(57)【要約】  本発明は多発性硬化症（ＭＳ）の治療及び／又は予防に関連する方法である。ＧＭ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な抗体などの、ＧＭ−ＣＳＦの拮抗体は、多発性硬化症（ＭＳ）の治療及び／又は予防に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多発性硬化症の治療又は予防に使用することを特徴とするＧＭ−ＣＳＦ拮抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の拮抗体において、前記治療又は予防が対象に有効量のＧＭ−ＣＳＦ拮抗体を投与するステップを具えることを特徴とする拮抗体。
【請求項３】
請求項２に記載の拮抗体において、前記対象がヒトであることを特徴とする拮抗体。
【請求項４】
請求項２に記載の拮抗体において、前記対象がラット又はマウスなどの齧歯類であることを特徴とする拮抗体。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の拮抗体において、前記拮抗体がＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体であることを特徴とする拮抗体。
【請求項６】
請求項５に記載の拮抗体において、ＧＭ−ＣＳＦに特異的な前記抗体の重鎖可変部が配列番号３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする拮抗体。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の拮抗体において、ＧＭ−ＣＳＦに特異的な前記抗体の軽鎖可変部が配列番号４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする拮抗体。
【請求項８】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の拮抗体において、前記拮抗体がＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な抗体であることを特徴とする拮抗体。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか１項に記載の拮抗体において、前記治療又は予防がミエリン鞘の脱ミエリン化を低減させることを特徴とする拮抗体。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の拮抗体において、前記治療又は予防が脊髄に炎症細胞の流入を減少させることを特徴とする拮抗体。
【請求項１１】
請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の拮抗体において、前記治療または予防がＴ細胞の増殖を低減させることを特徴とする拮抗体。
【請求項１２】
請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の拮抗体において、前記治療または予防がＴ細胞によるＩＬ１７の放出を減少させることを特徴とする拮抗体。
【請求項１３】
請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の拮抗体において、前記治療または予防が多発性硬化症の発症を遅延させることを特徴とする拮抗体。
【請求項１４】
請求項２乃至１３のいずれか１項に記載の拮抗体において、ＧＭ−ＣＳＦの前記拮抗体が皮下または脊髄内に投与されることを特徴とする拮抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願のクロスリファレンス］
本出願は２００９年５月５日に出願された米国仮出願第６１／１７５，４７１号の利益を主張するものであり、この出願は全体を参照することによって組み込まれている。
本発明は、概して多発性硬化症（ＭＳ）の治療、及び／又は、予防の方法に関連している。本発明によれば、ＧＭ−ＣＳＦの拮抗体は多発性硬化症の治療に有効になりうる。ＧＭ−ＣＳＦの拮抗体は、ＧＭ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な抗体を含むが、これらに限定されるものではない。
【背景技術】
【０００２】
播種性硬化症又は播種性脳脊髄炎としても知られている多発性硬化症（ＭＳ）は、免疫機構が中枢神経系（ＣＮＳ）を攻撃する自己免疫疾患である。基本的に、ＭＳはミエリンを損傷することによって、脳及び脊髄の神経細胞が相互にコミュニケーションする能力に影響を及ぼす。ミエリンが失われると軸索は、もはや、効果的に信号を伝導することができない。
【０００３】
ＭＳの４つの主要なサブタイプが説明されている。（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９６）４６；９０１−９１１；図１も参照）。再発寛解型ＭＳは、予測不能な再発後に、数カ月から数年続く新たな兆候のない比較的平穏（寛解）な疾患活動により特徴づけられる。二次進行型ＭＳは、当初は再発寛解型ＭＳであり、その後の急性期の間に明確な寛解期間有さず、進行性の神経減少を始める患者により説明される。一次進行サブタイプは、ＭＳの初期症状の後に寛解期を有さない患者により説明される。当該サブタイプは寛解と改善がないか、ほんの時折の軽微な寛解と改善により特徴づけられる。最後に、進行性再発ＭＳは発症からの一定した神経減少だけでなく、明らかな混合型発作を有する患者により説明される。様々なＭＳの境界例は同様に存在する。
【０００４】
ＭＳの症状は多面的であり、通常は一時的な急性悪化の期間（再発）、徐々に進行する神経機能の損傷、又はその両方の組み合わせで現れる。通常は感覚、視覚、小脳、および運動症状である。ＭＳ患者は、感覚の変化（感覚鈍麻や知覚異常）、筋力低下、筋肉のけいれん、移動の困難性を含め、ほとんどすべての神経学的症状や兆候に悩まされる。協調とバランスの問題、発語や嚥下の問題、視覚的な問題、疲労、急性または慢性的な痛み、膀胱と腸の問題などである。幅広い度合いの認知障害や鬱や不安定な気分の情動性症状も一般的である。
【０００５】
ＭＳは一般的には、３０代の大人に現れるが、子供にも現れることがあり、その一次進行サブタイプは５０代の人間において、より一般的である。様々な自己免疫疾患に関して、一般的には女性が多く、その傾向は高まっていると考えられる。
【０００６】
ＭＳは、恐らく患者自身の神経系と類似した構造を持つ分子へ暴露した結果、免疫系が神経系を攻撃する。ＭＳでは、小脳脳室、脳幹、大脳基底核や脊髄に近い白質領域と視神経を含む病変が最も一般的である。白質細胞の機能は、信号処理が行われる灰白質と体の残りの部分との間で信号を伝達することである。ＭＳは、ニューロンの電気信号の伝達を助けるミエリン鞘として知られる脂質皮膜の形成と維持に関連している細胞であるオリゴデンドリサイトを破壊する。ＭＳはミエリンの菲薄化又は完全な損失をひきおこし、疾病の進行によりニューロンの伸長や軸索を切断（切除）することとなる。再ミエリン化と呼ばれる修復過程が、本疾病の初期におこるが、オリゴデンドリサイトは、細胞のミエリン鞘を完全に再生をすることができない。損傷した軸索の周囲に、繰り返される攻撃により、瘢痕のようなプラークが構築されるまで効果的な再ミエリン化は連続的に低下する。
【０００７】
脱ミエリン化とは別に、本疾病の他の病理学的特徴は炎症である。Ｔ細胞はミエリンを異物と認識し、ウィルスが侵入しているかのようにミエリンを攻撃する。これが炎症過程を引き起こし、他の免疫細胞やサイトカインや抗体のような可溶性因子を刺激する。
【０００８】
多発性硬化症の様々な治療は存在するが、治癒は知られていない。急性発作の管理や、疾病の修正やＭＳの影響を管理するために様々な治療が用いられている。急性発作の管理にコルチコステロイドの静脈接種又は経口投与を行うことは日常的な治療法である。本治療は患者の、短期的な症状の緩和には有効であるが、長期的な回復に関しては十分な効果を有しない。疾患修正治療のための数多くの治療法は、ＭＳの正確な性質とサブタイプに応じて用いられている。再発寛解型ＭＳの治療にはインターフェロン（インターフェロンβ−１ａ、インターフェロンβ−１ｂ）、酢酸グラチラマー（コパキソン（Ｃｏｐａｘｏｎｅ）；免疫系の攻撃の標的を、それ自体に置換することによってミエリンタンパク質を保護することができるポリペプチドの混合物）、ミトキサントロン（免疫抑制剤であり癌化学療法でも使用される）とナタリズマブ（チサブリ（Ｔｙｓａｂｒｉ）；ヒト化モノクローナル抗体細胞接着分子α４−インテグリン）を含む。二次進行型ＭＳ及び進行型再発ＭＳの治療には、ミトキサントロン、ナタリズマブおよびインターフェロン−β−１ｂ（ベタフェロン）を含む。他の、主な予備的な治療も同様に使用されている。ＭＳは、ある範囲の進行性の障害やハンディキャップなどを引き起こす多様な症状や機能障害に関連している。特殊なケースが必要としているため、ＭＳの効果の管理には数多くの治療が研究され、使用されている。
【０００９】
顆粒球マクロファージ、コロニー刺激因子を含む一部のサイトカインは多発性硬化症に関与していることが知られている（Ｐｏｎｏｍａｒｅｖら、；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００７）１７８；３９−４８；ＭｃＱｕａｌｔｅｒら、；Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．（２００１）１９４；８７３−８２）。顆粒球マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、白血球の増殖因子として機能するサイトカインである。ＧＭ−ＣＳＦは、顆粒球（好中球、好酸球、及び好塩基球）と単球を生成する幹細胞を刺激する。単球は、マクロファージに成熟すると、すぐに循環を終了し、組織に移行する。これは、自然免疫／炎症カスケードの一部であり、これによって少数のマクロファージが活性化することにより、これらの数の増加を急速に引き起こすことができる。感染と戦うための重要なプロセスである。ＧＭ−ＣＳＦの活性型は、水溶性単量体として細胞外で見られる。とりわけ、ＧＭ−ＣＳＦは、炎症性サイトカイン、ケモカイン及びプロテアーゼの生産増を引き起こし、最終的に関節の破壊につながる関節リウマチ（ＲＡ）のような自己免疫疾患の炎症性メディエーターとして認識されている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明では、ＧＭ−ＣＳＦの効果を拮抗することが、ＭＳの治療に有効な手段であることを実証する。特に、ＧＭ−ＣＳＦ又はその受容体に対する抗体は、ＭＳの治療の介入する重要なポイントである。したがって、本発明は、例えば対象の多発性硬化症の治療方法を提供するものであり、この方法は有効量のＧＭ−ＣＳＦ拮抗体を前記対象に投与するステップを具える。
【００１１】
他の態様において、本発明は対象の多発性硬化症を予防する方法を含み、当該方法は有効量のＧＭ−ＣＳＦ拮抗体を前記対象に投与するステップを具える。
【００１２】
別の態様において、本発明は多発性硬化症におけるＧＭ−ＣＳＦの病態生理の役割に拮抗する能力があるＧＭ−ＣＳＦ拮抗体を含む組成物を対象としており、当該組成物は、更に１又はそれ以上の薬学的に許容可能な担体、及び／又は希釈剤を含む。
【００１３】
別の態様において、本発明は多発性硬化症の治療に有効なＧＭ−ＣＦＳ拮抗体を含む組成物を対象としており、当該組成物は、更に１又はそれ以上の薬学的に許容可能な担体、及び／又は希釈剤を含む。
【００１４】
本発明の特定の態様は、前記ＧＭ−ＣＦＳ拮抗体がＧＭ−ＣＦＳ特異抗体である。
【００１５】
本発明の他の態様は、前記ＧＭ−ＣＦＳ拮抗体がＧＭ−ＣＦＳ受容体の特異抗体である。
【００１６】
他の態様において、本発明は、多発性硬化症の治療についての薬剤の調整に、ＧＭ−ＣＦＳ拮抗体の使用することを対象としている。
【００１７】
他の態様において、本発明は多発性硬化症の治療にＧＭ−ＣＦＳ拮抗体を提供する。
【００１８】
この明細書を通して、文脈上必要のある場合を除き、「具える」、「有する」、「含む」及びそれぞれのバリエーションである「具えている」、「有している」、及び「含んでいる」は、規定の要素又は整数、又は要素又は整数の集合を包含するが、他の要素又は整数、又は要素又は整数の集合を排除することではない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
図１は、ＭＳの４つの主要なサブタイプの進行の種類を示している。
【００２０】
図２は、ＭＳのＭＯＧ誘発ＥＡＥモデルでのＧＭ−ＣＳＦの拮抗体の有効性を示している（予防処置）。０乃至１５日の累積ＥＡＥスコアを示している。Ａ：賦形剤（ＰＢＳ）で処置した動物；Ｂ：１０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ−ＧＭで処置した動物；Ｃ：２０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ−ＧＭで処置した動物；Ｄ：５０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ−ＧＭで処置した動物；Ｅ：０．５ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンを投与した動物；Ｆ：５０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ−ＮＯＧＭ（アイソタイプコントロール抗体）で処置した動物；Ｇ：１４日目に５０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ−ＧＭで最初の処置をした動物；＊：Ｐ＜０．０５としてアイソタイプコントロール抗体との比較をした。；＄：Ｐ＜０．０５としてＰＢＳの処置との比較をした。
【００２１】
図３の疾病の発症の遅延は、ＭＯＲ−ＧＭの処置によることを示している。Ａ：賦形剤（ＰＢＳ）で処置した動物；Ｂ：１０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ−ＧＭで処置した動物；Ｃ：２０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ−ＧＭで処置した動物；Ｄ：５０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ−ＧＭで処置した動物；Ｅ：０．５ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンで処置した動物；Ｆ：５０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ−ＮＯＧＭ（アイソタイプコントロール抗体）を投与した動物；Ｇ：１４日目の最初の処置に５０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ−ＧＭで処置した動物（治療的処置）。＊：Ｐ＜０．０５としてアイソタイプコントロール抗体との比較をした。＄：Ｐ＜０．１０としてＰＢＳの処置との比較をした。
【００２２】
図４は、本発明の化合物での処置後の後脊髄仙骨部における炎症細胞の浸潤を示している。Ａ：５０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ−ＮＯＧＭ（アイソタイプコントロール抗体、予防的処置）で処置した動物；Ｂ：５０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ−ＧＭで処置した動物（予防的処置）；Ｃ：５０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ−ＧＭで処置した動物（治療的処置）；Ｄ：０．５ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンで処置した動物（予防的処置）；各データポイントは１個体の動物のスコアを示している。＃：Ｐ＜０．１０としてアイソタイプコントロール抗体との比較をした。＊：Ｐ＜０．０５としてアイソタイプコントロール抗体との比較をした。
【００２３】
図５は、脊髄仙骨部分の脱ミエリン化の程度を示している。Ａ：５０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ−ＮＯＧＭで処置した動物（アイソタイプコントロール抗体、予防的処置）；Ｂ：５０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ−ＧＭで処置した動物（予防的処置）；Ｃ：５０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ−ＧＭで処置した動物（治療的処置）；Ｄ：０．５ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンで処置した動物（予防的処置）。；各データポイントは１個体の動物のスコアを示している。＊：Ｐ＜０．０５として、アイソタイプコントロール抗体との比較をした。
【００２４】
本発明はＧＭ−ＣＳＦが、ＭＳの治療のための有効な標的であることを示している。この点において、本発明の一態様では、ＭＳの分野での予防または治療効果をもたらすＧＭ−ＣＳＦの拮抗体を使用する方法を提供する。
【００２５】
本発明は、このような治療を必要としている患者にＧＭ−ＣＳＦ拮抗体を治療上有効量投与するステップを含む治療方法を提供する。本明細書で使用する「治療上有効量」、又は「有効量」とは望ましい生物反応を引き起こすのに必要なＧＭ−ＣＳＦ拮抗体の量を意味する。本発明によれば、治療上有効量とは多発性硬化症の治療、及び／又は予防に必要なＧＭ−ＣＳＦ拮抗体の量である。
【００２６】
本明細書で使用する「ＧＭ−ＣＳＦ拮抗体」は、最も幅広い意味でのＧＭ−ＣＳＦ拮抗体を含む。すなわち、ＧＭ−ＣＳＦの活性又は機能を阻害するあらゆる分子、又は他の任意の方法によりＧＭ−ＣＳＦの治療効果を発揮するあらゆる分子を含む。ＧＭ−ＣＳＦ拮抗体という用語は、ＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合する抗体、ＧＭ−ＣＳＦに特異的な抑制性核酸、ＧＭ−ＣＳＦに特異的な有機小分子も含むが、これらに限定されない。ＧＭ−ＣＳＦ拮抗体という用語の意味にはＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的に結合している抗体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な抑制性核酸、ＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な有機小分子も含まれる。ＧＭ−ＣＳＦ拮抗体という用語は、例えばフィブロネクチン骨格（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）、アンキリン（ａｎｋｙｒｉｎｓ）、マキシボディ／アビマー（ｍａｘｙｂｏｄｉｅｓ／ａｖｉｍｅｒｓ）、プロテインＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）由来の分子、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎｓ）、タンパク質抗原決定基低分子模倣薬（ＰＥＭｓ）又はその他の非抗体骨格分子も指す。
【００２７】
抑制性核酸は、アンチセンスＤＮＡ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、外部ガイドのシーケンス、ｓｉＲＮＡやマイクロＲＮＡを含むが、これらに限定されない。有用な抑制性核酸は、コントロールと比較して、ＧＭ−ＣＳＦをコードするＲＮＡの発現を少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または９５％減少させるものを含む。抑制性核酸およびそれらの製造方法は当該分野でよく知られている。ｓｉＲＮＡの設計ソフトウェアが利用可能である。
【００２８】
ＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な有機小分子（ＳＭＯＬｓ）は、化学ライブラリの天然産物経由のスクリーニングや化学ライブラリのスクリーニングを経由して特定される。典型的なＳＭＯＬｓの分子量は５００ダルトン以下であり、より典型的には１６０乃至４８０ダルトンである。ＳＭＯＬｓの他の典型的な特性は、下記の１又はそれ以上である。
・分配係数のログＰは−０．４乃至＋５．６の範囲である。
・分子屈折率は４０乃至１３０である。
・原子の数は２０乃至７０である。
Ｇｈｏｓｅら、（１９９９）Ｊ  Ｃｏｍｂｉｎ  Ｃｈｅｍ：１、５５−６８及びＬｉｐｉｎｓｋｉら（１９９７）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ  Ｒｅｖ：２３、３−２５．を参照。
【００２９】
好ましくは、本発明で使用するＧＭ−ＣＳＦの拮抗体はＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦの受容体に特異的な抗体である。この抗体は、マウス、ラット、キメラ、ヒト化又はヒト抗体のような任意のタイプである。本明細書で、「ヒト」抗体、又はその機能的ヒト抗体の断片は、キメラでなく（例えば、“ヒト化”ではない）、且つヒト以外の種由来（全体または一部のいずれでも）ではないものとして定義される。ヒト抗体、又はその機能的抗体フラグメントは、ヒト由来でもよく、又は合成ヒト抗体であってもよい。「合成ヒト抗体」は、既知のヒト抗体配列の分析に基づいた合成配列から、全部または一部が、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ派生の配列を有する抗体として定義される。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでのヒト抗体配列、又はフラグメントのデザインは、例えばそのヒト抗体または抗体断片配列のデータベースを分析し、そしてそこから得られたデータを利用したポリペプチド配列を考案することにより達成することができる。ヒト抗体または、その機能的抗体フラグメントの別の例では、ヒト由来の抗体配列（すなわち、ヒトの自然発生源から採取した抗体に基づいているようなライブラリ）のライブラリから単離された核酸によってコードされている。
【００３０】
本明細書において「ヒト化抗体」又は機能的ヒト化抗体断片は以下の１つより定義される。（ｉ）非ヒト源由来であるが、抗体の配列はヒト生殖系列配列に基づく（例えば、異種免疫系を有するトランスジェニックマウス）、又は
（ｉｉ）可変ドメインは非ヒト源に由来し、定常ドメインはヒト源に由来するキメラ、又は（ｉｉｉ）可変ドメインのＣＤＲｓが非ヒト源であり、さらに、可変ドメインの１又はそれ以上の骨格がヒト源であり、定常ドメイン（もし存在するならば）のフレームワークがヒト源であるＣＤＲ移植。
【００３１】
「キメラ抗体」または機能的なキメラ抗体フラグメントという用語は、本明細書では、ある種で発見された配列に由来する又はこの配列に対応する一定の抗体の領域を有する抗体分子として、及び別の種に由来する可変抗体領域を有する抗体分子として定義される。好ましくは、一定の抗体領域はヒト、例えばヒト生殖細胞系または体細胞にみられる配列由来、又はこの配列に対応する可変抗体領域（例えばＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲまたはＦＲ領域）はヒト以外の動物、例えばマウス、ラット、ウサギやハムスターにみられる配列由来である。
【００３２】
抗体の結合の特異性は絶対的な性質ではなく、相対的であるため、このような抗体がこのような抗原と１又はそれ以上の基準の抗原を判別することができる場合、本明細書で用いられているように抗体が「〜に特異的に結合する」とは、抗原（ここではＧＭ−ＣＳＦ、あるいは前記ＧＭ−ＣＳＦ受容体）「に／に対して、特異的である」又は抗原「を特異的に認識する」ことである。基準抗原は１又はそれ以上の近縁関係にある抗原であり、例えば、ＩＬ３、ＩＬ５、ＩＬ−４、ＩＬ１３又はＭ−ＣＳＦといった基準点として使用されている。最も一般的な形態は（及び、基準が定義されていない場合）「特異的結合」とは目的の抗原と無関係の抗原を区別することができる抗体の能力を意味しており、例えば以下の方法により決定される。このような方法はウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ−、ＲＩＡ−、ＥＣＬ−、ＩＲＭＡ−テストおよびペプチドのスキャンを含むが、これらに限定しない。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを行うことができる。スコアリングは、標準的な発色、例えば二次抗体と西洋ワサビ過酸化物に、過酸化水素とテトラメチルベンジジンを加えることにより行うことができる。特定のウェル内の反応は、例えば４５０ｎｍの光学密度によって点数化する。典型的なバックグラウンド（＝陰性反応）は、０．１ＯＤである。典型的な陽性反応は１ＯＤである。これは、陽性／陰性の差が１０倍以上になることをを意味する。通常は、結合特異性の決定は単一の基準抗原では行わず、粉ミルク、ＢＳＡ、トランスフェリン等の約３乃至５組の無関係な抗原を用いて行う。更に、「特異的結合」は、その標的抗原の異なる部分、例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ受容体の異なるドメインまたは領域、またはＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ受容体の１又はそれ以上ののキーアミノ酸残基またはアミノ酸残基のストレッチを区別するような抗体の能力に関連する。
【００３３】
また、本明細書中で使用されるように、“免疫グロブリン”（Ｉｇ）とはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤのクラス（又はこれらの任意のサブクラス）に属するタンパク質として定義され、そして、これらの従来、周知である全ての抗体と機能的断片を含む。本明細書中の抗体／免疫グロブリンの「機能的断片」とは、抗原結合領域を保持する抗体／免疫グロブリンのフラグメント（例えば、ＩｇＧの可変領域）として定義される。抗体の「抗原結合領域」は、一般的には、抗体の一又はそれ以上の超可変領域、すなわち、ＣＤＲ−１、−２、及び／又は−３の領域に存在する、しかし可変的な「フレームワーク」領域も、ＣＤＲｓの骨格を提供するなど、抗原結合に重要な役割を果たすことができる。好ましくは、「抗原結合領域」は少なくとものアミノ酸残基の４乃至１０３の軽鎖可変領域（ＶＬ）及びアミノ酸残基の５乃至１０９の重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、更に好ましくはアミノ酸残基の３乃至１０７のＶＬ及び４乃至１１１のＶＨであり、特に好ましいのは完全なＶＬとＶＨ鎖である（アミノ酸位置１乃至１０９のＶＬ及び１乃至１１３のＶＨである。番号付けに関しては国際公開公報第９７／０８３２０号を参照）。本発明の使用にあたり、好ましい免疫グロブリンのクラスはＩｇＧである。本発明の「機能的断片」は単一の免疫グロブリンの可変ドメインまたは単一ドメイン抗体のポリペプチド、例えば、単一の重鎖可変ドメインまたは単一の軽鎖可変ドメインを具えるＦ（ａｂ’）２フラグメントのドメイン、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖ又はコンストラクトを含む。Ｆ（ａｂ’）２又はＦａｂはＣＨ１及びＣＬドメイン間に生ずる分子内のジスルフィド結合を最小限に、又は完全に除去するように設計される。
【００３４】
本発明の抗体は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計され、そして合成により作成された核酸によってコード化されたアミノ酸配列に基づいた組み換え抗体ライブラリに由来している。例えば、ヒトの配列に関するデータベースを分析し、そしてそこから得られたデータを利用したポリペプチド配列を考案することによって抗体配列のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏデザインをすることができる。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ作成配列の設計及び取得方法は、例えばＫｎａｐｐｉｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）２９６：５７；Ｋｒｅｂｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００１）２５４：６７、Ｒｏｔｈｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００８）３７６：１１８２；及びＫｎａｐｐｉｋらにより発行された米国特許第６，３００，０６４号に記載されており、本発明は、これら全体を参照することによってここに組み込まれている。
【００３５】
ＧＭ−ＣＳＦの任意の特異的な抗体は、本発明で使用することができる。例示的な抗体は配列番号１に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列、又は配列番号２に示す軽鎖可変領域の配列番号２のアミノ酸配列を具える抗体を含む。他の例示的な抗体は配列番号１に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列、又は配列番号２に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列を具える抗体から派生する抗体を含む。更に他の例示的な抗体は配列番号１に示す重鎖可変領域又は配列番号２に示す軽鎖可変領域のアミノ酸を含む抗体と同じ特異性、及び／又は同じエピトープを含む抗体である。更に他の例示的抗体は、配列番号１に示す配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％相同である重鎖可変領域を具える抗体を含む。更に他の例示的な抗体は、配列番号２に示されている配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％相同である軽鎖可変領域を具える抗体を含む。
2012530047.tif 000002
2012530047.tif 000003
【００３６】
本発明に使用できる他の例示的な抗体は、配列番号３に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列又は、配列番号４に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体である。他の例示的な抗体は配列番号３に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列、又は配列番号４に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列を具える抗体から派生する抗体を含む。更に他の例示的な抗体は配列番号３に示す重鎖可変領域又は配列番号４に示す軽鎖可変領域のアミノ酸を具える抗体と同じ特異性、及び／又は同じエピトープを含む抗体である。更に、他の例示的抗体は、配列番号３に示す配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％相同である重鎖可変領域を具える抗体を含む。更に、他の例示的な抗体は、配列番号４に示されている配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％相同でる軽鎖可変領域を具える抗体を含む。
2012530047.tif 000004
【００３７】
本発明で使用できる代替の例示的な抗体は下記から選択されるＨ−ＣＤＲ３配列を含む抗体である。
2012530047.tif 000005
【００３８】
好ましくは、この抗体は配列番号５乃至１６のいずれから選択されるＨ−ＣＤＲ３配列を含み、更に以下のＨ−ＣＤＲ１配列を含む：
2012530047.tif 000006
【００３９】
本発明で使用できる、他の例示的な抗体は、以下のＬ−ＣＤＲ１配列を含む抗体である：
2012530047.tif 000007
【００４０】
ＧＭ−ＣＳＦ受容体は、ヘマトポエチン受容体スーパーファミリーのメンバーである。それは、αとβサブユニットから構成されるヘテロ２量体である。βサブユニットがＩＬ３及びＩＬ５を含む他のサイトカイン受容体と共有されているのに対し、αサブユニットは、ＧＭ−ＣＳＦに高度に特異的である。これは、β受容体のサブユニットの、より広範な組織分布に反映されている。このαサブユニットであるＧＭ−ＣＳＦＲαは、主に骨髄性細胞と、好中球、マクロファージ、好酸球、樹状細胞、内皮細胞、及び呼吸器上皮細胞などの非造血性細胞に発現する。ＧＭ−ＣＳＦＲαの全長は、４００アミノ酸のＩ型サイトカイン受容体ファミリーに属するＩ型膜貫通型糖タンパク質であり、２２アミノ酸のシグナルペプチド（ポジション１乃至２２）、２９８アミノ酸の細胞外ドメイン（ポジション２３乃至３２０）、ポジション３２１乃至３４５の膜貫通ドメイン及び短い５５アミノ酸の細胞内ドメインから構成される。シグナルペプチドを切断することで、３７８アミノ酸蛋白質のＧＭ−ＣＳＦＲαの成熟形態を提供する。ヒト及びマウスＧＭ−ＣＳＦＲαのｃＤＮＡクローンは入手可能であり、そして受容体のサブユニットは蛋白質レベルで３６％の相同性を有している。ＧＭ−ＣＳＦはαサブユニット（Ｋｄ１乃至５ｎｍ）に比較的低い親和性で単独で結合することができるが、単独のβサブユニットは全く結合しない。しかし、αおよびβサブユニットの両方の存在により、高親和性リガンド−受容体複合体（Ｋｄ≫１００ｐＭ）になる。ＧＭ−ＣＳＦシグナル伝達はＧＭ−ＣＳＦＲα鎖への初期結合を介し、より大きなサブユニットである共通のβ鎖と架橋することで強い親和性相互作用が生じ、これによりＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路をリン酸化する。
【００４１】
ＧＭ−ＣＳＦ受容体の任意の特異的な抗体は、本発明で使用することができる。例示的な抗体は、配列番号２７乃至４５のいずれかに示すＨ−ＣＤＲ３配列のアミノ酸配列を具える抗体を含む。他の例示的な抗体は、配列番号２７乃至４５のいずれかに示すＨ−ＣＤＲ３配列のアミノ酸配列を含む抗体から派生する抗体を含む。更に、他の例示的な抗体は、配列番号２７乃至４５のいずれかに示すＨ−ＣＤＲ３配列のアミノ酸配列を含む抗体と同じ特異性を有し、及び／又は前記配列と同じエピトープに結合する抗体を含む。更に、他の例示的な抗体は、Ｈ−ＣＤＲ３の配列に対して少なくとも７０％配列、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の相同性を示す配列番号２７乃至４５のいずれかに示す抗体を含む。
2012530047.tif 000008
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【００４２】
本発明で使用することができるＧＭ−ＣＳＦの特定の別の抗体は、配列番号４６乃至５６のいずれかに示すＨ−ＣＤＲ３配列のアミノ酸配列を具える抗体を含む。他の例示的な抗体は、配列番号４６乃至５６のいずれかに示すＨ−ＣＤＲ３配列のアミノ酸配列を具える抗体から派生する抗体を含む。更に、他の例示的な抗体は、配列番号４６乃至５６のいずれかに示すＨ−ＣＤＲ３配列のアミノ酸配列を含む抗体と同じ特異性を有し、及び／又は前記配列と同じエピトープに結合する抗体を含む。更に、他の例示的な抗体は、Ｈ−ＣＤＲ３の配列に対して少なくとも７０％配列、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の相同性を示す配列番号４６乃至５６のいずれかに示す抗体を含む。
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【００４３】
本発明の組成物は、治療的または予防的用途に使用される。従って、本発明は、本明細書記載の抗体（または機能的抗体フラグメント）及び薬学的に許容される担体又はそのための賦形剤を含む医薬組成物を含む。関連する態様において、本発明は、多発性硬化症を治療する方法を提供する。前記方法は、本明細書に記載又は意図する、本明細書記載の抗体を含む有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを具える。
【００４４】
特定の態様において、本発明は、対象における多発性硬化症の治療のための方法を提供し、前記方法はＧＭ−ＣＳＦ拮抗体を前記対象に投与するステップを具える。この文脈で使用される「対象」は、マウスやラットなどのげっ歯類そしてアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）などのカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）又はヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）などの霊長類等を含む任意の哺乳類を指す。好ましくは、対象は霊長類であり、最も好ましいのはヒトである。
【００４５】
特定の態様において、本発明は、多発性硬化症の治療方法を提供し、この方法はＧＭ−ＣＳＦ拮抗体を投与するステップを含み、当該ＧＭ−ＣＳＦの拮抗体はＧＭ−ＣＳＦに約１００ｎＭ以下の親和性でＧＭ−ＣＳＦに結合でき、より好ましくは約６０ｎＭ以下、いっそう好ましくは約３０ｎＭ以下である。更に好ましくは、約１０ｎＭ未満の親和性でＧＭ−ＣＳＦに結合し、そしてより好ましくは約３ｎＭ以下である。
【００４６】
特定の態様において、本発明は多発性硬化症の治療のための方法を提供し、この方法はＧＭ−ＣＳＦ拮抗体を対象に投与するステップを含み、当該ＧＭ−ＣＳＦ拮抗体はＧＭ−ＣＳＦとの結合について抗体と競合し、この抗体の重鎖は配列番号３のアミノ酸配列を含む。代替の態様において、本発明は、多発性硬化症の治療のための方法を提供し、当該方法がＧＭ−ＣＳＦの拮抗体を対象に投与するステップを具え、このＧＭ−ＣＳＦ拮抗体は抗体によりＧＭ−ＣＳＦと結合に関して競合し、このＧＭ−ＣＳＦに特異な抗体の軽鎖は配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００４７】
特定の態様において、本発明は、多発性硬化症の治療のための方法を提供し、この方法はＧＭ−ＣＳＦの拮抗体を対象に投与するステップを具え、このＧＭ−ＣＳＦの拮抗体はＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体であり、このＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体は、ラット及び／又はアカゲザル（マカク）のＧＭ−ＣＳＦと交差反応をする。交差反応は溶解平衡の滴定（ＳＥＴ）、及び／又は、ＴＦ１増殖アッセイにより決定する。
【００４８】
特定の態様において、本発明は、多発性硬化症における、ＧＭ−ＣＳＦの病態生理学的役割に拮抗することのできるＧＭ−ＣＳＦ拮抗体を含む組成物を提供し、この組成物は更に１又はそれ以上の薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む。本発明の抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体は、多発性硬化症におけるＧＭ−ＣＳＦのいずれかの役割を拮抗する。
【００４９】
特定の態様において、本発明は、ミエリン鞘の脱ミエリン化を低下させることができるＧＭ−ＣＳＦ拮抗体を含む組成物を提供し、この組成物は更に１又はそれ以上の薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む。
【００５０】
特定の態様において、本発明は、脊髄への炎症細胞の流入を減少させることができるＧＭ−ＣＳＦ拮抗体を含む組成物を提供し、更に、この組成物は更に１又はそれ以上の薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む。
【００５１】
特定の態様において、本発明は、対象における多発性硬化症の治療または予防する方法を提供し、対象にＧＭ−ＣＳＦの拮抗体を有効量投与するステップを具え、この投与が多発性硬化症の発症を遅らせる。
【００５２】
別の態様において、本発明は、多発性硬化症の予防のための方法を提供し、この方法は前記ＧＭ−ＣＳＦの拮抗体をこの対象に投与するステップを具える。この文脈で使用されている「予防」は疾病の発症を予防または疾病の発症を遅らせることを目的とする方法を意味する。
【００５３】
特定の態様において、本発明は、被験者における多発性硬化症の治療または予防するための方法を提供し、被験者にＧＭ−ＣＳＦの拮抗体の有効量を投与するステップを含み、この投与はＴ細胞の増殖を低下させる。
【００５４】
特定の態様において、本発明は、対象における多発性硬化症の治療または予防するための方法を提供し、この対象にＧＭ−ＣＳＦの拮抗体の有効量を投与するステップを含み、この投与がＴ細胞によるＩＬ１７の放出を減少させる。
【００５５】
Ｔ細胞増殖、及びＩＬ１７の放出を測定し、定量化するためのアッセイは当該分野で知られている。
【００５６】
特定の態様において、本発明は、多発性硬化症の治療に有効なＧＭ−ＣＳＦの拮抗体を含む組成物を提供する。この組成物は更に１又はそれ以上の薬学的に許容される担体、及び／又は希釈剤を含む。
【００５７】
他の態様において、本発明は、多発性硬化症の治療における薬剤の製造におけるＧＭ−ＣＳＦ拮抗体の使用を提供する。
【００５８】
他の態様において、本発明は、多発性硬化症の治療のためのＧＭ−ＣＳＦの拮抗体を提供する。
【００５９】
特定の態様において、本発明のＧＭ−ＣＳＦの拮抗体は皮下に投与される。他の態様において、本発明のＧＭ−ＣＳＦ拮抗体は脊髄内に投与される。皮下または脊髄内に投与した場合、ＧＭ−ＣＳＦの拮抗体は多発性硬化症の治療について特定の効果がある。
【００６０】
本発明の組成物は、好ましくは多発性硬化症の治療のためのＧＭ−ＣＳＦ拮抗体および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物である。このような担体、希釈剤及び賦形剤は当該分野で周知であり、当業者は、本発明のＧＭ−ＣＳＦ拮抗体で対象を治療する最も適した製剤設計と投与経路を発見するであろう。
【００６１】
特定の態様において、本発明は、多発性硬化症の対象の治療または予防する方法を提供し、この対象にＧＭ−ＣＳＦの拮抗体を有効量を投与するステップを具える。特定の態様においてこの対象はヒトである。別の態様においてこの対象がラットやマウスなどの齧歯類である。
【００６２】
特定の態様において、ＧＭ−ＣＳＦの前記拮抗体は、ＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体である。特定の態様においては、ＧＭ−ＣＳＦに特異的なこの抗体可変重鎖は配列番号３のアミノ酸配列を含む。他の特定の態様において、ＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体の軽鎖可変は配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００６３】
特定の態様において、前記ＧＭ−ＣＳＦの拮抗体は、ＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な抗体である。
【００６４】
特定の態様において、ＧＭ−ＣＳＦの拮抗体の投与はミエリン鞘の脱ミエリン化を低減する。
【００６５】
他の態様において、ＧＭ−ＣＳＦの拮抗体の投与は、脊髄への炎症細胞の流入を減少させる。
【００６６】
更に他の態様において、ＧＭ−ＣＳＦの拮抗体の投与はＴ細胞の増殖を低下させる。
【００６７】
更に他の態様において、ＧＭ−ＣＳＦの拮抗体の投与はＴ細胞によるＩＬ１７の放出を減少させる。
【００６８】
更にに他の態様において、この投与は多発性硬化症の発症を遅延させる。
【００６９】
特定の態様において、ＧＭ−ＣＳＦの拮抗体が皮下、又は脊髄内に投与される。
【００７０】
特定の態様において、本発明は、多発性硬化症の治療または予防に使用するＧＭ−ＣＳＦの拮抗体を提供する。特定の態様において前記治療または予防はＧＭ−ＣＳＦの拮抗体を有効量投与するステップを含む。特定の態様において、この対象がヒトである。別の態様において、この対象はラットやマウスなどの齧歯類である。
【００７１】
特定の態様において、ＧＭ−ＣＳＦの前記拮抗体が、ＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体である。特定の態様において、ＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体の重鎖可変は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。特定の態様においてＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体の軽鎖可変は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００７２】
特定の態様において、ＧＭ−ＣＳＦの前記拮抗体が、ＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な抗体である。
【００７３】
特定の態様において、前記ＧＭ−ＣＳＦ拮抗体による治療または予防が、ミエリン鞘の脱ミエリン化を低減する。
【００７４】
他の態様において、このＧＭ−ＣＳＦの拮抗体による治療または予防が、脊髄への炎症細胞の流入を減少させる。
【００７５】
他の態様において、このＧＭ−ＣＳＦ拮抗体による治療または予防は、Ｔ細胞の増殖を低下させる。
【００７６】
他の態様において、このＧＭ−ＣＳＦの拮抗体による治療または予防は、Ｔ細胞によるＩＬ１７の放出を減少させる。
【００７７】
他の態様において、このＧＭ−ＣＳＦ拮抗体による治療または予防は多発性硬化症の発症を遅延させる。
【００７８】
特定の態様において、ＧＭ−ＣＳＦのこの拮抗体が皮下または脊髄内に投与される。
【実施例１】
【００７９】
実施例１：本発明に使用する例示的な抗体及び動物
ＭＯＲ−ＧＭを、本発明の例示的なＧＭ−ＣＳＦ拮抗体として使用した。ＯＲ−ＧＭは完全なヒトＧＭ−ＣＳＦ特異的抗体である。（国際公開公報第０６／１２２７９７号）。
ＭＯＲ−ＧＭの重鎖可変領域は配列番号３、軽鎖可変領域は配列番号４に示されている。
抗体２２Ｅ９の抗マウスＧＭ−ＣＳＦ抗体は他の実験で使用した（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ社、マーティンスリート／ドイツ；カタログ番号１０２３５０１）。
明らかに、例えば、配列番号１乃至４５から選択されるアミノ酸のストレッチ含む任意の抗体である他のＧＭ−ＣＳＦ拮抗体は、本発明に従って使用することができる。
７又は８週齢の雄ダークアグーチラット（Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ  ｒａｔｓ（米国、インディアナ州、インディアナポリス、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社））を、２１±３０℃、４０乃至７０％の相対湿度と１２時間の明／暗サイクルの清潔な標準の条件下でペアで収容し、げっ歯類固形飼料（オランダ、ＳＳＮＩＦＦ社、Ｂｉｏ−Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社）を自由摂食させた。各動物個体は、尾をマークすることにより特定した。実験開始前に、ラットを４週間の期間飼育した。実験の開始前にラットをランダム化することでグループに割り当てた。開始時の実験ラットは１１又は１２週齢で２００乃至２５０グラムの重量であった。
【実施例２】
【００８０】
実施例２：ＭＯＧ−誘発ＥＡＥモデルにおけるＧＭ−ＣＳＦの拮抗体の治療効果。
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘発するために雄のＤＡラットに、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）及び１０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ３．０の１：１混合物で乳化した１５μｇの組換えミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質（ｒＭＯＧ）を皮内注射により尾の背面の付け根に隣接する２箇所に免疫した。免疫を容易にするために、ラットを酸素と亜酸化窒素の混合物の２乃至４％イソフルランの吸入により麻酔した。
試験組成物ＭＯＲ−ＧＭの腹腔内投与の効果は、賦形剤（ＰＢＳ）の治療との比較及び非特異／無関係のアイソタイプコントロール抗体ＭＯＲ−ＮＯＧＭ（５０ｍｇ／ｋｇ）投与群との比較により測定した。化合物ＭＯＲ−ＧＭによる予防的治療は３つの用量、すなわち１０、２０及び５０ｍｇ／ｋｇで試験を行なった。化合物は７、１０、１４、１７及び２１日目に投与した。更に、化合物（５０ｍｇ／ｋｇ）の有効性を、最初の治療を疾病の発症後に開始するレジメンでテストした。このテストでは、前記化合物を１４、１７及び２１日目に投与した。陽性コントロール群は、９日目以降から毎日デキサメタゾンを腹腔内投与したラット（０．５ｍｇ／ｋｇ）で構成した。
【００８１】
各実験群は１２匹で構成した。血液サンプルは、１７日目、２１日目及び（治療前に）実験のエンドポイントに尾静脈より採取した。各個体のラットの体重は毎日測定した。
・ラットのＥＡＥを、以下の障害スコアリングシステムを使用し毎日評価した。
０：無症状
０．５：尾の麻痺または部分的な麻痺
１：尾の完全な麻痺
２：後肢の脱力または部分的な麻痺
２．５：２であるが、前足の追加を含む
３：後肢及び／又は、下部の完全麻痺
３．５：３であるが、前足の追加を含む
４：ＥＡＥによる死
【００８２】
併存疾患に関連するＥＡＥのために安楽死が必要なラットには、安楽死の日に３．５の値を割り振り、そして全体の監視期間中の後続のすべての日に４のスコアを割り振った。
【００８３】
「最大臨床スコア」は実験期間における各ラットの最高ＥＡＥスコアを指す。
【００８４】
「累積スコア」は、規定された期間（曲線下面積）の所定のラットについての、すべてのＥＡＥスコアの合計である。累積スコアは、最初の疾病の段階（０乃至１５日目）及び再発段階（１６日目乃至、実験終了）により、全体の追跡期間を算出した。
【００８５】
「発症の日」とは、累積スコアが少なくとも３に到達し、それが３日間継続した最初の日のことである。
【００８６】
組織学的解析：ホルマリンで固定した組織をパラフィンに包埋し、５μｍの組織切片をヘマトキシリン／エオシンで染色して炎症細胞の浸潤を半定量的に類別できるようにするか、ミエリンの染色用のクリューバー・バレラ染によるルクソールファストブルーで染色した。炎症細胞の浸潤や脱ミエリン化の程度は、脊髄仙骨部からとった３つの非連続的切片（１００μｍに分割）で半定量的に評価した。以下の表で説明するようなスコアリングシステムを用い組織学的類別を行なった。組織学的類別は、盲検で実施した。
【００８７】
脊髄組織への炎症性細胞の浸潤の半定量的な類別のための組織学的スコアリングシステム。
2012530047.tif 000013
【００８８】
脊髄組織の脱ミエリン化の半定量的な類別のための組織学的スコアリングシステム。
2012530047.tif 000014
【００８９】
すべての統計解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ用の統計ソフトウェアプログラムＳＰＳＳ１４（米国、イリノイ州、シカゴ、ＳＰＳＳ社）を用いて行った。発症日、最大ＥＡＥスコア、累積スコア及び最大体重減少の複数群比較については、クラスカル・ワオリスの検定を適用し、次に、賦形剤投与群と比較し大幅に異なっている群を決定する事後マン・ホイットニーのＵ検定を適用した。疾病の進行は、一般的なリニア方式によりテストし、次に治療が著しく異なっている日をＡＮＯＶＡ及び事後ＬＳＤ−テストで決定した。マンテルコックステストを使用したカプラン・マイヤー法を用いて、複数のグループの生残率を比較し、その後の事後分析を行なった。
【００９０】
賦形剤によるコントロール処置（ＰＢＳ；ネガティブコントロール）
動物を７、１０、１４、１７および２１日目にＰＢＳの腹腔内投与により処置した。すべての動物は、ＥＡＥに発展した。疾病の最初の兆候は、９日目に現れた。平均発症日は１０．１±０．７であった。１１乃至１３日目に最初の発作ピークを迎え、２回目は約２１日目であった。このグループの平均最大ＥＡＥスコアは３．５±０．６で０乃至２４日目の平均累積ＥＡＥスコアは、３８．７±９．８であった。疾病の最初の段階（０乃至１５日目）における平均累積スコアは１１．７±２．７で、再発の段階では２６．９±７．６であった。すべての動物は、麻痺の徴候に関連して体重減少を示した。体重減少の平均最大割合は２１．１±５．７％であった。
【００９１】
アイソタイプコントロール抗体によるコントロール治療（ＭＯＲ−ＮＯＧＭ；ネガティブコントロール） 
動物は７、１０、１４、１７および２１日目にアイソタイプコントロール抗体ＭＯＲ−ＮＯＧＭを５０ｍｇ／ｋｇの用量で処置した。このグループのすべての動物は、ＥＡＥに発展した。いずれも賦形剤処置群（ＰＢＳ）の測定値から統計的な有意差はなかった。平均発症日は９．８±０．８だった。平均最大ＥＡＥスコアは３．４±０．７だった。累積ＥＡＥスコアは、賦形剤投与群のスコアと同等であった。全実験期間の累積的なＥＡＥスコアは３６．７±１０．９であった。疾患の第一段階での累積ＥＡＥは１３．３±３．１であり、再発段階では２３．５±８．０であった。最大体重減少は１９．６±５．６％であった。動物は、広範な脱ミエリン化と共に脊髄仙骨部における炎症性細胞の明らかな浸潤を示した。
【００９２】
デキサメタゾンによるコントロール処置（ポジティブコントロール）
９日目以降からは毎日０．５ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンを動物の腹腔に処置した。１２匹のうち、わずか９匹がＥＡＥに発展した。治療は、疾患の重症度に影響を及ぼした。最大ＥＡＥスコアは有意に１．７±１．０（ｐ＝０．００１）に減少した。平均累積ＥＡＥスコアは１３．１±１３．６（ｐ＜０．００５）に減少した。疾患の第一段階の間に累積スコアは６．０±５．７（ｐ＝０．０１０）、再発の段階で７．１±９．３に減少した（ｐ＜０．０００５）。ＥＡＥの抑制をよそに、デキサメタゾンは体重の損失には影響しなかった。脊髄仙骨部における炎症細胞の浸潤の程度は、アイソタイプコントロール抗体ＭＯＲ−ＮＯＧＭを投与したラットに比べて減少した（ｐ＝０．００３）。同様に、脱ミエリン化の程度は有意に低かった（ｐ＝０．００２）。
【００９３】
７日目以降のＭＯＲ−ＧＭによる処置（予防的処置）
７、１０、１４、１７、２０又は２１日目に動物にＭＯＲ−ＧＭを１０、２０又は５０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔に処置した。すべての動物は、ＥＡＥに発展した。アイソタイプコントロール抗体（ＭＯＲ−ＮＯＧＭ）による処置と比較して、５０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ−ＧＭの処置により、疾病の発症日は有意に２日遅れた（疾病発症：１１．８±３．０日、ｐ＝０．０４７）。累積ＥＡＥスコアが減少にむかう明確な傾向もあった。０乃至２４日の累積ＥＡＥスコアは２７．７±１２．３（ｐ＝０．０９４）であった。疾病の初期段階（０乃至１５日）の間の累積ＥＡＥスコアは８．７±４．９であった。これはアイソタイプ処置コントロール群（ｐ＝０．０４０）に比べて有意に減少した。処置が最大体重の減少に与える影響はなかった。５０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ−ＧＭによる処置により、毎日の平均累積スコア（ｐ＝０．０２２）が減少した。一日単位で評価すると平均累積スコアは１１日目から減少した。
結果を図２に示す。ＭＯＲ−ＧＭ（５０ｍｇ／ｋｇ）による予防的処置により０乃至１５日の累積ＥＡＥスコアは、有意に強い減少を示した。結果は、最初の発作（０乃至１５日）に特に顕著であった。
【００９４】
１４日目以降のＭＯＲ−ＧＭによる処置（治療的処置）
動物は５０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ−ＧＭ処置後１４日目、すなわちＥＡＥの発症後４日にＭＯＲ−ＧＭ（腹腔内）による最初の治療を受けた。更なる治療を１７日と２１日に行った。この治療レジメンは最大ＥＡＥスコアまたは累積ＥＡＥスコアについて、統計的に有意な効果を示さなかった。しかし、時間とともに累積スコアは、１４日目に処置を開始したアイソタイプコントロール抗体の臨床スコアと比較して、やや顕著な増加を示した。最大体重の減少に与える影響はなかった。
５０ｍｇ／ｋｇの濃度でのＭＯＲ−ＧＭ投与による予防的治療により、発症が遅延することを図３に示す（Ｐ＜０．１０）。組織学的所見は、図４（炎症）及び５（脱ミエリン化）に示す。結果は、ＧＭ−ＣＳＦ拮抗体により脊髄下部の炎症細胞の流入を減少させることを明らかに示している。ＧＭ−ＣＳＦの拮抗体はまた、脱ミエリン化を低減することができる。両パラメータについて、組織学的スコア２またはそれ以下のスコアはコントロール処置で観察できず、これはＭＯＲ−ＧＭによる治療の有効性を示している。要約すると、この結果は、多発性硬化症の治療におけるＧＭ−ＣＳＦの拮抗体の有効性を示している。
【実施例３】
【００９５】
実施例３：配列番号３又は４を含むＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体の治療効果
例２を繰り返す。ＧＭ−ＣＳＦの拮抗体として、配列番号１に示されるような重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む、又は配列番号２に示されるような軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体が使用される。マウス以外の種を用いることもでき、特に本実験で使用される抗体に交差反応する動物種を用いることもでき。好ましくは、この実験で使用されている動物はラットである。
アイソタイプコントロール抗体で処置した動物、例えばラットでは、配列番号１に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む、又は配列番号２に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体を受けた動物と比較してＥＡＥの有意な増加の兆候を示している。これは、ＥＡＥ及びＭＳの治療における抗体の有効性を示している。
【実施例４】
【００９６】
実施例４：配列番号５乃至２０を含むＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体の治療効果
例２を繰り返す。ＧＭ−ＣＳＦの拮抗体として、配列番号５乃至１６から選択される任意のＨ−ＣＤＲ３配列を含むＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体が使用される。好ましくは、前記抗体は、更に配列番号１６のＨ−ＣＤＲ１配列、及び／又は配列番号１７のＨ−ＣＤＲ２配列、及び／又は配列番号１８のＬ−ＣＤＲ１の配列、及び／又は配列番号１９のＬ−ＣＤＲ２の配列、及び／又は配列番号２０のＬ−ＣＤＲ３配列を含む。マウス以外の種、特にこの実験で使用されている抗体は交差反応性である種を用いてもよい。好ましくは、この実験で使用されている動物種はラットである。
アイソタイプコントロール抗体で処置された動物、例えばラットでは、本実施例によれば、ＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体を受けた動物と比較して、ＥＡＥの大幅な増加の兆候を示す。これは、ＥＡＥとＭＳの治療における抗体の有効性を示している。
【実施例５】
【００９７】
実施例５：  配列番号２１乃至２６を含むＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体の治療効果
例２を繰り返す。ＧＭ−ＣＳＦの拮抗体として、配列番号２１のＬ−ＣＤＲ１配列、及び／又は配列番号２２のＬ−ＣＤＲ２の配列、及び／又は配列番号２３のＬ−ＣＤＲ３の配列、及び／又は配列番号２４のＨ−ＣＤＲ１の配列、及び／又は配列番号２５のＨ−ＣＤＲ２配列、及び／又は配列番号２６のＨ−ＣＤＲ３配列を含むＧＭ−ＣＳＦ特異的抗体が使用される。好ましくは、この抗体は配列番号２１乃至２６の全てのＣＤＲｓを含む。マウス以外の種、特にこの実験で使用されている抗体は交差反応性である種を用いてもよい。好ましくは、この実験で使用されている動物種はラットである。
アイソタイプコントロール抗体で処置された動物、例えばラットは、本実施例によれば、ＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体を受けた動物と比較して、ＥＡＥの大幅な増加の兆候を示している。これは、ＥＡＥとＭＳの治療における抗体の有効性を示している。
【実施例６】
【００９８】
実施例６：配列番号４６乃至５６を構成するＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体の治療効果
例２を繰り返す。配列番号４６乃至５６から選択される任意のＨ−ＣＤＲ３配列を含むＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体が使用される。本マウス以外の種、特にこの実験で使用されている抗体は交差反応性である種を用いてもよい。
アイソタイプコントロール抗体で処置された動物、例えばアカゲザル又はカニクイザルでは、本実施例によって、ＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体を受けた動物と比較して、ＥＡＥの有意な増加の兆候を示す。これは、ＥＡＥとＭＳの治療における抗体の有効性を示している。
【実施例７】
【００９９】
実施例７：ＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な抗体の治療効果
例２が繰り返されるが、ＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的なモノクローナル抗体をＧＭ−ＣＳＦに特異なモノクローナル抗体の代わりに使用している。
配列番号２７乃至４５から選択される任意のＨ−ＣＤＲ３配列を含むＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体が使用される。マウス以外の種、特にこの実験で使用されている抗体は交差反応性である種を用いてもよい。好ましくは本実験で使用されている動物種はラットである。
アイソタイプコントロール抗体で処置された動物、例えばラットは、本実施例によるＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な抗体を受けた動物と比較して、ＥＡＥの大幅な増加の兆候を示している。これは、ＥＡＥとＭＳの治療における抗体の有効性を示している。
【実施例８】
【０１００】
実施例８：臨床試験
本発明の化合物の効果は、再発寛解型多発性硬化症に対する臨床試験でテストすることができる。治験対象母集団は、多発性硬化症（ＲＲＭＳ）の再発と寛解型の確定診断を受けた患者（１８歳以上５５歳以下の年齢、男性と女性の両方）で構成されている。
化合物は、静脈内投与する。目的は、多施設におけるＲＲＭＳ患者で二重盲検、プラセボコントロール、用量設定試験により、ＭＯＲ−ＧＭの早期の有効性を評価することである。
患者は異なる治療群に分類される。異なる治療群は、プラセボ、０．７５ｍｇ、１．５ｍｇ又は３．０ｍｇのＭＯＲ−ＧＭのいずれかを、最初の２回は２週間ごとに、その後は月に一回、受け取る。
臨床試験は更に、本発明のＧＭ−ＣＳＦの拮抗体の有効性を確認している。プラセボによる処置と比較して、ＭＯＲ−ＧＭによる治療後の多発性硬化症の発症は明らかに遅延した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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