(57)【要約】  本発明は、強皮症の治療方法を提供する。前記方法は、ｍｉＲ−２９の循環および／または細胞内濃縮を上昇させるｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−２９アップレギュレータの投与によるｍｉＲ−２９のアップレギュレーションによる。本発明はまた、ｍｉＲ−２９のこのような治療のための使用、およびｍｉＲ−２９の強皮症の治療用薬剤の製造のための使用に関する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−２９アップレギュレータの、強皮症の治療のための使用。
【請求項２】
前記ｍｉＲ−２９アップレギュレータは、ｍｉＲ−２９を発現する発現ベクターである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−２９アップレギュレータの、強皮症の治療用薬剤の製造のための使用。
【請求項４】
ｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−２９アップレギュレータの治療に有効な量を必要とする患者に投与することを含む、強皮症の治療方法。
【請求項５】
前記ｍｉＲ−２９アップレギュレータは、ｍｉＲ−２９を発現する発現ベクターである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
候補化合物を線維芽細胞に接触させること；ｍｉＲ−２９の活性または発現を評価すること；およびｍｉＲ−２９の活性または発現を候補化合物の不在下での活性または発現と比較して選択的に増加させる、候補化合物を選択すること；を含む、強皮症の治療に有効な化合物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、強皮症の新規な薬理学的治療に関する。詳細には、本発明は、強皮症を治療するための、マイクロＲＮＡファミリーのｍｉＲ−２９のアップレギュレーション（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、上方調節）に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
本発明は、強皮症ＳＳｃの新規な薬理学的治療に関する。様々なタイプの強皮症がある。全身性硬化症とも呼ばれる多臓器性線維性の形態は、皮膚病変の程度に依存して２つのサブタイプを含む：限局性皮膚型は四肢に影響を及ぼすが、びまん性サブタイプは体幹をも含む。全身性疾患に加えて、皮膚の特定の領域、場合によっては関節および筋肉を含むが、内部器官を含まない、例えば限局性強皮症を含む限局性の形態の疾患もある。全身性硬化症の主な特徴は、皮膚および内部器官の広範な細小血管障害および進行性線維症である。最も明らかな臨床症状は、通常、皮膚の硬化および関連した瘢痕である。皮膚はこわばり、赤みを帯び、またはうろこ状に見えうる。主に臓器不全によって起こる合併症の管理における進歩にもかかわらず、現在のところ、まだ治療法も疾患特異的治療法もない。いくつかの現在入手可能な薬剤は皮膚を柔らかくし炎症を低減しうるが、強皮症の治療のためのさらなる効果的な薬剤が必要であることは明らかである。
【０００３】
ｍｉＲ−２９は、遺伝子発現の調節に組み込まれる小さな非コードマイクロＲＮＡである。動物のｍｉＲＮＡは、約７０ヌクレオチドの前駆体として転写され、その後ダイサー酵素によって処理されて約２２ヌクレオチドの産物を与える。この場合、成熟配列は前駆体ＲＮＡの３’末端からもたらされる。前記産物は、標的ｍＲＮＡの５’末端との相補性を通して調節の役割を有すると考えられている。ｍｉＲ−２９ファミリーにはｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ１およびｍｉＲ２９ｂ２およびｍｉＲ−２９ｃが属する。
【０００４】
ｍｉＲ−２９はＢｃｌ−２ファミリーのタンパク質の抗アポトーシスメンバーであるＭｃｌ−１タンパク質のレベルを調節することが示されている。さらに、ｍｉＲ−２９が多くのＴ細胞白血病において破壊されることがわかっている癌遺伝子であるＴｃｌ１タンパク質のレベルを調節し、肺癌においてしばしばアップレギュレートされるＤＮＭＴ３ＡおよびＤＮＭＴ−３Ｂの両方を直接標的にすることが示されている。さらにｍｉＲ−２０８の不在下では、ｍｉＲ−２９の発現はアップレギュレートされ、心線維症を防ぐことが示されている（国際公開第２００８／０７４８６６号）。皮膚細胞および強皮症におけるｍｉＲ−２９の役割は、これまで研究されていなかった。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
本発明は、ｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−２９アップレギュレータ（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｏｒ）の治療に有効な量を必要とする患者に投与することを含む、強皮症の治療方法を提供する。さらに本発明は、ｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−２９アップレギュレータのこのような治療のための使用、およびｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−２９アップレギュレータの強皮症の治療用薬剤の製造のための使用、ならびに強皮症の治療に有効な化合物のスクリーニング方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】Ａ：ＳＳｃ線維芽細胞におけるｍｉＲ−２９ファミリーのベースライン発現：発現はｍｉＲ−２９ａで最も強い（デルタｃｔ法では低い数値が高い発現を意味する）。Ｂ：ｍｉＲ−２９ファミリーメンバーのベースライン発現レベルは、ＳＳｃ皮膚線維芽細胞において、正常な皮膚線維芽細胞と比較して強くダウンレギュレートされている（それぞれｎ＝６）。
【図２】Ａ：ＳＳｃ患者のパラフィン埋包皮膚片におけるｍｉＲ−２９ａのベースライン発現は健常対照群と比較してダウンレギュレートされている。表皮と真皮層との間で発現に差はない。Ｂ：ＳＳｃ患者の新しい皮膚生体組織におけるｍｉＲ−２９ａのベースライン発現は健常対照群と比較してダウンレギュレートされている。
【図３】Ａ：ＳＳｃ皮膚線維芽細胞におけるｍｉＲ−２９ａの強制発現は、トランスフェクション後７２時間のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルにおいて、コラーゲン１および３のダウンレギュレーションをもたらす。Ｂ：ＳＳｃ皮膚線維芽細胞におけるｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−２９ｃの強制発現は、トランスフェクション後７２時間のｍＲＮＡレベルにおいて、コラーゲン１および３のダウンレギュレーションをもたらす。
【図４】Ｃｏｌ３Ａ１−３’ＵＴＲを標的としたルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ：ｐＧＬ３コントロール／３’ＵＴＲ＿Ｃｏｌ３Ａ１＿５’から３’およびｐｒｅ−ｍｉＲ２９ａの同時トランスフェクションは蛍ルシフェラーゼ活性の減少をもたらす。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明は強皮症の治療方法を提供する。強皮症は、多臓器性の形態と、限局性の形態（限局性強皮症が挙げられるがこれに限定されない）とを含む。本発明の治療は、ｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−２９アップレギュレータの治療に有効な量を必要とする患者に投与することを含む。これは、ｍｉＲ−２９の循環および／または細胞内濃度の上昇を伴う。
【０００８】
ｍｉＲ−２９は、成熟ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ１、ｍｉＲ−２９ｂ２およびｍｉＲ−２９ｃに加えて、成熟ｍｉＲＮＡの生物学的活性を保持した、その相同配列、前駆体、フラグメントまたは変異体を含む。上記配列をコードするＤＮＡなどの他の核酸もまた含まれる。相同性は、一般に２以上の核酸の間の配列類似性から推論される。相同性の確立に有用な配列間の類似性の正確な百分率は、問題とする核酸によって異なるが、わずか２５％の配列類似性が通常相同性の確立に用いられる。より高い水準の配列類似性（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％以上）もまた相同性の確立に用いられうる。配列類似性の百分率を決定する方法（例えば、デフォルトのパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮ）が一般に適用できる。
【０００９】
ｍｉＲ−２９ファミリーのＲＮＡ配列は以下の通りである：
成熟ｍｉＲ−２９ａ：ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ
成熟ｍｉＲ−２９ｂ１：ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＡＧＵＧＵＵ
成熟ｍｉＲ−２９ｂ２：ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＡＧＵＧＵＵ
成熟ｍｉＲ−２９ｃ：ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ。
【００１０】
本発明による好ましいｍｉＲ−２９は、ｍｉＲ−２９ａ、および成熟ｍｉＲ−２９ａの生物学的活性を保持する、その相同配列、前駆体、フラグメントまたは変異体である。
【００１１】
ｍｉＲ−２９アップレギュレータは、血液または細胞中のｍｉＲ−２９の発現および／または活性を増加させる化合物であり、特に制限されないが、ｍｉＲ−２９を発現するベクターが挙げられる。発現ベクターの例は、アデノウイルスまたはレトロウイルス発現ベクターなどのウイルス発現ベクターである。
【００１２】
ｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−２９アップレギュレータの投与は、皮膚および内部器官への運搬に適した当業者に公知の方法によって行なわれうる。例えば、本発明の一形態によれば、ｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−２９アップレギュレータは静脈注射または動脈注射によって投与されうる。一形態においては、投与は、ｍｉＲ−２９もしくはｍｉＲ−２９アップレギュレータの経口、経皮、腹腔内、皮下、持続放出、制御放出、遅延放出、坐薬、または舌下投与を含む。
【００１３】
活性成分の投与量は、人種、年齢、体重、個人の状態、個人の薬物動態データ、および投与の形態に依存する。体重約７０ｋｇの人の場合、ｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−２９アップレギュレータの１日の投与量は、１回の投与または数回の投与で、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは１ｍｇ／ｋｇ体重〜２５ｍｇ／ｋｇ体重である。ｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−２９アップレギュレータは単独で、または他の薬剤と組み合わせて用いられうる。
【００１４】
さらに本発明は、強皮症の治療のためのｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−２９アップレギュレータの使用、特に、ｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−２９アップレギュレータを含む薬剤組成物の使用に関する。
【００１５】
本発明はまた、ｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−２９アップレギュレータの強皮症の治療用薬剤の製造のための使用に関する。
【００１６】
本発明の薬剤は、例えば、通常の混合、造粒、コーティング、溶解、または凍結乾燥法などのそれ自体が公知である方法によって調製される薬剤組成物である。本発明の一形態において、ｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−２９アップレギュレータは、脂質ビヒクルに用いられる。または、ｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−２９アップレギュレータがそれ自体で単純に提供されてもよく、任意でリポソームまたはナノ粒子などの運搬ビヒクル中に含まれてもよい。本発明の一形態において、ｍｉＲ−２９またはｍｉＲ−２９アップレギュレータは軟膏中に調製される。
【００１７】
本発明はさらに、ｉ）候補化合物を線維芽細胞に接触させること；ｉｉ）ｍｉＲ−２９の活性または発現を評価すること；およびｉｉｉ）ｍｉＲ−２９の活性または発現を候補化合物の不在下での活性または発現と比較して選択的に増加させる、候補化合物を選択すること；を含む、強皮症の治療に有効な化合物のスクリーニング方法に関する。活性または発現を評価することは、ｍｉＲ−２９の発現レベルを評価することを含みうる。ＲＮＡの発現レベルを評価するための、例えばノーザンブロット法またはＲＴ−ＰＣＲを含む多様な方法が当業者に公知である。本発明はさらに、これらのスクリーニング方法によって選択された化合物に関する。
【実施例】
【００１８】
以下の実施例は、本発明の技術的範囲を制限することなく本発明を説明するために示すものである。これらのデータは、とりわけ、ｍｉＲ−２９が強皮症患者の皮膚試料において、健常対照群と比較してダウンレギュレートされることを表し、したがってｍｉＲ−２９のアップレギュレーションが強皮症の治療に有用であることを示す。
【００１９】
実施例１：正常な皮膚線維芽細胞と比較した、培養ＳＳｃ線維芽細胞におけるｍｉＲ−２９ファミリーのベースライン発現
ＳＳｃ患者および健常人ドナーからの皮膚生体組織試料をパンチ生検によって得た。すべての患者は、ＬｅＲｏｙらによって示唆されたＳＳｃの基準を満たしていた。本願に記載されるすべてのインビトロの実験で、増殖培養からの皮膚線維芽細胞はＴ７５フラスコで培養された。前記皮膚線維芽細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中に維持し、継代（ｐａｓｓａｇｅｓ）３〜８を分析に用いた。
【００２０】
ｍｉＲＶａｎａキット（アンビオン／アプライドバイオシステムズ社製）を用いてＲＮＡを単離した後、Ｔａｑｍａｎ型ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＳＳｃ患者におけるｍｉＲ−２９の発現レベルを健常対照群と比較して解析した。アンビオン／アプライドバイオシステムズ社製の特異的単一ＴａｑｍａｎマイクロＲＮＡアッセイを用いた。標的配列は以下の通りである：ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ：ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵ（分析番号：０００４１２，部分番号：４３７３０６５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ：ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＡＧＵＧＵＵ（分析番号：０００４１３，部分番号：４３７３２８８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ：ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵ（分析番号：０００４１５，部分番号：４３７３２８９）、ＲＮＵ６Ｂ（内在性コントロール）：ＣＧＣＡＡＧＧＡＵＧＡＣＡＣＧＣＡＡＡＵＵＣＧＵＧＡＡＧＣＧＵＵＣＣＡＵＡＵＵＵＵＵ（分析番号：００１０９３，部分番号：４３７３３８１）。
【００２１】
低い数値が高い発現を意味するデルタｃｔ法で測定したところ、ｍｉＲ−２９ファミリーのすべてのメンバーがＳＳｃ線維芽細胞で発現されることがわかり、ｍｉＲ−２９ファミリーの中でも、ｍｉＲ−２９ｂ（デルタｃｔ＝２７．１±０．３）またはｍｉＲ−２９ｃ（デルタｃｔ＝２２．８±０．１）と比較して、ｍｉＲ−２９ａが最も高い発現（デルタｃｔ＝１７．４±０．２）を示した。図１Ａ参照。
【００２２】
健常対照群と比較して、ｍｉＲ−２９のベースラインレベルは培養ＳＳｃ線維芽細胞において常にダウンレギュレートされていた（ｍｉｒ−２９ａ：ｐ＝０．０１２，ｍｉＲ−２９ｂ：ｐ＝０．０４６，ｍｉＲ−２９ｃ：ｐ＝０．０２８）。図１Ｂ参照。
【００２３】
本願のすべてのデータは、平均±平均の標準誤差として与えられる。ｐ値＜０．０５を統計的に有意であると考える。
【００２４】
実施例２：健常対照群と比較した、ＳＳｃ患者のａ）パラフィン切片およびｂ）皮膚生体組織におけるｍｉＲ−２９ａのベースライン発現
【００２５】
ｍｉＲ−２９ａのベースライン発現を、ＳＳｃ患者の生体外試料において健常対照群と比較して調査した。組織粉砕機（ｔｉｓｓｕｅ  ｌｙｓｅｒ）を用いて均質化した後、ｍｉＲＶａｎａキット（アンビオン／アプライドバイオシステムズ社製）を用いてＲＮＡを単離し、Ｔａｑｍａｎ型ＲＴ−ＰＣＲを採用した。上述のアンビオン／アプライドバイオシステムズ社製のｍｉＲ−２９ａおよびＲＮＵ６Ｂのための特異的単一ＴａｑｍａｎマイクロＲＮＡアッセイを用いた。
【００２６】
ａ）表皮と真皮層との間の発現レベルの潜在的な差を評価するために、はじめに、表皮および真皮を解剖した後、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ全核酸単離キット（アンビオン／アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、パラフィン埋包組織切片から単離したＲＮＡを分析した。再び、組織にｍｉＲ−２９ａの非常に強い発現（デルタｃｔ＝１８）が見られ、正常対照群と比較すると、ＳＳｃ患者の表皮および真皮の両方において有意にダウンレギュレートされた（ｐ＝０．０１２）。図２Ａ参照。
【００２７】
ｂ）試料のパラフィン処理による潜在的な誤りを招くような影響を除くために、ＳＳｃ患者からの新しい皮膚生体組織におけるｍｉＲ−２９ａの発現をさらに調べ、後にＲＮＡ中に−２０℃で２年未満保存した健常対照群を調べた。再び、ｍｉＲ−２９ａはＳＳｃにおいて健常対照群と比較して有意にダウンレギュレートされた（ｐ＝０．０４２）。図２Ｂ参照。
【００２８】
実施例３：ＳＳｃ線維芽細胞におけるｍｉＲ−２９の強制発現はｍＲＮＡ上のコラーゲン１および３の発現ならびにタンパク質レベルをダウンレギュレートする
皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン発現に対するｍｉＲ−２９の効果を評価するために、そしてとりわけ、ｍｉＲ−２９ファミリーメンバーがＳＳｃにおけるコラーゲン発現を変化させることができたことを証明するために、ＳＳｃ皮膚線維芽細胞を６ウェルプレート中で、１００ｎＭ（最終濃度）のｐｒｅ−ｍｉＲ−２９ａ、ｐｒｅ−ｍｉＲ−２９ｂおよびｐｒｅ−ｍｉＲ−２９ｃまたはスクランブル対照とリポフェタミン２０００試薬（インビトロジェン）を用いてトランスフェクションし、ｍｉＲ−２９ａの過剰発現がコラーゲン遺伝子のダウンレギュレーションを招くかどうかを調べた。以下の前駆体分子および陰性対照群（アンビオン／アプライドバイオシステムズ社製）を採用した：ｐｒｅ−ｍｉＲ−２９ａ（製品番号：ＰＭ１２４９９，成熟ｍｉＲＮＡ配列：ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ），ｐｒｅ−ｍｉＲ−２９ｂ−２（製品番号：ＰＭ１０１０３，成熟ｍｉＲＮＡ配列：ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＡＧＵＧＵＵ），ｐｒｅ−ｍｉＲ−２９ｃ（製品番号：ＰＭ１０５１８，成熟ｍｉＲＮＡ配列：ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ），ｐｒｅ−ｍｉＲ  ｍｉＲＮＡ前駆体分子−陰性対照番号１（部分番号：１７１１０）。コラーゲン１および３の発現は、ｍＲＮＡレベルにおいて、Ｔａｑｍａｎ型ＲＴ−ＰＣＲによって、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎプライマーを用いて分析した。プライマー配列は以下の通りである：プロコラーゲン１Ａ１  ｆｗｄ：５’−ＴＣＡＡＧＡＧＡＡＧＧＣＴＣＡＣＧＡＴＧＧ−３’，ｒｅｖ．：５’−ＴＣＡＣＧＧＴＣＡＣＧＡＡＣＣＡＣＡＴＴ−３’；プロコラーゲン３Ａ１  ｆｗｄ：５’−ＧＧＣＡＴＧＣＣＡＣＡＧＧＧＡＴＴＣＴ−３’，ｒｅｖ．：５’−ＧＣＡＧＣＣＣＣＡＴＡＡＴＴＴＧＧＴＴＴＴ−３’。コラーゲン１Ａ１および３Ａ上のｍｉＲ−２９ａの過剰発現のタンパク質レベルに与える影響をウエスタンブロット法によって、標準的なプロトコルに従って調べた。一次抗体はサンタクルーズバイオテクノロジー社から購入した（コラーゲン１（Ｈ−７０）：ｓｃ−２８６５５，ロット番号Ｂ２４０６；コラーゲン３（Ｈ−３００）：ｓｃ−２８８８８，ロット番号Ｋ２２０５）。
【００２９】
ＳＳｃ皮膚線維芽細胞におけるｍｉＲ−２９ａの強制発現は、半定量的測定によって分析したところ、コラーゲン１および３の発現の顕著なダウンレギュレーション（それぞれｐ＝０．０４３）をｍＲＮＡレベルにおいて、またタンパク質レベル（ｐ＝０．０２７）において誘発した。ＳＳｃ線維芽細胞におけるｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−２９ｃの過剰発現もまた、ｍＲＮＡレベルにおけるコラーゲンＩおよびＩＩＩのダウンレギュレーションを招く。図３参照。
【００３０】
要約すると、これらの機能的実験は、ｍｉＲ−２９ファミリーがＳＳｃにおける主要な病原経路を負に調節することの強い証拠を与える。
【００３１】
実施例４：Ｃｏｌ３Ａ１の３’ＵＴＲを標的としたルシフェラーゼレポーターアッセイ
ｍｉＲ−２９ファミリーメンバー、特にｍｉＲ−２９ａが皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン遺伝子発現の直接的な調節因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）であることを示すために、そして遺伝子調節に対する効果がさらなる媒介因子を標的にすることによって媒介されないことを証明するために、ｍｉＲ−２９ファミリーメンバーのそれぞれに２つの結合部位を有するＣｏｌ３Ａ１の３’ＵＴＲを標的としたルシフェラーゼレポーターアッセイを行なった：ＣＯＬ３Ａ１  ３’ＵＴＲの２４２−２４９位の保存された結合部位、および６８２−６８９位の不完全に保存された結合部位（ＴａｒｇｅｔＳｃａｎデータベース，リリース４．２；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ／によって提供された情報）。実験のために、９７３塩基対のＣｏｌ３Ａ１  ３’ＵＴＲセグメントをヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、ルシフェラーゼの終止コドンからすぐ下流のＸｂａｌ部位を用いて、シミアンウイルス４０プロモータ（プロメガ）と共にｐＧＬ３−コントロールベクターに挿入した。ｍｉＲ−２９の予想されたマッチシードを有する特異的フラグメントを生成するための特異的プライマーを設計した。プライマー配列は以下の通りである：Ｃｏｌ３Ａ１−３’ＵＴＲ  ｆｗｄ：５’−ＡＣＧＣＡＡＧＧＣＴＧＴＧＡＧＡＣＴＡＣ−３’，Ｃｏｌ３Ａ１−３’ＵＴＲ  ｒｅｖ．：５’−ＣＡＴＴＧＡＧＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＡＣＴＣＴＧ−３’，Ｃｏｌ３Ａ１  Ｘｂａ１  ｆｗｄ：５’−ＧＴＡＡＴＴＣＴＡＧＡＡＣＣＡＡＡＣＴＣＴＡＴＣＴＧＡＡＡＴＣＣＣ−３’。ＳＳｃまたは正常な皮膚線維芽細胞を、６−ウェルプレート中でリポフェタミン２０００試薬（インビトロジェン）を用い、製造元の指示に従って、蛍ルシフェラーゼレポートベクター０．３７５μｇおよびレニラルルシフェラーゼｐＲＬ−ＳＶ４０ベクター（プロメガ）を含むコントロールベクター０．２μｇと同時トランスフェクションした。
【００３２】
各ウェルについて１００ｎＭのｐｒｅ−ｍｉＲ２９ａ、２９ｂ、２９ｃまたはスクランブル対照（アンビオン／アプライドバイオシステムズ）を用いた。蛍およびレニラルルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションの２４時間後にデュアルルシフェラーゼアッセイ（プロメガ）を用いて測定した。この実験を２回行った。
【００３３】
結果から、ｐｒｅ−ｍｉＲ２９ａとの同時トランスフェクションは蛍ルシフェラーゼ活性を約５０％減少させることが示され、したがって、他の媒介分子を介さない直接的な調節効果の証拠が得られた。図４参照。
【図１】
2012502007.tif 000003
【図２】
2012502007.tif 000004
【図３】
2012502007.tif 000005
【図４】
2012502007.tif 000006
【配列表】
2012502007000001.app
【国際調査報告】
2012502007.tif 000007
2012502007.tif 000008
2012502007.tif 000009
2012502007.tif 000010
2012502007.tif 000011