(57)【要約】  本発明は、対象組換えポリペプチドの産生方法、前記方法により得られるポリペプチド、組換えポリヌクレオチド、発現ベクター、発現コンストラクトに関し、並びに特定のシグナルペプチドの、及び前記特定のシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの、対象組換えポリペプチドを産生するための使用に関する。【選択図】  図１
2012524530.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象組換えポリペプチドの産生方法であって、
（ｉ）前記ポリペプチドの産生をもたらす条件下における糸状菌宿主細胞の培養であって、前記糸状菌宿主細胞が翻訳リーディングフレーム内で第２のポリヌクレオチドに連結された第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２のポリヌクレオチドが対象ポリペプチドをコードし、前記第１のポリヌクレオチドが、
ａ）配列番号２５、
ｂ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｄ）配列番号３９、
ｅ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｆ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｇ）配列番号４４、
ｈ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｉ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｊ）配列番号３４、
ｋ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｌ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
からなる群から選択されるシグナルペプチドをコードする、培養と、
（ｉｉ）場合により、培養培地からの前記ポリペプチドの単離と、
を含み、但し前記シグナルペプチドが（ｂ）又は（ｃ）であるとき、前記対象ポリペプチドはエルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来のペクチンメチルエステラーゼではない、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により得られるポリペプチド。
【請求項３】
翻訳リーディングフレーム内で第２のポリヌクレオチドに連結された第１のポリヌクレオチドによりコードされる組換えポリペプチドであって、前記第２のポリヌクレオチドが対象ポリペプチドをコードし、前記第１のポリヌクレオチドが、
ａ）配列番号２５、
ｂ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｄ）配列番号３９、
ｅ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｆ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｇ）配列番号４４、
ｈ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｉ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｊ）配列番号３４、
ｋ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｌ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
からなる群から選択されるシグナルペプチドをコードし、
但し前記シグナルペプチドが（ｂ）又は（ｃ）であるとき、前記対象ポリペプチドはエルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来のペクチンメチルエステラーゼではない、組換えポリペプチド。
【請求項４】
翻訳リーディングフレーム内で第２のポリヌクレオチドに連結された第１のポリヌクレオチドを含む組換え発現コンストラクトであって、前記第２のポリヌクレオチドが対象ポリペプチドをコードし、前記第１のポリヌクレオチドが、
ａ）配列番号２５、
ｂ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｄ）配列番号３９、
ｅ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｆ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｇ）配列番号４４、
ｈ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｉ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｊ）配列番号３４、
ｋ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｌ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
からなる群から選択されるシグナルペプチドをコードし、
但し前記シグナルペプチドが（ｂ）又は（ｃ）であるとき、前記対象ポリペプチドはエルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来のペクチンメチルエステラーゼではない、発現コンストラクト。
【請求項５】
前記第１及び第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項３に記載の発現コンストラクト。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の発現コンストラクトを含む組換え発現ベクター。
【請求項７】
請求項４又は５に記載の発現コンストラクトを含む、又は請求項６に記載の発現ベクターを含む組換え糸状菌宿主細胞。
【請求項８】
ａ）配列番号２５、
ｂ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｄ）配列番号３９、
ｅ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｆ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｇ）配列番号４４、
ｈ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｉ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｊ）配列番号３４、
ｋ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｌ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
からなる群から選択されるシグナルペプチドの、対象組換えポリペプチドを産生するための使用であって、但し前記シグナルペプチドが（ｂ）又は（ｃ）であるとき、前記対象ポリペプチドはエルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来のペクチンメチルエステラーゼではない、使用。
【請求項９】
ａ）配列番号２５、
ｂ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｄ）配列番号３９、
ｅ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｆ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｇ）配列番号４４、
ｈ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｉ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｊ）配列番号３４、
ｋ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｌ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
からなる群から選択されるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの、対象組換えポリペプチドを産生するための使用であって、但し前記シグナルペプチドが（ｂ）又は（ｃ）であるとき、前記対象ポリペプチドはエルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来のペクチンメチルエステラーゼではない、使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、対象組換えポリペプチドの産生方法、前記方法により得られるポリペプチド、組換えポリヌクレオチド、発現ベクター、発現コンストラクトに関し、並びに特定のシグナルペプチドの、及び前記特定のシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの、対象組換えポリペプチドを産生するための使用に関する。
【０００２】
［発明の背景］
糸状菌宿主細胞における組換えポリペプチドの産生は、当該技術分野において公知である。現在のポリペプチド産生は、様々な方法で実施されている。
【０００３】
当該分野の技術水準における組換えポリペプチドの産生方法は、発現コンストラクトを含む宿主細胞の発酵を用いるものであり、前記発現コンストラクトは、とりわけ対象ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。対象ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に誘導するため、対象ポリペプチドはシグナル配列を含む。Ｂｒｏｅｋｈｕｉｊｓｅｎらにおいては（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１（１９９３年）１３５〜１４５頁、Ｂｒｏｅｋｈｕｉｊｓｅｎら；「アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）による異種タンパク質の分泌：プロテアーゼ欠損変異株におけるグルコアミラーゼ−ｈＩＬ６融合タンパク質のＫＥＸ２様プロセシングによる活性ヒトインターロイキン−６の産生（Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｉｎ  ａ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｕｔａｎｔ  ｂｙ  ＫＥＸ２−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ−ｈＩＬ６  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」）、分泌ポリペプチドのグルコアミラーゼのシグナル配列を用いてアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）内で組換えタンパク質を発現させている。
【０００４】
工業的な文脈では、高収率のポリペプチド産生が要求される。
【０００５】
対象組換えポリペプチドの産生収率は、分泌効率を増加させることにより高まり得る。
【０００６】
結果的に、対象ポリペプチドの産生収率を高めるためには、分泌効率を向上させる必要がある。
【０００７】
本発明の目的は、組換えポリペプチドの改良された産生方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】発現ベクターｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−１（国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットに記載される）のプラスミドマップを示す。ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−１はまた、プラスミドｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−３及びｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−２１を代表する。ａｍｙＢプロモーターと、変異シグナル配列が導入されたα−アミラーゼをコードするＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ａｍｙＢ  ｃＤＮＡ配列との配列に対するｇｌａＡフランキング領域を示す。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株を形質転換する前に、制限酵素ＮｏｔＩで消化することにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡを取り除くことができる。
【図２】発現ベクターｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−６（実施例１に記載される構築物）のプラスミドマップを示す。ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−６はまた、プラスミドｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−８、ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−１１、ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−１２、ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−１３、ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−１５、ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−１６及びｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−１８を代表する。ｇｌａＡプロモーターと、変異シグナル配列が導入されたα−アミラーゼをコードするＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ａｍｙＢ  ｃＤＮＡ配列との配列に対するｇｌａＡフランキング領域を示す。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株を形質転換する前に、制限酵素ＮｏｔＩで消化することにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡを取り除くことができる。
【図３】単一相同組換えによる組込みの概略図を示す。発現ベクターは、選択可能なａｍｄＳマーカーと、変異シグナル配列を含むａｍｙＢ遺伝子に接続されたプロモーターとを含む。これらの機構にｇｌａＡ遺伝子座の相同領域（それぞれ３’ｇｌａＡ及び３”ｇｌａＡ）が隣接し、ｇｌａＡゲノム遺伝子座における組込みを誘導する。
【図４】いずれもｇｌａＡプロモーターの制御下にある種々のａｍｙＢコンストラクトを発現するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の培養ブロスにおけるα−アミラーゼ活性を示す。ａｍｙＢコンストラクトを発現するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の培養ブロスにおけるα−アミラーゼ活性を示し、ここで種々のコンストラクトにおいてシグナル配列は修飾されている。種々のコンストラクトに関する詳細は、表１に見ることができる。α−アミラーゼ活性は相対α−アミラーゼ単位［ＡＵ］で示され、３日目における３株のＦＵＡ６群のＦＵＡ−６  １コピー株の平均を１００％に設定した。示される全ての形質転換体株について、３個の形質転換体を単離し、独立して培養した。
【図５】双方ともａｍｙＢプロモーターの制御下で２つの異なるａｍｙＢコンストラクトを発現するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の培養ブロスにおけるα−アミラーゼ活性を示す。天然ａｍｙＢコンストラクト（ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−３）を発現するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の培養ブロスにおけるα−アミラーゼ活性を示し、ここでａｍｙＢシグナル配列は、本発明の方法に従い、コドン最適化ｐｍｅＡシグナル配列（ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−２１）となるよう修飾された。２個のコンストラクトに関する詳細は、表２に見ることができる。α−アミラーゼ活性は相対α−アミラーゼ単位［ＡＵ］で示され、３日目における３株のＦＵＡ３群のＦＵＡ−３−１  １コピー株の平均を１００％に設定した。示される２個の形質転換体群について、３個の形質転換体を単離し、独立して培養した。
【図６】双方ともｇｌａＡプロモーターの制御下でＰ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）グルコースオキシダーゼＧｏｘＡをコードする２つの異なるコンストラクトを発現するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の培養ブロスにおけるグルコースオキシダーゼ活性を示す。天然ｇｏｘＡコンストラクト（ＧＯＸ−１−＃）を発現するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の培養ブロスにおけるグルコースオキシダーゼ活性を示し、ここでコドン最適化ｇｏｘＡシグナル配列は、本発明の方法に従い、コドン最適化ｐｍｅＡシグナル配列（ＧＯＸ−２−＃）となるよう修飾された。グルコースオキシダーゼ活性は相対グルコースオキシダーゼ単位［ＡＵ］で示される。示される２個の形質転換体群について、５個の形質転換体を単離し、独立して培養した。
【０００９】
［本発明の詳細な説明］
意外にも、特定のシグナル配列を使用することにより対象組換えポリペプチドの産生を改良できることが確立された。従って、本発明の第１の態様では、対象組換えポリペプチドの産生方法であって、
（ｉ）前記ポリペプチドの産生をもたらす条件下における糸状菌宿主細胞の培養であって、前記糸状菌宿主細胞が翻訳リーディングフレーム内で第２のポリヌクレオチドに連結された第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２のポリヌクレオチドが対象ポリペプチドをコードし、前記第１のポリヌクレオチドが、
ａ）配列番号２５、
ｂ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｄ）配列番号３９、
ｅ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｆ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｇ）配列番号４４、
ｈ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｉ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｊ）配列番号３４、
ｋ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｌ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
からなる群から選択されるシグナルペプチドをコードする、培養と、
（ｉｉ）場合により、培養培地からの前記ポリペプチドの単離と、
を含む方法が提供される。
【００１０】
以上に記載される方法は、本明細書では本発明に係る方法と称される。
【００１１】
ある実施形態によれば、本発明の方法において、シグナルペプチドは配列番号２５である。
【００１２】
別の実施形態によれば、本発明の方法において、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。
【００１３】
別の実施形態によれば、本発明の方法において、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体である。
【００１４】
別の実施形態によれば、本発明の方法において、シグナルペプチドは配列番号３９である。
【００１５】
別の実施形態によれば、本発明の方法において、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。
【００１６】
別の実施形態によれば、本発明の方法において、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体である。
【００１７】
別の実施形態によれば、本発明の方法において、シグナルペプチドは配列番号４４である。
【００１８】
別の実施形態によれば、本発明の方法において、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。
【００１９】
別の実施形態によれば、本発明の方法において、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体である。
【００２０】
別の実施形態によれば、本発明の方法において、シグナルペプチドは配列番号３４である。
【００２１】
別の実施形態によれば、本発明の方法において、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。
【００２２】
別の実施形態によれば、本発明の方法において、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体である。
【００２３】
好ましくは、本発明に係る方法において、シグナルペプチドが、
（ａ）：配列番号２５、
（ｂ）：少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、又は
（ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
であるとき、対象ポリペプチドはペクチンメチルエステラーゼではなく、より好ましくは、対象ポリペプチドはエルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来のペクチンメチルエステラーゼではない。より好ましくは、シグナルペプチドが（ｂ）又は（ｃ）であるとき、対象ポリペプチドはペクチンメチルエステラーゼではなく、さらにより好ましくは、対象ポリペプチドはエルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来のペクチンメチルエステラーゼではない。
【００２４】
好ましくは、配列番号２５をコードするときの第１のポリヌクレオチドは、配列番号２９に係るポリヌクレオチドである。好ましくは、配列番号３９をコードするときの第１のポリヌクレオチドは、配列番号３８に係るポリヌクレオチドである。好ましくは、配列番号４４をコードするときの第１のポリヌクレオチドは、配列番号４３に係るポリヌクレオチドである。好ましくは、配列番号３４をコードするときの第１のポリヌクレオチドは、配列番号３３に係るポリヌクレオチドである。
【００２５】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである変異体は、少なくとも９アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。より好ましくは、１０アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである。
【００２６】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体は、
ａ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は４位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｂ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、且つ３位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は４位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置のアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ及びＡｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｄ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、且つ３位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置のアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ及びＡｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
の群から選択されるものである。
【００２７】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである変異体は、少なくとも９アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。より好ましくは、１０アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである。
【００２８】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体は、
ａ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は５位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｂ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、且つ５位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
の群から選択されるものである。
【００２９】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体は、少なくとも９アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。より好ましくは、１０アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである。
【００３０】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体は、
ａ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は４位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｂ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、且つ４位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
の群から選択されるものである。
【００３１】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体は、少なくとも９アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。より好ましくは、１０アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである。
【００３２】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体は、
ａ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は４位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｂ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、且つ３及び／又は４位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は４位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置のアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ及びＡｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｄ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、且つ３及び／又は４位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置のアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ及びＡｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｅ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｆ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置のアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ及びＡｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｇ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置におけるアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ、Ａｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｈ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも５個のＡｌａを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｉ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも４個のＡｌａと１個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｊ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも３個のＡｌａと２個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｋ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも２個のＡｌａと３個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｌ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも１個のＡｌａと４個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｍ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも５個のＬｅｕを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｎ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｏ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置におけるアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ、Ａｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｐ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも５個のＡｌａを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｑ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも４個のＡｌａと１個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｒ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも３個のＡｌａと２個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｓ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも２個のＡｌａと３個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｔ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも１個のＡｌａと４個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｕ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも５個のＬｅｕを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
の群から選択されるものである。
【００３３】
以上の配列番号２５の（ａ）〜（ｄ）、配列番号３９の（ａ）及び（ｂ）、配列番号４４の（ａ）及び（ｂ）並びに配列番号３４の（ａ）〜（ｕ）の変異体において、連続ストレッチは、好ましくは１０アミノ酸、より好ましくは９アミノ酸、さらにより好ましくは８アミノ酸、及び最も好ましくは７アミノ酸である。
【００３４】
以上の配列番号２５の（ａ）〜（ｄ）、配列番号３９の（ａ）及び（ｂ）、配列番号４４の（ａ）及び（ｂ）並びに配列番号３４の（ａ）〜（ｕ）の変異体において、アミノ酸の連続ストレッチは、好ましくはＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸、より好ましくはＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも６アミノ酸、及び最も好ましくはＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも７アミノ酸を含む。
【００３５】
１５〜２３アミノ酸の配列番号２５、配列番号３９、配列番号４４、又は配列番号３４の変異体は、１５アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、２０アミノ酸、２１アミノ酸、２２アミノ酸又は２３アミノ酸を含んでもよい。
【００３６】
以上に記載される第１のポリヌクレオチドによりコードされるシグナルペプチドは、本明細書では本発明に係るシグナルペプチドと称される。
【００３７】
「ペプチド」又は「オリゴペプチド」は、本明細書では、直鎖状に構成され、且つ隣接するアミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基との間のペプチド結合により互いにつなぎ合わされた少なくとも２個のアミノ酸からなる分子を指す。用語「ペプチド」及び「オリゴペプチド」は（一般に認識されるとおり）同義語と見なされ、文脈上の必要に応じて各用語を代替的に使用することができる。「ポリペプチド」は、本明細書では、少なくとも４０アミノ酸を含む分子を指す。
【００３８】
本発明との関連において、用語「シグナルペプチド」は、本明細書では、ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導くペプチドとして定義される。シグナル配列は、必ずしもそうとは限らないものの通常は、ポリペプチドのアミノ末端に存在し、ポリペプチドにインフレームで融合される。シグナルペプチドとポリペプチドのアミノ末端との間には、プロペプチドが存在し得る。シグナル配列は、必ずしもそうとは限らないものの通常は、分泌過程でポリペプチドから切断され、成熟ポリペプチドをもたらす。当業者には、シグナル配列の同定方法は公知である。様々なツール及び充実した文献が利用可能である。本発明の限定として解釈されてはならない例としては、
「シグナル配列の切断部位を予測するための新規方法（Ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅｓ）」ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  Ｇ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８６年６月１１日号；１４（１１）：４６８３〜９０頁
「原核生物及び真核生物シグナルペプチドの同定並びにその切断部位の予測（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅｓ）」Ｈｅｎｒｉｋ  Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｊａｃｏｂ  Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ、Ｓｏｒｅｎ  Ｂｒｕｎａｋ及びＧｕｎｎａｒ  ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０：１〜６頁、１９９７年
「ＴａｒｇｅｔＰ、ＳｉｇｎａｌＰ、及び関連ツールを使用した細胞内のタンパク質位置決定（Ｌｏｃａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｕｓｉｎｇ  ＴａｒｇｅｔＰ，ＳｉｇｎａｌＰ，ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏｏｌｓ）」Ｏｌｏｆ  Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ、Ｓｏｒｅｎ  Ｂｒｕｎａｋ、Ｇｕｎｎａｒ  ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ、Ｈｅｎｒｉｋ  Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２、９５３〜９７１頁（２００７年）
ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／
である。
【００３９】
用語「プロペプチド」は、本明細書では、ポリペプチドのアミノ末端にインフレームで融合したペプチドとして定義される。得られるポリペプチドはプロポリペプチドとして知られ、プロポリペプチドからのプロペプチドの自己触媒的切断の触媒により成熟ポリペプチドに変換され得る。
【００４０】
シグナルペプチド及びプロペプチドは、本明細書では合わせて「プレプロペプチド」と称され、シグナル配列がプロペプチドにインフレームで融合し、及びプロペプチドがポリペプチドのアミノ末端にインフレームで融合する。
【００４１】
シグナルペプチド、プロペプチド及びプレプロペプチドは、当該技術分野では「リーダー配列」と称されることもある。
【００４２】
用語「成熟ポリペプチド」は、本明細書では、翻訳、翻訳後修飾、例えばＮ末端プロセシング、Ｃ末端プロセシング、グリコシル化、リン酸化及び任意選択での切断によるリーダー配列の除去を経たその最終形態にあるポリペプチドとして定義される。
【００４３】
本発明との関連において用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は同じであり、本発明の記載全体を通じ、同義的に読まれ得る。
【００４４】
本発明との関連において、用語「組換え」は、宿主細胞がランダム突然変異誘発に供されることによって誘導される天然に存在するプロセス及び／又は遺伝子修飾のみが関与すのではない任意の遺伝子修飾を指す。結果的に、組換えのプロセス及び／又は遺伝子修飾と、宿主細胞がランダム突然変異誘発に供されることによって誘導される天然に存在するプロセス及び／又は遺伝子修飾との組み合わせは、組換えとして解釈される。好ましくは、組換え遺伝子修飾には、宿主細胞がランダム突然変異誘発に供されることにより誘導される天然に存在するプロセス及び／又は遺伝子修飾が関与しない。
【００４５】
用語「作動可能に連結された」は、本明細書では、制御配列がコード配列の発現を誘導するように、制御配列がコード配列に対して適切な位置に配置される構成として定義される。
【００４６】
本明細書に定義されるとおりの用語「コード配列」は、ｍＲＮＡに転写され、本発明に係るポリペプチドに翻訳される配列である。コード配列の境界は、概してｍＲＮＡの５’側でＡＴＧ又は他の開始コドンにより、及びｍＲＮＡの３’側でオープンリーディングフレームの終端となる翻訳終止コドン配列により決定される。コード配列としては、限定はされないが、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び組換え核酸配列が挙げられる。
【００４７】
用語「変異ペプチド」又は「変異ポリペプチド」は、本明細書では、それぞれペプチド又はポリペプチド内の１つ又は複数の特定の位置に１つ又は複数の特定のアミノ酸残基の置換、挿入、欠失及び／又は切断などの１つ又は複数の改変を含むそれぞれペプチド又はポリペプチドとして定義される。従って、変異シグナルペプチドは、シグナルペプチド内の１つ又は複数の特定の位置に１つ又は複数の特定のアミノ酸残基の置換、挿入、欠失及び／又は切断などの１つ又は複数の改変を含むシグナルペプチドである。
【００４８】
本発明に係る変異シグナルペプチドの対応位置は、シグナルペプチドの配列番号２５、配列番号３９、配列番号４４、又は配列番号３４などの参照配列に対するアラインメントにより決定される。適用可能な場合には、ペプチド、ポリペプチド又はポリヌクレオチドのアラインメント又はマルチアラインメントを、当該技術分野において公知の方法を用いて行うことができる。かかる方法としては、限定はされないが、ＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２、４６７３〜４６８０頁）、ＢＬＡＳＴ、ＧＡＰ、ＭＡＰ、ＭｕｌｔｉＢＬＡＳＴ、及びスミス・ウォーターマンが挙げられる。
【００４９】
用語「ポリヌクレオチド」は用語「核酸分子」と同じであり、本明細書では同義的に読まれ得る。この用語は、一本鎖又は二本鎖のいずれかであるリボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子であるポリヌクレオチド分子を指す。ポリヌクレオチドは、単離された形態で存在してもよく、又は組換え核酸分子又はベクター中に含まれてもよく、又は宿主細胞中に含まれてもよい。
【００５０】
用語「変異ポリヌクレオチド」は、本明細書では、ポリヌクレオチド内の１つ又は複数の特定の位置に１つ又は複数のヌクレオチドの置換、挿入、欠失及び／又は切断などの１つ又は複数の改変を含むポリヌクレオチドとして定義される。
【００５１】
本発明に係るシグナルペプチドは、第２のポリヌクレオチドによりコードされる対象ポリペプチドと天然に関係を有するものであってもよく、又は第２のポリヌクレオチドによりコードされる対象ポリペプチドにとって外来性であってもよい。好ましくは、本発明に係るシグナルペプチドは、第２のポリヌクレオチドによりコードされる対象ポリペプチドにとって外来性である。変異シグナルペプチドは、本明細書では、第２のポリヌクレオチドによりコードされる対象ポリペプチドにとって外来性のものとして定義される。
【００５２】
対象ポリペプチドと天然に関係を有するシグナルペプチドは、当該技術分野において公知の標準的な分子クローニング技法を用いて、天然に関係を有するシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明に係るシグナルペプチドに物理的に置き換えることにより、本発明に係るシグナルペプチドに置き換えてもよい。かかる方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第３版、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、２００１年；及びＡｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｗｉｌｅｙ  ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ、１９９５年に広範な記載がなされている。
【００５３】
或いは、対象ポリペプチドと天然に関係を有するシグナルペプチドは、公知の方法を用いた、天然に関係を有するシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発により、本発明に係るシグナルペプチドに変換されてもよい（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ、上記を参照のこと）。
【００５４】
本発明に係るシグナルペプチドは、糸状菌宿主細胞にとって天然であっても、又は外来性であってもよい。好ましくは、本発明に係るシグナルペプチドは糸状菌宿主細胞にとって天然である。
【００５５】
好ましくは、本発明に係る方法は、翻訳リーディングフレーム内でその天然シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドと連結された第２のポリヌクレオチドによりコードされる対象ポリペプチドと比較したとき、同一条件下での培養時に、翻訳リーディングフレーム内で本発明に係るシグナルペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと連結された第２のポリヌクレオチドによりコードされる対象組換えポリペプチドを少なくとも１０％多く、より好ましくは少なくとも２５％多く、さらにより好ましくは少なくとも５０％多く、さらにより好ましくは少なくとも７５％多く、さらにより好ましくは少なくとも１００％多く、さらにより好ましくは少なくとも２００％多く、最も好ましくは少なくとも５００％多く産生する。
【００５６】
対象ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドは、当業者に公知の一般的な方法により提供され得る。かかる方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、上記に広範な記載がなされている。前記方法の例は以下のとおりである。第２のポリヌクレオチドの配列が既知である場合、又はコードされる対象ポリペプチドの配列が既知である場合、ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドを天然に発現する宿主細胞から単離されてもよい。或いは、ポリヌクレオチドは化学的に合成されてもよい。例えば本明細書において以下に記載されるとおりのコドン最適化方法を用いて、選択した宿主細胞のコドン使用を適合させてもよい。ポリペプチドの配列が未知である場合、初めに当該技術分野において公知の方法を用いてその配列が決定され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ、上記）。
【００５７】
本明細書において組み合わされる、又は単独でのポリヌクレオチドは（すなわち、翻訳リーディングフレーム内で第２のポリヌクレオチドに連結された第１のポリヌクレオチドであって、前記第２のポリヌクレオチドが対象ポリペプチドをコードし、前記第１のポリヌクレオチドがシグナルペプチドをコードするもの；又は第１のポリヌクレオチド単独又は第２のポリヌクレオチド単独）、合成ポリヌクレオチドであってもよい。合成ポリヌクレオチドは、好ましくは、参照により本明細書に援用される国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレット及び／又はＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５５９４３号明細書に記載される方法により、コドン使用が最適化されてもよい。ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５５９４３号明細書はコドン対最適化を取り上げている。コドン対最適化は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列がそのコドン使用頻度、特に使用されるコドン対に関して修飾されており、それによりポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現の向上及び／又はコードされたポリペプチドの産生の向上が達成される方法である。コドン対は、コード配列内の２つの連続するトリプレット（コドン）の組として定義される。
【００５８】
本明細書において組み合わされる、又は単独でのポリヌクレオチドは（すなわち、翻訳リーディングフレーム内で第２のポリヌクレオチドに連結された第１のポリヌクレオチドであって、前記第２のポリヌクレオチドが対象ポリペプチドをコードし、前記第１のポリヌクレオチドがシグナルペプチドをコードするもの；又は第１のポリヌクレオチド単独又は第２のポリヌクレオチド単独）、１つ又は複数のイントロンを含んでもよい。
【００５９】
翻訳リーディングフレーム内でポリヌクレオチドを互いに連結する方法は、当該技術分野では一般的なクローニング技法として公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、上記）。例は、消化、ライゲーション、ＰＣＲ、化学合成等である。従って、第１のポリヌクレオチドは、かかる当該技術分野において公知の方法により翻訳リーディングフレーム内で第２のポリヌクレオチドに連結することができる。
【００６０】
翻訳リーディングフレーム内で第２のポリヌクレオチドに連結された第１のポリヌクレオチドを含む糸状菌宿主細胞であって、前記第２のポリヌクレオチドが対象ポリペプチドをコードし、前記第１のポリヌクレオチドが本発明に係るシグナルペプチドをコードする糸状菌宿主細胞は、当該技術分野において公知の方法を用いて構築することができる。好ましくは、前記糸状菌宿主細胞は、
−  好適な糸状菌宿主細胞を提供するステップと、
−  翻訳リーディングフレーム内で前記第２のポリヌクレオチドに連結された前記第１のポリヌクレオチドにより前記宿主細胞を形質転換するステップと、
を含む方法により構築される。
【００６１】
ポリヌクレオチド、発現ベクター又は核酸コンストラクトを細胞に導入することによる宿主細胞の形質転換は、好ましくは当該技術分野において公知の技法により実施される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記を参照のこと）。形質転換には、それ自体公知の方法によるプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生からなるプロセスが関与する。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞の形質転換に好適な手順が、欧州特許第２３８  ０２３号明細書及びＹｅｌｔｏｎら、１９８４年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ８１：１４７０〜１４７４頁に記載されている。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を使用するアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及び他の糸状菌宿主細胞の形質転換に好適な手順が、例えばＤｅ  Ｇｒｏｏｔら、「アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の媒介による糸状菌の形質転換（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ）」、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８、１６：８３９〜８４２頁、訂正記事：Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９８  １６：１０７４頁に記載されている。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種を形質転換する好適な方法が、Ｍａｌａｒｄｉｅｒら、１９８９年、Ｇｅｎｅ  ７８：１４７１５６頁又は国際公開第９６／００７８７号パンフレットに記載されている。Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎら、「偏性植物病原真菌の微粒子銃形質転換（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｐｌａｎｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｆｕｎｇｕｓ）」、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｆ．ｓｐ．ｈｏｒｄｅｉ．１９９５年、Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．２９：１００〜１０２頁に記載されるとおりの微粒子銃形質転換を用いる方法など、他の方法を適用することもできる。酵母は、Ｂｅｃｋｅｒ及びＧｕａｒｅｎｔｅ、Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．及びＳｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．編、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」所収、第１９４巻、１８２〜１８７頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏら、１９８３年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １５３：１６３頁；及びＨｉｎｎｅｎら、１９７８年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ７５：１９２０頁により記載される手順を用いて形質転換されてもよい。
【００６２】
本発明に係る糸状菌宿主細胞は、当該技術分野において公知の方法を用いた対象組換えポリペプチドの産生に好適な栄養培地において培養される。例えば、細胞は、好適な培地中、且つポリペプチドの発現及び／又は単離を可能にする条件下で、振盪フラスコ培養法、実験室又は工業用発酵槽内での小規模又は大規模発酵法（連続、バッチ、フェドバッチ、又は固体発酵を含む）により培養されてもよい。培養は、当該技術分野において公知の手順を用いて、炭素源及び窒素源並びに無機塩類を含む好適な栄養培地中で行われる（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．及びＬａＳｕｒｅ，Ｌ．編、「Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＣＡ、１９９１年を参照のこと）。好適な培地は供給業者から入手可能であり、又は公表されている組成物（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログにある）を使用して調製されてもよい。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、ポリペプチドは、培養培地から直接回収することができる。ポリペプチドが分泌されない場合、それは細胞溶解物から回収される。
【００６３】
産生される対象組換えポリペプチドは、当該技術分野において公知の方法により培養培地から回収され得る。例えば、ポリペプチドは、限定はされないが、遠心、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、又は沈殿を含めた従来の手順により培養培地から回収されてもよい。
【００６４】
対象組換えポリペプチドは、限定はされないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動法による手順（例えば、分取等電点電気泳動法）、溶解度差（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、又は抽出を含む当該技術分野において公知の様々な手順により精製されてもよい（例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、編者Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ及びＬａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９年を参照のこと）。
【００６５】
対象組換えポリペプチドは、ポリペプチドに特異的な当該技術分野において公知の方法を用いて検出されてもよい。これらの検出方法としては、特異的抗体の使用、高速液体クロマトグラフィー、キャピラリークロマトグラフィー、電気泳動法、酵素産物の形成、又は酵素基質の消失を挙げることができる。
【００６６】
本発明に係る宿主細胞は糸状菌宿主細胞である。「糸状菌」は、あらゆる糸状の形態の真菌（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）及び卵菌（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）亜門（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈら、「Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ」第８版、１９９５年、ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国により定義されるとおり）を含む。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖類からなる菌糸壁によって特徴付けられる。栄養成長は菌糸伸長により、及び炭素異化は絶対好気性である。糸状菌株としては、限定はされないが、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、パネロカエテ属（Ｐａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、プレウロタス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、スポロトリクム属（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、及びトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の株が挙げられる。
【００６７】
好ましい糸状菌細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、スポロトリクム属（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）又はトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種、及び最も好ましくは、アクレモニウム・アラバメンシス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ａｌａｂａｍｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ソジャエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、スポロトリクム・セルロフィルム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｐｈｉｌｕｍ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、タラロミセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）又はペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の種に属する。
【００６８】
糸状菌のいくつかの株、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＡＴＣＣ  ２０４２３、ＩＦＯ  ４１７７、ＡＴＣＣ  １０１１、ＡＴＣＣ  ９５７６、ＡＴＣＣ１４４８８−１４４９１、ＡＴＣＣ  １１６０１、ＡＴＣＣ１２８９２、Ｐ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＣＢＳ  ４５５．９５、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）ＡＴＣＣ  ３８０６５、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）Ｐ２、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＡＴＣＣ  ３６２２５又はＡＴＣＣ  ４８２７２、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＡＴＣＣ  ２６９２１又はＡＴＣＣ  ５６７６５又はＡＴＣＣ  ２６９２１、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）ＡＴＣＣ１１９０６、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）ＡＴＣＣ４４００６、タラロミセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）ＣＢＳ３９３．６４又はＣＢＳ８１４．７０及びそれらの誘導体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、及びＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）などの数多くのカルチャーコレクションにおいて一般に容易に入手可能である。
【００６９】
場合により、宿主細胞は、対象ポリペプチドの産生能を亢進させるため、野生型細胞と比較して高い小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を含む。ＵＰＲは、米国特許出願公開第２００４／０１８６０７０Ａ１号明細書及び／又は米国特許出願公開第２００１／００３４０４５Ａ１号明細書及び／又は国際公開第０１／７２７８３Ａ２号パンフレット及び／又は国際公開第２００５／１２３７６３号パンフレットに記載される技法により増加させ得る。より具体的には、高いＵＰＲを有する宿主細胞が得られるようＨＡＣ１及び／又はＩＲＥ１及び／又はＰＴＣ２のタンパク質レベルが調節されているか、及び／又はＳＥＣ６１タンパク質が操作されている。
【００７０】
それに代えて、又は高いＵＰＲとの組み合わせで、宿主細胞は、対象ポリペプチドの産生能を亢進させるため、野生型細胞と比較してより低いプロテアーゼ発現及び／又はプロテアーゼ分泌を呈する表現型を得るように遺伝子修飾される。かかる表現型は、プロテアーゼの発現の転写制御因子を欠失及び／又は修飾及び／又は不活化させることによって得てもよい。かかる転写制御因子は、例えばｐｒｔＴである。ｐｒｔＴを調節することによるプロテアーゼの発現の低下は、米国特許出願公開第２００４／０１９１８６４Ａ１号明細書に記載される技法により実施され得る。
【００７１】
それに代えて、又は高いＵＰＲ及び／又はより低いプロテアーゼ発現及び／又はプロテアーゼ分泌を呈する表現型との組み合わせで、宿主細胞は対象ポリペプチドの産生収率を亢進させるためシュウ酸欠損表現型を呈する。シュウ酸欠損表現型は、国際公開第２００４／０７００２２Ａ２号パンフレットに記載される技法により得てもよい。
【００７２】
それに代えて、又は高いＵＰＲ及び／又は高いＵＰＲ及び／又はより低いプロテアーゼ発現及び／又はプロテアーゼ分泌を呈する表現型及び／又はシュウ酸欠損との組み合わせで、宿主細胞は、対象ポリペプチドの産生収率を亢進させるため、野生型細胞と比較して表現型の違いの組み合わせを呈する。これらの違いとしては、限定はされないが、グルコアミラーゼ及び／又は中性α−アミラーゼＡ及び／又は中性α−アミラーゼＢ、プロテアーゼ、及びシュウ酸ヒドロラーゼの発現の低下を挙げることができる。宿主細胞が呈する前記表現型の違いは、米国特許出願公開第２００４／０１９１８６４Ａ１号明細書に記載される技法に係る遺伝子修飾によって得てもよい。
【００７３】
それに代えて、又は対象ポリペプチドの産生収率を亢進させるための野生型細胞との比較における高いＵＰＲ及び／又はより低いプロテアーゼ発現及び／又はプロテアーゼ分泌を呈する表現型及び／又はシュウ酸欠損及び表現型の違いの組み合わせとの組み合わせで、宿主細胞は毒素遺伝子の欠損を呈し、糸状菌宿主細胞の毒素発現能力が無効にされる。かかる毒素としては、限定はされないが、オクラトキシン、フモニシン、シクラピアゾン酸（ｃｙｃｌａｐｉａｚｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、３−ニトロプロピオン酸、エモジン、マルフォルミン、アフラトキシン及びセカロン酸が挙げられる。かかる欠損は、好ましくは国際公開第２０００／０３９３２２号パンフレットに記載されるようなものである。
【００７４】
対象ポリペプチドは、対象の生物活性を有する任意のポリペプチドであってよい。ポリペプチドは天然であっても、又は宿主細胞にとって異種であってもよい。異種ポリペプチドは、本明細書では、宿主細胞にとって天然ではないポリペプチド、又はポリペプチドを改変するよう構造的な修飾が加えられた天然ポリペプチドとして定義される。ポリペプチドはコラーゲン若しくはゼラチンであっても、又はその変異体若しくはハイブリッドであってもよい。ポリペプチドは、抗体若しくはその一部、抗原、凝固因子、酵素、ホルモン若しくはホルモン変異体、受容体若しくはその一部、調節タンパク質、構造タンパク質、レポーター、又は輸送タンパク質、分泌過程に天然に関与するタンパク質、フォールディング過程に関与するタンパク質、シャペロン、ペプチドアミノ酸トランスポーター、グリコシル化因子、転写因子、オリゴペプチド、天然の細胞内タンパク質であってもよい。天然の細胞内タンパク質は、プロテアーゼ、セラミダーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、アミノペプチダーゼ、アシラーゼ、アルドラーゼ、ヒドロキシラーゼ、アミノペプチダーゼ、リパーゼなどの酵素であってもよい。対象組換えポリペプチドは、好ましくは細胞外で分泌される酵素である。かかる酵素は、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼの群に属し得る。酵素は、カルボヒドラーゼ、例えば、エンドグルカナーゼ、β−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ又はβ−グルコシダーゼなどのセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、又はペクチン分解酵素、例えば、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチン酸リアーゼ、エンドポリガラクツロナーゼ、エキソポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、アラバナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アラビノキシランヒドロラーゼ、ガラクツロナーゼ、リアーゼ、又はデンプン分解酵素；ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼ、フィターゼなどのホスファターゼ、リパーゼなどのエステラーゼ、タンパク質分解酵素、オキシダーゼなどのオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、又はイソメラーゼであってもよい。酵素はフィターゼであってよい。酵素は、アスパラギナーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンドプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼカタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ミュータン分解酵素、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はグルコースオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼであってもよい。
【００７５】
ポリペプチドは、上述のポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子の変異体及び操作された変異体をさらに含む。
【００７６】
本発明によれば、対象ポリペプチドはまた、別のポリペプチドがそのポリペプチド又はその断片のＮ末端又はＣ末端に融合された融合又はハイブリッドポリペプチドであってもよい。融合ポリペプチドは、あるポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部分）を、別のポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部分）と融合することにより産生される。
【００７７】
ハイブリッドポリペプチドは、１つ又は複数が宿主細胞にとって異種であってもよい少なくとも２つの異なるポリペプチドから得られた部分的又は完全なポリペプチド配列の組み合わせを含んでもよい。
【００７８】
本発明に係る方法は、好都合には対象組換えポリペプチドの産生に用いられる。
【００７９】
従って、第２の態様において本発明は、本発明の第１の態様に係る方法により産生される対象組換えポリペプチドに関する。好ましくは、前記ポリペプチドは、以上に記載されるとおりの酵素である。
【００８０】
本発明はさらに、中間産物、すなわち、翻訳リーディングフレーム内で第２のポリヌクレオチドに連結された第１のポリヌクレオチドによりコードされる対象ポリペプチドであって、前記第２のポリヌクレオチドが対象ポリペプチドをコードし、前記第１のポリヌクレオチドが本発明に係るシグナルペプチドをコードする、対象ポリペプチドに関する。対象ポリペプチドは、好ましくは本発明の第１の態様に記載される対象ポリペプチドである。
【００８１】
好ましくは、シグナルペプチドは、
ａ）配列番号２５、
ｂ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｄ）配列番号３９、
ｅ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｆ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｇ）配列番号４４、
ｈ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｉ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｊ）配列番号３４、
ｋ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｌ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
からなる群から選択されるものである。
【００８２】
ある実施形態によれば、中間産物において、シグナルペプチドは配列番号２５である。
【００８３】
別の実施形態によれば、中間産物において、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。
【００８４】
別の実施形態によれば、中間産物において、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体である。
【００８５】
別の実施形態によれば、中間産物において、シグナルペプチドは配列番号３９である。
【００８６】
別の実施形態によれば、中間産物において、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。
【００８７】
別の実施形態によれば、中間産物において、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体である。
【００８８】
別の実施形態によれば、中間産物において、シグナルペプチドは配列番号４４である。
【００８９】
別の実施形態によれば、中間産物において、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。
【００９０】
別の実施形態によれば、中間産物において、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体である。
【００９１】
別の実施形態によれば、中間産物において、シグナルペプチドは配列番号３４である。
【００９２】
別の実施形態によれば、中間産物において、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。
【００９３】
別の実施形態によれば、中間産物において、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体である。
【００９４】
好ましくは、中間産物において、シグナルペプチドが
（ａ）：配列番号２５、
（ｂ）：少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、又は
（ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
であるとき、対象ポリペプチドはペクチンメチルエステラーゼではなく、より好ましくは、対象ポリペプチドはエルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来のペクチンメチルエステラーゼではない。より好ましくは、シグナルペプチドが（ｂ）又は（ｃ）であるとき、対象ポリペプチドはペクチンメチルエステラーゼではなく、さらにより好ましくは、対象ポリペプチドはエルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来のペクチンメチルエステラーゼではない。
【００９５】
好ましくは、配列番号２５をコードするときの第１のポリヌクレオチドは、配列番号２９に係るポリヌクレオチドである。好ましくは、配列番号３９をコードするときの第１のポリヌクレオチドは、配列番号３８に係るポリヌクレオチドである。好ましくは、配列番号４４をコードするときの第１のポリヌクレオチドは、配列番号４３に係るポリヌクレオチドである。好ましくは、配列番号３４をコードするときの第１のポリヌクレオチドは、配列番号３３に係るポリヌクレオチドである。
【００９６】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである変異体は、少なくとも９アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。より好ましくは、１０アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである。
【００９７】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体は、
ａ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は４位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｂ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、且つ３位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は４位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置のアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ及びＡｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｄ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、且つ３位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置のアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ及びＡｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
の群から選択されるものである。
【００９８】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである変異体は、少なくとも９アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。より好ましくは、１０アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである。
【００９９】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体は、
ａ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は５位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｂ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、且つ５位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
の群から選択されるものである。
【０１００】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体は、少なくとも９アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。より好ましくは、１０アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである。
【０１０１】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体は、
ａ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は４位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｂ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、且つ４位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
の群から選択されるものである。
【０１０２】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体は、少なくとも９アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。より好ましくは、１０アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである。
【０１０３】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体は、
ａ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は４位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｂ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、且つ３及び／又は４位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は４位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置のアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ及びＡｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｄ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、且つ３及び／又は４位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置のアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ及びＡｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｅ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｆ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置のアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ及びＡｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｇ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置におけるアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ、Ａｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｈ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも５個のＡｌａを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｉ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも４個のＡｌａと１個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｊ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも３個のＡｌａと２個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｋ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも２個のＡｌａと３個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｌ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも１個のＡｌａと４個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｍ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも５個のＬｅｕを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｎ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｏ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置におけるアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ、Ａｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｐ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも５個のＡｌａを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｑ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも４個のＡｌａと１個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｒ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも３個のＡｌａと２個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｓ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも２個のＡｌａと３個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｔ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも１個のＡｌａと４個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｕ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも５個のＬｅｕを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
の群から選択されるものである。
【０１０４】
以上の配列番号２５の（ａ）〜（ｄ）、配列番号３９の（ａ）及び（ｂ）、配列番号４４の（ａ）及び（ｂ）並びに配列番号３４の（ａ）〜（ｕ）の変異体において、連続ストレッチは、好ましくは１０アミノ酸、より好ましくは９アミノ酸、さらにより好ましくは８アミノ酸、及び最も好ましくは７アミノ酸である。
【０１０５】
以上の配列番号２５の（ａ）〜（ｄ）、配列番号３９の（ａ）及び（ｂ）、配列番号４４の（ａ）及び（ｂ）並びに配列番号３４の（ａ）〜（ｕ）の変異体において、アミノ酸の連続ストレッチは、好ましくはＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸、より好ましくはＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも６アミノ酸、及び最も好ましくはＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも７アミノ酸を含む。
【０１０６】
１５〜２３アミノ酸の配列番号２５、配列番号３９、配列番号４４、又は配列番号３４の変異体は、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、２０アミノ酸、２１アミノ酸、２２アミノ酸又は２３アミノ酸を含んでもよい。
【０１０７】
第３の態様において、本発明は、翻訳リーディングフレーム内で第２のポリヌクレオチドに連結された第１のポリヌクレオチドを含む組換え発現コンストラクトであって、前記第２のポリヌクレオチドが対象ポリペプチドをコードし、前記第１のポリヌクレオチドが本発明に係るシグナルペプチドをコードする、発現コンストラクトに関する。対象ポリペプチドは、好ましくは本発明の第１の態様に記載される対象ポリペプチドである。好ましくは、シグナルペプチドが、
（ａ）：配列番号２５、
（ｂ）：少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、又は
（ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
であるとき、対象ポリペプチドはペクチンメチルエステラーゼではなく、より好ましくは、対象ポリペプチドはエルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来のペクチンメチルエステラーゼではない。より好ましくは、シグナルペプチドが（ｂ）又は（ｃ）であるとき、対象ポリペプチドはペクチンメチルエステラーゼではなく、さらにより好ましくは、対象ポリペプチドはエルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来のペクチンメチルエステラーゼではない。
【０１０８】
好ましくは、配列番号２５をコードするときの第１のポリヌクレオチドは、配列番号２９に係るポリヌクレオチドである。好ましくは、配列番号３９をコードするときの第１のポリヌクレオチドは、配列番号３８に係るポリヌクレオチドである。好ましくは、配列番号４４をコードするときの第１のポリヌクレオチドは、配列番号４３に係るポリヌクレオチドである。好ましくは、配列番号３４をコードするときの第１のポリヌクレオチドは、配列番号３３に係るポリヌクレオチドである。
【０１０９】
本発明はさらに、翻訳リーディングフレーム内で第２のポリヌクレオチドに連結された第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む前記組換え発現コンストラクトであって、前記第２のポリヌクレオチドが対象ポリペプチドをコードし、前記第１のポリヌクレオチドが本発明に係るシグナルペプチドをコードする、発現コンストラクトに関する。対象ポリペプチドは、好ましくは本発明の第１の態様に記載される対象ポリペプチドである。
【０１１０】
本発明はさらに、以上に記載される発現コンストラクトを含む組換え発現ベクターに関する。
【０１１１】
用語「核酸コンストラクト」は、本明細書では、一本鎖又は二本鎖のいずれかの核酸分子を指し、これは、天然に存在する遺伝子から単離されるか、又は別の場合であれば天然には存在しないであろう形で組み合わされて並ぶ核酸のセグメントを含むように修飾されている。用語の核酸コンストラクトは、核酸コンストラクトがコード配列の発現に必要な全ての制御配列を含むとき用語「発現カセット」と同義語であり、ここで前記制御配列は前記コード配列に作動可能に連結される。
【０１１２】
用語「制御配列」は、本明細書では、インビトロ又は宿主細胞中のいずれかでのｍＲＮＡ及び／又はポリペプチドの発現に必要又は有利なあらゆる構成要素を含むように定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとって天然であっても、又は外来性であってもよい。かかる制御配列としては、限定はされないが、シャイン−ダルガノ配列、最適翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋ、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７〜１９８７０頁に記載されるとおり）、ポリアデニル化配列、プロモーター、及び転写ターミネーターが挙げられる。最小限として、制御配列は、プロモーター、並びに転写及び翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、その特定の目的に対して最適化されてもよい。好ましくは、ＤＮＡコンストラクトは、プロモーターＤＮＡ配列、前記プロモーターＤＮＡ配列及び制御配列と作動可能に連係したコード配列、例えば：
−  以下の配列リストから選択される５’から３’方向に向く一つの翻訳終結配列：ＴＡＡＧ、ＴＡＧＡ及びＴＡＡＡ、好ましくはＴＡＡＡ、及び／又は
−  以下の配列リストから選択される５’から３’方向に向く一つの翻訳開始コード配列：ＧＣＴＡＣＣＣＣＣ；ＧＣＴＡＣＣＴＣＣ；ＧＣＴＡＣＣＣＴＣ；ＧＣＴＡＣＣＴＴＣ；ＧＣＴＣＣＣＣＣＣ；ＧＣＴＣＣＣＴＣＣ；ＧＣＴＣＣＣＣＴＣ；ＧＣＴＣＣＣＴＴＣ；ＧＣＴＧＣＣＣＣＣ；ＧＣＴＧＣＣＴＣＣ；ＧＣＴＧＣＣＣＴＣ；ＧＣＴＧＣＣＴＴＣ；ＧＣＴＴＣＣＣＣＣ；ＧＣＴＴＣＣＴＣＣ；ＧＣＴＴＣＣＣＴＣ；及びＧＣＴＴＣＣＴＴＣ、好ましくはＧＣＴ  ＴＣＣ  ＴＴＣ、及び／又は
−  以下の配列リストから選択される一つの翻訳イニシエーター配列：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＡ−３’；５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＣＡ−３’又は５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＧ−３’、ヌクレオチドにアンビギュイティーコード：ｍ（Ａ／Ｃ）；ｗ（Ａ／Ｔ）；ｙ（Ｃ／Ｔ）；ｋ（Ｇ／Ｔ）；ｈ（Ａ／Ｃ／Ｔ）を使用、好ましくは５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’又は５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’ 
を含む。
【０１１３】
本発明との関連において、用語「翻訳イニシエーターコード配列」は、ＤＮＡコード配列のオープンリーディングフレームのイニシエーター又は開始コドンの直ちに下流にある９個のヌクレオチドとして定義される。イニシエーター又は開始コドンはＡＡメチオニンをコードする。イニシエーターコドンは典型的にはＡＴＧであるが、ＧＴＧなどの任意の機能的な開始コドンであってもよい。
【０１１４】
本発明との関連において、用語「翻訳終結配列」は、オープンリーディングフレーム又はヌクレオチドコード配列の３’末端の翻訳終止コドンを始端として５’から３’方向に向く４個のヌクレオチドとして定義される。
【０１１５】
本発明との関連において、用語「翻訳イニシエーター配列」は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のオープンリーディングフレームのイニシエーター又は開始コドンの直ちに上流にある１０個のヌクレオチドとして定義される。イニシエーター又は開始コドンはＡＡメチオニンをコードする。イニシエーターコドンは典型的にはＡＴＧであるが、ＧＴＧなどの任意の機能的な開始コドンであってもよい。ＲＮＡにおいてウラシルＵがデオキシヌクレオチドチミンＴに代わることは当該技術分野において公知である。
【０１１６】
制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域との制御配列のライゲーションを促進する特定の制限部位の導入を目的として、リンカーを備えてもよい。制御配列は、適切なプロモーター配列、すなわち核酸配列の発現が宿主細胞によって認識される核酸配列であってもよい。プロモーター配列は転写制御配列を含み、それがポリペプチドの発現を媒介する。プロモーターは、突然変異体プロモーター、トランケート型プロモーター、及びハイブリッドプロモーターを含め、細胞中で転写活性を示す任意の核酸配列であってよく、細胞と同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【０１１７】
制御配列はまた、好適な転写ターミネーター配列、すなわち糸状菌細胞によって転写の終結が認識される配列であってもよい。転写ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。本発明では、細胞内で機能する任意のターミネーターを使用することができる。
【０１１８】
糸状菌細胞に好ましいターミネーターは、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）タカアミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、ｔｒｐＣ遺伝子及びフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から得られる。
【０１１９】
制御配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわち核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、且つ転写されると、転写ｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして糸状菌細胞により認識される配列であってもよい。本発明では、細胞内で機能する任意のポリアデニル化配列を使用することができる。
【０１２０】
糸状菌細胞に好ましいポリアデニル化配列は、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）タカアミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。
【０１２１】
用語「プロモーター」は、本明細書では、ＲＮＡポリメラーゼを結合し、且つ生物学的化合物をコードする核酸配列の正しい下流の転写開始部位へとポリメラーゼを誘導して転写を開始させるＤＮＡ配列として定義される。ＲＮＡポリメラーゼは、コード領域の適切なＤＮＡ鎖と相補的なメッセンジャーＲＮＡの構築を有効に触媒する。用語「プロモーター」はまた、ｍＲＮＡに転写された後の翻訳のための５’−非コード領域（プロモーターと翻訳開始点の間）、エンハンサーなどのシス作用転写制御エレメント、及び転写因子と相互作用することが可能な他のヌクレオチド配列を含むようにも理解され得る。プロモーターは、突然変異プロモーター、トランケート型プロモーター、及びハイブリッドプロモーターを含め、真核又は原核宿主細胞に好適な、転写活性を示す任意の適切なプロモーター配列であってもよく、細胞と同種（天然）又は異種（外来性）のいずれかである細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得てもよい。プロモーターは、構成的又は誘導性プロモーターであってもよい。使用することのできる誘導性プロモーターの例は、デンプン誘導性、銅誘導性、オレイン酸誘導性プロモーターである。プロモーターは、限定はされないが、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）タカアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）又はＡ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒ．ミエヘイ（Ｒ．ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼをコードする遺伝子から得られるプロモーター、ＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ及びＡ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、及びそれらの突然変異プロモーター、トランケート型プロモーター、及びハイブリッドプロモーターを含む群から選択されてもよい。糸状菌細胞における使用に特に好ましいプロモーターは、プロテアーゼ遺伝子由来；例えば、Ｆ．オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ遺伝子（米国特許第４，２８８，６２７号明細書）、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｐａｃＡ遺伝子、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ遺伝子、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）中性メタロプロテアーゼ遺伝子、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスペルギロペプシンプロテアーゼｐｅｐＡ遺伝子、又はＦ．ベネナツム（Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）トリプシン遺伝子、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐＢ遺伝子由来のプロモーター、又はその機能部分である。他の好ましいプロモーターは、参照により本明細書に援用される国際公開第２００６／０９２３９６号パンフレ���ト及び国際公開第２００５／１００５７３号パンフレットに記載されるプロモーターである。
【０１２２】
対象組換えポリペプチドが、２個以上のポリペプチド（の部分）からなるキメラポリペプチドであるとき、当業者には、当該技術分野において公知の方法を用いてそれらの及び他のキメラポリヌクレオチドコンストラクトを構築する方法は周知である。
【０１２３】
発現及び／又は翻訳を促進するため、本発明に係るポリヌクレオチド又は核酸コンストラクトは、本発明のポリヌクレオチドがインビトロでの、又は原核若しくは真核宿主細胞中での発現及び／又は翻訳に適切な制御配列に作動可能に連結されるように発現ベクター中に含まれてもよい。
【０１２４】
組換え発現ベクターは、好都合に組換えＤＮＡ手順に供することができ、且つポリペプチドをコードする核酸配列の発現をもたらすことのできる任意のベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）であってもよい。ベクターの選択は、典型的にはベクターを導入する宿主細胞とのベクターの適合性に依存し得る。ベクターは直鎖状プラスミドであっても、又は閉環状プラスミドであってもよい。ベクターは自己複製ベクター、すなわち染色体外エンティティとして存在し、その複製が染色体の複製とは独立しているベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体であってもよい。自己維持されるクローニングベクターは、ＡＭＡ１配列を含み得る（例えばＡｌｅｋｓｅｎｋｏ及びＣｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ（１９９７年）、Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．２１：３７３〜３９７頁を参照のこと）。
【０１２５】
或いは、ベクターは、宿主細胞に導入されるとゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた１つ又は複数の染色体と共に複製されるものであってもよい。組込みクローニングベクターは、宿主細胞の染色体においてランダムに、又は所定の標的遺伝子座に組み込まれ得る。本発明の好ましい実施形態において、組込みクローニングベクターは、所定の遺伝子座へのクローニングベクターの組込みが標的化されるよう宿主細胞のゲノム内の所定の標的遺伝子座にＤＮＡ配列と相同なＤＮＡ断片を含む。標的組込みを促進するため、クローニングベクターは好ましくは細胞の形質転換前に直鎖化される。直鎖化は、好ましくは、クローニングベクターの少なくとも一方、但し好ましくは両側に標的遺伝子座と相同な配列が隣接するように実施される。標的遺伝子座が隣接する相同配列の長さは、好ましくは少なくとも３０ｂｐ、好ましくは少なくとも５０ｂｐ、好ましくは少なくとも０．１ｋｂ、さらに好ましくは少なくとも０．２ｋｂ、より好ましくは少なくとも０．５ｋｂ、さらにより好ましくは少なくとも１ｋｂ、最も好ましくは少なくとも２ｋｂである。好ましくは、宿主細胞のゲノムへの標的組込み、すなわち所定の標的遺伝子座における組込みの効率は、宿主細胞の相同組換え能力を増強することにより高められる。細胞のかかる表現型には、好ましくは、国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットに記載されるとおりの欠損したｋｕ７０遺伝子が関与する。国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットは、高効率の標的組込みを含む糸状菌細胞を得るための好ましい方法を開示している。好ましくは、標的遺伝子座と相同なクローニングベクター中の相同フランキングＤＮＡ配列は、高度に発現する遺伝子座から誘導され、これは、配列が宿主細胞中での高発現レベルが可能な遺伝子から誘導されることを意味する。高発現レベルが可能な遺伝子、すなわち高度に発現する遺伝子は、本明細書では、例えば誘導条件下でそのｍＲＮＡが全細胞ｍＲＮＡの少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）を構成し得る遺伝子か、或いは、その遺伝子産物が全細胞タンパク質の少なくとも１％（ｗ／ｗ）を構成できるか、若しくは分泌遺伝子産物の場合、少なくとも０．１ｇ／ｌのレベルまで分泌される可能性のある遺伝子として定義される（欧州特許第３５７  １２７  Ｂ１号明細書に記載されるとおり）。いくつもの好ましい高度に発現する真菌遺伝子が、例として挙げられる：アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）又はトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）由来のアミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、キシラナーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ又はセロビオヒドロラーゼ（ｃｂｈ）遺伝子。こうした目的に最も好ましい高度に発現する遺伝子は、グルコアミラーゼ遺伝子、好ましくはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ遺伝子、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）タカアミラーゼ遺伝子、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡ遺伝子、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ遺伝子、好ましくはｃｂｈ１である。
【０１２６】
遺伝子産物の産生を増加させるため、１個より多い核酸配列コピーが細胞に挿入されてもよい。これは、好ましくはＤＮＡ配列のそのゲノムコピーへの組込みにより、より好ましくは前段落に定義した高度に発現する遺伝子座の１つにおけるＤＮＡ配列の組込みを標的化することにより行われ得る。或いは、これは、核酸配列と共に増幅可能な選択可能マーカー遺伝子を含めることにより行うことができ、ここでは選択可能マーカー遺伝子の増幅されたコピー、従って核酸配列のさらなるコピーを含む細胞を、適切な選択可能薬剤の存在下で細胞を培養することにより選択することができる。ＤＮＡ配列のコピー数をさらに増加させて過剰発現させるには、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに記載されるとおりの遺伝子変換の技法を用いることができる。
【０１２７】
ベクター系は、単一のベクター若しくはプラスミド、又は宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを一体として含む２個以上のベクター若しくはプラスミド、又はトランスポゾンであってもよい。
【０１２８】
ベクターは、好ましくは１つ又は複数の選択可能マーカーを含み、それにより形質転換細胞の容易な選択が可能となる。選択可能マーカーは、産物が殺生物剤又はウイルス耐性、重金属耐性、栄養要求体に対して原栄養性などを提供する遺伝子である。糸状菌細胞において使用される選択可能マーカーは、限定はされないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｂｌｅＡ（フレオマイシン結合）、ｈｙｇＢ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、並びに他の種由来の均等物を含む群から選択されてもよい。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及びペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）細胞における使用においては、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はＡ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のａｍｄＳ（欧州特許第６３５５７４  Ｂ１号明細書、国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）及びｐｙｒＧ遺伝子及びストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のｂａｒ遺伝子が好ましい。より好ましくは、ａｍｄＳ遺伝子が使用され、さらにより好ましくはＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のａｍｄＳ遺伝子が使用される。最も好ましい選択マーカー遺伝子は、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡプロモーターに融合したＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳコード配列である（欧州特許第６３５５７４  Ｂ１号明細書を参照のこと）。他の好ましいＡｍｄＳマーカーは、国際公開第２００６／０４０３５８号パンフレットに記載されるものである。他の糸状菌由来のＡｍｄＳ遺伝子もまた使用することができる（国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）。
【０１２９】
上記に記載されるエレメントをライゲートして本発明の組換え発現ベクターを構築するために用いられる手順は、当業者に公知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、上記を参照のこと）。
【０１３０】
第４の態様において、本発明は、本発明の第３の態様に係る発現コンストラクトを含むか、又は本発明の第３の態様に係る発現ベクターを含む組換え糸状菌宿主細胞に関する。前記糸状菌宿主細胞は、好ましくは本明細書において先述したとおりの細胞である。前記糸状菌宿主細胞は、当該技術分野において公知の方法を用いて構築することができる。好ましくは、前記糸状菌宿主細胞は、
−  好適な糸状菌宿主細胞を提供するステップと、
−  本発明の第３の態様に係る発現コンストラクトにより、又は本発明の第３の態様に係る発現ベクターにより、前記宿主細胞を形質転換するステップと、
を含む方法により構築される。
【０１３１】
糸状菌宿主細胞の形質転換は、好ましくは本明細書において先述したとおり実施される。
【０１３２】
第５の態様において、本発明は、対象組換えポリペプチドを産生するための本発明に係るシグナルペプチドの使用に関する。
【０１３３】
従って、シグナルペプチドは、好ましくは
ａ）配列番号２５、
ｂ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｄ）配列番号３９、
ｅ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｆ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｇ）配列番号４４、
ｈ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｉ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｊ）配列番号３４、
ｋ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｌ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
からなる群から選択される。
【０１３４】
ある実施形態によれば、シグナルペプチドは配列番号２５である。
【０１３５】
別の実施形態によれば、中間産物において、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。
【０１３６】
別の実施形態によれば、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体である。
【０１３７】
別の実施形態によれば、シグナルペプチドは配列番号３９である。
【０１３８】
別の実施形態によれば、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。
【０１３９】
別の実施形態によれば、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体である。
【０１４０】
別の実施形態によれば、シグナルペプチドは配列番号４４である。
【０１４１】
別の実施形態によれば、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。
【０１４２】
別の実施形態によれば、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体である。
【０１４３】
別の実施形態によれば、シグナルペプチドは配列番号３４である。
【０１４４】
別の実施形態によれば、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。
【０１４５】
別の実施形態によれば、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体である。
【０１４６】
好ましくは、シグナルペプチドが
（ａ）：配列番号２５、
（ｂ）：少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、又は
（ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
であるとき、対象ポリペプチドはペクチンメチルエステラーゼではなく、より好ましくは、対象ポリペプチドはエルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来のペクチンメチルエステラーゼではない。より好ましくは、シグナルペプチドが（ｂ）又は（ｃ）であるとき、対象ポリペプチドはペクチンメチルエステラーゼではなく、さらにより好ましくは、対象ポリペプチドはエルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来のペクチンメチルエステラーゼではない。
【０１４７】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである変異体は、少なくとも９アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。より好ましくは、１０アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである。
【０１４８】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体は、
ａ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は４位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｂ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、且つ３位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は４位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置のアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ及びＡｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｄ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、且つ３位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置のアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ及びＡｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
の群から選択されるものである。
【０１４９】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである変異体は、少なくとも９アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。より好ましくは、１０アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである。
【０１５０】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体は、
ａ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は５位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｂ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、且つ５位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
の群から選択されるものである。
【０１５１】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体は、少なくとも９アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。より好ましくは、１０アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである。
【０１５２】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体は、
ａ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は４位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｂ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、且つ４位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
の群から選択されるものである。
【０１５３】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体は、少なくとも９アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。より好ましくは、１０アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである。
【０１５４】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体は、
ａ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は４位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｂ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、且つ３及び／又は４位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は４位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置のアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ及びＡｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｄ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、且つ３及び／又は４位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置のアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ及びＡｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｅ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｆ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置のアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ及びＡｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｇ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置におけるアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ、Ａｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｈ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも５個のＡｌａを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｉ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも４個のＡｌａと１個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｊ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも３個のＡｌａと２個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｋ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも２個のＡｌａと３個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｌ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも１個のＡｌａと４個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｍ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも５個のＬｅｕを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｎ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｏ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置におけるアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ、Ａｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｐ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも５個のＡｌａを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｑ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも４個のＡｌａと１個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｒ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも３個のＡｌａと２個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｓ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも２個のＡｌａと３個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｔ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも１個のＡｌａと４個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｕ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも５個のＬｅｕを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
の群から選択されるものである。
【０１５５】
以上の配列番号２５の（ａ）〜（ｄ）、配列番号３９の（ａ）及び（ｂ）、配列番号４４の（ａ）及び（ｂ）並びに配列番号３４の（ａ）〜（ｕ）の変異体において、連続ストレッチは、好ましくは１０アミノ酸、より好ましくは９アミノ酸、さらにより好ましくは８アミノ酸、及び最も好ましくは７アミノ酸である。
【０１５６】
以上の配列番号２５の（ａ）〜（ｄ）、配列番号３９の（ａ）及び（ｂ）、配列番号４４の（ａ）及び（ｂ）並びに配列番号３４の（ａ）〜（ｕ）の変異体において、アミノ酸の連続ストレッチは、好ましくはＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸、より好ましくはＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも６アミノ酸、及び最も好ましくはＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも７アミノ酸を含む。
【０１５７】
１５〜２３アミノ酸の配列番号２５、配列番号３９、配列番号４４、又は配列番号３４の変異体は、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、２０アミノ酸、２１アミノ酸、２２アミノ酸又は２３アミノ酸を含み得る。
【０１５８】
第６の態様において、本発明は、対象組換えポリペプチドを産生するための本発明に係るシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用に関する。従って、シグナルペプチドは、好ましくは
ａ）配列番号２５、
ｂ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｄ）配列番号３９、
ｅ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｆ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｇ）配列番号４４、
ｈ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｉ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｊ）配列番号３４、
ｋ）少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｌ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
からなる群から選択される。
【０１５９】
ある実施形態によれば、シグナルペプチドは配列番号２５である。
【０１６０】
別の実施形態によれば、中間産物において、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。
【０１６１】
別の実施形態によれば、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体である。
【０１６２】
別の実施形態によれば、シグナルペプチドは配列番号３９である。
【０１６３】
別の実施形態によれば、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。
【０１６４】
別の実施形態によれば、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体である。
【０１６５】
別の実施形態によれば、シグナルペプチドは配列番号４４である。
【０１６６】
別の実施形態によれば、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。
【０１６７】
別の実施形態によれば、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体である。
【０１６８】
別の実施形態によれば、シグナルペプチドは配列番号３４である。
【０１６９】
別の実施形態によれば、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。
【０１７０】
別の実施形態によれば、シグナルペプチドは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体である。
【０１７１】
好ましくは、シグナルペプチドが
（ａ）：配列番号２５、
（ｂ）：少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、又は
（ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
であるとき、対象ポリペプチドはペクチンメチルエステラーゼではなく、より好ましくは、対象ポリペプチドはエルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来のペクチンメチルエステラーゼではない。より好ましくは、シグナルペプチドが（ｂ）又は（ｃ）であるとき、対象ポリペプチドはペクチンメチルエステラーゼではなく、さらにより好ましくは、対象ポリペプチドはエルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来のペクチンメチルエステラーゼではない。
【０１７２】
好ましくは、配列番号２５をコードするときの第１のポリヌクレオチドは、配列番号２９に係るポリヌクレオチドである。好ましくは、配列番号３９をコードするときの第１のポリヌクレオチドは、配列番号３８に係るポリヌクレオチドである。好ましくは、配列番号４４をコードするときの第１のポリヌクレオチドは、配列番号４３に係るポリヌクレオチドである。好ましくは、配列番号３４をコードするときの第１のポリヌクレオチドは、配列番号３３に係るポリヌクレオチドである。
【０１７３】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである変異体は、少なくとも９アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。より好ましくは、１０アミノ酸が対応位置における配列番号２５の最初の１０アミノ酸と同じである。
【０１７４】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体は、
ａ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は４位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｂ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、且つ３位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は４位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置のアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ及びＡｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
ｄ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、且つ３位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置のアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ及びＡｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号２５の変異体、
の群から選択されるものである。
【０１７５】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである変異体は、少なくとも９アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。より好ましくは、１０アミノ酸が対応位置における配列番号３９の最初の１０アミノ酸と同じである。
【０１７６】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体は、
ａ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は５位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
ｂ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、且つ５位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３９の変異体、
の群から選択されるものである。
【０１７７】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体は、少なくとも９アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。より好ましくは、１０アミノ酸が対応位置における配列番号４４の最初の１０アミノ酸と同じである。
【０１７８】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体は、
ａ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は４位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
ｂ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、且つ４位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号４４の変異体、
の群から選択されるものである。
【０１７９】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体であって、少なくとも８アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体は、少なくとも９アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである変異体である。より好ましくは、１０アミノ酸が対応位置における配列番号３４の最初の１０アミノ酸と同じである。
【０１８０】
好ましくは、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体であって、１位のアミノ酸がＭｅｔであり、且つ２位のアミノ酸がＶａｌ又はＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む変異体は、
ａ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は４位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｂ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、且つ３及び／又は４位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｃ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２、３及び／又は４位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置のアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ及びＡｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｄ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、且つ３及び／又は４位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置のアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ及びＡｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｅ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｆ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置のアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ及びＡｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｇ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置におけるアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ、Ａｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｈ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも５個のＡｌａを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｉ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも４個のＡｌａと１個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｊ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも３個のＡｌａと２個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｋ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも２個のＡｌａと３個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｌ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも１個のＡｌａと４個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｍ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＶａｌであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも５個のＬｅｕを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｎ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｏ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチがＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸を含み、及び変異体の最後の３つの位置におけるアミノ酸がＡｌａ、Ｌｅｕ、Ａｌａである、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｐ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも５個のＡｌａを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｑ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも４個のＡｌａと１個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｒ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも３個のＡｌａと２個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｓ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも２個のＡｌａと３個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｔ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも１個のＡｌａと４個のＬｅｕとを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
ｕ）１位のアミノ酸がＭｅｔであり、２位のアミノ酸がＬｙｓであり、及び１０アミノ酸の連続ストレッチが少なくとも５個のＬｅｕを含む、１５〜２３アミノ酸の配列番号３４の変異体、
の群から選択されるものである。
【０１８１】
以上の配列番号２５の（ａ）〜（ｄ）、配列番号３９の（ａ）及び（ｂ）、配列番号４４の（ａ）及び（ｂ）並びに配列番号３４の（ａ）〜（ｕ）の変異体において、連続ストレッチは、好ましくは１０アミノ酸、より好ましくは９アミノ酸、さらにより好ましくは８アミノ酸、及び最も好ましくは７アミノ酸である。
【０１８２】
以上の配列番号２５の（ａ）〜（ｄ）、配列番号３９の（ａ）及び（ｂ）、配列番号４４の（ａ）及び（ｂ）並びに配列番号３４の（ａ）〜（ｕ）の変異体において、アミノ酸の連続ストレッチは、好ましくはＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも５アミノ酸、より好ましくはＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも６アミノ酸、及び最も好ましくはＡｌａ又はＬｅｕから選択される少なくとも７アミノ酸を含む。
【０１８３】
１５〜２３アミノ酸の配列番号２５、配列番号３９、配列番号４４、又は配列番号３４の変異体は、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、２０アミノ酸、２１アミノ酸、２２アミノ酸又は２３アミノ酸を含んでもよい。
【０１８４】
本明細書に提供されるとおりの配列情報は、誤って同定された塩基の包含を必要とするほど狭義に解釈されてはならない。本明細書に開示される特定の配列は、簡単にそれぞれの宿主細胞からの完全な遺伝子の単離に使用することができ、次に容易にそれをさらなる配列解析に供することによって配列決定の誤りを特定することができる。
【０１８５】
特に指示されない限り、本明細書においてＤＮＡ分子を配列決定することにより決定される全てのヌクレオチド配列は、自動ＤＮＡシーケンサーを使用して決定したものであり、及び本明細書において決定されるＤＮＡ分子によりコードされるポリペプチドの全てのアミノ酸配列は、上記のとおり決定された核酸配列の翻訳により予測した。従って、この自動化された手法により決定される任意のＤＮＡ配列について当該技術分野で公知のとおり、本明細書において決定される任意のヌクレオチド配列が、いくらかの誤りを含み得る。自動化により決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列と典型的には少なくとも約９０％同一であり、より典型的には少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該技術分野において公知の手動によるＤＮＡ配列決定方法を含めた他の手法により、より正確に決定することができる。同様に当該技術分野において公知のとおり、決定されたヌクレオチド配列に実際の配列と比較して単一の挿入又は欠失があると、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトが起こることがあり、従って決定されたヌクレオチド配列によりコードされる予想アミノ酸配列は、かかる挿入又は欠失を起点として、配列決定されたＤＮＡ分子により実際にコードされるアミノ酸配列と全く異なり得る。
【０１８６】
当業者は、かかる誤って同定された塩基を特定することができ、及びかかる誤りの修正方法を知っている。
【０１８７】
本明細書に含まれる具体的な実施形態は本発明のいくつかの態様の例示として意図されるため、それらの実施形態によって本明細書に記載及び特許請求される本発明の範囲が限定されるものではない。任意の均等な実施形態が、本発明の範囲内にあることが意図される。実際、本明細書に図示及び記載されるものに加え、本発明の様々な変形例が、前述の説明から当業者には明らかとなるであろう。かかる変形例もまた、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。対立がある場合、定義を含む本開示が指針とみなされる。
【０１８８】
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。
【０１８９】
［実施例］
［株］
ＷＴ  １：このＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株は野生型株として使用する。この株は、寄託番号ＣＢＳ  ５１３．８８としてＣＢＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託されている。
【０１９０】
ＷＴ  ２：このＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株は、グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）をコードする遺伝子の欠失を含むＷＴ  １株である。ＷＴ  ２は、欧州特許第０  ６３５  ５７４  Ｂ１号明細書に記載されるとおりの「マーカー遺伝子フリー」手法を用いることにより構築した。この特許には、ＣＢＳ  ５１３．８８のゲノム中のｇｌａＡ特異的ＤＮＡ配列を欠失させる方法についての広範な記載がなされている。この手順により、最終的には外来ＤＮＡ配列を一切有しないマーカー遺伝子フリーΔｇｌａＡ組換えＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ  ５１３．８８株が得られた。
【０１９１】
ＷＴ  ３：このＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株は、シュウ酸欠損Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株をもたらす欠失を含むＷＴ  ２株である。ＷＴ  ３は、欧州特許第１１５７１００号明細書及び米国特許第６，９３６，４３８号明細書に記載されるとおりの方法を用いることにより構築し、ここでシュウ酸欠損株は、オキサロ酢酸ヒドロラーゼをコードするｏａｈＡ遺伝子を欠失させることにより得られ、ＷＴ  ３株はＷＴ  ２株バックグラウンドにおいてｏａｈＡ遺伝子が不活化された代表株として選択した。或いは、欧州特許第１５９０４４４号明細書には、シュウ酸欠損突然変異Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株のスクリーニング方法について広範な記載がなされている。欧州特許第１５９０４４４号明細書の実施例１及び２の後に、ＷＴ  ２のシュウ酸欠損突然変異株をどのように得ることができるかが記載されている。
【０１９２】
ＷＴ  ４：このＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株は、３つの連続するステップでα−アミラーゼをコードする３個の遺伝子（ａｍｙＢ、ａｍｙＢＩ及びａｍｙＢＩＩ）の欠失を含むＷＴ  ３株である。これらの３個の遺伝子の欠失ベクター及びゲノム欠失の構築については、国際公開第２００５０９５６２４号パンフレットに詳細に記載されている。国際公開第２００５０９５６２４号パンフレットに記載されるベクターｐＤＥＬ−ＡＭＹＡ、ｐＤＥＬ−ＡＭＹＢＩ及びｐＤＥＬ−ＡＭＹＢＩＩは、欧州特許第０  ６３５  ５７４  Ｂ１号明細書に記載されるとおりの「マーカー遺伝子フリー」手法に従い使用されている。上記の手順により、最終的には外来ＤＮＡ配列を一切有しないシュウ酸欠損マーカー遺伝子フリーΔｇｌａＡ、ΔａｍｙＡ、ΔａｍｙＢＩ及びΔａｍｙＢＩＩアミラーゼ陰性組換えＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ  ５１３．８８株が得られた。従って、ＷＴ  ４はアミラーゼバックグラウンドが低く、ＷＴ  １と比較してα−アミラーゼ発現及び発現検出に対してより最適化されている。
【０１９３】
［分子生物学的技法］
これらの株において、当業者に公知の分子生物学的技法を用いて（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、２００１年を参照のこと）、いくつかの遺伝子を過剰発現させ、他の遺伝子は以下に記載されるとおり下方制御した。遺伝子過剰発現用の発現ベクター及び下方制御用の破壊ベクターの一般的な設計、形質転換、マーカー及び選択培地の使用の例は、国際公開第１９９８４６７７２号パンフレット、国際公開第１９９９３２６１７号パンフレット、国際公開第２００１１２１７７９号パンフレット、国際公開第２００５０９５６２４号パンフレット、欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書及び国際公開第２００５１００５７３号パンフレットに見ることができる。
【０１９４】
［Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）振盪フラスコ発酵］
国際公開第９９／３２６１７号パンフレットの実施例「アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）振盪フラスコ発酵」の節に記載されるとおり、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株を２０ｍｌの前培養培地中で前培養する。一晩増殖させた後、この培養物の１０ｍｌを発酵培地（ＦＭ）に移す。
【０１９５】
発酵培地（ＦＭ）は１リットル当たり以下を含む：８２．５ｇのグルコース．１Ｈ２Ｏ、２５ｇのＭａｌｄｅｘ  １５（Ｂｏｏｍ  Ｍｅｐｐｅｌ、オランダ）、２ｇのクエン酸、４．５ｇのＮａＨ２ＰＯ４．１Ｈ２Ｏ、９ｇのＫＨ２ＰＯ４、１５ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０２ｇのＺｎＣｌ２、０．１ｇのＭｎＳＯ４．１Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇのＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇのＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、１ｇのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．３ｇのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、３０ｇのＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）、ｐＨ＝６。
【０１９６】
ＦＭ中での発酵は、概して国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載されるとおり、１００ｍｌの発酵ブロスを含む５００ｍｌのバッフル付きフラスコ内において３４℃及び１７０ｒｐｍで指示される日数にわたり実施する。
【０１９７】
［真菌α−アミラーゼ活性］
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）培養ブロス中のα−アミラーゼ活性を決定するため、Ｍｅｇａｚｙｍｅ穀物α−アミラーゼキットを供給業者のプロトコルに従い使用する（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、ＣＥＲＡＬＰＨＡ  αアミラーゼアッセイキット、カタログ参照番号Ｋ−ＣＥＲＡ、２０００〜２００１年）。計測される活性は、過剰なグルコアミラーゼ及びα−グルコシダーゼの存在下における非還元末端がブロックされたρ−ニトロフェニルマルトヘプタオシドの加水分解に基づく。形成されたρ−ニトロフェノールの量が、試料中に存在するα−アミラーゼ活性の尺度となる。
【０１９８】
［グルコースオキシダーゼ活性］
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）培養ブロス中のグルコースオキシダーゼ活性を決定するため、Ｗｉｔｔｅｖｅｅｎら  １９９０年（「アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のグルコースオキシダーゼ過剰発現及びネガティブ変異体（Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）」、Ａｐｐ１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３３：６８３〜６８６頁）により記載されるとおりο−ジアニシジンを使用した４５０ｎｍでの分光測定によりグルコースオキシダーゼを計測した。
【０１９９】
［実施例１．Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−アミラーゼＡｍｙＢ及びＰ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）グルコースオキシダーゼｇｏｘＡについての修飾アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）発現コンストラクトの構築］
α−アミラーゼタンパク質をコードするａｍｙＢ遺伝子のＤＮＡ配列は、ＥＭＢＬヌクレオチド配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｌ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）から受託番号ＸＭ＿００１３９５７１２．１、ＸＭ＿００１３９０７４１．１又はＣＡＫ４６３２４に基づき検索することができる。天然Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ａｍｙＢ遺伝子のゲノム配列は、配列番号１として示される。対応するａｍｙＢのコード配列又はｃＤＮＡ配列は、配列番号２として示される。配列番号２の翻訳配列は配列番号３として指定され、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−アミラーゼタンパク質ＡｍｙＢを表す。この配列はまた、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）α−アミラーゼタンパク質と１００％の類似度を有する（Ｗｉｒｓｅｌ  Ｓ．、Ｌａｃｈｍｕｎｄ  Ａ．、Ｗｉｌｄｈａｒｄｔ  Ｇ．、Ｒｕｔｔｋｏｗｓｋｉ  Ｅ．、「アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の３個のα−アミラーゼ遺伝子は同一のイントロン−エクソン構成を示す（Ｔｈｒｅｅ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｉｎｔｒｏｎ−ｅｘｏｎ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）」（１９８９年）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：３１４頁）。天然の分泌Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）成熟α−アミラーゼペプチドは、配列番号４として指定される。本発明の方法による最適化は、以下に詳述するとおり最適化ａｍｙＢ  ｃＤＮＡ配列及び改良型発現ベクターにより実施している。
【０２００】
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ａｍｙＢコンストラクトの変異体のアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種における発現解析のため、ａｍｙＢコード配列は、α−アミラーゼをコードするａｍｙＢ遺伝子に対するコドン最適化（ＣＯ）コード配列を含んだ（国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットに詳細に記載されるとおり）。強力なＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼｇｌａＡプロモーター及びα−アミラーゼａｍｙＢプロモーターの双方を、ｐＧＢＦＩＮベースの発現コンストラクトを使用したＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）におけるαアミラーゼ酵素の過剰発現に適用した（国際公開第１９９９／３２６１７号パンフレット及び国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットに記載されるとおり）。グルコアミラーゼｇｌａＡ及びα−アミラーゼａｍｙＢプロモーターの翻訳開始配列は、続いて生成される全てのａｍｙＢ発現コンストラクトにおいて５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ  ＡＴＧ−３’となるよう修飾している（同様に国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットに詳述されるとおり）。天然α−アミラーゼａｍｙＢプロモーターに存在するＢｓｔＸＩ部位（５’ＣＣＡＮＮＮＮＮ／ＮＴＧＧ−３’）は、一部のベクターではシグナル配列変異体のクローニングを促進するため取り除いた。加えて、最適な翻訳終結配列を使用し、従って全ての発現コンストラクトで野生型ａｍｙＢ  ５’−ＴＧＡ−３’翻訳終結配列を５’−ＴＡＡＡ−３’に置き換えた（国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットに詳述されるとおり）。
【０２０１】
適切な制限部位を両末端に導入し、発現ベクターにおけるクローニングを可能にした。５’末端にＸｈｏＩ部位を導入し、３’末端にＰａｃＩ部位を導入した。修飾ゲノムｇｌａＡ又はａｍｙＢプロモーターと最適化ａｍｙＢ  ｃＤＮＡ配列とを含む参照コンストラクトのＤＮＡ断片を完全に合成し、サブクローニングし、配列解析により配列を確認した。２つの合成断片の末端にあるＸｈｏＩ−ＰａｃＩ制限部位を使用して、大型ベクター断片のＸｈｏＩ及びＰａｃＩ消化ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−１発現ベクターにおけるクローニングを可能にし（ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−１ベクターはまた、国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレット及び国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットにも記載があり、ベクターの概略的なレイアウトについては図１を参照のこと）、それぞれｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−６及びｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−３を生成した。
【０２０２】
本発明の方法に係るシグナル配列が特に異なる、修飾ＡｍｙＢ配列の全てのＤＮＡ断片を設計し、ＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ断片又はＥｃｏＲＩ−ＢｓｔＸＩ断片として完全に合成し、サブクローニングして配列を確認した。全ての合成断片の末端にあるＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ／ＢｓｔＸＩ制限部位を使用して、大型ベクター断片のＥｃｏＲＩ及びＰａｃＩ／ＢｓｔＸＩ消化ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−３又はＥｃｏＲＩ及びＰａｃＩ消化ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−６発現ベクターにおけるクローニングを可能にし、変異体ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ発現ベクターを生成した。それぞれのベクターの配列を確認した後、変異発現コンストラクトを以下の表１及び表２に記載するとおり命名した。全てのｐＧＢＦＩＮＦＵＡコンストラクトの全ての特徴及びそれぞれの配列に対する参照は、表１及び表２から推定され得る。
【０２０３】
【表１】
2012524530.tif 000003
【０２０４】
本明細書における実施例１の全ての表中では、全てのｐＧＢＦＩＮプラスミドのＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ部分の配列が「配列番号」に示され、完全な遺伝子コード配列及びそのコード配列の翻訳配列が、それぞれ「コード配列の配列番号」及び「タンパク質の配列番号」に示されるとおりのアミノ酸配列に従い、及び使用されるシグナル配列のヌクレオチド及び翻訳されたアミノ酸配列が、「シグナル配列コード配列の配列番号」及び「アミノ酸シグナル配列の配列番号」に示される。ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−６及び誘導されたベクターの概略レイアウトは図２に見ることができ、一方、ベクターｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−１、ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−３及びｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−２１のレイアウトは図１に見ることができる。
【０２０５】
【表２】
2012524530.tif 000004
【０２０６】
遺伝子コードＰｃ２０ｇ０９５６０の、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）グルコースオキシダーゼタンパク質をコードするｇｏｘＡ遺伝子のＤＮＡ配列は、ＥＭＢＬヌクレオチド配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｌ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）から受託番号ＡＭ９２０４３５．１に基づき検索することができる。Ｐｃ２０ｇ０９５６０の翻訳配列は配列番号４９として指定され、これはＰ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）グルコースオキシダーゼタンパク質ＧｏｘＡに相当する。
【０２０７】
上記に詳述したとおりの改良型発現ベクターによりｇｏｘＡ遺伝子又は遺伝子断片の発現を実施したとともに、配列番号４８として特定され得るコドン対最適化ｇｏｘＡ  ｃＤＮＡ配列により本発明の方法に係る最適化を実施している。
【０２０８】
本発明の方法に係るシグナル配列が特に異なり、且つｇｌａＡプロモーターの部分及び最適化ＧｏｘＡ  ｃＤＮＡ配列を特に含む、修飾ＧｏｘＡコンストラクトの２個のＤＮＡ断片を設計し、ＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ断片として完全に合成し、サブクローニングして配列を確認した。合成断片の末端にあるＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ制限部位を使用して大型ベクター断片のＥｃｏＲＩ及びＰａｃＩ消化ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−６発現ベクターにおけるクローニングを可能にし、変異体ｐＧＢＦＩＮＧＯＸ発現ベクターを生成した。それぞれのベクターの配列を確認した後、変異発現コンストラクトを以下の表３に記載するとおり命名した。２個のｐＧＢＦＩＮＧＯＸコンストラクトの全ての特徴及びそれぞれの配列に対する参照は、表３から推定され得る。
【０２０９】
【表３】
2012524530.tif 000005
【０２１０】
［実施例２．Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）におけるＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−アミラーゼ及びＰ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）グルコースオキシダーゼについての野生型及び修飾発現コンストラクトの発現］
実施例１（上記）で調製したｐＧＢＦＩＮＦＵＡ及びｐＧＢＦＦＩＮＧＯＸ発現コンストラクトを、以下に記載されるとおりの形質転換により、及び図３に図示される戦略に従い、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）に導入した。
【０２１１】
異なるｐＧＢＦＩＮＦＵＡベクター（表１及び表２）及び２つの異なるｐＧＢＦＩＮＧＯＸベクター（表３）をＷＴ  ４に導入するため、国際公開第１９９８／４６７７２号パンフレット及び国際公開第１９９９／３２６１７号パンフレットに記載されるとおり形質転換及び続く形質転換体の選択を行った。要約すれば、ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ及びｐＧＢＦＩＮＧＯＸコンストラクトの直鎖状ＤＮＡを単離し、それを使用してＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＷＴ４を形質転換した。形質転換体をアセトアミド培地上で選択し、標準的手順に従いコロニーを精製した。コロニーは、ｇｌａＡ遺伝子座における組込み及びコピー数についてＰＣＲを用いて診断した。同様の推定コピー数（推定単一コピー）を有する各ｐＧＢＦＩＮＦＵＡコンストラクトの３個の独立した形質転換体を選択し、形質転換プラスミドの番号を用いて、例えばそれぞれＦＵＡ−３−１、ＦＵＡ−３−２、ＦＵＡ−３−３、ＦＵＡ−６−１等のように命名した。
【０２１２】
同様に、同様の推定コピー数（推定単一コピー）を有する各ｐＧＢＦＩＮＧＯＸコンストラクトの５個の独立した形質転換体を選択し、形質転換プラスミドの番号を用いて、例えばそれぞれＧＯＸ−１−１、ＧＯＸ−１−２、ＧＯＸ−１−３、．．．、ＧＯＸ−２−１、ＧＯＸ−２−２、ＧＯＸ−２−３等のように命名した。
【０２１３】
選択したＦＵＡ株及びＧＯＸ株及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＷＴ  １及びＷＴ  ４を使用して、５００ｍｌのバッフル付き振盪フラスコを用いるインキュベーターシェーカーにおいて上記に記載したとおりの１００ｍｌの培地中、３４℃及び１７０ｒｐｍで振盪フラスコ実験を実施した。発酵の３日目及び４日目又は４日目及び５日目の後、試料を採取し、それぞれα−アミラーゼ活性又はグルコースオキシダーゼ活性を決定した。
【０２１４】
異なるコンストラクトを含む異なるＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＦＵＡ形質転換体の形質転換体により産生されるα−アミラーゼの産生を、培養上清中で計測した。コドン対最適化を伴う、若しくは伴わない内因性ａｍｙＢシグナル配列の使用、又は最適化グルコアミラーゼシグナル配列の使用については、α−アミラーゼ産生及び発現に対する正の効果を認めることはできなかった。意外にも、グルコアミラーゼプロモーターを使用するとき、図４で確認することができるとおりα−アミラーゼ産生に対する本発明の修飾及び最適化されたシグナル配列の使用の明らかな正の効果が観察された。本発明の複数の最適シグナル配列がα−アミラーゼの産生に対して正の効果を示し、ペクチンメチルエステラーゼ（すなわちｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−１２／１３におけるｐｍｅＡ）が最良である。図５においても、同様にα−アミラーゼ産生に対する本発明のｐｍｅＡシグナル配列の使用の明らかな正の効果が、α−アミラーゼＡｍｙＢプロモーターとの組み合わせで観察された。
【０２１５】
Ｐ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）グルコースオキシダーゼＧｏｘＡの産生を、２つの異なるＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＧＯＸ形質転換体の５個の形質転換体において計測した。ここでもまた、図６で確認することができるとおり、グルコースオキシダーゼ産生に対する本発明のシグナル配列（すなわちｐｍｅＡ）の使用の明らかな正の効果が観察された。
【０２１６】
このように、強力なα−アミラーゼＡｍｙＢ及びグルコアミラーゼｇｌａＡプロモーターとの組み合わせで、本発明の方法に係る最適シグナル配列及びより具体的にはｐｍｅＡシグナル配列の使用についての正の効果が認められた。また、ｇｏｘＡグルコースオキシダーゼをコードする酵素と融合した本発明の方法に係るｐｍｅＡシグナル配列は、細胞外ＧｏｘＡ酵素産生の明らかな増加をもたらした。加えて、本発明の方法を修飾翻訳開始部位、コドン最適化コード配列及び／又は翻訳終結配列と組み合わせることのα−アミラーゼ産生に対する正の効果が観察された。これらの結果は、明らかに、発現コンストラクトについて特定される他の配列最適化との本発明の修飾の相加的効果を示している。
【０２１７】
明らかにこれらの実施例は、どのように本発明の方法、例えば天然α−アミラーゼ又はグルコースオキシダーゼ配列と融合したｐｍｅＡシグナル配列を用いて、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）におけるα−アミラーゼ又はグルコースオキシダーゼ又は糸状菌における任意の他の対象タンパク質の分泌及び産生を改良することができるかを示す。加えて、これらの結果は、本発明の方法が宿主におけるタンパク質発現の改良に広範に適用できることを示すものであり、但し発現コンストラクト及び宿主は、例えば強力なプロモーター、改良された翻訳開始配列、改良された翻訳終結配列、最適化されたコドン及びコドン対使用頻度及び／又は改良されたタンパク質発現用宿主など、既にいくつかの他の最適化を有する。
【図１】
2012524530.tif 000006
【図２】
2012524530.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
2012524530.tif 000010
【図６】
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【配列表】
2012524530000001.app
【国際調査報告】
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