(57)【要約】  本発明は、一般に、ビフィズス菌の分野に関する。特に、本発明は、向上した酸化ストレス耐性を有するビフィズス菌の分野に関する。本発明者らは、例えば向上したＨ２Ｏ２耐性を示すビフィズス菌を同定した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２９１６。
【請求項２】
請求項１に記載のビフィズス菌を含む組成物。
【請求項３】
食品、動物性食品又は医薬組成物であることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
少なくとも１つのプレバイオティクスをさらに含有することを特徴とする、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
プレバイオティクスが、オリゴ糖からなる群から選択され、フルクトース、ガラクトース、マンノース、大豆及び／又はイヌリン、及び／又は食物繊維を含有してもよいことを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
１日用量当たり１０３〜１０１０ｃｆｕ及び／又は１０３〜１０１０細胞のビフィズス菌ＮＣＣ２９１６を含むことを特徴とする、請求項２〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
食品組成物の乾燥重量１ｇ当たり１０３〜１０１２ｃｆｕ及び／又は１０３〜１０１２細胞のビフィズス菌ＮＣＣ２９１６を含むことを特徴とする、請求項２〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１に記載のビフィズス菌、又は請求項２〜７のいずれか一項に記載の組成物の、製品中のプロバイオティクス生菌の数を増加させるための使用。
【請求項９】
プロバイオティクス細菌に対するストレスへの曝露後に、製品中のプロバイオティクス細菌の数を増加させるための請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ストレスが、濃度２００ｐｐｍの酸化種への３０秒〜２時間の曝露である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
酸化種が、Ｈ２Ｏ２、・Ｏ２−、・ＯＨ、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、一般に、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）の分野に関する。特に、本発明は、向上したＨ２Ｏ２耐性を有するビフィズス菌の分野に関する。
【０００２】
プロバイオティクス細菌はそれらの健康促進特性のため選択される。プロバイオティクスは、生きた細菌としての有益性を発揮する（Ｇｕａｎｅｒ，  Ｆ．  ａｎｄ  Ｇ．  Ｊ．  Ｓｃｈａａｆｓｍａ．  １９９８．  ”Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ”．  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３９：２３７−２３８）ので、この細菌は胃腸管の条件下で生存すべきである。産業上の利用において、大量生産するには、食品の加工及び保存に耐える、プロバイオティクスのさらなる能力が必要である。こうした生産段階は、細菌の良好な生存を危うくする種々のストレスによって特徴付けられる。こうしたストレスのうち、高温又は低温、高浸透圧、酸化、及び湿度が重要な要因であると考えられる。
【０００３】
いくつかの種のプロバイオティクス細菌は、温度、酸素、又は噴霧乾燥に対する耐性が低いことが特に知られている。ストレス耐性の低いこのようなプロバイオティクスの顕著な例は、例えばビフィズス菌、特にビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）である（Ｓｉｍｐｓｏｎ，  Ｐ．  Ｊ．，  Ｃ．  Ｓｔａｎｔｏｎ，  Ｇ．  Ｆ．  Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｐ．  Ｒｏｓｓ．  ２００５．  ”Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｔｏ  ｈｅａｔ  ａｎｄ  ｏｘｙｇｅｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｓｐｒａｙ  ｄｒｙｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔｏｒａｇｅ”．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９９：４９３−５０１）。
【０００４】
特にビフィズス菌の嫌気的性質のために、大量生産を容易にするように発酵条件をカスタマイズする必要が生じ、加工及び保存中に細胞の生存を保つさらなる取組みが通常必要となる。
【０００５】
耐酸素性は、細菌界全体を見ると、極めて多様である。好気性細菌は、活性酸素種（ＲＯＳ）が引き起こす損傷に対して自らを保護する、精巧な防御系を進化させてきた。しかしながら、このような細菌に対しても、その防御系に障害が生じれば、酸素が毒性をもつ恐れがある。主に３種類の異なる活性酸素種（ＲＯＳ）が形成でき、酸素が受け取る電子が１個か、２個か、又は３個かによって、それぞれが（ｉ）スーパーオキシドラジカル（Ｏ２−）、（ｉｉ）過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、又は（ｉｉｉ）ヒドロキシラジカル（・ＯＨ・）を形成する（Ｉｍｌａｙ，  Ｊ．  Ａ．，  ２００２，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ  ４６  ４６：１１１−１５３）。Ｈ２Ｏ２は、ＤＮＡ損傷及びタンパク質の酸化を引き起こす。このＲＯＳを除去するために、細菌は、カタラーゼ、ＮＡＤＨペルオキシダーゼ、及びリダクターゼを含むいくつかの酵素を用いることができる。
【０００６】
この問題に対処し、食品製造中のプロバイオティクスの生存率を増加させるために、マイクロカプセル化、保護剤の添加、酸素不透過性包装、及び増殖又は加工条件の改良を含むいくつかのアプローチが現在使用されている。
【０００７】
しかしながら、これらのアプローチは、実行するには複雑で労力を要し、また、副作用を有する可能性があって、最終的な食品において不要となる可能性があるさらなる化合物の添加を必要とすることが多い。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、従来技術の問題を克服し、当技術分野に、向上した酸化ストレス耐性及び／又は向上した耐酸素性を示すプロバイオティクスビフィズス菌、並びに組成物中のプロバイオティクスの生菌数を増加させる方法を提供することであった。
【０００９】
本発明のこの目的は、請求項１に記載のビフィズス菌、請求項２に記載の組成物、及び請求項８に記載の使用により解決される。
【００１０】
本発明者らは、自然選択の方法を適用し、例えばＨ２Ｏ２などの活性酸素種に向けて増強した耐性を有するビフィズス菌株を探求した。
【００１１】
１つの典型的なプロバイオティクス細菌はビフィドバクテリウム・ロンガムである。
【００１２】
本発明者らは、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２９１６を同定、単離することができ、それにより本発明の目的を達成することができた。自然選択によって得た、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５の派生株であるビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２９１６は、驚くことに、従来技術のビフィズス菌に比べ向上した耐酸素性を示している。自然選択により得られた菌株は、遺伝子技術によって改変されることなく本発明の目的を解決するという利点を有する。
【００１３】
特にＢ．ロンガムＮＣＣ２９１６株は、向上したＨ２Ｏ２耐性を示す。
【００１４】
したがって、本発明の一実施形態はビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２９１６である。
【００１５】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２９１６は、ブタペスト条約の下、ＣＮＣＭ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，  ２５；  Ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ；  Ｆ−７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５）にＣＮＣＭ  Ｉ−４０５３として寄託された。
【００１６】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５は、ブタペスト条約の下、ＣＮＣＭ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，  ２５；  Ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ；  Ｆ−７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５）にＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８として寄託された。
【００１７】
本発明はまた、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２９１６を含む組成物にも関する。
【００１８】
本発明の目的では、組成物は、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２９１６細胞（生細胞又は非複製性細胞）、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２９１６の任意の細菌画分、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２９１６を含む培養物の任意の画分、及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２９１６の培養に使用した培地若しくはその一部を含有していれば、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２９１６を含有しているとみなす。
【００１９】
プロバイオティクスビフィズス菌は、投与されると、宿主に対して健康上の利益を与える。ビフィズス菌の健康上の利益は多種多様であり、消化の補助、アレルギー発生率低下との関連、ある種の腫瘍増殖の予防、及び体重管理を含む。本発明の組成物及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２９１６は、したがって、こうした健康上の利益を対象に与えるために使用することができる。
【００２０】
本発明の組成物は、任意の組成物とすることができるが、好ましくは食品、動物性食品又は医薬組成物である。例えば、組成物は、栄養組成物、機能性食品、飲料、食品添加物又は薬物であってもよい。
【００２１】
好ましくは、組成物はヒト、ペット又は家畜用であり、またペット又は家畜は、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ及び／又は家禽からなる群から選択することができる。
【００２２】
組成物は、少なくとも１つの炭水化物源、少なくとも１つの脂質源及び／又は少なくとも１つのタンパク質源を含むことができる。
【００２３】
タンパク質源として、任意の適当な食物タンパク質、例えば動物性タンパク質（乳タンパク質、食肉タンパク質及び卵タンパク質など）、植物性タンパク質（大豆タンパク質、小麦タンパク質、米タンパク質、及びエンドウ豆タンパク質など）、遊離アミノ酸の混合物、又はそれらの組合せを使用することができる。カゼイン及び乳清などの乳タンパク質、及び大豆タンパク質は特に好ましい。タンパク質は、未処理であってもよく、又は加水分解されていてもよく、又は未処理のタンパク質及び加水分解されたタンパク質の混合物であってもよい。例えば、牛乳アレルギーを発症するリスクがあると考えられる動物には、部分的に加水分解されたタンパク質（加水分解度２〜２０％）を供給することが望ましい。加水分解されたタンパク質が必要とされる場合、加水分解プロセスは、所望の通り、また当技術分野において知られているように行うことができる。例えば、乳清タンパク質加水分解物は、１つ又は複数のステップにおいて乳清画分を酵素的に加水分解することによって調製することができる。出発物質として使用される乳清画分が実質的にラクトースを含まない場合、加水分解プロセス中にタンパク質が受けるリシン遮断がはるかに少ないことが分かる。このことは、リシン遮断の程度を全リシンの約１５重量％からリシンの約１０重量％未満まで、例えばタンパク質源の栄養価を大幅に向上させるリシンの約７重量％まで、低下させることを可能にする。
【００２４】
組成物が脂肪源を含む場合、脂肪源は、好ましくは組成物のエネルギーの５〜４０％、例えばエネルギーの２０〜３０％を供給する。適当な脂肪プロフィールは、キャノーラ油、トウモロコシ油及び高オレイン酸ヒマワリ油のブレンドを使用して得ることができる。
【００２５】
炭水化物源は、好ましくは組成物のエネルギーの４０〜８０％を供給する。任意の適当な炭水化物、例えば、スクロース、ラクトース、グルコース、フルクトース、コーンシロップ固形物、マルトデキストリン、及びこれらの混合物を使用することができる。
【００２６】
所望であれば、食物繊維を添加することもできる。食物繊維は、酵素によって消化されずに小腸を通過し、天然の膨張性薬剤及び下剤として機能する。食物繊維は、可溶性又は不溶性であってもよく、一般に２種類のブレンドが好ましい。適当な食物繊維源は、大豆、エンドウ豆、オート麦、ペクチン、グアーガム、アラビアゴム、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、シアリルラクトース及び動物乳由来のオリゴ糖を含む。好ましい繊維ブレンドは、イヌリン及び短鎖フラクトオリゴ糖の混合物である。好ましくは、繊維が存在する場合、繊維含量は、摂取される組成物１ｌ当たり２〜４０ｇ、より好ましくは４〜１０ｇ／ｌである。
【００２７】
組成物はまた、ＵＳＲＤＡなどの政府機関の勧告に従って、ミネラル並びに微量元素及びビタミンなどの微量栄養素を含有してもよい。
【００２８】
例えば、組成物は、以下の微量栄養素の１つ又は複数を１日用量当たり含有してもよい：カルシウム、マグネシウム、リン、鉄、亜鉛、銅、ヨウ素、セレン、ビタミンＣ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ６、ビタミンＢ２、ナイアシン、ビタミンＢ１２、葉酸、ビオチン、ビタミンＤ、ビタミンＥ。
【００２９】
１つ又は複数の食品等級の乳化剤、例えばモノ−及びジ−グリセリドのジアセチル酒石酸エステル、レシチン並びにモノ−及びジ−グリセリドを、所望であれば組成物中に組み込むことができる。同様に、適当な塩及び安定剤を含めることもできる。
【００３０】
組成物は、経口、非経口又は局所投与用であってもよい。経口適用は、本発明の目的では腸内投与を含む。
【００３１】
組成物は、少なくとも１つの他の種類の他の食品等級の細菌を含んでもよい。「食品等級の細菌」とは、食品に使用しても安全であるとして使用され、一般にみなされている細菌を意味する。食品等級の細菌は、乳酸菌及び／又はビフィズス菌からなる群から選択することができる。好ましくはプロバイオティクス細菌である。「プロバイオティクス細菌」とは、宿主の健康又は福祉に有益な効果を有する微生物細胞製剤又は微生物細胞成分を意味する（Ｓａｌｍｉｎｅｎ  Ｓ，  Ｏｕｗｅｈａｎｄ  Ａ．  Ｂｅｎｎｏ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ  ”Ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ：  ｈｏｗ  ｓｈｏｕｌｄ  ｔｈｅｙ  ｂｅ  ｄｅｆｉｎｅｄ”  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  １９９９：  １０１０７−１０）。
【００３２】
組成物は、少なくとも１つのプレバイオティクスをさらに含有してもよい。「プレバイオティクス」は、腸においてプロバイオティクス細菌の増殖を促進することを目的とする食品物質を意味する。プレバイオティクスは、例えばＧｌｅｎｎ  Ｒ．  Ｇｉｂｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｃｅｌ  Ｂ．  Ｒｏｂｅｒｆｒｏｉｄ，  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ：  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｅｐｔ  ｏｆ  Ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ，  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．  １９９５  １２５：  １４０１−１４１２により定義されている。プレバイオティクスは、オリゴ糖からなる群から選択することができ、フルクトース、ガラクトース、マンノース、大豆及び／又はイヌリン、及び／又は食物繊維を含有してもよい。
【００３３】
本発明の組成物は、保護親水コロイド（ゴム、タンパク質、加工デンプンなど）、結合剤、被膜形成剤、カプセル化剤／材、壁／殻材、マトリックス化合物、コーティング剤、乳化剤、界面活性剤、可溶化剤（油、脂肪、ワックス、レシチンなど）、吸着剤、担体、充填剤、共化合物、分散剤、湿潤剤、加工助剤（溶媒）、流動剤、風味マスキング剤、増量剤、ゼリー化剤、ゲル形成剤、酸化防止剤及び抗菌剤をさらに含有してもよい。組成物はまた、水、任意の起源のゼラチン、植物性ガム、リグニンスルホネート、タルク、糖、デンプン、アラビアゴム、植物油、ポリアルキレングリコール、香味剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、滑剤、着色剤、湿潤剤、充填剤などを含むがこれらに限定されない、従来の医薬添加物及びアジュバント、賦形剤並びに希釈剤も含有することができる。全ての場合において、このようなさらなる成分は、意図されるレシピエントに対する適性を考慮して選択されることになろう。
【００３４】
本発明の組成物は、任意の数の本発明によるビフィズス菌を含有してもよい。原理的には、腸に到達してコロニーを生成することができる単一のビフィズス菌は、宿主に有益な効果を生むのに十分である。
【００３５】
理想的な用量は、例えば治療される対象、その健康状態、性別、年齢又は体重によることになるのは当業者には明らかである。使用される理想的用量は、したがって様々であろうが、当業者であれば容易に決めることができる。
【００３６】
しかしながら、一般に、本発明の組成物が、１日用量当たり１０３〜１０１０ｃｆｕ及び／又は１０３〜１０１０細胞のビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２９１６を含んでいると好ましい。組成物は、その乾燥重量１ｇ当たり１０３〜１０１２ｃｆｕ及び／又は１０３〜１０１２細胞のビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２９１６を含むこともできる。
【００３７】
本発明はまた、製品中のプロバイオティクス生菌、例えばビフィドバクテリウム・ロンガムの数を増加させるための、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２９１６の使用にも関する。同様に、本発明は、製品中のプロバイオティクス生菌、例えばビフィドバクテリウム・ロンガムの数を増加させるための、本発明の組成物の使用に関する。本発明における使用はまた、プロバイオティクス細菌に対するストレスへの曝露後に、製品中のプロバイオティクス細菌、特にビフィズス菌の数を増加させるのにも役立つ。
【００３８】
ストレスは、例えば３０秒〜２時間の間、例えば濃度２００ｐｐｍの酸化種への曝露であってもよい。
【００３９】
酸化種は、特に限定しない。ごく一般的な活性酸素種は、例えば・Ｏ２−のスーパーオキシドアニオン、Ｈ２Ｏ２の過酸化水素、・ＯＨのヒドロキシラジカル、ＲＯＯＨの有機ヒドロペルオキシド、ＲＯ・のアルコキシラジカル、ＲＯＯ・のペルオキシラジカル、ＨＯＣｌの次亜塩素酸、ＯＯＮＯ−のペルオキシナイトライト、及び／又はＮＯ・である。好ましくは、活性酸素種は、Ｈ２Ｏ２、・Ｏ２−、・ＯＨ、及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【００４０】
開示した本発明の範囲を逸脱することなく、本明細書中に記述した本発明の全ての特徴を自由に組み合わせることができることが当業者には理解されよう。特に、本発明の使用のために記述した特徴は、本発明の組成物へ適用でき、逆もまた然りである。
【００４１】
本発明のさらなる利点及び特徴は、以下の実施例及び図から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】２００ｐｐｍのＨ２Ｏ２中での４時間後における、一晩１６時間の培養物の生細胞数を示す図である。ＮＣＣ２９１６（白の棒）及び野生株ＮＣＣ２７０５（黒の棒）。ｐ値は、野生株についてのｔ−検定を示す。
【実施例】
【００４３】
実施例１：ＮＣＣ２９１６の同定及び単離
およそ１０１１ｃｆｕのＮＣＣ２７０５を１０ｍｌの４０ｐｐｍＨ２Ｏ２中で８０分再懸濁した。細胞懸濁液１ｍｌ容量を、次いでＭＲＳ寒天上にプレーティングした。４８時間以内に目に見えたコロニーを２回、ＭＲＳブロス中で一晩（１６時間）継代培養し、さらなる分析用に−８０℃で凍結した。
【００４４】
野生型の細胞及び新変異株ＮＣＣ２９１６のＨ２Ｏ２耐性を比較するために、同じ細胞密度の野生型及び変異株培養物からの凍結細胞試料（一晩１６時間培養物）を解凍し、１ｍｌ分量を遠心分離にかけた（６０００ｇ、室温２分）。ペレットを、１０ｍｌの２００ｐｐｍＨ２Ｏ２溶液中で再懸濁した。４時間後、この細胞懸濁液を緩衝溶液中で希釈し、プレーティングした。４８時間後にコロニー数を測定した。本試験は３回繰り返した（図１）。ＮＣＣ２９１６のＨ２Ｏ２耐性は、少なくとも７０世代、安定であった。
【図１】
2012531192.tif 000002
【国際調査報告】
2012531192.tif 000003
2012531192.tif 000004