(57)【要約】  本発明は、例えば免疫グロブリンのような標的遺伝子の発現の増強のためのポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドを使用する標的遺伝子の発現方法も含まれる。
2012508563.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベータ−グロビンスプライスドナー部位および免疫グロブリンガンマスプライスアクセプター部位（それらの部位は約１２５ヌクレオチドにより分離されている）を含む、プロモーターに機能的に連結された単離されたポリヌクレオチドであって、それらの部位およびプロモーターが、抗ＩＧＦ１Ｒ、抗ＩＬ２３  ｐ１９、抗ＩＬ２３受容体、抗ＩＬ１７、抗ＰＤ１または抗ＨＧＦ抗体免疫グロブリン軽鎖または重鎖（それらの鎖は免疫グロブリン定常領域に機能的に融合されている）をコードする遺伝子に機能的に連結されている、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
ヌクレオチド配列ＣＡＧＧＴＡＡＧＴＴＴＡ（配列番号４）を含むベータ−グロビンスプライスドナー部位、およびヌクレオチド配列ＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＣ（配列番号５）を含む免疫グロブリンガンマスプライスアクセプター部位（それらの部位は約１２５ヌクレオチドにより分離されている）を含む、請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
該スプライスドナー部位および該スプライスアクセプター部位が配列
【化１】
2012508563.tif 000057
（配列番号３のヌクレオチド５１−１７５）により分離されている、請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
該プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
該遺伝子が、カッパ免疫グロブリン定常領域に融合した免疫グロブリン軽鎖をコードしている、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
該遺伝子が、ガンマ−１免疫グロブリン定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖をコードしている、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
該遺伝子が、配列番号６、８〜１１、１８もしくは２６のアミノ酸２０−１２８または配列番号３１を含む軽鎖免疫グロブリンのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３をコードしている、あるいは該遺伝子が、配列番号７、１２、１３、１４もしくは２２のアミノ酸２０−１３７または配列番号３０を含む重鎖免疫グロブリンのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３をコードしている、請求項６記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
該遺伝子が配列番号８、９、１０または１１のアミノ酸２０−１２８をコードしている、請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
該遺伝子が配列番号１２または１３のアミノ酸２０−１３７をコードしている、請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１記載のポリヌクレオチドを含む単離されたプラスミドベクター。
【請求項１１】
図１〜１０よりなる群から選択される図面に記載されているプラスミド地図により特徴づけられる単離されたプラスミドベクター。
【請求項１２】
配列番号３のヌクレオチド配列のヌクレオチド３９−１９０を含む、請求項１０記載のプラスミド。
【請求項１３】
請求項１記載のポリヌクレオチドを含む単離された宿主細胞。
【請求項１４】
該ポリヌクレオチドが該宿主細胞の染色体ＤＮＡ内に組込まれている、請求項１３記載の宿主細胞。
【請求項１５】
該ポリヌクレオチドのコピーの２以上を含む、請求項１４記載の宿主細胞。
【請求項１６】
該ポリヌクレオチドが該宿主細胞の染色体ＤＮＡ内に組込まれていない、請求項１３記載の宿主細胞。
【請求項１７】
該ポリヌクレオチドのコピーの２以上を含む、請求項１６記載の宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１記載のポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入し、該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞の単一クローン集団を選択し、該クローン集団を培養し、該培養からの細胞が細菌、ウイルス、真菌および／またはマイコプラズマを含有するかどうかを判定し、何も検出されなければ、該培養からの細胞を１以上の容器内に冷却下で保存することを含む、マスター細胞バンクの製造方法。
【請求項１９】
該ポリヌクレオチドが、図１または２のプラスミド地図を含むプラスミド内に存在する、請求項１８記載の製造方法。
【請求項２０】
該ポリヌクレオチドが、図６、７、８、９または１０のプラスミド地図を含むプラスミド内に存在する、請求項１８記載の製造方法。
【請求項２１】
該細菌、ウイルス、真菌および／またはマイコプラズマが、ヒト免疫不全ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトＴリンパ球親和性ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヒト単純ヘルペスウイルス、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）よりなる群から選択される１以上のメンバーである、請求項１８記載の製造方法。
【請求項２２】
請求項１８記載の製造方法により製造されたマスター細胞バンク。
【請求項２３】
請求項２２記載のマスター細胞バンクからの細胞を培養し、該培養からの細胞を１以上の容器内に冷却下で保存することを含む、実施用細胞バンクの製造方法。
【請求項２４】
該ポリヌクレオチドが、図１または２のプラスミド地図を含むプラスミド内に存在する、請求項２３記載の製造方法。
【請求項２５】
該ポリヌクレオチドが、図６、７、８、９または１０のプラスミド地図を含むプラスミド内に存在する、請求項２３記載の製造方法。
【請求項２６】
該培養細胞を細菌、ウイルス、真菌および／またはマイコプラズマに関して試験し、何も検出されなかったら、該培養からの細胞を冷却下で保存する、請求項２３記載の製造方法。
【請求項２７】
請求項２３記載の製造方法により製造された実施用細胞バンク。
【請求項２８】
請求項１３記載の宿主細胞を含むマスター細胞バンク。
【請求項２９】
該細胞が、バイアル当たり約１０７個の細胞を含むバイアル内に存在し、検出可能レベルの細菌、ウイルス、マイコプラズマおよび真菌を含有しない、請求項２８記載のマスター細胞バンク。
【請求項３０】
該細胞のバイアルの２００個以上を含む、請求項２９記載のマスター細胞バンク。
【請求項３１】
図１のプラスミド地図により特徴づけられるプラスミドを含むＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞を含む、請求項２８記載のマスター細胞バンク。
【請求項３２】
図２のプラスミド地図により特徴づけられるプラスミドを含むＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞を含む、請求項２８記載のマスター細胞バンク。
【請求項３３】
請求項１３記載の宿主細胞を含む実施用細胞バンク。
【請求項３４】
該細胞が、バイアル当たり約１０７個の細胞を含むバイアル内に存在し、検出可能レベルの細菌、ウイルス、マイコプラズマおよび真菌を含有しない、請求項３３記載の実施用細胞バンク。
【請求項３５】
該細胞のバイアルの２００個以上を含む、請求項３４記載の実施用細胞バンク。
【請求項３６】
図１のプラスミド地図により特徴づけられるプラスミドを含むＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞を含む、請求項３３記載の実施用細胞バンク。
【請求項３７】
図２のプラスミド地図により特徴づけられるプラスミドを含むＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞を含む、請求項３３記載の実施用細胞バンク。
【請求項３８】
プロモーターに機能的に結合された遺伝子によりコードされる標的ポリペプチドを宿主細胞内で発現させるための方法であって、該標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと該プロモーターとの間にベータ−グロビンスプライスドナー部位および免疫グロブリンガンマスプライスアクセプター部位（それらの部位は約１２５ヌクレオチドにより分離されている）を含むβＧｌ−ＩｇＧイントロンポリヌクレオチドを該宿主細胞内に導入し、該標的ポリペプチドが発現される条件下で該宿主細胞を培養することを含む方法。
【請求項３９】
該標的ポリペプチドを精製することを更に含む、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
該ベータ−グロビンスプライスドナー部位がヌクレオチド配列ＣＡＧＧＴＡＡＧＴＴＴＡ（配列番号４）を含み、該免疫グロブリンスプライスアクセプター部位がヌクレオチド配列ＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＣ（配列番号５）を含む、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
該スプライスドナー部位および該スプライスアクセプター部位が配列
【化２】
2012508563.tif 000058
（配列番号３のヌクレオチド５１−１７５）により分離されている、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
該遺伝子が免疫グロブリンをコードしている、請求項３８記載の方法。
【請求項４３】
該免疫グロブリンが、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ−２３、ＩＬ−２３受容体、ＩＬ−１７、ＰＤ１またはＨＧＦに特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域または重鎖可変領域である、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
該遺伝子が、配列番号６、８〜１１、１８もしくは２６のアミノ酸２０−１２８または配列番号３１を含む軽鎖免疫グロブリンのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３をコードしている、あるいは該遺伝子が、配列番号７、１２、１３、１４もしくは２２のアミノ酸２０−１３７または配列番号３０を含む重鎖免疫グロブリンのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３をコードしている、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
該遺伝子が配列番号８、９、１０または１１のアミノ酸２０−１２８をコードしている、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
該遺伝子が配列番号１２または１３のアミノ酸２０−１３７をコードしている、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
該ポリペプチドを単離することを更に含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
該遺伝子、プロモーターおよびポリヌクレオチドが、図１のプラスミド地図により特徴づけられるプラスミド内に存在する、請求項４４記載の方法。
【請求項４９】
図１のプラスミド地図により特徴づけられるプラスミドが配列番号３５のヌクレオチド配列を含む、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
該宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項４９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロモーター／ベータ−グロビン免疫グロビンガンマ（βＧｌ−ＩｇＧ）イントロン構築物に機能的に連結された標的遺伝子を含むポリヌクレオチドおよびそのような標的遺伝子の発現方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体、抗体フラグメントおよび他の治療用タンパク質の臨床的および商業的成功は哺乳類細胞培養内での非常に大規模な製造の必要性を招いた。これは全体的な製造能力の急速な拡大、リアクターのサイズの増加（２０，０００Ｌまで）、ならびにプロセス効率の改善およびそれに伴う製造コスト削減のための努力の著しい増大を招いた。
【０００３】
例えば、ほとんどの抗体療法は長期にわたって高い用量を要し、これは患者１人当たり大量の精製製品を必要とする。したがって、抗体製造の需要を満たすための製造能力はかなりの難題であり、高い生産性の製造方法を得ることが望ましい。
【０００４】
抗体または他のタンパク質のインビボ生産レベルを改善するための１つの手段は、標準的な構築物の場合と比較して増加したレベルのタンパク質産生を引き起こす新規ポリヌクレオチド発現構築物を作製することである。本発明は当技術におけるこの要求に対処するものである。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概括
本発明は１つには、ベータ−グロビンスプライスドナー部位および免疫グロブリンガンマスプライスアクセプター部位（それらの部位は約１２５ヌクレオチドにより分離されている）を含む単離されたβＧｌ−ＩｇＧイントロンポリヌクレオチドを提供する。βＧｌ−ＩｇＧイントロンに加えて、本発明は、標的ポリペプチドを高レベルで発現させるための使用方法を含む。プラスミド、宿主細胞、マスター細胞バンクおよび実施用細胞バンクも本発明の一部を構成する。
【０００６】
例えば、本発明の１つの実施形態においては、該ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列ＣＡＧＧＴＡＡＧＴＴＴＡ（配列番号４）を含むベータ−グロビンスプライスドナー部位と、ヌクレオチド配列ＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＣ（配列番号５）を含む免疫グロブリンガンマスプライスアクセプター部位とを含み、ここで、それらの部位は約１２５ヌクレオチドにより分離されており、例えば、該スプライスドナー部位および該スプライスアクセプター部位は配列
【化１】
2012508563.tif 000003
【０００７】
（配列番号３のヌクレオチド５１−１７５）により分離されている。本発明の１つの実施形態においては、βＧｌ−ＩｇＧイントロンは遺伝子の上流、かつ、該遺伝子に機能的に連結されているプロモーターの下流に位置する。該遺伝子は、任意のタイプの遺伝子、例えば免疫グロブリンの遺伝子であることが可能であり、例えば、この場合、該免疫グロブリンは、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ−２３  ｐ１９、ＩＬ２３受容体（その任意のサブユニット、例えばＩＬ−１２β１またはＩＬ−２３Ｒ）、ＩＬ−１７Ａ、ＰＤ１またはＨＧＦに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントの軽鎖可変領域（場合によってはシグナルペプチドを含む）または重鎖可変領域（場合によってはシグナルペプチドを含む）またはそれらの両方であり、例えば、この場合、該遺伝子は、配列番号６、８〜１１、１８もしくは２６のアミノ酸２０−１２８または配列番号３１を含む軽鎖免疫グロブリンのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３をコードしており、ならびに／または、この場合、該遺伝子は、配列番号７、１２、１３、１４もしくは２２のアミノ酸２０−１３７または配列番号３０を含む重鎖免疫グロブリンのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３をコードしている。該βＧｌ−ＩｇＧイントロンは任意のポリヌクレオチド、例えばベクター、例えばプラスミドベクターまたはウイルスベクター内に配置されうる。
【０００８】
本発明はその範囲内に、図１〜１０のいずれかのプラスミドベクター地図により特徴づけられるβＧｌ−ＩｇＧイントロンを含む単離されたプラスミドを含み、例えば、この場合、該プラスミドは配列番号３のヌクレオチド配列のβＧｌ−ＩｇＧイントロンヌクレオチド３９−１９０を含む。
【０００９】
本発明のβＧｌ−ＩｇＧイントロンを含む宿主細胞も本発明の範囲内である。例えば、該宿主細胞においては、該βＧｌ−ＩｇＧイントロンポリヌクレオチドは宿主細胞の染色体ＤＮＡ内に組込まれることが可能であり、あるいは組込まれないことが可能である。さらに、該宿主細胞は該ポリヌクレオチドの高コピー数、例えば、細胞当たり２以上のコピーを含有しうる。
【００１０】
マスター細胞バンク（ＭＣＢ）も本発明の一部を構成する。したがって、本発明は、本発明のβＧｌ−ＩｇＧイントロンポリヌクレオチド（例えば、図１〜１０のいずれかに示されているプラスミドベクター）を宿主細胞（例えば哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞、例えばＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｋ１またはＣＨＯ−ＤＸＢ１１）内に導入し、該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞の単一のクローン集団を選択し、該クローン集団を培養し、該培養からの細胞が細菌、ウイルス、真菌および／またはマイコプラズマを含有するかどうかを判定し、何も検出されなかった場合には、該培養からの細胞を１以上の容器内に冷却下で保存することを含む、マスター細胞バンクの製造方法を含む。本発明の１つの実施形態においては、該マスター細胞バンクは、生物学的汚染物、例えば細菌、ウイルス、真菌および／またはマイコプラズマを含有しない。該マスター細胞バンクは冷却下で保存されうる。マスター細胞バンク（例えば、ＭＣＢの記載製造方法により製造されたもの）も本発明の一部である。本発明は更に、本発明のマスター細胞バンクからの細胞を培養し、該培養からの細胞を１以上の容器内に冷却下で保存することによる実施用細胞バンク（ＷＣＢ）の製造方法を提供する。ＭＣＢの製造方法と同様に、この方法は、細菌、ウイルス、真菌および／またはマイコプラズマに関して該ＷＣＢを試験するための、そして何も検出されなかった場合には該培養からの細胞を冷却下で保存するための工程を含みうる。実施用細胞バンク（例えば、ＷＣＢの記載製造方法により製造されたもの）も本発明の一部である。例えば、本発明の１つの実施形態においては、該ＭＣＢまたはＷＣＢにおいて、該細胞は、バイアル１個当たり約１０７個の細胞を含むバイアル（例えば、約２００個以上）内に存在し、検出可能レベルの細菌、ウイルス、マイコプラズマおよび真菌を含有しない。
【００１１】
本発明はまた、プロモーターに機能的に連結された遺伝子によりコードされる標的ポリペプチドを宿主細胞（例えば哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１またはＣＨＯ−ＤＧ４４細胞）内で発現させるための方法であって、該標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えばプラスミドｐＡＩＧ１ＦＲＬＣｂ２Ｖ１、例えば配列番号３５のヌクレオチド配列を含む該プラスミド）と該プロモーターとの間にベータ−グロビンスプライスドナー部位および免疫グロブリンガンマスプライスアクセプター部位（ここで、これらの部位は約１２５ヌクレオチドにより分離されている）を含むβＧｌ−ＩｇＧイントロンポリヌクレオチドを、該標的ポリペプチドが発現される条件下、宿主細胞内に導入し、場合によっては該標的ポリペプチドを精製することを含む方法を提供する。本発明の１つの実施形態においては、該ベータ−グロビンスプライスドナー部位はヌクレオチド配列ＣＡＧＧＴＡＡＧＴＴＴＡ（配列番号４）を含み、該免疫グロブリンスプライスアクセプター部位はヌクレオチド配列ＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＣ（配列番号５）を含み、ここで、該スプライスドナー部位および該スプライスアクセプター部位は配列
【化２】
2012508563.tif 000004
【００１２】
（配列番号３のヌクレオチド５１−１７５）により分離されている。本発明の１つの実施形態においては、該遺伝子は免疫グロブリンであり、例えば、この場合、該免疫グロブリンは、ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域または重鎖可変領域であり、例えば、この場合、該遺伝子は、配列番号６、８〜１１、１８もしくは２６のアミノ酸２０−１２８または配列番号３１を含む軽鎖免疫グロブリンのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３をコードしており、または、この場合、該遺伝子は、配列番号７、１２、１３、１４もしくは２２のアミノ酸２０−１３７または配列番号３０を含む重鎖免疫グロブリンのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３をコードしている。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明は１つには、通常の発現構築物と比較して特に高いレベルで標的遺伝子、例えば免疫グロブリン軽鎖または重鎖が発現されうる発現構築物を提供する。例えば、本発明は、プロモーターに機能的に連結された、発現されるべき標的遺伝子（例えば、免疫グロブリン軽鎖および／または重鎖遺伝子）を含むポリヌクレオチド（例えば、プラスミドベクター）を含み、ここで、該遺伝子とプロモーターとの間に、ベータ−グロビンイントロンスプライスドナー部位およびそれに続く約１２５ヌクレオチドおよびそれに続く免疫グロブリンガンマイントロンアクセプター部位を含む構築物が存在する。本発明はまた、本発明の発現構築物を使用する該標的遺伝子の発現方法を含む。
【００１４】
分子生物学
本発明においては、当技術分野の技量の範囲内の通常の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が用いられうる。そのような技術は文献中に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（本明細書中では「Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９」）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  Ｉｌ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＭＪ．Ｇａｉｔら．１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  ＳＪ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５））；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  ＳＪ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，（１９８４））；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，（１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。
【００１５】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」はＤＮＡおよびＲＮＡを含む。
【００１６】
「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」は核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ中の一連のヌクレオチドであり、２以上のヌクレオチドの鎖のいずれかを意味する。
【００１７】
発現産物、例えばＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素を「コード」する配列または「コード配列」は、発現されると該産物の産生をもたらすヌクレオチド配列である。
【００１８】
「遺伝子」なる語は、１以上のＲＮＡ分子またはタンパク質の全部または一部を含むリボヌクレオチドまたはアミノ酸の特定の配列をコードする又はそれに対応するＤＮＡを含む。遺伝子は、アミノ酸配列へと翻訳されてもされなくてもよいＤＮＡまたはＲＮＡから転写されうる。「標的遺伝子」または「標的ポリヌクレオチド」は、例えば宿主細胞における発現のための発現構築物内に該ポリヌクレオチドを導入することにより、例えば実施者が発現させることを意図する又は発現させている標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００１９】
「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたポリペプチド」などの語は、細胞において又は組換えＤＮＡ発現系において通常見出される他の成分から部分的または完全に分離された、それぞれ、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）またはポリペプチドを含む。これらの成分には、細胞膜、細胞壁、リボソーム、ポリメラーゼ、血清成分および外来性ゲノム配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本発明の１つの実施形態においては、実質的に均一な分子組成物であるが、ある程度の不均一性を伴いうる。
【００２０】
本明細書中で用いるＤＮＡの「増幅」は、ＤＮＡ配列の混合物中の特定のＤＮＡ配列の濃度を増加させるためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を含む。ＰＣＲの説明に関しては、例えば、Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：４８７を参照されたい。
【００２１】
本明細書中で用いる「オリゴヌクレオチド」なる語は、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは関心のある他の核酸をコードするゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズ可能でありうる、一般には少なくとも１０（例えば、１０、１１、１２、１３または１４）、好ましくは少なくとも１５（例えば、１５、１６、１７、１８または１９）、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０）、好ましくは１００ヌクレオチド以下（例えば、４０、５０、６０、７０、８０または９０）の核酸を含む。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐ−ヌクレオチド、３Ｈ−ヌクレオチド、１４Ｃ−ヌクレオチド、３５Ｓ−ヌクレオチドの取り込みにより、または例えばビオチンのような標識が共有結合したヌクレオチドの取り込みにより、標識されうる。本発明の１つの実施形態においては、標識されたオリゴヌクレオチドは、核酸の存在を検出するためのプローブとして使用されうる。もう１つの実施形態においては、オリゴヌクレオチド（そのうちの一方または両方が標識されうる）は、完全長または断片の遺伝子をクローニングするための又は核酸の存在を検出するためのＰＣＲプライマーとして使用されうる。一般に、オリゴヌクレオチドは、例えば核酸合成装置により、合成的に製造される。
【００２２】
いずれの核酸の配列も、当技術分野で公知のいずれかの方法（例えば、化学的配列決定または酵素的配列決定）により配列決定されうる。ＤＮＡの「化学的配列決定」は、例えば、個々の塩基特異的反応を用いてＤＮＡがランダムに切断されるＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５６０）の方法のような方法を含む。ＤＮＡの「酵素的配列決定」は、例えば、Ｓａｎｇｅｒ（Ｓａｎｇｅｒら，（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３）の方法のような方法を含みうる。
【００２３】
本発明の核酸は、本発明の１つの実施形態においては、天然調節（発現制御）配列に隣接していることが可能であり、あるいはプロモーター、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答要素、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’−および３’−非コード領域などを含む異種配列に結合していることが可能である。
【００２４】
「プロモーター」または「プロモーター配列」は、本発明の１つの実施形態においては、細胞内で（例えば、直接的に又は他のプロモーター結合タンパク質もしくは物質を介して）ＲＮＡポリメラーゼに結合しコード配列（例えば免疫グロブリン、例えば抗ＩＧＦ１Ｒ免疫グロブリン）の転写を開始させうるＤＮＡ調節領域である。プロモーター配列は、一般に、その３’末端において、転写開始部位に結合しており、いずれかのレベルで転写を開始させるのに必要な最少数の塩基または要素を含むよう上流（５’方向）に伸長している。該プロモーター配列内には、転写開始部位（簡便には、例えば、ヌクレアーゼＳ１でのマッピングにより定められる）、およびＲＮＡポリメラーゼの結合をもたらすタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が存在しうる。該プロモーターは、エンハンサーおよびリプレッサー配列を含む他の発現制御配列に、または本発明の核酸に機能的に結合していることが可能である。遺伝子発現を制御するために使用されうるプロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号および第５，１６８，０６２号）、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔら，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復配列に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；原核生物発現プロモーター、例えばβ−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆら，（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５）（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ（１９８０）２４２：７４−９４における“Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ”も参照されたい）；および酵母または他の真菌由来のプロモーター要素、例えばＧａｌ  ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーターまたはアルカリホスファターゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
コード配列が細胞内の転写または翻訳制御配列「の制御下にある」、「に機能的に結合されている」または「に機能的に連結されている」または「に作動可能様態で結合されている」と言えるのは、該配列がＲＮＡ、例えばｍＲＮＡへの該コード配列のＲＮＡポリメラーゼ媒介性転写を導く場合であり、ついで該ＲＮＡは（それがイントロンを含有する場合には）トランスＲＮＡスプライシングされることが可能であり、場合によっては、該コード配列によりコードされるタンパク質へと翻訳されうる。プロモーターがβＧｌ−ＩｇＧイントロンに機能的に連結されていると言えるのは、該βＧｌ−ＩｇＧイントロンの非存在下の該プロモーターと比較して増加した、該プロモーターからの発現のレベルを、該イントロンがもたらす場合である。
【００２６】
「発現する」および「発現」なる語は、例えば、対応遺伝子の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによりタンパク質を産生させることにより、遺伝子、例えばＲＮＡまたはＤＮＡ内の情報が現れることを可能にする又はもたらすこと意味する。ＤＮＡ配列は細胞内で又は細胞により発現されて、「発現産物」、例えばＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）またはタンパク質を生成しうる。該発現産物自体も該細胞により「発現される」と言うことが可能である。
【００２７】
「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」なる語は、核酸が宿主細胞に導入されて宿主細胞を形質転換し、場合によっては、該核酸によりコードされる遺伝子の発現および／または該導入核酸の複製を促進することを媒介しうるビヒクル（例えば、プラスミド）を含む。本発明の１つの実施形態においては、該ベクターは、自律複製性核酸、例えば環状プラスミドである。
【００２８】
「形質転換」なる語は細胞内への核酸の導入を意味する。該用語は、抗ＩＧＦ１Ｒ、抗ＩＬ２３、抗ＩＬ２３Ｒ、抗ＩＬ１７、抗ＰＤ１もしくは抗ＨＧＦ抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントをコードする核酸の、細胞内への導入を含む。該導入遺伝子または配列は「クローン」と称されうる。該導入ＤＮＡまたはＲＮＡを受け入れる宿主細胞は「形質転換」され、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、宿主細胞と同じ属もしくは種の細胞または異なる属もしくは種の細胞を含む任意の起源に由来することが可能である。プラスミドは、当技術分野で一般に公知である多数の方法のいずれかにより細胞内に導入されうる。例えば、本発明のプラスミドは、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン法またはリポソーム法により細胞を形質転換するために使用されうる。
【００２９】
「宿主細胞」なる語は、該細胞による物質の産生、例えば、該細胞による遺伝子、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列、タンパク質または酵素の発現または複製のために任意の様態で選択され、修飾され、トランスフェクトされ、形質転換され、成長され又は使用され若しくは操作される任意の生物の任意の細胞を含む。宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−９６１８）、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞およびＣＨＯ−ＤＸＢ−１１細胞が含まれる。
【００３０】
「発現構築物」は、標的遺伝子の発現を駆動しうるポリヌクレオチドであり、ここで、該標的遺伝子は該ポリヌクレオチド内にコードされている。例えば、該遺伝子がプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）に機能的に連結されており、それらの間にβＧｌ−ＩｇＧイントロンが位置する。
【００３１】
「プロモーター／βＧｌ−ＩｇＧイントロン」は、βＧｌ−ＩｇＧイントロンに機能的に連結されたプロモーターである。該βＧｌ−ＩｇＧイントロンは、該βＧｌ−ＩｇＧイントロンの非存在下より高いレベルの、該プロモーターからの発現を引き起こす。
【００３２】
「βＧｌ−ＩｇＧイントロン」は、スプライスドナー部位（例えば、ベータ−グロビン）とスプライスアクセプター部位（例えば、ＩｇＧ）とを含むイントロンである。
【００３３】
本発明の１つの実施形態においては、発現構築物は、コザックコンセンサス配列、例えばｇｃｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇ（配列番号１）またはｇｃｃｇｃｃａｃｃａｔｇ（配列番号２）を含む。
【００３４】
「発現系」なる語は、宿主細胞および和合性ベクターを意味し、これらは、該ベクターにより運ばれ該宿主細胞内に導入されるタンパク質または核酸を適当な条件下で発現しうる。一般的な発現系には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳類宿主細胞およびベクターが含まれる。前記のとおり、宿主細胞には、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１またはＤＸＢ−１１；そしてまた、ＨｅＬａ細胞およびＮＩＨ  ３Ｔ３細胞およびＮＳＯ細胞（非Ｉｇ産生性マウス骨髄腫細胞系）が含まれる。
【００３５】
本発明のプラスミドベクターには、当技術分野で公知の幾つかの増幅可能なマーカーのいずれかが含まれうる。増幅可能なマーカーの使用はＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ（１９８９）に記載されている。薬物耐性哺乳類細胞における遺伝子増幅のための有用な選択マーカーには、ＤＨＦＲ（ＭＴＸ（メトトレキセート）耐性）（Ａｌｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７（１９７８）；Ｗｉｇｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５６７（１９８０））；メタロチオネイン（カドミウム耐性）（Ｂｅａｃｈら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２１０（１９８１））；ＣＡＤ（Ｎ−（ホスホノアセチル）−ｌ−アスパルタート（ＰＡＬＡ）耐性）（Ｗａｈｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：８６７９（１９７９））；アデニル酸デアミナーゼ（コホルマイシン耐性）（Ｄｅｂａｔｉｓｓｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１７７６（１９８６））；ＩＭＰ  ５’−デヒドロゲナーゼ（ミコフェノール酸耐性）（Ｈｕｂｅｒｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：３１５１（１９８１））および当技術分野で公知の他のマーカー（例えば、Ｋａｕｆｍａｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：５３７−５６６（１９８８）において概説されている）が含まれる。
【００３６】
本発明は、例えば本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントのような、本発明のプラスミドによりコードされる標的遺伝子をコードするアミノ酸またはヌクレオチド配列への任意の表面的な又は若干の修飾を想定している。ポリヌクレオチド配列の「配列保存的変異体」は、与えられたコドンにおける１以上のヌクレオチドの変化が、その位置でコードされるアミノ酸の変化を全く引き起こさないものである。本発明の標的遺伝子の機能保存的変異体も本発明で想定される。「機能保存的変異体」は、類似特性を有するアミノ酸でのアミノ酸の置換（何らこれに限定されるものではない）を含む、該ポリペプチドの全体的コンホメーションおよび機能を変化させることなくタンパク質内の１以上のアミノ酸残基が改変されているものである。類似特性を有するアミノ酸は当技術分野でよく知られている。例えば、交換可能でありうる極性／親水性アミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、トレオニン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、交換可能でありうる無極性／親水性アミノ酸には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれ、交換可能でありうるアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、交換可能でありうる塩基性アミノ酸には、ヒスチジン、リシンおよびアルギニンが含まれる。アミノ酸配列の保存的置換は、１つのサブタイプ（例えば、極性／親水性）のアミノ酸が同一サブタイプの別のアミノ酸で置換される置換を意味し、本発明の１つの実施形態においては、保存的に置換されたポリペプチドは、実質的に同じレベルの生物活性を保有する。
【００３７】
本発明は、標的遺伝子をコードする核酸とそれにハイブリダイズする核酸とを含むプラスミドを含む。本発明の１つの実施形態においては、該核酸は、低いストリンジェンシー条件下、より好ましくは中等度のストリンジェンシー条件下、最も好ましくは高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする。核酸分子の一本鎖形態が温度および溶液イオン強度の適当な条件下（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲を参照されたい）で他方の核酸分子にアニールしうる場合、核酸分子は、別の核酸分子、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡに「ハイブリダイズ可能」である。温度およびイオン強度の条件は該ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。典型的な低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件には、本発明の１つの実施形態においては、５５℃、５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、０．２５％  乳および無ホルムアミド；または３０％  ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳを含む。典型的な中等度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、５×または６×ＳＳＣを含有する４０％  ホルムアミド中でハイブリダイゼーションを行うこと以外は、低いストリンジェンシー条件に類似している。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、５０％  ホルムアミド、５×または６×ＳＳＣ中、そして場合によっては、より高い温度（例えば、５７℃、５９℃、６０℃、６２℃、６３℃、６５℃または６８℃）でハイブリダイゼーションを行うこと以外は、低いストリンジェンシー条件に類似している。一般に、ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍ  クエン酸Ｎａである。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチが可能であるが、ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを要する。核酸のハイブリダイゼーションのための適当なストリンジェンシーは核酸の長さ及び相補性の度合、当技術分野でよく知られた変数に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合が大きくなればなるほど、それらの核酸がハイブリダイズしうるストリンジェンシーは高くなる。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドの場合、融解温度を計算するための式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲，９．５０−９．５１を参照されたい）。より短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置がより重要となり、該オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲，１１．７−１１．８）。
【００３８】
ＢＬＡＳＴアルゴリズム（この場合、該アルゴリズムのパラメーターは、それぞれの基準配列の全長にわたってそれぞれの配列間で最大の一致が得られるように選択される）により比較を行った場合に本発明の基準ヌクレオチドおよびアミノ酸配列（例えば、配列番号６〜３１のいずれか）に対して少なくとも約７０％同一である、好ましくは少なくとも約８０％同一である、より好ましくは少なくとも約９０％同一である、最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）同一であるアミノ酸配列を含む標的ポリペプチドをコードする標的ヌクレオチド配列を含むプラスミドも、本発明に含まれる。ＢＬＡＳＴアルゴリズム（この場合、該アルゴリズムのパラメーターは、それぞれの基準配列の全長にわたってそれぞれの配列間で最大の一致が得られるように選択される）により比較を行った場合に本発明の基準アミノ酸配列（例えば、配列番号６〜３１のいずれか）に対して少なくとも約７０％類似している、好ましくは少なくとも約８０％類似している、より好ましくは少なくとも約９０％類似している、最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）類似しているアミノ酸配列を含むポリペプチドも、本発明に含まれる。
【００３９】
配列同一性は、比較されている２つの配列のヌクレオチドまたはアミノ酸間の厳密な一致（マッチ）を意味する。配列類似性は、生化学的に関連している非同一アミノ酸間の一致に加えて、比較されている２つのポリペプチドのアミノ酸間の厳密な一致の両方を意味する。類似特性を共有しており交換可能でありうる生化学的に関連しているアミノ酸は前記で説明されている。
【００４０】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する以下の参考文献を参照により本明細書に組み入れることとする：ＢＬＡＳＴアルゴリズム：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．ら，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌら，（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら，（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら，（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９−１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ら，（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７−７０；アライメントスコアリング系：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら，“Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３４５−３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．ら，“Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．”ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．“Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．ら，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：６６−７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．ら，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００；アライメント統計学：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．ら，（１９９４）Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２−２０３９；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．“Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．”ｉｎ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ編），（１９９７）ｐｐ．１−１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
【００４１】
イントロン
本発明は、ベータ−グロビンスプライスドナーおよび免疫グロブリンスプライスアクセプターを含むβＧｌ−ＩｇＧイントロンに機能的に連結されたプロモーター（ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーター−調節領域）（そのプロモーター／イントロンの組合せは標的遺伝子、例えば免疫グロブリンに機能的に連結されている）を含むポリヌクレオチド、例えばベクター（例えばプラスミド）を含む。本発明のポリヌクレオチドを使用するそのような標的遺伝子の発現方法も本発明の一部である。本明細書に記載されているとおり、ＣＭＶプロモーターがβＧｌ−ＩｇＧイントロン（ベータ−グロビンスプライスドナー／Ｉｇ．スプライスアクセプター）に連結されている場合に、ヒトＣＭＶプロモーターからの例えば抗ＩＧＦ１Ｒ免疫グロブリンのような遺伝子の発現が著しく増加することが、本発明において見出された。
【００４２】
例えば、本発明の１つの実施形態においては、該プロモーター／イントロン構築物は、それが機能的に連結されている標的遺伝子の上流に位置する。該プロモーター／イントロンに標的遺伝子を機能的に連結することを含む該標的遺伝子の発現を増加させるための方法も本発明の範囲内である。
【００４３】
本発明の１つの実施形態においては、ベータ−グロビンスプライスドナーとＩｇＧ．スプライスアクセプターとを含むβＧｌ−ＩｇＧイントロンは以下のヌクレオチド配列：
【化３】
2012508563.tif 000005
【００４４】
（配列番号３）を含む。該ベータグロビンスプライスドナー部位は実線の下線で示されており、該免疫グロブリンスプライスアクセプターは破線の下線で示されている。本発明の１つの実施形態においては、該ベータグロビンスプライスドナー部位はヌクレオチド配列ＣＡＧＧＴＡＡＧＴＴＴＡ（配列番号４）を含む。本発明の１つの実施形態においては、該免疫グロブリンスプライスアクセプター部位は、例えばヌクレオチド配列ＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＣ（配列番号５）を含むＩｇＧ可変領域から誘導される。
【００４５】
本発明の１つの実施形態においては、βＧｌ−ＩｇＧイントロンは
【化４】
2012508563.tif 000006
【００４６】
（配列番号３のヌクレオチド３９−１９０）を含む。
【００４７】
免疫グロブリン
本発明は、例えば免疫グロブリンのような標的遺伝子に機能的に結合されたプロモーター／イントロン構築物を含むポリヌクレオチド（例えば、プラスミド）を含む実施形態を含む。本発明の１つの実施形態においては、該免疫グロブリンは、場合によっては免疫グロブリン定常領域に連結された、抗ＩＧＦ１Ｒ免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変領域を含む。
【００４８】
本発明の１つの実施形態においては、該免疫グロブリン鎖は、以下に記載されているもののいずれか、例えば、以下の免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖のいずれか又はそのＣＤＲのいずれかをコードしている。点線の下線が付された記号はシグナルペプチドをコードしている。実線の下線が付された記号はＣＤＲをコードしている。無修飾文字はフレームワーク領域をコードしている。本発明の１つの実施形態においては、抗体鎖は、シグナルペプチドを欠く成熟フラグメントである。本発明の１つの実施形態においては、シグナルペプチドを含むプロセシングされていない免疫グロブリン鎖が発現され、宿主細胞から分泌され、それにより該シグナルペプチドがプロセシングされ除去されて成熟免疫グロブリン鎖を与える。そのような組成物および発現方法は本発明の一部を構成する。
【００４９】
以下の標的免疫グロブリンアミノ酸配列のいずれかをコードするポリヌクレオチドは本発明の一部を構成する。
【００５０】
１９Ｄ１２／１５Ｈ１２軽鎖（配列番号６）
【化５】
2012508563.tif 000007
【００５１】
１９Ｄ１２／１５Ｈ１２重鎖（配列番号７）
【化６】
2012508563.tif 000008
【００５２】
１９Ｄ１２／１５Ｈ１２軽鎖−Ｃ（ＬＣＣ）（配列番号８）
【化７】
2012508563.tif 000009
【００５３】
１９Ｄ１２／１５Ｈ１２軽鎖−Ｄ（ＬＣＤ）（配列番号９）
【化８】
2012508563.tif 000010
【００５４】
１９Ｄ１２／１５Ｈ１２軽鎖−Ｅ（ＬＣＥ）（配列番号１０）
【化９】
2012508563.tif 000011
【００５５】
１９Ｄ１２／１５Ｈ１２軽鎖−Ｆ（ＬＣＦ）（配列番号１１）
【化１０】
2012508563.tif 000012
【００５６】
１９Ｄ１２／１５Ｈ１２重鎖−Ａ（ＨＣＡ）（配列番号１２）
【化１１】
2012508563.tif 000013
【００５７】
１９Ｄ１２／１５Ｈ１２重鎖−Ｂ（ＨＣＢ）（配列番号１３）
【化１２】
2012508563.tif 000014
【００５８】
国際出願公開第ＷＯ２００３／１００００８号（これに各配列が開示されている；その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。
【００５９】
２Ｃ６重鎖
【化１３】
2012508563.tif 000015
【００６０】
（配列番号１４）
２Ｃ６  ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨ（配列番号１５）
２Ｃ６  ＣＤＲ−Ｈ２：ＧＩＳＷＮＳＧＳＫＧＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号１６）
２Ｃ６  ＣＤＲ−Ｈ３：ＤＩＲＩＧＶＡＡＳＹＹＦＧＭＤＶ（配列番号１７）
２Ｃ６軽鎖
【化１４】
2012508563.tif 000016
【００６１】
（配列番号１８）
２Ｃ６  ＣＤＲ−Ｌ１：ＲＡＳＱＧＩＳＳＶＬＡ（配列番号１９）
２Ｃ６  ＣＤＲ−Ｌ２：ＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号２０）
２Ｃ６  ＣＤＲ−Ｌ３：ＱＱＦＮＳＹＰＹＴ（配列番号２１）
９Ｈ２重鎖
【化１５】
2012508563.tif 000017
2012508563.tif 000018
【００６２】
（配列番号２２）
９Ｈ２  ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＹＴＦＴＳＹＶＭＨ（配列番号２３）
９Ｈ２  ＣＤＲ−Ｈ２：ＷＩＮＡＧＮＧＮＴＫＹＳＱＫＦＱＧ（配列番号２４）
９Ｈ２  ＣＤＲ−Ｈ３：ＧＧＭＰＶＡＧＰＧＹＦＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号２５）
９Ｈ２軽鎖
【化１６】
2012508563.tif 000019
【００６３】
（配列番号２６）
９Ｈ２  ＣＤＲ−Ｌ１：ＲＡＳＱＳＶＳＲＳＹＬＡ（配列番号２７）
９Ｈ２  ＣＤＲ−Ｌ２：ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号２８）
９Ｈ２  ＣＤＲ−Ｌ３：ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号２９）
重鎖免疫グロブリン可変領域＃１．０配列
【化１７】
2012508563.tif 000020
【００６４】
（配列番号３０）
軽鎖免疫グロブリン可変領域＃１．０配列
【化１８】
2012508563.tif 000021
【００６５】
（配列番号３１）
本発明の実施形態は、該ポリペプチド（例えば、プラスミド）が、２以上の免疫グロブリン、例えば、本明細書に記載のもののいずれかの組合せ（例えば、重鎖Ｉｇ．＃１．０および軽鎖Ｉｇ．＃１．０；またはＬＣＣおよびＨＣＡ；またはＬＣＦおよびＨＣＡ；またはＬＣＣおよびＨＣＢ）に機能的に連結されたプロモーター／βＧｌ−ＩｇＧイントロン構築物を含む実施形態を含む。
【００６６】
プラスミド
本発明は１つには、抗ＩＧＦ１Ｒ重鎖および軽鎖の高レベルの発現を示す単離されたプラスミドを提供する。これらのプラスミドはｐＡＩＧ１ＦＲＬＣｂ２Ｖ１およびｐＡＩＧ１ＦＲＬＣｂ２Ｖ３である。これらのプラスミドは、ＬＣＦおよびＨＣＡを含む抗体をコードしており、該抗体の発現を導く。該プラスミドの配列を以下に示す。
【００６７】
ｐＡＩＧ１ＦＲＬＣＢ２Ｖ１：
【化１９】
2012508563.tif 000022
2012508563.tif 000023
2012508563.tif 000024
2012508563.tif 000025
【００６８】
（配列番号３５）
ｐＡＩＧ１ＦＲＬＣＢ２Ｖ３：
【化２０】
2012508563.tif 000026
2012508563.tif 000027
2012508563.tif 000028
2012508563.tif 000029
【００６９】
（配列番号３６）
本発明は更に、１つには、抗ＩＬ２３  ｐ１９重鎖および軽鎖の高レベルの発現を示す単離されたプラスミドを提供する。１つのプラスミドはｐＡＩＬ２３Ｖ１−Ｋである。ｐＡＩＬ２３Ｖ１−Ｋプラスミドの配列を以下に示す。
【化２１】
2012508563.tif 000030
2012508563.tif 000031
2012508563.tif 000032
2012508563.tif 000033
【００７０】
（配列番号４４）
本発明は更に、１つには、抗ＩＬ２３Ｒ重鎖および軽鎖の高レベルの発現を示す単離されたプラスミドを提供する。１つのプラスミドはｐＡＩＬ２３ＲＶ１である。ｐＡＩＬ２３ＲＶ１プラスミドの配列を以下に示す。
【化２２】
2012508563.tif 000034
2012508563.tif 000035
2012508563.tif 000036
2012508563.tif 000037
2012508563.tif 000038
【００７１】
（配列番号４５）
本発明は更に、１つには、抗ＩＬ１７重鎖および軽鎖の高レベルの発現を示す単離されたプラスミドを提供する。１つのプラスミドはｐＡＩＬ１７ＡＶ１である。ｐＡＩＬ１７ＡＶ１プラスミドの配列を以下に示す。
【化２３】
2012508563.tif 000039
2012508563.tif 000040
2012508563.tif 000041
2012508563.tif 000042
【００７２】
（配列番号４６）
本発明は更に、１つには、抗ＰＤ１（プログラム死１）重鎖および軽鎖の高レベルの発現を示す単離されたプラスミドを提供する。１つのプラスミドはｐＡＰＤ１６Ｖ１−ＧＡである。ｐＡＰＤ１６Ｖ１−ＧＡプラスミドの配列を以下に示す。
【化２４】
2012508563.tif 000043
2012508563.tif 000044
2012508563.tif 000045
2012508563.tif 000046
2012508563.tif 000047
【００７３】
（配列番号４７）
本発明は更に、１つには、抗ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）重鎖および軽鎖の高レベルの発現を示す単離されたプラスミドを提供する。１つのプラスミドはｐＡＨＧＦＶ１である。ｐＡＨＧＦＶ１プラスミドの配列を以下に示す。
【化２５】
2012508563.tif 000048
2012508563.tif 000049
2012508563.tif 000050
2012508563.tif 000051
【００７４】
（配列番号４８）
これらのプラスミドのプラスミド地図は本出願の図１〜１０においても記載されている。
【００７５】
発現
発現されるべき標的遺伝子を含むベクター、例えばプラスミド（例えば図１〜１０）は、当技術分野で公知の幾つかの方法のいずれかにより宿主細胞内に導入されうる。細胞壁バリヤーを伴わない細胞が宿主細胞として使用される場合、形質転換は、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：５４６（１９７８）に記載されているリン酸カルシウム沈殿法により行われうる。しかし、ＤＮＡを細胞内に導入するための他の方法、例えば核注入またはプロトプラスト融合も用いられうる。形質転換のための他の方法には、エレクトロポレーション、リポソーム形質転換およびＤＥＡＥ−デキストラン形質転換が含まれる。
【００７６】
原核生物細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えばＢＬ２１またはＢＤ２１ＤＥ３またはＨＢ１０１またはＤＨ１またはＤＨ５）、または実質的な細胞壁構造体を含有する細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））が使用される場合には、形質転換は、Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｎ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）６９：２１１０（１９７２）に記載されている塩化カルシウムを使用するカルシウム処理によるものでありうる。
【００７７】
本発明のベクター（例えば、図１〜１０）を含む宿主細胞は、標的遺伝子の発現のための必要な特性を有するクローンを特定するために選択され、スクリーニングされうる。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞においては、最大発現を達成するための１つの一般的なアプローチは、突然変異細胞系の使用、およびコトランスフェクトされた選択マーカー、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１；Ｓｃｈｉｍｋｅら（１９８２）Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎｏｇｒ．６０：７９−８６）に関する数ヶ月にわたる選択圧の漸増を含む。高い生産率を達成するためには、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）陰性細胞系（例えば、ＣＨＯ細胞系）（Ｕｒｌａｕｂら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０）を、発現すべき標的遺伝子と共に機能性ＤＨＦＲ遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換する。培地への漸増量のＤＨＦＲアンタゴニストメトトレキセート（ＭＴＸ）の添加に応答して該ベクター挿入標的遺伝子の増幅が生じ、該組換え遺伝子の複数のコピーを含有するクローンまたは亜集団を生成させ、選択することが可能である（Ｗｕｍ（１９９０）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  １８：１５９−１６４）。該遺伝子増幅法は、高い標的遺伝子コピー数および所望のタンパク質の高い生産率を示す安定な細胞系が得られるまでに、典型的には数ヶ月を要する。
【００７８】
本発明の１つの実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｄ１  ＤＸＢ１１）ＤＮＡ内に組込まれるか、または異所性（非組込み性）である。本発明の１つの実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは該細胞内に細胞当たり数コピー（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０コピー）で存在する。安定性を改善するために発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡ内に組込まれている場合には、該宿主細胞のＤＮＡ内への組込み後に該ベクター配列が増幅されている細胞系を選択することにより、該ベクターＤＮＡのコピー数、ひいては発現されうる産物の量を増加させることが可能である。
【００７９】
標的遺伝子を発現する細胞を増殖させるためには、当技術分野で公知の幾つかの細胞培養培地のいずれかが使用されうる。幾つかの商業的に入手可能な培地が利用可能である。治療用に使用されるタンパク質を発現させる場合には、動物産物非含有培地（例えば、無血清培地（ＳＦＭ））が望ましいかもしれない。無血清培地内での増殖に細胞を適応させることが可能な幾つかの方法が当技術分野で公知である。例えば、直接適応は、細胞を血清補足培地から無血清培地へと単に移すことを含む。逐次適応またはウィーニング（ｗｅａｎｉｎｇ）は、細胞を血清補足培地から無血清培地へと幾つかの段階（例えば、２５％  ＳＦＭ、５０％  ＳＦＭ、７５％  ＳＦＭ、ついで９０％  ＳＦＭ（約３継代）、ついで１００％  ＳＦＭ）で移すことを含む。逐次適応は、細胞に対する過酷さが直接適応より低い傾向にある。一般に、細胞を無血清培地に適応させるためには、該培養は中期対数期にあるべきであり、９０％を超える生存率を示すべきであり、適応中より高い初期細胞接種物数で接種されるべきである。
【００８０】
また、本発明の宿主細胞を含有する細胞系はマスター細胞バンク（ＭＣＢ）および実施用細胞バンク（ＷＣＢ）中で保存されうる。典型的には、細胞系が多数の製造サイクルにわたって使用される場合には、マスター細胞バンクまたはマスターシードバンク（ＭＳＢ）と実施細胞バンクとからなる２段式細胞保存系が確立されうる。細胞系は単一宿主細胞クローンから樹立され、この細胞系は、ＭＣＢを形成するために使用される。一般に、このＭＣＢは、汚染物、例えば細菌、真菌、ウイルスおよびマイコプラズマに関して特徴づけられ、徹底的に試験されなければならない。ＭＣＢからの細胞のサンプルは、ＷＣＢを形成するために増殖されることが可能であり、これは、製造プロセスにおいて使用される前に細胞生存性に関して特徴づけられる。ＭＣＢまたはＷＣＢにおける細胞はバイアル内で、例えば低温（例えば０℃以下、−２０℃または−８０℃）で保存されうる。
【００８１】
典型的には、該実施用細胞バンクは、保存前に数継代にわたって増殖されたマスターバンクのバイアルの１つからの細胞を含む。一般に、将来の細胞が必要な場合、それは該実施用細胞バンクから採取され、一方、該細胞培養内の遺伝的変異を回避するために低い継代数を有する細胞のストックが確保されるよう、該マスター細胞バンクは、必要な場合だけ使用される。
【００８２】
したがって、本発明は、細胞、例えばＣＨＯ細胞を本発明のプラスミドで形質転換し、該形質転換細胞の単一クローン集団を選択し（例えば、培養プレート上の単コロニー増殖）、該クローン集団を（例えば、液体増殖培地内で）培養し、該培養からの細胞が細菌、ウイルス、マイコプラズマおよび／または真菌を含有するかどうか、ならびに該培養の細胞が検出可能レベルのそのような因子を含有しないかどうかを判定し、そのような培養から採取された細胞を例えば１以上の別々の容器、例えばバイアル（例えば、バイアル当たり約１０７個の細胞を含む）内に冷却下（例えば、−８０℃）で保存することを含む、マスター細胞バンクの製造方法を含む。本発明はまた、マスター細胞バンクからの細胞のサンプルを選択し、該細胞を増殖（成長）させ、該細胞を１以上の容器、例えばバイアル内に保存することを含む、実施用細胞バンクの製造方法を含む。実施用細胞バンクを製造するために使用される細胞も、該マスター細胞バンクの場合と同様に、細菌、ウイルス、マイコプラズマまたは真菌に関して試験されうる。
【００８３】
本発明はまた、本発明のいずれかの宿主細胞（例えば、本明細書に記載のもの）またはそれらからの１以上の細胞を含むマスター細胞バンクおよび／または実施用細胞バンクを含む。マスター細胞バンクまたは実施用細胞バンク内の細胞は、数百個（例えば、１００、２００、５００、７００、１０００または２０００バイアル以上）の容器、例えばバイアル（例えば、ガラスバイアル）内に冷却下（例えば、０℃以下、−２０℃または−８０℃）で保存されうる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】ｐＡＩＧ１ＦＲＬＣｂ２Ｖ１のプラスミド地図。このプラスミドの特性地図を以下に示す：ＡＰ（Ｒ）開始：３９６５  終結：４８２８（相補的）ＶＤＪ開始：５９６６  終結：６３９３ＩｇＧ１開始：６３９３  終結：７３７３ＩｇＧ１非ゲノム領域ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡ開始：６０１  終結：１３４７（相補的）ＳＶ４０  ｔ  Ａｇイントロン開始：１１９１６  終結：６００カッパ開始：１００５５  終結：１０３７８（相補的）カッパ鎖ＶＪ開始：１０３７９  終結：１０７５６（相補的）ＩＧＦ−１ＲのＶＪ（ＬＣｂ，ヒト生殖系列配列）ｐＢＲ３２２開始：２８１１  終結：３０１９（相補的）ｐＢＲ３２２開始：３０２０  終結：５０３３ＴＫ−ヒグロマイシンｓｅｑ開始：７６８２  終結：９６９１（相補的）ベータグロビンポリＡシグナル開始：７３９８  終結：７６３６ベータグロビンポリＡシグナル開始：９７８４  終結：１００３２（相補的）ＳＶ４０ポリＡシグナル開始：１１６６９  終結：１１９１７ＭＭＴＶ−ＬＴＲ開始：１３４８  終結：２８１０（相補的）ｈＣＭＶ／βＧｌ−ＩｇＧイントロン開始：５０６９  終結：５９１０ヒトＣＭＶプロモーター／βＧｌ−ＩｇＧイントロンｈＣＭＶ／βＧｌ−ＩｇＧイントロン開始：１０７７８  終結：１１６１９（相補的）ヒトＣＭＶプロモーター／βＧｌ−ＩｇＧイントロンｐＢＲ  ＯＲＩ開始：３２０７  終結：３２０７
【図２】ｐＡＩＧ１ＦＲＬＣｂ２Ｖ３のプラスミド地図。このプラスミドの特性地図を以下に示す：ＡＰ（Ｒ）開始：３９６５  終結：４８２８（相補的）ＩｇＧ１開始：７３７１  終結：８３５１（相補的）ＩｇＧ１非ゲノム領域ＶＤＪ開始：８３５１  終結：８７７８（相補的）ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡ開始：６０１  終結：１３４７（相補的）ＳＶ４０  ｔ  Ａｇイントロン開始：１１９１６  終結：６００カッパ開始：１００５５  終結：１０３７８（相補的）カッパ鎖ＶＪ開始：１０３７９  終結：１０７５６（相補的）ＩＧＦ−１ＲのＶＪ（ＬＣｂ，ヒト生殖系列配列）ｐＢＲ３２２開始：２８１１  終結：３０１９（相補的）ｐＢＲ３２２開始：３０２０  終結：５０３３ＴＫ−ヒグロマイシンｓｅｑ開始：５０５３  終結：７０６２ベータグロビンポリＡシグナル開始：７１０８  終結：７３４６（相補的）ベータグロビンｐＡシグナル開始：９７８４  終結：１００３２（相補的）ＳＶ４０ポリＡシグナル開始：１１６６９  終結：１１９１７ＭＭＴＶ−ＬＴＲ開始：１３４８  終結：２８１０（相補的）ｈＣＭＶ／βＧｌ−ＩｇＧイントロン開始：８８３４  終結：９６７５（相補的）βＧｌ−ＩｇＧイントロンを伴うヒトＣＭＶプロモーターｈＣＭＶ／βＧｌ−ＩｇＧイントロン開始：１０７７８  終結：１１６１９（相補的）ヒトＣＭＶプロモーターおよびβＧｌ−ＩｇＧイントロンｐＢＲ  ＯＲＩ開始：３２０７  終結：３２０７
【図３】ｐＡＩＧ１ＦＲＶ１のプラスミド地図。
【００８５】
ＡＰ（Ｒ）
開始：３９６５  終結：４８２８（相補的）
ＶＤＪ
開始：５８２４  終結：６２５１
１９Ｄ１２ハイブリドーマのＩＧＦＲ１のＶＤＪ
ＩｇＧ１
開始：６２４１  終結：７２３１
ＩｇＧ１非ゲノム領域
ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡ
開始：６０１  終結：１３４７（相補的）
ＳＶ４０  ｔ  Ａｇイントロン
開始：１１７４０  終結：６００
Ｋａｐ
開始：９８９８  終結：１０２３３（相補的）
ｈｕ−抗ＩＧＦＲ遺伝子のカッパ鎖
ＶＪ
開始：１０２３４  終結：１０６１４（相補的）
軽鎖に関するｈｕ−抗ＩＧＦＲ遺伝子のＶＪドメイン
ｐＢＲ３２２
開始：２８１１  終結：３０１９（相補的）
ｐＢＲ３２２
開始：３０２０  終結：５０３３
ＴＫ−ヒグロマイシンｓｅｑ
開始：７５４０  終結：９５４９（相補的）
Ｕｎｉｏｎ  Ｕ−３におけるＴＫ−ヒグロマイシン配列
ベータグロビンポリＡシグナル
開始：７２５６  終結：７４９４
ベータグロビンｐＡシグナル
開始：９６４２  終結：９８９０（相補的）
ＳＶ４０ポリＡ
開始：１１４９３  終結：１１７４１
ＭＭＴＶ−ＬＴＲ
開始：１３４８  終結：２８１０（相補的）
ＣＭＶ
開始：１０８０１  終結：１１４５５（相補的）
ＣＭＶ
開始：５０６９  終結：５７２３
Ｔ７プロモーター／プライミング部位
開始：５７２３  終結：５７４２
Ｔ７プロモーター／プライミング部位
開始：１０７８２  終結：１０８０１（相補的）
ｐＢＲ  ＯＲＩ
開始：３２０７  終結：３２０７
【図４】ｐＡＩＧ１ＦＲＶ３のプラスミド地図。
【００８６】
ＡＰ（Ｒ）
開始：３９６５  終結：４８２８（相補的）
ＩｇＧ１
開始：７３７１  終結：８３６１（相補的）
ＩｇＧ１非ゲノム領域
ＶＤＪ
開始：８３５１  終結：８７７８（相補的）
１９Ｄ１２ハイブリドーマのＩＧＦＲ１のＶＤＪ
ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡ
開始：６０１  終結：１３４７（相補的）
ＳＶ４０  ｔ  Ａｇイントロン
開始：１１７４０  終結：６００
Ｋａｐ
開始：９８９８  終結：１０２３３（相補的）
ｈｕ−抗ＩＧＦＲ遺伝子のカッパ鎖
ＶＪ
開始：１０２３４  終結：１０６１４（相補的）
軽鎖に関するｈｕ−抗ＩＧＦＲ遺伝子のＶＪドメイン
ｐＢＲ３２２
開始：２８１１  終結：３０１９（相補的）
ｐＢＲ３２２
開始：３０２０  終結：５０３３
ＴＫ−ヒグロマイシンｓｅｑ
開始：５０５３  終結：７０６２
ＴＫ−ヒグロマイシン
ベータグロビンポリＡシグナル
開始：７１０８  終結：７３４６（相補的）
ベータグロビンｐＡシグナル
開始：９６４２  終結：９８９０（相補的）
ＳＶ４０ポリＡ
開始：１１４９３  終結：１１７４１
ＭＭＴＶ−ＬＴＲ
開始：１３４８  終結：２８１０（相補的）
ＣＭＶ
開始：１０８０１  終結：１１４５５（相補的）
Ｔ７プロモーター／プライミング部位
開始：８８６０  終結：８８７９（相補的）
ＣＭＶ
開始：８８７９  終結：９５３３（相補的）
Ｔ７プロモーター／プライミング部位
開始：１０７８２  終結：１０８０１（相補的）
ｐＢＲ  ＯＲＩ
開始：３２０７  終結：３２０７
【図５】ｐＡＩＧ１ＦＲＬＣＢ２−Ｖ１Ｋのプラスミド地図。
【００８７】
ＡＰ（Ｒ）
開始：３９６５  終結：４８２８（相補的）
ＶＤＪ
開始：６３５６  終結：６３５６
抗ＩＬ１０（１２Ｇ８）のＶＤＪ領域
ＩｇＧ１
開始：６３６１  終結：７３４１
ＩｇＧ１非ゲノム領域
ＶＪ
開始：１０３６８  終結：１０７４５（相補的）
ＩｇＫ
開始：１００１３  終結：１０３６７（相補的）
１２Ｇ８軽鎖（抗ＩＬ１０）のＶＤＪ−ＩｇＫ
ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡ
開始：６０１  終結：１３４７（相補的）
ＳＶ４０  ｔ  Ａｇイントロン
開始：１１８９９  終結：６００
ｐＢＲ３２２
開始：２８１１  終結：３０１９（相補的）
ｐＢＲ３２２
開始：３０２０  終結：５０３３
ＴＫ−ヒグロマイシンｓｅｑ
開始：７６５０  終結：９６５９（相補的）
ＴＫ−ヒグロマイシン
ベータグロビンポリＡシグナル
開始：７３６６  終結：７６０４
ベータグロビンｐＡシグナル
開始：９７６３  終結：９９９６
ＳＶ４０ポリＡ
開始：１１６５２  終結：１１９００
ＭＭＴＶ−ＬＴＲ
開始：１３４８  終結：２８１０（相補的）
ｈＣＭＶ／βＧｌ−ＩｇＧイントロン
開始：５０６９  終結：５９１０
ハイブリッドイントロンを伴うヒトＣＭＶプロモーター
ｈＣＭＶ／βＧｌ−ＩｇＧイントロン
開始：１０７７３  終結：１１６１４（相補的）
ヒトＣＭＶプロモーターおよびハイブリッドイントロン
ｐＢＲ  ＯＲＩ
開始：３２０７  終結：３２０７
【図６−１】ｐＡＩＬ２３Ｖ１Ｋのプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ２３  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ２３  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０９０６−１０７５５および５７６０−５９１１に位置する。
【図６−２】ｐＡＩＬ２３Ｖ１Ｋのプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ２３  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ２３  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０９０６−１０７５５および５７６０−５９１１に位置する。
【図６−３】ｐＡＩＬ２３Ｖ１Ｋのプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ２３  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ２３  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０９０６−１０７５５および５７６０−５９１１に位置する。
【図６−４】ｐＡＩＬ２３Ｖ１Ｋのプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ２３  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ２３  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０９０６−１０７５５および５７６０−５９１１に位置する。
【図６−５】ｐＡＩＬ２３Ｖ１Ｋのプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ２３  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ２３  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０９０６−１０７５５および５７６０−５９１１に位置する。
【図７−１】ｐＡＩＬ２３ＲＶ１のプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ２３  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ２３Ｒ  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０９１４−１０７６３および５７６０−５９１１に位置する。
【図７−２】ｐＡＩＬ２３ＲＶ１のプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ２３  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ２３Ｒ  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０９１４−１０７６３および５７６０−５９１１に位置する。
【図７−３】ｐＡＩＬ２３ＲＶ１のプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ２３  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ２３Ｒ  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０９１４−１０７６３および５７６０−５９１１に位置する。
【図７−４】ｐＡＩＬ２３ＲＶ１のプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ２３  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ２３Ｒ  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０９１４−１０７６３および５７６０−５９１１に位置する。
【図７−５】ｐＡＩＬ２３ＲＶ１のプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ２３  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ２３Ｒ  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０９１４−１０７６３および５７６０−５９１１に位置する。
【図８−１】ｐＡＩＬ１７ＡＶ１のプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ１７  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ１７  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０９３４−１０７８３および５７５９−５９１０に位置する。
【図８−２】ｐＡＩＬ１７ＡＶ１のプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ１７  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ１７  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０９３４−１０７８３および５７５９−５９１０に位置する。
【図８−３】ｐＡＩＬ１７ＡＶ１のプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ１７  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ１７  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０９３４−１０７８３および５７５９−５９１０に位置する。
【図８−４】ｐＡＩＬ１７ＡＶ１のプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ１７  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ１７  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０９３４−１０７８３および５７５９−５９１０に位置する。
【図８−５】ｐＡＩＬ１７ＡＶ１のプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ１７  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＩＬ１７  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０９３４−１０７８３および５７５９−５９１０に位置する。
【図９−１】ｐＡＰＤ１６Ｖ１−ＧＡのプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＰＤ１  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＰＤ１  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０８７１−１０７２０および５７５９−５９１０に位置する。
【図９−２】ｐＡＰＤ１６Ｖ１−ＧＡのプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＰＤ１  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＰＤ１  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０８７１−１０７２０および５７５９−５９１０に位置する。
【図９−３】ｐＡＰＤ１６Ｖ１−ＧＡのプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＰＤ１  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＰＤ１  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０８７１−１０７２０および５７５９−５９１０に位置する。
【図９−４】ｐＡＰＤ１６Ｖ１−ＧＡのプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＰＤ１  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＰＤ１  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０８７１−１０７２０および５７５９−５９１０に位置する。
【図９−５】ｐＡＰＤ１６Ｖ１−ＧＡのプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＰＤ１  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＰＤ１  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０８７１−１０７２０および５７５９−５９１０に位置する。
【図１０−１】ｐＡＨＧＦＶ１のプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＨＧＦ  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＨＧＦ  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０９２２−１０７７１および５７６０−５９１１に位置する。
【図１０−２】ｐＡＨＧＦＶ１のプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＨＧＦ  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＨＧＦ  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０９２２−１０７７１および５７６０−５９１１に位置する。
【図１０−３】ｐＡＨＧＦＶ１のプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＨＧＦ  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＨＧＦ  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０９２２−１０７７１および５７６０−５９１１に位置する。
【図１０−４】ｐＡＨＧＦＶ１のプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＨＧＦ  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＨＧＦ  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０９２２−１０７７１および５７６０−５９１１に位置する。
【図１０−５】ｐＡＨＧＦＶ１のプラスミド地図。ｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＨＧＦ  Ｉｇ．軽鎖およびｈＣＭＶプロモーター−（βＧｌ−ＩｇＧイントロン）−抗ＨＧＦ  Ｉｇ．重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βＧｌ−ＩｇＧイントロンは１０９２２−１０７７１および５７６０−５９１１に位置する。
【００８８】
実施例
これらの実施例は本発明を更に明瞭にすることを意図するものであり、本発明を限定するものではない。該実施例に記載されている組成物または方法はいずれも、全体的または部分的に、本発明の一部を構成する。
【実施例１】
【００８９】
抗体発現カセットにおけるイントロン要素の評価
免疫グロブリンスプライスアクセプターおよびｐＤＳＲＧの配列の一部と共にプラスミドｐＤＳＲＧ中に存在するβ−グロビンスプライスドナーを含有するβＧｌ−ＩｇＧイントロンをＰＣＲにより合成した。
【化２６】
2012508563.tif 000052
【００９０】
（配列番号３８）
ＣＡＧＧＴＡＡＧＴＴＴＡ（配列番号４）を含有する配列はβ−グロビンスプライスドナーであり、ＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＣ（配列番号５）を含有する配列は免疫グロブリンアクセプター部位である。スラッシュは該ドナーおよびアクセプター配列間の推定スプライス部位を表す。
【００９１】
発現増強のために、該イントロンを、該発現カセットの５’隣接領域内の、ヒトＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。これを行うために、該ＣＭＶプロモーターの部分配列を含有するよう、該βＧｌ−ＩｇＧイントロンの５’末端をＰＣＲにより伸長させた。得られた伸長ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、クレノウポリメラーゼで埋め、ＮｃｏＩで消化した。同時に、軽鎖発現プラスミドｐＵｈＣＭＶＩＧＦＲＬＣｂ２もＮｈｅＩで消化し、クレノウポリメラーゼで埋め、ＮｃｏＩで消化した。ついで該イントロンをｐＵｈＣＭＶＩＧＦＲＬＣｂ２に連結してｐＵＩＧＦＲＬＣｂ２（配列番号３２）を構築した。該イントロンを該重鎖発現プラスミド内に挿入するために、該ＰＣＲ伸長イントロン含有断面をＳｎａＢＩおよびＡｆｌＩＩで消化した。同時に、ｐＵｈｙｇ（−）ＩＧ１ＦＲｈｕＨをＳｎａＢＩおよびＡｆｌＩＩにより消化し、該イントロンを挿入してｐＵＩＧ１ＦＲｍｏｄＨ（配列番号３）を構築した。ついで、重鎖および軽鎖発現カセットの両方を含有する単一プラスミドベクターを以下のとおりに構築した。ｐＵＩＧＦＲＬＣｂ２をＲｓｒＩＩおよびＰａｃＩにより消化して該軽鎖発現カセットを移した。また、ｐＸＢＬＳをＲｓｒＩＩおよびＰａｃＩにより消化し、ＬＣＢ２含有軽鎖発現カセットを挿入してｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２（配列番号３４）を構築した。ついでｐＵＩＧ１ＦＲｍｏｄＨをＢｓｓＨＩＩにより消化して、重鎖およびヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ発現カセットを含有する断片を遊離させた。また、ｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２をＢｓｓＨＩＩにより消化し、該重鎖発現カセットを該部位に挿入してｐＡＩＧ１ＦＲＬＣｂ２Ｖ１（配列番号３５）およびｐＡＩＧ１ＦＲＬＣｂ２Ｖ３（配列番号３６）を構築した。
【００９２】
該イントロン含有プラスミドを、ＥＬＩＳＡにより、一過性トランスフェクションにおける抗体発現に関して評価した。重鎖および軽鎖発現カセットの両方において該イントロンを含有するプラスミドで該トランスフェクションを行った場合、抗ＩＧＦ１Ｒの発現は、該イントロンを含有しない類似プラスミドによるトランスフェクションから得られたものより約２〜３倍高いことを、結果は示した。
【００９３】
２つの単一発現プラスミドｐＡＩＧ１ＦＲＬＣｂ２Ｖ１およびｐＡＩＧ１ＦＲＬＣｂ２Ｖ３をＫＩＲＡ（キナーゼ受容体活性化）アッセイにおける生物活性に関して評価した。該単一発現プラスミドは共に、１９Ｄ１２ハイブリドーマから得られた精製抗体により示されるのと同等の生物活性を示すことを、結果は示唆している。
【００９４】
コザックコンセンサス配列（以下に太字で示されている）を重鎖および軽鎖ｃＤＮＡ配列の５’末端に組込むために、幾つかのプラスミドベクターをＰＣＲにより更に修飾した。以下に示すプライマー内の制限部位は下線で示されており、開始メチオニンコドン（ａｔｇ）は太字およびイタリック体で示されている。
【００９５】
該重鎖のためのプライマーペアは以下のとおりである。
【化２７】
2012508563.tif 000053
【００９６】
該５’プライマーはコザック配列と共にＫｐｎＩ（ｇｇｔａｃｃ）部位を有し、３’プライマーはＡｐａＩ部位（ｇｇｇｃｃｃ）を有する。
【００９７】
該軽鎖には以下のプライマーを使用した。
【化２８】
2012508563.tif 000054
【００９８】
該軽鎖のための５’プライマーはコザック配列と共にＥｃｏＲＩ（ｇａａｔｔｃ）およびＰｍｅＩ（ｇｔｔｔａａａｃ）部位を有し、３’プライマーはＢｓｉＷＩ部位（ｃｇｔａｃｇ）を有する。該プラスミドへの該ＰＣＲ産物の連結の成功の指標として利用するためのＰｍｅＩ部位を該５’プライマーに付加した。
【００９９】
増幅された重鎖配列をｐＵＩＧ１ＦＲｍｏｄＨ／Ｋａｎ内のＫｐｎＩおよびＡｐａＩ部位にクローニングしてｐＡＩＧ１ＦＲＨ−Ｋ（配列番号４１）を構築し、該軽鎖配列をｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２内のＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩ部位にクローニングしてｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２（−）Ｌ−Ｋ（配列番号４２）を構築した。
【０１００】
ついでｐＡＩＧ１ＦＲＨ−ＫをＢｓｓＨＩＩにより消化して、該重鎖発現カセットを該ヒグロマイシンＢ耐性遺伝子発現カセットと共にｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２（−）Ｌ−Ｋに移した。ｐＡＩＧＦＲＬＣｂ２（−）Ｌ−ＫもＢｓｓＨＩＩにより消化し、該重鎖発現カセットを同じ部位に挿入してｐＡＩＧ１ＦＲＬＣｂ２Ｖ１−Ｋ（配列番号４３）を構築した。
【０１０１】
ＤＸＢ１１細胞を、イントロンを伴う発現プラスミドおよびイントロンを伴わない発現プラスミドでトランスフェクトした。βＧｌ−ＩｇＧイントロンの存在はＤＸＢ１１細胞内の抗ＩＧＦ１Ｒの発現における２〜３倍の増加をもたらした。ｐＡＩＧ１ＦＲＶ１およびｐＡＩＧ１ＦＲＶ３は、該イントロンを伴わない抗ＩＧＦ１Ｒの重鎖発現カセットおよび軽鎖発現カセットの両方を含有するプラスミドであった。ｐＡＩＧ１ＦＲＬＣＢ２Ｖ１およびｐＡＩＧＦＲＬＣＢ２Ｖ３は、該イントロンを伴う抗ＩＧＦ１Ｒの重鎖発現カセットおよび軽鎖発現カセットの両方を含有するプラスミドであった。トランスフェクションの３日後および５日後の上清をＥＬＩＳＡにより分析した。該ＥＬＩＳＡ分析からのデータを以下の表１に示す。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡ法
試薬：
・抗ＩＧＦ１Ｒ  ２０．２４ｍｇ／ｍＬ  濃縮物
・ヒトＩｇＧコート化プレート
・ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ
・ＥＬＩＳＡ希釈剤  −  ０．１％  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）／ＰＢＳＴ（リン酸緩衝食塩水およびＴｗｅｅｎ２０）
・ＴＭＢ液体基質系：Ｐｉｅｒｃｅの１工程ターボ系
・停止試薬（〜２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）
方法：
Ａ．標準曲線の作成
精製抗ＩＧＦ１ＲをＥＬＩＳＡ希釈剤中で２００ｎｇ／ｍＬまで希釈した。
【０１０３】
２０，２４０，０００ｎｇ／ｍＬ÷２００ｎｇ／ｍＬ＝１：１０１２００希釈。
【０１０４】
１０μＬのヒト標準物を９９０μＬのＥＬＩＳＡ希釈剤に加えた（Ｉ）。
【０１０５】
４９．４μＬの（Ｉ）を４９９５０．６μＬのＥＬＩＳＡ希釈剤に加えることにより２００ｎｇ／ｍＬに希釈した。
【０１０６】
２００ｎｇ／ｍＬ  標準物の４ｍＬアリコートを調製し、４℃で保存した。アッセイ当日、２００μＬの標準物をＡ行にローディングすることにより該標準曲線の残部を作成し、最上標準物から底（３．１２５ｎｇ／ｍＬ）まで１：２系列希釈を行った。ＥＬＩＳＡ希釈剤をブランクまたは０ｎｇ／ｍＬ  標準物として使用した。
【０１０７】
Ｂ．対照の調製
対照を３００ｎｇ／ｍＬで調製した。
【０１０８】
７４．１μＬの（Ｉ）（「標準曲線の作成」を参照されたい）を４９９２５．９μＬのＥＬＩＳＡ希釈剤に加えた。２．５ｍＬのアリコートを調製し、４℃で保存した。
【０１０９】
Ｃ．アッセイ
全ての試薬を、それらを使用する前に室温に加温した。
【０１１０】
１．標準曲線の位置を示す鋳型および未知物質を準備した。
【０１１１】
２．プレートをＥＩＡ洗浄バッファーで洗浄した（１×）。
【０１１２】
３．該鋳型に従って標準物、対照およびサンプルを適当なウェルに加えた。各ウェル内の最終容量は１００μＬであった。該プレートをカバーで覆い、室温で１時間インキュベートした。
【０１１３】
４．ＨＲＰ結合抗ｈｕＩｇＧをＥＬＩＳＡ希釈剤中で１：１０，０００希釈した。
【０１１４】
１０μＬの抗ｈｕＩｇＧストックを９９０μＬの０．１％  ＢＳＡ−ＰＢＳＴに加えることにより初期１：１００希釈を行い、ついで３５０μＬの該初期希釈液を３４６５０μＬの０．１％  ＢＳＡ−ＰＢＳＴに加えることにより追加的な１：１００希釈を行った。この溶液の最終希釈度は１：１００００であった。
【０１１５】
５．該ウェル内の液体を吸引した。該ウェルをＥＩＡ洗浄バッファーで４回洗浄した。
【０１１６】
６．１００μＬの該ＨＲＰコンジュゲートを全ウェルに加えた。該プレートをカバーで覆い、室温で３０分間インキュベートした。
【０１１７】
７．工程５と同様にして該ウェルを洗浄した。
【０１１８】
８．１００μＬのＴＭＢ基質を各ウェルに加えることにより該ウェル内で発色させた。
【０１１９】
９．該ウェル内の青色の量に応じて、５０μＬの停止試薬を、工程８において分注したのと同じ順序で全ウェルに加えた。これは約２〜４分間を要した。プレートを２分間、展開させた。
【０１２０】
１０．停止試薬の添加の３０分以内に、波長を４５０〜６５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを使用して各ウェルの吸光度を読取った。
【０１２１】
Ｄ．データ解析：
４パラメーターロジスティック曲線フィットを用いてデータを解析した。
【０１２２】
キナーゼ受容体活性化（ＫＩＲＡ）アッセイ法
１）ＭＣＦ−７細胞を、ウシインスリンを含有しない培地内で２００，０００細胞／ウェル（２．０×１０６細胞／ｍＬ−０．１ｍＬ）で調製した。細胞を９６ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ＃３５−３０７５）内に播いた。サンプル当たり２通りのウェルを調製した。プレートをＣＯ２インキュベーター（５〜６％  ＣＯ２、３５〜３７℃）内で一晩インキュベートした。
【０１２３】
２）ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ  ＭＡＸＩ−ＳＯＲＰ）を１００μＬ／ウェル  抗ＩＧＦ１Ｒ捕捉抗体（商業的に入手可能なＩｇＧ１特異的抗体）でコートした。精製ハイブリドーマ由来１９Ｄ１２を１．０μｇ／ｍＬに調製した。使用のために各バッチを試験した。ＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩インキュベートした。
【０１２４】
３）組織培養プレートをインキュベーターから取り出した。未処理（ＥＭＥＭ）
対照ウェル以外の全てのウェルから培地を抜き取った。サンプル添加前にウェルが乾燥するのを防ぐために、１２チャネル多チャネルピペットを使用して１つの行の該培地を同時に除去した。
【０１２５】
４）９６ウェル希釈プレートにおける希釈曲線のために、１００μｌ／ｍＬ  ＥＭＥＭを第１〜１０および１２列に加えた。５．０μｇ／ｍＬの２００μＬ／ウェルの対照Ａｂを第１１列の適当なウェルに加えた。２００μｌ／ウェルのサンプルを第１１列の適当なウェルに加えた。系列希釈装置を使用して、１００μｌ（１：２）を第１１列から第１列に移した（第１２列は未処理細胞対照である）。細胞プレートのウェルから培地を除去した。５０μ／ウェルを希釈プレートから細胞プレートの対応ウェルに移した。ＣＯ２インキュベーター（５〜６％  ＣＯ２、３５〜３７℃）内で３０分間インキュベートした。
【０１２６】
５）ＩＧＦ−Ｉ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）をＥＭＥＭ（無ＦＢＳ）中で７５ｎｇ／ｍＬに調製した。インキュベーターから組織培養プレートを取り出した。全てのウェルから（１つのプレートは同時に）内容物を抜き取った。１００μＬ／ウェルのＩＧＦ−ＩをサンプルウェルおよびＩＧＦ−Ｉ対照ウェルに加えた。１００μｌ／ウェルのＥＭＥＭを第１２列に加えた。
【０１２７】
６）細胞プレートをインキュベートしながら、予めコートされたＥＬＩＳＡプレートをブロッキングした。捕捉抗体を捨て（容器内にあけること（ダンプ）が許容される）、紙タオル上にブロットした。１５０μＬ／ウェルのブロッキングバッファー（試薬シートを参照されたい）を加えた。プレートシェーカー上、プレートを室温で１時間、穏やかに振とうした。
【０１２８】
７）細胞プレートのＩＧＦ−Ｉインキュベーションの後、組織培養プレートの全ウェルの内容物を抜き取った（９６ウェルプレートのうちの全ウェルが抜き取られうる）。１００μＬ／ウェルの細胞溶解バッファーを加えた。プレートシェーカー上、室温で１時間、プレートを振とうした。
【０１２９】
８）ＥＬＩＳＡプレートのブロッキングバッファーインキュベーションの後、ブロックバッファーを捨てた（ダンプ、ブロット）。プレートを１５０μＬ／ウェルの洗浄バッファー（試薬シートを参照されたい）で洗浄した（６×）。各洗浄の後、ダンプし、ブロットした。
【０１３０】
９）細胞プレートの細胞溶解バッファーインキュベーションの後、８５μＬを細胞プレートウェルからＥＬＩＳＡプレートの対応ウェルに移した。１２チャネル多チャネルピペットを使用して行の全体を一度に移した。移す前に、残存細胞凝塊の幾らかを破壊するために、移す容量を穏やかに上下にピペッティングした。該ライセートをピペッティングする際、発泡するのを避けた。プレートシェーカー上、室温で２時間、プレートを振とうした。
【０１３１】
１０）ビオチン化抗ホスホチロシン検出Ａｂ−４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ  ＵＳＡ；Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）を希釈バッファー（試薬シートを参照されたい）中で０．２μｇ／ｍＬで調製した。室温にした。ライセートのインキュベーションの後、該ライセートを捨てた（ダンプ、ブロット）。ＥＬＩＳＡプレートを１００μＬ／ウェルの洗浄バッファーで洗浄した（４×）。各洗浄後、ダンプし、プロットした。
【０１３２】
１１）１００μＬ／ウェルの４Ｇ１０  Ａｂ（抗ホスホチロシン抗体）をＥＬＩＳＡプレートに加えた。プレートシェーカー上、室温で２時間、プレートを穏やかに振とうした。
【０１３３】
１２）ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を希釈バッファー中で０．０２５μｇ／ｍＬで調製した。室温にした。４Ｇ１０（抗ホスホチロシン抗体）のインキュベーションの後、該検出抗体を捨てた（ダンプ、ブロット）。ＥＬＩＳＡプレートを１００μＬ／ウェルの洗浄バッファーで洗浄した（４×）。各洗浄後、ダンプし、プロットした。
【０１３４】
１３）１００μＬ／ウェルのＨＲＰ結合ストレプトアビジンを加えた。プレートシェーカー上、室温で３０分間、プレートを穏やかに振とうした。
【０１３５】
１４）ＴＭＢ基質（２成分系，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を成分Ａと化合物Ｂとの１：１混合物で調製した。室温にした。ＥＬＩＳＡプレート内での該ストレプトアビジンインキュベーションの後、該ストレプトアビジンを捨てた（ダンプ、ブロット）。ＥＬＩＳＡプレートを１００μＬ／ウェルの洗浄バッファーで洗浄した（４×）。各洗浄後、ダンプし、ブロットした。
【０１３６】
１５）１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質をＥＬＩＳＡプレートに加えた。プレートシェーカー上、室温で１５分間、プレートを振とうした。
【０１３７】
１６）ＴＭＢインキュベーション後、５０μＬ／ウェルの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４停止剤を加えた。プレートをプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上、４５０ｎｍ／５７０ｎｍで読取った。停止剤の添加の２０分以内に、プレートを読取った。
【表１】
2012508563.tif 000055
【０１３８】
これらのデータは、該βＧｌ−ＩｇＧイントロンを欠く関連プラスミドｐＡＩＧ１ＦＲＶ１およびｐＡＩＧ１ＦＲＶ３と比べて高い、βＧｌ−ＩｇＧ含有プラスミドｐＡＩＧ１ＦＲＬＣＢ２Ｖ１およびｐＡＩＧ１ＦＲＬＣＢ２Ｖ３に関連した発現レベルを示している。コザックコンセンサス配列をプラスミドｐＡＩＧ１ＦＲＬＣＢ２Ｖ１の免疫グロブリン遺伝子に機能的に結合させてｐＡＩＧ１ＦＲＬＣＢ２−Ｖ１Ｋを得た場合に、より一層高い発現レベルが可能であった。
【０１３９】
１９Ｄ１２親ハイブリドーマからの並びにプラスミドｐＡＩＧ１ＦＲＬＣＢ２Ｖ１およびｐＡＩＧ１ＦＲＬＣＢ２Ｖ３からの１９Ｄ１２抗体の生物活性をＫＩＲＡアッセイにより分析した。これらのデータを以下の表２に示す。
【表２】
2012508563.tif 000056
【０１４０】
これらのデータは、ｐＡＩＧ１ＦＲＬＣｂ２Ｖ１およびｐＡＩＧ１ＦＲＬＣｂ２Ｖ３プラスミドが、生物学的に活性な抗ＩＧＦ１Ｒ抗体を生成することを示した。
【０１４１】
本発明は、本明細書に記載の具体的な実施形態により範囲において限定されるものではない。実際、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載されている実施形態、および本明細書に具体的に記載されていない他の実施形態を含み、本明細書に具体的に記載されている実施形態は必ずしも包括的なものではない。本明細書に記載されているものに加えて本発明の種々の修飾が前記説明から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
【０１４２】
本出願の全体にわたり特許、特許出願、刊行物、産物説明およびプロトコールが引用されているが、それらの開示の全体をあらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れることとする。
【図１】
2012508563.tif 000059
【図２】
2012508563.tif 000060
【図３】
2012508563.tif 000061
【図４】
2012508563.tif 000062
【図５】
2012508563.tif 000063
【図６−１】
2012508563.tif 000064
【図６−２】
2012508563.tif 000065
【図６−３】
2012508563.tif 000066
【図６−４】
2012508563.tif 000067
【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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