(57)【要約】  本発明は、ヒトインターロイキン−２１受容体（ＩＬ２１Ｒ）に特異的に結合する、ヒト結合タンパク質およびその抗原結合断片、ならびにその使用を提供する。本発明はさらに、本発明の結合タンパク質がインビボで作動性活性を獲得し得るかどうか、またサイトカインストームを生じさせ得るかどうかを予測する方法を提供する。さらに、本発明は、いくつかのＩＬ２１応答性遺伝子の同定に基づいて、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質が中和抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質であるかどうかを決定するための方法を提供する。結合タンパク質は、例えばＩＬ２１Ｒ活性のアンタゴニストとして作用することができ、それにより、概して免疫応答を、とりわけＩＬ２１Ｒによって仲介される免疫応答を調整する。    【図１】2012504939.tif 000009
2012504939.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用結合タンパク質が、第１の哺乳動物対象に投与されるとサイトカインストームを誘発するかどうかを予測する方法であって、
（ａ）治療用結合タンパク質を第２の哺乳動物対象に投与するステップであって、第２の哺乳動物対象が結合タンパク質で処理された第２の哺乳動物対象であるステップ、
（ｂ）結合タンパク質で処理された第２の哺乳動物対象から血液試料を得るステップ、
（ｃ）結合タンパク質で処理された第２の哺乳動物対象の血液における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを決定するステップ、および
（ｄ）結合タンパク質で処理された第２の哺乳動物対象の血液における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを、未処理の第２の哺乳動物対象の血液における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルと比較するステップ
を包含し、結合タンパク質で処理された第２の哺乳動物対象における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルが、未処理の第２の哺乳動物対象における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルよりも実質的に大きいことにより、治療用結合タンパク質が第１の哺乳動物対象においてサイトカインストームを誘発することが示される、方法。
【請求項２】
第１の哺乳動物対象がヒト対象である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
治療用結合タンパク質が抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質がＡｂＳである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第２の哺乳動物対象が、安全性試験用の動物種の１種である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
安全性試験用の動物種の１種がカニクイザル対象である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子が、ＩＬ４、ＩＬ２、ＩＬ１β、ＩＬ１２、ＴＮＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ６、ＩＬ８、およびＩＬ１０からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、または少なくとも９個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを決定することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
９個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを決定することを包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
結合タンパク質で処理された第２の哺乳動物対象の血液における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを決定する方法が、少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
結合タンパク質で処理された第２の哺乳動物対象の血液における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを決定する方法が、少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子のタンパク質発現レベルを測定することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子のタンパク質発現レベルを測定することが、少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子のサイトカイン放出レベルを測定することを包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
治療用結合タンパク質が哺乳動物対象においてサイトカインストームを誘発するかどうかを予測する方法であって、
（ａ）哺乳動物対象から血液試料を得るステップ、
（ｂ）治療用結合タンパク質を血液試料とインキュベートするステップであって、血液試料が結合タンパク質で処理された血液試料であるステップ、
（ｃ）結合タンパク質で処理された血液試料における少なくとも１個のサイトイカインストーム遺伝子の発現レベルを決定するステップ、および
（ｄ）結合タンパク質で処理された血液試料における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを、未処理のまたは陰性対照で処理された血液試料における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルと比較するステップ
を包含し、結合タンパク質で処理された血液試料における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルが、未処理のまたは陰性対照で処理された血液試料における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルよりも実質的に大きいことにより、治療用結合タンパク質が哺乳動物対象においてサイトカインストームを誘発することが示される、方法。
【請求項１４】
哺乳動物対象がヒト対象である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物対象が、安全性試験用の動物種の１種である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
安全性試験用の動物種の１種がカニクイザル対象である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
血液試料が精製末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
治療用結合タンパク質が抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質がＡｂＳである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子が、ＩＬ４、ＩＬ２、ＩＬ１β、ＩＬ１２、ＴＮＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ６、ＩＬ８、およびＩＬ１０からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、または少なくとも９個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを決定することを包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
９個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを決定することを包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
結合タンパク質で処理された血液試料における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを決定する方法が、少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定することを包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
結合タンパク質で処理された血液試料における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを決定する方法が、少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子のタンパク質発現レベルを測定することを包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子のタンパク質発現レベルを測定することが、少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子のサイトカイン放出レベルを測定することを包含する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質が中和抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質であるかどうかを決定する方法であって、
（ａ）対象の第１の血液試料をＩＬ２１リガンドと接触させるステップ、
（ｂ）ＩＬ２１リガンドと接触させた第１の血液試料における少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子の発現レベルを決定するステップ、
（ｃ）対象の第２の血液試料を抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の存在下でＩＬ２１リガンドと接触させるステップ、
（ｄ）抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の存在下でＩＬ２１リガンドと接触させた第２の血液試料における少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子の発現レベルを決定するステップ、および
（ｅ）ステップ（ｂ）および（ｄ）において決定された、少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子の発現レベルを比較するステップ
を包含し、少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子の発現レベルにおける変化が、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質が中和結合タンパク質であることを示す、方法。
【請求項２７】
対象が哺乳動物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
対象がサルである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
対象がヒトである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子が、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ４０、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＧＺＭＢ、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１２β、ＩＬ１β、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ６、ＰＲＦ１、ＰＴＧＳ２、およびＴＢＸ２１からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子がＩＬ２ＲＡである、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００８年９月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／０９９，４７６号の優先権の利益を主張するものであり、前記出願の内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれるものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、結合タンパク質がインビボで作動性活性を獲得し得るかどうか、またサイトカインストームを生じさせ得るかどうかを予測する方法に関する。これらの方法は、例えば拮抗的結合タンパク質の架橋により生じる、望ましくない作動性活性の予測および予防において有用である。さらに、本発明に関連する研究は、インターロイキン−２１受容体（ＩＬ２１Ｒ）、とりわけヒトＩＬ２１Ｒと結合する、結合タンパク質およびその抗原結合断片、ならびに、ＩＬ２１Ｒに関連する活性、例えばＩＬ２１応答性遺伝子の発現レベルに対するＩＬ２１の効果の調節におけるそれらの使用に焦点を当てた。本明細書において開示される結合タンパク質および関連する方法は、ＩＬ２１Ｒに関連する障害、例えば炎症性障害、自己免疫疾患、アレルギー、移植拒絶反応、血液の過剰増殖性障害、および他の免疫系の障害の診断および／または治療において有用である。
【背景技術】
【０００３】
関連する背景技術
抗原は免疫応答を開始させ、２つの最大のリンパ球集団であるＴ細胞およびＢ細胞を活性化させる。抗原に遭遇した後、Ｔ細胞は増殖してエフェクター細胞に分化するが、一方、Ｂ細胞は増殖して抗体分泌形質細胞に分化する。これらのエフェクター細胞は、リンパ球および他の細胞型によって分泌される小タンパク質（約３０ｋＤａ未満）であるサイトカインを分泌し、かつ／またはサイトカインに応答する。
【０００４】
ヒトＩＬ２１は、ＩＬ２、ＩＬ４、およびＩＬ５に対する配列相同性を示すサイトカインである（Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：５７〜６３）。インターロイキンサイトカイン間では配列相同性は低いにも関わらず、サイトカインは、そのファミリーを代表する「４ヘリックスバンドル」構造という共通のフォールディングを共有する。ほとんどのサイトカインは、クラスＩまたはクラスＩＩのサイトカイン受容体のいずれかと結合する。クラスＩＩのサイトカイン受容体には、ＩＬ１０およびインターフェロンに対する受容体が含まれるが、クラスＩのサイトカイン受容体には、ＩＬ２からＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、およびＩＬ１５、ならびに造血成長因子、レプチン、および成長ホルモンに対する受容体が含まれる（Ｃｏｓｍａｎ（１９９３）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ５：９５〜１０６）。
【０００５】
ヒトＩＬ２１Ｒは、クラスＩのサイトカイン受容体である。ヒトＩＬ２１およびその受容体（ＩＬ２１Ｒ）をコードするヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えば、国際出願公開ＷＯ００／０５３７６１およびＷＯ０１／０８５７９２、上記のＰａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら（２０００）、ならびにＯｚａｋｉら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１１４３９〜４４において記載されている。ＩＬ２１Ｒは、ＩＬ２受容体のβ鎖およびＩＬ４受容体のα鎖に対して最も高い配列相同性を有する（上記のＯｚａｋｉら（２０００））。リガンドの結合の際、ＩＬ２１Ｒは、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１３、およびＩＬ１５に対する受容体複合体によって共有されている、共通のガンマサイトカイン受容体鎖（γｃ）と会合する（上記のＯｚａｋｉら（２０００）、Ａｓａｏら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１〜５）。
【０００６】
ＩＬ２１Ｒは、リンパ組織内、とりわけ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、およびマクロファージにおいて発現し（上記のＰａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら（２０００））、それにより、これらの細胞がＩＬ２１に応答することが可能になる（ＬｅｏｎａｒｄおよびＳｐｏｌｓｋｉ（２００５）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：６８８〜９８）。ＩＬ２１Ｒが広くリンパに分布していることは、ＩＬ２１が免疫調節において重要な役割を有することを示す。インビトロでの研究により、ＩＬ２１が、Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞の機能を有意に調整することが示されている（上記のＰａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら（２０００）、Ｋａｓａｉａｎら（２００２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６：５５９〜６９）。最近の証拠によると、ＩＬ２１介在性のシグナル伝達が抗腫瘍活性を有し得ること（Ｓｉｖａｋｕｍａｒら（２００４）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１２：１７７〜８２）、およびＩＬ２１がマウスにおいて抗原誘発性の喘息を予防し得ること（Ｓｈａｎｇら（２００６）Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４１：６６〜７４）が示唆される。
【０００７】
自己免疫において、ＩＬ２１遺伝子の破壊および組換えＩＬ２１の注入が、実験的自己免疫性重症筋無力症（ＥＡＭＧ）および実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の進行をそれぞれ調整することが示されている（Ｋｉｎｇら（２００４）Ｃｅｌｌ  １１７：２６５〜７７、Ｏｚａｋｉら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：５３６１〜７１、Ｖｏｌｌｍｅｒら（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：２６９６〜２７０１、Ｌｉｕら（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６：５２４７〜５４）。これらの実験系において、ＩＬ２１介在性のシグナル伝達を操作すると、ＣＤ８＋細胞、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、およびＮＫ細胞の機能が直接的に改変されることが示唆されている。したがって、ＩＬ２１介在性のシグナル伝達経路の操作は、ＩＬ２１に関連する障害、例えば炎症性障害（例えば、肺の炎症（例えば胸膜炎）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））、自己免疫疾患、アレルギー、移植拒絶反応、血液の過剰増殖性障害、および他の免疫系障害を、診断、予防、治療、または改善するための効果的な手段であり得る。したがって、ＩＬ２１Ｒアンタゴニスト、例えば抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質は、ＩＬ２１に関連する障害を治療するための治療薬として作用し得る。
【０００８】
抗ＩＬ２１Ｒ療法の通常の治療目的は、ＩＬ２１介在性の免疫活性化の阻害であるため、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質が、たとえ架橋していても、活性化（または作動性）シグナルを伝達しないことを実証することが重要である。架橋した治療用結合タンパク質の作動性潜在能力に関する懸念は、抗ＣＤ２８抗体であるＴＧＮ１４１２の静脈内投与に応答する、生命に関わる免疫毒性のサイトカインストームによって増している（Ｓｕｎｔｈａｒａｌｉｎｇｈａｍら（２００６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５５：１０１８〜２８）。１種の炎症性カスケードである、このサイトカインストーム応答は、６人の健康な成人男性において治療の数時間以内に観察された。ＴＧＮ１４１２の症例における仮説は、抗体がインビボで架橋し、ヒト対象においてサイトカインストーム応答を誘発したというものであった。臨床研究の後に行われた実験により、インビトロでの強い作動性シグナルが架橋ＴＧＮ１４１２によって伝達されたが、可溶性ＴＧＮ１４１２によっては伝達されなかったことが実証された（Ｓｔｅｂｂｉｎｇｓら（２００７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９（５）：３３２５〜３１）。ＴＧＮ１４１２の経験を踏まえると、結合タンパク質、例えば抗体、とりわけ免疫系細胞上の受容体に対する抗体が、インビボで作動性活性を獲得し得るという懸念がある。したがって、活性化シグナルが架橋抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質によって伝達され得るかどうかを決定することが、非常に重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、本発明の結合タンパク質がインビボで作動性活性を獲得し得るかどうか、またサイトカインストームまたは他の形態の炎症性カスケードを生じさせ得るかどうかを予測する方法を提供する。さらに、本発明は、いくつかのＩＬ２１応答性遺伝子の同定に基づいて、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質が中和抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質であるかどうかを決定するための方法を提供する。本発明は、サイトカインストームおよび／またはＩＬ２１応答性に関連する遺伝子の組の同定に少なくとも部分的に関連する、いくつかの他の方法を提供する。さらに、インビトロでの架橋結合タンパク質が、ＩＬ２１によって活性化される任意の遺伝子（例えば、ＩＬ２１応答性遺伝子）の遺伝子活性化を誘発するかどうかを決定することによって、治療用結合タンパク質が、ＩＬ２１Ｒを介して仲介される活性化シグナルを誘発するかどうかを予測する方法が提供される。本明細書において記載される結合タンパク質は、抗体１８Ａ５に由来するものであり、この抗体は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４９５，０８５号において開示されている。本明細書において開示される結合タンパク質は、親１８Ａ５抗体よりもはるかに優れた程度の、ヒトおよび／またはマウスＩＬ２１Ｒに対する親和性を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
少なくとも１つの実施形態において、本発明は、治療用結合タンパク質が、第１の哺乳動物対象に投与されるとサイトカインストームを誘発するかどうかを予測する方法であって、治療用結合タンパク質を第２の哺乳動物対象に投与するステップであって、第２の哺乳動物対象が結合タンパク質で処理された第２の哺乳動物対象であるステップ、結合タンパク質で処理された第２の哺乳動物対象から血液試料を得るステップ、結合タンパク質で処理された第２の哺乳動物対象の血液における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを決定するステップ、および結合タンパク質で処理された第２の哺乳動物対象の血液における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを、未処理の第２の哺乳動物対象の血液における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルと比較するステップを包含し、結合タンパク質で処理された第２の哺乳動物対象における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルが、未処理の第２の哺乳動物対象における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルよりも実質的に大きいことにより、治療用結合タンパク質が第１の哺乳動物対象においてサイトカインストームを誘発することが示される、方法を提供する。いくつかの実施形態において、第１の哺乳動物対象は、ヒト対象である。いくつかの実施形態において、治療用結合タンパク質は、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質（例えば、ＡｂＡ〜ＡｂＺ）である。特定の実施形態において、第２の哺乳動物対象は、安全性試験用の動物種の１種（例えば、カニクイザル対象）である。いくつかの実施形態において、少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子は、ＩＬ４、ＩＬ２、ＩＬ１β、ＩＬ１２、ＴＮＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ６、ＩＬ８、およびＩＬ１０からなる群から選択される。本方法は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、もしくは少なくとも９つ、またはそれ以上のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを決定することを包含し得る。いくつかの実施形態において、結合タンパク質で処理された第２の哺乳動物対象の血液における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを決定する方法は、少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定することを包含する。いくつかの実施形態において、この決定は、少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子のタンパク質発現レベルを測定すること（例えば、少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子のサイトカイン放出レベルを測定すること）を包含する。
【００１１】
少なくとも１つの実施形態において、本発明は、治療用結合タンパク質が哺乳動物対象においてサイトカインストームを誘発するかどうかを予測する方法であって、哺乳動物対象から血液試料を得るステップ、治療用結合タンパク質を血液試料とインキュベートするステップであって、血液試料が結合タンパク質で処理された血液試料であるステップ、結合タンパク質で処理された血液試料における少なくとも１個のサイトイカインストーム遺伝子の発現レベルを決定するステップ、および結合タンパク質で処理された血液試料における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを、未処理のまたは陰性対照で処理された血液試料における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルと比較するステップを包含し、結合タンパク質で処理され血液試料における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルが、未処理のまたは陰性対照で処理された血液試料における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルよりも実質的に大きいことにより、治療用結合タンパク質が哺乳動物対象においてサイトカインストームを誘発することが示される、方法を提供する。いくつかの実施形態において、結合タンパク質で処理された血液試料における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルが、未処理のまたは陰性対照で処理された血液試料における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルよりも実質的に小さいことにより、治療用結合タンパク質が哺乳動物対象においてサイトカインストームを誘発しないことが示される。いくつかの実施形態において、哺乳動物対象は、ヒト対象である。いくつかの実施形態において、哺乳動物対象は、安全性試験用の動物種の１種（例えば、カニクイザル対象）である。本発明のいくつかの実施形態において、血液試料は、精製末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料である。さらなる実施形態において、治療用結合タンパク質は、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質であり、少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子は、ＩＬ４、ＩＬ２、ＩＬ１β、ＩＬ１２、ＴＮＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ６、ＩＬ８、およびＩＬ１０からなる群から選択され、本方法は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、または少なくとも９個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを決定することを包含する。いくつかの実施形態において、結合タンパク質で処理された血液試料における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを決定する方法は、少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定することを包含する。いくつかの他の実施形態において、この決定は、少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子のタンパク質発現レベルを測定すること（例えば、少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子のサイトカイン放出レベルを測定すること）を包含する。
【００１２】
少なくとも１つの実施形態において、本発明は、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質が中和抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質であるかどうかを決定する方法であって、対象の第１の血液試料をＩＬ２１リガンドと接触させるステップ、ＩＬ２１リガンドと接触させた第１の血液試料における少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子の発現レベルを決定するステップ、対象の第２の血液試料を抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の存在下でＩＬ２１リガンドと接触させるステップ、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の存在下でＩＬ２１リガンドと接触させた第２の血液試料における少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子の発現レベルを決定するステップ、および少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子の決定された発現レベルを比較するステップを包含し、少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子の発現レベルにおける変化が、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質が中和結合タンパク質であることを示す、方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、安全性試験用の動物種の１種）である。いくつかの実施形態において、少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子は、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ４０、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＧＺＭＢ、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１２β、ＩＬ１β、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ６、ＰＲＦ１、ＰＴＧＳ２、およびＴＢＸ２１からなる群から選択される。
【００１３】
本発明はまた、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質が治療用抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質であるかどうかを決定する方法であって、対象の第１の血液試料をＩＬ２１リガンドと接触させるステップ、ＩＬ２１リガンドと接触させた第１の血液試料における少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子の発現レベルを決定するステップ、対象の第２の血液試料を抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の存在下でＩＬ２１リガンドと接触させるステップ、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の存在下でＩＬ２１リガンドと接触させた第２の血液試料における少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子の発現レベルを決定するステップ、および少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子のこれら２つの発現レベルを比較するステップを包含し、少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子の発現レベルにおける実質的な変化が、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質が治療用結合タンパク質であることを示す、方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、安全性試験用の動物種の１種）である。いくつかの実施形態において、少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子は、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ４０、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＧＺＭＢ、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１２β、ＩＬ１β、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ６、ＰＲＦ１、ＰＴＧＳ２、およびＴＢＸ２１からなる群から選択される。
【００１４】
本発明はまた、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の薬力学的活性を決定する方法であって、対象の血液試料における少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子の発現レベルの調整を検出することを包含する方法を提供する。この方法の少なくとも１つの実施形態において、少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子の発現レベルの調整の検出は、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質を対象に投与するステップであって、対象が抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質で処理されるステップ、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質で処理された対象の血液試料をＩＬ２１リガンドと接触させるステップ、ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質で処理された対象のＩＬ２１リガンドと接触させた血液試料における少なくとも１個のＩＬ２１Ｒ応答性遺伝子の発現レベルを決定するステップ、および少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子のこの決定された発現レベルを、ＩＬ２１リガンドと接触させた血液試料における少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子の発現レベルと比較するステップであって、血液試料が抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質で処理されていない対象由来であるステップを包含する。いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物（例えば、サル、ヒト）である。いくつかの実施形態において、少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子は、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ４０、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＧＺＭＢ、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１２β、ＩＬ１β、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ６、ＰＲＦ１、ＰＴＧＳ２、およびＴＢＸ２１からなる群から選択される。いくつかのさらなる実施形態において、少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子は、ＣＤ１９、ＧＺＭＢ、ＰＲＦ１、ＩＬ２ＲＡ、ＩＦＮγ、およびＩＬ６から選択される。
【００１５】
本発明はまた、ＩＬ２１Ｒに関連する障害を有する試験対象を診断する方法であって、健康な対象と比較した、試験対象の血液試料の免疫細胞における少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子の発現レベルの差を検出することを包含する方法を提供する。少なくとも１つの実施形態において、本方法は、健康な対象の血液試料における少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子の発現レベルを決定するステップ、試験対象の血液試料における少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子の発現レベルを決定するステップ、および少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子のこれらの発現レベルを比較するステップを包含し、少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子の発現レベルの差は、試験対象がＩＬ２１Ｒに関連する障害に罹患していることを示す。いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物（例えば、サル、ヒト）である。いくつかの実施形態において、少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子は、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ４０、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＧＺＭＢ、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１２β、ＩＬ１β、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ６、ＰＲＦ１、ＰＴＧＳ２、およびＴＢＸ２１からなる群から選択される。いくつかのさらなる実施形態において、少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子は、ＣＤ１９、ＧＺＭＢ、ＰＲＦ１、ＩＬ２ＲＡ、ＩＦＮγ、およびＩＬ６から選択される。いくつかの実施形態において、ＩＬ２１Ｒに関連する障害は、自己免疫障害、炎症状態、アレルギー、移植拒絶反応、および血液の過剰増殖性障害からなる群から選択される。
【００１６】
本発明はまた、インビトロでの架橋結合タンパク質が、ＩＬ２１によって活性化される任意の遺伝子（すなわち、ＩＬ２１応答性遺伝子）の遺伝子活性化を誘発するかどうかを決定することによって、治療用結合タンパク質が、ＩＬ２１Ｒを介して仲介される活性化シグナルを誘発するかどうかを予測する方法を提供する。
【００１７】
本開示のさらなる態様は、一部は本記載において説明され、一部は本記載から明らかとなり、または本発明の実施により知ることができる。本発明は、特許請求の範囲において説明され、具体的に指摘されており、また、本開示は、特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００１８】
以下の詳細な説明には、本発明の様々な実施形態の代表的な例が含まれ、これは、特許請求されている本発明を制限するものではない。添付の図面は、この明細書の一部を構成するものであり、本記載と共に、実施形態を説明するためだけに機能し、本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａは、２時間、４時間、６時間、または２４時間のいずれかの時点における異なる濃度のＩＬ２１での（Ｘ軸）、６つの検査された遺伝子（ＣＤ１９、ＧＺＭＢ、ＩＦＮγ（ＩＦＮＧ）、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ６、およびＰＲＦ１）の遺伝子発現の相対定量（ＲＱ、Ｙ軸）を示す図である。図１Ｂは、異なる濃度のＡｂＳ（Ｘ軸）で処理した後の、同一の遺伝子のＩＬ２１応答の阻害パーセント（Ｙ軸）を表す図である。
【図２】ＩＬ２１によって誘発される、インビトロでのタンパク質（図２Ａ）シグナルまたはインビトロでのＲＮＡ（図２Ｂ）シグナルのいずれかを表す図である。図２Ａは、１μｇ／ウェルのＴＧＮ１４１２で処理した後に報告された応答と比較した、３３ｎｇ／ｍＬのＩＬ２１で処理した後の、５人の個別のヒトドナー（Ｘ軸）から得られる末梢血単核球（ＰＢＭＣ）におけるＴＮＦタンパク質シグナルまたはＩＬ８タンパク質シグナルのいずれかの程度（Ｙ軸、刺激／対照）を示す図である。図２Ｂは、様々な遺伝子転写産物（Ｘ軸）の遺伝子活性化に対する、抗ＣＤ２８抗体またはＡｂＳの効果（ＩｇＧＴＭ対照に対する比較で表される）（Ｙ軸、平均ｌｏｇ２倍率変化）を表す図である。
【図３】インビトロでの結合タンパク質（例えば、抗ＩＬ２１Ｒ抗体）介在性のＰＢＭＣ活性化を試験するためのスキームを表す図である。
【図４】４５０ｎｍでのＯ．Ｄ．によって測定された（Ｙ軸）、乾燥被覆プレートおよび抗ＩｇＧ被覆プレートの両方における、表示された濃度（Ｘ軸）でのいくつかの被覆抗体の持続性を実証する確認ＥＬＩＳＡから得られる結果を表す図である。
【図５】ＡｂＳに応じたＲＮＡ発現またはサイトカイン放出の上方調節を決定するための、ヒトドナーから得られるＰＢＭＣに対する、架橋ＡｂＳのインビトロでの試験に用いられる手順を表す図である。
【図６】５人の個別のヒトドナーから得られるＰＢＭＣについてのインビトロでの実験における、サイトカイン放出およびＲＮＡ発現に対する架橋ＡｂＳの効果を表す図である。図６Ａは、２０時間の時点での、ＩＦＮγ放出の誘発（媒質対照と比較した変化として表される、ｐｇ／ｍｌ、Ｙ軸）に対する、表示された濃度での架橋ＡｂＳ、ＩＬ２１（陽性対照）、ならびにＩｇＧＴＭ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧＦｃ（全て陰性対照）（Ｘ軸）の効果を表す図である。図６Ｂは、乾燥被覆プレートにおいてまたは抗ＩｇＧ被覆プレートに対して行われる実験による、４時間の時点での、様々な表示されたＲＮＡの発現（Ｙ軸、ＩｇＧＴＭ対照と比較した倍率変化）に対する、表示された濃度でのＡｂＳまたはＩＬ２１の効果を表す図である。
【図７】ＬＰＳ刺激またはＰＨＡ刺激の効果と比較した、カニクイザルの血液におけるＩＬ２ＲＡおよびＴＮＦαの応答に対するＩＬ２１刺激の効果（Ｙ軸、刺激されていない血液に対する、ＲＮＡ濃度の増大）を表す図である。
【図８】カニクイザルの血液に対するエクスビボでの実験における、ＩｇＧ対照と比較した、ＩＬ２１で刺激されたＩＬ２ＲＡ発現に対する３つの表示された濃度でのＡｂＳの効果（Ｙ軸、相対的なＩＬ２ＲＡ発現レベル（ＲＱ））を表す図である。
【図９】未処理のサルと比較した、ＡｂＳで処理されたカニクイザルに対するインビボでの実験における、異なる時点での、ＴＮＦαおよびＩＦＮγに対するＡｂＳの効果（Ｙ軸、ベースラインと比較したＲＮＡ濃度における変化（ベースラインを１と設定する））を表す図である。結果はまた、２時間のインビトロでの実験における、ＴＮＦに対するＬＰＳ刺激またはＰＨＡ刺激の効果と比較される（挿入図）。ＡおよびＢは、２頭の異なるカニクイザルの全血球を用いた実験を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書において開示される抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質は、ＩＬ２１活性の潜在的阻害剤として記載されており、ＩＬ２１に関連する障害を治療するための有望な治療薬となる。抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の、限定はしないがそれらの薬物動態学的および薬力学的活性を含む特性は、２００９年５月２６日に出願された米国特許出願第１２／４７２，２３７号、および２００８年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／０５５，５４３号において詳細に記載されており、これらの文献の両方は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２１】
具体的には、いくつかの結合タンパク質、例えば、ＡｂＳを含む、本明細書において開示されるＡｂＡ〜ＡｂＺの範囲内のいくつかは、ＩＬ２１ＲとのＩＬ２１の相互作用を強力に遮断し、それによりＩＬ２１経路またはサイトカインストームを誘発することなく、ＩＬ２１応答性サイトカインまたはＩＬ２１応答性遺伝子の発現を調整する。拮抗的結合タンパク質などのタンパク質アンタゴニストが、投与されると有害な免疫反応を誘発するかどうか、例えばサイトカインストームを誘発するかどうかの決定は、現在では、新たな治療薬の開発および試験における、ならびに／または、管理機関（例えば、米国食品医薬品局）による製品の承認の前、最中、および／もしくは後の、潜在的な治療用製品の安全性プロフィールの評価における、重要なステップであることが理解されている。したがって、本発明は、サイトカインストームの誘発に対する、結合タンパク質、例えば抗体、例えば拮抗性抗ＩＬ２１Ｒ抗体の効果を試験するための新規なアッセイを利用する。結果として、ＡｂＳおよび他の結合タンパク質は、本明細書において、サイトカインストームの活性化を誘発しないＩＬ２１経路の潜在的阻害剤であることが実証され、したがって、これらの結合タンパク質は、有望な治療標的となる。
【００２２】
定義
本発明がさらに容易に理解され得るようにするために、特定の用語をまず定義する。さらなる定義は、詳細な説明の全体にわたり、および明細書の他の箇所で説明される。
【００２３】
「インターロイキン−２１受容体」または「ＩＬ２１Ｒ」などの用語は、ＩＬ２１リガンドに結合する、ＭＵ−１（例えば、米国特許出願第０９／５６９，３８４号、ならびに米国特許出願公開第２００４／０２６５９６０号、第２００６／０１５９６５５号、第２００６／００２４２６８号、および第２００８／０２４１０９８号を参照されたい）、ＮＩＬＲ、またはｚａｌｐｈａｌ１（例えば、国際出願公開ＷＯ０１／０８５７９２、上記のＰａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら（２０００）、上記のＯｚａｋｉら（２０００）を参照されたい）としても知られている、クラスＩのサイトカインファミリー受容体を言う。ＩＬ２１Ｒは、ＩＬ２受容体およびＩＬ１５受容体が共有するβ鎖ならびにＩＬ４受容体α鎖に相同である（上記のＯｚａｋｉら（２０００））。リガンドが結合すると、ＩＬ２１Ｒは共通のガンマサイトカイン受容体鎖（γｃ）と相互作用すること、およびＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３（上記のＡｓａｏら（２００１））またはＳＴＡＴ５（上記のＯｚａｋｉら（２０００））のリン酸化を誘発することが可能である。ＩＬ２１Ｒは、広いリンパ組織分布を示す。「インターロイキン−２１受容体」または「ＩＬ２１Ｒ」などの用語はまた、ポリペプチド（好ましくは哺乳動物由来のもの、例えばマウスまたはヒトのＩＬ２１Ｒ）を言うか、または、文脈上必要な場合は、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、ＩＬ２１（好ましくは哺乳動物由来のＩＬ２１、例えばマウスまたはヒトのＩＬ２１Ｒ）と相互作用することができ、かつ、（１）天然に生じる哺乳動物ＩＬ２１Ｒポリペプチドのアミノ酸配列またはその断片、例えば、配列番号２（ヒト−ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）アクセッション番号ＮＰ＿０６８５７０に対応する）または配列番号４（マウス−ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＰ＿０６８６８７に対応する）で示されるアミノ酸配列またはその断片、（２）配列番号２または配列番号４で示されるアミノ酸配列またはその断片に実質的に相同な、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同なアミノ酸配列、（３）天然に生じる哺乳動物ＩＬ２１Ｒヌクレオチド配列またはその断片（例えば、配列番号１（ヒト−ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０２１７９８に対応する）または配列番号３（マウス−ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０２１８８７に対応する）またはその断片）によってコードされるアミノ酸配列、（４）配列番号１または配列番号３で示されるヌクレオチド配列またはその断片に実質的に相同な、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同なヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、（５）天然に生じるＩＬ２１Ｒヌクレオチド配列、例えば配列番号１もしくは配列番号３またはその断片に縮重するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、またはその断片、あるいは（６）ストリンジェントな条件下、例えば高度にストリンジェントな条件下で、前述のヌクレオチド配列の１つにハイブリ���イズするヌクレオチド配列、という特徴の少なくとも１つを有するポリヌクレオチドを言う。さらに、他のヒト以外のおよび哺乳動物以外のＩＬ２１Ｒが、開示される方法において有用であると考えられる。
【００２４】
「インターロイキン−２１」または「ＩＬ２１」という用語は、ＩＬ２、ＩＬ４、およびＩＬ１５に対する配列相同性を示し（上記のＰａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら（２０００））、かつＩＬ２１Ｒに結合するサイトカインを言う。このようなサイトカインは、そのファミリーの代表である「４ヘリックスバンドル」構造への共通のフォールディングを共有する。ＩＬ２１は、活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞において主に発現し、かつ、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、およびＴ細胞に対する効果を有することが報告されている（上記のＰａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら（２０００）、上記のＫａｓａｉａｎら（２００２））。ＩＬ２１がＩＬ２１Ｒに結合すると、ＩＬ２１Ｒの活性化により、例えば、ＳＴＡＴ５シグナル伝達またはＳＴＡＴ３シグナル伝達が生じる（上記のＯｚａｋｉら（２０００））。「インターロイキン−２１」または「ＩＬ２１」という用語はまた、ポリペプチド（好ましくは哺乳動物由来のもの、例えばマウスまたはヒトのＩＬ２１）を言うか、または、文脈上必要な場合は、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、ＩＬ２１Ｒ（好ましくは哺乳動物由来のもの、例えばマウスまたはヒトのＩＬ２１Ｒ）と相互作用することができ、かつ、（１）天然に生じる哺乳動物ＩＬ２１のアミノ酸配列もしくはその断片、例えば、配列番号２１２（ヒト）で示されるアミノ酸配列もしくはその断片、（２）配列番号２１２で示されるアミノ酸配列もしくはその断片に実質的に相同な、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％相同なアミノ酸配列、（３）天然に生じる哺乳動物ＩＬ２１ヌクレオチド配列もしくはその断片（例えば、配列番号２１１（ヒト）もしくはその断片）によってコードされるアミノ酸配列、（４）配列番号２１１で示されるヌクレオチド配列もしくはその断片に実質的に相同な、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％相同なヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、（５）天然に生じるＩＬ２１ヌクレオチド配列もしくはその断片に縮重するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、または（６）ストリンジェントな条件下、例えば高度にストリンジェントな条件下で、前述のヌクレオチド配列の１つにハイブリダイズするヌクレオチド配列、という特徴の少なくとも１つを有するポリヌクレオチドを言う。
【００２５】
「ＩＬ２１Ｒ活性」などの用語（例えば、「ＩＬ２１Ｒの活性」、「ＩＬ２１／ＩＬ２１Ｒ活性」）は、ＩＬ２１Ｒの結合の結果として開始または中断される少なくとも１個の細胞プロセスを言う。ＩＬ２１Ｒ活性には、限定はしないが、（１）リガンド、例えばＩＬ２１ポリペプチドとの相互作用、例えば結合と、（２）シグナル変換（「シグナル伝達」とも呼ばれ、これは、特定の刺激に応じて生じる細胞内カスケードについて言う）およびシグナル変換分子（例えば、ガンマ鎖（γｃ）およびＪＡＫ１）との会合もしくはその活性化、ならびに／または、ＳＴＡＴタンパク質、例えばＳＴＡＴ５および／もしくはＳＴＡＴ３のリン酸化および／もしくは活性化の刺激と、（３）免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、および巨核球の、増殖、分化、エフェクター細胞機能、細胞溶解活性、サイトカイン分泌、および／または生存の調整と、（４）ＩＬ２１応答性の遺伝子またはサイトカインの発現の調整、例えば、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ４０、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＧＺＭＢ、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１２β、ＩＬ１β、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ６、ＰＲＦ１、ＰＴＧＳ２、およびＴＢＸ２１などの発現レベルに対するＩＬ２１の効果の調整とが含まれる。
【００２６】
本明細書において用いられる「結合タンパク質」という用語には、抗原、標的タンパク質、もしくはペプチド、または１つもしくは複数のその断片と結合する、あらゆる天然に生じるタンパク質、組換えタンパク質、合成タンパク質、もしくは遺伝子操作されたタンパク質、またはその組合せが含まれる。本発明に関連する結合タンパク質は、抗体を含み得るか、または少なくとも１個の抗体断片に由来し得る。結合タンパク質は、天然に生じるタンパク質、および／または合成によって改変されたタンパク質を含み得る。本発明の結合タンパク質は、抗原またはその断片に結合して、複合体を形成し、生物学的応答を引き起こし得る（例えば、特定の生物学的活性を作動させる、または前記活性に拮抗する）。結合タンパク質は、単離された抗体断片、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって繋がれている、組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）、ならびに超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位を含み得る。結合タンパク質断片はまた、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、および抗体の単一可変ドメイン（ｄＡｂ）などの、抗体の機能的断片を含み得る。結合タンパク質は、二本鎖または一本鎖であってもよく、かつ、単一の結合ドメインまたは複数の結合ドメインを包含し得る。
【００２７】
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、指定されたタンパク質もしくはペプチドまたはその断片に対して反応性である免疫グロブリンを言う。適切な抗体には、限定はしないが、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、単一特異的抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体、非特異的抗体、二重特異的抗体、複特異的抗体、ヒト化抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、突然変異抗体、グラフト結合抗体（すなわち、他のタンパク質、放射性標識、細胞毒素にコンジュゲートまたは融合している抗体）、およびインビトロで生成した抗体が含まれる。本発明の抗体は、限定はしないが、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、ニワトリ、およびウシを含む、あらゆる種に由来し得る。典型的には、抗体は、所定の抗原、例えば、炎症性障害、免疫障害、自己免疫障害、神経変性障害、代謝障害、および／または悪性障害などの障害に関連する抗原（例えば、ＩＬ２１Ｒ）に特異的に結合する。
【００２８】
抗体（免疫グロブリン）を包含する結合タンパク質は、典型的には、それぞれがおよそ２５ｋＤａの２つの軽（Ｌ）鎖と、それぞれがおよそ５０ｋＤａの２つの重（Ｈ）鎖とからなる、四量体グリコシル化タンパク質である。ラムダ（λ）およびカッパ（κ）と呼ばれる２つのタイプの軽鎖を、抗体において見ることができる。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＭ（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）という５つの主要クラスに割り当てることができ、これらのいくつかはさらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分割され得る。各軽鎖は、Ｎ末端の可変（Ｖ）ドメイン（ＶＬ）および定常（Ｃ）ドメイン（ＣＬ）を含む。各重鎖は、Ｎ末端のＶドメイン（ＶＨ）、３つまたは４つのＣドメイン（ＣＨ）、およびヒンジ領域を含む。ＶＨに最も近位のＣＨドメインは、ＣＨ１と称される。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、ＣＤＲと呼ばれる超可変配列の３つの領域のための足場を形成する、フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）と呼ばれる、比較的保存された配列の４つの領域からなる。ＣＤＲは、抗原との抗体の特異的相互作用に関与する残基のほとんどを含有する。ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる。重鎖上のＣＤＲ構成要素は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３と呼ばれ（本明細書においては、それぞれ、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、およびＣＤＲ  Ｈ３とも呼ばれる）、一方、軽鎖上のＣＤＲ構成要素は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３と呼ばれる（本明細書においては、それぞれ、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、およびＣＤＲ  Ｌ３とも呼ばれる）。
【００２９】
ＣＤＲ３は、典型的には、抗原結合部位内の分子多様性の最大の原因である。ＣＤＲ  Ｈ３は、例えば、２アミノ酸残基という短さのこともあり、または、２６アミノ酸を超えることもあり得る。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元立体配座が、当技術分野において周知である。抗体の構造の概説については、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）を参照されたい。当業者には、各サブユニット構造、例えば、ＣＨ、ＶＨ、ＣＬ、ＶＬ、ＣＤＲ、および／またはＦＲ構造が、活性断片を包含することが認識され、前記活性断片は、例えば、抗原に結合するＶＨ、ＶＬ、もしくはＣＤＲサブユニットの部分、すなわち抗原結合断片であるか、または、例えば、Ｆｃ受容体および／もしくは補体などに結合する、および／もしくはそれを活性化する、ＣＨサブユニットの部分である。ＣＤＲは、典型的には、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ（Ｋａｂａｔら（第５版、１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１〜３２４２において記載されている）を言う。抗原結合部位を特徴付けするための別の標準は、例えばＣｈｏｔｈｉａら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９〜８１７、およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：４６２８〜３８において記載されている、超可変ループを参照することである。さらに別の標準は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられる「ＡｂＭ」定義である（全体として、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１）、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇを参照されたい）。Ｋａｂａｔ  ＣＤＲに関して記載されている実施形態は、代替として、Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループ、またはＡｂＭによって規定されたループに関する類似の記載された関連を用いて実行することができる。
【００３０】
アセンブリおよび体細胞突然変異の後の抗体遺伝子の配列は大きく変化しており、これらの変化した遺伝子は、１０１０個の異なる抗体分子をコードすると推定される（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ、第２版（１９９５）Ｊｏｎｉｏら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。
【００３１】
「抗原結合ドメイン」および「抗原結合断片」という用語は、結合タンパク質と抗原との間の特異的結合に関与するアミノ酸を包含する、結合タンパク質の一部（すなわち、結合タンパク質断片）を言う。結合タンパク質によって特異的に認識され結合される抗原の部分は、「エピトープ」と呼ばれる。抗原結合ドメインは、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）を包含し得るが、両方を包含している必要はない。Ｆｄ断片は、例えば、２つのＶＨ領域を有し、また、無傷の抗原結合ドメインの抗原結合機能を保持することが多い。結合タンパク質の抗原結合断片の例には、限定はしないが、（１）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインを有する一価断片である、Ｆａｂ断片、（２）ジスルフィド架橋によってヒンジ領域で結合している２つのＦａｂ断片を有する二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片、（３）２つのＶＨドメインおよび１つのＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片、（４）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインを有するＦｖ断片、（５）ＶＨドメインを有するｄＡｂ断片（例えば、Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜４６を参照されたい）、（６）単離されたＣＤＲ、ならびに（７）一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が含まれる。Ｆａｂ断片は、定常領域間のジスルフィド結合によって共有結合している、ＶＨ−ＣＨ１ドメインおよびＶＬ−ＣＬドメインからなる。Ｆｖ断片はさらに小さく、非共有結合しているＶＨドメインおよびＶＬドメインからなる。Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え方法を用いて、それらが一本のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって繋げることができ、このタンパク質鎖において、ＶＬ領域およびＶＨ領域は、対合して一価分子（ｓｃＦｖとして知られている）を形成する（例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜２６、Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜８３を参照されたい）。これは、非共有結合したドメインが解離する傾向にあることを克服するために行われる。合成ポリペプチドリンカーは、（１）ＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端に連結するか、または（２）ＶＬのＣ末端をＶＨのＮ末端に連結する。例えば、１５ｍｅｒの（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドをリンカーとして用いることができるが、他のリンカーも当技術分野において知られている。抗原結合断片は、当業者に知られている従来の技術を用いて得ることができ、断片は、例えば抗体などの無傷の結合タンパク質と同じように、機能について評価される。
【００３２】
当業者に知られている多くの方法が、結合タンパク質またはその抗原結合断片を得るために利用可能である。例えば、抗ＩＬ２１Ｒ抗体を含む抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質を、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）を用いて作製することができる。モノクローナル抗体もまた、既知の方法に従ったハイブリドーマの生成によって作製することができる（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜９９を参照されたい）。この様式で形成されるハイブリドーマは、次に、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））分析などの標準的な方法を用いてスクリーニングされ、特定の抗原と特異的に結合する抗体を産生する１つまたは複数のハイブリドーマが同定される。特定された抗原のあらゆる形態を、免疫原として、例えば、組換え抗原、天然に生じる形態、そのあらゆる変異体または断片、およびその抗原ペプチドとして用いることができる。
【００３３】
抗体を作製する１つの例示的な方法には、タンパク質発現ライブラリー、例えば、ファージディスプレイライブラリーまたはリボソームディスプレイライブラリーのスクリーニングが含まれる。ファージディスプレイは、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５〜１７、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜２８、Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜９７、ＷＯ９２／０１８６１９、ＷＯ９１／０１７２７１、ＷＯ９２／０２０７９１、ＷＯ９２／０１５６７９、ＷＯ９３／００１２８８、ＷＯ９２／００１０４７、ＷＯ９２／００９６９０、およびＷＯ９０／００２８０９において記載されている。米国出願第１２／４７２，２３７号において詳細に記載されているように、本発明に関連するいくつかの抗体は、ファージディスプレイ技術によって作製された。
【００３４】
ディスプレイライブラリーの使用に加え、特定された抗原を、ヒト以外の動物、例えば、サル、ニワトリ、および齧歯動物（例えば、マウス、ハムスター、およびラット）を免疫化するために用いることができる。１つの実施形態において、ヒト以外の動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、ヒトＩｇ遺伝子座の大きな断片を用いて、マウス抗体の産生を欠いたマウス株を遺伝子工学的に作製することが可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子に由来する抗原特異的モノクローナル結合抗体を、作製および選択することができる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎら（１９９４）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．７：１３〜２１、米国特許第７，０６４，２４４号、ＷＯ９６／０３４０９６、およびＷＯ９６／０３３７３５を参照されたい）。
【００３５】
別の実施形態において、結合タンパク質は、ヒト以外の動物から得られ、次に当技術分野において知られている組換えＤＮＡ技術を用いて修飾された（例えば、キメラ、ヒト化、脱免疫化）、モノクローナル抗体である。キメラ抗体を作製するための様々なアプローチが記載されている（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１（２１）：６８５１〜５５、Ｔａｋｅｄａら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４（６０１０）：４５２〜５４、米国特許第４，８１６，５６７号、米国特許第４，８１６，３９７号、欧州特許公開ＥＰ０１７１４９６、欧州特許公開ＥＰ０１７３４９４、および英国特許ＧＢ２１７７０９６を参照されたい）。
【００３６】
ヒト化結合抗体は、例えば、ヒトの重鎖および軽鎖の遺伝子を発現するが内因性マウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の遺伝子は発現することができないトランスジェニックマウスを用いて、作製することができる。Ｗｉｎｔｅｒ（米国特許第５，２２５，５３９号）は、本明細書において記載されるヒト化結合タンパク質を調製するために用いることができる例示的なＣＤＲグラフト法を記載している。特定のヒト結合タンパク質のＣＤＲの全てを、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置き換えてもよく、または、ＣＤＲのいくつかのみを、非ヒトＣＤＲで置き換えてもよい。所定の抗原に対するヒト化結合タンパク質の結合に必要なＣＤＲの数を置き換えさえすればよい。
【００３７】
ヒト化結合タンパク質またはその断片は、抗原の結合に直接的には関与しないＦｖ可変ドメインの配列を、ヒトＦｖ可変ドメインから得られる同等の配列で置き換えることにより生成させることができる。ヒト化結合タンパク質またはその断片を生成させるための例示的な方法は、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２〜０７、Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４、ならびに米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、第５，８５９，２０５号、および第６，４０７，２１３号によって提供されている。これらの方法には、重鎖または軽鎖の少なくとも１つから得られる免疫グロブリンＦｖ可変ドメインの全てまたは一部をコードする核酸配列の単離、操作、および発現が含まれる。このような核酸は、上記のような、所定の標的に対する結合タンパク質、例えば抗体を産生するハイブリドーマ、および他の供給源から得ることができる。ヒト化結合タンパク質分子をコードする組換えＤＮＡは次に、適切な発現ベクター内にクローニングすることができる。
【００３８】
特定の実施形態において、ヒト化結合抗体は、保存的な置換、コンセンサス配列の置換、生殖細胞系の置換、および／または復帰突然変異の導入によって最適化される。このような改変された免疫グロブリン分子は、当技術分野において知られているいくつかの技術のいずれかによって作製することができる（例えば、Ｔｅｎｇら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７３０８〜７３、Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２７９、Ｏｌｓｓｏｎら（１９８２）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：３〜１６、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／００６１９３、およびＥＰ０２３９４００を参照されたい）。
【００３９】
結合タンパク質またはその断片はまた、ヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失によって、または、例えばＷＯ９８／０５２９７６およびＷＯ００／０３４３１７において開示されている方法による「脱免疫化」によって、修飾することができる。簡潔に述べると、抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインを、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて分析することができ、これらのペプチドは、潜在的なＴ細胞エピトープに相当する（ＷＯ９８／０５２９７６およびＷＯ００／０３４３１７において定義されている）。潜在的なＴ細胞エピトープを検出するために、「ペプチドスレッディング」と呼ばれるコンピュータモデリングアプローチを適用することができ、さらに、例えばＷＯ９８／０５２９７６およびＷＯ００／０３４３１７において記載されているように、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを、ＶＨ配列およびＶＬ配列内に存在するモチーフについて検索することができる。これらのモチーフは、１８個の主要なＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲアロタイプのいずれかに結合し、それにより、潜在的なＴ細胞エピトープを構成する。検出された潜在的なＴ細胞エピトープは、可変ドメイン内の少数のアミノ酸残基を置換することにより、または単一アミノ酸の置換により、取り除くことができる。典型的には、保存的な置換が行われる。これだけに限られるわけではないが、ヒト生殖細胞系抗体の配列における１つの位置に共通しているアミノ酸を用い得ることが多い。ヒト生殖細胞系の配列は、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６〜９８、Ｃｏｏｋら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １６（５）：２３７〜４２、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９〜８１７、およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：４６２８〜３８において開示されている。Ｖ  ＢＡＳＥディレクトリは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的なディレクトリを提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫによってまとめられている）。これらの配列は、例えばフレームワーク領域およびＣＤＲについての、ヒト配列の供給源として、用いることができる。例えば米国特許第６，３００，０６４号において記載されているように、コンセンサスヒトフレームワーク領域もまた用いることができる。
【００４０】
「ヒト結合タンパク質」という用語には、例えば、Ｋａｂａｔら（第５版、１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１〜３２４２によって記載されているものを含む、当技術分野において知られているヒト生殖細胞系免疫グロブリンの配列に実質的に対応する可変領域および定常領域を有する、結合タンパク質が含まれる。本発明のヒト結合タンパク質（例えばヒト抗体）には、例えばＣＤＲにおいて、とりわけＣＤＲ３において、ヒト生殖細胞系免疫グロブリンの配列によってはコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでの、ランダムなもしくは部位特異的な突然変異生成によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）が含まれ得る。ヒト結合タンパク質は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリンの配列によってはコードされないアミノ酸残基で置換された、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の位置を有し得る。
【００４１】
結合タンパク質の領域、例えば、抗体の定常領域は、抗体の特性を修飾するため（例えば、Ｆｃ受容体の結合、抗体のグリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、または補体機能の１つまたは複数を、増大または低減させるため）に改変、例えば突然変異させることができる。
【００４２】
特定の実施形態において、結合タンパク質は、改変された、免疫グロブリンの定常領域またはＦｃ領域を含有し得る。例えば、結合タンパク質は、エフェクター分子の活性、溶解、補体介在性の活性、結合タンパク質のクリアランス、および結合タンパク質の半減期などの、結合タンパク質のいくつかの免疫機能を制御することができる、補体および／またはＦｃ受容体などのエフェクター分子に、さらに強力に結合し得るか、または前記分子に対するさらなる特異性を有し得る。結合タンパク質（例えばＩｇＧ抗体）のＦｃ領域に結合する典型的なＦｃ受容体には、限定はしないが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃＲｎサブクラスの受容体が含まれ、これには、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシングをされた形態が含まれる。Ｆｃ受容体は、例えば、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ（１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７〜９２、Ｃａｐｅｌら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５〜３４、ならびにｄｅ  Ｈａａｓら（１９９５）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０〜４１において概説されている。
【００４３】
本明細書において用いられる「単一ドメイン結合タンパク質」という用語には、抗原、タンパク質、またはポリペプチドに結合する、あらゆる単一ドメイン結合足場が含まれる。単一ドメイン結合タンパク質には、抗原またはその断片と結合して、複合体を形成し、生物学的応答を引き起こす（例えば、特定の生物学的活性を作動させるかまたは前記活性に拮抗する）、あらゆる天然タンパク質足場、組換えタンパク質足場、合成タンパク質足場、もしくは遺伝子操作されたタンパク質足場、またはその組合せが含まれ得る。単一ドメイン結合タンパク質は、天然に生じるタンパク質もしくは抗体に由来し得るか、または、それらは、合成により作製するかもしくは組換え技術によって作製することができる。本発明の特定の実施形態において、単一ドメイン結合タンパク質には、ＣＤＲが単一ドメインポリペプチドの一部である、結合タンパク質が含まれる。例には、限定はしないが、重鎖結合タンパク質、軽鎖を天然に欠いている結合タンパク質、従来の４本鎖抗体に由来する単一ドメイン結合タンパク質、改変された結合タンパク質、および抗体に由来するもの以外の単一ドメイン足場が含まれる。単一ドメイン結合タンパク質には、当技術分野において知られているあらゆるもの、および、あらゆる今後決定されるかまたは知られる単一ドメイン結合タンパク質が含まれる。単一ドメイン結合タンパク質は、限定はしないが、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、ニワトリ、およびウシを含むあらゆる種に由来し得る。本発明の１つの態様において、単一ドメイン結合タンパク質は、魚において見られる免疫グロブリンの可変領域、例えば、サメの血清において見られるＮｏｖｅｌ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＡＲ）として知られている免疫グロブリンアイソタイプに由来する可変領域に由来し得る。ＮＡＲの可変領域に由来する単一ドメイン結合タンパク質（ＩｇＮＡＲ）を作製する方法は、例えば、ＷＯ０３／０１４１６１およびＳｔｒｅｌｔｓｏｖ（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１４：２９０１〜０９において記載されている。
【００４４】
単一ドメイン結合タンパク質にはまた、軽鎖を欠いている重鎖抗体として当技術分野において知られている、天然に生じる単一ドメイン結合タンパク質が含まれる。軽鎖を天然に欠いている重鎖抗体に由来するこの可変ドメインは、従来の４本鎖免疫グロブリンのＶＨと区別するために、本明細書においてはＶＨＨまたはナノボディーとして知られる。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科の種において、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、およびグアナコにおいて形成される抗体から得ることができ、ラクダ科動物可変ドメインまたはラクダ化可変ドメインと呼ばれることがある（例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７４（４）：２７７〜３０２を参照されたい）。ラクダ科に含まれる種以外の他の種もまた、軽鎖を天然に欠いている重鎖結合タンパク質を産生し得る。ＶＨＨ分子は、ＩｇＧ分子よりも約１０倍小さい。それらは単一ポリペプチドであり、非常に安定であり、極端なｐＨおよび温度の条件に耐える。さらに、それらは、プロテアーゼの作用に対して耐性であり、これは、従来の抗体には当てはまらない。さらに、ＶＨＨのインビトロでの発現により、高収量の、適切にフォールディングした機能的ＶＨＨが産生される。さらに、ラクダ科動物において生成した結合タンパク質は、抗体ライブラリーを介してインビトロで生成した、またはラクダ科動物以外の哺乳動物の免疫化を介して生成した抗体によって認識されるもの以外のエピトープを認識する（例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる、ＷＯ９７／０４９８０５およびＷＯ９４／００４６７８を参照されたい）。
【００４５】
「二重特異的」結合タンパク質または「二官能性」結合タンパク質は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する、人工ハイブリッド結合タンパク質である。二重特異的結合タンパク質は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の結合を含む、様々な方法によって作製することができる（例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５〜２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜５３を参照されたい）。１つの実施形態において、二重特異的結合タンパク質は、免疫グロブリンの定常領域を介して第２の結合ドメインポリペプチドに結合している、Ｆａｂ’断片などの第１の結合ドメインポリペプチドを包含する。
【００４６】
本発明の結合タンパク質はまた、ペプチド模倣体を包含し得る。ペプチド模倣体は、タンパク質の二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子である（例えば、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｕｒｎ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｉｎ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９９３）Ｐｅｚｚｕｔｏら編、Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。ペプチド模倣体の使用の背後にある内在的な根拠は、タンパク質のペプチド骨格が、抗体と抗原との間の分子相互作用などの分子相互作用を容易にするように、アミノ酸側鎖を正しい方向に向けるために主に存在することである。ペプチド模倣体は、天然分子に類似した分子相互作用を可能にすることが予想される。これらの原理は、本明細書において開示される標的化ペプチドの天然の特性の多くを有するが、改変されており潜在的に改良されている特徴を有する、第２世代分子を改変するために用いることができる。
【００４７】
結合タンパク質の他の実施形態には、融合タンパク質が含まれる。これらの分子は通常、Ｎ末端またはＣ末端で第２のポリペプチドまたはタンパク質の全てまたは一部に結合している、標的化ペプチド、例えばＩＬ２１Ｒまたは抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の、全てまたはほとんどの部分を有する。例えば、融合タンパク質は、他の種から得られるリーダー配列を採用して、異種宿主におけるタンパク質の組換え発現を可能にし得る。別の有用な融合には、融合タンパク質の精製を容易にするための、結合タンパク質エピトープなどの免疫学的に活性なドメインの付加が含まれる。融合結合部に、またはその付近に切断部位を含めると、精製後の外来ポリペプチドの除去が容易になる。他の有用な融合には、酵素から得られる活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞標的化シグナル、または膜貫通領域などの、機能的ドメインの連結が含まれる。融合タンパク質に組み込まれ得るタンパク質またはペプチドの例には、限定はしないが、細胞増殖抑制タンパク質、細胞破壊タンパク質、アポトーシス促進物質、抗血管形成物質、ホルモン、サイトカイン、成長因子、ペプチド薬、抗体、抗体のＦａｂ断片、抗原、受容体タンパク質、酵素、レクチン、ＭＨＣタンパク質、細胞接着タンパク質、および結合タンパク質が含まれる。融合タンパク質を生成する方法は、当業者に周知である。このようなタンパク質は、例えば、二官能性架橋試薬を用いた化学的接着によって、完全融合タンパク質のデノボ合成によって、または標的化ペプチドをコードするＤＮＡ配列を第２のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列に接着させ、その後、無傷な融合タンパク質を発現させることによって、作製することができる。
【００４８】
結合タンパク質はまた、免疫グロブリンのヒンジ領域ポリペプチドまたはヒンジ作用領域ポリペプチドに融合されているか、そうでなければそれに接続されている結合ドメインポリペプチドを含む、結合ドメイン−免疫グロブリン融合タンパク質を含むことができ、これが次に、ＣＨ１以外の免疫グロブリン重鎖、例えば、ＩｇＧおよびＩｇＡのＣＨ２領域およびＣＨ３領域、またはＩｇＥのＣＨ３領域およびＣＨ４領域から得られる、１つまたは複数の天然のまたは改変された定常領域を包含する領域に融合されているか、そうでなければそれに接続されている（例えば、より完全な記載については、Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒら、米国特許出願公開第２００５／０１３６０４９号を参照されたい）。結合ドメイン−免疫グロブリン融合タンパク質にはさらに、ヒンジ領域ポリペプチドに融合されているか、そうでなければそれに接続されている、天然のまたは改変された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域ポリペプチド（または、ＩｇＥに全体または一部が由来する構築物の場合ではＣＨ３）、および、ＣＨ２定常領域ポリペプチド（または、ＩｇＥに全体または一部が由来する構築物の場合ではＣＨ３）に融合されているか、そうでなければそれに接続されている、天然のまたは改変された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域ポリペプチド（または、ＩｇＥに全体または一部が由来する構築物の場合ではＣＨ４）を含む領域が含まれ得る。典型的には、このような結合ドメイン−免疫グロブリン融合タンパク質は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性、補体結合反応、および／または標的、例えば標的抗原への結合からなる群から選択される、少なくとも１個の免疫学的活性の能力がある。本発明の結合タンパク質は、限定はしないが、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、ニワトリ、およびウシを含むあらゆる種に由来し得る。
【００４９】
融合タンパク質の１つの実施形態において、標的化ペプチド、例えばＩＬ２１Ｒは、２つの定常領域ドメインおよび１つのヒンジ領域を含有するが可変領域を欠いている、Ｆｃ断片などの免疫グロブリン重鎖定常領域と融合される（例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０１８，０２６号および第５，７５０，３７５号を参照されたい）。Ｆｃ領域は、天然に生じるＦｃ領域であってもよく、または、特定の質、例えば治療上の質、循環時間、凝集の低減を向上させるために改変されてもよい。Ｆｃ領域に融合されたペプチドおよびタンパク質は、典型的に、融合されていない同等物よりもインビボにおいて優れた半減期を示す。さらに、Ｆｃ領域への融合により、融合ポリペプチドの二量体化／多量体化が可能になる。
【００５０】
さらなる結合タンパク質／抗体の作製技術については、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）を参照されたい。本発明は、結合タンパク質または抗体の任意の特定の供給源、作製方法、または他の特別な特徴に限定される必要はない。
【００５１】
さらに、当業者であれば、本明細書において記載される結合タンパク質に対する修飾が網羅的ではないこと、および多くの他の修飾が本開示の教示に照らして当業者に明らかとなることが理解されよう。多くの修飾が、例えば米国特許出願第１２／４７２，２３７号において詳細に記載されている。
【００５２】
「中和」という用語は、シグナル伝達経路または抗原、例えばＩＬ２１／ＩＬ２１Ｒシグナル伝達経路またはＩＬ２１Ｒ抗原の活性を低減または遮断する、結合タンパク質またはその抗原結合断片（例えば抗体）について言う。本明細書において用いられる「抗生成物抗体」は、外因性タンパク質に応じて形成される抗体、例えば抗ＩＬ２１Ｒ抗体を言う。本明細書において用いられる「中和抗生成物抗体」は、外部から導入されたタンパク質のインビボでの活性を遮断する抗生成物抗体、例えば、抗ＩＬ２１Ｒ抗体を言う。本発明のいくつかの実施形態において、中和抗生成物抗体は、ＩＬ２１Ｒ抗体のインビボでの活性、例えば、ＩＬ２１Ｒ抗体のインビボでの薬力学的（ＰＤ）活性（抗ＩＬ２１Ｒ抗体の、ＩＬ２１応答性サイトカインまたはＩＬ２１応答性遺伝子の発現を調整する能力など）を減少させる。
【００５３】
「効果的な量」という用語は、ＩＬ２１Ｒ活性を調節して、臨床症状の重症度を改善もしくは低下させるため、または所望の生物学的結果、例えばＴ細胞および／もしくはＢ細胞の活性の低減、自己免疫の抑制、移植拒絶反応の抑制を達成するために十分な、投与量または量を言う。
【００５４】
ＩＬ２１Ｒの活性を「阻害する」、「拮抗する」、「遮断する」、または「中和する」という表現およびその同種の表現は、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質と結合することによる、ＩＬ２１Ｒの少なくとも１個の活性の低減、阻害、または減少を言い、低減は、同一の結合タンパク質の非存在下でのＩＬ２１Ｒの活性と比較したものである。ＩＬ２１Ｒ活性は、当技術分野において知られている任意の技術を用いて測定することができる。阻害または拮抗は、必ずしもＩＬ２１Ｒの生物学的活性の完全な排除を示すわけではない。活性における低減は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上であり得る。
【００５５】
本発明の１つの実施形態において、ＩＬ２１Ｒによって仲介される少なくとも１個の活性は、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ４０、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＧＺＭＢ、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１２β、ＩＬ１β、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ６、ＰＲＦ１、ＰＴＧＳ２、およびＴＢＸ２１について試験された少なくとも１個の条件下で観察されたＲＮＡレベルの有意な上昇を伴う、遺伝子発現に対するＩＬ２１のＰＢＭＣにおける効果である。試験した培養物下のＰＢＭＣにおいて観察された最も強力なＩＬ２１依存性ＲＮＡ応答は、ＧＺＭＢ、ＩＦＮγ、ＩＬ２ＲＡ、ＰＲＦ１、およびＩＬ６のものであり、より長時間の試験期間ではＩＬ１０のものであった。
【００５６】
本明細書において用いられる「調整する」という用語は、少なくとも１個のＩＬ２１応答性遺伝子の発現の変化などの、あらゆる実質的な増大を言う。当業者であれば、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の非存在下でＩＬ２１がＩＬ２１応答性遺伝子の発現レベルを上方調節する場合、ＩＬ２１Ｒ活性の阻害により（例えば、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質を用いて）ＩＬ２１応答性遺伝子の発現が遮断または阻害されることが理解されよう。あるいは、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の非存在下でＩＬ２１がＩＬ２１応答性遺伝子の発現レベルを低減させる場合、ＩＬ２１Ｒ活性の阻害により、ＩＬ２１応答性遺伝子の発現が回復または増大する。
【００５７】
本明細書において用いる場合、「インビトロで生成した結合タンパク質」、例えば「インビトロで生成した抗体」は、可変領域の全てまたは一部（例えば、少なくとも１個のＣＤＲ）が、非免疫細胞選択（例えば、インビトロでのファージディスプレイ、タンパク質チップ、または、候補配列を抗原への結合能力について試験することができる任意の他の方法）において生成する、結合タンパク質／抗体を言う。
【００５８】
「単離された」という用語は、その天然の環境を実質的に有さない分子を言う。例えば、単離されたタンパク質は、それが由来した元である細胞源または組織源から得られる、細胞材料または他のタンパク質を実質的に有さない。この用語はまた、単離されたタンパク質が医薬組成物のために実質的に純粋であるか、または少なくとも７０〜８０％（ｗ／ｗ）の純度、少なくとも８０〜９０％（ｗ／ｗ）の純度、少なくとも９０〜９５％（ｗ／ｗ）の純度、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（ｗ／ｗ）の純度である調製物を言う。
【００５９】
「同一パーセント」または「パーセント同一性」という表現は、少なくとも２個の異なる配列間の類似性を言う。このパーセント同一性は、標準的なアラインメントアルゴリズム、例えば、Ａｌｔｓｈｕｌら（（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０）によって記載されているＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４〜５３）のアルゴリズム、またはＭｅｙｅｒｓら（（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１〜１７）のアルゴリズムによって決定することができる。一組のパラメータは、ギャップペナルティー１２、ギャップ伸長ペナルティー４、およびフレームシフトギャップペナルティー５の、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２スコアリングマトリクスであり得る。２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性はまた、ＰＡＭ１２０重み付き残差表、ギャップ長ペナルティー１２、およびギャップペナルティー４を用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１〜１７）のアルゴリズムを用いて決定することができる。パーセント同一性は、通常、類似の長さの配列を比較することによって計算される。
【００６０】
「レパートリー」という用語は、少なくとも１個の免疫グロブリンをコードする少なくとも１個の配列に完全にまたは部分的に由来する、少なくとも１個のヌクレオチド配列を言う。１つまたは複数の配列は、重鎖のＶ、Ｄ、およびＪセグメント、ならびに軽鎖のＶおよびＪセグメントのインビボでの再配列により生成され得る。あるいは、１つまたは複数の配列は、どの再配列が生じるかに応じて、例えばインビトロでの刺激に応じて、細胞から生成され得る。あるいは、１つまたは複数の配列の一部または全ては、ＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、突然変異生成、または他の方法（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい）によって得ることができる。レパートリーは、唯一の配列を含み得るか、または、遺伝的に多様なコレクションにおける配列を含む複数の配列を含み得る。
【００６１】
「特異的結合」、「特異的に結合する」などの用語は、生理的条件下で比較的安定な複合体を形成する２つの分子について言う。特異的結合は、低い親和性および中度から高度の能力を通常有する非特異的結合とは区別される、高い親和性および低度から中度の能力によって特徴付けされる。典型的には、結合は、会合定数Ｋａが約１０６Ｍ−１ｓ−１よりも高い場合に、特異的であると判断される。必要であれば、結合条件を変化させることによって、特異的結合に実質的に影響することなく非特異的結合を低減させることができる。結合タンパク質の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合のために与えられる時間、遮断薬（例えば、血清アルブミンまたはミルクカゼイン）の濃度などの、適切な結合条件を、通常の技術を用いて当業者が向上させることができる。実例的な条件は、本明細書において説明されるが、当業者に知られている他の条件は、この発明の範囲内である。
【００６２】
本明細書において用いる場合、「ストリンジェント」、「ストリンジェンシー」などの用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を説明する。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、開示されるポリヌクレオチドをコードする配列と同一のまたは類似の配列を有する核酸を同定および単離するための、ハイブリダイゼーションプローブおよびハイブリダイゼーションプライマーとして用いることができる。したがって、この様式で単離されたポリヌクレオチドは、ＩＬ２１Ｒに対する結合タンパク質を作製するため、またはこのような結合タンパク質を発現する細胞を同定するために用いることができる。核酸を同定および単離するためのハイブリダイゼーション法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、サザンハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、およびノーザンハイブリダイゼーションを含み、当業者に周知である。
【００６３】
ハイブリダイゼーション反応は、異なるストリンジェンシーの条件下で行うことができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーには、あらゆる２つの核酸分子が互いにハイブリダイズする困難性、およびそれらがハイブリダイズしたままとなる条件が含まれる。好ましくは、ハイブリダイズする各ポリヌクレオチドは、低いストリンジェンシー条件下で、より好ましくはストリンジェントな条件下で、最も好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、その対応するポリヌクレオチドにハイブリダイズする。ストリンジェントな条件は、当業者に知られており、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）６．３．１〜６．３．６において見ることができる。水性方法および非水性方法の両方がこの参考文献において記載されており、両方を用いることができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の１つの例は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーション、その後の、５０℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおける少なくとも１回の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件はまた、例えば、５５℃、６０℃、または６５℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおける、１回または複数回の洗浄で達成される。高度にストリンジェントな条件には、例えば、６５℃での０．５Ｍリン酸ナトリウム／７％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、その後の、６５℃での０．２×ＳＳＣ／１％ＳＤＳでの少なくとも１回の洗浄が含まれる。ストリンジェンシー条件のさらなる例を、以下の表１において示し、この図において、高度にストリンジェントな条件は、少なくとも例えば条件Ａ〜Ｆと同様にストリンジェントなものであり、ストリンジェントな条件は、少なくとも例えば条件Ｇ〜Ｌと同様にストリンジェントであり、低いストリンジェンシー条件は、少なくとも例えば条件Ｍ〜Ｒと同様にストリンジェントである。
【００６４】
【表１−１】
2012504939.tif 000003
【００６５】
【表１−２】
2012504939.tif 000004
【００６６】
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、開示されるポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体をコードする配列を有するＤＮＡを同定および単離するための、ハイブリダイゼーションプローブおよびハイブリダイゼーションプライマーとして用いることができる。対立遺伝子変異体は、開示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに同一の、またはそれに対する有意な類似性を有するポリペプチドをコードする、開示されるポリヌクレオチドの、天然に生じる別の形態である。好ましくは、対立遺伝子変異体は、開示されるポリヌクレオチドと少なくとも約９０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも約９５％の同一性、最も好ましくは、少なくとも約９９％の同一性）を有する。本発明の単離されたポリヌクレオチドはまた、開示されるポリヌクレオチドに相同なポリペプチドをコードする配列を有するＤＮＡを同定および単離するための、ハイブリダイゼーションプローブおよびハイブリダイゼーションプライマーとして用いることができる。これらの相同体は、開示されるポリペプチドおよびポリヌクレオチドの種とは異なる種から単離されるか、または同一の種内で単離されるが、開示されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対する有意な配列類似性を有するポリヌクレオチドおよびポリペプチドである。好ましくは、ポリヌクレオチド相同体は、開示されるポリヌクレオチドと少なくとも約５０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも約７５％の同一性、最も好ましくは、少なくとも約９０％の同一性）を有する一方で、ポリペプチド相同体は、開示される結合タンパク質／ポリペプチドと少なくとも約３０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも約４５％の同一性、最も好ましくは、少なくとも約６０％の同一性）を有する。好ましくは、開示されるポリヌクレオチドおよびポリペプチド相同体は、哺乳動物種から単離されるものである。本発明の単離されたポリヌクレオチドはさらに、本発明の結合タンパク質を発現する細胞および組織、ならびにそれらが発現する条件を特定するための、ハイブリダイゼーションプローブおよびハイブリダイゼーションプライマーとして用いることができる。
【００６７】
「実質的に示されているような」、「実質的に同一な」、および「実質的に相同の」という表現は、関連するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列（例えば、１つまたは複数のＣＤＲ、１つまたは複数のＶＨドメインまたはＶＬドメイン）が、示されている配列と比較して、同一であるかまたはごくわずかな差を有する（例えば、保存されたアミノ酸置換による）ことを意味する。ごくわずかな差には、特定の領域の５つのアミノ酸からなる配列における１つまたは２つの置換などの、アミノ酸のわずかな変化が含まれる。例えば、抗体の場合では、第２の抗体は同一の特異性を有し、第１の抗体の親和性の少なくとも約５０％を有する。
【００６８】
本明細書において開示される配列に実質的に同一または相同である配列もまた、この出願の一部である。いくつかの実施形態において、配列同一性は、約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上であり得る。あるいは、実質的な同一性または相同性は、核酸セグメントが、選択的ハイブリダイゼーション条件（例えば、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下で鎖の相補体にハリブリダイズする場合に存在する。核酸は、細胞全体として、細胞溶解物として、または、部分的に精製されているかもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。
【００６９】
「治療薬」などの用語は、医学的障害またはその症状を治療する、またはその治療において役立つ物質である。治療薬には、限定はしないが、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の使用を補完するように免疫細胞または免疫応答を調整する物質が含まれ得る。本発明の１つの実施形態において、治療薬は、治療用結合タンパク質、例えば治療用抗体、例えば抗ＩＬ２１Ｒ抗体である。本発明の別の実施形態において、治療薬は、治療用結合タンパク質、例えば抗ＩＬ２１Ｒナノボディーである。治療薬の非限定的な例および使用が、本明細書において記載される。
【００７０】
本明細書において用いる場合、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の「治療上効果的な量」は、障害または再発性障害の少なくとも１個の症状を治療する、予防する、治癒する、遅らせる、その重症度を低減させる、および／もしくは改善するため、または、このような治療の非存在下で予想される生存よりも対象の生存を延ばすための、対象（ヒト患者など）に対する単回投与または複数回投与の際に効果的な、結合タンパク質の量を言う。１つの実施形態において、治療上効果的な量は、少なくとも１個のＩＬ２１応答性サイトカインまたはＩＬ２１応答性遺伝子の発現を調整するために十分な、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の量であり得る。
【００７１】
「安全性試験用の動物種」という用語は、所望の生物学的活性を有する結合タンパク質を有し、安全性についての別の哺乳動物種との有効な比較が可能である種を言う。例えば、適切な安全性試験用の動物種は、霊長類動物、例えばカニクイザルであり得る。
【００７２】
「治療」という用語は、治療的または予防的な手段を言う。治療は、障害または再発性障害の１つまたは複数の症状を予防する、治癒する、遅らせる、その重症度を低減させる、および／もしくは改善するため、または、このような治療の非存在下で予想される生存よりも対象の生存を延ばすために、医学的障害を有するかまたは最終的にその障害を獲得し得る対象に行われ得る。
【００７３】
「サイトカインストーム」という用語は、引き続いて様々なサイトカインのレベルを非常に上昇させる、サイトカインと免疫細胞との間の正のフィードバックループを包含する、深刻なおよび潜在的に致命的な免疫反応をもたらす一連の事象を言う。サイトカインストーム中に誘発されるサイトカインには、例えば、ＩＬ４、ＩＬ２、ＩＬ１β、ＩＬ１２、ＴＮＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ６、ＩＬ８、およびＩＬ１０のうちの１つまたは複数が含まれる。
【００７４】
抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質
本願の開示は、さらに米国出願第１２／４７２，２３７号（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）の開示と併せて、新規な抗原結合断片を包含する新規な抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質を提供する。この開示はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーに由来している新規なＣＤＲを提供する。ＣＤＲを坦持させるために通常用いられるタンパク質構造は、天然に生じるＣＤＲに関連する領域にＣＤＲが位置する、抗体の重鎖もしくは軽鎖またはその一部である。可変ドメインの構造および位置は、Ｋａｂａｔら（（１９９１）、上記）において記載されているように決定することができる。
【００７５】
本発明に関連する結合タンパク質（およびその抗原結合断片）の実例的な実施形態は、ＡｂＡ〜ＡｂＵ、Ｈ３〜Ｈ６、Ｌ１〜Ｌ６、Ｌ８〜Ｌ２１、およびＬ２３〜Ｌ２５として同定される。抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質のこれらの非限定的な実例的な実施形態のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、配列番号５〜１９５、２１３〜２２９、および２３９〜２４８で示される。そのｓｃＦｖ断片、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、およびＣＤＲ、ならびにそれらの現在のコードおよびこれまでの呼称を含む、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質のいくつかの実例的な実施形態のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列が、表２Ａおよび２Ｂにおいて示され、米国特許出願第１２／４７２，２３７号（参照することにより本明細書に組み込まれる）において詳細に記載されている。
【００７６】
【表２】
2012504939.tif 000005
【００７７】
【表３−１】
2012504939.tif 000006
【００７８】
【表３−２】
2012504939.tif 000007
【００７９】
本発明は、ＩＬ２１Ｒ、とりわけヒトＩＬ２１Ｒに結合する、単離された結合タンパク質またはその抗原結合断片を含む、任意の数の結合タンパク質に適用することができる。特定の実施形態において、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質、例えば抗ＩＬ２１Ｒ抗体は、米国特許出願第１２／４７２，２３７号（参照することにより本明細書に組み込まれる）において詳細に記載されている、薬物動態学的特徴および薬力学的特徴を含むいくつかの特徴の少なくとも１つを有し得る。例えば、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質は、ＩＬ２１応答性サイトカインもしくはＩＬ２１応答性遺伝子の発現を調整することができ、かつ／または、前記タンパク質は、対象、例えばヒトもしくはカニクイザル対象に投与される場合、サイトカインストーム遺伝子を活性化させない可能性がある。
【００８０】
抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の治療的使用
ＩＬ２１Ｒに対するアンタゴニストとして作用する抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質は、細胞増殖と、サイトカインの発現または分泌と、ケモカインの分泌と、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、または滑膜細胞の細胞溶解活性との１つまたは複数などの、少なくとも１個のＩＬ２１Ｒ介在性免疫応答を調整するために用いることができる。したがって、開示される結合タンパク質は、免疫細胞または造血細胞（例えば、骨髄系、リンパ系、もしくは赤血球系の細胞、またはその前駆細胞）の活性（例えば、増殖、分化、および／または生存）を阻害するために用いることができ、したがって、例えば、様々な免疫障害、血液の過剰増殖性障害、および急性期反応を治療するために用いることができる。治療され得る免疫障害の例には、限定はしないが、移植拒絶反応、移植片対宿主疾患、アレルギー（例えば、アトピー性アレルギー）、および自己免疫疾患が含まれる。自己免疫疾患には、糖尿病、関節障害（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、および強直性脊髄炎を含む）、脊椎関節症、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、皮膚エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹様皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群、ＩＢＤ（クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）、喘息（内因性喘息およびアレルギー性喘息を含む）、強皮症、および血管炎が含まれる。
【００８１】
抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の診断的使用
結合タンパク質はまた、生物学的試料におけるＩＬ２１Ｒの存在を検出するために用いることができる。これらの結合タンパク質の存在またはレベルを医学的状態と相関させることにより、当業者は、関連する医学的状態を診断することができる。例えば、刺激されたＴ細胞は、自らのＩＬ２１Ｒの発現を増大させ、関節における非常に高い濃度のＩＬ２１Ｒ発現Ｔ細胞が、関節の炎症および可能性のある関節炎を示し得る。本発明の結合タンパク質によって診断され得る実例的な医学的状態には、限定はしないが、多発性硬化症、関節リウマチ、および移植拒絶反応が含まれる。
【００８２】
抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質を用いた毒性の研究
アンタゴニストとして作用する結合タンパク質、例えば抗体を、少なくとも１個のＩＬ２１Ｒ介在性免疫応答を調節するために用いることができ、したがって、免疫系に対する何らかの副作用を伴うことなく、例えば、免疫系（例えば、ヒトの免疫系）に対する活性化シグナルの伝達、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の活性化、および対象におけるサイトカインストームの誘発を伴うことなく、様々な免疫障害を治療するために用いることができる。さらに、本発明の結合タンパク質は、対象におけるＩＬ２１経路の活性化を誘発しない。
【００８３】
実施例において説明されるように、ＡｂＳおよびいくつかの他の抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質は、抗ＩＬ２１Ｒ拮抗的結合タンパク質として作用するが、サイトカインストームに関連する毒性事象のいずれも誘発しない。したがって、いくつかの実施形態において、本発明はまた、アンタゴニスト、例えば拮抗的抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質が、臨床的な試験および治療において副作用、例えばサイトカインストームの活性化を有し得るかどうかを決定または予測する方法を提供する。
【００８４】
いくつかの実施形態において、本方法は、インビトロでの方法であり得る。本発明の１つの実施形態において、本方法は、例えば、ＩＬ２１の活性化効果、およびＩＬ２１アンタゴニスト、例えば本明細書において記載されるＡｂＳまたは他の抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の阻害効果を検出するために用いることができる。例えば、本発明の１つの実施形態において、本方法は、毒性免疫応答（例えば、サイトカインストームの活性化）に関連するサイトカインの上方調節について試験するために、哺乳動物対象、例えばヒト対象の血液細胞、例えばＰＢＭＣを利用する。このようなインビトロでの方法は、（ａ）哺乳動物対象から血液試料を得るステップ、（ｂ）治療用結合タンパク質、例えばＡｂＳを血液試料と共にインキュベートするステップであって、血液試料が結合タンパク質で処理された血液試料であるステップ、（ｃ）結合タンパク質で処理された血液試料における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを決定するステップ、および（ｄ）結合タンパク質で処理された血液試料における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを、未処理のまたは陰性対照で処理された試料における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルと比較するステップを包含し、結合タンパク質で処理された血液試料における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルが、未処理のまたは陰性対照で処理された試料における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルよりも実質的に大きいことにより、治療用結合タンパク質が哺乳動物対象においてサイトカインストームを誘発することが示される（例えば予測される）。他方で、結合タンパク質で処理された血液試料における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルが、未処理のまたは陰性対照で処理された試料における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルよりも実質的に大きくない場合は、治療用結合タンパク質が哺乳動物対象においてサイトカインストームを誘発しないことが示され得る（例えば予測され得る）。
【００８５】
いくつかの実施形態において、インビトロでの方法は、マルチウェルプレート内で行うことができる。例えば、抗ＩＬ２１Ｒ拮抗的結合タンパク質または対照試薬は、プレートのウェル上に直接的に被覆されているか（乾燥被覆）、またはプレートの抗ＩｇＧで被覆されたウェルにアプライされ、哺乳動物ドナーのＰＢＭＣに曝露される。
【００８６】
他の実施形態において、治療用結合タンパク質がサイトカインストームを誘発するかどうかを決定するために用いられる方法は、ＩＬ２１の活性化効果、およびＩＬ２１アンタゴニスト、例えば、ＡｂＳまたは本明細書において記載される他の拮抗的結合タンパク質の阻害効果を検出するために用いることができる、エクスビボでの全血法、例えば、ヒト全血法またはサル全血法である。
【００８７】
あるいは、本方法は、インビボでのアッセイであり、対象における、ＡｂＳまたは本明細書において記載される他の結合タンパク質の投与後効果を決定するために用いられる。このような投与後法は、抗ＩＬ２１Ｒ拮抗的結合タンパク質、例えばＡｂＳを、哺乳動物対象、例えばヒト以外の哺乳動物対象（例えば、カニクイザル）に投与した後に行うことができる。例えば、治療用結合タンパク質が第１の哺乳動物対象（例えば、ヒト対象）においてサイトカインストームを誘発するかどうかを予測する方法において、本方法は、（ａ）治療用結合タンパク質、例えばＡｂＳを第２の哺乳動物対象（例えば、カニクイザル対象）に投与するステップであって、第２の哺乳動物対象が結合タンパク質で処理された第２の哺乳動物対象であるステップ、（ｂ）結合タンパク質で処理された第２の哺乳動物対象から血液試料を得るステップ、（ｃ）結合タンパク質で処理された第２の哺乳動物対象の血液における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを決定するステップ、および（ｄ）結合タンパク質で処理された第２の哺乳動物対象の血液における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを、未処理の第２の哺乳動物対象の血液における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルと比較するステップを包含することができ、結合タンパク質で処理された第２の哺乳動物対象における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルが、未処理の第２の哺乳動物対象における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルよりも実質的に大きいことにより、治療用結合タンパク質が第１の哺乳動物対象においてサイトカインストームを誘発することが示される。あるいは、結合タンパク質で処理された第２の哺乳動物対象の血液における少なくとも１個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルが、未処理の第２の哺乳動物対象におけるそのサイトカインストーム遺伝子の発現レベルよりも実質的に大きくない場合は、治療用結合タンパク質が第１の哺乳動物対象においてサイトカインストームを誘発しないことが示され得る（例えば予測され得る）。
【００８８】
１つの実施形態において、インビボでの方法は、高用量の、すなわち、予想された臨床用量よりも高い用量の抗ＩＬ２１Ｒ拮抗的結合タンパク質を、例えばカニクイザルに投与すること、ならびに、毒性免疫応答（サイトカインストーム）およびＩＬ２１応答のいずれかまたは両方に関連するサイトカインの変化について、全血試料をモニタリングすることを包含する。したがって、いくつかの実施形態において、第１の哺乳動物対象はヒト対象であり、一方、第２の哺乳動物対象はカニクイザル対象である。当業者には、第２の哺乳動物対象が、拮抗的結合タンパク質の毒性を試験するために適した任意の対象、例えば、齧歯動物対象、ヒト以外の別の霊長類動物対象であってもよいことが理解されよう。
【００８９】
本明細書において用いる場合、「結合タンパク質で処理された」という用語は、サイトカインストーム遺伝子の上方調節のレベルを決定するために、治療用結合タンパク質、例えば治療用抗体、例えば抗ＩＬ２１Ｒ抗体（例えばＡｂＳ）で処理された、試料または対象について言う。「未処理の」は、活性化物質または阻害物質、例えば、結合タンパク質、抗体、またはサイトカインが添加されていない試料または対象を言う。未処理の対象または試料は、結合タンパク質で処理された対象におけるサイトカインの上方調節のレベルと比較するための陰性対照として用いられる。したがって、「陰性対照で処理された」は、陰性対照の結合タンパク質、例えば、ＩｇＧＴＭ（ＩｇＧ１抗破傷風三重突然変異体）抗体、ＩｇＧ１（ＩｇＧ１抗破傷風野生型）抗体、またはＩｇＧＦｃ（Ｆｃ対照）抗体で処理された試料または対象を言う。「陽性対照で処理された」は、ＩＬ２１サイトカインで処理された試料または対象を言う。本発明のいくつかの実施形態において、血液試料は、全血試料、例えば、ヒト全血試料またはカニクイザル全血試料であり得る。別の実施形態において、血液試料は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料であり得る。
【００９０】
サイトカインストーム遺伝子の上方調節について試験することに加え、本発明の方法は、ＩＬ２１応答性サイトカインおよびＩＬ２１応答性タンパク質の上方調節について同時にまたは別の方法で試験することができる。サイトカインストームに関連するサイトカイン（例えば、サイトカインストーム遺伝子）には、限定はしないが、ＩＬ４、ＩＬ２、ＩＬ１β、ＩＬ１２、ＴＮＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ６、ＩＬ８、およびＩＬ１０が含まれる。ＩＬ２１応答性のサイトカインおよびタンパク質には、限定はしないが、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ４０、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＧＺＭＢ、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１２β、ＩＬ１β、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ６、ＰＲＦ１、ＰＴＧＳ２、およびＴＢＸ２１が含まれる。したがって、サイトカインストームに関連する、全てではないがいくつかのサイトカインは、ＩＬ２１応答性サイトカインとオーバーラップすることが明らかである。本発明の方法は、少なくとも１個の、少なくとも２個の、少なくとも３個の、少なくとも４個の、少なくとも５個の、少なくとも６個の、少なくとも７個の、少なくとも８個の、もしくは少なくとも９個の、またはそれ以上のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを決定することを包含し得る。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、９個のサイトカインストーム遺伝子の発現レベルを決定することを包含する。同様に、本発明の方法は、少なくとも１個の、少なくとも２個の、少なくとも３個の、少なくとも４個の、少なくとも５個の、少なくとも６個の、少なくとも７個の、少なくとも８個の、少なくとも９個の、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、少なくとも１２個の、少なくとも１３個の、少なくとも１４個の、少なくとも１５個の、少なくとも１６個の、少なくとも１７個の、少なくとも１８個の、少なくとも１９個の、少なくとも２０個の、もしくは少なくとも２１個の、またはそれ以上のＩＬ２１応答性サイトカインのレベルを決定することを包含し得る。
【００９１】
サイトカインの変化は、ＲＮＡまたはタンパク質の発現の変化を試験するための方法のいずれかによってモニタリングすることができる。１つの実施形態において、サイトカインの変化、例えば、毒性免疫応答またはＩＬ２１応答性サイトカインに関連する、サイトカインの上方調節を、タンパク質検出法またはｍＲＮＡ検出法のいずれかなどの、遺伝子またはタンパク質の発現の変化を試験するための方法のいずれかによって検出することができる。遺伝子発現の上方調節は、ｍＲＮＡ発現の上方調節によって試験することができ、また、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）低密度アレイ上でリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって標的をスクリーニングすることによって検出することができる。本発明の別の実施形態において、遺伝子発現の上方調節は、タンパク質発現の上方調節を測定することによって試験することができる。１つの実施形態において、サイトカインのレベルは、例えばＭＳＤ多重免疫測定（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いることによって、サイトカインの放出を測定することによって決定することができる。本発明の結合タンパク質を試験するためのアッセイの具体的な例は、実施例において記載される。
【００９２】
当業者には、実施例において記載される結合タンパク質に加え、任意の結合タンパク質を、サイトカインストームに関連する毒性事象を含む毒性を誘発することなく、結合タンパク質がアンタゴニスト、例えばＩＬ２１Ｒアンタゴニストとして作用するかどうかを決定するための、本明細書において記載されるアッセイにおいて用い得ることが認識されよう。
【００９３】
本発明の別の態様は、治療用結合タンパク質が投与されるとサイトカインストームを誘発するかどうかを予測するためのキットに関する。例えば、本キットは、サイトカインストームの予測に関連する重要な遺伝子のレベルを評価するためのオリゴヌクレオチドマイクロアレイチップなどを提供し得る。他の実施形態において、本発明の他の態様は、キットの中心であってもよく、当業者であれば、このようなキットおよびそれらの構成要素を、本開示に基づいて構築／作製することが可能である。
【００９４】
組合せ療法
１つの実施形態において、少なくとも１個の抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質と少なくとも１個の治療薬とを包含する医薬組成物が、組合せ療法において投与される。本療法は、免疫障害および炎症性障害などの病理学的状態または病理学的障害を治療するために有用である。この状況において「組み合わせて」という用語は、結合タンパク質組成物および治療薬が、実質的に同時期に、すなわち同時にまたは連続的に投与されることを意味する。連続的に投与される場合、第２の化合物の投与の開始時に、２つの化合物のうちの第１の化合物は、治療部位で、効果的な濃度で依然として検出可能であり得る。
【００９５】
例えば、組合せ療法は、少なくとも１個のさらなる治療薬と共製剤および／または共投与される、少なくとも１個の抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質を含むことができる。さらなる作用物質は、以下においてより詳細に記載される、少なくとも１個のサイトカイン阻害剤、成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、細胞傷害性物質、および細胞増殖抑制剤を含み得る。このような組合せ療法は、有利には、低用量の、投与される治療薬を利用し、したがって、様々な単独療法に関連する可能性のある毒性または合併症を避けることができる。さらに、本明細書において開示される治療薬は、ＩＬ２１／ＩＬ２１Ｒ経路とは異なる経路に対して作用し、したがって、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の効果を増強させ、かつ／または前記効果との相乗効果をもたらすことが予想される。抗ＩＬ２１Ｒ抗体と他の治療薬との組合せ投与を行うためのキットもまた提供される。１つの実施形態において、本キットは、医薬担体中に製剤された少なくとも１個の抗ＩＬ２１Ｒ抗体と、必要に応じて１つまたは複数の個別の医薬調製物中に製剤された少なくとも１個の治療薬とを包含する。
【００９６】
この出願を通して引用される全ての参考文献、特許出願、および特許の全内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００９７】
本発明は、以下の非限定的な実施例においてさらに説明される。以下の実施例は、本発明の理解に役立つべく説明されるが、決して、本発明の範囲を限定することを意図したものではなく、また、限定すると解釈されるべきではない。実施例は、従来の方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイムＰＣＲ、クローニング、トランスフェクション、細胞系においてタンパク質を過剰発現させるための方法の基本的な態様、およびタンパク質精製のための基本的な方法の詳細な記載を含まない。このような方法は、当業者に周知である。
【００９８】
（実施例１）
抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の生成
本明細書において説明される抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質と、ＩＬ２１に関連する多くの障害を治療するための、前記タンパク質の治療薬としての有用性とは、例えば、米国特許出願第１２／４７２，２３７号（参照することにより本明細書に組み込まれる）において詳細に記載されている。いくつかの抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の配列、ならびにこれらの結合タンパク質の生成および研究に関与する他の配列（例えば、配列番号１９６〜２１０、および２３０〜２３８）は、添付の配列表において開示され、表２Ｂおよび／または参照することによりその全体が組み込まれる米国特許出願第１２／４７２，２３７号において詳細に記載されている。
【００９９】
（実施例２）
ＩＬ２１に対するヒト全血の作動性応答は、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質を用いたエクスビボでの処理によって中和される
ＩＬ２１Ｒ依存性応答の阻害における、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の有用性を実証するために、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質での、ＩＬ２１に対するヒト全血の作動性応答の阻害を分析した。ヒト全血は、マサチューセッツ州、ケンブリッジにあるＨｕｍａｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍによって採血された。全てのヒト血液試料を、ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）ＣＰＴ（商標）細胞調製チューブ内に回収した。回収チューブはヘパリンナトリウムを含むものであった。試料を周囲温度で維持し、迅速に処理した。血液を、クライオバイアル内の１〜２ｍＬのアリコートに分け、ＩＬ２１、ＡｂＳ、または対照タンパク質で処理した。試料を抗ＩＬ２１結合タンパク質とＩＬ２１との両方で処理する場合、結合タンパク質はＩＬ２１の直前に添加した。次に、試料を、４時間にわたり、Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅａｃｈ−Ｉｎ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒモデル番号３９５６において３７℃でインキュベートし、一方で、インキュベーションの間に、Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｉｎｃ（ＡＴＲ）Ｒｏｔａｍｉｘ
（カタログ番号ＲＫＶＳ）回転ミキサー（シリアル番号０９９５−５２および０６９５−３６）を用いて、またはＬａｂｑｕａｋｅ（登録商標）Ｔｕｂｅ  Ｓｈａｋｅｒ／Ｒｏｔａｔｏｒ（カタログ番号４００１１０）を用いて、１５ＲＰＭで連続的に混合した。アリコート（０．５ｍＬ）を、ＡＲＴ  １０００Ｅチップ（カタログ番号７２８３０−０４２）を有するＧｉｌｓｏｎ  Ｐ１０００ピペットを用いて取り出し、Ｈｕｍａｎ  ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）−Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ；カタログ番号ＡＭ１９２８）に同梱されている１．３ｍＬのＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（登録商標）を含有する、２．０ｍＬのマイクロチューブ（Ａｘｙｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１００１１−７４４）に添加し、５回の完全な反転によって完全に混合した。試料を一晩にわたり周囲温度で保存し、次に、ＲＮＡ精製を待つ間、−８０℃で凍結した。
【０１００】
ＲＮＡを、Ｈｕｍａｎ  ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号ＡＭ１９２８）を用いて単離した。Ｈｕｍａｎ  ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）ＲＮＡ単離手順は、グアニジウムベースの溶液における細胞溶解、およびフェノール／クロロホルム抽出によるＲＮＡの最初の精製、およびガラスファイバーフィルター上での固相抽出による最終的なＲＮＡ精製からなる。残りのゲノムＤＮＡを、キットにおいて提供されるＤＮＡ−ｆｒｅｅ（商標）試薬を用いて、ＤＮＡｓｅ処理のために、製造者の使用説明書に従って除去した。全ての試料について、ＲＮＡの量を、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（ＮａｎｏＤｒｏｐ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いた２６０ｎｍでの吸光度によって決定した。ＲＮＡの質は、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いて抽出検査した。試料は、ｃＤＮＡ合成が行われるまで−８０℃で保存した。
【０１０１】
製造者の使用説明書に従って、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ、カタログ番号４３６８８１４）を、５０Ｕ／試料のさらなるＲＮａｓｅ阻害剤（ＡＢＩ、カタログ番号Ｎ８０８−０１１９）と共に用いて、ｃＤＮＡを全ＲＮＡから逆転写した。ｃＤＮＡ試料は、ＲＴ−ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）を行うまで、−２０℃で保存した。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ａｒｒａｙ  ｃａｒｄ（ＴＬＤＡ）上にロードされたｃＤＮＡの量を、実験内で得られた最小ＲＮＡ収量を用いて決定した。
【０１０２】
ＴＬＤＡは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓ  Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（ＡＯＤ）の遺伝子特異的プライマー対／プローブの組からなる、マイクロ流体カードである。各ウェルは、遺伝子特異的な標識されていないフォワードプライマーおよびリバースプライマーと、非蛍光クエンチャー（ＮＦＱ）を有する、遺伝子特異的な５’ＦＡＭ（商標）染料で標識されたＴａｑｍａｎマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）プローブとからなる、単一のＡＯＤを含有する。これらのＡＯＤは、事前に検証され、品質管理の試験をされ、かつあらゆるＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ配列検出システムでの使用について最適化されている。
【０１０３】
試料ｃＤＮＡを、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０４４３７）と共に混合し、ＴＬＤＡ上に添加した。次に、ＴＬＤＡを、室温で、１２００×ｇ、１分間の回転を連続して２回行い、密封し、そしてＡＢＩ  ７９００ＨＴ配列検出器（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ２．２．３、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）内にロードした。以下の共通の温度サイクル条件（５０℃で２分間、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間を４０サイクル、および６０℃で１分間）を、この実施例および以下の実施例において記載されている全てのＴＬＤＡについて用いた。これらの共通の温度サイクル条件は、全てのその後の実験で用いた。
【０１０４】
内因性対照を用いて、ロードされた試料の濃度のｎ変動を明らかにすることによって、試料の定量を正規化した。全てのＴＬＤＡデータについての相対的な定量を、Ｓｐｏｔｆｉｒｅガイドアプリケーション（ＬｉｖａｋおよびＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎ（２００１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４０２〜０８）において行った。
【０１０５】
ＩＬ２１のエクスビボでの効果を確認するために、ヒト全血および／または精製ＰＢＭＣが、遺伝子発現レベルにおける検出可能な変化を伴ってＩＬ２１に応答したかどうかを試験するために実験を行った。ヒトドナーから得られる全血または精製ＰＢＭＣを、ＩＬ２１の存在下および非存在下でインキュベートし、ＲＮＡレベルを、ＴＬＤＡカードを用いて決定した。２つの異なるＴＬＤＡを用いて、ＲＮＡ発現レベルを測定した。第１のヒト免疫ＴＬＤＡ（ＡＢＩ、カタログ番号４３７０５７３）では９６個の遺伝子を試験し、そのうち９１個は、刺激されたヒト血液において検出可能であった。ヒトドナーの全血から得られるＬＰＳまたはＰＨＡで刺激されたＰＢＭＣを、陽性対照として用いた。ＩＬ２１の刺激に応じたＩＬ２１Ｒの上方調節を試験するために、ＩＬ２１Ｒ遺伝子を含有する特注設計のＴＬＤＡを用いて結果を得た。
【０１０６】
最大シグナルを生成させるためのＩＬ２１処理の最適な時間および用量を決定するために、５人の健康なドナーから得られる全血試料を、３．３、１０、または３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ２１の存在下で、２、４、６、または２４時間にわたりインキュベートした。ＲＮＡを単離し、遺伝子発現レベルを測定した。顕著な、および強力なＩＬ２１依存性シグナルが、ＩＬ６、ＩＦＮγ、ＩＬ２ＲＡ、ＧＺＭＢ、ＰＲＦ１、ＣＤ１９という６つの遺伝子について得られた。ＣＤ１９を除く全てについての最適なシグナルが、２時間の時点で得られた（図１Ａ）。３．３、１０、または３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ２１で得られた応答にはほとんど差はなかった。エクスビボでのＩＬ２１処理に対する応答は、全ての５人のドナーの間で一貫していた（データは示していない）。これらの５人のドナーで得られた結果に基づいて、ＩＬ２１に対するエクスビボでの応答に対するＡｂＳの阻害効果について用量設定するために選択されたアッセイ条件は、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ２１で２時間にわたり刺激することであった。
【０１０７】
ＩＬ２１の効果を最適に遮断するためのＡｂＳの用量を決定するために、４人の個別のドナーから得られる試料を、共にＰＢＳ内に希釈されたＡｂＳおよびＩｇＧ１ＴＭの指定された濃度で、２時間にわたりプレインキュベートし、その後、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ２１を添加した。ＩＬ２１を添加した後、試料をさらに２時間にわたりインキュベートした。０．１μｇ／ｍＬのＡｂＳを添加すると、完全な阻害が生じ、したがって、０．００３μｇ／ｍＬのＡｂＳを、後の実験に用いた。図１Ｂにおいて実証されるように、ＡｂＳは、全ての４人のドナーにおいて試験された全ての６つの遺伝子の応答を阻害したが、ＩｇＧ１ＴＭは阻害しなかった。
【０１０８】
これらの結果は、ＩＬ２１依存性の応答の阻害における抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の有用性を実証し、また、ヒト血液におけるＩＬ２１に対する応答を測定するための方法を規定するものである。
【０１０９】
（実施例３）
ヒト対象およびカニクイザル対象における抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質処理後の細胞シグナル伝達およびサイトカインストームについての可能性の評価
（実施例３．１）
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）におけるＩＬ２１リガンドによるサイトカインのインビトロでの活性化の測定
全身性の炎症性応答および多臓器不全をもたらした、サイトカインストームの誘発による、臨床試験におけるＴＧＮ１４１２（抗ＣＤ２８抗体）の最近の失敗を受けて、類似の毒性応答を誘発させるためのリード化合物となる治療用結合タンパク質を試験することが急務となった。ＴＧＮ１４１２の臨床試験の後、プラスチック製の組織培養ウェル（Ｓｔｅｂｂｉｎｇｓら（２００７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：３３２５〜３１）の表面に架橋したＴＧＮ１４１２によるＰＢＭＣの活性化を試験するための、インビトロでの活性化プロトコルが開発された。６つの異なるプロトコルを、ＴＧＮ１４１２によるＰＢＭＣの活性化について試験し、３つは、活性化を誘発することが示された（上記のＳｔｅｂｂｉｎｇｓら（２００７））。これらのプロトコルのうち、２つ（抗ＩｇＧおよび乾燥被覆上での提示）をここで試験した。ＩＬ２１は、特定の条件下で、ならびに異なる細胞系および精製細胞集団から得られる、サイトカインストームに関連するいくつかの遺伝子を誘発することが知られているが、ＰＢＭＣおよび全血に対するＩＬ２１誘発性の活性化の程度は知られていない。したがって、免疫活性化に関連する１２個のタンパク質および９０個のｍＲＮＡの、ＩＬ２１による誘発を試験した。
【０１１０】
新鮮なヒトＰＢＭＣを、クエン酸ナトリウムＣＰＴ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ管（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を用いて、５人の健康なドナーの全血から単離した。各ドナーから得られたおよそ３１０〜４５０ｍｌの全血（８ｍｌ／管）を、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ（Ｂｒｉｇｈｔｏｎ、ＭＡ）から購入し、異なる日に抽出した。各試料を、採血の４時間以内に処理した。ＣＰＴ管のアリコート（８ｍｌ）を、室温で、１５００×ｇで２０分間にわたり回転させた（血漿、赤血球、好中球などを除去するため）。ＰＢＭＣをＰＢＳ内で２回洗浄し（ｐＨ＝７．２）、精製後の示差的な細胞計数を、Ｐａｎｔａ  ６０Ｃ（ＨＯＲＩＢＡ  ＡＢＸ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を用いて得た。最終的な細胞ペレットを、細胞培養培地（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ＨＩＦＢＳ、２ｎＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（１：１００）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０μＭのβ−メルカプトエタノール、１２．５ｍｌ／Ｌの２０％グルコース）中で再構成し、２〜２．５×１０６個／ｍｌの最終濃度とした。１００μＬ／ウェルの懸濁液細胞をウェルに添加し、ここに用量設定したＩＬ２１もまた添加した。
【０１１１】
ＴＧＮ１４１２と比較した、ＩＬ２１により誘発されるタンパク質の程度を試験するために、３３ｎｇ／ｍｌのＩＬ２１を、５人の個別のヒト対象から得られたＰＢＭＣと共に、９６ウェルプレート内でインキュベートした。ＭＳＤ多重免疫アッセイプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて、製造者の使用説明書に従って、ＰＢＭＣ培養物から採取された細胞調整培地における、分泌されたサイトカインレベルを測定した。結果を、１μｇ／ウェルでの架橋ＴＧＮ１４１２について報告されているシグナルと比較した（上記のＳｔｅｂｂｉｎｇｓら（２００７））。２０時間のインキュベーションの後の、ＴＧＮ１４１２またはＩＬ２１のいずれかによって誘発されたインビトロでのＩＬ８タンパク質シグナルまたはＴＮＦαタンパク質シグナルの程度を、表２Ａに示す。Ｓｔｅｂｂｉｎｇｓらによると、ＩＬ８およびＴＮＦαは、ＴＧＮ１４１２刺激によってそれぞれ１８倍および１３倍誘発されたが、ＩＬ８およびＴＮＦαのはるかに少ない誘発がＩＬ２１については実証された（１．５〜４倍の増大）。
【０１１２】
（実施例３．２）
架橋抗ＣＤ２８および架橋ＡｂＳの効果の比較
全部で１５人の健康なドナーから得られたＰＢＭＣをインキュベートし、様々な時点でのタンパク質およびＲＮＡの発現に対する架橋ＡｂＳの効果、ＩｇＧ濃度、および架橋プロトコルについて試験した。
【０１１３】
インキュベーションの最後に、全ての９６ウェルプレートを、Ｊｏｕａｎ  ＣＲ４２２冷却遠心分離機（Ｊｏｕａｎ  Ｉｎｃ．、Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＶＡ）を用いて、２８０×ｇ（冷却下で）で回転させた。細胞ペレットからのＲＮＡ抽出を、調整培地を除去する際に、１％のβ−メルカプトエタノールを含有する１００μＬのＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）をウェルに添加することで開始した。次に、ウェルを、その後のＲＮＡ精製のために急速冷凍した。簡潔に述べると、ＲＬＴ溶解緩衝液内で凍結させた細胞ペレットを解凍し、製造者の推奨に従ってＱＩＡシュレッダーキットおよびＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、全ＲＮＡの単離のために処理した。試料の全てをＤＮａｓｅ（オンカラム処理）に供し、潜在的なＤＮＡ汚染を除去し、次に、Ｑｉａｇｅｎキットにおいて提供されるカラムを用いて精製した。次に、フェノール−クロロホルム抽出を行い、ＲＮｅａｓｙミニキット試薬を用いて、ＲＮＡをさらに精製した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いて、溶出されたＲＮＡを定量した。試料当たりおよそ２２５ｎｇの全ＲＮＡ（ＴＬＤＡ当たり、以下を参照されたい）を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキット（カタログ番号４３２２１７１；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いてｃＤＮＡに変換した。
【０１１４】
実施例３（ヒト）におけるこの研究および以下の研究における全ての遺伝子転写分析では、ＴＬＤＡヒト免疫アレイカード（カタログ番号４３７０５７３、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）低密度アレイ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、または特注のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）低密度アレイのいずれかを用い、この低密度アレイは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手され、既知のＩＬ２１応答性遺伝子およびサイトカインストームに関連する遺伝子を照会するために設計されたものである。
【０１１５】
１０μｇ／ウェルの架橋抗体で試験された５人のドナーで得られた結果を図２Ｂに示す。結果は、Ｓｔｅｂｂｉｎｇｓら（上記）によって記載されている抗ＣＤ２８架橋の条件が、サイトカインストームに関連するサイトカインの強力な分泌を誘発することを裏付けるものであった。さらに、また予想通りに、サイトカインストームとの既知の関連および／またはＩＬ２１介在性の活性化との関連に基づいて選択された１４個の遺伝子のＲＮＡ発現レベルにおいて、大幅な増大が観察された（図２Ｂ、黒いバー）。逆に、架橋ＡｂＳは、ＲＮＡ発現の増大を誘発しなかった（図２Ｂ、白いバー）。
【０１１６】
対照ＩｇＧ１ＴＭで観察されるいくつかのサイトカインのレベルは、培地対照群におけるレベルよりも増大したが、図２Ｂに示すように、抗ＣＤ２８で刺激された群におけるレベルは、対照ＩｇＧ１ＴＭで刺激された培養物におけるレベルよりも有意に高かった。観察されたＩｇＧ１ＴＭの効果が、その特定の試薬に特異的な特徴に起因するかどうかを調べるために、２つの他の架橋Ｉｇ対照試薬を試験した。これらの試薬の両方、すなわち、定常領域における３つの突然変異を除いてＩｇＧ１ＴＭと全ての特徴を共有するヒトＩｇＧ１野生型と、精製ヒトＦｃとは、培地対照に対する、類似の増大を誘発した（データは示していない）。これらの結果は、ＩｇＧ試薬が、これらの研究において採用された架橋プロトコルのもとで活性化を誘発することを示し、このような研究における、よく特徴付けされた対照ＩｇＧ試薬の必要性を強調する。
【０１１７】
（実施例３．３）
インビトロでの架橋抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質でのヒトＰＢＭＣ活性化の検出
抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質が、ＩＬ２１で観察されるシグナルと類似のシグナル、またはサイトカインストームに関連するシグナルを誘発するかどうかを決定するために、１５人の個別のヒトドナーから得られたＰＢＭＣに対する架橋結合タンパク質（例えばＡｂＳ）のインビトロでの試験を行った（図３）。具体的には、結合タンパク質（ウェル当たり、１００ｎｇ、３００ｎｇ、１μｇ、または１０μｇ）または対照ＩｇＧ［ＩｇＧＴＭ、ＩｇＧ１（ヒトＩｇＧ抗破傷風野生型）、またはＩｇＧＦｃ］を、９６ウェルプレートの抗ＩｇＧ被覆ウェルまたは乾燥被覆ウェルのいずれかに吸着させた。ＩＬ２１および抗ＣＤ２８（ＡＮＣ２８．１／５Ｄ１０；Ａｎｃｅｌｌ、Ｂａｙｐｏｒｔ、ＭＮ）を、活性化シグナルの検出のための陽性対照として用いた。
【０１１８】
乾燥被覆プロトコルにおいて、結合タンパク質は、全容積がウェル当たり５０μｌの無菌ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）中の用量設定された結合タンパク質のそれぞれのマスターストック溶液を空気乾燥させることによって、ウェル上に被覆され、これは、９６ウェルポリスチレンＣｏｒｎｉｎｇ高結合プレート（カタログ番号３３６１、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｌｏｗｅｌｌ、ＭＡ）のウェル上に直接アプライされた。これらのプレートは、乾燥のために、室温で一晩、組織培養フードの下で開いたままにした。
【０１１９】
抗ＩｇＧ被覆プロトコルにおいて、無菌ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）中の用量設定された結合タンパク質の、ウェル当たり１００μｌのマスターストック溶液を、室温で１時間にわたり、９６ウェルヤギ抗ヒトＩｇＧプレート（Ｈ＋Ｌ）（カタログ番号３５４１８０；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＭＡ）のウェル上に直接アプライし、次に、４℃で一晩撹拌した。
【０１２０】
乾燥被覆プロトコルおよび抗ＩｇＧ被覆プロトコルの両方によって、ＰＢＭＣ架橋実験について、良好に結合したヒトＩｇＧが得られた（図４）。培養ウェルにおける被覆された結合タンパク質の持続性を、細胞培養物試料を回収した後に、ヒトＩｇＧのＥＬＩＳＡ検出によって、各条件について確認した。ウェルを、２００μｌ／ウェルの、ＰＢＳ内の０．０３％Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄した。検出抗体であるマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ＨＲＰ（カタログ番号９０４０−０５；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）を、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ内の、０．５％ＢＳＡ＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０）内に１：２０００の割合で希釈し、１００μｌを各ウェルに添加し、３０分間にわたりゆっくりと撹拌した。次に、ウェルを、２００μＬ／ウェルの、ＰＢＳ内の０．０３％Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄した。最後に、１００μｌ／ウェルのＢｉｏＦＸ  ＴＭＢ  ＨＲＰ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ、ＭＤ；カタログ番号ＴＭＢＷ−０１００−０１）を各ウェルに添加し、室温で８分間にわたり発色させた。５０μｌ／ウェルの、０．１８ＮのＨ２ＳＯ４によって、反応を停止させた。結合した結合タンパク質の相対的な量を、４５０ｎｍのＯ．Ｄ．での吸光度を測定することによって、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて記録した。
【０１２１】
結合タンパク質の吸着の後、プレートを、実施例３．１において記載したように単離された、２〜２．５×１０５個細胞／ウェルのヒトＰＢＭＣと共に、４、２０、４８、７２、または１２０時間にわたりインキュベートし、タンパク質レベルおよびＲＮＡレベルを測定した（図５）。表３は、最初の５人のヒトドナーで試験されたタンパク質レベルおよびＲＮＡレベルの結果を示す。次の１０人のドナーから得られた試料を、２１個の試験遺伝子（ＣＸＣＬ１０、ＩＣＯＳ、ＩＦＮγ、ＩＬ２ＲＡ、ＣＤ１９、ＰＲＦ１、ＧＺＭＢ、ＧＮＬＹ、ＩＬ１３、ＩＬ１７、ＣＸＣＬ１１、ＣＤ４０ＬＧ、ＩＬ１ｂ、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＬ１２Ｂ、ＴＮＦ、およびＩＬ２１Ｒ）および３つの内因性対照遺伝子（１８Ｓ、ＺＮＦ５９２、およびＰＴＰＲＣ）という遺伝子を含有する、特注のＴＬＤＡを用いて試験した。
【０１２２】
【表４】
2012504939.tif 000008
【０１２３】
表３について、タンパク質レベルを、多重免疫アッセイによって決定した。具体的には、６ウェルの、１０スポット（ＩＦＮγ、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＬ１３、ＴＮＦ）ＭＳＤプレート（ＭＳ６０００  Ｈｕｍａｎ  ＴＨ１／ＴＨ２  １０−Ｐｌｅｘ  Ｋｉｔ、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）ならびに９６ウェルの特注の２スポット（ＩＬ６およびＣＣＬ３）ＭＳＤプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いて、製造者の使用説明書に従って、ＰＢＭＣ培養物から採取された細胞調整培地における、分泌されたサイトカインレベルを測定した。アッセイの感度は、製造者のガイドラインの限定値内であった。
【０１２４】
ＲＮＡレベルを、実施例３．２において記載したように、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ａｒｒａｙ上で標的をスクリーニングすることによって決定した。ＡｂＳ対ＩｇＧＴＭのＲＱは、同一の濃度の対照結合タンパク質に対する抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質の相対的な倍率変化の代表的なものであった。
【０１２５】
測定値は、複数の時点で、複数の結合タンパク質濃度および３つの異なる陰性対照ＩｇＧで得た。ＩＬ２１刺激／抗ＣＤ２８刺激を陽性対照として含め、プレートへの結合タンパク質の結合を常にＥＬＩＳＡによって確認した。
【０１２６】
結合タンパク質処理によるＩＦＮγ放出の決定によって実証されるように、２０時間の時点では、全ての１２個のサイトカインについて、架橋ＡｂＳでは有意なサイトカインタンパク質の放出は実証されなかった（図６Ａ）。同様に、４時間の時点での乾燥被覆提示法または抗ＩｇＧ被覆提示法のいずれかによって実証されるように、架橋ＡｂＳは、ＩＬ２１応答性遺伝子またはサイトカインストーム遺伝子のいずれかのヒトＰＢＭＣのＲＮＡ発現を有意には活性化しなかった（図６Ｂ）。実際、架橋ＡｂＳでは、ＩｇＧＴＭ対照と比較して、ＩＬ２１依存性の増大は観察されなかった。
【０１２７】
したがって、ＡｂＳは、ヒトＰＢＭＣのインビトロでのアッセイにおいて、ＩＬ２１で観察されたシグナルまたはサイトカインストームに関連するシグナルを誘発しない。
【０１２８】
異なるドナー間の処理応答における固有の変動を制御するため、および、所与のドナーにおいて誘発された何らかのアゴニスト応答が、他のドナーにおける応答の欠如により統計的にマスキングされる可能性を避けるため、ＡｂＳ処理による誘発遺伝子転写産物を、対照ＩｇＧＴＭを有する全てのドナーで見られる範囲と比較した。アッセイの固有の変動性の範囲は、全てのドナーから得られるＩｇＧＴＭ対照の値の平均±３標準偏差と定義した。活性化シグナルは、アッセイの固有の変動の範囲よりも大きい任意の値として定義した。
【０１２９】
ＡｂＳ（１０、１、０．３、および０．１μｇ／ウェル）で得られたサイトカインストーム誘発の値を、ＩｇＧＴＭで得られた値によって定義された、アッセイの固有の変動性の範囲と比較した。１０μｇ／ウェルのＡｂＳ（抗ＣＤ２８抗体によるサイトカインストーム誘発のために最適な用量）では、いずれのドナーにおけるいずれのサイトカインストーム遺伝子についても、シグナルは観察されなかった。１人のドナーにおける０．３μｇ／ウェルでのＩＬ２ＲＡの値は、３．１８倍増大して固有の変動性の範囲を超えたが、一方、別のドナーにおける、０．１および０．３μｇ／ウェルでのＩＬ２ＲＡの値は、それぞれ０．５倍および０．０４倍低下し、また同様に、固有の変動性の範囲を超えた。しかし、ＩＬ２ＲＡ遺伝子は、サイトカインストームとも炎症性カスケードとも関連していない。
【０１３０】
ＡｂＶ、ＡｂＷ、およびＡｂＵを含むいくつかの他の結合タンパク質についてのサイトカインストーム活性化シグナルもまた決定した（データは示していない）。個別のドナーを任意の活性化シグナルについて評価すると、非常に少数の散発的なシグナルが観察された。ＡｂＶでは、試験したあらゆる濃度でのあらゆる遺伝子について、いずれのドナーにおいても活性化シグナルは観察されなかった。ＡｂＷおよびＡｂＵでは、対照を超えるわずかな散発性の活性化シグナルが、非常に少数の試料において観察されたが、これらのシグナルは、より低い、試験された濃度でのものであった。
【０１３１】
（実施例３．４）
ＩＬ２１に対するカニクイザル全血の作動性応答は、抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質を用いたエクスビボでの処理によって中和される
拮抗的結合タンパク質、例えばＡｂＳを用いた毒性研究におけるカニクイザルの使用を支持するために、ＡｂＳが、カニクイザルの血液におけるＩＬ２１誘発性の活性化シグナルを遮断するという所望のエクスビボでの効果を誘発することを示す必要があった。
【０１３２】
カニクイザル全血試料を、ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）ＣＰＴ（商標）細胞調製チューブ内に回収した。回収チューブは、クエン酸ナトリウム、ヘパリンリチウム、またはヘパリンナトリウムという抗凝固剤の１つを含有するものであった。カニクイザル全血を採血し、迅速に処理した。血液を、クライオバイアル内の１〜２ｍｌのアリコートに分け、ＩＬ２１、ＡｂＳ、または指定された場合は対照タンパク質で処理した。試料を、結合タンパク質とＩＬ２１との両方で処理する場合、結合タンパク質はＩＬ２１の直前に添加した。次に、試料を、４時間にわたり、Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅａｃｈ−Ｉｎ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒモデル番号３９５６（Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｍａｒｉｅｔｔａ、ＯＨ）において３７℃でインキュベートし、一方で、インキュベーションの間に、ＡＴＲ  Ｒｏｔａｍｉｘ回転ミキサー（カタログ番号ＲＫＶＳ；シリアル番号０９９５−５２および０６９５−３６；Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｕｒｅｌ、ＭＤ）を用いて、またはＬａｂＱｕａｋｅ（登録商標）Ｔｕｂｅ  Ｓｈａｋｅｒ／Ｒｏｔａｔｏｒ（カタログ番号４００１１０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｄｕｂｕｑｕｅ、ＩＡ）を用いて、１５ＲＰＭで連続的に混合した。アリコート（０．５ｍｌ）を、ＡＲＴ  １０００Ｅチップ（カタログ番号７２８３０−０４２）を有するＧｉｌｓｏｎ  Ｐ１０００ピペットを用いて取り出し、Ｈｕｍａｎ  ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）−Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ（カタログ番号ＡＭ１９２８；Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）に同梱されている１．３ｍｌのＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）を含有する、２．０ｍｌのマイクロチューブ（カタログ番号１００１１−７４４；Ａｘｙｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に添加し、５回の完全な反転によって完全に混合した。試料を一晩にわたり周囲温度で保存し、次に、ＲＮＡ精製を待つ間、−８０℃で凍結した。
【０１３３】
ＲＮＡを、Ｈｕｍａｎ  ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）−Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号ＡＭ１９２８）を用いて単離した。Ｈｕｍａｎ  ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）ＲＮＡ単離手順は、グアニジウムベースの溶液における細胞溶解、およびフェノール／クロロホルム抽出によるＲＮＡの最初の精製、およびガラスファイバーフィルター上での固相抽出による最終的なＲＮＡ精製からなる。残りのゲノムＤＮＡを、キットにおいて提供されるＤＮＡ−ｆｒｅｅ（商標）試薬を用いて、ＤＮＡｓｅ処理のために、製造者の使用説明書に従って除去した。全ての試料について、ＲＮＡの量を、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた２６０ｎｍでの吸光度によって決定した。ＲＮＡの質は、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いて抽出検査した。試料は、ｃＤＮＡ合成が行われるまで、−８０℃で保存した。
【０１３４】
製造者の使用説明書に従って、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カタログ番号４３６８８１４；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を、５０Ｕ／試料のさらなるＲＮａｓｅ阻害剤（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｎ８０８−０１１９）と共に用いて、ｃＤＮＡを全ＲＮＡから逆転写した。ｃＤＮＡ試料は、ＲＰ−ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）を行うまで、−２０℃で保存した。ｃＤＮＡ試料を、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、次に９５℃で１５秒間を４０サイクル、および６０℃で１分間という普遍的な温度サイクル条件を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００配列検出器（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ２．２．２、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でのサルの研究のために設計された特注のＴＬＤＡを用いてアッセイした。
【０１３５】
ＩＬ２１がカニクイザルおよびヒトの血液において類似の応答を誘発するかどうかを決定するために、ＰＲＦ１、ＩＬ２１Ｒ、ＧＺＭＢ、ＩＬ１０、ＴＮＦ、およびＩＬ２ＲＡを含む１７個のＲＮＡのＩＬ２１依存性の誘発を試験した。ＩＬ２１に対する、強力な、顕著な応答が、ＩＬ２ＲＡ、ＰＲＦ１、ＧＺＭＢ、およびＩＬ２１Ｒを含むいくつかの遺伝子について観察された（データは示していない）。ＩＬ２１は、カニクイザルの血液において強力なＩＬ２ＲＡ応答を誘発したが、ＴＮＦ応答は、別の実験において観察されたＬＰＳ誘発性およびＰＨＡ誘発性の応答と比較してはるかに弱かった（図７）。
【０１３６】
ＡｂＳは、ヒト血液におけるその応答と同様に、ＩＬ２１に対するカニクイザル血液のエクスビボでの応答を阻害した。ＩＬ２１によって典型的に誘発される１１個のサイトカインの発現レベルを試験した（データは示していない）。ＩＬ２ＲＡのＡｂＳによる阻害により実証されるように（図８）、ＡｂＳは、ＩＬ２１に対するカニクイザル血液のエクスビボでの応答を阻害した。これらのデータは、ＡｂＳがカニクイザルにおいて所望の生物学的活性を有することを示し、したがって、カニクイザルを、さらなる毒性研究に用いた。
【０１３７】
（実施例３．５）
ＩＬ２１経路およびサイトカインストームの結合タンパク質誘発性の活性化について試験するためのインビボでの非ヒトモデルの確立
カニクイザルにおけるＩＬ２１経路およびサイトカインストーム遺伝子に対するＡｂＳのインビボでの効果を実証するため、サルを２つの処理群、すなわちＡｂＳ処理群または未処理群に分けた。処理される動物には、１００ｍｇ／ｋｇのＡｂＳを１回静脈内投与した（これは、予想された臨床用量よりも少なくとも１０倍高いものである）。血液は、処理後６時間、２４時間、１４日、または５６日でサルから得た。動物から血液を採取する際、１ｍｌの血液を、１２５μｌのクエン酸ナトリウム（０．１Ｍ）に迅速に添加し、５回反転させ、その後、遠心分離機において１２００×ｇで１０分間にわたり回転させた。血漿を、クライオチューブ内にアリコート化し、３００μｌのＲＰＭＩ１６４０を残りの血液ペレットに添加した（血漿の損失を補うため）。次に、２．６ｍｌのＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号ＡＭ７０２０）を血液と培地との混合物に添加し、よく混合し、−８０℃で凍結した。
【０１３８】
実施例３．４において記載するように、ＲＮＡを、ＲｉｂｏＰｕｒｅ−Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号ＡＭ１９２８）を用いて精製し、Ａ２６０／２８０のＯＤ値をモニタリングするＮａｎｏｄｒｏｐ製品（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量した。各ＲＮＡ試料の質を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）上のＲＮＡ分子量ラダーに沿ったキャピラリー電気泳動によって評価した。
【０１３９】
各試料から得られるＲＮＡを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ；カタログ番号４３２２１７１）を用いてｃＤＮＡに変換し、ＴＬＤＡカード上にロードし、上記の実施例において記載したように処理した。
【０１４０】
ＴＮＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ２、ＩＬ１２β、ＩＬ１０、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＰＲＦ１、ＧＺＭＢ、ＳＴＡＴ３、ＴＢＸ２１、ＣＳＦ１、およびＣＤ１９を含む、いくつかのサイトカインストーム遺伝子およびＩＬ２１応答性遺伝子の発現レベルを測定した。
【０１４１】
ＴＮＦおよびＩＦＮγに対する効果によって実証されるように（図９）、ＡｂＳで処理したサルおよび対照で処理したサルは、ＩＬ２１誘発性遺伝子およびサイトカインストームに関連する遺伝子の同程度の血液ＲＮＡ発現レベルを示した。対照的に、インビトロでのアゴニストＬＰＳおよびＰＨＡは、別のインビトロでの刺激実験において、ＴＮＦのＲＮＡの５０倍および２０倍の刺激を誘発した（図９）。
【０１４２】
これらのデータは、結合タンパク質ＡｂＳが、ＩＬ２１応答性シグナルもサイトカインストームに関連するシグナルも誘発せず、薬剤開発のための有望な標的となることを実証する。
【０１４３】
本明細書において記載される具体的な実施例のいくつかは、ＡｂＳを用いる研究であったが、同一のまたは類似のタイプの研究を、例えばサイトカインストームに対する、特定のＩＬ２１Ｒ結合タンパク質／抗体の効果を決定するため、およびヒトの療法における特定の抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質／抗体の安全性の評価において役立てるために、本願内に組み込まれる抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質または他の抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質／抗体などの任意の抗ＩＬ２１Ｒ結合タンパク質を用いて行うことができる。例えば、このような実験は、法的提出文書に含めるために行うことができ、また、将来の抗ＩＬ２１Ｒ療法を評価するために用いることができる。
【０１４４】
均等物
当業者であれば、ただの常法通りの実験を用いて、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することができる。このような同等物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2012504939.tif 000023
2012504939.tif 000024
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