(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物の生産に関与する生合成遺伝子クラスターの１個以上の機能的フラグメントを含むポリヌクレオチドの提供に関する。本発明はまた、式（Ｉ）もしくは（Ｉ’）または式（ＩＩ）〜（ＶＩＩ）、（ＸＩ）〜（ＸＩＶ）ならびに（ＸＶＩＩ）および（ＸＶＩＩＩ）の化合物を製造する方法も提供する。さらに、医薬組成物としてのかかる化合物の使用も本発明において提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物の生産に関与する非リボソームペプチドシンターゼであるＮＲＰＳ２をコードする生合成遺伝子クラスターの１個以上の機能的フラグメントを含むポリヌクレオチドであって、以下のものを含むポリヌクレオチド：
(i) ＮＲＰＳ２ドメインをコードする配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８および６０からなる群から選択される配列と、少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、特に少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、特に少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(ii) ＮＲＰＳ２ドメインをコードする配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８または６０からなる群から選択されるヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(iii) ＮＲＰＳ２ドメインを示す配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９または６１からなる群から選択される配列と、少なくとも６０％、特に少なくとも７０％、特に少なくとも８０％、特に少なくとも９０％、特に少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(iv) ＮＲＰＳ２ドメインを示す配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９または６１からなる群から選択されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(v) 配列番号１５、配列番号２８からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、特に少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、特に少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(vi) 配列番号１５、配列番号２８からなる群から選択されるヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
ここで、前記(i) 〜 (vi)のヌクレオチド配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、４７、４９、５１、５３、５５、５９および／または６１の参照配列によって示される対応ＮＲＰＳドメインの活性を保持する発現産物をコードする。
【請求項２】
以下の１個以上のＮＲＰＳ２ドメインの活性を保持する発現産物をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド：
(i)配列番号４７のチオレーションドメイン；
(ii)配列番号４９のコンデンセーションドメイン；
(iii)配列番号５１のプロリンのアデニレーションドメイン；
(iv)配列番号５３のチオレーションドメイン；
(v)配列番号２のコンデンセーションドメイン；
(vi)配列番号４のイソロイシンのアデニレーションドメイン；
(vii)配列番号６のチオレーションドメイン；
(viii)配列番号８のコンデンセーションドメイン；
(ix)配列番号１０のチロシンのアデニレーションドメイン；
(x)配列番号１２のＮ−メチレーションドメイン；
(xi)配列番号１４のチオレーションドメイン；
(xii)配列番号５５のコンデンセーションドメイン；
(xiii)配列番号５７のイソロイシンのアデニレーションドメイン；
(xiv)配列番号５９のチオレーションドメイン；および
(xv)配列番号６１のチオエステラーゼドメイン。
【請求項３】
式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物の生産に関与する非リボソームペプチドシンターゼであるＮＲＰＳ１をコードする生合成遺伝子クラスターの１個以上の機能的フラグメントを含むポリヌクレオチドであって、以下のものを含むポリヌクレオチド：
(i) ＮＲＰＳ１ドメインをコードする配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および４４からなる群から選択される配列と、少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、特に少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、特に少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(ii) ＮＲＰＳ１ドメインをコードする配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(iii) ＮＲＰＳ１ドメインを示す配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５からなる群から選択される配列と、少なくとも６０％、特に少なくとも７０％、特に少なくとも８０％、特に少なくとも９０％、特に少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(iv) ＮＲＰＳ１ドメインを示す配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５からなる群から選択されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(v) 配列番号２６からなる群から選択される配列と、少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、特に少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、特に少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列および／またはその相補体；または
(vi)配列番号２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(vii) ここで、前記(i) 〜 (vi)のヌクレオチド配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５の参照配列によって示される対応ＮＲＰＳドメインの活性を保持する発現産物をコードする。
【請求項４】
以下の１個以上のＮＲＰＳ１ドメインの活性を保持する発現産物をコードする、請求項３に記載のポリヌクレオチド：
(i) 配列番号３１のローディングドメイン；
(ii)配列番号３３のグルタミンのアデニレーションドメイン；
(iii)配列番号３５のチオレーションドメイン；
(iv)配列番号３７のコンデンセーションドメイン；
(v)配列番号３９のスレオニンのアデニレーションドメイン；
(vi)配列番号４１のチオレーションドメイン；
(vii)配列番号４３のコンデンセーションドメイン；および
(viii)配列番号４５のロイシンのアデニレーションドメイン。
【請求項５】
式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物を生産するＮＲＰＳ２をコードする請求項１または２に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号２９に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項６】
式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物を生産するＮＲＰＳ１をコードする請求項３または４に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号２７に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかの１個以上のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
【請求項８】
式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物を生産するポリペプチドであって、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド：
(i)ＮＲＰＳ１を示す配列番号２７、第２のＮＲＰＳ２を示す配列番号２９、チトクロムＰ４５０を示す配列番号６３；および
(ii) (i)に列挙した参照配列と６０％、特に少なくとも７０％、特に少なくとも８０％、特に少なくとも９０％、特に少なくとも９５％の配列同一性を有し、実質的に同じ触媒機能を保持する、(i)に列挙したアミノ酸配列の機能的変異体。
【請求項９】
請求項８の１個以上のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１０】
(i)配列番号２７またはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列；および
(ii)配列番号２９またはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列
を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
さらに配列番号６３またはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
受託番号ＤＳＭ  １９３２９を有するコンドロマイセス・クロカツス（Chondromyces crocatus）株ＮＰＨ−ＭＢ１８０から単離された、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
オープンリーディングフレームが転写および翻訳配列と作動可能に連結している、請求項９〜１２のいずれか１項のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１〜６および９〜１２のいずれか１項の組換えポリヌクレオチドの１個以上または請求項１３の発現ベクターを含む宿主細胞であって、組換えポリヌクレオチドが宿主細胞のゲノム中で天然には見出されない、宿主細胞。
【請求項１５】
配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２および配列番号２４からなる群から選択される式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物の生産に必要な１個以上のオープンリーディングフレームまたはそれらの機能的変異体をさらに含む、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
式（Ｉ）もしくは（Ｉ’）または式（ＩＩ）〜（ＶＩＩ）、（ＸＩ）〜（ＸＩＶ）ならびに（ＸＶＩＩ）および（ＸＶＩＩＩ）の化合物を生産するための、請求項１４または１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
組換えポリペプチドが遺伝子発現に最適化するために修飾されている、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
ポリヌクレオチドのコドン出現頻度が宿主細胞の豊富なタンパク質のコドン出現頻度に調節されている、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
宿主細胞がミキソコッカス目（Myxococcales）またはシュードモナス属（Pseudomonas）もしくはストレプトマイセス属（Streptomyces）から選択される、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
宿主細胞がシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）から選択される、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物の生産に必要な遺伝子を最早発現しない、変異微生物。
【請求項２２】
配列番号６３に示すチトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を最早発現しない、請求項２１に記載の変異微生物。
【請求項２３】
式（Ｉ）もしくは（Ｉ’）または式（ＩＩ）〜（ＶＩＩ）、（ＸＩ）〜（ＸＩＶ）もしくは（ＸＶＩＩ）〜（ＸＶＩＩＩ）の化合物を製造する方法であって、請求項１６〜２０のいずれか１項の宿主細胞を、当該化合物が生産される条件下で培養することを含む、製造方法。
【請求項２４】
請求項２３の方法によって得られる、式（Ｉ）もしくは（Ｉ’）または式（ＩＩ）〜（ＶＩＩ）、（ＸＩ）〜（ＸＩＶ）もしくは（ＸＶＩＩ）〜（ＸＶＩＩＩ）の化合物。
【請求項２５】
薬物として使用するための、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
アトピー性皮膚炎の処置に使用するための、請求項２５に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物の生産に関与する生合成遺伝子クラスターの１個以上の機能的フラグメントを含むポリヌクレオチドの提供に関する。本発明はまた、式（Ｉ）もしくは（Ｉ’）または式（ＩＩ）〜（ＶＩＩ）、（ＸＩ）〜（ＸＩＶ）ならびに（ＸＶＩＩ）および（ＸＶＩＩＩ）の化合物を製造する方法も提供する。さらに、医薬組成物としてのかかる化合物の使用も本発明において提供される。
【背景技術】
【０００２】
微生物由来の多くの天然産物は、高等生物において見られる生物学的活性を有しており、数世紀にわたってその治療特性が探索されている。これらの天然産物のほとんどはポリケチドクラスおよび非リボソームペプチドクラスに属しており、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）および非リボソームペプチドシンターゼ（ＮＲＰＳ）として知られるモジュラー酵素系によって合成される（Finkering and Marahiel 2004； Staunton and Weissman, 2001）。さらに、同じ経路にＰＫＳ遺伝子およびＮＲＰＳ遺伝子の両方を含み、したがってこれら２つのクラスのハイブリッドである二次代謝産物を生産する経路が存在している。これらの生合成経路によって生産される天然産物は、短鎖カルボン酸およびアミノ酸のような小さな、比較的単純な構成要素から構成されている。しかし、これらの経路に由来する最終天然産物は、極めて多様であり、しばしば構造的に複雑であり、通常複数の立体中心を含んでいる。このため、これらの化合物の生産のための合成アプローチは、しばしば実行不可能であり、したがってそれらの生産には発酵が常套のアプローチで有り続けている。しかし、発酵プロセスは、代謝的に特徴付けられておらず、しばしば遺伝子の取り扱いが困難であり、そしてしばしばあまり増殖せず、目的化合物を十分なレベルでは生産しないという、微生物に対する信頼に関する固有の問題を有する。これらの問題を回避するため、これらの欠点を有さない、十分に特徴付けられた宿主生物におけるＰＫＳまたはＰＲＰＳ経路の異種発現が一つの選択肢であり得る（Wenzel and Muller, 2005に概説されている）。事実、このアプローチは、発見努力のために「静かな」または「隠れた」ＰＫＳおよびＮＲＰＳ経路の発現に延長でき（Shen, 2004）、または研究室で培養できない生物からの経路の発現に使用できる。さらに、ＰＫＳおよびＮＲＰＳ経路の異種宿主への移動により、親化合物の新規なアナログを作成するための二次代謝経路の効率的なバイオエンジニアリングが可能となる。
【０００３】
異種発現は、一般に、ＰＫＳおよびＮＲＰＳ経路がゲノム上の連続したクラスターに位置しているという事実を利用している。したがって、原理上は、これらの経路は、標準的なＢＡＣまたはコスミドベクターに比較的容易にクローニングされる。ある微生物から別の微生物へとある経路を動かすことの原理的な単純さに反して、２種の生物間の制御、コドン出現頻度または代謝における差異は、異種発現の成功に大きな課題を引き起こしている。さらに、ＢＡＣライブラリー構築物のようなこの戦略を効率的に適用することができる分子ツールおよびクローニングのための組換えアプローチは、比較的最近になってからのみ利用可能となった（Wenzel and Muller, 2005）。このため、異種発現の成功例は、文献には極僅かしか存在しない。
【０００４】
好適な異種宿主の選択は発現戦略を設計する際に重要な検討事項である。新たな宿主は、遺伝子操作が用意であり、研究室での取り扱いが容易であり、ＰＫＳおよびＮＲＰＳ経路を用いる能力を有するべきである。例えば、新たな宿主におけるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの存在は、移入されたＰＫＳおよびＮＲＰＳの活性化を促進するために必須である（Pfeifer et al. 2001）。さらに、新たな宿主が元の宿主のものと同様のコドン出現頻度を有し、移入された経路の効率的な発現が可能であることが重要である。使用される最も一般的な宿主は、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）および十分に特徴付けられたストレプトマイセス（Streptomyces）株のうちわずかに選択されたものである（Zhang and Pfeifer, 2008に概説されている）。利用されている他の宿主は、ミキソコッカス・ザンサス（Myxococcus xanthus）および糸状菌類を含む。これらの宿主株のいくつかは、変異によって主要な常在性二次代謝系がサイレンシングされて、バックグラウンド代謝プロフィールを除き、移入される生合成経路に利用可能な前駆体貯蓄の減少を防止するように、修飾されている。
【０００５】
特定の経路を移動させるためには、適切な移動可能な遺伝的要素に基づく当該経路のパッケージングが必要である。まず初めにＰＫＳまたはＮＲＰＳ系の配列を、少なくともアミノ酸レベルで、より好ましくはヌクレオチドレベルで知らなければならない。典型的には、この配列を用いて、天然宿主から構築されたゲノムライブラリーから、ＢＡＣまたはコスミドクローンを位置づけるプローブを設計する。これらの経路クラスターのサイズが大きいため（通常３０ｋｂ以上、しばしば１００ｋｂを超える）、「ショットガン」クローニング戦略を用いるとき、それらはしばしば１個のＢＡＣまたはコスミドクローン中には捕捉されない。したがって、この経路は、しばしば、全経路を含む１個のＢＡＣまたはコスミドベクター構築物を作成するために再構築する必要がある。極めて大きな経路を発現させようとするとき、それは新たな宿主中でトランスで発現されるように２個以上の別個のベクター構築物に分割してもよい（Gu, et al. 2007）。最終的には、構築物を有する大腸菌から新たな宿主へと移動するために、ベクター構築物は、プラスミド移行性機能（例えばＲＫ２からｏｒｉＴ）をも有していなければならない。構築物が新たな宿主において好適であることを確保するため、それを宿主染色体に融合させることを勧める。これを達成するため、構築物は、効率的な染色体融合のための部位を含んでいるべきである。例えば、ストレプトマイセスのファージ接着部位ΦＣ３１が、この系における染色体挿入のためにしばしば用いられる（Binz, et al. 2008）。さらに、新たな宿主で適切に機能する新たなプロモーターを、生合成経路の前に挿入する必要がしばしばある。問題の生物２種が密接に関連しており、したがって多くの制御因子を共有している可能性がある場合、この工程を避けることができる。最後に、選択マーカー、一般には抗生物質耐性カセットが、新たな宿主における構築物（修飾ＢＡＣまたはコスミド）の移行および融合が成功したかを選択するために、必要である。典型的には、これらの操作は大腸菌において行われ、しばしばＲｅｄ／ＥＴ組換えの使用によってなされる（Zhang, et al. 1998）。このクローニングアプローチは、制限酵素利用操作がせいぜい挑戦的である場合に、大きなＤＮＡ構築物を含む応用に特に適用可能である。
【０００６】
構築物が新たな宿主に融合されると、発酵および続く化学分析を行って、経路の発現が成功したかを決定する。ほぼ全ての場合で異種発現が成功した場合、天然宿主で観察されるものと比較してより低い力価で天然産物が生産される。この明らかな抑制にも拘わらず、異種発現の成功は、常套の株開発方法論に利用可能な多くの選択肢を有する発現プラットフォームを提供する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、式Ｉ
【化１】
2012517801.tif 000002
［式中、Ａ７のカルボキシ基とＡ２のヒドロキシ基の間にエステル結合があり、所望により、Ａ５とＡ６の間のアミド結合の窒素原子がメチルで置換されていてもよく、
ＸおよびＡ１は各々独立して任意であり、そして
Ｘは任意の化学残基、特にＨまたはアシル残基、特にＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ、（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２ＣＯまたは（ＣＨ３）２ＣＨＣＯであり；
Ａ１はアスパラギン酸以外の標準アミノ酸、特にグルタミンであり；
Ａ２はスレオニンまたはセリン、特にスレオニンであり；
Ａ３は非塩基性標準アミノ酸またはその非塩基性誘導体、特にロイシンであり；
Ａ４はＡｈｐ、デヒドロ−ＡＨＰ、プロリンまたはその誘導体、特にＡｈｐまたはその誘導体、特にＡｈｐ誘導体３−アミノ−２ピペリドンであり；
Ａ５はイソロイシンまたはバリン、特にイソロイシンであり；
Ａ６はチロシンまたはその誘導体、特にチロシンであり；
Ａ７はロイシン、イソロイシンまたはバリン、特にイソロイシンまたはバリン、特にイソロイシンである。］
のデプシペプチドの生合成に関与する生合成クラスターの同定、並びに式Ｉの非リボソームペプチドまたはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を生産するための異種発現系の開発に関する。特に、式（Ｉ’）
【化２】
2012517801.tif 000003
［式中、Ａ７のカルボキシ基とＡ２のヒドロキシ基の間にエステル結合があり、所望により、Ａ５とＡ６の間のアミド結合の窒素原子がメチルで置換されていてもよく、
ＸはＣＨ３ＣＯ、（ＣＨ３）２ＣＨＣＯ、ＣＨ３Ｓ（Ｏ）ＣＨ２ＣＯ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯまたはＣ６Ｈ５ＣＯであり；
Ａ１はグルタミンであり；
Ａ２はスレオニンであり；
Ａ３はロイシンであり；
Ａ４はＡｈｐ、デヒドロ−ＡＨＰ、プロリンまたは５−ヒドロキシ−プロリンであり；
Ａ５はイソロイシンまたはバリン、特にイソロイシンであり；
Ａ６はチロシンであり；
Ａ７はイソロイシンまたはバリン、特にイソロイシンである。］
のデプシペプチドの生合成における生合成遺伝子クラスターの使用を見出す。
【０００８】
特に本発明は、図１に示す式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）〜（ＸＩＶ）、（ＸＶＩＩ）および／または（ＸＶＩＩＩ）の非リボソームペプチドの生合成に関与する生合成クラスターの同定、並びに式（Ｉ）または（Ｉ’）の非リボソームペプチドまたはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を生産するための異種発現系の開発に関する。
【０００９】
式（Ｉ）、特に式（Ｉ’）の化合物は、粘液細菌コンドロマイセス・クロカツス（Chondromyces crocatus）ＮＰＨ−ＭＢ１８０によって生産されるデプシペプチドのファミリーに属する非リボソームポリペプチドである。これらのデプシペプチドは、極めて強力で選択的なヒトカリクレイン７（ｈＫ７）およびエラスターゼ阻害剤であることが示されている。ヒトカリクレイン７はセリンプロテアーゼ活性を有する酵素であり、アトピー性皮膚炎の処置のための潜在的標的である。この新規化合物の詳細な物理化学データならびに発酵および抽出法は、WO2009/024527として公開されているＰＣＴ出願PCT/EP08/060689に記載されている。
【００１０】
本明細書において使用するとき、用語「式（Ｉ）の化合物」または「式（Ｉ）のデプシペプチド」は、上記定義の式（Ｉ）の化合物、特に図１に記載の式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）および／または（ＸＶＩＩＩ）の非リボソームペプチド、ならびに実質的に同じプロテアーゼ活性を保持するあらゆる誘導体を意味する。かかる誘導体の例は、WO2009/024527として公開されているＰＣＴ出願にさらに記載されている。
【００１１】
本明細書において使用するとき、用語「式（Ｉ’）の化合物」または「式（Ｉ’）のデプシペプチド」は、上記定義の式（Ｉ’）の化合物、特に図１に記載の式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）および／または（ＸＶＩＩＩ）の非リボソームペプチド、ならびに実質的に同じプロテアーゼ活性を保持するあらゆる誘導体を意味する。
【００１２】
本発明の技術的課題は、式（Ｉ）または（Ｉ’）のデプシペプチドの生合成に関与する生合成クラスターまたはその機能的部分の提供である。
この技術的課題は、特許請求の範囲に特徴付けられた態様の提供によって解決される。
本発明の別の技術的課題は、異種遺伝子発現、例えば目的の組換えタンパク質の合成に適切な抑制プロモーターの提供である。
【００１３】
本発明は、第一の態様において、（１）式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物の生産に関与する非リボソームペプチドシンターゼ（ＮＲＰＳ）（以下ＮＲＰＳ２と称する）をコードする生合成遺伝子クラスターの１個以上の機能的フラグメントを含むポリヌクレオチドであって、以下のものを含むポリヌクレオチドの提供に関する：
(i) ＮＲＰＳ２ドメインをコードする配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８および６０からなる群から選択される配列と、少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、特に少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、特に少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(ii) ＮＲＰＳ２ドメインをコードする配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８または６０からなる群から選択されるヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(iii) ＮＲＰＳ２ドメインを示す配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９または６１からなる群から選択される配列と、少なくとも６０％、特に少なくとも７０％、特に少なくとも８０％、特に少なくとも９０％、特に少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(iv) ＮＲＰＳ２ドメインを示す配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９または６１からなる群から選択されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(v) 配列番号１５、配列番号２８からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、特に少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、特に少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(vi) 配列番号１５、配列番号２８からなる群から選択されるヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
ここで、前記(i) 〜 (vi)のヌクレオチド配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、４７、４９、５１、５３、５５、５９および／または６１の参照配列によって示される対応ＮＲＰＳドメインの活性を保持する発現産物をコードする。
【００１４】
第２の態様において、（２）以下の１個以上のＮＲＰＳ２ドメインの活性を保持する発現産物をコードする、態様（１）に記載のポリヌクレオチドを提供する：
(i)配列番号４７のチオレーションドメイン；
(ii)配列番号４９のコンデンセーションドメイン；
(iii)配列番号５１のプロリンのアデニレーションドメイン；
(iv)配列番号５３のチオレーションドメイン；
(v)配列番号２のコンデンセーションドメイン；
(vi)配列番号４のイソロイシンのアデニレーションドメイン；
(vii)配列番号６のチオレーションドメイン；
(viii)配列番号８のコンデンセーションドメイン；
(ix)配列番号１０のチロシンのアデニレーションドメイン；
(x)配列番号１２のＮ−メチレーションドメイン；
(xi)配列番号１４のチオレーションドメイン；
(xii)配列番号５５のコンデンセーションドメイン；
(xiii)配列番号５７のイソロイシンのアデニレーションドメイン；
(xiv)配列番号５９のチオレーションドメイン；および／または
(xv)配列番号６１のチオエステラーゼドメイン。
【００１５】
態様（２）の特定の態様において、ポリヌクレオチドは、式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物を生産するＮＲＰＳ２をコードし、配列番号２９に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
第３の態様において、（３）本発明は、式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物の生産に関与するＮＲＰＳであるＮＲＰＳ１をコードする生合成遺伝子クラスターの１個以上の機能的フラグメントを含むポリヌクレオチドであって、以下のものを含むポリヌクレオチドに関する：
(i) ＮＲＰＳドメインをコードする配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および４４からなる群から選択される配列と、少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、特に少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、特に少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(ii) ＮＲＰＳドメインをコードする配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(iii) ＮＲＰＳ１ドメインを示す配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５からなる群から選択される配列と、少なくとも６０％、特に少なくとも７０％、特に少なくとも８０％、特に少なくとも９０％、特に少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(iv) ＮＲＰＳ１ドメインを示す配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５からなる群から選択されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(v) 配列番号２６からなる群から選択される配列と、少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、特に少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、特に少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列および／またはその相補体；または
(vi)配列番号２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(vii) ここで、前記(i) 〜 (vi)のヌクレオチド配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５の参照配列によって示される対応ＮＲＰＳドメインの活性を保持する発現産物をコードする。
【００１７】
第４の態様において、態様（３）に記載のポリヌクレオチドは、以下の１個以上のＮＲＰＳ１ドメインの活性を保持する発現産物をコードする：
(i) 配列番号３１のローディングドメイン；
(ii)配列番号３３のグルタミンのアデニレーションドメイン；
(iii)配列番号３５のチオレーションドメイン；
(iv)配列番号３７のコンデンセーションドメイン；
(v)配列番号３９のスレオニンのアデニレーションドメイン；
(vi)配列番号４１のチオレーションドメイン；
(vii)配列番号４３のコンデンセーションドメイン；および
(viii)配列番号４５のロイシンのアデニレーションドメイン。
【００１８】
態様（４）の特定の態様において、ポリヌクレオチドは、式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物を生産するＮＲＰＳ１をコードし、配列番号２７に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００１９】
他の態様において、本発明は、上記１個以上のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。特に、該ポリペプチドは、式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物の生産に適切であり、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む：
(i)ＮＲＰＳ１を示す配列番号２７、第２のＮＲＰＳ２を示す配列番号２９、チトクロムＰ４５０を示す配列番号６３；および
(ii) (i)に列挙した参照配列と６０％、特に少なくとも７０％、特に少なくとも８０％、特に少なくとも９０％、特に少なくとも９５％の配列同一性を有し、実質的に同じ触媒機能を保持する、(i)に列挙したアミノ酸配列の機能的変異体。
【００２０】
本発明は、さらに、上記１個以上のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【００２１】
さらに別の態様において、本発明は、
(i)配列番号２７またはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列；および
(ii)配列番号２９またはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００２２】
かかるポリヌクレオチドは、配列番号６３またはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列をさらに含んでいてもよい。ある特定の態様において、該ポリヌクレオチドは、受託番号ＤＳＭ  １９３２９を有するコンドロマイセス・クロカツス（Chondromyces crocatus）株ＮＰＨ−ＭＢ１８０から単離される。
【００２３】
本発明は、さらに、オープンリーディングフレームが転写および翻訳配列と作動可能に連結している、上記態様のいずれかに定義のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００２４】
さらなる態様において、上記態様のいずれかに定義のポリヌクレオチドまたは発現ベクターでトランスフェクトされており、それを発現する宿主細胞、特に式（Ｉ）もしくは（Ｉ’）の化合物または式（ＩＩ）〜（ＶＩＩ）、（ＸＩ）〜（ＸＩＶ）ならびに（ＸＶＩＩ）および（ＸＶＩＩＩ）の化合物の異種生産のための宿主細胞を提供する。
【００２５】
他の態様において、本発明は、式（Ｉ）もしくは（Ｉ’）または式（ＩＩ）〜（ＶＩＩ）、（ＸＩ）〜（ＸＩＶ）ならびに（ＸＶＩＩ）および（ＸＶＩＩＩ）の化合物を製造する方法であって、上記態様に記載の宿主細胞を、当該化合物が生産される条件下で培養することを含む、製造方法に関する。
【００２６】
ある態様において、本発明は、上記態様のいずれかに記載のポリペプチドまたはＮＲＰＳもしくはＮＲＰＳドメインに特異的に結合する抗体、並びに当該抗体の使用、すなわちポリペプチドまたはＮＲＰＳの精製のための使用に関する。
【００２７】
ある態様において、上記態様のいずれかに定義のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、ＮＲＰＳもしくはＮＲＰＳドメインまたは抗体を含む医薬組成物を提供する。
【００２８】
ある態様において、上記態様のいずれかに定義の本発明のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を好適な条件下で培養して得られるまたはそのようにして得た式（Ｉ）または（Ｉ’）のデプシペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００２９】
ある態様において、本発明は、疾患または状態、すなわちアトピー性皮膚炎の処置および／または診断に使用するための医薬組成物の製造のための、式（Ｉ）または（Ｉ’）のデプシペプチドに関する。ある特定の態様において、式（Ｉ）または（Ｉ’）のデプシペプチドは、選択的ヒトカリクレイン（ｈＫ７）およびエラスターゼ阻害剤、特に選択的ヒトカリクレイン（ｈＫ７）の阻害剤であり、酵素活性、特にセリンプロテアーゼ活性を有する。
【００３０】
本発明のさらなる態様において、式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物の生産に関与するＮＲＰＳをコードする生合成遺伝子クラスターであって、上記態様のいずれかに定義のポリヌクレオチドを含むものを提供する。
【００３１】
本発明の他の態様において、以下の工程：
(a)コンドロマイセス・クロカツス株または関連株のゲノムＤＮＡからなるヌクレオチドライブラリーを構築する；(b)コロニーとしてライブラリー株を培養する；(c)ＮＲＰＳ遺伝子クラスターを含むクローンの同定のための上記態様のいずれかに定義のポリヌクレオチドに基づくプローブ分子で、増殖したコロニーを分析する、そして(d)ＮＲＰＳ遺伝子クラスターを同定する；
を含む方法によって得られる、本発明の生合成遺伝子クラスターの同定のための上記態様のいずれかに定義のポリヌクレオチド配列を提供する。
【００３２】
本発明の骨子は、式（Ｉ）または（Ｉ’）のデプシペプチド、特に式（ＩＩ）〜（ＶＩＩ）、（ＸＩ）〜（ＸＩＶ）ならびに（ＸＶＩＩ）および（ＸＶＩＩＩ）のデプシペプチドの整合性に関与する生合成クラスターまたはその機能的部分の提供にある。特に利点としては、式（Ｉ）または（Ｉ’）のデプシペプチドの生合成クラスターの同定を当該デプシペプチドの異種発現に使用できることである。
【００３３】
「非リボソームペプチド」は、単純アミノ酸モノマーから構成される複雑な天然産物のファミリーに属するペプチドのクラスを意味する。これは非リボソームペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）と呼ばれる大型多機能タンパク質によって、多くの細菌または真菌において合成される。ＮＲＰＳ系の特徴は、タンパク新生および非タンパク新生アミノ酸を含むペプチドを合成できることである。
【００３４】
「非リボソームペプチドシンターゼ」（ＮＲＰＳ）は、モジュールと呼ばれる活性部位の協調的なグループに組織される、大型多機能タンパク質を意味し、ここで各モジュールは、産物長伸長および官能基の修飾の１サイクルを触媒するために必要である。モジュールの数および順序、並びに各ＮＲＰＳ上のモジュール内に存在するドメインのタイプは、取り込まれるアミノ酸の数、順序、選択、そして特定のタイプの伸長に関連した修飾を指示することによって、得られるペプチド産物の構造バリエーションを決定する。
【００３５】
用語「ドメイン」は、触媒活性に必要なタンパク質の機能的部分を意味する。かかるドメインは、同じ触媒活性を有する異なる種由来の酵素間で保存されている。
伸長サイクルに必要な最小セットのドメインは、アデニレーション（Ａ）、チオレーション（Ｔ）またはペプチジルキャリアタンパク質（ＰＣＰ）およびコンデンセーション（Ｃ）ドメインを有するモジュールからなる。
【００３６】
「アデニレーションドメイン」は、ＡＭＰ誘導体中間体を介して、基質選択およびチオエステルとしてＴドメインのホスホ−パンテテインアームへの共有結合性固定に関与している。
【００３７】
Ｃドメインは、上流モジュールからのアミノアシル−またはペプチジル−Ｓ−ＰＣＰと、対応する下流モジュールのＰＣＰに結合したアミノアシル基の間のペプチド結合の形成を触媒する。その結果は、下流モジュールのＰＣＰドメインに固定された１個の残基によるペプチド伸長である。任意の修飾ドメインは、基質エピマー化、Ｎ−メチル化およびヘテロ環化のために存在していてもよい。このモジュールは、１または複数のポリペプチド鎖上に残っていてよい。
【００３８】
多くの場合、最終産物の放出／環化に関与する最後のモジュールの最もＣ末端側にチオエステラーゼ（ＴＥ）ドメインが存在する。
【００３９】
１．式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物を生産する生合成遺伝子クラスターをコードするポリヌクレオチド
下記表１は、式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物の生合成遺伝子クラスターのポリヌクレオチドの具体例およびそれらの対応する機能およびアミノ酸配列を記載している。
【００４０】
【表１】
2012517801.tif 000004
【表２】
2012517801.tif 000005
【００４１】
式（Ｉ）または（Ｉ’）のデプシペプチドの合成のための単離された生合成遺伝子クラスターは、ＮＲＰＳ１およびＮＲＰＳ２とも呼ばれる非リボソームペプチドシンテターゼをコードするＯＲＦ６およびＯＲＦ７を含む、８個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる。ＮＲＰＳ１およびＮＲＰＳ２はＮＲＰＳドメインを含み、対応する推定機能を表１に列挙する。
【００４２】
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ポリペプチド」の意味は当該技術分野において周知であり、当該用語は、異なる定義がないかぎり、本発明の文脈に従って使用される（例えば、それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２）。例えば、「ポリヌクレオチド配列」は、本明細書において使用するとき、天然に生じるかまたは組換えによって作成するタイプの核酸および／またはヌクレオチド配列のあらゆる形態、並びに化学的に合成した核酸／ヌクレオチド配列を意味する。この用語は、核酸アナログおよび核酸誘導体、例えばロックドＤＮＡ、ＰＮＡ、チオリン酸オリゴヌクレオチドおよび置換されたリボオリゴヌクレオチド等も含む。さらに、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含むあらゆる分子をも意味する。
【００４３】
好ましくは、用語「ポリヌクレオチド配列」は、核酸分子、すなわちデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）を意味する。本発明の文脈における「ポリヌクレオチド配列」は、当業者に知られている合成的化学法または組換え技術の使用によって作成してよく、あるいは天然源から単離してもよく、あるいはそれらの組合せでもよい。ＤＮＡおよびＲＮＡは、所望により非天然ヌクレオチドを含んでいてもよく、一本鎖でも二本鎖でもよい。「ポリヌクレオチド配列」は、センスおよびアンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡ、すなわちＤＮＡおよび／またはＲＮＡのヌクレオチドの特定の配列に相補的であるポリヌクレオチド配列も意味する。
【００４４】
さらに、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらのハイブリッドまたは当該技術分野において既知のそのいずれかの修飾物を意味していてもよい（修飾物の例として例えばUS 5525711、US 4711955、US 5792608またはEP 302175参照）。ポリヌクレオチド配列は一本鎖または二本鎖、直線または環状、天然または合成であってよく、いかなるサイズによる限定もない。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはかかるＲＮＡもしくはキメロプラスト（chimeroplast）をコードするＤＮＡであってよい（Gamper, Nucleic Acids Research, 2000, 28, 4332 - 4339）。当該ポリヌクレオチド配列は、プラスミドまたはウイルス性ＤＮＡもしくはＲＮＡの形態であってもよい。「ポリヌクレオチド配列」はホスホチオエートまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）のような当該技術分野で知られている修飾を含む、オリゴヌクレオチドを意味していてもよい。
【００４５】
用語「遺伝子クラスター」または「生合成遺伝子クラスター」は、式（Ｉ）または（Ｉ’）のデプシペプチドの生合成に関与する遺伝子またはその変異体の群を意味する。遺伝子クラスターまたは生合成遺伝子クラスターの遺伝子改変は、式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物の変異体を作成するために適用可能な核酸の突然変異誘発、不活性化または置換を含む当該技術分野で既知のあらゆる遺伝子組換え技術を意味する。遺伝子クラスターまたは生合成遺伝子クラスターの遺伝子改変は、式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物の遺伝的変異体を作成するために適用可能な核酸の突然変異誘発、不活性化または置換を含む当該技術分野で既知のあらゆる遺伝子組換え技術を意味する。
【００４６】
ＤＮＡもしくはヌクレオチド「コーティング配列」または特定のポリペプチドもしくはタンパク質を「コードする配列」は、適切な制御配列の制御下に置かれたときにポリペプチドまたはタンパク質に転写および翻訳されるＤＮＡ配列である。
【００４７】
具体的な態様において、複数の本発明のポリヌクレオチド（例えば、それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２）を組み合わせて用いてもよい。あるいは、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２のフラグメントまたは機能的変異体に関する。
【００４８】
ポリヌクレオチド配列の文脈において、用語「そのフラグメント」または「その機能的フラグメント」は、特に核酸分子のフラグメントまたは変異体を意味する。「ポリヌクレオチドのフラグメント」は、例えば、少なくとも１個のアミノ酸欠失を有しており、それによって野生型ポリペプチドと同じ機能（各ポリペプチドの機能は表１および図２により詳細に記載されている）を実質的に保持している本発明のポリペプチド（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４に示すポリペプチド）をコードしてよい。このような短くなったポリペプチドは、本発明のポリペプチド（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３に示す）の機能的フラグメントと理解されうる。
【００４９】
「ポリヌクレオチドの機能的変異体」は、例えば、少なくとも１個のアミノ酸置換または付加を有しており、それによって好ましくは野生型ポリペプチドと同じ機能（各ポリペプチドの機能は表１および図２により詳細に記載されている）を保持している本発明のポリペプチド(例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３に示すポリペプチド）をコードしうる。このような短くなったポリペプチドは、本発明のポリペプチド（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３に示す）の機能的フラグメントと理解されうる。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチド／ポリペプチドの機能的変異体は、表１に記載の対応する元のポリヌクレオチド／ポリペプチド配列と、少なくとも５０％、５５％、６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％さらに最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。例えば、ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３に示すポリペプチドと少なくとも５０％、５５％、６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性／相同性を有する。
【００５１】
非リボソームペプチドシンターゼ（ＮＲＰＳ）または表１に記載の他のＯＲＦのヌクレオチド配列に関して、用語「フラグメント」は、本明細書において使用するとき、少なくとも７、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０または少なくとも７００ヌクレオチド長を有するヌクレオチド配列を意味する。
【００５２】
用語「ハイブリダイズ」は、本明細書において使用するとき、常套のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントな条件下での、例えばハイブリダイゼーションSambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USAに記載のハイブリダイゼーションを意味する。さらに特定されていない限り、条件は、好ましくは非ストリンジェントである。ハイブリダイゼーション条件は、例えばSambrook (2001) loc. citに記載の、常套のプロトコルに従って確立できる。条件設定は十分に当業者の技術の範囲内であり、当該技術分野において記載のプロトコルに従って決定できる。したがって、特異的にのみハイブリダイズする配列の検出は、通常、ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび線条条件を必要とする。非限定的な例として、高いストリンジェントなハイブリダイゼーションは、次の条件下で生じうる：
【表３】
2012517801.tif 000006
【００５３】
ホモログまたは正確に相補的でない配列の検出のための低いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば6 x SSC、1% SDS、65℃に設定できる。周知のとおり、プローブの長さおよび決定する核酸の組成は、ハイブリダイゼーション条件のさらなるパラメーターを構成する。
【００５４】
本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドも、本発明の一部であり、例えば動物のゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーまたは微生物のＤＮＡライブラリーから単離できる。好ましくは、かかるポリヌクレオチドは微生物起源のもの、特にプロテオバクテリアクラスに属する微生物、特にデルタプロテオバクテリア、特にミキソコッカス目（Myxococcales）、特にソランギウム亜目（Sorangiineae）、特にポリアンギウム科（Polyangiaceae）、とりわけコンドロマイセス属（Chondromyces）、例えばコンドロマイセス・クロカツス（Chondromyces crocatus）またはその改良株のものである。
【００５５】
あるいは、かかる本発明の変異ヌクレオチド配列は、遺伝子操作または化学合成によって作成してもよい。ハイブリダイズ可能なかかるポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列またはその一部もしくは逆相補体を用いて、例えば標準的な方法によるハイブリダイゼーション（例えばSambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA参照）によって、同定および単離できる。列挙した配列番号またはその一部／フラグメントと同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列は、例えばハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。フラグメントはＮＲＰＳ遺伝子クラスターの診断、配列決定またはクローニングのためのプローブまたはプライマーとしても有用でありうる。ハイブリダイゼーションプローブとして使用されるフラグメントは、通常の合成技術によって作成される合成フラグメントであってもよく、その配列は本発明のヌクレオチド配列のものと実質的に同一である。
【００５６】
本明細書において使用するとき、２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要のあるギャップ数および各ギャップの長さを考慮し、当該配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一性パーセント＝同一位置数／全位置数×１００）である。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、下記のような、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。
【００５７】
好ましくは、同一性／相同性の程度は、列挙した配列番号に示すヌクレオチド配列とそれぞれの配列を比較して決定する。比較する配列が同じ長さを有さないとき、相同性の程度は、好ましくは、より長い配列におけるヌクレオチド残基と同一であるより短い配列のヌクレオチド残基のパーセンテージを意味する。通常は、相同性の程度は、ClustalW分析を備えたDNASTARプログラムのような既知のコンピュータープログラムを用いて決定できる。このプログラムはDNASTAR, Inc., 1228 South Park Street, Madison, WI 53715から、またはDNASTAR, Ltd., Abacus House, West Ealing, London W13 0AS UKから入手でき（support@dnastar.com）、ＥＭＢＬ外部ステーションのサーバーでアクセス可能である。
【００５８】
特定の配列が例えば参照配列と８０％同一であるかを決定するためにClustal分析法を用いる場合、好ましくは、アミノ酸配列の比較のための設定は次の通りである：マトリックス: blosum 30； オープンギャップペナルティ: 10.0； エクステンドギャップペナルティ: 0.05； ディレイダイバージェント: 40； ギャップ分離距離: 8 。ヌクレオチド配列比較については、エクステンドギャップペナルティは好ましくは5.0に設定する。
【００５９】
配列比較によって比較される２つのヌクレオチド配列が異なる場合、同一性は、より短い配列とより短い配列にマッチするより長い配列の一部を意味する。換言すれば、比較する配列が同じ長さを有さない場合、同一性の程度は、好ましくは、より長い配列におけるヌクレオチド残基と同一であるより短い配列におけるヌクレオチド残基のパーセンテージまたはより短い配列におけるヌクレオチド残基と同一であるより長い配列におけるヌクレオチドのパーセンテージのいずれかを意味する。この文脈において、当業者は、より短い配列に「マッチ」するより長い配列の一部を、容易に決定することができる。
【００６０】
一般に、どのように核酸分子を、例えば天然源から得るか、あるいは合成またはＰＣＲのような組換え技術によって作成できるかを、当業者は知っている。これらの核酸分子は、関連文献に記載の技術を適用して得ることができる修飾または誘導体化された核酸分子を含む。
【００６１】
さらに、同一性は、対応するヌクレオチド配列またはポリペプチド（例えばそれによってコードされるポリペプチド）間の機能的および／または構造的均等性が存在することを意味する。本明細書に記載の特定のヌクレオチド／アミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド／アミノ酸配列は、好ましくは同じ生物学的機能を有し、これらの配列の誘導体／変異体を意味しうる。それらは天然に生じる変異体、例えば生態型、変種、種等に由来する配列または変異体であってよく、当該変異体は、天然に形成されるかあるいは計画的突然変異誘発によって作成してよい。さらに、変異体は合成的に作成された配列であってもよい。アレル変異体は天然に生じる変異体または合成によって作成した変異体または組換えＤＮＡ技術によって作成した変異体であってよい。上記ポリヌクレオチドからの逸脱は、例えば欠失、置換、付加、挿入および／または組換えによって作成できる。用語「付加」は、所定の配列の末端に少なくとも１個の核酸残基／アミノ酸を加えることを意味し、一方で「挿入」は、所定の配列中に少なくとも１個の核酸残基／アミノ酸を挿入することを意味する。
【００６２】
変異体ポリペプチドおよび特に本発明のヌクレオチド配列の異なる変異体によってコードされるポリペプチドは、好ましくは、共通して有するある特徴を示す。これらは、例えば生物学的活性、分子量、免疫応答、コンホメーション等および物理的特性、例えばゲル電気泳動における泳動動態、クロマトグラフでの動態、沈降係数、溶解性、分光学的特性、安定性、至適ｐＨ、至適温度等を含む。
【００６３】
ある具体的な態様において、本発明は、下記１個以上のＮＲＰＳ１ドメインの活性を保持する１個以上の発現産物をコードするポリヌクレオチドを提供する：
(i)配列番号３１のローディングドメイン；
(ii)配列番号３３のグルタミンのアデニレーションドメイン；
(iii)配列番号３５のチオレーションドメイン；
(iv)配列番号３７のコンデンセーションドメイン；
(v)配列番号３９のスレオニンのアデニレーションドメイン；
(vi)配列番号４１のチオレーションドメイン；
(vii)配列番号４３のコンデンセーションドメイン；および
(viii)配列番号４５のロイシンのアデニレーションドメイン。
【００６４】
特定の態様において、ポリヌクレオチドは上記全てのＮＲＰＳ１ドメインの活性を保持する１個以上の発現産物をコードする。
【００６５】
別の態様において、ポリヌクレオチドは、１、２または３個のアデニレーションドメインが異なるアミノ酸特異性を有する１個以上のアデニレーションドメインに置換されていることを除き、上記全てのＮＲＰＳ１ドメインの活性を保持する１個以上の発現産物をコードする。
【００６６】
別の具体的な態様において、本発明は、下記１個以上のＮＲＰＳ２ドメインの活性を保持する１個以上の発現産物をコードするポリヌクレオチドを提供する：
(i)配列番号４７のチオレーションドメイン；
(ii)配列番号４９のコンデンセーションドメイン；
(iii)配列番号５１のプロリンのアデニレーションドメイン；
(iv) 配列番号５３のチオレーションドメイン；
(v) 配列番号２のコンデンセーションドメイン；
(vi) 配列番号４のイソロイシンのアデニレーションドメイン；
(vii) 配列番号６のチオレーションドメイン；
(viii) 配列番号８のコンデンセーションドメイン；
(ix) 配列番号１０のチロシンのアデニレーションドメイン；
(x) 配列番号１２のＮ−メチレーション ドメイン；
(xi) 配列番号１４のチオレーションドメイン；
(xii) 配列番号５５のコンデンセーションドメイン；
(xiii)配列番号５７のイソロイシンのアデニレーションドメイン；
(xiv) 配列番号５９のチオレーションドメイン；および
(xv) 配列番号６１のチオエステラーゼドメイン。
【００６７】
特定の態様において、ポリヌクレオチドは上記全てのＮＲＰＳ２ドメインの活性を保持する１個以上の発現産物をコードする。別の態様において、ポリヌクレオチドは、１、２、３または４個のアデニレーションドメインが異なるアミノ酸特異性を有する１個以上のアデニレーションドメインに置換されていることを除き、上記全てのＮＲＰＳ１ドメインの活性を保持する１個以上の発現産物をコードする。
【００６８】
ＮＲＰＳ１をコードするＯＲＦ６、ＮＲＰＳ２をコードするＯＲＦ７およびチトクロムＰ４５０をコードするＯＲＦ８は、式（Ｉ）または（Ｉ’）のデプシペプチドの生合成のためのコア酵素をコードすると推定される。したがって、さらなる局面において、本発明は、
(i) 配列番号２７（ＮＲＰＳ１）をコードするヌクレオチド配列またはその機能的変異体；および
(ii) 配列番号２９（ＮＲＰＳ２）をコードするヌクレオチド配列またはその機能的変異体
を含むポリヌクレオチドに関する。
【００６９】
ポリヌクレオチドは、さらに、配列番号６３をコードするヌクレオチド配列またはその機能的変異体を含んでいてもよい。ある具体的な態様において、これらのポリヌクレオチドは、受託番号ＤＳＭ１９３２９を有するコンドロマイセス・クロカツス（Chondromyces crocatus）株ＮＰＨ−ＭＢ１８０から単離される。
【００７０】
２．式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物の生産に関与するＮＲＰＳおよび他のポリペプチド
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、特に表１に記載のもの、例えばＮＲＰＳ１およびＮＲＰＳ２に関する。本発明はさらにそれらの機能的フラグメントおよび機能的変異体に関する。
【００７１】
本発明はまた、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３のポリペプチドの変異体またはその少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００または５００連続アミノ酸を含むフラグメントに関する。用語「変異体」は、誘導体またはこれらのポリペプチドのアナログを含む。特に、変異体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３のポリペプチドとアミノ酸配列において、１、２、３、４、５またはそれ以上の置換、付加、欠失、融合およびトランケーション（これらは任意の組合せで存在していてもよい）によって異なっていてよい。
【００７２】
変異体は天然に存在するかあるいはインビトロで作成できる。特に、かかる変異体は遺伝子操作技術、例えば部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、エキソヌクレアーゼIII欠失法および標準的なクローニング技術を用いて作成できる。あるいは、かかる変異体、フラグメント、アナログまたは誘導体は、化学合成または修飾法を用いて作成してもよい。
【００７３】
変異体を作成する他の方法も当業者に周知である。これらには、天然単離体から得られた核酸配列を修飾して、工業的または研究的利用価値を高めた特性を有するポリペプチドをコードする核酸を作成する手法が含まれる。かかる手法において、天然単離体から得られる配列について１個以上のヌクレオチドの相違を有する多数の変異体配列が作成され、特徴付けられる。好ましくは、これらのヌクレオチドの相違は、天然単離体からの核酸によってコードされるポリペプチドに対して、アミノ酸の変化を引き起こす。
【００７４】
例えば、変異体は、エラープローンＰＣＲを用いて作成できる。エラープローンＰＣＲにおいて、ＤＮＡ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼの忠実度が低く、したがってＰＣＲ産物の全長にわたって点突然変異が高い確率で得られるような条件下で実施される。エラープローンＰＣＲはLeung, D.W., et al., Technique, 1:11-15 (1989)およびCaldwell, R. C. & Joyce G.F., PCR Methods Applic., 2:28-33 (1992)に記載されている。変異体は、部位特異的突然変異誘発を用いて、目的のクローン化されたＤＮＡセグメントに部位特異的変異を作成することで作成してもよい。オリゴヌクレオチド突然変異誘発はReidhaar-Olson, J.F. & Sauer, R.T., et al., Science, 241:53-57 (1988)に記載されている。米国特許第6,361,974号及び第6,372,497号に記載のもののような定向進化戦略を用いて変異体を作成してもよい。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４のポリペプチドの変異体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３のポリペプチドのアミノ酸残基の１、２、３、４、５またはそれ以上が保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されており、かかる置換アミノ酸残基は遺伝コードによってコードされるかされなくてよい、変異体であってよい。
【００７５】
保存的置換は、あるポリペプチドにおける所定のアミノ酸を、同様の特性の別のアミノ酸で置換することである。典型的には、保存的置換は以下の置換として見られる：Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅのような脂肪族アミノ酸の別の脂肪族アミノ酸での置換；ＳｅｒのＴｈｒでの置換またはＴｈｒのＳｅｒでの置換；ＡｓｐまたはＧｌｕのような酸性残基の別の酸性残基での置換；ＡｓｎまたはＧｌｎのようなアミド基を有する残基の別のアミド基を有する残基での置換；ＬｙｓまたはＡｒｇのような塩基性残基の別の塩基性残基での交換；およびＰｈｅまたはＴｙｒのような芳香族性残基の別の芳香族性残基での置換。
【００７６】
他の変異体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３のポリペプチドの１個以上のアミノ酸残基が置換基を含むものである。さらに別の変異体は、ポリペプチドが別の化合物、例えばポリペプチドの半減期を延長させる化合物（例えばポリエチレングリコール）と結合しているものである。さらなる変異体は、ポリペプチドにさらなるアミノ酸、例えばリーダー配列、分泌配列、前タンパク質配列またはポリペプチドの精製、富化もしくは安定化を促進する配列と融合しているものである。
【００７７】
ある態様において、フラグメント、誘導体およびアナログは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３のポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を保持している。用語「そのフラグメント」は、ポリペプチドの文脈において本明細書において使用するとき、本発明のポリヌクレオチド（例えばそれぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２）によってコードされてもよい本発明に定義のポリペプチド（例えばそれぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３のとおり）と実質的に同じ（生物学的）活性を有する機能的フラグメントを意味する。
【００７８】
他の態様において、フラグメント、誘導体およびアナログは、少なくとも１、２、３、４、５、６または７このアデニレーションドメインが異なるアデニレーションドメインによって置換されておりそれによって異なるアミノ酸特異性が与えられていることを除き、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３のポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を保持する。
【００７９】
他の態様において、フラグメント、誘導体またはアナログは、フラグメント、誘導体またはアナログから離れて全体または一部で酵素的に切断されうるポリペプチドの精製、富化、検出、安定化または分泌を促進する融合異種配列を含む。
【００８０】
本発明の別の局面は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３のポリペプチドまたはその少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００もしくは５００連続アミノ酸を含むフラグメントの一つと、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントである。アミノ酸「同一性」は、上記のもののような保存的置換を含むと理解される。
【００８１】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３のポリペプチドまたはその少なくとも少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００もしくは５００連続アミノ酸を含むフラグメントの一つと相同性を有するポリペプチドまたはフラグメントは、上記技術を用いてそれらをコードする核酸を単離して得ることができる。
【００８２】
あるいは、生化学的富化または精製手法によって、相同なポリペプチドまたはフラグメントを得ることができる。潜在的に相同なポリペプチドまたはフラグメントの配列は、タンパク質消化、ゲル電気泳動および／またはミクロシークエンシングによって決定できる。推定される相同なポリペプチドまたはフラグメントの配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３のポリペプチドまたはその少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００もしくは５００連続アミノ酸を含むフラグメントの一つと比較できる。
【００８３】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３のポリペプチドまたはその少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００もしくは５００連続アミノ酸を含むフラグメント、その少なくとも４０、５０、７５、１００、１５０、２００もしくは３００連続アミノ酸を含むフラグメントは、様々な用途に使用できる。例えばポリペプチドまたはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログを用いて、本明細書の別の箇所に記載の生化学反応を触媒することができる。
【００８４】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３のポリペプチドまたはその少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００もしくは５００連続アミノ酸を含むフラグメントを用いて、ポリペプチドまたはフラグメント、誘導体もしくはアナログに特異的に結合する抗体を作成してもよい。
【００８５】
具体的な態様において、本発明のポリペプチド（例えばそれぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３）を組み合わせて用いてよい。
【００８６】
用語「活性」または「機能性」は、本明細書において使用するとき、特に酵素活性、例えばＮＲＰＳ１およびＮＲＰＳ２のペプチドシンターゼ活性を誘発するポリペプチドまたはそのフラグメントの能力を意味する。当業者は本明細書に記載の機能性の（生物学的）活性はしばしば発現レベル（例えばタンパク質／ｍＲＮＡ）と相関すると気付くであろう。異なることが記載されていない限り、用語「発現」は、本明細書において用いるとき、本発明のポリペプチド／タンパク質（またはそのフラグメント）をコードする核酸分子の発現を意味し、一方で「活性」は、当該ポリペプチド／タンパク質の活性を意味する。本明細書に記載のポリペプチドの活性を測定する方法／アッセイは、当該技術分野において周知である。
【００８７】
３．発現ベクター、組換え宿主細胞および式（Ｉ）または（Ｉ’）のデプシペプチドを製造する方法
本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチドは、例えば式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物の異種発現に有用である。具体的な態様において、それらは、式（Ｉ’）の化合物の異種発現に有用である。
【００８８】
したがって、さらなる局面において、本発明は、本明細書に記載の核酸分子を含むベクター、より具体的には発現ベクター、ならびに当該核酸分子および／またはベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
【００８９】
用語「ベクター」は、本明細書において使用するとき、特にプラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体、ウイルス、バクテリオファージおよび遺伝子工学において一般に使用される他のベクターを意味する。好ましい態様において、本発明のベクターは、細胞、例えば真菌細胞、酵母もしくは細菌細胞のような微生物の細胞または動物細胞の形質転換に好適である。「発現ベクター」は、核酸を宿主細胞に導入して導入した配列の発現を引き起こすビークルを意味する。
【００９０】
本明細書に記載のとおり、ポリペプチドは、コード配列が好適な宿主細胞においてコードされるポリペプチドの発現を駆動することができる配列と作動可能に連結するように、ポリペプチドをコードする核酸をベクターに挿入して、得ることができる。例えば、発現ベクターは、プロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含んでいてよい。ベクターは、発現レベルを調節するための適切な配列、複製起点および選択マーカーを含んでいてもよい。細菌におけるポリペプチドまたはそのフラグメントの発現に好適なプロモーターは、E. coli lacまたはtrp プロモーター、lacl プロモーター、lacZ プロモーター、T3 プロモーター、T7 プロモーター、gpt プロモーター、ラムダ PR プロモーター、ラムダ PL プロモーター、解糖系の酵素、例えば３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）をコードするオペロン由来のプロモーターおよび酸ホスファターゼプロモーターを含む。真菌プロモーターは、α因子プロモーターを含む。シュードモナス・プチダ（Pseudomonas Putida）における発現に好適なプロモーターは、ゲノムに存在する７つの16S rRNA遺伝子（PP 16SA、PP 16SB、PP 16SC、PP 16SD、PP 16SE、PP 16SF、PP 16SG）の対応転写プロモーター、抗生物質耐性決定要因の転写プロモーター、三価鉄取り込みリプレッサー（Fur）制御遺伝子の転写プロモーターを含むが、これらに限定されない。三価鉄取り込みリプレッサー（Fur）制御プロモーターのより詳細な説明は、以下に提供する。真核生物プロモーターは、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、熱ショックプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルス由来のＬＴＲおよびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターを含む。原核生物もしくは真核生物細胞またはウイルスにおいて、遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターを用いてもよい。
【００９１】
哺乳類発現ベクターは、複製起点、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニレーション部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列および５’フランキング非転写配列を含んでいてもよい。ある態様において、ＳＶ４０スプライスおよびポリアデニレーション部位由来のＤＮＡ配列を用いて、必要な非転写遺伝要素を提供することができる。
【００９２】
真核生物細胞においてポリペプチドまたはそのフラグメントを発現するためのベクターは、発現レベルを上昇させるエンハンサーを含んでいてもよい。エンハンサーは、転写を増加させるプロモーターとして作用する通常約１０〜約３００ｂｐ長のＤＮＡのシス−作用エレメントである。例えば、複製起点の後側の１００〜２７０ｂｐのＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを含む。
【００９３】
さらに、発現ベクターは好ましくは、ベクターを含む宿主細胞の選択が可能なように１個以上の選択マーカー遺伝子を含む。使用できる選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子または真核細胞培養にネオマイシン耐性を与える遺伝子、大腸菌にテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性を与える遺伝子、ならびに出芽酵母ＴＲＰ１遺伝子を含む。好適なマーカーの例は、ゲンタマイシン耐性カセットａａｃＣｌである。他の選択マーカーーは、アンピシリン耐性を与えるヌクレオチドカセット（例えばｂｌａ）、クロラムフェニコール耐性を与えるヌクレオチドカセット（例えばｃａｔ）、カナマイシン耐性を与えるヌクレオチドカセット（例えばａａｃＣ２、ａａｄＢまたは他のアミノグリコシド修飾酵素）またはテトラサイクリン耐性を与えるヌクレオチドカセット（例えばｔｅｔＡまたはｔｅｔＢ）である。
【００９４】
適切なＤＮＡ配列は、様々な手段でベクターに挿入できる。一般に、ＤＮＡ配列をベクターの所望の位置にライゲートし、次いで適切な制限エンドヌクレアーゼで挿入物およびベクターを消化する。あるいは、ＰＣＲにより適切な制限酵素部位をＤＮＡ配列へと設計することができる。様々なクローニング技術がAusbel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997 および Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989に記載されている。かかる手法および他のものは、当該技術分野の技術範囲内であると理解される。
【００９５】
ベクターは例えば、プラスミド、ウイルス粒子またはファージの形態であってよい。他のベクターは、染色体の誘導体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、ウイルス、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、ワクチンのようなウイルス性ＤＮＡ，アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病ウイルスを含む。原核および真核宿主で使用するための多様なクローニングおよび発現ベクターは、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)に記載されている。
【００９６】
使用できる具体的な細菌ベクターは、周知のクローニングベクターの遺伝的要素を含む商業的に入手可能なプラスミド、例えばpBR322 (ATCC 37017)、pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)、pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) pQE70、pQE60、pQE-9 (Qiagen)、pD10、phiX174、pBluescript(商標) II KS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A (Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5 (Pharmacia)、pKK232-8 および pCM7を含む。具体的な真核ベクターは、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG (Stratagene) pSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL (Pharmacia)を含む。しかし、あらゆる他のベクターが、宿主細胞において複製可能であり安定である限り、使用可能である。
【００９７】
エレクトロポレーション形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃またはＴｉ介在遺伝子導入を含む多様な技術のいずれかを用いて、ベクターを宿主細胞に導入してよい。適切であるとき、操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化させ、形質転換体を選択しまたは本発明の遺伝子を増幅するために適切なように修飾された、常套の栄養培地で培養できる。好適な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への当該宿主株の成長の後、選択されたプロモーターを適切な手段（例えば温度変化または化学的誘導）で誘導してよく、所望のポリペプチドまたはそのフラグメントを生産させるためにさらなる期間にわたって当該細胞を培養してよい。
【００９８】
さらなる局面において、本発明の組換え宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを発現できるかあるいは発現している。具体的な態様において、宿主細胞に含まれる「ポリペプチド」は、宿主細胞の起源に対して異種であってよい。本発明の宿主細胞を作成するために用いる様々な発現系の例の概略、例えば上記の具体的なものは、例えばGlorioso et al. (1999), Expression of Recombinant Genes in Eukaryotic Systems, Academic Press Inc., Burlington, USA、Paulina Balbas und Argelia Lorence (2004), Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols, Second Edition: Reviews and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press, USAに記載されている。
【００９９】
本発明のヌクレオチド配列またはベクターによる宿主細胞の形質転換または遺伝子操作は、標準的な方法、例えばSambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USAに記載のとおりに行うことができる。さらに、本発明の宿主細胞は、特にｐＨ値、温度、塩濃度、通気、抗生物質、ビタミン、微量元素等の観点から、使用する具体的な宿主細胞の要求を満たす栄養培地中で培養する。
【０１００】
一般に、本発明の宿主細胞は、本発明のヌクレオチド配列、ベクターおよび／またはポリペプチドを含む原核または真核細胞、あるいは本発明のヌクレオチド配列、ベクターおよび／またはポリペプチドを含む細胞に由来する細胞であってよい。好ましい態様において、宿主細胞は、例えば遺伝子操作によって、そのゲノムに組み込まれた本発明のヌクレオチド配列をそれが含むように、本発明のヌクレオチド配列またはベクターを含む。かかる本発明の宿主細胞の非限定的な例（一般的な本発明の宿主細胞でもある）は、細菌、酵母、真菌、植物、動物またはヒト細胞であってよい。
【０１０１】
用語「宿主細胞」または「単離された宿主細胞」は、その生物が式（Ｉ）の化合物または式（Ｉ’）の化合物を生産することが知られていようといまいと、その化合物を生産するために必要な遺伝子情報を担持する微生物を意味する。該用語は、本明細書において使用するとき、天然環境に存在するままでその生物に例えば式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物を生産するための遺伝情報が見られる生物と、遺伝情報が組換え技術によって導入される生物に、等しく適用する。宿主細胞は原核細胞または真核細胞を含む当該技術分野において周知のあらゆる宿主細胞であってよい。適切な宿主の代表例として、次のものを挙げることができる：細菌細胞、例えば大腸菌（E. coli）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・グリセオフスカス（Streptomyces griseofuscus）、ストレプトマイセス・アムボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、ミキソコッカス・キサンタス（Myxococcus xanthus）、ソランギウム・セルロサム（Sorangium cellulosum）、コンドロマイセス・クロカツス（Chondromyces crocatus）およびシュードモナス属、ストレプトマイセス属、バシラス属およびスタフィロコッカス属の多様な種、真菌細胞、例えば酵母、困窮細胞、例えばDrosophila S2およびSpodoptera Sf9、動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫、ならびにアデノウイルス。適切な宿主の選択は当業者の能力の範囲内である。
【０１０２】
本明細書で意図する生物源は、プロテオバクテリアに含まれる生物、好ましくはデルタプロテオバクテリア、より好ましくはミキソコッカス目（Myxococcales）、より好ましくはソランギウム亜目（Sorangiineae）、より好ましくはポリアンギウム科（Polyangiaceae）、最も好ましくはコンドロマイセス属（Chondromyces）、例えばコンドロマイセス・クロカツス（Chondromyces crocatus）またはその改良株のものである。
【０１０３】
用語「組換え宿主細胞」は、本明細書において使用するとき、本発明のヌクレオチド配列で遺伝子操作されているかまたは本発明のベクターまたはポリペプチドもしくはそのフラグメントを含む宿主細胞を意味する。本発明は、異種組換え宿主細胞、すなわち天然生産株とは異なる別の株において発現される式（Ｉ）または式（Ｉ’）のデプシペプチドの生産を可能とする。例示として細菌株の使用を説明するが、本明細書に記載のとおり、あらゆる生物または発現系を用いてよい。生物の選択は当業者の必要に応じる。例えば、遺伝子操作を受け入れられる株は、デプシペプチド化合物の修飾および生産を促進するために使用できる。
【０１０４】
ある具体的な態様において、宿主細胞は、ミキソコッカス属またはシュードモナス属、例えばシュードモナス・プチダから選択される。あるより具体的な態様において、組換え宿主細胞、例えばシュードモナス・プチダは、ＮＲＰＳ１（配列番号２７）およびＮＲＰＳ２（配列番号２９）またはその機能的変異体をコードするヌクレオチドを含む。それはさらに、配列番号６３のチトクロムＰ４５０またはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよい。それはまた、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５および配列番号２７の１つ以上を含んでいてもよい。有利には、各オープンリーディングフレームは、これらのＯＲＦが組換え宿主細胞によって好適な条件下で発現されるように、機能的転写および翻訳配列の制御下に存在する。シュードモナス・プチダにおける異種発現の具体例は、下記実施例にさらに説明されている。
【０１０５】
上記に従って、本発明は、さらなる態様において、式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物を生産する方法であって、式（Ｉ）または式（Ｉ’）、例えば式（ＩＩ）〜（ＶＩＩ）、（ＸＩ）〜（ＸＩＶ）ならびに（ＸＶＩＩ）および（ＸＶＩＩＩ）の化合物が合成される条件下で組換え宿主細胞を培養し、そして当該化合物を回収することを含む方法に関する。
【０１０６】
用語「条件」は、本明細書において使用するとき、式（Ｉ）の化合物または式（Ｉ’）の化合物を発現し、回収するための組換え宿主細胞の培養条件を意味する。ある具体的な態様において、組換え宿主細胞はシュードモナス・プチダである。別の具体的な態様において、組換え宿主細胞はシュードモナス・プチダであり、当該細胞は３０℃未満、例えば１０〜２０℃、例えば約１５℃で成長させる。
【０１０７】
別の具体的な態様において、成長培地はイソ酪酸、例えば１〜５ｇ／ｌのイソ酪酸、例えば約２ｇ／ｌのイソ酪酸を含む。
【０１０８】
例えば、本発明の組換え宿主細胞は、特に、式（Ｉ）または式（Ｉ’）のデプシペプチドの促進されたかあるいは増加した生産に好適であり得る。
【０１０９】
４．異種遺伝子発現における鉄制御プロモーターの使用
本発明の別の局面は、宿主細胞、例えばシュードモナス属宿主細胞、例えばシュードモナス・プチダにおける、目的の組換えタンパク質の異種遺伝子発現または合成に関する。例えば、特に組換えタンパク質発現が細菌の増殖を損ねうる場合、増殖の転換期までまたは宿主細胞が健康な集団密度もしくは最も適切な異種遺伝子発現の段階まで、異種遺伝子発現が阻害されるようにそれを制御する必要がある。本発明は、宿主細胞、例えばシュードモナス・プチダにおいて、Ｆｕｒ制御プロモーターによって異種遺伝子発現の制御に成功しうることを示す。かかるプロモーターの使用は、デプシペプチドの生合成遺伝子クラスターの異種発現のために、本明細書に記載されているが、本発明のＦｕｒ制御プロモーターは、目的の組換えタンパク質の異種遺伝子発現または合成のために、当該技術分野においてより広い用途を有しうる。
【０１１０】
したがって本発明は、組換え宿主細胞、好ましくは細菌宿主細胞、例えばシュードモナス属、例えばシュードモナス・プチダにおける異種遺伝子発現を制御し、向上させる手段を提供する。
【０１１１】
ある態様において、本発明は、異種遺伝子発現または目的の組換えタンパク質の合成のための発現カセットに関する。かかる発現カセットは、鉄制御プロモーターと作動可能に連結した、目的の成熟組換えタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（以下、コード配列と称する）を少なくとも含むポリヌクレオチドである。
【０１１２】
「異種遺伝子発現」の文脈内で本明細書において使用するとき、用語「目的の組換えタンパク質」は、鉄制御プロモーターの制御下では天然には発現されないタンパク質を意味する。好ましい態様において、目的の組換えタンパク質は、酵素、治療用タンパク質（ホルモン、成長因子、抗凝固剤、レセプターアゴニストもしくはアンタゴニストまたはデコイレセプターを含むがこれらに限定されない）、抗体（診断用または治療用を含む）または別の標的結合足場、例えばフィブロネクチン由来のタンパク質、シングルドメイン抗体、一本鎖抗体、ナノボディー等であってよいが、これらに限定されない。
【０１１３】
発現カセットの文脈において本明細書において使用するとき、用語「作動可能に連結」は、プロモーターがタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を制御するようにタンパク質をコードするヌクレオチド配列に連結しているプロモーターを含むポリヌクレオチド配列を意味する。
【０１１４】
本発明の発現カセットは、宿主細胞における目的の組換えタンパク質の好適な発現に必要な他の制御配列、例えば５’非翻訳領域、シグナルペプチド、ポリアデニレーション領域および／または他の３’非翻訳領域をさらに含んでいてよい。
【０１１５】
４．１  鉄制御プロモーターおよびＦｕｒ制御プロモーター
ある具体的な態様において、本明細書の第４項に記載の本発明の発現カセットに使用できる鉄制御プロモーターは、培養培地中の鉄の利用能に応答して機能する鉄上流リプレッサー（Ｆｕｒ）またはＦｕｒリプレッサータンパク質のホモログから選択されるタンパク質によって部分的または完全に転写的に抑制される、いずれかの細菌プロモーターであり得る。それはさらに、Ｆｕｒ依存的および培養培地中の鉄の利用能に応答してコード配列の発現を制御するように、コード配列と作動可能に連結していてよいＦｕｒリプレッサー結合部位を含む、いずれかのプロモーターを含む。細菌Ｆｕｒリプレッサータンパク質の例は、当該技術分野において知られており、例えばCarpenter et al. (2009)に記載されている。
【０１１６】
本明細書において使用するとき、抑制条件下（すなわちリプレッサーもしくはリプレッサー刺激および／またはリプレッサー結合部位の存在下）でのプロモーター活性が、レポータージーンアッセイ、例えばlacZレポータージーンアッセイで測定したとき、非抑制条件下（すなわち、リプレッサーもしくはリプレッサー刺激および／またはリプレッサー結合部位の非存在下）でのプロモーター活性の少なくとも５倍低いとき、プロモーターは、外部の刺激もしくはシス−エレメントまたはリプレッサーに応答して抑制されている。
【０１１７】
Ｆｕｒリプレッサー結合部位は当該技術分野において既知であり、多くの細菌、例えば大腸菌、緑膿菌、ネズミチフス菌および枯草菌において発見されている（Carpenter et al. (2002)）。他のＦｕｒリプレッサー結合部位は、配列番号６４のＦｕｒリプレッサー結合部位コンセンサス配列とのホモロジーによって探索できる。好ましい態様において、Ｆｕｒリプレッサー結合部位は配列番号６４〜６８のいずれか１つからなる群から選択される。
【０１１８】
Ｆｕｒ制御プロモーターは当該技術分野において既知であり、多くの細菌、例えば大腸菌、緑膿菌、コレラ菌、ネズミチフス菌、枯草菌、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylorii）、ヒト結核菌、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobium japonicum）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ペスト菌および黄色ブドウ球菌において同定されている（Carpenter et al. (2002)）。Ｆｕｒ制御プロモーターの例は、配列番号６９〜７１のいずれか１つを含むが、それらに限定されない。
【０１１９】
好ましい態様において、Ｆｕｒ制御プロモーターは、下記群から選択されるポリヌクレオチド配列である：
a) 配列番号６９
b) 配列番号６９と実質的に同じプロモーター活性を保持する配列番号６９のフラグメント；
c) 配列番号６９と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有する配列番号６９の変異プロモーター。
【０１２０】
ある態様において、配列番号６９のフラグメントは、配列番号６５または配列番号６６のＦｕｒリプレッサー結合部位の少なくとも１個および配列番号６９の３’下流配列のいずれかを含むフラグメントである。
【０１２１】
ある態様において、かかる変異プロモーターは、配列番号６５もしくは配列番号６６と同一または配列番号６５および配列番号６６のＦｕｒリプレッサー結合部位における１、２、３、４または５個以上のヌクレオチドの変化を有する、Ｆｕｒリプレッサー結合部位を含む核酸であってよい。
【０１２２】
他の態様において、配列番号６９の変異プロモーターは、配列番号６９と実質的に同じ活性を保持する機能的変異体である。具体的な態様において、変異プロモーターは配列番号６９と実質的に同じ活性を保持し、配列番号６９と少なくとも５０％同一であるが、配列番号６５および配列番号６６と同じかまたは配列番号６５および配列番号６６とアラインメントしたときそれぞれ１、２、３、４または５個以上のヌクレオチドの変化を有する２つのリプレッサー結合部位を含む機能的変異体である。
【０１２３】
プロモーターのプロモーター活性を測定し、配列番号６９のプロモーター活性と比較するために、lacZレポータージーンアッセイのようないずれかの好適なレポータージーンアッセイを用いて、レポータージーン発現を直接、例えばｍＲＮＡレベルを測定して、あるいは間接的に、レポーター酵素活性（例えばβガラクトシダーゼ活性）を抑制および非抑制条件下で測定することがでる。試験プロモーターと配列番号６６のプロモーターの間で抑制および非抑制条件下でのかかる活性に顕著な違いがない場合、該試験プロモーターは、配列番号６９と実質的に同じプロモーター活性を保持すると言える。
【０１２４】
４．２  鉄制御プロモーターを有する発現カセットを含む発現ベクターおよび組換え宿主細胞
発現カセットを任意の好適な発現ベクターに挿入できる。Ｆｕｒ制御プロモーターを用いた目的の組換えタンパク質の合成の文脈において、発現ベクターは、核酸を宿主細胞に導入して目的の組換えタンパク質をコードする遺伝子の異種発現を引き起こすことのできるビークルを意味する。
【０１２５】
それは例えばプラスミド、バクテリオファージまたはコスミドもしくは他の人工染色体、あるいは宿主細胞における組換えタンパク質生産に一般に用いられる他のベクターに由来してよい。かかる発現ベクターは、さらに、発現カセットに加えて、宿主細胞に入るための手段および／または宿主細胞において複製するための手段、および／またはポリペプチドを細胞の表面または細胞の外側に分泌するための手段を含む。発現ベクターは、１種以上の細胞タイプ、例えば少なくとも２種の細胞タイプ、１種の原核細胞タイプおよび１種の真核細胞タイプにおいて複製されるかまたは増殖されるための手段を含んでいてもよい。
【０１２６】
使用できる具体的な細菌ベクターは、周知のクローニングベクターの遺伝的要素を含む商業的に入手可能なプラスミド、例えばpBR322 (ATCC 37017)、pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)、pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) pQE70、pQE60、pQE-9 (Qiagen)、pD10、phiX174、pBluescript(商標) II KS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A (Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5 (Pharmacia)、pKK232-8 および pCM7を含む。具体的な真核ベクターは、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG (Stratagene) pSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL (Pharmacia)を含む。しかし、あらゆる他のベクターが、宿主細胞において複製可能であり安定である限り、使用可能である。
【０１２７】
エレクトロポレーション形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃またはＴｉ介在遺伝子導入を含む多様な技術のいずれかを用いて、発現ベクターを宿主細胞に導入してよい。適切であるとき、操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化させ、形質転換体を選択しまたは目的の組換えタンパク質をコードする遺伝子を増幅するために適切なように修飾された、常套の栄養培地で培養できる。
【０１２８】
さらなる局面において、本発明の組換え宿主細胞は、目的の組換えタンパク質を発現できるかあるいは発現している。発明の宿主細胞を作成するために用いる様々な発現系の例の概略、例えば上記の具体的なものは、例えばGlorioso et al. (1999), Expression of Recombinant Genes in Eukaryotic Systems, Academic Press Inc., Burlington, USA、Paulina Balbas und Argelia Lorence (2004), Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols, Second Edition: Reviews and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press, USAに記載されている。
【０１２９】
本発明のヌクレオチド配列またはベクターによる宿主細胞の形質転換または遺伝子操作は、標準的な方法、例えばSambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USAに記載のとおりに行うことができる。さらに、本発明の宿主細胞は、特にｐＨ値、温度、塩濃度、通気、抗生物質、ビタミン、微量元素等の観点から、使用する具体的な宿主細胞の要求を満たす栄養培地中で培養する。
【０１３０】
一般に、本発明の組換え宿主細胞は、本発明の発現カセットおよび／または発現ベクターを含む原核または真核細胞、または本発明の発現カセットおよび／または本発明の発現ベクターを含む細胞由来の細胞であってよい。
【０１３１】
したがって本発明は、適切な成長培地条件下での異種遺伝子発現または目的の組換えタンパク質の合成のための組換え宿主細胞であって、ゲノムに融合されているかまたは自律レプリコンとして、上記本発明の発現カセットまたは発現ベクターを含む、組換え宿主細胞に関する。
【０１３２】
「組換え宿主細胞」は、適切な成長培地条件下での目的の組換えタンパク質の異種発現に好適なあらゆる細胞であってよい。好ましくは、かかる組換え宿主細胞は、細菌細胞である。
【０１３３】
好ましい態様において、組換え宿主細胞は、上段に記載の鉄制御プロモーターと作動可能に連結した目的の成熟組換えタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされている細菌宿主細胞である。より具体的な態様において、組換え宿主細胞は、本発明の発現ベクターを含むシュードモナス属、例えばシュードモナス・プチダ、最も好ましくは、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０から選択され、ここで、鉄制御プロモーターは配列番号６９〜７１のいずれか１つまたはそのいずれかの機能的変異プロモーターからなる群から選択される。
【０１３４】
本発明はさらに、例えば目的の組換えタンパク質の合成における、異種遺伝子発現のための上記発現カセット、発現ベクターおよび／または組換え宿主細胞の使用に関する。
【０１３５】
４．３  異種遺伝子発現方法
鉄制御プロモーターを含む本発明の組換え宿主細胞は、有利には、異種遺伝子発現、例えば目的の組換えタンパク質の合成のために使用できる。好適な宿主細胞の形質転換および当該宿主細胞の適切な細胞密度への増殖の後、Ｆｕｒ制御プロモーターを適切な手段（例えばＦｅキレート剤、Ｆｅ飢餓）で抑制でき、当該細胞をさらなる期間培養して目的のタンパク質を生産させることができる。
【０１３６】
したがって、ある態様において、本発明は、宿主細胞、好ましくは細菌宿主細胞、頼好ましくはシュードモナス属における異種遺伝子発現または目的の組換えタンパク質の合成のための方法であって、a) 鉄制御プロモーターを含む発現カセットを含んである宿主細胞を、抑制条件下で培養し、
b) 適切な生産段階で鉄制御プロモーターを抑制解除するために増殖条件を変化させ、
c) 抑制解除条件下で細胞を増殖させて異種遺伝子を発現させ、そして／または目的の組換えタンパク質を合成すること
を含む方法を提供する。
【０１３７】
具体的な態様において、抑制条件は、成長培地中で十分な濃度の鉄を提供することで得られ、抑制解除条件は、鉄不足条件を作出することで得られる。係る条件は成長期の自然な使用および鉄飢餓によって達成されうる。あるいは、かかる条件は、鉄キレート剤を培地に加えて得られる。
【０１３８】
あらゆる好適な鉄キレート剤を、鉄制御プロモーターの抑制解除のために使用できる。かかる鉄キレート剤の例は、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸塩または鉄取り込みシデロホアとして作用する既知化合物（例えばデスフェリオキサミン、エンテロバクチンまたはバシリバクチン）を含むがこれらに限定されない。好ましい態様において、かかる鉄キレート剤は、２’２’ジピリジルである。キレート剤を培地に、例えば少なくとも成長培地中の鉄濃度と等しい、好ましくはそれの少なくとも３倍の濃度で、加えてよい。
【０１３９】
４．４  異種遺伝子発現のための鉄制御プロモーターの使用に関する本発明の具体的な態様
態様１：宿主細胞、好ましくは細菌宿主細胞、より好ましくはシュードモナス属宿主細胞における異種遺伝子発現に好適な発現カセットであって、天然には鉄制御プロモーターを制御しない遺伝子と作動可能に連結された鉄制御プロモーターを含む、発現カセット。
【０１４０】
態様２：鉄制御プロモーターが、鉄取り込み制御リプレッサータンパク質（Ｆｕｒ）からなる群から選択されるタンパク質によって抑制される細菌プロモーター、またはＦｕｒリプレッサータンパク質によって転写的に抑制されるいずれかの相同プロモーターである、態様１に記載の発現カセット。
【０１４１】
態様３：Ｆｕｒリプレッサータンパク質によって抑制されるプロモーターが、以下のものからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列である、態様２に記載の発現カセット：
(a) 配列番号６９、
(b) 配列番号６９と実質的に同じプロモーター活性を保持する配列番号６９のフラグメント、
(c) 配列番号６９と実質的に同じプロモーター活性を保持する、配列番号６９と少なくとも５０％同一性を有するポリヌクレオチド配列。
【０１４２】
態様４：態様１〜３のいずれかの発現カセットを含む、組換え宿主細胞。
態様５：細菌種から選択される、態様４の組換え宿主細胞。
態様６：シュードモナス属、例えばシュードモナス・プチダから選択される、態様５の組換え宿主細胞。
【０１４３】
態様７：宿主細胞における目的の組換えタンパク質の合成のための、鉄制御プロモーターの使用。
態様８：鉄制御プロモーターが、鉄取り込み制御リプレッサータンパク質（Ｆｕｒ）からなる群から選択されるタンパク質によって抑制される細菌プロモーター、またはＦｕｒリプレッサータンパク質によって転写的に抑制されるいずれかの相同プロモーターである、態様７に記載の使用。
【０１４４】
態様９：Ｆｕｒリプレッサータンパク質によって抑制されるプロモーターが、以下のものからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列である、態様７に記載の使用：
(a) 配列番号６９、
(b) 配列番号６９と実質的に同じプロモーター活性を保持する配列番号６９のフラグメント、
(c) 配列番号６９と実質的に同じプロモーター活性を保持する、配列番号６９と少なくとも５０％同一性を有するポリヌクレオチド配列。
【０１４５】
態様１０：目的の組換えタンパク質の合成が成長培地中の鉄濃度を調節することによって制御される、態様７〜９のいずれか１つに記載の使用。
態様１１：目的の組換えタンパク質の合成が細菌宿主細胞、好ましくはシュードモナス属、例えばシュードモナス・プチダで行われる、態様７〜１０のいずれか１つに記載の使用。
態様１２：目的の組換えタンパク質の合成が鉄をキレート化して鉄制御プロモーターを制御解除するのに十分な濃度で鉄キレート剤を培地に加えることによって誘導される、態様７〜１１のいずれか１つに記載の使用。
態様１３：鉄キレート剤が２’２’ジピリジルである、態様１２に記載の使用。
【０１４６】
５．異種発現によって得られるデプシペプチドおよびその使用
本発明はさらに、上記方法で得られるかまたは得た式（Ｉ）または（Ｉ’）、例えば式（ＩＩ）〜（ＶＩＩ）、（ＸＩ）〜（ＸＩＶ）ならびに（ＸＶＩＩ）および（ＸＶＩＩＩ）の化合物に関する。
【０１４７】
さらなる局面において、本発明は、上記方法で得られるかまたは得た式（Ｉ）または（Ｉ’）、例えば式（ＩＩ）〜（ＶＩＩ）、（ＸＩ）〜（ＸＩＶ）ならびに（ＸＶＩＩ）および（ＸＶＩＩＩ）の化合物を含む医薬組成物に関する。
【０１４８】
医薬組成物は、個々の患者の臨床状態、医薬組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュールおよび実施者に知られている他の要因を考慮して、良好な医療実務に一致するように、製剤され、投薬される。本明細書の目的での医薬組成物の「有効量」は、したがって、かかる検討事項によって決定される。
【０１４９】
当業者は個体に投与される医薬組成物の有効量が、特に、化合物の性質に依存することを理解している。例えば、化合物が（ポリ）ペプチドまたはタンパク質である場合、非経腸的に投与される医薬組成物の用量あたりの総薬学的有効量は、患者体重の約１μｇのタンパク質／ｋｇ／日〜１０ｍｇのタンパク質／ｋｇ／日の範囲であるが、上記の通り、これは治療上の裁量の問題である。より好ましくは、この用量は少なくとも０．０１ｍｇのタンパク質／ｋｇ／日、例えばヒトについて、約０．０１〜１ｍｇのタンパク質／ｋｇ／日である。連続的に投与する場合、医薬組成物は典型的には、１日あたり１〜４回の注射または例えばミニポンプを用いた連続皮下輸液によって、投薬速度約１μｇ／ｋｇ／時〜約５０μｇ／ｋｇ／時で投与する。静脈内バッグ溶液を用いてもよい。変化が観察されるのに必要な処置の長さおよび応答が生じるのに必要な処置後の感覚は、望まれる効果に依存して変化すると考えられる。具体的な量は、当業者に周知の常套の試験によって決定されうる。
【０１５０】
本発明の医薬組成物は、経口、非経腸、大槽内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、ドロップまたは経皮パッチとして）、舌下または経口もしくは経鼻スプレーとして、投与してよい。
【０１５１】
本発明の医薬組成物は、好ましくは、薬学的に許容される担体を含む。「薬学的に許容される担体」とは、非毒性の固体、半固体または液体増量剤、希釈剤、カプセル化材またはあらゆるタイプの添加剤を意味する。用語「非経腸」は、本明細書において使用するとき、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内注射および輸液を含む投与形態を意味する。
【０１５２】
医薬組成物は好適には徐放系で投与する。徐放組成物の好適な例は、造形品の形態の半透ポリマー材料、例えばフィルムまたはマイクロカプセルを含む。徐放性材料は、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号、EP 58,481)、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸エステルのコポリマー（Sidman, U. et al., Biopolymers 22:547-556 (1983))、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981)、およびR. Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)）、エチレンビニルアセテート（R. Langer et al., Id.）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（EP 133,988）を含む。徐放医薬組成物は、リポソームに封入した化合物を含んでいてもよい。リポソーム含有医薬組成物は、自体公知の方法：E 3,218,121； Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985)； Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980)； EP 52,322； EP 36,676； EP 88,046； EP 143,949； EP 142,641； 日本特許出願第83-118008号； 米国特許第4,485,045号および第4,544,545号；ならびにEP 102,324によって製造される。通常は、リポソームは、約３０モルパーセントのコレステロール以上の脂質含有量であり、選択された割合は最適な治療のために調節される、小さな（約２００〜８００オングストローム）単層型のものである。
【０１５３】
非経腸投与用医薬組成物は、一般に、所望の純度で薬学的に許容される担体と、すなわち使用する用量および濃度で受容者に非毒性であり製剤の他の成分と適合するものと、単位投与注射形態（溶液、懸濁液またはエマルジョン）に混合して製剤する。
【０１５４】
一般に、医薬組成物の成分を液体担体または微粉化担体またはその両方と均一かつ密接に接触させて、製剤を製造する。次いで、所望により、製品を所望の剤形に造形する。好ましくは、担体は非経腸担体、より好ましくは受容者の血液と等張な溶液である。かかる担体ビークルの例は、水、食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液を含む。非水性ビークル、例えば固定油およびオレイン酸エチルならびにリポソームもここで有用である。担体は好適には、微量の添加物、例えば等張性および化学的安定性を向上させる物質を含む。かかる物質は使用する用量および濃度で受容者に非毒性であり、バッファー、例えばリン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸および他の有機酸またはそれらの塩；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）（ポリ）ペプチド、例えばポリアルギニンまたはトリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニン；単糖類、二糖類および他の炭水化物、例えばセルロールまたはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトールまたはソルビトール；対イオン、例えばナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート、ポロキサマーまたはＰＥＧを含む。
【０１５５】
治療投与に使用する医薬組成物の成分は滅菌されていなければならない。滅菌は、滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロンの膜）による濾過によって容易に達成される。医薬組成物の治療用成分は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば静脈内溶液バッグまたは皮下注射針により貫通可能なストッパーを有するバイアルに入れる。
【０１５６】
通常、医薬組成物の成分は、単位または複数投与容器、例えば密封アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成用凍結乾燥製剤として保存される。凍結乾燥製剤の例として、１０ｍｌバイアルを滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）水溶液５ｍｌで満たし、得られた混合物を凍結乾燥させる。輸液溶液は、静菌注射用水を用いて、凍結乾燥化合物を再構成して製造する。
【０１５７】
本発明はまた、上記デプシペプチドまたはその誘導体の、医薬としての使用に関する。例えばがん、特に卵巣がんの処置または炎症性および／または過増殖性および掻痒性皮膚疾患、例えばケロイド、肥厚性瘢痕、ざ瘡、アトピー性皮膚炎、乾癬、膿疱性乾癬、酒さ、ネザートン症候群または他の掻痒性皮膚疾患、例えば結節性痒疹、老人の不特定の痒み、ならびに上皮バリアー機能不全に関連した他の疾患、例えば加齢性皮膚、炎症性腸疾患およびクローン病、ならびに膵炎またはがん、特に卵巣がん、嚢胞性線維症（ＣＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、成人呼吸窮迫症候群、慢性気管支炎、遺伝性肺気腫、リウマチ性関節炎、ＩＢＤ、乾癬、喘息のため。
【０１５８】
ある態様において、本発明は、炎症性および／または過増殖性および掻痒性皮膚疾患、例えばケロイド、肥厚性瘢痕、ざ瘡、アトピー性皮膚炎、乾癬、膿疱性乾癬、酒さ、ネザートン症候群または他の掻痒性皮膚疾患、例えば結節性痒疹、老人の不特定の痒み、ならびに上皮バリアー機能不全に関連した他の疾患、例えば加齢性皮膚、炎症性腸疾患およびクローン病、ならびに膵炎またはがん、特に卵巣がんの処置用医薬としての、上記デプシペプチドまたはその誘導体の使用に関する。
【０１５９】
他の態様において、本発明は、嚢胞性線維症（ＣＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、成人呼吸窮迫症候群、慢性気管支炎、遺伝性肺気腫、リウマチ性関節炎、ＩＢＤ、乾癬、喘息の処置用医薬としての、上記デプシペプチドまたはその誘導体の使用に関する。
【０１６０】
さらに別の態様において、本発明は、炎症性および／または過増殖性および掻痒性皮膚疾患、例えばケロイド、肥厚性瘢痕、ざ瘡、アトピー性皮膚炎、乾癬、膿疱性乾癬、酒さ、ネザートン症候群または他の掻痒性皮膚疾患、例えば結節性痒疹、老人の不特定の痒みの処置用医薬としての、上記デプシペプチドまたはその誘導体の使用に関する。
【０１６１】
６．本発明のポリペプチドに対する抗体
具体的な態様において、本発明は、本明細書に記載され、定義されている本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する抗体およびその使用に関する。さらに、かかる抗体は、当該ポリペプチド、特に非リポソームペプチドおよび／または非リポソームペプチドシンターゼ（ＮＲＰＳ）の精製に使用できる。用語「抗体」は、当該技術分野において周知である。
【０１６２】
本発明の文脈において、用語「抗体」は、本明細書において使用するとき、特に、完全な免疫グロブリン分子および実質的に結合特異性を保持しているかかる免疫グロブリン分子の一部を意味する。さらに、この用語は、キメラおよびヒト化抗体のような修飾および／または改変抗体分子、組換えまたは合成により作成／合成した抗体およびインタクトな抗体、ならびに分離した軽鎖および重鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ／ｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２のようなその抗体フラグメントを意味する。用語「抗体」はまた、二重機能後退、三重機能抗体および一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）または抗体融合タンパク質のような抗体構築物も含む。
【０１６３】
抗体を作成する技術は当該技術分野において周知であり、例えばHoward and Bethell (2000) Basic Methods in Antibody Production and Characterization, Crc. Pr. Inc.に記載されている。本発明のポリペプチドに対する抗体は、例えばポリペプチド（またはそのフラグメント）を動物に直接注射して、あるいはポリペプチド（またはそのフラグメント）を動物に投与して得ることができる。そのようにして得られた抗体は、ポリペプチド（またはそのフラグメント）それ自体に結合する。この方法において、結合が上記定義の「特異的」である限り、ポリペプチドのフラグメントを用いて全ポリペプチドに結合する抗体を作成することすらできる。
【０１６４】
本発明の文脈において特に好ましいものは、モノクローナル抗体である。連続細胞系培養によって作成した抗体を提供するモノクローナル抗体の作製のためのあらゆる技術を使用してよい。かかる技術の例は、ヒトモノクローナル抗体を作成するためのハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術およびＥＢＶハイブリドーマ技術を含む（Shepherd and Dean (2000), Monoclonal Antibodies: A Practical Approach, Oxford University Press、Goding and Goding (1996), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice - Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, Academic Pr Inc, USA）。
【０１６５】
抗体誘導体はまた、ペプチド模倣によって作成してもよい。さらに、一本鎖抗体の作製について記載されている技術（特に米国特許第4,946,778号参照）は、本発明のポリペプチドを特異的に認識する一本鎖抗体を作成するために適用できる。また、トランスジェニック動物を用いて、本発明のポリペプチドに対するヒト化抗体を発現させてもよい。
【０１６６】
用語「特異的に結合」は、本明細書において使用するとき、タンパク質および他の生物製剤の異種集団の存在下での非リボソームペプチドおよび／または非リボソームペプチドシンターゼ（ＮＲＰＳ）および抗体の存在を決定づける結合反応を意味する。したがって、指定されたアッセイ条件下では、特異的抗体とポリペプチドは互いに結合するが、サンプル中に存在する他の成分とは顕著な量で結合しない。かかる条件下での標的分析物との特異的結合は、特定の標的分析物に対する特異性について選択される結合部分を必要としうる。多様なイムノアッセイフォーマットを用いて、特定の抗原と特異的に反応する抗体を選択できる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイを通常通りに用いて、分析物と特異的に免疫応答するモノクローナル抗体を選択する。イムノアッセイフォーマットおよび特異的免疫応答を決定するために使用できる条件の説明については、Shepherd and Dean (2000), Monoclonal Antibodies: A Practical Approach, Oxford University Press および／または Howard and Bethell (2000) Basic Methods in Antibody Production and Characterization, Crc. Pr. Inc.を参照されたい。典型的には、特異的または選択的応答は、ノイズよるバックグラウンドシグナルの少なくとも２倍、より典型的にはバックグラウンドの１０〜１００倍以上である。
【０１６７】
用語「精製」は、本明細書において使用するとき、複数の混合物から１つのタイプのタンパク質を単離することを意図する一連のプロセスを意味する。タンパク質精製は目的のタンパク質の機能、構造および相互作用の特徴付けに重要である。出発物質は、非限定的な例として、生物学的組織または微生物培養であってよい。精製プロセスの多様な工程が、それを制限するマトリックスからタンパク質を開放し、タンパク質と混合物の非タンパク質部分とを分離し、そして最終的に所望のタンパク質を他の全てのタンパク質から分離することができる。分離工程は、タンパク質のサイズ、物理化学的特性および結合親和性の違いを利用する。
【０１６８】
以下の非限定的な図、配列および実施例を参照して、本発明をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】本発明のＮＲＰＳクラスターから生合成される、コンドロマイセスＮＰＨ−ＭＢ１８０によって生産された確認された構造の一覧を示す。
【図２】式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物をコードするＮＲＰＳ生合成遺伝子クラスターのドメイン構造を示し、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＶＩ）および（ＶＩＩ）〜（ＸＶＩＩ）の化合物の生合成経路案を例示する。Ｌ、ローディングドメイン；ＡＱ、アデニレーションドメイン（Ｇｌｎ）；Ｔ、チオレーションドメイン；Ｃ、コンデンセーションドメイン；ＮＭ、Ｎ−メチレーションドメイン；ＴＥ、チオエステラーゼドメイン、ＡＰアデニレーションドメイン（Ｐｒｏ）；ＡＴ、アデニレーションドメイン（Ｔｈｒ）；ＡＬ、アデニレーションドメイン（Ｌｅｕ）；ＡＥ、アデニレーションドメイン（Ｇｌｕ）；ＡＩ、アデニレーションドメイン（Ｉｌｅ）；ＡＹ、アデニレーションドメイン（Ｔｙｒ）。
【図３】ＮＲＰＳセグメントF 10517242における２個のアデニレーションドメインの結合ポケットとそれらの最もマッチする定義されたアデニレーションドメインを並べた、１０アミノ酸残基のアラインメントを示す。
【図４】コンドロマイセスＮＰＨ−ＭＢ１８０に対するコンドロマイドＮ−メチレーションドメインのＢＬＡＳＴｐアラインメントからの結果を示し、これは、ＮＲＰＳセグメントF 10517242に位置するＮ−メチレーションドメインを明らかにする。Ｎ−メチレーションドメインモチーフは太字で示す。
【図５】ａｈｐ残基を形成するヒドロキシプロリンを含む化合物の推定相互変換を示す。水性条件下では、式（ＸＶＩＩＩ）で例示されるヒドロキシプロリンと、式（ＩＩ）で例示されるａｈｐ含有化合物間との間で、平衡が存在する。
【図６】Ｐ．プチダ  ＫＴ２４４０の異種発現培養抽出物のＬＣ−ＭＳ分析による式（ＩＩ）の化合物の検出。ＨＰＬＣクロマトグラムはＭＳによって陽イオン（左パネル）および陰イオン（右パネル）検出を示す：Ａ）式（ＩＩ）参照化合物；Ｂ）６日目  ＬＢ＿Ｄ培地；Ｃ）６日目  Ｐ．プチダ陰性対照。ＭＳスペクトル：Ｄ）Ａに示すＨＰＬＣ実行からの式（ＩＩ）参照化合物；Ｅ）６日目  ＬＢ＿Ｄ培地、Ｂに示すＨＰＬＣ実行から３．２分でピーク。
【発明を実施するための形態】
【０１７０】
本発明は以下のヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関する：
配列番号１は、Ｖａｌ／Ｉｌｅコンデンセーションドメインを示す、ドメイン１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号２は、Ｖａｌ／Ｉｌｅコンデンセーションドメインを示す、ドメイン１のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、Ｖａｌ／Ｉｌｅアデニレーションドメインを示す、ドメイン２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号４は、Ｖａｌ／Ｉｌｅアデニレーションドメインを示す、ドメイン２のアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、Ｖａｌ／Ｉｌｅチオレーションドメインを示す、ドメイン３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
【０１７１】
配列番号６は、Ｖａｌ／Ｉｌｅチオレーションドメインを示す、ドメイン３のアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、Ｔｙｒコンデンセーションドメインを示す、ドメイン４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号８は、Ｔｙｒコンデンセーションドメインを示す、ドメイン４のアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、Ｔｙｒアデニレーションドメインを示す、ドメイン５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号１０は、Ｔｙｒアデニレーションドメインを示す、ドメイン５のアミノ酸配列を示す。
【０１７２】
配列番号１１は、Ｔｙｒ  ６−Ｎ−メチレーションドメインを示す、ドメイン６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号１２は、Ｔｙｒ  ６−Ｎ−メチレーション ドメインを示す、ドメイン６のアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、Ｔｙｒチオレーションドメインを示す、ドメイン７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号１４は、Ｔｙｒチオレーションドメインを示す、ドメイン７のアミノ酸配列を示す。
配列番号１５は、それぞれＶａｌ／ＩｌｅおよびＴｙｒのアデニレーションドメイン、コンデンセーションドメインおよびチオレーションドメインならびにＴｙｒ  ６−Ｎ−メチレーションドメインを含むＮＲＰＳフラグメントをコードするヌクレオチド配列を示す。
【０１７３】
本明細書に記載のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の機能および推定される役割は、上記表１および下記実施例においてさらに説明される。
【実施例】
【０１７４】
実施例
下記実施例は本発明を説明する：
【０１７５】
実施例１：ＮＰＨ−ＭＢ１８０のゲノム配列；会合および分析。
４５４配列決定法（ピロホスフェートを利用した配列決定プラットフォーム）を用いてＮＰＨ−ＭＢ１８０の完全なゲノムを配列決定して、「ドラフト」配列を作成した。ショットガン配列決定を１回行い、次に対末端配列決定を２回行った。対末端試験は、より伝統的なショットガン法の補完的技術として用いられる。簡潔に述べると、物理的に断片化され、環化された染色体ＤＮＡフラグメントを短いＤＮＡアダプターセクションにライゲートする配列決定法である。これにより、互いに約３ｋｂ（断片化された環化ＤＮＡの平均サイズ）離れている２つの短いリード（約１５０〜２００ｂｐ）を与えるアダプターからの配列決定を多岐にわたって行うことができる。２つの別個のコンティグにおける２つの短いリードのオーバーラップ（ホモロジー）によって、非オーバーラップコンティグを一体に連結することができ、未定義ヌクレオチド（Ｎ）の進展によって３ｋｂ近似に基づいて見積もられたおよその長さと連結することができる。このようにして連結されたコンティグを足場と呼ぶ。全体で、1,295,834の個々のリードを実行して、配列決定された310,674,400塩基が得られた。平均リード長は、このタイプの配列決定法の標準である２３９塩基であった。これらのリードを集積して、リード間の配列オーバーラップに基づきコンティグを形成した。この努力により15,449,316塩基についての平均コンティグ長8,931 bpのコンティグ4,038個が得られた。対末端試験の使用は、足場を作成するためにオーバーラップし、15,029,556塩基を含む９６個の足場の集積をもたらす。平均足場サイズは1,227,671塩基であり、平均足場サイズは156,557塩基であった。
【０１７６】
式（Ｉ）または（Ｉ’）のデプシペプチドの生合成に関与するＮＲＰＳ遺伝子クラスターを同定するために、ゲノムデータを分析した。全体的なアプローチは、サーチクエリーとしてＮＲＰＳドメインを用いて９６個の足場に対してＢＬＡＳＴサーチ（Altschul et. al. 1990； Gish, W. & States, D.J. 1993）を用いることであった。信頼されるＮＲＰＳドメインは、どのアミノ酸が非リボソームペプチドに導入されるかが特異的であり、したがって特定のＮＲＰＳクラスターを同定するための良好なマーカーであるため、アデニレーションドメインであった（Marahiel, M.A. et. al. 1997）。一般に、以下の特異性および相対順序：Gln-Thr-Val-Glu-Ile-Tyr+(N-meth.)-Ileを有するその構造アデニレーションドメイン内に含まれるＮＲＰＳクラスターを発見すると予測された。さらに、遺伝子クラスターは、イソ酪酸のようなカルボン酸で生合成を開始することができるローディングドメインによって開始すると予測され、さらにクラスターがチオエステラーゼドメインで終わると推測された。また、グルタミン酸残基の酸化を促進して３−アミノ−６−ヒドロキシ−ピペリドン残基（Ａｈｐ）を形成する他の生合成ユニットが存在している可能性があった。これらのアクセサリー遺伝子の相対位置は、このクラスター内に存在するならば、予測できなかった。さらに、この領域に存在する１個以上の転写産物を定義する転写開始および終了の位置は、この段階では予測できなかった。
【０１７７】
実施例２：ＢＬＡＳＴ分析によるＮＰＨ−ＭＢ１８０ゲノム配列における全ＮＲＰＳアデニレーションドメインの同定。
ＮＲＰＳクラスターを同定するために頼ったアプローチは、まずＮＰＨ−ＭＢ１８０ゲノムの全ＮＲＰＳアデニレーションドメインを同定することであった。ＮＲＰＳアデニレーションドメインは、それらが使用するアミノ酸について特異的であり、したがってこれらのドメインを分析して、式（Ｉ）または（Ｉ’）のデプシペプチドを構成するアミノ酸の含有量および相対順序に基づいて正確なＮＲＰＳクラスターを同定した。このような目的で、ゲノム配列データにおける全ての可能性のあるＮＲＰＳクラスターを同定するための一般アデニレーションドメインの例として、シクロスポリンのバリンアデニレーションドメインを用いた。これは、アミノ酸配列のホモロジーによって全てのＮＲＰＳアデニレーションドメインを同定するため、ゲノムのｔＢＬＡＳＴｎ（Altschul et. al. 1990； Gish, W. & States, D.J. 1993）分析を行って達成した。このアプローチにより１４個の可能性のあるＮＲＰＳクラスター（表２）を同定し、これらのクラスターを含む足場オリジナルＢＬＡＳＴヒット（例えばA 12171827）の開始のヌクレオチド数と共にＡ−Ｎ標識した。このリストから各アデニレーションドメインを同定し、ドメイン特異性を定義する保存アミノ酸残基の分析によって、各ドメインの特異性を決定した（詳細は実施例３を参照）。
【０１７８】
【表４】
2012517801.tif 000007
【０１７９】
この第一の分析は、正確なアデニレーションドメイン組成および生合成経路をコードする予測されたクラスター（〜３０ｋｂ）の全体のサイズを有するいずれかのＮＲＰＳクラスターを同定することができなかった。実際、我々の目的の経路に見られると予測した７個のアデニレーションドメインを含むＮＲＰＳ経路は同定されなかった。しかし、F 10517242 がイソロイシンおよびチロシンアデニレーションドメイン（表２）を含むことを見出した。なお、この足場（足場＃７２）は極めて短い（〜７．４ｋｂ）が、これは目的のＮＲＰＳクラスターの一部であり、クラスターの残りの部分（配列決定ギャップ領域の残基）が配列決定されないままであると仮定した。チロシンアデニレーションドメインと部分Ｔドメインの間に存在するＮ−メチレーションドメインの発見は、この仮定にさらなるサポートを与えた（詳細は実施例４参照）。
【０１８０】
これらのデータに基づいて、ゲノム配列は生合成遺伝子クラスターの全体を含んでいないと結論づけた。実際、５’方向の約２０ｋｂおよび３’方向の６ｋｂは不明であると予測できる。
【０１８１】
実施例３：ＮＲＰＳアデニレーションドメイン特異性の予測
本明細書に記載のアデニレーションドメインの特異性を、下記一般プロトコルを用いて予測する。シクロスポリンシンターゼ（ＣｓｓＡ）のバリンアデニレーションドメインのアミノ酸配列を目的のコンドロマイセスゲノムＤＮＡに対してアラインメントするｔＢＬＡＳＴｎ（Altschul et. al. 1990; Gish, W. & States, D.J. 1993）サーチを用いて、アデニレーションドメインを同定した。ClustalX 複数配列アラインメントソフトウェア（Higgins et. al. 1996）を用いて、Marahiel et. al. (1997)により定義された２つのコアモチーフ（Ａ３およびＡ６）間のアミノ酸レベルで、翻訳されたコンドロマイセスアデニレーションドメインをＧｒｓＡ（ＰｈｅＡ）（グラミシジンＳシンテターゼ）に対してアラインメントした。アデニレーションドメインの結合ポケットを定義し、したがってアミノ酸特異性を決定づける、Marahiel et al.によって報告された１０個のアミノ酸を、このアラインメントで同定した。次いでRausch et. al. (2005) および Stachelhaus et. al. (1999)によって報告されたデータを用いて、この１０個のアミノ酸を定義されたアデニレーションドメインアミノ酸コードと比較した。
【０１８２】
生合成クラスターのセグメントにおいて同定された２個のアデニレーションドメインが、イソロイシンおよびチロシンの結合ポケットを定義する１０個のアミノ酸と高い相同性を示した（図３）。これらのアミノ酸特異性は絶対ではなく、同様の化学的特徴を有するアミノ酸がしばしば該ドメインを定義するアミノ酸に代えて使用される。これは、１個のＮＲＰＳオペロンに沿って合成される構造の可変性に寄与する。本件の場合、イソロイシンアデニレーションドメインはその結合ポケットにバリンも受け入れると推測され、特徴は他の「イソロイシン」アデニレーションドメインについても見られる（Rausch et. al. (2005)）。実際、利用可能なＮＲＰＳ予測ツール（例えば、http://www-ab.informatik.uni-tuebingen.de/software/NRPSpredictor）は一般に、アデニレーションドメインをイソロイシン特異的ともバリン特異的とも宣言することができない。
【０１８３】
実施例４：ＮＲＰＳＮ−メチレーションドメインの予測
Ｎ−メチレーションドメインの存在は、下記アプローチを用いて、チロシンアデニレーションドメインと３’方向に直接隣接して位置していると予測された。コンドロマイセス・クロカツスＮＰＨ−ＭＢ１８０  コンドロマイドＮＲＰＳクラスターのＮ−メチレーションドメインのアミノ酸配列を用いて、ｔＢＬＡＳＴｎ（Altschul et. al. 1990； Gish, W. & States, D.J. 1993）を用いて同様のドメインのゲノムをサーチした。このアプローチを用いて、Ｎ−メチレーションドメインはＮＲＰＳセグメント内で期待値5e-43 および４６％アミノ酸配列同一性を有することが同定された（図４）。さらに、このＮＲＰＳセグメントからのＮ−メチレーションドメインは機能的Ｎ−メチレーションドメインにおいて共通して見出される予測アミノ酸モチーフを有することを見出した（von Dohren, H. et. al. 1997; Marahiel, M.A. et. al. 1997）。このデータを確認するため、アナベナ株９０アナベノペプチリド生合成クラスター由来のＮ−メチルトランスフェラーゼＡｐｓｙ−６（Rouhiainen et. al. 2000）を、上記のＮ−メチルトランスフェラーゼと比較した。この比較のＢＬＡＳＴｐの結果は、これらのドメインが期待値2e-65で極めて類似していることを示し、したがって、このドメインの最初の同定が確認された。このドメインがチロシンアデニレーションドメインに直接隣接して存在していることは、ＮＲＰＳ遺伝子クラスターの予測された構造と一致する。さらに、Ｎ−メチレーションドメインは比較的珍しく、したがってＮＲＰＳセグメント内のこのドメインの存在は、ＮＲＰＳクラスターに属するこのセグメントについて強い証拠を提供する。
【０１８４】
実施例５：全生合成ＮＲＰＳ遺伝子クラスターの同定
式（Ｉ’）のデプシペプチドの生産に関与する完全な非リボソームペプチド生合成遺伝子を同定し、特徴付けた。足場D 942267に挿入した足場F 10517242からなる足場に、生合成遺伝子を構築した（表１）。足場F 10517242に直接隣接するヌクレオチドの配列分析によって、元のゲノムアセンブリへのこの挿入調節が保証されることが示された後に、これらの足場の組合せを行った。この構築物をＰＣＲで確認し、次いで足場連結領域を介してＤＮＡ配列決定した。この足場は式（Ｉ’）のデプシペプチドの生合成、修飾および細胞外輸送に関与している可能性がある８個の近接オープンリーディングフレームを含む。さらに、可能性のある分泌型プロテアーゼは、最終的にはデプシペプチドの天然の細胞標的であり得るこれらのオープンリーディングフレーム内に位置し、プロテアーゼ阻害剤であることが示された。これらのＯＲＦおよび対応するＮＲＰＳドメインの配置は、図２に示す。
【０１８５】
核非リボソームペプチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ６およびＯＲＦ７）の直前に５個のＯＲＦが存在する。ＯＲＦ１およびＯＲＦ２は、ソランギウム・セルロサム（Sorangium cellulosum）から報告された２個の異なる特徴付けられていないタンパク質とそれぞれ類似する。これらのタンパク質は仮説機能を有さないが、重要なことに、それらはポリアンギウム科（Polyangiaceae）においてのみ見られるようである。さらに、ＯＲＦ２と類似するソランギウム（Sorangium）タンパク質は、S. cellulosumゲノムにおいて少なくとも５回発見されている。これらのタンパク質は、ほぼ完全なヌクレオチド配列連結性に基づいて、ＯＲＦ３と共に転写されると考えられる。ＯＲＦ３はセリンプロテアーゼ、特にスブチリシン群に属するものと高い配列ホモロジーを有する。我々は、デプシペプチドが高度に特異的なセリンプロテアーゼ阻害剤であることを生化学的に決定し、したがって、デプシペプチドがＯＲＦ３セリンプロテアーゼの阻害剤であることは真実味がある。逆に、ＯＲＦ３は、コンドロマイセス株へのデプシペプチド耐性付与に関連しているかもしれない。ＯＲＦ４およびＯＲＦ５は、ＡＢＣトランスレポータータイプのシデロフォアパーミアーゼおよび一般的な環状ペプチドパーミアーゼと類似する。このパーミアーゼ系は細胞膜を通過するデプシペプチドの排出に関与している可能性がある。実際、これらのＯＲＦの５つ全てが細胞膜転位プロセスに関与しており、実際のプロテアーゼとしてそれはプロテアーゼ阻害剤に結合するため、「セリンプロテアーゼ様」ＯＲＦ３はセリンプロテアーゼファミリーとだけ類似性を有する可能性がある。
【０１８６】
コアデプシペプチド生合成クラスターはＯＲＦ６に属し、ＯＲＦ７へと続く。これらの２個のＯＲＦは合わせて１５ｋｂ長以上である。全ＮＲＰＳ生合成クラスター同様、それらはコンデンセーションドメイン、次いでアデニレーションドメイン、次いでチオレーションドメインからなる一般トポロジーを有する機能的ドメインへと崩壊しうる（Marahiel et. al. 1997）。この３個のドメインモジュールは、通常、ペプチドに取り込まれる各アミノ酸につき、ＮＲＰＳクラスターで複数回反復される。デプシペプチド生合成クラスターは、ペプチドコアに含まれる７個のアミノ酸からなる７個のかかるモジュラー反復を有するこのパターンに従う。アデニレーションドメインは成長ペプチドにアミノ酸特異性を与え、それらが受け入れ、次いで取り込むアミノ酸を同定するために分析できる。
【０１８７】
ＯＲＦ６および７に存在する７個のアデニレーションドメインの予測されるアミノ酸特異性は、１つの例外を有するが、デプシペプチドの最終構造と一般に一致する。第４アデニレーションドメイン（ドメイン 7.3）は、プロリンを成長ペプチドにこの位置で受け入れ、取り込むが、最終ペプチドは非標準アミノ酸、３−アミノ−６−ヒドロキシピペリドン（ａｈｐ）をこの位置で含むと予測される。ａｈｐはアナベナ株９０によって生産される関連アナベナペプトリドを含む様々なデプシペプチドに存在する（Rouhiainen et. al. 2000）。ａｈｐ形成は、アナベナペプトリドにおいて、鎖の４位にグルタミンが取り込まれた後、前のアミノ酸のアミンに戻る反応を起こしてａｈｐを形成することで生じると主張されている（Rouhiainen et. al. 2000）。しかし、ａｈｐ特異的アデニレーションドメインは文献にも記載されている（Rausch et al. 2005）。式（ＩＩ）〜（ＶＩＩ）、（ＸＩ）〜（ＸＩＩＩ）および（ＸＶＩＩ）のＭＢ１８０株から単離したａｈｐ含有デプシペプチドにおいて、我々は、最初にプロリンが成長ペプチドに４位において取り込まれ、次いでオキシドレダクターゼの作用によりａｈｐが形成されるというａｈｐ形成の新たなプロセスを仮定する。実際、驚くべきことに、チトクロムＰ４５０遺伝子（ＯＲＦ８）がデプシペプチド生合成クラスターにおいて見出されており、それはＮＲＰＳ生合成クラスターの直後に位置しており、プロリン残基をヒドロキシル化する変換を触媒している可能性がある。
【０１８８】
重要なことに、この位置でプロリンを含むデプシペプチドアナログがＭＢ１８０株から単離されている（式（ＸＩＶ））。また、数日間水性環境中でインキュベーションすると、ａｈｐ含有デプシペプチド（例えば式（ＩＩ））から自然に５−ヒドロキシプロリンを有するアナログ（式（ＸＶＩＩＩ））が形成されることも示された。この５−ヒドロキシプロリン形態とａｈｐ形態の相互変換が可逆性であることも我々は示した。他のデプシペプチドもこの戦略に従うかは不明であるが、これが我々のＭＢ１８０株によって使用されるａｈｐ形成戦略である可能性がある。
【０１８９】
デプシペプチド生合成クラスターは、スターターユニットで生合成を開始するローディングドメインを有するＯＲＦ６で開始する。式（Ｉ’）のデプシペプチドにおけるＸ残基の構造バリエーションに基づき、スターターユニットとして、カルボン酸、例えばＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯＯＨ、（ＣＨ３）２ＣＨＣＯＯＨ、Ｃ６Ｈ５ＣＯＯＨ、ＣＨ３Ｓ（Ｏ）ＣＨ２ＣＯＯＨまたはＣＨ３ＣＯＯＨが想定できる。
【０１９０】
非リボソープペプチドにとって小さな酸性残基で開始することは一般的であるが、残基の選択はペプチド毎に大きく異なる。しかし、複雑なカルボン酸スターターユニットは、非リボソープペプチドの間でも比較的稀である。デプシペプチド生合成を開始するために用いるローディングドメインは、構造においても使用するスターターユニットにおいてもアナベナペプトリドローディングドメインと異なっている。実際、デプシペプチドローディングは、標準コンデンセーションドメインと極めて密接に関連しているが、アナベナペプトリドのホルミル基ローディングドメインは前述のホルミルトランスフェラーゼと極めて類似している（Rouhiainen et. al. 2000）。カルボン酸スターターユニットがドメイン6.2によって特定されるグルタミンアミノ酸のアルファアミノ基に濃縮された後、鎖が１回に１アミノ酸成長し続け、次いでＮＲＰＳ生合成装置を通る（図２）。
【０１９１】
デプシペプチド生合成装置は、ペプチド結合の２級アミンをメチル化する比較的稀なメチルトランスフェラーゼドメイン（ドメイン7.10）に遭遇するまで、１回に１アミノ酸、狂いなく、単純なＮＲＰＳペプチドから、ペプチドを合成する。この場合、これはチロシン由来アミノ基に３級アミンをもたらす。おそらく、このメチル化は、チロシンが成長ペプチドに加えられた後であるが、次のおよび最終アミノ酸が加えられる前に生じる。このことは、Ｎ−メチラーゼドメインがチロシン特異的アデニレーションドメインの直後に位置することによって強く示唆されている。
【０１９２】
最後に、ペプチドが最終チオレーションドメインから除去され、スレオニンのアルコールと末端イソロイシンのアルファケト基の間でエステル結合が形成されて環化する。これは、ＯＲＦ７に位置する最終ドメインである標準チオエステラーゼドメイン（ドメイン7.15）によって行われる。ａｈｐ形成がこのチオエステラーゼ段階の前後いずれに生じるのかは不明である。しかし、この生合成クラスターに含まれる遺伝子は、式（Ｉ’）のデプシペプチドの全構造を明らかにするのに十分である。
【０１９３】
実施例６：シュードモナス・プチダＫＴ２４４０におけるデプシペプチドの異種発現
ここで、我々は、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０における式（Ｉ）または（Ｉ’）のデプシペプチドの異種発現を行うためのアプローチの一例を説明する。この宿主は天然生産株C. crocatusと比較して様々な利点、例えば速やかで予測可能な増殖、遺伝子ツールの利用可能性および大規模発酵におけるバリデートされた使用を有する。さらに、この宿主は、C. crocatusと同様のゲノムＧＣ％を有し、天然ＮＲＰＳ系を有する；これら２つの特徴は、異種発現戦略を設計する際に重要な検討事項である。
【０１９４】
大きな挿入を受け入れることができるコスミドpWEB-TNC（Epicenter Biotechnologies, Madison WI, USA）に生合成遺伝子クラスターをクローン化した；本質は生合成遺伝子クラスターが３０ｋｂ長を超えることである。生合成遺伝子クラスターのクローニングは、まず、約３０〜４０ｋｂの直線ＤＮＡフラグメントを作成するために生合成遺伝子クラスターの境界の外側を切断する、適切な制限酵素を同定することによって行った。ゲノム配列データの分析により、この目的のために酵素ＸｍｎＩが適切であり、完全ゲノムＤＮＡフラグメント消化を行うとこのサイズ範囲の異なる１５個のＤＮＡフラグメントを作成することが示された。これらの１５個のＤＮＡフラグメントのうち、１個の３９ｋｂのフラグメントが生合成クラスターを含むと予測された。アガロースゲル電気泳動により、これらの１５個のＤＮＡフラグメントを他の染色体消化フラグメントから分離した。ガイドとして適切なサイズのＤＮＡ標準を用いて所望のサイズ範囲の１５個のＤＮＡフラグメントをゲルから切り出し、製造業者の指示書に従ってコスミドpWEB-TNCにクローン化した。完全な生合成クラスターを含むコスミドクローンは、コロニーＰＣＲで同定し、ＤＮＡ配列決定で確認した。コスミドまたはＢＡＣベクターを用いて完全ゲノムのランダムショットガンライブラリーを作成し、次いで放射線標識化プローブを用いたクローンライブラリーへのコロニーハイブリダイゼーションにより、目的の生合成クラスターを含むクローンライブラリーのメンバーを同定するという別のアプローチも存在する。
【０１９５】
クローン化した生合成経路を得た後、コスミドクローンに挿入して異種発現を成功させるためにはいくつかの遺伝子成分が必要であった。これらの成分は、i) 異種宿主への移入が成功したことを同定することができる選択マーカー、ii) 異種宿主において機能するプロモーター、iii) 異種宿主への染色体組込みのための部位および iv) pRK2013 oriT配列によって与えられるプラスミド接合伝達性機能（ＲＫ２トランスファー機能で使用するため）を含む。本実施例のためにシュードモナス・プチダＫＴ２４４０に使用するため選択した選択マーカーは、ゲンタマイシン耐性カセットａａｃＣＩ（Blondelet-Rouault et al. 1997）であった。他の選択マーカーは以下の薬剤耐性を与えるヌクレオチドカセットを含む：アンピシリン（例えばｂｌａ）、クロラムフェニコール（例えばｃａｔ）、カナマイシン（例えばａａｃＣ２、ａａｄＢまたは他のアミノグリコシド修飾酵素）またはテトラサイクリン（例えばｔｅｔＡおよびｔｅｔＢ）。シュードモナス・プチダＫＴ２４４０における異種発現を駆動するためのプロモーターとして、ここで、フマラーゼＣ−１（ＰＰ  ０９４４）遺伝子プロモーターの使用を記載する（実施例８も参照）。転写プロモーターの選択は、上記抗生物質耐性決定因子のいずれかの転写プロモーターまたはシュードモナス・プチダＫＴ２４４０において機能的であるいずれかの転写プロモーター、例えばシュードモナス・プチダＫＴ２４４０ゲノムに存在する７個の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の転写プロモーター（PP 16SA、PP 16SB、PP 16SC、PP 16SD、PP 16SE、PP 16SF、PP 16SG）、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０鉄取り込みリプレッサー（Ｆｕｒ）制御遺伝子のいずれかの転写プロモーター（fagA (PP 0943)または他のfumC ホモログ、fumC-2 [PP 1755]のプロモーターを含む）、シデロフォアまたはシデロフォア様化合物の生合成および輸送に関与するプロモーター（pvdE [PP 4216]、fpvA [PP 4217]を含む）または遺伝子PP 4243もしくはPP 0946の転写プロモーターを含んでいてよいが、それらに限定されない。ここに記載のフマラーゼＣ−１プロモーターの使用を含むP. putida由来のプロモーターは、我々の戦略において、ＲｅｃＡ介在染色体組込み事象を介してP. putida宿主に染色体組込みの部位を提供することによって、第二の目的に供される。効果的な染色体組込みを促進するために、1046 bpのプロモーター領域がコスミド構築物内に含まれた。下流生合成クラスター遺伝子に転写の促進を可能とするため、プロモーター要素は意図した挿入の３’末端に位置した。プラスミド接合はpSET152からのori Tヌクレオチド配列の取り込みによって促進された。oriT配列は、ＲＫ２転写機能がトランスで提供されるとき、コスミドの接合伝達を成功させるために必要かつ十分である。これら３つの遺伝子成分は、バックボーンとしてpUC19を用いて、順次クローン化した（５’−ゲンタマイシン耐性−oriT−fumC1プロモーター−３’）。この異種発現カセットは標準的な分子生物学の実技を用いて作成した。
【０１９６】
完了後、pUC19から生合成遺伝子クラスターを含むコスミドクローンに異種発現カセットを移した。この挿入は、プロモーター要素を含む挿入物の３’末端が生合成遺伝子クラスターの第一オープンリーディングフレームの翻訳開始コドンから２０塩基対離れて位置するように行い、それによってプロモーター要素と生合成遺伝子クラスターの転写融合体を作成した。プロモーターは、遺伝子クラスターの転写を駆動することおよび生合成タンパク質の翻訳を開始するため生合成遺伝子クラスター内に位置する天然リボソーム結合部位に依拠することを意図した。この挿入は、Chaveroche et al. 2000に従って、ラムダＲＥＤリコンビナーゼ機能によって介在される異種組換えの使用によって行った。簡潔には、生合成遺伝子クラスターの意図した挿入部位とホモロジーを有する100 ntの隣接領域（ＰＣＲプライマーに設計）を有する上記構築物からなるＰＣＲ産物を作成した。これらの100 ntの隣接領域は、長フランキングホモロジーＰＣＲ（Moore et al. 2005）によって、存在する100 ntの隣接領域に600 nt長のＰＣＲ作成隣接領域を加えることにより、さらに延長した。プラスミドpKOBEGhyg（HindIII制限部位にクローン化されたpKOBEGプラスミドのハイグロマイシンカセット含有構築物）からのラムダＲＥＤタンパク質を予め発現していた大腸菌ＥＰＩ１００エレクトロコンピテント細胞に、600 ntのホモロジー隣接領域を有する異種発現カセットをエレクトロポレーションした。１５μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補ったLauria培養液寒天で、コスミドへの組込みに成功したトランスコンジュゲートを選択した。このようにして作成した異種発現構築物をＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定で確認した。効率が低くなるが、コスミドクローンへの異種発現カセットの挿入は、伝統的な制限酵素を利用したクローニング戦略によって行ってもよい。
【０１９７】
大腸菌ヘルパー株HB101 (pRK2013)に依拠してＲＫ２トランスファー機能を提供する確立された方法（Stanisich and Holloway, 1969）を用いた三親接合により、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０に異種発現構築物を接合により移した。P. putidaトランスコンジュゲートを選択するため７５μｇ／ｍｌのゲンタマイシンならびに大腸菌ドナーおよびヘルパー株の増殖を防止するため２５μｇ／ｍｌのイルガサンを補ったLauria培養液寒天でP. putidaトランスコンジュゲートを選択した。Transconjugates that had successfully integrated into the P. putida chromosome at the fumC-1上流プロモーター領域でのP. putida染色体への組込みに成功したトランスコンジュゲートを、ＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーションおよびＤＮＡ配列分析により確認した。
【０１９８】
２ｇ／Ｌのイソ酪酸および１００μＭの２，２，ジピリジル（培地ｐＨは７．０に調節）を含むLauria培養液中、１５℃、２００ｒｐｍの一定回転撹拌で増殖させて、式（ＩＩ）の化合物の生産を確認した。化学抽出は、６日目に粗発酵液５ｍＬについて１：１の酢酸エチルで行い、次いで３０℃で乾燥濃縮し、メタノールで２０Ｘ最終濃度に再構成した。オンラインＤＡＤ、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ検出を組み合わせたＣ−１８カラムを用いたＨＰＬＣ分離により分析を行った。式（ＩＩ）の化合物は、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ検出を用いてはっきりと確認された（図６）。
【０１９９】
実施例７：５−ヒドロキシプロリンから３−アミノ−６−ヒドロキシ−２−ピペリドン（ａｈｐ）への転位のメカニズム
式（Ｉ’）のデプシペプチドの重要な生合成経路は、プロリンがデプシペプチド鎖の４位アミノ酸で取り込まれることを示唆している。これはプロリンに代えてａｈｐまたはデヒドロａｈｐを含む式（ＸＩＶ）の化合物と一致している。我々は、プロリンをヒドロキシル化して、式（ＸＶＩＩＩ）で例示される５−ヒドロキシプロリンを有する化合物を製造していると仮定するチトクロムＰ４５０酵素（orf 8）を同定した。式（ＸＶＩＩＩ）の化合物は、ａｈｐ含有デプシペプチド（例えば式（ＩＩ））を水性環境中に数日インキュベーションすると自然に形成された（図５）。この５−ヒドロキシプロリン形態とａｈｐ形態の相互変換が可逆性であること、そして５０℃の水中で１０日後にモル比約９：１（ａｈｐ：５−ヒドロキシプロリン）で平衡に達することも我々は示した。
【０２００】
実施例８：デプシペプチド生合成用遺伝子クラスターの異種遺伝子発現のための、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０由来Ｆｕｒ制御fumC-1プロモーターの使用
宿主シュードモナス・プチダＫＴ２４４０におけるデプシペプチドの生合成遺伝子の異種発現を成功させるために、異種宿主の遺伝子クラスターの前に置く好適なプロモーターを見つける必要があった。異種宿主、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０からのｆｕｒ制御プロモーターを選択した（配列番号６９）。ほとんどではないが多くの細菌において、標準の複合成長培地（たとえばＬＢ）を用いた場合、成長の転換期は、成長培地中の鉄制限の発生と一致する。我々は、この成長段階で一般にほとんどの二次代謝産物が作成されることが知られているため、健康な集団密度に細胞が達することができるように成長の転換期まで異種宿主におけるデプシペプチドの生合成遺伝子クラスターの転写を遅延させることが有利であると考えた。鉄制限に応答して活性化される遺伝子は、しばしば鉄取り込みリプレッサー（Ｆｕｒ）によって制御される。このメタロレギュレーターは、鉄が十分な条件下で制御遺伝子のプロモーター領域と直接結合して物理的にＲＮＡポリメラーゼ結合を防止することによって、遺伝子セットを抑制するＦｅセンサーとして作用する（Barton et. al. 1996）。鉄が不充分な条件下では、Ｆｕｒはプロモーター領域から遊離して、遺伝子の転写が生じる。したがって、Ｆｕｒ制御プロモーターを用いて、転換期まで異種遺伝子の発現を抑制することができる。
【０２０１】
我々は、十分な鉄レベルに対して低い鉄レベルに応答して発現される遺伝子の公表されているプロテオーム（Heim et al. 2003）から、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０における潜在的なＦｕｒ制御遺伝子を同定し、緑膿菌Ｆｕｒリプレッサーコンセンサス部位「gataatgataatcattatc」（配列番号６４）（Barton et al. 1996）を用いてそれらの遺伝子の前のプロモーター領域を探索した。Barton et alからの鉄制御プロテオームの試験によって測定したとき、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０において最も高度にアップレギュレートされた遺伝子産物の一つが、２つのP. putidaフマラーゼ酵素の一方をコードするfumC-1の遺伝子産物であった。さらなる調査により、この遺伝子はＦｕｒ制御であることが既に示されていることが分かった（Hassett et. al. 1997）。したがって我々は、公表されたデータに基づいて、このプロモーター領域が強く、鉄依存的に作用し、鉄レベルが細胞中で低いときにオンになることを期待した。これらの特徴は、fumC-1プロモーター領域をシュードモナス・プチダＫＴ２４４０における異種遺伝子発現の目的に使用する理想的な候補たらしめた。実施例６および図６に示すように、全生合成遺伝子クラスターの異種遺伝子発現の成功によってかかる仮説が確認された。
【０２０２】
鉄が不充分な条件は、発酵成長培地中の鉄濃度と同等乃至３倍以上のモル濃度で鉄キレート剤２’２’ジピリジルを発酵培養に加えて得られる。これによりＦｕｒ制御遺伝子を、２’２’ジピリジルの添加により制御可能な方法で、アップレギュレートできる。例えば、我々は、成長培地ＬＢを用いる異種発現発酵培養において３００μＭの２’２’ジピリジルを用いた。他の鉄キレート剤、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸塩または鉄取り込みシデロフォアとして作用することが知られている化合物（例えばデスフェリオキサミン、エンテロバクチンまたはバシリバクチン）も、発酵培地に鉄が不充分な条件を作り出すための同様の方法において使用できた。あるいは、所定の発酵培地を用いて、鉄レベルを注意深く制御することができた。
【０２０３】
ここに記載したfumC-1プロモーターの使用の成功と同じように、他のＦｕｒ制御プロモーターを使用できた。同様にＦｕｒリプレッサー結合部位を含むため、例えばFpvA および OmpR-1 の発現を制御するプロモーターを使用できた。かかるプロモーターは、下記実施例９に更に詳細に記載する。Ｆｅが不充分な条件下でアップレギュレートされるあらゆる遺伝子の前の他のＦｕｒ結合部位は、ここに記載のバイオインフォマティクスアプローチを用いるか、あるいはBaichoo et al. (2002)に記載のように、プロモーター領域のＤＮＡに対する精製Ｆｕｒタンパク質の電気泳動移動度シフトアッセイを用いて、同定された。Ｆｕｒファミリーは細菌ドメインに広く拡がっており、プロモーター領域およびそれらのそれぞれのＦｕｒ結合部位は、一般に、属特異的であり、しばしば種特異的である。したがって、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０のＦｕｒ制御プロモーター領域が他のシュードモナス種でも機能することは明らかである。
【０２０４】
実施例９：Ｆｕｒ制御プロモーター
シュードモナス・プチダＫＴ２４４０からのＦｕｒ制御プロモーター。Ｆｕｒリプレッサー結合部位は下線で示し、緑膿菌Ｆｕｒリプレッサーコンセンサス部位gataatgataatcattatc （配列番号６４）（Barton et al. 1996）に対するコンセンサスヌクレオチド類似性サーチにより同定した。
【０２０５】
fumC-1 Ｆｕｒ制御プロモーター領域（Ｆｕｒリプレッサー部位には下線を付す）
atcaggccgcgctgattcgccgtatggggcgcgggctgctggtgaccgaactgatggggcatggcttgaacatggtgacgggggactattcccgtggtgcggcggggttctgggtcgagaatggcgagattcagcatgccgtacaggaagtcaccatcgccggaaacatgaaggacatgttccagcagattgtcgcgatcggtagcgatcttgaaacccgtagcaatattcatacgggctcggtgttgatcgagcggatgaccgttgctggtagctgatctttagcctgcgccggccctttcgcgggtaaacccgctcctacacggtggtggacgtacatcggggttggacacaggccgttgtaggagcgggttcacccgcgaagaggccggaacagcactacacctttccctgcaaatccgaagacccggccctcgcgccgggtttttatttcatcacctttttcttgaagtgattctatttatcacttaataatgaatatcattatccagtaacccggcgatgatgttcatgaaatccgtcctccgcgaactgccctacctggaaaactggcgctggctcagccggcgcattcgctgtgcgctcgaccccgacgagccgcgcctgatcgagcattacctggccgaaggccgctatctggtgtgctgcaccgaaacctcgccatggacggtggcgctgacagcgtttcgcctgctgctggataccgcctgcgatcgcatgctcccctggcattggcgttgtctgtgcctggaccaggcgtggcgccctctgctggacctgcgcaacctcgaccgccaggaacagaaccaacgctggcaaccctacgccttgcagttggccaattgccgtctgctgccttcgatttctcccgatgaactgatgcaaggatttgatgatgagtgatacccgtatcgagcg (配列番号69)
FpvA Ｆｕｒ制御プロモーター領域（Ｆｕｒリプレッサー部位には下線を付す）
tccggcgaattttctacacagagctgctgccggacctcaagcgcctgggcaagaccatca
tcgtgataagccacgacgaccgctacttcgacgtcgccgaccagctcatccacatggcgg
caggcaaggtccaacaggagaaccgcgtcgcagattgcatttaatttttccggttttggc
cgatgagtgcgtcccaatcaataacaagaattaatactattaacatctgacactcaaggg
ctttgaaaaa (配列番号70)
OmpR-1 Ｆｕｒ制御プロモーター領域（Ｆｕｒリプレッサー部位には下線を付す）
caggtagcgcaggcgctcttccaggtggcgcaactgagtgtcgtcaaggctaccggtcac
ttccttgcgatagcgggcgatgaagggcacggtcgagccttcgtccaacaggctcacggc
cgcctcgacctgctgcgggcgtacgcccagttcctcggcgatacggctgttgatgctgtc
catgtaaaccacctgacatttgtgaatacgggggtcgcctgtgggctttttgcccggcgg
cgctggatgaaagccgcgcattatacccatcgcaaacggcttgcggtgatggcgcccggc
cagccggaactggcgccgggggaaaaatctgctaacaatgctcacgcaacgtgcagcaat
ggctacgccataatgcgcggcgatatcagaggagttattc (配列番号71)
fumC-1 プロモーターのＦｕｒリプレッサー結合部位
aaacatgaaggacatgttc (配列番号65)
aataatgaatatcattatc (配列番号66) 
fpvA プロモーターＦｕｒリプレッサー結合部位
aataacaagaattaatact (配列番号67)
ompR-1 プロモーターのＦｕｒリプレッサー結合部位
cataatgcgcggcgatatc (配列番号68) 
【０２０６】
Ｆｕｒ制御プロモーターおよびそれらのＦｕｒリプレッサー部位は、多くの非シュードモナス種から記載され、特徴付けられており、そしてCarpenter et al. (2009)に列挙され、レビューされている。Ｆｕｒ結合は異なる属間で大きく異なりうる。例えば、大腸菌のコンセンサスＦｕｒ結合部位はGATAATGATAATCATTATC（de Lorenzo et al. 1987）であるが、枯草菌のコンセンサスＦｕｒ結合部位はTGATAATTATTATCA（Baichoo and Helmann, 2002）である。
【０２０７】
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【図１Ａ】
2012517801.tif 000008
【図１Ｂ】
2012517801.tif 000009
【図２Ａ】
2012517801.tif 000010
【図２Ｂ】
2012517801.tif 000011
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年9月29日(2011.9.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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