(57)【要約】  本発明は、転移性悪性黒色腫並びに、これらに限定されるものではないが、リンパ腫、肉腫、癌腫、及び神経膠腫をはじめとする他の癌のための、一般式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のトリアゼン類似体、それらの互変異性形態、立体異性体、多形体、水和物、溶媒和物、及びその薬剤的に許容される塩を開示する。本発明はさらに、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の前記トリアゼン類似体、ならびにそれらの薬剤的に許容される組成物の調製法も開示する。【選択図】図１０【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2012502900.tif 000037
一般式Ｉ
（式中、
Ｒは、独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨから選択され；
Ｒ１は、独立して、ＯＨ、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨでから選択され；
Ｒ２、及びＲ３の少なくとも１つは、Ｈ、Ｎ＝Ｎ−Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ＝Ｎ−ＮＨＣＨ３、Ｎ＝Ｎ−Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨ、ＣＯＮＨＲ４、ＣＯＮＲ４Ｒ５、ＣＯＮＨＮＨ２、ＣＯＮＨＮＨＲ４、ＣＯＮＨＮＲ４Ｒ５、ＣＯＯＣＨ３、ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＯＨ、ＣＯＳＨ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＲ４、ＳＯ２ＮＲ４Ｒ５、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２ＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨ、ＮＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＯＯＨ、ＮＯ２、ＣＦ３、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＣＣｌ３、Ｐｈ（Ｃ６Ｈ５）、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ｎ−Ｃ３Ｈ７、イソ−Ｃ３Ｈ７、ｎ−Ｃ４Ｈ９、イソ−Ｃ４Ｈ９、ｔｅｒｔ−Ｃ４Ｈ９、ＯＨ、ＯＣＨ３、NH２、NHCH３など電子求引基及び電子供与基から選択され；
Ｒ４及びＲ５は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキロール、アルキルアミンなどから選択され；
Ｘ、Ｙ、及びＺは、独立して、Ｃ、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択され、したがって、前記複素環式芳香族部分の結果として得られる５員環系は、非置換及び置換されたチオフェン、フラン、チアゾール、イソチアゾール、及びフラゾールである）
の化合物又はその薬剤的に許容される塩。
【請求項２】
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボキサミド；
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−４−ブロモチオフェン−２−カルボキサミド；
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−５−ニトロチオフェン−２−カルボキサミド；
４−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−３−メトキシチオフェン−２，５−ジカルボキサミド；
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−５−フェニルチオフェン−２−カルボキサミド；
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸；
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−５−ニトロチオフェン−２−カルボン酸；
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−５−フェニルチオフェン−２−カルボン酸；
｛３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］（２−チエニル）｝−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−カルボキサミド；
｛３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］（２−チエニル）｝−Ｎ−メチルカルボキサミド；
Ｎ−（２−アミノエチル）｛３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］（２−チエニル）｝−カルボキサミド；
４−［ジメチルアミノ］ジアゼニル］チオフェン−２−カルボキサミド；
４−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−３−カルボキサミド；
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸のカリウム塩
を特に含む、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
式（ＩＩ）：
【化２】
2012502900.tif 000038
一般式ＩＩ
（式中、
Ｒ１、及びＲ２の少なくとも１つは、独立して、Ｈ、Ｎ＝Ｎ−Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ＝Ｎ−ＮＨＣＨ３、Ｎ＝Ｎ−Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ４、ＣＯＮＲ４Ｒ５、ＣＯＮＨＮＨ２、ＣＯＮＨＮＨＲ４、ＣＯＮＨＮＲ４Ｒ５、ＣＯＯＣＨ３、ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＯＨ、ＣＯＳＨ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＲ４、ＳＯ２ＮＲ４Ｒ５、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２ＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨ、ＮＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＯＯＨ、ＮＯ２、ＣＦ３、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＣＣｌ３、Ｐｈ（Ｃ６Ｈ５）、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ｎ−Ｃ３Ｈ７、イソ−Ｃ３Ｈ７、ｎ−Ｃ４Ｈ９、イソ−Ｃ４Ｈ９、ｔｅｒｔ−Ｃ４Ｈ９、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３など電子求引基及び電子供与基から選択され；
Ｒ４及びＲ５は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキロール、アルキルアミンなどから選択され；
Ｘ、Ｙ、及びＺは、独立して、Ｃ、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択され、したがって前記縮合二環系の複素環式芳香族５員環は、非置換及び置換されたチオフェン、フラン、チアゾール、イソチアゾール、及びフラゾールであり；一般式（ＩＩ）の化合物は、３−メチルチオフェノ［３，２−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン（Ｘ＝Ｙ＝Ｃ；Ｚ＝Ｓ；Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ）でない）
の化合物又はその薬剤的に許容される塩。
【請求項４】
３−メチルチオフェノ［２，３−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン；
３−メチル−６−ニトロチオフェノ［２，３−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン；
６−アミノ−３−メチルチオフェノ［２，３−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン；
３−メチル−６−フェニルチオフェノ［３，２−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン；
を特に含む、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
請求項１及び３記載の式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）の少なくとも１つの化合物又はその薬剤的に許容される塩、並びに薬剤的に許容される希釈剤又は担体を含む医薬組成物。
【請求項６】
請求項１及び３記載の式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）の少なくとも１つの化合物又はその薬剤的に許容される塩、並びに少なくとも１つの化学療法剤及び場合によって薬剤的に許容される希釈剤又は担体を含む、医薬組成物。
【請求項７】
前記化学療法剤が、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、テモゾラミド、メトトレキサート、ドキソルビシン、シトキサン、５−フルオロウラシル、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、イリノテカン、トポテカン、パクリタキセル、ドセタキセル、タキソテレ、タキソール、タモキシフェン、ゲフィチニブ、アドリアマイシン、ゲムシタビン、メルファラン、ストレプトゾシン、フロキシウリジン、６−メルカプトプリン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、マイトマイシンＣ、アムサクリン、プロカバジン（ｐｒｏｃａｂａｚｉｎｅ）、カペシタビン、アバスチン、ハーセプチン、ベキサール、ベルケード、ゼヴァリン、ゼローダ、アービタックス（セツキシマブ）、リツキシマブ、キャンパス（アレムツズマブ）などからなる群から選択される、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
請求項１及び３記載の式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）の少なくとも１つの化合物又はその薬剤的に許容される塩、及び／又は少なくとも１つの化学療法剤並びに少なくとも１つの生物学的反応修飾剤及び場合によって薬剤的に許容される希釈剤又は担体を含む、医薬組成物。
【請求項９】
前記生物学的反応修飾剤が、モノクローナル抗体、インターフェロン（インターフェロン−γ）、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２）、様々な種類のコロニー刺激因子（ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ）、ＴＮＦ−α受容体遮断薬（ＴＮＦ−α）などからなる群から選択される、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
患者において癌細胞成長を阻害するか又は癌細胞を殺す方法であって、前記患者に治療上有効な量の請求項１〜９記載の化合物を投与することを含む、方法。
【請求項１１】
前記癌が、あらゆる種類（固形、液性、及びリンパ管由来）であり、これらに限定されないが、転移性悪性黒色腫、リンパ腫（ホジキン及び非ホジキン）、肉腫（ユーイング肉腫）、癌腫、脳腫瘍、中枢神経系（ＣＮＳ）転移、神経膠腫、乳癌、前立腺癌、肺癌（小細胞及び非小細胞）、結腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、口腔咽頭扁平上皮癌である、請求項１０記載の癌に罹っている対象を治療する方法。
【請求項１２】
癌細胞が、身体の任意の部分、及びこれらに限定されるものではないが、脳、肺、副腎、下垂体、胸部、前立腺、膵臓、卵巣、胃腸管、腎臓、肝臓、脾臓、睾丸、頸部、食道上部、下部、若しくは中部などの人体の任意の器官由来のあらゆる種類の一次又は二次腫瘍である、請求項１０記載の患者において癌細胞成長を阻害するか、または癌細胞を殺す方法。
【請求項１３】
患者に対して、特に腹腔内（ＩＰ）、静脈内（ＩＶ）、経口（ＰＯ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＣ）、真皮内（ＩＤ）、子宮内、直腸内などをはじめとする任意の様式によって、請求項１〜９記載の化合物を投与する方法。
【請求項１４】
エマルジョン中異なるサイズのナノ粒子を用いて、それを必要とする患者に対して、請求項１〜９記載の化合物を投与する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転移性悪性黒色腫並びに限定されないがリンパ腫、肉腫、癌腫、及び神経膠腫を包含する他の癌についての、一般式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のトリアゼン類似体、それらの互変異性体、立体異性体、多形体、水和物、溶媒和物、及びそれらの薬剤的に許容される塩に関する。
【０００２】
本発明はさらに、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の前記トリアゼン類似体、ならびにそれらの薬剤的に許容される組成物の調製法に関する。
【背景技術】
【０００３】
悪性腫瘍である黒色腫は、メラニンを形成でき、最も一般的には、身体の全ての部分の皮膚及び眼、又はまれに性器、肛門、口腔、若しくは他の部位の粘膜において発生する細胞に由来する。主に成人に起こり、新たに発生するか又は色素性母斑もしくは悪性黒子起源であり得る。初期においては、皮膚の形状は真皮内皮接合部での細胞の増殖により特徴づけられ、これはまもなく隣接する組織に浸潤する。細胞は、細胞質の量及び着色の点で異なり；核は比較的大きく、多くの場合、形状が奇異で、好酸性核小体が突出し；有糸分裂像は多数である傾向にある。黒色腫は多くの場合、広範囲に転移し；所属リンパ節、皮膚、肝臓、肺、及び脳に転移する可能性がある。
【０００４】
１９８５年１月に、環境保護庁（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ：ＥＰＡ）は、地球を宇宙空間からの紫外線（ＵＶ）から保護する地球のオゾン層の減少が、黒色腫をはじめとする皮膚癌の世界的な症例数を増加させることを予測している。ＥＰＡは、２０５０年までに年間２００万例の増加を推定し、２０５０年には、人間の活動（主に長寿命のクロロフルオロカーボン（現在はほとんどの先進国で禁止されている）の大気中への放出）のためにオゾン層は１０％減少すると予想される。公衆衛生の取り組みは、人々に日焼け止めを使用すること、ピークの暴露時間中の屋外活動を回避すること、皮膚を頻繁にセルフチェックすること、及び異常に気づいたら皮膚科医の診察を受けることの奨励を重点的に取り組んできた。高レベルの紫外線への暴露は、白内障及び免疫系の機能不全も促進する可能性がある。
【０００５】
ＵＶ線放射は、特に暴露が赤毛及び色白などの潜在するある遺伝形質と組み合わせて起こった場合、皮膚癌の決定的な危険因子である（１）。皮膚の着色は、色素産生細胞であるメラニン細胞でメラニンが合成され、続いて色素顆粒が隣接するケラチノサイトへ輸送されることから生じる。メラニンは、ＵＶによって細胞質内で生成するフリーラジカルの吸収に重要であり、ＵＶ及び可視光線からの直接的シールドとして作用すると一般的に考えられている（２、３）。
【０００６】
ＵＶ誘発性着色（日焼け）には、ケラチノサイトによるα−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）分泌の誘発が必要である。α−ＭＳＨ及び他の生物活性ペプチドは、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ：Ｐｒｏ−Ｏｐｉｏｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ）の分解産物である（４）。ｐ５３腫瘍抑制遺伝子は、癌における遺伝子変化の最高頻度標的の１つである。ｐ５３は、ＰＯＭＣ遺伝子の転写制御因子であり、メラニン細胞にメラニンを産生させるタンパク質に翻訳され、このメラニンはＵＶ線を吸収することによって皮膚癌を回避する。ｐ５３の直接的突然変異による不活性化は、全てのヒト腫瘍の半分近くにおいて観察される（５）。悪性黒色腫は、間違いなく今日治療するのが最も困難な癌の１つである皮膚癌である。ダカルバジン（ＤＴＩＣ）は、転移性悪性黒色腫を治療するために使用される唯一の薬剤である。しかし、臨床背景において、ダカルバジンの完全寛解（ＣＲ）率は１０％より低く、したがってまだ対処されていない医学的ニーズであり、さらに良好な薬剤が必要とされている。加えて、ダカルバジンはまた、他の有効な薬剤と併用される場合に二次選択療法としてホジキンリンパ腫にも適応される。化学的には、ＤＴＩＣは、次の構造式：
【化１】
2012502900.tif 000002
を有する５−（３，３−ジメチル−１−トリアゼノ）−イミダゾール−４−カルボキサミドである。
【０００７】
しかし、ダカルバジンは肝臓によるインビボ生体内活性化を必要とする。ジメチルトリアゼノ官能基のメチル基の１つは、肝臓ミクロソーム酵素によって、特にシトクロムＰ４５０によって活性化され、酸化されて、その結果、ヒドロキシメチル基になる。したがって、ジメチルトリアゼノ官能基の酸化的モノ脱メチル化反応によって、モノメチルトリアゼンを得る。モノメチルトリアゼン代謝産物である３−メチル−（トリアゼン−１−イル）−イミダゾール−４−カルボキサミド（ＭＴＩＣ）をさらに加水分解して、プリン及び核酸生合成における中間体であることが知られている５−アミノ−イミダゾール−４−カルボキサミド（ＡＩＣ）、及び活性なアルキル化種であると考えられるメチルヒドラジンにする。シトクロムＰ４５０酵素も、ＭＴＩＣの代謝において大した役割を果たさない。テモゾロマイドもまた、ＤＮＡを求核部位でメチル化する類似のイミダゾテトラジンアルキル化剤である。テモゾロマイドは、経口投与可能であり、さらに親油性が高く、自発的にＭＴＩＣに変わり、また吐き気を起こしにくいようである（６）。Ｏ６−メチルグアニン付加物は、ＤＮＡ複製中にミスマッチを起こし、新たに形成されたＤＮＡ鎖に対してシトシンの代わりにチミジンを付加する（７）。優れたＣＮＳ生体内分布のために、テモゾロマイドは、一次脳腫瘍およびＣＮＳ転移のどちらにおいても放射線増感剤として有用である（８〜１１）。テモゾロマイドの薬物動態は子どもで研究され、クリアランスは体表面積と関連する（１２）。テモゾロマイドは、脳転移を有する患者において放射線療法と併用される場合、クオリティ・オブ・ライフを改善する。ダカルバジンと異なり、テモゾロマイドは肉腫に対して活性を有する（１３〜１５）。したがって、肉腫放射線増感において、一次制御のため、ならびに転移の治療のために有用であり得る。テモゾロマイドは、良好な耐容性を示し、副作用が少ない、放射線増感剤である。テモゾロマイドとイリノテカンとの組み合わせは、一部の癌に対しては相加作用以上の効果がある（１６）。著者らは、経験により、再発性ユーイング肉腫及びＤＳＲＣＴにおいて高い奏効率を確認し、これは文献で報告されているよりもさらに高い可能性があることを報告している（１７〜１９）。テモゾロマイド＋イリノテカンの組み合わせは、標準的シクロホスファミドを含むレジメンよりも免疫抑制性が低い（２０）。このことは、ユーイング肉腫において特に重要であり得る。その理由は、これらや他の著者らが、リンパ球回復（すなわち、化学療法の初回サイクル後１５日の絶対リンパ球数＞５００）はユーイング肉腫において有意に高い生存率と関連することを示しているからである（２１、２２）。テモゾロマイド又はダカルバジンはまた、ゲムシタビン及びドキソルビシンリポソームをはじめとする他の薬剤と組み合わせられている（２３、２４）。ＤＴＩＣの血漿からの消失は二相性であり、最初の半減期は１９分であり、最終的半減期は５時間である。腎機能障害及び肝機能障害の患者において、半減期はそれぞれ５５分及び７．２時間延長された。尿中の未変化ＤＴＩＣの平均累積的排出は、６時間で注射された用量の４０％である。ＤＴＩＣ、糸球体濾過ではなく腎細尿管分泌を受ける。治療濃度で、ＤＴＩＣはヒト血漿タンパク質とはっきりとは結合しない。
【０００８】
ヒトにおいて、ＤＴＩＣは広範囲に分解する。未変化ＤＴＩＣに加えて、ＡＩＣは尿中に排出されるＤＴＩＣの主な代謝産物である。ＤＴＩＣの正確な作用機構はわからないが、３つの仮説が立てられている：
１．プリン類似体として作用することによるＤＮＡ合成の阻害
２．アルキル化剤としての作用
３．ＳＨ基との相互作用。
【０００９】
したがって、その細胞毒性がインビボでのメチルカルボニウムイオンの生成に関与する、結果として得られるＭＴＩＣ反応性種の作用の生化学的機構は、主にＤＮＡのアルキル化のためであると考えられる。アルキル化（メチル化）は、主にグアニンのＯ６及びＮ７位で起こる。
【００１０】
あるいは、ＤＴＩＣは、代謝されてモノメチルトリアゼンになる前に、酸化されてまずモノヒドロキシメチルになり、最終的にアルデヒドになる。モノメチルトリアゼンは、酸化的モノ脱メチル化の前のアルデヒド形態で、（スキーム１に図示するように）環化されて環状化合物になり、この化合物は二重らせんＤＮＡ構造を妨害し、癌細胞の複製をブロックする。そして最終的に、第２の代謝産物であるＡＩＣは不活性である。
【００１１】
［スキーム１］  ダカルバジンの作用の生化学的機構
【化２】
2012502900.tif 000003
【００１２】
ダカルバジンのイミダゾール環系は本来親水性である。したがって、当分野では、メラニンとできる限り有効に結合させて、分子の細胞傷害機能を１００パーセント有効にすることが必要とされる。したがって、本発明者らは、増大した親油性を有し、これによってさらに高い標的特異性を提供する新規化合物を提供することを目的とする。したがって、５員複素環式環系を有するチオフェンは、本来親油性であり、メラニンと増大した親和性で有効に結合し得、その結果、有意に低い用量で同じ治療有効性を得ることができ、それ故に毒性を最小限に抑えることができる。このことは、ひいては治療指数（ＴＩ）の枠が大きな高特異性を提供する。一般的に、癌患者の治療に関しては、より大きな治療指数が好ましい。これは、非常に高い最大耐量（ＭＴＤ）の治療レジメンを開始して、最初の化学療法自体において癌細胞に大打撃を与えることが好まれるからである。そうでなければ、生存する癌細胞はＤＮＡ損傷を修復して、その後他の器官へ転移するであろう。加えて、最初の治療で生き残った癌細胞は、必要に応じて再度行われる２回目の化学療法に対して耐性になる。それにまた、第１化学療法から得られる免疫系は弱いので、最適以下の用量が２回目の治療で投与され、これは毒性の一因となる。スキーム１に示す様に、ＤＴＩＣと異なって、チオフェン環系と、腫瘍抗原の表面上のＳＨ基との良好な相互作用の結果、有効性が増大する。これは、硫黄（Ｓ）が大きな原子であり、したがって５員複素環式芳香族チオフェン環系が空間においてフェニル環と類似し、腫瘍部位でスルフヒドリルと良好に相互作用するために、環の残りにその孤立電子対を提供するからである。加えて、その電子配置のために、複素環式芳香族チオフェン環系は、プリン類似体として作用すること、並びにアルキル化剤として作用することによって、ＤＮＡ合成の阻害の目的でＤＴＩＣよりも優れている可能性がある。さらに、ＤＴＩＣとは異なって、アミノイミダゾールカルボキサミド（ＡＩＣ）は不活性であるが、対応するアミノチオフェンカルボキサミド（ＡＴＣ）は環の硫黄からの電子非局在化によってインビボで確実に活性になり、有効性が増大する。したがって、新規トリアゼノチオフェン類似体は、活性の増大に関して、ダカルバジンよりも優れた、構造内に本質的に備わったいくつかの利点を有する。
【００１３】
その生化学的作用機構に加えて、近年、他の化学療法剤と併用することによってダカルバジンの有効性を有意に増大させることが文献でいくつか報告されている（２５、２６）。同様に、臨床前背景で、有効性を有意に増大させるために、異種移植片マウス黒色腫モデルにおいてダカルバジンのナノエマルジョン製剤が使用されている（２７）。同様に、転帰を改善するために、免疫療法、チロシンキナーゼ阻害剤及び血管形成阻害剤を包含する多くの革新的な治療方針が進められている（２８）。文献では、ダカルバジンをインターフェロンと併用した転移性黒色腫の治療は不十分であることが報告されている（２９）。
【００１４】
前述のように、近年、ダカルバジン及びテモゾロマイドは、転移性悪性黒色腫を治療するために広く用いられている化学療法剤である。しかし、成功率は低く、副作用が高い。したがって、有効な薬剤の開発についての医学的要求は満たされておらず、転移性悪性黒色腫は依然として大きな課題である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Fitzpatrick, T.B., Sober, A.J. Sunlight and skin cancer. N. Engl. J. Med., 1985, 313, 818-820.
【非特許文献２】Pathak, M.A., Fanselow, D.L. Photobiology of melanin pigmentation: dose/response of skin to sunlight and its contents. J. Am. Acad. Dermatol., 1983, 9, 724- 733.
【非特許文献３】Riley, P.A. Melanin. Int. J. Biochem. Cell Biol, 1997, 29, 1235-1239.
【非特許文献４】Rutao, C, Hans R., Widlund, E.F., Jennifer, Y. L., Dara, L.W., Viven, E.I., John, D. O., Claire, Y.F., Carl, F. S., Scott, R.G., David, E.F., Cell, 2007, 128, 853-864.
【非特許文献５】Moshe, O., Jiri, B. Cell, 2007, 128, 826-828.
【非特許文献６】Danson, S.J., Middleton, M.R. Temozolomide: a novel oral alkylating agent. Expert Rev. Anticancer Ther., 2001, 1, 13-19.
【非特許文献７】Νagasubramanian, R., DoIa, M.E. Tomozolamide: Realizing the promise and potential. Curr. Opin. Oncol, 2003, 15, 412-418.
【非特許文献８】Lanzetta, G., Campanella, C, Razzi, A., et al. Temozolomide in radio- chemotherapy combined treatment for newly-diagnosed glioblastoma multi-forme: Phase - II clinical trial. Anticancer Res., 2003, 23, 5159-5164.
【非特許文献９】Stripp, R., Mason, W.P., Van den Bent, MJ., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N. Engl. J. Med., 2005, 352, 987-996.
【非特許文献１０】Gilbert, M.R. Advances in the treatment of brain tumors: dawn of a new era? Curr. Oncol. Rep., 2006, 8, 45-49.
【非特許文献１１】Atallah, E., Flaherty, L. Treatment of metastatic malignant melanoma. Curr. Treat. Options Oncol, 2005, 6, 185-193.
【非特許文献１２】Panetta, J.C., Kirstein, M.Ν., Gajjar, A., et al. Population of temezolomide and metabolites in infants and children with primary central nervous system tumors. Cancer Chemother. Pharmacol, 2003, 52, 435-441.
【非特許文献１３】Houghton, P.J., Stewart, C.F., Cheshire, PJ., et al. Anti-tumor activity of tomozolomide combined with irinotecan is partly independent of 06 - methylguanine - DNA methyltransferase and mismatch repair phenotypes in xenograft models. Clin. Cancer Res., 2000, 6, 4110-4118.
【非特許文献１４】Middlemas, D.S., Stuart, C.F., Kirstein, M.N., et al. Biochemical correlates of temozolomide sensitivity in pediatric solid tumor xenograft models. Clin. Cancer Res., 2000, 6, 998-1007.
【非特許文献１５】Aksoy, S., Abali, H., Kilickap, S., et al. Successful treatment of a chemoresistant tumor with temozolomide in an adult patient: report of a recurrent intracranial mesenchymal chondrosarcoma. J. NeurooncoL, 2005, 71, 333-334.
【非特許文献１６】Patel, V.J., Elion, G.B., Houghton, P.J., et al. Schedule-dependent activity of temozolomide plus CPT-I l against a human central nervous system tumor-derived xenograft. CHn. Cancer Res., 2000, 6, 4154-4157.
【非特許文献１７】Anderson, P.M., Pearson, M. Novel therapeutic approaches in pediatric and young adult sarcoma. Curr. Oncol. Rep., 2006, 8, 310-315.
【非特許文献１８】Wagner, L.M., McAllister, N., Goldsby, R.E., et al. Temozolomide and intravenous irinotecan for treatment of advanced Ewing's sarcoma. Pediatr. Blood Cancer, 2007, 48, 132-139.
【非特許文献１９】Wagner, L.M., Crews, K.R., Iacono, L.C., et al. Phase I trial of temozolomide and protracted irinotecan in pediatric patients with refractory solid tumors. Clin. Cancer Res., 2004, 10, 840-848.
【非特許文献２０】Kushner, B.H., Kramer, K., Modak, S., et al. Irinotecan plus temozolomide for relapsed or refractory neuroblastoma. J. Clin. Oncol., 2006, 24, 5271-5276.
【非特許文献２１】De Angulo, G., Hermandez, M., Morales-Arias, J., et al. Early lymphocyte recovery as a prognostic indicator for High-risk Ewing's sarcoma. J. Pediatr. Hematol. Oncol., 2007, 29, 48-52.
【非特許文献２２】DuBois, S.G., Elterman, K., Grier, H.E. Early lymphocyte recovery in Ewing sarcoma. J. Pediatr. Hematol. Oncol, 2007, 29, 351-352.
【非特許文献２３】Losa, R., Fra, J., Lopez-Pousa, A., et al. Phase II study with the combination of gemcitabine and DTIC in patients with advanced soft tissue sarcoma. Cancer Chemother. Pharmacol, 2007, 59, 251-259.
【非特許文献２４】Awada, A., Gil, T., Sales, F., et al. Prolonged schedule of temozolomide (Temodal) plus liposomal doxorubicin (Caelyx) in advanced solid cancers. Anticancer Drugs, 2004, 15, 499-502.
【非特許文献２５】Cruz-Munoz, W., Man, S., Kerbel, R.S. Effective treatment of Advanced human melanoma metastases in immunodefficient mice using combination metronomic chemotherapy regimens. Clin. Cancer Res., 2009, 15, 4867-74.
【非特許文献２６】Ott, P.A., Chang, J.L., Oratz, R., Jones, A., Farrell, K., Muggia, F., Pavlick, A.C. Phase II trial of dacarbazine and thalidomide for the treatment of malignant melanoma. Chemotherapy, 2009, 55, 221-7.
【非特許文献２７】Tagne, J.B., Kakumanu, S., Nicolosi, RJ. Nanoemulsion preparations of the anticancer drug dacarbazine significantly increase its efficacy in a xenograft mouse melanoma model. MoI. Pharm., 2008, 5, 1055-63.
【非特許文献２８】Mansfield, A.S., Markovic, S.N. Novel therapeutics for the treatment of metastatic melanoma. Future Oncol., 2009, 5, 543-57.
【非特許文献２９】Lui, P., Cashin, R., Machado, M., Hemels, M., Corey-Lisle, P.K., Einarson, T.R. Treatments for metastatic melanoma: synthesis of evidence from randomized trials. Cancer Treat. Rev., 2007, 33, 665-80.
【非特許文献３０】Fiesselmann, H. Method for the preparation of 3-Oxythiophen-2-carboxylic acids derivatives. DE 1020641 (1957).
【非特許文献３１】Hartmann, H., Liebscher, J. A simple method for the synthesis of 5-aryl-3- aminoalkoxycarbonylthiophenes. Synthesis, 1984, 275-276.
【非特許文献３２】Shishoo, C.J., Pathak, U.S., Jain, K.S., Devani, I.T., Chhabria, M.T. Synthesis of some 2-substituted-6-phenyl- and 7-phenyl-thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-ones. Indian J. Chem., 1994, 33B, 436-440.
【非特許文献３３】Barker, J.M., Huddleston, P.R., Wood, M.L. A rapid conversion of 3-oxothiolanes into 3-aminothiolanes. Synth. Commun., 2002, 32, 2565-2568.
【非特許文献３４】Dowd, P., Choi, S.-C. Free radical ring-expansion leading to novel six- and seven membered heterocycles. Tetrahedron, 1991, 47, 4847-4860.
【非特許文献３５】Woodward, R.B., Eastman, R.H. Tetrahydrothiophene derivatives. J. Am. Chem. Soc, 1946, 68, 2229-2235.
【非特許文献３６】Hesse, S., Perspicace, E., Kirsch, G. Microwave-assisted synthesis of 2- aminothiophene-3-carboxylic acid derivatives, 3H-thieno[2,3-d]pyrimidin-4-one and 4- chlorothieno[2,3-d]pyrimidine. Tetrahedron Letts., 2007, 48, 5261-5264.
【非特許文献３７】Dumaitre, B., Dodic, N. Synthesis and cyclic GMP phosphodiesterase inhibitory activity of a series of 6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidones. J. Med. Chem., 1996, 39, 1635-1644.
【非特許文献３８】Banerjee, S., Mehta, S., Haque, I., Sengupta, K., Dhar, K., Kambhampati, S., Van Veldhuizen, P.J., Banerjee, S.K. VEGF-A 165 induces human aortic smooth muscle cell migration by activating neuropilin-l-VEGFRl-PI3K axis. Biochemistry, 2008, 47, 3345- 51.
【非特許文献３９】Tewari, M., L.T. Quan., O'Rourke, K., Desnoyers, S., Zeng, Z., Beidler, D.R., Poirier, G.G., Salvesen, G.S., Dixit, V.M. Yama/CPP32B, a mammalian homolog of CED-3, is a CrmA-inhibitable protease that cleaves the death substrate poly(ADP-ribose) polymerase. Cell, 1995, 81, 801-809.
【非特許文献４０】Sengupta, K., Banerjee, S., Dhar, K., Saxena, N.K., Mehta, S., Campbell, D.R., Banerjee, S.K. WISP-2/CCN5 is involved as a novel signaling intermediate in Phorbol ester protein kinase Calpha-mediated breast tumor cell proliferation. Biochemistry, 2006, 45, 10698-709.
【非特許文献４１】Wu, K., Yuan, L.H., Xia, W. Inhibitory effects of apigenin on the growth of gastric carcinoma SGC-7901 cells. World. J. Gastroenterol, 2005, 11, 4461-4464.
【非特許文献４２】Ray, G., Dhar, G., Van Veldhuizen, PJ., Banerjee, S., Saxena, N.K., Sengupta, K., Banerjee, S.K. Modulation of cell-cycle regulatory signaling network by 2- Methoxyestradiol in prostate cancer cells is mediated through multiple signal transduction pathways. Biochemistry, 2006, 45, 3703-3713.
【非特許文献４３】Sengupta, K., Banerjee, S., Saxena, N.K., Banerjee, S.K. Thombospondin-1 Disrupts Estrogen-Induced Endothelial Cell Proliferation and Migration and its Expression Suppressed by Estradiol. MoI. Cancer Res., 2004, 2, 150-158.
【非特許文献４４】Diana, G., Chalupowicz, Z., Chowdhury, A., Tami, L.B., Carl, B., Jose, M. Fibrin II Induces Endothelial Cell Capillary Tube Formation. J. Cell Biol., 1995, 130, 207-215.
【非特許文献４５】Michelle, L.R., Johnathan, M., Hartwig, B., Ronald, G.T. Dietary glycine inhibits the growth of B16 melanoma tumors in mice. Carcinogenesis, 1999, 20, 793-798.1303179642312_0.html
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、本明細書で「トリアゼン類似体」と呼ぶ式（Ｉ）の化合物を提供する。
【化３】
2012502900.tif 000004
（式中、
Ｒは独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨから選択され、
Ｒ１は独立して、ＯＨ、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨから選択され、
Ｒ２、及びＲ３の少なくとも一方は、Ｈ、Ｎ＝Ｎ−Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ＝Ｎ−ＮＨＣＨ３、Ｎ＝Ｎ−Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨ、ＣＯＮＨＲ４、ＣＯＮＲ４Ｒ５、ＣＯＮＨＮＨ２、ＣＯＮＨＮＨＲ４、ＣＯＮＨＮＲ４Ｒ５、ＣＯＯＣＨ３、ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＯＨ、ＣＯＳＨ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＲ４、ＳＯ２ＮＲ４Ｒ５、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２ＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨ、ＮＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＯＯＨ、ＮＯ２、ＣＦ３、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＣＣｌ３、Ｐｈ（Ｃ６Ｈ５）、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ｎ−Ｃ３Ｈ７、イソ−Ｃ３Ｈ７、ｎ−Ｃ４Ｈ９、イソ−Ｃ４Ｈ９、ｔｅｒｔ−Ｃ４Ｈ９、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３など、電子求引基及び電子供与基から選択され、
Ｒ４及びＲ５は独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキロール、アルキルアミンなどから選択され、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、独立して、Ｃ、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択され、したがって結果として得られる複素環式芳香族部分の５員環系は、非置換及び置換チオフェン、フラン、チアゾール、イソチアゾール、及びフラゾールである）。
【００１７】
もう１つの態様において、本発明は、式（ＩＩ）の化合物も提供する。
【化４】
2012502900.tif 000005
Ｒ１、及びＲ２の少なくとも一方は、独立して、Ｈ、Ｎ＝Ｎ−Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ＝Ｎ−ＮＨＣＨ３、Ｎ＝Ｎ−Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ４、ＣＯＮＲ４Ｒ５、ＣＯＮＨＮＨ２、ＣＯＮＨＮＨＲ４、ＣＯＮＨＮＲ４Ｒ５、ＣＯＯＣＨ３、ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＯＨ、ＣＯＳＨ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＲ４、ＳＯ２ＮＲ４Ｒ５、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２ＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨ、ＮＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＯＯＨ、ＮＯ２、ＣＦ３、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＣＣｌ３、Ｐｈ（Ｃ６Ｈ５）、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ｎ−Ｃ３Ｈ７、イソ−Ｃ３Ｈ７、ｎ−Ｃ４Ｈ９、イソ−Ｃ４Ｈ９、ｔｅｒｔ−Ｃ４Ｈ９、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３など、電子求引基及び電子供与基から選択される。
【００１８】
Ｒ４及びＲ５は独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキロール、アルキルアミンなどから選択される。
【００１９】
Ｘ、Ｙ、及びＺは、独立して、Ｃ、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択され、したがって縮合二環系の複素環式芳香族５員環は、非置換及び置換チオフェン、フラン、チアゾール、イソチアゾール、及びフラゾールである。一般式（ＩＩ）の化合物は、３−メチルチオフェノ［３，２−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン（Ｘ＝Ｙ＝Ｃ；Ｚ＝Ｓ；Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ）ではない。
【００２０】
もう１つの態様において、本発明は、式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物の薬剤的に許容される塩、たとえば有機及び無機酸付加塩を包含する。
【００２１】
もう１つの態様において、本発明は、式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）の少なくとも１つのトリアゼン類似体或いはその薬剤的に許容される塩及び薬剤的に許容される担体若しくは希釈剤を含む組成物を提供する。
【００２２】
別の態様において、本発明は、式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）の少なくとも１つのトリアゼン類似体又はその薬剤的に許容される塩及び少なくとも１つの化学療法剤及び場合によって薬剤的に許容される担体若しくは希釈剤を含む組成物を提供する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）のトリアゼン類似体又はその薬剤的に許容される塩並びに少なくとも１つの化学療法剤及び少なくとも１つの生物学的反応修飾剤及び場合によって薬剤的に許容される担体若しくは希釈剤を含む組成物を提供する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、患者における癌細胞成長を阻害するか、又は癌細胞を殺す方法であって、それを必要とする対象に対して、癌細胞を殺すために有効な量で、式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）のトリアゼン類似体又はトリアゼン類似体または他の化学療法剤との組み合わせを含む組成物を投与することによる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】様々な濃度の化合物１、化合物６、化合物１３及びＤＴＩＣで処理された、Ａ２０５８ヒト黒色腫細胞から漏出した乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）における増加（％）を示す折線グラフである。各点は、４連のウェルの平均から計算された、ビヒクル対照培養物に対する漏出したＬＤＨにおける増加（％）を示す。
【図２】様々な濃度のＤＴＩＣ及び関連する試験化合物で処理したＨＳ．５３１．ｓｋ正常ヒト皮膚上皮細胞の細胞生存率（％）の棒グラフである（上側のパネル）。下側のパネルの棒グラフは、表示するような１２０μｇ／ｍｌでの様々な試験化合物によるＨＳ．５３１．ｓｋ細胞生存率の低下（％）を表す。
【図３】１００μｇ／ｍｌのＤＴＩＣ並びに試験生成物化合物１、化合物６、及び化合物１３で処理したＡ２０５８細胞におけるＰＡＲＰ切断を表すウェスタンブロット画像を表す。対照培養物にビヒクルとして０．５％ＤＭＳＯを添加した。アクチンタンパク質の発現をローディング対照として示す。８９ｋＤａで切断したＰＡＲＰタンパク質の発現をアクチン発現（任意単位）で正規化し、下側のパネルで棒グラフとして表した。
【図４】インビトロでＤＴＩＣ及び化合物６の存在下でのＢ１６Ｆ０コロニー形成の阻害を示す画像である。Ｂ１６Ｆ０細胞を０．１％ＤＭＳＯ（Ａ）、又は１００μｇ／ｍｌのＤＴＩＣ（Ｂ）又は５０μｇ／ｍｌ（Ｃ）若しくは１００μｇ／ｍｌ（Ｄ）の化合物６で処理した。０．１％ＤＭＳＯ（ａ）、又は１００μｇ／ｍｌのＤＴＩＣ（ｂ）又は５０μｇ／ｍｌの化合物６（ｃ）又は１００μｇ／ｍｌの化合物６（ｄ）で処理した培養物におけるコロニーの平均数及びコロニーの平均面積を、それぞれ棒グラフＥ及びＦで表す。
【図５】化合物６によるＧ２／Ｍ期での細胞周期停止の誘発を表す。Ｂ１６Ｆ０細胞を表示された濃度のビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）又はＤＴＩＣ又は化合物６のいずれかで２４時間、表示するような様々な濃度で処理した。ヨウ化プロピジウムで染色した細胞を、ＦＡＣＳ  ｃａｌｉｂｕｒによって細胞サイクルの分布について分析し、細胞サイクルの異なる期の分布（％）を、ＭｏｄＦＩＴソフトウェアを用いて決定した。データは少なくとも３回の独立した実験の代表的な一例として示す。
【図６】対照（Ａ）、１００μｇ／ｍｌのＤＴＩＣ（Ｂ）、及び化合物６（Ｃ）で処理された培養物における浸潤されたＢ１６Ｆ０細胞を示す顕微鏡写真である。棒グラフ（Ｄ）は、２０×対物レンズで観察した２０の独立したフィールドから計数された、浸潤細胞の平均数を表す。
【図７】化合物６で処理されたＢ１６Ｆ０細胞におけるＶＥＧＦタンパク質の下方制御を示すイムノブロット画像である。棒グラフは、任意単位でＶＥＧＦタンパク質の正規化された発現を表す。各棒グラフは、少なくとも３回の独立した実験から計算された平均発現を表す。
【図８】ヒト内皮細胞遊走に対する化合物６の阻害効果を示す。顕微鏡写真は、ＤＴＩＣ（パネルＢ及びＣでそれぞれ２５及び５０μｇ／ｍｌ）又は化合物６（パネルＥ及びＦでそれぞれ２５及び５０μｇ／ｍｌ）のいずれかの存在下でのＨＵＶＥＣの遊走を示す。パネルＡ及びＤは、０．１％ＤＭＳＯで処理されたビヒクル対照ウェルにおける細胞遊走を表す。棒グラフは、各棒グラフの下に表示した様々な培養条件下での遊走細胞の数を示す。各棒グラフは、２０×対物レンズ下で少なくとも２０フィールドから計算された遊走細胞の平均を表す。
【図９】化合物６による毛細管様管形成の阻害を示す。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ＤＴＩＣ（パネルＢ及びＣでそれぞれ２５及び５０μｇ／ｍｌ）又は化合物６（パネルＥ及びＦでそれぞれ２５及び５０μｇ／ｍｌ）のいずれかの存在下、Ｃｕｌｔｒｅｘでコーティングしたプレート上に置き、内皮毛細管を１６時間３７℃で形成させた。パネルＡ及びＤは、０．１％ＤＭＳＯで処理されたビヒクル対照ウェルにおける毛細管様管形成を表す。
【図１０】インビボのＣ５７Ｂ６ＪマウスにおけるＢ１６Ｆ０腫瘍成長に対する化合物６及びＤＴＩＣの有効性を示す。上側のパネルは、それぞれ、ビヒクル対照（Ａ及びＤ）、５０及び１００ｍｇ／ｋｇのＤＴＩＣ（Ｂ及びＣ）で処置された群並びに５０及び１００ｍｇ／ｋｇの化合物６（Ｅ及びＦ）で処置された群に含まれる屠殺された動物から切除した腫瘍のサイズを表す写真である。下側のパネルの表は、表示された各群（ｎ＝６）における平均腫瘍重量を表す。各群で到達した腫瘍成長の阻害（％）は、ビヒクル対照群との比較で計算した。  本発明のこれらの実施形態及び他の実施形態は、以下の詳細な実施例及び添付の図面を参照すると明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
黒色腫は今まで化学療法耐性であり、治療するのが非常に困難であると考えられていた。近年、ダカルバジン及びテモゾラミドが、転移性悪性黒色腫を治療するための化学療法剤として広く使用されている。しかし、成功率は低く、副作用が高い。
【００２７】
転移性悪性黒色腫は、依然として中央生存期間が約８ヶ月であり、診断の５年後の生存可能性が５％未満の難病である。併用レジメンに対する奏効率は、標準的ダカルバジンを用いるよりも再現性よく高い。しかし、転移性悪性黒色腫の管理において明確に差をつけるために、薬剤が単独で、より高い完全寛解（ＣＲ）率（％）をまず達成する重要な効能を証明する必要がある。その時になって、化学療法剤、インターロイキン、インターフェロン、及び同様の生物学的応答調節物質を含む任意の他の併用法は、悪性黒色腫治療をより管理しやすくし、制御されるようにする。したがって、用法を有効にするためには、おそらくは高メラニン結合部分、たとえば親油性チオフェン系は、前向きな効果を有するＤＴＩＣ（ダカルバジン）よりも優れた３つの生化学的作用機構全てを有する可能性があり、完全寛解を得るのが有意に増大する治療的処置を提供することができる。したがって、本発明者らの方法についてまず選択した分子構造は、５員複素環式チオフェン環系を含み、これは、フェニル環に対して類似し、フェニル環に類似した形状及びサイズを有し、本来親油性である。加えて、チオフェン環構造は、分子単独での有効性を増大させるのに助けとなる内在したさらなる利点を有する。
【００２８】
したがって、本発明は、標的黒色腫細胞と選択的に結合し、正常細胞に危害を加えず、非標的細胞に対する標的細胞の比を増大させ、本明細書に記載する他の関連する利点をさらに提供するという、このまだ満たされていない医学的必要性を満たすことを目的とする。したがって、メラニン結合を増大させる取り組みにおいて、骨格として複素環式チオフェン環系を含むいくつかの化合物がまず検討された。大きな硫黄原子が存在するために、５員チオフェン環系は、空間において親油性６員フェニル環系と類似した大きさ及び形状を実現する。したがって、置換チオフェン環系は、その芳香族性に加えて、環における電子の共鳴非局在化をもたらし、これは有効性の増大に寄与し得る。したがって、試験モードにおいて、いくつかのチオフェン系トリアゼン類似体を合成し、ＤＴＩＣを用いてそれらのインビトロ有効性について評価した。最初に設計された化合物のＤＴＩＣよりも良好なインビトロ有効性のために、インビボ有効性及び作用モードを含む特徴化をさらに評価した。本発明の新規トリアゼン類似体、これを含む組成物、並びに類似体及び組成物の治療用途における使用を以下に記載する。
【００２９】
本発明に関して、「チオフェントリアゼン類似体」、「メラニン結合類似体」、「新規類似体」という語句／表現は、本明細書では以下、本文全体にわたって交換可能に用いられ、式Ｉ及び式ＩＩの化合物を意味する。本発明の式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物、チオフェントリアゼン類似体は、メラニンに関して高い親和性を有し、これによって有効性を増大させてさらに有効にする。さらに、好適な実施形態において、本発明の新規類似体は、メラニンをさらに有効に結合して、標的の非標的に対する比を増大させることができ、これによって毒性を減少させるように特に設計することができる。
【００３０】
一実施形態において、メラニン結合類似体は次式によって表すことができる：
【化５】
2012502900.tif 000006
式中、
Ｒは独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨから選択され、
Ｒ１は独立して、ＯＨ、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨから選択され、
Ｒ２、及びＲ３の少なくとも一方は、Ｈ、Ｎ＝Ｎ−Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ＝Ｎ−ＮＨＣＨ３、Ｎ＝Ｎ−Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨ、ＣＯＮＨＲ４、ＣＯＮＲ４Ｒ５、ＣＯＮＨＮＨ２、ＣＯＮＨＮＨＲ４、ＣＯＮＨＮＲ４Ｒ５、ＣＯＯＣＨ３、ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＯＨ、ＣＯＳＨ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＲ４、ＳＯ２ＮＲ４Ｒ５、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２ＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨ、ＮＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＯＯＨ、ＮＯ２、ＣＦ３、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＣＣｌ３、Ｐｈ（Ｃ６Ｈ５）、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ｎ−Ｃ３Ｈ７、イソ−Ｃ３Ｈ７、ｎ−Ｃ４Ｈ９、イソ−Ｃ４Ｈ９、ｔｅｒｔ−Ｃ４Ｈ９、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３など電子求引基及び電子供与基から選択され、
Ｒ４及びＲ５は独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキロール、アルキルアミンなどから選択され、
Ｘ、Ｙ、及びＺは独立して、Ｃ、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択され、したがって結果として得られる複素環式芳香族部分の５員環系は、非置換及び置換チオフェン、フラン、チアゾール、イソチアゾール、及びフラゾールである。
【００３１】
別の実施形態において、本発明は、式（ＩＩ）の化合物も提供する：
【化６】
2012502900.tif 000007
式中、
Ｒ１、及びＲ２の少なくとも一方は独立して、Ｈ、Ｎ＝Ｎ−Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ＝Ｎ−ＮＨＣＨ３、Ｎ＝Ｎ−Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ４、ＣＯＮＲ４Ｒ５、ＣＯＮＨＮＨ２、ＣＯＮＨＮＨＲ４、ＣＯＮＨＮＲ４Ｒ５、ＣＯＯＣＨ３、ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＯＨ、ＣＯＳＨ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＲ４、ＳＯ２ＮＲ４Ｒ５、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２ＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨ、ＮＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＯＯＨ、ＮＯ２、ＣＦ３、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＣＣｌ３、Ｐｈ（Ｃ６Ｈ５）、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ｎ−Ｃ３Ｈ７、イソ−Ｃ３Ｈ７、ｎ−Ｃ４Ｈ９、イソ−Ｃ４Ｈ９、ｔｅｒｔ−Ｃ４Ｈ９、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３など電子求引基及び電子供与基から選択され、
Ｒ４及びＲ５は独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキロール、アルキルアミンなどから選択され、
Ｘ、Ｙ、及びＺは独立して、Ｃ、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択され、したがって縮合二環系の複素環式芳香族５員環は、非置換及び置換チオフェン、フラン、チアゾール、イソチアゾール、及びフラゾールである。一般式（ＩＩ）の化合物は、３−メチルチオフェノ［３，２−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン（（Ｘ＝Ｙ＝Ｃ；Ｚ＝Ｓ；Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ）でない。
【００３２】
本発明は、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の化合物の定義と一致して、本明細書で前述の本発明の特定の実施形態のあらゆる組み合わせを対象とすると理解すべきである。
【００３３】
本発明の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の好適なチオフェントリアゼン類似体のいくつかは、これらに限定されるものではないが以下のものである：
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボキサミド（化合物番号１）
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−４−ブロモチオフェン−２−カルボキサミド（化合物番号２）
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−５−ニトロチオフェン−２−カルボキサミド（化合物番号３）
４−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−３−メトキシチオフェン−２，５−ジカルボキサミド（化合物番号４）
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−５−フェニルチオフェン−２−カルボキサミド（化合物番号５）
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸（化合物番号６）
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−５−ニトロチオフェン−２−カルボン酸（化合物番号７）
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−５−フェニルチオフェン−２−カルボン酸（化合物番号８）
｛３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］（２−チエニル）｝−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−カルボキサミド（化合物含号９）
｛３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］（２−チエニル）｝−Ｎ−メチルカルボキサミド（化合物番号１０）
Ｎ−（２−アミノエチル）｛３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］（２−チエニル）｝−カルボキサミド（化合物含号１１）
４−［ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボキサミド（化合物番号１２）
４−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物番号１３）
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸のカリウム塩（化合物含号１４）
３−メチルチオフェノ［２，３−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン（化合物番号１５）
３−メチル−６−ニトロチオフェノ［２，３−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン（化合物番号１６）
６−アミノ−３−メチルチオフェノ［２，３−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン（化合物番号１７）
３−メチル−６−フェニルチオフェノ［３，２−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン（化合物番号１８）。
【００３４】
発明において、式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物は構造が類似しているのであわせて開示する。たとえば、肝臓ミクロソーム酵素（シトクロムＰ４５０）によってインビボで活性化され、続いて酸化的脱メチル化反応によって、式（Ｉ）の不活性化合物は活性なモノメチルトリアゼン類似体を提供する。同様に、式（ＩＩ）の化合物は、インビボ加水分解によって、式（Ｉ）から誘導される酵素活性種の類似したモノメチルトリアゼン類似体を提供する。したがって、インビボでのそれらの代謝産物が類似しているために、一実施形態では式（Ｉ）の化合物を開示し、別の実施形態では式（ＩＩ）の化合物を開示した。したがって、便宜上、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の化合物を開示するが、これらは生物学的理由から構造的に類似していると考えるべきである。
【００３５】
トリアゼン類似体合成
本発明の別の特性により、スキームに示す様な、一般式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のトリアゼン類似体を調製するためのプロセスが提供され、ここで全ての基は前記定義のとおりである。
【００３６】
一般式（Ｉ）の化合物（１〜８）は、スキームＡに示す様な以下の方法に従って製造することができる。
【００３７】
［スキームＡ］
【化７】
2012502900.tif 000008
【００３８】
試薬及び条件：（ｉ）ＨＣｌ、ＮａＮＯ２、ジメチルアミン、０℃（ｉｉ）ＮＨ３、室温（ｉｉｉ）水性ＮａＯＨ、メタノール、室温
【００３９】
３−アミノチオフェン−２−カルボン酸メチル又はその前駆体を亜硝酸ナトリウムでジアゾ化し、続いてジメチルアミンで処理して、３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸メチル又はその誘導体を良好な収率で得る。前記エステルをアンモニアで処理して、式（Ｉ）のトリアゼン類似体（３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボキサミド（化合物番号１）、化合物番号２、化合物番号３、化合物番号４、化合物番号５）を得た。
【００４０】
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸メチル又はその誘導体をメタノール中水酸化ナトリウム水溶液で加水分解して、式（Ｉ）のトリアゼン酸誘導体を得た（化合物番号６、化合物番号７及び化合物番号８）。
【００４１】
スキームＡで使用した前駆体化合物は、次の方法で製造した：３−アミノ−４−ブロモチオフェン−２−カルボン酸メチルを３−アミノチオフェン−２カルボン酸メチル（Ａｌｄｒｉｃｈ）の臭素化によって調製する。
【００４２】
４−ヒドロキシ−５−（メトキシカルボニル）チオフェン−２−カルボン酸メチル（３０）のニトロ化により、４−ヒドロキシ−５−（メトキシカルボニル）−３−ニトロチオフェン−２−カルボン酸メチルを得、これを次いで硫酸ジメチルを用いてメチル化して、４−メトキシ−５−（メトキシカルボニル）−３−ニトロチオフェン−２−カルボン酸メチルを得た。ニトロ基を鉄及びＨＣｌで還元して、３−アミノ−４−メトキシ−５−（メトキシカルボニル）チオフェン−２−カルボン酸メチルを得た。３−アミノ−５−フェニルチオフェン−２−カルボン酸メチルを公知手順で調製する（３１、３２）。
【００４３】
一般式（Ｉ）の化合物（９〜１１）をスキームＢに示す様に以下の方法に従って製造することができる。
【００４４】
［スキームＢ］
【化８】
2012502900.tif 000009
【００４５】
試薬及び条件：（ｉ）ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ又はＮＨ２ＣＨ３又はＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、室温
【００４６】
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸メチルをメチルアミン、エタノールアミン及びエチレンジアミンなどの様々なアミンで処理して、式（Ｉ）の対応するトリアゼンアミド類似体を得た（化合物番号９、化合物番号１０、及び化合物番号１１）。
【００４７】
一般式（Ｉ）の化合物（１２）は、スキームＣに示す様な以下の方法に従って製造することができる。
［スキームＣ］
【化９】
2012502900.tif 000010
【００４８】
試薬及び条件：（ｉ）ＨＣｌ、ＮａＮＯ２、ジメチルアミン、０℃（ｉｉ）ＮＨ３、室温
【００４９】
４−アミノチオフェン−２−カルボン酸メチルを亜硝酸ナトリウムでジアゾ化し、続いてジメチルアミンで処理して、４−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸メチルを得る。エステルをアンモニアで処理して、必要とされる４−［ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボキサミド（化合物番号１２）を得た。前駆体化合物である４−アミノチオフェン−２カルボン酸メチルを市販のチオフェン−２−カルボン酸から製造する。チオフェン−２−カルボン酸のニトロ化によって、４−ニトロチオフェン−２−カルボン酸と５−ニトロチオフェン−２−カルボン酸との分離不可能な混合物を得、これをエステル化して、対応するエステルを得る。鉄粉を用いてニトロ官能基を次に還元してアミンにし、混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって分離して、４−アミノチオフェン−２−カルボン酸メチルを得る。
【００５０】
一般式（Ｉ）の化合物（１３）は、スキームＤに示す様な次の方法に従って製造することができる。
【００５１】
［スキームＤ］
【化１０】
2012502900.tif 000011
【００５２】
試薬及び条件：（ｉ）ＨＣｌ、ＮａＮＯ２、ジメチルアミン、０℃（ｉｉ）ＮＨ３、室温
【００５３】
４−アミノチオフェン−３−カルボン酸メチルを亜硝酸ナトリウムでジアゾ化し、続いてジメチルアミンで処理して、４−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−３−カルボン酸メチルを得る。エステルをアンモニアで処理して、必要とされる４−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物番号１３）を得る。４−アミノチオフェン−３−カルボン酸メチルは、従来技術で既知の手順を用いて製造する（３３、３４、３５）。したがって、メチルアクリレートをチオグリコール酸メチルに添加することによって、３−［（メトキシカルボニル）メチルチオ］プロパン酸メチルを定量的収率で得、これをナトリウムメトキシドの存在下で環化して、４−オキソ−２，３，５−トリヒドロチオフェン−３−カルボン酸メチルを得た。４−オキソ−２，３，５−トリヒドロチオフェン−３−カルボン酸メチルをヒドロキシルアミンで処理し、続いてアンモニアで塩基性化して、４−アミノチオフェン−３−カルボン酸メチルを得た。
【００５４】
一般式（Ｉ）の化合物（１４）は、スキームＥで示す様な以下の方法にしたがって製造することができる。
【００５５】
［スキームＥ］
【化１１】
2012502900.tif 000012
【００５６】
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸をメタノールの存在下、水酸化カリウムで処理することによって、式（Ｉ）のトリアゼン類似体の対応するカリウム塩、すなわち化合物番号１４を得た。
【００５７】
一般式（ＩＩ）の化合物（１５〜１７）は、スキームＦに示されるように以下の方法にしたがって製造することができる。
【００５８】
［スキームＦ］
【化１２】
2012502900.tif 000013
【００５９】
試薬及び条件：（ｉ）Ｈ２ＳＯ４、ＮａＮＯ２、０℃（ｉｉ）Ｋ２ＣＯ３、ＣＨ３Ｉ、アセトン、室温
【００６０】
２−アミノチオフェン−３−カルボキサミド又はその誘導体を、亜硝酸ナトリウムを用いて濃硫酸の存在下でジアゾ化し、３Ｈ−チオフェノ［２，３−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン又はその誘導体を得た。３Ｈ−チオフェノ［２，３−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン又はその誘導体を、炭酸カリウムの存在下、ヨードメタンでメチル化して、式（ＩＩ）の対応するトリアゼン類似体（化合物番号１５、又は化合物番号１６又は化合物番号１７）を得た。２−アミノチオフェン−３−カルボキサミドを従来技術で公知の手順から製造し（３６、３７）、ニトロ化混合物の処理によってニトロ誘導体を調製する。
【００６１】
一般式（ＩＩ）の化合物（１８）は、スキームＧに示す様な以下の方法にしたがって製造することができる。
【００６２】
［スキームＧ］
【化１３】
2012502900.tif 000014
【００６３】
試薬及び条件：（ｉ）Ｈ２ＳＯ４、ＮａＮＯ２、０℃（ｉｉ）Ｋ２ＣＯ３、ＣＨ３Ｉ、アセトン、室温
【００６４】
３−アミノ−５−フェニルチオフェン−２−カルボキサミドを濃硫酸の存在下、亜硝酸ナトリウムでジアゾ化して、６−フェニル−３Ｈ−チオフェノ［３，２−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オンを得た。６−フェニル−３Ｈ−チオフェノ［３，２−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オンを炭酸カリウムの存在下、ヨードメタンでメチル化して、式（ＩＩ）の対応するトリアゼン類似体、すなわち化合物番号１８を得た。
【００６５】
別の実施形態において、式（Ｉ）のトリアゼン類似体の合成法は、金属硝酸塩及び酸を用いて対応するアミン化合物のジアゾ化することを含み；結果として得られるジアゾ化生成物を塩基の存在下でアミンと反応させることができ；最終的にトリアゼンエステルをカルボン酸又はカルボン酸アミドに変換することができる。
【００６６】
ジアゾ化段階で使用される金属硝酸塩が、亜硝酸ナトリウム又は亜硝酸カリウムから選択され、酸が無機酸又は有機酸から選択される、式（Ｉ）のトリアゼン類似体の合成法。無機酸は、塩酸、硫酸などであってもよく、有機酸は安息香酸、パラトルエンスルホン酸などであってもよい。
【００６７】
ジアゾ化生成物をアミンと反応させることができ、アミンが、メチルアミン、エチルアミンなどの第１級アミン、又はジメチルアミン、ジエチルアミンなどの第２級アミンから選択される、式（Ｉ）のトリアゼン類似体の合成法。
【００６８】
式（Ｉ）のトリアゼン類似体の合成法であって、カルボン酸の類似体は、金属水酸化物を溶媒の存在下で使用して、対応するエステルの加水分解によって製造することができる。金属水酸化物は、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムなどから選択することができ、溶媒は、水、メタノール、エタノール、又はその混合物から選択される方法。
【００６９】
式（Ｉ）のトリアゼン類似体の合成法であって、カルボキサミドの類似体は、対応するエステルを溶媒中塩基の存在下、周囲温度でアミンで処理することによって製造することができる。アミンは、アンモニア、メチルアミン、エタノールアミン、エチレンジアミンなどから選択することができ、塩基は、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ピリジン、トリエチルアミンなどから選択され、溶媒は、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール、アセトン、水又はその混合物から選択される。
【００７０】
別の実施形態において、本発明は、式（Ｉ）、及び式（ＩＩ）の化合物の薬剤的に許容される塩、たとえば有機及び無機酸付加塩を包含する。前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のトリアゼン類似体並びにその誘導体は、溶媒和物又は薬剤的に許容される塩の形態、たとえば酸付加塩若しくは塩基付加塩であってもよい。このような塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、マンデル酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、アミノ酸、及び当分野で公知の他の好適な塩が挙げられる。
【００７１】
別の実施形態において、本発明は、式（Ｉ）、及び式（ＩＩ）の光学活性化合物の光学エナンチオマー又はジアステレオマーを包含する。
【００７２】
トリアゼン類似体を含む組成物
本発明は、前述のようなメラニン標的類似体を、薬剤的に許容される担体若しくは希釈剤との混合物で含み得る、医薬又は獣医学的組成物（以下、単に医薬組成物と呼ぶ）を提供する。本発明は、前述のようなメラニン標的類似体を、薬剤的に許容される担体若しくは希釈剤との混合物で含み得る医薬組成物を提供する。
【００７３】
本発明の医薬組成物は、組成物が対象に投与されることを可能にする任意の形態であってもよい。たとえば、組成物は、固体、液体又は気体（エアゾル）形態であってもよい。典型的な投与経路としては、これらに限定されるものではないが、経口、局所、非経口、舌下、及び直腸が挙げられる。本明細書で用いられる非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射又は注入技術を包含する。本発明の医薬組成物は、組成物を対象に投与するとその中に含まれる活性成分が、体内に吸収され得るように処方される。対象に投与される組成物は、１以上の投与形態をとり、この場合、たとえば、錠剤は単一投与形態であってもよく、局所形態のトリアゼンの容器は複数の投与形態を含んでもよい。
【００７４】
医薬組成物の調製で用いられる物質は、薬剤的に純粋で、用いられる量で非毒性でなければならない。医薬組成物中の活性成分の最適用量が様々な因子に依存することは、当業者には明らかであろう。関連する因子としては、これらに限定されるものではないが、対象の種類（たとえば、ヒト）、活性成分の特定の形態、投与方法及び用いられる組成物が挙げられる。
【００７５】
一般的に、医薬組成物は、本明細書で前述のようなメラニン標的類似体又はその誘導体を、１以上の担体との混合物で含んでもよい。担体は粒状であり得るので、組成物はたとえば、錠剤又は粉末形態である。担体は液体であってもよく、この場合、組成物は、たとえば経口シロップ又は注射可能な液体である。加えて、担体は気体状であってもよく、たとえば、吸入器による吸入投与において有用なエアゾル組成物を提供する。
【００７６】
経口投与を対象とする場合、組成物は好ましくは固形又は液体形態のいずれかであり、ここで、半固体、半液体、懸濁液及びゲル形態が、固体又は液体として本明細書で考えられる形態に含まれる。
【００７７】
経口投与用固体組成物として、組成物を、粉末、顆粒、圧縮錠、丸薬、カプセル、チューインガム、水などの形態に処方することができる。このような固体組成物は、典型的には、１以上の不活性希釈剤又は可食担体を含む。加えて、１以上の以下のアジュバントが存在してもよい：カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、又はゼラチンなどのバインダー；デンプン、ラクトース又はデキストリン、シクロデキストリンなどの賦形剤、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、プリモゲル、コーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はステロテックスなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味料、ペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジフレーバーなどの矯味矯臭剤、及び着色剤。
【００７８】
組成物が、カプセル、たとえば、ゼラチンカプセルの形態である場合、前記種類の物質に加えて、エチレングリコール又は脂肪油などの液体担体を含み得る。
【００７９】
組成物は、液体、たとえばエリキシル剤、シロップ、溶液、エマルジョン又は懸濁液の形態であってもよい。液体は、２つ例を挙げると、経口投与用又は注射による送達用であってもよい。経口投与を対象とする場合、好適な組成物は、本発明の化合物に加えて、甘味料、保存料、色素／着色剤及び調味料のうちの１以上を含む。注射により投与されることを意図される組成物中に、界面活性剤、保存料、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝液、安定剤及び等張剤のうちの１以上を含めることができる。
【００８０】
本発明の液体医薬組成物は、溶液、懸濁液などの形態であるかどうかによらず、以下のアジュバントの１以上を含み得る：滅菌希釈剤、たとえば注射用水、塩溶液、好ましくは生理食塩水、リンガー液、等張塩化ナトリウム、固定油、たとえば合成モノ又はジグリセリド（溶媒又は懸濁媒として機能し得る）、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の溶媒；殺菌剤、たとえばベンジルアルコール又はメチルパラベン；酸化防止剤、たとえばアスコルビン酸又は重硫酸ナトリウム；キレート化剤、たとえばエチレンジアミン四酢酸；緩衝液、たとえば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩及び浸透圧を調節するための薬剤、たとえば塩化ナトリウム又はデキストロース。非経口製剤を、アンプル、使い捨て注射器又はガラス若しくはプラスチックで作られた複数回投与バイアル中に封入することができる。生理食塩水が好適なアジュバントである。注射可能な医薬組成物は好ましくは滅菌である。
【００８１】
非経口又は経口投与のいずれかを対象とする液体組成物は、適切な投与量が得られるようなある量の式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）のトリアゼン類似体を含まなければならない。典型的には、この量は組成物中の本発明の化合物の少なくとも０．１％である。経口投与を対象とする場合、この量は、組成物の０．１〜８０重量％の間で変化し得る。好適な経口組成物は、４％〜約５０％の活性なトリアゼン化合物を含む。好適な本発明の組成物及び製剤は、非経口投与形態が少なくとも０．０１重量％〜１重量％の式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）のトリアゼン類似体を含むように調製される。
【００８２】
医薬組成物は、局所投与を対象としたものであってもよく、この場合、担体は、適切には溶液、エマルジョン、軟膏又はゲル基剤を含み得る。基剤は、たとえば次のものの１以上を含み得る：ペトロラタム、ラノリン、ポリエチレングリコール、ミツロウ、鉱油、希釈剤、たとえば水及びアルコール、並びに乳化剤及び安定剤。増粘剤が局所投与用医薬組成物中に存在してもよい。経皮投与を対象とする場合、組成物は、経皮貼付剤又はイオン泳動装置を含んでもよい。局所処方は少なくとも０．１〜約１０％ｗ／ｖ（単位体積あたりの重量）濃度の式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）のトリアゼン類似体を含んでもよい。
【００８３】
組成物は、直腸投与を対象とし、たとえば、直腸中で融解して、薬剤を放出する、坐剤の形態であってもよい。直腸投与用組成物は、適切な刺激性のない賦形剤として脂肪性基剤を含み得る。このような基剤としては、これらに限定されるものではないが、ラノリン、ココアバター及びエチレングリコールが挙げられる。組成物は、固形又は液体の投与単位の物理的形態を変更する様々な物質を含んでもよい。たとえば、組成物は、式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）のトリアゼン類似体の周りにコーティングシェルを形成する物質を含んでもよい。コーティングシェルを形成する物質は、典型的には不活性であり、例えば、糖、シェラック、及び他の腸溶性コーティング剤から選択することができる。あるいは、式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）のトリアゼン類似体をゼラチンカプセル中に入れてもよい。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、気体状投与単位から構成されていてもよく、たとえば、エアゾルの形態であってもよい。エアゾルという用語は、コロイド状のものから、加圧パッケージで構成されるシステムまで様々なシステムを表すのに用いられる。送達は、液化ガス若しくは圧縮ガスによるか、または式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）のトリアゼン類似体を投薬する適切なポンプシステムによってもよい。本発明の化合物のエアゾルは、式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）のトリアゼン類似体を送達するための単相、二相、または三相システムで送達することができる。エアゾルの送達は、必要な容器、活性剤、バルブ、サブコンテナー、スペーサーなどを含み、これらは併せてキットを形成してもよい。好適なエアゾルは、必要以上の実験をおこなわず当業者が決定してもよい。
【００８５】
別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物及び／又は式（ＩＩ）或いはその薬剤的に許容される塩、並びに少なくとも１つの化学療法剤及び場合によって薬剤的に許容される希釈剤又は担体を含む。
【００８６】
前記化学療法剤が、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、テモゾラミド、メトトレキサート、ドキソルビシン、シトキサン、５−フルオロウラシル、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、イリノテカン、トポテカン、パクリタキセル、ドセタキセル、タキソテレ、タキソール、タモキシフェン、ゲフィニチブ、アドリアマイシン、ゲムシタビン、メルファラン、ストレプトゾシン、フロキシウリジン、６−メルカプトプリン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、マイトマイシン−Ｃ、アムサクリン、プロカバジン（ｐｒｏｃａｂａｚｉｎｅ）、カペシタビン、アバスチン、ハーセプチン、ベキサール、ベルケード、ゼヴァリン、ゼローダ、アービタックス（セツキシマブ）、リツキシマブ、キャンパス（アレムツズマブ）などからなる群から選択される、前述の組成物。
【００８７】
注射によって投与されることが意図される組成物は、式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）のトリアゼン類似体を水と組み合わせて、溶液を形成することによって調製することができる。界面活性剤を添加して、均一な溶液又は懸濁液の形成を促進することができる。界面活性剤は、トリアゼン類似体又は誘導体と非共有的に相互作用して、式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）のトリアゼン類似体の溶解または均質な懸濁を促進する化合物である。
【００８８】
有効量の本発明の化合物又は組成物を使用して、黒色腫及び他の癌を有する細胞の疾患を治療する。これらの細胞は、典型的には哺乳動物の細胞である。有効量の式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）のトリアゼン類似体を投与する方法は、当分野で周知であり、吸入、経口又は非経口形態の投与を包含する。このような投与形態としては、これらに限定されるものではないが、非経口溶液、錠剤、カプセル、持続放出性インプラント及び経皮送達システム；又はドライパウダー吸入器若しくは加圧複数回投与吸入装置を用いる吸入投与システムが挙げられる。投与量及び頻度は、有害な影響なしに薬剤の有効なレベルを得るために選択される。一般的には、有効性を得るために約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には、経口若しくは静脈内投与される場合は約２〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、鼻内又は吸入により投与される場合は約０．１〜４ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量である。
【００８９】
式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）の少なくとも１つの化合物又はその薬剤的に許容される塩、並びに少なくとも１つの化学療法剤及び少なくとも１つの生物学的反応修飾剤及び場合によって薬剤的に許容される希釈剤又は担体を含む医薬組成物。
【００９０】
前述の少なくとも１つの生物学的反応修飾剤を含む組成物であって、前記生物学的反応修飾剤が、モノクローナル抗体、インターフェロン（インターフェロン−γ）、インターロイキン（ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２）、様々な種類のコロニー刺激因子（ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ）、ＴＮＦ−α受容体遮断薬ｓ（ＴＮＦ−α）などからなる群から選択される組成物。
【００９１】
トリアゼン類似体を含むキット、ならびにその調製及び使用
本発明の別の実施形態において、前述のトリアゼン類似体を、医薬用途の本発明のトリアゼン類似体（メラニン標的類似体）を生成させるためのキット中に含めることができる。このようなキットは、一般的に、このような配合物を処方するために、病院、診療所または日常的にすぐに利用できる他の医療施設で使用される。患者において癌細胞成長を阻害するかまたは癌細胞を殺す方法であって、前記患者に対して治療上有効な量の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の化合物を投与することによる方法。
【００９２】
癌に罹っている患者を治療する方法であって、前記癌があらゆる種類（固形、液性、及びリンパ管由来）のものであり、これらに限定されるものではないが、転移性悪性黒色腫、リンパ腫（ホジキン及び非ホジキン）、肉腫（ユーイング肉腫）、癌腫、脳腫瘍、中枢神経系（ＣＮＳ）転移、神経膠腫、乳癌、前立腺癌、肺癌（小細胞及び非小細胞）、結腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、口腔咽頭扁平上皮癌であって、前記対象に、有効量の式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）の化合物を投与するステップを含む方法。
【００９３】
前述の患者において癌細胞成長を阻害するかまたは癌細胞を殺す方法であって、癌細胞が身体のあらゆる部分由来であり、これらに限定されるものではないが、脳、肺、副腎、下垂体、胸部、前立腺、膵臓、卵巣、胃腸管、腎臓、肝臓、脾臓、睾丸、頸部、食道上部、下部、若しくは中部などのヒト身体のあらゆる器官由来であり、あらゆる種類の一次又は二次腫瘍のいずれかである方法。
【００９４】
式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の化合物を患者に対して、これらに限定されるものではないが、腹腔内（ＩＰ）、静脈内（ＩＶ）、経口（ＰＯ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＣ）、真皮内（ＩＤ）、子宮内、直腸内などのあらゆる送達様式により投与する方法。
【００９５】
エマルジョン中異なるサイズのナノ粒子を用いて、それらを必要とする患者に対して、式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）の化合物を投与する方法。
【００９６】
抗腫瘍活性
本発明者らは、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のトリアゼン類似体の腫瘍を抑える可能性を評価した。Ａ２０５８細胞中のＭＴＴ取り込みに基づく細胞増殖分析から、ＤＴＩＣ（表１）と比較すると、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のトリアゼン類似体が腫瘍細胞増殖の阻害において、より良好な有効性を示すことがわかった。式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のトリアゼン類似体の一部の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、標準薬（ＤＴＩＣ）によって示される活性と比較すると、より良好な活性を示すことが判明した。
【００９７】
同様に、式（Ｉ）の化合物６は、Ｃ５７Ｂ６ＪマウスのＢ１６Ｆ０黒色腫異種移植片モデルにおいて、ＤＴＩＣよりも良好な抗腫瘍活性を示した。加えて、化合物６はまた、試験した２つの用量レベルで、用量反応阻害を示した。しかし、ＤＴＩＣは、試験した同じ２つの用量レベルで統計的に有意な用量反応を示さなかった（図１０）。ＤＴＩＣが用量反応を示さなかったことは、ＤＴＩＣが血管新生プロモータであることを示す文献の報告と一致し、一方、本発明者らは、化合物６が血管形成阻害物質であることを見いだした（図７、９）。
【００９８】
本発明は、以下に記載する実施例によって説明され、この実施例は説明のみのために記載され、本発明の範囲を制限するとみなされるべきではない。当業者には明らかな変化及び変更は、添付の特許請求の範囲で定義される、本発明の範囲及び性質内に含まれることが意図される。
【実施例】
【００９９】
実施例１：３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボキサミド（化合物１）の合成
【化１４】
2012502900.tif 000015
【０１００】
ステップａ：
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸メチル：３−アミノチオフェン−２−カルボン酸メチル（０．５ｇ、３．１８ｍｍｏｌ）及び濃ＨＣｌ（１．３ｍＬ、１２．７３ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（７．５ｍＬ）溶液に、ＮａＮＯ２（０．２４ｇ、３．５０ｍｍｏｌ）を５分間０℃で数回に分けて添加した。０〜５℃で０．５時間撹拌した後、反応混合物をＫ２ＣＯ３（１．６６ｇ、１２．０９ｍｍｏｌ）及びジメチルアミン（１．３ｍＬ、４０％、１１．４６ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（９ｍＬ）溶液に０℃で添加した。混合物を０〜５℃で１時間撹拌し、氷冷水中に注加した。溶液をクロロホルムで抽出した（３×３０ｍＬ）。合したＣＨＣｌ３層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（８０：２０）を溶離液として使用してシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、淡オレンジ色固体（６００ｍｇ、８８％）、ｍｐ７４〜７６℃として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．３３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．６Ｈｚ）、７．２４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．６Ｈｚ）、３．８７（３Ｈ、ｓ）、３．５２（３Ｈ、ｓ）、３．２９（３Ｈ、ｓ）；ＬＣ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ２１４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１０１】
ステップｂ：
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボキサミド：水酸化アンモニウムの氷冷（０〜５℃）溶液（２０ｍＬ）に、３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸メチル（６００ｍｇ）のＴＨＦ（５ｍＬ）溶液を５分間添加し、室温で２０時間撹拌した。溶液を氷冷水中に注加し、沈殿した固体を濾過し、乾燥して粗生成物を得、これを、クロロホルム−メタノール（９８：２）を溶離液として用いてシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、灰白色固体（４００ｍｇ、７２％）、ｍｐ１６８〜１７０℃として組成生物を得た。ＩＲ（ニート）ｖｍａｘ３３３７、３１７２、２９２３、１６３６、１５９９、１３４８、１２１９、１１１７、８８４、７７１ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．２８（２Ｈ、ｂｒ  ｓ）、７．３５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．６Ｈｚ）、７．３１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．６Ｈｚ）、３．５８（３Ｈ、ｂｒ  ｓ）、３．２０（３Ｈ、ｂｒ  ｓ）；ＬＣ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ２２１（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【０１０２】
実施例２：３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−４−ブロモチオフェン−２−カルボキサミド（化合物２）の合成
【化１５】
2012502900.tif 000016
【０１０３】
ステップａ：
３−アミノ−４−ブロモチオフェン−２−カルボン酸メチル：３−アミノチオフェン−２カルボン酸メチル（１ｇ、６．３６ｍｍｏｌ）の酢酸（１０ｍＬ）溶液に、臭素（０．３２ｍＬ、６．３６ｍｍｏｌ）の酢酸（１ｍＬ）溶液をゆっくりと５分間室温で添加し、同じ温度で１６時間撹拌した。反応混合物を氷冷水中に注加し、クロロホルムで抽出した（３×１００ｍＬ）。合した有機層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（９５：５）を溶離液として使用するシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、淡黄色固体（０．５ｇ、３３％）、ｍｐ５８〜６０℃として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．２９（１Ｈ、ｓ）、５．６３（２Ｈ、ｂｒ  ｓ）、３．８５（３Ｈ、ｓ）。
【０１０４】
ステップｂ：
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−４−ブロモチオフェン−２−カルボン酸メチル：３−アミノ−４−ブロモチオフェン−２−カルボン酸メチル（０．５ｇ、２．１１ｍｍｏｌ）及び濃ＨＣｌ（０．８５ｍＬ、８．４７ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（５ｍＬ）溶液に、ＮａＮＯ２（１６０ｍｇ、２．３３ｍｍｏｌ）を数回に分けて５分間０℃で添加した。０．５時間（０〜５℃）で撹拌した後、反応混合物をＫ２ＣＯ３（１．１ｇ、８．０４ｍｍｏｌ）及びジメチルアミン（０．８５ｍＬ、４０％、７．６ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（６ｍＬ）溶液に０℃で添加した。混合物を０〜１０℃で１時間撹拌し、氷冷水中に注加した。溶液をクロロホルムで抽出した（３×３０ｍＬ）。合したＣＨＣｌ３層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（９０：１０）を溶離液として用いてシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、淡オレンジ色油状物（０．５ｇ、８１％）として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．３８（１Ｈ、ｓ）、３．８０（３Ｈ、ｓ）、３．５３（３Ｈ、ｂｒ  ｓ）、３．２８（３Ｈ、ｂｒ  ｓ）。
【０１０５】
ステップｃ：
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−４−ブロモチオフェン−２−カルボキサミド：水酸化アンモニウム（１０ｍＬ）の氷冷（０〜５℃）溶液に、３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−４−ブロモチオフェン−２−カルボン酸メチル（５００ｍｇ）のＴＨＦ（５ｍＬ）溶液を５分間添加し、室温で２０時間撹拌した。溶液を氷冷水中に注加し、酢酸エチルで抽出した（３×５０ｍＬ）。合したＥｔＯＡｃ層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、クロロホルム−メタノール（９８：２）を溶離液として用いてシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、灰白色固体（２５０ｍｇ、５３％）、ｍｐ１９４〜１９６℃として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．８５（１Ｈ、ｓ）、７．７５（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、７．５６（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、３．５６（３Ｈ、ｂｒ  ｓ）、３．２１（３Ｈ、ｂｒ  ｓ）；ＬＣ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ２７７、２７９（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１０６】
実施例３：３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−５−ニトロチオフェン−２−カルボキサミド（化合物３）の合成
【化１６】
2012502900.tif 000017
【０１０７】
ステップａ：
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸メチル：３−アミノチオフェン−２−カルボン酸メチル（２．０ｇ、１２．７ｍｍｏｌ）及び濃ＨＣｌ（５ｍＬ、５０．８ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（３０ｍＬ）溶液に、ＮａＮＯ２（０．９６ｇ、１４．０８ｍｍｏｌ）を数回に分けて５分間０℃で添加した。０．５時間０〜５℃で撹拌した後、反応混合物をＫ２ＣＯ３（６．６５ｇ、４８．２６ｍｍｏｌ）及びジメチルアミン（５．１４ｍＬ、４０％、４５．７ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（３６ｍＬ）溶液に０℃で添加した。混合物を０〜１０℃で１時間撹拌し、氷冷水中に注加した。溶液をクロロホルムで抽出した（３×１００ｍＬ）。合した層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（８０：２０）を溶離液として使用してシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、淡オレンジ色固体（２．５ｍｇ、９１％）、ｍｐ７４〜７６℃として生成物を得た。
【０１０８】
ステップｂ：
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−５−ニトロチオフェン−２−カルボン酸メチル：３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸メチル（２ｇ、９．３８ｍｍｏｌ）を１５分間、０〜−５℃で濃硫酸（２０ｍＬ）にゆっくりと添加した。次いで、濃硝酸（０．５４ｍＬ、７０％、１０．７ｍｍｏｌ）を前記反応混合物に１０分間添加し、同じ温度で１時間、室温で１６時間撹拌した。混合物を氷冷水中に注加し、水酸化アンモニウムで塩基性化した。溶液をクロロホルムで抽出し（３×１００ｍＬ）、合した有機層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、ヘキサン−酢酸エチル（８０：２０）を溶離液として用いてシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、黄色固体（４５０ｍｇ、２６％）、ｍｐ１２８〜１３０℃として生成物を得た。
【０１０９】
ステップｃ：
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−５−ニトロチオフェン−２−カルボキサミド：水酸化アンモニウム（３５ｍＬ）の氷冷（０〜５℃）溶液に、３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−５−ニトロチオフェン−２−カルボン酸メチル（４００ｍｇ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液を５分間添加し、室温で２０時間撹拌した。溶液を氷冷水中に注加し、酢酸エチルで抽出した（３×１００ｍＬ）。合した有機層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、ヘキサン−酢酸エチル（５０：５０）を溶離液として使用してシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、黄色固体（９０ｍｇ、２６％）、ｍｐ２４０〜２４６℃として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．２２（１Ｈ、ｓ）、８．０５（１Ｈ、ｓ）、７．９１（１Ｈ、ｓ）、３．６３（３Ｈ、ｓ）、３．２６（３Ｈ、ｓ）；ＬＣ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ２６６（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【０１１０】
実施例４：４−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−３−メトキシチオフェン−２，５−ジカルボキサミド（化合物４）の合成
【化１７】
2012502900.tif 000018
【０１１１】
ステップａ：
４−ヒドロキシ−５−（メトキシカルボニル）−３−ニトロチオフェン−２−カルボン酸メチル：４−ヒドロキシ−５−（メトキシカルボニル）チオフェン−２−カルボン酸メチル（５ｇ、２３．１４ｍｍｏｌ）を１５分間０〜−５℃で濃硫酸（２５ｍＬ）にゆっくりと添加した。次いで、濃硝酸（３．２ｍＬ、７０％、３４．７ｍｍｏｌ）を前記反応混合物に１０分間添加し、同じ温度で１時間撹拌した。混合物を氷冷水中に注加し、酢酸エチルで抽出した（３×１００ｍＬ）。合した有機層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、クロロホルム−メタノール（９５：５）を溶離液として用いてシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、黄色半固体（１．２ｇ、２０％）として生成物を得た。
【０１１２】
ステップｂ：
４−メトキシ−５−（メトキシカルボニル）−３−ニトロチオフェン−２−カルボン酸メチル：４−ヒドロキシ−５−（メトキシカルボニル）−３−ニトロチオフェン−２−カルボン酸メチル（６５０ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）のアセトン（２０ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（０．６８ｇ、５ｍｍｏｌ）を室温で添加した。硫酸ジメチル（０．３６ｍＬ、３．７３ｍｍｏｌ）を反応混合物に撹拌しながらゆっくりと添加し、触媒量のＫＩを添加した。混合物を４時間還流し、冷却した反応混合物を濾過し、固体をアセトンで洗浄した。アセトンを減圧下で除去し、残留物を、ヘキサン−酢酸エチル（９０：１０）を溶離液として用いてシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、淡黄色固体（０．３ｇ、４５％）、ｍｐ８０〜８２℃として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ４．０８（３Ｈ、ｓ）、３．９４（３Ｈ、ｓ）、３．９２（３Ｈ、ｓ）。
【０１１３】
ステップｃ：
３−アミノ−４−メトキシ−５−（メトキシカルボニル）チオフェン−２−カルボン酸メチル：４−メトキシ−５−（メトキシカルボニル）−３−ニトロチオフェン−２−カルボン酸メチル（０．９ｇ、３．２７ｍｍｏｌ）のメタノール（２０ｍＬ）溶液に濃塩酸（０．３ｍＬ）を添加した。前記溶液に鉄粉（０．９１ｇ、１６．３６ｍｍｏｌ）を添加し、続いて塩化アンモニウム水溶液（０．８７ｇ、１６．３ｍｍｏｌ、水：５ｍＬ）を室温で添加した。反応混合物を撹拌し、７０℃に１時間温め、次いで室温まで放冷した。溶液を濾過し、飽和重炭酸ナトリウム溶液で塩基性化した。溶液を酢酸エチルで抽出した（４×１００ｍＬ）。合した有機層を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させて、淡黄色固体（０．６５ｇ、８１％）、ｍｐ１２０〜１２４℃として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ５．３９（２Ｈ、ｂｒ  ｓ）、４．０１（３Ｈ、ｓ）、３．８７（３Ｈ、ｓ）、３．８５（３Ｈ、ｓ）；ＬＣ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ２４６（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１１４】
ステップｄ：
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−４−メトキシ−５−（メトキシカルボニル）チオフェン−２−カルボン酸メチル：３−アミノ−４−メトキシ−５−（メトキシカルボニル）チオフェン−２−カルボン酸メチル（０．６ｇ、２．４４ｍｍｏｌ）、濃ＨＣｌ（１ｍＬ、９．８ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１０ｍＬ）及びアセトン（１０ｍＬ）溶液に、ＮａＮＯ２（０．１９ｇ、２．７ｍｍｏｌ）を数回に分けて５分間０℃で添加した。０〜５℃で０．５時間撹拌した後、反応混合物を、Ｋ２ＣＯ３（１．２８ｇ、９．３ｍｍｏｌ）及びジメチルアミン（１ｍＬ、４０％、８．７８ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（８ｍＬ）溶液に０℃で添加した。混合物を０〜１０℃で１時間撹拌し、氷冷水中に注加した。溶液をクロロホルムで抽出した（３×１００ｍＬ）。合したＣＨＣｌ３層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（８０：２０）を溶離液として使用してシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、淡オレンジ色油状物として生成物を得た（０．４５ｇ、６２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ３．９３（３Ｈ、ｓ）、３．８８（３Ｈ、ｓ）、３．８２（３Ｈ、ｓ）、３．５３（３Ｈ、ｂｒ  ｓ）、３．２６（３Ｈ、ｂｒ  ｓ）；ＬＣ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ３２４（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【０１１５】
ステップｅ：
４−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−３−メトキシチオフェン−２，５−ジカルボキサミド：水酸化アンモニウムの氷冷（０〜５℃）溶液（２０ｍＬ）に、３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−４−メトキシ−５−（メトキシカルボニル）チオフェン−２−カルボン酸メチル（４００ｍｇ）のＴＨＦ（５ｍＬ）溶液を５分間添加し、室温で２０時間撹拌した。溶液を氷冷水中に注加し、酢酸エチルで抽出した（１０×５０ｍＬ）。合した有機層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物をクロロホルム−メタノールから結晶化して、灰白色固体（８０ｍｇ、２２％）、ｍｐ２２６〜２２８℃として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．８６（１Ｈ、ｓ）、７．８１（１Ｈ、ｓ）、７．７３（１Ｈ、ｓ）、７．３５（１Ｈ、ｓ）、３．７２（３Ｈ、ｓ）、３．５９（３Ｈ、ｂｒ  ｓ）、３．２１（３Ｈ、ｂｒ  ｓ）；ＬＣ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ２９４（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【０１１６】
実施例５：３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−５−フェニルチオフェン−２−カルボキサミド（化合物５）の合成
【化１８】
2012502900.tif 000019
【０１１７】
ステップａ：
３−クロロ−３−フェニルプロプ−２−エンニトリル：乾燥ジメチルホルムアミド（２５．６ｍＬ、３３３．２ｍｍｏｌ）の氷冷（０〜５℃）溶液に、オキシ塩化リン（１５．６ｍＬ、１６６．６ｍｍｏｌ）を撹拌しながら１５分間滴加した。この冷混合物に、アセトフェノン（１０ｇ、８３ｍｍｏｌ）を、反応混合物の温度を４５〜５５℃に維持しつつ１０分間滴加した。反応混合物をゆっくりと室温にし、３０分間静置した。反応混合物に、ヒドロキシルアミン塩酸塩（２３．１ｇ、３３３．２ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（３３ｍＬ）全溶液７ｍＬを添加し、混合物を７０〜８０℃で５分間撹拌した。次いで残りのヒドロキシルアミン塩酸塩のＤＭＦ溶液を、反応混合物の温度が１４５〜１５５℃を越えて上昇するような速度で添加した。添加が完了した後、反応混合物を３０分間室温にし、冷水（０．５Ｌ）で希釈した。溶液をクロロホルムで抽出し、クロロホルム層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、ヘキサン−酢酸エチル（９８：２）を溶離液として使用してシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、油状物（７ｇ、５２％）として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．６４−７．６７（２Ｈ、ｍ）、７．４３−７．５３（３Ｈ、ｍ）、６．０２（１Ｈ、ｓ）。
【０１１８】
ステップｂ：
３−アミノ−５−フェニルチオフェン−２−カルボン酸メチル：チオグリコール酸メチル（１ｇ、９．４３ｍｍｏｌ）のメタノール（５ｍＬ）溶液に、ナトリウムメトキシド（０．５ｇ、９．４３ｍｍｏｌ）のメタノール（５ｍＬ）溶液を添加し、０．５時間撹拌した。前記混合物に、３−クロロ−３−フェニルプロプ−２−エンニトリル（１．２２ｇ、７．５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３．５ｍＬ）溶液を１０分間室温で滴加し、混合物を６０℃で２時間撹拌した。次いで、ナトリウムメトキシド（１ｇ、１８．６ｍｍｏｌ）のメタノール（１０ｍＬ）溶液を室温で滴加し、撹拌を２時間６０℃で続けた。混合物を室温にし、冷水中に注加し、１５分間撹拌した。溶液をクロロホルムで抽出し（３×１００ｍＬ）、合したクロロホルム層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、ヘキサン−酢酸エチル（９２：８）を溶離液として用いてシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、淡黄色固体（１．１ｇ、５０％）、ｍｐ１３０〜１３２℃として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．６２−７．６５（２Ｈ、ｍ）、７．３８−７．４８（３Ｈ、ｍ）、７．００（１Ｈ、ｓ）、４．２９（２Ｈ、ｂｒ  ｓ）、３．７４（３Ｈ、ｓ）；ＬＣ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ２３４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１１９】
ステップｃ：
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−５−フェニルチオフェン−２−カルボン酸メチル：３−アミノ−５−フェニルチオフェン−２−カルボン酸メチル（５ｇ、２１．４ｍｍｏｌ）及び濃ＨＣｌ（９ｍＬ、８５．８ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（５１ｍＬ）溶液に、アセトン（３０ｍＬ）を添加して、生成物を溶解させた。次いで、ＮａＮＯ２（１．７ｇ、２３．６ｍｍｏｌ）を数回に分けて１５分間０℃で添加した。０〜５℃で１時間撹拌した後、反応混合物をＫ２ＣＯ３（１１．２ｇ、８１．５ｍｍｏｌ）及びジメチルアミン（８．５ｍＬ、４０％、７７．２ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（６０ｍＬ）溶液に０℃で添加した。混合物を０〜５℃で１時間撹拌し、氷冷水中に注加した。溶液をクロロホルムで抽出した（３×１００ｍＬ）。合したＣＨＣｌ３層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（９０：１０）を溶離液として用いてシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、淡褐色固体（３．８ｇ、７６％）、ｍｐ９２〜９４℃として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．７８−７．８０（２Ｈ、ｍ）、７．６４（１Ｈ、ｓ）、７．４６−７．５２（３Ｈ、ｍ）、３．８４（３Ｈ、ｓ）、３．６０（３Ｈ、ｓ）、３．２８（３Ｈ、ｓ）；ＬＣ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ２９０（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１２０】
ステップｄ：
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−５−フェニルチオフェン−２−カルボキサミド：水酸化アンモニウム（８０ｍＬ）の氷冷（０〜５℃）溶液に、３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−５−フェニルチオフェン−２−カルボン酸メチル（２．２ｇ）のＴＨＦ（１５ｍＬ）溶液を５分間添加し、続いて触媒量のＰＥＧ−４００を添加し、混合物を３６時間撹拌した。溶液を氷冷水中に注加し、クロロホルムで抽出した。合した有機層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、クロロホルム−メタノール（９４：６）を溶離液として用いてシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、生成物を得た。粗生成物をクロロホルム−ヘキサンから再結晶して、黄色固体（１７０ｍｇ、８％）、ｍｐ２２０〜２２２℃として生成物を得た。ＩＲ（ニート）ｖｍａｘ３３４３、２９２２、２８５５、１６４２、１５９５、１２２１、１０２３、８８０、８４１ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．３０（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、７．６４−７．６６（２Ｈ、ｍ）、７．５３（１Ｈ、ｓ）、７．３０−７．４１（３Ｈ、ｍ）、６．３４（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、３．５９（３Ｈ、ｓ）、３．２０（３Ｈ、ｓ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１６４．７、１５１．１、１４６．７、１３３．９、１２８．９、１２８．５、１２５．８、１２５．４、１１４．７、４３．６、３６．５；ＬＣ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ２９７（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【０１２１】
実施例６：３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸（化合物６）の合成
【化１９】
2012502900.tif 000020
【０１２２】
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸メチル（２００ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）のメタノール（１０ｍＬ）溶液に、水酸化ナトリウム（９３ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）の水（２ｍＬ）溶液を添加し、室温で２時間撹拌した。混合物を氷冷水で希釈し、希ＨＣｌで酸性化し、クロロホルムで抽出した。合したクロロホルム層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、ヘキサン−酢酸エチル（８０：２０）を溶離液として用いてシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、灰白色固体（７０ｍｇ、３８％）、ｍｐ１０８〜１１０℃として生成物を得た。ＩＲ（ニート）ｖｍａｘ３４０２、３０８２、２９２３、１７０８、１２１８、１１１６、１０６６、１０１６、８８０、７７３ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１２．２１（１Ｈ、ｓ）、７．４７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．２Ｈｚ）、７．３０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．２Ｈｚ）、３．６５（３Ｈ、ｓ）、３．２８（３Ｈ、ｓ）；ＬＣ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ２００（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１２３】
実施例７：３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−５−ニトロチオフェン−２−カルボン酸（化合物７）の合成
【化２０】
2012502900.tif 000021
【０１２４】
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−５−ニトロチオフェン−２−カルボン酸メチル（５５０ｍｇ）のメタノール（１０ｍＬ）溶液に、水酸化ナトリウムの水溶液（５ｍＬの水中０．２５ｇ）を室温で添加し、混合物を１４時間撹拌した。過剰のメタノールを減圧下で蒸発させ、残留物を氷冷水で希釈した。溶液を希ＨＣｌで酸性化し、分離した固体を濾過し、水で洗浄し、乾燥して、黄色固体として生成物を得た（４５０ｍｇ、８６％）。粗生成物をクロロホルム−メタノールから再結晶した（２９０ｍｇ）、ｍｐ１８４〜１８６℃。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１３．２６（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、８．００（１Ｈ、ｓ）、３．５９（３Ｈ、ｓ）、３．２５（３Ｈ、ｓ）；ＬＣ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ２４５（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１２５】
実施例８：３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−５−フェニルチオフェン−２−カルボン酸（化合物８）の合成
【化２１】
2012502900.tif 000022
【０１２６】
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］−５−フェニルチオフェン−２−カルボン酸メチル（１．８ｇ、６．２２ｍｍｏｌ）のメタノール（５０ｍＬ）溶液に、水酸化ナトリウム（１．２４ｇ、３１．１ｍｍｏｌ）の水（１５ｍＬ）溶液を添加し、室温で１６時間撹拌した。混合物を氷冷水で希釈し、希ＨＣｌで酸性化した。混合物を３０分間撹拌し、沈殿した固体を濾過し、水で洗浄し、乾燥した。固体を、ヘキサン−酢酸エチル（７０：３０）を溶離液として用いてシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、生成物を得た。粗固体をヘキサン−クロロホルムから再結晶して、淡ピンク色固体（１．１ｇ、６１％）、ｍｐ１６２〜１６６℃として生成物を得た。ＩＲ（ニート）ｖｍａｘ２９２３、２８５３、１７０８、１２６０、１２２０、１１７３、１０４２、１０２０、８７９、８３６ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１２．１５（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、７．５８−７．６０（２Ｈ、ｍ）、７．４４（１Ｈ、ｓ）、７．３２−７．４０（３Ｈ、ｍ）、３．６５（３Ｈ、ｓ）、３．２５（３Ｈ、ｓ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１６２．８、１５３．３、１４９．７、１３３．３、１２９．１、１２９．０、１２５．９、１２０．１、１１３．４、４４．３、３７．０；ＬＣ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ２９８（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【０１２７】
実施例９：｛３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］（２−チエニル）｝−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−カルボキサミド（化合物９）の合成
【化２２】
2012502900.tif 000023
【０１２８】
エタノールアミン（５ｍＬ）のＴＨＦ（５ｍＬ）氷冷（０〜５℃）溶液に、３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸メチル（５００ｍｇ）のＴＨＦ（５ｍＬ）溶液を５分添加し、室温で２０時間撹拌した。溶液を氷冷水中に注加し、溶液を酢酸エチルで抽出した（３×５０ｍＬ）。合したＥｔＯＡｃ層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、クロロホルム−メタノール（９５：５）を溶離液として使用してシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて生成物を得、これをクロロホルム−ヘキサンから再結晶して、淡オレンジ色固体（４３０ｍｇ、７７％）、ｍｐ１１８〜１２２℃として生成物を得た。ＩＲ（ニート）ｖｍａｘ３３９７、３２７８、２９２６、１６２１、１３５３、１２９８、１２２０、１０８３、１００７、８８２、７７５ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．８６（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、７．３１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．６Ｈｚ）、７．２８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．２Ｈｚ）、３．７８−３．８２（２Ｈ、ｍ）、３．６０−３．６４（２Ｈ、ｍ）、３．５７（３Ｈ、ｂｒ  ｓ）、３．２３（３Ｈ、ｂｒ  ｓ）、２．７６（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝５．０Ｈｚ）；ＬＣ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ２４３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１２９】
実施例１０：｛３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］（２−チエニル）｝−Ｎ−メチルカルボキサミド（化合物１０）の合成
【化２３】
2012502900.tif 000024
【０１３０】
メチルアミン（３ｍＬ）のＴＨＦ（５ｍＬ）氷冷（０〜５℃）溶液に、３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸メチル（５００ｍｇ）のＴＨＦ（５ｍＬ）溶液を５分間添加し、室温で３６時間撹拌した。溶液を氷冷水中に注加し、溶液をクロロホルムで抽出した（３×１００ｍＬ）。合したクロロホルム層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、クロロホルム−メタノール（９８：２）を溶離液として用いてシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、生成物を得、これをクロロホルム−ヘキサンから再結晶して、淡オレンジ色固体（３８０ｍｇ、７６％）、ｍｐ９８〜１０２℃として生成物を得た。ＩＲ（ニート）ｖｍａｘ３２９７、３０８２、２９２９、１６３７、１３８０、１３４８、１２９９、１２２１、１１０９、１０１６、８８２、７７６ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．３５（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、７．２９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．２Ｈｚ）、７．２７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．２Ｈｚ）、３．５７（３Ｈ、ｂｒ  ｓ）、３．２１（３Ｈ、ｂｒ  ｓ）、３．００（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝４．８Ｈｚ）；ＬＣ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ２１３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１３１】
実施例１１：Ｎ−（２−アミノエチル）｛３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］（２−チエニル）｝−カルボキサミド（化合物１１）の合成
【化２４】
2012502900.tif 000025
【０１３２】
エチレンジアミン（５ｍＬ）のエタノール（５ｍＬ）氷冷（０〜５℃）溶液に、３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸メチル（２５０ｍｇ）のエタノール（５ｍＬ）溶液を５分間添加し、室温で２４時間撹拌した。溶液を氷冷水中に注加し、塩化ナトリウムで飽和させた。溶液をＴＨＦで抽出した（３×１００ｍＬ）。合したＴＨＦ層を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、クロロホルム−メタノール（９０：１０）を溶離液として使用してシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、灰白色固体（６０ｍｇ、２２％）、ｍｐ９８〜１００℃として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．６５（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、７．３０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．２Ｈｚ）、７．２８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．２Ｈｚ）、３．５０−３．５７（５Ｈ、ｍ）、３．２４（３Ｈ、ｂｒ  ｓ）、２．９１（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）。
【０１３３】
実施例１２：４−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボキサミド（化合物１２）の合成
【化２５】
2012502900.tif 000026
【０１３４】
ステップａ：
４−ニトロチオフェン−２−カルボン酸：硫酸（３．０ｍＬ、５．５０５ｇ、５６．１７ｍｍｏｌ）を硝酸（２．０ｍＬ、２．９８ｇ、４９．６ｍｍｏｌ）に０〜１０℃でゆっくりと添加した。添加が完了した後、チオフェン−２−カルボン酸（２．８ｇ、２１．８７ｍｍｏｌ）を前記ニトロ化混合物に１５分間同じ温度でゆっくりと添加し、混合物を１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水中に注加し、３０分間撹拌した。沈殿した固体を濾過し、冷水で洗浄し、乾燥した。濾液を酢酸エチルで抽出した。合した酢酸エチル層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。合した生成物をヘキサン（２×５０ｍＬ）とともに撹拌し、固体を濾過し、乾燥して、灰白色固体（２．８ｇ、７５％）、ｍｐ１１０〜１１８℃として生成物を得た。生成物は、ＨＰＬＣ及び１Ｈ  ＮＭＲによると２つの化合物の混合物であり、次の段階に進めた。
【０１３５】
ステップｂ：
４−ニトロチオフェン−２−カルボン酸メチル：ニトロチオフェン−２−カルボン酸（６．８ｇ、３９．３ｍｍｏｌ）のメタノール（５０ｍＬ）溶液に、塩化チオニル（６ｍＬ、７８．６ｍｍｏｌ）を撹拌下、室温で滴加した。反応混合物を２時間還流し、室温にした。混合物を氷冷水中に注加し、１５分間撹拌した。沈殿した固体を濾過し、冷水で洗浄し、乾燥して、灰白色固体（６．２ｇ、８５％）として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲは、これが２つの化合物の混合物であることを示し、粗生成物を次の段階に進めた。
【０１３６】
ステップｃ：
４−アミノチオフェン−２−カルボン酸メチル：ニトロチオフェン−２−カルボン酸メチル（７ｇ、３７．４３ｍｍｏｌ）の水（１５０ｍＬ）とメタノール（５０ｍＬ）の溶液に、濃塩酸（４．５ｍＬ）を添加した。前記溶液に、鉄粉（１０．５ｇ、１８８ｍｍｏｌ）を添加し、続いて塩化アンモニウム（１０ｇ、１８７ｍｍｏｌ）を室温で添加した。反応混合物を撹拌して７０℃に１時間温め、次いで室温まで放冷した。溶液を濾過し、飽和重炭酸ナトリウム溶液で塩基性化した。溶液をクロロホルムで抽出した（４×１００ｍＬ）。合した有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過した。溶媒を蒸発させ、残留物を、ヘキサン−酢酸エチル（９０：１０及び少量のトリエチルアミン）を溶離液として用いてシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、４−アミノチオフェン−２−カルボン酸メチル（１．８ｇ、３１％）、ｍｐ７６〜７８℃を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．３１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１．６Ｈｚ）、６．４０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１．６Ｈｚ）、３．８５（３Ｈ、ｓ）、３．６３（２Ｈ、ｂｒ  ｓ）。
【０１３７】
カラムを同じ溶媒系でさらに溶出して、５−アミノチオフェン−２−カルボン酸メチル（０．５ｇ、８．５％）、ｍｐ７０〜７２℃を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．４５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ）、６．０９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ）、４．２９（２Ｈ、ｂｒ  ｓ）、３．８１（３Ｈ、ｓ）。
【０１３８】
ステップｄ：
４−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸メチル：４−アミノチオフェン−２−カルボン酸メチル（１．７ｇ、１０．８２ｍｍｏｌ）及び濃ＨＣｌ（４．６ｍＬ、４３．５ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（２０ｍＬ）溶液に、ＮａＮＯ２（０．８４ｇ、１２．１７ｍｍｏｌ）を数回に分けて５分間０℃で添加した。０〜５℃で０．５時間撹拌した後、反応混合物をＫ２ＣＯ３（５．８ｇ、４２ｍｍｏｌ）及びジメチルアミン（４．６ｍＬ、４０％、４０．９ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（３０ｍＬ）溶液に０℃で添加した。混合物を０〜５℃で１時間撹拌し、氷冷水中に注加した。溶液をクロロホルムで抽出した（３×１００ｍＬ）。合したＣＨＣｌ３層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（８０：２０）を溶離液として使用してシリカゲルカラム上クロマトグラフィーにかけ、明赤色固体（２５０ｍｇ）として生成物を得、これをクロロホルム−ヘキサンから再結晶した（１１０ｍｇ）、ｍｐ９０〜９２℃。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．９３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１．６Ｈｚ）、７．３１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１．６Ｈｚ）、３．８８（３Ｈ、ｓ）、３．３１（６Ｈ、ｂｒ  ｓ）。
【０１３９】
ステップｅ：
４−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボキサミド：水酸化アンモニウム（５ｍＬ）の氷冷（０〜５℃）溶液に、４−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸メチル（１１０ｍｇ）のＴＨＦ（２ｍＬ）溶液を５分間添加し、室温で２０時間撹拌した。溶液を氷冷水中に注加し、クロロホルムで抽出した。合した有機層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物をクロロホルム−メタノール（９９：１）を溶離液として用いてシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、淡赤色固体（６０ｍｇ、６０％）、ｍｐ１２８〜１３０℃として生成物を得た。ＩＲ（ニート）ｖｍａｘ３３７２、３１８９、１６４８、１６０９、１２１９、１１２０、１０８８、８６５、７７２ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．６８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１．２Ｈｚ）、７．２８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１．２Ｈｚ）、６．１８（２Ｈ、ｂｒ  ｓ）、３．２９（６Ｈ、ｂｒ  ｓ）；ＬＣ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ１９９（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１４０】
実施例１３：４−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物１３）の合成
【化２６】
2012502900.tif 000027
【０１４１】
ステップａ：
３−［（メトキシカルボニル）メチルチオ］プロパン酸メチル：メチルアクリレート（４．２５ｇ、４９．５ｍｍｏｌ）を２０分かけて、チオグリコール酸メチル（５ｇ、４７．１６ｍｍｏｌ）及びピペリジン（０．１０ｍＬ）撹拌溶液に室温で滴加した。アクリレートの約半分が導入されたら、さらにピペリジン（０．１０ｍＬ）を添加した。アクリレートの添加が完了した後、反応混合物を１時間室温で撹拌した。混合物を１００ｍＬのクロロホルムで希釈した。クロロホルム層を水、食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させて、油状物（９ｇ、１００％）として生成物を得た。
【０１４２】
ステップｂ：
４−オキソ−２，３，５−トリヒドロチオフェン−３−カルボン酸メチル：ナトリウムメトキシド（１．６８ｇ、３１．２５ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（１５ｍＬ）溶液の撹拌スラリーに、３−チアヘキサン二酸ジメチル（５ｇ、２６．０３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）中溶液を室温で５分間添加した。反応混合物を２時間還流加熱し、室温まで冷却し、氷冷水中に注加し、希ＨＣｌで酸性化した。溶液をクロロホルムで抽出し、合したクロロホルム層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（９５：５）を溶離液として用いてシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、淡黄色油状物（１．６ｇ、３９％）として生成物を得た。
【０１４３】
ステップｃ：
４−アミノチオフェン−３−カルボン酸メチル塩酸塩：４−オキソ−３−メトキシカルボニルテトラヒドロチオフェン（６．５ｇ、４０．６２ｍｍｏｌ）、ヒドロキシルアミン塩酸塩（２．８４ｇ、４０．６２ｍｍｏｌ）及びアセトニトリル（３０ｍＬ）の混合物を還流下で１時間撹拌した。混合物を次いで冷却し、分離した固体を濾過し、乾燥エーテルで洗浄して、標記化合物を得た（４．９ｇ、６２％）、ｍｐ１９２〜１９６℃。
【０１４４】
ステップｄ：
４−アミノチオフェン−３−カルボン酸メチル：４−アミノチオフェン−３−カルボン酸メチル塩酸塩（２９０ｍｇ）を水（２０ｍＬ）中に溶解させ、アンモニア溶液で塩基性化した。溶液をクロロホルムで抽出し、合したクロロホルム層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させて、淡黄色油状物（１５０ｍｇ、６５％）として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．９２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）、６．０８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）、４．７９（２Ｈ、ｂｒ  ｓ）、３．８５（３Ｈ、ｓ）。
【０１４５】
ステップｅ：
４−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−３−カルボン酸メチル：４−アミノチオフェン−３−カルボン酸メチル（２００ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ）及び濃ＨＣｌ（０．５ｍＬ、５．０９ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（５ｍＬ）溶液に、ＮａＮＯ２（９６ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）を数回に分けて５分間、０℃で添加した。０〜５℃で０．５時間撹拌した後、反応混合物をＫ２ＣＯ３（６６５ｍｇ、４．８ｍｍｏｌ）及びジメチルアミン（０．５ｍＬ、４０％、４．５７ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（５ｍＬ）溶液に０℃で添加した。混合物を０〜５℃で１時間撹拌し、氷冷水中に注加した。溶液をクロロホルムで抽出した（３×３０ｍＬ）。合したＣＨＣｌ３層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（９０：１０）を溶離液として用いてシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、淡赤色油状物（２０ｍｇ、８％）として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．００（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝２．８Ｈｚ）、６．９７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）、３．８５（３Ｈ、ｓ）、３．３４（６Ｈ、ｂｒ  ｓ）。
【０１４６】
ステップｆ：
４−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−３−カルボキサミド：水酸化アンモニウムの氷冷（０〜５℃）溶液（５ｍＬ）に、４−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−３−カルボン酸メチル（１１０ｍｇ）のＴＨＦ（２ｍＬ）溶液を５分間添加し、室温で３６時間撹拌した。溶液を氷冷水中に注加し、クロロホルムで抽出した。合したクロロホルム層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、クロロホルム−メタノール（９８：２）を溶離液として用いてシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、淡赤色固体（２５ｍｇ、２５％）、ｍｐ１６８〜１７２℃として生成物を得た。ＩＲ（ニート）ｖｍａｘ３３２４、３１２５、２９１７、２８５１、１６５５、１６００、１３６７、１３３６、１０９０ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．５５（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、８．１９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）、７．１５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）、５．８４（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、３．５６（３Ｈ、ｂｒ  ｓ）、３．１９（３Ｈ、ｂｒ  ｓ）；ＬＣ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ１９９（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１４７】
実施例１４：３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸のカリウム塩（化合物１４）の合成
【化２７】
2012502900.tif 000028
【０１４８】
３−［（ジメチルアミノ）ジアゼニル］チオフェン−２−カルボン酸（実施例４：３００ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）のメタノール（１５ｍＬ）溶液に、水酸化カリウム（８４ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）のメタノール（５ｍＬ）溶液を室温で添加し、混合物を同じ温度で１時間撹拌した。溶液を濾過して不純物を除去し、減圧下で蒸発させて、褐色固体（２９０ｍｇ、８１％）、ｍｐ２７４〜２８０℃として化合物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ７．３６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．６Ｈｚ）、７．１０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．６Ｈｚ）；ＬＣ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ２３８（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１４９】
実施例１５：３−メチルチオフェノ［２，３−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン（化合物１５）の合成
【化２８】
2012502900.tif 000029
【０１５０】
ステップａ：
２−アミノチオフェン−３−カルボキサミド：２，５−ジヒドロキシ−１，４−ジチアン（１０ｇ、６５．７８ｍｍｏｌ）のエタノール（２００ｍＬ）及びトリエチルアミン（２ｍＬ）溶液に、シアノアセトアミド（５．５２ｇ、６５．７８ｍｍｏｌ）を室温で５分間添加した。反応混合物を３時間還流し、室温にした。エタノール（約１５０ｍＬ）を減圧下で除去し、内容物を氷冷水中に注加し、１５分間撹拌した。溶液を酢酸エチルで抽出し（３×１００ｍＬ）、合したＥｔＯＡｃ層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物をクロロホルム−メタノール（９５：５）を溶離液として用いたシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、淡黄色固体（４．９ｇ、５３％）、ｍｐ１５０〜１５２℃として生成物を得た。
【０１５１】
ステップｂ：
３Ｈ−チオフェノ［２，３−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン：２−アミノチオフェン−３−カルボキサミド（５ｇ、３５．２１ｍｍｏｌ）の濃硫酸（４０ｍＬ）氷冷溶液（０℃）に、亜硝酸ナトリウム（２．５ｇ、３５．２１ｍｍｏｌ）の濃硫酸（３０ｍＬ）冷（０℃）溶液を３０分間添加した（添加中、温度は−５〜０℃に保たなければならない）。添加後、混合物を同じ温度（０℃）で３時間撹拌した。混合物を撹拌しながら１５分間ゆっくりとクラッシュアイス中に注加し、同じ温度で１５分間撹拌した。溶液を酢酸エチルで抽出し（４×２００ｍＬ）、合したＥｔＯＡｃ層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、クロロホルム−メタノール（９５：５）を溶離液として用いるシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、淡赤色固体（１．０ｇ、１８％）、ｍｐ１７５〜１７６℃として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１５．１８（１Ｈ、ｓ）、８．１６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．６Ｈｚ）、７．６４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．６Ｈｚ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１５９．１、１５３．８、１３２．０、１２６．１、１２１．２；ＬＣ−ＭＳ（陰イオンモード）：ｍ／ｚ１５２（Ｍ−Ｈ）−。
【０１５２】
ステップｃ：
３−メチルチオフェノ［２，３−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン：３Ｈ−チオフェノ［２，３−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン（８０ｍｇ、０．５２２ｍｍｏｌ）のアセトン（５０ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（１４４ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）、ヨードメタン（０．０４ｍＬ、０．６２７ｍｍｏｌ）及びヨウ化カリウム（触媒）を室温で連続して添加し、混合物を室温で３時間撹拌した。溶液を濾過し、固体をアセトンで洗浄した。アセトンを減圧下で蒸発させ、氷冷水で希釈し、１０分間撹拌した。溶液をクロロホルムで抽出し（４×７５ｍＬ）、合したＣＨＣｌ３層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、ヘキサン−酢酸エチル（９０：１０）を溶離液として用いてシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、灰白色固体（５０ｍｇ、５７％）、ｍｐ１０４〜１０８℃として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．１７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．６Ｈｚ）、７．６４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．６Ｈｚ）、３．９５（３Ｈ、ｓ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５９．４、１５３．９、１３０．７、１２５．６、１２１．７、３７．３。
【０１５３】
実施例１６：３−メチル−６−ニトロチオフェノ［２，３−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン（化合物１６）の合成
【化２９】
2012502900.tif 000030
【０１５４】
濃硫酸（５ｍＬ）の氷冷（−１０℃）溶液に、３−メチルチオフェノ［２，３−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン（０．６ｇ、３．６ｍｍｏｌ）を１０分間添加し、硝酸（０．４ｍＬ、９ｍｍｏｌ）を前記反応混合物に５分間添加し、混合物を室温にし、１時間撹拌した。混合物を氷冷水中に注加し、１５分間撹拌した。沈殿した固体を濾過し、ヘキサン−クロロホルム（１：１）を溶離液として用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって濾過及び精製して、淡黄色固体（３９０ｍｇ、５１％）、ｍｐ１６４〜１６８℃として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．６０（１Ｈ、ｓ）、３．９９（３Ｈ、ｓ）。
【０１５５】
実施例１７：６−アミノ−３−メチルチオフェノ［２，３−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン（化合物１７）の合成
【化３０】
2012502900.tif 000031
【０１５６】
３−メチル−６−ニトロチオフェノ［２，３−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン（１．２５ｇ、５．９ｍｍｏｌ）のメタノール（５０ｍＬ）溶液に、濃塩酸（０．６ｍＬ）を添加した。前記溶液に、鉄粉（１．６７ｇ、２９．５ｍｍｏｌ）を添加し、続いて塩化アンモニウム（１．５７ｇ、２９．５ｍｍｏｌ）の水（１０ｍＬ）溶液を室温で添加した。反応混合物を撹拌し、７０℃に１時間温め、次いで室温まで放冷した。溶液を濾過し、飽和重炭酸ナトリウム溶液で塩基性化した。溶液を酢酸エチルで抽出した（４×１００ｍＬ）。合した有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過した。溶媒を蒸発させ、残留物を、ヘキサン−酢酸エチル（６０：４０）を溶離液として使用してシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、淡黄色固体（８０ｍｇ、７．５％）、ｍｐ１９０〜１９４℃として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．４０（２Ｈ、ｓ）、６．１１（１Ｈ、ｓ）、３．８２（３Ｈ、ｓ）；ＬＣ−ＭＳ（陰イオンモード）：ｍ／ｚ１８１（Ｍ−Ｈ）−。
【０１５７】
実施例１８：３−メチル−６−フェニルチオフェノ［３，２−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン（化合物１８）の合成
【化３１】
2012502900.tif 000032
【０１５８】
ステップａ：
３−アミノ−５−フェニルチオフェン−２−カルボニトリル：硫化ナトリウム（０．９５ｇ、１２．２３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１２．５ｍＬ）懸濁液に、３−クロロ−３−フェニルプロプ−２−エンニトリル（２ｇ、１２．２３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液を室温で５分間添加し、混合物を６０〜７０℃で２時間撹拌した。次いで、クロロアセトニトリル（０．７７ｍＬ、１２．２３ｍｍｏｌ）を反応混合物に滴加し、再度６０〜７０℃で２時間撹拌した。次に、ナトリウムメトキシド（０．６６ｇ、１２．２３ｍｍｏｌ）のメタノール（５ｍＬ）溶液を滴加し、撹拌を同じ温度で１時間続けた。混合物を室温にし、冷水中に注加し、１５分間撹拌した。分離した固体を濾過し、水で洗浄し、乾燥した。固体をヘキサン−クロロホルムから再結晶して、淡褐色固体（１５０ｍｇ、８％）、ｍｐ１５８〜１６０℃として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．５２−７．５４（２Ｈ、ｍ）、７．３７−７．４１（３Ｈ、ｍ）、６．７５（１Ｈ、ｓ）、４．４８（２Ｈ、ｓ）；ＬＣ−ＭＳ（陰イオンモード）：ｍ／ｚ１９９（Ｍ−Ｈ）−。
【０１５９】
ステップｂ：
３−アミノ−５−フェニルチオフェン−２−カルボキサミド：３−アミノ−５−フェニルチオフェン−２−カルボニトリル（１５０ｍｇ）の水酸化ナトリウム水溶液（２０ｍＬ、１０％）懸濁液にエタノール（１０ｍＬ）を添加し、混合物を１時間還流させた。反応混合物を室温にし、析出した結晶を濾去し、冷水で洗浄し、乾燥して、明黄色固体（７０ｍｇ、４５％）、ｍｐ１８０〜１８２℃として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．５６−７．５８（２Ｈ、ｍ）、７．３３−７．４１（３Ｈ、ｍ）、６．７９（１Ｈ、ｓ）、５．６８（１Ｈ、ｓ）、５．２１（１Ｈ、ｓ）；ＬＣ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ２４１（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【０１６０】
ステップｃ：
６−フェニル−３Ｈ−チオフェノ［３，２−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン：３−アミノ−５−フェニルチオフェン−２−カルボキサミド（０．３７ｇ、１．７ｍｍｏｌ）の濃硫酸（２０ｍＬ）氷冷溶液（０℃）に、亜硝酸ナトリウム（１２０ｍｇ、１．８６ｍｍｏｌ）の濃硫酸（８ｍＬ）冷（０℃）溶液を１０分間添加した（添加中、温度は−５〜０℃に維持しなければならない）。添加後、混合物を０℃で１時間、そして室温で１時間撹拌した。反応混合物を冷却し、撹拌しながら１５分間ゆっくりとクラッシュアイス中に注加し、同じ温度で１５分間撹拌した。溶液を酢酸エチルで抽出し（３×５０ｍＬ）、合したＥｔＯＡｃ層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させて、灰白色固体（２００ｍｇ、３９％）、ｍｐ１７８〜１８０℃として生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１２．３０（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、７．８６（１Ｈ、ｓ）、７．７３−７．７５（２Ｈ、ｍ）、７．４９−７．５４（３Ｈ、ｍ）；ＬＣ−ＭＳ（陰イオンモード）：ｍ／ｚ２２８（Ｍ−Ｈ）−。
【０１６１】
ステップｄ：
３−メチル−６−フェニルチオフェノ［３，２−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン：６−フェニル−３Ｈ−チオフェノ［３，２−ｄ］１，２，３−トリアジン−４−オン（２５０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）のアセトン（２５ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（３００ｍｇ、２．１８ｍｍｏｌ）、ヨードメタン（０．０８ｍＬ、１．３１ｍｍｏｌ）及びヨウ化カリウム（触媒）を連続して室温で添加し、混合物を室温で１６時間撹拌した。溶液を濾過し、固体をアセトンで洗浄した。アセトンを減圧下で蒸発させ、氷冷水で希釈し、１０分間撹拌した。溶液をクロロホルムで抽出し（４×７５ｍＬ）、合したＣＨＣｌ３層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、クロロホルム−メタノール（９５：０５）を溶離液として使用してシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけて、黄色固体（１１０ｍｇ、４２％）、ｍｐ２２０〜２２２℃として生成物を得た。ＩＲ（ＫＢｒ）ｖｍａｘ３０９５、２９２４、１６８０、１２９８、１２４８、１１０２、９７７、８２９ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．７８（１Ｈ、ｓ）、７．７０−７．７３（２Ｈ、ｍ）、７．４５−７．５１（３Ｈ、ｍ）、４．０９（３Ｈ、ｓ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５５．１、１５３．８、１５３．３、１３２．２、１３０．２、１２９．４、１２６．７、１２５．４、１１９．５、３７．４；ＬＣ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ２４４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１６２】
インビトロ及びインビボ抗黒色腫成長可能性の評価
実施例１９：ＭＴＴに基づく分析を用いた細胞増殖分析
ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］取り込みに基づく細胞増殖分析を、若干の変更を加えた標準的手順を用いて実施した（３８）。試験化合物の細胞傷害有効性をヒト悪性黒色腫Ａ２０５８細胞においてＭＴＴ細胞増殖分析キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ドイツ））によって評価した。分析は製造元によって提供された指示にしたがって実施した。手短に説明すると、等しい数の細胞を９６穴平底プレート中、１００μｌの培地中に播種し、ＤＴＩＣ又はその誘導体化合物のいずれかに１５０μｇ／ｍｌまでの様々な濃度で３日の期間中暴露した。ビヒクル対照培養物ウェルに最高０．５％のＤＭＳＯのみを添加した。その後、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ試薬を各ウェルに添加し、マイクロプレートを３７℃、５％ＣＯ２の存在下でさらに４時間インキュベートした。最後に、可溶化溶液を添加することによって細胞を可溶化し、３７℃で一夜インキュベートした。ホルマザン結晶を完全に可溶化させた後、吸光度をマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ（米国））で５４０ｎｍで読み取った。４連ウェルから得られた結果（平均ＯＤ±ＳＤ）を、試験化合物の細胞増殖の阻害（５０％阻害濃度、ＩＣ５０）を決定した計算で使用した。
【０１６３】
【表１】
2012502900.tif 000033
Ａ２０５８、ヒト悪性黒色腫細胞におけるＤＴＩＣおよびその関連する化合物の腫瘍を抑える可能性
【０１６４】
実施例２０：ＬＤＨ漏出分析を用いた細胞傷害性
ＭＴＴ分析から得られたデータから（表１）、化合物１、化合物６及び化合物１３を選択し、それらの細胞傷害可能性をＬＤＨ漏出分析においてさらに検証した。図１は、表示された異なる濃度でのＤＴＩＣ及び表示する他の試験化合物での漏出ＬＤＨにおける増加（％）に関する細胞生存率の減少を示す。
【０１６５】
ＤＴＩＣ及びその誘導体化合物の細胞傷害可能性は、培養上清中への漏出した乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を測定することによって評価した（ＬＤＨ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＫｉｔＰｌｕｓ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ドイツ））。漏出ＬＤＨは、細胞傷害性化合物によって加えられた細胞損傷に正比例する。手短に説明すると、細胞を様々な濃度の試験化合物で処理し、４８時間インキュベートした。ビヒクル対照培養物ウェルに最高０．５％のＤＭＳＯのみを加えた。無細胞培養上清を触媒及び色素溶液と混合し、室温で１５分間インキュベートした。最後に、反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ（米国））で４９２ｎｍにて光学密度を測定した。４連のウェルから得られた結果（平均ＯＤ±ＳＤ）を、試験化合物の細胞傷害可能性（５０％阻害濃度、ＩＣ５０）を決定する計算で使用した。ＬＤＨの漏出対薬剤濃度によって示される細胞生存率の低下のプロットを図１に示す。
【０１６６】
実施例２１：腫瘍選択性
次に、ＤＴＩＣ誘導体化合物が、正常な細胞に影響を与えないか又はほとんど与えずに黒色腫細胞を選択的に殺すことができるかどうかをチェックするために、本発明者らは正常なヒト上皮ＨＳ．５３１．ｓｋ細胞に対する試験化合物の影響を評価した。ＬＤＨ漏出分析は、１００μｇ／ｍｌまでの用量のＤＴＩＣ及びその誘導体化合物が、正常細胞皮膚細胞成長に影響を及ぼさないことを示す。一方、１２０μｇ／ｍｌのＤＴＩＣ、化合物１、化合物３及び化合物４は、正常細胞生存率においてそれぞれ５．８％、４．２％、２．４％、及び２．４％減少させた。したがって、この観察結果から、化合物３及び化合物４が正常細胞に影響を及ぼさないかまたはほとんど及ぼさずに黒色腫細胞を殺すのにＤＴＩＣよりも高い選択性を有することは明らかである（図２）。
【０１６７】
実施例２２：Ａ２０５８ヒト黒色腫細胞におけるアポトーシス細胞死可能性に対するトリアゼン化合物の影響
カスパーゼによるＰＡＲＰのタンパク質分解的切断は、アポトーシスの顕著な特徴とみなされる。カスパーゼ−３は、１１３−ｋＤａのＰＡＲＰを切断して、８９ｋＤａ及び２４−ｋＤａのポリペプチドを生成させる（３９）。次に、ＤＴＩＣ及び試験生成物化合物１、化合物６及び化合物１３の相対的アポトーシス可能性を評価するために、ＰＡＲＰ切断分析をＡ２０５８細胞に関して実施した。ＰＡＲＰ切断は、先に記載したようなウェスタンイムノブロット分析を用いることによって評価した（４０）。図３は、１００μｇ／ｍｌの固定用量での試験化合物によるＰＡＲＰ切断の有効性の比較を示す。ウェスタンブロット画像は、化合物番号３で処理したＡ２０５８細胞において８９ｋＤａのＰＡＲＰの切断されたサブユニットの発現は、同じ濃度のＤＴＩＣで処理された細胞においてよりも５６．６％高いことを示す。この観察結果は、化合物番号３がＡ２０５８ヒト黒色腫細胞においてより良好なアポトーシス細胞死可能性を示すことを示唆する。
【０１６８】
実施例２３：Ｂ１６Ｆ０マウス黒色腫細胞及びＡ３７５ヒト黒色腫細胞におけるＤＴＩＣ及び化合物６による細胞増殖阻害の効果の比較
ＭＴＴベースの細胞増殖分析を先に記載した方法論にしたがって用いることにより、ＤＴＩＣ及び化合物６の抗腫瘍成長可能性の比較を、Ｂ１６Ｆ０マウス黒色腫細胞及びＡ３７５ヒト黒色腫細胞においてさらに試験した（実施例１９）。手短に説明すると、等しい数のＢ１６Ｆ０又はＡ３７５細胞いずれかを、９６穴平底プレート中、１００μｌの培地中に播種し、様々な濃度のＤＴＩＣ又は化合物６のいずれかで３日間処理した。ビヒクル対照培養物ウェルに最高０．５％のＤＭＳＯのみを添加した。ＭＴＴ試薬を添加した後、細胞を可溶化し、細胞内ホルマザン形成を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ（米国））で５４０ｎｍにて熱量測定によって読み取った。４連のウェルから得られた結果（平均ＯＤ±ＳＤ）を、試験化合物の細胞増殖の阻害（５０％阻害濃度、ＩＣ５０）を決定するための計算で使用した。
【０１６９】
【表２】
2012502900.tif 000034
Ｂ１６Ｆ０マウス黒色腫及びＡ３７５ヒト黒色腫細胞におけるＤＴＩＣ及び化合物６の抗腫瘍成長可能性の比較
【０１７０】
実施例２４：Ｂ１６Ｆ０マウス黒色腫細胞及びＡ３７５ヒト黒色腫細胞に対するＤＴＩＣ及び化合物６の細胞傷害可能性の比較
Ｂ１６Ｆ０マウス黒色腫細胞及びＡ３７５ヒト黒色腫細胞に対するＤＴＩＣ及び化合物６の細胞傷害可能性の比較を、先に記載した方法論（実施例２０）に従って培養上清中への漏出乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を測定することによってさらに評価した（ＬＤＨ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＫｉｔＰ｜ｕｓ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ドイツ））。４連のウェルから得られた結果（平均ＯＤ±ＳＤ）を、試験化合物の細胞傷害可能性（５０％阻害濃度、ＩＣ５０）を決定するための計算において使用した（表３）。
【０１７１】
【表３】
2012502900.tif 000035
Ｂ１６Ｆ０マウス黒色腫及びＡ３７５ヒト黒色腫細胞におけるＤＴＩＣ及び化合物６の細胞傷害可能性の比較
【０１７２】
実施例２５：ＭＣＦ−７ヒト胸部腫瘍細胞、ＭＩＡ−ＰａＣａ２ヒト膵臓腫瘍細胞及びＤＵ１４５ヒト前立腺腫瘍細胞における化合物１及び化合物６の抗腫瘍有効性
化合物１及び化合物６の抗腫瘍成長可能性をＭＣＦ−７ヒト胸部腫瘍細胞、ＭＩＡ−ＰａＣａ２ヒト膵臓腫瘍細胞及びＤＵ１４５ヒト前立腺腫瘍細胞において、先に記載したようなＭＴＴベースの細胞増殖研究（実施例１９）を用いることによって評価した。４連のウェルから得られた結果（平均ＯＤ±ＳＤ）を、試験化合物の細胞増殖（５０％阻害濃度、ＩＣ５０）の阻害を決定するための計算において使用した（表４）。
【０１７３】
【表４】
2012502900.tif 000036
ＭＣＦ−７ヒト胸部腫瘍細胞、ＭＩＡ−ＰａＣａ２ヒト膵臓腫瘍細胞及びＤＵ１４５ヒト前立腺腫瘍細胞におけるＤＴＩＣ、化合物１及び化合物６の抗腫瘍成長可能性の比較
【０１７４】
実施例２６：Ｂ１６Ｆ０マウス黒色腫細胞コロニー形成分析
化合物６及びＤＴＩＣのクローン形成効率を、先に記載した手順に若干の変更を加えたものに準拠して試験した（４１）。手短に説明すると、Ｂ１６Ｆ０細胞を集め、６ウェルプレート中に播種した（１００細胞／ｍｌ）。細胞を２日間成長させ、その後、細胞を０．１％ＤＭＳＯ又は１００μｇ／ｍｌのＤＴＩＣ又は５０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌの化合物６のいずれかを含むＭＥＭとともにさらに８日間インキュベートした。試験薬剤を含む新鮮な培地を２４時間ごとに取り替えた。最後に、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、メタノール中で１５分間固定した。細胞をギムザ染色で染色し、顕微鏡下で観察した。染色されたウェルの画像をデジタルで記録し（Ｋｏｄａｋ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４０００ＭＭ，  Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｃ．，（コネチカット州ニューヘーブン））、コロニー数を数え、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いることによって分析した。図４は、ＤＴＩＣ及び化合物６で処理したウェルにおけるＢ１６コロニー成長の阻害を示す。化合物６は、ＤＴＩＣと比較してＢ１６腫瘍細胞コロニー成長において有意な阻害を示した。３７．６％、５５．２％及び６８．７％成長阻害がそれぞれ１００μｇ／ｍｌのＤＴＩＣ、５０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌの化合物６によって達成された。
【０１７５】
実施例２７：化合物６で処理したＢ１６Ｆ０マウス黒色腫細胞の細胞サイクル分析
化合物６及びＤＴＩＣで処理したＢ１６Ｆ０細胞の細胞サイクル分析を、若干の変更を加えて先に記載したようにしてフローサイトメトリーによって分析した（４２）。手短に説明すると、Ｂ１６Ｆ０細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ中、４．５ｇ／ｌのＤ−グルコースの存在下で培養した。サブコンフルエント細胞を、ＤＴＩＣ又は化合物６のいずれかで処理し、２４時間インキュベートした。細胞を集め、緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）中単細胞懸濁液を調製した。細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで冷７０％エタノールで３０分間固定した。エタノールを遠心分離によって除去し、細胞を懸濁させ、細胞数を１ｍｌあたり１０６細胞に調節した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで細胞をヨウ化プロピジウムで３０分間３７℃にてＲＮａｓｅの存在下で染色した。最後に、細胞をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国））で分析した。図５は、ＤＴＩＣ及び化合物６によって調節された細胞サイクルの異なる期における細胞の分布を表す。
【０１７６】
実施例２８：Ｂ１６Ｆ０マウス黒色腫細胞浸潤分析
Ｂ１６Ｆ０のインビトロ浸潤能に対するＤＴＩＣ及び化合物４の阻害効果を、マトリゲル（ＢＭＥ  −Ｃｕｌｔｒｅｘ（登録商標）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（米国））でコーティングした細胞培養インサート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（米国））（８μｍポア膜を有する）を用いることによって実施した細胞浸潤分析で試験した。等しい数（５００００）のＢ１６Ｆ０細胞を各インサートウェル中に塗布し、２時間３７℃にて５％ＣＯ２の存在下で付着させた。その後、マトリゲル層を通過する細胞浸潤を試験化合物の存在下又は非存在下で実施した。１００μｇ／ｍｌのＤＴＩＣ又は化合物６のいずれかを浸潤アセンブリの下側のチャンバー中に塗布した。０．１％ＤＭＳＯをビヒクル対照培養物チャンバー中に塗布した。２４時間処理した後、細胞を含むマトリゲル層をコットンプラグで除去し、膜の反対側上の浸潤細胞をメタノールで５分間固定し次いでギムザで染色した。染色された膜をガラススライド上に載せ、浸潤細胞数を光学顕微鏡下（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ  １００）、２０ランダムフィールド中で数えた（２０×対物レンズ）。化合物６は、インビトロＢ１６黒色腫細胞培養実験においてビヒクル又はＤＴＩＣと比較すると、悪性腫瘍細胞浸潤を有意に減少させた（図６）。
【０１７７】
実施例２９：化合物６は血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）産生Ｂ１６Ｆ０細胞を阻害する。
Ｂ１６Ｆ０細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び４．５ｇ／ｌのＤ−グルコースを含むダルベッコの修飾イーグルレッド培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（米国））中で培養した。等しい数の細胞（５×１０４）を培養皿（３５×１０ｍｍ、１１．７ｃｍ２）中に播種した。細胞を５０μｇ／ｍｌのＤＴＩＣ又は化合物４のいずれかで２４時間処理した。０．１％ＤＭＳＯのみとともにインキュベートした細胞をビヒクル対照とみなした。２４時間後、細胞溶解物を調製し、先に記載したようにして適切な変更を加えてウェスタンブロット分析により血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）発現について分析した（４３）。ウェスタンブロット分析に関して、等量のＢ１６Ｆ０細胞溶解物タンパク質を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中、還元条件下で分離し、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（米国））上に移した。膜をＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（米国））でブロックし、続いてＶＥＧＦ抗体（Ａｂｃａｍ（英国））と４℃で一夜反応させた。結合した抗体をホースラディッシュペルオキシダーゼ接合二次抗体でプローブし、化学発光が向上した特異的免疫反応を生じさせた（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（米国））。ストリップされた膜を、内部ローディング対照として抗アクチン抗体を用いて再度生じさせた。免疫反応性バンドの画像をＫｏｄａｋ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４０００ＭＭ（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｃ．，（コネチカット州ニューヘーブン））で記録し、Ｋｏｄａｋ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．５による濃度測定によって分析した。図７は、化合物６で処理したＢ１６Ｆ０細胞におけるＶＥＧＦタンパク質の下方調節を示す、代表的なイムノブロット画像である。
【０１７８】
実施例３０：内皮細胞遊走分析
内皮細胞遊走分析の方法論は、先に記載したものと本質的に同じであり、若干の変更を加えた（４３）。ＦＡＬＣＯＮ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅインサート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（米国））（そのＰＥＴ膜中に８μｍポアを有する）を０．１ｍｇ／ｍｌのコラーゲンでコーティングした。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を細胞培養インサート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に５×１０４細胞／インサートの密度で添加した。細胞を、インサートを通って１８時間、様々な濃度のＤＴＩＣ又は化合物６のいずれかの存在下で遊走させた。遊走アセンブリを含む対照培養物に０．１％ＤＭＳＯのみを添加した。遊走しなかった細胞をコットンプラグでこすり落とし、遊走した細胞をメタノールで５分間固定し、次いでギムザで染色した。インサートの膜を次いでガラススライド上に載せた。膜の孔を通って遊走した細胞を２０ランダムフィールドにおいてＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ  １００顕微鏡下、２０×対物レンズで計数した。図８は、化合物６で処理した内皮細胞の遊走の有意な阻害を示す。
【０１７９】
実施例３１：インビトロ毛細管形成分析
インビトロ毛細管形成分析は、１０ｍｇ／ｍｌの基底膜抽出物（ＢＭＥ−Ｃｕｌｔｒｅｘ（登録商標）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（米国））床上で培養した、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いて実施した。インビト内皮管形成分析のプロトコルは、先に記載したのと同じであり、若干の変更を加えた（４４）。手短に説明すると、４００マイクロリットルのＣｕｌｔｒｅｘを４℃にて２４穴培養プレートの各ウェル中にコーティングし、３７℃で１時間ゲル化させた。ＨＵＶＥＣを、１０％ウシ胎仔血清及び４．５ｇ／ｌ  Ｄ−グルコースを添加したＤＭＥＭ４００μｌでウェルあたり７．５×１０４細胞の密度で播種した。細胞を次いでＤＴＩＣ又は化合物６のいずれかで、表示した所望の濃度で１６時間処理した。ビヒクル対照培養物に０．１％ＤＭＳＯのみを添加した。Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｏｌｐｉｘカメラを備えたＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ  １００顕微鏡下で写真を撮影した。化合物６は用量に依存して毛細管形成の阻害を示し、対照的に、ＤＴＩＣはインビトロ培養条件で、ヒト内皮細胞を用いて毛細管形成を促進した（図９）。
【０１８０】
実施例３２：Ｃ５７Ｂ６ＪマウスのＢ１６Ｆ０黒色腫異種移植片モデルにおける化合物６の腫瘍成長を抑える素質
化合物６の黒色腫成長に対するインビボ有効性をＣ５７Ｂ６ＪマウスのＢ１６Ｆ０黒色腫異種移植片モデルで評価した（４５）。６週齢のＣ５７Ｂ６Ｊマウス（体重１８〜２２ｇ）をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（ＮＩＮ）（インド、ハイデラバード）から購入した。動物実験のプロトコルは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＥＣ）により承認された。全ての実験は、Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌｓ（ＣＰＣＳＥＡ）ガイドライン及びＯＥＣＤガイドラインにしたがって実施した。動物に標準的飼料を自由に摂取させ、活性炭濾過しＵＶに暴露した水を適宜与えた。動物を制御された温度（２４〜２６℃）、湿度（４５〜７０％）、及び１２ｈ／１２ｈの明／暗サイクルで維持した。黒色腫形成を誘発するために、サブコンフルエントＢ１６Ｆ０細胞を簡単なトリプシン処理によって集め、１×１０６細胞を０．２ｍｌのリン酸緩衝塩溶液中、皮下注射した。薬剤処置は、触診可能な腫瘍の発生後に開始した（細胞移植の３〜５日後）。薬剤をリン酸塩緩衝塩溶液（１０％ＤＭＳＯ、ｖ／ｖ）中で調製し、異なる用量のＤＴＩＣ又は化合物６を、腹腔内経路によって毎日投与した。ビヒクル処置対照動物には１０％ＤＭＳＯのみを投与した。１４日の処置後、ＣＯ２吸入によって動物を屠殺し、腫瘍を切除し、計量した。図１０は、Ｃ５７Ｂ６ＪマウスのＢ１６Ｆ０黒色腫異種移植片モデルにおいて様々な濃度のＤＴＩＣ及び化合物６による腫瘍成長の阻害の効果の比較を示す。
【図１】
2012502900.tif 000039
【図２】
2012502900.tif 000040
【図３】
2012502900.tif 000041
【図４】
2012502900.tif 000042
【図５】
2012502900.tif 000043
【図６】
2012502900.tif 000044
【図７】
2012502900.tif 000045
【図８】
2012502900.tif 000046
【図９】
2012502900.tif 000047
【図１０】
2012502900.tif 000048
【国際調査報告】
2012502900.tif 000049
2012502900.tif 000050
2012502900.tif 000051
2012502900.tif 000052