(57)【要約】対象が、正常ＩＣＶと比較してシアル酸に対する低下した結合を有するＩＣＶバリアントを持っているかどうかを判定することによって、免疫調節剤で治療されている対象を含む対象が、ＰＭＬのリスクがあるかどうかを判定するための方法および組成物を提示する。さらに、ＰＭＬと関連し、ＰＭＬに感受性がある対象、ＰＭＬ（例えば、初期段階のＰＭＬ）を患う対象、または免疫抑制治療に応答してＰＭＬを発症するリスクがある対象を特定するためのアッセイの基準として使用することができる、ＪＣＶ−ＶＰ１配列変異の組み合わせを提供する。
2012517017.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸残基１２２の置換を含むバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について、対象からの生体試料を調査することを含み、
前記対象は、前記試料が、前記少なくとも１つの兆候を含む場合、ＰＭＬに対する感受性が増加していると判定される、方法。
【請求項２】
アミノ酸残基２および６６のうちの少なくとも１つの置換を含むバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について、前記生体試料を調査することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料は、アミノ酸残基２、６６、および１２２のうちの少なくとも１つの置換を有するバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質のそれぞれの、少なくとも１つの兆候を検出することが可能なアッセイを用いて調査され、前記対象は、前記試料が、前記バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質のうちの少なくとも１つの少なくとも１つの兆候を含む場合、ＰＭＬに対する感受性が増加していると判定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アミノ酸断片５０〜５１、５４〜５５、および１２３〜１２５のうちの１つまたはそれ以上の欠失を含むバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について、前記生体試料を調査することをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記試料は、アミノ酸断片５０〜５１、５４〜５５、および１２３〜１２５のうちの少なくとも１つの欠失を有するバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質のそれぞれの、少なくとも１つの兆候を検出することが可能なアッセイを用いて調査され、前記対象は、前記試料が、前記バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質のうちの少なくとも１つの少なくとも１つの兆候を含む場合、ＰＭＬに対する感受性が増加していると判定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
低シアル酸結合を有する疑いがあるバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について、前記生体試料を調査することをさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
アミノ酸残基５５、６０、２６５、２６７、および２６９のうちの少なくとも１つの置換を含むバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について、前記生体試料を調査することをさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記試料は、アミノ酸残基５５、６０、２６５、２６７、および２６９のうちの少なくとも１つの置換を有するバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質のそれぞれの、少なくとも１つの兆候を検出することが可能なアッセイを用いて調査され、前記対象は、前記試料が、前記バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質のうちの少なくとも１つの少なくとも１つの兆候を含む場合、ＰＭＬに対する感受性が増加していると判定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記生体試料は、血液試料である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記生体試料は、ＣＳＦ試料である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記生体試料は、尿試料である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記対象は、野生型ＪＣＶに以前に感染したことがあることが知られている、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記対象からの新しい生体試料が、毎年少なくとも２回、少なくとも１つのバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について調査される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候の検出を用いて、前記対象が免疫抑制治療に不適当であることを特定する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候の検出を用いて、前記対象に対する免疫抑制治療の修正を勧告する、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の兆候の不在を用いて、前記対象が免疫抑制治療に適していることを特定する、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の兆候の不在を用いて、前記対象が継続して行う免疫抑制治療に適していることを特定する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記生体試料は、バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質に対して特異的な抗体の存在について調査される、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
生体試料は、バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の存在について調査される、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記生体試料は、バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の存在について調査される、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記生体試料は、バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列の存在について調査される、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記生体試料は、ＥＬＩＳＡに基づく分析を用いて調査される、請求項１９または２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００９年２月５日に出願された、名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＪＣ  Ｐｏｌｙｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ」の米国仮出願第６１／１５０，３１０号からの、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下の恩典を主張し、この開示は、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ヒトＪＣポリオーマウイルスウイルスの検出のための方法、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）の診断、およびＰＭＬに対する治療薬の開発に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトにおけるＪＣポリオーマウイルス（ＪＣＶ）感染は、中枢神経系の脱髄疾患である、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）を引き起こし得る。しかしながら、ＪＣＶ感染は、通常、健常対象においてはＰＭＬをもたらさない。ＪＣＶ感染は、広範囲にわたってＰＭＬを引き起こすことなく、多くのヒト集団に蔓延している。ＰＭＬは、一般的に、弱体化した免疫系をさらに有する、ＪＣＶに感染した対象にのみ発症する。疾患または免疫抑制治療により免疫不全をきたした対象は、ＪＣＶ感染に伴うＰＭＬになりやすい可能性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の態様は、対象が、ＰＭＬに感受性があるかどうかを判定するための方法および組成物に関する。特に、本発明は、対象の免疫系が損なわれているか、または抑制されている場合、対象がＰＭＬを発症するリスクがあるかどうかを判定するための方法および組成物を提供する。例えば、本発明の態様は、ＪＣＶ感染によって引き起こされるＰＭＬの発症に関する対象のリスクプロファイルを判定することによって、対象が免疫抑制剤を用いた最初の、または継続される治療に適しているかどうかを判定することに関する。
【０００５】
ヒトゲノムは、個人の生涯の間に多くのウイルスに暴露され、それらを獲得し得る。そのようなウイルスの一例が、ＪＣポリオーマウイルス（ＪＣＶ）である。ＪＣウイルス感染は、ヒトの間で高度に蔓延している。ＪＣＶによる一次感染は、小児期に無症候性で生じる（Ｐａｄｇｅｔｔ  ＆  Ｗａｌｋｅｒ，１９７３）。ＪＣＶは、その後、おそらくウイルス血症を通じて体全体に広がる（Ｉｋｅｇａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＪＣＶは、主に、脳および腎組織内にとどまると考えられている。ＪＣＶによる感染は、ほとんどの対象において無症候性であるが、感染が深刻な状態（ＰＭＬのような）をもたらし、一部の対象においては死をもたらす場合もある。ＰＭＬに最も感受性がある対象は、免疫不全をきたした対象（例えば、ＡＩＤＳ患者）、または（例えば、臓器移植後、または多発性硬化症等の炎症関連の病状を治療するために）免疫調節剤による治療を受けている対象である。本発明は、ＪＣＶバリアントを提供し、増加したＰＭＬリスクと関連する新規のバリアントを含むバリアントのパネルを特定し、ＪＣＶバリアントとＰＭＬとの間の構造的および機能的関係の発見に関する方法を提供する。
【０００６】
「野生型」ＪＣＶ配列は、ＰＭＬに罹患していない、および／またはＰＭＬのリスクがない健常な対象において見出されるＪＣＶの原型のいずれかの配列を指すために、本明細書において使用される。幾つかの実施形態においては、コンセンサス「野生型」参照配列は、健常な個人の群において見出される平均的な配列であり得る。ＰＭＬの高いウイルス性有病率と低い発生率との間の不一致は、免疫機能障害に加えて、無症状感染からのＰＭＬへの進行を調節する幾つかの特有のウイルス特性があり得ることを示唆している。幾つかの実施形態においては、本発明の態様は、細胞受容体と宿主細胞感染とのウイルスの相互作用に関与するウイルス表面タンパク質の部分が、無症状感染の部位である腎臓から、ＰＭＬの部位であるＣＮＳまでのどこか途中で、患者の中で特異的なアミノ酸変異を獲得するという発見に関する。さらに、幾つかの実施形態において、ＰＭＬに特異的な変異は、様々なシアル酸および様々な末梢細胞型に結合するウイルスカプシドの能力を変化させるが、ＣＮＳグリア細胞に結合する能力は保持する。
【０００７】
ＰＭＬ患者および非ＰＭＬ患者からの公表されたＶＰ１配列の数学的な解析に基づいて、ＰＭＬの間の特異的なアミノ酸バリアントの正の選択を提供する。しかしながら、公的に入手可能なＰＭＬ配列は、ＰＭＬ患者のＣＳＦまたは脳組織から得られたが、非ＰＭＬ配列は、健常な対象の尿から得られたため、単に、Ｇｅｎｅｂａｎｋ試料の解析に基づいてでは、これらのアミノ酸バリアントが、患者におけるウイルス変異を介して産生されたかどうか、または全てのＪＣＶ分岐群において生じ、ＰＭＬを引き起こす可能性が高いものとしてＰＭＬ症例において豊富である（例えば、正の選択による）１つまたはそれ以上のまれなウイルスバリアントを示すかどうかを明らかに示すことができなかった。本発明の態様によれば、ＶＰ１置換が患者内で生じ、ＰＭＬを引き起こし得る。これは、同じ時点で得られた同じ患者からの整合した尿−ＣＳＦおよび尿−血漿試料の分析によって支持される。ＰＭＬ患者からのＣＳＦおよび血漿ＶＰ１配列は、同じ患者の尿から単離されたＶＰ１配列と比較して、幾つかのアミノ酸の単一のアミノ酸置換または欠失を含んだ。本明細書に示されるように、同じ個人のＣＳＦ、血漿、および尿に見出されるＪＣウイルス型は、同じウイルス株からのものであったが、異なる患者は、異なる株を担持した。したがって、理論により拘束されるものではないが、ＣＳＦ中であって、尿中ではないＶＰ１アミノ酸置換の存在は、２つの異なるウイルスバリアントによる二重感染によってよりはむしろ、患者内の変異の出現に起因する。
【０００８】
ＰＭＬ患者のＣＳＦおよび血漿中に検出されるアミノ酸置換の幾つかは、既に説明されている。しかしながら、これらの置換は、増加したＰＭＬのリスクと直接に相互関係について調べられておらず、それらの構造的および機能的特性は、ＰＭＬの発症および進行の局面とは関連付けられていなかった。ＰＭＬと関連するさらなるＪＣＶ  ＶＰ１変異および／または欠失も本明細書において提供される。
【０００９】
本発明の態様によれば、ＶＰ１タンパク質における置換は、異なる臨床状況での異なる転帰を判定することよりもむしろ、初期疾患進行（例えば、ウイルスが末端からＣＮＳに移動することを可能にし、ＣＮＳ細胞を感染することによって）を判定するために、さらに重要であり得る。しかしながら、幾つかの実施形態においては、ＶＰ１に存在する変異型と、ある臨床的測定との間に関連性がある場合がある。例えば、非変異ウイルスまたは位置１２２〜１３４に変異／欠失を担持するウイルスを有する患者において、低ＪＣＶ  ＣＳＦ複製レベルが観察されている。また、変異は、細胞受容体とのウイルスの相互作用の強度に影響を及ぼすため、死細胞からのウイルス放出もまた、これらの受容体に強固に結合するウイルスに対して妨げられ得る。したがって、より弱い細胞結合力を有するウイルスは、さらに豊富に細胞外空間に放出されることが見出され得る。これは、位置５５〜６１および２６５〜２７１の変異は、非変異ウイルスと比較してシアル酸受容体に結合する能力を欠き、ひいては、細胞残屑から分離するより良好な能力を有し（ウイルスが宿主細胞を殺した後）、ＣＳＦにたどり着くという観察と一致する。
【００１０】
したがって、対象がＪＣＶの幾つかの異なる変異型に（例えば、異なる組織または器官中で異なるバリアントに）同時に感染する場合があったとしても、ＰＭＬ関連変異は、野生型ＪＣＶに感染している個人の既存のＪＣＶウイルス集団から生じる可能性が高い。
【００１１】
本発明の態様は、少なくとも部分的に、ＪＣＶカプシドタンパク質のある種類の変異が、ＪＣＶ感染の無症候性型の、ＪＣＶのＰＭＬ関連型への変換と関連するという発見に基づく。本発明の態様によれば、いかなる特定の機序も約束するものではないが、シアル酸に結合するか、またはそれと相互作用するＪＣＶ粒子の能力を妨害する変異によって、ウイルスが対象の末梢コンパートメントにもはや含まれず、ウイルスがＰＭＬ疾患の部位であるＣＮＳへのより自由な経路を得るという結果となり得る。幾つかの実施形態においては、これらの変異が、免疫細胞および赤血球を含むが、これらに限定されない末梢器官および細胞に発現する特定の糖タンパク質および糖脂質擬似受容体上での「捕獲（ｔｒａｐｐｉｎｇ）」を避けることによって、ウイルスがそれを達成することを可能にする。さらに、これらの部位の一部は、正常宿主免疫応答（抗体およびＴ細胞）における標的であるため、これらの変異により、特に、弱体化した免疫系を有する対象において、免疫系によるウイルスの認識を回避することができる。
【００１２】
本発明の態様は、ＰＭＬに対する対象のリスクプロファイルを評価するための方法および組成物を提供する。
【００１３】
幾つかの実施形態においては、本発明の態様は、対象がいずれかのＪＣＶバリアントによって感染に暴露されているかどうかを判定することに関する。幾つかの態様において、野生型ＪＣＶバリアントによる感染は、たとえこれらがまれな事象であるとしても、ＰＭＬ関連変異は野生型ＪＣＶに起因する場合があるため、ＰＭＬに関するリスクプロファイルを増加させる可能性がある。したがって、幾つかの実施形態においては、対象は、ＪＣＶ感染の１つまたはそれ以上の兆候（例えば、ウイルスタンパク質または核酸の検出、または例えば、ＪＣＶウイルスタンパク質への血清抗体の形での、ＪＣＶ感染への免疫応答の間接的検出）の存在の検査を受けてもよい。いかなるＪＣＶ感染（例えば、野生型またはバリアント）の兆候も評価され得ることを認識するべきである。対象が、既にＪＣＶ感染に暴露されている場合、該対象は、非感染対象よりも高いリスクプロファイルを有すると特定することができる。したがって、免疫抑制剤で治療されるべきＪＣＶ感染した対象は、特定のＪＣＶ変異について評価され得るか、または非感染対象よりもさらに頻繁にモニターされてもよい。
【００１４】
幾つかの実施形態においては、免疫抑制剤で治療されている（またはそれを用いた治療を開始する予定の）対象は、ＪＣＶ感染の１つまたはそれ以上の兆候の検査を受ける。ＪＣＶ感染の１つまたはそれ以上の兆候が検出される場合、該対象は、本明細書に記載される、ＰＭＬと関連する１つまたはそれ以上のＪＣＶバリアントの存在を判断され得る。ＪＣＶに対して兆候が検出されない場合、該対象は、時間経過に伴い、例えば、４週間ごとに、月に１回、３ヶ月ごとに、４ヶ月ごとに、６ヶ月ごとに、または１２ヶ月ごとに、ＪＣＶ感染のいずれの兆候の存在に対しても、モニターされ得る。ＪＣＶ感染が検出される場合、該対象は、１つまたはそれ以上のＪＣＶバリアントの存在をさらに判断され得る。増加するＰＭＬリスクと関連するＪＣＶバリアントが検出される場合、該対象は、さらに、ＰＭＬの任意の初期症状を検出するためにモニターされ得、および／または本明細書に詳述されるように治療計画を変更し得る。
【００１５】
一態様においては、本発明は、アミノ酸残基１２２の置換を含むバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について、対象からの生体試料を調査することを含む方法を提供し、該試料が少なくとも１つの兆候を含む場合、該対象は、ＰＭＬに対する感受性が増加していると判定される。
【００１６】
一態様においては、本発明は、アミノ酸残基２の置換を含むバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について、対象からの生体試料を調査することを含む方法を提供し、該試料が少なくとも１つの兆候を含む場合、該対象は、ＰＭＬに対する感受性が増加していると判定される。
【００１７】
一態様においては、本発明は、アミノ酸残基６６の置換を含むバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について、対象からの生体試料を調査することを含む方法を提供し、該試料が少なくとも１つの兆候を含む場合、該対象は、ＰＭＬに対する感受性が増加していると判定される。
【００１８】
一態様においては、本発明は、アミノ酸残基２８３の置換を含むバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について、対象からの生体試料を調査することを含む方法を提供し、該試料が少なくとも１つの兆候を含む場合、該対象は、ＰＭＬに対する感受性が増加していると判定される。
【００１９】
幾つかの実施形態においては、該方法は、アミノ酸残基２および６６のうちの少なくとも１つの置換を含むバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について、生体試料を調査することをさらに含む。幾つかの実施形態においては、該方法は、アミノ酸残基１２２および６６のうちの少なくとも１つの置換を含むバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について、生体試料を調査することをさらに含む。幾つかの実施形態においては、該方法は、アミノ酸残基２および１２２のうちの少なくとも１つの置換を含むバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について、生体試料を調査することをさらに含む。幾つかの実施形態においては、該試料は、アミノ酸残基２、６６、および１２２のうちの少なくとも１つの置換を有するバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質のそれぞれの、少なくとも１つの兆候を検出することが可能なアッセイを用いて調査され、該試料が、バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの少なくとも１つの兆候を含む場合、該対象は、ＰＭＬに対する感受性が増加していると判定される。幾つかの実施形態においては、該試料は、アミノ酸残基２、６６、１２２、および２８３のうちの少なくとも１つの置換を有するバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質のそれぞれの、少なくとも１つの兆候を検出することが可能なアッセイを用いて調査され、該試料が、バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの少なくとも１つの兆候を含む場合、該対象は、ＰＭＬに対する感受性が増加していると判定される。
【００２０】
幾つかの実施形態においては、該方法は、アミノ酸断片５０〜５１の欠失を含むバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について、生体試料を調査することをさらに含む。幾つかの実施形態においては、該方法は、アミノ酸断片５４〜５５の欠失を含むバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について、生体試料を調査することをさらに含む。幾つかの実施形態においては、該方法は、アミノ酸断片１２３〜１２５の欠失を含むバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について、生体試料を調査することをさらに含む。幾つかの実施形態においては、該方法は、アミノ酸断片１２５〜１３４の欠失を含むバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について、生体試料を調査することをさらに含む。幾つかの実施形態においては、該方法は、アミノ酸断片１２５〜１３６の欠失を含むバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について、生体試料を調査することをさらに含む。
【００２１】
幾つかの実施形態においては、該方法は、アミノ酸断片５０〜５１、５４〜５５、および１２３〜１２５の１つまたはそれ以上の欠失を含むバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について、生体試料を調査することをさらに含む。幾つかの実施形態においては、該試料は、アミノ酸断片５０〜５１、５４〜５５、および１２３〜１２５のうちの少なくとも１つの欠失を有するバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質のそれぞれの、少なくとも１つの兆候を検出することが可能なアッセイを用いて調査され、該試料が、バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの少なくとも１つの兆候を含む場合、該対象は、ＰＭＬに対する感受性が増加していると判定される。
【００２２】
幾つかの実施形態においては、該方法は、低シアル酸結合を有する疑いがあるバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について、生体試料を調査することをさらに含む。
【００２３】
幾つかの実施形態においては、該方法は、アミノ酸残基５５、６０、２６５、２６７、および２６９のうちの少なくとも１つの置換を含むバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について、生体試料を調査することをさらに含む。幾つかの実施形態においては、該試料は、アミノ酸残基５５、６０、２６５、２６７、および２６９のうちの少なくとも１つの置換を有するバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質のそれぞれの、少なくとも１つの兆候を検出することが可能なアッセイを用いて調査され、該試料が、バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの少なくとも１つの兆候を含む場合、該対象は、ＰＭＬに対する感受性が増加していると判定される。
【００２４】
幾つかの実施形態においては、該生体試料は、血液試料である。幾つかの実施形態においては、該生体試料は、ＣＳＦ試料である。幾つかの実施形態においては、該生体試料は、尿試料である。
【００２５】
幾つかの実施形態においては、該対象は、野生型ＪＣＶに以前に感染したことがあることが知られている。幾つかの実施形態においては、該対象からの新しい生体試料が、毎年少なくとも２回、少なくとも１つのバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について調査される。幾つかの実施形態においては、該対象からの新しい生体試料が、少なくとも毎日、週に１回、月に１回、２ヶ月ごと、年に４回、年に２回、年に１回、２年ごと、５年ごと、またはその間のあらゆる頻度で、少なくとも１つのバリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候について調査される。
【００２６】
幾つかの実施形態においては、バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の）兆候の検出を用いて、該対象が免疫抑制治療に不適当であることを特定する。幾つかの実施形態においては、バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０の、またはそれ以上の兆候の検出を用いて、該対象が免疫抑制治療に不適当であることを特定する。
【００２７】
幾つかの実施形態においては、バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの兆候の検出を用いて、該対象に対する免疫抑制治療の修正を勧告する。幾つかの実施形態においては、バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０の、またはそれ以上の兆候の検出を用いて、該対象に対する免疫抑制治療の修正を勧告する。
【００２８】
幾つかの実施形態においては、バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の兆候の不在を用いて、該対象が免疫抑制治療に適していることを特定する。
【００２９】
幾つかの実施形態においては、バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の兆候の不在を用いて、該対象が継続して免疫抑制治療を行うことに適していることを特定する。
【００３０】
幾つかの実施形態においては、該生体試料は、バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質に対して特異的な抗体の存在について調査される。
【００３１】
幾つかの実施形態においては、該生体試料は、バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の存在について調査される。
【００３２】
幾つかの実施形態においては、該生体試料は、バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の存在について調査される。
【００３３】
幾つかの実施形態においては、該生体試料は、バリアントＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列の存在について調査される。
【００３４】
幾つかの実施形態においては、該生体試料は、ＥＬＩＳＡに基づく分析を用いて調査される。
【００３５】
したがって、幾つかの実施形態においては、対象がＰＭＬを発症するリスクがあるかどうかを判定するために、対象をスクリーニングすることができる。ある実施形態においては、疾患が深刻な臨床症状に進行する前に、初期段階のＰＭＬを検出するために、対象をスクリーニングすることができる。対象は、ＰＭＬ関連のＪＣＶバリアント、例えば、シアル酸への結合が低下していることが予測されるＪＣＶバリアントへの暴露の兆候について、対象から得られた生体試料を調査することによって、ＰＭＬのリスクまたは初期段階のＰＭＬについてアッセイされ得る。本発明は、ＰＭＬのリスクおよび／またはＰＭＬの疾患進行と関連する主要ＪＣウイルスカプシドタンパク質（ＪＣＶ−ＶＰ１）における特定位置を提供する。幾つかの実施形態においては、ＰＭＬに関する対象のリスクプロファイルは、対象が暴露されたＪＣウイルスのＶＰ１タンパク質の１つまたはそれ以上の選択された位置での変異状態に基づいて決定される。
【００３６】
本発明の態様は、感受性がある対象、例えば、免疫不全をきたした、および／または免疫抑制剤で治療されている患者において、ＰＭＬのリスクまたは初期段階の疾患進行を検出するのに有用である。
【００３７】
したがって、一態様においては、本発明は、対象が、ＰＭＬに感受性があることを判定するための方法を提供する。幾つかの実施形態においては、該方法は、対象が、低シアル酸結合特性（例えば、結合力または親和性）を有する疑いがあるＪＣＶバリアントを持っている場合、対象がＰＭＬに感受性があることを判定することを含む。
【００３８】
幾つかの実施形態においては、該方法は、対象が低シアル酸結合を有する疑いがあるＪＣＶバリアントを持っているかどうかを判定することと、対象がそのＪＣＶバリアントを持っている場合、ＰＭＬに感受性がある対象を特定することと、を含む。幾つかの実施形態においては、該方法は、低シアル酸結合を有する疑いがあるＪＣＶバリアントの存在について、対象を検査することと、低シアル酸結合を有する疑いがあるＪＣＶバリアントの存在が検出される場合、対象がＰＭＬに感受性があると特定することと、を含む。
【００３９】
一態様においては、本発明は、対象が免疫抑制治療に適していることを判定するための方法を提供する。幾つかの実施形態においては、方法には、対象が低シアル酸結合を有する疑いがあるＪＣＶバリアントを持っていない場合、対象が免疫抑制治療に適していることを判定することが含まれる。幾つかの実施形態においては、方法には、対象が低シアル酸結合を有する疑いがあるＪＣＶバリアントを持っているかどうかを判定することと、対象がＪＣＶバリアントを持っていない場合、対象を免疫抑制治療に適切であると特定すること、あるいは、対象がＪＣＶバリアントを持っている場合、対象が免疫抑制治療に不適切であると特定することと、を含む。
【００４０】
一態様においては、本発明は、対象が免疫抑制治療に不適切であることを判定するための方法を提供する。幾つかの実施形態においては、方法は、対象が低シアル酸結合を有する疑いがあるＪＣＶバリアントを持っている場合、対象が免疫抑制治療に不適切であることを判定することを含む。
【００４１】
本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、判定は、低シアル酸結合を有する疑いがあるＪＣＶバリアントの兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含む。本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、生体試料は、尿試料、血液試料、血漿、血清、粘膜標本、またはＣＳＦ試料である。本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、該兆候は、低シアル酸結合を有する疑いがあるＪＣＶバリアントに特異的に結合することができる抗体の存在である。本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、該兆候は、低シアル酸結合を有する疑いがあるＪＣＶバリアントと関連する核酸配列の存在であり、その核酸配列は、野生型ＪＣＶには存在しない。
【００４２】
本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、アッセイは、生体試料をＪＣＶ抗体と接触させることと、ＪＣＶバリアントまたはＪＣＶペプチドバリアントの存在について、試料を判定することと、を含む。本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、アッセイは、生体試料をＪＣＶペプチドと接触させることと、ＪＣＶ抗体の存在について、試料を判定することと、を含む。本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、アッセイには、生体試料上でＰＣＲ反応を行うことと、ＪＣＶ核酸バリアントの存在について、試料を判定することと、を含む。
【００４３】
本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、該免疫抑制治療は、免疫抑制薬を投与することを含む。本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、該免疫抑制治療は、抗ＶＬＡ４抗体の投与を含む。本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、該免疫抑制薬は、ナタリズマブである。
【００４４】
本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、低シアル酸結合を有する疑いがあるＪＣＶバリアントは、ＪＣＶシアル酸結合部位における１つまたはそれ以上の変異を含むＪＣＶバリアントである。本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、ＪＣＶシアル酸結合部位における変異は、Ｌ５５Ｆ、Ｋ６０Ｍ、Ｋ６０Ｅ、Ｋ６０Ｎ、Ｎ２６５Ｄ、Ｎ２６５Ｔ、Ｓ２６７Ｆ、Ｓ２６７Ｌ、Ｓ２６９Ｆ、Ｓ２６９Ｙ、またはＳ２６９Ｃである。
【００４５】
本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、ＪＣＶバリアントの低シアル酸結合は、野生型ＪＣＶのシアル結合よりも低い。
【００４６】
本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、該対象は、免疫抑制薬を用いた治療を必要とするか、または該対象は、免疫抑制薬を用いて治療されている。
【００４７】
一態様においては、本発明は、対象から生体試料を採取することと、低シアル酸結合を有する疑いがあるＪＣＶバリアントの兆候について、生体試料をアッセイすることと、を含む方法を提供し、該生体試料がそのＪＣＶバリアントの兆候を含む場合、該対象は、ＰＭＬに感受性があると特定される。
【００４８】
一態様においては、本発明は、対象から生体試料を採取することと、低シアル酸結合を有する疑いがあるＪＣＶバリアントの兆候について、生体試料をアッセイすることと、を含む方法を提供し、該対象は、ｉ）該生体試料がＪＣＶバリアントの兆候を含まない場合、免疫抑制治療に適している、あるいは、ｉｉ）該生体試料がＪＣＶバリアントの兆候を含む場合、免疫抑制治療に不適切であると特定される。
【００４９】
一態様においては、本発明は、免疫抑制治療を受けている対象を、低シアル酸結合を有する疑いがあるＪＣＶバリアントを持っていることについて、モニターすることを含む方法を提供する。
【００５０】
一態様においては、本発明は、ＪＣＶへの暴露の兆しに対して、免疫抑制治療を受けている対象をモニターすることと、ＪＣＶへの暴露の兆しが検出される場合、低シアル酸結合を有する疑いがあるＪＣＶバリアントを持っていることについて、対象をモニターすることと、を含む方法を提供する。
【００５１】
本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、モニタリングは、ＪＣＶバリアントの兆候について、対象からの生体試料を定期的に採取し、アッセイすることを含む。
【００５２】
一態様においては、本発明は、対象から生体試料を採取することと、ＪＣＶの兆候について、生体試料をアッセイすることと、を含む方法を提供し、該生体試料がＪＣＶの兆候を含む場合、該対象は、低シアル酸結合を有する疑いがあるＪＣＶバリアントの存在について、定期的にモニターされ、該臨床試料がＪＣＶを含まない場合、該対象は、暴露ＪＣＶについて、定期的にモニターされる。
【００５３】
一態様においては、本発明は、対象への免疫抑制剤を投与するための治療計画を修正すべきかどうかを判定する方法を提供し、該方法は、対象から生体試料を採取することと、低シアル酸結合を有する疑いがあるＪＣＶバリアントの兆候について、生体試料をアッセイすることと、を含み、治療計画は、該生体試料がＪＣＶバリアントの兆候を有する場合、対象に対して修正されるべきである。
【００５４】
本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、該治療計画は、低用量の免疫抑制剤を投与すること、異なる免疫抑制剤と該免疫抑制剤を置き換えること、または該免疫抑制剤の投与を中止することによって、修正されるべきである。
【００５５】
一態様においては、本発明は、対象に第１の免疫抑制薬を投与することと、該対象が低シアル酸結合を有する疑いがあるＪＣＶバリアントを持っているかどうか、モニターすることと、を含む方法を提供する。本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、該対象がＪＣＶバリアントを持っている場合、第１の免疫抑制薬の投与量および／または投与頻度が低減される。本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、該対象がＪＣＶバリアントを持っている場合、第１の免疫抑制薬は、第２の免疫抑制薬と置き換えられる。本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、該対象がＪＣＶバリアントを持っている場合、該対象は、ＰＭＬの症状に対してスクリーニングされる。本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、該対象がＪＣＶバリアントを持っている場合、該対象は、ＰＭＬに対して治療される。
【００５６】
一態様においては、本発明は、低シアル酸結合を有する疑いがあるＪＣＶバリアントを検出する方法を提供し、該方法には、低シアル酸結合を有する疑いがあるＪＣＶバリアントの兆候に対して特異的な高感度アッセイを用いて、対象からの生体試料を調査することを含む。本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、調査には、ＪＣＶバリアントに特異的に結合することができる抗体と生体試料を接触させることを含む。本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、調査には、ＪＣＶバリアントポリペプチドと生体試料を接触させることを含む。
【００５７】
本明細書に提供される方法の幾つかの実施形態においては、調査には、ＪＣＶバリアント核酸と生体試料を接触させることを含む。
【００５８】
本発明の態様は、パネルのＪＣＶ−ＶＰ１アミノ酸位置を含み、ここで、配列変異は、ＰＭＬのリスクおよび／または疾患進行と関連する。パネルの１つまたはそれ以上のＶＰ−１アミノ酸位置にＰＭＬ関連配列変異を有するバリアントＪＣウイルスに暴露されている個人を特定するために、対象をスクリーニングするための方法および組成物を提供する。
【００５９】
本発明の態様は、ＰＭＬを診断する、または対象におけるＰＭＬ疾患の進行、回帰、および／もしくは状態を判定する、および／もしくはモニターするために、使用することができる。
【００６０】
本発明のある態様は、ＰＭＬに対する治療処置を評価することに関する。
【００６１】
本発明の他の態様は、ＰＭＬ関連ＪＣウイルスバリアントに対するワクチンに関する。
【００６２】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含む。幾つかの実施形態においては、該アッセイは、配列変異の存在について、表１Ａ中の位置６９、７４、７５、１１３、１１７、１２８、１３４、１５８、１６４、２２３、２７１、３２１、３３２、および３４５から選択された少なくとも１つのＪＣＶ−ＶＰ１位置を調査し、配列変異が１つまたはそれ以上の調査された位置に存在する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクがある、または罹患していると特定される。
【００６３】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含む。幾つかの実施形態においては、該アッセイは、配列変異の存在について、１つの位置を調査する。幾つかの実施形態においては、該位置は、位置１６４である。幾つかの実施形態においては、配列変異が位置１６４に存在する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクがある、または罹患していると特定される。
【００６４】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、表１Ａ中の位置から選択された少なくとも８つのＪＣＶ−ＶＰ１位置を調査し、配列変異が１つまたはそれ以上の調査された位置に存在する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクがある、または罹患していると特定される。
【００６５】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、表１Ａ中の位置から選択された少なくとも８つのＪＣＶ−ＶＰ１位置を調査し、配列変異は、以下の５５Ｆ、６０Ｍ、６０Ｅ、６１Ｌ、６６Ｈ、６６Ｎ、６９Ｄ、７４Ｓ、７５Ｒ、１１３Ｌ、１１７Ｓ、１２３Ｃ、１２８Ａ、１３４Ｇ、１５８Ｌ、１６４Ｋ、２２３Ａ、２６５Ｄ、２６５Ｔ、２６７Ｆ、２６７Ｌ、２６９Ｆ、２６９Ｙ、２７１Ｈ、３２１Ｖ、３３２Ｅ、または３４５Ｋのうちの１つであり、配列変異が１つまたはそれ以上の調査された位置に存在する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクがある、または罹患していると特定される。
【００６６】
幾つかの実施形態においては、表１Ａ中の８つを超える位置を調査してもよい。幾つかの実施形態においては、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２の位置が調査される。
【００６７】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、表１Ｂ中の位置から選択された少なくとも５つのＪＣＶ−ＶＰ１位置を調査し、配列変異が１つまたはそれ以上の調査された位置に存在する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクがある、または罹患していると特定される。
【００６８】
幾つかの実施形態においては、表１Ｂ中の５つを超える位置を調査してもよい。幾つかの実施形態においては、６つまたは７つの位置が調査される。
【００６９】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、表１Ｃ中の位置から選択された少なくとも４つのＪＣＶ−ＶＰ１位置を調査し、配列変異が１つまたはそれ以上の調査された位置に存在する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクがある、または罹患していると特定される。
【００７０】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、表１Ｄ中の位置から選択された少なくとも２つのＪＣＶ−ＶＰ１位置を調査し、配列変異が１つまたはそれ以上の調査された位置に存在する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクがある、または罹患していると特定される。
【００７１】
幾つかの実施形態においては、表１Ｄ中の２つを超える位置を調査してもよい。幾つかの実施形態においては、３つ、４つ、または５つの位置が調査される。
【００７２】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、表１Ｆ中の位置から選択された少なくとも２つのＪＣＶ−ＶＰ１位置を調査し、配列変異が１つまたはそれ以上の調査された位置に存在する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクがある、または罹患していると特定される。
【００７３】
幾つかの実施形態においては、表１Ｆ中の２つを超える位置を調査してもよい。幾つかの実施形態においては、３つまたは４つの位置が調査される。
【００７４】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、表１Ｇ中の位置から選択された少なくとも８つのＪＣＶ−ＶＰ１位置を調査し、配列変異が１つまたはそれ以上の調査された位置に存在する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクがある、または罹患していると特定される。
【００７５】
幾つかの実施形態においては、表１Ｇ中の８つを超える位置を調査してもよい。幾つかの実施形態においては、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の位置が調査される。
【００７６】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、表１Ｈ中の位置から選択された少なくとも１つのＪＣＶ−ＶＰ１位置を調査し、配列変異が１つまたはそれ以上の調査された位置に存在する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクが低い、または罹患していないと特定される。幾つかの実施形態においては、表１Ｈ中の２つの位置が調査される。
【００７７】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、表１Ｈ中の位置から選択された少なくとも１つのＪＣＶ−ＶＰ１位置を調査し、配列変異は、１１５Ｅまたは２７７Ｋのうちの１つであり、配列変異が１つまたはそれ以上の調査された位置に存在する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクが低い、または罹患していないと特定される。
【００７８】
幾つかの実施形態においては、表１Ｈ中の２つの位置が調査される。
【００７９】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、ＪＣＶ−ＶＰ１の選択された領域の位置を調査し、配列変異は、以下の１１５Ｅまたは２７７Ｋのうちの１つであり、選択された数よりも少ない配列変異が調査された位置に存在する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクが低い、または罹患していないと特定される。
【００８０】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、ＪＣＶ−ＶＰ１の少なくとも位置５５〜７５および２６５〜２７１を調査し、２つ未満の配列変異が調査された位置に存在する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクが低い、または罹患していないと特定される。
【００８１】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、ＪＣＶ−ＶＰ１の少なくとも位置５５〜７５、１１３〜１６４、２２３、２６５〜２７７、および３２１〜３４５を調査し、３つ未満の配列変異が調査された位置に存在する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクが低い、または罹患していないと特定される。
【００８２】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、ＪＣＶ−ＶＰ１の少なくとも位置５５〜７５、１１３〜１６４、２２３、２６５〜２７７、および３２１〜３４５を調査し、２つ未満の配列変異が調査された位置に存在する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクが低い、または罹患していないと特定される。
【００８３】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、位置１６４および表１Ａ中の位置から選択された少なくとも１つの他のＪＣＶ−ＶＰ１位置を調査し、配列変異が１つまたはそれ以上の調査された位置に存在する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクがある、または罹患していると特定される。
【００８４】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、位置１６４および表１Ａ中の位置から選択された少なくとも１つの他のＪＣＶ−ＶＰ１位置を調査し、配列変異が２つまたはそれ以上の調査された位置に存在する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクがある、または罹患していると特定される。
【００８５】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、ＪＣＶ−ＶＰ１の選択された領域の位置を調査し、調査された位置に存在する特異的な特性を有するアミノ酸の数が増加する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクがある、または罹患していると特定される。幾つかの実施形態においては、特異的な特性は、非極性である。
【００８６】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、ＪＣＶ−ＶＰ１の少なくとも位置５５〜７５および２６５〜２７１を調査し、調査された位置の非極性のアミノ酸バリアント（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、もしくはＰｒｏ）または芳香族バリアント（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、もしくはＴｒｐ）の総数が増加する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクがある、または罹患していると特定される。
【００８７】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、ＪＣＶ−ＶＰ１の少なくとも位置５５〜７５、１１３〜１６４、２２３、２６５−２７７、および３２１〜３４５を調査し、調査された位置の非極性のアミノ酸バリアントまたは芳香族バリアントの総数が増加する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクがある、または罹患していると特定される。
【００８８】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、ＪＣＶ−ＶＰ１の少なくとも位置５５〜７５および２６５−２７１を調査し、調査された位置の１つまたはそれ以上の配列変異が、配列変異当たり１０平方オングストロームまたはそれ以上の非極性の表面積の増加をもたらす場合、該対象は、ＰＭＬのリスクがある、または罹患していると特定される。
【００８９】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、ＪＣＶ−ＶＰ１の選択された領域の位置を調査し、調査された位置に存在する特異的な特性を有するアミノ酸の数が低下する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクが低い、または罹患していないと特定される。幾つかの実施形態においては、特異的な特性は、極性である。
【００９０】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、ＪＣＶ−ＶＰ１の少なくとも位置５５〜７５および２６５−２７１を調査し、調査された位置の極性のアミノ酸バリアント（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、もしくはＧｌｎ）、正電荷を持つバリアント（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、もしくはＨｉｓ）、または負電荷を持つバリアント（ＡｓｐもしくはＧｌｕ）の総数が低下する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクがある、または罹患していると特定される。
【００９１】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、ＪＣＶ−ＶＰ１の少なくとも位置５５〜７５、１１３〜１６４、２２３、２６５−２７７、および３２１〜３４５を調査し、調査された位置の極性のアミノ酸バリアント、正電荷を持つバリアント、または負電荷を持つバリアントの総数が低下する場合、該対象は、ＰＭＬのリスクがある、または罹患していると特定される。
【００９２】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、ＪＣＶ−ＶＰ１の少なくとも位置５５〜７５および２６５−２７１を調査し、調査された位置の１つまたはそれ以上の配列変異が、配列変異当たり１０平方オングストロームまたはそれ以上の極性の表面積の低下をもたらす場合、該対象は、ＰＭＬのリスクがある、または罹患していると特定される。
【００９３】
一態様においては、本発明は、生体試料中の配列変異のために選択されたＪＣＶ−ＶＰ１位置を調査するための方法を提供する。
【００９４】
幾つかの実施形態においては、配列変異のために選択されたＪＣＶ−ＶＰ１位置を調査することは、生体試料中における、表１Ａまたは１Ｈのパネルから選択された１つまたはそれ以上のアミノ酸配列変異を含むポリペプチドに特異的に結合する１つまたはそれ以上の抗体の存在を判定することが含まれる。幾つかの実施形態においては、１つまたはそれ以上の抗体の存在は、１つまたはそれ以上のアミノ酸配列変異を含む組み換え産生されたポリペプチドへの特異的結合によって決定される。幾つかの実施形態においては、１つまたはそれ以上の抗体の存在は、１つまたはそれ以上のアミノ酸配列変異を含む合成的に産生されたポリペプチドへの特異的結合によって決定される。
【００９５】
幾つかの実施形態においては、配列変異のために選択されたＪＣＶ−ＶＰ１位置を調査することは、生体試料中における、表１Ａまたは１Ｈのパネルから選択された１つまたはそれ以上のアミノ酸配列変異を含む１つまたはそれ以上のポリペプチドの存在を判定することが含まれる。幾つかの実施形態においては、１つまたはそれ以上のポリペプチドの存在は、１つまたはそれ以上のペプチド結合剤へのポリペプチドの特異的結合によって検出される。幾つかの実施形態においては、該ペプチド結合剤は、抗体である。
【００９６】
幾つかの実施形態においては、配列変異のために選択されたＪＣＶ−ＶＰ１位置を調査することは、生体試料中における、表１Ａまたは１Ｈのパネルから選択された１つまたはそれ以上のアミノ酸配列変異をコードする核酸の存在を判定することが含まれる。
【００９７】
幾つかの実施形態においては、配列変異のために選択されたＪＣＶ−ＶＰ１位置の調査は、血液、脳脊髄液、血清、尿、痰、骨髄、脳、膵臓、腎臓、または他の組織の試料中で行われる。
【００９８】
幾つかの実施形態においては、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、バリアントＪＣＶへの暴露は、バリアントＪＣＶの現行の感染を含む。
【００９９】
幾つかの実施形態においては、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、バリアントＪＣＶへの暴露は、以前の感染を含むか、またはバリアントＪＣＶは、対象の血液または尿中で検出不可能である。
【０１００】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、表１Ｆ中の位置から選択された少なくとも２つのＪＣＶ−ＶＰ１位置を調査し、配列変異が調査された位置のうちの１つに存在しない場合、該対象は、ＰＭＬのリスクが低い、または罹患していないと特定される。
【０１０１】
一態様においては、本発明は、対象が、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、または罹患しているかどうかを判定するための方法を提供し、該方法は、バリアントＪＣポリオーマウイルスへの暴露の兆候について、対象からの生体試料をアッセイすることを含み、該アッセイは、配列変異の存在について、表１Ｇ中の位置から選択された少なくとも２つのＪＣＶ−ＶＰ１位置を調査し、配列変異が調査された位置のうちの１つに存在しない場合、該対象は、ＰＭＬのリスクが低い、または罹患していないと特定される。
【０１０２】
一態様においては、本発明は、対象がＰＭＬのリスクがあるかどうかを診断するためのキットを提供する。
【０１０３】
幾つかの実施形態においては、対象がＰＭＬのリスクがあるかどうかを診断するためのキットには、１つまたはそれ以上の容器が含まれ、それぞれの容器は、表１Ａ、表１７、および／または表１８のパネルから選択された１つまたはそれ以上のアミノ酸配列変異および／または本明細書に記載される１つまたはそれ以上の他のバリアントを含むポリペプチドを含み、該キットは、さらに、ポリペプチドを用いて、これらのポリペプチドに特異的に結合する抗体の存在を判定するための取扱説明書を含む。
【０１０４】
幾つかの実施形態においては、対象がＰＭＬのリスクがあるかどうかを診断するためのキットには、１つまたはそれ以上の容器が含まれ、それぞれの容器は、表１Ｂのパネルから選択された１つまたはそれ以上のアミノ酸配列変異を含むポリペプチドを含み、該キットは、さらに、ポリペプチドを用いて、これらのポリペプチドに特異的に結合する抗体の存在を判定するための取扱説明書を含む。
【０１０５】
幾つかの実施形態においては、対象がＰＭＬのリスクがあるかどうかを診断するためのキットには、１つまたはそれ以上の容器が含まれ、それぞれの容器は、表１Ｃのパネルから選択された１つまたはそれ以上のアミノ酸配列変異を含むポリペプチドを含み、該キットは、さらに、ポリペプチドを用いて、これらのポリペプチドに特異的に結合する抗体の存在を判定するための取扱説明書を含む。
【０１０６】
幾つかの実施形態においては、対象がＰＭＬのリスクがあるかどうかを診断するためのキットには、１つまたはそれ以上の容器が含まれ、それぞれの容器は、表１Ｄのパネルから選択された１つまたはそれ以上のアミノ酸配列変異を含むポリペプチドを含み、該キットは、さらに、ポリペプチドを用いて、これらのポリペプチドに特異的に結合する抗体の存在を判定するための取扱説明書を含む。
【０１０７】
幾つかの実施形態においては、対象がＰＭＬのリスクがあるかどうかを診断するためのキットには、１つまたはそれ以上の容器が含まれ、それぞれの容器は、表１Ｆのパネルから選択された１つまたはそれ以上のアミノ酸配列変異を含むポリペプチドを含み、該キットは、さらに、ポリペプチドを用いて、これらのポリペプチドに特異的に結合する抗体の存在を判定するための取扱説明書を含む。
【０１０８】
幾つかの実施形態においては、対象がＰＭＬのリスクがあるかどうかを診断するためのキットには、１つまたはそれ以上の容器が含まれ、それぞれの容器は、表１Ｇのパネルから選択された１つまたはそれ以上のアミノ酸配列変異を含むポリペプチドを含み、該キットは、さらに、ポリペプチドを用いて、これらのポリペプチドに特異的に結合する抗体の存在を判定するための取扱説明書を含む。
【０１０９】
幾つかの実施形態においては、対象がＰＭＬのリスクがあるかどうかを診断するためのキットには、１つまたはそれ以上の容器が含まれ、それぞれの容器は、表１Ｈのパネルから選択された１つまたはそれ以上のアミノ酸配列変異を含むポリペプチドを含み、該キットは、さらに、ポリペプチドを用いて、これらのポリペプチドに特異的に結合する抗体の存在を判定するための取扱説明書を含む。
【０１１０】
幾つかの実施形態においては、対象がＰＭＬのリスクがあるかどうかを診断するためのキットには、１つまたはそれ以上の容器が含まれ、それぞれの容器は、位置１６４にアミノ酸配列変異を含むポリペプチドを含み、該キットは、さらに、ポリペプチドを用いて、これらのポリペプチドに特異的に結合する抗体の存在を判定するための取扱説明書を含む。
【０１１１】
一態様においては、本発明は、対象における、ＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法を提供する。
【０１１２】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の一実施形態においては、該方法は、対象から得られた第１の生体試料中のバリアントＪＣＶ−ＶＰ１のアミノ酸配列変異数を判定することと、第１の試料を採取した時点よりも後の時点で対象から得られた第２の生体試料中のバリアントＪＣＶ−ＶＰ１のアミノ酸配列変異数を判定することと、第１の試料中の配列変異数を第２の試料中の配列変異数と比較することと、を含み、第２の試料中の配列変異数と比較して第１の試料中の配列変異数が少ないことは、対象におけるＰＭＬの発病または進行を示し、第２の試料中の配列変異数と比較して第１の試料中の配列変異数が多いことは、対象におけるＰＭＬの回帰を示す。
【０１１３】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の一実施形態においては、該配列変異は、表１Ａ中の位置から選択される。
【０１１４】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の一実施形態においては、該配列変異は、表１Ｂ中の位置から選択される。
【０１１５】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の一実施形態においては、該配列変異は、表１Ｃ中の位置から選択され。
【０１１６】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の一実施形態においては、該配列変異は、表１Ｄ中の位置から選択される。
【０１１７】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の一実施形態においては、該配列変異は、表１Ｆ中の位置から選択される。
【０１１８】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の一実施形態においては、該配列変異は、表１Ｇ中の位置から選択される。
【０１１９】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の幾つかの実施形態においては、該配列変異は、バリアントＪＣＶ−ＶＰ１を野生型ＪＣＶ−ＶＰ１と比較することによって決定される。
【０１２０】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の一実施形態においては、該方法は、配列変異が対象から得られた第１の生体試料中のバリアントＪＣＶ−ＶＰ１の位置１６４に存在するかどうか、配列変異が第１の試料を採取した時点よりも後の時点で対象から得られた第２の生体試料中のバリアントＪＣＶ−ＶＰ１の位置１６４に存在するかどうかを判定することを含み、第１の試料中の配列変異の不在および第２の試料中の配列変異の存在は、対象におけるＰＭＬの発病または進行を示し、第１の試料中の配列変異の存在および第２の試料中の配列変異の不在は、対象におけるＰＭＬの回帰を示す。
【０１２１】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の幾つかの実施形態においては、該方法は、さらに、後の時点で対象からさらなる試料を採取すること、これらの試料中のＪＣＶ−ＶＰ１のアミノ酸配列変異数を判定すること、およびこれらの試料中の配列変異数を１つまたはそれ以上の以前の試料中の配列変異数と比較することによって、対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰をモニターすることを含む。
【０１２２】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の幾つかの実施形態においては、該対象は、免疫調節剤による治療を受けながら、モニターされる。幾つかの実施形態においては、該免疫調節剤は、ナタリズマブである。
【０１２３】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の一実施形態においては、該方法は、対象から得られた第１の生体試料中のバリアントＪＣＶ−ＶＰ１のウイルス量を判定することと、第１の試料を採取した時点よりも後の時点で対象から得られた第２の生体試料中のバリアントＪＣＶ−ＶＰ１のウイルス量を判定することと、第１の試料中のウイルス量を第２の試料中のウイルス量と比較することと、を含み、第２の試料中のウイルス量と比較して第１の試料中のウイルス量が少ないことは、対象におけるＰＭＬの発病または進行を示し、第２の試料中のウイルス量と比較して第１の試料中のウイルス量が多いことは、対象におけるＰＭＬの回帰を示す。
【０１２４】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の幾つかの実施形態においては、該方法は、バリアントＪＣＶ−ＶＰ１のウイルス量を判定することを含み、該バリアントＪＣＶ−ＶＰ１は、表１Ａ中の位置から選択された１つまたはそれ以上の配列変異を含む。
【０１２５】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の幾つかの実施形態においては、該方法は、バリアントＪＣＶ−ＶＰ１のウイルス量を判定することを含み、該バリアントＪＣＶ−ＶＰ１は、表１Ｂ中の位置から選択された１つまたはそれ以上の配列変異を含む。
【０１２６】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の幾つかの実施形態においては、該方法は、バリアントＪＣＶ−ＶＰ１のウイルス量を判定することを含み、該バリアントＪＣＶ−ＶＰ１は、表１Ｃ中の位置から選択された１つまたはそれ以上の配列変異を含む。
【０１２７】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の幾つかの実施形態においては、該方法は、バリアントＪＣＶ−ＶＰ１のウイルス量を判定することを含み、該バリアントＪＣＶ−ＶＰ１は、表１Ｄ中の位置から選択された１つまたはそれ以上の配列変異を含む。
【０１２８】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の幾つかの実施形態においては、該方法は、バリアントＪＣＶ−ＶＰ１のウイルス量を判定することを含み、該バリアントＪＣＶ−ＶＰ１は、表１Ｆ中の位置から選択された１つまたはそれ以上の配列変異を含む。
【０１２９】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の幾つかの実施形態においては、該方法は、バリアントＪＣＶ−ＶＰ１のウイルス量を判定することを含み、該バリアントＪＣＶ−ＶＰ１は、表１Ｇ中の位置から選択された１つまたはそれ以上の配列変異を含む。
【０１３０】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の幾つかの実施形態においては、該方法は、バリアントＪＣＶ−ＶＰ１のウイルス量を判定することを含み、該バリアントＪＣＶ−ＶＰ１は、位置１６４に配列変異を含む。
【０１３１】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の幾つかの実施形態においては、バリアントＪＣＶ−ＶＰ１のウイルス量は、野生型ＪＣＶ−ＶＰ１のウイルス量と比較される。
【０１３２】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の幾つかの実施形態においては、該方法は、バリアントＪＣＶ−ＶＰ１のウイルス量を判定することを含み、該方法は、さらに、後の時点で対象からさらなる試料を採取すること、これらの試料中のバリアントＪＣＶ−ＶＰ１のウイルス量を判定すること、およびこれらの試料中のウイルス量を１つまたはそれ以上の以前の試料中のウイルス量と比較することによって、対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰をモニターすることを含む。
【０１３３】
対象におけるＰＭＬの発病、進行、または回帰を判定するための方法の幾つかの実施形態においては、該方法は、バリアントＪＣＶ−ＶＰ１のウイルス量を判定することを含み、該対象は、免疫調節剤による治療を受けながら、モニターされる。幾つかの実施形態においては、該免疫調節剤は、ナタリズマブである。
【０１３４】
一態様においては、本発明は、対象におけるＰＭＬに対する治療への応答をモニターするための方法を提供する。
【０１３５】
対象におけるＰＭＬに対する治療への応答をモニターするための方法の幾つかの実施形態においては、該方法は、対象から得られた第１の生体試料中のＪＣＶ−ＶＰ１のアミノ酸配列変異数を判定することと、対象へＰＭＬ治療を施すことと、治療後、および第１の試料よりも後の時点で対象から採取された、第２の試料中のＪＣＶ−ＶＰ１のアミノ酸配列変異数を判定することと、第１の試料中のアミノ酸配列変異数を第２の試料中のアミノ酸配列変異数と比較することと、を含み、第１の試料中のものよりも第２の試料中のアミノ酸配列変異数が少ないことは、対象がＰＭＬ治療に対して反応性があることを示す。
【０１３６】
対象におけるＰＭＬに対する治療への応答をモニターするための方法の幾つかの実施形態においては、該方法は、対象から得られた第１の生体試料中のＪＣＶバリアントのウイルス量を判定することと、対象へＰＭＬ治療を施すことと、第２の試料中のＪＣＶバリアントのウイルス量を判定することと、を含み、第２の試料は、治療後、および第１の試料よりも後の時点で対象から採取され、および第１の試料中のウイルス量を第２の試料中のウイルス量と比較することと、を含み、第１の試料中のものよりも第２の試料中のウイルス量が少ないことは、対象がＰＭＬ治療に対して反応性があることを示す。
【０１３７】
一態様においては、本発明は、ＰＭＬに罹患しているか、または罹患している疑いがある対象の治療コースを選択するための方法を提供する。
【０１３８】
ＰＭＬに罹患しているか、または罹患している疑いがある対象の治療コースを選択するための方法の幾つかの実施形態においては、該方法は、対象から得られた生体試料中のＪＣＶ−ＶＰ１のアミノ酸配列変異数を判定することと、配列変異数を配列変異の対照数と比較することと、少なくとも部分的に、配列変異の対照数と比較して試料中の配列変異数の差異に基づいてＰＭＬの段階を判定することと、対象に対して、対象のＰＭＬの段階に適切な治療コースを選択することと、を含む。
【０１３９】
ＰＭＬに罹患しているか、または罹患している疑いがある対象の治療コースを選択するための方法の幾つかの実施形態においては、該方法は、対象から得られた生体試料中のＪＣＶバリアントのウイルス量を判定することと、該ウイルス量を対照試料中のウイルス量と比較することと、少なくとも部分的に、対照試料と比較して該試料中のウイルス量の差異に基づいてＰＭＬの段階を判定することと、対象に対して、対象のＰＭＬの段階に適切な治療コースを選択することと、を含む。
【０１４０】
一態様においては、本発明は、１つまたはそれ以上の免疫調節剤による対象の治療を中断する決定を行うこと、または支援するための方法を提供する。
【０１４１】
１つまたはそれ以上の免疫調節剤による対象の治療を中断する決定を行うこと、または支援するための方法の幾つかの実施形態においては、対象から得られた生体試料中のＪＣＶ−ＶＰ１のアミノ酸配列変異数を判定することと、配列変異数を配列変異の対照数と比較することと、少なくとも部分的に、配列変異の対照数と比較した該試料中の配列変異数の差異に基づいて対象の治療を中断する決定を行うことと、を含む。
【０１４２】
１つまたはそれ以上の免疫調節剤による対象の治療を中断する決定を行うこと、または支援するための方法の幾つかの実施形態においては、対象から得られた生体試料中のＪＣＶバリアントのウイルス量を判定することと、対照試料中のウイルス量と比較することと、少なくとも部分的に、対照試料と比較した該試料中のウイルス量の差異に基づいて１つまたはそれ以上の免疫調節剤による対象の治療を中断する決定を行うことと、を含む。
【０１４３】
１つまたはそれ以上の免疫調節剤による対象の治療を中断する決定を行うこと、または支援するための方法の幾つかの実施形態においては、該免疫調節剤は、ナタリズマブである。
【０１４４】
一態様においては、本発明は、治療候補化合物を特定するための方法を提供する。
【０１４５】
治療候補化合物を特定するための方法の幾つかの実施形態においては、該方法は、表１Ａ、表１７、および／もしくは表１８のパネルから選択された１つまたはそれ以上のアミノ酸配列変異、および／または本明細書に記載される１つまたはそれ以上の他のバリアントを含む単離ポリペプチドを、化合物と接触させて、該化合物が単離ポリペプチドに結合するかどうかを判定することを含み、該化合物が単離ポリペプチドに結合する場合、該化合物は、治療候補化合物である。
【０１４６】
一態様においては、本発明はまた、表１Ａ、表１７、および／もしくは表１８のパネルから選択された１つまたはそれ以上のアミノ酸配列変異、および／または本明細書に記載される１つまたはそれ以上の他のバリアントを含む単離ポリペプチドを接触させることによって特定される治療候補化合物も提供する。
【０１４７】
治療候補化合物を特定するための方法の幾つかの実施形態においては、該方法は、対象から得られた第１の生体試料中のＪＣＶ−ＶＰ１のアミノ酸配列変異数を判定することと、化合物を投与することと、化合物を投与した時点よりも後の時点で、対象から得られた第２の生体試料中のＪＣＶ−ＶＰ１のアミノ酸配列変異数を判定することと、を含み、第２の試料中のＪＣＶ−ＶＰ１のアミノ酸配列変異数が、第１の試料中のものよりも低い場合、該化合物は、治療候補化合物である。
【０１４８】
一態様においては、本発明はまた、対象から得られた第１の生体試料中のＪＣＶ−ＶＰ１のアミノ酸配列変異数を判定すること、化合物を投与すること、および化合物を投与した時点より後の時点で、対象から得られた第２の生体試料中のＪＣＶ−ＶＰ１のアミノ酸配列変異数を判定することによって特定される治療候補化合物も提供する。
【０１４９】
治療候補化合物を特定するための方法の幾つかの実施形態においては、該方法は、対象から得られた第１の生体試料中のＪＣＶバリアントのウイルス量を判定することと、化合物を投与することと、化合物を投与した時点より後の時点で、対象から得られた第２の生体試料中のＪＣＶバリアントのウイルス量を判定することと、を含み、第２の試料中のウイルス量が第１の試料中のものよりも低い場合、該化合物は、治療候補化合物である。
【０１５０】
一態様においては、本発明はまた、対象から得られた第１の生体試料中のＪＣＶバリアントのウイルス量を判定すること、化合物を投与すること、および化合物を投与した時点より後の時点で、対象から得られた第２の生体試料中のＪＣＶバリアントのウイルス量を判定することによって特定される治療候補化合物も提供する。
【０１５１】
一態様においては、本発明はまた、表１Ａ、表１７、および／もしくは表１８中の位置から選択された１つまたはそれ以上のＪＣＶ−ＶＰ１位置に配列変異、および／または本明細書に記載される１つまたはそれ以上の他のバリアントを有するポリペプチドを含むワクチンも提供する。幾つかの実施形態においては、該ワクチンは、表１Ａ中の位置から選択された１つまたはそれ以上のＪＣＶ−ＶＰ１位置に配列変異を有する２つまたはそれ以上のポリペプチドを含む。幾つかの実施形態においては、該ワクチンは、さらに、アジュバントを含む。
【０１５２】
一態様においては、本発明はまた、対象にＰＭＬに対する免疫を与える方法も提供し、該方法は、表１Ａ、表１７、および／もしくは表１８中の位置から選択された１つまたはそれ以上のＪＣＶ−ＶＰ１位置に配列変異、および／または本明細書に記載される１つまたはそれ以上の他のバリアントを有する１つまたはそれ以上のポリペプチドを含むワクチンを投与することを含む。
【０１５３】
一態様においては、本発明はまた、表１Ａ中の位置から選択された１つまたはそれ以上のＪＣＶ−ＶＰ１位置に配列変異を有するポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体も提供する。幾つかの実施形態においては、該ポリペプチドは、表１Ａ、表１７、および／もしくは表１８中の位置から選択された２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の配列変異、および／または本明細書に記載される１つまたはそれ以上の他のバリアントを有する。幾つかの実施形態においては、該抗体は、モノクローナル抗体である。幾つかの実施形態においては、該抗体は、ポリクローナル抗体である。
【０１５４】
ある実施形態においては、該抗体は、本明細書に記載される配列変異を含む少なくとも１つのＶＰ１ポリペプチドを含むＶＰ１粒子に特異的に結合する。本発明に有用なＶＰ１粒子は、当技術分野で周知の方法を用いて、一般的に、本明細書に記載されるバリアントを含む組み換えＶＰ１ポリペプチドを発現することによって産生することができる。ＶＰ１粒子は、少なくとも２つ、４つ、１０、２０、３０、４０、または５０のＶＰ１ポリペプチドを含む。幾つかの実施形態においては、該ＶＰ１粒子は、バリアントを含むＶＰ１ポリペプチドのみを含む。他の実施形態においては、該ＶＰ１粒子は、１を超えるＶＰ１ポリペプチド配列を含む異種粒子、例えば、１を超えるバリアントポリペプチドまたは少なくとも１つのバリアントポリペプチド、および少なくとも１つの野生型ポリペプチドである。
【０１５５】
本発明はまた、（例えば、表１Ａ〜１Ｈ、表１７、および／もしくは表１８中に記載される１つまたはそれ以上のバリアント、および／または本明細書に記載される１つまたはそれ以上の他のバリアントを含む）ＶＰ１ポリペプチドバリアント、またはそのようなポリペプチドのペプチドをコードする単離された核酸配列も包含し、該ポリペプチドまたはペプチドは、ＶＰ１ポリペプチドのシアル酸結合領域を含む。場合によっては、本発明は、異種発現制御配列に動作可能に連結されたそのような単離された核酸配列を含む。本発明はまた、そのような核酸配列を含む、一時的に、または安定に導入されたベクターおよび宿主細胞も含む。そのような配列、ベクター、および宿主細胞を産生するための方法は、当技術分野で周知である。
【０１５６】
本発明の限定のそれぞれは、本発明の様々な実施形態を包含することができる。したがって、いずれか１つの構成要素または構成要素の組み合わせを含む本発明の限定のそれぞれは、本発明のそれぞれの態様に含まれ得ることが見込まれる。本発明は、本発明の適用において、以下の説明に記載し、または図面に示す構成要素の構造の詳細および配置に限定されるものではない。本発明は、他の実施形態、および様々な方法で実践する、または実行することが可能である。また、本明細書において使用される表現および用語は、説明の目的のためのものであり、限定と見なされるべきではない。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、または「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、および本明細書におけるそれらの変形の使用は、その後に列記された項目、ならびに追加の項目を包含することを意味する。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】ＳＶ４０  ＣＯＡ配列との参照ＪＣＶ−ＶＰ１配列の比較を示す。
【図２】ＪＣＶ−ＶＰ１のモデルを示す。
【図３−１】ＶＰ１ペプチド配列を示す。
【図３−２】ＶＰ１ペプチド配列を示す。
【図３−３】ＶＰ１ペプチド配列を示す。
【図３−４】ＶＰ１ペプチド配列を示す。
【図３−５】ＶＰ１ペプチド配列を示す。
【図３−６】ＶＰ１ペプチド配列を示す。
【図３−７】ＶＰ１ペプチド配列を示す。
【図３−８】ＶＰ１ペプチド配列を示す。
【図４Ａ】ＰＭＬ関連ウイルスの系統的分布を示す。
【図４Ｂ】ＰＭＬ関連ウイルスの系統的分布を示す。
【図５Ａ】ＪＣＶ  ＶＰ１／ＮｅｕＮＡｃ−（α２，３）−Ｇａｌ−（β１，３）−［（α２，６）−ＮｅｕＮＡｃ］−Ｇｌｃ−ＮＡｃ四糖類複合体の構造モデルを示す。
【図５Ｂ】ＪＣＶ  ＶＰ１／ＮｅｕＮＡｃ−（α２，３）−Ｇａｌ−（β１，３）−［（α２，６）−ＮｅｕＮＡｃ］−Ｇｌｃ−ＮＡｃ四糖類複合体の構造モデルを示す。
【図６】ウイルス様粒子の性質を示す。
【図７】野生型ＪＣＶが、幾つかのグリカンに結合することを示す。
【図８】選択されるガングリオシドの構造および野生型ＪＣＶに結合するそれらの能力を示す。
【図９】Ｆ５５変異およびＦ２６９変異が、Ｎｅｕ５Ａｃα（２−３）およびα（２−６）グリカンに結合することができないことを示す。
【図１０】選択されるガングリオシドの構造および変異型ＪＣＶに結合するそれらの能力を示す。
【図１１】選択されたガングリオシドに結合するＪＣＶに対する野生型および変異型の能力を比較する。
【図１２】変異型ＪＶＣは、さらに、グリア細胞株に結合することができることを示す。
【図１３】変異型に特異的なＪＣＶ抗体は、野生型ＪＣＶ抗体と区別することができることを示す。
【図１４】変異抗体を野生型と区別するためのアッセイを示す。
【図１５】変異型ＪＣＶ−ＶＬＰに結合するそれらの能力について、変異型ＪＣＶおよび野生型ＪＣＶ抗体を比較する。
【図１６】変異型ＪＣＶ−ＶＬＰに結合するそれらの能力について、変異型ＪＣＶおよび野生型ＪＣＶ抗体を比較する。
【図１７】Ｆ２６９変異ウイルスを有する患者は、野生型ウイルスに対して抗体応答を生じたが、Ｆ２６９変異ウイルスに対して生じなかったことを示す。
【図１８】（上）非変異ＶＬＰを用いて免疫性を与えられたウサギは、変異することができた部位（この場合、Ｓ２６９）への抗体をもたらすことを示す。
【図１９】より高いＣＳＦ  ＪＣＶ  ＤＮＡレベルが、ＤＥループの変異を有する、または変異を有さないものよりもＢＣおよびＨＩループの変異を有する患者に見出されたことを示す。
【図２０】ＪＣＶ  ＶＰ１／ＮｅｕＮＡｃ−（ａ２，３）−Ｇａｌ−（ｂ１，３）−［（ａ２，６）−ＮｅｕＮＡｃ］−Ｇｌｃ−ＮＡｃ四糖類複合体の構造モデルを示す。
【図２１】ＶＰ１のＰＭＬ特異的変異は、シアル化ガングリオシドに対するウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１の特異性をなくす、または大きく変化させることを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１５８】
本発明の態様は、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）の増加したリスクがある対象を特定することと、それらの対象の医療を管理することに関する。ＰＭＬは、ヒト、特に、弱体化した免疫系を有する対象において、ＪＣポリオーマウイルス（ＪＣＶ）感染によって引き起こされ得る。しかしながら、ＰＭＬは、弱体化した免疫系を有する全てのＪＣＶに感染した対象において発症するわけではない。本発明によれば、あるＪＣＶバリアントのみがＰＭＬを引き起こす。幾つかの実施形態においては、低下したシアル酸結合を有するＪＣＶバリアントが、特に、ＰＭＬを引き起こす可能性がある。したがって、本発明の態様は、シアル酸に低下した結合を有することが予測されるＪＣＶバリアントの存在を検出するための方法および組成物に関する。
【０１５９】
本発明の態様によれば、理論により拘束されるものではないが、野生型ＪＣＶのシアル結合と比較して、低シアル酸結合を有するＪＣＶバリアントは、末梢部位（例えば、末梢細胞、タンパク質、糖、または他の分子におけるシアル酸）に低下した結合を有する。したがって、幾つかの実施形態においては、これらのバリアントは、体の他の部分、例えば、ＣＮＳに広がる可能性が高い。さらに、本発明の態様によれば、健康な免疫系を有する対象は、低下したシアル酸結合を有するあるＪＣＶバリアントの広がりを制御する。しかしながら、欠陥がある免疫系を有する対象において、これらのバリアントは、免疫系を回避し、ＰＭＬに進行する可能性が高い。
【０１６０】
したがって、本発明の態様は、正常または野生型ＪＣＶの結合と比較して、低シアル酸結合（例えば、低結合または結合力）を有することが予測されるＪＣＶバリアントの存在を検出するための組成物および方法に関する。幾つかの実施形態においては、ＪＣＶカプシドタンパク質のシアル酸結合ドメインにおいて、１つまたはそれ以上の変異を有するＪＣＶバリアントは、低シアル酸結合特性を有することが予測される。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載される特異的バリアントは、低シアル酸結合特性を有することが予測される。
【０１６１】
本発明の態様によれば、シアル酸結合を低下させることが予測される１つまたはそれ以上の変異を有するＪＣＶバリアントを持っている対象は、特に、対象の免疫系が損なわれている場合、ＰＭＬに対する感受性が増加している（例えば、ＪＣＶまたはそのようなＪＣＶバリアントを持っていない対象と比較して）と特定される。したがって、低下したシアル酸結合ＪＣＶバリアントを持っている対象は、対象が免疫抑制薬（例えば、ナタリズマブまたは免疫抑制薬）を用いて治療される場合、ＰＭＬを発症するリスクがある。
【０１６２】
幾つかの実施形態においては、対象において、ＰＭＬ感受性と関連するＪＣＶ変異は、位置１２２、２、および６６の変異、ならびにＪＣＶのＶＰ１カプシドタンパク質中のアミノ酸５０〜５１、１２３〜１２５、および１２６〜１３４の欠失である。幾つかの実施形態においては、対象において、ＰＭＬ感受性と関連するＪＣＶ変異は、Ｈ１２２Ｒ、Ａ２Ｖ、およびＤ６６Ｇである。幾つかの実施形態においては、対象において、ＰＭＬ感受性と関連するＪＣＶ変異は、Ｈ１２２Ｒ、Ａ２Ｖ、Ｄ６６Ｇ、および２８３Ｉである。幾つかの実施形態においては、ＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質が、アミノ酸残基１２２、２、６６、５５、６０、２６５、２６７、および２６９のうちの少なくとも１つの置換、または５０〜５１、１２３〜１２５、および１２６〜１３４の１つまたはそれ以上の欠失を含む場合、対象は、ＰＭＬに感受性がある。
【０１６３】
本発明の態様は、免疫抑制治療を必要とする対象（例えば、多発性硬化症、または１つまたはそれ以上の免疫抑制薬を用いて治療することができる任意の他の状態を有する対象）に対する治療法を選択および／またはモニタリングを支援するのに有用である。幾つかの実施形態においては、本発明の態様は、免疫抑制治療を開始する前に、ＰＭＬに感受性がある対象を特定するために使用することができる。幾つかの実施形態においては、免疫抑制治療を受けている対象は、ＰＭＬに対して増加したリスクと関連するＪＣＶバリアントの出現についてモニターされ得る。幾つかの実施形態においては、対象が、シアル酸への結合が低下しているＪＣＶバリアントを有すると特定される場合、該対象は、ｉ）免疫抑制薬を用いて治療されない、ｉｉ）低用量または低頻度の薬物投与を用いて治療される、および／またはｉｉｉ）ＰＭＬの初期症状について、定期的にモニターされる。治療時に、ＰＭＬの症状が現れる場合、該治療を、中止し得るか、または薬物投与の量もしくは頻度を低減し得る。幾つかの実施形態においては、ＰＭＬの１つまたはそれ以上の症状を示す場合、第１の薬物に対して代替的な免疫抑制薬に置き換えてもよい。
【０１６４】
本発明の態様は、患者にモニタリング手順を実施するために使用してよい。幾つかの実施形態においては、患者は、まず、ＪＣＶに暴露されているかどうかを判定するために、（例えば、ＪＣＶ抗体の存在について、患者の血清をアッセイすることによって）アッセイされる。ＪＣＶに暴露されていない患者は、ＰＭＬに対してリスクが低いと特定される。しかしながら、幾つかの実施形態においては、そのような患者は、ＪＣＶに暴露されているかどうか、またはいつ暴露されているかを判定するために、定期的にモニターされる。ＪＣＶ暴露の兆しは、治療前、または治療時に、対象において特定される場合、該対象は、ＰＭＬに対する増加したリスクと関連する１つまたはそれ以上のＪＣＶバリアント（例えば、ＪＣＶの正常型または野生型と比較して、低下したシアル酸結合を有すると予測される１つまたはそれ以上のバリアント）の存在を評価することができる。患者は、ＰＭＬ関連ＪＣＶバリアントの存在について、定期的にモニターされ得る。患者が１つまたはそれ以上のＰＭＬ関連ＪＣＶバリアントを持っていることが分かる場合、ＰＭＬの兆しについて、該患者を慎重にモニターすることができ、患者の治療を中断もしくは変更することができ、ならびに／またはＰＭＬから患者を保護するのに役立つように、該患者を、１つまたはそれ以上の予防薬もしくは治療薬を用いて治療することができる。
【０１６５】
幾つかの実施形態においては、患者または対象は、毎日、週に１回、隔週に、月に１回、２ヶ月ごと、年に４回、年に２回、年に１回、または２年ごとにモニターされる。幾つかの実施形態においては、患者または対象は、該患者または対象が、免疫調節剤による治療を受けている場合、モニターされる。
【０１６６】
本発明の態様によれば、ＪＣＶバリアントは、該バリアントがＪＶＣ  ＶＰ１タンパク質のシアル結合ポケット中に１つまたはそれ以上の変異を有する場合、低シアル酸結合（例えば、親和性または結合力）を有することが予測され得る。幾つかの実施形態においては、シアル酸結合ポケット中で結合する１２オングストロームの分子内にある任意の１つまたはそれ以上のアミノ酸の変異は、シアル酸結合に影響を及ぼすことが予測され得る。シアル酸結合ポケット中で結合する１２オングストロームの分子内のＶＰ１アミノ酸の一覧表を実施例１２の表１６中に提供する。したがって、これらのアミノ酸の１つまたはそれ以上の変異を有するＪＣＶバリアントは、シアル酸への結合を低下させ、したがって、ＰＭＬを引き起こすリスクが増加するため候補であると特定され得る。
【０１６７】
本発明の態様によれば、幾つかの異なる天然に存在するＪＣＶ  ＶＰ１配列は、本明細書に記載される、ＰＭＬに対して増加したリスクと関連しないＪＣＶバリアントに由来する場合、正常なまたは野生型の参照配列として使用され得る。そのような参照配列の例は、例えば、Ｃｕｂｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  １００  ＪＣＶ  ｓｔｒａｉｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＮｅｕｒｏＶｉｒｏｌｏｇｙ，７：３３９−３４４，２００１において、本明細書にさらに詳細に記載されており、これらの配列の開示は、参照することによって、その全体として本明細書に組み込まれる。
【０１６８】
本発明の態様によれば、バリアントＪＣＶのシアル酸結合特性（例えば、親和性または結合力）は、任意の適したアッセイを用いて測定することができる。例えば、シアル酸に結合するＪＣＶおよびまたはＪＣＶ  ＶＰ１は、赤血球凝集アッセイ、固定化分子（例えば、ガングリオシド、糖、糖たんぱく質等）への直接結合、細胞ベースの結合アッセイ（例えば、結合が、フローサイトメトリーを用いて標識抗体で検出される場合）等、またはこれらの任意の組み合わせを用いて、測定することができる。幾つかの実施形態においては、低結合は、本明細書に記載される、正常型または野生型ＪＣＶ参照の結合と比較して、５倍を超える結合（例えば、結合力または親和性）の低下である。しかしながら、幾つかの実施形態においては、低結合は、正常型または野生型ＪＣＶ参照と比較して、約１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれ以上の結合の低下である。
【０１６９】
したがって、本発明の態様は、ＰＭＬ関連ＪＣＶバリアントの存在により、対象がＰＭＬに感受性があるかどうかを判定することに関する。幾つかの実施形態においては、この情報を用いて、該対象が免疫抑制剤による治療に適しているかどうかを判定することができる。幾つかの実施形態においては、この情報を用いて、免疫抑制剤で治療されている対象が、治療を継続すべきかどうか、または免疫抑制薬の異なる投与量、計画、および／または種類に切り替えるべきかどうかを判定することができる。ある実施形態においては、免疫抑制剤で治療されている対象において、ＰＭＬ関連ＪＣＶバリアントの検出は、少なくとも一定期間、治療を中止するための基準を提供する。
【０１７０】
免疫抑制剤で治療されている患者は、ＪＣＶ感染の存在について、定期的にモニターすることができる。幾つかの実施形態においては、対象がＪＣＶに感染していることが知られている、または感染していると特定される場合、該対象は、シアル酸に対する結合が低下していることが予測されるＪＣＶバリアントの存在について、定期的にモニターすることができる。
【０１７１】
したがって、本発明は、対象が進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）のリスクがあるか、またはＰＭＬ（例えば、初期段階のＰＭＬ）に罹患しているかどうかを判定するための方法および組成物を提供する。一実施形態においては、対象の生体試料は、ＰＭＬと関連する１つまたはそれ以上の配列変異、例えば、低下したシアル酸結合をもたらすことが予測される１つまたはそれ以上の配列バリアントを有するバリアントＪＣウイルスへの暴露について、調査される。幾つかの実施形態においては、複数の特定の所定のＶＰ−１位置が、それらの変異状態について調査される。特定の位置で見出される配列変異のパターンは、ＰＭＬに対する対象のリスクプロファイルを提供する。
【０１７２】
幾つかの実施形態においては、本発明は、ＰＭＬのリスクおよび／またはＰＭＬの疾患進行と関連する、ＪＣＶ−ＶＰ１アミノ酸位置のパネルを提供する。ＰＭＬのリスクの兆候について、生体試料をアッセイするための方法および組成物が提供される。幾つかの実施形態においては、ＪＣウイルスポリペプチドおよび／または核酸を単離し、分析して、それらが１つまたはそれ以上の所定のＶＰ−１位置に配列変異を有するかどうかを判定することができる。しかしながら、ある特定の状況において、ＪＣウイルスに暴露されていて、現行のＪＣにウイルス感染している場合であっても、ＪＣウイルスは、低いＪＣウイルス量を有する対象から得られたある生体試料から単離することは困難であり得る。とはいえ、ＰＭＬ関連バリアントＪＣウイルスへの対象の暴露は、１つまたはそれ以上のＰＭＬ関連バリアントＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドに対する抗体（例えば、血清抗体）の、対象から得られた生体試料中の存在から推定することができる。
【０１７３】
ＰＭＬ患者の脳におけるＪＣＶ配列は、とても変化しやすいので、同一のＪＣＶ配列は、異なるＰＭＬ患者において一度も検出されていない（Ｙｏｇｏ  ＆  Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，２００１）。しかしながら、本発明の態様は、健常な対象およびＰＭＬ対象からのＪＣＶ配列の分析、およびアミノ酸置換がＰＭＬと強い相関を持つＶＰ１配列における位置のサブセットの特定に基づく。一態様においては、本発明は、ＰＭＬのリスクプロファイルに達するように調査される必要があるＪＣＶ−ＶＰ１における位置に関するガイダンスを提供する。一態様においては、本発明は、ＶＰ１アミノ酸位置の新しいパネルを提供し、配列変異は、対応するバリアントＪＣＶに感染した対象において、ＰＭＬのリスクを予測する。本発明の態様は、シアル酸への低下した結合を有するＪＣＶバリアントの兆しまたは兆候の存在について、対象をスクリーニングすることに関する。幾つかの実施形態においては、異なるＰＭＬリスクプロファイルと関連するＪＣＶ配列変異のパネルを、表１Ａ〜１Ｈ中に提供し、本明細書にさらに詳細に記載している。
【０１７４】
ＪＣＶおよびＶＰ１
幾つかの実施形態においては、ＰＭＬと関連するＪＣＶ配列変異は、ＪＣＶの主要なカプシドタンパク質（ＶＰ１）中の選択された位置で見出される。文献に記載される多くのＶＰ１タンパク質の配列を分析して、配列変異がＰＭＬと強く関連しているＶＰ１位置のサブセットを特定する。本発明によれば、アミノ酸は、それが、コンセンサス配列または他の参照配列（例えば、野生型原型ウイルスの配列）の位置でアミノ酸とは異なる場合、ＶＰ−１における特定の位置で変異体またはバリアントと特定される。幾つかの実施形態においては、健常な対象からのＪＣＶのＶＰ１タンパク質に対するコンセンサス配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ番号＃３７０５０８４９（ＡＡＱ８８２６４、図１中でＶＰ１配列として示される）によって提供される。ＪＣＶ−ＶＰ１は、ＳＶ４０と比較した場合、図１に示されるように、保存される。多くの異なるＪＣＶの原型が特定されている。本明細書において使用される、原型は、健常な個人の尿中に見られるＪＣＶである。幾つかの実施形態においては、図１のＶＰ１配列は、参照配列である。幾つかの実施形態においては、参照配列は、Ｚｈｅｎｇら（２００５）の１つまたはそれ以上の原型である。３つの主な原型は、地域によって決定される（ＥＵ原型は、ヨーロッパ系の人々に見られ、ＣＹおよびＭＹ原型は、アジア系の人々に見られる）。ＰＭＬ関連配列変異は、「コンセンサス」配列との比較に基づいて特定されたが、幾つかの原型は、ＰＭＬ関連と特定される位置に同じアミノ酸を有し、したがって、本発明は、原型配列のいずれとの配列比較に基づいても実践することができる。他の実施形態においては、アッセイは、参照配列との比較を行うことなく、ＪＣＶが、ある位置で１つまたはそれ以上の所定のアミノ酸を有するかどうかを判定することに基づき得る。あるＪＣＶ−ＶＰ１バリアント配列の存在を判定するための方法は、対象から単離されたＪＣＶ核酸またはポリペプチドの直接特徴付けに基づき得ることを認識すべきである。代替として、対象におけるバリアントＪＣＶの存在（またはバリアントＪＣＶへの対象の事前暴露）は、１つまたはそれ以上のバリアントＪＣＶ−ＶＰ１配列に対して特異的な対象抗体（例えば、血清抗体）を検出することによって推測することができる。本発明の態様はまた、他の参照配列とＪＣＶ−ＶＰ１配列を比較するために提供することを認識すべきである。しかしながら、他の参照配列を使用するとしても、分析は、１つまたはそれ以上の本明細書に記載されるＰＭＬ関連ＶＰ１位置にアミノ酸の同一性を判定することを含み得る。
【０１７５】
本発明によれば、ＶＰ１バリアントの配列分析は、ＰＭＬのリスクと関連する配列変異の「ホットスポット」領域を特定した。幾つかの実施形態においては、ＰＭＬのリスクを示す配列変異は、ＶＰ１タンパク質の表面ループに位置する。これらの位置は、表１Ｂ〜１Ｄに見出すことができる。幾つかの実施形態においては、ＶＰ１タンパク質の特定のエリアにおける総配列変異数は、ＰＭＬのリスクを示し得る（表２を参照のこと）。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載される２またはそれ以上（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上）の位置のバリアントアミノ酸の存在は、ＰＭＬのリスクを示し得る。これらの領域の極性は、ＰＭＬのリスクを示し得、極性のアミノ酸が非極性のアミノ酸で置き換えられる場合、ＰＭＬのリスクは、増加し得る。幾つかの実施形態においては、表１Ａまたは表１Ｂ〜１Ｄ中で特定される任意の１つまたはそれ以上の位置の極性のアミノ酸損失は、ＰＭＬとの関連性が増加するＪＣＶウイルスをもたらす。幾つかの実施形態においては、図２に示される構造的領域のうちの１つの領域内（例えば、ＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチド配列の位置５５〜７５または２６５〜２７１によって画定される領域内）の任意の１つまたはそれ以上の位置の極性のアミノ酸損失は、ＰＭＬとの関連性が増加するＪＣウイルスをもたらす。同様に、ある実施形態においては、表１Ａまたは表１Ｂ〜１Ｄ中で特定される任意の１つまたはそれ以上の位置の非極性のアミノ酸獲得は、ＰＭＬとの関連性が増加するＪＣＶウイルスをもたらす。また、ある実施形態においては、図２に示される構造的領域のうちの１つの領域内（例えば、ＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチド配列の位置５５〜７５または２６５〜２７１によって画定される領域内）の任意の１つまたはそれ以上の位置の非極性のアミノ酸獲得は、ＰＭＬとの関連性が増加するＪＣウイルスをもたらす。図２は、ＰＭＬと関連すると特定されるあるアミノ酸位置は、構造にマップされる領域をハイライト表示する予測したＪＣＶ−ＶＰ１構造を示す。ＪＣＶ−ＶＰ１タンパク質の予測された構造は、ＳＶ４０コートタンパク質１の結晶構造およびＪＣＶタンパク質とＳＶ４０タンパク質との間の配列相同性に基づく。配列変異の解析は、ＶＰ１タンパク質の表面積における極性のアミノ酸数の低下および／または非極性のアミノ酸数の増加は、ＰＭＬに対する増加したリスクをもたらすことを示した（実施例３を参照のこと）。一実施形態においては、１つまたはそれ以上の表面ループにおける配列変異が、配列変異当たり１０平方オングストロームまたはそれ以上の非極性の表面積の増加をもたらす、または配列変異当たり１０平方オングストロームまたはそれ以上の極性の表面積の低下をもたらす場合、対象は、ＰＭＬのリスクがある。本発明は、特定の機構に限定されないが、表面ループの変化は、抗体が、ＪＣＶ−ＶＰ１に結合する、ならびに／または炭水化物等のその受容体および／もしくは５ＨＴ２Ａ等のタンパク質受容体とのＪＣＶ  ＶＰ１の相互作用を促進するのを妨げ得る。ＶＰ１の表面ループの変化（例えば、非極性のアミノ酸もしくは表面積の増加、および／または極性のアミノ酸もしくは表面���の低下）は、細胞受容体に対するＶＰ１の親和性を増加させ、ＰＭＬの進行にとって重要な、宿主細胞もしくはある特定の宿主細胞へのウイルスの進入および／または感染を促進し得る。
【０１７６】
配列変異のパネル
位置の調査は、その位置のアミノ酸を判定することと、参照アミノ酸（例えば、コンセンサス配列または原型配列における、例えば、野生型／対照バリアントに見出されるアミノ酸）とそのアミノ酸を比較することの両方を含み得る。
【０１７７】
あらゆる単一のバリアントまたはバリアントの組み合わせが、ＰＭＬのリスクを示し得ることを認識すべきである。ある領域または選択された群の調査したバリアントに存在する総バリアント数は、ＰＭＬのリスクを示し得ることを認識すべきである。
【０１７８】
本発明の態様は、ＰＭＬのリスクと関連するＪＣＶバリアントに対応するＪＣＶ−ＶＰ１アミノ酸配列上に１つまたはそれ以上の位置を提供することに関する。例えば、表１Ａに示される位置のそれぞれは、ＰＭＬのリスクと関連し、任意の適したアッセイを用いて、１つまたはそれ以上の選択された位置にアミノ酸バリアントを有するＪＣＶバリアントの存在、またはＪＣＶバリアントへの過去の暴露の指標（兆候）を検出することができる。幾つかの実施形態においては、アッセイを用いて、表１Ａに列記される位置から選択された２つまたはそれ以上の位置にバリアントアミノ酸バリアントを有するＪＣＶバリアントの存在、またはＪＣＶバリアントへの暴露を検出することができ、バリアント／複数のバリアントの存在は、ＰＭＬを示す。
【０１７９】
幾つかの実施形態においては、対象において、ＰＭＬ感受性と関連するＪＣＶ変異は、位置１２２、２、および６６の変異、ならびにＪＣＶのＶＰ１カプシドタンパク質中のアミノ酸５０〜５１、１２３〜１２５、および１２６〜１３４の欠失である。幾つかの実施形態においては、対象において、ＰＭＬ感受性と関連するＪＣＶ変異は、Ｈ１２２Ｒ、Ａ２Ｖ、およびＤ６６Ｇである。幾つかの実施形態においては、ＪＣＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質が、アミノ酸残基１２２、２、６６、５５、６０、２６５、２６７、および２６９のうちの少なくとも１つの置換、または５０〜５１、１２３〜１２５、および１２６〜１３４の１つまたはそれ以上の欠失を含む場合、対象は、ＰＭＬに感受性がある。
【０１８０】
幾つかの実施形態においては、選択された位置は、参照に存在するアミノ酸とその位置に存在するアミノ酸を比較することによって調査される。アミノ酸が、参照に見出されるアミノ酸とは異なる選択された位置に存在する場合、その位置は、変異があると考えられる。したがって、幾つかの態様においては、本発明は、ＰＭＬのリスクに関するバリアントの一覧表を含む表（例えば、データベース）を提供する。データベースはまた、ＰＭＬを保護するバリアントおよびバリアントを提供する。幾つかの実施形態においては、選択された位置に見出されるあらゆるバリアントは、ＰＭＬのリスクを示す。さらなる実施形態においては、表は、対象に関して、ＰＭＬのリスクプロファイルに達する群であると調査され得るＰＭＬと関連するバリアント群を提供する。参照データベースにおいて特定される多くのバリアントは、あまり一般的ではないことを認識すべきである。例えば、ＰＭＬのリスクを示すバリアントは、ＰＭＬのリスクがあることが知られている人の試料のわずか１０％に見出され得る。対象に対するリスクプロファイルに達するために、１を超える位置を調査する必要があり得る。したがって、一態様においては、本発明は、ＰＭＬのリスクプロファイルに達すると特定される必要がある郡内の、位置群および位置番号の表を提供する。幾つかの実施形態においては、表１Ａ中の少なくとも８つ（例えば、８つ、９つ、１０もしくはそれ以上、または全ての）位置が、ＰＭＬに対する対象のリスクプロファイルに達することを調査する必要がある。同様に、表のいずれかにおいて、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０もしくはそれ以上、または全ての位置を調査することができる。
【０１８１】
表に示される位置に見出されるアミノ酸は、このアミノ酸を参照に見出されるアミノ酸と比較することによって、ＰＭＬのリスクを示すことができる。例えば、表１Ａ中の、位置５５の野生型（例えば、参照／コンセンサス）アミノ酸は、ロイシン（Ｌ）である。幾つかの実施形態においては、ロイシンでない位置５５に見出されるあらゆるアミノ酸は、ＰＭＬのリスクを示す。幾つかの実施形態においては、特定のバリアントは、ＰＭＬのリスクと関連する。例えば、位置５５のフェニルアラニン（Ｆ）の存在は、ＰＭＬのリスクを示し得る。したがって、位置５５のバリアントアミノ酸（例えば、Ｐｈｅ）の出現は、ＰＭＬの発病または進行を示し得る。同様に、ＶＰ１上のＰＭＬ関連位置における本明細書に記載される１つまたはそれ以上の他のバリアントアミノ酸は、ＰＭＬの発病または進行を示し得る。幾つかの実施形態においては、特定の特徴付けを有するアミノ酸の存在は、ＰＭＬのリスクを示し得る。例えば、参照配列に見出されるアミノ酸よりも極性が少ないアミノ酸のＪＣＶバリアントの存在は、ＰＭＬのリスクを示す。ＰＭＬのリスクを示すことに加えて、特定位置に見出されるバリアントを用いて、対象における発病、進行、または回帰も判定し得る。幾つかの実施形態においては、特定の位置に見出されるバリアントは、ＰＭＬに対する対象の治療のモニタリングを可能にする。幾つかの実施形態においては、特定の位置に見出されるバリアントは、ＰＭＬに罹患している、または罹患している疑いがある対象の治療の選択を可能にする。
【０１８２】
幾つかの実施形態においては、特定のアミノ位置に見出されるアミノ酸は、ＰＭＬから保護することを示す、例えば、ＰＭＬに発症するリスクが低い人を特定することができる。
【０１８３】
幾つかの実施形態においては、ＰＭＬのリスクは、参照配列と特定の位置に判定されたアミノ酸を比較することなく、判定することができることを認識すべきである。例えば、試料中の位置５５を調査し、その位置に見出されるアミノ酸がフェニルアラニンである場合、該対象は、ＰＭＬのリスクがあると判定される。この判定は、野生型参照と位置５５に見出されるアミノ酸を比較することなく、行うことができる。
【０１８４】
本発明は、ＪＣＶバリアントの現在の存在および過去の存在の両方を判定するための方法を提供することを認識すべきである。ＪＣＶバリアントに暴露されているが、現在、そのＪＣＶバリアントに感染していると特定することができない対象は、そのＪＣＶバリアントに対する指標の存在を判定することによって、そのＪＣＶバリアントに暴露されていると判定することができる。対象は、それが暴露される、ウイルスおよび細菌を含む、任意の外来作用物質に対して抗体を作ることができる。したがって、対象における、ウイルス、またはウイルスのバリアントは、そのウイルスまたはウイルスバリアントに特異的な抗体の検出によって診断することができる。ウイルスが、複製し、変異する（およびひいては、新しいバリアントを作成する）場合、ウイルスの変異型に対して特異的な新しい抗体を作る。特異的ウイルスバリアントがもはや体内に存在しなくとも、バリアントへの過去の暴露はなお、抗体の存在によって判定することができる。したがって、一実施形態においては、ＪＣＶバリアントの変異状態（現在の暴露および過去の暴露の両方）は、１つまたはそれ以上の特異的バリアントに対する抗体の存在の検出によって判定される。一実施形態においては、ＶＰ１−抗体の存在は、１つまたはそれ以上のバリアントを含む１つまたはそれ以上のポリペプチドへの抗体の特異的な結合によって判定される。抗体は、定性的におよび定量的に決定することができることを認識すべきである。したがって、本発明の抗体検出アッセイは、対象に今までに暴露された全てのウイルスバリアントの決定、および特異的抗体の量子化を通して体内に現在存在するバリアントのウイルス量の推定を促進する。
【０１８５】
一実施形態においては、アミノ酸バリアントは、直接検出され、例えば、対象におけるウイルスバリアントの存在は、バリアントのうちの１つまたはそれ以上のバリアントを含むポリペプチドの存在を判定することによって判定される。特定のポリペプチドに特異的に結合することができる薬剤が、開発される。幾つかの実施形態においては、これらの薬剤は、抗体である。幾つかの実施形態においては、バリアントは、バリアントをコードする核酸の配列を判定することによって判定される。試料は、対象から採取され、特定のウイルスバリアントの存在について分析される。特異的なＪＣＶバリアントは、脳および髄液中にのみ存在し得るが、「野生型」バリアントは、同じ対象において他の組織に存在し得ることを認識すべきである。ポリペプチドの存在は、これらのポリペプチドに対して特異的な抗体によって判定され得る。アッセイは、特異的なバリアントの存在およびバリアントの定量（ウイルス量）の両方を判定することが可能で、さらに、野生型に対するバリアントの比を決定することができる。
【０１８６】
免疫抑制剤は、潜在的な微生物感染の進行もしくは再発への、または新しい微生物感染の収縮への対象の感受性を増加させ得ることを認識すべきである。幾つかの実施形態においては、微生物感染は、ＰＭＬを引き起こす、ＪＣＶによる感染である。したがって、ＰＭＬのリスクは、免疫抑制剤で治療を開始する前、免疫抑制剤の投与中、評価され得るか、または免疫抑制剤を投与した後、または免疫抑治療での治療を終えた後に評価され得る。
【０１８７】
幾つかの実施形態においては、本発明の方法によって判定される、ＰＭＬのリスクは、免疫調節剤または免疫抑制剤による治療を決定するのに役立つ。幾つかの実施形態においては、免疫調節剤による治療中、診断されたＰＭＬの増加したリスクは、免疫調節剤による治療計画の修正または終了を示唆し得る。
【０１８８】
【表１Ａ】
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【０１８９】
【表１Ｂ】
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【０１９０】
【表１Ｃ】
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【０１９１】
【表１Ｄ】
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【０１９２】
【表１Ｅ】
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【０１９３】
【表１Ｆ】
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【０１９４】
【表１Ｇ】
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【０１９５】
【表１Ｈ】
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【０１９６】
【表２Ａ】
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【０１９７】
【表２Ｂ】
2012517017.tif 000012
診断
したがって、本発明の方法は、対象が、本発明のバリアント／複数のバリアントのパネルおよび群に基づくＰＭＬのリスクがあるか、またはＰＭＬに罹患しているかどうかを判定するために、一態様において有用である。バリアントＪＣＶへの暴露の兆候について、対象からの生体試料のアッセイは、人が、ＰＭＬのリスクがあるか、またはＰＭＬに罹患しているかどうか、またはＰＭＬと関連するＪＣＶバリアントによって感染しているかどうかを決定することを可能にする。対象が、本明細書に記載される１つまたはそれ以上のＶＰ１位置に配列変異を有するＪＣＶバリアントに暴露しているかどうか、または感染しているかどうかの判定は、対象が、ＰＭＬのリスクがあるかどうかの評価を可能にする（ＰＭＬと関連するＪＣＶバリアントのＶＰ１位置のバリアントは、本発明のバリアントと称される）。一態様においては、本発明は、ＪＣＶバリアントの所定の位置の変異状態とＰＭＬのリスクとの間の相関関係を提供する。幾つかの実施形態においては、該バリアントは、ＪＣＶ−ＶＰ１タンパク質に位置する。
【０１９８】
本明細書において使用される、ＰＭＬを「診断する」および「特定する」とは、人がＰＭＬのリスクがあるかどうか、またはＰＭＬに罹患しているかどうかの認識を意味する。ＰＭＬのリスクがあるという診断は、ＪＣＶバリアントへの暴露を示す位置のバリアントの判定に限定されず、当技術分野で日常の診断方法と組み合わせられ得る。これらの診断アッセイとしては、ＭＲＩおよびトモグラフィー、神経学的アッセイ、生化学的アッセイを含む、組織病理学、免疫組織化学、フローサイトメトリー、細胞学、病態生理学アッセイが含まれるが、これらに限定されない。ＣＳＦ中のＰＣＲによるＪＣＶ  ＤＮＡの検出は、最も広く容認されているＰＭＬの診断テストである。それは、９９％の特異性および７０％の選択性を有する。ＣＳＦのＪＣＶ  ＰＣＲ陽性結果がない場合は、脳生検が行われ得る。脳組織中のＪＣＶ  ＤＮＡ検出は、ＰＭＬの陽性診断として用いることができる。生化学的アッセイとしては、所定の位置以外のバリアント分析、ウイルスゲノム分析、特異タンパク質のＥＬＩＳＡ分析、血小板数等が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、当技術分野で日常的に利用される多くの診断プロトコルおよびパラメータを知っているであろう。
【０１９９】
診断はまた、ＪＣＶバリアントの量（ウイルス量）の判定、ならびに試料および／または対象におけるＪＣＶバリアント対ＪＣＶ野生型の比を網羅する。
【０２００】
本発明の方法および／またはキットを用いて、ＪＣＶバリアントへの暴露を示す所定の位置のバリアント（本発明のバリアント）の存在によって示されるように、ＰＭＬに罹患している、およびＰＭＬのリスクがある対象をスクリーニングすることができ、ここで、本発明の１つまたはそれ以上のバリアントの存在は、ＰＭＬのリスクがあることと関連する。ＰＭＬと関連するＪＣＶバリアントに暴露されている、または暴露される疑いがある対象からの試料中の本発明のバリアントを評価することによって、本発明の方法を用いて、ＰＭＬのリスクを診断することができる。
【０２０１】
幾つかの態様においては、本発明は、対象が、ＶＰ１タンパク質中の特定の位置に１つまたはそれ以上のバリアントを有するＪＣＶバリアントに暴露されているかどうかを判定するための様々なアッセイを含む。本発明の方法およびアッセイを用いて、時間経過に伴う、試料およびまたは対象における本発明のバリアントの状態の変化をモニターすることができる。さらに、本発明の方法を用いて、異なる時点で対象から複数の試料を採取することによって、時間経過に伴う、対象に存在するＪＣＶバリアント量をモニターすることができる。故に、本発明の方法を用いて、時間経過に伴う、対象または試料における、本発明のバリアントおよび／またはＪＣＶバリアントの量の変化を試験することができる。これは、ＰＭＬを発症するリスクがあると疑われている対象における変異状態のモニタリングが可能であり、また、ＪＣＶバリアントに暴露されることが知られている対象において定量的モニタリングも可能である。
【０２０２】
ＪＣＶ−ＶＰ１バリアント核酸、ポリペプチド、および抗体の検出
一態様においては、本発明は、生体試料中のＪＣＶバリアントポリペプチドに特異的に結合することができるＪＣＶ−ＶＰ１バリアントポリペプチドおよび／または抗体（またはそれぞれ、本発明のポリペプチドおよび抗体とも称される）の検出のための方法を提供する。ポリペプチドおよび抗体を検出する方法は、当技術分野で周知であり、本発明は、任意の特定の検出方法に限定されない。さらに、本発明のポリペプチドまたは抗体をコードする核酸の検出を通して、ポリペプチドおよび抗体を直接検出することができる。核酸の検出のための方法は、当技術分野で周知であり、限定されない例は、ＰＣＲ、シークエンシング、ハイブリダイゼーション分析、プローブ分析、およびマイクロアレイ分析であり、これらは全て、本発明に包含される。ポリペプチドおよび／または抗体の検出のための方法の限定されない例には、ペプチドシークエンシング、質量分析、および免疫吸着アッセイ（例えば、抗体へのポリペプチドの結合）およびタンパク質アレイが含まれる。
【０２０３】
酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、ポリペプチドを含む様々な抗原の検出のために使用される周知のアッセイである。本発明は、本発明のポリペプチドの存在を検出することができる任意のＥＬＩＳＡ、および試料中の本発明の抗体の存在を検出することができる任意のＥＬＩＳＡを包含する。
【０２０４】
一実施形態においては、ＥＬＩＳＡの第１のステップは、マルチウェルプレートに結合するＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドに対して特異的な一次抗体を提供することを含む。本発明は、マルチウェルプレートに限定されず、抗体は、ビーズおよびスライドガラスを含む任意の表面に固定化され得る。本発明はまた、抗体に限定されず、アプタマー、抗体断片、および小分子を含む任意のペプチド結合部分は、本発明に包含される。本発明は、本発明のポリペプチドの存在の定性的および定量的決定の両方を包含する。一実施形態においては、ウェルは、ウシ血清アルブミンまたはカゼイン等の高濃度の無関連タンパク質を含有する緩衝液を用いて、遮断することができる。遮断ステップは、表面の任意のコーティングされていない領域が、必要に応じて、反応しないタンパク質で占有されることを確実にする。次いで、過剰な遮断剤は、１回またはそれ以上の洗浄によって除去される。幾つかの実施形態においては、ＥＬＩＳＡは、多重アッセイであり、マルチウェルプレートのそれぞれのウェルは、ある特異的なＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドバリアントに対して特異的な抗体を含む。表面が遮断されると、ＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドを含む試料、またはＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドの存在に対して試験すべき試料は、一次抗体と接触させることができ、一次抗体へのＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドの特異的な結合を可能にするのに適した条件下および時間、インキュベートすることが可能である。そのような条件および時間は、例えば、室温で、３〜４時間、または４℃で、１０〜１６時間であり得る。次いで、過剰な試料は、１回またはそれ以上の洗浄によって除去される。次のステップとして、ＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドに対して特異的な二次抗体はまた、一次抗体−ポリペプチド複合体に接触し、二次抗体によってＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドの特異的な結合を可能にするのに適した条件下および時間、インキュベートすることが可能である。そのような条件および時間は、例えば、１〜１０マイクログラム／ｍＬでの抗体、室温で、１〜４時間、４℃で１０〜１６時間であり得る。幾つかの実施形態においては、二次抗体を、蛍光タグ、または代謝酵素に接触させ、結合ＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドの検出を可能にする。代替として、結合ＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドは、標識三次抗体と二次抗体を接触させることによって判定することができる。上記のＥＬＩＳＡは、ＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドが、２つの抗体（一次抗体および二次抗体）の間に挟まれる場合、サンドイッチＥＬＩＳＡとして称される。
【０２０５】
幾つかの実施形態においては、ＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドに対して特異的な抗体の存在が、判定される。本発明は、本発明の抗体の存在の定性的および定量的決定の両方を包含する。抗体の存在の決定は、現在および過去の感染の両方の決定を可能にすることができる。ほとんどの場合、人体は、ＪＣＶタンパク質等の外来ポリペプチドに対して抗体を生じる。ウイルス（例えば、ウイルス核酸）自体がもはや体内に検出されない場合であっても、ウイルスに対する抗体はなお、存在し、それによって、ウイルスへの暴露の指標であり得る。バリアントＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドに対して特異的な抗体を検出するための方法の一実施形態においては、１つまたはそれ以上の固体表面（例えば、マルチウェルプレート、ビーズ、またはスライド）が提供され、それぞれの表面は、固定化した特有のＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドバリアントを有する。
【０２０６】
幾つかの実施形態においては、ＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドバリアントは、ＪＣＶ粒子（例えば、１つまたはそれ以上のバリアントを含み、例えば、アッセイ表面上に固定化される粒子を形成するために自己組織化した、組み換えＶＰ１タンパク質）として固定化される。これらの粒子は、本明細書に記載される１つまたはそれ以上のバリアントを含み得る（例えば、表１Ａ〜１Ｈ、表１７、および／もしくは表１８、および／または本明細書に記載される１つまたはそれ以上の他のバリアントを参照のこと）。
【０２０７】
それぞれのポリペプチドバリアントは、表１Ａ〜１Ｈ、表１７、および／もしくは表１８の１つまたはそれ以上のバリアント、および／または本明細書に記載される１つまたはそれ以上の他のバリアントを含む。複数のペプチドは、１つまたはそれ以上の同じバリアントを網羅し得る。一実施形態においては、ポリペプチドバリアントの組み合わせを固体表面に付着させる。幾つかの実施形態においては、固体表面のマルチウェルプレートを提供し、それぞれのウェルは、１つまたはそれ以上のバリアントを含む。幾つかの実施形態においては、マルチウェルプレートは、ＰＭＬのリスクを示す本明細書に記載される全てのバリアントを網羅するペプチドを有するウェルを含む。本明細書に記載されるＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドバリアントに結合することができる１つまたはそれ以上の抗体を含む、または含む疑いがある試料は、固定化ＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドに結合するための抗体に適した条件下で、固定化ペプチドと接触させる。続いて、結合抗体の存在は、二次抗体の結合を通して検出される。
【０２０８】
本発明のＥＬＩＳＡは、上記の実施形態に限定されないが、競合ＥＬＩＳＡならびに本発明のポリペプチドおよび抗体の検出を可能にするいかなる形態のＥＬＩＳＡも包含する。
【０２０９】
発病、進行、回帰
本発明の方法および／またはキットを用いて、ＰＭＬの発病、進行、および／または回帰の早期指標を提供することによって有用な予後情報を得ることができる。本発明は、例えば、連続する時点で、対象から試料を得ること、および本発明のＪＣＶバリアントへの暴露のためにそのような試料をアッセイすることによって、対象におけるＰＭＬおよび／またはＪＣＶバリアント感染の発病、進行、または回帰をモニターするための方法を含む。対象は、ＰＭＬに罹患している疑いがあり得るか、またはＰＭＬに罹患していないと考えられ得、後者の場合、該試料は、その後の試料との比較のための正常なベースライン値として機能を果たし得る。
【０２１０】
状態の発病は、対象における状態と関連する変化の開始である。そのような変化は、生理的症状によって証明され得る。しかしながら、患者は、臨床的に無症候であり得る。例えば、ＰＭＬおよび／またはＪＣＶ感染の発病後、臨床的症状がその時は明らかではないかもしれないが、対象におけるＰＭＬ関連の病原性変化があり得る期間が続き得る。ＰＭＬの進行は、発病に続き、状態の病原性（例えば、生理的）要素の進展であり、これは、臨床的な症状の増加を特徴とし得るか、または特徴とし得ない。対照的に、ＰＭＬおよび／またはＪＣＶ感染の回帰は、おそらく並行した症状の低減とともに、状態の生理的な特徴の低減を含み得、治療に由来し得るか、または状態の天然の逆転であり得る。ＰＭＬおよび／またはＪＣＶ感染の発病は、対象から得られた試料中の調査された位置のバリアントの変化によって示され得る。例えば、調査された位置のバリアント数が、対象からの第２の、もしくはそれに続く試料においてよりも、対象からの第１の試料において少ない場合、それは、ＰＭＬおよび／またはＪＣＶ感染の発病または進行を示し得る。幾つかの実施形態においては、唯一１つのバリアントの存在が、ＰＭＬの発病または進行を示し得る。幾つかの実施形態においては、該バリアントは、位置１６４である。特定の実施形態においては、位置１６４のバリアントアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ）の出現は、ＰＭＬの発病または進行を示す。幾つかの実施形態においては、ＰＭＬおよび／またはＪＣＶ感染の発病は、ＪＣＶバリアントのウイルス量および／またはＪＣＶ野生型に対するＪＣＶバリアントの比の変化によって示される。幾つかの実施形態においては、ウイルス量の増加は、バリアント数の増加を伴う。
【０２１１】
ＰＭＬおよび／またはＪＣＶ感染の進行および回帰は、一般的に、時間経過に伴い、対象の試料中の調査された位置のバリアント数の増加または減少によって示され得る。例えば、バリアント数が、対象からの第１の試料中に少なく、バリアントレベルの増加が、対象からの第２の、もしくはそれに続く試料に存在すると判定される場合、それは、それぞれ、ＰＭＬおよび／またはＪＣＶ感染の進行を示し得る。バリアント数の増加および減少は共に、それぞれ、ＰＭＬおよび／またはＪＣＶ感染の進行または回帰を示し得ることを認識すべきである。例えば、ある位置のバリアント数は増加し得るが、他の位置のバリアント数は、減少し得、その双方の変化は、ＰＭＬおよび／またはＪＣＶ感染を示す。
【０２１２】
ＰＭＬおよび／またはＪＣＶ感染の進行はまた、ＪＣＶバリアントのウイルス量の増加、またはＪＣＶ野生型に対するＪＣＶバリアントの比の増加によって示され得るが、回帰は、ＪＣＶバリアントのウイルス量の減少、またはＪＣＶ野生型に対するＪＣＶバリアントの比の減少によって示され得る。
【０２１３】
発病、進行、および回帰は、異なる時点で対象から得られた複数の試料をアッセイすることによって判定することができる。例えば、異なる時点で取り込んだ第１群の試料が、ＰＭＬの発病、進行、または回帰を示さないとしても、さらなる試料を採取して、本発明のバリアントについてアッセイし、早期試料と比較して、発病、進行、または回帰が生じているかどうかを判定することができる。幾つかの実施形態においては、さらなる試料は、１つまたはそれ以上の免疫調節剤の投与計画が修正される場合、アッセイされる。
【０２１４】
ＰＭＬ治療のためのアッセイ
また、本発明の方法を用いて、様々な時点で、対象における、ＪＣウイルスのバリアントへの暴露に対する調査によって、ＰＭＬの治療処置の有効性を評価し得る。例えば、バリアントＪＣウイルスへの暴露を示すバリアント数は、治療計画の開始前（癌または前癌状態の予防または治療のいずれか）、治療計画中、および／または治療計画後に得ることができ、故に、対象における該計画の有効性における情報を提供することができる。さらに、ＰＭＬリスクを示すＪＣＶバリアントの存在度はまた、時間経過に伴いモニターすることができる。幾つかの実施形態においては、ＪＣＶバリアントの量（ウイルス量）または野生型ＪＣＶに対するＪＣＶバリアントの比は、対象における該計画の有効性における情報を提供し得る。本発明の方法を用いて、異なる時点で、対象から得られた２つまたはそれ以上の試料中の変異した位置を比較し得る。幾つかの実施形態においては、試料は、対象から得られ、該対象は、ＰＭＬの治療を施され、その後の試料が、対象から得られる。本発明の対象のバリアント、またはＪＣバリアントのウイルス量、またはＪＣＶ野生型に対するＪＣバリアントの比の比較は、異なる時点で、および／または異なる日数において、得られた試料中で判定され、それによって、対象のＰＭＬの状態の測定を提供し、これを用いて、対象における、ＰＭＬおよび／またはＪＣＶ感染の任意の治療の有効性を判定することができる。
【０２１５】
本明細書において使用される、ＰＭＬ治療は、予防および治療処置の両方を包含し、ＰＭＬの予防および治療の両方を包含する。対象は、ＰＭＬのリスクがあると判定されている、または代替として、該対象が、ＰＭＬに罹患し得るため、対象は、ＰＭＬ治療を受けることができる。故に、治療は、ＰＭＬおよび／またはＪＣＶ感染を低減させるか、または完全に排除するか、または悪化するのを予防し得る。本明細書において使用される、「治療の評価」とは、異なる試料時点で、例えば、少なくとも１日おきに、対象から得られた試料中のＪＣＶバリアントへの暴露を示す対象のバリアントレベルまたはＪＣＶバリアントのウイルス量の比較を意味する。幾つかの実施形態においては、対象から第２の試料を得る時間は、対象から第１の試料を得てから少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０分後である。ある実施形態においては、対象から第２の試料を得る時間は、対象から第１の試料を得てから少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３６、４８、７２、９６、１２０時間後、またはそれ以上である。幾つかの実施形態においては、対象から第２の試料を得る時間は、対象から第１の試料を得てから少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６０、９０、１２０、１５０、１８０、３６０日後、またはそれ以上である。
【０２１６】
ＰＭＬの治療
一実施形態においては、ＰＭＬの治療のための治療剤は、抗感染剤である。治療剤は、微生物感染を治療する抗感染剤、例えば、ＣＮＳの感染を治療するのに有効な治療剤であり得る。幾つかの実施形態においては、抗感染剤は、ｓｉＲＮＡであり得る。しかしながら、他の適した抗感染剤が、使用され得る。抗感染剤は、抗ウイルス剤等の抗菌剤であり得る。抗感染剤は、抗真菌財または抗菌剤等のさらなる抗感染剤と組み合わせられ得る。本発明の治療剤は、天然に存在する、または合成分子または化合物であり得る。本発明の方法および組成物に有用な治療剤は、ポリペプチド、化学的、小分子、脂質、核酸、または他の化合物であり得る。
【０２１７】
本発明の方法および組成物において、治療剤（例えば、抗感染剤）として使用することができる核酸の例は、ＰＭＬを含む、ＣＮＳ疾患または障害を予防する、および／または治療するために使用することができる低分子干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、またはアプタマーである。本明細書において使用される、「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」とは、ＲＮＡ分子を産生するために、細胞内で、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の連続的切断に由来し得るＲＮＡ分子を指す。有効なｓｉＲＮＡは、一般的に、１５〜３０ヌクレオチドの長さ、さらに、多くの場合、２０〜２５のヌクレオチドの長さを有する。ｓｉＲＮＡは、動物におけるＲＮＡ干渉中に、対応するｍＲＮＡ標的の破壊を導くために機能する。本発明の方法は、部分的に、バリアントＪＣウイルスと関連するＣＮＳ疾患または障害（例えば、ＣＮＳ感染）を治療するために、ｓｉＲＮＡ分子の投与を含む。幾つかの態様においては、本発明の方法は、ＣＮＳ疾患または状態の治療として、ｓｉＲＮＡおよび／または前駆体ｓｉＲＮＡを含む治療組成物を対象に投与することを含み得る。前駆体ｓｉＲＮＡ分子は、投与後、例えば、酵素Ｄｉｃｅｒによって、大きさを減少させ、所望のｓｉＲＮＡを形成することができる、二本鎖ＲＮＡ分子であり、これにより、ＣＮＳ疾患または状態のＲＮＡｉ治療に対して機能的になる。故に、本発明の方法は、ＣＮＳ疾患または状態を治療するために、ｓｉＲＮＡまたは前駆体ｓｉＲＮＡ分子の投与を含み得る。
【０２１８】
治療の選択
幾つかの実施形態においては、本発明の方法を用いて、ＰＭＬに罹患している、またはＰＭＬのリスクがある対象のための治療を選択するのに役立ち得る。ＰＭＬに対する治療の選択は、ＪＣＶバリアントへの暴露を示すバリアントの判定に基づき得る。治療の選択はまた、試料中のＪＣＶバリアント量（ウイルス量）または野生型ＪＣＶに対するバリアントＪＣＶの比に基づき得る。治療を選択する方法は、既にＰＭＬに対して薬物または治療を受けている対象の治療を評価する、および／または調節するのに有用であり得る。ＪＣＶバリアントへの暴露を示すことが見出されるバリアントに基づいて、対象に対する治療計画を変更するのに適切であり得る。例えば、ＰＭＬまたはＪＣＶの治療を受けたことがあるか、または受けている対象における、ＪＣＶバリアントへの暴露を示す１つまたはそれ以上の位置の変化の検出は、治療計画が、調節すべきであることを示し得る（例えば、投与の用量または頻度、増加した、開始される新規の治療等）。幾つかの実施形態においては、ＪＣＶバリアントのウイルス量、または野生型ＪＣＶに対するバリアントＪＣＶの比の変化は、治療計画が調節されるべきであることを示し得る。幾つかの実施形態においては、対象は、ＰＭＬおよび／またはＪＣＶ感染に対するいかなる現行の治療もなく、ＪＣＶバリアントへの暴露を示す位置のバリアントのモニタリング、および／またはＪＣＶバリアントのウイルス量および／またはＪＣＶ野生型に対するＪＣＶバリアントの比は、ＰＭＬおよび／またはＪＣＶ感染に対する治療の候補として対象を特定し得る。故に、対象は、ＪＣＶバリアントへの暴露の兆候、および／またはＪＣＶバリアントのウイルス量、および／またはＪＣＶ野生型に対するＪＣＶバリアントの比に対するアッセイの結果として、より高いレベルの同じ薬物、または異なる治療法を選択し、これらで治療し得る。
【０２１９】
本発明によれば、一部の対象は、そうでなければ特定の療法での治療を要求するであろう症状がなく、ＪＣＶバリアントへの暴露の兆候の検出および／またはＪＣＶバリアントのウイルス量および／またはＪＣＶ野生型に対するＪＣＶバリアントの比は、対象を治療が必要であるとして特定し得る。これは、ＪＣＶバリアントへの暴露の兆候および／またはＪＣＶバリアントのウイルス量および／またはＪＣＶ野生型に対するＪＣＶバリアントの比を特定するために本発明の方法の使用がない限り、対象は、慣例によれば、本出願の出願日現在で、特定のＰＭＬおよび／またはＪＣＶ感染治療で治療を要求する症状がないことを意味する。
【０２２０】
一態様においては、本発明は、ＰＭＬに対する治療計画に関する決定のための方法を提供する。医師は、本発明の診断アッセイに基づいて少なくとも部分的に、治療法の選択肢の決断を下すことができる。
【０２２１】
免疫調節剤に関する治療
治療を選択する方法は、ＰＭＬまたはＪＣＶ感染を対象にしないが、異なる状態を対象にする治療を受けている対象に有用であり得る。一実施形態においては、該治療は、免疫調節剤を含む治療である。幾つかの実施形態においては、ＰＭＬを発症するリスクがある疑いがある人は、免疫調節剤で治療を受けている人である。
【０２２２】
幾つかの実施形態においては、ＰＭＬを対象にする治療を受けたことがあるか、または受けている対象において、ＪＣＶバリアントへの暴露の１つまたはそれ以上の兆候の変化の検出は、治療計画が、調整されるべきであることを示し得る。幾つかの実施形態においては、免疫調節剤による治療を受けたことがあるか、または受けている対象において、ＪＣＶバリアントへの暴露の１つまたはそれ以上の兆候の変化の検出は、治療計画が、調整されるべきであることを示し得る。幾つかの実施形態においては、免疫調節剤による治療を受けたことがあるか、または受けている対象において、ＪＣＶバリアントのウイルス量または野生型に対するＪＣＶバリアントの比の変化の検出は、治療計画が、調整されるべきであることを示し得る。幾つかの実施形態においては、免疫調節剤による治療を受けたことがあるか、または受けている対象において、ＪＣＶの１つまたはそれ以上の所定のＶＰ１位置の配列変化の検出は、治療計画が、終了されるか、または中断されるべきであることを示し得る。幾つかの実施形態においては、該免疫調節剤は、ナタリズマブである。幾つかの実施形態においては、免疫調節剤による治療を受けたことがあるか、または受けている対象において、ＪＣＶバリアントのウイルス量および／または野生型に対するＪＣＶバリアントの比の増加の検出は、治療計画が、終了されるか、または中断されるべきであることを示し得る。
【０２２３】
一態様においては、本発明は、治療計画の決定のための方法を提供する。医師は、本発明の診断アッセイに基づいて、少なくとも部分的に治療の選択肢を決定することができる。幾つかの実施形態においては、本発明の方法は、免疫抑制剤による適した治療を決定するための診断アッセイを提供する。幾つかの実施形態においては、医師は、本発明の１つまたはそれ以上のＪＣＶ−ＶＰ１の診断アッセイの結果に基づいて、免疫抑制剤による治療を終了するか、または中断することを決定し得る。幾つかの実施形態においては、本発明の方法は、対象が免疫不全をきたした場合、該対象の治療のための診断アッセイを提供する。幾つかの実施形態においては、医師は、本発明のＪＣＶ−ＶＰ１の診断アッセイの結果に基づいて、免疫不全をきたした対象の治療を終了するか、または中断することを決定し得る。
【０２２４】
免疫不全をきたした対象または免疫調節剤による治療を受けている対象
本発明のアッセイは、特に、免疫不全をきたした対象および／または１つまたはそれ以上の免疫調節剤により治療されている対象に有用であり得る。
【０２２５】
対象は、異なる疾患または状態を対象にする１つまたはそれ以上の免疫抑制剤（免疫調節剤とも称される）による治療を受けている場合があり、これには、１つまたはそれ以上の以下の限定されない例を含む：癌、臓器もしくは組織移植、炎症状態もしくは疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、関節炎等、またはその任意の組み合わせ。
【０２２６】
また、対象は、免疫不全をきたした者であり得る。免疫不全をきたした対象の限定されない例は、ＨＩＶ陽性であるか、またはＡＩＤＳもしくはリンパ腫に罹患している、または免疫応答の抑制を生じさせる任意の他の状態を有する、対象である。
【０２２７】
本明細書において使用される、「免疫抑制剤」という用語は、本明細書において治療される対象の免疫系を抑制するか、遮蔽するように作用する物質を指す。免疫抑制剤は、サイトカイン産生を抑制する、自己抗原を下方制御するか、もしくは抑制する、またはＭＨＣ抗原を遮蔽する物質であり得る。このような薬剤の例には、２−アミノ−６−アリール−５−置換ピリミジン（米国特許第４，６６５，０７７号を参照のこと）；非ステロイド抗炎症性薬物（ＮＳＡＩＤ）；ガンシクロビル、タクロリムス、グルココルチコイド、例えばコルチゾールもしくはアルドステロン、抗炎症剤、例えばシクロオキシゲナーゼ阻害剤、５−リポキシゲナーゼ阻害剤、もしくはロイコトリエン受容体アンタゴニスト；プリンアンタゴニスト、例えばアザチオプリンもしくはミコフェノレートモフェチル（ＭＭＦ）；アルキル化剤、例えばシクロホスファミド；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタルアルデヒド（米国特許第４，１２０，６４９号に記載されるように、ＭＨＣ抗原を遮蔽する）；ＭＨＣ抗原およびＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；ステロイド、例えばコルチコステロイドもしくはグルココルチコステロイドまたはグルココルチコイドアナログ、例えばプレドニソン、メチルプレドニソロン、およびデキサメタゾン；ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤、例えばメトトレキセート（経口または皮下）；ヒドロキシクロロキン；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカインまたはサイトカイン受容体アンタゴニスト（抗インターフェロンα抗体、抗インターフェロンβ抗体もしくは抗インターフェロンγ抗体、抗腫瘍壊死因子α抗体（インフリキシマブまたはアダリムマブ）、抗ＴＮＦ−αイムノアヘシン（エタネルセプト）、抗腫瘍壊死因子β抗体、抗インターロイキン２抗体、および抗ＩＬ−２受容体抗体を含む）；抗ＬＦＡ−１抗体（抗ＣＤ１１ａおよび抗ＣＤ１８抗体を含む）；抗ＣＤ２０抗体（例えばリツキシマブ、例えば、商標ＲＩＴＵＸＡＮ下で入手可能）；抗Ｌ３Ｔ４抗体；抗ＶＬＡ−４抗体（例えば、ナタリズマブ、例えば、商標ＴＹＳＡＢＲＩ下で入手可能）；異種抗リンパ球グロブリン；汎Ｔ抗体、例えば抗ＣＤ３抗体もしくは抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ−３結合ドメインを含有する可溶性ペプチド（１９９０年７月２６日に公開されたＷＯ第９０／０８１８７号）；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ−β；ストレプトドルナーゼ；宿主からのＲＮＡもしくはＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ−６１４４３；デオキシスペルグアリン；ラパマイシン；Ｔ細胞受容体（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，１１４，７２１号）；Ｔ細胞受容体断片（Ｏｆｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：４３０４３２（１９９１）；ＷＯ第９０／１１２９４号；Ｉａｎｅｗａｙ，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：４８２（１９８９）；およびＷＯ第９１／０１１３３号）；およびＴ細胞受容体抗体（ＥＰ第３４０，１０９号）、例えばＴ１０Ｂ９が含まれる。しかしながら、他の免疫抑制剤を受けている対象は、診断アッセイに選択され得る、および／または本発明が、本態様に限定されないものとして処理され得る。
【０２２８】
候補治療剤に対するスクリーニング
本発明はまた、ＰＭＬおよび／もしくはＪＣＶ感染を予防するおよび／もしくは治療するための候補治療剤または戦略に対するスクリーニングのための方法も包含する。候補治療剤および戦略の有効性の評価は、対象（例えば、非ヒト動物）において、および培養液からの細胞中の本発明のアッセイを用いて行われ得る。幾つかの実施形態においては、候補治療剤は、ＰＭＬと関連する１つまたはそれ以上のＪＣＶ−ＶＰ１バリアントを含むポリペプチドと相互作用することができる化合物または分子であり得る。幾つかの実施形態においては、候補治療剤は、ＪＣＶ感染に罹患している対象における、ＪＣＶ−ＶＰ１バリアントのパターンおよび数を変化させることができる化合物または分子であり得る。幾つかの実施形態においては、候補治療剤は、試料または対象における、ＪＣＶバリアントの量（ウイルス量）を低下させることができる薬剤である。幾つかの実施形態においては、候補治療剤は、野生型ＪＣＶに対するバリアントＪＣＶの比を低下させることができる薬剤である。幾つかの実施形態においては、候補治療剤は、ＪＣＶ受容体を模倣し、かつＪＣＶ結合に対して競合することができる薬剤（例えば、小分子）である。幾つかの実施形態においては、対象への薬剤の投与、または候補剤もしくは候補治療への試料の暴露は、対象における、ＪＣＶ感染と関連するＪＣＶ−ＶＰ１バリアントのパターンの変化をもたらす。幾つかの実施形態においては、対象への薬剤の投与、または候補剤もしくは候補治療への試料の暴露は、ＪＣＶ感染において、ＰＭＬ関連のＪＣＶ−ＶＰ１バリアント数の変化をもたらす。幾つかの実施形態においては、対象への薬剤の投与、または候補剤もしくは候補治療への試料の暴露は、ＪＣＶバリアントのウイルス量および／またはＪＣＶ野生型に対するＪＣＶバリアントの比の低下をもたらす。
【０２２９】
一実施形態においては、ＪＣＶバリアントを発現する細胞を含む試料が、候補治療剤または治療に暴露される。ＪＣＶバリアントを発現しない、該候補剤に暴露される細胞を含む試料は、対照としての機能を果たす。ＪＣＶバリアントの発現レベル（ウイルス量）は、候補治療剤または治療の投与の際、モニターされ、ＪＣＶバリアントの発現の変化は、候補治療剤による治療が施されなかった試料と比較される。薬剤に暴露されている試料中の本発明のＪＣＶバリアントのウイルス量のレベルが、対照試料と比較して変化がある場合、該薬剤は、候補治療剤または候補治療である。幾つかの実施形態においては、ＪＣＶバリアントは、細胞から発現し、分泌され、候補剤と接触させる。ＪＣＶバリアントに結合することができる任意の候補剤は、候補治療剤である。幾つかの実施形態においては、該候補治療剤は、ＪＣＶバリアントのＶＰ１ポリペプチドに結合する。
【０２３０】
幾つかの実施形態においては、本発明は、ＪＣＶ感染におけるＰＭＬ関連ＶＰ１バリアントの数またはレベルを抑制し、かつＰＭＬのリスクを抑制する、候補治療剤を特定するための方法を提供する。幾つかの実施形態においては、該候補治療剤は、ＰＭＬでもＪＣＶ感染でもない疾患または状態を対象にする。幾つかの実施形態においては、該候補治療剤は、免疫調節剤である。幾つかの実施形態においては、該候補治療剤は、免疫抑制治療に規定されている薬剤である。
【０２３１】
ＪＣＶバリアントの発現レベルを調節する薬剤または治療に対してスクリーニングする方法が、本発明に包含される。スクリーニング法は、細胞もしくは組織と、または対象において、候補剤を混合すること、または細胞もしくは組織もしくは対象を候補治療に暴露すること、およびＪＣＶバリアントのウイルス量をアッセイする方法を用いて、候補剤または治療と接触させる前および後の発現のレベルを判定することを含み得る。対照と比較してＪＣＶバリアントの発現量の低下は、候補剤または治療が、細胞、組織、および／または対象において、ＰＭＬおよび／またはＪＣＶ感染を治療することが可能であることを示す。
【０２３２】
幾つかの実施形態においては、候補剤を試験するためのアッセイ混合物は、候補剤を含む。候補剤は、抗体、小有機化合物、またはポリペプチドであり得、したがって、組み合わせ抗体ライブラリー、組み合わせタンパク質ライブラリー、または有機小分子ライブラリーから選択され得る。通常、様々な濃度に対する異なる反応を得るために、複数の反応混合物を、異なる薬剤濃度で並行して実行する。通常、これらの濃度のうちの１つは、例えば、薬剤のゼロ濃度で、またはアッセイ検出の限度を下回る薬剤の濃度で、陰性対照としての役割を果たす。
【０２３３】
任意の分子または化合物は、候補治療剤であり得る。候補治療剤の限定されない例は、小分子、ｓｉＲＮＡを含むＲＮＡ、アプタマーを含むＤＮＡ、ならびに抗体および抗体断片を含むタンパク質である。本発明はまた、異なる作用モードを有する候補治療剤を包含する。
【０２３４】
候補剤は、多くの化学クラスを包含するが、通常、それらは有機化合物、タンパク質、または抗体（および抗原に結合するその断片）である。幾つかの実施形態においては、該候補剤は、小有機化合物、例えば、５０超で約２５００未満、例えば、約１０００未満、ある実施形態においては、約５００未満の分子量を有するものである。候補剤は、ポリペプチドおよび／または核酸との構造的相互作用に必要な化学官能基を含み、少なくとも１つのアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基を含み得、任意に、少なくとも２つの化学官能基、または少なくとも３つの化学官能基を含み得る。候補剤は、１つまたはそれ以上の上記で特定された官能基により置換されている、環式炭素もしくは複素環構造、および／または芳香族もしくはポリ芳香族構造を含むことができる。候補剤はまた、生体分子、例えば核酸、ポリペプチド、単糖類、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、上記のものの誘導体または構造類似体、またはそれらの込み合わせ等であり得る。
【０２３５】
候補剤は、合成または天然化合物のライブラリーを含む、広範囲の供給源から得られる。例えば、多くの手段は、広範囲の有機化合物および生体分子のランダムおよび定方向合成に利用可能であり、これには、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現、合成有機組み合わせライブラリー、ランダムまたは非ランダムポリペプチドのファージ提示ライブラリー、タンパク質もしくは抗体の組み合わせライブラリー等が含まれる。代替として、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態での天然化合物のライブラリーが利用可能であり、また、容易に産生される。さらに、天然および合成的に産生されたライブラリーおよび化合物を、従来の化学的、物理的、および生化学的手段により容易に修飾することができる。さらに、既知の薬剤を、アクリル化、アルキル化、エステル化、アミド化等の定方向的またランダム化学修飾に供して、薬剤の構造的類似体を産生し得る。
【０２３６】
種々の他の試薬もまた、混合物に含むことができる。これらには、最適なタンパク質−タンパク質および／またはタンパク質−薬剤結合を促進するために用いられ得る、塩、緩衝液、中性タンパク質（例えばアルブミン）、界面活性剤等の試薬を含む。そのような試薬も、反応成分の非特異的またはバックグラウンド相互作用を低下させることができる。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等のアッセイの効率を改善する他の試薬も用いられ得る。
【０２３７】
キット
本発明の幾つかの態様においては、キットが提供される。本発明のキットは、ＰＭＬおよび／もしくはＪＣＶ感染のインビトロでの診断、予防、モニタリング、ＪＣＶバリアントへの暴露、ならびに／または候補治療剤を試験するために用いる、核酸、ポリペプチド、抗体、または本発明の他の分子を含み得る。キットの構成要素は、水性媒質中で、あるいは凍結乾燥された形態のいずれかで包装され得る。ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡアッセイで用いる試薬もまた、ＰＭＬ、ＪＣＶ感染、またはＪＣＶバリアントへの暴露のリスクをアッセイするための手順の一部として共役される中間体の形態または別個の部分としての検出可能な標識薬剤と同様、本発明のキットに含まれ得る。本発明のキットの幾つかの実施形態においては、該キットは、本発明のバリアントの存在を判定するため、および／またはＪＣＶバリアントのウイルス量を判定するための取扱説明書を含み得る。該キットはまた本発明において使用される方法の結果を解釈するために使用することができる対照値（例えば、参照番号）も含み得る。
【０２３８】
本発明のキットは、１つまたはそれ以上のＰＭＬ関連のＶＰ１バリアントを有するＪＣＶバリアントへの暴露の１つまたはそれ以上の兆候を特定するために使用することができる、核酸、抗体、またはポリペプチドを含み得る。幾つかの実施形態においては、キットは、ＪＣＶバリアントへの暴露を示す１つまたはそれ以上のバリアントを含む１つまたはそれ以上のポリペプチドに結合することができる抗体を特定するために、ＥＬＩＳＡの標準の手法を用いる物質を含む。幾つかの実施形態においては、本発明のキットは、ＰＭＬと関連するような、１つまたはそれ以上のバリアントまたは本明細書に記載されるバリアントの組み合わせをコードする核酸に結合し、検出するための核酸構成要素を含み得る。幾つかの実施形態においては、キットは、１つまたはそれ以上のバリアントまたは本発明のバリアントの組み合わせを含む１つまたはそれ以上のポリペプチドに特異的に結合する１つまたはそれ以上の異なる抗体を含み得る。キットはまた、細胞、組織、または対象において、ＪＣＶバリアントの発現またはＪＣＶバリアントへの暴露を判定するために、抗体と共に用いる構成要素を含み得る。
【０２３９】
キットは、試験管、バイアル、フラスコ、瓶、シリンジ等のような、１つまたはそれ以上の容器手段または一連の容器手段を密閉した状態で受けるために区画分けされる担体を含み得る。該キットはまた、対照試料を含み得る。幾つかの実施形態においては、該キットは、アッセイ中の検出された薬剤のレベルが、ＪＣＶ感染への暴露と相関するかどうかを示すかどうかを判定する（例えば、野生型またはバリアントＪＣＶによって）ための取扱説明書等の試験結果を解釈するための取扱説明書を含む。
【０２４０】
生体試料
ＪＣＶバリアントへの暴露についてアッセイするための方法は、任意の適した生体試料において実行され得る。幾つかの実施形態においては、試料は、本明細書に記載されるように、対象から得られ、直接処理され、ＪＣＶの兆候についてアッセイし得る。幾つかの実施形態においては、細胞は、生体試料から単離され、分析前に、培養液中で成長させ得る。本明細書において使用される、対象は、ヒト、または非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、またはげっ歯類を含むが、これらに限定されない、非ヒト動物であり得る。本発明の方法を用いて、まだＰＭＬと診断されていない対象におけるＪＣＶのバリアントへの暴露について、アッセイし得る。本発明の方法を用いて、まだＪＣＶに感染していない対象におけるＪＣＶバリアントアッセイへの暴露について、アッセイし得る。さらに、本発明の方法を、ＰＭＬおよび／またはＪＣＶバリアントによる感染と判断されている対象に、適用し得る。試料は、１つまたはそれ以上の細胞を含み得る。試料は、対象から、または細胞培養に直接起源し得る。試料は、（例えば、細胞溶解物を調製するために）処理され得るか、または本発明の方法に用いる前に、部分的に処理され得る。幾つかの実施形態においては、対象または培養からの試料を、アッセイで用いる核酸またはポリペプチド得るために処理し、本明細書に記載されるＪＣウイルスのバリアントへの暴露を検出し得る。故に、アッセイにおける初期ステップは、ゲノム核酸試料、ならびに／または細胞、組織、および／もしくは他の試料からの他の核酸および／もしくはポリペプチドの単離を含み得る。核酸および／またはポリペプチドの抽出は、洗剤溶解物、超音波照射、および／またはガラスビーズを用いたボルテックス撹拌等の使用が含まれる方法等の当業者によって使用される日常的方法を含む、任意の適した手段によるものであり得る。
【０２４１】
本明細書において使用される、「試料」という用語は、例えば、個人から単離された組織または流体（血漿、血清、脳脊髄液、尿、リンパ液、涙、唾液、および組織切片が含まれるが、これらに限定されない）等の、またはインビトロ細胞培地構成要素からの、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはタンパク質を含む任意の動物性物質を意味する。核酸を含む試料は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、またはデオキシリボ核酸およびリボ核酸のコポリマー、またはこれらの組み合わせを含み得る。ポリペプチドを含む試料は、ペプチドおよび／またはタンパク質を含み得る。幾つかの実施形態においては、該試料は、抗体を含む。試料は、精製（例えば、抽出）および／または他の処理に供され得る。また、「試料」という用語は、「生体試料」を指し得る。
【０２４２】
本明細書において使用される、「生体試料」という用語は、対象の組織、細胞、または構成要素部分（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血、尿、膣液、および精液等を含むが、これらに限定されない体液）を意味し得る。また、「生体試料」は、組織、細胞、もしくは構成要素部分から調製されたホモジネート、溶解物、もしくは抽出物、またはその画分もしくは部分を意味し得、例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、尿、皮膚の外部切片、気道、腸管および尿生殖路、涙、唾液、大便、母乳、血液細胞、腫瘍、器官、ＣＮＳの生検等を含むが、これらに限定されない。
【０２４３】
試料源は、リンパ組織、体液（例えば、血液、リンパ液等）、培養細胞、細胞株、組織学的スライド、パラフィン中の包埋された組織等を含むが、これらに限定されない、組織を含み得る。本明細書において使用される、「組織」という用語は、局在および分散した細胞集団の両方を指し、これには、  脳、心臓、血清、乳房、結腸、膀胱、表皮、皮膚、子宮、前立腺、胃、睾丸、卵巣、すい臓、下垂体、副腎、甲状腺、唾液腺、乳腺、腎臓、肝臓、腸、脾臓、胸腺、骨髄、気管、および肺を含むが、これらに限定されない。生体液は、血液、リンパ液、脳脊髄液、涙、唾液、尿、および便等を含むが、これらに限定されない。浸襲的および非浸襲的技術を用いて、かかる試料を得ることができ、これらは当分野においてよく記録されている。対照試料は、細胞、組織、または、その溶解物を含み得る。幾つかの実施形態においては、対照試料は、ＰＭＬおよび／もしくはＪＣＶバリアントによる感染、またはＪＣＶバリアントへの暴露がない、細胞または対象からの試料であり得る。幾つかの実施形態においては、対照試料は、ＰＭＬに罹患している、および／またはＪＣＶバリアントに暴露されている、細胞または対象からの試料であり得る。幾つかの実施形態においては、対照試料は、野生型ＪＣウイルスを含む試料である。
【０２４４】
ワクチン
本発明はさらに、ＰＭＬ、またはＰＭＬ関連ＪＣＶバリアントによる感染に対して哺乳類に免疫を与えるためのワクチンに関する。ワクチンは、本発明の１つまたはそれ以上のＪＣＶバリアント配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含み得る。幾つかの実施形態においては、ワクチンは、シアル酸結合を低下させることが予測される、本明細書に記載される１つまたはそれ以上のバリアントＪＣＶまたはＪＣＶペプチドを含み得る。幾つかの実施形態においては、ワクチンは、複数の異なるペプチド（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜５０、またはそれ以上）を含み、広範囲の異なるエピトープを提供し得る。幾つかの実施形態においては、該ポリペプチドは、完全長ＪＣＶ−ＶＰ１バリアントポリペプチドである。さらに別の実施形態においては、該ポリペプチドは、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の所定の位置に、少なくとも１つのバリアントアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のバリアントアミノ酸）を有する、本明細書に記載されるポリペプチドからなる群から選択された完全長ＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチド（例えば、図３または表１または２Ｂ、表１７、および／もしくは表１８中の、および／または本明細書に記載される１つまたはそれ以上の他のバリアント）、またはその任意の断片（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１００〜１５０、１５０〜２００のアミノ酸長ポリペプチド、またはさらに長い、短い、もしくは中間の長さのポリペプチド）である。幾つかの実施形態においては、該ポリペプチドは、本発明の１つまたはそれ以上のバリアントアミノ酸を含むＪＣＶ−ＶＰ１タンパク質の断片である。さらなる態様においては、本発明は、少なくとも１つのＪＣＶバリアントポリペプチド、および適した賦形剤、希釈剤、または担体を含む薬学的組成物に関する。幾つかの実施形態においては、ワクチン中のポリペプチドは、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、または約５０個のアミノ酸であるか、またはＪＣＶ−ＶＰ１タンパク質の全長を含む。これらの組成物は、ＰＭＬおよび／またはＰＭＬと関連するＪＣＶバリアントによる感染を予防するまたは治療するのに適している。薬学的組成物を、防御抗体または防御Ｔ細胞応答の生産を刺激するのに有効な量で対象に投与し得る。幾つかの実施形態においては、該ワクチンは、本発明の１つまたはそれ以上のバリアントＪＣＶポリペプチドをコードする核酸を含む核酸ワクチンである。
【０２４５】
「免疫を与える」という用語は、アジュバントの存在下または不在下で、単独の場合または担体に結合した場合のいずれであっても、対象において、物質の体液性および／または細胞性応答を生じる能力を指し、また、病原菌の感染性を一部または完全に遮断する免疫応答を指す。ＰＭＬ「ワクチン」は、ＰＭＬに対する保護を一部または完全に導くことが可能な免疫原性組成物である。ワクチンはまた、ＰＭＬに罹患している対象を治療するのに有用であり得る。ワクチン用の投与計画は、当業者には周知である。幾つかの実施形態においては、ＰＭＬの予防用のポリペプチドワクチンの量の範囲は、０．０１〜１００マイクログラム／用量、例えば、０．１〜５０マイクログラム／用量である。ＰＭＬ、またはＰＭＬと関連するＪＣＶバリアントによる感染に対して、十分な免疫応答およびそれに続く保護を達成するために、対象ごとに、幾つかの用量が、必要とされ得る。
【０２４６】
薬学的に許容される担体は、組成物を受けている個人に対して有害な抗体の産生を、それ自体が誘発しない任意の担体を含む。適した担体は、典型的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー等の大きな、ゆっくりと代謝される巨大分子；および不活性ウイルス粒子である。そのような担体は、当業者によく知られている。
【０２４７】
本発明のポリペプチドワクチンの有効性を増強するために好ましいアジュバントとしては、  水酸化アルミニウム（ａｌｕｍ）、米国特許第４，６０６，９１８号に見出されているＮ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓ−ｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、および、２％スクアレン／トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０エマルジョン中の細菌から抽出された３つの成分、すなわち、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコール酸、および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含有するＲＩＢＩが含まれるが、これらに限定されない。３つの成分ＭＰＬ、ＴＤＭまたはＣＷＳのいずれも、単独で、または、２つずつ組み合わせて用いてもよい。幾つかの実施形態においては、本発明の１つまたはそれ以上のペプチドは、Ｇｏｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．５，ｐｐ４４６５−４４６９に記載される１つまたはそれ以上の技法を用いて、免疫付与のために使用され得、この開示は、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０２４８】
幾つかの実施形態においては、ワクチンは、免疫抑制治療、または免疫系に影響を及ぼし得る（例えば、弱体化させる）任意の他の治療の開始前、または開始と共に、対象に投与することができる。
【０２４９】
抗体
ある実施形態においては、ＪＣＶバリアントへの抗体またはその抗原結合断片はまた、本発明に包含する。抗体は、本明細書に記載される検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）において使用され得る。抗体は、ＰＭＬに罹患している対象を治療するための、および／またはＪＣＶバリアントによる感染を予防する、もしくは減少させるための治療に使用され得る。適した抗体またはその断片は、本明細書に記載される１つまたはそれ以上のＪＣＶバリアントポリペプチドに結合する能力に対して選択され得る。抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、ＩｇＥであり得るか、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥの免疫グロブリン定常および／もしくは可変ドメインを有し得る。幾つかの実施形態においては、該抗体は、二重特異的または多重特異的抗体である。さらなる実施形態においては、該抗体は、組み換え抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、あるいはこれらの混合物である。幾つかの実施形態においては、該抗体は、ヒト抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはモノクローナルおよびポリクローナル抗体の混合物である。抗原結合断片は、ＦＡＢ断片、Ｆ（ＡＢ’）２断片、および／またはＦＶ断片ＣＤＲ３を含み得る。
【０２５０】
抗体は、完全長ＪＣＶ−ＶＰ１タンパク質バリアントに対して、またはＪＣＶ−ＶＰ１タンパク質バリアントの部分配列を含むポリペプチドバリアントに対して生じることができる。動物、例えば、ウサギまたはヤギまたはマウスに注入することによって、抗原（例えば、ＪＣＶ−ＶＰ１バリアントのポリペプチド）を有する抗体を生成することができる。
【０２５１】
ポリクローナル抗体を調製するために、ＪＣＶ−ＶＰ１バリアントを含む融合タンパク質を、適したクローニング媒体中に対応するＤＮＡ配列の発現によって、細菌内で合成することができる。次いで、タンパク質を精製し、担体タンパク質に連結させ、（ウサギによる抗原応答の誘発を補助するために）フロイントアジュバントと混合し、ウサギまたは他の実験動物に注入することができる。代替として、該ポリペプチドは、タンパク質を発現する培養細胞から単離することができる。２週間間隔でブースター注入を行った後、ウサギまたは他の実験動物に瀉血を施し、血清を単離する。血清は、直接使用するか、または例えば、親和性クロマトグラフィー等の方法によって、プロテインＡ−セファロース、抗原セファロース、および抗マウスＩｇ−セファロースを使用する前に精製することができる。次いで、ＪＣＶバリアントポリペプチドを特定するために、ポリアクリルアミドゲルにかけたタンパク質抽出物を検出するために血清を用いることもできる。代替として、合成ＪＣＶバリアントポリペプチドを作製し、使用して、動物に予防接種することができる。
【０２５２】
モノクローナルＪＣＶバリアント抗体を産生するために、マウスに複数回注入し（上記を参照）、マウスの膵臓を摘出し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁する。この膵臓細胞は、リンパ球の供給源としての機能を果たし、その一部は、適切な特異性のある抗体を産生する。次いで、これらを永久増殖性の骨髄腫パートナー細胞と融合させ、ＨＡＴ等の選択性薬剤の存在下において、融合産物を多数の組織培養ウェルに平板培養する。次いで、有用な抗体を発現する細胞を含むウェル特定するために、ＥＬＩＳＡによって、ウェルをスクリーニングする。次いで、これらを新たに平板培養する。一定期間増殖させた後、抗体産生細胞を特定するために、これらのウェルを再びスクリーニングする。９０％を超えるウェルが、抗体産生に関して陽性である単一クローンを含むようになるまで、何回かのクローニング手順を実施する。この手順によって、抗体を産生するためのクローンの安定系列が確立される。次いで、プロテインＡセファロース、イオン交換クロマトグラフィー、ならびにこれらの手法の変形および組み合わせを用いる親和性クロマトグラフィーにより、モノクローナル抗体を精製することができる（例えば、米国特許第６，９９８，４６７号を参照のこと）。
【０２５３】
幾つかの実施形態においては、「ヒト化」抗体が、ヒトにおける治療に使用される。抗体のヒト化は、治療抗体をヒトに導入すると、免疫応答の機会を低減させるように、天然のマウス配列をヒト配列と置き換えることを含む。
【０２５４】
ＣＮＳ感染
ＪＣポリオーマウイルスは、脳およびＣＮＳ（中枢神経系）に感染するウイルスである。ＣＮＳの微生物感染を患っている対象は、ＣＮＳにおいて、バリアントＪＣウイルス感染および／または増殖に感受性があり得る。ＣＮＳの微生物感染としては、細菌、真菌、原生動物、ウイルス様、およびウイルス感染が含まれるが、これらに限定されない。感染には、急性状態および慢性状態の両方が含まれる。例示的な微生物ＣＮＳ感染症は、脳腫瘍、髄膜炎、脳炎、血管炎、または進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）をもたらし得る。ＣＮＳのほとんどの腫瘍を形成する感染症は、血液によって広がり、敗血症および心内膜炎に関連しているが、膿瘻または中耳／乳突部感染から生じる直接感染があり得る。ＣＮＳの細菌感染症には、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、エンテロバクテリアセア、プロピオニバクテリウム属、緑膿菌、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）、インフルエンザ菌、またはリステリア・モノサイトゲネスによる感染が含まれ得るが、これらに限定されない。ＣＮＳの真菌感染症は、細菌感染症ほど一般的ではないが、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に罹患している個人および化学療法または免疫抑制療法を受けているもの等の他の免疫不全をきたした個人に生じ得る。ＣＮＳの原生動物感染症の例は、後期神経トリパノソーマ症、または睡眠病であり、これは、トリパノソーマ原虫によるＣＮＳの感染によって引き起こされる。
【０２５５】
ＣＮＳのウイルス感染症には、無菌性髄膜炎、脳炎、および進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）が含まれ得るが、これらに限定されない。ウイルス感染と関連する急性神経学的症候群には、例えば、急性ウイルス性脳炎、弛緩性麻痺、ウイルス性髄膜炎、および感染後脳脊髄炎が含まれる。急性ウイルス性脳炎は、例えば、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘、狂犬病、またはアルボウイルスによって引き起こされ得る。弛緩性麻痺の一般的なウイルス性因子には、例えば、エンテロウイルス、ムンプスウイルス、およびリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスが含まれる。感染後脳脊髄炎は、例えば、はしか、流行性耳下腺炎、風疹、および一次水痘帯状ヘルペスウイルス感染による感染の合併症である。また、ギランバレー症候群も、ウイルス感染と関連する急性神経学的症候群である。
【０２５６】
ウイルス感染に起因するさらなる慢性神経系疾患には、麻痺、萎縮、および運動失調により特徴付けられる、亜急性硬化性汎脳炎（持続性麻疹感染により生じる）、海綿状脳症（プリオン病）（例えば、クロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・ストロイスラー症候群）、およびレトロウイルスによる疾病（例えば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）が含まれる。
【０２５７】
したがって、本発明の態様を用いて、微生物ＣＮＳ感染の１つまたはそれ以上の症状を有する対象における、ＰＭＬのリスクを評価し得る。
【０２５８】
ＪＣＶバリアントの研究
宿主およびウイルス遺伝学は共に、ＰＭＬに貢献し得る。ウイルス遺伝因子に焦点を当てる先行研究は、ウイルスゲノムの調節領域における複製および再配列を特定した［Ｐｆｉｓｔｅｒ  ＬＡ，Ｌｅｔｖｉｎ  ＮＬ，Ｋｏｒａｌｎｉｋ  ＩＪ（２００１）ＪＣ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｇｉｏｎ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｐｏｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：５６７２−５６７６、Ｍａｊｏｒ  ＥＯ，Ａｍｅｍｉｙａ  Ｋ，Ｔｏｒｎａｔｏｒｅ  ＣＳ，Ｈｏｕｆｆ  ＳＡ，Ｂｅｒｇｅｒ  ＪＲ（１９９２）Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ，ｔｈｅ  ＪＣ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ５：４９−７３、Ｌｏｅｂｅｒ  Ｇ，Ｄｏｒｒｉｅｓ  Ｋ（１９８８）ＤＮＡ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＪＣ  ｓｔｒａｉｎ  ＧＳ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６２：１７３０−１７３５、Ｍａｒｔｉｎ  ＪＤ，Ｋｉｎｇ  ＤＭ，Ｓｌａｕｃｈ  ＪＭ，Ｆｒｉｓｑｕｅ  ＲＪ（１９８５）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ＪＣ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ５３：３０６−３１１、およびＺｈｅｎｇ  ＨＹ，Ｔａｋａｓａｋａ  Ｔ，Ｎｏｄａ  Ｋ，Ｋａｎａｚａｗａ  Ａ，Ｍｏｒｉ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎｅｗ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｕｔｅｒ  ｌｏｏｐｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＪＣ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ｍａｊｏｒ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＶＰ１）ｐｏｓｓｉｂｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８６：２０３５−２０４５］。また、ＰＭＬおよび健常な個人からの非常に限られた試料数による幾つかの研究は、ＰＭＬに罹患しているＶＰ１タンパク質中の幾つかの変異の可能性がある関連性における矛盾した結果を報告した［Ｚｈｅｎｇ  ＨＹ，Ｔａｋａｓａｋａ  Ｔ，Ｎｏｄａ  Ｋ，Ｋａｎａｚａｗａ  Ａ，Ｍｏｒｉ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎｅｗ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｕｔｅｒ  ｌｏｏｐｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＪＣ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ｍａｊｏｒ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＶＰ１）ｐｏｓｓｉｂｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８６：２０３５−２０４５、Ｚｈｅｎｇ  ＨＹ，Ｉｋｅｇａｙａ  Ｈ，Ｔａｋａｓａｋａ  Ｔ，Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ−Ｏｈｎｏ  Ｔ，Ｓａｋｕｒａｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＶＰ１  ｌｏｏｐ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ａｍｏｎｇ  ＪＣ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３３３：９９６−１００２、Ｋａｔｏ  Ａ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  Ｃ，Ｚｈｅｎｇ  ＨＹ，Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｔ，Ｙｏｇｏ  Ｙ（２０００）Ｌａｃｋ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ＪＣ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ．Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １４５：２１７３−２１８２］。ＰＭＬに罹患しているＪＣＶの遺伝子をコードするタンパク質中の変化の関連性の総合的解析は報告されていない。インフルエンザウイルス［Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  Ａ，Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ  Ｋ，Ｒａｍａｎ  Ｒ，Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋａｒａｎ  Ａ，Ｒａｇｕｒａｍ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  １９１８  ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５：２８００−２８０５、およびＣｈａｎｄｒａｓｅｋａｒａｎ  Ａ，Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  Ａ，Ｒａｍａｎ  Ｒ，Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ  Ｋ，Ｒａｇｕｒａｍ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｇｌｙｃａｎ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｈｕｍａｎ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｖｉａｎ  Ｈ５Ｎ１  ｖｉｒｕｓ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６：１０７−１１３］からヒトＪＣＶ類に近親なマウスポリオーマウイルス［Ｂａｕｅｒ  ＰＨ，Ｂｒｏｎｓｏｎ  ＲＴ，Ｆｕｎｇ  ＳＣ，Ｆｒｅｕｎｄ  Ｒ，Ｓｔｅｈｌｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｉｎ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＶＰ１．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６９：７９２５−７９３１、およびＢａｕｅｒ  ＰＨ，Ｃｕｉ  Ｃ，Ｌｉｕ  ＷＲ，Ｓｔｅｈｌｅ  Ｔ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＳＣ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｐｓｅｕｄｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ｓｐｒｅａｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：５８２６−５８３２］に及ぶウイルスの病原性は、シアル化されたグリカン受容体へのウイルスカプシドタンパク質の結合に関与するアミノ酸配列によって決定されることを示した。その細胞受容体におけるウイルスの親和性および特異性の変化は、���イルス感染価および伝染に影響を及ぼし、故に、毒性に重要な役割を果たす。例えば、マウスポリオーマウイルスの研究は、コードされていない調節領域の変化よりもむしろＶＰ１アミノ酸の変化が、ウイルスの増加した病原性に関与することを示した。
【０２５９】
本発明の態様を、ＶＰ１タンパク質に関する実験およびＰＭＬとのその関係によって説明する。分子進化の方法を用いて、ＰＭＬと関連するＶＰ１アミノ酸配列の推定的適応変化の存在を判定した。疾患に罹患している配列バリアントの単純な統計の関連性に伴うこのアプローチの利点は、ウイルス株の系統発生関係を考慮に入れ、また、配列進化の速度を試験することによって、機能的に有意なアミノ酸位置の特定を可能にすることである。
【０２６０】
本発明の態様によれば、置換を含むウイルスは、単離されたＰＭＬ患者のＣＮＳにおいて、そのウイルスが十分豊富である場合、十分に感染性を有する。幾つかの実施形態においては、グリカン特異性の変化により、ＪＣＶが、ＣＮＳの外（例えば、ＲＢＣ）に発現したシアル化グリカンへのその特異性を失わせることが予測される。故に、このようなウイルスは、「擬似受容体」上で捕獲されることを避け、脳に進入するためにウイルス排出の部位から妨げないで移動した。変異したウイルスはなお、乏突起膠細胞上に発現したグリカンへのその特異性を維持しなければならない。これは、ＪＣＶの位置２６９に対してオーソロガスな位置の変異が、ＲＢＣに結合するウイルス能力に影響を及ぼす、マウスポリオーマウイルスモデルからの観察と一致し、また、致死的な転帰を有する動物を通してウイルス伝播の劇的な増加にもつながる［Ｄｕｂｅｎｓｋｙ  ＴＷ，Ｆｒｅｕｎｄ  Ｒ，Ｄａｗｅ  ＣＪ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ  ＴＬ（１９９１）Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ＶＰ１  ｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｒｏｕｔｅ  ｏｆ  ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６５：３４２−３４９、およびＦｒｅｕｎｄ  Ｒ，Ｇａｒｃｅａ  ＲＬ，Ｓａｈｌｉ  Ｒ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ  ＴＬ（１９９１）Ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＶＰ１  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｑｕｅ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ｂｅｈａｖｉｏｒ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６５：３５０−３５５］。さらに、多くの無症候で感染した個人の扁桃腺におけるＪＣＶ検出の幾つかの報告がある［Ｋａｔｏ  Ａ，Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｔ，Ｔａｋａｓａｋａ  Ｔ，Ｔｏｍｉｎａｇａ  Ｔ，Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｃｈｅｔｙｐａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ＪＣ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｔｏｎｓｉｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｏｎｓｉｌｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｔｏｎｓｉｌａｒ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ  １０：２４４−２４９、およびＭｏｎａｃｏ  ＭＣ，Ｊｅｎｓｅｎ  ＰＮ，Ｈｏｕ  Ｊ，Ｄｕｒｈａｍ  ＬＣ，Ｍａｊｏｒ  ＥＯ（１９９８）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＪＣ  ｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｏｎｓｉｌ  ｔｉｓｓｕｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：９９１８−９９２３．］。この観察は、扁桃腺細胞のＪＣＶ感染への支持として取られたが、リンパ様組織中のウイルス捕獲によっても説明することができた。これは、扁桃腺細胞中のシアル酸へのＪＣＶ結合と一致している［Ｅａｓｈ  Ｓ，Ｔａｖａｒｅｓ  Ｒ，Ｓｔｏｐａ  ＥＧ，Ｒｏｂｂｉｎｓ  ＳＨ，Ｂｒｏｓｓａｙ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＪＣ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔｙｐｅ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６４：４１９−４２８���。
【０２６１】
本発明によれば、ＰＭＬに対して特異的な多くの変異を考えると、１つ以上の機構（例えば、２つまたはそれ以上の機構）が、異なるＰＭＬ症例でＰＭＬの病因に影響を与える可能性が高い。本発明の幾つかの態様によれば、ＰＭＬ関連ＶＰ１変異は、乏突起膠細胞中のウイルス感染および複製の増加をもたらす脳白質細胞に対するＪＣＶ向性を増加させ得る。本発明の他の態様によれば、ＰＭＬにおける変異は、ウイルスによる免疫回避を可能にし得る。ＶＰ１分子のみを対象にするポリクローナル免疫応答のうち、細胞受容体結合部位（シアル酸）を対象にする限定された数の抗体は、ウイルス感染の広がりに対する保護を提供し得る。感染防御免疫に不可欠であるエピトープ内のアミノ酸の変異は、ウイルスがその標的細胞に結合し、阻害されていない広がりを可能にさせ得る。
【０２６２】
本明細書に記載される実験は、いかにある変異がＰＭＬに生じ、なぜ、ＪＣＶの非常に高い有病率にもかかわらず、少ない割合の免疫不全患者のみがＰＭＬを発症するかを検討する。本発明の態様によれば、ウイルス系統樹における変異のクラスタリングの不在は、病原性ウイルスバリアントとして一般集団に固執するよりもむしろ、個々の患者に独立して生じることを示唆している。本発明の態様によれば、本明細書に記載される実験に基づいて、ＶＰ１変異は、ＰＭＬ出現の機構に非常に有意な役割を果たす。シアル酸結合に影響を及ぼす特異的変異が生じると、ウイルスを脳に蔓延させ、乏突起膠細胞に感染させる。変異ウイルスが腎臓に検出されなかったという事実は、グリカン結合の変化が、腎臓において、変異ウイルスへの選択的な利点をいずれも提示しなかったことを示唆している。変異は、ＰＭＬの直前またはずっと以前に免疫抑制の条件下で生じ、したがって、ウイルスの脳における滞留を確立させたのかもしれない。無症候の個人の脳において、ウイルス複製が検出されなかったため、ＰＭＬ発症前に、区分化された進化（例えば、中枢神経内）は、ＰＭＬ患者の中枢神経における変異ＶＰ１の存在の主な原因となり得る。しかしながら、正常な脳におけるＪＣＶ潜伏の問題はなお、論議の余地があるため、非変異ウイルスが、脳に進入し、変異が、末梢部、例えば、腎臓ではなく、脳に生じることが正式に起こり得る。
【０２６３】
本発明の態様によれば、健常な免疫系は、脳におけるウイルス活性化を効果的に抑制する。しかしながら、免疫系が、このような変異したウイルスを持つある個人に不足するとすぐに、ウイルスは、ＰＭＬを生じる乏突起膠細胞に積極的に蔓延し始める。また、健常な免疫系が、それらの末梢部位（例えば、腎臓）に新しく展開した変異を効率的に抑制し、新しい標的細胞を拡散させ、感染することを防ぐことが考えられる。故に、ＰＭＬ発症のタイミングは、変異によって限定されるものであり得、環境または宿主遺伝因子との相互作用は、非決定的なＰＭＬの発症に起因し得る。さらに、ＰＭＬの発症は、乏突起膠細胞中のウイルス複製を増加させる、ウイルスのさらなる選択的利点を与え得る場合の、ウイルス調節領域の再配列を含むウイルスのさらなる遺伝子変化とのＶＰ１変異の相互作用によって制御され得る。
【０２６４】
本発明の態様によれば、本明細書に記載される実施例により例示されるように、その受容体特異性に影響を及ぼすＪＣＶ  ＶＰ１変異は、ＰＭＬ病変に関与し得る。これらの結果は、新規の抗ポリオーマウイルス治療薬およびこれらのウイルスによって引き起こされる疾患の診断の発見の機会を提供する。これらの変異が、ＰＭＬの病因、ならびにそれらが生じる経緯と理由に働く明確な役割は、異なる器官（例えば、尿、血液、ＣＳＦ）から、および様々なＰＭＬ患者からの試料に一致する長期的期間のＶＰ１配列分析を含むさらなる広範な調査を必要とする。
【０２６５】
本明細書に記載される、連続的試料からのＶＰ１配列の試験は、疾患の過程を通して同じウイルス株の持続性を示した。変異したウイルスがよく見られる単独集団を提示し、時間経過を伴い維持されたため、感染の伝播に対して必要かつ十分であるように思われる。とりわけ、さらなる置換は、第１のＰＭＬの症状の発現から生存した患者において再発した場合に必要とされた。この観察は、まず、古い変異したウイルスが、中枢神経または末梢神経のいずれかにおいて、効率的に生存し、第２に、新しい置換の参入が、新しいＰＭＬの症状の発現を引き起こし得ることを示唆している。幾つかの実施形態においては、新しく変異したウイルスは、準最適な免疫による制御下で、ウイルス活性化の状況で生じ得、いったん出現すると、免疫系によって直ちに認識され得ない。
【０２６６】
幾つかの実施形態においては、本発明の態様は、ＰＭＬ患者におけるＣＳＦおよび血漿ＶＰ１配列の特定に関する。血漿に単離されたウイルスおよびＣＳＦに単離されたウイルスは共に、この変異が分析から除外されたとしても、同様に、尿に単離されたウイルスとは明確に異なると思われる。これは、ＣＳＦおよび血漿集団が、独立して、尿から生じなかったが、これらの集団の１つは尿集団と同一の源が起源であり、その他は、第一のものが起源であったことを示す。ＰＭＬ遺伝子変異を担持するＶＰ１配列は、ＰＭＬ患者の尿には観察されなかったが、腎臓におけるウイルス複製中、元来得られる変異は、腎臓部位において、優先遺伝子、または検出可能な集団であるように、常在非変異ウイルスにわたっていかなる競争上の優位性も受け取らなかった。これは、ほとんどの変異体ＶＰ１分子から調製されるＶＬＰが、腎臓におけるウイルス感染の部位の腎臓尿細管上皮細胞に結合する能力を失うという観察と一致している。
【０２６７】
本発明の態様によれば、理論により拘束されるものではないが、変異が、受容体を含む１つまたはそれ以上の幅広く存在するシアル酸に対してその特異性を失うようにウイルスを生じる場合、変異体ウイルス（血液循環において）は、野生型ウイルスよりも、末梢における細胞の大部分に発現する多数のシアロ含有オリゴ糖擬似受容体によってトラップされることから免れる可能性が高い。したがって、変異体ウイルスは、脳、または少なくとも血液脳関門（ＢＢＢ）に到達する可能性が高い。ウイルスが、末梢の障害物を擦り抜け、血液脳関門に到達すると、それでも、ウイルスは、内皮細胞層を横断して、中枢神経に達しなければならない。幾つかの実施形態においては、有意な免疫抑制を有する患者においてでさえ、ＰＭＬの極めて稀な発生は、ある変異体ウイルス粒子の出現および血液脳関門開口の存在のような独立した稀な事象の必要とされる一時的な集まりによるものであり得る。
【０２６８】
ＶＰ１タンパク質における変異がウイルスが末梢循環を免れて、ＣＮＳに進入する機会を増加させることによってＰＭＬ進行の一因となるという仮説は、全てのＰＭＬ症例の約１０％が、非変異ウイルスを含むという観察と一致している。故に、ウイルスの擬似受容体の末梢防衛を圧倒し得る高レベルのウイルス血症を考慮し、また、血液脳関門において時間的に一致した開口を考慮すると、非変異体ウイルスでさえも、ＣＮＳに進入し得る。しかしながら、ウイルスが脳に一旦進入すると、乏突起膠細胞に感染し、ＣＮＳに広がるそれらの能力において、変異体と非変異体ウイルスとの間の差異はなく、これは、進行中の脳感染時、ＪＣＶの別の標的の、ＣＮＳ由来の星状膠細胞に結合するための変異体ＶＬＰの保持した能力と一致する。代替として、ＶＰ１変異は、ウイルスが脳を通じて広がる幾つかの競争上の優位性を提供するため、ＣＮＳにおいて優勢になる場合、ＣＮＳにおいてウイルス複製中、生じ得る。分析した試料の大部分は、最終的な仮説が、真実であるためには、変異を含む全ての単離されたクローン、またはそのうちの９５％を超える単離されたクローンを有するため、変異は、脳においてウイルス複製中、非常に早期に生じなければならない。ＶＰ１において変異がないウイルスは、ＣＮＳ細胞に実にうまく感染し得るため、変異を、ＣＮＳ細胞のためにウイルス親和性の獲得によって競争上の優位性を提供しない。さらに、少なくとも場合によっては、患者における免疫抑制の条件下で、ウイルスが、非変異形態において、脳に進入し、ＣＮＳ内のその活性化中、変異を得る可能性は、正式には除外することはできない。
【０２６９】
選択の部位にかかわらず、ＪＣＶ  ＶＰ１置換は、ウイルスＰＭＬ遺伝子の潜在性の鍵であると考えられる。ウイルスカプシドタンパク質および外膜タンパク質は、ウイルス標的細胞および感染へのウイルス付着を媒介するために重要である。故に、インフルエンザＨＡタンパク質における変異は、ウイルスが、シアル酸結合に対するそのわずかな特異性および動物指向性（ｚｏｏｔｒｏｐｉｃ）からヒトへの感染に転換するウイルスの能力を変化させる。同様に、これらの変異の一部は、肺葉の上部の細胞に優先的に発現したシアル酸から肺の下部に発現したシアル酸に特異性を変化させることによって１９１８年のインフルエンザの例によって強調されるように、ヒト集団において、増加したインフルエンザ病原性と関連することを示した。ウイルスが病原性の増加を得ることができた別の機構は、おそらくウイルスが生産的に感染しない細胞上にトラップさせる、その幅広い受容体特異性を失うことによるものである。そのような機構の最も研究が行なわれた例の１つは、別のポリオーマウイルス、マウスにおけるマウスポリオーマウイルス感染の研究に由来する。ＪＣＶの臨界ＰＭＬ遺伝子位置２６９に対して構造的にオーソロガスな位置２９６の変異が、シアル酸に対してウイルス特異性を劇的に変化させ、標的細胞およびＲＢＣに結合するウイルス能力に影響を及ぼし、また、致死的な転帰をもたらす動物を通じてウイルス伝播の増加にもつながる。故に、その受容体へのウイルス結合に影響を及ぼすウイルス被覆タンパク質の変化は、例外でないウイルス病因およびヒトポリオーマウイルスを有する病原性を変化させる重要な役割を担う、極めて一般的な機構であると考えられる。
【０２７０】
幾つかの態様においては、フェニルアニンに対する位置５５および２６９の変異は、対象からの試料中に検出される。他の態様においては、少なくともこれらの変異が検出され、対象が、最も一般的であると考えられることを示し、これらの２つの部位は、強い選択圧のもとにあり、ＰＭＬを引き起こす最も優位であるＪＣウイルスを提供することを示唆している。この観察は、これらの２つの部位での末梢細胞およびオリゴ糖を含むシアル酸へのウイルス結合を無効にする変異の能力と強い相関を持ち、ひいては、特定の機能の喪失が、他の変異よりもさらに頻繁に積極的に選択したウイルスに対して最も有利であることを示唆している。本明細書の他の箇所にさらに詳細に記載されるように、これらの部位のそれぞれは、本研究において、全ての変異の２５％を占め、次に頻度が高い位置２６７、２６５、および６０を有し、それぞれ、全ての症例の７．５％を有する。興味深いことに、何人かの患者からのＣＳＦ試料は、２つまたはそれ以上の異なる集団を含み、それぞれが、同時に、２つのかかる変異を含んだウイルスがないそれ独自のＰＭＬ固有の変異を担持する。したがって、本発明の幾つかの態様は、幾つかの異なる変異は、正常なウイルス複製中、独立して生じ得、それぞれが、ウイルスに、非変異ウイルスを超える競争上の優位性を提供する場合、全ては、選択され得る。３つの症例、または本研究からの全ての症例のうちの約１０％においては、ＰＭＬ関連の置換は、ＣＳＦおよび／または血漿中に見出すことができなかった。例えば、副ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ２またはＶＰ３における変異を含むＪＣＶゲノムの他の遺伝子変化はまた、これらの症例において、ＰＭＬと関連するこれらのウイルスの存在を説明するために、仮説を立てられ得る。
【０２７１】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、決してさらなる制限と解釈されるべきではない。本出願を通じて引用された参照文献（文献参照、交付済み特許、公開特許出願および同時係属特許出願を含む）の全ての全内容は、参照することによって、本明細書に明白に組み込まれる。
【実施例】
【０２７２】
実施例１：ＰＣＲによるＪＣＶバリアントの検出
核酸は、確立されたプロトコルを用いた生体試料（例えば、細胞溶解）から単離される。ウイルスＤＮＡは、ゲノムＤＮＡに組み込まれ得るか、またはより小さい実体としてなお存在しため、ゲノムＤＮＡおよび短いＤＮＡ配列は共に、単離され、ＰＣＲ分析に供される。単離する際、核酸は、ＰＣＲ分析を促進する緩衝液中で再懸濁する。ＰＣＲ分析を促進する緩衝液は、当業者（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ）に知られており、また、ＰＣＲ酵素の製造業者（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）より市販される。ヌクレオチドプライマーは、ＪＣＶ−ＶＰ１遺伝子の増幅をもたらすように設計される。ＰＣＲ増幅は、確立された実験手法であり、ヌクレオチドプライマー、ポリメラーゼ、および単一ヌクレオチド、ならびにポリメラーゼ緩衝液を添加し、アニーリング、増幅、および解離のサイクルにこの混合物を供することを含み、所望のＤＮＡ配列の増幅をもたらす。増幅する際、ＪＣＶ−ＶＰ１遺伝子は、残余ＤＮＡおよび過剰単一ヌクレオチドから分離される。増幅したＪＣＶ−ＶＰ１  ＤＮＡは、配列決定され、得られたヌクレオチド配列は、ペプチド配列に翻訳される。本ペプチド配列は、続いて、バリアントパネルと比較され、どのＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドバリアントが、生体試料中に存在するかを決定する。
【０２７３】
実施例２：ＥＬＩＳＡを用いるＪＣＶバリアントの検出
タンパク質およびペプチドは、標準実験手法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ）を用いて、生体試料から単離される。細胞タンパク質および非細胞成分のタンパク質は、該分析に供される。一アッセイにおいては、該試料は、本発明の１つまたはそれ以上のバリアントを含むＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドの存在について調査される。サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、本発明のＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドに対して特異的な抗体を含むポリペプチドを検出する。該抗体は、ポリクローナル抗体をもたらす本発明のＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドで動物（例えば、ウサギ）に接種することによって生成される。望ましい場合、細胞は、モノクローナル交代を生成するために、接種した動物から採取することができる。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方の生成のための方法は、当技術分野で日常的である。ＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドバリアントに対する抗体は、ウェルまたは表面積当たり１つの抗体型を有する、固体表面（例えば、９６ウェルプレート）上で固定化される。ポリペプチドを含む生体試料をウェルに添加し、固定化した抗体でインキュベートする。試料中に存在する任意のポリペプチドＪＣＶ−ＶＰ１バリアントは、ポリペプチドに対して特異的な抗体に結合する。インキュベーション後、該試料を除去し、固体表面を洗浄し、任意の非結合物質を除去する。次のステップとして、ＪＣＶ−ＶＰ１ペプチドに対して特異的なさらなる抗体をウェルに添加する。抗体のこの第２のアリコートは、「サンドイッチ」を作製する（例えば、固体化した抗体：  ＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチド：第２の抗体）。この第２の抗体は、例えば、ＪＣＶ−ＶＰ１バリアントポリペプチドの検出を可能にする、標識三次抗体を用いて検出することができる。代替として、二次抗体自体は、標識され得る。
【０２７４】
第２のＥＬＩＳＡアッセイにおいては、生体試料は、１つまたはそれ以上のＪＣＶ−ＶＰ１バリアントポリペプチドに対する抗体の存在についてアッセイされる。このアッセイを用いて、対象が、現在、ＪＣＶ−ＶＰ１バリアントに感染しているか、または今までにＪＣＶ−ＶＰ１バリアントに暴露したことがあるかどうかを判定することができる。ＪＣＶ−ＶＰ１バリアントがもはや存在しないとしても、バリアントに対する抗体はなお、生体試料中に存在する場合があり、検出することができる。このＥＬＩＳＡアッセイにおいては、ＪＣＶ−ＶＰ１ポリペプチドを固体表面に付着させ、該生体試料は、これらのポリペプチドでインキュベートされる。これらのポリペプチドに対して特異的な抗体が、生体試料中に存在する場合、それらは、ポリペプチドに結合する。任意の非結合物質を再度除去する。結合抗体の存在は、標識二次抗体を用いて検出される。
【０２７５】
実施例３：ＶＰ１タンパク質の溶媒接触可能表面積組成物の判定
接触可能表面積の計算は、生体分子の三次元座標の知識を必要とする。ＪＣＶ  ＶＰ１ウイルス様粒子のホモロジーモデルは、テンプレート（ＰＤＢ  ＩＤ：  １ＳＶＡ）としてＳＶ４０ウイルス様粒子のＣｏＡ１の構造を用いて構成された。ＭＯＤＥＬＥＲ（Ａ．Ｓａｌｉ  ＆  Ｔ．Ｌ．Ｂｌｕｎｄｅｌｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｂｙ  ｓａｔｉｓｆａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐａｔｉａｌ  ｒｅｓｔｒａｉｎｔｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４，７７９−８１５，１９９３）アルゴリズムをモデル構築のために使用し、ＳＣＷＲＬ３（Ａ．Ａ．Ｃａｎｕｔｅｓｃｕ，Ａ．Ａ．Ｓｈｅｌｅｎｋｏｖ，ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．Ｄｕｎｂｒａｃｋ，Ｊｒ．Ａ  ｇｒａｐｈ  ｔｈｅｏｒｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２，２００１−２０１４（２００３））アプローチを側鎖位置の精密化のために使用した。アミノ酸側鎖の極性および非極性の溶媒接触可能表面積は、Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓの方法（Ｂ．Ｌｅｅ  Ｂ  ＆  Ｆ．Ｍ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ．Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ：Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｃ  Ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ５５，３７９−４００（１９７１））を用いて計算した。続いて、ＪＣＶ−ＶＰ１バリアントのウイルス様粒子の３Ｄモデルが構成され、それらの側鎖の極性および非極性の溶媒接触可能表面積が、続いて、計算された。バリアント上の極性の表面積の差異は、アミノ酸側鎖ごとの基準で、バリアントの極性の溶媒接触可能表面積からコンセンサス配列の極性の溶媒接触可能表面積を差し引くことによって計算された。バリアント上の非極性の表面積の差異は、アミノ酸側鎖ごとの基準で、バリアントの非極性の溶媒接触可能表面積からコンセンサス配列の非極性の溶媒接触可能表面積を差し引くことによって計算された。計算結果を表３に示す。
【０２７６】
【表３】
2012517017.tif 000013
実施例４：ＪＣＶ配列の配列分析
ＰＭＬは、ＪＣウイルス感染および感受性がある個人の複数の脳病巣における感染した乏突起膠細胞の崩壊によって引き起こされる進行性のほとんど致命的な脱髄疾患である。ＪＣウイルスは、ヒト集団に高度に蔓延しているが、ＰＭＬは、ＨＩＶ（ＡＩＤＳ）または免疫抑制薬によって影響を受けるものを含む、免疫不全をきたしたわずかな比率の個人にのみが排他的に患う稀な疾患である。ウイルスの蔓延と低い疾患発生率との間の非常に大きな相違を説明する、特定ウイルスおよび／または宿主固有の因子と単に免疫状態ではない何かが働いているに違いない。本発明によれば、ＪＣウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１の表面上の幾つかのアミノ酸は、ＰＭＬ患者から単離されるウイルス配列において加速進化を示すが、健常な対象から単離される配列においては示さない。本明細書に記載される例は、これらの変異の少なくとも一部が、ＪＣウイルスに対して知られている受容体である、シアル酸の結合に関与するという有力な証拠を提供する。分子進化の統計的方法を用いて、ＰＭＬ患者から単離した５５のＪＣウイルスＶＰ１配列および健常な個人の尿から単離した２５３配列の総合的解析を行い、ＰＭＬのＶＰ１配列のみに見出されるアミノ酸のサブセットは、適応進化を介して得られることが見出された。ＪＣウイルスカプシドの三次元構造のモデリングは、これらの残基が、細胞感染に対するＪＣウイルス受容体のシアル酸結合部位内に位置することを示した。受容体結合のこれらの部位の一部の関与は、これらの変異を担持するＶＰ１タンパク質からなるウイルス様粒子の血球凝集特性の著しい低下を示すことによって実証された。同時に、これらの結果は、ＪＣウイルスの表現型を生じるさらなる悪性のＰＭＬが、その細胞受容体に対してウイルス特異性を変化させる適応進化を介して得られることを示す。
【０２７７】
方法：
ＰＭＬ患者から単離したＪＣウイルスの３５完全長ＶＰ１配列および健常な対象から単離したＪＣウイルスの２５３完全長ＶＰ１配列を、Ｇｅｎｂａｎｋからダウンロードした。さらに、位置４３〜２８７の計５５の配列の分析を可能にする２０の不完全ＶＰ１配列を、Ｇｅｎｂａｎｋから入手した。ＰＭＬ患者から単離したこれらの５５  ＶＰ１配列に加えて、表４はまた、Ｓａｌａらによる公開から入手できる１２以上の部分配列を含む［Ｓａｌａ  Ｍ，Ｖａｒｔａｎｉａｎ  ＪＰ，Ｋｏｕｓｉｇｎｉａｎ  Ｐ，Ｄｅｌｆｒａｉｓｓｙ  ＪＦ，Ｔａｏｕｆｉｋ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＪＣ  ｖｉｒｕｓ  ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｏｃｉ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８２：８９９−９０７．］。これらの例において、ＰＭＬ患者から単離した全てのウイルス試料は、腎臓から単離された１例を除いて、脳またはＣＳＦ組織が起源であることに留意すべきである（表４）。健常な対象から単離した全てのウイルス試料は、尿が起源であった。複数の配列アラインメントは、ＴＣｏｆｆｅｅを用いて構成された［Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ  Ｃ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ，Ｈｅｒｉｎｇａ  Ｊ（２０００）Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅ：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｆａｓｔ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０２：２０５−２１７］。多くのＰＭＬ配列は、同じ個人から単離された。ウイルス配列の進化の研究において、同じ患者の単離配列が、それらが１以上のヌクレオチドで互いに異なる限り、分析に対して認められた。しかしながら、同一の「クローン」配列は、分析から除外された。これにより、ＰＭＬ患者から単離した２８の完全長ＶＰ１配列および４２の部分ＶＰ１配列の最終セットを得た。配列の複製起点およびクローンにおける全ての情報を表４に含む。系統樹は、Ｆ８４置換モデル［Ｋｉｓｈｉｎｏ  Ｈ，Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｍ（１９８９）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｅｓｔｉｍａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｔｒｅｅ  ｔｏｐｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｏｒｄｅｒ  ｉｎ  ｈｏｍｉｎｏｉｄｅａ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２９：１７０−１７９およびＦｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ  Ｊ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  ＧＡ（１９９６）Ａ  Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｍｏｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  １３：９３−１０４．］を用いた、ＰｈｙＭＬ最尤法［Ｇｕｉｎｄｏｎ  Ｓ，Ｇａｓｃｕｅｌ  Ｏ（２００３）Ａ  ｓｉ��ｐｌｅ，  ｆａｓｔ，ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｔｏ  ｅｓｔｉｍａｔｅ  ｌａｒｇｅ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｅｓ  ｂｙ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ．Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  ５２：６９６−７０４］を用い、ＰＨＹＬＩＰパッケージ（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．２００５．ＰＨＹＬＩＰ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．６．Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｕｔｈｏｒ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ）を含む幾つかの方法を用いて、構築した。ＰＭＬ患者から単離したＶＰ１配列および健常な対象から単離した配列のランダムサブセットを、さらに、ＰＡＭＬ［Ｙａｎｇ  Ｚ（１９９７）ＰＡＭＬ：ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ．Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  １３：５５５−５５６］を用いて分析した。複数の配列進化のモデル（Ｍ０〜Ｍ８）が、調べられた。尤度比検定を用いて、モデルＭ１とＭ２との間の差異を評価し、正の選択について検定した。完全長または部分的セットのいずれかの分析において、事後確率が０．５を超えるＢａｙｅｓ  Ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  Ｂａｙｅｓを有する残基が表５に報告される。Ｓｐｉｄｅｒｍｏｎｋｅｙ［Ｐｏｏｎ  ＡＦ，Ｌｅｗｉｓ  ＦＩ，Ｆｒｏｓｔ  ＳＤ，Ｋｏｓａｋｏｖｓｋｙ  Ｐｏｎｄ  ＳＬ（２００８）Ｓｐｉｄｅｒｍｏｎｋｅｙ：ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏ−ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｂａｙｅｓｉａｎ  ｇｒａｐｈｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２４：１９４９−１９５０］を用いて、エピスタシス相互作用を分析した。Ｓｐｉｄｅｒｍｏｎｋｅｙは、Ｄａｔａｍｏｎｋｅｙのウェブサーバーを通して起動された［Ｐｏｎｄ  ＳＬ，Ｆｒｏｓｔ  ＳＤ（２００５）Ｄａｔａｍｏｎｋｅｙ：ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｏｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｃｏｄｏｎ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１：２５３１−２５３３］。
【０２７８】
【表４−１】
2012517017.tif 000014
【表４−２】
2012517017.tif 000015
【表４−３】
2012517017.tif 000016
結果：
ＪＣＶ  ＶＰ１遺伝子配列をＧｅｎＢａｎｋからダウンロードし（表４）、それを用いて、健常な個人から単離した配列および明確に異なるＰＭＬ患者から単離した完全長配列のランダムサブセットに対する系統樹を構築した（図４ａ）。図４は、ＰＭＬ関連ウイルスの系統的分布を示す。（Ａ）ＰＭＬを生じるＪＣウイルスの広範な系統的分布。ＰＭＬを生じるウイルスおよび健常な対象から単離したウイルスに対応する系図の枝（ＧＩ番号によって表示される）を示す。系図は、最尤法を用いて、ＶＰ１遺伝子のＤＮＡ配列に基づいて構築される。患者当たり１つの配列のみを含んだ。（Ｂ）コドン２６９の変異の系統的分布。系図は、ＰＭＬ患者から単離したウイルスのＶＰ１遺伝子（ＧＩ番号によって表示される）を示す。Ｓｅｒ２６９コドンの変異は、テキストの挿入によって示される。枝上の丸は、ＬＲＴサポートを反映する。このコドンの変異を有する枝の誘引を避けるために、系図を構築する前に、位置２６９を遮蔽した。Ｆ８４置換モデル［Ｋｉｓｈｉｎｏ  Ｈ，Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｍ（１９８９）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｅｓｔｉｍａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｔｒｅｅ  ｔｏｐｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｏｒｄｅｒ  ｉｎ  ｈｏｍｉｎｏｉｄｅａ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２９：１７０−１７９およびＦｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ  Ｊ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  ＧＡ（１９９６）Ａ  Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｍｏｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  １３：９３−１０４］を用いた、ＰｈｙＭＬ最尤法［Ｇｕｉｎｄｏｎ  Ｓ，Ｇａｓｃｕｅｌ  Ｏ（２００３）Ａ  ｓｉｍｐｌｅ，ｆａｓｔ，ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｔｏ  ｅｓｔｉｍａｔｅ  ｌａｒｇｅ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｅｓ  ｂｙ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ．Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  ５２：６９６−７０４．］を用いた。ＰＨＹＬＩＰパッケージ最尤法に組み込まれた幾つかの方法の適用、系統発生的再構成の距離に基づいた方法、および最節約原理に基づいた方法により、同様の結果を得た。ＰＭＬ患者から単離したウイルス配列は、系統樹にクラスター化せず、試料のウイルス型および地理的起源の中で広く分布している（図４ａ）。これは、さらに、非常に低い集団の階層化測定ＦＳＴによって支持される［Ｓｌａｔｋｉｎ  Ｍ，Ｍａｄｄｉｓｏｎ  ＷＰ（１９９０）Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｅｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２６：２４９−２６０］（１．８％）。先行研究［Ｚｈｅｎｇ  ＨＹ，Ｔａｋａｓａｋａ  Ｔ，Ｎｏｄａ  Ｋ，Ｋａｎａｚａｗａ  Ａ，Ｍｏｒｉ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎｅｗ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｕｔｅｒ  ｌｏｏｐｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＪＣ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ｍａｊｏｒ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＶＰ１）ｐｏｓｓｉｂｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉ���ｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８６：２０３５−２０４５、Ｊｏｂｅｓ  ＤＶ，Ｃｈｉｍａ  ＳＣ，Ｒｙｓｃｈｋｅｗｉｔｓｃｈ  ＣＦ，Ｓｔｏｎｅｒ  ＧＬ（１９９８）Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ２２  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＪＣ  ｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７９（Ｐｔ  １０）：２４９１−２４９８、およびＡｇｏｓｔｉｎｉ  ＨＴ，Ｄｅｃｋｈｕｔ  Ａ，Ｊｏｂｅｓ  ＤＶ，Ｇｉｒｏｎｅｓ  Ｒ，Ｓｃｈｌｕｎｃｋ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ＪＣ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  Ｅａｓｔ，Ｃｅｎｔｒａｌ  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ  Ｅｕｒｏｐｅ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８２：１２２１−１３３１］に一致して、ＰＭＬを生じるウイルスは、特異的なウイルス系統発生型に限定されない。
【０２７９】
ＰＭＬ患者から単離されたウイルスからの配列は、ＰＭＬ関連の進化論的な選択圧が、ウイルスＶＰ１遺伝子に作用しているかどうかを判定する目的で、健常な対象からのものと同様に使用した。この分析は、正の選択下で進化するコドンの存在を特定するように設計されたＰＡＭＬパッケージ［Ｙａｎｇ  Ｚ（１９９７）ＰＡＭＬ：ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ．Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  １３：５５５−５５６］を使用した。ＰＡＭＬは、パラメータの尤度比検定を用いて複数の進化モデルを評価する。中立進化のモデル、純化（例えば、負の）選択が可能なほぼ中立進化のモデル、ならびに幾つかのコドン位置を正の選択下で進化させる、および他のコドン位置を負の選択下でまたは中立的に進化させる異種モデルを含む幾つかのモデルを検定した（表５）。多くのさらに複雑なモデルも検査した。
【０２８０】
健常な対象から単離されたＪＣＶからのＶＰ１配列の場合、中立的に進化するコドンと純化選択下のコドンの混合物を伴うほぼ中立進化のモデルは、純粋な中立モデルよりも明らかに効率が良い（ｐ値７．０×１０−６）。しかしながら、正の選択を有するモデルを含むさらに複雑なモデルに対する統計的支援は見出されなかった。対照的に、ＰＭＬ患者から単離されたＶＰ１配列については、コドンを正の選択下で進化させることにより、モデル尤度の極めて有意な増加を得た（表５）。純化選択下で進化する部位、中立部位、および正の選択下の部位を含む部位の３つのカテゴリーを有するモデルは、中立部位および純化選択下での部位にのみ限定されるほぼ中立のモデルよりも有意に良好なデータを説明した（ｐ値２．５×１０−７）。さらに複雑なモデルは、コドンの３つのカテゴリーを有する最も単純なモデルを超える有意な改善を示さなかった。
【０２８１】
４つのコドン位置（アミノ酸５５、６０、２６７、および２６９に対応する）が、完全長配列のＰＭＬ試料標本中の正の選択下で進化するとして特定された（表５）。ＰＡＭＬによって計算された正の選択に対するベイズの事後確率（Ｂａｙｅｓｉａｎ  ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）は、これらのコドン位置において０．５を超えた。コドン２６９の正の選択に対する事後確率は、１近くであった。分析の力を増加させるために、部分ＶＰ１配列をＰＭＬ患者から単離されたＪＣウイルスに追加した。部分配列の追加は、コドン２６５の正の選択のシグナルを示した（表５）。
【０２８２】
【表５】
2012517017.tif 000017
この例においては、２つのＶＰ１変異は、同じＪＣＶ単離株には観察されなかった。Ｓｐｉｄｅｒｍｏｎｋｅｙ［Ｐｏｏｎ  ＡＦ，Ｌｅｗｉｓ  ＦＩ，Ｆｒｏｓｔ  ＳＤ，Ｋｏｓａｋｏｖｓｋｙ  Ｐｏｎｄ  ＳＬ（２００８）Ｓｐｉｄｅｒｍｏｎｋｅｙ：ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏ−ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｂａｙｅｓｉａｎ  ｇｒａｐｈｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２４：１９４９−１９５０］の方法による分析は、位置５５と２６９との間および位置６０と２６９との間にエピスタシス相互作用を示した（それぞれ、事後確率０．８８および０．７０を有する）。これは、「収穫逓減」エピスタシス相互作用に反映し得、例えば、その後の変異は、有益ではなく、単一の変異のバックグラウンドにとって有害になる可能性がある。
【０２８３】
これらの５つのコドンの全ての置換は、明らかにＰＭＬと関連する。ＰＭＬ患者から単離されたＪＣウイルスの少なくとも５２％（または部分配列を含む、６９の配列のうちの３６の配列）は、これらの変異の少なくとも１つを有するのに対して、これらの置換は、健常な対象からの２５３の完全長ウイルス配列には、観察されなかった（表６）。
【０２８４】
【表６】
2012517017.tif 000018
濃い陰影付けでハイライト表示した残基は、ＰＭＬ群と非ＰＭＬ群の間で明確に異なり、正の選択に対して、０．５を越えるＢａｙｅｓ  Ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  Ｂａｙｅｓの事後確率を有する（表５）。薄い陰影付けでハイライト表示した残基は、ＰＭＬ群と非ＰＭＬ群の間で明確に異なる。
【０２８５】
ＰＭＬ試料中の正の選択の最も強いシグナルは、位置２６９のアミノ酸をコードするコドンに対して検出された。図４ｂは、芳香族残基フェニルアラニンおよびチロシンへのＳｅｒ２６９の複数の独立した変異は、ＰＭＬ関連ウイルスからのＶＰ１に観察されたことを示す。複数の独立した変異の存在は、変異バリアントの系統が、ブートストラップ分析の９０％を超える支援およびＰｈｙＭＬ［Ｇｕｉｎｄｏｎ  Ｓ，Ｇａｓｃｕｅｌ  Ｏ（２００３）Ａ  ｓｉｍｐｌｅ，ｆａｓｔ，ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｔｏ  ｅｓｔｉｍａｔｅ  ｌａｒｇｅ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｅｓ  ｂｙ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ．Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  ５２：６９６−７０４］により実施される尤度比検定の支援を有する複数の分岐によって分離されるため、系統発生的再構成のアーチファクトではない。これらの系統は、ＪＣウイルスの異なる、以前に特定された、系統発生型に対応し、多様な地理的位置のものである［Ｊｏｂｅｓ  ＤＶ，Ｃｈｉｍａ  ＳＣ，Ｒｙｓｃｈｋｅｗｉｔｓｃｈ  ＣＦ，Ｓｔｏｎｅｒ  ＧＬ（１９９８）Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ２２  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＪＣ  ｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７９（Ｐｔ１０）：２４９１−２４９８およびＡｇｏｓｔｉｎｉ  ＨＴ，Ｄｅｃｋｈｕｔ  Ａ，Ｊｏｂｅｓ  ＤＶ，Ｇｉｒｏｎｅｓ  Ｒ，Ｓｃｈｌｕｎｃｋ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ＪＣ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  Ｅａｓｔ，Ｃｅｎｔｒａｌ  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ  Ｅｕｒｏｐｅ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８２：１２２１−１３３１］。
【０２８６】
ＰＭＬ患者から単離されたＶＰ１配列および健常な対象から単離された配列のランダムサブセットは、さらに、ＰＡＭＬ［Ｙａｎｇ  Ｚ（１９９７）ＰＡＭＬ：ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ．Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  １３：５５５−５５６］を用いて分析された。
【０２８７】
純粋な中立モデル（Ｍ０）、ほぼ中立なモデル（Ｍ１）、正の選択を有するモデル（Ｍ２）、およびさらに複雑なモデル（Ｍ３〜Ｍ８）を含むＰＡＭＬに組み込まれる配列進化の複数のモデルを検査した。尤度比検定（ＬＲＴ）を用いて、モデルＭ１とＭ２との間の差異を比較し、正の選択について検定した。３つのデータセットにおける、正の選択に対するＰ値を、それぞれのコドン位置に対するベイズの事後確率と共に示す。０．５を越えるＢａｙｅｓ  Ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  Ｂａｙｅｓの事後確率を有する残基を示す。
【０２８８】
実施例５：シアル酸結合部位に集合する特定された変異
方法：
ＪＣＶ  ＶＰ１タンパク質の五量体単位の相同モデルは、テンプレートとして、ＭＰｙＶ  ＶＰ１（タンパク質データバンクＩＤ：１ＶＰＳ［Ｓｔｅｈｌｅ  Ｔ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＳＣ（１９９７）Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＶＰ１−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｅｍｂｏ  Ｊ  １６：５１３９−５１４８］の構造を用いて、ＭＯＤＥＬＥＲ［Ｓａｌｉ  Ａ，Ｂｌｕｎｄｅｌｌ  ＴＬ（１９９３）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｂｙ  ｓａｔｉｓｆａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐａｔｉａｌ  ｒｅｓｔｒａｉｎｔｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３４：７７９−８１５］と共に構築された。ＮｅｕＮＡｃ−（α２，３）−Ｇａｌ−（β１，３）−［（α２，６）−ＮｅｕＮＡｃ］−Ｇｌｃ−ＮＡｃ四糖類のモデルは、ＭＰｙＶ  ＶＰ１［Ｓｔｅｈｌｅ  Ｔ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＳＣ（１９９７）Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＶＰ１−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｅｍｂｏ  Ｊ  １６：５１３９−５１４８］に結合したＮｅｕＮＡｃ−（α２，３）−Ｇａｌ−（β１，３）−［（α２，６）−ＮｅｕＮＡｃ］−Ｇｌｃ−ＮＡｃの構造に基づいて構築された。ＪＣＶ  ＶＰ１／ＮｅｕＮＡｃ−（α２，３）−Ｇａｌ−（β１，３）−［（α２，６）−ＮｅｕＮＡｃ］−Ｇｌｃ−ＮＡｃ四糖類のモデルは、ＣＨＡＲＭＭ［Ｂｒｏｏｋｓ  ＢＲ，Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ  ＲＥ，Ｏｌａｆｓｏｎ  ＢＤ，Ｓｔａｔｅｓ  ＤＪ，Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）ＣＨＡＲＭＭ：Ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｅｒｇｙ，ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４：１８７−２１７］において、広範囲に精密化され、ＰｙＭＯＬ可視化ソフトウェア（Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（２００２）ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ．ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）を用いて分析された。
【０２８９】
結果：
本発明の態様によれば、５つの特定されたアミノ酸位置の機能的な役割は、ＭＰｙＶ  ＶＰ１／オリゴ糖複合体［Ｓｔｅｈｌｅ  Ｔ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＳＣ（１９９７）Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＶＰ１−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｅｍｂｏ  Ｊ  １６：５１３９−５１４８］の結晶構造に基づくＮｅｕＮＡｃ−（α２，３）−Ｇａｌ−（β１，３）−［（α２，６）−ＮｅｕＮＡｃ］−Ｇｌｃ−ＮＡｃ四糖類に結合したＪＣウイルスＶＰ１の三次元構造の分子モデルを構成することによって評価することができる。図５ａに示される構造モデルは、全てのＰＡＭＬを特定したアミノ酸が、シアル酸結合部位でＶＰ１タンパク質の表面上にクラスター化され、シアル酸結合に関与する可能性があることを示唆している。図５は、ＪＣＶ  ＶＰ１／ＮｅｕＮＡｃ−（α２，３）−Ｇａｌ−（β１，３）−［（α２，６）−ＮｅｕＮＡｃ］−Ｇｌｃ−ＮＡｃ四糖類複合体の構造モデルである。（Ａ）ＮｅｕＮＡｃ−（α２，３）−Ｇａｌ−（β１，３）−［（α２，６）−ＮｅｕＮＡｃ］−Ｇｌｃ−ＮＡｃ四糖類と複合したＪＣＶ  ＶＰ１塩基性五量体のモデル。ＪＣＶ  ＶＰ１の５つの鎖の表面を示す。中心的なシアル酸の結合に必須のＲＧモチーフを示す。ＰＡＭＬによって確認されるＰＭＬ関連の変異残基（Ｌ５５、Ｋ６０、Ｓ２６５、Ｓ２６７、Ｓ２６９）を示す。ＰＭＬに単離された試料に特有のさらなる変異（Ｓ６１、Ｄ６６、Ｓ１２３、Ｈ１２９、Ｖ２２３、およびＱ２７１）も示す。（Ｂ）ＮｅｕＮＡｃ−（α２，３）−Ｇａｌ−（β１，３）−［（α２，６）−ＮｅｕＮＡｃ］−Ｇｌｃ−ＮＡｃ四糖類／ＪＣＶ  ＶＰ１複合体のクローズアップ写真。ＪＣＶ  ＶＰ１のＳ２６９と同等であることが予想されるＭＰｙＶ  ＶＰ１のＶ２９６の位置をメッシュで示す。さらに、幾つかの実施形態においては、Ｌ５５Ｆ、Ｋ６０Ｍ、Ｓ２６７Ｆ、およびＳ２６９Ｆ置換は、相互作用の親和性の低下をもたらすモデル化単糖類で立体的衝突を誘発し得る。シアル酸への親和性は、インフルエンザウイルス、マウスポリオーマウイルス、およびマウス微小ウイルスの複数の研究において、ウイルス病原性に関連した［Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  Ａ，Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ  Ｋ，Ｒａｍａｎ  Ｒ，Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋａｒａｎ  Ａ，Ｒａｇｕｒａｍ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  １９１８  ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５：２８００−２８０５、Ｂａｕｅｒ  ＰＨ，Ｃｕｉ  Ｃ，Ｌｉｕ  ＷＲ，Ｓｔｅｈｌｅ  Ｔ．，Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＳＣ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｐｓｅｕｄｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ｓｐｒｅａｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：５８２６−５８３２、およびＮａｍ  ＨＪ，Ｇｕｒｄａ−Ｗｈｉｔａｋｅｒ  Ｂ，Ｇａｎ  ＷＹ，Ｉｌａｒｉａ  Ｓ，ＭｃＫｅｎｎａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ｍｉｎｕｔｅ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：２５６７０−２５６７７］。特に、ＪＣウイルスに近親のマウスポリオーマウイルスの病原性が、本研究におけるＰＭＬを生じるウイルス単離体中で最も強力な正の選択のシグナルを示したヒトＪＣウイルスにおける位置２６９に対してオーソロガスな位置である、位置２９６［Ｂａｕｅｒ  ＰＨ，Ｂｒｏｎｓｏｎ  ＲＴ，Ｆｕｎｇ  ＳＣ，Ｆｒｅｕｎｄ  Ｒ，Ｓｔｅｈｌｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｉｎ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＶＰ１．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６９：７９２５−７９３１］のＶＰ１アミノ酸置換にマップされた。図５ｂに示されるように、ヒトＪＣウイルスのシリン２６９およびマウスポリオーマウイルスのバリン２９６は、シアル酸結合ポケットの同一の位置を占める。
【０２９０】
位置６１、６６、１２３、１２９、２２３、および２７１は全て、ＰＭＬ試料に限定され（表６）、シアル酸結合ポケットとぴったり合う（図５ｂ）。それらの残基は、小規模な試料サイズのため、ＰＡＭＬ分析によって検出されず、ＰＭＬの発症は、症例の大部分においてシアル酸結合に関与するアミノ酸に対する正の選択を伴うことが見込まれる。分析の系統樹の長さが短く、ひいては、正の選択を検出するための力を制限する［Ａｎｉｓｉｍｏｖａ  Ｍ，Ｂｉｅｌａｗｓｋｉ  ＪＰ，Ｙａｎｇ  Ｚ（２００１）Ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  ｐｏｗｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｒａｔｉｏ  ｔｅｓｔ  ｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  １８：１５８５−１５９２  ａｎｄ  Ａｎｉｓｉｍｏｖａ  Ｍ，Ｂｉｅｌａｗｓｋｉ  ＪＰ，Ｙａｎｇ  Ｚ（２００２）Ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  ｐｏｗｅｒ  ｏｆ  ｂａｙｅｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｉｔｅｓ  ｕｎｄｅｒ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  １９：９５０−９５８］。短い系図を用いた正の選択を検出するための尤度比検定は、保守的であり［Ａｎｉｓｉｍｏｖａ  Ｍ，Ｂｉｅｌａｗｓｋｉ  ＪＰ，Ｙａｎｇ  Ｚ（２００１）Ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  ｐｏｗｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｒａｔｉｏ  ｔｅｓｔ  ｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  １８：１５８５−１５９２］、Ｂａｙｅｓ  Ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  Ｂａｙｅｓ分析は、制限された力しかない［Ａｎｉｓｉｍｏｖａ  Ｍ，Ｂｉｅｌａｗｓｋｉ  ＪＰ，Ｙａｎｇ  Ｚ（２００２）Ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  ｐｏｗｅｒ  ｏｆ  ｂａｙｅｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｉｔｅｓ  ｕｎｄｅｒ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  １９：９５０−９５８］。故に、さらなるＰＭＬに特異的なＶＰ１変異も正に選択することができる。残基１０７の変異はまた、ＰＭＬ試料中にのみ見出される。しかしながら、それは、ＰＡＭＬによる正の選択の証拠を示さず、シアル酸結合ポケットに位置しない。
【０２９１】
実施例６：ＪＣＶ変異体およびシアル酸結合
方法：血球凝集アッセイおよびウイルス様粒子
血球凝集アッセイは、前述のように行われた［Ｃｈａｐａｇａｉｎ  ＭＬ，Ｎｇｕｙｅｎ  Ｔ，Ｂｕｉ  Ｔ，Ｖｅｒｍａ  Ｓ，Ｎｅｒｕｒｋａｒ  ＶＲ（２００６）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＪＣ．Ｖｉｒｏｌ  Ｊ  ３：３およびＰａｄｇｅｔｔ  ＢＬ，Ｗａｌｋｅｒ  ＤＬ（１９７３）Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒａ  ａｇａｉｎｓｔ  ＪＣ  ｖｉｒｕｓ，ａｎ  ｉｓｏｌａｔｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １２７：４６７−４７０］。簡潔に述べると、ヒトＯ型血液を２回洗浄し、約０．５％の最終濃度で、Ａｌｓｅｖｅｒ液（２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、７２ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  グルコース、酢酸でｐＨ６．５に調整）中で懸濁した。ＶＬＰの連続２倍希釈液をＡｌｓｅｖｅｒ液中に調製し、等量のＲＢＣを９６ウェル「Ｕ」底マイクロタイタプレートのそれぞれのウェルに添加し、４℃で３〜６時間インキュベートした。最低ＨＡ濃度は、ＲＢＣをさらに凝集したＶＬＰタンパク質の最低濃度である。
【０２９２】
ＪＣウイルス株ＢＡＥ００１１７、ＡＡＴ０９８３１、およびＡＡＱ８８２６４からＶＰ１タンパク質をコードする遺伝子が、合成的に作製され、ＳＦ９細胞中のバキュロウイルス発現のｐＦＡＳＴＢＡＣバキュロウイルス発現系への移動のためにＧａｔｅｗａｙ  ｐＤＥＳＴ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）シャトルベクターにクローン化された。５リットルの培養液からの約１００グラムの凍結細胞ペレットからＶＬＰの精製を実施した。細胞は、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する５００ｍＬのＰＢＳ中で再懸濁した。細胞懸濁液をＭｉｃｒｏｆｕｉｄｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒに２回通過させることによって、細胞を分離する。細胞残屑を、８０００ＸＧで１５分間沈殿させることによって除去した。上清の容量をＰＢＳ／ＣａＣｌ２を用いて７２０ｍＬに調整し、５ｍＬ  ４０％  スクロースクッション上にロードした。ウイルス様粒子は、ＳＷ２８ローターにおいて、１００，０００ＸＧで５時間、スクロースクッションを通して２回沈殿させた。ＶＬＰ沈殿物をＰＢＳ／ＣａＣｌ２中で再懸濁し、３７℃で１時間、０．２５％  デオキシコール酸塩で処理し、続いて、４℃で１時間、４Ｍ  ＮａＣｌ／０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２を添加した。沈殿した物質を、８０００ＸＧで１５分間の遠心分離により除去した。得られた上清を濃縮し、Ｐｅｌｉｃｏｎ−２５００，０００ＭＷＣＯ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して限外濾過することによって緩衝液交換を行った。濃縮したＶＬＰを、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ）の２５〜４０％  ステップ勾配の中心に適用し、タイプ５０．２ローターにおいて、１９０，０００ｇで１７時間バンド化した。ＶＬＰバンドを収集し、次いで、濃縮し、３００，０００ＭＷＣＯ膜を用いてＡｍｉｃｏｎ撹拌細胞中で緩衝液交換を行った。ＶＬＰの性質をゲル電気泳動法および電子顕微鏡法によって判定した（図６）。タンパク質濃度をＭｉｃｒｏ  ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって判定した。ハーバードメディカルスクールの細胞生物学部で電子顕微鏡法を行った。ＶＬＰ試料は、炭素グリッド上に置かれ、水で簡単に洗浄し、酢酸ウラニルで陰性に染色し、乾燥させた。グリッドを、視察し、Ｔｅｃｈｎａｉ  Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ  ＴＥＭ上に画像化した。
【０２９３】
結果：
これらの置換が、ＶＰ１カプシドによってシアル酸結合において果たす役割を実験的に検証するために、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、異なる天然に存在するウイルスによってコードされるＶＰ１タンパク質から組み換え技術によって産生された。ＶＬＰは、ＰＡＭＬによって特定された正の選択の２つの最も強いシグナル、位置２６９のフェニルアラニン（Ｆ２６９）を有するものと、位置５５のフェニルアラニン（Ｆ５５）を有する別のもののうちの１つによるウイルスＶＰ１配列をコードする置換から生成された。対照として使用された２つの異なるＶＰ１遺伝子は、特定されたＰＭＬ関連変異の、健常な対象からのもの（ＷＴ）およびＰＭＬ患者からの別のもの（Ｍａｄ−１）のいずれも持たない（表７）。
【０２９４】
【表７】
2012517017.tif 000019
赤血球（ＲＢＣ）のウイルス赤血球凝集は、ポリオーマウイルスによるシアル酸結合の信頼性のある測定であることが示されている［Ｆｒｅｕｎｄ  Ｒ，Ｇａｒｃｅａ  ＲＬ，Ｓａｈｌｉ  Ｒ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ  ＴＬ（１９９１）Ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＶＰ１  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｑｕｅ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ｂｅｈａｖｉｏｒ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６５：３５０−３５５  ａｎｄ  Ｌｉｕ  ＣＫ，Ｗｅｉ  Ｇ，Ａｔｗｏｏｄ  ＷＪ（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＪＣ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ａｌｐｈａ（２−６）−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：４６４３−４６４９］。血球凝集アッセイにおいて、全て４つのＶＬＰを検定した。際立って、Ｆ５５およびＦ２６９バリアントは共に、いずれの対照ＶＬＰよりも８０００倍以上低いＨＡ活性を示した（表７Ａ）。具体的に、Ｆ５５バリアントは、検定した最高濃度の２００μｇ／ｍＬでさえ、ヒトＯ型ＲＢＣを完全に凝集できずＦ２６９バリアントは、２５μｇ／ｍＬを超える濃度で血球凝集を生じた場合、非常に低いＨＡ活性を示した。同時に、Ｌ５５およびＳ２６９を担持するバリアント（ＷＴおよびＭａｄ−１）は、対応して、０．３７５ｎｇ／ｍＬおよび６．２５ｎｇ／ｍＬまで下がった濃度で、ＲＢＣの血球凝集を生じた。この例において、Ｆ５５変異は、その対応する野生型バリアント（ＷＴ）との単一のアミノ酸差異を有する。したがって、血球凝集の変化は、このアミノ酸置換に特異的に起因し得る。位置２６９の変化に加えて、Ｆ２６９変異バリアントは、その対応する対照バリアント（Ｍａｄ−１）とは異なる２つのさらなるアミノ酸位置を有する。それらのアミノ酸変化は共に、ＰＭＬ特異的ではなく、血球凝集の差異を説明する可能性は低い。Ｍａｄ−１単離は、ＰＭＬ患者が起源であるが［Ｐａｄｇｅｔｔ  ＢＬ，Ｗａｌｋｅｒ  ＤＬ，ＺｕＲｈｅｉｎ  ＧＭ，Ｅｃｋｒｏａｄｅ  ＲＪ，Ｄｅｓｓｅｌ  ＢＨ（１９７１）Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｐｏｖａ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｃｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ．Ｌａｎｃｅｔ  １：１２５７−１２６０］、それは、ＲＢＣを血球凝集する能力とうまく相関するＰＭＬ特異的変異のいずれも含んでいない。このＰＭＬ単離におけるＰＭＬ遺伝子変異の欠如は、ＶＰ１変異がＰＭＬ発症をもたらす唯一の機構ではないことを示唆している。
【０２９５】
【表７Ａ】
2012517017.tif 000020
２００μｇ／ｍＬから開始するＶＬＰの連続希釈液を用いて、材料および方法に記載されるように、血球凝集を行った。ＶＬＰをＯ型ＲＢＣに添加し、４℃で３時間インキュベートした。凝集は、懸濁液からのＲＢＣの沈降によって形成される丸い沈殿物の欠如によって可視化される。Ｅ５５は、位置５５にフェニルアラニンを有するＶＰ１バリアント（ＡＡＴ０９８３１）であり、Ｆ２６９は、位置２６９にフェニルアラニンを有するＶＰ１バリアント（ＢＡＥ００１１）である。野生型（ＡＡＱ８８２６４）およびＭａｄ−１（Ｐ０３０８９）は、それぞれ、位置５５にロイシンおよび位置２６９にセリンを有するＶＰ１バリアントである。
【０２９６】
タンパク質配列は、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて整列され、残りの配列とは少なくとも１つの配列が異なるアミノ酸を、示されたそれらの位置で示す。
【０２９７】
実施例７：変異型ＪＣＶは、ガングリオシドへの減少した結合を有する。
【０２９８】
ガングリオシドＥＬＩＳＡ：
メタノール中の１ｍｇ／ｍＬで、以下のガングリオシドを調製した：アシアロＧＭ１（ヒト）、モノシアロＧＭ１（ヒト）、ＧＭ２（ヒト）、ＧＭ３（ウシ）、ＧＭ４（ヒト）、ジシアロＧＤ１ａ（ウシ）、ＧＤ１ｂ（ヒト）、ＧＤ２（ヒト）、ＧＤ３（ウシ）、トリシアロＧＴ１ｂ（ウシ）。Ａｍｅｒｉｃａｎ  ＲａｄｉｏＣｈｅｍｉｃａｌｓから購入されたＧＭ２を除いて、全てのガングリオシドをＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。
【０２９９】
ガングリオシドを、メタノール中で０．１ｍｇ／ｍＬまで希釈し、０．１ｍＬ／ウェルのＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ９０１８）を添加し、このメタノールを一晩蒸発させた。翌日、このプレートを、０．２５ｍＬ／ウェル  Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を有する１×ＰＢＳ、１％  ＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて、１時間遮断した。次いで、このプレートは、氷上に移動させ、全ての間接的なインキュベーションを＋４℃で行った。
【０３００】
ＶＬＰを、遮断緩衝液中０．０３ｍｇ／ｍＬで調製し、この緩衝液をプレートから除去し、ＶＬＰを０．１ｍＬ／ウェル添加した。このプレートを、氷上で６０〜９０分間インキュベートした。抗ＪＣＶ  ＶＰ１（クローンＰＡＢ５９７）を、遮断緩衝液中０．００２ｍｇ／ｍＬで調製した。このプレートを、０．２５ｍＬ／ウェルの遮断緩衝液で洗浄し、抗ＶＰ１を０．１ｍＬ／ウェル添加した。このプレートを、氷上で４５〜６０分間インキュベートした。ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、遮断緩衝液中１：５，０００に調製した。このプレートを洗浄し、０．１ｍＬ／ウェルのＨＲＰ抗マウスを添加した。このプレートを、氷上で３０分間インキュベートした。このプレートを洗浄し、０．１ｍＬ  １−Ｓｔｅｐ  Ｔｕｒｂｏ  ＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ）で展開させた。色の展開をモニターし、０．１ｍＬ  ２Ｎ  Ｈ３ＰＯ４を添加して、反応を停止させた。次いで、プレートを、４５０ｎｍで、分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で読み取った。
【０３０１】
それぞれのガングリオシドは、対照ウェル（ＨＲＰ抗マウスＩｇＧのみ、ＰＡＢ５９７およびＨＲＰ抗マウスＩｇＧ）を有した。バックグラウンド対照は、ＨＲＰ抗マウスＩｇＧのみを表す。それぞれの実験用ウェルは、式（実験用−バックグラウンド）／バックグラウンドを用いて計算された。
【０３０２】
野生型ＪＣＶの結合は、種々のガングリオシドに対して評価された。図７は、野生型ＪＣＶが幾つかのグリカンに結合するが、全てには結合しないことを示す。選択されたガングリオシドの構造を図８に示し、野生型ＪＣＶに結合するそれらの能力を示す。
【０３０３】
図９は、Ｆ５５変異およびＦ２６９変異が、Ｎｅｕ５Ａｃα（２−３）およびα（２−６）グリカンに結合することができないことを示す。選択されたガングリオシドの構造を図１０に示し、変異型ＪＣＶに結合するそれらの能力を示す。
【０３０４】
図１１は、選択されたガングリオシドに結合するＪＣＶに対するＷＴおよび変異の能力を比較する。
【０３０５】
実施例８：変異型ＪＣＶは、グリア細胞株に結合するが、リンパ球に結合しない。
【０３０６】
ＶＬＰ染色のフローサイトメトリー分析；
以下の細胞を使用した：ＳＶＧ−Ａ（Ｗａｌｔｅｒ  Ａｔｗｏｏｄからの贈答品）、ドナーからの単離された末梢単核細胞。Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて、付着細胞を剥離し、回収し、洗浄した。静脈血を健常なドナーから採血し、ＰＭＢＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）における遠心分離を伴う標準プロトコルを用いて単離した。
【０３０７】
全ての染色は、カルシウムおよびマグネシウム、１％  ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、２ｍＭ  アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ緩衝液中の氷上で行われた。
【０３０８】
細胞（１〜５×１０５細胞／試料）を、０．０５ｍＬの総容量のＦＡＣＳ緩衝液中に希釈された１０μｇ／ｍＬ  ＶＬＰで、９６Ｖ型底ウェルプレート中で、氷上で６０〜９０分間インキュベートした。細胞を、０．１５ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、２０００ｒｐｍ（約８００ｘｇ）で５分間遠心分離を行った。ＶＬＰ結合は、０．０５ｍＬ中の０．００２ｍｇ／ｍＬで４５〜６０分間、抗ＪＣＶ  ＶＰ１（クローンＰＡＢ５９７）で細胞を染色することによって検出し、続いて、洗浄ステップ、およびさらに３０〜４５分間０．０５ｍＬ／試料中で１：１００に希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による検出が続いた。細胞を洗浄し、０．０５ｍＬ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ）で１５〜２５分間固定し、洗浄し、０．２ｍＬ  ＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁した。該試料をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ上で分析した。
【０３０９】
変異型ＪＣＶ（２６９Ｆ）は、リンパ球に結合しない。しかしながら、変異体ＪＶＣはなお、グリア細胞株に結合することができる（図１２）。野生型ＪＣＶおよび陰性対照も示す。
【０３１０】
実施例９：変異特異的抗ＪＣＶ抗体の生成
抗ＪＣＶ  ＶＰ１血清を生成するウサギの免疫付与のために、ＰＢＳ緩衝液中のウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形態で、０．５ｍｇのＶＰ１タンパク質は、ウサギの背部に１０のスポット（．０５ｍｇ／スポット）に皮下注射した。一次免疫は、２週間間隔で、２回のブーストが続き、この後、血清を収集し、抗ＶＰ１活性についてアッセイした。
【０３１１】
競合ＥＬＩＳＡによる抗変異型ＪＣＶ抗体の検出：
Ａ：２６９Ｆ−ＶＬＰの免疫性を与えられたウサギからの抗血清または抗野生型−ＭＡＤ１の免疫性を与えられたＶＬＰウサギの血清は、１００ｕｇ／ｍＬの野生型−ＭＡＤ１−ＶＬＰを用いて、または用いずにプレインキュベートされ、次いで、２６９Ｆ−ＶＬＰで被覆されたプレートでインキュベートされた。ペルオキシダーゼでコンジュゲートした抗ウサギを用いて、結合抗体を示した。
【０３１２】
Ｂ：５５Ｆ−ＶＬＰの免疫性を与えられたウサギからの抗血清または抗野生型の免疫性を与えられたＶＬＰウサギの血清は、１００ｕｇ／ｍＬの野生型−ＶＬＰを用いて、または用いずにプレインキュベートされ、次いで、５５Ｆ−ＶＬＰで被覆されたプレートでインキュベートされた。ペルオキシダーゼでコンジュゲートした抗ウサギを用いて、結合抗体を示した。
【０３１３】
ウサギは、変異型ＪＣＶに対して特異的な抗体の生成をもたらすＦ２６９およびＦ５５  ＪＣＶ変異ＶＰ１  ＶＬＰで注射した。競合ＥＬＩＳＡは、変異特異的ＪＣＶ抗体が、野生型ＪＣＶ抗体と区別することができることを示した（図１３）。アッセイ構造を図１４に例示する。抗体は、プレート上に捕獲された変異ＶＬＰ（Ｆ５５あるいはＦ２６９）に結合する。非変異ＶＬＰと、分子の「骨格」に対して行なわれる全ての抗体を吸収する競合を行い、プレートに結合させるために、変異エピトープに対抗する抗体（試料中にそのようなものが存在する場合）のみをプレートに結合させ、検出するように残した。
【０３１４】
また、変異型ＪＣＶ−ＶＬＰに結合するそれらの能力について、変異型ＪＣＶおよび野生型ＪＣＶ抗体を比較した。ＥＬＩＳＡプレートを、Ｆ２６９およびＦ５５変異型ＪＣＶポリペプチドで被覆し、野生型ＪＣＶ抗体および変異型ＪＣＶ抗体をプレートに付加した（図１５および１６）。変異抗体および野生型ＪＣＶ抗体は、被覆されたＥＬＩＳＡプレートに結合する。野生型ＪＣＶ（ＪＣＶ−４７１およびＪＣＶ−ＭＡＤ１）の付加により、野生型ＪＣＶ抗体の結合の消失をもたらしたが、変異抗体は、ＥＬＩＳＡプレートに結合したままであった。さらに、ＪＣＶウイルスの付加により、結合野生型抗体の消失をもたらしたが、変異抗体は、ＥＬＩＳＡプレートに結合したままであった。
【０３１５】
実施例１０：一部の患者における、ウイルス免疫回避機構としてのＪＣＶ−ＶＰ１変異
ＶＰ１タンパク質中に２６９Ｆ変異を担持する患者からの血清および抗野生型−ＭＡＤ１の免疫性を与えられたＶＬＰウサギ血清（陽性対照として）は、１００μｇ／ｍＬの野生型−ＭＡＤ１−ＶＬＰを用いて、または用いずにプレインキュベートされ、次いで、２６９Ｆ−ＶＬＰで被覆されたプレートでインキュベートされた。被覆された２６９Ｆ変異ＶＬＰに結合する抗体を検出するために、ペルオキシダーゼでコンジュゲートした抗ヒトまたはウサギ抗体を用いて、結合抗体を示した。
【０３１６】
図１７は、Ｆ２６９変異ウイルスを有する患者が、野生型ウイルスに対して抗体応答を生じるが、Ｆ２６９変異ウイルスに対して生じないことを示す。
【０３１７】
図１８は、（上）非変異ＶＬＰを用いて免疫性を与えられたウサギは、変異することができた部位（この場合、Ｓ２６９）への抗体をもたらすことを示す。この場合、幾つかの相違があるスライド１６（上記の挿入）における概略図と同様に、実験を行い、変異ＶＬＰの代わりに、非変異ＶＬＰをプレート上に被覆し、血清中の抗体結合は、変異（Ｆ５５あるいはＦ２６９）タンパク質）と競合するため、非変異ＡＡエピトープへの抗体のみが、プレートに結合したままであった。（下）健常な志願者の試料を用いた同じ実験を示す。表８中の結果は、何人かの異なる志願者の試料を用いた同様の実験に基づく。表８は、ＰＭＬを患っていない人が、ＰＭＬ変異に対する抗体を有し得ることを示す。これは、シアル酸結合部位における幾つかの残基に対して特異的な抗体を担持する人もいれば（例えば、患者２９は、Ｌ５５およびＳ２６９への抗体を有する）、１つの部位、Ｌ５５またはＳ２６９に対してのみ抗体を有する人もおり、さらにはいずれの部位に対する抗体を有さない人もいるということを示す。本発明の態様によれば、シアル酸結合部位の残基に対して抗体を有さない、またはこれらの残基にのみ抗体を有する個人は、中和抗体からの保護が少ないため、ＪＣＶ回避変異に対してより弱い可能性がある。
【０３１８】
【表８】
2012517017.tif 000021
実施例１１：進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）に罹患している患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）および血漿からのＪＣウイルス（ＪＣＶ）ＶＰ１は、シアル酸結合に関与するアミノ酸残基の特異的変異を担持する。
【０３１９】
本明細書に記載されるように、ＰＭＬは、現在、ＡＩＤＳ関連の２番目に多い死因である。他の日和見感染とは違って、それは、長期成功的治療の開始直後、またはその治療中のいずれか、ＨＡＡＲＴ治療を行なった患者にも生じる。一次感染後、原因物質のＪＣＶは、尿道中に持続性の良性感染を起こし、健常な人の３０％において、尿に排出される。ＪＣＶ再活性化およびＰＭＬをもたらす機構は、はっきりしないが、主要なＪＣＶカプシドタンパク質のＶＰ１が、細胞のシアル酸残基との結合を通して、細胞への進入に関与することが知られており、最近、ＶＰ１アミノ酸置換が、ＰＭＬにおいて報告されている。
【０３２０】
全ＪＣＶ−ＶＰ１領域を増幅し、クローン化（試料当たり２〜４８のクローン、平均２３）し、２６人のＰＭＬ患者（ＨＩＶ感染に罹患する２０人）のＣＳＦ、ならびに１１対の血漿および６対の尿試料から配列決定した。９人の患者からの、連続的ＣＳＦ（ｎ＝７）または血漿（ｎ＝２）試料も分析された。ＪＣＶ  ＤＮＡは、リアルタイムＰＣＲによって測定された。三次元モデリングを用いて、ＶＰ１構造上の変異をマッピングした。
【０３２１】
ＤＮＡ抽出およびＶＰ１増幅：
ＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ  Ｂｌｏｏｄキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、２００μＬのＣＳＦ、血漿、または尿から抽出し、最終容量の５０μＬに溶出した。
全ＪＣＶ−ＶＰ１領域を、以下のプライマーを用いて、入れ子ＰＣＲによって増幅した。
アウター（２０２７ｂｐ）
ＶＰ１−ＬＦ  ＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＡＴＧＧＣＴＴＴＡＣ    （配列番号５５）
ＶＰ１−ＬＲ  ＧＣＴＧＣＣＡＴＴＣＡＴＧＡＧＡＧＧＡＴ    （配列番号５６）
インナー（１２３３ｂｐ）
ＶＰ１−ＳＦ  ＣＣＴＣＡＡＴＧＧＡＴＧＴＴＧＣＣＴＴＴ    （配列番号５７）
ＶＰ１−ＳＲ  ＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＴ            （配列番号５８）
ＰＣＲ反応混合物は、５μＬの１０×ＰＣＲ緩衝液、４ｍＭのそれぞれのｄＮＴＰ、０．７μＭのプライマーＶＰ１−ＬＦおよびＶＰ１−ＬＲ（第１ラウンド）およびプライマーＶＰ１−ＳＦおよびＶＰ１−ＳＲ（第２ラウンド）、１．２５ユニットのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＨＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および総容量の５０μＬで１μＬの抽出されたＤＮＡから構成された。サイクルパラメータは、自動化温度サイクリング（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、（第１ラウンドおよび第２ラウンドの両方に対して）９４℃で２０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の３０サイクルであった。
【０３２２】
アウタープライマーを用いた第１の増幅後、２．５μＬの増幅した産物を第１の反応混合物から第２の反応混合物に移した。インナープライマーを用いて増幅した後、１０μＬの第２の混合物からの増幅した産物を、０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲル上で電気泳動させた。その結果を、紫外線照明下で写真に撮り、期待されたｂｐ長のＤＮＡ断片に対応する帯が存在する場合、陽性と見なされた。
【０３２３】
ＶＰ１  ＰＣＲクローン作成：
増幅産物をＱｉａｇｅｎ精製キットで精製した。Ａのもの
を、Ｔａｑポリメラーゼ（Ａ−オーバーハング反応）によって除去したｃｌｅａｎｅｄ  ｕｐ  ＰＣＲ産物の末端に添加し、クローニングは、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行なった。クローン化したＶＰ１  ＰＣＲ産物を含有するコロニーからのＭｉｎｉ−ｐｒｅｐ  ＤＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を調製した。
【０３２４】
ＶＰ１の配列決定：
２〜４８のクローンを、それぞれの試料（中央値２３）に対して配列決定した。ＶＰ１配列の翻訳後、アミノ酸変異は、ＰＭＬおよび非ＰＭＬの症例からのＶＰ１配列の大規模な選択と比較することによって特徴付けられた。試料に対して１を超えるクローンに存在している変異のみを考慮した。
【０３２５】
ＪＣＶ−ＤＮＡの定量化のためのリアルタイムＰＣＲ：
ＪＣＶ  ＤＮＡは、以前に説明されたように、リアルタイムＰＣＲによって、ＣＳＦ、血漿、および尿試料において定量化した（Ｂｏｓｓｏｌａｓｃｏ  Ｓ，Ｃａｌｏｒｉ  Ｇ，Ｍｏｒｅｔｔｉ  Ｆ，Ｂｏｓｃｈｉｎｉ  Ａ，Ｂｅｒｔｅｌｌｉ  Ｄ，Ｍｅｎａ  Ｍ，Ｇｅｒｅｖｉｎｉ  Ｓ，Ｂｅｓｔｅｔｔｉ  Ａ，Ｐｅｄａｌｅ  Ｒ，Ｓａｌａ  Ｓ，Ｓａｌａ  Ｓ，Ｌａｚｚａｒｉｎ  Ａ，Ｃｉｎｑｕｅ  Ｐ．Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ＪＣ  ｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＨＩＶ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２００５  Ｍａｒ  １；４０（５）：７３８−４４．）。
【０３２６】
患者：
ＰＭＬ患者は、ａ）対のＣＳＦおよび血漿、または尿試料、あるいはｂ）連続的ＣＳＦ試料、リアルタイムＰＣＲによって検出可能なＪＣＶ  ＤＮＡを有する全てのいずれかの有効性に基づいて選択された。試料は、１９９３年〜２００８年に、サンラファエロ病院、感染クリニック（Ｃｌｉｎｉｃ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｅａｅｓｅｓ，Ｓａｎ  Ｒａｆｆａｅｌｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｍｉｌａｎｏ）の患者から採血した。試料アリコートは、本試験のためのレトロスペクティブ分析まで−８０℃で保存された。ＪＣＶ  ＶＰ１は、合計３０人のＰＭＬ患者からの合計２６のＣＳＦ試料、１１の血漿試料、および６つの尿試料から成功裏に増幅された。
【０３２７】
臨床試料の分析−研究計画：
１．  ＣＳＦ配列の分析：
ＣＳＦ配列は、２６人の患者を検査し（表９）、変異の型および頻度、ならびに患者との相関変数を分析した。
【０３２８】
２．同じ患者の対の試料からの配列の分析：
対のＣＳＦ／血漿／尿試料（「三重試料」）を、２人の患者において検査を行なった。ＣＳＦ／血漿、ＣＳＦ／尿、および血漿／尿の対をそれぞれ、６人、１人、および３人の患者において検査を行なった。三重項および対から得た配列を比較した。
【０３２９】
３．連続的試料からの配列の分析：
連続的なＣＳＦまたは血漿試料はそれぞれ、５人、および２人の患者から入手した。これらの試料は、ＰＭＬの診断寸前（ベースライン）、その後、異なる時間で採取された。それぞれの患者から、１７〜４７７日のタイムフレームにわたって採取された２〜３つの試料を分析した。これらの患者のうち５人の患者は、ＰＭＬに対して進行性の経過があった。１人の患者は、ＨＡＡＲＴの開始後、ウイルス学的応答を経験した。１人の患者は、シタラビンによる治療後、臨床的およびウイルス学的回復があったが、６ヶ月後、ＰＭＬの再発があり、シタラビンの使用を中止した。
【０３３０】
【表９】
2012517017.tif 000022
臨床試料の分析−結果：
１．ＣＳＦ配列の分析：
ＶＰ１  ＰＭＬ固有の変異は、ＰＭＬに罹患していない患者の尿には、通常存在しない変異として定義された。これらの変異または欠失は、それらの地理的分布に従って、ＶＰ１配列を区別するＶＰ１遺伝子型を決定する位置の変異を含まない。
【０３３１】
８つの異なるＰＭＬ固有の変異または欠失のうちの１つは、２６人の患者のうちの２４人（９２％）のＣＳＦにおいて特定された。これらは、ＪＣＶ  ＶＰ１アウターループのうちの１つにおいて、アミノ酸置換を含んだ（表１０）。
【０３３２】
症例の全てにおいて、同じ試料からのほぼ全てのクローンは、変異または欠失を含んだ。５人の患者において、２つの異なる変異または欠失が、同じクローン（ｎ＝２）あるいは異なるクローン（ｎ＝３）のいずれかにおいて特定された。
【０３３３】
【表１０】
2012517017.tif 000023
ＢＣ、ＤＥ、およびＨＩ  ＪＣＶ  ＶＰ１ループは、ＳＶ４０のＶＰ１ループへのａａ配列の類似性によって定義され（Ｃｈａｎｇ  Ｄ，Ｌｉｏｕ  ＺＭ，Ｏｕ  ＷＣ，Ｗａｎｇ  ＫＺ，Ｗａｎｇ  Ｍ，Ｆｕｎｇ  ＣＹ，Ｔｓａｉ  ＲＴ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＪＣ  ｖｉｒｕｓ  ｍａｊｏｒ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＰ１．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９６  Ｍａｙ；５９（１−２）：１７７−８７）、以前は、Ｘ線結晶学によって判定された（Ｌｉｄｄｉｎｇｔｏｎ  ＲＣ，Ｙａｎ  Ｙ，Ｍｏｕｌａｉ  Ｊ，Ｓａｈｌｉ  Ｒ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ  ＴＬ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＳＣ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０  ａｔ  ３．８−Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  １９９１  Ｎｏｖ  ２８；３５４（６３５１）：２７８−８４）。
＊変異／欠失のいずれかが、異なるクローン（１５および４クローン中の５５Ｆ＋２７１Ｈ、１８および４クローン中の６１Ｌ＋５５欠失、１５および４クローン中の２６７Ｆ＋６１Ｌ）に存在した。＊＊変異／欠失は共に、それぞれのクローンに存在した。
【０３３４】
より高いＣＳＦ  ＪＣＶ  ＤＮＡレベルは、ＤＥループの変異を有するもの、または変異を有さないものよりもＢＣおよびＨＩループの変異を有する患者において見出された（図１９）。変異の型とＣＤ４細胞数、血漿ＨＩＶ−１  ＲＮＡレベル、または生存時間との間の相関関係は、ＨＩＶ関連のＰＭＬに罹患している患者において観察されなかった。
【０３３５】
２．対の試料からの配列の分析：
２つのＣＳＦ／血漿／尿の三重試料の分析は、ＣＳＦおよび血漿において、同じＶＰ１  ＰＭＬ固有の変異を示したが、ＰＭＬ変異は、対応する尿配列には存在しなかった（表１１）。同様に、同一のＰＭＬ固有の変異は、ＣＳＦ／血漿の対を有する６人の患者からのＣＳＦおよび血漿配列において見出された（表１２）が、ＣＳＦあるいは血漿のいずれかのみではなく、ＣＳＦ／尿の対を有する１人の患者または血漿／尿の対を有する３人の患者の尿配列では見出されなかった（表１３）。
【０３３６】
【表１１】
2012517017.tif 000024
【０３３７】
【表１２】
2012517017.tif 000025
【０３３８】
【表１３】
2012517017.tif 000026
３．  連続的試料からの配列の分析：
連続的ＣＳＦまたは血漿試料の分析は、進行性疾患を患う７人の患者においてＰＭＬ固有の変異、およびＣＳＦにおいて、ＪＣＶ  ＤＮＡの安定した、または増加を示した（表１４および１５）。
【０３３９】
ウイルス学的応答を経験した患者において、第１のＣＳＦ試料に存在する主なＰＭＬ変異は、第２のＣＳＦ試料がＪＣＶ  ＤＮＡレベルの低下を示すことをもはや見出されなかったが、この後続の試料において、以前に若干示された変異の出現が観察された。
【０３４０】
ＰＭＬの再発を経験していた患者において、ＰＭＬの第１の症状の発現の臨床的およびウイルス学的回復から数ヶ月後、２つの異なる変異は、２つの症状の発現中、採取したＣＳＦ試料に存在した。
【０３４１】
【表１４】
2012517017.tif 000027
【０３４２】
【表１５】
2012517017.tif 000028
表１４および１５、注記：
＊変異／欠失のいずれかが、異なるクローン（１５および４クローン中の５５Ｆ＋２７１Ｈ、１８および４クローン中の６１Ｌ＋５５欠失、１５および４クローン中の２６７Ｆ＋６１Ｌ）に存在した。
＊＊変異／欠失は共に、それぞれのクローンに存在した。
【０３４３】
ＪＣＶ−ＶＰ１の分子モデリング：
ＪＣＶ  ＶＰ１／四糖類複合体の分子モデリング：
ＪＣＶ  ＶＰ１タンパク質の五量体単位の相同モデルは、テンプレートとしてＭＰｙＶ  ＶＰ１（タンパク質データバンクＩＤ：１ＶＰＳ）の構造を用いて、ＭＯＤＥＬＥＲと共に構築された。ＮｅｕＮＡｃ−（α２，３）−Ｇａｌ−（β１，３）−［（α２，６）−ＮｅｕＮＡｃ］−Ｇｌｃ−ＮＡｃ四糖類のモデルは、ＭＰｙＶ  ＶＰ１に結合したＮｅｕＮＡｃ−（α２，３）−Ｇａｌ−（β１，３）−［（α２，６）−ＮｅｕＮＡｃ］−Ｇｌｃ−ＮＡｃの構造に基づいて構築された。ＪＣＶ  ＶＰ１／ＮｅｕＮＡｃ−（α２，３）−Ｇａｌ−（β１，３）−［（α２，６）−ＮｅｕＮＡｃ］−Ｇｌｃ−ＮＡｃ四糖類のモデルは、ＣＨＡＲＭＭにおいて、広範囲に精密化され、ＰｙＭＯＬ可視化ソフトウェア（Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（２００２）ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）を用いて分析された。
【０３４４】
したがって、野生型ウイルス（健常な人の尿に存在する）と比較して、８つの特異的な単一の変異または欠失のうちの１つは、２６人の患者中２４人（９２％）のそれぞれからのほぼ全てのＣＳＦクローンに特定された。ＶＰ１の３つのアウターループのうちの１つにおいて、これらが与えた置換または欠失は、最も高い頻度で、残基５５（５５Ｆ、７人の患者、２７％）および２６９（２６９Ｆ、６人の患者、２３％）を含む。対の血漿は、常に、同じＣＳＦ変異を示したが、尿においては、変異は特定されなかった。変異は、進行性疾患を患う７人の患者からの連続的試料中に維持され、ＣＳＦにおいて、ＪＣＶ  ＤＮＡを安定した、または増加した。それらは、２人の患者：新しい変異が発生した、ＰＭＬ回復および再発を経験している１人、および以前は微量であった異なる変異バリアントが出現した、ＣＳＦ  ＪＣＶ  ＤＮＡが低下した１人において、失われた。三次元モデリングによって、全ての変異した残基は、ＶＰ１におけるシアル酸細胞受容体結合部位内、またはそこに近接してクラスター化された。
【０３４５】
したがって、このデータに基づいて、ＰＭＬに罹患している患者において、ＣＳＦおよび血漿から見出されたが、尿には見出されないＪＣＶは、ＰＭＬ固有のＶＰ１置換を担持する。これらの置換は、疾患の進行中、維持される。それらは、シアル酸細胞受容体と結合する重要な部位で、ＶＰ１のＢＣ、ＤＥ、またはＨＩ外部ループを含む。したがって、ＰＭＬにおいて、ＣＳＦおよび血漿からであって、尿からではないＪＣＶは、細胞結合に対する重要部位にＶＰ１置換を担持し、これは、疾患中、維持される。これらの所見は、モデルを支持し、それによって、ＪＣＶは、脳に持続し、最終的にＰＭＬをもたらす部位からの遷移中、適応変化を得る。
【０３４６】
実施例１２：ＶＰ１のシアル酸結合ポケットにおける残基
モデル化したシアル酸含有糖からの１２オングストローム内の残基（本明細書の実施例に記載される）を、表１６に列記する。
【０３４７】
【表１６−１】
2012517017.tif 000029
【０３４８】
【表１６−２】
2012517017.tif 000030
【０３４９】
【表１６−３】
2012517017.tif 000031
【０３５０】
【表１６−４】
2012517017.tif 000032
実施例１３：ＰＭＬ患者のＣＳＦおよび血漿は、ＰＭＬ関連のＶＰ−１変異を担持するが、尿は、ＰＭＬ関連のＶＰ−１変異を担持しない。
【０３５１】
ＰＭＬ関連の変異が、ＰＭＬ患者のＣＳＦにおいて、特異的に選択されたかどうかを調査するために、初めに、７人の患者からの対のＣＳＦおよび尿配列を分析した（表１７）。それぞれの患者において、ＣＳＦ  ＪＣＶ−ＶＰ１は、尿由来の配列には存在しなかったアミノ酸置換を担持した。そうでなければ、ＣＳＦおよび尿配列は、個人の患者内で同一であり、参照株（同じウイルスサブタイプ）と比較して、同一の多形によって特徴付けられた。ＰＭＬ関連のＣＳＦ変異は、コドン５５、６０、２６７、２６９、また、コドン１２２も含んだ。１３人の患者から入手される血漿ＶＰ１配列（表１７）は、全ての場合において、対応するＣＳＦ由来の配列に同一であり、同じＰＭＬ関連の置換を担持した。
【０３５２】
表１７．ＰＭＬ患者からの対の尿、ＣＳＦ、および血漿試料に由来する配列におけるＪＣＶ  ＶＰ１アミノ酸置換
【０３５３】
【表１７】
2012517017.tif 000033
Ｕ、尿；ＣＳＦ、脳脊髄液；Ｐ、血漿。＊置換が特定されない場合、カラム値は、置換がない、クローン数／検査されたクローン数を指す。
【０３５４】
実施例１４：  ＰＭＬ患者のＣＳＦ  ＪＣＶは、細胞結合に重要な部位に位置する幾つかの変異または欠失のうちの１つを一貫して担持する。
【０３５５】
インビボでのＶＰ１  ＰＭＬ関連の置換の型および頻度を定義するために、より大きな患者群におけるＣＳＦ由来ＶＰ１配列を分析した。１つの主なＰＭＬ関連の変異または欠失は、４０人の患者のうちの３７人（９０％）において特定された（表１８）。ＶＰ１遺伝子は、材料および方法に記載されるように、クローン化され、多くのクローンに対して配列決定した。変異は、Ｇｅｎｅｂａｎｋにおいて報告されるように、整合した尿試料からのいずれかのＶＰ１配列への配列（利用可能な場合）を、非ＰＭＬ個人の尿から単離された４６０の配列（ｎ＝４６０）と比較することによって特定された。一部の患者において、変異Ｈ１２２Ｒを特定した。一部の患者において、変異２８３Ｉを特定した。一部の患者において、変異Ａ２Ｖを特定した。一部の患者において、欠失５０〜５１を特定した。一部の患者において、欠失５０〜５１を特定した。一部の患者において、欠失５４〜５５を特定した。一部の患者において、欠失１２３〜１２５を特定した。一部の患者において、欠失１２５〜１３４を特定した。一部の患者において、欠失１２６〜１３４を特定した。
【０３５６】
最も頻度の高い変化は、コドン５５および２６９を含み、それぞれ、２５％の患者において特定された。既に報告されている置換に加えて、コドン５５、６０、６１、および２６５、２６７、２６９で、幾つかの他のＰＭＬ関連の変異または欠失は、新たに特定され、Ｇｅｎｅｂａｎｋからの尿由来配列と比較することによって証明されるように、非多型ＶＰ１コドンを含む。全てのこれらの新たに特定された変異はまた、臨界ＶＰ１結合部位に位置する（表１８）。図２０は、ＪＣＶ  ＶＰ１／ＮｅｕＮＡｃ−（ａ２，３）−Ｇａｌ−（ｂ１，３）−［（ａ２，６）−ＮｅｕＮＡｃ］−Ｇｌｃ−ＮＡｃ四糖類複合体の構造モデルである。（Ａ）ＪＣＶ  ＶＰ１の５つの鎖の表面を示す。中心的なシアル酸の結合に必須のＲＧモチーフを示す。また、ＰＭＬ関連の変異残基（Ｌ５５、Ｋ６０、Ｓ２６５、Ｓ２６９）を示す。また、ＰＭＬに単離された試料に特有のさらなる変異（Ｓ６１、Ｄ６６、Ｑ２７１）および（Ｐ５１、Ｄ５２、Ｈ１２２、Ｓ１２３、Ｎ１２４、Ｇ１２５、Ｑ１２６、Ａ１２７）も示す。（Ｂ）図２０Ａのクローズアップ写真。ＪＣＶ  ＶＰ１のＳ２６９と同等であることが予想されるＭＰｙＶ  ＶＰ１のＶ２９６の位置をメッシュで示す。
【０３５７】
【表１８−１】
2012517017.tif 000034
【０３５８】
【表１８−２】
2012517017.tif 000035
【０３５９】
【表１８−３】
2012517017.tif 000036
Ｕｎｄｅｔ．、判定されず；Ｃｏｎｓ．、コンセンサス；ｖ、バリアント
ａ．位置２９５まで利用可能な配列
実施例１５：異なるコンパートメントから単離されたＪＣウイルス間の関係
３つのコンパートメント（腎臓、血漿、およびＣＳＦ）におけるウイルス集団間の関係を調査するために、３人の患者における全て３つのコンパートメントからの個別に配列決定されたクローンによって示されるＶＰ１配列の集団変異を分析した。ＰＭＬの発症と推定上関連するアミノ酸変化を除いて、全て３つのコンパートメントの優性のＶＰ１遺伝子型は、常に同一である。全ての観察された配列変異は、低頻度の単一ヌクレオチドバリアントによるものであった。これは、ウイルスを生じるＰＭＬが、腎臓において既存の常在集団が起源であることを示唆している。
【０３６０】
３つのコンパートメントにおけるウイルス集団間の関係は、共有した低頻度の多型の程度によって特徴付けることができる。２つまたはそれ以上のクローンにおいて観察された単一のヌクレオチドバリアントを分析した。３人全ての患者において、遺伝子変異の大部分は、１を超える配列に存在する対立遺伝子のバリアントが、単一のコンパートメントにおいて観察される場合、個々のコンパートメントに閉じ込められた。したがって、ウイルス集団は、高度に構造化される。
【０３６１】
３人の患者のうちの２人において、一部の対立遺伝子バリアントは、ＣＳＦ集団と血漿集団との間で共有され、ＣＳＦ集団と腎臓集団、または血漿集団と腎臓集団との間ではバリアントは、共有されなかった。これらの２人の患者のそれぞれにおいて、同じＰＭＬ関連の変異は、ＣＳＦおよび血漿からのクローンにおいて観察された。これらのデータは、推定上、腎臓事象からの１回限りの回避のため、ＣＳＦおよび血漿集団の単一起源と一致している。このシナリオでは、ＣＳＦ集団と血漿集団との間で共有された配列変異は、腎臓の外側のＰＭＬ関連の変異の固定後に生じた（同じ部位での独立した複数の変異の可能性が低いと仮定して）。ＣＳＦ集団と血漿集団の間で共有したＶＰ１配列変異は、コンパートメント間のウイルス転移の存在を示し得る。また、腎臓の外側の常在ウイルス集団が、まず、１つのコンパートメント（ＣＳＦあるいは血漿のいずれか）に構築され、遺伝子変異を蓄積し、次いで、第２のコンパートメントに感染するという段階的な感染のシナリオと一致する。
【０３６２】
１／３の患者は、コンパートメント間の共有した多型の異なる画像を提示する。２つのバリアントは、ＣＳＦと腎臓との間を共有し、３つのバリアントは、血漿と腎臓との間を共有し、１つのバリアントは、全て３つのコンパートメント間を共有した。ＣＳＦから単離された全てのクローンおよび血漿から単離されたクローンの大部分は、同じＰＭＬ関連の変異（Ｓ２６９Ｆ）を持つ。しかしながら、血漿から単離された３つのクローンは、異なるＰＭＬ関連の変異（Ｓ２６７Ｆ）があった。これらのクローンは、優性のＰＭＬ関連の変異を欠いた。
【０３６３】
患者３のＣＳＦおよび血漿の複数の逐次感染の可能性を除外することはできないが、これらの観察は、腎臓からの１回限りの回避後、ＣＳＦ集団および腎臓集団の単一起源のシナリオと必ずしも矛盾しない。患者３のデータは、穏やかな選択的一掃の一例であり得る。強固な選択的一掃と違って、穏やかな選択的一掃は、完全には既存の遺伝的変異を排除しない。穏やかな一掃シナリオは、有効な集団の大きさおよび変異率（Ｎｅ  ｘ  ｍｕ）の産物がある産物を超える場合、可能性が非常に高い。この場合においては、有益な変異（または等しいまたは同等の選択的優位性の幾つかの有益な変異）の複数の例は、異なるハプロタイプのバックグラウンドにおける元の集団に存在する可能性がある。穏やかな一掃後、全ての配列は、有益な変異を持つが、集団は、多様型のままである。Ｓ２６９Ｆ変異およびＳ２６７Ｆ変異の複数の例は、回避および固定が生じる前に、腎臓集団に存在し、続いて、穏やかな一掃シナリオが、血漿集団にＳ２６９ＦおよびＳ２６７Ｆ  ＶＰ１バリアントの共存をもたらし、３つ全てのコンパートメント間の変異を共有した可能性がある。
【０３６４】
実施例１６：臨床転帰との様々な変異の相関関係
個々のＰＭＬ関連のＶＰ１置換が、臨床的に有意な、例えば、患者および臨床状況に従って異なった選択をする、または異なる疾患転帰と関連するかどうかを評価するために、それらの存在を、多くの変数と相関させた。
【０３６５】
ＶＰ１置換、または位置１２２〜１３４を含む置換がないＪＣウイルスは、他の位置（ｐ＝０．０１３、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）を含む置換、例えば、異なるＶＰ１置換を担持する位置５０〜６１（ｐ＝０．０２）あるいは２６５〜２６９（ｐ＝０．０３６）のいずれかの置換を有するウイルスと比較する場合、ＣＳＦにおいて、有意に低いＤＮＡレベルで存在することが観察された。
【０３６６】
実施例１７：ＰＭＬ関連の変異は、ＲＢＣを凝集させるＶＰ１の能力を減退させる。
【０３６７】
ＰＭＬ関連の変異が、疾病病因に働く役割を理解するために、ウイルス受容体結合におけるこれらの変異の幾つかの効果を調査した。ＪＣＶが、シアル酸構造（Ｌｉｕ）に結合することが知られているため、これらの構造を発現するＲＢＣの血球凝集を生じるウイルス能力は、その受容体とのウイルスの相互作用のモデルとして幅広く使用されている。
【０３６８】
主要なＪＣＶカプシドタンパク質ＶＰ１から調製したウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、それらの細胞受容体とのポリオーマウイルスの相互作用を調査する良好なモデルとして幅広く使用されている。ウイルスカプシドと同様に、ＶＬＰは、電子顕微鏡法で証明されるように（データは示さず）、ウイルスカプシド構造を形成する。次に、「野生型」あるいは様々な「変異体」ＶＰ１分子のいずれかから調製されるＶＬＰの結合を調査した。ＰＭＬ中、積極的に選択されたことを示す多くのＰＭＬ関連の変異は、点変異として、単一のウイルスバックグラウンド（ＪＣＶ３型）からのＶＰ１分子の骨格に導入され、赤血球（ＲＢＣ）を血球凝集する（例えば、結合する）、それらの能力を比較した。１Ａ型（例えば、Ｍａｄ−１）ウイルスから調製されるＶＬＰと同様に、３型ウイルスのＶＰ１分子から調製されるＶＬＰは、ＲＢＣの血球凝集を生じさせることができ、それらは、７６０ｐｇ／ｍＬの低濃度で、生じる。しかしながら、最も高い頻度で起こる変異５５Ｆ、２６７Ｆ、位置２６９（ＦまたはＹ）の変異のうちの１つを担持するＶＬＰは、１００，０００倍以上の活性の低下に対応する、１００μｇ／ｍＬの最高の試験濃度でさえ、血球凝集を生じなかった。血球凝集はなお、６０Ｅ、２６５Ｄ、および２７１Ｈ変異体ＶＬＰを伴うが、２００〜２５，０００倍の活性の喪失に対応する非常に高濃度でのみ、見掛けられた。６６Ｈ変異体ＶＬＰの結合のみが、強く影響されず、血球凝集において、わずか３倍の低下を示した（最低の血球凝集濃度として３０００ｐｇ／ｍＬ）。６６Ｈあるいは２７１Ｈ変異のいずれも、本実施例において分析された配列の中に観察されなかったが、これらの変異は、Ｇｅｎｅｂａｎｋからの配列の分析に基づいて、ＰＭＬ関連であると特定される。血球凝集を生じるＶＬＰの能力におけるこの変異効果は、変異が、細胞受容体に結合するウイルスの能力を無効にすることによってウイルス受容体特異性を変化させ得ることを示唆している。
【０３６９】
実施例１８：ＰＭＬ関連の変異は、異なる血液群からのＲＢＣを血球凝集する能力を失う。
【０３７０】
ＰＭＬ関連の変異を担持するＶＬＰは、異なる血液群からのＲＢＣを血球凝集する能力を失う。血球凝集アッセイのために、赤血球（ＲＢＣ）を、１００μｇ／ｍＬから開始する様々なＶＬＰの連続２倍希釈液でインキュベートした。最低ＨＡ濃度は、ＲＢＣをさらに凝集したＶＬＰタンパク質の最低濃度である。血球凝集は、前述のように、ウイルス感染によって検査が行なわれた。全ての血球凝集反応は、２重に行なわれた。最低ＨＡ濃度に対する平均値＋／−標準偏差は、４つの異なる血液群ドナー（Ａ型、Ｂ型、Ｏ型、およびＡＢ型）からの血球凝集の結果に基づいて計算される。１００μｇ／ｍＬの最低血球凝集濃度を示すＶＬＰは、試験した最高のＶＬＰ濃度（例えば、１００μｇ／ｍＬ）で血球凝集を生じなかった。
【０３７１】
実施例１９：ＰＭＬ関連の変異は、ＶＰ１のガングリオシド特異性を変化させる。
【０３７２】
ＪＣＶ  ＶＰ１受容体をさらに分析するために、異なるガングリオシドへの様々な変異体ＶＬＰの結合の特異性を調査した。ガングリオシドは、複合スフィンゴ糖脂質の一群であり、１つまたはそれ以上のシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＮｅｕＮＡｃ）を含むオリゴ糖鎖は、セラミドに付着し、細胞膜への構造を固定する。これらのガングリオシドに結合するＶＬＰは、ＥＬＩＳＡ様形式において測定され、ガングリオシドは、抗原と同種のＥＬＩＳＡプレートに被覆され、続いて、ＶＬＰを添加し、結合は、ＶＰ１固有のモノクローナル抗体で検出された。３型「野生型」ＪＣＶ  ＶＬＰを用いて、ガングリオシドを全く有さないウェルへのＶＬＰの結合によって産生されたバックグラウンドと比較した場合、８〜１２倍以上のシグナルの増加を有する、最も強い結合が、ＧＤ１ｂ、ＧＤ２、およびＧＴ１ａに観察された（図２１）。ＶＰ１のＰＭＬ特異的変異は、シアル化ガングリオシドに対するウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１の特異性をなくす、または大きく変化させる。９６ウェルプレート上で被覆されたガングリオシドのアレイへのＶＬＰの結合は、ＶＰ１固有のマウス抗体および抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ標識化抗体を有するガングリオシドに結合するＶＬＰの検出を含む２つのステッププロセスで検出され、続いて、ＴＭＢ溶液を用いて展開させた。特定のガングリオシドへのＶＬＰ結合は、同じガングリオシドの存在下で、ＶＬＰを用いずに、および抗体のみで得たものと比較して、存在した特定のＶＬＰを用いて得られた光学濃度の増加の割合として、以下のように計算された。１００＊（ＯＤ４５０（＋ＶＬＰ）−ＯＤ４５０（−ＶＬＰ））／ＯＤ４５０（−ＶＬＰ）。ガングリオシドの図式的構造は、様々なＶＬＰによって結合されるコア結合構造を示すことが示される。行なわれた４つの実験のうちの１つの代表的な実験を示す。このガングリオシドの特異性は、１Ａ型「野生型」ウイルスＭａｄ−１に対して前述されるものと一致している。アシアロ−ＧＭ１およびＧＤ１ａに対するＶＬＰの結合は、はるかに弱いが、なお、バックグラウンドを超えて有意であるが、他のガングリオシドへの結合は、ガングリオシドがないバックグラウンドと比較して非常にわずかであった。結合パターンに基づいて、野生型ウイルスによって結合される主要な「コア」構造は、結合に欠かせないＮｅｕ５Ａｃ（β２−８）−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）のジシアル酸モチーフを有する、四糖類ＧａｌＮＡｃ（β１−４）［Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−８）−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）］Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ構造からなることは明らかである。
【０３７３】
しかしながら、全ての変異体ＶＬＰの結合は、「野生型」分子とは大幅に異なった。具体的には、図２１に見られるように、ＶＬＰ変異体５５Ｆ、６０Ｅ、２６７Ｆ、２６９Ｆ、および２６９Ｙは、全てのシアル化したガングリオシドへの結合を完全に失うが、それでも、アシアロ化したＧＭ１構造（例えば、アシアロ−ＧＭ１）への変化しない結合を示す。さらに、６６Ｈ、２６５Ｈ、および２７１Ｈ等のその他は、元来の変異しないＶＬＰ分子よりもさらに広範囲のガングリオシド結合を示した。
【０３７４】
実施例２０：様々な細胞標的へのＶＬＰの結合
血球凝集および直接ガングリオシド結合アッセイからの結果は共に、ＰＭＬ関連の変異が、ウイルス受容体の特異性、特に、シアル化したオリゴ糖構造に結合するウイルス能力を変化させることを示唆している。したがって、次に、特定の受容体結合におけるこれらの変異が与えた変化が、いかにその主張される標的細胞に結合するＪＣＶの能力に影響を及ぼすかについて調査した。ウイルス細胞サイクルにとって重要であると報告された３つの主要な細胞型：  腎臓上皮細胞、リンパ球、およびＣＮＳ細胞への上記の野生型および変異体ＶＬＰの結合を測定した。一次ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞（ＨＲＰＴＥＣ）を、非変異ウイルスへのウイルス無症候性が持続する部位からの細胞として選択された。初代ヒトＢリンパ球もまた、ＣＮＳへの末梢部位からウイルスの拡散には欠かせないことが示唆されている細胞型、ならびに他のリンパ球様細胞、例えば、初代Ｔリンパ球およびリンパ球細胞株Ｊｕｒｋａｔとして選択された。リンパ球様細胞の増殖感染は、明白には示されていないが、リンパ球が、それらのシアル酸構造を介してＪＣＶに結合することが示され（Ａｔｗｏｏｄら）、したがって、インビボでのウイルスを潜在的に担持し得る。初代ヒト胎児星状膠細胞およびヒトグリア細胞株ＳＶＧ−Ａもまた、ＰＭＬ中、ＣＮＳ感染に対するモデル細胞型として使用された。星状膠細胞の感染は、ＰＭＬ患者において十分に文書化されており、これらのグリア細胞型は共に、インビトロでＪＣＶによって感染させることができる。
【０３７５】
ＶＰ１のＰＭＬを生じる変異体は、腎臓および血液細胞への結合能力を失うが、グリア細胞に結合する。グリア細胞株ＳＶＧ−Ａ（Ａ）、初代ヒト星状膠細胞（Ｂ）、ヒト脳微小血管細胞（Ｃ）、腎臓尿細管上皮細胞（Ｄ）、または末梢血単核細胞（ＥおよびＦ）細胞は、まず、異なるＶＬＰ（ｘ軸上に示される）でインキュベートし、抗ＶＰ１抗体でさらにインキュベートし、続いて、蛍光標識抗体で染色した。Ｔ−リンパ球（Ｅ）およびＢ−リンパ球（Ｅ）へのＶＬＰの結合は、ヒトＣＤ３およびＣＤ２０マーカーに対して特異的な抗体でＰＢＭＣを共染色し、対応する集団にゲーティングした後、評価された。ＶＬＰの存在下で、抗ＶＰ１抗体で染色した細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比は、ＶＬＰの不在下で、検出抗体でのみ染色した細胞のバックグラウンドＭＦＩと比較して、それぞれのＶＬＰに対してプロットした。平均ＭＦＩ比＋／標準偏差は、幾つかの独立した実験からの結果に基づいて、計算される（Ｎは、グラフ上に示される）。「野生型」ＶＰ１から作製されたＶＬＰは、バックグラウンド染色を２倍以上上回る上記の細胞型の全てに強力に結合した。しかしながら、変異体ＶＬＰの結合は、変異したアミノ酸の細胞型および位置の両方に依存した。具体的には、最も頻度の高いＰＭＬ関連の変異５５Ｆ、２６７Ｆ、２６９Ｆ、および２６９Ｙは、腎臓尿細管上皮細胞および全てのリンパ球細胞へのＶＬＰの結合を無効にするが、初代星状膠細胞もしくはグリア細胞株ＳＶＧ−Ａへの結合はなくさない。ＣＮＳ細胞型は共に、これらの変異（ＳＶＧ−Ａ細胞に結合するが、初代星状膠細胞には結合しない５５Ｆを除く）を担持するＶＬＰに、今なお強く結合した。６０Ｅ、６６Ｈ、および２７１Ｈを担持するＶＬＰは、腎臓上皮細胞およびリンパ球細胞を含む全ての細胞型に、今なお結合したが、２７１Ｈの結合は、強く減退した。
【０３７６】
実施例２１：ＰＭＬ関連の変異を担持するＶＬＰは、シアル酸非依存の様式でグリア細胞に結合する。
【０３７７】
細胞へのウイルスの結合は、シアル酸依存性であることが前に示されている（例えば、Ａｔｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ）が、データが、ほとんどのＰＭＬ関連の変異が、ガングリオシドを含むシアル酸へのＶＬＰの結合をなくすことを示すので、次に、細胞への変異体ＶＬＰの結合が、それでも、シアル酸依存性であるかどうかを試験した。それを行なうために、ＳＶＧ−ＡあるいはＪｕｒｋａｔ細胞のいずれかを、ノイラミニダーゼで処理し、細胞表面からシアル酸を除去した。ノイラミン酸（例えば、Ｓａｍｂｕｃｕｓ  Ｎｉｇｒａ  Ｌｅｃｔｉｎ（ＳＮＡ）およびＭａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ  ｌｅｃｔｉｎ（ＭＡＡ））の様々な配座に対して特異的なレクチンでの細胞の染色は、シアル酸除去におけるノイラミニダーゼ処理の有効性を証明した。グリア細胞へのＶＰ１のＰＭＬを生じる変異体の結合は、シアル酸非依存性である。グリア細胞株ＳＶＧ−Ａ細胞またはリンパ球細胞株Ｊｕｒｋａｔｓは、まず、３７℃で６０分間、α２−３，６ノイラミニダーゼで事前に処理するか、または模擬処理し、続いて、本明細書に記載されるように、指示されたＶＬＰを用いて４℃でインキュベートし、検出抗体で染色した。
【０３７８】
ＳＶＧ−Ａ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞の両方への３型野生型ＶＬＰの結合は、シアル酸依存性であり、これは、Ｍａｄ−１ウイルス（例えば、１Ａ型野生型）に対して前に示されることを確認する。しかしながら、ＳＶＧ−Ａ細胞への、Ｋ６０Ｅ変異体ＶＬＰではないが、全ての試験したＶＬＰの結合は、これらの細胞へのこれらの変異体の結合が、シアル酸非依存性であることを示唆しているノイラミニダーゼ処理によって影響を及ぼさなかった。興味深いことに、Ｊｕｒｋａｔ細胞（例えば、Ｋ６０Ｅ、Ｄ６６Ｈ、Ｎ２６５Ｄ、およびＱ２７１Ｈ）に、今もなお結合することができたこれらの変異体は、ノイラミニダーゼにより処理したＪｕｒｋａｔ細胞への結合を減退することによって証明されるように、シアル酸依存性の様式に結合した。
【０３７９】
要約した表１９から理解され得るように、Ｊｕｒｋａｔ細胞へのＶＬＰの結合は、主にシアル酸媒介であると思われ、シアル化したガングリオシドへのいずれの結合を示さない変異体ＶＬＰは、Ｊｕｒｋａｔ細胞に結合せず、シアル酸依存性の様式でＪｕｒｋａｔ細胞にも結合する。ガングリオシドへの直接結合に基づいて、その観察がＮ２６５Ｄ変異体であるという１つの注目すべき例外は、非常に幅広いシアル酸結合を得られるように思われるが、それでも、Ｊｕｒｋａｔ細胞へのその結合を失うことである。上記の結果に基づいて、ＶＬＰ結合の結果は、血球凝集の結果から判断されるように、ＲＢＣへのＶＬＰ結合と一致している。
【０３８０】
要約すれば、ＰＭＬ関連の変異は、ＲＢＣ、腎臓尿細管上皮細胞、およびリンパ球細胞を含む、大部分の異なる末梢細胞型へのウイルスのシアル酸依存性結合をなくすと考えられる。ＣＮＳ固有のグリア細胞への変異体ウイルスの結合は、大部分は、影響を受けず、シアル酸依存性であると考えられる。
【０３８１】
【表１９】
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【０３８２】
実施例１３〜２１に従って、以下の方法および材料を用いた。
【０３８３】
患者および試料
本研究は、倫理審査委員会によって承認された。ＰＭＬ患者の大規模コホートからの、インビボでのＰＭＬ関連の変異の存在および進化を調査するために、１９９２年〜２００９年に、サンラファエロ病院、感染クリニックに従い、４０人の患者が、初めに、対のＣＳＦ、血漿、または尿試料が入手可能であり、リアルタイムＰＣＲ（Ｂｏｓｓｏｌａｓｃｏ）によって決定される、ＪＣＶ  ＤＮＡを含む者から選択された。ＶＰ１は、最終的に、これらの患者のうちの１４人において、少なくとも２つの異なる型の試料から増幅された。
【０３８４】
続いて、ＣＳＦのみ入手可能な、リアルタイムＰＣＲによってＣＳＦに検出されたＪＣＶ  ＤＮＡを有する４３人の追加のＰＭＬ患者を選択した。ＪＣＶ  ＶＰ１は、これらの患者のうちの２８人から成功裏に増幅された。故に、１４人の患者からの試料および合計４０人の患者からのＣＳＦ由来配列を研究することができた。
【０３８５】
ＪＣＶ  ＶＰ１  ＰＣＲ
ＤＮＡ抽出およびＶＰ１増幅
ＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ  Ｂｌｏｏｄキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、２００μＬのＣＳＦ、血漿、または尿から抽出し、最終容量の５０μＬに溶出した。ＶＰ１は、全ＶＰ１遺伝子（完全ＶＰ１  ＰＣＲ）の側面にあるプライマーを用いるか、あるいは、この方法による増幅が、成功しない場合、より短いＶＰ１領域（短い断片ＶＰ１  ＰＣＲ）を別個に増幅したセミネスト化ＰＣＲアッセイのいずれかによって、増幅された。
【０３８６】
完全ＶＰ１  ＰＣＲは、２０２７ｂｐ断片を増幅するアウタープライマーのＶＰ１−ＬＦおよびＶＰ１−ＬＲ、ならびに１２３３ｂｐ長の断片を増幅するインナープライマーのＶＰ１−ＳＦおよびＶＰ１−ＳＲを用いたネスト化アッセイから構成された。ＰＣＲ反応混合物は、５μＬの１０Ｘ  ＰＣＲ緩衝液、４ｍＭのそれぞれのｄＮＴＰ、０．７μＭのプライマーＶＰ１−ＬＦおよびＶＰ１−ＬＲ（第１ラウンド）およびプライマーＶＰ１−ＳＦおよびＶＰ１−ＳＲ（第２ラウンド）、１．２５ユニットのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＨＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および総容量の５０μＬに１μＬの抽出されたＤＮＡ（第１ラウンド）または２．５μＬの増幅産物（第２ラウンド）から構成された。サイクルパラメータは、自動化温度サイクリング（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、（第１ラウンドおよび第２ラウンドの両方に対して）９４℃で２０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の３０サイクルであった。
【０３８７】
短い断片ＰＣＲは、７９７ｂｐ断片を増幅するプライマーＶＰ１−１およびＶＰ１−４ａ（第１ラウンド）を使用したセミネスト化ＰＣＲから構成され、続いて、４８１ｂｐ長の断片を増幅するプライマーＶＰ１−１およびＶＰ１−２ａ、または４９０長の断片を増幅するプライマーＶＰ１−１．５およびＶＰ１−４ａを用いて、２つのセミネスト化シタアッセイが続く（Ｚｈｅｎｇ）（表２０）。ＰＣＲ反応混合物は、２．５μＬの１０×ＰＣＲ緩衝液、２００μＭのそれぞれのｄＮＴＰ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５μＭ  プライマー、および１．２５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から構成された。第１ラウンドにおいては、４μＬの抽出したＤＮＡを、総容量の２５μＬに添加し、サイクルパラメータは、自動化温度サイクリング（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、９４℃で２０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の２０サイクルであった。この第１ステップのＰＣＲ産物は、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐキットで精製し、プロトコルは、単一のピペットステップ（酵素混合付加物）、３７℃での３０分間のインキュベーション、続いて、８０℃でさらに１５分間、酵素不活性化から構成される。セミネスト化ＰＣＲの第２ラウンドにおいては、４μＬの清浄したＰＣＲ産物を、総容量の２５μＬに添加し、サイクルパラメータは、自動化温度サイクリング（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、９４℃で２０秒間、６２℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の４０サイクルであった。
【０３８８】
両方のアッセイを用いて、インナープライマーを用いて増幅した後、１０μＬの第２の混合物からの増幅産物を、０．５μｇ／ｍＬ  臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲル上で電気泳動させた。その結果を、紫外線照明下で写真に撮り、期待されたｂｐ長のＤＮＡ断片に対応する帯が存在する場合、陽性と見なされた。
【表２０】
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【０３８９】
ＶＰ１  ＰＣＲクローニングおよび配列決定
増幅産物をＱｉａｇｅｎ精製キットによって精製した。Ａのものを、Ｔａｑポリメラーゼ（Ａ−オーバーハング反応）によって除去したｃｌｅａｎｅｄ  ｕｐ  ＰＣＲ産物の末端に添加し、クローニングは、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行なった。クローン化したＶＰ１  ＰＣＲ産物を含有するコロニーからのＭｉｎｉ−ｐｒｅｐ  ＤＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を調製した。２〜４８のクローンを、それぞれの試料（中央値２３）に対して配列決定した。ＶＰ１配列の翻訳後、アミノ酸変異は、ＰＭＬおよび非ＰＭＬの症例からのＶＰ１配列の大規模な選択と比較することによって特徴付けられた。試料に対して１を超えるクローンを示す変異のみを考慮した。
【０３９０】
ＪＣＶ−ＤＮＡの定量化に対するリアルタイムＰＣＲ
ＪＣＶ  ＤＮＡは、前述されるように、リアルタイムＰＣＲによって、ＣＳＦ、血漿、および尿試料において定量化した（Ｂｏｓｓｏｌａｓｃｏ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．２００５）。
【０３９１】
血球凝集アッセイ
Ｏ型＋ドナーからの赤血球（ＲＢＣ）を２回洗浄し、約０．５％の最終濃度で、Ａｌｓｅｖｅｒ液（２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、７２ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  グルコース、酢酸でｐＨ６．５に調整）中で懸濁した。１００μｇ／ｍＬのＶＬＰから開始する連続２倍希釈液をＡｌｓｅｖｅｒ液中に調製し、等量のＲＢＣを９６ウェル「Ｕ」底マイクロタイタプレートのそれぞれのウェルに添加し、４℃で３〜６時間インキュベートした（２４回の２倍希釈を行なった）。最低ＨＡ濃度は、ＲＢＣをさらに凝集したＶＬＰタンパク質の最低濃度である。
【０３９２】
ガングリオシドＥＬＩＳＡ
特定のガングリオシド（メタノール中で再懸濁）を、一晩マイクロタイタープレート（１０μｇ）に被覆させた。このプレートを遮断した（１％  ＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋を有するＰＢＳ）。ＶＬＰを、遮断緩衝液中の３０μｇ／ｍＬで調製し、添加した（１００μＬ／ウェル）。全てのインキュベーションを氷上で行なった。９０分後、このプレートを遮断緩衝液で洗浄した。ＶＬＰ結合は、抗ＶＰ１（２μｇ／ｍＬでＰＡＢ５９７）およびＨＲＰ−抗−ｍＩｇＧ（１：１００）の結合を含む２つのステッププロセスで検出した。プレートは洗浄し、ＴＭＢ  Ｔｕｒｂｏ  ＥＬＩＳＡ溶液で展開した。反応を、酸で停止させ、プレートを４５０ｎｍで、分光光度計上で読み取った。
【０３９３】
細胞に結合するＶＬＰのフローサイトメトリー分析
細胞を付着させ、収集した（ＳＶＧ−Ａ、Ｊｕｒｋａｔ、ヒト星状膠細胞、ヒト腎臓近位尿細管上皮）。まず、試料（１〜５×１０５細胞）を、氷上で６０〜９０分間５０μＬの容量で、ＦＡＣＳ緩衝液（１％  ＢＳＡ［Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ］、２ｍＭ  アジ化ナトリウム、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋を有するＰＢＳ）中のＶＬＰ（１０〜３０μｇ／ｍＬ）でインキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、６０分間抗−ＶＰ１（ＰＡＢ５９７  ２μｇ／ｍＬ）でさらにインキュベートし、続いて、洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−抗−ｍＩｇＧ（１：１００）でさらに３０〜４５分間インキュベートした。細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍで２０分間固定し、続いて、最終洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。細胞をＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ上で分析した。必要に応じて、適切な対照および他の抗体（イソタイプ対照、ＧＭ１、アシアロＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂ）およびレクチン（Ｐｅａｎｕｔ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＮＡ）、Ｓａｍｂｕｃｕｓ  Ｎｉｇｒａ  Ｌｅｃｔｉｎ（ＳＮＡ）、Ｍａａｃｋｉａ  Ａｍｕｒｅｎｓｉｓ  Ｌｅｃｔｉｎ  ＩＩ（Ｍａｌ  ＩＩ））を用いた染色。場合によっては、細胞をα２−３ノイラミニダーゼ、α２−３，６ノイラミニダーゼ、またはＰＮＧａｓｅＦで事前に処理し、それらの細胞表面糖構造を変化させた。
【０３９４】
前述の本明細書は、当業者が本発明を実施できるようにするのに十分であると見なされる。実施例は、本発明の一態様の単なる説明として意図されており、その他の機能的に同等の実施形態も本発明の範囲内であるため、本発明は、提供された実施例によってその範囲が限定されるものではない。本明細書において示され説明されたものに加えて、本発明の様々な改変が、当業者であれば前述の説明から十分明らかとなり、それらは添付の請求項の範囲内に含まれる。本発明の利点および目的が、必ずしも本発明の各実施態様に包含されるわけではない。
【０３９５】
本明細書を通して引用される全ての参考文献、特許、および公開特許出願の内容は、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図４Ａ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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