(57)【要約】  本発明は、成長ホルモンポリペプチド、例えば組換えヒト成長ホルモンの精製のための新規な方法に関する。本発明の方法は、一つ以上の低分子量合成リガンドを固定化している固相材料を含むアフィニティー樹脂を利用する。前記アフィニティー樹脂は、密接に関連するタンパク質からの成長ホルモンの分離を可能にする。
2012508728.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）成長ホルモンポリペプチドの一部のアフィニティー樹脂への結合を容易にする条件下で、成長ホルモンポリペプチドを含む懸濁物または溶液をアフィニティー樹脂と接触させる工程；
（ｂ）成長ホルモンポリペプチドを含む前記アフィニティー樹脂を、洗浄バッファーで任意に洗浄する工程；及び
（ｃ）成長ホルモンポリペプチドを含む前記アフィニティー樹脂を溶出バッファーで溶出し、溶出物として成長ホルモンポリペプチドを回収する工程
を含む、成長ホルモンポリペプチドの精製方法であって、
前記アフィニティー樹脂が、一般式（Ｉ）の一つ以上のリガンドを共有結合で固定化している固相材料である、方法：
【化１】
2012508728.tif 000043
［式中、
ｉ＝１，２，・・・，ｍ、及びｊ＝１，２，・・・，ｎ；
ｍ及びｎは独立に０−３の範囲の整数であり、但しｎ＋ｍの合計は１−４の範囲内である；
ｐ、ｑ及びｒは独立に０−６の範囲の整数である；
Ａ１１，・・・，Ａ１ｍ及びＡ２１，・・・，Ａ２ｎは独立に、α−アミノ酸部分、β−アミノ酸部分、α−アミノスルホン酸部分、及びβ−アミノスルホン酸部分から選択される；
Ｚ１及びＺ２は独立に、水素、Ｃ１−６アルキル、カルボン酸部分（Ｚ−Ｃ（＝Ｏ）−）、及びスルホン酸部分（Ｚ−Ｓ（＝Ｏ）２−）から選択され、Ｚは水素、任意に置換されたＣ１−１２アルキル、任意に置換されたＣ３−１２シクロアルキル、任意に置換されたＣ１−１２アルケニル、任意に置換されたＣ１−１２アルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、及び任意に置換されたヘテロシクリルから選択される；
Ｒ１及びＲ２は独立に、水素及びＣ１−６アルキルから選択される；
Ｘは直接のまたはリンカーを介した固相材料に対するリガンドの結合のための基であり、Ｘはカルボン酸（−ＣＯＯＨ）、カルボン酸エステル（−ＣＯＯＲ）、カルボン酸無水物（−ＣＯＯＣＯＲ）、カルボン酸ハライド（−ＣＯＨａｌ）、スルホン酸（−Ｓ（＝Ｏ）２ＯＨ）、スルホニルクロリド（−Ｓ（＝Ｏ）２Ｃｌ）、チオール（−ＳＨ）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−Ｒ）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、アルデヒド（Ｃ（＝Ｏ）Ｈ）、エポキシド（−ＣＨ（Ｏ）ＣＨ２）、シアニド（−ＣＮ）、ハロゲン（−Ｈａｌ）、第一級アミン（−ＮＨ２）、第二級アミン（−ＮＨＲ）、ヒドラジド（−ＮＨ＝ＮＨ２）、及びアジド（−Ｎ３）から選択され、Ｒは任意に置換されたＣ１−１２アルキルから選択され、Ｈａｌはハロゲンである；及び
前記リガンドの全分子量（「Ｘ」といずれかのリンカーを除く）は２００−２０００ｇ／ｍｏｌである］。
【請求項２】
Ｚ１及びＺ２が、水素、Ｃ１−６アルキル、キサンテン−９−カルボニル、２−アミノニコチニル、２−キナルジンカルボニル、４，８−ジヒドロキシ−２−キノリンカルボニル、４−キノリンカルボニル、５−メチル−２−ニトロベンゾイル、２−（ベンゾイミダゾリルチオ）アセチル、５−メチル−２−フェニル−２Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−カルボニル、６−ヒドロキシ−２−ナフトイル、４，７−ジメチルピラゾロ［５，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−３−カルボニル、３−アミノ−４−（フェニルスルホニル）−２−チオフェンカルボニル、（＋／−）−３−オキソ−１−インダンカルボニル、５，６，７，８−テトラヒドロアクリジン−９−カルボニル、２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−カルボニル、５−（４−メチル−２−ニトロフェニル）フロイル、１−シクロヘキシル−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボニル、キノキサリン−６−カルボニル、及び４−メチル−２−フェニルピリミジン−５−カルボニルから独立に選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｚ１及びＺ２が、水素、Ｃ１−６アルキル、キサンテン−９−イルカルボニル、５−メチル−２−フェニル−２Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルカルボニル、３−アミノ−（フェニルスルホニル）−チオフェン−２−イルカルボニル、（＋／−）−３−オキソ−１−インダニル、５，６，７，８−テトラヒドロアクリジン−９−イルカルボニル、及び２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−イルカルボニルから独立に選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｚ１が三環式の任意に置換されたヘテロ芳香族基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記リガンドが一般式（ＩＩ）を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法：
【化２】
2012508728.tif 000044
［式中、
Ｚ１はＺ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、Ｚが任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、及び任意に置換されたヘテロシクリルから選択され
Ｚ２は水素及びＺ−Ｃ（＝Ｏ）−から選択され、Ｚが任意に置換されたＣ１−１２アルキル、任意に置換されたＣ３−１２シクロアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、及び任意に置換されたヘテロシクリルから選択され；
Ａ２１及びＡ２２の各々はα−アミノ酸及びβ−アミノ酸から独立に選択される］。
【請求項６】
Ａ２１がアルギニン、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、及びリジンから選択され、Ａ２２がアルギニン、フェニルアラニン、イソロイシン、プロリン、チロシン、及びトリプトファンから選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドが一般式（ＩＩＩ）を有する、請求項５に記載の方法：
【化３】
2012508728.tif 000045
［式中、Ｒ’及びＲ”はα−アミノ酸の側鎖から独立に選択され、Ｒ’’’は任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、及び任意に置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される］。
【請求項８】
前記リガンドが以下のリガンド番号（１）−（１６）から選択される、請求項７に記載の方法：
【化４−１】
2012508728.tif 000046
【化４−２】
2012508728.tif 000047
【化４−３】
2012508728.tif 000048
【化４−４】
2012508728.tif 000049
【請求項９】
工程（ｂ）において、少なくとも一つの洗浄バッファーが０−５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、ｐＨ６．０−６．５を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｃ）において、溶出バッファーが７．０から８．０の間のｐＨを有する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
溶出バッファーが０−２００ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、ｐＨ７．０−７．５を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
成長ホルモンポリペプチドがヒト成長ホルモンポリペプチドである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ヒト成長ホルモンポリペプチドが組換えヒト成長ホルモンポリペプチドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ヒト成長ホルモンポリペプチドが修飾ヒト成長ホルモンポリペプチドである、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
修飾ヒト成長ホルモンポリペプチドがＰＥＧ化ヒト成長ホルモンポリペプチドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
一般式（Ｉ）の一つ以上のリガンドを共有結合で固定化している固相材料を含むアフィニティー樹脂：
【化５】
2012508728.tif 000050
［式中、
ｉ＝１，２，・・・，ｍ、及びｊ＝１，２，・・・，ｎ；
ｍ及びｎは独立に０−３の範囲の整数であり、但しｎ＋ｍの合計は１−４の範囲内である；
ｐ、ｑ及びｒは独立に０−６の範囲の整数である；
Ａ１１，・・・，Ａ１ｍ及びＡ２１，・・・，Ａ２ｎは独立に、α−アミノ酸部分、β−アミノ酸部分、α−アミノスルホン酸部分、及びβ−アミノスルホン酸部分から選択される；
Ｚ１及びＺ２は独立に、水素、Ｃ１−６アルキル、カルボン酸部分（Ｚ−Ｃ（＝Ｏ）−）、及びスルホン酸部分（Ｚ−Ｓ（＝Ｏ）２−）から選択され、Ｚは水素、任意に置換されたＣ１−１２アルキル、任意に置換されたＣ３−１２シクロアルキル、任意に置換されたＣ１−１２アルケニル、任意に置換されたＣ１−１２アルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、及び任意に置換されたヘテロシクリルから選択される；
Ｒ１及びＲ２は独立に、水素及びＣ１−６アルキルから選択される；
Ｘは直接のまたはリンカーを介した固相材料に対するリガンドの結合のための基であり、Ｘはカルボン酸（−ＣＯＯＨ）、カルボン酸エステル（−ＣＯＯＲ）、カルボン酸無水物（−ＣＯＯＣＯＲ）、カルボン酸ハライド（−ＣＯＨａｌ）、スルホン酸（−Ｓ（＝Ｏ）２ＯＨ）、スルホニルクロリド（−Ｓ（＝Ｏ）２Ｃｌ）、チオール（−ＳＨ）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−Ｒ）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、アルデヒド（Ｃ（＝Ｏ）Ｈ）、エポキシド（−ＣＨ（Ｏ）ＣＨ２）、シアニド（−ＣＮ）、ハロゲン（−Ｈａｌ）、第一級アミン（−ＮＨ２）、第二級アミン（−ＮＨＲ）、ヒドラジド（−ＮＨ＝ＮＨ２）、及びアジド（−Ｎ３）から選択され、Ｒは任意に置換されたＣ１−１２アルキルから選択され、Ｈａｌはハロゲンである；及び
前記リガンドの全分子量（「Ｘ」といずれかのリンカーを除く）は２００−２０００ｇ／ｍｏｌである］。
【請求項１７】
前記リガンドが請求項２から８のいずれか一項に特定される、請求項１６に記載のアフィニティー樹脂。
【請求項１８】
前記リガンドが直接にまたはリンカーを介してのいずれかで、カルボン酸基を介してアフィニティー樹脂の固相材料に共有結合している、請求項８に規定されるリガンド（１）−（１６）からなる群から選択される、請求項１７に記載のアフィニティー樹脂。
【請求項１９】
ここに規定されたリガンド（１）−（１６）からなる群から選択されるアフィニティーリガンド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成長ホルモンポリペプチド、例えば組換えヒト成長ホルモンの精製のための新規な方法に関する。本発明の方法は、一つ以上の低分子量合成リガンドを固定化している固相材料を含むアフィニティー樹脂を利用する。前記アフィニティー樹脂は、密接に関連するタンパク質からの成長ホルモンの分離を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
治療上のタンパク質は、生存細胞で生産され、患者において使用する前に、タンパク質の複雑な混合物、及び他の生物学的種類から精製されなければならない。この分離は、非常に労力を必要としコストが掛かるはずである。数多くのクロマトグラフィー材料が、そのような分離における使用のために記載されている。
【０００３】
アフィニティークロマトグラフィーは、アフィニティーカラムに実装された固相材料、通常は多孔性のポリマーマトリックスに、タンパク質のような生物学的物質を選択的且つ可逆的に吸着することが可能である。適切なリガンドが、固相材料に直接またはリンカーによって共有結合される。リガンドに対してアフィニティーを有する生物学的物質を含むサンプルが、リガンドと、リガンドに対するアフィニティーを有する生物学的物質との間の特異的な結合を促進する適切な結合条件下で、固相材料に共有結合で固定化されたアフィニティーリガンドと接触させることができる。アフィニティーカラムは、バッファーで後に洗浄して未結合の物質を除去でき、さらなる工程で、リガンドに対するアフィニティーを有する生物学的物質が溶出されて、精製形態または更に単離した形態で得られる。従ってリガンドは。精製または単離の目的である生物学的物質に対して特異的かつ可逆的な結合特性を好ましくは示す。
【０００４】
数多くのクロマトグラフィー材料及び方法が、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の精製について記載されている。
【０００５】
ＵＳ５，０４７，３３３は、イオン交換クロマトグラフィーまたは固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを使用するヒト成長ホルモンの精製方法を開示している。
【０００６】
ＵＳ４，３３２，７１７は、アルキル基またはフェニル基といった疎水性基を有する水不溶性担体をクロマトグラフィー材料として使用する疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用する、ヒト成長ホルモンの精製方法を開示している。
【０００７】
上記二つの方法は、化合物の物理化学的特性の差異を利用する伝統的な精製技術に依存している。しかしながらこれらは、より低収率且つより高コストを結果として導くいくつかの過度の精製工程をしばしば必要とする。
【０００８】
ＵＳ６，１１７，９９６は、以下の一般式を有するリガンドを含むアフィニティーリガンド−マトリックス接合体を開示している：
【化１】
2012508728.tif 000003
【０００９】
前記リガンドは、マトリックスとリガンドの間に位置するスペーサーアームを任意に介して、位置（Ａ）で支持体マトリックスに結合している。そのようなアフィニティーリガンド−マトリックス接合体を使用する、例えばイムノグロブリン、インスリン、第ＶＩＩ因子、またはヒト成長ホルモン若しくはそのアナログ、誘導体及び断片及び前駆体といったタンパク質性材料の精製も開示されている。
【００１０】
ＵＳ５，７６０，１８７は、支持体マトリックスに結合したCibacron 3GA：
【化２】
2012508728.tif 000004
のような青色色素を使用するヒト成長ホルモンの精製方法を開示している。青色色素は、トリプシンまたはラクテートデヒドロゲナーゼといったアデニル含有補因子依存性酵素のアフィニティークロマトグラフィー精製で長く使用されている。しかしながら、前記担体からの成長ホルモンの溶出は、６Ｍウレアといったタンパク質変性剤を必要とする。
【００１１】
上記当該技術分野で記載されているクロマトグラフィー材料は、実際にｈＧＨの精製で使用することができる。しかしながら、合成アフィニティーリガンドを含み、更により少ない工程とより穏やかな溶出条件を含む精製方法を可能にする、ｈＧＨに対する高い特異性を有するクロマトグラフィー材料に対する必要性が未だ存在する。
【００１２】
現在の組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＨＧ）は、以下の各種の工程による発酵上清から精製できる：
【００１３】
例えばＵＳ５，２６８，２７７及びＵＳ５，６３３，３５２に開示された方法といった、複数のクロマトグラフィー工程を利用する従来のクロマトグラフィー：
【００１４】
例えばＵＳ５，３５０，８３６に開示されたような、タンパク質リガンドを有するアフィニティー樹脂を利用するアフィニティークロマトグラフィー：または
【００１５】
例えばＵＳ５，７６０，１８７に開示されたような、合成小分子リガンドを有するアフィニティー樹脂を利用するアフィニティークロマトグラフィー。
【００１６】
複数の工程を含む従来のクロマトグラフィーは、低い全体の収率、高いバッファーの消費、長い反応時間及び方法装置の大きい投資、過度の労力の一つ以上に苦慮している。
【００１７】
タンパク質リガンドを有するアフィニティー樹脂は、選択性の増大、より高い収率、より低いバッファーの消費、及び方法装置の投資の減少を導いている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】ＵＳ５，０４７，３３３
【特許文献２】ＵＳ４，３３２，７１７
【特許文献３】ＵＳ６，１１７，９９６
【特許文献４】ＵＳ５，７６０，１８７
【特許文献５】ＵＳ５，２６８，２７７
【特許文献６】ＵＳ５，６３３，３５２
【特許文献７】ＵＳ５，３５０，８３６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
しかしながら、タンパク質リガンドを有するアフィニティー樹脂は、製造が非常に高価であり、且つ小合成リガンドと比較して化学的及び構造的に不安定であり、タンパク質リガンドを有するアフィニティー樹脂の生産から、タンパク質リガンドまたは他の生物学的物質由来のタンパク質断片が、精製したｒｈＧＨに混在する危険を固有にはらんでいる。
【００２０】
ＵＳ５，７６０，１８７に開示されたもののような、ヒト成長ホルモンのアフィニティークロマトグラフィー用の最近報告された合成リガンドは、アフィニティー樹脂からタンパク質を放出するための強力なタンパク質変性剤の使用を必要とする。
【００２１】
それゆえ、組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）の精製のためのより優れたアフィニティー樹脂に対する必要性が存在している
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、新規なアフィニティー樹脂を使用する成長ホルモンポリペプチドの精製方法を提供する。本発明は、成長ホルモンポリペプチド、特にヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、例えばｒｈＧＨに選択的であり、タンパク質リガンドに基づかず、且つ安価で塩基安定性である新規な合成アフィニティーリガンドを含むアフィニティー樹脂を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ＡＡ１（上部）、ＡＡ２（中央）及びＣＡ（下部）についての平均蛍光値（任意単位）を示すグラフである。
【図２】図２は、Fractogel Amino上のリガンド１１（左図）及びFractogel Amino上のリガンド６（右図）の選択性試験から得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルの写真である。
【図３】図３は、リガンドＬ１０を有するアフィニティー樹脂を使用した典型的な稼動を示すクロマトグラムを示すグラフである。
【図４】図４は、リガンドＬ１０を有するアフィニティー樹脂を使用した精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。レーン１：Mark 12マーカー；レーン２：フロースルー；レーン３：溶出物（リガンドＬ１０を有するアフィニティー樹脂）；レーン４：精製ｈＧＨ（アミノ酸伸張を欠く）；レーン５：精密濾過された大腸菌細胞培養液。
【図５】図５は、Fractogel Amino Mに対するリガンドＬ１０を使用するｈＧＨ回収由来の精密濾過物からのｈＧＨのアフィニティー精製のクロマトグラムを示すグラフである。
【図６】図６は、リガンドＬ１０を有するアフィニティー樹脂を使用した精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。レーン１（左から）：タンパク質マーカーMark 12（Invitrogen）；レーン２：フロースルー（フラクション１＋２＋３のプール、ゲル上に１０μｌのサンプル）；レーン３：溶出物（フラクション６＋７＋８のプール、ゲル上に１０μｌのサンプル）；レーン４：ＣＩＰ（フラクション１０＋１１＋１２のプール、ゲル上に１０μｌのサンプル）；レーン５：参照精密濾過サンプル（×５０の希釈）。
【図７】図７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーン３に示されたプールされたフラクションのＨＰＬＣを示すグラフである。純度７４％、Ｔｒ＝２２分でのｈＧＨ。
【図８】図８は、５０ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ、ｐＨ６．２５のロードバッファーで得られたクロマトグラムを示すグラフである。
【図９】図９は、リガンドＬ１０を有するアフィニティー樹脂を使用した精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。レーン１（左から）：タンパク質マーカーMark 12（Invitrogen）；レーン２：フロースルー（フラクション１＋２＋３のプール、ゲル上に１０μｌのサンプル）；レーン３：溶出物（フラクション６＋７＋８のプール、ゲル上に１０μｌのサンプル）；レーン４：ＣＩＰ（フラクション１０＋１１＋１２のプール、ゲル上に１０μｌのサンプル）；レーン５：参照精密濾過サンプル（×５０の希釈）。
【図１０】図１０は、プールされた溶出フラクション（フラクション６−８）のＨＰＬＣクロマトグラムを示すグラフである。Ｔｒ＝２１．５分でのｈＧＨ。
【図１１】図１１は、Fractogel上のリガンドＬ１４を使用するｈＧＨのアフィニティー精製から得られたクロマトグラムを示すグラフである。
【図１２】図１２は、リガンドＬ１４を有するアフィニティー樹脂を使用した精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。ゲル分析：レーン１（左から）：タンパク質マーカーMark 12（Invitrogen）；レーン２：フロースルー（フラクション１＋２のプール、ゲル上に１０μｌのサンプル）；レーン３：溶出物（フラクション８のプール、ゲル上に１０μｌのサンプル）；レーン４：溶出物（フラクション９のプール、ゲル上に１０μｌのサンプル）；レーン５：溶出物（フラクション７＋８＋９のプール、ゲル上に１０μｌのサンプル）；レーン６：ＣＩＰ（フラクション１６＋１７のプール、ゲル上に１０μｌのサンプル）；レーン７：ｈＧＨ参照；レーン８：参照精密濾過サンプル（×５０の希釈）。
【図１３】図１３は、フラクション９の溶出物のＨＰＬＣクロマトグラムを示すグラフである。
【図１４】図１４は、Fractogel上のリガンドＬ１６を使用するｈＧＨのアフィニティー精製から得られたクロマトグラムを示すグラフである。
【図１５】図１５は、リガンドＬ１６を有するアフィニティー樹脂を使用した精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。レーン１：タンパク質マーカーMark 12（Invitrogen）；レーン２：フロースルー（フラクション１＋２のプール、ゲル上に１０μｌのサンプル）；レーン３：溶出物（フラクション７＋８のプール、ゲル上に１０μｌのサンプル）；レーン４：溶出物（フラクション９のプール、ゲル上に１０μｌのサンプル）；レーン５：溶出物（フラクション７＋８＋９のプール、ゲル上に１０μｌのサンプル）；レーン６：ＣＩＰ（フラクション１６＋１７のプール、ゲル上に１０μｌのサンプル）；レーン７：ｈＧＨ参照；レーン８：参照精密濾過サンプル（×５０の希釈）。
【図１６】図１６は、プールされた溶出物フラクション７，８及び９のＨＰＬＣクロマトグラムを示すグラフである。
【図１７】図１７は、Fractogel上のリガンドＬ１４を使用するハイパーグリコシル化ｈＧＨのアフィニティー精製から得られたクロマトグラムを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、成長ホルモンポリペプチドの精製方法を提供する。
【００２５】
本発明は、リガンドが成長ホルモンポリペプチドの特異的結合パートナーであり、それ故前記ポリペプチドの精製に使用できる、アフィニティーリガンドとアフィニティー樹脂の使用を含む、成長ホルモン（ＧＨ）ポリペプチドの精製方法を開示する。
【００２６】
従って、本発明の一つの実施態様は、
（ａ）成長ホルモンポリペプチドの一部のアフィニティー樹脂への結合を容易にする条件下で、成長ホルモンポリペプチドをアフィニティー樹脂と接触させる工程；
（ｂ）結合した成長ホルモンポリペプチドを含む前記アフィニティー樹脂を、洗浄バッファーで任意に洗浄する工程；及び
（ｃ）成長ホルモンポリペプチドを含む前記アフィニティー樹脂を溶出バッファーで溶出し、溶出物として精製成長ホルモンポリペプチドを回収する工程
を含む、成長ホルモンポリペプチドの精製方法に関する。
【００２７】
本発明の一つの実施態様では、アフィニティー樹脂は、一般式（Ｉ）のリガンドを共有結合で固定化している固相材料である：
【化３】
2012508728.tif 000005
［式中、
ｉ＝１，２，・・・，ｍ、及びｊ＝１，２，・・・，ｎ；
ｍ及びｎは独立に０−３の範囲の整数であり、但しｎ＋ｍの合計は１−４の範囲内である；
ｐ、ｑ及びｒは独立に０−６の範囲の整数である；
Ａ１１，・・・，Ａ１ｍ及びＡ２１，・・・，Ａ２ｎは独立に、α−アミノ酸部分、β−アミノ酸部分、α−アミノスルホン酸部分、及びβ−アミノスルホン酸部分から選択される；
Ｚ１及びＺ２は独立に、水素、Ｃ１−６アルキル、カルボン酸部分（Ｚ−Ｃ（＝Ｏ）−）、及びスルホン酸部分（Ｚ−Ｓ（＝Ｏ）２−）から選択され、Ｚは水素、任意に置換されたＣ１−１２アルキル、任意に置換されたＣ３−１２シクロアルキル、任意に置換されたＣ１−１２アルケニル、任意に置換されたＣ１−１２アルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、及び任意に置換されたヘテロシクリルから選択される；
Ｒ１及びＲ２は独立に、水素及びＣ１−６アルキルから選択される；
Ｘは直接のまたはリンカーを介した固相材料に対するリガンドの結合のための基であり、Ｘはカルボン酸（−ＣＯＯＨ）、カルボン酸エステル（−ＣＯＯＲ）、カルボン酸無水物（−ＣＯＯＣＯＲ）、カルボン酸ハライド（−ＣＯＨａｌ）、スルホン酸（−Ｓ（＝Ｏ）２ＯＨ）、スルホニルクロリド（−Ｓ（＝Ｏ）２Ｃｌ）、チオール（−ＳＨ）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−Ｒ）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、アルデヒド（Ｃ（＝Ｏ）Ｈ）、エポキシド（−ＣＨ（Ｏ）ＣＨ２）、シアニド（−ＣＮ）、ハロゲン（−Ｈａｌ）、第一級アミン（−ＮＨ２）、第二級アミン（−ＮＨＲ）、ヒドラジド（−ＮＨ＝ＮＨ２）、及びアジド（−Ｎ３）から選択され、Ｒは任意に置換されたＣ１−１２アルキルから選択され、Ｈａｌはハロゲンである；及び
前記リガンドの全分子量（「Ｘ」といずれかのリンカーを除く）は２００−２０００ｇ／ｍｏｌである］。
【００２８】
驚くべきことに、例えばα,ω−ジアミノカルボン酸、及び同種のタイプ、例えばα,β−ジアミノプロピオン酸（ｐ＝１、ｑ＝ｒ＝０）、α,γ−ジアミノ酪酸、及びα,δ−ジアミノペントン酸、特にα,β−ジアミノプロピオン酸（ｐ＝１、ｑ＝ｒ＝０）に基づく足場が、ｈＧＨポリペプチドに対する優れた結合特性を有し、例えば細胞培養上清または血漿中に存在する他のタンパク質と比較して、ｈＧＨポリペプチドに対する特異的な結合を更に示す興味深いリガンドのクラスを与えることが見出された。
【００２９】
更に、上記仮説によって支持される通り、「Ｘ」及びいずれかのリンカーを除くリガンドは好ましくは、２００Ｄａより大きい、例えば３００Ｄａより大きい、例えば４００Ｄａより大きい、例えば５００Ｄａより大きい、例えば６００Ｄａより大きい、例えば７００Ｄａより大きい、例えば８００Ｄａより大きい分子量を有する。それに独立して前記リガンドは、５０００Ｄａ未満、例えば４０００Ｄａ未満、例えば３０００Ｄａ未満、例えば２５００Ｄａ未満、例えば２０００Ｄａ未満、例えば１５００Ｄａ未満、例えば１０００Ｄａ未満の分子量を有する。
【００３０】
本発明の一つの実施態様では、Ｚ１−（Ａ１ｉ）ｍ−Ｎ（Ｒ１）−及びＺ２−（Ａ２ｊ）ｎ−Ｎ（Ｒ２）−の各々は、５０−５００ｇ／ｍｏｌの分子量の有機部分を表し、リガンドの全分子量は２５０−１５００ｇ／ｍｏｌ、例えば３００−１２００ｇ／ｍｏｌ、例えば３５０−１０００ｇ／ｍｏｌである。
【００３１】
本発明の一つの実施態様では、Ａ１１，・・・，Ａ１ｍ及びＡ２１，・・・，Ａ２ｎはα−アミノ酸部分及びβ−アミノ酸部分から独立に選択され、特にα−アミノ酸部分から独立に選択される。
【００３２】
本発明の一つの実施態様では、Ａ１１，・・・，Ａ１ｍ及びＡ２１，・・・，Ａ２ｎは、Ｌ型及びＤ型のいずれかのＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ及びＡｓｐのアミノ酸から独立に選択される。
【００３３】
本発明の一つの実施態様では、Ａ１１，・・・，Ａ１ｍ及びＡ２１，・・・，Ａ２ｎは、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ａｓｎ及びＤ−Ａｓｐから独立に選択される。
【００３４】
本発明の一つの実施態様では、Ａ１１，・・・，Ａ１ｍ及びＡ２１，・・・，Ａ２ｎは、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ａｓｎ及びＬ−Ａｓｐから独立に選択される。
【００３５】
本発明の一つの実施態様では、Ａ１１，・・・，Ａ１ｍ及びＡ２１，・・・，Ａ２ｎの少なくとも一つは、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ａｓｎ及びＬ−Ａｓｐから独立に選択される。
【００３６】
本発明の一つの実施態様では、Ａ１１，・・・，Ａ１ｍ及びＡ２１，・・・，Ａ２ｎは、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ及びＴｙｒから選択される少なくとも一つのアミノ酸部分を含み、特にＬ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｐｈｅ及びＬ−Ｉｌｅから選択される少なくとも一つのアミノ酸部分を含む。
【００３７】
本発明の一つの実施態様では、Ｚ１及びＺ２は、水素、Ｃ１−６アルキル、カルボン酸部分、及びスルホン酸部分から独立に選択される。
【００３８】
本発明の一つの実施態様では、Ｚ１及びＺ２は、少なくとも一つのカルボン酸部分またはスルホン酸部分からを含む、特に少なくとも一つのカルボン酸部分を含む。
【００３９】
本発明の別の実施態様では、Ｚ１及びＺ２は、水素、Ｃ１−６アルキル、キサンテン−９−イルカルボニル、５−メチル−２−フェニル−２Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルカルボニル、３−アミノ−（フェニルスルホニル）−チオフェン−２−イルカルボニル、（＋／−）−３−オキソ−１−インダニルカルボニル、５，６，７，８−テトラヒドロアクリジン−９−イルカルボニル、及び２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−イルカルボニルから独立に選択される。
【００４０】
特に好ましい例は、以下に与えられた表から選択される（対応するカルボン酸の構造が明確化のために提供される）：
【００４１】
【化４−１】
2012508728.tif 000006
【化４−２】
2012508728.tif 000007
【００４２】
本発明の一つの実施態様では、Ｚ１は１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルカルボニル、キサンテン−９−イルカルボニル、２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−イルカルボニル、及び３−オキソ−インダン−１−イルカルボニルから選択される。
【００４３】
本発明の一つの実施態様では、Ｚ１は三環式へテロ芳香族基を含み、例えばＺ１は５，６，７，８−テトラヒドロアクリジン−９−イルカルボニル、またはキサンテン−９−イルカルボニルである。
【００４４】
本発明の一つの実施態様では、アミノ酸／アミノスルホン酸の数に関して、ｎは好ましくは０−２、例えば０−１、特に０であり、ｍは好ましくは１−３、例えば２−３、特に２である。ｎ＋ｍの合計は好ましくは２−４、例えば２−３、特に２または３である。
【００４５】
本発明の一つの実施態様では、ｎが０である場合、Ｚ２は好ましくはカルボン酸部分及びスルホン酸部分から選択される。更に、ｍが０である場合、Ｚ１は好ましくはカルボン酸部分及びスルホン酸部分から選択される。
【００４６】
本発明の一つの実施態様では、足場中の炭素原子の数に関して、ｐは好ましくは０−３、例えば０−２、例えば１−２、特に２であり、ｑは好ましくは０−３、例えば０−２、特に０または１である。ｐ＋ｑの合計は好ましくは１−７、例えば２−５、特に２または３である。それと独立に、ｒは好ましくは０−６、例えば０−４、例えば０−２、特に０または１、とりわけ０である。
【００４７】
本発明の一つの実施態様では、足場中の炭素原子の数に関するさらなる変形例では、（ｐ，ｑ）は（０，１）、（０，２）、（０，３）、（０，４）、（１，０）、（２，０）、（３，０）、または（４，０）である。
【００４８】
本発明の一つの実施態様では、ｒの変形例は好ましくは０である。
【００４９】
本発明の一つの実施態様では、Ｘは、直接またはリンカーを介して（更に以下参照）、固相材料にリガンドを結合させるために使用される反応基である。好ましい実施態様では、前記リンカーは−ＣＯＮ（Ｒ）−（特に−ＮＨＣＯ−）セグメントを介して足場に結合され、固相ペプチド合成から既知の標準的な方法体系によりリガンドを調製可能とするため、前記カルボニルは「Ｘ」を表す足場の一部である。
【００５０】
本発明の一つの実施態様では、Ｘはカルボン酸（−ＣＯＯＨ）、カルボン酸エステル（−ＣＯＯＲ）、カルボン酸無水物（−ＣＯＯＣＯＲ）、カルボン酸ハライド（−ＣＯＨａｌ）、スルホン酸（−Ｓ（＝Ｏ）２ＯＨ）、スルホニルクロリド（−Ｓ（＝Ｏ）２Ｃｌ）、チオール（−ＳＨ）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−Ｒ）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、アルデヒド（Ｃ（＝Ｏ）Ｈ）、エポキシド（−ＣＨ（Ｏ）ＣＨ２）、シアニド（−ＣＮ）、ハロゲン（−Ｈａｌ）、第一級アミン（−ＮＨ２）、第二級アミン（−ＮＨＲ）、ヒドラジド（−ＮＨ＝ＮＨ２）、及びアジド（−Ｎ３）から選択され、Ｒは任意に置換されたＣ１−１２アルキルから選択され、Ｈａｌはハロゲンである。
【００５１】
本発明の一つの実施態様では、ＸはＣＯＯＨである。
【００５２】
本発明の一つの実施態様では、リンカーを任意に介して結合した一般式（Ｉ）のリガンドを有する固相材料を含むアフィニティー樹脂であって、式中、
Ａ２１，・・・，Ａ２ｎが、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ及びＡｓｐ、特にＬ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ａｓｎ及びＬ−Ａｓｐから独立に選択され；
Ｚ１が水素、Ｃ１−６アルキル、キサンテン−９−カルボニル、２−アミノニコチニル、２−キナルジンカルボニル、４，８−ジヒドロキシ−２−キノリンカルボニル、４−キノリンカルボニル、５−メチル−２−ニトロベンゾイル、２−（ベンゾイミダゾリルチオ）アセチル、５−メチル−２−フェニル−２Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−カルボニル、６−ヒドロキシ−２−ナフトイル、４，７−ジメチルピラゾロ［５，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−３−カルボニル、３−アミノ−４−（フェニルスルホニル）−２−チオフェンカルボニル、（＋／−）−３−オキソ−１−インダンカルボニル、５，６，７，８−テトラヒドロアクリジン−９−カルボニル、２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−カルボニル、５−（４−メチル−２−ニトロフェニル）フロイル、１−シクロヘキシル−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボニル、キノキサリン−６−カルボニル、及び４−メチル−２−フェニルピリミジン−５−カルボニルから選択され；
Ｚ２がＨであり；
Ｒ１及びＲ２が水素及びＣ１−６アルキルから独立に選択され；
ｍ＝０、ｎ＝２、ｐ＝１、ｑ＝０、ｒ＝０
であるアフィニティー樹脂が好ましい。
【００５３】
本発明の一つの実施態様では、リンカーを任意に介して結合した一般式（Ｉ）のリガンドを有する固相材料を含むアフィニティー樹脂であって、式中、
Ａ２１，・・・，Ａ２ｎが、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ及びＡｓｐ、特にＬ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ａｓｎ及びＬ−Ａｓｐから独立に選択され；
Ｚ１が水素、Ｃ１−６アルキル、キサンテン−９−イルカルボニル、５−メチル−２−フェニル−２Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルカルボニル、３−アミノ−（フェニルスルホニル）−チオフェン−２−イルカルボニル、（＋／−）−３−オキソ−１−インダニルカルボニル、５，６，７，８−テトラヒドロアクリジン−９−イルカルボニル、及び２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−イルカルボニルから選択され；
Ｚ２がＨであり；
Ｒ１及びＲ２が水素及びＣ１−６アルキルから独立に選択され；
ｍ＝０、ｎ＝２、ｐ＝１、ｑ＝０、ｒ＝０
であるアフィニティー樹脂が好ましい。
【００５４】
本発明の一つの実施態様では、リガンドは以下の一般式（ＩＩ）を有する：
【化５】
2012508728.tif 000008
［式中、Ｚ１、Ｚ２、Ａ２１及びＡ２２は、一般式（Ｉ）について上述した通りであり、この一般式について記載された実施態様を含む］。
【００５５】
特に好ましい一般式（ＩＩ）のリガンドは、式中、
Ｚ１がＺ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、Ｚが任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、及び任意に置換されたヘテロシクリルから選択され；
Ｚ２が水素及びＺ−Ｃ（＝Ｏ）−から選択され、Ｚが任意に置換されたＣ１−１２アルキル、任意に置換されたＣ３−１２シクロアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、及び任意に置換されたヘテロシクリルから選択され；
Ａ２１及びＡ２２の各々がα−アミノ酸及びβ−アミノ酸から独立に選択される
ものである。
【００５６】
本発明の一つの実施態様では、式中、Ａ２１がアルギニン、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、及びリジンから好ましくは選択され、Ａ２２がアルギニン、フェニルアラニン、イソロイシン、プロリン、チロシン、及びトリプトファンから選択される、一般式（ＩＩ）を有する。
【００５７】
本発明の一つの実施態様では、一般式（ＩＩ）のリガンドは、好ましくは一般式（ＩＩＩ）：
【化６】
2012508728.tif 000009
［式中、Ｒ’及びＲ”はα−アミノ酸の側鎖から独立に選択され、Ｒ’’’は任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、及び任意に置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される］
を有する。
【００５８】
本発明の一つの実施態様では、前記リガンドは、以下のリガンド番号（１）−（１６）から選択される構造を有する。
【００５９】
【化７−１】
2012508728.tif 000010
【化７−２】
2012508728.tif 000011
【化７−３】
2012508728.tif 000012
【化７−４】
2012508728.tif 000013
【化７−５】
2012508728.tif 000014
【化７−６】
2012508728.tif 000015
【化７−７】
2012508728.tif 000016
【００６０】
更に好ましい実施態様では、前記リガンドは、式中、Ｚ１及びＺ２が水素、Ｃ１−６アルキル、５，６，７，８−テトラヒドロアクリジン−９−カルボニル、及び２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−カルボニルから独立に選択される、一般式（Ｉ）を有する。
【００６１】
ここに記載されたリガンドは、ここでの記載または表現から明らかな通り、いずれかのまたは全ての非対称の原子での濃縮または分解光学異性体を含む。ラセミ混合物及びジアステレオマー混合物の両者、並びに個々の光学異性体は、そのエナンチオマーまたはジアステレオマーカウンターパートを実質的に含まないように単離または合成することができ、これらは全て本発明の範囲内に存在する。
【００６２】
定義
「α−アミノ酸部分」は、アミノ基がα−炭素に共有結合している天然に存在する及び合成のアミノ酸（必須アミノ酸を含む）を指す。本発明のリガンドに存在する場合、α−アミノ酸部分は−Ｎ（Ｒ）−Ｘ−Ｃ（＝Ｏ）−断片として存在し、Ｘはα−炭素及びいずれかの側鎖を表す。
【００６３】
「β−アミノ酸部分」は、アミノ基がβ−炭素に共有結合している天然に存在する及び合成のアミノ酸を指す。本発明のリガンドに存在する場合、β−アミノ酸部分は−Ｎ（Ｒ）−Ｘ−Ｃ（＝Ｏ）−断片として存在し、Ｘはα−及びβ−炭素及びいずれかの側鎖を表す。
【００６４】
「α−アミノスルホン酸部分」は、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）がスルホン基（−Ｓ（＝Ｏ）２−）で置換されている「α−アミノ酸部分」に対応する。本発明のリガンドに存在する場合、α−アミノスルホン酸部分は−Ｎ（Ｒ）−Ｘ−Ｓ（＝Ｏ）２−断片として存在し、Ｘはα−炭素及びいずれかの側鎖を表す。
【００６５】
「β−アミノスルホン酸部分」は、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）がスルホン基（−Ｓ（＝Ｏ）２−）で置換されている「β−アミノ酸部分」に対応する。本発明のリガンドに存在する場合、β−アミノスルホン酸部分は−Ｎ（Ｒ）−Ｘ−Ｓ（＝Ｏ）２−断片として存在し、Ｘはα−及びβ−炭素及びいずれかの側鎖を表す。
【００６６】
用語「必須アミノ酸」は、２０の遺伝的にコードされたＬ−α−アミノ酸及びその立体異性体Ｄ−α−アミノ酸のいずれか一つを指す。それ故、本発明の範囲内の「アミノ酸部分」はその最も広い意味で使用され、その天然に存在するＬ−アミノ酸を含むように意味される。天然に存在するアミノ酸について一般的に使用される一文字及び三文字標記がここで使用される（Lehninger, Biochemistry, 第２版, pp, 71-92, Worth Publishers: New York, 1975）。この用語は更にＤ−アミノ酸（及びその残基）、並びに化学的に修飾されたアミノ酸、例えば通常タンパク質には取り込まれない天然に存在するアミノ酸を含むアミノ酸アナログ、例えばノルロイシン、並びにアミノ酸の特徴であると当該技術分野で既知の特性を有する化学的に合成された化合物を含む。
【００６７】
「アミノ酸部分」として本発明によってリガンドに一般的に取り込まれることができるアミノ酸の例が以下に記載される：
【００６８】
グリシル（ＧＬＹ）；アミノポリカルボン酸、例えばアスパラギン酸（ＡＳＰ）、ｐ−ヒドロキシアスパラギン酸、グルタミン酸（ＧＬＵ）、β-ヒドロキシグルタミン酸、β−メチルアスパラギン酸、β−メチルグルタミン酸、β,β−ジメチルアスパラギン酸、γ−ヒドロキシグルタミン酸、β,γ−ジヒドロキシグルタミン酸、β−フェニルグルタミン酸、γ−メチレングルタミン酸、３−アミノアジピン酸、２−アミノピメリン酸、２−アミノスベリン酸及び２−アミノセバシン酸残基；グルタミン（ＧＬＮ）；アスパラギン（ＡＳＮ）；アルギニン（ＡＲＧ）、リジン（ＬＹＳ）、β−アミノアラニン、γ−アミノブチリン、オルニチン（ＯＲＮ）、シトルリン、ホモアルギニン、ホモシトルリン、５−ヒドロキシ−２，６−ジアミノヘキサン酸、ジアミノ酪酸；ヒスチジン（ＨＩＳ）；α, α’−ジアミノコハク酸、α, α’−ジアミノグルタル酸、α, α’−ジアミノアジピン酸、α, α’−ジアミノピメリン酸、α, α’−アジミノ−β−ヒドロキシピメリン酸、α, α’−ジアミノスベリン酸、α, α’−ジアミノアゼライン酸、及びα, α’−ジアミノセバシン酸残基；プロリン（ＰＲＯ）；４−または３−ヒドロキシ−２−ピロリジンカルボン酸、γ−メチルピロリン、ピペコリン酸、５−ヒドロキシピペコリン酸、−Ｎ［ＣＨ２］２−ＣＯ−、アゼチジン−２−カルボン酸；アラニン（ＡＬＡ）、バリン（ＶＡＬ）、ロイシン（ＬＥＵ），アリルグリシン、ブチリン、ノルバリン、ノルロイシン（ＮＬＥ）、ヘプチリン、α−メチルセリン、α−アミノ−α−メチル−γ−ヒドロキシ吉草酸。α−アミノ−α−メチル−６−ヒドロキシ吉草酸、α−アミノ−α−メチル−ε−ヒドロキシカプロン酸、イソバリン、α−メチルグルタミン酸、α−アミノイソ酪酸、α−アミノジエチル酢酸、α−アミノジイソプロピル酢酸、α−アミノジ−ｎ−プロピル酢酸、α−アミノジイソブチル酢酸、α−アミノジ−ｎ−ブチル酢酸、α−アミノエチルイソプロピル酢酸、α−アミノ−ｎ−プロピル酢酸、α−アミノジイソアミ酢酸、α−メチルアスパラギン酸、α−メチルグルタミン酸、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸；イソロイシン（ＩＬＥ）、アロイソロイシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、β−メチルトリプトファン；α−アミノ−α−フェニルプロピオン酸；β−フェニルセリニル；セリン（ＳＥＲ）、β−ヒドロキシロイシン、β−ヒドロキシノルロイシン、β−ヒドロキシノルバリン、α−アミノ−α−ヒドロキシステアリン酸；ホモセリン、γ−ヒドロキシノルバリン、δ-ヒドロキシノルバリン、ε−ヒドロキシノルロイシン；カナビニル、カナリニル；γ−ヒドロキシオルニチニル；２−ヘキソサミン酸、Ｄ−グルコサミン酸、Ｄ−ガラクトサミン酸；α−アミノ−β−チオール、ペニシルアミン、β−チオールノルバリン、β−チオールブチリン；システイン（ＣＹＳ）；ホモシステイン；β−フェニルメチオニン；メチオニン（ＭＥＴ）；Ｓ−アリル−（Ｌ）−システインスルホキシド；２−チオールヒスチジン；シスタチオニン；フェニルアラニン（ＰＨＥ）、トリプトファン（ＴＲＰ）、α−アミノフェニル酢酸、α−アミノシクロヘキシル酢酸、α−アミノ−β−シクロヘキシルプロピオン酸；アリール−、Ｃ１−６−アルキル−、ヒドロキシ−��ハロゲン−、グアニジン−、オキシアルキルエーテル−、ニトロ−、サルファー−、またはハロ−置換フェニル（例えばチロシン（ＴＹＲ）、メチルチロシン、及びｏ−クロロ−、ｐ−クロロ−、３，４−ジクロロ−、ｏ−、ｍ−、またはｐ−メチル−、２,４,６−トリメチル−、２−エトキシ−５−ニトロ−、２−ヒドロキシ−５−ニトロ−、及びｐ−ニトロ−フェニルアラニン）；フリル−、チエニル−、ピリジル−、ピリミジニル−、プリンまたはナフチルアラニン；キヌレニン、３−ヒドロキシキヌレニン、２−ヒドロキシトリプトファン、４−カルボキシトリプトファン；サルコシン（Ｎ−メチルグリシン；ＳＡＲ）、Ｎ−ベンジルグリシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−ベンジルアラニン、Ｎ−メチルフェニルアラニン、Ｎ−ベンジルフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、及びＮ−ベンジルバリン；トレオニン（ＴＨＲ）、アロトレオニン、ホスホセリン、ホスホトレオニン。
【００６９】
用語「α−アミノ酸の側鎖」は、上記開示されたアミノ酸の側鎖を構成する基を指す。典型的にそのような側鎖は、水素（グリシンを表す）、メチル（アラニン）、２−プロピル（バリン）、２−メチル−１−プロピル（ロイシン）、２−ブチル（イソロイシン）、メチルチオエチル（メチオニン）、ベンジル（フェニルアラニン）、３−インドリルメチル（トリプトファン）、ヒドロキシメチル（セリン）、１−ヒドロキシエチル（トレオニン）、メルカプトメチル（システイン）、４−ヒドロキシベンジル（チロシン）、アミノカルボニルメチル（アスパラギン）、２−アミノカルボニルエチル（グルタミン）、カルボキシメチル（アスパラギン酸）、２−カルボキシエチル（グルタミン酸）、４−アミノ−１−ブチル（リジン）、３−グアニジノ−１−プロピル（アルギニン）、及び４−イミダゾリルメチル（ヒスチジン）、または介在する炭素と隣接する窒素原子とが一緒になってピロリジン環を形成する側鎖（プロリン）から選択される。
【００７０】
「α−アミノスルホン酸部分」は、カルボニル酸素（＝Ｏ）が硫黄（＝Ｓ）に置換されている「α−アミノ酸部分」を指す。「β−アミノスルホン酸部分」は、カルボニル酸素（＝Ｏ）が硫黄（＝Ｓ）に置換されている「β−アミノ酸部分」を指す。
【００７１】
ここでの文脈で、用語「Ｃ１−１２アルキル」及び「Ｃ１−６アルキル」は、それぞれ１から１２の炭素原子、及び１から６の炭素原子を有する直鎖状、環状、または分枝状の炭化水素基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシルを企図する。用語「Ｃ１−４アルキル」は、１から４の炭素原子を有する直鎖状、環状、または分枝状の炭化水素基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、シクロプロピル、ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチルを企図する。
【００７２】
用語「Ｃ３−１２シクロアルキル」は、用語「Ｃ１−１２アルキル」によって包含されるが、特にエキソ−サイクリック原子を有するアルキル基を含む一環式及び二環式カウンターパート、例えばシクロヘキシルメチルを指す。
【００７３】
同様に、用語「Ｃ２−１２アルケニル」及び用語「Ｃ２−６アルケニル」は、それぞれ２から１２の炭素原子、及び２から６の炭素原子を有し、（少なくとも）一つの不飽和結合を含む直鎖状、環状、または分枝状の炭化水素基を包含するように企図される。アルケニル基の例は、ビニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ヘプタデカエニルである。アルケニルの好ましい例は、ビニル、アリル、ブテニル、特にアリルである。
【００７４】
用語「Ｃ３−１２シクロアルケニル」は、用語「Ｃ２−１２アルケニル」によって包含されるが、特にエキソ−サイクリック原子を有するアルケニル基を含む一環式及び二環式カウンターパート、例えばシクロヘキセニルメチルを指す。
【００７５】
同様に、用語「Ｃ２−１２アルキニル」及び用語「Ｃ２−６アルキニル」は、それぞれ２から１２の炭素原子、及び２から６の炭素原子を有し、（少なくとも）一つの三重結合を含む直鎖状、環状、または分枝状の炭化水素基を包含するように企図される。
【００７６】
用語「Ｃ１−６アルコシキ」は、「Ｃ１−６アルキル−Ｏ」を意味するように企図される。
【００７７】
ここでの文脈で、即ち用語「アルキル」、「アルコキシ」、「アルケニル」、「アルキニル」等と関連して、用語「任意に置換された」は、問題となる基が、ヒドロキシ（不飽和炭素原子に結合した際、互変異性のケト形態で存在しても良い）、Ｃ１−６アルコキシ（即ちＣ１−６アルキル−オキシ）、Ｃ２−６アルケニルオキシ、カルボキシ、オキソ（ケトまたはアルデヒド官能性を形成する）、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、Ｃ１−６アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アリールカルボニル、アリールオキシカルボニル、アリールカルボニルオキシ、アリールアミノカルボニル、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアリールカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールカルボニルオキシ、ヘテロアリールアミノカルボニル、ヘテロアリールカルボニルアミノ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルアミノ、ヘテロシクリルカルボニル、ヘテロシクリルオキシカルボニル、ヘテロシクリルカルボニルオキシ、ヘテロシクリルアミノカルボニル、ヘテロシクリルカルボニルアミノ、アミノ、モノ及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、−Ｎ（Ｃ１−４アルキル）３＋、カルバモイル、モノ及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、シアノ、グアニジノ、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、Ｃ１−６アルカノイルオキシ、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、Ｃ１−６アルキルチオ、及びハロゲンから選択される基で、一回または数回、好ましくは１−３回置換されて良いことを意味するように企図され、ここでいずれかのアリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルは、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリル、及びいずれかのアルキル、アルコキシ等について以下に特に記載されるように置換されても良く、置換基はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、アミノ、モノ及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、カルボキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル、またはハロゲンで置換されても良いことを表す。
【００７８】
典型的に置換基は、ヒドロキシ（不飽和炭素原子に結合した際、互変異性のケト形態で存在しても良い）、Ｃ１−６アルコキシ（即ちＣ１−６アルキル−オキシ）、Ｃ２−６アルケニルオキシ、カルボキシ、オキソ（ケトまたはアルデヒド官能性を形成する）、Ｃ１−６アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアリールカルボニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルアミノ、ヘテロシクリルカルボニル、アミノ、モノ及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル、アミノ−Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル、モノ及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ−Ｃ１−６アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、グアニジノ、カルバミド、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルチオ、及びハロゲンから選択され、ここでいずれかのアリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルは、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルについて以下に特に記載されるように置換されても良い。
【００７９】
いくつかの実施態様では、置換基は、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、アミノ、モノ及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、カルボキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル、またはハロゲンから選択される。
【００８０】
用語「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードを含む。
【００８１】
ここでの文脈で、用語「アリール」は、完全にまたは部分的に芳香族の炭素環または環系、例えばフェニル、ナフチル、１,２,３,４−テトラヒドロナフチル、ビフェニル、アントラシル、フェナントラシル、ピレニル、ベンゾピレニル、フルオレニル、及びキサンテニルを意味するように企図し、その中でもフェニルが好ましい例である。
【００８２】
用語「ヘテロアリール」は、一つ以上の炭素原子がヘテロ原子、例えば窒素（＝Ｎ−または−ＮＨ−）、硫黄、及び／または酸素原子で置換されている完全にまたは部分的に芳香族の炭素環または環系を意味するように企図する。そのようなヘテロアリールの例は、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、クマリル、フラニル、チエニル、キノリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾジアゾリル、ベンゾオキソゾリル、フタラジニル、フタラニル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソキノリル、アクリジニル、カルバゾリル、ジベンザゼピニル、インドリル、ベンゾピラゾリル、フェノキサゾニルである。特に興味深いヘテロアリール基は、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、フリル、チエニル、キノリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソキノリル、インドリル、特にベンジイミダゾリル、ピロリル、イミダゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、フリル、チエニル、キノリル、テトラゾリル、及びイソキノリルである。
【００８３】
用語「ヘテロシクリル」は、一つ以上の炭素原子がヘテロ原子、例えば窒素（＝Ｎ−または−ＮＨ−）、硫黄、及び／または酸素原子で置換されている非芳香族の炭素環または環系を意味するように企図する。そのようなヘテロシクリル基（環に従って命名される）の例は、イミダゾリジン、ピペラジン、ヘキサヒドロピリダジン、ヘキサヒドロピリミジン、ジアゼパン、ジアゾカン、ピロリジン、ピペリジン、アセパン、アゾカン、アジリジン、アジリン、アゼチジン、ピロリン、トロパン、オキサジナン（モルホリン）、アゼピン、ジヒドロアゼピン、テトラヒドロアゼピン、及びヘキサヒドロアゼピン、オキサゾラン、オキサゼパン、オキサゾカン、チアゾラン、チアジナン、チアゼパン、チアゾカン、オキサゼタン、ジアゼタン、チアゼタン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、オキセパン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロチオピラン、チエパン、ジチアン、ジチエパン、ジオキサン、ジオキセパン、オキサチアン、オキサチエパンである。最も興味深い例は、テトラヒドロフラン、イミダゾリジン、ピペラジン、ヘキサヒドロピリダジン、ヘキサヒドロピリミジン、ジアゼパン、ジアゾカン、ピロリジン、ピペリジン、アセパン、アゾカン、アゼチジン、トロパン、オキサジナン（モルホリン）、オキサゾラン、オキサゼパン、チアゾラン、チアジナン、及びチアゼパン、特にテトラヒドロフラン、イミダゾリジン、ピペラジン、ヘキサヒドロピリダジン、ヘキサヒドロピリミジン、ジアゼパン、ピロリジン、ピペリジン、アセパン、オキサジナン（モルホリン）、及びチアジナンである。
【００８４】
ここでの文脈で、即ち用語「アリール」、「ヘテロアリール」、「ヘテロシクリル」等（例えば「アリールオキシ」、「ヘテロアリールカルボニル」等）に関連して、用語「任意に置換された」は、問題となる基が、ヒドロキシ（エノール系に存在する際、互変異性のケト形態で存在しても良い）、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ２−６アルケニルオキシ、オキソ（互変異性のエノール形態で表されても良い）、オキシド（Ｎ−オキシドとしてのみ関連する）、カルボキシ、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、Ｃ１−６アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アリールオキシカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアミノ、アミノ、モノ及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル、アミノ−Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル、モノ及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ−Ｃ１−６アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、シアノ、グアニジノ、カルバミド、Ｃ１−６アルキルアルカノイルオキシ、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、スルファニル、アミノ、アミノスルホニル、モノ及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノスルホニル、ジハロゲン−Ｃ１−４アルキル、トリハロゲン−Ｃ１−４アルキル、ハロゲンから選択される基で、一回または数回、好ましくは１−５回、特に１−３回置換されて良いことを意味するように企図され、ここで置換基を表すアリール及びヘテロアリールは、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ニトロ、シアノ、アミノ、またはハロゲンで１−３回置換されても良く、及び置換基を表すいずれかのアルキル、アルコキシ等は、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ２−６アルケニルオキシ、アミノ、モノ及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、カルボキシ、Ｃ１−４アルキルカルボニルアミノ、ハロゲン、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、またはグアニジノで置換されても良い。
【００８５】
典型的に置換基は、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、オキソ（互変異性のエノール形態で表されても良い）、カルボキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アミノ、モノ及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル、アミノ−Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、グアニジノ、カルバミド、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニルオキシ、スルファニル、アミノ、アミノスルホニル、モノ及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノスルホニル、またはハロゲンから選択され、ここで置換基を表すいずれかのアルキル、アルコキシ等は、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ２−６アルケニルオキシ、アミノ、モノ及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、カルボキシ、Ｃ１−４アルキルカルボニルアミノ、ハロゲン、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、またはグアニジノで置換されても良い。いくつかの実施態様では、置換基は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、アミノ、モノ及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、スルファニル、カルボキシ、またはハロゲンから選択され、ここで置換基を表すいずれかのアルキル、アルコキシ等は、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ２−６アルケニルオキシ、アミノ、モノ及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、カルボキシ、Ｃ１−４アルキルカルボニルアミノ、ハロゲン、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、またはグアニジノで置換されても良い。
【００８６】
カルボン酸部分は、Ｑ−Ｃ（＝Ｏ）−としてＺ１及びＺ２として含まれる部分を指し、ここでＱは任意に置換されたＣ１−１２アルキル、任意に置換されたＣ２−１２アルケニル、任意に置換されたＣ２−１２アルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、及び任意に置換されたヘテロシクリルから選択される。
【００８７】
スルホン酸部分は、Ｑ−Ｓ（＝Ｏ）２−としてＺ１及びＺ２として含まれる部分を指し、ここでＱは任意に置換されたＣ１−１２アルキル、任意に置換されたＣ２−１２アルケニル、任意に置換されたＣ２−１２アルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、及び任意に置換されたヘテロシクリルから選択される。
【００８８】
ここで使用される場合、用語「有機部分」（及び「有機部分類」）は、共有結合した一つ以上の炭素原子、及び一つ以上の水素（Ｈ）、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、臭素（Ｂｒ）、塩素（Ｃｌ）、フッ素（Ｆ）、またはリン（Ｐ）原子を含む分子断片を意味するように企図される。
【００８９】
本発明の特定の特徴点では、有機部分Ｚ１−（Ａ１ｉ）ｍ−Ｎ（Ｒ１）−及びＺ２−（Ａ２ｊ）ｎ−Ｎ（Ｒ２）−のそれぞれは、典型的に一般式ＣａＨｂＯｃＮｄＳｅＢｒｆＣｌｇＦｈＰｉを有し、式中、０≦ａ≦１５、０≦ｂ≦２ｘ＋１、０≦ｃ≦ｘ、０≦ｄ≦ｘ、０≦ｅ≦ｘ、０≦ｆ≦３ｘ、０≦ｇ≦３ｘ、０≦ｈ≦３ｘ、０≦ｉ≦ｘ、及び５０≦１２ａ＋ｂ＋１６ｃ＋１４ｄ＋３２ｅ＋８０ｆ＋３５ｇ＋１９ｈ＋３１ｉ≦５００である。
【００９０】
溶液または懸濁物
ここでの用語「溶液または懸濁物」は、成長ホルモンポリペプチド、特にヒト成長ホルモンポリペプチドを含む固体の塊及び／または液体の塊を意味するように企図する。用語「溶液または懸濁物」は、特に「大きな」体積または質量を指し、即ちラージスケール及び工業的なスケールでの方法から既知の体積及び質量を指すように意味する。
【００９１】
成長ホルモンポリペプチドの「懸濁物または溶液」は典型的に、例えば細胞培養物、微生物的方法、クローン動物（例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、及び魚）または昆虫等、特に細胞培養物または工業的スケールの生産方法から由来する。別法として、成長ホルモンポリペプチドの懸濁物または溶液は、血漿等から由来しても良い。
【００９２】
成長ホルモンポリペプチドの懸濁物または溶液は典型的に、細胞、特に細胞培養物の溶解後に、あるいは細胞培養液から直接得られる。成長ホルモンポリペプチドを含む懸濁物または溶液は、所望されるまたは有益であれば、ｐＨ、イオン強度の変化によって、または二価金属イオンのキレート化等によって後に調節できる。
【００９３】
本発明の一つの実施態様では、成長ホルモンポリペプチドを含む懸濁物または溶液は、事前の精製工程から直接、または所望されるまたは有益であれば、ｐＨ、イオン強度の変化、または二価金属イオンのキレート化等を後に有する事前の精製工程から得られる。
【００９４】
リガンド
アフィニティー樹脂は、本発明の文脈で記載されるような成長ホルモンポリペプチドに対して高い特異性を有するリガンドを共有結合で固定化した固相材料（以下参照）である。
【００９５】
ここで使用される場合、用語「リガンド」は、ここでの文脈で成長ホルモンポリペプチドであり得る標的化合物を結合できる分子を意味する。好ましくはリガンドは、少なくとも実質的に特異的な態様で問題となる成長ホルモンポリペプチドに結合すべきである（「特異的な結合」）。用語「一つ以上のリガンド」は、固相材料が一つのタイプを超えたそこに固定化されたリガンドを有しても良いという事実を指す。こう称されると、単一のタイプのリガンド（「一つのリガンド」）の固定化は典型的に、複数／多数の種類の同一のリガンドの固定化を含むであろう。
【００９６】
ここでの文脈で、「特異的な結合」は、好ましくは結合した成長ホルモンポリペプチドの質量が、成長ホルモンポリペプチド以外の結合した分子の相対的質量よりも、少なくとも２倍、例えば５０倍、例えば１００倍、例えば１０００倍以上大きいような、成長ホルモンポリペプチドに結合するリガンドの特性を指す。結合した化合物の相対質量は、結合した特異的バインダーの相対的質量＝（特異的に結合した質量／結合した全化合物の質量）／（非特異的に結合した質量／結合した全化合物の質量）を意味する。
【００９７】
アフィニティーリガンドは、サイト１として既知のｈＧＨポリペプチドのｈＧＨｂｐ結合エピトープに結合するバーチャルコンビナトリアルスクリーニング法によってin silicoでデザインされた。前記リガンドは、ｈＧＨのサイト１エピトープ中のＧｌｕ５６、Ｉｌｅ５８、Ｔｈｒ６０、Ｐｒｏ６１、Ｓｅｒ６２、Ａｓｎ６３、Ａｒｇ６４、Ｔｈｒ６７、Ｇｌｎ６８、Ｇｌｎ６９、Ｌｙｓ１６８、Ａｓｐ１７１、Ｌｙｓ１７２、Ｔｈｒ１７５、Ｐｈｅ１７６及びＩｌｅ１７９の残基と相互作用するように特にデザインされている。ｈＧＨは、ｈＧＨポリペプチドの高アフィニティーのサイト１で初めに結合し、その後より低いアフィニティーのサイト２でｈＧＨｂｐの第二の分子と結合し、２：１のレセプター−リガンドの複合体を形成することを通じてｈＧＨのレセプター（ｈＧＨｂｐ）と相互作用する（Walsh等, Proc. Natl. Acad. Sci. 2004, 101, 17078-17083）。サイト１でのｈＧＨｂｐに対するｈＧＨポリペプチドの結合アフィニティーは、ｈＧＨの二つのトリプトファン残基、主にＴｒｐ１０４とＴｒｐ１６９によって主として容易になり、両者はより大きいサイト１内の中央の疎水性パッチに位置している。これらの残基は、ｈＧＨに対する結合アフィニティーの大部分を説明し、ｈＧＨｂｐミュータントＷ１０４Ａ及びＷ１６９Ａは、それぞれ２５００を超える因数まで野生型に対してアフィニティーを減少することを示す（Clackson等, J. Mol. Biol. 1998, 277, 1111-1128）。ここに記載されたリガンドは、ｈＧＨのＴｒｐ１０４及びＴｒｐ１６９と相互作用するサイト１の高アフィニティーパッチ、特にｈＧＨのサイト１エピトープ中のＧｌｕ５６、Ｉｌｅ５８、Ｔｈｒ６０、Ｐｒｏ６１、Ｓｅｒ６２、Ａｓｎ６３、Ａｒｇ６４、Ｔｈｒ６７、Ｇｌｎ６８、Ｇｌｎ６９、Ｌｙｓ１６８、Ａｓｐ１７１、Ｌｙｓ１７２、Ｔｈｒ１７５、Ｐｈｅ１７６及びＩｌｅ１７９内に、数多くのコンビナトリアルに構築されたリガンドのコンピュータードッキングによるこれらの好ましい相互作用を模倣するようにデザインされている。
【００９８】
固相材料
上述のように、アフィニティー樹脂は、一つ以上の合成リガンドを固定化している置換された固相材料である。固相材料（場合により、「マトリックス」または「ポリマーマトリックス」と称される）は、クロマトグラフィー目的とペプチド合成について従来使用されている広範囲の材料から原則として選択されて良い。そのような材料の例は以下に記載される。
【００９９】
前記リガンドは、任意に架橋化された及び／またはビーズ状の形態またはモノリスの多孔物で、多孔性の無機マトリックスまたはポリマーマトリックスのような固相材料に共有結合で固定化される。好ましくはポリマーマトリックスの孔は、前記孔を通じて標的タンパク質が拡散し、孔の内側表面上のリガンドと相互作用するように十分に広い。約２２ｋＤａの分子量を有するＧＨポリペプチドについては、２０−１５０ｎｍの平均孔径が好ましく、例えば約７５ｎｍである。
【０１００】
一つの実施態様では、ビーズ状の任意に架橋されたポリマーマトリックスは、複数の親水性部分を含む。親水性部分は、架橋した際に、架橋化ポリマーマトリックスを形成するポリマー鎖であることができる。例として、例えばポリエチレングリコール部分、ポリアミン部分、ポリビニルアミン部分、及びポリオール部分が含まれる。
【０１０１】
本発明の一つの実施態様では、ビーズ状ポリマーマトリックスの孔及び／または表面は、ポリビニル、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリスチレンポリエステル、及びポリアミドからなる群から選択されるポリマー材料を含む。
【０１０２】
ビーズ状ポリマーマトリックスは更に、ＰＳ、ＰＯＥＰＳ、ＰＯＥＰＯＰ、ＳＰＯＣＣ、ＰＥＧＡ、ＣＬＥＡＲ、Expansin、Polyamide、Jandagel、ＰＳ−ＢＤＯＤＭＡ、ＰＳ−ＨＤＯＤＡ、ＰＳ−ＴＴＥＧＤＡ、ＰＳ−ＴＥＧＤＡ、ＧＤＭＡ−ＰＭＭＡ、ＰＳ−ＴＲＰＧＤＡ、ArgoGel、Argopore樹脂、ULTRAMIME、架橋化LUPAMINE、高性能ＰＥＧＡ、Silica、Fractogel、Sephadex、Sepharose、Glassビーズ、架橋化ポリアクリレート及び上述のものの誘導体からなる群から選択でき、特にポリマーマトリックスは、ＳＰＯＣＣ、ＰＥＧＡ、ＨＹＤＲＡ、ＰＯＥＰＯＰ、ＰＥＧ−アクリレートコポリマー、ポリエーテル−ポリアミンコポリマー、及び架橋化ポリエチレンジアミンからなる群から選択される。
【０１０３】
上述の例から離れて、ポリマーマトリックスを形成できるいずれかの材料は、本発明のビーズの生産において原則として使用できる。好ましくは、ビーズのコア材料はポリマー状である。いくつかの実施態様では、前記コアは、親水性ポリマー材料を含むまたはこれらからなる。他の実施態様では、前記コアは疎水性ポリマー材料を含むまたはこれらからなる。いくつかの実施態様では、ビーズの表面はコアと同じ材料を含むまたはこれらからなる。
【０１０４】
ラージスケールでの応用に有用な樹脂は、上述のものの一つ、またはSephadex（登録商標）、Sepharose（登録商標）、Fractogel（登録商標）、CIMGEL（登録商標）、Toyopearl（登録商標）、HEMA（登録商標）、架橋化アガロース、架橋化セルロース、他の架橋化された炭水化物に基づく樹脂、及び多孔性ポリスチレンまたはポリアクリレートといった他の樹脂であって良い。前記マトリックスは更に、主に無機性質を有するもの、例えば多孔性ガラス若しくはクレー材料、または樹脂と無機材料との組み合わせ、例えばCeramic HyperD（登録商標）若しくはシリカゲルであっても良い。
【０１０５】
本発明に係るポリマービーズは、スチレン、アクリレート、及び不飽和クロリド、エステル、アセテート、アミド及びアルコールを含み、ポリスチレン（高密度ポリスチレンラテックス、例えばブロミネート化ポリスチレンを含む）、ポリメチルメタクリレート、及び他のポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリアクロレイン、ポリジメチルシロキサン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリウレタン、ポリビニルアセテート、ポリビニルクロリド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルベンジルクロリド、ポリビニルトルエン、ポリビニリデンクロリド、及びポリビニルベンゼンをこれらに制限することなく含む、各種の重合化モノマーから調製できる。他の実施態様では、前記ビーズは、スチレンモノマーまたはＰＥＧに基づくマクロモノマーから調製される。前記ポリマーは好ましい実施態様では、ポリエーテル、ポリビニル、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアシルアミド、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリアミド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。特に好ましい表面及びコア部分は、架橋化ＰＥＧ部分、ポリアミン部分、ポリビニルアミン部分、及びポリオール部分を含む。
【０１０６】
本発明の組成物のビーズの生産に使用される好ましい疎水性ポリマーは、ＰＳ−ＤＶＢ（ポリスチレンジビニルベンゼン）である。ＰＳ−ＤＶＢは、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）で広く使用されており、より最近では特定の有機分子のポリマー支持性の調製についての有用性が示されている（Adams等 (1998) J. Org. Chem. 63: 3706-3716）。正確に調製されると（Grotll等 (2000) J. Combi. Chem. 2: 108-119）、ＰＳ−ＤＶＢ固相材料は、高ローディング、有機溶媒中での合理的な膨潤、及び物理的安定性といった化学合成についての優れた特性を示す。
【０１０７】
リンカー
上述のリガンドは、可能であればリンカーを介して固相材料に共有結合で固定化されている。好ましい実施態様では、リガンドは、ポリマーマトリックスに共有結合されているリンカーに共有結合される。固相材料にアフィニティーリガンドを結合するための一般的な方法は、Hermanson, Krishna及びSmith, Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, 1992に見出すことができる。
【０１０８】
前記リンカーは、リガンドの適切な移動度を提供すべきであるが、興味ある抗体に対するリガンドの結合においてはそのように関与するべきではない。実際、固定化リガンドの結合は、非固定化リガンドの結合と同様であるべきである。
【０１０９】
リンカーは、例えばポリマーマトリックスまたは無機支持体といった固相材料にリガンドを結合するために使用される。好ましくはリンカーは、リガンドと固相材料との間に強力で永続的な結合を形成する。本発明の固相材料がＧＨポリペプチドの繰り返しの精製に使用される際、これは特に重要である。
【０１１０】
しかしながら、本発明の一つの実施態様では、リンカーは選択的に切断可能であることができる。固相材料が分析的な目的で使用される際、これは有用であることができる。
【０１１１】
アミノ酸及びポリペプチドは、典型的なリンカーの例である。他の考え得るリンカーは、炭水化物及び核酸を含む。
【０１１２】
本発明の一つの実施態様では、ポリマーマトリックスに結合したリンカー残基Ｌは、酸、塩基、温度、光によって、または化学試薬との接触によって切断可能である。特にポリマーマトリックスに結合したリンカーは、（３−ホルミルインドール−１−イル）酢酸、２，４−ジメトキシ−４’−ヒドロキシベンゾフェノン、ＨＭＰＡ、ＨＭＰＢ、ＨＭＰＰＡ、Ｒｉｎｋ酸、Ｒｉｎｋアミド、Ｋｎｏｒｒリンカー、ＰＡＬリンカー、ＤＣＨＤリンカー、Ｗａｎｇリンカー、及びＴｒｉｔｙｌリンカーであることができる。
【０１１３】
前記リンカーは、好ましくは５０Å未満の長さ、例えば３から３０Åの長さ、例えば３から２０Åの長さ、例えば３から１０Åの長さを有するリンカーを介して固相材料と会合できる。
【０１１４】
好ましくは前記リンカーは、カルボン酸基、アミノ基、特にカルボン酸基を解してリガンドに結合される。
【０１１５】
前記リンカーは更に、複数の共有結合したサブユニットを含んでも良い、例えば前記サブユニットは、同一の及び非同一のリンカーサブユニットから選択される。一つの変形例では、前記リンカーはフレキシブルで、３から好ましくは５０未満の同一または非同一の共有結合したサブユニットを含む。
【０１１６】
本発明の一つの実施態様では、リンカーＬは、グリシン、アラニン、３−アミノプロピオン酸、４−アミノプロピオン酸、及びＨＭＢＡからなる群から選択される。
【０１１７】
本発明の一つの実施態様では、前記リンカーは、アルカン、例えば直鎖状アルカン、例えば２−１２の炭素原子を有する直鎖状アルカン、単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば２−２０の繰り返し単位を有するＰＥＧ、及びペプチド、例えば１−２０の結合したアミノ酸を含むペプチドから選択できる。
【０１１８】
前記リンカーは更に、多分散ポリエチレングリコール；単分散ポリエチレングリコール、例えばトリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ペンタエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ヘプタエチレングリコール；アミノ酸；ジペプチド；トリペプチド；テトラペプチド；ペンタペプチド；ヘキサペプチド；ヘプタペプチド；オクタペプチド；ノナペプチド；デカペプチド；ポリアラニン；ポリグリシン；それらの組み合わせからなる群から選択できる。
【０１１９】
固相材料は、ビーズの形態、例えば０．１−１０００μｍの範囲の平均径を有する粒子状材料、またはスティック、膜、ペレット、モノリス等の形態で最もしばしば提供される。
【０１２０】
ペプチド
用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結した二つ以上のアミノ酸の配列を示すように企図され、ここのアミノ酸は天然に存在するものでも合成のものでも良い。この用語は、用語ポリペプチド及びタンパク質を包含し、後者は共有相互作用、例えばシステイン架橋、または非共有相互作用によって共に保持された二つ以上のポリペプチドからなって良い。この用語は更に、例えば脂溶性基、ＰＥＧまたはプロテーゼ基の結合によって誘導化されているペプチドを含むように企図するものと解される。用語ペプチドは、いずれかの適切なペプチドを含み、他に記載がないまたは文脈によって否定されなければ、用語ポリペプチド及びタンパク質と同義語として使用されて良い；但し読者は、それぞれのタイプの各アミノ酸ポリマー含有分子が、有意な差異で会合しても良く、それによって本発明の個々の実施態様を形成しても良いことを認識すべきである（例えば、複数のポリペプチド鎖からなる抗体のようなペプチドは、例えば一本鎖抗体、ペプチドイムのアドヘシン、または一本鎖免疫原性ペプチドとは有意に異なる）。それ故ここでの用語ペプチドは、いずれかの適切なサイズ及び組成のいずれかの適切なペプチドを参照するものと一般的に解されるべきである（ペプチド分子中のアミノ酸の数及び会合鎖の数に関して）。更にここで記載されるペプチドは、他に記載がないまたは文脈によって否定されなければ、天然に存在しない及び／または非Ｌアミノ酸残基を含んでも良い。
【０１２１】
用語ペプチドは、他に記載がないまたは文脈によって否定されなければ（且つ、用語ポリペプチド及び／またはタンパク質の個々の実施態様として議論されるならば）、誘導化ペプチド分子をも包含する。略記すると、本発明の文脈では、誘導体は、ペプチドの一つ以上のアミノ酸残基が化学的に修飾されている（例えばアルキル化、アシル化、エステル形成、またはアミド形成によって）、あるいは一つ以上の非アミノ酸有機及び／または無機の原子性または分子性置換基（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、脂溶性置換基（リンカー残基またはβ−アラニン、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、Ｌ／Ｄ−グルタミン酸、コハク酸等といった基によって、ペプチドのアミノ酸配列に任意に結合してよい）、蛍光分子、ビオチン等）と会合しているペプチドであり、更にまたは別法として、他に記載がないまたは文脈によって否定されなければ、非必須の天然に存在しない、及び／または非Ｌ−アミノ酸残基を含んでも良い（しかしながら、そのような誘導体は、それら自体が及びそれら自体で、本発明の独立の特徴を考慮されても良く、ペプチドの意味内のそのような分子の取り込みは、そのままのペプチドとそのような誘導体との間の等価値のいずれかの類を意味するよりはむしろ、本発明を記載する簡便性の目的でなされることが再度認識されるべきである）。そのようなアミノ酸残基の非制限的な例は、例えば２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、デスモシン、２,２−ジアミノピメリン酸、２,３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、６−Ｎ−メチルリジン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、及びスタチンハロゲン化アミノ酸を含む。この誘導化は本発明の誘導化ではなく、むしろ本発明の方法による精製前の成長ホルモンポリペプチドにすでに存在する誘導化、または精製後に実施される誘導化であると解されるべきである。
【０１２２】
同一性
当該技術分野で既知の用語「同一性」は、配列を比較することによって測定される、二つ以上のペプチドの配列の間の関係を指す。当該技術分野では、「同一性」は更に、二つ以上のアミノ酸残基の一群の間の適合の数によって測定される、ペプチド間の配列の関係性の度合いを意味する。「同一性」は、特定の機械的なモデルまたはコンピュータープログラム（即ち「アルゴリズム」）によって接近される、ギャップアライメント（存在すれば）を有する二つ以上の配列のより小さい間の同一の適合のパーセントを測定する。関連するペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算できる。そのような方法は、Computatinal Molecular Biology, Lesk, A.M.編, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Information and Genome Projects, Smith, D.W.編, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M.及びGriffin, H.G.編, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及びDevereux, J.編, M. Stockton Press, New York, 1991; 並びにCarillo等, SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)に記載されたものをこれらに制限されることなく含む。
【０１２３】
同一性を測定する好ましい方法は、試験される配列間の最大の適合を与えるようにデザインされている。同一性を測定する方法は、市販のコンピュータープログラムに記載されている。二つの配列間の同一性を測定する好ましいコンピュータープログラム方法は、ＧＣＧプログラムパッケージに含まれており、ＧＡＰ（Devereux等, Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wilconsin, Madison, Wis.）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Altschul等, J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)）を含む。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、National Center for Biotechnology Information （ＮＣＢＩ）及び他のソース（BLAST Manual, Altschul等, NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul等, 上記参照）から公衆に入手可能である。周知のSmith Watermanアルゴリズムもまた、同一性の測定のために使用されて良い。
【０１２４】
例えば、コンピューターアルゴリズムＧＡＰ（Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.）を使用して、配列同一性パーセントが測定される二つのペプチドが、それらそれぞれのアミノ酸の最適なマッチングのために整列される（アルゴリズムによって測定される「マッチスパン」）。ギャップオープニングペナルティ（３倍として計算される。平均項；「平均項」は、使用される比較行列の項の平均である）；「項」は特定の比較行列による各完全なアミノ酸適合に割り付けられるスコアまたは数字である）及びギャップエクステンションペナルティ（通常ギャップオープニングペナルティの｛分数（１／１０）｝倍である）、並びにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２のような比較行列を、アルゴリズムでの連言命題で使用する。標準的な比較行列（ＰＡＭ２５０比較行列についてDayhoff等, Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978)；ＢＬＯＳＵＭ６２比較行列についてHenikoff等, Proc Natl. Acad. Sci USA 89, 10915-10919 (1992)を参照）もまた前記アルゴリズムによって使用される。
【０１２５】
ペプチド配列比較のための好ましいパラメーターは以下のものを含む：
【０１２６】
アルゴリズム：Needleman等, J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970)；比較行列：Henikoff等, PNAS USA 89, 10915-10919 (1992)由来のＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップペナルティ：１２、ギャップ長ペナルティ：４、相同性の閾値：０
【０１２７】
ＧＡＰプログラムは、上記パラメーターで有用である。上述のパラメーターは、ＧＡＰアルゴリズムを使用するペプチド比較（末端ギャップについてペナルティーなし）のためのデフォルトパラメーターである。
【０１２８】
用語「相同性」は、同一性に関連する概念であるが、「同一性」とは対照的に、同一の適合及び保存的な置換の適合の両者を含む配列の関係を指す。二つのポリペプチド配列が、例えば（分数（１０／２０））の同一なアミノ酸を有し、残りの部分は全て非保存的な置換であれば、同一性及び相同性のパーセントは両者とも５０％となろう。同じ例で、保存的な置換が５を超える位置で存在するのであれば、同一性パーセントは５０％のままであるが、相同性パーセントは７５％であろう（分数（１５／２０））。それ故、保存的な置換が存在する場合、二つのポリペプチド間の相同性の度合いは、これらの二つのポリペプチド間の同一性パーセントよりも高くなるであろう。
【０１２９】
配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドの保存的な修飾（及びコードしている核酸に対する対応する修飾）は、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドのものと同じである機能的及び化学的特徴を有するペプチドを生ずる。対照的に、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドと比較して、本発明に係るペプチドの機能的及び／または化学的特徴の実質的な修飾は、（ａ）例えばシート形状またはへリックス形状としての、置換の領域の分子骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性度、あるいは（ｃ）側鎖の嵩を維持するその効果において有意に異なるアミノ酸配列中の置換を選択することによって達成されて良い。
【０１３０】
例えば「保存的なアミノ酸置換」は、当該位置でのアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどまたは全く影響のないように、本来のアミノ酸残基を本来ではない残基で置換することを含んで良い。更に、ポリペプチド中のいずれかの本来の残基が、「アラニンスキャニングミュータジェネシス」について以前に記載されているように、アラニンで置換されても良い（例えば、アラニンミュータジェネシスを議論しているMacLennan等, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643, 55-67 (1998); Sasaki等, Adv. Biophys. 35, 1-24 (1998)を参照）。
【０１３１】
所望のアミノ酸置換（保存的でも非保存的でも）は、そのような置換が所望される時期で当業者によって決定されて良い。例えばアミノ酸置換は、本発明に係るペプチドの重要な残基を同定するために、またはすでに記載されたミューテーションに加えて、レセプターに対するここに記載されるペプチドのアフィニティーを増大若しくは減少するために使用できる。
【０１３２】
天然に存在するアミノ酸残基は、一般的な側鎖の特性に基づいてクラスに分けられて良い：
１）  疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）  中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）  酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
４）  塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）  鎖の配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
６）  芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１３３】
そのような変化を行う際、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮されて良い。各アミノ酸は、その疎水性及び電荷特性に基づいて以下のような疎水性親水性指標が割り付けられている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。
【０１３４】
タンパク質に対して相互作用的な生物学的機能を与えるアミノ酸の疎水性親水性指標の重要性は、当該技術分野で理解されている。Kyte等, J. Mol. Biol., 157, 105-131 (1982)。特定のアミノ酸は、同じ疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸について置換されて良く、同じ生物学的活性を未だ維持する。疎水性親水性指標に基づいて変化を行う際、疎水性親水性指標が±２の範囲内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものが更に特に好ましい。隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるように、タンパク質の最大の局所的平均親水性は、その免疫原性及び抗原性、即ち前記タンパク質の生物学的特性と相関する。
【０１３５】
以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。同様な親水性値に基づいて変化を行う際、親水性値が±２の範囲内のアミノ酸の置換が好ましく、±１の範囲内が特に好ましく、±０．５の範囲内が特に好ましい。
本発明のポリペプチドは更に、天然に存在しないアミノ酸を含んでも良い。
【０１３６】
成長ホルモンポリペプチド
ここでの文脈で、用語「ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）」及び「野生型ｈＧＨ（ｗｔｈＧＨ）」は互換的に使用され、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質を両者とも指す。
【０１３７】
本発明の文脈で、ここで使用される用語「成長ホルモンポリペプチド」は、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドを意味する。
【０１３８】
本発明の一つの実施態様では、成長ホルモンポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドである。
【０１３９】
本発明の一つの実施態様では、成長ホルモンポリペプチドは、そのようなペプチドの断片であり、当該断片は、有意な量の成長ホルモン活性を保持し、例えばそのようなペプチドと実質的に同じ成長ホルモン活性を有する。
【０１４０】
本発明の一つの実施態様では、成長ホルモン化合物は、ｈＧＨの切り詰めた形態、即ち一つ以上のアミノ酸が配列番号１に対応するＮ及び／またはＣ末端から欠如しており、野生型ｈＧＨの所望の生物学的特性を保持しているものである。
【０１４１】
本発明の一つの実施態様では、成長ホルモン化合物は、少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％配列番号１と相同である配列を有するアミノ酸配列を含み、少なくとも１％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、例えば少なくとも２５％のｈＧＨの活性の関連するｈＧＨアッセイでの活性を有するポリペプチドである。
【０１４２】
疑義を避けるために、本発明の成長ホルモン化合物は、野生型ｈＧＨより高い活性を有するものであっても良い。成長ホルモン化合物がいくつかの態様で誘導化されるのであれば、誘導化は活性を有意に変化させるかもしれないので、ｈＧＨに関して成長ホルモンの活性は、非誘導化成長ホルモン化合物について測定されるべきである。例えば、成長ホルモン化合物のin vivoでの半減期を長くする特性改変基で誘導化された成長ホルモン化合物の場合、誘導化成長ホルモン化合物の活性は、ｈＧＨの活性よりもずっと低くなっても良く、その減少は長期化した滞留時間によって中和される。一つの実施態様では、成長ホルモン化合物はそのようなポリペプチドの断片であり、当該断片は、有意な量の上述の成長ホルモン活性を維持している。
【０１４３】
さらなるジスルフィド架橋が導入されて良いＧＨ化合物の他の例は、ＷＯ９２／０９６９０（Genentech）、ＵＳ６，００４，９３１（Genentech）、ＵＳ６，１４３，５２３（Genentech）、ＵＳ６，１３６，５３６（Genentech）、ＵＳ６，０５７，２９２（Genentech）、ＵＳ５，８４９，５３５（Genentech）、ＷＯ９７／１１１７８（Genentech）、ＷＯ９０／０４７８８（Genentech）、ＷＯ０２／０５５５３２（Maxygen APS及びMaxygen Holdings）、ＵＳ５，９５１，９７２（American Cynanamid Corporation）、ＵＳ２００３／０１６２９４９（Bolder Biotechnologies Inc.）に記載されたものを含み、これらの文献が参考としてここに取り込まれる。
【０１４４】
一つの現在好ましい実施態様では、成長ホルモンポリペプチドは、ヒト成長ホルモンポリペプチド、特に組換えヒト成長ホルモンポリペプチドである。一つのその重要な変形例では、ヒト成長ホルモンポリペプチドは、修飾ヒト成長ホルモンポリペプチド、特にＰＥＧ化ヒト成長ホルモンポリペプチド、ハイパーグリコシル化成長ホルモン、または２を超えるジスルフィド架橋を有するポリペプチドである。
【０１４５】
アフィニティー樹脂の調製
アフィニティー樹脂は、特に（ｉ）遊離形態でリガンドを合成し、その後直接またはリンカー（上記参照）を介して固相にリガンドを固定化することにより、または（ｉｉ）固相材料を官能化し、その後連続してリガンドを合成することにより、二つの基本的に異なる態様で原則として調製できる。第一の変形例に関して、固定化法は当該技術分野で容易に利用可能であり、例えばHermanson等（上記参照）を参照。第二の変形例に関して、この方法も容易に利用可能であり、例えば固相ペプチド合成の当該技術分野で既知の方法及び由来する方法を参照［Fields, G.B.等, (1992) Principles and practice of solid-phase peptide synthesis. In Synthetic Peptides: A User’s Guide (Grant, G.A.編), pp. 77-183, W.H. Freeman］及び［Fields, G.B.編, (1997) Solid-phase peptide synthesis. Methods in Enzymology 289. 3; Dorwald, F.Z. Organic synthesis on solid phase-supports, linker, reactions; Wiley-VCH: Weinheim, 2000］。
【０１４６】
この例は、実施例１及び２に提供される。
【０１４７】
工程（ａ）−成長ホルモンポリペプチドとアフィニティー樹脂との接触
前記方法の第一の工程では、成長ホルモンポリペプチドを含む懸濁物または溶液をアフィニティー樹脂と、前記成長ホルモンポリペプチドの一部の前記アフィニティー樹脂への結合を容易にする条件下で接触させる。この目的は、前記アフィニティー樹脂へのＧＨを含む懸濁物または溶液の成長ホルモンを含む一部の結合を容易にすることである。
【０１４８】
工程（ａ）に関して用語「一部」は、懸濁物または溶液に存在する成長ホルモンポリペプチドの質量の少なくとも３０％（即ち３０−１００％）を意味する。ほとんどの例では、成長ホルモンポリペプチドの質量の３０％をはるかに超える量、例えば少なくとも５０％、または少なくとも７０％、または主たる部分を結合することが望ましいことが理解されるべきである。用語「主たる部分」は、懸濁物または溶液に存在する成長ホルモンポリペプチドの質量の少なくとも９０％を意味する。好ましくは更に高い部分、例えば成長ホルモンポリペプチドを含む懸濁物または溶液に存在する成長ホルモンポリペプチドの質量の少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または実質的に全てがアフィニティー樹脂に結合されるようになる。
【０１４９】
アフィニティー樹脂の最も一般的なアレンジは、カラムフォーマットで存在する。バッチ容器でのアレンジももちろん可能である。
【０１５０】
成長ホルモンポリペプチドの懸濁物または溶液の接触は、典型的には従来のプロトコールに従って実施され、即ち懸濁物または溶液の濃度、温度、イオン強度等を通常のようにしてよく、アフィニティー樹脂を洗浄し、通常のように適用する前に平衡化して良い。
【０１５１】
成長ホルモンポリペプチドの搭載は、典型的にはアフィニティー樹脂のリットル当たり少なくとも５．６ｇ、例えば湿潤形態のフィニティー樹脂のリットル当たり１−２０．０ｇ、例えば３．０−１０．０ｇの範囲の成長ホルモンポリペプチドの量であり、成長ホルモンポリペプチドを含む懸濁物または溶液は、典型的に一時間当たり１−５０カラム体積（ＣＶ／ｈ）、例えば２５−３５ＣＶ／ｈのフローで典型的に搭載される。
【０１５２】
アフィニティー樹脂への適用前及び適用の際の成長ホルモンポリペプチドを含む懸濁物または溶液のｐＨは、例えば成長ホルモンポリペプチドのダイマーの形態及び分解産物といった混在物の形成と関連する役割を果たすと思われる。かくして、成長ホルモンポリペプチドを含む懸濁物または溶液は液体形態で存在し、アフィニティー樹脂への適用の際に、３．０−１０．０の範囲、例えば３．０−７．０、または６．５−１０．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの興味深い実施態様では、成長ホルモンポリペプチドを含む懸濁物または溶液は、４．０−７．０の範囲、または７．０−９．０の範囲、または４．５−８．５の範囲のｐＨを有する。好ましいｐＨ範囲は５．０−６．５であろう。
【０１５３】
典型的に伝導度は、少なくとも１ｍＳ／ｃｍ、例えば４０ｍＳ／ｃｍ、例えば少なくとも５０ｍＳ／ｃｍ、例えば少なくとも１００ｍＳ／ｃｍ、例えば少なくとも２００ｍＳ／ｃｍである。
【０１５４】
成長ホルモンポリペプチドを含む懸濁物または溶液の温度は、典型的に０−３０℃、例えば約２−２５℃である。
【０１５５】
結合した成長ホルモンポリペプチドを有するアフィニティー樹脂の温度は、典型的に０−３０℃、例えば約２−２５℃であり、冷却筒と制御された温度の溶液を使用することにより特定の範囲内で維持される。
【０１５６】
工程（ｂ）−洗浄工程（任意）
アフィニティー樹脂に対する成長ホルモンポリペプチドの結合の後、アフィニティー樹脂に非特異的に結合したタンパク質を除去するために、洗浄工程（ｂ）が典型的に実施される。この工程により、アフィニティー樹脂上の成長ホルモンポリペプチドの残留（結合）フラクションは、ずっと低い混在物の存在量を有するであろう。
【０１５７】
この洗浄工程（ｂ）は、好ましくは２．０−６．９の範囲のｐＨを有する洗浄バッファーで実施される。いくつかの興味深い実施態様では、洗浄バッファーは、アフィニティー樹脂への適用の際に３．０−１０．０の範囲、例えば３．０−７．０、または６．５−１０．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの興味深い実施態様では、洗浄バッファーは、４．０−７．０の範囲、または７．０−９．０の範囲、または４．５−８．５の範囲のｐＨを有する。
【０１５８】
洗浄工程（ｂ）は、一時間当たり１−５０カラム体積のフローで典型的に実施される。
【０１５９】
洗浄バッファーは典型的に緩衝剤を含む水溶液であり、典型的に緩衝剤は、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、ＢＩＳＴＲＩＳ、トリエタノールアミン、ヒスチジン、イミダゾール、グリシン、グリシルグリシン、グリシンアミド、リン酸、酢酸（例えば酢酸ナトリウム）、乳酸、グルタル酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸、及びコハク酸の酸及び塩基からなる群から選択される少なくとも一つの成分を含む。緩衝剤は二つ以上の成分の混合物を含んでも良いことが理解されるべきであり、前記混合物は特定の範囲のＰＨ値を提供することができる。例として、酢酸と酢酸ナトリウム等が挙げられる。
【０１６０】
緩衝剤に加えて、洗浄バッファーは、ＮＰ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、Ｔｗｅｅｎ−８０といった非イオン性界面活性剤、またはカプリル酸のような他の添加剤を含んでも良い。
【０１６１】
緩衝剤に加えて、洗浄バッファーは更に、バッファーのｐＨを変化しないイオン強度増強剤、例えば塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム等を含んでも良い。
【０１６２】
本発明の一つの実施態様では、工程（ｂ）は、好ましくは室温近くで０−５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、ｐＨ６．０−６．５を含む少なくとも一つの洗浄バッファーを含む。
【０１６３】
本発明の一つの実施態様では、工程（ｂ）は、２５ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７．５を含む少なくとも一つの洗浄バッファー（バッファーＡ）を含む。
【０１６４】
洗浄工程（ｂ）は、一つ、二つまたはいくつかの異なる洗浄バッファーを使用することにより、あるいは洗浄バッファーの勾配の適用により実施されて良いと解されるべきである。
【０１６５】
洗浄工程と溶出工程は別個の工程である必要はないが、特に溶出バッファーの勾配が溶出工程で使用されるのであれば、両者を組み合わせても良いことに注意すべきである。
【０１６６】
工程（ｃ）−溶出工程
洗浄工程（ｂ）の後、アフィニティー樹脂は溶出バッファーで溶出され、精製された成長ホルモンポリペプチドが溶出物として回収される。
【０１６７】
非常に多くの変形例が溶出工程（ｃ）では可能である。
【０１６８】
溶出のタイプは特に必須ではない、即ち例えば、塩の段階的に減少する勾配を含む溶出バッファーでの溶出、塩の直線的に減少する勾配での溶出（または勾配−維持−勾配プロフィール、または他の変形例）、あるいはｐＨ勾配の使用、あるいは温度勾配の使用、あるいは上述のものの組み合わせが可能である。
【０１６９】
最終溶出バッファーの伝導度は、好ましくは工程（ａ）の成長ホルモンポリペプチドを含む組成物の伝導度より高い。
【０１７０】
ほとんどの例では、工程（ｃ）の溶出バッファーは典型的に、工程（ａ）及び（ｂ）と同じｐＨを有する。しかしながら工程（ｃ）の溶出バッファーは、工程（ａ）及び（ｂ）より高いｐＨを有しても良い。
【０１７１】
工程（ｃ）の溶出バッファーが７．０から８．０の間のｐＨを有するのが好ましい実施態様である。
【０１７２】
更により好ましい実施態様では、溶出バッファーは、好ましくは室温近くで２５−２００ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、ｐＨ６．５−７．５を含む。
【０１７３】
別の好ましい実施態様では、溶出バッファーは、２５−２００ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ７．５−８．０を含む。
【０１７４】
別の好ましい実施態様では、溶出バッファーは、５０ｍＭのトリエタノールアミン、ｐＨ８．０を含む。
【０１７５】
別の好ましい実施態様では、溶出バッファーは、上述のバッファーのいずれかの組み合わせで１Ｍ ＮａＣｌまたは１Ｍ ＭｇＣｌ２を含む。
【０１７６】
別の好ましい実施態様では、溶出バッファーは、上述のバッファーのいずれかの組み合わせで５−３０％ｖ／ｖグリセロールまたはプロピレングリコールを含む。
【０１７７】
典型的に本発明の方法は、少なくとも５０％で他のタンパク質の含量を減少できるが、より好ましくは且つ実際には、減少は少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、更には少なくとも８０％、または少なくとも８５％である。
【０１７８】
通常アフィニティー樹脂は、連続的な工程により後の使用の目的のために再生できる。
【０１７９】
洗浄工程と溶出工程は別個の工程である必要はないが、特に溶出バッファーの勾配が溶出工程で使用されるのであれば、両者を組み合わせても良いことに注意すべきである。
【０１８０】
これらに制限されるものではないが、本発明の方法は、成長ホルモンポリペプチドの「工業的なスケール」（または「ラージスケール」）での精製のために特に実施可能である。用語「工業的なスケール」は典型的に、液体成長ホルモンポリペプチド組成物の体積が少なくとも１０Ｌ、例えば少なくとも５０Ｌ、例えば少なくとも５００Ｌ、または少なくとも５０００Ｌであり、生成物の重量が少なくとも１０ｇ（乾燥重量）、例えば少なくとも１００ｇ、例えば少なくとも５００ｇ、例えば１−１５０００ｇである方法を意味する。
【０１８１】
新規なアフィニティー樹脂
ここに記載されるもっとも興味深いアフィニティー樹脂のいくつかは、そのままで新規なものであると解される。それ故本発明は、一つ以上のリガンド、即ち上述のリガンドを共有結合している固相材料を含む新規なアフィニティー樹脂を提供する。
【０１８２】
本発明は更に、一つ以上のリガンド、即ち上述のリガンドを共有結合している固相材料を含む新規なアフィニティー樹脂を提供する。
【０１８３】
本発明の一つの実施態様は、
（ａ）成長ホルモンポリペプチドの一部のアフィニティー樹脂への結合を容易にする条件下で、成長ホルモンポリペプチドを含む懸濁物または溶液をアフィニティー樹脂と接触させる工程；
（ｂ）成長ホルモンポリペプチドを含む前記アフィニティー樹脂を、洗浄バッファーで任意に洗浄する工程；及び
（ｃ）成長ホルモンポリペプチドを含む前記アフィニティー樹脂を溶出バッファーで溶出し、溶出物として成長ホルモンポリペプチドを回収する工程
を含む、成長ホルモンポリペプチドの精製方法であって、
前記アフィニティー樹脂が、一般式（Ｉ）の一つ以上のリガンドを共有結合で固定化している固相材料を含む、方法を提供する：
【化８】
2012508728.tif 000017
［式中、
ｉ＝１，２，・・・，ｍ、及びｊ＝１，２，・・・，ｎ；
ｍ及びｎは独立に０−３の範囲の整数であり、但しｎ＋ｍの合計は１−４の範囲内である；
ｐ、ｑ及びｒは独立に０−６の範囲の整数である；
Ａ１１，・・・，Ａ１ｍ及びＡ２１，・・・，Ａ２ｎは独立に、α−アミノ酸部分、β−アミノ酸部分、α−アミノスルホン酸部分、及びβ−アミノスルホン酸部分から選択される；
Ｚ１及びＺ２は独立に、水素、Ｃ１−６アルキル、カルボン酸部分（Ｚ−Ｃ（＝Ｏ）−）、及びスルホン酸部分（Ｚ−Ｓ（＝Ｏ）２−）から選択され、Ｚは水素、任意に置換されたＣ１−１２アルキル、任意に置換されたＣ３−１２シクロアルキル、任意に置換されたＣ１−１２アルケニル、任意に置換されたＣ１−１２アルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、及び任意に置換されたヘテロシクリルから選択される；
Ｒ１及びＲ２は独立に、水素及びＣ１−６アルキルから選択される；
Ｘは直接のまたはリンカーを介した固相材料に対するリガンドの結合のための基であり、Ｘはカルボン酸（−ＣＯＯＨ）、カルボン酸エステル（−ＣＯＯＲ）、カルボン酸無水物（−ＣＯＯＣＯＲ）、カルボン酸ハライド（−ＣＯＨａｌ）、スルホン酸（−Ｓ（＝Ｏ）２ＯＨ）、スルホニルクロリド（−Ｓ（＝Ｏ）２Ｃｌ）、チオール（−ＳＨ）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−Ｒ）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、アルデヒド（Ｃ（＝Ｏ）Ｈ）、エポキシド（−ＣＨ（Ｏ）ＣＨ２）、シアニド（−ＣＮ）、ハロゲン（−Ｈａｌ）、第一級アミン（−ＮＨ２）、第二級アミン（−ＮＨＲ）、ヒドラジド（−ＮＨ＝ＮＨ２）、及びアジド（−Ｎ３）から選択され、Ｒは任意に置換されたＣ１−１２アルキルから選択され、Ｈａｌはハロゲンである；及び
前記リガンドの全分子量（「Ｘ」といずれかのリンカーを除く）は２００−２０００ｇ／ｍｏｌである］。
【０１８４】
本発明の一つの実施態様では、Ｚ１及びＺ２は、水素、Ｃ１−６アルキル、キサンテン−９−カルボニル、２−アミノニコチニル、２−キナルジンカルボニル、４，８−ジヒドロキシ−２−キノリンカルボニル、４−キノリンカルボニル、５−メチル−２−ニトロベンゾイル、２−（ベンゾイミダゾリルチオ）アセチル、５−メチル−２−フェニル−２Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−カルボニル、６−ヒドロキシ−２−ナフトイル、４，７−ジメチルピラゾロ［５，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−３−カルボニル、３−アミノ−４−（フェニルスルホニル）−２−チオフェンカルボニル、（＋／−）−３−オキソ−１−インダンカルボニル、５，６，７，８−テトラヒドロアクリジン−９−カルボニル、２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−カルボニル、５−（４−メチル−２−ニトロフェニル）フロイル、１−シクロヘキシル−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボニル、キノキサリン−６−カルボニル、及び４−メチル−２−フェニルピリミジン−５−カルボニルから独立に選択される。
【０１８５】
本発明の一つの実施態様では、Ｚ１及びＺ２は、水素、Ｃ１−６アルキル、キサンテン−９−イルカルボニル、５−メチル−２−フェニル−２Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルカルボニル、３−アミノ−（フェニルスルホニル）−チオフェン−２−イルカルボニル、（＋／−）−３−オキソ−１−インダニルカルボニル、５，６，７，８−テトラヒドロアクリジン−９−イルカルボニル、及び２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−イルカルボニルから独立に選択される。
【０１８６】
本発明の一つの実施態様では、Ｚ１は三環式の任意に置換されたヘテロ芳香族基を含む。
【０１８７】
本発明の一つの実施態様では、Ｚ１−（Ａ１ｉ）ｍ−Ｎ（Ｒ１）−及びＺ２−（Ａ２ｊ）ｎ−Ｎ（Ｒ２）−の各々は、５０−５００ｇ／ｍｏｌの分子量の有機部分を表し、リガンドの全分子量は２５０−１５００ｇ／ｍｏｌ、例えば３００−１２００ｇ／ｍｏｌ、例えば３５０−１０００ｇ／ｍｏｌである。
【０１８８】
本発明の一つの実施態様では、リガンドは一般式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）で上記特定されたものであり、更に各種の実施態様、特に一般式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の実施態様のものである。現在最も興味深いリガンドは、上述のリガンド番号（１）−（１６）のものである。
【０１８９】
本発明の一つの実施態様によれば、
（ａ）成長ホルモンポリペプチドの一部のアフィニティー樹脂への結合を容易にする条件下で、成長ホルモンポリペプチドを含む懸濁物または溶液をアフィニティー樹脂と接触させる工程；
（ｂ）成長ホルモンポリペプチドを含む前記アフィニティー樹脂を、洗浄バッファーで任意に洗浄する工程；及び
（ｃ）成長ホルモンポリペプチドを含む前記アフィニティー樹脂を溶出バッファーで溶出し、溶出物として精製成長ホルモンポリペプチドを回収する工程
を含む、成長ホルモンポリペプチドの精製方法であって、
前記アフィニティー樹脂が、一般式（ＩＩ）を有する、方法を提供する：
【化９】
2012508728.tif 000018
［式中、
Ｚ１はＺ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、Ｚが任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、及び任意に置換されたヘテロシクリルから選択され
Ｚ２は水素及びＺ−Ｃ（＝Ｏ）−から選択され、Ｚが任意に置換されたＣ１−１２アルキル、任意に置換されたＣ３−１２シクロアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、及び任意に置換されたヘテロシクリルから選択され；
Ａ２１及びＡ２２の各々はα−アミノ酸及びβ−アミノ酸から独立に選択される］。
【０１９０】
本発明の一つの実施態様では、式中、Ａ２１がアルギニン、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、及びリジンから好ましくは選択され、Ａ２２がアルギニン、フェニルアラニン、イソロイシン、プロリン、チロシン、及びトリプトファンから選択される。
【０１９１】
本発明の一つの実施態様では、成長ホルモンポリペプチドの精製方法であって、リガンドが一般式（ＩＩＩ）：
【化１０】
2012508728.tif 000019
［式中、Ｒ’及びＲ”はα−アミノ酸の側鎖から独立に選択され、Ｒ’’’は任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、及び任意に置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される］
を有する、方法を提供する。
【０１９２】
本発明の一つの実施態様では、前記リガンドが以下のリガンド番号（１）−（１６）から選択される、方法を提供する。
【０１９３】
【化１１−１】
2012508728.tif 000020
【化１１−２】
2012508728.tif 000021
【化１１−３】
2012508728.tif 000022
【化１１−４】
2012508728.tif 000023
【化１１−５】
2012508728.tif 000024
【化１１−６】
2012508728.tif 000025
【化１１−７】
2012508728.tif 000026
【０１９４】
本発明の一つの実施態様は、工程（ｂ）において、少なくとも一つの洗浄バッファーが０−５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、ｐＨ６．０−６．５を含む、成長ホルモンポリペプチドの精製方法を提供する。
【０１９５】
本発明の一つの実施態様は、工程（ｃ）において、溶出バッファーが７．０から８．０の間のｐＨを有する、成長ホルモンポリペプチドの精製方法を提供する。
【０１９６】
本発明の一つの実施態様は、溶出バッファーが０−２００ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、ｐＨ７．０−７．５を含む、成長ホルモンポリペプチドの精製方法を提供する。
【０１９７】
本発明の一つの実施態様は、成長ホルモンポリペプチドがヒト成長ホルモンポリペプチドである、成長ホルモンポリペプチドの精製方法を提供する。
【０１９８】
本発明の一つの実施態様は、ヒト成長ホルモンポリペプチドが組換えヒト成長ホルモンポリペプチドである、成長ホルモンポリペプチドの精製方法を提供する。
【０１９９】
本発明の一つの実施態様は、ヒト成長ホルモンポリペプチドが修飾ヒト成長ホルモンポリペプチドである、成長ホルモンポリペプチドの精製方法を提供する。
【０２００】
本発明の一つの実施態様は、修飾ヒト成長ホルモンポリペプチドがＰＥＧ化ヒト成長ホルモンポリペプチドである、成長ホルモンポリペプチドの精製方法を提供する。
【０２０１】
本発明の一つの実施態様は、一般式（Ｉ）の一つ以上のリガンドを共有結合で固定化している固相材料を含むアフィニティー樹脂を提供する：
【化１２】
2012508728.tif 000027
［式中、
ｉ＝１，２，・・・，ｍ、及びｊ＝１，２，・・・，ｎ；
ｍ及びｎは独立に０−３の範囲の整数であり、但しｎ＋ｍの合計は１−４の範囲内である；
ｐ、ｑ及びｒは独立に０−６の範囲の整数である；
Ａ１１，・・・，Ａ１ｍ及びＡ２１，・・・，Ａ２ｎは独立に、α−アミノ酸部分、β−アミノ酸部分、α−アミノスルホン酸部分、及びβ−アミノスルホン酸部分から選択される；
Ｚ１及びＺ２は独立に、水素、Ｃ１−６アルキル、カルボン酸部分（Ｚ−Ｃ（＝Ｏ）−）、及びスルホン酸部分（Ｚ−Ｓ（＝Ｏ）２−）から選択され、Ｚは水素、任意に置換されたＣ１−１２アルキル、任意に置換されたＣ３−１２シクロアルキル、任意に置換されたＣ１−１２アルケニル、任意に置換されたＣ１−１２アルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、及び任意に置換されたヘテロシクリルから選択される；
Ｒ１及びＲ２は独立に、水素及びＣ１−６アルキルから選択される；
Ｘは直接のまたはリンカーを介した固相材料に対するリガンドの結合のための基であり、Ｘはカルボン酸（−ＣＯＯＨ）、カルボン酸エステル（−ＣＯＯＲ）、カルボン酸無水物（−ＣＯＯＣＯＲ）、カルボン酸ハライド（−ＣＯＨａｌ）、スルホン酸（−Ｓ（＝Ｏ）２ＯＨ）、スルホニルクロリド（−Ｓ（＝Ｏ）２Ｃｌ）、チオール（−ＳＨ）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−Ｒ）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、アルデヒド（Ｃ（＝Ｏ）Ｈ）、エポキシド（−ＣＨ（Ｏ）ＣＨ２）、シアニド（−ＣＮ）、ハロゲン（−Ｈａｌ）、第一級アミン（−ＮＨ２）、第二級アミン（−ＮＨＲ）、ヒドラジド（−ＮＨ＝ＮＨ２）、及びアジド（−Ｎ３）から選択され、Ｒは任意に置換されたＣ１−１２アルキルから選択され、Ｈａｌはハロゲンである；及び
前記リガンドの全分子量（「Ｘ」といずれかのリンカーを除く）は２００−２０００ｇ／ｍｏｌである］。
【０２０２】
本発明の一つの実施態様は、リガンドが上述の実施態様のいずれか一つに従って特定されるアフィニティー樹脂を提供する。
【０２０３】
本発明の一つの実施態様は、リガンドが直接にまたはリンカーを介してのいずれかで、カルボン酸基を介してアフィニティー樹脂の固相材料に共有結合している、上述のリガンド（１）−（１６）からなる群から選択されるリガンドを提供する。
【０２０４】
本発明の一つの実施態様は、ここに規定されたリガンド（１）−（１６）からなる群から選択されるアフィニティーリガンドを提供する。
【０２０５】
新規なアフィニティー樹脂は、タンパク質、特に成長ホルモンポリペプチドといった生体分子の精製及び／または単離に特に有用である。アフィニティーリガンドは、成長ホルモンポリペプチドに対する特異的な結合パートナーであり、緊密に関連するタンパク質から前記ポリペプチドを単離することができる。
【０２０６】
本発明の一つの実施態様では、リガンドはセンサーまたはアレイプレート（「固相材料」）の表面に固定化され、生物学的サンプル中の成長ホルモンポリペプチドの検出及び／または定量のために使用できる。
【０２０７】
ここで使用される用語「生物学的サンプル」は、天然の方法または他の方法、例えば工業的な方法、組換え方法から得られるサンプルを含み、「体液」、即ち生物または生物の組織から抽出、排泄、または分泌されたいずれかの液体物質を含む。体液は細胞を必ずしも含む必要はない。本発明に関連する体液は、全血、血清、尿、血漿、脊髄液、涙、乳、洞液、及び羊水をこれらに制限されることなく含む。
【０２０８】
本発明の一つの実施態様では、複数のリガンドがアレイプレート（「固相材料」）の表面に固定化され、複数のスポットに並べられ、各スポットは一つのリガンドを示す。そのような官能化アレイは、溶液中の成長ホルモンポリペプチドの存在を検出するために使用できる。そのようなアレイは、生物学的サンプル中の成長ホルモンポリペプチドの存在を検出するための診断の応用のために使用できる。
【０２０９】
本発明の一つの実施態様では、成長ホルモンポリペプチドの検出及び任意に定量のためのカンチレバーセンサー（「固相材料」）の結合表面に、複数のリガンドが固定化される。複数のアフィニティーリガンドは複数のカンチレバーに固定化でき、各カンチレバーが一つのリガンドを示す。そのような官能化アレイは、溶液中の各種の抗体の存在を検出するために使用できる。そのようなマルチセンサーは、生物学的サンプル中の特定の成長ホルモンポリペプチドの存在を検出するための診断の応用のために使用できる。
【０２１０】
更に、リガンドのいくつかはそのままで新規であると解される。
【０２１１】
それゆえ本発明は更に、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩ）で上記特定されたアフィニティーリガンド、特にリガンド（１）−（１６）からなる群から選択されるリガンドを提供する。
【実施例】
【０２１２】
実施例１
コードされたビーズ法と共に固相コンビナトリアルアプローチを使用する、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の精製のための小分子アフィニティー樹脂の開発
【０２１３】
ｈＧＨは、ヒトにおける成長と細胞再生を刺激するタンパク質ホルモンである。それは、活性な１：２（ｈＧＨ：ｈＧＨｂｐ）複合体を形成することにより、そのレセプター、ｈＧＨｂｐを結合する。前記ホルモンはそのレセプター上の同じ部位を結合するが、ｈＧＨの二つの結合部位は、最も高いアフィニティーを有するサイト１とは構造的に別個である。サイト１は大きなタンパク質表面であり、各タンパク質について３０を超えるアミノ酸を包含する。アフィニティーは、いくつかの残基、特にレセプターのＴｒｐ１０４及びＴｒｐ１６９で濃縮される。
【０２１４】
In silicoスクリーニング及びライブラリーデザイン
天然リガンドの小分子模倣体を構築するために、３点の多様性を有する分枝状構造（ＩＶ）を選択した：
【化１３】
2012508728.tif 000028
［式中、ＡＡ２及びＡＡ１はアミノ酸残基であり、ＣＡはカルボン酸残基である］。
活性リガンドの発見の可能性を高めるために、事実上４００００の化合物ライブラリーを、ｈＧＨの結晶構造に対してin silicoでスクリーニングした（１Ａ２２）。このライブラリーは、化学物質データベース（ＡＣＤ）から得られた２５００のビルディングブロックのセットを選択することによりデザインされた。前記ライブラリーは、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３位置にビルディングブロックを導入することにより、Sybyl(Legion)で構築された。ドッキングアルゴリズムFlexXを使用して、ドッキングがSybylで更に実施された。これらの結果から、いくつかの異なるスコアリング機能、並びに化学的安定性、毒性、及び入手可能性に基づいて、１８のビルディングブロックのサブセットがＣＡについて選択され、１１のビルディングブロックがＡＡ１とＡＡ２のそれぞれについて選択された。
【０２１５】
ＡＡ１とＡＡ２は、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ及びＡｒｇから独立に選択された。ＣＡは、表１に記載されたＣＡ１−ＣＡ１８から選択された。
【０２１６】
表１
【化１４−１】
2012508728.tif 000029
【化１４−２】
2012508728.tif 000030
【０２１７】
ライブラリー合成及びスクリーニング
コードされたポリエチレングリコール−アクリルアミド（ＰＥＧＡ）ビーズ状でのスプリットアンドミックス固相合成によって、リガンドライブラリーを合成した。全ライブラリーは２１７８の独特の化合物からなった。ビーズコード法は、ＰＥＧＡビーズの内部のランダムな位置で固定化された蛍光粒子によって作製された３次元イメージパターン認識に基づく。３の直交するＣＣＤカメラを備えた装置による各化学的転位の後、個々のビーズコードを記録した。３つのイメージを三角測量し、各ビーズに独特のコードを与え、化学的ヒストリーが追跡できるようにした［S.F. Christensen, M. Meldal, Genetic Engineering News, 25, No. 7, April 1, 2005］。
【０２１８】
このビーズをＰＢＳ中のローダミン標識ｈＧＨとインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、その蛍光を測定して定量した。ｈＧＨに対して高アフィニティーを有するリガンドを有するビーズは高い蛍光値を有し、ｈＧＨに対して低アフィニティーを有するリガンドを有するビーズは低い蛍光を有する。リガンドのビルディングブロック配列と全てのビーズの蛍光値をマッチさせることにより、構造とアフィニティーの関係を全ての２１７８化合物について確立した。各化合物の蛍光値はここでは示されていない。変わりに、各ＡＡ１、各ＡＡ２及び各ＣＡについての平均蛍光値が図１に示されている。
【０２１９】
構造−アフィニティーデータに基づいて、１６の高アフィニティーが予測されるリガンドが表２に示され（Ｌ１−Ｌ１６）、並びに２の低アフィニティーが予測されるリガンドが表３に示され（Ｌ１７−Ｌ１８）、それらは０．１６ｍｍｏｌ／ｇのアミン搭載と４０−９０μｍの粒径を有するFractogel Amino(Merck)で段階的に合成された。樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭおよびエタノールで徹底的に洗浄し、１ｍＬのカラムに実装し、０．２Ｍ ＮａＣｌ、次いで２０％エタノールで洗浄し、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ＝７．５０に平衡化した（バッファーＡ）。
【０２２０】
表２
【化１５−１】
2012508728.tif 000031
【化１５−２】
2012508728.tif 000032
【化１５−３】
2012508728.tif 000033
【化１５−４】
2012508728.tif 000034
【化１５−５】
2012508728.tif 000035
【化１５−６】
2012508728.tif 000036
表３
【化１６】
2012508728.tif 000037
【０２２１】
ａ）０．５ｍｌ／分の流速で、バッファーＡ中のｈＧＨの５ｍｇ／ｍｌ溶液でカラムを充填する工程；
ｂ）カラムを離れるバッファーの安定な低いＵＶ吸光度が観察されるまで、少なくとも１０カラム体積のバッファーＡでカラムを洗浄する工程；
ｃ）１ＭのＮａＣｌ／２５ｍＭのＴｒｓｉ、ｐＨ７．５（バッファーＢ）の勾配を適用することにより、タンパク質を溶出する工程；
ｄ）０．２ＭのＮａＯＨ、次いでバッファーＢ、次いでバッファーＡでカラムを浄化する工程
によって、各樹脂サンプルについて  野生型ｈＧＨについての結合能力を測定した。
【０２２２】
工程（ｃ）の間でＵＶシグナルを調査することによって結合能力を計算し、上記の各リガンドについて示された。
【０２２３】
（ａ）バッファーＡで５倍希釈されたｈＧＨ発酵ブロスでカラムを搭載する工程；
（ｂ）カラムを離れるバッファーの安定な低いＵＶ吸光度が観察されるまで、少なくとも１０カラム体積のバッファーＡでカラムを洗浄する工程；
（ｃ）バッファーＢの勾配を適用することにより、タンパク質を溶出する工程；
（ｄ）０．２ＭのＮａＯＨ、次いでバッファーＢ、次いでバッファーＡでカラムを浄化する工程
によって、樹脂の選択性を試験した。
【０２２４】
「観察された選択性」は、工程（ｇ）の間で得られた溶出物のＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルによって判断され、上記の各リガンドについて示された。「非常に良好な」選択性を有する樹脂の例（Fractogel上のリガンドＬ１１）、及び「穏やかな」選択性を有する樹脂の例（Fractogel上のリガンド１６）が図２に示されている。
【０２２５】
図２は、Fractogel Amino上のリガンド１１（左図）及びFractogel Amino上のリガンド６（右図）の選択性試験から得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０２２６】
実施例２
以下の構造を有するリガンドをFractogel Amino上に合成し、実施例１に記載されたのと同じ方法によって試験した。生成した樹脂は、＜０．５ｍｇ／ｍｌの結合能力を有した。選択性は試験しなかった。
【化１７】
2012508728.tif 000038
【０２２７】
Ｌ１９のカルボン酸残基は置換したナフトイルであり、実施例１のＣＡ３、ＣＡ４、ＣＡ５、ＣＡ９及びＣＡ１７と構造的に類似するが、これら全ては図２により「非常に低い」から「穏やかな」平均蛍光値を生じる。これに基づいて、Ｌ１９はｈＧＨに対する低いアフィニティーを有すると予測されるであろう。他方で、表１によれば、Ｌ１９の（ＡＡ１，ＡＡ２）＝（Ｔｙｒ，Ａｒｇ）のアミノ酸残基の組み合わせは、ｈＧＨに対する高いアフィニティーを生ずると予測されるであろう。しかしながら、ｈＧＨに対するリガンドアフィニティーについてのアミノ酸残基の組み合わせの予測されたポジティブな効果は、カルボン酸残基の予測されたネガティブな効果によって打ち消され、合計でＬ１９の低いｈＧＨアフィニティーを生じる。
【０２２８】
実施例３−アミノ官能化Fractogel樹脂に対する実施例１由来のリガンドＬ１０の直接的合成
Fractogel EMD−アミノ樹脂（７０ｍｌ、２．３４ｍｍｏｌ、Merck KGaAによって供給）を、ガラスシリンジで水（３×）、ＥｔＯＨ（３×）及びＤＭＦ（５×）で洗浄し、丸底フラスコ（２５０ｍｌ）に移した。Ｆｍｏｃ-Ｌ-ＤＡＰＡ（Alico）−ＯＨ（２．８８ｇ、３．０当量、７．０ｍｍｏｌ）及びＴＢＴＵ（２．１０ｇ、２．８当量、６．５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍｌ）とＮ−エチルモルホリン（１．１８ｍｌ、４．０当量、９．４ｍｍｏｌ）に溶解し、１０分間事前活性化した。透明な溶液を樹脂に添加し、更に５０ｍｌのＤＭＦを添加した。フラスコを一晩シェイカーに配置した。樹脂を大きなガラスシリンジに移し、ＤＭＦ（５×）及びＤＣＭ（５×）で洗浄した。小サンプルのＦｍｏｃ定量により、０．１９ｍｍｏｌ／ｇの搭載を測定した。残りのアミノ残基をＤＭＦ中の２０％無水酢酸で１時間キャップした。樹脂をＤＭＦ（５×）及びＤＣＭ（５×）で洗浄した。ネガティブKaiser試験により、樹脂上の遊離アミノ基の不存在が示された。樹脂の一部（１５ｍｌ）をＤＭＦ（５×）で洗浄し、Ｆｍｏｃ保護基をＤＭＦ中の２０％ピペリジンでの２＋３０分の処理によって除去した。樹脂をＤＭＦ（５×）及びＤＣＭ（５×）で洗浄し、小サンプルはポジティブKaiser試験を与えた。樹脂をＤＭＦ（５×）で洗浄した。Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ（５８２ｍｇ、３．０当量、１．５０ｍｍｏｌ）及びＴＢＴＵ（４５０ｍｇ、２．８当量、１．４０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍｌ）及びＮＥＭ（２５４μｌ、４．０当量、２．００ｍｍｏｌ）に溶解し、１０分間事前活性化した。溶液を樹脂に添加し、キャップしたガラスシリンジで一晩震盪した。樹脂をＤＭＦ（５×）、ＤＣＭ（５×）で徹底的に洗浄し、ネガティブKaiser試験を与えた。樹脂をＤＭＦ（５×）で洗浄し、Ｆｍｏｃ保護基をＤＭＦ中の２０％ピペリジンでの２＋３０分の処理によって除去した。Kaiser試験はポジティブであった。樹脂をＤＭＦ（５×）で洗浄した。Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ（５３２ｍｇ、３．０当量、１．５０ｍｍｏｌ）及びＴＢＴＵ（４５０ｍｇ、２．８当量、１．４０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍｌ）及びＮＥＭ（２５４μｌ、４．０当量、２．００ｍｍｏｌ）に溶解し、１０分間事前活性化した。溶液を樹脂に添加し、キャップしたガラスシリンジで一晩震盪した。Kaiser試験はネガティブであったが、わずかに青味がかった色合いを有した。樹脂をＤＭＦ中の２０％無水酢酸で１時間キャップし、ＤＭＦ（５×）、ＤＣＭ（５×）で洗浄し、ネガティブKaiser試験を与えた。樹脂を担持しているシリンジをラバーセプタムでフィットし、窒素環境下で維持した。樹脂を窒素で徹底的に脱気している純粋ＤＣＭ（２×）で洗浄した。Ａｌｌｏｃ保護基を除去するために、Ｍｅ２ＮＨＢＨ３（５９０ｍｇ、２０当量、１０．０ｍｍｏｌ）を純粋な脱気したＤＣＭ（１０ｍｌ）で溶解し、震盪して１０分間静置した樹脂に添加した。Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（１１６ｍｇ、０．２当量、０．１ｍｍｏｌ）を脱気したＤＣＭ（１ｍｌ）に溶解し、１時間震盪した樹脂に添加した。樹脂をＤＣＭ（３×）で洗浄し、この方法を繰り返して完全な脱保護を達成した。樹脂をＤＣＭ（５×）、ＤＭＦ（５×）、ＤＣＭ（５×）、ＥｔＯＨ（５×）、ＤＣＭ（５×）及びＤＭＦ��５×）で徹底的に洗浄した。１,２,３,４−テトラヒドロアクリジン−９−カルボン酸（３４２ｍｇ、３．０当量、１．５０ｍｍｏｌ）及びＴＢＴＵ（４５０ｍｇ、２．８当量、１．４０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍｌ）、ＮＥＭ（２５４μｌ、４．０当量、２．００ｍｍｏｌ）及び１０滴のＤＭＳＯに溶解し、１０分間事前活性化した。この溶液を樹脂に添加し、キャップしたガラスシリンジで一晩震盪した。樹脂をＤＭＦ（５×）、ＤＣＭ（５×）及びＤＭＦ（５×）で洗浄し、カップリング法を上述のように繰り返した。Ｆｍｏｃ保護基をＤＭＦ中の２０％ピペリジンでの５＋４０分の処理によって除去した。酸標識側鎖保護基を有するリガンドを、ＴＦＡ／水／ＴＩＳ（９３：５：２）で一時間処理した。樹脂をＤＣＭ、ＥｔＯＨ、ＤＣＭ、ＤＭＦ、ＤＭＦ中の５％ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、ＤＣＭ、ＥｔＯＨ及び水で徹底的に洗浄した。
【０２２９】
実施例４−実施例１由来のリガンドＬ１０の合成とアミノ官能化Fractogel樹脂へのカップリング
ＤＣＭ中のＤＩＣ（３当量）とＨＯＢｔ（３当量）を使用して結合された酸で切断可能な４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸（ＨＭＰＡ、３当量）リンカーを使用して、アミノメチルポリスチレン樹脂（CBL Patras社により供給）に対して、実施例１に記載された態様でリガンドＬ１０を合成した。乾燥環境下で、ＤＣＭ中の１−（メシチレン−２−スルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ，３当量）と１−メチルイミダゾール（２．２５当量）を使用して、前記樹脂にＦｍｏｃ−Ｌ−ＤＡＰＡ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ（３当量）を結合した。Ａｌｌｏｃ基の脱保護を、スカベンジャーとしてフェニルシランを使用して実施した。１,２,３,４−テトラヒドロアクリジン−９−カルボン酸のカップリングを、ＮＭＰ中のＨＡＴＵとＤＩＰＥＡを使用して実施した。未だＮα−Ｆｍｏｃ保護基を含むリガンドを、ＴＦＡ／水／ＴＩＳ（９３：５：２）を使用して樹脂から切断した。リガンドを回収し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。リガンド（１当量）をＤＭＦ中に溶解し、ＨＡＴＵ（１当量）とＤＩＰＥＡ（１．２当量）を添加した。リガンドを１０分間事前活性化し、次いでFractogel EMD-アミノ樹脂（１当量、Merck KGaA社により供給）に添加し、６０℃で３時間震盪した。次いでこの方法を二度繰り返した。ＤＭＦ中の２０％ピペリジン、２＋３０分を使用して、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。ＤＭＦ（５×）、ＤＣＭ（５×）、ＥｔＯＨ（５×）、及び水（５×）で樹脂を徹底的に洗浄した。
【０２３０】
実施例５−アミノ官能化セファロース樹脂へのＬ１０のカップリング
２５％ＥｔＯＨ／水（５×）、５０％ＥｔＯＨ／水（５×）、７５％ＥｔＯＨ／水（５×）、ＥｔＯＨ（５×）、２５％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（５×）、５０％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（５×）、７５％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（５×）、及びＮＭＰ（１０×）で、アミノーセファロース樹脂（５ｍｌ、〜１０μｍｏｌアミノ／ｍｌ）を洗浄した。Ｉｌｅアミノ基（３当量）上のＢｏｃ保護を有するｈＧＨリガンドＬ１０を、ＮＭＰ／ＤＭＳＯ（２：１，５ｍｌ）に溶解し、ＥＤＣ（３当量）、ＨＯＡｔ（３当量）及びＤＩＰＥＡ（４当量）を添加した。反応混合物を５分間攪拌し、次いで樹脂に添加し、室温で４時間震盪した。溶媒を濾過し、樹脂をＮＭＰ（１０×）とＤＣＭ（５×）で洗浄した。
３０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（３０分）を使用してＢｏｃ保護を切断し、樹脂をＤＣＭ（５×）で洗浄した。樹脂を１０％ＤＩＰＥＡ／ＤＣＭ（１０分）で中和し、樹脂をＤＣＭ（５×）、ＮＭＰ（６×）、７５％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（４×）、５０％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（４×）、２５％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（４×）、ＥｔＯＨ（６×）、７５％ＥｔＯＨ／水（４×）、５０％ＥｔＯＨ／水（４×）、２５％ＥｔＯＨ／水（４×）、水（６×）、及び２０％ＥｔＯＨ／水（４×）で洗浄した。
【０２３１】
実施例６−アミノ官能化Fractogel樹脂へのＬ１２のカップリング
アルギニン部分上のＰｂｆ保護基とフェニルアラニンのアミノ基上のＦｍｏｃ基を有するリガンドＬ１２（５ｇ）を、ＴＦＡ／水／ＴＩＳ（９３：５：２）（２０ｍｌ）で室温で３時間処理した。溶媒を蒸発させ、残余物のみを冷却ジエチルエーテルで沈降した。沈降した生成物をジエチルエーテル（１０×）で洗浄し、凍結乾燥して９７％の収率で生成物を得た。
２５％ＥｔＯＨ／水（５×）、５０％ＥｔＯＨ／水（５×）、７５％ＥｔＯＨ／水（５×）、ＥｔＯＨ（５×）、２５％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（５×）、５０％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（５×）、７５％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（５×）、及びＮＭＰ（１０×）で、Fractogel EMDアミノ樹脂（５ｍｌ）を洗浄した。
Ｐｂｆ切断リガンドＬ１２（３当量）をＮＭＰ／ＤＭＳＯ（２：１、５ｍｌ）に溶解し、ＥＤＣ（３当量）、ＨＯＡｔ（３当量）及びＤＩＰＥＡ（４当量）を添加した。反応混合物を５分間攪拌して樹脂に添加し、室温で一晩震盪した。溶媒を濾過し、樹脂をＮＭＰ（１×）で洗浄した。２０％ピペリジン／ＮＭＰ（３０分）でＦｍｏｃを切断し、樹脂をＮＭＰ（６×）、７５％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（４×）、５０％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（４×）、２５％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（４×）、ＥｔＯＨ（６×）、７５％ＥｔＯＨ／水（４×）、５０％ＥｔＯＨ／水（４×）、２５％ＥｔＯＨ／水（４×）、水（６×）、及び２０％ＥｔＯＨ／水（４×）で洗浄した。
【０２３２】
実施例７−アミノ官能化セファロース樹脂へのＬ１２のカップリング
２５％ＥｔＯＨ／水（５×）、５０％ＥｔＯＨ／水（５×）、７５％ＥｔＯＨ／水（５×）、ＥｔＯＨ（５×）、２５％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（５×）、５０％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（５×）、７５％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（５×）、及びＮＭＰ（１０×）で、アミノーセファロース樹脂（５ｍｌ、〜１０μｍｏｌアミノ／ｍｌ）を洗浄した。
実施例６から得られたＰｂｆ切断ｈＧＨリガンド００６を、ＮＭＰ／ＤＭＳＯ（２：１，５ｍｌ）に溶解し、ＥＤＣ（３当量）、ＨＯＡｔ（３当量）及びＤＩＰＥＡ（４当量）を添加した。反応混合物を５分間攪拌し、次いで樹脂に添加し、室温で４時間震盪した。溶媒を濾過し、樹脂をＮＭＰ（１０×）で洗浄した。２０％ピペリジン／ＮＭＰ（３０分）でＦｍｏｃを切断し、樹脂をＮＭＰ（６×）、７５％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（４×）、５０％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（４×）、２５％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（４×）、ＥｔＯＨ（６×）、７５％ＥｔＯＨ／水（４×）、５０％ＥｔＯＨ／水（４×）、２５％ＥｔＯＨ／水（４×）、水（６×）、及び２０％ＥｔＯＨ／水（４×）で洗浄した。
【０２３３】
実施例８−アミノ官能化Fractogel樹脂へのＬ１４のカップリング
２５％ＥｔＯＨ／水（５×）、５０％ＥｔＯＨ／水（５×）、７５％ＥｔＯＨ／水（５×）、ＥｔＯＨ（５×）、２５％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（５×）、５０％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（５×）、７５％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（５×）、及びＮＭＰ（１０×）で、Fractogel EMDアミノ樹脂（５ｍｌ）を洗浄した。
リジンのα及びεアミノ基上のＢｏｃ保護基を有するリガンドＬ１４（３当量）を、ＮＭＰ／ＤＭＳＯ（２：１、５ｍｌ）に溶解し、ＥＤＣ（３当量）、ＨＯＡｔ（３当量）及びＤＩＰＥＡ（４当量）を添加した。反応混合物を５分間攪拌し、次いで樹脂に添加し、室温で一晩震盪した。溶媒を濾過し、樹脂をＮＭＰ（１０×）で、次いでジクロロメタン（５×）で洗浄した。次いで樹脂をジクロロメタン中の３０％ＴＦＡで３０分処理し、樹脂を水（５×）とＥｔＯＨ（５×）で洗浄した。樹脂を１０％ＤＩＰＥＡ／ＥｔＯＨ（１０分）で中和し、樹脂をＥｔＯＨ（６×）、７５％ＥｔＯＨ／水（４×）、５０％ＥｔＯＨ／水（４×）、２５％ＥｔＯＨ／水（４×）、水（６×）、及び２０％ＥｔＯＨ／水（４×）で洗浄した。
【０２３４】
実施例９−アミノ官能化セファロース樹脂へのＬ１４のカップリング
２５％ＥｔＯＨ／水（５×）、５０％ＥｔＯＨ／水（５×）、７５％ＥｔＯＨ／水（５×）、ＥｔＯＨ（５×）、２５％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（５×）、５０％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（５×）、７５％ＮＭＰ／ＥｔＯＨ（５×）、及びＮＭＰ（１０×）で、アミノーセファロース樹脂（５ｍｌ、〜１０μｍｏｌアミノ／ｍｌ）を洗浄した。
リジンのα及びεアミノ基上のＢｏｃ保護基を有するリガンドＬ１４（３当量）を、ＮＭＰ／ＤＭＳＯ（２：１、５ｍｌ）に溶解し、ＥＤＣ（３当量）、ＨＯＡｔ（３当量）及びＤＩＰＥＡ（４当量）を添加した。反応混合物を５分間攪拌し、次いで樹脂に添加し、室温で４時間震盪した。溶媒を濾過し、樹脂をＮＭＰ（１０×）で、次いでジクロロメタン（５×）で洗浄した。次いで樹脂をジクロロメタン中の３０％ＴＦＡで３０分処理し、樹脂を水（５×）とＥｔＯＨ（５×）で洗浄した。樹脂を１０％ＤＩＰＥＡ／ＥｔＯＨ（１０分）で中和し、樹脂をＥｔＯＨ（６×）、７５％ＥｔＯＨ／水（４×）、５０％ＥｔＯＨ／水（４×）、２５％ＥｔＯＨ／水（４×）、水（６×）、及び２０％ＥｔＯＨ／水（４×）で洗浄した。
【０２３５】
実施例１０−セファロース及びFractogel樹脂にカップリングしたリガンドＬ２、Ｌ１０及びＬ１４のｈＧＨに対する結合能力
【０２３６】
ａ）１ｍｌ／分の流速で、バッファーＡ中のｈＧＨの０．５ｍｇ／ｍｌ溶液でカラムを充填する工程；
ｂ）５以上のカラム体積のバッファーＡでカラムを洗浄する工程；
ｃ）１ＭのＮａＣｌ／２５ｍＭのＴｒｓｉ、ｐＨ７．５（バッファーＢ）の勾配を適用することにより、タンパク質を溶出する工程；
ｄ）０．２ＭのＮａＯＨ、次いでバッファーＢ、次いでバッファーＡでカラムを浄化する工程
によって、約２ｍｌで各樹脂サンプルについて  野生型ｈＧＨについての結合能力を測定した。
【０２３７】
工程（ｃ）の間のＵＶシグナルを調査することにより結合能力を計算し、以下の表４に示された。
【０２３８】
表４
【表１】
2012508728.tif 000039
【０２３９】
実施例１１−組換え野生型ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の精製
実施例３及び４で調製されたクロマトグラフィー樹脂のそれぞれ１．０ｍｌを有するTricorn 5/50(GE Healthcare Life Sciences, １ｍｌ)カラムを、１：１の水中のスラリーとして実装した。１６℃に冷蔵したAkta Explorer(GE Healthcare Life Sciences)液体クロマトグラフィーシステムにカラムを結合した。安定なＵＶベースラインが観察されるまで、樹脂を０．２ＭのＮａＯＨで徹底的に洗浄した。次いで樹脂を１ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（バッファーＢ、ｐＨ＝７．５０）で中和し、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（バッファーＡ、ｐＨ＝７．５０）で平衡化した。精密濾過した大腸菌細胞培養物の液体（２．６１ｍｇ／ｍｌｈＧＨ力価）をシリンジドライブフィルター（Millex HV、０．４５ｍｍ、Millipore）を使用して濾過し、次いで２００μｌをバッファーＡで１ｍｌに希釈した。サンプル中のｈＧＨの全予測量は０．５２ｍｇであった。サンプルを２ｍｌ／分で１００％バッファーＡ中のカラムに搭載し、フロースルーを回収した。バッファーＡでの１０カラム体積での洗浄後、吸着したタンパク質を６カラム体積を超えるバッファーＢの勾配を適用することにより溶出し、溶出物を回収した。次いでカラムを０．２ＭのＮａＯＨでその場で洗浄し（ＣＩＰ）、別の稼動のため平衡化した。Invitrogen Nu-PAGEシステム（Novex 4-12% Bis-Trisゲルで実施）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより複数の溶出物を測定した。ゲルを製造者のプロトコールに従って稼動した。複数の溶出タンパク質は、両者の樹脂について約７５％であった。
【０２４０】
実施例１２
実施例１から得たリガンドＬ１０を、Fractogel Amino M(Merck KgaA社により供給)で段階的に合成し、生成したアフィニティー樹脂をTricorn 5/50、１ｍｌ（GE Healthcare）に実装した。
【０２４１】
タンパク質サンプル：
ｈＧＨスタンダード：ｈＧＨを新たに調製された５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中に２０ｍｇ／ｍｌで溶解し、次いでバッファーＡ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５０、Ｔ＝１５℃（Akta中で２０℃））で２または３．３ｍｇ／ｍｌに希釈した。
【０２４２】
ｈＧＨ精密濾過バッファー：ｈＧＨ回収物由来の２．６１ｍｇ／ｍｌｈＧＨの大腸菌精密濾過物。凍結した１５ｍｌのサンプルを室温で解凍し、シリンジドライブフィルター（０．２２ｍｍ）を使用して濾過した。バッファーＡで０．５２ｍｇｈＧＨ／ｍｌに希釈した。
【０２４３】
搭載条件：
バッファーＡ１：５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝６．５０、Ｔ＝１５℃（Akta中で２０℃）、フロー０．５ｍｌ／分（１５０ｃｍ／ｈ）
【０２４４】
溶出条件：
バッファーＺ１：２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．５０、Ｔ＝１５℃（Akta中で２０℃）、フロー０．５ｍｌ／分（１５０ｃｍ／ｈ）
【０２４５】
その場での洗浄（ＣＩＰ）条件
０．２ＭのＮａＯＨ
これらの条件下で動的１０％ＢＴ能力（精製したｈＧＨ）は６．７ｍｇ／ｍｌであり、ｈＧＨ精密濾過物についての動的１０％ＢＴ能力は３．２２ｍｇ／ｍｌであった。
【０２４６】
２００ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ８．００、１ＭのＮａＣｌ、３０％プロピレングリコールの溶出バッファーは、ｈＧＨの高回収を生じた。この溶出バッファーと上述の５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．５搭載バッファーを使用した。カラムをｈＧＨでオーバーロードした、これらの条件を使用する実験からの結果が以下に示されている：
【０２４７】
搭載バッファーを５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．２５に変更し、各種の溶出バッファー、ｐＨ７．２５，７．５０及び８．００を試験した。この結果が表５に要約されている。
【０２４８】
表５
【表２】
2012508728.tif 000040
【０２４９】
最も高い純度（９１％）がｐＨ７．２５で観察され、回収は予測された通りｐＨ８．００で最も高かった。ｐＨ８．００での回収は高いが、より不純物が多く存在した。
【０２５０】
以下の条件：搭載バッファー：５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、ｐＨ６．２５及び溶出バッファー：５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、ｐＨ８．００での稼動についてのクロマトグラム及びゲルは図８に示されている。
【０２５１】
実施例１３−Fractogel−リガンドＬ１０−遊離リガンドカップリング
３種の異なるカップリング条件下でリガンドＬ１０をFractogel Amino Mにカップリングすることにより、一連の樹脂を調製した。この樹脂は３３μｍｏｌ／ｍｌのアミノ密度を有し、リガンドＬ１０を十分に搭載した。
【０２５２】
【表３】
2012508728.tif 000041
【０２５３】
全ての３種の樹脂は、Fractogel上での直接合成によって合成された樹脂と同じ挙動を示すが、純粋なｈＧＨに対するいくらか高い能力を有した。精密濾過物ｈＧＨについての能力は、直接合成された樹脂と同様であった。
【０２５４】
実施例１４
実施例１由来のリガンド１４をFractogelに直接合成した。この樹脂を５ｍｌのスケールで評価した。
搭載バッファー：５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、ｐＨ６．２５
溶出バッファー：５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、ｐＨ８．００勾配
ＣＩＰ：０．２ＭのＮａＯＨ
流速：２ｍｌ／分
温度：１５℃（Aktaにより測定すると２０℃）
純粋なｈＧＨに対する動的１０％ＢＴ能力：１６．３ｍｇ／ｍｌ
精密濾過物ｈＧＨに対する動的１０％ＢＴ能力：６．７ｍｇ／ｍｌ
回収：９２％
純度：７１％
【０２５５】
実施例１５
実施例１由来のリガンド１６をFractogel Aminoに直接合成した。この樹脂を５ｍｌのスケールで評価した。
搭載バッファー：５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、ｐＨ６．２５
溶出バッファー：５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、ｐＨ８．００勾配
ＣＩＰ：０．２ＭのＮａＯＨ
流速：２ｍｌ／分
温度：２０℃
純粋なｈＧＨに対する動的１０％ＢＴ能力：１１．９ｍｇ／ｍｌ
精密濾過物ｈＧＨに対する動的１０％ＢＴ能力：５．７ｍｇ／ｍｌ
回収：９８％
純度：７０％
【０２５６】
実施例１６−Fractogel上のリガンドＦ１０及びＦ１４に対するハイパーグリコシル化ｈＧＨの結合
ハイパーグリコシル化ｈＧＨを含む３ｍｌの細胞回収物を、０．２５ＭのＨＣｌで７．７から６．２３にｐＨ調節し、水で３倍に希釈した。
回収物を、５０ｍＭのＢＩＳ-ＴＲＩＳ、ｐＨ６．２３で平衡化した樹脂の１ｍｌカラムに適用した。適用後、樹脂を同じバッファーで洗浄し（１５ＣＶ）、結合したタンパク質を２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０（１０ＣＶ）で溶出した。両者の樹脂により精製されたハイパーグリコシル化ｈＧＨの量は３．５ｍｇ／ｍｌであった。
【０２５７】
議論
高アフィニティーが予測されたリガンドはｈＧＨを結合する一方、低アフィニティーが予測されたリガンドは、予測どおり低アフィニティーを示すという事実は、実施例１で生成され図１及び表２に示された構造−蛍光データが、ｈＧＨに対する一般構造（ＩＶ）を有するリガンドのアフィニティーを予測するための良好な基礎を構成することを示す。
【０２５８】
更に、実施例１に略述されたコンピューター的で実験的な方法は、コンビナトリアル合成工程の数を変数ｍ及びｎに従って調節する範囲において（即ち式（Ｉ））、一般式（Ｉ）を有するかなりの数のｈＧＨアフィニティーリガンドをデザインし、合成し、スクリーニングするための良好な基礎を構成するものと仮定することは公正である。
【０２５９】
同様に、実施例１に略述された実験的な方法は、コンビナトリアル合成工程の数を変数ｍ及びｎに従って調節し（即ち式（Ｉ））、蛍光スクリーニングをｈＧＨの代わりに問題となるタンパク質で実施する範囲において、いずれかのタンパク質に対する一般式（Ｉ）を有するかなりの数のアフィニティーリガンドをスクリーニングするための良好な基礎を構成するものと仮定することは公正である。
【０２６０】
実施例３〜９に記載されたような本発明に係る新規なアフィニティー樹脂の合成及び試験は、ＮａＯＨ溶液に曝露することを含む方法の変わりに洗浄に対する樹脂の安定性を含むアフィニティー樹脂の工業的な応用を説明する。
【０２６１】
配列番号１
【化１８】
2012508728.tif 000042
【図１】
2012508728.tif 000051
【図２】
2012508728.tif 000052
【図３】
2012508728.tif 000053
【図４】
2012508728.tif 000054
【図５】
2012508728.tif 000055
【図６】
2012508728.tif 000056
【図７】
2012508728.tif 000057
【図８】
2012508728.tif 000058
【図９】
2012508728.tif 000059
【図１０】
2012508728.tif 000060
【図１１】
2012508728.tif 000061
【図１２】
2012508728.tif 000062
【図１３】
2012508728.tif 000063
【図１４】
2012508728.tif 000064
【図１５】
2012508728.tif 000065
【図１６】
2012508728.tif 000066
【図１７】
2012508728.tif 000067
【配列表】
2012508728000001.app
【国際調査報告】
2012508728.tif 000068
2012508728.tif 000069
2012508728.tif 000070
2012508728.tif 000071
2012508728.tif 000072