(57)【要約】本発明は、プロテアーゼ活性を低下させた骨移植片（例えば、骨同種移植片）を特徴とする。これらの骨移植片は、例えば、個体（例えば、ヒト）における骨、歯根膜、靭帯、軟骨または腱の症状を処置するため、安定させるため、予防するため、および／または遅延させるために目的のポリペプチド（例えば、血小板由来成長因子）と併用するとき、有用である。さらに、本発明は、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を測定する方法、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性のレベルを低下させる方法、許容され得るレベルのプロテアーゼ活性を有する骨移植片を選択する方法、ならびに骨移植片および目的のポリペプチドを個体に投与する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のポリペプチドと組み合わせて個体に投与するための骨移植片を選択する方法であって、該方法は、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を測定する工程を包含し、ここで、該骨移植片に関連するプロテアーゼ活性の量が、該骨移植片が該目的のポリペプチドと組み合わせて該個体に投与するために選択されるか否かを決定する、方法。
【請求項２】
前記選択された骨移植片および前記目的のポリペプチドを前記個体に投与する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２つ以上の骨移植片のプロテアーゼ活性が測定され、最も低いプロテアーゼ活性を有する該骨移植片を前記目的のポリペプチドと組み合わせて前記個体に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記選択された骨移植片のプロテアーゼ活性が、約５０トリプシン当量未満である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を測定する工程が：
（ａ）該骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部を該骨移植片から取り出す工程；および
（ｂ）該取り出されたプロテアーゼによって切断されるポリペプチド基質の量を測定することによって、該骨移植片に関連するプロテアーゼ活性の量を決定する工程
を包含する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）が、前記骨移植片およびプロテアーゼを含む溶液のイオン強度を増大させる工程を包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）が、塩溶液中で前記骨移植片とプロテアーゼとをインキュベートする工程を包含する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記塩溶液が、ＮａＣｌ溶液である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記塩溶液が、約０．１５Ｍ  ＮａＣｌと約１．５Ｍ  ＮａＣｌとの間を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記塩溶液が、約０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｂ）が、切断された前記ポリペプチド基質と、切断されていない該ポリペプチド基質と、前記骨移植片とを分離する工程を包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
高速液体クロマトグラフィーを使用することにより、切断された前記ポリペプチド基質と、切断されていない該ポリペプチド基質と、前記骨移植片とを分離する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
サイズ排除クロマトグラフィーを使用することにより、切断された前記ポリペプチド基質と、切断されていない該ポリペプチド基質と、前記骨移植片とを分離する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を測定する工程が、該骨移植片に関連するプロテアーゼ活性によって切断されるポリペプチド基質の量を測定する工程を包含する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
切断されるポリペプチド基質の量を測定する工程が：
（ａ）該ポリペプチド基質を前記骨移植片とともにインキュベートする工程、
（ｂ）切断されたポリペプチド基質の総量の少なくとも一部を該骨移植片から取り出す工程、および
（ｃ）切断されるポリペプチド基質の量を測定する工程
を包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）が、前記骨移植片および前記ポリペプチド基質を含む溶液のイオン強度を増大させる工程を包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｂ）が、前記骨移植片と前記ポリペプチド基質とを塩溶液中でインキュベートする工程を包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記塩溶液が、ＮａＣｌ溶液である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記塩溶液が、約０．１５Ｍと約２．０Ｍ  ＮａＣｌとの間を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記塩溶液が、約０．６Ｍ  ＮａＣｌを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｃ）が、切断された前記ポリペプチド基質と、切断されていない該ポリペプチド基質と、前記骨移植片とを分離する工程を包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
高速液体クロマトグラフィーを使用することにより、切断された前記ポリペプチド基質と、切断されていない該ポリペプチド基質と、前記骨移植片とを分離する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
サイズ排除クロマトグラフィーを使用することにより、切断された前記ポリペプチド基質と、切断されていない該ポリペプチド基質と、前記骨移植片とを分離する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記目的のポリペプチドと前記ポリペプチド基質とが同じである、請求項５〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記目的のポリペプチドと前記ポリペプチド基質とが異なる、請求項５〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記目的のポリペプチドが、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ＰＤＧＦと組み合わせて個体に投与するための骨移植片を選択する方法であって、該方法は、ＰＤＧＦと組み合わせて個体に投与するための、プロテアーゼ活性が約５０トリプシン当量未満の骨移植片を選択する工程を包含する、方法。
【請求項２８】
骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を測定するための方法であって、該方法は：
（ａ）該骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部を該骨移植片から取り出す工程；および
（ｂ）該取り出されたプロテアーゼによって切断されるポリペプチド基質の量を測定することによって、該骨移植片に関連するプロテアーゼ活性の量を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項２９】
工程（ａ）が、前記骨移植片およびプロテアーゼを含む溶液のイオン強度を増大させる工程を包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ａ）が、塩溶液中で前記骨移植片とプロテアーゼとをインキュベートする工程を包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記塩溶液が、ＮａＣｌ溶液である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記塩溶液が、約０．１５Ｍ  ＮａＣｌと約１．５Ｍ  ＮａＣｌとの間を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記塩溶液が、約０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ｂ）が、切断された前記ポリペプチド基質と、切断されていない該ポリペプチド基質と、前記骨移植片とを分離する工程を包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
高速液体クロマトグラフィーを使用することにより、切断された前記ポリペプチド基質と、切断されていない該ポリペプチド基質と、前記骨移植片とを分離する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
サイズ排除クロマトグラフィーを使用することにより、切断された前記ポリペプチド基質と、切断されていない該ポリペプチド基質と、前記骨移植片とを分離する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリペプチド基質が、ＰＤＧＦである、請求項２８〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を測定するための方法であって、該方法は：
（ａ）約０．１５Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌを含む塩溶液中で該骨移植片をインキュベートすることによって、該骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部を該骨移植片から取り出す工程；および
（ｂ）該取り出されたプロテアーゼによって切断されたＰＤＧＦの量を測定することによって、該骨移植片に関連するプロテアーゼ活性の量を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項３９】
骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を測定するための方法であって、該方法は、該骨移植片に関連するプロテアーゼ活性によって切断されるポリペプチド基質の量を測定する工程を包含する、方法。
【請求項４０】
切断されるポリペプチド基質の量を測定する工程が：
（ｉ）該ポリペプチド基質を前記骨移植片とともにインキュベートする工程、
（ｉｉ）切断されたポリペプチド基質の総量の少なくとも一部を該骨移植片から取り出す工程、および
（ｉｉｉ）切断されるポリペプチド基質の量を測定する工程
を包含する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
工程（ｉｉ）が、前記骨移植片および前記ポリペプチド基質を含む溶液のイオン強度を増大させる工程を包含する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
工程（ｉｉ）が、前記骨移植片と前記ポリペプチド基質とを塩溶液中でインキュベートする工程を包含する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記塩溶液が、ＮａＣｌ溶液である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記塩溶液が、約０．１５Ｍと約２．０Ｍ  ＮａＣｌとの間を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記塩溶液が、約０．６Ｍ  ＮａＣｌを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
工程（ｉｉｉ）が、切断された前記ポリペプチド基質と、切断されていない該ポリペプチド基質と、前記骨移植片とを分離する工程を包含する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
高速液体クロマトグラフィーを使用することにより、切断された前記ポリペプチド基質と、切断されていない該ポリペプチド基質と、前記骨移植片とを分離する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
サイズ排除クロマトグラフィーを使用することにより、切断された前記ポリペプチド基質と、切断されていない該ポリペプチド基質と、前記骨移植片とを分離する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記ポリペプチド基質が、ＰＤＧＦである、請求項３９〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を測定するための方法であって、該方法は、
（ｉ）ＰＤＧＦを該骨移植片とともにインキュベートする工程、
（ｉｉ）切断されたＰＤＧＦの総量の少なくとも一部を該骨移植片から取り出す工程、および
（ｉｉｉ）切断されたＰＤＧＦの量を測定する工程
を包含する、方法。
【請求項５１】
骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を低下させるための方法であって、該骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部を該骨移植片から取り出す工程を包含する、方法。
【請求項５２】
前記骨移植片に関連した状態で残存するプロテアーゼの量を測定する工程をさらに包含する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記プロテアーゼを取り出す工程が、前記骨移植片およびプロテアーゼを含む溶液のイオン強度を増大させる工程を包含する、請求項５１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記プロテアーゼを取り出す工程が、塩溶液中で前記骨移植片とプロテアーゼとをインキュベートする工程を包含する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記塩溶液が、ＮａＣｌ溶液である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記塩溶液が、約０．１５Ｍ  ＮａＣｌと約１．５Ｍ  ＮａＣｌとの間を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記塩溶液が、約０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を低下させるための方法であって、約０．１５Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌを含む塩溶液中で該骨移植片をインキュベートすることによって、該骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部を該骨移植片から取り出す工程を包含する、方法。
【請求項５９】
個体を処置するための方法であって、該方法は、骨移植片および目的のポリペプチドを個体に投与する工程を包含し、ここで、該骨移植片は、プロテアーゼ活性のレベルに基づいて選択されている、方法。
【請求項６０】
前記骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部が、該個体に該骨移植片を投与する前に該骨移植片から除去されている、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
２つ以上の骨移植片のプロテアーゼ活性が測定され、最も低いプロテアーゼ活性を有する該骨移植片が、前記目的のポリペプチドと組み合わせて前記個体に投与される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記選択された骨移植片のプロテアーゼ活性が、約５０トリプシン当量未満である、請求項５９〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
許容され得るレベルのプロテアーゼ活性を有する前記骨移植片を選択する工程が：
（ｉ）該骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部を該骨移植片から取り出す工程；および
（ｉｉ）該取り出されたプロテアーゼによって切断されるポリペプチド基質の量を測定することによって、該骨移植片に関連するプロテアーゼ活性の量を決定する工程
を包含する、請求項５９〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
工程（ｉ）が、前記骨移植片およびプロテアーゼを含む溶液のイオン強度を増大させる工程を包含する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
工程（ｉ）が、塩溶液中で前記骨移植片とプロテアーゼとをインキュベートする工程を包含する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記塩溶液が、ＮａＣｌ溶液である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記塩溶液が、約０．１５Ｍ  ＮａＣｌと約１．５Ｍ  ＮａＣｌとの間を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記塩溶液が、約０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
工程（ｉｉ）が、切断された前記ポリペプチド基質と、切断されていない該ポリペプチド基質と、前記骨移植片とを分離する工程を包含する、請求項６３に記載の方法。
【請求項７０】
高速液体クロマトグラフィーを使用することにより、切断された前記ポリペプチド基質と、切断されていない該ポリペプチド基質と、前記骨移植片とを分離する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
サイズ排除クロマトグラフィーを使用することにより、切断された前記ポリペプチド基質と、切断されていない該ポリペプチド基質と、前記骨移植片とを分離する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
許容され得るレベルのプロテアーゼ活性を有する前記骨移植片を選択する工程が、該骨移植片に関連するプロテアーゼ活性によって切断されるポリペプチド基質の量を測定する工程を包含する、請求項５９〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
切断されるポリペプチド基質の量を測定する工程が：
（ｉ）ポリペプチド基質を前記骨移植片とともにインキュベートする工程、
（ｉｉ）切断されたポリペプチド基質の総量の少なくとも一部を該骨移植片から取り出す工程、および
（ｉｉｉ）切断されるポリペプチド基質の量を測定する工程
を包含する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
工程（ｉｉ）が、前記骨移植片および前記ポリペプチド基質を含む溶液のイオン強度を増大させる工程を包含する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
工程（ｉｉ）が、前記骨移植片と前記ポリペプチド基質とを塩溶液中でインキュベートする工程を包含する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記塩溶液が、ＮａＣｌ溶液である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記塩溶液が、約０．１５Ｍと約２．０Ｍ  ＮａＣｌとの間を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記塩溶液が、約０．６Ｍ  ＮａＣｌを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
工程（ｉｉｉ）が、切断された前記ポリペプチド基質と、切断されていない該ポリペプチド基質と、前記骨移植片とを分離する工程を包含する、請求項７３に記載の方法。
【請求項８０】
高速液体クロマトグラフィーを使用することにより、切断された前記ポリペプチド基質と、切断されていない該ポリペプチド基質と、前記骨移植片とを分離する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
サイズ排除クロマトグラフィーを使用することにより、切断された前記ポリペプチド基質と、切断されていない該ポリペプチド基質と、前記骨移植片とを分離する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記目的のポリペプチドと前記ポリペプチド基質とが同じである、請求項６３〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記目的のポリペプチドと前記ポリペプチド基質とが異なる、請求項６３〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記目的のポリペプチドが、ＰＤＧＦである、請求項５９〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
個体を処置するための方法であって、該方法は、骨移植片およびＰＤＧＦを個体に投与する工程を包含し、ここで、該骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０トリプシン当量未満である、方法。
【請求項８６】
個体を処置するための方法であって、該方法は、骨移植片および目的のポリペプチドを個体に投与する工程を包含し、ここで、該骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部が、該骨移植片から除去されている、方法。
【請求項８７】
前記骨移植片に関連した状態で残存するプロテアーゼの量を測定する工程をさらに包含する、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部を除去する工程が、該骨移植片およびプロテアーゼを含む溶液のイオン強度を増大させる工程を包含する、請求項８６〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部を除去する工程が、塩溶液中で該骨移植片とプロテアーゼとをインキュベートする工程を包含する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記塩溶液が、ＮａＣｌ溶液である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記塩溶液が、約０．１５Ｍ  ＮａＣｌと約１．５Ｍ  ＮａＣｌとの間を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記塩溶液が、約０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記目的のポリペプチドが、ＰＤＧＦである、請求項８６〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
個体を処置するための方法であって、該方法は、骨移植片およびＰＤＧＦを個体に投与する工程を包含し、ここで、該骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部が、塩溶液中で該骨移植片をインキュベートすることによって該骨移植片から除去されている、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００８年１２月１９日に出願された米国仮出願第６１／１３９，４４８号、２００９年２月４日に出願された同第６１／１４９，９９８号、および２００９年２月２０日に出願された同第６１／１５４，３１１号（これらの内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
骨移植片（例えば、骨同種移植片）を個体に移植することにより、骨の治癒を促進し、骨を強化し、そして／または骨機能を改善することができる。場合によっては、あるヒトドナー由来の骨が、別のヒトに移植される。例示的なヒト骨同種移植片は、ヒトドナーの死後に単離された骨格の一部である。
【０００３】
１つ以上のポリペプチド（例えば、成長因子）を骨移植片と組み合わせて投与することにより、その骨移植片の有効性が高まることがある。例えば、組換えヒト血小板由来成長因子ＢＢ（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）は、強力な創傷治癒ポリペプチドであり、かつ骨細胞の増殖および動員の刺激物質である。特に、ヒト骨移植片とＰＤＧＦとの組み合わせが、骨折および他の骨損傷の骨の治癒における骨再生のために使用することができる（例えば、２００７年２月９日出願の特許文献１を参照のこと）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００７／０２０７１８５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
骨、歯根膜、靭帯、軟骨または腱の症状、疾患または欠損を処置するため、安定させるため、予防するため、および／または遅延させるために、目的のポリペプチド（例えば、骨の修復、治癒または成長を促進するポリペプチド）と組み合わせて投与するための、改善された骨移植片（例えば、骨同種移植片）が必要とされている。望ましくは、骨移植片は、目的のポリペプチドの生物学的機能および／または構造に対して最小の影響を与えるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の簡単な要旨
１つの局面において、本発明は、目的のポリペプチド（例えば、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ））と組み合わせて個体に投与するための骨移植片（例えば、骨同種移植片）を選択する方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、この方法は、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を測定する工程を包含し、ここで、その骨移植片に関連するプロテアーゼ活性の量が、その骨移植片が目的のポリペプチドと組み合わせてその個体に投与するために選択されるか否かを決定する。いくつかの実施形態において、この方法は、目的のポリペプチドと組み合わせて個体に投与するための、許容され得るレベルのプロテアーゼ活性を有する骨移植片を選択する工程を包含する。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦと組み合わせて個体に投与するための骨移植片を選択する方法は、ＰＤＧＦと組み合わせて個体に投与するための、プロテアーゼ活性が約５０トリプシン当量（ｔｒｙｐｓｉｎ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）未満の骨移植片を選択する工程を包含する（ここで、１トリプシン当量は、ＱｕａｎｔｉＣｌｅａｖｅプロテアーゼアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）において、プロテアーゼ基質、例えば、サクシニル化カゼインを用いたときの１ｎｇのトリプシンと等価なプロテアーゼ活性の量である）。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦと組み合わせて個体に投与するための骨移植片を選択する方法は、ＰＤＧＦと組み合わせて個体に投与するための、プロテアーゼ活性が約５０〜約６５トリプシン当量（例えば、約５０〜約５５、約５５〜約６０または約６０〜約６５トリプシン当量）の骨移植片を選択する工程を包含する。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦと組み合わせて個体に投与するための骨移植片を選択する方法は、ＰＤＧＦと組み合わせて個体に投与するための、プロテアーゼ活性が約５０トリプシン当量未満（例えば、約４５未満、約４０未満（ｌｅｓｓ  ｔｈａｔ）、約３５未満、約３０未満、約２５未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満、約５未満のトリプシン当量、約０トリプシン当量）の骨移植片を選択する工程を包含する。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦと組み合わせて個体に投与するための骨移植片を選択する方法は、ＰＤＧＦと組み合わせて個体に投与するための、プロテアーゼ活性が約５０、５５、６０または６５のいずれかのトリプシン当量の骨移植片を選択する工程を包含する。上記方法のいずれかのいくつかの実施形態において、この方法は、選択された骨移植片および目的のポリペプチドを個体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、２つ以上の骨移植片のプロテアーゼ活性が測定され、最も低いプロテアーゼ活性を有する骨移植片が、目的のポリペプチドと組み合わせて個体に投与される。いくつかの実施形態において、選択された骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０トリプシン当量未満である。いくつかの実施形態において、選択された骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０〜約６５トリプシン当量（例えば、約５０〜約５５、約５５〜約６０または約６０〜約６５トリプシン当量）である。いくつかの実施形態において、選択された骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０、５５、６０または６５のい��れかのトリプシン当量である。いくつかの実施形態において、選択された骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０トリプシン当量未満（例えば、約４５未満、約４０未満、約３５未満、約３０未満、約２５未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満、約５未満のトリプシン当量、約０トリプシン当量）である。
【０００７】
上記方法のいずれかのいくつかの実施形態において、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を測定する工程は、（ａ）その骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部をその骨移植片から取り出す工程；および（ｂ）その取り出されたプロテアーゼによって切断されるポリペプチド基質の量を測定することによって、その骨移植片に関連するプロテアーゼ活性の量を決定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、工程（ａ）は、骨移植片およびプロテアーゼを含む溶液のイオン強度を増大させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、工程（ａ）は、塩溶液中で骨移植片とプロテアーゼとをインキュベートする工程を包含する。いくつかの実施形態において、塩溶液は、ＮａＣｌ溶液である。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．１５Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌまたは約０．３Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、工程（ｂ）は、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とを分離する工程を包含する。いくつかの実施形態において、高速液体クロマトグラフィーを使用することにより、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とが分離される。いくつかの実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーを使用することにより、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とが分離される。いくつかの実施形態において、別の分離方法を用いることにより、切断されたポリペプチド基質、切断されていないポリペプチド基質および／または骨移植片が分離される。他の例示的な分離方法としては、単純な遠心分離、イオン交換クロマトグラフィーおよび電気泳動が挙げられる。
【０００８】
上記方法のいずれかのいくつかの実施形態において、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を測定する工程は、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性によって切断されるポリペプチド基質の量を測定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、切断されるポリペプチド基質の量を測定する工程は、（ａ）そのポリペプチド基質を骨移植片とともにインキュベートする工程、（ｂ）切断されたポリペプチド基質の総量の少なくとも一部を骨移植片から取り出す工程、および（ｃ）切断されるポリペプチド基質の量を測定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、工程（ｂ）は、骨移植片およびポリペプチド基質を含む溶液のイオン強度を増大させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、工程（ｂ）は、骨移植片とポリペプチド基質とを塩溶液中でインキュベートする工程を包含する。いくつかの実施形態において、塩溶液は、ＮａＣｌ溶液である。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．１５Ｍ〜約２．０Ｍ  ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．６Ｍ  ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、工程（ｃ）は、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とを分離する工程を包含する。いくつかの実施形態において、高速液体クロマトグラフィーを使用することにより、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とが分離される。いくつかの実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーを使用することにより、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とが分離される。いくつかの実施形態において、別の分離方法を用いることにより、切断されたポリペプチド基質、切断されていないポリペプチド基質および／または骨移植片が分離される。他の例示的な分離方法としては、単純な遠心分離、イオン交換クロマトグラフィーおよび電気泳動が挙げられる。
【０００９】
上記方法のいずれかのいくつかの実施形態において、目的のポリペプチドとポリペプチド基質とは、同じである。いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドとポリペプチド基質とは、異なる。いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドは、ＰＤＧＦである。いくつかの実施形態において、骨移植片は、その骨移植片に加えられたリン酸カルシウム（例えば、β−リン酸三カルシウム）を含む。いくつかの実施形態において、骨移植片は、その骨移植片に加えられた１つ以上の他の化合物（例えば、グリセリン）を含む。
【００１０】
１つの局面において、本発明は、骨移植片（例えば、骨同種移植片）に関連するプロテアーゼ活性を測定するための方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、この方法は、（ａ）骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部をその骨移植片から取り出す工程；および（ｂ）その取り出されたプロテアーゼによって切断されるポリペプチド基質の量を測定することによって、その骨移植片に関連するプロテアーゼ活性の量を決定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を測定するための方法は、（ａ）約０．１５Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌ（例えば、約０．３Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌ）を含む塩溶液中で骨移植片をインキュベートすることによって、その骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部をその骨移植片から取り出す工程；および（ｂ）その取り出されたプロテアーゼによって切断されたＰＤＧＦの量を測定することによって、その骨移植片に関連するプロテアーゼ活性の量を決定する工程を包含する。上記方法のいずれかのいくつかの実施形態において、工程（ａ）は、骨移植片およびプロテアーゼを含む溶液のイオン強度を増大させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、工程（ａ）は、塩溶液中で骨移植片とプロテアーゼとをインキュベートする工程を包含する。いくつかの実施形態において、塩溶液は、ＮａＣｌ溶液である。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．１５Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌまたは約０．３Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、工程（ｂ）は、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とを分離する工程を包含する。いくつかの実施形態において、高速液体クロマトグラフィーを使用することにより、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とが分離される。いくつかの実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーを使用することにより、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とが分離される。いくつかの実施形態において、別の分離方法を用いることにより、切断されたポリペプチド基質、切断されていないポリペプチド基質および／または骨移植片が分離される。他の例示的な分離方法としては、単純な遠心分離、イオン交換クロマトグラフィーおよび電気泳動が挙げられる。いくつかの実施形態において、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を測定するための方法は、（ｉ）その骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部をその骨移植片から取り出す工程；および（ｉｉ）その骨移植片から取り出された１つ以上のプロテアーゼの量または濃度を測定することによって、その骨移植片に関連するプロテアーゼ活性の量を決定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、ポリペプチド基質は、ＰＤＧＦである。いくつかの実施形態において、骨移植片は、その骨移植片に加えられたリン酸カルシウム（例えば、β−リン酸三カルシウム）を含む。いくつかの実施形態において、骨移���片は、その骨移植片に加えられた１つ以上の他の化合物（例えば、グリセリン）を含む。
【００１１】
上記方法のいずれかのいくつかの実施形態において、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を測定するための方法は、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性によって切断されるポリペプチド基質の量を測定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、切断されるポリペプチド基質の量を測定する工程は、（ｉ）ポリペプチド基質を骨移植片とともにインキュベートする工程、（ｉｉ）切断されたポリペプチド基質の総量の少なくとも一部を骨移植片から取り出す工程、および（ｉｉｉ）切断されるポリペプチド基質の量を測定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を測定するための方法は、（ｉ）ＰＤＧＦを骨移植片とともにインキュベートする工程、（ｉｉ）切断されたＰＤＧＦの総量の少なくとも一部を骨移植片から取り出す工程、および（ｉｉｉ）切断されたＰＤＧＦの量を測定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、工程（ｉｉ）は、骨移植片およびポリペプチド基質を含む溶液のイオン強度を増大させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、工程（ｉｉ）は、骨移植片とポリペプチド基質とを塩溶液中でインキュベートする工程を包含する。いくつかの実施形態において、塩溶液は、ＮａＣｌ溶液である。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．１５Ｍ〜約２．０Ｍ  ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．６Ｍ  ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、工程（ｉｉｉ）は、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とを分離する工程を包含する。いくつかの実施形態において、高速液体クロマトグラフィーを使用することにより、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とが分離される。いくつかの実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーを使用することにより、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とが分離される。いくつかの実施形態において、別の分離方法を用いることにより、切断されたポリペプチド基質、切断されていないポリペプチド基質および／または骨移植片が分離される。他の例示的な分離方法としては、単純な遠心分離、イオン交換クロマトグラフィーおよび電気泳動が挙げられる。いくつかの実施形態において、ポリペプチド基質は、ＰＤＧＦである。いくつかの実施形態において、骨移植片は、その骨移植片に加えられたリン酸カルシウム（例えば、β−リン酸三カルシウム）を含む。いくつかの実施形態において、骨移植片は、その骨移植片に加えられた１つ以上の他の化合物（例えば、グリセリン）を含む。
【００１２】
１つの局面において、本発明は、骨移植片（例えば、骨同種移植片）に関連するプロテアーゼ活性を低下させるための方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、この方法は、その骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部をその骨移植片から除去する工程を包含する。いくつかの実施形態において、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を低下させるための方法は、約０．１５Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌまたは約０．３Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌを含む塩溶液中で骨移植片をインキュベートすることによって、その骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部をその骨移植片から除去する工程を包含する。いくつかの実施形態において、この方法は、骨移植片に関連した状態で残存するプロテアーゼの量を測定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、プロテアーゼを除去する工程は、骨移植片およびプロテアーゼを含む溶液のイオン強度を増大させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、プロテアーゼを除去する工程は、塩溶液中で骨移植片とプロテアーゼとをインキュベートする工程を包含する。いくつかの実施形態において、塩溶液は、ＮａＣｌ溶液である。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．１５Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌまたは約０．３Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、骨移植片は、その骨移植片に加えられたリン酸カルシウム（例えば、β−リン酸三カルシウム）を含む。いくつかの実施形態において、骨移植片は、その骨移植片に加えられた１つ以上の他の化合物（例えば、グリセリン）を含む。いくつかの実施形態において、この方法は、プロテアーゼインヒビターを骨移植片に加える工程を包含する。
【００１３】
１つの局面において、本発明は、骨移植片（例えば、個体における骨、歯根膜、靭帯、軟骨または腱の症状の処置において使用するための骨移植片または骨同種移植片）を調製するための方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、この方法は、骨移植片（例えば、ヒトでの使用に適するようにするための１つ以上の処理工程を経た骨移植片）に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部を除去する工程を包含する改良点を含む。いくつかの実施形態において、プロテアーゼを除去する工程は、骨移植片およびプロテアーゼを含む溶液のイオン強度を増大させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、この方法は、骨移植片（例えば、ヒトでの使用に適するようにするための１つ以上の処理工程を経た骨移植片）およびプロテアーゼを含む溶液のイオン強度を増大させる工程を包含する改良点を含む。いくつかの実施形態において、この方法は、骨移植片（例えば、ヒトでの使用に適するようにするための１つ以上の処理工程を経た骨移植片）を塩溶液で洗浄する工程を包含する改良点を含む。いくつかの実施形態において、この方法は、骨移植片とプロテアーゼとを塩溶液中でインキュベートする工程を包含する。いくつかの実施形態において、塩溶液は、ＮａＣｌ溶液（例えば、約０．１５Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌまたは約０．３Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌ）である。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．３Ｍ  ＮａＣｌである。いくつかの実施形態において、骨移植片は、その骨移植片に加えられたリン酸カルシウム（例えば、β−リン酸三カルシウム）を含む。いくつかの実施形態において、骨移植片は、その骨移植片に加えられた１つ以上の他の化合物（例えば、グリセリン）を含む。いくつかの実施形態において、この方法は、プロテアーゼインヒビターを骨移植片に加える工程を包含する。
【００１４】
１つの局面において、本発明は、個体を処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は、骨移植片（例えば、骨同種移植片）および目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ）を個体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、その骨移植片は、プロテアーゼ活性のレベルに基づいて選択されている。いくつかの実施形態において、この方法は、（ａ）許容され得るレベルのプロテアーゼ活性を有する骨移植片を選択する工程、および（ｂ）その骨移植片および目的のポリペプチドを個体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、この方法は、骨移植片およびＰＤＧＦを個体に投与する工程を包含し、ここで、その骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０トリプシン当量未満である。いくつかの実施形態において、この方法は、骨移植片およびＰＤＧＦを個体に投与する工程を包含し、ここで、その骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０〜約６５トリプシン当量（例えば、約５０〜約５５、約５５〜約６０または約６０〜約６５トリプシン当量）である。いくつかの実施形態において、この方法は、骨移植片およびＰＤＧＦを個体に投与する工程を包含し、ここで、その骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０、５５、６０または６５のいずれかのトリプシン当量である。いくつかの実施形態において、この方法は、骨移植片およびＰＤＧＦを個体に投与する工程を包含し、ここで、その骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０トリプシン当量未満（例えば、約４５未満、約４０未満、約３５未満、約３０未満、約２５未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満、約５未満のトリプシン当量、約０トリプシン当量）である。いくつかの実施形態において、骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部が、その骨移植片を個体に投与する前に骨移植片から除去されている。いくつかの実施形態において、この方法は、工程（ｂ）の前に、骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部をその骨移植片から除去する工程を包含する。いくつかの実施形態において、この方法は、工程（ｂ）の前に、プロテアーゼインヒビターを骨移植片に加える工程を包含する。いくつかの実施形態において、２つ以上の骨移植片のプロテアーゼ活性が測定され、最も低いプロテアーゼ活性を有する骨移植片が、目的のポリペプチドと組み合わせて個体に投与される。いくつかの実施形態において、選択された骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０トリプシン当量未満である。いくつかの実施形態において、選択された骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０〜約６５トリプシン当量（例えば、約５０〜約５５、約５５〜約６０または約６０〜約６５トリプシン当量）である。いくつかの実施形態において、選択された骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０、５５、６０または６５のいずれかのトリプシン当量である。いくつかの実施形態において、選択された骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０トリプシン当量未満（例えば、約４５未満、約４０未満、約３５未満、約３０未満、約２５未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満、約５未満のトリプシン当量、約０トリプシン当量）である。
【００１５】
上記方法のいずれかのいくつかの実施形態において、許容され得るレベルのプロテアーゼ活性を有する骨移植片を選択する工程は、（ｉ）その骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部をその骨移植片から取り出す工程；および（ｉｉ）その取り出されたプロテアーゼによって切断されるポリペプチド基質の量を測定することによって、その骨移植片に関連するプロテアーゼ活性の量を決定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、工程（ｉ）は、骨移植片およびプロテアーゼを含む溶液のイオン強度を増大させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、工程（ｉ）は、塩溶液中で骨移植片とプロテアーゼとをインキュベートする工程を包含する。いくつかの実施形態において、塩溶液は、ＮａＣｌ溶液である。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．１５Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌまたは約０．３Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、工程（ｉｉ）は、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とを分離する工程を包含する。いくつかの実施形態において、高速液体クロマトグラフィーを使用することにより、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とが分離される。いくつかの実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーを使用することにより、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とが分離される。いくつかの実施形態において、別の分離方法を用いることにより、切断されたポリペプチド基質、切断されていないポリペプチド基質および／または骨移植片が分離される。他の例示的な分離方法としては、単純な遠心分離、イオン交換クロマトグラフィーおよび電気泳動が挙げられる。
【００１６】
上記方法のいずれかのいくつかの実施形態において、許容され得るレベルのプロテアーゼ活性を有する骨移植片を選択する工程は、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性によって切断されるポリペプチド基質の量を測定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、切断されるポリペプチド基質の量を測定する工程は、（ｉ）ポリペプチド基質を骨移植片とともにインキュベートする工程、（ｉｉ）切断されたポリペプチド基質の総量の少なくとも一部をその骨移植片から取り出す工程、および（ｉｉｉ）切断されるポリペプチド基質の量を測定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、工程（ｉｉ）は、骨移植片およびポリペプチド基質を含む溶液のイオン強度を増大させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、工程（ｉｉ）は、骨移植片とポリペプチド基質とを塩溶液中でインキュベートする工程を包含する。いくつかの実施形態において、塩溶液は、ＮａＣｌ溶液である。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．１５Ｍ〜約２．０Ｍ  ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．６Ｍ  ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、工程（ｉｉｉ）は、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とを分離する工程を包含する。いくつかの実施形態において、高速液体クロマトグラフィーを使用することにより、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とが分離される。いくつかの実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーを使用することにより、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とが分離される。いくつかの実施形態において、別の分離方法を用いることにより、切断されたポリペプチド基質、切断されていないポリペプチド基質および／または骨移植片が分離される。他の例示的な分離方法としては、単純な遠心分離、イオン交換クロマトグラフィーおよび電気泳動が挙げられる。
【００１７】
上記方法のいずれかのいくつかの実施形態において、目的のポリペプチドとポリペプチド基質とは、同じである。いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドとポリペプチド基質とは、異なる。いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドは、ＰＤＧＦである。いくつかの実施形態において、骨移植片は、その骨移植片に加えられたリン酸カルシウム（例えば、β−リン酸三カルシウム）を含む。いくつかの実施形態において、骨移植片は、その骨移植片に加えられた１つ以上の他の化合物（例えば、グリセリン）を含む。
【００１８】
上記方法のいずれかのいくつかの実施形態において、処置方法は、骨移植片および目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ）を個体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部が、骨移植片から除去されている。いくつかの実施形態において、個体を処置するための方法は、（ａ）骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部をその骨移植片から除去する工程、および（ｂ）その骨移植片および目的のポリペプチドを個体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、この方法は、骨移植片およびＰＤＧＦを個体に投与する工程を包含し、ここで、骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部が、塩溶液（例えば、約０．３Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌを含む塩溶液）中で骨移植片をインキュベートすることによって骨移植片から除去されている。いくつかの実施形態において、プロテアーゼインヒビターが、骨移植片に加えられる。
【００１９】
上記方法のいずれかのいくつかの実施形態において、その方法は、骨移植片に関連した状態で残存するプロテアーゼの量を測定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部を除去する工程は、骨移植片およびプロテアーゼを含む溶液のイオン強度を増大させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部を除去する工程は、塩溶液中で骨移植片とプロテアーゼとをインキュベートする工程を包含する。いくつかの実施形態において、塩溶液は、ＮａＣｌ溶液である。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．１５Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌまたは約０．３Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドは、ＰＤＧＦである。いくつかの実施形態において、骨移植片は、その骨移植片に加えられたリン酸カルシウム（例えば、β−リン酸三カルシウム）を含む。いくつかの実施形態において、骨移植片は、その骨移植片に加えられた１つ以上の他の化合物（例えば、グリセリン）を含む。
【００２０】
１つの局面において、本発明は、薬物として使用するための、本明細書中に記載される任意の骨移植片（例えば、骨同種移植片）を特徴とする。いくつかの実施形態において、本発明は、任意の目的のポリペプチドと併用される、薬物として使用するための、本明細書中に記載される任意の骨移植片を特徴とする。いくつかの実施形態において、本発明は、個体（例えば、骨、歯根膜、靭帯、軟骨または腱の症状を有する個体）を処置する方法において使用するための、任意の目的のポリペプチドと併用される、本明細書中に記載される骨移植片を特徴とする。いくつかの実施形態において、本発明は、個体（例えば、骨、歯根膜、靭帯、軟骨または腱の症状を有する個体）を処置するための薬物などの薬物を製造するための、任意の目的のポリペプチドと併用される、本明細書中に記載される任意の骨移植片の使用を特徴とする。
【００２１】
本発明はまた、骨移植片（例えば、骨同種移植片）および塩（例えば、ＮａＣｌの溶液）を含むかまたはそれらからなる組成物を特徴とする。いくつかの実施形態において、その組成物は、目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ）も含む。いくつかの実施形態において、その組成物は、約０．００００１Ｍ〜約１．５Ｍの塩、約０．０１Ｍ〜約１．５Ｍの塩、約０．０１〜約０．１５Ｍの塩、約０．１５Ｍ〜約１．５Ｍの塩または約０．３Ｍ〜約１．５Ｍの塩を含む。いくつかの実施形態において、その組成物は、約０．００００１Ｍ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌ、約０．０１Ｍ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌ、約０．０１〜約０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、約０．１５Ｍ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌまたは約０．３Ｍ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌを含む。
【００２２】
本発明はまた、本明細書中に記載される方法のいずれかによって生成される組成物（例えば、骨移植片（例えば、骨同種移植片）および塩溶液を含む組成物）を特徴とする。いくつかの実施形態において、その組成物は、目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ）も含む。
【００２３】
本明細書中に記載される様々な実施形態の特性のうちの１つ、いくつかまたはすべてが組み合わされることにより、本発明の他の実施形態が形成され得ることが理解される。本発明のこれらおよび他の局面は、当業者に明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、ＰＤＧＦの結合および骨移植片からの放出を研究するための例示的なプロトコルの要約である。
【図２】図２は、徐々に高くした塩濃度を用いたときの、１時間後および２４時間後の骨移植片からのＰＤＧＦの放出を示しているグラフである。このグラフは、ＰＢＳ溶液（最も左のバー）または１．５Ｍ（最も右のバー）まで徐々に高くした濃度のＮａＣｌ溶液を用いたときに放出された、１時間後または２４時間後のＰＤＧＦの量を示している。
【図３】図３は、ＰＤＧＦが、４０〜６０％の回収率で骨移植片から急速に溶出されること、およびＰＤＧＦの回収率が、混合時間にほとんど依存しないことを示しているグラフである。混合時間は、１０分（左のバー）、６０分（中央のバー）および一晩（右のバー）だったが、塩を加え、１５，３３０×ｇで２分間遠心し、解析のために上清を得ることによる溶出は即時的だった。コントロール実験におけるＰＤＧＦを１００％とした。このグラフは、いくらかのＰＤＧＦが、骨移植片に関連した状態で残存することを示唆している。
【図４Ａ】図４Ａは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用することによる、ヒト骨移植片マトリックスから溶出されたＰＤＧＦの量の定量、ならびにその本来のサイズおよび／または凝集の解析を示しているクロマトグラムである。ＳＥ−ＨＰＬＣは、ＰＤＧＦの本来のサイズおよびその相互作用、ＰＤＧＦの凝集ならびにサンプルの他の成分を示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、示されている異なる分子サイズのタンパク質標準を用いたサイズ排除カラムの較正を示している。
【図４Ｃ】図４Ｃは、異なる濃度のＰＤＧＦを用いたＳＥＣカラムの較正を示しているグラフである。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ＳＥＣプロファイルが温度および放出時間に依存していることを示しているクロマトグラムである。これらのクロマトグラムは、より高温およびより長い放出時間において非特異的なポリペプチドが著しく溶出されたことを示している。ＰＤＧＦの溶出は、試験された条件下で大きく変化しない。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、ＳＥＣプロファイルがサンプル依存的であることを示しているクロマトグラムである。
【図７】図７は、ＱｕａｎｔｉＣｌｅａｖｅＴＭプロテアーゼアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて測定されたプロテアーゼ活性を示しているグラフである。懸濁液中に５０、２５および１２．５ｍｇずつ量り入れたヒト骨移植片０７−０７２０−Ａ（Ａ）、室温で６０分間、０．６６Ｍ  ＮａＣｌとともにインキュベートし、次いで、２０ｍＭ  酢酸ナトリウムで３回洗浄した同じ骨移植片（ＡＷ）、０．６６Ｍ  ＮａＣｌとともに６０分間インキュベートし、次いで、酢酸ナトリウムで洗浄し、５ｍＭのＥＤＴＡの存在下においてプロテアーゼ活性を測定した同じ骨移植片（ＡＷＥ）、室温で６０分間、０．６６Ｍ  ＮａＣｌとともに骨移植片をインキュベートしたものから得られた骨移植片の上清（ＡＷＳ）、同じであるが５ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下でアッセイしたもの（ＡＷＳＥ）。示されたデータは、乾燥骨移植片１ｍｇあたりで正規化された３回の実験の平均値である。
【図８】図８は、異なるロットの骨移植片についてのＰＤＧＦの結合および骨移植片からの放出を研究するための例示的なプロトコルの要約である。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、ヒト骨移植片の年齢／性別がＰＤＧＦの放出に対して統計学的に有意に影響しないことを示している表およびグラフである。
【図１０】図１０は、様々な骨移植片サンプルについて、ＥＬＩＳＡ（左のバー）またはＳＥＣ（右のバー）によって測定されたヒト骨移植片からのＰＤＧＦの回収率を示しているグラフである。この実験に使用されたＰＤＧＦの元の量を、回収されたＰＤＧＦの量に対して１００％に正規化した。
【図１１】図１１は、１０個の異なる骨移植片サンプルについての、ＥＬＩＳＡ（左のバー）またはＳＥＣ（右のバー）による、ヒト骨移植片からのＰＤＧＦの回収率を要約しているグラフである。
【図１２】図１２は、逆相ＨＰＬＣを使用することによる、ＰＤＧＦの量の定量ならびにタンパク分解性切断および／または化学修飾に起因するその化学構造の変化の検出を示しているクロマトグラムである。
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｅは、様々な骨移植片サンプルから放出されたＰＤＧＦ（図１３Ａ〜１３Ｄ）およびＰＤＧＦコントロール（図１３Ｅ）の逆相ＨＰＬＣプロファイルを示しているクロマトグラムである。３つ組のランが示されている。新しいピークのＢＣおよびＣＤは、骨移植片がタンパク分解活性を含んでいる場合のＰＤＧＦのタンパク分解性の切断産物を示している。
【図１３−２】図１３Ａ〜１３Ｅは、様々な骨移植片サンプルから放出されたＰＤＧＦ（図１３Ａ〜１３Ｄ）およびＰＤＧＦコントロール（図１３Ｅ）の逆相ＨＰＬＣプロファイルを示しているクロマトグラムである。３つ組のランが示されている。新しいピークのＢＣおよびＣＤは、骨移植片がタンパク分解活性を含んでいる場合のＰＤＧＦのタンパク分解性の切断産物を示している。
【図１３−３】図１３Ａ〜１３Ｅは、様々な骨移植片サンプルから放出されたＰＤＧＦ（図１３Ａ〜１３Ｄ）およびＰＤＧＦコントロール（図１３Ｅ）の逆相ＨＰＬＣプロファイルを示しているクロマトグラムである。３つ組のランが示されている。新しいピークのＢＣおよびＣＤは、骨移植片がタンパク分解活性を含んでいる場合のＰＤＧＦのタンパク分解性の切断産物を示している。
【図１４Ａ】図１４Ａおよび１４Ｂは、ＰＤＧＦサンプルの全イオン電流（ＴＩＣ）プロファイルおよびＥＳＩ  ＬＣ／ＭＳによるＰＤＧＦ切断産物の同定を示している表である。
【図１４Ｂ】図１４Ａおよび１４Ｂは、ＰＤＧＦサンプルの全イオン電流（ＴＩＣ）プロファイルおよびＥＳＩ  ＬＣ／ＭＳによるＰＤＧＦ切断産物の同定を示している表である。
【図１５】図１５は、ヒト血小板から単離されたＰＤＧＦの例示的なタンパク分解性の切断部位を示しているＰＤＧＦのアミノ酸配列である（Ｈａｒｔら、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＤＧＦ−ＡＢ  ａｎｄ  ＰＤＧＦ−ＢＢ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｌ  ｔｈｒｅｅ  ＰＤＧＦ  ｄｉｍｅｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９：１６６−１７２，１９９０（特に、ＰＤＧＦポリペプチドに関して、その全体が本明細書中で参考として援用される））。図１４に示されているのと同じＰＤＧＦの切断を、タンパク分解活性を含むヒト骨移植片によって誘導した。
【図１６】図１６は、骨移植片からのプロテアーゼ活性の除去を研究するための例示的なプロトコルの要約である。
【図１７−１】図１７Ａ〜１７Ｅは、ヒト骨移植片０７−０７２０−Ａ抽出物（上清）とともに様々な時間にわたってインキュベートされたＰＤＧＦの逆相ＨＰＬＣプロファイルを示しているクロマトグラムである。
【図１７−２】図１７Ａ〜１７Ｅは、ヒト骨移植片０７−０７２０−Ａ抽出物（上清）とともに様々な時間にわたってインキュベートされたＰＤＧＦの逆相ＨＰＬＣプロファイルを示しているクロマトグラムである。
【図１７−３】図１７Ａ〜１７Ｅは、ヒト骨移植片０７−０７２０−Ａ抽出物（上清）とともに様々な時間にわたってインキュベートされたＰＤＧＦの逆相ＨＰＬＣプロファイルを示しているクロマトグラムである。
【図１８】図１８Ａおよび１８Ｂは、ＰＤＧＦのタンパク分解切断の時間依存性を示しているグラフである。
【図１９−１】図１９Ａ〜１９Ｃは、０．３Ｍの塩による溶出の後に固体ヒト骨移植片０７−０７２０−Ａとともに様々な時間にわたってインキュベートされたＰＤＧＦの逆相ＨＰＬＣプロファイルを示しているクロマトグラムである。
【図１９−２】図１９Ａ〜１９Ｃは、０．３Ｍの塩による溶出の後に固体ヒト骨移植片０７−０７２０−Ａとともに様々な時間にわたってインキュベートされたＰＤＧＦの逆相ＨＰＬＣプロファイルを示しているクロマトグラムである。
【図２０】図２０は、滅菌水（左のバー）、滅菌食塩水（中央のバー）または滅菌溶出緩衝液（右のバー）で５分間洗浄した後のＤＭＦＤＢＡからのＰＤＧＦの累積的な放出を示しているグラフである。
【図２１Ａ】図２１Ａは、様々な同種移植片ロットに含まれているタンパク質／ペプチドの分子機能の比較を示している。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、様々な同種移植片ロットに含まれているタンパク質／ペプチドの分子機能の比較を示している。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、様々な同種移植片ロットに含まれているタンパク質／ペプチドの分子機能の比較を示している。
【図２１Ｄ】図２１Ｄは、様々な同種移植片ロットに含まれているタンパク質／ペプチドの分子機能の比較を示している。
【図２２】図２２は、様々な同種移植片ロットの中のいずれか１つの同種移植片の５％またはそれ以上を構成する上位タンパク質の比較を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、骨移植片（例えば、ヒト骨同種移植片）が、ヒトに移植されたときの有害反応を最小限にするために内在性ポリペプチドの量を減少させるように処理された後でさえも残存プロテアーゼ活性を有し得るという驚くべき発見に一部基づいている。特に、ヒト骨移植片に関連する残存プロテアーゼ活性の量が変動することが発見された。そのプロテアーゼ活性が、目的のポリペプチドを切断し得るので（目的のポリペプチドが個体に投与される前または後に）、この残存プロテアーゼ活性は、目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ）と組み合わせて個体に投与される骨移植片にとって望ましくない。目的のポリペプチドが切断されることにより、完全長ポリペプチドと切断型ポリペプチドとの混合物が生成されるので、目的のポリペプチドの構造は多様なものになる。さらに、切断型ポリペプチドのパーセンテージは、経時的に増加し得る。対照的に、目的のポリペプチドの構造が変化することに起因して生じ得る生物学的活性または安定性の変化を最小にするためまたは防ぐために、目的のポリペプチドのより均一な組成物が望ましい。特に、目的のポリペプチドおよび骨移植片を個体（例えば、骨、歯根膜、靭帯、軟骨または腱の症状を有するヒト）に投与する工程を含む治療方法にとっては、骨移植片マトリックスとの相互作用に起因する目的のポリペプチドの構造（例えば、その一次、二次または三次構造）および／または機能の変化を最小にすることが望ましい。
【００２６】
本発明はまた、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を測定する方法を提供する。この測定によって、特定の骨移植片が、目的のポリペプチドとともに個体（例えば、骨、歯根膜、靭帯、軟骨または腱の症状を有するヒト）に投与されるべきか否かの判定が可能になる。さらに、本発明は、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性のレベルを低下させる方法を特徴とする。これらの方法によって、治療に適用するための、許容され得るレベルのプロテアーゼ活性を有する（かまたはプロテアーゼ活性を有しない）骨移植片を生成することができる。
【００２７】
以下の項では、まず、例示的な骨移植片、目的のポリペプチドおよびポリペプチド基質を記載する。次いで、骨移植片を特徴づけるため、および／または望ましい特性を有する骨移植片を選択するための例示的な方法を説明する。次に、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性のレベルを低下させるための方法を記載する。次いで、例示的な処置方法およびキットを開示する。
【００２８】
例示的な骨移植片
例示的な骨移植片としては、骨同種移植片、骨同系移植片、骨自家移植片および骨異種移植片が挙げられる。骨同種移植片には、同じ種の遺伝的に同一でないメンバーに移植され得る、ドナー由来の骨または骨細胞が含まれる。遺伝的に同一のドナー、すなわち、一卵性双生児由来の移植される骨または骨細胞は、同系移植片と呼ばれる。細胞または組織が、同じ個体の１つの部位から別の部位に移植されるとき、その細胞または組織は、自家移植片と呼ばれる。対照的に、別の種からの移植は、異種移植片と呼ばれる。場合によっては、ヒトドナー由来の骨が、別のヒトに移植される。例示的なヒト骨同種移植片は、ヒトドナーの死後に単離された骨格の一部である。その骨移植片は、標準的な方法を用いて、石灰化されてもよいし、部分的または完全に鉱質除去されてもよい（約４％の残留が、通常使用される最大の鉱質除去である）。特定の実施形態において、骨移植片は、鉱質除去されない。特定の実施形態において、骨移植片は、標準的な方法を用いて有機物除去（ｄｅｏｒｇａｎｉｆｉｅｄ）される。特定の実施形態において、骨移植片は、鉱質除去されず、有機物除去される。いくつかの実施形態において、骨移植片は、（ｉ）石灰化された骨と（ｉｉ）部分的または完全に鉱質除去された骨との組み合わせを含む。所望であれば、骨移植片は、標準的な方法を用いて部分的または完全に除タンパクされてもよい（例えば、除タンパクされたウシまたはヒトの骨塊）。例示的な骨移植片としては、鉱質除去されフリーズドライされた骨移植片（ＤＦＤＢＡ）、フリーズドライされた骨移植片（ＦＤＢＡ）、新鮮凍結された骨同種移植片、鉱質除去された粒状の骨マトリックス（ＤＢＭ）または骨塊が挙げられる（例えば、２００７年２月２０日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／８９０，７６３；２００７年２月９日出願のＵ．Ｓ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．２００７／０２０７１８５；２００６年１１月１７日出願のＵ．Ｓ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．２００７／０１２９８０７を参照のこと；これらの各々は、特に骨移植片に関して、それらの全体が本明細書中で参考として援用される）。いくつかの実施形態において、骨移植片は、自己の皮質、海綿状または皮質−海綿状の骨塊である。いくつかの実施形態において、骨移植片は、有機物除去された異種材料、例えば、ＢｉｏＯｓｓ（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．）である。いくつかの実施形態において、骨移植片は、ヒトにおいて使用するための商業的に調製された骨移植片である。いくつかの実施形態において、骨移植片は、ヒトにおいて使用するために適するように処理されている。ヒトにおいて使用するために適する骨移植片を生成する例示的な処理工程としては、バイオバーデンの制御、バイオバーデンの評価、汚染の最小化、厳格な清浄、消毒およびすすぎ、粉砕、フリーズドライ、等分、包装、最後の滅菌、石灰化、鉱質除去、フリーズドライ、無菌的調製、骨塊もしくは骨粒子の形成、または前述のものの２つ以上の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、骨移植片は、Ａｌｌｏｗａｓｈ  ＸＧＴＭ（バイオバーデンの制御、バイオバーデンの評価、汚染の最小化、厳格な清浄、消毒およ��すすぎ）を受ける。様々な実施形態において、骨同種移植片は、粉砕されるかまたは粉砕されず、フリーズドライされるかまたはフリーズドライされず、滅菌されるかまたは単に無菌的に調製される。いくつかの実施形態において、骨移植片は、１つ以上の化学物質（例えば、過酸化水素、洗浄用界面活性剤、例えば、ノンオキシノール（ｎｏｎｏｘｙｎｙｌ）−９またはイソプロピルアルコール（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  ａｌｃｏｌｏｌ）または抗生物質（例えば、ポリミキシンまたはバシトラシン）で処理される。いくつかの実施形態において、骨移植片は、滅菌のために、ガンマ照射またはエチレンオキシドに曝露される。すべての骨移植片が、最後に滅菌されるわけではない。いくつかの実施形態において、骨移植片は、ウイルスおよび／または細菌を除去するように処理される。
【００２９】
いくつかの実施形態において、骨移植片は、目的のポリペプチドの添加前に洗浄される（例えば、水、食塩水または溶出緩衝液中で洗浄される）。例示的な骨移植片は、以下のタイプの骨：上腕骨、尺骨、橈骨、大腿骨、脛骨、腓骨、膝蓋骨、距骨、手首の骨、手根骨、中手骨、指節骨、足根骨、中足骨、肋骨、胸骨、椎骨、肩甲骨、鎖骨、骨盤、仙骨および頭蓋顔面骨の１つ以上に由来する。骨移植片のための例示的なドナーとしては、霊長類（例えば、ヒト、サル、ゴリラ、類人猿、キツネザルなど）、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌおよびネコが挙げられる。
【００３０】
いくつかの実施形態において、骨移植片としては、粒子、混合物、メッシュまたは塊が挙げられる。任意の適切な外形サイズ（例えば、特定サイズの骨の欠損または損傷を処置するために有用な外形サイズ）の骨移植片が、使用され得る。いくつかの実施形態において、骨移植片は、任意の適切なサイズ（例えば、約５０〜約７５０μｍ、約５０〜約５００μｍ、約１２５〜約５００μｍ、約２５０〜約７１０μｍまたは約１２５〜約１０００μｍ）の粒子からなる。いくつかの実施形態において、骨移植片は、約５０μｍ〜約１００ｍｍまたは約０．１ｍｍ〜約１００ｍｍの平均直径を有する骨塊からなる。約１００〜約３５５μｍの粒径を有する骨移植片が、いくつかの適用にとって、望まれるものよりも流動性が低いことがあるので、いくつかの実施形態において、粒子は、約１００μｍ未満（例えば、約５０〜約９０μｍ）または３５５μｍ超（例えば、約３６０〜約１０００μｍ）である。流動性とは、材料が、均一な混合物として、すなわち、粒子と液体とが分離されずに、カニューレまたは小口径の管を通過する能力のことを指す。いくつかの実施形態において、骨移植片からの収量を最大にするために、広いサイズ範囲（例えば、約２５０〜約７１０μｍ）が用いられる。例えば、あるサイズ範囲の粒子を生成する標準的な粉砕装置において、砕かれた皮質骨が加工される。許容可能なサイズの範囲が大きいほど、収量は大きくなる。
【００３１】
特定の実施形態において、骨移植片は、約１：１の比の、フリーズドライされ粉砕された皮質骨と鉱質除去されフリーズドライされ粉砕された皮質骨を含むか、またはそれらからなる。そのようないくつかの実施形態では、外来性リン酸カルシウムを加えない。
【００３２】
多孔性の骨移植片は、いくつかの実施形態によれば、約１μｍ〜約１ｍｍの範囲の直径を有する孔を備え得る。１つの実施形態において、骨移植片は、約１００μｍ〜約１ｍｍの範囲の直径を有するマクロ孔を備える。別の実施形態において、骨移植片は、約１０μｍ〜約１００μｍの範囲の直径を有するメソ孔を備える。さらなる実施形態において、骨移植片は、約１０μｍ未満の直径を有するミクロ孔を備える。本発明の実施形態は、マクロ孔、メソ孔、ミクロ孔またはそれらの任意の組み合わせを備える骨移植片を企図する。多孔性の骨移植片は、１つの実施形態において、約２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０もしくは９５％のいずれかまたはそれらより大きい多孔度を有する骨移植片を含む。いくつかの実施形態において、骨移植片の多孔性の構造のおかげで、細胞（例えば、骨芽細胞）がマトリックスの孔に浸潤することが可能になる。いくつかの実施形態において、骨移植片は、多方向の孔および／または相互接続した孔を有する多孔性の構造を含む。他の実施形態において、骨移植片は、相互接続されていない孔を有する多孔性の構造を含む。いくつかの実施形態において、骨移植片は、相互接続した孔と相互接続されていない孔との混合物を有する多孔性の構造を含む。いくつかの実施形態において、骨移植片は、多孔性であり、骨移植片の質量の約１〜約１５倍の範囲の量の水を吸収することができる。
【００３３】
いくつかの実施形態において、骨移植片は、骨移植片に加えられたリン酸カルシウム（例えば、外来性リン酸カルシウム）を含む。例えば、２００７年２月９日出願のＵ．Ｓ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．２００７／０２０７１８５（特に、リン酸カルシウムに関して、その全体が本明細書中で参考として援用される）に開示されたリン酸カルシウムのいずれかが、使用され得る。骨移植片と組み合わせて使用するのに適したリン酸カルシウムは、本発明のいくつかの実施形態において、約０．５〜約２．０の範囲のカルシウムとリンとの原子比率を有する。骨移植片と組み合わせて使用するのに適したリン酸カルシウムの非限定的な例としては、非晶質リン酸カルシウム、リン酸一カルシウム一水和物（ＭＣＰＭ）、無水リン酸一カルシウム（ＭＣＰＡ）、リン酸二カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）、無水リン酸二カルシウム（ＤＣＰＡ）、リン酸八カルシウム（ＯＣＰ）、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、ヒドロキシアパタイト（ＯＨＡｐ）、不完全結晶性ヒドロキシアパタイト、リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）、十リン酸七カルシウム、メタリン酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム二水和物、炭酸含有（ｃａｒｂｏｎａｔｅｄ）リン酸カルシウムおよびピロリン酸カルシウムが挙げられる。いくつかの実施形態において、マトリックスは、β−ＴＣＰなどの加えられたリン酸カルシウムの重量よりも約１、２、３、４、５または６倍のいずれかだけ重量が重い骨移植片を含む。いくつかの実施形態において、マトリックスは、約８０重量％の骨移植片（例えば、骨同種移植片）および約２０重量％のβ−ＴＣＰなどの別のリン酸カルシウムを含む。いくつかの実施形態において、リン酸カルシウム（例えば、β−ＴＣＰ）は、約４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０もしくは９５％のいずれかまたはそれらより大きい多孔度を有する。
【００３４】
いくつかの実施形態において、生体適合性の結合剤が、骨移植片（例えば、骨移植片単独または骨移植片と外来性リン酸カルシウムとの混合物）に加えられる。例えば、２００７年２月９日出願のＵ．Ｓ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．２００７／０２０７１８５（特に生体適合性の結合剤に関して、その全体が本明細書中で参考として援用される）に開示されている生体適合性の結合剤のいずれかが、使用され得る。いくつかの実施形態において、生体適合性の結合剤には、コラーゲン、エラスチン、多糖、核酸、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリウレタン、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物−ｃｏ−イミド）、ポリ（オルトカーボネート）、ポリ（α−ヒドロキシアルカノエート）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（リン酸エステル）、ポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−炭酸トリメチレン）、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（δ−バレロラクトン）、ポリ（γ−ブチロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアクリル酸、ポリカルボン酸、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリ（塩化ジアリルジメチルアンモニウム）、ポリ（エチレンイミン）、ポリプロピレンフマレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、炭素繊維、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）−ｃｏ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロック共重合体、ポリ（エチレンテレフタレート）ポリアミド、ならびにそれらの共重合体および混合物が含まれ得る。他の実施形態において、生体適合性の結合剤には、アルギン酸、アラビアゴム、グアーゴム、キサンタン（ｘａｎｔｈａｍ）ゴム、ゼラチン、キチン、キトサン、キトサンアセテート、キトサンラクテート、コンドロイチン硫酸、Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサン、デキストラン（例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンまたはデキストラン硫酸ナトリウム）、フィブリン糊、レシチン、ホスファチジルコリン誘導体、グリセロール、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、セルロース（例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロース）、グルコサミン、プロテオグリカン、デンプン（例えば、ヒドロキシエチルデンプンまたは可溶性デンプン）、乳酸（ｌａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、プルロニック酸、グリセロリン酸ナトリウム、グリコーゲン、ケラチン、絹、ならびにそれらの誘導体および混合物が含まれ得る。
【００３５】
いくつかの実施形態において、骨移植片の多孔性の構造のおかげで、約１時間後に（適切なアッセイ（例えば、本明細書中に記載されるＥＬＩＳＡまたはサイズ排除クロマトグラフィーアッセイ）を用いて測定された目的のポリペプチドの量に基づいて）約２０、３０、４０、５０、６０もしくは７０％のいずれかまたはそれらより多い目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ）の放出が可能になる。他の実施形態において、骨移植片の多孔性の構造のおかげで、約８時間後に、約２０、３０、４０、５０、６０もしくは７０％のいずれかまたはそれらより多い目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ）の放出が可能になる。他の実施形態において、骨移植片の多孔性の構造のおかげで、約２４時間後に、約２０、３０、４０、５０、６０もしくは７０％のいずれかまたはそれらより多い目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ）の放出が可能になる。
【００３６】
いくつかの実施形態において、骨移植片は、生体吸収性（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ）である。「生体吸収性」とは、インビボにおいて骨移植片が再吸収されるかまたはリモデリングされる能力のことを指す。再吸収プロセスは、体液、酵素または細胞の作用による元の材料の分解および除去を含む。再吸収された材料は、処置された個体によって、新しい組織を形成する際に使用され得るか、または処置された個体によって別途再利用され得るか、または排泄され得る。いくつかの実施形態において、骨移植片は、インビボ投与の１年以内に再吸収され得る。他の実施形態において、骨移植片は、インビボ投与の１、３、６または９ヶ月以内に再吸収され得る。生体吸収性は：（１）マトリックス材の性質（すなわち、その化学的組成、物理的構造およびサイズ）；（２）マトリックスが留置される体内の位置；（３）使用されるマトリックス材の量；（４）処置される個体の代謝状態（糖尿病／非糖尿病、骨粗鬆症、喫煙者、年齢、ステロイド使用など）；（５）処置される損傷または症状の程度および／もしくはタイプ；および（６）マトリックスのほかに使用される他の材料（例えば、他の骨同化因子、骨異化因子および抗骨異化因子）に依存する。
【００３７】
例示的な目的のポリペプチド
任意の目的のポリペプチドが、本明細書中に記載される骨移植片とともに使用され得る。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーのことを指すために交換可能に使用される。そのポリマーは、直鎖状であっても分枝状であってもよく、改変アミノ酸を含み得、非アミノ酸によって分断され得る。これらの用語は、天然に、または介入によって；例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または他の任意の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）によって改変されたアミノ酸ポリマーのことも包含する。例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）ならびに当該分野で公知の他の改変を含むポリペプチドもまた、この定義の中に含まれる。
【００３８】
いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドは、骨移植片に関連する１つ以上のプロテアーゼによって切断され得るポリペプチドである。所望であれば、目的のポリペプチドが骨移植片に関連する１つ以上のプロテアーゼによって切断される能力は、本明細書中に記載される方法のいずれかを用いて（例えば、目的のポリペプチドを骨移植片とともにインキュベートすること、骨移植片から目的のポリペプチドを分離すること、および切断された目的のポリペプチドの量を測定することによって）測定され得る。望ましくは、本明細書中に記載される方法は、目的のポリペプチドを切断し得る、骨移植片に関連するプロテアーゼの量を減少させる。いくつかの実施形態において、１つより多い目的のポリペプチド（例えば、２、３、４、５つまたはそれ以上の異なるポリペプチド）が、本明細書中に記載される方法、組成物またはキットにおいて使用される。いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドは、骨の修復、治癒または成長を促進する。
【００３９】
いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドは、損傷部位の血小板から天然に放出される成長因子であるＰＤＧＦである。ＰＤＧＦは、ＶＥＧＦと協力して新生血管形成を促進し、また、間葉系由来の細胞（腱細胞（ｔｅｎｏｃｙｔｅｓ）、骨芽細胞、軟骨細胞および血管平滑筋細胞を含む）の走化性および増殖を刺激する。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦホモ二量体およびヘテロ二量体を含み、それらには、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤならびにそれらの混合物および誘導体が含まれる。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ−ＢＢを含む。他の実施形態において、ＰＤＧＦは、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢなどの組換えヒトＰＤＧＦを含む。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦフラグメントを含む。１つの実施形態において、ｒｈＰＤＧＦ−Ｂは、以下のフラグメント：Ｂ鎖全体のうちのアミノ酸配列１〜３１、１〜３２、３３〜１０８、３３〜１０９および／または１〜１０８を含む。ＰＤＧＦのＢ鎖の完全なアミノ酸配列（アミノ酸１〜１０９）は、米国特許第５，５１６，８９６号（特に、ＰＤＧＦポリペプチドに関して、その全体が本明細書中で参考として援用される）の図１５に提供されている。本発明のｒｈＰＤＧＦ組成物は、インタクトなｒｈＰＤＧＦ−Ｂ（アミノ酸１〜１０９）とそれらのフラグメントとの組み合わせを含み得ることが理解されるべきである。米国特許第５，５１６，８９６号に開示されているフラグメントなどのＰＤＧＦの他のフラグメントも使用され得る。いくつかの実施形態によれば、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、インタクトなｒｈＰＤＧＦ−Ｂ（アミノ酸１〜１０９）の約６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％のいずれかまたはそれらより大きいものを含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドは、ＰＤＧＦも切断する、骨移植片に関連する１つ以上のプロテアーゼ（例えば、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼおよびメタロプロテアーゼ）によって切断されるポリペプチドである。例えば、目的のポリペプチドは、ＰＤＧＦについて図１５に示される切断部位の１つ以上：Ｓｅｒ１、Ｌｅｕ５またはＡｒｇ３２の後のペプチド結合の切断部位を有し得る。いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドは、Ｓｅｒ１、Ｌｅｕ５またはＡｒｇ３２を含むＰＤＧＦポリペプチドの２、３、４、５、６、７つまたはそれ以上の連続的なアミノ酸と同一である少なくとも約２、３、４、５、６、７つまたはそれ以上のいずれかの連続的なアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドは、Ｓｅｒ１、Ｌｅｕ５またはＡｒｇ３２を含むＰＤＧＦポリペプチドの連続的なアミノ酸と約８０、８５、９５、９９もしくは１００％またはそれを超えて同一である少なくとも約４、５、６、７つまたはそれ以上のいずれかの連続的なアミノ酸を含む。配列同一性は、例えば、配列解析ソフトウェアを使用し、そこで特定されているデフォルトのパラメータを用いて測定され得る（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７０５）。このソフトウェアプログラムは、様々なアミノ酸の置換、欠失および他の改変に対する相同性の程度を割り当てることによって類似配列と一致させる。
【００４１】
いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドは、天然の起源から得られる。他の実施形態において、目的のポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって作製される。いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドまたはそのフラグメントは、固相ペプチド合成などの当業者に公知のペプチド合成技術を用いて作製され得る。
【００４２】
目的のポリペプチドは、天然の起源から得られるとき、例えば、生体液に由来し得る。生体液は、いくつかの実施形態によれば、血液をはじめとした、生体に関連する、処理されたまたは処理されていない任意の流体を含み得る。生体液は、血小板濃縮物、アフェレーシスされた（ａｐｈｅｒｅｓｅｄ）血小板、血小板リッチ血漿、血漿、血清、新鮮凍結血漿およびバフィーコートをはじめとした血液成分も含み得る。生体液は、血漿から分離され、生理学的流体中に再懸濁された血小板を含み得る。
【００４３】
単一のモノマー（例えば、ＰＤＧＦのＢ鎖またはＡ鎖）をコードするＤＮＡ配列が、組換えＤＮＡ技術によって生成されるとき、そのＤＮＡ配列は、発現のために、原核生物または真核生物の培養細胞に挿入され、それにより続いてホモ二量体（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＡ）が生成される。組換え技術によって生成されたホモ二量体ＰＤＧＦが、いくつかの実施形態において使用され得る。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦのホモ二量体は、操作されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母細胞において産生される。他の実施形態において、ＰＤＧＦヘテロ二量体は、そのヘテロ二量体の両方のモノマー単位をコードするＤＮＡ配列を、原核生物または真核生物の培養細胞に挿入し、それらの細胞によってプロセシングされ翻訳されたモノマー単位がヘテロ二量体（例えば、ＰＤＧＦ−ＡＢ）を生成することによって、作製され得る。商業的に入手可能な目的の組換えポリペプチド（例えば、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ）は、種々の供給源から入手され得る。
【００４４】
いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドは、高度に精製された形態である。「精製されたポリペプチド」は、本明細書中で使用されるとき、本発明の溶液に組み込まれる前に、約９５重量％超または約９５重量％の目的のポリペプチドを有する組成物を含む。その溶液は、任意の薬学的に許容され得る緩衝液または希釈剤を用いて調製され得る。他の実施形態において、目的のポリペプチドは、実質的に精製され得る。「実質的に精製されたポリペプチド」は、本明細書中で使用されるとき、本発明の溶液に組み込まれる前に、約５重量％〜約９５重量％の目的のポリペプチドを有する組成物を含む。１つの実施形態において、実質的に精製されたポリペプチドは、本発明の溶液に組み込まれる前に、約６５重量％〜約９５重量％の目的のポリペプチドを有する組成物を含む。他の実施形態において、実質的に精製された目的のポリペプチドは、本発明の溶液に組み込まれる前に、約７０重量％〜約９５重量％、約７５重量％〜約９５重量％、約８０重量％〜約９５重量％、約８５重量％〜約９５重量％または約９０重量％〜約９５重量％の目的のポリペプチドを有する組成物を含む。精製された目的のポリペプチドおよび実質的に精製された目的のポリペプチドが、骨移植片に組み込まれ得る。
【００４５】
さらなる実施形態において、目的のポリペプチドは、部分的に精製され得る。例示的な部分的に精製されたポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ）は、血小板リッチ血漿、新鮮凍結血漿または目的のポリペプチドを得るために回収および分離を必要とする他の任意の血液製剤の状況における、目的のポリペプチドを有する組成物を含む。本発明の実施形態は、ホモ二量体およびヘテロ二量体を含む本明細書中に提供されるポリペプチドアイソフォームのいずれかが、精製され得るか、または部分的に精製され得ることを企図する。ポリペプチド混合物を含む本発明の組成物は、部分的に精製された部分として、目的のポリペプチドのアイソフォーム、バリアントまたはフラグメントを含み得る。部分的に精製されたＰＤＧＦおよび精製されたＰＤＧＦは、いくつかの実施形態において、２００５年６月２３日出願のＵ．Ｓ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．２００６／００８４６０２（特に、ＰＤＧＦポリペプチドに関して、その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されるように調製され得る。
【００４６】
例示的なポリペプチド基質
プロテアーゼによって切断され得る任意のポリペプチドが、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を測定するためまたは許容され得るレベルのプロテアーゼ活性を有する骨移植片を選択するために、本明細書中に記載される方法のいずれかにおいてポリペプチド基質として使用され得る。例示的なポリペプチド基質としては、本明細書中に記載される目的のポリペプチドのいずれかが挙げられる。いくつかの実施形態において、そのポリペプチド基質は、１つ以上のプロテアーゼ（例えば、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼおよび／またはメタロプロテアーゼ）によって切断されると知られているポリペプチドである。いくつかの実施形態において、そのポリペプチド基質は、商業的に入手可能なポリペプチド（例えば、ＱｕａｎｔｉＣｌｅａｖｅＴＭプロテアーゼアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｅｏｃｋｆｒｄ，ＩＬ）におけるサクシニル化カゼイン、ウシヘモグロビン（ｃａｔ．＃Ｈ２６２５，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ゼラチン（Ｃａｔ．＃Ｇ７７６５，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）または牛乳由来のカゼインフルオレセインイソチオシアネート（ｃａｓｅｉｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｉｏｃｙａｎａｔｅ）Ｉ型（Ｃａｔ．＃Ｃ０４０３，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））である。
【００４７】
骨移植片を特徴づけるためおよび／または選択するための例示的な方法
所望であれば、本明細書中に記載される骨移植片のいずれかを解析することにより、その骨移植片に関連するプロテアーゼ活性（例えば、１つ以上のアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼおよび／またはメタロプロテアーゼの活性）の量を定量すること（例えば、目的のポリペプチドが骨移植片と組み合わせて投与されたときに、どれくらいの目的のポリペプチドが、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性によって切断されるかを予測すること）ができる。１つのそのような局面において、本発明は、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を測定するための方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、その方法は、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性によって切断されたポリペプチド基質（例えば、ＰＤＧＦ）の量を測定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、切断されるポリペプチド基質の量を測定する工程は、（ｉ）そのポリペプチド基質を骨移植片とともにインキュベートする工程、（ｉｉ）切断されたポリペプチド基質の総量の少なくとも一部をその骨移植片から取り出す工程、および（ｉｉｉ）切断されるポリペプチド基質の量を測定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、工程（ｉｉ）は、骨移植片およびポリペプチド基質を含む溶液のイオン強度を増大させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、工程（ｉｉ）は、骨移植片とポリペプチド基質とを塩溶液中でインキュベートする工程を包含する。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．１５Ｍ〜約２．０Ｍ  ＮａＣｌまたは約０．６Ｍ  ＮａＣｌなどのＮａＣｌ溶液である。いくつかの実施形態において、工程（ｉｉｉ）は、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とを分離する工程を包含する。いくつかの実施形態において、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することにより、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とが分離される。いくつかの実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用することにより、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とが分離される。いくつかの実施形態において、ポリペプチド基質は、ＰＤＧＦである。
【００４８】
実施例にさらに記載されるように、ＰＤＧＦまたは別の目的のポリペプチドが骨移植片に結合した後に、そのＰＤＧＦまたは別の目的のポリペプチドを分離する方法を開発した。例えば、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢと骨移植片との混合物を、低イオン強度の緩衝液で洗浄したとき、骨移植片マトリックスに結合していた１０％未満のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが、骨移植片から回収された（骨移植片からその溶液へのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの放出によって）。緩衝液のイオン強度を上げると、骨移植片から放出されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの量は増加した（図２）。塩（例えば、ＮａＣｌ）の至適濃度は、０．６Ｍだったが、約０．１５Ｍ〜約２．０Ｍなどの他の濃度も使用することができる。マトリックスからのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの放出は、これらの条件下においてほぼ即時的だった（図３）。他の一価または二価の塩（例えば、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮａＨＰＯ４など）を用いることにより、骨移植片からｒｈＰＤＧＦまたは別の目的のポリペプチドが放出され得る。所望であれば、ＥＬＩＳＡアッセイを用いることにより、骨移植片から放出されるＰＤＧＦまたは他の目的のポリペプチドの量（例えば、可溶性ポリペプチドの量）を測定することができる。実施例に記載されるＥＬＩＳＡアッセイは、ＰＤＧＦのそのレセプターへの結合を測定することにより、なおもそのレセプターに結合することができるＰＤＧＦの量を測定することが可能である。それらの実施例では、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＨＰＬＣ）法およびＳＥＣ法、例えば、切断されたＰＤＧＦおよび切断されていないＰＤＧＦを骨移植片から分離するために使用され、骨移植片に関連するプロテアーゼによって切断されたＰＤＧＦのパーセンテージを測定することが可能である、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）を記載している。例えば、これらの方法によって、構造の変化（例えば、切断または化学修飾）およびポリペプチド凝集の程度を測定することが可能になった。例えば、ＰＤＧＦが凝集する場合、図５Ｂに示されるように３７℃において、そのサイズは増加し、より早い溶出時間に溶出する。ＲＰＨＰＬＣプロファイルの任意の変化（例えば、新しいピークの出現）は、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの構造の変化の可能性（タンパク分解性の切断もしくはいくつかのアミノ酸残基の化学修飾またはその両方に起因することが最も可能性が高いこと）を示唆する。これらの方法は、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの解析を別途妨げ得る内在性骨移植片ポリペプチドとｒｈＰＤＧＦ−ＢＢとの分離も可能にした。ＳＥＣ法を用いてｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの量を定量するために、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢに対応するピークを積分し、図４Ａ〜４Ｃに示されるような既知濃度のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ標準から計算された検量線を用いることによって、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ濃度を測定した。ＲＰＨＰＬＣ法を用いてｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの量を定量するために、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの構成要素に属するすべてのピーク面積の合計を用いる。実際に、ＲＰＨＰＬＣプロファイルにおける新しいピークの出現によって証明されるように、いくつかの骨移植片は、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢのタンパク分解性の切断を誘導した（図１４Ａ）。新しいピークは、ＲＰＨＰＬＣプロファイルにおいて分離され得るので、ＲＰＨＰＬＣ法は、質量分析（図１４Ｂ）または他の任意の標準的な方法（例えば、ＥｄｍａｎＮ末端配列決定）による新しいポリペプチドピークの同定のために使用され得る。このように、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（図１５）もしくは別の目的のポリペプチドにおける切断部位および／または切断を引き起こすプロテアーゼが、同定され得る。所望であれば、目的のポリペプチドが骨移植片から放出された後に標準的な細胞ベースアッセイ（例えば、目的の成長因子とのインキュベートに応答した細胞増殖を測定するアッセイ）（例えば、細胞ベースのアルカリホスファターゼバイオアッセイ）を用いて、目的のポリペプチドの機能特性を測定することができる。例えば、ＭＧ−６３細胞の成長に対するｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの刺激性の作用を測定するバイオアッセイを使用することができる。
【００４９】
いくつかの実施形態において、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を測定するための方法は、（ａ）その骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部をその骨移植片から取り出す工程；および（ｂ）その取り出されたプロテアーゼによって切断されるポリペプチド基質の量を測定することによって、その骨移植片に関連するプロテアーゼ活性の量を決定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、工程（ａ）は、骨移植片およびプロテアーゼを含む溶液のイオン強度を増大させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、工程（ａ）は、塩溶液中で骨移植片とプロテアーゼとをインキュベートする工程を包含する。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．１５Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌまたは約０．３Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌなどのＮａＣｌ溶液である。いくつかの実施形態において、工程（ｂ）は、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とを分離する工程を包含する。いくつかの実施形態において、ＨＰＬＣまたはＳＥＣを使用することにより、切断されたポリペプチド基質と、切断されていないポリペプチド基質と、骨移植片とが分離される。いくつかの実施形態において、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を測定するための方法は、（ｉ）その骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部をその骨移植片から取り出す工程；および（ｉｉ）骨移植片から取り出された１つ以上のプロテアーゼの量または濃度を測定することにより、その骨移植片に関連するプロテアーゼ活性の量を決定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、ポリペプチド基質は、ＰＤＧＦである。
【００５０】
実施例にさらに記載されるように、プロテアーゼ活性の少なくとも一部を骨移植片から除去する方法を開発した。そのプロテアーゼ活性は、０．３Ｍ  ＮａＣｌを用いるとヒト骨移植片からほぼ完全に溶出されたが、約０．１５Ｍ〜約１．５Ｍなどの他の濃度の塩も使用することができる。基質としてＰＤＧＦを使用し、３７℃においてプロテアーゼ活性をアッセイするための最適時間は、８０分だったが、他のインキュベーション時間および温度も使用することができる。所望であれば、プロテアーゼが骨移植片から除去された後に、標準的なＥｄｍａｎＮ末端配列決定を用いることにより、プロテアーゼを同定することができる。あるいはまたはさらに、プロテアーゼが骨移植片から除去された後、質量分析を使用し、本明細書中に記載される方法などの標準的な方法を用いることにより、プロテアーゼのサイズを決定し、そのプロテアーゼを同定することができる。
【００５１】
１つの局面において、本発明は、目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ）と組み合わせて個体に投与するための骨移植片を選択する方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、この方法は、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を測定する工程を包含し、ここで、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性の量が、骨移植片が目的のポリペプチドと組み合わせてその個体に投与するために選択されるか否かを決定する。いくつかの実施形態において、この方法は、目的のポリペプチドと組み合わせてその個体に投与するための、許容され得るレベルのプロテアーゼ活性を有する骨移植片を選択する工程を包含する。いくつかの実施形態において、２つ以上の骨移植片のプロテアーゼ活性が測定され、最も低いプロテアーゼ活性を有する骨移植片が、目的のポリペプチドと組み合わせて個体に投与される。いくつかの実施形態において、選択された骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０トリプシン当量未満である。いくつかの実施形態において、選択された骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０〜約６５トリプシン当量（例えば、約５０〜約５５、約５５〜約６０または約６０〜約６５トリプシン当量）である。いくつかの実施形態において、選択された骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０、５５、６０または６５のいずれかのトリプシン当量である。いくつかの実施形態において、選択された骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０トリプシン当量未満（例えば、約４５未満、約４０未満、約３５未満、約３０未満、約２５未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満、約５未満のトリプシン当量、約０トリプシン当量）である。いくつかの実施形態において、この方法は、許容され得る量の最初の目的のポリペプチドに結合し、そして／または許容され得るパーセンテージの、骨移植片に結合した目的のポリペプチドを放出する骨移植片を選択する工程も含む。
【００５２】
骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を低下させるための例示的な方法
１つの局面において、本発明は、骨移植片に関連するプロテアーゼ活性を低下させるための方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、この方法は、その骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部をその骨移植片から除去する工程を包含する。いくつかの実施形態において、プロテアーゼを除去する工程は、骨移植片およびプロテアーゼを含む溶液のイオン強度を増大させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、プロテアーゼを除去する工程は、骨移植片とプロテアーゼとを塩溶液（例えば、ＮａＣｌ溶液）中でインキュベートする工程を包含する。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．１５Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌまたは約０．３Ｍ  ＮａＣｌ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、骨移植片に関連した状態で残存するプロテアーゼの量を測定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、骨移植片は、プロテアーゼが除去された後もその骨誘導活性の少なくとも一部を保持する。いくつかの実施形態において、骨移植片は、プロテアーゼが除去された後も骨移植片に関連する内在性ポリペプチド（例えば、ＢＭＰ）の少なくとも一部を保持する。いくつかの実施形態において、次いで、骨移植片は、以下に記載されるように個体に投与される。
【００５３】
いくつかの実施形態において、プロテアーゼインヒビターが、骨移植片に加えられ得る。例えば、骨移植片内の１つ以上のプロテアーゼに特異的なプロテアーゼインヒビター、例えば、カテプシンＧ、マトリクスメタロプロテアーゼ−９および／またはキマーゼに対するプロテアーゼインヒビターが、加えられ得る。
【００５４】
骨移植片を洗浄するための例示的な方法
いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドを加える前に、骨移植片（例えば、ヒト骨同種移植片）が洗浄される（例えば、水、食塩水または溶出緩衝液中で洗浄される）。この洗浄工程は、骨移植片からプロテアーゼ活性の一部を除去することに加えて、またはその代わりに行われるものであり得る。いくつかの実施形態において、この洗浄工程は、骨移植片から酸性残渣を除去する。いくつかの実施形態において、この洗浄工程は、骨移植片が目的のポリペプチドを保持する能力を改善する。
【００５５】
例えば、図２０には、鉱質除去されたヒト骨移植片を水、食塩水または溶出緩衝液中で洗浄することが、骨移植片へのＰＤＧＦの結合にどのように影響するかが要約されている。その傾向は、骨移植片を滅菌水中で５分間洗浄することにより、６０分間の研究の終わりに、ＤＭ骨移植片から放出されたＰＤＧＦの量が減少したことを示唆した。より多くのＰＤＧＦが、食塩水で洗浄した５分後に放出され、溶出緩衝液中での洗浄は、水での洗浄と食塩水での洗浄のほぼ中間だった。
【００５６】
洗浄は、以下のとおり行われた。骨移植片サンプル（約０．１ｇ）を小型のプラスチックチューブに入れ、次いで、そのサンプルに１．０ｍｌの水、食塩水溶液または溶出緩衝液を加えた。その混合物を、時々手で静かに混合しながら室温において５分間静置させた。５分間の終わりに、ピペットを用いて流体を骨移植片材料から取り出し、滅菌されたコットンＱ−ｔｉｐアプリケーターで材料を圧縮することによって残りの流体を除去した。これに続いて、洗浄された骨移植片に０．３ｍｇ／ｍｌ  ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの溶液を加え、６０分間にわたるＥＬＩＳＡによるＰＤＧＦの定量のためにサンプルを取り出した。
【００５７】
例示的な処置方法
別の局面において、本発明は、任意の骨移植片、および本明細書中に記載される１つ以上の目的のポリペプチドを用いて個体を処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、その方法は、骨移植片および目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ）を個体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、その骨移植片は、プロテアーゼ活性のレベルに基づいて選択されたものである。いくつかの実施形態において、骨移植片に関連するプロテアーゼの総量の少なくとも一部が、個体に骨移植片を投与する前にその骨移植片から除去されている。いくつかの実施形態において、２つ以上の骨移植片のプロテアーゼ活性が測定され、そして最も低いプロテアーゼ活性を有する骨移植片が、目的のポリペプチドと組み合わせて個体に投与される。いくつかの実施形態において、選択される骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０トリプシン当量未満である。いくつかの実施形態において、選択される骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０〜約６５トリプシン当量（例えば、約５０〜約５５、約５５〜約６０または約６０〜約６５トリプシン当量）である。いくつかの実施形態において、選択された骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０、５５、６０または６５のいずれかのトリプシン当量である。いくつかの実施形態において、選択される骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０トリプシン当量未満（例えば、約４５未満、約４０未満、約３５未満、約３０未満、約２５未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満、約５未満のトリプシン当量、約０トリプシン当量）である。様々な例において、目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ）の活性は、少なくとも約３０分間、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約１週間にわたって骨移植片と接触した後でも維持され得る。
【００５８】
骨移植片（例えば、ヒト骨同種移植片）およびｒｈＰＤＧＦ−ＢＢから構成される混合物は、骨の処置；骨、歯根膜、靭帯または軟骨の成長の促進；骨の増強；関節固定手技（ａｒｔｈｒｏｄｅｔｉｃ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）；脊柱の処置；骨壊死（ＯＮＪ）または顎放射線骨壊死（ＯＲＮＪ）の処置；腱または回旋筋腱板損傷の処置；または伸延骨形成術のために使用され得る（例えば、２００５年６月２３日出願のＵ．Ｓ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．２００６／００８４６０２；２００７年２月９日出願のＵ．Ｓ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．２００７／０２０７１８５；２００６年１１月１７日出願のＵ．Ｓ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．２００７／０１２９８０７；２００７年１１月５日出願のＰＣＴ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．ＷＯ２００８／０７３６２８；２００８年６月３日出願のＰＣＴ  Ａｐｐ．Ｎｏ．ＷＯＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５６６６；２００８年２月２０日出願のＰＣＴ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．ＷＯ２００８／１０３６９０；２００８年７月２日出願のＵ．Ｓ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．２００８／００２７４７０；２００８年２月７日出願のＵ．Ｓ．Ａｐｐ．Ｎｏ．６１／０２６，９３４を参照のこと；これらの各々は、特に骨の処置；骨、歯根膜、靭帯または軟骨の成長の促進；骨の増強；関節固定手技；脊柱の処置；ＯＮＪまたはＯＲＮＪの処置；腱または回旋筋腱板損傷の処置；または伸延骨形成術に関してそれらの全体が本明細書中で参考として援用される）。ＰＤＧＦに加えて、またはＰＤＧＦに対する代替物として、他の任意の目的のポリペプチドが、骨、歯根膜、靭帯、軟骨または腱の症状を処置するため、安定させるため、予防するためおよび／または遅延させるために、骨移植片とともに投与され得る。したがって、本発明は、骨（例えば、障害のある骨または骨粗鬆症の骨）、橈骨遠位端骨折、椎体、歯根膜、靭帯または軟骨を処置する方法も提供する。さらに、本発明は、骨の増強、関節固定手技、骨壊死または放射線骨壊死の処置、腱または回旋筋腱板損傷の処置および伸延骨形成術の方法を提供する。
【００５９】
１つの実施形態において、骨を処置するための方法は、目的のポリペプチドおよび骨移植片（例えば、骨移植片内に配置された目的のポリペプチド）を含む組成物を提供する工程およびその組成物を骨に適用する工程を包含する。いくつかの実施形態において、その組成物を障害のある骨に適用する工程は、障害のある骨の外形を組成物で覆うようにする工程を包含し得る。例えば、骨折部位を組成物で覆うようにすることによって、骨折によってもたらされた体積を満たすことができる。骨を処置するための方法は、別の実施形態において、目的のポリペプチドおよび骨移植片を含む組成物を提供する工程、その組成物を注射器に入れる工程およびその組成物を障害のある骨の部位に注射する工程を包含する。１つの実施形態において、目的のポリペプチドおよび骨移植片を含む組成物は、骨折によってもたらされた体積に注射され得る。組成物を注射する工程は、いくつかの実施形態において、障害のある骨の部位の周辺の組織またはその部位を覆う組織を注射器で穿通する工程および組成物を障害のある骨の部位に配置する工程を包含し得る。１つの実施形態において、例えば、注射器は、皮膚、および骨折部位を覆う皮膚の下にある組織（例えば、筋肉）を穿通し得、続いて、骨折の部位におよびその周囲に本発明の組成物を配置し得る。そのような実施形態において、処置のために骨折部位を露出させるために使用される侵襲性の手法（例えば、切開術および組織の除去）は、最小限にされ得る。
【００６０】
いくつかの実施形態において、上記組成物が損傷部位に直接適用され、目的のポリペプチドが放出されることにより、骨の治癒が促進される。１つの実施形態において、本発明の組成物は、障害のある骨、損傷した骨、傷ついた骨または骨折した骨に直接適用され得る。別の実施形態において、本発明の組成物は、骨折の安定化を容易にするために使用される器材、例えば、髄内釘、ねじおよび当該分野の通常のスキルを有する医師（例えば、整形外科医）によって使用される他の器材に適用され得る。別の実施形態において、その組成物は、骨における開口部（例えば、剥離（ｅｖｕｌｓｉｏｎ）骨折の部位、ねじ用の穴、髄内釘を受けるための穴または髄管）に適用され得る。
【００６１】
本発明の組成物は、骨折、骨欠損および骨癒着（ｂｏｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ）を含む骨の治癒を促進するために使用される。任意の骨が、本発明の組成物で処置され得、その任意の骨としては、上腕骨、尺骨、橈骨、大腿骨、脛骨、腓骨、膝蓋骨、距骨、手首の骨、手根骨、中手骨、指節骨、足根骨、中足骨、肋骨、胸骨、椎骨、肩甲骨、鎖骨、骨盤、仙骨および頭蓋顔面骨が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、処置される個体は、骨粗鬆症を有する。
【００６２】
本発明は、橈骨、特に橈骨遠位端および関連する手首の解剖学的構造の骨折、傷または損傷を処置するための方法も提供する。本方法は、骨折部位の骨癒合を含む橈骨遠位端骨折における治癒応答を加速させ得る。橈骨遠位端骨折は、本発明の実施形態によれば、橈骨遠位端骨折のＡＯ分類体系によって記載されているような関節内および関節外の骨折を含むすべての骨折タイプを包含する。いくつかの実施形態において、橈骨遠位端骨折は、タイプＡ骨折（関節外）を含む。他の実施形態において、橈骨遠位端骨折は、タイプＢ骨折（部分関節内）を含む。別の実施形態において、橈骨遠位端骨折は、タイプＣ１骨折（完全関節内骨折、単純関節内骨折かつ骨幹端骨折）を含む。さらなる実施形態において、橈骨遠位端骨折は、タイプＣ２骨折（完全関節内骨折、骨幹端複雑骨折を伴う単純関節内骨折）を含む。いくつかの実施形態において、橈骨遠位端骨折は、タイプＣ３骨折（完全関節内骨折、関節複雑骨折かつ骨幹端骨折）を含む。
【００６３】
別の実施形態において、橈骨遠位端骨折を処置するための方法は、目的のポリペプチドおよび骨移植片（例えば、骨移植片内に配置された目的のポリペプチド）を含む組成物を提供する工程およびその組成物を橈骨遠位端における骨折に適用する工程を包含する。いくつかの実施形態において、組成物を適用する工程は、組成物を橈骨遠位端の骨折に注射する工程を包含する。１つの実施形態において、注射工程は、組成物を骨折部位に経皮的に注射する工程を包含する。別の実施形態において、組成物は、橈骨遠位端の開口した骨折部位または外科的に露出された骨折部位に注射される。さらなる実施形態において、適用工程は、スパーテルまたは他のデバイスを用いて骨折部位に組成物を配置する工程を包含する。いくつかの実施形態において、橈骨遠位端骨折を処置するための方法は、骨折を減少させる工程、および／または骨折を安定させる工程をさらに包含する。骨折を減少させる工程は、いくつかの実施形態によれば、観血的整復法を含む。他の実施形態において、骨折を減少させる工程は、非観血的整復法を含む。さらに、橈骨遠位端骨折を安定させる工程は、いくつかの実施形態において、外部または内部の固定化デバイスを骨折部位（例えば、掌側板）に適用する工程を包含する。別の実施形態において、橈骨遠位端骨折を処置するための方法は、骨折部位が新しい骨で満たされるのを加速させる工程を包含し、ここで、加速工程は、目的のポリペプチドおよび骨移植片を含む組成物を提供する工程およびその組成物を骨折部位に適用する工程を包含する。
【００６４】
本発明は、椎体を含む脊柱の構造を処置するために有用な方法を提供する。いくつかの実施形態において、椎体における骨の形成を促進するための方法が提供される。他の実施形態において、脊椎圧迫骨折を予防するためまたはその可能性を低下させるための方法が提供される。別の実施形態において、椎体形成術および椎骨形成術に関連する続発性脊椎圧迫骨折を予防するためまたはその可能性を低下させるための方法が提供される。これらの方法は、骨粗鬆症を有する個体の椎体を処置する際に有用である。いくつかの実施形態において、本発明は、椎体における骨の形成を促進するための方法を提供し、その方法は、目的のポリペプチドおよび骨移植片（例えば、骨移植片内に配置された目的のポリペプチド）を含む組成物を提供する工程およびその組成物を少なくとも１つの椎体に適用する工程を包含する。組成物を少なくとも１つの椎体に適用する工程は、いくつかの実施形態において、組成物を少なくとも１つの椎体に注射する工程を包含する。いくつかの実施形態において、組成物は、複数の椎体に適用され得る。組成物を適用する工程は、いくつかの実施形態において、少なくとも１つの椎体に組成物を注射する工程を包含する。本発明の組成物は、いくつかの実施形態において、椎体の海綿骨に注射される。椎体は、いくつかの実施形態において、胸郭椎体、腰椎椎体またはそれらの組み合わせを含む。椎体は、いくつかの実施形態において、頚椎椎体、尾椎椎体、仙骨またはそれらの組み合わせを含む。
【００６５】
別の局面において、本発明は、続発性脊椎圧迫骨折を含む脊椎圧迫骨折を予防する工程またはその可能性を低下させる工程を包含する方法を提供する。脊椎圧迫骨折を予防する工程またはその可能性を低下させる工程は、本発明の実施形態によれば、骨移植片に目的のポリペプチドを含む組成物を提供する工程およびその組成物を少なくとも１つの椎体に適用する工程を包含する。いくつかの実施形態において、組成物を少なくとも１つの椎体に適用する工程は、組成物を少なくとも１つの椎体に注射する工程を包含する。１つの実施形態において、組成物は、第１椎体の椎体形成術または椎骨形成術の後に、第２椎体、場合によっては隣接する椎体に適用される。いくつかの実施形態において、骨移植片内に配置された目的のポリペプチドを含む組成物は、少なくとも１つの高リスク椎体に適用される。「高リスク椎体」（ＨＶＢ）とは、本明細書中で使用されるとき、Ｔ５〜Ｔ１２ならびにＬ１〜Ｌ４の椎骨の椎体のことを指し、それらは、続発性脊椎圧迫骨折を起こすリスクが最も高い。
【００６６】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、第１椎体の椎体形成術または椎骨形成術の後に第２椎体に適用される。いくつかの実施形態において、第２椎体は、第１椎体に隣接している。他の実施形態において、第２椎体は、第１椎体に隣接していない。さらなる実施形態において、本発明の組成物は、第１椎体の椎体形成術または椎骨形成術の後に第３椎体に適用される。いくつかの実施形態において、第３椎体は、第１椎体に隣接している。他の実施形態において、第３椎体は、第１椎体に隣接していない。本発明の実施形態はさらに、第１椎体の椎体形成術または椎骨形成術の後に、本明細書中に提供される組成物を、高リスク椎体を含む複数の椎体に適用することを企図する。続発性圧迫骨折を含む脊椎圧迫骨折を阻害するための方法が、胸郭椎体、腰椎椎体、頚椎椎体、尾椎椎体および仙骨をはじめとしたすべてのタイプの椎体に適用され得るので、第１椎体、第２椎体および第３椎体は、本明細書中で使用されるとき、脊柱における任意の特定の位置のことを指さないことが理解されるべきである。
【００６７】
本発明はまた、目的のポリペプチドおよび骨移植片（例えば、骨移植片内に配置された目的のポリペプチド）を含む組成物を骨、歯根膜、靭帯または軟骨に適用することによって、哺乳動物における骨、歯根膜、靭帯または軟骨の成長を促進するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、その方法は、骨、歯根膜、靭帯もしくは軟骨の治癒ならびに／またはそのような組織および構造の再生を含む。いくつかの実施形態において、その骨、歯根膜、靭帯または軟骨は、傷ついているかまたは負傷しており、再生または治癒を必要としている。
【００６８】
本発明は、骨増強手技を行う方法も提供する。１つの実施形態において、骨増強手技を行う方法は、目的のポリペプチドおよび骨移植片（例えば、骨移植片内に配置された目的のポリペプチド）を含む組成物を提供する工程およびその組成物を少なくとも１つの所望の骨増強部位に適用する工程を包含する。いくつかの実施形態において、骨増強手技を行う方法は、上顎骨または下顎骨における少なくとも１つの骨増強部位に組成物を適用する工程を包含する。いくつかの実施形態において、組成物は、上顎骨または下顎骨における所望の骨増強部位に詰め込まれる。別の実施形態において、目的のポリペプチドは、目的のポリペプチドおよび骨移植片を含む組成物を移植部位に留置する前および必要に応じてその後に、その移植部位に適用される。上顎骨または下顎骨における骨の沈着を増大させることによって、後にインプラントを受けるために歯槽突起が増強され得る。そのようなインプラントは、歯または他の歯科用デバイスのための支持として、ならびに様々な口腔および顎顔面への適用のため（抜歯窩、上顎洞底挙上術（ｓｉｎｕｓ  ｅｌｅｖａｔｉｏｎ）および歯槽堤増大術（ｒｉｄｇｅ  ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を含む）をはじめとした種々の目的のために使用され得る。
【００６９】
本発明は、関節固定手技を行う方法も提供する。１つの実施形態において、関節固定手技を行う方法は、目的のポリペプチドおよび骨移植片（例えば、骨移植片内に配置された目的のポリペプチド）を含む組成物を提供する工程およびその組成物を関節内の所望の骨癒着部位に適用する工程を包含する。いくつかの実施形態において、関節固定手技を行う方法は、複数の関節内の所望の骨癒着部位にその組成物を適用する工程を包含する。いくつかの実施形態において、その組成物は、関節内の所望の骨癒着部位に詰め込まれる。いくつかの実施形態において、その組成物は、組成物が関節内の癒着される骨の表面積全体と接触するように詰め込まれ得る。その組成物は、癒着された関節をさらに強化するために骨癒着部位の近傍にさらに適用され得る。いくつかの実施形態において、関節固定手技を行う方法は、さらに、関節を整列させる工程および少なくとも１つの固定化デバイス（例えば、ねじ）をその関節の少なくとも１つの骨に挿入する工程を包含する。いくつかの実施形態において、複数のねじが、関節の少なくとも１つの骨に挿入される。別の実施形態において、本発明の方法は、関節固定手技において骨癒合を加速させる工程を包含し、ここで、骨癒合を加速させる工程は、目的のポリペプチドおよび骨移植片（例えば、骨移植片内に配置された目的のポリペプチド）を含む組成物を提供する工程およびその組成物を関節内の少なくとも１つの骨癒着部位に適用する工程を包含する。
【００７０】
任意の関節内の骨が、本発明の組成物および方法を用いて癒着され得る。そのような関節としては、足、足指、足首、膝、臀部、脊椎、肋骨、胸骨、鎖骨、関節、肩、肩甲骨、肘、手首、手、手指、顎および頭蓋の関節が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、付属器官または脊椎の骨格における関節固定術に対して任意の所望の部位に適用され得ることが理解されるべきである。本発明の１つの実施形態において、関節固定手技には、距骨下関節固定術、距舟関節固定術、三関節固定術および足首関節固定術をはじめとした足および足首の関節固定術が含まれる。
【００７１】
本発明はまた、ＯＮＪまたはＯＲＮＪを処置するため、予防するため、またはその進行を遅延させるための方法も提供する。組成物は、任意の適切な手段によって投与され得る。１つの実施形態において、目的のポリペプチドおよび骨移植片（例えば、骨移植片内に配置された目的のポリペプチド）を含む組成物の投与は、所望の部位に直接組成物を適用することによって行われ得る。別の実施形態において、目的のポリペプチドおよび骨移植片（例えば、骨移植片内に配置された目的のポリペプチド）を含む組成物の投与は、所望の部位に直接組成物を適用することによって行われ得る。そのような部位としては、上顎骨、下顎骨、および胞巣構造を含むそれらの付属器（ａｄｎｅｘｉａ）、ならびにＯＮＪまたはＯＲＮＪに罹患した他の任意の骨または軟部組織が挙げられるが、これらに限定されない。下顎骨において、後臼歯豊隆より前の部位が、所望の部位を構成し得る。例えば、手術野が、ＯＮＪまたはＯＲＮＪを有する患者の上顎骨または下顎骨において開口しており、壊死部位が、創面切除され、調えられているとき、組成物は、注射器による送達によって、針またはカニューレによって、スパーテル、鉗子、匙もしくは他の許容され得る手段を用いて直接適用することによって、適用され得る。他の実施形態において、ＯＮＪまたはＯＲＮＪになりやすいと予測される部位が同定されるとき、その部位は、外科的に露出されて組成物が適用され得るか、または下顎骨もしくは上顎骨における部位を外科的に露出させずに、注射器および針による注射によって、皮膚を通過して所望の部位の近傍に組成物が適用され得る。他の実施形態において、組成物は、直接的な経皮的投与によって所望の部位に適用され得る。
【００７２】
いくつかの実施形態において、組成物は、歯科的手技と同時的に、または歯科的手技の直後に投与される。例えば、歯科外科手技を受けるリスクのある患者および抜歯などの歯科外科手技を受けている患者は、１つの実施形態において、ポリペプチド含有組成物を、例えば、抜歯薬物または包帯剤とともに同時投与される。なおも別の例は、口腔歯科（ｏｒｏ−ｄｅｎｔａｌ）嚢胞切除術であり、ここで、ポリペプチド含有組成物が、嚢胞腔に適用される。なおも別の例としては、歯周組織の手技が挙げられ、ここで、歯肉組織が切開され、歯槽および／または根間の骨・口腔外科術（ｉｎｔｅｒ−ｒａｄｉｃｕｌａｒ  ｏｓｓｅｏ−ｄｅｎｔａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ）が行われ、ポリペプチド含有組成物が、歯周組織治療包帯剤と同時に投与される。
【００７３】
いくつかの実施形態において、投与される組成物の量は、例えば、抜歯窩から、嚢胞切除術（ｃｙｓｔｒｅｃｔｏｍｙ）または歯周の骨の外科術によって外科的に取り出された骨の体積によって決定される。いくつかの実施形態において、組成物を用いたＯＲＮＪまたはＯＮＪの予防的処置の場合、歯周靭帯の厚さのＸ線検査による測定が、診断上の判定基準と考えられ得る。
【００７４】
本発明は、腱を骨に付着させるためまたは再付着させるため、骨への腱の付着を強化するため、ならびに腱（例えば、裂傷、層間剥離または他の任意の挫傷もしくは変形を示している腱）を処置するための方法も提供する。１つの実施形態において、腱を骨に再付着させるための方法は、生体適合性マトリックスに配置されたＰＤＧＦ溶液を含む組成物を提供する工程およびその組成物を骨の少なくとも１つの腱再付着部位に適用する工程を包含する。別の実施形態において、骨への腱の付着を強化する方法は、生体適合性マトリックスに配置されたＰＤＧＦ溶液を含む組成物を提供する工程およびその組成物を少なくとも１つの骨への腱付着部位に適用する工程を包含する。骨への腱付着を強化する方法は、いくつかの実施形態において、骨からの腱の剥離（例えば、回旋筋腱板損傷における剥離）の予防または阻害を補助する。
【００７５】
本発明は、回旋筋腱板裂傷を処置する方法も提供する。１つの実施形態において、回旋筋腱板裂傷を処置するための方法は、目的のポリペプチドおよび骨移植片（例えば、骨移植片内に配置された目的のポリペプチド）を含む組成物を提供する工程およびその組成物を、上腕頭における少なくとも１つの腱再付着部位に適用する工程を包含する。いくつかの実施形態において、組成物を少なくとも１つの腱再付着部位に適用する工程は、上腕頭における再付着部位の外形を組成物で覆うようにする工程を包含し得る。例えば、剥離した腱を受けるために上腕頭の表面に形成された通路を組成物で覆うようにされ得る。組成物は、付着をさらに強化するために、骨への腱の挿入部位の近傍に適用され得る。
【００７６】
いくつかの実施形態において、回旋筋腱板裂傷を処置するための方法は、少なくとも１つの固着手段（例えば、上腕頭に骨アンカー）を配置する工程（ここで、骨アンカーは、目的のポリペプチド（例えば、骨移植片内に配置された目的のポリペプチド）をさらに含む）および少なくとも１つの剥離した腱を骨アンカーと結合する工程をさらに包含する。本発明の実施形態において、腱は、縫合糸によって骨アンカーに固定され得る。縫合糸は、目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ）の溶液に浸漬されてもよいし、使用前にポリペプチド−組成物でコーティングされてもよい。
【００７７】
別の実施形態において、腱を処置する方法は、目的のポリペプチドおよび骨移植片（例えば、骨移植片内に配置された目的のポリペプチド）を含む組成物を提供する工程およびその組成物を少なくとも１つの腱の表面に適用する工程を包含する。いくつかの実施形態において、その少なくとも１つの腱は、損傷した腱または傷害を受けた腱（例えば、裂傷、層間剥離または他の任意の変形を示す腱）である。
【００７８】
いくつかの実施形態において、骨形成を刺激するためおよび／または加速させるための方法は、目的のポリペプチドおよび骨移植片（例えば、骨移植片内に配置された目的のポリペプチド）を含む組成物を提供する工程および有効量の組成物を少なくとも１つの骨延展部位に適用する工程を包含する。いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドおよび骨移植片（例えば、骨移植片内に配置された目的のポリペプチド）を含む組成物は、骨延展術中に適用される。他の実施形態において、組成物は、骨延展術後に適用される。１つの実施形態において、有効量の組成物は、骨延展術中および骨延展術後に適用される。
【００７９】
本発明は、骨延展術後の骨癒合を加速させる方法も提供する。いくつかの実施形態において、骨延展術（ｂｏｎｅ  ｉｓｔｒａｃｔｉｏｎ）後の骨癒合を加速させるための方法は、目的のポリペプチドおよび骨移植片（例えば、骨移植片内に配置された目的のポリペプチド）を含む組成物を提供する工程および有効量の組成物を少なくとも１つの骨延展部位に適用する工程を包含する。
【００８０】
本発明は、さらに、骨延長手技を行う方法を提供する。１つの実施形態において、骨延長手技を行う方法は、（ａ）骨を第１骨セグメントと第２骨セグメントとに分割する工程、（ｂ）第１骨セグメントおよび第２骨セグメントの少なくとも１つを移動することにより、第１骨セグメントと第２骨セグメントとの間に空間を作る工程、および（ｃ）その空間における骨形成を刺激する工程（ここで、骨形成を刺激する工程は、組成物、目的のポリペプチドおよび骨移植片（例えば、骨移植片内に配置された目的のポリペプチド）を提供する工程、および有効量の組成物をその空間に少なくとも部分的に配置する工程を包含する）を包含する。いくつかの実施形態において、工程（ｂ）および（ｃ）は、骨を任意の所望の量だけ長くするために必要な回数だけ繰り返され得る。
【００８１】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、組成物を適用する工程は、組成物を骨延展部位に注射する工程を包含する。１つの実施形態において、注射工程は、延展部位に組成物を経皮的に注射する工程を包含する。別の実施形態において、組成物は、骨延展の開口部位または外科的に露出された部位に注射される。さらなる実施形態において、組成物を適用する工程は、スパーテルまたは他のデバイスを用いて、骨延展部位に組成物を配置する工程を包含する。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、骨延長手技の延展段階中に少なくとも１つの骨延展部位に適用される。他の実施形態において、本発明の組成物は、骨延展後の硬化段階において少なくとも１つの骨延展部位に適用される。さらなる実施形態において、本発明の組成物は、延展段階および硬化段階において少なくとも１つの骨延展部位に適用される。
【００８３】
本明細書中に提供されるとき、骨延長手技は、本発明の実施形態によれば、両側性下顎骨形成不全、片側小顔面症、先天性短小大腿骨（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｓｈｏｒｔ  ｆｅｍｕｒ）、腓骨欠損（ｆｉｂｕｌａｒ  ｈｅｍｉｍｅｌｉａ）、片側萎縮、軟骨形成不全、神経線維腫症、内反膝、成長板骨折、骨欠損、頭蓋顔面適用、骨髄炎、化膿性関節炎および灰白髄炎の処置において使用される手技を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態において、骨移植片は、ドナー由来のウイルスで汚染されていないことを確かめる標準的な方法を用いてスクリーニングされる。処置される骨のタイプは、骨移植片の起源として使用される骨のタイプと同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００８５】
本発明の方法は、任意の個体を処置するために使用され得る。本明細書中で使用する場合、明らかに別のことが示されない限り、「個体」は、本明細書中で使用されるとき、霊長類（例えば、ヒト、サル、ゴリラ、類人猿、キツネザルなど）、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌおよびネコを含むがこれらに限定されない哺乳動物を意図する。したがって、本発明は、ヒト用の医薬と、農業用動物および家庭内のペットにおける使用を含む動物用の両方の文脈における使用を見出す。その個体は、ある徴候（例えば、骨、歯根膜、靭帯、軟骨または腱の症状）と診断されていることがあるか、ある徴候を有すると疑われるか、またはある徴候を発症するリスクがある。その個体は、その徴候に関連する１つ以上の症候を示し得る。その個体は、遺伝的にまたは別途、そのような症状を発症する傾向があり得る。
【００８６】
本明細書中で使用されるとき、「その必要のある」は、症状もしくは疾患を有する個体、または症状もしくは疾患の「リスクのある」個体を含む。本明細書中で使用されるとき、「リスクのある」個体は、ある症状を発症するリスクのある個体である。「リスクのある」個体は、検出可能な疾患または症状を有していてもよいし、有していなくてもよく、本明細書中に記載される処置方法の前に検出可能な疾患を示していてもよいし、示していなくてもよい。疾患または症状の発症と相関する測定可能なパラメータであり、当該分野で公知である、１つ以上のいわゆる危険因子を個体が有することを、「リスクのある」は表す。これらの１つ以上の危険因子を有する個体は、これらの危険因子を有しない個体よりもその疾患または症状を発症する確率が高い。これらの危険因子としては、年齢、性別、人種、食餌、以前の疾患の履歴、前駆疾患の存在、遺伝子的な（すなわち、遺伝性の）考慮すべき点、および環境曝露が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
本明細書中で使用されるとき、「処置」または「処置する」は、有益な結果または所望の結果（望ましくは臨床結果を含む）を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益な臨床結果または所望の臨床結果としては、以下：疾患に起因する症候の減少、疾患に罹患している者の生活の質の向上、疾患を処置するために必要とされる他の薬剤の用量の減少、および／または疾患進行の遅延のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
本明細書中で使用されるとき、「疾患の発症の遅延」は、その疾患（例えば、骨、歯根膜、靭帯、軟骨または腱の症状）の発症を延期すること、妨げること、遅くすること、遅らせること、安定させること、および／または延ばすことを意味する。この遅延は、疾患の履歴および／または処置される個体に応じて、様々な長さの時間であり得る。当業者に明らかであるように、十分な遅延または著しい遅延は、個体が疾患を発症しない点において、実質的に予防を包含し得る。
【００８９】
本明細書中で使用されるとき、骨移植片、ポリペプチド、薬、化合物または薬学的組成物の「有効投薬量」または「有効量」は、有益な結果または所望の結果をもたらすのに十分な量である。予防的に使用する場合、有益な結果または所望の結果には、リスクを除くこともしくは減少させること、重症度を低下させること、または疾患の発生を遅延させること（疾患発生中に示される疾患、その合併症ならびに中間の病理学的表現型の生化学的症候、組織学的症候および／または行動症候を含む）などの結果が含まれる。治療的に使用する場合、有益な結果または所望の結果には、疾患に起因する１つ以上の症候の減少、疾患に罹患している者の生活の質の向上、疾患を処置するために必要とされる他の薬剤の用量の減少、別の薬剤の効果の増加（例えば、標的化を介して）、疾患の進行の遅延、および／または生存時間の延長などの臨床結果が含まれる。有効投薬量は、１回以上の投与で投与され得る。本発明の目的のために、骨移植片、ポリペプチド、薬化合物または薬学的組成物の有効投薬量は、直接または間接的に予防的または治療的な処置を達成するのに十分な量である。臨床の状況において理解されるように、有効投薬量の骨移植片、ポリペプチド、薬、化合物または薬学的組成物は、別の骨移植片、ポリペプチド、薬、化合物または薬学的組成物と組み合わせて達成されてもよいし、そうでなくてもよい。したがって、「有効投薬量」は、１つ以上の治療薬を投与する状況において考えられ得、１つ以上の他の薬剤と組み合わせて望ましい結果が達成され得る場合または達成される場合、単一の薬剤が、有効量で与えられると考えられ得る。
【００９０】
本明細書中で使用されるとき、「〜と組み合わせて」とは、別の処置様式（例えば、目的のポリペプチド）に加えた１つの処置様式（例えば、骨移植片）の投与のことを指す。同様に、「〜と組み合わせて」とは、個体への他の処置様式の投与前、投与中または投与後の１つの処置様式の投与のことを指す。いくつかの実施形態において、骨移植片および目的のポリペプチドは、同時に、順次または同時的に投与される。いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドは、目的のポリペプチドと骨移植片の両方が個体に同時に投与される前に、骨移植片に結合するか、骨移植片に配置されるようになる。いくつかの実施形態において、骨移植片は、個体に投与され（結合した目的のポリペプチドとともに、またはそのポリペプチドなしで）、次いで、目的のポリペプチドが、個体の骨移植片の部位に、または部位近傍に投与される。
【００９１】
いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドを含む溶液は、１つ以上の緩衝液に目的のポリペプチドを可溶化することによって形成される。本発明のポリペプチド溶液における使用に適した緩衝液としては、炭酸塩、リン酸塩（例えば、リン酸緩衝食塩水）、ヒスチジン、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、酸性緩衝液（例えば、酢酸およびＨＣｌ）および有機緩衝液（例えば、リジン、Ｔｒｉｓ緩衝液（例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）および３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ））が挙げられ得るが、これらに限定されない。緩衝液は、目的のポリペプチドとの生体適合性および望ましくないポリペプチドの改変を妨害する緩衝液の能力に基づいて選択され得る。さらに、緩衝液は、宿主組織との適合性に基づいて選択され得る。１つの実施形態において、酢酸ナトリウム緩衝液が使用される。緩衝液は、様々なモル濃度、例えば、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約２５ｍＭまたはこれらの範囲内の任意のモル濃度で使用され得る。いくつかの実施形態において、酢酸緩衝液は、約２０ｍＭのモル濃度で使用される。別の実施形態において、目的のポリペプチドを含む溶液は、凍結乾燥された目的のポリペプチドを水に可溶化することによって形成され得、ここで、目的のポリペプチドは、可溶化の前に適切な緩衝液から凍結乾燥されている。
【００９２】
本発明によって提供される組成物および方法は、骨移植片および目的のポリペプチドの溶液を含み得、ここで、その溶液は、骨移植片中に分散されている。いくつかの実施形態において、目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ）は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５．０ｍｇ／ｍｌまたは約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度の溶液として存在する。いくつかの好ましい実施形態において、目的のポリペプチドは、０．３ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液として存在する。他の実施形態において、目的のポリペプチドは、以下の濃度：約０．０５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．３５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．５５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．７５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．８５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約０．９５ｍｇ／ｍｌまたは約１．０ｍｇ／ｍｌのうちのいずれか１つの溶液として存在する。これらの濃度が、特定の実施形態の単なる例であること、および目的のポリペプチドの濃度が、上で述べられたいずれかの濃度範囲内または他の任意の適当な濃度であり得ることが、理解されるべきである。様々な量の目的のポリペプチドが、本発明の組成物において使用され得る。使用され得る目的のポリペプチドの量としては、以下の範囲：約１μｇ〜約５０ｍｇ、約１０μｇ〜約２５ｍｇ、約１００μｇ〜約１０ｍｇおよび約２５０μｇ〜約５ｍｇの量が挙げられる。
【００９３】
いくつかの実施形態において、約１．５ｍＬの目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦまたは別の成長因子）の溶液が、約２立方センチメートル（ｃｃ）の骨移植片と組み合わされる。様々な実施形態において、目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦまたは別の成長因子）の溶液の量と骨移植片との比は、約１：２、３：４または１：１（液体体積（ｍＬ）と乾燥容積（ｃｃ）との比）である。いくつかの実施形態において、溶液中のＰＤＧＦの濃度は、約０．１〜約１．０ｍｇ／ｍＬである。
【００９４】
本発明の実施形態における目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦまたは他の成長因子）の濃度は、米国特許第６，２２１，６２５号；同第５，７４７，２７３号；および同第５，２９０，７０８号（これらの各々は、特にＥＬＩＳＡアッセイに関してそれらの全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されているような酵素結合イムノアッセイまたはポリペプチド濃度を測定するための当該分野で公知の他の任意のアッセイを用いることによって測定され得る。ＰＤＧＦのモル濃度は、本明細書中に提供されるとき、ＰＤＧＦ二量体（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ，ＭＷ約２５ｋＤａ）の分子量に基づいて測定される。
【００９５】
目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ）を含む溶液は、本発明の実施形態によれば、約３．０〜約８．０の範囲のｐＨを有し得る。１つの実施形態において、目的のポリペプチドを含む溶液は、約５．０〜約８．０、より望ましくは、約５．５〜約７．０、最も望ましくは、約５．５〜約６．５の範囲またはこれらの範囲内の任意の値のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドを含む溶液のｐＨは、目的のポリペプチドまたは他の任意の望まれる生物学的に活性な薬剤の長期間にわたる安定性および有効性に影響を及ぼさないものであり得る。例えば、ＰＤＧＦは、一般に、酸性の環境においてより安定である。ゆえに、いくつかの実施形態によれば、本発明は、ポリペプチド溶液（例えば、ＰＤＧＦ溶液）の酸性の貯蔵製剤を含む。いくつかの実施形態によれば、その溶液は、望ましくは、約３．０〜約７．０、より望ましくは、約４．０〜約６．５のｐＨを有する。しかしながら、目的のポリペプチドの生物学的活性は、中性のｐＨ範囲を有する溶液において最適化され得る。ゆえに、他の実施形態において、本発明は、ポリペプチド溶液の中性ｐＨの製剤を含む。この実施形態によれば、ポリペプチド溶液は、望ましくは、約５．０〜約８．０、より望ましくは、約５．５〜約７．０、最も望ましくは、約５．５〜約６．５のｐＨを有する。
【００９６】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドを含む溶液のｐＨは、マトリックス基質に対する目的のポリペプチドの結合動力学を最適化するために変更され得る。所望であれば、材料のｐＨは、近接する材料に対して平衡化されるので、結合した目的のポリペプチドは、不安定になり得る。目的のポリペプチドを含む溶液のｐＨは、いくつかの実施形態において、本明細書中で列挙された緩衝液によって制御され得る。様々なポリペプチドは、それらが安定である様々なｐＨの範囲を示す。ポリペプチドの安定性は、主に、そのポリペプチドの等電点および電荷によって反映される。ｐＨの範囲は、ポリペプチドの立体配座構造、ならびにタンパク分解性の分解、加水分解、酸化ならびにポリペプチドの構造および／または生物学的活性に改変を生じ得る他のプロセスに対するポリペプチドの感受性に影響し得る。
【００９７】
本発明の組成物および方法は、いくつかの実施形態によれば、目的のポリペプチドに加えて、１つ以上の生物学的に活性な薬剤をさらに含み得る。例示的な生物学的に活性な薬剤としては、有機分子、無機材料、ポリペプチド、ペプチド、核酸（例えば、遺伝子、遺伝子フラグメント、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、遺伝子制御配列、核転写因子およびアンチセンス分子）、核タンパク質、多糖（例えば、ヘパリン）、糖タンパク質およびリポタンパク質が挙げられる。例えば、抗癌剤、抗生物質、鎮痛薬、抗炎症剤、免疫抑制剤、酵素インヒビター、抗ヒスタミン剤、ホルモン、筋弛緩剤、プロスタグランジン、栄養素、骨誘導ポリペプチド、成長因子、ビタミン類（例えば、ビタミンＤ３）、カルシウムサプリメント、破骨細胞インヒビター（例えば、ビスホスホネート）およびワクチンをはじめとした、本発明の組成物に組み込まれ得る生物学的に活性な化合物の非限定的な例は、２００５年６月２３日出願のＵ．Ｓ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．２００６／００８４６０２（特に、生物学的に活性な薬剤に関して、その全体が本明細書中で参考として援用される）に開示されている。他の実施形態において、本発明（ｐｒｅｓｅｔ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）の組成物および方法は、細胞培養液、安定化ポリペプチド（例えば、アルブミン、抗菌剤、プロテアーゼインヒビター（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（ベータ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、アプロチニン、Ｅ−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）など））、プロテアーゼインヒビター（例えば、アルファ１抗トリプシン（トリプシン／エラスターゼインヒビター）、オボムコイド、膵臓インヒビター、ａｍａｓｔｉｎ−ＨＣｌ（メタロプロテアーゼインヒビター）、アンチパイン（セリンおよびシステインプロテアーゼインヒビター）、アプロチニン（セリンプロテアーゼインヒビター））を含むペプチドもしくは有機分子、および／または他の成長因子（例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ））、ＦＸＩＩＩなどの止血因子、骨形成ポリペプチド（ＢＭＰ）または他のＰＤＧＦ（ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣおよび／またはＰＤＧＦ−ＤＤの組成物を含む）をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、本発明の組成物および方法は、骨移植片に関連する１つ以上のプロテアーゼによって切断されるポリペプチドなどの安定化剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、骨移植片に関連するプロテアーゼによって切断される１つ以上のポリペプチドが、骨移植片に加えられることにより、そのプロテアーゼによって切断される目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ）の量が減少する。
【００９８】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物および方法は、少なくとも１つの造影剤をさらに含む。１つの実施形態において、適用された組成物または注射された組成物の可視化を促進するために、造影剤が、必要に応じて本発明の組成物と組み合わされる。本発明の実施形態によれば、造影剤は、画像化したときに２つ以上の身体組織を少なくとも部分的に区別するように操作可能な物質である。いくつかの実施形態によれば、造影剤としては、陽イオン性造影剤、陰イオン性造影剤、非イオン性造影剤またはそれらの混合物が挙げられる。いくつかの実施形態において、造影剤は、放射線不透過性の造影剤を含む。いくつかの実施形態において、放射線不透過性の造影剤は、（Ｓ）−−Ｎ，Ｎ’−ビス［２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）−エチル］−２，４，６−トリヨード−５−ラクトアミド−イソフタルアミド（ｏｉｓｏｐｈｔｈａｌａｍｉｄｅ）（イオパミドール）およびその誘導体を含むヨード化合物を含む（例えば、２００７年２月９日出願のＵ．Ｓ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．２００７／０２０７１８５（これは特に造影剤に関してその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【００９９】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの薬剤（例えば、生物学的に活性な薬剤、プロテアーゼインヒビターまたは造影剤）が、局所的に投与される。そのような実施形態において、その薬剤は、骨移植片に組み込まれ得るか、または処置される骨の部位に、および部位周辺に別途配置される。他の実施形態において、少なくとも１つの薬剤（例えば、生物学的に活性な薬剤）が、全身的に、経口的に、または静脈内に個体に投与される。様々な実施形態において、１つ以上のプロテアーゼインヒビターが、骨移植片に目的のポリペプチドを加える前、加えている最中または加えた後に骨移植片に加えられる。
【０１００】
例示的なキット
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載される目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ）を備える第１容器および本明細書中に記載される骨移植片（例えば、ヒト骨移植片）を備える第２容器を備えるキットを提供する。いくつかの実施形態において、第１容器は、所定の濃度の目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ）を含む溶液を有する。目的のポリペプチドの濃度は、いくつかの実施形態において、処置される骨、歯根膜、靭帯、軟骨または腱の症状の性質に従ってあらかじめ決定され得る。いくつかの実施形態において、骨移植片は、処置される骨、歯根膜、靭帯、軟骨または腱の症状の性質に従った所定量を含む。いくつかの実施形態において、異なるタイプの骨移植片を備える１つより多い容器が存在し得る。いくつかの実施形態において、選択された骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０トリプシン当量未満である。いくつかの実施形態において、選択された骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０〜約６５トリプシン当量（例えば、約５０〜約５５、約５５〜約６０または約６０〜約６５トリプシン当量）である。いくつかの実施形態において、選択された骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０、５５、６０または６５のいずれかのトリプシン当量である。いくつかの実施形態において、選択された骨移植片のプロテアーゼ活性は、約５０トリプシン当量未満（例えば、約４５未満、約４０未満、約３５未満、約３０未満、約２５未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満、約５未満のトリプシン当量、約０トリプシン当量）である。いくつかの実施形態において、骨の損傷または傷害の部位などの外科術の部位において適用するために、骨移植片中に目的のポリペプチドの溶液を分散することを注射器が促進し得る。
【０１０１】
このキットは、使用するための指示書も備え得る。骨、歯根膜、靭帯、軟骨または腱の症状を処置するために骨移植片および目的のポリペプチドを使用することに関する指示書は、一般に、意図される処置のための投薬量、投薬スケジュールおよび投与経路に関する情報を含む。これらの容器は、単位用量、バルク包装（例えば、複数回用量の包装）または単位用量以下の用量であり得る。本発明のキットに供給される指示書は、代表的には、ラベルまたは添付文書（例えば、キット内に含められる紙のシート）上に記載された指示であるが、機械可読の指示書（例えば、磁気ディスクまたは光学式記憶ディスクに保持された指示書）もまた許容され得る。そのラベルまたは添付文書は、その組成物が、本明細書中に記載される骨、歯根膜、靭帯、軟骨または腱の症状を処置するため、予防するため、またはその発症を遅延させるために使用されることを示している。指示書は、本明細書中に記載される方法のいずれかを実施するために提供され得る。
【０１０２】
本発明のキットは、適当な包装の中に収められる。適当な包装としては、バイアル、ビン、ジャー、可撓性の包装（例えば、密閉されるＭｙｌａｒまたはプラスチックバッグ）などが挙げられるが、これらに限定されない。キットまたは容器は、滅菌された接続口を有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静脈内投与用の溶液バッグまたはバイアルであり得る）。このキットは、生物学的に活性な薬剤（目的のポリペプチドに加えて）、造影剤、プロテアーゼインヒビター、緩衝液または前述のものの任意の組み合わせをさらに備え得る。
【０１０３】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるものであり、本発明を限定するために提供されるものではない。
【実施例】
【０１０４】
実施例１．ＰＤＧＦの結合およびフリーズドライされた骨移植片（「ＦＤＢＡ」）マトリックスからの放出
図１は、ＰＤＧＦの結合および骨移植片からの放出を研究するための例示的なプロトコルを要約している。いくつかの実験では、骨移植片材料を残しておくために、量を２倍または１０倍スケールダウンさせた。特に、１００μｌのヒト骨移植片（ＬｉｆｅＮｅｔ，Ｉｎｃ．）を、２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ，ｐＨ６．０中で、１０分間、０．３ｍｇ／ｍＬの濃度の１００μｌのＰＤＧＦと混合した。その骨移植片は、乾燥粒子からなるものだった。その骨移植片は、フリーズドライされた後、販売されたものである（フリーズドライされた骨同種移植片すなわちＦＤＢＡと呼ばれる）。次いで、２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ，ｐＨ６．０またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＮａＯＡｃを含まない）中の２００μｌのＮａＣｌ（様々な濃度）を加えた。異なる濃度のＮａＣｌを用いることにより、図２に列挙されるＮａＣｌの最終濃度を得た。次いで、その溶液を１時間または２４時間インキュベートした。４℃、約２０００×ｇで５分間遠心分離することによって、溶液中のＰＤＧＦを不溶性のヒト骨移植片から分離し、次いで、マトリックスから放出されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの量を、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢに対するレセプターでコーティングされたプレートを用いる比色定量のＥＬＩＳＡ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅアッセイ（ａｓｓｙ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって定量した。図２は、かなりの量のＰＤＧＦが塩とのインキュベートによって放出されたこと、およびその放出が高速かつ塩依存性であることを示唆している。
【０１０５】
図３は、ＰＤＧＦの放出が混合時間とは無関係であり、回収率が４０〜６０％だったことを示唆している。特に、ＰＤＧＦ（０．５ｍｌの０．３ｍｇ／ｍｌ）を、フリーズドライされた骨移植片（約０．５ｍｌ）とともにインキュベートし、室温で１０分間、６０分間または一晩混合した。次いで、１ｍＬの１Ｍ  ＮａＣｌを、図１について上で記載したように加えた。最終的なＮａＣｌ濃度は、６６７ｍＭだった。１５，３３４×ｇで２分間遠心分離することによってＰＤＧＦを骨移植片から分離し、ＰＤＧＦを含む上清をＳＥＣ、ＲＰＨＰＬＣ、ＥＬＩＳＡおよび非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。コントロール実験におけるＰＤＧＦを、１００％として正規化した。ヒトＦＤＢＡから溶出されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によってはｒｈＰＤＧＦ−ＢＢのコントロールサンプルと電気泳動的に識別不能だった（データ示さず）。さらに、１０分後にＮａＣｌを用いてＦＤＢＡから溶出されたｒｈＰＤＧＦは、標準的なＭＧ−６３細胞ベースのバイオアッセイを用いて測定されたとき、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢのコントロールサンプルよりも生物作用能を保持していた（データ示さず）。放出されたＰＤＧＦを、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。このＥＬＩＳＡアッセイは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．製のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  ＰＤＧＦ−ＢＢ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙを製造者のプロトコルに従って用いて行われた（例えば、ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｐｄｆ／ｄｂｂ００．ｐｄｆのワールドワイドウェブを参照のこと）。簡潔には、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢに対するレセプターをプレート上にコーティングし、次いで、ＰＤＧＦを結合させ、二次抗体−ＨＲＰ結合体および検出用の色素原テトラメチルベンジジンを用いて評価した。図３は、一部のＰＤＧＦが、骨移植片に結合したままであることを示唆している。あるいは、ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｅｐ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ、７．８ｍｍ×３ｃｍ  ＨＰＬＣカラムおよびＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｅｐ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ、６．０ｍｍ×４．０ｃｍプレカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）におけるサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ）を使用し、ＰＤＧＦの溶出プロファイルの積分、および図４Ｃに示されているような異なる５つの濃度の標準的なＰＤＧＦにおける較正によって、上清中のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの濃度を測定した。
【０１０６】
ＳＥＣを用いることにより、フリーズドライされた骨移植片マトリックスから溶出されたＰＤＧＦの量を定量し、本来の構造および凝集を解析した（図４Ａ〜４Ｃ、５Ａ、５Ｂ、６Ａおよび６Ｂ）。骨移植片（約１ｍｌ）を、ＰＤＧＦ（０．３ｍｇ／ｍｌ；１：１ｖｏｌ／ｖｏｌ）と混合し、直ちに２ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌで溶出し、１５，３３４×ｇで２分間遠心した。１００μｌの上清をＳＥＣによって解析した。０．０５Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ４．０中の０．４Ｍ  ＮａＣｌを移動相として、０．８ｍｌ／分の流速、室温において、ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｅｐ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ６．０ｍｍ×４．０ｃｍ  ＨＰＬＣガードカラム（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓ．Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）とともにＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｅｐ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ、７．８ｍｍ×３０ｃｍ  ＨＰＬＣカラムを用いてＳＥＣを行った。図４Ｃは、ＳＥＣカラムの較正を示しているグラフである。
【０１０７】
ＳＥＣは、ＰＤＧＦの本来のサイズおよびその相互作用、ＰＤＧＦの凝集ならびにそのサンプルの他の成分を示す（図４Ａおよび４Ｂ）。例えば、骨移植片コントロールまたはＰＤＧＦコントロールと比べて、骨移植片およびＰＤＧＦのＳＥＣプロファイルに新しい高分子量のピークが現れる場合、骨移植片とＰＤＧＦとの相互作用が生じ、そして／またはＰＤＧＦ自体が骨移植片との相互作用に起因して二量体の集合体に凝集した。新しい高分子量のピークは、ある特定の条件下で観察された。そのＳＥＣプロファイルは、温度および放出時間に依存した（図５Ａおよび５Ｂ）。これらのクロマトグラムは、より高い温度およびより長い放出時間において非特異的なポリペプチドの著しい溶出を示している。ＰＤＧＦの溶出は、図５Ａおよび５Ｂについて試験された条件下においてほぼ同じままである。ＳＥＣプロファイルは、サンプルにも依存した（図６Ａおよび６Ｂ）。
【０１０８】
ＮａＣｌの代わりにＭＥＭおよび酢酸などの他の化合物を試験し、その場合もフリーズドライされた骨移植片からいくらかのＰＤＧＦが放出された。
【０１０９】
実施例２．ＰＤＧＦの結合および骨移植片からの放出
図８は、異なるロットの骨移植片についてのＰＤＧＦの結合および骨移植片からの放出を研究するための例示的なプロトコルを要約している。具体的には、０．５ｍｌのヒト骨移植片を、２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ，ｐＨ６．０中の０．３ｍｇ／ｍＬの濃度の０．５ｍｌのＰＤＧＦと１時間混合した。次いで、２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ，ｐＨ６．０中の１ｍＬの１Ｍ  ＮａＣｌを加えた。その塩を加えた後、すぐに上清を１５，３３４×ｇの遠心分離によって骨移植片から分離し、さらなる解析（ＳＥＣ、ＲＰＨＰＬＣおよびＥＬＩＳＡ）に供した。ヒト骨移植片の年齢／性別は、ＰＤＧＦの放出に対して統計学的に有意に影響しなかった（図９Ａおよび９Ｂ）。ＳＥＣおよびＲＰＨＰＬＣを使用し、総ピーク面積に基づいて、図９Ａおよび９ＢについてＰＤＧＦを定量した。図１０は、様々な骨移植片サンプルについて実施例１に記載したようにＥＬＩＳＡまたはＳＥＣによって測定された骨移植片からのＰＤＧＦの回収率を示している。この実験で使用されたＰＤＧＦの元の量を１００％として正規化した。このデータは、１０個の異なる骨移植片サンプルについて図１１にも要約されている。
【０１１０】
逆相ＨＰＬＣを用いることによってもまた、ＰＤＧＦの量、ならびにタンパク分解性切断および／または化学修飾に起因するその構造の変化を定量した（図１２および１３Ａ〜１３Ｅ）。２００ｍＭ  ＤＴＴおよび４Ｍ  グアニジンＨＣｌ，ｐＨ８．８によって５０℃で５分間サンプルを還元した。３７℃において１．２ｍｌ／分の流速で６０分間、０．０６％トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）中の２４〜８０％の勾配のアセトニトリルを使用し、５μｍガードカートリッジ（Ｇｒａｃｅ  Ｄａｖｉｓｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）とともにＶｙｄａｃ  Ｃ１８カラム５μｍ  ４．６ｍｍ×２５０ｍｍを使用して、逆相ＨＰＬＣを行った。図１２は、いくつかの見込みのあるＰＤＧＦフラグメントまたは化学的に修飾されたポリペプチドを図示している。図１３Ａ〜１３Ｄについては、３つ組のランをＰＤＧＦコントロール（図１３Ｅ）と比較している。
【０１１１】
また、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３１２Ａ  Ｂｉｎ  Ｐｕｍｐ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３２９Ａ  ＡＬＳ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３３０Ｂ  ＡＬＳおよびＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３１４Ａ  ＶＷＤを備えたＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズを使用し、５μｍガードカートリッジ（Ｇｒａｃｅ  Ｄａｖｉｓｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）を備えたＶｙｄａｃ  Ｃ１８カラム５μｍ  ４．６ｍｍ×２５０ｍｍにおいてＰＤＧＦ切断産物を分離した後、ＴｕｎｅおよびＸｃａｌｉｂｕｒソフトウェアを用いたＴｈｅｒｍｏ  ＬＣＡ  Ｄｅｃａ  ＸＰ  ＭＡＸにおいて、ＥＳＩ  ＬＣ／ＭＳを使用してそのＰＤＧＦ切断産物を同定した。ＭＳモードに対するｍ／ｚ２００〜２０００からデータを取得した（図１４Ａおよび１４Ｂ）。
【０１１２】
実施例３．ＰＤＧＦの結合および骨移植片からの放出
図１６は、骨移植片からのプロテアーゼ活性の除去を研究するための例示的なプロトコルを要約している。特に、（ｉ）２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ，ｐＨ６．０中の０．３Ｍ  ＮａＣｌと（ｉｉ）ヒト骨移植片サンプル０７−０７２０−Ａとの１：１（体積／重量）混合物を３７℃で１時間インキュベートした。次いで、その固体の骨移植片を、標準的な方法を用いて沈降させることにより、固体の骨移植片を液体上清（骨移植片抽出物）と分離した。その固体骨移植片の沈降物を、３７℃の０．２４０ｍｇ／ｍＬのＰＤＧＦとともに８０分間または一晩インキュベートした。上清（骨移植片抽出物）を０．２４０ｍｇ／ｍＬのＰＤＧＦとともに３７℃において０、５、１０、２０、４０、８０または１６０分間インキュベートした。次いで、実施例２に記載したようにそれらのサンプルに対して逆相ＨＰＬＣを行った。様々な時間にわたって上清（骨移植片抽出物）とともにインキュベートされたＰＤＧＦの逆相ＨＰＬＣプロファイルを図１７Ａ〜１７Ｅに示す。骨移植片抽出物／上清によるＰＤＧＦの切断は、時間依存的だった（図１８Ａおよび１８Ｂ）。様々な時間にわたって骨移植片沈降物とともにインキュベートされたＰＤＧＦの逆相ＨＰＬＣプロファイルを図１９Ａ〜１９Ｃに示す。図１７Ａ〜１７Ｅおよび１９Ａ〜１９Ｃでは、１８．３分におけるピークが、切断されたＰＤＧＦを表している。図１９Ａ〜１９Ｃは、０．３Ｍの塩で溶出した後の骨移植片沈降物中にプロテアーゼ活性がほとんど残っていないことを示唆している。
【０１１３】
実施例４．ＰＤＧＦの結合および骨移植片からの放出
ＱｕａｎｔｉＣｌｅａｖｅＴＭ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃａｔ．＃２３２６３を用いたプロテアーゼ活性に対する例示的なアッセイを以下に記載する。ヒト骨移植片サンプル０７−０７２０を、８０％骨移植片および２０％β−ＴＣＰの懸濁液中に含めた（実施例１に記載したのと同様に）。ＢｕｐＨホウ酸塩緩衝液パックを５００ｍｌのＤＩ水に溶解して５０ｍＭホウ酸塩，ｐＨ８．５を作製することによって、アッセイ緩衝液を調製した。１本のバイアル（１０ｍｇ）の凍結乾燥サクシニル化カゼインを５ｍｌの同種移植片再懸濁緩衝液に溶解して０．２ｍｇ／ｍｌ溶液（この溶液は、９６ウェルマイクロプレートにおいて４８個のサンプルのために使用され得る）を作製することによって、サクシニル化カゼイン溶液を調製した。凍結乾燥ＴＰＣＫトリプシンを１ｍｌのアッセイ緩衝液に溶解して、５０ｍｇ／ｍｌ原液を作製することによって、トリプシン原液を調製した。この原液のアリコート（１０〜５０μＬ）を凍結し、−８０℃で保存した。１０μｇ／ｍｌから出発してトリプシン標準を段階希釈することによってトリプシン標準を調製した。供給された１００μＬのＴＮＢＳＡ原液を１４．９ｍｌのアッセイ緩衝液に加えることによって、ＴＮＢＳＡ使用溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を調製した。１体積の２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ，ｐＨ６．０を２体積の２０ｍＭ  ＮａＯＡｃおよび１Ｍ  ＮａＣｌと混合することによって、同種移植片再懸濁緩衝液（ＡＲＢ）を調製した。２．９２ｇのＥＤＴＡを計量し、８０ｍｌの水を加えることによって、ＥＤＴＡ１００ｍＭ原液を調製した。このＥＤＴＡ溶液を、２．５Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨ７．００に滴定し、最終体積を１００ｍｌに調整した。
【０１１４】
８０％骨移植片および２０％ＴＣＰ懸濁液を、１．５ｍｌ遠心管に計量し（５０、２５または１２．５ｍｇ）、２００μＬの同種移植片再懸濁緩衝液を加えた。基質溶液（１００μＬ）を、５０μＬのトリプシン標準または５０μＬの骨移植片上清（実施例２に記載したように調製したもの）および２００μＬのサクシニル化カゼイン基質とともに、室温で２０分間混合しながらインキュベートした。ＴＮＢＳ（５０μＬ）を各標準および上記上清に加えた。ＴＮＢＳ（１００μＬ）を各骨移植片懸濁液に加えた。混合物を室温でさらに２０分間インキュベートした。骨移植片を遠心し、得られた２００μＬの上清をトリプシン標準が入ったマイクロプレートに加えた。４５０ｎｍにおける吸光度をＳｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において測定した。
【０１１５】
このアッセイでは、以下のサンプルおよびコントロールを解析した。「Ａ」は、洗浄なしのコントロール骨移植片を表す。基質を加える直前に、相補的体積（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｖｏｌｕｍｅ）のＡＲＢを加えた。「Ａｃ」は、基質の代わりに等体積のＡＲＢを加えたこと以外は「Ａ」と同じであるコントロールを表す。「ＡＷ」は、骨移植片を室温において６０分間、１５０μＬのＡＲＢとともにインキュベートし、次いで、１ｍｌのＮａＯＡｃ，ｐＨ６．０で３回洗浄し、骨移植片を、１５，３４４×ｇで２分間遠心した後に上清（「ＡＷＳ」）から分離し、次いで、骨移植片単独（Ａ）に対して行ったようにアッセイしたことを表す。プロテアーゼ基質（サクシニル化カゼインの溶液）の代わりにＡＲＢだけをインキュベーション混合物に加えたこと以外は通例のサンプルと同じように、すべてのコントロール（サンプル名に「ｃ」が入っているもの）を調製した。これらのコントロールは、トリニトロベンゼン（ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｓｅｎｅ）スルホン酸（ＴＮＢＳ，これは、ペプチドのＮ末端アミノ基と特異的に反応して４５０ｎｍにおいてシグナルを生じる）によって偽陽性シグナルを生じる、ＡＲＢを用いて骨移植片から溶出されたペプチドの原因を説明するものである。それらのコントロールを控除したサンプル値を図７に示す。「ＡＷＥｃ」は、等体積のＡＲＢを基質の代わりに加えたこと以外は「ＡＷ」と同じであるコントロールのことを表す。「ＡＷＥＳ」は、「ＡＷＥ」を、１００μＬのＡＲＢとともに６０分間、最初にインキュベートしたものからの上清のことを表す。「ＡＷＥｃＳｃ」は、等体積のＡＲＢを基質の代わりに加えたこと以外は「ＡＷＥＳ」と同じであるコントロールのことを表す。サンプル名に「Ｅ」が入っているサンプルは、プロテアーゼアッセイを５ｍＭ  ＥＤＴＡ（反応混合物にプロテアーゼ基質とともに加えた）の存在下において行ったこと以外はＡＷおよびＡＷＳサンプルと同様に得た。
【０１１６】
図７は、この方法を用いて測定されたプロテアーゼ活性を示している。骨移植片から溶出されたペプチドは、このアッセイにおいて大きなシグナルを生成したので、プロテアーゼ基質を含まないコントロールのシグナルを引くことにより、この図に対するデータを得た。プロテアーゼ活性は、塩洗浄からの可溶性上清と不溶性の骨移植片沈降物とに均等に分配された。可溶性プロテアーゼは、基質の拡散が大きいことに起因して、骨移植片上または骨移植片中に残存している不溶性プロテアーゼよりも速い切断動力学を示すと予想される。
【０１１７】
実施例５．例示的なプロテアーゼ測定方法
所望であれば、標準的な方法を用いることにより、骨移植片に関連する１つ以上のプロテアーゼおよび／または存在する１つ以上の他のポリペプチドを同定することができる。特に、以下の方法は、骨移植片に関連するほとんどまたはすべてのポリペプチドの同定を可能にする。これらのポリペプチドは、目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ）を切断し得る１つ以上のプロテアーゼを含み得る。
【０１１８】
原則としては、実施例３に記載したように調製された骨移植片からの塩溶出物は、１０００Ｄａカットオフ限外濾過デバイスを用いて少なくとも約１００倍濃縮され、次いで、ＭｕｄＰＩＴ（多次元（Ｍｕｌｄｉｔｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ）タンパク質同定技術）ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ実験（ｆｉｅｌｄｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｍｕｄｐｉｔ／またはｃｓｈｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｓｈｌｐ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｆｕｌｌ／２００６／２８／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ４５５５のワールドワイドウェブ（これらの各々は、特にＬＣ  ＭＳ／ＭＳ法に関してそれらの全体が本明細書中で参考として援用される））に直接使用されるか、またはＳＤＳ  ＰＡＧＥで分離され、切り出され、トリプシンを用いてゲル内で消化され、その後、標準的なプロトコルを用いてサンプル中のポリペプチドがＬＣ  ＭＳ／ＭＳまたはＭＡＬＤＩ  ＭＳにより測定される。ＭｕｄＰＩＴ実験では、希釈されたサンプルをイオン交換キャピラリーカラムに充填する。次いで、そのカラムからの画分をＣ１８カラムにおいて分離し、質量分析計に注入する。いくつかの実施形態では、骨移植片溶出物のトリプシン消化を行い、次いで、得られた混合物を、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳを用いて解析する。
【０１１９】
データを確かめるために、複数のオルソゴナル（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）法を適用し、相互参照してもよい。いくつかの実施形態において、プロテアーゼ同定の最終的な確認は、基質としての目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ）と、ＭＳによって同定された候補プロテアーゼに対する特定のペプチド基質の両方を使用する実験である。骨移植片の塩溶出液による切断を、売主から購入した精製された候補プロテアーゼによる切断と比較する。いくつかの実施形態において、複数のプロテアーゼが、同時に目的のポリペプチド（例えば、ＰＤＧＦ）のタンパク分解性の分解に寄与する。
【０１２０】
例えば、以下のプロトコルが使用され得る。この例示的なプロトコルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質分離、ゲル内トリプシン消化およびＭＡＬＤＩ  ＭＳを含む。所望であれば、骨移植片中に存在するプロテアーゼの濃度に応じて、サンプルをスケールアップまたはスケールダウンすることができる。
１）１アリコートの骨移植片（例えば、ＬｉｆｅＮｅｔ，＃０７−７２０Ｂ−３２０）を１５ｍＬコニカルチューブに量り入れる。
２）１：１ｖ／ｗの再懸濁緩衝液を加え、十分混合し、回転装置上において室温で１時間インキュベートする。
【０１２１】
ａ．再懸濁緩衝液を調製するために、１体積の２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ溶液を２体積の２０ｍＭ  ＮａＯＡｃおよび１Ｍ  ＮａＣｌ溶液に混合する。
３）骨同種移植片サンプルおよびコントロールを最高速度で２分間遠心する。
４）１０００ダルトン限外濾過デバイスを用いて上清を１００μｌに濃縮する。
５）ゲルを泳動することにより、プロテアーゼの存在について試験する。
【０１２２】
ａ．骨移植片サンプルからの１０μＬの上清を１０μＬのＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（ＢｉｏＲａｄ＃１６１−０７３７）と併せる。
【０１２３】
ｂ．９０℃で５分間インキュベートする。
【０１２４】
ｃ．サンプルを１４×ｇで１分間遠心する。
【０１２５】
ｄ．１０ウェルの１２％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル（ＢｉｏＲａｄ＃１６１−１１５６）に充填する。
【０１２６】
ｅ．２００Ｖで約３０分間泳動する。
【０１２７】
ｆ．Ｈ２Ｏで３回洗浄する（各洗浄２０分間）。
【０１２８】
ｇ．クーマシー染色（ＢｉｏＲａｄ  ＃１６１−０７８６）で一晩染色する。
６）標準的な方法を用いてゲルを処理する。
【０１２９】
質量分析によるその後の解析のためのゲル内トリプシン消化は、以下のとおり行うことができる。この方法の場合、最高純度の清潔な試薬を使用し、それらをこの手順のために使用する。振盪および／または超音波処理は、必要ない。
【０１３０】
一般的な試薬
以下の一般的な試薬を使用する。
１）重炭酸アンモニウム。０．７９ｇを１００ｍＬのｍｉｌｌｉＱ水に溶解し、フィルター滅菌し（任意）、ふたがきつく閉まるビンに入れる。１ヶ月後に交換する。
２）アセトニトリル。
３）ジチオトレイトール（ＤＴＴ，１５４．２ｇ／ｍｏｌ）。１０ｍｇ未満を計量し、適切な量のｍｉｌｌｉＱ水を加えることによって１．５ｍＬチューブに新鮮な４５ｍＭ溶液を作製する。２Ｄゲル電気泳動においてサンプルが予め還元されておらず、またアルキル化もされていない場合だけ、ＤＴＴが必要である。
４）ヨードアセトアミド（ＩＡ，１８５ｇ／ｍｏｌ）。１０ｍｇ未満を計量し、適切な量のｍｉｌｌｉＱ水を加えることによって１．５ｍＬチューブに新鮮な１００ｍＭ溶液を作製する。２Ｄゲル電気泳動においてサンプルが予め還元されておらず、またアルキル化もされていない場合だけ、ＩＡが必要である。
５）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１０×１ｍＬアンプル，Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔ  ＃２８９０４）。換気フード内において、１ｍＬアンプルを開封し、５０％原液になるようにｍｉｌｌｉＱ水と５０：５０に混合し、次いで、ｍｉｌｌｉＱ水で１：５希釈することにより、１０％使用原液を作製する。すべて−２０℃に保存され得る。
６）改変トリプシン（各々２０μｇの凍結乾燥トリプシン（ｔｙｐｓｉｎ）を含む５本のバイアル；Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃａｔ  ＃Ｖ５１１１，トリプシンゴールドを使用）。再懸濁することにより、０．１ｍｇ／ｍＬの使用原液を作製する。１０×２０μＬを０．５ｍＬチューブに慎重に分注し、−２０℃で保存する。
【０１３１】
銀染色されたタンパク質に特異的な試薬
以下の試薬は、銀染色されたタンパク質：フェリシアン化カリウムおよびチオ硫酸ナトリウムに特異的である。清潔な１５ｍＬチューブにおいて５０ｍｇのフェリシアン化カリウムおよび８０ｍｇのチオ硫酸ナトリウムを５ｍＬのｍｉｌｌｉＱ水に溶解する。この溶液は、不安定であり、毎回新鮮なものを作製すべきであり、３０分以内に使用するべきである。
【０１３２】
ペプチドの精製および濃縮に特異的な試薬
以下のものが推奨される：１０μＬのピペッター（ｐｉｐｅｔｔｏｒ）（または１０μＬのチップを保持するもの）およびＺｉｐＴｉｐＣ１８ピペットチップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｃａｔ  ＃ＺＴＣ１８Ｓ０９６）。
【０１３３】
使用溶液
以下の使用溶液の１ｍＬだけが通常１０〜２０反応に対して必要とされる。毎日新鮮なものを作製する：
１）５０ｍＭ重炭酸アンモニウム，５０％アセトニトリル。等体積の１００ｍＭ重炭酸アンモニウムと１００％アセトニトリルとを混合する。
２）２５ｍＭ重炭酸アンモニウム。２５０μＬの１００ｍＭ重炭酸アンモニウムと７５０μＬのｍｉｌｌｉＱ水とを併せる。
３）０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）。１０μＬの１０％ＴＦＡを９９０μＬのｍｉｌｌｉＱ水に希釈する。
４）６０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ。６００μＬのアセトニトリルと３９０μＬのｍｉｌｌｉＱ水と１０μＬの１０％ＴＦＡとを併せる。
【０１３４】
ピペットチップは、以下の工程１〜６のためにサンプル間で交換する必要はない。トリプシンプロテアーゼが、ゲル切片に入り、サンプルを消化し始めるまでは、サンプルの相互汚染のリスクは最小である。振盪および／または超音波処理は、必要ない。
【０１３５】
工程１．バンドの切り出し。湿っているゲルの場合、西洋かみそりの角の刃をバンドの上部角に挿入し、そのバンドの長さに沿って切り取る（かみそりをゲルに貫通させない）。過剰なゲルを最小にすることが最も好ましく、必要であれば、少量のタンパク質を無駄にすることがより好ましい。これにより、バックグラウンドが減少する（および、全体のタンパク質濃度が高まる）。バンドの側面を切り落とし、次いで、バンドを１ｍｍ角の立方体に切り、０．５ｍＬチューブに入れる。アセテートシートに記録されたゲルの場合、西洋かみそりの角の刃を用いてバンドを切り取り、０．５ｍＬチューブに入れる。
【０１３６】
工程２．平衡化。１００μＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウムを１５分間使用する。アセテートシートに記録されたゲルの場合、鉗子を用いてアセテート片を除去し、再膨潤されたゲル切片を取り出し、１ｍｍ角の立方体に切り、チューブに戻す。洗浄液を廃棄する。
【０１３７】
クマシーブルー染色されたタンパク質を脱染色する別個の工程は、必要ない。十分な脱染色は、処理工程４〜５の間に完了する。
【０１３８】
工程３．銀の除去（Ｇｈａｒａｈｄａｇｈｉら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２０：６０１から適合）。ゲル切片が入ったチューブに１００μＬのフェリシアン化カリウム／チオ硫酸ナトリウム溶液を加え、５分間（または、茶色がかった色がゲルから除去されない場合はそれ以上）静置させる。溶液を廃棄し、過剰量（２５０μＬ）の１００ｍＭ重炭酸アンモニウムで１０分間置換する。重炭酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｕｉｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）を除去し、１００ｍＭ重炭酸アンモニウムで１０分間置換する。この重炭酸アンモニウムによる洗浄を、黄色の呈色がゲル切片からなくなるまで繰り返す。最後の洗浄液を廃棄する。
【０１３９】
工程４．還元／アルキル化（サンプルが還元およびアルキル化を含む２ＤＥプロトコルに由来するものである場合、この工程を省略することができる）。１５０μＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウムをサンプルに加える。１０μＬの４５ｍＭ  ＤＴＴを加え、５０°において１５分間インキュベートする。次いで、（同じチューブに）１０μＬの１００ｍＭヨードアセトアミドを加え、室温で１５分間、暗黒下で放置する。これにより、システイン残基のカルバミドメチル化（ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）が生じる（各システイン残基に正味５７ダルトンが付加される）。
【０１４０】
工程５．平衡化／脱水。１０分間またはゲル切片が白色を呈するまで（一度は繰り返さなければならないかもしれない）、液体を５０〜１００μＬの１００％アセトニトリルで置換する。液体を除去し、真空遠心機において５分間乾燥させる。脱水されたゲル切片は、蓋つきの０．５ｍＬチューブ内で−２０℃において数ヶ月間保存することができる。
【０１４１】
任意の工程として、１００％アセトニトリルの前に、液体を除去し、１００μＬの５０％アセトニトリル、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム（５０ｍＭアセトニトリルとの１：１混合物）で置換し、１５分間静置する。これを一度繰り返すことにより、残存しているクーマシー染色をさらに除去することができる。
【０１４２】
工程６．消化。脱水されたゲル切片を、１２．５ｍＭ重炭酸アンモニウム中の１０〜１５μＬの０．０１μｇ／μＬ改変トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）において再膨潤する。適切な量の０．１ｍｇ／ｍＬ原液トリプシン溶液を１２．５ｍＭ重炭酸アンモニウムに１：１０希釈し、１サンプルあたり１０〜１５μＬを慎重に加える。これは、トリプシンがゲルに入るときの重要な工程である；ゲル切片を覆うのに必要なものだけを使用する。２０分後に、溶液すべてがゲルに入ることが、過剰量が残存するよりも好ましい。消化は、３７°における２時間によって完了するか、または必要であれば一晩行われ得る。
【０１４３】
工程７からは、サンプルごとに新しいピペットチップを使用する。
【０１４４】
工程７．重層（任意）。必要であれば、トリプシン溶液すべてがゲル切片に入った後（約２０分後）、ゲル切片がちょうど覆われるまで（過剰量を加えない）、５μＬずつ、さらに１２．５ｍＭ重炭酸アンモニウム（追加のトリプシンなし）を加える。
【０１４５】
工程８．ペプチド抽出。上清（ゲル切片から拡散したいくらかのペプチドを含み得る）を、新しくラベルされた０．５ｍＬチューブに取り出す。そのゲル切片から１５〜２５μＬの６０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡを用いてペプチドを抽出する。１５分後、抽出物を取り出し、上記新しいチューブ内の上清と併せ、上記のように第２の抽出を繰り返す。第２の抽出物を第１の抽出物および上清が入った上記新しいチューブに移すとき、数回ピペッティングすることにより、確実に試薬を完全に混合させる。最後に、真空遠心機を用いて、その新しいチューブ内の抽出物／上清を蒸発乾固するが、液体が蒸発した後、長時間そのままで放置しない（様々な真空遠心機によって時間は変動し、上に列挙した体積を用いるとき、どのようなものでも３０〜６０分はかかるだろう；必要に応じて確認すること）。
【０１４６】
工程９．再構成および質量解析。ペプチドを４μＬの０．１％ＴＦＡに溶解する。サンプルを直接ＬＣ／ＭＳで解析することができる。大量のサンプルは、直接ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで解析することができ、大量でないサンプルは、通常、ＺｉｐＴｉｐＣ１８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，カタログ番号ＺＴＣ１８Ｓ０９６）ピペットチップ（１０μＬのピペッターが必要）を用いる精製および濃縮が必要である：
ａ．チップを６０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ中で平衡化する（２×１０μＬ）。
【０１４７】
ｂ．０．１％ＴＦＡ中で洗浄する（２×１０μＬ）。
【０１４８】
ｃ．毎回ピペッティング（約５回）して、最大１０μＬのサンプルを充填する。
【０１４９】
ｄ．０．１％ＴＦＡ中で洗浄する（２×１０μＬ）。
【０１５０】
ｅ．毎回ピペッティングして、２μＬの６０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ中に溶出する（２μＬを新しいチューブに入れた後、溶出する）。
【０１５１】
工程１０．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ用のサンプル調製。０．４μＬのペプチド混合物をＭＡＬＤＩターゲットに適用し、その上に０．４μＬのα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸マトリックス（１ｍｇ／ｍＬクエン酸アンモニウムが補充された６０％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡ中の５ｍｇ／ｍＬ）を重層する。
【０１５２】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ。ペプチド混合物を、Ｖｏｙａｇｅｒ  ４７００質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ  ＭＡ）を用いる、飛行時間型マトリックス支援レーザー脱離（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）およびＴＯＦ／ＴＯＦタンデム質量分析で解析した。インタクトな分子のペプチドイオン（Ｍ＋Ｈ）のペプチド質量マップの形態の質量スペクトルデータ、ならびに個別のペプチドイオンから得られる断片化データを用い、ＭＡＳＣＯＴ検索エンジン（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を実行するＧＰＳ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、統計学的に有意なタンパク質のマッチについてＳｗｉｓｓ−ＰｒｏｔおよびＮＣＢＩｎｒタンパク質データベースを調べた。トリプシン自己分解のペプチドイオン（ｍ／ｚ＝８４２．５１，２２１１．１０）を、上記ペプチド質量マップの内部較正に使用することにより、検索を２０ｐｐｍ未満の質量精度で行うことができた。また、検索は、１つの切断ミス、システインスルフヒドリルの完全なカルバミドメチル化（ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）およびメチオニン残基の部分酸化を考慮に入れた。
【０１５３】
実施例６．石灰化されたヒト骨同種移植片中のタンパク質成分の質量分析による解析
本研究の目的は、この材料からｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを溶出する条件下でヒト同種移植片から溶出されたペプチド画分の主成分を同定すること、およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって、タンパク分解活性ありおよびなしの同種移植片からの溶出液のペプチドプロファイルを比較することにより、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを切断するプロテアーゼに対する有望な候補を同定することだった。
【０１５４】
材料および装置
以下の材料を使用して、試験を行った：
【０１５５】
【表１】
2012512728.tif 000002
以下の供給品を使用して、試験を行った：
【０１５６】
【表２】
2012512728.tif 000003
以下の装置を使用して、試験を行った：
【０１５７】
【表３】
2012512728.tif 000004
サンプル調製
未知のピークを同定する際、さらなる徹底的なＭｕＤＰＩＴ解析に送られるヒト骨同種移植片サンプルを選択した。各同種移植片サンプルを１：３（ｗ／ｖ）２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ，ｐＨ６．０（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含まない）と混合し、ＲＴにおいて１時間インキュベートさせた。インキュベート後、サンプルを１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。
【０１５８】
上清を取り出し、２本の１．５μＬチューブに分け、１４０００ｒｐｍで１分間遠心した。次いで、任意の同種移植片粒子から上清を取り出し、１０００ＭＷＣＯフィルターに加え、一晩またはサンプルが約１００μＬに濃縮されるまで４７５０ｒｐｍで遠心した。濃縮後、サンプルを−８０℃で凍結した。
【０１５９】
各サンプルの濃度を、標準としてアルブミンを用いるＢＣＡタンパク質アッセイによって測定した。１〜１２００μｇ／ｍＬのアルブミンを用いて検量線を作成した。サンプル緩衝液を用いて様々な程度でサンプルを希釈した（０７−０７２０は、１：２および１：４希釈し、０７−２５１８は、１：１０希釈し、０６−５７２６は、１：１０希釈し、０６−１２４７は、１：４希釈した）。各サンプルのＢＣＡ解析を行い、各サンプルの体積は、５０μｇに等しいと判定された。
【０１６０】
次いで、それらのサンプルをＴＣＡ沈殿に使用した。次いで、各サンプルについて５０μｇと判定された現在の体積の１／３を、２５％ＴＣＡで２００μＬまで希釈した。そのサンプルを４℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、サンプルを４℃、１４０００ｒｐｍで３０分間遠心した。上清を廃棄した。サンプルを５００μＬの冷アセトンで洗浄し、再度、４℃、１４０００ｒｐｍで３０分間遠心した。もう一度、上清を廃棄し、洗浄を繰り返した。タンパク質ペレットは、チューブの側面に容易に貼り付かなかったので、できるだけ多く上清を除去し、サンプルを真空遠心機において乾燥させた。
【０１６１】
乾燥工程が完了した後、サンプルを４０μＬの８Ｍ尿素および１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５に再懸濁した。この溶液に０．４μＬの５００ｍＭ  ＴＣＥＰを加え、ＲＴで２０分間インキュベートした。インキュベートした後、０．８μＬの５００ｍＭヨードアセトアミドを用いてタンパク質サンプルをアルキル化し、暗黒下で２０分間インキュベートした。次いで、サンプルを１２０μＬの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５で希釈した。そのサンプルに１．６μＬの１００ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．５μｇのトリプシンを加え、消化のために３７℃で一晩インキュベートした。翌朝、直ちにサンプルを恒温器から取り出し、−８０℃に置いた。
【０１６２】
ＲＰＨＰＬＣの手順
ＨＰＬＣシステムを以下の条件に従って設定した：注入量：１２．５μｇ；実行時間：約１２０分／パルス；勾配：時間０：％Ａ（１００），％Ｂ（０），５００μＬ／分；時間１０：％Ａ（１００），％Ｂ（０），５００μＬ／分；時間１０．５：％Ａ（１００），％Ｂ（０），３００μＬ／分；時間１１５：％Ａ（６０），％Ｂ（４０），３００μＬ／分；時間１１５．１：％Ａ（１００），％Ｂ（０），３００μＬ／分；時間１２０：％Ａ（１００），％Ｂ（０），３００μＬ／分。
【０１６３】
ＭＳの手順
装置およびソフトウェアの自動調整機能を用いて、アンギオテンシンの４３３ピークについてその装置を調整した。装置のパラメータを、その装置に対する自動調整機能によって決定し、Ａｐｐｅｎｄｉｘに含める。
【０１６４】
チップを１００μｍ  ＩＤ石英ガラスから採った。前面の逆相カラムに５μｍ  Ｃ１８Ｊｕｐｉｔｅｒ樹脂を詰め、圧力セルを用いてきつく詰めた。そのチップに詰め、２０ｃｍに切り取った（同一の分析カラムを４つすべてのサンプルに対して使用した）。
【０１６５】
ＭｕＤＰＩＴカラムを調製するために、長い石英ガラスの片を加圧下においてメタノールですすぎ、乾燥させた。次いで、その石英ガラスを２０ｃｍ片に切った。１７０μＬのＫａｓｉｌを３０μＬのホルムアミドと併せ、３０秒間ボルテックスした。そのＫａｓｉｌ混合物中に上記石英ガラスを置いた（毛細管作用によってフリットが生成する）。次いで、そのＫａｓｉｌが注入された石英を１００℃で４時間焼いた。焼いた後、フリットを０．５ｃｍに切った。次いで、圧力セルを用いて、そのカラムに３〜４ｃｍのＳＣＸ  Ｌｕｎａ樹脂を詰めた；加圧下でメタノールを用いてその樹脂を下に詰めた。次いで、圧力セルを用いて、さらに３〜４ｃｍ、Ｃ１８Ｊｕｐｉｔｅｒ樹脂を詰めた。次いで、そのカラムを、０．１％ギ酸を用いて５分間、平衡化した。
【０１６６】
サンプルを上記カラムに充填する前に、４０μＬのサンプルを冷凍庫から取り出し、１．５μＬのギ酸でクエンチした。次いで、１２．５μｇを、圧力セルを介してＭｕＤＰＩＴカラムに加えた。次いで、そのＭｕＤＰＩＴカラムを、直線に並んだ分析カラムの上流に配置した。
【０１６７】
ＭｕＤＰＩＴ解析は、５μＬの０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭおよび１０００ｍＭをサンプル上に注入する一続きの塩パルスからなるものだった。各塩パルスについて、上記のＨＰＬＣ勾配に示したような勾配を用いた。
【０１６８】
結果
ＭｕＤＰＩＴ解析の結果は、複雑であり、コラーゲンまたはケラチンなどの内在性タンパク質が高レベルだった。同種移植片のロットは、特定のサンプル中に以下の「ヒット」数の各タンパク質を有しており、ここで、タンパク質は、確認されたペプチド配列に基づいてデータベースから同定された：／０７２０（２２１８）；／１２４７（７５５）；／２５１８（２１９７）；／５７２６（９２９）。同種移植片０７−０７２０および０７−２５１８は、同種移植片０６−５７２６および０６−１２４７よりもかなり多くのタンパク質／ペプチドを含んでいた。同種移植片０７−０７２０および０７−２５１８は、これら２つが組み合わされたときにｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの高レベルのタンパク分解性切断を示した２つのロットでもある。
【０１６９】
分子機能、生物学的プロセスまたは細胞成分に基づいてタンパク質を比較するＧｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）アノテーション（ｈｔｔｐ：／／ａｍｉｇｏ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ａｍｉｇｏ／ｂｒｏｗｓｅ．ｃｇｉ，ＧＯデータベース  ２００９−０７−０２に公開）に基づいて、比較を行った。高レベルのタンパク分解性切断の活性を示した同種移植片（０７−０７２０および０７−２５１８）は、核酸結合、触媒的活性、シグナル伝達物質活性およびイオン結合に関わるタンパク質を、より高いパーセンテージで有した（図２１を参照のこと）。対照的に、タンパク分解性切断を示さない同種移植片（図２１Ｃおよび２１Ｄ）は、組織の構造的成分の一部であるタンパク質を、より高いパーセンテージで有した。このことから、いくつかの同種移植片は、その他のものと同程度には十分清浄にされておらず、任意の潜在的な活性成分に対して負に反応するタンパク質／ペプチドが残存していることが示唆される。少なくとも１つの同種移植片サンプルの５％超を構成するタンパク質（ケラチン、コラーゲンおよび血清アルブミン）を比較した（図２２）。より少ないタンパク質／ペプチドを有する（およびタンパク分解活性を有しない）サンプルは、これらのタンパク質をより高いパーセンテージで有する一方、より「汚染されている」同種移植片ロットは、これらのタンパク質をより低い濃度で有する。
【０１７０】
３つのプロテアーゼ（カテプシンＧ、マトリックスメタロプロテアーゼ−９、キマーゼ）または切断を引き起こすと知られているタンパク質は、サンプル０７−０７２０および０７−２５１８に見出され、サンプル０６−５７２６および０６−１２４７では検出されなかった。
【０１７１】
同種移植片０７−０７２０および０７−２５１８は、ＨＰＳＥＣにおいて、同種移植片０６−５７２６および０６−１２４７よりも高いパーセンテージで、溶出された他のタンパク質／ペプチドパーセンテージを有した：それぞれ８７．７２および９０．１０パーセント。逆に、同種移植片０６−５７２６および０６−１２４７は、それぞれＨＰＳＥＣによって８６．１４および８４．０３パーセントの他のタンパク質／ペプチドを有した。
【０１７２】
同種移植片０７−０７２０のＲＰＨＰＬＣプロファイルが、０７−２５１８と同一でないことから、タンパク分解性切断が、２つのサンプル間で異なるプロテアーゼによって生じた可能性が示唆される。
【０１７３】
前述の本発明は、理解しやすくする目的で図示および例を介していくらか詳細に記載されてきたが、当業者には、ある特定の軽微な変更および改変が実施され得ることが明らかである。ゆえに、これらの記載および例は、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。
【０１７４】
本明細書中に開示されるすべての参考文献、刊行物、特許および特許出願は、それらの全体が本明細書中で参考として援用される。
【０１７５】
本明細書中で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別段示されない限り、複数の参照物を含む。
【０１７６】
本明細書中での「約」ある値またはパラメータという言及は、その値またはパラメータそれ自体を対象とする実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及している記載は、「Ｘ」の記載を含む。
【０１７７】
本明細書中に記載される本発明の局面およびバリエーションは、局面およびバリエーション「からなる」および／またはそれら「から本質的になる」ことを含むことが理解される。
【図１】
2012512728.tif 000005
【図２】
2012512728.tif 000006
【図３】
2012512728.tif 000007
【図４Ａ】
2012512728.tif 000008
【図４Ｂ】
2012512728.tif 000009
【図４Ｃ】
2012512728.tif 000010
【図５】
2012512728.tif 000011
【図６】
2012512728.tif 000012
【図７】
2012512728.tif 000013
【図８】
2012512728.tif 000014
【図９】
2012512728.tif 000015
【図１０】
2012512728.tif 000016
【図１１】
2012512728.tif 000017
【図１２】
2012512728.tif 000018
【図１３−１】
2012512728.tif 000019
【図１３−２】
2012512728.tif 000020
【図１３−３】
2012512728.tif 000021
【図１４Ａ】
2012512728.tif 000022
【図１４Ｂ】
2012512728.tif 000023
【図１５】
2012512728.tif 000024
【図１６】
2012512728.tif 000025
【図１７−１】
2012512728.tif 000026
【図１７−２】
2012512728.tif 000027
【図１７−３】
2012512728.tif 000028
【図１８】
2012512728.tif 000029
【図１９−１】
2012512728.tif 000030
【図１９−２】
2012512728.tif 000031
【図２０】
2012512728.tif 000032
【図２１Ａ】
2012512728.tif 000033
【図２１Ｂ】
2012512728.tif 000034
【図２１Ｃ】
2012512728.tif 000035
【図２１Ｄ】
2012512728.tif 000036
【図２２】
2012512728.tif 000037
【国際調査報告】
2012512728.tif 000038
2012512728.tif 000039
2012512728.tif 000040