(57)【要約】本発明は、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｄＡｂ）、例えばプロテアーゼ耐性であるｄＡｂに、さらにまた眼送達のためのこのようなｄＡｂを含む製剤および組成物に、ならびに眼の疾患および症状を治療するためのそれらの使用に関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼送達のための、標的分子と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含む組成物。
【請求項２】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインがプロテアーゼに耐性である請求項１記載の組成物であって、前記プロテアーゼが、眼プロテアーゼ、カスパーゼ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ、ジスインテグリン、メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）およびトロンボスポンジンモチーフを有するＡＤＡＭ、プロテオソーム、組織プラスミノーゲン活性化因子、セクレターゼ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、シスタチンＣ、セリンプロテアーゼＰＲＳＳ１およびユビキチンプロテオソーム経路（ＵＰＰ）からなる群から選択される眼送達のための組成物。
【請求項３】
眼送達のための、ＶＥＧＦ、ＴＮＦα、ＴＮＦαＲ、ＩＬ−１、ＩＬ−１ｒ、ＴＮＦαＲ１、ＴＧＦβ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＣＤ２０、Ｎｏｇｏ−ａ、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）およびベータアミロイドの群から選択される標的分子と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含む請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
ＶＥＧＦと結合する前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、（ａ）ＤＯＭ１５−２６−５９３のアミノ酸配列（配列番号１で示される）または（ｂ）ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号２）と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む請求項３記載の組成物。
【請求項５】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、Kabatによる番号付けで位置６にバリンを含む請求項４記載の組成物。
【請求項６】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、Kabatによる番号付けで位置９９にロイシンを含む請求項４記載の組成物。
【請求項７】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、Kabatによる番号付けで位置３０にリシンを含む請求項４記載の組成物。
【請求項８】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、（ａ）ＤＯＭ１５−２６−５９３のアミノ酸配列（配列番号１で示される）、（ｂ）ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号２で示される）から選択される配列と同一であるアミノ酸配列を含む請求項４記載の組成物。
【請求項９】
ＩＬ−１と結合する前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、（ａ）ＤＯＭ４−１３０−５４のアミノ酸配列（配列番号５で示される）と、または（ｂ）ＤＯＭ０４００ＰＥＧのアミノ酸配列（配列番号４で示される）と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む請求項３記載の組成物。
【請求項１０】
ＩＬ−１と結合する前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、（ａ）ＤＯＭ４−１３０−５４のアミノ酸配列（配列番号５で示される）と、または（ｂ）ＤＯＭ０４００ＰＥＧのアミノ酸配列（配列番号４で示される）と同一であるアミノ酸配列を含む請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
α−ＴＮＦ−αＲ１と結合する前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、Ｄｏｍ  １ｈ−１３１−２０６のアミノ酸配列（配列番号６で示される）と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む請求項３記載の組成物。
【請求項１２】
α−ＴＮＦ−αＲ１と結合する前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、Ｄｏｍ  １ｈ−１３１−２０６のアミノ酸配列（配列番号６で示される）と同一であるアミノ酸配列を含む請求項３記載の組成物。
【請求項１３】
抗体定常領域の一ドメインをさらに含む請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物であって、前記抗体定常領域が抗体Ｆｃ領域である組成物。
【請求項１４】
前記抗体Ｆｃ領域が配列番号３で示されるアミノ酸Ｆｃ配列を有する請求項９記載の組成物。
【請求項１５】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインがＦｃとの融合体として存在し、ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃ融合体のアミノ酸配列（配列番号２で示される）と同一のアミノ酸配列を有する請求項９記載の組成物。
【請求項１６】
硝子体液、眼房水、網膜および脈絡膜から選択される眼領域のうちの１つ以上への送達のための、標的分子と結合する裸の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む組成物。
【請求項１７】
前記標的分子が、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＴＮＦα、ＴＮＦα受容体、ＩＬ−１、α−ＴＮＦ−αＲ１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、Ｎｏｇｏ−ａ、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）およびベータアミロイドから選択される請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインがプロテアーゼに耐性である請求項１６または１７記載の組成物であって、前記プロテアーゼが、眼プロテアーゼ、カスパーゼ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ、ジスインテグリン、メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）およびトロンボスポンジンモチーフを有するＡＤＡＭ、プロテオソーム、組織プラスミノーゲン活性化因子、セクレターゼ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、シスタチンＣ、セリンプロテアーゼＰＲＳＳ１ならびにユビキチンプロテオソーム経路（ＵＰＰ）の群から選択される組成物。
【請求項１９】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、（ａ）ＶＥＧＦと結合し、（ｉ）ＤＯＭ１５−２６−５９３のアミノ酸配列（配列番号１で示される）または（ｉｉ）ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号２で示される）と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメイン；（ｂ）ＩＬ−１と結合し、（ｉ）ＤＯＭ４−１３０−５４のアミノ酸配列（配列番号５で示される）と、または（ｉｉ）ＤＯＭ０４００ＰＥＧのアミノ酸配列（配列番号４で示される）と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメイン；（ｃ）α−ＴＮＦ−αＲ１と結合し、Ｄｏｍ  １ｈ−１３１−２０６のアミノ酸配列（配列番号６で示される）と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインからなる群から選択される請求項１６または１７記載の組成物。
【請求項２０】
網膜、脈絡膜および涙液から選択される眼領域のうちの１つ以上への送達のための、標的分子と結合するフォーマット化免疫グロブリン単一可変ドメインを含む組成物。
【請求項２１】
前記標的分子が、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＴＮＦα、ＴＮＦα受容体、ＩＬ−１、α−ＴＮＦ−αＲ１、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、Ｎｏｇｏ−ａ、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）およびベータアミロイドから選択される請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインがプロテアーゼに耐性である請求項２０または２１記載の組成物であって、前記プロテアーゼが、眼プロテアーゼ、カスパーゼ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ、ジスインテグリン、メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）およびトロンボスポンジンモチーフを有するＡＤＡＭ、プロテオソーム、組織プラスミノーゲン活性化因子、セクレターゼ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、シスタチンＣ、セリンプロテアーゼＰＲＳＳ１ならびにユビキチンプロテオソーム経路（ＵＰＰ）の群から選択される組成物。
【請求項２３】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、（ａ）ＶＥＧＦと結合し、（ｉ）ＤＯＭ１５−２６−５９３のアミノ酸配列（配列番号１で示される）または（ｉｉ）ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号２で示される）と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメイン；（ｂ）ＩＬ−１と結合し、（ｉ）ＤＯＭ４−１３０−５４のアミノ酸配列（配列番号５で示される）と、または（ｉｉ）ＤＯＭ０４００ＰＥＧのアミノ酸配列（配列番号４で示される）と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメイン；（ｃ）α−ＴＮＦ−αＲ１と結合し、Ｄｏｍ  １ｈ−１３１−２０６のアミノ酸配列（配列番号６で示される）と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインからなる群から選択される請求項１６または１７記載の組成物。
【請求項２４】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインが約５０ＫＤａの分子量を有する請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインがＰＥＧ化または抗体Ｆｃとの融合によりフォーマット化される請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
眼浸透増強剤および増粘剤から選択される１つ以上のエンハンサーをさらに含む請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
薬学的または生理学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤をさらに含む請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
眼に直接的に請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組成物を送達する方法であって、点眼液によるような眼への局所送達、または眼内注射、眼周囲投与、あるいは緩徐放出製剤による群から選択される方法により眼に前記組成物を投与することを包含する方法。
【請求項２９】
眼内注射、硝子体内注射、例えば点眼液によるような眼への局所送達、または眼周囲投与による、および緩徐放出製剤からなる群から選択される方法により、眼に直接的に請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組成物を投与することを包含する眼症状を治療し、予防し、または診断するための方法。
【請求項３０】
前記組成物が、眼の表面、涙管、涙腺、眼内領域、前眼房、後眼房および硝子体液の群から選択される眼の１つ以上の領域に投与される請求項２８または２９記載の方法。
【請求項３１】
硝子体液、眼房水、網膜および脈絡膜の群から選択される眼の１つ以上の領域への請求項１６〜１９および２６〜２７のいずれか一項に記載の組成物の送達方法であって、局所的送達により、例えば点眼液を用いることにより、眼に前記組成物を投与することを包含する方法。
【請求項３２】
網膜、脈絡膜および涙液の群から選択される眼の１つ以上の領域への請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の組成物の送達方法であって、局所的送達により、例えば点眼液を用いることにより、眼に前記組成物を投与することを包含する方法。
【請求項３３】
（ａ）請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組成物を（ｂ）薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と混合することを包含する医薬組成物の製造方法。
【請求項３４】
前記医薬組成物が眼の症状または疾患を治療し、予防し、または診断するためのものである請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記眼の症状または疾患が、ＡＭＤ、ブドウ膜炎、緑内障、ドライアイ、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫およびブドウ膜炎の群から選択される請求項３４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｄＡｂ）、例えばプロテアーゼ耐性であるｄＡｂに、さらにまた眼送達のためのこのようなｄＡｂを含む製剤および組成物に、ならびに眼の疾患および症状を治療するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
眼の疾患および症状を治療することの難しさは、眼に治療薬を送達することの非効率性にあった。薬剤が眼に送達される場合、それは、非常にしばしば、眼組織から極端に急速に出て行く。さらに、治療薬が眼に局所的に送達される場合、それらが眼の後部セグメント（網膜、硝子体および脈絡膜）に到達し得ない、という問題があった。それゆえ、多数の後部セグメント眼症状は、静脈内に薬剤を投与することにより、または硝子体内投与により、治療されてきた。これらの疾患、例えばＡＭＤ、緑内障、糖尿病性網膜症の多くは、最適に治療され得ない。したがって、眼送達に適しており、そして眼の疾患および症状を治療するかまたは予防し得るさらなる作用物質を提供する必要がある。
【０００３】
ポリペプチドおよびペプチドは、次第に医療用、治療用および診断用作用物質として用いるための重要な作用物質になってきた。しかしながら、あるin vivo環境、例えば眼において、ならびにある生理学的状態、例えば癌および炎症状態において、組織、器官または動物中に存在するプロテアーゼの量は増大し得る。プロテアーゼのこの増大は、内因性タンパク質の、ならびに疾患を治療するために投与される治療用ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の分解および不活性化を加速し得る。したがって、in vivo使用（例えば、疾患を治療し、診断し、または予防するに際しての使用）への可能性を有するいくつかの作用物質は、それらがプロテアーゼにより迅速に分解され、不活性化されるため、限定された効力を有するに過ぎなかった。
【０００４】
プロテアーゼ耐性ポリペプチドは、いくつかの利点を提供する。例えば、プロテアーゼ耐性ポリペプチドは、プロテアーゼ感受性作用物質より長くin vivoで活性のままであり、したがって、生物学的作用を生じるのに十分な時間の間、依然として機能的である。
【０００５】
ＶＥＧＦは、その一次転写物の代替的スプライシングのために、いくつかの代替形態で存在する分泌型ヘパリン結合性ホモ二量体糖タンパク質である（Leung et al., 1989, Science 246: 1306）。ＶＥＧＦは、炎症における重要な過程である血管漏出を誘導するその能力のため、血管透過性因子（ＶＰＦ）としても知られている。
【０００６】
眼において、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体は、脈絡膜および網膜血管の血管新生をともに刺激し、このような血管の血管透過性を調節することが知られている。これらの特徴はともに、網膜損傷と、結果として起こる視力悪化（多数の網膜炎症性症状、血管障害および黄斑症に起因する）に関与する。ＶＥＧＦ活性またはＶＥＧＦ受容体活性を調節する試みは、動物モデルおよびヒト疾患の両方において、血管透過性を有効に管理することが以前に示されている（Gragoudas et al., 2004: N. Engl. J. Med 351: 2805）。
【０００７】
現在入手可能な治療薬でＶＥＧＦをターゲッティングすることは、全ての患者に有効であるというわけではない。したがって、ＶＥＧＦにより媒介される病理学的状態、例えば血管増殖性疾患（例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ））を治療するための改良された作用物質が必要とされている。
【０００８】
ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α）は、ブドウ膜炎およびＡＭＤのような多数の眼炎症性症状に、ならびに炎症性構成成分が存在する網膜血管障害の発生に関連づけられてきた炎症促進性サイトカインである。加齢性黄斑性疾患に関連する脈絡膜新生血管性病変の発生は、関連炎症構成成分を有することが実証されている。この関連炎症構成成分の有効な管理は、その両方がヒト疾患に影響を及ぼし得る脈絡膜新生血管性病変ならびに血管透過性の発現に直接的に影響することが実証されている。ヒトＡＭＤ患者における近年の証拠は、抗ＴＮＦα治療薬の使用が、抗ＶＥＧＦ治療薬に非応答性である患者における疾患に影響を及ぼし得る、ということを示唆している（Theodossiadis et al., 2009: Am. J. Ophthalmol. 147: 825-830）。
【０００９】
インターロイキン１（ＩＬ−１）は、いくつかの型の細胞に及ぼす生物学的影響を有する免疫応答の重要な媒介物質である。インターロイキン１は、２つの受容体、すなわち、ＩＬ−１の結合時に細胞中にシグナルを伝達するインターロイキン１受容体１型（ＩＬ−１Ｒ１、ＣＤ１２１ａ、ｐ８０）、ならびにＩＬ−１の結合時にシグナルを伝達せず、ＩＬ−１の内因性調節因子として作用するインターロイキン１受容体２型（ＩＬ−１Ｒ１、ＣＤｗ１２１ｂ）と結合する。ＩＬ−１とＩＬ−１Ｒ１との相互作用を調節する別の内因性タンパク質は、インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）である。ＩＬ−１ｒａはＩＬ−１Ｒ１に結合するが、しかしシグナルを伝達するためにＩＬ−１Ｒ１を活性化することはない。
【００１０】
ＩＬ−１（例えば、ＩＬ−１αまたはＩＬ−１β）の結合時にＩＬ−１Ｒ１を介して伝達されるシグナルは、病原性であり得る広範囲の生物学的活性を誘導する。例えば、ＩＬ−１の結合時にＩＬ−１Ｒ１を介して伝達されるシグナルは、局所性または全身性炎症を、ならびに付加的炎症媒介物質（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ）の生成（ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）を引き起こし得る。したがって、ＩＬ−１とＩＬ−１Ｒ１との相互作用は、眼疾患の病因に関連づけられてきた。
【００１１】
インターロイキン１受容体１型（ＩＬ−１Ｒ１）に結合し、その活性を中和するある作用物質（例えばＩＬ−１ｒａ）は、ある炎症性症状のための有効な治療薬であることが立証されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Leung et al., 1989, Science 246: 1306
【非特許文献２】Gragoudas et al., 2004: N. Engl. J. Med 351: 2805
【非特許文献３】Theodossiadis et al., 2009: Am. J. Ophthalmol. 147: 825-830
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
第一の態様に於いて、本発明は、眼への投与のための、例えば送達部位で所望の標的分子（例えば、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−α）と結合し得る免疫グロブリン単一可変ドメイン（またはｄＡｂ）を含むかまたはそれからなる組成物を提供する。
【００１４】
本発明は、眼の疾患または症状、例えば加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、ブドウ膜炎、緑内障、ドライアイ、糖尿病性網膜症および糖尿病性浮腫を治療し、予防し、または診断するために用いるための、所望の標的分子（例えば、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−α、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＩＬ−１ｒ）と結合し得る免疫グロブリン単一可変ドメイン（またはｄＡｂ）を含むかまたはそれからなる組成物も提供する。
【００１５】
一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、プロテアーゼ耐性であり得る、例えば、以下のうちの１つ以上に対して耐性であり得る：セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ）、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、トロンビン、プラスミン、カテプシン（例えばカテプシンＧ）、プロテイナーゼ（例えば、プロテイナーゼ１、プロテイナーゼ２、プロテイナーゼ３）、サーモリシン、キモシン、エンテロペプチダーゼ、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ９、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３）、カルパイン、フィカイン、クロストリパイン、アクチニダイン、ブロメラインおよびセパラーゼ。特定の実施形態では、プロテアーゼはトリプシン、エラスターゼまたはロイコザイムである。このようなプロテアーゼ耐性ポリペプチドは、眼のようなin vivoでプロテアーゼに富む環境への送達に特に適している。プロテアーゼは、生物学的抽出物、生物学的ホモジネートまたは生物学的調製物によっても提供され得る。一実施形態では、プロテアーゼは、眼および／または涙中に見出されるものである。眼中に見出されるこのようなプロテアーゼの例としては、カスパーゼ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ、ジスインテグリン、メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）およびトロンボスポンジンモチーフを有するＡＤＡＭ、プロテオソーム、組織プラスミノーゲン活性化因子、セクレターゼ、カテプシンＢおよびＤ、シスタチンＣ、セリンプロテアーゼＰＲＳＳ１、ユビキチンプロテオソーム経路（ＵＰＰ）が挙げられる。一実施形態では、プロテアーゼは非細菌プロテアーゼである。一実施形態では、プロテアーゼは、動物、例えば哺乳動物、例えばヒトのプロテアーゼである。
【００１６】
組成物は、眼の異なる領域に、例えば眼の表面、角膜、もしくは涙管または涙腺に送達され得るし、あるいは眼内送達（例えば、硝子体液のような眼の前または後眼房への）ならびに虹彩、毛様体、涙腺のような眼構造への送達が存在し得る。そして組成物は、眼のこれらの部分で標的分子（例えば、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−α）と結合し得る。組成物は、眼周囲領域へも送達され得る。
【００１７】
標的分子は、例えばＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−αであり得るし、あるいはそれは、任意の他の所望の標的、例えば眼に、例えば眼の表面に、眼の中に、あるいは涙管または涙腺中に存在する標的分子であり、例えば標的は、ＩＬ−１、ＩＬ−１７またはＴＮＦ受容体、例えばＴＮＦＲ１、ＴＧＦβ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＣＤ２０、Ｎｏｇｏ−ａ、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）またはベータアミロイドであり得る。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、例えば点眼液の形態で、またはゲルとして、または例えば埋込み物中で、眼への投与のためのプロテアーゼ耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン（またはｄＡｂ）を提供する。ｄＡｂは、例えば眼中に存在する標的分子、例えばＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−αと結合し得る。
【００１９】
眼への投与は、例えば、点眼液の形態で、局所投与により得る；代替的には、それは眼への注射により得る。
【００２０】
眼の表面、もしくは涙管または涙腺のような眼の特定領域中への免疫グロブリン単一可変ドメインの送達を標的にすることは有用であり得るし、あるいは眼内送達（例えば、硝子体液のような眼の前または後眼房への）が存在し得る。それゆえ、本発明は、眼に直接的に組成物を送達する方法であって、眼内注射、局所送達、点眼、眼周囲投与、ならびに緩徐放出製剤（例えば、高分子ナノまたはマイクロ粒子あるいはゲル）の使用から選択される方法により、もしくはイオン泳動を使用する送達デバイスを用いることにより、眼に前記組成物を投与することを包含する方法をさらに提供する。
【００２１】
例えば局所送達により、例えば点眼液として、眼浸透増強剤、例えばカプリン酸ナトリウムとともに、または増粘剤、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）とともに、免疫グロブリン単一可変ドメインが眼に送達される場合も、有用であり得る。したがって、本発明は、例えば、眼への局所的送達のための、（ａ）例えば眼中の標的分子（例えばＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−α）と結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン、さらにまた（ｂ）眼浸透増強剤、および／または（ｃ）増粘剤を含む組成物をさらに提供する。
【００２２】
一態様では、眼に送達されるべき免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＶＥＧＦと結合する、ＷＯ２００８／１４９１４６、ＷＯ２００８１４９１４７またはＷＯ２００８１４９１５０に開示されたＶＥＧＦ  ｄＡｂのうちのいずれかであり得る。例えばそれは、ＤＯＭ１５−２６−５９３のアミノ酸配列（図１ａ：配列番号１で示される）と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列によりコードされるポリペプチドであり得る。一実施形態では、同一性パーセントは、少なくとも７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％または１００％である。一実施形態では、プロテアーゼ耐性ポリペプチドは、プロテアーゼ耐性ポリペプチドを単離するための本明細書中に記載される方法により得られる。眼への送達のためのＤＯＭ１５−２６−５９３は、さらに、抗体定常領域のドメインも含み得る。例えばそれは、ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃ融合物のアミノ酸配列（図１ｂ：配列番号２で示される）と同一のアミノ酸配列を有し得るし、あるいは同一性パーセントは、図１ｂに示される配列番号２と少なくとも７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％であり得る。
【００２３】
一態様では、ＤＯＭ１５−２６−５９３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列により（例えば、９７％またはそれ以上同一であるものにより）コードされるＶＥＧＦ  ｄＡｂは、ＷＯ２００８１４９１５０およびＷＯ２００８１４９１４７（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されたように、位置６（Kabat番号付け）にバリン、および／または位置９９にロイシン、および／または位置３０にリシンを含み得る。
【００２４】
さらなる一態様では、眼に送達されるべき免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＷＯ２００８／１４９１４４またはＷＯ２００８／１４９１４８に開示された抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂのいずれかであり得る。
【００２５】
一実施形態では、α−ＴＮＦ−αＲ１と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、Ｄｏｍ  １ｈ−１３１−２０６のアミノ酸配列（図４：配列番号６で示される）と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含み得る。Ｄｏｍ  １ｈ−１３１−２０６の調製および選択は、ＷＯ２００８１４９１４８に開示されている。
【００２６】
さらなる一態様では、眼に送達されるべき免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＷＯ２００８／１４９１４９に開示された抗ＩＬ−１Ｒ１  ｄＡｂのいずれかであり得る。
【００２７】
一実施形態では、ＩＬ−１と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、（ａ）ＤＯＭ４−１３０−５４のアミノ酸配列（図３：配列番号５で示される）と、または（ｂ）ＤＯＭ０４００ＰＥＧのアミノ酸配列（図２：配列番号４で示される）と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含み得る。
【００２８】
ＤＯＭ  ４−１３０−５４の調製および選択は、ＷＯ２００７０６３３１１に、そしてＷＯ２００８１４９１４９にも記載されている。Ｄｏｍ  ０４００を調製するために、ＤＯＭ  ４−１３０−５４  ｄＡｂ配列が取り上げられ、位置８０のシステインをＤＯＭ  ４−１３０−５４中に存在するプロリンに取り替えるよう、突然変異化され、このｄＡｂは次に、ｄＡｂの位置８０での遊離システインとの標準マレイミドカップリングにより、４０ＫＤａ線状ＰＥＧ分子（NOF Corporation, Europeから得られる）に付着される。
【００２９】
本発明は、眼の症状または疾患の治療、予防または診断のための薬剤の製造における免疫グロブリン単一可変ドメインを含むかまたはそれからなる組成物のいずれかの使用も提供するが、例えばこの場合、上記眼疾患は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、ブドウ膜炎、緑内障、ドライアイ、糖尿病性網膜症または糖尿病性浮腫である。
【００３０】
本発明は、眼の症状または疾患、例えばＡＭＤ、ブドウ膜炎、緑内障、ドライアイ、糖尿病性網膜症または糖尿病性浮腫の治療、予防または診断に用いるための、免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−α  ｄＡｂを含むかまたはそれからなる組成物も提供する。
【００３１】
代替的一実施形態では、眼への送達のための免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＤＯＭ１５−２６−５９３のアミノ酸配列（図１ａ：配列番号１で示される）でないか、またはＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃ融合物のアミノ酸配列（図１ｂ：配列番号２で示される）でないものであり得る。
【００３２】
別の代替的実施形態では、眼への送達のための免疫グロブリン単一可変ドメインは、以下の出願に開示された分子のいずれかを含むかまたはそれからなる分子でないものであり得る：ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０３９９、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０４００、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０４０６、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０４０５、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０４０３、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０４０４、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０４０７。
【００３３】
別の代替的実施形態では、眼への送達のための免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０４００に開示されたようなＤｏｍ１ｈ−１３１−５１１、Ｄｏｍ１ｈ−１３１−２０１、Ｄｏｍ１ｈ−１３１−２０２、Ｄｏｍ１ｈ−１３１−２０３、Ｄｏｍ１ｈ−１３１−２０４、Ｄｏｍ１ｈ−１３１−２０５のアミノ酸配列でないものであり得る。
【００３４】
別の代替的実施形態では、眼への送達のための免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０４０６に開示されたようなＤｏｍ４−１３０−２０２のアミノ酸配列でないものであり得る。
【００３５】
別の代替的実施形態では、眼への送達のための免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０４０５に開示されたようなＤｏｍ１ｈ−１３１−２０６のアミノ酸配列でないものであり得る。
【００３６】
免疫グロブリン単一可変ドメインと組合せて、または関連して、眼にその他の作用物質を送達することも有用である。例えば、浸透増強剤、例えばカプリン酸ナトリウム、または粘性作用物質、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）を送達することは有用であり得る。
【００３７】
眼送達のための単一免疫グロブリン可変ドメイン（ｄＡｂ）（例えば、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−αと結合する）は、例えば、ＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体またはその少なくともトランスフェリン結合部分、抗体Ｆｃ領域の付着により、あるいは抗体ドメインとの接合により、より大きな水力学的サイズを有するようフォーマット化され得る。例えば、ｄＡｂモノマー（例えば、ＶＥＧＦ  ｄＡｂ）は、抗体のより大きな抗原結合断片としてフォーマット化され得る（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ＩｇＧ、ｓｃＦｖとしてフォーマット化される）。ｄＡｂの水力学的サイズおよびその血清半減期は、本明細書中に記載されるように、in vivoで半減期を増大する抗原またはエピトープに結合する結合ドメイン（例えば、抗体または抗体断片）にそれを接合するかまたは連結することによっても増大され得る（ＷＯ２００６０３８０２７（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）の付録１参照）。例えば、ＶＥＧＦ  ｄＡｂは、抗血清アルブミンまたは抗新生児Ｆｃ受容体抗体または抗体断片、例えば抗ＳＡまたは抗新生児Ｆｃ受容体ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはｓｃＦｖに、あるいは抗ＳＡアフィボディまたは抗新生児Ｆｃ受容体アフィボディに接合されるかまたは連結され得る。
【００３８】
例えばＶＥＧＦ結合ｄＡｂと連結される、本明細書中に記載される組成物中に用いるための適切なアルブミン、アルブミン断片またはアルブミン変異体の例は、ＷＯ  ２００５／０７７０４２Ａ２およびＷＯ２００６０３８０２７（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
【００３９】
フォーマット化ｄＡｂ（例えば、ＰＥＧ化によりフォーマットされるｄＡｂ）は、例えば３０ＫＤａ〜１００ＫＤａ、例えば約５０〜６０ＫＤａである分子量を有し得るし、網膜および／または脈絡膜および／または涙液への送達のために有用であり得る。
【００４０】
約１５ＫＤａの分子量を有する裸（非フォーマット化）ｄＡｂは、硝子体液および／または眼房水および／または網膜および／または脈絡膜への送達のために有用であり得る。
【００４１】
この開示全体を通して記載される本発明の他の実施形態では、本発明のアンタゴニストまたはリガンドにおいて単一免疫グロブリン可変ドメインまたは「ｄＡｂ」を用いる代わりに、例えばＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−αに結合するｄＡｂのＣＤＲ（例えば、適切なタンパク質足場または骨格、例えばアフィボディ、ＳｐＡ足場、ＬＤＬ受容体クラスＡドメインまたはＥＧＦドメイン上にグラフトされるＣＤＲ）を含むか、あるいはＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−αに関する結合部位を含むタンパク質ドメインであり得る（この場合、ドメインは、アフィボディ、ＳｐＡドメイン、ＬＤＬ受容体クラスＡドメインまたはＥＧＦドメインから選択される）ドメインを当業者は用い得ることが意図される。したがって、全体としての開示は、アンタゴニスト、リガンド、ならびにｄＡｂの代わりにこのようなドメインを用いる方法の開示を提供するよう理解されるべきである。
【００４２】
本明細書中に記載されるプロテアーゼ耐性ｄＡｂは、ＷＯ２００８１４９１４３（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載された方法および教示を用いて選択され得る。
【００４３】
一態様では、本発明は、例えばＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−α結合部位を含むプロテアーゼ耐性免疫グロブリン単一可変ドメインであって、
（ｉ）３７℃で少なくとも１時間（ｔ）、少なくとも１０μｇ／ｍｌの濃度（ｃ）のプロテアーゼ；あるいは
（ｉｉ）３０℃で少なくとも１時間（ｔ）、少なくとも４０μｇ／ｍｌの濃度（ｃ’）のプロテアーゼ
とともにインキュベートされた場合にプロテアーゼに対して耐性である上記可変ドメインを提供する。一実施形態では、プロテアーゼ、例えばトリプシンの、可変ドメインに対する比（モル／モルに基づいて）は、８，０００対８０，０００  プロテアーゼ：可変ドメインであり、例えばＣが１０μｇ／ｍｌである場合、比は８００対８０，０００  プロテアーゼ：可変ドメインであり；あるいはＣまたはＣ’が１００μｇ／ｍｌである場合、比は８，０００対８０，０００  プロテアーゼ：可変ドメインである。一実施形態では、プロテアーゼ（例えばトリプシン）の可変ドメインに対する比（重量／重量、例えばμｇ／μｇに基づいて）は、１６，０００対１６０，０００  プロテアーゼ：可変ドメインであり、例えばＣが１０μｇ／ｍｌである場合、比は１，６００対１６０，０００  プロテアーゼ：可変ドメインであり；あるいはＣまたはＣ’が１００μｇ／ｍｌである場合、比は１６，０００対１６０，０００  プロテアーゼ：可変ドメインである。一実施形態では、濃度（ｃまたはｃ’）は、少なくとも１００または１０００μｇ／ｍｌ  プロテアーゼである。ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーまたはライブラリーを用いて作業する場合（例えばｗ／ｗパラメーター）、用いるのに適したプロテアーゼのタンパク質分解活性の条件については、本明細書中の記述を参照されたい。これらの条件は、特定の免疫グロブリン単一可変ドメインのプロテアーゼ耐性を確定するための条件に用いられ得る。一実施形態では、時間（ｔ）は、１、３または２４時間あるいは一晩（例えば約１２〜１６時間）であるかまたはそれらのおよその値である。一実施形態では、可変ドメインは条件（ｉ）下で耐性であり、濃度（ｃ）は１０または１００μｇ／ｍｌまたはそれらのおよその値のプロテアーゼであり、時間（ｔ）は１時間である。一実施形態では、可変ドメインは条件（ｉｉ）下で耐性であり、濃度（ｃ’）は４０μｇ／ｍｌまたはそのおよその値のプロテアーゼであり、時間（ｔ）は３時間または約３時間である。一実施形態では、プロテアーゼは、トリプシン、エラスターゼ、ロイコザイムおよびパンクレアチンから選択される。一実施形態では、プロテアーゼはトリプシンである。一実施形態では、プロテアーゼは、痰、粘液（例えば、胃粘液、鼻粘液、気管支粘液）、気管支肺胞洗浄液、肺ホモジネート、肺抽出物、膵臓抽出物、胃液、唾液または涙液あるいは眼において見出されるプロテアーゼである。一実施形態では、プロテアーゼは眼および／または涙液中に見出されるものである。一実施形態では、プロテアーゼは非細菌プロテアーゼである。一実施形態では、プロテアーゼは動物、例えば哺乳動物、例えばヒトプロテアーゼである。
【００４４】
一実施形態では、可変ドメインは、トリプシン、および／またはエラスターゼ、ロイコザイムおよびパンクレアチンから選択される少なくとも１つの他のプロテアーゼに対して耐性である。例えば、耐性は、トリプシンおよびエラスターゼ；トリプシンおよびロイコザイム；トリプシンおよびパンクレアチン；トリプシン、エラスターゼおよびロイコザイム；トリプシン、エラスターゼおよびパンクレアチン；トリプシン、エラスターゼ、パンクレアチンおよびロイコザイム；あるいはトリプシン、パンクレアチンおよびロイコザイムに対してである。
【００４５】
一実施形態では、条件（ｉ）または（ｉｉ）下で、例えば１０６〜１０１３、例えば１０８〜１０１２複製単位のファージライブラリーサイズ（感染性ビリオン）でインキュベートされる場合、可変ドメインはバクテリオファージ上に提示される。
【００４６】
一実施形態では、ＢｉａＣｏｒｅ  （商標）またはＥＬＩＳＡ、例えばファージＥＬＩＳＡまたはモノクローナルファージＥＬＩＳＡを用いて査定される条件（ｉ）または（ｉｉ）下でのインキュベーション後、可変ドメインはＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−αに特異的に結合する。
【００４７】
一実施形態では、可変ドメインは、プロテインＡまたはプロテインＬに特異的に結合する。一実施形態では、プロテインＡまたはＬとの特異的結合は、条件（ｉ）または（ｉｉ）下でのインキュベーション後に存在する。
【００４８】
一実施形態では、可変ドメインは、例えば条件（ｉ）または（ｉｉ）下でのインキュベーション後、少なくとも０．４０４のＥＬＩＳＡ（例えば、ファージＥＬＩＳＡまたはモノクローナルファージＥＬＩＳＡ）でのＯＤ４５０読取値を有し得る。
【００４９】
一実施形態では、可変ドメインは、例えば条件（ｉ）または（ｉｉ）下でのインキュベーション後に、ゲル電気泳動において（実質的に）単一の帯域を表示する。
【００５０】
別の実施形態では、作用物質（ｄＡｂ）は、埋め込み可能な送達デバイスを介して眼に局所的に投与され得る。したがって、一実施形態では、本発明は、眼送達のための、例えばＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−α  ｄＡｂを含有する埋め込み可能な送達デバイスを提供する。
【００５１】
さらなる態様において、本発明は、眼送達のための免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えばＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−α  ｄＡｂ）ならびに薬学的または生理学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１ａは、ＤＯＭ１５−２６−５９３のアミノ酸配列を示す図である。図１ｂは、ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃ融合物のアミノ酸配列を示す図である。図１ｃは、抗体Ｆｃのアミノ酸配列を示す図である。
【図２】ＤＯＭ  ０４００ＰＥＧ（ＰＥＧ化抗ＩＬ１  ｄＡｂ、分子量約５２ＫＤａ）のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】ＤＯＭ４−１３０−５４（抗ＩＬ１  ｄＡｂ）のアミノ酸配列を示す図である。
【図４】Ｄｏｍ  １ｈ−１３１−２０６（抗ＴＮＦαＲ１  ｄＡｂ）のアミノ酸配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
この明細書中で、明瞭且つ簡潔な明細書を書き表すよう、実施形態を参照しながら本発明を記載している。実施形態は、本発明を逸脱しない限り、種々に組合され、または切り離され得るよう意図されるし、そのように理解されるべきである。
【００５４】
別記しない限り、本明細書中で用いられる技術および科学用語は全て、当該技術分野（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学）の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。分子的、遺伝学的および生化学的方法（一般的に、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor , N.Y.およびAusubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 第4版, John Wiley & Sons, Inc.参照）（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）ならびに化学的方法のための標準技法が用いられる。
【００５５】
本明細書中で用いる場合、「血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のアンタゴニスト」または「抗ＶＥＧＦアンタゴニスト」等という用語は、ＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦの（すなわち１つ以上の）機能を抑制し得る作用物質（例えば分子、化合物）を指す。
【００５６】
本明細書中で用いる場合、「ペプチド」は、ペプチド結合を介して一緒に繋がれる約２〜約５０アミノ酸を指す。
【００５７】
本明細書中で用いる場合、「ポリペプチド」は、ペプチド結合により一緒に繋がれる少なくとも約５０アミノ酸を指す。ポリペプチドは一般的に、三次構造を含み、機能的ドメインに折りたたまれる。
【００５８】
本明細書中で用いる場合、「プロテアーゼ分解に対して耐性」であるペプチドまたはポリペプチド（例えば、ドメイン抗体（ｄＡｂ））は、プロテアーゼ活性に適した条件下でプロテアーゼとともにインキュベートされる場合、プロテアーゼにより実質的に分解されない。プロテアーゼ活性に適した温度で、例えば３７または５０℃で、約１時間、プロテアーゼとともにインキュベート後に、プロテアーゼにより約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１４％以下、約１３％以下、約１２％以下、約１１％以下、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下のタンパク質のタンパク質が分解されるか、または実質的に全くタンパク質が分解されない場合、ポリペプチド（例えばｄＡｂ）は実質的に分解されない。タンパク質分解は、本明細書中に記載されるような任意の適切な方法を用いて、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、または機能性検定（例えばリガンド結合）により査定され得る。
【００５９】
本明細書中で用いる場合、「標的リガンド」は、ポリペプチドまたはペプチドにより特異的にまたは選択的に結合されるリガンドを指す。例えば、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合断片である場合、標的リガンドは任意の所望の抗原またはエピトープであり得る。標的抗原との結合は、機能性であるポリペプチドまたはペプチドに左右される。
【００６０】
本明細書中で用いる場合、抗体は、天然に抗体を産生する任意の種に由来するにせよ、または組換えＤＮＡ技術により作製されるにせよ；血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母または細菌から単離されるにせよ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥあるいは断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、閉構造多特性抗体、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、ジアボディ）を指す。
【００６１】
本明細書中で用いる場合、「抗体フォーマット」は、その構造上に抗原に対する結合特異性を付与するために１つ以上の抗体可変ドメインが組み入れられ得る任意の適切なポリペプチド構造を指す。種々の適切な抗体フォーマット、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または抗体軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、前記のいずれかの抗原結合断片（例えば、Ｆｖ断片（例えば一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片）、単一抗体可変ドメイン（例えば、ｄＡｂ、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）、ならびに前記のいずれかの修飾バージョン（例えば、ポリエチレングリコールまたは他の適切なポリマーの共有的結合により修飾されたもの、あるいはヒト化ＶＨＨ）が、当該技術分野で知られている。
【００６２】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という語句は、他のＶ領域またはドメインとは関係なく、一抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の可変領域または可変ドメインを有するフォーマット（例えば、ホモ−またはへテロ−多量体）中に存在し得るが、この場合、他の領域またはドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合のために必要でない（すなわち、この場合、免疫グロブリン単一可変ドメインは、付加的可変ドメインとは関係なく、抗原に結合する）。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、当該用語を本明細書中で用いる場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。「単一免疫グロブリン可変ドメイン」は、当該用語を本明細書中で用いる場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同一である。「単一抗体可変ドメイン」は、当該用語を本明細書中で用いる場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同一である。免疫グロブリン単一可変ドメインは、一実施形態では、ヒト抗体可変ドメインであるが、しかし、齧歯類（例えば、ＷＯ  ００／２９００４（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に開示）、テンジクザメおよびラクダ類ＶＨＨｄＡｂのような他の種からの単一抗体可変ドメインも含む。ラクダ類ＶＨＨは、軽鎖を天然に欠く重鎖抗体を産生する、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコを含めた種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。ＶＨＨは、ヒト化され得る。
【００６３】
「ドメイン」は、タンパク質の残部とは無関係な三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造である。一般的に、ドメインはタンパク質の別個の機能的特性の元をなし、多くの場合、残りのタンパク質および／またはドメインの機能の損失を伴わずに、他のタンパク質に付加され、除去され、または運ばれ得る。「単一抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折り畳まれたポリペプチドドメインである。したがって、それは、完全抗体可変ドメインおよび修飾可変ドメイン（例えば、１つ以上のループが、抗体可変ドメインに特徴的でない配列により取り替えられる）、あるいは切断されているかまたはＮ−またはＣ−末端伸張を含む抗体可変ドメイン、ならびに全長ドメインの少なくとも結合活性および特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれた断片を包含する。
【００６４】
本明細書中で用いる場合、「用量」は、全てを一度に（単位用量）、または限定時間に亘って２回以上投与で、被験者に投与されるリガンドの量を指す。例えば、用量は、１日（２４時間）（一日量）、２日、１週間、２週間、３週間、または１ヶ月以上の経過中に被験者に（例えば、１回投与により、または２回以上の投与により）投与されるリガンド（例えば、標的抗原に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むリガンド）の量を示し得る。投与間の間隔は、任意の所望量の時間であり得る。
【００６５】
「半減期」という語句は、例えば、自然の機序によるリガンドの分解および／またはリガンドのクリアランスまたは隔離のため、in vivoで５０％低減するためにリガンド（例えば、ｄＡｂ、ポリペプチドまたはアンタゴニスト）の血清濃度に関して要する時間を指す。本発明のリガンドは、in vivoで安定化され得るし、それらの半減期は、分解および／またはクリアランスまたは隔離を阻止する分子との結合により、増大され得る。典型的には、このような分子は、それ自体、in vivoで長い半減期を有する天然タンパク質である。リガンドの半減期は、その機能的活性が、半減期増大分子に特異的でない類似のリガンドより長い期間、in vivoで存続する場合に増大する。例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に特異的なリガンドおよび標的分子は同一リガンドと比較され、この場合、ＨＳＡに対する特異性は存在せず、すなわち、ＨＳＡに結合しないが、しかし別の分子に結合する。例えば、それは、細胞上の第三の標的に結合し得る。典型的には、半減期は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上増大される。半減期の２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍またはそれ以上の範囲の増大が可能である。代替的には、あるいはさらに、半減期の３０倍まで、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍の範囲の増大が考えられ得る。
【００６６】
本明細書中で用いる場合、「水力学的サイズ」は、水溶液を通した分子の拡散に基づいた分子（例えば、タンパク質分子、リガンド）の見掛けのサイズを指す。溶液を通してのタンパク質の拡散または動きは、タンパク質の見掛けのサイズを誘導するよう処理され得るが、この場合、サイズは、タンパク質粒子の「ストークス半径」または「水力学的半径」により示される。タンパク質の「水力学的サイズ」は、質量および形状（立体配座）の両方によっており、したがって、同一分子量を有する２つのタンパク質は、タンパク質の全体的立体配座に基づいて種々の水力学的サイズを有し得る。
【００６７】
本明細書中で言及される場合、「競合する」という用語は、第一標的とその同種標的結合ドメインとの結合が、上記同種標的に特異的である第二結合ドメインの存在下で抑制される、ということを意味する。例えば、結合は、標的に対するその親和性または結合力が低減されるよう、結合ドメインの物理的遮断により、あるいは結合ドメインの構造または環境の変更により、立体的に抑制され得る。第一および第二結合ドメイン間の競合を確定するために競合ＥＬＩＳＡおよび競合ＢｉａＣｏｒｅ実験を実施する方法の詳細に関しては、ＷＯ２００６０３８０２７を参照されたい。
【００６８】
２つの配列間の「相同性」または「同一性」または「類似性」（これらの用語は、本明細書中では互換的に用いられる）の算定は、以下のように実施される。配列は、最適比較目的のために整列される（例えば、最適アラインメントのためにギャップが第一および第二アミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入され、非相同配列が比較目的に関して無視され得る）。一実施形態では、比較目的のために整列される参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが、次に比較される。第一の配列中の位置は、第二配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められている場合には、分子はその位置で同一である（本明細書中で用いる場合、アミノ酸または核酸「相同性」はアミノ酸または核酸「同一性」と等価である）。２つの配列間の同一性パーセントは、（２つの配列の最適アラインメントのために導入される必要がある）ギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、配列が共有する同一位置の数の一関数である。本明細書中で定義されるようなアミノ酸およびヌクレオチド配列アラインメント、ならびに相同性、類似性または同一性は、デフォルトパラメーターを用いて、アルゴリズムＢＬＡＳＴ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓを用いて、調製され、確定され得る（Tatusova, T.A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174: 187-188 (1999)）。
【００６９】
プロテアーゼ耐性：
本発明は、一実施形態において、眼への送達のためのｄＡｂ、例えば抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂ、ＴＮＦＲ１  ｄＡｂ、ＩＬ−１  ｄＡｂに関するが、これらは、所望の生物学的活性、例えばＶＥＧＦ、ＴＮＦＲ１またはＩＬ−１との結合を有するプロテアーゼ耐性ｄＡｂに関する選択方法により選択されている。プロテアーゼ分解に対して高度に安定で且つ耐性であり、そして所望の生物学的活性を有するポリペプチドを選択するための効率的プロセスを生じるための方法に、２つの選択的圧力が用いられる。本明細書中で用いる場合、プロテアーゼ耐性ペプチドおよびポリペプチドは、一般的に、生物学的活性を保持する。これに対比して、プロテアーゼ感受性ペプチドおよびポリペプチドは、本明細書中に記載される方法において、プロテアーゼにより切断されるかまたは消化され、したがって、それらの生物学的活性を失う。したがって、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドは、一般的に、それらの生物学的活性、例えば結合活性に基づいて選択される。
【００７０】
眼環境は、プロテアーゼに富むものであり、それゆえ、本明細書中に記載されるような眼送達のためのプロテアーゼ耐性ｄＡｂの使用は、いくつかの利点を提供する。例えば、あるプロテアーゼ（例えばトリプシン）によるタンパク質分解に対する耐性に関して選択される可変ドメインは、他のプロテアーゼ（例えばエラスターゼ、ロイコザイム）による分解に対しても耐性である。プロテアーゼ耐性は、ペプチドまたはポリペプチドの高い融点（Ｔｍ）と相関し得る。融点が高いほど、より安定な可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチドおよびポリペプチドであることを示す。プロテアーゼ分解に対する耐性は、標的リガンドに対する高親和性結合とも相関する。したがって、本明細書中で記載され、参照される方法（ＷＯ２００８１４９１４３）は、所望の生物学的活性を有し、そして、それらがプロテアーゼ耐性および安定性であるためin vivoでの治療的および／または診断的眼使用に十分に適しているｄＡｂを選択し、単離し、および／または回収するための効率的な方法を提供する。一実施形態では、プロテアーゼ耐性は、例えば、プロテアーゼ耐性でない可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチドまたはポリペプチドより上回って改良された改良型ＰＫと相関し得る。改良型ＰＫは、改良型ＡＵＣ（曲線下面積）および／または改良型半減期であり得る。プロテアーゼ耐性は、例えば、プロテアーゼ耐性でない可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチドまたはポリペプチドより上回って改良された、剪断および／または熱応力、および／または噴霧化中の凝集傾向低減に対する可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチドまたはポリペプチドの改良型安定性とも相関し得る。一実施形態では、プロテアーゼ耐性は、例えば、プロテアーゼ耐性でない可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチドまたはポリペプチドより上回って改良された改良型貯蔵安定性と相関する。一態様では、利点のうちの１つ、２つ、３つ、４つまたは全てが提供され、利点はプロテアーゼ分解に対する耐性、高Ｔｍならびに標的リガンドとの高親和性結合である。
【００７１】
本明細書中で記載され、参照される方法（ＷＯ２００８１４９１４３）は、所望によりその他の適切な選択方法を含み得る、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチド、例えばｄＡｂを単離するためのプログラムの一部として用いられ得る。これらの状況では、本明細書中に記載される方法は、プログラムの任意の所望の時点で、例えば他の選択方法が用いられる前または後に用いられ得る。
【００７２】
ある実施形態では、眼送達のためのｄＡｂは、トリプシン、エラスターゼまたはロイコザイムによる分解に対する耐性に関して選択され、ＶＥＧＦに特異的に結合する。これらの実施形態では、ｄＡｂを含むライブラリーまたはレパートリーが提供され、タンパク質分解性消化に適した条件下で、トリプシン、エラスターゼまたはロイコザイム（またはトリプシンを含む生物学的調製物、抽出物またはホモジネート）と組合される。ＶＥＧＦに結合する、トリプシン、エラスターゼまたはロイコザイム耐性ｄＡｂが選択される。例えば、プロテアーゼ耐性ｄＡｂは、少なくとも約２時間の期間中、プロテアーゼの０．０４％（ｗ／ｗ）溶液中で３７℃でインキュベートされる場合、実質的に分解されない。別の例では、プロテアーゼ耐性ｄＡｂは、少なくとも約３時間の期間中、プロテアーゼの０．０４％（ｗ／ｗ）溶液中で３７℃でインキュベートされる場合、実質的に分解されない。別の例では、プロテアーゼ耐性ｄＡｂは、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間または少なくとも約１２時間の期間中、プロテアーゼの０．０４％（ｗ／ｗ）溶液中で３７℃でインキュベートされる場合、実質的に分解されない。
【００７３】
別の態様では、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチド（例えば、ｄＡｂ）のレパートリーの産生方法が提供される。この方法は、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを提供すること；プロテアーゼ活性に適した条件下でペプチドまたはポリペプチドのレパートリーとプロテアーゼを組合せること；そしてＶＥＧＦに特異的に結合する複数のペプチドまたはポリペプチドを回収し、それによりプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーが産生されることを包含する。本方法で用いるのに適しているプロテアーゼ、表示系、プロテアーゼ活性のための条件、ならびにペプチドまたはポリペプチドの選択方法は、他の方法と関連して本明細書中に記載される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含む表示系（例えば、核酸のコード機能と核酸によりコードされるペプチドまたはポリペプチドの機能的特徴を連結する表示系）が用いられ、そして当該方法はさらに、複数の選択ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸のコピー数を増幅するかまたは増大することを包含する。核酸は、任意の適切な方法を用いて、例えばファージ増幅、細胞増殖またはポリメラーゼ連鎖反応により増幅され得る。
【００７５】
特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂを含むプロテアーゼ耐性ポリペプチドのレパートリーの産生方法が提供される。この方法は、抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂを含むポリペプチドのレパートリーを提供すること；プロテアーゼ活性に適した条件下でペプチドまたはポリペプチドのレパートリーとプロテアーゼ（例えば、トリプシン、エラスターゼ、ロイコザイム）を組合せること；そしてＶＥＧＦに対する結合特異性を有するｄＡｂを含む複数のポリペプチドを回収することを包含する。この方法を用いて、ナイーブレパートリー、あるいは所望の結合特異性に偏向されるレパートリー、例えばＶＥＧＦに対する結合特異性を有する親ｄＡｂを基礎にした親和性成熟レパートリーを産生し得る。
【００７６】
選択／単離／回収
プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチド（例えば、プロテアーゼ耐性ポリペプチドの集団）は、任意の適切な方法を用いて、レパートリーまたはライブラリー（例えば、表示系における）から選択され、単離され、および／または回収され得る。一実施形態では、プロテアーゼ耐性ポリペプチドは、選択可能な特徴（例えば、物理的特徴、化学的特徴、機能的特徴）に基づいて、選択されるかまたは単離される。適切な選択可能な機能的特徴としては、レパートリー中のペプチドまたはポリペプチドの生物学的活性、例えば一般的リガンド（例えば、超抗原）との結合、標的リガンド（例えば、抗原、エピトープ、基質）との結合、抗体との結合（例えば、ペプチドまたはポリペプチド上に発現されるエピトープを介して）、および触媒活性が挙げられる（例えば、Tomlinson et al.、ＷＯ９９／２０７４９；ＷＯ０１／５７０６５；ＷＯ９９／５８６５５参照）。一実施形態では、選択は、ＶＥＧＦとの特異的結合に基づいている。別の実施形態では、選択は、成員がプロテアーゼ耐性である第二レパートリーを産生し、その後、ＶＥＧＦに特異的に結合する第二レパートリーから成員を選択するよう選択された機能的特徴に基づいている。
【００７７】
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドは、実質的に全てのプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドが共通の選択可能な特徴を共有するペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーから、選択され、および／または単離される。例えば、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドは、実質的に全てのプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドが、共通の一般的リガンドに結合し、共通の標的リガンドに結合し、共通の抗体に結合し（またはそれにより結合され）、あるいは共通の触媒活性を保有するライブラリーまたはレパートリーから選択され得る。この型の選択は、例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインの親和性成熟を実施する場合、所望の生物学的活性を有する親ペプチドまたはポリペプチドに基づいているプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを調製するために特に有用である。
【００７８】
共通の一般的リガンドとの結合に基づいた選択は、元のライブラリーまたはレパートリーの構成成分であったプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドのうちの全てまたは実質的に全てを含有するペプチドまたはポリペプチドのコレクションまたは集団を生じ得る。例えば、標的リガンドまたは一般的リガンド、例えばプロテインＡ、プロテインＬまたは抗体に結合するペプチドまたはポリペプチドは、適切な親和性マトリックスをパニング（panning）するかまたは用いることにより、選択され、単離され、および／または回収され得る。パニングは、適切な容器（例えば、試験管、ペトリ皿）にリガンド（例えば、一般的リガンド、標的リガンド）の溶液を付加し、そして容器の壁上にリガンドが沈着しまたは被覆するようにさせることにより成し遂げられ得る。過剰量のリガンドは洗い落とされ、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、プロテアーゼとともにインキュベートされたレパートリー）が容器に付加されて、固定化リガンドに結合するためにペプチドまたはポリペプチドに適した条件下で容器が保持される。任意の適切な方法、例えば削り落とすか、またはｐＨを下げることにより、非結合ペプチドまたはポリペプチドは洗い落とされて、結合ペプチドまたはポリペプチドが回収され得る。
【００７９】
適切なリガンド親和性マトリックスは、一般的に、リガンドが共有的にまたは非共有的に結合される固体支持体またはビーズ（例えば、アガロース）を含有する。親和性マトリックスは、マトリックス上のリガンドとのペプチドまたはポリペプチドの結合に適した条件下で、バッチ法、カラム法または任意の他の適切な方法を用いて、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、プロテアーゼとともにインキュベートされたレパートリー）と組合され得る。親和性マトリックスを結合しないペプチドまたはポリペプチドは洗い落とされて、結合ペプチドまたはポリペプチドが溶離され、任意の適切な方法を用いて、例えば、低ｐＨ緩衝液を用いた、低刺激性変性剤（例えば、尿素）を用いた、あるいはリガンドとの結合に関して競合するペプチドを用いた溶離により、溶離され、回収され得る。一例では、ビオチニル化標的リガンドが、レパートリー中のペプチドまたはポリペプチドに適した条件下でレパートリーと組合されて、標的リガンド（ＶＥＧＦ）に結合する。結合ペプチドまたはポリペプチドは、固定化アビジンまたはストレプトアビジン（例えば、ビーズ上）を用いて回収される。
【００８０】
いくつかの実施形態では、一般的リガンドは、抗体またはその抗原結合断片である。ライブラリーまたはレパートリーのペプチドまたはポリペプチド中に実質的に保存されるペプチドまたはポリペプチドの構造的特徴に結合する抗体または抗原結合断片は、一般的リガンドとして特に有用である。プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを単離し、選択し、および／または回収するためのリガンドとして用いるのに適した抗体および抗原結合断片は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得るし、任意の適切な方法を用いて調製され得る。
【００８１】
核酸、宿主細胞およびプロテアーゼ耐性ポリペプチドの産生方法：
本明細書中に記載される方法により選択されるプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドは、適切なin vitro発現系、例えば大腸菌またはピキア種、例えばメタノール資化酵母において、化学合成により、または任意の他の適切な方法によっても産生され得る。
【００８２】
ポリペプチド、ｄＡｂおよびアンタゴニスト：
本明細書に記載されるように、プロテアーゼ耐性ｄＡｂは、一般に、高い親和性で標的リガンドに結合する。
【００８３】
例えば、ＶＥＧＦ  ｄＡｂは、３００ｎＭ〜１ｐＭ（すなわち、３×１０−７〜５×１０−１２Ｍ）、例えば５０ｎＭ〜１ｐＭ、例えば５ｎＭ〜１ｐＭおよび例えば１ｎＭ〜１ｐＭの親和性（ＫＤ；表面プラズモン共鳴により確定した場合、ＫＤ＝Ｋoff（ｋｄ）／Ｋon（ｋａ））；例えば１×１０−７Ｍ以下、例えば１×１０−８Ｍ以下、例えば１×１０−９Ｍ以下、例えば１×１０−１０Ｍ以下および例えば１×１０−１１Ｍ以下のＫＤ；および／または表面プラズモン共鳴により確定した場合に５×１０−１ｓ−１〜１×１０−７ｓ−１、例えば１×１０−２ｓ−１〜１×１０−６ｓ−１、例えば５×１０−３ｓ−１〜１×１０−５ｓ−１、例えば５×１０−１ｓ−１以下、例えば１×１０−２ｓ−１以下、例えば１×１０−３ｓ−１以下、例えば１×１０−４ｓ−１以下、例えば１×１０−５ｓ−１以下、および例えば１×１０−６ｓ−１以下のＫoff速度定数でＶＥＧＦに結合し得る。
【００８４】
任意の特定の理論に縛られることなく考えると、プロテアーゼに対して耐性であるペプチドおよびポリペプチドはより低いエントロピーおよび／またはより高い安定化エネルギーを有する。したがって、プロテアーゼ耐性と高親和性結合との間の相関は、本明細書中に記載される方法により選択されるペプチドおよびポリペプチドおよびｄＡｂの表面の緊密性および安定性と関連づけられ得る。
【００８５】
一実施形態では、ＶＥＧＦ  ｄＡｂは、約１μＭ以下、約５００ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約７５ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、または約１ｎＭ以下のＩＣ５０の濃度５０（ＩＣ５０）で、ＶＥＧＦの結合を抑制する。
【００８６】
ある実施形態では、ＶＥＧＦ  ｄＡｂはＶＥＧＦ、例えばヒトＶＥＧＦに特異的に結合し、そして表面プラズモン共鳴により確定した場合に、３００ｎＭ〜１ｐＭまたは３００ｎＭ〜５ｐＭ、または５０ｎＭ〜１ｐＭ、または５０ｎＭ〜５ｐＭ、または５０ｎＭ〜２０ｐＭまたは約１０ｐＭ、または約１５ｐＭ、または約２０ｐＭの解離定数（ＫＤ）でヒトＶＥＧＦから解離する。ある実施形態では、ポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニストは、ＶＥＧＦ、例えばヒトＶＥＧＦに特異的に結合し、そして表面プラズモン共鳴により確定した場合に５×１０−１ｓ−１〜１×１０−７ｓ−１、例えば１×１０−２ｓ−１〜１×１０−６ｓ−１、例えば５×１０−３ｓ−１〜１×１０−５ｓ−１、例えば５×１０−１ｓ−１以下、例えば１×１０−２ｓ−１以下、例えば１×１０−３ｓ−１以下、例えば１×１０−４ｓ−１以下、例えば１×１０−５ｓ−１以下、および例えば１×１０−６ｓ−１以下のＫoff速度定数でヒトＶＥＧＦから解離する。
【００８７】
ある実施形態では、ＶＥＧＦ  ｄＡｂは、１×１０−３Ｍ−１ｓ−１〜１×１０−７Ｍ−１ｓ−１、または１×１０−３Ｍ−１ｓ−１〜１×１０−６Ｍ−１ｓ−１、または約１×１０−４Ｍ−１ｓ−１、または約１×１０−５Ｍ−１ｓ−１のＫonで、ＶＥＧＦ、例えばヒトＶＥＧＦに特異的に結合する。一実施形態では、ポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニストは、ＶＥＧＦ、例えばヒトＶＥＧＦに特異的に結合し、そして本段落で明示したような解離定数（ＫＤ）およびＫoffで、ヒトＶＥＧＦから解離する。一実施形態では、ポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニストは、ＶＥＧＦ、例えばヒトＶＥＧＦに特異的に結合し、そして本段落で明示したような解離定数（ＫＤ）およびＫonで、ヒトＶＥＧＦから解離する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはｄＡｂは、この段落で記述したようなＫＤおよび／またはＫoffおよび／またはＫonでＶＥＧＦ（例えばヒトＶＥＧＦ）に特異的に結合し、そしてＤＯＭ１５−２６−５９３のアミノ酸配列を有するｄＡｂのアミノ酸配列と少なくともまたは少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００８８】
ｄＡｂは、大腸菌で、またはピキア種（例えば、メタノール資化酵母）で発現され得る。一実施形態では、リガンドまたはｄＡｂモノマーは、大腸菌で、またはピキア種（例えば、メタノール資化酵母）で発現される場合、少なくとも約０．５ｍｇ／Ｌの量で分泌される。本明細書中に記載されるリガンドおよびｄＡｂモノマーは、大腸菌で、またはピキア種（例えば、メタノール資化酵母）で発現される場合に分泌可能であり得るが、しかし、それらは、大腸菌またはピキア種を用いない任意の適切な方法、例えば合成化学的方法または生物学的産生方法を用いて産生され得る。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニストは、ラクダ類免疫グロブリン可変ドメイン、あるいは、例えば位置１０８、３７、４４、４５および／または４７で、ラクダ類生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる免疫グロブリン可変ドメインに独特である１つ以上のフレームワークアミノ酸を含まない。
【００９０】
ＶＥＧＦのアンタゴニストは、一価または多価であり得る。いくつかの実施形態では、アンタゴニストは一価であり、本発明のポリペプチドまたはｄＡｂにより提供される結合部位である、ＶＥＧＦと相互作用する１つの結合部位を含有する。一価アンタゴニストは１つのＶＥＧＦに結合し、受容体の活性化およびシグナル伝達を引き起こし得る細胞の表面上のＶＥＧＦの架橋またはクラスター化を誘導し得ない。
【００９１】
代替的には、ＶＥＧＦのアンタゴニストは多価である。ＶＥＧＦの多価アンタゴニストは、ＶＥＧＦに関する特定結合部位の２つ以上のコピーを含有するか、またはＶＥＧＦに結合する２つ以上の異なる結合部位を含有し得る（結合部位の少なくとも１つは、本発明のｄＡｂにより提供される）。例えば、本明細書中に記載されるように、ＶＥＧＦのアンタゴニストは、ＶＥＧＦに結合するｄＡｂの２つ以上のコピー、あるいはＶＥＧＦに結合する２つ以上の異なるｄＡｂを含む二量体、三量体または多量体であり得る。
【００９２】
他の実施形態では、ｄＡｂは、本明細書中に記載されるＫＤでＶＥＧＦに特異的に結合し、標準マウス異種移植モデルにおける腫瘍増殖を抑制する（例えば、適切な対照と比較した場合、腫瘍増殖を少なくとも約１０％抑制する）。一実施形態では、ポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニストは、約１ｍｇ／ｋｇ以上、例えば約５または１０ｍｇ／ｋｇで投与される場合、標準マウス異種移植モデルにおいて、適切な対照と比較して、少なくとも約１０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％、腫瘍増殖を抑制する。
【００９３】
他の実施形態では、ポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニストはＶＥＧＦに結合し、そして≦１００ｎＭのＮＤ５０で標準細胞検定においてＶＥＧＦの活性に拮抗する。
【００９４】
ある実施形態では、ｄＡｂは、有効量が投与される場合、眼疾患の動物モデルにおいて有効である。一般的に、有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇまたは約１０ｍｇ／ｋｇ）である。ｄＡｂは、例えば１日１回または２回、毎週１回または２回、毎月１回または２回の投与頻度で投与され得る。
【００９５】
一般的に、ｄＡｂは、眼送達のために薬理学的に適切な担体と一緒に、精製形態で利用される。典型的には、これらの担体としては、水性またはアルコール性／水性の溶液、乳濁液または懸濁液、整理食塩水および／または緩衝媒質を含む何れかが挙げられ得る。適切な生理学的に許容可能なアジュバントは、懸濁液中にポリペプチド複合体を保持する必要がある場合、濃化剤、例えばカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギン酸塩から選択され得る。防腐剤およびその他の添加剤、例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤および不活性ガスも存在し得る（Mack (1982) Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第16版）。種々の適切な製剤、例えば徐放性製剤が用いられ得る。これらは、埋込み物、ゲル、ナノ粒子およびマイクロ粒子を含み得る。薬剤負荷ＰＬＡナノ−およびマイクロ粒子は、製剤の結膜下送達後に眼の後部セグメントに薬剤を送達するために用いられてきた（Kompella et al IOVS 2003 44(3) 1192-1201）。特に、マイクロスフェアは送達部位に保持され、そしてより容易に除去され得るナノ粒子と比較して、腎薬剤送達により適していると思われる（Amrite et al ARVO abstract #5067/B391 2003）。
【００９６】
本発明のリガンド（例えばアンタゴニスト）は、別々に投与される組成物として、または他の作用物質とともに用いられ得る。これらの例としては、眼への眼送達のための種々の薬剤、および／または眼浸透増強剤および／または増粘剤が挙げられる。
【００９７】
医薬組成物は、本発明のリガンドとともに種々の他の作用物質の、あるいは異なる特異性を有する本発明によるリガンド、例えば（それらが投与前にプールされていてもいなくても）異なる標的抗原またはエピトープを用いて選択されるリガンドの組合せの「カクテル」を包含し得る。
【００９８】
眼へのｄＡｂの投与の精確な投与量および頻度は、患者の年齢、性別および症状、他の薬剤の同時投与、禁忌、ならびに臨床医が考慮すべきその他のパラメーターに左右される。
【００９９】
本発明のｄＡｂは、貯蔵のために凍結乾燥され、そして使用前に適切な担体中で再構成され得る。この技法は、慣用的免疫グロブリンを用いて有効であることが示されており、当該技術分野で既知の凍結乾燥および再構成技法が用いられ得る。凍結乾燥および再構成が種々の程度の抗体活性損失（例えば、慣用的免疫グロブリンに関しては、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体より大きい活性を有する傾向がある）を引き起こし得る、そして使用レベルを補うように上向きに調整しなければならないこともある、と当業者は理解するであろう。
【０１００】
本発明のｄＡｂまたはそのカクテルを含有する組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与され得る。ある治療的適用では、選択細胞の集団の、少なくとも部分的な抑制、抑圧、調整、死滅、あるいはいくつかの他の測定可能なパラメーターを成し遂げるための適切な量は、「治療的有効用量」と定義され得る。この投与量を達成するために必要とされる量は、患者自身の免疫系の疾患および全身状態の重症度に左右される。疾患を治療し、抑圧し、または防止するための適切な投与間隔を、熟練臨床医は確定し得る。
【０１０１】
本明細書中に記載される組成物を用いて実施される治療または療法は、治療前に存在するこのような症候に比して、あるいはこのような組成物で治療されない個体（ヒトまたはモデル動物）または他の適切な対照におけるこのような症候に比して、１つ以上の症候が低減される場合（例えば少なくとも１０％または臨床的査定尺度で少なくとも１点）、「有効」とみなされる。症候は、標的にされる疾患または障害によって明白に変わるが、しかし通常の熟練臨床医または技術者により測定され得る。このような症候は、例えば、疾患または障害の１つ以上の生化学的指標のレベル（例えば、疾患、罹患細胞数等と相関する酵素または代謝産物のレベル）をモニタリングすることにより、身体的症状発現をモニタリングすることにより、あるいは容認された臨床的査定尺度により、測定され得る。
【０１０２】
同様に、本明細書中に記載されるような組成物を用いて実施される予防は、当該組成物で治療されない類似の個体（ヒトまたは動物モデル）におけるこのような症候に比して、１つ以上の症候の開始または重症度が遅延され、低減され、または無効にされる場合、「有効」である。
【０１０３】
一実施形態では、本発明は、例えば癌（例えば固形腫瘍）、炎症性疾患、自己免疫疾患、血管増殖性疾患（例えば、ＡＭＤ（加齢性黄斑変性））から選択される眼の疾患または症状を治療し、抑圧し、または防止するための方法であって、それを必要とする哺乳動物に、治療的有効用量または量のポリペプチド、ｄＡｂ（これは、本発明によるＶＥＧＦまたはＶＥＧＦのアンタゴニストと、あるいはＩＬ−１またはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−αＲと結合する）を投与することを包含する方法である。このような眼の疾患または症状の例としては、ＡＭＤ、ブドウ膜炎、ドライアイ、糖尿病性網膜症および糖尿病性黄斑浮腫が挙げられる。
【０１０４】
フォーマット：
半減期増大は、免疫グロブリン、特に抗体、最も特定的には小サイズの抗体断片のin vivo適用に有用である。このような断片（Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ）は、身体からの急速なクリアランスを蒙り得る；したがって、それらは迅速に身体のほとんどの部分に到達し得るし、産生が素早く且つ取扱いが容易である一方で、それらのin vivo適用は、in vivoでのそれらのほんの短い持続性により限定されてきた。それゆえ、本明細書中に記載されるｄＡｂは、in vivoでの半減期増大と、その結果としてのより長い身体中持続時間を提供するよう修飾され得る。
【０１０５】
薬物動態分析およびリガンド半減期の確定のための方法は、当業者にはよく知られている。詳細は、Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacistsに、ならびにPeters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)に見出され得る。”Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982)（ｔアルファおよびｔベータ半減期ならびに曲線下面積（ＡＵＣ）のような薬物動態パラメーターを記載する）も参照され得る。
【０１０６】
半減期（ｔ1/2アルファおよびｔ1/2ベータ）およびＡＵＣは、時間に対するリガンドの血清濃度の曲線から確定され得る。例えば、この曲線をモデル化するために、WinNonlin分析パッケージ（Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USAから入手可能）が用いられ得る。第一相（アルファ相）では、リガンドは主に患者における分布を受けつつあり、多少の排除を伴う。第二相（ベータ相）は、リガンドが分布されて、リガンドが患者から排泄されるので、血清濃度が減少している末期相である。ｔアルファ半減期は第一相の半減期であり、ｔベータ半減期は第二相の半減期である。したがって、一実施形態では、本発明は、１５分またはそれ以上の範囲のｔα半減期を有する本発明によるリガンドまたはリガンドを含む組成物を提供する。一実施形態では、その範囲の下限は、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間または１２時間である。さらに、または代替的には、本発明によるリガンドまたは組成物は、１２時間を含めて１２時間までの範囲のｔα半減期を有する。一実施形態では、この範囲の上限は、１１、１０、９、８、７、６または５時間である。適切な範囲の一例は、１〜６時間、２〜５時間または３〜４時間である。
【０１０７】
一実施形態では、本発明によるｄＡｂまたはｄＡｂを含む組成物は、３０分またはそれ以上の範囲のｔβ半減期を有する。一実施形態では、この範囲の下限は、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間または１２時間である。さらに、または代替的には、本発明によるリガンドまたは組成物は、２１日を含めて２１日までの範囲のｔβ半減期を有する。一実施形態では、この範囲の上限は、１２時間、２４時間、２日、３日、５日、１０日、１５日または２０日である。一実施形態では、本発明によるリガンドまたは組成物は、１２〜６０時間の範囲のｔβ半減期を有する。さらなる一実施形態では、それは、１２〜４８時間の範囲である。さらなる一実施形態では、それは１２〜２６時間の範囲である。
【０１０８】
上記判定基準のほかに、またはそれに代替的には、本発明は、１ｍｇ・分／ｍｌまたはそれ以上の範囲のＡＵＣ値（曲線下面積）を有する本発明によるｄＡｂまたはリガンドを含む組成物を提供する。一実施形態では、この範囲の下限は、５、１０、１５、２０、３０、１００、２００または３００ｍｇ・分／ｍｌである。さらに、または代替的には、本発明によるリガンドまたは組成物は、６００ｍｇ・分／ｍｌまでの範囲のＡＵＣを有する。一実施形態では、この範囲の上限は、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５または５０ｍｇ・分／ｍｌである。一実施形態では、本発明によるリガンドは、以下からなる群から選択される範囲のＡＵＣを有する：１５〜１５０ｍｇ・分／ｍｌ、１５〜１００ｍｇ・分／ｍｌ、１５〜７５ｍｇ・分／ｍｌおよび１５〜５０ｍｇ・分／ｍｌ。
【０１０９】
本発明のｄＡｂは、ＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体またはその少なくともトランスフェリン結合部分、抗体Ｆｃ領域の付着により、あるいは抗体ドメインとの接合により、より大きな水力学的サイズを有するようフォーマット化され得る。例えば、ｄＡｂは、抗体のより大きな抗原結合断片として、または抗体としてフォーマットされ得る（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ＩｇＧ、ｓｃＦｖとしてフォーマットされる）。別の実施形態では、本発明によるｄＡｂは、別のポリペプチドまたはペプチドとの融合体または接合体としてフォーマットされ得る。
【０１１０】
本発明のリガンド（例えば、ｄＡｂ単量体および多量体）の水力学的サイズは、当該技術分野で周知の方法を用いて確定され得る。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、リガンドの水力学的サイズを確定し得る。リガンドの水力学的サイズを確定するための適切なゲル濾過マトリックス、例えば架橋アガロースマトリックスがよく知られており、容易に入手可能である。
【０１１１】
リガンドのサイズ、すなわちｄＡｂフォーマット（例えば、ｄＡｂ単量体に付着されるＰＥＧ部分のサイズ）は所望の用途によって変わり得る。例えば、ｄＡｂが長時間、全身循環中に残存することが望ましい場合、そのサイズは、例えばＩｇ様タンパク質としてフォーマットすることにより増大され得る。
【０１１２】
in vivoで半減期を増大する抗原またはエピトープを標的化することによる半減期延長
リガンドの水力学的サイズおよびその血清半減期は、本明細書中に記載されるように、in vivoで半減期を増大する抗原またはエピトープに結合する結合ドメイン（例えば、抗体または抗体断片）とｄＡｂを接合するかまたは会合させることによっても増大され得る。例えば、ＶＥＧＦ  ｄＡｂは、抗血清アルブミンまたは抗新生児Ｆｃ受容体抗体または抗体断片、例えば抗ＳＡまたは抗新生児Ｆｃ受容体ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはｓｃＦｖに、あるいは抗ＳＡアフィボディまたは抗新生児Ｆｃ受容体アフィボディまたは抗ＳＡアビマー、あるいは抗ＳＡ結合ドメイン（ＣＴＬＡ−４、リポカリン、ＳｐＡ、アフィボディ、アビマー、ＧｒｏＥｌおよびフィブロネクチン（好ましくはこれらに限定されない）からなる群から選択される足場を含む）に接合されるかまたは連結され得る（これらの結合ドメインの開示に関しては、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０００４５３（２００８年２月８日出願）参照。このドメインおよびそれらの配列は、参照により本明細書中に組み入れられ、本文の開示の一部を構成する）。接合することは、血清アルブミンに結合する結合ドメインと（共有的にまたは非共有的に）結合される本発明のポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニストを含む組成物を指す。
【０１１３】
in vivoでの血清半減期を拡大する適切なポリペプチドとしては、例えば、トランスフェリン受容体特異的リガンド−神経薬学的因子融合タンパク質（米国特許第５，９７７，３０７号（この教示は参照により本明細書中で援用される）参照）、脳毛細管内皮細胞受容体、トランスフェリン、トランスフェリン受容体（例えば、可溶性トランスフェリン受容体）、インスリン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）受容体、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ２）受容体、インスリン受容体、血液凝固因子Ｘ、α１−抗トリプシンおよびＨＮＦ  １αが挙げられる。血清半減期を拡大する適切なポリペプチドとしては、アルファ−１糖タンパク質（オロソムコイド；ＡＡＧ）、アルファ−１抗キモトリプシン（ＡＣＴ）、アルファ−１マイクログロブリン（プロテインＨＣ；ＡＩＭ）、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ  ＩＩＩ）、アポリポプロテインＡ−１（アポＡ−１）、アポリポプロテインＢ（アポＢ）、セルロプラスミン（Ｃｐ）、補体成分Ｃ３（Ｃ３）、補体成分Ｃ４（Ｃ４）、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１  ＩＮＨ）、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フェリチン（ＦＥＲ）、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ミオグロビン（Ｍｙｏ）、プレアルブミン（トランスチレチン；ＰＡＬ）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）およびリウマチ因子（ＲＦ）も挙げられる。
【０１１４】
細胞外マトリックスからの適切なタンパク質としては、例えば、コラーゲン、ラミニン、インテグリンおよびフィブロネクチンが挙げられる。コラーゲンは、細胞外マトリックスの主要タンパク質である。約１５の型のコラーゲン分子が一般に知られており、身体の異なる部分に見出され、例えば、Ｉ型コラーゲン（身体コラーゲンの９０％を占める）は骨、皮膚、腱、靭帯、角膜、内部器官に見出され、あるいはＩＩ型コラーゲンは軟骨、椎骨円板、脊索および眼の硝子体液中に見出される。
【０１１５】
血液からの適切なタンパク質としては、例えば、血漿タンパク質（例えば、フィブリン、α−２マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノーゲン（例えば、フィブリノーゲンＡ、フィブリノーゲンＢ）、血清アミロイドプロテインＡ、ハプトグロビン、プロフィリン、ユビキチン、ウテログロブリンおよびβ−２−マイクログロブリン）、酵素および酵素阻害剤（例えば、プラスミノーゲン、ライソザイム、シスタチンＣ、アルファ−１−アンチトリプシンおよび膵臓トリプシン阻害剤）、免疫系のタンパク質、例えば免疫グロブリンタンパク質（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、免疫グロブリン軽鎖（カッパ／ラムダ））、輸送タンパク質（例えば、レチノール結合タンパク質、α−１マイクログロブリン）、デフェンシン（例えば、ベータ−デフェンシン１、好中球デフェンシン１、好中球デフェンシン２および好中球デフェンシン３）等が挙げられる。
【０１１６】
血液脳関門または神経組織で見出される適切なタンパク質としては、例えば、メラノコルチン受容体、ミエリン、アスコルビン酸輸送体等が挙げられる。
【０１１７】
in vivoでの血清半減期を拡大する適切なポリペプチドとしては、腎臓に限局されるタンパク質（例えば、ポリシスチン、ＩＶ型コラーゲン、有機陰イオン輸送体Ｋ１、ヘイマン抗原）、肝臓に限局されるタンパク質（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｇ２５０）、肺に限局されるタンパク質（例えば分泌成分。ＩｇＡに結合する）、心臓に限局されるタンパク質（例えばＨＳＰ２７。拡張心筋症と関連する）、皮膚に限局されるタンパク質（例えばケラチン）、骨特異的タンパク質、例えば形態形成タンパク質（ＢＭＰ）（これは、骨形成活性を実証するタンパク質の形質転換増殖因子βスーパーファミリーのサブセットである（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８））、腫瘍特異的タンパク質（例えば、栄養芽細胞抗原、ハーセプチン受容体、エストロゲン受容体、カテプシン（例えば、カテプシンＢ。これは肝臓および脾臓中に見出され得る））も挙げられる。
【０１１８】
適切な疾患特異的タンパク質としては、例えば、活性化Ｔ細胞上でのみ発現される抗原、例えば、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子）、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ；Nature 402, 304-309 (1999)参照）、ＯＸ４０（ＴＮＦ受容体ファミリーの一成員。活性化Ｔ細胞上で発現され、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）産生細胞中で特異的に上方調節される；Immunol. 165(1): 263-70 (2000)参照）が挙げられる。適切な疾患特異的タンパク質としては、例えば、メタロプロテアーゼ（関節炎／癌と関連）、例えばＣＧ６５１２ショウジョウバエ、ヒト・パラプレジン、ヒトＦｔｓＨ、ヒトＡＦＧ３Ｌ２、ネズミｆｔｓＨ；ならびに血管形成増殖因子、例えば、酸性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、血管内皮細胞増殖因子／血管浸透性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）、形質転換増殖因子−α（ＴＧＦα）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、アンギオゲニン、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、胎盤増殖因子（Ｐ１ＧＦ）、ミドカイン血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ）およびフラクタルカインも挙げられる。
【０１１９】
in vivoでの血清半減期を拡大する適切なポリペプチドとしては、ストレスタンパク質、例えば熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）も挙げられる。ＨＳＰは、細胞内に普通に見出される。それらが細胞外に見出される場合、それは、細胞が死んでおり、その内容物を外に出した、ということの指標である。このプログラムされない細胞死（壊死）は、外傷、疾患または損傷の結果として、細胞外ＨＳＰが免疫系からの応答を誘発した場合に起こる。細胞外ＨＳＰとの結合は、疾患部位への本発明の組成物の局在化を生じ得る。
【０１２０】
Ｆｃ輸送に関与する適切なタンパク質としては、例えば、ブラムベル受容体（ＦｃＲＢとしても知られている）が挙げられる。このＦｃ受容体は２つの機能を有し、この両方が送達のために潜在的に有用である。この機能は、（１）胎盤を横断する母親から子供へのＩｇＧの輸送、（２）ＩｇＧを分解から防護し、それによりその血清半減期を延長することである。受容体はエンドソームからＩｇＧを再循環させる、と考えられる（Holliger et al, Nat Biotechnol 15(7): 632-6 (1997)参照）。
【０１２１】
血清アルブミンに結合するｄＡｂ
本発明は、一実施形態において、眼標的分子、例えばＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−αと結合する第一ｄＡｂ、ならびに血清アルブミン（ＳＡ）に結合する第二ｄＡｂを提供し、上記の第二ｄＡｂは、表面プラズモン共鳴により確定した場合に、１ｎＭ〜１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、１００、２００、３００、４００または５００μＭ（すなわち、×１０−９〜５×１０−４）、または１００ｎＭ〜１０μＭ、または１〜５μＭ、または３〜７０ｎＭまたは１０ｎＭ〜１、２、３、４または５μＭ、例えば３０〜７０ｎＭ（表面プラズモン共鳴により確定した場合）のＫＤで、ＳＡに結合する。一実施形態では、第一ｄＡｂ（またはｄＡｂ単量体）は、表面プラズモン共鳴により確定した場合、約１、５０、７０、１００、１５０、２００、３００ｎＭ、あるいは１、２または３μＭのＫＤで、ＳＡ（例えばＨＳＡ）に結合する。一実施形態では、第一抗ＳＡ  ｄＡｂおよびＶＥＧＦに対する第二ｄＡｂを含む二重特異性リガンドに関して、その標的に対する第二ｄＡｂの親和性（例えば、ＢｉａＣｏｒｅを用いて、表面プラズモン共鳴により測定した場合のＫＤおよび／またはＫoff）は、ＳＡに対する第一ｄＡｂの親和性の１〜１０００００倍（例えば、１００〜１０００００、または１０００〜１０００００、または１００００〜１０００００倍）である。一実施形態では、血清アルブミンはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。例えば、第一ｄＡｂは約１０μＭの親和性でＳＡに結合するが、一方、第二ｄＡｂは１００ｐＭの親和性でその標的に結合する。一実施形態では、血清アルブミンはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。一実施形態では、第一ｄＡｂは、約５０、例えば７０、１００、１５０または２００ｎＭのＫＤでＳＡ（例えばＨＳＡ）に結合する。二重特異性リガンドの詳細は、ＷＯ０３００２６０９、ＷＯ０４００３０１９およびＷＯ０４０５８８２１に見出される。
【０１２２】
本発明のｄＡｂは、一実施形態では、表面プラズモン共鳴により確定した場合に、１ｎＭ〜１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、１００、２００、３００、４００または５００μＭ（すなわち、×１０−９〜５×１０−４）、または１００ｎＭ〜１０μＭ、または１〜５μＭ、または３〜７０ｎＭまたは１０ｎＭ〜１、２、３、４または５μＭ、例えば３０〜７０ｎＭ（表面プラズモン共鳴により確定した場合）のＫＤで、血清アルブミン（ＳＡ）に結合するｄＡｂを含み得る。一実施形態では、第一ｄＡｂ（またはｄＡｂ単量体）は、表面プラズモン共鳴により確定した場合、約１、５０、７０、１００、１５０、２００、３００ｎＭ、あるいは１、２または３μＭのＫＤで、ＳＡ（例えばＨＳＡ）に結合する。一実施形態では、第一および第二ｄＡｂは、リンカー、例えば１〜４アミノ酸、または１〜３アミノ酸、あるいは３より多くのアミノ酸、あるいは４より多い、５より多い、６より多い、７より多い、８より多い、９より多い、１０より多い、１５より多いまたは２０より多いアミノ酸を有するリンカーにより連結される。一実施形態では、より長いリンカー（３アミノ酸より長い）を用いて、効力（アンタゴニスト中のｄＡｂの一方または両方のＫＤ）を増強する。
【０１２３】
特定の実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、アルブミンとの結合に関して、以下からなる群から選択されるｄＡｂと競合する：
ＭＳＡ−１６、ＭＳＡ−２６（これらの配列の開示に関してはＷＯ０４００３０１９参照（配列およびそれらの核酸相手は参照により本明細書中に組み入れられ、本文の開示の一部を構成する））、
ＤＯＭ７ｍ−１６（配列番号４７３）、ＤＯＭ７ｍ−１２（配列番号４７４）、ＤＯＭ７ｍ−２６（配列番号４７５）、ＤＯＭ７ｒ−１（配列番号４７６）、ＤＯＭ７ｒ−３（配列番号４７７）、ＤＯＭ７ｒ−４（配列番号４７８）、ＤＯＭ７ｒ−５（配列番号４７９）、ＤＯＭ７ｒ−７（配列番号４８０）、ＤＯＭ７ｒ−８（配列番号４８１）、ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号４８３）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号４８４）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号４９７）、ＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号４９８）、ＤＯＭ７ｒ−１５（配列番号４９９）、ＤＯＭ７ｒ−１６（配列番号５００）、ＤＯＭ７ｒ−１７（配列番号５０１）、ＤＯＭ７ｒ−１８（配列番号５０２）、ＤＯＭ７ｒ−１９（配列番号５０３）、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号５０４）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号５０５）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号５０６）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号５０７）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号５０８）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号５０９）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号５１０）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号５１１）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号５１２）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号５１３）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号５１４）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号５１５）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号５１６）、ＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号５１７）（これらの配列の開示に関しては、ＷＯ２００７０８０３９２参照。これらの配列およびそれらの核酸相手は参照により本明細書中に組み入れられ、本文の開示の一部を構成する。この段落における配列番号は、ＷＯ２００７０８０３９２に出ていたものである）、
ｄＡｂ８（ｄＡｂ１０）、ｄＡｂ  １０、ｄＡｂ３６、ｄＡｂ７ｒ２０（ＤＯＭ７ｒ２０）、ｄＡｂ７ｒ２１（ＤＯＭ７ｒ２１）、ｄＡｂ７ｒ２２（ＤＯＭ７ｒ２２）、ｄＡｂ７ｒ２３（ＤＯＭ７ｒ２３）、ｄＡｂ７ｒ２４（ＤＯＭ７ｒ２４）、ｄＡｂ７ｒ２５（ＤＯＭ７ｒ２５）、ｄＡｂ７ｒ２６（ＤＯＭ７ｒ２６）、ｄＡｂ７ｒ２７（ＤＯＭ７ｒ２７）、ｄＡｂ７ｒ２８（ＤＯＭ７ｒ２８）、ｄＡｂ７ｒ２９（ＤＯＭ７ｒ２９）、ｄＡｂ７ｒ２９（ＤＯＭ７ｒ２９）、ｄＡｂ７ｒ３１（ＤＯＭ７ｒ３１）、ｄＡｂ７ｒ３２（ＤＯＭ７ｒ３２）、ｄＡｂ７ｒ３３（ＤＯＭ７ｒ３３）、ｄＡｂ７ｒ３３（ＤＯＭ７ｒ３３）、ｄＡｂ７ｈ２２（ＤＯＭ７ｈ２２）、ｄＡｂ７ｈ２３（ＤＯＭ７ｈ２３）、ｄＡｂ７ｈ２４（ＤＯＭ７ｈ２４）、ｄＡｂ７ｈ２５（ＤＯＭ７ｈ２５）、ｄＡｂ７ｈ２６（ＤＯＭ７ｈ２６）、ｄＡｂ７ｈ２７（ＤＯＭ７ｈ２７）、ｄＡｂ７ｈ３０（ＤＯＭ７ｈ３０）、ｄＡｂ７ｈ３１（ＤＯＭ７ｈ３１）、ｄＡｂ２（ｄＡｂｓ  ４、７、４１）、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ１１、ｄＡｂ１２（ｄＡｂ７ｍ１２）、ｄＡｂ１３（ｄＡｂ  １５）、ｄＡｂ１５、ｄＡｂ１６（ｄＡｂ２１、ｄＡｂ７ｍ１６）、ｄＡｂ１７、ｄＡｂ１８、ｄＡｂ１９、ｄＡｂ２１、ｄＡｂ２２、ｄＡｂ２３、ｄＡｂ２４、ｄＡｂ２５（ｄＡｂ２６、ｄＡｂ７ｍ２６）、ｄＡｂ２７、ｄＡｂ３０（ｄＡｂ３５）、ｄＡｂ３１、ｄＡｂ３３、ｄＡｂ３４、ｄＡｂ３５、ｄＡｂ３８（ｄＡｂ５４）、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ４６（ｄＡｂｓ  ４７、５２および５６）、ｄＡｂ４７、ｄＡｂ５２、ｄＡｂ５３、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ５５、ｄＡｂ５６、ｄＡｂ７ｍ１２、ｄＡｂ７ｍ１６、ｄＡｂ７ｍ２６、ｄＡｂ７ｒ１（ＤＯＭ  ７ｒ１）、ｄＡｂ７ｒ３（ＤＯＭ７ｒ３）、ｄＡｂ７ｒ４（ＤＯＭ７ｒ４）、ｄＡｂ７ｒ５（ＤＯＭ７ｒ５）、ｄＡｂ７ｒ７（ＤＯＭ７ｒ７）、ｄＡｂ７ｒ８（ＤＯＭ７ｒ８）、ｄＡｂ７ｒ１３（ＤＯＭ７ｒ１３）、ｄＡｂ７ｒ１４（ＤＯＭ７ｒ１４）、ｄＡｂ７ｒ１５（ＤＯＭ７ｒ１５）、ｄＡｂ７ｒ１６（ＤＯＭ７ｒ１６）、ｄＡｂ７ｒ１７（ＤＯＭ７ｒ１７）、ｄＡｂ７ｒ１８（ＤＯＭ７ｒ１８）、ｄＡｂ７ｒ１９（ＤＯＭ７ｒ１９）、ｄＡｂ７ｈ１（ＤＯＭ７ｈ１）、ｄＡｂ７ｈ２（ＤＯＭ７ｈ２）、ｄＡｂ７ｈ６（ＤＯＭ７ｈ６）、ｄＡｂ７ｈ７（ＤＯＭ７ｈ７）、ｄＡｂ７ｈ８（ＤＯＭ７ｈ８）、ｄＡｂ７ｈ９（ＤＯＭ７ｈ９）、ｄＡｂ７ｈ１０（ＤＯＭ７ｈ１０）、ｄＡｂ７ｈ１１（ＤＯＭ７ｈ１１）、ｄＡｂ７ｈ１２（ＤＯＭ７ｈ１２）、ｄＡｂ７ｈ１３（ＤＯＭ７ｈ１３）、ｄＡｂ７ｈ１４（ＤＯＭ７ｈ１４）、ｄＡｂ７ｐ１（ＤＯＭ７ｐ１）およびｄＡｂ７ｐ２（ＤＯＭ７ｐ２）（２００８年２月８日に出願され、これらの配列の開示に関してＷＯ  ２００８／０９６１５８として公開されたＰＣＴ／ＧＢ２００８／０００４５３を参照。これらの配列およびそれらの核酸相手は参照により本明細書中に組み入れられ、本文の開示の一部を構成する）。代替的名称は、ｄＡｂの後の括弧内に示されており、例えばｄＡｂ８はｄＡｂ１０である代替的名称を有し、すなわちｄＡｂ８（ｄＡｂ１０）である。
【０１２４】
ある実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、以下からなる群から選択されるｄＡｂのアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む：
ＭＳＡ−１６、ＭＳＡ−２６、
ＤＯＭ７ｍ−１６（配列番号４７３）、ＤＯＭ７ｍ−１２（配列番号４７４）、ＤＯＭ７ｍ−２６（配列番号４７５）、ＤＯＭ７ｒ−１（配列番号４７６）、ＤＯＭ７ｒ−３（配列番号４７７）、ＤＯＭ７ｒ−４（配列番号４７８）、ＤＯＭ７ｒ−５（配列番号４７９）、ＤＯＭ７ｒ−７（配列番号４８０）、ＤＯＭ７ｒ−８（配列番号４８１）、ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号４８３）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号４８４）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号４９７）、ＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号４９８）、ＤＯＭ７ｒ−１５（配列番号４９９）、ＤＯＭ７ｒ−１６（配列番号５００）、ＤＯＭ７ｒ−１７（配列番号５０１）、ＤＯＭ７ｒ−１８（配列番号５０２）、ＤＯＭ７ｒ−１９（配列番号５０３）、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号５０４）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号５０５）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号５０６）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号５０７）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号５０８）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号５０９）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号５１０）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号５１１）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号５１２）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号５１３）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号５１４）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号５１５）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号５１６）、ＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号５１７）（この段落における配列番号は、ＷＯ２００７０８０３９２に出ていたものである）、
ｄＡｂ８、ｄＡｂ  １０、ｄＡｂ３６、ｄＡｂ７ｒ２０、ｄＡｂ７ｒ２１、ｄＡｂ７ｒ２２、ｄＡｂ７ｒ２３、ｄＡｂ７ｒ２４、ｄＡｂ７ｒ２５、ｄＡｂ７ｒ２６、ｄＡｂ７ｒ２７、ｄＡｂ７ｒ２８、ｄＡｂ７ｒ２９、ｄＡｂ７ｒ３０、ｄＡｂ７ｒ３１、ｄＡｂ７ｒ３２、ｄＡｂ７ｒ３３、ｄＡｂ７ｈ２１、ｄＡｂ７ｈ２２、ｄＡｂ７ｈ２３、ｄＡｂ７ｈ２４、ｄＡｂ７ｈ２５、ｄＡｂ７ｈ２６、ｄＡｂ７ｈ２７、ｄＡｂ７ｈ３０、ｄＡｂ７ｈ３１、ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ１１、ｄＡｂ１２、ｄＡｂ１３、ｄＡｂ１５、ｄＡｂ１６、ｄＡｂ１７、ｄＡｂ１８、ｄＡｂ１９、ｄＡｂ２１、ｄＡｂ２２、ｄＡｂ２３、ｄＡｂ２４、ｄＡｂ２５、ｄＡｂ２６、ｄＡｂ２７、ｄＡｂ３０、ｄＡｂ３１、ｄＡｂ３３、ｄＡｂ３４、ｄＡｂ３５、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ４６、ｄＡｂ４７、ｄＡｂ５２、ｄＡｂ５３、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ５５、ｄＡｂ５６、ｄＡｂ７ｍ１２、ｄＡｂ７ｍ１６、ｄＡｂ７ｍ２６、ｄＡｂ７ｒ１、ｄＡｂ７ｒ３、ｄＡｂ７ｒ４、ｄＡｂ７ｒ５、ｄＡｂ７ｒ７、ｄＡｂ７ｒ８、ｄＡｂ７ｒ１３、ｄＡｂ７ｒ１４、ｄＡｂ７ｒ１５、ｄＡｂ７ｒ１６、ｄＡｂ７ｒ１７、ｄＡｂ７ｒ１８、ｄＡｂ７ｒ１９、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３、ｄＡｂ７ｈ１４、ｄＡｂ７ｐ１およびｄＡｂ７ｐ２。
【０１２５】
例えば、ヒト血清アルブミンに結合するｄＡｂは、ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号４８３）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号４８４）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号４９７）、ＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号４９８）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）（この段落における配列番号は、ＷＯ２００７０８０３９２に出ていたものである）、
ｄＡｂ８、ｄＡｂ  １０、ｄＡｂ３６、ｄＡｂ７ｈ２１、ｄＡｂ７ｈ２２、ｄＡｂ７ｈ２３、ｄＡｂ７ｈ２４、ｄＡｂ７ｈ２５、ｄＡｂ７ｈ２６、ｄＡｂ７ｈ２７、ｄＡｂ７ｈ３０、ｄＡｂ７ｈ３１、ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ１１、ｄＡｂ１２、ｄＡｂ１３、ｄＡｂ１５、ｄＡｂ１６、ｄＡｂ１７、ｄＡｂ１８、ｄＡｂ１９、ｄＡｂ２１、ｄＡｂ２２、ｄＡｂ２３、ｄＡｂ２４、ｄＡｂ２５、ｄＡｂ２６、ｄＡｂ２７、ｄＡｂ３０、ｄＡｂ３１、ｄＡｂ３３、ｄＡｂ３４、ｄＡｂ３５、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ４６、ｄＡｂ４７、ｄＡｂ５２、ｄＡｂ５３、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ５５、ｄＡｂ５６、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３およびｄＡｂ７ｈ１４
と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１２６】
ある実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、以下からなる群から選択されるｄＡｂのアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む：
ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）（この段落における配列番号は、ＷＯ２００７０８０３９２に出ていたものである）、
ｄＡｂ７ｈ２１、ｄＡｂ７ｈ２２、ｄＡｂ７ｈ２３、ｄＡｂ７ｈ２４、ｄＡｂ７ｈ２５、ｄＡｂ７ｈ２６、ｄＡｂ７ｈ２７、ｄＡｂ７ｈ３０、ｄＡｂ７ｈ３１、ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３およびｄＡｂ７ｈ１４。
【０１２７】
さらに特定の実施形態では、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンに結合し、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶκｄＡｂである：
ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）（この段落における配列番号は、ＷＯ２００７０８０３９２に出ていたものである）、
ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３およびｄＡｂ７ｈ１４。
【０１２８】
さらに特定の実施形態では、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンに結合し、ｄＡｂ７ｈ３０およびｄＡｂ７ｈ３１から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨｄＡｂである。
【０１２９】
さらに特定の実施形態では、ｄＡｂはｄＡｂ７ｈ１１またはｄＡｂ７ｈ１４である。
【０１３０】
他の実施形態では、ｄＡｂ、リガンドまたはアンタゴニストは、ヒト血清アルブミンに結合し、前記のアミノ酸配列のいずれかのＣＤＲのうちの１、２または３つ、例えばｄＡｂ７ｈ１１またはｄＡｂ７ｈ１４のＣＤＲのうちの１、２または３つを含む。
【０１３１】
血清アルブミンに結合する適切なラクダ類ＶＨＨとしては、ＷＯ  ２００４／０４１８６２（Ablynx N.V.）に、ならびにＷＯ２００７０８０３９２（このＶＨＨ配列およびそれらの核酸相手は、参照により本明細書中に組み入れられ、そして本文の開示の一部を構成する）に開示されたもの、例えば、配列Ａ（配列番号５１８）、配列Ｂ（配列番号５１９）、配列Ｃ（配列番号５２０）、配列Ｄ（配列番号５２１）、配列Ｅ（配列番号５２２）、配列Ｆ（配列番号５２３）、配列Ｇ（配列番号５２４）、配列Ｈ（配列番号５２５）、配列Ｉ（配列番号５２６）、配列Ｊ（配列番号５２７）、配列Ｋ（配列番号５２８）、配列Ｌ（配列番号５２９）、配列Ｍ（配列番号５３０）、配列Ｎ（配列番号５３１）、配列Ｏ（配列番号５３２）、配列Ｐ（配列番号５３３）、配列Ｑ（配列番号５３４）が挙げられ、これらの配列番号は、ＷＯ２００７０８０３９２またはＷＯ  ２００４／０４１８６２（Ablynx N.V.）に列挙されたものと対応する。ある実施形態では、ラクダ類ＶＨＨは、ヒト血清アルブミンに結合し、ＷＯ２００７０８０３９２に開示されたＡＬＢ１と、または配列番号５１８〜５３４（これらの配列番号は、ＷＯ２００７０８０３９２またはＷＯ  ２００４／０４１８６２に列挙されたものと対応する）のいずれか１つと、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ｄＡｂ組成物は、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）との結合に関して本明細書中に開示される任意の抗血清アルブミンｄＡｂと競合する抗血清アルブミンｄＡｂを含む。
【０１３３】
半減期延長部分（例えばアルブミン）との接合
一実施形態では、（１つ以上の）半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリンならびにその断片および類似体）は、ＶＥＧＦ結合（またはＩＬ−１またはＴＮＦ−α結合、あるいはＴＮＦ−αＲ結合）ｄＡｂと接合されるかまたは会合される。ＶＥＧＦ（またはＩＬ−１、あるいはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−αＲ）結合フォーマットに用いるための適切なアルブミン、アルブミン断片またはアルブミン変異体の例は、ＷＯ  ２００５０７７０４２（この開示内容は参照により本明細書中に組み入れられて、本文の開示の一部を構成する）に記載されている。特に、以下のアルブミン、アルブミン断片またはアルブミン変異体が、本発明に用いられ得る：
・配列番号１（ＷＯ  ２００５０７７０４２に開示。この配列は、参照により本開示中に明白に組み入れられる）；
・ＷＯ  ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸１〜３８７を含むかまたはそれからなるアルブミン断片または変異体；
・（ａ）ＷＯ  ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸５４〜６１；（ｂ）ＷＯ  ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸７６〜８９；（ｃ）ＷＯ  ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸９２〜ｌ００；（ｄ）ＷＯ  ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸１７０〜１７６；（ｅ）ＷＯ  ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸２４７〜２５２；（ｆ）ＷＯ  ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸２６６〜２７７；（ｇ）ＷＯ  ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸２８０〜２８８；（ｈ）ＷＯ  ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸３６２〜３６８；（ｉ）ＷＯ  ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸４３９〜４４７；（ｊ）ＷＯ  ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸４６２〜４７５；（ｋ）ＷＯ  ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸４７８〜４８６；および（ｌ）ＷＯ  ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸５６０〜５６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアルブミンあるいはその断片または変異体。
【０１３４】
ＶＥＧＦ結合フォーマットに用いるための適切なアルブミン、断片および類似体のさらなる例は、ＷＯ  ０３０７６５６７（この開示内容は参照により本明細書中に組み入れられて、本文の開示の一部を構成する）に記載されている。特に、以下のアルブミン、断片または変異体が本発明に用いられ得る：
・ＷＯ  ０３０７６５６７に、例えば図３に記載されているようなヒト血清アルブミン（この配列情報は、参照により本開示中に明白に組み入れられる）；
・６６，５００の式分子量を有する５８５アミノ酸の単一非グリコシル化ポリペプチド鎖からなるヒト血清アルブミン（ＨＡ）（Meloun, et al., FEBS Letters 58: 136 (1975)；Behrens, et al., Fed. Proc. 34: 591 (1975)；Lawn, et al., Nucleic Acids Research 9: 6102-6114 (1981)；Minghetti, et al., J. Biol. Chem. 261: 6747 (1986)参照）；
・Weitkamp, et al., Ann. Hum. Genet. 37: 219 (1973)に記載されたようなアルブミンの多型性変異体または類似体または断片；
・ＥＰ  ３２２０９４に記載されたようなアルブミン断片または変異体、例えばＨＡ（１〜３７３）、ＨＡ（１〜３８８）、ＨＡ（１〜３８９）、ＨＡ（１〜３６９）およびＨＡ（１〜４１９）ならびに１〜３６９および１〜４１９間の断片；
・ＥＰ  ３９９６６６に記載されたようなアルブミン断片または変異体、例えばＨＡ（１〜１７７）およびＨＡ（１〜２００）ならびにＨＡ（１〜Ｘ）間の断片（ここで、Ｘは１７８から１９９までの任意の数である）。
【０１３５】
（１つ以上の）半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリンならびにその断片および類似体）が本発明のｄＡｂをフォーマットするために用いられる場合、それは、任意の適切な方法を用いて、例えば直接融合により、例えば融合タンパク質をコードする単一ヌクレオチド構築物を用いることにより（ここで、上記融合タンパク質は、ｄＡｂに対してＮ−またはＣ−末端に位置する半減期延長部分を有する単一ポリペプチド鎖としてコードされる）、接合され得る。代替的には、接合は、部分間にペプチドリンカー、例えばＷＯ  ０３０７６５６７またはＷＯ  ２００４００３０１９に記載されたようなペプチドリンカー（これらのリンカー開示は、参照により本発明の開示中に組み入れられて、本発明に用いるための例を提供する）を用いることにより、達成され得る。典型的には、in vivoで血清半減期を拡大するポリペプチドは、in vivoで天然に生じる、そして生物体（例えばヒト）から望ましくない物質を除去する内因性機序による分解または除去を阻止するポリペプチドである。例えば、in vivoで血清半減期を拡大するポリペプチドは、細胞外マトリックスからのタンパク質、血中に見出されるタンパク質、血液脳関門に、または神経組織中に見出されるタンパク質、腎臓、肝臓、肺、心臓、皮膚または骨に限局されるタンパク質、ストレスタンパク質、疾患特異的タンパク質、あるいはＦｃ輸送に関与するタンパク質から選択され得る。
【０１３６】
本発明のｄＡｂは、第二免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合される第一免疫グロブリン単一可変ドメインを含有する融合タンパク質としてフォーマットされ得る。所望により、このようなフォーマットは、半減期延長部分をさらに含み得る。例えば、リガンドは、血清アルブミンに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合される第二免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合される第一免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得る。
【０１３７】
一般的に、標的に対する結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチドドメインの配向は、リガンドがリンカーを含んでいてもいなくても、設計選択の問題である。しかしながら、いくつかの配向は、リンカーがあってもなくても、他の配向より良好な結合特性を提供する。全ての配向（例えば、ｄＡｂ１−リンカー−ｄＡｂ２；ｄＡｂ２−リンカー−ｄＡｂ１）が本発明に包含され、所望の結合特性を提供する配向を含有するリガンドは、スクリーニングにより容易に同定され得る。
【０１３８】
本発明によるｄＡｂは、ｄＡｂ単量体、二量体および三量体を含めて、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの一方または両方と、任意にヒンジ領域を含む抗体Ｆｃ領域と連結され得る。例えば、単一ヌクレオチド配列としてＦｃ領域に連結されるリガンドをコードするベクターを用いて、このようなポリペプチドを調製し得る。
【０１３９】
本発明の実施形態において、ｄＡｂは、例えば、ＷＯ２００８１４９１４７に記載されたようなメタノール資化酵母または大腸菌Ｅ．Ｇ．による発現に関して最適化されたコドン最適化ヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【実施例１】
【０１４０】
ウサギの眼へのＤＯＭ１５−２６−５９３（ｍｙｃタグ化抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂ）の局所的送達：
ＤＯＭ−１５−２６−５９３は、ＷＯ２００８１４９１４７に記載されたように選択され、調製され得るし、図１ａに示したアミノ酸配列（配列番号１）を有する。
【０１４１】
ｍｙｃタグ化ＤＯＭ１５−２６−５９３（図１ａに示したアミノ酸配列（配列番号１）を有するＤｏｍ１５−２６−５９３  ｄＡｂを調製し、ｃ−ｍｙｃタグ化抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂとしてこの実験に用いた）を、１０４ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）トゥイーン８０、０．５％（ｗ／ｖ）カプリン酸ナトリウム、ならびに０．３％または１．５％（ｗ／ｖ）ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）を補足した５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に製剤化された２ｍｇ／ｍｌの濃度の内毒素無含有調製物として調製した。成体のチンチラバスタード・ウサギを、Charles River(Germany)から入手した。使用前に、動物を馴化させた。６匹の雌ウサギの左眼に、４時間の期間に亘って２０分毎に、抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂの２ｍｇ／ｍｌ溶液５０μｌを投与した。各投与は、結膜嚢下に入れた。３匹には０．３％ＨＰＭＣ中に製剤化した抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂを投与し、３匹には１．５％ＨＰＭＣ中に製剤化した薬剤を用いた。最終投与の２時間後に、動物を屠殺した。安楽死が確証された時から出来るだけ近い時点で、各動物から両眼を摘出した。各眼をＰＢＳ中で洗浄して、過剰量の薬剤をその表面から除去した。眼房水および硝子体液の試料を収集し、分析前に凍結保存した（−２０℃）。サンドイッチＥＬＩＳＡ検定を用いて、存在するＤＯＭ１５−２６−５９３（抗ＶＥＧＦ−ｄＡｂ）の濃度に関して、眼房水および硝子体液の試料を試験した。この場合、ｄＡｂを組換えヒトＶＥＧＦタンパク質被覆プレート上に捕捉し、ｃ−ｍｙｃタグに関して特異性を有する抗体を用いて検出した。
【０１４２】
上記のＶＥＧＦ  ｄＡｂＥＬＩＳＡは、以下のように実施した：
本検定は、ＶＥＧＦ  ｄＡｂを捕捉するために、Immunsorbプレート（Nuncから入手）の表面に被覆される組換えヒトＶＥＧＦ（ｒＶＥＧＦ、R&D Systemsから入手）を用いる。プレートを洗浄して、任意の非結合ｄＡｂを除去した。その後、ＶＥＧＦ  ｄａｂのＭｙｃタグに対する抗体（Sigmaから入手）を用いて、結合ｄＡｂを検出した。過剰量の抗体を洗浄により除去し、抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ接合体（Sigma）を用いて結合抗ｍｙｃ抗体を検出した。ＴＭＢ溶液を用いて検定を発現させ、酸を用いて停止した。検定からのシグナルは、ｄＡｂの量と比例する。検定における段階を以下に要約する：
プレートの被覆：
１．十分量のｒＶＥＧＦを０．２５μｇ／ｍｌで調製して、プレートを被覆した（各ＥＬＩＳＡプレートに関して５ｍｌ）。これを、各プレートに関して、ストックＶＥＧＦ２５μＬを５ｍＬの炭酸塩コーティング緩衝液（０．２Ｍ炭酸−重炭酸ナトリウムコーティング緩衝液、ｐＨ９．４（Pierce、カタログ番号２８３８２））に添加し、転倒混合することによって実行した。
【０１４３】
２．ｒＶＥＧＦ（０．２５μｇ／ｍＬ）溶液５０μＬを、マルチチャンネルピペットを用いてImmunsorb９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加した。
【０１４４】
３．プレートにプラスチック蓋を被せて、４℃で約４２時間保存した。
【０１４５】
プレートの洗浄およびブロッキング：
４．プレートを４℃貯蔵から取り出した。
【０１４６】
５．各プレートを、ＰＢＳ＋０．１％トゥイーン２０で６回洗浄した。
【０１４７】
６．検定ブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）１００μＬを、各プレートの全ウェルに添加した。
【０１４８】
７．プレートを、１時間撹拌しながら室温でインキュベートした。
【０１４９】
試料および標準物質の調製：
８．標準物質および試料を、プレートをブロッキングする間、検定希釈液（０．１％ＢＳＡ／０．０５％トゥイーン２０／ＰＢＳ）中に希釈した。標準物質（参照物質、すなわちＤｏｍ１５−２６−５９３）を連続（１０倍）希釈して、対数希釈曲線を作成した。
【０１５０】
試料の添加：
９．ブロッキングしたプレートを洗浄した（上記６．）。
【０１５１】
１０．希釈試料または標準物質５０μｌを、適切なウェルに添加した。５０μｌ／ウェル検定希釈液をウェルに添加して、陰性対照として用いた。
【０１５２】
１１．撹拌しながら室温で２時間、プレートをインキュベートした。
【０１５３】
１２．プレートを６回洗浄し、ブロット乾燥した（上記６．）。
【０１５４】
１３．全ウェルに、１：５００に希釈した（検定希釈液：０．１％ＢＳＡ／０．０５％トゥイーン２０／ＰＢＳ中）抗ｍｙｃ抗体  ５０μＬ（９Ｅ１０ Sigma Ｍ５５４６）を添加した（すなわち、各プレートに関して、抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）１０μＬを検定希釈液５ｍｌに添加した）。
【０１５５】
１４．室温で少なくとも１時間、ロッカー上でプレートをインキュベートした。
【０１５６】
１５．プレートを６回洗浄し、ブロット乾燥した（上記６．）。
【０１５７】
１６．５０μＬの抗マウスＩｇ  ＨＲＰ（SigmaＡ９３０９）を１：１００００で全ウェルに添加した（すなわち、抗マウスＩｇ  ＨＲＰ抗体５μＬを、検定希釈液（０．１％ＢＳＡ／０．０５％トゥイーン２０／ＰＢＳ）４５μＬに添加することにより、ストック抗体を１：１０に希釈する）。各プレートに関して、１：１０希釈ストック５μＬを検定希釈液５ｍｌに添加する。
【０１５８】
１７．室温で少なくとも１時間、ロッカー上でプレートをインキュベートした。
【０１５９】
１８．プレートを６回洗浄し、ブロット乾燥した（上記６．）。
【０１６０】
１９．ＴＭＢ基質５０μＬを全ウェルに添加した。この検定の発現は非常に迅速であるので、一度に３つ以下のプレートにＴＭＢを添加することが望ましい。ＴＭＢは、冷蔵庫から直接、あるいは室温で用いられ得る。
【０１６１】
２０．（一旦、十分に発色したら、）全てのウェルに１Ｍ  ＨＣｌ  ５０μＬを添加することにより、反応を停止させた。
【０１６２】
２１．プレートを、９６ウェルプレート読取器で４５０ｎｍで読み取った。
【０１６３】
結果：
結果を表１に示す。投与スケジュールは十分に耐容されて、発赤、刺激性または異常動物行動の徴候は観察されなかった。処置および対側（非処置）眼から得られた硝子体液および眼房水試料中に存在する抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂ（ＤＯＭ１５−２６−５９３）のレベルを調べるために実行されるＥＬＩＳＡ検定の結果は、検出されたｄＡｂのほとんどが処置眼の硝子体液中に存在する、ということを示した。硝子体液中に最高濃度を有したウサギ（動物３）は、処置眼の眼房水中に存在する検出レベルの抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂも示した。
【０１６４】
１．５％ＨＰＭＣ（より粘性の溶液である）中に製剤化されたｄＡｂは、より流動性の０．３％ＨＰＭＣ含有製剤より有効に各投与後に、眼中に保持されると思われる、ということも観察された。低ＨＰＭＣ濃度で投与されたウサギは、それを瞬きして出すことにより、その後の投与物質を多少失うと思われた。
【表１】
2012509852.tif 000003
【０１６５】
結論：
抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂの用量を、結膜嚢中に入れた。多少のｄＡｂは角膜を通り抜けて、その後、眼房水中に検出され得る、と予測された。意外にも、検出された抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂの大部分は硝子体液中に存在し、この観察は、後眼房に進入するために強膜および脈絡膜を通して眼窩から分散することにより眼に入る抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂと一致する。
【０１６６】
ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＭＣ）は、増粘剤として製剤中に含まれた。１．５％製剤は、より効果的に処置眼中に保持されると思われた。より流動性の０．３％製剤は十分には保持されず、これが、この群における３羽のウサギのうちの２羽で観察された対側眼への抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂの移動に関与し得る。
【実施例２】
【０１６７】
ウサギの眼への硝子体内投与後のＤＯＭ１５−２６−５９３の薬物動態：
硝子体液中へのＤＯＭ１５−２６−５９３の直接注入後に、抗ＶＥＧＦ免疫グロブリン単一可変ドメイン抗体（抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂ）ＤＯＭ１５−２６−５９３が眼中に保持される持続期間を調べるために、実験を実行した。図１ａに示したアミノ酸配列（配列番号１）を有するＤｏｍ１５−２６−５９３  ｄＡｂを調製し（１０４ｍＭ塩化ナトリウム、0.02％（ｗ／ｖ）トゥイーン８０を補足した５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に製剤化された２ｍｇ／ｍｌ濃度）、この実験においてｃ−ｍｙｃ標的化抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂとして用いた。成体のチンチラバスタード・ウサギを、Charles River(Germany)から入手した。使用前に、動物を馴化させた。各ウサギを麻酔して、ｃ−ｍｙｃタグ化抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂ（ＤＯＭ１５−２６−５９３）の２ｍｇ／ｍｌ溶液（実施例１に記載したように調製した溶液）１０μｌを左眼の硝子体液中に直接注入した（総量２０μｇ）。注入後の種々の時点（２、２４および３０時間）でウサギを安楽死させて、両眼を摘出し、眼房水および硝子体液の試料を収集した。これらの試料を、分析前に凍結保存した（−２０℃）。サンドイッチＥＬＩＳＡ検定を用いて、存在するＤＯＭ１５−２６−５９３の濃度に関して、眼房水および硝子体液の試料を試験した。この場合、ｄＡｂを組換えＶＥＧＦタンパク質被覆プレート上に捕捉し、ｃ−ｍｙｃタグに関して特異性を有する抗体を用いて検出した。
【０１６８】
結果：
ＤＯＭ１５−２６−５９３（抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂ）の濃度を、以下の表２に示す：
【表２】
2012509852.tif 000004
【０１６９】
結論：
実験の結果は、ＤＯＭ１５−２６−５９３の濃度が投与後２４時間目の注入濃度に近いレベルに保持された、ということを示した。ドメイン抗体は、投与後２４および３０時間目に硝子体液中に存在する。
【０１７０】
低濃度のＤＯＭ１５−２６−５９３（抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂ）が、処置眼のいくつかの眼房液中で検出された。しかしながら、対側非処置眼へのＤＯＭ１５−２６−５９３の移入は最小であった。
【実施例３】
【０１７１】
ラットレーザー誘導脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）モデル：
５匹の２〜４月齢雌Dark Agouti（ＤＡ）ラットの群において、実験的脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）を片側で誘導した。レーザー光凝固（ＰＣ）を用いて、麻酔ラットのブルッフ膜を破裂させた。スリットランプ眼底検査鏡に取り付けられたダイオード励起５３２ｎｍアルゴンレーザー（Novus Omni, Coherent Inc., Santa Clara, CA）、ならびに視力（ocular power）を中和するために角膜に適用されるハンドヘルド平凹コンタクトレンズ（Moorfields Eye Hospital, London, UK）を用いて、色素レーザーＰＣを実施した。５つの病変（５３２ｎｍ、１５０ｍＷ、０．２秒、直径２００μｍ）を、各実験動物の片眼に作成した。視神経を中心に置いて半径５００μｍで、大きな血管を避けて、乳頭周囲分布および標準化方式で、病変を作成した。レーザー損傷の形態学的終点を、ブルッフ膜の崩壊に関連した徴候である空洞気泡の一過性出現として同定した。気泡の形成を生じないレーザースポットを、分析から除外した。レーザーＣＮＶ誘導直後に、各動物に（視神経円板を中心にして）５μＬ容積で硝子体内投与した（病変が作成された網膜域を被覆するのに十分な容積が存在すると算定されたので、この容積を選択した）。１０４ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）トゥイーン８０を補足した５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中に２ｍｇ／ｍｌの濃度として、ｄＡｂを処方した。５μＬ容積は、５０μｇの抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂ（ＤＯＭ１５−２６−５９３；図１ａに示したアミノ酸配列（配列番号１）を有する）、５０μｇの抗ＶＥＧＦ  ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃ融合体（図１ｂに示したアミノ酸配列（配列番号２）を有する）（あるいは化合物なし（ビヒクルのみ、陰性対照））を含有した。病変生成および注入後７および１４日目に、共焦点高分解能ＳＬＯ蛍光眼底造影（０．２ｍｌの１０％腹腔内注入フルオレセインナトリウム、ＦＳ）およびＯＣＴ（Heidelberg Spectralis, Heidelberg, Germany）を用いて、ＣＮＶおよび関連漏出のin vivo画像データを生成した。ベースライン反射率（４８８ｎｍおよび７９０ｎｍでの）および自己蛍光（励起  ４８８ｎｍ、発光  ＞４９８ｎｍ）画像をＦＳの注入前に作成して、蛍光眼底造影画像における病変の位置を示す手助けをした。ＦＳ注入直後に、動静脈相を記録した。その後、注入の１分後および４分後に再び、蛍光眼底造影を記録した。後期蛍光眼底造影の半定量的査定により、薬剤治療の効果を評価した。漏出は、後期血管撮影像において時間に伴ってサイズを増大する過蛍光病変の存在として定義された。後期蛍光眼底造影における染色の強度および面積を、遮蔽方式で２名の実験者が等級づけした。特定病変に関して示された２つのスコアが一致しなかった場合、高いほうのスコアを分析のために用いた。このような矛盾するスコアづけは分析された病変の＜１０％で観察され、矛盾は一等級より大きくはなかった。遮蔽方式で試験を実行し、一旦データがすべて収集されたら、物質の遮蔽を解いた。
【０１７２】
結果
結果を、表３で以下に示す。ラット網膜にレーザー熱傷を用いた脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）の誘導後７および１４日目に、蛍光眼底造影を用いて、各病変を観察した。病変を、以下のように等級分けした：等級０＝漏出なし、等級１＝小漏出、等級２＝中等度漏出、および等級３＝大漏出。抗血管内皮細胞増殖因子ドメイン抗体（抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂ、ＤＯＭ１５−２６−５９３）、ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃ融合体で硝子体内処置されたラットの群に関する、ならびに陰性対照ビヒクル投与群に関する結果を、以下に表記する。結果は、抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂ（ＤＯＭ１５−２６−５９３）またはＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃ融合体による処置が、対照（擬似処置）ラットと比較して、新血管新生および漏出の程度を低減した、ということを示す。
【表３】
2012509852.tif 000005
【０１７３】
結論：
結果は、ＲＰＥ−脈絡膜のレーザー光凝固により誘導される実験的脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）が蛍光眼底造影により特性化されるラットモデルにおいて、ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃ融合体（抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂ−Ｆｃ）が有効であった、ということを示した。ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃ融合体に関する結果は、７および１４日目の両方での対照ビヒクル投与群より有意に良好であった。この群は、抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂ（ＤＯＭ１５−２６−５９３）群よりわずかに高い活性を保持すると思われた。しかしながら、抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂ（ＤＯＭ１５−２６−５９３）も有効であった（レーザー誘導性損傷後７および１４日目の両方で、対照より有意に良好であった）。
【０１７４】
これらの結果は、抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂ（ＤＯＭ１５−２６−５９３）および抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂ−Ｆｃが実験的ラットＣＮＶモデルにおいて有効であった、ということを示す。眼疾患のin vivo齧歯類モデルにおける効能についてのこの実証は、ドメイン抗体が加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）における脈絡膜新血管新生の治療に有益であり得る、ということを示す。
【実施例４】
【０１７５】
ウサギへの抗ＴＮＦ−α抗体、Ｆｃ−フォーマット化抗ＶＥＧＦ  ｄＡｂ、ＰＥＧ化抗ＩＬ−１  ｄＡｂおよび抗ＩＬ−１  ｄＡｂの局所送達
方法
雌成体チンチラバスタード・ウサギを、Charles River(Germany)から入手した。使用前に、動物を馴化させた。投与の開始の５日前に、全ウサギの周縁耳静脈から血液試料を採取した。血液を室温で凝固させて、遠心分離（１２０００ｒｐｍ／２分）して、血清を分離した。血清を新しい試験管に移して、凍結保存した（−２０℃）。
【０１７６】
ＤＯＭ４−１３０−５４の調製および選択は、ＷＯ  ２００７０６３３１１に、そしてＷＯ２００８１４９１４９にも記載されている。Ｄｏｍ０４００を調製するために、ＤＯＭ４−１３０−５４  ｄＡｂ配列を得て、位置８０のシステインがＤＯＭ４−１３０−５４  ｄＡｂ中に存在するプロリンに取って代わり、このｄＡｂが次に、ｄＡｂの位置８０の遊離システインとの標準マレイミドカップリングにより、４０ＫＤａ線状ＰＥＧ分子（NOF Corp., Europe）に付着される。
【０１７７】
裸フォーマット（ＤＯＭ４−１３０−５４；ＩＬ−１裸ｄＡｂ、１２．０２６ｋＤａ；図３に示したアミノ酸配列（配列番号５）を有する）またはＰＥＧ化フォーマット（ＤＯＭ０４００ＰＥＧ；ＩＬ−１ＰＥＧ化ｄＡｂ、５２．０３２ｋＤａ；図２に示したアミノ酸配列（配列番号４）を有する）でのＩＬ−１に対する特異性を有するドメイン抗体（ｄＡｂ）を、２０ｍＭコハク酸塩、５％ソルビトール、ｐＨ６．０中でそれぞれ８．５および１０．４ｍｇ／ｍｌで製剤化した。Ｆｃフォーマット化α−ＶＥＧＦ  ｄＡｂ（図１ｂに示したアミノ酸配列（配列番号２）を有するＶＥＧＦ１５−２６−５９３）を、５０ｍＭリン酸塩、１％Ｌ−アルギニン、０．０５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％ポリソルベートおよび０．３％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中で９．１ｍｇ／ｍｌで製剤化した。ＴＮＦ−α（市販）に対する特異性を有するモノクローナル抗体を、滅菌蒸留水をもちいて、１０ｍｇ／ｍｌでの凍結乾燥調製物から再構成した。４羽のウサギの群の左眼に、４．２日の期間に亘って１日５回（３時間間隔で）、投与した。各投与日間、動物には１２時間（一晩）の休止期間を与えた。各用量は、上眼瞼の下に入れられる関連化合物の溶液２５μｌで構成された。投与後、少なくとも３０秒間、動物を静止させた。投与スケジュールの前および最中の種々の時点で、多少の流体を吸収するために眼瞼下に紙の小吸収片を入れることにより、涙液（涙）の試料を収集した。涙液を含浸した紙の領域を、リン酸塩緩衝生理食塩水２００μＬを含有する試験管中に入れた。試験管を遠心分離（１２０００ｒｐｍ／２分）し、紙を取り出し、回収試料を分析前に凍結保存した（−２０℃）。
【０１７８】
最終投与の１時間後、全ウサギの周縁耳静脈から血液試料を採取した。血液を凝固させて、その結果、上記の方法により血清を分離し、保存し得た。その直後に、動物を安楽死させた。安楽死が確証された時から出来るだけ近い時点で、各動物から両眼を摘出した。各眼をＰＢＳ中で洗浄して、過剰量の薬剤をその表面から除去した。眼房水および硝子体液の試料を収集し、分析前に凍結保存した（−２０℃）。各検定で試験する前に、硝子体液を単一凍結／解凍サイクルに付した。眼を切り出して、網膜／脈絡膜を採取した。網膜／脈絡膜試料を計量し、１００μｌの溶解緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４；０．１％ＳＤＳ；プロテイナーゼ阻害剤カクテル（Roche）を有する）を、各々１５ｍｇの網膜／脈絡膜組織に添加した。２分周期の反復高および低周波バーストを用いる超音波破砕（Covaris S2 Sonolab Single）を用いて、試料をホモジナイズした。網膜／脈絡膜の試料を、微量遠心管（Heraeus）中で遠心分離（１２０００ｒｐｍ／２分）した。上清を新しい試験管に移して、凍結保存した（−２０℃）。
【０１７９】
サンドイッチフォーマットＥＬＩＳＡ検定を用いて、各試料の薬剤含量を試験し、測定した。α−ＴＮＦ−α抗体を、組換えヒトＴＮＦ−αタンパク質（Peprotech）で被覆したプレートを用いて捕捉し、アルカリホスファターゼ接合抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体（Sigma）を用いて検出した。ＩＬ−１およびＰＥＧ化ＩＬ−１  ｄＡｂを、組換えヒトＩＬ−１受容体１型Ｆｃ（Axxora）で被覆したプレートを用いて捕捉し、プロテインＬ−ペルオキシダーゼ（Sigma）を用いて検出した。ＶＥＧＦ−Ｆｃフォーマット化ｄＡｂを、組換えＶＥＧＦタンパク質の企業内調製物を用いて捕捉し、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）アルカリホスファターゼ接合抗体（Sigma）で検出した。
【０１８０】
結果
全症例において、薬剤投与は良好に耐容され、発赤、刺激性または異常動物行動の徴候はなかった。
【０１８１】
眼房水および硝子体液中の、ならびに網膜／脈絡膜中の、種々のフォーマットのドメイン抗体の、ならびにα−ＴＮＦ−α抗体に関する結果を、以下の表に示す。結果を、（各試料が三重反復実験で試験された３つの別個の検定からの）平均濃度に関して、＋／−標準偏差（括弧内に示す）として示す。
【表４】
2012509852.tif 000006
【表５】
2012509852.tif 000007
【表６】
2012509852.tif 000008
【０１８２】
投与２０および２１の直前に、ウサギから涙液（涙）試料を採取した。存在する薬剤の濃度に関する結果を、それぞれ表４および５に示す。左（投与）眼の全てにおいて、投与物質を検出し（しかし、個々のウサギ間の濃度には非常に多くの変動が認められた）、ほとんどの対側（投与されなかった右）眼への多少の移送も起きていた。投与２０の１２時間後には、投与物質は依然として存在した。ＤＯＭ０４００ＰＥＧ（ＰＥＧ化ＩＬ−１  ｄＡｂ）およびＶＥＧＦ−Ｆｃ（１５−２６−５９３）は、裸ＩＬ−１  ｄＡｂ（ＤＯＭ４−１３０−５４）より高い濃度で、投与２０および２１間の１２時間の期間中、保持されると思われた。
【０１８３】
種々のフォーマットのドメイン抗体の濃度に関する、ならびに涙液（涙）中の抗体に関する結果を、以下の表に示す（左眼のみに投与した）
【表７】
2012509852.tif 000009
【表８】
2012509852.tif 000010
【０１８４】
種々のフォーマットのドメイン抗体の濃度に関する、ならびにプレブリード（prebleed）中および血清中の抗体に関する結果を、以下の表に示す：
【表９】
2012509852.tif 000011
【実施例５】
【０１８５】
α−ＴＮＦ−αＲ１  ｄＡｂの局所的送達
方法
成体雄チンチラバスタード・ウサギを、Charles River(Germany)から入手した。使用前に、動物を馴化させた。投与の開始の７日前に、全ウサギの周縁耳静脈から血液試料を採取した。血液を室温で凝固させた後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ／２分）して、血清を分離した。血清を新しい試験管に移して、凍結保存した（−２０℃）。
【０１８６】
図４に示したアミノ酸配列（配列番号６）を有するＤｏｍ  １ｈ−１３１−２０６（Ｄｏｍ  １ｈ−１３１−２０６の調製および選択は、ＷＯ２００８１４９１４８に記載されている）であるＴＮＦ−αＲ１（すなわち、抗ＴＮＦα受容体１型ｄＡｂ）に対する特異性を有するドメイン抗体（ｄＡｂ）を、１０ｍｇ／ｍｌでリン酸塩緩衝液中に製剤化した。４羽のウサギの群の左眼に、単一日に１０回（１時間間隔で）、投与した。各用量は、上眼瞼の下に入れられる１０ｍｇ／ｍｌ  α−ＴＮＦ−αＲ１  ｄＡｂ溶液５０μｌで構成された。投与後、少なくとも３０秒間、動物を静止させた。投与スケジュールの前および最中の種々の時点で、多少の流体を吸収するために眼瞼下に紙の小吸収片を入れることにより、涙液（涙）の試料を収集した。涙液を含浸した紙の領域を、リン酸塩緩衝生理食塩水２００μＬを含有する試験管中に入れた。試験管を遠心分離（１２０００ｒｐｍ／２分）し、紙を取り出し、回収試料を分析前に凍結保存した（−２０℃）。
【０１８７】
最終投与の１時間後、全ウサギの周縁耳静脈から血液試料を採取した。血液を凝固させて、その結果、上記の方法により血清を分離し得た。その直後に、動物を安楽死させた。安楽死が確証された時から出来るだけ近い時点で、各動物から両眼を摘出した。各眼をＰＢＳ中で洗浄して、過剰量の薬剤をその表面から除去した。眼房水および硝子体液の試料を収集し、分析前に凍結保存した（−２０℃）。各検定で試験する前に、硝子体液を１回の凍結／解凍サイクルに付した。眼を切り出して、網膜／脈絡膜を採取した。網膜／脈絡膜試料を計量し、９００μｌの溶解緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４；０．１％ＳＤＳ；プロテイナーゼ阻害剤カクテル（Roche）を有する）を、各試料に添加した。２分周期の反復高および低周波バーストを用いる超音波破砕（Covaris S2 Sonolab Single）を用いて、試料をホモジナイズした。網膜／脈絡膜の試料を、微量遠心管（Heraeus）中で遠心分離（１２０００ｒｐｍ／２分）した。上清を新しい試験管に移して、凍結保存した（−２０℃）。サンドイッチＥＬＩＳＡ検定により、α−ＴＮＦ−αＲ１  ｄＡｂの濃度に関して試料を試験した。この場合、ｄＡｂを、組換えヒトＴＮＦ  Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／Ｆｃキメラ（R+D Systems）で被覆したプレートを用いて捕捉し、ヒトＩｇＧ（Ｆ（ａｂ）２）断片（Thermo）に対する特異性を用いて検出した。この抗体は接合されておらず、したがって、抗ヤギ／ヒツジ−ＨＲＰ試薬（Sigma）を用いて、結合抗体を検出した。
【０１８８】
結果
薬剤投与は良好に耐容され、発赤、刺激性または異常動物行動の徴候は観察されなかった。
【０１８９】
眼内液および血清中のα−ＴＮＦ−αＲ１  ｄＡｂの濃度を、三重反復実験で試験した試料に関して示す。試験した眼試料のすべてにおいて、α−ＴＮＦ−αＲ１  ｄＡｂを検出した。
【表１０】
2012509852.tif 000012
【０１９０】
投与２、６、１０の直前に、同時に、最終投与の１時間後に、ウサギから涙液（涙）試料を採取した。試料中に検出されたα−ＴＮＦ−αＲ１  ｄＡｂの濃度を表８に示す。左（投与）眼の全てにおいて、α−ＴＮＦ−αＲ１  ｄＡｂを検出し、ほとんどの対側（投与されなかった右）眼への多少の移送も起きていた。
【表１１】
2012509852.tif 000013
【０１９１】
初回投与前ならびに安楽死時に血清に関して血液を採取した。その結果生じたデータを、表９に示す。最終投与の１時間後に、４羽のウサギの各々から得た血清中で、低濃度のα−ＴＮＦ−αＲ１  ｄＡｂを検出した。
【表１２】
2012509852.tif 000014
【図１】
2012509852.tif 000015
【図２】
2012509852.tif 000016
【図３】
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【図４】
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【配列表】
2012509852000001.app
【国際調査報告】
2012509852.tif 000019
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