(57)【要約】  本発明は、ＲＮＡ−オリゴヌクレオチド二本鎖分離活性を有し、プライマーの不存在下でde novoＲＮＡ合成が可能であるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを利用する鎖置換法を使用する、標的ＲＮＡ配列の検出方法及びＲＮＡ増幅方法に関する。本発明は更に、そのような方法を実施するためのキットに関する。
2012508571.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の標的ＲＮＡ配列の検出方法であって、
（ａ）サンプル中に存在する一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）分子を、標的ＲＮＡの領域に実質的に相補的な配列を含む標識化オリゴヌクレオチドと、ＲＮＡ−オリゴヌクレオチド二本鎖の混合物を提供するハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、前記ＲＮＡ−オリゴヌクレオチド二本鎖は、標識化オリゴヌクレオチドにアニールした標的ＲＮＡを含む、工程；
（ｂ）工程（ａ）の混合物を、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）と、プライマーの不存在下でのＲＮＡ重合条件下で維持する工程であって、前記ＲｄＲｐはＲＮＡ−オリゴヌクレオチド二本鎖分離活性を有し、ＲｄＲｐがサンプル中のｓｓＲＮＡに相補的なＲＮＡ鎖を重合し、標識化オリゴヌクレオチドを放出するように、de novoＲＮＡ合成が可能である、工程；及び
（ｃ）放出された標識化オリゴヌクレオチドによって生成するシグナルを検出及び／または測定する工程
を含む、サンプル中の標的ＲＮＡ配列の検出方法。
【請求項２】
ＲＮＡ増幅方法であって、
（ｉ）一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）鋳型を、前記ｓｓＲＮＡの領域に実質的に相補的な配列を含む標識化オリゴヌクレオチドと、標識化オリゴヌクレオチドにアニールしたｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ−オリゴヌクレオチド二本鎖を提供するハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）のＲＮＡ−オリゴヌクレオチド二本鎖を、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）と、プライマーの不存在下でのＲＮＡ重合条件下で維持する工程であって、前記ＲｄＲｐはＲＮＡ−オリゴヌクレオチド二本鎖分離活性を有し、ＲｄＲｐがｓｓＲＮＡに相補的なＲＮＡ鎖を重合し、標識化オリゴヌクレオチドを放出するように、de novoＲＮＡ合成が可能である、工程；及び
（ｉｉｉ）ｓｓＲＮＡと重合した相補鎖との間で、ＲｄＲｐによって形成されたＲＮＡ二本鎖を分離する工程；
（ｉｖ）任意に、工程（ｉ）から（ｉｉｉ）を繰り返す工程；及び
（ｖ）放出された標識化オリゴヌクレオチドによって生成するシグナルを検出及び／または測定する工程
を含む、ＲＮＡ増幅方法。
【請求項３】
ＲｄＲｐがCaliciviridae科のウイルスのＲｄＲｐである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
サンプル中のｓｓＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ鋳型のそれぞれがその３’末端で少なくとも一つのＣを有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
サンプル中のｓｓＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ鋳型のそれぞれがその３’末端で（Ｃ）ｎリピート［式中、ｎ≧３］を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
標識化オリゴヌクレオチドが蛍光標識を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドがその５’末端で蛍光標識を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
標的ＲＮＡにハイブリダイズした際にオリゴヌクレオチドの蛍光標識の蛍光を消光する分子をｓｓＲＮＡに提供する、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
標識化オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡの５’末端にハイブリダイズする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）または（ｉ）のそれぞれで、第二のオリゴヌクレオチドがｓｓＲＮＡにハイブリダイズし、第二のオリゴヌクレオチドは標識化オリゴヌクレオチドに相補的な領域と重ならないｓｓＲＮＡの領域に実質的に相補的であり、標識化オリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドの両者がｓｓＲＮＡにハイブリダイズした際に、第二のオリゴヌクレオチドは標識化オリゴヌクレオチドの蛍光標識の蛍光を消光することが可能な化学分子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
標識化オリゴヌクレオチド、及び任意に第二のオリゴヌクレオチドが、５から２０、好ましくは１０から１２のヌクレオチドの長さを有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ｓｓＲＮＡが、１６から４０、好ましくは１８から２５のヌクレオチドの長さを有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ｓｓＲＮＡがマイクロＲＮＡまたは破壊されたマイクロＲＮＡである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
サンプル中の標的ＲＮＡ配列の検出用キットであって、
−標的ＲＮＡ配列の領域に実質的に相補的な配列を含む少なくとも一つの標識化オリゴヌクレオチド；
−重合条件下でＲＮＡ二本鎖分離活性を有し、プライマーの不存在下でde novoＲＮＡ合成が可能であるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）
を含む、サンプル中の標的ＲＮＡ配列の検出用キット。
【請求項１５】
ＲｄＲｐがCaliciviridae科のウイルスのＲｄＲｐである、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドが蛍光標識を含む、請求項１４または１５に記載のキット。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドがその５’末端で蛍光標識を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
標識化オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡの５’末端にハイブリダイズする、請求項１４から１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１９】
標識化オリゴヌクレオチドに相補的な領域と重ならない標的ＲＮＡ配列の第二の領域に実質的に相補的な配列を含む第二のオリゴヌクレオチドを更に含み、標識化オリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドの両者が標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズした際に、第二のオリゴヌクレオチドは標識化オリゴヌクレオチドの蛍光標識の蛍光を消光することが可能な化学分子を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項２０】
標的ＲＮＡにハイブリダイズした際に、オリゴヌクレオチドの標識の蛍光を消光することが可能な消光部分を更に含む、請求項１４から１９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２１】
標識化オリゴヌクレオチド、及び任意に第二のオリゴヌクレオチドが、５から２０、好ましくは１０から１２ヌクレオチドの長さを有する、請求項１４から２０のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ−オリゴヌクレオチド二本鎖分離活性を有し、プライマーの不存在下でde novoＲＮＡ合成が可能であるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを利用する鎖置換法を使用する、標的ＲＮＡ配列の検出方法及びＲＮＡ増幅方法に関する。本発明は更に、そのような方法を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
鎖置換及びＰＣＲ増幅反応におけるその利用を使用する核酸配列の検出の概念は、１９９０年代早期のGelfand等によって紹介されている（ＷＯ−Ａ−１９９２／００２６３８を参照）。対応する方法及びキットは、Roche Diagnostics社から市販されており、TaqMan法として既知である。TaqManの原理は、核酸（特にＤＮＡ）ポリメラーゼの５’から３’のヌクレアーゼ活性を利用している。
【０００３】
TaqMan法は、主としてＤＮＡ構築物に関するものであり、かくしてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用している一方で、さらなる研究により、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、事前に形成されたＲＮＡ二本鎖に対して下流の領域からプロセッシングした際に、鋳型鎖から事前にハイブリッド形成したヌクレオチド配列を置換する能力を有することが示されている。例えば、Cho等 (1993), Journal of Virology 67(6), pages 3010-3018は、ポリオウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）がそのようなＲＮＡ二本鎖分離活性を示し、鋳型鎖から１０００ｎｔのアンチセンス配列を置換することができることを示す。しかしならが、ポリオウイルスＲｄＲｐは、プライマー依存性酵素であり、即ち相補的ＲＮＡ鎖の重合が生ずるためには、オリゴヌクレオチドプライマーを必要とする。
【０００４】
かくして、特に鎖置換を使用するＲＮＡ検出及びＲＮＡ増幅について存在する方法はいくつかの制限を有している：TaqManアプローチは、プルーフリーディング活性、即ち５’から３’のヌクレアーゼ活性を有する酵素を必要とする。更に、少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを必要とする：（１）標的配列に対する事前ハイブリッド形成のための標識化オリゴヌクレオチド、及び（２）ポリメラーゼ活性を開始するための少なくとも一つのプライマーである。
【０００５】
後者の欠点は更に、ポリオウイルスＲｄＲｐが同様にプライマー依存性酵素であるため、Cho等、上記参照に従った研究についても妥当する。ポリオウイルスＲｄＲｐは更に、バックプライミングによるＲＮＡ合成の開始が可能であり、これはＲｄＲｐによる３’末端の伸張の後に生じ、ＲＮＡ合成の開始に対するプライミングを導く鋳型上の伸張テールのスナップバックを生ずる。ポリオウイルスＲｄＲｐは、de novoで、即ちプライミングなしで開始することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ−Ａ−１９９２／００２６３８
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Cho等 (1993), Journal of Virology 67(6), pages 3010-3018
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
それゆえ、本発明が解決しようすると技術的課題は、反応物、特にオリゴヌクレオチドの要求をできるだけ低くし、特に小ＲＮＡ分子の検出及び増幅に有用であるＲＮＡ検出及びＲＮＡ増幅のための新規な方法を提供することである。
【０００９】
上記の技術的課題に対する解決策は、特許請求の範囲に記載された本発明の実施態様によって提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
特に本発明は、サンプル中の標的ＲＮＡ配列の検出方法であって、
（ａ）サンプル中に存在する一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）分子を、標的ＲＮＡの領域に実質的に相補的な配列を含む標識化オリゴヌクレオチドと、ＲＮＡ−オリゴヌクレオチド二本鎖の混合物を提供するハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、前記ＲＮＡ−オリゴヌクレオチド二本鎖は、標識化オリゴヌクレオチドにアニールした標的ＲＮＡを含む、工程；
（ｂ）工程（ａ）の混合物を、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）と、プライマーの不存在下でのＲＮＡ重合条件下で維持する工程であって、前記ＲｄＲｐはＲＮＡ−オリゴヌクレオチド二本鎖分離活性（または一般的に核酸二本鎖分離活性）を有し、ＲｄＲｐがサンプル中のｓｓＲＮＡに相補的なＲＮＡ鎖を重合し、標識化オリゴヌクレオチドを放出するように、de novoＲＮＡ合成が可能である、工程；及び
（ｃ）放出された標識化オリゴヌクレオチドによって生成するシグナルを検出及び／または測定する工程
を含む、サンプル中の標的ＲＮＡ配列の検出方法に関する。
【００１１】
本発明のさらなる主題は、ＲＮＡ増幅方法であって、
（ｉ）一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）鋳型を、前記ｓｓＲＮＡの領域に実質的に相補的な配列を含む標識化オリゴヌクレオチドと、標識化オリゴヌクレオチドにアニールしたｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ−オリゴヌクレオチド二本鎖を提供するハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）のＲＮＡ−オリゴヌクレオチド二本鎖を、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）と、プライマーの不存在下でのＲＮＡ重合条件下で維持する工程であって、前記ＲｄＲｐはＲＮＡ−オリゴヌクレオチド二本鎖分離活性（または一般的に核酸二本鎖分離活性）を有し、ＲｄＲｐがｓｓＲＮＡに相補的なＲＮＡ鎖を重合し、標識化オリゴヌクレオチドを放出するように、de novoＲＮＡ合成が可能である、工程；及び
（ｉｉｉ）ｓｓＲＮＡと重合した相補鎖との間で、ＲｄＲｐによって形成されたＲＮＡ二本鎖を分離する工程；
（ｉｖ）任意に、工程（ｉ）から（ｉｉｉ）を繰り返す工程；及び
（ｖ）放出された標識化オリゴヌクレオチドによって生成するシグナルを検出及び／または測定する工程
を含む、ＲＮＡ増幅方法である。
【００１２】
ｓｓＲＮＡ鋳型は、当該技術分野で既知のいずれかの方法、例えば化学合成、in vitro転写、細胞、組織または他のサンプル、例えば血液、漿液、液状体等からの全ＲＮＡの調製によって提供されて良い。ｄｓＲＮＡ鋳型は、熱変性を通じてｓｓＲＮＡに分離されて良い。
【００１３】
本発明は更に、サンプル中の標的ＲＮＡ配列の検出用キットであって、
−標的ＲＮＡの領域に相補的な配列を含む少なくとも一つの標識化オリゴヌクレオチド；
−重合条件下でＲＮＡ二本鎖分離活性を有し、プライマーの不存在下でde novoＲＮＡ合成が可能であるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）
を含む、サンプル中の標的ＲＮＡ配列の検出用キットに関する。
【００１４】
ここで使用される用語「サンプル」は、ＲＮＡを含むまたはＲＮＡを含むと推定されるいずれかの物質を指し、独りまたは複数の個人から単離された組織または流体のサンプルを含み、例えば皮膚、漿液、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血液細胞、器官、腫瘍をこれらに制限することなく含み、且つin vitro細胞培養構成物（培養培地における細胞の成育から生成する調製培地、組換え細胞、及び細胞成分をこれらに制限することなく含む）のサンプルをも含む。本発明に記載の方法で使用される「標識化」オリゴヌクレオチドは、いずれかの既存のまたは天然の配列から物理的に由来するものでは必ずしもなく、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはそれらの組み合わせを含むいずれかの態様で生成されてもよい。
【００１５】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、一本鎖核酸、主としてＤＮＡまたはＲＮＡである。本発明に係る「オリゴヌクレオチド」は「オリゴプローブ」と称されても良く、いずれかの長さのポリヌクレオチドであってよい。ＲＮＡオリゴヌクレオチド、即ちオリゴリボヌクレオチドが好ましい。用語「オリゴヌクレオチド」は更に、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成起源、または合成起源のポリヌクレオチドを企図し、ここで合成起源は、その起源または操作に基づいて、（１）天然で会合しているポリヌクレオチドの全部または一部と会合していないもの、（２）天然で結合しているもの以外のポリヌクレオチドに結合しているもの、及び（３）天然で見出されないもの、である。
【００１６】
「オリゴヌクレオチド」は更に、かなり小さいポリヌクレオチドであることが好ましく、即ち好ましくは５から１００、より好ましくは５から２０、最も好ましくは１０から１２ヌクレオチドの長さを有する。
【００１７】
ここで使用される用語「標識」は、検出可能な（好ましくは定量可能な）シグナルを提供するように使用でき、核酸、特にオリゴヌクレオチドに結合できるいずれかの原子または分子を指す。標識は、蛍光、放射性活性、発色測定、重量測定、Ｘ線解析または吸収、磁性、酵素活性等によって検出可能なシグナルを提供する。本発明に係る好ましい標識は、蛍光標識である。
【００１８】
サンプル中の一本鎖ＲＮＡ及びｓｓＲＮＡ鋳型も同様に、いずれかの起源及び長さを有してよい。本発明に係る方法によって検出または増幅される一本鎖ＲＮＡ分子の典型的な例は、メッセンジャーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ等である。本発明は特に、より小さいＲＮＡ分子が検出及び／または増幅される状況に適用可能であるため、一本鎖ＲＮＡは好ましくは１８から２００、より好ましくは１６から４０、最も好ましくは１０から２５ヌクレオチドの長さを有する。上述の長さは、本発明に係るＲＮＡ増幅方法に特に適用される。
【００１９】
本発明に係る方法によって検出／増幅されて良い標的／鋳型の更に好ましい例は、マイクロＲＮＡ分子（「ｍｉＲＮＡ」または「ｍｉＲ」とも称される）である。ｍｉＲＮＡは、翻訳サイレンシングを通じて遺伝子調節に役割を果たしており、特定の遺伝子によってコードされている。特にヒトでは、ｍｉＲＮＡの破壊は、いくつかのガン形態と関連していることが記載されている。それ故、ｍｉＲＮＡのプロファイリングは、ガンの病因、診断、及び治療の重要な指標を有している（例えばEsquela-Kerscher等, (2006) Nat. Rev. Cancer 6, 259-269; Calin等, (2006) Nat. Rev. Cancer 6, 857-866を参照）。本発明の方法を使用して、例えばそのような標的／鋳型に特異的な標識化オリゴヌクレオチドを使用する特定のｍｉＲＮＡ（または破壊されたｍｉＲＮＡ）を検出することが可能であろう。
【００２０】
特に、上記例示されたように、より小さい長さのＲＮＡ分子の検出及び／または増幅に関して、一本鎖ＲＮＡ（本発明に係る検出方法の場合は、サンプル中の標的ＲＮＡとして存在し、増幅方法の場合は、鋳型ＲＮＡとして存在する）は、３’末端で少なくとも一つのＣを含み、より好ましくは（Ｃ）ｎ３’末端リピート（「ポリＣ」リピートとも称される）［式中、ｎは少なくとも２または３の整数である］を有することが望ましい。
【００２１】
標的ＲＮＡにアニールしたオリゴヌクレオチドを置換することができ、更にいずれかのプライマーの不存在下でde novoＲＮＡ合成が可能である特別なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの活性は、本発明に必須である。
【００２２】
このカテゴリーの酵素は典型的に、de novoＲＮＡ合成がｓｓＲＮＡ鎖に伴うことができるという特徴を有する。そのようなＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは典型的に、「右手配置」を示し、以下の配列モチーフの保存整列を含む一次配列を有する：
ａ．ＸＸＤＹＳ
ｂ．ＧＸＰＳＧ
ｃ．ＹＧＤＤ
ｄ．ＸＸＹＧＬ
ｅ．ＸＸＸＸＦＬＸＲＸＸ
［式中、以下の意味を有する：
Ｄ：アスパラギン酸
Ｙ：チロシン
Ｓ：セリン
Ｇ：グリシン
Ｐ：プロリン
Ｌ：ロイシン
Ｆ：フェニルアラニン
Ｒ：アルギニン
Ｘ：いずれかのアミノ酸］。
【００２３】
ここで使用される用語「右手構造」は、タンパク質の四次構造（配置）が、ほとんどの鋳型依存性ポリメラーゼで観察すると、指、手のひら、及び親指を有する右手のようにホールドしていることを意味する。
【００２４】
配列モチーフ「ＸＸＤＹＳ」はＡモチーフと称される。Ａモチーフは、リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドの間の識別に関与する。モチーフ「ＧＸＰＳＧ」はＢモチーフと称される。Ｂモチーフは、Caliciviridae由来の対応するポリメラーゼのＲｄＲｐファミリーの全ての代表物内で保存されている。モチーフ「ＹＧＤＤ」（「Ｃモチーフ」）は、酵素の活性部位を表す。このモチーフ、特に最初のアスパラギン残基（下線部位、ＹＧＤＤ）は、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性触媒反応の間の金属イオンの配意に重要な役割を果たす。モチーフ「ＸＸＹＧＬ」はＤモチーフと称される。Ｄモチーフは、鋳型依存性ポリメラーゼの特徴である。最後に、「ＸＸＸＸＦＬＸＲＸＸ」モチーフ（「Ｅモチーフ」）は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼからＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを識別する後者の特徴である。
【００２５】
上記タイプのＲｄＲｐの典型的な代表物は、カリシウイルス科(Caliciviridae)の対応する酵素である。カリシウイルス科のＲｄＲｐは、異種ウイルス、真核生物鋳型、及び原核生物鋳型を含む、いずれかのｓｓＲＮＡ鋳型をin vitroで鋳型として使用する相補的鋳型を合成可能である。ｓｓＲＮＡ鋳型は、ポジティブ鎖またはネガティブ鎖であって良い。本発明における使用のためのＲｄＲｐは、プライマーの不存在下でのde novo合成によって検出または増幅されるｓｓＲＮＡに対して相補鎖を合成することが可能である。
【００２６】
本発明の文脈で用語「プライマーの不存在下でのde novo合成」は、ＲｄＲｐが、重合の開始のためにＲＮＡ二本鎖（別のプライマー分子によって、または鋳型のバックホールディングによって形成される）を必要とせずに、一本鎖ＲＮＡ鋳型に相補的ＲＮＡ鋳型を合成できることを意味する。de novo合成が生ずるためには、ＲＮＡ標的／鋳型が、その３’末端にポリＵ、ポリＡまたはポリＧ配列を含むべきではない。好ましくはそのようなde novo合成は、その３’末端に少なくとも一つのＣを有する、より好ましくは（Ｃ）ｎ３’末端リピート［式中、ｎは少なくとも２または３の整数である］を有するｓｓＲＮＡ鋳型で生ずる。
【００２７】
特に（Ｃ）ｎ３’末端リピートを有するＲＮＡを検出または増幅する場合、上述の工程（ｂ）または（ｉｉ）のそれぞれにおいて、ＡＴＰ、ＵＴＰ及びＣＴＰのそれぞれに対して過剰量で（好ましくは、２倍、３倍、４倍、または５倍以上）ＧＴＰが添加されることが好ましい。
【００２８】
ＲｄＲｐの好ましい実施態様は、ヒト及び／または非ヒトカリシウイルスの対応する酵素である。ノロウイルス、サポウイルス、ベシウイルスまたはラゴウイルスのＲｄＲｐ、例えばノロウイルス株HuCV/NL/Dresden174/1997/GE（GenBank登録番号AY41811）のＲｄＲｐ、サポウイルス株pJG-Sap01（GenBank登録番号AY694184）のＲｄＲｐ、またはベシウイルス株FCV/Dresden/2006/GE（GenBank登録番号DQ424892）のＲｄＲｐが特に好ましい。
【００２９】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、ＲｄＲｐは、配列番号１（ノロウイルスＲｄＲｐ）、配列番号２（サポウイルスＲｄＲｐ）または配列番号３（ベシウイルスＲｄＲｐ）に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質である。当業者は、例えば適切な発現ベクターと宿主生物を使用して組換え発現によって、そのようなＲｄＲｐを容易に調製することが可能である（ＷＯ−Ａ−２００７／０１２３２９を参照）。組換え発現におけるＲｄＲｐの精製を容易にするために、対応する配列のＮ末端またはＣ末端で適切な「タグ」（例えばＧＳＴまたは（ＨＩＳ）６タグ）を有するＲｄＲｐを発現することが好ましい。例えばヒスチジンタグは、既知の態様でニッケルまたはコバルトカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによってタンパク質の精製が可能である。ヒスチジンタグに融合したＲｄＲｐの実施態様の例は、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質である。配列番号４及び配列番号５は、ヒスチジンタグを有するノボウイルスＲｄＲｐに対応する（配列番号４：Ｃ末端Ｈｉｓタグ；配列番号５：Ｎ末端Ｈｉｓタグ）。配列番号６及び配列番号７は、ヒスチジンタグを有するサポウイルスＲｄＲｐのアミノ酸配列に対応する（配列番号６：Ｃ末端Ｈｉｓタグ；配列番号７：Ｎ末端Ｈｉｓタグ）。配列番号８は、ヒスチジンタグ（Ｃ末端）を有するベシウイルスＲｄＲｐのアミノ酸配列に対応する。
【００３０】
配列番号１
【化１】
2012508571.tif 000003
【００３１】
配列番号２
【化２】
2012508571.tif 000004
【００３２】
配列番号３
【化３】
2012508571.tif 000005
【００３３】
配列番号４
【化４】
2012508571.tif 000006
【００３４】
配列番号５
【化５】
2012508571.tif 000007
【００３５】
配列番号６
【化６】
2012508571.tif 000008
【００３６】
配列番号７
【化７】
2012508571.tif 000009
【００３７】
配列番号８
【化８】
2012508571.tif 000010
【００３８】
上述の酵素、特にCaliciviridae由来のＲｄＲｐの別の特徴的な特性は、末端トランスフェラーゼ活性である。本発明に係る方法で使用される好ましい酵素のこのさらなる活性は、ｓｓＲＮＡ鋳型が上述のｓｓＲＮＡの３’末端でポリ（Ｃ）（またはポリ（Ｕ））末端リピートを有する場合に上手く適用できる。本発明に係る酵素の末端トランスフェラーゼ活性、及びここに記載されたカリシウイルスＲｄＲｐの末端トランスフェラーゼ活性を達成するための反応条件については、Rohayem等, (2006) Journal of General Virology 87, 2621-2630を参照。
【００３９】
ここで使用される標識化オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡ（即ち、検出または増幅されるＲＮＡ配列）の領域に「実質的に」相補的であるように選択される。かくして、前記オリゴヌクレオチドは、標的の正確な配列を反映する必要はないが、それに対して選択的にハイブリダイズするために、標的の少なくとも一部の領域に十分相補的でなければならない。非相補的な塩基またはより長い配列が、鋳型鎖と安定な二本鎖を形成するために鋳型鎖との十分な相補性を維持する限りにおいて、前記オリゴヌクレオチド内に挿入されても良いし、前記オリゴヌクレオチドの末端に付加されても良い。
【００４０】
本発明では、標識化オリゴヌクレオチドは、ＲｄＲｐによる重合がこの二本鎖領域に達する前に、標的ｓｓＲＮＡの相補領域に最初にアニールしなければならない。標識化オリゴヌクレオチドが、ＲｄＲｐが二本鎖領域に達する前に、標的の相補領域にアニールする可能性を増大するために、各種の方法を用いることができる。例えば、５’末端が標的ＲＮＡ配列の３’末端と比較的遠くなり、それによって標識化オリゴヌクレオチドと標的配列の間の二本鎖が形成される領域にＲｄＲｐがプロセッシングする前に、オリゴヌクレオチドがアニールする時間を稼ぐように、前記オリゴヌクレオチドを配置することが可能である。
【００４１】
前記オリゴヌクレオチド、及び本発明の文脈でいずれかのｓｓＲＮＡは、いずれかの適切な方法によって調製されてよい。特異的な配列のオリゴヌクレオチドの調製方法は当該技術分野で既知であり、例えば適切な配列のクローニングと制限、及び直接的化学合成を含む。化学合成法は例えば、Narang等, (1979) Method in Enzymology 68-90に記載されたホスホトリエステル法、Brown等, (1979) Methods in Enzymology 68:109に記載されたホスホジエステル法、Beaucage等, (1981) Tetrahedron Letters 22: 1859に開示されたジエチルホスホルアミデート法、及びＵＳ−Ａ−４，４５８，０６６に開示された固相支持体法を含んでよい。
【００４２】
前記オリゴヌクレオチドは、以下に記載されるように、分光光度的手段、光化学的手段、免疫化学的手段、または化学的手段によって検出可能な部分を取り込むことによって標識される。標識をオリゴヌクレオチドに結合または接合する方法は、もちろん使用される標識のタイプ、及びオリゴヌクレオチド上の標識の位置に依存する。
【００４３】
本発明における使用に適していよう各種の標識、並びにオリゴヌクレオチドにそれらを導入する方法は、当該技術分野で既知であり、酵素（例えばアルカリホスファターゼ、及びセイヨウワサビペルオキシダーゼ）及び酵素基質、放射性活性原子、蛍光色素、発色団、化学的発光標識、電気化学的発光標識、例えばOrigen(登録商標)(Igen)、互いに相互作用してシグナルを増大、変更、または減少できる特異的結合パートナーまたはいずれかの他の標識を有するリガンドをこれらに制限することなく含む。
【００４４】
放射性活性原子としては３２Ｐが好ましい。核酸に３２Ｐを導入する方法は当該技術分野で既知であり、例えばキナーゼでの５’ラベリング、またはニックトランスレーションによるランダム挿入を含む。酵素は典型的にその活性によって検出される。「特異的結合パートナー」は、例えば抗原とそれに特異的なモノクローナル抗体の場合のように、高い特異性でリガンド分子を結合できるタンパク質を指す。他の特異的結合パートナーは、ストレプトアジビンに対するビオチンまたはアビジン、ＩｇＧとプロテインＡ、及び当該技術分野で既知の数多くのレセプター−リガンドの組み合わせを含む。上述の記載は、各種の標識を別個のクラスに分類することを意味するものではなく、同じ標識がいくつかの異なる態様で機能しても良い。例えば、１２５Ｉは、放射性活性標識としても電子密度試薬としても機能してよい。ＨＲＰは、酵素としてもモノクローナル抗体についての抗原としても機能してよい。更に、所望される効果のために各種の標識を組み合わせても良い。例えば、プローブをビオチンで標識し、１２５Ｉで標識したアビジン、またはＨＲＰで標識した抗ビオチンモノクローナル抗体でオリゴヌクレオチドの存在を検出できるであろう。他の変形例及び可能性は、当業者に容易に理解可能であり、本発明の範囲内で同等なものとして考慮されるであろう。
【００４５】
本発明に係る標識化オリゴヌクレオチドの構築における標識としての使用のための蛍光分子は好ましく、ローダミン及び誘導体、例えばTexas Red、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（６−ＴＡＭＲＡ）、及びそれらそれぞれのスクシンイミジルエステル、フルオレセイン及び誘導体、例えば５−ブロモメチルフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）及びそれらそれぞれのスクシンイミジルエステル、Lucifer Yellow、IAEDANS、７−Ｍｅ２−Ｎ−クマリン−４−アセテート、７−ＯＨ−４−ＣＨ３−クマリン−３−アセテート、７−ＮＨ２−４−ＣＨ３−クマリン−３−アセテート（ＡＭＣＡ）、モノブロモビマン、ピレントリスルホネート、例えばCascade Blue、及びモノブロモトリメチル−アンモニオビマンを含む。
【００４６】
放出されたオリゴヌクレオチドを検出するために蛍光が使用されるのであれば、標的ＲＮＡにハイブリダイズした際に、オリゴヌクレオチドの蛍光標識の蛍光を消光する分子をｓｓＲＮＡに提供することが更に好ましい。例えば、オリゴヌクレオチドはフルオレセイン誘導体、例えば５−または６−ＦＡＭで、好ましくはその５’末端で標識され、ｓｓＲＮＡにフルオレセインに対する消光剤、例えば５−ＴＡＭＲＡまたは６−ＴＡＭＲＡを提供しても良い。
【００４７】
更にこの場合、好ましくはその５’末端で（フルオレセイン）標識を含むオリゴヌクレオチドが、消光部分を有する５’末端近傍で標的配列にハイブリダイズすることが好ましい。消光剤／ドナーは、ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡの場合のような、ＦＲＥＴ（フルオレセイン共鳴エネルギー伝達）ペアとして一般的に選択されて良い。しかしながら、「ダーククエンチャー」（例えばDabcyl、メチルオレンジ）と称されるものを選択することが所望されても良い。
【００４８】
本発明の更なる実施態様によれば、蛍光ドナー−消光剤ペアは、標的／鋳型ＲＮＡに実質的に相補的（「実質的に相補的」の意味に関しては、上述の対応する段落を参照）であるが、前記標的／鋳型ＲＮＡの異なっていて重ならない領域でそれらにハイブリダイズする二つのオリゴヌクレオチドの形態で提供することができ、それによって標的／鋳型ＲＮＡに対する相補性の領域は、オリゴヌクレオチドが標的／鋳型ＲＮＡにハイブリダイズすると、標的オリゴヌクレオチドによる蛍光が、特に蛍光ドナーと消光剤の間のＦＲＥＴによって、消光剤を有する第二のオリゴヌクレオチドによって消光されるように選択される。かくして、ドナーと消光剤オリゴヌクレオチドの両者が標的／鋳型ＲＮＡにハイブリダイズすると、両者が検出されないか、またはマイナーな蛍光シグナルのみが検出される。本発明に係るＲｄＲｐは、de novoＲＮＡ合成を開始し、標的／鋳型ＲＮＡに相補的なＲＮＡ鎖を合成する場合、それは標的からドナー及び消光剤のオリゴヌクレオチドを置換し、ドナーによって放射される蛍光が検出される（図５参照）。図５の説明的な実施例では、消光剤オリゴは、５’末端で消光部分を有し、標的／鋳型ＲＮＡの５’末端にまたはその近傍にハイブリダイズする。ドナーオリゴは、その３’末端で蛍光ドナーを有し、標的／鋳型ＲＮＡの３’末端にまたはその近傍にハイブリダイズする。もちろん、消光部分及びドナー部分がそれぞれのプローブに存在できる。更に消光部分は、標的／鋳型の５’末端にまたはその近傍にハイブリダイズする一方のオリゴの３’末端で存在でき、ドナー基は、標的／鋳型ＲＮＡの３’末端にまたはその近傍にハイブリダイズする他方のオリゴ（即ち、標的化オリゴヌクレオチド）の５’末端に結合できるであろう。逆もまた然り。後者の場合では、お互いにかなり離れたハイブリダイズ領域を使用することが可能であろう。消光剤オリゴヌクレオチド（上述の方法の工程（ａ）または（ｉ）のそれぞれに存在する、または本発明のキットの更なる成分として存在する第二のオリゴヌクレオチド）の好ましい長さ及び他の特徴に関しては、標識化オリゴヌクレオチド（即ちドナーオリゴ）に関する上記段落を参照。本発明の文脈で有用なドナー／消光剤ペアの例は、すでに上記記載されている。二つのオリゴヌクレオチドの形態のドナー／消光剤ペアの特に好ましい例は、５−または６−ＦＡＭ標識化オリゴヌクレオチド（ドナー）と５−または６−ＴＡＭＲＡ結合オリゴヌクレオチド（消光剤）である。
【００４９】
本発明に係る方法の更に好ましい実施態様は、標識化オリゴヌクレオチドとしてMolecular Beaconと称されるものを使用することである。Molecular Beaconは、ＵＳ−Ａ−５，９２５，５１７に記載されている。
【００５０】
この文脈では、「５’末端でハイブリダイズする」または「３’末端でハイブリダイズする」は、標識化オリゴヌクレオチド（または消光部分を有する第二のオリゴヌクレオチド）が、標的配列の５’末端または３’末端のそれぞれに正確にハイブリダイズすることを必ずしも意味するものではない。むしろこれらの用語は、オリゴヌクレオチドが５’末端または３’末端のそれぞれの近傍でハイブリダイズして良いことを含み、それは各オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする配列の真に５’末端または３’末端それぞれとの間に標的配列内の更なるヌクレオチドが存在することを意味する。
【００５１】
本発明における使用のための標識は、各種の方法によって直接または間接にオリゴヌクレオチドに結合してよい。使用される標識の正確なタイプに依存して、標識はオリゴヌクレオチドの５’または３’末端で配置でき、オリゴヌクレオチドの内部に配置でき、またはシグナルインターラクションを容易にするために各種のサイズ及び組成のスペーサーアームに結合できる。市販のホスホルアミダイト試薬を使用して、適切な保護化ホスホルアミダイトを介して５’または３’末端のいずれかで官能基（例えばチオールまたは第一級アミン）を含むオリゴマーを生産でき、例えばPCR
Protocols: A Guide to Methods and Application (Innis等編, Academic Press, 1990)に記載されたプロトコールを使用してそれらを標識できる。同じことは、任意に存在する消光剤オリゴヌクレオチドについての化学的消光部分についても当てはまる。
【００５２】
典型的に５’末端で、一つ以上のスルフィドリル、アミノまたはヒドロキシル部分をオリゴヌクレオチドに導入するための、オリゴヌクレオチド官能化試薬の導入方法は、ＵＳ−Ａ−４，９１４，２１０に記載されている。５’リン酸基は、ポリヌクレオチドキナーゼ及びガンマ３２Ｐ−ＡＴＰを使用することにより、放射性同位元素として導入でき、レポーター基を提供する。ビオチンは、合成の間で導入される、アミノチミジン残基または６−アミノヘキシル残基を、ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させることにより、５’末端に加えることができる。３’末端の標識化は、ポリヌクレオチド末端トランスフェラーゼを利用して、例えばコルジセピン３５Ｓ−ｄＡＴＰ及びビオチン化ｄＵＴＰといった所望される部分を加えることができる。
【００５３】
オリゴヌクレオチド誘導体も利用可能な標識である。例えば、エテノ−ｄＡ及びエテノ−Ａは、オリゴヌクレオチドに導入できる既知の蛍光アデニンヌクレオチドである。同様に、エテノ−ｄＣまたは２−アミノプリンデオキシリボシドは、オリゴヌクレオチド合成で使用できる別のアナログである。そのようなヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドは、ＲｄＲｐが標的ｓｓＲＮＡと標識化オリゴヌクレオチドの間で形成される二本鎖を解くため、ずっと強力な蛍光モノヌクレオチドを放出するようにハイブリダイズされて良い。
【００５４】
本発明によれば、用語「ＲＮＡ重合条件」は、特にバッファー、温度、塩、及び金属イオン（適用可能であれば）に関して、ＲｄＲｐがプライマーの不存在下で鋳型鎖に相補的なＲＮＡ鎖を合成可能である条件を意味する。ＲｄＲｐの適切なバッファー、塩、金属イオン、還元剤（適用可能であれば）、及び他の条件は、当業者に既知である。カリシウイルスのＲｄＲｐに関しては、ＷＯ−Ａ−２００７／０１２３２９を参照。かくして、本発明に係る方法の適切な例では、ｓｓＲＮＡ鋳型は、５０μｌの反応体積当たり例えば１μｇから４μｇの量で使用される。リボヌクレオシド三リン酸の濃度は、好ましくは０．１μモル／ｌから１μモル／ｌの範囲、例えば０．４μモル／ｌである。ＲｄＲｐの濃度は、例えば１μモル／ｌから６μモル／ｌであって良い。
【００５５】
典型的なバッファー濃度は、１０から８０ｍＭ、より好ましくは２０から５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１から４ｍＭ、例えば３ｍＭの酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸マンガン、または塩化マンガン、１から４ｍＭの還元剤、例えばＤＴＴである。ＲｄＲｐの末端トランスフェラーゼ活性に関しては、一つのみのリボヌクレオチドが存在する（例えばＣ末端リピートを提供するためにｒＣＴＰ）点を除いて、実質的に同じ条件が提供される。
【００５６】
本発明に係る方法は、反応混合物に停止溶液を導入することによって停止されて良い。典型的な停止溶液は、２から１０ｍＭ、好ましくは４から８ｍＭの酢酸アンモニウム、５０から２００ｍＭ、例えば１００ｍＭのＥＤＴＡを含む。
【００５７】
本発明に係る方法の生成物は、ＲｄＲｐによりde novoで合成された鋳型鎖と相補鎖とからなる二本鎖分子である。この合成の副産物は、置換された標識化オリゴヌクレオチドである。ＲＮＡ増幅において本発明に係るプロトコールが企図される場合、ＲｄＲｐによって重合されたｓｓＲＮＡと相補鎖から形成された二本鎖が分離され、標識化オリゴヌクレオチド（及び任意に、消光部分を有する第二のオリゴヌクレオチド）をアニールする工程、相補鎖を重合する工程、及びＲＮＡ二本鎖を分離する工程が、例えば２から５０回、または２００回まで、より好ましくは１５から４０回、最も好ましくは２０から３０回繰り返されても良い。
【００５８】
鎖分離は、熱の適用（熱変性）、化学的変性、または好ましくはヘリカーゼにより酵素的に実施されて良い。特に熱変性の場合は、次の重合工程を実施する前に、反応混合物にさらなるＲｄＲｐ分子を添加することが所望される。
【００５９】
本発明の方法を実施するために、サーマルサイクラー、例えばPerkin-Elmer Instruments またはRoche Diagnostics社製の市販の機械を利用しても良い。
【００６０】
ＲｄＲｐの作用によって置換された標識化オリゴヌクレオチドの検出または確認は、各種の方法によって達成されて良く、利用される標識類の供給源に依存してよい。本発明の一つの簡便な実施態様は、放出された標識化オリゴヌクレオチドを含む反応生成物をサイズ分析に供することである。標識化核酸断片のサイズを測定する方法は当該技術分野で既知であり、例えばゲル電気泳動、沈降成分、ゲル排出クロマトグラフィー、及びホモクロマトグラフィを含む。
【００６１】
本発明に係る方法で適用される試薬は、診断キット内に実装できる。診断キットは、標識化オリゴヌクレオチドとＲｄＲｐを含む。標識化オリゴヌクレオチドは、好ましくはその３’末端でブロックされており、上述のように標識を含む。このキットは更に、好ましくはその５’または３’末端で消光部分を含む上述の第二のオリゴヌクレオチドを含んでも良い。消光部分が５’末端に存在するのであれば、第二のオリゴヌクレオチドはその３’末端で好ましくはブロックされる。前記キットは更に、本発明に係る方法を実施するために必要とされる他の適切な実装試薬及び材料を含んでも良く、例えばバッファー、リボヌクレオチド（ｒＡＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰ）、及び任意に停止溶液（好ましくは上述の停止溶液、より好ましくは５倍または１０倍の停止溶液の形態）、及び任意にヘリカーゼ、並びに方法を実施するための説明書を含んで良い。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、鋳型として使用された消光剤／ドナー二本鎖ＲＮＡハイブリッド（Ｑ／Ｄ−ｄｓＲＮＡ−ハイブリッド）の生成を示す、本発明に係るＲＮＡ検出方法の好ましい実施態様の模式図である。図１Ａ：前記ハイブリッドは、その５’末端で消光剤で標識された一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｓＲＮＡ−Ｑ）と、その５’末端でドナーで標識された一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ−Ｄ）とをハイブリダイズすることによって生成される。ｓｓＲＮＡ−ＱとｓｓＲＮＡ−Ｄは相補的な配列を有する。ドナーによるエネルギーの放出は、共鳴エネルギー伝達を通じて消光剤によって減弱される。ハイブリダイゼーション反応混合物は、６５℃で３０分ハイブリダイゼーションバッファーでインキュベートされ、次いで氷上で１５分冷まされた等モル濃度のｓｓＲＮＡ−ＱとｓｓＲＮＡ−Ｄを含む。ハイブリダイゼーションバッファーは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １０ｍＭ ｐＨ８．０、ＮａＣｌ ２０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭを含む。図１Ｂ：カリシウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）による鎖置換の模式図を示す。ＲｄＲｐは、鋳型（ｓｓＲＮＡ−Ｑ）の３’末端で開始し、ｓｓＲＮＡ−Ｑの５’末端でハイブリダイズしたｓｓＲＮＡ−Ｄを置換してＲＮＡを合成する。ｓｓＲＮＡ−Ｑ鋳型鎖は、その３’末端で（Ｃ）ｎヌクレオチド配列（式中、ｎ≧３）を有する。ＲＮＡ合成は、その５’末端で消光剤で標識された一本鎖ＲＮＡと、示されたようにＲｄＲｐによって合成されたその相補的一本鎖ＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡ分子を生成する。鎖置換は、ｓｓＲＮＡ−ＱからのｓｓＲＮＡ−Ｄの放出を導き、その後ドナーによって放射されるエネルギーが検出される。
【図２Ａ】図２は、カリシウイルスＲｄＲｐによる鋳型ｓｓＲＮＡ鎖からの標識化オリゴヌクレオチドの鎖置換を説明する実験の結果を示す。図２Ａ：反応サイクル数に依存する蛍光放射を表すグラフである。実線：カリシウイルスＲｄＲｐ、リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）、ＲｄＲｐバッファー、及びＱ／Ｄ−ｄｓＲＮＡハイブリッドを含む反応。破線：ｒＮＴＰの不存在下のネガティブコントロール反応。
【図２Ｂ】図２は、カリシウイルスＲｄＲｐによる鋳型ｓｓＲＮＡ鎖からの標識化オリゴヌクレオチドの鎖置換を説明する実験の結果を示す。図２Ｂ：未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を使用して分析された図２Ａの反応の生成物を示す写真である。レーン（左から右）：Ｍ：分子サイズマーカー（塩基対（ｂｐ）が示されている）；第１反応レーン：Ｑ／Ｄ−ｄｓＲＮＡハイブリッドのみを含む反応；第２反応レーン：ＲｄＲｐとＱ／Ｄ−ｄｓＲＮＡハイブリッドを含むがｒＮＴＰを含まないコントロール反応；第３反応レーン：全ての必要とされる成分（ＲｄＲｐ、ｒＮＴＰ、Ｑ／Ｄ−ｄｓＲＮＡハイブリッド）を含む反応。
【図３Ａ】図３は、カリシウイルスＲｄＲｐによる鋳型ｓｓＲＮＡ鎖からの標識化オリゴヌクレオチドの鎖置換を説明するさらなる実験の結果を示す。図３Ａ：反応サイクル数に依存する蛍光放射を表すグラフである。実線：カリシウイルスＲｄＲｐ、リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）、ＲｄＲｐバッファー、及びＱ／Ｄ−ｄｓＲＮＡハイブリッドを含む反応。破線：酵素によるＲＮＡ合成の完全な阻害を導くＲｄＲｐの活性部位ミュータント（μＲｄＲｐ）の存在下でのコントロール反応。
【図３Ｂ】図３は、カリシウイルスＲｄＲｐによる鋳型ｓｓＲＮＡ鎖からの標識化オリゴヌクレオチドの鎖置換を説明するさらなる実験の結果を示す。図３Ｂ：未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を使用して分析された図３Ａの反応の生成物を示す写真である。レーン（左から右）：Ｍ：分子サイズマーカー（塩基対（ｂｐ）が示されている）；第１反応レーン：カリシウイルスＲｄＲｐ、ｒＮＴＰ、及びＱ／Ｄ−ｄｓＲＮＡハイブリッドを含む反応；第２反応レーン：μＲｄＲｐ、ｒＮＴＰ、及びＱ／Ｄ−ｄｓＲＮＡハイブリッドを含むコントロール反応；第３反応レーンＱ／Ｄ−ｄｓＲＮＡハイブリッドのみを含むコントロール反応。
【図４Ａ】図４は、カリシウイルスＲｄＲｐによって置換された鎖を通じてｄｓＲＮＡの濃度及び時間依存性合成を説明する実験の結果を示す。図４Ａ：反応サイクル数に依存する蛍光放射を表すグラフである、反応ミックスはＲｄＲｐの増大していく濃度（示された通り２．５μＭ、３μＭ、４μＭ、及び６μＭ）を含んだ。
【図４Ｂ】図４は、カリシウイルスＲｄＲｐによって置換された鎖を通じてｄｓＲＮＡの濃度及び時間依存性合成を説明する実験の結果を示す。図４Ｂ：カリシウイルスＲｄＲｐの濃度に依存し、示された通り異なる反応時間について示された蛍光シグナルを表すグラフである。
【図５】図５は、蛍光ドナー（Ｄ）を有する標識化ＤＮＡオリゴプローブと、蛍光消光剤（Ｑ）に結合した第二のオリゴプローブの存在下で、カリシウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）と鋳型としての一本鎖ＲＮＡとを使用する、蛍光共鳴エネルギー伝達アッセイ（ＦＲＥＴ）を説明する本発明に係るＲＮＡ検出方法のさらなる実施態様の模式図を示す。図５Ａ：その５’末端で蛍光ドナーを有する標識化ＤＮＡオリゴプローブと、その３’末端で蛍光消光剤を含む第二のＤＮＡオリゴプローブとに一本鎖ＲＮＡをハイブリダイズすることにより、ｓｓＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドが生成される。その５’末端でドナーを含むオリゴプローブは、鋳型ＲＮＡの３’末端に相補的であり、消光剤を含むオリゴプローブは、鋳型ＲＮＡの５’末端に相補的である。ドナーによるエネルギーの放出は、共鳴エネルギー伝達を通じて消光剤により減弱される。図５Ｂ：カリシウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）による鎖置換の模式図である。ＲｄＲｐは、鋳型（ｓｓＲＮＡ−鋳型）の３’末端で開始し、ｓｓＲＮＡ−鋳型の３’末端でハイブリダイズしたオリゴプローブ−ＤＮＡ−ドナーを置換してＲＮＡを合成する。ＲＮＡ合成は、二本鎖ＲＮＡ分子を生成する。鎖置換は、ｓｓＲＮＡ鋳型からオリゴプローブ−ＤＮＡ−ドナーとオリゴプローブ−ＤＮＡ−消光剤の放出を導き、その後ドナーによって放射される蛍光が検出される。
【図６】図６は、蛍光ドナーを含む標識化ＤＮＡオリゴプローブと、蛍光を有する第二のオリゴプローブとの存在下で、カリシウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）と鋳型としての一本鎖ＲＮＡとを使用する、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）の実施例を説明する、反応サイクル数に依存する蛍光放射を表すグラフである。この実験では、各種の量（示された通りのｎｇ）で二つの異なるｓｓＲＮＡ鋳型（鋳型Ａと鋳型Ｂ）を使用した。鋳型ＢはｍｉＲ−３７５であり、配列5’-UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA-3’（配列番号９)を有する。鋳型Ａは、配列5’-UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGACCC-3’（配列番号１０)を有するｍｉＲ−３７５の修飾形態である。μＲｄＲｐ：カリシウイルスＲｄＲｐの活性部位ミュータント。ネガティブコントロールＲＮＡ鋳型：使用されたオリゴプローブに相補性を有さないｓｓＲＮＡ。
【図７】図７は、カリシウイルスＲｄＲｐによる鎖置換を通じたｄｓＲＮＡの合成の鋳型濃度に関する依存性を説明する、反応サイクル数に依存する蛍光放射を表すグラフを示す。増大する濃度の鋳型Ａ（示された通り１０から２５０ｎｇ）を使用した。鋳型Ａは図６に記載されたものと同じである。
【図８】図８は、カリシウイルスＲｄＲｐによる鎖置換を通じたｄｓＲＮＡの合成の鋳型濃度に関する依存性を説明する、反応サイクル数に依存する蛍光放射を表す更なるグラフを示す。増大する濃度の鋳型Ｂ（示された通り１０から２５０ｎｇ）を使用した。鋳型Ｂは図６に記載されたものと同じである。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
本発明は、以下の非制限的な実施例により更に説明される。
【実施例】
【００６４】
実施例１：カリシウイルスＲｄＲｐを使用する鎖置換アッセイ
反応ミックス（２５μｌ）は、ＲｄＲｐ（サポウイルス；６μＭ）、Ｑ／Ｄ−ｄｓＲＮＡハイブリッドを４μＭの最終濃度、ＲｄＲｐバッファー（ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０ ４ｍＭ、ＭｎＣｌ２ ０．６ｍＭ、酢酸アンモニウム２５ｍＭ、ＤＴＴ ０．２５ｍＭからなる）、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰをそれぞれ０．４ｍＭの最終濃度で含む。使用された消光剤はＴＡＭＲＡであり、ドナーは６−ＦＡＭである。蛍光は、LightCycler 1.5機械(Roche, Basel, Switzerland)でリアルタイムにモニターされる。各サイクルは３０℃で１５秒間の反応のインキュベーションに対応し、その後蛍光放射が測定される。３０００秒（２００サイクル×１５秒＝３０００秒）の期間に亘る蛍光の増大が図２Ａに示されている。図２Ａの蛍光の増大で、実線は上述の通りカリシウイルスＲｄＲｐ、リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）、ＲｄＲｐバッファー、及びＱ／Ｄ−ｄｓＲＮＡハイブリッドからなる反応で観察された。コントロールとして、ｒＮＴＰの不存在下で同じ反応を実施した（図２Ａ、破線）。
【００６５】
反応の生成物を、未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を使用して分析した。ＲｄＲｐは、上述の反応の全ての成分の存在下でのみ、二本鎖ＲＮＡ生成物を合成する。ｄｓＲＮＡの合成は、鎖置換によって生じ、図２Ｂに示される通り、その５’末端で消光剤で標識された一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ−Ｑ）と、ＲｄＲｐによって合成されたその相補的な一本鎖ＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡ分子を導く。ｒＮＴＰが省略されると、同様に図２Ｂに示される通り、ｄｓＲＮＡは合成されない。両者の反応で使用された反応生成物は、「Ｑ／Ｄ−ｄｓＲＮＡハイブリッド」として図２Ｂに記載されている。
【００６６】
実施例２：鎖置換はカリシウイルスＲｄＲｐの活性部位ミュータントでは生じない
コントロール反応においてサポウイルスＲｄＲｐの活性部位ミュータント（μＲｄＲｐ）を使用する点を除いて、実施例１と同じ反応を実施した。その結果が図３に示されている。
【００６７】
かくして、反応ミックス（２５μｌ）は、ＲｄＲｐ（６μＭ）、Ｑ／Ｄ−ｄｓＲＮＡハイブリッドを４μＭの最終濃度、ＲｄＲｐバッファー（ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０ ４ｍＭ、ＭｎＣｌ２ ０．６ｍＭ、酢酸アンモニウム２５ｍＭ、ＤＴＴ ０．２５ｍＭからなる）、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ（リボヌクレオチド三リン酸ｒＮＴＰとしてここで記載される）をそれぞれ０．４ｍＭの最終濃度で含む。使用された消光剤はＴＡＭＲＡであり、ドナーは６−ＦＡＭである。蛍光は、LightCycler 1.5機械(Roche, Basel, Switzerland)でリアルタイムにモニターされる。各サイクルは３０℃で１５秒間の反応のインキュベーションに対応し、その後蛍光放射が測定される。３０００秒（２００サイクル×１５秒＝３０００秒）の期間に亘る蛍光の増大がモニターされる。上述の通りサポウイルスＲｄＲｐ、リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）、ＲｄＲｐバッファー、及びＱ／Ｄ−ｄｓＲＮＡハイブリッドを含む反応で、蛍光の増大が観察された（実線）。コントロールとして、酵素によるＲＮＡ合成の完全な阻害を導くＲｄＲｐの活性部位ミュータント（μＲｄＲｐ）の存在下で同じ反応を実施した（図３Ａ、破線）。
【００６８】
反応の生成物を、未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を使用して分析した。ｄｓＲＮＡの合成は、鎖置換によって生じ、図３Ｂに示される通り、その５’末端で消光剤で標識された一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ−Ｑ）と、サポウイルスＲｄＲｐによって合成されたその相補的な一本鎖ＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡ分子を導く。μＲｄＲｐを使用すると、図３Ｂに示される通り、ｄｓＲＮＡは合成されない。両者の反応で使用された反応生成物は、Ｑ／Ｄ−ｄｓＲＮＡハイブリッドである。
【００６９】
実施例３：カリシウイルスＲｄＲｐによる鎖置換を通じたｄｓＲＮＡ合成の濃度と時間依存性
反応ミックスは、増大する濃度のサポウイルスＲｄＲｐ（示される通り２．５μＭ、３μＭ、４μＭ及び６μＭ）、Ｑ／Ｄ−ｄｓＲＮＡハイブリッドを４μＭの最終濃度、ＲｄＲｐバッファー（ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０ ４ｍＭ、ＭｎＣｌ２ ０．６ｍＭ、酢酸アンモニウム２５ｍＭ、ＤＴＴ ０．２５ｍＭからなる）、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ（リボヌクレオチド三リン酸ｒＮＴＰとしてここで記載される）をそれぞれ０．４ｍＭの最終濃度で含んだ。使用された消光剤はＴＡＭＲＡであり、ドナーは６−ＦＡＭである。蛍光は、LightCycler 1.5機械(Roche, Basel, Switzerland)でリアルタイムにモニターされる。各サイクルは３０℃で１５秒間の反応のインキュベーションに対応し、その後蛍光放射が測定される。３０００秒（２００サイクル×１５秒＝３０００秒）の期間に亘る蛍光の増大が、全ての４種の濃度のカリシウイルスＲｄＲｐについて図４Ａに示されている。
【００７０】
鎖置換を通じたカリシウイルスＲｄＲｐによるＲＮＡ合成の時間依存性を調べるために、反応ミックス（２５μｌ）は、増大する濃度のサポウイルスＲｄＲｐ（２．５μＭ、３μＭ、４μＭ及び６μＭ）、Ｑ／Ｄ−ｄｓＲＮＡハイブリッドを４μＭの最終濃度、ＲｄＲｐバッファー（ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０ ４ｍＭ、ＭｎＣｌ２ ０．６ｍＭ、酢酸アンモニウム２５ｍＭ、ＤＴＴ ０．２５ｍＭからなる）、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ（リボヌクレオチド三リン酸ｒＮＴＰとしてここで記載される）をそれぞれ１ｍＭの最終濃度で含んだ。使用された消光剤はＴＡＭＲＡであり、ドナーは６−ＦＡＭである。蛍光は、図４に示される通り、１０分、２５分及び５０分でLightCycler 1.5機械でリアルタイムにモニターされる。図４Ｂは、蛍光の増大がＲｄＲｐ濃度及び反応時間に依存することを表す。
【００７１】
実施例４：二つのオリゴヌクレオチドプローブを使用するＲＮＡ鎖置換アッセイ
反応ミックス（２５μｌ）は、ＲｄＲｐ（サポウイルス；７．５μＭ）、消光剤−オリゴプローブ（Ｑ）とドナー−オリゴプローブ（Ｄ）を０．５μＭの最終濃度、ＲｄＲｐバッファー（ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０ ４ｍＭ、ＭｎＣｌ２ ０．６ｍＭ、酢酸アンモニウム２５ｍＭ、ＤＴＴ ０．２５ｍＭからなる）、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ（リボヌクレオチド三リン酸ｒＮＴＰとしてここで記載される）をそれぞれ０．４ｍＭの最終濃度、ＧＴＰを２ｍＭの最終濃度で含む。使用された消光剤はＴＡＭＲＡであり、ドナーは６−ＦＡＭである。蛍光は、LightCycler 1.5機械(Roche, Basel, Switzerland)でリアルタイムにモニターされる。各サイクルは３０℃で１５秒間の反応のインキュベーションに対応し、その後蛍光放射が測定される。３０００秒（２００サイクル×１５秒＝３０００秒）の期間に亘る蛍光の増大が測定される。その実験結果が図６に示されている。
【００７２】
蛍光の増大を、カリシウイルスＲｄＲｐ、リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）、ＲｄＲｐバッファー、消光剤−オリゴプローブ（Ｑ）、ドナー−オリゴプローブ（Ｄ）、及び５３ｎｇの鋳型Ｂ（ｍｉＲ−３７５：5’-UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA-3’；配列番号９)または４８ｎｇの鋳型Ａ（ｍｉＲ−３７５の修飾配列：5’-UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGACCC-3’；配列番号１０)を含む反応で観察した。コントロールとして、酵素によるＲＮＡ合成の完全な阻害を導くＲｄＲｐの活性部位ミュータント（μＲｄＲｐ）の存在下で同じ反応を実施し、後の蛍光シグナルは不存在であった。反応中にＲＮＡ鋳型が存在しない場合、または消光剤−オリゴプローブ（Ｑ）及びドナー−オリゴプローブ（Ｄ）とは相補的でないネガティブコントロールｓｓＲＮＡ鋳型を使用する場合、シグナルは検出されない。
【００７３】
実施例５：鋳型濃度に関する鎖置換アッセイの依存性
反応ミックス（２５μｌ）は、ＲｄＲｐ（サポウイルス；７．５μＭ）、消光剤−オリゴプローブ（Ｑ）とドナー−オリゴプローブ（Ｄ）を０．５μＭの最終濃度、ＲｄＲｐバッファー（ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０ ４ｍＭ、ＭｎＣｌ２ ０．６ｍＭ、酢酸アンモニウム２５ｍＭ、ＤＴＴ ０．２５ｍＭからなる）、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ（リボヌクレオチド三リン酸ｒＮＴＰとしてここで記載される）をそれぞれ０．４ｍＭの最終濃度、ＧＴＰを２ｍＭの最終濃度で含む。使用された消光剤はＴＡＭＲＡであり、ドナーは６−ＦＡＭである。蛍光は、LightCycler 1.5機械(Roche, Basel, Switzerland)でリアルタイムにモニターされる。前記反応は各種の濃度の鋳型ＡまたはＢを含む（１０ｎｇ、１５．６ｎｇ、３１ｎｇ、６２ｎｇ、１２５ｎｇ、２５０ｎｇ）。各サイクルは３０℃で１５秒間の反応のインキュベーションに対応し、その後蛍光放射が測定される。３０００秒（２００サイクル×１５秒＝３０００秒）の期間に亘る蛍光の増大が測定される。蛍光の増大は、カリシウイルスＲｄＲｐ、リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）、ＲｄＲｐバッファー、消光剤−オリゴプローブ、及びドナー−オリゴプローブ（Ｄ）を含む反応で観察された。
【００７４】
図７及び８に示される通り、蛍光放射の検出可能な増大が、１０ｎｇ（鋳型Ｂ）または１５．６ｎｇ（鋳型Ａ）のそれぞれを超える鋳型濃度で観察される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図３Ａ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図２Ｂ】
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【図３Ｂ】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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