(57)【要約】一態様では、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のようなクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）微生物による、多種多様な供給原料からのエタノールおよびその他の発酵最終産物の生産を増大させる方法が開示される。フェドバッチ法の使用によりクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のようなクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）微生物の発酵性能を向上させる方法、ならびに脂肪酸含有化合物の存在下および／または低ｐＨでのクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のようなクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）微生物の発酵による、アルコールおよび／または化学製品などの発酵最終産物の生産方法が記載されている。
2012519500.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵最終産物を生産するための方法であって、
クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）を含む培地を、第一の期間の間、前記による発酵最終産物の生産に適した条件下で培養することと、
前記発酵最終産物の回収前の間に、前記クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）を含む培地に１つ以上の栄養素を添加することと、
クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）を含む培地を第二の期間の間培養することと、
前記培地から発酵最終産物を回収することと
を含む方法。
【請求項２】
前記クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）菌株がクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発酵最終産物がエタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記培地がセルロースおよび／またはリグノセルロース原料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記セルロースまたはリグノセルロース原料が、２４時間以内に１５％を超える前記セルロースまたはリグノセルロース原料が単純糖類に変換されるのに十分な量の酵素で酵素処理されない、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
発酵最終産物を生産する方法であって、
クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株を培地で培養する段階と、
前記培地中の糖化合物の総濃度を少なくとも約１８ｇ／Ｌに維持する段階と、
前記培地から発酵最終産物を回収する段階と
を含む方法。
【請求項７】
前記糖化合物の総濃度の維持が、その少なくとも１つが１つ以上の糖化合物を含む１つ以上の培地成分を前記培地へ培養中に少なくとも１回添加することを含み、前記培地成分を、培養物を含む容器に添加する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記培地中の糖化合物の総濃度を、培養の間の一部で約１ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの範囲内に維持する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記培地中の糖化合物の総濃度の変化が、発酵最終産物生産の期間の間、約２５％未満である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記発酵最終産物がエタノールである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
１つ以上の窒素含有原料を含む培地成分を前記培地へ培養中に少なくとも１回添加することをさらに含み、かつ前記培地成分を、培養物を含む容器に添加する、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
１つ以上の培地成分が１つ以上の窒素含有原料を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記培地がセルロースまたはリグノセルロース原料を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記セルロースまたはリグノセルロース原料が、２４時間以内に１５％を超える前記セルロースまたはリグノセルロース原料が単純糖類に変換されるのに十分な量の酵素で酵素処理されない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
発酵最終産物を生産する方法であって、
クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）菌株を培地で培養する段階と、
前記クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）を培養中に、１つ以上の糖化合物を含む１つ以上の培地成分を前記培地に添加し、前記１つ以上の糖化合物を、前記クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）により他の化合物に変換される糖の量に関連させて添加する段階と
を含む方法。
【請求項１６】
前記１つ以上の培地成分が窒素源を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記窒素源がプロリン、グリシン、ヒスチジンおよび／またはイソロイシンを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ以上の培地成分がセルロースまたはリグノセルロース原料を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記セルロースまたはリグノセルロース原料が、２４時間以内に１５％を超える前記セルロースまたはリグノセルロース原料が単純糖類に変換されるのに十分な量の酵素で酵素処理されない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
発酵最終産物を生産する方法であって、
クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）菌株の第一の接種材料を培地に添加することと、
前記クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）をエタノール生産に適した条件下で培養することと、
前記第一のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）接種材料を前記培地に添加後５時間を過ぎてから、追加のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種の生細胞を前記培地に添加することと、
前記培地から前記発酵最終産物を回収すること
を含む方法。
【請求項２１】
前記第一のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）接種材料の添加後に、１つ以上の培地成分を前記培地に添加することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
培地成分の添加および生細胞の添加を逐次的にまたは同時に行う、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
エタノールを生産する方法であって、不純なエタノール原料から不純物を除去して精製エタノール原料を生産し、前記精製エタノール原料が約９０％（ｗｔ．）を超えるエタノールであり、かつ前記不純なエタノール原料がクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）細胞をフェドバッチ培養で培養することにより生成される発酵培地に由来し、前記発酵培地中のエタノール濃度が約７ｇ／Ｌよりも大きい段階を含む方法。
【請求項２４】
発酵最終産物を生産する方法であって、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株を含む培地を培養し、前記発酵最終産物が少なくとも約３ｇ／（Ｌ・日）の瞬間生産性で生産される段階を含む方法。
【請求項２５】
発酵最終産物を生産する方法であって、
外部から補充される化学物質または酵素で処理されていないセルロース原料を提供することと、
外部から補充された酵素を含まない培地中で前記セルロース原料を微生物と混合することと、
発酵最終産物を生産するのに十分な条件および時間で前記セルロース原料を発酵させることと
を含む方法。
【請求項２６】
発酵最終産物を生産する方法であって、ｐＨ調整剤の存在下でクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）細胞を発酵させて、発酵最終産物を生産することを含む方法。
【請求項２７】
前記発酵最終産物がエタノールである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞の発酵を約６．０〜約７．２の間のｐＨで行う、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｐＨが約６．５である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
発酵最終産物を生産する方法であって、添加脂肪酸原料の存在下でクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）菌株の細胞を発酵させて、発酵最終産物を生産することを含む方法。
【請求項３１】
前記脂肪酸含有原料がコーン油、ヒマワリ油、ベニバナ油、カノーラ油、ダイズ油またはナタネ油の１つ以上を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記脂肪酸含有原料がリン脂質またはリゾリン脂質を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）細胞とｐＨ調整剤とを含み、発酵最終産物が生産される発酵培地。
【請求項３４】
クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）菌株の細胞と添加脂肪酸含有化合物とを含み、発酵最終産物が生産される発酵培地。
【請求項３５】
クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株と、プロリン、グリシン、ヒスチジンおよび／またはイソロイシンを含む窒素源と、セルロースまたはリグノセルロース原料とを含む発酵培地。
【請求項３６】
アルコールを生産する方法であって、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）菌株の細胞を発酵させることと、ｐＨ調整剤および脂肪酸原料の存在とを含み、発酵最終産物が生産される方法。
【請求項３７】
培地およびクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株を収容するように設定された発酵槽を含み、前記発酵槽が、発酵中の変化が約２５％未満であるレベルに糖化合物量を維持するように設定されている燃料プラント。
【請求項３８】
培地およびクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株を収容するように設定された発酵槽を含み、前記発酵槽が、追加の培地成分または追加のクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）生細胞を定期的に前記培地に補充するように設定されている燃料プラント。
【請求項３９】
培地およびクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株を収容するように設定された発酵槽を含み、前記培地が、ｐＨ調整剤と、セルロースまたはリグノセルロース原料とを含む燃料プラント。
【請求項４０】
前記培地が脂肪酸原料をさらに含む、請求項３９に記載の燃料プラント。
【請求項４１】
培地およびクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株を収容するように設定された発酵槽を含み、前記培地が、プロリン、グリシン、ヒスチジンおよび／またはイソロイシンを含む窒素源と、セルロースまたはリグノセルロース原料とを含む燃料プラント。
【請求項４２】
培地およびクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株を収容するように設定された発酵槽を含み、前記培地が、脂肪酸原料と、セルロースまたはリグノセルロース原料とを含む燃料プラント。
【請求項４３】
発酵中の変化が約２５％未満であるレベルの糖化合物量を含む培地で、セルロースまたはリグノセルロース原料をクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株で発酵させることにより生産される発酵最終産物。
【請求項４４】
ｐＨ調整剤を含む培地で、セルロースまたはリグノセルロース原料をクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株で発酵させることにより生産される発酵最終産物。
【請求項４５】
脂肪酸を含む培地で、セルロースまたはリグノセルロース原料をクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株で発酵させることにより生産される発酵最終産物。
【請求項４６】
プロリン、グリシン、ヒスチジンおよび／またはイソロイシンを含む窒素源を含む培地で、セルロースまたはリグノセルロース原料をクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株で発酵させることにより生産される発酵最終産物。
【請求項４７】
前記発酵最終産物がエタノールである、請求項４３〜４６に記載の発酵最終産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００９年３月９日に出願された米国特許仮出願第６１／１５８，５８１号、２００９年３月９日に出願された米国特許仮出願第６１／１５８，６００号、２００９年４月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／１７１，０７７号に対する優先権を主張するものであり、これらはそれぞれその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
石油ベースの輸送燃料のコスト上昇、石油埋蔵量の減少および石油燃料燃焼の環境への影響に関する懸念により、石油ベース燃料に替わる実行可能な代替物への要求が強まっている。特に、酵素および酵母／細菌系と組み合わせた、様々な前処理バイオマス原料、例えばリグノセルロース原料、デンプンまたは農業廃棄物／副産物などの生物学的変換によるバイオ燃料生産の有望性が近年注目されている。木質または非木質植物原料のような多糖含有原料、ならびに植物性物質の加工から生じる廃棄原料および副産物を、高価値な輸送燃料およびその他のエネルギー形態または化学供給原料へ安価に変換する可能性のある技術の開発が、特に課題となっている。上記多糖含有原料の様々な例として、セルロース、リグノセルロースおよびヘミセルロース原料；ペクチン含有原料；デンプン；木材；トウモロコシ茎葉；スイッチグラス；紙；および製紙パルプスラッジが挙げられる。
【０００３】
上記多糖含有原料をエタノールのようなバイオ燃料に変換するプロセスのいくつかは、最初に、例えば単純糖類の酵素的加水分解による、デンプンまたはセルロース含有原料のような前処理バイオマス基質から単純糖類への変換（糖化）、次いで、酵母による発酵を介した、これらの単純糖類からエタノールのようなバイオ燃料への変換（発酵）を必要とする。しかし、現在の生物学的変換技術は、高い生産コストおよび食糧供給からの農産物の転換という問題に直面している。
【０００４】
エタノール生産のための発酵のいくつかにおいては、スクロースのような単純糖を入手して直接エタノールに発酵する。例えばブラジルでは、このようなプロセスを用いて、甘蔗糖を燃料用エタノールに変換する。こうしたプロセスは、サトウキビ栽培地域のような、単純糖源が安価な場所に地理的に限定される。さらに、こうしたプロセスには、糖のような貴重な食糧源を食糧用途ではなく工業用途に転換するという、望ましくない面がある。
【０００５】
エタノール生産のための発酵では、エタノールに変換する前に、最初により単純なまたは低分子量の糖類への加水分解または変換を必要とする原料を利用することがある。このようなプロセスは、トウモロコシエタノールの生産に関して多く記載されており、トウモロコシ由来のデンプンを、例えば添加酵素により分解し、次いで、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）種のような微生物により最終的にエタノールへと変換する。他の原料、例えば、同様に添加酵素による加水分解またはその他の化学物質／熱的手段を必要とすることが多い、セルロース、ヘミセルロースまたはリグノセルロース原料などの使用が多くの研究の対象となっているが、これまでほとんど成功していない。
【０００６】
このプロセスに添加される上記酵素の使用は、コストの観点および一般に処理装置が容易に購入可能な酵素に限定されている事実、この両者から望ましくない。これまで市販の酵素は、デンプンからグルコースまたはフルクトースのような単純糖類への変換などのプロセス、洗濯用途および穀物食品用に選択されてきた。これらは概して、高度に特化している、つまり、単一酵素は一般に多種多様な供給原料に使用できないということである。代わりに、多数の酵素を使用して「酵素カクテル」として組み合わせる場合が多い。このような混合物によって幅広い活性が得られるが、添加される酵素の一部のみがいずれかの特定のバッチで使用される特定の基質に有用であり得るため、この幅広い活性は非常に割高となり得る。カクテルの一部である他の酵素は、１つの基質に対して活性でないかもしれないが、使用され得る他の供給基質に有用性をもたらすために混合物に含まれている。その結果、いずれかの特定のバッチにおいて、添加された酵素の少なくとも一部は処理にあまり寄与しない可能性があり、廃棄される。
【０００７】
したがって、様々な供給原料からエタノールまたはその他の望ましい生成物を高い収率および生産性で生産するための発酵プロセスが望ましい。
【０００８】
セルロース、リグノセルロース、ペクチン、ポリグルコースおよび／またはポリフルクトース含有バイオマスを含めたバイオマスからのエタノール発酵は、世界のエネルギー問題に大いに必要とされる解決策をもたらし得る。酵母、真菌および細菌種は、モノマー糖類からなるセルロースバイオマスをエタノールへ変換すること可能であると報告されている。しかし、これらの微生物の多くは、低濃度でしかエタノールを生産しない。この制限は、微生物のエタノールに対する耐性の全般的な欠如、または微生物内に存在するフィードバック阻害もしくは抑制機構、または他の何らかの機構、およびこれらの機構の組合せに起因し得る。このようなエタノール生産の制限は、エタノール力価に影響し得るだけでなく、エタノール生産性にも影響し得る。
【０００９】
発酵によるエタノール生産のための野生型および遺伝子改良微生物が数多く記載されている。これらには、サーモアナエロバクター・エタノリカス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、クロストリジウム・ベイジェリニキイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｉｃｋｉｉ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・チロブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム・サーモブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サーモアナエロバクター・サーモヒドロスルフリカス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ）、およびサッカロミケス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、モーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）亜種、カルボキシドセラ（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｃｅｌｌａ）亜種、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、組換え大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）およびクロストリジウム・ベイジェリキイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｃｋｉｉ）、およびその他の微生物が含まれる。上記および他の微生物を工業規模のアルコール生産に使用する際の問題点として、比較的低アルコール濃度での細胞毒性、比較的低アルコール濃度での細胞増殖もしくは生存率の低下、低いアルコール力価または低いアルコール生産性を挙げることができる。アルコール耐性は、種および菌株によって大きく左右される。例えば、発酵プロセスによっては、約１０〜２０ｇ／Ｌのアルコールでアルコール生産が減速するかまたは完全に停止する。微生物によっては、エタノールのようなアルコールが約２０ｇ／Ｌで死滅するかたまは著しく損なわれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様では、以下のものを含む発酵最終産物の生産方法が本明細書に提供される：クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）を含む培地を、前記クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）による発酵最終産物の生産に適した条件下で第一の期間の間培養すること；発酵最終産物の回収前の間に、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）を含む培地に１つ以上の栄養素を添加すること；クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）を含む培地を第二の期間の間培養すること；および培地から発酵最終産物を回収すること。一実施形態では、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）菌株はクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）である。別の実施形態では、発酵最終産物はエタノールである。別の実施形態では、培地はセルロースおよび／またはリグノセルロース原料を含む。別の実施形態では、セルロースまたはリグノセルロース原料を、２４時間以内に１５％を超えるセルロースまたはリグノセルロース原料が単純糖類に変換されるのに十分な量の酵素で酵素処理しない。
【００１１】
一態様では、次の段階を含む発酵最終産物の生産方法が本明細書に提供される：クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株を培地で培養する段階；培地中の糖化合物の総濃度を少なくとも約１８ｇ／Ｌに維持する段階；および培地から発酵最終産物を回収する段階。一実施形態では、糖化合物の総濃度の維持は、その少なくとも１つが１つ以上の糖化合物を含む、１つ以上の培地成分を、培養中に少なくとも一回培地に添加することを含み、培地成分は培養物を含む容器に添加する。別の実施形態では、培養の間の一部では、培地中の糖化合物の総濃度を約１ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの範囲内に維持する。別の実施形態では、発酵最終産物生産の期間における培地中の糖化合物の総濃度の変化は、約２５％未満である。別の実施形態では、発酵最終産物はエタノールである。別の実施形態では、１つ以上の窒素含有原料を含む培地成分を、発酵中に少なくとも一回培地に添加することをさらに含み、培地成分は培養物を含む容器に添加する。別の実施形態では、１つ以上の培地成分は１つ以上の窒素含有原料を含む。別の実施形態では、培地はセルロースまたはリグノセルロース原料を含む。別の実施形態では、セルロースまたはリグノセルロース原料を、２４時間以内に１５％を超えるセルロースまたはリグノセルロース原料が単純糖類に変換されるのに十分な量の酵素で酵素処理しない。
【００１２】
一態様では、発酵最終産物の生産方法が本明細書に提供され、この方法は次の段階を含む：クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）菌株を培地で培養する段階；およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の培養中に１つ以上の培地成分を培地に添加する段階であって、１つ以上の培地成分が１つ以上の糖化合物を含み、かつクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）により他の化合物に変換される糖の量に関連させて、１つ以上の糖化合物を添加する段階。一実施形態では、１つ以上の培地成分は窒素源を含む。別の実施形態では、窒素源は、プロリン、グリシン、ヒスチジンおよび／またはイソロイシンを含む。別の実施形態では、培地成分はセルロースまたはリグノセルロース原料を含む。別の実施形態では、セルロースまたはリグノセルロース原料を、２４時間以内に１５％を超えるセルロースまたはリグノセルロース原料が単純糖類に変換されるのに十分な量の酵素で酵素処理しない。
【００１３】
一態様では、発酵最終産物の生産方法が本明細書に提供され、この方法は以下のものを含む：クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）菌株の第一の接種材料を培地に添加すること；クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）をエタノール生産に適した条件下で培養すること；第一のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）接種材料を培地に添加後５時間を過ぎてから、追加のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種の生細胞を培地に添加すること；および培地から発酵最終産物を回収すること。一実施形態では、この方法は、第一のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）接種材料を培地に添加した後に、１つ以上の培地成分を培地に添加することをさらに含む。別の実施形態では、培地成分の添加および生細胞の添加は、逐次的にまたは同時に行う。
【００１４】
一態様では、エタノールの生産方法が本明細書に提供され、この方法は次の段階を含む：不純なエタノール原料から不純物を除去して精製エタノール原料を生産する段階であって、精製エタノール原料が約９０％（ｗｔ．）を超えるエタノールであり、かつ不純なエタノール原料が、フェドバッチ培養でクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）細胞を培養することにより生成される発酵培地に由来し、かつ発酵培地中のエタノール濃度が約７ｇ／Ｌより高い段階。
【００１５】
一態様では、発酵最終産物の生産方法が本明細書に提供され、この方法は次の段階を含む：クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株を含む培地を培養する段階であって、発酵最終産物が少なくとも約３ｇ／（Ｌ・日）の瞬間生産性で生産される段階。
【００１６】
一態様では、以下のものを含む発酵最終産物の生産方法が本明細書に提供される：セルロース原料を提供することであって、前記セルロース原料が、外部から補充された化学物質または酵素で処理されていないこと；培地中でセルロース原料を微生物と混合することであって、培地が、外部から補充された酵素を含まないこと；ならびに発酵最終産物を生産するのに十分な条件および十分な時間で、セルロース原料を発酵させること。
【００１７】
一態様では、発酵最終産物の生産方法が本明細書に提供され、この方法は以下のものを含む：ｐＨ調整剤の存在下でクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）細胞を発酵させて、発酵最終産物を生産すること。一実施形態では、発酵最終産物はエタノールである。別の実施形態では、約６．０〜約７．２のｐＨで細胞の発酵が起こる。別の実施形態では、ｐＨは約６．５である。
【００１８】
一態様では、発酵最終産物の生産方法が本明細書に提供され、この方法は以下のものを含む：添加脂肪酸原料の存在下でクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）菌株の細胞を発酵させて、発酵最終産物を生産すること。一実施形態では、脂肪酸含有原料は、コーン油、ヒマワリ油、ベニバナ油、カノーラ油、ダイズ油またはナタネ油の１つ以上を含む。別の実施形態では、脂肪酸含有原料はリン脂質またはリゾリン脂質を含む。
【００１９】
一態様では、発酵培地が本明細書に提供され、この培地はクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）細胞およびｐＨ調整剤を含み、発酵最終産物が生産される。
【００２０】
一態様では、発酵培地が本明細書に提供され、この培地はクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）菌株の細胞および添加脂肪酸含有化合物を含み、発酵最終産物が生産される。
【００２１】
一態様では、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株と、プロリン、グリシン、ヒスチジンおよび／またはイソロイシンを含む窒素源と、セルロースまたはリグノセルロース原料とを含む発酵培地が本明細書に提供される。
【００２２】
一態様では、アルコールの生産方法が本明細書に提供され、この方法は、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）菌株の細胞の発酵と、ｐＨ調整剤および脂肪酸原料の存在とを含み、発酵最終産物が生産される。
【００２３】
一態様では、培地およびクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株を収容するように設定された発酵槽を含む燃料プラントであって、前記発酵槽が、発酵中の変動が約２５％未満のレベルで糖化合物の量を維持するように設定されている燃料プラントが本明細書に提供される。
【００２４】
一態様では、培地およびクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株を収容するように設定された発酵槽を含む燃料プラントであって、前記発酵槽が、追加の培地成分または追加のクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）生細胞を定期的に培地に補充するように設定されている燃料プラントが本明細書に提供される。
【００２５】
一態様では、培地およびクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株を収容するように設定された発酵槽を含む燃料プラントであって、前記培地がｐＨ調整剤およびセルロースまたはリグノセルロース原料を含む燃料プラントが本明細書に提供される。一実施形態では、前記培地は脂肪酸原料をさらに含む。
【００２６】
一態様では、培地およびクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株を収容するように設定された発酵槽を含む燃料プラントであって、前記培地が、プロリン、グリシン、ヒスチジンおよび／またはイソロイシンを含む窒素源ならびにセルロースまたはリグノセルロース原料を含む、燃料プラントが本明細書に提供される。
【００２７】
一態様では、培地およびクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株を収容するように設定された発酵槽を含む燃料プラントであって、前記培地が脂肪酸原料およびセルロースまたはリグノセルロース原料を含む燃料プラントが本明細書に提供される。
【００２８】
一態様では、セルロースまたはリグノセルロース原料を、発酵中の変動が約２５％未満のレベルの糖化合物量を含む培地中でクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株を用いて発酵させることにより生産される、発酵最終産物が本明細書に提供される。
【００２９】
一態様では、セルロースまたはリグノセルロース原料を、ｐＨ調整剤を含む培地中でクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株を用いて発酵させることにより生産される、発酵最終産物が本明細書に提供される。
【００３０】
一態様では、セルロースまたはリグノセルロース原料を、脂肪酸を含む培地中でクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株を用いて発酵させることにより生産される、発酵最終産物が本明細書に提供される。
【００３１】
一態様では、セルロースまたはリグノセルロース原料を、プロリン、グリシン、ヒスチジンおよび／またはイソロイシンを含む窒素源を含む培地中で、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株を用いて発酵させることにより生産される、発酵最終産物が本明細書に提供される。
【００３２】
本発明の別の態様では、エタノール生産のための方法が開示される。この方法は、（１）増殖培地にクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株を接種してブロスを形成すること；（２）クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の増殖およびクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）によるエタノール生産に適した条件下でブロスを培養すること；（３）クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）が存在する間に、１つ以上の栄養素をブロスに添加すること；ならびに（４）クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の増殖およびクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）によるエタノール生産に適した条件下でブロスを培養し続けることであって、エタノールがブロス中に約５ｇ／Ｌ以上の濃度で存在することを含む。
【００３３】
上記プロセスの一実施形態では、ブロス中にエタノールが約７ｇ／Ｌ以上の濃度で存在する。別の実施形態では、ブロス中にエタノールが約９ｇ／Ｌ以上の濃度で存在する。別の実施形態では、ブロス中にエタノールが約１１ｇ／Ｌ以上の濃度で存在する。別の実施形態では、ブロス中にエタノールが約１３ｇ／Ｌ以上の濃度で存在する。別の実施形態では、ブロス中にエタノールが約１０〜１４ｇ／Ｌの濃度で存在する。
【００３４】
別の実施形態では、増殖培地はセルロースおよび／またはリグノセルロース原料を含む。別の実施形態では、増殖培地はセルロースまたはリグノセルロース原料を含み、セルロースまたはリグノセルロース原料は、２４時間以内に１５％を超えるセルロースまたはリグノセルロース原料が単純糖類に変換されるのに十分な量の酵素で酵素処理されていない。
【００３５】
別の態様では、エタノール製造のための本発明の好適な実施形態に従ったプロセスが開示される。このプロセスは、（１）クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株をブロス中で培養すること；（２）ブロス中の糖化合物の総濃度を約１８ｇ／Ｌを超えて維持すること；および（３）約１０ｇ／Ｌ以上の濃度でエタノールを生産することを含む。上記プロセスの一実施形態では、培養中のある時間におけるブロスは、約７ｇ／Ｌを超えるエタノールを含む。
【００３６】
別の実施形態では、糖化合物の総濃度の維持は、その少なくとも１つが１つ以上の糖化合物を含む１つ以上の培地補充物を、培養中に少なくとも一回ブロスに添加することを含み、培地補充物は培養物を含む容器に添加する。
【００３７】
別の実施形態では、培養の間の一部でブロス中の糖化合物の総濃度を約２５ｇ／Ｌを超えて維持する。別の実施形態では、培養の間の一部でブロス中の糖化合物の総濃度を約３０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの範囲内に維持する。
【００３８】
別の実施形態では、糖化合物の総濃度の維持は、その少なくとも１つが１つ以上の糖化合物を含む１つ以上の培地補充物を、培養中に少なくとも一回ブロスに添加することを含み、かつ１つ以上の培地補充物はフィチン酸塩を含み、培地補充物は培養物を含む容器に添加する。
【００３９】
別の実施形態では、ブロス中の糖化合物の総濃度をある期間維持し、その期間は少なくとも約１０時間である。
【００４０】
別の実施形態では、ブロス中の糖化合物の総濃度をある期間維持し、その期間は少なくとも約１０時間であり、かつその期間中、ブロス中の糖化合物の総濃度の変化が約２５％未満である。
【００４１】
別の実施形態では、このプロセスは、１つ以上の窒素含有原料を含む培地補充物を、発酵中に少なくとも一回ブロスに添加することを含み、培地補充物は培養物を含む容器に添加する。
【００４２】
別の実施形態では、糖化合物の総濃度の維持は、その少なくとも１つが１つ以上の糖化合物を含む１つ以上の培地補充物を、培養中に少なくとも一回ブロスに添加することを含み、かつ１つ以上の１つ以上の培地補充物は、１つ以上の窒素含有原料を含み、培地補充物は培養物を含む容器に添加する。
【００４３】
別の実施形態では、ブロスはセルロースまたはリグノセルロース原料を含む。別の実施形態では、増殖培地はセルロースまたはリグノセルロース原料を含み、かつセルロースまたはリグノセルロース原料は、２４時間以内に１５％を超えるセルロースまたはリグノセルロース原料が単純糖類に変換されるのに十分な量の酵素で酵素処理されていない。
【００４４】
別の態様では、エタノール製造のための本発明の好適な実施形態に従ったプロセスが開示される。このプロセスは、（１）クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株をブロス中で培養すること；および（２）クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の培養中に１つ以上の培地成分をブロスに添加することであって、１つ以上の培地補充物が１つ以上の糖化合物を含み、かつクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）により他の化合物に変換される糖の量に関連させて、１つ以上の糖化合物を添加し、かつエタノールが約１０ｇ／Ｌよりも多く生産されることを含む。
【００４５】
上記プロセスの一実施形態では、１つ以上の培地成分は窒素源を含む。別の実施形態では、１つ以上の培地成分は、窒素源と、プロリン、グリシン、ヒスチジンおよび／またはイソロイシンを含む窒素源とを含む。別の実施形態では、１つ以上の培地成分は窒素源を含み、窒素源はプロリン、グリシン、ヒスチジンおよび／またはイソロイシンを含み、かつプロリン、グリシン、ヒスチジンまたはイソロイシンが少なくとも０．９ｇ／Ｌの量で供給される。
【００４６】
別の実施形態では、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の培養は増殖期を含み、かつ増殖期の間に培地成分の少なくとも一部をブロスに添加する。
【００４７】
別の実施形態では、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の培養は静止期を含み、かつ静止期の間に培地補充物の少なくとも一部をブロスに添加する。
【００４８】
別の態様では、エタノール製造のための本発明の好適な実施形態に従ったプロセスが開示される。このプロセスは、（１）クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）を含むブロスをエタノール生産に適した条件下で培養すること；および（２）ブロス中でクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）により生産されたエタノールを回収することであって、ブロス中のエタノール濃度が約８ｇ／Ｌを超えることを含む。上記プロセスの一実施形態では、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）培養中のある時点におけるブロス中のエタノール濃度は、約８〜約１４ｇ／Ｌの範囲にある。
【００４９】
別の態様では、エタノール製造のための本発明の好適な実施形態に従ったプロセスが開示される。このプロセスは、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）を含むブロスをエタノール生産に適した条件下で培養することを含み、ブロスは約８ｇ／Ｌを超える濃度のエタノールを含む。
【００５０】
別の態様では、エタノール製造のための本発明の好適な実施形態に従ったプロセスが開示される。このプロセスは、（１）第一のクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）接種材料を培地に添加してブロスを形成すること；（２）クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）を含むブロスをエタノール生産に適した条件下で培養すること；（３）第一のクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）接種材料を培地に添加後５時間を過ぎてから、追加のクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）生細胞をブロスに添加すること；および（４）ブロスを培養し続けることであって、エタノールが約８ｇ／Ｌよりも多く生産されることを含む。
【００５１】
上記プロセスの一実施形態では、このプロセスは、第一のクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）接種材料の添加後に、１つ以上の培地成分をブロスに添加することをさらに含む。
【００５２】
別の実施形態では、このプロセスは、第一のクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）接種材料の添加後に、１つ以上の培地成分をブロスに添加することをさらに含み、かつ培地成分の添加および生細胞の添加は逐次的にまたは同時に行う。
【００５３】
別の態様では、エタノール製造のための本発明の好適な実施形態に従ったプロセスが開示される。このプロセスは、（１）不純なエタノール原料から不純物を除去して精製エタノール原料を生産することであって、精製エタノール原料が約９０％（ｗｔ．）を超えるエタノールであり、かつ不純なエタノール原料がフェドバッチ培養でクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）細胞を培養することにより生成される発酵ブロスに由来することを含み、発酵ブロス中のエタノール濃度が約７ｇ／Ｌより高い。
【００５４】
上記プロセスの一実施形態では、不純なエタノール原料から除去される不純物は水を含む。
【００５５】
別の態様では、エタノール製造のための本発明の好適な実施形態に従ったプロセスが開示される。このプロセスは、（１）培地にクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）微生物を接種してブロスを形成すること；（２）微生物の増殖および微生物によるエタノール生産に適した条件下でブロスを培養すること；（３）微生物が存在する間に、培地をブロスに添加することによりブロス体積を増加させること；ならびに（４）微生物の増殖および微生物によるエタノール生産に適した条件下でブロスを培養し続けることであって、微生物の増殖期を約６時間以上に延長することを含む。
【００５６】
別の態様では、エタノール製造のための本発明の好適な実施形態に従ったプロセスが開示される。このプロセスは、（１）クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株と、プロリン、グリシン、ヒスチジンおよび／またはイソロイシンを含む窒素源とを含むブロスを、約８ｇ／Ｌ以上の濃度でのエタノール生産に適した条件下で培養することを含む。
【００５７】
上記プロセスの一実施形態では、プロリン、グリシン、ヒスチジンおよび／またはイソロイシンが少なくとも約０．０９ｇ／Ｌの量で供給される。別の実施形態では、窒素源の少なくとも一部をコーンスティープリカー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）またはコーンスティープパウダー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｐｏｗｄｅｒ）から得る。別の実施形態では、ブロスは少なくとも約０．４ｇ／Ｌのフィチン酸塩をさらに含む。別の実施形態では、ブロスはセルロースまたはリグノセルロース原料をさらに含む。別の実施形態では、ブロスはセルロースまたはリグノセルロース原料をさらに含み、セルロースまたはリグノセルロース原料は、２４時間以内に１５％を超えるセルロースまたはリグノセルロース原料が単純糖類に変換されるのに十分な量の酵素で酵素処理されていない。別の実施形態では、ブロスが少なくとも約０．４ｇ／Ｌのフィチン酸塩をさらに含み、かつプロリン、グリシン、ヒスチジンまたはイソロイシンが少なくとも約０．０９ｇ／Ｌの濃度で供給される。
【００５８】
別の態様では、エタノール製造のための本発明の好適な実施形態に従ったプロセスが開示される。このプロセスは、（１）クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株、窒素源およびフィチン酸塩を含むブロスを培養することであって、約８ｇ／Ｌ以上の濃度でのエタノール生産に適した条件下で、フィチン酸塩が約０．４ｇ／Ｌ以上の濃度で存在することを含む。
【００５９】
別の態様では、エタノール製造のための本発明の好適な実施形態に従ったプロセスが開示される。このプロセスは、（１）クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株を含むブロスを培養することであって、エタノールが少なくとも約３ｇ／（Ｌ・日）の瞬間生産性で生産されることを含む。このプロセスの一実施形態では、エタノールが約３ｇ／（Ｌ・日）〜約１５ｇ／（Ｌ・日）の瞬間速度で生産される。別の実施形態では、エタノールが約５ｇ／（Ｌ・日）〜約１２ｇ／（Ｌ・日）の瞬間生産性で生産される。別の実施形態では、エタノールが約７ｇ／（Ｌ・日）〜約１０ｇ／（Ｌ・日）の瞬間生産性で生産される。
【００６０】
別の実施形態では、ブロスはフィチン酸塩を含む。別の実施形態では、ブロスはプロリン、グリシン、ヒスチジンおよび／またはイソロイシンを含む。別の実施形態では、ブロスはセルロースまたはリグノセルロース原料を含む。別の実施形態では、ブロスはセルロースまたはリグノセルロース原料を含み、セルロースまたはリグノセルロース原料は、２４時間以内に１５％を超えるセルロースまたはリグノセルロース原料が単純糖類に変換されるのに十分な量の酵素で酵素処理されていない。
【００６１】
別の態様では、エタノール製造のための本発明の好適な実施形態に従ったプロセスが開示される。このプロセスは、（１）クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の増殖に適した培地にクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）培養物を接種して、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のブロスを得ることであって、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）がその前にエタノール生産に使用されていることを含む。
【００６２】
上記プロセスの一実施形態では、このプロセスは、エタノール生産に適した条件下でクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のブロスを増殖させること、エタノールを生産することおよびブロスからエタノールを含む原料を回収することをさらに含む。
【００６３】
別の実施形態では、このプロセスは、約６ｇ／Ｌよりも高いエタノール濃度でクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のブロスを増殖させることをさらに含む。別の実施形態では、このプロセスは、約６〜約１８０ｇ／Ｌのエタノール濃度でクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のブロスを増殖させることをさらに含む。別の実施形態では、このプロセスは、約１５〜約１６０ｇ／Ｌのエタノール濃度でクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のブロスを増殖させることをさらに含む。別の実施形態では、このプロセスは、約２０〜約１００ｇ／Ｌのエタノール濃度でクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のブロスを増殖させることをさらに含む。別の実施形態では、このプロセスは、約３０〜約８０ｇ／Ｌのエタノール濃度でクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のブロスを増殖させることをさらに含む。別の実施形態では、このプロセスは、約８〜約１４ｇ／Ｌのエタノール濃度でクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のブロスを増殖させることをさらに含む。別の実施形態では、このプロセスは、エタノール生産に適した条件下でクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のブロスを増殖させること、エタノールを生産することおよびブロスからエタノールを含む原料を回収することをさらに含む。
【００６４】
別の態様では、エタノール製造のための本発明の好適な実施形態に従ったプロセスが開示される。このプロセスは、（１）クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の増殖に適したある量の培地に、ある量のクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）培養物を接種して、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のブロスを得ることであって、培養培地に対する培養物の体積の比は約０．１〜約１であること；および（２）エタノール生産に適した条件下でクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のブロスを増殖させること、およびクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のブロスからエタノールを含む原料を回収することを含む。
【００６５】
上記プロセスの一実施形態では、ブロスの増殖中にエタノールが約８〜約１５０ｇ／Ｌの濃度で存在する。別の実施形態では、培養培地に対する培養物の体積の比は約０．２〜約１である。別の実施形態では、ブロスの増殖中にエタノールが約８ｇ／Ｌより高い濃度で存在する。
【００６６】
燃料生産のための別の方法および組成物が提供される。一態様では、本発明はアルコール生産のための方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、添加ｐＨ調整剤の存在下でクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）細胞を発酵させて、アルコールを生産することを含む。いくつかの実施形態では、アルコールはエタノールである。
【００６７】
この態様のいくつかの実施形態では、細胞の発酵は約６．０〜約７．２のｐＨで起こる。他の実施形態では、細胞の発酵は約６．２〜約６．８のｐＨで起こる。
【００６８】
この態様のいくつかの実施形態では、アルコールは約１５〜約２００ｇ／Ｌの濃度で生産される。他の実施形態では、アルコールは約１５〜約１５０ｇ／Ｌの濃度で生産される。他の実施形態では、アルコールは約１８〜約１００ｇ／Ｌの濃度で生産される。他の実施形態では、アルコールは約２０〜約６０ｇ／Ｌの濃度で生産される。
【００６９】
別の態様では、本発明は、添加脂肪酸含有原料の存在下でクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）細胞を発酵させることによるアルコールの生産方法を提供する。いくつかの実施形態では、脂肪酸含有原料は食用油脂である。いくつかの実施形態では、脂肪酸含有原料は、デルタ−９位に不飽和を有する脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸含有原料は、オメガ−９位に不飽和を有する脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸含有原料は１つ以上のオレイン酸およびリノール酸を含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸含有原料は、コーン油、ヒマワリ油、ベニバナ油、カノーラ油、ダイズ油またはナタネ油の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸含有原料はリン脂質またはリゾリン脂質を含む。
【００７０】
別の態様では、本発明は発酵ブロスを提供し、このブロスはクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）細胞および添加ｐＨ調整剤を含み、そこではアルコールが生産される。
【００７１】
別の態様では、本発明は発酵ブロスを提供し、このブロスはクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）細胞および添加脂肪酸含有化合物を含み、そこではアルコールが生産される。
【００７２】
別の態様では、本発明はアルコールの生産方法を提供し、それはクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）細胞の発酵ならびにｐＨ調整剤および脂肪酸含有原料の存在を含み、そこではアルコールが生産される。
【００７３】
参照による組込み
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示された場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７４】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に記載される。本発明の特徴および利点は、本発明の原理を用いた具体的な実施形態を記載した以下の詳細な説明およびその添付の図面を参照することにより、さらに理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）によるバッチ発酵の基質およびエタノール濃度のグラフである。
【図２】クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）によるフェドバッチ発酵の基質およびエタノール濃度のグラフである。
【図３】酵母抽出物を用いたクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）発酵中の時間関数としてのエタノール濃度のグラフである。
【図４】異なる脂肪酸の発酵条件に対する経時的なエタノール濃度のグラフを示す。
【図５】異なるｐＨの発酵条件に対する経時的なエタノール濃度のグラフを示す。
【図６】異なる脂肪酸およびｐＨの発酵条件に対する経時的なエタノール濃度のグラフを示す。
【図７】クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）を形質転換するために使用されるプラスミドｐＩＭＰＴ１０２９の地図である。
【図８】最初に、加水分解ユニット内で高い温度および圧力においてバイオマスを酸で処理することにより、バイオマスから発酵最終産物を生産するための方法の例である。
【図９】バイオマスを発酵容器に投入することにより、バイオマスから発酵最終産物を生産するための方法を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。
【００７７】
「約」は、言及される数値表示のプラス・マイナス１０％の数値表示を意味する。例えば、約４という用語であれば３．６〜４．４の範囲を包含する。
【００７８】
本明細書では「発酵最終産物」は、バイオ燃料、化学製品、液体燃料、ガス燃料、試薬、化学供給原料、化学添加物、加工助剤、食品添加物として適した化合物およびその他の生成物を包含するために使用される。発酵最終産物の例としては、１，４−二酸（コハク酸、フマル酸およびリンゴ酸）、２，５フランジカルボン酸、３ヒドロキシプロピオン酸、アスパラギン酸、グルカル酸、グルタミン酸、イタコン酸、レブリン酸、３−ヒドロキシブチロラクトン、グリセロール、ソルビトール、キシリトール／アラビニトール、ブタンジオール、ブタノール、メタン、メタノール、エタン、エテン、エタノール、ｎ−プロパン、１−プロペン、１−プロパノール、プロパナール、アセトン、プロピオン酸、ｎ−ブタン、１−ブテン、１−ブタノール、ブタナール、ブタノアート、イソブタナール、イソブタノール、２−メチルブタナール、２−メチルブタノール、３−メチルブタナール、３−メチルブタノール、２−ブテン、２−ブタノール、２−ブタノン、２，３−ブタンジオール、３−ヒドロキシ−２−ブタノン、２，３−ブタンジオン、エチルベンゼン、エテニルベンゼン、２−フェニルエタノール、フェニルアセトアルデヒド、１−フェニルブタン、４−フェニル−１−ブテン、４−フェニル−２−ブテン、１−フェニル−２−ブテン、１−フェニル−２−ブタノール、４−フェニル−２−ブタノール、１−フェニル−２−ブタノン、４−フェニル−２−ブタノン、１−フェニル−２，３−ブタンジオール、１−フェニル−３−ヒドロキシ−２−ブタノン、４−フェニル−３−ヒドロキシ−２−ブタノン、１−フェニル−２，３−ブタンジオン、ｎ−ペンタン、エチルフェノール、エテニルフェノール、２−（４−ヒドロキシフェニル）エタノール、４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、１−（４−ヒドロキシフェニル）ブタン、４−（４−ヒドロキシフェニル）−１−ブテン、４−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ブテン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−ブテン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ブタノール、４−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ブタノール、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ブタノン、４−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ブタノン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ブタンジオール、１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−ブタノン、４−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−ブタノン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ブタノンジオン、インドリルエタン、インドリルエテン、２−（インドール−３−）エタノール、ｎ−ペンタン、１−ペンテン、１−ペンタノール、ペンタナール、ペンタノアート、２−ペンテン、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−ペンタノン、３−ペンタノン、４−メチルペンタナール、４−メチルペンタノール、２，３−ペンタンジオール、２−ヒドロキシ−３−ペンタノン、３−ヒドロキシ−２−ペンタノン、２，３−ペンタンジオン、２−メチルペンタン、４−メチル−１−ペンテン、４−メチル−２−ペンテン、４−メチル−３−ペンテン、４−メチル−２−ペンタノール、２−メチル−３−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノン、２−メチル−３−ペンタノン、４−メチル−２，３−ペンタンジオール、４−メチル−２−ヒドロキシ−３−ペンタノン、４−メチル−３−ヒドロキシ−２−ペンタノン、４−メチル−２，３−ペンタンジオン、１−フェニルペンタン、１−フェニル−１−ペンテン、１−フェニル−２−ペンテン、１−フェニル−３−ペンテン、１−フェニル−２−ペンタノール、１−フェニル−３−ペンタノール、１−フェニル−２−ペンタノン、１−フェニル−３−ペンタノン、１−フェニル−２，３−ペンタンジオール、１−フェニル−２−ヒドロキシ−３−ペンタノン、１−フェニル−３−ヒドロキシ−２−ペンタノン、１−フェニル−２，３−ペンタンジオン、４−メチル−１−フェニルペンタン、４−メチル−１−フェニル−１−ペンテン、４−メチル−１−フェニル−２−ペンテン、４−メチル−１−フェニル−３−ペンテン、４−メチル−１−フェニル−３−ペンタノール、４−メチル−１−フェニル−２−ペンタノール、４−メチル−１−フェニル−３−ペンタノン、４−メチル−１−フェニル−２−ペンタノン、４−メチル−１−フェニル−２，３−ペンタンジオール、４−メチル−１−フェニル−２，３−ペンタンジオン、４−メチル−１−フェニル−３−ヒドロキシ−２−ペンタノン、４−メチル−１−フェニル−２−ヒドロキシ−３−ペンタノン、１−（４−ヒドロキシフェニル）ペンタン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−ペンテン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ペンテン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ペンテン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ペンタノール、１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ペンタノール、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ペンタノン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ペンタノン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ペンタンジオール、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−３−ペンタノン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−ペンタノン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ペンタンジオン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）ペンタン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ペンテン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ペンテン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−ペンテン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ペンタノール、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ペンタノール、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ペンタノン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ペンタノン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ペンタンジオール、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ペンタンジオン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−ペンタノン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−３−ペンタノン、１−インドール−３−ペンタン、１−（インドール−３）−１−ペンテン、１−（インドール−３）−２−ペンテン、１−（インドール−３）−３−ペンテン、１−（インドール−３）−２−ペンタノール、１−（インドール−３）−３−ペンタノール、１−（インドール−３）−２−ペンタノン、１−（インドール−３）−３−ペンタノン、１−（インドール−３）−２，３−ペンタンジオール、１−（インドール−３）−２−ヒドロキシ−３−ペンタノン、１−（インドール−３）−３−ヒドロキシ−２−ペンタノン、１−（インドール−３）−２，３−ペンタンジオン、４−メチル−１−（インドール−３−）ペンタン、４−メチル−１−（インドール−３）−２−ペンテン、４−メチル−１−（インドール−３）−３−ペンテン、４−メチル−１−（インドール−３）−１−ペンテン、４−メチル−２−（インドール−３）−３−ペンタノール、４−メチル−１−（インドール−３）−２−ペンタノール、４−メチル−１−（インドール−３）−３−ペンタノン、４−メチル−１−（インドール−３）−２−ペンタノン、４−メチル−１−（インドール−３）−２，３−ペンタンジオール、４−メチル−１−（インドール−３）−２，３−ペンタンジオン、４−メチル−１−（インドール−３）−３−ヒドロキシ−２−ペンタノン、４−メチル−１−（インドール−３）−２−ヒドロキシ−３−ペンタノン、ｎ−ヘキサン、１−ヘキセン、１−ヘキサノール、ヘキサナール、ヘキサノアート、２−ヘキセン、３−ヘキセン、２−ヘキサノール、３−ヘキサノール、２−ヘキサノン、３−ヘキサノン、２，３−ヘキサンジオール、２，３−ヘキサンジオン、３，４−ヘキサンジオール、３，４−ヘキサンジオン、２−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、３−ヒドロキシ−２−ヘキサノン、３−ヒドロキシ−４−ヘキサノン、４−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２−メチル−２−ヘキセン、２−メチル−３−ヘキセン、５−メチル−１−ヘキセン、５−メチル−２−ヘキセン、４−メチル−１−ヘキセン、４−メチル−２−ヘキセン、３−メチル−３−ヘキセン、３−メチル−２−ヘキセン、３−メチル−１−ヘキセン、２−メチル−３−ヘキサノール、５−メチル−２−ヘキサノール、５−メチル−３−ヘキサノール、２−メチル−３−ヘキサノン、５−メチル−２−ヘキサノン、５−メチル−３−ヘキサノン、２−メチル−３，４−ヘキサンジオール、２−メチル−３，４−ヘキサンジオン、５−メチル−２，３−ヘキサンジオール、５−メチル−２，３−ヘキサンジオン、４−メチル−２，３−ヘキサンジオール、４−メチル−２，３−ヘキサンジオン、２−メチル−３−ヒドロキシ−４−ヘキサノン、２−メチル−４−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、５−メチル−２−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、５−メチル−３−ヒドロキシ−２−ヘキサノン、４−メチル−２−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、４−メチル−３−ヒドロキシ−２−ヘキサノン、２，５−ジメチルヘキサン、２，５−ジメチル−２−ヘキセン、２，５−ジメチル−３−ヘキセン、２，５−ジメチル−３−ヘキサノール、２，５−ジメチル−３−ヘキサノン、２，５−ジメチル−３，４−ヘキサンジオール、２，５−ジメチル−３，４−ヘキサンジオン、２，５−ジメチル−３−ヒドロキシ−４−ヘキサノン、５−メチル−１−フェニルヘキサン、４−メチル−１−フェニルヘキサン、５−メチル−１−フェニル−１−ヘキセン、５−メチル−１−フェニル−２−ヘキセン、５−メチル−１−フェニル−３−ヘキセン、４−メチル−１−フェニル−１−ヘキセン、４−メチル−１−フェニル−２−ヘキセン、４−メチル−１−フェニル−３−ヘキセン、５−メチル−１−フェニル−２−ヘキサノール、５−メチル−１−フェニル−３−ヘキサノール、４−メチル−１−フェニル−２−ヘキサノール、４−メチル−１−フェニル−３−ヘキサノール、５−メチル−１−フェニル−２−ヘキサノン、５−メチル−１−フェニル−３−ヘキサノン、４−メチル−１−フェニル−２−ヘキサノン、４−メチル−１−フェニル−３−ヘキサノン、５−メチル−１−フェニル−２，３−ヘキサンジオール、４−メチル−１−フェニル−２，３−ヘキサンジオール、５−メチル−１−フェニル−３−ヒドロキシ−２−ヘキサノン、５−メチル−１−フェニル−２−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、４−メチル−１−フェニル−３−ヒドロキシ−２−ヘキサノン、４−メチル−１−フェニル−２−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、５−メチル−１−フェニル−２，３−ヘキサンジオン、４−メチル−１−フェニル−２，３−ヘキサンジオン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）ヘキサン、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−ヘキセン、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ヘキセン、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヘキセン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−ヘキセン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ヘキセン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヘキセン、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ヘキサノール、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヘキサノール、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ヘキサノール、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヘキサノール、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ヘキサノン、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヘキサノン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ヘキサノン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヘキサノン、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ヘキサンジオール、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ヘキサンジオール、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−ヘキサノン、５−メチル−１−（４
−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−ヘキサノン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、５−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ヘキサンジオン、４−メチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ヘキサンジオン、４−メチル−１−（インドール−３−）ヘキサン、５−メチル−１−（インドール−３）−１−ヘキセン、５−メチル−１−（インドール−３）−２−ヘキセン、５−メチル−１−（インドール−３）−３−ヘキセン、４−メチル−１−（インドール−３）−１−ヘキセン、４−メチル−１−（インドール−３）−２−ヘキセン、４−メチル−１−（インドール−３）−３−ヘキセン、５−メチル−１−（インドール−３）−２−ヘキサノール、５−メチル−１−（インドール−３）−３−ヘキサノール、４−メチル−１−（インドール−３）−２−ヘキサノール、４−メチル−１−（インドール−３）−３−ヘキサノール、５−メチル−１−（インドール−３）−２−ヘキサノン、５−メチル−１−（インドール−３）−３−ヘキサノン、４−メチル−１−（インドール−３）−２−ヘキサノン、４−メチル−１−（インドール−３）−３−ヘキサノン、５−メチル−１−（インドール−３）−２，３−ヘキサンジオール、４−メチル−１−（インドール−３）−２，３−ヘキサンジオール、５−メチル−１−（インドール−３）−３−ヒドロキシ−２−ヘキサノン、５−メチル−１−（インドール−３）−２−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、４−メチル−１−（インドール−３）−３−ヒドロキシ−２−ヘキサノン、４−メチル−１−（インドール−３）−２−ヒドロキシ−３−ヘキサノン、５−メチル−１−（インドール−３）−２，３−ヘキサンジオン、４−メチル−１−（インドール−３）−２，３−ヘキサンジオン、ｎ−ヘプタン、１−ヘプテン、１−ヘプタノール、ヘプタナール、ヘプタノアート、２−ヘプテン、３−ヘプテン、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、４−ヘプタノール、２−ヘプタノン、３−ヘプタノン、４−ヘプタノン、２，３−ヘプタンジオール、２，３−ヘプタンジオン、３，４−ヘプタンジオール、３，４−ヘプタンジオン、２−ヒドロキシ−３−ヘプタノン、３−ヒドロキシ−２−ヘプタノン、３−ヒドロキシ−４−ヘプタノン、４−ヒドロキシ−３−ヘプタノン、２−メチルヘプタン、３−メチルヘプタン、６−メチル−２−ヘプテン、６−メチル−３−ヘプテン、２−メチル−３−ヘプテン、２−メチル−２−ヘプテン、５−メチル−２−ヘプテン、５−メチル−３−ヘプテン、３−メチル−３−ヘプテン、２−メチル−３−ヘプタノール、２−メチル−４−ヘプタノール、６−メチル−３−ヘプタノール、５−メチル−３−ヘプタノール、３−メチル−４−ヘプタノール、２−メチル−３−ヘプタノン、２−メチル−４−ヘプタノン、６−メチル−３−ヘプタノン、５−メチル−３−ヘプタノン、３−メチル−４−ヘプタノン、２−メチル−３，４−ヘプタンジオール、２−メチル−３，４−ヘプタンジオン、６−メチル−３，４−ヘプタンジオール、６−メチル−３，４−ヘプタンジオン、５−メチル−３，４−ヘプタンジオール、５−メチル−３，４−ヘプタンジオン、２−メチル−３−ヒドロキシ−４−ヘプタノン、２−メチル−４−ヒドロキシ−３−ヘプタノン、６−メチル−３−ヒドロキシ−４−ヘプタノン、６−メチル−４−ヒドロキシ−３−ヘプタノン、５−メチル−３−ヒドロキシ−４−ヘプタノン、５−メチル−４−ヒドロキシ−３−ヘプタノン、２，６−ジメチルヘプタン、２，５−ジメチルヘプタン、２，６−ジメチル−２−ヘプテン、２，６−ジメチル−３−ヘプテン、２，５−ジメチル−２−ヘプテン、２，５−ジメチル−３−ヘプテン、３，６−ジメチル−３−ヘプテン、２，６−ジメチル−３−ヘプタノール、２，６−ジメチル−４−ヘプタノール、２，５−ジメチル−３−ヘプタノール、２，５−ジメチル−４−ヘプタノール、２，６−ジメチル−３，４−ヘプタンジオール、２，６−ジメチル−３，４−ヘプタンジオン、２，５−ジメチル−３，４−ヘプタンジオール、２，５−ジメチル−３，４−ヘプタンジオン、２，６−ジメチル−３−ヒドロキシ−４−ヘプタノン、２，６−ジメチル−４−ヒドロキシ−３−ヘプタノン、２，５−ジメチル−３−ヒドロキシ−４−ヘプタノン、２，５−ジメチル−４−ヒドロキシ−３−ヘプタノン、ｎ−オクタン、１−オクテン、２−オクテン、１−オクタノール、オクタナール、オクタノアート、３−オクテン、４−オクテン、４−オクタノール、４−オクタノン、４，５−オクタンジオール、４，５−オクタンジオン、４−ヒドロキシ−５−オクタノン、２−メチルオクタン、２−メチル−３−オクテン、２−メチル−４−オクテン、７−メチル−３−オクテン、３−メチル−３−オクテン、３−メチル−４−オクテン、６−メチル−３−オクテン、２−メチル−４−オクタノール、７−メチル−４−オクタノール、３−メチル−４−オクタノール、６−メチル−４−オクタノール、２−メチル−４−オクタノン、７−メチル−４−オクタノン、３−メチル−４−オクタノン、６−メチル−４−オクタノン、２−メチル−４，５−オクタンジオール、２−メチル−４，５−オクタンジオン、３−メチル−４，５−オクタンジオール、３−メチル−４，５−オクタンジオン、２−メチル−４−ヒドロキシ−５−オクタノン、２−メチル−５−ヒドロキシ−４−オクタノン、３−メチル−４−ヒドロキシ−５−オクタノン、３−メチル−５−ヒドロキシ−４−オクタノン、２，７−ジメチルオクタン、２，７−ジメチル−３−オクテン、２，７−ジメチル−４−オクテン、２，７−ジメチル−４−オクタノール、２，７−ジメチル−４−オクタノン、２，７−ジメチル−４，５−オクタンジオール、２，７−ジメチル−４，５−オクタンジオン、２，７−ジメチル−４−ヒドロキシ−５−オクタノン、２，６−ジメチルオクタン、２，６−ジメチル−３−オクテン、２，６−ジメチル−４−オクテン、３，７−ジメチル−３−オクテン、２，６−ジメチル−４−オクタノール、３，７−ジメチル−４−オクタノール、２，６−ジメチル−４−オクタノン、３，７−ジメチル−４−オクタノン、２，６−ジメチル−４，５−オクタンジオール、２，６−ジメチル−４，５−オクタンジオン、２，６−ジメチル−４−ヒドロキシ−５−オクタノン、２，６−ジメチル−５−ヒドロキシ−４−オクタノン、３，６−ジメチルオクタン、３，６−ジメチル−３−オクテン、３，６−ジメチル−４−オクテン、３，６−ジメチル−４−オクタノール、３，６−ジメチル−４−オクタノン、３，６−ジメチル−４，５−オクタンジオール、３，６−ジメチル−４，５−オクタンジオン、３，６−ジメチル−４−ヒドロキシ−５−オクタノン、ｎ−ノナン、１−ノネン、１−ノナノール、ノナナール、ノナノアート、２−メチルノナン、２−メチル−４−ノネン、２−メチル−５−ノネン、８−メチル−４−ノネン、２−メチル−５−ノナノール、８−メチル−４−ノナノール、２−メチル−５−ノナノン、８−メチル−４−ノナノン、８−メチル−４，５−ノナンジオール、８−メチル−４，５−ノナンジオン、８−メチル−４−ヒドロキシ−５−ノナノン、８−メチル−５−ヒドロキシ−４−ノナノン、２，８−ジメチルノナン、２，８−ジメチル−３−ノネン、２，８−ジメチル−４−ノネン、２，８−ジメチル−５−ノネン、２，８−ジメチル−４−ノナノール、２，８−ジメチル−５−ノナノール、２，８−ジメチル−４−ノナノン、２，８−ジメチル−５−ノナノン、２，８−ジメチル−４，５−ノナンジオール、２，８−ジメチル−４，５−ノナンジオン、２，８−ジメチル−４−ヒドロキシ−５−ノナノン、２，８−ジメチル−５−ヒドロキシ−４−ノナノン、２，７−ジメチルノナン、３，８−ジメチル−３−ノネン、３，８−ジメチル−４−ノネン、３，８−ジメチル−５−ノネン、３，８−ジメチル−４−ノナノール、３，８−ジメチル−５−ノナノール、３，８−ジメチル−４−ノナノン、３，８−ジメチル−５−ノナノン、３，８−ジメチル−４，５−ノナンジオール、３，８−ジメチル−４，５−ノナンジオン、３，８−ジメチル−４−ヒドロキシ−５−ノナノン、３，８−ジメチル−５−ヒドロキシ−４−ノナノン、ｎ−デカン、１−デセン、１−デカノール、デカノアート、２，９−ジメチルデカン、２，９−ジメチル−３−デセン、２，９−ジメチル−４−デセン、２，９−ジメチル−５−デカノール、２，９−ジメチル−５−デカノン、２，９−ジメチル−５，６−デカンジオール、２，９−ジメチル−６−ヒドロキシ−５−デカノン、２，９−ジメチル−５，６−デカンジオンｎ−ウンデカン、１−ウンデセン、１−ウンデカノール、ウンデカナール．ウンデカノアート、ｎ−ドデカン、１−ドデセン、１−ドデカノール、ドデカナール、ドデカノアート、ｎ−ドデカン、１−デカデセン、１−ドデカノール、ドデカナール、ドデカノアート、ｎ−トリデカン、１−トリデセン、１−トリデカノール、トリデカナール、トリデカノアート、ｎ−テトラデカン、１−テトラデセン、１−テトラデカノール、テトラデカナール、テトラデカノアート、ｎ−ペンタデカン、１−ペンタデセン、１−ペンタデカノール、ペンタデカナール、ペンタデカノアート、ｎ−ヘキサデカン、１−ヘキサデセン、１−ヘキサデカノール、ヘキサデカナール、ヘキサデカノアート、ｎ−ヘプタデカン、１−ヘプタデセン、１−ヘプタデカノール、ヘプタデカナール、ヘプタデカノアート、ｎ−オクタデカン、１−オクタデセン、１−オクタデカノール、オクタデカナール、オクタデカノアート、ｎ−ノナデカン、１−ノナデセン、１−ノナデカノール、ノナデカナール、ノナデカノアート、エイコサン、１−エイコセン、１−エイコサノール、エイコサナール、エイコサノアート、３−ヒドロキシプロパナール、１，３−プロパンジオール、４−ヒドロキシブタナール、１，４−ブタンジオール、３−ヒドロキシ−２−ブタノン、２，３−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、ホモクエン酸、ホモイソクエン酸、ｂ−ヒドロキシアジピン酸、グルタル酸、グルタルセミアルデヒド、グルタルアルデヒド、２−ヒドロキシ−１−シクロペンタノン、１，２−シクロペンタンジオール、シクロペンタノン、シクロペンタノール、（Ｓ）−２−アセト乳酸、（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−イソバレラート、２−オキソイソバレラート、イソブチリル−ＣｏＡ、イソブチラート、イソブチルアルデヒド、５−アミノペンタアルデヒド、１，１０−ジアミノデカン、１，１０−ジアミノ−５−デセン、１，１０−ジアミノ−５−ヒドロキシデカン、１，１０−ジアミノ−５−デカノン、１，１０−ジアミノ−５，６−デカンジオール、１，１０−ジアミノ−６−ヒドロキシ−５−デカノン、フェニルアセトアルデヒド、１，４−ｄｉフェニルブタン、１，４−ジフェニル−１−ブテン、１，４−ジフェニル−２−ブテン、１，４−ジフェニル−２−ブタノール、１，４−ジフェニル−２−ブタノン、１，４−ジフェニル−２，３−ブタンジオール、１，４−ジフェニル−３−ヒドロキシ−２−ブタノン、１−（４−ハイドキシフェニル（ｈｙｄｅｏｘｙｐｈｅｎｙｌ））−４−フェニルブタン、１−（４−ハイドキシフェニル（ｈｙｄｅｏｘｙｐｈｅｎｙｌ））−４−フェニル−１−ブテン、１−（４−ハイドキシフェニル（ｈｙｄｅｏｘｙｐｈｅｎｙｌ））−４−フェニル−２−ブテン、１−（４−ハイドキシフェニル（ｈｙｄｅｏｘｙｐｈｅｎｙｌ））−４−フェニル−２−ブタノール、１−（４−ハイドキシフェニル（ｈｙｄｅｏｘｙｐｈｅｎｙｌ））−４−フェニル−２−ブタノン、１−（４−ハイドキシフェニル（ｈｙｄｅｏｘｙｐｈｅｎｙｌ））−４−フェニル−２，３−ブタンジオール、１−（４−ハイドキシフェニル（ｈｙｄｅｏｘｙｐｈｅｎｙｌ））−４−フェニル−３−ヒドロキシ−２−ブタノン、１−（インドール−３）−４−フェニルブタン、１−（インドール−３）−４−フェニル−１−ブテン、１−（インドール−３）−４−フェニ
ル−２−ブテン、１−（インドール−３）−４−フェニル−２−ブタノール、１−（インドール−３）−４−フェニル−２−ブタノン、１−（インドール−３）−４−フェニル−２，３−ブタンジオール、１−（インドール−３）−４−フェニル−３−ヒドロキシ−２−ブタノン、４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、１，４−ジ（４−ヒドロキシフェニル）ブタン、１，４−ジ（４−ヒドロキシフェニル）−１−ブテン、１，４−ジ（４−ヒドロキシフェニル）−２−ブテン、１，４−ジ（４−ヒドロキシフェニル）−２−ブタノール、１，４−ジ（４−ヒドロキシフェニル）−２−ブタノン、１，４−ジ（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ブタンジオール、１，４−ジ（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−ブタノン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−４−（インドール−３−）ブタン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−４−（インドール−３）−１−ブテン、１−ジ（４−ヒドロキシフェニル）−４−（インドール−３）−２−ブテン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−４−（インドール−３）−２−ブタノール、１−（４−ヒドロキシフェニル）−４−（インドール−３）−２−ブタノン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−４−（インドール−３）−２，３−ブタンジオール、１−（４−ヒドロキシフェニル−４−（インドール−３）−３−ヒドロキシ−２−ブタノン、インドール−３−アセトアルデヒド、１，４−ジ（インドール−３−）ブタン、１，４−ジ（インドール−３）−１−ブテン、１，４−ジ（インドール−３）−２−ブテン、１，４−ジ（インドール−３）−２−ブタノール、１，４−ジ（インドール−３）−２−ブタノン、１，４−ジ（インドール−３）−２，３−ブタンジオール、１，４−ジ（インドール−３）−３−ヒドロキシ−２−ブタノン、コハク酸セミアルデヒド、ヘキサン−１，８−ジカルボン酸、３−ヘキセン−１，８−ジカルボン酸、３−ヒドロキシ−ヘキサン−１，８−ジカルボン酸、３−ヘキサノン−１，８−ジカルボン酸、３，４−ヘキサンジオール−１，８−ジカルボン酸、４−ヒドロキシ−３−ヘキサノン−１，８−ジカルボン酸、フコイダン、ヨウ素、クロロフィル、カロテノイド、カルシウム、マグネシウム、鉄、ナトリウム、カリウム、リン酸、乳酸、酢酸、ギ酸、イソプレノイドおよびゴムを含めたポリイソプレンが挙げられるが、これらに限定されない。さらに上記産物は、コハク酸、ピルビン酸、酵素、例えばセルラーゼ、ポリサッカラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、リグニナーゼおよびヘミセルラーゼなどを包含し得、純粋化合物、混合物または不純もしくは希釈形態として存在し得る。
【００７９】
本明細書で使用される「脂肪酸含有原料」という用語は、当業者に公知のその通常の意味を有し、１つ以上の脂肪酸部分を含む１つ以上の化合物および上記化合物の誘導体、ならびに１つ以上の上記化合物を含む原料を含み得る。１つ以上の脂肪酸部分を含有する化合物の一般的な例としては、トリアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、リン脂質、リゾリン脂質、遊離脂肪酸、脂肪酸塩、石鹸、脂肪酸含有アミド、脂肪酸と一価アルコールのエステル、脂肪酸とグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールなど）を含めた多価アルコールのエステル、脂肪酸とポリエチレングリコールのエステル、脂肪酸とポリエーテルのエステル、脂肪酸とポリグリコールのエステル、脂肪酸と糖類のエステル、脂肪酸と他のヒドロキシル含有化合物とのエステルなどが挙げられる。脂肪酸含有原料は、単離または精製された形態の１つ以上の上記化合物であり得る。これは、他の同様のまたは異なる原料と組み合わされたまたは混合された、１つ以上の上記化合物を含む原料であり得る。これは、脂肪酸含有原料が、他の同様のまたは異なる原料、例えば、植物および動物油；植物および動物油の混合物；植物および動物油副生成物；植物および動物油副生成物の混合物；植物および動物ワックスエステル；植物および動物ワックスエステルの混合物、誘導体および副生成物；種子；加工種子；種子副生成物；殻果；加工殻果；殻果副生成物；動物性物質；加工動物性物質；動物性物質副生成物；トウモロコシ；加工トウモロコシ；トウモロコシ副生成物；蒸留穀物残渣（ｄｉｓｔｉｌｌｅｒ’ｓ  ｇｒａｉｎｓ）；豆；加工豆；豆副生成物；大豆製品；脂質を含有する植物性、魚類性または動物性物質；加工された、脂質を含有する植物性または動物性物質；脂質を含有する植物性、魚類性または動物性物質の副生成物；脂質を含有する微生物原料；加工された、脂質を含有する微生物原料；ならびに脂質を含有する微生物物質の副生成物などと共に生じるか、または提供される物質であり得る。このような原料は、液体または固体形態で使用され得る。固体形態としては、全形態、例えば細胞、豆および種子など；粉末化、寸断、スラリー化、抽出、薄片化、粉砕された形態などが挙げられる。脂肪酸含有化合物の脂肪酸部分は、置換または非置換アルキル基と結合しているカルボキシル基を含む脂肪酸のような単純脂肪酸であり得る。置換または非置換アルキル基は、直鎖または分岐、飽和または不飽和であり得る。アルキル基上での置換は、ヒドロキシル、リン酸、ハロゲン、アルコキシまたはアリール基を含み得る。置換または非置換アルキル基は、７〜２９個の炭素、好ましくは、側鎖および／または置換を有するかまたは有さない直鎖状に配列された１１〜２３個の炭素（例えば、カルボキシル基も含めて８〜３０個の炭素、好ましくは１２〜２４個の炭素）を有し得る。脂肪酸含有化合物の添加は、脂肪酸含有化合物を含有する原料の添加によるものであり得る。
【００８０】
本明細書で使用される「ｐＨ調整剤」という用語は、当業者に公知のその通常の意味を有し、ブロスまたは培地のｐＨを上昇、低下または安定させる傾向のある任意の物質を包含し得る。ｐＨ調整剤は、酸、塩基、緩衝剤、または存在する他の物質と反応してｐＨを上昇、低下もしくは安定させる働きのある物質であり得る。いくつかの実施形態では、２つ以上のｐＨ調整剤、例えば２つ以上の酸、２つ以上の塩基、１つ以上の酸と１つ以上の塩基、１つ以上の酸と１つ以上の緩衝剤、１つ以上の塩基と１つ以上の緩衝剤、または１つ以上の酸と１つ以上の塩基と１つ以上の緩衝剤などであり得る。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、ブロスもしくは培地中でまたは別個に生成され、少なくとも一部はそれぞれ酸もしくは塩基と塩基もしくは酸の形で反応することにより、一成分として使用され得る。２つ以上のｐＨ調整剤を使用する場合、これらは同じ時間または異なる時間に添加し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の酸と１つ以上の塩基を組み合わせて１つの緩衝剤を得てもよい。いくつかの実施形態では、炭素源または窒素源のような培地成分もｐＨ調整剤として働くことができ；適切な培地成分としては、高いもしくは低いｐＨのもの、または緩衝能を有するものが挙げられる。培地成分の例としては、酸または塩基で加水分解された、残留酸または塩基を有する植物多糖類、アンモニア繊維爆砕（ＡＦＥＸ）処理された、残留アンモニアを有する植物原料、乳酸、コーンスティープソリッド（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｓｏｌｉｄ）またはコーンスティープリカー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）が挙げられる。
【００８１】
本明細書で使用される「発酵」という用語は、当業者に公知のその通常の意味を有し、微生物用の適切な培地中または培地上での微生物または微生物群の培養を包含し得る。微生物は、好気性菌、嫌気性菌、通性嫌気性菌、従属栄養生物、独立栄養生物、光独立栄養生物、光従属栄養生物、化学合成独立栄養生物および／または化学合成従属栄養生物であり得る。微生物は、好気的または嫌気的に生育し得る。これらは、遅滞（または誘導）期、対数期、移行期、定常期、死滅期、静止期、栄養期、胞子形成期などを含めた任意の増殖期であり得る。
【００８２】
「増殖期」は、「誘導期」の後かつ「静止期」および「死滅期」の前に起こる細胞増殖のタイプを記述するために使用される。増殖期は、指数期または対数期（ｌｏｇ  ｐｈａｓｅまたはｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ  ｐｈａｓｅ）と呼ばれることもある。
【００８３】
本明細書で使用される「植物多糖」という用語は、当業者に公知のその通常の意味を有し、糖および糖誘導体ポリマー、ならびに／または植物性物質中に存在するその他のポリマー原料を１つ以上含み得る。植物多糖類の例としては、リグニン、セルロース、デンプン、ペクチンおよびヘミセルロースが挙げられる。他の多糖類は、キチン、硫酸化多糖類、例えばアルギン酸、アガロース、カラゲナン、ポルフィラン、フルセレランおよびフノランなどが挙げられる。一般に多糖は、２つ以上の糖単位または糖単位誘導体を有し得る。糖単位および／または糖単位誘導体は、規則的なパターンまたはそれ以外で反復し得る。糖単位は、ヘキソース単位またはペントース単位あるいはこれらの組合せであり得る。糖単位誘導体は、糖アルコール、糖酸、アミノ糖などであり得る。多糖類は、直鎖状、分岐状、架橋またはそれらの組合せであり得る。多糖の１つのタイプまたはクラスは、別のタイプまたはクラスの多糖と架橋され得る。
【００８４】
本明細書で使用される「発酵性糖」という用語は、当業者に公知のその通常の意味を有し、炭素源として微生物により利用され得る１つ以上の糖および／または糖誘導体を包含し得、２つ以上の上記化合物を含む、上記化合物のモノマー、ダイマーおよびポリマーを包含する。ある場合には、分解原料を加える前に、微生物がこれらのポリマーを加水分解などにより分解し得る。典型的な発酵性糖としては、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、ラムノース、セロビオース、ラクトース、スクロース、マルトースおよびフルクトースが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
本明細書で使用される「糖化」という用語は、当業者に公知のその通常の意味を有し、植物多糖類を微生物により直ちに利用され得る低分子量種に変換することを包含する。いくつかの微生物では、これは、約７モノマー単位以下の単糖類、二糖類、三糖類およびオリゴ糖類、ならびに同様の大きさの鎖の糖誘導体および糖と糖誘導体の組合せへの変換を包含し得る。いくつかの微生物では、許容可能な鎖長は、より長いものであり得、いくつかの微生物では、許容可能な鎖長はより短いものであり得る。
【００８６】
本明細書で使用される「バイオマス」という用語は、当業者に公知のその通常の意味を有し、バイオ燃料、化学製品またはその他の生成物に変換され得る１つ以上の生物学的原料を包含し得る。バイオマス源の一例は植物性物質である。植物性物質は、例えば、木質植物性物質、非木質植物性物質、セルロース原料、リグノセルロース原料、ヘミセルロース原料、炭水化物、ペクチン、デンプン、イヌリン、フルクタン、グルカン、トウモロコシ、サトウキビ、草、スイッチグラス、タケ、藻およびこれらに由来する原料であり得る。植物性物質は、存在する化学種、例えばタンパク質、多糖類および油に言及することにより、さらに記載することができる。多糖類としては、グルコース、フルクトース、ラクトース、ガラクツロン酸、ラムノースなどを含めた様々な単糖類および単糖類誘導体のポリマーが挙げられる。また植物性物質として、農業廃棄物の副生成物またはサイドストリーム、例えば絞り粕、コーンスティープリカー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）、コーンスティープソリッド（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｓｏｌｉｄ）、蒸留穀物残渣（ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  ｇｒａｉｎｓ）、皮、種子、発酵廃棄物、わら、材木、汚水、生ごみおよび残飯も挙げられる。これらの原料は、農場、林業、工業発生源、家庭などから生じ得る。別の非限定的なバイオマスの例は動物性物質であり、例えば、乳、肉、脂肪、動物加工廃棄物および動物廃棄物が挙げられる。本明細書に記載のようなプロセスに使用されるバイオマスを指すために、「供給原料」がよく使用される。
【００８７】
本明細書では「ブロス」は、接種直後の時点および任意のまたはすべての細胞活動が停止した後の期間を含めた、任意の増殖段階で接種された培地を指すために使用され、発酵処理後の原料を包含し得る。これは必要に応じて、可溶性および不溶性物質、懸濁物質、細胞ならびに培地の組合せの全内容物を包含する。
【００８８】
本明細書で使用される「生産性」という用語は、当業者に公知のその通常の意味を有し、所与の体積中で所与の時間内に生産される目的物質の質量を包含し得る。単位は、例えば、リットル−時間当たりのグラム数、または質量、体積および時間の他の組合せであり得る。発酵では、生産性は、所与の発酵体積内で生産物が生成され得る速さの特性を表すために使用される。体積は、発酵容器の総体積、発酵容器の稼動体積または発酵されているブロスの実体積を基準とし得る。この語句の文脈により、当業者を対象とした意味が示されるであろう。生産性は、それが時間の用語を含むという点で「力価」とは異なり、力価は濃度と類似している。力価および生産性は一般に、発酵中の任意の時点、例えば開始、終了時またはある中間時点などで測定することができ、力価は、目的とする時点で存在するまたは生産された特定物質の量と関連し、生産性は、所与の時間量で１リットル当たりに生産される特定物質の量と関連する。生産性判定で使用される時間量は、発酵の開始または他のある時間から、発酵の終了、例えば、さらなる物質が生産されない時点、または回収が行われる時点、またはこの用語が使用される文脈により示される他のある時点までであり得る。「全生産性」は、最終力価および全発酵時間を用いて判定される。「最大力価に対する生産性」は、最大力価および最大力価を達成するための時間を用いて判定される生産性を指す。「瞬間生産性」は、ある瞬間の生産性を指し、目的化合物の力価対時間曲線の傾きから、または実施状況および用語の文脈により決定される他の適当な手段により判定することができる。「生産性増加量」は、発酵時間の一部分、例えば数分、１時間または数時間などにわたる生産性を指す。多くの場合、生産性増加量は、瞬間生産性を意味するか、またはそれに近い意味である。この値の決定方法を示す文脈よって、他のタイプの生産性も使用され得る。
【００８９】
「力価」は、発酵ブロス中に存在する特定物質の量を指す。これは濃度と同様であり、全発酵サイクルからのブロス中の微生物により生成される物質の量、または進行中の発酵サイクルにおいてもしくは所与の時間にわたって生成される物質の量、またはあらゆる源由来の存在する物質、例えば微生物により生産されたもしくはブロスに添加された物質の量を指し得る。多くの場合、可溶種の力価は不溶物を除去したブロスの液体部分を基準とし、不溶種の力価は不溶種が存在するブロスの総量を基準とするが、場合によっては、可溶種の力価が総ブロス体積を基準とし得、不溶種の力価が液体部分を基準とし得るが、この場合、意図される両方の基準系に関してどちらの系が使用されるかが文脈により示される。多くの場合、一方の系を基準にして決定される値は、他方の系を基準にした値と同じであるか、または十分に近似している。ブロス中の物質を指す場合の「濃度」は一般に、微生物により生成されたものまたはブロスに添加されたものに関係なく、すべての源由来の存在する物質の量を指す。「力価」に関しては、濃度は可溶種または不溶種を指し得、ブロスの液体部分かブロスの総体積のいずれかを基準とし得る。
【００９０】
本明細書で使用される「生体触媒」という用語は、当業者に公知のその通常の意味を有し、溶液、懸濁液および酵素と微生物の混合物を含めた、１つ以上の酵素および微生物を包含し得る。文脈によっては、この単語は、特定の機能を果たす酵素または微生物の可能な使用を指す場合、２つを組み合わせた使用を指す場合、および２つのうちの一方のみを指す場合がある。この語句の文脈により、当業者を対象とした意味が示されるであろう。
【００９１】
本明細書で使用される「変換効率」または「収率」という用語は、当業者に公知のその通常の意味を有し、ある質量の基質から生成される生産物の質量を包含し得る。この用語は、開始質量の基質に由来する生産物のパーセント収率として表すことができる。グルコースからのエタノール生産では、正味の反応は一般に：
Ｃ６Ｈ１２Ｏ６→２Ｃ２Ｈ５ＯＨ＋２ＣＯ２
と考えられており、理論上の最大変換効率または収率は５１％（ｗｔ．）である。多くの場合、変換効率は理論最大値を基準とし、例えば「理論最大値の８０％」となる。グルコースからエタノールへの変換の場合、この記述は４１％（ｗｔ．）の変換効率を示すことになる。この語句の文脈により、当業者を対象とした基質および生産物が示されるであろう。
【００９２】
本明細書では「前処理」または「前処理された」は、複合段階によるか、または逐次的に行われるかに関係なく、バイオマスが酵素および／または微生物による攻撃をより受けやすくするためにバイオマスの破壊または膨張を達成する任意の機械的、化学的、熱的、生化学的プロセスまたはこれらのプロセスの組合せを指すために使用される。いくつかの実施形態では、前処理は、植物中のセルロースおよびヘミセルロースポリマーをセルロース分解酵素および／または微生物により利用されやすくするために、例えば、酸または塩基での処置により、リグニンを除去または破壊することを含み得る。いくつかの実施形態では、前処理は、例えば、酸または塩基での処置により、植物多糖類を別の種類の微生物がより利用しやすくするために、ある種類の微生物を使用することを含み得る。いくつかの実施形態では、前処理は、セルロースおよび／またはヘミセルロース原料の破壊または膨張も含み得る。水蒸気爆砕およびアンモニア繊維膨潤（爆砕）（ＡＦＥＸ）は、公知の熱的／化学的技術である。酸、塩基および／または酵素を使用する方法を含めた加水分解を使用することができる。他の熱的、化学的、生化学的、酵素的技術も使用することができる。
【００９３】
本明細書では「フェドバッチ」または「フェドバッチ発酵」は、培養の間に、栄養素、他の培地成分または生体触媒（例えば、酵素、新たな微生物、細胞外ブロスなどを含む）は発酵槽へ供給するが、培養ブロスは発酵終了まで発酵槽から回収しない微生物の培養法を包含するために使用されるが、発酵槽体積の一部を回収し、次いで、発酵槽内の残りのブロスに新たな培地を加え、少なくとも接種材料の一部は発酵槽内に残ったブロスである、「自然接種」または「部分回収」技術も包含し得る。フェドバッチ発酵の間に、ブロス体積は、発酵微生物が存在する間に培地または栄養素をブロスに添加することにより、少なくともある期間は増加し得る。いくつかのフェドバッチ発酵では、ブロス体積が栄養素の添加による影響を受けず、場合によっては栄養素の添加により変化しないことがあり得る。使用することができる適切な栄養素としては、気体、液体および固体を含めた、可溶性、不溶性および一部可溶性のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、フェドバッチプロセスは、「細胞増加を伴うフェドバッチ」のような語句と共に言及され得る。この語句は、栄養素および細胞を加える操作、または実質量の栄養素なしで細胞を加える操作を包含し得る。より一般的な語句「フェドバッチ」も上記操作を包含する。任意の上記語句が使用される文脈により、考慮されている技術が当業者に示されるであろう。
【００９４】
本明細書で使用される「フィチン酸塩」という用語は、当業者に公知のその通常の意味を有し、フィチン酸、その塩およびその混合形態、ならびにこれらの組合せを包含し得る。
【００９５】
本明細書では「糖化合物」は、ヘキソースおよびペントースを含むがこれらに限定されない単糖；糖アルコール；糖酸；糖アミン；これらが共有結合またはイオン結合により直接的または間接的に２つ以上結合したものを含有する化合物；ならびにそれらの混合物を包含するために使用される。この記述には、二糖類；三糖類；オリゴ糖類；多糖類；ならびに任意の長さの分岐および／または直鎖状糖鎖が含まれる。
【００９６】
本明細書では「乾燥細胞重量」は、ブロスまたは接種材料の細胞含有量を決定する方法およびそれにより決定される値を指す。一般にこの方法は、必須ではないが、ある体積のブロスをリンスまたは洗浄した後に、残渣を乾燥させて重量を量ることを含む。ある場合には、ブロス試料を単に遠心分離して細胞含有層を回収し、乾燥させて重量を量る。多くの場合、ブロスを遠心分離し、次いで、水、または水と他成分、例えば緩衝剤、等張状態を生じる成分、浸透圧の任意の変化を調節する成分などとの混合物中に再懸濁する。遠心分離−再懸濁段階を必要に応じて繰り返すことができ、最終的な遠心分離および乾燥の前に、異なる再懸濁溶液を使用することができる。不溶性の培地成分が存在する場合、不溶性成分の存在を無視して、上記のように値を決定する。不溶性の培地成分が存在する場合の好適な方法としては、不溶性成分を、可溶型のものと反応させる、水を含み得る異なる溶媒中に溶解させる、もしくはその中に抽出するか、あるいは適当な方法、例えば遠心分離、勾配遠心分離、浮選、ろ過、または他の適当な技術もしくは技術の組合せなどにより分離する方法が挙げられる。
【００９７】
説明
以下の説明および例は、本開示の発明の典型的ないくつかの実施形態を詳細に説明するものである。本発明の範囲に包含される本発明の変更および修正が数多く存在することを、当業者は理解するであろう。したがって、特定の例示的な実施形態の説明が本発明の範囲を限定するものと見なすべきではない。
【００９８】
Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）（「Ｑ微生物」）はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ７００３９４Ｔを含み、いくつかの実施形態では、培養株ＩＳＤｇＴの表現型および遺伝子型の特徴に基づき定義することができる（Ｗａｒｎｉｃｋら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５２：１１５５−６０，２００２）。本発明の態様は概略的には、エタノールのような燃料および／または他の有用な有機生成物を生産するためのシステム、方法および組成物を含み、これらは例えば、ＩＳＤｇＴ株、および／または遺伝子組換え菌株または別に分離された菌株を含めた、ＩＳＤｇＴ株に由来し得る菌株を含む、任意の他のクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）種の菌株を含む。いくつかの典型的な種は、標準的な分類学的考察を用いて定義することができる（ＳｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔおよびＧｏｅｂｅｌ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，４４：８４６−９，１９９４）：菌株（ＩＳＤｇＴ）タイプと比べて９７％以上の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列相同値を有する菌株および少なくとも約７０％のＤＮＡ再結合値を有する菌株はクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）と見なすことができる。７０％以上のＤＮＡ再結合値を有する多くの微生物はまた、少なくとも９６％のＤＮＡ配列同一性を有し、種を定義する表現型形質を共有することを示す証拠が多数存在する。クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ＩＳＤｇＴ株のゲノム配列解析は、植物多糖発酵の機構および経路に関与する可能性のある数多くの遺伝子および遺伝子座の存在を示しており、これらはクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）種のすべてまたはほぼすべての菌株に見られる、この微生物の並外れた発酵特性を生じさせる。クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）菌株は天然の分離菌または遺伝子組換え株であり得る。
【００９９】
Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の特性
「Ｑ」微生物は、バイオマスからエタノールおよびその他の生成物への変換に有用な利点をもたらす。Ｑ微生物の１つの利点は、多糖類および高分子量糖類を、オリゴ糖、二糖および単糖類のような低分子量糖類に加水分解することができる酵素を生産するその能力である。Ｑ微生物は、広い範囲の加水分解酵素を生産することができ、これらの酵素は、セルロース、ヘミセルロース、リグノセルロース原料；ペクチン；デンプン；木材；紙；農産物；森林廃棄物；樹木廃棄物；樹皮；葉；草；ソーグラス（ｓａｗｇｒａｓｓ）；木質植物性物質；非木質植物性物質；炭水化物；ペクチン；デンプン；イヌリン；フルクタン；グルカン；トウモロコシ；サトウキビ；草；タケ；藻および上記原料に由来する原料を含めた様々なバイオマス原料の発酵を促進し得る。この微生物は通常、上記酵素を必要に応じて、多くの場合は不必要な加水分解酵素を過剰に生産せずに生産し得るか、またはいくつかの実施形態では、１つ以上の酵素を添加して微生物の生産能をさらに向上させることができる。非常に広範囲の加水分解酵素を生産するこの能力は、バイオマス発酵、特に、供給原料として単純糖を利用しないバイオマス発酵において、Ｑ微生物および関連技術に明らかな利点をもたらす。様々な発酵条件が微生物の活動を増大させる結果、より高い収率、より高い生産性、より優れた生成物選択性および／またはより高い変換効率を生じ得る。いくつかの実施形態では、発酵条件は、フェドバッチ操作および細胞増加を伴うフェドバッチ操作；コーンスティープパウダー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｐｏｗｄｅｒ）または酵母抽出物のような複合窒素源の添加；プロリン、グリシン、イソロイシンおよび／またはヒスチジンを含めた特定アミノ酸の添加；１つ以上の上記アミノ酸を含有する複合体原料の添加；フィチン酸塩、プロテアーゼ酵素またはポリサッカラーゼ酵素のような他の栄養素または他の化合物の添加を含み得る。一実施形態では、発酵条件は、有機窒素源を有する培地の補充を含み得る。別の実施形態では、発酵条件は、無機窒素源を有する培地の補充を含み得る。いくつかの実施形態では、１つの原料の添加が、例えばアミノ酸とフィチン酸塩を供給するなど、２つ以上の部類に属する補充物を供給し得る。
【０１００】
いくつかの実施形態では、Ｑ微生物を用いて、エタノール、水素または他の化学製品、例えばギ酸、酢酸および乳酸を含めた有機酸などを生産する発酵の準備などで、バイオマス中に存在する様々な高分子糖類（高分子量）を低分子糖類（低分子量）に加水分解することができる。Ｑ微生物の別の利点は、多糖類ならびにヘキソース糖単位を含有する、またはペントース糖単位を含有する、および両方を含有する高分子糖類を、低分子糖類および場合によっては単糖類に加水分解するその能力である。上記酵素および／または加水分解物を発酵で使用して、燃料およびその他の化学製品を含めた様々な生成物を生産することができる。Ｑ微生物の別の利点は、単糖類のような低分子糖類（低分子量）からエタノール、水素およびその他の燃料または化合物、例えば酢酸、ギ酸および乳酸を含めた有機酸などを生産するその能力である。Ｑ微生物の別の利点は、糖類を含有する高分子量バイオマスおよび／または高分子糖類または多糖類を低分子糖類に加水分解する段階と、これらの低分子糖類を、エタノール、水素およびその他の燃料または化合物、例えばギ酸、酢酸および乳酸を含めた有機酸などを含めた所望の生成物に発酵する段階との組合せを行うその能力である。
【０１０１】
Ｑ微生物の別の利点は、高エタノール濃度、高糖濃度、低糖濃度を含む条件下で増殖する、不溶性炭素源を利用するおよび／または嫌気性条件下で働くその能力である。上記特性は、様々な組合せで、長い発酵周期での作動を達成するために使用することができ、かつバッチ発酵、フェドバッチ発酵、自然接種／部分回収発酵、および接種材料として最終発酵からの細胞の再利用と組み合わせて使用することができる。
【０１０２】
一般的に、細胞再利用および部分回収発酵のような技術は、こうした技術に固有の様々な問題点により、生産規模での操作ではあまり使用されない。例えば、細胞が単に、十分なまたは最初もしく以前の発酵と同様の収率および／または生産性の発酵を後に提供しなくなる「培養物の疲弊」は稀ではない。さらに、特に、ブロスの回収中であり無菌性が中断される危険性がある場合、長期間にわたる単一培養による操作により、それが使用されている培養物および発酵物の汚染の深刻な問題が生じ得る。その結果、細胞再利用および／または部分回収発酵のための微生物の適合性は、一般的に期待されない。
【０１０３】
ある場合には、バイオマス原料をエタノールに変換するプロセスは、バイオマス原料（例えば、「供給原料」）の前処理、前処理バイオマスの加水分解による多糖類からオリゴ糖への変換、オリゴ糖類から単糖類へのさらなる加水分解および単糖類からエタノールへの変換を含む。ある場合には、バイオマスは、エタノールまたは他の生成物を生産するために発酵微生物によって利用され得る単糖類または他の糖類へ直接加水分解され得る。異なる最終産物、例えば炭化水素、水素、メタン、アルコール（例えば、ブタノール、プロパノール、メタノールなど）のようなヒドロキシ化合物、アルデヒドおよびケトン（例えば、アセトン、ホルムアルデヒド、１−プロパナールなど）のようなカルボニル化合物、有機酸、エステル（例えば、ワックスエステル、グリセリドなど）のような有機酸誘導体、ならびに限定されないが、１、２−プロパンジオール、１、３−プロパンジオール、乳酸、ギ酸、酢酸、コハク酸、ピルビン酸、酵素、例えばセルラーゼ、ポリサッカラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、リグニナーゼおよびヘミセルラーゼなどを含めた他の機能的化合物などが望まれる場合、その特定化合物の生合成に単糖類を使用することができる。利用可能なバイオマス原料としては、木質植物性物質、非木質植物性物質、セルロース原料、リグノセルロース原料、ヘミセルロース原料、炭水化物、ペクチン、デンプン、イヌリン、フルクタン、グルカン、トウモロコシ、サトウキビ、草、スイッチグラス、タケおよびこれらに由来する原料が挙げられる。次いで、所望の最終産物の特性に適するように、最終産物を分離および／または精製することができる。場合によっては、糖アルコールまたは糖酸のような糖関連化合物も利用することができる。
【０１０４】
この実施形態では、いつでも２つ以上の上記段階を行うことができる。例えば、前処理供給原料の加水分解とオリゴ糖類の加水分解を行い、そしてこれらの１つ以上を同時に行って、単糖類をエタノールに変換することができる。
【０１０５】
場合によっては、酵素は多糖類を単糖類に直接変換し得る。場合によっては、酵素が多糖類をオリゴ糖類に加水分解し、そしてその酵素または別の酵素がそのオリゴ糖類を単糖類に加水分解し得る。
【０１０６】
一実施形態では、発酵中に存在する酵素は、別途生産されて、次いで発酵に添加され得るか、またはそれらは発酵中に存在する微生物により生産され得る。他の実施形態では、発酵中に存在する微生物が酵素を生産し得る場合もあれば、酵素が別途生産されて発酵に添加され得る場合もある。
【０１０７】
前処理バイオマスから最終産物への変換が全般的に速い速度で行われるためには、各変換段階に必要な各酵素が、十分に高い活性状態で存在する必要がある。これらの酵素の１つが不在であるか、または不十分な量で存在すれば、エタノールまたは他の所望の生成物の生産速度が低下する。また、単糖類から生成物への変換に関与する微生物が、単糖類を低速でしか取り込まない、あるいは／または単糖類およびエタノールへの変換中に生産される中間産物を転移するのに限られた能力しか有さない場合にも、生産速度が低下する。
【０１０８】
一実施形態では、この方法の酵素はＱ微生物それ自体により生産され、その酵素はバイオマス原料に適した範囲の加水分解酵素を含む。一実施形態では、Ｑ微生物は、存在する多糖の糖化に必要な酵素の生産を誘導および／または促進するのに適した条件下で増殖する。上記酵素の生産は、播種用発酵容器または他の発酵容器のような別の容器内で、またはエタノール生産が行われる生産用発酵容器内で行われ得る。酵素が別の容器内で生産される場合、それらは、例えば細胞と共に、または酵素と共に細胞間媒介物を含有する、細胞を比較的含まない溶液として、生産用容器に移される。酵素が別の容器で生産される場合、それらを、生産用発酵容器に添加される前に乾燥および／または精製することもできる。酵素の生産に適した条件は、続く発酵段階で細胞が加水分解すると予想されるバイオマスを含む培地で細胞を増殖させることにより管理される場合が多い。追加の培地成分、例えば、限定されないがフィチン酸塩、アミノ酸およびペプチドを含めた、塩補充物、増殖因子および補助因子なども、所望の生成物の生産において微生物により利用される酵素の生産の補助となり得る。
【０１０９】
供給原料および供給原料の前処理
セルロース、ヘミセルロースおよび／またはリグノセルロース原料を含有し得る供給原料は、農作物、作物残渣、樹木、木片、おがくず、紙、ボール紙、草およびその他の源に由来し得る。
【０１１０】
セルロースは、グルコース単位がβ（１→４）結合により結合した、グルコースの線状ポリマーである。ヘミセルロースは、グルコース、キシロース、マンノース、ガラクトース、ラムノースおよびアラビノースを含めた多数の糖モノマーからなる分岐ポリマーであり、存在するマンヌロン酸およびガラクツロン酸のような糖酸も有し得る。リグニンは、主としてｐ−クマリルアルコール、コンフェリルアルコール（ｃｏｎｆｅｒｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）およびシナピルアルコールからなる、架橋されたラセミ巨大分子である。これら３つのポリマーは、植物性バイオマス中のリグノセルロース原料中に一緒に存在する。この３つのポリマーの異なる特性により、各ポリマーが他のポリマーを酵素の攻撃から保護する傾向があるため、加水分解の組合せが困難となり得る。
【０１１１】
本発明の一態様では、発酵ならびにバイオ燃料およびエタノール生産で使用する供給原料の前処理の方法が提供される。前処理段階は、燃料および化学製品生産のためのバイオプロセスで使用される前の機械的、熱的、圧力、化学的、熱化学的および／または生化学的試験前処理を含み得るが、未処理のバイオマス原料をこのプロセスで使用することもできる。機械的プロセスは、バイオマス原料がバイオプロセスにおいてより好都合に処理されるようにその粒子サイズを減少させることができ、さらに供給原料の表面積を増加させて、化学物質／生化学物質／生体触媒との接触を容易にすることができる。機械的プロセスは、１つのタイプのバイオマス原料を別のものから分離することもできる。バイオマス原料に熱的および／または化学的前処理を行うことにより、植物性ポリマーをより利用しやすくすることもできる。複数の処理段階を使用することもできる。
【０１１２】
機械的プロセスとしては、洗浄、浸漬、粉砕、サイズ減少、篩過、剪断、サイズによる分別および密度による分別プロセスが挙げられるが、これらに限定されない。化学的プロセスとしては、漂白、酸化、還元、酸処理、塩基処理、亜硫酸処理、酸性亜硫酸処理、塩基性亜硫酸処理、アンモニア処理および加水分解が挙げられるが、これらに限定されない。熱的プロセスとしては、滅菌、アンモニア繊維膨潤または爆砕（「ＡＦＥＸ」）、水蒸気爆砕、水の存在または非存在下における加圧下または非加圧下での高温保持および凍結が挙げられるが、これらに限定されない。生化学的プロセスとしては、酵素による処理および微生物による処理が挙げられるが、これらに限定されない。利用可能な様々な酵素としては、セルラーゼ、アミラーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、グルコナーゼ（ｇｌｕｃｏｎａｓｅ）およびその他のポリサッカラーゼ；リゾチーム；ラッカーゼおよびその他のリグニン修飾酵素；リポキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼおよびその他の酸化酵素；プロテアーゼ；ならびにリパーゼを挙げることができる。機械的、化学的、熱的、熱化学的および生化学的プロセスを１つ以上組み合わせるか、または別々に用いることができる。このような複合プロセスは、紙、セルロース製品、微結晶性セルロースおよびセルロース系物質の生産に使用されるものも含み得、さらにパルプ製造、クラフト・パルプ法、酸性亜硫酸処理を含み得る。供給原料は、セルロース、ヘミセルロースまたはリグノセルロース原料のようなバイオマス原料に１つ以上の上記プロセスを用いる施設からのサイドストリームまたは廃水流であり得る。例としては、製紙工場、セルロース系工場、木綿加工工場および微結晶性セルロース工場が挙げられる。供給原料は、セルロース含有またはセルロース系物質含有廃棄物も含み得る。供給原料は、例えば、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）などによるエタノールまたは他の生成物生産を目的とした供給原料として生産または収穫された木材、草、トウモロコシ、デンプンまたは糖などのバイオマス原料も含み得る。
【０１１３】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許および米国特許出願第ＵＳ２００４０１５２８８１号、第ＵＳ２００４０１７１１３６号、第ＵＳ２００４０１６８９６０号、第ＵＳ２００８０１２１３５９号、第ＵＳ２００６００６９２４４号、第ＵＳ２００６０１８８９８０号、第ＵＳ２００８０１７６３０１号、第５６９３２９６号、第６２６２３１３号、第ＵＳ２００６００２４８０１号、第５９６９１８９号、第６０４３３９２号、第ＵＳ２００２００３８０５８号、第ＵＳ５８６５８９８号、第ＵＳ５８６５８９８号、第ＵＳ６４７８９６５号、第５９８６１３３号、第ＵＳ２００８０２８０３３８号に開示されている前処理プロセスを利用し得る。
【０１１４】
別の実施形態では、ＡＦＥＸプロセスをバイオマスの前処理に使用し得る。好適な一実施形態では、セルロース、ヘミセルロースまたはリグノセルロース原料をエタノールまたはその他の生成物へ発酵するための準備に使用する。このプロセスは概略的には、供給原料とアンモニアの混合、圧力下での加熱および急激な圧力除去を含む。様々な量で水が存在し得る。ＡＦＥＸプロセスは、数多くの特許および刊行物の主題となっている。
【０１１５】
別の実施形態では、バイオマスの前処理は、バイオマスが分解を受けやすくするためにバイオマスに水酸化カルシウムを添加することを含む。前処理は、バイオマスに水酸化カルシウムおよび水を添加して混合物を形成すること、ならびにその混合物を比較的高温に維持することを含む。あるいは、酸素および酸素含有ガスからなる群より選択される酸化剤を、圧力下で混合物に添加し得る。水酸化炭素処理の例は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｌｔｚａｐｐｌｅに対する米国特許第５８６５８９８号ならびにＳ．ＫｉｍおよびＭ．Ｔ．Ｈｏｌｚａｐｐｌｅ，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９６，（２００５）１９９４に開示されている。
【０１１６】
他の実施形態では、バイオマスの前処理は希酸加水分解を含む。希酸加水分解処理の例は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔ．Ａ．ＬｌｏｙｄおよびＣ．Ｅ  Ｗｙｍａｎ，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００５）９６，１９６７に開示されている。
【０１１７】
他の実施形態では、バイオマスの前処理はｐＨ制御液体熱水処理を含む。ｐＨ制御液体熱水処理の例は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｎ．Ｍｏｓｉｅｒら，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００５）９６，１９８６に開示されている。
【０１１８】
他の実施形態では、バイオマスの前処理は水溶性アンモニアリサイクルプロセス（ＡＲＰ）を含む。水溶性アンモニアリサイクルプロセスの例は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔ．Ｈ．ＫｉｍおよびＹ．Ｙ．Ｌｅｅ，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００５）９６，２００７に記載されている。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、上記方法は次の２つの段階を有する：洗浄流を生じる前処理段階および加水分解流を生じる前処理バイオマスの酵素的加水分解段階。上記方法では、前処理段階が行われるｐＨは、酸加水分解、熱水前処理またはアルカリ試薬による方法（ＡＦＥＸ、ＡＲＰおよび石灰前処理）を含む。希酸および熱水処理法が主としてヘミセルロースを可溶化するのに対し、アルカリ試薬を用いる方法は、前処理段階中に大部分のリグニンを除去する。その結果、前者の方法での前処理からの洗浄流が、主としてヘミセルロース系の糖類を含有するのに対し、この流水は、主として高ｐＨ法のためのリグニンを含む。これに続く残留バイオマスの酵素的加水分解では、アルカリによる前処理法においては混合糖（Ｃ５およびＣ６）を生じるが、グルコースが低ｐＨおよび中性ｐＨ法による加水分解物中の主要生成物である。残留バイオマスの酵素的消化性は、セルラーゼ酵素のセルロースへの接触を阻害し得るリグニンが除去されることから、高ｐＨ法の方がやや優れている。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、バイオマスの前処理はイオン液体前処理を含む。バイオマスをイオン液体とのインキュベーションにより前処理を行い、次いで、アルコールまたは水のような洗浄溶媒でＩＬ抽出を行い得る。次いで、この処理バイオマスを遠心分離またはろ過によりイオン液体／洗浄溶媒溶液から分離し、糖化リアクターまたは容器に移し得る。イオン液体前処理の例は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００８／０２２７１６２号に開示されている。
【０１２１】
前処理法の例は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｌｅに対する米国特許第４６００５９０号、Ｃｈｏｕに対する米国特許第４６４４０６０号、Ｄａｌｅに対する米国特許第５０３７６６３号、Ｈｏｌｔｚａｐｐｌｅらに対する米国特許第５１７１５９２号、Ｋａｒｓｔｅｎｓらに対する米国特許第５９３９５４４号、Ｂｒｅｄｅｒｅｃｋらに対する米国特許第５４７３０６１号、Ｋａｒｓｔｅｎｓに対する米国特許第６４１６６２１号、Ｄａｌｅらに対する米国特許第６１０６８８８号、Ｄａｌｅらに対する米国特許第６１７６１７６号、Ｄａｌｅらに対するＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／０２０９０１号、Ｆｅｌｉｘ，Ａ．ら，Ａｎｉｍ．Ｐｒｏｄ．５１，４７−６１（１９９０）、Ｗａｉｓ，Ａ．Ｃ．，Ｊｒ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５，Ｎｏ．１，１０９−１１２（１９７２）に開示されている。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、バイオマスの前処理は酵素加水分解を含む。一実施形態では、酵素または酵素混合物、例えば、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リアーゼ、エステラーゼおよび糖質結合モジュール含有タンパク質で前処理し得る。いくつかの実施形態では、酵素または酵素混合物は、異なる活性を有する別々の酵素であり得る。いくつかの実施形態では、酵素または酵素混合物は、特定の触媒活性を有する酵素ドメインであり得る。例えば、複数の活性を有する酵素は、例えばグリコシドヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リアーゼおよび／またはエステラーゼ触媒ドメインを含めた複数の酵素ドメインを有し得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、バイオマスの前処理は、Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）由来の１つ以上の酵素での酵素加水分解を含む。いくつかの実施形態では、バイオマスの前処理は、Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）由来の１つ以上の酵素での酵素加水分解を含み、１つ以上の酵素は、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リアーゼ、エステラーゼおよび糖質結合モジュール含有タンパク質からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、バイオマスを、Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）において同定される加水分解酵素で前処理し得る。Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）において同定される加水分解酵素の例としては、Ｃｐｈｙ３３６７、Ｃｐｈｙ３３６８、Ｃｐｈｙ０４３０、Ｃｐｈｙ３８５４、Ｃｐｈｙ０８５７、Ｃｐｈｙ０６９４およびＣｐｈｙ１９２９（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、バイオマスの前処理は、表１、表２、表３または表４に記載の１つ以上の酵素での酵素加水分解を含む。表１〜４はそれぞれ、Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）に存在すると予想されるグリコシドヒドロラーゼ、リアーゼ、エステラーゼおよび糖質結合モジュール含有タンパク質ファミリーメンバーの一部の既知の活性の例を示す。既知の活性は、活性、および国際生化学・分子生物学連合により決定されている通りの対応するＰＣ番号により記載する。
【０１２５】
【表１−１】
2012519500.tif 000003
【表１−２】
2012519500.tif 000004
【表１−３】
2012519500.tif 000005
【表１−４】
2012519500.tif 000006
【表１−５】
2012519500.tif 000007
【０１２６】
【表２】
2012519500.tif 000008
【０１２７】
【表３】
2012519500.tif 000009
【０１２８】
【表４−１】
2012519500.tif 000010
【表４−２】
2012519500.tif 000011
【表４−３】
2012519500.tif 000012
【０１２９】
いくつかの実施形態では、多糖類を分解する酵素をバイオマスの前処理に使用し、セルロースを分解する酵素、すなわちセルラーゼを含み得る。いくつかのセルラーゼの例は、エンドセルラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）およびエキソセルラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）を含み、ベータ−１，４−グルコシド結合を加水分解する。
【０１３０】
バイオマスの前処理で使用し得る、Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）において予想されるエンドセルラーゼの例としては、ＧＨ５ファミリー、例えばＣｐｈｙ３３６８、Ｃｐｈｙｌ１６３およびＣｐｈｙ２０５８など；Ｃｐｈｙ３２０７のようなＧＨ８ファミリー；ならびにＣｐｈｙ３３６７のようなＧＨ９ファミリー内の遺伝子が挙げられる。バイオマスの前処理で使用し得る、Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のエキソセルラーゼの例としては、Ｃｐｈｙ３３６８のようなＧＨ４８ファミリー内の遺伝子が挙げられる。一部のエキソセルラーゼは、多糖類を加水分解してグルコースからなる２〜４単位のオリゴ糖を生成し、セロデキストリン二糖（セロビオース）、三糖（セロトリオース）または四糖（セロテトラオース）を生じる。ＧＨ５、ＧＨ９およびＧＨ４８ファミリーのメンバーは、エキソ−およびエンド−セルラーゼ活性の両方を有し得る。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、多糖類を分解する酵素をバイオマスの前処理に使用し、ヘミセルロースを分解する能力を有する酵素、すなわちヘミセルラーゼを含み得る（Ｌｅｓｃｈｉｎｅ、Ｓ．Ｂ．ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ（Ｄｕｒｒｅ，Ｐ．編）（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、２００５））。ヘミセルロースは、植物バイオマスの主要成分となり得、ペントースおよびヘキソース、例えば、Ｄ−キシロピラノース、Ｌ−アラビノフラノース、Ｄ−マンノピラノース、Ｄ−グルコピラノース、Ｄ−ガラクトピラノース、Ｄ−グルコピラノシルウロン酸およびその他の糖類の混合物を含有し得る（Ａｓｐｉｎａｌｌ，Ｇ．Ｏ．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ  ４７３，１９８０；Ｈａｎ、Ｊ．Ｓ．＆  Ｒｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｓ．ｉｎ  Ｐａｐｅｒ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ａｇｒｏ−ｂａｓｅｄ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ８３，１９９７）。特定の実施形態では、バイオマスの前処理で使用し得る、Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）において同定される予想されるヘミセルラーゼとしては、ヘミセルロースの直線状主鎖に対して活性な酵素、例えば、エンド−ベータ−１，４−Ｄ−キシラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８）、例えばＧＨ５、ＧＨ１０、ＧＨ１１、およびＧＨ４３ファミリーメンバーなど；１，４−ベータ−Ｄ−キシロシドキシロヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３７）、例えばＧＨ３０、ＧＨ４３およびＧＨ３ファミリーメンバーなど；ならびにＧＨ２６ファミリーメンバーのようなベータ−マンナナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．７８）が挙げられる。
【０１３２】
さらなる実施形態では、バイオマスの前処理で使用し得る、Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）において同定される予想されるヘミセルラーゼとしては、ヘミセルロースの側基および置換基に対して活性な酵素、例えば、アルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５５）、例えばＧＨ３、ＧＨ４３およびＧＨ５１ファミリーメンバーなど；ＧＨ３１ファミリーメンバーのようなアルファ−キシロシダーゼ；ＧＨ９５およびＧＨ２９ファミリーメンバーのようなアルファ−フコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５１）；ガラクトシダーゼ、例えばＧＨ１、ＧＨ２、ＧＨ４、ＧＨ３６およびＧＨ４３ファミリーメンバーなど；ならびにＣＥ２およびＣＥ４のようなアセチル−キシランエステラーゼ（ＥＣ  ３．１．１．７２）が挙げられる。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、多糖類を分解する酵素をバイオマスの前処理に使用し、ペクチンを分解する能力を有する酵素、すなわちペクチナーゼを含み得る。植物細胞壁において、架橋されたセルロースのネットワークが、キシログルカンおよびある種の構造タンパク質と共有結合で架橋され得るペクチンの基質中に埋め込まれ得る。ペクチンはホモガラクツロナン（ＨＧ）またはラムノガラクツロナン（ＲＨ）を含み得る。
【０１３４】
さらなる実施形態では、バイオマスの前処理は、Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）において同定される、ＨＧを加水分解し得るペクチナーゼを含む。ＨＧは、アセチル化およびメチル化され得るＤ−ガラクツロン酸（Ｄ−ｇａｌＡ）単位から構成され得る。ＨＧを加水分解する酵素としては、例えば、１，４−アルファ−Ｄ−ガラクツロナンリアーゼ（ＥＣ  ４．２．２．２）、例えばＰＬ１、ＰＬ９およびＰＬ１１ファミリーメンバーなど；ＧＨ８８およびＧＨ１０５ファミリーメンバーのようなグルクロニルヒドロラーゼ；ＣＥ１２ファミリーメンバーのようなペクチンアセチルエステラーゼ；ならびにＣＥ８ファミリーメンバーのようなペクチンメチルエステラーゼを挙げ得る。
【０１３５】
さらなる実施形態では、バイオマスの前処理は、Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）において同定される、ＲＨを加水分解し得るペクチナーゼを含む。ＲＨは、交互に繰り返す１，２−アルファ−Ｌ−ラムノース（Ｌ−Ｒｈａ）および１，４−アルファ−Ｄ−ガラクツロン残基からなる主鎖であり得る（Ｌａｕ，Ｊ．Ｍ．，ＭｃＮｅｉｌ  Ｍ．，Ｄａｒｖｉｌｌ  Ａ．Ｇ．＆  Ａｌｂｅｒｓｈｅｉｍ  Ｐ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｏｆ  ｒｈａｍｎｏｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｎ  Ｉ，ａ  ｐｅｃｔｉｃ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３７，１１１（１９８５））。主鎖のラムノース残基は、Ｃ４に結合したガラクタン、アラビナンまたはアラビノガラクタンを側鎖として有し得る。ＨＧを加水分解する酵素としては、例えば、ＧＨ２８ファミリーメンバーのようなエンドラムノガラクツロナーゼ；およびＰＬ１１ファミリーメンバーのようなラムノガラクツロナンリアーゼを挙げ得る。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、バイオマスの前処理は、デンプンを加水分解し得る酵素を含む。Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）はデンプンおよびキチンを分解することができる（Ｗａｒｎｉｃｋ，Ｔ．Ａ．，Ｍｅｔｈｅ，Ｂ．Ａ．＆  Ｌｅｓｃｈｉｎｅ，Ｓ．Ｂ．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ｓｐ．ｎｏｖ．，ａ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ  ｍｅｓｏｐｈｉｌｅ  ｆｒｏｍ  ｆｏｒｅｓｔ  ｓｏｉｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２，１１５５−１１６０（２００２）；Ｌｅｓｃｈｉｎｅ，Ｓ．Ｂ．ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ（Ｄｕｒｒｅ，Ｐ．編（「ｕ」はウムラウト付き））（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，２００５）；Ｒｅｇｕｅｒａ，Ｇ．＆  Ｌｅｓｃｈｉｎｅ，Ｓ．Ｂ．Ｃｈｉｔｉｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ  ａｎａｅｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ  ａｅｒｏｂｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｏｉｌｓ  ａｎｄ  ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏ  ｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．  ２０４，３６７−３７４（２００１））。デンプンを加水分解する酵素としては、アルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、エキソ−アルファ−１，４−グルカナーゼおよびプルラナーゼが挙げられる。デンプン加水分解に関与し、Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）において同定される予想される酵素の例としては、ＧＨ１３ファミリーメンバーが挙げられる。
【０１３７】
さらなる実施形態では、バイオマスの前処理は、キチンを加水分解し得る加水分解酵素を含む。キチンを加水分解し得る酵素の例としては、ＧＨ１８およびＧＨ１９ファミリーメンバーが挙げられる。さらなる実施形態では、加水分解酵素は、地衣類を加水分解する酵素、すなわちリケナーゼとして、例えば、Ｃｐｈｙ３３８８のようなＧＨ１６ファミリーメンバーを挙げ得る。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、バイオマスの前処理は、糖質結合モジュール含有タンパク質ファミリーのメンバー（ＣＢＭ）である加水分解酵素を含む。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ＣＢＭドメインは、酵素複合体を特定の基質に局在させるために機能し得る。セルロースと結合し得る、Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）において同定される予想されるＣＢＭファミリーの例としては、ＣＢＭ２、ＣＢＭ３、ＣＢＭ４、ＣＢＭ６およびＣＢＭ４６ファミリーメンバーが挙げられる。キシランと結合し得る、Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）において同定される予想されるＣＢＭファミリーの例としては、ＣＢＭ２、ＣＢＭ４、ＣＢＭ６、ＣＢＭ１３、ＣＢＭ２２、ＣＢＭ３５およびＣＢＭ３６ファミリーメンバーが挙げられる。さらなる実施形態では、ＣＢＭドメインファミリーメンバーは、酵素複合体を安定化するために機能し得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、任意の上記方法による前処理後に、供給原料は、セルロース、ヘミセルロース、可溶性オリゴマー、単純糖、リグニン、揮発性物質および灰分を含有する。前処理のパラメーターを変化させて、前処理供給原料の成分濃度を変え得る。例えば、いくつかの実施形態では、前処理後に可溶性オリゴマーの濃度が高く、リグニンの濃度が低くなるように前処理を選択する。前処理のパラメーターの例としては、温度、圧力、時間およびｐＨが挙げられる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、前処理原料の成分濃度が、Ｑ微生物のような微生物での発酵に最適となるように、前処理のパラメーターを変化させて前処理供給原料の成分濃度を変える。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、前処理供給原料中の利用可能なセルロース濃度が１％、５％、１０％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１９％、２０％、３０％、４０％または５０％になるように、前処理のパラメーターを変化させる。いくつかの実施形態では、前処理供給原料中の利用可能なセルロース濃度が５％〜３０％になるように、前処理のパラメーターを変化させる。いくつかの実施形態では、前処理供給原料中の利用可能なセルロース濃度が１０％〜２０％になるように、前処理のパラメーターを変化させる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、前処理供給原料中のヘミセルロース濃度が１％、５％、１０％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、４０％または５０％になるように、前処理のパラメーターを変化させる。いくつかの実施形態では、前処理供給原料中のヘミセルロース濃度が５％〜４０％になるように、前処理のパラメーターを変化させる。いくつかの実施形態では、前処理供給原料中のヘミセルロース濃度が１０％〜３０％になるように、前処理のパラメーターを変化させる。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、前処理供給原料中の可溶性オリゴマー濃度が１％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％になるように、前処理のパラメーターを変化させる。可溶性オリゴマーの例としては、セロビオースおよびキシロビオースが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、前処理供給原料中の可溶性オリゴマー濃度が３０％〜９０％になるように、前処理のパラメーターを変化させる。いくつかの実施形態では、前処理供給原料中の可溶性オリゴマー濃度が４５％〜８０％になるように、前処理のパラメーターを変化させる。いくつかの実施形態では、前処理供給原料中の可溶性オリゴマー濃度が４５％〜８０％であり、かつ可溶性オリゴマーが主としてセロビオースおよびキシロビオースであるように、前処理のパラメーターを変化させる。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、前処理供給原料中の単純糖濃度が１％、５％、１０％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１９％、２０％、３０％、４０％または５０％になるように、前処理のパラメーターを変化させる。いくつかの実施形態では、前処理供給原料中の単純糖濃度が０％〜２０％になるように、前処理のパラメーターを変化させる。いくつかの実施形態では、前処理供給原料中の単純糖濃度が０％〜５％になるように、前処理のパラメーターを変化させる。単純糖の例としては、Ｃ５およびＣ６単量体および二量体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、前処理供給原料中のリグニン濃度が１％、５％、１０％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１９％、２０％、３０％、４０％または５０％になるように、前処理のパラメーターを変化させる。いくつかの実施形態では、前処理供給原料中のリグニン濃度が０％〜２０％になるように、前処理のパラメーターを変化させる。いくつかの実施形態では、前処理供給原料中のリグニン濃度が０％〜５％になるように、前処理のパラメーターを変化させる。いくつかの実施形態では、前処理供給原料中のリグニン濃度が１％〜２％未満になるように、前処理のパラメーターを変化させる。いくつかの実施形態では、フェノール類濃度が最小となるように、前処理のパラメーターを変化させる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、前処理供給原料中のフルフラールおよび低分子量リグニンの濃度が１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満になるように、前処理のパラメーターを変化させる。いくつかの実施形態では、前処理供給原料中のフルフラールおよび低分子量リグニンの濃度が１％〜２％未満になるように、前処理のパラメーターを変化させる。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、利用可能なセルロース濃度が１０％〜２０％であり、ヘミセルロース濃度が１０％〜３０％であり、可溶性オリゴマー濃度が４５％〜８０％であり、単純糖濃度が０％〜５％であり、かつリグニン濃度が０％〜５％であり、かつ前処理供給原料中のフルフラールおよび低分子量リグニンの濃度が１％〜２％未満であるように、前処理のパラメーターを変化させる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、高濃度のヘミセルロースおよび低濃度のリグニンを得るために、前処理のパラメーターを変化させる。いくつかの実施形態では、前処理原料の成分濃度が、Ｑ微生物のような微生物での発酵に最適となるように、前処理のパラメーターを変化させて高濃度のヘミセルロースおよび低濃度のリグニンを得る。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、供給原料をｐＨ８〜１２で前処理して、前処理供給原料中の高濃度のヘミセルロースおよび低濃度のリグニンを得る。いくつかの実施形態では、前処理原料の成分濃度が、Ｑ微生物のような微生物での発酵に最適となるように、供給原料をｐＨ８〜１２で前処理して高濃度のヘミセルロースおよび低濃度のリグニンを得る。温度および時間のような他のパラメーターを変化させて、所望の結果を得ることができる。例えば、いくつかの実施形態では、供給原料を低温下、ｐＨ８〜１２で長時間前処理して、前処理供給原料中の高濃度のヘミセルロースおよび低濃度のリグニンを得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、前処理のパラメーターを変化させて、最大数のＣ５成分炭水化物を得る。いくつかの実施形態では、供給原料中の成分の結晶化度が天然の量以下になるように、前処理のパラメーターを変化させる。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、供給原料を様々な条件下、ＮａＯＨ、ＫＯＨおよびＣａ（ＯＨ）２のようなアルカリ化合物で処理して、前処理供給原料中での所望の成分濃度を得る。例えば、いくつかの実施形態では、処理後にヘミセルロースの濃度が高く、リグニンの濃度が低くなるように、供給原料を様々な条件下、ＮａＯＨ、ＫＯＨおよびＣａ（ＯＨ）２のようなアルカリ化合物で処理する。アルカリ処理は、過酸化水素または尿素のような薬剤と組み合わせて行い得る。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、前処理原料中の成分濃度が、Ｑ微生物のような微生物での発酵に最適となるように、供給原料を様々な条件下、ＮａＯＨ、ＫＯＨおよびＣａ（ＯＨ）２のようなアルカリ化合物で処理する。アルカリ処理は、過酸化水素または尿素のような薬剤と組み合わせて行い得る。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、前処理原料中の成分濃度がＱ微生物での発酵に最適となるように、供給原料をＮａＯＨで処理する。ＮａＯＨ前処理は、過酸化水素または尿素のような薬剤と組み合わせて行い得る。ＮａＯＨ前処理は、単独でまたは過酸化水素もしくは尿素と組合せて、６０℃、８０℃、９０℃、１００℃、１２０℃、１４０℃、１６００℃または１８０℃で行い得る。ＮａＯＨ前処理は、単独でまたは過酸化水素もしくは尿素と組合せて、１０、１５、２０、３０、３５、４０、５０分間、または１、５、７、９、１０、１１、１５、２０、２５、３０、３５もしくは３６時間行い得る。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、前処理原料中の成分濃度がＱ微生物での発酵に最適となるように、供給原料をＫＯＨで処理する。一実施形態では、ＫＯＨ前処理は、過酸化水素または尿素のような薬剤と組み合わせて行い得る。別の実施形態では、Ｃａ（ＯＨ）２前処理は、単独でまたは過酸化水素もしくは尿素と組合せて、約６０℃〜１８０℃で行い得る。別の実施形態では、ＫＯＨ前処理は、単独でまたは過酸化水素もしくは尿素と組合せて、約６０℃、８０℃、９０℃、１００℃、１２０℃、１４０℃、１６０℃または１８０℃で行い得る。一実施形態では、ＫＯＨ前処理は、単独でまたは過酸化水素もしくは尿素と組合せて、約１〜６０分間行い得る。別の実施形態では、ＫＯＨ前処理は、単独でまたは過酸化水素もしくは尿素と組合せて、約１〜９６時間行い得る。別の実施形態では、ＫＯＨ前処理は、単独でまたは過酸化水素もしくは尿素と組合せて、約１０、１５、２０、３０、３５、４０もしくは５０分間、または約１、５、７、９、１０、１１、１５、２０、２５、３０、３５、３６、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０もしくは９６時間行い得る。
【０１５５】
一実施形態では、前処理原料中の成分濃度がＱ微生物での発酵に最適となるように、供給原料をＣａ（ＯＨ）２で処理する。別の実施形態では、Ｃａ（ＯＨ）２前処理は、過酸化水素または尿素のような薬剤と組合せて行い得る。別の実施形態では、Ｃａ（ＯＨ）２前処理は、単独でまたは過酸化水素もしくは尿素と組合せて、約６０℃〜１８０℃で行い得る。別の実施形態では、Ｃａ（ＯＨ）２前処理は、単独でまたは過酸化水素もしくは尿素と組合せて、約６０℃、８０℃、９０℃、１００℃、１２０℃、１４０℃、１６０℃または１８０℃で行い得る。一実施形態では、Ｃａ（ＯＨ）２前処理は、単独でまたは過酸化水素もしくは尿素と組合せて、約１〜６０分間行い得る。別の実施形態では、Ｃａ（ＯＨ）２前処理は、単独でまたは過酸化水素もしくは尿素と組合せて、約１〜９６時間行い得る。別の実施形態では、Ｃａ（ＯＨ）２前処理は、単独でまたは過酸化水素もしくは尿素と組合せて、約１０、１５、２０、３０、３５、４０もしくは５０分間、または約１、５、７、９、１０、１１、１５、２０、２５、３０、３５、３６、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０もしくは９６時間行い得る。
【０１５６】
エタノールまたは他の発酵最終産物の回収
本発明の別の態様では、アルコール（例えば、エタノール、プロパノール、メタノール、ブタノールなど）または別のバイオ燃料もしくは化学製品のような発酵最終産物を回収するための方法が提供される。一実施形態では、発酵中のある時点でブロスを回収し、１つまたは複数の発酵最終産物を回収する。エタノールを含んだ回収されるブロスは、エタノールおよび不純物を共に含む。不純物は、水、細胞体、細胞残屑、余剰炭素基質、余剰窒素基質、その他の残存栄養素、非エタノール代謝産物およびその他の培地成分または消化された培地成分などの物質を含む。ブロス処理の過程において、ブロスを加熱する、および／または様々な試薬と反応させることにより、ブロス中にさらなる不純物が生じ得る。
【０１５７】
一実施形態では、エタノールを回収するための処理段階は多くの場合、例えば、純エタノール含有量の少ない原料からの高濃度エタノール原料の蒸留を含めた、いくつかの分離段階を含む。他の実施形態では、非常に高濃度、例えば９８％または９９％または９９．５％（ｗｔ．）以上などのエタノールを得るために、高濃度エタノール原料をさらに濃縮し得る。他の分離段階、例えばろ過、遠心分離、抽出、吸着なども、製品もしくはバイオ燃料としてのエタノール、またはその他のバイオ燃料もしくは化学製品のいくつかの回収プロセスの一部であり得る。
【０１５８】
一実施形態では、プロセスは、商業的に有用なバイオ燃料を生産するように調節し得る。別の実施形態では、Ｑ微生物を用いて、アルコール、例えばエタノール、ブタノール、プロパノール、メタノール、または燃料、例えば炭化水素、水素、メタンおよびヒドロキシ化合物などを生産する。別の実施形態では、Ｑ微生物を用いて、アルデヒドまたはケトン（例えば、アセトン、ホルムアルデヒド、１−プロパナールなど）のようなカルボニル化合物、有機酸、エステルのような有機酸誘導体（例えば、ワックスエステル、グリセリドなど）、１、２−プロパンジオール、１、３−プロパンジオール、乳酸、ギ酸、酢酸、コハク酸、ピルビン酸、あるいは酵素、例えばセルラーゼ、ポリサッカラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、リグニナーゼおよびヘミセルラーゼなどを生産する。
【０１５９】
一実施形態では、発酵最終産物生産のためのフェドバッチ発酵が記載されている。別の実施形態では、エタノール生産のためのフェドバッチ発酵が記載されている。フェドバッチ培養は微生物プロセスの一種であり、このプロセスでは、培養中に、培地成分、例えば炭素基質、窒素基質、ビタミン、無機物、増殖因子、補助因子など、または生体触媒（例えば、新たな微生物、別の発酵でＱ微生物により調製した酵素、他の微生物により調製した酵素、またはこれらの組合せ）を発酵槽に補充するが、培養ブロスは同じ時間および体積で回収しない。可溶性および不溶性基質、例えばバイオ燃料生産で使用され得るような基質などからの生物変換を向上させるために、様々な供給ストラテジーを用いて収率および／または生産性を高める。この技術を用いて、所与の時間内に高細胞密度を達成し得る。また、この技術を用いて、生物変換プロセスのための栄養をおよび基質の十分な供給も維持し得る。また、この技術を用いて、別の方法であれば達成が遅いか、または全く達成されないような、所望の生成物のより高い力価および生産性も達成し得る。
【０１６０】
別の実施形態では、供給ストラテジーは、細胞生産速度とエタノール生産を伴うバイオマス供給原料の加水分解速度とのバランスをとる。十分な培地成分を多量に添加して、細胞生産およびエタノール生産を伴うバイオマス供給原料の加水分解の維持を達成する。いくつかの実施形態では、十分な炭素および窒素基質を多量に添加して、新たな細胞および多糖類から低分子量糖類への変換のための加水分解酵素の生産の維持、ならびに低分子量糖類から新たな細胞およびエタノールへの変換の維持を達成する。
【０１６１】
別の実施形態では、微生物による成分の消費または摂取に合わせて追加の培地成分を添加することにより、培地成分のレベルを所望のレベルに維持する。培地成分の例としては、炭素基質、窒素基質、ビタミン、無機物、増殖因子、補助因子および生体触媒が挙げられるが、これらに限定されない。培地成分は、継続的に、または規則的もしくは不規則的な間隔で添加し得る。いくつかの実施形態では、培地中の培地成分が完全に枯渇する前に追加の培地成分を添加する。いくつかの実施形態では、例えば、異なる代謝経路を開始させるために、下流操作を簡素化するために、またはその他の理由でも、完全な枯渇を有効に利用し得る。いくつかの実施形態では、培地成分レベルをおよそ中間点で約１０％変動させ、いくつかの実施形態では、それをおよそ中間点で約３０％変動させ、またいくつかの実施形態では、それをおよそ中間点で６０％以上変動させる。いくつかの実施形態における操作では、培地成分を適当なレベルまで枯渇させた後、培地成分レベルを別の適当なレベルまで増加させることにより、培地成分レベルを維持する。一実施形態では、ビタミンのような培地成分を、発酵プロセス中の２つの異なる時点で添加する。例えば、発酵開始時に総ビタミン量の半分を添加し、発酵の中間点で残りの半分を添加する。
【０１６２】
別の実施形態では、微生物による窒素の消費または摂取に合わせて追加の窒素含有原料を添加することにより、窒素レベルを所望のレベルに維持する。窒素含有原料は、継続的に、または規則的もしくは不規則的な間隔で添加し得る。いくつかの実施形態では、培地中の利用可能な窒素が完全に枯渇する前に追加の窒素含有原料を添加する。いくつかの実施形態では、例えば、異なる代謝経路を開始させるために、下流操作を簡素化するために、またはその他の理由でも、完全な枯渇を有効に利用し得る。いくつかの実施形態では、窒素レベル（ブロス１リットル当たりの窒素含有原料中の実際の窒素グラム数により測定される）をおよそ中間点で約１０％変動させ、いくつかの実施形態では、それをおよそ中間点で約３０％変動させ、またいくつかの実施形態では、それをおよそ中間点で６０％以上変動させる。いくつかの実施形態における操作では、窒素を適当なレベルまで枯渇させた後、窒素レベルを別の適当なレベルまで増加させることにより、窒素レベルを維持する。有効な窒素レベルとしては、約５〜約１０ｇ／Ｌのレベルが挙げられる。一実施形態では、約１〜約１２ｇ／Ｌのレベルも有効に使用され得る。別の実施形態では、約０．５、０．１ｇ／Ｌなどのまたはさらに低いレベル、およびより高レベル、約２０、３０ｇ／Ｌなどまたはさらに高いレベルが使用される。別の実施形態では、有効な窒素レベルは約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ｇ／Ｌである。このような窒素レベルは、新たな細胞および加水分解酵素の生産を促進し得る。窒素レベルを増加させることにより、より高レベルの酵素および／またはより多くの細胞生産が起こり、その結果、所望の生成物のより高い生産性が生じ得る。窒素は、単純な窒素含有原料、例えばアンモニア化合物（例えば、硫酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、アンモニア、硝酸アンモニウム、またはアンモニウム部分を含有する任意の他の化合物もしくは混合物）、硝酸もしくは亜硝酸化合物（例えば、カリウム、ナトリウム、アンモニウム、カルシウム、または硝酸もしくは亜硝酸部分を含有する他の化合物もしくは混合物）などとして、あるいはより複雑な窒素含有原料、例えばアミノ酸、タンパク質、加水分解タンパク質、加水分解酵母、酵母抽出物、乾燥醸造酵母、酵母加水分解物、大豆タンパク質、加水分解大豆タンパク質、発酵産物、および加工またはコーンスティープパウダー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｐｏｗｄｅｒ）または未加工の、タンパク質が豊富な植物性または動物性物質（豆、種子、大豆、豆類、殻果、乳、ブタ、ウシ、哺乳動物、魚類、およびその他の植物の一部分および他の種類の動物を含む）などとして供給し得る。様々な実施形態において有用な窒素含有原料としては、窒素含有原料を含有する原料も挙げられ、これには炭素源、別の窒素含有原料または他の栄養素もしくは非栄養素、およびＡＦＥＸ処理された植物性物質と混合された、単純な、またはより複雑な窒素含有原料��混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６３】
別の実施形態では、微生物による糖の消費または摂取に合わせて糖化合物または糖化合物を含有する原料（糖含有原料）を添加することにより、炭素レベルを所望のレベルに維持する。糖含有原料は、継続的に、または規則的もしくは不規則的な間隔で添加し得る。いくつかの実施形態では、培地中の利用可能な糖化合物が完全に枯渇する前に追加の糖含有原料を添加する。いくつかの実施形態では、例えば、異なる代謝経路を開始させるために、下流操作を簡素化するために、またはその他の理由でも、完全な枯渇を有効に利用し得る。いくつかの実施形態では、炭素レベル（ブロス１リットル当たりの糖含有原料中の実際の糖グラム数により測定される）をおよそ中間点で約１０％変動させ、いくつかの実施形態では、それをおよそ中間点で約３０％変動させ、またいくつかの実施形態では、それをおよそ中間点で６０％以上変動させる。いくつかの実施形態における操作では、炭素を適当なレベルまで枯渇させた後、炭素レベルを別の適当なレベルまで増加させることにより、炭素レベルを維持する。いくつかの実施形態では、炭素レベルを約５〜約１２０ｇ／Ｌのレベルに維持し得る。しかし、約３０〜約１００ｇ／Ｌのレベルも約６０〜約８０ｇ／Ｌのレベルと同様に、有効に使用し得る。一実施形態では、炭素レベルを、培養の間の一部で２５ｇ／Ｌよりも高く維持する。別の実施形態では、炭素レベルを約５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１３ｇ／Ｌ、１４ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌ、１７ｇ／Ｌ、１８ｇ／Ｌ、１９ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２１ｇ／Ｌ、２２ｇ／Ｌ、２３ｇ／Ｌ、２４ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、２６ｇ／Ｌ、２７ｇ／Ｌ、２８ｇ／Ｌ、２９ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３１ｇ／Ｌ、３２ｇ／Ｌ、３３ｇ／Ｌ、３４ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、３６ｇ／Ｌ、３７ｇ／Ｌ、３８ｇ／Ｌ、３９ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４１ｇ／Ｌ、４２ｇ／Ｌ、４３ｇ／Ｌ、４４ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、４６ｇ／Ｌ、４７ｇ／Ｌ、４８ｇ／Ｌ、４９ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５１ｇ／Ｌ、５２ｇ／Ｌ、５３ｇ／Ｌ、５４ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、５６ｇ／Ｌ、５７ｇ／Ｌ、５８ｇ／Ｌ、５９ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６１ｇ／Ｌ、６２ｇ／Ｌ、６３ｇ／Ｌ、６４ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、６６ｇ／Ｌ、６７ｇ／Ｌ、６８ｇ／Ｌ、６９ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７１ｇ／Ｌ、７２ｇ／Ｌ、７３ｇ／Ｌ、７４ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、７６ｇ／Ｌ、７７ｇ／Ｌ、７８ｇ／Ｌ、７９ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８１ｇ／Ｌ、８２ｇ／Ｌ、８３ｇ／Ｌ、８４ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、８６ｇ／Ｌ、８７ｇ／Ｌ、８８ｇ／Ｌ、８９ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９１ｇ／Ｌ、９２ｇ／Ｌ、９３ｇ／Ｌ、９４ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、９６ｇ／Ｌ、９７ｇ／Ｌ、９８ｇ／Ｌ、９９ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１０１ｇ／Ｌ、１０２ｇ／Ｌ、１０３ｇ／Ｌ、１０４ｇ／Ｌ、１０５ｇ／Ｌ、１０６ｇ／Ｌ、１０７ｇ／Ｌ、１０８ｇ／Ｌ、１０９ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１１１ｇ／Ｌ、１１２ｇ／Ｌ、１１３ｇ／Ｌ、１１４ｇ／Ｌ、１１５ｇ／Ｌ、１１６ｇ／Ｌ、１１７ｇ／Ｌ、１１８ｇ／Ｌ、１１９ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１２１ｇ／Ｌ、１２２ｇ／Ｌ、１２３ｇ／Ｌ、１２４ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１２６ｇ／Ｌ、１２７ｇ／Ｌ、１２８ｇ／Ｌ、１２９ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１３１ｇ／Ｌ、１３２ｇ／Ｌ、１３３ｇ／Ｌ、１３４ｇ／Ｌ、１３５ｇ／Ｌ、１３６ｇ／Ｌ、１３７ｇ／Ｌ、１３８ｇ／Ｌ、１３９ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１４１ｇ／Ｌ、１４２ｇ／Ｌ、１４３ｇ／Ｌ、１４４ｇ／Ｌ、１４５ｇ／Ｌ、１４６ｇ／Ｌ、１４７ｇ／Ｌ、１４８ｇ／Ｌ、１４９ｇ／Ｌまたは１５０ｇ／Ｌに維持する。
【０１６４】
炭素基質は、窒素基質と同様に細胞生産および酵素生産に必要であるが、窒素基質とは異なり、それはエタノールの原材料となる。多くの場合、炭素基質が多いほどエタノールの生産量は多い。
【０１６５】
別の実施形態では、発酵時間の少なくとも一部で、炭素レベルと窒素レベルを互いに関連させて操作することが有利であり得る。一実施形態では、窒素に対する炭素の比を約３０：１〜約１０：１の範囲内に維持する。別の実施形態では、炭素−窒素比を約２０：１〜約１０：１、またはより好ましくは約１５：１〜約１０：１に維持する。別の実施形態では、炭素−窒素比は約３０：１、２９：１、２８：１、２７：１、２６：１、２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１または１：１である。
【０１６６】
炭素の割合および窒素の割合を特定の範囲内に維持することにより、エタノール生産速度とバランスのとれた、存在する炭素基質量および酵素の量と活性に依存する炭素基質の加水分解速度のような操作に利益がもたらされる。こうしたバランスは重要であり得るが、これは例えば、高濃度の低分子量糖類の存在による細胞活動の阻害の可能性および長鎖糖類が存在しかつ加水分解に利用可能である期間を通して、酵素的加水分解の活性を維持する必要性が理由である。窒素に対する炭素の比のバランスをとることは、例えば、活性を失った酵素に替わるような酵素生産の維持を促進し得る。
【０１６７】
別の実施形態では、炭素、窒素または他の培地成分添加の量および／またはタイミングは、発酵中に得られる測定結果に関連させ得る。例えば、存在する単糖類の量、存在する不溶性多糖の量、ポリサッカラーゼ活性、存在するエタノールの量、細胞原料の量（例えば、圧縮細胞量、乾燥細胞重量など）および／または存在する窒素（例えば、硝酸、亜硝酸、アンモニア、尿素、タンパク質、アミノ酸など）の量を測定し得る。特定種の濃度、発酵槽中に存在する種の総量、発酵を行った時間数および発酵槽の容積が考慮され得る。様々な実施形態では、これらの測定結果を相互に比較し得る、および／またはそれらを同じ発酵または別の発酵から以前得られた同じパラメーターの以前の測定結果と比較し得る。培地成分量の調節は、その成分を含有する流れの流速を変化させることにより、またはその成分の添加頻度を変化させることにより行い得る。一実施形態では、単糖類レベルがエタノールレベルの増加よりも速く増加場合に、多糖類の量を減少させ得る。別の実施形態では、単糖類レベルは低下しているがエタノール生産はほぼ一定である場合に、多糖類の量を増加させ得る。別の実施形態では、単糖類レベルが生細胞レベルよりも速く増加する場合に、窒素の量を増加させ得る。細胞生産がエタノール生産よりも速く増加する場合にも、多糖類の量を増加させ得る。別の実施形態では、酵素活性レベルが減少する場合に、窒素の量を増加させ得る。
【０１６８】
別の実施形態では、例えば、異なる代謝経路を開始させる、または発酵プロセスの異なる生成物の収率を変化させために、培地成分の異なるレベルまたは完全枯渇を有効に利用し得る。例えば、培地成分の異なるレベルまたは完全枯渇を有効に利用して、エタノールの収率および生産性を増加させ、炭素利用（例えば、ｇエタノール／ｇ発酵糖）および酸生産の減少（例えば、ｇ酸／ｇエタノールおよびｇ酸／ｇ発酵糖）を向上させ得る。いくつかの実施形態では、窒素の異なるレベルまたは完全枯渇を有効に利用して、エタノールの収率および生産性を増加させ、炭素利用（例えば、ｇエタノール／ｇ発酵糖）および酸生産の減少（例えば、ｇ酸／ｇエタノールおよびｇ酸／ｇ発酵糖）を向上させ得る。いくつかの実施形態では、炭素の異なるレベルまたは完全枯渇を有効に利用して、エタノールの収率および生産性を増加させ、炭素利用（例えば、ｇエタノール／ｇ発酵糖）および酸生産の減少（例えば、ｇ酸／ｇエタノールおよびｇ酸／ｇ発酵糖）を向上させ得る。いくつかの実施形態では、少なくとも一部の発酵時間での窒素レベルに対する炭素レベルの比を有効に利用して、エタノールの収率および生産性を増加させ、炭素利用（例えば、ｇエタノール／ｇ発酵糖）および酸生産の減少（例えば、ｇ酸／ｇエタノールおよびｇ酸／ｇ発酵糖）を向上させ得る。
【０１６９】
別の実施形態では、回収のためのブロスの一部を発酵終了の前に取り出さずに、発酵中に培地成分および／または新たな細胞を添加する、フェドバッチ操作を用い得る。一実施形態では、フェドバッチプロセスは、微生物培養物への増殖制限栄養培地の供給による。一実施形態では、供給培地は、バイオリアクターの希釈を避けるために非常に濃縮されている。別の実施形態では、制御された栄養素の添加が、培養物の増殖速度に直接影響し、かつ副代謝産物の形成のような過剰な代謝を回避する。一実施形態では、増殖制限栄養素は窒素源または糖源である。
【０１７０】
別の実施形態では、別々の時間にブロスの一部を回収する、改変されたフェドバッチ操作を用い得る。このような改変されたフェドバッチ操作は、例えば、非常に長い発酵サイクルが用いられる場合に有利に用い得る。非常に長い発酵条件下では、発酵槽内の液体の体積が増加する。非常に長い期間操作するために、例えば、体積がほぼ一杯になったときに、発酵槽を一部空けることが有利であり得る。フェドバッチ操作などによる、ブロスの部分回収とそれに続く新たな培地成分の補充により、発酵槽の利用を向上させることができ、かつ設備の清掃および滅菌のような作業時間の削減による、より高いプラント処理能力を促進することができる。「部分回収」型の操作を用いる場合、発酵槽に残っているブロス、または新たな接種材料、またはこの２つの混合物を発酵に接種し得る。さらに、ブロスを新たな接種材料として、単独でまたは他の新たな接種材料と組み合わせて使用するために再利用し得る。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、ブロスの加水分解活性が減少したときに発酵中に培地成分および／または新たな細胞を添加する、フェドバッチ操作を用い得る。いくつかの実施形態では、ブロスの加水分解活性が約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％減少したときに、発酵中に培地成分および／または新たな細胞を添加する。
【０１７２】
Ｑ微生物は、長いまたは短い発酵サイクルで使用し得るが、ブロスにおいて低糖濃度を生じるか否かに関係なく、発酵の嫌気性条件、アルコールの存在、微生物の速い増殖速度、およびいくつかの実施形態では、固体の炭素基質の使用という理由から、長い発酵サイクルならびに部分回収、自然接種およびブロス再利用操作を伴う発酵での使用に特によく適している。
【０１７３】
別の実施形態では、高濃度の１つ以上の炭素源を含む培地でＱ微生物株を培養すること、および／または発酵過程でＱ微生物の新たな細胞を添加して培養を増強することにより、エタノールを生産するための発酵を行う。得られるエタノール生産量は、バッチプロセスよりも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍まで、および場合により１０倍以上まで高い体積生産性であり得、理論最大値に近い炭素変換効率を達成し得る。理論最大値は基質および生成物によって変化し得る。例えば、グルコースからエタノールへの一般に認められている最大変換効率は、０．５１ｇエタノール／ｇグルコースである。一実施形態では、Ｑ微生物は、エタノールの理論最大収率の約４０〜１００％を生産し得る。別の実施形態では、Ｑ微生物は、エタノールの理論最大収率の約４０％まで生産し得る。別の実施形態では、Ｑ微生物は、エタノールの理論最大収率の約５０％まで生産し得る。別の実施形態では、Ｑ微生物は、エタノールの理論最大収率の約７０％を生産し得る。別の実施形態では、Ｑ微生物は、エタノールの理論最大収率の約９０％を生産し得る。別の実施形態では、Ｑ微生物は、エタノールの理論最大収率の約９５％を生産し得る。別の実施形態では、Ｑ微生物は、エタノールの理論最大収率の約９５％を生産し得る。別の実施形態では、Ｑ微生物は、エタノールの理論最大収率の約９９％を生産し得る。別の実施形態では、Ｑ微生物は、エタノールの理論最大収率の約１００％を生産し得る。一実施形態では、Ｑ微生物は、エタノールの理論最大収率の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９９％または１００％まで生産し得る。
【０１７４】
種菌接種または細胞増加に使用するＱ微生物細胞は、生産培地の成分の加水分解に有用な酵素を生産するその能力に関連する方法で調製または処理し得る。例えば、一実施形態では、Ｑ微生物細胞は、生産培地または生産発酵槽に移された後に有用な酵素を生産し得る。別の実施形態では、Ｑ微生物細胞は、生産培地または生産発酵槽への移動の前に、既に有用な酵素を生産していてもよい。別の実施形態では、Ｑ微生物細胞は、生産培地もしくは生産発酵槽に一度移されると、有用な酵素を生産する態勢になり得る、またはＱ微生物細胞は、上記酵素生産特性の何らかの組合せを有し得る。一実施形態では、種菌を最初にコーンシロップのような単純糖源を含有する培地で増殖させ、次いで、生産培地への移動の前に生産培地炭素源に移行させる。別の実施形態では、生産培地への移動の前に、単純糖および生産培地炭素源を組合せたもので種菌を増殖させる。別の実施形態では、種菌を始めから生産培地炭素源で増殖させる。別の実施形態では、種菌を生産培地で増殖させ、次いで、生産培地への移動の前に別の生産培地炭素源に移行させる。別の実施形態では、生産培地への移動の前に、生産培地炭素源を組合せたもので種菌を増殖させる。別の実施形態では、生産培地成分に対する活性を有する加水分解酵素の生産に有利な炭素源で増殖させる。
【０１７５】
別の実施形態では、Ｑ微生物株を培養すること、ならびに発酵槽内の細胞が増殖している間に新たな培地成分および新たなＱ微生物細胞を添加することにより、エタノールを生産するための発酵を行う。炭素、窒素およびこれらの組合せのような培地成分と同様に、培地中のこれら栄養素の有効なレベルを維持するのに十分なビタミン、因子類、補助因子、酵素、無機物、塩などを含めた他の栄養素を、本明細書に開示される通りに添加し得る。培地およびＱ微生物細胞は、同時にまたは１つずつ添加し得る。別の実施形態では、加水分解酵素の活性が減少したとき、特に、アルコールの存在に対してより感受性の高いこれら加水分解酵素の活性が減少したときに、新たなＱ微生物細胞を添加し得る。新たなＱ微生物細胞の添加後に、窒素供給物または窒素供給物と炭素供給物の組合せ、および／または他の培地成分を供給して、酵素生産または他の細胞活動を延長し得る。別の実施形態では、細胞に十分な炭素および窒素を添加して、次の新たな細胞添加まで酵素生産または他の細胞活動を十分に延長し得る。別の実施形態では、発酵層内に存在する窒素レベルおよび炭素レベルが共に減少したときに、新たなＱ微生物細胞を添加し得る。別の実施形態では、生細胞数が減少したとき、特に、窒素レベルが比較的安定しているかまたは増加しているときに、新たなＱ微生物細胞を添加し得る。別の実施形態では、かなりの割合の生細胞が、胞子形成過程にあるかまたは既に胞子を形成しているときに、新たな細胞を添加し得る。新たなＱ微生物細胞の添加に適した時期は、胞子形成過程にあるかまたは既に胞子を形成している細胞の割合が、約２％〜約１００％、約１０％〜約７５％、約２０％〜約５０％であるか、あるいは約２５％〜約３０％の細胞が、胞子形成過程にあるかまたは既に胞子を形成しているときであり得る。
【０１７６】
他の実施形態では、接種材料として再利用細胞を培養することにより、エタノールを生産するための発酵を行う。より高い個体密度を使用してエタノール生産を増加させ得る。接種材料の適切なレベルとしては、約０．０１％（ｖ／ｖ）未満または約０．０１％〜約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．１％〜約１％（ｖ／ｖ）、約１％〜約３％（ｖ／ｖ）、約３％〜約５％（ｖ／ｖ）、または１０％（ｖ／ｖ）、またはそれを超えるレベルの使用が挙げられる。接種材料の細胞数は、様々な方法、例えば吸光度、顕微鏡解析、圧縮細胞量、乾燥細胞重量、ＤＮＡ解析などにより測定し得る。接種材料中の適切な細胞レベルは、約０．０１ｇ／ｍＬ〜約０．０５ｇ／ｍＬ乾燥細胞重量（ＤＣＷ）、約０．０５ｇ／ｍＬ〜約０．１ｇ／ｍＬ乾燥細胞重量（ＤＣＷ）、または約０．１ｇ／ｍＬ〜約０．３ｇ／ｍＬ乾燥細胞重量（ＤＣＷ）であり得る。発酵培地内に接種される細胞総量は、乾燥細胞重量または他の適当な手段により決定されるような細胞レベルと、接種材料レベルとを関連させることで決定し得る。好適な総細胞量としては、ブロス１ｍｌ当り約０．０００１〜約０．００１ｇ乾燥細胞、ブロス１ｍｌ当り約０．００１〜約０．０１ｇ乾燥細胞、またはブロス１ｍｌ当り約０．０１〜約０．０３ｇ乾燥細胞が挙げられるが、場合によっては、これより高いまたは低い総量を使用し得る。より高いエタノール力価は、例えば再利用細胞の量を変化させること；細胞を再利用する回数を変化させること；本明細書に記載の手段などにより培地成分レベル（例えば、炭素および窒素レベルを別々にまたは状況に合わせて）を変化させること；および本明細書に記載のような培地成分源（例えば、炭素および／または窒素源）を変化させることなどのような技術により達成し得る。これらを含めた技術により高エタノール濃度を達成し得る。一実施形態では、本明細書に記載の方法により達成し得るエタノール濃度は約２０ｇ／Ｌ、２１ｇ／Ｌ、２２ｇ／Ｌ、２３ｇ／Ｌ、２４ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、２６ｇ／Ｌ、２７ｇ／Ｌ、２８ｇ／Ｌ、２９ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３１ｇ／Ｌ、３２ｇ／Ｌ、３３ｇ／Ｌ、３４ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、３６ｇ／Ｌ、３７ｇ／Ｌ、３８ｇ／Ｌ、３９ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４１ｇ／Ｌ、４２ｇ／Ｌ、４３ｇ／Ｌ、４４ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、４６ｇ／Ｌ、４７ｇ／Ｌ、４８ｇ／Ｌ、４９ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５１ｇ／Ｌ、５２ｇ／Ｌ、５３ｇ／Ｌ、５４ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、５６ｇ／Ｌ、５７ｇ／Ｌ、５８ｇ／Ｌ、５９ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６１ｇ／Ｌ、６２ｇ／Ｌ、６３ｇ／Ｌ、６４ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、６６ｇ／Ｌ、６７ｇ／Ｌ、６８ｇ／Ｌ、６９ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７１ｇ／Ｌ、７２ｇ／Ｌ、７３ｇ／Ｌ、７４ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、７６ｇ／Ｌ、７７ｇ／Ｌ、７８ｇ／Ｌ、７９ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８１ｇ／Ｌ、８２ｇ／Ｌ、８３ｇ／Ｌ、８４ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、８６ｇ／Ｌ、８７ｇ／Ｌ、８８ｇ／Ｌ、８９ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９１ｇ／Ｌ、９２ｇ／Ｌ、９３ｇ／Ｌ、９４ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、９６ｇ／Ｌ、９７ｇ／Ｌ、９８ｇ／Ｌ、９９ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１０１ｇ／Ｌ、１０２ｇ／Ｌ、１０３ｇ／Ｌ、１０４ｇ／Ｌ、１０５ｇ／Ｌ、１０６ｇ／Ｌ、１０７ｇ／Ｌ、１０８ｇ／Ｌ、１０９ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１１１ｇ／Ｌ、１１２ｇ／Ｌ、１１３ｇ／Ｌ、１１４ｇ／Ｌ、１１５ｇ／Ｌ、１１６ｇ／Ｌ、１１７ｇ／Ｌ、１１８ｇ／Ｌ、１１９ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１２１ｇ／Ｌ、１２２ｇ／Ｌ、１２３ｇ／Ｌ、１２４ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１２６ｇ／Ｌ、１２７ｇ／Ｌ、１２８ｇ／Ｌ、１２９ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１３１ｇ／Ｌ、１３２ｇ／Ｌ、１３３ｇ／Ｌ、１３４ｇ／Ｌ、１３５ｇ／Ｌ、１３６ｇ／Ｌ、１３７ｇ／Ｌ、１３８ｇ／Ｌ、１３９ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１４１ｇ／Ｌ、１４２ｇ／Ｌ、１４３ｇ／Ｌ、１４４ｇ／Ｌ、１４５ｇ／Ｌ、１４６ｇ／Ｌ、１４７ｇ／Ｌ、１４８ｇ／Ｌ、１４９ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１５１ｇ／Ｌ、１５２ｇ／Ｌ、１５３ｇ／Ｌ、１５４ｇ／Ｌ、１５５ｇ／Ｌ、１５６ｇ／Ｌ、１５７ｇ／Ｌ、１５８ｇ／Ｌ、１５９ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１６１ｇ／Ｌ、１６２ｇ／Ｌ、１６３ｇ／Ｌ、１６４ｇ／Ｌ、１６５ｇ／Ｌ、１６６ｇ／Ｌ、１６７ｇ／Ｌ、１６８ｇ／Ｌ、１６９ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１７１ｇ／Ｌ、１７２ｇ／Ｌ、１７３ｇ／Ｌ、１７４ｇ／Ｌ、１７５ｇ／Ｌ、１７６ｇ／Ｌ、１７７ｇ／Ｌ、１７８ｇ／Ｌ、１７９ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌまたは１８１ｇ／Ｌである。
【０１７７】
別の実施形態では、Ｑ微生物株を培養すること、ならびに発酵槽内の細胞が細胞増殖段階（例えば、接種段階）および／または発酵の最終発酵段階である間に再利用Ｑ微生物細胞を添加することにより、エタノールを生産するための発酵を行う。いかなる理論にも拘束されることを意図しないが、本明細書に記載の結果は、再利用細胞が、高エタノール濃度に対する耐性およびそのような環境中での増殖能力を有することを示している。したがって、こうした耐性および能力は、細胞増殖段階（例えば、接種段階）およびエタノール生産発酵を含めた上記濃度のエタノールが存在する発酵の最終発酵段階のような状況に対して、または上記濃度のエタノール存在下での他の生成物生産に対して有用であり得る。
【０１７８】
培地組成物
様々な実施形態では、特定の培地成分が発酵の遂行に有益な効果、例えば所望の生成物力価の増加または所望の生成物の生産速度の増加などを有し得る。特定のアミノ酸、促進因子、補助因子または他の有用な化合物を提供するために、特定のアミノ酸のような特定の純成分として特定の化合物を供給してもよく、あるいは微生物性、植物性または動物性製品を培地成分として用いるなどして、より複雑な原料の一成分として特定の化合物を供給してもよい。ある場合には、培地成分中に供給される特定の化合物は、発酵に有用な化合物を生じる微生物による他の化合物と組み合わせ得る。この状況の一例は、微生物が発酵に有用な酵素を生成するために使用する特定のアミノ酸を培地成分が提供する場合であり得る。他の例としては、増殖を引き起こすまたは促進因子を生産するために使用される培地成分を挙げ得る。このような場合、酵素、プロモーター、増殖因子などを補充することにより、または前駆体を添加することにより、発酵に有用な結果を得ることが可能であり得る。場合によっては、培地成分が発酵に利益をもたらす特定の機構が不明で、有用な結果だけが達成される。
【０１７９】
一実施形態では、酵母抽出物を添加することにより、有用な発酵結果を達成し得る。酵母抽出物の典型的な組成を表８に示す。酵母抽出物の添加は、バッチ発酵におけるエタノール力価の増加、生産性の向上および有機酸のような副生成物生産の減少をもたらし得る。一実施形態では、約０．５〜約５０ｇ／Ｌ、約５〜約３０ｇ／Ｌまたは約１０〜約３０ｇ／Ｌの使用レベルでの実施形態の方法において、酵母抽出物による有用な結果を達成し得る。別の実施形態では、酵母抽出物を約０．５ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、１．１ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、１．９ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．１ｇ／Ｌ、２．２ｇ／Ｌ、２．３ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．６ｇ／Ｌ、２．７ｇ／Ｌ、２．８ｇ／Ｌ、２．９ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．１ｇ／Ｌ、３．２ｇ／Ｌ、３．３ｇ／Ｌ、３．４ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、３．６ｇ／Ｌ、３．７ｇ／Ｌ、３．８ｇ／Ｌ、３．９ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．１ｇ／Ｌ、４．２ｇ／Ｌ、４．３ｇ／Ｌ、４．４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、４．６ｇ／Ｌ、４．７ｇ／Ｌ、４．８ｇ／Ｌ、４．９ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、５．１ｇ／Ｌ、５．２ｇ／Ｌ、５．３ｇ／Ｌ、５．４ｇ／Ｌ、５．５ｇ／Ｌ、５．６ｇ／Ｌ、５．７ｇ／Ｌ、５．８ｇ／Ｌ、５．９ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、６．１ｇ／Ｌ、６．２ｇ／Ｌ、６．３ｇ／Ｌ、６．４ｇ／Ｌ、６．５ｇ／Ｌ、６．６ｇ／Ｌ、６．７ｇ／Ｌ、６．８ｇ／Ｌ、６．９ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、７．１ｇ／Ｌ、７．２ｇ／Ｌ、７．３ｇ／Ｌ、７．４ｇ／Ｌ、７．５ｇ／Ｌ、７．６ｇ／Ｌ、７．７ｇ／Ｌ、７．８ｇ／Ｌ、７．９ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、８．１ｇ／Ｌ、８．２ｇ／Ｌ、８．３ｇ／Ｌ、８．４ｇ／Ｌ、８．５ｇ／Ｌ、８．６ｇ／Ｌ、８．７ｇ／Ｌ、８．８ｇ／Ｌ、８．９ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、９．１ｇ／Ｌ、９．２ｇ／Ｌ、９．３ｇ／Ｌ、９．４ｇ／Ｌ、９．５ｇ／Ｌ、９．６ｇ／Ｌ、９．７ｇ／Ｌ、９．８ｇ／Ｌ、９．９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１０．１ｇ／Ｌ、１０．２ｇ／Ｌ、１０．３ｇ／Ｌ、１０．４ｇ／Ｌ、１０．５ｇ／Ｌ、１０．６ｇ／Ｌ、１０．７ｇ／Ｌ、１０．８ｇ／Ｌ、１０．９ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ、１１．１ｇ／Ｌ、１１．２ｇ／Ｌ、１１．３ｇ／Ｌ、１１．４ｇ／Ｌ、１１．５ｇ／Ｌ、１１．６ｇ／Ｌ、１１．７ｇ／Ｌ、１１．８ｇ／Ｌ、１１．９ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１２．１ｇ／Ｌ、１２．２ｇ／Ｌ、１２．３ｇ／Ｌ、１２．４ｇ／Ｌ、１２．５ｇ／Ｌ、１２．６ｇ／Ｌ、１２．７ｇ／Ｌ、１２．８ｇ／Ｌ、１２．９ｇ／Ｌ、１３ｇ／Ｌ、１３．１ｇ／Ｌ、１３．２ｇ／Ｌ、１３．３ｇ／Ｌ、１３．４ｇ／Ｌ、１３．５ｇ／Ｌ、１３．６ｇ／Ｌ、１３．７ｇ／Ｌ、１３．８ｇ／Ｌ、１３．９ｇ／Ｌ、１４ｇ／Ｌ、１４．１ｇ／Ｌ、１４．２ｇ／Ｌ、１４．３ｇ／Ｌ、１４．４ｇ／Ｌ、１４．５ｇ／Ｌ、１４．６ｇ／Ｌ、１４．７ｇ／Ｌ、１４．８ｇ／Ｌ、１４．９ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１５．１ｇ／Ｌ、１５．２ｇ／Ｌ、１５．３ｇ／Ｌ、１５．４ｇ／Ｌ、１５．５ｇ／Ｌ、１５．６ｇ／Ｌ、１５．７ｇ／Ｌ、１５．８ｇ／Ｌ、１５．９ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌ、１６．１ｇ／Ｌ、１６．２ｇ／Ｌ、１６．３ｇ／Ｌ、１６．４ｇ／Ｌ、１６．５ｇ／Ｌ、１６．６ｇ／Ｌ、１６．７ｇ／Ｌ、１６．８ｇ／Ｌ、１６．９ｇ／Ｌ、１７ｇ／Ｌ、１７．１ｇ／Ｌ、１７．２ｇ／Ｌ、１７．３ｇ／Ｌ、１７．４ｇ／Ｌ、１７．５ｇ／Ｌ、１７．６ｇ／Ｌ、１７．７ｇ／Ｌ、１７．８ｇ／Ｌ、１７．９ｇ／Ｌ、１８ｇ／Ｌ、１８．１ｇ／Ｌ、１８．２ｇ／Ｌ、１８．３ｇ／Ｌ、１８．４ｇ／Ｌ、１８．５ｇ／Ｌ、１８．６ｇ／Ｌ、１８．７ｇ／Ｌ、１８．８ｇ／Ｌ、１８．９ｇ／Ｌ、１９ｇ／Ｌ、１９．１ｇ／Ｌ、１９．２ｇ／Ｌ、１９．３ｇ／Ｌ、１９．４ｇ／Ｌ、１９．５ｇ／Ｌ、１９．６ｇ／Ｌ、１９．７ｇ／Ｌ、１９．８ｇ／Ｌ、１９．９ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２０．１ｇ／Ｌ、２０．２ｇ／Ｌ、２０．３ｇ／Ｌ、２０．４ｇ／Ｌ、２０．５ｇ／Ｌ、２０．６ｇ／Ｌ、２０．７ｇ／Ｌ、２０．８ｇ／Ｌ、２０．９ｇ／Ｌ、２１ｇ／Ｌ、２１．１ｇ／Ｌ、２１．２ｇ／Ｌ、２１．３ｇ／Ｌ、２１．４ｇ／Ｌ、２１．５ｇ／Ｌ、２１．６ｇ／Ｌ、２１．７ｇ／Ｌ、２１．８ｇ／Ｌ、２１．９ｇ／Ｌ、２２ｇ／Ｌ、２２．１ｇ／Ｌ、２２．２ｇ／Ｌ、２２．３ｇ／Ｌ、２２．４ｇ／Ｌ、２２．５ｇ／Ｌ、２２．６ｇ／Ｌ、２２．７ｇ／Ｌ、２２．８ｇ／Ｌ、２２．９ｇ／Ｌ、２３ｇ／Ｌ、２３．１ｇ／Ｌ、２３．２ｇ／Ｌ、２３．３ｇ／Ｌ、２３．４ｇ／Ｌ、２３．５ｇ／Ｌ、２３．６ｇ／Ｌ、２３．７ｇ／Ｌ、２３．８ｇ／Ｌ、２３．９ｇ／Ｌ、２４ｇ／Ｌ、２４．１ｇ／Ｌ、２４．２ｇ／Ｌ、２４．３ｇ／Ｌ、２４．４ｇ／Ｌ、２４．５ｇ／Ｌ、２４．６ｇ／Ｌ、２４．７ｇ／Ｌ、２４．８ｇ／Ｌ、２４．９ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、２５．１ｇ／Ｌ、２５．２ｇ／Ｌ、２５．３ｇ／Ｌ、２５．４ｇ／Ｌ、２５．５ｇ／Ｌ、２５．６ｇ／Ｌ、２５．７ｇ／Ｌ、２５．８ｇ／Ｌ、２５．９ｇ／Ｌ、２６ｇ／Ｌ、２６．１ｇ／Ｌ、２６．２ｇ／Ｌ、２６．３ｇ／Ｌ、２６．４ｇ／Ｌ、２６．５ｇ／Ｌ、２６．６ｇ／Ｌ、２６．７ｇ／Ｌ、２６．８ｇ／Ｌ、２６．９ｇ／Ｌ、２７ｇ／Ｌ、２７．１ｇ／Ｌ、２７．２ｇ／Ｌ、２７．３ｇ／Ｌ、２７．４ｇ／Ｌ、２７．５ｇ／Ｌ、２７．６ｇ／Ｌ、２７．７ｇ／Ｌ、２７．８ｇ／Ｌ、２７．９ｇ／Ｌ、２８ｇ／Ｌ、２８．１ｇ／Ｌ、２８．２ｇ／Ｌ、２８．３ｇ／Ｌ、２８．４ｇ／Ｌ、２８．５ｇ／Ｌ、２８．６ｇ／Ｌ、２８．７ｇ／Ｌ、２８．８ｇ／Ｌ、２８．９ｇ／Ｌ、２９ｇ／Ｌ、２９．１ｇ／Ｌ、２９．２ｇ／Ｌ、２９．３ｇ／Ｌ、２９．４ｇ／Ｌ、２９．５ｇ／Ｌ、２９．６ｇ／Ｌ、２９．７ｇ／Ｌ、２９．８ｇ／Ｌ、２９．９ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３０．１ｇ／Ｌ、３０．２ｇ／Ｌ、３０．３ｇ／Ｌ、３０．４ｇ／Ｌ、３０．５ｇ／Ｌ、３０．６ｇ／Ｌ、３０．７ｇ／Ｌ、３０．８ｇ／Ｌ、３０．９ｇ／Ｌ、３１ｇ／Ｌ、３１．１ｇ／Ｌ、３１．２ｇ／Ｌ、３１．３ｇ／Ｌ、３１．４ｇ／Ｌ、３１．５ｇ／Ｌ、３１．６ｇ／Ｌ、３１．７ｇ／Ｌ、３１．８ｇ／Ｌ、３１．９ｇ／Ｌ、３２ｇ／Ｌ、３２．１ｇ／Ｌ、３２．２ｇ／Ｌ、３２．３ｇ／Ｌ、３２．４ｇ／Ｌ、３２．５ｇ／Ｌ、３２．６ｇ／Ｌ、３２．７ｇ／Ｌ、３２．８ｇ／Ｌ、３２．９ｇ／Ｌ、３３ｇ／Ｌ、３３．１ｇ／Ｌ、３３．２ｇ／Ｌ、３３．３ｇ／Ｌ、３３．４ｇ／Ｌ、３３．５ｇ／Ｌ、３３．６ｇ／Ｌ、３３．７ｇ／Ｌ、３３．８ｇ／Ｌ、３３．９ｇ／Ｌ、３４ｇ／Ｌ、３４．１ｇ／Ｌ、３４．２ｇ／Ｌ、３４．３ｇ／Ｌ、３４．４ｇ／Ｌ、３４．５ｇ／Ｌ、３４．６ｇ／Ｌ、３４．７ｇ／Ｌ、３４．８ｇ／Ｌ、３４．９ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、３５．１ｇ／Ｌ、３５．２ｇ／Ｌ、３５．３ｇ／Ｌ、３５．４ｇ／Ｌ、３５．５ｇ／Ｌ、３５．６ｇ／Ｌ、３５．７ｇ／Ｌ、３５．８ｇ／Ｌ、３５．９ｇ／Ｌ、３６ｇ／Ｌ、３６．１ｇ／Ｌ、３６．２ｇ／Ｌ、３６．３ｇ／Ｌ、３６．４ｇ／Ｌ、３６．５ｇ／Ｌ、３６．６ｇ／Ｌ、３６．７ｇ／Ｌ、３６．８ｇ／Ｌ、３６．９ｇ／Ｌ、３７ｇ／Ｌ、３７．１ｇ／Ｌ、３７．２ｇ／Ｌ、３７．３ｇ／Ｌ、３７．４ｇ／Ｌ、３７．５ｇ／Ｌ、３７．６ｇ／Ｌ、３７．７ｇ／Ｌ、３７．８ｇ／Ｌ、３７．９ｇ／Ｌ、３８ｇ／Ｌ、３８．１ｇ／Ｌ、３８．２ｇ／Ｌ、３８．３ｇ／Ｌ、３８．４ｇ／Ｌ、３８．５ｇ／Ｌ、３８．６ｇ／Ｌ、３８．７ｇ／Ｌ、３８．８ｇ／Ｌ、３８．９ｇ／Ｌ、３９ｇ／Ｌ、３９．１ｇ／Ｌ、３９．２ｇ／Ｌ、３９．３ｇ／Ｌ、３９．４ｇ／Ｌ、３９．５ｇ／Ｌ、３９．６ｇ／Ｌ、３９．７ｇ／Ｌ、３９．８ｇ／Ｌ、３９．９ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４０．１ｇ／Ｌ、４０．２ｇ／Ｌ、４０．３ｇ／Ｌ、４０．４ｇ／Ｌ、４０．５ｇ／Ｌ、４０．６ｇ／Ｌ、４０．７ｇ／Ｌ、４０．８ｇ／Ｌ、４０．９ｇ／Ｌ、４１ｇ／Ｌ、４１．１ｇ／Ｌ、４１．２ｇ／Ｌ、４１．３ｇ／Ｌ、４１．４ｇ／Ｌ、４１．５ｇ／Ｌ、４１．６ｇ／Ｌ、４１．７ｇ／Ｌ、４１．８ｇ／Ｌ、４１．９ｇ／Ｌ、４２ｇ／Ｌ、４２．１ｇ／Ｌ、４２．２ｇ／Ｌ、４２．３ｇ／Ｌ、４２．４ｇ／Ｌ、４２．５ｇ／Ｌ、４２．６ｇ／Ｌ、４２．７ｇ／Ｌ、４２．８ｇ／Ｌ、４２．９ｇ／Ｌ、４３ｇ／Ｌ、４３．１ｇ／Ｌ、４３．２ｇ／Ｌ、４３．３ｇ／Ｌ、４３．４ｇ／Ｌ、４３．５ｇ／Ｌ、４３．６ｇ／Ｌ、４３．７ｇ／Ｌ、４３．８ｇ／Ｌ、４３．９ｇ／Ｌ、４４ｇ／Ｌ、４４．１ｇ／Ｌ、４４．２ｇ／Ｌ、４４．３ｇ／Ｌ、４４．４ｇ／Ｌ、４４．５ｇ／Ｌ、４４．６ｇ／Ｌ、４４．７ｇ／Ｌ、４４．８ｇ／Ｌ、４４．９ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、４５．１ｇ／Ｌ、４５．２ｇ／Ｌ、４５．３ｇ／Ｌ、４５．４ｇ／Ｌ、４５．５ｇ／Ｌ、４５．６ｇ／Ｌ、４５．７ｇ／Ｌ、４５．８ｇ／Ｌ、４５．９ｇ／Ｌ、４６ｇ／Ｌ、４６．１ｇ／Ｌ、４６．２ｇ／Ｌ、４６．３ｇ／Ｌ、４６．４ｇ／Ｌ、４６．５ｇ／Ｌ、４６．６ｇ／Ｌ、４６．７ｇ／Ｌ、４６．８ｇ／Ｌ、４６．９ｇ／Ｌ、４７ｇ／Ｌ、４７．１ｇ／Ｌ、４７．２ｇ／Ｌ、４７．３ｇ／Ｌ、４７．４ｇ／Ｌ、４７．５ｇ／Ｌ、４７．６ｇ／Ｌ、４７．７ｇ／Ｌ、４７．８ｇ／Ｌ、４７．９ｇ／Ｌ、４８ｇ／Ｌ、４８．１ｇ／Ｌ、４８．２ｇ／Ｌ、４８．３ｇ／Ｌ、４８．４ｇ／Ｌ、４８．５ｇ／Ｌ、４８．６ｇ／Ｌ、４８．７ｇ／Ｌ、４８．８ｇ／Ｌ、４８．９ｇ／Ｌ、４９ｇ／Ｌ、４９．１ｇ／Ｌ、４９．２ｇ／Ｌ、４９．３ｇ／Ｌ、４９．４ｇ／Ｌ、４９．５ｇ／Ｌ、４９．６ｇ／Ｌ、４９．７ｇ／Ｌ、４９．８ｇ／Ｌ、４９．９ｇ／Ｌまたは５０ｇ／Ｌのレベルで使用する。
【０１８０】
酵母抽出物を全発酵過程または発酵の一部にわたって、継続的に供給するか、または間隔を置いて供給することもできる。一実施形態では、使用レベルは、窒素の少なくとも一部がコーンスティープパウダー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｐｏｗｄｅｒ）から供給される、約０．０５ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌ（窒素として）；または約０．３ｇ／Ｌ〜１．３ｇ／Ｌ；または０．４ｇ／Ｌ〜約０．９ｇ／Ｌの窒素濃度の維持を含む。別の実施形態では、窒素濃度は約０．０５ｇ／Ｌ、０．０６ｇ／Ｌ、０．０７ｇ／Ｌ、０．０８ｇ／Ｌ、０．０９ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．１１ｇ／Ｌ、０．１２ｇ／Ｌ、０．１３ｇ／Ｌ、０．１４ｇ／Ｌ、０．１５ｇ／Ｌ、０．１６ｇ／Ｌ、０．１７ｇ／Ｌ、０．１８ｇ／Ｌ、０．１９ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．２１ｇ／Ｌ、０．２２ｇ／Ｌ、０．２３ｇ／Ｌ、０．２４ｇ／Ｌ、０．２５ｇ／Ｌ、０．２６ｇ／Ｌ、０．２７ｇ／Ｌ、０．２８ｇ／Ｌ、０．２９ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．３１ｇ／Ｌ、０．３２ｇ／Ｌ、０．３３ｇ／Ｌ、０．３４ｇ／Ｌ、０．３５ｇ／Ｌ、０．３６ｇ／Ｌ、０．３７ｇ／Ｌ、０．３８ｇ／Ｌ、０．３９ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．４１ｇ／Ｌ、０．４２ｇ／Ｌ、０．４３ｇ／Ｌ、０．４４ｇ／Ｌ、０．４５ｇ／Ｌ、０．４６ｇ／Ｌ、０．４７ｇ／Ｌ、０．４８ｇ／Ｌ、０．４９ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．５１ｇ／Ｌ、０．５２ｇ／Ｌ、０．５３ｇ／Ｌ、０．５４ｇ／Ｌ、０．５５ｇ／Ｌ、０．５６ｇ／Ｌ、０．５７ｇ／Ｌ、０．５８ｇ／Ｌ、０．５９ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．６１ｇ／Ｌ、０．６２ｇ／Ｌ、０．６３ｇ／Ｌ、０．６４ｇ／Ｌ、０．６５ｇ／Ｌ、０．６６ｇ／Ｌ、０．６７ｇ／Ｌ、０．６８ｇ／Ｌ、０．６９ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．７１ｇ／Ｌ、０．７２ｇ／Ｌ、０．７３ｇ／Ｌ、０．７４ｇ／Ｌ、０．７５ｇ／Ｌ、０．７６ｇ／Ｌ、０．７７ｇ／Ｌ、０．７８ｇ／Ｌ、０．７９ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．８１ｇ／Ｌ、０．８２ｇ／Ｌ、０．８３ｇ／Ｌ、０．８４ｇ／Ｌ、０．８５ｇ／Ｌ、０．８６ｇ／Ｌ、０．８７ｇ／Ｌ、０．８８ｇ／Ｌ、０．８９ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ、０．９１ｇ／Ｌ、０．９２ｇ／Ｌ、０．９３ｇ／Ｌ、０．９４ｇ／Ｌ、０．９５ｇ／Ｌ、０．９６ｇ／Ｌ、０．９７ｇ／Ｌ、０．９８ｇ／Ｌ、０．９９ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、１．０１ｇ／Ｌ、１．０２ｇ／Ｌ、１．０３ｇ／Ｌ、１．０４ｇ／Ｌ、１．０５ｇ／Ｌ、１．０６ｇ／Ｌ、１．０７ｇ／Ｌ、１．０８ｇ／Ｌ、１．０９ｇ／Ｌ、１．１ｇ／Ｌ、１．１１ｇ／Ｌ、１．１２ｇ／Ｌ、１．１３ｇ／Ｌ、１．１４ｇ／Ｌ、１．１５ｇ／Ｌ、１．１６ｇ／Ｌ、１．１７ｇ／Ｌ、１．１８ｇ／Ｌ、１．１９ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．２１ｇ／Ｌ、１．２２ｇ／Ｌ、１．２３ｇ／Ｌ、１．２４ｇ／Ｌ、１．２５ｇ／Ｌ、１．２６ｇ／Ｌ、１．２７ｇ／Ｌ、１．２８ｇ／Ｌ、１．２９ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．３１ｇ／Ｌ、１．３２ｇ／Ｌ、１．３３ｇ／Ｌ、１．３４ｇ／Ｌ、１．３５ｇ／Ｌ、１．３６ｇ／Ｌ、１．３７ｇ／Ｌ、１．３８ｇ／Ｌ、１．３９ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．４１ｇ／Ｌ、１．４２ｇ／Ｌ、１．４３ｇ／Ｌ、１．４４ｇ／Ｌ、１．４５ｇ／Ｌ、１．４６ｇ／Ｌ、１．４７ｇ／Ｌ、１．４８ｇ／Ｌ、１．４９ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．５１ｇ／Ｌ、１．��２ｇ／Ｌ、１．５３ｇ／Ｌ、１．５４ｇ／Ｌ、１．５５ｇ／Ｌ、１．５６ｇ／Ｌ、１．５７ｇ／Ｌ、１．５８ｇ／Ｌ、１．５９ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌ、１．６１ｇ／Ｌ、１．６２ｇ／Ｌ、１．６３ｇ／Ｌ、１．６４ｇ／Ｌ、１．６５ｇ／Ｌ、１．６６ｇ／Ｌ、１．６７ｇ／Ｌ、１．６８ｇ／Ｌ、１．６９ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌ、１．７１ｇ／Ｌ、１．７２ｇ／Ｌ、１．７３ｇ／Ｌ、１．７４ｇ／Ｌ、１．７５ｇ／Ｌ、１．７６ｇ／Ｌ、１．７７ｇ／Ｌ、１．７８ｇ／Ｌ、１．７９ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、１．８１ｇ／Ｌ、１．８２ｇ／Ｌ、１．８３ｇ／Ｌ、１．８４ｇ／Ｌ、１．８５ｇ／Ｌ、１．８６ｇ／Ｌ、１．８７ｇ／Ｌ、１．８８ｇ／Ｌ、１．８９ｇ／Ｌ、１．９ｇ／Ｌ、１．９１ｇ／Ｌ、１．９２ｇ／Ｌ、１．９３ｇ／Ｌ、１．９４ｇ／Ｌ、１．９５ｇ／Ｌ、１．９６ｇ／Ｌ、１．９７ｇ／Ｌ、１．９８ｇ／Ｌ、１．９９ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．０１ｇ／Ｌ、２．０２ｇ／Ｌ、２．０３ｇ／Ｌ、２．０４ｇ／Ｌ、２．０５ｇ／Ｌ、２．０６ｇ／Ｌ、２．０７ｇ／Ｌ、２．０８ｇ／Ｌ、２．０９ｇ／Ｌ、２．１ｇ／Ｌ、２．１１ｇ／Ｌ、２．１２ｇ／Ｌ、２．１３ｇ／Ｌ、２．１４ｇ／Ｌ、２．１５ｇ／Ｌ、２．１６ｇ／Ｌ、２．１７ｇ／Ｌ、２．１８ｇ／Ｌ、２．１９ｇ／Ｌ、２．２ｇ／Ｌ、２．２１ｇ／Ｌ、２．２２ｇ／Ｌ、２．２３ｇ／Ｌ、２．２４ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．２６ｇ／Ｌ、２．２７ｇ／Ｌ、２．２８ｇ／Ｌ、２．２９ｇ／Ｌ、２．３ｇ／Ｌ、２．３１ｇ／Ｌ、２．３２ｇ／Ｌ、２．３３ｇ／Ｌ、２．３４ｇ／Ｌ、２．３５ｇ／Ｌ、２．３６ｇ／Ｌ、２．３７ｇ／Ｌ、２．３８ｇ／Ｌ、２．３９ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．４１ｇ／Ｌ、２．４２ｇ／Ｌ、２．４３ｇ／Ｌ、２．４４ｇ／Ｌ、２．４５ｇ／Ｌ、２．４６ｇ／Ｌ、２．４７ｇ／Ｌ、２．４８ｇ／Ｌ、２．４９ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．５１ｇ／Ｌ、２．５２ｇ／Ｌ、２．５３ｇ／Ｌ、２．５４ｇ／Ｌ、２．５５ｇ／Ｌ、２．５６ｇ／Ｌ、２．５７ｇ／Ｌ、２．５８ｇ／Ｌ、２．５９ｇ／Ｌ、２．６ｇ／Ｌ、２．６１ｇ／Ｌ、２．６２ｇ／Ｌ、２．６３ｇ／Ｌ、２．６４ｇ／Ｌ、２．６５ｇ／Ｌ、２．６６ｇ／Ｌ、２．６７ｇ／Ｌ、２．６８ｇ／Ｌ、２．６９ｇ／Ｌ、２．７ｇ／Ｌ、２．７１ｇ／Ｌ、２．７２ｇ／Ｌ、２．７３ｇ／Ｌ、２．７４ｇ／Ｌ、２．７５ｇ／Ｌ、２．７６ｇ／Ｌ、２．７７ｇ／Ｌ、２．７８ｇ／Ｌ、２．７９ｇ／Ｌ、２．８ｇ／Ｌ、２．８１ｇ／Ｌ、２．８２ｇ／Ｌ、２．８３ｇ／Ｌ、２．８４ｇ／Ｌ、２．８５ｇ／Ｌ、２．８６ｇ／Ｌ、２．８７ｇ／Ｌ、２．８８ｇ／Ｌ、２．８９ｇ／Ｌ、２．９ｇ／Ｌ、２．９１ｇ／Ｌ、２．９２ｇ／Ｌ、２．９３ｇ／Ｌ、２．９４ｇ／Ｌ、２．９５ｇ／Ｌ、２．９６ｇ／Ｌ、２．９７ｇ／Ｌ、２．９８ｇ／Ｌ、２．９９ｇ／Ｌまたは３ｇ／Ｌである。
【０１８１】
一実施形態では、コーンスティープパウダー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｐｏｗｄｅｒ）を発酵に添加することにより、有用な発酵結果を達成し得る。別の実施形態では、コーンスティープパウダー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｐｏｗｄｅｒ）の典型的な組成を表１〜２に示す。コーンスティープパウダー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｐｏｗｄｅｒ）の添加は、バッチ発酵におけるエタノール力価の増加、生産性の向上および有機酸のような副生成物生産の減少をもたらし得る。別の実施形態では、約３〜約２０ｇ／Ｌ、約５〜約１５ｇ／Ｌまたは約８〜約１２ｇ／Ｌの使用レベルでの実施形態の方法において、コーンスティープパウダー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｐｏｗｄｅｒ）による有用な結果を達成し得る。別の実施形態では、スティープパウダーによる有用な結果は約３ｇ／Ｌ、３．１ｇ／Ｌ、３．２ｇ／Ｌ、３．３ｇ／Ｌ、３．４ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、３．６ｇ／Ｌ、３．７ｇ／Ｌ、３．８ｇ／Ｌ、３．９ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．１ｇ／Ｌ、４．２ｇ／Ｌ、４．３ｇ／Ｌ、４．４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、４．６ｇ／Ｌ、４．７ｇ／Ｌ、４．８ｇ／Ｌ、４．９ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、５．１ｇ／Ｌ、５．２ｇ／Ｌ、５．３ｇ／Ｌ、５．４ｇ／Ｌ、５．５ｇ／Ｌ、５．６ｇ／Ｌ、５．７ｇ／Ｌ、５．８ｇ／Ｌ、５．９ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、６．１ｇ／Ｌ、６．２ｇ／Ｌ、６．３ｇ／Ｌ、６．４ｇ／Ｌ、６．５ｇ／Ｌ、６．６ｇ／Ｌ、６．７ｇ／Ｌ、６．８ｇ／Ｌ、６．９ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、７．１ｇ／Ｌ、７．２ｇ／Ｌ、７．３ｇ／Ｌ、７．４ｇ／Ｌ、７．５ｇ／Ｌ、７．６ｇ／Ｌ、７．７ｇ／Ｌ、７．８ｇ／Ｌ、７．９ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、８．１ｇ／Ｌ、８．２ｇ／Ｌ、８．３ｇ／Ｌ、８．４ｇ／Ｌ、８．５ｇ／Ｌ、８．６ｇ／Ｌ、８．７ｇ／Ｌ、８．８ｇ／Ｌ、８．９ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、９．１ｇ／Ｌ、９．２ｇ／Ｌ、９．３ｇ／Ｌ、９．４ｇ／Ｌ、９．５ｇ／Ｌ、９．６ｇ／Ｌ、９．７ｇ／Ｌ、９．８ｇ／Ｌ、９．９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１０．１ｇ／Ｌ、１０．２ｇ／Ｌ、１０．３ｇ／Ｌ、１０．４ｇ／Ｌ、１０．５ｇ／Ｌ、１０．６ｇ／Ｌ、１０．７ｇ／Ｌ、１０．８ｇ／Ｌ、１０．９ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ、１１．１ｇ／Ｌ、１１．２ｇ／Ｌ、１１．３ｇ／Ｌ、１１．４ｇ／Ｌ、１１．５ｇ／Ｌ、１１．６ｇ／Ｌ、１１．７ｇ／Ｌ、１１．８ｇ／Ｌ、１１．９ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１２．１ｇ／Ｌ、１２．２ｇ／Ｌ、１２．３ｇ／Ｌ、１２．４ｇ／Ｌ、１２．５ｇ／Ｌ、１２．６ｇ／Ｌ、１２．７ｇ／Ｌ、１２．８ｇ／Ｌ、１２．９ｇ／Ｌ、１３ｇ／Ｌ、１３．１ｇ／Ｌ、１３．２ｇ／Ｌ、１３．３ｇ／Ｌ、１３．４ｇ／Ｌ、１３．５ｇ／Ｌ、１３．６ｇ／Ｌ、１３．７ｇ／Ｌ、１３．８ｇ／Ｌ、１３．９ｇ／Ｌ、１４ｇ／Ｌ、１４．１ｇ／Ｌ、１４．２ｇ／Ｌ、１４．３ｇ／Ｌ、１４．４ｇ／Ｌ、１４．５ｇ／Ｌ、１４．６ｇ／Ｌ、１４．７ｇ／Ｌ、１４．８ｇ／Ｌ、１４．９ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１５．１ｇ／Ｌ、１５．２ｇ／Ｌ、１５．３ｇ／Ｌ、１５．４ｇ／Ｌ、１５．５ｇ／Ｌ、１５．６ｇ／Ｌ、１５．７ｇ／Ｌ、１５．８ｇ／Ｌ、１５．９ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌ、１６．１ｇ／Ｌ、１６．２ｇ／Ｌ、１６．３ｇ／Ｌ、１６．４ｇ／Ｌ、１６．５ｇ／Ｌ、１６．６ｇ／Ｌ、１６．７ｇ／Ｌ、１６．８ｇ／Ｌ、１６．９ｇ／Ｌ��１７ｇ／Ｌ、１７．１ｇ／Ｌ、１７．２ｇ／Ｌ、１７．３ｇ／Ｌ、１７．４ｇ／Ｌ、１７．５ｇ／Ｌ、１７．６ｇ／Ｌ、１７．７ｇ／Ｌ、１７．８ｇ／Ｌ、１７．９ｇ／Ｌ、１８ｇ／Ｌ、１８．１ｇ／Ｌ、１８．２ｇ／Ｌ、１８．３ｇ／Ｌ、１８．４ｇ／Ｌ、１８．５ｇ／Ｌ、１８．６ｇ／Ｌ、１８．７ｇ／Ｌ、１８．８ｇ／Ｌ、１８．９ｇ／Ｌ、１９ｇ／Ｌ、１９．１ｇ／Ｌ、１９．２ｇ／Ｌ、１９．３ｇ／Ｌ、１９．４ｇ／Ｌ、１９．５ｇ／Ｌ、１９．６ｇ／Ｌ、１９．７ｇ／Ｌ、１９．８ｇ／Ｌ、１９．９ｇ／Ｌまたは２０ｇ／Ｌのレベルで達成し得る。
【０１８２】
一実施形態では、コーンスティープパウダー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｐｏｗｄｅｒ）を全発酵過程または発酵の一部にわたって、継続的に供給するか、または間隔を置いて供給することもできる。別の実施形態では、使用レベルは、窒素の少なくとも一部がコーンスティープパウダー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｐｏｗｄｅｒ）から供給される、約０．０５ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌ（窒素として）；約０．３ｇ／Ｌ〜１．３ｇ／Ｌ；または約０．４ｇ／Ｌ〜約０．９ｇ／Ｌの窒素濃度の維持を含む。別の実施形態では、窒素レベルは約０．０５ｇ／Ｌ、０．０６ｇ／Ｌ、０．０７ｇ／Ｌ、０．０８ｇ／Ｌ、０．０９ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．１１ｇ／Ｌ、０．１２ｇ／Ｌ、０．１３ｇ／Ｌ、０．１４ｇ／Ｌ、０．１５ｇ／Ｌ、０．１６ｇ／Ｌ、０．１７ｇ／Ｌ、０．１８ｇ／Ｌ、０．１９ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．２１ｇ／Ｌ、０．２２ｇ／Ｌ、０．２３ｇ／Ｌ、０．２４ｇ／Ｌ、０．２５ｇ／Ｌ、０．２６ｇ／Ｌ、０．２７ｇ／Ｌ、０．２８ｇ／Ｌ、０．２９ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．３１ｇ／Ｌ、０．３２ｇ／Ｌ、０．３３ｇ／Ｌ、０．３４ｇ／Ｌ、０．３５ｇ／Ｌ、０．３６ｇ／Ｌ、０．３７ｇ／Ｌ、０．３８ｇ／Ｌ、０．３９ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．４１ｇ／Ｌ、０．４２ｇ／Ｌ、０．４３ｇ／Ｌ、０．４４ｇ／Ｌ、０．４５ｇ／Ｌ、０．４６ｇ／Ｌ、０．４７ｇ／Ｌ、０．４８ｇ／Ｌ、０．４９ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．５１ｇ／Ｌ、０．５２ｇ／Ｌ、０．５３ｇ／Ｌ、０．５４ｇ／Ｌ、０．５５ｇ／Ｌ、０．５６ｇ／Ｌ、０．５７ｇ／Ｌ、０．５８ｇ／Ｌ、０．５９ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．６１ｇ／Ｌ、０．６２ｇ／Ｌ、０．６３ｇ／Ｌ、０．６４ｇ／Ｌ、０．６５ｇ／Ｌ、０．６６ｇ／Ｌ、０．６７ｇ／Ｌ、０．６８ｇ／Ｌ、０．６９ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．７１ｇ／Ｌ、０．７２ｇ／Ｌ、０．７３ｇ／Ｌ、０．７４ｇ／Ｌ、０．７５ｇ／Ｌ、０．７６ｇ／Ｌ、０．７７ｇ／Ｌ、０．７８ｇ／Ｌ、０．７９ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．８１ｇ／Ｌ、０．８２ｇ／Ｌ、０．８３ｇ／Ｌ、０．８４ｇ／Ｌ、０．８５ｇ／Ｌ、０．８６ｇ／Ｌ、０．８７ｇ／Ｌ、０．８８ｇ／Ｌ、０．８９ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ、０．９１ｇ／Ｌ、０．９２ｇ／Ｌ、０．９３ｇ／Ｌ、０．９４ｇ／Ｌ、０．９５ｇ／Ｌ、０．９６ｇ／Ｌ、０．９７ｇ／Ｌ、０．９８ｇ／Ｌ、０．９９ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、１．０１ｇ／Ｌ、１．０２ｇ／Ｌ、１．０３ｇ／Ｌ、１．０４ｇ／Ｌ、１．０５ｇ／Ｌ、１．０６ｇ／Ｌ、１．０７ｇ／Ｌ、１．０８ｇ／Ｌ、１．０９ｇ／Ｌ、１．１ｇ／Ｌ、１．１１ｇ／Ｌ、１．１２ｇ／Ｌ、１．１３ｇ／Ｌ、１．１４ｇ／Ｌ、１．１５ｇ／Ｌ、１．１６ｇ／Ｌ、１．１７ｇ／Ｌ、１．１８ｇ／Ｌ、１．１９ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．２１ｇ／Ｌ、１．２２ｇ／Ｌ、１．２３ｇ／Ｌ、１．２４ｇ／Ｌ、１．２５ｇ／Ｌ、１．２６ｇ／Ｌ、１．２７ｇ／Ｌ、１．２８ｇ／Ｌ、１．２９ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．３１ｇ／Ｌ、１．３２ｇ／Ｌ、１．３３ｇ／Ｌ、１．３４ｇ／Ｌ、１．３５ｇ／Ｌ、１．３６ｇ／Ｌ、１．３７ｇ／Ｌ、１．３８ｇ／Ｌ、１．３９ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．４１ｇ／Ｌ、１．４２ｇ／Ｌ、１．４３ｇ／Ｌ、１．４４ｇ／Ｌ、１．４５ｇ／Ｌ、１．４６ｇ／Ｌ、１．４７ｇ／Ｌ、���．４８ｇ／Ｌ、１．４９ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．５１ｇ／Ｌ、１．５２ｇ／Ｌ、１．５３ｇ／Ｌ、１．５４ｇ／Ｌ、１．５５ｇ／Ｌ、１．５６ｇ／Ｌ、１．５７ｇ／Ｌ、１．５８ｇ／Ｌ、１．５９ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌ、１．６１ｇ／Ｌ、１．６２ｇ／Ｌ、１．６３ｇ／Ｌ、１．６４ｇ／Ｌ、１．６５ｇ／Ｌ、１．６６ｇ／Ｌ、１．６７ｇ／Ｌ、１．６８ｇ／Ｌ、１．６９ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌ、１．７１ｇ／Ｌ、１．７２ｇ／Ｌ、１．７３ｇ／Ｌ、１．７４ｇ／Ｌ、１．７５ｇ／Ｌ、１．７６ｇ／Ｌ、１．７７ｇ／Ｌ、１．７８ｇ／Ｌ、１．７９ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、１．８１ｇ／Ｌ、１．８２ｇ／Ｌ、１．８３ｇ／Ｌ、１．８４ｇ／Ｌ、１．８５ｇ／Ｌ、１．８６ｇ／Ｌ、１．８７ｇ／Ｌ、１．８８ｇ／Ｌ、１．８９ｇ／Ｌ、１．９ｇ／Ｌ、１．９１ｇ／Ｌ、１．９２ｇ／Ｌ、１．９３ｇ／Ｌ、１．９４ｇ／Ｌ、１．９５ｇ／Ｌ、１．９６ｇ／Ｌ、１．９７ｇ／Ｌ、１．９８ｇ／Ｌ、１．９９ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．０１ｇ／Ｌ、２．０２ｇ／Ｌ、２．０３ｇ／Ｌ、２．０４ｇ／Ｌ、２．０５ｇ／Ｌ、２．０６ｇ／Ｌ、２．０７ｇ／Ｌ、２．０８ｇ／Ｌ、２．０９ｇ／Ｌ、２．１ｇ／Ｌ、２．１１ｇ／Ｌ、２．１２ｇ／Ｌ、２．１３ｇ／Ｌ、２．１４ｇ／Ｌ、２．１５ｇ／Ｌ、２．１６ｇ／Ｌ、２．１７ｇ／Ｌ、２．１８ｇ／Ｌ、２．１９ｇ／Ｌ、２．２ｇ／Ｌ、２．２１ｇ／Ｌ、２．２２ｇ／Ｌ、２．２３ｇ／Ｌ、２．２４ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．２６ｇ／Ｌ、２．２７ｇ／Ｌ、２．２８ｇ／Ｌ、２．２９ｇ／Ｌ、２．３ｇ／Ｌ、２．３１ｇ／Ｌ、２．３２ｇ／Ｌ、２．３３ｇ／Ｌ、２．３４ｇ／Ｌ、２．３５ｇ／Ｌ、２．３６ｇ／Ｌ、２．３７ｇ／Ｌ、２．３８ｇ／Ｌ、２．３９ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．４１ｇ／Ｌ、２．４２ｇ／Ｌ、２．４３ｇ／Ｌ、２．４４ｇ／Ｌ、２．４５ｇ／Ｌ、２．４６ｇ／Ｌ、２．４７ｇ／Ｌ、２．４８ｇ／Ｌ、２．４９ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．５１ｇ／Ｌ、２．５２ｇ／Ｌ、２．５３ｇ／Ｌ、２．５４ｇ／Ｌ、２．５５ｇ／Ｌ、２．５６ｇ／Ｌ、２．５７ｇ／Ｌ、２．５８ｇ／Ｌ、２．５９ｇ／Ｌ、２．６ｇ／Ｌ、２．６１ｇ／Ｌ、２．６２ｇ／Ｌ、２．６３ｇ／Ｌ、２．６４ｇ／Ｌ、２．６５ｇ／Ｌ、２．６６ｇ／Ｌ、２．６７ｇ／Ｌ、２．６８ｇ／Ｌ、２．６９ｇ／Ｌ、２．７ｇ／Ｌ、２．７１ｇ／Ｌ、２．７２ｇ／Ｌ、２．７３ｇ／Ｌ、２．７４ｇ／Ｌ、２．７５ｇ／Ｌ、２．７６ｇ／Ｌ、２．７７ｇ／Ｌ、２．７８ｇ／Ｌ、２．７９ｇ／Ｌ、２．８ｇ／Ｌ、２．８１ｇ／Ｌ、２．８２ｇ／Ｌ、２．８３ｇ／Ｌ、２．８４ｇ／Ｌ、２．８５ｇ／Ｌ、２．８６ｇ／Ｌ、２．８７ｇ／Ｌ、２．８８ｇ／Ｌ、２．８９ｇ／Ｌ、２．９ｇ／Ｌ、２．９１ｇ／Ｌ、２．９２ｇ／Ｌ、２．９３ｇ／Ｌ、２．９４ｇ／Ｌ、２．９５ｇ／Ｌ、２．９６ｇ／Ｌ、２．９７ｇ／Ｌ、２．９８ｇ／Ｌ、２．９９ｇ／Ｌまたは３ｇ／Ｌである。
【０１８３】
別の実施形態では、コーンスティープリカー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）またはコーンスティープソリッド（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｓｏｌｉｄ）のような他の関連製品を使用し得る。コーンスティープリカー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）を使用した場合、その使用比率は、固体ベースでコーンスティープソリッド（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｓｏｌｉｄ）のときとほぼ同じである。別の実施形態では、コーンスティープパウダー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｐｏｗｄｅｒ）（またはソリッド（ｓｏｌｉｄ）またはリカー（ｌｉｑｕｏｒ））を、存在するかまたはこれから添加する炭素基質の量に関連させて添加する。このように添加する場合、有用なコーンスティープパウダー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｐｏｗｄｅｒ）（またはソリッド（ｓｏｌｉｄ）またはリカー（ｌｉｑｕｏｒ））の量としては、約１：１〜約１：６ｇ／ｇ炭素、約１：１〜約１：５ｇ／ｇ炭素または約１：２〜約１：４ｇ／ｇ炭素を挙げ得る。別の実施形態では、約１．５：１ｇ／ｇ炭素もしくは約３：１ｇ／ｇ炭素の高い比率または約１：８ｇ／ｇ炭素もしくは約１：１０ｇ／ｇ炭素の低い比率を用いる。別の実施形態では、比率は２：１ｇ／ｇ炭素、１．９：１ｇ／ｇ炭素、１．８：１ｇ／ｇ炭素、１．７：１ｇ／ｇ炭素、１．６：１ｇ／ｇ炭素、１．５：１ｇ／ｇ炭素、１．４：１ｇ／ｇ炭素、１．３：１ｇ／ｇ炭素、１．２：１ｇ／ｇ炭素、１．１：１ｇ／ｇ炭素、１：１ｇ／ｇ炭素、１：１．１ｇ／ｇ炭素、１：１．２ｇ／ｇ炭素、１：１．３ｇ／ｇ炭素、１：１．４ｇ／ｇ炭素、１：１．５ｇ／ｇ炭素、１：１．６ｇ／ｇ炭素、１：１．７ｇ／ｇ炭素、１：１．８ｇ／ｇ炭素、１：１．９ｇ／ｇ炭素、１：２ｇ／ｇ炭素、１：２．１ｇ／ｇ炭素、１：２．２ｇ／ｇ炭素、１：２．３ｇ／ｇ炭素、１：２．４ｇ／ｇ炭素、１：２．５ｇ／ｇ炭素、１：２．６ｇ／ｇ炭素、１：２．７ｇ／ｇ炭素、１：２．８ｇ／ｇ炭素、１：２．９ｇ／ｇ炭素、１：３ｇ／ｇ炭素、１：３．１ｇ／ｇ炭素、１：３．２ｇ／ｇ炭素、１：３．３ｇ／ｇ炭素、１：３．４ｇ／ｇ炭素、１：３．５ｇ／ｇ炭素、１：３．６ｇ／ｇ炭素、１：３．７ｇ／ｇ炭素、１：３．８ｇ／ｇ炭素、１：３．９ｇ／ｇ炭素、１：４ｇ／ｇ炭素、１：４．１ｇ／ｇ炭素、１：４．２ｇ／ｇ炭素、１：４．３ｇ／ｇ炭素、１：４．４ｇ／ｇ炭素、１：４．５ｇ／ｇ炭素、１：４．６ｇ／ｇ炭素、１：４．７ｇ／ｇ炭素、１：４．８ｇ／ｇ炭素、１：４．９ｇ／ｇ炭素、１：５ｇ／ｇ炭素、１：５．１ｇ／ｇ炭素、１：５．２ｇ／ｇ炭素、１：５．３ｇ／ｇ炭素、１：５．４ｇ／ｇ炭素、１：５．５ｇ／ｇ炭素、１：５．６ｇ／ｇ炭素、１：５．７ｇ／ｇ炭素、１：５．８ｇ／ｇ炭素、１：５．９ｇ／ｇ炭素、１：６ｇ／ｇ炭素、１：６．１ｇ／ｇ炭素、１：６．２ｇ／ｇ炭素、１：６．３ｇ／ｇ炭素、１：６．４ｇ／ｇ炭素、１：６．５ｇ／ｇ炭素、１：６．６ｇ／ｇ炭素、１：６．７ｇ／ｇ炭素、１：６．８ｇ／ｇ炭素、１：６．９ｇ／ｇ炭素、１：７ｇ／ｇ炭素、１：７．１ｇ／ｇ炭素、１：７．２ｇ／ｇ炭素、１：７．３ｇ／ｇ炭素、１：７．４ｇ／ｇ炭素、１：７．５ｇ／ｇ炭素、１：７．６ｇ／ｇ炭素、１：７．７ｇ／ｇ炭素、１：７．８ｇ／ｇ炭素、１：７．９ｇ／ｇ炭素、１：８ｇ／ｇ炭素、１：８．１ｇ／ｇ炭素、１：８．２ｇ／ｇ炭素、１：８．３ｇ／ｇ炭素、１：８．４ｇ／ｇ炭素、１：８．５ｇ／ｇ炭素、１：８．６ｇ／ｇ炭素、１：８．７ｇ／ｇ炭素、１：８．８ｇ／ｇ炭素、１：８．９ｇ／ｇ炭素、１：９ｇ／ｇ炭素、１：９．１ｇ／ｇ炭素、１：９．２ｇ／ｇ炭素、１：９．３ｇ／ｇ炭素、１：９．４ｇ／ｇ炭素、１：９．５ｇ／ｇ炭素、１：９．６ｇ／ｇ炭素、１：９．７ｇ／ｇ炭素、１：９．８ｇ／ｇ炭素、１：９．９ｇ／ｇ炭素または１：１０ｇ／ｇ炭素である。
【０１８４】
【表５】
2012519500.tif 000013
【０１８５】
【表６】
2012519500.tif 000014
【０１８６】
一実施形態では、コーンスティープパウダー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｐｏｗｄｅｒ）を酵母抽出物と組み合わせて発酵に添加することにより、有用な発酵結果を達成し得る。約３〜約２０ｇ／Ｌ、約５〜約１５ｇ／Ｌまたは約８〜約１２ｇ／Ｌのコーンスティープパウダー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｐｏｗｄｅｒ）使用レベルおよび約３〜５０ｇ／Ｌ、約５〜約３０ｇ／Ｌまたは約１０〜約３０ｇ／Ｌの酵母抽出物使用レベルでの実施形態の方法において、酵母抽出物と組み合わせたコーンスティープパウダー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｐｏｗｄｅｒ）による有用な結果を達成し得る。コーンスティープパウダー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｐｏｗｄｅｒ）および酵母抽出物を全発酵過程または発酵の一部にわたって、継続的に供給するか、または間隔を置いて供給することもできる。
【０１８７】
他の実施形態では、コーンスティープパウダー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｐｏｗｄｅｒ）および／または酵母抽出物由来の有用な化合物、例えばグリシン、ヒスチジン、イソロイシン、プロリンまたはフィチン酸塩など、およびこれらの化合物の組合せを培地またはブロスに添加して、有用な効果を得ることができる。
【０１８８】
本発明の様々な実施形態では、特定の脂肪酸部分を含有する１つ以上の化合物を含む培地で微生物を培養することにより、および／またはｐＨが制御された条件下で微生物を培養することにより、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）によるアルコール生産の力価および／または生産性の向上に関連した利益が提供される。
【０１８９】
高レベルのアルコールの生産には、微生物が高アルコールレベルの存在下で全般的によく生育する能力、ならびに存在するアルコールおよび／または他の成分により過度の阻害または抑制を受けずにアルコールを生産し続ける能力の両方が必要である。多くの場合、上記のそれぞれに異なった代謝経路が関与する。例えば、細胞増殖に関連する経路としては、タンパク質生産、膜生産および細胞の生存に必要な細胞サブシステムすべての生産に関連する経路が一般に挙げられる。アルコール生産に関連する経路は、アルコール生産をもたらす糖代謝ならびにアルコールおよび中間体の生産に必要な酵素に関連する経路のように、より特異的である場合が多い。１種類のアルコール、例えばエタノールのための経路は、いくつかの類似した酵素などを共有し得るが、その経路に固有の酵素および基質も有する。これらの経路のセットの間に一部重複が存在し得るが、一方を増強することが自動的に他方の増強をもたらすことは期待されない。
【０１９０】
ある場合には、アルコール耐性またはアルコールによる毒性は、アルコールレベル上昇による細胞膜の透過化と関連し、細胞内の酵素および栄養素の漏出を招き得る。別のある場合には、アルコール耐性および高アルコール力価の生産能力は、細胞自体により生産されるまたは細胞膜を横断する輸送による細胞内酵素の、例えば細胞内に存在するアルコールによる変性に抵抗する能力と関連する。ある場合には、より頑強な膜によって、高いアルコール勾配がその膜を横断して存在することが可能となるため、細胞がより高い外部アルコール濃度で増殖するおよび／またはアルコールを生産し続けることが可能となる。いくつかの発酵プロセスにおいて、約３６〜４８時間のバッチ発酵後に、ブロス中に炭素基質が残った状態でエタノール濃度が約１５ｇ／Ｌのプラトーに達することが、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）で示されている。一実施形態では、発酵ｐＨを約６．５まで低下させること、および／または不飽和脂肪酸を添加することにより、微生物により生産されるエタノールの量が有意に増加し、７２時間の発酵後に約３５ｇ／Ｌのエタノールがブロス中に観察された。別の実施形態では、微生物の生産性が、エタノール力価が低い場合により高くなり（約０ｇ／（Ｌ・日）まで）、エタノール濃度がより高い場合に低くなる（約２ｇ／（Ｌ・日）まで）ことが観察された。低下させたｐＨでのおよび／または脂肪酸を添加した発酵では、エタノール生産速度が約５倍増加した。
【０１９１】
一実施形態では、Ｑ微生物を約ｐＨ５〜８．５で基質と共に発酵させる。一実施形態では、Ｑ微生物を約５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４または８．５のｐＨで発酵させる。
【０１９２】
脂肪酸培地成分
一態様では、本発明は、脂肪酸含有化合物を含む培地でのクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）培養物を含む、アルコール、例えばエタノール生産のための組成物を提供する。培地は、バイオマス、例えば農作物、作物残渣、樹木、木片、おがくず、紙、ボール紙、あるいはセルロース、ヘミセルロース性物質、リグノセルロース、ペクチン、ポリグルコース、ポリフルクトースおよび／またはこれらの加水分解形態を含有するその他の原料などの炭素源（まとめて「供給原料」）も含み得る。硫黄含有および窒素含有化合物、例えばアミノ酸、タンパク質、加水分解タンパク質、アンモニア、尿素、硝酸、亜硝酸、大豆、大豆派生物、カゼイン、カゼイン誘導体、粉乳、乳派生物、乳清、酵母抽出物、加水分解酵母、自己消化酵母、コーンスティープリカー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）、コーンスティープソリッド（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｓｏｌｉｄ）、グルタミン酸ナトリウムおよび／またはその他の発酵窒素源、ビタミン、補助因子、および／または無機物の補充物などを含めた追加の栄養素が存在し得る。供給原料は、例えば２００８年２月２７日に出願された米国特許仮出願第６１／０３２０４８号または米国特許仮出願第６１／１５８，５８１号として２００９年３月９日に本願と同時に出願された米国特許仮出願（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように前処理しても、しなくてもよい。微生物を増殖させて燃料または他の所望の化学製品を生産するための手順および技術は、例えば組み込まれる米国特許仮出願第６１／０３２０４８号または米国特許仮出願第６１／１５８，５８１号として２００９年３月９日に本願と同時に出願された米国特許仮出願（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）などに記載されている。
【０１９３】
一実施形態では、組成物の脂肪酸含有化合物は、遊離脂肪酸、脂肪酸塩もしくは石鹸、トリアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、リン脂質、リゾリン脂質、脂肪酸エステルまたは脂肪酸アミドであり得る。脂肪酸エステルは、長鎖アルコール、短鎖アルコール、中鎖アルコール、一水和物アルコール（ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｌｃｏｈｏｌ）、二価アルコール、三価アルコール、多価アルコール、分岐アルコール、またはヒドロキシル基を含む他の化合物を含み得る。好適なエステルとしては、メタノール（脂肪酸メチルエステル）、エタノール（脂肪酸エチルエステル）、ｎ−プロパノール（脂肪酸プロピルエステル）およびイソプロパノール（脂肪酸イソプロピルエステル）のエステルが挙げられるが、４〜２０個の炭素を有するアルコールのような他のアルコールも使用し得る。場合によっては、より長鎖のアルコールおよび多価のアルコールも使用し得る。適切なより長鎖または多価のアルコールとしては、グリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールなど）、グリセロール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、アラビトール、または１つ以上のヒドロキシル基を含有するポリエーテルおよびポリエチレングリコールのような化合物が挙げられる。２つ以上のヒドロキシル基が存在する場合、これらの基の１つ以上は別の化学的部分と結合し得る（例えば、エステル、アミド、エーテルなどとして）か、またはそれらは遊離ヒドロキシル基であり得る。
【０１９４】
別の実施形態では、脂肪酸は、８〜４０個の炭素、および好ましくは１２〜２４個の炭素からなる炭素鎖を含み得る。特定の実施形態では、単一の脂肪酸または脂肪酸の混合物を使用し得る。多価アルコールを使用する場合、脂肪酸は、１個のみのヒドロキシル基または２つ以上のヒドロキシル基と結合し得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の脂肪酸種が単一の多価アルコールと結合し得る。単一の多価アルコールと結合した複数の脂肪酸の例としては、油脂、例えばトウモロコシ、カノーラ、ベニバナ、ナタネ、ヒマワリ、ダイズ、オリーブ、ピーナッツ、ヤシ、パーム核、魚、トウゴマ種子、獣脂、ラードを含めた、動物および植物由来の油脂、ならびに部分グリセリドおよびリン脂質などが挙げられる。
【０１９５】
任意のＣ８〜Ｃ３０脂肪酸を使用し得るが、好適な脂肪酸としては、不飽和脂肪酸、例えば１個、２個、３個またはそれを超える炭素−炭素二重結合を有する不飽和脂肪酸などが挙げられる。特に好適なのは、オメガ−９位（非カルボキシル末端から計算）またはデルタ９位（カルボキシル末端から計算）に不飽和を有する不飽和脂肪酸である。上記位置の一方または両方にある不飽和は、他の位置にも不飽和を伴い得る。また、８〜３０個の炭素からなる炭素鎖を有する脂肪酸も使用し得るが、好適なのは、８〜２８個、または１２〜２４個、または１６〜１８個の炭素からなる炭素鎖を有する脂肪酸である。このような脂肪酸の例としては、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、モロクチン酸またはアラクチドン酸（ａｒａｃｔｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）が挙げられる。ある場合には、炭素−炭素二重結合がシス立体配置であり得、またある場合には、炭素−炭素二重結合がトランス立体配置であり得る。場合によっては、２個以上の炭素−炭素二重結合が存在し得る。共役リノール酸および他のいくつかの脂肪酸のように、１つ以上のシスおよび１つ以上のトランス炭素−炭素二重結合を有し得る適切な脂肪酸もあれば、すべての炭素−炭素二重結合をシス立体配置でまたはトランス立体配置で有し得る適切な脂肪酸もある。
【０１９６】
一実施形態では、１つ以上の脂肪酸を含有する化合物（「脂肪酸」）を、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の発酵プロセスの初期、中期または後期に培地に添加し得る。一実施形態では、脂肪酸化合物を発酵の１つ以上の接種段階の間に添加し得る。様々な実施形態において、脂肪酸化合物を、培地のクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）による接種の前、または接種後、または接種と同時に添加し得る。別の実施形態では、脂肪酸を最終発酵培地に添加してもよく、かつ培地のクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）による接種前、接種後また接種と同時に添加してもよい。いくつかの実施形態では、発酵の少なくとも一部の間に、複数回分としてまたは継続的に添加し得る。最も好ましくは、発酵内にアルコール、例えばエタノールが蓄積し始めた後に脂肪酸を添加し得る。一実施形態では、アルコール濃度が約２ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌの間に達したときに脂肪酸を添加する。別の実施形態では、アルコール濃度が約２ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの間に達したときに脂肪酸を添加する。別の実施形態では、アルコール濃度が約５ｇ／Ｌ〜４０ｇ／Ｌの間に達したときに脂肪酸を添加する。別の実施形態では、アルコール濃度が約１０ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌの間に達したときに脂肪酸を添加する。別の実施形態では、アルコール濃度が約２ｇ／Ｌに達したときに脂肪酸を添加する。別の実施形態では、アルコール濃度が約５ｇ／Ｌに達したときに脂肪酸を添加し得る。別の実施形態では、アルコール濃度が約１０ｇ／Ｌに達したときに脂肪酸を添加し得る。別の実施形態では、アルコール濃度が約１５ｇ／Ｌに達したときに脂肪酸を添加し得る。別の実施形態では、アルコール濃度が約２０ｇ／Ｌに達したときに脂肪酸を添加し得る。別の実施形態では、アルコール濃度が約２５ｇ／Ｌの間に達したときに脂肪酸を添加し得る。別の実施形態では、アルコール濃度が約３０ｇ／Ｌに達したときに脂肪酸を添加し得る。別の実施形態では、アルコール濃度が約３５ｇ／Ｌに達したときに脂肪酸を添加し得る。別の実施形態では、アルコール濃度が約４０ｇ／Ｌに達したときに脂肪酸を添加し得る。別の実施形態では、アルコール濃度が約４５ｇ／Ｌに達したときに脂肪酸を添加し得る。別の実施形態では、アルコール濃度が約５０ｇ／Ｌに達したときに脂肪酸を添加し得る。いくつかの実施形態では、脂肪酸を、１つ以上の培地成分と共に添加してもよく、または発酵中と同様に、発酵開始近くで補充してもよい。一実施形態ではアルコール濃度が２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１３ｇ／Ｌ、１４ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌ、１７ｇ／Ｌ、１８ｇ／Ｌ、１９ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２１ｇ／Ｌ、２２ｇ／Ｌ、２３ｇ／Ｌ、２４ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、２６ｇ／Ｌ、２７ｇ／Ｌ、２８ｇ／Ｌ、２９ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３１ｇ／Ｌ、３２ｇ／Ｌ、３３ｇ／Ｌ、３４ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、３６ｇ／Ｌ、３７ｇ／Ｌ、３８ｇ／Ｌ、３９ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４１ｇ／Ｌ、４２ｇ／Ｌ、４３ｇ／Ｌ、４４ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、４６ｇ／Ｌ、４７ｇ／Ｌ、４８ｇ／Ｌ、４９ｇ／Ｌまたは５０ｇ／Ｌであるときに脂肪酸を添加する。
【０１９７】
一実施形態では、脂肪酸をアルコール、例えばエタノール溶液として添加し得る。別の実施形態では、脂肪酸をコロイドとして添加し得る。別の実施形態では、脂肪酸を界面活性剤と共に添加し得る。
【０１９８】
添加する脂肪酸化合物の量は、脂肪酸化合物の形態（例えば、トリアシルグリセリドまたはリン脂質）および添加される特定の脂肪酸または脂肪酸の組合せ（例えば、オレイン酸またはパルミトレイン酸）により異なり得るが、適切な脂肪酸化合物の量は、遊離脂肪酸として報告される、約１ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌであり得る。期間を延長した稼動または大量のアルコール生産もしくは細胞増殖を伴う稼動を含めた、いくつかの実施形態では、脂肪酸レベルを約１ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌの範囲内に維持するか、または約１ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌの範囲で再利用し得るが、これは上清中に存在する遊離脂肪酸が細胞表面または基質もしくは設備などの固体表面に吸着されたものとして報告される。脂肪酸レベルを測定するための適切な技術は、脂肪酸含有化合物の脱離または可溶化を補助するための溶媒和補助剤を添加するかまたは添加せずに、上清の少なくとも一部をブロスから分離すること、および例えば、ガスクロマトグラフによる脂肪酸含有量の解析を含む。発酵がフェドバッチとして操作される場合、発酵槽に供給される培地成分と関連させるなどして、脂肪酸化合物を一度にすべて添加し得るか、またはそれを分割してもしくは継続的に添加し得る。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、微生物との制限された相互作用のみを有する形態で脂肪酸を供給し、次いで、微生物との相互作用の増大を可能にする化合物を添加することにより、脂肪酸が微生物により摂取される速度を修正する。分離相または微生物によって摂取されない相に存在する形態は、微生物との制限された相互作用を有する形態の例である。相互作用を増大させる化合物は、存在する脂肪酸形態を加水分解することができる化合物、例えばリパーゼ活性、ホスホリパーゼ活性を有する化合物、酸、塩基など、または脂肪酸を溶媒和させることができる化合物である。
【０２００】
酸性培養条件
別の態様では、本発明は、ｐＨが制御された条件下の培地におけるクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の培養を含む、アルコール、例えばエタノールの生産方法を提供する。一実施形態では、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の培養物を酸性ｐＨで増殖させ得る。培養物を増殖させる培地は、炭素源、例えば農作物、作物残渣、樹木、木片、おがくず、紙、ボール紙、あるいはセルロース、ヘミセルロース性物質、リグノセルロース、ペクチン、ポリグルコース、ポリフルクトースおよび／またはこれらの加水分解形態など（まとめて「供給原料」）を含み得る。硫黄含有および窒素含有化合物、例えばアミノ酸、タンパク質、加水分解タンパク質、アンモニア、尿素、硝酸、亜硝酸、大豆、大豆派生物、カゼイン、カゼイン誘導体、粉乳、乳派生物、乳清、酵母抽出物、加水分解酵母、自己消化酵母、コーンスティープリカー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）、コーンスティープソリッド（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｓｏｌｉｄ）、グルタミン酸ナトリウムおよび／またはその他の発酵窒素源、ビタミン、補助因子、および／または無機物の補充物などを含めた追加の栄養素が存在し得る。供給原料は、例えば２００８年２月２７日に出願された米国特許仮出願第６１／０３２０４８号または２００９年３月９日に出願された米国特許仮出願第６１／１５８，５８１号（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように前処理しても、しなくてもよい。微生物を増殖させて燃料または他の所望の化学製品などを生産するための手順および技術は、例えば組み込まれる米国特許仮出願第６１／０３２０４８号または２００９年３月９日に出願された米国特許仮出願第６１／１５８，５８１号（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）などに記載されている。
【０２０１】
一実施形態では、発酵の少なくとも一部の間は培地のｐＨを約７．２未満に制御する。好適な実施形態では、ｐＨを約ｐＨ３．０〜約７．１、または約ｐＨ４．５〜約７．１、または約ｐＨ５．０〜約６．３、または約ｐＨ５．５〜約６．３、または約ｐＨ６．０〜約６．５、または約ｐＨ５．５〜約６．９、または約ｐＨ６．２〜約６．７の範囲内に制御する。ｐＨはｐＨ調整剤の添加により制御し得る。この実施形態では、ｐＨ調整剤は、酸、塩基、緩衝剤、または存在する他の物質と反応して低ｐＨを上昇または低下させる働きのある物質であり得る。いくつかの実施形態では、２つ以上のｐＨ調整剤、例えば２つ以上の酸、２つ以上の塩基、１つ以上の酸と１つ以上の塩基、１つ以上の酸と１つ以上の緩衝剤、１つ以上の塩基と１つ以上の緩衝剤、または１つ以上の酸と１つ以上の塩基と１つ以上の緩衝剤などであり得る。２つ以上のｐＨ調整剤を使用する場合、これらは同じ時間または異なる時間に添加し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の酸と１つ以上の塩基を組み合わせて１つの緩衝剤を得てもよい。いくつかの実施形態では、炭素源または窒素源のような培地成分もｐＨ調整剤として働くことができ；適切な培地成分としては、高いもしくは低いｐＨのもの、または緩衝能を有するものが挙げられる。培地成分の例としては、酸または塩基で加水分解された、残留酸または塩基を有する植物多糖類、アンモニア繊維爆砕（ＡＦＥＸ）処理された、残留アンモニアを有する植物原料、乳酸、コーンスティープソリッド（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｓｏｌｉｄ）またはコーンスティープリカー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）が挙げられる。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、培地のクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）による接種前に、培地成分の一部としてｐＨ調整剤を添加し得る。他の実施形態では、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）による接種後に、ｐＨ調整剤を添加することもできる。いくつかの実施形態では、様々なｐＨ調整剤および／または他の培地成分および／または代謝産物によって接種発酵に十分な緩衝能を付加して、最終発酵段階中の適切なｐＨ制御をもたらし得る。他の場合には、最終発酵段階にのみｐＨ調整剤を添加し得る。さらに他の場合には、接種段階および最終段階の両方にｐＨ調整剤を添加し得る。一実施形態では、発酵を通じてｐＨを監視し、発酵内の変化に応じて調整する。一実施形態では、任意の発酵段階において、発酵のｐＨが約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５以上のｐＨ値で変化するたびにｐＨ調整剤を添加する。他の実施形態では、発酵のアルコール含有量が約０．５ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌまたは５．０ｇ／Ｌ以上になるたびにｐＨ調整剤を添加する。場合によっては、例えば、緩衝剤接種段階で使用し、最終発酵槽に塩基および／または酸を添加する、あるいはある時点では酸を使用し、別の時点では塩基使用するなどのように、発酵の異なる段階または時点で異なる種類のｐＨ調整剤を使用し得る。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、発酵を通じて一定のｐＨを使用し得る。いくつかの実施形態では、発酵をあるｐＨで開始し、次いで、発酵の過程でｐＨを低下させることが有利であり得る。ｐＨを低下させる実施形態では、ｐＨを段階的にまたはより緩やかに低下させ得る。ｐＨを低下させるのに適した時点としては、細胞増殖の遅滞期の間、細胞増殖の指数期の間、細胞増殖の静止期の間、細胞増殖の死滅期の間、または細胞増殖期の前もしくは間が挙げられる。いくつかの実施形態では、２つ以上の増殖期の間にｐＨを低下させ得る。いくつかの実施形態では、例えば約１０分以下の間にわたって生じる変化などにより、段階的にｐＨを低下させ得るが、いくつかの実施形態では、例えば約１０分〜約６時間以上などの間にわたって、より緩やかにｐＨを低下させることにより、有利な増殖を達成し得る。いくつかの実施形態では、ｐＨ低下のタイミングおよび／または量は、細胞数、生産されるアルコール、存在するアルコールまたはアルコール生産速度と関連させるなど、細胞の増殖条件と関連させ得る。いくつかの実施形態では、発酵の物理的または化学的特性、例えば粘度、培地組成、ガス生産、オフガス組成などと関連させてｐＨを低下させ得る。
【０２０４】
適切な緩衝剤の非限定的な例としては、一塩基性、二塩基性および三塩基性塩、これらの塩の混合物ならびに酸との混合物を含めたリン酸塩；様々な塩基形態、混合物および酸との混合物を含めたクエン酸塩；および炭酸塩が挙げられる。
【０２０５】
ｐＨ調整剤として使用し得る適切な酸および塩基としては、微生物と適合性のある任意の液体または気体の酸または塩基が挙げられる。例としては、アンモニア、水酸化アンモニウム、硫酸、乳酸、クエン酸、リン酸、水酸化ナトリウムおよびＨＣｌが挙げられる。ある場合には、酸および塩基の選択は、酸または塩基と発酵に使用する設備との適合性に影響され得る。ある場合には、ｐＨ低下または塩基消費のための酸の添加およびｐＨ上昇または酸消費のための塩基の添加の両方を同じ発酵において使用し得る。
【０２０６】
ｐＨ調整剤を添加するタイミングおよび量は、グラブサンプルもしくは液内ｐＨプローブなどによる、発酵槽の内容物のｐＨ測定値から決定し得るか、またはそれを他のパラメーター、例えば発酵時間、ガス生成、粘度、アルコール生産量、力価測定などに基づき決定し得る。いくつかの実施形態では、上記技術の組合せを使用し得る。
【０２０７】
一実施形態では、発酵のｐＨを中性ｐＨで開始し、次いで、アルコール生産が検出されたときに酸性ｐＨに低下させる。別の実施形態では、発酵のｐＨを酸性ｐＨで開始し、発酵が増殖の静止期に達するまで酸性ｐＨを維持する。
【０２０８】
脂肪酸培地成分および酸性培養条件
別の実施形態では、培地への脂肪酸含有化合物の添加と低ｐＨでの発酵の組合せを使用し得る。いくつかの実施形態では、遊離脂肪酸のような脂肪酸の添加は、脂肪酸化合物添加および発酵ｐＨ低下の両方の技術を遂行する。他の実施形態では、異なる化合物を添加して各技術を遂行する。例えば、培地に植物油を添加して脂肪酸を供給することができ、次いで、発酵中に無機酸または有機酸を添加して、上記のような適切なレベルまでｐＨを低下させることができる。発酵が低ｐＨでの操作および脂肪酸含有化合物の添加の両方を含む場合、各操作の種類それぞれに対する本明細書に記載の方法および技術を一緒に用い得る。いくつかの実施形態では、低ｐＨでの操作および脂肪酸含有化合物の存在は同時である。いくつかの実施形態では、脂肪酸含有化合物の存在が低ｐＨでの操作に先行し、いくつかの実施形態では、低ｐＨでの操作が脂肪酸含有化合物の添加に先行する。いくつかの実施形態では、低ｐＨでの操作および脂肪酸の存在はクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）による接種の前にある。いくつかの実施形態では、低ｐＨでの操作での操作がクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）による接種の前にあり、かつ脂肪酸の存在がクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）による接種の後または間に生じる。いくつかの実施形態では、脂肪酸の存在がクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）による接種の前にあり、かつ低ｐＨでの操作での操作がクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）による接種の後または間に生じる。他の実施形態では、低ｐＨでの操作および脂肪酸の存在はクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）による接種の後にある。いくつかの実施形態では、低ｐＨでの操作および脂肪酸の存在は発酵の他の段階にある。
【０２０９】
クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の遺伝子改変
別の態様では、本発明は、遺伝子改変クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の作出および使用による、１つ以上のアルコール、例えばエタノールのような燃料生産のための組成物および方法を提供する。本発明は特に、発酵の生化学的経路の調節、糖分解酵素の発現またはクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の発酵中の環境条件への耐性の増大を意図する。一実施形態では、目的とする経路、酵素またはタンパク質の１つ以上の遺伝子をコードする異種ポリヌクレオチドでクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）を形質転換する。別の実施形態では、目的とする経路、酵素またはタンパク質の１つ以上の遺伝子の複数コピーを産生するようにクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）を形質転換する。一実施形態では、ヘキソースの加水分解および／または発酵のための酵素をコードする１つ以上の遺伝子をコードする異種ポリヌクレオチドでクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）を形質転換し、形質転換されていないクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）に比べて増加した濃度、生産性レベルまたは収率でエタノールを生産する能力を前記クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）形質転換体に付与するのに十分なレベルで前記遺伝子が発現される。このようにして、エタノール生産速度の増大を達成し得る。
【０２１０】
別の実施形態では、多糖類糖化のための糖分解酵素をコードする１つ以上の遺伝子をコードする異種ポリヌクレオチドでクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）を形質転換し、形質転換されていないクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）に比べて増加した単糖、二糖またはオリゴ糖類の濃度、糖化速度または収率で多糖類を単糖、二糖またはオリゴ糖類に糖化する能力を、前記クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）形質転換体に付与するのに十分なレベルで前記遺伝子が発現される。宿主による糖分解酵素の生産、およびそれに続くその糖分解酵素の培地中への放出により、バイオマスまたは多糖類を発酵性単糖類およびオリゴ糖類に分解するのに必要な市販酵素の量が削減される。糖分解ＤＮＡは宿主に天然のものであり得るが、糖分解ＤＮＡは外来性、異種性であることの方が多い。有利な糖分解遺伝子としては、セルラーゼ、キシラナーゼおよびアミラーゼのような、セルロース分解性、キシラン分解性およびデンプン分解性酵素が挙げられる。糖分解酵素は少なくとも一部が宿主により分泌され得るか、または後の放出のためにそれが十分に細胞内に蓄積され得る。または後の放出のためにそれが十分に細胞内に蓄積され得る。有利には、細胞内に蓄積された耐熱性の酵素は、必要に応じて熱誘発性溶解により放出される。一部のものが分泌され、一部のものが蓄積される酵素の組合せが、異種ＤＮＡによりコードされ得る。
【０２１１】
他の改変を行って、本発明の組換え細菌のエタノール生産を増大させ得る。たとえば、宿主は、その発現産物が単糖および／またはオリゴ糖類の組換え宿主内への輸送に関与するタンパク質である、追加の異種ＤＮＡセグメントをさらに含み得る。同様に、解糖系由来の追加の遺伝子を宿主内に組み込み得る。このようにして、エタノール生産速度の増大を達成し得る。
【０２１２】
バイオ燃料（例えば、エタノール）の生産を向上させるために、転写調節因子、有機酸形成のための遺伝子、炭水化物輸送体遺伝子、胞子形成遺伝子、酵素補助因子の形成／再生に影響する遺伝子、エタノール耐性に影響する遺伝子、耐塩性に影響する遺伝子、増殖速度に影響する遺伝子、酸素耐性に影響する遺伝子、カタボライト抑制に影響する遺伝子、水素生産に影響する遺伝子、重金属に対する耐性に影響する遺伝子、酸に対する耐性に影響する遺伝子またはアルデヒドに対する耐性に影響する遺伝子の改変を行うことができる。
【０２１３】
本明細書に例示される方法に対して数多くの改変を行い得ることを、当業者は理解するであろう。例えば、様々なプロモーターを用いて、組換えクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）宿主における異種遺伝子の発現を駆動することができる。本開示を利用できる当業者は、この目的のために利用可能な様々プロモーターのいずれかを容易に選択し使用することができるであろう。同様に当業者は、慣例的に行われているように、高コピー数のプラスミドを使用することができる。別の実施形態では、所望の遺伝子の染色体組込みのための構築物を調製することができる。外来遺伝子の染色体組込みは、商業的プロセスにある種の限界があるプラスミド系の構築物を上回る、いくつかの利点を提供し得る。メタン生成遺伝子が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂの染色体に組み込まれており；Ｏｈｔａら（１９９１）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：８９３−９００を参照されたい。一般にこれは、（１）抗生物質耐性遺伝子上流の所望の遺伝子と（２）標的微生物由来の相同ＤＮＡフラグメントとを含むＤＮＡフラグメントの精製により行われる。このＤＮＡを連結してレプリコンのない環を形成し、形質転換に使用し得る。このようにして、目的遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような異種宿主に導入することができ、短いランダムフラグメントを単離してクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の中に連結し、相同組換えを促進することができる。
【０２１４】
バイオ燃料プラントおよびバイオ燃料生産プロセス：
バイオマスからの大規模エタノール生産
一般に、微生物細胞、特にＣ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）細胞を用いて、バイオマスから燃料用エタノールを大規模に生産するための基本的なアプローチは２つある。第一の方法では、最初に、高分子量炭水化物を含むバイオマス原料を低分子量炭水化物に加水分解し、次いで、微生物細胞を用いてこの低分子量炭水化物を発酵させてエタノールを生産する。第二の方法では、化学的および／または酵素的前処理を行わずにバイオマス原料そのものを発酵させる。第一の方法では、加水分解を、酸、例えばブレンステッド酸（例えば、硫酸または塩酸）、塩基、例えば水酸化ナトリウム、熱水処理、アンモニア繊維爆砕処理（「ＡＦＥＸ」）、石灰処理、酵素またはこれらの組合せを用いて行い得る。水素およびその他の発酵産物を必要に応じて捕捉して、精製し、または例えば燃焼により、処分し得る。例えば、水素ガスを燃やすか、またはプロセスでのエネルギー源として、例えば燃焼により、例えば蒸気ボイラーを運転するために使用し得る。バイオマスの加水分解および／または水蒸気処理により、例えば、バイオマスの空隙性および／または表面積を増加させて、セルロース原料がより微生物細胞に触れやすくすることができ、これにより、発酵速度および収率が増加し得る。リグニンの除去は、例えば、ボイラー運転のための可燃燃料を供給することができ、また、例えばバイオマスの空隙性および／または表面積を増加させて、多くの場合発酵速度および収率を増加させることもできる。一般に、以下に記載の実施形態いずれにおいても、培地中の炭水化物の初期濃度は２０ｍＭを超え、例えば、３０ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭを超えるか、または５００ｍＭをも超える。
【０２１５】
バイオマス処理プラントおよびバイオマスからの生成物生産のプロセス
一態様では、本発明は、高分子量炭水化物を含むバイオマス原料を加水分解するように設定された加水分解ユニットと、中にクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）細胞または別のＣ５／Ｃ６加水分解微生物を散布した培地を収容するように設定された発酵槽と、１つまたは複数の生成物ならびに付随する副生成物および副産物を単離するための１つ以上の生成物回収システム（単数または複数）とを含む、燃料プラントを特徴とする。
【０２１６】
別の態様では、本発明は、１つまたは複数の生成物を製造する方法を特徴とし、この方法は、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）細胞または別のＣ５／Ｃ６加水分解微生物と培地中へのバイオマス供給とを組み合わせること、ならびに段落［００６３］に記載のようなバイオ燃料、化学製品または発酵最終産物、例えばエタノール、プロパノール、水素、リグニン、テルペノイドなどを生産するのに十分な条件および時間でバイオマス原料を発酵させることを含む。
【０２１７】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のいずれかのプロセスにより製造される生成物を特徴とする。
【０２１８】
バイオマスからの大規模な化学製品生産
一般に、Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）または他のＣ５／Ｃ６加水分解微生物のような微生物を用いて、バイオマスから化学製品を大規模に生産するための基本的なアプローチは２つある。すべての方法において、バイオマスの種類およびその物理的発現（ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ）に応じて、プロセスの１つは、湿式または乾式粉砕により炭素質原料を粉砕し、原料のサイズを減らして表面積対体積比を増加させることを含み得る（物理的変形）。
【０２１９】
第一の方法では、最初に、高分子量炭水化物を含むバイオマス原料を加水分解して、その脱リグニンを行うかまたは非炭水化物化合物から炭水化物化合物を分離する。熱、化学的および／または酵素的処理の任意の組合せを用いて、加水分解原料を、液体および脱水されたストリームから分離し得るが、これは別々に処理して別々にしておくかまたは再混合しても、またはしなくてもよく、次いで、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）細胞または別のＣ５／Ｃ６加水分解微生物を用いて発酵させ、１つ以上の化学製品を生産する。第二の方法では、熱、化学的および／または酵素的前処理を行わずに、バイオマス原料そのものを発酵させる。第一の方法では、加水分解を、酸（例えば、硫酸または塩酸）、塩基（例えば、水酸化ナトリウム）、熱水処理、アンモニア繊維爆砕処理（「ＡＦＥＸ」）、石灰処理、酵素またはこれらの組合せを用いて行い得る。バイオマスの加水分解および／または水蒸気処理により、例えば、バイオマスの空隙性および／または表面積を増加させ得るが、これにより多くの場合、セルロース原料がＣ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のような任意のＣ５／Ｃ６加水分解微生物に曝されやすくなり、このことが発酵速度および収率を増加させ得る。バイオマスの加水分解および／または水蒸気処理は、例えば、分離または処理して発酵速度および収率を向上させるか、またはプロセスを進行させる動力を生産するために使用するか、またはさらなる処理を行ってもしくは行わずに製品として使用することができる、副生成物または副産物を生成し得る。リグニンの除去により、例えば、ボイラー運転のための可燃燃料を供給し得る。気体（例えば、水素およびＣＯ２）、液体（例えば、エタノールおよび有機酸）ならびに固体（例えば、リグニン）の発酵産物を必要に応じて捕捉して、精製し、または例えば、燃焼により処分し得る。例えば、水素ガスを燃やすか、またはプロセスでのエネルギー源として、例えば燃焼により、例えば蒸気ボイラーを運転するために使用し得る。発酵槽に存在する生成物をさらに処理して、例えば、エタノールを蒸留および精留に移して、濃縮エタノール混合物を生産し得るか、または固体を分離して、エネルギーをもたらすためにもしくは化学製品として使用し得る。発酵最終産物またはバイオ燃料の他の生産方法は、いずれかのおよびすべての記載されているプロセス、ならびにこれらの方法を経済的または機械的に効率化するために開発し得る追加のプロセスまたは代替プロセスを組み込み得ること、そしてこれらはすべてその内容全体が本発明の範囲内に組み込まれるものとすることが理解される。
【０２２０】
図８は、最初にバイオマスを、加水分解ユニット中、高い温度および圧力において酸で処理することにより、バイオマスから化学製品を生産する方法の例である。最初にバイオマスを、熱水または水蒸気の添加により加熱し得る。バイオマスは、気体の二酸化硫黄を水中に懸濁させたバイオマスの中を通気させることにより、または強酸、例えば硫酸、塩酸もしくは硝酸を、予熱／前蒸気処理／水添加を行うかもしくは行わずに添加することにより酸性化し得る。酸性化の間、ｐＨを低レベル、例えば約５未満に維持する。酸添加後に温度および圧力を上げ得る。酸性化ユニット中に既に存在する酸に加え、金属塩、例えば硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、塩化第二鉄、硫酸アルミニウム、塩化アルミニウム、硫酸マグネシウムまたはこれらの混合物などを任意に添加して、バイオマスの加水分解を補助し得る。酸含浸バイオマスを前処理ユニットの加水分解セクションに送り込む。水蒸気を前処理ユニットの加水分解部分に注入してバイオマスに直接当て、バイオマスを所望の温度まで加熱する。水蒸気添加後のバイオマスの温度は、例えば、約１３０℃〜２２０℃の間である。次いで、加水分解物を前処理ユニットのフラッシュタンク部分へ排出し、バイオマスを例えば、オリゴ糖類およびモノマー糖類へさらに加水分解する時間の間、タンク内に保持する。また、水蒸気爆砕を用いてバイオマスをさらに分解してもよい。あるいは、任意の高圧前処理プロセスのために、圧力ロックを通してバイオマスを放出させ得る。次いで、水添加を行うかまたは行わずに、例えば約１５％〜６０％の間の固体濃度で、加水分解物を前処理反応器から放出する。
【０２２１】
前処理後、バイオマスを、例えば逆流抽出装置、圧洗浄器、圧ろ器、加圧フィルター、スクリューコンベア抽出装置またはバキュームベルト抽出装置を用いて、例えば搾出により、または遠心分離により、またはろ過により、脱水および／または多量の水での洗浄を行って、酸性化された液体を除去し得る。酸性化された液体を、さらなる処理、例えばアルカリ（例えば、石灰）および／またはアンモニア（例えば、リン酸アンモニウム）の添加を行うかまたは行わずに、例えば前処理ユニットの酸性化部分で再利用するか、または発酵に添加するか、または他の使用／処理のために回収し得る。生成物は、酸性化された液体、例えばセッコウまたはリン酸アンモニウムの処理から生じ得る。前処理中に酵素または酵素の混合物を添加し、高分子量成分の加水分解において、例えば、セルロース、ヘミセルロース、ペクチンおよびデンプンの成分に対して活性なエンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）、ベータ−グルコシダーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リアーゼおよびエステラーゼを補助し得る。
【０２２２】
発酵槽に加水分解バイオマス、バイオマス前処理由来の任意の液体画分、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）細胞の活性種菌培養物、必要に応じて共発酵微生物、例えば酵母または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、および必要に応じてクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）または他の微生物の増殖を促進する栄養素を供給する。あるいは、それぞれが異なるクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）および／または他の微生物の菌株を含み、かつそれぞれが特定の物理的条件下で稼動するように、前処理バイオマスまたは液体画分を複数の発酵槽に分割し得る。温度を例えば、２５℃〜５０℃の間に維持しながら、ある期間、例えば約１５〜１５０時間の間、発酵を進ませる。発酵中に生産されるガスは、発酵層から一掃し、さらなる処理を行うかまたは行わずに、排出するか、回収するか、または燃やし、例えば、水素ガスを回収して、動力源として使用するかまたは副産物として精製し得る。
【０２２３】
発酵後、発酵槽の内容物を生成物回収に移す。生成物を抽出する、例えば、エタノールを蒸留および精留により回収する。
【０２２４】
前処理をしないバイオマスからの化学製品生産
図９は、バイオマスを発酵容器に投入することにより、バイオマスから化学製品を生産するための方法を図示している。バイオマスは、熱、水、酵素または酸／アルカリの添加を行うかまたは行わずに、一定期間浸漬させ得る。処理容器内の圧力は、大気圧以上に維持し得る。前処理期間の終わりに、中和のために酸またはアルカリを添加し得る。前処理期間の終わりに、または前処理の開始と同時に、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）細胞または別のＣ５／Ｃ６加水分解微生物の活性種菌培養物、および必要に応じて共発酵微生物、例えば酵母または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、および必要に応じてクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）または他の微生物の増殖を促進する栄養素を添加する。上記のように発酵を進ませる。発酵後、発酵槽の内容物を上記のように生成物回収に移す。
【０２２５】
化学製品生産の方法および／または特徴の任意の組合せを用いて、複合型の生産方法を作成し得る。本明細書に記載の任意の方法において、生成物を任意の段階で除去するか、添加するか、または組み合わせてよい。クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）を単独で、または１つ以上の他の微生物（例えば、酵母、真菌または他の細菌）と組み合わせて相乗的に使用し得る。単一のプラント内で異なる方法を用いて異なる生成物を生産し得る。
【０２２６】
別の態様では、本発明は、高分子量炭水化物を含むバイオマス原料を加水分解するように設定された加水分解ユニット、および培地を収容するように設定された発酵槽を含み、かつそこに散布されたクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）細胞を含む、燃料プラントを特徴とする。
【０２２７】
別の態様では、本発明は、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）細胞とリグノセルロース原料（および／または他のバイオマス原料）を培地中で混合することと、１つまたは複数の燃料、例えばエタノール、プロパノールおよび／または水素または別の化合物を生産するのに十分な条件および時間でリグノセルロース原料を発酵させることとを含む、１つまたは複数の燃料を製造する方法を特徴とする。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、本発明は、酸加水分解前処理を用いてバイオマスからエタノールおよび水素を生産するためのプロセスを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、酵素的加水分解前処理を用いてバイオマスからエタノールおよび水素を生産するためのプロセスを提供する。他の実施形態は、酵素的に前処理されていないバイオマスを用いて、バイオマスからエタノールおよび水素を生産するためのプロセスを提供する。さらに他の実施形態は、化学的または酵素的に前処理されていないが任意に水蒸気処理されたバイオマスを用いて、バイオマスからエタノールおよび水素を生産するためのプロセスを開示する。
【０２２９】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のいずれかのプロセスにより製造される生成物を特徴とする。
【実施例】
【０２３０】
以下の実施例は、特定の好適な実施形態および態様を説明するためのものであり、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０２３１】
実施例１．Ｑ微生物のバッチ発酵とフェドバッチ発酵の比較−供給培地成分のみ
実験条件：
３つの攪拌槽型反応器（ＳＴＲ）または発酵槽をフェドバッチ法で操作して、Ｑ微生物を用いたセロビオース発酵の実験を行った。第四のＳＴＲを対照としてバッチ法で操作した。操作がフェドバッチ法かバッチ法かに関係なく、すべてのＳＴＲはゼロ時間では３０ｇ／Ｌのセロビオース基質を含んでいた。試薬はすべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手し、試薬グレード以上のものであった。
【０２３２】
接種材料調製：
接種材料を作成するために、凍結培養物（−８０℃で保管）を用い、これを０．３％のセロビオースと共に４ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、８ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．６ｇ／Ｌのシステイン−ＨＣｌ、６ｇ／ＬのＡｍｂｒｅｘ６９５酵母抽出物（Ｓｅｎｓｉｅｎｔ、Ｊｕｎｅａｕ、ＷＩ）をＤＩ水中に含有する（液体体積約１０ｍｌ）１０ｍＬのチューブ内で、３５℃で４８時間嫌気的に繁殖させた。その後、接種材料を、２％（ｖ／ｖ）の種菌サイズを用いて１００ｍＬ血清中、３５℃で４８時間増殖させた。血清バイアルは、ＤＩ水中に２０ｇ／Ｌのセロビオース、１．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、２．１ｇ／Ｌの尿素、２ｇ／Ｌのシステイン−ＨＣｌ、１０ｇ／ＬのＭＯＰＳ緩衝剤、３ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム、１ｇ／ＬのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００１２５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含んでいた。一定分量の増殖した接種材料を、微生物汚染に関して顕微鏡下で調べ、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して発酵槽の接種用にバイオマスを濃縮した（総懸濁固体が約２〜４ｇ／Ｌになるまで）。同じ接種材料調製の手順をバッチおよびフェドバッチ発酵の両方に用いた。
【０２３３】
バッチ発酵（対照）：
５０ｇ／Ｌのセロビオース、１．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、２．１ｇ／Ｌの尿素、２ｇ／Ｌのシステイン−ＨＣｌ、１０ｇ／ＬのＭＯＰＳ緩衝剤、３ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム、１ｇ／ＬのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００１２５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２ＯをＤＩ水中に含有する培地を調製した。２ＮのＮａＯＨで培地のｐＨを７．５に調節し、培地３００ｍＬを５００ｍＬの各発酵槽に移した。容器の脱気（培地をほぼ室温にして、６００ミリバールの真空下で少なくとも５分間、次いで、上部空間の窒素パージを行って容器の圧力を上げて大気圧まで戻した）後、容器を１２１℃の温度および１５ｐｓｉ（約１０３ｋＰａ）で３０分間、オートクレーブにより滅菌した。オートクレーブした容器を室温まで冷却した時点で、それに６０ｍＬ滅菌シリンジを用いて１０％（ｖ／ｖ）接種材料（濃縮種菌体積／最終発酵体積）を接種した。ブロスを３５℃で１５１時間、１２５ｒｐｍで撹拌しながら培養した。
【０２３４】
発酵槽から毎日試料を抽出し、Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）ＨＰＸ−８７Ｈ排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）が装備されたＨＰＬＣおよびＲＩ検出器を用いて、セロビオース、乳酸、ギ酸、酢酸およびエタノールについて分析した。移動相として０．００５ＮのＨ２ＳＯ４を０．６ｍＬ／分で使用し、カラムを５５℃に維持した。
【０２３５】
フェドバッチ発酵：
３０ｇ／Ｌのセロビオース、１．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、２．１ｇ／Ｌの尿素、２ｇ／Ｌのシステイン−ＨＣｌ、１０ｇ／ＬのＭＯＰＳ緩衝剤、３ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム、１ｇ／ＬのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００１２５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２ＯをＤＩ水中に含有する培地を調製した。２ＮのＮａＯＨで培地のｐＨを７．５に調節した。３つの各５００ｍＬ発酵容器に培地（３００ｍＬ）を加えた。発酵槽をバッチ発酵と同じ方法で脱気し、次いで、１２１℃の温度および１５ｐｓｉ（約１０３ｋＰａ）で３０分間、オートクレーブした。オートクレーブした容器を室温まで冷却した時点で、それらに６０ｍＬ滅菌シリンジを用いて１０％（ｖ／ｖ）接種材料（濃縮種菌体積／最終発酵体積）を接種した。ブロスを３５℃で１８４時間、１２５ｒｐｍで撹拌しながら培養した。発酵槽の接種の２４、４８、７２、９６、１２０、１４４および１６８時間後に、２５０ｇ／Ｌのセロビオースと共に１．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、２．１ｇ／Ｌの尿素、２ｇ／Ｌのシステイン−ＨＣｌ、１０ｇ／ＬのＭＯＰＳ緩衝剤、３ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム、１ｇ／ＬのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００１２５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２ＯをＤＩ水中に含む新たな培地２５ｍＬをブロスに補充した。補充用培地は滅菌済みであった。
【０２３６】
発酵槽の監視
発酵槽から毎日試料を抽出し、Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）ＨＰＸ−８７Ｈ排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）が装備されたＨＰＬＣおよびＲＩ検出器を用いて、セロビオース、乳酸、ギ酸、酢酸およびエタノールについて分析した。移動相として０．００５ＮのＨ２ＳＯ４を０．６ｍＬ／分で使用し、カラムを５５℃に維持した。
【０２３７】
結果：
図１は、バッチ法で操作された対照発酵槽での発酵実行を通した基質（セロビオース）および生成物（エタノール）の濃度を示す。約３０時間後にブロス中のエタノール濃度がプラトーに達したことが、図により明らかである。対照発酵槽は６日間にわたって実行し続けたが、エタノール濃度の大きな増加はなかった。
【０２３８】
図２は、フェドバッチ法で操作された発酵槽での基質（セロビオース）および生成物（エタノール）のプロファイルを示す。表示の数値は３つの発酵の平均値である。図に示されるように、新たな栄養素および基質の供給に伴ってエタノール濃度が増加し続けた。フェドバッチ操作により達成された最大エタノール濃度は約１２ｇ／Ｌであったが、これはバッチ法で操作された対照発酵槽で得られた力価の２倍を超えている。
【０２３９】
表７に示すように、より高いエタノール力価に加え、フェドバッチプロセス（約２０〜３０ｇ／Ｌの炭素基質濃度）は、ｇ／ｇ発酵糖およびｇ／ｇ生産エタノールの両方の基準においてより高い生産性およびより低い酸生産ももたらした。使用された特定の培地および発酵条件により、この微生物で報告されているものよりも高い初期生産性（発酵の初期の間に約４ｇ／（Ｌ・日））が得られたことも重要である。
【０２４０】
【表７】
2012519500.tif 000015
【０２４１】
実施例２．不溶性炭素源によるフェドバッチ操作
微結晶性セルロースのような不溶性炭素源を用いてバッチおよびフェドバッチ発酵を行う。発酵培地は、最終生産培地にセロビオースを微結晶性セルロースの代わりに使用する以外は実施例１と同様に作成する。（最終発酵培地の代わりにまたはそれに加えて、１つ以上の他の発酵または接種段階で微結晶性セルロースをセロビオースの代わりに使用する。）微結晶性セルロース使用の結果は、傾向的にセロビオース使用と同様であり、フェドバッチ操作におけるエタノールの収率および生産性はバッチ操作に比べて高い。同様に、フェドバッチ操作ではバッチ操作に比べて、糖からエタノールへのより高い変換（ｇエタノール／ｇ発酵糖）および糖から酸へのより低い変換（ｇ酸／ｇ発酵糖およびｇ酸／ｇエタノール）が生じた。より複雑な不溶性炭素源、例えば粉砕木材、粉砕植物性物質、または前処理粉砕木材または前処理粉砕植物性物質などを用いて、およびセルロース、リグノセルロースもしくはヘミセルロース原料、または廃水流を用いて、傾向的に同様の結果が得られる。しかし、エタノールまたは他の目的生成物生産の絶対速度は、少なくとも部分的には、より複雑な基質中に追加の栄養素または阻害物質が存在することを理由として、セロビオースの結果よりも高いかまたは低いかのいずれかで変動する。
【０２４２】
実施例３．細胞増加によるフェドバッチ操作
発酵過程で新たな細胞をブロスに添加してフェドバッチ発酵を行う。実施例１と同様にして発酵培地を調製し、接種する。２４時間間隔で、新たな接種材料（２〜３％ｖ／ｖ）を発酵に添加し、ブロス試料を実施例１と同様にして分析する。約２〜４日後にブロスを回収する。回収時、ブロスのエタノール含有量は約６ｇ／ｌよりも多く、このことは、バッチ操作を上回る実質的な増加を示し、また生産性の増加も示している。
【０２４３】
同様の結果が、実施例２の不溶性で複雑な炭素源ベースの培地で見られる。約１００ｇ／Ｌ以下、場合によってはそれを超えるような、より高濃度の炭素基質が存在する状況においては、新たな細胞による発酵ブロスの増強も使用する。
【０２４４】
実施例４．細胞増加と培地添加の組合せによるフェドバッチ操作
発酵過程で新たな細胞および新たな培地成分をブロスに添加するフェドバッチ発酵も行う。発酵培地は実施例１に記載の通りに調製および接種し得る。２４時間間隔で、新たな接種材料（２〜３％ｖ／ｖ）および実施例１と同じ培地を発酵に添加する。ブロス試料を実施例１と同様にして分析する。約２〜４日後にブロスを回収する。回収時、エタノールの収率および生産性は、細胞増加を行わないフェドバッチ発酵よりも高い。同様に、細胞増加を行わないフェドバッチに比べて、向上した炭素利用（ｇエタノール／ｇ発酵糖）および減少した酸生産（ｇ酸／ｇエタノールおよびｇ酸／ｇ発酵糖）が示される。
【０２４５】
同様の結果が、実施例２の不溶性で複雑な炭素源ベースの培地で見られる。
【０２４６】
実施例５．酵母抽出物が存在するフェドバッチ発酵
５ｇ／Ｌのセロビオース、１．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、４．６ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、２ｇ／Ｌのシステイン−ＨＣｌ、３ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム、１ｇ／ＬのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００１２５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび諸レベルの酵母抽出物（Ｂａｃｔｏ（商標），Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）（１０、１５、２０および３０ｇ／Ｌ）を含有する３００ｍＬの培地をそれぞれが有する４つの攪拌槽型反応器（ＳＴＲ）を使用した。Ｂａｃｔｏ酵母抽出物の分析を表８に記載する。すべてのＳＴＲは、３５℃、１２５ｒｐｍでインキュベートし、２４時間ごとに追加のセロビオースを添加（２５ｍｌの２００ｇ／ｌ溶液）するフェドバッチとして操作した。発酵過程を通してエタノール生産を監視した。表９は、これらの実験から得られたエタノール濃度を示す。
【０２４７】
【表８】
2012519500.tif 000016
【０２４８】
【表９】
2012519500.tif 000017
【０２４９】
１８時間における異なる培地組成での体積生産性は、１０、１５、２０および３０ｇ／Ｌの酵母抽出物培地に対して、それぞれ２．００、２．６９、２．４８、３．２０ｇ／（Ｌ・日）であった。
【０２５０】
これらの結果は、酵母抽出物量の増加に伴うエタノール力価および全生産性の増加を示し、かつ約１５ｇ／Ｌ以下のエタノール生産および約１０ｇ／（Ｌ・日）を超える瞬間生産性を示している。
【０２５１】
実施例６．異なる植物油補充物を用いたＣ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）によるエタノール生産
クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）培養物を、セロビオース培地において撹拌しながらエタノール生産が停止するまで培養することにより、発酵中の脂肪酸補充のエタノール生産に対する効果を評価した。１０ｍＬの新たに増殖させた接種材料を含む新たな培地を２ｇ／Ｌの植物油を組み合わせた。エタノール生産をさらに１００時間監視した。
【０２５２】
使用した試薬：
植物油を除くすべての化学製品は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の少なくとも試薬グレードのものであった。植物油は、Ｗａｌ−Ｍａｒｔ（Ｂｅｎｔｏｎｖｉｌｌｅ，ＡＲ）により販売されているＧｒｅａｔ  Ｖａｌｕｅブランドの油であった。
【０２５３】
脱気および滅菌手順：
接種材料の繁殖に使用された反応器および血清バイアルはすべて、窒素パージ下、真空下で脱気した。最小限の３つの脱気サイクルを行った。容器は、１２１℃の温度および１５ＰＳＩ（約１０３ｋＰａ）の圧力で３０分間オートクレーブすることにより滅菌した。
【０２５４】
接種材料調製：
凍結培養物（−８０℃で保管）を、０．３％のセロビオースと共に１．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、４．６ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、２ｇ／Ｌのシステイン−ＨＣｌ、１ｇ／ＬのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００１２５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２ＯをＤＩ水中に含有する１０ｍＬチューブ内で、３５℃で４８時間繁殖させた。２ＮのＮａＯＨで培地のｐＨを７．５に調節した。オートクレーブ後、接種材料を、２％（ｖ／ｖ）の種菌サイズを用いて１００ｍＬ血清中、３５℃で２４時間増殖させた。血清バイアルは、２０ｇ／Ｌのセロビオース、１．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、４．６ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、２ｇ／Ｌのシステイン−ＨＣｌ、３ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム、１ｇ／ＬのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００１２５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２ＯをＤＩ水中に含有していた。接種材料を、発酵槽用の接種材料として使用する前に、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細胞を濃縮した（約２〜４ｇ／Ｌの総懸濁固体）。
【０２５５】
最終発酵−異なる油によるスクリーニング実験：
５つの攪拌槽型反応器を、２０ｇ／Ｌのセロビオース、１．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、４．６ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、２ｇ／Ｌのシステイン−ＨＣｌ、３ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム、１ｇ／ＬのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００１２５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、６ｇ／Ｌの酵母抽出物（Ｂａｃｔｏ）を含有する培地５０ｍＬで満たした。各反応器に１つの血清バイアルからの濃縮細胞を接種した。エタノール生産が停止するまで発酵槽をバッチ法で操作した。各反応器のエタノール濃度を表１０に示す。この時点での培地中の残存セロビオースは約１５〜２０ｇ／Ｌであった。次いで、新たに増殖させた接種材料約１０ｍＬおよび表１０に示す植物油２ｇ／Ｌを反応器に補充した。発酵をさらに１００時間続けた。最終エタノール濃度を表１０に示す。補充後の期間を通したエタノール濃度を図４および表１１に示す。
【０２５６】
【表１０】
2012519500.tif 000018
【０２５７】
【表１１】
2012519500.tif 000019
【０２５８】
結果
コーン油、ダイズ油、カノーラ油、ヤシ油およびオリーブ油の発酵への添加はすべて、さらなるエタノール生産をもたらした。さらに、最も多いエタノール増加は、高オレイン酸油（表１４に示されるオリーブ、カノーラ、ダイズおよびコーン油）の補充により得られ、リノール酸含有も収率増加の一因であった。
【０２５９】
実施例７．低ｐＨでのクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）によるエタノール生産
バイオリアクターは、２０ｇ／Ｌのセロビオース、１．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、４．６ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、２ｇ／Ｌのシステイン−ＨＣｌ、３ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム、１ｇ／ＬのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００１２５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、６ｇ／Ｌの酵母抽出物（Ｂａｃｔｏ）を含有する培地３００ｍＬを含んでいた。２００ｇ／Ｌのセロビオースを含有する濃縮培地を１．４ｍＬ／時で継続的に供給することにより、発酵槽をフェドバッチ法で操作した。バイオリアクターはそれぞれ、７．５、７および６．５の調節されたｐＨで操作した。
【０２６０】
発酵を通して発酵槽をエタノール濃度に関して監視した。結果を表１２および図５に示す。結果は、ｐＨ７．５未満での発酵により、エタノール濃度の増加およびエタノール生産性の増加が得られることを示している。
【０２６１】
【表１２】
2012519500.tif 000020
【０２６２】
実施例８．カノーラ油の存在下での低ｐＨ
反応器は、５０ｇ／Ｌのセロビオース、３ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．６ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／Ｌのクエン酸三ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．２ｇ／Ｌのクエン酸・Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．８ｇ／ＬのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００１２５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ＬのシステインＨＣｌ、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物（Ｂａｃｔｏ）と共に５ｇ／Ｌのコーンスティープパウダー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｐｏｗｄｅｒ）をＤＩ水に溶解させて含有する培地３００ｍＬを含んでいた。発酵槽をバッチ法で操作した。
【０２６３】
発酵槽をエタノール濃度に関して監視した。結果を表１３に示す。カノーラ油の存在下で低ｐＨでの操作により、より高いエタノール濃度および生産が得られ、同様にｐＨ７．０での操作に比べて向上した力価および生産性がｐＨ６．５での操作で得られた（図６）。
【０２６４】
【表１３】
2012519500.tif 000021
【０２６５】
【表１４】
2012519500.tif 000022
【０２６６】
実施例１０．エタノール、その他のバイオ燃料および化学製品の生産を増加させるためのクロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の遺伝子改変
Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）での使用に適したプラスミドを、細菌培養コレクションから入手したプラスミドの一部を用いて構築した。プラスミドＰｉｍｐ１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および様々なグラム陽性細菌種内で複製可能な非結合性プラスミドであり、またそれはエリスロマイシンに対する耐性もコードする。Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）はエリスロマイシンに対して非常に感受性が高く、微生物増殖培地１ｍｌ当たり０．５マイクログラムのエリスロマイシン濃度で増殖することができない。宿主範囲の広い接合性プラスミドＲＫ２は、細菌接合システムに必要な遺伝子をすべて含み、このような遺伝子には、接合システムのＤＮＡポリメラーゼに特異的な複製起点、接合ＤＮＡ複製遺伝子、および潜在的な受容菌細胞の認識を可能にし、一本鎖プラスミドＤＮＡを細胞間の接触により供与細胞から受容細胞へ転移するための導管として働く線毛の合成をコードする遺伝子が含まれる。ＲＫ２接合システムのための転移起点は、Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（（ＤＳＭＺ）からＤＳＭ３９２８として得たプラスミドＰｒｋ２９０から入手し、ＲＫ２の他の接合機能は、ＤＳＭＺからＤＳＭ５５９９として得たＰｒｋ２０１３から入手した。ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、１１２塩基対の転移起点領域（ｏｒｉＴ）を、ｏｒｉＴ領域に隣接するＣｌａ１制限部位を付加するプライマーを使用してＰｒｋ２９０から複製した（７５）。このＤＮＡフラグメントをｐＩＭＰ１のＣｌａ１部位内に挿入して、プラスミドＰｉｍｐｔを得た。Ｐｉｍｐｔは、他の接合機能を補うＰｒｋ２０１３も存在する場合に、１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株から別の株へ転移可能であることが示された。しかし、Ｐｉｍｐｔが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からＣ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）へ接合により転移されることを示すことができなかった。Ｐｉｍｐｔ内のエリスロマイシン耐性遺伝子の発現を駆動するプロモーターがＣ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）内で機能しない可能性があったので、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子であるＣ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）１０２９のプロモーターを、ＰＣＲを用いてＣ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）染色体から増幅し、これを用いてＰｉｍｐｔ内のエリスロマイシン遺伝子のプロモーターと置き換え、Ｐｉｍｐｔ１０２９を作製した。他の接合機能を補うＰｒｋ２０１３も存在する場合に、Ｐｉｍｐｔ１０２９は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からＣ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）へ接合により転移させることができた。Ｐｉｍｐｔ１０２９を含むＣ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）派生体の、１ｍｌ当たり１０マイクログラム以下のエリスロマイシンを含有する培地で増殖する能力により、およびプラスミドを含まない対照Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）培養物からではなく、Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）派生体からＰｉｍｐｔ１０２９に特異的な２つの遺伝子領域を特異的に増幅するＰＣＲプライマーの使用により、Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）内へのプラスミドＤＮＡが良好に転移されることが示された。
【０２６７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からＣ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）へのＰｉｍｐｔ１０２９の接合転移は、最初に、Ｐｉｍｐｔ１０２９およびＰｒｋ２０ｌ３の両方を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ＤＨ５アルファ）を構築することにより行う。次いで、適当な増殖培地（それぞれ、ＬブロスおよびＱＭ１培地）を用いて対数中期まで増殖させることにより、この大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物の新たな細胞およびＣ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）受容培養物の新たな細胞を得る。次いで、この２つの細菌培養物を遠心分離して細胞ペレットを得、このペレットを同じ培地中に再懸濁させて、約１０倍に濃縮され１ｍｌ当たり約１０１０個の細胞密度を有する細胞懸濁液を得る。次いで、供与体対受容体比が５対１になるように、これらの濃縮細胞懸濁液を混合する。この後に、細胞懸濁液をＱＭ１寒天プレート上にスポットし、３０℃で２４時間、嫌気的にインキュベートした。細胞混合物をＱＭ１プレートから取り出し、エリスロマイシン耐性を発現するＣ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）受容細胞のみが生存できるように選択した抗生物質を含有する固体または液体のＱＭ１倍地に置いた。これは、１ｍｌ当たり２０マイクログラムのトリメトプリム、１ｍｌ当たり２５０マイクログラムのシクロセリンおよび１ｍｌ当たり１０マイクログラムのエリスロマイシンからなる抗生物質の組合せを用いて行った。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）供与体は、上記濃度のトリメトプリムおよびシクロセリンへの曝露を生き延びることができなかったのに対し、Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）受容体は、上記濃度のエリスロマイシンへの曝露を生き延びることができなかった（しかし、この濃度のトリメトプリムおよびシクロセリンには耐えることができた）。したがって、上記抗生物質を含有するプレートまたは液体培地で５〜７日間、嫌気性条件下、３０℃でインキュベーションした後に、エリスロマイシン耐性であるＣ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）派生体を入手し、次いでこの派生体は、ＰＣＲ解析により示されるように、Ｐｉｍｐｔ１０２９を含むことが示された。
【０２６８】
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のＣ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）プロモーターを含むエリスロマイシン耐性遺伝子の特別に構築した派生物のみを、Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）において機能的に発現させることができたのは、驚くべき結果であった。
【０２６９】
Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）由来または異種の源由来のいずれかの他の目的遺伝子をＰｉｍｐｔ構築物内に導入してＣ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の形質転換に使用するため、これらの遺伝子産物は、Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の、糖分解酵素、ヘキソース輸送タンパク質ならびに発酵中間体からアルコール最終産物および他のバイオ燃料への変換に利用されるヘキソース代謝および酵素の生産を増加させるのに有用である。プラスミドＰｉｍｐｔ１０２９の地図を図７に示す。
【０２７０】
本明細書に引用されるすべての参照物には、特に限定されないが、発表済みまたは未発表の特許出願、特許および参考文献が含まれ、また特に限定されないが、付属書類に掲載されている参照物も含まれるが、これらはすべてその内容全体が参照により本明細書に組み込まれ、ここにおいて本明細書の一部とされる。参照により組み込まれる刊行物および特許または特許出願が、本明細書に含まれる開示と矛盾する限りにおいては、上記のどの矛盾する資料に対しても本明細書が優先するおよび／または上位にあるものとする。
【０２７１】
本明細書で使用される「含む、含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「含有する、含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同義であり、かつ包括的または無制限であり、また追加の列挙されていない要素または方法段階を排除しない。
【０２７２】
本明細書で使用される成分量、反応条件などを表す数値はすべて、あらゆる場合において「約」という用語により修飾されるものと理解するべきである。したがって、そうでないと明示されない限り、本明細書に記載の数値パラメーターは、得ようとする所望の特性によって変動し得る近似値である。少なくとも、そして本願に対する優先権を主張する任意の出願における任意の特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限する試みとしてではなく、各数値パラメーターは、有効数字および通常の丸めの手法を考慮して解釈されるべきである。
【０２７３】
本発明の好適な実施形態が本明細書に示され、記載されているが、このような実施形態は単なる例として提供されることが、当業者には明らかであろう。これから当業者は、本発明を逸脱することなく数多くの変更、改変および代替を考え付くであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替手段が、本発明の実施において使用され得ることを理解するべきである。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであること、ならびにこれら特許請求の範囲およびその均等物内の方法および構造が特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図７】
2012519500.tif 000023
【図１】
2012519500.tif 000024
【図２】
2012519500.tif 000025
【図３】
2012519500.tif 000026
【図４】
2012519500.tif 000027
【図５】
2012519500.tif 000028
【図６】
2012519500.tif 000029
【図８】
2012519500.tif 000030
【図９】
2012519500.tif 000031
【国際調査報告】
2012519500.tif 000032