(57)【要約】  ヒト・オクルディンタンパク質を、本質的なＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の細胞侵入因子であると特定する。オクルディンが、マウスおよび他の非ヒト細胞をＨＣＶ感染性にすること、およびヒト細胞のＨＣＶ感受性に必要とされることを示す。ＨＣＶ感染を抑制するための関連方法、ＨＣＶ発症機序に関するトランスジェニック動物モデル、ＨＣＶとオクルディンとの相互作用を妨げるか又は弱める化合物または物質を同定する方法、ＨＣＶ阻害剤もまた開示する。ＨＣＶとオクルディンとの相互作用を妨げるか又は弱める化合物または物質を同定するのに有用なキットおよび細胞培養組成物もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による対象の感染を抑制、緩和または予防する方法であって、前記対象の細胞を、オクルディンタンパク質とのＨＣＶ相互作用を阻害する試薬と接触させることを含み、前記相互作用が、ＨＣＶ侵入に必要とされるオクルディンの直接的または間接的機能のいずれかを含む、方法。
【請求項２】
前記対象が、マウス、ラット、サルまたはヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試薬が、オクルディンタンパク質の細胞外ループに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試薬が、抗体、アプタマーおよび組換えタンパク質からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、モノクローナル抗体または一本鎖抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）発症機序の研究のためのトランスジェニック動物モデルであって、前記動物におけるヒト・オクルディン・トランス遺伝子の発現を含み、それによって前記ヒト・オクルディン・トランス遺伝子の発現が、前記動物をＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染に対して寛容にする、モデル。
【請求項７】
前記動物が、マウス、サルおよびラットからなる群より選択される、請求項１４に記載のトランスジェニック動物モデル。
【請求項８】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染の阻害物質をスクリーニングする方法であって、Ｃ型肝炎ウイルスの領域とオクルディンタンパク質の領域との結合を妨げるか又は弱める化合物について、ライブラリーをスクリーニングすることを含む、方法。
【請求項９】
Ｃ型肝炎ウイルスの領域とオクルディンタンパク質の領域との相互作用を妨げるか又は弱める化合物または物質を同定する方法であって、
ａ）  ｉ）少なくともオクルディンタンパク質の細胞外ループまたはその保存的アミノ酸置換を含む組換えタンパク質、あるいはｉｉ）オクルディンタンパク質の細胞外ループを含有する膜結合タンパク質の発現を提供する組換えベクターを含む細胞であって、前記オクルディンタンパク質のアミノ酸残基が前記細胞に対して細胞外に位置することを特徴とする、前記細胞のいずれかを提供すること；
ｂ）  工程（ａ）由来のタンパク質または細胞を、物質または化合物、およびＨＣＶエンベロープタンパク質、ＨＣＶエンベロープタンパク質ＥｌおよびＥ２を発現する細胞、ＨＣＶ偽型レトロウイルス粒子、ＨＣＶ細胞培養粒子、エクスビボＨＣＶ細胞培養粒子またはＨＣＶと接触させること；および
ｃ）  前記化合物または物質が、工程（ａ）で提供されたタンパク質または細胞と、工程（ｂ）で提供されたＨＣＶエンベロープタンパク質、ＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２を発現する細胞、ＨＣＶ偽型レトロウイルス粒子、ＨＣＶ細胞培養粒子、エクスビボＨＣＶ細胞培養粒子またはＨＣＶとの相互作用または融合を阻害するかどうかを決定し、それによってＣ型肝炎ウイルスの領域とオクルディンタンパク質の領域との相互作用を妨げるか又は弱める化合物または物質を同定することを含む、方法。
【請求項１０】
工程（ａ）における細胞が、ＣＤ８１陽性細胞、ＳＲ−ＢＩ陽性細胞、および／またはクローディン−１陽性細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）における細胞が、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ９２９、Ｈ２．３５、Ｈｅｐａ１．６、ＡＭＬ１２、ＣＨＯ、７８６−０またはＴＺＭ細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換えベクターが、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）における物質が、抗体ライブラリー、アプタマーライブラリー、ペプチドライブラリー、組換えタンパク質ライブラリーまたはペプチドミメティックライブラリーにより提供される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ａ）における組換えタンパク質の相互作用の阻害が、工程（ｂ）で提供されたＨＣＶエンベロープタンパク質による、ＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２を発現する細胞による、ＨＣＶ偽型レトロウイルス粒子、ＨＣＶ細胞培養粒子による、エクスビボＨＣＶ細胞培養粒子による、またはＨＣＶによる、前記組換えタンパク質の保持率をアッセイすることで、工程（ｃ）において決定され、ここに、前記組換えタンパク質の減少した保持率が、結合阻害の指標であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｃ）における相互作用または融合の決定が、レポータータンパク質をアッセイすることにより行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
Ｃ型肝炎ウイルスの領域とオクルディンタンパク質の細胞外ループとの相互作用を妨げるか又は弱める試薬であって、前記試薬が、抗体、アプタマー、ペプチド、ペプチドミメティック化合物または組換えタンパク質であり、前記相互作用が、ＨＣＶ侵入に必要とされる直接的または間接的機能のいずれかを含むことを特徴とする、試薬。
【請求項１７】
オクルディンの細胞外タンパク質配列との特異的な相互作用を通じ、傍細胞透過性を高めないことを特徴とする、請求項１６に記載の試薬。
【請求項１８】
オクルディン依存性の細胞接着を阻害しないことを特徴とする、請求項１６に記載の試薬。
【請求項１９】
オクルディンの細胞外タンパク質配列との特異的な相互作用を通じて傍細胞透過性を高めず、かつオクルディン依存性の細胞接着を阻害しないことを特徴とする、請求項１６に記載の試薬。
【請求項２０】
Ｃ型肝炎ウイルスの領域とオクルディンタンパク質の領域との相互作用を妨げるか又は弱める化合物または物質を同定するためのキットであって、ｉ）オクルディンタンパク質の細胞外ループまたはその保存的なアミノ酸置換を含有する組換えタンパク質、またはｉｉ）オクルディンタンパク質の細胞外ループまたはその保存的アミノ酸置換を含有する膜結合タンパク質の発現を提供する組換えベクターであって、前記のオクルディンタンパク質のアミノ酸残基が、前記膜結合タンパク質を発現する細胞に対して細胞外に位置することを特徴とする、前記組換えベクター、またはｉｉｉ）前記組換えベクターを含有する細胞のいずれか；およびＣ型肝炎ウイルスの領域とオクルディンタンパク質の領域との相互作用を妨げるか又は弱める化合物または物質を同定するためにキットを用いるための取扱説明書を含む、キット。
【請求項２１】
ＨＣＶエンベロープタンパク質、ＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２をコードする組換えベクター、ＨＣＶ偽型レトロウイルス粒子をコードする組換えベクター、ＨＣＶ細胞培養粒子をコードする組換えベクターまたは感染性ＨＣＶ粒子をコードする組換えベクターをさらに含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
ｉ）オクルディンタンパク質またはその保存的アミノ酸置換を含有する膜結合タンパク質の発現を提供する組換えベクターを含む細胞であって、前記のオクルディンタンパク質のアミノ酸残基が前記細胞に対して細胞外に位置することを特徴とする、前記細胞、および
ｉｉ）ＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２をコードする組換えベクターを含む細胞、または
ｉｉｉ）ＨＣＶ偽型レトロウイルス粒子、ＨＣＶ細胞培養粒子、エクスビボＨＣＶ細胞培養粒子もしくはＨＣＶ粒子のいずれか、のいずれか、
を含む、細胞培養組成物。
【請求項２３】
前記のＨＣＶ偽型レトロウイルスベクターが、レポーター遺伝子を含み、ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質およびパッキング可能なレトロウイルスゲノムを含む、請求項２２に記載の細胞培養組成物。
【請求項２４】
前記のパッキン可能なレトロウイルスゲノムが、ＨＩＶまたはＭＬＶのパッキング可能なレトロウイルスゲノムである、請求項２３に記載の細胞培養組成物。
【請求項２５】
前記のパッキング可能なレトロウイルスゲノムが、エンベロープ欠損レトロウイルスゲノムである、請求項２３に記載の細胞培養組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００８年１０月３日に出願された米国仮出願第６１／１０２，５８８号と２００９年１月２日に出願された米国仮出願第６１／１４２，２６２号との両方に対する優先権の利益を主張し、両方ともその全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（配列表の組込み）
２００９年９月２９日に作成された１６７４１バイト（オペレーティング・システムMS-Windows（登録商標）での測定)でファイル名「48602_84546_ST25.txt」に含まれる配列表は、本願と共に電子的に提出され、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。配列表は４８個の配列を含む。
【０００３】
（政府支援の表明）
本願の保護対象は、ＮＩＨ、グラント番号ＡＩ０７２６１３のもと、合衆国政府による支援によりなされた。合衆国政府は本発明の権利の一部を有する。
【背景技術】
【０００４】
（背景）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、世界的な肝疾患の主要因である。強く必要とされる特異的な抗ウイルス治療および有効なワクチンの開発は、この病原体の好都合な小動物モデルの欠如によって妨げられている。ヒトおよびチンパンジー宿主へのＨＣＶ親和性を制限する決定因子は未知である。ウイルスＲＮＡの複製は、マウス細胞で実際に示されたが（２５）（２９）、これらの細胞は、ＨＣＶ糖タンパク質を有するレンチウイルス粒子（ＨＣＶｐｐ）（２）または細胞培養で産生されたＨＣＶ（ＨＣＶｃｃ）に対して感染性ではなかった（未発表データ）。これは、侵入レベルでのブロックを示す。
【０００５】
米国特許第６，２５２，０４５号は、オクルディン配列、オクルディン阻害剤の投与による増強された薬物送達およびオクルディン阻害剤を特定する方法を開示しており、ここでオクルディン阻害剤は、オクルディンの細胞外タンパク質配列との特異的な相互作用を通じ、傍細胞の透過性を高めるいずれかの試薬である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，２５２，０４５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
（発明の概要）
反復ｃＤＮＡライブラリースクリーニングアプローチを通じて、我々は、ヒト・オクルディン（ＯＣＬＮ）が、マウス細胞をＨＣＶｐｐに対して感染性にさせうる本質的なＨＣＶ細胞侵入因子であることを特定した。同様に、ＯＣＬＮはヒト細胞のＨＣＶ感受性に必要である。これは、非感染細胞でのＯＣＬＮ過剰発現が、ＨＣＶｐｐの取り込みを特異的に増強する一方で、許容細胞でのＯＣＬＮサイレンシングが、ＨＣＶｐｐおよびＨＣＶｃｃ両方の感染を成立させなかったからである。ＯＣＬＮに加えて、マウス細胞のＨＣＶｐｐ感染は、以前に特定されたＨＣＶ侵入因子であるＣＤ８１（２０）、スカベンジャー受容体クラスＢタイプＩ（ＳＲ−ＢＩ）（２２）およびクローディン−１（ＣＬＤＮ１）（１１）の発現を必要とした。ヒトまたはマウス起源のＳＲ−ＢＩおよびＣＬＤＮ１タンパク質は、ＨＣＶ侵入において同等に機能するが、ＯＣＬＮとＣＤ８１の両方は、効率的な感染を可能にするためにはヒト起源のものでなければならない。ＣＯＬＮの種特異的決定因子は、ＯＣＬＮの第２の細胞外ループにマップされた。新たなＨＣＶ侵入因子としてのＯＣＬＮの特定は、ウイルス侵入プロセスにおけるタイトジャンクション複合体の重要性をさらに強調するものであり、ＨＣＶの小動物モデルを開発することに対する大きな前進である。
【０００８】
ウイルス糖タンパク質Ｅ１およびＥ２を有する脂質で覆われたヌクレオカプシドであるＨＣＶビリオンは、ウイルス粒子成分と多くの細胞因子とが関与する高度に協調したプロセスでもって、宿主細胞に侵入するようである（２６）。推定されるＨＣＶ侵入因子の長いリストに基づく強力な証拠が、テトラスパニンＣＤ８１（２０）、ＳＲ−ＢＩ（２２）およびタイトジャンクションタンパク質ＣＬＤＮ１（１１）の一定の役割を裏付ける。しかしながら、３つすべてのヒト因子を過剰発現させた場合でも、多くのヒト細胞系およびすべての非霊長類細胞系がＨＣＶ侵入に対して耐性であることから（２）（図４ｃ）、このリストは不完全なようである。
【０００９】
非ヒト細胞をＨＣＶ侵入に対して感受性にさせる更なる因子を特定するために、我々は、高ＨＣＶ許容性ヒト肝細胞癌Ｈｕｈ−７．５細胞系（３）から得られた相補ＤＮＡライブラリーのサイクリック・レトロウイルス・ベースのリパッケージング・スクリーン（cyclic retrovirus-based repackaging screen）を実施した。非許容性のマウス胎児線維芽細胞系ＮＩＨ３Ｔ３を、ＨＣＶ糖タンパク質を提示しウイルスの侵入のみを測定する欠損レンチウイルス粒子であるＨＣＶ偽粒子（HCV pseudoparticle）（ＨＣＶｐｐ）（１）、（１０）、（１４）に対して感染可能にさせる遺伝子をスクリーンした（図４ａおよび補助的な方法）。非ヒト細胞へのＨＣＶの侵入を可能にしうる新しい成分を同定する可能性を最大にするために、我々は、ヒトＣＤ８１、ＳＲ−ＢＩおよびＣＬＤＮ１を過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３サブクローンを利用した。このスクリーンは、ヒト・オクルディン（ＯＣＬＮ）が潜在的な新規のＨＣＶ侵入因子であると特定した。ＯＣＬＮは、極性化上皮細胞のタイトジャンクション複合体に存在する４回膜貫通ドメインのタンパク質であり、そこでオクルディンは、傍細胞透過性および細胞接着を制御する機能を果たすようである（６、１９）。ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるヒトＣＤ８１、ＳＲ−ＢＩ、ＣＬＤＮ１およびＯＣＬＮの発現は、およそ１２０倍にまでＨＣＶｐｐの感染率を高めた（図４ｃ）。
【００１０】
ＯＣＬＮがＨＣＶ侵入に必要とされることを確かめるため、我々は、ＯＣＬＮ発現とＨＣＶ感受性との間の関係をさまざまなヒト細胞系で調べた。本来的にＨＣＶ許容性のヒト肝細胞系（Ｈｕｈ−７．５およびＨｅｐ３Ｂ）または以前に他の侵入因子を欠損することが示されたもの（肝細胞癌ＨｅｐＧ２および胎児腎臓ＨＥＫ２９３Ｔ）が、内因性のＯＣＬＮの容易に検出可能な濃度を発現することが分かった（図４ｄ）。これらの細胞系において、ＯＣＬＮのさらなる過剰発現はＨＣＶｐｐの感受性を高めなかった（図１ａ）。しかしながら、ＯＣＬＮのサイレンシングは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞のＨＣＶｐｐ感染を抑制し（図２ｆ）、Ｈｕｈ−７．５細胞のＨＣＶｐｐおよびＨＣＶｃｃ感染の両方を抑制した（それぞれ図２ｅおよびｇ）。これは、ＯＣＬＮが本来的に許容性細胞のＨＣＶ感染に必須であることを示す。水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質を有する偽粒子（ＶＳＶＧｐｐ）による感染は影響を受けなかったため、この阻害はＨＣＶ特異的であった（図２ｅ−ｆの値はＶＳＶ−Ｇｐｐ感染率に対して補正する）。対照的に、本来ＨＣＶ耐性の腎癌細胞系の７８６−Ｏは、高濃度の主要なＨＣＶ侵入因子ＣＤ８１、ＳＲ−ＢＩおよびＣＬＤＮ１を発現するが、Ｈｕｈ−７．５細胞よりも約１７倍低いＯＣＬＮを発現する（図４ｄ）。７８６−Ｏ細胞におけるＯＣＬＮ過剰発現は、ＨＣＶｐｐ感染を８８倍超にまで特異的に高めた（図１ａ）。さらに、このＨＣＶｐｐ感染のＯＣＬＮ依存性は、さまざまなＨＣＶ遺伝子型パネルにわたって観察された（図１ｂ）。他のＨＣＶｐｐ耐性細胞系であるＨｅＬａ細胞由来の子宮頸癌系ＴＺＭは、内因性のＣＬＤＮ１およびＯＣＬＮの両方を欠くことが見出された（Ｈｕｈ−７．５細胞よりもそれぞれ、＞１００倍および２５倍未満のｍＲＮＡ）（図４ｄ）。これらの因子の過剰発現は組み合わさって、ＴＺＭのＨＣＶｐｐ感染率を４５０倍まで高めた。これらの結果は、ＯＣＬＮが必須のＨＣＶ進入因子であることを示す。
【００１１】
非ヒト細胞におけるＨＣＶ侵入の必要条件をさらに調べるために、我々は、ヒトＣＤ８１、ＳＲ−ＢＩ、ＣＬＤＮ１およびＯＣＬＮの１つ、２つ、３つまたはすべての組み合わせでマウスＮＩＨ３Ｔ３を形質転換した。発現レベルは、ｍＣｈｅｒｒｙ／ＣＬＤＮ１蛍光タンパク質融合体を発現させることによって（図５ａ）、またはＣＤ８１、ＳＲ−ＢＩ（図５ａ）およびＯＣＬＮ（図５ｂ）のＦＡＣＳ染色によって決定した。ヒト因子の組合せはいずれも、ＶＳＶＧｐｐの感染率を高めなかった（データは示さず、図３ａの結果はＶＳＶＧｐｐの値に対して規格化した）。ヒトＣＬＤＮ１単独発現もＳＲ−ＢＩ単独発現もいずれも、ＮＩＨ３Ｔ３のＨＣＶｐｐ感染率を劇的に高めなかった（図３ａ）。反対に、ヒトＯＣＬＮまたはＣＤ８１のいずれかを発現する集団は、ＨＣＶｐｐ感染率をわずかに高めたが（０．５倍）（図３ａ）、これら２つの因子の組合せを発現する細胞は、ＨＣＶｐｐに関して１．２倍のより高い感染率であった（図３ａ）。しかしながら、４つすべての進入因子の完全なセットは、ＨＣＶｐｐ許容性に関して、未処理のＮＩＨ３Ｔ３細胞よりも４５倍も高いという、より大きな影響を与えた（図３ａ）。さらに、４つすべての因子の発現は、マウス胚性繊維芽細胞系のＳＴＯ５およびＬ９２９、ならびにマウス肝細胞系のＡＭＬ１２、Ｈｅｐａ１．６およびＨ２．３５に対して、未処理細胞よりも４倍〜８５倍高いＨＣＶ感受性を与えた（図１ｃ）。ＶＳＶＧｐｐに対する許容性は、ヒト・タンパク質の発現によっては影響がなかった。これらのマウス細胞をＨＣＶｃｃで感染させる試みが失敗に終わったことは、以前に資料で裏付けられたように（２４）（２９）、これらの細胞中での不十分なウイルスＲＮＡ複製の結果のようである。
【００１２】
４つの侵入因子のいずれがＨＣＶ種−特異的親和性に関与するかを調べるために、我々は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をヒトおよびマウスＣＤ８１、ＳＲ−ＢＩ、ＣＬＤＮ１およびＯＣＬＮのすべての組合せで形質転換した。４つすべてのヒト因子の発現は、ＣＨＯ細胞のＨＣＶｐｐ感染率を３３６倍にまで特異的に高めた（図３ｂ）。逆にいえば、４つのマウス・タンパク質の発現は、ＨＣＶｐｐの感染率をわずか１８倍にまで高めただけであった（図３ｂ）。すべての組合せで、マウスＳＲ−ＢＩおよびＣＬＤＮ１はヒト起源のものと同等に機能した（図３ｂ）。これは、ヒト細胞において、９０％の同一性を有するヒトおよびマウスＣＬＤＮ１タンパク質は両方ともＨＣＶ侵入因子として同等に機能的であるという、我々の以前の観察（１１）と一致するものであり、マウスおよびヒトＳＲ−ＢＩがＨＣＶ取り込みを同等に媒介できることをはじめて示すものである。以上で試験したマウス細胞はいずれも、マウスＳＲ−ＢＩまたはＣＬＤＮ１のいずれも高レベルで発現していないことは注目すべきことであり、かくしてＨＣＶｐｐの許容性に関して、これらのタンパク質の形質転換に対する依存性が説明される。対照的に、ＣＤ８１およびＯＣＬＮはＣＨＯ細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞における種−特異的ＨＣＶ侵入因子機能を発揮した。これらのヒト・タンパク質のいずれかを他の３つのマウス・タンパク質との関係で発現するＣＨＯ細胞は、マウス・タンパク質のみを発現する細胞よりもＨＣＶｐｐに対してわずかによい許容度であった（図３ｂ）。さらに、ヒトＣＤ８１およびＯＣＬＮ両方の発現は、マウスＳＲ−ＢＩおよびＣＬＤＮ１と組み合わさって、４つすべてのヒト因子を発現する細胞と同じ様に、ＣＨＯ細胞にＨＣＶｐｐによる感染性を与えた（図３ｂ、ヒトＣＤ８１およびＯＣＬＮを有するいずれかと最後の棒を比較する）。これらの結果は、マウスおよびハムスターＣＤ８１をＣＤ８１欠損ヒト肝細胞癌の細胞系ＨｅｐＧ２で発現させた場合、低レベルのＨＣＶ侵入（ヒトＣＤ８１よりも１０倍超も低い）だけしか支援しないという、我々のこれまでの知見（１３）と一致する。重要なことに、これらのデータは、ＣＤ８１およびＯＣＬＮが、少なくともマウスおよびハムスター細胞との関係で最小のヒト特異的侵入因子を表すことを示す。
【００１３】
ＣＤ８１に関し、ラット・タンパク質とヒト・タンパク質との間のＨＣＶ侵入活性における種特異性の差異は、もっぱらその大きな細胞外ループに位置する（１３）。９１％同一性であるマウス・タンパク質とヒト・タンパク質との間に観察される機能的差異の要因をもたらすＯＣＬＮ領域を決定するために、我々は、７８６−Ｏ細胞にキメラＯＣＬＮ分子を発現させ、ＨＣＶｐｐ許容性をアッセイした。これらの実験において、ヒトＯＣＬＮの第２細胞外ループ（ＥＣ２）を有するマウス・キメラが、全長のヒト・タンパク質と同程度の活性であり、マウスホモログよりも少なくとも４倍超の活性であった（図３ｄ、それぞれｍＯＣＬＮ／ｈＥＣ２をｈＯＣＬＮとｍＯＣＬＮとで比較する）。反対に、マウス・タンパク質のＥＣ２を有するヒトＯＣＬＮ変異体は、ＨＣＶｐｐ感染性において全長マウス因子と同様に機能した（図３ｄ、ｈＯＣＬＮ／ｍＥＣ２をｍＯＣＬＮと比較する）。これらのデータは、ＯＣＬＮ  ＨＣＶ侵入因子機能のヒト特異的な決定因子が、ＥＣ２内に完全に含まれることを示す。
【００１４】
本研究は、ＨＣＶ宿主細胞侵入とＨＣＶ種親和性の両方を理解することの大きな前進を表す。我々が試験したヒト、マウスまたはハムスター細胞系はすべて、ＣＤ８１、ＳＲ−ＢＩ、ＣＬＤＮ１およびＯＣＬＮを発現するように改変すると、ＨＣＶ侵入を許容するようになった。これは、ＯＣＬＮが細胞型特異的なＨＣＶ侵入因子のリストを完成させることを示し、ＨＣＶ侵入に必要とされる他のいずれかの因子は偏在的に発現されているはずであることを示す。ＯＣＬＮがタイトジャンクション複合体の主成分であるという事実は、ＨＣＶ侵入に対するこの構造体と細胞極性の意義をさらに強調する。我々は以前に、ＣＬＤＮ１が、侵入プロセスの後半であって、ビリオン・インターナリゼーションの直前に作用することを示した（１１）。タイトジャンクションでのこのＣＬＤＮ１とＯＣＬＮとの密接な関係は、これら双方の因子が類似の時間枠内で機能しうることを示す。異なる細胞表面分布を有する複数の取込み因子の使用は、ＨＣＶがコクスサッキーウイルス（coxsackievirus）Ｂの協調された侵入経路と類似する侵入経路をたどるという仮説を強化する。コクスサッキーウイルスＢは、はじめに管腔細胞表面上の一次受容体（崩壊促進因子）と相互作用し、続いてそのウイルス−受容体の複合体がタイトジャンクションに側方移動し、そこでコクサッキー・アデノウイルス（Adenovirus）受容体の補助受容体との相互作用に続いて、すぐに宿主細胞への取込みが生じる（７）。注目すべきことに、コクスサッキーウイルスＢ侵入もまたＯＣＬＮを要求する（８）。これは、このウイルスとＨＣＶの類似の侵入機構を示す。Brazzoli et al.による最近の研究は、細胞表面上のＣＤ８１の、蛍光標識されたＣＤ８１抗体または可溶型のＨＣＶ糖タンパク質のいずれかによる初期の会合に続いて、ＧＴＰａｓｅ依存的なアクチン再構成が生じ、ＣＬＤＮ１局在とＯＣＬＮ局在双方が重なる細胞間接触領域にＣＤ８１結合型複合体が側方移動することが可能となることを実証しており（４）、ＨＣＶ侵入のこの段階的モデルを支持する。
【００１５】
ＨＣＶ発症機序の研究、ならびにＨＣＶウイルスを標的とする緊急の必要性のある有効な抗ウイルス物質および治療ワクチンおよび／または予防ワクチンの開発は、ＨＣＶ感染および複製を裏づけることができる好都合な同系交配の小動物モデルの欠如によって著しく妨げられてきた。多くの障壁が確実に克服される必要があり、その後にマウスにおける完全なウイルス複製が達成されうる。マウス細胞におけるＨＣＶ  ＲＮＡ複製は非効率的であり（２５）、（２９）、ビリオン会合を支援するマウス細胞の能力は知られていない。しかしながら、我々の結果は、マウス細胞がＨＣＶ侵入を支援できない理由を明確に実証する。マウス細胞におけるＨＣＶ複製に対する主な障壁は、もはや、マウスＣＬＤＮ１とＳＲ−ＢＩとの関係で、ヒトＣＤ８１およびＯＣＬＮの発現によって簡単に克服することができる。これは、ＨＣＶ感染に関するマウスモデルを構築しうる明確なプラットフォームを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
オクルディンタンパク質とのＨＣＶ相互作用を抑制する試薬と、対象の細胞とを接触させることを含みうる、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による前記対象の感染を抑制、緩和または予防する方法であって、前記相互作用は、ＨＣＶ侵入に必要とされるオクルディンの直接的もしくは間接的機能を含む、前記方法が、本明細書中で提供される。本方法の特定の実施形態において、対象は、マウス、ラット、サルまたはヒトである。本方法の特定の実施形態において、試薬は、オクルディンタンパク質の細胞外ループと結合する。特定の実施形態において、前記試薬は、抗体、アプタマーまたは組換えタンパク質からなる群より選択される。特定の実施形態において、前記試薬は抗体であり、該抗体はモノクローナル抗体または一本鎖抗体であってよい。
【００１７】
また、本明細書中で提供されるものには、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）発症機序を研究するためのトランスジェニック動物モデルがあり、前記モデルは、当該動物におけるヒト・オクルディンのトランス遺伝子の発現を含み、それによって、前記のヒト・オクルディンのトランス遺伝子の発現が、前記動物をＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染に対して許容性にすることを特徴とする。幾つかの実施形態において、トランスジェニック動物モデルは、前記動物が、マウス、サルおよびラットからなる群より選択されるものである。
【００１８】
また、提供されるものは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染の抑制物質をスクリーニングする方法であり、前記方法は、Ｃ型肝炎ウイルスの領域とオクルディンタンパク質の領域との結合を妨げるか又は弱める化合物ライブラリーをスクリーニングすることを含む。
【００１９】
Ｃ型肝炎ウイルスの領域とオクルディンタンパク質の領域との相互作用を妨げるか又は弱める化合物または物質を特定する方法もまた提供され、前記方法は、ａ）工程  ｉ）少なくともオクルディンタンパク質の細胞外ループまたはその保存的アミノ酸置換を含有する組換えタンパク質、あるいはｉｉ）オクルディンタンパク質の細胞外ループを含有する膜結合タンパク質の発現を提供する組換えベクターを含む細胞であって、前記オクルディンタンパク質のアミノ酸残基が前記細胞に対して細胞外に位置することを特徴とする、前記細胞のいずれかを提供すること；ｂ）工程  （ａ）工程由来のタンパク質または細胞と、物質または化合物およびＨＣＶエンベロープタンパク質、ＨＣＶエンベロープタンパク質ＥｌおよびＥ２を発現する細胞、ＨＣＶ偽型（pseudotyped）レトロウイルス粒子、ＨＣＶ細胞培養粒子、エクスビボＨＣＶ細胞培養粒子またはＨＣＶとを接触させること；ならびにｃ）工程  前記化合物または物質が、工程（ａ）で提供されたタンパク質または細胞と、工程（ｂ）で提供されたＨＣＶエンベロープタンパク質、ＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２を発現する細胞、ＨＣＶ偽型レトロウイルス粒子、ＨＣＶ細胞培養粒子、エクスビボＨＣＶ細胞培養粒子またはＨＣＶとの相互作用または融合を阻害するかどうかを決定し、それによってＣ型肝炎ウイルスの領域とオクルディンタンパク質の領域との相互作用を妨げるか又は弱める化合物または物質を同定することを含む。本方法の特定の実施形態において、工程（ａ）の細胞は、ＣＤ８１陽性細胞、ＳＲ−ＢＩ陽性細胞および／またはクローディン−１陽性細胞である。本方法の特定の実施形態において、工程（ａ）の細胞は、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ９２９、Ｈ２．３５、Ｈｅｐａ１．６、ＡＭＬ１２、ＣＨＯ、７８６−０またはＴＺＭ細胞である。本方法の特定の実施形態において、組換えベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターである。本方法の特定の実施形態において、工程（ｂ）における物質は、抗体ライブラリー、アプタマーライブラリー、ペプチドライブラリー、組換えタンパク質ライブラリーまたはペプチドミメティックライブラリーにより提供される。本方法の特定の実施形態において、工程（ａ）の組換えタンパク質の相互作用の阻害が、工程（ｂ）で提供されるＨＣＶエンベロープタンパク質による、ＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２を発現する細胞による、ＨＣＶ偽型レトロウイルス粒子、ＨＣＶ細胞培養粒子による、エクスビボＨＣＶ細胞培養粒子による、またはＨＣＶによる、前記組換えタンパク質の保持率をアッセイすることにより、工程（ｃ）において決定され、ここに、前記組換えタンパク質の減少した保持率が、結合阻害の指標である。本方法の特定の実施形態において、工程（ｃ）における相互作用または融合の決定が、レポータータンパク質をアッセイすることによって実施される。特定の実施形態において、Ｃ型肝炎ウイルスの領域とオクルディンタンパク質の領域との相互作用を妨げるか又は弱める化合物または物質を特定する方法が、ｉ）オクルディンの細胞外タンパク質配列との特異的な相互作用を通じて傍細胞浸透性を高めない物質または化合物をスクリーニングすること；およ���／またはｉｉ）オクルディン依存性の細胞接着を阻害しない物質または化合物をスクリーニングすることからなる工程（ｓ）のいずれか１つまたは両方をさらに含んでいてもよい。ｉ）オクルディンの細胞外タンパク質配列との特異的な相互作用を通じて傍細胞浸透性を高めない物質または化合物をスクリーニングすること；およびｉｉ）オクルディン依存性の細胞接着を阻害しない物質または化合物をスクリーニングすることに関する技術は、限定するものではないが、出典明示によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，２５２，０４５号に開示される技術を含む。
【００２０】
Ｃ型肝炎ウイルスの領域とオクルディンタンパク質の細胞外ロープとの相互作用を妨げるか又は弱める試薬もまた提供し、前記試薬は抗体、アプタマー、ペプチド、ペプチドミメティック化合物または組換えタンパク質であって、前記相互作用はＨＣＶ侵入に必要とされるオクルディンの直接的または間接的な機能のいずれかを含む。特定の実施形態において、前記試薬は、オクルディンの細胞外タンパク質配列との特異的な相互作用を通じて傍細胞浸透性を高めない。特定の実施形態において、前記試薬は、オクルディン依存的な細胞接着を阻害しない。さらなる他の実施形態では、前記試薬は、オクルディンの細胞外タンパク質配列との特異的な相互作用を通じて傍細胞浸透性を高めず、かつオクルディン依存的な細胞接着を阻害しない。
【００２１】
Ｃ型肝炎ウイルスの領域とオクルディンタンパク質の領域との相互作用を妨げるか又は弱める化合物または物質を同定するためのキットもまた提供し、前記キットは、ｉ）オクルディンタンパク質の細胞外ループまたはその保存的なアミノ酸置換を含有する組換えタンパク質、またはｉｉ）オクルディンタンパク質の細胞外ループまたはその保存的アミノ酸置換を含有する膜結合タンパク質の発現を提供する組換えベクターであって、前記のオクルディンタンパク質のアミノ酸残基が前記膜結合タンパク質を発現する前記細胞に対して細胞外に位置することを特徴とする、前記組換えベクター、またはｉｉｉ）前記組換えベクターを含む細胞のいずれか；およびＣ型肝炎ウイルスの領域とオクルディンタンパク質の領域との相互作用を妨げるか又は弱める化合物または物質を同定するためのキットを使用するための取扱説明書を含む。特定の実施形態において、前記キットは、ＨＣＶエンベロープタンパク質、ＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２をコードする組換えベクター、ＨＣＶ偽型レトロウイルス粒子をコードする組換えベクター、ＨＣＶ細胞培養粒子をコードする組換えベクター、または感染性ＨＣＶ粒子をコードする組換えベクターをさらに含む。
【００２２】
ｉ）オクルディンタンパク質またはその保存的アミノ酸置換を含有する膜結合タンパク質の発現を提供する組換えベクターを含む細胞であって、前記のオクルディンタンパク質のアミノ酸残基が前記細胞に対して細胞外に位置することを特徴とする、前記細胞、およびｉｉ）ＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２をコードする組換えベクターを含む細胞か、あるいはｉｉｉ）ＨＣＶ偽型レトロウイルス粒子、ＨＣＶ細胞培養粒子、エクスビボＨＣＶ細胞培養粒子またはＨＣＶ粒子のいずれかを含む、細胞培養組成物もまた提供する。前記細胞培養組成物の特定の実施形態において、ＨＣＶ偽型レトロウイルスベクターは、ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質およびレポーター遺伝子を含有するパッキング可能なレトロウイルスゲノムを含む。前記細胞培養組成物の特定の実施形態において、パッキン可能なレトロウイルスゲノムは、ＨＩＶまたはＭＬＶのパッキング可能なレトロウイルスゲノムである。前記の細胞培養組成物の特定の実施形態において、パッキング可能なレトロウイルスゲノムは、エンベロープ欠損レトロウイルスゲノムである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＯＣＬＮ発現はＨＣＶｐｐに対する感受性を与える。ａ、表示するヒト細胞系は、モック形質導入またはヒトｐＴＲＩＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＤ８１（ＣＤ８１）、ｐＴＲＩＰ−Ｃｅｒｕｌｅａｎ−ＣＬＤＮ１（ＣＬＤＮ１）、ｐＴＲＩＰ−Ｖｅｎｕｓ−ＯＣＬＮ（ＯＣＬＮ）もしくはＣＬＤＮ１とＯＣＬＮとの両方を発現するように形質導入した。次いで、これらの集団の並行培養物を、別々にＧＦＰレポーターをコードするＨＣＶｐｐおよびＶＳＶＧｐｐでチャレンジした。ＨＣＶｐｐ感染率は、材料および方法に記載するように、非エンベロープ偽粒子（Ｅｎｖ−ｐｐ）による感染からのシグナルを減算した後に、ＶＳＶＧｐｐの力価で除算したＨＣＶｐｐの力価として報告する。ｂ、さまざまなＨＣＶ遺伝子型（丸括弧内は分離株の名前）由来の表示する糖タンパク質を有しＧＦＰをコードする偽粒子を用いて、未処理の７８６−Ｏ細胞（黒）またはＯＣＬＮ発現７８６−Ｏ細胞（白）に感染させた。ｃ、表示するマウス細胞系は、モック形質導入したか、またはヒトｐＴＲＩＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＤ８１（ＣＤ８１）、ｐＴＲＩＰ−ＳＲ−ＢＩ（ＳＲ−ＢＩ）、ｐＴＲＩＰ−Ｃｅｒｕｌｅａｎ−ＣＬＤＮ１（ＣＬＤＮ１）およびｐＴＲＩＰ−Ｖｅｎｕｓ−ＯＣＬＮ（ＯＣＬＮ）の組合せ（４×）を発現するよう形質導入したかのいずれかである。次いで、並行培養物および許容性のＨｕｈ−７．５細胞を、ＧＦＰレポーターをコードするＨＣＶｐｐおよびＶＳＶＧｐｐでチャレンジし、上記のようにＨＣＶｐｐ感染率を計算した。少なくとも３重の試験結果の平均値および標準偏差（ＳＤ）を示す。
【図２】ＯＣＬＮサイレンシングはＨＣＶ侵入を阻害する。Ｈｕｈ−７．５（左列）およびＨｅｐ３Ｂ（右列）を、無関係のもの（irrelevant；灰色棒）、ＣＤ８１（格子縞の棒）またはＯＣＬＮ（黒棒）特異的ｓｉＲＮＡプールでトランスフェクトした。発現レベルを決定するために、各細胞集団をＣＤ８１（ａおよびｂ）およびＯＣＬＮ（ｃおよびｄ）特異抗体で染色した。タンパク質発現は、フローサイトメトリーにより分析した。特異染色とアイソタイプ対照染色との間の比を示す。発現分析時に、並行してｓｉＲＮＡ処理した細胞を、ＨＣＶｐｐ（ｅおよびｆ）およびＨＣＶｃｃ（ｇ）でチャレンジした。材料および方法に記載するように、ＨＣＶｐｐ感染率を計算し、規格化した。ＨＣＶｃｃ感染は、アイソタイプ対照染色に対するウイルスタンパク質（ＮＳ５Ａ）染色の比により定量した。試料はすべて無関係なｓｉＲＮＡ処理細胞に対して規格化する。ｄＭＦＩ、平均蛍光強度における差異。少なくとも３重の試験結果の平均値およびＳＤを示す。
【図３】ヒトＯＣＬＮおよびヒトＣＤ８１の発現は、ＨＣＶ種親和性を決定する。（ａ）マウスＮＩＨ３Ｔ３を、ヒトｐＴＲＩＰ−ＣＤ８１（ＣＤ８１）、ｐＴＲＩＰ−ＳＲ−ＢＩ（ＳＲ−ＢＩ）、ｐＴＲＩＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＬＤＮ１（ＣＬＤＮ１）およびｐＴＲＩＰ−ＯＣＬＮ（ＯＣＬＮ）の組合せで形質導入した。ハムスターＣＨＯ（ｂ）およびＮＩＨ３Ｔ３（ｃ）細胞を、ヒト（Ｈ）およびマウス（Ｍ）ｐＴＲＩＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＤ８１（ＣＤ８１）、ｐＴＲＩＰ−ＳＲ−ＢＩ（ＳＲ−ＢＩ）、ｐＴＲＩＰ−Ｃｅｒｕｌｅａｎ−ＣＬＤＮ１（ＣＬＤＮ１）およびｐＴＲＩＰ−Ｖｅｎｕｓ−ＯＣＬＮ（ＯＣＬＮ）の組合せで形質導入した。ｄ、ＯＣＬＮの膜トポロジーの略図（１２）。ｅ、７８６−Ｏ細胞を、マウス／ヒトＯＣＬＮキメラで形質導入した。キメラはすべてＮ末端にＶｅｎｕｓ黄色蛍光タンパク質がタグ付けされた。形質導入した細胞（ａ、ｂ、ｃおよびｅ）を、ＧＦＰレポーターをコードするＨＣＶｐｐおよびＶＳＶＧｐｐでチャレンジし、ＨＣＶｐｐ感染率は、方法で記載するように、計算し規格化した。少なくとも２重の試験結果の平均値およびＳＤを示す。
【図４】ＨＣＶ侵入因子としてのＯＣＬＮの同定。ａ、ヒトＣＤ８１、ＳＲ−ＢＩおよびｍＣｈｅｒｒｙ／ＣＬＤＮ１を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｎ３ｘＦ２６）に対してＨＣＶｐｐ感受性を与えるｃＤＮＡのスクリーンに関する。ＬＭＮ８マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ベースのレトロウイルスベクター中の最初のＨｕｈ−７．５誘導（derived）ライブラリーは、ライブラリーＤＮＡならびにＭＬＶ  ｇａｇ−ｐｏｌを発現するベクターおよびＶＳＶ−Ｇを発現するベクターを用いた２９３Ｔ細胞の同時トランスフェクションにより、ＶＳＶＧｐｐ中にパッケージした。次いで、未処理Ｎ３ｘＦ２６細胞を、偽粒子ライブラリーを用いて形質導入して、ピューロマイシン耐性遺伝子（ＣＳＰＷ）をコードするＨＣＶｐｐでチャレンジし、続いて抗生物質選択を行った。生存コロニーをプールし、展開し、糖タンパク質を有さない偽粒子（Ｅｎｖ−ｐｐ）、ＧＦＰレポーター（ＣＳＧＷ）をコードするＨＣＶｐｐおよびＶＳＶＧｐｐに対する感受性について試験した。続いて、その集団をＭＬＶ  ｇａｇ−ｐｏｌおよびＶＳＶ−Ｇでトランスフェクトし、生存Ｎ３ｘＦ２６細胞中に含有されるｃＤＮＡ挿入物を含むＬＭＮ８ゲノムをコードするＶＳＶＧｐｐを産生させた（サイクリック・パッキングレスキュー、ＣＰＲ）。これらのリパッケージ偽粒子を用いて、後のスクリーニングラウンドのために未処理Ｎ３ｘＦ２６細胞に形質導入した。ＣＳＰＷプロウイルスは、ＨＩＶ−１ベースであり、かくしてＭＬＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ媒介型ＣＰＲ工程の間にリパッケージされない。加えて、このプロウイルスは、形質導入細胞においてパッケージ可能なウイルスＲＮＡの発現を妨げる３’ＬＴＲ中の欠失を有する。ｂ、Ｎ３ｘＦ２６細胞のＨＣＶｐｐの許容性は、複数ラウンドのライブラリー形質導入および選択の間に増大した。未処理Ｎ３ｘＦ２６細胞（最初の列）またはＬＭＮ８−ｃＤＮＡライブラリーで形質導入された親の（第２列）もしくはリパッケージ（第３列および第４列）Ｎ３ｘＦ２６細胞の一部を、ＧＦＰレポーター（ＣＳＧＷ）をコードするＥｎｖ−ｐｐ、ＨＣＶｐｐまたはＶＳＶＧｐｐに対する許容性について評価した。ＧＦＰ発現は、感染後７２時間でフローサイトメトリーにより測定した。アッセイ間で実施した作業を上部に記載する：ライブラリー−ｃＤＮＡライブラリーの最初の形質導入；ｐｕｒｏ−ピューロマイシン耐性レポーター遺伝子をコードするＨＣＶｐｐによる形質導入後のピューロマイシン選択；ＣＰＲ−ＭＬＶ  ｇａｇ−ｐｏｌおよびＶＳＶ−Ｇでのトランスフェクション、Ｎ３ｘＦ２６細胞集団に含有されるｃＤＮＡを偽粒子中にリパッケージすること、未処理Ｎ３ｘＦ２６細胞への輸送およびさらなる選択。ＧＦＰ陽性細胞の百分率を、各プロットの右上の隅に表示する。１回のリパッケージング工程を含む２ラウンドの選択後に、選択した集団における有効なＨＣＶｐｐ力価は、約１００倍にまで増加した（第３列）。２回のリパッケージングを含む３ラウンドの選択後の有効なＨＣＶｐｐ力価は、未処理Ｎ３ｘＦ２６細胞と比較して約２０倍に増加したが（一番上の行）、ＶＳＶ−Ｇｐｐ（第２行）とＥｎｖ−ｐｐ（第３行）の有効な力価は、本質的に変化しなかったか、または減少さえした。３ラウンドの選択後のＦＡＣＳにより単離された２４の細胞クローンのうち、８つがＯＣＬＮをコードするｃＤＮＡを保有した。残りの１６クローンでは、ｃＤＮＡは見出されず、ＨＣＶｐｐの非特異的な取り込みを通じて選択された形質導入されていない細胞を表すようであった。ＬＭＮ８−ＯＣＬＮ  ｃＤＮＡクローンはすべて同一のアミノ末端切断型のＯＣＬＮ  ｃＤＮＡ断片を含み、それは最初の１４０アミノ酸のない、本質的に細胞内Ｎ末端テイルを除去したＯＣＬＮタンパク質を発現した。ｃ、単離されたＮ末端切断型のＯＣＬＮをコードするＬＭＮ８−ＶＳＶＧｐｐおよび全長のＯＣＬＮをコードするｐＴＲＩＰ−ＶＳＶＧｐｐを用いて、未処理Ｎ３ｘＦ２６細胞に形質導入した。これらの細胞を、次いで、ＧＦＰをコードする偽粒子でチャレンジした。ＨＣＶｐｐ感染率は、材料および方法に記載したように、Ｅｎｖ−ｐｐシグナルを減算した後、ＶＳＶＧｐｐの力価で除算したＨＣＶｐｐの力価として報告する。値は、高許容性のＨｕｈ−７．５細胞の並行感染に対して規格化する。ｄ、全ＲＮＡを、表示した細胞系から単離し、ヒトＣＤ８１、ＣＬＤＮ１およびＯＣＬＮ  ｍＲＮＡレベルをＲＴ定量ＰＣＲにより決定した。データは、ＧＡＰＤＨ発現に対して規格化し、Ｈｕｈ−７．５細胞の百分率としてプロットした。少なくとも３重の試験結果の平均値および標準偏差（ＳＤ）を示す。
【図５】形質導入した細胞中でのＨＣＶ侵入因子の発現。マウスＮＩＨ３Ｔ３を、ヒトｐＴＲＩＰ−ＣＤ８１（ＣＤ８１）、ｐＴＲＩＰ−ＳＲ−ＢＩ（ＳＲ−ＢＩ）、ｐＴＲＩＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ／ＣＬＤＮ１（ＣＬＤＮ１）およびｐＴＲＩＰ−ＯＣＬＮ（ＯＣＬＮ）の表示した組合せで形質導入した。ＣＤ８１、ＳＲ−ＢＩおよびＣＬＤＮ１（ａ）ならびにＯＣＬＮ発現（ｂ）を感染時にフローサイトメトリーにより観察した。ｄＭＦＩ、平均蛍光強度の差異。少なくとも３重の試験結果の平均値およびＳＤを示す。
【図６】フローサイトメトリーにより分析した場合の、ヒト、マウスおよびハムスター細胞におけるＨＣＶ侵入の選択した生データ。ヒト（Ｈｕｈ７．５、７８６−Ｏ）、マウス（ＮＩＨ３Ｔ３）およびハムスター（ＣＨＯ）細胞を、表示するようにヒトｐＴＲＩＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｈＣＤ８１（ｈＣＤ８１）、ｐＴＲＩＰ−Ｃｅｒｕｌｅａｎ−ｈＣＬＤＮ１（ｈＣＬＤＮ１）、ｐＴＲＩＰ−Ｖｅｎｕｓ−ｈＯＣＬＮ（ｈＯＣＬＮ）で形質導入し、次いで並行してＨＣＶｐｐ、ＶＳＶＧｐｐまたはＥｎｖ−ｐｐでチャレンジした。他のすべての分析でＨＣＶ感染の計算に用いたものの中で代表的なＦＡＣＳプロットを示す。
【図７】ＣＤ８１、ＳＲ−ＢＩ、ＣＬＤＮ１およびＯＣＬＮは、非ヒト細胞への有効なＨＣＶｐｐ侵入のための最小のセットを構成する。（ａ）ハムスターＣＨＯ細胞を、表示したヒトｐＴＲＩＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＤ８１（ＣＤ８１）、ｐＴＲＩＰ−ＳＲ−ＢＩ（ＳＲ−ＢＩ）、ｐＴＲＩＰ−Ｃｅｒｕｌｅａｎ−ＣＬＤＮ１（ＣＬＤＮ１）およびｐＴＲＩＰ−Ｖｅｎｕｓ−ＯＣＬＮ（ＯＣＬＮ）の組合せで形質導入した。形質導入した細胞を、ＧＦＰレポーターをコードするＨＣＶｐｐおよびＶＳＶＧｐｐでチャレンジし、材料および方法に記載したようにＨＣＶｐｐ感染率を計算し規格化した。全ＲＮＡをＣＨＯ（ｂ）およびＮＩＨ３Ｔ３（ｄ）、ハムスター（ｃ）およびマウス（ｄ）の肝臓から単離し、ハムスターまたはマウスＣＤ８１、ＣＬＤＮ１およびＯＣＬＮ  ｍＲＮＡレベルをＲＴ定量ＰＣＲにより決定した。データはＧＡＰＤＨ発現に対して規格化した。少なくとも２重の実験結果の平均値およびＳＤを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（詳しい説明）
以下の開示する実施形態は、さまざまな形態で具体化しうる本発明の単なる例示である。かくして、本明細書中で開示される具体的な構造および機能の詳細は、限定を示すものと解釈すべきではない。
【００２５】
試薬および化学薬品はすべて商業的に入手可能であるか、または文献で見出される標準的な手順により調製することができるか、あるいは細胞もしくは分子生物学、有機化学、生化学、その他の類似の分野で当業者には公知なものである。
【００２６】
（定義）
本明細書で用いられる用語「ＨＣＶ」は、いずれかの主要なＨＣＶ遺伝子型、サブタイプ、分離株および／または擬似種を示す。ＨＣＶ遺伝子型は、限定するものではないが、遺伝子型１、２、３、４、５および６を含み、ＨＣＶサブタイプは、限定するものではないが、サブタイプIａ、Ｉｂ、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａ、４ａ−４ｆ、５ａ、および６ａを含む。
【００２７】
本明細書で用いられる語句「保存的アミノ酸置換」は、配列中の（複数の）アミノ酸における１つ以上の変更であって、他の（複数の）アミノ酸で置き換えられ、その電荷および極性が本来のアミノ酸のものと類似するものを意味する。タンパク質、ペプチドまたはペプチドミメティック化合物におけるアミノ酸の保存的な置換は、もとのアミノ酸が属する群のメンバーによって行われる。アミノ酸は、以下の４つの群に分けることができる。（１）酸性アミノ酸；（２）塩基性アミノ酸；（３）中性極性（neutral polar）アミノ酸；および（４）中性無極性アミノ酸。さまざまな群の中の代表的なアミノ酸には、限定するものではないが、（１）酸性（負に帯電している）アミノ酸、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性（正に帯電している）アミノ酸、例えばアルギニン、ヒスチジンおよびリジン；（３）中性極性アミノ酸、例えばグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミン；（４）中性無極性（疎水性）アミノ酸、例えばアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。保存的アミノ酸変更は、これらの群のうちの１つのアミノ酸を、同じ群の中の他のアミノ酸で置換することによって行うことができる。
【００２８】
本明細書で用いられる「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、または合成抗体のいずれかである。
【００２９】
本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」は、単一のエピトープを認識するいずれかの起源由来のいずれかの抗体である。
【００３０】
本明細書で用いられる「一本鎖抗体」は、いずれかの軽鎖抗体、いずれかの重鎖抗体、または抗原認識部位を含むいずれかのそのフラグメントである。一本鎖抗体は、いずれの起源由来のものであってもよい。
【００３１】
本明細書で用いられる「合成抗体」は、組換えＤＮＡ技術により作り出されるいずれかの抗体である。かくして、合成抗体は、限定するものではないが、ヒト化抗体、変異導入抗体、およびヒト、細菌、酵母またはバクテリオファージ発現ライブラリー由来の抗体を含む。
【００３２】
本明細書で用いられる語句「ペプチドミメティック化合物」は、１つ以上の非天然のアミノ酸（例えば、非天然の側鎖、非天然のキラリティー、Ｎ置換アミノ酸、またはベータアミノ酸）を含有するペプチドアナログ、非天然のトポロジー（例えば、環状もしくは分枝）および／またはアミド（ペプチド）結合が部分的に若しくは全体的にエステル、チオエステルもしくは他の結合で置換されたペプチドアナログを意味する。
【００３３】
本明細書で用いられる語句「化学的に誘導されたバリアント」は、ペプチドまたはペプチドミメティック化合物に関連して用いられる場合、共有結合で改変されたペプチドまたはペプチドミメティック化合物を意味する。共結合による改変は、限定するものではないが、アセチル化、アミド化、硫酸化、スクシニル化、メチル化、キレート結合（chelator linkage）または末端ブロッケージ（terminal blockage）を含む。
【００３４】
本明細書で用いられる用語「対応する」は、１つのペプチド配列中の同等のアミノ酸を他のポリペプチド、ペプチドまたはペプチドミメティック化合物配列と比較する、アライメントする、または同定することに関連して用いられる場合に、他のポリペプチド配列と整列させたときに、もっとも高い同一性パーセンテージを与えうる比較またはアライメントを意味する。
【００３５】
本明細書で用いられる語句「膜結合タンパク質」は、生理学的なｐＨおよび塩濃度のもとで細胞膜に結合しているタンパク質のいずれかを意味する。膜結合タンパク質の結合は、リン脂質二重層に直接結合すること、または膜に結合するタンパク質、糖タンパク質もしくは他の媒介物に結合することのいずれかによる。
【００３６】
本明細書中で用いられる用語「細胞外」は、細胞の外側で、非細胞質領域を意味する。
【００３７】
本明細書中で用いられる語句「Ｃ型肝炎ウイルスの領域とオクルディンタンパク質の領域との相互作用」は、ＨＣＶビリオンまたはそれから誘導された成分が細胞によって認識、結合および／または内在化するプロセス中のいずれかの過程を包含する。本明細書で用いられるように、相互作用は、ＨＣＶ侵入に必要とされるオクルディンの直接的または間接的機能のいずれかを含む。
【００３８】
オクルディンタンパク質とのＨＣＶ相互作用を阻害することによりＨＣＶ感染を抑制、緩和または予防する方法。
内因性のオクルディン機能を阻害することによりＨＣＶ感染を抑制する方法の変法は、本発明により考えられる。そのような方法としては、ＨＣＶ侵入に必要とされる細胞性相互作用を提供する内因性のオクルディンの領域のブロッケージ、または内因性のオクルディンまたはオクルディン含有タンパク質複合体との相互作用を提供するＨＣＶの領域のブロッケージのいずれかを含み得る。内因性のオクルディン機能を阻害することによってＨＣＶ感染を抑制することに関する類似の方法は、国際公開公報第２００７／１３０６４６号にも記載される。
【００３９】
結合してＨＣＶ感染を抑制することができる内因性のオクルディンの領域が特定されたため、さまざまな有効な細胞外領域結合性試薬が本明細書において考えられる。抗体に加えて、オクルディン細胞外ループに結合するアプタマーを、ＨＣＶ感染を抑制するために用いることができる。本明細書で用いられるように、アプタマーは、標的に結合するいずれかのＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドまたは化学修飾されたオリゴヌクレオチドを含み得る。アプタマーの分離および同定は、開示されている（米国特許第５，５８２，９８１号、米国特許第６，８６７，２８９号、米国特許第７，１７９，８９４号）。あるいは、内因性のオクルディン細胞外ループに結合する組換え結合性タンパク質（recombinant binding protein）を、ＨＣＶ感染を抑制するために用いることができる。本明細書で用いられる「組換え結合性タンパク質」は、組換えＤＮＡまたはポリメラーゼ連鎖反応−媒介反応物により得られる、標的に結合するいずれかの非天然のタンパク質である。組換え結合性タンパク質は、免疫グロブリン重鎖の可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖の可変ドメイン、Ｔ細胞レセプタータンパク質のＶ．アルファ／Ｖ．ベータ・ドメイン、またはその組合せのポリペプチド結合性領域を含む。組換え結合性タンパク質の単離および同定は、開示されている（米国特許第６，０１０，８８４号および米国特許第６，２９７，０５３号）。
【００４０】
ＨＣＶ感染を抑制するためのＨＣＶ領域のブロッケージは、ＨＣＶと相互作用するオクルディンの細胞外ループの領域を模倣する試薬によっても行うことができる。理論により拘泥されることを意図するものではないが、オクルディンの細胞外ループの重要な領域を模倣する試薬とＨＣＶとを接触させることで、ＨＣＶの細胞侵入およびＨＣＶ感染を許容する内因性のオクルディンとＨＣＶとの生産的な相互作用を阻害することが期待される。これらの試薬は、ＨＣＶと内因性のオクルディンとの相互作用を競合的に阻害することが期待される。オクルディン細胞外ループを模倣する試薬の利点の１つには、それらのＨＣＶの重要な領域との相互作用が増強されるようにし、一方で内因性のオクルディン細胞外ループを認識するいずれかの他の内因性の細胞性リガンドとの相互作用が最小となるように、当該試薬を最適化できることがある。オクルディンを模倣する試薬の最適化は、ＨＣＶ感染を抑制、予防または緩和を提供し、一方で望ましくない副作用を最小にすることが期待される。
【００４１】
ＨＣＶの抑制、予防または緩和試薬の対象への投与に関する上記で引用する方法のいずれかの実施に際して、これらの活性試薬を含むさまざまな医薬組成物を、さまざまな技術により投与し得ることが考えられる。そのような医薬組成物は、投与を目的とする分野で公知のさまざまな方法で製剤化することができる。本発明の医薬組成物を調製するために、有効量の特定の化合物を、塩基性塩または酸性塩の形態で、活性成分として、１つ以上の医薬上許容される担体および送達ビヒクルと組み合わせられる。容易に入手可能であり、当分野で周知な多くの医薬上許容される担体および送達ビヒクルが存在し、それらを用いて所望の調合物を作り出すことができる（すなわち、医薬組成物の経口、局所、直腸内、経皮投与を可能にし、非経口注射による投与、鼻腔内投与または吸入による投与を可能にする）。医薬上許容される担体および送達ビヒクルの代表例としては、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン；緩衝物質、例えばさまざまなリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的なグリセリド混合物；水、塩類または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウムおよび亜鉛塩；コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース・ベースの物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアリーレート、ワックス、ポリエチレン、ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂およびその他の類似物を含む。本明細書に記載される医薬組成物は、経口、経皮、注射剤（経皮、筋肉内、静脈内および皮内）、局所用、鼻腔内、吸入による投与に適した、または医療器具、例えばインプラント、カテーテルまたは他の装置への適用に適した単回剤形にさらに調製することができる。経口投薬量の投与を可能にする組成物を調製する際に、例えば懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤および溶剤などの液体調剤の経口送達を可能にする担体の場合には、水、グリコール、油、アルコールおよびその類似物などの当分野で公知の医薬上許容されるいずれかの担体を用いることができる。経口または直腸投与を可能にする固体の医薬上許容される担体が望ましい場合には、澱粉、糖、カオリン、潤滑剤、結合剤、セルロースおよびその誘導体、ならびに崩壊剤およびその類似物を用いて、例えば粉剤、ピル、カプセル剤および錠剤を調剤することができる。非経口投与を可能にする医薬上許容される担体に関し、医薬上許容される担体はしばしば無菌水を含み、例えば可溶性を増加させるためのさまざまな溶質が補充されてよい。医薬上許容される担体が食塩溶液、グルコース溶液またはその混合を含み、特定の周知の抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および製剤を対象患者の血液と等張性にする他の溶質を含んでいてもよい、注射可能な溶液を調剤することができる。
【００４２】
ＨＣＶとオクルディンとの相互作用を阻害する化合物または物質の同定を提供する、さまざまなインビトロおよび細胞ベースのアッセイが本明細書において考えられる。オクルディンとのＨＣＶ相互作用の阻害を用いて、いずれかの主要なＨＣＶ遺伝子型、サブタイプ、分離株および／または擬似種による患者の感染を抑制、緩和または予防することができる。ＨＣＶ遺伝子型は、限定するものではないが、遺伝子型１、２、３、４、５および６を含み、ならびにＨＣＶサブタイプは、限定するものではないが、サブタイプＩａ、Ｉｂ、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａ、４ａ−４ｆ、５ａおよび６ａを含む。さらに、当業者には、オクルディンのいずれかの領域と相互作用する物質または化合物であれば、ＨＣＶ侵入を提供するオクルディン機能を乱しうることは明らかであろう。インビトロアッセイは、組換えオクルディンタンパク質とＨＣＶまたはＨＣＶ成分との結合、相互作用または会合を決定するいずれかのアッセイを含む。組換えオクルディンとＨＣＶまたはＨＣＶ成分との結合が、直接的なものであってもよいし、間接的なものであってもよいことは理解される。間接的な結合は、媒介物を介したオクルディンとＨＣＶとの結合を必要とする。組換えオクルディンタンパク質を、インビトロ結合または相互作用アッセイに、可溶性形態または不溶性の形態、例えばリポソームのいずれかで用いることができる。結合アッセイに用いることができる他の不溶性形態には、組換えオクルディンタンパク質を固体支持体に連結した形態が含まれる。固体支持体は、ビーズ、マイクロタイタープレート、カラム材料、または結合アッセイのためにタンパク質を固定するのに適した他のいずれかの材料を含む。組換えオクルディンの可溶性形態は、可溶性、検出および／または保持を容易にする配列をさらに含んでいてもよい。可溶性を容易にすることができる配列は、限定するものではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたは大腸菌マルトース結合タンパク質由来の配列を含む。検出を容易にする配列は、いずれかのレポータータンパク質、いずれかのエピトープまたはいずれかのタンパク質結合ドメインを含む。当業者には、可溶性または検出を促進する外来配列はいずれも保持を容易にしうることを理解するであろう。保持は、固体支持体に対してタンパク質またはタンパク質リガンドを会合させるために、結合アッセイで典型的に用いられる。また、組換えタンパク質は、ＦＬＡＧ（商標）エピトープ（Stratagene, La Jolla, CA, USA）、ｍｙｃエピトープ、ヒスチジンタグおよび他の類似物などの保持のための付加的な配列をさらに含む。
【００４３】
組換えオクルディンタンパク質といずれかのＨＣＶまたはＨＣＶ誘導物質、例えばＨＣＶ、ＨＣＶｃｃ、ＨＣＶｐｐ、粗精製ＨＣＶ成分、精製ＨＣＶタンパク質または（複数の）組換えＨＣＶタンパク質との結合または相互作用は、本明細書で考慮された方法で決定することができる。組換えオクルディンとＨＣＶ  Ｅ１およびＥ２との結合または相互作用が、具体的に考えられる。
【００４４】
そのような結合は、直接的であってもよいし、または間接的であってもよい。組換えオクルディンまたはＨＣＶもしくはＨＣＶ誘導物質のいずれも、結合アッセイを容易にするために検出可能に標識化することができる。特定の実施形態において、組換えオクルディンおよびＨＣＶまたはＨＣＶ由来物質は、それら各々の同時検出を可能にする別個の検出可能な標識で標識化される。結合アッセイにおいて、組換えオクルディンタンパク質は、ＨＣＶまたはＨＣＶ誘導物質と典型的に接触させ、ある形態の緩衝液交換を行い、結合を測定する。結合は、限定するものではないが、結合標識の検出、表面プラズモン共鳴またはシンチレーション近接アッセイを含む、いずれかの適切な技術または技術の組合せにより測定することができる。当業者は、オクルディン配列が細胞の細胞外表面に存在する方法は、ＨＣＶ相互作用を可能にする様式で当該配列が存在する限り重要ではないことを認識するであろう。
【００４５】
本方法の特定の実施形態では、組換え膜結合細胞外オクルディンアミノ酸残基を発現する細胞を、ＨＣＶエンベロープタンパク質、ＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２、ＨＣＶ偽型レトロウイルス粒子、ＨＣＶｃｃ粒子、エクスビボＨＣＶｃｃ粒子またはＨＣＶを発現する細胞のいずれかにより接触させる。組換えオクルディンを発現する細胞を（複数の）ＨＣＶエンベロープタンパク質により接触させた場合、前記（複数の）エンベロープタンパク質の結合が化合物または試薬により阻害されるかどうかを、緩衝液交換に続いて、エンベロープタンパク質の有無を観察することにより決定することができる。そのような結合分析は、検出可能に標識したエンベロープタンパク質を提供することにより容易になされる。エンベロープタンパク質、ＨＣＶｐｐ、ＨＣＶｃｃ、エクスビボＨＣＶｃｃまたはＨＣＶを発現する細胞と組換えオクルディンを発現する細胞との結合は、エンベロープタンパク質の結合に関して記載した様式で観察することも可能である。ＨＣＶｐｐまたはＨＣＶｃｃによる感染は、これらの種によりコードされるレポーター遺伝子の使用により観察することも可能であり、それらは、試薬または化合物に対する暴露に続いて、細胞に対するアッセイを可能にする。
【００４６】
他の態様のオクルディン媒介型の細胞へのＨＣＶ侵入を模擬する、インビトロアッセイにおける組換えオクルディンタンパク質の使用もまた考えられる。そのようなアッセイは、ＨＣＶ、ＨＣＶｃｃ、エクスビボＨＣＶ、ＨＣＶｐｐ、（複数の）ＨＣＶエンベロープタンパク質を発現する組換え細胞、ＨＣＶ成分を含有する再構成されたリポソーム由来の生化学的なフラクションおよび組換えオクルディン発現細胞由来の他のフラクションもしくは再構成物質の使用を含み得る。
【００４７】
結果的にＨＣＶの細胞内への侵入をもたらすＨＣＶとオクルディンとの相互作用をアッセイして、いずれかの態様のプロセスを干渉する化合物または物質を特定することもできる。エンベロープタンパク質、ＨＣＶｐｐ、ＨＣＶｃｃ、エクスビボＨＣＶｃｃまたはＨＣＶを発現する細胞と組換えオクルディンを発現する細胞との生産的な相互作用または融合は、エンベロープタンパク質、ＨＣＶｐｐ、ＨＣＶｃｃ、エクスビボＨＣＶｃｃまたはＨＣＶを発現する細胞から組換えオクルディンを発現する細胞へのタンパク質または核酸の移動を観察する技術によりアッセイすることもできる。特定の実施形態において、レポーター遺伝子の移動を観察する。レポーターが、ＨＣＶｐｐまたは他の適切ないずれかのウイルスベクターから移動する場合、前記レポーターは、組換えオクルディンタンパク質を発現する細胞内への侵入の際にのみ発現するであろう。レポーターが、組換えオクルディンタンパク質を発現する細胞と融合する別個の細胞内に存在する場合、レポーター遺伝子は、細胞が融合し、当該レポーターが、組換えオクルディンタンパク質を発現する細胞内の因子に曝された場合にだけ発現するであろう。細胞融合に際してレポーターの発現を提供する方法は、限定するものではないが、レポーターと宿主細胞内に存在するトランス作用性の転写因子により調節されるプロモーターとを操作可能に連結することを含む。ＨＣＶ、ＨＣＶｃｃまたはエクスビボＨＣＶｃｃの侵入は、関連するＨＣＶ  ＲＮＡを測定するためのハイブリダイゼーション−またはポリメラーゼ連鎖反応−ベースの方法のいずれかにより決定することもできる。複製可能なＨＣＶ  ＲＮＡの細胞への侵入は、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製を可能にし、結果的にＨＣＶ  ＲＮＡ複製のために実質的なシグナル増幅となる。定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の使用によりＨＣＶ  ＲＮＡを定量する場合、ＨＣＶ由来のＰＣＲ産物は、いずれかの標識化したポリヌクレオチドプローブの使用により、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲグリーンなどのインターカレーティング色素の使用により、蛍光色素がＰＣＲ反応で用いられたポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性（すなわち、TaqMan（商標）反応；Applied Biosystems, Foster City, CA）により放出された場合にのみ蛍光色素からの発光が検出されるような、蛍光色素および消光剤を含有するハイブリダイゼーションプローブの使用、または蛍光色素および消光剤が相補鎖のポリメラーゼ媒介型の合成により置き換えられる方法（すなわち、Scorpion（商標）またはMolecular Beacon（商標）プローブ）の使用により、検出することができる。ｍＲＮＡレベルを定量するためのｑＲＴ−ＰＣＲ分析を実施するさまざまな方法は、詳しく特徴づけられている（Bustin, S.A.; Journal of Molecular Endocrinology 29, 23, 2002）。ミスマッチした核酸複合体を認識する酵素作用により活性化される蛍光プローブ（すなわち、Invader（商標）、Third Wave Technologies, Madison, WI）もまた、ＲＮＡを定量するために用いることができる。当業者であれば、ＲＮＡ定量技術、例えば、増幅に基づく定量的核酸配列（Quantitative Nucleic Acid Sequence Based Amplification；Q-NASBA（商標））を用いて、ＴＩＣ８０７タンパク質をコードするｍＲＮＡを定量し、発現植物を特定することができる。ＨＣＶ  ＲＮＡを定量するための商業的に入手可能なキットには、COB AS（商標）TaqMan HCV Test（TaqMan HCV；Roche Molecular Systems Inc., Branchburg, N.J.）が挙げられる。レポーター遺伝子を含むＨＣＶｃｃもまた利用可能であり、かくして、ＨＣＶｐｐについて記載した方法と同様に、チャレンジ後の感染の定量が可能である。
【００４８】
ＨＣＶ領域とオクルディンとの相互作用を阻害する物質を同定するために、多種多様なライブラリーにあたることができる。抗体の抗原認識領域を提示するファージベクターを含むバクテリオファージライブラリーは、１つの潜在的なオクルディン認識試薬の供給源であり、米国特許第６，２６５，１５０号に記載されている。抗原を組み合わせた多彩なタンパク質ライブラリーを作製する方法は、米国特許第５７８０２２５号および米国特許第６，３０３，３１３号に記載されている。抗原認識領域を得るためにライブラリーを使用する方法もまた、米国特許第５，３９５，７５０号に記載されている。所定の標的材料に結合するタンパク性の結合ドメインを有する結合タンパク質をコードする核酸を得る方法は、米国特許第５，２２３，４０９号に記載されている。酵母の抗体提示ライブラリーもまた、抗原認識領域を得るために用いることができ、米国特許第６，３００，０６５号に記載されている。当業者であれば、そのような抗原認識配列は、続いて組換えファージ、細菌もしくは酵母ベクターから単離し、対象での使用に適した合成抗体を作り出すことができることは認識するであろう。これらの認識ドメインをヒト化抗体に再改変することが、具体的に考えられる。
【００４９】
Ｃ型肝炎ウイルスの領域とオクルディンタンパク質の領域との相互作用を妨げるか又は弱める化合物または物質を同定するためのキット
本明細書中で考えられる特定の実施形態において、本方法およびキットはＨＣＶの領域とオクルディンタンパク質との相互作用を検出する。
【００５０】
キットは、ｉ）オクルディンタンパク質またはその保存的アミノ酸置換を含有する組換えタンパク質、またはｉｉ）細胞外ループを発現するオクルディンタンパク質の発現を提供する組換えベクター、またはｉｉｉ）前記組換えベクターを含む細胞、およびキットを使用するための取扱説明書のいずれかを含み得る。また、キットは、ＨＣＶ、ＨＣＶｃｃ、ＨＣＶｐｐ、ＨＣＶエンベロープタンパク質を含む試料とオクルディンタンパク質を含む後述の組換えタンパク質、ベクターまたは細胞との相互作用を検出するための特定の（複数の）試薬も含んでいてよいる。提供される（複数の）試薬は、放射−、分光光度−、蛍光−または酵素−標識化されていてよい。提供される試薬はまた、他の物質により検出可能に標識化されていてよい。提供される試薬は、分光光学的に、発光学的に、または蛍光により検出することができる生成物に変換される基質を含んでいてよい。キットは、本発明の抗体と結合または相互作用することができる公知の放射標識またはハプテン標識化試薬を含んでいてよい。
【００５１】
キットの（複数の）試薬は、溶液として提供されてよいし、固体支持体中にもしくは上に付着、別には堆積されていてよく、あるいは所望の粉剤として提供されてよい。（複数の）試薬が溶液で提供される場合、好ましくは、前記溶液は水溶液である。（複数の）試薬が固体支持体に対して付着されているか、別には固体支持体上に堆積されている場合、好ましくは、前記固体支持体はクロマトグラフィー媒体、複数のウェルを有する試験プレート、または顕微鏡のスライドでありうる。（複数の）試薬が乾燥粉末である場合、前記粉末は、備え付けられていてもよい適切な溶媒の付加により、再構成できる。
【００５２】
容器は、一般に、組換えタンパク質、組換えベクター、細胞または検出試薬を入れることができるバイアルであってよく、好ましくは分割単位であることが好ましい。本発明のキットはまた、商業的販売のために厳重に密封された容器内に組換えタンパク質、組換えベクターおよび／または細胞を含ませる手段を典型的に含みうる。そのような容器は、所望のバイアルを保持することができる注射またはブロー成形プラスチック容器を含みうる。しかしながら、そのようなキットとしては、商業的販売のためではなく、研究グループ内での内部使用のために集めることも考えられる。かくして、当該キットの有用性は、商業的販売に限定されない。キットの取扱説明書は、キット内に含ませてもよいし、あるいは外部向けもしくは内部向けのウェブサイトまたは内部もしくは外部文書もしくは参照を参酌する様式で提供されてもよく、いずれであってもよい。
【００５３】
本発明の原理および実用的な応用を分かりやすく説明し、他の当業者がさまざまな実施形態で、また考えられる特定の使用に適するようにさまざまな修飾を加えて本発明をよりよく利用できるように、実施形態を選び出し記載した。
【００５４】
実施例
実施例１  補助的な材料および方法
細胞
２９３Ｔ、７８６−Ｏ、ＡＭＬ１２、Ｈ２．３５、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｅｐａ１．６、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ−７．５、Ｌ９２９、ＮＩＨ３Ｔ３、ＳＴＯ６およびＴＺＭ細胞は、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ中で維持した。ＣＨＯ細胞は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２中で維持した。ＨｅｐＧ２は、コラーゲンコートしたプラスチック上で生育させた。
【００５５】
抗体および試薬
ＯＣＬＮに対するマウス・モノクローナル抗体（クローンＯＣ−３Ｆ１０）はZymed Laboratories（San Francisco, CA）から購入した。マウス・抗ＣＤ８１  １．３．３．２２は、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)から入手した。精製されたマウス・ＩｇＧ１は、BD Pharmingen（Franklin Lakes, NJ）からのものであった。マウス・抗ＮＳ５Ａ抗体  ９Ｅ１０（１５）およびヒト・抗ＳＲ−ＢＩ抗体Ｃ１６７（５）は、以前に記載されている。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲート抗マウスＩｇＧ二次抗体は、Invitrogen（Carlsbad, CA）から入手し、Ｒ−フィコ・エリトリン（ＰＥ）ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体は、Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.（West Grove, PA）から入手した。抗ヒトＩｇＧ４抗体およびストレプトアビジンＡＰＣは、BD Biosciences Pharmingen（San Diego, CA）から入手した。
【００５６】
ＤＮＡコンストラクト
下記するように、ヒトＣＤ８１、ＳＲ−ＢＩおよびＣＬＤＮ１を発現するＮＩＨ３Ｔ３クローンは、ＶＳＶＧパッケージ・プロウイルスによるプログレッシブ形質導入に続き、細胞選別により得た。これらのプロウイルスゲノムは、ＨＩＶタンパク質を発現しないが、代わりに内部のＣＭＶプロモーターを用いてクローン化した遺伝子を発現させる、ｐＴＲＩＰ（２３、２７）自己不活性化レトロウイルスのプロウイルスに基づいた。以前に記載されたＴＲＩＰレトロウイルスプラスミドには、ＴＲＩＰ−ＣＤ８１（２８）およびＴＲＩＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＬＤＮ１（１１）が挙げられる。ＴＲＩＰ−ｈＳＲ−ＢＩは、プライマー  ５’GAC GAG CTG TAC AGA TCT AGA ATG GGC TGC TCC GCC AAA GCG CGC TGG （配列番号：１）および５’G GCG GTC GAC CTA CAG TTT TGC TTC CTG CAG CAC AGA （配列番号：２）を用いて、ヒトＳＲ−ＢＩ  ｏｒｆを増幅することによってクローン化した。この産物を、ＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ断片とし、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消化したＴＲＩＰ−ＧＦＰにクローン化し、かくしてＧＦＰコード配列を置き換えた。ＴＲＩＰ−ｍＳＲ−ＢＩは、プライマー  ５’GAC GAG CTG TAC AGA TCT AGA ATG GGC GGC AGC TCC AGG GCG CGC TGG （配列番号：３）および５’GGCG CTC GAG CTA TAG CTT GGC TTC TTG CAG CAC CGT （配列番号：４）を用いて、マウスＳＲ−ＢＩ  ｏｒｆを増幅することにより構築した。次いで、この断片をＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ断片とし、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消化したＴＲＩＰ−ＧＦＰにクローン化し、かくしてＧＦＰコード配列を置き換えた。
【００５７】
ＣＳＧＷおよびＣＳＰＷプラスミドは以前に記載されている（９）。ＬＭＮ８−ｈＯＣＬＮは、レスキュードＲＴ−ＰＣＲ（rescued RT-PCR）産物を、ＰｍｌＩおよびＳｆｉＩによりＬＭＮ８ＳｆｉＩｌｉｎｋ中にクローン化することにより作り出した（以下を参照のこと）。ヒトよびマウスＯＣＬＮの増幅に関し、Integrated Molecular Analysis of Genome Expression（I.M.A.G.E.）Consortium（image.llnl.gov）により構築された発現配列タグ（ＥＳＴ）クローン（それぞれMGC IRAT ヒト5179203およびLLAM3658586）は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手した。ＴＲＩＰ−ｈＯＣＬＮは、プライマー  ５’GAC GAG CTG TAC AGA TCT AGA ATG TCA TCC AGG CCT CTT GAA （配列番号：５）および５’GGGG CTCGAG CTA TGT TTT CTG TCT ATC ATA GTC （配列番号：６）を用いて相補ＯＣＬＮ  ｏｒｆを増幅し、このＰＣＲ産物を部分的なＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ断片とし、ｐＴＲＩＰのＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位にクローン化して構築した。同じＰＣＲ産物を、部分的なＢｓｒＧＩ／ＸｈｏＩ断片とし、ＴＲＩＰ−ＧＦＰにクローン化し、ＴＲＩＰ−ＧＦＰ−ｈＯＣＬＮと称するＧＦＰ−ｈＯＣＬＮ融合体を作製した。このプラスミドの派生物のほとんどは、クローニングを容易にするために、ｈＯＣＬＮ  ｏｒｆ中のＢｇｌＩＩ部位が、オーバーラップＰＣＲによるサイレント変異（AGA TCT GAAからAGg TCc GAAに）を挿入することによって壊された。ＧＦＰの代替物として、ＴＲＩＰ−Ｖｅｎｕｓ蛍光タンパク質レンチウイルス発現プラスミドを、プライマー  ５’GGGG GGA TCC GGA ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC （配列番号：７）および５’GGG CTCGAG TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT （配列番号：８）を用いて、Ｖｅｎｕｓ（１８）ｏｒｆ（Atsushi Miyawaki提供, RIKEN, Saitama, Japan）を増幅することによって作製した。結果として得られた産物を、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消化断片とし、同じ酵素で消化したｐＴＲＩＰ−ＧＦＰ中にクローン化した。ＴＲＩＰ−Ｖｅｎｕｓ−ｈＯＣＬＮは、上記のｈＯＣＬＮ  ＰＣＲ産物を部分的なＢｓｒＧＩ／ＸｈｏＩ消化断片とし、ＴＲＩＰ−Ｖｅｎｕｓ中にクローン化した。ＴＲＩＰ−ｍＯＣＬＮは、プライマー  ５’GAC GAG CTG TAC AGA TCT AGA ATG TCC GTG AGG CCT TTT GAA AGT CCA （配列番号：９）および５’GGGG CTCGAG CTA AGG TTT CCG TCT GTC ATA ATC （配列番号：１０）を用いて、マウスＯＣＬＮ  ｏｒｆを増幅することによって構築した（内部のＢｇｌＩＩ部位は、ATA AGA TCT GGA （配列番号：１１）からATA AGg TCc GGA （配列番号：１２）へのサイレント変異導入により壊した）。この産物を、ＢｇｌＩＩ／Ｘｈｏ断片とし、ＴＲＩＰ−ＧＦＰのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にクローン化し、部分的なＢｓｒＧＩ／ＸｈｏＩ断片とし、同じく消化したＴＲＩＰ−ＧＦＰにクローン化して、ＴＲＩＰ−ＧＦＰ−ｍＯＣＬＮおよびＴＲＩＰ−Ｖｅｎｕｓを作製し、ＴＲＩＰ−Ｖｅｎｕｓ−ｍＯＣＬＮを作製した。マウス／ヒト・キメラは、ＣＬＤＮ１／ＣＬＤＮ７キメラの構築に関して以前に記載されたように（１１）、オーバーラップＰＣＲ増幅によりＴＲＩＰ−Ｖｅｎｕｓの関係で作製した。ＴＲＩＰ−Ｖｅｎｕｓを作製するために用いたものと同じ方法およびプライマーを用いて、ＴＲＩＰ−Ｃｅｒｕｌｅａｎと称する、紺色（Cerulean）蛍光タンパク質（２１）を発現するレンチウイルスベクターを構築した。前記プラスミドからのＮｄｅＩ／ＢｓｒＧＩ断片を、ＴＲＩＰ−ＧＦＰ−ｈＣＬＤＮ１およびＴＲＩＰ−ＧＦＰ−ｍＣＬＤＮ１（１１）中のＧＦＰ  ｏｒｆの場所にクローン化し、ＴＲＩＰ−Ｃｅｒｕｌｅａｎ−ｈＣＬＤＮ１およびＴＲＩＰ−Ｃｅｒｕｌｅａｎ−ｍＣＬＤＮ１を作製した。
【００５８】
ヒトＣＤ８１のＮ末端でのｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質融合体を発現するＴＲＩＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｈＣＤ８１は、プライマー  ５’GAG CTG TAC AAG GGA TCC GTC ATG GGA GTG GAG GGC TGC ACC AAG TGC ATC （配列番号：１３）および５’GGGG CTCGAG TCA GTA CAC GGA GCT GTT CCG GAT GCC ACA （配列番号：１４）を用いて、ＴＲＩＰ−ｈＣＤ８１（１３）からＣＤ８１  ｏｒｆを増幅し、それをＢｓｒＧＩ／ＸｈｏＩ消化断片とし、ＴＲＩＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＬＤＮ１（１１）にクローン化することによって作製した。マウスＣＤ８１を発現するＴＲＩＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｍＣＤ８１は、テンプレートとしてＴＲＩＰ−ＣＤ８１を用いて同じプライマーにより増幅し、同じ様式でクローン化した。
【００５９】
レトロウイルスＨｕｈ−７．５細胞ｃＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡ挿入物が、ＨＩＶベースのｐＶ１ベクターに代えてＬＭＮ８ＳｆｉＩｌｉｎｋと称するＭＬＶベースのプロウイルスベクター（Paul D. Bieniaszにより寄贈, The Aaron Diamond AIDS Research Center, The Rockefeller University）にクローン化したことを除いて、本質的に以前に記載されたように（１１）構築した。ＬＭＮ８ＳｆｉＩｌｉｎｋは、ｐＢＭＮ−Ｚ  ＭＬＶプロウイルスに基づき、それはレトロウイルスＬＴＲおよびパッキングシグナルを含有するＭＬＶゲノムであるが、ウイルスタンパク質を発現せず、代わりにＬａｃＺ遺伝子をコードする。ＬＭＮ８を作り出すために、ＬａｃＺ遺伝子を、SMART cDNA Library Construction Kit（Clontech, Mountain View, CA）にしたがって、ｃＤＮＡクローニングに適した２つのＳｆｉＩ部位に置き換えた。最終的なＬＭＮ８Ｈｕｈ７．５ｃＤＮＡライブラリーは、４×１０７クローンを含み、その６５％が平均１,３００ｂｐの大きさの挿入物を有した。ＥＧＦＰ遺伝子がＬＮ８ＳｆｉＩｌｉｎｋのＳｆｉＩ部位に挿入されたＬＭＮ８ＧＦＰは、このプラスミドの変種である。
【００６０】
偽粒子作出および感染アッセイ
偽粒子はすべて、（１）所望のレポーター遺伝子またはトランス遺伝子を含有するプロウイルス、（２）ＭＬＶまたはＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌのいずれか、および（３）適当なエンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドの同時トランスフェクションにより作出した。別に注記しない限り、本研究で用いたＨＣＶｐｐはＨ７７  Ｅ１Ｅ２配列（１７０−７４６残基）を用いて作製した（１２）。ＨＣＶｐｐ作出に用いた他のＥ１Ｅ２配列（Con1、ＯＨ８、Ｓ５２、ＥＤ４３、ＳＡ１３)は、以前に記載されている（１７）。トランスフェクションの前日に、８×１０５の２９３Ｔ細胞を３５ｍｍ２ディッシュに播種した。全１．５μｇのＤＮＡを、６μｌのＦｕＧＥＮＥ６（Roche Applied Science, Indianapolis, IN）を用いてトランスフェクトし、培地を６時間後に交換した。上清を、トランスフェクション後２４時間、４８時間および７２時間で回収し、プールし、そして濾過（０．４５μｍ孔径）した。以下のプラスミドの組合せおよび比率（重量あたり）を用いた：ＧＦＰまたはピューロマイシンレポーターＨＣＶｐｐおよび対照を作出するために、（１）それぞれのレポーター遺伝子（ＣＳＧＷまたはＣＳＰＷ）をコードするプロウイルス、（２）ＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌおよび（３）ＨＣＶ株Ｈ７７  Ｅ１Ｅ２、ＶＳＶ−Ｇをコードするプラスミドまたは空ベクターを、１：１：４の比率でトランスフェクトした。トランス遺伝子送達のための偽粒子を作出するために、（１）所望のトランス遺伝子をコードするｐＴＲＩＰプロウイルス、（２）ＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌおよび（３）ＶＳＶ−Ｇをコードするプラスミドを７：７：１の比率で同時トランスフェクトした。ｃＤＮＡライブラリーをパッキンするために、（１）所望のトランス遺伝子を含有するいずれかのＬＭＮ８プロウイルス、（２）ＭＬＶ  ｇａｇ−ｐｏｌおよび（３）ＶＳＶＧをコードするプラスミドを、７:７:１の比率で同時トランスフェクトした。（サイクリックリパッケージングに関連した偽粒子作出についての詳細は以下を参照のこと）。偽粒子を用いた形質導入および感染アッセイはすべて、４μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で実施した。
【００６１】
ＧＦＰレポーターＨＣＶｐｐを用いた感染アッセイについて、２×１０４の細胞を４８ウェルプレートに撒いた。翌日、細胞を、偽粒子を用いて６時間感染させた。この培地を交換し、細胞をさらに７２時間培養した後、回収し、０．５％ｗ／ｖのパラフォルムアルデヒドを用いて固定した。ＧＦＰ発現は、ＬＳＲ２フローサイトメトリー（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）を用いて定量した。非エンベロープ偽微粒子（Ｅｖｎ−ｐｐ）由来のＧＦＰシグナルの背景光を、ＶＳＶＧｐｐおよびＨＣＶｐｐシグナルから減算し、次いでＨＣＶｐｐシグナルをＶＳＶＧｐｐ感染に対して規格化し［（ＨＣＶｐｐ−ＮＥ）／（ＶＳＶＧ−ＮＥ）］、次いでＨｕｈ−７．５細胞におけるＨＣＶｐｐ感染に対して規格化して、実験の相互比較を可能にした。特に注記しない限り、感染実験の結果は、４回以上の独立した感染の平均値であり、キメラおよび変異ＯＣＬＮ分析の場合には、少なくとも２回の独立した形質導入集団の平均値である。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。
【００６２】
ｈＣＤ８１、ｈＳＲＢＩおよび／またはｈＣＬＤＮ１を安定して発現するＮＩＨ３Ｔ３クローンの作製
ＮＩＨ３Ｔ３マウス胚性線維芽細胞を、ＴＲＩＰレンチウイルスをコードするＶＳＶＧｐｐでトランスフェクトし、ヒトＣＤ８１、ＳＲ−ＢＩまたはＮ末端ｍＣｈｅｒｒｙタグ付ＣＬＤＮ１を発現させた。発現は、ヒトＣＤ８１に対する抗体を用い、ヒトＳＲ−ＢＩに対するＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート・ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と組合せ、ビオチン化抗ヒトＩｇＧ４とストレプトアビジンＡＰＣとの組合せで、または直接的なｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の検出により、可視化した。クローン集団は、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａセルソーター（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）を用いて単一細胞選別により作り出し、Ｈｕｈ−７．５細胞と同様の発現レベルを有するクローンを、形質導入の次のラウンドで選択した。この手順を繰り返し、ヒトホモログのＣＤ８１、ＳＲ−ＢＩおよびＣＬＤＮ１を単一、二重および三重の組合せで安定して発現する細胞クローンを得た。３つすべてのヒト・タンパク質を発現する最終的な三重形質導入クローンを、ＮＩＨ３Ｔ３  Ｎ３ｘＦ２６と称した。
【００６３】
マルチカラー・フローサイトメトリー
レンチウイルス運搬（delivered）トランス遺伝子の発現とＨＣＶｐｐ許容性とを直接的に相互に関係づけるために、我々は、マルチカラー・フローサイトメトリーを用いた。ＨＣＶｐｐ感染（ＧＦＰ）、ＣＤ８１（ｍＣｈｅｒｒｙ）、ＳＲ−ＢＩ（ＡＰＣ染色）、ＣＬＤＮ１（Ｃｅｒｕｌｅａｎ）およびＯＣＬＮ（Ｖｅｎｕｓ）からの蛍光を、ＬＳＲ２フローサイトメーター（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）で区別した。
【００６４】
ｃＤＮＡライブラリースクリーニングおよびサイクリック・パッキングレスキュー
反復ライブラリースクリーニングアプローチの図式的概観を図４ａで提供する。レトロウイルスＬＭＮ８ベクター中にクローン化されたｃＤＮＡは、上記のようにＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質を有するＭＬＶベースの偽粒子内にパックされた。ＬＭＮ８ベクターはレポーター遺伝子をコードしないため、ヒトｃＤＮＡライブラリーを保有する偽粒子の力価は並行して作出されたＬＭＮ８−ＥＧＦＰ偽粒子からの力価を推定することにより見積もった。次いで、見積もったその力価を用い、目的の細胞系に対するＧＦＰの測定可能な感染率に基づいて、目的の細胞系に対するライブラリーウイルスの有効な力価に近づけた。次いで、ＬＭＮ８−ライブラリーを保有するＶＳＶＧｐｐを用いて、ヒトＣＤ８１、ＳＲ−ＢＩおよびｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＬＤＮ１を発現するＮＩＨ３Ｔ３（Ｎ３ｘＦ２６）細胞を、約１の感染の多重度（multiplicity）で形質導入した。約１×１０７の細胞をスクリーニングの最初のラウンドで形質導入し；より少数を次のラウンドに用いた。前記ライブラリーを発現する細胞を、ピューロマイシン（ＣＳＰＷ）選択マーカーを保有するＨＣＶｐｐでチャレンジし、抗生物質選択を４８時間後に行った。生存細胞クローンをプールし、ＭＬＶ  ｇａｇ−ｐｏｌおよびＶＳＶ−Ｇを用いてトランスフェクトし、これらの細胞に存在するＬＭＮ８／ｃＤＮＡゲノムを偽粒子中にリパッケージさせ、さらなる選択ラウンドのためにそれらを未処理のＮ３ｘＦ２６細胞集団に移した。我々は、選択工程、すなわちライブラリー運搬（deliver）、ピューロマイシン耐性をコードするＨＣＶｐｐによる感染、続いてピューロマイシンによる選択を全体で３回実施した。各選択工程後に、集団の画分をＧＦＰレポーターＥｎｖ−ｐｐ、ＨＣＶｐｐおよびＶＳＶＧｐｐによりチャレンジし、ＨＣＶｐｐ感受性の分集団の存在を観察した（図４ｂ）。最終の３回選択した集団の単一細胞クローンを得て、これらのクローンのゲノムＤＮＡを、製造業者のプロトコルにしたがってＤＮｅａｓｙ  ｔｉｓｓｕｅキット（QIAGEN, Valencia, CA）により調製した。ｃＤＮＡ  ＬＭＮ８挿入物は、ｃＤＮＡクローニング部位に隣接するＬＭＮ８配列に特異的なプライマー、５’ACCGCCCTCAAAGTAGAC （配列番号：１５）および５’GCTTGCCAAACCTACAGG（配列番号：１６）を用いて増幅した。これらのＰＣＲ産物はＴＡクローニングし、配列決定した。
【００６５】
ＨＣＶｃｃ作出および感染
この研究の実験に用いたＪｃ１ＦＬＡＧ（ｐ７−ｎｓＧｌｕｃ２Ａ）は、以前に記載されている（１６）。ＨＣＶｃｃは、以前に報告されたように作出した（１５）。ＨＣＶｃｃはトランスフェクション後４８〜７２時間後に上清から回収した。感染単位（組織培養感染量の中央値［ＴＣＩＤ５０］）は、未処理のＨｕｈ−７．５細胞に対する限界希釈滴定により定量した。感染実験のために、Ｈｕｈ−７．５細胞を４８ウェルプレートに播種した。翌日、ＨＣＶｃｃ含有の上清を供し、７２時間後に、一次抗体として９Ｅ１０抗ＮＳ５Ａを用い、ＰＥコンジュゲート・ヤギ抗マウス二次抗体により染色して感染を検出し、シグナルはフローサイトメトリーによる分析で定量した。
【００６６】
ＨＣＶ侵入因子のＲＴ−ＰＣＲ定量
さまざまな細胞系におけるＨＣＶ侵入因子の発現を定量するために、全ＲＮＡをＱＩＡＧＥＮ  ＲＮＡアイソレーションキット（Valencia, CA）を用いて単離した。RETROSCRIPT FIRST STRAND SYNTHESIS Kit （Ambion, Austin, TX）を用い、製造業者の取扱説明書にしたがって、ｃＤＮＡを合成した。定量ＰＣＲは、Light Cycler LC480機器（Roche Applied Science, Indianapolis, IN）により、ＳＹＢＲグリーンQuantitect Primer Assay （QIAGEN）を用いて、以下の遺伝子特異プライマーと組み合わせて実施した。
【００６７】
【表１】
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【００６８】
ＣＨＯ細胞およびハムスター肝臓におけるＨＣＶ侵入受容体発現の分析
ＣＨＯ細胞およびハムスター肝臓におけるＨＣＶ侵入受容体発現の分析について、以下のＰＣＲプライマーを用いてハムスター特異遺伝子を増幅した。
【００６９】
【表２】
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【００７０】
マウス細胞およびマウス肝臓におけるＨＣＶ侵入受容体発現の分析
マウス細胞およびマウス肝臓におけるＨＣＶ侵入受容体発現の分析について、以下のＰＣＲプリマーを用いて、マウス特異遺伝子を増幅した。
【００７１】
【表３】
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【００７２】
ＲＮＡ干渉
ヒトＣＤ８１、ヒトＯＣＬＮに対するｓｉＲＮＡ、および非標的化ｓｉＲＮＡのプール（ON-TARGETplus SMARTpools）は、Dharmacon（Lafayette, CO）から購入した。Ｈｕｈ−７．５およびＨｅｐ３Ｂ細胞は、製造業者の取扱説明書にしたがい、リバーストランスフェクトした。簡単には、トランスフェクションのために、１ウェルあたり０．５μｌのＲＮＡｉＭＡＸ（Invitrogen, Carlsbad, CA）および５０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを用いた。１ウェルあたり１×１０４細胞を、４８ウェルプレートにてトランスフェクションミックスと共に播種した。トランスフェクションし播種した後４８時間に、タンパク質発現をフローサイトメトリーで測定し、感染アッセイを行った。
【００７３】
オクルディン・ジーンバンク・受入番号
ヒト−ＮＭ＿００２５３８  １４−ＳＥＰ−２００８（配列番号：４７のＤＮＡ配列；配列番号：４８のタンパク質配列）。
【００７４】
統計分析
統計分析はすべて、Ｐｒｉｓｍ４ソフトウェア（GraphPad Software, San Diego, CA）を用いて実施した。
【００７５】
引用文献
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【００７６】
2012504647.tif 000006
【００７７】
2012504647.tif 000007
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年6月1日(2011.6.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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