるマイクロＲＮＡ又はかかるマイクロＲＮＡによって誘導された分化したＭＳＣを患者に投与することによって、前記患者における細胞、組織又は器官損傷を治療するために使用することができる。
【００１０】
我々は、特定のマイクロＲＮＡが、神経系の損傷及び疾患（これには、神経変性障害及び脊髄損傷が含まれるが、これらに限定されない）を呈する対象における細胞ベースの治療に使用するためのＭＳＣの長期間のニューロン分化を誘導することができることを意外にも発見した。かかる対象は、哺乳動物を含むことができ、哺乳動物には、ヒトが含まれるが、これに限定されない。従って、我々は、かかるマイクロＲＮＡ及びそれから生じる誘導されたＭＳＣの新規の用途を発見した。この用途は、他の可能な用途の中でもとりわけ、哺乳動物における特定の神経系の損傷又は疾患の影響を低減又は緩和することができる。
【００１１】
本発明のいくつかの実施態様は、限定なしに、マイクロＲＮＡ−１２４，マイクロＲＮＡ−１３７及び／又はマイクロＲＮＡ−９＊の使用及び発現を通してＭＳＣのニューロン分化を誘導するための方法、システム及び／又は組成物を含む。ＭＳＣは、通常、成体の骨髄に、通常、極めて低い濃度（１００００個の有核細胞中に約１個）で存在する中胚葉由来の細胞である。ＭＳＣは、分化して、骨髄ストローマ、血管、脂肪、骨及び軟骨などの細胞を生成することができる。これらの細胞は、環境シグナルに依存してニューロンやグリア様細胞に分化する潜在能力も有することがあり得る。さらに、これらの細胞は、成長因子及びホルモンの様々な組み合わせと共にインキュベートすることによって、特定のニューロン又はグリア表現型を発現するように誘導されるか又はこれらの表現型を維持されることができる。
【００１２】
ＭＳＣは、実験的動物モデルで、及びより最近では試験的な臨床試験で、様々な神経性疾患及び機能不全において治療効果を発揮することが示されている。それらの効果は主に、免疫抑制及び神経保護機能に基づいていた。実験的な自己免疫脳炎（ＥＡＥ）及び多発性硬化症（ＭＳ）の動物モデルにおいて、骨髄由来のＭＳＣでのマウスの処理は、疾患症状の有意な抑制を生じた。ある研究では、自己免疫のダウンレギュレーションに加えて、これらの細胞のニューロン分化は、虚血脳などの様々な症例におけるそれらの治療効果を増大させた。
【００１３】
我々の研究では、ヒトＭＳＣの分化に対する三種のニューロン関連マイクロＲＮＡ、つまりマイクロＲＮＡ−１２４、マイクロＲＮＡ−１３７及びマイクロＲＮＡ−９＊の影響を試験した。これらのマイクロＲＮＡは、通常はＭＳＣ中で発現されない。我々は、マイクロＲＮＡ−１２４、マイクロＲＮＡ−１３７及びマイクロＲＮＡ−９＊の発現は、細胞の形態及びβＩＩＩ−チューブリン及びＭＡＰ２の増大した発現によって示されるようにＭＳＣのニューロン分化を誘導することを発見した。マイクロＲＮＡ−１２４、マイクロＲＮＡ−１３７及びマイクロＲＮＡ−９＊は、チロシンヒドロキシラーゼの増大を誘導し、これは、ドーパミン作用性表現型へのＭＳＣの分化を示唆する。プレマイクロＲＮＡ−１２４（ｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１２４）の標的の一つは、多数のニューロン遺伝子を抑制する翻訳因子ＲＥＳＴである。我々の結果によれば、ニューロン関連マイクロＲＮＡは、神経変性及び神経炎症疾患並びに骨髄損傷において細胞ベースの治療の使用のためのＭＳＣの長期間のニューロン分化を誘導し得ることが示される。既存の方法と比較したマイクロＲＮＡの使用の一つの利点は、ＭＳＣにおいてプレマイクロＲＮＡを安定的に発現することができ、それは成長因子での処理によって誘導される一過的な分化と比べて長期間のニューロン分化を生ずる。このように、患者自身の骨髄由来のＭＳＣへの容易なアクセス、及びＭＳＣを多数に富化させて拡大させる可能性は、かかる細胞のニューロン分化が、ニューロンの欠失又は傷害と関連する多数の後天的又は先天的な神経疾患の治療に利用されることができる自己ニューロン幹細胞として使用できることを示す。限定されない一例として、ＭＳＣは、脂肪吸引によって除去された脂肪から、及び臍帯血又は胎盤から調製されることができる。ＭＳＣの減少された免疫原性は、例えば必須酵素又は他の必須生成物の先天的な欠失によって生じた症状の治療のための、在庫のある同種のニューロン又は適合するもしくは部分的に非適合の家族の一員からの同種のニューロンの使用を容易にすることができる。
【００１４】
本明細書に明示的に開示される実施態様のみに限定されることなしに、及び他の実施態様を棄権することなしに、本発明のいくつかの実施態様は以下のことを含む：
【００１５】
１．マイクロＲＮＡ−１２４，及び／又はマイクロＲＮＡ−１３７、及び／又はマイクロＲＮＡ−９＊を含むがこれらに限定されないマイクロＲＮＡとの培養又はこれらのマイクロＲＮＡへの他の暴露を通したＭＳＣのニューロン分化；
【００１６】
２．かかるマイクロＲＮＡでのＭＳＣのトランスフェクション；
【００１７】
３．神経系の損傷又は疾患に罹患している対象への、インビトロでニューロン分化へと誘導されたＭＳＣの投与；及び／又は
【００１８】
４．神経系の損傷又は疾患に罹患している対象への、かかるマイクロＲＮＡでトランスフェクトされたＭＳＣの投与。
【００１９】
いくつかの実施態様では、限定なしに、ニューロンへのＭＳＣの再現可能な分化転換を伴って、ＭＳＣの治療的使用が得られ、これはインビトロであれインビボであれ、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、及び関連する運動ニューロン疾患などの神経変性傷害の治療に、及び脳血管疾患や脊髄損傷の治療に拡張されることができる。進行中の臨床研究は、ＭＳＣのくも膜下及び静脈内注入は、ＭＳを有する患者において疾患の臨床的症状を部分的に改善することができ、ＡＬＳを有する患者においてもより少ない程度に改善することができることを既に示している。かかる臨床研究は、ＭＳＣのくも膜下及び静脈内注入の両方が安全な手順であるという証拠を与える。なぜなら、治療された患者のいずれもいかなる深刻な副作用も発展させなかったからである。ＭＳＣを使用した細胞治療は、多数の神経変性傷害の治療のための重要なアプローチを予言的に表わし、特にＭＳＣが、局所的に存在する幹細胞の神経発生を誘導することができるニューロン又は乏突起膠細胞及び／又は分泌因子へと誘導されることができるアプローチを表わす。
【００２０】
実施例：
【００２１】
本発明のいくつかの実施態様の以下の実施例は、本発明をそこに記載されている実施態様のみに限定することなしに、かついかなる実施態様も棄権することなしに与えられる。
【００２２】
マイクロＲＮＡ
【００２３】
マイクロＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を介して転写後遺伝子サイレンシングに影響を与える機能を有する内因性の小さな（いくつかの非限定的な実施例では１９〜２３ヌクレオチド）非コードＲＮＡのファミリーを表わす。マイクロＲＮＡは、相補性に基づいて特定の遺伝子のｍＲＮＡを標的化し、ｍＲＮＡの開裂（完全な相補性）又は翻訳抑制（部分的な相補性）を媒介する。マイクロＲＮＡは、発生において重要な役割を果たすことが示されており、細胞の運命を決定する特定の発現プロファイルを確立又は維持する役に立つ基本的な遺伝子制御因子として機能することができる。
【００２４】
ＭＳＣのニューロン分化の操作は、分化過程での遺伝子発現プログラムを編成する制御経路に関与することができる。分化はしばしば、ｍＲＮＡ及び細胞のタンパク質構成のシフトを要求する。遺伝子制御分子の一つのクラスは、マイクロＲＮＡ（小さなＲＮＡのサブクラス）であり、このマイクロＲＮＡは、ＲＮＡ干渉経路の因子を使用してタンパク質コード遺伝子の発現を転写後にダウンレギュレートすると考えられている。マイクロＲＮＡは、細胞分化において重要な役割を果すことがありうる。なぜなら、マイクロＲＮＡは、何百もの標的遺伝子を同時に個別に制御すると予測されているからである。
【００２５】
方法
【００２６】
ＭＳＣの分化に対するマイクロＲＮＡ−１２４、マイクロＲＮＡ−１３７及びマイクロＲＮＡ−９＊の影響を決定するため、我々は、継代数４〜１２のこれらの細胞の三つの異なる調製物を使用した。ＭＳＣ細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で２４時間培養され、次に、三種類のマイクロＲＮＡの成熟配列の二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド及び陰性コントロールのオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた。使用されたマイクロＲＮＡは以下の通りである：
【００２７】
ダルマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）模倣生成物：
2012530054.tif 000002
【００２８】
2012530054.tif 000003
【００２９】
マイクロＲＮＡ９＊配列：
【００３０】
2012530054.tif 000004
【００３１】
マイクロＲＮＡ９模倣物：
【００３２】
2012530054.tif 000005
【００３３】
３日後、細胞は、Ｂ２７を補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＮＢ）に移された。細胞形態は、２４時間ごとに監視され、免疫蛍光染色、ウェスタンブロット又はリアルタイムＰＣＲによるニューロンマーカーの分析は、トランスフェクションの５、７及び９日後に行われた。ニューロン分化の誘導についての正のコントロールとして、我々は、Ｓｈｈ、ＦＧＦ８及びｂＦＧＦの組み合わせで刺激された細胞を使用した。
【００３４】
結果
【００３５】
マイクロＲＮＡ−１２４、マイクロＲＮＡ−１３７及びマイクロＲＮＡ−９＊は、ＭＳＣのニューロン分化を促進する。
図１の写真は、同様の結果を与える六つの別個の実験の代表例である。図１に示されるように、マイクロＲＮＡ−１２４、マイクロＲＮＡ−１３７又はマイクロＲＮＡ−９＊での細胞のトランスフェクションは、細胞の増殖を減少させ、トランスフェクションの７２時間後に既に細胞の形態学的分化を誘導した。マイクロＲＮＡ−１３７でのＭＳＣのトランスフェクションは、迅速で堅固な形態学的変化を誘導し、細胞は、緻密な細胞本体及び静脈瘤を有する細長い突起を持つ典型的なニューロン表現型を獲得した。マイクロＲＮＡ−１２４でトランスフェクトされた細胞は、細胞増殖の強い減少に続いていくつかの細胞型（長い突起を持つ細長い細胞、多数の短い突起を持つ小さな細胞、及び平坦な星状細胞）の発生を示した。コントロールのマイクロＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、コントロールの非処理の細胞と似ていた。興味深いことに、マイクロＲＮＡ−１３７の効果は、ＧＦの効果より迅速で強かった。マイクロＲＮＡ−１３７でトランスフェクトされた細胞の約９０％が、ニューロン形態を示した。
【００３６】
マイクロＲＮＡ−１２４、マイクロＲＮＡ−１３７及びマイクロＲＮＡ−９＊は、ＭＳＣにおけるニューロンマーカーの発現を増大させる。
ニューロン分化に対するマイクロＲＮＡ−１２４、マイクロＲＮＡ−１３７及びマイクロＲＮＡ−９＊の影響をさらに調べるため、我々は、神経幹細胞マーカであるネスチン、星状細胞マーカーであるＧＦＡＰ、及びニューロンマーカーであるβＩＩＩチューブリン及びチロシンヒドロキシラーゼの発現を調査した。細胞は、適当なマイクロＲＮＡでトランスフェクトされるか、又はＤＭＥＭもしくはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ＋Ｂ２７で処理された。５日後、ネスチンｍＲＮＡの発現は、リアルタイムＰＣＲを使用して決定され、ネスチン、ＧＦＡＰ、βＩＩＩチューブリン及びチロシンヒドロキシラーゼの発現は、処理の９日後にウェスタンブロット分析によって調査された。結果は、同様の結果を与える五つの異なる実験を表わす。図２は、トランスフェクションの５日後に、リアルタイムＰＣＲによって決定されるようにネスチンｍＲＮＡの大きな増大があったことを示す。対照的に、様々なマイクロＲＮＡでのトランスフェクションの９日後に、我々は、βＩＩＩチューブリンの発現の増大を見出したが、ネスチン又はＧＦＡＰの発現は観察されなかった。加えて、我々は、マイクロＲＮＡ−１３７及びマイクロＲＮＡ−９＊がチロシンヒドロキシラーゼの発現の大きな増大を誘導したことを見出したが、マイクロＲＮＡ−１２４でトランスフェクトされた細胞では小さな増大が観察された。コントロールのマイクロＲＮＡでトランスフェクトされた細胞では、これらのマーカー全ての発現は、存在しないか又はごくわずかであった。
【００３７】
マイクロＲＮＡ−９＊は、ＭＳＣにおいてドーパミン作用性マーカーであるチロシンヒドロキシラーゼを誘導した。
図３は、適当なマイクロＲＮＡでのトランスフェクション又はＤＭＥＭでの処理の後のＭＳＣのウェスタンブロットの結果を示す。９日後、チロシンヒドロキシラーゼの発現が、ウェスタンブロット分析によって調査された。結果は、同様の結果を与える五つの異なる実験を表わす。マイクロＲＮＡ−９＊は、ＭＳＣにおいてドーパミン作用性マーカーであるチロシンヒドロキシラーゼを誘導した。
【００３８】
我々の結果は、マイクロＲＮＡ−１２４、マイクロＲＮＡ−１３７及びマイクロＲＮＡ−９＊は、ＭＳＣのニューロン分化を誘導するが、我々の試験モデルにおいてそれぞれ異なる度合いで誘導することを証明する。マイクロＲＮＡ−１３７は、一層迅速で堅固な効果を誘導し、ニューロン細胞の均一な集団を生じる。これらの細胞において発現される高レベルのチロシンヒドロキシラーゼは、これらの細胞がドーパミン作用性の表現型を示すことを示唆する。
【００３９】
マイクロＲＮＡ−１２４も、コントロールのマイクロＲＮＡで処理された細胞と比較して高レベルのβＩＩＩチューブリンによって決定されるようにニューロン分化を誘導する。我々の研究では、この処理は、低レベルのチロシンヒドロキシラーゼを発現する細胞の混合集団を生じた。いずれの処理も、ＧＦＡＰ発現の欠如によって決定されるように星状細胞の分化を誘導しなかった。
【００４０】
さらに、処理の５日後、両方のマイクロＲＮＡは、ネスチン発現の大きな一過性の増大を誘導し、神経幹細胞様又は神経先祖体様細胞の発生を示した。ＭＳＣのＮＳＣ又はＮＰＣ様細胞の制御された分化は、特定の転写因子又は成長因子の特定の組み合わせを使用してこれらの細胞を様々な神経系統に又は様々な表現型を有するニューロンに分化させるためにさらに使用されることができる。
【００４１】
マイクロＲＮＡ−１２４及びマイクロＲＮＡ−９＊は、ニューロン分化及び神経突起の外方成長に関与していると報告されていた。同様に、神経膠腫幹細胞及びＮＳＣのニューロン分化に対するマイクロＲＮＡ−１３７の影響を証明する一つの報告書がある。しかし、ＭＳＣのニューロン分化に対するマイクロＲＮＡの影響は報告されておらず、特定の表現型を有するニューロンの発生に対するマイクロＲＮＡ−１２４及びマイクロＲＮＡ−１３７の影響は示されていない。さらに、これらのマイクロＲＮＡのいずれも、ＮＳＣ／ＮＰＣ表現型を有する細胞を誘導することが報告されていない。
【００４２】
マイクロＲＮＡ−１２４及びマイクロＲＮＡ−１３７は、脂肪及び臍帯由来のＭＳＣにおけるニューロン分化を誘導した。
脂肪及び臍帯由来のＭＳＣは、骨髄のＭＳＣと同様に、コントロールのマイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ−１２４及びマイクロＲＮＡ−１３７でトランスフェクトされた（図４）。
【００４３】
脂肪由来のＭＳＣの調製：脂肪由来のＭＳＣは、太もも又は腹部壁から脂肪吸引によって得られた。１００〜２００ｍｌの吸引物は、ＭＳＣを脂肪細胞と残骸とに分離する特別に設計されたＣｙｔｏｒｉ分離器で処理された。細胞は、骨髄由来のＭＳＣについて記述したようにしてさらに処理され維持された。
【００４４】
ヒト臍帯ＭＳＣの調製：新鮮なヒト臍帯は、出生後に（親の同意を得て）得られ、ＤＭＥＭ中で４℃で採取された。臍帯管は、除去され、間葉組織（Ｗｈａｒｔｏｎのゼリー）は、小片に切り刻まれた。２５０ｇで５分間の遠心分離後、組織は、血清非含有ＤＭＥＭで洗浄され、コラゲナーゼで３７℃で１８時間処理され、２．５％のトリプシンで３７℃で３０分間消化された。解離されたＭＳＣは、さらに分散され、骨髄由来のＭＳＣについて記述したようにして維持された。
【００４５】
１２日後、ｍＲＮＡが抽出され、βＩＩＩチューブリン及びハウスキーピング遺伝子Ｓ１２のレベルが、リアルタイムＰＣＲを使用して決定された。
【００４６】
我々の結果（図４）は、マイクロＲＮＡ−１２４及びマイクロＲＮＡ−１３７が、骨髄由来のＭＳＣ中のみでなく、脂肪組織及び臍帯血由来の細胞の中でもニューロン分化を誘導することを証明する。ニューロンマーカーであるβＩＩＩチューブリンは、マイクロＲＮＡでの処理後にこれらの細胞中で誘導された。これらの細胞源のそれぞれは、それ自体の利点を有する。骨髄由来のＭＳＣは、極めて良く特性決定されており、２０年にわたって発癌の潜在能力なしに成功裏に使用されている。脂肪由来のＭＳＣは、あまり特性決定されていないが、多数得ることができ、臍帯血細胞は、非侵襲的な方法で容易に得ることができ、ドナーと患者との間の完全な遺伝子適合性を必要とせず、それ故、一層アクセスしやすい。
【００４７】
プレマイクロＲＮＡ及びＧＤＮＦを含むプラスミドの構築
ＧＤＮＦはドーパミン作用性ニューロンの生存に関与していたので、我々は、別個のプロモーター下でプレマイクロＲＮＡ−１２４又はプレマイクロＲＮＡ−１３７をＧＤＮＦと共発現するプラスミドを構築した。
【００４８】
本明細書に記載される実施態様のみに限定されることなしに、及びいかなる実施態様も棄権することなしに、配列決定の工程及びプレマイクロＲＮＡ  ＧＤＮＦベクターのクローニング手順、及びマイクロＲＮＡのクローニング手順は、ＧＤＮＦのプルミエ（ｐｒｅｍｉｒ）ベクター（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの（ＣＤ−５１１＿１又はＰＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ｃｏｐＧＦＰ）中へのクローニングの個々の工程について記述される。
【００４９】
ホモサピエンスの神経膠細胞由来の神経向性因子（ＧＤＮＦ）テンプレートのｃＤＮＡは、Ｏｒｉｇｅｎｅから得られた。プルミエ１２４及び１３７ベクター（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中へのＧＤＮＦのクローニングのためにＧＤＮＦ  ＯＲＦのためのＸｈｏ１及びＳａｌ１制限酵素消化部位を有するプライマーが以下のように設計された：
【００５０】
2012530054.tif 000006
【００５１】
2012530054.tif 000007
【００５２】
ＰＣＲ後、ＧＤＮＦ  ＤＮＡ生成物は、浄化され、次にＸｈｏ１及びＳａｌ１で消化され、ＤＮＡは、再び浄化され、クローニング用のＧＤＮＦのＤＮＡを生じた。
【００５３】
Ｘｈｏ１制限部位は、以下のプライマーを使用してプルミエ１２４及び最初の１３７のベクターに追加された：
【００５４】
2012530054.tif 000008
【００５５】
2012530054.tif 000009
【００５６】
ＧＦＰ遺伝子は、制限酵素Ｘｈｏ１及びＳａｌ１を使用してプルミエ１２４及び１３７ベクターから除去され、ベクターは、浄化された。
【００５７】
ＧＤＮＦとプルミエ１２４及び１３７ベクターとのライゲーション。ライゲートされたプラスミドは、Ｏｎｅ  ｓｈｏｔ  Ｔｏｐ１０化学的コンピーラント細胞中に形質転換された。プルミエ１２４及び１３７を有するプラスミドは、クローンの培養によって選択され、ミニプレップで処理された。
【００５８】
プラスミドは、Ｘｈｏ１及びＳａｌ１を使用して消化され、ＧＤＮＦのインサートの消化が検出された。プラスミドは、次に配列決定された。マイクロＲＮＡ−１２４及びマイクロＲＮＡ−１３７の配列、及びプルミエベクターの骨格の配列を以下に示す：
【００５９】
マイクロＲＮＡ-１２４：
【００６０】
2012530054.tif 000010
【００６１】
マイクロＲＮＡ−１３７：
【００６２】
2012530054.tif 000011
2012530054.tif 000012
【００６３】
骨格ベクター（ＣＤ−５１１＿１）の配列が取り付けられた：
【００６４】
2012530054.tif 000013
2012530054.tif 000014
2012530054.tif 000015
2012530054.tif 000016
【００６５】
我々は、これらのプラスミドでトランスフェクトされたＭＳＣがＧＤＮＦを分泌し、それぞれのマイクロＲＮＡを発現することを見出した。従って、分化したドーパミン作用性ニューロンによって分泌されるＧＤＮＦは、分化した細胞に対する及び内因性のドーパミン作用性ニューロンに対する生存信号を与えると予測される。
【００６６】
誘導可能なマイクロＲＮＡの構築
移植されたＭＳＣは、中枢神経系の損傷された組織に移動し、神経向性及び免疫調節作用を示すことが報告されている。特に、パーキンソン病の動物モデルにおいて、移植されたＭＳＣは、損傷された線状体に合体することが示されている。いくつかの実施態様では、限定なしに、誘導可能なプレマイクロＲＮＡ発現ベクターであって所望の時点で特定のプレマイクロＲＮＡの発現の誘導を可能にする発現べクターが使用されることができる。従って、ＭＳＣは、特定のプレマイクロＲＮＡでトランスフェクトされ、その発現は、損傷された線状体におけるＭＳＣの合体前に又は合体後に様々な時点で誘導されるであろう。かかる研究のため、我々は、誘導可能なマイクロＲＮＡ、及びＴｅｔ−ｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して着色された蛍光タンパク質レポーターを使用した。このシステムは、プロモーターの添加によって、一例として、ドキンサイクリンの添加によって特定のマイクロＲＮＡの誘導を可能にし、しかもマイクロＲＮＡが生成される細胞の同定も可能にする。
【００６７】
まとめると、我々は、ＮＳＣ／ＮＰＣへの及び特定のニューロン表現型（マイクロＲＮＡ−１３７）を有するニューロンへのＭＳＣの分化転換を誘導するマイクロＲＮＡ−１２４、マイクロＲＮＡ−１３７及びマイクロＲＮＡ−９＊の能力を証明した。マイクロＲＮＡ−９及びマイクロＲＮＡ−２１８のような追加のニューロンマイクロＲＮＡも、ＭＳＣの分化転換に影響を与えることができ、ニューロン分化を誘導することができる。
【００６８】
既存の方法と比較したマイクロＲＮＡの使用の利点は、プレマイクロＲＮＡをＭＳＣ中で安定に発現することができ、これは、成長因子での処理によって誘導される一過的な分化と比較して長期間のニューロン分化を生じるということである。
【００６９】
我々の研究は、ニューロン関連のマイクロＲＮＡは、以下に示されるように、例のみとして、神経変性疾患及び脊髄損傷における細胞ベースの治療の用途のためにＭＳＣの長期間のニューロン分化を誘導するために使用されることができるということを示す：
【００７０】
１．マイクロＲＮＡ（マイクロＲＮＡ−１２４、マイクロＲＮＡ−１３７、マイクロＲＮＡ−９＊）によるＭＳＣのニューロン分化；
【００７１】
２．マイクロＲＮＡ−１３７、マイクロＲＮＡ−１２４、マイクロＲＮＡ−９＊によるＭＳＣの特定のドーパミン作用性分化；及び
【００７２】
３．マイクロＲＮＡによるＭＳＣの神経幹細胞様細胞又は神経先祖体様細胞への一過的な分化の誘導。マイクロＲＮＡでのトランスフェクションは、細胞が中枢神経系の様々な系譜（ニューロン、星状細胞、及び乏突起膠細胞）へと分化できるか又は転写因子もしくは成長因子の特定の組み合わせを使用して細胞が特定のニューロン表現型へと分化できる機会を与える。この機会は、マイクロＲＮＡの表現レベルによって、又は特定の時点でのポストトランスフェクトによって制御されることができる。
【００７３】
コミットされていない（ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）先祖細胞にＭＳＣを分化転換させるマイクロＲＮＡの能力、及びＭＳＣを様々なニューロン細胞のサブセットに分化転換させるマイクロＲＮＡの能力は、これらの細胞を広範囲の神経学的疾患の治療に使用することを可能にする。これらの疾患は、脊髄及び末梢神経の損傷、出血又は閉塞傷害によって生じる中枢神経系への損傷（ＣＶＡ）、又は深く傷ついた中枢又は末梢神経系の傷害を含む。加えて、分化転換したＭＳＣは、特発性の自己免疫疾患（ＥＡＥ）によって生じる神経変性疾患、又はパーキンソン病もしくはアルツハイマー病もしくはＡＬＳのような未知の病因を有する疾患の場合に使用されることができる。さらに、分化転換されたＭＳＣによる神経機能の改善は、薬物によって誘導されるニューロン損傷及び／又は毒性によって生じる様々な退行性疾患においても使用されることができる。
【００７４】
従って、我々の研究では、マイクロＲＮＡ−１２４、マイクロＲＮＡ−１３７、及びマイクロＲＮＡ−９＊は、形態学的変化及び表現型マーカーの発現を伴って、ＭＳＣのニューロン分化を促進する。
【００７５】
いくつかの実施態様の誘導性マイクロＲＮＡは、標的ＭＳＣの所望の効果を達成するために使用される技術、個々の患者の臨床状況、投与の部位及び方法、投与スケジュール、患者の年齢、性別、体重及び医療の専門家には公知の他の要因を考慮に入れて、良好な医学的慣例に従って投与されかつ用量決定されるであろう。従って、本発明の目的のための「医薬的に有効な量」は、当該技術分野で公知のかかる考慮事項によって決定される。量は改善を達成するのに有効でなければならず、この改善は、インビボ及び／又はインビトロでのＭＳＣの所望の分化、減少された傷害又は損傷、又は徴候の改善又は削減、及び当業者によって好適な手段として選択される他の指標を含むが、これらに限定されない。
【００７６】
本発明の実施態様は、治療領域を神経系の損傷及び疾患の治療に拡大することができ、米国で毎年かかる損傷及び疾患に罹患している多数の患者集団の治療に適用されることができる。従って、いつくかの実施態様では、本発明は、本発明の実施様態を含む誘導性マイクロＲＮＡの選択的な適用を通して、哺乳動物の神経系の損傷及び疾患（これらには、脳傷害、神経変性又は脊髄損傷が含まれるが、これらに限定されない）を予防、制御又は緩和する新規の方法を含む。いくつかの実施態様によれば、限定なしに、かかる損傷又は疾患の影響を制限する治療において使用するためのインビボ又はインビトロでの標的細胞における分化を誘導するための一種以上のかかるマイクロＲＮＡの使用及び／又は投与を通じてかかる治療の介入を行うことができる。従って、限定なしに及び発明特定事項の棄権なしに、いくつかの実施態様は、分化転換されたＭＳＣの選択的な適用及び／又は誘導を通じて、脳傷害を含む（これに限定されない）哺乳動物の損傷を予防、制御又は緩和する新規な組成物及び方法を含む。
【００７７】
本願は、論文、プレゼンテーション及び、米国特許を含む（これらに限定されない）著者、引用及び／又は特許番号による様々な文献を参照として引用することができる。かかる参照のそれぞれの開示は、それらの全体が、本願に参照として組み込まれる。
【００７８】
本発明は、上述の好ましい及び代替的な実施様態に言及して特に示され記述されてきたが、ここに記述される本発明の実施態様に対する様々な変形例は、以下の特許請求の範囲において規定される本発明の精神及び範囲から離れることなしに本発明の実施において使用されることができることは、当業者によって理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を規定すること、及びこれらの特許請求の範囲の範囲内の方法及び装置並びにそれらの等価物は特許請求の範囲においてカバーされることを意図される。本発明のこの記述は、ここに記載される要素の全ての新規かつ非自明の組み合わせを含むものとして理解されるべきであり、特許請求の範囲は、これらの要素のいかなる新規かつ非自明の組み合わせに対しても本願又は後願で呈示されることができる。上述の実施態様は例示的であり、本願又は後願において特許請求されることができる全ての可能な組み合わせに対していかなる単一の特徴又は要素も必須でない。特許請求の範囲がその等価物の「一つの（ａ）」又は「第一の（ａ  ｆｉｒｓｔ）」要素に言及している場合、かかる特許請求の範囲は、二つ以上のかかる要素を必要としたり又は除外したりせずに一つ以上のかかる要素の組み入れを含むものとして理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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