(57)【要約】単一タンパク質コアと、タンパク質コアに共有結合によって固定された薄いポリマーシェルとを有するタンパク質ナノカプセル。本発明の態様は、単一タンパク質コアと、タンパク質コアに共有結合によって固定された薄いポリマーシェルとを有するタンパク質ナノカプセルを含む。いくつかの実施形態において、単一タンパク質コアは、複数の重合性基を有するタンパク質である。いくつかの実施形態において、単一タンパク質コアは、タンパク質触媒である。いくつかの実施形態において、ナノカプセルは、タンパク質コアの触媒活性を保持する。
2012519733.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一タンパク質コアと、前記タンパク質コアに共有結合によって固定された薄いポリマーシェルとを含むタンパク質ナノカプセル。
【請求項２】
前記単一タンパク質コアが、複数の重合性基を有するタンパク質を含む、請求項１に記載のナノカプセル。
【請求項３】
前記重合性基が二重結合である、請求項２に記載のナノカプセル。
【請求項４】
前記重合性基が、ビニル、アクリル、アルキルアクリル、およびメタクリルから選択される、請求項２に記載のナノカプセル。
【請求項５】
少なくとも１種のモノマー単位と共重合された単一タンパク質コアを含む、請求項１に記載のナノカプセル。
【請求項６】
少なくとも２種の異なるモノマー単位と共重合された単一タンパク質コアを含む、請求項５に記載のナノカプセル。
【請求項７】
少なくとも１種のモノマー単位が、ｐＨ＝７．０で正電荷または負電荷を有する、請求項５から６のいずれか一項に記載のナノカプセル。
【請求項８】
少なくとも１種のモノマー単位および少なくとも１種の架橋剤で共重合された単一タンパク質コアを含む、請求項５から７のいずれか一項に記載のナノカプセル。
【請求項９】
前記架橋剤が分解性架橋剤である、請求項８に記載のナノカプセル。
【請求項１０】
表面修飾剤をさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のナノカプセル。
【請求項１１】
前記表面修飾剤が、発光分子、細胞標的化部分、ペプチド、タンパク質、抗体またはオリゴ糖からなる群より選択される、請求項１０に記載のナノカプセル。
【請求項１２】
前記表面修飾剤が、造影剤、細胞標的化促進剤、または細胞透過促進剤として機能する、請求項１０から１１のいずれか一項に記載のナノカプセル。
【請求項１３】
前記表面修飾剤が抗体である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載のナノカプセル。
【請求項１４】
前記単一タンパク質コアがタンパク質触媒である、請求項１から１３のいずれか一項に記載のナノカプセル。
【請求項１５】
前記単一タンパク質コアの触媒活性を有する、請求項１４に記載のナノカプセル。
【請求項１６】
少なくとも１つの重合性基を有するタンパク質を誘導体化するステップと、
前記誘導体化されたタンパク質をモノマー単位と共重合させるステップと
を含む、ナノカプセルを生成する方法。
【請求項１７】
前記重合性基が二重結合含有基である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記重合性基が、ビニル、アクリル、アルキルアクリル、およびメタクリルから選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記共重合させるステップが、少なくとも２種の異なるモノマー単位を含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１種のモノマー単位が、ｐＨ＝７．４で正電荷または負電荷を有する、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記共重合させるステップが架橋剤をさらに含む、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記架橋剤が分解性架橋剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ナノカプセルの表面を修飾するステップをさらに含む、請求項１６から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
有効濃度の請求項１から１５のいずれか一項に記載のナノカプセルに細胞を暴露するステップを含む、タンパク質を送達する方法。
【請求項２５】
前記タンパク質が治療用タンパク質である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００９年３月９日に出願された米国仮出願第６１／１５８，５８８号（この全体の内容は、参考として本明細書に援用される）および２００９年１０月２２日に出願された米国仮出願第６１／２５４，１２１号（この全体の内容は、参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、Ｄｅｆｅｎｓｅ  Ｔｈｒｅａｔ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ａｇｅｎｃｙ（ＤＴＲＡ）によって付与された助成金第ＢＲＢＡＡ０７−Ｅ−２−００４２号の政府の支援によってなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、細胞内タンパク質送達ビヒクル、該ビヒクルを調製方法、およびタンパク質を細胞標的に送達するための該ビヒクルの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
平均的な真核細胞は、通常の細胞機能に関与する何千もの異なるタンパク質を含有する。ほとんどの人間の疾患は、何らかの形で、特定タンパク質の全身性または限局性の機能不全に関連付けられる。これに関して、タンパク質療法（非特許文献１）は、そのような疾患を治療するための最も直接的で安全な手法を提供する。組換えＤＮＡ技術の最近の進歩により、多種多様の医薬用タンパク質の合成が可能となっている（非特許文献２；非特許文献３）が、タンパク質療法の広範な使用は、細胞内送達の効率が低いことやプロテアーゼに対するタンパク質の安定性が低いこと等、まだいくつかの根本的な技術的障壁により制限されている。
【０００５】
治療用タンパク質の細胞内における使用は、癌およびタンパク質欠乏性疾患の治療において非常に重要である（Ｗａｄｉａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  （Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）、３６５頁、２００２年）。しかしながら、細胞外活性タンパク質の用途が幅広いのと比較して、細胞内活性タンパク質薬物は、血清中での安定性が悪く、細胞膜の透過性が低いことに一部起因して、臨床用途が極めて少ない（非特許文献１）。いくつかのタンパク質は、受容体媒介エンドサイトーシスにより細胞外空間から細胞内に移行し得る（Ｖｙａｓら、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．、第１８巻、１〜７６頁、２００１年；Ｓａｔｏら、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．、第１９巻、４４５〜４６７頁、１９９６年）が、それらのタンパク質はエンドソーム内に取り込まれ、適切な細胞内コンパートメントに放出されずにリソソーム内で分解され得る。この問題を回避するための取り組みが次第に行われている。例えば、リポソームに包まれたタンパク質は、細胞質内に輸送されるものの、効率が低いことが示されている（Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、第１７９巻、１４８〜１５４頁、１９８５年；Ｂｕｌｍｕｓら、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ、第９３巻、１０５〜１２０頁、２００３年）。最近、いくつかの微小カチオン性ペプチド（細胞透過性ペプチド、ＣＰＰと呼ばれる）が同定され、タンパク質送達を補助するために使用された（Ｆａｗｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第９１巻、６６４〜６６８頁、１９９４年；Ｍｏｒｒｉｓら、第１９巻、１１７３〜１１７６頁、２００１年；Ｓｃｈｗａｒｚｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８５巻、１５６９〜１５７２頁、１９９９年）。細胞内送達効率が大幅に改善され、細胞内で活性が保持されるため、この戦略は医薬的用途において有望である。また、これらの戦略を用いるとタンパク質を細胞内に送達することができるものの、細胞内のタンパク質の安定性が低いことが、まだ治療用タンパク質の幅広い用途を妨げている。様々な考えられる不活性化要因（Ｆａｇａｉｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．、第１２５２巻、１〜１４頁、１９９５年）のうち、血清中のプロテアーゼ消化が決定的な要因であり、細胞内タンパク質送達の成功を確実とするにはこれに対処する必要がある（Ｈｏｏｐｅｒ，  Ｎ．  Ｍ．  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、（Ｐｏｒｔｌａｎｄ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）、２００２年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｉｒｃｈら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００５年）（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ）、１〜１６頁
【非特許文献２】Ｎａｇｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．（２００３年）第２巻、７５〜７９頁
【非特許文献３】Ｂｒｅｋｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．（２００３年）第２巻、５２〜６２頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の態様は、単一タンパク質コアと、タンパク質コアに共有結合によって固定された薄いポリマーシェルとを有するタンパク質ナノカプセルを含む。いくつかの実施形態において、単一タンパク質コアは、複数の重合性基を有するタンパク質である。いくつかの実施形態において、単一タンパク質コアは、タンパク質触媒である。いくつかの実施形態において、ナノカプセルは、タンパク質コアの触媒活性を保持する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、単一タンパク質コアは、少なくとも１種のモノマーと共重合してナノカプセルを形成する。他の実施形態において、単一タンパク質コアは、少なくとも１種のモノマーおよび少なくとも１種の架橋剤と共重合している。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ナノカプセルは、表面修飾をさらに含む。表面修飾剤は、発光分子、細胞標的化部分、ペプチド、タンパク質、抗体またはオリゴ糖であってもよい。表面修飾剤は、造影剤（ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、細胞標的化促進剤（ｃｅｌｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）、または細胞透過促進剤（ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）として機能し得る。
【００１０】
本発明の別の態様は、少なくとも１つの重合性基を有するタンパク質を誘導体化し、次いで誘導体化されたタンパク質をモノマー単位と共重合させることにより、ナノカプセルを調製する方法を含む。いくつかの実施形態において、共重合は、架橋剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、ナノカプセルの表面を修飾するステップをさらに含む。
【００１１】
本発明の別の態様は、有効濃度の上述のナノカプセルに細胞を暴露することによりタンパク質を送達する方法を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、アクリルアミド（１）、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート（２）、および非分解性架橋剤メチレンビスアクリルアミド（３）または酸分解性グリセロールジメタクリレート（４）のｉｎ  ｓｉｔｕ共重合により調製された、分解性および非分解性ポリマーシェルを有する例示的なカチオン性単一タンパク質ナノカプセルの合成および細胞取り込みを示す概略図である。Ｉ、タンパク質表面に重合性アクリル基を複合化することによる、重合性タンパク質の形成；ＩＩ、１、２および３からの非分解性ナノカプセルの形成；ＩＩＩ、１、２および４からの分解性ナノカプセルの形成；ＩＶ、エンドサイトーシスによる分解性または非分解性ナノカプセルの細胞取り込み；Ｖ、分解性ナノカプセルのシェルは、内在化後に分解してタンパク質カーゴを放出し、大分子基質と相互作用させる。
【図２】図２は、Ｎ−アクリルオキシスクシンイミド（ＮＡＳ）による修飾前後のタンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。図２Ａは、ネイティブＥＧＦＰ（１）および修飾ＥＧＦＰ（２）を示す。図２Ｂは、ネイティブＨＲＰ（１）および修飾ＨＲＰ（２）を示す。図２Ｃは、ネイティブＳＯＤ（１）および修飾ＳＯＤ（２）を示す。図２Ｄは、ネイティブカスパーゼ−３（１）および修飾カスパーゼ−３（２）を示す。
【図３】図３は、５０ｍＭのｐＨ７．０リン酸緩衝液中のネイティブＥＧＦＰおよびｎＥＧＦＰの、４８９ｎｍの励起波長を用いた蛍光スペクトルを示す。
【図４】図４は、例示的ナノカプセルのサイズを示す。図４Ａは、ＨＲＰナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。図４Ｂは、ＨＲＰナノカプセルのＡＦＭ画像を示す。図４Ｃは、単一の１．４ｎｍ金量子ドット標識化ＨＲＰコアを含有するナノカプセルのＴＥＭ画像を示す。これらの図は、単一コアのナノスケール構造の形成を裏付けている。
【図５】図５は、動的光散乱（ＤＬＳ）により決定された、ＨＲＰおよびｎＨＲＰの粒度分布を示す。
【図６】図６は、ゼータ電位に対するモノマーの重量比の効果を示す。図６Ａは、異なるモノマー重量比（上から下の順に、ＤＭＡＥＭＡ（２）／ＡＡｍ（１）＝０、１／３、１）で形成されたナノカプセルのゼータ電位分布を示す。図６Ｂは、異なるモノマー重量比（上から下の順に、モノマー２対モノマー１＝１／６、１／３、１、ゼータ電位：２．２３、５．８３から１０．９３ｍＶ）で形成されたｎＨＲＰのゼータ電位分布を示す。
【図７】図７は、ネイティブＨＲＰ（左）およびｎＨＲＰ（右）の相対触媒活性を示す。ネイティブＨＲＰおよびｎＨＲＰの活性試験は、既存のプロトコル（Ｄａｖｉｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、第２５６巻、５９９２〜５９９６頁、１９８１年）に従った。簡潔には、試験中、ｐＨ５．５の１００ｍＭクエン酸リン酸塩０．９ｍｌ、０．０２ＭのＨ２Ｏ２  ０．０５ｍｌ、および０．２μｇ／ｍＬのＨＲＰまたはｎＨＲＰ  １０μＬを試験管内に入れた。０．０２ＭのＴＭＢを含有するＤＭＳＯ  ０．０５ｍｌを添加することにより反応を開始させ、６５５ｎｍで監視した。ＴＭＢの酸化速度は、ＴＭＢの酸化生成物のモル吸収係数（３９，０００Ｍ−１ｃｍ−１）を使用し、吸着曲線の初期線形部分の傾きから導出した。
【図８】図８は、例示的ナノカプセルのプロテアーゼに対する安定性を示す。図８Ａは、５０℃での１ｍｇ／ｍＬトリプシンおよびキモトリプシンへの暴露後のネイティブＥＧＦＰおよびＥＧＦＰナノカプセルの蛍光強度の比較を示すが、ＥＧＦＰナノカプセルが、プロテアーゼに対し極めて安定であることを示唆している（蛍光強度は、プロテアーゼへの暴露前の未接触ＥＧＦＰに正規化した）。図８Ｂは、４００ｎＭのＥＧＦＰナノカプセルとの３時間、４８時間および１４４時間のインキュベーション後のＨｅＬａ細胞の細胞蛍光強度を示すが、細胞の繁殖に起因する強度低下を示している。図８Ｃは、４００ｎＭのＴＡＴ−ＥＧＦＰ融合タンパク質との３時間のインキュベーション後のＨｅＬａ細胞の細胞蛍光強度を示すが、未修飾タンパク質の急速な分解を示している。図８Ｄは、異なる時間でのｎＥＧＦＰまたはＴＡＴ−ＥＧＦＰ融合タンパク質による処理後の細胞の細胞蛍光強度を示す。
【図９】図９は、規定温度でのＥＧＦＰナノカプセルまたは未接触ＥＧＦＰとの３時間のインキュベーション後のＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡画像を示し、細胞はＤＡＰＩで対比染色されている（スケールバー＝５０μｍ）。
【図１０】図１０は、ローダミン標識化ｎＨＲＰの取り込みを示す蛍光画像を示す。細胞は、ＥＥＡ１（初期エンドソームに対して）またはＲａｂ７（リソソームに対して）で対比染色された。
【図１１】図１１は、異なる時間でのＥＧＦＰナノカプセルとのインキュベーション後のＨｅｌａ細胞蛍光強度を示す。ＨｅＬａ細胞は、異なる時間４００ｎＭのＥＧＦＰナノカプセルとインキュベートし、洗浄し、トリプシン処理し、ＦＡＣＳ分析に供した。
【図１２】図１２は、ＴＡＴ−ＥＧＦＰおよびアンテナペディア−ＥＧＦＰ複合体と比較したナノカプセル、ならびに細胞取り込みに対するゼータ電位の効果を示す。図１２Ａは、異なる濃度のｎＥＧＦＰ（１１．７ｎｍ、ゼータ電位１０．９ｍＶ）、ＴＡＴ−ＥＧＦＰ融合タンパク質またはネイティブＥＧＦＰとインキュベートしたＨｅＬａ細胞の蛍光支援細胞分類を示す。図１２Ｂは、ネイティブＥＧＦＰ、ＥＧＦＰナノカプセル（ｎＥＧＦＰ）、アンテナペディア−ＥＧＦＰ複合体（ＡＮＴＥ−ＥＧＦＰ）による処理後のＨｅＬａ細胞の細胞蛍光分布を示す。図１２Ｃは、ＥＧＦＰナノカプセルのゼータ電位と、ＥＧＦＰナノカプセルとの３時間の共培養後のＨｅＬａ細胞の平均細胞蛍光強度との相関を示す。
【図１３】図１３は、インキュベーション時間の延長のナノカプセル取り込みに対する効果を示す。図１３Ａおよび１３Ｂは、異なる時間のｎＥＧＦＰとのインキュベーション後のＨｅｌａ細胞蛍光強度を示す。ＨｅＬａ細胞は、異なる時間４００ｎＭのｎＥＧＦＰとインキュベートし、洗浄し、トリプシン処理し、ＦＡＣＳ分析に供した。
【図１４】図１４は、ナノカプセルサイズの細胞取り込みに対する効果を示す。異なるサイズのｎＥＧＦＰとのインキュベーション後のＨｅＬａ細胞の細胞蛍光強度分布である（赤：７．５３ｎｍ、緑：１０．６ｎｍ、紫：１５．７ｎｍ）。
【図１５】図１５は、異なる温度、および３つの異なるエンドサイトーシス阻害剤：アミロリド、ＣＰＺおよびβ−シクロデキストリン（β−ＣＤ）の存在下での、ＨｅＬａ細胞の平均細胞蛍光強度を示す。蛍光強度は、３７℃でｎＥＧＦＰとインキュベートされた細胞に正規化されている。
【図１６】図１６は、１００μＭクロロキンによる処理あり、またはなしでの３時間のＥＧＦＰナノカプセルとのインキュベーション後のＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡画像を示す（スケールバー＝２０μｍ）。
【図１７】図１７は、金量子ドット標識化ＨＲＰナノカプセルとのインキュベーション後のＨｅＬａ細胞のＴＥＭ画像を示す。濃い矢印は、細胞サイトゾル内の単一ナノカプセルの分散を示し、薄い矢印は、ナノカプセルのクラスタを示す。
【図１８】図１８は、複数タンパク質送達を示す。図１８Ａは、ローダミン−Ｂ標識化ｎＨＲＰ（赤）、ｎＥＧＦＰ（緑）、およびＮＩＲ−６６７標識化ｎＢＳＡ（青）の導入後のＨｅＬａ細胞の共焦点画像を示す。図１８Ｂは、ｎＥＧＦＰ、ＮＩＲ−６６７標識化ｎＢＳＡ、およびローダミン−Ｂ標識化ｎＨＲＰが同時にＨｅＬａ細胞内に導入された後の、これらのナノ粒子の共局在化定量を示す。
【図１９】図１９は、ＭＴＴ分析により決定される、３時間のＥＧＦＰナノカプセルとの共培養と、それに続く新鮮培地中での１２時間のインキュベーション後のＨｅＬａ細胞の相対細胞増殖速度を示し、細胞増殖速度は、いかなる薬剤でも処理していないＨｅＬａ細胞に正規化した。
【図２０】図２０は、異なる濃度のＨＲＰまたはＨＲＰナノカプセルとの３時間のインキュベーションと、それに続くＰＢＳ洗浄、ならびにＰＢＳ中の１ｍＭのＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）および１μＭのＨ２Ｏ２との１０分間のインキュベーション後の、ＨｅＬａ細胞の写真を示す。
【図２１】図２１は、ＨＲＰおよびＳＯＤナノカプセルの細胞内の活性を示す。図２１Ａは、４００ｎＭネイティブＨＲＰまたはｎＨＲＰの導入およびＩＡＡとの１２時間のインキュベーション後のＨｅＬａ細胞生存能力を示す、ＭＴＴ分析を示す。細胞増殖速度は、未処理細胞に正規化した。図２１Ｂは、ｎＳＯＤおよびパラコートとのインキュベーション後のＨｅＬａ細胞生存能力を示す。未処理細胞は、１００％細胞増殖対照として使用し、パラコートのみで処理した細胞は、０％対照として使用した。データは平均を示し、エラーバーは、３回行った３つの独立した実験からのものである。
【図２２】図２２は、ＥＧＦＰナノカプセルまたはＨＲＰナノカプセルの投与および１ｍＭジヒドロエチジウムへの暴露後の、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの組織切片の共焦点画像を示す。
【図２３】図２３は、例示的な分解性ナノカプセルの異なるｐＨでのサイズ変化を示す。図２３Ａは、分解性ＣＡＳナノカプセル（ｄｅ−ｎＣＡＳ）および非分解性ＣＡＳナノカプセル（ｎＣＡＳ）のｐＨ５．５でのサイズを示す。図２３Ｂは、分解性ＣＡＳナノカプセル（ｄｅ−ｎＣＡＳ）および非分解性ＣＡＳナノカプセル（ｎＣＡＳ）のｐＨ７．４でのサイズを示す。
【図２４】図２４は、５０℃のｐＨ７．４緩衝液中１ｍｇ  ｍｌ−１トリプシンおよびα−キモトリプシン（ａ−ｃｈｙｍｏｓｔｒｙｐｓｉｎ）への暴露後の、ネイティブＥＧＦＰ、非分解性ＥＧＦＰナノカプセル（ｎＥＧＦＰ）および分解性ＥＧＦＰナノカプセル（ｄｅ−ｎＥＧＦＰ）の蛍光強度を示す。蛍光強度は、プロテアーゼ添加前のネイティブＥＧＦＰに正規化されている。
【図２５】図２５は、ｎＥＧＦＰまたはｄｅ−ｎＥＧＦＰとの３時間のインキュベーションと、それに続く新鮮培地中でのインキュベーション後の、異なる時間でのＨｅＬａ細胞の蛍光強度を示す。蛍光強度は、新鮮培地とのさらなるインキュベーションを行わなかった各細胞に正規化されている。
【図２６】図２６は、様々な濃度のｄｅ−ｎＣＡＳ、ｎＣＡＳ、ＣＡＳ、ｄｅ−ｎＢＳＡまたはｎＢＳＡとの４８時間のインキュベーション後の細胞増殖プロファイルを示す、ＭＴＴ分析を示す。データは、未処理細胞に正規化されている。
【図２７】図２７は、ネイティブＣＡＳ、ｎＣＡＳまたはｄｅ−ｎＣＡＳが導入されたＨｅＬａ細胞を示す、ＡＰＯ−ＢｒｄＵＴＭ  ＴＵＮＥＬ分析を示す。ｄｅ−ｎＣＡＳとインキュベートされた細胞内のＰＩ染色核およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８染色ニックエンド標識は、アポトーシスＤＮＡ断片化を示している。データは平均を示し、エラーバーは、３回行った３つの独立した実験からのものである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態を以下で詳細に説明する。実施形態の説明において、明確性のために具体的な用語が使用される。しかしながら、本発明は、そのように選択された具体的な用語に制限されることを意図しない。本発明の広い概念から逸脱しない範囲で、他の等価の成分を使用することができ、また他の方法を考案することができることが、関連技術の当業者には認識される。本明細書中のいずれかで引用される全ての参考文献は、参照することにより、それぞれが個々に組み込まれているかのように組み込まれる。
【００１４】
本明細書において、値の範囲が示されている場合、文脈上異なる定義が明示されていない限り、その範囲の上限および下限の間の、下限の単位の１０分の１までの各介在値、ならびにその示された範囲内の任意の他の示された値または介在値が、本発明に包含されることが理解される。任意の範囲の端点の値は、その範囲内に含まれる。
【００１５】
本発明の実施形態は、単一タンパク質コアと、タンパク質コアに共有結合によって固定された薄いポリマーシェルとを有するナノカプセルを含む。いくつかの実施形態において、ナノカプセルは、正電荷を有する。いくつかの実施形態において、ナノカプセルは、約５ｎｍから約２００ｎｍの間の最大寸法を有してもよい。サイズは、単一タンパク質コアのサイズおよび薄いポリマーシェルの厚さによって変わり得る。小さいサイズおよび電荷が、高い細胞内効率をもたらす。各ナノカプセルは、共有結合によって連結した２つの部分、すなわち単一タンパク質コアおよび薄いポリマーネットワークシェルを含有する。そのコアシェル構造は、タンパク質をタンパク質分解および熱変性から保護し、生体内または生体外での高い安定性をもたらす。
【００１６】
本明細書において使用される場合、単一タンパク質コアは、ナノカプセルが、薄いポリマーシェルを有する単一の機能性タンパク質を含むことを意味する。多くの場合、単一の機能性タンパク質は、単一のポリペプチドである。対象のタンパク質がマルチマー（すなわち、二量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、三量体等）として正常に機能する場合、単一タンパク質コアはマルチマーを含む。例えば、カスパーゼ−３（ＣＡＳ）の活性型は二量体であり、カスパーゼ−３を含有するナノカプセルは、単一タンパク質コアとして二量体を含む。複数の機能を有する融合タンパク質もまた単一タンパク質コアに使用することができるが、通常互いに相互作用して機能性単位を形成しない複数のタンパク質は、単一タンパク質コアではない。通常会合して機能性単位を形成しない同じタンパク質の複数の複製は、単一タンパク質コアではない。
【００１７】
ナノカプセルは、離散した粒度分布および低い粒度分布を有する。単一タンパク質コアは、ポリマーコーティング内にカプセル化される。いくつかの実施形態において、ポリマーコーティングは架橋して、タンパク質をカプセル化するポリマーコーティグの密度を増加させる。いくつかの実施形態において、ポリマーは、タンパク質上の少なくとも３、４、５、７、１０、１５、または２０箇所で、薄いポリマーシェルに共有結合によって固定される。いくつかの実施形態において、ポリマーは、少なくとも３箇所で、薄いポリマーシェルに共有結合によって固定される。これにより、タンパク質は確実にポリマーネットワーク内にカプセル化される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ナノカプセルは、約５ｎｍから約２００ｎｍの間の最大寸法を有してもよい。ナノカプセルのサイズは、単一タンパク質コアのサイズおよび薄いポリマーシェルの厚さに一部依存する。いくつかの実施形態において、ナノカプセルは、約１０ｎｍから約２００ｎｍの間、約５から約１００ｎｍの間、約５ｎｍから５０ｎｍの間、または約１０ｎｍから約３０ｎｍの間であってもよい。いくつかの実施形態において、ポリマーシェルは、約１ｎｍから約２０ｎｍの間の厚さであってもよい。いくつかの実施形態において、ポリマーシェルは、約１ｎｍから約１０ｎｍの間の厚さであってもよい。いくつかの実施形態において、ナノカプセルは略球形であるが、形状は、単一タンパク質コアの形状に依存して変動し得る。一例として、厚さ約２ｎｍのポリマーシェルを有する直径約５ｎｍの単一タンパク質コア（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）等）は、約９ｎｍの全体的サイズを有する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、タンパク質は、タンパク質触媒（すなわち酵素）であってもよい。いくつかの実施形態において、タンパク質は、発光等の別の機能を有してもよい（例えばＥＧＦＰ）。化学的にまたは共有結合によって修飾されたタンパク質は、その修飾がナノカプセルの形成に干渉しない限り、所望により使用することもできる。一般に、任意のタンパク質を本発明によるナノカプセル内に組み込むことができ、またタンパク質の実用性に基づき選択することができる。いくつかの実施形態において、タンパク質は、化粧品用途または治療用途において有用である。ナノ粒子を構築するために使用されるタンパク質の典型的な例には、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カスパーゼ−３、およびリパーゼが含まれる。ローダミン−Ｂ標識化ＨＲＰおよびＮＩＲ−６６７標識化ＢＳＡ等の化学修飾タンパク質もまた使用されている。様々な異なる用途の具体的なタンパク質の例を、以下の表に示す。タンパク質の他の例は、当業者に明らかである。
【００２０】
【表１−１】
2012519733.tif 000003
いくつかの実施形態において、ポリマーシェルは透過性である。本明細書において使用される場合、透過性は、ポリマーシェルにおける細孔もしくは穴を通して、またはポリマーを通した拡散により、分子がポリマーシェルを通過し得ることを意味する。例えば、基質、補因子および他の化学元素がポリマーシェルを通過することができ、これによりナノカプセルは単一タンパク質コアの活性を保持することができる。
【００２１】
これらのナノカプセル内のタンパク質は、非修飾タンパク質よりも安定である。安定性は、経時的なタンパク質活性の損失、またはタンパク質の分解もしくは変性で決定される。いくつかの実施形態において、ナノカプセルは、プロテアーゼによる分解に耐性を有する。薄いポリマーシェルは、プロテアーゼ酵素に対するタンパク質コアの暴露を低減する。その結果、タンパク質コアの活性は、プロテアーゼの存在下（例えば生体内、血清中、または細胞内）で、保護されていないネイティブタンパク質より長く持続する。薄いポリマーシェルは、タンパク質構造を安定化し、タンパク質の凝集を防止する。したがって、ナノカプセルは、ｐＨおよび温度の変化に対しより耐性を有する。例えば、ナノカプセルは、ネイティブタンパク質よりも、室温または低温（すなわち冷蔵または冷凍）での保存寿命が長い。同様に、ナノカプセルは、ネイティブタンパク質よりも、複数回の冷凍／解凍サイクル後に活性を失いにくい。薄いポリマーシェルによりタンパク質構造が安定化されるため、ナノカプセルは、有機溶媒および界面活性剤に対しより耐性を有する。ポリマーコーティングはまた、有機溶媒中での溶解性を増加させるために調節され得る。ナノカプセルとともに使用され得る有機溶媒および界面活性剤の例には、化粧品（すなわちメークアップ）および医薬品において広く使用されるものの中でも、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、４−ジクロロベンゼン、パラジクロロベンゼン、１，４−ジオキサン、１，４−ジオキサンＰＥＧ、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン、ラウレス硫酸ナトリウムまたはオキシノール、ポリソルベート６０、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、２−ブトキシ−１−エタノール、アルキルフェノキシ、ポリエトキシエタノールが含まれる。他の有機溶媒は、当業者に明らかである。薄いポリマーコーティングは凝集を防止するため、ナノカプセルは、保護されていないタンパク質が凝集する傾向がある界面（すなわち気／液または液／固界面）においてより安定である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ナノカプセルは、単一タンパク質コアの活性を保持する。単一タンパク質コアが蛍光性（例えばＥＧＦＰ、または蛍光標識化ＢＳＡ）である場合、ナノカプセルもまた蛍光性である。単一タンパク質コアが酵素的に活性である場合、酵素活性はナノカプセル内に存在する。ナノカプセルの活性は、ポリマーシェルのない単一タンパク質コアに比べて低くなり得る。いくつかの実施形態において、ナノカプセルの活性は、ネイティブタンパク質の少なくとも約３０％である。他の実施形態において、ナノカプセルの活性は、ネイティブタンパク質の少なくとも約５０％、ネイティブタンパク質の少なくとも約７０％、またはネイティブタンパク質の少なくとも約９０％である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、単一タンパク質コアは、複数の重合性基を有するタンパク質である。重合性基は、ある特定の化学的条件下で重合する化学部分である。重合条件の例には、光重合、ラジカル重合、および触媒誘導重合が含まれる。一般に、重合性基がナノカプセルを形成するために使用されるモノマーと重合することができる限り、重合性基の種類は決定的ではない。重合性基の例には、光重合またはラジカル重合により重合する二重結合含有部分が含まれる。いくつかの実施形態において、重合性基は、ビニル基、アクリル基、アルキルアクリル基（すなわち、メタクリル等のアルキル置換基を有するアクリル基）である。本明細書において使用される場合、アクリル（アルキルアクリル、メタクリル等）は、アクリルエステルおよびアクリルアミドを含む。いくつかの実施形態において、重合性基は、タンパク質コアのリジン残基に共有結合したアクリル基である。
【００２４】
タンパク質は、容易に修飾され得る多くの異なる表面アミノ酸を含有する。例えば、リジン、システイン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、ヒスチジン、アルギニン、チロシン、プロリンおよびトリプトファンは、公知のプロセスおよび手順を使用して容易に修飾され得る。タンパク質を修飾するために使用される試薬は、少なくとも１つの重合性基と、タンパク質表面上のアミノ酸側鎖と反応する少なくとも１つの反応基とを有する。アミノ酸側鎖と反応するために使用される反応基の例には、ある特定のカップリング試薬で活性化されると、アミン（例えばリジン）およびヒドロキシル（例えばトレオニンまたはセリン）含有残基と反応する活性化エステル（例えばハロゲン化アシルまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）；チオール（例えばシステイン）含有残基と反応するマレイミド；ならびにカルボン酸（例えばグルタミン酸およびアスパラギン酸）含有残基と反応するアミンが含まれる。このように、重合性基は、単一タンパク質コアに共有結合する。重合性基は、直接結合してもよく、または連結基を介して結合してもよい。
【００２５】
いくつかの実施形態において、連結基は、タンパク質コアと重合性基との間に存在する。連結基は、重合性基とタンパク質コアとを分離する化学部分である。連結基として使用される試薬は、少なくとも１つの重合性基と、連結基により分離された少なくとも１つの反応基とを有する。反応基は、通常タンパク質表面上のアミノ酸側鎖との反応によりタンパク質コアと反応し、その間の連結基により重合性基を単一タンパク質コアに共有結合させる。
【００２６】
いくつかの実施形態において、連結基は分解性であってもよい。分解性連結基は、ある特定の条件下で切断する化学部分である。例として、分解性連結基は、例えば、ある特定のｐＨ値（高ｐＨまたは低ｐＨ）で加水分解し得るか、あるいは光分解的に（すなわちある特定の波長の光が照射されると）、またはある特定の温度下、還元−酸化条件下、もしくは触媒作用によって（すなわちプロテアーゼにより）切断し得る。タンパク質コアと反応する反応基と、ナノカプセルを形成する重合性基とを連結基が有する限り、任意の好適な分解性連結基を使用することができる。分解性連結基はまた、ナノカプセルの重合中に安定である必要がある。連結基の種類は、連結基が切断する条件に基づき選択することができる。多くの連結基が公知であり、当業者に容易に明らかとなる。
【００２７】
いくつかの実施形態において、ナノカプセルは、モノマー単位と共重合した単一タンパク質コアである。モノマー単位は、単一タンパク質コアと重合してコポリマーを形成し、ナノカプセルのポリマーシェルを形成する化学部分である。いくつかの実施形態において、単一タンパク質コアが二重結合を有する重合性基、例えばビニル、アクリル、アルキルアクリルまたはメタクリル基を備える場合、モノマー単位もまた二重結合を有する重合性基、例えばビニル、アクリル、アクリルアミド、アルキルアクリル、アルキルアクリルアミド、メタクリルまたはメタクリルアミド基を有する。タンパク質の重合性基、およびモノマー単位の重合性基は、ナノカプセルを形成するために使用される条件下でコポリマーを形成することができる限り、同じであっても異なっていてもよい。例えば、ビニルおよびアクリル基は、ラジカル重合条件下でコポリマーを形成し得る。
【００２８】
いくつかの実施形態において、ナノカプセルは、２種以上の異なるモノマー単位と共重合した単一タンパク質コアである。一般に、異なるモノマー単位が全てナノカプセルを形成するために使用される条件下でコポリマーを形成することができる限り、任意の数の異なるモノマー単位を使用してタンパク質コアとのコポリマーを形成することができる。異なる側鎖を有するモノマー単位を使用して、ナノカプセルの表面特徴を改変することができる。表面特徴は、異なるモノマー単位間の比を調節することにより制御することができる。いくつかの実施形態において、モノマーは、中性、中性親水性、疎水性、正荷電または負荷電であってもよい。ナノカプセルの溶解度は、例えば、荷電モノマー単位と非荷電または親水性または疎水性モノマー単位との間の比を変更することにより調節することができる。いくつかの実施形態において、ナノカプセルは、正電荷または負電荷を有する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、少なくとも１種のモノマー単位が、ｐＨ＝７．４で正電荷または負電荷を有する。ｐＨ＝７．４で電荷を有するモノマー単位を使用することにより、ナノカプセルの全体的な電荷は、荷電および非荷電モノマー単位の比を変更することにより変更および調節することができる。いくつかの実施形態において、モノマー単位は、ｐＨ＝７．４で正電荷を有する。正荷電モノマー単位を使用することにより、正電荷を有するナノカプセルを形成することができる。電荷は、中性および正荷電モノマー単位の比を変更することにより調節することができる。
【００３０】
いくつかの実施形態において、ナノカプセルは、少なくとも１種のモノマー単位（上述の通り）および少なくとも１種の架橋剤と共重合した単一タンパク質コアを備える。架橋剤は、２つ以上の重合性基を有する化学化合物である。一般に、架橋剤上の重合性基が、ナノカプセルを形成するために使用される条件下で、タンパク質コアと少なくとも１種のモノマー単位との間で架橋したコポリマーを形成することができる限り、任意の架橋化合物を使用することができる。架橋剤の例には、２つのビニル、アクリル、アルキルアクリル、またはメタクリル基を有する化合物が含まれる。２つのアクリル基を有する具体的な架橋剤の例には、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドおよびグリセロールジメタクリレート（共に図１に示される）が含まれる。
【００３１】
いくつかの実施形態において、架橋剤は、分解性架橋剤である。分解性架橋剤は、ある特定の条件下で切断し、ナノカプセルのポリマーシェルの少なくとも一部の分解または除去をもたらす。例えば、分解性架橋剤は、ある特定のｐＨ（高いまたは低い）で加水分解し得るか、特定酵素（例えばエステラーゼまたはペプチダーゼ）により切断され得るか、ある特定の波長に暴露されると光分解的に切断され得るか、またはある特定の温度で切断され得る。低いｐＨで加水分解する架橋剤の例には、生理学的なｐＨ（約７．４）で安定であるがより低いｐＨ（約５．５）では加水分解するグリセロールジメタクリレートが含まれる。分解性架橋剤の他の例には、参照することによりその全内容が組み込まれる米国特許第７，０５６，９０１号に記載されている、アセタール架橋剤が含まれる。
【００３２】
分解性および非分解性架橋基のさらなる具体例を、以下の表に示す。
【００３３】
【表１−２】
2012519733.tif 000004
タンパク質コアの基質がポリマーコーティングを通過するには大き過ぎる場合、ポリマーコーティングを除去または低減する分解性架橋剤が有利となり得る。例えば、低いｐＨで分解する分解性架橋剤を使用して、ナノカプセルがエンドサイトーシスにより細胞内に内在化した後にポリマーコーティングを除去または低減することができる。血清および後期エンドソームは、それぞれ約７．４および約５．５のｐＨ値を有することが周知である。したがって、ｐＨ約７．４では安定であるがｐＨ約５．５では分解する分解性架橋剤は、ナノカプセルが細胞内に進入した後にのみポリマーコーティングを除去または低減する。このように、タンパク質コアは血清中に存在するプロテアーゼから保護されるが、大きな基質を有するタンパク質コアがまだ細胞に効果的に送達され得る。ポリマーコーティングが低減された後でも、タンパク質コアの活性はまだ存在する。しかしながら、ポリマーコーティングが除去された後、タンパク質コアは細胞内プロテアーゼによる分解を受けやすくなるが、この欠点は、ナノカプセルの増加した血清中安定性および血清プロテアーゼ耐性により相殺される。
【００３４】
ある特定の実施形態において、ナノカプセルは、表面修飾をさらに含む。表面修飾は、ナノカプセルの形成後にナノカプセルの表面に付加される化学部分である。反応性側鎖がナノカプセルの形成に干渉しない限り、反応性側鎖（または保護された反応性側鎖）を有するモノマー単位を使用してナノカプセルを形成することができる。反応性側鎖は、（必要に応じて脱保護後に）表面修飾剤と反応させて、表面修飾をナノカプセルに共有結合させることができる。表面修飾剤は、小分子、ポリマー、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、多糖類、または抗体であってもよい。表面修飾は、ナノカプセルの溶解度を改変する、ナノカプセルの表面電荷を変更する、またはナノカプセルに発光、細胞標的化もしくは細胞透過等の追加的機能を付与することができる。細胞標的化を向上させる表面修飾は、非標的化細胞と比較して、標的細胞へのナノカプセルの導入を増加させる。細胞透過を向上させる表面修飾は、細胞透過促進剤を含まないナノカプセルと比較して、細胞へのナノカプセルの導入を増加させる。ナノカプセル上に、２種以上の表面修飾が存在してもよい。小分子表面修飾の例には、フルオレセインもしくはローダミン等の発光性化合物、または葉酸等の細胞標的化化合物が含まれる。ポリマーは、溶解度を増加させるためのポリエチレングリコールを含む。特定の細胞表面特徴、細胞情報伝達タンパク質、または成長ホルモンに対する抗体等のペプチドを細胞標的化に使用することができる。他のペプチドを使用して、ナノ粒子の細胞透過を増加させることができる（例えばＴＡＴまたはアンテナペディア（ａｎｔｅｎｎｅｐｅｄｉａ）ホメオドメイン）。いくつかの実施形態において、表面修飾は抗体である。
【００３５】
生成
本発明の実施形態は、少なくとも１つの重合性基を有するタンパク質を誘導体化し、次いで誘導体化されたタンパク質をモノマー単位と共重合させることにより、単一タンパク質コアと、タンパク質コアに共有結合によって固定された薄いポリマーシェルとを有するナノカプセルを生成する方法を含む。
【００３６】
単一タンパク質ナノカプセルを形成するために、一般的な２段階手順が使用される。まず、重合性基がタンパク質表面に共有結合によって連結される。次いで、緩衝液中での機能性モノマー、および任意選択で架橋剤の後続する重合により、タンパク質コアのそれぞれが、薄い（架橋ネットワーク）ポリマー外皮で被覆される。この一般法は、所望のタンパク質コアを有する多種多様な低粒度分布ナノカプセルの簡便な合成、ならびに表面電荷および官能基の容易な制御を可能にする。
【００３７】
重合性基が酵素表面に結合したら、モノマー（例えば、表２に列挙されるもの等）を使用して、調整可能な組成、構造、表面特性および機能性を有するポリマーコーティングを形成することができる。酵素活性の保持を確実とするために、室温ラジカル重合技術を使用することができる。これらのポリマーコーティングは、カプセル化された酵素用の人工膜として機能するため、構造的完全性を提供するための好適な機械的強度を示し、迅速な基質輸送を可能にする効果的な輸送経路を有し、基質選択性および保湿を提供する特定の機能性を含有する。
【００３８】
ナノカプセルは、商業的供給源から直接、または他の報告されている方法を使用して得ることができるタンパク質コアの生物機能を変化させない。
【００３９】
タンパク質を誘導体化または修飾するために使用される試薬は、以下の一般構造
【００４０】
【化１】
2012519733.tif 000005
を有し、重合性基は、ナノカプセルを形成するために使用される条件下で、１種または複数種のモノマーおよび／または架橋剤とコポリマーを形成する化学部分である。いくつかの実施形態において、重合性基は、二重結合含有基、例えばビニル、アクリル、アルキルアクリル、およびメタクリルである。前述したように、アクリル（およびアルキルアクリルおよびメタクリル）は、アクリルエステルおよびアクリルアミドの両方を含む。
【００４１】
連結基は任意選択的であり、重合性基とタンパク質との間に存在し得る。連結基は、反応基を重合性基から分離する化学部分である。連結基は、いかなる特定の化学構造にも限定されないが、重合反応に干渉するべきではない。いくつかの実施形態において、連結基は、ある特定の条件下で切断する分解性連結基である。例えば、アセタール、ケタールまたはエステルは、ある特定のｐＨで加水分解され得る。これらの官能基の１つまたは複数を有する連結基は、（例えば、上述したようにエンドソーム内で）ｐＨの変化に応答して分解し得る。
【００４２】
反応基は、アミノ酸側鎖と反応して重合性基をタンパク質に共有結合させる化学部分である。多くの反応基が公知であり、異なるアミノ酸側鎖と反応するために使用される。例えば、ハロゲン化アシル、または活性化エステル（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）は、アミン（例えばリジン上）またはヒドロキシル（例えばセリンもしくはトレオニン上）と反応する。イソシアネートは、アミンと反応する。エポキシドは、アミンまたはチオール（例えばシステイン）と反応する。マレイミドは、チオールと反応する。他の官能基は、１種または複数種のカップリング試薬（例えばカルボジイミド試薬）の存在下で、アミノ酸側鎖と反応し得る。例えば、アミンは、カルボン酸アミノ酸側鎖（例えば、グルタメートまたはアスパルテート上）と反応し得る。他の反応基は、当業者に容易に明らかとなる。
【００４３】
上述のタンパク質修飾中、部位特異的な制御修飾を実現するために、遺伝子組換え技術を使用して、空間的に定義された場所に特定のアミノ酸を導入することができる。この技術により、修飾部位および密度を正確に制御することができる。
【００４４】
タンパク質を誘導体化するために使用される具体的な化合物の例を、表１に示す。多くの他の例が利用可能であり、当業者に明らかである。
【００４５】
【表１−３】
2012519733.tif 000006
モノマー単位は、一般構造
【００４６】
【化２】
2012519733.tif 000007
を有し、重合性基は、ナノカプセルを形成するために使用される条件下で、タンパク質コアおよび任意選択の架橋剤とコポリマーを形成する化学部分である。重合性基は、前述した全ての重合性基を含む。タンパク質の重合性基、およびモノマー単位の重合性基は、ナノカプセルを形成するために使用される条件下でコポリマーを形成することができる限り、同じであっても異なっていてもよい。例えば、ビニルおよびアクリル基は、ラジカル重合条件下でコポリマーを形成し得る。
【００４７】
側鎖は、重合に関与しないモノマー単位の一部である。一般に、側鎖は、任意の構造を有してもよく、ナノカプセルの所望の特性に基づき選択され得る。モノマー単位の側鎖は、ナノカプセルの表面特性に影響する。いくつかの実施形態において、側鎖は、中性、中性親水性（すなわち水溶性であるが荷電していない）、疎水性、正荷電または負荷電であってもよい。中性側鎖は、アミド、エステル、エーテル、ヒドロキシルを含み、そのいくつかは、その構造に依存して親水性または疎水性であってもよい。正荷電側鎖は、アミン（モノおよびジアルキルアミン等の置換アミン、ならびに四置換アンモニウム化合物、ならびにその環式変異型を含む）、グアニジン、ならびにピリジンおよびイミダゾール等の複素環を含む。負荷電側鎖は、カルボン酸を含む。疎水性側鎖は、アルキル基（直鎖、分岐鎖または環式アルキル基を含む）およびアリール基を含む。
【００４８】
具体的なモノマー単位の例およびそれらの機能を表２に示す。
【００４９】
【表２】
2012519733.tif 000008
機能：１から５：親水性表面および保湿；２）温度応答性；３）負荷電表面；４）表面修飾のための反応性側鎖；５）正荷電表面；６）疎水性表面  。
【００５０】
修飾タンパク質およびモノマー単位（複数種可）の重合には、タンパク質およびモノマー単位（複数種可）に対し使用され、重合中にタンパク質の機能を損なわない、重合性基に好適な任意の方法を使用することができる。重合方法の例には、前述したもの等の二重結合含有重合性基の光重合およびラジカル重合が含まれる。いくつかの実施形態において、重合は、ラジカル重合である。
【００５１】
いくつかの実施形態において、重合は室温で行われるが、重合中にタンパク質の機能が失われない限り、温度は、重合方法に依存して、所望により上昇させても低下させてもよい。分解性架橋剤または連結基が使用される場合、ナノ粒子の機能は、ポリマーコーティングの分解後に測定され得る。重合反応があまりにもゆっくりと生じる場合、または重合を開始させるために高温が必要である場合には、反応温度を上昇させてもよい。重合反応があまりにも急速に生じる場合には、温度を低下させてもよい。
【００５２】
いくつかの実施形態において、重合反応は、水中または水性緩衝液中で行われる。溶媒が重合反応に干渉しない、またはタンパク質を分解しない限り、所望により他の溶媒を使用してもよい。反応成分を溶解するために必要である場合には、溶媒混合物が反応に干渉しない、またはタンパク質コアに損傷を与えない限り、水または水性緩衝液と有機共溶媒との混合物を使用してもよい。いくつかの実施形態において、重合反応は、緩衝液中で行われる。
【００５３】
いくつかの実施形態において、共重合ステップは、少なくとも２種の異なるモノマー単位を含む。一般に、異なるモノマー単位が全てナノカプセルを形成するために使用される条件下でコポリマーを形成することができる限り、任意の数の異なるモノマー単位を使用してタンパク質コアとのコポリマーを形成することができる。異なる側鎖を有するモノマー単位を使用して、ナノカプセルの表面特徴を改変することができる。表面特徴は、異なるモノマー単位間の比を調節することにより制御することができる。いくつかの実施形態において、モノマーは、中性、中性親水性、疎水性、正荷電または負荷電であってもよい。ナノカプセルの溶解度は、荷電モノマー単位と非荷電または親水性または疎水性モノマー単位との間の比を変更することにより調節することができる。
【００５４】
いくつかの実施形態において、共重合ステップは、架橋剤をさらに含む。架橋剤は、連結基により分離された少なくとも２つの重合性基を有する試薬である。架橋剤は、３つ以上の重合性基を有してもよい。架橋剤上の全ての重合性基が、ナノカプセルを形成するために使用される条件下でモノマー単位（複数可）およびタンパク質コアとコポリマーを形成することができる限り、架橋剤上の重合性基は、同じであっても異なっていてもよい。２つの重合性基を有する架橋剤は、一般構造
【００５５】
【化３】
2012519733.tif 000009
を有し、重合性基は、前述のものと同じである。連結基は、重合反応に干渉しない限り、任意の構造を有し得る。好適な連結基の例には、アルキル基（置換アルキル基を含む）、アリール基（置換アリール基を含む）、ケトン、アミド、エステル、エーテルおよびそれらの組合せが含まれる。架橋剤の具体例には、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドおよびグリセロールジメタクリレート（図１を参照）が含まれる。
【００５６】
いくつかの実施形態において、連結基は分解性である。分解性連結基は、ある特定の条件下で切断し得る。分解性連結基の構造は、連結基を切断させるために必要な条件の種類を決定付ける。例えば、連結基は、ｐＨの変化（すなわち増加または減少）により、特定波長の光への暴露により、または熱に応答して切断し得る。分解性架橋剤の例は、グリセロールジメタクリレートである。
【００５７】
いくつかの実施形態において、ナノカプセルを生成する方法は、ナノカプセルの表面を修飾するステップをさらに含む。モノマー単位（複数種可）の側鎖は、重合後、ナノカプセルの表面上に存在する。反応性側鎖（または保護された反応性側鎖）を有するモノマー単位を使用して、ナノカプセルを調製することができる。反応性側鎖は重合に干渉しないが、ナノカプセルが形成された後に（すなわち重合が完了した後に）さらに化学修飾され得る。標準的化学脱保護方法を使用して、保護された反応性側鎖を脱保護し、次いで化学修飾剤と反応させることができる。反応性側鎖は、表面修飾剤をナノカプセルの表面に共有結合させるために化学試薬で処理される。表面修飾は、小分子、ポリマー、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、多糖類、または抗体であってもよい。表面修飾は、ナノカプセルの溶解度を改変する（例えば、ポリエチレングリコールまたは他の親水性基を添加することにより）、ナノカプセルの表面電荷を変化させる（例えば、荷電表面修飾剤を添加することにより）、またはナノカプセルに発光、細胞標的化もしくは細胞透過等の追加的機能を付与することができる。小分子表面修飾の例には、フルオレセインもしくはローダミン等の発光性化合物、または葉酸等の細胞標的化化合物が含まれる。ポリマーは、溶解度を増加させるためのポリエチレングリコールを含む。ペプチドおよびポリペプチドを細胞標的化に使用してもよく、これには、特定の細胞表面特徴、細胞情報伝達ペプチド、またはホルモンに対し選択的な抗体が含まれ得る。他のペプチドを使用して、ナノ粒子の細胞透過を増加させることができる（例えばＴＡＴまたはアンテナペディアホメオドメイン）。いくつかの実施形態において、表面修飾は抗体である。ナノカプセルは誘導体化されやすい表面を有しているため、特定の抗体がナノカプセルと複合化して、標的化送達のさらなる能力を提供することができる。
【００５８】
ナノカプセルのサイズおよび表面特徴は、ナノカプセルを形成するために使用される異なるモノマーおよび／または架橋剤の重量比を変更することにより調節することができる。例えば、ＤＭＡＥＭＡ（正荷電）対ＡＡｍ（中性）の重量比を０：１から１：３、さらには１：１に変えると、それぞれ−１２．８から８．６４、さらには１５．２ｍＶ（図６Ａ）という調節可能なゼータ電位を有するＢＳＡナノカプセルを合成することができる。モノマー単位および架橋剤の種類および比を変化させることにより、溶解度もまた容易に調節することができる。親水性または荷電モノマーの量を増加させると、水溶性が増加する。疎水性モノマーの量を増加させると、有機溶媒または混合有機／水溶媒系に対するナノカプセルの溶解度が増加する傾向がある。
【００５９】
薄いポリマーコーティングの透過性は、ナノカプセルを調製するために使用される反応混合物中の架橋剤の比を変更することにより調節することができる。一般に、架橋剤の量が少ない程、より高い透過性が得られる。同様に、薄いポリマーコーティングの透過性は、架橋剤上の連結基の長さを変化させることにより変更することができる。一般に、連結基が長い程、透過性の増加がもたらされる。
【００６０】
この単純な方法は、サイズ、表面特徴が良好に制御され、また任意のタンパク質コアを使用した、新規なタンパク質細胞内送達ベクターの調製への効果的な経路を提供する。
【００６１】
使用
ナノカプセルは、内部に組み込まれたタンパク質に非常に類似した細胞内機能を果たす。多種多様なタンパク質を使用して、異なる機能を果たすナノカプセルを形成することができる。試験された例示的な生物活性タンパク質には、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）が含まれる。
【００６２】
本明細書に記載のナノカプセルは、生体外または生体内において、改善された安定性および／または長期間の効果をもって細胞にタンパク質またはタンパク質活性を送達するために使用され得る。ナノカプセルはプロテアーゼによる分解に対しより耐性を有するため、タンパク質活性は、ネイティブまたは保護されていないタンパク質が投与された場合よりも長い効果を有する。その結果、（保護されていないタンパク質と比較して）同じ効果を得るためにより少ないタンパク質（ナノカプセルの形態）が必要となり、それにより効率が向上する。
【００６３】
本発明の実施形態は、有効濃度の上述のナノカプセルに細胞を暴露することによりタンパク質を送達する方法を含む。細胞は、培地内（すなわち生体外）にあってもよく、または生物内（すなわち生体内）に存在してもよい。本明細書において使用される場合、「タンパク質を送達する」とは、タンパク質はナノカプセルを形成するように修飾されているため、タンパク質の活性を細胞に送達することを意味する。しかしながら、ナノカプセルの活性は、ナノカプセルに使用されるネイティブタンパク質の活性と同じである。タンパク質基質がナノカプセルを透過しない場合、分解性ポリマーコーティングを使用して、ポリマーコーティングの低減または除去後に細胞にタンパク質を送達することができる。
【００６４】
いくつかの実施形態において、タンパク質は、治療用タンパク質である。治療用タンパク質は、対象における疾患または障害を治療するために使用されるタンパク質または酵素である。いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物または人間である。
【００６５】
本明細書に記載のナノカプセルは、対象における疾患または障害を治療するために使用され得る任意のタンパク質または酵素と併用することができる。例えば、本発明によるナノカプセルは、過剰増殖性障害、癌、または腫瘍の治療に使用され得る。他の実施形態において、ナノカプセルは、化粧品に使用され得る。
【００６６】
医薬組成物
本明細書に記載のナノカプセルは、診断または治療上の処置方法における使用のための、様々な組成物に配合することができる。組成物（例えば医薬組成物）は、キットとして製造することができる。一般に、本発明の医薬組成物は、有効量（例えば医薬的有効量）の本発明の組成物を含む。
【００６７】
本発明の組成物は、本発明の組成物および医薬的に許容されるキャリアを含む医薬組成物として配合することができる。「医薬的に許容されるキャリア」とは、生物学的またはその他の点で望ましくないわけではない材料を意味し、すなわち、材料は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさずに、またはそれが含有される医薬組成物の他の成分のいずれとも有害に相互作用することなく、対象に投与され得る。キャリアは、当然ながら、当業者には周知であるように、活性成分のいかなる分解も最小限化するように、また対象におけるいかなる有害な副作用も最小限化するように選択される。医薬的に許容されるキャリアおよび医薬組成物の他の成分に関する議論については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年を参照されたい。いくつかの好適な医薬的キャリアは、当業者に明らかであり、例えば、水（滅菌および／または脱イオン水を含む）、好適な緩衝液（例えばＰＢＳ）、生理食塩水、細胞培地（例えばＤＭＥＭ）、人工脳脊髄液等を含む。
【００６８】
本発明の医薬組成物またはキットは、本発明の組成物に加えて他の医薬品を含有し得る。他の薬剤（複数種可）は、患者の治療中任意の好適な時点で、同時または順番に投与することができる。
【００６９】
具体的な配合は、使用される具体的な薬剤および選択された投与経路に一部依存することが、当業者には理解される。したがって、本発明の組成物の多種多様な好適な配合が存在する。
【００７０】
目下の具体的用途に基づいて、好適または適切な配合を選択、適合または確立することができることが、当業者には理解される。本発明の組成物の用量は、単位投薬形態であってもよい。「単位投薬形態」という用語は、本明細書において使用される場合、動物（例えば人間）対象への単位用量として好適な、物理的に別個の単位を指し、各単位は、医薬的に許容される希釈剤、キャリアまたはビヒクルと関連して所望の効果を生成するのに十分な量として計算される、単独または他の治療薬剤と組み合わせた所定量の本発明の薬剤を含有する。
【００７１】
当業者は、個々の患者において所望の有効量または有効濃度の薬剤を達成するために、使用されている組成物の正確な配合のための適切な用量、スケジュール、および投与方法を容易に決定することができる。
【００７２】
本発明に関して、動物、具体的には人間に投与される本発明の組成物の用量は、妥当な期間にわたり個人において少なくとも検出可能な量の診断または治療応答を生じさせるのに十分である必要がある。所望の効果を達成するために使用される用量は、投与されている具体的薬剤の効力、ホストにおける薬剤に関連した薬力学、感染した個人の疾患状態の重症度、対象に投与されている他の医薬等を含む、様々な因子により決定される。用量のサイズはまた、使用される具体的薬剤またはその組成物に付随し得るいかなる有害な副作用の存在によっても決定付けられる。一般に、可能な時にはいつでも、有害な副作用を最小限に維持することが望ましい。生物学的に活性な材料の用量は変動し、具体的薬剤毎の好適な量は、当業者に明らかである。
【００７３】
本発明の別の実施形態は、生体外または生体内において、本明細書に開示される方法のいずれかに有用なキットである。そのようなキットは、本発明の組成物の１種または複数種を備えることができる。任意選択で、キットは、方法を実行するための指示を備える。本発明のキットの任意の要素は、好適な緩衝液、医薬的に許容されるキャリア等、容器、または包装材料を含む。キットの試薬は容器内にあってもよく、その中で試薬は安定、例えば凍結乾燥形態または安定化された液体である。試薬は、単一使用形態、例えば単一投薬形態であってもよい。
【００７４】
上記説明から、本明細書に記載の発明に変形および修正を行い、様々な使用および条件に適合させることができることが明らかである。そのような実施形態もまた、以下の特許請求の範囲内である。
【００７５】
本明細書におけるいかなる変数の定義における要素のリストの列挙も、任意の単一の要素またはリストされた要素の組合せ（または部分的組合せ）としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態、または任意の他の実施形態もしくはその一部との組合せとしてのその実施形態を含む。
【００７６】
また、単一の時制でリストされた用語は、文脈上異なる意味が示されない限り、複数も含む。
【００７７】
以下に開示される実施例は、本発明を例示するために提供されるが、その範囲を限定するものではない。本発明の他の変形例は、当業者に容易に明らかとなり、添付の特許請求の範囲に包含される。本明細書において引用される全ての出版物、データベースおよび特許は、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【００７８】
本発明の化合物を調製、特性決定および使用する方法を、以下の実施例において例示する。出発材料は、当技術分野において公知の手順に従い、または本明細書において例示されるように作製される。以下の実施例は、本発明がより完全に理解され得るように提供される。これらの実施例は単なる例示にすぎず、決して本発明を制限するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００７９】
材料
全ての化学薬品は、別段に指定されない限りＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、そのまま使用した。Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩は、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．から購入した。ウサギ抗ＥＥＡ抗体およびウサギ抗Ｒａｂ７抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から購入した。Ａｌｅｘａ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧおよびＡＰＯ−ＢｒｄＵＴＭ  ＴＵＮＥＬアポトーシスキットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から購入した。スルフヒドリル含有Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）アンテナペディアペプチドは、ＡｎａＳｐｅｃ，Ｉｎｃ．から購入した。２−ジメチルアミノエチルメタクリレートは、使用前にカラムクロマトグラフィーで精製し、その後−２０℃で保存した。
【００８０】
機器
ナノカプセルのＩＲスペクトルは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｐａｒａｇｏｎ  １０００  ＦＴ−ＩＲ分光器で得られた。ＵＶ−可視スペクトルは、ＧｅｎｅＳｙｓ  ６分光器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用して得られた。蛍光スペクトルは、ＱｕａｎｔａＭａｓｔｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を使用して得られた。ナノカプセルのＴＥＭ画像は、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＥＭ  １２０  ＴＥＭで１０００００倍で得られた。観察前、１％のｐＨ７．０リンタングステン酸（ＰＴＡ）溶液を用いてナノカプセルを負染色した。ゼータ電位および粒径分布は、Ｍａｌｖｅｒｎ社製粒度測定器Ｎａｎｏ−ＺＳを使用して測定した。ナノカプセルのＳＥＭ画像は、ＪＥＯＬ  ＪＳＭ−６７００Ｆ  ＳＥＭを使用して得られた。測定前に、シリコン表面上の乾燥試料を金でスパッタコーティングした。試料のＡＦＭ測定は、新しく開裂した雲母表面上で、空気中のタッピングモードで操作したＮａｎｏｓｃｏｐｅ  ＩＩＩ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＵＳＡ）を使用して行った。細胞の蛍光画像は、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１蛍光顕微鏡またはＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ  ＭＰ  Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して得られた。細胞蛍光強度分布は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して決定された。励起光として４８８ｎｍアルゴンレーザを使用した。質量スペクトルは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ−ＳＴＲ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を使用して得られた。
【００８１】
ＥＧＦＰおよびＴＡＴ−ＥＧＦＰの調製
Ｈｉｓ標識化ＥＧＦＰおよびＴＡＴ−ＥＧＦＰ融合タンパク質の配列は、以前に報告されたもの（Ｃａｒｏｎら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、第３巻、３１０〜３１８頁、２００１年）に従い設計した。融合タンパク質は、形質転換Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＢＬ２１中で発現させ、ニッケル樹脂親和性カラム（Ｓｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用して精製した。ＥＧＦＰおよびＴＡＴ−ＥＧＦＰは、Ｈｉｓ標識ペプチドのさらなる処理を行わずに、以降の実験に直接使用した。ＥＧＦＰの濃度は、４８９ｎｍで５３，０００Ｍ−１ｃｍ−１の消光係数により決定した。
【００８２】
アンテナペディアペプチドＥＧＦＰ複合体の調製
ＥＧＦＰを５０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２に２ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ＤＭＳＯ中２ｍＭの濃度のＳｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）２５μＬを、ＥＧＦＰ溶液１ｍＬに添加した。室温で３０分間混合し反応させる。５０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２を使用して、反応副生成物および未修飾ＥＧＦＰから修飾ＥＧＦＰをゲル濾過により精製する。ＡｎａＳｐｅｃ，Ｉｎｃ．製スルフヒドリル含有Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）アンテナペディアペプチド０．５ｍｇを添加してアンテナペディアペプチドＥＧＦＰ複合体を形成し、ゲル濾過により最終複合体を精製する。ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、約１：１のアンテナペディアペプチド対ＥＧＦＰの比を示した。
【００８３】
タンパク質濃度分析
ナノカプセルの形態のタンパク質の含有量を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）比色タンパク質分析により決定した。簡潔には、２５ｍＭのＢＣＡ、３．２ｍＭのＣｕＳＯ４、および適切に希釈されたタンパク質／ナノカプセルを含有する酒石酸塩（ｔｅｒｔｒａｔｅ）緩衝液（ｐＨ１１．２５）を、６０℃で３０分間インキュベートした。溶液を室温まで冷却した後、ＵＶ−Ｖｉｓ分光器で５６２ｎｍでの吸光度値を測定した。標準として公知の濃度のＢＳＡ溶液を使用した。
【００８４】
アポトーシス分析
市販のＡＰＯ−ＢｒｄＵ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｄＵＴＰ  Ｎｉｃｋ  Ｅｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）分析キットを使用して、単離されたＨｅＬａ細胞においてアポトーシスを検出した。簡潔には、細胞を６ウェルプレート上に１ウェル当たり１００，０００細胞の密度で播種し、１０％ウシ成長血清（ＢＧＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）２ｍＬ中で培養した。次いでプレートを、５％ＣＯ２中、３７℃で１２時間インキュベートし、タンパク質／ナノカプセルの添加前に７０〜８０％の集密度に到達させた。２４時間のインキュベーション後、細胞をまずリン酸緩衝生理食塩水中１％のパラホルムアルデヒド、ｐＨ７．４で固定し、続いて氷上の７０％エタノールで処理した。次いで細胞に、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼおよびブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵｒｄ）を含有するＤＮＡ標識化溶液を加えた。次いで細胞をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８染料標識化抗ＢｒｄＵｒｄ抗体で染色した。最後に、ＲＮａｓｅ  Ａを含有するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液で細胞を染色し、蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社製、Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１）下で、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８およびＰＩ用の適切なフィルタを使用して可視化した。
【００８５】
実施例１  −  ナノカプセル合成
分解性または非分解性架橋剤によるＥＧＦＰナノカプセル
図１に示すように、重合性ビニル基は、タンパク質（Ｉ）に共有結合している。モノマー（１、２）および架橋剤（３または４）を含有する水溶液中での後続の重合により、各タンパク質コアは薄いポリマーシェルに被覆される。このスキームによって、非分解性（３）または分解性（４）架橋剤を使用することでそれぞれ非分解性（ＩＩ）または分解性（ＩＩＩ）外皮を有するタンパク質ナノカプセルを合成することができる。以降、非分解性および分解性ナノカプセルは、それぞれｎタンパク質およびｄｅ−ｎタンパク質と示されるが、接頭辞「ｎ」は「ナノカプセル」を示す。カチオン性（２）または中性（１）モノマー等のモノマーの適切な選択により、表面電荷の正確な制御が可能となる。タンパク質コアは、広範なタンパク質ライブラリから選択することができる。
【００８６】
タンパク質修飾
ｐＨ８．５、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液３．８ｍｌ中１０ｍｇの量のＥＧＦＰを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）４０ｍｌ中Ｎ−アクリルオキシスクシンイミド４ｍｇと、室温で２時間反応させた。最後に、ｐＨ７．０、２０ｍＭリン酸緩衝液に対して反応溶液を十分に透析した。
【００８７】
修飾度は、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）質量スペクトルを用いて測定したが、これはタンパク質１分子当たりビニル基が５個から２０個の間であった（図２、表３）。
【００８８】
【表３】
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＊カスパーゼ−３は二量体であり、分子量は質量値を２倍することにより計算した。
【００８９】
ナノカプセル重合
１ｍｇ  ｍｌ−１のアクリロイル化ＥＧＦＰ溶液５ｍｌを使用して、アクリロイル化タンパク質表面からのラジカル重合を、脱酸素および脱イオン水３０ｍｌ中に溶解した過硫酸アンモニウム２ｍｇ、およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン４ｍｌを試験管に加えることにより開始させた。脱酸素および脱イオン水０．５ｍｌ中に溶解した特定量の２−ジメチルアミノエチルメタクリレート、アクリルアミドおよびＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（非分解性架橋剤）またはグリセロールジメタクリレート（分解性架橋剤）（モル比＝５：５：１）を、６０分かけて試験管に加えた。窒素雰囲気下でさらに６０分間反応を進行させた。最後に、透析を使用してモノマーおよび開始剤を除去した。合成直後のＥＧＦＰナノカプセルは、ネイティブＥＧＦＰのナノカプセルと同様の蛍光スペクトルを示している（図３）。タンパク質ナノカプセルの収率は、９５％を超えていた。未修飾ＥＧＦＰは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して除去した。
【００９０】
ＨＲＰナノカプセル
ＨＲＰナノカプセルを合成するために、アクリロイル化および重合中の安定剤として４−ジメチルアミノアンチピリン（ＨＲＰに対し１：１０の重量比）を反応混合物中に添加した。同様のアクリロイル化、重合、および精製プロセスを行って、ＨＲＰナノカプセルを合成した。
【００９１】
ＳＯＤ、ＣＡＳ、ＢＳＡ、ＨＲＰナノカプセル
ＳＯＤ、ＣＡＳ、ＨＲＰ、ＮＩＲ−６６７標識化ＢＳＡおよびローダミン−Ｂ標識化ＨＲＰナノカプセルを、ＥＧＦＰナノカプセルの方法と類似の方法を使用して合成した。ＮＩＲ−６６７標識化ＢＳＡおよびローダミン−Ｂ標識化ＨＲＰは、複合化技術を使用してタンパク質を修飾することにより合成した。ＣＡＳは、ＥＧＦＰの方法と類似の方法を使用して発現および精製し、使用したプラスミド、ｐＨＣ３３２は、Ａ．Ｃｌａｙ  Ｃｌａｒｋ博士（ノースカロライナ州立大学）からの寛大なる寄贈品であった。ウシ赤血球からのＣｕ、Ｚｎ−ＳＯＤおよびホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）は、２０ｍＭのｐＨ７．０リン酸緩衝液に対する透析後に使用した。
【００９２】
Ａｕナノ粒子標識化ナノカプセル
ｐＨ７．５の緩衝液中で１時間、Ａｕナノ粒子（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅ社（ＮＹ）製モノ−スルホ−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドナノゴールド）をネイティブＨＲＰと５：１のモル比で反応させた。ゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５）を使用して、過剰のナノゴールドを除去した。ナノゴールドおよびタンパク質のモル濃度は、４２０ｎｍでのナノゴールドの１５５，０００Ｍ−１ｃｍ−１のモル消光係数に基づき、ＵＶ／ｖｉｓスペクトルから計算した。得られたＡｕ標識化ナノカプセルは、０．９４の金／ＨＲＰ比を含む。次いで、標識化ＨＲＰを使用し、同様のプロトコルを用いてナノカプセルを合成した。ＴＥＭでのより良好な画像化のために、銀増感技術を使用した。簡潔には、Ａｕ標識化ナノカプセルをＴＥＭグリッド上に滴下し、脱イオン水で濯いだ。次いで新たに調製したＡｇ含有現像液上にグリッドを１〜２分浮遊させ、水で濯ぎ、ｐＨ７．０の１％リンタングステン酸ナトリウムを使用して染色した。このプロセスにより、直径３〜４ｎｍの均一なナノ粒子が形成された。
【００９３】
ナノカプセルの特性決定
図４Ａおよび４Ｂは、約１５ｎｍの均一な直径を示すＨＲＰナノカプセルの代表的なＴＥＭおよびＡＦＭ画像である。動的光散乱（ＤＬＳ）は、ＨＲＰナノカプセルが１６．８ｎｍに狭い粒度分布を示すことを示唆していた（図５）。ＤＬＳによってより大きな直径が測定されたのは、水溶液中での水和層に起因し得る。ＨＲＰ分子の流体力学半径は約５ｎｍであるため、平均シェル厚は約５ｎｍから８ｎｍである。単一の１．４ｎｍ金ナノ粒子により各ＨＲＰ酵素を標識化することにより、ほとんどのナノカプセルは、単一の金粒子のみを含有することが観察され（図４Ｃ）、これは単一タンパク質コアシェル構造をさらに裏付けている。さらに、ＤＭＡＥＭＡ（正荷電）対ＡＡｍ（中性）の重量比を０：１から１：３、さらには１：１に変えると、それぞれ−１２．８から８．６４、さらには１５．２ｍＶという調節可能なゼータ電位を有するＢＳＡナノカプセルを合成することができる（図６）。この単純な方法は、サイズ、表面電荷およびタンパク質コアが良好に制御された、新規なタンパク質細胞内送達ベクターの調製への効果的な経路を提供する。
【００９４】
実施例２  −  ナノカプセルタンパク質活性
ネイティブＨＲＰ（左）およびＨＲＰナノカプセル（右）の相対触媒活性を決定した。ネイティブＨＲＰおよびＨＲＰナノカプセルの活性試験は、既存の（ｅｘｉｔｉｎｇ）プロトコル（Ｄａｖｉｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、第２５６巻、５９９２〜５９９６頁、１９８１年）に従った。簡潔には、試験中、ｐＨ５．５、１００ｍＭのクエン酸リン酸塩０．９ｍｌ、０．０２ＭのＨ２Ｏ２  ０．０５ｍｌ、および０．２μｇ／ｍＬのＨＲＰまたはＨＲＰナノカプセル１０μＬを、試験管内に入れた。０．０２ＭのＴＭＢを含有するＤＭＳＯ  ０．０５ｍｌを添加することにより反応を開始させ、６５５ｎｍで監視した。ＴＭＢの酸化速度は、ＴＭＢの酸化生成物のモル吸収係数（３９，０００Ｍ−１ｃｍ−１）を使用し、吸着曲線の初期線形部分の傾きから導出した。
【００９５】
実施例３  −  プロテアーゼに対する安定性
ＥＧＦＰおよびＥＧＦＰナノカプセルを、ＰＢＳ緩衝液中、１ｍｇ／ｍＬのトリプシンおよびα−キモトリプシンの両方と５０℃でインキュベートした。ＥＧＦＰおよびＥＧＦＰナノカプセルの蛍光強度を、４８９ｎｍの励起波長で、異なる時間間隔で測定した。
【００９６】
生理環境内に広く存在するプロテアーゼに起因した低いタンパク質安定性は、治療用タンパク質の応用におけるもう１つの課題である。トリペプチドＳｅｒ６５−Ｔｙｒ６６−Ｇｌｙ６７の翻訳後の環化により形成されるＥＧＦＰ分子内のフルオロフォアは、周囲微小環境に対し極めて敏感である（Ｔｓｉｅｎ，  Ｒ．  Ｙ．、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第６７巻、５０９〜５４４頁、１９９８年）。外部β−バレル構造の保護なしでは、フルオロフォアは容易に破壊され消光し得る（Ｏｒｍｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７３巻、１３９２〜１３９５頁、１９９６年）。ポリマーシェルの存在は、タンパク質コアをタンパク質分解から保護する。図８Ａは、５０℃で３時間の１ｍｇ／ｍＬプロテアーゼ（トリプシンおよびα−キモトリプシン）に対する暴露後のネイティブＥＧＦＰおよびＥＧＦＰナノカプセルの蛍光強度を比較したものである。ネイティブＥＧＦＰは、その元の蛍光強度の６０％しか維持せず、一方ナノカプセルはその９０％超を維持した。
【００９７】
ナノカプセルの安定性をさらに確認するために、ナノカプセル導入後の細胞蛍光強度を監視した。図８Ｂは、導入後０時間、４８時間および１４４時間でのＨｅＬａ細胞の蛍光強度分布を示す。必然的に、細胞の繁殖の結果、ＨｅＬａ細胞の蛍光強度は経時的に減少する。それにもかかわらず、ＥＧＦＰナノカプセルが導入された細胞の蛍光強度は、１４４時間後でさえも対照（ネイティブＥＧＦＰ）より著しく高い。常に、他のタンパク質と同様に、ＴＡＴ−ＥＧＦＰは送達効率が良好な手法と考えられているものの、プロテアーゼ攻撃を受ける。ＴＡＴ−ＥＧＦＰとのインキュベーションの４８時間後における９１％の細胞蛍光強度の損失と比較して、ＥＧＦＰナノカプセルにおいては、４２％のみの低下が観察された（図８Ｄ）。
【００９８】
実施例４  −  細胞内在化
細胞内在化試験は、蛍光顕微鏡技術および蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）により評価した。１０％ウシ成長血清（ＢＧＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、ＨｅＬａ細胞を培養した。細胞（２００００細胞／ウェル、２４ウェルプレート）を、ナノカプセルを添加する前日に播種した。異なる濃度のナノカプセルまたはネイティブタンパク質を、細胞培地中に添加した。３７℃で２時間から４時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、蛍光顕微鏡で可視化するか、またはトリプシン処理し、遠心分離し、ＰＢＳ中に再懸濁し、ＦＡＣＳで分析した。製造者のマニュアルに従い、エンドソーム／リソソーム染色を行った。簡潔には、ローダミン標識化ＨＲＰナノカプセルとのインキュベーション後、細胞を簡単に洗浄し、２％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ／１％Ｔｒｉｔｏｎを浸透させ、５％ＢＳＡでブロックし、ウサギ抗ＥＥＡ抗体（初期エンドソームに対して）またはウサギ抗Ｒａｂ７抗体（リソソームに対して）で一晩処理した。細胞をＡｌｅｘａ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧで染色し、次いで共焦点顕微鏡で観察した。
【００９９】
ＥＧＦＰナノカプセルをモデルとして使用して、細胞導入を試験した。図９は、４００ｎＭのＥＧＦＰナノカプセルまたは未修飾ＥＧＦＰとの２時間の共培養後のＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。未修飾ＥＧＦＰと比較して、ナノカプセルは、ＨｅＬａ細胞によってより効果的に内在化される。インキュベーション時間を２時間から４時間または８時間に延長すると、それぞれ４４８から５５９または６１９に蛍光強度が若干増加したが、取り込みは２時間以内でほとんど終了したことを示している（図１１）。細胞蛍光強度は、より高いナノカプセル濃度で増加した（図１２Ａ）。比較として、ＴＡＴ−ＥＧＦＰ融合タンパク質（ＴＡＴはＨＩＶウイルスから得られる細胞透過性ペプチドである）と２時間インキュベートされた細胞は、ナノカプセル処理細胞の蛍光強度よりも１／１００低い蛍光強度を示した（図１２Ａ）。さらに、細胞取り込み効率に対するナノカプセルの表面電荷の効果もまた調査した。１３．３ｍＶのゼータ電位を有する４００ｎＭナノカプセルとインキュベートしたＨｅＬａ細胞は、３９８の平均蛍光強度を有することが判明したが、これは６．７ｍＶのナノカプセルで得られた平均蛍光強度よりも３．２倍高い（図１２Ｃ）。
【０１００】
ｎＥＧＦＰを有する細胞は、ネイティブＥＧＦＰを有する細胞よりも著しく高い蛍光強度を示す（図１２Ａ）。ＣＰＰ支援送達と比較して、この戦略は有利である。同じタンパク質濃度では、ナノカプセルとインキュベートされた細胞は、ＴＡＴ−ＥＧＦＰ融合タンパク質（図１２Ａ）またはアンテナペディア−ＥＧＦＰ複合体（図１２Ｂ；ＴＡＴおよびアンテナペディアは、それぞれＨＩＶ−Ｔａｔタンパク質およびアンテナペディアホメオドメインから得られるＣＰＰである）とインキュベートされた細胞よりも、２桁から３桁高い蛍光強度を示す。ナノカプセルの取り込みは、時間（図１３）、濃度（図１２Ａ）およびゼータ電位（図１２Ｃ）とともに増加するが、ナノカプセルサイズ（７．５〜１５．７ｎｍの範囲、図１４）による大きな影響は観察されないことが判明した。
【０１０１】
エンドサイトーシス阻害
ナノカプセルの取り込み経路は、エンドサイトーシスプロセスが関与し得る。ＨｅＬａ細胞をＥＧＦＰナノカプセルと４℃で３時間インキュベートすると、３７℃でインキュベートした場合よりもはるかに低い細胞取り込みを示した（図９）。この観察は、細胞取り込みが、主に、活性化された経路、すなわち、ほとんどのカチオン性ＣＰＰおよびポリマーで観察されるエンドサイトーシスプロセス（Ｂｒｏｏｋｓら、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．、第５７巻、５５９〜５７７頁、２００５年；Ｐｏｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．、第３５巻、７７８〜７９３頁、２００７年；Ｆｕｔａｍｉら、Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．、第９９巻、９５〜１０３頁、２００５年；Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏ．  Ｃｈｅｍ．、第２７９巻、１２６２５〜１２６３５頁、２００４年）と一致するエンドサイトーシスによるものであったことを裏付けている。
【０１０２】
ＨｅＬａ細胞（２００００細胞／ウェル、２４ウェルプレート）を、ナノカプセルを添加する前日に播種した。次いで、実験の前に、培地を、２ｍＭのアミロリド（マクロピノサイトーシスの阻害剤）、２０μｇ／ｍＬのクロルプロマジン（ｃｈｌｏｒｏｐｒｏａｍｚｉｎｅ）（ＣＰＺ、クラスリン媒介エンドサイトーシスの阻害剤）、または５ｍＭのβ−シクロデキストリン（β−ＣＤ、カベオラ媒介エンドサイトーシスの阻害剤）を含む０．５ｍｌの新鮮培地と交換した。３０分後、５０ｎＭのＥＧＦＰナノカプセルを細胞培地に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、ＰＢＳ中に再懸濁し、ＦＡＣＳで分析した。エンドサイトーシス阻害剤を含まない培地中でインキュベートしたＨｅＬａ細胞を対照として使用した。適用した３種のエンドサイトーシス阻害剤（図１５）のうち、β−シクロデキストリン（β−ＣＤ）のみが、ナノカプセル取り込みを効果的に阻害したが、これはカベオラ媒介エンドサイトーシス経路を示唆している。
【０１０３】
クロロキン処理
事前にＥＧＦＰナノカプセルとインキュベートしたＨｅＬａ細胞の拡大蛍光画像（図１６）では、ナノカプセルの不均質な分布が明らかである。
【０１０４】
ＨｅＬａ細胞（２００００細胞／ウェル、２４ウェルプレート）を、ナノカプセルを添加する前日に播種した。実験の前に、培地を１００μＭクロロキンを含む新鮮培地０．５ｍｌと交換し、細胞を０．２μＭのＥＧＦＰナノカプセルと３時間インキュベートした。ＰＢＳでの洗浄後、細胞を蛍光顕微鏡で観察した。クロロキンを含まない培地中でインキュベートしたＨｅＬａ細胞を対照として使用した。
【０１０５】
リソソーム指向性薬剤であるクロロキン（Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏ．  Ｃｈｅｍ．、第２７９巻、１２６２５〜１２６３５頁、２００４年；Ｃｉｆｔｃｉら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．、第２１８巻、８１〜９２頁、２００１年）をインキュベーション中に培地に導入し、エンドソームを破壊した。その結果、小胞内に捕捉されるナノカプセルの数が減少し、細胞内においてナノカプセルの均一な分散が得られた（図１６）。それにもかかわらず、クロロキンの使用前、サイトゾル内の高濃度のナノカプセルが観察された（図１７の赤矢印）が、これは、恐らくは「プロトンスポンジ」効果（Ａｋｉｎｃら、Ｊ．  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．、第７巻、６５７〜６６３頁、２００４年）によるエンドソームからのナノカプセルの部分的な放出を示唆している。
【０１０６】
ＴＥＭ試験
ナノゴールド標識化ナノカプセルを導入したＨｅＬａ細胞を、１％グルタルアルデヒドで４℃で１時間固定し、２％四酸化オスミウムで１時間処理し、段階的な一連のエタノール洗浄で脱水した。次いで処理後の細胞をＥｐｏｎ８１２（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ｆｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）に包埋した。極薄い（約８０ｎｍ）断面を２％酢酸ウラニルで染色し、ＴＥＭで検査した。
【０１０７】
一貫して、事前に金標識化ナノカプセルとインキュベートしたＨｅＬａ細胞のＴＥＭ画像は、エンドソームの輪郭と類似した輪郭を有する凝集金粒子を示している（図１７、緑矢印）が、これは、エンドソーム内へのナノカプセルの捕捉を示唆している。
【０１０８】
複数タンパク質内在化
この方法は、低い毒性での複数タンパク質送達に一般化することができる。図１８Ａは、ＥＧＦＰ（緑）、ローダミン−Ｂ標識化ＨＲＰ（赤）およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｏ−６６４標識化ＢＳＡ（青）のナノカプセルを同時に内在化したＨｅＬａ細胞の蛍光画像を示す。同時導入後の共局在化の定量化を、図１８Ｂに示す。そのような複数タンパク質送達は、２つ以上のタンパク質が相乗的または並行して作用する治療に非常に有望である（Ｙａｍａｕｃｈｉら、Ｊａｐａｎ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、第８３巻、５４０〜５４５頁、１９９２年；Ｋａｌｉｂｅｒｏｖら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、第１３巻、２０３〜２１４頁、２００６年）。
【０１０９】
実施例５  −  生体外活性
細胞生存能力
ネイティブタンパク質を対照として使用して、ナノカプセルの毒性をＭＴＴ分析により評価した。ナノカプセルへの暴露の前日に、９６ウェルプレート上にＨｅＬａ細胞（７０００細胞／ウェル）を播種した。異なる濃度のナノカプセルを細胞と２〜４時間インキュベートし、混合物から除去し、新鮮培地で２４時間インキュベートした。ＭＴＴ溶液（２０μＬ）を各ウェルに添加し、３時間インキュベートした。次いで培地を除去し、ＤＭＳＯ１００μＬをセル上に添加した。プレートを振動台の上に設置し、１５０ｒｐｍで５分間溶液を完全に混合し、次いで５６０ｎｍで吸光度値を測定した。未処理の細胞を、１００％細胞増殖対照として使用した。
【０１１０】
図１９は、異なる濃度のＥＧＦＰナノカプセルおよびネイティブＥＧＦＰへの暴露後の、ＨｅＬａ細胞の生存能力を比較したものである。ＥＧＦＰナノカプセルおよびネイティブＥＧＦＰは両方とも、試験された各濃度において同様の細胞毒性を示す（図１９）。１７．２４μＭのＥＧＦＰナノカプセルへの暴露においても、細胞生存能力の低下はわずか１５％であった。
【０１１１】
癌細胞成長阻害
９６ウェルプレートに設置したＨｅＬａ細胞（２０００細胞／ウェル）を、ＨＲＰナノカプセルまたはネイティブＨＲＰと４時間インキュベートし、次いで異なる濃度のインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）に１２時間暴露した。ＭＴＴを使用して評価したＨｅＬａ細胞生存能力曲線から、最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を決定した。
【０１１２】
高い送達効率、低い毒性、および長期安定性の他に、タンパク質送達システムは、送達される医薬用タンパク質が内在化後に完全な生体触媒活性によりその生物活性を保持し得ない限り、効果的とはなり得ない。酵素ナノカプセルの送達が活性細胞内酵素をもたらすか否かを決定するために、ＨＲＰおよびＳＯＤナノカプセルの送達を調査した。最近、潜在的なプロドラッグ癌治療として、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）およびＨＲＰの組合せが提案されている（Ｆｏｌｋｅｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第６１巻、１２９〜１３６頁、２００１年）。ＩＡＡは、人間において良好な耐容性を示す植物ホルモンであり、ＨＲＰによりフリーラジカル中間体に特異的に転換されて、哺乳動物細胞内でアポトーシスを誘導することができる（ｄｅ  Ｍｅｌｏら、Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｌｅｔｔ．、第１４８巻、１０３〜１１１頁、２００４年）。ＨＲＰナノカプセルが合成され、ネイティブＨＲＰ活性の９２％を保持することが示された（図７）。ＨＲＰナノカプセルが細胞内在化後にその活性を保持するか否かを決定するために、ＨｅＬａ細胞をＨＲＰおよびＨＲＰナノカプセルとインキュベートし、発色基質である１ｍＭのＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）および１μＭのＨ２Ｏ２に暴露した（図２０）。ナノカプセル導入細胞は、ナノカプセル濃度の増加とともに増強する緑色を示すが、これは細胞内で活性なナノカプセルの送達が成功したことを裏付けている。ＨＲＰナノカプセルの細胞内活性をさらに決定するために、ＨｅＬａ細胞をＨＲＰまたはＨＲＰナノカプセルと４時間インキュベートした。洗浄後、ＩＡＡを培地内に添加した。ＩＡＡ濃度の増加とともに、ＨＲＰナノカプセルで前処理した細胞は、細胞生存能力の劇的な低下を示したが、ネイティブＨＲＰで前処理した細胞は、対照細胞と同様の挙動を示し（図２１Ａ）、これは酵素が細胞内で生体触媒活性を示したことを実証している。
【０１１３】
細胞内酵素ナノカプセル活性をさらに確認するために、細胞内スーパーオキシド生成化合物であるパラコートで処理した細胞内にＳＯＤナノカプセルを送達した。好気性細胞内で酸素代謝中に形成される副生成物であるスーパーオキシドイオンは、広範な人間の疾患、例えば炎症、糖尿病、発癌、虚血／再かん流傷害および神経変性疾患等の発生および進行に関与する（Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈら、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．、第２３巻、２３９〜２５７頁、１９８３年；Ｆｉｎｋｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ、第４０８巻、２３９〜２４４頁、２０００年；Ａｍｅｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第９０巻、７９１５〜７９２２頁、１９９３年）。ＳＯＤはスーパーオキシドアニオンを効果的に不均化することができ、フリーラジカルの無害化において重要な役割を果たし、細胞を酸化的損傷から保護する（ＭｃＣｏｒｄ，  Ｊ．  Ｍ．、Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第３４９巻、３３１〜３４１頁、２００２年）。したがって、細胞内ＳＯＤの活性は、細胞生存能力に直接的に関連し得る。図２１Ｂは、ＳＯＤナノカプセルとの２時間のインキュベーションに続く、５ｍＭパラコートへの１２時間の暴露後の相対細胞生存能力を示す。ＳＯＤナノカプセルは、低いナノカプセル濃度で、細胞の酸化的損傷を効果的に妨げた。しかしながら、ナノカプセル濃度を増加させると、細胞生存率が低下した。この曲線は、多くの異なる心筋虚血−再かん流モデルにおいて観察される用量反応曲線と一致し、これは高ＳＯＤ濃度におけるヒドロキシル基生成量の増加に起因し得る（Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，  Ｉ．、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．、第２３巻、２３９〜５７頁、１９８３年）。それにもかかわらず、この研究は、様々な治療薬または老化防止薬への機能性ナノカプセルの使用の可能性をさらに証明している。
【０１１４】
実施例５  −  インビボ生体内分布
全ての動物実験は、Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ  Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒ’ｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＡＲＣ）のカリフォルニア大学により確立されたＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｉｍａｌｓに従って行った。６〜８週齢のヌードマウスに、ナノカプセル生理食塩水溶液または生理食塩水溶液（対照）１００ｕＬを注射した。２４時間および４８時間後、マウスを致死させ、生体外画像化のために全ての主要な臓器を取り出した。次いで、ナノカプセルを含有する凍結臓器を寒剤および低温保持装置内のミクロトームに埋設した。ＨＲＰナノカプセルを含有する組織切片をジヒドロエチジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で染色し、共焦点顕微鏡を使用して観察した。
【０１１５】
ナノカプセルの生体内送達は、ヌードマウスに０．２ｍｇのＥＧＦＰナノカプセルまたは対照ＥＧＦＰを腹腔内注射することにより行った。８時間後、様々な臓器切片の蛍光共焦点顕微鏡分析により、ナノカプセル注射マウスからの全ての検査組織において強い信号が明らかとなったが、一方対照ＥＧＦＰ注射マウスにおける信号はバックグラウンドレベルのままであった（図２２）。蛍光強度は経時的に減少するが、注射から５０時間後であってもまだ高いままである。そのような極めて安定なナノカプセルは、幹細胞画像化および腫瘍追跡等、長期安定性を必要とする生体内細胞画像化マーカーとして使用することができる。さらに、注射されたナノカプセルは、組織内でもまだ活性なままであった。例えば、ＨＲＰナノカプセルまたはネイティブＨＲＰの注射から８時間後、マウスを致死させ、切開し、ジヒドロエチジウム（ＨＲＰの蛍光性基質）を用いてＨＲＰ活性に関して組織を検査した。蛍光共焦点顕微鏡画像から、生成物エチジウムからの赤色蛍光が明確に観察され、ナノカプセルが生体内で活性であることを示した。
【０１１６】
実施例６  −  分解性架橋剤含有ナノカプセル
安定性およびｐＨ誘導分解
非分解性ナノカプセルプラットフォームを使用して、小分子基質のタンパク質が長期安定性および高活性をもって効果的に送達され得ることが実証された。しかしながら、巨大分子基質の場合、ポリマー外皮がコアタンパク質へのそのアクセスを阻害し得る。血清および後期エンドソームは、それぞれ約７．４および約５．５のｐＨ値を有することが周知である。したがって、この障害を克服するため、酸分解性ナノカプセルが開発された。ｄｅ−ｎＣＡＳおよびｎＣＡＳを例として使用して、ｐＨ５．５（図２３Ａ）および７．４（図２３Ｂ）でのサイズ発達を試験した。ｎＣＡＳは両方のｐＨ値で安定であるが、ｄｅ−ｎＣＡＳはｐＨ７．４でのみ安定である。ｐＨ５．５では、ｄｅ−ｎＣＡＳの平均直径は、３時間以内に、２０ｎｍからネイティブＣＡＳの平均直径（約６ｎｍ）と同様のサイズである６ｎｍに急速に減少する。重要なことに、分解性ナノカプセルは、ｐＨ７．４ではトリプシンおよびα−キモトリプシン（ａ−ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）に対し安定であり（図２４）、これにより、分解性ナノカプセルは循環系において安定性を維持し得、内部エンドソームがそのタンパク質カーゴを細胞内で放出する際に分解され得る。
【０１１７】
細胞内分解をさらに定量化するために、ｄｅ−ｎＥＧＦＰおよびｎＥＧＦＰをＨｅＬａ細胞に送達した。２４時間後、ｄｅ−ｎＥＧＦＰを含有する細胞の細胞蛍光強度は、ｎＥＧＦＰを含有する細胞よりも大幅に低く（図２５）、これは分解性ナノカプセルが酸性細胞内環境に応じてそのシェルを剥離され得ることを裏付けている。
【０１１８】
アポトーシス誘導
脱保護プロセスは、必然的にカーゴタンパク質をプロテアーゼ攻撃に暴露するが、カーゴタンパク質と大きな基質との相互作用を可能にする。例えば、アポトーシス、壊死および炎症において重要な役割を果たすシステインプロテアーゼファミリーの一員であるＣＡＳは、細胞内の他のタンパク質基質を切断させてアポトーシスを誘発する（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、第３７６巻、３７〜４３頁、１９９５年；Ｐｏｒｔｅｒら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．、第６巻、９９〜１０４頁、１９９９年；Ｏｌｉｖｅｒら、Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ．  Ｕｐｄａｔｅｓ、第８巻、１６３〜１７０頁、２００５年）。図２６に示すように、ＨｅＬａ細胞のネイティブＣＡＳ、ｎＣＡＳ、ｄｅ−ｎＢＳＡまたはｎＢＳＡとのインキュベーションにより、ｄｅ−ｎＣＡＳを含む細胞よりも著しく高い同様の生存能力が示された。末端ｄＵＴＰニックエンド標識化（ＴＵＮＥＬ）分析（図２７）は、ｄｅ−ｎＣＡＳにより誘発されたアポトーシスを裏付けている。
【０１１９】
結論
蛍光、発光および治療用タンパク質の細胞内の使用は、癌およびタンパク質欠乏性疾患の診断および治療において非常に重要である。２００７年、治療用タンパク質市場は、約１９％成長して４８０億ドルとなり、２０１０年までに９００億ドルを超える売上を達成すると予測されている。しかしながら、将来の成長は、薬物送達の課題およびコスト問題を含む多くの障害を克服する産業に大きく依存する。高血圧用のアンジオテンシン変換酵素、貧血用のエリスロポエチン、肝炎用のインターフェロン、ゴーシェ病用のグルコセレブロシダーゼ、および酵素プロドラッグ化学療法用のアスパラギナーゼ等の治療用タンパク質は、特異的および効果的な治療薬剤として認識されている。緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質および有機蛍光分子標識化タンパク質等の蛍光および生物発光タンパク質、蛍または甲虫からのルシフェラーゼならびにホースラディッシュペルオキシダーゼは、腫瘍および血管画像化に広く使用されている。これらの単一タンパク質ポリマーナノカプセルは、生体外および生体内の両方において、天然タンパク質の直接的使用よりも細胞内送達における高い効率、活性および安定性を示す。
【０１２０】
タンパク質画像化および治療は、癌およびタンパク質機能不全疾患を診断および治療するための、最も直接的で安全な手法を提供する。しかしながら、タンパク質画像化および治療の広範な使用は、細胞内送達の効率が低いことやプロテアーゼに対するタンパク質の安定性が低いこと等の、いくつかの根本的な技術的障壁によってなお制限されている。これらの単一タンパク質ポリマーナノカプセルは、生体外および生体内の両方での細胞内送達における高い効率、活性および安定性のための、治療、画像化、およびその他の用途への極めて有望な経路を提示する。単一タンパク質ポリマーナノカプセルは、天然タンパク質に基づくものと比べて、癌についてのタンパク質に基づく画像化におけるより良好なコントラストおよび正確性、ならびにより長い半減期、より高い活性およびタンパク質療法のより低い用量を提供する。
【０１２１】
本発明のある特定の具体的実施形態を参照しながら本発明を説明および例示したが、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、手順およびプロトコルの様々な適合、変更、修正、置換、削除、または追加を行うことができることが、当業者に理解される。したがって、本発明は以下の特許請求の範囲により定義されること、およびそのような特許請求の範囲は妥当な限り広義に解釈されることが意図される。
【図４】
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【図１７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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