(57)【要約】  本発明は、ＣＲＭ１９７をコードし、その大腸菌中での発現に最適化された、配列番号１を含むポリヌクレオチド配列に関するものである。その結果、本発明は、大腸菌中での、融合タンパク質ＣＲＭ１９７−タグを経由した、ＣＲＭ１９７の生産方法に関する。
2012531198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
更に、タグポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を少なくとも含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
タグ配列が、タグを後で取り除くことのできる適切な酵素による認識に適した切断配列と関係がある、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項５】
大腸菌種に属し、請求項４に記載の発現ベクターを含む、遺伝子改変微生物。
【請求項６】
請求項２又は３に記載のポリヌクレオチドによってコードされる組換え融合タンパク質ＣＲＭ１９７−タグ。
【請求項７】
請求項６に記載のタンパク質ＣＲＭ１９７−タグの生産方法であって、請求項５に記載されるように遺伝子改変した大腸菌中での培養による発現を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項５に記載されるように遺伝子改変した大腸菌中での発現を用いた、タンパク質ＣＲＭ１９７の生産方法。
【請求項９】
請求項６に記載のタンパク質を中間体として含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
薬用の又は医薬組成物におけるキャリヤーとしての、請求項６に記載の組換え融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工遺伝子配列を用いた医薬的興味のあるタンパク質の産生であって、前述の配列が発現ベクター中に挿入されているものと、前述の発現ベクターを用いて転換された微生物中での対応タンパク質の過剰発現と、発現したタンパク質を単離する方法の分野に関する；具体的に、それは、ＣＲＭ１９７全体及びその誘導体をコードする人工遺伝子の構築、大腸菌（エシェリキア・コリ）中でのＣＲＭ１９７及びその誘導体の発現、並びにタンパク質ＣＲＭ１９７の単離及び精製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質ＣＲＭ１９７（交差反応性物質１９７，５８ｋＤａ）は、ジフテリア毒素（ＤＴｘ）の変異体であって、その毒性を低減する単一変異を特徴とするものである（即ち、ヌクレオチド変異が、５２位におけるグリシン−グルタミン酸置換を生じさせる）（Ｕｃｈｉｄａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ，１９７３；Ｇｉａｎｎｉｎｉ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ，１９８４）。それにもかかわらず、タンパク質ＣＲＭ１９７は、ジフテリア毒素と同一の炎症特性及び免疫刺激特性を保持しており、それは、ボルデテラ・パータッシス、クロストリジウム・テタニ、コリネバクテリウム・ジフセリエ、ヘパティティスＢウイルス、及びヘモフィルス・インフルエンザＢ型に対する結合型ワクチンの調製に広く使用されている（ＷＯ９３／２４１４８及びＷＯ９７／００６９７，ＷＯ０２／０５５１０５）。野生型ジフテリア毒素と同様に、ＣＲＭ１９７は、ジスルフィド架橋により一緒に結合した２つのドメインＡ及びＢを含む。ドメインＡ（２１ｋＤａ）は、触媒ドメインであり、一方、ドメインＢ（３７ｋＤａ）は、細胞受容体に結合するための１つのサブドメインと、転位のためのもう１つのサブドメインとを含有する（Ｇｉｌｌ  Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ，１９７１；Ｕｃｈｉｄａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ，１９７３）。ＤＴｘと同様に、タンパク質ＣＲＭ１９７は、（ドメインＢを用いて）細胞受容体ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合性上皮増殖因子）に結合することができ、それは、エンドサイトーシスによって細胞内部で転位を可能にする。エンドソーム中で低いｐＨにさらされ、膜中におけるドメインＢの挿入及びサイトゾル中におけるその後のドメインＡの転位に欠かせない立体構造変化を引き起こす（Ｐａｐｉｎｉ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ，１９９３；Ｃａｂｉａｕｘ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ，１９９７）。転位に必須の条件は、２つのドメインＡ及びＢ間のペプチド結合のプロテアーゼによる破断である。ジスルフィド架橋の還元と組み合わされて、この消化はドメインＡを放出し、それを活性にする一方で、単一ポリペプチドとして合成された全タンパク質は、不活性である（Ｇｉｌｌ  Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ，１９７１）。
【０００３】
ジフテリア毒素のドメインＡは、ＡＤＰリボシル化活性を有し、ＡＤＰリボース基のＮＡＤから伸長因子２（ＥＦ−２）への転移を触媒しており、それはタンパク質合成に関与するものである。形成される複合体は、不活性であり、それ故に真核生物のタンパク質合成の妨害を引き起こす（Ｈｏｎｊｉｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ，１９７１）。また、タンパク質の細胞毒性効果も、ドメインＡのもう１つの活性によるものであり、それはＤＮＡを非特異的に分解することができる（Ｇｉａｎｎｉｎｉ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ，１９８４）。このエンドヌクレアーゼ活性は、二価の陽イオンによって決まり、その上、ＣＲＭ１９７中に保持される（Ｂｒｕｃｅ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ，１９９０；Ｌｅｅ  Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ，２００５）。
【０００４】
ＣＲＭ１９７及び他の非毒性変異体は、通常、特定のβファージ（そのゲノムはジフテリア毒素（ＤＴｘ）をコードする変異型ｔｏｘ遺伝子を含有する）に感染したコリネバクテリウム・ジフセリエの溶原性培養物を用いて産生されている。ジフテリア毒素及び他の変異体は、特定の増殖条件下の培地中に分泌され、次いで、ろ過又は沈殿によって回収され、その後、クロマトグラフィー法を用いて精製される（Ｃｏｘ  Ｊ．，１９７５）。ＤＴｘ及びその誘導体（ＣＲＭｓ）の両方の産生のために最初に使用される手順は、高収率を保証し得るが、コリネバクテリウムの単一溶原株からのＣＲＭ１９７の産生は、ワクチン中での抱合体としての使用に対して経済的に有利でなかった。ＣＲＭ１９７の産生を工業規模に増大させるため、二重及び三重溶原変異体をその後に単離したが、それらは染色体中に組み込まれた２つ又は３つのｔｏｘ遺伝子を含有するものである（Ｒａｐｐｕｏｌｉ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ，１９８３；Ｒａｐｐｕｏｌｉ  Ｒ．，１９８３）。１９９０年、Ｒａｐｐｕｏｌｉは、ＤＴｘに由来するタンパク質の産生方法であって、染色体中に組み込まれた変異ｔｏｘ遺伝子の２コピーを備えたコリネバクテリウム菌株を使用する方法について説明した。また、収率を増加させるため、増殖条件を確立した（培地、第一鉄イオンの濃度、増殖温度、酸素濃度等）（米国特許４９２５７９２，１９９０年）。ＣＲＭ１９７は、対数増殖期を通じて、定常期の開始まで、培地中に蓄積しており、それは、発酵が開始してから２０時間前後でピークに達する。その後、収率の大幅な減少の痕跡があるが、おそらくタンパク質分解が原因である（米国特許４９２５７９２，１９９０年）。
【０００５】
発現効率の増加のための二重及び三重溶原株の構築は、骨の折れる選別段階を伴う長期間のプロセスであることに注意しなくてはいけない。高レベルのＣＲＭ１９７を得るための代替方法は、ＣＲＭ１９７をコードするファージ遺伝子のプラスミドｐＮＧ−２２による融合から得られる、特異的プラスミド，ｐＰＸ３５１１を使用する（米国特許５６１４３８２，１９９５年）。これは、多重溶原性菌種の選択を必要とせずに、遺伝子のコピー数を増大させることを可能にする（細胞につき５〜１０まで）。繰り返して言うが、ファージβ１９７ｔｏｘ−に感染したコリネバクテリウム菌株の場合のように、ＣＲＭ１９７は、第一鉄の含量が低い特定の培地中において発現される。上記菌種の遺伝子処理に必要とされる時間の低減にもかかわらず、ＣＲＭ１９７の産出量は、二重溶原菌の使用と比較して劇的には増大しない。最近では、ＤＴｘ又は他の各種ＣＲＭｓの産生のための発酵方法が、幾つかの特許に記載されており、通常、Ｃ．ジフセリエ培養物の使用を含む。一般的に言えば、増殖は、温度、攪拌及び曝気の制御された条件下で行われ、その毒素及び／又はその誘導体の最大産生量は、２０時間の培養後に生じる（Ｄｅｈｏｔｔａｙ  Ｐ．Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ，ＵＳ２００８／０１９３４７５；Ｗｏｌｆｅ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ，ＵＳ２００８／０１５３７５０）。
【０００６】
一方、コリネバクテリウムの代替物としての細菌宿主の使用に関する研究は、制限されている。ドメインＡ及びＢの発現、並びに一部中間形態のＤＴｘ（ドメインＡがドメインＢの部分と一緒のもの）に関し、大腸菌中でテストが行われた。これらの研究は、一般に、毒性、受容体への結合、タンパク質の折り畳み及び安定性の観点から、ドメインＡ及びＢ（並びにそれらの部分）の役割を詳細に調べるために行われている（Ｂｉｓｈａｉ  ＷＲ  ｅｔ  ａｌ，１９８７ａ；Ｂｉｓｈａｉ  ＷＲ  ｅｔ  ａｌ，１９８７ｂ）。これら断片（その一部は融合タンパク質として産生される）は、それらの溶解度及び最終収率（０．４〜１０ｍｇ／Ｌの範囲で変化し、全タンパク質の約７％に相当する）を評価する目的で、異なるプロモーター及び異なる発現条件を用いて大腸菌中で発現されてきた。並行して、１８７５ｂｐの断片であって、元のｔｏｘプロモーター、シグナル配列及びＣＲＭ１９７をコードする全遺伝子を含む断片をクローン化した。ウエスタンブロッティング実験における対照として使用されると、このクローンは、細胞質周囲レベルで発現した場合、各種断片よりも安定しいるようであるが、タンパク質の溶解度は、高温下、細胞質中で発現した場合、著しく低下する（Ｂｉｓｈａｉ  ＷＲ  ｅｔ  ａｌ，１９８７ｂ）。
【０００７】
天然のｔｏｘプロモーターを用いて、完全なドメインＡを発現することが可能であるが（Ｌｅｏｎｇ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ，１９８３）、大腸菌中におけるドメインＢ単独の発現は、このドメインが非常に不安定で、タグとの融合においてのみ発現するため、より複雑であると証明されている（Ｓｐｉｌｓｂｅｒｇ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ，２００５）。
【０００８】
明らかに、上記毒素及びその誘導体の異種産生は、最適なタンパク質立体構造の採用、潜在的な分解及び低い最終収率に関する多くの問題によって制限される。理想的なタンパク質立体構造に関与する２つの分子間ジスルフィド架橋の形成を回避するための１つの戦略は、幾つかの修飾ペプチド誘導体、特にはペプチドＤＴａ（ＣＲＭ１９７配列の最初の１８５ａａからなる）、ペプチドＤＴｂ（２５５ａａ、細胞受容体に結合するドメイン及びＮ末端での８ａａの欠失がある）、及び先の２つのペプチドの融合から得られるペプチドＤＴａＤＴｂ（４４０ａａ）の構築を含んだ。これら断片は、Ｃ．ジフセリエゲノムを鋳型として用いるＰＣＲによって合成され、その後、トリプトファン誘導システムを利用することによって、それらは大腸菌中で発現した（Ｃｏｒｖａｉａ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ，ＦＲ２８２７６０６Ａ１  ２００３年）。
【０００９】
最近では、可溶形態のＨＢ−ＥＧＦに結合する能力に関する潜在的な抗腫瘍作用のため、ＣＲＭ１９７への関心が高まっている（Ｍｅｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ，ＵＳ２００６／０２７０６００Ａ１）。この抗腫瘍機能は、ＣＲＭ１９７だけでなく、ＤＴ毒素の他の非毒性誘導体（例えば、二重変異体ＤＴ５２Ｅ１４８Ｋ、又は融合タンパク質ＧＳＴ−ＤＴ）にも起因し得る。これら変異体は、ＣＲＭ１９７をコードする遺伝子から開始して、ＰＣＲによって構築された。しかしながら、前述の研究では、３５℃にて１６〜１７時間成長させた、Ｃ．ジフセリエの培養物を用いて、ＣＲＭ１９７全体を産生した。ＣＲＭ１９７は、硫酸アンモニウムによる初期沈殿によって上澄みから精製され、次に、イオン交換及び疎水性クロマトグラフィーの連続する３つの工程が続いた（Ｍｅｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ，ＵＳ２００６／０２７０６００Ａ１）。
【００１０】
それ故、ジフセリエ毒素全体又はＣＲＭ１９５の大腸菌中での発現を記載する文献において利用できる研究はない。
【００１１】
従って、短期間に、費用効率の高い収率で、好ましくはコリネバクテリウムに代わる細菌宿主の使用によって、ＣＲＭ１９７（及びその誘導体）を産生するための代替方法を処理する必要が明らかにある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ９３／２４１４８
【特許文献２】ＷＯ９７／００６９７
【特許文献３】ＷＯ０２／０５５１０５
【特許文献４】米国特許４９２５７９２
【特許文献５】米国特許５６１４３８２
【特許文献６】ＵＳ２００８／０１９３４７５
【特許文献７】ＵＳ２００８／０１５３７５０
【特許文献８】ＦＲ２８２７６０６Ａ１
【特許文献９】ＵＳ２００６／０２７０６００Ａ１
【発明の概要】
【００１３】
（定義及び略語）
ＣＲＭ１９７：交差反応性物質
ＤＴｘ：ジフテリア毒素
ＤＴＡ：ジフテリア毒素ドメインＡ
ＤＴＢ：ジフテリア毒素ドメインＢ
ＥＦ−２：伸長因子−２
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＩＰＴＧ：イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
【００１４】
（発明の概要）
本発明は、大腸菌中でのタンパク質ＣＲＭ１９７の過剰発現に特異的な人工ポリヌクレオチド配列（配列番号１）を用いて、上述の問題を解決する。その遺伝子は、タグ配列に関連でき、その結果、大腸菌中での融合タンパク質，ＣＲＭ１９７−タグの発現を可能にする。また、本発明は、配列番号１の配列を含有するプラスミド、及び前記プラスミドの導入によって遺伝子改変した大腸菌株に関係する。一の態様では、本発明は、上述の遺伝子改変した大腸菌から産生された組換え融合タンパク質ＣＲＭ１９７−タグに関係する。
【００１５】
また、本発明は、先に説明したように遺伝子改変した大腸菌中での発現及びその後の精製による、Ｎ末端タグを持つ組換えタンパク質ＣＲＭ１９７（ドメインＡ及びＢ）の生産方法に関係する。また、上記方法は、天然型のタンパク質ＣＲＭ１９７を得るための上記タグの除去を含む。
【００１６】
本発明は、微生物コリネバクテリウム・ジフセリエの使用に代わるものとしての、タンパク質ＣＲＭ１９７及び類似のタンパク質を産生するための新規な方法を提供する。本発明に記載の手順によれば、興味のある上記タンパク質は、基礎研究及び内科治療分野での適用のため、大量に得ることができる。本発明は、以下に示す利点を示す：ｉ）それは、微生物である大腸菌（産業的及び薬理学的用途のための異種タンパク質の発現において十分に使用される）を使用する；ｉｉ）大腸菌の遺伝的特徴は、何年にもわたり知られており、多くの代替システム（ベクター及び菌株）がその発現に使用可能である；ｉｉｉ）それは、非病原性微生物である；ｉｖ）大腸菌の使用は、それが高バイオマス収率で急速に成長するため、生産回数が低減できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、電気泳動実験（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ１０％）を示し、ここで、大腸菌の異なる細菌培養物、即ちＢＬ２１ＡＩ（レーン１，２，３，４）及びＢＬ２１（ＤＥ３）（レーン５，６，７，８）の全タンパク質抽出物から得られた配列番号６を備えるタンパク質（ＣＲＭ１９７−タグ，６１ｋＤａ）に相当するバンドを見ることができる。上記培養物は、様々な誘導時間（１時間、３時間及び一晩）にかけられた。レーンＭ：標準分子量マーカー；レーン１及び５：誘導されないサンプル；レーン２及び６：１時間誘導されたサンプル；レーン３及び７：３時間誘導されたサンプル；レーン４及び８：一晩誘導されたサンプル。
【図２】図２は、不溶性画分からのタンパク質ＣＲＭ１９７−タグの可溶化に関して行われた試験を図示する。全ての試験は、６〜７Ｍの尿素を含有する溶液を用いて行われた。レーン１及び２：非誘導の培養物（１）及び誘導した培養物（２）から得られた可溶性画分；レーン３：標準分子量マーカー；レーン４：２０℃での可溶化溶液及びＴｗｅｅｎ２０；レーン５：２０℃での可溶化溶液及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；レーン６：２０℃での可溶化溶液及び還元剤（β−メルカプトエタノール２０ｍＭ）；レーン７：２０℃での可溶化溶液及びＳＤＳ；レーン８：３０℃での可溶化溶液及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；レーン９：３０℃での可溶化溶液及び還元剤。
【図３】アフィニティークロマトグラフィー後に得られた幾つかの画分の電気泳動実験を示す。レーン１：６〜７Ｍの尿素を用いて可溶化したサンプル，プレカラム；レーン２：カラム中で結合しないフロースルー；レーン３及び４：イミダゾール勾配で溶出された第一画分；レーン５〜１０：溶出ピークの中心部分に相当する画分。
【図４】精製段階が目に見えるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）ゲルを示す。レーンＭ：標準分子量マーカー；レーン１：可溶性画分；レーン２：尿素を用いて可溶化した全抽出物；レーン３：アフィニティークロマトグラフィー後のサンプル；レーン４：ゲルろ過クロマトグラフィー後のサンプル。
【図５】エンテロキナーゼによる消化の前後でのＣＲＭ１９７サンプルの電気泳動実験を示す。Ｍ：標準分子量マーカー；レーン１：エンテロキナーゼを用いて処理していないＣＲＭ１９７−タグ；レーン２：２４℃にて２０時間消化したＣＲＭ１９７−タグ。上記サンプルは、還元剤の存在下において煮沸された。可視帯は、ドメインＢ、ドメインＡ及びドメインＡ−タグ（それぞれａ，ｂ，ｃ）に相当する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
Ｇｉａｎｎｉｎｉ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ（１９８４）によって説明され、細胞外に搬出するための天然シグナル配列のない、全ＣＲＭ１９７に相当する配列は、Ｌｅｔｏソフトウェア（Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ  ＧｍｂＨ，レーゲンスブルク，ドイツ）の助けにより、大腸菌中での発現のために最適化された配列番号１のポリヌクレオチド配列を得るために使用された。
【００１９】
また、配列番号１の遺伝子配列は、細胞質安定性を促進し及び／又は各種タグペプチドに対して親和性の高いマトリックス及び樹脂を用いたその後の精製を容易にするため、タグポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列と、５’及び３’の両末端にて、関連することができる。タグポリペプチドをコードする既知ヌクレオチド配列は、非常に多く存在する。これらの中でも、タグＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ（Ｔ７−タグ）、ＮＤＹＫＤＤＤＤＫＣ（ＦＬＡＧ−タグ）、ＷＳＨＰＱＦＥＫ（Ｓｔｒｅｐ−タグ）、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（ＨＡＴ−タグ）、ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ（Ｓ−タグ）、及びＮＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＣ（Ｍｙｃ−タグ）について、６，８，１０のヒスチジン（Ｈ）（Ｈｉｓ−タグ）をコードするヌクレオチド配列がある。
【００２０】
また、配列番号１の遺伝子は、他のタグ配列、例えばチオレドキシン（Ｔｒｘ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、セルロース結合タンパク質（ＣＢＤ）及びキチン結合タンパク質（ＣＢＰ）と関連することができる。
【００２１】
タグ配列は、そのタグを後で除去することができる適切な酵素による認識に特異的な切断配列と適切に関連することができる。エンテロキナーゼ、トロンビン、Ｘａ因子又はフューリンは、タグを除去するため、好適に使用され、最もよく知られ且つほとんどの場合に使用される切断ペプチド配列は、それぞれＤＤＤＤＫ、ＬＶＰＲＧＳ、ＩＥ／ＤＧＲ及びＲＸＸＲである。
【００２２】
一の好適な実施態様において、配列番号１の遺伝子は、ポリ−ヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチドと関連する。ｈｉｓ−タグ配列は、５’末端側端部及び３’末端側端部の両方に加えることができる。
【００２３】
以下に示すものは、ｈｉｓ−タグペプチド配列の例である：ＭＧＧＳＨＨＨＨＨＨＧＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲ，ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧ，ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬ，ＭＧＳＧＨＨＨＨＨＨ，ＭＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＳＳＧ，ＭＨＨＨＨＨＨＳＳＧ，ＡＬＥＨＨＨＨＨＨ，ＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨ。
【００２４】
一の特に好適な実施態様は、配列番号２であり、ここでは、８４のヌクレオチドの配列が、５’末端側端部にて配列番号１の配列に加えられ、６のヒスチジンを含有する配列ＭＧＧＳＨＨＨＨＨＨＧＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲ及びエンテロキナーゼの切断配列ＤＤＤＤＫをコードする。
【００２５】
当然ながら、配列番号１を含む配列は、開始及び停止コドンと、クローニングのために用いる制限酵素の認識部位をコードする適切な配列とを備えるのに適しているのが好ましい。
【００２６】
配列番号１を含む遺伝子は、化学合成によって調製でき、次いで、適切な発現ベクター中でクローン化できる。一の特定の実施態様において、人工配列（配列番号１及び２）は、組立手順によって合成的に調製されたものであり、配列番号４と配列番号６の配列をそれぞれ備えるタンパク質をコードする配列番号３と５がそれぞれ得られた。
【００２７】
また、本発明は、配列番号１の配列、好ましくはタグと制限酵素及び／又はプロテアーゼに特異的な認識部位とを備えたその誘導体を含む発現ベクター（プラスミド）に関する。
【００２８】
ｐＥＴシリーズからのプラスミドは、配列番号１を含む人工遺伝子をクローン化するのに好適に使用される。具体的に、ベクターｐＥＴ９ａは、ファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ酵素に対して特異的なプロモーターＴ７を含有する。このポリメラーゼは、極めて効率的であり（細菌ＲＮＡポリメラーゼよりもはるかに高い）、また特異的である（それは、細菌プロモーターを認識しない）。プラスミドｐＥＴ９ａの他、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）において、そのプロセスに適した他のベクターには、ｐＥＴ３ａ，ｐＥＴ３ｂ，ｐＥＴ３ｃ，ｐＥＴ５ａ，ｐＥＴ５ｂ，ｐＥＴ５ｃ，ｐＥＴ９ｂ，ｐＥＴ９ｃ，ｐＥＴ１２ａ，ｐＥＴ１２ｂ，ｐＥＴ１２ｃ，ｐＥＴ１７ｂが含まれ、一般には、強力なファージＴ７プロモーターを有する全てのベクターが含まれる（例えば、ｐＲＳＥＴＡ，Ｂ及びＣ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］並びにｐＴＹＢ１，ｐＴＹＢ２，ｐＴＹＢ３及びｐＴＹＢ４［Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ］）。
【００２９】
クローニングのため、制限酵素として、Ｎｄｅｌ及びＢａｍＨＩを使用することが好ましい。
【００３０】
得られた構築物は、大腸菌株を転換するために使用できる。前述の大腸菌株は、異なる誘導質、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）又はアラビノース等を利用する代わりの遺伝子発現調節システムを特徴とすることができる。
【００３１】
ｐＥＴ型プラスミドであって、ファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ酵素に対して特異的なプロモーターＴ７を含有するものを用いる場合、そのときの配列番号１を含有するｐＥＴ構築物による転換に適した大腸菌株は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ酵素を提供可能なもののうちいずれでもよいが、好ましくは、ＥＲ２５６６，ＥＲ２８３３，ＥＲ３０１１，ＥＲ３０１２，ＢＬ２１ＡＩＴＭ，ＢＬ２１（ＤＥ３），ＢＬ２１ＳｔａｒＴＭ（ＤＥ３），ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３），ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ，Ｃ４１（ＤＥ３），Ｃ４３（ＤＥ３），ＢＬＲ（ＤＥ３），Ｂ８３４（ＤＥ３  ＴｕｎｅｒＴＭ（ＤＥ３）等の大腸菌Ｂ型；又はＨＭＳ１７４（ＤＥ３），ＡＤ４９４（ＤＥ３），ＯｒｉｇａｍｉＴＭ（ＤＥ３），ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３），ＲｏｓｅｔｔａＴＭ（ＤＥ３）等のＫ−１２に由来する大腸菌である。細菌株は、電気穿孔法によって転換されるのが好ましいが、他の既知の方法が、同様に適している場合もある。
【００３２】
特定の実施態様において、配列番号３と５を備える遺伝子は、それぞれ配列番号１と２を含み、化学的に合成され、次いで、ｐＥＴシリーズの特定のプラスミド中でクローン化される。クローニング及び発現に用いるベクターは、複製開始点ｐＢＲ３２２を特徴とするｐＥＴ９ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）であった。それは、以下のことを保証する：細胞当たりの多数のコピー；細菌宿主の内部にプラスミドを保持するための選択的マーカー（カナマイシン耐性のｋａｎ遺伝子）；クローニングに適した多数の制限部位を含有するポリリンカー領域；及びＣＲＭ１９７の過剰発現を調節するために誘導できる特異的プロモーターである。
【００３３】
Ｎｄｅｌ及びＢａｍＨＩは、（ポリリンカー中）プラスミドの内部で人工遺伝子をクローニングするための制限酵素として使用され、配列決定は、その適切な配向及び位置を検証するために使用された。得られた構築物は、電気穿孔法によって幾つかの大腸菌株を転換するために使用され、Ｐｅｔｒｉ皿（カナマイシンが加えられた固体ＬＢを含有する）上に転換コロニーを選択する。ベクターｐＥＴ９ａ中でクローン化されるＣＲＭ１９７発現に適切な細菌株の中でも、大腸菌Ｂ型の２つの誘導体、即ちＢＬ２１ＡＩ及びＢＬ２１（ＤＥ３）が選択された。両者は、誘導プロモーターによって制御される、染色体中に組み込まれたファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子のコピーを含有する。細胞内部で一度、この酵素は、プロモーターｐＴ７から下流でクローン化された人工遺伝子ＣＲＭ１９７又はＣＲＭ１９７−タグの転写を活性化させることができる。ＢＬ２１ＡＩ菌株は、プロモーターｐＢＡＤによって制御されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を有するため、培地へのアラビノースの添加のおかげで、誘導が起こる。ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株は、代わりに、ｌａｃプロモーターによって制御されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子を含有するプロファージλ（ＤＥ３）の細菌ゲノム中への組み込みのおかげで、得られた。この後者のケースでは、発現システムのカスケード誘導が、ＩＰＴＧ，ラクトース類似体によって活性化される。ｐＥＴ９ａ−ＣＲＭ１９７構築物との転換及び興味のある上記タンパク質の発現に適した他の大腸菌株は、ＢＬ２１ＳｔａｒＴＭ（ＤＥ３），ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３），ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ等のＢＬ２１（ＤＥ３）誘導体、ＥＲ２５６６の誘導体、及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子のコピーをそのゲノム中に含有する全ての改変したＢ又はＫ−１２菌株である。
【００３４】
転換した大腸菌株を選択したら、異なる培地及び誘導条件で発現試験を行った。予備試験の目的は、細菌タンパク質と比べて高レベルのタンパク質ＣＲＭ１９７を得ることができるようにする方法（好ましくは最大で約３０〜４０％）を確認することであった。検討した因子は、培地、増殖温度（３０℃及び３７℃）、誘導因子の濃度及び誘導時間であった。用いた培地は、古典的ＬＢであったが、高いバイオマス生産を可能にする他のリッチ培地を用いることもできる。組換えタンパク質を過剰発現させたとき、その生成物は、培地中に分泌させ得るか（特異的なシグナル配列を有する場合）、又は可溶性形態若しくは不溶性封入体の形態で細胞質内に構築できる。タンパク質の局在は、その後の精製過程に影響を与える。配列番号５によって表される人工遺伝子（ｈｉｓ−タグ付き）の転写から得られた、配列番号６を持つ融合タンパク質ＣＲＭ１９７−タグという特定の場合では、タンパク質が不溶性形態の本体によって発現され（封入体）、工業生産のために非常に都合よく蓄積する。本発明に記載の発現プロトコルは、前述の不溶性形態でのＣＲＭ１９７−タグの蓄積を含み、それを可溶性形態に戻し、生物学的に活性な形態のタンパク質を得るためにそれを再生する際に関与する工程について説明する。更に、本発明は、２つのクロマトグラフィー精製工程と、タグを取り除くための最終工程とを含む。最も適切なクロマトグラフィー法の選択は、ＣＲＭ１９７−タグの化学的物理的特徴、ｐＩ（等電点）、アミノ酸組成及び寸法等によって決まる。タグとの融合は、そのタンパク質を、タグに対する高い親和性を持つ特定の樹脂を（カラム及びバッチの両方で）用いて精製できるようにする。タグの存在は、細胞質中でのタンパク質の安定性を増加させることとその後の精製の両方において有用である。
【００３５】
そこで、一の態様において、本発明は、配列番号１及びポリペプチドタグをコードする短い配列を含むポリヌクレオチドによってコード化された組換え融合タンパク質ＣＲＭ１９７−タグに関する。
【００３６】
特に好適には、配列番号２を含むヌクレオチドによってコード化された、配列番号６の配列の組換え融合タンパク質である。
【００３７】
上記の組換え融合タンパク質ＣＲＭ１９７−タグは、医療目的、乳癌、卵巣癌及び前立腺癌等の腫瘍の治療、又は動脈硬化プラークの減少に対し、潜在的に有用である。また、前述の融合タンパク質は、ニューモコッカス・ヘモフィラス・インフルエンザ、メニンゴコッカス、ストレプトコッカス・ニューモニエ及び他の病原性細菌に対するワクチン等のワクチン用の抱合キャリヤーとして役立つこともできる。
【００３８】
更に、本発明は、ＣＲＭ１９７−タグタンパク質を産生するための方法であって、先に説明した通りに改変された大腸菌株の使用を含む方法に関するものである。
【００３９】
前述の方法は、
（ｉ）上述のように大腸菌の培養物を用いてタンパク質を適当に誘導して発現させること；
（ｉｉ）
ａ．攪拌しながら、０〜５℃にて、１．５〜２．５時間の、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２０〜５０ｍＭ  ｐＨ７．５〜８．５、ＮａＣｌ１００〜１５０ｍＭ、洗剤０．５〜１．５％及びプロテアーゼ阻害薬０．５〜１．５％を含有する緩衝液中での溶解；
ｂ．固体残留物（ペレット）からの上澄みの分離；
ｃ．攪拌しながら、２０〜３０℃にて、１．５〜２．５時間の、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２０〜５０ｍＭ、ＮａＣｌ１００〜１５０ｍＭ、洗剤０．５〜１．５％及び尿素５〜７Ｍを含有するｐＨ７．５〜８．５の可溶化緩衝液による、先の経路から生じる固体残留物の処理；
ｄ．固体残留物からの上澄みの分離であって、該上澄みが可溶化ＣＲＭ１９７−タグタンパク質を含有する分離；
によって抽出すること；
（ｉｉｉ）
ａ．アフィニティークロマトグラフィー又は透析；
ｂ．分子排除クロマトグラフィー（ゲルろ過）又はアニオン交換クロマトグラフィー
によって、工程（ｉｉ）から得られるタンパク質を精製及び再生すること
を含むことが好ましい。
【００４０】
大腸菌が、配列番号５等の、配列番号２を含むプラスミドによって改変された実施態様においては、組換えタンパク質ＣＲＭ１９７−タグが、６のヒスチジンを含有するタグ配列との融合において産生された。ここで、６のヒスチジンは、その発現を可能にし、アフィニティークロマトグラフィーによるその後の精製を容易にする。この手順によって得られるＣＲＭ１９７及び類似タンパク質の量は、発現レベルを支配するパラメータ（培地、増殖温度、誘導時間等）を調節することによって改変できる。ＢＬ２１ＡＩ又はＢＬ２１（ＤＥ３）の大腸菌株が適切なプラスミドで転換されたものを使用する場合、最良の発現条件は、３７℃で３時間の誘導後に得られ（図１）、その転換株ＢＬ２１ＡＩは望ましい。これら条件下、発現収率は、４０％もあり、ＣＲＭ１９７−タグは、溶解及び可溶性画分の除去後に得られた不溶性画分の約８０％に相当する。最適な増殖、溶解及び回収条件を採用する生産方法では、ＣＲＭ１９７−タグ発現収率が０．５〜１ｇ／Ｌもあり得ることを主張することができる。
【００４１】
配列番号５を用いる特定の場合では、配列番号６を発現する組換えＣＲＭ１９７−タグは、６のヒスチジンを含有する２８のアミノ酸のタグを有し、二価の金属イオン（銅、ニッケル等）に対する親和性が高い；この特徴は、不溶性形態で発現した融合タンパク質の精製を容易にするのに利用される。また、アフィニティークロマトグラフィーは、不溶性画分からＣＲＭ１９７−タグを回収するために必要な変性剤を除去するのに使用できる。この場合、その除去は（２つの逆勾配段階において）徐々に行われ、正しいタンパク質の立体構造（折り畳み）の採用を容易にする。
【００４２】
興味のある上記タンパク質と関係を保ったままの混入タンパク質は、分子量が互いにかなり異なる場合、ゲルろ過クロマトグラフィーによって後で除去できる。或いは、ＣＲＭ１９７のｐＩ値（５．８〜５．９）を利用して、イオン交換クロマトグラフィーを用いた第二の精製通路を行うことができる。このため、本発明は、アフィニティークロマトグラフィーの後で、必要に応じて使用される２つの異なる精製方法を含む。組換えタンパク質の最終収率及び純度のレベルは、どのタイプの方法を用いても、同程度である。そのタンパク質は、ブラッドフォード分析によって数量化され、１０％アクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中において可視化される。
【００４３】
本発明に記載のプロトコルに従って得られたＣＲＭ１９７−タグタンパク質の発現収率は、（ＬＢ培地を備えた目盛り付きフラスコ中で）２５０±５０ｍｇ／培地Ｌである。先に述べたように、発酵槽中で行われる工業的過程では、適切な増殖培地及び条件を用いて、その収率が更に増加する。本発明に記載の溶解及び抽出の方法が単純で安価であることを強調する価値がある；その上、上記方法の段階は、特定の緩衝剤／試薬又は特別な実験装置（細胞溶解用の超音波処理器等）の必要性を避けるために設計されており、すべては、工業的過程に適したプロトコルを達成することを視野に入れている。
【００４４】
最後に、本発明は、二重の目的、即ちＣＲＭ１９７の発現を可能にし、その安定性を増大させ且つその精製を容易にする目的を有するタグを取り除く手順に関係する。
【００４５】
その結果として、本発明は、ＣＲＭ１９７の調製方法であって、先に説明したように改変された大腸菌株の使用を含む方法にも関係する。
【００４６】
上述のＣＲＭ１９７の生産方法は、上述の融合タンパク質ＣＲＭ１９７−タグの発現と、その後の、適切な酵素を用いた消化によるタグの除去とを含むことが好ましい。
【００４７】
配列番号６の配列を持つＣＲＭ１９７−タグの場合、タグの除去に適した酵素は、エンテロキナーゼであり、その消化は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ１０〜２０ｍＭ，ｐＨ７．５〜８．５、ＮａＣｌ４０〜６０ｍＭ、ＣａＣｌ２１．５〜２．５ｍＭ及び０．０１〜０．０３％重量対重量（ｗ／ｗ）の範囲の濃度の酵素を含有する緩衝液中において、２０〜２５℃にて１８〜２４時間行われるのが好ましい。
【００４８】
タグを取り除いた後、タグのないタンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製されるのが好ましい。
【００４９】
本発明に従う方法によって得られる配列番号７のＣＲＭ１９７組換えタンパク質は、構造及び機能の点で、既知の方法を用いて産生されたＣＲＭ１９７と同一である；それは、天然の形態で得られ、その結果、活性があり、延いては、既知の用途に使用できる。
【００５０】
本発明は、以下に示す実施態様の例を考慮すると、より分かりやすいだろう。
【００５１】
（配列）
配列番号１−大腸菌中での発現のために最適化されたＣＲＭ１９７をコードする人工配列
【化１】
2012531198.tif 000003
【００５２】
配列番号２−大腸菌中におけるＣＲＭ１９７−Ｈｉｓタグをコードする人工配列
【化２】
2012531198.tif 000004
【００５３】
下線が引かれた部分：６のヒスチジンを含有するタグペプチドをコードする配列
イタリック体で下線が引かれた部分：エンテロキナーゼによって認識される５ａａをコードする１５のヌクレオチド（ＤＤＤＤＫ）
【００５４】
配列番号３−大腸菌中でのＣＲＭ１９７タンパク質の発現のための人工配列
【化３】
2012531198.tif 000005
【００５５】
太字部分：Ｎｄｅｌ（ＣＡＴＡＴＧ）及びＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）制限部位
下線が引かれた部分：開始（ＡＴＧ）及び停止（ＴＡＡ  ＴＧＡ）コドン．
【００５６】
配列番号４−配列番号３からのＣＲＭ１９７タンパク質配列
【化４】
2012531198.tif 000006
【００５７】
配列番号５−大腸菌中での融合タンパク質ＣＲＭ１９７−Ｈｉｓタグの発現のための人工配列
【化５】
2012531198.tif 000007
【００５８】
太字部分：Ｎｄｅｌ（ＣＡＴＡＴＧ）及びＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）制限部位．
下線が引かれた部分：６のヒスチジンを含有するタグペプチドをコードする８４のヌクレオチド：
【化６】
2012531198.tif 000008
イタリック体で下線が引かれた部分：エンテロキナーゼによって認識される５ａａをコードする１５のヌクレオチド（ＤＤＤＤＫ）．
開始コドン：ＡＴＧ
停止コドン：ＴＡＡ  ＴＧＡ
【００５９】
配列番号６−配列番号５からのタンパク質配列ＣＲＭ１９７−Ｈｉｓタグ
【化７】
2012531198.tif 000009
【００６０】
太字部分：６のヒスチジン（Ｈ）とエンテロキナーゼの切断部位（ＤＤＤＤＫ）とを含有するタグ配列（２８のアミノ酸）
【００６１】
配列番号７−配列番号６からタグを除去した後のＣＲＭ１９７タンパク質配列
【化８】
2012531198.tif 000010
【００６２】
（実験パート）
例１−配列番号３及び配列番号４の遺伝子の合成、並びに構築物ｐＥＴ９ａ−ＣＲＭ１９７−タグの調製
合成遺伝子は、約２７〜４３ｂｐのオリゴヌクレオチドマルチプル（１０〜１５ｂｐで重複する領域を持つ）を一緒に結合させることにより得られた。この手順は、「組み立て」と呼ばれている。具体的には、各種合成オリゴヌクレオチドの末端をリン酸化して上記結合反応をできるようにし、次いで、それらを、酵素ＴａｑＤＮＡリガーゼの存在下、等モル量で混合した。前述の酵素は、高温（４５〜６５℃）で活性があり、一方のオリゴヌクレオチドの５’位にあるリン酸塩ともう一方のオリゴヌクレオチドの３’位にあるヒドロキシ基の間のホスホジエステル結合の形成を触媒する。次いで、結合性生成物をＰＣＲによって増幅し、Ｎｄｅｌ及びＢａｍＨＩ酵素を用いてｐＥＴ９ａベクター中においてクローン化した。増幅に用いたプライマーは、以下の通りであった：
ＣＲＭ１９７  ｆｗｄ：５’ｇｇａａｔｔＣＡＴＡＴＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＧＡＣＧＴＧＧＴＴＧＡ  ３’
ＣＲＭ１９７  ｒｅｖ：５’ｃｇＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＡＡＧＡＴＴＴＧＡＴＴＴＣＧＡＡＧ  ３’
ＣＲＭ１９７−Ｈｉｓ  ｆｗｄ：５’ｇｇａａｔｔＣＡＴＡＴＧＧＧＴＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡ  ３’
ＣＲＭ１９７−Ｈｉｓ  ｒｅｖ：５’ｃｇＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＡＡＧＡＴＴＴＧＡＴＴＴＣＧＡＡＧＡＡＣＡＧＧ  ３’
【００６３】
ＰＣＲ（３０サイクル）は、以下に示す分量を用いた標準プロトコルに従って行われた：
３μｌ  結合性生成物
５μｌ  ｄＮＴＰｓ（４ｍＭ）
５μｌ  １ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反応緩衝液１０Ｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）
２μｌ  ｆｗｄ＿プライマー（５０ｐｍｏｌ）
２μｌ  ｒｅｗ＿プライマー（５０ｐｍｏｌ）
０．５μｌ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）
及び体積を５０μｌに揃えるための水３２．５μｌの添加。
【００６４】
配列番号１及び配列番号２を含むＰＣＲ産物を精製してプライマー、ｄＮＴＰｓ及び酵素を除去し、次いで、Ｎｄｅｌ及びＢａｍＨＩを用いて消化させ、それ故に、配列番号３及び配列番号５の配列の遺伝子を得た。並行して、１μｇのプラスミドｐＥＴ９ａを同一の条件下（３７℃２時間）で同一の酵素により消化した。最後に、１：１及び３：１の挿入物対ベクター比により、上記結合反応を１６℃にて１２〜１６時間行った。この反応のアリコートを用い、レシピエント細菌性細胞を転換した。
【００６５】
例２−細菌の菌株及び培地
ＢＬ２１ＡＩ（インビトロゲン）及びＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株（ノバジェン）をＣＲＭ１９７−タグ（配列番号５）の発現用宿主として用いた。一般的に使用される液体及び固体の培地は、古典的ＬＢ（ルリア−ベルタニ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）であった。適切に処理した宿主株を１０ｎｇのｐＥＴ９ａ−ＣＲＭ１９７−タグ構築物（例１から得られたもの）を用いて転換した；１ｍｍの適切なキュベット及び１．８ｋＶのパルス（ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いる標準プロトコルに従って、電気穿孔を行った。電気穿孔を行った細胞を３７℃のＳＯＣ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，１９８９）中で攪拌しながら４５分間成長させ、次いで、固体のＬＢ培地に移し、それにカナマイシンを加え（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）、形質転換体を選択した。一般には、好気性条件において、攪拌（１８０ｒｐｍ）しながら３７℃にて培養を行った。
【００６６】
例３−発現
アラビノース１３ｍＭ（ＢＬ２１ＡＩ菌株のため）及びＩＰＴＧ１ｍＭ（ＢＬ２１［ＤＥ３］菌株のため）を上記培地に加え、配列番号５のＣＲＭ１９７−タグの発現を誘導した。転換した菌株を選択した後、少量（１０ｍＬ）に対し発現試験を行った。単一コロニーを１ｍＬのＬＢ培地（カナマイシンを備える）中で成長させ、対数増殖期に達するまで（分光光度法による６００ｎｍでの吸光度を測定することによって確認される）、新鮮な培地中で適切に再開された。その誘導因子を約０．５〜０．６ＯＤの吸光度値にて加え、様々な時間の間（１時間、３時間及び１５時間）、培養物を誘導した。その細胞を遠心分離（４０００ｇ１５分間）により集め、得られた細胞ペレットを溶解させ全タンパク質を放出させた。最初は、単純にサンプル緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の存在下において５分間サンプルを煮沸することによって溶解を行い、２０μＬのサンプルそれぞれをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（１０％アクリルアミド）において分離した。タンパク質バンドを可視化するため、そのゲルをＣｏｍａｓｓｉｅブリリアント・ブルーの溶液で染色し、ＣＲＭ１９７−タグに相当する過剰発現のバンド（約６１ｋＤａ；図１）が確認できた。前述のバンドは、アクリルアミドゲル中で見える全タンパク質の約４０％を示した。
【００６７】
興味のある上記タンパク質の発現を確認した後、最適な条件（アラビノース１３ｍＭによる３時間の誘導）において、多量の培養物（５００ｍＬ）を用いた試験を続いて行った。
【００６８】
例４−抽出
超音波処理器の使用に頼ることなく、細胞を溶解させるため、既知の組成の異なる溶解液を調製し、溶液の体積のサンプルのものに対する比を変えつつ、それらの有効性を評価した。溶解緩衝液の成分は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８（２０〜５０ｍＭの範囲の濃度）、ＮａＣｌ（１００〜１５０ｍＭの範囲の濃度）、０．５〜１．５％の範囲の濃度の洗剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，ＳＤＳ，Ｔｗｅｅｎ２０）及びプロテアーゼ阻害薬（例えばＰＭＳＦ１ｍＭ）であった。また、我々は、β−メルカプトエタノール又はＤＴＴ等の還元剤の効果を評価した（１０〜５０ｍＭ）。氷上で２時間攪拌して、細胞ペレットを溶解させた。上澄み（可溶性タンパク質画分に相当する）を遠心分離（１０，０００ｇ３０分間）によって分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて分析した（図２）。組換えタンパク質は、それが封入体の形態で蓄積し、溶解後に得られるペレット中でクラスター化されるため、この画分中では、目に見えなかった。結果として、本発明は、不溶性画分からＣＲＭ１９７−タグを回収するため、可溶化溶液の使用を含む（図２）。この溶液の成分は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８（２０〜５０ｍＭの範囲の濃度）、ＮａＣｌ（１００〜１５０ｍＭの範囲の濃度）、０．５〜１．５％の洗剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，ＳＤＳ，Ｔｗｅｅｎ２０）及び６〜７Ｍの尿素であった。封入体を含有するペレットを、２０〜３０℃の範囲の温度にて、攪拌しながら、２時間可溶化させた。上澄みは、遠心分離によって回収され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中において分析した。ここで、ＣＲＭ１９７−タグに相当するバンドが目に見えた（図２）。尿素を用いて可溶化したサンプルでは、ＣＲＭ１９７−タグに関するバンドが、ゲル中に含まれるタンパク質の約５０％に相当した。
【００６９】
例５−精製
尿素を用いて可溶化したサンプル（４℃にて貯蔵したもの）は、予備精製と、カラム中においてタンパク質を再生するために尿素を除去するという二重目的のため、アフィニティークロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を受けた。もう一つの適切な再生方法は、透析であり、減少する濃度の尿素（６〜７Ｍから０まで）を備えた溶液を用いる。クロマトグラフィーカラムを製造業者の取扱説明書に従って調整及び処理した。６−ヒスチジンタグ付きのＣＲＭ１９７タンパク質の場合、カラムはニッケルイオン（ＮｉＳＯ４０．１Ｍ）と複合体を形成した。この手順は、３つの段階を含む：１）洗剤の除去；２）２段階逆勾配による尿素の除去；３）イミダゾール勾配（０〜５００ｍＭ）による溶出である。サンプルを、遅いフロー条件（０．５ｍＬ／ｍｉｎ）下で、充填し、再生させ、一方、他の段階は、１ｍＬ／ｍｉｎの流量で完了した。得られた最終画分は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、ＮａＣｌ、イミダゾールの溶液中にＣＲＭ１９７タンパク質（タグと融合したもの）を含有した（図３は、一部のクロマトグラフィー画分を示す）。
【００７０】
本発明は、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるその後の精製を含む。この工程が完了する前に、サンプルを限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって濃縮し、脱塩してイミダゾールを除去した（ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラムは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ５０ｍＭ  ｐＨ８、ＮａＣｌ１５０ｍＭを含有する緩衝液を用いて調整された。その画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて分析し、純ＣＲＭ１９７−タグを含有するものをプールし、凍結させた。図４は、ＣＲＭ１９７−タグ精製の各種段階を示す。
【００７１】
分子排除クロマトグラフィーに代わるものとして、イオン交換クロマトグラフィーによってＣＲＭ１９７−タグを精製することができる。この場合、ｐＨ８の適切な緩衝液を用いて調整された陰イオン交換樹脂を用いるのが好ましい。
【００７２】
例６−Ｔａｇ除去
また、タグ配列（ＭＧＧＳＨＨＨＨＨＨＧＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＤＤＤＤＫ）は、精製に必要な６のヒスチジンに加えて、特異的なプロテアーゼ，エンテロキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）によって認識される切断部位，ＤＤＤＤＫを含有する。タグのない純粋な組換えタンパク質（配列番号６）を得るため、ＣＲＭ１９７−タグ（配列番号５）をエンテロキナーゼと共にインキュベートした。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２０ｍＭ  ｐＨ８、ＮａＣｌ５０ｍＭ、ＣａＣｌ２２ｍＭの緩衝液中、０．０２％（ｗ／ｗ）に相当する酵素量を用いて、消化反応を２２〜２４℃にて１８〜２４時間行った。図５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、ここで、消化されたＣＲＭ１９７は、２つのドメインＡ及びＢに分離して、目に見える（レーン２）（サンプルは、ドメイン間のジスルフィド架橋を破壊する還元剤と共に煮沸された）。そのプロトコルは、アフィニティークロマトグラフィーによってタグだけからＣＲＭ１９７（タグなし、配列番号６）を分離するためのその後の工程を含む（上述したＣＲＭ１９７−タグの精製に使用したものと同一のカラム中において、同一の樹脂を使用する）。
【００７３】
（参考資料）
-Uchida T., Pappenheimer A.M. Jr, and Greany R., 1973. J Biol Chem, 248:3838-44
-Gill D.M., and Pappenheimer A.M. Jr, 1971. J. Biol Chem, 246:1492-1495.
-Uchida T., Pappenheimer A.M. Jr, Harper A.A., 1973. J Biol Chem, 248:3845-50.
-Papini E., Rappuoli R., Murgia M., and Montecucco C., 1993. J. Biol. Chem, 268:1567-1574.
-Cabiaux V., Wolff C., and Ruysschaert J.M., 1997. Int J Biol Macromol, 21:285-98.
-Honjo T., Nishizuka Y., Kato I., and Hayaishi O., 1971. J Biol Chem, 246:4251-60.
-Giannini G., Rappuoli R., and Ratti G., 1984. Nucleic Acids Res, 12: 4063-4069. 
-Bruce C., Baldwin R.L., Lessnick S.L., and Wisnieski B.J., 1990. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87:2995-2998.
-Lee J.W., Nakamura L.T., Chang M.P., and Wisnieski B.J., 2005. BBActa,1747:121-131.
-Cox J.C., 1975. Applied Microbiol, 29:464-468.
-Rappuoli R., 1983. Applied Envirom Microbiol, 46:560-564.
-Rappuoi R., Michel J.L., and Murphy J.R., 1983. J. Bacteriol, 153:1202-1210.
-Rappuoli R. et al, 1990, US Patent 4925792.
-Metcalf B.J., 1997, US Patent 5614382.
-Leong D., Coleman K.D., and Murphy J.R., 1983. J Biol Chem, 258:15016-20.
-Bishai W.R., Miyanohara A. and Murphy J.R., 1987a. J Bacteriol, 169(4): 1554-1563.
-Bishai W.R., Rappuoli R. and Murphy J.R., 1987b. J Bacteriol, 169(11): 5140-5151.
-Spilsberg B., Sandvig K., and Walchli S., 2005. Toxicon, 46: 900-906.
- Corvaia N., Nguyen T.N. and Beck A., FR 2827606A1 2003.
- Dehottay P.M.H. et al, US2008/0193475.
- Wolfe H. et al, US2008/0153750.
- Mekada E. and Miyamoto S., US 2006/0270600A1.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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