(57)【要約】  薬理学的に活性な物質を含むポリ（エチレンカーボネート）（ＰＥＣ）ナノ粒子、それらの製造方法、および適用後の薬理学的に活性な薬剤の持続性放出のためのそれらの使用が説明される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の薬理学的に活性な薬剤、少なくとも１種のポリ（エチレンカーボネート）ポリマー、および任意選択の薬学的に許容される添加剤を含むナノ粒子を含む医薬組成物。
【請求項２】
ナノ粒子懸濁液の形態の、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
非経口製剤である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ナノ粒子が、１０００ｎｍ未満の大きさを有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ナノ粒子が５００ｎｍ未満の大きさを有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＰＥＣポリマーの分子量が、２０００ｋＤａ未満である、請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＰＥＣポリマーの分子量が、５００ｋＤａ未満である、請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
薬理学的に活性な薬剤が、化合物、生物学的に活性な薬剤、核酸、ペプチド、およびタンパク質からなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ソマトスタチン類似体阻害剤、ビスホスホネート、脂質低下薬、および免疫抑制剤の部類からなる群からさらに選択される薬理学的に活性な薬剤を含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
少なくとも１種の薬理学的に活性な薬剤および少なくとも１種のポリ（エチレンカーボネート）ポリマーを含むナノ粒子を含む懸濁液。
【請求項１１】
ポリ（エチレンカーボネート）が次の特性：
（ａ）７０〜１００モル％のエチレンカーボネート含有量、
（ｂ）クロロホルム中、２０℃で測定した場合に０．４〜４．０ｄｌ／ｇの固有粘度、および／または
（ｃ）５〜５０℃のガラス転移温度
の少なくとも１つを有する、請求項１０に記載の懸濁液。
【請求項１２】
ＰＥＣナノ粒子懸濁液が非経口製剤である、請求項１０に記載の懸濁液。
【請求項１３】
ＰＥＣナノ粒子懸濁液が、持続性放出特性を有する、請求項１０に記載の懸濁液。
【請求項１４】
ＰＥＣナノ粒子懸濁液が、非経口デポ製剤である、請求項１０に記載の懸濁液。
【請求項１５】
懸濁液のナノ粒子の直径が１０００ｎｍ未満である、請求項１０に記載の懸濁液。
【請求項１６】
ＰＥＣポリマーの分子量が２０００ｋＤａ未満である、請求項９に記載の懸濁液。
【請求項１７】
使用されるポリ（エチレンカーボネート）が、５００ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項９に記載の懸濁液。
【請求項１８】
ナノ粒子懸濁液が、薬学的に許容される添加剤または添加物をさらに含む、請求項１０に記載の懸濁液。
【請求項１９】
医薬組成物を調製するための、請求項１０から１８の少なくとも一項に記載の懸濁液の使用。
【請求項２０】
少なくとも１種の薬理学的に活性な薬剤および少なくとも１種のポリ（エチレンカーボネート）ポリマーを含むナノ粒子の懸濁液を調製することによる、請求項１から９の少なくとも一項に記載の医薬組成物を製造する方法。
【請求項２１】
ナノ粒子懸濁液が、溶媒置換法、溶媒蒸発法、または塩析法を使用して調製される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
粒径が、ポリマー濃度を変えることによって調節される、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
溶媒置換法、溶媒蒸発法、または塩析法を使用することによって、請求項１０から１８の少なくとも一項に記載の懸濁液を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬理学的に活性な薬剤を含むポリ（エチレンカーボネート）（ＰＥＣ）ナノ粒子、それらの製造、およびそれらの医薬組成物としての、とりわけナノ粒子懸濁液としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリマーナノ粒子は、それらが薬物送達システムとして前途有望な利点を提供するので、医薬および医療分野における微粒子状担体として広く研究されている。ナノ粒子は、一般に、生分解性であってもなくてもよい、サブミクロンの大きさの固形の薬物担体と定義される。用語「ナノ粒子」は、ナノ球体およびナノカプセルの双方に対する集合的名称である。ナノ球体は、マトリックス型の構造を有する。薬物を、球表面に吸着させるか、あるいは粒子内に封入することができる。ナノカプセルは、管装置であり、薬物はポリマー膜で囲まれた内部液状コアからなる空洞に閉じ込められる。この場合、活性物質は、内部コア中に溶解されるのが通常であるが、カプセルの表面に吸着されることもできる。ナノ粒子は、治療用薬物の送達に関してかなり注目されている。
【０００３】
とりわけ、注射可能なナノ担体は、それらの空間的および時間的に制御された薬物送達機構のため、疾患治療に大変革を起こす能力を有すると考えられる。例えば、毒性薬物およびその他の強力な薬物の放出を特定の治療部位のみに空間的に集中すると、総合的な全身投与量、および別の方法であればこれらの薬物が引き起こすであろう危害を低減することができる。薬物の放出を時間的に制御すると、別の方法であれば身体中の化学物質濃度の自然日周性変動によって発生する可能性のある望ましくない副作用を低減するのを助けることができる。疾患治療におけるこれらの改善の総合的利益は、患者の応諾性および生活の質の増大である。ポリマーナノ粒子を製造するのに使用されてきた典型的なポリマーは、例えば、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（シアノアクリル酸エチル）、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、ポリ（乳酸）、ポリスチレン、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、またはポリ（ε−カプロラクトン）である。
【０００４】
薬物送達デバイスが上記の利益を達成するためには、該デバイスが、その治療の作用部位に到達し、またはその部位を認識するのに十分な長さで血流中に存在しなければならない。しかし、細網内皮系（ＲＥＳ）としても知られる単核食細胞系（ＭＰＳ）によるナノ粒子状薬物担体のオプソニン化および身体からの除去が、これらの目標を実現する上での大きな障害である。ＭＰＳのマクロファージは、血流から無防備のナノ粒子を静脈内投与から数秒以内に除去し、それらを部位特異的薬物送達デバイスとして無効にする能力を有する。典型的にはクッパー細胞または肝臓のマクロファージであるこれらのマクロファージは、ナノ粒子それ自体を直接的に識別できないが、粒子の表面に結合された特定のオプソニンタンパク質をかなり認識する。
【０００５】
ナノ粒子を製造するのに現在使用されるポリマーは、それらが、急速に認識され、かつ結果的にマクロファージ系によって除去されるという、あるいはそれらが加水分解に対して安定でないという欠点を有する。ナノ粒子のオプソニン化（および、結果的にマクロファージによる排除）を減速するのに広く使用される１つの方法が、オプソニンが粒子表面に結合するのを助ける静電および疎水性相互作用を遮断できる、表面に吸着またはグラフトされた遮蔽基の使用である。これらの基は、長い親水性ポリマー鎖および非イオン性界面活性剤である傾向がある。オプソニン化および結果的にマクロファージの排除を減速するための遮蔽基として試みられてきたポリマー系の一部の例には、多糖、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ＰＥＧ、およびＰＥＧ含有コポリマーが含まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、医薬組成物として適する改善された安定性特性を有するナノ粒子、およびとりわけナノ粒子懸濁液を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様によれば、本出願は、薬理学的に活性な薬剤を含むポリ（エチレンカーボネート）（ＰＥＣ）ナノ粒子を含む医薬組成物に関する。これらのＰＥＣナノ粒子は、従来のポリマーナノ粒子に比較して、物理的および化学的安定性のみならず、さらに、食作用に対する生物学的安定性も示す。このより遅い食作用速度のため、ＰＥＣナノ粒子は、マクロファージ系によってそれほど急速には排除されない。これらの重要な特性により、本出願のＰＥＣナノ粒子は、薬理学的に活性な薬剤を送達するための医薬組成物として使用するのに適したものになる。その独特な特性により、ＰＥＣは、含められた、好ましくは封入された薬理学的に活性な薬剤の制御性または持続性放出に適したナノ粒子担体になる。とりわけ、食作用に対する改善された安定性は、封入された薬理学的に活性な薬剤をＰＥＣナノ粒子の生分解により放出し、それによって前記の薬理学的に活性な薬剤をより長い放出期間にわたって全身性で利用可能にするための非経口デポ剤としての、本発明によるＰＥＣナノ粒子の使用を可能にする。したがって、薬理学的に活性な薬剤のための担体としてのＰＥＣナノ粒子の使用は、先行技術中で知られているポリマーナノ粒子に優るかなりの利点を有する。
【０００８】
さらなる態様によれば、本出願は、好ましくは薬理学的に活性な薬剤を組み込んだポリ（エチレンカーボネート）ナノ粒子の懸濁液に関する。それぞれのＰＥＣナノ粒子懸濁液は、物理的に安定であり、かつ皮下局所送達に適している。さらなる態様によれば、本出願は、医薬組成物を調製するための、ＰＥＣナノ粒子懸濁液の使用に関する。
【０００９】
さらなる態様において、本出願は、とりわけ溶媒置換法によってＰＥＣナノ粒子懸濁液を調製することによる、薬理学的に活性な薬剤を含むポリ（エチレンカーボネート）ナノ粒子を含む医薬組成物の製造法に関する。
【００１０】
当業者にとって、本出願のその他の目的、特徴、利点および態様は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。しかし、以下の説明、添付の特許請求の範囲、および特定の実施例は、本出願の好ましい実施形態を示すとはいえ、単に例示のために提供されることを理解されたい。当業者にとって、開示された本発明の精神および範囲内での種々の変化および修正は、以下に目を通すことによって容易に明らかになるであろう。
【００１１】
本発明は、非限定的実施例によってさらに概説されるが、それらの実施例は本発明の好ましい実施形態を構成する。さらに、本出願中で引用される参考文献は、参照により全体で組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１ａ】ポリマー濃度の変化による未装填ナノ粒子の粒径調節を示す図である（図１ａはＰＥＣ９５の場合）。図は、異なるポリマー濃度を使用する３つの異なるバッチに関してＰＣＳによって得られた粒径をナノメートルで示す（実施例４参照）。三つ組みの平均ＰＤＩを、仕込み名称(charge name)の後の丸括弧内に示す。粒径の標準偏差は棒線で示される。
【図１ｂ】ポリマー濃度の変化による未装填ナノ粒子の粒径調節を示す図である（図１ｂはＰＥＣ９９の場合）。図は、異なるポリマー濃度を使用する３つの異なるバッチに関してＰＣＳによって得られた粒径をナノメートルで示す（実施例４参照）。三つ組みの平均ＰＤＩを、仕込み名称の後の丸括弧内に示す。粒径の標準偏差は棒線で示される。
【図２】ポリマー濃度の変化による被装填ナノ粒子の粒径調節を示す図である。図は、異なるポリマー濃度を使用する３つの異なるバッチに関してＰＣＳによって得られた粒径をナノメートルで示す。粒径の標準偏差は棒線で示される。
【図３】異なる温度でのＰＥＣ９５ナノ粒子の粒径変化を示す図である。横に引かれた線は、４℃で調製された三つ組みの平均粒径に相当し、それは、気候環境試験機のすべての温度変化を経験(run)する（実施例５．２参照）。
【図４】異なる温度でのＰＥＣ９９ナノ粒子の粒径変化を示す図である。横に引かれた線は、４℃で調製された三つ組みの平均粒径に相当し、それは、気候環境試験機のすべての温度変化を経験する（実施例５．２参照）。
【図５】ＰＥＣ９９（Ａ）またはＰＥＣ９５（Ｂ）から構成されたナノ粒子のＰＣＳで分析された膨潤試験の結果を示す図である（実施例５．３参照）。粒径変化は、蒸発処理中に示される。ナノ粒子は、ＰＥＣ９９またはＰＥＣ９５を使用して調製される。ＰＶＡ溶液中へ注入した後（Ｔ＝０）、アリコートを、示した３つの時点で採取し、ＰＣＳを使用して粒径について分析する。最初の２４時間（ｔ＝０、３０分、６０分、９０分、１２０分、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間および２４時間）のデータのみを示す。エラーバーは、三つ組みの標準偏差を示す。
【図６ａ】図６ａは、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を使用するＰＥＣ９５粒子（０．１ｍｇ／５ｍｌ）の分析を示す図である。
【図６ｂ】図６ｂは、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を使用するＰＥＣ９５粒子（３ｍｇ／５ｍｌ）の分析を示す図である。
【図７】原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を使用するＰＥＣ９９粒子（０．１ｍｇ／５ｍｌ）の分析を示す図である。
【図８】粒子を調製する際の蒸発処理の最初の30分内でのＰＥＣ９５（３ｍｇ／ｍｌ）の膨潤特性を示す図である（実施例５．３参照）。
【図９】被装填ＰＥＣ９５およびＰＥＣ９９ナノ粒子懸濁液に関して３７℃でＦＡＣＳによって測定した場合の蛍光を示す図である（実施例８参照）。
【図１０】種々のナノ粒子＋ＮａＮ３に関して４℃および３７℃でＦＡＣＳによって測定した場合の蛍光を示す図である（実施例８参照）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本出願の一態様によれば、医薬組成物は、薬理学的に活性な薬剤を含むポリ（エチレンカーボネート）ナノ粒子を含めて提供される。
【００１４】
ポリマーナノ粒子用マトリックス材料としてのポリ（エチレンカーボネート）（ＰＥＣ）の使用は、ＰＬＧＡまたはポリ（ε−カプロラクトン）などの一般的な生分解性および加水分解で分解可能なポリマーの使用に優る利点がある。ＰＥＣナノ粒子は、大きな装填能力を有し、かつＰＥＣは、水性溶液中で化学的に安定であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでのみ分解する。ＰＥＣは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで、とりわけスーパーオキシドラジカルアニオンＯ２−１によって生分解性であり、前記アニオンは、ｉｎ  ｖｉｖｏで炎症細胞によって主に産生される。Ｏ２−１を産生する細胞によるこの非加水分解性の生分解は、生分解性ポリマーの中でどちらかと言えば独特である。さらに、ＰＥＣのそれら生分解産物は、極めて低い毒性を有するに過ぎないか、毒性を有さない。
【００１５】
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、ＰＥＣナノ粒子は、先行技術中で知られている例えばポリスチレンナノ粒子などのその他のポリマーナノ粒子に比べて、マクロファージによって貧食され結果的に除去／排出されることがより少ないことを見出した。この重要な特性のため、本発明のＰＥＣナノ粒子は、該ナノ粒子がマクロファージによって攻撃され結果的に排出されることがより少なく、したがって、含まれている薬物を、従来のポリマーナノ粒子に比べてより長期間にわたって放出するという意味で、生物学的により安定である。
【００１６】
これらの重要な態様、ＰＥＣナノ粒子の物理的安定性、ＰＥＣナノ粒子の化学的安定性、およびそれらの食作用に対する生物学的安定性は、本発明のＰＥＣナノ粒子を、薬理学的に活性な薬剤を送達するための医薬組成物として使用するのに適するものにする。その独特の特性は、ＰＥＣを、含められたまたは好ましくは封入された薬理学的に活性な薬剤の制御性または持続性放出のための適切なナノ粒子担体にする。本明細書中で使用する場合、用語「持続性放出」または「制御性放出」は、使用されるＰＥＣナノ粒子が、ヒトまたは動物の身体内へデバイスを埋め込んで３〜１０日以内、例えば７日目に、その中に溶解または分散された薬理学的に活性な薬剤の１０、２０、３０、４０または５０重量％以下から６０、７０、８０または９０重量％までを放出することを意味する。
【００１７】
とりわけ、食作用に対する改善された安定性は、本発明によるＰＥＣナノ粒子の、封入された薬理学的に活性な薬剤を該ＰＥＣナノ粒子の生分解により放出し、それによって、前記の薬理学的に活性な薬剤をより長い放出期間にわたって全身性で利用可能にするための非経口デポ剤としての使用を可能にする。したがって、薬理学的に活性な薬剤のための担体としてのＰＥＣナノ粒子の使用は、先行技術で知られているポリマーナノ粒子に優るかなりの利点を有する。
【００１８】
本発明において、医薬組成物は、ＰＥＣナノ粒子内に含められ、かつ、例えばその中に封入、溶解または分散されることのできる、少なくとも１種の薬理学的に活性な薬剤を含む。本発明のナノ粒子は、薬理学的に活性な薬剤の患者への制御性または持続性放出のために使用できる。用語「持続性放出」または「制御性放出」は、本明細書中で使用する場合、前に定義したように使用されるものとする。
【００１９】
本発明のＰＥＣナノ粒子は、１〜１０００ｎｍの範囲の直径を有する。ナノ粒子の直径は、好ましくは狭い粒度分布の、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００ｎｍ未満、および／または４５０ｎｍ未満でよい。ナノ粒子懸濁液が使用される、すなわち注射されると想定される場合において、より小さな直径のナノ粒子は、より小さなサイズの注射針の使用を可能にする。
【００２０】
本明細書中で使用する場合、用語「薬学的に活性な薬剤」は、生きている生物体に投与された場合に生理学的反応をもたらすことのできる任意の物質を包含する。このような物質は、通常、治療有効量で投与される。本明細書中で使用する場合、用語「治療有効量」は、一般に、哺乳動物を襲う疾患または状態の症状または発症を低減する、排除する、治療する、予防する、または制御するのに有効である量または濃度を指す。制御することは、哺乳動物を襲う疾患または状態の進行または発症を減速する、中断する、阻止するまたは停止することであってよいすべての過程を指すと解釈される。しかし「制御する」は、すべての疾患および状態の症状の全体的排除を必ずしも指さず、かつ予防治療を含むと解釈される。適切な治療有効量は、当業者に周知であり、その量は、使用されている治療用化合物および取り組まれている適応症と共に変化する。本明細書中で使用する場合、用語「医薬活性薬剤」、「活性成分」、「薬理学的に活性な化合物」、「活性物質」、または「薬物物質」は、同義と解される。
【００２１】
多くの異なる薬理学的に活性な薬剤は、本発明によるＰＥＣナノ粒子を用いて送達／製剤化することができる。薬物の治療部類（therapeutic class）の例には、限定はされないが、血圧降下剤、抗不安剤、抗凝血剤、抗痙攣剤、血中グルコース低下剤、抗ヒスタミン剤、鎮咳剤、抗悪性腫瘍薬、β−遮断剤、抗炎症剤、抗精神剤、認知強化剤、抗アテローム硬化剤、コレステロール低下剤、抗肥満剤、自己免疫障害剤、抗インポテンス剤、抗菌および抗真菌剤、免疫抑制剤、催眠剤、抗欝剤、抗ウイルス剤、抗生物質、化学療法剤、避妊剤、鎮静剤、ステロイド、ビタミン、酵素、抗原、およびこれらの組合せが含まれる。
【００２２】
ＰＥＣナノ粒子は、少量で薬理学的に活性があり、かつ長期間途切れることのない血中レベルを有する必要のある薬理学的に活性な薬剤、例えば、ホルモン、ペプチドおよびタンパク質、生物学的標的に高い親和性を有する化学的存在物（例えば、ソマトスタチン、ビスホスホネート、インターフェロン、およびインターロイキン）などにとりわけ適している。本発明によるＰＥＣナノ粒子懸濁液は、不安定であり、経口での使用後に、または消化管系中で崩壊し、そのため好ましくは非経口で投与される薬理学的に活性な薬剤の送達にとりわけ適している。
【００２３】
ＰＥＣポリマーの長所は、タンパク質を、それらを変性することなしに封入することである。ＰＥＣがｉｎ  ｖｉｖｏで分解しても、酸性の微視的環境（ＰＬＧＡポリマーの場合に典型的に観察される）は生じず、このことは、酸性で不安定なタンパク質をＰＥＣデポ剤中で利用することもできるので、もう１つの利点である。
【００２４】
本発明中で使用される薬理学的に活性な薬剤は、化合物、生物学的に活性な薬剤、核酸、ペプチド、およびタンパク質からなる群から選択できる。用語「生物学的に活性な薬剤」は、本明細書中で使用する場合、生物学的成分と反応する潜在能力を有する薬剤を指す。より詳細には、本明細書中で利用される生物学的に活性な薬剤は、生存細胞に付随する本来的過程を変えるように設計される。本明細書の目的に関して、細胞の本来的過程は、生物学的に活性な薬剤を送達する前の細胞に付随する過程である。生物学的に活性な薬剤の例には、限定はされないが、医薬、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、酵素阻害剤、ホルモン、サイトカイン、抗原、ウイルス、オリゴヌクレオチド、酵素が含まれ、ポリヌクレオチドは、生物学的に活性な薬剤の例である。
【００２５】
用語「タンパク質」は、本明細書中で使用する場合、ポリペプチド（すなわち、ペプチド結合で互いに連結された少なくとも２つのアミノ酸からなる紐）を指す。タンパク質は、アミノ酸以外の部分を含むことができ（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカンなどでよい）、かつ／または別の方法で処理または修飾されていてもよい。当業者は、「タンパク質」が、細胞によって産生されるような完全なポリペプチド鎖であることができ（シグナル配列を伴うまたは伴わない）、あるいはその特徴的な部分であることができることを認識するであろう。当業者は、タンパク質が、時には、例えば１つまたは複数のジスルフィド結合によって連結された、またはその他の手段によって会合された二以上のポリペプチド鎖を含むことができることを認識するであろう。有用な修飾には、例えば、末端アセチル化、アミド化などが含まれる。一部の実施形態において、タンパク質は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、およびこれらの組合せを含むことができる。用語「ペプチド」は、一般に、約１００個未満のアミノ酸の長さを有するポリペプチドを指すのに使用される。タンパク質およびペプチドの例には、限定はされないが、サイトカイン、例えばインターロイキン、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦもしくはＬＩＦ、インターフェロン、エリスロポエチン、シクロスポリンもしくはホルモン、またはそれらの類似体が含まれる。
【００２６】
ＰＥＣナノ粒子は、２５００Ｄａ未満の小さな分子量（ＭＷ）を有する薬理学的に活性な薬剤のための担体としてとりわけ適している。さらに、好ましい実施形態によれば、薬理学的に活性な薬剤は、親油性の性質を有するか、あるいは親油性基を含む。それぞれの薬剤は、ＰＥＣマトリックスによって効率的に封入されて本発明のＰＥＣナノ粒子を形成する。
【００２７】
薬理学的に活性な薬剤は、ソマトスタチン類似体、例えば、パシレオチド、ランレオチド、オクトレオチド、バプレオチドおよびその塩；ビスホスホネート、例えば、ゾレドロン酸およびその塩；脂質低下薬（lipid altering drug）の部類からなる群から選択できる。ソマトスタチン類似体は、ソマトスタチン様活性を有する化合物である。哺乳動物の下垂体からの成長ホルモン放出を阻害するソマトスタチン様活性を有するいくつかの生物活性オリゴペプチドが知られている。これらの生物学的に活性なオリゴペプチドは、その双方が参照により本明細書に組み込まれる、例えば、Ｗｅｃｋｂｅｃｋｅｒら（２００３年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２巻、９９９〜１０１６頁、およびＭｕｒｒａｙら（２００４年）、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１１４巻、３４９〜３５６頁で開示されているその活性機構と一緒に当技術分野で周知である。ソマトスタチンそれ自体に加えて、これらの生物学的に活性なオリゴペプチドには、限定はされないが、オクトレオチド、ランレオチド、バプレオチドおよびパシレオチドがその薬学的に許容される塩、好ましくは酢酸塩と一緒に含まれる。
【００２８】
本発明の目的に関して、用語「ビスホスホネート」は、２つのリン酸基を含む薬物を指す。ビスホスホネートは、パミドロネート、ネリドロネート、アレンドロネート、イバンドロネートまたはリセドロネートのようなＮ含有ビスホスホネート、およびエチドロネート、クロドロネートおよびチルドロネートのようなＮ非含有ビスホスホネートに分類される。例えば、ゾレドロン酸は、本発明の薬物送達系のために使用できる、ビスホスホネートであるゾレドロン酸は、化学的には（１−ヒドロキシ−２−イミダゾール−１−イル−ホスホノエチル）ホスホン酸一水和物と呼ばれ、その構造は式Ａとして示される：
【００２９】
【化１】
2012512148.tif 000002
【００３０】
代わりに、脂質低下薬も、本発明のナノ粒子中に装填することができる。本発明の目的に関して、表現「脂質低下薬」は、例えば、コレステロール、トリグリセリド、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、超高密度リポタンパク質（ＶＨＤＬ）、リポポタンパク質Ａ（lipopoprotein a）およびキロミクロンのような脂質またはリポタンパク質の血中濃度を変える任意の薬物を指す。これらの薬物には、限定はされないが、コレステロール吸収阻害剤、ナイアシン、フィブラート類、またはスタチン類が含まれる。脂質低下薬の非限定的例が、レスコル、ナイアシン受容体活性化剤および甲状腺ホルモン受容体βの活性化剤である。
【００３１】
代わりに、免疫抑制剤も、本発明のナノ粒子中に装填することができる。免疫抑制剤の非限定例が、コルチゾール、デキサメタゾン、アルキル化剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、アザチオプリン、ラパマイシン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、およびメトトレキセートである。
【００３２】
薬理学的に活性な薬剤は、組成物の約７０重量％までの、組成物の約０．５重量％〜約６０重量％、組成物の約１０重量％〜約４０重量％、または組成物の約１．０重量％〜約１０重量％の量で存在することができる。しかし、薬理学的に活性な薬剤の特定レベルの選択は、薬理学的に活性な薬剤の使用されるＰＥＣへの溶解度、投与方式、ならびに対象の大きさおよび状態を含む、薬学技術で周知の因子に従ってなされる。
【００３３】
薬物の治療部類の例には、限定はされないが、血圧降下剤、抗不安剤、抗凝血剤、抗痙攣剤、血中グルコース低下剤、鬱血除去剤、抗ヒスタミン剤、鎮咳剤、抗悪性腫瘍薬、β−遮断剤、抗炎症剤、抗精神剤、認知強化剤、抗アテローム硬化剤、コレステロール低下剤、抗肥満剤、自己免疫障害剤、抗インポテンス剤、抗菌および抗真菌剤、催眠剤、抗生物質、抗欝剤、抗ウイルス剤、およびこれらの組合せが含まれる。
【００３４】
本発明によるＰＥＣナノ粒子の調製で使用されるＰＥＣポリマーは、式Ａ：
−（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）−                （式Ａ）
のエチレンカーボネート単位を含むことができ、次の特性の少なくとも１つを有する：
・７０〜１００モル％のエチレンカーボネート含有量を有する、および／または
・クロロホルム中、２０℃で測定した場合に、０．４〜４．０ｄｌ／ｇの固有粘度を有する、および／または
・５〜５０℃のガラス転移温度を有する。
【００３５】
使用されるＰＥＣポリマーは、７０〜１００モル％のエチレンカーボネート含有量を有する。好ましくは、ＰＥＣポリマーのエチレン含有量は、８０〜１００％、好ましくは９０〜９９．９％である。
【００３６】
使用されるＰＥＣポリマーは、クロロホルム中、２０℃で測定して０．４〜４．０ｄｌ／ｇの固有粘度を有する。好ましくは、ＰＥＣポリマーは、２０℃で、かつクロロホルム中１ｇ／ｄｌの濃度で測定して、０．４〜３．０ｄｌ／ｇの固有粘度を有する。
【００３７】
使用されるＰＥＣポリマーは、５℃〜５０℃、好ましくは１５℃〜２５℃のガラス転移温度を有する。
【００３８】
使用されるＰＥＣポリマーは、約２０００ｋＤより小さい分子量を有する。好ましくは、分子量は、例えば、溶離液として塩化メチレンを、参照としてポリスチロールを用いるゲル浸透クロマトグラフィーによって測定できるような、５００ｋＤ未満である。
【００３９】
さらなる実施形態において、ＰＥＣポリマーは、例えばｃｏ−単位として式Ｂ：
−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）−                              （式Ｂ）
のエチレンオキシド単位を含む（ｃｏ）−ポリマーの形態で存在することができる。ＰＥＣポリマーは、エチレンオキシド単位を有するなら、要約式Ａｍ−Ｂｎ＝
−（Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）−ｍ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）−ｎ      （式Ｃ）
（ここで、ｍ／（ｎ＋ｍ）×１００＝７０〜１００）により、エチレンカーボネート単位とエチレンオキシド単位とのランダムな分布を有する。しかし、本発明のＰＥＣポリマー中のほとんどのエチレンオキシド単位は、エチレンオキシド単位のモル比が小さい場合には特に、隣接したエチレンカーボネート単位を統計的に有する。それは、これらの場合に、生じるエーテル官能基のほとんどがポリマー鎖に沿ってカーボネート官能基の間にランダムに分布されることを意味する。当業者は、本発明の生成物のＤＣＣｌ３中での１Ｈ−ＮＭＲスペクトルが、この仮定を確証することを理解するであろう。
【００４０】
本発明のＰＥＣポリマーは、熱水（９０〜１００℃）中で分子量はあまり低下せず数時間安定である。沸騰している２回蒸留水に数時間の間暴露した後、ガラス転移温度のかなりの（例えば、１８℃を超える、例えば２８℃までの）上昇が観察される。
【００４１】
ＰＥＣポリマーは、組成物の約９９重量％までの、組成物の約０．５重量％〜約８０重量％、組成物の約１０重量％〜約３０重量％、または約１重量％〜約１０重量％の量で存在することができる。
【００４２】
一実施形態によれば、医薬組成物は、ナノ粒子懸濁液の形態を取る。ナノ粒子懸濁液は、ミクロ粒子懸濁液と対照的に、沈降せず、物理的に安定な懸濁液を形成するので、生分解性ＰＥＣナノ粒子懸濁液の使用は、ＰＥＣミクロ粒子の使用に優る利点がある。
【００４３】
ナノ懸濁液の注射の後に、いくつかの薬物動態学的プロフィールが生じることができる。皮下、筋内または皮内経路を経由するデポ剤送達は、小さな注射容積中により多くの薬物量を安全に装填する能力のため、長期の薬物放出を提供する。ＰＥＣナノ粒子懸濁液の大きな装填能力は、本発明のナノ粒子懸濁液の重要で有利な特徴である。
【００４４】
したがって、本発明のＰＥＣナノ粒子は、懸濁液の形態で、とりわけ非経口製剤の形態で有利に使用することができる。本明細書中で使用する場合、用語「非経口製剤」は、シリンジおよびニードルまたはカテーテルを使用して消化管以外の経路で与えられる組成物を意味する。これには、静脈内、動脈内、筋内、心臓内、皮下、骨内、皮内、髄腔内、腹膜内、膀胱内、経皮、経粘膜、硬膜外、および硝子体内適用が含まれる。ＰＥＣナノ粒子懸濁液は、皮下局所送達にとりわけ適している。
【００４５】
それらの有益な安定性プロフィールのため、本発明のＰＥＣナノ粒子は、例えば皮下で注射することができる即用型非経口デポ剤の形態で使用できる。この目的に関して、ＰＥＣナノ粒子の大きさが小さいので、極めて小さいサイズのニードル（例えば、２７Ｇ以下）も使用することができる。これらの特性により、それぞれのデポ製剤の家庭内使用および自己投与も可能になる。
【００４６】
いくつかの非経口適用形態およびそれぞれの薬物製剤は、当業者にとって周知であり、注射、点滴、濃縮製剤、埋込み製剤を包含する。ＰＥＣナノ粒子を含む医薬組成物は、それらを適切なガレヌス添加剤と共に仕上げること、および任意選択でそれらを適切なディスペンサー中に詰めることによって作製することができる。
【００４７】
ＰＥＣナノ粒子懸濁液の安定性を高めるために、製剤は、例えば、ナノ粒子の凝集または沈殿を防止する界面活性剤などの安定剤をさらに含むことができる、例えば、イオン性または非イオン性界面活性剤を使用できる。界面活性剤の例には、限定はされないが、脂肪酸；アルキルスルホン酸塩；ポリオキシエチレン脂肪酸；ソルビタン誘導体；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；レシチン；リン脂質；モノ、ジおよびトリグリセリド；ならびにこれらの混合物が含まれる。医薬組成物中での界面活性剤の使用は、当業者に周知である。便宜的には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、２０００年が参照される。
【００４８】
本出願のさらなる態様において、ＰＥＣポリマーおよび薬理学的に活性な薬剤を含む医薬組成物は、薬学的に許容される添加剤、例えば、イオン性または非イオン性界面活性剤、結合剤もしくは接着剤、抗酸化剤、滑沢剤、および／またはｐＨ調節剤をさらに含むことができる。このようなさらなる成分は当技術分野で周知であることが認識されるであろう。それゆえ、ＰＥＣナノ粒子は、さらなるポリマーおよび／または添加物を含むことができる。例には、ナノ粒子中またはその表面上の、例えばメナジオンおよび／またはビタミンＣなどのラジカル捕捉剤が含まれる。それぞれの添加物は、（コ）ポリマー中に包埋されることができ、例えば、ポリ（エチレンカーボネート）の分解速度を減速し、それによって、薬物放出、および結果としてナノ粒子製剤のデポ剤としての活性のさらなる延長を可能にすることができる。
【００４９】
このような界面活性剤の例には、限定はされないが、ＢＡＳＦ社（Ｍｔ．Ｏｌｉｖｅ、ニュージャージー州）からのＣＲＥＭＯＰＨＯＲシリーズなどの、天然または水素化されたヒマシ油とエチレンオキシドとの反応生成物；Ｕｎｉｑｅｍａ社（Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ、デラウェア州）からのＭＹＲＪシリーズなどの、ポリオキシエチレンステアリン酸エステルを包含するポリオキシエチレン脂肪酸エステル；Ｕｎｉｑｅｍａ社（Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ、デラウェア州）からのＴＷＥＥＮシリーズなどのソルビタン誘導体；Ｕｎｉｑｅｍａ社からのＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ  ＰＥ／Ｆ８７／１０８／１２７Ｌ４４およびＢＡＳＦ社からのＰＬＵＲＯＮＩＣ（Ｌｕｔｒｏｌ  Ｆ１２７）などの、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンのコポリマーおよびブロックコポリマーまたはポロキサマー；ポリオキシエチレンアルキルエーテル；Ｅａｓｔｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（Ｋｉｎｇｓｐｏｒｔ、テネシー州）から購入できる融点が約３６℃の水溶性トコフェリルＰＥＧコハク酸エステル；例えば５〜３５、例えば２０〜３０の［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ］単位を有するＰＥＧステロールエーテル、例えば、Ｃｈｅｍｒｏｎ社（Ｐａｓｏ  Ｒｏｂｌｅｓ、カリフォルニア州）からのＳＯＬＵＬＡＮ  Ｃ２４（Ｃｈｏｌｅｔｈ−２４およびＣｅｔｈｅｔｈ−２４）；日光ケミカルズ（株）（東京、日本）からのＤＥＣＡＧＬＹＮ、ＨＥＸＡＧＬＹＮおよびＴＥＴＲＡＤＬＹＮなどのポリグリセロール脂肪酸エステル；ならびにアルキレンポリオールのエーテルまたはエステル化合物が含まれる。
【００５０】
結合剤もしくは接着剤の例には、限定はされないが、個別的にまたは組合せのどちらかで、アラビアゴム；トラガカントゴム；蔗糖；ゼラチン；ブドウ糖；限定はされないがα化デンプンなどのデンプン；アルギン酸およびアルギン酸塩；ケイ酸マグネシウムアルミニウム；ＰＥＧ；グアーゴム；多糖酸；ベントナイト；ポビドン、例えばポビドンＫ−１５、Ｋ−３０およびＫ−２９／３２；ポリメタクリレート；ＨＰＭＣ；ヒドロキシプロピルセルロース；およびエチルセルロースが含まれる。
【００５１】
抗酸化剤の例には、限定はされないが、アスコルビン酸およびその誘導体、トコフェロールおよびその誘導体、ブチルヒドロキシルアニソールおよびブチルヒドロキシルトルエンが含まれる。α−トコフェロールのようなビタミンＥがとりわけ有用である。
【００５２】
滑沢剤の例には、限定はされないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、蔗糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、タルク、およびステアリン酸が含まれる。
【００５３】
ｐＨ調節剤の例には、限定はされないが、ＮａＯＨ、ＬｉＯＨ、ＫＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｎａ３ＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、Ｋ３ＰＯ４、メグルミン、Ｃａ（ＯＨ）２、Ｍｇ（ＯＨ）２、Ｚｎ（ＯＨ）２、Ａｌ（ＯＨ）３、ピリドキシン、トリエタノールアミン、水酸化アンモニウム、シトシン、ジエチルアミン、メグルミン、オルニチン、グリシン、リシン、アルギニン、バリン、プロリン、アスパラギン酸、アラニン、アルパラギン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、トレオニン、水酸化コリン、プロカイン、ジエチルエタノールアミン、グルコサミン、グアニン、ニコチンアミド、ピペラジン、グアニジン、オラミン、ピペリジン、トリエチルアミン、トロメタミン、ベンザチン、アデニン、これらの混合物などが含まれる。
【００５４】
本出願のさらなる態様において、ポリ（エチレンカーボネート）ナノ粒子は、懸濁液の形態で存在する。懸濁液中のＰＥＣナノ粒子の特性については、既に前に説明しており、本発明者らは、前記開示を参照する。
【００５５】
一実施形態によれば、ＰＥＣナノ粒子懸濁液は、少なくとも１種の薬理学的に活性な薬剤を含み、かつ次の付加的特性の少なくとも１つを有する：
ａ）ＰＥＣポリマーは、少なくとも１つの次の特性を有する：
・７０〜１００モル％のエチレンカーボネート含有量を有する、
・クロロホルム中、２０℃で測定すると０．４〜４．０ｄｌ／ｇの固有粘度を有する、
・５〜５０℃のガラス転移温度を有する；
ｂ）ＰＥＣナノ粒子懸濁液は、非経口製剤である；
ｃ）ＰＥＣナノ粒子懸濁液は、持続性放出特性を有する；
ｄ）ＰＥＣナノ粒子懸濁液は、非経口デポ製剤である；
ｅ）懸濁液中のナノ粒子の直径は、１０００ｎｍ未満、８００ｎｍ、７５０ｎｍ、７００ｎｍ、６５０ｎｍ、６００ｎｍ、５５０ｎｍ、５００ｎｍおよび／または４５０ｎｍ未満である；および／または
ｆ）使用されるＰＥＣポリマーは、２０００ｋＤａ未満の分子量を有する。
【００５６】
懸濁液のＰＥＣナノ粒子は、薬理学的に活性な薬剤、とりわけ前に記載のような薬理学的に活性な薬剤を含む。懸濁液中のＰＥＣナノ粒子は、任意選択で、薬学的に許容される付加的添加剤、例えば、イオン性または非イオン性界面活性剤、接着剤、安定剤、抗酸化剤、滑沢剤および／またはｐＨ調節剤、ならびに／あるいは添加物、例えば、ナノ粒子の中または表面上にマナジオンおよび／またはビタミンＣなどのラジカル捕捉剤を含むことができる。本発明者らは、ここでも適用される前記の詳細な開示を参照する。
【００５７】
本発明は、また、医薬組成物を調製するためのそれぞれのＰＥＣナノ粒子懸濁液の使用に関する。
【００５８】
本発明は、また、薬理学的に活性な薬剤を含むポリ（エチレンカーボネート）ナノ粒子の懸濁液を調製することによる、前記のような医薬組成物の製造方法を提供する。
【００５９】
ナノ粒子懸濁液は、種々の技術によって得ることができる。ナノ粒子懸濁液を調製するのに適切な方法は、参照により全体で本明細書に組み込まれ、本明細書に記載のＰＥＣナノ粒子懸濁液を調製するのにも利用できる、例えば、Ｒｉｃｅら、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２巻（２００６年）８〜２１頁に詳細に記載されている。とりわけ、溶媒蒸発法、塩析および溶媒置換法が、最も有利である。溶媒置換法は、それが均一な分布の大きさのナノ粒子を与えるので、結果として使用された。
【００６０】
溶媒置換法を使用する場合には、ポリマーを、まず、水と混和性である有機溶媒（例えば、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、クロロホルム、１，４−ジオキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、またはＮ−２−ピロリドン）中に定められた濃度で溶解する。この混合物を、次いで、シリンジまたは注入ポンプを介して安定剤を含んでいてもよい水性溶液（例えば、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、０．１Ｍ））中に注入する。直ちに、水性相中での有機層の急速な拡散が起こり、それによって、コロイド状のチンダル現象を呈した系の創生に至る。この溶液を、有機溶媒が完全に蒸発するまで、常圧または減圧下に磁気撹拌器を用いて混合する。溶媒置換法によって製造できるナノ粒子の大きさは、種々の因子を変更することによって変えることができる。大きさに影響を及ぼす重要な因子は、ポリマー濃度、水性溶液中の任意選択の安定剤の濃度、および有機相の水性相に対する比率、注入用毛細管の直径、ポリマー／溶媒混合物の注入速度、さらには温度である。とりわけ、ポリマー濃度が決定的に重要である。溶媒置換法は、とりわけ親油性化合物に対して高い封入効率を示し、結果として、実施例中でモデル物質としての親油性蛍光マーカーであるクマリン−６によって示されるように、親油性薬物化合物を封入するのに極めて適している。
【００６１】
有機溶媒の例には、限定はされないが、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、クロロホルム、１，４−ジオキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、またはＮ−２−ピロリドン；好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはＮ−１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）が含まれる。
【００６２】
ナノ粒子に少なくとも１種の薬理学的に活性な薬剤を装填するために、薬理学的に活性な薬剤を水と混和性である有機溶媒（例えば、アセトンまたはアセトニトリル）中に定められた濃度で溶解することによって、薬理学的に活性な薬剤の第１原液を調製する。第１原液中での薬理学的に活性な薬剤の濃度は、有機溶媒１ｍＬにつき１〜５００μｇ、好ましくは有機溶媒１ｍＬにつき５〜１００μｇ、最も好ましくは有機溶媒１ｍＬにつき２５〜７μｇの範囲でよい。ＰＥＣポリマーを水と混和性である有機溶媒（例えば、アセトンまたはアセトニトリル）中に溶解することによって、第２原液を調製する。第２原液中でのＰＥＣポリマーの濃度は、有機溶媒１ｍＬにつき０．１〜１００ｍｇ、好ましくは１ｍＬにつき０．５〜５０ｍｇ、最も好ましくは１ｍＬにつき１〜２５ｍｇの範囲でよい。第１原液および第２原液の必要量を、ピペットを用いてエッペンドルフカップ中に移送し、有機溶媒で１．５ｍｌにする。渦撹拌し、そしてＰＶＡ溶液中に注入して、所望の最終濃度が得られる。所望の最終濃度を得るための原液の妥当な濃度および量を決定する方法は、当業者に周知である。
【００６３】
薬理学的に活性な薬剤の物理的および化学的特性に応じて、薬物装填量は、０．１〜７０重量％の間で変えることができる。薬理学的に活性な薬剤を含むＰＥＣナノ粒子を調製する場合、ＰＥＣポリマーの量は、薬理学的に活性な薬剤と対比して、１〜９０重量％の間で変えることができ、好ましくはほぼ３０重量％である。
【００６４】
一実施形態によれば、アセトニトリルが水と混和性であり、かつＰＥＣポリマーを溶解するので、ＰＥＣポリマーは、アセトニトリルに溶解される。
【００６５】
ＰＥＣポリマーを溶解するのに使用される溶媒は、好ましくは乳化剤を含む第２溶媒で置換される。詳細は、実施例の部にも記載される。乳化剤としては、ポリビニルアルコール、好ましくはＭｏｗｉｏｌ  １８／８８を使用できる。
【００６６】
一実施形態によれば、粒子の大きさは、ポリマー濃度で調節される。実験によって、０．１ｍｇ／５ｍｌ  ＰＶＡであるＰＥＣポリマー濃度は、２００ｎｍ未満の大きさを有するナノ粒子を得るのに適していることが示された。３ｍｇ／５ｍｌ  ＰＶＡの濃度は、僅かに２００ｎｍを超える大きさを有し、結果としてやはり極めて適切な範囲にあるナノ粒子を与えた。
【００６７】
本発明を、非限定的実施例によってさらに概略的に説明するが、それらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を構成する。さらに、本出願中で引用されるすべての参考文献、参照により全体で組み込まれる。
【実施例１】
【００６８】
（ポリエチレン）カーボネートを合成するための実験手順
ＰＥＣは、ＣＯ２とエチレンオキシドとの反応、およびそれに続く重合から得ることができる（参照により本明細書に組み込まれる、例えば、Ａｃｅｍｏｇｌｕら、「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）ｓ  ｐａｒｔ  Ｉ：Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ、１９９７年、４９巻（２，３号）：２６３〜２７５頁；およびＶｏｇｄａｎｉｓら「Ｃａｒｂｏｎ  ｄｉｏｘｉｄｅ  ａｓ  ａ  ｍｏｎｏｍｅｒ．Ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ」Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８６年、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．７巻、５４３〜５４７頁を参照されたい）。
【００６９】
続いてナノ粒子の調製に使用されるＰＥＣポリマーであるＰＥＣ９５およびＰＥＣ９９は、表１に示す物理的特性を呈示する。ＰＥＣ９５は、９７％のエチレンカーボネート含有量（モル％）を有する。
【００７０】
【表１】
2012512148.tif 000003
【実施例２】
【００７１】
溶媒置換法を使用することによるＰＥＣナノ粒子の調製
ＰＥＣナノ粒子懸濁液を、改変された次の溶媒置換法により調製した。
【００７２】
最初に、ＰＥＣ９９およびＰＥＣ９５からポリマー／アセトニトリルの原液を創製した。アセトニトリルは水に混和性であり、かつＰＥＣがそれに溶解するので、アセトニトリルを使用する。１００ｍｇのＰＥＣを、紫色キャップ中に秤量し、ほぼ２４時間以内に１０ｍｌのアセトニトリルに溶解する。原液は、１０ｍｇポリマー／ｍｌの濃度を有する。
【００７３】
安定化溶液の調製には、１００ｍｇのＭｏｗｉｏｌ  １８／８８を２００ｍｌの超純水を添加して使用する（最終濃度：０．０５％ＰＶＡ）。ＰＶＡを完全に溶解するために、溶液を磁気撹拌器上で、ほぼ９０℃で３時間加熱する。溶液を、放冷した後、０．２μｍの酢酸セルロースフィルターを通して濾過し、冷蔵庫中に貯蔵する。
【００７４】
ナノ懸濁液を調製するために、５ｍｌのＰＶＡ溶液（室温）を、圧搾空気で清浄にしたガラス製バイアル瓶中に添加し、溶液の高さおよび仕込み量を外側に記入する。
【００７５】
意図した最終濃度のために、ＰＥＣ／アセトニトリル−溶液からピペットを用いて所望量のポリマーを採取し、１．５ｍｌのエッペンドルフカップに添加する。その後、最終容積を１．５ｍｌにするためにアセトニトリルを添加する。カップを閉じ、渦撹拌器を用いてホモジナイズする。得られた溶液を、２３Ｇａｕｃｈｅカニューレを備えた２ｍｌシリンジ（Ｂ  Ｂｒａｕｎ）中に吸引し、注入中の乱流を最小化するため空気を押し出す。その後、カニューレをＰＶＡ溶液の中心部に浸し、ピストンを迅速かつ途切れずに押し下げる。
【００７６】
その後、バイアル瓶を、換気フード下で磁気撹拌子を使用しないで一夜にわたって蒸発作用に付す。磁気撹拌子を除外すると、ＰＥＣの凝集が防止される。蒸発後、アセトニトリルが残留していないことをチェックし、記入した位置まで蒸発水を添加する。
【実施例３】
【００７７】
被装填ＰＥＣナノ粒子の調製
細胞アッセイのため、モデル薬物として使用される蛍光マーカーであるクマリン−６（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を装填したナノ粒子懸濁液を製造する。クマリン−６（Ｃ−６）の構造は次の通りである：
【００７８】
【化２】
2012512148.tif 000004
【００７９】
クマリン−６は、潜在的な食作用過程の光学的検出を可能にし、さらに親油性薬剤の適切なモデルであるので、クマリン−６を使用する（吸光：４８５ｎｍ、発光５０５〜５２５ｎｍ）。その親油性特性および低水溶性のため、クマリン−６を、高い封入率を達成するように溶媒置換法によって好適に処理できる。封入効率は極めて高く、１００％に近い。被装填ナノ粒子の調製は、また、実施例２に記載のような改変された溶媒置換法を使用して実施される。クマリン−６は、５０μｇ／ｍｌアセトニトリルの原液で使用され（原液は、冷蔵庫中に貯蔵され、例えばアルミニウム箔によって光から保護される）、ＰＥＣ９５および９９ポリマーは、１０ｍｇ／ｍｌアセトニトリルの原液として使用される。すべてのサンプルは三つ組みで準備される。ナノ粒子に装填するために、必要量のＰＥＣ原液およびクマリン−６原液を、混合し、アセトニトリルで１．５ｍｌとし、渦撹拌する（表２参照）。この溶液を、次いで、通常のスキームによりＰＶＡ溶液中に注入する（前記参照）。
【００８０】
本実験において、クマリン−６の濃度は、０．２％（ＰＥＣの質量に対して）が選択される。３ｍｇ／５ｍｌの濃度において、ＰＥＣ９５のナノ粒子は、ＰＥＣ９９のナノ粒子に比べてより小さいので、三つ組みのＰＥＣ９５（３ｍｇ／５ｍｌ）（０．２％クマリン−６）に対しては、０．０５％ＰＶＡ溶液に代わって１％ＰＶＡ溶液が作られる。
【００８１】
【表２】
2012512148.tif 000005
【００８２】
大きさの測定は、Ｍａｌｖｅｒｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のゼータサイザー（zetasizer）を用いる光子相関分光法によって実施される。
【００８３】
ＴＥＭ分析は、クマリン−６がナノ粒子中に組み込まれていることを示す。被装填ナノ粒子は、表面が滑らかな丸い形状を有する。凝集は見出されない。
【実施例４】
【００８４】
ポリマー溶液の濃度によるナノ粒子の大きさの調節
ナノ粒子懸濁液の調製は、３種の異なるＰＥＣ９５またはＰＥＣ９９濃度（表３参照）を利用し、実施例２に記載のような改変された溶媒置換法を使用して実施される。必要量の原液を、ピペットを用いてエッペンドルフカップに移送し、アセトニトリルで１．５ｍｌとする。渦撹拌し、ＰＶＡ溶液に注入して、所望の最終濃度が得られる。その他すべての反応条件（反応容積、温度、注入条件、蒸発の時間および温度）は一定のままである。反応は、三つ組みで準備され、すべての実験を少なくとも１回繰り返す。
【００８５】
【表３】
2012512148.tif 000006
【００８６】
得られたナノ粒子の粒径は、「Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ」（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を使用する光子相関分光法（PCS）によって測定される。
【００８７】
図１に示すようなＰＣＳの結果は、ポリマー濃度の増加と共に粒径が増加することを立証している。したがって、ナノ粒子の大きさを、ポリマー濃度によって調節することができる。ＰＥＣ９５の場合（図１ａ参照）、ＰＥＣ９９（図１ｂ参照）に比べてより一様な粒度分布が得られる。最良の結果は、多分散性指数がむしろ狭いので、３ｍｇ／５ｍｌのポリマー濃度で得られる。０．１ｍｇ／５ｍｌのポリマー濃度は、２００ｎｍ未満の直径を有するナノ粒子を製造するのに極めて適している。３ｍｇ／５ｍｌの濃度は、より大きな直径、例えば２００ｎｍを超えるナノ粒子をもたらすのが通常である。
【実施例５】
【００８８】
ＰＥＣナノ粒子の特性付け
１．クマリン−６を装填したＰＥＣ粒子の粒径測定
ＰＥＣ９５およびＰＥＣ９９の被装填ナノ粒子懸濁液を、０．１ｍｇ／５ｍｌおよび３ｍｇ／５ｍｌのポリマー濃度で前記のように調製する。装填は、０．２％（ｗ／ｗ）のクマリン−６を用いて実施される。未装填ＰＥＣ９９の懸濁液を調製すると、３００ｎｍおよびより大きな粒径を有する粒子が得られ、一方、ＰＥＣ９５は、より一様な粒径を与える。３００ｎｍを超える粒径を有するナノ粒子は細胞実験にとってより興味深いので、濃度が３ｍｇ／５ｍｌのＰＶＡ溶液の代わりに１％ＰＶＡ溶液を用いて、ＰＥＣ９５ナノ粒子の粒径を大きくすることができる。ＰＥＣ９５（０．１ｍｇ／５ｍｌ）およびＰＥＣ９９（３ｍｇ／５ｍｌ）のナノ粒子は前記のように調製される。粒径を、ＰＶＡが０．０５％のＰＶＡ溶液中で、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｔｓ社）を使用する光子相関分光法（ＰＣＳ）によって測定する。１％ＰＶＡ溶液中で調製されるＰＥＣ９５（３ｍｇ）ナノ粒子のサンプルを、超純水を使用して０．０５％ＰＶＡまで希釈する。
【００８９】
ＰＣＳの結果を図２に示す。要するに、粒子の大きさは、その大きさがほんの僅かに拡大されるので、未装填粒子の大きさにほぼ等しい。１％ＰＶＡの使用は、大きさの増加をもたらすが、ＰＣＳで測定されるように３００ｎｍを超えない。
【００９０】
２．異なる温度でのＰＥＣ９５およびＰＥＣ９９ナノ粒子に関する安定性分析
気候環境実験のために、ＰＥＣ９５およびＰＥＣ９９のナノ粒子懸濁液の三つ組みを、種々の温度で、３ｍｇ／５ｍｌの濃度で調製する。
【００９１】
ナノ粒子懸濁液を４℃で調製する。したがって、ＰＶＡ溶液で満たしたガラス製バイアル瓶を、周囲温度に順応させるために気候環境試験機中に２時間配置する。その後、ＰＥＣ／アセトニトリル溶液の注入を実施する（０日目）。４８時間（低温のため）の蒸発処理の後、サンプルを抜き取り、ゼータサイザーで粒径およびゼータ電位を測定し、バイアル瓶を再び閉じる。バイアル瓶を閉じたまま４℃で貯蔵し、注入の３日後にさらなる測定を実施する。三つ組みのナノ粒子を、同時に冷蔵庫中に保存し、温度変化にさらす。それぞれ新たなサンプルをより高い温度で調製し、分析する。最後の測定の２４時間後（４日目）に、気候環境試験機の温度を１４℃まで上昇させ、双方のＰＥＣポリマーの２つの新たな三つ組みを、気候環境試験機中で、したがって１４℃で、同一濃度で調製する。２４時間後、新たなサンプルのアセトニトリルを蒸発させ、該サンプルをゼータサイザーで測定する（５日目）。気候環境試験機の温度を２４℃まで上昇させ、この温度に到達した後（６日目）、ＰＥＣ９５および９９のさらなる三つ組みを調製する。２４℃でのナノ粒子の調製の２４時間後（７日目）に、新たなおよびより古いナノ粒子懸濁液のさらなる分析を実施し、気候環境試験機の温度を３１℃まで高める。この温度に到達した後、２つの新たな三つ組みを調製し、２４時間後（１０日目）に、４℃および３１℃で調製された三つ組みを分析／測定した。
【００９２】
ＰＥＣ９５およびＰＥＣ９９ナノ粒子に関する結果を、それぞれ図３および４に示す。４℃で調製されたナノ粒子は、粒径の明らかな変化を示さず、少なくとも１０日間にわたって安定なままである。１４℃、２４℃および３１℃で調製されたナノ粒子の場合、３１℃の反応温度の場合にのみ、粒径が有意に増加したことがわかる。
【００９３】
ＰＥＣ９５ポリマーから調製されたナノ粒子懸濁液は、温度が、粒子の粒径およびゼータ電位にほとんど影響を及ぼさないことを示す。４℃で調製された三つ組みは、全温度範囲にわたって（したがって、ガラス転移温度を超えても）基本的には同じ粒径およびゼータ電位を示す。ガラス転移温度よりも高い温度で調製される三つ組みの場合、粒径のわずかな増加が検出された。したがって、温度は、粒子の調製中に、あったとしてもほんのわずかな影響を及ぼすが、貯蔵中の未装填懸濁液には影響を及ぼさない。
【００９４】
３．未装填ナノ粒子に関する粒径および膨潤性の分析
ＰＥＣ９５およびＰＥＣ９９ナノ粒子の反応混合物から、ポリマー溶液をＰＶＡ溶液中へ注入した直後（Ｔ＝０）、蒸発中のｔ＝３０分、６０分、９０分、１２０分、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間および２４時間の時点でアリコートを採取する。その後、蒸発処理を完結し、バイアル瓶を蓋で密閉する。最終密閉ナノ粒子容器から、Ｔ０後の、ｔ＝４８時間、４日および９日の時点でさらなる測定を実施する。
【００９５】
アリコートを、粒径について前記のようにＰＣＳで分析する。最初の２４時間のＰＥＣ９５およびＰＥＣ９９ナノ粒子に関する結果を図５に示す。双方のポリマーに関して、最初の３０分間中での粒径の増加を観察できた。ｔ＝３０分後の粒径は、残りの実験期間中、一定のままであった。
【００９６】
【表４】
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【００９７】
このデータに基づいて、ナノ粒子は、３０分以内に基本的に成熟し、蒸発期間および９日目までの貯蔵中にさらなる大きな変化を受けないと結論付けることができる。原子間力顕微鏡法によるナノ粒子の並行分析は、最初の３０分間中の粒径増加は、実のところ単一粒子の膨潤によって引き起こされ、合着によるものではないことを示す。
【００９８】
粒径の増加が粒子の膨潤によるのか、粒子の合着および凝集によるのかを明らかにするため、ＡＦＭを使用するさらなる実験を実施する。この目的のため、ナノ粒子を、「ＪＥＭ３０１０」（Ｊｅｏｌ  ＧｍｂＨ）を使用する原子間力顕微鏡法（AFM）によって分析する。実験は、粒径、粒度分布（particle distribution）、および表面特性を測定するために、および膨潤特性を分析するために実施される。
【００９９】
ＰＥＣ（ＰＥＣ９５およびＰＥＣ９９）濃度が０．１ｍｇ／５ｍｌおよび３ｍｇ／５ｍｌのナノ粒子を調製し、翌日にＰＣＳで測定する。その後、表面特性および粒度分布を測定するための最初の部分の分析に関して、粒度分布および表面特性の分析を、ＡＦＭ（後記参照）を使用して実施する。
【０１００】
膨潤の分析に関して、ナノ粒子の成長および膨潤特性を、ＡＦＭで前記のように測定する。ＡＦＭ分析のための最初のサンプル抜き取りをＴ０の時点で、したがってアセトニトリル／ＰＥＣ溶液を０．０５％ＰＶＡ溶液中に注入した直後に実施する。
【０１０１】
ＡＦＭでは、数滴のナノ粒子懸濁液をガラススライド上に載せる。ナノ粒子を表面に吸着させた後、余分な液体をタッピングで除去し、ガラススライドを乾燥する。乾燥後、ガラススライドをＡＦＭに差し込む。粒子を保護するために、顕微鏡分析は、１６０ｋＨｚのタッピング方式でＳｉ３Ｎ４チップを用いて実施される。分析は、「ＪＰＫ」−ソフトウェアを使用して実施し、それに続いて「ＩｍａｇｅＪ」ソフトウェアを使用して粒径を測定する。
【０１０２】
典型的な結果を図６ａ、６ｂおよび７に示す。
【０１０３】
ＰＥＣ９５（０．１ｍｇ／５ｍｌ）
ＰＣＳ測定は、０．２９５のＰＤＩ（多分散指数）を有する２００．５ｎｍの粒径を示す。ＡＦＭの結果を図６ａに示す。大きな粒はナノ粒子に対応する。ＡＦＭ測定は、表面が平滑な丸い形状を有する粒子を示す。ＡＦＭ写真はより小さな粒径を示すので、明らかに、ＰＣＳで測定された直径は真の大きさに対応しない。粒子は、ＡＦＭ測定によれば、１００ｎｍ（標準偏差２８ｎｍ）の平均粒径を有する。しかし、それから演繹できる重要な事実は、平滑で丸い形状、および粒子は凝集体としてではなく単一粒子として存在するという事実の確認である。
【０１０４】
ＰＥＣ９５（３ｍｇ／５ｍｌ）
ＰＥＣ９５（３ｍｇ／５ｍｌ）ナノ粒子の場合、分析は、ＰＣＳで観察される２３５．９ｎｍ（０．０３のＰＤＩ）より小さい２０２ｎｍの平均直径を示す。しかし、ＰＣＳで測定される粒径は、ＰＣＳがその溶媒層を含む粒子を検出するので、より大きいと思われる。写真は、合着の徴候のない個々の粒子としてほとんどすべて沈積されている表面が平滑な丸い粒子を示した。結果を図６ｂに示す。
【０１０５】
ＰＥＣ９９（０．１ｍｇ／５ｍｌ）
粒子は、外観において類似していた。直径は、ＰＣＳで測定された１３９．８ｎｍ（０．２１６のＰＤＩ）と比較すると１０６ｎｍと判定された。ＰＥＣ９９ナノ粒子（３ｍｇ／５ｍｌ）は、凝集体を形成し、かつより大きい顕著な傾向を有した。
【０１０６】
結果は、ＡＦＭでの測定がナノ粒子の粒径を判定するのにより正確であることを示す。
【０１０７】
それぞれの未装填ＰＥＣナノ粒子を用いる膨潤実験の結果を図８に示す（ＰＥＣ９５（３ｍｇ／５ｍｌ）の場合）。結果は、蒸発処理の最初の３０分以内でのＰＥＣ９５ナノ粒子の粒径の増加を示す。グラフで示されているように、粒子の大部分は、合着しないが、膨潤処理のためそれらの粒径を増す。ＰＥＣ９９のナノ粒子は、蒸発処理の最初の３０分以内でＰＥＣ９５粒子に比べて粒径のより大きな増加を示し、かつより合着しやすかった。
【０１０８】
【表５】
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【実施例６】
【０１０９】
クマリン−６のｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されたマクロファージ中への取込み
クマリン−６を装填したナノ粒子の取込みを分析するために、マウスのマクロファージ細胞系Ｊ７４４Ａ．１（ＤＳＭＺ  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）を３７℃、８．５％ＣＯ２、相対湿度９５％で培養する。細胞に、ＤＭＥＭ（ＰＡＡ即用培地）、グルコース、グルタミンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ  Ｃｙｔｏｇｅｎ社）を２日毎に与えた。臨界細胞数に到達した後、培養物を分割する（通常、１週に２〜３回）。ＣＳＬＭ（共焦点レーザー走査顕微鏡法）下での分析のため、細胞核をＤＡＰＩ：
【０１１０】
【化３】
2012512148.tif 000009
で染色する。
【０１１１】
非貧食性の蛍光を発するナノ粒子の蛍光を消光するため、培地に非蛍光性染料トリパンブルー：
【０１１２】
【化４】
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を添加する。
【０１１３】
この染料は、生存細胞によって受け入れられないので、細胞外の蛍光のみが消光される。
【０１１４】
被装填ナノ粒子が細胞によってどのように処理されるかを分析するために、細胞をＣＬＳＭによって分析した。共焦点顕微鏡法は、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １００Ｍおよび５１０走査装置（Ｚｅｉｓｓ社）を使用して実施され、ＬＳＭ  Ｉｍａｇｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒソフトウェアを使用して解析される。ＣＳＬＭ分析は、定性分析を可能にするだけである。
【０１１５】
Ｚ軸に沿った光学的切断面を作製することによって、クマリン−６の蛍光が細胞の内部で発生するか、外部で発生するかを判定することができる。対照として、一部のマクロファージを４℃でインキュベートする。この温度で、細胞のエネルギー過程は抑制され、結果として食作用過程も抑制される。
【０１１６】
ここで使用されるＰＢＳ緩衝液は次の濃度を有する（０．２ｇのＫＣｌ、８．０ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４、１．５１ｇのＮａ２ＨＰＯ４を蒸留水（ａｑｕａ  ｄｅｓｔ．）で１０００ｍｌに希釈）。細胞実験のため、１０倍濃度のＰＢＳ緩衝液が必要である。この目的には、緩衝剤を、蒸留水で１０００ｍｌの代わりに１００ｍｌまで希釈する。緩衝液を、ｐＨ７に調整し、０．２μｍのフィルターを使用して滅菌濾過する。
【０１１７】
この実験の最初の部分に関して、５ｍｌにつき０．１ｍｇおよび３ｍｇのポリマー濃度で０．２％のクマリン−６を含む種々の負荷量のＰＥＣ９９ナノ粒子を、既知のスキーム（前記参照）を使用して調製する。実験には、０．１ｍｇ／５ｍｌの負荷量で１２６ｎｍの、３ｍｇ／５ｍｌ負荷量で２９７ｎｍの大きさの粒子が選択される。
【０１１８】
実験には、Ｊ７７４細胞を、取込み実験の４８時間前に、４００μｌの作業容積で２つのチャンバースライド中に０．５×１０４／ウェルの密度で播種する。存在する培地を吸引し、３２０μｌのＰＥＣ９９（０．１ｍｇ）ナノ粒子懸濁液、４０μｌの１０倍濃度のＰＢＳ緩衝液、および４０μｌのマウス血清を添加する（ＰＥＣの最終濃度：１６μｇ／ｍｌ）。６つのさらなるチャンバー中に、やはり４０μｌのマウス血清および１０倍濃度のＰＢＳ緩衝液の添加のもとに３２０μｌのＰＥＣ９９（３ｍｇ）ナノ粒子懸濁液を添加した（ＰＥＣの最終濃度：４８０μｇ／ｍｌ）。スライドの４つのチャンバーは、未処理細胞の比較プローブを保持するために、培地はそのままでナノ粒子を添加しないままにする。細胞を３７℃で１時間インキュベートする。その後、培地を吸引し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＤＡＰＩを使用して染色する。染色は、ナノ粒子と共にインキュベートされたすべての細胞、および比較細胞の２つのチャンバーについて実施される。２つのチャンバーの細胞は、ＤＡＰＩがクマリン−６の領域で蛍光を発光するかどうかを分析するために、固定するだけで染色しない。チャンバーを、実験の最後にスライドから取り出し、数滴のＦｌｕｏｒｓａｖｅ（Ｃｌａｂｉｏｃｈｅｍ社）を使用してカバースライドで覆う。サンプルを、光から保護して貯蔵し、その後直ぐにＣＬＳＭで分析する。
【０１１９】
実験の第２の部分は、種々の濃度のナノ粒子懸濁液の３７℃および４℃での取込みを分析する。この実験のために、０．２％のクマリン−６を含む新たな負荷量のＰＥＣ９９（３ｍｇ）を調製する（直径：ほぼ３００ｎｍ）。
【０１２０】
実験開始の４８時間前に、マクロファージを、３つのチャンバースライドに０．５×１０４／ウェルの密度で播種する。４℃で細胞をインキュベートするために、チャンバースライドを冷蔵庫中に貯蔵する。濃度依存性を分析するために、４８０μｇ／ｍｌ、３２０μｇ／ｍｌ、１２０μｇ／ｍｌ（スライドのチャンバー内での最終濃度を指す）であるＰＥＣ懸濁液の濃度を選択する。したがって、４つのチャンバー（比較サンプル）を除くすべてで培地を吸引し、１０％マウス血清およびＰＢＳ緩衝液を添加し、そして所望の最終濃度に応じてナノ粒子懸濁液を添加する（１２０μｇ／ｍｌには８０μｌ、２４０μｇ／ｍｌには１６０μｌ、または４８０μｇ／ｍｌには３２０μｌ）。４つのチャンバーは、種々の濃度のＰＥＣナノ粒子と共に３７℃で１時間インキュベートされる。４８０μｇ／ｍｌおよび２４０μｇ／ｍｌのＰＥＣナノ粒子を含む４つのチャンバー中の予冷されたスライド中で、４℃で１時間を超えるインキュベーションが実施される。陰性対照として、３７℃で貯蔵された４つのチャンバーの細胞は、ナノ粒子と共にインキュベートされない。
【０１２１】
１時間インキュベートした後、液体を吸引し、細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、固定し、ＤＡＰＩで染色する（実施例７参照）。その後、チャンバーを、スライドから取り出し、数滴のＦｌｕｏｒｓａｖｅ（Ｃｌａｂｉｏｃｈｅｍ社）を使用してカバースライドで覆う。サンプルを光から保護して貯蔵し、その後直ぐにＣＬＳＭで分析する。
【０１２２】
結果は、分析の最初の部分について（定性分析）、ＰＥＣナノ粒子（１２６ｎｍおよび２９７ｎｍ）と一緒のインキュベーションが、細胞内での蛍光をもたらすことを示す。取込みが、活性な食作用を介して起こったのかどうかを分析するために、実験の第２の部分は、異なる温度で実施される。ＰＥＣナノ粒子が活性な食作用の過程によって処理されるなら、４℃でインキュベートされた細胞は、蛍光を示さないか、相当に低下した蛍光を示すはずである。ＣＳＬＭの結果は、ナノ粒子濃度の増加に対応する蛍光の増加を示した。しかし、４８０μｇ／ｍｌおよび２４０μｇ／ｍｌのナノ粒子と共に４℃でインキュベートされた細胞も、蛍光を示した。このことは、ＰＥＣナノ粒子が、マクロファージによる活性な食作用を低下させることを示している。
【実施例７】
【０１２３】
ＤＡＰＩ染色（１５ｍｌの作業容積の場合）
培地と共に２ｍｌの固定化溶液（一部のＰＢＳおよび一部の４％パラホルムアルデヒド）を細胞に添加し、その後、全部の液体を吸引した。その後、細胞に５ｍｌの固定化溶液を２回添加し、５分間インキュベートし、吸引する。その後、細胞を、空気で１５分間乾燥し、ＤＡＰＩ溶液（１ｍｌ  ＰＢＳ＋２０μｌ  ＤＡＰＩ）と共に暗所で３０分間インキュベートする。染色処理の終末にＤＡＰＩを吸引し、ＰＢＳで３回洗浄する。
【実施例８】
【０１２４】
３７℃および４℃でのＦＡＣＳによる標準として蛍光性ポリスチレンラテックスビーズを用い、ＮａＮ３の添加による、ＰＥＣ９９およびＰＥＣ９５ナノ粒子の食作用の比較
蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）は、多数の細胞を、それらの大きさ、密集度、および短時間内での蛍光に関して分析し、かつ特徴付ける可能性を提供する。
【０１２５】
この実験の目的は、種々の大きさのＰＥＣナノ粒子が、４６８ｎｍで賦活され５０８ｎｍで蛍光を発光する蛍光標識化ポリスチロール標準（ＰＳＳ）に比べて、マクロファージによってより多く、あるいはより少なく取込まれ／処理されるかどうかをＦＡＣＳによって判定することである。１つの対照実験は、食作用の阻害剤としてＮａＮ３を添加することによって実施される。細胞処理およびその結果として食作用はその温度で抑制／減速されるので、他の対照実験は、４℃のインキュベーション温度で実施される。
【０１２６】
【表６】
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【０１２７】
最初の実験では、Ｊ７７４細胞を、開始２４時間前に、２４ウェルプレート中に６×１０４／ウェルの密度（作業容積１ｍｌ）で播種する。マクロファージによる食作用速度を測定するため、５ｍｌにつき０．１ｍｇおよび３ｍｇの濃度のＰＥＣ９５およびＰＥＣ９９および０．２％のクマリン−６からなるナノ粒子懸濁液を作製する。加えて、ＰＥＣ９５型のより大きなナノ粒子を、安定剤として１％ＰＶＡを使用して調製する。陰性対照として、プレート中の６ウェルを、マクロファージで処理しないで残す。ナノ粒子懸濁液とのインキュベーションのために、残りのウェルの培地を吸引し、ＰＥＣ９５−ＮＰ  ０．１ｍｇ（１３７ｎｍ）および３ｍｇ（２３９ｎｍ）、ならびにＰＥＣ９９−ＮＰ  ０．１ｍｇ（１３３ｎｍ）および３ｍｇ（２８３ｎｍ）を、１０％マウス血清およびＰＢＳの添加のもとに三つ組みで添加する。ウェル中の最終濃度は、０．１ｍｇおよび３ｍｇのＰＥＣ−ＮＰの各三つ組みについては１６μｇ／ｍｌ、および付加的に３ｍｇのＰＥＣ−ＮＰを用いる１つの三つ組みについては４８０μｇ／ｍｌである。インキュベーションは、インキュベーター中、３７℃で１時間実施される。インキュベーション期間が終わった後に、対照細胞の場合の懸濁液および培地を吸引し、ＰＢＳで２回洗浄する。細胞の表面の蛍光性ナノ粒子を消光するために、細胞を０．４％トリパンブルーと共に５分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄する。その後、１００μｌのトリプシンを添加し、ウェルプレートからマクロファージを除去するためにウェルプレートを揺すった。細胞にパラホルムアルデヒド：ＦＡＣＳ  Ｆｌｏｗ（１：１）を２００μｌ添加し、サンプルを、ガラスパイプに移し、ＦＡＣＳによって分析する。
【０１２８】
この最初の実験の目的は、同一濃度の被装填ＰＥＣ９９およびＰＥＣ９５ナノ粒子の食作用に関して差異が存在するかどうかを分析することである。結果を図９に示す。示した蛍光値は、目隠しプローブ、すなわち未処理細胞の蛍光を差し引いた後の蛍光測定の算術平均値に相当する。結果は、細胞内の蛍光が主として使用されたナノ粒子濃度に依存することを示す。
【０１２９】
次の実験の目的は、ＰＥＣ９９およびＰＥＣ９５のインキュベーション後のマクロファージの蛍光を、標準ポリマーナノ粒子である蛍光性ポリスチロールナノ粒子の添加後の蛍光と比較してＦＡＣＳごとに分析することである。実験は４℃および３７℃で実施される。活性な食作用過程を抑制するためのさらなる可能性を利用するために、３７℃での実験の一部の細胞を、食作用抑制剤であるＮａＮ３と共にインキュベートする。したがって、６０ｍＭのＮａＮ３溶液を、例えば、３９ｍｇのＮａＮ３を１０ｍｌの超純水に溶解することによって調製する。
【０１３０】
実験開始の２４時間前に、細胞を６×１０４／ウェルの密度で２つの２４ウェルプレート中に播種する。その後、０．２％のクマリン−６と共に５ｍｌにつき０．１ｍｇおよび３ｍｇの濃度で装填されたＰＥＣ９５およびＰＥＣ９９のナノ粒子懸濁液を調製する。
【０１３１】
実験を開始する１時間前に、一方のウェルを４℃の冷蔵庫に入れる。実験を開始する３時間前に、３７℃で貯蔵されるもう一方のプレートの細胞の半分は、培地を吸引した後に、５００μｌのＮａＮ３および５００μｌの培地で補足される（ＮａＮ３の最終濃度：３０ミリモル／ｌ）。ＮａＮ３溶液中で３時間インキュベートし、それぞれ４℃で１時間貯蔵した後、細胞実験を開始する。したがって、ウェル中の培地を吸引する（目隠しサンプルを除いて）。４℃で冷却されるプレートの各ウェルに、ＰＥＣ−ＮＰ  ０．１ｍｇ（１０８ｎｍ）、ＰＥＣ−９５  ３ｍｇ（２８５ｎｍ）、ＰＥＣ−９９  ０．１ｍｇ（１１０ｎｍ）およびＰＥＣ−９９  ３ｍｇ（２９７ｎｍ）の懸濁液を添加する。１０％マウス血清およびＰＢＳ緩衝液を添加した後の、ウェル中のＰＥＣナノ粒子の最終濃度は、すべてのサンプルに関して１６μｇ／ｍｌに達する。さらに、大きさが１００ｎｍおよび５００ｎｍの蛍光性ポリスチロール標準が、１０％マウス血清およびＰＢＳの添加のもとにウェルを分離するために添加される。ウェル中の標準の最終濃度は、２０μｇ／ｍｌである。
【０１３２】
３７℃で貯蔵される細胞を、それぞれＮａＮ３で処理される側（半分）およびＮａＮ３で処理されない側（半分）に粒子と共に同様に準備する。
【０１３３】
粒子を添加した後、細胞を４℃または３７℃で１時間インキュベートし、その後、懸濁液を吸引し、ＰＢＳで２回洗浄し、０．４％トリパンブルーを添加した後５分間インキュベートする。その後、細胞を、再びＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、ＦＡＣＳ  Ｆｌｏｗ：パラホルムアルデヒド（前記参照）を用いてガラスチューブに移送する。
【０１３４】
ＦＡＣＳ分析の結果を図１０に示す。示した蛍光値は、目隠しプローブ、すなわち未処理細胞の蛍光を差し引いた後の蛍光測定の算術平均値に相当する。蛍光の強度は、ナノ粒子の食作用の程度に関する尺度である。ポリスチロール標準は、食作用が起こる条件（３７℃、阻害剤なし）下で予想される高レベルの蛍光を、食作用が抑制／減速される場合（４℃、またはＮａＮ３の添加）に低い蛍光を示す。したがって、ポリスチレンナノ粒子は、効率的に貧食され、そのことが、それらの粒子を生物学的に不安定にする。なぜなら、それらの粒子は身体中でマクロファージによって急速に排除されるからである。本発明のＰＥＣナノ粒子に関する結果は、著しく異なるプロフィールを示し、食作用が抑制／減速される場合でも有意な差異が存在しない（４℃およびＮａＮ３を用いた結果を参照されたい）。
【０１３５】
「ＰＥＣ９５  １６μｇ／ｍｌ  １０８ｎｍ  ３７℃」および「ＰＥＣ９９  １６μｇ／ｍｌ  １１０ｎｍ  ３７℃」の低い蛍光値（＝低レベルの食作用）と「ポリスチロール  ２０μｇ／ｍｌ  １００ｎｍ  ３７℃」の場合の高い蛍光値（＝高レベルの食作用）とを比較した場合に演繹できるように、特により小さなナノ粒子の場合に、ポリスチレン−ＮＰとＰＥＣ−ＮＰとの間の食作用の差異が大きい。したがって、本発明によるＰＥＣナノ粒子は、マクロファージによって攻撃されることがより少なく、それによって、封入された薬理学的に活性な薬剤を生分解によって放出し、かつ薬理学的に活性な薬剤をすべてのそれぞれより長い放出期間にわたって全身性で利用可能にする非経口デポ剤としてＰＥＣナノ粒子を使用することを可能にする。さらに、結果は、より小さなＰＥＣナノ粒子が、より大きなＰＥＣナノ粒子に比べて貧食されるのがさらにより少ないことを示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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