(57)【要約】本発明は、概して、ガス流、特に燃焼排ガス、改質器からの水素ガス、天然ガス、またはセメント窯からのガスからの二酸化炭素の除去に関する。炭素捕捉に使用するための固定化酵素および他のシステムも開示する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＯ２含有ガスからＣＯ２を除去するためのプロセスであって、前記プロセスは、水性液をＣＯ２含有ガスと接触させて、前記ＣＯ２の前記水性液への拡散を促進することと、前記水性液中の前記ＣＯ２を高分子固定化材料の中に封入した固定化炭酸脱水酵素と接触させ、前記ＣＯ２の水和を触媒し、水素イオンおよび重炭酸イオンを含有する処理された液体を形成することと、を含み、前記高分子固定化材料は、（ｉ）前記炭酸脱水酵素を安定化させるか、または（ｉｉ）ミセル材料または反転ミセル材料を含むかのいずれかである、プロセス。
【請求項２】
前記水性液およびＣＯ２含有ガスは、並流配置で接触する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記ＣＯ２含有ガスは、前記水性液中で微小気泡を形成する、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記プロセスは、ガスの入口および液体の出口を含む底部と、液体の入口およびガスの出口を含む上部と、固定化された炭酸脱水酵素を含むか、または高分子固定化材料に封入された固定化炭酸脱水酵素で被覆される複数の粒子を含有する中間部とを備える反応槽中で実施され、前記プロセスは、前記液体の入口から入り、前記反応槽の下方に流れる水性液を、前記ガスの入口から入り、前記反応槽の上方に流れるＣＯ２含有ガスと接触させ、前記ＣＯ２の前記水性液への拡散を促進し、前記固定化炭酸脱水酵素の存在下で、前記水性液中のＣＯ２の水和を触媒し、水素イオンおよび重炭酸イオンを含有する処理された液体ならびに処理されたガスを形成することと、前記液体出口から前記処理された液体を排出することと、前記ガスの出口から前記処理されたガスを排出することと、を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
前記処理された液体を高分子固定化材料に封入された固定化炭酸脱水酵素で被覆された粒子と接触させることをさらに含み、前記炭酸脱水酵素は、前記水素イオンおよび前記重炭酸イオンの濃縮されたＣＯ２および水への変換を触媒する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記安定化された炭酸脱水酵素は、約３０℃〜約１００℃の温度で化学転換を連続して触媒する時に、少なくとも約５日間、その初期の触媒活性の少なくとも約１５％を維持する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記ＣＯ２含有ガスは、微小気泡の形態で前記ガスの入口に入る、請求項４〜６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８】
ＣＯ２含有ガスからＣＯ２を除去するための反応槽であって、ガスの入口および液体の出口を収容する底部と、液体の入口およびガスの出口を収容する上部と、高分子固定化材料に封入された炭酸脱水酵素で被覆された複数の粒子を収容する中間部と、を備え、前記炭酸脱水酵素は、ＣＯ２の水素イオンおよび重炭酸イオンへの水和を触媒することができ、前記高分子固定化材料は、（ｉ）前記炭酸脱水酵素を安定化させるか、または（ｉｉ）ミセル材料または反転ミセル材料を含む、反応槽。
【請求項９】
ＣＯ２をＣＯ２含有ガスから除去するためのシステムであって、第１および第２の反応槽を備え、前記第１の反応槽は請求項８に記載の前記反応槽を備え、前記第２の反応槽は、高分子固定化材料に封入された炭酸脱水酵素で被覆された粒子を収容し、前記炭酸脱水酵素は、水素イオンおよび重炭酸イオンの濃縮されたＣＯ２および水への変換を触媒することができる、システム。
【請求項１０】
前記第２反応槽は、ミセル材料または反転ミセル材料を含む固定化材料を収容する、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記水性液は、塩基を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記塩基は、金属水酸化物、四級アンモニウム水酸化物、金属炭酸塩、弱酸の共役塩基、四級アンモニウム炭酸塩、四級アンモニウムアルコキシド、金属アミド、金属アルカリ、金属アルコキシド、金属シラノエート（ｓｉｌａｎｏａｔｅ）、アミン、アルカノールアミン、またはそれらの組み合わせである、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記塩基は、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化ストロンチウム、水酸化バリウム、水酸化アンモニウム、またはそれらの組み合わせである、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記塩基は、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ルビジウム、炭酸セシウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸ストロンチウム、炭酸バリウム、炭酸アンモニウム、有機カチオンの炭酸塩、またはそれらの組み合わせである、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記塩基は、水酸化ベンジルトリメチルアンモニウム、水酸化コリン、水酸化ジエチルジメチルアンモニウム、水酸化ジメチルドデシルエチルアンモニウム、Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ヘキサブチルヘキサメチレンジアンモニウム二水酸化物、水酸化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、水酸化ヘキサメトニウム、水酸化トリエチルメチルアンモニウム、水酸化トリブチルメチルアンモニウム、水酸化トリヘキシルテトラデシルアンモニウム、水酸化テトラプロピルアンモニウム、水酸化テトラブチルアンモニウム、水酸化テトラオクタデシルアンモニウム、水酸化メチルトリプロピルアンモニウム、テトラブチルアンモニウムエトキシド、水酸化テトラエチルアンモニウム、水酸化テトラヘキシルアンモニウム、水酸化テトラキス（デシル）アンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウム、水酸化トリメチルフェニルアンモニウム、またはそれらの組み合わせである、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記塩基は、リチウムｔｅｒｔ−アモキシド、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド、リチウムジエチルアミド、リチウムジメチルアミド、リチウムジイソプロピルアミド、ナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド、カリウムビス（トリメチルシリル）アミド、リチウムジシクロヘキシルアミド、リチウムトリメチルシラノラート、ナトリウムメトキシド、カリウムメトキシド、リチウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムエトキシド、リチウムエトキシド、リチウムイソプロポキシド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、リチウムｔｅｒｔ−ブトキシド、ナトリウムｔｅｒｔ−ペントキシド、カリウムｔｅｒｔ−ペントキシド、マグネシウムエトキシド、マグネシウムジ−ｔｅｒｔ−ブトキシド、ナトリウムトリメチルシラノラート、カリウムトリメチルシラノラート、またはそれらの組み合わせである、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記塩基は、２−（２−クロロ−６−フルオロフェニル）エチルアミン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタンＤＡＢＣＯ（登録商標）３３−ＬＶ）、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノン−５−エン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、２，６−ルチジン、ピペリジン、１，８−（ジメチルアミノ）ナフタレン、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン、２，８，９−トリイソブチル−２，５，８，９−テトラアザ−１−ホスファビシクロ［３．３．３］ウンデカン、トリペレナミン、アニリン、ベンジルアミン、Ｎ−メチルアニリン、イミダゾール、ピロール、ピリジン、モルホリン、またはそれらの組み合わせである、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記塩基は、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソ−プロピルアミン、ブチルアミン、イソ−ブチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、ペンチルアミン、イソ−ペンチルアミン、ｓｅｃ−ペンチルアミン、ｔｅｒｔ−ペンチルアミン、ヘキシルアミン、イソ−ヘキシルアミン、ｓｅｃ−ヘキシルアミン、ｔｅｒｔ−ヘキシルアミン、エチレンジアミン、（２−メチルブチル）アミン、２−アミノペンタン、３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）プロピルアミン、２−アミノ−６−メチルヘプタン、１−エチルプロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミン、ジペンチルアミン、ジヘキシルアミン、メチルエチルアミン、メチルプロピルアミン、メチルブチルアミン、エチルプロピルアミン、エチルブチルアミン、Ｎ−エチルメチルアミン、Ｎ−イソプロピルメチルアミン、Ｎ−ブチルメチルアミン、Ｎ−エチルイソプロピルアミン、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルメチルアミン、Ｎ−エチルブチルアミン、３−イソプロポキシプロピルアミン、クロロ（ジエチルアミノ）ジメチルシラン、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）、１，３−ビス（クロロメチル）−１，１，３，３−テトラメチルジシラザン、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルイソプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルトリメチルシリルアミン、ジ−ｓｅｃ−ブチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、ジメチルエチルアミン、ジメチルプロピルアミン、ジメチルブチルアミン、ジエチルメチルアミン、ジエチルプロピルアミン、ジエチルブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチルアミン、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルブチルアミン、１，２−ジメチルプロピルアミン、Ｎ、Ｎ−ジエチルメチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルイソプロピルアミン、１，３−ジメチルブチルアミン、３，３−ジメチルブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルブチルアミン、またはそれらの組み合わせである、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記塩基は、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール（Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基）、プロパノールアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ジメチルエタノールアミン、Ｎ−メチルエタノールアミン、トリエタノールアミン、またはそれらの組み合わせである、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記塩基は、モノエタノールアミン（ＭＥＡ）、メチルジエタノールアミン（ＭＤＥＡ）、Ｎ，Ｎ−ジエチルメチルアミン（ＤＭＡ）、またはそれらの組み合わせである、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記塩基は、炭酸イオンを含む、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記炭酸脱水酵素は、ウシ炭酸脱水酵素またはヒト炭酸脱水酵素を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のプロセス、反応槽、またはシステム。
【請求項２３】
前記ウシ炭酸脱水酵素は、ウシ炭酸脱水酵素ＩＩを含み、前記ヒト炭酸脱水酵素は、ヒト炭酸脱水酵素ＩＶを含む、請求項２２に記載のプロセス、反応槽、またはシステム。
【請求項２４】
前記ヒト炭酸脱水酵素またはヒト炭酸脱水酵素ＩＶは、遺伝子組み換えされている、請求項２２または２３に記載のプロセス、反応槽、またはシステム。
【請求項２５】
高分子固定化材料に封入されることにより固定化された酵素であって、前記材料は、前記酵素より小さい化合物に対して透過性であり、前記酵素は、親水性部分、疎水性部分、または両親媒性部分によりイオン修飾されるか、または共有結合的に修飾される、酵素。
【請求項２６】
前記炭酸脱水酵素は、界面活性剤との相互作用によりイオン修飾される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項２７】
前記界面活性剤は、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コールアミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコールアミド、ポリオキシエチレンアルコール、２−シクロヘキシルメチル−β−Ｄ−マルトシド、２−シクロヘキシルエチル−β−Ｄ−マルトシド、シクロヘキシルペンチル−β−Ｄ−マルトシド、シクロヘキシルヘキシル−β−Ｄ−マルトシド、デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ヘキサデシル−β−Ｄ−マルトシド、ウンデシル−β−Ｄ−マルトシド、デシル−β−Ｄ−１−チオマルトピラノシド、オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ジギトニン、ジメチデシルホスフィンオキシド、ドデシルジメチルホスフィンオキシド、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール、Ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミン、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミン、ポリオキシエチレンオクチルフェノール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン遮断共重合体、サポニン、ポリオキシエチレン９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェノール、ソルビタンモノラウレートのポリオキシエチレン誘導体、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミン−Ｎ−オキシド、アルコールエトキシレート、アミドスルホベタイン−１４、アミドスルホベタイン−１６、Ｃ７ＢｚＯ、３−［（３−コールアミドプロピルジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート、３−［（３−コールアミドプロピルジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート、（ドデシルジメチルアンモニオ）アセテート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホネート、３−（ドデシルアンモニオ）プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデシルアンモニオ）プロパンスルホネート、またはそれらの組み合わせである、請求項２５または２６に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項２８】
前記界面活性剤は、ポリオキシエチレンオクチルフェノールである、請求項２７に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項２９】
前記酵素は、疎水性部分により共有結合的に修飾される、請求項１〜２５に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項３０】
前記酵素は、モノアミン、アルデヒド、四級アンモニウム塩、アルキルトリメチルアンモニウムカチオン、有機カチオン、ホスホニウムカチオン、ピリジニウムカチオン、イミダゾリウムカチオン、ビオローゲン、またはそれらの組み合わせにより共有結合的に修飾される、請求項２９に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項３１】
前記酵素は、親水性部分により共有結合的に修飾される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項３２】
前記酵素は、ジアミン、モノカルボキシレート、二酸、ポリアール、多糖、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、グリコシル、無水物、ポリエチレングリコール、アガロース、またはそれらの組み合わせにより共有結合的に修飾される、請求項３１に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項３３】
前記酵素は、両親媒性部分により共有結合的に修飾される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項３４】
前記酵素は、アミノ酸、脂肪酸、脂肪アルコール、脂質、アルキルポリエチレンオキシド、他のポリエチレンオキシド共重合体、アルキルポリグルコシド、またはそれらの組み合わせにより共有結合的に修飾される、請求項３３に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項３５】
前記固定化材料は、カチオン修飾されたパーフルオロスルホン酸−ＰＴＦＥ共重合体を含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項３６】
前記固定化材料は、アルギン酸塩を含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項３７】
前記アルギン酸塩は、カチオン修飾されたアルギン酸塩である、請求項３６に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項３８】
前記カチオン修飾されたパーフルオロスルホン酸−ＰＴＦＥ共重合体、またはカチオン修飾されたアルギン酸塩は、ＮＨ４＋より大きい疎水性カチオンで修飾される、請求項３５または３６に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項３９】
前記疎水性カチオンは、アンモニウム系カチオン、四級アンモニウムカチオン、アルキルトリメチルアンモニウムカチオン、ホスホニウムカチオン、トリフェニルホスホニウム、ピリジニウムカチオン、イミダゾリウムカチオン、ヘキサデシルピリジニウム（ｈｅｘｄｅｃｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ）、エチジウム、ビオローゲン、メチルビオローゲン、およびベンジルビオローゲン、ビス（トリフェニルホスフィン）イミニウム、金属複合体、ビピリジル（ｂｉｐｒｉｄｙｌ）金属複合体、フェナンスロリン系金属複合体、［Ｒｕ（ビピリジン）３］２＋、または［Ｆｅ（フェナンスロリン）３］３＋を含む、請求項３８に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項４０】
前記疎水性カチオンは、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム（Ｔ３Ａ）、テトラペンチルアンモニウム（Ｔ５Ａ）、テトラヘキシルアンモニウム（Ｔ６Ａ）、テトラヘプチルアンモニウム（Ｔ７Ａ）、トリメチルイコシルアンモニウム（ＴＭＩＣＡ）、トリメチルオクチルデシルアンモニウム（ＴＭＯＤＡ）、トリメチルヘキシルデシルアンモニウム（ＴＭＨＤＡ）、トリメチルテトラデシルアンモニウム（ＴＭＴＤＡ）、トリメチルオクチルアンモニウム（ＴＭＯＡ）、トリメチルドデシルアンモニウム（ＴＭＤＤＡ）、トリメチルデシルアンモニウム（ＴＭＤＡ）、トリメチルヘキシルアンモニウム（ＴＭＨＡ）、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）、トリエチルヘキシルアンモニウム（ＴＥＨＡ）、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３８に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項４１】
前記疎水性カチオンは、式１
2012504047.tif 000028
により表される四級アンモニウムカチオンを含み、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、水素、ヒドロカルビル、置換されたヒドロカルビル、またはヘテロシクロであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の少なくとも１つは、水素以外である、請求項３８に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項４２】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、またはデシルであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの少なくとも１つは、水素以外である、請求項４１に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項４３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、またはヘキシルである、請求項４１に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項４４】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はエチルである、請求項４１に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項４５】
前記酵素固定化材料は、その中の酵素を拘束するのに十分な大きさのミセルを有する、塩抽出されたテトラアルキル−アンモニウム修飾パーフルオロスルホン酸−ＰＴＦＥ共重合体である、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項４６】
前記ミセルは、前記酵素と実質的に同じ大きさであり、実質的に同じ形状である、請求項４５に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項４７】
前記テトラアルキル−アンモニウムイオンは、アルキルトリメチルアンモニウムカチオンまたはアルキルトリエチルアンモニウムカチオンを含む、請求項４５または４４に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項４８】
前記固定化材料は、ミセル疎水性修飾された多糖である、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項４９】
前記多糖はキトサンを含む、請求項４８に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項５０】
前記ミセル疎水性修飾された多糖は、式２
2012504047.tif 000029
に対応し、式中、ｎは整数であり、
Ｒ１０は、独立して、水素、ヒドロカルビル、置換されたヒドロカルビル、または疎水性酸化還元介在物質であり、
Ｒ１１は、独立して、水素、ヒドロカルビル、置換されたヒドロカルビル、または疎水性酸化還元介在物質である、請求項４８または４９に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項５１】
Ｒ１０は、独立して、水素またはアルキルであり、Ｒ１１は、独立して水素またはアルキルである、請求項５０に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項５２】
Ｒ１０は、独立して水素またはヘキシルであり、Ｒ１１は、独立して、水素またはヘキシルである、請求項５０に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項５３】
Ｒ１０は、独立して、水素またはオクチルであり、Ｒ１１は、独立して、水素またはオクチルである、請求項５０に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項５４】
Ｒ１０は、独立して、水素またはブチルであり、Ｒ１１は、独立して、水素またはブチルである、請求項５０に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項５５】
Ｒ１０は、独立して、水素または疎水性酸化還元介在物質であり、Ｒ１１は、独立して、水素または疎水性酸化還元介在物質である、請求項５０に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項５６】
前記酵素固定化材料は、疎水性基により修飾されたキトサンのアミン官能性の少なくとも約１０％を有する、ミセル疎水性修飾されたキトサンである、請求項４８〜５５のいずれか１項に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項５７】
前記酵素固定化材料は、式２Ａ
2012504047.tif 000030
に対応する構造を有するミセル疎水性酸化還元介在物質で修飾されたキトサンであり、式中、ｎは整数であり、
Ｒ１０ａは、独立して、水素または疎水性酸化還元介在物質であり、
Ｒ１１ａは、独立して、水素または疎水性酸化還元介在物質である、請求項４８〜５６のいずれか１項に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項５８】
高分子固定化材料に封入することにより固定化された酵素であって、前記固定化材料は、前記酵素より小さい化合物に対して透過性であり、式５、６、７、または８
2012504047.tif 000031
2012504047.tif 000032
のいずれかの構造を有し、式中、
Ｒ２１およびＲ２２は、独立して、水素、アルキル、または置換されたアルキルであるが、ただし、反復単位毎のアルキル基または置換されたアルキル基の平均数が、少なくとも０．１であることを条件とし、
Ｒ２３およびＲ２４は、独立して、水素、アルキル、または置換されたアルキルであるが、ただし、反復単位毎のアルキル基または置換されたアルキル基の平均数が、少なくとも０．１であることを条件とし、
Ｒ２５は、水素、アルキル、または置換されたアルキルであるが、ただし、反復単位毎のアルキル基または置換されたアルキル基の平均数が、少なくとも０．１であることを条件とし、
Ｒ３２およびＲ３３は、独立して、水素、アルキル、アリール、または置換されたアルキルであるが、ただし、反復単位毎の水素原子の平均数が、少なくとも０．１であることを条件とし、
ｍ、ｎ、ｏ、およびｐは、少なくとも１０の整数である、酵素。
【請求項５９】
前記固定化材料は、前記酵素を封入し、前記固定化材料は、前記酵素より小さい化合物に対して透過性であり、式５、６、７、または８
2012504047.tif 000033
のいずれかの構造を有し、式中、
Ｒ２１およびＲ２２は、独立して、水素、アルキル、または置換されたアルキルであるが、ただし、反復単位毎のアルキル基または置換されたアルキル基の平均数が、少なくとも０．１であることを条件とし、
Ｒ２３およびＲ２４は、独立して、水素、アルキル、または置換されたアルキルであるが、ただし、反復単位毎のアルキル基または置換されたアルキル基の平均数が、少なくとも０．１であることを条件とし、
Ｒ２５は、水素、アルキル、または置換されたアルキルであるが、ただし、反復単位毎のアルキル基または置換されたアルキル基の平均数が、少なくとも０．１であることを条件とし、
Ｒ３２およびＲ３３は、独立して、水素、アルキル、アリール、または置換されたアルキルであるが、ただし、反復単位毎のアルキル水素原子の平均数が、少なくとも０．１であることを条件とし、
ｍ、ｎ、ｏ、およびｐは、少なくとも１０の整数である、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項６０】
前記固定化材料は、式５の構造を有する、請求項５８または５９に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項６１】
Ｒ２１およびＲ２２は、独立して、水素、または−（ＣＨ２）ｑＮ＋Ｒ２６Ｒ２７Ｒ２８であり、Ｒ２６、Ｒ２７、およびＲ２８は、独立して、アルキルであり、ｑは、１、２、または３の整数である、請求項６０に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項６２】
Ｒ２６、Ｒ２７、およびＲ２８は、独立して、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルである、請求項６１に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項６３】
Ｒ２６およびＲ２７は、独立して、メチル、エチル、またはプロピルであり、Ｒ２８は、アルキルアミノである、請求項６１に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項６４】
Ｒ２８は、−ＣＨ２Ｎ＋Ｒ２９Ｒ３０Ｒ３１、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋Ｒ２９Ｒ３０Ｒ３１、または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋Ｒ２９Ｒ３０Ｒ３１であり、Ｒ２９、Ｒ３０、およびＲ３１は、独立して、水素またはアルキルである、請求項６３に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項６５】
Ｒ２１またはＲ２２は、−（ＣＨ２）ｑ−ポリエーテルを含み、ｑは、１、２、または３の整数である、請求項６０に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項６６】
ｑは１である、請求項６５に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項６７】
Ｒ２１またはＲ２２は、−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２（ＣＨ３）−ＣＨ２−Ｏ）Ｚ−Ｒｔ、−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｚ−Ｒｔ、またはそれらの組み合わせを含み、Ｒｔは、水素、アルキル、置換されたアルキル、アリール、または置換されたアリールであり、ｚは、約２００ダルトン（Ｄａ）〜約９００ダルトン（Ｄａ）の分子量と対応する整数である、請求項６０に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項６８】
前記ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）２−Ｒｔであって、ｚは、約５００Ｄａ〜約６００Ｄａの分子量と対応する整数である、請求項６７に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項６９】
前記固定化材料は、式６の構造を有する、請求項５８または５９に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項７０】
Ｒ２３およびＲ２４は、独立して水素、または−（ＣＨ２）ｑＮ＋Ｒ２６Ｒ２７Ｒ２８であり、Ｒ２６、Ｒ２７、およびＲ２８は、独立して、アルキルであり、ｑは、１、２、または３の整数である、請求項６９に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項７１】
Ｒ２６、Ｒ２７、およびＲ２８は、独立して、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、またはヘキシルである、請求項７０に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項７２】
Ｒ２６およびＲ２７は、独立して、メチル、エチル、またはプロピルであり、Ｒ２８は、アルキルアミノである、請求項７０に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項７３】
Ｒ２８は、−ＣＨ２Ｎ＋Ｒ２９Ｒ３０Ｒ３１、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋Ｒ２９Ｒ３０Ｒ３１、または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋Ｒ２９Ｒ３０Ｒ３１であり、Ｒ２９、Ｒ３０、およびＲ３１は、独立して、水素またはアルキルである、請求項７２に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項７４】
Ｒ２３またはＲ２４は、−（ＣＨ２）ｑ−ポリエーテルを含み、ｐは、１、２、または３の整数である、請求項７０に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項７５】
前記固定化材料は、式７の構造を有する、請求項５８または５９に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項７６】
Ｒ２５は、水素、または−（ＣＨ２）ｑＮ＋Ｒ２６Ｒ２７Ｒ２８であり、Ｒ２６、Ｒ２７、およびＲ２８は、独立して、アルキルであり、ｑは、１、２、または３の整数である、請求項７５に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項７７】
Ｒ２６およびＲ２７は、独立して、メチル、エチル、またはプロピルであり、Ｒ２８は、アルキルアミノである、請求項７６に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項７８】
Ｒ２８は、−ＣＨ２Ｎ＋Ｒ２９Ｒ３０Ｒ３１、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋Ｒ２９Ｒ３０Ｒ３１、または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋Ｒ２９Ｒ３０Ｒ３１であり、Ｒ２９、Ｒ３０およびＲ３１は、独立して、水素またはアルキルである、請求項７７に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項７９】
前記アルキルアミノ基は、式７の別の反復単位に架橋する、請求項７７または７８に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項８０】
前記固定化材料は、式８の構造を有する、請求項５８または５９に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項８１】
Ｒ３２およびＲ３３は、独立して、水素、アルキル、アリール、−（置換されたアルキレン）−酸もしくはその塩、−（置換されたアルキレン）−塩基もしくはその塩、−（ＣＨ２）ｑＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｚ−Ｒｔ、−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２（ＣＨ３）−ＣＨ２−Ｏ）ｚ−Ｒｔ、またはそれらの組み合わせであり、Ｒｔは、水素、アルキル、置換されたアルキル、アリール、または置換されたアリールであり、ｑは、２、３、または４の整数である、請求項８０に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項８２】
前記酸基は、カルボン酸、ホスホン酸、リン酸、スルホン酸、硫酸、スルファミン酸、それらの塩、またはそれらの組み合わせを含む、請求項８１に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項８３】
前記塩基は、三級アミン、四級アミン、窒素複素環、それらの塩、またはそれらの組み合わせを含む、請求項８１に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項８４】
Ｒ３２およびＲ３３は、独立して水素、アルキル、アリール、−（ＣＨ２）３−Ｏ−（（ＣＨ２）２−Ｏ）Ｚ−ＣＨ３、−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−イミダゾリウム、または−（ＣＨ２）３−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｎａである、請求項８０に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項８５】
ｍ、ｎ、ｏ、およびｐは、１０〜５０００の整数である、請求項５８〜８４のいずれか１項に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項８６】
前記固定化材料は、前記酵素を安定化させる、請求項１〜８５のいずれか１項に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項８７】
前記固定化材料は、ポリスルホンを含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項８８】
前記酵素は、リパーゼ、グルコースイソメラーゼ、ニトリラーゼ、グルコースオキシダーゼ、プロテアーゼ、炭酸脱水酵素、ペプシン、アミラーゼ、真菌アミラーゼ、マルトース生成型アミラーゼ、セルラーゼ、ラクターゼ、エステラーゼ、カルボヒドラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペントサナーゼ（ｐｅｎｔｏｓａｎａｓｅ）、キシラナーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、β−グルコシダーゼ、グルタミナーゼ、ペニシリンアシラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素、シクロデキストリングリコシル基転移酵素、サブチリシン、アミノアシラーゼ、アルコール脱水素酵素、アミノ酸オキシダーゼ、ホスホリパーゼ、ウレアーゼ、コレステラーゼ、デスルフィナーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ペクチナーゼ、酸化還元酵素、デキストラナーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシターゼ、グルコアミラーゼ、マルターゼ、スクラーゼ、転化酵素、ナリンガナーゼ（ｎａｒｉｎｇａｎａｓｅ）、ブロメライン、フィシン、パパイン、ペプシン、ペプチダーゼ、キモシン、サーモリシン、トリプシン、トリグリセリダーゼ（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄａｓｅ）、前胃（ｐｒｅｇａｓｔｒｉｃ）エステラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、アミダーゼ、グルタミナーゼ、リゾチーム、カタラーゼ、脱水素酵素、ペルオキシダーゼ、リアーゼ、フマラーゼ、ヒスタダーゼ（ｈｉｓｔａｄａｓｅ）、アミノ基転移酵素、連結酵素、環化酵素、ラセミ化酵素、ムターゼ、オキシダーゼ、還元酵素、リグニナーゼ、ラッカーゼ、クロロペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヒドロゲナーゼ、ニトロゲナーゼ、オキシニトリラーゼ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２５〜８７のいずれか１項に記載の固定化酵素。
【請求項８９】
前記酵素は、炭酸脱水酵素を含む、請求項８８に記載の固定化酵素。
【請求項９０】
生物燃料電池において電気を生成するため、生物反応器において化学転換を触媒するため、または感知器において検体を検出するための、請求項２５〜８９のいずれか１項に記載の固定化酵素の使用。
【請求項９１】
前記固定化材料は、アルギン酸塩を含み、前記固定化炭酸脱水酵素は、前記酵素のシェル重合体を通過する拡散を制限することができる前記シェル重合体で被覆される、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項９２】
前記固定化材料は、アルギニン酸塩を含み、前記固定化炭酸脱水酵素は、前記固定化酵素の溶媒との相互作用を防ぐことができるシェル重合体で被覆される、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項９３】
前記シェル重合体は、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルベンジル、またはそれらの組み合わせである、請求項９１または９２に記載のプロセス、反応槽、システム、または固定化酵素。
【請求項９４】
ＣＯ２含有ガスからＣＯ２を除去するためのプロセスであって、前記プロセスは、水性液をＣＯ２含有ガスと接触させ、ＣＯ２の前記水性液への拡散を促進することと、前記水性液中のＣＯ２を固定化炭酸脱水酵素と接触させ、ＣＯ２の水和を触媒し、水素イオンおよび重炭酸イオンを含有する処理された液体を形成することと、を含み、前記水性液は、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソ−プロピルアミン、ブチルアミン、イソ−ブチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、ペンチルアミン、イソ−ペンチルアミン、ｓｅｃ−ペンチルアミン、ｔｅｒｔ−ペンチルアミン、ヘキシルアミン、イソ−ヘキシルアミン、ｓｅｃ−ヘキシルアミン、ｔｅｒｔ−ヘキシルアミン、エチレンジアミン、（２−メチルブチル）アミン、２−アミノペンタン、３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）プロピルアミン、２−アミノ−６−メチルヘプタン、１−エチルプロピルアミンジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミン、ジペンチルアミン、ジヘキシルアミン、Ｎ−エチルメチルアミン、Ｎ−イソプロピルメチルアミン、Ｎ−ブチルメチルアミン、Ｎ−エチルイソプロピルアミン、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルメチルアミン、Ｎ−エチルブチルアミン、３−イソプロポキシプロピルアミン、クロロ（ジエチルアミノ）ジメチルシラン、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）、１，３−ビス（クロロメチル）−１，１，３，３−テトラメチルジシラザン、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルイソプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルトリメチルシリルアミン、ジ−ｓｅｃ−ブチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、ジメチルプロピルアミン、ジエチルプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチルアミン、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルブチルアミン、１，２−ジメチルプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルメチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルイソプロピルアミン、１，３−ジメチルブチルアミン、３，３−ジメチルブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルブチルアミン、またはそれらの組み合わせを含む、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ガス流、特に炎管ガス、改質器からの水素ガス、天然ガス、またはセメント窯からのガスからの二酸化炭素の除去に関する。
【背景技術】
【０００２】
工業ガス流から二酸化炭素（ＣＯ２）を捕捉して、エネルギー費用および大気中のＣＯ２の環境影響を削減するための技術が開発されている。ＣＯ２排出の主な排出源は、発電所、セメント窯、天然ガス処理施設、アンモニア工場、および水素工場を含む。捕捉されたＣＯ２は、隔離、石油採収率増加、または藻類の成長促進を含む、複数の用途を有し得る。水素、アンモニア、および天然ガスの場合、ガス流の価値を増加するためには、ＣＯ２の除去が必要不可欠である。
【０００３】
現在、いくつかの別のＣＯ２捕捉技術が、商業的実践および開発の種々の段階にある。これらには、アミン（特にモノエタノールアミン−ＭＥＡ）を用いた化学吸着、物理吸着、膜分離、および低温蒸留が含まれる。加えて、燃焼前に炭素または非酸素ガス構成要素を除去する酸素燃焼およびガス化複合発電等の技術は、炎管ガスを排除する手段として検討されている。アミンを用いた化学吸着は、現在、大部分のガス流において、特に天然ガス中の低レベルのＣＯ２の精製のためのＣＯ２除去の最も低コストの方法である。ＭＥＡシステムがより反応性であるため好まれるが、約４００万ＢＴＵ／ＣＯ２トンでの、ＭＥＡから吸着されたＣＯ２を除去するためのエネルギー負荷は非常に高く、最大約３分の１の発電所のボイラー出力を必要とする場合がある。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の種々の態様の中で、システムは、ガス流、特に炎管ガス、改質器からの水素ガス、天然ガス、またはセメント窯からのガスから二酸化炭素を除去するための固定化炭酸脱水酵素を含む。
【０００５】
別の態様は、ＣＯ２含有ガスからＣＯ２を除去するためのプロセスであり、該プロセスは、水性液をＣＯ２含有ガスと接触させて、ＣＯ２の水性液への拡散を促進することと、水性液中のＣＯ２を高分子固定化材料の中に封入された固定化された炭酸脱水酵素と接触させ、ＣＯ２の水和を触媒し、水素イオンおよび重炭酸イオンを含有する処理された液体を形成することとを含み、該高分子固定化材料は、（ｉ）炭酸脱水酵素を安定化させるか、または（ｉｉ）ミセル材料または反転ミセル材料を含むかのいずれかである。
【０００６】
また別の態様は、上述のプロセスであり、該プロセスは、ガスの入口および液体の出口を含む底部と、液体の入口およびガスの出口を含む上部と、高分子固定化材料が、（ｉ）炭酸脱水酵素を安定化させるか、または（ｉｉ）ミセル材料または反転ミセル材料を含むかのいずれかである、高分子固定化材料に封入された固定化された炭酸脱水酵素で被覆される複数の粒子を収容する中間部とを備える、反応槽中で実施される。プロセスは、液体の入口から入り、反応槽の下方に流れる水性液を、ガスの入口から入り、反応槽の上方に流れるＣＯ２含有ガスと接触させ、ＣＯ２の水性液への拡散を促進し、固定化された炭酸脱水酵素の存在下で、水性液中のＣＯ２の水和を触媒し、水素イオンおよび重炭酸イオンを含有する処理された液体ならびに処理されたガスを形成することと、液体出口から処理された液体を排出することと、ガスの出口から処理されたガスを排出することとを含む。
【０００７】
本発明のさらなる態様は、ＣＯ２含有ガスからＣＯ２を除去するための反応槽であり、ガスの入口および液体の出口を収容する底部と、液体の入口およびガスの出口を収容する上部と、高分子固定化材料が、（ｉ）炭酸脱水酵素を安定化させるか、または（ｉｉ）ミセル材料または反転ミセル材料を含むかのいずれかである、高分子固定化材料に封入された炭酸脱水酵素で被覆される複数の粒子を収容する中間部とを備える。炭酸脱水酵素は、ＣＯ２の水素イオンおよび重炭酸イオンへの水和を触媒することができる。
【０００８】
また別の態様は、高分子固定化材料に封入することにより固定化された酵素であり、該材料は、酵素より小さい化合物に対して透過性であり、酵素は、親水性部分、疎水性部分、または両親媒性部分によりイオン修飾されるか、または共有結合的に修飾される。
【０００９】
高分子固定化材料に封入することにより固定化された酵素であり、該固定化材料は、酵素より小さい化合物に対して透過性であり、式５、６、７、または８
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のいずれかの構造を有し、式中、Ｒ２１およびＲ２２は、独立して、水素、アルキル、または置換されたアルキルであるが、ただし、反復単位毎のアルキルまたは置換されたアルキル基の平均数が、少なくとも０．１であることを条件とし、Ｒ２３およびＲ２４は、独立して、水素、アルキル、または置換されたアルキルであるが、ただし、反復単位毎のアルキルまたは置換されたアルキル基の平均数は、少なくとも０．１であることを条件とし、Ｒ２５は、水素、アルキル、または置換されたアルキルであるが、ただし、反復単位毎のアルキルまたは置換されたアルキルの平均数は、少なくとも０．１であることを条件とし、Ｒ３２およびＲ３３は、独立して、水素、アルキル、アリール、または置換されたアルキルであるが、ただし、反復単位毎のアルキルまたは置換されたアルキルの平均数は、少なくとも０．１であることを条件とし、ｍ、ｎ、ｏ、およびｐは、少なくとも１０の整数である。
【００１０】
別の態様は、ＣＯ２含有ガスからＣＯ２を除去するためのシステムであり、第１および第２の反応槽を備え、該第１の反応槽は、上述の反応槽であり、該第２の反応槽は、高分子固定化材料に封入された炭酸脱水酵素で被覆される粒子を収容し、該炭酸脱水酵素は、水素イオンおよび重炭酸イオンの濃縮されたＣＯ２および水への変換を触媒することができる。
【００１１】
さらなる態様は、ＣＯ２含有ガスからＣＯ２を除去するためのプロセスであり、水性液をＣＯ２含有ガスと接触させ、ＣＯ２の水性液への拡散を促進することと、水性液中のＣＯ２を固定化された炭酸脱水酵素と接触させ、ＣＯ２の水和を触媒し、水素イオンおよび重炭酸イオンを含有する処理された液体を形成する。水性液は、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソ−プロピルアミン、ブチルアミン、イソ−ブチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、ペンチルアミン、イソ−ペンチルアミン、ｓｅｃ−ペンチルアミン、ｔｅｒｔ−ペンチルアミン、ヘキシルアミン、イソ−ヘキシルアミン、ｓｅｃ−ヘキシルアミン、ｔｅｒｔ−ヘキシルアミン、エチレンジアミン、（２−メチルブチル）アミン、２−アミノペンタン、３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）プロピルアミン、２−アミノ−６−メチルヘプタン、１−エチルプロピルアミンジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミン、ジペンチルアミン、ジヘキシルアミン、Ｎ−エチルメチルアミン、Ｎ−イソプロピルメチルアミン、Ｎ−ブチルメチルアミン、Ｎ−エチルイソプロピルアミン、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルメチルアミン、Ｎ−エチルブチルアミン、３−イソプロポキシプロピルアミン、クロロ（ジエチルアミノ）ジメチルシラン、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）、１，３−ビス（クロロメチル）−１，１，３，３−テトラメチルジシラザン、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルイソプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルトリメチルシリルアミン、ジ−ｓｅｃ−ブチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、ジメチルプロピルアミン、ジエチルプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチルアミン、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルブチルアミン、１，２−ジメチルプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルメチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルイソプロピルアミン、１，３−ジメチルブチルアミン、３，３−ジメチルブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルブチルアミン、またはそれらの組み合わせを含む。
【００１２】
また別の態様は、炭酸脱水酵素が、ウシ炭酸脱水酵素またはヒト炭酸脱水酵素である、上述のプロセス、反応槽、またはシステムである。具体的には、炭酸脱水酵素は、ウシ炭酸脱水酵素ＩＩ、ヒト炭酸脱水酵素ＩＶ、または修飾されたヒト炭酸脱水酵素ＩＶである。
【００１３】
他の目的および特徴は、一部は明白であり、一部は以後指摘される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】炭酸脱水酵素により触媒された反応、および炭酸脱水酵素触媒なしの反応についての炭酸への二酸化炭素の変換の反応の時間に対するｐＨのグラフであり、実験は、４℃で、０．５ＭのＮａ２ＣＯ３、５０ｓｃｃｍ  ＣＯ２で、２５ｍｇの（０．５ｍｇ／ｍＬ）炭酸脱水酵素を使用して実施された。
【図２】ＣＯ２脱着装置を伴ったＣＯ２吸着装置の概略図である。
【図３Ａ】実施例１に表示されるデータを収集するために使用された充填層反応器の概略図である。
【図３Ｂ】吸着装置およびストリッパを有する炭素捕捉システムの概略図である。
【図４】ＣＯ２が、重炭酸に変換される時、時間に対するｐＨを一定に保つように反応器に添加された２Ｍの水酸化ナトリウム量のグラフであり、炭酸脱水酵素は、トリトン−Ｘ１００で処理され、テトラエチルアンモニウム修飾されたナフィオン（登録商標）に固定化された。
【図５】ＣＯ２が、重炭酸に変換される時、時間に対するｐＨを一定に保つように反応器に添加された２Ｍの水酸化ナトリウム量のグラフであり、炭酸脱水酵素は反応器に存在しない。
【図６】実施例２Ａに記載される、非固定化された炭酸脱水酵素および酵素不在により触媒された二酸化炭素への重炭酸の変換の反応の時間に対するｐＨのグラフであり、実験は、４０℃で、０．１ＭのＮａ２ＣＯ３、５０ｓｃｃｍ  ＣＯ２で、０．３１３ｍｇ／ｍＬの炭酸脱水酵素および５０分の実行時間を使用して実施された。
【図７】実施例２Ａに記載される、非固定化された炭酸脱水酵素および酵素不在により触媒された二酸化炭素への重炭酸の変換の反応の時間に対するｐＨのグラフであり、実験は、４０℃で、０．１ＭのＮａ２ＣＯ３、５０ｓｃｃｍ  ＣＯ２で、０．３１３ｍｇ／ｍＬの炭酸脱水酵素および１６時間の実行時間を使用して実施された。
【図８】実施例２Ｂに記載される、非固定化された炭酸脱水酵素により触媒された二酸化炭素への重炭酸の変換の反応の時間に対するｐＨのグラフであり、実験は、４０℃で、０．１Ｍ、０．５Ｍ、および２ＭのＮａ２ＣＯ３、５０ｓｃｃｍ  ＣＯ２で、０．３１３ｍｇ／ｍＬの炭酸脱水酵素を使用して実施された。
【図９】実施例２Ｃに記載される、非固定化された炭酸脱水酵素により触媒された二酸化炭素への重炭酸の変換の反応の時間に対するｐＨのグラフであり、実験は、２０℃および４０℃で、０．５ＭのＮａ２ＣＯ３、５０ｓｃｃｍ  ＣＯ２で、０．３１３ｍｇ／ｍＬの炭酸脱水酵素を使用して実施された。
【図１０】実施例２Ｄに記載される、２つの異なる実行で、固定化された炭酸脱水酵素により触媒された二酸化炭素への重炭酸の変換の反応の時間に対するｐＨのグラフであり、実験は、４０℃で、０．１ＭのＮａ２ＣＯ３、５０ｓｃｃｍ  ＣＯ２で、トリトン−Ｘ１００で処理され、テトラエチルアンモニウム修飾されたナフィオン（登録商標）で固定化された、０．３１３ｍｇ／ｍＬの炭酸脱水酵素を使用して実施された。炭酸脱水酵素触媒が使用されない実験も実施された。
【図１１】可溶性色素を有する、もしくは有さないポリスルホンビーズの写真ならびに断面写真である。
【図１２】実施例１Ｃに記載する、ポリスルホンに固定化された炭酸脱水酵素、遊離炭酸脱水酵素、および酵素なしで触媒された炭酸への二酸化炭素の変換の反応の時間に対するｐＨのグラフであり、実験は、４℃で、０．５ＭのＮａ２ＣＯ３、５０ｓｃｃｍ  ＣＯ２で、２５ｍｇ（０．５ｍｇ／ｍＬ）の炭酸脱水酵素を使用して実施された。
【図１３】実施例２Ａに記載する、アルギン酸塩に固定化され、ポリスルホンで被覆された炭酸脱水酵素、遊離炭酸脱水酵素、および酵素なしで触媒された炭酸への二酸化炭素の変換の反応の時間に対するｐＨのグラフであり、実験は、４℃で、０．５ＭのＮａ２ＣＯ３、５０ｓｃｃｍ  ＣＯ２で、２５ｍｇ（０．５ｍｇ／ｍＬ）の炭酸脱水酵素を使用して実施された。
【図１４】実施例３に記載する、架橋されたポリ（塩化ビニルベンジル）（ＰＶＢＣ）に固定化された炭酸脱水酵素、および酵素なしで触媒された炭酸への二酸化炭素の変換の反応の時間に対するｐＨのグラフであり、実験は、４℃で、０．５ＭのＮａ２ＣＯ３、５０ｓｃｃｍ  ＣＯ２で、８０ｍｇの炭酸脱水酵素を使用して実施された。
【図１５】実施例７に記載する、テトラメチルジアミン化ポリスルホン粒子に固定化された炭酸脱水酵素、および酵素なしで触媒された炭酸への二酸化炭素の変換の反応の時間に対するｐＨのグラフであり、実験は、４℃で、０．５ＭのＮａ２ＣＯ３、５０ｓｃｃｍ  ＣＯ２で、５０ｍｇの炭酸脱水酵素を使用して実施された。
【図１６】モノエタノールアミン（ＭＥＡ）、Ｎ，Ｎ−ジエチルメチルアミン（ＤＭＡ）、およびＮ−メチルジエタノールアミン（ＭＤＥＡ）の溶液中の炭酸脱水酵素（ＣＡ）においてｍｍｏｌ／分／Ｌを単位とした、捕捉された総ＣＯ２のグラフである。
【図１７】ＭＥＡ、ＤＭＡ、およびＭＤＥＡ溶液における、μｍｏｌ／分／ｍｇを単位とした、炭酸脱水酵素の特定の活性のグラフである。
【図１８】ペグ化されたポリスルホンに固定化された炭酸脱水酵素、遊離炭酸脱水酵素、および酵素なしで触媒された炭酸への二酸化炭素の変換の反応の時間に対するｐＨのグラフであり、実験は、２０℃で、０．５ＭのＭＥＡ、２００ｓｃｃｍ  Ｎ２で、２５ｍｇ（０．５ｍｇ／ｍＬ）の炭酸脱水酵素を使用して実施された。
【図１９】ペグ化されたポリスルホンに固定化された炭酸脱水酵素、遊離炭酸脱水酵素、および酵素なしで触媒された炭酸への二酸化炭素の変換の反応の時間に対するｐＨのグラフであり、実験は、５０℃で、０．５ＭのＭＥＡ、２００ｓｃｃｍ  Ｎ２で、２５ｍｇ（０．５ｍｇ／ｍＬ）の炭酸脱水酵素を使用して実施された。
【図２０】ペグ化されたポリスルホンに固定化された炭酸脱水酵素、遊離炭酸脱水酵素、および酵素なしで触媒された炭酸への二酸化炭素の変換の反応の時間に対するｐＨのグラフであり、実験は、２０℃で、０．５ＭのＭＤＥＡ、２００ｓｃｃｍ  Ｎ２で、２５ｍｇ（０．５ｍｇ／ｍＬ）の炭酸脱水酵素を使用して実施された。
【図２１】ペグ化されたポリスルホンに固定化された炭酸脱水酵素、遊離炭酸脱水酵素、および酵素なしで触媒された炭酸への二酸化炭素の変換の反応の時間に対するｐＨのグラフであり、実験は、５０℃で、０．５ＭのＭＤＥＡ、５０ｓｃｃｍ  Ｎ２で、２５ｍｇ（０．５ｍｇ／ｍＬ）の炭酸脱水酵素を使用して実施された。
【図２２】指定された時間の間、７０℃に曝露した後、室温で検定された遊離炭酸脱水酵素（ＣＡ）含有溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）の酵素活性のグラフである。
【図２３】指定された時間の間の、遊離および固定化された未精製ウシ炭酸脱水酵素ＩＩ（ＢＣＡ  ＩＩ）における７０℃での酵素活性のグラフである。
【図２４】ｐＨスタットを介して検査された溶岩上のポリエチレングリコール（ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧ、２２重量％ＰＥＧ、５５０Ｄａ  ＰＥＧ）とグラフトされた、ポリスルホンに固定化された未精製ＢＣＡ  ＩＩの時間に対する酵素活性のグラフである。
【図２５】ｐＨスタットを介して検査された溶岩上のＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧ（３８重量％ＰＥＧ、５５０Ｄａ  ＰＥＧ）に固定化された未精製ＢＣＡ  ＩＩの時間に対する酵素活性のグラフである。
【図２６】指定された時間の間、遊離および固定化されたヒト炭酸脱水酵素ＩＶ（ＨＣＡ  ＩＶ）の７０℃での酵素活性のグラフである。
【図２７】溶岩上のＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧ（４０重量％ＰＥＧ、５５０Ｄａ  ＰＥＧ）に固定化されたＨＣＡ  ＩＶの時間に対する酵素活性のグラフである。
【図２８】スズおよびジシラノール終結ＰＤＭＳ、ＭＷａｖｇ＝２７５０ｇ／ｍｏｌ（全体で２０重量％ＰＥＧ）を用いて架橋された、ＰＭＨＳ−ｇ−ＰＥＧ（５０重量％ＰＥＧ、５００Ｄａ  ＰＥＧ）に固定化された未精製ＢＣＡ  ＩＩの残存活性率の５日単純移動平均のグラフである。
【図２９】スズおよびジシラノール終結ＰＤＭＳ、ＭＷａｖｇ＝２７５０ｇ／ｍｏｌ（全体で２０重量％ＰＥＧ）を用いて架橋された、ＰＭＨＳ−ｇ−ＰＥＧ（５０重量％ＰＥＧ、５００Ｄａ  ＰＥＧ）に固定化された未精製ＢＣＡ  ＩＩの熱ショックの結果のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のシステムは、ＣＯ２の炭酸（ＣＯ３２-）溶液の水相への吸収速度および反応速度を加速し、重炭酸（ＨＣＯ３-）を形成する。全体的な化学作用は、以下の通りである。
ＣＯ３２-  ＋  Ｈ２Ｏ  ＋  ＣＯ２  →  ２ＨＣＯ３-
酵素を使用しない反応は、２段階のシーケンスで生じる。
ＣＯ３２-  ＋  Ｈ２Ｏ  →  ＯＨ-  ＋  ＨＣＯ３-  （１）
ＣＯ２  ＋  ＯＨ-  →  ＨＣＯ３-              （２）
１０．５を越えるｐＨで、反応速度は、ＣＯ２の水での低い溶解度により制限される拡散であってもよい。１０．５より低いｐＨで、反応速度は、低濃度のＯＨ-のため、非常に遅い。
【００１６】
ＣＯ２の水和をもたらす別の手段は、炭酸脱水酵素（ＣＡ）を使用して、反応を触媒することである。酵素触媒された反応は、異なる２段階のシーケンスを有する。
ＣＯ２  ＋  Ｈ２Ｏ  →  Ｈ＋  ＋  ＨＣＯ３-      （３）
ＣＯ３２-  ＋  Ｈ＋  →  ＨＣＯ３-                （４）
ＣＯ２水和［反応（３）］を触媒するためにＣＡを使用することにより、ＣＯ２の重炭酸形態への変換速度は、特に１０．５より低いｐＨで加速される。２５℃での水和反応のＫｅｑは、１．７×１０-３であり、平衡での反応は、方程式のＣＯ２／Ｈ２Ｏ側を好む。ＣＡの存在下で、平衡に近づく反応速度は、６〜８桁増加する。反応（４）において、炭酸は、反応（３）で産生されたプロトンを捕捉し、より多くの重炭酸およびプロトンを産生する推進力を生成する。反応混合物のｐＨの減少の速さに認められる、ＣＯ２水和の反応速度の増加を示すデータを図１に示す。
【００１７】
同様に、第２の反応器において、ＣＡは、重炭酸のＣＯ３２-、ＣＯ２、および水へ戻る脱水を触媒する。炭酸は、ＣＯ２の脱水が生じる第１の反応器に再循環され得る。例えば、ＣＯ２の脱水の化学作用は、以下の通りである。
２ＮａＨＣＯ３  →  Ｎａ２ＣＯ３  ＋  Ｈ２Ｏ  ＋  ＣＯ２            （５）
加熱時、重炭酸は、ＣＯ２および水を放出し、水和反応に再利用され得る炭酸イオンを形成する。脱水反応器中のＣＡは、ＣＯ２水和ユニットのそれと類似し、この反応の速度を増加するはずである。ナトリウムが、別のカチオン（例えば、アルカリ金属、アルカリ土類金属等）で置換される時、金属は、得られる炭酸が、好ましくは水性溶液に可溶性であるように選択される。標準温度および圧力で、ＣＯ２は、約１．８グラム／リットルの溶解度を有し、したがって、ＣＯ２の水相への急速な移行を可能にするシステムが望ましい。
システム設計
【００１８】
重炭酸イオンを形成するように、ガス流中の二酸化炭素ガスを水和するために使用されるシステムは、充填層、流動層、または連続攪拌槽を含む、種々の反応器を使用することができる。充填層または流動層反応器が使用される時、反応器に流入するガス流および液体流は、並流または対向流の構成であり得る。例えば、並流システムにおいて、ガス流および液体流は、液体流中のガスの微小気泡の形態で反応器に流入することもあり得る。さらに、反応器の充填は、固定化された炭酸脱水酵素を含む充填材料であり得、例えば、固定化された炭酸脱水酵素は、充填材料上に被覆され得る。これらの実施形態のいくつかにおいて、充填材料は、高表面積を有する。さらに、反応器中の構成は、トレー形式の蒸留塔に類似し得、この場合、充填材料は、（例えば、膜を蛇行形態にそれ自身上に折り返すことにより）ガス流および液体流と接触する表面を最大にするように配向される、固定化炭酸脱水酵素を含む膜を含む。
【００１９】
特定の一システムにおいて、２ユニット式連続流動システムは、ＣＯ２ガスを水和して、ＣＯ２吸着装置中で重炭酸イオンを形成し、ＣＯ２脱着装置中で重炭酸イオンをＣＯ２、水、および炭酸イオンに脱水するように使用され得る。いくつかの場合において、ユニットは、充填塔設計を有する。吸着装置１０および脱着装置１２を含む、この２ユニット式システムの概略図を図２に示す。ＣＯ２ガス流１４は、吸着装置１０の底部に入り、液体流１６は、吸着装置１０の上部に入る。液体流１６は、分配器（図示せず）により、吸着装置１０の中間部の充填物（図示せず）の上に分配される。ＣＯ２ガス流１４が、液体の流れの充填対向流の隙間を通して上方に流れる一方で、液体流１６は、充填物の表面を湿らし、吸着装置１０を通って下方に流れる。充填物は、液体相とガス相との間に接触面を提供し、その外表面上に固定された炭酸脱水酵素を含む。ガス流中のＣＯ２は、液体に吸着され、処理されたガス流１８は、吸着装置の上から流出する。液体は、塔から下に流れる時にＣＯ２を豊富に含み、重炭酸が形成され、処理された液体流２０は、吸着装置の塔底から流出する。処理された液体流２０は、脱着装置１２の上部に送り出され、分配器（図示せず）により、そこに固定化された炭酸脱水酵素を有する充填物に渡って分配される。液体流２０内の重炭酸は、二酸化炭素、水、および炭酸に変換される。ＣＯ２を産生するこの反応の反応速度は、大気圧以下で操作することによって、熱を加え、脱着装置１２からのＣＯ２の除去速度を増加することにより増加され得る。水および炭酸は、再利用され、吸着装置１０に流入する液体流１６と混合され、二酸化炭素は、ガス流２２として脱着装置の上から流出し、所望に応じてさらに処理され得る。
【００２０】
代替的に、吸着装置は、標準の反応器充填材料（充填塔に通常使用されるバールサドル、インタロックスサドル、ラシヒリングもしくはパールリング充填物等）上に固定化される炭酸脱水酵素を有することができ、微小気泡ＣＯ２ガスおよび水性炭酸溶液と接触させて、ＣＯ２ガスを水性炭酸溶液中に運搬するために、ガスと液体との間の表面積を増加することができる。
【００２１】
他の実施形態において、システムは、膜２６を有する図２Ｂに示す反応器２４を含み、この場合、ＣＯ２を含有するガス流２８は、膜の第１の表面３０と接触し、水性炭酸流３４は、膜の第２の表面３２上である。膜は、少なくともＣＯ２ガスに透過性であるが、水性炭酸流３４に不透過性であるか、または第１の表面３０は、流れ３４に不透過性であるかのいずれかである。膜２６は、本明細書に記載されるように、固定化された炭酸脱水酵素を支持することができる。ガス流２８中のＣＯ２ガスは、固定化された炭酸脱水酵素および流れ３４と相互作用することができ、重炭酸に変換される。重炭酸は、固定化された酵素と接触する流れ３４により吸収され得る。膜材料は、多糖、イオン交換樹脂、処理されたシリコンオキシド、多孔金属構造、炭素棒もしくは炭素管、黒鉛繊維、ケイ素ビーズ、セルロース膜、ゲルマトリックス（例えば、ポリアクリルアミドゲル、ポリ（アクリロイルモルホリン）ゲル、ナイロンメッシュ等）であり得る。この構成に使用され得る高表面積／体積膜システムは、米国特許第６，５２４，８４３号に記載されている。
【００２２】
脱着装置は、標準の反応器充填材料上に固定化された炭酸脱水酵素、および吸着装置からの重炭酸溶液の供給物を有することができる。ＣＯ２を産生するためのこの反応の反応速度は、熱を加えることにより増加され得、脱着装置からのＣＯ２の除去は、大気圧以下で操作することによって増加され得る。
【００２３】
これらのシステム設計は、特定の用途または処理されるガス流に応じて、異なる構成に組み合わされ得る。例えば、システムの仕様を、産生物流に要求される供給物流のＣＯ２含有量および全体的な純度、回収率、ならびに汚染物質レベルに、両方の流れの温度および圧力条件に沿って、合わせることができる。固定化された酵素の使用は、対応する遊離酵素と比較して、システムの操作条件の範囲を広げる。本明細書に記載する充填塔は、脱着装置として本明細書に記載される膜反応器と併せて、吸着装置として使用され得る。代替的に、本明細書に記載する膜反応器は、吸着装置として使用され得、本明細書に記載される充填塔は、脱着装置として使用され得る。
【００２４】
また、システム設計は、概して、図３Ｂに図示される通りであり得る。例えば、炭素捕捉プロセスユニットは、標準の吸着ユニットと、剥離（反応蒸溜）ユニットとを含む。炭素捕捉システム（ＣＣＳ）の主な構成要素は、吸着ユニット操作、剥離ユニット操作、および２つのユニット操作間の熱交換構成要素である。周辺機器は、標準の制御ハードウェアおよびソフトウェア、流量監視および調節（例えば、制御弁、流量計）、ポンプ、ｐＨ監視（例えば、ｐＨ計）、温度監視（例えば、温度モニター）、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。追加機器は、プロセスを監視し、制御する手段を提供し得る。
炭酸脱水酵素
【００２５】
本明細書に記載するシステムに使用される炭酸脱水酵素（ＣＡ）は、二酸化炭素の重炭酸イオンおよびプロトンへの変換、ならびに重炭酸イオンおよびプロトンの二酸化炭素への変換を触媒する。いくつかの炭酸脱水酵素の形態が自然界に存在する。炭酸脱水酵素は、哺乳類、植物、藻類、および細菌で発見される。酵素は、通常、３つのクラス（例えば、α、β、およびγの炭酸脱水酵素）に分けられる。哺乳類の炭酸脱水酵素は、αクラスに属し、植物の炭酸脱水酵素は、βクラスに属し、温泉で成長するメタン生成細菌からの炭酸脱水酵素は、γクラスに属する。異なるクラスの構成要素は、シーケンスまたは構造の類似性を持たないが、同じ機能を行い、活性部位で亜鉛イオンを必要とする。
【００２６】
哺乳類の炭酸脱水酵素において、少なくとも１４の既知のイソ型が存在する。これらの哺乳類のＣＡ酵素は、組織または細胞区画の位置（例えば、細胞基質、ミトコンドリア、分泌、および膜関連）により４つの広範なサブグループに分けられる。最も速い回転速度を有することで知られるＣＡは、ＣＡ  ＩＩである。ＣＡ  ＩＶは、特に高温安定性を有することが知られており、この安定性は、酵素の２つのジスルフィド架橋からの基部と考えられている。
【００２７】
好適な実施形態のいくつかにおいて、ウシ炭酸脱水酵素ＩＩまたはヒト炭酸脱水酵素ＩＶが使用される。ヒト炭酸脱水酵素ＩＶは、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｓ．Ｓｌｙ  ａｔ  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手可能であり、以下の参考文献により詳細に記載されている：Ｔ．Ｏｋｕｙａｍａ，Ｓ  Ｓａｔｏ，Ｘ．Ｌ．Ｚｈｕ，Ａ．Ｗａｈｅｅｄ，ａｎｄ  Ｗ．Ｓ．Ｓｌｙ，Ｈｕｍａｎ  ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ  ＩＶ：ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＣＯＳ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９２，８９（４），１３１５−１３１９  ａｎｄ  Ｔ．Ｓｔａｍｓ，Ｓ．Ｋ．Ｎａｉｒ，Ｔ．Ｏｋｕｙａｍａ，Ａ．Ｗａｈｅｅｄ，Ｗ．Ｓ．Ｓｌｙ，Ｄ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ  ＩＶ  ａｔ  ２．８−Å  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９６，９３，１３５８９−１３５９４。
【００２８】
炭酸脱水酵素の活性部位を模倣する化合物も使用され得る。例えば、種々の金属複合体は、炭酸脱水酵素活性部位を模倣するために使用されている。例えば［Ｚｎ２（３，６，９，１２，２０，２３，２６，２９−オクタアザトリシクロ［２９．３．１．１１４，１８］ヘキサトリアコンタ−１（３４），１４，１６，１８（３６），３１（３５），３２−ヘキサエン）（ＣＯ３）］Ｂｒ２−７Ｈ２Ｏおよび［Ｚｎ２（３，６，９，１２，２０，２３，２６，２９−オクタアザトリシクロ［２９．３．１．１１４，１８］ヘキサトリアコンタ−１（３４），１４，１６，１８（３６），３１（３５），３２−ヘキサエン）（ＣＯ３）］Ｂｒ２・０．５ＣＨ３ＣＯＣＨ３・５Ｈ２Ｏ（Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２００８，１１，９２９−９３４を参照のこと）。また、炭酸脱水酵素の模倣物として、［トリス（２−ベンズイミダゾリルメチル）アミンＺｎ（ＯＨ）２］２＋が使用され、［トリス（２−ベンズイミダゾリル）アミンＺｎ（ＯＨ）２］（ＣｌＯ４）２、および［トリス（ヒドロキシ−２−ベンズイミダゾリルメチル）アミンＺｎ（ＯＨ）］ＣｌＯ４−１．５Ｈ２Ｏも、ＣＯ２を水和するために使用された（Ｎａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９７，９９１−９９２およびＥｃｈｉｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００４，９８，１３４７−１３６０も参照のこと）。
酵素および酵素修飾
【００２９】
炭酸脱水酵素を含む酵素、または他の酵素は、本明細書に記載される方法および材料を使用して修飾、および固定化され得る。酵素は、所望の反応を触媒するために使用される。概して、自然に生じる酵素、人工酵素、擬似酵素、および化学的または遺伝子組み換えされている自然に生じる酵素が固定化され得る。加えて、自然または指向性進化により操作された操作酵素が使用され得る。言い換えると、酵素の特性を模倣する有機または無機の分子が、本発明の実施形態に使用され得る。固定化され得る酵素は、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、異性化酵素、連結酵素、またはそれらの組み合わせである。使用される他の酵素は、エラープローンＰＣＲ法および遺伝子組み換え等の、通常使用される組み換え遺伝子法により取得され得る。さらに、他の適切な酵素は、土壌等の種々の環境から酵素を採掘することにより取得してもよい。加えて、新しい酵素および酵素の形態が、環境の微生物または他の生物源で発見され得る。
【００３０】
種々の好適な実施形態において、固定化される酵素は、脂肪分解酵素、グルコース異性化酵素、ニトリラーゼ、グルコースオキシダーゼ、プロテアーゼ（例えば、ペプシン）、アミラーゼ（例えば、真菌アミラーゼ、マルトース生成型アミラーゼ）、セルラーゼ、ラクターゼ、エステラーゼ、カルボヒドラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペントサナーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、β−グルコシダーゼ、グルタミナーゼ、ペニシリンアシラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素、シクロデキストリングリコシル基転移酵素、サブチリシン、アミノアシラーゼ、アルコール脱水素酵素、アミノ酸オキシダーゼ、ホスホリパーゼ、ウレアーゼ、コレステラーゼ、デスルフィナーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ペクチナーゼ、酸化還元酵素、デキストラナーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシターゼ、グルコアミラーゼ、マルターゼ、スクラーゼ、転化酵素、ナリンガナーゼ（ｎａｒｉｎｇａｎａｓｅ）、ブロメライン、フィシン、パパイン、ペプシン、ペプチダーゼ、キモシン、サーモリシン、トリプシン、トリグリセリダーゼ（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄａｓｅ）、前胃（ｐｒｅｇａｓｔｒｉｃ）エステラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、アミダーゼ、グルタミナーゼ、リゾチーム、カタラーゼ、脱水素酵素、ペルオキシダーゼ、リアーゼ、フマラーゼ、ヒスチダーゼ（ｈｉｓｔｉｄａｓｅ）、アミノ基転移酵素、連結酵素、環化酵素、ラセミ化酵素、ムターゼ、オキシダーゼ、還元酵素、リグニナーゼ、上に挙げられる、ラッカーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヒドロゲナーゼ、ニトロゲナーゼ、オキシニトリラーゼ（マンデロニトリルリアーゼ）、またはそれらの組み合わせである。
【００３１】
種々の実施形態において、酵素は、グルコースが産生される反応を触媒する。一システムにおいて、β−グルコシダーゼは、セロビオーズをグルコースに加水分解するために使用され得る。さらに、セルラーゼは、セルロースのグルコースへの加水分解を触媒し、アミラーゼは、澱粉またはマルトースのグルコースへの加水分解を触媒する。複合糖質は、最も豊富な生体分子であり、基質の良い供給源であるが、グルコースは、複合糖質よりも広く使用することができるため、糖質は、好ましくはグルコースのような低分子量構成要素に分解される。セルロースは、最も豊富な糖質であり、グルコースサブユニットから形成される。セルロースは、グリコシド結合を加水分解するセルラーゼにより容易に分解される。複合基質のそれらの低分子量構成要素への生体再編成は、酵素を用いた触媒作用により達成され得る。これらの酵素は、多糖（澱粉およびセルロース）および二糖（スクロースおよびラクトース）の多数の反応に使用され得る個別の糖質への消化に使用され得る。
【００３２】
他の好適な実施形態において、炭酸脱水酵素は、固定化され得る。炭酸脱水酵素は、二酸化炭素の炭酸（例えば、水性溶液中の重炭酸およびプロトン）への変換、または重炭酸およびプロトンの二酸化炭素への変換を触媒するために使用され得る。
【００３３】
この用途の目的のため、「修飾」という用語は、酵素の表面上の種々の官能基が、種々の修飾剤と共有結合的に、イオン的に、または疎水性会合もしくは親水性会合により相互作用することを意味する。種々の酵素への共有結合による修飾は、酵素の疎水性剤、親水化剤、または両親媒性剤との反応により成され得る。これらの相互作用は、酵素に疎水性、親水性、または両親媒性部分を付加する。例えば、モノアミン（例えば、アルキルアミン）、アルデヒド（例えば、ペンタナール、イソブタナール、アセタナール、ヘキサナール、オクタナール、デカナール）、四級アンモニウム塩、アルキルトリメチルアンモニウムカチオン、有機カチオン、ホスホニウムカチオン、ピリジニウムカチオン、イミダゾリウムカチオン、ビオローゲン、ビス（トリフェニルホスフィン）イミニウム金属複合体、ビピリジル金属複合体、フェナンスロリン系金属複合体、またはそれらの組み合わせの、種々の疎水性剤が使用され得る。種々の実施形態において、疎水性剤は、ブチルアミン、ヘキシルアミン、オクチルアミン、デシルアミン、ドデシルアミン、ペンタナール、イソブタナール、アセタナール、ヘキサナール、オクタナール、デカナール、アセチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、トリフェニルホスホニウム、ヘキサデシルピリジニウム、エチジウム、メチルビオローゲン、ベンジルビオローゲン、［Ｒｕ（ビピリジン）３］２＋、［Ｆｅ（フェナンスロリン）３］３＋、またはそれらの組み合わせであり得る。他の実施形態において、疎水性剤は、ブチルアミン、ヘキシルアミン、オクチルアミン、デシルアミン、ドデシルアミン、ペンタナール、イソブタナール、アセタナール、ヘキサナール、オクタナール、デカナール、アセチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、トリフェニルホスホニウム、ヘキサデシルピリジニウム、エチジウム、メチルビオローゲン、ベンジルビオローゲン、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００３４】
さらに、例えば、ジアミン（例えば、エチレンジアミン）、モノカルボキシレート、二酸（例えば、スベリン酸）、ポリアール、多糖、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、グリコシル、無水物（例えば、コハク酸無水物、ピロメリット酸無水物、グリセリンアルデヒド）、ポリエチレングリコール、アガロース、またはそれらの組み合わせの、親水性剤が、使用され得る。また、例えば、アミノ酸、脂肪酸、脂肪アルコール、脂質、アルキルポリエチレンオキシド、他のポリエチレンオキシド共重合体、アルキルポリグルコシド、またはそれらの組み合わせの、種々の両親媒性修飾剤が使用され得る。さらに、以下に記載される界面活性剤も、酵素を修飾するために使用され得る。共有結合による修飾のための薬剤は、修飾される酵素の官能基と反応性である、またはそれと反応性にさせる官能基を有する。さらに、酵素は、適切な発現系を使用して、または生体外グリコシル化によりグリコシル化され得、この場合、糖部分は酵素に結合される。
【００３５】
種々の好適な実施形態において、酵素は、炭酸脱水酵素であり、この場合、酵素は、アルキルアミンであるか、またはポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等の水溶性重合体のいずれかを用いて、共有結合的に修飾されている。共有結合による修飾に有用なアルキルアミンは、ブチルアミン、ヘキシルアミン、オクチルアミン、デシルアミン、ドデシルアミン等である。
【００３６】
酵素は、分子内のランダムな位置で、または分子内の所定の位置で修飾されてもよく、１、２、３、またはそれ以上の結合された化学部分を含む。
【００３７】
水溶性重合体は、任意の分子量であり得、分枝または非分枝であり得る。ポリエチレングリコールにおいて、好適な分子量は、取り扱いおよび製造の簡易化のために、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａ（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの調製物において、いくつかの分子が記載される分子量よりも多いまたは幾分少ない重さであることを示す）の間である。所望の特性、具体的には、生物学活性に応じて、他の大きさが使用されてもよい。例えば、ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、５５，０００，６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または１００，０００ｋＤａの質量平均分子量を有してもよい。種々の実施形態において、ポリエチレングリコールは、約２００Ｄａ〜約９００Ｄａ、約３００Ｄａ〜約８００Ｄａ、約４００Ｄａ〜約７００Ｄａ、約５００Ｄａ〜約６００Ｄａの質量平均分子量、または約５５０Ｄａの質量平均分子量を有することができる。
【００３８】
上述のように、ポリエチレングリコールは、分枝構造を有してもよい。分枝ポリエチレングリコールは、例えば、米国特許第５，６４３，５７５号、Ｍｏｒｐｕｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６：５９−７２（１９９６）、Ｖｏｒｏｂｊｅｖ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１８：２７４５−２７５０（１９９９）、およびＣａｌｉｃｅｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−６４６（１９９９）に記載されており、それぞれの開示は、参照により本明細書に援用される。
【００３９】
ポリエチレングリコール分子（または他の化学部分）は、酵素の機能ドメインへの影響を考慮して酵素に結合されるべきである。当業者に利用可能ないくつかの結合方法、例えば、参照により本明細書に援用される、ＥＰ０４０１３８４（ＰＥＧをＧ−ＣＳＦに結合）があり、また、Ｍａｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−１０３５（１９９２）（塩化トレシルを使用したＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告）も参照のこと。例えば、ポリエチレングリコールは、遊離アミノ基またはカルボキシル基等の反応基を介した、アミノ酸残基を通して共有結合的に結合されてもよい。反応基は、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合されてもよいものである。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基は、リジン、アルギニン、アスパラギン、ならびにグルタミン残基およびＮ−末端アミノ酸残基を含み、遊離カルボキシル基を有するものは、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびＣ−末端アミノ酸残基を含んでもよい。スルフヒドリル基も、ポリエチレングリコール分子を結合するために、反応基として使用されてもよい。
【００４０】
上に示すように、ポリエチレングリコールは、いくつかのアミノ酸残基のいずれかへの連結を介して、酵素に結合されてもよい。例えば、ポリエチレングリコールは、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン残基への共有結合的結合を介して、酵素に連結され得る。１つ以上の反応化学が、ポリエチレングリコールを酵素の特定のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン）に、または１つ以上の種類のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、およびそれらの組み合わせ）に結合するために利用されてもよい。
【００４１】
上に示すように、酵素のペグ化は、任意の数の手段により達成されてもよい。例えば、ポリエチレングリコールは、直接的に、または介在リンカーのいずれかにより酵素に結合されてもよい。ポリエチレングリコールを酵素に結合するためにリンカーを使用しないシステムは、Ｄｅｌｇａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）、Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒ  Ｊ．ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１−１８（１９９８）、米国特許第４，００２，５３１号、米国特許第５，３４９，０５２号、国際公開第ＷＯ９５／０６０５８号、および国際公開第ＷＯ９８／３２４６６号に記載されており、それぞれの開示は、参照により本明細書に援用される。
【００４２】
介在リンカーを使用せずポリエチレングリコールを直接酵素のアミノ酸残基に結合するためのシステムの１つは、塩化トレシル（ＣｌＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３）を使用した、モノメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）の修飾により産生される、トレシル化ＭＰＥＧを利用する。酵素のトレシル化ＭＰＥＧとの反応時、ポリエチレングリコールは、酵素のアミン基に直接結合される。したがって、本発明は、本発明の酵素を２，２，２−トリフルオロエタンスルホニル基を有するポリエチレングリコール分子と反応させることにより産生される、酵素−ポリエチレングリコール共役を含む。
【００４３】
ポリエチレングリコールは、また、いくつかの異なる介在リンカーを使用して酵素に結合されてもよい。例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第５，６１２，４６０号は、ポリエチレングリコールを酵素に接続するための、ウレタンリンカーを開示している。ポリエチレングリコールがリンカーにより酵素に結合される、酵素−ポリエチレングリコール共役は、酵素のコハク酸ＭＰＥＧ−サクシニミジル、１，１’−カルボニルジイミダゾールで活性化されたＭＰＥＧ、炭酸ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロぺニル、炭酸ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロフェノール、および種々のＭＰＥＧコハク酸誘導体等の化合物との反応によっても産生され得る。ポリエチレングリコールを酵素に結合するための、いくつかのさらなるポリエチレングリコール誘導体および反応化学は、国際公開第ＷＯ９８／３２４６６号に記載されており、その開示全体は、参照により本明細書に援用される。
【００４４】
各酵素に結合されるポリエチレングリコール部分の数（すなわち、置換の程度）も変動してもよい。例えば、ペグ化酵素は、平均して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０、またはそれ以上のポリエチレングリコール分子に連結されてもよい。同様に、置換の程度の平均は、酵素分子当り、１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１９、または１８〜２０ポリエチレングリコール部分の範囲である。置換の程度を決定するための方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）に論議されている。
【００４５】
アミンが酵素を修飾するために使用される時、酵素は、結合剤（例えば、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ））、およびエステル活性化剤（例えば、Ｎ−ヒドロキシスルホサクシニミドナトリウム塩（スルホ−ＮＨＳ））、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリゾール）と混合され、得られた溶液は、５秒間、激しくボルテックスされる。第２の溶液は、アルキルアミンまたはポリエチレングリコールと混合される、ｐＨ５．０のＭＥＳ緩衝液を用いて作製される。この溶液を結合剤／酵素溶液と混合し、５秒間、激しくボルテックスする。混合溶液を一晩、冷蔵庫で保持する。その後、修飾された酵素は、本明細書に記載する固定化材料に固定化され得る。
【００４６】
さらに、酵素は、種々の界面活性剤により修飾され得る。例えば、非イオン界面活性剤は、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コールアミド（ＢｉｇＣＨＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコールアミド（ＤｅｏｘｙＢｉｇＣＨＡＰ）、ポリオキシエチレンアルコール（例えば、Ｂｒｉｊ３５およびＢｒｉｊ  ５８Ｐ）、２−シクロヘキシルメチル−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−１）、２−シクロヘキシルエチル−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−２）、シクロヘキシルペンチル−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−５）、シクロヘキシルヘキシル−β−Ｄ−マルトシド（Ｃｙｍａｌ−６）、デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ヘキサデシル−β−Ｄ−マルトシド、ウンデシル−β−Ｄ−マルトシド、デシル−β−Ｄ−１−チオマルトピラノシド、オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ジギトニン、ジメチデシルホスフィンオキシド、ドデシルジメチルホスフィンオキシド、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ６３０）、Ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミン（ＭＥＧＡ−８）、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン（ＭＥＧＡ−９）、Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミン（ＭＥＧＡ−１０）、ポリオキシエチレンオクチルフェノール（ノニデット（登録商標）Ｐ４０−置換）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン遮断共重合体（プルロニックＦ−６８）、サポニン、ポリオキシエチレン９−ラウリルエーテル（Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標））、ポリオキシエチレンオクチルフェノール（例えば、トリトンＴ（登録商標）Ｘ−１００およびトリトン（登録商標）Ｘ−１１４）、ソルビタンモノラウレートのポリオキシエチレン誘導体（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０、およびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミン−Ｎ−オキシド、アルコールエトキシレート（Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  Ａ７）、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００４７】
例えば、アミドスルホベタイン−１４、アミドスルホベタイン−１６、Ｃ７ＢｚＯ、３−［（３−コールアミドプロピルジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コールアミドプロピルジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、（ドデシルジメチルアンモニオ）アセテート（ＥＭＰＩＧＥＮ（登録商標）ＢＢ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホネート、３−（ドデシルアンモニオ）プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデシルアンモニオ）プロパンスルホネート、またはそれらの組み合わせの、双性イオン界面活性剤も使用され得る。
【００４８】
酵素が界面活性剤で修飾される時、修飾された酵素は、酵素に適切なｐＨの緩衝液中で、酵素を界面活性剤と混合することにより調製される。当業者は、特定の酵素に適切なｐＨの緩衝液を容易に決定することができるだろう。
酵素固定化材料
【００４９】
本発明の目的において、（１）室温で、化学転換を連続して触媒した時、少なくとも約３０日間、その初期の触媒活性の少なくとも約１５％を維持する、（２）室温で、化学転換を連続して触媒した時、少なくとも約５日間、その初期の触媒活性の少なくとも約１５％を維持する、（３）約３０℃〜約１００℃の温度で処理された時、少なくとも約５日間、その初期の触媒活性の少なくとも約１５％を維持する、（４）室温で、約０〜約１３のｐＨで化学転換を連続して触媒した時、少なくとも約５日間、その初期の触媒活性の少なくとも約１５％を維持する、（５）非極性溶媒、油、アルコール、アセトニトリル、または高イオン濃度中で、室温で化学転換を連続して触媒した時、少なくとも約５日間、その初期の触媒活性の少なくとも約１５％を維持する、いずれかの場合、酵素は「安定化」される。典型的に、適切に固定化および安定化された酵素は、少なくとも約５日間〜約１０９５日間（３年間）、その触媒活性を維持することができるが、溶液中の遊離酵素は、数時間〜数日内にその触媒活性を失う。したがって、酵素の固定化は、安定性に顕著な利点を提供する。触媒活性の維持は、その初期の触媒活性の少なくとも約１５％を有する酵素として定義され、これは、特性の強度が、初期の時間で測定される、化学発光、電気化学、質量分析、分光光度（すなわち、ＵＶ−Ｖｉｓ）、放射化学、または蛍光検定等の、産物の酵素媒介性生成を実証する手段により測定され得る。種々の実施形態において、酵素が化学転換を連続して触媒される間、酵素は、その初期の活性の少なくとも約１５％を維持する。
【００５０】
酵素の安定化に関して、酵素固定化材料は、化学的および／または機械的バリアを提供し、酵素の変性を阻止または妨害する。そのために、酵素固定化材料は、物理的に酵素を閉じ込め、酵素がほどけるのを阻止する。折り畳まれた３次元構造から酵素をほどくプロセスは、酵素の変性の仕組みの１つである。
【００５１】
いくつかの実施形態において、酵素固定化材料は、酵素が、少なくとも約５日間〜約７３０日間（２年間）、その触媒活性を維持するように、酵素を安定化させる。他の実施形態において、固定化された酵素は、少なくとも約３０、４５、６０、７５、９０、１０５、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００、３３０、３６５、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７３０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１０９５日間、またはそれ以上の間、その初期の触媒活性の少なくとも約７５％を維持する。いくつかの場合において、固定化された酵素は、約３０〜約１０９５日間、約４５〜約１０９５日間、約６０〜約１０９５日間、約７５〜約１０９５日間、約９０〜約１０９５日間、約１０５〜約１０９５日間、約１２０〜約１０９５日間、約１５０〜約１０９５日間、約１８０〜約１０９５日間、約２１０〜約１０９５日間、約２４０〜約１０９５日間、約２７０〜約１０９５日間、約３００〜約１０９５日間、約３３０〜約１０９５日間、約３６５〜約１０９５日間、約４００〜約１０９５日間、約４５０〜１０９５日間、約５００〜約１０９５日間、約５５０〜約１０９５日間、約６００〜約１０９５日間、約６５０〜約１０９５日間、約７００〜約１０９５日間、約７３０〜約１０９５日間、その初期の触媒活性の少なくとも約７５％〜約９５％を維持する。種々の実施形態において、固定化された酵素は、少なくとも約５、７、１０、１５、２０、２５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００、３３０、３６５、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７３０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１０９５日間またはそれ以上の間、その初期の触媒活性の少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０もしくは９５％、またはそれ以上を維持する。いくつかの場合において、固定化された酵素は、約５〜約１０９５日間、約７〜約１０９５日間、約１０〜約１０９５日間、約１５〜約１０９５日間、約２０〜約１０９５日間、約２５〜約１０９５日間、約３０〜約１０９５日間、約４５〜約１０９５日間、約６０〜約１０９５日間、約７５〜約１０９５日間、約９０〜約１０９５日間、約１０５〜約１０９５日間、約１２０〜約１０９５日間、約１５０〜約１０９５日間、約１８０〜約１０９５日間、約２１０〜約１０９５日間、約２４０〜約１０９５日間、約２７０〜約１０９５日間、約３００〜約１０９５日間、約３３０〜約１０９５日間、約３６５〜約１０９５日間、約４００〜約１０９５日間、約４５０〜約１０９５日間、約５００〜約１０９５日間、約５５０〜約１０９５日間、約６００〜約１０９５日間、約６５０〜約１０９５日間、約７００〜約１０９５日間、約７３０〜約１０９５日間、その初期の触媒活性の少なくとも約１５〜約９５％、約２０〜約９５％、約２５〜約９５％、約３０〜約９５％、約３５〜約９５％、約４０〜約９５％、約４５〜約９５％、約５０〜約９５％、約５５〜約９５％、約６０〜約９５％、約６５〜約９５％、約７０〜約９５％、約７５〜約９５％、約８０〜約９５％、約８５〜約９５％、または約９０〜約９５％を維持する。
【００５２】
種々の実施形態において、高温またはｐＨ安定性を有する酵素も、上述の化学転換を活発に触媒する時、少なくとも約５日間、その初期の触媒活性の少なくとも約７５％を維持してもよい。
【００５３】
他の実施形態において、約２より低い、約３より低い、約４より低い、または約５より低いｐＨに曝される時、安定化された酵素は、化学転換を連続して触媒される時に、少なくとも約５、１０、１５、３０、４０、５０、６０、７５、９０日間、またはそれ以上の間、その初期の触媒活性の少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５％を維持する。いくつかの場合において、約２より低い、約３より低い、約４より低い、または約５より低いｐＨに曝される時、安定化された酵素は、化学転換を連続して触媒する時、約５〜９０日間、約１０〜９０日間、約１５〜９０日間、約２０〜９０日間、約２５〜９０日間、約３０〜９０日間、約３５〜９０日間、約４０〜９０日間、約４５〜９０日間、約５０〜９０日間、約５５〜９０日間、約６０〜９０日間、約６５〜９０日間、約７０〜９０日間、約７５〜９０日間、約８０〜９０日間、約８５〜９０日間、その初期の触媒活性の約１５〜約９５％、約２０〜約９５％、約２５〜約９５％、約３０〜約９５％、約３５〜約９５％、約４０〜約９５％、約４５〜約９５％、約５０〜約９５％、約５５〜約９５％、約６０〜約９５％、約６５〜約９５％、約７０〜約９５％、約７５〜約９５％、約８０〜約９５％、約８５〜約９５％、または約９０〜約９５％を維持する。いくつかの場合において、約２より低い、約３より低い、約４より低い、または約５より低いｐＨに曝される時、安定化された酵素は、化学転換を連続して触媒する時、少なくとも約５、１０、１５、３０、４０、５０、６０、７５、９０日間、またはそれ以上の間、その初期の触媒活性の約１５〜約９５％、約２０〜約９５％、約２５〜約９５％、約３０〜約９５％、約３５〜約９５％、約４０〜約９５％、約４５〜約９５％、約５０〜約９５％、約５５〜約９５％、約６０〜約９５％、約６５〜約９５％、約７０〜約９５％、約７５〜約９５％、約８０〜約９５％、約８５〜約９５％、または約９０〜約９５％を維持する。いくつかの場合において、約９を越える、約１０を越える、約１１を超える、または約１２を超えるｐＨに曝される時、安定化された酵素は、化学転換を連続して触媒する時、約５〜９０日間、約１０〜９０日間、約１５〜９０日間、約２０〜９０日間、約２５〜９０日間、約３０〜９０日間、約３５〜９０日間、約４０〜９０日間、約４５〜９０日間、約５０〜９０日間、約５５〜９０日間、約６０〜９０日間、約６５〜９０日間、約７０〜９０日間、約７５〜９０日間、約８０〜９０日間、約８５〜９０日間、その初期の触媒活性の約１５〜約９５％、約２０〜約９５％、約２５〜約９５％、約３０〜約９５％、約３５〜約９５％、約４０〜約９５％、約４５〜約９５％、約５０〜約９５％、約５５〜約９５％、約６０〜約９５％、約６５〜約９５％、約７０〜約９５％、約７５〜約９５％、約８０〜約９５％、約８５〜約９５％、または約９０〜約９５％を維持する。
【００５４】
他の実施形態において、非極性溶媒、油、アルコール、アセトニトリル、濃縮イオン溶液、またはそれらの組み合わせ等の薬剤に曝される時、安定化された酵素は、少なくとも約５、１０、１５、３０、４０、５０、６０、７５、９０日間、またはそれ以上の間、その初期の触媒活性の少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５％を維持する。いくつかの場合において、薬剤に曝される時、安定化された酵素は、化学転換を連続して触媒する時、約５〜９０日間、約１０〜９０日間、約１５〜９０日間、約２０〜９０日間、約２５〜９０日間、約３０〜９０日間、約３５〜９０日間、約４０〜９０日間、約４５〜９０日間、約５０〜９０日間、約５５〜９０日間、約６０〜９０日間、約６５〜９０日間、約７０〜９０日間、約７５〜９０日間、約８０〜９０日間、約８５〜９０日間、その初期の触媒活性の約１０〜約９５％、約１５〜約９５％、約２０〜約９５％、約２５〜約９５％、約３０〜約９５％、約３５〜約９５％、約４０〜約９５％、約４５〜約９５％、約５０〜約９５％、約５５〜約９５％、約６０〜約９５％、約６５〜約９５％、約７０〜約９５％、約７５〜約９５％、約８０〜約９５％、約８５〜約９５％、または約９０〜約９５％を維持する。これらの場合において、薬剤の濃度は、約１重量％〜約９５重量％、５重量％〜約９５重量％、１０重量％〜約９５重量％、１５重量％〜約９５重量％、２０重量％〜約９５重量％、３０重量％〜約９５重量％、４０重量％〜約９５重量％、５０重量％〜約９５重量％であり得る。
【００５５】
固定化された酵素は、その触媒活性を維持しながら、酵素固定化材料の特定の領域に物理的に閉じ込められた酵素である。担体結合、架橋、および封入を含む、酵素固定化のための種々の方法がある。担体結合は、酵素の水不溶性担体への結合である。架橋は、二官能性または多官能性試薬による酵素の分子間架橋である。封入は、酵素を半透過性材料の格子中へ組み込むことである。酵素の固定化の特定の方法は、酵素固定化材料が、（１）酵素を固定化し、いくつかの実施形態において、（２）酵素を安定化させる限り、特に重要ではない。種々の実施形態において、酵素固定化材料は、酵素より小さい化合物に透過性でもある。酵素は、化学的または物理的相互作用により材料の表面に付着する時、固定化材料に吸収される。さらに、酵素は、材料のポケット内にあるかないかに関わらず、酵素が固定化材料内に含有される時、封入により固定化される。
【００５６】
酵素より小さい種々の化合物に対する固定化材料の透過性に関して、固定化材料は、それを通して基材化合物の移動を可能にするため、基材化合物は、酵素と接触することができる。固定化材料は、固定化材料を通して基材化合物の移動を可能にするが、酵素を固定化材料内の実質的に同じ空間に制限する、内部細孔、ミセルポケット、チャネル、開口部、またはそれらの組み合わせを含有するような様式で調製され得る。このような制限は、酵素がその触媒活性を維持することを可能にする。種々の好適な実施形態において、酵素は、酵素と実質的に同じ大きさ、および形状である空間に閉じ込められ、該酵素は、実質的にその触媒活性の全てを維持する。細孔、ミセルポケット、チャネル、または開口部は、上記の必要条件を満たし、固定化される特定の酵素の大きさおよび形状に応じた、物理的な寸法を有する。
【００５７】
実施形態のいくつかにおいて、酵素は、好ましくは、固定化材料の細孔内に位置し、化合物は、輸送チャネルを通して固定化材料の内外に移動する。酵素固定化材料の細孔は、約６ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約３０ｎｍ、約２５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約６ｎｍ〜約２０ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約２０ｎｍであり得る。細孔および輸送チャネルの相対的な大きさは、細孔が、酵素を固定化するのに十分大きいが、輸送チャネルは、酵素がそれらを通して移動するのに非常に小さくてもよい。さらに、輸送チャネルは、好ましくは、少なくとも約１０ｎｍの径を有する。いくつかの実施形態において、輸送チャネル径に対する細孔径の比は、少なくとも約２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１、５：１、５．５：１、６：１、６．５：１、７：１、７．５：１、８：１、８．５：１、９：１、９．５：１、１０：１またはそれ以上であり、輸送チャネル径に対する細孔径の比は、約２：１〜約１０：１、約２．５：１〜約１０：１、約３：１〜約１０：１、約３．５：１〜約１０：１、約４：１〜約１０：１、約４．５：１〜約１０：１、約５：１〜約１０：１、約５．５：１〜約１０：１、約６：１〜約１０：１、約６．５：１〜約１０：１、約７：１〜約１０：１、約７．５：１〜約１０：１、約８：１〜約１０：１、約８．５：１〜約１０：１、約９：１〜約１０：１、または約９．５：１〜約１０：１であり得る。また別の実施形態において、好ましくは、輸送チャネルは、少なくとも約２ｎｍの径を有し、輸送チャネル径に対する細孔径の比は、少なくとも約２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１、５：１、５．５：１、６：１、６．５：１、７：１、７．５：１、８：１、８．５：１、９：１、９．５：１、１０：１またはそれ以上であり、輸送チャネル径に対する細孔径の比は、約２：１〜約１０：１、約２．５：１〜約１０：１、約３：１〜約１０：１、約３．５：１〜約１０：１、約４：１〜約１０：１、約４．５：１〜約１０：１、約５：１〜約１０：１、約５．５：１〜約１０：１、約６：１〜約１０：１、約６．５：１〜約１０：１、約７：１〜約１０：１、約７．５：１〜約１０：１、約８：１〜約１０：１、約８．５：１〜約１０：１、約９：１〜約１０：１、または約９．５：１〜約１０：１であり得る。
【００５８】
種々の実施形態のいくつかにおいて、酵素が、大きいまたは凝集される時、酵素固定化材料は、酵素または凝集された酵素と実質的に同じ大きさである細孔の大きさを有することができる。このような酵素固定化材料は、酵素または凝集された酵素を酵素固定化材料内の実質的に同じ空間に制限する細孔を有することができ、材料を通して酵素または凝集された酵素より小さい化合物の拡散を可能にする。この酵素固定化材料は、約１５ｎｍ〜約２０００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約２０００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約２０００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約２０００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約２０００ｎｍ、約４００ｎｍ〜約２０００ｎｍ、約５００ｎｍ〜約２０００ｎｍ、約６００ｎｍ〜約２０００ｎｍ、約７００ｎｍ〜約２０００ｎｍ、約８００ｎｍ〜約２０００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約４００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約５００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約６００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、または約７００ｎｍ〜約１０００ｎｍの平均的な大きさのミセルを有するであろう。
【００５９】
これらの実施形態のいくつかにおいて、固定化材料は、ミセルまたは反転ミセル構造を有する。概して、ミセルを構成する分子は、両親媒性であり、つまり、これらは、極性の親水性基および非極性疎水性基を含有する。極性基が凝集物および炭化水素の表面上にあり、非極性基が凝集物内に隔離される場合、分子は、凝集してミセルを形成することができる。反転ミセルは、極性基および非極性基の反対の配向を有する。凝集物を構成する両親媒性分子は、極性基が相互に近位であり、非極性基が相互に近位である限り、様々な方式で配置され得る。また、分子は、非極性基が相互に向かいあい、極性基が相互から離れる向きとなる、二層を形成することができる。代替的に、非極性基が相互から離れる向きとなる一方、極性基が二層において相互に向かいあうことができる、二層を形成することができる。
修飾されたナフィオン（登録商標）
【００６０】
好適な実施形態の１つにおいて、ミセル固定化材料は、修飾された全フッ素化スルホン酸−ＰＴＦＥ共重合体（または修飾された過フッ素化イオン交換重合体）（修飾されたナフィオン（登録商標）または修飾されたフレミオン（登録商標））膜である。過フッ素化イオン交換重合体膜は、アンモニウム（ＮＨ４＋）イオンより大きい疎水性カチオンで修飾される。疎水性カチオンは、（１）膜の細孔の大きさを指定し、（２）細孔のｐＨレベルの維持を補助するための化学緩衝剤として作用する、機能を供給し、この両方とも、酵素を安定化させる。
【００６１】
疎水性カチオンの第１の機能に関して、修飾された全フッ素化スルホン酸−ＰＴＦＥ共重合体（または過フッ素化イオン交換重合体）（ナフィオン（登録商標）またはフレミオン（登録商標））膜を産生するために、全フッ素化スルホン酸−ＰＴＦＥ共重合体（または過フッ素化イオン交換重合体）を疎水性カチオンで混合成型することによって、細孔の大きさが疎水性カチオンの大きさに依存する固定化材料が提供される。したがって、疎水性カチオンが大きければ、細孔の大きさも大きくなる。疎水性カチオンのこの機能は、疎水性カチオンの大きさを変化させることにより、特定の酵素に合致するように、細孔の大きさを大きく、または小さく作製することを可能にする。
【００６２】
疎水性カチオンの第２の機能に関して、全フッ素化スルホン酸−ＰＴＦＥ共重合体（または過フッ素化イオン交換重合体）膜の特性は、全フッ素化スルホン酸−ＰＴＦＥ共重合体（または過フッ素化イオン交換重合体上のアニオン）膜上の−ＳＯ３-基に対する対イオンとして、疎水性カチオンをプロトンと交換することにより変更される。対イオンのこの変更は、疎水性カチオンが、−ＳＯ３-部位に対して、プロトンより非常に大きな親和性を有するため、ｐＨに緩衝効果を提供する。膜のこの緩衝効果は、溶液のｐＨが変化しても、細孔のｐＨを実質的に未変化に維持する、つまり、細孔のｐＨは、溶液のｐＨの変化に侵されない。加えて、膜は、固定化された酵素をさらに保護する、機械的バリアを提供する。
【００６３】
修飾された全フッ素化スルホン酸−ＰＴＦＥ共重合体（または過フッ素化イオン交換重合体）膜を調製するために、第１のステップは、全フッ素化スルホン酸−ＰＴＦＥ共重合体（または過フッ素化イオン交換重合体）、特にナフィオン（登録商標）を疎水性カチオンの溶液で成型し、膜を形成することである。過剰な疎水性カチオンおよびそれらの塩は、その後、膜から抽出され、膜が再成型される。再成型時、膜は、全フッ素化スルホン酸−ＰＴＦＥ共重合体（または過フッ素化イオン交換重合体）膜の−ＳＯ３-部位を伴って疎水性カチオンを含有する。膜からの疎水性カチオンの塩の除去は、より安定し、再現可能な膜をもたらすが、これらが除去されない場合、過剰塩は、細孔に封入されるか、または膜に空隙を生じさせることができる。
【００６４】
一実施形態において、修飾されたナフィオン（登録商標）膜は、ナフィオン（登録商標）重合体の懸濁液を四級臭化アンモニウム等の疎水性カチオンの塩の溶液で成型することにより調製される。過剰の四級臭化アンモニウムまたは臭化水素は、塩抽出された膜を形成するために再成型される前に膜から除去される。膜の塩抽出は、スルホン酸交換部位で、四級アンモニウムカチオンの存在を維持するが、細孔に封入される可能性がある、または平衡膜に空隙を生じる可能性がある過剰塩からの厄介な問題を排除する。塩抽出された膜の化学的および物理的特性は、酵素固定化前に、ボルタメトリー、イオン交換能測定、および蛍光顕微鏡により特徴付けされた。代表的な疎水性カチオンは、アンモニウム系カチオン、四級アンモニウムカチオン、アルキルトリメチルアンモニウムカチオン、アルキルトリエチルアンモニウムカチオン、有機カチオン、ホスホニウムカチオン、トリフェニルホスホニウム、ピリジニウムカチオン、イミダゾリウムカチオン、ヘキサデシルピリジニウム、エチジウム、ビオローゲン、メチルビオローゲン、ベンジルビオローゲン、ビス（トリフェニルホスフィン）イミニウム、金属複合体、ビピリジル金属複合体、フェナンスロリン系金属複合体、［Ｒｕ（ビピリジン）３］２＋、および［Ｆｅ（フェナンスロリン）３］３＋である。
【００６５】
好適な実施形態の１つにおいて、疎水性カチオンは、アンモニウム系カチオンである。特に、疎水性カチオンは、四級アンモニウムカチオンである。別の実施形態において、四級アンモニウムカチオンは、式１
2012504047.tif 000004
により表され、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、水素、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、またはヘテロシクロであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの少なくとも１つは、水素以外である。さらなる実施形態において、好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、またはテトラデシルであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの少なくとも１つは、水素以外である。また別の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、同一であり、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、またはヘキシルである。さらに別の実施形態において、好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、ブチルである。さらに別の実施形態において、好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、エチルである。好ましくは、四級アンモニウムカチオンは、テトラエチルアンモニウム（Ｔ２Ａ）、テトラプロピルアンモニウム（Ｔ３Ａ）、テトラペンチルアンモニウム（Ｔ５Ａ）、テトラヘキシルアンモニウム（Ｔ６Ａ）、テトラヘプチルアンモニウム（Ｔ７Ａ）、トリメチルイコシルアンモニウム（ＴＭＩＣＡ）、トリメチルオクチルデシルアンモニウム（ＴＭＯＤＡ）、トリメチルヘキシルデシルアンモニウム（ＴＭＨＤＡ）、トリメチルテトラデシルアンモニウム（ＴＭＴＤＡ）、トリメチルオクチルアンモニウム（ＴＭＯＡ）、トリメチルドデシルアンモニウム（ＴＭＤＤＡ）、トリメチルデシルアンモニウム（ＴＭＤＡ）、トリメチルヘキシルアンモニウム（ＴＭＨＡ）、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）、トリエチルヘキシルアンモニウム（ＴＥＨＡ）、およびそれらの組み合わせである。
【００６６】
炭酸脱水酵素は、以下のように、ＴＥＡＢ修飾されたナフィオン（登録商標）中に固定化され得る。臭化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）修飾されたナフィオン（登録商標）をエタノールに添加し、５．０重量％濃度を有する溶液を作製する。炭酸脱水酵素を緩衝溶液に添加し、界面活性剤を総溶液パーセンテージの０．５％で添加し、均一な溶解が生じるまで攪拌する。溶液が十分に分散されたら、ＴＥＡＢ修飾されたナフィオン（登録商標）溶液を添加し、溶液が十分に均質になるまで攪拌する。固定化された酵素溶液が十分に混合されたら、高表面積支持体上に成型し、４℃で１２時間、その後、真空下で２時間乾燥させる。代替的に、高表面炭素支持体を固定化された酵素溶液に添加し、混合し、噴霧し、室温で数時間乾燥させることができる。
疎水性修飾された多糖
【００６７】
他の種々の実施形態において、代表的なミセル固定化材料または反転ミセル固定化材料は、疎水性修飾された多糖であり、これらの多糖は、キトサン、セルロース、キチン、澱粉、アミロース、アルギン酸塩、グリコーゲン、およびそれらの組み合わせから選択される。種々の実施形態において、ミセル固定化材料または反転ミセル固定化材料は、ポリカチオン重合体、具体的には、疎水性修飾されたキトサンである。キトサンは、ポリ［β−（１−４）−２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノース］である。キトサンは、典型的に、キチン（ポリ［β−（１−４）−２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノース］）の脱アセチル化により調製される。典型的な商業用キトサンは、約８５％の脱アセチルを有する。これらの脱アセチル基または遊離アミン基は、ヒドロカルビル、具体的には、アルキル基を用いてさらに官能化され得る。したがって、種々の実施形態において、ミセル疎水性修飾されたキトサンは、式２
2012504047.tif 000005
の構造に対応し、式中、ｎは整数であり、Ｒ１０は、独立して、水素、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、または疎水性酸化還元介在物質であり、Ｒ１１は、独立して、水素、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、または疎水性酸化還元介在物質である。本発明の特定の実施形態において、ｎは、重合体に約２１，０００〜約４，０００，０００、約２１，０００〜約５００，０００、好ましくは、約９０，０００〜約５００，０００、より好ましくは、約１５０，０００〜約３５０，０００、より好ましくは、約２２５，０００〜約２７５，０００の分子量を付与する整数である。多くの実施形態において、Ｒ１０は、独立して、水素またはアルキルであり、Ｒ１１は、独立して水素またはアルキルである。さらに、Ｒ１０は、独立して、水素またはヘキシルであり、Ｒ１１は、独立して、水素またはヘキシルである。代替的に、Ｒ１０は、独立して、水素またはオクチルであり、Ｒ１１は、独立して、水素またはオクチルである。
【００６８】
他の種々の実施形態において、ミセル疎水性修飾されたキトサンは、式２Ａ
2012504047.tif 000006
に対応する、ミセル疎水性酸化還元介在物質修飾されたキトサンであり、式中、ｎは、整数であり、Ｒ１０ａは、独立して、水素または疎水性酸化還元介在物質であり、Ｒ１１ａは、独立して、水素または疎水性酸化還元介在物質である。
【００６９】
さらに、種々の実施形態において、ミセル疎水性修飾されたキトサンは、式２Ｂ
2012504047.tif 000007
に対応する、修飾されたキトサン、または酸化還元介在物質修飾されたキトサンであり、式中、Ｒ１１、Ｒ１２、およびｎは、式２に関連して定義される。いくつかの実施形態において、Ｒ１１およびＲ１２は、独立して、水素、または直鎖状または分枝鎖状アルキル、好ましくは、水素、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、またはドデシルである。種々の実施形態において、Ｒ１１およびＲ１２は、独立して、水素、ブチル、またはヘキシルである。
【００７０】
ミセル疎水性修飾されたキトサンは、疎水性基を用いて、様々な程度に修飾され得る。疎水性修飾の程度は、未修飾のキトサン中の遊離アミン基の数と比較した、疎水性基で修飾される遊離アミン基のパーセンテージにより決定される。疎水性修飾の程度は、酸−塩基滴定および／または核磁気共鳴（ＮＭＲ）、特に１Ｈ  ＮＭＲデータから推定され得る。疎水性修飾のこの程度は、幅広く変化し、少なくとも約０．２５、０．５、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３２、２４、２６、２８、４０、４２、４４、４６、４８％、またはそれ以上である。好ましくは、疎水性修飾の程度は、約１０％〜約４５％、約１０％〜約３５％、約２０％〜約３５％、または約３０％〜約３５％である。
【００７１】
他の種々の実施形態において、式２Ａの疎水性酸化還元介在物質は、１，１０−フェナンスロリン（ｐｈｅｎ）、２，２’−ビピリジン（ｂｐｙ）、または２，２’，２’’−ターピリジン（ｔｅｒｐｙ）を伴うオスミウム、ルテニウム、鉄、ニッケル、ロジウム、またはコバルトの遷移金属複合体、メチレングリーン、メチレンブルー、ポリ（メチレングリーン）、ポリ（メチレンブルー）、ルミノール、ニトロ−フルオレノン誘導体、アジン、オスミウムフェナントロリンジオン、カテコール−ペンダントターピリジン、トルエンブルー、クレシルブルー、ナイルブルー、ニュートラルレッド、フェナジン誘導体、チオニン、アズールＡ、アズールＢ、トルイジンブルーＯ、アセトフェノン、メタロフタロシアニン、ナイルブルーＡ、修飾された遷移金属リガンド、１，１０−フェナンスロリン−５，６−ジオン、１，１０−フェナンスロリン−５，６−ジオール、［Ｒｅ（ｐｈｅｎ−ジオン）（ＣＯ）３Ｃｌ］、［Ｒｅ（ｐｈｅｎ−ジオン）３］（ＰＦ６）２、ポリ（メタロフタロシアニン）、ポリ（チオニン）、キノン、ジイミン、ジアミノベンゼン、ジアミノピリジン、フェノチアジン、フェノキサジン、トルイジンブルー、ブリリアントクレシルブルー、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アズールＩ）、ポリ（ナイルブルーＡ）、ポリアニリン、ポリピリジン、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリ（チエノ［３，４−ｂ］チオフェン）、ポリ（３−ヘキシルチオフェン）、ポリ（３，４−エチレンジオキシピロール）、ポリ（イソチアナフテン）、ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）、ポリ（ジフルオロアセチレン）、ポリ（４−ジシアノメチレン−４Ｈ−シクロペンタ［２，１−ｂ；３，４−ｂ’］ジチオフェン）、ポリ（３−（４−フルオロフェニル）チオフェン）、ポリ（ニュートラルレッド）、またはそれらの組み合わせである。
【００７２】
好ましくは、疎水性酸化還元介在物質は、Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３＋２、Ｆｅ（ｐｈｅｎ）３＋２、Ｏｓ（ｐｈｅｎ）３＋２、Ｃｏ（ｐｈｅｎ）３＋２、Ｃｒ（ｐｈｅｎ）３＋２、Ｒｕ（ｂｐｙ）３＋２、Ｏｓ（ｂｐｙ）３＋２、Ｆｅ（ｂｐｙ）３＋２、Ｃｏ（ｂｐｙ）３＋２、Ｃｒ（ｂｐｙ）３＋２、Ｏｓ（ｔｅｒｐｙ）３＋２、Ｒｕ（ｂｐｙ）２（４−メチル−４’−（６−ヘキシル）−２，２’−ビピリジン）＋２、Ｃｏ（ｂｐｙ）２（４−メチル−４’−（６−ヘキシル）−２，２’−ビピリジン）＋２、Ｃｒ（ｂｐｙ）２（４−メチル−４’−（６−ヘキシル）−２，２’−ビピリジン）＋２、Ｆｅ（ｂｐｙ）２（４−メチル−４’−（６−ヘキシル）−２，２’−ビピリジン）＋２、Ｏｓ（ｂｐｙ）２（４−メチル−４’−（６−ヘキシル）−２，２’−ビピリジン）＋２、またはそれらの組み合わせである。より好ましくは、疎水性酸化還元介在物質は、Ｒｕ（ｂｐｙ）２（４−メチル−４’−（６−ヘキシル）−２，２’−ビピリジン）＋２、Ｃｏ（ｂｐｙ）２（４−メチル−４’−（６−ヘキシル）−２，２’−ビピリジン）＋２、Ｃｒ（ｂｐｙ）２（４−メチル−４’−（６−ヘキシル）−２，２’−ビピリジン）＋２、Ｆｅ（ｂｐｙ）２（４−メチル−４’−（６−ヘキシル）−２，２’−ビピリジン）＋２、Ｏｓ（ｂｐｙ）２（４−メチル−４’−（６−ヘキシル）−２，２’−ビピリジン）＋２、またはそれらの組み合わせである。種々の好適な実施形態において、疎水性酸化還元介在物質は、Ｒｕ（ｂｐｙ）２（４−メチル−４’−（６−ヘキシル）−２，２’−ビピリジン）＋２である。
【００７３】
修飾因子として疎水性酸化還元介在物質を有する固定化材料において、疎水性酸化還元介在物質は、典型的に、キトサンまたは多糖骨格に共有結合的に結合される。典型的に、キトサンの場合において、疎水性酸化還元介在物質は、−Ｎ−Ｃ−結合を通してキトサンのアミン官能基の１つに共有結合的に結合される。金属複合体酸化還元介在物質の場合において、金属複合体は、金属複合体のリガンドの１つ以上に結合される、キトサンアミン基からアルキル基への−Ｎ−Ｃ−結合を通してキトサンに結合される。式２Ｃに対応する構造は、キトサンに結合される金属複合体の例であり、
2012504047.tif 000008
式中、ｎは整数であり、Ｒ１０ｃは、独立して、水素であるか、または式２Ｄに対応する構造であり、Ｒ１１ｃは、独立して、水素であるか、または式１Ｄに対応する構造であり、ｍは、０〜１０の整数であり、Ｍは、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｆｅ、Ｃｒ、またはＣｏであり、複素環は、ビピリジル、置換されたビピリジル、フェナンスロリン、アセチルアセトン、およびそれらの組み合わせである。
【００７４】
キトサンを修飾するために使用される疎水性基は、（１）固定化材料のミセルの大きさを指定し、（２）許容可能なミセル環境を維持するようにキトサンの化学環境を修飾する、二重機能を供給し、この両方とも酵素を安定化させる。疎水性基の第１の機能に関して、疎水性修飾キトサンは、細孔の大きさが疎水性基の大きさに依存する固定化材料を産生する。したがって、疎水性基を用いたキトサンの大きさ、形状、および修飾の程度は、ミセルの細孔／ポケットの大きさおよび形状に影響を与える。疎水性基のこの機能は、疎水性基の大きさおよび分枝を変化させることにより、特定の酵素に合致するように、ミセルの細孔／ポケットの大きさを大きく、もしくは小さく、または異なる形状に作製することを可能にする。
【００７５】
疎水性カチオンの第２の機能に関して、疎水性修飾されたキトサン膜の特性は、疎水性基を用いてキトサンを修飾することにより変更される。キトサンのこの疎水性修飾は、プロトンに利用可能な交換部位の数を増大することにより、細孔の環境に影響を与える。材料のｐＨに影響を与えることに加え、キトサンの疎水性修飾は、固定化された酵素をさらに保護する、機械的バリアである膜を提供する。
【００７６】
疎水性修飾されたキトサン膜における、プロトンに利用可能な交換部位の数を表１に示す。
表１：キトサン重合体の１グラム当りのプロトンに利用可能な交換部位の数
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さらに、このようなポリカチオン重合体は、酵素を固定化することができ、また、緩衝溶液中の同じ酵素の活性と比較して、そこに固定化された酵素の活性を増大することができる。種々の実施形態において、ポリカチオン重合体は、疎水性修飾された多糖、具体的には、疎水性修飾されたキトサンである。例えば、記述される疎水性修飾において、グルコースオキシダーゼの酵素活性が測定された。最も高い酵素活性は、ｔ−アミルアルコールに懸濁されたヘキシル修飾されたキトサン中のグルコースオキシダーゼにおいて観察された。これらの固定化膜は、緩衝液中の酵素に対するグルコースオキシダーゼ酵素活性において２．５３倍の増加を示した。表２は、種々の疎水性修飾されたキトサンにおけるグルコースオキシダーゼ活性を詳述する。
表２：修飾されたキトサンにおけるグルコースオキシダーゼ酵素活性
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【００７７】
修飾因子としてアルキル基を有する本発明の疎水性修飾されたキトサンを調製するために、キトサンゲルを酢酸に懸濁した後、アルコール溶媒を添加した。このキトサンゲルにアルデヒド（例えば、ブタナール、ヘキサナール、オクタナール、またはデカナール）を添加した後、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。得られた産物を減圧濾過で単離し、アルコール溶媒で洗浄した。修飾されたキトサンを４０℃の真空オーブンで乾燥させ、鱗状の白色固体を得た。
【００７８】
修飾因子として酸化還元介在物質を有する本発明の疎水性修飾されたキトサンを調製するために、４，４’−ジメチル−２，２’−ビピリジンをリチウムジイソプロピルアミンと接触させた後、ジハロアルカンを添加し、４−メチル−４’−（６−ハロアルキル）−２，２’−ビピリジンを産生することにより、酸化還元介在物質リガンドを誘導化した。次いで、無機塩基の存在下で、このリガンドをＲｕ（ビピリジン）２Ｃｌ２水和物と接触させ、Ｒｕ（ビピリジン）２Ｃｌ２が枯渇するまで、水−アルコール混合物中で還流した。次いで、産物をアンモニウムヘキサフルオロリン酸、または任意に、過塩酸ナトリウム塩または過塩酸カリウム塩で沈殿させ、再結晶化した。その後、誘導化された酸化還元介在物質（Ｒｕ（ビピリジン）２（４−メチル−４’−（６−ブロモヘキシル）−２，２’−ビピリジン）＋２）を脱アセチル化キトサンと接触させ、加熱した。酸化還元介在物質修飾されたキトサンを、次いで、沈殿させ、再結晶化した。
【００７９】
疎水性修飾されたキトサン膜は、エタノールにおいて有利な不溶性を有する。例えば、上述のキトサン酵素固定化材料は、一般的に、最大約９９重量％、または９９容量％を超えるエタノールを有する溶液中の酵素を固定化し、安定化させるために機能的である。種々の実施形態において、キトサン固定化材料は、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくはそれ以上の重量％または容量％のエタノールを有する溶液において機能的である。いくつかの場合において、キトサン固定化材料は約１５〜約９５重量％または容量％のエタノール、約２５〜約９５重量％または容量％のエタノール、約３５〜約９５重量％または容量％のエタノール、約４５〜約９５重量％または容量％のエタノール、約５５〜約９５重量％または容量％のエタノール、約６５〜約９５重量％または容量％のエタノール、約７０〜約９５重量％または容量％のエタノール、約７５〜約９５重量％または容量％のエタノール、約８０〜約９５重量％または容量％のエタノール、約８５〜約９５重量％または容量％のエタノール、約９０〜約９５重量％または容量％のエタノールを有する溶液において、機能的である。
【００８０】
他の実施形態において、ミセル固定化材料または反転ミセル固定化材料は、疎水性修飾された多糖、具体的には、疎水性修飾されたアルギン酸塩等のポリアニオン重合体である。アルギン酸塩は、β−（１−４）−連結されたＤ−マンヌロン酸およびα−（１−４）−連結されたＬ−グルロン酸残基を含有する直鎖状の非分枝鎖状重合体である。非プロトン化形態において、β−（１−４）−連結されたＤ−マンヌロン酸は、式３Ａ
2012504047.tif 000011
の構造に対応し、非プロトン化形態において、α−（１−４）−連結されたＬ−グルロン酸は、３Ｂの構造に対応する（構造３ａおよび３Ｂは、ヒドロキシル基のＣ６カルボン酸の炭素への結合、および３Ａにおいて、Ｃ３の酸素への結合を示すことにより、より良く作製され得る）。
2012504047.tif 000012
アルギン酸塩は、マンヌロン酸残基の重合体ブロックおよびグルロン酸残基の重合体ブロックからなる不均一重合体である。
【００８１】
アルギン酸塩重合体は、種々の方式で修飾され得る。その１つは、アンモニウム（ＮＨ４＋）イオンより大きい疎水性カチオンでアルギン酸塩修飾される。疎水性カチオンは、（１）重合体の細孔の大きさを指定し、（２）ミセルのｐＨレベルの維持を補助するための化学緩衝剤として作用する、二重機能を供給し、この両方とも、酵素を安定化させる。疎水性カチオンの第１の機能に関して、疎水性カチオンでのアルギン酸塩の修飾は、ミセルの大きさが、疎水性カチオンの大きさに依存する固定化材料を産生する。したがって、疎水性カチオンを用いたアルギン酸塩の大きさ、形状、および修飾の程度は、ミセルの細孔／ポケットの大きさおよび形状に影響を与える。疎水性カチオンのこの機能は、疎水性カチオンの大きさおよび分枝を変化させることにより、特定の酵素に合致するように、ミセルの大きさを大きく、もしくは小さく、または異なる形状に作製することを可能にする。
【００８２】
疎水性カチオンの第２の機能に関して、アルギン酸塩重合体の特性は、アルギン酸塩上の−ＣＯ２−基に対する対イオンとして、疎水性カチオンをプロトンと交換することにより変更される。対イオンのこの変更は、疎水性カチオンが、−ＣＯ２−部位に対して、プロトンより非常に大きな親和性を有するため、ｐＨに緩衝効果を提供する。アルギン酸塩膜のこの緩衝効果は、溶液のｐＨが変化しても、ミセルの細孔／ポケットのｐＨを実質的に未変化に維持する、つまり、細孔のｐＨは、溶液のｐＨの変化に侵されない。加えて、アルギン酸塩膜は、固定化された酵素をさらに保護する、機械的バリアを提供する。
【００８３】
修飾されたアルギン酸塩膜を調製するために、第１のステップは、アルギン酸塩重合体の懸濁液を疎水性カチオンの溶液で成型し、膜を形成することである。過剰な疎水性カチオンおよびそれらの塩は、その後、膜から抽出され、膜が再成型される。再成型時、膜は、アルギン酸塩膜の−ＣＯ２−部位を伴って疎水性カチオンを含有する。膜からの疎水性カチオンの塩の除去は、より安定し、再現可能な膜をもたらすが、これらが除去されない場合、過剰塩は、細孔に封入されるか、または膜に空隙を生じさせることができる。
【００８４】
一実施形態において、修飾されたアルギン酸塩膜は、アルギン酸塩重合体の懸濁液を四級臭化アンモニウム等の疎水性カチオンの塩の溶液で成型することにより調製される。過剰の四級臭化アンモニウムまたは臭化水素は、塩抽出された膜を形成するために再成型される前に膜から除去される。膜の塩抽出は、カルボン酸交換部位で、四級アンモニウムカチオンの存在を維持するが、細孔に封入される可能性がある、または平衡膜に空隙を生じる可能性がある過剰塩からの厄介な問題を排除する。代表的な疎水性カチオンは、アンモニウム系カチオン、四級アンモニウムカチオン、アルキルトリメチルアンモニウムカチオン、アルキルトリエチルアンモニウムカチオン、有機カチオン、ホスホニウムカチオン、トリフェニルホスホニウム、ピリジニウムカチオン、イミダゾリウムカチオン、ヘキサデシルピリジニウム、エチジウム、ビオローゲン、メチルビオローゲン、ベンジルビオローゲン、ビス（トリフェニルホスフィン）イミニウム、金属複合体、ビピリジル金属複合体、フェナンスロリン系金属複合体、［Ｒｕ（ビピリジン）３］２＋、および［Ｆｅ（フェナンスロリン）３］３＋である。
【００８５】
好適な実施形態の１つにおいて、疎水性カチオンは、アンモニウム系カチオンである。特に、疎水性カチオンは、四級アンモニウムカチオンである。別の実施形態において、四級アンモニウムカチオンは、式４
2012504047.tif 000013
により表され、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、水素、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、またはヘテロシクロであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの少なくとも１つは、水素以外である。さらなる実施形態において、好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、またはテトラデシルであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの少なくとも１つは、水素以外である。また別の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、同一であり、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、またはヘキシルである。さらに別の実施形態において、好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、ブチルである。さらに別の実施形態において、好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、エチルである。好ましくは、四級アンモニウムカチオンは、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム（Ｔ３Ａ）、テトラペンチルアンモニウム（Ｔ５Ａ）、テトラヘキシルアンモニウム（Ｔ６Ａ）、テトラヘプチルアンモニウム（Ｔ７Ａ）、トリメチルイコシルアンモニウム（ＴＭＩＣＡ）、トリメチルオクチルデシルアンモニウム（ＴＭＯＤＡ）、トリメチルヘキシルデシルアンモニウム（ＴＭＨＤＡ）、トリメチルテトラデシルアンモニウム（ＴＭＴＤＡ）、トリメチルオクチルアンモニウム（ＴＭＯＡ）、トリメチルドデシルアンモニウム（ＴＭＤＤＡ）、トリメチルデシルアンモニウム（ＴＭＤＡ）、トリメチルヘキシルアンモニウム（ＴＭＨＡ）、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）、トリエチルヘキシルアンモニウム（ＴＥＨＡ）、およびそれらの組み合わせである。
【００８６】
ミセルの特徴が試験され、ミセル細孔／ポケットは、疎水性であり、構造がミセルであり、外部ｐＨ変化を緩衝し、高い細孔相互接続性を有するため、この膜のミセルの細孔／ポケット構造は、酵素固定化に最適である。
【００８７】
別の実験において、超低分子量アルギン酸塩およびドデシルアミンを２５％エタノールに設置し、還流し、カルボン酸基のアミド化によりドデシル修飾されたアルギン酸塩を産生した。種々のアルキルアミンは、ドデシルアミンと置換され得、様々な数のアルギン酸塩構造の反応性カルボン酸基に結合される、Ｃ４−Ｃ１６アルキル基を有するアルキル修飾されたアルギン酸塩を産生する。種々の実施形態において、カルボン酸基の少なくとも約１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８％、またはそれ以上が、アルキルアミンと反応する。いくつかの場合において、カルボン酸基の約２〜約５０％、約１０〜約５０％、約２０〜約５０％、約３０〜約５０％、約４０〜約５０％が、アルキルアミンと反応する。
【００８８】
疎水性修飾されたアルギン酸塩膜は、エタノールにおいて有利な不溶性を有する。例えば、上述のアルギン酸塩酵素固定化材料は、一般的に、少なくとも約２５重量％または２５容量％のエタノールを有する溶液中の酵素を固定化し、安定化させるために機能的である。種々の実施形態において、アルギン酸塩固定化材料は、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０もしくはそれ以上の重量％、または容量％のエタノールを有する溶液において機能的である。いくつかの場合において、アルギン酸塩固定化材料は、約２５〜約９５重量％または容量％のエタノール、約３５〜約９５重量％または容量％のエタノール、約４５〜約９５重量％または容量％のエタノール、約５５〜約９５重量％または容量％のエタノール、約６５〜約９５重量％または容量％のエタノール、約７０〜約９５重量％または容量％のエタノール、約７５〜約９５重量％または容量％のエタノール、約８０〜約９５重量％または容量％のエタノール、約８５［ｔｅｘｔ  ｃｕｔ  ｏｕｔ］を有する溶液において機能的である。
【００８９】
特定の酵素において最も有利な固定化材料を評価するために、選択された酵素を、種々の固定化材料に固定化し、電子伝導体上に沈着させ、電子介在物質（例えば、ＮＡＤ＋）を含有する溶液、および／または緩衝溶液中の特定の酵素用の基材で処理することが可能である。特定の固定化材料に固定化された酵素が、固定化後、まだ触媒的に活性酵素である時、蛍光顕微鏡像が得られ、蛍光を示す。酵素活性は、任意の標準の分光検定によっても決定され得る。さらに、酵素活性は、その酵素の生物反応器を使用して決定され得るが、特に炭酸脱水酵素の活性は、実施例１に記載する生物反応器、またはＳｉｇｍａ（改訂年月日０７／２２／９６）により発表された炭酸脱水酵素検定を使用することによって測定され得る。炭酸脱水酵素検定は、８．３〜６．３の緩衝された反応混合物のｐＨの減少に必要とされる時間において、非酵素性ブランクと酵素含有試料との間の実速度の相違を決定することにより、酵素性ＣＯ２水和の速度を測定する。
【００９０】
上述の検定法は、特定の固定化材料が、酵素の触媒活性を維持しながら、酵素を固定化し、かつ安定化させるかどうかを決定する一方式である。例えば、澱粉消費アミラーゼにおいて、最も大きな相対的活性を提供した酵素固定化材料は、ｔ−アミルアルコールに懸濁されたブチルキトサンにおける酵素の固定化により提供される。マルトース消費アミラーゼにおいて、最も大きな相対的活性は、中分子量のデシル修飾されたキトサンにおける酵素の固定化により提供される。
【００９１】
本発明の一態様は、高分子固定化材料に封入することにより固定化された酵素を対象とし、該固定化材料は、酵素より小さい化合物に対して透過性であり、式５、６、７、または８
2012504047.tif 000014
のいずれかの構造を有し、式中、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、およびＲ２４は、独立して、水素、アルキル、または置換されたアルキルであるが、ただし、反復単位毎のアルキルまたは置換されたアルキル基の平均数が、少なくとも０．１であることを条件とし、Ｒ２５は、水素または置換されたアルキルであるが、ただし、反復単位毎の置換されたアルキル基の平均数が、少なくとも０．１であることを条件とし、Ｒ３２およびＲ３３は、独立して、水素、アルキル、アリール、または置換されたアルキルであるが、ただし、反復単位毎の水素原子の平均数は、少なくとも０．１であることを条件とし、ｍ、ｎ、ｏ、およびｐは、独立して、約１０〜約５０００の整数である。これらの実施形態の多くにおいて、酵素固定化材料は、ミセル重合体または反転ミセル重合体を含む。
修飾されたポリスルホン
【００９２】
種々の実施形態のいくつかにおいて、固定化材料は、式５
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の構造を有し、式中、Ｒ２１、Ｒ２２、およびｎは、上に定義される。種々の実施形態において、Ｒ２１およびＲ２２は、独立して、水素、アルキルまたは置換されたアルキルである。種々の実施形態において、Ｒ２１およびＲ２２は、独立して、水素、または−（ＣＨ２）ｑＮ＋Ｒ２６Ｒ２７Ｒ２８であり、Ｒ２６、Ｒ２７、およびＲ２８は、独立して、アルキルであり、ｑは、１、２、または３の整数であり、具体的には、Ｒ２６、Ｒ２７、およびＲ２８は、独立して、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、またはヘキシルであり、より具体的には、Ｒ２６、Ｒ２７、およびＲ２８は、メチルである。
【００９３】
代替的に、Ｒ２１およびＲ２２は、独立して、水素、または−（ＣＨ２）ｑＮ＋Ｒ２６Ｒ２７Ｒ２８であり、Ｒ２６およびＲ２７は、独立して、メチル、エチル、またはプロピルであり、Ｒ２８は、アルキルアミノであり、ｑは、１、２、または３の整数である。Ｒ２８がアルキルアミノである時、好適なアルキルアミノ基は、三級アルキルアミノ基である。例えば、アルキルアミノ基は、−ＣＨ２Ｎ＋Ｒ２９Ｒ３０Ｒ３１、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋Ｒ２９Ｒ３０Ｒ３１、または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋Ｒ２９Ｒ３０Ｒ３１であり得、Ｒ２９、Ｒ３０、およびＲ３１は、独立して、水素またはアルキルである。種々の好適な実施形態において、Ｒ２９、Ｒ３０、およびＲ３１は、独立して、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、またはヘキシルであり、より具体的には、Ｒ２９、Ｒ３０、およびＲ３１は、メチルまたはエチルである。
【００９４】
好ましくは、Ｒ２１、Ｒ２２、またはＲ２１およびＲ２２は、アルキルまたは置換されたアルキルであり、反復単位毎のアルキルまたは置換されたアルキル基の平均数は、約０．１〜約１．４、約０．２〜約１．４、約０．３〜約１．４、約０．３〜約１．２、約０．３〜約１、約０．３〜約０．８、約０．４〜約１．４、約０．４〜約１．２、約０．４〜約１、約０．４〜約０．８、約０．５〜約１．４、約０．５〜約１．２、約０．５〜約１、約０．５〜約０．８である。
【００９５】
他の好適な実施形態において、Ｒ２１およびＲ２２は、独立して、水素、または−（ＣＨ２）ｑ−ポリエーテルであり、ここで、ｑは、１、２、または３の整数である。好適な実施形態において、ｑは、１である。好適な実施形態のいくつかにおいて、Ｒ２１およびＲ２２は、独立して、水素、−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２（ＣＨ３）−ＣＨ２−Ｏ）ｚ−Ｒｔ、−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｚ−Ｒｔ、またはそれらの組み合わせであり、ｚは、３〜１８０の整数であり、ポリエチレンオキシドまたはポリプロピレンオキシド（例えば、Ｒｔが、水素、アルキル、置換されたアルキル、アリール、または置換されたアリールである、−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｚ−Ｒｔまたは−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２（ＣＨ３）−ＣＨ２−Ｏ）ｚ−Ｒｔ）は、約１５０ダルトン（Ｄａ）〜約８０００ダルトン（Ｄａ）の分子量である。特定の実施形態においてポリエチレンオキシドは、約５００Ｄａ〜約６００Ｄａ、具体的には、約５５０Ｄａの分子量を有する。
【００９６】
修飾されたポリスルホンは、良好な化学および熱安定性を有するため、望ましい固定化材料である。加えて、修飾されたポリスルホンは、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）およびジオキサン等の極性有機溶媒において、有利な溶解特性を有する。この溶解性は、修飾されたポリスルホンビーズが、水または低脂肪族アルコール中での沈殿により調製されることを可能にする。未修飾のポリスルホンは、ビーズにおいて、酵素（例えば炭酸脱水酵素）を固定化し、維持することができる。しかし、炭酸脱水酵素の活性は減少し、低多孔度、したがって、重合体−溶媒界面での未修飾ポリスルホンビーズの低透過性が、基材および産物を酵素の活性部位への、およびそこからの拡散を妨げると仮定されている。多孔度を改善するために、ポリスルホンは、多孔度ならびに材料を通した基材および産物の輸送を増加するように修飾され得る。
【００９７】
例えば、ポリスルホンは、アミン基をポリスルホンのベンゼン基に添加することにより修飾され得る。ポリスルホンを四級アミン基で修飾することにより、ポリスルホンの親水性が影響され、そして、多孔度および炭酸／重炭酸イオンの輸送が増加する。また、陽電荷されたアミン基は、静電作用を通して、炭酸脱水酵素を安定化させることができる。疎水性基を親水性重合体に添加するこの修飾は、重合体にミセル凝集物／孔構造も形成してもよい。アミン基をポリスルホンに添加するために、骨格のベンゼン環をクロロメチル化した後、クロロメチル基をアミノ化する。このプロセスは、概して、Ｊｉｈｕａ，Ｈ．；Ｗｅｎｔｏｎｇ，Ｗ．；Ｐｕｃｈｅｎ，Ｙ．；Ｑｉｎｇｓｈｕａｎｇ，Ｚ．Ｄｅｓａｌｉｎａｔｉｏｎ  １９９１，８３，３６１  ａｎｄ  Ｐａｒｋ，Ｊ．−Ｓ．；Ｐａｒｋ，Ｇ．−Ｇ．；Ｐａｒｋ，Ｓ．−Ｈ．；Ｙｏｏｎ，Ｙ．−Ｇ．；Ｋｉｍ，Ｃ．Ｓ．；Ｌｅｅ，Ｗ．Ｙ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．２００７，２４９−２５０，１７４に記載されている。この転換の一般的な反応スキームをスキーム１に示す。反復単位毎に添加されるクロロメチル基の平均数は、Ｈｉｂｂｓ，Ｍ．Ｒ．；Ｈｉｃｋｎｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ａｌａｍ，Ｔ．Ｍ．；ＭｃＩｎｔｙｒｅ，Ｓ．Ｋ．；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｃ．Ｈ．；Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓ，Ｃ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．２００８，２０，２５６６に記載される、第１のステップ中に反応体比を操作することにより調整され得る。
2012504047.tif 000016
スキーム１．アミノ化ポリスルホン形成の反応スキーム
【００９８】
加えて、クロロメチル化されたポリスルホン（ＰＳｆ−ＣＨ２Ｃｌ）に添加される三級アミンの選択は、ポリスルホンの特性に影響を与えることができる。例えば、トリメチルアミンは、ＰＳｆ−ＣＨ２Ｃｌをアミノ化するために使用され得、四級ベンジルトリメチルアンモニウムカチオンをもたらす。このベンジルトリメチルアンモニウムカチオンは、高温および／または強塩基溶液への長期曝露により安定的であることが示されている（Ｓａｔａ，Ｔ．；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｍ．；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．；Ｍａｔｓｕｓａｋｉ，Ｋ．Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｉ．１９９６，１１２，１６１を参照のこと）。三級ジアミンも、このアミノ化ステップに使用され得、架橋ポリスルホンの一方式を提供し、その機械的および熱的安定性を改善する。ジアミンのクロロメチル化されたポリスルホン溶液への添加は、ポリスルホンを架橋し、混合物を固化する。溶媒は、次いで、水またはメタノールと交換され、より多孔質のアミノ化されたポリスルホンをもたらすことができる。溶液の初期の重合体濃度は、得られるポリスルホンの多孔度を操作することにより調節され得る。アミノ化後の塩素アニオンの重炭酸アニオンとの交換は、酵素活性を阻害する塩素イオンを除去することにより、固定化された炭酸脱水酵素の性能を改善することが可能である。加えて、重炭酸イオンのポリスルホンへの組み込みは、ｐＨの変化から酵素を保護するための緩衝能を提供することが可能である。
【００９９】
さらに、ポリスルホンがクロロメチル化されると、他の修飾されたポリスルホン重合体が調製され得る。例えば、クロロメチル基は、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）のヒドロキシル末端基と反応し、グラフト化されたＰＥＯ測鎖を伴うポリスルホン重合体を作製する（Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｙ．；Ａｃａｒ，Ｍ．Ｈ．；Ａｋｔｈａｋｕｌ，Ａ．；Ｋｕｈｌｍａｎ，Ｗ．；Ｍａｙｅｓ，Ａ．Ｍ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．２００６，２７，８５６を参照のこと）。一般的な反応スキームをスキーム２に示す。上述の通り、ＰＥＯ測鎖のグラフト密度に対する調整を提供するように、ポリスルホンのクロロメチル化を操作することができる。加えて、ＰＥＯ測鎖の分子量は、ＰＥＯ修飾されたポリスルホンの全体的なＰＥＯの重量負荷に影響を与えるように変更され得、負荷は、重合体の全体的な機械的特性に影響を及ぼす。
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スキーム２．ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＯ形成の反応スキーム
【０１００】
ＰＥＯのポリスルホンへの組み込みは、これらのビーズの親水性、および炭酸／重炭酸イオンの輸送を改善する。加えて、ポリエチレングリコール修飾された炭酸脱水酵素が酵素である時、ＰＥＯ修飾されたポリスルホンは、炭酸脱水酵素の周囲に親水性ＰＥＯ層を提供し、酵素が浸出するのをさらに防ぐ。炭酸脱水酵素のＰＥＯ被包は、固定化時のその活性を維持するために重要であってもよい乾燥作用から酵素を保護することもできる。
【０１０１】
加えて、特定のプロセス条件も、多孔度および重合体のイオン輸送を改善することができる。例えば、微孔質構造をポリスルホン重合体に導入するために、超臨界二酸化炭素の使用を通してポリスルホンを起泡することが可能である（Ｋｒａｕｓｅ，Ｂ．；Ｍｅｔｔｉｎｋｈｏｆ，Ｒ．；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｅｇｔ，Ｎ．Ｆ．Ａ．；Ｗｅｓｓｌｉｎｇ，Ｍ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００１，３４，８７４．を参照のこと）。同様のアプローチは、修飾されたポリスルホンビーズの起泡を可能にするために使用され得る。微孔質は、微孔質キトサンを作製するために使用されるプロセスに類似した凍結乾燥プロセスを使用することにより、ポリスルホンに導入され得る（Ｃｏｏｎｅｙ，Ｍ．Ｊ．；Ｌａｕ，Ｃ．；Ｗｉｎｄｍｅｉｓｓｅｒ，Ｍ．；Ｌｉａｗ，Ｂ．Ｙ．；Ｋｌｏｔｚｂａｃｈ，Ｔ．；Ｍｉｎｔｅｅｒ，Ｓ．Ｄ．Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．２００８，１８，６６７．を参照のこと）。ポリスルホンは、水／酢酸混合液に可溶性ではないため、真空下のその固体状態において、かなりの昇華を可能にするポリスルホンに適切な溶媒が要求される。メントールは、ポリスルホンが、わずかに高温のメントールにおいて高濃度で溶解することができることを示唆する、その低融解温度（３５℃）およびジオキサンに対する比較可能な溶解パラメータのため、有望な候補である。
修飾されたポリカーボネート
【０１０２】
特定の実施形態において、固定化材料は、式６
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の構造を有し、式中、Ｒ２３、Ｒ２４、およびｍは、上に定義される。種々の実施形態において、Ｒ２３およびＲ２４は、独立して、水素、アルキルまたは置換されたアルキルである。種々の実施形態において、Ｒ２３およびＲ２４は、独立して、水素、または−（ＣＨ２）ｑＮ＋Ｒ２６Ｒ２７Ｒ２８であり、Ｒ２６、Ｒ２７、およびＲ２８は、独立して、アルキルであり、ｑは、１、２、または３の整数であり、具体的には、Ｒ２６、Ｒ２７、およびＲ２８は、独立して、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、またはヘキシルであり、より具体的には、Ｒ２６、Ｒ２７、およびＲ２８は、メチルである。
【０１０３】
代替的に、Ｒ２３およびＲ２４は、独立して、水素、または−（ＣＨ２）ｐＮ＋Ｒ２６Ｒ２７Ｒ２８であり、Ｒ２６およびＲ２７は、独立して、メチル、エチル、またはプロピルであり、Ｒ８は、アルキルアミノであり、ｐは、１、２、または３の整数である。Ｒ２８がアルキルアミノである時、好適なアルキルアミノ基は、三級アルキルアミノ基である。例えば、アルキルアミノ基は、−ＣＨ２Ｎ＋Ｒ２９Ｒ３０Ｒ３１、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋Ｒ２９Ｒ３０Ｒ３１、または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋Ｒ２９Ｒ３０Ｒ３１であり得、Ｒ２９、Ｒ３０、およびＲ３１は、独立して、水素またはアルキルである。種々の好適な実施形態において、Ｒ２９、Ｒ３０、およびＲ３１は、独立して、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、またはヘキシルであり、より具体的には、Ｒ２９、Ｒ３０、およびＲ３１は、メチルまたはエチルである。
【０１０４】
他の好適な実施形態において、Ｒ２３およびＲ２４は、独立して、水素、または−（ＣＨ２）ｑ−ポリエーテルであり、ｑは、１、２、または３の整数である。好適な実施形態のいくつかにおいて、Ｒ２３およびＲ２４は、独立して、水素、−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２（ＣＨ３）−ＣＨ２−Ｏ）ｚ−Ｒｔ、−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｚ−Ｒｔ、またはそれらの組み合わせであり、ｚは、３〜１８０の整数であり、ポリエチレンオキシドまたはポリプロピレンオキシド（例えば、Ｒｔが、水素、アルキル、置換されたアルキル、アリール、または置換されたアリールである、−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｚ−Ｒｔまたは−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２（ＣＨ３）−ＣＨ２−Ｏ）ｚ−Ｒｔ）は、約１５０ダルトン（Ｄａ）〜約８０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有する。
【０１０５】
好ましくは、Ｒ２３、Ｒ２４、またはＲ２３およびＲ２４は、アルキルまたは置換されたアルキルであり、反復単位毎のアルキルまたは置換されたアルキル基の平均数は、約０．１〜約１．４、約０．２〜約１．４、約０．３〜約１．４、約０．３〜約１．２、約０．３〜約１、約０．３〜約０．８、約０．４〜約１．４、約０．４〜約１．２、約０．４〜約１、約０．４〜約０．８、約０．５〜約１．４、約０．５〜約１．２、約０．５〜約１、約０．５〜約０．８である。
【０１０６】
ポリカーボネートは、ポリスルホンに類似した構造を有する。また、その骨格にベンゼン環も含むため、ポリスルホンにおいて上述する同様の様式で、クロロメチル基を添加することにより官能化され得る。これらのクロロメチル基は、次いで、アミノ化されるか、またはポリスルホンにおいて利用された同様の手順後にＰＥＯをグラフト化させることができる。スキーム３および４は、両方の一般反応スキームを示す。ポリスルホンと同様に、ポリカーボネートは、超臨界二酸化炭素を使用して起泡され得る。
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スキーム３．アミノ化されたポリカーボネート形成の反応スキーム
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スキーム４．ＰＣ−ｇ−ＰＥＯ形成の反応スキーム
修飾されたポリ（塩化ビニルベンジル）
【０１０７】
他の実施形態において、固定化材料は、式７
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の構造を有し、式中、Ｒ２５およびｏは、上に定義される。種々の実施形態において、Ｒ２５は、水素、アルキル、または置換されたアルキルである。種々の実施形態において、Ｒ２５は、水素、または−（ＣＨ２）ｑＮ＋Ｒ２６Ｒ２７Ｒ２８であり、Ｒ２６、Ｒ２７、およびＲ２８は、独立して、アルキルであり、ｑは、１、２、または３の整数であり、具体的には、Ｒ２６、Ｒ２７、およびＲ２８は、独立して、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、またはヘキシルであり、より具体的には、Ｒ２６、Ｒ２７、およびＲ２８は、メチルである。
【０１０８】
代替的に、Ｒ２５は、水素、または−（ＣＨ２）ｐＮ＋Ｒ２６Ｒ２７Ｒ２８であり、Ｒ２６およびＲ２７は、独立して、メチル、エチル、またはプロピルであり、Ｒ２８は、アルキルアミノであり、ｐは、１、２、または３の整数である。Ｒ２８がアルキルアミノである時、好適なアルキルアミノ基は、三級アルキルアミノ基である。例えば、好適なアルキルアミノ基は、−ＣＨ２Ｎ＋Ｒ２９Ｒ３０Ｒ３１、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋Ｒ２９Ｒ３０Ｒ３１、または−Ｃ６Ｈ４Ｎ＋Ｒ２９Ｒ３０Ｒ３１であり得、Ｒ２９、Ｒ３０、およびＲ３１は、独立して、水素またはアルキルである。種々の好適な実施形態において、Ｒ２９、Ｒ３０、およびＲ３１は、独立して、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、またはヘキシルであり、より具体的には、Ｒ２９、Ｒ３０、およびＲ３１は、メチルまたはエチルである。
【０１０９】
好ましくは、Ｒ２５は、置換されたアルキルであり、反復基毎の置換されたアルキル基の平均数は、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、またはそれ以上である。
【０１１０】
ポリ（塩化ビニルベンジル）（ＰＶＢＣ）は、重合体に含有されるクロロメチル基を有する商業的に入手可能な重合体であるため、クロロメチル化ポリスルホンまたはポリカーボネートにおける上述の合成手順に類似してアミノ化され得る。しかしながら、ＰＶＢＣは、ポリスルホンおよびポリカーボネートの機械的強度を欠損し、いくらか脆性であり、低ガラス遷移温度を有する。しかしながら、この重合体の機械的および熱的安定性は、三級ジアミンでアミノ化することによって、ＰＶＢＣを架橋することにより改善され得る。（Ｖａｒｃｏｅ，Ｊ．Ｒ．；Ｓｌａｄｅ，Ｒ．Ｃ．Ｔ．；Ｌｅｅ，Ｅ．Ｌ．Ｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００６，１４２８．を参照のこと）。このプロセスは、ＰＶＢＣに陽電荷を組み込み、これらの電荷も、静電気作用を通して固定化された酵素を安定化させることができる。スキーム５は、この反応の一般的なスキームを示す。
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スキーム５．架橋されたＰＶＢＣ形成の反応スキーム
【０１１１】
ジアミンの４０重量％のＰＶＢＣ含有ＮＭＰ溶液への添加時、ジアミン中のメチレン（−ＣＨ２−）およびフェニレン（−Ｃ６Ｈ４−）スペーサーの両方は、架橋された固体フィルムを産生する。以下の構造を有するジアミンは、これらの四級アミンに長期間の安定性を提供するため、選択された。テトラメチルメタンジアミン（ＴＭＭＤＡ）の使用は、この溶液を急速に固化し（例えば、１０分未満）、ＴＭＭＤＡのＰＶＢＣとの反応が速いことを示す。固化されると、ＴＭＭＤＡと架橋されたＰＶＢＣは、メタノールまたは水の添加時に膨潤しない。逆に、テトラメチルフェニレンジアミン（ＴＭＰＤＡ）の反応は遅く、固化に数時間かかる。固化されると、ＴＭＰＤＡと架橋されたＰＶＢＣは、メタノールまたは水のいずれかに曝露されると、顕著に膨潤する（が、その原形は維持する）。ＴＭＰＤＡと架橋されたＰＶＢＣは、親水性の高膨潤材料を形成し、これは、剛性のガラス状重合体であるポリスルホンおよびポリカーボネートと比較すると、重合体を通した炭酸／重炭酸イオンの輸送を著しく改善する。ポリスルホンおよびポリカーボネートと同様に、修飾されたＰＶＢＣの誘導体化の量は、クロロメチル化反応中、溶液の重合体濃度を調節することにより変更され得る。
修飾されたポリシロキサン
【０１１２】
種々の実施形態において、固定化材料は、式８
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の構造を有し、式中、Ｒ３２およびＲ３３は、独立して、水素、アルキル、アリール、または置換されたアルキルであるが、ただし、反復単位毎の水素原子の平均数が、少なくとも０．１であることを条件とする。
【０１１３】
種々の実施形態において、Ｒ３２およびＲ３３は、独立して、水素、アルキル、アリール、−（置換されたアルキレン）−酸もしくはその塩、−（置換されたアルキレン）−塩基もしくはその塩、−（ＣＨ２）ｑＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｚ−Ｒｔ、−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２（ＣＨ３）−ＣＨ２−Ｏ）ｚ−Ｒｔ、またはそれらの組み合わせであり、ｑは、２、３、または４の整数であり、Ｒｔは、［ｔｅｘｔ  ｃｕｔ  ｏｕｔ］。酸基は、カルボン酸基、ホスホン酸基、硫酸基、スルファミン酸、それらの塩、またはそれらの組み合わせであり得る。塩基は、アミン塩基、具体的には、三級アミン、四級アミン、窒素複素環、それらの塩、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態において、Ｒ３２およびＲ３３は、独立して、水素、アルキル、アリール、−（ＣＨ２）３−Ｏ−（（ＣＨ２）２−Ｏ−）ｚＣＨ３、−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−イミダゾリウム、−（ＣＨ２）３−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｎａである。
【０１１４】
式８の構造は、水素化ケイ素結合を含有するポリシロキサンである、ヒドロシロキサンから始めて調製される。例としては、ポリ（メチルヒドロシロキサン）（ＰＭＨＳ）同種重合体、ポリ（フェニルジメチルヒドロシロキシ）シロキサン（ＰＰＤＭＨＳ）同種重合体、およびポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）またはポリ（フェニルメチルシロキサン）（ＰＰＭＳ）等のＰＭＨＳまたはＰＰＤＭＨＳの他のポリシロキサンとの共重合体が挙げられる。具体的には、ポリアルキルヒドロシロキサン（例えば、ポリ（メチルヒドロシロキサン）、ポリ（エチルヒドロシロキサン）、ポリ（プロピルヒドロシロキサン）、ポリアリールヒドロシロキサン（例えば、ポリ（フェニルヒドロシロキサン）、ポリ（トリルヒドロシロキサン））、ポリ（フェニルジメチルヒドロシロキシ）シロキサン、ポリ（ジメチルシロキサン共−メチルヒドロシロキサン）、ポリ（メチルヒドロシロキサン共−フェニルメチルシロキサン）、ポリ（メチルヒドロシロキサン共−アルキルメチルシロキサン）、ポリ（メチルヒドロシロキサン共−ジフェニルシロキサン）、ポリ（メチルヒドロシロキサン共−フェニルメチルシロキサン）である。これらのポリシロキサンは、望ましいＣＯ２溶解度を有する。理論に拘束されることなく、ポリシロキサンの弾性は、ＣＯ２溶解度を増加すると考えられている。発表された手順を使用して、これらの水素化官能ポリシロキサンは、白金触媒（ヒドロシリル化反応）を使用して、ポリエーテルおよび／またはイオン基をアリル含有化合物と共役することにより、これらでグラフト化することができる。一般的な反応スキームをスキーム６〜８に示す。
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スキーム６．ポリエチレングリコール修飾されたポリ（メチルヒドロシロキサン）の合成
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スキーム７．カチオン修飾されたポリ（メチルヒドロシロキサン）の合成
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スキーム８．アニオン修飾されたポリ（メチルヒドロシロキサン）の合成
【０１１５】
一般的に、イオンポリシロキサンまたは非イオンポリシロキサンの官能化は、添加されるポリエーテルまたはイオン基の量を調整することにより操作され得る。特に、ＰＭＨＳの官能化は、反応混合物に添加されるアリルＰＥＧ、アリルグリシジルエーテル、および／またはアクリル酸アルキルイミダゾリウムの量を変更することにより変更され得る。官能部位の追加（例えばポリエーテルまたはイオン基）は、イオンポリシロキサンおよび非イオンポリシロキサンの水溶解度を増加する。重合体の水溶解度は、ポリシロキサンに付加される官能部位の数に依存する。さらに、ポリシロキサンは、アリル基を有するポリエーテル、およびアリル基を有するイオン化合物を同反応混合物に添加することにより、ポリエーテルおよびイオン種の両方で官能化され得る。
【０１１６】
官能化されたＰＭＨＳは、次いで、ヒドロシリル化反応または脱水素共役反応の２つの可能な経路を介して、残存Ｓｉ−Ｈ基を使用することによって天然ゴムに近い特性を有するエラストマーの中に架橋され得る。ヒドロシリル化反応は、架橋剤として白金ジビニルテトラメチルジシロキサン複合体およびビニル官能性ポリシロキサン等の白金触媒を使用する。ビニル官能性ポリシロキサンの例としては、ジビニル終結ＰＤＭＳまたはＰＰＭＳ、ポリ（ビニルメチルシロキサン）（ＰＶＭＳ）同種重合体、ならびにＰＶＭＳおよびＰＤＭＳもしくはＰＰＭＳの共重合体が挙げられる。脱水素共役反応は、触媒の選択が共役作用に依存する触媒を使用する。スズ触媒は、主に、Ｓｉ−ＨがＳｉ−ＯＨと共役し、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ連結を形成する、脱水素共役反応で使用される。ジ−ｎ−ブチルジラウリルスズ等のスズ触媒は、架橋剤としてシラノール官能性ポリシロキサンと共に使用される。スズ化合物に加え、亜鉛、鉄、コバルト、ルテニウム、イリジウム、パラジウム、および白金系の他の遷移金属複合体が使用され得る。具体的な例としては、オクチル酸亜鉛、オクチル酸鉄、およびウィルキンソン触媒（ロジウム系金属塩；（ＰｈＰ）３ＲｈＣｌ）が挙げられる。貴金属触媒（主に白金だが、ロジウムも）は、Ｓｉ−Ｈが末端ビニル結合と反応し、Ｓｉ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓｉを形成する、ヒドロシリル化反応に使用される。遊離ラジカル発動因子（熱および／またはＵＶ生成）は、ポリシロキサンを含有するビニル、アクリル酸塩、またはメタクリル酸塩を架橋するために使用され得る。スズおよび／またはチタン化合物は、Ｓｉ−ＯＨ基が種々の反応基（アルコキシ、アセトキシ、オキシム、エノキシ（ｅｎｏｘｙ）、およびアミン）と反応し、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ結合を形成する、縮合硬化システムを触媒するために使用される。これらの縮合硬化システムは、湿度感受性であり、水の存在下のみで反応するが、チタンおよび／またはスズ化合物を使用するとその反応を加速する。シラノール官能性ポリシロキサンの例としては、ジシラノール終結ＰＤＭＳまたはポリ（トリフルオロプロピルメチルシロキサン）（ＰＴＦＰＭＳ）、ＰＰＭＳおよびＰＤＭＳのジシラノール終結共重合体、ならびにシラノール−トリメチルシリル修飾されたＱ樹脂が挙げられる。架橋密度は、固定化マトリックスにおける金属特性および酵素維持に影響を与える。
【０１１７】
この固定化手順に対する他の変形は、アニール温度（ウシ炭酸脱水酵素（ＢＣＡ）に対しては４℃〜６０℃）、ヒト炭酸脱水酵素（ＨＣＡ）に対しては〜８０℃））、ならびにスズ触媒選択および負荷を含む。ジブチルジラウリルスズに加えて、ビス（２−エチルヘキサノエート）スズ、ジメチルヒドロキシ（オレイン酸塩）スズ、およびジオクチルジラウリルスズが、触媒として使用され得る。アニール温度が上昇すると、高反応速度（３０分、またはそれ未満で固化する）の維持に必要なスズの触媒量は、減少し、約０．０１〜約１０容量％、好ましくは、約０．２〜約４容量％の範囲である。
【０１１８】
重合体片の最終形状も、変動し得る。円柱の径および長さは、異なるアクリル型を使用して変更され得る。代替的に、ポリシロキサンは、固体支持体上に被覆され得る。理想的には、固体支持体の表面は、スズ触媒された架橋反応中にポリシロキサンに共有結合的に結合することができるように、Ｓｉ−ＯＨ基で官能化される。ジシラノール終結重合体架橋剤の種類および分子量も、複合体ポリシロキサンの特性（例えば、密度、機械的強度等）を変更するように変更され得る。ＰＤＭＳ−（ＯＨ）２の代替としては、ジシラノール終結ジフェニルシロキサン−ジメチルシロキサン共重合体、ジシラノール終結ポリ（トリフルオロプロピルメチルシロキサン）、およびジシラノール終結ポリ（ジフェニルシロキサン）である。
【０１１９】
加えて、ＰＭＨＳ−ｇ−ＰＥＧは、種々の分子量の貴金属触媒およびビニル含有ポリシロキサン架橋剤を使用して、異なる作用（ヒドロシリル化）を介して架橋され得る。この反応に対する有用な触媒は、約０．０１〜約５容量％、好ましくは約０．０２〜約０．５容量％の負荷での白金−ジビニルテトラメチルジシロキサン複合体、白金−シクロビニルメチルシロキサン複合体、および三塩化トリス（ジブチルスルフィド）ロジウムである。ビニル含有ポリシロキサン架橋剤の例としては、ジビニル終結ポリ（ジメチルシロキサン）、ジビニル終結ジフェニルシロキサン−ジメチルシロキサン複合体、ジビニル終結ポリ（フェニルメチルシロキサン）、ポリ（ビニルメチルシロキサン）、ビニルＱ樹脂、ビニルＴ構造重合体、ビニルメチルシロキサン−ジメチルシロキサン共重合体、およびポリ（ビニルフェニルシロキサン共−フェニルメチルシロキサン）である。
酵素被包プロセス
【０１２０】
酵素をポリスルホンに被包するために、酵素は、重合体を溶解するために使用される溶媒によって非活性化されてはならない。酵素被包された重合体ビーズを調製する時に、酵素は、界面活性剤を用いて溶媒中に溶解される。次いで、ポリスルホンを溶液に添加し、完全に溶解するまで攪拌する。ポリスルホン／酵素溶液は、完全な混合が達成されるまで室温で保持される。溶解されたポリスルホン／酵素溶液を、次いで、水、アルコール、または水−アルコール溶液に滴下して添加するが、このプロセスは、図１に示す重合体ビーズを形成する。加えて、図１は、重合体ビーズにおける溶解性種の保持率を図示する。青色ビーズは、２０ｍｇ／ｍＬの銅フタロシアニンを２０重量％のポリスルホン含有１−メチルピロリドン溶液中に混合することにより作製された。次いで、溶液を水のビーカーの中に滴下して添加し、ビーズを形成する。ビーズを水、アルコール、および炭酸溶液で繰り返し洗浄し、ビーズから残ったあらゆる色素を洗い流す。
【０１２１】
アルギン酸塩に酵素を固定化するために、２％の未修飾アルギン酸塩溶液を酵素で充填し、２重量％の塩化カルシウム中に滴下して添加し、少なくとも３０分間攪拌した。次いで、酵素被包されたアルギン酸塩ビーズを取り除き、ペーパータオルで軽く乾燥させる。次に、手でビーズを２０重量％のポリスルホン溶液に転がし入れ、ポリスルホンフィルム被包アルギン酸塩ビーズを得る。ポリスルホン被覆なしでは、アルギン酸塩ビーズは、炭酸ナトリウム溶液に溶解するが、ポリスルホンの薄いフィルムがビーズを被覆すると、酵素はアルギン酸塩中に保持されるため、このフィルムは、必要である。このプロセスは、基材拡散を調整するために、他の重合体に使用され得る。
【０１２２】
ポリ（塩化ビニルベンジル）（ＰＶＢＣ）に酵素を固定化するために、ジオキサンまたは１−メチルピロリドン等の水置換可能な溶媒でＰＶＢＣ溶液を作製した。次いで、炭酸脱水酵素を溶液に添加し、均一な溶解が生じるまで攪拌した。溶液が十分に分散されたら、ジアミン架橋剤を添加し、溶液がビーズを形成するのに十分に粘稠になるまで攪拌する。しかしながら、攪拌は、溶液がゲルになるほど長くてはならない。粘稠性が、ホールピペットを使用して容易にピペットするのに十分に低い時に、溶液を水のビーカー中に滴下して添加し、過剰な溶媒を除去するために攪拌する。
【０１２３】
ポリスルホン−グラフト−ポリエチレングリコール（ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧ）重合体に酵素を固定化するために、ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧが溶解するまで、乾燥ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧおよび低沸点溶媒（例えば、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、１，４−ジオキサン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、トルエン、２−ブタノン、ベンゼン、酢酸エチル、アセトニトリル、アセトン）を槽に設置した。支持体材料（例えば、多孔質溶岩、多孔質シリカ、多孔質セラミック、多孔質重合体ビーズ、または他の適切な支持体）をビーカーに設置し、酵素（例えば炭酸脱水酵素）を攪拌しながら添加する。均質化したら、ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧを添加し、支持体材料を被覆するために攪拌する。溶媒が蒸発するまで、続けて内容物を攪拌する。固定化された炭酸脱水酵素被覆された支持体材料を真空オーブンに設置し、残留溶媒を除去し、重炭酸溶液に保存する。
【０１２４】
代替的に、水混和性溶媒（例えば、Ｎ−メチルピロリドン、１，４−ジオキサン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトン）と共に乾燥ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧを槽に設置することにより、酵素をＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧに固定化し、ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧが溶解するまで攪拌することができる。ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧが溶解したら、酵素（例えば、炭酸脱水酵素）を添加し、完全に混合する。酵素／ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧ溶液を脱イオン水に滴下して添加し、重合体ビーズを形成する。ビーズを重炭酸溶液に保存する。
コア構成要素
【０１２５】
コアは、固定化された酵素層の支持体を提供し、スプレー乾燥され得る任意の粒子である。コア粒子は、例えば、重合体粒子、炭素粒子、ゼオライト粒子、金属粒子、セラミック粒子、酸化金属粒子、シリカ粒子、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、コア粒子は、不活性コア粒子である。種々の実施形態において、コア粒子は、重合体粒子ではない。好適なコア粒子は、酵素の安定性または酵素に関与する化学転換に有害な影響を与えない。特定の用途において、コア粒子は、固定化された酵素で被覆される時、粒子の意図される使用に応じて、約２００ｎｍ〜約１００μｍの平均径を有する。他の用途において、コア粒子は、用途のために設計されたシステムに適切な寸法を有することができる。
被覆された粒子の調製方法
【０１２６】
被覆された粒子は、酵素を含む溶液を、少なくとも１つのコア粒子、固定化材料、および液体媒体を含む懸濁剤と混合し、得られた混合物をスプレー乾燥させることにより調製される。溶液、懸濁剤、およびスプレー乾燥工程は、以下により詳細に記載される。
【０１２７】
酵素および溶媒を含む酵素溶液は、被覆手順で使用される。酵素は、溶媒と混ぜ合わされ、溶液が形成されるまで混合される。許容される酵素は、以下により詳細に記載される。溶媒は、水性溶液、具体的には、酢酸緩衝液またはリン酸緩衝液等の緩衝溶液であり得る。緩衝液のｐＨは、固定化される特定の酵素に許容されるｐＨを提供するように設計される。また、種々の実施形態において、酵素溶液は、上述のように、電子介在物質を含有することができる。
【０１２８】
懸濁液は、コア粒子、所望の固定化材料、および液体媒体を混ぜ合わせることにより調製される。代表的なコア粒子および固定化材料は、上述の通りである。液体媒体は、酢酸緩衝液またはリン酸緩衝液等の溶媒または緩衝液であり得る。緩衝液が液体媒体として使用される時、緩衝液のｐＨは、固定化および被覆される特定の酵素に許容されるｐＨを提供するように選択される。
【０１２９】
酵素溶液および懸濁液が調製されたら、これらを混ぜ合わせ、良く混合する。次に、得られた混合物を乾燥させる。乾燥が、固定化された酵素層でコア粒子の被覆ももたらすため、好適な乾燥方法は、スプレー乾燥である。従来のスプレー乾燥法が、本発明の方法に使用され得る。スプレー乾燥の代替としては、流動層顆粒化、スプレー乾燥顆粒化、回転式顆粒化、流動層／スプレー乾燥顆粒化、押出し、および球状化等の、被覆された粒子を形成するための他の従来のプロセスを含む。
【０１３０】
種々の実施形態のいくつかにおいて、溶液は、約０．１重量％〜約１５重量％の酵素、および約８５重量％〜約９９．１重量％の溶媒を含み、懸濁液は、約０．１重量％〜約５０重量％のコア粒子、約４重量％〜約１０重量％の酵素固定化材料、および約５０重量％〜約７５重量％の液体媒体を含む。成型用溶液を作製する他の方式は、緩衝液に粒子と酵素を一緒に混合し、懸濁液を形成した後、可溶化された固定化材料を添加し、混合物を完了するか、または材料の全てを一度に混ぜ合わせ、懸濁液を形成することを含む。
【０１３１】
種々の好適な実施形態において、酵素と酵素固定化材料との混合物は、スプレー被覆／乾燥法を使用して、支持粒子上に被覆され得る。例えば、エアブラシ（例えば、Ｐａａｓｃｈｅ  ＶＬシリーズ）は、混合物の構成要素のエアロゾルを生成し、これらを標的に向かって推進させるために使用され得る。エアロゾルは、約２５ｐｓｉに調節された圧縮窒素ガスを使用して生成される。エアブラシの先端からシールドまで約４０ｃｍの距離から、ポリカーボネートシールド等の表面上に混合物をエアブラシで吹きつける。エアブラシは、ポリカーボネート標的をジグザグパターンで垂直方向下に移動させながら、ラスターパターンで移動し、成型用溶液を塗布することができる。この手順は、シールド上の被覆の厚さを最小にし、乾燥中の粒子−粒子相互作用を最小にするために使用される。大型のヘラ／スクレーパで収集される前に、約２０分間、成型用溶液をシールド上で乾燥させる。
【０１３２】
上述のスプレー乾燥法を使用して被覆できない他の粒子において、粒子は、浸漬被覆、ブラシ被覆、スピン被覆等の、当該分野に公知の方法により被覆され得る。
支持体または基材
【０１３３】
酵素が、酵素固定化材料内に固定化されると、この固定化された酵素は、支持体上に沈着され得る。基材は、選択された使用に必要な所望の機械的支持体を提供する材料であり得る。例えば、支持体は、固定化された酵素が化学転換の触媒として使用される時、フィルタ、ワイヤメッシュ、多孔質重合体、有機膜および無機膜等であってもよい。
水性液
【０１３４】
上述の通り、水性液をＣＯ２含有ガスと接触させて、ＣＯ２の吸収を補助し、水性液中のＣＯ２濃度を増大させる。多くの好適な実施形態において、水性液は、塩基を含む。塩基は、プロトン受容体である。塩基は、水可溶性であり、炭酸脱水酵素を変性しない。塩基は、金属水酸化物、四級アンモニウム水酸化物、金属炭酸塩、四級アンモニウム炭酸塩、四級アンモニウムアルコキシド、金属アミド、金属アルカリ、金属アルコキシド、金属シラノエート（ｓｉｌａｎｏａｔｅ）、アミン、アルカノールアミン、弱酸の共役塩基、またはそれらの組み合わせであり得る。金属水酸化物は、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化ストロンチウム、水酸化バリウム、またはそれらの組み合わせを含むことができる。水酸化アンモニウムも、水性液に使用され得る。金属炭酸塩は、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ルビジウム、炭酸セシウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸ストロンチウム、炭酸バリウム、炭酸アンモニウム、有機カチオンの炭酸塩、またはそれらの組み合わせであり得る。例えば、有機カチオンの炭酸塩は、テトラアルキルアンモニウム炭酸塩（例えば、テトラメチルアンモニウム炭酸塩、テトラエチルアンモニウム炭酸塩、テトラプロピルアンモニウム炭酸塩、テトラブチルアンモニウム炭酸塩、テトラペンチルアンモニウム炭酸塩、またはテトラヘキシルアンモニウム炭酸塩）、アルキルトリメチルアンモニウム炭酸塩（例えば、エチルトリメチルアンモニウム炭酸塩、プロピルトリメチルアンモニウム炭酸塩、ブチルトリメチルアンモニウム炭酸塩、ペンチルトリメチルアンモニウム炭酸塩、ヘキシルトリメチルアンモニウム炭酸塩、ヘプチルトリメチルアンモニウム炭酸塩、オクチルトリメチルアンモニウム炭酸塩、ノニルトリメチルアンモニウム炭酸塩、デシルトリメチルアンモニウム炭酸塩、ドデシルトリメチルアンモニウム炭酸塩、またはウンデシルトリメチルアンモニウム炭酸塩）、アルキルトリエチルアンモニウム炭酸塩（例えば、メチルトリエチルアンモニウム炭酸塩、プロピルトリエチルアンモニウム炭酸塩、ブチルトリエチルアンモニウム炭酸塩、ペンチルトリエチルアンモニウム炭酸塩、ヘキシルトリエチルアンモニウム炭酸塩、ヘプチルトリエチルアンモニウム炭酸塩、オクチルトリエチルアンモニウム炭酸塩、ノニルトリエチルアンモニウム炭酸塩、デシルトリエチルアンモニウム炭酸塩、ドデシルトリエチルアンモニウム炭酸塩、またはウンデシルトリエチルアンモニウム炭酸塩）、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１３５】
四級アンモニウム水酸化物、四級アンモニウム炭酸塩、または四級アンモニウムアルコキシドは、水酸化ベンジルトリメチル、水酸化コリン、水酸化ジエチルジメチルアンモニウム、水酸化ジメチルドデシルエチルアンモニウム、Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′，Ｎ′−ヘキサブチルヘキサメチレンジアンモニウム二水酸化物、水酸化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、水酸化ヘキサメトニウム、水酸化トリエチルメチルアンモニウム、水酸化トリブチルメチルアンモニウム、水酸化トリヘキシルテトラデシルアンモニウム、水酸化テトラプロピルアンモニウム、水酸化テトラブチルアンモニウム、水酸化テトラオクタデシルアンモニウム、水酸化メチルトリプロピルアンモニウム、テトラブチルアンモニウムエトキシド、水酸化テトラエチルアンモニウム、水酸化テトラヘキシルアンモニウム、水酸化テトラキス（デシル）アンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウム、水酸化トリメチルフェニルアンモニウム、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１３６】
金属アミド、金属アルコキシド、または金属シラノエートは、リチウムｔｅｒｔ−アモキシド、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド、リチウムジエチルアミド、リチウムジメチルアミド、リチウムジイソプロピルアミド、ナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド、カリウムビス（トリメチルシリル）アミド、リチウムジシクロヘキシルアミド、リチウムトリメチルシラノラート、ナトリウムメトキシド、カリウムメトキシド、リチウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムエトキシド、リチウムエトキシド、リチウムイソプロポキシド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、リチウムｔｅｒｔ−ブトキシド、ナトリウムｔｅｒｔ−ペントキシド、カリウムｔｅｒｔ−ペントキシド、マグネシウムエトキシド、マグネシウムジ−ｔｅｒｔ−ブトキシド、ナトリウムトリメチルシラノラート、カリウムトリメチルシラノラート、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１３７】
アミンは、２−（２−クロロ−６−フルオロフェニル）エチルアミンの環式アミン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタンＤＡＢＣＯ（登録商標）３３−ＬＶ）、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノン−５−エン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、２，６−ルチジン、ピペリジン、１，８−（ジメチルアミノ）ナフタレン、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン、２，８，９−トリイソブチル−２，５，８，９−テトラアザ−１−ホスファビシクロ［３．３．３］ウンデカン、トリペレナミン、アニリン、ベンジルアミン、Ｎ−メチルアニリン、イミダゾール、ピロール、ピリジン、モルホリン、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１３８】
アミンは、一級アミン、二級アミン、三級アミン、またはそれらの組み合わせであり得る。一級アミンは、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソ−プロピルアミン、ブチルアミン、イソ−ブチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、ペンチルアミン、イソ−ペンチルアミン、ｓｅｃ−ペンチルアミン、ｔｅｒｔ−ペンチルアミン、ヘキシルアミン、イソ−ヘキシルアミン、ｓｅｃ−ヘキシルアミン、ｔｅｒｔ−ヘキシルアミン、エチレンジアミン、（２−メチルブチル）アミン、２−アミノペンタン、３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）プロピルアミン、２−アミノ−６−メチルヘプタン、１−エチルプロピルアミン、またはそれらの組み合わせであり得る。さらに二級アミンは、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミン、ジペンチルアミン、ジヘキシルアミン、メチルエチルアミン、メチルプロピルアミン、メチルブチルアミン、エチルプロピルアミン、エチルブチルアミン、Ｎ−エチルメチルアミン、Ｎ−イソプロピルメチルアミン、Ｎ−ブチルメチルアミン、Ｎ−エチルイソプロピルアミン、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルメチルアミン、Ｎ−エチルブチルアミン、３−イソプロポキシプロピルアミン、クロロ（ジエチルアミノ）ジメチルシラン、２，２′−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）、１，３−ビス（クロロメチル）−１，１，３，３−テトラメチルジシラザン、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルイソプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルトリメチルシリルアミン、ジ−ｓｅｃ−ブチルアミン、またはそれらの組み合わせであり得る。加えて、三級アミンは、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、ジメチルエチルアミン、ジメチルプロピルアミン、ジメチルブチルアミン、ジエチルメチルアミン、ジエチルプロピルアミン、ジエチルブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチルアミン、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルブチルアミン、１，２−ジメチルプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルメチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルイソプロピルアミン、１，３−ジメチルブチルアミン、３，３−ジメチルブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルブチルアミン、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１３９】
種々の実施形態において、アミンは、三級アミン、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、ジメチルエチルアミン、ジメチルプロピルアミン、ジメチルブチルアミン、ジエチルメチルアミン、ジエチルプロピルアミン、ジエチルブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチルアミン、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルブチルアミン、１，２−ジメチルプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルメチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルイソプロピルアミン、１，３−ジメチルブチルアミン、３，３−ジメチルブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルブチルアミン、またはそれらの組み合わせである。
【０１４０】
アルカノールアミンは、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール（Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基）、プロパノールアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ジメチルエタノールアミン、Ｎ−メチルエタノールアミン、トリエタノールアミン、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１４１】
弱酸の共役塩基は、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、リンゴ酸塩、マロン酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩、スルファミン酸塩であり得、対イオンは、アルカリ金属、アルカリ土類金属、またはアンモニウムカチオン等の陽イオンであり得る。
【０１４２】
特に記載のない限り、本明細書に記載されるアルキル基は、好ましくは、主鎖に１〜８個の炭素原子、および最大２０個の炭素原子を含有する低級アルキルである。アルキルは、置換または非置換されてもよく、直鎖または分枝鎖であってもよい。非置換されたアルキルの例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｉ−ペンチル、ｓ−ペンチル、ｔ−ペンチル等が挙げられる。「置換されたアルキル」のように、「置換された」という用語は、酸素、窒素、硫黄、リン等の種々のヘテロ原子が、主鎖に、またはペンダント基としてのいずれかでアルキル基の炭素原子に結合され得ることを意味する。例えば、置換されたアルキル基は、Ｘがヘテロ原子である、主鎖で、−Ｃ−Ｘ−Ｃ−断片を有することができる。さらに、置換されたアルキル基は、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、ホスフィノ、アミノ、ハロ、シリル、ニトロ、エステル、ケトン、複素環、アリール等の、１つ以上の置換基と置換される炭素原子に結合される、少なくとも１つの水素原子を有することができる。
【０１４３】
本発明をより詳細に記載したが、付属の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲から逸脱することなく、修正および変形が可能であることを理解されたい。
実施例
【０１４４】
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに図示するために提供される。
実施例１：ベンチスケール充填層反応器
【０１４５】
ＣＯ２を水和するための充填層反応器のフローダイアグラムを図３に示す。図３に示す部品を有する充填層反応器を製作した。反応器の筺体は、両端にＰＶＣキャップを備える３インチ径のＰＶＣパイプで作製された。反応器の充填材料は、重量で０．１８重量％の固定化された炭酸脱水酵素で覆われた商業的に入手可能な溶岩であった。固定化された炭酸脱水酵素を以下に記載する。二酸化炭素ガスは、反応器の底部のスパージャを通過して反応器に入り、反応器の上部から大気圧に出た。５００ｍＭ炭酸ナトリウムの水性溶液は、反応器の上部に入り、反応器の側部から出た。この構成は、二次ポンプを使用せずに反応器の液体レベルを維持することを可能にした。
【０１４６】
炭酸脱水酵素を充填物上に被覆した後、検査した。試料１Ａは、０．１８重量％炭酸脱水酵素に１００ｍＬの充填容量で、２３９ｇの重さの充填物を使用した。４２８ｍｇウシ炭酸脱水酵素の溶液、０．４２５ｍＬのトリトンＸ−１００、ｐＨ８．３の８４．５７５ｍＬの０．０２Ｍトリス硫酸緩衝液、および１５ｍＬの１５％臭化テトラエチルアンモニウム修飾されたナフィオン（登録商標）の溶液を調製し、固定化された酵素溶液を形成した。溶液を約５分間ボルテックスした。酵素固定化溶液を溶岩上にピペットで移し、４℃で一晩乾燥させた後、溶岩を反応器に設置する前に、２時間、室温で−３０ｍｍＨｇで、真空オーブンに設置した。試料１Ｂは、同じ充填容量および充填物の重さであったが、対照として使用するために炭酸脱水酵素を含有しなかった。
【０１４７】
反応器の流入速度、ガス流および液体流の組成物、充填物の重さ、触媒の重さ、および分離されたｍｏｌ  ＣＯ２／（ｈ  Ｌ）を収集した。ｐＨスタットを通して炭酸溶液を再生するために使用された水酸化ナトリウム／水酸化カリウムの量に基づき、分離されたｍｏｌ  ＣＯ２／（ｈ  Ｌ）を計算した。全体的なシステムを図３に図示する。４．１８Ｌ／ｈの０．５Ｍの炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）溶液、および７３０８Ｌ／ｈのＣＯ２流速が反応器に使用された（反応器の条件は最適化されなかった）。
【０１４８】
どのくらいの二酸化炭素が分離されたかを決定するためにｐＨスタットを使用する時、記録された時間量において、容量単位に２Ｍの容量の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加した。固定化された炭酸脱水酵素を伴って、およびそれを伴わずに、単位時間（ｓ）毎に添加された水酸化ナトリウムの容量（ｍＬ）のグラフを、それぞれ、図４および図５に示す。
【０１４９】
充填材料が固定化された炭酸脱水酵素で被覆された実験は、０．７１９ｍｏｌ／ｈの二酸化炭素が分離されたことを示したが、一方、充填材料が酵素で被覆されなかった実験は、０．４７１ｍｏｌ／ｈの二酸化炭素が分離されたことを示した。除去された二酸化炭素の量は、方程式
2012504047.tif 000027
によって計算され、式中、ΔＶは、容量の変化であり、Δｔは、時間の変化である。
実施例２：炭酸脱水酵素を使用した重炭酸溶液の脱水
【０１５０】
重炭酸イオンのＣＯ２、水、および炭酸イオンへの変換における反応速度は、密閉システムにおける時間の関数として、ｐＨの変化により監視された。変更されたシステムのパラメータは、反応温度、初期の重炭酸濃度、および反応時間を含む。実験は、０．３１３ｍｇ／ｍＬの炭酸脱水酵素なしの溶液か、または溶液に添加された多孔質支持体上に固定された０．３１３ｍｇ／ｍＬの炭酸脱水酵素を有する、８０ｍＬの重炭酸ナトリウム溶液を含有する２００ｍＬの三つ口フラスコで実施された。システムの温度は、恒温制御された水浴を使用して、一定の設定値に設定された。中程度の多孔度の半融ガラススパージャを通して、５０標準立方センチメートル毎分（ｓｃｃｍ）の速度で、窒素ガスをシステムに導入し、反応の過程中に産生されたいくらかの二酸化炭素を除去した。システムの初期のｐＨは、約８．４であり、ｐＨの変化は、温度補償ｐＨプローブにより監視され、データは３秒間隔で記録が取られた。検査された全ての酵素システムは、酵素を含有しない重炭酸溶液か、またはそこに被覆された固定化された酵素を有さない支持体材料を含有する重炭酸溶液のいずれかの比較可能なブランクと比較された。
実施例２Ａ：遊離酵素含有重炭酸溶液
【０１５１】
非固定化された炭酸脱水酵素により触媒された重炭酸の脱水は、触媒なしの重炭酸の脱水と比較された。炭酸脱水酵素触媒された反応を非触媒システムと比較した、反応時間に対するｐＨのグラフを図６に示す。この反応の温度は、４０℃に設定され、重炭酸含有溶液の初期濃度は、０．１Ｍであった。ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）パドルを装着したオーバーヘッドガラスロッドを使用して、溶液を攪拌した。酵素が、システムに導入された時に、反応のデータ収集が開始され、約５０分間、連続して収集された。最初に、酵素システムは、ブランクと比較した時、全体的なシステムにおいて高速のｐＨ変化を実証し、高速は、全実験を通して継続した。４５分で、非触媒反応混合物のｐＨは、同じ経過時間後、炭酸脱水酵素触媒された反応混合物の９．２と比較して、８．９であった。炭酸脱水酵素触媒された反応混合物は、非触媒反応と比較すると、３分の１の時間で０．５ｐＨ単位増加した。
【０１５２】
完了のために、より長い時間反応させた（最大１６時間）時、炭酸脱水酵素触媒された反応混合物は、全実験を通して、非触媒反応混合物より高いｐＨ値を維持した。１６時間実験の時間に対する反応混合物のｐＨのグラフを図７に示す。炭酸脱水酵素溶液は、１６時間後、１０．１のｐＨで終了した。炭酸ナトリウム溶液は、約１１．３のｐＨであるため、炭酸の濃度は、より長く反応させることが可能であった反応混合物で高かった。
実施例２Ｂ：重炭酸濃度の変更
【０１５３】
重炭酸の初期濃度は、非固定化酵素システムにおいて、０．１Ｍから２．０Ｍの値の間で変更された。図８は、０．１、０．５、および２．０Ｍの初期重炭酸濃度を有する３つの炭酸脱水酵素触媒された反応混合物の反応時間に対するｐＨのグラフである。最も大きなｐＨの変化は、低濃度システムで観察された。重炭酸の濃度が、０．５Ｍに増加されると、システムのｐＨの変化は、０．１Ｍで、ブランクシステムと比較可能であったが、０．５Ｍで、ブランクよりまだわずかに良かった。ｐＨ増加および最終ｐＨ値の速度は、０．５Ｍシステムと比較した時、重炭酸濃度が２．０Ｍに増加される時にわずかに遅くなったのみであった。重炭酸レベルの増加に反応するシステムの逆関係には、多くの原因があり得る。例えば、重炭酸は、炭酸に変換され、したがって、ｐＨをこのような緩衝がないと同じように上昇させないため、重炭酸／炭酸溶液の緩衝能は、システムの濃度が増加すると増加する。さらに、使用されるウシ炭酸脱水酵素の特定の系は、重炭酸脱水反応に対して二酸化炭素水和反応を好む場合があり、反応が進むと、炭酸脱水酵素は、優先的に、新しく形成された炭酸および二酸化炭素を元の重炭酸形態に変換した。最後に、高イオン濃度および高温の組み合わされた作用は、二酸化炭素水和反応における遊離炭酸脱水酵素の活性を減少させることを示しており、同様の結果が重炭酸脱水に対して予測されてもよい。
実施例２Ｃ：反応温度
【０１５４】
非触媒された反応において、重炭酸脱水の速度は、反応混合物の温度が上昇すると増加する。これは、反応混合物を通して蒸気を通過させることにより、反応温度を上昇させ、したがって反応速度を増加し、溶液から産生された二酸化炭素を除去することにより、重炭酸の炭酸への変換において達成された。０．１Ｍ重炭酸溶液において、２０℃および４０℃での、重炭酸の炭酸、ＣＯ２、および水への炭酸脱水酵素触媒された変換における、時間に対するｐＨのグラフを図９に示す。非固定化された酵素システムにおいて、反応速度は、高温のシステムに対して室温のシステムがわずかに速かった。これは、以前に試験された重炭酸濃度の結果と同じように、高温およびイオン濃度の組み合わされた作用が酵素の活性を減少させた結果であってもよい。
実施例２Ｄ：固定化された炭酸脱水酵素
【０１５５】
非触媒された反応混合物と比較した、触媒として固定化された炭酸脱水酵素を使用した重炭酸の脱水における、時間に対するｐＨのグラフを図１０に示す。この実施例の炭酸脱水酵素は、乾燥プロセスの間中、酵素の水和を維持するために、０．５％重量のトリトンＸ界面活性剤を伴う０．５％重量の負荷で、洗浄され粉砕された溶岩支持体（＜１ｃｍ）上の臭化テトラエチルアンモニウム修飾されたナフィオン（登録商標）に被包された。
【０１５６】
固定化された炭酸脱水酵素を以下のように調製した。エタノール（２ｍＬ）を臭化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）修飾されたナフィオン（登録商標）（３０ｍｇ）に添加し、５．０重量％の溶液を作製した。炭酸脱水酵素（５０ｍｇ）を、０．５％の総溶液パーセンテージで０．０２ｍＬのトリトンＸ−１００が添加された、２ｍＬのＴｒｉｚｍａ塩基緩衝溶液（０．０５Ｍ、ｐＨ  ７．６）に添加し、均一な溶解が生じるまで攪拌した。溶液が十分に分散されたら、ＴＥＡＢ修飾されたナフィオン（登録商標）溶液を添加し、溶液が十分に均質になるまで攪拌した。固定化された酵素溶液が十分に混合されたら、高表面積支持体上に成型し、４℃で１２時間、その後、真空下で２時間乾燥させた。代替的に、高表面炭素支持体を固定化された酵素溶液に添加し、混合し、噴霧し、室温で数時間乾燥させた。
【０１５７】
固定化された酵素の活性および性能は、同じ塩濃度および温度での遊離酵素と非常に類似した。さらに、この試料での検査は、非固定化された酵素と比較した、高温（＞５０Ｃ）、高濃度の重炭酸、および作動寿命への曝露を含む。固定化された炭酸脱水酵素を有する同じ充填材料が、実行１および実行２に使用された。性能におけるこの相違は、複数の洗浄と、高炭酸濃度溶液に曝露された後の、固定化された酵素浸出の安定性に起因する場合がある。
実施例３．Ｐｒｉｎｔｅｘ−９５炭素上の炭酸脱水酵素ＴＢＡＢ修飾されたナフィオン（登録商標）の固定化
【０１５８】
ウシ炭酸脱水酵素（７０ｍｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入）をｐＨ８．３緩衝液の１０ｍＬの２０ｍＭトリス−ＳＯ４と混ぜ合わせ、約５秒間、激しくボルテックスした。Ｐｒｉｎｔｅｘ−９５炭素支持体材料（０．５グラム）を酵素溶液と混ぜ合せ、室温で１分間、激しくボルテックスした。臭化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＢ）修飾されたナフィオン（登録商標）（２ｍＬ、１５％ｗ／ｖ）含有９５％エタノール溶液を酵素／支持体懸濁液に添加し、室温で１分間、激しくボルテックスした。酵素／支持体／ナフィオン（登録商標）／修飾因子溶液を、約２０ｐｓｉで、窒素ガスと共に鏡の上にスプレー乾燥させた。得られた固定化された試料を、３０分間、室温で、鏡の上で乾燥させた。乾燥させた固定化された酵素を鏡から剥がし、約４℃で保存した。
【０１５９】
Ｓｉｇｍａ（改訂年月日０７／２２／９６）により発表された炭酸脱水酵素検定を使用して、酵素活性を測定し、計算した。検定は、８．３〜６．３の緩衝された反応混合物のｐＨの減少に必要とされる時間において、非酵素性ブランクと酵素含有試料との間の実速度の相違を決定することにより、酵素性ＣＯ２水和の速度を測定する。この酵素活性検定は、この実施例および全ての後続の実施例に使用された。
【０１６０】
得られたデータは、非酵素反応と比べ、固定化された酵素を使用した反応速度に純増加を示さなかった。調製および固定化された材料の検査に使用された酵素の量は、関与しているならば、明白な速度増加を示すことが予想された。
実施例４：Ｐｒｉｎｔｅｘ−９５炭素上の臭化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）修飾されたナフィオン（登録商標）への炭酸脱水酵素の固定化
【０１６１】
臭化テトラエチルアンモニウムを修飾因子として使用したことを除き、炭酸脱水酵素を実施例３に記載するように固定化した。同じく、速度の純増加は、この固定化された酵素の検定において観察されなかった。調製および固定化された材料の検査に使用された酵素の量は、関与しているならば、明白な速度増加を示すことが予想された。
実施例５：ポリ（スチレン−ｃｏ−ジビニルベンゼン）（ＰＳ−ｃｏＤＶＢ）上のヘキサナール修飾されたキトサンへの炭酸脱水酵素の固定化
【０１６２】
重合体および修飾因子が、それぞれキトサンおよびヘキサナールであったことを除き、前の実施例に記載するように、炭酸脱水酵素を固定化し、酵素／重合体／修飾因子懸濁液をスプレー乾燥させる前に混合した。非酵素対照反応に対するＣＯ２水和の速度に、純増加はなかった。調製および固定化された材料の検査に使用された酵素の量は、関与しているならば、明白な速度増加を示すことが予想された。
実施例６：ＰＳ−ｃｏ−ＤＶＢ上の脱アセチル化キトサン／アセトアルデヒドへの炭酸脱水酵素の固定化
【０１６３】
重合体および修飾因子が脱アセチル化キトサンおよびアセトアルデヒドであったことを除き、前の実施例に記載するように、炭酸脱水酵素を固定化し、スプレー乾燥させた。支持体は、８μｍの大きさの公称粒子のポリ（スチレン−ｃｏ−ジビニルベンゼン）であった。この固定化材料において、純酵素活性は観察されなかった。調製および固定化された材料の検査に使用された酵素の量は、関与しているならば、明白な速度増加を示すことが予想された。
実施例７：Ｐｒｉｎｔｅｘ−９５炭素上のＴＥＡＢ修飾されたナフィオン（登録商標）へのトリトンＸ−１００処理された炭酸脱水酵素の固定化
【０１６４】
ウシ炭酸脱水酵素（７０ｍｇ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入）をｐＨ８．３緩衝液の１０ｍＬの２０ｍＭトリス−ＳＯ４および０．０５０ｍＬのトリトンＸ−１００と混ぜ合わせた。固定化およびスプレー乾燥は、実施例２のように行われた。この工程により固定化されたトリトン処理された酵素は、活性において検査され、固定化された酵素を含有する材料１グラム当り１０７７単位の活性を有した。
実施例８：Ｐｒｉｎｔｅｘ−９５炭素上のＴＥＡＢ修飾されたナフィオン（登録商標）へのデシルアミン修飾された炭酸脱水酵素の固定化
【０１６５】
炭酸脱水酵素（７０ｍｇ）をｐＨ５．０の５ｍＬの７５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、その後、７．８ｍｇのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（４ｍＭ）および２３．８ｍｇのＮ−ヒドロキシスルホコハク酸イミドナトリウム塩（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）（１１ｍＭ）と混ぜ合わせた。溶液を５秒間激しくボルテックスした。第２の溶液をｐＨ５．０の５ｍＬの７５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液で作製し、７．８７ｍｇのデシルアミンと混ぜ合わせた。この溶液をＥＤＣ／酵素溶液と混ぜ合わせ、５秒間、激しくボルテックスした。混合溶液を一晩、冷蔵庫で保持した。次いで、修飾された酵素を１５％（ｗ／ｖ）のＴＥＡＢ修飾されたナフィオン（登録商標）および１グラムのＰｒｉｎｔｅｘ−９５と混合し、上述のようにスプレー乾燥させた。酵素活性検定は、この修飾が、固定化された酵素を含有する材料１グラム当り３７２９単位の活性を有することを示した。
実施例９：Ｐｒｉｎｔｅｘ−９５炭素上の（ＰＥＧ）８修飾された炭酸脱水酵素の固定化
【０１６６】
デシルアミンの代わりに、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得た１１．０ｍｇの（ＰＥＧ）８修飾された炭酸脱水酵素が使用されたことを除き、炭酸脱水酵素（７０ｍｇ）を実施例８に記載するように溶解し、使用した。一晩、冷蔵した後、修飾された酵素調製物をＰｒｉｎｔｅｘ−９５炭素と混ぜ合わせた後、実施例８のようにスプレー乾燥させた。酵素検定は、この固定化された修飾炭酸脱水酵素調製物が、固定化された酵素を含有する材料１グラム当り３４２１単位の活性を有することを示した。
実施例１０：ポリスルホンに固定化された炭酸脱水酵素
【０１６７】
ポリスルホンに炭酸脱水酵素を固定化する時、炭酸脱水酵素を８ｇの１−メチルピロリドンおよび０．０５ｍＬのトリトンＸ−１００に溶解した。ポリスルホン（２ｇ、２０重量％）を溶液に添加し、完全に溶解するまで攪拌した。ポリスルホン／炭酸脱水酵素溶液は、完全な混合が達成されるまで、室温で保持された。溶解されたポリスルホン／炭酸脱水酵素溶液を、次いで、水、アルコール、または水−アルコール溶液に滴下して添加し、図１１に示す重合体ビーズ（試料１Ａ）を形成した。青色ビーズ（試料１Ｂ）は、２００ｍｇの銅フタロシアニンを１０ｍＬの２０重量％ポリスルホン含有１−メチルピロリドン溶液中に混合することにより調製された。次に、溶液を水のビーカーの中に滴下して添加することにより、ビーズを形成した。ビーズを水、アルコール、および炭酸溶液で繰り返し洗浄し、ビーズから残ったあらゆる色素を洗い流す。
【０１６８】
試料１Ｃは、１００ｍｇの炭酸脱水酵素を０．０５ｍＬのトリトンＸ−１００を有する１０ｍＬの１−メチルピロリドンに溶解し、２０重量％ポリスルホン含有１−メチルピロリドンを添加することにより調製された。試料１Ａおよび１Ｂを図１１に写真で示す。酵素活性について、試料１Ｃを検査した。図１２は、ポリスルホンに固定化された炭酸脱水酵素のブランク溶液および遊離酵素含有溶液との比較を示す。固定化された酵素は、活性を示したが、活性は、遊離酵素と同様に高くはなかった。実験は、溶液に５０ｓｃｃｍの二酸化炭素を散布した三環フラスコに０℃で０．５Ｍ炭酸ナトリウムに設置された試料１Ｃのビーズを使用した。約５０分の経過に渡り、温度調節されたｐＨメータを使用して、ｐＨを監視した。各実行は、時間に対して適切なｐＨの比較をするために、ｐＨが１１．０に達した時に開始された。
実施例１１：炭酸脱水酵素固定化されたポリスルホン／アルギン酸塩コアシェル粒状支持体
【０１６９】
２５ｍｇの炭酸脱水酵素を２ｍＬの２重量％アルギン酸塩溶液と混合することにより、炭酸脱水酵素をアルギン酸塩に固定化し、アルギン酸塩ビーズを形成した。この溶液を５０ｍＬの２重量％塩化カルシウム溶液の中に滴下して添加し、少なくとも３０分間攪拌した。次いで、アルギン酸塩に固定化された炭酸脱水酵素を有するビーズを取り出し、ペーパータオルで軽く乾燥させた。次に、ビーズを２０重量％のポリスルホン溶液に手で転がし入れ、薄いポリスルホンフィルム被覆アルギン酸塩ビーズを得る。アルギン酸塩ビーズは、ポリスルホン被覆なしでは、炭酸ナトリウム溶液に溶解する。しかし、薄いポリスルホンのフィルムがビーズを被覆する時、アルギン酸塩は、溶解せず、炭酸脱水酵素は保持される。このプロセスは、基材拡散を有利に調整するように、他の高分子固定化材料にも使用され得る。
【０１７０】
図１３は、ポリスルホンに被包されたアルギン酸塩に固定化された炭酸脱水酵素のブランク溶液との比較を示す。固定化された酵素は、両方の実行の間中、活性を示した。最初の実行は、アルギン酸塩ビーズがポリスルホンで被覆された後、ほぼすぐに行われた。第２の実行は、炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム溶液に一晩浸漬した後、洗浄され、新しい溶液で検査された。得られたデータは、全体的な二酸化炭素に対する拡散制限が作用したことを示唆した。図１３に見られるように、第２の実行が、ブランクと密に対応する一方、最初の実行は、反応の最初の２０分間、ブランクよりも低速度の反応であったが、酵素を含有する両方の実行は、同じｐＨ値で実験を終了した。実験は、溶液に５０ｓｃｃｍの二酸化炭素を散布した三環フラスコ中の０℃の０．５Ｍ炭酸ナトリウムから構成された。約５０分の経過に渡り、温度調節されたｐＨメータを使用して、ｐＨを監視した。各実行は、時間に対して適切なｐＨの比較をするために、ｐＨが１１．０に達した時に開始された。
実施例１２：  修飾されたポリ（塩化ビニルベンジル）に固定化された炭酸脱水酵素
【０１７１】
図１４は、このジアミン架橋されたＰＶＢＣ被包された炭酸脱水酵素の活性が、溶液中の遊離酵素の約５０％であることを示す。図１４に示される試料は、蒸留された、脱イオン水中で２時間激しく攪拌された後に採取され、支持体内に酵素を保持することを実証した。
【０１７２】
最初に、５ｍＬの２０重量％ポリ（塩化ビニルベンジル）含有ジオキサンの溶液を調製した。次いで、８０ｍｇの炭酸脱水酵素を溶液に添加し、均一な溶解になるまで攪拌した。溶液が十分に分散されたら、０．４３５ｍＬのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルジアミノメタンを添加し、溶液が、ビーズを形成するのに十分な粘稠になるまで攪拌した。しかしながら、攪拌は、溶液がゲルになるほど長くなかった。粘稠性が、ホールピペットを使用して容易にピペットするのに十分に低い時に、溶液を水のビーカー中に滴下して添加し、過剰な溶媒を除去するために攪拌した。
実施例１３：アミノ化ポリスルホンの合成
【０１７３】
ポリスルホン（１０ｇ、ＰＳｆ）および４０ｍＬの１，２−ジクロロエタンを３首２５０ｍＬ丸底フラスコに設置し、溶液をテフロン（登録商標）攪拌棒で攪拌し、ポリスルホンを溶解した。均質になったら、２０ｍＬのクロロメチルメチルエーテルおよび２ｇの塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）をフラスコに添加した。温度計、冷却器、３つ目の開口部を塞ぐためのゴム状隔壁をフラスコに装着した。次いで、攪拌しながら反応混合物を４０℃に加熱し、４．５時間、反応させた。次いで、溶液を室温に冷却し、１．２Ｌのメタノール中に沈殿させた。粗クロロメチル化ポリスルホンを収集し、室温で一晩、真空オーブンで乾燥させた。次いで、この重合体を２００ｍＬの１，４−ジオキサンに溶解し、１．２Ｌのメタノール中に再度沈殿させた。次いで、精製されたクロロメチル化ポリスルホン（ＰＳｆ−ＣＨ２Ｃｌ）を収集し、室温で一晩、真空オーブンで乾燥させた。１Ｈ  ＮＭＲの結果は、ポリスルホン骨格のベンゼン環の３３％が、クロロメチル化され、反復単位毎の１．３クロロメチル基の平均に対応することを示した。ガラスバイアル中で、テフロン（登録商標）攪拌棒で攪拌することにより、２０重量％ＰＳｆ−ＣＨ２Ｃｌ含有１，４−ジオキサンの溶液を調製した。
【０１７４】
トリメチルアミンを介したアミノ化。２０重量％ＰＳｆ−ＣＨ２Ｃｌ含有ジオキサン溶液を５００ｍＬの脱イオン水の入ったビーカー中に沈殿させることにより、ＰＳｆ−ＣＨ２Ｃｌのビーズを調製した。次いで、ビーズを脱イオン水中で３０分間、テフロン（登録商標）攪拌棒で攪拌した。次いで、ビーズを収集し、０．０４Ｍトリメチルアミン含有脱イオン水の溶液に２４時間浸漬した。次いで、これらを収集し、脱イオン水で洗浄し、１Ｍ水酸化カリウムまたは重炭酸カリウム水性溶液に２４時間浸漬し、塩化アニオンを水酸化イオンまたは重炭酸イオンのいずれかと交換した。
【０１７５】
三級ジアミンを介したアミノ化。三級窒素に対するクロロメチル基の等モル比（ジアミンに対するクロロメチル基の１：０．５比に等しい）で、三級ジアミン（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルｔ−１，６−ヘキサンジアミン、ＴＭＨＤＡ等）を２０重量％ＰＳｆ−ＣＨ２Ｃｌ含有ジオキサン溶液に添加した。例えば、０．３２ｍＬのＴＭＨＤＡを上述の５ｍＬの２０重量％ＰＳｆ−ＣＨ２Ｃｌ溶液に添加した（反復単位毎に１．３クロロメチル基）。目立ってより粘稠になるまで、混合物を数分間、攪拌した。次いで、この混合物を５００ｍＬの脱イオン水の入ったビーカー中に沈殿させることにより、ビーズを調製した。次いで、ビーズを脱イオン水中で３０分間、テフロン（登録商標）攪拌棒で攪拌した。次いで、これらを収集し、１Ｍ水酸化カリウムまたは重炭酸カリウム水性溶液に２４時間浸漬し、塩化アニオンを水酸化イオンまたは重炭酸イオンのいずれかと交換した。
実施例１４：アミノ化ポリカーボネートの合成
【０１７６】
ポリカーボネート（１０ｇ、ＰＣ）および８０ｍＬの１，２−ジクロロエタンを３首２５０ｍＬ丸底フラスコに設置し、溶液をテフロン（登録商標）攪拌棒で攪拌し、ポリカーボネートを溶解した。均質になったら、２０ｍＬのクロロメチルメチルエーテルおよび２ｇの塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）をフラスコに添加した。温度計、冷却器、３つ目の開口部を塞ぐためのゴム状隔壁をフラスコに装着した。次いで、攪拌しながら反応混合物を４０℃に加熱し、４．５時間、反応させた。次いで、溶液を室温に冷却し、１．２Ｌのメタノール中に沈殿させた。粗クロロメチル化ポリカーボネートを収集し、室温で一晩、真空オーブンで乾燥させた。次いで、この重合体を２００ｍＬの１，４−ジオキサンに溶解し、１．２Ｌのメタノール中に再度沈殿させた。次いで、精製されたクロロメチル化ポリカーボネート（ＰＣ−ＣＨ２Ｃｌ）を収集し、室温で一晩、真空オーブンで乾燥させた。１Ｈ  ＮＭＲの結果は、ポリスルホン骨格のベンゼン環の５％のみが、クロロメチル化され、反復単位毎の０．１クロロメチル基の平均に対応することを示した。ガラスバイアル中で、テフロン（登録商標）攪拌棒で攪拌することにより、２０重量％ＰＣ−ＣＨ２Ｃｌ含有Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）の溶液を調製した。
【０１７７】
トリメチルアミンを介したアミノ化。２０重量％ＰＣ−ＣＨ２Ｃｌ含有ＮＭＰ溶液を５００ｍＬの脱イオン水の入ったビーカー中に沈殿させることにより、ＰＣ−ＣＨ２Ｃｌのビーズを調製した。次いで、ビーズを脱イオン水中で３０分間、テフロン（登録商標）攪拌棒で攪拌した。次いで、ビーズを収集し、０．０４Ｍトリメチルアミン含有脱イオン水の溶液に２４時間浸漬した。次いで、これらを収集し、脱イオン水で洗浄し、１Ｍ水酸化カリウムまたは重炭酸カリウム水性溶液に２４時間浸漬し、塩化アニオンを水酸化イオンまたは重炭酸イオンのいずれかと交換した。
【０１７８】
三級ジアミンを介したアミノ化。三級窒素に対するクロロメチル基の等モル比（ジアミンに対するクロロメチル基の１：０．５比に等しい）で、三級ジアミン（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルｔ−１，６−ヘキサンジアミン、ＴＭＨＤＡ等）を２０重量％ＰＣ−ＣＨ２Ｃｌ含有ＮＭＰ溶液に添加した。例えば、０．０４ｍＬのＴＭＨＤＡを上述の５ｍＬの２０重量％ＰＣ−ＣＨ２Ｃｌ溶液に添加した（反復単位毎に０．１クロロメチル基）。目立ってより粘稠になるまで、混合物を数分間、攪拌した。次いで、この混合物を５００ｍＬの脱イオン水の入ったビーカー中に沈殿させることにより、ビーズを調製した。次いで、ビーズを脱イオン水中で３０分間、テフロン（登録商標）攪拌棒で攪拌した。次いで、これらを収集し、１Ｍ水酸化カリウムまたは重炭酸カリウム水性溶液に２４時間浸漬し、塩化アニオンを水酸化イオンまたは重炭酸イオンのいずれかと交換した。
実施例１５：架橋されたポリ（塩化ビニルベンジル）の合成
【０１７９】
ガラスバイアル中で、テフロン（登録商標）攪拌棒で攪拌することにより、３３重量％ポリ（塩化ビニルベンジル）（ＰＶＢＣ）含有ジオキサンの溶液を調製した。ＰＶＢＣを同時にアミノ化および架橋するために利用される三級ジアミンまたは三級ジアミン混合物の選択は、得られるビーズの化学特性および機械特性に影響を与えるため、最良の性能のために最適化されなければならない。２つの異なるジアミン架橋剤の使用を以下に記載する。
【０１８０】
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−メタンジアミン（ＴＭＭＤＡ）を用いた架橋。ＴＭＭＤＡ（０．７４ｍＬ）を５ｍＬの３３重量％ＰＶＢＣジオキサン溶液（窒素に対するクロロメチル基の等モル比に対応する）に添加した。目立ってより粘稠になるまで、混合物を３分間攪拌した。次いで、この溶液を５００ｍＬの脱イオン水の入ったビーカー中に沈殿させることにより、ビーズを調製した。次いで、ビーズを脱イオン水中で３０分間、テフロン（登録商標）攪拌棒で攪拌した。次いで、これらを収集し、１Ｍ水酸化カリウムまたは重炭酸カリウム水性溶液に２４時間浸漬し、塩化アニオンを水酸化イオンまたは重炭酸イオンのいずれかと交換した。
【０１８１】
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−フェニレンジアミン（ＴＭＰＤＡ）を用いた架橋。ＴＭＰＤＡ（０．８９ｇ）を５ｍＬの３３重量％ＰＶＢＣジオキサン溶液（窒素に対するクロロメチル基の等モル比に対応する）に添加した。目立ってより粘稠になるまで、混合物を１時間攪拌した。ＰＶＢＣのＴＭＰＤＡとの反応は、ＴＭＭＤＡとのその反応より非常に遅かったため、これらの溶液は、ビーズ形成前により長い間攪拌された。次いで、この溶液を５００ｍＬの脱イオン水の入ったビーカー中に沈殿させることにより、ビーズを調製した。次いで、ビーズを脱イオン水中に、３０分間、浸漬した。これらのビーズは、強い攪拌により破砕する恐れがある親水性の高膨潤材料であったため、これらのビーズは、沈殿後に水中で攪拌されなかった。次いで、これらを収集し、１Ｍ水酸化カリウムまたは重炭酸カリウム水性溶液に２４時間浸漬し、塩化アニオンを水酸化イオンまたは重炭酸イオンのいずれかと交換した。
実施例１６：アミノ化されたポリスルホンに固定化された炭酸脱水酵素
【０１８２】
図５は、アミノ化高分子固定化材料に見られた、最良の活性の保持を示す。このアミノ化されたポリスルホン固定化された炭酸脱水酵素の活性は、溶液中の遊離酵素の約７０％である。図５に示される試料は、脱イオン水中で２時間激しく攪拌された後に採取され、固定化材料内に酵素を保持することを実証した。固定化された炭酸脱水酵素粒子を作製するために、５ｍｌの２０重量％クロロメチル化ポリスルホンの溶液をジオキサン中で作製した。次いで、５０ｍｇの炭酸脱水酵素を溶液に添加し、均一な溶解が生じるまで攪拌した。溶液が十分に分散されたら、テトラメチルジアミンを添加し、溶液が、ビーズを形成するのに十分な粘稠になるまで攪拌した。しかしながら、攪拌は、溶液がゲルになるほど長くなかった。粘稠性が、ホールピペットを使用して容易にピペットするのに十分に低い時に、溶液を水のビーカー中に滴下して添加し、過剰な溶媒を除去するために攪拌した。
実施例１７：炭酸脱水酵素を使用したＣＯ２含有アミン溶液の水和
【０１８３】
水、アミン、およびいくつかの場合、酵素を含有する水性溶液は、それを通して起泡された二酸化炭素を有し、捕捉された二酸化炭素の量は、１１（アミン溶液のｐＨ）のｐＨ値を維持するために、溶液に添加された水酸化ナトリウムの量を決定することにより測定された。しかしながら、ＭＤＥＡ検査の１つは、ｐＨ８．４（二酸化炭素を有する溶液を散布することにより調節されたｐＨ）で実施された。二酸化炭素は、球状の散布石を通して、２００ｓｃｃｍの速度で水性溶液に導入された。
【０１８４】
使用された固定化材料は、約３８％重量（ペグ化ＰＳｆ）に対応する０．５の官能性の程度にグラフトされたポリエチレンオキシド（ＰＥＯ；５５０の平均分子量）を有するポリスルホン（ＰＳｆ）骨格であった。以下のプロセスを使用して、炭酸脱水酵素（ウシＣＡ）をペグ化ＰＳｆ球体に固定化した。界面活性剤を有する溶媒中に酵素を溶解した。炭酸脱水酵素をポリスルホンに被包するために、酵素を非活性化しないように溶媒を選択した。重合体を溶液に添加し、完全に溶解するまで攪拌した。完全に混合されるまで、重合体酵素溶液を室温で保持した。次いで、溶解された重合体酵素溶液を水、アルコール、または水−アルコール溶液に滴下して添加し、重合体ビーズを作製した。使用された酵素は、商業的に入手可能なウシ源の哺乳類ＣＡであった。
【０１８５】
これらの試験に使用された一級アミンは、両方のアミン濃度に０．２５ｍｇ／ｍＬ、および１４４ｍＭ  ＭＥＡ溶液に０．５ｍｇ／ｍＬの酵素なし溶液の負荷の酵素溶液、ならびに０．２５ｍｇ／ｍＬ溶液の負荷の固定化された酵素溶液を有する、脱イオン水中１２および１４４ｍＭの濃度で検査されたモノエタノールアミン（ＭＥＡ）であった。検討された三級アルコールアミンは、Ｎ−メチルジエタノールアミン（ＭＤＥＡ）であり、両方のアミン濃度に０．２５ｍｇ／ｍＬの負荷の酵素溶液を有する脱イオン水中１２および１４４ｍＭの濃度で検査された。第２の非アルコール三級アミンであるＮ，Ｎ−ジエチルメチルアミン（ＤＭＡ）は、この試験に含まれ、両方のアミン濃度に０．２５ｍｇ／ｍＬの負荷の酵素溶液を有する脱イオン水中７１および１４４ｍＭの濃度で検査された。溶液の全ては、室温に保たれ、総容量は、５０ｍＬに設定された。
【０１８６】
酵素寄与率は、アミン溶液の酵素溶液を加えたアミンとの比較を通して、アミン寄与率から分離された。アミンおよび酵素の両方の構成要素において捕捉された総二酸化炭素に関して、この試験の結果を図１６に示す。酵素およびアミンの両方で捕捉された二酸化炭素の総量は、ｐＨ１１での全てのシステムにおいて相対的に同じであった。酵素は、１２ｍＭ  ＭＤＥＡおよび１２ｍＭ  ＭＤＥＡ／１２ｍＭ  ＭＥＡ溶液で約２５％の最も大きな寄与率であった。酵素は、ＤＭＡ溶液で総二酸化炭素捕捉の寄与率が最も低かったが、これらの溶液での全体的な二酸化炭素の捕捉は、検査された全てのシステム、および検査された濃度で最も大きく、アミン濃度と無関係のようであった。
【０１８７】
上に挙げられる全ての条件での酵素の比活性を図１７に示す。酵素システムの最も大きな活性は、ＭＥＡとＭＤＥＡの混合溶液、次いで低濃度のＭＤＥＡ溶液で観察された。高濃度の同じアミンと比較した時、酵素は、低濃度アルコールアミン溶液で最も高い比活性を有した。これらの酵素活性がアミンによる基材阻害の結果であるのか、またはアミン塩基が高濃度で二酸化炭素の吸収に競合的であるためなのかは、不明である。
実施例１８：炭酸脱水酵素を使用した溶液からの二酸化炭素の除去
【０１８８】
炭酸脱水酵素は、実施例１７に記載される水性液から二酸化炭素を除去するために使用された。この試験の実験設計および条件は、実施例１７に類似するが、炭酸脱水酵素の基材は、吸収された二酸化炭素であり、固定化された酵素混合物は、高表面積の支持体の粉砕された溶岩（径は約１ｃｍ）上に成型され、フィルムに乾燥させた。
【０１８９】
アミン溶液中の二酸化炭素の反応は、反応温度、アミンの性質（すなわち、一級、二級、または三級アミン）、二酸化炭素の分圧、および反応ｐＨに応じて、カルバミン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、または混合物を産生することができる。基材を産生するために、一定の時間、二酸化炭素ガスをシステムに導入することにより基材を生成し、その後、溶液のｐＨの変化を監視し、二酸化炭素の放出を追うことが、実験を実施する効率的な方式であると決定された。アミン、ＭＥＡおよびＭＤＥＡの濃度は、０．０５Ｍであり、反応は、室温および５０℃で検査され、酵素質量は、２５ｍｇであった。逆反応の産物は、ガラスフリットスパージャを通して、２００ｓｃｃｍの速度で、１０分間、酵素を有する、および酵素なしのアミン溶液に二酸化炭素を導入することにより生成された。アミンの変換が完了し、逆反応の開始ｐＨおよび温度が、各試料（例えば、ブランクアミン溶液、非固定化された酵素を有するアミン溶液、および固定化酵素を有するアミン溶液）で同じであることを検証するために、この反応のｐＨを監視した。二酸化炭素曝露後、溶液のｐＨを監視し、記録しながら、ガラスフリットスパージャを介して、２００ｓｃｃｍの速度で、２０分間、窒素ガスを溶液に導入した。各事例の酵素の相対的活性は、開始点から２０分後の溶液の最終ｐＨまでのｐＨ増加の速度により決定された。ｐＨの増加が速く、最終ｐＨが大きければ、酵素の相対的活性も高い。２０℃および５０℃でのＭＥＡ溶液の結果を、それぞれ図１８および図１９に示す。２０℃で、溶液中の遊離酵素および固定化された酵素の両方は、酵素なしの比較可能な溶液よりも二酸化炭素放出の変換が高かった。固定化された酵素は、遊離酵素より活性が低かったが、おそらく固定化材料からの質量転移作用によるものであろう。５０℃では、遊離酵素とブランク溶液との間に相違はなく、固定化された酵素の性能の減少が観察された。
【０１９０】
２０℃および５０℃でのＭＤＥＡ溶液の結果を、それぞれ図２０および図２１に示す。２０℃で、溶液中の遊離酵素および固定化された酵素の両方は、酵素なしの比較可能な溶液よりも二酸化炭素放出の変換が高かった。溶液のｐＨにおける変更速度は、実験の開始時、溶液中の遊離酵素と比較して、固定化酵素では低かったが、実験の終了時近くでは、両方のシステムのｐＨは、ＭＤＥＡ溶液においてほぼ同じであった。ＭＤＥＡ溶液中の遊離酵素とブランクＭＤＥＡ溶液との間に相違はなく、低量の二酸化炭素が、固定化された酵素を有する試料において放出された。
【０１９１】
反応条件下で、二酸化炭素を有する一級アミンは、カルバミン酸塩を産生するため、炭酸脱水酵素は、基材としてカルバミン酸塩を使用することができないと考えられる。したがって、このシステムにおいて、高温ではなく、低温での酵素システムの改善された性能は、正反応および逆反応の両方において、アルカリ溶液中の二酸化炭素の初期の酵素性の水和および脱水に起因する場合がある。この反応は、低温でアミン反応を支配するようであり、アミン反応は、温度が上昇すると優性になる。
実施例１９：炭酸脱水酵素の熱安定性
【０１９２】
いくつかの炭酸脱水酵素の熱安定性を、二酸化炭素活性を測定することにより試験した。ウシ炭酸脱水酵素ＩＩ（ＢＣＡ  ＩＩ、（精製および未精製）およびヒト炭酸脱水酵素ＩＶ（ＨＣＡ  ＩＶ）の熱安定性を、割り当てられた時間の間、７０℃のオーブンで、０．２ｍｇ／ｍＬ溶液含有脱イオン（ＤＩ）水（総量２５ｍＬ）をインキュベートした後、二酸化炭素活性のｐＨスタット分析を実施するために、等用量の０．４Ｍ  ＮａＨＣＯ３でこれらを希釈することにより決定した。２５ｍＬの脱イオン水がオーブンで７０℃に達するのに１．５時間かかると決定されたため、試料がオーブンに入っていた総時間は、温度設定点に達するまでの長い遅延時間を考慮して調節された。これらの結果を図２２に要約する。この図に見られるように、ＨＣＡ  ＩＶは、７０℃に曝露された３２時間後、その初期の活性のほぼ１００％を保持することにより、高い熱安定性を示した。逆に、ＢＣＡ  ＩＩ（未精製）は、７０℃で、たった１時間後にその活性の全てを失った。ＢＣＡ  ＩＩの精製は、その熱安定を改善したが、精製されたＢＣＡ  ＩＩは、それでもＨＣＡ  ＩＶより熱安定性が低かった。
ＨＣＡ  ＩＶの熱安定性の追加測定は、７０℃に曝露された３２時間後に見られた酵素の凝集により制限された。ＨＣＡ  ＩＶは、ｐＨスタットを介した二酸化炭素活性検査によりまだ活性状態であった酵素の大きな塊に非可逆的に凝集するようであった。
実施例２０：ポリエチレングリコール（ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧ）固定化材料でグラフトされたポリスルホンの合成
【０１９３】
ポリスルホンのクロロメチル化。ポリスルホン（ＰＳｆ、２０ｇ）および２００ｍＬの１，２−ジクロロエタンを２首５００ｍＬ丸底フラスコに設置し、溶液をテフロン（登録商標）攪拌棒で攪拌し、ＰＳｆを溶解した。均質になったら、１５ｍＬのクロロメチルメチルエーテルおよび１．５ｇの塩化亜鉛（ＩＩ）（ＺｎＣｌ２）をフラスコに添加した。温度計および冷却器をフラスコに装着した。次いで、攪拌しながら反応混合物を４０℃に加熱し、一定の時間、反応させた。反応時間は、ＰＳｆのクロロメチル化の程度を決定した。例えば、２．５時間の反応時間は、０．５５の官能の程度（ＤＦ）をもたらし、ＰＳｆ反復単位毎の平均０．５５クロロメチル基を意味する。同様に、２．２５時間、２時間、および１．２５時間の反応時間は、それぞれ、０．５、０．４、および０．２３のＤＦをもたらす。割り当てられた反応時間後、反応混合物を室温に冷却し、２００ｍＬの１，２−ジクロロエタンで希釈し、４．５Ｌのメタノール中に沈殿させた。次いで、濾過を介してクロロメチル化ポリスルホン（ＰＳｆ−ＣＨ２Ｃｌ）を収集し、室温で一晩、真空オーブンで乾燥させた。
【０１９４】
ポリ（エチレングリコール）のクロロメチル化されたポリスルホン上へのグラフト。乾燥したら、クロロメチル化ポリスルホン（ＰＳｆ−ＣＨ２Ｃｌ、１０ｇ）および２５０ｍＬの乾燥１，４−ジオキサン（分子ふるい上で乾燥）を５００ｍＬ丸底フラスコに添加し、溶液をテフロン（登録商標）攪拌棒で攪拌し、ＰＳｆ−ＣＨ２Ｃｌを溶解した。均質になったら、このフラスコをゴム状隔壁で蓋をし、１５分間、窒素でフラッシュした。別の５０ｍＬ丸底フラスコに、５５０Ｄａの分子量の１．５モル過剰（ＰＳｆ−ＣＨ２Ｃｌのクロロメチル基に対して）のポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテル（ＰＥＧ）を添加した。十分に乾燥した１，４−ジオキサンをこのフラスコに添加し、２５容量％のＰＥＧ溶液を作製した。例えば、０．５５のＤＦを有するＰＳｆ−ＣＨ２Ｃｌにおいて、１０．３ｍＬのＰＥＧおよび３１ｍＬの１，４−ジオキサンを添加した。このフラスコをゴム状隔壁で蓋をし、１０分間、窒素でフラッシュした。別の１００ｍＬ丸底フラスコに、１．５モル過剰（ＰＳｆ−ＣＨ２Ｃｌのクロロメチル基に対して）の水素化ナトリウム（ＮａＨ）を添加した。十分に乾燥した１，４−ジオキサンをこのフラスコに添加し、１重量／容量％のＮａＨ溶液を作製した。例えば、０．５５のＤＦを有するＰＳｆ−ＣＨ２Ｃｌにおいて、０．４４ｇのＮａＨおよび４４ｍＬの１，４−ジオキサンを添加した。次いで、このフラスコにテフロン（登録商標）攪拌棒を装着し、ゴム状隔壁で蓋をし、１０分間、窒素でフラッシュした。次いで、攪拌しながら、カニューレを介してＰＥＧ溶液をＮａＨ溶液に滴下して添加した。次いで、針で生成された水素ガスを周期的に抜きながら、この反応混合物を室温で３時間攪拌した。３時間後、攪拌しながら、カニューレを介してＰＥＧ／ＮａＨ溶液をＰＳｆ−ＣＨ２Ｃｌ溶液に滴下して添加した。次いで、この反応混合物を室温で２日間攪拌した。反応が完了した後、濃縮酢酸を使用して反応混合物をｐＨ７に中和した後、４．５Ｌの脱イオン水中に沈殿させた。ＰＥＧ（ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧ）でグラフトされたポリスルホンを、濾過を介して収集し、過剰な脱イオン水で洗い流し、４０℃の真空オーブンで一晩乾燥させた。ＰＳｆ−ｇ−ＣＨ２ＣｌのＤＦは、ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧ中のＰＥＧの最終重量パーセントを決定した。例えば、０．５５のＤＦを有するＰＳｆ−ｇ−ＣＨ２Ｃｌは、４０重量％ＰＥＧを有するＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧをもたらす。同様に、０．５、０．４、および０．２３のＤＦは、それぞれ、３８重量％、３３重量％、および２２重量％のＰＥＧ負荷をもたらす。
実施例２１：ポリスルホン−グラフト−ポリ（エチレングリコール）を使用した炭酸脱水酵素の固定化
【０１９５】
溶媒蒸発法。乾燥ポリスルホン−グラフト−ポリ（エチレングリコール）（ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧ、０．２５ｇ）および３．５ｍＬのジクロロメタンを蓋付きガラスバイアルに添加し、溶液をテフロン（登録商標）攪拌棒で攪拌し、ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧを溶解した。５０ｍＬのビーカーに、約６ｇの多孔質の支持体材料および２５ｍｇのＢＣＡ  ＩＩ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、精製）または１０ｍｇのＨＣＡ  ＩＶ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を添加した。均質化したら、ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧ溶液をビーカーに添加し、攪拌して、多孔質の支持体材料を被覆した。溶媒の全てが蒸発するまで、ビーカーの内容物を続けて攪拌した。次いで、被覆された多孔質の支持体材料を、室温で１５分間、真空オーブンに移し、保管のために０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３に移す前に、残ったあらゆるジクロロメタンを蒸発させる。
【０１９６】
溶媒交換法。乾燥ポリスルホン−グラフト−ポリ（エチレングリコール）（ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧ、０．３３ｇ）、および１．５ｍＬのＮ−メチルピロリドン（または１，４−ジオキサン等の、この重合体も溶解する比較可能な水混和性溶媒）を蓋付きガラスバイアルに添加し、溶液をテフロン（登録商標）攪拌棒で攪拌し、ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧを溶解した。均質化したら、２５ｍｇのＢＣＡ  ＩＩ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、未精製）または１０ｍｇのＨＣＡ  ＩＶ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を添加し、十分に混合した。次いで、ホールピペットを介して溶液を２５０ｍＬの脱イオン水に滴下して添加し、重合体ビーズを形成した。１時間後、保管のため、ビーズを０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３に移した。
実施例２２：固定化されたＢＣＡ  ＩＩ
【０１９７】
ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧ（３３重量％ＰＥＧ、５５０  Ｄａ  ＰＥＧ）に固定化された未精製ＢＣＡ  ＩＩは、７０℃で３３時間後（二晩）、その初期の活性の約５０％を維持した。７０℃で３夜目（さらに１６時間）には、残りの活性の消失をもたらした。逆に、未精製ＢＣＡ  ＩＩなしの溶液は、７０℃で１時間後にその活性を消失した。遊離酵素と比較した、この固定化された試料の熱安定性を図２３に要約する。
【０１９８】
期日の最も長い寿命試験は、図２４に示す、溶岩上のＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧ（２２重量％ＰＥＧ、５５０Ｄａ  ＰＥＧ）に固定化された未精製ＢＣＡ  ＩＩ、ならびに図２５に示す溶岩上のＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧ（３８重量％ＰＥＧ、５５０Ｄａ  ＰＥＧ）に固定化された未精製ＢＣＡ  ＩＩであった。これらの固定化された試料は、それぞれ６０日後、および５６日後での活性を実証している。未精製ＢＣＡ  ＩＩなしの溶液の寿命は、決定されなかった。
実施例２３  固定化されたＨＣＡ  ＩＶ
【０１９９】
ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧも、ＨＣＡ  ＩＶを固定化するために使用された。最も高い熱安定性は、その初期活性の約１００％が、７０℃で、１１３時間（７晩）後、維持された、ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧ（４０重量％ＰＥＧ、５５０Ｄａ  ＰＥＧ）に固定化されたＨＣＡ  ＩＶにおいて見られた。しかしながら、７０℃で８夜目（さらに１６時間）には、残りの活性の消失をもたらした。この固定化された試料の熱安定性を遊離酵素と比較し、図２６に要約する。前述の通り、溶液中の遊離ＨＣＡ  ＩＶの熱安定性の決定は、長期加熱時間後、大きな凝集物の形成により制限された。寿命試験は、ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧ試料に固定化されたＨＣＡ  ＩＶにおいて継続する。例えば、ＰＳｆ−ｇ−ＰＥＧ（４０重量％ＰＥＧ、５５０Ｄａ  ＰＥＧ）に固定化されたＨＣＡ  ＩＶは、図２７に見られる通り、２２日後、顕著な活性を実証した。
実施例２４：ポリ（エチレングリコール）のポリ（メチルヒドロシロキサン）上へのグラフト
【０２００】
ポリ（メチルヒドロシロキサン）（ＰＭＨＳ、ＭＷａｖｇ＝２２５０ｇ／ｍｏｌ、３０ｍＬ）およびアリルオキシ（ポリエチレングリコール）モノメチルエーテル（ＰＥＧ、ＭＷａｖｇ＝５００ｇ／ｍｏｌ、２７ｍＬ）を、テフロン（登録商標）磁気攪拌棒を装着した５００ｍＬ  ２首丸底フラスコに添加した。次いで、攪拌しながら、乾燥トルエン（１５０ｍＬ、分子ふるい上で乾燥）を添加し、溶液を均質化した。フラスコに冷却器およびサーモスタットを装着し、加熱用ジャケットに設置した。攪拌しながら８０℃に加熱する間、フラスコおよび冷却器を窒素でパージした。次いで、０．８ｍＬの１ｍＭ  クロロ白金酸（Ｈ２ＰｔＣｌ６）溶液含有２−プロパノールをガス密封シリンジを介して注入した。さらに５分間、窒素バージした後、パージ針およびガス抜き針を取り除いた。蓄積された圧力を緩和するために、反応混合物を攪拌しながら、かつ周期的にガス抜きしながら、反応混合物をゆっくり１０８℃に加熱した。３日間、攪拌しながら窒素下で、反応を１０８℃で続けた。反応を室温に冷却した後、活性炭上で攪拌することで停止させ、白金触媒を除去した。３０分後、濾過を介して炭を除去した。減圧下でトルエンを除去することにより、ＰＥＧ（ＰＭＨＳ−ｇ−ＰＥＧ）でグラフトされた約５５ｍＬのＰＭＨＳを収集した。この重合体の平均ＰＥＧグラフト密度は、１Ｈ  ＮＭＲにより４．８であると決定され、ＰＭＨＳ鎖当り平均４．８ＰＥＧ鎖を有することを意味する。このグラフト密度は、約５２重量％のＰＥＧ負荷に対応する。ＰＭＨＳ−ｇ−ＰＥＧ重合体におけるＰＥＧ負荷は、反応中に使用されるＰＭＨＳに対するＰＥＧの量を変更することにより調節された。さらなるトルエンが、反応混合物の均質化に必要とされる場合がある。
実施例２５：ポリ（メチルヒドロシロキサン）−グラフト−ポリ（エチレングリコール）を使用したＣＡの固定化：
【０２０１】
ポリ（メチルヒドロシロキサン）−グラフト−ポリ（エチレングリコール）（１ｍＬ、ＰＭＨＳ−ｇ−ＰＥＧ、〜５２重量％ＰＥＧ）、１ｍＬのジシラノール終結ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ−（ＯＨ）２、ＭＷａｖｇ＝４２００ｇ／ｍｏｌ）、および０．１５ｍＬのシラノール−トリメチルシリル修飾されたＱ樹脂（５０重量％溶液含有デカメチルシクロペンタシロキサン溶媒）をガラスバイアルに一緒に混合した。この混合物に、５０ｍｇのＢＣＡ  ＩＩ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、未精製）または３０ｍｇのＨＣＡ  ＩＶ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を添加し、十分に混合した。次いで、脱水素共役作用を介した架橋のために、ジブチルラウリルスズ触媒（７０μＬ）を混入した。ホールピペットを介して、溶液をアクリルの円柱型（深さ１／４インチ、径１／８インチ）に移した。数時間、型を４℃の冷蔵庫に設置し、混合物を架橋させた。固化したら、重合体ペレット（全体的に、〜２５重量％ＰＥＧ）を型から取り出し、脱イオン水中で攪拌し、平衡化した。酵素含有ポリシロキサン片のＰＥＧ含有率は、異なるＰＥＧ重量％のＰＭＨＳ−ｇ−ＰＥＧ重合体を使用することにより変更され得る。ＰＥＧ含有率が増加する場合、いくらかのＰＭＨＳまたは水素化物Ｑ樹脂を添加し、架橋密度（使用されるＰＭＨＳ−ｇ−ＰＥＧの１０〜５０容量％）を改善する。シラノール−トリメチルシリル修飾されたＱ樹脂の量も、使用されるＰＭＨＳ−ｇ−ＰＥＧの１０〜５０容量％の範囲で架橋密度を変更するために調節され得る。
【０２０２】
図２８は、スズ触媒およびジシラノール終結ＰＤＭＳ（ＭＷａｖｇ＝２７５０ｇ／ｍｏｌ）を使用して架橋された、ＰＭＨＳ−ｇ−ＰＥＧ（５０重量％ＰＥＧ）に固定化された未精製ＢＣＡ  ＩＩの寿命試験を要約する。ＰＤＭＳの量は、固定化マトリックスにおける全体的なＰＥＧ含有率が２０重量％であるように添加された。この図は、試料中の％残存活性の５日単純移動平均を示すため、エラーバーは含まれていない。この図から見られるように、平均残存活性は、その寿命の８２日目まで、６０％辺りに完全に定着したままである。
【０２０３】
図２９は、スズ触媒およびジシラノールＰＤＭＳ（ＭＷａｖｇ＝２７５０ｇ／ｍｏｌ）を使用して架橋された、ＰＭＨＳ−ｇ−ＰＥＧ（５０重量％ＰＥＧ）に固定化された未精製ＢＣＡ  ＩＩの熱安定性を示す。ＰＤＭＳの量は、固定化マトリックスにおける全体的なＰＥＧ含有率が２０重量％であるように添加された。この図に見られるように、ＢＣＡ  ＩＩなしの溶液は、７０℃で、たった１時間で全ての活性を消失した一方で、酵素は、７０℃で、３２時間後、その活性の約８０％を維持する。
【０２０４】
本発明またはその好適な実施形態の要素を導入する時、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「ｓａｉｄ」は、要素が１つ以上存在することを意味するものとする。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、排他的ではなく、挙げられる要素以外の追加要素が存在する場合があることを意味するものとする。
【０２０５】
上記を考慮して、本発明のいくつかの目的が達成され、他の有益な結果が獲得されることが理解されるであろう。
【０２０６】
本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更が上記の組成物および使用になされ得るが、上記説明に含まれ、添付の図面に示される全ての事象は、例示的であり、制限的意味として解釈されるものではないことが意図される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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