(57)【要約】  手術又は移植前の、例えば、肝臓、大動脈、消化管中、又は分娩の間にサンプリングされた胎児頭皮血液中の組織の低酸素状態の検出方法、試料から得られた血漿中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の総量を測定することを含む。この方法は、血漿及び／又は血液中のＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、乳酸の追加測定を含み得る。ＬＤＨ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、乳酸の１種以上の値の上昇は、胎児における低酸素状態の指標である。方法における、血漿分離装置の使用も開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の組織部位における低酸素状態の評価方法であって、下記：
ａ．組織部位から血液試料を集める工程（前記血液試料は血漿及び血球を含む）；
ｂ．血球から血漿を分離する工程；
ｃ．血漿中のＬＤＨの量を測定する工程；及び
ｄ．血漿中のＬＤＨ量から、組織部位における低酸素状態を評価する工程
を含む方法。
【請求項２】
基本的にＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸からなる群から選択される、血漿中の少なくとも１種の追加の予後マーカーの量を測定することを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
血液試料の容量が、５μＬ〜１５０μＬである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
血液試料の容量が、５μＬ〜２５μＬである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
血液試料の容量が、５μＬ〜１５μＬである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
血漿が膜を通過し、血球が膜に保持されるように、血漿が、半透性膜を用いて血球から分離される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
血液試料が、哺乳動物の腸から集められる、請求項１記載の方法。
【請求項８】
血液試料が医療処置の前に集められ、更に下記工程： 
ａ．医療処置の後に第二の血液試料を集める工程（前記血液試料は血漿及び血球を含む）；
ｂ．第二の血液試料の血球から血漿を分離する工程；及び
ｃ．第二の血液試料の血漿中のＬＤＨの総量を測定する工程
を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
基本的にＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸からなる群から選択される、両方の血液試料の血漿中の少なくとも１種の追加の予後マーカーの量を測定することを更に含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
血液試料中の予後マーカーの量を比較することを更に含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
医療処置が消化管の吻合を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
血液試料が、外科手術の間に哺乳動物の特定の器官、髄液、尿、又は腹腔内液の１種以上から集められる、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
器官が哺乳動物の大動脈を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
基本的にＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸からなる群から選択される、血液試料の血漿中の少なくとも１種の追加の予後マーカーの量を測定することを更に含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１種の予後マーカーが乳酸を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
血液試料が、前記器官を必要とする哺乳動物に移植される器官から集められる、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
血液試料が、移植手術の前に集められる、請求項１７記載の方法。
【請求項１８】
器官が肝臓を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
基本的にＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸からなる群から選択される、血漿中の少なくとも１種の追加の予後マーカーの量を測定することを更に含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
基本的にＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸からなる群から選択される、血漿中の少なくとも１種の追加の予後マーカーの量を測定することを更に含む、請求項２記載の方法。
【請求項２１】
予後マーカーの測定が、個体に哺乳動物の肝臓の健康を評価することを可能とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
低酸素状態の検出が、出生前仮死後の脳損傷の予測を可能にする、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
基本的にＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸からなる群から選択される、血漿中の少なくとも１種の追加の予後マーカーの量を測定することを更に含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
血漿中のＡＬＴの量を測定することを更に含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
血漿中のＬＤＨの測定が哺乳動物の脳における遅発性細胞死を示す、治療を必要とする動物に対する低体温療法を供給することを更に含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
血漿中のＬＤＨの総量の測定が、治療又は外科治療の前、最中又は後に哺乳動物の手足への血行の評価を可能にする、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
分娩の間に血液試料を集め、低酸素状態を検出するための少なくとも１種の指標を探すために血液試料を処理することを含む、胎児頭皮の血液中の急性低酸素状態の検出法であって、前記試料から得られる血漿中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の総量を測定することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
試料が５μＬ〜６０μＬである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
試料が５μＬ〜２５μＬである、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
試料が５μＬ〜１５μＬである、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
半透性膜及び／又はフィルターを用いて、血球から血漿を分離することを含む、請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
膜が、５ｍｍ２〜１０００ｍｍ２、好ましくは１００ｍｍ２未満の面積を有する、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
試料を含む膜の一方の表面を取り付け、膜の他の表面に陰圧を適用し、前記他の表面に面する区画中に血漿を集める工程を含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
前記区画からの血漿を、ＬＤＨの測定のための装置及び／又は機器に移動する工程を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記区画内に配置された血漿中のＬＤＨを測定する工程を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
前記膜が多孔質マトリクス上に配置されるか又は一体化されており、血漿が、毛細管力により引き込まれて移動する、請求項３１記載の方法。
【請求項３７】
マトリクス中のＬＤＨを測定する時間が付与された後、マトリクスから膜を除去する、請求項３６記載の方法
【請求項３８】
試料中の血球からの血漿を分離し、ＬＤＨの測定のための装置に上清の血漿を移動する工程を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項３９】
測定したＬＤＨを、非低酸素状態における胎児からの分娩の間にサンプリングした、胎児頭皮の血液から得られた血漿中の測定されたＬＤＨと比較することを更に含む、請求項２７記載の方法。
【請求項４０】
統計学的に有意に増加したＬＤＨレベルが低酸素状態の指標である、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
３種以上の因子により統計学的に有意に増加したＬＤＨレベルが、低酸素性虚血性脳症のリスクの指標である、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
前記頭皮血液及び／又は前記血漿中の、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸からなる群の１種又は数種のメンバーの測定を更に含む、請求項２７記載の方法。
【請求項４３】
Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸のいずれかの統計学的に有意に増加したレベルと、ＬＤＨの統計学的に有意に増加したレベルとの組み合わせが低酸素状態の指標である、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
血漿を分離するための手段と、ＬＤＨの測定を実施するために配置された区画とを含む、使い捨ての機器上に試料を集めることを特徴とする、請求項２７記載の方法。
【請求項４５】
請求項２７記載の方法における、血球からの血漿の分離のための装置の使用であって、該装置が、筐体、筐体内の区画、半透性膜に覆われた筐体内の第一の開口、導管を通って陰圧又は毛細管力により区画と連結している筐体内の第二の開口、及び陰圧の場合に前記連結を制御するための弁手段を含む装置の使用。
【請求項４６】
前記弁手段が導管内に配置され、好ましくは、区画が、その底部分と連結するように配置された第二の導管を更に含み、区画の底部に蓄積した血漿を空にすることを制御するための第二の弁手段を備えている、請求項４５記載の使用。
【請求項４７】
区画筐体が、筐体中に蓄積した血漿中のＬＤＨを測定するための手段と連結している、請求項４５記載の使用。
【請求項４８】
請求項２７記載の方法を実施するための試験システムであって、前記システムが、血液試料を集める部分を有する使い捨て機器、血漿分離装置、及び血漿中の総乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を間接的又は直接的に測定するために配置された区画を含むシステム。
【請求項４９】
前記使い捨て機器が、平らな形態の物体であり、前記受け取り部分が区画を形成し、毛細管試料収集装置と結合していることを特徴とする、請求項４８記載の試験システム。
【請求項５０】
カード上に配置された多数の測定区画が存在し、好ましくは、前記区画の各々が、試薬を有する上流の区画と接続していることを特徴とする、請求項４９記載の試験システム。
【請求項５１】
前記接合部分と前記血漿分離機器との間に分取器が配置されていることを特徴とする、請求項４８記載の試験システム。
【請求項５２】
前記区画が光学的検出セルの形態であり、本体が、光学スペクトルのための少なくとも１つの装置を配置した機器内に収まるように形成されていることを特徴とする、請求項４９記載の試験システム。
【請求項５３】
前記本体が、固有の符号を配置しており、好ましくは前記機器が読み取り装置を配置していることを特徴とする、請求項４８記載の試験システム。
【請求項５４】
前記使い捨て機器が、視覚的検出のための乾燥化学的手段を配置した区画を含むことを特徴とする、請求項４８記載の試験システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年１０月１３日に出願されたスウェーデン出願番号０６０２１５８−８に対する優先権を主張する、２００７年１０月１２日に出願された、出願番号ＰＣＴ／ＳＥ２００７／０５０７３８の一部継続出願であり、それらはいずれも全体として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は低酸素状態の検出方法に関する。本発明の一態様は、胎児器官の障害のリスクを示す分娩の間の胎児の頭皮の血中の低酸素状態を検出する方法に関する。他の態様においては、本発明は、低酸素状態の検出装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
分娩の間又は分娩の終わりにおける急性周産期仮死、すなわち、低酸素状態（胎児血液の不十分な酸素飽和）は、新生児の低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）の形態における神経損傷の重要な原因を残している。それは２〜９／１０００の満期産児において見られ、厳しいケースにおいては、その後、脳性麻痺（ＣＰ）及び死が続く。グローバルな視点においては、毎年約４百万の新生児が死亡し、約２３％が急性周産期仮死に起因する。資金の欠如のため、発展途上国は困窮しており、西欧諸国においても大勢の人に理解されるようにこれは深刻な問題である。スウェーデンは、西欧諸国の代表的な国として見られ、仮死は約７／１０００の満期産において生じ、２／１０００の子供がＨＩＥとなって生まれるであろう。周産期仮死により引き起こされる持続的障害を防止するため、その発症に関してできるだけ速く胎児における低酸素状態を検出することが重要である。早期検出は、持続的障害が生じない段階で介入するかどうかを決定することを可能にする。介入は、実質的に、有益な分娩、特に帝王切開によりできるだけ迅速に幼児を外に出すことからなる。
【０００４】
急性周産期仮死の検出は、現在、悪い前兆となる胎児の心拍パターンが見られる場合、胎児の心臓の速度を監視し、次いでｐＨの測定、膣からサンプリングした胎児の頭皮の血液中の乳酸の測定により実施される。
【０００５】
ｐＨ及び乳酸は、不十分な酸素供給の状況における嫌気性代謝に切り替えることにより起こる代謝性アシドーシスの指標である。酸素が不足した胎児においては、ピルビン酸は乳酸及びエネルギーに代謝される。現在のところ、ｐＨの測定は素晴らしい標準である。しかし、ｐＨの迅速な測定は３５μＬの頭皮の血液を必要とし、これは容易に得られない。いくつかの研究が示すように、最初の測定の失敗はとてもありふれたことである（２０％）。たったの５μＬの血液が必要であり、ベッドサイドで分析を実施することができるので、乳酸は測定することが容易である。乳酸の分析は１分以内に実施することができ、その結果十分に速い。
【０００６】
乳酸及びｐＨは急性仮死の指標でもある。そのようなものとして、分娩の間に低酸素虚血の突然の急な発症にさらされた、全体として健康な胎児の表示を提供する。低酸素性虚血性脳症を発症した全ての幼児のかなりの割合に、送達相に入る前に低酸素虚血の症状の発現がある。彼らは、分娩の間、低酸素虚血に対して脆弱であり、健康な胎児と同じ方法で反応せず、その結果、現在使用されている方法はこのグループの患者には十分でない。
【０００７】
膣液のような液体中の乳酸の測定を含む、分娩を監視する方法は、ＷＯ２００５／０３４７６２Ａ１に開示されている。分娩時の胎児血液のｐＨ及び乳酸を任意抽出した、スウェーデンの最近の研究からの予備的結果は、アシドーシスの指標としての乳酸はｐＨと同じくらい良好である。乳酸もｐＨも、中程度／重度のＨＩＥの理想的な予測因子ではなく；感度は乳酸についてはたった６７％であり、ｐＨについて５０％であるが、特異性はほぼ同じであり、乳酸について７６％、ｐＨについて７３％である。また、新生児におけるアシドーシスの予測についての感度及び特異性は、乳酸及びｐＨについて７０％未満である。最近のスウェーデンの報告は、心拍動記録法（ＣＴＧ）及びＳＴＡＮ（心拍動記録法ＳＴセグメントの分析）の組み合わせにより監視する胎児においても、脳障害をもたらし得る、ある種の周産期仮死を検出できないというリスクがあることを報告している（ＳＢＵ  Ａｌｅｒｔ−ｒａｐｐｏｒｔ  ｎｒ  ２００６−０４）。
【０００８】
分娩の間に仮死にさらされた新生児内で上昇することが知られている酵素は、肝臓酵素としても知られているＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）及びＡＳＴ（アスパルテートアミノトランスフェラーゼ）である。ＬＤＨは、身体内のほとんどの細胞中に見られ、非特異的酵素と考えられる。従って、それは臨床業務においてまれに用いられる。ＬＤＨは、以前は心筋障害のマーカーとして用いられたが、今は、より特異的な試験に取って代わられた。特に、ＡＳＴ及びＡＬＴは肝臓障害により特異的である。低リスク群の中国人女性の新生児における、血漿、肝臓の酵素における作業及び送達の効果についての研究においては、ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）、ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）、ＡＳＴ（アスパルテートトランスアミナーゼ）、ＧＧＴ（γ−グルタミルトランスアミナーゼ）を測定し、母体及び新生児の相互関係を示した（Ｍｏｎｇｒｅｌｌｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎａｅｃｏｌ  Ｒｅｓ，２６（１）：６１−６３，２０００）。
【０００９】
分娩の間又は終わりに、胎児が低酸素状態にさらされると、その体内の血流が、脳、心臓及び副腎を支持して「それほど重要でない器官」（腎臓、肝臓、脂肪及び腸）から再分配されるであろう。これは、最下層の器官における細胞を損傷させる傾向にある。細胞の損傷は、血液循環に入る酵素の漏出をもたらす。低酸素状態が厳しいと細胞は死に、血中の酵素濃度さえも上昇するであろう。ＬＤＨ、ＡＳＴ及びＡＴＬの減少速度（１２〜３６時間）は、送達の前に開始する以前の低酸素状態のための送達の間の低酸素虚血に対して、より脆弱であるケースを検出することを可能にする。低酸素状態は、胎児体内の電解質のバランスにも影響する。一例は、低酸素状態の間の細胞内の血液からのカルシウムの流入である。新生児動物モデルにおける低酸素状態の間に血清イオン化カルシウム濃度が上昇することが示されている。カルシウムは、ヒトの幼児において結果をも予測する（脳の障害があるかに関係なく）。新生児哺乳動物における低酸素状態の間に変化する、興味のある他の酵素及び電解質は、カリウム（Ｋ＋）、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、ナトリウム（Ｎａ＋）、グルコース、クレアチニンキナーゼ（ＣＫ）及びＧＧＴである。
【００１０】
グローバルな視点においては、毎年約４百万人の子供が死亡し、これらの死亡の約２３％が急性周産期仮死によりもたらされる。脳内のニューロンの損傷を誘発する低酸素虚血の病理学的メカニズムは、出生直後の主要相から開始する、二相性のものである。幼児が首尾良く蘇生した場合、この主要な相には、数時間継続するフリーの間隔が続くであろう。窒息している７人の幼児のうちの２人において、このフリーの間隔には、子供の脳内の遅発性細胞死をもたらす二次エネルギー枯渇、及びてんかん発作（ＨＩＥとしても知られている）を伴う臨床像が続くであろう。フリーの間隔は、低体温処理（子供の脳を３４．５℃まで冷却）による遅発性細胞死を最小にする可能性を提供する。しかし、現在では、子供がＨＩＥを発症し得ることを予測し、その結果、低体温処理の利益を享受するための確実な手段がない。
【００１１】
低酸素状態は、分娩の間又は分娩の終わりに加え、多くの他の病状における重大な関心事である。例えば、結腸直腸癌は、男女のいずれにおいて最も一般的な腫瘍であり、その発生は年々増加している。最新の治療は外科手術であり、それによって腸の根本部分（ｒａｄｉｃａｌ  ｐａｒｔ）を除去してしまう。このケースの大部分においては、その後、腸の遠心端及び近位端は、再度構成される。これは吻合と呼ばれる。この進行の間、動脈血管が切断される時に、腫瘍が位置する腸の部分に供給される動脈血は遮断される。全ての手術の７〜１０％において、吻合の漏出のための手術後の合併症が予測され得る。このようなケースにおいては、腸の内容物が腹部に漏出し、炎症、腹膜炎、敗血症及び潜在的な死を引き起こす。この合併症の主な理由は、血管の摘出の結果としての、吻合のための領域への血液の不十分な供給である。最新の解決法は簡単に再手術をすることである。望ましくなくは、現在、それは、吻合が漏出するかしないかを予測するためには、手術の際には可能ではない。
【００１２】
低酸素状態が主な関心事である他の分野には、血管手術及び肝臓移植手術が含まれる。例えば、肝臓移植療法後の患者における罹患率及び死亡率を決定する主な因子は、肝臓移植片の損傷の保存である（Ｌｅｅｍａｓｔｅｒ  １９９７）。灌流液へのＬＤＨ、ＡＳＴ及びＡＬＴの漏出は、肝臓細胞の膜の完全性の損失の程度である（Ｋｅｂｉｓ  ２００７）。
【００１３】
低酸素状態を検出するための以前の装置及び方法の一つの主要な欠点は、ＬＤＨのみが血漿又は血清内で分析され得ることである。更に、それらは、このような測定のためには最低限１５０μＬの全血を必要とする。このような容量の血液を小動物、特定の組織又は分娩の間の生まれる前の子供から得ることは困難である。他の問題は、ＬＤＨが赤血球にも存在し、溶血（赤血球の破裂）が正しくない高価値をもたらすであろうことである（検出限界を超えて）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、ＬＤＨを、単独で、又は電解質及び肝臓酵素と一緒に分析し、低酸素虚血を検出するための少量の血液のみを必要とする方法が必要である。更に、分娩時の胎児の酸素供給の検出における改善が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、１０マイクロリットルの全血で、数分（又は数秒）以内に、ＬＤＨを、場合によってＡＳＴ、ＡＬＴ、Ｍｇ及び乳酸も分析することができる装置及び方法を提供することにより、少なくともいくつかの要求を満足させる。これらの分析は、結果として正しくないＬＤＨの増大値を有する、溶血が存在しないことを確認するためにフリーのヘモグロビンを一緒に測定することができる。
【００１６】
本発明の実施態様は、低酸素状態、特に、分娩の間にサンプリングされた胎児頭皮の血液中の低酸素状態を検出する方法を含む。このような実施態様においては、方法は、血漿中のＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の測定を含み得る。ＬＤＨに加え、胎児頭皮の血液中のＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸からなる群から選択される１種又は数種のマーカーを測定することが好ましい。特に好ましくは、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、乳酸のいずれかと、ＬＤＨとの組み合わせである。また、好ましくは、ＬＤＨ、乳酸、Ｍｇ及びＡＳＴ及び／又はＡＬＴとの組み合わせである。
【００１７】
本明細書を通して用いられる場合、「ＬＤＨ」及び「乳酸デヒドロゲナーゼ」は、全てのデヒドロゲナーゼを意味し、すなわち、そのアイソザイムを意味しないことを理解すべきである。
【００１８】
本発明の方法においては、患者の近くの環境において、分娩の間に膣を通して胎児から一定限度量（好ましくは約５〜２５μＬ）の頭皮の血液がサンプリングされる。試料は、血球、特に血球からの血漿（血清）の分離に供され、血漿は、症状を見つけるため、数分以内に、ＬＤＨ、場合によってＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、乳酸について分析される。結果として、医療チームは、子供が急性仮死に苦しんでいるか、すなわち、帝王切開が必要であるか否かを示すことを直接的に結論することができる。本発明のおかけで、低酸素状態に関連する多くの苦しみを排除でき、多くの救済をも達成することができる。
【００１９】
発明者らにより実施された研究において、子供に由来する血液試料中のＬＤＨ、ＡＳＴ及びＡＬＴは最初の２４時間以内に分析された。それは、１９３人の試験を行った子供たちによって見い出された。これらの子供のうちの１９人が、５分齢において、＜７のアプガースコアの形態の仮死の兆候を示した。ＲＯＣ曲線により、１０００Ｕ／Ｌのカットオフ値においてＬＤＨについて９６％の感度及び特異性が観察された（図１を参照）。ＨＩＥについては、同じカットオフ値において感度は１００％であり、特異性は９６％である。言い換えれば、これは、本発明の方法による主要なマーカーが、本当の低酸素状態を伴う全ての子供の９５％（又はそれ以上）が、健康である正しい全ての健康な子供の９５％を同時に決定することを意味する。ＡＳＴ及びＡＬＴは、それぞれ５５Ｕ／Ｌ及び１８Ｕ／Ｌのカットオフ値において、８６％の感度及び９０％の特異性を表す。この研究が予備的であるという事実にもかかわらず、今日存在する方法と比べ、意外な向上を示している。
【００２０】
費用の視点から、結果は驚くほどである。今日の方法を用いる場合、ＨＩＥを伴う１人の子供を見つけるために約１０回の不必要な帝王切開が実施され、すなわち、ＨＩＥを伴う１人の子供を見つけるために合計１１回の帝王切開が実施され、そのうちの１０回が不必要である。本発明の感度及び特異性は、結果が反対であり、すなわち単に１０回の帝王切開のうちの１回が不必要であったことを示す。従って、社会は、何百万人をも救い、少なくとも、より多くの子供に自然分娩を利用することをもたらし得る。
以下に述べる。公知の方法と比較し、本発明の方法により大幅な改善を示す表を下記に示す。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
健康な人間においては、赤血球は、血清よりも約１５０倍のＬＤＨを含むことが知られている。従って、血漿に通過させることから、ＬＤＨ含有量が血漿内に通過することを防止するために赤血球を損傷させないような方法でサンプリング及び分離を実施することが重要である。分析に使用可能である少量の頭皮の血液試料も考慮することが重要である。本発明の方法においては、血漿を、本出願においては、血球を保持し得る固相上の「膜」と命名される多孔質マトリクスに通過させることにより、血漿及び血球に分離する。血漿を、従来の方法でＬＤＨについて分析する。血漿又は血液中のＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び／又は乳酸を分析する；血液中において分析する場合は、頭皮血液試料を、ＬＤＨの測定のために得られる血漿に由来する部分と、他の低酸素状態のマーカーの分析についての１以上の部分とに分離する。本発明の頭皮の血液試料中の血球から血漿を分離するために、微量遠心分離、マイクロ流体コンパクトディスク技術及びマグネトフォレシスのような、当該技術分野で用いられる他の方法を用いることは本発明の範囲内である。
【００２３】
血漿のような液体中のＬＤＨの分析方法は当該技術分野において公知であり、胎児の血液から得られた血清中のＬＤＨを測定するために適用することができる；例えば、Ｐｉｎｔｏ  ＰＶ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  １５：３３９−３４９，１９６９を参照されたい。最後に言及された方法において用いられる市販の装置は市販されている（Ｖｉｔｒｏｓ（登録商標）ＤＴ６０  ＩＩ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）。血中のＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＬＴ、ＡＳＴ及び乳酸の分析方法は臨床化学において通常に用いられており、従って、当業者のすぐ手の届く範囲内である。
【００２４】
本発明によれば、胎児が低酸素状態にある場合に、分娩の間に膣を通して胎児からサンプリングした頭皮血液中のＬＤＨ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＬＴ、ＡＳＴ及び乳酸のレベルを評価し、標準（ベースライン）は、問題のない出生との関連で、分娩の間及び／又は分娩の直後の胎児中の対応するレベルである。特に、重度の低酸素状態、すなわち、胎児をＨＩＥを得る高いリスクに置く低酸素状態に苦しむ分娩における胎児においては、ＬＤＨ、ＡＬＴ及びＡＳＴのレベルは２倍、特に３倍以上増加する。
【００２５】
本発明の好ましい態様によれば、数分以内に、急性低酸素状態にあるかどうかを決定するための、少なくとも１種、好ましくは多数のマーカーを用いる、特徴となるケア機器を提供することを含む、分娩の間の頭皮血液試料中の低酸素状態を検出する方法が開示される。
【００２６】
更に好ましい変形によれば、前記機器は、更に、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、乳酸の１種又は数種の分析手段と連結されている。
【００２７】
更に好ましい態様によれば、本発明の機器／方法において簡単かつ直接的に用いられる血漿分離機器に関する。
【００２８】
他の態様においては、本発明は、哺乳動物の組織部位における低酸素状態の評価方法を含む。このような実施態様においては、本発明の方法は、組織部位から血液試料を集めることを含み、前記血液試料が血漿及び血球を含み、血球に由来する血漿を分離することを含む。血漿中のＬＤＨ量を測定し、血漿中のＬＤＨ量から組織部位における低酸素状態の存在を評価する。組織部位における低酸素状態の評価方法は、哺乳動物の消化管（例えば、哺乳動物の腸）に由来する血液試料の分析、特定の器官（例えば、哺乳動物の大動脈）若しくはマイクロカテーテルにより集めた脳脊髄液に由来する試料の分析、尿若しくは腹腔液の分析、並びに移植を必要とする哺乳動物に移植された器官に由来する試料の分析を含む。本発明の実施態様による低酸素状態の評価方法は、出産前低酸素状態後の脳損傷の可能性を予測すること、並びに医療処置又は外科手術の前、最中及び後の哺乳動物の手足への血流の評価を可能にする。
【００２９】
以下、多かれ少なかれ、略図に示した、好ましいが限定的でない本発明の実施態様の説明により、本発明を詳細に説明するであろう。
【００３０】
従って、一般用語において本発明を説明するが、記号は、必ずしもスケールに記載されていない添付の図面に伴って実施される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、感度及び特異性についてのＲＯＣ曲線を示す。
【図２】図２は、本発明の方法の実施態様を概略的に示すブロック図を示す。
【図３】図３は、本発明の方法において用いられる逐次段階における分離機器の第一の実施態様の断面図を示す。
【図４】図４は、本発明の方法において用いられる逐次段階における分離機器の第一の実施態様の断面図を示す。
【図５】図５は、本発明の方法において用いられる逐次段階における分離機器の第一の実施態様の断面図を示す。
【図６】図６は、試験頭皮血液を集めるために用いられることを意図する、本発明の毛細管装置の実施態様を示す。
【図７】図７は、本発明の他の実施態様による、迅速な試験分析システムを示す。
【図８】図８は、本発明の迅速な試験のための使い捨てカード装置の実施態様を示す。
【図９】図８は、本発明と正常に連結する作用の略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明を、本発明の全ての実施態様を示してない、いくつかの添付図面を参照しつつ、以下に更に詳細に説明するであろう。実際、本発明は多くの異なる形態で具体化され、本明細書に示される実施態様に限定されると解釈すべきでない；むしろ、これらの実施態様は、本明細書の開示が適用可能な法的必要条件を満足させるように提供される。
【００３３】
本発明は、１０マイクロリットルの全血で数分（又は数秒）以内に、ＬＤＨ、場合によってＡＳＴ、ＡＬＴ、Ｍｇ及び乳酸を分析することのできる機器及び方法を提供する。分析は、これらの分析は、結果として正しくないＬＤＨの増大値を有する、溶血が存在しないことを確認するためにフリーのヘモグロビンを一緒に測定することができる。
【００３４】
位置態様においては、本発明は低酸素状態の検出方法を含む。特定の実施態様によれば、方法は、血液試料を集め；血中のＬＤＨの総量を測定することを含み得る。血液試料は、任意の哺乳動物、又は移植を必要とする哺乳動物に移植される任意の器官に由来する代替え物から集めることができる。
【００３５】
他の実施態様においては、低酸素状態の検出方法は、血液試料を集めることを含み、血液試料は血漿及び血球を含む。好ましくは、血球の非存在下で血漿を分析することができるように、血漿を血球から分離する。分離された血漿は、血漿中のＬＤＨの総量について分析され得る。ＬＤＨの検出自体を達成することができる。ＬＤＨ量、又は他の予後マーカーと組み合わせたものをベースとし、低酸素状態の検出を容易に実現することができる。
【００３６】
好ましい実施態様においては、低酸素状態の検出は、複数の予後マーカーの含量又は量を測定するために血液試料を分析することを含む。このような一つの実施態様においては、方法は、血液試料、又は好ましくは血漿中のＬＤＨの量を測定し、基本的にＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸からなる群から選択される、少なくとも１種の追加の予後マーカーの量を測定することを含む。
【００３７】
好ましくは、分析のための血液試料は、血漿を血球から分離するように操作する。一実施態様においては、この分離は、半透性膜又は遠心分離を用いることにより達成することができる。半透性膜を利用する場合、血漿は好ましくは膜を通過し、血球は膜に保持される。従って、血漿は、全ての実用的な目的のために血球のバルクから分離される。次いで血漿はサンプリングされ、血球の非存在下に試験される。
【００３８】
種々の実施態様によれば、分析のための試料容量は以前の方法よりも非常に減少している。一実施態様においては、低酸素状態の検出のための血液の容量は５μＬ〜６０μＬ、又は５μＬ〜２５μＬ、又は好ましくは約５〜１５μＬ、特に１０μＬである。特定の実施態様においては、低酸素状態の検出のための血液の容量は、約５μＬ〜１５０μＬ、又は１０μＬ〜１２０μＬ、又は１０μＬ〜１００μＬ、又は１０μＬ〜８０μＬを含む。
【００３９】
有利には、本発明の実施態様は、種々の環境において低酸素状態の検出を可能にする。例えば、本発明の実施態様は、胎児の頭皮、消化管（例えば、結腸吻合）、特定の器官（例えば、肝臓及び大動脈）、腰部ドレインからの脳脊髄液、及び移植される器官に由来する血液中の低酸素状態の検出を含むが、これらに限定されない。更に、本発明の実施態様は、
肝臓（例えば、潜在的に多臓器機能不全に苦しむ哺乳動物の）、末梢組織（例えば、外傷、敗血症、出血又は広範囲の手術）、出生前仮死後の脳損傷の予測の評価及び／又は監視、並びに哺乳動物の末梢血流の監視を可能にする。
【００４０】
本発明における使用の連続的な工程における、本発明の血漿分離機器１を図３〜５に示す。機器１は通常、ポリ（テトラフルオロエチレン）のような疎水性ポリマー材料中に環状の筐体を含む。筐体内の血漿の収集区画２は、筐体のもののように、同一又は類似の材料のグリッド１２により支持される血漿分離膜１１により閉鎖された上部開口を有する。区画底部１３は、広角錐体の形態で、その中心に向かって傾斜している。区画１４の側壁から、弁１６を備えた管状導管１５に伸長している。導管１５は、真空ポンプ（図示せず）のような陰圧源に伸長している。図３においては、４０μＬの頭皮血液試料７が膜１１の外面に配置され、弁は閉鎖状態にある。弁１６を開放することにより、区画１４は陰圧下に置かれ（図４）；それによって、血漿７’が区画１４中に吸引され、その傾斜底１３に蓄積し、血球７’’は膜１１に保持される。弁６を閉鎖した後、図５に示す状態に到達し、区画内の圧力は、膜１１に吸引された空気により大気圧と等しくなる。区画１４中の他の圧力均一化は、陰圧の形成を停止した後、又は他の適切な手段により導管１５を通して達成することができる。図５は、吸引シリンジによる区画１４からの血漿試料７の除去し示し、吸引シリンジのカニューレ１０は膜１１を通して挿入される。膜上の血球による血漿試料７の汚染を回避するため、分離挿入ポート（図示せず）、例えば、機器１の上部又は側壁内の分離開口内に配置されるゴム隔壁が供給される。図２のブロック図は、本発明の方法の原理を示す。
【００４１】
区画は、更にその底部と連結するように配置された第二の導管を備え、区画の底部に蓄積する液体（血漿）の排出を制御する第二の弁手段を備えている。また、区画は、蓄積されたＬＤＨ及び他のマーカーを検出する手段を含む。膜は、５ｍｍ２〜１０００ｍ２、特に２０ｍｍ２〜３００ｍｍ２の面積を有することが好ましい。
【００４２】
頭皮血液の分析
分析は、ｐＨ又は乳酸の測定について臨床ルーチンで用いられている標準的装置を用いて、健康な成人男性に由来する頭皮血液試料を用いて首尾よく繰り返された。試料は、膣チューブを用い、かつ用いない（実在の生活状況における羊水の汚染を回避するため）。結果を示すための血漿分離カードへの血液試料の適用の時間は平均７分であった。本発明の方法に適用される機器を用いることにより、特に、膜の真空側に適用される陰圧が、電気的手段を用いることにより、十分に制御され、時間を計測することにより、分析のための時間は、例えば３〜４分、又はそれ以下と相当に短くなった。従って、緊急事態におけるベッドサイドにおける胎児の頭皮血液の検出における本発明の方法の使用は、完全に実現可能である。
【００４３】
測定において、頭皮血液中のＬＤＨが指の毛細血管よりも想到に高いことがわかった；指の血液中で４００Ｕ／Ｌであったのに対し、羊水チューブを使用した場合と使用しない場合とで、１０４４Ｕ／Ｌ及び１１２７Ｕ／Ｌであった。ＬＤＨについて見られるのと同様の頭皮と臍帯血との間の相違は、胎児におけるグルコール及びヘモグロビンについて得られた。胎児の頭皮血液中のＬＤＨの測定は、当該技術分野において未知である。
【００４４】
図６に、使い捨てカード２、ケア試験のポイントを実施するための分析手段３を含む、すなわち、患者の近くの環境で、７分以内、好ましくは２分以内、更に好ましくは数秒で試験結果を示すことを可能にする、本発明のシステムを示す。使い捨てカード２は、好ましくは多くの異なる検出セル２０Ａ〜２０Ｅを有して配置され、これは図７に詳細に説明され、実際にはＬＤＨのみ（又は、例えば、ＬＤＨ＋ＡＳＴについての２個のセル）を試験するだけのカードは、いくつかの適用において十分であるかもしれない。
【００４５】
図６においては、本発明の方法による２種の連続工程を示す。上部左側に、ガラス毛細管装置４を用いて試験血液７が供給されるように新規なカード２が供給され、例えば約１０μＬの量で血液が満たされる第一工程を示す。連続工程において、ガラス毛細管装置４は、カード２を有する血液試料７と、機器３内に配置される使い捨てカード２とを接続するためにカード２の区画２１内に挿入され、血液試料７の直接的分析が行われ、図７と関連して詳細に説明する。カードは、血液試料７に由来する血漿７’が少なくとも１個の検出セル２０Ａ〜Ｅに、好ましく血球が少なくとも１個の他のセルに、更に好ましくは全血が少なくとも１個の他のセルに入ることを可能にする装置（例えば、本質的に、血漿／血清の分布のための微小流体チャンバーとして知られているような）を備えている。検出セルに入る前に、血漿／血清／全血が、試薬（好ましくは、乾燥した）が沈着する反応チャンバー（２６Ａ〜２６Ｅ）に入る。従って、検出の前に反応が起こるであろう。光学的測定（例えば、それ自体公知であり、参照として本明細書に組み入れられる米国特許第４８０３１５９号に記載される、分光光度法）が、機器３のプロセッサ３１により直接処理され、ディスプレイ３２に示され、及び／又は例えば印刷された紙の上のデータ出力３３として提供される。更に、分析機器３は、好ましくは、各使い捨てカード２についての固有のコードを備えたバーコード２２を読み取り処理することのできるバーコード読み取りアレンジメントを備えている。好ましくは、分析機器３は持ち運び可能にするための筐体３５で囲まれている。必要な供給品、例えば電力（なければ電池式）を供給するための接続を備えている。他の実施態様においては、外部のプロセッサ、例えば、ＵＳＢケーブルによりラップトップと接続可能な機器を製造するラップトップを用いることにより、より小さく製造されている。
【００４６】
図７においては、本発明の具体的な使い捨てカード２の態様を示す。カード２は、５つの検出セル２０Ａ〜２０Ｅを配置しており、それらの全ては光学的検出セルである。第一の検出セル２０ＡはＡＬＴのためである。第二の検出セル２０ＢはＡＳＴのためである。第三の検出セル２０Ｃは総ＬＤＨのためである。第四及び第五の検出セル２０Ｄ、２０Ｅは、それぞれ乳酸及びＭｇ２＋のためである。実施態様に示すカードは、処理を容易にする直径、例えば２０〜１２０ｍｍ、好ましくは４０〜１００ｍｍの範囲の直径を有する、円形の平面な形状の本体２３を有する。本体２３の材料は広い範囲、例えば、ポリ（テトラフルオロ）エチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン及び類似物から選択することができる。図７に概略的に示すように、カード２は、血液試料７を供給する、ガラス毛細管装置４を取り付けるように適合するチャンバー２１を備えている。チャンバー２１に関連し、その底部に、血液試料の更なる輸送を保護する、それ自体公知の方法でインターフェース２３（膜及び血漿収集区画を含む、図３〜５に示す膜１１と比較されたい）がある。血漿分離膜２５及びインターフェース２３の間に、場合により、例えば、それぞれＡＬＴ及びＡＳＴを検出するための印刷試薬２６Ａ、Ｂにより、全血のいくつかの検出セルへの供給を可能にする試料スプリッター２４（点線で示す）をそなえている次いで、大量の全血試料は、例えば、それぞれ、血漿７’中の総ＬＤＨ及び乳酸を検出する、印刷試薬により血漿分離装置２５に供給される。分離後に得られる血球７’’はＭｇ２＋を検出するために光学セル２０Ｅに印刷試薬２６Ｄと混合を混合した後に実施される。
【００４７】
本発明の具体的な使い捨てカードにおいて種々のマーカーの組み合わせを用いた試験結果を以下に示すであろう。
【００４８】
乳酸デヒドロゲナーゼは低酸素状態の間に増加し、全ての身体の細胞内に存在する。血流内に存在するＬＤＨは、末梢器官に対する血流を減少するのに十分に重症の低酸素状態を示す。これは、これらの細胞に由来するＬＤＨの漏出の発症である。ＬＤＨを検出することにより、どの器官が低酸素状態を患っているかを検出することは可能ではない。溶血が起こっている場合（低酸素状態でない場合でも、赤血球の破裂はＬＤＨの増大をも引き起こす）、溶血は２つのグループに分類される：（１）インビトロにおいて、試験管内で試料を取得するか保存する場合に起こる溶血を意味し、（２）インビボにおいて、疾患のために患者内で破裂する赤血球を意味する。次いで、進行中の溶血は、低酸素状態のためだけではない、不当な高レベルのＬＤＨを与えるであろう。ＬＤＨの半減期（Ｔ１／２）は、ＬＤＨの５種の異性体のうちのいずれが血中に放出されるかに依存する。心臓、脳及び血球内に主に存在するＬＤＨ１は、１２０時間のＴ１／２を有するが、肝臓及び筋肉に主に見られるＬＤＨ５は１０時間のＴ１／２を有する。
【００４９】
【表２】
2012524518.tif 000003
【００５０】
新生児における我々の研究において、ＨＩＥを患っている患者は、１８４人の健康な患者のうちの１７８人と同様にマーカーとしてＬＤＨを用いることによって見つけられるであろう。これは、低酸素状態に関するケースがなく、６人の乳児が帝王切開によるか又は器具分娩（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）により不必要に分娩されていることを意味する。
【００５１】
高いＬＤＨは、身体のどこかにおける低酸素状態又は溶血の発症又は最新の発現を示す。
【００５２】
ＡＳＴは身体中の多くの器官内に存在するが、ＬＤＨより器官特異的である酵素である。ＡＳＴは、肝臓、筋肉及び赤血球内に存在する。ＡＳＴ並びにＬＤＨは溶血に対して感受性であるが同程度ではない。
【００５３】
ＡＳＴについてのＴ１／２は新生児について１２〜１５時間である。
【００５４】
【表３】
2012524518.tif 000004
【００５５】
我々の研究において、ＨＩＥを患っている患者は、２３６人の健康な患者のうちの２１０人と同様にマーカーとしてＡＳＴを用いることによって見つけられるであろう。これは、低酸素状態に関するケースがなく、２６人の乳児が帝王切開によるか又は器具分娩により不必要に分娩されていることを意味する。
【００５６】
高いレベルのＡＳＴは、肝臓、筋肉における低酸素状態又は溶血の発症又は最新の発現を示す。
【００５７】
ＡＬＴは肝臓に特異的な酵素であり、溶血により非常に少し影響を受ける。
【００５８】
ＡＬＴについてのＴ１／２は３６時間である。
【００５９】
【表４】
2012524518.tif 000005
【００６０】
我々の研究において、脳損傷を患っている患者は、２４０人の健康な患者のうちの２８人と同様にマーカーとしてＡＳＴを用いることによって見つけられるであろう。これは、帝王切開によるか又は器具分娩により不必要に分娩されている。
【００６１】
上昇したレベルのＡＬＴは、肝臓における低酸素状態の発症又は発現を示す。
【００６２】
身体内のマグネシウムは骨格内に５０％が位置し、細胞内に５０％が位置する。例えば低酸素状態の間にアシドーシスが発生する場合（ｐＨの低下）、水素イオンが細胞内に移動するであろう。同時にＭｇはから細胞内に移動し、血中のＭｇレベルを上昇させる。ＨＩＥを患っている新生児について、Ｍｇレベルは健康な新生児より引き。Ｍｇは、細胞障害よりもアシドーシスについてよりよいマーカーである。
【００６３】
上昇したＭｇレベルは、低酸素状態の症状であるアシドーシスの指標である。低いＭｇレベルは、脳損傷を誘発する低酸素状態の発症の指標である。
【００６４】
現段階において、我々は分娩の間のＭｇについてのデータを有していない。しかし、我々は、新しく生まれた子ブタにおける動物研究においてＭｇレベルが上昇することを信頼する。
【００６５】
【表５】
2012524518.tif 000006
【００６６】
この発見は、全ての健康な乳児は低レベルのＡＳＴ及び／又はＬＤＨを有することを示す。ＨＩＥを患っている１０人の乳児のうちの全ての乳児が高レベルのＡＳＴ及び／又はＬＤＨを有及びＬＤＨを有している。ＡＳＴは、乳児が健康であるかどうかを決定するのにＬＤＨを用いるという効果を加える。
【００６７】
高レベルのＬＤＨ及びＡＳＴは、低酸素状態及び溶血を示す。
【００６８】
下記表は、マーカーとしてＬＤＨ＋ＡＬＴの使用をベースとする結果を示す。
【００６９】
【表６】
2012524518.tif 000007
【００７０】
上記表は、ＬＤＨ及びＡＬＴを同時に分析する場合に、健康な乳児が低レベルのＡＬＴ及び／又はＬＤＨを有することを示す。ＨＩＥを患っている１０人の幼児のうち、全ての幼児がＡＬＴ及びＬＤＨのいずれもが上昇していた。ＡＳＴ及びＬＤＨのレベルが上昇している１人の乳児はＨＩＥを患っていなかった。ＡＬＴは、乳児が健康であるかどうかを決定するのにＬＤＨを用いるという効果を加える。
【００７１】
ＡＬＴは、また、ＡＬＴが長時間血中に残存する（Ｔ１／２は３６時間である）ので、子宮内で乳児が早期に低酸素状態に苦しんでいるかどうかを理論的に伝えることができるので、興味がある。
【００７２】
ＬＤＨ及びＡＬＴの上昇したレベルは、肝臓（他の臓器の間で）に影響を及ぼす低酸素状態を示す。
【００７３】
以下の表は、マーカーとしてＬＤＨ＋ＡＬＴ＋ＡＳＴの使用をベースとする結果を示す。
【００７４】
【表７】
2012524518.tif 000008
【００７５】
ＬＤＨを、ＡＳＴ及びＡＬＴと一緒に分析した場合、全ての酵素レベルは低く、ＨＩＥを患っている乳児を見つけることはできない。３種全てのマーカーの上昇において、ＨＩＥを患っている全ての乳児が見つけられ、たった１人の乳児はＨＩＥなしで不必要に分娩される。
【００７６】
高レベルのＬＤＨ＋ＡＬＴ＋ＡＳＴは、以前の時間における低酸素状態の発症又は低酸素状態を示す。ＡＬＴの半減期が、ＡＳＴ及びＬＤＨよりも２４時間長いという事実は、この組み合わせが低酸素状態の時間局面をも与えることを可能にする。ＬＤＨ＋ＡＬＴ＋ＡＳＴの例は全て高く、乳児の出生の２４時間後にも増大したままであり、これは、低酸素状態が分娩の終わり近くに発現することを示す。
【００７７】
これらの計算に用いられる材料において、実際に２３回の帝王切開及び２２回の器具分娩が、低酸素状態（ＨＩＥ、アシドーシス又は低アプガースコア）における指標を示さない群において実施された。ここには、疑わしい害のために実施された乳児が含まれる帝王切開しかない。
【００７８】
上記例において、ＡＬＴと組み合わせてＬＤＨを用いることにより、４５人に代え、１人の乳児が不必要に分娩されたことが示された。これは、吸引分娩を含まず、帝王切開のための費用においてのみ８８００００ＳＥＫの節約を与える。吸引分娩は、患者の苦しみの増加と組み合わせ、ヘルスケアのための費用を発生させ、母親及び乳児の両方の傷害のリスクを増加させる。
【００７９】
上述したように、ＡＳＴは、乳児が低酸素状態に苦しんでいるか否かを決定する場合に、方法に多くを与えてはいない。ＡＳＴは、１２時間の半減期のために情報を与えたままである。ＡＬＴと一緒に、また出生後に試料を繰り返し取り、これら２種の酵素は、低酸素状態が起こっているかについての情報を与えることができる。今日の産科医は、女性が分娩のために病院に到着した時に低酸素状態の症状であるか、又は乳児が既に低酸素状態に苦しんでいるかを立証するための問題を有しているので、これは大いに法律上の有用性がある。
【００８０】
科学文献からの情報に基づいた結論は、マグネシウムが、低酸素状態が存在するか、又は以前の発現であるかについての知識をもたらすことを示す。
【００８１】
高レベルのＬＤＨ＋ＡＬＴ＋ＡＳＴ＋Ｍｇは、末梢器官に影響を及ぼし、アシドーシスを示すのに十分に重症の低酸素状態の発症を示す。高レベルのＬＤＨ＋ＡＬＴ＋ＡＳＴであり、低レベルのＭｇは、器官損傷をもたらし、おそらく脳に影響を及ぼす低酸素状態の最近の発症を示す。Ｍｇは、溶血に対して感受性でなく、ＡＬＴと一緒に、ＬＤＨのレベルの上昇が器官損傷のためであり、溶血のためでないことを強調する。
【００８２】
以下において、実施例は、本発明の方法及び装置の実際の使用を記載し、Ａｎｎａと名付けられた患者が分娩をするために分娩室に到着したと仮定する。職員は、女性の胃に備えた小片を用いて心拍数を調べることにより、乳児の状態の制御を開始する（胎児の心拍数パターン、ＣＴＧ）。間隔をあけ、可能な変化を観察するためＣＴＧによる制御を実施する。分娩の８時間後、Ａｎｎａを８ｃｍ開腹する。新規なＣＴＧコントロールにおいて、子供の心拍数が上昇するのがわかる。助産婦が、病気の他の兆候がある場合に乳児の頭皮から試料をとることを継続することを望む産科医に呼びかける。
【００８３】
彼女の側に横たわっているＡｎｎａは、産科医の位置に移動することを求め、産科医は金属チューブを膣に通し、それを乳児の頭皮に押し込む。彼女は羊液を洗浄し、乳児の頭皮を小さく切断した（頭皮試料）。彼女が１滴の血液７を見た時、彼女は毛細管チューブを取り、約１０μＬの血液を採取する。（清潔にし、迅速に作業することを必要とする場合に、同時に小さいチューブから血液を採取するのは容易でない。３０〜４０μＬはこの設定において想到に大容量であり、ｐＨを測定する頭皮試料に必要である。）
【００８４】
次いで、助産婦は、医師が毛細管チューブ４に挿入した使い捨てカード２を産科医に提供する。次いで、血液を含むカード２をすぐ近くの検出機器３に挿入し、分光光度計により、ＬＤＨ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及びマグネシウムのレベルを分析する。赤血球７’’の分離後にカード２の上で分析を行い、残りの血漿７’をカードの上で試薬２０Ａ〜Ｄと反応させる。数分以内（例えば、２分）に結果が機器のディスプレイ上に示される。「正常−正常−正常−正常」と示され、これは、ＬＤＨ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及びマグネシウムのいずれのマーカーのレベルが上昇していないことを産科医に告げている。Ａｎｎａは自然の方法で分娩を続け、後に健康な乳児を出産する。
【００８５】
その夜遅く、産科医は、Ｈｅｌｅｎａが最初の子供を出産する部屋３を訪問する。ここで、同様にＣＴＧは良好でなく、頭皮試料を採取する。この時、ディスプレイは「高−高−高−高」を示し、これは、全てのマーカーのレベルが上昇していることを産科医に告げている。これは、ただ、乳児が低酸素状態に苦しんでいること、及び緊急の帝王切開をすることを決定することを意味する。手術のためのアラームが鳴り、Ｈｅｌｅｎａは大急ぎで彼女のベッドの部屋に行く。急速麻酔が実施され、産科医は彼女の手を洗浄し、手術衣に着替える。次いで、彼女は皮膚及び子宮を切断し、アラームのたった数分後に乳児を出産する。
【００８６】
上述したように、いくつかのマーカーは溶血に対して感受性である。この方法における溶血の影響は現段階では完全に調査されていないが、少なくともいくつかの局面においては結果を劇的に変化させないであろう。しかし、サンプリングの間に溶血が頻繁に出現する場合、それは、カード中の溶血についてのマーカーを統合するためのフォーサム（ｆｏｒｅｓｏｍｅ）である。最もありそうなシナリオは、我々が、マーカーの選択としてフリーのヘモグロビン（ＨＢ）を用いるであろうことである。血漿中のＨｂを測定することにより、溶血に関する情報が得られ、どれほど重症であるかを示すことも可能である。また、それを考慮し、溶血の程度に依存する酵素レベルを再検討することも可能である。
【００８７】
ある状況においては、このような分析が比色（試薬の色の変化）であり得る場合、ＬＤＨ単独、又は例えば乳酸、ＡＬＴ、ＡＳＴ又はマグネシウムと組み合わせたＬＤＨは乳児がどうすべきかを判断するのに十分である。
【００８８】
図８においては、分析を実施するために乾燥化合物を用いる、他の試験配置の実施態様を示す。図８に示すような試験装置５を用いる利点は、全ての創傷において電源が必要でないことである。試験装置５は、本体／ケース５０を形成する細長いチューブと一緒に配置されている。細長い本体５０内に、筐体５０の前部末端に隣接した位置の前部チャンバー５２内に広がったチャンネル５１がある。筐体の背部末端近くのチャンネル５１の他の末端に、ポンプ装置５３が供給されている。ポンプ装置５３は、その出口末端に、逆止め弁５４と一緒に配置された、弾力性のある中空体の形態である。出口（逆止め弁５４を通して）は、処理装置５５内に広がっている。筐体５０の前部末端に、血球をろ過して除去する、フィルター５８をによる前部チャンバー５２と連結した、中心に位置する孔５７を有するカラー装置５６がある。チャンネル５１の一部を形成する前部末端からの距離において、乾燥科学手段８を配置する追加チャンバー５９がある。また、ポンプ装置５３に隣接するチャンネル５１の一部として、バッファーを形成し、チャンネル５１内の血液７の容量に関する指標も提供する追加のチャンバー５０１が配置されている。
【００８９】
図８に示す試験装置は、分娩と関連して用いることを意図する。図８に図示するように、子供の頭部６の頭皮を貫通し、少量の血液７が得られる。その後、試験装置５を膣を通して挿入し、少量の血液の周囲にカラー５６を位置させることにより、血液試料７と接触させる。次の工程において、逆止め弁５４が、弾力性のあるポンプ装置５３の中空内部から逃げた空気に広がるであろう、ポンプメカニズム５３が活性化される。ポンプ装置５３が解放されると、真空が形成され（弾力性のために）、チャンネル５１を通して少量の血液７と連結し、それによって血液がフィルター５８を通してチャンネル５１に吸引される。従って、血漿７’は分析チャンバー５９内に入る。ポンプメカニズムは、試験のための十分な血液を保護するための多くの時間を適用するかもしれず、それは、血液がバッファーチャンバー５０１内でいったん観察されると測定され得る。その後、試験装置５が除去され、分析チャンバー５９内の化学的手段のカラーを観察することにより、子供が低酸素状態に苦しんでいるかどうかを決定することができる。それ自体公知であるように、乾燥化学的手段８は、どの色が示されるかに依存する種々の手段を示すために用いることができる。例えば、どの手段をとるかを示すために以下の色が用いられる。緑色が示される場合、手段を実施すべきでない。赤色が示される場合、子供は可能な限り迅速に取り出すべきである。黄色が示される場合、２０分以内に新しい試料を採取すべきである。
【００９０】
臨床的に、試験装置５は上述したように同じ種類の指標を与えるであろう。乳児の頭皮から血液を集めるための毛細管チューブの使用は、わずかに修飾された試験装置５と組み合わせることもできるが、好ましくは、血液を集める場合に、装置５内に閉鎖系が形成されるように設計することもできる。これは、多くの方法、例えば、乳児の頭皮に対してシリコンカラー（図示せず）により上部を押すことにより、又は装置５を取り除き、上部に堅く密封したキャップを取り付けることにより達成し得る。
【００９１】
我々は、また、今日用いられている乳酸試験を、本発明の本発明と組み合わせて分析すし得ると予見する。
【００９２】
図９において、それぞれ、好ましくは本発明の方法及び装置を用いる場合のフローチャートが示される。フローチャートに示すように、ＣＴＧは、好ましくは最初の指標として用いるべきである。ＣＴＧが正常であれば、通常は、どのような手段も着手する必要はない。しかし、ＣＴＧが異常である場合は、子供の頭皮に由来する血液試料を本発明に従い、直接分析するか、又は場合により胎児の心臓のＳＴ−分析を開始してもよい。
【００９３】
本発明は、前述したことにより限定されないが、添付した請求項の範囲内で変化し得る。例えば、「頭皮試料」の定義について、また身体の他の部分から集めた血液試料は、本発明の利点を得るために、いろいろな機会において機能することが当業者には明らかである。本発明において用いられる試料には、全血、血漿及び血清が含まれる。
【００９４】
他の態様において、本発明の実施態様は、は、他の医療状況において有利に用いることができる。医療処置の前に興味のある位置から血液試料を集め、予後マーカーについて分析する。
【００９５】
種々の実施態様においては、複数の予後マーカーを分析する。このような実施態様は、ＬＤＨと、両方の血液試料の血漿中の、基本的にＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸からなる群から選択される少なくとも１種の追加の予後マーカーの総量の測定を含む。従って、第一及び第二の試料中の各予後マーカーのそれぞれの量を、吻合の正確な位置を確認するために比較することができる。一実施態様においては、医療処置は、消化管の吻合を含む。
【００９６】
例えば、結腸直腸癌は、男女のいずれにおいても最も一般的な腫瘍の１種である。最新の治療法は、腸の根本部分と一緒に腫瘍を除去する外科手術を含む。これらの大部分のケースにおいて、その後、腸の遠位端及び近位端は再度構成される。これは吻合と呼ばれる。
【００９７】
それ自体は、特定の実施態様は、哺乳動物の消化管（例えば、腸）から集めた血液試料に由来する低酸素状態の検出方法を含む。それ自体は、特定の実施態様は、少量の血液からの低酸素虚血の迅速な（例えば、上記で議論したように数分又は数秒以内）検出のためのポイントオブケア（ＰＯＣ）法を含む。従って、これらの実施態様は、腸の選択部位が吻合に適切か否かを決定することを可能にする。
【００９８】
ＬＤＨ、ＡＳＴ、マグネシウム及び乳酸は、低酸素虚血の間に、細胞障害及び嫌気的代謝のために血液中で増加するマーカーである。血管を切除する前に、外科用メス（又は同様のもの）及び無菌毛細管を用いて腸からの血液を集めることができる。毛細管を前述した分析カードに挿入し、分析することができる。結果は、固有の患者の基準値（例えば、ベースライン）として用いることができる。腫瘍（及び周囲の腸）を除去した後、マーカーが上昇したかどうかを調べるために新しい試験を実施することができる。そうであれば、吻合の不足及び漏出を誘発する低酸素虚血のリスクを最小限にするために、いまだに存在する血液供給の近くに吻合の領域を移動することができる。
【００９９】
消化管に由来する血液のサンプリングに加え、本発明の実施態様は、有利には、外科手術の間に哺乳動物の興味のある器官又は脳脊髄液から血液試料を集めることを含む
【０１００】
例えば、胸腹部大動脈中における手術の主な原因は動脈瘤及び解離である。必要とされる広範囲の手術は、著しい罹患率及び死亡率と関連している。最も一般的な合併症のいくつかは神経損傷である。これらの大部分の合併症の原因は、虚血による酸素及びエネルギー供給の不足である。具体例として、このような処理は、大動脈の手術の部位に依存して患者の１〜１０％で術後合併症として永久麻痺を起こす。
【０１０１】
しかし、本発明の実施態様は、手術の間の、腰部ドレインを通した、特定の器官又は脳脊髄液（ＣＳＦ）に由来する血液中の低酸素虚血のためのＰＯＣ法であり得る方法を含む。それ自体は、興味のある特定の器官に由来する試料を得、前記に詳述したようにＬＤＨについて分析する。好ましい実施態様においては、低酸素状態を検出する方法は、試料中の、ＬＤＨと、基本的にＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸からなる群から選択される少なくとも１種の追加の予後マーカーとを検出することを含む。好ましくは、検出される追加の予後マーカーの１種には乳酸が含まれる。具体例として、興味のある特定の器官には哺乳動物の大動脈が含まれる。
【０１０２】
他の態様においては、本発明の実施態様は、移植療法後に患者の罹患率及び死亡率を改善することができる。特に移植後の罹患率及び死亡率に影響を及ぼす鍵となる因子の１つは、肝臓移植における肝臓移植片のような移植片の保存損傷に関連する。例えば、潅流液へのＬＤＨ、ＡＳＴ及びＡＬＴの漏出は、肝臓細胞膜の完全性損失の指標である。
【０１０３】
このような一実施態様においては、検出を必要とする哺乳動物に移植された器官内の低酸素状態の存在を検出する方法は、移植手術前の予後マーカーについて、前述したように、血液試料を集め、試料を分析することを含み得る。一実施態様においては、試料を分析し、試料中のＬＤＨ及び基本的にＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸からなる群から選択される少なくとも１種の追加の予後マーカーの総量を測定する。好ましい一実施態様においては、移植のための器官には肝臓が含まれる。
【０１０４】
本発明の特定の実施態様は、多臓器機能不全の危機的状態の発症のリスクを伴う患者の特定のための病院における要求を満足し得る。現在、ある国は、多臓器機能不全のリスクのある患者の評価のための病室（集中治療室でない）に現れることのできる移動チームを提供することを目的とし、集中治療室（ＩＣＵ）からの医師及び看護師からなる個人のチームを展開している。リスクにあると確認された場合、患者は治療を受け、ＩＣＵに移動することができる。オーストラリアにおいて、これらの移動チームの導入は、心停止、心停止による突然死、手術後合併症の発生及びＩＣＵにおける日数を５０％減少している。
【０１０５】
これら移動チームは、多臓器機能不全のリスクを評価するため、肺、腎臓及び血液循環の臨床検査を実施する。しかし、肝臓又は代謝の評価のための迅速な信頼できる方法はない。肝臓は、しばしば重症疾患により影響を受け、肝臓酵素及び代謝性アシドーシスは死亡率の予測因子である。
【０１０６】
従って、本発明の実施態様の装置は、このようなチームによる使用に十分に適している。このような装置は、通常は小さく、病室において調べる場合に、移動チームが持って行く（例えばバッグ内に）のに十分に迅速である。ＬＤＨ、ＡＳＴ及びＡＬＴは肝臓細胞内に存在し、代謝性アシドーシスの際に乳酸が増加するので、これらのチームは、現在、本発明の装置を利用することによって調べる他のパラメータに対する肝臓の評価を加えることができる。従って、本発明の装置及び方法は、重症疾患のリスクのある患者でさえ潜在的に特定し、その結果、人道主義（ｈｕｍａｎｉｔａｒｉａｎ）及び経済的費用の両方を節約する。
【０１０７】
他の態様においては、特定の実施態様の装置及び方法は、集中治療室（ＩＣＵ）内のスタッフによる使用に十分に適している。ＩＣＵは、ヘルスケアシステムにおける大部分の重病患者に対して責任がある。              独立して、外傷、心臓診断、敗血症、出血又は広範囲の手術のために患者がＩＣＵに搬送される場合、血液循環及び飽和状態が不十分であると、低酸素状態の相当なリスクにある。典型的なパラメータを慎重に監視し、異常な状態を流体及び薬剤で処理したとしても、末梢組織における治療効果に関する情報をＩＣＵのスタッフに提供することのできるベッドサイドでの方法はないままである。
【０１０８】
激しいショックを受けた患者における、血清ＬＤＨ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸の相当な増加が、悪い結果（例えば、死亡）の指標であることが知られている（Ｈａｒｄａｗａｙ  １９８１）。ＡＳＴ、ＡＬＴ（以前はＬＤＨでもある）は、肝障害のマーカーとして、多くのＩＣＵにおける臨床ルーチンとして測定され、乳酸は、嫌気的代謝及び腸虚血のマーカーとして用いられる（Ｊｕｅｌ  ２００７）。しかし、ベッドのそばで操作することができ、又は数分程度で結果を与えることのできる装置は、未だにない。
【０１０９】
本発明の実施態様は、結果を最大限でも数分以内の程度で利用できる、ベッドサイドでの低酸素状態の検出のための装置及び方法を含む。このような実施態様は、ＬＤＨの分析及び検出のための試料を得ることを含む。好ましい実施態様においては、方法は、血漿中の、基本的にＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸からなる群から選択される少なくとも１種の追加の予後マーカーの量を測定することを含む。
【０１１０】
前記で議論したように、分娩の間又は終わりにおける急性周産期仮死、すなわち、低酸素状態（胎児血液の不十分な酸素飽和）は、新生児乳児における低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）の形態における神経損傷の重要な原因を残している。脳内のニューロンの損傷を誘発する低酸素虚血の病理学的メカニズムは、出生直後の主要相から開始する、二相性のものである。幼児が首尾良く蘇生した場合、この主要な相には、数時間継続するフリーの間隔が続くであろう。窒息している７人の幼児のうちの２人において、このフリーの間隔には、子供の脳内の遅発性細胞死をもたらす二次エネルギー枯渇、及びてんかん発作（ＨＩＥとしても知られている）を伴う臨床像が続くであろう。フリーの間隔は、低体温処理（子供の脳を３４．５℃まで冷却）による遅発性細胞死を最小にする可能性を提供する。。しかし、現在では、子供がＨＩＥを発症し得ることを予測し、その結果、低体温処理の利益を享受するための確実な手段がない。
【０１１１】
出生後可能な限り早く低酸素状態の処理を開始することが重要なので（神経保護効果は、呼吸停止５．５時間後に最も減少する）、予後マーカーの検出のためのケアシステムの迅速なポイントに臨床的価値がある。データは、ＡＬＴと共にＬＤＨの量を測定することにより、それが＞９６％の特異性を有するＨＩＥの予測について１００％の感度を提供することを示す新生児から集められた。
【０１１２】
本発明の特定の実施態様は、臨床の現場、及び周産期仮死にかかっている新生児における低酸素状態の治療に関する研究における医師のための診断手段を提供する。更に、本発明の実施態様は、個体が、周産期仮死後の脳損傷を予測し得る、低酸素状態の検出方法を含む。このような方法は前記に詳細に議論したような、ＬＤＨの解析のための試料を得ることを含む。好ましい実施態様においては、複数の予後マーカーの相対量を測定することができる。好ましくは、血液試料を、血漿が血球から分離され、種々の予後マーカーのレベルの測定が、血漿のみの分析に基づくように処理される。好ましい実施態様においては、方法は、血漿中の、ＬＤＨと、基本的にＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸からなる群から選択される少なくとも１種の追加の予後マーカーの量を測定することを含む。最も好ましくは、ＡＬＴの量は、測定される予後マーカーの１種である。
【０１１３】
本発明の実施態様の一つの方法においては、方法は、血漿中のＬＤＨ（単独又は他の予後マーカーと共に）の測定が哺乳動物の脳内の細胞死の遅延を示す、必要とする哺乳動物に対する低酸素状態の治療を提供することを含む。
【０１１４】
他の態様においては、本発明の実施態様は、医療処置又は手術処置の前、最中及び後の哺乳動物の手足の状態を評価するために用いることができる。例えば、外傷、骨折及び血管閉塞は、末梢の手足及び筋肉の循環に影響を及ぼし得る（例えば、筋区画症候群）。虚血性筋肉内の酸素と乳酸のレベルとの間に有意な相関があり、ＬＤＨが観察され（Ｙａｍａｍｏｔｏ  １９８８）、末梢性動脈閉塞性疾患を患っている患者の大腿骨の血液中で、コントロールの値と比較して乳酸が上昇している（Ｒｅｘｒｏｔｈ  １９８８）。本発明の実施態様の装置は、特定の手足の虚血を診断し、ほとんどの治療の効果を評価するために酵素及び乳酸レベルを用いることを可能にする。
【０１１５】
更に、本発明の実施態様は、興味のある手足に由来する試料を分析し、血漿中のＬＤＨの総量を測定することにより、低酸素虚血を検出する方法を含む。追加の診断マーカーは、ＬＤＨの測定と同時に定量することができる。これは、医療処置又は手術処置の前、最終及び後で哺乳動物の手足に対する血液循環を評価することを可能にする。
【０１１６】
当業者は、発明性のあるスキルなしで、例えば、プラスチックに代えてガラス又はある種の適切な他の材料を用いるなどにより、前記記載を逸脱することなく多種多様の修飾を実施することができる。
【０１１７】
本明細書に開示した本発明の多くの修飾及び他の実施態様は、これらの発明が前記記載及び関連図面に示される教示の利益を有するように、当業者には思い浮かぶであろう。従って、本発明は、開示された特定の実施態様に限定されず、他の実施態様は添付された請求項の範囲内に含まれることが意図される。本明細書で特定の用語が用いられるが、それらは限定の目的に用いられるのではなく、一般的かつ記述的に用いられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年9月2日(2009.9.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
ａ．組織部位から血液試料を集める工程（前記血液試料は血漿及び血球を含む）；
ｂ．血球から血漿を分離する工程；
ｃ．血漿中のＬＤＨの量を測定する工程；及び
ｄ．血漿中のＬＤＨ量から、組織部位における低酸素状態を評価する工程
を含む、哺乳類の組織部位における低酸素状態の評価方法。
【請求項２】
基本的にＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸からなる群から選択される、血漿中の少なくとも１種の追加の予後マーカーの量を測定することを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
血液試料の容量が、５μＬ〜１５０μＬである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
血液試料の容量が、５μＬ〜２５μＬである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
血液試料の容量が、５μＬ〜１５μＬである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
血漿が膜を通過し、血球が膜に保持されるように、血漿が、半透性膜を用いて血球から分離される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
血液試料が、哺乳動物の腸から集められる、請求項１記載の方法。
【請求項８】
血液試料が医療処置の前に集められ、更に下記工程：
ａ．医療処置の後に第二の血液試料を集める工程（前記血液試料は血漿及び血球を含む）；
ｂ．第二の血液試料の血球から血漿を分離する工程；及び
ｃ．第二の血液試料の血漿中のＬＤＨの総量を測定する工程
を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
基本的にＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸からなる群から選択される、両方の血液試料の血漿中の少なくとも１種の追加の予後マーカーの量を測定することを更に含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
血液試料中の予後マーカーの量を比較することを更に含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
医療処置が消化管の吻合を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
血液試料が、外科手術の間に哺乳動物の特定の器官、髄液、尿、又は腹腔内液の１種以上から集められる、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
器官が哺乳動物の大動脈を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
基本的にＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸からなる群から選択される、血液試料の血漿中の少なくとも１種の追加の予後マーカーの量を測定することを更に含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１種の予後マーカーが乳酸を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
血液試料が、前記器官を必要とする哺乳動物に移植される器官から集められる、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
血液試料が、移植手術の前に集められる、請求項１７記載の方法。
【請求項１８】
器官が肝臓を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
基本的にＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸からなる群から選択される、血漿中の少なくとも１種の追加の予後マーカーの量を測定することを更に含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
基本的にＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸からなる群から選択される、血漿中の少なくとも１種の追加の予後マーカーの量を測定することを更に含む、請求項２記載の方法。
【請求項２１】
予後マーカーの測定が、個体に哺乳動物の肝臓の健康を評価することを可能とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
低酸素状態の検出が、出生前仮死後の脳損傷の予測を可能にする、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
基本的にＡＳＴ、ＡＬＴ及び乳酸からなる群から選択される、血漿中の少なくとも１種の追加の予後マーカーの量を測定することを更に含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
血漿中のＡＬＴの量を測定することを更に含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
血漿中のＬＤＨの測定が哺乳動物の脳における遅発性細胞死を示す、治療を必要とする動物に対する低体温療法を供給することを更に含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
血漿中のＬＤＨの総量の測定が、治療又は外科治療の前、最中又は後に哺乳動物の手足への血
【国際調査報告】
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