(57)【要約】本発明は分子生物、分子遺伝学およびバイオプロセシングに関する。実施形態では、発育卵に標的遺伝子の発現を調節できるＲＮＡエフェクター分子を導入し、調節によって卵の中の生物由来物質の産生を増強する、免疫原性物質等の生物由来物質を発育卵で産生するための組成物および方法を提供する。この方法では、生物由来物質、例えば季節性およびパンデミックインフルエンザワクチンを含むウイルスワクチンの発育卵での産生を最適化するために、ＲＮＡｉベースのアプローチが提供される。本発明は、さらにこの方法の実行に有用な分子、試薬、細胞およびキット、ならびにこの方法によって産生される生物由来物質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
発育卵内で生物由来物質を産生するための方法であって、
（ａ）少なくとも、標的遺伝子に対してその一部分が相補的である第一のＲＮＡエフェクター分子を前記卵に導入すること、
（ｂ）第一の標的遺伝子と第二の標的遺伝子の少なくとも１つの発現を調節するのに十分な時間、前記卵を維持すること、および
（ｃ）前記卵から前記生物由来物質を単離すること、を含み、
前記標的遺伝子は細胞性免疫反応の遺伝子である、方法。
【請求項２】
前記標的遺伝子は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ２１、ＲＩＧ−１、ＬＰＧＰ２、ＲＩＧ−１−様受容体、ＴＲＩＭ２５、ＩＦＮＡ、ＩＦＮＢ、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＧ、ＭＡＶＳ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＲ２、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−２、ＳＴＡＴ−３、ＳＴＡＴ−４、ＪＡＫ−１、ＪＡＫ−２、ＪＡＫ−３、ＩＲＦ１、ＩＲＦ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ５、ＩＲＦ６、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＩＲＦ１０、２’，５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ、ＲＮａｓｅＬ、ＰＫＲ（ＥＩＦ２ＡＫ２）、ＭＸ１、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、炎症性サイトカイン、ダイサー、ＭＹＤ８８、ＴＲＩＦ、ＰＫＲ、ＣＳＫＮ２Ｂ、および前述のいずれかの調節領域からなる群から選択される、宿主免疫応答に関連した遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記卵へ第二の標的遺伝子を標的とする第二のＲＮＡエフェクター分子を導入することをさらに含み、前記第二の標的遺伝子は、細胞生存度、増殖または細胞周期に関連した遺伝子であり、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＬＤＨＡ、ＬＤＨＢ、ＢＩＫ、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＨＲＫ、ＢＣＬＧ、ＨＲ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＯＫ、ＢＯＯ、ＢＣＬＢ、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳＰ１０、ＢＣＬ２、ｐ５３、ＡＰＡＦ１、ＨＳＰ７０、ＴＲＡＩＬ、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ１３、ＢＣＬ２Ｌ１４、ＦＡＳＬＧ、ＤＰＦ２、ＡＩＦＭ２、ＡＩＦＭ３、ＳＴＫ１７Ａ、ＡＰＩＴＤ１、ＳＩＶＡ１、ＦＡＳ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦＢＲ１、ＬＯＣ３７８９０２、ＢＣＬ２Ａ１、ＰＵＳＬ１、ＴＰＳＴ１、ＷＤＲ３３、Ｎｏｄ２、ＭＣＴ４、ＡＣＲＣ、ＡＭＥＬＹ、ＡＴＣＡＹ、ＡＮＰ３２Ｂ、ＤＥＦＡ３、ＤＨＲＳ１０、ＤＯＣＫ４、ＦＡＭ１０６Ａ、ＦＫＢＰ１Ｂ、ＩＲＦ３、ＫＢＴＢＤ８、ＫＩＡＡ０７５３、ＬＰＧＡＴ１、ＭＳＭＢ、ＮＦＳ１、ＮＰＩＰ、ＮＰＭ３、ＳＣＧＢ２Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＢ７、ＳＬＣ１６Ａ４、ＳＰＴＢＮ４、ＴＭＥＭ１４６、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ，ＦＯＸＯ１、ＰＴＥＮ、ＦＮ１、ＣＳＫＮ２Ｂ、ｍｉＲＮＡアンタゴニスト、宿主シアリダーゼ、ＮＥＵ２シアリダーゼ２、ＮＥＵ３シアリダーゼ３、ダイサー、ＩＳＲＥ、Ｂ４ＧａｌＴ１、Ｂ４Ｇａｌｔ６、Ｃｍａｓ、Ｇｎｅ、ＳＬ３５Ａ１、および前述のいずれかの調節領域からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記卵へ、内在性ウイルス、潜伏ウイルス、および外来ウイルスのうちの少なくとも一つの標的遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子を導入することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記卵へ、インフルエンザＮＰ、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、ＮＡと、ＨＡまたはＮＡのグリコシル化に影響する遺伝子と、前述のいずれかの調節領域と、から選択されるウイルス遺伝子である標的遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子を導入することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡエフェクター分子が遺伝子発現を抑制する、または活性化する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子発現の調節により、卵内のウイルス感染価、ウイルス複製、細胞生存度、細胞増殖、翻訳、タンパク質産生またはウイルスの吸着が増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
遺伝子発現の調節により、感染細胞のアポトーシスが減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡエフェクター分子がオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが修飾される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、コレステリル誘導体に結合した末端のヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルフォリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および、非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、デコイオリゴヌクレオチド、ａｎｔｉｍｉｒ、ｓｕｐｅｒｍｉｒ、またはＲＮＡ活性化物質を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記発育卵に、免疫抑制物質、成長因子、アポトーシス阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、病原体の阻害剤、およびヒストン脱メチル化物質から選択される第二の物質を投与することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＮＡエフェクター分子を調剤する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＮＡエフェクター分子を脂肪粒子中に調剤する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記脂質粒子はＸＴＣ−ＭＣ３−Ｃ１２−２００ベースの脂質粒子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
発育卵内で生物由来物質を産生するための方法であって、
（ａ）少なくとも、第一のＲＮＡエフェクター分子であって、少なくとも第一の標的遺伝子に対してその一部分が相補的である第一のＲＮＡエフェクター分子、および第二のＲＮＡエフェクター分子であって、少なくとも第二の標的遺伝子に対してその一部分が相補的である第二のＲＮＡエフェクター分子を前記卵へ導入すること、
（ｂ）前記第一の標的遺伝子と前記第二の標的遺伝子の少なくとも１つの発現を調節するのに十分な時間、前記卵を維持すること、および
（ｃ）前記卵から前記生物由来物質を単離すること、を含み、
前記第一の標的遺伝子は細胞性免疫反応の遺伝子であり、前記第二の標的遺伝子は細胞内プロセスの遺伝子である、方法。
【請求項１９】
前記標的遺伝子は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ２１、ＲＩＧ−１、ＬＰＧＰ２、ＲＩＧ−１−様受容体、ＴＲＩＭ２５、ＩＦＮＡ、ＩＦＮＢ、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＧ、ＭＡＶＳ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＲ２、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−２、ＳＴＡＴ−３、ＳＴＡＴ−４、ＪＡＫ−１、ＪＡＫ−２、ＪＡＫ−３、ＩＲＦ１、ＩＲＦ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ５、ＩＲＦ６、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＩＲＦ１０、２’，５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ、ＲＮａｓｅＬ、ＰＫＲ（ＥＩＦ２ＡＫ２）、ＭＸ１、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、炎症性サイトカイン、ダイサー、ＭＹＤ８８、ＴＲＩＦ、ＰＫＲ、ＣＳＫＮ２Ｂ、および前述のいずれかの調節領域からなる群から選択される宿主免疫応答に関連した遺伝子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第二標的遺伝子は、細胞生存度、増殖または細胞周期に関連した遺伝子であり、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＬＤＨＡ、ＬＤＨＢ、ＢＩＫ、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＨＲＫ、ＢＣＬＧ、ＨＲ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＯＫ、ＢＯＯ、ＢＣＬＢ、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳＰ１０、ＢＣＬ２、ｐ５３、ＡＰＡＦ１、ＨＳＰ７０、ＴＲＡＩＬ、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ１３、ＢＣＬ２Ｌ１４、ＦＡＳＬＧ、ＤＰＦ２、ＡＩＦＭ２、ＡＩＦＭ３、ＳＴＫ１７Ａ、ＡＰＩＴＤ１、ＳＩＶＡ１、ＦＡＳ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦＢＲ１、ＬＯＣ３７８９０２、ＢＣＬ２Ａ１、ＰＵＳＬ１、ＴＰＳＴ１、ＷＤＲ３３、Ｎｏｄ２、ＭＣＴ４、ＡＣＲＣ、ＡＭＥＬＹ、ＡＴＣＡＹ、ＡＮＰ３２Ｂ、ＤＥＦＡ３、ＤＨＲＳ１０、ＤＯＣＫ４、ＦＡＭ１０６Ａ、ＦＫＢＰ１Ｂ、ＩＲＦ３、ＫＢＴＢＤ８、ＫＩＡＡ０７５３、ＬＰＧＡＴ１、ＭＳＭＢ、ＮＦＳ１、ＮＰＩＰ、ＮＰＭ３、ＳＣＧＢ２Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＢ７、ＳＬＣ１６Ａ４、ＳＰＴＢＮ４、ＴＭＥＭ１４６、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＦＯＸＯ１、ＰＴＥＮ、ＦＮ１、ＣＳＫＮ２Ｂ、ｍｉＲＮＡアンタゴニスト、宿主シアリダーゼ、ＮＥＵ２シアリダーゼ２、ＮＥＵ３シアリダーゼ３、ダイサー、ＩＳＲＥ、Ｂ４ＧａｌＴ１、Ｂ４Ｇａｌｔ６、Ｃｍａｓ、Ｇｎｅ、ＳＬ３５Ａ１、および前述のいずれかの調節領域からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記卵にＲＮＡエフェクター分子を接触させることをさらに含み、前記標的遺伝子が、インフルエンザＮＰ、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、ＮＡと、ＨＡまたはＮＡのグリコシル化に影響する遺伝子と、前述のいずれかの調節領域と、から選択されるウイルス遺伝子である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＲＮＡエフェクター分子が遺伝子発現を抑制する、または活性化する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
遺伝子発現の調節により、卵内のウイルス感染価、ウイルス複製、細胞生存度、細胞増殖、翻訳、タンパク質産生またはウイルスの吸着が増加する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子発現の調節により、感染細胞のアポトーシスが減少する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＲＮＡエフェクター分子がオリゴヌクレオチドを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記オリゴヌクレオチドが一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドが修飾される、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記修飾は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、コレステリル誘導体に結合した末端のヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルフォリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および、非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、デコイオリゴヌクレオチド、ａｎｔｉｍｉｒ、ｓｕｐｅｒｍｉｒ、またはＲＮＡ活性化物質を含む、請求項１８〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
免疫抑制物質、成長因子、アポトーシス阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、病原体の阻害剤、およびヒストン脱メチル化物質から選択される第二の物質を前記発育卵に投与することをさらに含む、請求項１８〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＲＮＡエフェクター分子を調剤する、請求項１８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＲＮＡエフェクター分子を脂肪粒子中に調剤する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記脂質粒子はＸＴＣ−ＭＣ３−Ｃ１２−２００ベースの脂質粒子である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
免疫原性物質であって、
（ａ）少なくとも、第一のＲＮＡエフェクター分子であって、少なくとも第一の標的遺伝子に対してその一部分が相補的である第一のＲＮＡエフェクター分子、および第二のＲＮＡエフェクター分子であって、少なくとも第二の標的遺伝子に対してその一部分が相補的である第二のＲＮＡエフェクター分子を発育卵へ導入するステップと、
（ｂ）前記少なくとも第一の標的遺伝子と第二の標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間、前記卵を維持するステップであって、前記発現の調節により前記卵内の生物由来物質の産生が改善される、ステップと、
（ｃ）前記卵から前記免疫原性物質を単離するステップと、を含むプロセスであって、
前記第一の標的遺伝子は免疫応答の遺伝子であり、前記第二の標的遺伝子は細胞内プロセスの遺伝子であるプロセス、により産生される免疫原性物質。
【請求項３５】
前記免疫原性物質はウイルス産物であり、かつインフルエンザ、はしか、流行性耳下腺炎、三日ばしか、黄熱病、狂犬病、痘瘡、水疱、西ナイルウイルス、がん、肝炎、ニューカッスル病、鶏痘、アヒルペスト、ニワトリ脳脊髄炎、軟卵症候群、伝染性気管支炎、マレック病、伝染性ファブリーキウス嚢病、伝染性喉頭気管炎または牛疫に対して免疫原性である、請求項３４の免疫原性物質。
【請求項３６】
前記産物はインフルエンザに対して免疫原性である、請求項３５の免疫原性物質。
【請求項３７】
前記免疫原性物質は、１投与当たり少なくとも１０６ＥＩＤ５０（５０％胚感染用量）のウイルス力価を含む、請求項３６の免疫原性物質。
【請求項３８】
前記第一標的遺伝子は、卵細胞の免疫応答に関連した遺伝子であり、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ２１、ＲＩＧ−１、ＬＰＧＰ２、ＲＩＧ−１−様受容体、ＴＲＩＭ２５、ＩＦＮＡ、ＩＦＮＢ、ＩＦＮＧ  ＭＡＶＳ／ＶＩＳＡ／ＩＰＳ−１／Ｇａｒｄｉｆ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＲ２、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−２、ＳＴＡＴ−３、ＳＴＡＴ−４、ＪＡＫ−１、ＪＡＫ−２、ＪＡＫ−３、ＩＲＦ１、ＩＲＦ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ５、ＩＲＦ６、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＩＲＦ１０、２’，５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ、ＲＮａｓｅＬ、ｄｓＲＮＡ−ｄＰＫＲ、Ｍｘ、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、炎症性サイトカイン、ＭＹＤ８８、ＴＲＩＦ、ダイサー、ＰＫＲ、ＣＳＫＮ２Ｂ、および前述のいずれかの調節領域からなる群から選択される、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の免疫原性物質。
【請求項３９】
前記第二の標的遺伝子は、卵細胞生存度、増殖または細胞周期に関連した遺伝子であり、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＬＤＨＡ、ＬＤＨＢ、ＢＩＫ、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＨＲＫ、ＢＣＬＧ、ＨＲ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＯＫ、ＢＯＯ、ＢＣＬＢ、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳ１０、ＢＣＬ２、ｐ５３、ＡＰＡＦ１、ＨＳＰ７０、ＴＲＡＩＬ、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ１３、ＢＣＬ２Ｌ１４、ＦＡＳＬＧ、ＤＰＦ２、ＡＩＦＭ２、ＡＩＦＭ３、ＳＴＫ１７Ａ、ＡＰＩＴＤ１、ＳＩＶＡ１、ＦＡＳ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦＢＲ１、ＬＯＣ３７８９０２、またはＢＣＬ２Ａ１、ＰＵＳＬ１、ＴＰＳＴ１、ＷＤＲ３３、Ｎｏｄ２、ＭＣＴ４、ＡＣＲＣ、ＡＭＥＬＹ、ＡＴＣＡＹ、ＡＮＰ３２Ｂ、ＤＥＦＡ３、ＤＨＲＳ１０、ＤＯＣＫ４、ＦＡＭ１０６Ａ、ＦＫＢＰ１Ｂ、ＩＲＦ３、ＫＢＴＢＤ８、ＫＩＡＡ０７５３、ＬＰＧＡＴ１、ＭＳＭＢ、ＮＦＳ１、ＮＰＩＰ、ＮＰＭ３、ＳＣＧＢ２Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＢ７、ＳＬＣ１６Ａ４、ＳＰＴＢＮ４、ＴＭＥＭ１４６、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＦＯＸＯ１、ＰＴＥＮ、ＦＮ１、ｍｉＲＮＡアンタゴニスト、宿主シアリダーゼ、ＮＥＵ２シアリダーゼ２、ＮＥＵ３シアリダーゼ３、ダイサー、ＩＳＲＥ、Ｂ４ＧａｌＴ１、Ｂ４ＧａｌＴ６、Ｃｍａｓ、Ｇｎｅ、ＳＬ３５Ａ１、および前述のいずれかの調節領域からなる群から選択される、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の免疫原性物質。
【請求項４０】
前記標的遺伝子がＨＡまたはＮＡのグリコシル化に影響し、ＲＮＡエフェクター分子を前記細胞に接触させる、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の免疫原性物質。
【請求項４１】
前記標的遺伝子がＮＰ、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、ＮＡから選択されるウイルス遺伝子、または前述のいずれかの調節領域であり、ＲＮＡエフェクター分子を前記細胞に接触させる、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の免疫原性物質。
【請求項４２】
前記ＲＮＡエフェクター分子が遺伝子発現を抑制または活性化する、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の免疫原性物質。
【請求項４３】
遺伝子発現の調節により、卵内のウイルス感染価、ウイルス複製、細胞生存度、細胞増殖、翻訳、タンパク質産生またはウイルスの吸着が増加する、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の免疫原性物質。
【請求項４４】
遺伝子発現の調節により、感染細胞のアポトーシスが減少する、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の免疫原性物質。
【請求項４５】
前記ＲＮＡエフェクター分子がオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の免疫原性物質。
【請求項４６】
前記オリゴヌクレオチドが一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドである、請求項１〜４５に免疫原性物質。
【請求項４７】
前記オリゴヌクレオチドが修飾される、請求項４５または４６に記載の免疫原性物質。
【請求項４８】
前記修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、コレステリル誘導体に結合した末端のヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルフォリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および、非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される、請求項４７に記載の免疫原性物質。
【請求項４９】
前記オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、デコイオリゴヌクレオチド、ａｎｔｉｍｉｒ、ｓｕｐｅｒｍｉｒ、またはＲＮＡ活性化物質を含む、請求項３４〜４８のいずれか一項に記載の免疫原性物質。
【請求項５０】
免疫抑制物質、成長因子、アポトーシス阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、病原体の抑制剤、およびヒストン脱メチル化物質から選択される第二の物質を前記発育卵に投与することをさらに含む、請求項３４〜４９のいずれか一項に記載の免疫原性物質。
【請求項５１】
前記ＲＮＡエフェクター分子を調剤する、請求項３４〜５０のいずれか一項に記載の免疫原性物質。
【請求項５２】
前記ＲＮＡエフェクター分子を脂肪粒子中に調剤する、請求項５１に記載の免疫原性物質。
【請求項５３】
前記脂質粒子がＸＴＣ−ＭＣ３−Ｃ１２−２００ベースの脂質粒子である、請求項５２に記載の免疫原性物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子生物学、分子遺伝学およびバイオプロセシングに関する。より具体的には、本発明は、標的遺伝子の発現を調節できるＲＮＡエフェクター分子を発育卵に導入することにより、発育卵中の生物由来物質を産生するための方法を提供し、調節により卵での生物由来物質の産生を増強する。この方法では、生物由来物質、例えば季節性およびパンデミックインフルエンザワクチンを含むウイルスワクチンの受精卵での産生を最適化するために、ＲＮＡｉベースのアプローチが提供される。本発明は、さらにこの方法の実行に有用な分子、試薬、細胞およびキット、ならびにこの方法によって産生される生物由来物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
受精させたニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）の卵は、５０年以上ワクチン製造に使用されている。これは低コストで、容易に拡張可能で、比較的環境にやさしい、初めての使い捨てのバイオリアクターである。ワクチンの調製に使用されるヒト、トリおよびヒト：トリのハイブリッド系統は、卵または羊膜腔へ注入後、受精卵内で複製させ、羊水等の卵から回収される。ヒトワクチンは、他のどのような生物学的基質よりも発育卵内で多く製造され、年間２５億接種分以上の不活化季節性インフルエンザワクチンが１００の国に配布されている。黄熱病用ワクチンおよび獣医学の多数のワクチンも通常卵内で産生される。
【０００３】
にもかかわらず、卵での大量のワクチン産生には多数の障害があり、細胞培養ベースの代替法の開発にかなりの投資がなされている。組み換え哺乳動物細胞培養、植物由来のワクチン、ならびに大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）および他の微生物ベースの産生システム等の新しいプラットフォームはかなりの進歩を見せているが、最も進んだものでさえ、インフルエンザ予防で年間必要となる大量ワクチン産生への要求を満たすには至っていない。
【０００４】
この状況を考慮すると、卵は当分の間インフルエンザワクチン産生のための重要な産生プラットフォームであり続けると思われる。しかし、不活化インフルエンザワクチンの収量は系統に依存し、卵１つ当たり１〜３接種分と変動する。また、温帯地方での生産は季節性であり、生産設備は半年間使用されない。このような要因から、余裕のない状況下での高速、高収率を可能とするワクチンバイオプロセシングの重要性が示唆される。
【０００５】
現在の卵ベースのバイオプロセシングでの限界の一例が２００９年に発生した：世界保健機構は、パンデミックワクチンの作製のために発育卵に注入した新型Ｈ１Ｎ１ウイルスの成長が芳しくないと報告した。Ｈ１Ｎ１種系統は、季節性インフルエンザウイルスと比較して、最速でもわずか２５％〜５０％パーセントの成長であった。Ｈ１Ｎ１ウイルスの重要な表面タンパク質、ヘマグルチニンが卵内で不安定であったようである。これにより世界のワクチン研究者は「出発点」に戻り、感染した人々からウイルスの新規のサンプルを急いで単離し、この新しい系統を、卵内でよく増殖するインフルエンザウイルス系統にハイブリダイズした。
【０００６】
さらに、例えばトリインフルエンザウイルスのＨ５Ｎ１系統は発育鶏卵において致死的である。実際、高病原性のトリ系統は、トリ胚に対して致死的であるため、鶏卵中で多量に増殖させることができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、発育卵はバイオプロセシングにとって今も重要なアプローチであるが、産生物の収量を改善する技術、特にワクチンバイオプロセシングが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、発育卵内で免疫原性物質等の生物由来物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ）の産生を改善するための方法を提供する。この方法では、その一部分が少なくとも１つの核酸ベースの存在（例えば標的遺伝子）に相補的であるＲＮＡエフェクター分子を少なくとも１つ卵へ導入するステップと、少なくとも１つの核酸ベースの存在の発現を調節するのに十分な時間、卵を維持し、発現の調節により卵内の生物由来物質の産生が改善されるステップと、発育卵から生物由来物質を単離するステップとが含まれる。
【０００９】
より具体的には、本発明の実施形態のいくつかでは、ウイルス感染またはベクター接種の前、その間、または後に、発育卵でＲＮＡ干渉を開始させ、回収されるウイルス／免疫原性産物の収量および品質を損なう、細胞および／または抗ウイルスプロセスを抑制することに関する。例えば、実施形態では、胚細胞の抗ウイルス経路（例えばインターフェロン経路（ＩＦＮＢ）、またはＩＦＮ受容体（例えばＩＦＮＡＲ１））を標的にする、裸の、複合体の、または調剤形態（例えば脂質ナノ粒子）のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを投与する。これにより、細胞の抗ウイルス応答を抑制し、ウイルス複製を増強し、生物由来物質（例えばウイルス粒子および／または免疫原性物質）の収量を増加させる。これは、漿尿膜（ｃｈｏｒｉｏｎａｌｌａｎｔｏｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を標的として、羊膜腔／羊水および／または他の組織への注入によって、所望の生物由来物質を産生することにより可能となる。
【００１０】
本発明の実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡｉ製剤に関しては、単一（生理食塩水もしくは同様の溶液、または製剤中の裸のｓｉＲＮＡ）で、および複合化（例えばコレステロールまたは他の標的化リガンド）して使用でき、同様に、ＬＮＰもしくは代替ポリマー製剤または送達手段、およびｓｈＲＮＡのためのプラスミドまたはウイルスベクターも使用できる。さらに、前述の製剤は、ビリオン粒子と一緒に調剤するかベクターそのものに組み入れて、ウイルス／ベクターが所望の産物を産生できる適切な発育卵組織に対してＲＮＡｉ物質の送達を促進でき、またはＲＮＡｉ物質を安定化させることができる。
【００１１】
様々な実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子には、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔｋＲＮＡｉ、ｅｉＲＮＡ、ｐｄＲＮＡ、ギャップマー、アンタゴｍｉｒまたはリボザイムがある。一実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子はｓｈＲＮＡではない。一実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子はｄｓＲＮＡである。
【００１２】
一実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は標的遺伝子を活性化できる。
別の実施形態において、ＲＮＡエフェクターは標的遺伝子を抑制できる。
実施形態のいくつかにおいては、ＲＮＡエフェクター分子は、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が少なくとも１６個の隣接するヌクレオチド（例えば１７個のヌクレオチド、１８個のヌクレオチドまたは１９個のヌクレオチド）を含む。一実施形態において、アンチセンス鎖は少なくとも１６個の隣接するヌクレオチドを含む。一実施形態において、アンチセンス鎖は少なくとも１７個の隣接するヌクレオチドを含む。一実施形態において、アンチセンス鎖は少なくとも１８個の隣接するヌクレオチドを含む。一実施形態において、アンチセンス鎖は少なくとも１９個の隣接するヌクレオチドを含む。一実施形態において、アンチセンス鎖はさらに少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む。一実施形態において、アンチセンス鎖はさらに少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドを含む。一実施形態において、アンチセンス鎖はさらに２つのデオキシチミジン残基を含む。
【００１３】
実施形態のいくつかにおいては、ＲＮＡエフェクター分子は、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、このアンチセンス鎖は少なくとも１６個の隣接するヌクレオチド（例えば１７個のヌクレオチド、１８個のヌクレオチドまたは１９個のヌクレオチド）を含む。一実施形態において、アンチセンス鎖は少なくとも１６個の隣接するヌクレオチドを含む。一実施形態において、アンチセンス鎖は少なくとも１７個の隣接するヌクレオチドを含む。一実施形態において、アンチセンス鎖は少なくとも１８個の隣接するヌクレオチドを含む。一実施形態において、アンチセンス鎖は少なくとも１９個の隣接するヌクレオチドを含む。一実施形態において、アンチセンス鎖はさらに少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む。一実施形態において、アンチセンス鎖はさらに少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドを含む。一実施形態において、アンチセンス鎖はさらに２つのデオキシチミジン残基を含む。
【００１４】
特定の実施形態において、標的遺伝子は、ウイルス認識に関連した、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ２１、ＲＩＧ−１、ＬＰＧＰ２および他のＲＩＧ−１−様受容体、ＴＲＩＭ２５またはＭＡＶＳ／ＶＩＳＡ／ＩＰＳ−１／Ｇａｒｄｉｆ等；ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ等のインターフェロン遺伝子；ＩＦＮＡＲ１またはＩＦＮＲ２等のインターフェロン受容体；およびＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−２、ＳＴＡＴ−３、ＳＴＡＴ−４、ＪＡＫ−１、ＪＡＫ−２、ＪＡＫ−３、ＩＲＦ１、ＩＲＦ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ５、ＩＲＦ６、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９またはＩＲＦ１０等のインターフェロンシグナル伝達に関連した遺伝子である。
【００１５】
他の特定の実施形態において、標的遺伝子は、２’，５’オリゴアデニル酸シンテターゼ（２−５ＯＡＳ）、ＲＮａｓｅＬ（リボヌクレアーゼＬ（２’，５’−オリゴイソアデニル酸シンテターゼ依存）、ｄｓＲＮＡ−依存型タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）（真核生物翻訳開始因子２−αキナーゼ２、ＥＩＦ２ＡＫ２）、Ｍｘ（ＭＸ１  ミクソウイルス（インフルエンザウイルス）耐性１、インターフェロン誘導タンパク質ｐ７８）、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、炎症性サイトカイン、ＭＹＤ８８（ミエロイド分化一次応答遺伝）またはＴＲＩＦ（トール様受容体アダプター分子１）などのインターフェロン誘導タンパク質をエンコードする。
【００１６】
さらに他の特定の実施形態において、標的遺伝子は、タンパク質キナーゼＣＫ２βサブユニット（ＣＳＫＮ２Ｂ）などの細胞増殖に関連した遺伝子；Ｂａｘ、Ｂａｋ（ＢＣＬ２拮抗性キラー１）、ＬＤＨＡ（乳酸デヒドロゲナーゼＡ）、ＬＤＨＢ、ＢＩＫ、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＨＲＫ、ＢＣＬＧ、ＨＲ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＯＫ（ＢＣＬ２関連卵巣キラー）、ＢＯＯ、ＢＣＬＢ、ＣＡＳＰ２（アポトーシス関連システインペプチダーゼ（神経前駆細胞発現、発生的に下方制御２）、ＣＡＳＰ３（アポトーシス関連システインペプチダーゼ）、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳＰ１０、ＢＬＣ２（Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫２）、ｐ５３、ＡＰＡＦ１、ＨＳＰ７０、ＴＲＡＩＬ（ＴＲＡＩＬ−様、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド様）、ＢＬＣ２Ｌ１（ＢＣＬ２様１）、ＢＬＣ２Ｌ１３（ＢＣＬ２様１３（アポトーシス促進剤））；ＢＣＬ２Ｌ１４（ＢＣＬ２様１４（アポトーシス促進剤）、ＦＡＳＬＧ（Ｆａｓリガンド（ＴＮＦスーパーファミリー、メンバー６））、ＤＰＦ２（Ｄ４、ジンクアンドダブルＰＨＤフィンガーファミリー２）、ＡＩＦＭ２（アポトーシス誘導因子ミトコンドリア関連２）およびＡＩＦＭ３、ＳＴＫ１７Ａ（セリン／トレオニンキナーゼ１７ａ（アポトーシス誘導））、ＡＰＩＴＤ１（アポトーシス誘導、ＴＡＦ９様ドメイン１）、ＳＩＶＡ１（アポトーシス誘導因子）、ＦＡＳ（ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー６）、ＴＧＦβ２（トランスフォーミング成長因子β２）、ＴＧＦＢＲ１（トランスフォーミング成長因子、β受容体Ｉ）、ＬＯＣ３７８９０２（デスドメイン含有腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー２３）またはＢＣＬ２Ａ１（ＢＣＬ２関連タンパク質Ａ１）等のアポトーシスに関連した遺伝子である。
【００１７】
他の特定の実施形態では、標的はスクリーニングによって同定された遺伝子であり、例えば、ＰＵＳＬ１（シュードウリジレートシンターゼ様１）、ＴＰＳＴ１（チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ１）、ＷＤＲ３３（ＷＤ反復ドメイン３３）、Ｎｏｄ２、ＭＣＴ４（溶質輸送体ファミリー１６、メンバー３（モノカルボン酸）輸送体４））、ＡＣＲＣ（酸性反復含有）、ＡＭＥＬＹおよびＡＴＣＡＹ（小脳、カイマン型（ｃａｙｔａｘｉｎ））、ＡＮＰ３２Ｂ（酸性（ロイシンリッチ）核リン酸化タンパク質３２ファミリーメンバー）、ＤＥＦＡ３、ＤＨＲＳｌ０、ＤＯＣＫ４（細胞質分裂デディケーター４）、ＦＡＭ１０６Ａ、ＦＫＢＰ１Ｂ（ＦＫ５０６結合タンパク質１Ｂ）、ＩＲＦ３、ＫＢＴＢＤ８（ケルヒリピート、およびＢＴＢ（ＰＯＺ）ドメイン含有８）、ＫＩＡＡ０７５３（ＫＩＡＡ０７５３遺伝子のホモログ）、ＬＰＧＡＴ１（リゾフォスファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１）、ＭＳＭＢ（マイクロセミノタンパク質β）、ＮＦＳ１（窒素固定１のホモログ）、ＮＰＩＰ、ＮＰＭ３（ヌクレオフォスミン／ヌクレオプラスミン３）、ＳＣＧＢ２Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＢ７、ＳＬＣ１６Ａ４（溶質輸送体ファミリー１６、メンバー４（モノカルボン酸）輸送体５）、ＳＰＴＢＮ４（スペクトリン、β、非赤血球４）、またはＴＭＥＭ１４６；細胞周期／細胞増殖に関連した遺伝子、例えばＣＤＫＮ１Ｂ（サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ｂ、ｐ２７、ｋｉｐ１）、ＣＤＫＮ２ＡまたはＦＯＸＯ１である。
【００１８】
実施形態のいくつかにおいては、標的はＰＴＥＮまたはＦＮ１、またはｍｉＲＮＡアンタゴニスト、宿主シアリダーゼ、ＮＥＵ２シアリダーゼ２（細胞基質シアリダーゼ）、ＮＥＵ３シアリダーゼ３（膜シアリダーゼ）、ダイサー（ダイサー１、リボヌクレアーゼＩＩＩ型）またはＩＳＲＥ（インターフェロン刺激応答エレメント）等の遺伝子である。
【００１９】
他の実施形態において、標的は、産物の収量および／または品質を損なう、宿主細胞のまたはウイルスの他のプロセスを抑制する標的となり得る。例えばＳＬＣ３５Ａ１、ＳＬＣ３５Ａ２、ＧＮＥ、Ｃｍａｓ、Ｂ４ＧａｌＴ１およびＢ４ＧａｌＴ６等のウイルス結合を減少させるために細胞表面からシアル酸を除去する標的遺伝子である。他の標的遺伝子には、前述のいずれかのプロモーター領域、３’ＵＴＲおよび／または５’ＵＴＲがある。
【００２０】
他の実施形態において、標的遺伝子は、産物に混入できる、または産物の収量および／または品質を損ない得る内在性ウイルス、潜伏ウイルスまたは外来ウイルスであり得る。例えば、内在性レトロウイルスの標的遺伝子は、ｇｇ０１−ｃｈｒ７−７１６３４６２、ｇｇ０１−ｃｈｒＵ−５２１９０７２５、ｇｇ０１−Ｃｈｒ４−４８１３０８９４、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）ｐｏｌ、ＡＬＶ  ｐ２、ＡＬＶ  ｐ１０、ＡＬＶ  ｅｎｖ、ＡＬＶ細胞膜貫通型タンパク質、ｔｍ、ＡＬＶトランス活性化因子、ｇｇ０１−ｃｈｒ１−１５１６８８４５、ｇｇ０１−ｃｈｒ４−７７３３８２０１、ｇｇ０１−ＣｈｒＵ−１６３５０４８６９およびｇｇ０１−ｃｈｒ７−５７３３７８２であり得る。潜在ＤＮＡウイルスの標的遺伝子は例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の遺伝子であり得る。外来ウイルスの標的遺伝子は例えばＡＬＶの遺伝子であり得る。
【００２１】
さらに、ウイルスの子孫は、ビルレンス（例えばインフルエンザＮＰ、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、Ｍ、およびＮＳ遺伝子）に関連したウイルスタンパク質を標的とすることにより弱毒化できる。目的の生物学的産物のグリコシル化パターン、例えばヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）インフルエンザタンパク質等は、抗原性または宿主適応を改善するために弱毒化できるが、これらの標的遺伝子の相同性は、系統間で極めてまれである。つまり、バイオプロセシングの品質、特質および効率のあらゆる側面をこのアプローチによって改変できる。
【００２２】
したがって、本発明の実施形態のいくつかにおいて、生物由来物質は、天然のウイルス系統、変異体、または突然変異体系統のウイルスであり；（例えば、変異誘発物質への暴露、非許容宿主での継代接種および／または継代接種を繰り返すことにより産生される）突然変異誘発されたウイルスであり；（分節型ウイルスゲノムの場合）リアソータントなウイルスであり；および／または（例えば、「逆遺伝学」の技術を使用した）所望の表現型を有する遺伝子改変ウイルスであり；および他のウイルスベースの（ウイルスの）産物である。本発明のウイルスは弱毒化されており、感染性を有しインビボで複製できるが、力価が低く、非病原性で無症状レベルでの感染を起こす。
【００２３】
別の実施形態はワクチンで使用されるウイルス産物を調製することをさらに含む。
一実施形態において、発育卵に複数の異なるＲＮＡエフェクター分子を投与して複数の標的遺伝子の発現を調節する。ＲＮＡエフェクター分子を、別々に、または同時に、同一の、または異なる頻度で、同一の、または異なる濃度で投与できる。
【００２４】
さらなる実施形態において、この方法は第二の物質を発育卵に投与することをさらに含む。第二の物質は免疫抑制物質；成長因子；アポトーシス阻害剤；キナーゼ阻害剤；ホスファターゼ阻害剤；プロテアーゼ阻害剤；病原体の阻害剤（例えば、ウイルスが生物由来物質である場合、内在性ウイルスもしくは混入ウイルス、または真菌性病原体もしくは細菌性病原体の増殖および／または繁殖を抑制する物質）；またはヒストン脱メチル化物質であってもよい。
【００２５】
追加の実施形態において、標的遺伝子は、発育卵の生理的過程に影響するタンパク質をコードする。様々な実施形態において、生理的過程とは、アポトーシス、細胞周期進行、炭素代謝もしくは輸送、乳酸形成、またはＲＮＡｉの取込みおよび／または効率である。
【００２６】
一実施形態において、本発明は、本明細書で提供されるＲＮＡエフェクター分子を少なくとも１つ含む発育卵を提供する。発育卵は、例えば鳥卵、爬虫類卵、魚卵、昆虫卵または両生類卵である。鳥卵は、鶏卵、アヒル卵、シチメンチョウ卵、ガチョウ卵、ダチョウ卵または他の鳥卵であり得る。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、卵の中の標的遺伝子の発現の調節により、培養された発育卵内の生物由来物質の産生を増強するための組成物を提供する。組成物は典型的には本明細書に記述された１つまたは複数のＲＮＡエフェクター分子および適切な担体または、送達手段を含む。
【００２８】
別の実施形態において、別々の標的遺伝子に対する２つ以上のＲＮＡエフェクター分子を含む組成物は、卵の中の第一の標的遺伝子および少なくとも第二の標的遺伝子の発現の調節により、発育卵のバイアル産物の産生を増強するために使用され、第一と第二の標的遺伝子は、同じタンパク質（例えば、第一標的はコード領域にあり、第二の標的はＵＴＲにある）の発現に関連し得る。
【００２９】
本発明のまた別の実施形態は、培養された発育卵での生物由来物質の産生を増強するためのキットを包含する。一態様において、キットは、生物由来物質の産生に影響するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を調節するＲＮＡエフェクター分子を含む。別の実施形態において、キットは、生物由来物質の産生に影響するタンパク質の発現を調節するＲＮＡエフェクター分子を発現する発育卵を含む。このようなキットには、さらに、本明細書で提供された方法を実施するための指示を含むことができる。
【００３０】
本発明の実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡエフェクター分子を、インフルエンザウイルスＨＡおよび／またはＮＡ残基と相互作用するシアル酸の「デコイ」と併用する。一実施形態において、シアル酸のデコイを、ＲＮＡエフェクター分子および感染ウイルスの導入と同時に発育卵に導入する。これにより、卵に混入物が入る可能性のある暴露を繰り返すことなく、ＲＮＡエフェクターが細胞に接触し細胞活動を調節する間、ウイルス感染を遅らせることができる。
【００３１】
別の実施形態において、シアル酸にウイルスを結合させ、運搬メカニズムとして使用し、ＲＮＡｉ剤（例えばＲＮＡエフェクター分子）を宿主細胞に接触させる。この方法では、ＲＮＡエフェクター分子はシアル酸またはその誘導体と組み合わせるか、または複合体化させる。一実施形態において、ウイルス接種物をＲＮＡエフェクター結合シアル酸誘導体と混合し、ウイルスのヘマグルチニン残基の一部分が、シアル酸−ｓｉＲＮＡ複合物と複合体を形成する。
【００３２】
他の実施形態において、シアル酸をｓｉＲＮＡを有するリポソーム製剤へ組み入れる。この実施形態の態様において、ｓｉＲＮＡ−シアル酸−リポソーム製剤は発育卵への接種に先立ってインフルエンザと混合する。
【００３３】
本発明の実施形態のいくつかにおいては、例えば、宿主細胞の免疫応答が（例えばＲＮＡエフェクター分子によって）少なくとも部分的に抑制されるまで一時的にウイルス複製を抑制し、細胞の免疫応答が十分抑制された後にウイルス複製を起こすことは有利となる。別の方法には、細胞にウイルスを接種させ、非結合ウイルスを細胞から洗い流し、次いでこの感染細胞をＲＮＡエフェクター分子と同時に発育卵に導入する。別の実施形態において、ウイルスの感染の多重度（ＭＯＩ）は、発育卵中のＲＮＡエフェクター分子および細胞密度と比較して比較的低く、ウイルス力価が上昇するとともに卵細胞のＲＮＡエフェクターが大きな影響を持つことができる。
【００３４】
卵は、不活化インフルエンザワクチン製造でのバルクワクチンのコストのおよそ５０％を占める。ＲＮＡ干渉ベースのアプローチでは、高収量および高品質が実現できるため、所与の収量に必要な卵の数を減少させてワクチン製造コストを低減できる。例えば、収量を１０倍にすると、ワクチン製造コストが４０％減少する。さらに、単位稼働時間あたりより多くのワクチンを産生することで、不活化インフルエンザワクチンの産生スピードを加速できる。必要とされる卵の数を１／３から１／５にするだけで、製造ロジスティクスが劇的に改善し、品質管理を改善する効果も生まれ、インフルエンザ等の疾病の流行時およびパンデミック発生時にワクチンの供給を拡大できるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、例えば本明細書に記述された特定の方法、プロトコルおよび試薬に制限されず、変更できる。本明細書に使用された用語は、特定の実施形態を単に記述するためのものであり、請求項により定義された本発明の範囲の限定を意図しない。
【００３６】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形は、文脈が明らかにそうではないと示していないかぎり、複数の指示対象を含み、また逆も同様である。実施例以外で、または特記しない限り、成分量、反応条件などを表現している全ての数は、全て「約」により修飾されると理解されるべきである。
【００３７】
識別される全特許および他の文献を、本明細書に参照して組み込むが、その目的は例えば本発明に関連して使用され得る、そのような文献で記述された方法を説明および開示するためである。これらの文献は本出願の出願日より前に、その内容を開示するためだけに提供される。従来の発明、またはその他のあらゆる理由により本発明者らがそのような開示の日付を早める権利がないことを是認するものとして解釈されるべきではない。日付に関する記載またはこれらの文書の内容に関する表現はすべて、出願者に入手可能な情報に基づき、これらの文書の日付または内容の正確さに関していかなる是認をも構成するものではない。
【００３８】
別に定義しない限り、本明細書に使用される技術および科学用語はすべて、本発明が関係する業界の一般的な関係者に理解されるものと同一の意味を所有している。あらゆる既知の方法、デバイスおよび物質を本発明の実施または試験において使用できるが、方法、デバイスおよび物質は使用の際に本明細書で記述される。
【００３９】
ヒトの遺伝子記号は一般的に大文字で記載されるが、本明細書においては、大文字または小文字の遺伝子記号を区別なく使用し、両遺伝子記号はヒトまたは非ヒト種の両方を含み得る。したがって、例えば本明細書で遺伝子または遺伝子標的「乳酸デヒドロゲナーゼＡ」を「ＬＤＨＡ」（「Ｌｄｈａ」または「ＬｄｈＡ」）と言及する場合、ヒトおよび／または非ヒト（例えばトリの）遺伝子および遺伝子標的が含まれる。言いかえれば、特定の遺伝子記号の大文字または小文字は、遺伝子または遺伝子標的の範囲をヒトまたは非ヒト種に限定しない。本明細書のすべての遺伝子の識別番号（ＧｅｎｅＩＤ）は、別記しない限り、国立バイオテクノロジー情報センターの「Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ」ウェブサイトのニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）のものである。
【００４０】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、本明細書で必須の組成物、方法および各構成成分に関して使用されるが、必須または必須でない不特定の要素の包含に対しても制限しない。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「から本質的になる」は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、本発明の実施形態の基本的なおよび新規な、または機能的な特性に実質的に影響を与えない要素の存在を容認する。
【００４２】
用語「からなる」は、本明細書に記述する組成物、方法およびその各構成成分を指し、実施形態の記述において詳述されない任意の要素を除外する。
本明細書で使用される場合、「免疫原性物質（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）」は、患者の免疫システムを刺激するために使用される物質を指し、刺激によって免疫システムの１つまたは複数の機能が増強し、免疫原性物質へ向かって移動する。抗原または免疫原は、１つまたは複数の抗原決定基を含む分子を意味することを目的とし、宿主の免疫システムを刺激して、抗原に特異的な分泌、体液および／または細胞性免疫反応を引き起こす。免疫原性物質は、当該技術分野において周知の技術を使用して、抗体、つまり単離されたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生に使用できる。免疫原性物質にはワクチンが含まれる。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「ワクチン」は、患者の免疫システムを刺激するために使用される薬剤を指し、患者の免疫システムにより自己抗原として認識されない抗原に対する防御作用を付与する。免疫化は、生物体が暴露された病原体または抗原に対する高レベルの抗体および／または細胞性免疫反応を患者内で誘導する過程を指す。本明細書に使用されるワクチンおよび免疫原性物質は患者の免疫システム、つまり、患者の細胞または細胞外液に侵入する抗原物質に対する抗体および／または細胞性免疫反応を引き起こす解剖学的特徴およびメカニズムに関する。抗体産生の場合には、このように産生された抗体は、免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭ等の免疫学上のクラスのいずれかに分類される。免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）が温血動物の分泌システムにおける主要な免疫グロブリンであるため、ＩｇＡの産生を刺激するワクチンが対象となる。ワクチンは、例えば細胞および液性免疫に対して、ＩｇＡの形成に加えて他の様々な免疫応答を引き起こすようである。抗原に対する免疫応答はよく研究されており、広く報告されている。例えば、Ｅｌｇｅｒｔ、ＩＭＭＵＮＯＬ．（Ｗｉｌｅｙ  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９６）；Ｓｔｉｔｅｓら、ＢＡＳＩＣ＆ＣＬＩＮ．ＩＭＭＵＮＯＬ．（第７版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、１９９１）を参照のこと。対照的に、「宿主細胞の免疫応答」なる語句は、単細胞の宿主生物（つまり発育卵内の細胞の異物の存在に対する応答を指す。
【００４４】
本発明の文脈において、用語「オリゴヌクレオチド」または「核酸分子」は、自然界で発現または見出される核酸分子だけでなく、本明細書に記載の、または当該技術分野において周知の、リボヌクレオチド類似体もしくは誘導体、リボヌクレオシド類似体もしくは誘導体、またはデオキシリボヌクレオチド類似体もしくは誘導体、デオキシリボヌクレオシド類似体もしくは誘導体を１つまたは複数含む、核酸の類似体および誘導体も包含する。このような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば細胞に良く取込まれ、核酸分解酵素の存在下でも安定性に優れ、本明細書でも触れる特質を有するため、天然型よりも頻繁に使用される。「ヌクレオシド」はヌクレオシド塩基と糖リボースを含み、「ヌクレオチド」は１つ、２つ、または３つのリン酸成分を有するヌクレオシドである。用語「ヌクレオシド」と「ヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、等しいものとみなせる。オリゴヌクレオチドは核酸塩基構造、またはリボース−リン酸主鎖構造において修飾でき、例えば、本明細書に記述するように、ＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡヌクレオチドへの修飾を含む。ヌクレオシド類似体または誘導体を含む分子は、二本鎖を形成する機能を保ち続けなければならない。
【００４５】
非限定的な例として、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドを含んでもよく、例えば、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシド、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、コレステロール誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結した末端ヌクレオシド、ロックドヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオシド、２’−アミノ修飾ヌクレオシド、２’−アルキル修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ホスホロアミダートもしくは非天然塩基を含むヌクレオシド、またはその任意の組み合わせがあるが、これらに限定されない。あるいは、オリゴヌクレオチドは修飾されたヌクレオシドを少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個含んでもよく、または、オリゴヌクレオチド全長にわたり修飾されたヌクレオシドを含んでもよい。このように、オリゴヌクレオチドにある複数の修飾されたヌクレオシドは、それぞれが同じ修飾を受ける必要はない。ＲＮＡエフェクター分子が二本鎖の場合、鎖はそれぞれ、修飾ヌクレオシドの個数、型および／または部位に関して独立して修飾され得る。一実施形態において、本明細書に記載の方法と組成物で使用することを考慮した修飾オリゴヌクレオチドは、必要な二本鎖構造を形成でき、ＲＩＳＣ経路経由で標的ＲＮＡの特定の分解を可能とする、または媒介するペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
【００４６】
用語「リボヌクレオシド」、「リボヌクレオチド」、「ヌクレオチド」または「デオキシリボヌクレオチド」は、本明細書で詳述するように、修飾ヌクレオチド、または代わりの置換成分を指すこともできる。当該技術分野において、チミン塩基を含むリボヌクレオチドは５−メチルウリジンとも呼ばれ、ウラシル塩基を含むデオキシリボヌクレオチドはデオキシウリジンとも呼ばれる。グアニン、シトシン、アデニン、チミンおよびウラシルは、他の成分と置換できるが、この置換成分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的には変化させずに置換できる。例えば、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシンまたはウラシル等を含むヌクレオチドと塩基対を制限なく形成できる。よって、本発明で注目するｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列内のウラシル、グアニンまたはアデニン等を含むヌクレオチドは、例えば、イノシンを含むヌクレオチドに置換できる。別の例では、オリゴヌクレオチド内の任意の場所にあるアデニンおよびシトシンはそれぞれ、グアニンおよびウラシルに置換でき、標的ｍＲＮＡとのＧ−Ｕ揺らぎ塩基対を形成できる。このような置換成分を含む配列は、本発明で注目する組成物と方法にとって適切である。
【００４７】
同様に、当業者は、用語「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」は、自然界で発現または見出されるＲＮＡ分子だけでなく、本明細書に記載の、または当該技術分野において周知の、リボヌクレオチド類似体もしくは誘導体、またはリボヌクレオシド類似体もしくは誘導体を１つまたは複数含む、ＲＮＡの類似体および誘導体も包含することを理解するであろう。用語「リボヌクレオシド」と「リボヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、等しいものとみなせる。本明細書に記述するように、ＲＮＡを核酸塩基構造、またはリボース−リン酸主鎖構造において修飾できる。
【００４８】
一態様において、ＲＮＡエフェクター分子はデオキシリボヌクレオシド残基を含むことができる。このような場合、ＲＮＡエフェクター分子剤は１つまたは複数のデオキシヌクレオシドを含むことができ、例えば、ｄｓＲＮＡの二本鎖の一部分にデオキシヌクレオシド突出、または１つもしくは複数のデオキシヌクレオシドを含む。
【００４９】
実施形態のいくつかにおいて、複数のＲＮＡエフェクター分子を、１つまたは複数の標的遺伝子の発現を調節するために使用する。「複数」は、少なくとも２つ以上のＲＮＡエフェクター分子を指し、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、またはそれ以上のＲＮＡエフェクター分子を指す。「複数」はさらに少なくとも２つ以上の標的遺伝子を指すことができ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上の標的遺伝子を指す。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞に接触する」は、卵内の宿主細胞（「卵細胞」または「宿主卵細胞」）を物質で処理し、物質を細胞へ導入することを指す。宿主細胞は発育卵内にあり、ＲＮＡエフェクターの細胞への取込みを促進する送達剤を含む組成物内に調製されることが多い、ＲＮＡエフェクター分子（例えばｓｉＲＮＡ）を少なくとも１つ使用して卵に組成物を接種させることにより、細胞と接触させる。一実施形態において、宿主卵細胞を、ＲＮＡエフェクター分子をコードするベクター、例えば、組み込みベクターまたは非組み込みベクターに接触させる。一実施形態において、細胞にＲＮＡエフェクター分子をコードするベクターを接触させてから、ウイルス産生のために卵を感染させる。一実施形態において、宿主卵細胞の接触には、ウイルス産生のために宿主細胞を感染させる前に、宿主細胞にＲＮＡエフェクター分子をコードするベクターを接触させない。すなわち、生物由来物質を産生する過程でＲＮＡエフェクター分子を卵に付加するなどして、産生の間だけ細胞に接触させる。一実施形態において、宿主卵細胞の接触には、ＲＮＡエフェクター分子をコードするベクターを宿主細胞に接触させることを含まない。
【００５１】
ＲＮＡエフェクター分子を宿主卵細胞に接触させるステップは、２回以上、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、３０回、４０回、５０回、６０回、７０回、８０回、９０回、１００回、またはそれ以上繰り返してもよい。
【００５２】
一実施形態において、例えば生物由来物質の産生に使用される卵にＲＮＡエフェクター分子の組成物を付加することで、一時的に標的遺伝子を調節するよう、細胞への接触が行われる。この場合、ＲＮＡエフェクター分子は細胞内で恒常的に発現せず、時間の経過とともに消失する。
【００５３】
ＲＮＡエフェクター分子を指す場合、「細胞へ導入する」は、当業者が理解するように、卵宿主細胞への取込みもしくは吸収の達成、またはその促進を意味する。ＲＮＡエフェクター分子は、自発的な拡散もしくは能動的な細胞内プロセスを通して、または助剤もしくはデバイスによって吸収または取込まれる。例えば、細胞への導入は少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子を卵細胞に接触させることを意味するか、または少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子と、細胞への取込みまたは吸収を達成または促進する物質とで細胞を処理することを意味し、これは、ＲＮＡエフェクター分子とＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進する送達剤（例えば形質移入試薬、乳剤、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、荷電脂質、リポソーム、アニオン性脂質、透過促進剤、または、リガンド、標的成分、ペプチド、親油基等に結合するためのＲＮＡエフェクター分子の修飾）を含む組成物と、に調製されることが多い。インビトロでの細胞への導入には、エレクトロポレーション、リポフェクション等の当該技術分野において周知の方法がある。他の方法は、本明細書で後述され、または当該技術分野において周知である。
【００５４】
実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡエフェクター分子は、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡエフェクター分子の１つまたは複数、またはｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡエフェクター分子の１つまたは複数をコードするＤＮＡを含む侵襲性細菌を卵へ導入することにより卵細胞へ導入された、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡエフェクター分子である（このプロセスはｔｒａｎｓｋｉｎｇｄｏｍ  ＲＮＡｉ（ｔｋＲＮＡｉ）と呼ばれることもある）。侵襲性細菌には、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｅ）の弱毒化された菌株、または侵襲性細菌が卵細胞の細胞質に到達できるように１つまたは複数の遺伝子を導入するなどしてその侵襲性特性が増加するよう遺伝子組み換えを行った非侵襲性細菌がある。そのような細胞質を標的とする遺伝子には、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）のリステリオリシンＯおよび偽結核菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のインベイシンタンパク質がある。動物細胞にＲＮＡエフェクター分子を送達してｔｒａｎｓｋｉｎｇｄｏｍ  ＲＮＡｉ（ｔｋＲＮＡｉ）を誘導するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば米国特許出願公開第２００８／０３１１０８１号明細書、米国特許出願公開第２００９／０１２３４２６号明細書を参照のこと。一実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子はｓｉＲＮＡ分子である。一実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子はｓｈＲＮＡ分子ではない。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡエフェクター組成物」は有効量のＲＮＡエフェクター分子および許容できる担体を含む。本明細書で使用される場合、「有効量」は、生物由来物質の産生のためのバイオプロセスに影響（例えば調節性作用）を与えられるＲＮＡエフェクター分子の量を指す。一実施形態において、ＲＮＡエフェクター組成物は、ＲＮＡエフェクター分子取込みを促進する試薬（例えば形質移入試薬、乳剤、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、荷電脂質、リポソーム、アニオン性脂質、透過促進剤、または、リガンド、標的成分、ペプチド、親油基等に結合するためのＲＮＡエフェクター分子）の修飾を含む。
【００５６】
用語「許容できる担体」は、ＲＮＡエフェクター分子を宿主の卵細胞に投与するための担体を指す。このような担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせがあるが、これらに限定されない。一実施形態において、用語「許容できる担体」には、特に細胞培養培地を含まない。
【００５７】
本明細書に使用される場合、用語「発現」は、ＲＮＡおよび／またはポリペプチドの配列をコードする標的遺伝子からのＲＮＡへの転写および／または１つもしくは複数のポリペプチドへの翻訳を意味することを目的とする。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「標的遺伝子」は、宿主細胞による生物由来物質の産生の１つまたは複数の側面に影響するタンパク質をコードする遺伝子を指し、この遺伝子の発現の調節により生物由来物質の産生が増強される。標的遺伝子は、宿主由来、宿主細胞に内在（宿主細胞ゲノム内に存在）、導入遺伝子（宿主細胞ゲノムの異所性部位に挿入された遺伝子コンストラクト）、または生物由来物質またはその誘導体を使用するであろう対象（例えばヒト）もしくは宿主細胞に感染できる病原体（例えばウイルス、真菌または細菌）由来であり得る。
【００５９】
実施形態のいくつかにおいて、標的遺伝子は卵細胞の内因性遺伝子である。例えば、特定の実施形態において、標的遺伝子はポリペプチドまたはタンパク質をコードできる。標的遺伝子はさらにウイルス産物の産生の１つまたは複数の側面に直接的にまたは間接的に影響する宿主細胞タンパク質をコードできる。ウイルスポリペプチドの産生に影響する標的遺伝子の例には、ポリペプチドの分泌、折り畳みまたは翻訳後修飾（例えばグリコシル化、アミド分解、ジスルフィド結合形成、メチオニン酸化またはピログルタミン酸化）に関わるタンパク質をコードする遺伝子；宿主細胞の特性または表現型（例えば増殖、生存能、細胞のｐＨ、細胞周期進行、アポトーシス、炭素代謝もしくは輸送、乳酸形成、ウイルス感染に対する感受性、またはＲＮＡｉの取込み、活性もしくは効率）に影響するタンパク質をコードする遺伝子；および、宿主細胞による生物由来物質の産生を損なうタンパク質（例えば生物由来物質と結合するかまたは同時精製するタンパク質）をコードする遺伝子がある。
【００６０】
さらに、実施形態のいくつかにおいて、「標的遺伝子」は、細胞による生物由来物質の産生の１つまたは複数の側面に影響する核酸（すなわち非コード遺伝子）の発現を調節する遺伝子を指し、この遺伝子の発現の調節により生物由来物質の産生が増強される。
【００６１】
「標的遺伝子ＲＮＡ」または「標的ＲＮＡ」は、標的遺伝子から転写されたＲＮＡを意味する。よって、標的遺伝子は、標的遺伝子のコード領域、プロモーター領域、３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）および／または５’−ＵＴＲであり得る。
【００６２】
ポリペプチドをコードする標的遺伝子ＲＮＡは、一般的には伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として知られている。標的遺伝子は、宿主細胞由来であるか、宿主細胞内に潜在しているか、宿主細胞に内在（宿主細胞ゲノム内に存在）しているか、導入遺伝子（宿主細胞ゲノムの異所性部位に挿入された遺伝子コンストラクト）であるか、または、生物由来物質もしくはその誘導体、産物を使用するであろう対象または宿主細胞のいずれかに感染できる病原体（例えばウイルス、真菌または細菌）由来であり得る。実施形態のいくつかにおいて、標的遺伝子は、ペプチドのグリコシル化等の宿主細胞による翻訳後修飾の１つまたは複数の側面に影響するタンパク質をコードする。例えば、翻訳後のプロセシングに関わるタンパク質をコードする遺伝子の発現の調節は、末端のマンノースを少なくとも１つ含むポリペプチドの産生を増強する。
【００６３】
実施形態のいくつかにおいて、標的遺伝子は非翻訳領域等の非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）をコードする。本明細書で使用される場合、ｎｃＲＮＡは、タンパク質に翻訳されない標的遺伝子ＲＮＡを指す。当該技術分野においてｎｃＲＮＡはまた、非タンパク質コードＲＮＡ（ｎｐｃＲＮＡ）、非伝令ＲＮＡ（ｎｍＲＮＡ）、小型非伝令ＲＮＡ（ｓｎｍＲＮＡ）および機能性ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）と呼ばれる。ｎｃＲＮＡが最終産物として転写される標的遺伝子もＲＮＡ遺伝子またはｎｃＲＮＡ遺伝子と呼ばれる。ｎｃＲＮＡ遺伝子には、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）等の非常に大量で機能上重要なＲＮＡや、ｓｎｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡ等のＲＮＡがある。本明細書で使用される場合、ＲＮＡエフェクター分子がＲＮＡ転写物の特定部位内の任意の場所にある転写物の切断を促進する場合、ＲＮＡエフェクター分子はＲＮＡ転写物の特定部位内を標的にすると言われる。
【００６４】
実施形態のいくつかにおいて、標的遺伝子は宿主細胞の内因性遺伝子である。例えば、免疫原性物質がポリペプチドである場合、標的遺伝子は免疫原性物質またはその一部分をコードできる。標的遺伝子はさらに、直接的にまたは間接的に免疫原性物質の産生の１つまたは複数の側面に影響する宿主細胞のタンパク質をコードできる。ポリペプチドの産生に影響する標的遺伝子の例には、ポリペプチドの分泌、折り畳みまたは翻訳後修飾（例えばグリコシル化、アミド分解、ジスルフィド結合形成、メチオニン酸化またはピログルタミン酸化）に関わるタンパク質をコードする遺伝子；宿主細胞の特性または表現型（例えば増殖、生存能、細胞のｐＨ、細胞周期進行、アポトーシス、炭素代謝または、輸送、乳酸形成、細胞骨格構造（例えばアクチンダイナミクス）、ウイルス感染またはＲＮＡｉ取込み、活性または効率に対する感受性）に影響するタンパク質をコードする遺伝子；および、宿主細胞による免疫原性物質の産生を損なうタンパク質（例えば免疫原性物質と結合するかまたは同時精製するタンパク質）をコードする遺伝子がある。
【００６５】
実施形態のいくつかにおいて、標的遺伝子は免疫原性物質の産生に間接的に影響する宿主細胞のタンパク質をコードし、標的遺伝子の発現により免疫原性物質の産生が増強するのを抑制する。例えば、標的遺伝子は免疫原性物質の産生に直接影響しないが免疫原性物質の産生を増強できる細胞資源を利用することなどで間接的にその産生を減少させる、大量に発現される宿主細胞のタンパク質をコードできる。標的遺伝子は本明細書でより詳細に議論される。
【００６６】
用語「発現を調節する」等は、標的遺伝子に言及する限りにおいて本明細書では標的遺伝子の発現の調節を指す。この調節は、標的遺伝子が転写され、標的遺伝子の発現が調節されるように処理された第一の細胞または細胞の群から単離または検出できる標的遺伝子ｍＲＮＡの量の、最初の細胞または細胞の群と実質上同一だが、同じような処理が施されていない第二の細胞または細胞の群（対照細胞）と比較した場合の変化（例えば増加または減少）により明らかとなる。調節の程度は、以下の式で表すことができる：
【００６７】
【数１】
2012531929.tif 000002
あるいは、調節の程度は、標的遺伝子の発現、例えば標的遺伝子によってコードされたタンパク質の量に機能的に関連づけられたパラメータによって、またはある表現型、例えば微小管の安定化を示す細胞の数により明らかとなる。原理的には、標的遺伝子の調節は、標的遺伝子を恒常的に、またはゲノム工学によって発現する任意の宿主細胞で、当該技術分野において周知の適切な分析によって測定できる。
【００６８】
例えば、場合によっては、標的遺伝子の発現は抑制される。例えば、標的遺伝子の発現は、本明細書で提供されるＲＮＡエフェクター分子の投与により、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％抑制される。実施形態のいくつかにおいて、標的遺伝子は、ＲＮＡエフェクター分子の投与により少なくとも約６０％、７０％または８０％抑制される。実施形態のいくつかにおいて、標的遺伝子は、本明細書に記述されたＲＮＡエフェクター分子の投与によって少なくとも約８５％、９０％または９５％以上抑制される。他の場合、標的遺伝子の発現は、本明細書に記述されたＲＮＡエフェクター分子の投与によって少なくとも１０％、２０％、２５％、５０％、１００％、２００％、４００％以上活性化される。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「ＲＮＡエフェクター分子」は、本明細書に定義するように宿主細胞内で、標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチド剤、または、場合により宿主細胞内で（つまり宿主細胞へ導入されて）、そのようなオリゴヌクレオチドを形成できるオリゴヌクレオチド剤を指す。ＲＮＡエフェクター分子の一部は、標的遺伝子のコード領域、プロモーター領域、３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）および／または５’−ＵＴＲ等の標的遺伝子の少なくとも一部に実質上相補的である。
【００７０】
本明細書に記述されたＲＮＡエフェクター分子は一般的に、第一の鎖と第二の鎖を有し、どちらかの鎖は実質上、標的遺伝子の少なくとも一部に相補的であり、種々のメカニズムの内の１つまたは複数により標的遺伝子の発現を調節する。このメカニズムには、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物のアルゴノート媒介転写後切断（当該技術分野においてＲＮＡｉと呼ばれることもある）ならびに／または他に転写前および翻訳前のメカニズムがあるが、これに限定されない。
【００７１】
ＲＮＡエフェクター分子は一本鎖または二本鎖以上の鎖を含むことができ、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、プロモーター指向性ＲＮＡ（ｐｄＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、発現干渉ＲＮＡ（ｅｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンタゴｍｉｒ、デコイＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミドおよびアプタマーがある。ＲＮＡエフェクター分子は一本鎖または二本鎖であり得る。一本鎖ＲＮＡエフェクター分子は二本鎖領域を有してもよく、二本鎖ＲＮＡエフェクターは一本鎖領域を有してもよい。
【００７２】
用語「一部分」は、オリゴヌクレオチド（例えばＲＮＡエフェクター分子）に関して使用される場合、標的遺伝子の領域に相補的に結合するのに所望の長さ、または所望の長さの二重領域を有するＲＮＡエフェクター分子の一部を指す。例えば、「一部分」または「領域」は、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはこれ以上でＲＮＡエフェクター分子の全長よりも１ヌクレオチド短い長さを最長とするヌクレオチドの核酸配列を指す。実施形態のいくつかにおいては、「領域」または「一部分」には、ＲＮＡエフェクター分子に関して使用される場合、ＲＮＡエフェクター分子の鎖の全核酸配列より１ヌクレオチド短い核酸配列が含まれる。当業者は、ＲＮＡエフェクター分子が所望の特性（例えば標的遺伝子の抑制または安定性）を有するように、標的遺伝子に相補的である、または二重領域内に配置した「一部分」の長さを変えることができる。理論に制限されるものではないが、本明細書で提供されたＲＮＡエフェクター分子は、種々のメカニズムの１つまたは複数により発現を調節する。このメカニズムには、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物のアルゴノート媒介転写後切断（当該技術分野において、ＲＮＡｉ呼ばれることもある）ならびに／または転写前および／もしくは翻訳前メカニズムがあるが、これに限定されない。
【００７３】
本明細書に開示されたＲＮＡエフェクター分子は、３０以下のヌクレオチド長、例えば１０〜３０のヌクレオチド長、または１９〜２４のヌクレオチド長の領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、この領域は、生物由来物質の産生の１つまたは複数の側面、例えば生物由来物質の収量、純度、同質性、生物活性または安定性等、に影響する標的遺伝子の少なくとも一部分に実質上相補的である。ＲＮＡエフェクター分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖には、本明細書で提供されたｓｉＲＮＡ配列のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）が含まれる。ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のＲＮＡ転写物と相互作用し、転写物の選択的な分解を媒介するか、そうでなければ転写物の翻訳を阻止する。
【００７４】
用語「アンチセンス鎖」は、ＲＮＡエフェクター分子、例えばｄｓＲＮＡの鎖を指し、標的配列に実質上相補的な領域を含む。用語「相補性の領域」は、本明細書に定義するように、配列、例えば標的配列に実質上相補的なアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性の領域が標的配列に完全に相補的でない場合、不適正塩基対が分子の内部または末端領域に存在する場合がある。一般的に、最も許容できる不適正塩基対は末端領域、例えば、５’および／または３’末端の５、４、３、または２個のヌクレオチド内にある。
【００７５】
用語「センス鎖」は、本明細書に定義されるように、アンチセンス鎖の領域に実質上相補的な領域を含むＲＮＡエフェクター分子の鎖を指す。
本明細書で使用される場合、および別記しない限り、用語「相補的な」は、第二のヌクレオチド配列に関して第一のヌクレオチド配列を記述するために使用される場合、当業者によって理解されるように、ある条件下で、第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし二本鎖の構造を形成する、第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの能力を指す。「相補的な」配列は、ハイブリダイズ能力に関して上記の要件が満たされる限り、非ワトソン−クリック型塩基対ならびに／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成された塩基対を含むか、またはこのような塩基対から完全に形成される。そのような非ワトソン−クリック型塩基対には、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対形成またはフーグスタイン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）塩基対形成があるが、これに限定されない。ハイブリダイゼーション条件は、例えばストリンジェントな条件であり、同条件は、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃での１２〜１６時間のハイブリダイゼーションとその後の洗浄が含まれる。他の条件、例えば生物体内で見られるような条件と同様の生理学上適切な条件を適用できる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な適用に従い、２つの配列の相補性の検査に最も適切な条件セットを決定し得るだろう。
【００７６】
本明細書において、用語「相補的な」、「完全に相補的な」および「実質上相補的な」は、使用する文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の間の、またはＲＮＡエフェクター分子剤のアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基の組み合わせに関して使用する。本明細書で使用される場合、標的遺伝子の「少なくとも一部に実質上相補的」であるオリゴヌクレオチドは、目的の標的遺伝子の隣接部分（例えば標的遺伝子によってコードされたｍＲＮＡ、標的遺伝子のプロモーター領域または３’ＵＴＲ、またはＥＲＶ  ＬＴＲ）に実質上相補的なオリゴヌクレオチドを指す。例えば、配列が標的遺伝子によってコードされたｍＲＮＡの途切れのない一部分に実質上相補的な場合、オリゴヌクレオチドは標的ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
【００７７】
ＲＮＡエフェクター分子内、例えば本明細書で記述したｄｓＲＮＡ（二本鎖のリボ核酸）内の相補配列には、第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの塩基対合を、一方または両方のヌクレオチド配列の全長にわたって含む。そのような配列は、本明細書で、それぞれに対して「完全に相補的」と表現できる。本明細書で、第一の配列が第二の配列に対して「実質上相補的」と表現される場合、２つの配列は完全に相補的であるか、または、最終的な適用、例えばＲＩＳＣ経路経由の遺伝子発現の抑制に最適な条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、３０塩基対までの二重領域のハイブリダイゼーションにおいて１つまたは複数の、ただし一般的には５つ、４つ、３つまたは２つ以下の不適正塩基対を形成できる。２つのオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーションで１つまたは複数の一本鎖の突出を形成するよう設計する場合、このような突出は相補性の判定に関して不適正塩基対と見なさないものとする。例えば、一方が２１ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、他方が２３ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡにおいて、長いオリゴヌクレオチドが短いオリゴヌクレオチドに完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含む場合、本明細書に記述した目的に照らせば「完全に相補的」と表現できる。
【００７８】
実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のＲＮＡ転写物と相互作用し、その切断を指示する一本鎖のオリゴヌクレオチドを含む。例えば、一本鎖ＲＮＡエフェクター分子では、１つまたは複数のリン酸基またはその誘導体で５’が修飾され、エフェクター分子を核酸分解酵素による分解から保護する。ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子の「センス」核酸の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖のアンチセンス核酸であり得、標的遺伝子は例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖、またはＲＮＡ配列（例えばｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡ前駆体）である。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸標的と水素結合を形成できる。別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、少なくとも９つのヌクレオチド長の二重領域を含む。
【００７９】
コード鎖配列（例えばｃＤＮＡ分子のセンス鎖の配列）が与えられれば、アンチセンス核酸は、ワトソン−クリック型塩基対のルールにより設計できる。アンチセンス核酸は、ＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部、例えばｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡの翻訳開始部位を包囲する領域、例えば５’ＵＴＲに相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約１０〜２５のヌクレオチド長（例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４のヌクレオチド長）であり得る。実施形態のいくつかにおいては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体および／またはアクリジン置換ヌクレオチド）を含むが、これはその分子の生物学的安定性および／またはアンチセンスと標的核酸の間で形成される二重領域の物理的な安定性を増加させるために設計されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドはリボヌクレオチドのみ、デオキシリボヌクレオチドのみ（例えばオリゴデオキシヌクレオチド）またはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方を含み得る。例えば、リボヌクレオチドのみからなるアンチセンス物質は、相補ＲＮＡにハイブリダイズし、翻訳機構が標的ＲＮＡ転写物へ接近できないようにして、タンパク質合成を防げる。デオキシリボヌクレオチドのみを含む、またはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含むアンチセンス分子は、相補ＲＮＡにハイブリダイズでき、次いでＲＮＡ標的は、酵素、例えばＲＮＡｓｅＨにより切断され、翻訳されなくなる。フランキングＲＮＡ配列には２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドおよびホスホロチオエート結合が含まれ、内部ＤＮＡ配列はヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含むことができる。ＲＮＡｓｅＨ活性による標的化が望ましい場合、内部ＤＮＡ配列は少なくとも５ヌクレオチド長であることが好ましい。
【００８０】
実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡエフェクター分子は二本鎖のオリゴヌクレオチドである。用語「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、本明細書で使用される場合、２つの逆平行で、実質上相補的な核酸鎖を含むハイブリダイズされた二重領域を有するオリゴヌクレオチド分子または分子の複合体を指す。この核酸鎖は、標的ＲＮＡに対して「センス」および「アンチセンス」の向きを有するものとして言及される。典型的には、相補性の領域は、３０ヌクレオチド長以下であり、一般的に、例えば両端の値を含めて、１０〜２６のヌクレオチド長、１８〜２５のヌクレオチド長、または１９〜２４のヌクレオチド長である。標的遺伝子を発現する細胞との接触では、ＲＮＡエフェクター分子は標的遺伝子の発現を少なくとも１０％抑制し、これは例えばＰＣＲ法、もしくは分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベースの方法、またはタンパク質免疫ブロット等のタンパク質ベースの方法によって定量される。卵細胞内の標的遺伝子の発現は標的遺伝子ｍＲＮＡのレベルの測定により定量することができ、例えば、ｂＤＮＡもしくはＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分析によって、または免疫蛍光分析法もしくは定量的免疫ブロット等のタンパク質レベルの測定により定量できる。
【００８１】
二本鎖の領域は、ＲＩＳＣ経路によって所望の標的ＲＮＡの特定の分解を可能にする長さであればいかなる長さでもよいが、典型的には９〜３６の塩基対長、例えば１５〜３０の塩基対長の範囲の長さであろう。より具体的には、二本鎖の領域は、ＲＩＳＣ経路によって所望の標的ＲＮＡの特定の分解を可能にする長さであればいかなる長さでもよいが、典型的には９〜３６の塩基対長、例えば１５〜３０の塩基対長の範囲の長さであろう。９〜３６塩基対の間の二重領域を考えると、二重領域はこの範囲の任意の長さでよく、例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６、およびこれらの間の下位範囲、例えば、両端の値を含めて、１５〜３０の塩基対、１５〜２６の塩基対、１５〜２３の塩基対、１５〜２２の塩基対、１５〜２１の塩基対、１５〜２０の塩基対、１５〜１９の塩基対、１５〜１８の塩基対、１５〜１７の塩基対、１８〜３０の塩基対、１８〜２６の塩基対、１８〜２３の塩基対、１８〜２２の塩基対、１８〜２１の塩基対、１８〜２０の塩基対、１９〜３０の塩基対、１９〜２６の塩基対、１９〜２３の塩基対、１９〜２２の塩基対、１９〜２１の塩基対、１９〜２０の塩基対、２０〜３０の塩基対、２０〜２６の塩基対、２０〜２５の塩基対、２０〜２４の塩基対、２０〜２３の塩基対、２０〜２２の塩基対、２０〜２１の塩基対、２１〜３０の塩基対、２１〜２６の塩基対、２１〜２５の塩基対、２１〜２４の塩基対、２１〜２３の塩基対、または２１〜２２の塩基対であってもよいが、これらに限定されない。
【００８２】
ダイサーおよび同様の酵素でプロセシングすることにより細胞内で産生されたｄｓＲＮＡの長さは、一般的に１９〜２２塩基対長の範囲にある。ｄｓＤＮＡの二重領域の一方の鎖は、標的ＲＮＡの領域に実質上相補的な配列を含む。二本鎖の構造を形成する２つの鎖は、自己相補的な領域を少なくとも１つ有する単一のＲＮＡ分子から、または、２つ以上の別個のＲＮＡ分子から形成できる。二本鎖の領域が単一分子の２つの鎖から形成される場合、分子は、二本鎖の構造の形成する一方の鎖の３’末端とそれに対応する他方の鎖の５’末端の間のヌクレオチドの一本鎖の鎖（「ヘアピンループ」）によって区別できる二本鎖の領域を有している。ヘアピンループは少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含むことができ、実施形態のいくつかにおいて、ヘアピンループは少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２３またはそれ以上の不対ヌクレオチドを含むことができる。ｄｓＲＮＡの２つの実質上の相補鎖は別々のＲＮＡ分子によって形成される場合、それらの分子は共有結合で結合できるが、共有結合で結合されていなくてもよい。２つの鎖がヘアピンループ以外の方法で共有結合的に接続されている場合、接続構造は「リンカー」と呼ばれる。用語「ｓＲＮＡエフェクター分子」も、本明細書では、ｄｓＲＮＡを指すために使用される。
【００８３】
標的遺伝子の発現を調節するＲＮＡエフェクター分子が本明細書に記述される。一実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子剤には、細胞内の標的遺伝子の発現抑制のための二本鎖のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子が含まれ、ｄｓＲＮＡが標的遺伝子の発現で形成された標的遺伝子の少なくとも一部に相補的である相補性の領域を有するアンチセンス鎖を含み、相補性の領域は、３０ヌクレオチド長以下であり、一般的に１０〜２４ヌクレオチド長であり、標的遺伝子を発現する細胞との接触により、ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の発現を少なくとも１０％抑制し、これは例えばＰＣＲ法、ＰＥＲＴもしくはｂＤＮＡベースの方法、またはタンパク質免疫ブロット（例えばウェスタンブロット）等のタンパク質ベースの方法によって定量される。細胞内の標的遺伝子の発現は標的遺伝子ｍＲＮＡのレベルの測定により定量することができ、例えば、ＰＥＲＴ、ｂＤＮＡもしくはＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子発現分析によって、または免疫蛍光分析法もしくは定量的タンパク質免疫ブロット等のタンパク質レベルの測定により定量できる。
【００８４】
ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが使用される条件下でハイブリダイズし、二本鎖構造を形成するのに十分相補的な２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、例えば、標的遺伝子の発現で形成されたｍＲＮＡの配列に由来する標的配列に、実質上相補的、一般的に完全に相補的である相補性の領域を含む。他方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に相補的な領域を含み、適切な条件下で結合された場合、２つの鎖がハイブリダイズし二本鎖構造を形成する。一般に、二本鎖構造の長さは、例えば、両端の値を含めて、９〜３６、１０〜３０の塩基対、１８〜２５、１９〜２４、または１９〜２１の塩基対である。同様に、標的配列に対する相補性の領域の長さは例えば、両端の値を含めて、１０〜３０、１８〜２５、１９〜２４、または１９〜２１のヌクレオチド長である。実施形態のいくつかにおいては、ｄｓＲＮＡは、１０〜２０のヌクレオチド長であり、他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２５〜３０のヌクレオチド長である。したがって、一実施形態中において、例えば１５〜３０の塩基対の機能的な二重鎖にプロセシングされ、所望のＲＮＡを切断する場合、３１塩基対以上の二本鎖の領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子の複合体は、ｄｓＲＮＡである。一般的な当業者が認識するように、切断の標的となるＲＮＡの標的領域は、より大型のＲＮＡ分子、特にｍＲＮＡ分子の一部になることが多い。
【００８５】
関連する場合には、ｍＲＮＡ標的の「部分」は、ＲＮＡｉ指令型切断（すなわちＲＩＳＣ経路による切断）の基質となるのに十分な長さのｍＲＮＡ標的の隣接配列である。９塩基対ほどの短い二本鎖を有するｄｓＲＮＡは、ある条件下で、ＲＮＡｉ指令型ＲＮＡ切断を媒介する。標的は、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば、両端の値を含めて、１５〜３０のヌクレオチド長であることが最も多い。
【００８６】
当業者は、２０〜２３塩基対の、特に２１塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉の誘導に特に効果的であると認められたことを認識している。Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２０  ＥＭＢＯ  ６８７７−８８（２００１）。上記で記述された実施形態において、オリゴヌクレオチド配列の性質から、本明細書に記述されたｄｓＲＮＡは、少なくとも２１ヌクレオチド長の鎖を１つ含み得る。一方の鎖が片端または両端で数ヌクレオチドだけ少ない配列を有する短い二本鎖は、詳細に記述したｄｓＲＮＡと比較しても同様に有効であることが合理的に予想できる。よって、所与の配列の少なくとも、両端の値を含めて、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の隣接ヌクレオチドの部分配列を有し、標的遺伝子の発現を抑制する能力が、完全な配列を含むｄｓＲＮＡの能力の、両端の値を含めて、５％、１０％、１５％、２０％、２５％または３０％の抑制というように異なるｄｓＲＮＡは、本発明で考慮される。
【００８７】
ｄｓＲＮＡは、以下で詳述されるように、当該技術分野において周知の標準的な方法、例えば、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）等から入手可能な自動ＤＮＡ合成装置を利用して合成できる。一実施形態において、標的遺伝子はヒト標的遺伝子である。特定の実施形態において、第一配列はセンス配列を含むｄｓＲＮＡのセンス鎖であり、第二の配列はアンチセンス配列を含むｄｓＲＮＡの鎖である。標的配列内のあらゆる場所を標的にする別のｄｓＲＮＡ物質は、標的配列およびフランキング標的配列を使用して、容易に決定できる。この態様において、２つの配列の一方は、２つの配列の他方に相補的であり、一方は標的遺伝子の発現で生成されたｍＲＮＡの配列に実質上相補的な配列である。そのため、この態様において、ｄｓＲＮＡは２つのオリゴヌクレオチドを含み、一方のオリゴヌクレオチドがセンス鎖として記述され、他方のオリゴヌクレオチドがアンチセンス鎖として記述される。本明細書で記述されたように、また当該技術分野において周知のように、ｄｓＲＮＡの相補配列は、別々のオリゴヌクレオチド上にある配列に対して、単一の核酸分子の自己相補的な領域としても含むことができる。
【００８８】
二本鎖オリゴヌクレオチドは一本鎖のヌクレオチド突出を１つまたは複数含み得る。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド突出」は、二本鎖のオリゴヌクレオチド、例えばｄｓＲＮＡの二本鎖構造の末端から突出する、少なくとも１つの不対のヌクレオチドを指す。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドの一方の鎖の３’末端が、他方の鎖の５’末端を越えて伸びる場合、または逆の場合、ヌクレオチド突出があることとなる。二本鎖オリゴヌクレオチドでは、少なくとも１個のヌクレオチドが突出しており；あるいは、突出は、少なくとも２個のヌクレオチド、少なくとも３個のヌクレオチド、少なくとも４個のヌクレオチド、少なくとも５個のヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドで構成され得る。ヌクレオチド突出はヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含むか、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体から成ってもよい。突出は、センス鎖、アンチセンス鎖またはその任意の組み合わせ上にあってもよい。更に、突出したヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖の５’末端、３’末端、または両末端に存在できる。
【００８９】
一実施形態において、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の末端には１〜４ヌクレオチドの一本鎖のヌクレオチド突出があり、一般的に１個または２個のヌクレオチドの突出である。例えば、ｓｉＲＮＡは各３’末端で２つのデオキシチミジン（または「ｄＴｄＴ」）を有し得る。言いかえれば、ｄｓＲＮＡの各鎖は３’末端に２つのヌクレオチド突出を有し、それぞれがＤＮＡジヌクレオチドを含む。少なくとも１個のヌクレオチド突出を有するｄｓＲＮＡには、平滑末端化されている結合相手に対して意外にも優れた抑制特質がある。さらに、ｄｓＲＮＡの１つの鎖の一端にのみヌクレオチド突出がある場合、全体の安定性には影響せずに、ｄｓＲＮＡの干渉活性を強化する。このような突出は単一ヌクレオチド突出である必要はなく、ジヌクレオチド突出もある。
【００９０】
二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖には、３’末端および／または５’末端で１〜１０個のヌクレオチドの突出があり、３’末端および／または５’末端で１〜１０個のヌクレオチドの突出を有する二本鎖オリゴヌクレオチド等である。突出にあるヌクレオシド間の結合の１つまたは複数をホスホロチオエートと置換できる。実施形態のいくつかにおいて、突出にはデオキシリボヌクレオシドが１つまたは複数含まれ、または、突出にはｄＴを１つまたは複数、例えば配列５’−ｄＴｄＴ−３’、または５’−ｄＴｄＴｄＴ−３’が含まれる。実施形態のいくつかにおいて、突出には配列５’−ｄＴ＊ｄＴ−３’が含まれ、＊はホスホロチオエートヌクレオシド間の結合である。
【００９１】
理論に制限されるものではないが、ヌクレオチドが少なくとも１つ突出している二本鎖オリゴヌクレオチドには、平滑末端化されている対照に対して意外にも優れた抑制特質がある。さらに、ｄｓＲＮＡの１つの鎖の一端にのみヌクレオチド突出がある場合、全体の安定性に影響せずに二本鎖オリゴヌクレオチドの干渉活性を強化する。
【００９２】
突出が１つだけのｄｓＲＮＡは、種々の細胞、細胞培養培地、血液、血清および発育卵と同様、インビボにおいても特に安定的で有効であることが証明されている。一般的に、一本鎖の突出はアンチセンス鎖の３’末端に、あるいはセンス鎖の３’終端に位置する。一端にのみ突出があるｄｓＲＮＡはさらに、アンチセンス鎖の５’末端に一般的に位置する一平滑末端がある。そのようなｄｓＲＮＡには優れた安定性および抑制活性があり、したがって、低用量、すなわち受容者一日あたり５ｍｇ／ｋｇ体重未満で投与できる。一実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖には、３’末端および／または５’末端にヌクレオチド１〜１０個の突出がある。一実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖には、３’末端および／または５’末端にヌクレオチド１〜１０個の突出がある。別の実施形態において、突出にある１つまたは複数のヌクレオチドをヌクレオシドチオホスフェートと置換する。
【００９３】
用語は「平滑」、または「平滑末端」は、本明細書で二本鎖のオリゴヌクレオチドに対して使用される場合、二本鎖のオリゴヌクレオチドの所与の末端に不対ヌクレオチドもヌクレオチド類似体もない、すなわち、ヌクレオチド突出がないことを意味する。二本鎖オリゴヌクレオチドの一端または両端を平滑化できる。両端が平滑化されている場合、オリゴヌクレオチドは、二重平滑末端と言われる。明確に言うと、「二重平滑末端」オリゴヌクレオチドは両端で平滑化されている二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、すなわち、分子の両端にヌクレオチド突出はない。このような分子はその全長にわたり二本鎖であることが多い。一端のみが平滑化されている場合、オリゴヌクレオチドは単一平滑末端と言われる。明確に言うと、「単一平滑末端」オリゴヌクレオチドは、一末端のみが平滑化されている二本鎖オリゴヌクレオチドであり、すなわち、分子の一端にヌクレオチド突出がない。一般的に、単一平滑末端化オリゴヌクレオチドでは、センス鎖の５’末端が平滑末端化されている。
【００９４】
ＲＮＡエフェクター分子には、本明細書で記述するように標的配列に対して不適正塩基対を１つまたは複数含むことができる。例えば、ＲＮＡエフェクター分子は本明細書で記述するように多くとも３つの不適正塩基対を含む。ＲＮＡエフェクター分子のアンチセンス鎖が標的配列に対する不適正塩基対を含んでいる場合、不適正塩基対の領域が相補性の領域の中心に位置しないことが好ましい。ＲＮＡエフェクター分子のアンチセンス鎖が標的配列に対する不適正塩基対を含む場合、不適正塩基対が相補性の領域の５’または３’末端いずれかから５ヌクレオチド以内にあるよう限定されることは好ましい。例えば、ＲＮＡ鎖が標的遺伝子の領域に相補的な２３ヌクレオチドのＲＮＡエフェクター分子剤のＲＮＡ鎖では、一般的に中心の１３ヌクレオチド内にはいかなる不適正塩基対も含まない。本明細書に記述された方法、または、当該技術分野に周知の方法は、標的配列に対する不適正塩基対を含むＲＮＡエフェクター分子が、標的遺伝子の発現を抑制するのに有効かどうか判定するために使用できる。標的遺伝子の発現の抑制に対する不適正塩基対を有するＲＮＡエフェクター分子の有効性を考察することは重要であり、特に標的遺伝子内の特定の相補性の領域が集団内で多型配列変異であると知られている場合、重要である。
【００９５】
実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物の非コード領域の少なくとも一部に実質上相補的なプロモーター指向性ＲＮＡ（ｐｄＲＮＡ）である。一実施形態において、ｐｄＲＮＡは、転写開始部位から上流に位置する部位にある標的遺伝子ｍＲＮＡのプロモーター領域の少なくとも一部分に実質上相補的であり、この部位は、例えば転写開始部位から１００塩基以上、２００塩基以上、または１，０００塩基以上上流にある。別の実施形態においてｐｄＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物の３’−ＵＴＲの少なくとも一部分に実質上相補的である。一実施形態において、ｐｄＲＮＡは、１８〜２８塩基のｄｓＲＮＡを含み、場合により各鎖上に３’ジヌクレオチドまたはトリヌクレオチド突出を含む。ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物のプロモーター領域または３’−ＵＴＲ領域の少なくとも一部に実質上相補的である。別の実施形態において、ｐｄＲＮＡは、プロモーターまたは標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物の３’―ＵＴＲの少なくとも一部に実質上相補的であるＤＮＡ塩基配列を含む一本鎖のポリヌクレオチドからなり、細胞の核酸分解酵素からギャップマーを保護する、２’ＭＯＥ、２’ＯＭｅまたはロックド核酸分子的基盤（ＬＮＡ）等の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列（例えば、ギャップマーの５’および３’末端の各々で５つの終端塩基を含む）に隣接するギャップマーを含む。
【００９６】
ｐｄＲＮＡを使用して、標的遺伝子の発現を選択的に増加、減少、また他の場合には、調節できる。理論に制限されるものではないが、ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物の非コード領域に重なっている内在性アンチセンスＲＮＡ転写物に結合し、（ｄｓＲＮＡの場合）アルゴノートタンパク質、または（ギャップマーの場合）宿主細胞の核酸分解酵素（例えばＲＮａｓｅＨ）を動員し、内在性のアンチセンスＲＮＡを選択的に分解することにより標的遺伝子の発現を調節すると考えられている。実施形態のいくつかにおいて、内在性アンチセンスＲＮＡは、標的遺伝子の発現を負に調節し、ｐｄＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子の発現を活性化する。したがって、実施形態のいくつかにおいて、ｐｄＲＮＡを使用して、内在性アンチセンスＲＮＡによる標的遺伝子発現の負の調節を抑制することで、標的遺伝子の発現を選択的に活性化できる。標的遺伝子のプロモーター配列によりコードされたアンチセンス転写物を同定するための方法、およびプロモーター指向性ＲＮＡの産生および使用のための方法が知られている。例えば国際公開第２００９／０４６３９７号パンフレットを参照のこと。
【００９７】
実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡエフェクター分子には、非核酸リガンド、例えば転写または翻訳因子等の小型有機分子またはタンパク質に結合して活性を修飾する（例えば、抑制する）アプタマーが含まれる。アプタマーは、非核酸リガンド上の標的結合部位の認識を指示する特定の構造へ折り畳まれる。アプタマーは、本明細書に記述された修飾のうちのいずれかを含むことができる。
【００９８】
実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡエフェクター分子にはアンタゴｍｉｒがある。アンタゴｍｉｒは、マイクロＲＮＡを標的にする一本鎖、二本鎖、部分的に二本鎖またはヘアピン構造である。アンタゴｍｉｒは内在性ｍｉＲＮＡ、特にｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体のヌクレオチド配列の標的配列に実質上相補的な少なくとも１０以上の隣接するヌクレオチドから実質的に形成される。アンタゴｍｉｒは、約１２〜２５のヌクレオチド、例えば約１５〜２３のヌクレオチドのｍｉＲＮＡ標的配列に十分に相補的なヌクレオチド配列を有し、標的配列にハイブリダイズできることが好ましい。標的配列は、アンタゴｍｉｒの配列と１、２または３ヌクレオチドしか違わないことがより好ましい。実施形態のいくつかにおいては、アンタゴｍｉｒは非ヌクレオチド成分、例えばコレステロール成分を含み、これは、例えば、オリゴヌクレオチド剤の３’または５’末端に結合する。
【００９９】
実施形態のいくつかにおいて、アンタゴｍｉｒに修飾、例えばヌクレオチド修飾を組み入れることで、核酸分解による分解に対して安定化させる。例えば、実施形態のいくつかにおいて、アンタゴｍｉｒは、ヌクレオチド配列の５’または３’末端で少なくとも第一、第二および／または第三のヌクレオチド間の結合を含むホスホロチオエートを含んでいる。さらなる実施形態において、アンタゴｍｉｒは２’修飾ヌクレオチド、例えば２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）を含む。実施形態のいくつかにおいて、アンタゴｍｉｒは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを少なくとも１つ含む。
【０１００】
実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物の非コード領域の少なくとも一部に実質上相補的なプロモーター指向性ＲＮＡ（ｐｄＲＮＡ）である。ｐｄＲＮＡは、転写開始点から上流に位置する部位、例えば転写開始点から１００塩基以上、２００塩基以上、または１，０００塩基以上上流の標的遺伝子ｍＲＮＡのプロモーター領域の少なくとも一部に実質上相補的であり得る。また、ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物の−ＵＴＲの少なくとも一部分に実質上相補的である。例えば、ｐｄＲＮＡは、１８〜２８塩基のｄｓＲＮＡを含み、場合により各鎖上に３’ジヌクレオチドまたはトリヌクレオチド突出を含む。ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物のプロモーター領域または３’−ＵＴＲ領域の少なくとも一部に実質上相補的である。別の実施形態において、ｐｄＲＮＡはギャップマーを含むが、このギャップマーは標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物のプロモーターまたは３’−ＵＴＲの少なくとも一部分に実質上相補的であるＤＮＡ配列を含む一本鎖のポリヌクレオチドから構成され、細胞の核酸分解酵素からギャップマーを保護する、２’ＭＯＥ、２’ＯＭｅまたはロックド核酸塩基（ＬＮＡ）等の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列（例えば、ギャップマーの５’および３’末端の各々で５つの終端塩基を含む）に隣接する。
【０１０１】
ｐｄＲＮＡを使用して、標的遺伝子の発現を選択的に増加、減少、また他の場合には、調節できる。理論に制限されるものではないが、ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物の非コード領域に重なっている内在性アンチセンスＲＮＡ転写物に結合し、（ｄｓＲＮＡの場合）アルゴノートタンパク質、または（ギャップマーの場合）宿主細胞の核酸分解酵素（例えばＲＮａｓｅＨ）を動員し、内在性のアンチセンスＲＮＡを選択的に分解することにより標的遺伝子の発現を調節できる。実施形態のいくつかにおいて、内在性アンチセンスＲＮＡは、標的遺伝子の発現を負に調節し、ｐｄＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子の発現を活性化する。したがって、実施形態のいくつかにおいて、ｐｄＲＮＡを使用して、内在性アンチセンスＲＮＡによる標的遺伝子発現の負の調節を抑制することで、標的遺伝子の発現を選択的に活性化できる。標的遺伝子のプロモーター配列によりコードされたアンチセンス転写物を同定するための方法、およびプロモーター指向性ＲＮＡの産生および使用のための方法が知られている。例えば国際公開第２００９／０４６３９７号パンフレットを参照のこと。
【０１０２】
発現干渉ＲＮＡ（ｅｉＲＮＡ）を使用して、標的遺伝子の発現を選択的に増加、減少、また他の場合には調節できる。典型的には、ｅｉＲＮＡ、つまりこのｄｓＲＮＡは発現ベクターで最初に形質移入された細胞内で発現される。そのようなベクターにおいて、ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、例えば核酸配列の両端の２つの収れんプロモーター、またはセンスもしくはアンチセンス配列のいずれかを転写する別々のプロモーターを使用して、同じ核酸配列から転写できる。あるいは、ｄｓＲＮＡの一方の鎖を転写するために設計されているプラスミドと、他方の鎖を転写するために設計されているプラスミドの２つのプラスミドを共感染させてもよい。ｅｉＲＮＡエフェクター分子を産生するための、および使用するための方法は当該技術分野において周知である。例えば国際公開第２００６／０３３７５６号パンフレット；米国特許出願公開第２００５／０２３９７２８号明細書および米国特許出願公開第２００６／００３５３４４号明細書参照のこと。
【０１０３】
実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡエフェクター分子は小型の単鎖Ｐｉｗｉ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡエフェクター分子）を含んでもよく、これは本明細書に定義するように標的遺伝子の少なくとも一部に実質上相補的であり、アルゴノートタンパク質のＰｉｗｉまたはＡｕｂｅｒｇｉｎｅのサブクラスのタンパク質に選択的に結合する。特定の理論に制限されるものではないが、ｐｉＲＮＡエフェクター分子は標的遺伝子のＲＮＡ転写物と相互作用し、Ｐｉｗｉおよび／またはＡｕｂｅｒｇｉｎｅタンパク質を動員してリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成し、この複合体が標的遺伝子の転写および／または転写後遺伝子サイレンシングを誘導すると考えられている。ｐｉＲＮＡエフェクター分子は、約１０〜５０のヌクレオチド長、約２５〜３９のヌクレオチド長、または約２６〜３１のヌクレオチド長であり得る。例えば米国特許出願公開第２００９／００６２２２８号明細書を参照のこと。
【０１０４】
マイクロＲＮＡは高度に保存された小型ＲＮＡ分子のクラスであり、動植物のゲノムＤＮＡから転写されるが、タンパク質には翻訳されない。マイクロＲＮＡ前駆体はｍｉＲＮＡへプロセシングされる。プロセシングされたマイクロＲＮＡは一本鎖で１７〜２５ヌクレオチド長のＲＮＡ分子であり、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へ組み込まれ、発生、細胞増殖、アポトーシスおよび分化の主要制御因子として同定されている。それらは特定のｍＲＮＡの３’非翻訳領域に結合して、遺伝子発現の調節における役割を果たすと考えられる。マイクロＲＮＡは、例えば標的となったｍＲＮＡの翻訳の抑制、または分解を開始して、特定の標的遺伝子の転写後サイレンシングを引き起こす。実施形態のいくつかにおいて、ｍｉＲＮＡは標的の核酸と完全に相補的である。他の実施形態において、ｍｉＲＮＡには標的の核酸と非相補性の領域があり、非相補性の領域で「バルジ」を引き起こす。実施形態のいくつかにおいて、非相補性の領域（バルジ）に隣接して、十分に相補的、例えば完全に相補的な領域があり、二本鎖を形成できる。例えば、相補性の領域は、少なくとも８〜１０のヌクレオチド長（例えば、８、９、または１０のヌクレオチド長）である。
【０１０５】
ｍｉＲＮＡは例えば、ｍｉＲＮＡが標的核酸に完全に相補的ではない場合には翻訳を抑制することにより、またはｍｉＲＮＡがその標的に完全な、もしくは高度な相補性を有し結合する場合には、標的ＲＮＡの分解を引き起こすことにより、遺伝子発現を抑制できる。さらなる実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、内在性ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体を標的にするオリゴヌクレオチド剤を含むことができる。例えば、ＲＮＡエフェクターは標的遺伝子の発現を負に調節する内在性ｍｉＲＮＡを標的にできるので、ＲＮＡエフェクターがｍｉＲＮＡに基づく標的遺伝子の抑制を緩和できる。オリゴヌクレオチド剤は天然の核酸塩基、糖、およびヌクレオチド間（主鎖）の共有結合、ならびに／または、細胞への取込の増強、内在性ｍｉＲＮＡ標的への親和性の増強および／もしくは核酸分解酵素存在下での安定性の増強等の所望の特性を与える、非天然の特質を１つまたは複数有するオリゴヌクレオチドを含めることができる。実施形態のいくつかにおいて、特定の内在性ｍｉＲＮＡと結合するよう設計されたオリゴヌクレオチド剤は、標的ｍｉＲＮＡの少なくとも１０、２０、２５以上の塩基と実質上相補的であり、例えば少なくとも７０％、８０％、９０％、または１００％相補的である。ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ前駆体を標的にする代表的なオリゴヌクレオチド剤は、米国特許出願公開第２００９／０３１７９０７号、第２００９／０２９８１７４号、第２００９／０２９１９０７号、第２００９／０２９１９０６号、第２００９／０２８６９６９号、第２００９／０２３６２２５号、第２００９／０２２１６８５号、第２００９／０２０３８９３号、第２００７／００４９５４７号、第２００５／０２６１２１８号、第２００９／０２７５７２９号、第２００９／００４３０８２号、第２００７／０２８７１７９号、第２００６／０２１２９５０号、第２００６／０１６６９１０号、第２００５／０２２７９３４号、第２００５／０２２２０６７号、第２００５／０２２１４９０号、第２００５／０２２１２９３号、第２００５／０１８２００５号および第２００５／００５９００５号明細書の中で、例えば記述される。
【０１０６】
ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体は１０〜２００のヌクレオチド長であってもよく、例えば１６〜８０のヌクレオチド長である。成熟ｍｉＲＮＡは１６〜３０のヌクレオチドの長を有し、例えば２１〜２５のヌクレオチド長、特に２１、２２、２３、２４または２５のヌクレオチド長である。ｍｉＲＮＡ前駆体は７０〜１００のヌクレオチド長を有してもよく、ヘアピン立体配座を有してもよい。実施形態のいくつかにおいては、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ前駆体から酵素ｃダイサーおよびドローシャによってインビボで産生される。ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体は、細胞ベースのシステムによってインビボで合成でき、または化学的に合成できる。ｍｉＲＮＡは、優れた安定性、標的核酸とのハイブリダイゼーション熱力学、特定の組織もしくは細胞型に対する標的指向化、および／または、エンドサイトーシス依存型、もしくはエンドサイトーシス非依存型のメカニズム等による細胞透過性等の所望の特質を１つまたは複数与える修飾を含み得る。修飾により配列特異性を増加させ、その結果的、非特異的な影響を減少させる。
【０１０７】
さらなる実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、内在性ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体を標的とするオリゴヌクレオチド剤を含み得る。例えば、ＲＮＡエフェクターは標的遺伝子の発現を負に調節する内在性ｍｉＲＮＡを標的にできるので、ＲＮＡエフェクターがｍｉＲＮＡに基づく標的遺伝子の抑制を緩和できる。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子の存在下」なる語句は、細胞内で発現されたＲＮＡエフェクター分子、例えばｓｈＲＮＡへの細胞の暴露、または細胞への取込みを促進する物質を場合により使用して送達することにより、細胞へ付加した外来性ＲＮＡエフェクター分子への細胞の暴露を包含する。ＲＮＡエフェクター分子の一部分は、標的遺伝子ＲＮＡのコード領域、プロモーター領域、３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）または長端末反復（ＬＴＲ）等の標的遺伝子ＲＮＡの少なくとも一部に実質上相補的である。本明細書に開示されたＲＮＡエフェクター分子は、３０以下のヌクレオチド長、例えば１０〜２００のヌクレオチド長、または１９〜２４のヌクレオチド長の領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、この領域は、生物由来物質の産生の１つまたは複数の側面、例えば生物由来物質の収量、純度、同質性、生物活性または安定性等、に影響するタンパク質をコードする標的遺伝子の少なくとも一部分に実質上相補的である。ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のＲＮＡ転写物と相互作用し、転写物の選択的な分解を媒介するか、そうでなければ転写物の翻訳を阻止する。本発明の多様な実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、少なくとも１つのギャップマー、またはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔｋＲＮＡｉ、ｅｉＲＮＡ、ｐｄＲＮＡ、アンタゴｍｉｒまたはリボザイムである。
【０１０９】
ＲＮＡ干渉を誘導するのに効果的な二本鎖および一本鎖のオリゴヌクレオチドも、本明細書ではｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ物質またはｉＲＮＡ物質と呼ばれる。これらのＲＮＡ干渉を誘導するオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られる、細胞質の多タンパク質複合体と関連している。理論に制限されるものではないが、ＲＮＡ干渉は標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物のアルゴノート媒介転写後切断につながる。多くの実施形態では、一本鎖、および二本鎖のＲＮＡｉ物質は十分に長いので、内在性分子、例えばダイサーにより切断されて、より低分子のオリゴヌクレオチドが産生される。このオリゴヌクレオチドは、ＲＩＳＣ機構に取り込まれ、標的配列、例えばｍＲＮＡのＲＩＳＣ媒介切断の一端を担う。
【０１１０】
実施形態のいくつかにおいて、本明細書で提供されたＲＮＡは、ＲＩＳＣ媒介切断に感受性のある標的転写物の部位を同定する。そのため、本発明はさらに、そのような配列のうちの１つを標的とするＲＮＡエフェクター分子に注目する。そのようなＲＮＡエフェクター分子は一般に、提供された配列の１つの少なくとも１０の隣接するヌクレオチドを含み、標的遺伝子の選択された配列に隣接する領域から得た追加のヌクレオチド配列に結合する。
【０１１１】
「ゲノム情報」なる語句は、本明細書および請求項と明細書の全体にわたって使用される場合、生物体の一部の、または全ゲノムからの配列情報を指すことを意図し、タンパク質をコードする領域および非コード領域も含む。これらの配列は同一の生物体に由来する全細胞に存在する。トランスクリプトーム配列情報とは対照的に、ゲノム情報にはコード領域だけでなく、例えばイントロン配列、プロモーター配列、サイレンサー配列、エンハンサー配列も含まれる。したがって、「ゲノム情報」は、例えばヒトゲノム、マウスゲノム、ラットゲノムを指すことができる。全ゲノム情報または一部のゲノム情報を使用し、データベース配列に追加の特質を付加して、ＲＮＡエフェクター分子で修飾する標的候補を増加できる。
【０１１２】
「役割を果たす」なる語句は、当業者に知られた、またはこの明細書内で同定された分子経路での転写物またはタンパク質の任意の活動を指す。このような経路の細胞活動には、アポトーシス、細胞分裂、グリコシル化、増殖速度、細胞生産能、最大細胞密度、持続的細胞生存度、アンモニア産生または消費率、または乳酸産率の速度があるが、これらに限定されない。
【０１１３】
「宿主細胞」は、本明細書で使用される場合、生物由来物質、例えば免疫原性物質の有用量の産生および回収が可能な条件下、発育卵内で増殖、維持できる任意の細胞、細胞培養、細胞バイオマスまたは組織である。宿主細胞は、昆虫、両生類、魚類、爬虫類または鳥類の卵内で培養できる。宿主細胞は、生物由来物質の産生を促進する非修飾細胞、または（例えば形質転換動物由来の）遺伝子組み換え細胞でもよい。例えば、遺伝子組み換え鶏卵では、ＩＦＮ経路に不可欠な１つまたは複数の遺伝子、例えばインターフェロン受容体、ＳＴＡＴ１等が、遺伝子組み換えによる「遺伝子ノックアウト」等により破壊されている。例えばＳａｎｇ、１２  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．４１５（１９９４）；Ｐｅｒｒｙら、２  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．１２５（１９９３）；Ｓｔｅｒｎ、２１２  Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９５−２０６（１９９６）；Ｓｈｕｍａｎ、４７  Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ８９７（１９９１）を参照のこと。さらに、宿主細胞を、所望の条件下、例えば３０℃でのインキュベーションで増殖可能とするために修飾できる。
【０１１４】
「宿主細胞から生物由来物質を単離する」ことは、生物由来物質を宿主の細胞物質、例えば宿主細胞、卵の細胞外環境、胚性バイオマスまたは卵から分離するための少なくとも１ステップを意味する。したがって、卵から最終的に回収される生物由来物質の単離は、「宿主細胞から単離された」なる語句に包含される。有用量は、アリコートまたは試料を含み、標的遺伝子発現の調節のモニタリング等、産生をスクリーニング、またはモニターするために使用される量が含まれる。
【０１１５】
本発明は、「免疫原性物質」を含む生物由来物質の産生を提供し、「免疫原性物質」には、抗原、抗原のポリペプチド、代謝産物、中間体、ウイルス抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、寄生虫抗原、ウイルス粒子、欠陥ウイルス、生弱毒ウイルス、死滅ウイルスまたはワクチンがある。免疫原性物質には、宿主細胞により産生され、有用量で回収できるあらゆる免疫原性物質があり、ポリペプチド、糖タンパク質、および、生体で合成されるワクチン、またはそれらの産物等の予防または治療薬として使用される「生物由来物質」が含まれる。したがって、免疫原性物質は、生物学的薬物、ワクチン、研究または診断試薬等の広範な適用範囲で使用できる。
【０１１６】
実施形態のいくつかにおいて、生物由来物質はポリペプチドである。ポリペプチドは、組換えポリペプチドまたは発育卵に内在性のポリペプチドであってもよい。実施形態のいくつかにおいて、ポリペプチドは糖タンパク質である。本明細書で提供された方法によって産生できるポリペプチドには、受容体、膜タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、酵素、成長因子、成長因子受容体、抗体、抗体誘導体および他の免疫性エフェクター、インターロイキン、インターフェロン、エリトロポエチン、インテグリン、溶解性の主要組織適合複合体抗原、結合性タンパク質、転写因子、翻訳因子、腫瘍性タンパク質または癌原タンパク質、筋肉タンパク質、骨髄性タンパク質、神経刺激性タンパク質、腫瘍成長抑制因子、構造タンパク質および血液タンパク質（例えばトロンビン、血清アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、フォンビルブランド因子等）があるが、これに限定されない。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、ポリペプチドは、アミド分解、グリコシル化等の翻訳後修飾を受けた糖タンパク質または他のポリペプチドを包含する。実施形態のいくつかにおいて、免疫原性物質は異常グリコシル化タンパク質である。
【０１１８】
実施形態のいくつかにおいて、生物由来物質は、免疫原性ウイルス、細菌、原虫、または発現ベクター由来の組換えタンパク質等の免疫原性物質である。
ウイルスベースのワクチン産生のための別の方法では弱毒化した生ウイルスワクチンを利用する。これは、複製可能だが病原性が無いため、免疫を持続させ、疾病を強力に防ぐことができる。弱毒性ウイルスを産生するための従来の方法では、その多くが温度感受性である宿主域突然変異体の単離の機会を利用し、例えば、ウイルスが非天然の宿主で継代され、免疫原性を有するが病原性は無い子孫ウイルスが選択される。効果的なワクチン産生には、宿主システムから高収率で産生される大量のウイルスの増殖が必要である。ウイルスの型が異なれば、許容可能な収量を得るために異なる増殖条件が必要となる。したがって、ウイルスが増殖する宿主は非常に重要である。ウイルス型の機能として、弱毒化した生ウイルスは、発育卵内で増殖できる。
【０１１９】
したがって、本発明の実施形態のいくつかにおいて、免疫原性物質は、天然のウイルス系統、変異体、または突然変異体等のウイルス産物であり；（例えば、変異誘発物質への暴露、非許容宿主での継代接種および／または継代接種を繰り返すことにより産生される）突然変異誘発されたウイルスであり；（分節型ウイルスゲノムの場合）リアソータントウイルスであり；および／または（例えば、「逆遺伝学」の技術の使用した）所望の表現型を有する遺伝子改変ウイルスである。これらの実施形態のウイルスは弱毒化されており、感染性を有しインビボで複製できるが、力価が低く、一般に非病原性で無症状レベルでの感染を起こす。
【０１２０】
実施形態のいくつかにおいて、免疫原性物質の産生は、卵内の細胞の生存能を改善することにより強化される。本明細書で使用される場合、用語「細胞生存能を改善する」は、ＲＮＡエフェクター分子存在下で、そのような処置のない発育卵の細胞密度またはアポトーシスレベルと比較して、発育卵の細胞密度の少なくとも１０％の増加（例えばトリパンブルー色素排除試験法により評価）、またはアポトーシスの少なくとも１０％の減少（例えばＴＵＮＥＬ法を使用して評価）を指す。実施形態のいくつかにおいては、ＲＮＡエフェクター分子での処理に応じた細胞密度の増加またはアポトーシスの減少は、無処置の細胞と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％である。実施形態のいくつかにおいては、ＲＮＡエフェクター分子での処理に応じた細胞密度の増加は、ＲＮＡエフェクター分子が無い場合の細胞密度の少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上である。
【０１２１】
「バイオプロセシング」は、本明細書で使用される場合、発育卵での生物由来物質（例えば免疫原性物質）の工業規模の産生の代表的なプロセスである。ヒト、哺乳類および鳥類のウイルスのいくつかは、卵の漿尿膜の細胞（卵内の液体で満たされた尿膜腔を囲む細胞の単分子膜）に感染できる。感染により、適切なインキュベーション時間後に回収できる尿膜腔液内に生ウイルス粒子等の産物が蓄積する。卵ベースのワクチン産生の標準的な方法は、発育卵のプレインキュベーション、生ウイルス（例えばインフルエンザ、黄熱病）の接種、インキュベーション、尿膜腔液の回収、下流プロセシングおよび充填と仕上げからなる。例えば、インフルエンザウイルスは一般的に、１０〜１１日齢の卵内で３７℃、２〜４日間で増殖する。伝統的な不活化されたインフルエンザワクチンについては、この回収された物質の精製、不活性化および安定化によりワクチン産物が得られるが、この技術は当該技術分野において周知である。
【０１２２】
インフルエンザＡ型とＢ型ウイルスのヒト一次単離体は、胚の羊膜腔内でよく増殖するが、２〜３継代後、ウイルスは卵の外側から到達できる尿膜腔の細胞で増殖するよう適応する。ＭｕｒｐｈｙおよびＷｅｂｓｔｅｒ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ  １３９７−１４４５、ＦＩＥＬＤＳ  ＶＩＲＯＬＯＧＹ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  ｐｕｂ．、ＰＡ、１９９６）。特定の突然変異をウイルスゲノムに計画的に作成できるため、組換ＤＮＡ技術と遺伝子工学技術により、理論上は優れた弱毒性ウイルスの産生方法が考案できる。しかしながら、ウイルスの弱毒化に必要な遺伝子変異は常に予測可能とは限らない。一般に、ウイルスワクチンを操作する組み換えＤＮＡ技術を使用する試みは、免疫応答に関与し、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルス等の組換えウイルスベクターで発現される病原体のタンパク質サブユニットのみを含むサブユニットワクチンの産生を目指した。最近になって、組換ＤＮＡ技術を使用して、天然にまたは既知の宿主域突然変異体で見られる弱毒性ウイルスを模倣するヘルペスウイルス欠失突然変異体またはポリオウイルスが産生された。１９９０年まで、マイナス鎖ＲＮＡウイルスを部位特異的に操作できず、したがって遺伝子的に操作できなかった。
【０１２３】
ウイルスを複製する宿主内でのインターフェロン応答等の免疫応答は、弱毒化された生インフルエンザウイルスの産生収量に悪影響を及ぼし得る。さらに、ウイルス収量が最大化される前に、卵内の感染細胞がアポトーシスする可能性もある。したがって、これらのウイルスは免疫原性であり病原性ではないが、ワクチンを産生する目的で従来の卵基質内で増殖させるのは難しい場合が多い。よって、本発明の実施形態のいくつかにおいて、卵内の宿主細胞の不利益な応答の発現を調節し、ウイルス収量を増加させるためにＲＮＡエフェクター分子を使用する手段と方法を提供する。例えば、本発明の実施形態のいくつかでは、ウイルスまたはベクター接種の前、その間、または後に、ＲＮＡエフェクター分子（例えばｄｓＲＮＡ）を卵、例えば羊膜内のスペースに、または漿尿膜（ＣＡＭ）に注入し、ウイルス／免疫原性産物の収量および品質を損なう、細胞および抗ウイルスプロセスを抑制する。本明細書に記述された組成物および方法も、生物由来物質産生によく使用される細胞、例えば鶏繊維芽細胞を使用する細胞培養ベースの方法で使用できる。
【０１２４】
本発明は、ＲＮＡエフェクター分子を卵に導入し標的遺伝子の発現を調節することでウイルス産物の産生の増強を提供するが、この標的遺伝子は、細胞増殖、細胞分裂、細胞生存能、アポトーシス、細胞の免疫応答、栄養の取扱い、ならびに／または卵内での細胞増殖および／もしくは分裂に関連する他の特質に影響するタンパク質を場合によりコードする。したがって、実施形態のいくつかにおいて、発育卵におけるウイルス産物の産生を、ウイルスタンパク質の発現を調節するＲＮＡエフェクター分子を卵に導入し、宿主細胞のウイルスの感染力および／または量を増加させることにより、強化する。追加の実施形態おいては、発育卵におけるウイルス産物の産生を、ウイルス感染または複製に関与する宿主（卵）細胞のタンパク質の発現を調節するＲＮＡエフェクター分子を導入し、ウイルスの感染力および／または量を増加させることにより、強化する。さらなる実施形態において、増殖相においてウイルスタンパク質の発現を一時的に抑制するＲＮＡエフェクター分子を卵に導入することにより産生を増強する。
【０１２５】
ＲＮＡエフェクター分子による標的遺伝子の発現の調節（例えば抑制）はさらに、第二のＲＮＡエフェクター分子を導入することにより緩和でき、第二のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一部分は、宿主細胞中のＲＮＡｉを媒介するタンパク質をコードする標的遺伝子に対して相補的である。例えば、標的遺伝子の発現の調節は、細胞のＲＮＡｉ経路のアルゴノートタンパク質（例えばアルゴノート−２）または他の構成成分の発現を抑制するＲＮＡエフェクター分子を卵に導入することにより緩和できる。一実施形態において、生物由来物質はウイルスであり、ウイルスの発現を、ウイルスタンパク質を標的とする第一のＲＮＡエフェクター分子を細胞に接触させることにより一時的に抑制する。その後、ウイルス産物の発現の抑制は、ＲＮＡｉ経路のタンパク質をコードする遺伝子を標的とする第二のＲＮＡエフェクター分子を卵に導入することにより緩和される。
【０１２６】
または、ＲＮＡエフェクター分子を、生産相において卵に導入し、タンパク質発現、翻訳後修飾、折り畳み、分泌および／または産生に関する他の方法ならびに／またはウイルスの産生および／もしくは回収に関連する他のプロセスに影響するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を調節することにより、ウイルスの産生を増強する。あるいは、ウイルス産物の産生を、細胞増殖および／または細胞分裂を抑制するＲＮＡエフェクター分子を、ウイルス生産相において卵に導入することにより増強する。
【０１２７】
実施形態のいくつかにおいては、標的遺伝子の調節におけるウイルス産物の産生の増強は、細胞密度、培養液のｐＨ、酸素レベル、グルコースレベル、乳酸レベル、温度、ウイルスタンパク質、またはウイルス粒子の産生等の計測可能なバイオプロセスパラメータを１つまたは複数モニターすることにより検出する。ウイルスタンパク質の産生は、比生産性（ＳＰ）（溶液中の産物の濃度）として測定でき、ｍｇ／Ｌまたはｇ／Ｌで表すことができる。あるいは、比生産性はｐｇ／細胞／日として表すことができる。ＳＰの上昇は、２つの定義された条件セットで産生されたタンパク質産物の、絶対または相対の濃度上昇を指すことができる。あるいはウイルスは、有名なプラークアッセイで力価測定でき、またｍＬ当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ／ｍＬ）として測定できる。
【０１２８】
ＩＩ．バイオプロセシングの増強
本発明は、本明細書に記述したＲＮＡエフェクター分子を使用して、免疫原性物質等の生物由来物質の卵ベースの産生を増強する方法を提供する。この方法は、一般的に、その一部分が標的遺伝子に対して相補的であるＲＮＡエフェクター分子を卵内の細胞と接触させることと、細胞を標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間、卵培養中で維持し、卵での免疫原性物質の産生を増強させることと、卵から免疫原性物質を単離することとを含む。ＲＮＡエフェクター分子は、生物由来物質が産生できる状況下の卵に付加し、例えば標的遺伝子を一時的に調節し、生物由来物質の発現を増強できる。
【０１２９】
一実施形態において、本明細書で提供されたＲＮＡエフェクター分子を、生産相において卵細胞に接触させ、タンパク質発現、翻訳後修飾、折り畳み、分泌および／または産生に関する他の方法および／または免疫原性物質の回収に影響するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を調節することにより、免疫原性物質の産生を増強する。さらなる実施形態において、免疫原性物質の産生を、細胞増殖および／または細胞分裂を抑制するＲＮＡエフェクター分子を、生産相において卵細胞に接触させることにより増強する。
【０１３０】
実施形態のいくつかにおいては、卵における免疫原性物質の産生を、混入ウイルスのタンパク質の発現を調節するＲＮＡエフェクター分子を卵に接触させ、宿主細胞での混入物の感染力および／またはウイルス量を減少させることにより増強する。追加の実施形態において、発育卵の宿主細胞における免疫原性物質の産生は、例えば細胞膜のリガンド等のウイルス感染に関する宿主細胞のタンパク質の発現、またはウイルスの複製を調節するＲＮＡエフェクター分子を細胞に接触させ、宿主細胞中の混入ウイルスの感染力および／または量を減少させる。
【０１３１】
実施形態のいくつかにおいては、標的遺伝子の調節における生物由来物質の産生の増強は、細胞密度、ｐＨ、酸素レベル、グルコースレベル、乳酸レベル、温度およびタンパク質産生からなる群から選択される１つまたは複数の測定可能なバイオプロセスパラメータのモニタリングにより検出する。タンパク質産生は比生産性（ＳＰ）（溶液中の産物、例えば非相同的に発現されたポリペプチドの濃度）として測定でき、ｍｇ／ｍＬまたはｇ／ｍＬで表すことができる。あるいは、比生産性はｍｇ／卵／日として表すことができる。ＳＰの上昇は、２つの定義された条件セット（例えばＲＮＡエフェクター分子で処理しない対照と比較する場合）下で産生された産物の、絶対または相対の濃度上昇を指すことができる。例えば、インフルエンザ産生における増強はサンプル中のウイルスのＮＰタンパク質の含量の測定によりモニターすることができる。
【０１３２】
実施形態のいくつかにおいては、ＲＮＡエフェクター組成物は、２つ以上のＲＮＡエフェクター分子、例えば、２つ、３つ、４つ以上のＲＮＡエフェクター分子を含む。様々な実施形態において、２つ以上のＲＮＡエフェクター分子は、同じ標的遺伝子および／または１つまたは複数の追加の標的遺伝子の発現を調節できる。複数のＲＮＡエフェクター分子を含むある種の組成物は、個々のＲＮＡエフェクター分子を含む別々の組成物より、免疫原性物質の産生の増強、またはこのような産生の１つまたは複数の側面においてより効果的であり、有利である。
【０１３３】
他の実施形態において、複数の異なるＲＮＡエフェクター分子を卵細胞に接触させ、１つまたは複数の標的遺伝子を調節できる。一実施形態において、複数の異なるＲＮＡエフェクター分子の少なくとも１つは、グルタミナーゼ、グルタミンデヒドロゲナーゼまたはＬＤＨの発現を調節するＲＮＡエフェクター分子である。別の実施形態において、ＢａｘおよびＢａｋを標的にするＲＮＡエフェクター分子は、免疫原性物質の産生の間に卵に対して同時に投与され、場合により追加のＲＮＡエフェクター分子または物質を少なくとも１つ含むことができる。別の実施形態において、複数の異なるＲＮＡエフェクター分子を卵内の細胞に接触させ、Ｂａｘ、ＢａｋおよびＬＤＨの発現を調節できる。別の実施形態において、複数の異なるＲＮＡエフェクター分子を卵内の細胞に接触させ、Ｂａｘ、Ｂａｋと同様に、グルタミナーゼおよび／またはグルタミンデヒドロゲナーゼを調節できる。
【０１３４】
複数の異なるＲＮＡエフェクター分子を１つまたは複数の標的遺伝子の発現を調節するために使用する場合、複数のＲＮＡエフェクター分子を卵細胞に同時に、または別々に接触させることができる。また、ＲＮＡエフェクター分子それぞれの投与計画があってもよい。例えば、複数のＲＮＡエフェクター分子を含む組成物を調製して、細胞に接触させてもよい。あるいは、一度に１つのＲＮＡエフェクター分子を卵に投与してもよい。このように、特定のＲＮＡエフェクター分子の投与の回数を変更して、各標的遺伝子に対して所望の平均パーセント抑制を容易に調整できる。例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の高抑制（例えば８０％を超える抑制）は、生物由来物質の産生を大きく改善するのに、常に必要というわけではなく、ある条件下では、ＬＤＨ活性が少し残っていることが好ましい場合もある。したがってＬＤＨを標的とするＲＮＡエフェクター分子を低頻度で（例えば、回数を少なく）、または、他のＲＮＡエフェクター分子の投与量よりも低用量で（例えば、ＩＣ５０以上の用量の数分の１で）細胞に接触させることが望ましい場合がある。さらに、各ＲＮＡエフェクター分子を別々に細胞に接触させると、標的遺伝子の調節効率を低下させる可能性のあるＲＮＡエフェクター分子間の相互作用を阻止できる。方法を簡単にするため、および汚染の可能性をなくすため、異なるＲＮＡエフェクター分子の混合物を投与し、必要となる投与回数を減らし、卵に混入物が導入される機会を最小にするのが好ましいであろう。
【０１３５】
また、さらなる実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子による標的遺伝子の発現の調節（例えば抑制）は、細胞を第二のＲＮＡエフェクター分子と接触させることにより緩和でき、第二のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一部は、宿主細胞中のＲＮＡｉを媒介するタンパク質をコードする標的遺伝子に対して相補的である。例えば、標的遺伝子の発現の調節は、細胞のＲＮＡｉ経路のアルゴノートタンパク質（例えばアルゴノート−２）または他の構成成分の発現を抑制するＲＮＡエフェクター分子と細胞を接触させることにより緩和できる。一実施形態において、免疫原性物質は組換えタンパク質であり、産物の発現は、免疫原性物質をコードする導入遺伝子を標的とする第一のＲＮＡエフェクター分子を卵細胞に接触させることにより一時的に抑制する。その後、免疫原性物質の発現の抑制は、細胞ＲＮＡｉ経路のタンパク質をコードする遺伝子を標的とする第二のＲＮＡエフェクター分子を卵細胞に接触させることにより緩和される。
【０１３６】
さらなる実施形態では、発育卵に第二の物質を投与することをさらに含む。第二の物質は免疫抑制物質、つまり成長因子；アポトーシス阻害剤；キナーゼ阻害剤；ホスファターゼ阻害剤；プロテアーゼ阻害剤；病原体の阻害剤（例えば、ウイルスが生物由来物質である場合、内在性ウイルスもしくは混入ウイルス、または真菌性病原体もしくは細菌性病原体の増殖および／または繁殖を抑制する物質）またはヒストン脱メチル化物質であってもよい。
【０１３７】
ウイルス産物の産生は、この産物に結合するタンパク質の発現を減少させることにより増強できる。例えば、ウイルスタンパク質を産生する際に、その受容体／リガンドの発現を減少または抑制させ、細胞におけるウイルスタンパク質の産生により生物学的反応が誘発されないようにすることは有利であろう。別の例として、成長因子、ホルモンまたは細胞シグナルタンパク質を産生する際に、その受容体／リガンドの発現を減少または抑制させ、宿主細胞におけるそれらの産生により細胞の生物学的反応が誘発されないようにすることは有利であろう。受容体が細胞表面受容体または内部（例えば核内）受容体でもよいことは当業者に知られている。したがって、一例として、インフルエンザウイルス等の生物由来物質の産生は、細胞にある受容体のレベル（例えばシアル酸）を調節（例えば、減少）させることにより増強できる。結合相手の発現は、本明細書に記述された方法に従い、受容体経路の遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子を宿主細胞に接触させることにより調節できる。
【０１３８】
真核細胞の中で発現されたタンパク質は、ウイルスタンパク質の産生、ならびに／または、ウイルス粒子の構造、生物活性、安定性、同質性および／もしくは他の特質を損なう翻訳後修飾をいくつか受ける可能性がある。これらの修飾の多くは、細胞増殖およびポリペプチド発現中に自然に生じ、所与のポリペプチドのペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノ末端および／またはカルボキシル末端を含む部位のいくつかで生じ得る。さらに、所与のポリペプチドはいくつかの異なるタイプの修飾を受け得る。例えば、トリ細胞で発現されたタンパク質は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ユビキチン化、メチオニン酸化、ジスルフィド結合形成、メチレーション、脱メチル化、硫酸化、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、ミリストイル化、酸化、タンパク質プロセシング、リン酸エステル化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、グルコノイル化、配列突然変異、Ｎ末端のグルタミン閉環ならびにアミド分解、およびアスパラギンアミド分解を受け得る。
【０１３９】
翻訳後修飾では、修飾されたポリペプチドと無修飾のポリペプチドを分離する追加のバイオプロセスステップが必要となる場合があるが、これによりウイルス産生のコストが増加し効率が減少する。したがって、実施形態のいくつかにおいては、細胞内でのウイルスポリペプチドの産生は、翻訳後修飾に影響するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を調節することにより増強される。追加の実施形態において、ウイルスタンパク質産生は、第一の翻訳後修飾に影響するタンパク質をコードする第一の標的遺伝子の発現の調節、および第二の翻訳後修飾に影響するタンパク質をコードする第二の標的遺伝子の発現の調節により増強される。
【０１４０】
ウイルス産物、特にウイルス表面膜タンパク質は糖タンパク質を含み、ウイルス産生は、タンパク質のグリコシル化に関与するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現の調節により増強される。グリコシル化パターンは、哺乳類の糖タンパク質の構造および機能の重要な決定因子であることが多く、糖タンパク質の溶解性、熱安定性、プロテアーゼ酵素耐性、抗原性、免疫原性、血清半減期、安定性および生物活性に影響する。
【０１４１】
ある場合には、タンパク質産生の速度および回収されたタンパク質の収量は、宿主細胞によるタンパク質の折り畳みと分泌の速度に直接関係がある。例えば、宿主細胞の小胞体（ＥＲ）に誤って折り畳まれたタンパク質が蓄積すると、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）経路を経由した分泌が遅くなるか、または止まる。ＵＰＲは、過剰な非折り畳みタンパク質を検出するＥＲ膜のストレス感知タンパク質により引き起こされる。ＵＰＲの活性化により、誤って折り畳まれたタンパク質に結合し、正常な折り畳みを促進するシャペロンタンパク質（例えばＢｉｐ）の発現上昇が誘導される。さらに、ＵＰＲ活性化により転写因子ＸＢＰ−１およびＣＨＯＰの発現が上昇する。ＣＨＯＰは、一般的には、細胞の増殖、分化および生存の負の制御因子として機能し、ＵＰＲにより発現が上昇すると、細胞周期を停止させ、タンパク質の折り畳みと分泌の速度を速め、折り畳まれていない過剰な非折り畳みタンパク質を細胞から除去する。よって、細胞周期はまず促進され、次にウイルス生産相中に抑制され、ウイルス産物の収量を増加させる。宿主細胞によるタンパク質分泌の速度の上昇は、例えば、細胞外の環境にあるタンパク質の量を経時的にモニターすることにより測定できる。
【０１４２】
本発明の実施形態のいくつかにおいては、例えば、ＲＮＡｉが宿主細胞の免疫応答を抑制するまで一時的にウイルス複製を抑制し、細胞の免疫応答が十分抑制された後にウイルス複製を起こすことは有利となる。この実施形態では、ＲＮＡｉを引き起こしてからウイルスを接種する２ステップではなく、ウイルスの接種物とともにＲＮＡエフェクター分子を導入し、バイオプロセスの不必要な中断（および混入の可能性）を回避する。この実施形態では、ウイルス量と免疫原性物質の収量を増強するための方法を提供する。
【０１４３】
例えば、ウイルスゲノムの保存領域に特異的なｓｉＲＮＡは、細胞株および発育鶏卵の両方でインフルエンザウイルスの産生を抑制できる。抑制は、ｓｉＲＮＡ二本鎖の機能的なアンチセンス鎖の存在に依存しており、ウイルスｍＲＮＡがＲＮＡ干渉の標的であることを示唆する。ヌクレオカプシド（ＮＰ）またはＲＮＡ転写酵素（ＰＡ）の構成成分に特異的なｓｉＲＮＡは、対応するｍＲＮＡ、ビリオンＲＮＡ、その相補ＲＮＡの蓄積をなくし、宿主細胞のＲＮＡではなく他のウイルスのＲＮＡの蓄積を幅広く抑制する。インフルエンザＡ型、例えばＰＢ、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳ遺伝子を抑制するのに有益なＲＮＡエフェクター分子は、Ｇｅら、１００  ＰＮＡＳ  ２７１８−２３（２００３）に報告されている。インフルエンザＡ型のＮＰおよびＰＡ遺伝子の発現の抑制に有益なｓｉＲＮＡ（そのうちのいくつかは修飾されている）は、国際公開第２００７／０５６８６１号パンフレットで報告されている。
【０１４４】
インフルエンザＡ型のウイルスには８本に分かれたＲＮＡゲノムがある。８つのＲＮＡセグメントのうちの３つは、ＲＮＡ転写酵素（ＰＡ、ＰＢ１およびＰＢ２）の３つの構成成分をコードする。別の３つＲＮＡセグメントは主要な糖タンパク質；ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）およびヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）をコードする。残りの２つのＲＮＡセグメントの各々は２つのタンパク質、Ｍ１またはＭ２、およびＮＳ１またはＮＳ２のいずれかをコードし、ウイルス構造タンパク質として、またはウイルスの生活環のいずれかで機能する。インフルエンザＡウイルスには、ＨＡには１５のサブタイプが、ＮＡには９つのサブタイプがあることが知られている。ヒトおよび異なる種から単離されたウイルスの遺伝子のヌクレオチド配列は大きく異なっているため、抗原連続変異および抗原不連続変異にもかかわらず有効なままであるｓｉＲＮＡは、ヒトおよび非ヒト種のウイルスの様々なサブタイプおよび系統で保存されているウイルス遺伝子に着目することにより設計できる。さらに、設計では、宿主細胞の遺伝子と同一であることを回避するべきである。インターネット上で利用可能なインフルエンザ配列データベースがある。ウイルス増殖を標的にするＲＮＡエフェクター分子の量は、ウイルス複製に与える影響に応じて調整できる。例えば、ＮＰ−１４９６は、感染の多重度によって、２００倍〜３０，０００倍のウイルス増殖を抑制するため、これらの要素はＲＮＡエフェクター組成物の製剤において考慮されるべきである。Ｇｅらによって設計されたｓｉＲＮＡの中で、ＮＰ−１４９６、ＰＡ−２０８７およびＰＢ１−２２５７はＭＤＣＫ細胞と鶏胚の両方で強力にインフルエンザウイルス産生を抑制したが、ＮＰ−２３１、Ｍ−３７およびＰＢ１−１２９は、ＭＤＣＫ細胞ではあまり効果的ではなく、鶏胚においては効果がなかった。
【０１４５】
あるいは、ＲＮＡエフェクター分子の安定性は、宿主細胞内での半減期を調節するために操作できる。例えば、本明細書において、ＲＮＡエフェクター分子の半減期をもたらす多数のヌクレオチド修飾が想定される。ｓｉＲＮＡをウイルス遺伝子を標的にするよう設計する場合、不安定な形態（無修飾）で調製できるが、宿主細胞の免疫応答遺伝子を標的にするＲＮＡエフェクター分子は、安定性を増すために修飾される。
【０１４６】
この実施形態の別の側面において、ウイルスは放出制御媒体に封入されており、ウイルスがＲＮＡエフェクター分子と同時に卵に投与されても、細胞の免疫応答がＲＮＡｉによって抑制されるのに十分な時間の経過後にウイルス感染が行われる。注射による放出制御型のウイルス運搬方法には、注射可能高分子、高分子電解質、高分子ミクロスフェアおよび高分子−ウイルス複合物を含む多数の方法がある。ＷａｎｇおよびＰｈａｍ、５  Ｅｘｐ．Ｏｐ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．３８５−４０１（２００８）。
【０１４７】
別の方法には、細胞にウイルスを接種させ、非結合ウイルスを細胞から洗い流し、次いでこの感染細胞をＲＮＡエフェクター分子と同時に発育卵に導入する。ここでは細胞を、ウイルスベクターを運搬しインビボで産生するための媒体として使用している。Ｓｏｎａｂｅｎｄら（１１  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７９−９２（２００７））を参照のこと。ウイルス複製には数時間（例えばＭＤＣＫ細胞から排出されたインフルエンザウイルスでは約４時間）かかるため、発育卵に導入するウイルスの放出制御ビヒクルとなる。
【０１４８】
あるいは、感染の多重度はＲＮＡエフェクター分子および細胞培養液の密度と比較して低いので、ウイルス力価が上昇すると、細胞集団においてＲＮＡエフェクターが大きな影響を持つことができる。
【０１４９】
宿主細胞の免疫応答
実施形態のいくつかにおいては、発育卵における免疫原性物質の産生を、微生物感染または複製に関与する細胞タンパク質の発現を調節するＲＮＡエフェクター分子を導入し、所望の微生物の感染力および／または量を増加させることにより、さらに増強する。卵の免疫応答の調節は、免疫応答の調節にそれ自身関与する、ある種の免疫原性物質（例えばインフルエンザおよびその同種のもの）の産生にさらに有益であり得る。
【０１５０】
ヒト、哺乳類および鳥類のウイルスのいくつかは、ウイルス産生（例えば最終的にはワクチン産生用）、または異種タンパク質発現のために、発育卵内で培養できる。感染または形質移入により組換え抗原または生ウイルス粒子等の免疫原性物質が蓄積されるが、これは適切なインキュベーション時間後に卵から収集できる。例えば、ワクチン産生の標準方法は、卵の培養；生ウイルス（例えばインフルエンザ）での感染；インキュベーション；卵組織の回収；下流プロセッシング；ならびに充填および仕上げからなる。伝統的な不活化インフルエンザワクチンでは、この回収された免疫原性物質を精製、失活および安定化させることでワクチン製品が得られる。この技術は当該技術分野において周知である。
【０１５１】
特定の突然変異をウイルスゲノムに計画的に作成できるため、組換ＤＮＡ技術と遺伝子工学技術により、理論上は優れた弱毒性ウイルス産生方法が考案できる。しかしながら、ウイルスの弱毒化に必要な遺伝子変異は常に予測可能とは限らない。一般に、ウイルスワクチンを操作する組み換えＤＮＡ技術を使用する試みは、免疫応答に関与し、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルス等の組換えウイルスベクターで発現される病原体のタンパク質サブユニットのみを含むサブユニットワクチンの産生を目指した。最近になって、組換ＤＮＡ技術を使用して、天然にまたは既知の宿主域突然変異体で見られる弱毒性ウイルスを模倣するヘルペスウイルス欠失突然変異体またはポリオウイルスが産生された。
【０１５２】
卵の中で産生された、弱毒化した生インフルエンザウイルスまたは免疫調節性のポリペプチド等の免疫原性物質の収量は、宿主細胞の免疫応答、例えばウイルスまたはウイルスベクターが複製される宿主細胞のインターフェロン応答、により悪影響を受け得る。さらに、ウイルス収量が最大化される前に、感染した宿主細胞はアポトーシスする可能性もある。したがって、これらの弱毒性ウイルスは免疫原性を有し病原性は無いが、ワクチンを産生する目的で従来の細胞基質内でこのウイルスを増殖させるのは難しい場合が多い。よって、本発明実施形態のいくつかでは、宿主細胞の不利益な応答の発現を調節し収量を増加させるためにＲＮＡエフェクター分子を使用する組成物および方法を提供する。例えば、本発明の実施形態のいくつかは、ウイルス感染またはベクター投与の前、その間、または後に、ＲＮＡｉベースの産物（例えばｓｉＲＮＡ）を卵細胞に接触させ、回収産物の収量および品質を損なう細胞および抗ウイルスプロセスを抑制することに関する。
【０１５３】
実施形態にいくつかにおいて、ウイルス産物の生産のための卵ベースのバイオプロセスを、宿主細胞のウイルス感染への反応に影響する標的遺伝子の発現を調節することにより増強できる。生物由来物質がウイルスか、そうでなければ免疫調節性である場合、またはウイルスベクターを宿主細胞へ異種タンパク質の導入に使用する場合、この方法は有意義である。
【０１５４】
例えば、実施形態のいくつかにおいて、標的遺伝子は細胞インターフェロンタンパク質またはインターフェロンの信号伝達に関連したタンパク質である。特に遺伝子は、ＩＦＮ−α（ＧｅｎｅＩＤ：３９６３９８）；ＩＦＮ−β（ＧｅｎｅＩＤ：５５４２１９、対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節される。このＲＮＡエフェクター分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が、配列番号：３１５６１５５−３１５６３３（センス）および配列番号：３１５６１８１−３１５６２０６（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む）；またはＩＦＮ−γ（ＩＦＮ−γ  ＧｅｎｅＩＤ：３９６０５４）等のインターフェロン遺伝子であってもよい。遺伝子は、ＩＦＮＡＲ１（インターフェロンα，βおよびω受容体１、ＧｅｎｅＩＤ：３９５６６５、この発現は対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節される。このＲＮＡエフェクター分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が、配列番号：３５１４６０５−３１５４６３３（センス）および配列番号：３１５４６３４−３１５４６６２（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む）；ＩＦＮＡＲ２（インターフェロンα，βおよびω受容体２）（ＧｅｎｅＩＤ：３９５６６４）、ＩＦＮＧＲ１（インターフェロン−γ受容体１）（ＧｅｎｅＩＤ：４２１６８５）またはＩＦＮＧＲ２（インターフェロン−γ受容体２［インターフェロンγトランスデューサー１］）（ＧｅｎｅＩＤ：４１８５０２）等のインターフェロン受容体であり得る。
【０１５５】
実施形態のいくつかにおいて、遺伝子は、ＳＴＡＴ−１（シグナル伝達性転写因子１、ＧｅｎｅＩＤ：４２４０４４）、ＳＴＡＴ−２、ＳＴＡＴ−３（ＧｅｎｅＩＤ：４２００２７）、ＳＴＡＴ−４（ＧｅｎｅＩＤ：７６８４０６）、ＳＴＡＴ−５（ＧｅｎｅＩＤ：３９５５５６；ＪＡＫ−１（ヤヌスキナーゼ１）（Ｊａｋ１、ＧｅｎｅＩＤ：３９５６８１；ＪＡＫ−２（Ｊａｋ２、ＧｅｎｅＩＤ：３７４１９９）、ＪＡＫ−３（Ｊａｋ３、ＧｅｎｅＩＤ：３９５８４５）、ＩＲＦ１（インターフェロン調節因子１）（ＧｅｎｅＩＤ：３９６３８４）、ＩＲＦ２（ＧｅｎｅＩＤ：３９６１１５）、ＩＲＦ３（ＧｅｎｅＩＤ：３９６３３０）この発現は、対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節される。同ＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が、配列番号：３２８８９４８−３２８９２４９（センス）および配列番号：３２８９２５０−３２８９５５１（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む）；ＩＲＦ４（ＧｅｎｅＩＤ：３７４１７９）、ＩＲＦ５（ＧｅｎｅＩＤ：４３０４０９）、ＩＲＦ６（ＧｅｎｅＩＤ：４１９８６３）、ＩＲＦ７（ＧｅｎｅＩＤ：３９６３３０）、ＩＲＦ８（ＧｅｎｅＩＤ：３９６３８５）、ＩＲＦ９（例えばゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）ｉｒｆ９、ＧｅｎｅＩＤ：４０３０１３）、またはＩＲＦ１０（ＧｅｎｅＩＤ：３９５２４３）等のインターフェロンの信号伝達に関与し得る。
【０１５６】
同様に、標的遺伝子は、２’，５’オリゴアデニル酸シンテターゼ（２−５  ＯＡＳ）等のインターフェロン誘導タンパク質、インターフェロン誘導抗ウイルスタンパク質をコードできる。インターフェロン誘導抗ウイルスタンパク質には、ＲＮａｓｅＬ（リボヌクレアーゼＬ（２’，５’−オリゴイソアデニル酸シンテターゼ依存）、ＧｅｎｅＩＤ：４２４４１０；（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、１４  Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ．１０１−０４（１９９４）；ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２およびＩＦＩＴＭ３（Ｂｒａｓｓら、１３９  Ｃｅｌｌ  １２４３−５４（２００９））；炎症性サイトカイン；ＭＹＤ８８（ミエロイド分化一次応答遺伝子）ウイルス攻撃で発現上昇、ＧｅｎｅＩＤ：４２０４２０）；ＴＲＩＦ（トール様受容体アダプター分子１、ＧｅｎｅＩＤ：１００００８５８５）（Ｈｇｈｉｇｈｉら、Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１０年１月１３日）；Ｍｘ（ＭＸ１  ｍｙｘｏｖｉｒｕｓ（ミクソウイルス（インフルエンザウイルス）耐性１、インターフェロン誘導タンパク質ｐ７８）（ｍｘ１、ＧｅｎｅＩＤ：３９５３１３；Ｈａｌｌｅｒら、９  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．１６３６−４３（２００７）；またはｄｓＲＮＡ−依存型タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）（真核生物翻訳開始因子２−αキナーゼ２）（ＥＩＦ２ＡＫ２、Ｌｉら、１０６  ＰＮＡＳ  １６４１０−０５（２００９））がある。
【０１５７】
よって、例えば標的遺伝子Ｍｘ１は、対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節され得る。このＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が、配列番号：３２８６６８２−３２８６９７５（センス）および配列番号：３２８６９７６−３２８７２６９（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む。
【０１５８】
標的遺伝子ＰＫＲ（ＥＩＦ２ＡＫ２）（Ｌｉら、１０６  ＰＮＡＳ  １６４１０−０５（２００９）は、対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節され得る。このＲＮＡエフェクター分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が下の表１に示したオリゴヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む。
【０１５９】
【表１】
2012531929.tif 000003
2012531929.tif 000004
別の実施形態において、生物由来物質は、細胞が１つまたは複数のレトロウイルスベクターで形質移入された卵によって産生される。例えば第一のレトロウイルスベクターでの形質移入に際して、レトロウイルスベクターＥｎｖおよび／またはＧａｇの分子の発現は、細胞に第一のＲＮＡエフェクター分子（つまりｅｎｖ遺伝子またはｇａｇ遺伝子を標的とする）を接触させることにより一時的に抑制され、第二のレトロウイルスベクターでのより効果的な形質移入が可能となる。例えば、第一のレトロウイルスベクターは第一のペプチドをコードし、第二のレトロウイルスベクターは第二の相補的なペプチドをコードする（したがって生物由来物質が両方のペプチドを含む）。さらに、発現の抑制は、ＲＮＡｉ経路のタンパク質をコードする遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子を追加で細胞へ導入することにより緩和できる。
【０１６０】
実施形態のいくつかにおいて、標的遺伝子は、内在性のトリのレトロウイルス（ＥＡＶ）の調節エレメントまたは遺伝子である。例えば、特定の実施形態において、標的遺伝子はトリ白血病ウイルスＬＴＲ、ｅｎｖタンパク質またはｇａｇタンパク質をコードし得る。Ｔｓａｎｇら（７３  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８４３−５１（１９９９））を参照のこと。
【０１６１】
追加の実施形態において、標的遺伝子はウイルス感染を媒介する細胞タンパク質である。このタンパク質には例えばｄｓＲＮＡ（ＧｅｎｅＩＤ：４２２７２０）を検出するＴＬＲ３があり、これは対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節される。このＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が、配列番号：３１５５９６５−３１５６０１１（センス）および配列番号３１５６０１２−３１５６０５８（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む；ｓｓＲＮＡを検出するＴＬＲ７（ＧｅｎｅＩＤ：４１８６３８）；ＣｐＧモチーフを有する非メチル化ＤＮＡを認識するＴＬＲ２１（Ｔｌｒ３、ＧｅｎｅＩＤ：４１５６２３）；ウイルス認識に関連するＲＩＧ−１（Ｍｙｏｎｇら、３２３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０７０−７４（２００９））；ウイルス認識の正の制御因子であるＬＰＧＰ２および他のＲＩＧ−１様受容体（Ｓａｔｏｈら、１０７  ＰＮＡＳ  １２６１−６２（２０１０）；Ｎａｋｈａｅｉら、２００９）；ＴＲＩＭ２５（ＧｅｎｅＩＤ：４１７４０１；Ｇａｃｋら、Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂ．４３９−４９（２００９））；または、抗ウイルス信号伝達カスケードを開始するためにＲＩＧ−１と相互作用するＭＡＶＳ／ＶＩＳＡ／ＩＰＳ−１／Ｇａｒｄｉｆ（Ｃｕｉら、２９  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１６９−７９（２００８））；Ｋａｗａｉら、６  Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９８１−８８（２００５））がある。したがって、例えば、ＭＡＶＳを標的にするＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が、配列番号：３１５６２０７−３１５６２５３（センス）および配列番号：３１５６２５４−３１５６３００（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む。
【０１６２】
組成物は、別の実施形態において、細胞の共通の生物学的プロセスまたは特性、例えばＩＦＮ、ＳＴＡＴタンパク質もしくはＪＡＫ−ＳＴＡＴ信号伝達経路内の他のタンパク質、ＩＦＮＲＡ１および／またはＩＦＮＲＡ２等のインターフェロンシグナル伝達経路に関連する１つまたは複数の遺伝子の発現を調節できるＲＮＡエフェクター分子を１つまたは複数含むことができる。例えば、ウイルス感染により、潜在的な溶菌感染、形質転換および／またはアポトーシスに対して感染細胞内で速やかに生得的反応がおこるが、これはＩＦＮαとＩＦＮβの産生を特徴とする。この信号伝達により、ＩＦＮの作用を媒介するＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）が活性化される。ＩＦＮ調節因子（ＩＲＦ）は、合致したＩＦＮ刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）に結合し、他のＩＳＧを誘導する、９つの細胞因子ファミリーである。Ｋｉｒｓｈｎｅｒら、７９  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９３２０−２４（２００５）を参照のこと。ＩＦＮは、ＴＲＩＭ５α、Ｆｖ、Ｍｘ、ｅＩＦ２αおよび２’−５’ＯＡＳ等の内在性タンパク質の発現を増加させ、ウイルス感染細胞のアポトーシスおよびウイルス感染に対する細胞抵抗性を誘導する。Ｋｏｙａｍら、４３  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ３３６−４１（２００８）。よって、特定の実施形態では、ＩＦＮＲ１遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子を提供する。他の実施形態は、ＩＦＮ信号伝達経路内の１つまたは複数の遺伝子を標的とする。
【０１６３】
ＩＦＮ信号伝達応答の抑制は、ウイルス感染後のＩＦＮ経路の構成成分、例えばトリＩＲＦ３のリン酸化状態を測定することにより測定できる。トリＩＲＦ３はウイルスのｄｓＲＮＡに応じてリン酸化される。Ｉ型ＩＦＮに応じて、Ｊａｋ１キナーゼおよびＴｙＫ２キナーゼ、ＩＦＮ受容体のサブユニット、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２は、速やかにチロシンリン酸化される。したがって、ＲＮＡエフェクター分子がＩＦＮ応答を抑制したかどうか決定するために、ＲＮＡエフェクター分子を細胞に接触させ、ウイルス感染後に細胞を溶解する。Ｊａｋ１キナーゼまたはＴｙＫ２キナーゼ等のＩＦＮ経路構成成分は、特定のポリクローナル血清または抗体を使用して、感染細胞可溶化物から免疫沈降させる。キナーゼのチロシンリン酸化状態は、抗リン酸化チロシン抗体を用いた免疫ブロット分析によって決定される。例えばＫｒｉｓｈｎａｎら、２４７  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９８−３０５（１９９７）を参照のこと。ウイルス感染後、ＩＦＮ経路の構成成分のいずれかのリン酸化状態が減少する場合、ウイルスによるＩＦＮ応答がＲＮＡエフェクター分子に応じて減少したことを示す。
【０１６４】
ＩＦＮ信号伝達抑制の有効性も、特定のＤＮＡ配列と結合する能力、またはウイルス感染およびＲＮＡエフェクター分子による処理に応じて誘導された転写因子、例えばＩＲＦ７、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２等の移動を測定することにより測定できる。特にＳＴＡＴ１とＳＴＡＴ２はＩ型ＩＦＮに応じてリン酸化され、細胞質から核へ移動する。特定のＤＮＡ配列と結合する能力、または転写因子の移動は、当業者には既知の技術、例えばゲル電気泳動移動度シフトアッセイ、細胞染色法によって測定できる。ＩＦＮ誘導の抑制を測定する別の方法では、所望のウイルス産物を産生する、ＲＮＡエフェクター分子を接触させた卵からの抽出液が、ウイルス感染に対する保護活性を付与できるかどうかを測定する。より具体的には、例えば、卵を所望のウイルスに感染させ、ＲＮＡエフェクターに接触させる。感染後およそ１５〜２０時間経過後、卵を回収し、ウイルス力価を、定量的な逆転写酵素活性試験（ＰＥＲＴ）、免疫分析、またはインビボで接種して測定する。
【０１６５】
発育卵細胞の遺伝子で抑制が増加する例は他に、タンパク質キナーゼＣＫ２βサブユニット（ＣＳＫＮ２Ｂ）がある。より具体的には、ＣＳＫＮ２Ｂ遺伝子が発現停止させられる細胞では、インフルエンザタンパク質の産生、複製およびウイルス力価が増加を示す。Ｍａｒｊｕｋｉら、３  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  １３（２００８）。よって、実施形態のいくつかにおいて、ＣＳＫＮ２Ｂの発現は、対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節できる。このＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が、配列番号３２３９５５２−３２８９８４６（センス）および配列番号３２８９８４７−３２９０１４１（アンチセンス）のヌクレオチドから選択された、少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む。
【０１６６】
宿主細胞の受容体
実施形態のいくつかにおいては、標的遺伝子は、膜受容体または他の成分をコードする、またはその合成に関与する、またはそれを調節する宿主細胞遺伝子（内在性）である。細胞膜の発現の調節によって、（例えば受容体の発現の増加または減少により）ウイルス感染を増加または減少させることができ、または（受容体発現を減少させることにより）宿主の細胞膜に吸着してしまう産物の回収を増加させることができる。
【０１６７】
例えば、多数のウイルスが宿主細胞表面のヘパリンに吸着するが、これらにはＰＣＶ（Ｍｉｓｉｎｚｏら、８０  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３４８７−９４（２００６））；ＣＭＶ（Ｃｏｍｐｔｏｎら、１９３  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８３４−４１（１９９３））；偽性狂犬病ウイルス（Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒら、６４  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２７８−８６（１９９０））；ＢＨＶ−１（Ｏｋａｚａｋｉら、１８１  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６６６−７０（１９９１））；ブタ水疱病ウイルス（Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ−Ｒｏｍｅｒｏら、８５  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６５３−６３（２００４））；およびＨＳＶ（ＷｕＤｕｎｎおよびＳｐｅａｒ、６３  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５２−５８（１９８９））がある。さらに、表面ヘパリン結合に関連した感染性を有する外膜ウイルスには、ＨＩＶ−１（Ｍｏｎｄｏｒら、７２  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３６２３−３４（１９９８））；ＡＡＶ−２（ＳｕｍｍｅｒｆｏｒｄおよびＳａｍｕｌｓｋｉ、７２  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１４３８−４５（１９９８））；ウマ動脈炎ウイルス（Ａｓａｇｏｅら、５９  Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．７２７−２８（１９９７））；ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｂｅｒｎａｒｄら、２７６  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ９３−１０３（２０００））；Ｓｉｎｄｂｉｓウイルス（ＢｙｒｎｅｓおよびＧｒｉｆｆｉｎ、７２  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３４９−５６（１９９８）；Ｃｈｕｎｇら、７２  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１５７７−８５（１９９８））；ブタ熱ウイルス（Ｈｕｌｓｔら、７５  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９５８５−９５（２００１））；ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（Ｊｕｓａら、６２  Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．２６１−６４（１９９７））；およびＲＳＶ（ＫｒｕｓａｔおよびＳｔｒｅｃｋｅｒｔ、１４２  Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１２４７−５４（１９９７））がある。細胞表面ヘパリンに関連する非外膜ウイルスもいくつかある。ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーメンバーのいくつかは、細胞表面ヘパリンと関連しており、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）（体外培養で結合）（Ｆｒｙら、１８  ＥＭＢＯ  Ｊ．５４３−５４（１９９９）；Ｊａｃｋｓｏｎら、７０  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５２８２−８７（１９９６））；コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）（Ｚａｕｔｎｅｒら、７７  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１００７１−７７（２００３））；タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（ＲｅｄｄｉおよびＬｉｐｔｏｎ、７６  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４００−０７（２００２））；およびエコーウイルスのセロタイプのいくつか（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗら、７５  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９１８−２１（２００１））がある。
【０１６８】
よって、特に、本発明の実施形態においては、ヘパリンの細胞発現をウイルスの宿主細胞への吸着を減少させるまたは増加させるために調節できる。例えば、１つまたは複数のＲＮＡエフェクター分子は、エピメラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼまたは２−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ等の、ヘパリンの合成または構造に関連した遺伝子を１つまたは複数標的にできる。例えばＲｏｓｔａｎｄおよびＥｓｋｏ、６５  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１−８（１９９７）を参照のこと。
【０１６９】
細胞表面ヘパリンの発現が増加すると考えられる場合、ＲＮＡエフェクター分子は、ヘパラナーゼ（ｈｅｐ）（ｈｅｐ１  ＧｅｎｅＩＤ：３７３９８１；ｈｅｐ２、ＧｅｎｅＩＤ：４２３８３４）をコードする遺伝子等のヘパリンの分解に関連した遺伝子を標的とできる。Ｇｉｎｇｉｓ−Ｖｅｌｉｔｓｋｉら（２７９  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４４０８４−９２（２００４））。同様に、インフルエンザウイルスの感染力は細胞表面上のシアル酸の存在に依存する。（Ｐｅｄｒｏｓｏら、１２３６  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３２３−３０（１９９５）、ロタウイルス（Ｉｓａら、２３  Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．２７−３７（２００６）；Ｆｕｋｕｄｏｍｅら、１７２  Ｖｉｒｏｌ．１９６−２０５（１９８９））、他のレオウイルス（Ｐａｕｌら、１７２  Ｖｉｒｏｌ．３８２−８５（１９８９））、およびウシコロナウイルス（ＳｃｈｕｌｚｅおよびＨｅｒｒｌｅｒ、７３  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９０１−０６（１９９２））の感染力も同様である。
【０１７０】
したがって、実施形態のいくつかにおいて、遺伝子標的には、トリ細胞中の宿主のシアリダーゼに関するものを含む（Ｗａｎｇら、１０  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５１２（２００９）を参照のこと）。インフルエンザが細胞表面のシアル酸残基に結合するため、シアリダーゼの減少により、精製率を増加させることができる。標的遺伝子には例えば、ＮＥＵ２シアリダーゼ２（細胞基質シアリダーゼ）（Ｎｅｕ２、ＧｅｎｅＩＤ：４３０５４２）；ＮＥＵ３シアリダーゼ３（膜シアリダーゼ）（Ｎｅｕ３、ＧｅｎｅＩＤ：６８８２３）；溶質輸送体ファミリー３５（ＣＭＰ−シアル酸輸送体）メンバーＡ１（Ｓｌｃ３５Ａ１、対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節できる。このＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が、配列番号３１５４３４５−３１５４３６８（センス）および配列番号：３１５４３６９−３１５４３９２（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む）；ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（Ｇｎｅ、対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節できる。このＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が配列番号：３１５４２９７−３１５４３２０（センス）および配列番号３１５４３２１−３１５４３４４（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む）；シチジン−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（Ｃｍａｓ）、この発現は、対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節できる。このＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が配列番号：３１５４２４９−３１５４２７２（センス）および配列番号：３１５４２７３−３１５４２９６（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む）；ＵＤＰ−Ｇａｌ：βＧｌｃＮＡｃβ１、４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧａｌＴ１）、発現は対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節できる。このＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が配列番号３１５４１５３−３１５４１７６（センス）および配列番号３１５４１７７−３１５４２００（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む）；およびＵＤＰ−Ｇａｌ：βＧｌｃＮＡｃβ１、４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ポリペプチド６（Ｂ４ＧａｌＴ６）、発現は、対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節できる。このＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が、配列番号３１５４２０１−３１５４２２４（センス）および配列番号３１５４２２５−３１５４２４８（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個���接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む）がある。
【０１７１】
宿主細胞表面の糖タンパク質のシアル酸残基はインフルエンザウイルスの受容体である。インフルエンザＡ型とＢ型は、最も多量に存在するシアル酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸に結合し、インフルエンザＣ型は、吸着に関して、９−Ｏ−アセチル−Ｎ−アセチルノイラミン酸に結合する。インフルエンザＡ型の結合はヘマグルチニンが媒介する。より具体的には、ヘマグルチニンはウイルスの糖タンパク質であり、細胞上のシアル酸残基を認識することでウイルスを細胞に結合させる働きをし、この結合により、細胞とウイルスとの関係が始まる。ヘマグルチニンはインフルエンザウイルスの主要な病原性（疾病の原因）因子である。さらに、ヘマグルチニンは続いて、細胞内のエンドソームで（つまりウイルスがエンドサイトーシスにより取り込まれた後）ウイルスと宿主の膜とを融合させる。エンドサイトーシスによりウイルスが細胞のエンドソームへ運搬された後、エンドソームを酸性化させ（約ｐＨ５．５）、ヘマグルチニンがコンホメーション変化を起こしてエンドソーム膜との融合を促進し、これによって宿主の細胞質へのインフルエンザウイルスの遊離が促進される。
【０１７２】
ノイラミニダーゼはアセチルノイラミニルヒドロラーゼの一般名であり、他の糖タンパク質の糖鎖からＮ−アセチルノイラミン酸と呼ばれる残基を除く糖タンパク質酵素である。宿主細胞のノイラミン酸残基の破壊により、ウイルスは細胞に入ってウイルス複製を開始でき、複製中の細胞から遊離できる。ヘマグルチニンは細胞表面のシアル酸に結合し、次にシアル酸はウイルスのノイラミニダーゼによって切断され、子孫ウイルス粒子の効果的な遊離が促進される。またノイラミニダーゼを持っていることはウイルス粒子の凝集を防いでいる。典型的なインフルエンザウイルス粒子には、約５００のヘマグルチニン分子が、およびが約１００のノイラミニダーゼ分子が含まれる。
【０１７３】
ヘマグルチニンとノイラミニダーゼの抑制物質がウイルス感染防止のために開発されている。抑制物質のいくつかは、細胞表面上のシアル酸に構造上似ているため、デコイとして働き、ウイルスが細胞ではなく抑制物質に結合するという原理である。
【０１７４】
本発明の一実施形態において、シアル酸または、シアル酸の誘導体もしくは類似体は卵に付加され、ＲＮＡエフェクター分子が標的細胞の分子機能を調節するまでインフルエンザウイルス感染を抑制する。インフルエンザが標的とするシアル酸のデコイは、細胞培養と発育卵の両方で使用されている。Ｗｏｏｄｓら、３７  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１４７３−７９（１９９３）。
【０１７５】
シアル酸、またはそのデコイの１つはヘマグルチニンに対する親和性に基づいて選択できる。例えば、ベンジル−α−Ｎｅｕ５Ａｃ；２−ｄ−２Ｈｅｑ−Ｎｅｕ５Ａｃ；メチル−α―Ｎｅｕ５Ａｃ；メチル−α−９−ｄ−Ｎｅｕ５Ａｃ；（４−イソチオシアノ）ベンジル−α−Ｎｅｕ５Ａｃ；および２−ナフチル−α−Ｎｅｕ５Ａｃは、比較的強力なシアル酸デコイであり、インフルエンザＡ型ヘマグルチニンの赤血球への吸着を抑制する（ＩＣ５０は約１．７〜約８ｍＭの範囲）。相対的に、２，７−ｄ２−２Ｈｅｑ−Ｎｅｕ５Ａｃ；２，８−ｄ２−２Ｈｅｑ−Ｎｅｕ５Ａｃ、２，７−ｄ２−２Ｈｅｑ−７，８−ｅｐｉ２−Ｎｅｕ５Ａｃ；２，−ｄ−２Ｈｅｑ−８−ｅｐｉ−Ｎｅｕ５Ａｃ；および、ベンジル−α−８，９−イソプロピリデン−Ｎｅｕ５Ａｃは、比較的弱いシアル酸デコイ（ＩＣ５０は約１７〜約４０ｍＭの範囲）である。Ｋｅｌｍら、２０５  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４７−５３（１９９２）。
【０１７６】
糖タンパク質等の他の分子は、インフルエンザヘマグルチニンのレクチン様活性でシアル酸と競合できる。例えば、シアロ糖タンパク質フェチュインは、インビトロでインフルエンザＡ型のＭＤＣＫ細胞への吸着を抑制する、セイヨウスモモ中のレクチン結合化合物と競合することが示されている。Ｙｉｎｇｓａｋｍｏｎｇｋｏｎら、３１  Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５１１−１５（２００８）。さらに、コレクチン肺サーファクタントタンパク質Ａおよびスカベンジャー受容体に富む糖タンパク質３４０（ｇｐ３４０）は、インフルエンザＡ型ウイルスヘマグルチニンに結合するシアル酸リガンドを提供するという点でムチンと同様に作用する。Ｗｈｉｔｅら、２８８  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌ８３１（２００４）。
【０１７７】
シアル酸のデコイも、ヘマグルチニンへのウイルスの結合およびノイラミニダーゼ活性の両抑制に基づいて選択できる。例えばＯ−グリコシドシアル酸誘導体Ｎｅｕ５Ａｃ３Ｆ−ＤＳＰＥ（４）は、Ｃ−３位をアキシャルなフッ素原子で修飾するが、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンの結合活性およびそのシアリダーゼの触媒加水分解の両方を抑制した。ＭＤＣＫ細胞のインフルエンザ感染に対するＮｅｕ５Ａｃ３Ｆ−ＤＳＰＥ（４）の抑制効果が調査され、誘導体は細胞変性効果に基づきＩＣ５０値５．６μＭでインフルエンザ感染を抑制した。Ｇｕｏら、１２  Ｇｌｙｃｏｂｉｏ．１８３−９０（２００２）。肺サーファクタントタンパク質Ｄはウイルスのヘマグルチニンとノイラミニダーゼの糖結合部位にカルシウム依存的な方法で結合する。Ｗｈｉｔｅら、２００４。よって、肺サーファクタントタンパク質Ｄの抑制効果は、カルシウムの付加、および場合によりＥＤＴＡ等のキレート化剤をさらに付加することによって調節できる。
【０１７８】
さらに、へマグルチニン−ノイラミニダーゼを単一のウイルスタンパク質に結合したウイルスが存在しており、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ活性の両方を有する。（これは、インフルエンザで見つかったタンパク質と対照的である。インフルエンザでは、両方の機能が存在するが、それぞれは異なるタンパク質にある。）これらには、流行性耳下腺炎ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼおよびパラインフルエンザヘマグルチニン−ノイラミニダーゼがある。ヒトパラインフルエンザウイルスは、呼吸器、特に小児の重大な呼吸器の病原体である。パラインフルエンザウイルス抑制剤ＢＣＸ２７９８およびＢＣＸ２８５５はヘマグルチニン−ノイラミニダーゼタンパク質の三次元構造に基づいて設計された。この化合物は、ヘマグルチニンとノイラミニダーゼの活性、およびＬＬＣ−ＭＫ２細胞での複数のパラインフルエンザウイルスの増殖を抑制するのに非常に効果的だった。ＬＣ５０は抑制分析において０．０２〜２０．０μＭまでの範囲であった。ウイルス複製を対照の５０％レベルまで抑制するために必要とされる濃度は、０．７〜１１．５μＭの範囲であった。Ａｌｙｍｏｖａら、４８  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇ．Ｃｈｅｍｏ．１４９５−５０２（２００４）。
【０１７９】
シアル酸のデコイはさらに、ノイラミニダーゼ抑制のみに基づいて選択できる。例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸の４−ジフルオロメチル−２−メトキシ−フェニール−α−ケトシドはインフルエンザ感染ＭＤＣＫ細胞においてノイラミニダーゼの可逆的抑制を示す。（Ｋｉ８ｘ１０−５Ｍ）。Ｂａｒｒｅｒｅら、１４２  Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１３６５−８０（１９９７）。インフルエンザＡ型とＢ型の可逆的なノイラミニダーゼ拮抗阻害剤には、ザナミビル、オセルタミビルカルボン酸塩（ＧＳ４０７１）およびＲＷＪ−２７０２０１（ＢＣＸ−１８１２）がある。オセルタミビルカルボン酸のノイラミニダーゼ活性部位の分解半減期速度は、細胞培養液において３３〜６０分である。相対的に、ピロリジンベースの化合物、Ａ−３１５６７５（５−［（１Ｒ，２Ｓ）―１−（アセチルアミノ）−２−メトキシ−２−メチルペンチル］−４−［（１Ｚ）−１−プロペニル］−（４Ｓ，５Ｒ）−Ｄ−プロリン）とインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼの分解半減期速度は、ＭＤＣＫ細胞培養液中で１０〜１２時間である。Ｋａｔｉら、４６  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１０１４−２１（２００２）。
【０１８０】
インフルエンザＡ型（トリペストウイルス）に感染した鶏胚線維芽細胞は、切断によりヘマグルチニン糖タンパク質をもたらす前駆体糖タンパク質を含む。Ｄ−グルコサミンおよび２−デオキシ−Ｄ−グルコースが高濃度であると、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼおよび成熟ウイルス粒子の形成が抑制される。分析により、これらの条件下では、ウイルスの糖タンパク質がすべて欠損していることが明らかとなった。糖タンパク質の代わりに、ヘマグルチニンの糖タンパク質前駆体の糖−遊離ポリペプチドタ単鎖が、感染細胞の中で蓄積された。Ｋｌｅｎｋら、４９  Ｖｉｒｏｌ．７２３−３４（１９７２）。
【０１８１】
一実施形態において、シアル酸のデコイは、ＲＮＡエフェクター分子および感染ウイルス導入と同時に発育卵に導入される。これにより、卵に混入物が入る可能性のある暴露を複数回行うことを回避するとともに、ＲＮＡエフェクターが細胞に接触し、細胞活動を調節する間ウイルス感染を遅らせることができる。
【０１８２】
シアル酸デコイが感染開始と同様ウイルスの遊離も抑制できるため、デコイは細胞培養液へのウイルス粒子の遊離抑制にも使用でき、この結果が望ましい場合、ウイルスの子孫を宿主細胞中に保持できる。Ｇｕｂａｒｅｖａら、３５５  Ｌａｎｃｅｔ  ８７２（２０００）。したがって、実施形態のいくつかにおいて、所望のレベル感染が達成された後、不完全な（非エンベロープ）ウイルスまたは他の免疫原性物質は、収集された細胞から回収できる。
【０１８３】
別の実施形態において、シアル酸にウイルスを結合させ、運搬メカニズムとして使用し、ＲＮＡｉ剤（例えばＲＮＡエフェクター分子）を宿主細胞に接触させる。この方法では、ＲＮＡエフェクター分子はシアル酸またはその誘導体と組み合わせるか、または複合体化させる。一実施形態において、ウイルス接種をＲＮＡエフェクター結合シアル酸誘導体と混合し、ウイルスのヘマグルチニン残基の一部分（すべてでない）が、シアル酸−ｓｉＲＮＡ複合物と複合体を形成する。非占有ヘマグルチニン残基は宿主細胞のシアル酸に結合し、エンドサイトーシスが起こり、ウイルスおよびＲＮＡエフェクター分子の宿主細胞の細胞質への遊離が促進される。
【０１８４】
他の実施形態において、シアル酸をｓｉＲＮＡを有するリポソーム製剤へ組み入れる。シアル酸残基を発現するリポソームは、インフルエンザと細胞表面の相互作用に関する研究で広範に使用されている。Ｒｅｉｃｈｅｒｔら、１１７  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８２９−３０（１９９５）；Ｓｐｅｖａｋら、１１５  Ｊ．Ａｍ．ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４６−４７（１９９３）。この実施形態の態様において、ｓｉＲＮＡ−シアル酸リポソーム製剤は卵の接種に先立ってインフルエンザと混合する。
【０１８５】
宿主細胞の生存能
実施形態のいくつかにおいて、宿主細胞での生物由来物質の産生は、追加のＲＮＡエフェクター分子を細胞へ導入することにより増強されるが、このＲＮＡエフェクター分子は細胞増殖、細胞分裂、細胞生存度、アポトーシス、栄養の取扱い、ならびに／または細胞増殖および／もしくは細胞内の分裂に関連する他の特質に影響する。標的遺伝子はさらに、直接的にまたは間接的に生物由来物質の産生の１つまたは複数の側面に影響する宿主細胞のタンパク質をコードできる。ポリペプチドの産生に影響する標的遺伝子の例には、ポリペプチドおよび／またはウイルス粒子の分泌、折り畳みまたは翻訳後修飾（例えばグリコシル化、アミド分解、ジスルフィド結合形成、メチオニン酸化またはピログルタミン酸化）に関わるタンパク質をコードする遺伝子；宿主細胞の特性または表現型（例えば増殖、生存能、細胞のｐＨ、細胞周期進行、アポトーシス、炭素代謝もしくは輸送、乳酸形成、ウイルス感染に対する感受性、またはＲＮＡｉの取込み、活性もしくは効率）に影響するタンパク質をコードする遺伝子；および、宿主細胞による生物由来物質の産生を損なうタンパク質（例えば生物由来物質と結合するかまたは同時精製するタンパク質）をコードする遺伝子がある（さらに、遺伝子は、細胞からのウイルス粒子の遊離に干渉するタンパク質をコードする）。
【０１８６】
本発明の実施形態のいくつかにおいては、標的遺伝子は、生物由来物質の産生に間接的に影響する宿主細胞のタンパク質をコードし、標的遺伝子の発現により生物由来物質の産生が増強するのを抑制する。例えば、標的遺伝子は、生物学由来物質の産生に直接影響しないが生物学由来物質の産生を増強できる細胞資源を利用することなどで間接的に産生を減少させる、宿主細胞の大量発現タンパク質をコードできる。
【０１８７】
本明細書に記載の細胞ベースのバイオプロセスで生物由来物質を最適に産生するには、細胞生存度を最大化することが望ましい。したがって、一実施形態において、生物由来物質の産生を、Ｂａｘ（ＢＣＬ２結合Ｘタンパク質）等のアポトーシスまたは細胞生存度に影響する細胞タンパク質の発現の調節により増強させる。ＢａｘにはＢａｋ（ＢＣＬ２拮抗性キラー１）（Ｂａｋ、ＧｅｎｅＩＤ：４１９９１２）、ＬＤＨＡ（乳酸デヒドロゲナーゼＡ）（ＬｄｈＡ、ＧｅｎｅＩＤ：３９６２２１、対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節される。このＲＮＡエフェクター分子は、一方の鎖が、配列番号：３１５４５５３−３１５４５７８（センス）および配列番号：３１５４５７９−３１５４６０４（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む）；ＬＤＨＢ（ＧｅｎｅＩＤ：３７３９９７）、ＢＩＫ；ＢＡＤ、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＨＲＫ、ＢＣＬＧ、ＨＲ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＯＫ（ＢＣＬ２関連卵巣キラー、ＧｅｎｅＩＤ：９９５４４５）、ＢＯＯ、ＢＣＬＢ、ＣＡＳＰ２（アポトーシス関連システインペプチダーゼ２）（Ｃａｓｐ２、ＧｅｎｅＩＤ：３９５８５７）、ＣＡＳＰ３（ＧｅｎｅＩＤ：３９５４７６）、ＣＡＳＰ６（ＧｅｎｅＩＤ：３９５４７７）、ＣＡＳＰ７（ＧｅｎｅＩＤ：４２３９０１）、ＣＡＳＰ８（ＧｅｎｅＩＤ：３９５２８４）、ＣＡＳＰ９（ＧｅｎｅＩＤ：４２６９７０）、ＣＡＳＰ１０（ＧｅｎｅＩＤ：４２４０８１）、ＢＣＬ２（Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫２）（Ｂｃｌ２、ＧｅｎｅＩＤ：３９６２８２）、ｐ５３（ＧｅｎｅＩＤ：３９６２００）、ＡＰＡＦ１、ＨＳＰ７０（ＧｅｎｅＩＤ：４２３５０４）、ＴＲＡＩＬ（ＴＲＡＩＬ様、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド様）（Ｔｒａｉｌ、ＧｅｎｅＩＤ：３９５２８３）およびＢＣＬ２Ｌ１（ＢＣＬ２様１）（Ｂｃｌ２Ｌ１、ＧｅｎｅＩＤ：３７３９５４）、ＢＣＬ２Ｌ１３（ＢＣＬ２様１３［アポトーシス促進因子］）（Ｂｃｌ２ｌ１３、ＧｅｎｅＩＤ：４１８１６３）、ＢＣＬ２Ｌ１４（ＧｅｎｅＩＤ：４１９０９６）、ＦＡＳＬＧ（Ｆａｓリガンド［ＴＮＦスーパーファミリー、メンバー６］）、ＧｅｎｅＩＤ：４２９０６４）、ＤＰＦ２（Ｄ４、ジンクアンドダブルＰＨＤフィンガーファミリー２）（Ｄｐｆ２、ＧｅｎｅＩＤ：４２９０６４）、ＡＩＦＭ２（アポトーシス誘導因子ミトコンドリア関連２）（Ａｉｆｍ２、ＧｅｎｅＩＤ：４２３７２０）、ＡＩＦＭ３（ＧｅｎｅＩＤ：４１６９９９）、ＳＴＫ１７Ａ（セリン／トレオニンキナーゼ１７ａ［アポトーシス誘導］）（Ｓｔｋ１７Ａ、ＧｅｎｅＩＤ：４２０７７５）、ＡＰＩＴＤ１（アポトーシス誘導、ＴＡＦ９様ドメイン１）（Ａｐｉｔｄ１、ＧｅｎｅＩＤ：７７１４１７）、ＳＩＶＡ１（アポトーシス誘発因子）（Ｓｉｖａ１、ＧｅｎｅＩＤ：４２３４９３）、ＦＡＳ（ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー６、Ｆａｓ、ＧｅｎｅＩＤ：３９５２７４）、ＴＧＦβ２（トランスフォーミング成長因子β２、ＴｇｆＢ２、ＧｅｎｅＩＤ：４２１３５２）、ＴＧＦＢＲ１（トランスフォーミング成長因子、β受容体Ｉ、ＴｇｆＲ１、ＧｅｎｅＩＤ：３７４０９４）、ＬＯＣ３７８９０２（デスドメイン含有腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー２３）（ＧｅｎｅＩＤ：３７８９０２）、またはＢＣＬ２Ａ１（ＢＣＬ２関連タンパク質Ａ１、ＧｅｎｅＩＤ：３９５６７３）がある。
【０１８８】
例えば、Ｂａｋタンパク質は細胞アポトーシス経路を下方制御することが知られている。したがって、ニワトリＢａｋを標的にするＲＮＡエフェクター分子は、アポトーシスを抑制し、かつ産生物の収量を増加させるために使用できる。またこのＲＮＡエフェクター分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が、配列番号：３１５４３９３−３１５４４１３（センス）および配列番号：３１５４４１４−３１５４４３４（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む。さらにＳｕｙａｍａら、Ｓ１  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０７−０８（２００１）を参照のこと。したがって特定の実施形態では、Ｂａｋ遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子を提供する。
【０１８９】
同様に、Ｂａｘタンパク質は細胞アポトーシス経路を下方制御することが知られている。したがって、ニワトリＢａｘを標的にするＲＮＡエフェクター分子は、アポトーシスを抑制し、かつ産生物の収量を増加させるために使用できる。またこのＲＮＡエフェクター分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が、配列番号：３１５４３９３−３１５４４１３（センス）および配列番号：：３１５４４１４−３１５４４３４（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む。
【０１９０】
実施形態のいくつかにおいては、アポトーシスに関与する遺伝子（例えばＢａｋ、Ｂａｘ、カスパーゼ等）の少なくとも１つを標的にするＲＮＡエフェクター分子の投与後、卵にグルコースを投与し細胞密度を増加させ、細胞を乳酸利用モードに切り換える。実施形態のいくつかにおいては、グルコースの濃度は少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍増加させる。
【０１９１】
別の実施形態において、複数の異なるＲＮＡエフェクター分子を卵内の細胞に接触させ、Ｂａｘ、ＢａｋおよびＬＤＨの発現を調節できる。別の実施形態において、ＢａｘおよびＢａｋを標的にするＲＮＡエフェクター分子は、生物学的物質の産生の間に卵に対して同時に投与され、場合により追加のＲＮＡエフェクター分子または物質を少なくとも１つ含むことができる。
【０１９２】
あるいは、一度に１つのＲＮＡエフェクター分子を卵に投与してもよい。このように、特定のＲＮＡエフェクター分子の投与頻度を変更して、各標的遺伝子に対して所望の平均パーセント抑制を容易に調整できる。例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の８０％を超える抑制は、生物由来物質の産生を大きく改善するのに常に必要というわけではなく、ある条件下では細胞生存度に有害にさえなりうる。したがってＬＤＨを標的とするＲＮＡエフェクター分子を、他のＲＮＡエフェクター分子（例えばＢａｘ／Ｂａｋ）の接触頻度よりも低頻度で（例えば回数を少なく）で細胞に接触させることができる。または、ＬＤＨを標的とするＲＮＡエフェクター分子を、他のＲＮＡエフェクター分子（例えばＢａｘ／Ｂａｋ）の用量よりも低用量で（例えば、ＩＣ５０以上の用量の数分の１で）細胞に接触させることができる。方法を簡易にし、汚染の可能性を無くすため、異なるＲＮＡエフェクター分子の混合物を投与して必要となる投与回数を減らし、卵に不純物が混入する機会を最小にするのが好ましいであろう。
【０１９３】
本明細書に記述する細胞ベースのバイオプロセスにおける生物由来物質の産生も、スクリーニングされ同定された標的遺伝子により最適化できる。これらには例えば、ＰＵＳＬ１（シュードウリジレートシンターゼ様１）、ＴＰＳＴ１（チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ１、Ｔｐｓｔ１、ＧｅｎｅＩＤ：４１７５４６）および、ＷＤＲ３３（ＷＤ反復ドメイン３３、ＧｅｎｅＩＤ：４２４７５３）（Ｂｒａｓｓら、１３９  Ｃｅｌｌ  １２４３−５４（２００９）を参照のこと）Ｎｏｄ２（ヌクレオチド結合オリゴマー形成ドメイン含有２）（Ｓａｂｂａｈら、１０  Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７３−８０（２００９））；ＭＣＴ４（溶質輸送体ファミリー１６、メンバー４［モノカルボン酸輸送体４］、ＧｅｎｅＩＤ：３９５３８３）、ＡＣＲＣ（酸性反復含有）、ＧｅｎｅＩＤ：４２２２０２、ＡＭＥＬＹおよびＡＴＣＡＹ（小脳、カイマン型［ｃａｙｔａｘｉｎ］、ＧｅｎｅＩＤ：４２００９４）、ＡＮＰ３２Ｂ（酸性（ロイシンリッチ）核リン酸化タンパク質３２ファミリーメンバー）ＧｅｎｅＩＤ：４２００８７）、ＤＥＦＡ３、ＤＨＲＳ１０、ＤＯＣＫ４（細胞質分裂デディケーター４）ＧｅｎｅＩＤ：４１７７７９）、ＦＡＭ１０６Ａ、ＦＫＢＰ１Ｂ（ＦＫ５０６結合タンパク質１Ｂ、ＧｅｎｅＩＤ：３９５２５４）、ＩＲＦ３、ＫＢＴＢＤ８（ケルヒリピート、およびＢＴＢ（ＰＯＺ）ドメイン含有８、ＧｅｎｅＩＤ：４１６０８５）、ＫＩＡＡ０７５３（ＧｅｎｅｌＤ：４１７６８１）、ＬＰＧＡＴ１（リゾフォスファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１、ＧｅｎｅＩＤ：４２１３７５）、ＭＳＭＢ（マイクロセミノタンパク質β、ＧｅｎｅＩＤ：４２３７７３）、ＮＦＳ１（窒素固定１のホモログ、ＧｅｎｅＩＤ：４１９１３３）、ＮＰＩＰ、ＮＰＭ３（ヌクレオフォスミン／ヌクレオプラスミン３、ＧｅｎｅＩＤ：７７０４３０）、ＳＣＧＢ２Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＢ７、ＳＬＣ１６Ａ４（溶質輸送体ファミリー１６、メンバー４［モノカルボン酸輸送体５］、ＧｅｎｅＩＤ：４１９８０９）、ＳＰＴＢＮ４（スペクトリン、β、非赤血球４、ＧｅｎｅＩＤ：４３０７７５）、またはＴＭＥＭ１４６（Ｋｒｉｓｈｎａｎら、２００８）。
【０１９４】
生物由来物質産生の最適化に影響する可能性のある他の標的遺伝子には、細胞周期および／または細胞増殖に関する遺伝子を含み、ＣＤＫＮ１Ｂ（サイクリン依存性キナーゼ阻害分子１Ｂ、ｐ２７、ｋｉｐ１、ＧｅｎｅＩＤ：３７４１０６）、ｐ２７ｋｉｐ１に対するｓｉＲＮＡが増殖を誘導する標的（Ｋｉｋｕｃｈｉら、４７  Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．４８０３−０９（２００６）；またはＦＯＸ０１、ｓｉＲＮＡが大動脈内皮細胞増殖を誘導する標的（Ｆｏｓｂｒｉｎｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９００９−１８（２００６））等がある。
【０１９５】
細胞内タンパク質発現の改善に関連した追加の遺伝子はＦＮ１である。ＦＮ１の発現は、対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節されるが、このＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が、配列番号３１５４４３５−３１５４４６３（センス）および配列番号３１５４４６４−３１５４４９２（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む。
【０１９６】
活性酸素種（ＲＯＳ）は宿主細胞に有毒で、非特異的酸化、分解および／または切断、ならびに生物由来物質の他の構造上の修飾を媒介する可能性があり、これにより不均一性の増加、生物活性の減少、回収量の低下および／または本明細書で提供された方法により産生した生物由来物質の機能障害を招く。したがって、生物由来物質の産生は、次からなる群から選択されるタンパク質等の酸化促進剤酵素の発現の調節により増強される：ＮＡＤ（ｐ）Ｈ酸化酵素、グルタチオンペルオキシダーゼ（例えばグルタチオンペルオキシダーゼ１、グルタチオンペルオキシダーゼ４、グルタチオンペルオキシダーゼ８（推定）、グルタチオンペルオキシダーゼ３、ミエロペルオキシダーゼ、構成的神経型一酸化窒素合成酵素（ｃｎＮＯＳ）、キサンチン酸化酵素（ＸＯ）およびミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、１５−リポキシゲナーゼ−１、ＮＡＤＰＨシトクロムｃレダクターゼ、ＮＡＰＨシトクロムｃレダクダーゼ、ＮＡＤＨシトクロムｂ５レダクターゼおよびサイトクロムＰ４５０２Ｅ１）等の過酸化酵素。
【０１９７】
さらに、タンパク質産生は、宿主細胞の細胞周期に影響するタンパク質の発現の調節により増強でき、例えばサイクリンＭ４、サイクリンＪ、サイクリンＴ２、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１Ａ（Ｐ２１）、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１Ｂ、サイクリンＭ３、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子２Ｂ（ｐ１５、ＣＤＫ４抑制）、サイクリンＥ２、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ６（カルシクリン）、サイクリン依存性キナーゼ５、制御サブユニット１（ｐ３５）、サイクリンＴ１、ＣＤＫの抑制物質、サイクリンＡ１相互作用タンパク質、またはサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）等のサイクリンがある。実施形態のいくつかにおいて、標的ＣＤＫはＣＤＫ２Ａであり、対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節される。このＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が、配列番号３１５４６６３−３１５４６９６（センス）および配列番号３１５４６９７−３１５４７３０（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む。例えば、様々な実施形態において、細胞周期進行に影響する１つまたは複数のタンパク質の発現は、異種タンパク質の発現および回収を増強するために、異種タンパク質産生の増殖および／または生産相中に一時的に調節できる。
【０１９８】
また、バイオプロセシングにおいてアンモニアが過度に産生されるが、これはよくある問題である。高いアンモニア濃度により、細胞株とプロセス条件にもよるが細胞および産生収量が減少する。アンモニアの遊離は、グルタミナーゼによりグルタミンがグルタミン酸へ分解することにより、および／またはグルタミンデヒドロゲナーゼによりグルタミン酸がα−ケトグルタル酸に変換することにより生じると考えられる。したがって、一実施形態において、生物由来物質産生は、グルタミナーゼまたはグルタミンシンテターゼ等のアンモニア産生に影響するタンパク質の発現の調節により増強できる。
【０１９９】
細胞内で乳酸が産生されると、細胞増殖が抑制され、解糖系およびグルタミン分解に関与する代謝経路に影響を及ぼすことが知られている（ＬａｏおよびＴｏｔｈ、１３  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｐｒｏｇ．、６８８−９１（１９９７））。乳酸は細胞内で、主にグルコースのＣＯ２とＨ２Ｏへの不完全酸化により蓄積するが、ほとんどのグルコースはピルビン酸に酸化され、最終的には乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）によって乳酸に変換される。細胞内に乳酸が蓄積すると、高い細胞密度および生存能の実現に悪影響を及ぼす。したがって、一実施形態において、免疫原性タンパク質の産生を、乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）等の乳酸形成に影響するタンパク質の発現の調節により増強する。よって、特定の実施形態では、ＬＤＨＡ１遺伝子ＬＤＨＡを標的にするＲＮＡエフェクター分子を提供する。この遺伝子は、対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節されるが、このＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が、配列番号３１５４５５３−３１５４５７８（センス）および配列番号３１５４５７９−３１５４６０４（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む。
【０２００】
一実施形態において、Ｂａｘ、ＢａｋおよびＬＤＨの発現を調節できるＲＮＡエフェクター分子で、本明細書に記述するように細胞培養を処理する。別の実施形態において、Ｂａｘ、ＢａｋおよびＬＤＨを標的にするＲＮＡエフェクター分子は、１つまたは複数の、追加のＲＮＡエフェクター分子および／または物質と併用して投与できる。Ｂａｘ、ＢａｋおよびＬＤＨの発現を標的にするＲＮＡエフェクター分子の混合物が本明細書で提供されが、これを、本明細書に記述する追加のＲＮＡエフェクター分子または他の生理活性物質と場合により混合してもよい。
【０２０１】
実施形態のいくつかにおいて、生物由来物質の産生は、ＬＤＨまたはリソソームのＶ型ＡＴＰアーゼ等の細胞のｐＨに影響するタンパク質の発現の調節により増強される。実施形態のいくつかにおいて、生物由来物質の産生は、コフィリン（例えば筋型コフィリン２、または非筋型コフィリン−１）の発現の調節により増強される。
【０２０２】
実施形態のいくつかにおいて、生物由来物質の産生は、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ４、ＰＴＥＮまたはＬＤＨ等の炭素代謝または輸送に影響するタンパク質の発現の調節により増強される。例えば、標的がＰＴＥＮである場合、卵細胞にＲＮＡエフェクター分子を接触させることができるが、このＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が、配列番号：３１５４４９３−３１５４５２２（センス）および配列番号：３１５４５２３−３１５４５５２（アンチセンス）からなる群から選択されるヌクレオチド配列のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む。
【０２０３】
実施形態のいくつかにおいて、生物由来物質の産生は、アポＥ、マンノース／ＧａｌＮＡｃ受容体およびＥｒｉ１等の宿主細胞のＲＮＡエフェクター分子の取込みまたは効率に影響するタンパク質の発現の調節により増強される。様々な実施形態において、細胞へのＲＮＡｉ取込みまたは効率に影響する、１つまたは複数のタンパク質の発現は、本明細書に提供された方法と同時に、本明細書に記述したような１つまたは複数の追加の標的遺伝子の調節によって調節され、１つまたは複数の追加の標的遺伝子の調節の程度および／または広がりを増強するためである。
【０２０４】
実施形態のいくつかにおいて、生物由来物質の産生は、増殖停止および生産力の増強の原因となる、宿主細胞のストレス応答の誘導により増強される。ストレス応答は、例えば、栄養入手の制限、溶質濃度の増加、または温度もしくはｐＨを下げること、および酸化ストレスにより誘導できる。生産能の増加とともに、ストレス応答はタンパク質の折り畳みと分泌にも悪影響を与え得る。実施形態のいくつかにおいて、そのような悪影響は、ストレス応答タンパク質、例えば本明細書に記述したタンパク質の折り畳みおよび／または分泌に影響するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現の調節により改善する。
【０２０５】
実施形態のいくつかにおいては、生物由来物質の産生は、細胞骨格構造に影響するタンパク質の発現を調節することにより、例えば単量体アクチンと繊維状アクチン間の平衡状態を変更することにより増強される。一実施形態において、標的遺伝子はコフィリンをコードし、ＲＮＡエフェクター分子はコフィリンの発現を抑制する。一実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子の少なくとも１つは、細胞質のアクチンキャップタンパク質（ＣａｐＺ）、エズリン（ＶＩＬ２）およびラミニンＡからなる群から選択される標的遺伝子の発現を増加させる。
【０２０６】
ＲＮＡエフェクター分子による標的遺伝子の発現の調節（例えば抑制）は、さらに第二のＲＮＡエフェクター分子を導入することにより緩和でき、第二のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一部分は、宿主細胞内のＲＮＡｉを媒介するタンパク質をコードする標的遺伝子に相補的である。例えば、標的遺伝子の発現の調節は、細胞のＲＮＡｉ経路のアルゴノートタンパク質（例えばアルゴノート−２）または他の構成成分の発現を抑制するＲＮＡエフェクター分子を細胞に導入することにより緩和できる。一実施形態において、生物由来物質を標的とする第一のＲＮＡエフェクター分子を細胞に接触させることにより生物由来物質を一時的に抑制する。その後、生物由来物質の発現の抑制を、細胞のＲＮＡｉ経路のタンパク質をコードする遺伝子を標的とする第二のＲＮＡエフェクター分子を導入することにより緩和する。
【０２０７】
また、所望の生物由来物質の産生を、生産相においてＲＮＡエフェクター分子を細胞に導入し、タンパク質発現、翻訳後修飾、折り畳み、分泌および／または所望の生物由来物質の産生および／または回収に関する他のプロセスに影響するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を調節することにより増強できる。あるいは、生物由来物質の産生を、細胞増殖および／または細胞分裂を抑制するＲＮＡエフェクター分子を、生産相において細胞に導入することにより増強する。
【０２０８】
追加の標的遺伝子には、ｍｉＲＮＡアンタゴニスト、例えばダイサー（ｄｉｃｅｒ１、リボヌクレアーゼＩＩＩ型）を含む。ダイサーがノックダウンされると、感染率の増加につながるため、ｍｉＲＮＡアンタゴニストはある種のウイルスの細胞内での増殖が不良である原因であるかどうかを判断するために使用でき（Ｍａｔｓｋｅｖｉｃｈら、８８  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２６２７−３５（２００７）、ｍｉＲＮＡアンタゴニストの発現は、対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節されるが、このＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が、配列番号３１５６０５９−３１５６１０６（センス）および配列番号３１５６１０７−３１５６１５４（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む；または、追加の標的遺伝子は、ＩＳＲＥ含有プロモーターにＴＦを近づけないためのデコイとしてのＩＳＲＥ（インターフェロン刺激応答エレメント）を含む。
【０２０９】
複数の異なるＲＮＡエフェクター分子が卵へ導入され、１つまたは複数の標的遺伝子を調節する。一実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子はウイルス産物の産生の間に投与される。別の実施形態において、複数の異なるＲＮＡエフェクター分子を卵内の細胞に接触させ、ＰＴＥＮ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＢＡＫ１、ＦＮ１、ＬＤＨＡ、ＩＦＮおよび／またはＩＦＮＡＲ１遺伝子発現の調節できるようにする。エフェクター分子はウイルス産生の間に同時投与することができ、場合により、追加の遺伝子または物質を含み得る。
【０２１０】
複数の異なるＲＮＡエフェクター分子を、１つまたは複数の標的遺伝子発現を調節するために使用する場合、複数のＲＮＡエフェクター分子を卵細胞に同時にまたは別々に接触させる。また、ＲＮＡエフェクター分子それぞれの投与計画があってもよい。例えば、複数のＲＮＡエフェクター分子を含む組成物を調製して、細胞に接触させてもよい。あるいは、一度に１つのＲＮＡエフェクター分子を卵に投与してもよい。このように、特定のＲＮＡエフェクター分子の投与頻度を変更して、各標的遺伝子に対して所望の平均パーセント抑制を容易に調整できる。例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の完全抑制（例えば８０％を超える抑制）は、ウイルス物質の産生を大きく改善するのに、常に必要というわけではなく、ある条件下では卵細胞の生存度に有害にさえなりえる。したがってＬＤＨを標的とするＲＮＡエフェクター分子を低頻度で（例えば、回数を少なく）、または、他のＲＮＡエフェクター分子の投与量よりも低用量で（例えば、ＩＣ５０以上の用量の数分の１で）細胞に接触させることが望ましい場合がある。方法を簡易にし、汚染の可能性を無くすため、異なるＲＮＡエフェクター分子の混合物を投与して必要となる投与回数を減らし、卵に不純物が混入する機会を最小にするのが好ましいであろう。
【０２１１】
さらに、タンパク質産生を、サイクリン（例えばＣＤＣ２）またはサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）等の宿主細胞の細胞周期に影響するタンパク質の発現の調節により増強できる。例えば、サイクリン依存性キナーゼは、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、Ｐ１０、Ｐ２１、Ｐ２７、ｐ５３、Ｐ５７、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｐ１４ＡＲＦおよびＣＤＫ４であり得る。したがって、例えば、細胞周期進行に影響する１つまたは複数のタンパク質の発現は、ウイルス産物の発現および回収を増強するために、ウイルスタンパク質産生の増殖相および／または生産相中に一時的に調節することができる。特定の実施形態では、ＣＤＫＮ１遺伝子を標的にするＲＮＡエフェクター分子を提供する。
【０２１２】
翻訳後のプロセシング
翻訳後修飾では、修飾されたポリペプチドと無修飾のポリペプチドを選別する追加のバイオプロセスステップが必要となる場合があるが、これにより生物由来物質産生のコストが増加し効率が減少する。したがって、実施形態のいくつかにおいては、細胞内でのポリペプチド物質の産生を、翻訳後修飾に影響するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を調節することにより増強する。追加の実施形態において、生物由来物質の産生は、第一の翻訳後修飾に影響するタンパク質をコードする第一の標的遺伝子の発現の調節、および第二の翻訳後修飾に影響するタンパク質をコードする第二の標的遺伝子の発現の調節により増強される。
【０２１３】
より具体的には、真核細胞内で発現されたタンパク質は、生物由来物質の産生ならびに／または構造、生物活性、安定性、同質性および／もしくは他の特質を障害し得る翻訳後修飾をいくつか受け得る。これらの修飾の多くは、細胞増殖およびポリペプチドの発現中に自然に生じ、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、所与のポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末端等のいくつかの部位で生じ得る。さらに、所与のポリペプチドは異なるタイプの修飾を複数受け得る。例えば、トリおよび哺乳類細胞で発現されたタンパク質は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ユビキチン化、メチオニン酸化、ジスルフィド結合形成、メチレーション、脱メチル化、硫酸化、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、ミリストイル化、酸化、タンパク質プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、グルコノイル化、配列突然変異、Ｎ末端のグルタミン閉環ならびにアミド分解、およびアスパラギンアミド分解を受け得る。Ｎ末端のアスパラギンアミド分解はＮ末端のアスパラギンアミダーゼを標的とするＲＮＡエフェクター分子を細胞に接触させることにより調節できる。
【０２１４】
実施形態のいくつかにおいては、タンパク質の産生は、タンパク質アミド分解に関与するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現の調節により増強する。タンパク質は、Ｎ末端のグルタミンの閉環およびアミド分解、およびアスパラギンのアミド分解等のいくつかの経路を経由してアミド分解できる。したがって、一実施形態において、タンパク質のアミド分解に関与するタンパク質はＮ末端アスパラギンアミドヒドラーゼである。タンパク質のアミド分解により、構造的特質が変更され、力価、生物活性、効率が減少し、免疫原性および／または他の望ましくない特質が増加する。タンパク質のアミド分解は、いくつかの方法によって測定することができ、電荷に基づくタンパク質の分離、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、等電点分離法、キャピラリー電気泳動法、天然ゲル電気泳動法、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、質量分析法またはＬ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの利用等の方法があるが、これらに限定されない。
【０２１５】
生物由来物質が、ウイルス表面膜タンパク質を有するウイルス産物、またはグリコシル化されたアミノ酸残基があるモノクローナル抗体等の糖タンパク質を含む場合、生物由来物質の産生は、タンパク質糖鎖形成に関与するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現の調節により増強される。グリコシル化パターンは、哺乳類の糖タンパク質の構造および機能の重要な決定因子であることが多く、糖タンパク質の溶解性、熱安定性、プロテアーゼ酵素耐性、抗原性、免疫原性、血清半減期、安定性および生物活性に影響する。
【０２１６】
様々な実施形態において、グリコシル化に影響するタンパク質は次からなる群から選択される：ドリキル−ジホスホオリゴサッカライド−タンパク質グリコシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｇａｌ：βＧｌｃＮＡｃβ１、４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ガラクトース−セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、タンパク質Ｏフコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、特にＴ４、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｏ結合型Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼ。
【０２１７】
さらなる実施形態において、糖タンパク質の産生を、シアリダーゼまたはシアリルトランスフェラーゼ酵素の発現の調節により増強する。糖タンパク質の末端のシアル酸残基は、糖タンパク質の溶解性、熱安定性、プロテアーゼ攻撃に対する抵抗性、抗原性および比活性を決定する特に重要な因子である。例えば、末端のシアル酸が血清糖タンパク質から除去される場合、シアル酸が付加された対照物と比較して、脱シアル化タンパク質の生物活性は著しく減少し、循環性半減期も低下する。糖タンパク質のシアル酸の量は、２つの対立するプロセス、すなわちシアリルトランスフェラーゼによるシアル酸の細胞内付加およびシアリダーゼによるシアル酸の除去により決定される。したがって、実施形態のいくつかにおいて、糖タンパク質の産生を、シアリダーゼの発現の抑制および／またはシアリルトランスフェラーゼの発現の活性化により増強する。
【０２１８】
実施形態のいくつかにおいて、タンパク質の産生は、Ｎ末端のグルタミン残基を分子内環化させピログルタミン酸への変換を触媒し、アンモニアを遊離する（ピログルタミン酸化）、グルタミニルシクラーゼ発現の調節により増強される。グルタミニルシクラーゼは細胞にグルタミニルシクラーゼ遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子を接触させることにより調節できる。
【０２１９】
実施形態のいくつかにおいて、ジスルフィド結合を含むタンパク質の産生を、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼまたはスルフヒドリルオキシダーゼ等の、ジスルフィド結合の酸化、還元および／または異性化に影響するタンパク質の発現の調節により増強される。ジスルフィド結合形成は、組み換え細胞内の多重サブユニットタンパク質またはペプチドの産生に対して特に問題となり得る。多重サブユニットタンパク質またはペプチドには、受容体、細胞外マトリクスタンパク質、免疫調節剤があり、例えばＭＨＣタンパク質、完全抗体および抗体断片、酵素ならびに膜蛋白等がある。
【０２２０】
実施形態のいくつかにおいて、タンパク質の産生はメチオニン酸化に影響するタンパク質の発現の調節により増強される。活性酸素（ＲＯＳ）はメチオニン（Ｍｅｔ）をメチオニンスルホキシド（ＭｅｔＯ）に酸化させ、分解および産物の不均一性を増加させ生物活性および安定性を減少させる。実施形態のいくつかにおいて、標的遺伝子は、ＭｅｔＯ残基のメチオニンへの還元を触媒するメチオニンスルホキシド還元酵素をコードする。
【０２２１】
工業規模で卵内で産生された生物由来物質（ある種の生弱毒ウイルスを含む）は典型的には、卵細胞により分泌され、周囲の細胞外環境から回収され、精製される。一般的に、タンパク質産生の速度および回収されたタンパク質の収量は、宿主細胞によるタンパク質の折り畳みと分泌の速度に直接関係がある。例えば、宿主細胞の小胞体（ＥＲ）に誤って折り畳まれたタンパク質が蓄積すると、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）経路を経由した分泌が遅くなるか、または止まる。ＵＰＲは、過剰な非折り畳みタンパク質を検出するＥＲ膜のストレス感知タンパク質により引き起こされる。ＵＰＲの活性化により、誤って折り畳まれたタンパク質に結合し、正常な折り畳みを促進するシャペロンタンパク質（例えばＢｉｐ）の発現上昇が誘導される。さらに、ＵＰＲ活性化により転写因子ＸＢＰ−１およびＣＨＯＰの発現が上昇する。ＣＨＯＰは、一般的には、細胞の増殖、分化および生存の負の制御因子として機能し、ＵＰＲにより発現が上昇すると、細胞周期を停止させ、タンパク質の折り畳みと分泌の速度を速め、折り畳まれていない過剰な非折り畳みタンパク質を細胞から除去する。よって、細胞周期はまず促進され、次にウイルス生産相中に抑制され、ウイルス産物の収量を増加させる。宿主細胞による免疫原性タンパク質分泌の速度の上昇は、例えば、卵内にあるタンパク質の量を経時的にモニターすることにより測定することができる。
【０２２２】
本発明は、発育卵内の細胞によるタンパク質の分泌に影響するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現の調節により、卵細胞内で分泌されたポリペプチドの産生を増強する方法を提供する。実施形態のいくつかにおいて、標的遺伝子は、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ４、ＡＴＦ６、ｅＩＦ２α、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４、カルレチキュリンまたはその変異体等のＵＰＲ経路のタンパク質、または転写調節因子（例えばシス作用性ＵＰＲ因子（ＵＰＲＥ））等のＵＰＲ経路を調節するタンパク質をコードする。実施形態のいくつかにおいて、タンパク質分泌に影響するタンパク質は、ガンマセクレターゼ、ｐｌ１５、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）タンパク質、セクレチンおよびキナーゼ（例えばＭＥＫ）からなる群から選択される。
【０２２３】
実施形態のいくつかにおいて、タンパク質分泌に影響するタンパク質は次からなる群から選択される分子シャペロンである：Ｈｓｐ４０、ＨＳＰ４７、ＨＳＰ６０、Ｈｓｐ７０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ１００、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、ペプチジルプロリルイソメラーゼ、カルネキシン、Ｅｒｐ５７、およびＢＡＧ−１。
【０２２４】
卵内の生物由来物質の産生は、生物由来物質への、または生物由来物質に特異的に結合する分子または因子への親和性を有するタンパク質により負の影響を受け得る。例えば、いくつかの異種タンパク質は宿主細胞表面の糖タンパク質、ヘパリンおよびヘパラン硫酸に結合することが示されている。これは、ヘパリン、ヘパラン硫酸および／またはヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質と組換えタンパク質産物との同時精製につながり、回収されるタンパク質の収量を減少させ、同質性、安定性、生物活性および／または他の特質を損なう原因となる。一実施形態において、ヘパリンおよび／またはヘパラン硫酸のレベルは、ヘパリンおよび／またはヘパラン硫酸の産生に関与する宿主細胞の酵素、例えば宿主細胞のキシロシルトランスフェラーゼ等の発現の調節により減少させる。
【０２２５】
実施形態のいくつかにおいて、例えば、生物由来物質がインフルエンザウイルス等のウイルスである場合、標的遺伝子は宿主細胞表面からのシアル酸の減少に関与する遺伝子である。このため、ウイルス結合が減少し、細胞外環境からのウイルス回収が増加する（すなわち、宿主細胞膜に結合し続けるウイルスが減少する）。これらの標的には、溶質輸送体ファミリー３５（ＣＭＰ−シアル酸輸送体）メンバーＡ１（ＳＬＣ３５Ａ１、これは、対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節され、このＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が、配列番号３１５４３４５−３１５４３６８（センス）および配列番号３１５４３６９−３１５４３９２（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む）；溶質輸送体ファミリー３５（ＵＤＰ−ガラクトース輸送体）メンバーＡ２（ＳＬＣ３５Ａ２）；ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）、これは対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節され、このＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が、配列番号３１５４２９７−３１５４３２０（センス）および配列番号３１５４３２１−３１５４３４４（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む）；シチジンモノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（Ｃｍａｓ）、これは対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節され、このＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が配列番号３１５４２４９−３１５４２７２（センス）および配列番号３１５４２７３−３１５４２９６（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む）；ＵＤＰ−Ｇａｌ：βＧｌｃＮＡｃβ１、４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧａｌＴ１、これは対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節され、このＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が配列番号３１５４１５３−３１５４１７６（センス）および配列番号３１５４１７７−３１５４２００（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む）；およびＵＤＰ−Ｇａｌ：βＧｌｃＮＡｃβ１、４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ポリペプチド６（Ｂ４ＧａｌＴ６）、これは対応するＲＮＡエフェクター分子の使用により調節され、このＲＮＡエフェクター分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、一方の鎖が配列番号３１５４２０１−３１５４２２４（センス）および配列番号：３１５４２２５−３１５４２４８（アンチセンス）のヌクレオチドが少なくとも１６個隣接したヌクレオチド（例えば少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含���。
【０２２６】
インフルエンザが細胞表面のシアル酸残基に結合するため、シアリダーゼを減少させると感染率または精製率を増加させることができる。したがって、追加の標的には、トリ細胞の宿主シアリダーゼに関与するものでもよく（Ｗａｎｇら、１０  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５１２（２００９）を参照）、ＮＥＵ２シアリダーゼ２（細胞基質シアリダーゼ）（ＧｅｎｅＩＤ：４３０５４２）およびＮＥＵ３シアリダーゼ３（膜シアリダーゼ）（ＧｅｎｅＩＤ：６８８２３）がある。追加の標的遺伝子には、ｍｉＲＮＡアンタゴニスト、例えばダイサー（ダイサー１、リボヌクレアーゼＩＩＩ型）を含む。ダイサーがノックダウンされると、ある程度の感染率の増加につながるため、ｍｉＲＮＡアンタゴニストはある種のウイルスの細胞内での増殖が不良である原因であるかどうかを判断するために使用できる（Ｍａｔｓｋｅｖｉｃｈら、８８  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２６２７−３５（２００７））；または、追加の標的遺伝子は、ＩＳＲＥ含有プロモーターにＴＦを近づけないデコイとしてのＩＳＲＥ（インターフェロン刺激応答エレメント）を含む。
【０２２７】
工業規模でポリペプチド等の生物由来物質を生産するためにバイオプロセスを利用する場合、活性ウイルス粒子および他の外来性の物質（例えばプリオン）等の病原体の存在が障害となることが多く、規制手順に合致させるため、病原体の検出、除去（例えばウイルスろ過）および／または不活性化（例えば加熱処理）等の高コストで時間のかかる手段を取らねばならないことも多い。このようなウイルスを検出しモニターすることは困難であるため、この問題はさらに深刻なものとなる。したがって、実施形態のいくつかにおいて、病原性の感染に対する宿主細胞の感受性に影響する標的遺伝子の発現の調節により、生物由来物質の産生を増強するための方法が提供される。例えば、実施形態のいくつかにおいて、標的遺伝子はウイルス感染を媒介する宿主細胞タンパク質であり、例えば膜貫通型タンパク質ＸＰＲ１、ＲＤＲ、Ｆｌｖｃｒ、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＣＤ４、Ｐｉｔ１およびＰｉｔ２である。
【０２２８】
標的配列は一般的に１０〜３０ヌクレオチド長であるが、任意の所与の標的ＲＮＡの切断を指示するための特定の配列はこの範囲内で様々である。本明細書にある様々なパッケージソフトおよびガイドラインは、任意の所与の遺伝子標的に最適な標的配列を同定するための指針となるが、経験的アプローチを取ってもよく、所与の大きさ（非限定的な例として、２１ヌクレオチド）の「ウィンドウ」または「マスク」を、標的ＲＮＡ配列に、文字通りまたは比喩的に（例えばコンピュータで）置き、標的配列として使用できる大きさの範囲にある配列を同定する。可能な配列の完全なセットが、選択した所与の標的の大きさに対して同定されるまで、配列「ウィンドウ」を最初の標的配列の場所から上流、または下流にヌクレオチド１つ分ずつ連続的に移動させて、候補となる標的配列を同定できる。このプロセスに、同定された配列の体系的な合成と、この配列が最適であるかどうか確認する試験（本明細書に記述した、または当該技術分野において周知の分析を使用）と組み合わせると、ＲＮＡエフェクター分子剤の標的となった場合、標的遺伝子発現の最良の抑制を媒介するＲＮＡ配列を同定できる。したがって本明細書で同定した配列は有効な標的配列を表すが、所与の配列の上流、または下流にヌクレオチド１つ分ずつ連続的に「ウィンドウを動かす」ことにより、抑制特性が同等である、またはより優れている配列を同定して抑制効率をさらに最適化することも考えられる。
【０２２９】
さらに、ヌクレオチドを系統的に付加するか除去し、より長い、またはより短い配列を産生して、これらと、長いまたは短いサイズのウィンドウを標的ＲＮＡのこのポイントから上へ、または下へ少しずつ動かすことにより作成した配列とを試験して、本明細書で同定された任意のオリゴヌクレオチドをさらに最適化することも考えられる。新しい候補標的を産生するためのこの手法と、当該技術分野において周知の、または本明細書で記述した抑制分析を用いた、標的配列に基づいたＲＮＡエフェクター分子の有効性の試験とを合わせて、抑制効率のさらなる改善につなげることができる。また、このような最適化された配列を、例えば、本明細書に記述した、または当該技術分野において周知の修飾ヌクレオチドの導入、突出の付加もしくは変更、または本明細書に記述する、または当該技術分野において周知の他の修飾により調節し、発現阻害剤として分子をさらに最適化（例えば血清安定性または循環半減期の増加、熱安定性の増加、膜貫通送達の強化、特定の部位または細胞型に対する標的指向化、サイレンシング経路の酵素との相互作用の増加、エンドソームからの遊離増加、等）できる。
【０２３０】
ＩＩＩ．バイオコンタミネーション
トリ白血病ウイルスおよび内在性鳥ウイルスの証拠は、ニワトリ細胞由来のワクチン内で同定された。Ｔｓａｎｇら、１９９９。よって、本発明の実施形態では、内在性鳥ウイルスの発現を抑制するＲＮＡエフェクター分子の利用が提供される。そのような内在性ウイルスには、トリのクラスＩＩＩの内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）、Ｓｐｕｍａ様ＥＲＶ  ｇｇ０１−ｃｈｒ７−７１６３４６２、ｇｇ０１−ｃｈｒＵ−５２１９０７２５およびｇｇ０１−Ｃｈｒ４−４８１３０８９４；トリαＥＲＶ  ＡＬＶ（ＡＬＶ  ｐｏｌ  ＧｅｎｅＩＤ：１４９１９１０、ＡＬＶ  ｐ２、ＧｅｎｅＩＤ：１４９１９０９、ＡＬＶｐ１０、ＧｅｎｅＩＤ：１４９１９０８およびＡＬＶ  ｅｎｖ、ＧｅｎｅＩＤ：１４９１９０７；ＡＬＶ膜貫通型タンパク質、ｔｍ、ＧｅｎｅＩＤ：１４９１９０６；ＡＬＶトランス活性化因子、ＧｅｎｅＩＤ：１４９１９１１）およびｇｇ０１−ｃｈｒ１−１５１６８８４５；トリ媒介β様ＥＲＶ  ｇｇ０１−ｃｈｒ４−７７３３８２０１、ｇｇ０１−ＣｈｒＵ−１６３５０４８６９およびｇｇ０１−ｃｈｒ７−５７３３７８２がある。
【０２３１】
本発明の方法が標的とし得る潜在ＤＮＡウイルスには、アデノウイルスがある。例えば、トリアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）タンパク質は特定病原体除去のニワトリにより産生され、トリＡＡＶはニワトリの生殖系に潜伏感染していることが示されている。Ｓａｄａｓｉｖら、３３  Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．１２５−３３（１９８９）；さらにＫａｔａｎｏら、３６  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ．６７６−８０（２００４）を参照のこと。本発明の実施形態のいくつかにおいて、標的遺伝子は潜在ＤＮＡウイルスである。
【０２３２】
「外来ウイルス」または「外来性ウイルス物質」は、生物由来物質内に存在するウイルス混入物を指し、例えば、ワクチン、細胞株、および他の細胞由来の産物がある。ワクチン産物に関して、例えば、外因性、外来性のＡＬＶは、ニワトリとアヒルの胚繊維芽細胞培養で増殖させた、異なる製造者による市販のマレック病ワクチンにおいて発見された。さらに、これらのワクチンのうちのいくつかには内在性のトリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）も混入していた。Ｆａｄｌｙら、５０  Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３８０−８５（２００６）；ＺａｖａｌａおよびＣｈｅｎｇ、５０  Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２０９−１５（２００６）。
【０２３３】
ＩＶ．ＲＮＡエフェクター修飾
本発明の実施形態のいくつかにおいて、オリゴヌクレオチド（例えばＲＮＡエフェクター分子）は安定性または他の有益な特性を増強するために化学的に修飾される。一実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は化学的に修飾されない。オリゴヌクレオチドを修飾することで、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの急速分解を防ぎ、かつ望ましくない非特異的な影響を回避できる。
【０２３４】
本発明で注目する核酸は、当該技術分野において確立された方法、例えばＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＮＵＣＬ．ＡＣＩＤ  ＣＨＥＭ．に記述された方法によって合成かつ／または修飾できる。（Ｂｅａｕｃａｇｅら、編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ）。修飾には、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、結合、逆向き結合等）、または３’末端修飾（結合、ＤＮＡヌクレオチド、逆向き結合等）；（ｂ）塩基修飾、例えば安定化塩基、不安定化塩基、または分子的基盤、結合相手のレパートリーが拡張した塩基対の塩基、塩基除去（脱塩基ヌクレオチド）、または結合塩基；（ｃ）糖修飾（例えば、２’位置または４’位置での）または糖の置換；また、（ｄ）ホスホジエステル結合の修飾または置換等のヌクレオシド間の結合修飾。本発明に有益な特定のオリゴヌクレオチドには、主鎖を修飾した、または非天然のヌクレオシド間結合を有するＲＮＡがあるが、これに限定されない。主鎖を修飾したＲＮＡのなかには主鎖にリン原子を有していないものがある。本発明に有益な特定のオリゴヌクレオチドには、修飾または非天然のヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドがあるが、これに限定されない。ヌクレオシド間結合を修飾したオリゴヌクレオチドのなかにはヌクレオシド間結合にリン原子を有していないものがある。この明細書の目的のため、および当該技術分野において時折言及されるように、ヌクレオシド間結合にリン原子を有していない修飾オリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオシドであると考えられる。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合にリン原子を有するであろう。この明細書の目的のため、および当該技術分野において時折言及されるように、ヌクレオシド間主鎖にリン原子を有していない修飾ＲＮＡも、オリゴヌクレオチドであると考えられる。特定の実施形態において、修飾ＲＮＡは、そのヌクレオシド間主鎖にリン原子を有するであろう。
【０２３５】
修飾ヌクレオシド間結合（例えばＲＮＡ主鎖）には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネート等のメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィナート、３’−アミノホスホロアミダートをおよびアミノアルキルホスホロアミダート等のホスホロアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３’−５’結合のボラノリン酸、この２’−５’結合類似体、および極性が反転しており、ヌクレオシド単位の隣接ペアが３’−５’から５’−３’に、または、２’−５から５’−２’に結合しているボラノリン酸がある。様々な塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。
【０２３６】
上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な特許には、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９５号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３１６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；第５，６２５，０５０号；第６，０２８，１８８号；第６，１２４，４４５号；第６，１６０，１０９号；第６，１６９，１７０号；第６，１７２，２０９号；第６，２３９，２６５号；第６，２７７，６０３号；第６，３２６，１９９号；第６，３４６，６１４号；第６，４４４，４２３号；第６，５３１，５９０号；第６，５３４，６３９号；第６，６０８，０３５号；第６，６８３，１６７号；第６，８５８，７１５号；第６，８６７，２９４号；第６，８７８，８０５号；第７，０１５，３１５号；第７，０４１，８１６号；第７，２７３，９３３号；第７，３２１，０２９号；およびＲＥ３９４６４号明細書があるが、これらに限定されない。
【０２３７】
リン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合（例えばＲＮＡ主鎖）は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルのヌクレオチド間結合、異種原子およびアルキルもしくはシクロアルキルの混合ヌクレオシド間結合、または１つまたは複数の短鎖異種原子もしくは複素環のヌクレオシド間結合から形成されるヌクレオチド間の結合を有する。また、モルフォリノ結合、（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；フォルムアセチルおよびチオフォルムアセチル主鎖；メチレンフォルムアセチルおよびチオフォルムアセチル主鎖；アルケンを含む主鎖；スルファマート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨主鎖；スルホン酸およびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖を含むもの、および他のＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を混合したものもある。
【０２３８】
上記のオリゴヌクレオチドの調製を教示する代表的な特許には米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５、６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；および第５，６７７，４３９号明細書があるが、これに限定されない。
【０２３９】
オリゴヌクレオチドを修飾することで、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの急速分解を防ぎ、かつ望ましくない非特異的な影響を回避できる。例えば米国特許出願公開第２００９／００６２２２５号明細書を参照のこと。別の化学的な方法を使用してエキソ／エンドヌクレアーゼの軽鎖を修飾できる。例えば（ａ）エキソ／エンド軽センス鎖：全ピリミジンの２’−Ｏ−メチル、（５’末端から数えて）ヌクレオチド２０と２１の間のＰＴＯ、３’末端のｄＴｄＴ（ヌクレオチド２０および２１）、エキソ／エンド軽アンチセンス鎖：５’−ＵＡ−３’および５’−ＣＡ−３’モチーフのピリミジンの２’−Ｏ−メチル、（５’末端から数えて）ヌクレオチド２０と２１の間のＰＴＯ、３’末端（ヌクレオチド２０および２１）のｄＴｄＴ；エキソ／エンド軽鎖およびアンチセンス鎖の位置２の２’−Ｏ−メチル（５’末端に５’−ＵＡ−３’および、５’−ＣＡ−３’がない場合のみ、これ以外はすでにエキソ／エンド軽によってカバーされている）（ｃ）エキソ／エンド軽鎖およびセンス鎖の位置２の２’−Ｏ−メチル（位置２にピリミジンがない場合のみ、他はエキソ／エンド軽鎖によりカバーされている）および（ｄ）エキソ／エンド軽鎖およびセンスとアンチセンス鎖の位置２の２’−Ｏ−メチル（（ａ）（ｂ）、および（ｃ）によってカバーされていない場合のみ）。
【０２４０】
ＲＮＡエフェクター分子での使用に適切な、または使用を考慮した他の修飾オリゴヌクレオチドでは、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合、すなわち主鎖の両方を新規の基と置換する。塩基単位は適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このようなオリゴマー化合物のひとつで、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているＲＮＡ模倣体はペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、ＲＮＡの糖主鎖がアミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換されている。核酸塩基は保持され、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的に、または間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な特許には、米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；および第５，７１９，２６２号明細書があるがこれに限定されない。ＰＮＡ化合物の教示は他にも、例えばＮｉｅｌｓｅｎら、２５４  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １４９７−１５００（１９９１）に見出すことができる。
【０２４１】
本発明で注目する実施形態のいくつかでは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチド、および異種原子主鎖を有するオリゴヌクレオチドが含まれ、特に、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られる］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［ここで天然のホスホジエステルヌクレオシド間結合は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される］（米国特許第５，４８９，６７７号明細書を参照）、およびアミド主鎖（米国特許第５，６０２，２４０号明細書を参照）を有するオリゴヌクレオチドがある。実施形態のいくつかにおいて、本明細書で注目するオリゴヌクレオチドにはモルフォリノ主鎖構造がある（米国特許第５，０３４，５０６号明細書を参照）。
【０２４２】
修飾オリゴヌクレオチドはさらに置換された糖成分を１つまたは複数含み得る。本明細書で注目するＲＮＡエフェクター分子、例えばｄｓＲＮＡは、２’位置で下記のうちの１つを含み得る：Ｈ（デオキシリボース）；ＯＨ（リボース）；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル、またはＣ２〜Ｃ１０のアルケニルおよびアルキニルに置換されても、置換されなくてもよい。適切な修飾の代表例にはＯ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２があり、ここでｎとｍは１〜１０である。実施形態のいくつかにおいて、オリゴヌクレオチドは、２’位置で下記のうちの１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、干渉物質、オリゴヌクレオチド（例えばＲＮＡエフェクター分子）の薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチド（例えばＲＮＡエフェクター分子）の薬力学特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。実施形態のいくつかにおいて、修飾には２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル））または２’−ＭＯＥとしても知られる２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Ｍａｒｔｉｎら、７８  Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ４８６−５０４（１９９５））、すなわち、アルコキシ−アルコキシ基がある。別の代表的な修飾には２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち本明細書の以下の例でおいて記述するように、２’−ＤＭＡＯＥとして知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとして当該技術分野において周知、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２である）がある。
【０２４３】
他の修飾には２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）がある。オリゴヌクレオチドの他の位置、特に、３’末端のヌクレオチドの糖の３’位置、または２’−５’結合オリゴヌクレオチド、および５’末端のヌクレオチドの５’位置でも同様に修飾できる。オリゴヌクレオチドにはさらにペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル成分等の糖模倣体を含み得る。このような修飾糖構造の調製を教示する代表的な特許には、米国特許第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；および第５，７００，９２０号明細書があり、この中のいくつかの特許は本出願と共有である。
【０２４４】
オリゴヌクレオチド（例えばＲＮＡエフェクター分子）はさらに核酸塩基（当該技術分野において単に「塩基」と呼ばれることが多い）の修飾または置換を含み得る。本明細書で使用される場合、「無修飾の」、「天然の」核酸塩基はブリン塩基のアデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）およびピリミジン塩基のシトシン（Ｃ）とウラシル（ウラシル）を含む。
【０２４５】
修飾核酸塩基には他の合成および天然の核酸塩基を含み、例えば以下のようなものがある。イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ネブラリン、イソグアノシン、ツベルシジン、２−（ハロ）アデニン、２−（アルキル）アデニン、２−（プロピル）アデニン、２（アミノ）アデニン、２−（アミノアルキル）アデニン、２（アミノプロピル）アデニン、２（メチルチオ）Ｎ６（イソペンテニル）アデニン、６（アルキル）アデニン、６（メチル）アデニン、７（デアザ）アデニン、８（アルケニル）アデニン、８−（アルキル）アデニン、８（アルキニル）アデニン、８（アミノ）アデニン、８−（ハロ）アデニン、８−（ヒドロキシル）アデニン、８（チオアルキル）アデニン、８−（チオール）アデニン、Ｎ６−（イソペンチル）アデニン、Ｎ６（メチル）アデニン、Ｎ６、Ｎ６（ジメチル）アデニン、２−（アルキル）グアニン、２（プロピル）グアニン、６−（アルキル）グアニン、６（メチル）グアニン、７（アルキル）グアニン、７（メチル）グアニン、７（デアザ）グアニン、８（アルキル）グアニン、８−（アルケニル）グアニン、８（アルキニル）グアニン、８−（アミノ）グアニン、８（ハロ）グアニン、８−（ヒドロキシル）グアニン、８（チオアルキル）グアニン、８−（チオール）グアニン、Ｎ（メチル）グアニン、２−（チオ）シトシン、３（デアザ）５（アザ）シトシン、３−（アルキル）シトシン、３（メチル）シトシン、５−（アルキル）シトシン、５−（アルキニル）シトシン、５（ハロ）シトシン、５（メチル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（トリフルオロメチル）シトシン、６−（アゾ）シトシン、Ｎ４（アセチル）シトシン、３（３アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル、２−（チオ）ウラシル、５（メチル）２（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２（チオ）ウラシル、４−（チオ）ウラシル、５（メチル）４（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−４（チオ）ウラシル、５（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２，４（ジチオ）ウラシル、５（２−アミノプロピル）ウラシル、５−（アルキル）ウラシル、５−（アルキニル）ウラシル、５−（アリルアミノ）ウラシル、５（アミノアリル）ウラシル、５（アミノアルキル）ウラシル、５（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル、５−（シアノアルキル）ウラシル、５−（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５−（ハロ）ウラシル、５−（メトキシ）ウラシル、ウラシル−５オキシ酢酸、５（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル、５（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（トリフルオロメチル）ウラシル、６（アゾ）ウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ３（メチル）ウラシル、５−ウラシル（すなわち偽ウラシル）、２（チオ）偽ウラシル、４（チオ）偽ウラシル，２，４−（ジチオ）偽ウラシル，５−（アルキル）偽ウラシル、５−（メチル）偽ウラシル、５−（アルキル）−２−（チオ）偽ウラシル、５−（メチル）−２−（チオ）偽ウラシル、５−（アルキル）−４（チオ）偽ウラシル、５−（メチル）−４（チオ）偽ウラシル、５−（アルキル）−２，４（ジチオ）偽ウラシル、５−（メチル）−２，４（ジチオ）偽ウラシル、１置換偽ウラシル、１置換２（チオ）−偽ウラシル、１置換４（チオ）偽ウラシル、１置換２，４−（ジチオ）偽ウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−偽ウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−２（チオ）−偽ウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）偽ウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）偽ウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−偽ウラシル、１（アミノアルキルアミノ−カルボニルエチレニル）−２（チオ）−偽ウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）偽ウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）偽ウラシル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）フェノキサジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノサイアジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノサイアジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−ｌ−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノサイアジン−１−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノサイアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル，７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル，７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノサイアジン−１−イル，７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３（アザ）−フェノサイアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）  −  １，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノサイアジン−１−イル、７−（グアニジンアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノサイアジン−１−イル、１，３，５−（トリアザ）−２，６−（ジオキサ）−ナフタリン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ネブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、イノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、３−（メチル）イソカルボスチリリル、５−（メチル）イソカルボスチリリル，３−（メチル）−７−（プロピニル）イソカルボスチリリル，７−（アザ）インドリル、６−（メチル）−７−（アザ）インドリル，イミダゾピリジニル，９−（メチル）−イミダゾピ��ジニル，ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−（プロピニル）イソカルボスチリリル，プロピニル−７−（アザ）インドリル，２、４、５−（トリメチル）フェニール、４−（メチル）インドリル，４，６−（ジメチル）インドリル，フェニール、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、ジフルオロトリル、４−（フルオロ）−６−（メチル）ベンズイミダゾール，４−（メチル）ベンズイミダゾール，６−（アゾ）チミン、２−ピリジノン、５ニトロインドール、３ニトロピロール、６−（アザ）ピリミジン、２（アミノ）プリン、２，６−（ジアミノ）プリン、５置換ピリミジン、Ｎ２置換プリン、Ｎ６−置換プリン、Ｏ６−置換プリン、置換１，２，４−トリアゾール、ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル，６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−置換−６−フェニール−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルソ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルソ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、およびパラ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルソ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルソ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−７−アミノ−ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−ピリドピリミジン−３−イル、またはそのＯ−アルキル化もしくはＮ−アルキル化誘導体。修飾核酸塩基には、さらに結合成分、例えばリガンドを含む天然の塩基を含む。
【０２４６】
さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号明細書；ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ  ＢＩＯＣＨＥＭ．、ＢＩＯＴＥＣＨ．＆ＭＥＤＩＣＩＮＥ（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ編、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００８）；国際公開第２００９／１２０８７８号パンフレット；ＣＯＮＣＩＳＥ  ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ  ＯＦ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＳＣＩＥＮＣＥ＆ＥＮＧＩＮ．８５８−５９；（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９０）；Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、３０  Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．６１３（１９９１）；Ｓａｎｇｈｖｉ、１５  ＤＳＲＮＡ  ＲＥＳ．＆ＡＰＰＬＳ．２８９−３０２（ＣｒｏｏｋｅおよびＬｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９３）に開示されたものがある。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明で注目するオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有益である。これには５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２，Ｎ−６およびＯ−６置換プリンがあり、例えば２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンがある。５−メチルシトシン置換により０．６〜１．２℃、核酸二本鎖の安定性が増加することが示されており、（Ｓａｎｇｈｖｉ、２７６−７８（１９９３））、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合、特に好ましい塩基置換となる。
【０２４７】
他の修飾核酸塩基と同様に上記の修飾核酸塩基のいくつかの調製を教示する代表的な特許には、上記の米国特許第３，６８７，８０８号；第４，８４５，２０５号；第５，１３０、３０号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１９１号第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；第５，６８１，９４１号；第６，０１５，８８６号；第６，１４７，２００号；第６，１６６，１９７号；第６，２２２，０２５号；第６，２３５，８８７号；第６，３８０，３６８号；第６，５２８，６４０号；第６，６３９，０６２号；第６，６１７，４３８号；第７，０４５，６１０号；第７，４２７，６７２号；および第７，４９５，０８８号；および第５，７５０，６９２号明細書があるがこれに限定されない。
【０２４８】
オリゴヌクレオチドはまた、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）を有するよう修飾できる。ロックド核酸は、修飾リボース成分を有するヌクレオチドであり、リボース成分の２’および４’の炭素が架橋されている。この構造により３’−内の構造的立体配座にリボースを効果的に「固定する」。オリゴヌクレオチド分子にロックド核酸を追加することで、血清内のオリゴヌクレオチド分子の安定性を高め、かつ非特異的な影響を減少させることが示されている。Ｅｌｍｅｎら、３３  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４３９−４７（２００５））；Ｍｏｏｋら、６  Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．８３３−４３（２００７）；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒら  ３１  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１８５−９３（２００３）；米国特許第６，２６８，４９０号；第６，６７０，４６１号；第６，７９４，４９９号；第６，９９８，４８４号；第７，０５３，２０７号；第７，０８４，１２５号；第７，３９９，８４５号明細書。
【０２４９】
ある場合、ＲＮＡエフェクター分子のオリゴヌクレオチドは非リガンド基によって修飾できる。いくつかの非リガンド分子は、活性、細胞分布、またはオリゴヌクレオチドの細胞への取込みを強化するために、オリゴヌクレオチドに結合しているが、そのような結合を実施する手順は科学論文において入手可能である。そのような非リガンド成分には脂質成分、例えばコレステロール（Ｋｕｂｏら、３６５  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．５４−６１（２００７））；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（８６  ＰＮＡＳ  ６５５３（１９８９））；コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、１９９４）；チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、１９９２；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、１９９３）；チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、１９９２）；脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、１９９１；Ｋａｂａｎｏｖら、２５９  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３２７（１９９０）；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、７５  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ７５（１９９３））；リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール、またはトリエチルアンモニウム１、２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、１９９５）；Ｓｈｅａら（１８  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７７７（１９９０））；ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５）；またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９９５）；パルミチル成分（Ｍｉｓｈｒａら、１９９５）；またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール成分（Ｃｒｏｏｋｅら、１９９６）。そのようなＲＮＡ複合物の調製を教示する代表的な米国特許は、本明細書にリストされている。典型的な結合プロトコルには、配列の１つまたは複数の位置でアミノリンカーを有するオリゴヌクレオチドの合成が含まれる。その後、アミノ基は適切なカップリング試薬または活性化試薬を使用して結合した分子と反応させる。結合反応は、固体担体に結合されたままのＲＮＡと、または溶液相中でＲＮＡの切断後に実施できる。高速液体クロマトグラフィーによるＲＮＡ複合物の精製により、典型的には純粋な複合物が産出される。
【０２５０】
代表的なＲＮＡエフェクター分子の核酸配列は、正式名称を使用して、および特に表２の略名で以下に表される：
【０２５１】
【表２】
2012531929.tif 000005
リガンド
本発明で注目するオリゴヌクレオチド（例えばＲＮＡエフェクター分子）の別の修飾には、オリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布、または細胞への取込み増強する１つまたは複数のリガンド、成分または複合物のオリゴヌクレオチドへの化学的な結合がある。そのような成分には脂質成分、例えばコレステロール成分Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（８６  ＰＮＡＳ  ６５５３−５６（１９８９）；コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、４  Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．１０５３−６０（１９９４））；チオエーテル（例えばベリル−Ｓ−トリチルチオール）（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、６６０  Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３０６３０９（１９９２）；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、３  Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．２７６５−７０（１９９３））；チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、２０  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．５３３−３８（１９９２））；脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、１０  ＥＭＢＯ  Ｊ．１１１１−１８（１９９１）；Ｋａｂａｎｏｖら、２５９  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３２７−３０（１９９０））；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、７５  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ４９−５４（１９９３））；リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、３６  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３６５１−５４（１９９５）；Ｓｈｅａら、１８  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７７７−８３（１９９０）；ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、１４  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ９６９−７３（１９９５））；またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９９５）；パルミチル成分（Ｍｉｓｈｒａら、１２６４  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２２９−３７（１９９５））；またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール成分（Ｃｒｏｏｋｅら、２２７  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．９２３−３７（１９９６））があるがこれらに限定されない。
【０２５２】
一実施形態において、リガンドは、リガンドを組み入れるＲＮＡエフェクター分子剤の分布、標的指向化または寿命を変更する。実施形態のいくつかにおいては、リガンドにより、選択された標的、例えば分子、細胞または細胞型、細胞または臓器コンパートメント等のコンパートメント、身体の組織、臓器または領域への親和性が、例えば、そのようなリガンドを有さない種と比較して増強する。理想的には、リガンドは二本鎖核酸の二本鎖の対形成に関与しないのが理想的であろう。
【０２５３】
リガンドには、天然の物質、例えばタンパク質（例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）またはグロブリン）；糖（例えばデキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）；または脂質がある。リガンドはさらに、合成高分子、例えば合成ポリアミノ酸等の組み換えまたは合成分子であり得る。ポリアミノ酸には、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクタイド−ＣＯ−グリコライド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンがある。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、偽ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはα−ヘリカルペプチドがある。
【０２５４】
リガンドには標的化基、例えば細胞または組織を標的とする物質、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば腎細胞等の特定の細胞型に結合する抗体もある。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、肺サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン糖、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホン酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパルタート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、またはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。
【０２５５】
リガンドの他の例には、色素、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばプソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレンブタン酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メンソール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えばアンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化試薬、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射能標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン、輸送／吸収促進剤（例えばアスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えばイミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰまたはＡＰがある。
【０２５６】
リガンドは糖タンパク質等のタンパク質、共リガンドへの特定の親和性を有する分子等のペプチド、または、がん細胞、血管内皮細胞または骨細胞等の特定の細胞型に結合する抗体であり得る。リガンドにはさらに、ホルモンとホルモン受容体がある。さらに、リガンドには非ペプチド種もあり、脂質、レクチン、糖、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル―ガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン多価マンノース、または多価フコースがある。リガンドは、例えばリポポリサッカリド、ＭＡＰキナーゼｐ３８の活性化物質またはＮＦ−κＢの活性化物質であり得る。
【０２５７】
リガンドは物質、例えば薬剤でもよく、例えば細胞の細胞骨格を破壊することにより、例えば細胞の微小管、マイクロフィラメントおよび／または中間径繊維を破壊することにより細胞へのＲＮＡエフェクター分子剤の取込みを増加させることができる。薬剤は、例えばタキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシンまたはミオセルビンであり得る。
【０２５８】
一例ではリガンドは脂質または脂質系分子である。このような脂質または脂質系分子は血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合することが好ましい。ＨＳＡ結合リガンドは、標的組織、例えば身体の腎臓以外の標的組織に複合物を分布させることができる。例えば、標的組織は肝臓、例えば肝臓の実質細胞であり得る。他のＨＳＡに結合できる分子もリガンドとして使用できる。例えば、ナプロキセンまたはアスピリンを使用できる。脂質または脂質系リガンドは、（ａ）複合物の分解に対する耐性を増加させ、（ｂ）標的細胞または細胞膜への標的指向化または輸送を増加させ、かつ／あるいは（ｃ）血清タンパク質、例えばＨＳＡとの結合を調節するために使用できる。
【０２５９】
脂質系リガンドは、標的組織に対する複合物の結合を調節、例えば制御するために使用できる。例えば、ＨＳＡにより強く結合する脂質または脂質系リガンドは腎臓への標的指向性をより低下させ、したがって胚から除去されにくくなるであろう。ＨＳＡに弱く結合する脂質または脂質系リガンドは複合物の腎臓への標的指向化に使用できる。例えば、脂質系リガンドはＨＳＡに結合する、または、ＨＳＡと十分な親和性を持って結合するため、複合物は非腎臓組織に分布されるが、これは可逆的である。あるいは、脂質系リガンドはＨＳＡに弱く、または全く結合しないため、複合物が腎臓に分布される。他の腎細胞を標的とする成分は、脂質系リガンドの代わりに、または脂質系リガンドに加えて使用できる。
【０２６０】
別の態様において、リガンドは胚細胞、例えば増殖細胞によって取り入れられる成分であり、例えばビタミンである。代表的なビタミンにはビタミンＡ、ＥおよびＫがある。他の代表的なビタミンには、ビタミンＢ、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または胚細胞によって取り入れられる他のビタミンもしくは栄養素がある。さらに、ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質も含まれる。
【０２６１】
別の態様において、リガンドは細胞透過物質、好ましくはらせん状の細胞透過物質である。この物質は両親媒性であることが好ましい。代表的な物質はｔａｔまたはアンテナペディア等のペプチドである。物質がペプチドである場合、ペプチジル模倣体、インバートマ（ｉｎｖｅｒｔｏｍｏｒ）、非ペプチドまたは偽ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸の利用を含めて、ペプチドを修飾できる。らせん状の物質はα−らせん物質であり、親油性、および疎油性の相を有し得る。
【０２６２】
リガンドはペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体（本明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ぶ）天然のペプチドに類似した一定の３次元構造に折り畳める分子である。ペプチドおよびペプチド模倣体がＲＮＡエフェクター分子剤に結合することで、細胞の認識および吸収が高まるため、ＲＮＡエフェクター分子の薬物動態分布に影響を与えられる。ペプチドまたはペプチド模倣体の成分は約５〜５０アミノ酸長であり、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸長である（例えば表３を参照）。
【０２６３】
【表３】
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ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅから構成される）であり得る。ペプチド成分はデンドリマーペプチド、制限ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。別の代替例では、ペプチド成分は疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含み得る。代表的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号：３２８４９５８）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含むＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号：３２８４９５９）も、標的化部分であり得る。ペプチド部分は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含めた大きな極性分子を、細胞膜を介して運ぶことができる「送達」ペプチドであってよい。例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質由来の配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号３２８４９６０））、およびショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質由来の配列（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２８４９６１））は、送達ペプチドとして機能しうることが見出されている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから同定されたペプチドなど、ＤＮＡのランダムな配列によってコードされてもよい。Ｌａｍら、３５４  Ｎａｔｕｒｅ  ８２−８４（１９９１）。取り込まれたモノマーユニットを経由してｄｓＲＮＡ物質と連結できるペプチドまたはペプチド模倣体は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド、またはＲＧＤ模倣体などの、細胞標的化ペプチドである。言及した通り、ペプチド部分は、安定性を増大させるため、あるいは立体構造上の特性を得るためなどの、構造的修飾を有し得る。以下に記載する任意の構造的修飾を使用できる。
【０２６４】
ＲＧＤペプチド成分は内皮系腫瘍細胞または乳がん腫瘍細胞等の腫瘍細胞を標的とするために使用できる。Ｚｉｔｚｍａｎｎら、６２  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１３９−４３（２００２）。ＲＧＤペプチドはｄｓＲＮＡ物質の肺臓、腎臓、脾臓または肝臓を含む、様々な他の組織の腫瘍に対する標的指向化を促進できる。Ａｏｋｉら、８  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７８３−８７（２００１）。ＲＧＤペプチドは、ＲＮＡエフェクター分子剤の腎臓に対する標的指向化を促進するのが好ましい。ＲＧＤペプチドは直鎖状または環状でもよく、修飾、例えば、グリコシル化、またはメチル化でき、特定の組織への標的指向化を促進できる。例えば、グリコシル化ＲＧＤペプチドはαＶβ３を発現する腫瘍細胞にＲＮＡエフェクター分子剤を送達できる。Ｈａｕｂｎｅｒら、４２  Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３２６−３６（２００１）。
【０２６５】
「細胞透過ペプチド」は細胞、例えばトリ細胞に透過できる。これは例えば、αヘリックス直鎖ペプチド（例えばＬＬ−３７またはＣｅｒｏｐｉｎ  Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えばα−デフェンシン、β−デフェンシン、またはバクテネシン）または、わずか１または２種の支配アミノ酸（例えばＰＲ−３９またはインドリシジン）しか含まないペプチドなどである。細胞透過ペプチドにはさらに核極在化シグナル（ＮＬＳ）がある。例えば、細胞透過ペプチドはＭＰＧ等の２部分の両親媒性ペプチドであり得、それは、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１の融合ペプチド領域とＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳとに由来する。Ｓｉｍｅｏｎｉら、３１  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７１７−２４（２００３）。
【０２６６】
オリゴヌクレオチド複合物の調製を教示する代表的な特許には米国特許第４，８２８，９７９号；第４，９４８，８８２号；第５，２１８，１０５号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１３号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１７号；第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８４号；第５，１０９，１２４号；第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４５号；第５，４１４，０７７号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３９号；第５，５７８，７１８号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４４号；第４，６０５，７３５号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７９号；第４，７８９，７３７号；第４，８２４，９４１号；第４，８３５，２６３号；第４，８７６，３３５号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１３号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，２４５，０２２号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０６号；第５，２６２，５３６号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７３号；第５，３１７，０９８号；第５，３７１，２４１号；第５，３９１，７２３号；第５，４１６，２０３号；第５，４５１，４６３号；第５，５１０，４７５号；第５，５１２，６６７号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５２号；第５，５６７，８１０号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８１号；第５，５８７，３７１号；第５，５９５，７２６号；第５，５９７，６９６号；第５，５９９，９２３号；第５，５９９，９２８号；第５，６８８，９４１号；第６，２９４，６６４号；第６，３２０，０１７号；第６，５７６，７５２号；第６，７８３，９３１号；第６，９００，２９７号；および第７，０３７，６４６号明細書があるが、これに限定されない。
【０２６７】
所与の化合物のすべての位置で一様に修飾される必要はなく、実際、上述の修飾のうちの１つ以上の修飾を、単一の化合物内、またはｓｎオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにも組み込むことができる。本発明は、さらにキメラ化合物であるオリゴヌクレオチド分子化合物を含む。「キメラの」ＲＮＡエフェクター分子化合物または「キメラ」は、本発明の文脈において、ｄｓＲＮＡ等のオリゴヌクレオチド化合物であり、それらは、２つ以上の化学的に別個の領域を含み、各々が少なくとも１つのモノマー単位から作られ、すなわちｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドから作られる。これらのＲＮＡエフェクター分子は典型的には少なくとも１つの領域を含み、そこでＲＮＡは、ＲＮＡエフェクター分子の核酸分解酵素による分解に対する耐性を増加させ、細胞への取込みを増加させ、および／または標的核酸への結合親和性を増加させるよう修飾される。オリゴヌクレオチドの追加の領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ、または、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断できる酵素の基質となる。例として、ＲＮａｓｅＨはＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞のエンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮａｓｅＨの活性化によりＲＮＡ標的が切断され、それによって、ＲＮＡエフェクター分子による遺伝子発現抑制の効率が大きく増強する。したがって、キメラｄｓＲＮＡを使用する場合、同一の標的部位にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、より短いＲＮＡエフェクター分子で類似の結果が得られることが多い。オリゴヌクレオチドの切断は、当該技術分野において周知のゲル電気泳動法、および必要な場合には核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて通常検出できる。
【０２６８】
ＶＩ．ＲＮＡエフェクター分子の導入／送達
本明細書に提供された方法による、発育卵内の細胞へのオリゴヌクレオチド（例えばＲＮＡエフェクター分子）の送達は、異なるいくつかの方法で達成できる。例えば、ＲＮＡエフェクター分子、例えばｄｓＲＮＡを含む組成物を卵に投与して、直接的に送達できる。あるいは、ＲＮＡエフェクター分子の発現をコードし指示する１つまたは複数のベクターを卵に投与して、間接的に送達できる。このような代替方法については、本明細書でより詳細に議論する。
【０２６９】
実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡエフェクター分子はｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡエフェクター分子であり、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡエフェクター分子の１つもしくは複数を、またはｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡエフェクター分子の１つもしくは複数をコードするＤＮＡを含む侵襲性細菌を卵へ導入することにより、卵内の細胞へ導入する（このプロセスはｔｒａｎｓｋｉｎｇｄｏｍ  ＲＮＡｉ（ｔｋＲＮＡｉ）と呼ばれることもある）。侵襲性細菌には、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくはビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｅ）の弱毒化された菌株、または侵襲性細菌が細胞の細胞質に到達できるように１つまたは複数の遺伝子を導入するなどして遺伝子組み換えを行い侵襲性特質を増加させた非侵襲性細菌がある。そのような細胞質を標的とする遺伝子には、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）のリステリオリシンＯおよび偽結核菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のインベイシンタンパク質がある。動物細胞にＲＮＡエフェクター分子を送達してｔｒａｎｓｋｉｎｇｄｏｍ  ＲＮＡｉ（ｔｋＲＮＡｉ）を誘導するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば米国特許出願公開第２００８／０３１１０８１号および第２００９／０１２３４２６号明細書を参照のこと。一実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子はｓｉＲＮＡ分子である。別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子はｓｈＲＮＡ分子ではない。
【０２７０】
本明細書に記述されるように、オリゴヌクレオチドを修飾して、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの急速分解を防ぎ、かつ望ましくない非特異的な影響を回避できる。例えば、ＲＮＡエフェクター分子を、細胞への取込みを増強させ、かつ分解を防ぐためにコレステロール等の親油基に化学的に結合させて修飾できる。別の実施形態においては、ＲＮＡエフェクター分子を親油基、例えばコレステロールへの化学的な結合により修飾しない。
【０２７１】
別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソームまたはカチオン性のデリバリーシステム等のドラッグデリバリーシステムを使用して送達できる。正に荷電したカチオン性のデリバリーシステムは、ＲＮＡエフェクター分子（負に荷電）の結合を促進し、さらに負に荷電した細胞膜での相互作用を増強し、効果的な細胞の取込みを可能とする。カチオン性脂質、デンドリマーまたはポリマーは、ＲＮＡエフェクター分子に結合するか、またはＲＮＡエフェクター分子を包む小胞またはミセルの形成を誘導できる。例えばＫｉｍら、１２９  Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７−１６（２００８）を参照のこと。カチオン性ＲＮＡエフェクター分子複合体を産生する、および使用するための方法は、当業者により十分実施可能である。例えば、Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、３２７  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７６１−６６（２００３）；Ｖｅｒｍａら、９  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２９１−１３００（２００３））；Ａｒｎｏｌｄら、２５  Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１９７−２０５（２００７）を参照のこと。
【０２７２】
ＲＮＡエフェクター分子が低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）等のセンス鎖とアンチセンス鎖を含む二本鎖の分子である場合、センス鎖とアンチセンス鎖は別々に、かつ一時的に暴露できる。「別々におよび時間的に」なる語句は、二本鎖ＲＮＡエフェクター分子の各鎖の卵への、一本鎖の形態での導入を指し、例えば、両方の鎖がアニールしていない混合物の形態で、または別々で、つまり各鎖を混ぜずに調製して導入することを指す。実施形態のいくつかにおいては、各鎖の導入の間の間隔は、数秒〜数分、約１時間またはそれ以上、例えば１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間以上の範囲である。別々のおよび時間的な投与は標準的または非標準的ＲＮＡエフェクター分子で実施できる。
【０２７３】
複数のＲＮＡエフェクター分子を別々のおよび時間的な方法で投与することも本明細書で考慮した。したがって、複数のＲＮＡエフェクター分子の各々を別の時間に、または異なる頻度間隔で投与し、標的遺伝子に対する所望の平均パーセント抑制を達成できる。例えば、ＢａｋＲＮＡエフェクター分子での処理後Ｂａｋの発現がより速く回復するため、Ｂａｋを標的とするＲＮＡエフェクター分子はＬＤＨを標的とするＲＮＡエフェクター分子より頻繁に投与できる。一実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、卵の容積に基づいて算定された、およそ０．０１ｎＭ〜２００ｎＭまでの濃度で付加される。別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、１細胞当たり約５０分子〜１細胞当たり５００，０００分子以下の量で付加される。別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、卵の容積に基づいて算定された、約０．１ｆｍｏｌ／１０６細胞〜約１ｐｍｏｌ／１０６細胞の濃度で付加される。
【０２７４】
別の態様において、標的遺伝子の発現を調節するためのＲＮＡエフェクター分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写ユニットから発現できる。例えばＣｏｕｔｕｒｅら、１２  ＴＩＧ  ５−１０（１９９６））；国際公開第００／２２１１３号パンフレット；国際公開第００／２２１１４号パンフレット；米国特許第６，０５４，２９９号明細書を参照のこと。卵内で使用される特定のコンストラクトおよび標的組織によるが、発現は一時的（数時間〜数日）、または持続的（数日〜約１週間）となり得る。これらの導入遺伝子は直鎖状コンストラクト、環状プラスミド、または組込または非組み込みのウイルスベクターとして導入することができる。導入遺伝子も染色体とは別のプラスミドとして遺伝するように作成できる。Ｇａｓｓｍａｎｎら、９２  ＰＮＡＳ  １２９２（１９９５）。
【０２７５】
ＲＮＡエフェクター分子の個々の鎖または両鎖は、発現ベクター上のプロモーターから転写できる。２つの別々の鎖が例えば、ｄｓＲＮＡを産生するために発現される場合、２つの別個の発現ベクターを標的細胞へ（例えば形質移入または感染によって）一緒に導入できる。あるいは、同一の発現プラスミドに置かれる両プロモーターは、ｄｓＲＮＡの各鎖をそれぞれ転写できる。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、リンカーのポリヌクレオチド配列により結合された逆方向反復として発現するため、ｄｓＲＮＡにステム−アンド−ループ構造が存在する。
【０２７６】
ＲＮＡエフェクター分子の発現ベクターは一般的にＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。トリ細胞に適合する発現ベクターは、本明細書に記述するようなＲＮＡエフェクター分子の発現のための組み換えコンストラクトを作製するために使用できる。真核細胞の発現ベクターは当該技術分野において周知であり、いくつかの商業的供給源から入手可能である。典型的には、そのようなベクターは、所望の核酸セグメントの挿入に都合よい制限部位を含んで提供されている。ＲＮＡエフェクター分子の発現ベクターは、標準的な形質移入および形質導入方法を使用して、標的細胞に直接送達できる。
【０２７７】
ＲＮＡエフェクター分子の発現プラスミドはカチオン性脂質担体（例えばＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）試薬）、または非カチオン性脂質ベースの担体（例えばＴＲＡＮＳＩＴ−ＴＫＯ（登録商標）形質移入試薬、Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  ＬＬＣ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を有する複合体で卵へ形質移入できる。１週間またはそれ以上の期間にわたる、標的ＲＮＡの異なる領域を標的とするＲＮＡエフェクター分子媒介ノックダウンのために、脂質を複数形質移入することも、本発明で考えられる。宿主細胞へベクターがうまく導入できたかどうかは、既知の様々な方法を使用してモニターできる。例えば、一過性形質転換は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の蛍光性マーカー等のレポーターで示すことができる。エキソビボでの細胞への安定的遺伝子導入は、ハイグロマイシンＢ耐性等の特定の環境要因（例えば抗生物質と薬剤）に対する耐性で形質移入された細胞を示すマーカーを使用して確認できる。ＲＮＡエフェクター分子の発現プラスミドはカチオン性脂質担体（例えばＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）試薬）、または非カチオン性脂質ベースの担体（例えばＴＲＡＮＳＩＴ−ＴＫＯ（登録商標）形質移入試薬）を有する複合体で標的細胞へ形質移入できる。１週間またはそれ以上の期間にわたる、標的ＲＮＡの異なる領域を標的とするＲＮＡエフェクター分子媒介ノックダウンのために、脂質を複数形質移入することも、本発明で考えられる。ベクターが宿主細胞へうまく導入できたかどうかは、既知の様々な方法を使用してモニターできる。例えば、一過性形質転換は、例えばＧＦＰの蛍光性マーカー等のレポーターで示すことができる。エキソビボでの細胞への安定的遺伝子導入は、ハイグロマイシンＢ耐性等の特定の環境要因（例えば抗生物質と薬剤）に対する耐性で形質移入された細胞を示すマーカーを使用して確認できる。
【０２７８】
本明細書に記述された方法および組成物で利用できるウイルスベクターシステムには、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどを含むがこれらに限定されないレトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）パピローマウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウイルスベクター；（ｉ）オルトポックス、例えばワクシニアウイルスベクター、またはアビポックス、例えばカナリア痘、ニワトリ痘等のポックスウイルスベクター；および（ｊ）ヘルパー依存型またはガットレスアデノウイルスがあるがこれらに限定されない。複製欠損ウイルスはさらに有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムへ組み入れられるようになるか、またはならないであろう。必要に応じて、コンストラクトは形質移入のためのウイルス配列を含み得る。あるいは、コンストラクトはエピゾーム性複製可能なベクター、例えばＥＰＶ、ＥＢＶベクターに組み込み得る。ＲＮＡエフェクター分子の組み換え発現のためのコンストラクトには、標的細胞内のＲＮＡエフェクター分子の発現を確実にするために、プロモーター、エンハンサー等の調節エレメントが必要となるのが一般的である。ベクターとコンストラクトを考慮する他の態様はさらに本明細書に記述される。
【０２７９】
ＲＮＡエフェクター分子の送達に有益なベクターには、所望の標的細胞または組織でのＲＮＡエフェクター分子の発現に十分な調節エレメント（プロモーター、エンハンサーなど）が含まれる。調節エレメントは恒常的または調節／誘導性発現の実現に合わせて選択できる。
【０２８０】
ＲＮＡエフェクター分子の発現は、例えばある種の生理学的な制御因子、例えばグルコースレベルに感受性のある誘導性調節配列の使用により調節できる。Ｄｏｃｈｅｒｔｙら、８  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２０−２４（１９９４）。そのような、細胞でのｄｓＲＮＡ発現の制御に適切な誘導発現システムには、例えば、エクダイソン、卵胞ホルモン、黄体ホルモン、テトラサイクリン、二量体化の化学的誘発物質およびイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（イソプロピルチオガラクトシド）による制御がある。当業者は、ＲＮＡエフェクター分子導入遺伝子の使用目的に基づいた適切な調節／プロモーター配列を選ぶことができる。
【０２８１】
特定の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子をコードする核酸配列を含むウイルスベクターを使用できる。例えば、レトロウイルスベクターを使用できる。Ｍｉｌｌｅｒら、２１７  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５８１−９９（１９９３）；米国特許第６，９４９，２４２号明細書を参照のこと。レトロウイルスベクターはウイルスゲノムの正確なパッケージングと宿主細胞ＤＮＡへの組込みに必要な構成成分を含む。ＲＮＡエフェクター分子をコードする核酸配列は１つまたは複数のベクターにクローン化され、細胞への核酸の送達が促進される。例えば、レトロウイルスベクターに関する詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら、６  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ２９１−３０２（１９９４）に記載されているが、ここでは、化学療法により耐性のある幹細胞を産生するために、造血系幹細胞にｍｄｒ１遺伝子を送達するが、この送達にレトロウイルスベクターを利用することが記述されている。遺伝子療法でのレトロウイルスベクターの利用を説明する他の参考文献には、Ｃｌｏｗｅｓら、９３  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６４４−６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍら、８３  Ｂｌｏｏｄ  １４６７−７３（１９９４）；ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ、４  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２９−１１（１９９３）；ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、３  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｄｅｖｅｌ．１１０−１４（１９９３）がある。レンチウイルスベクターの使用を考慮した例には、ＨＩＶベースのベクターがあり、米国特許第６，１４３，５２０号；第５，６６５，５５７号；および第５，９８１，２７６号明細書に記述されている。
【０２８２】
レトロウイルス侵入のための宿主細胞の表面受容体をＥＲＶのＥｎｖタンパク質（ウイルス干渉）が抑制できることは注目すべきである。Ｍｉｌｌｅｒ、９３  ＰＮＡＳ  １１４０７−１３（１９９６）を参照のこと。レトロウイルス外皮（Ｅｎｖ）タンパク質は、細胞受容体へのウイルス粒子の結合を媒介し、新しい複製サイクルの第一段階であるウイルスの侵入を可能にする。ＥＲＶが細胞内で発現される場合、関連する外在性ウイルスによる再感染は干渉（受容体干渉とも呼ばれる）によって妨げられる。つまり、細胞膜に挿入されるＥＲＶのＥｎｖタンパク質は、受容体競合作用によって対応する外来性のウイルスに干渉する。これにより細胞をレトロウイルスの過負荷から保護している。例えば、ｅｎＪＳＲＶは細胞のヒアルロニダーゼ−２をすべて受容体として利用するため、ｅｎＪＳＲＶは、外来性のＪＳＲＶの侵入を阻むことができる。Ｓｐｅｎｃｅｒら  ７７Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７４９−５３（２００３）。ＥＲＶは欠損していてもなお干渉することは注目すべきである。２つのｅｎＪＳＲＶ、ｅｎＪＳ５６Ａ１およびｅｎＪＳＲＶ−２０にはｇａｇポリタンパク質突然変異体があり、外来性のＪＳＲＶの後期の複製に干渉できる。Ａｒｎａｕｄら、２  ＰＬｏＳ  ｅ１７０（２００７）。したがって、欠損したレトロウイルスと正常に複製できるレトロウイルス間の干渉は、ＥＲＶコピー数調節の重要なメカニズムとなる。ＥＲＶが発現したＥｎｖ分子（例えば、ＨＥＲＶ−Ｈファミリーにより発現）による受容体干渉により、組換えタンパク質の産生を目的とした細胞の形質移入または再感染が妨害される。このような作用があるため、レトロウイルスベクターを媒介とした組み換え宿主細胞では、低コピー数または低発現となる。例えば、それぞれが単一の相補的な抗体鎖をコードする２つのレトロウイルスベクターで形質移入された宿主細胞での低コピー数または低発現が説明できる。よって、ＥＲＶのＥｎｖタンパク質の発現を抑制する、本発明の実施形態の標的遺伝子は、卵細胞でのレトロウイルスベクターの感染を増加させ、生物由来物質の収量を増加させる。
【０２８３】
ＲＮＡエフェクター分子の送達にアデノウイルスの使用も考えられる。本発明中で注目するＲＮＡエフェクター分子の発現に適切なＡＶベクター、組み換えＡＶベクターを構成する方法、および標的細胞へベクターを送達する方法は、Ｘｉａら、２０  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１００６−１０（２００２）に記述されている。
【０２８４】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの利用も考えられる（Ｗａｌｓｈら、２０４  Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号明細書）。一実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、組み換えＡＡＶベクターから２つの別々の相補的な一本鎖ＲＮＡ分子として発現できる。このＡＡＶベクターは、例えば、Ｕ６もしくはＨ１ＲＮＡプロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを有する。本発明で注目するｄｓＲＮＡの発現に適切なＡＡＶベクター、組み換えのＡＡＶベクターを構成する方法、および標的細胞へベクターを送達する方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、６１  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３０９６−１０１（１９８７）；Ｆｉｓｈｅｒら、７０  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７０：５２０−３２（１９９６）；Ｓａｍｕｌｓｋｉら（６３  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３８２２−２６（１９８９）；米国特許第５，２５２，４７９および第５，１３９，９４１号明細書；国際公開第９４／１３７８８号パンフレット；国際公開第９３／２４６４１号パンフレットに記述されている。
【０２８５】
卵ベースのバイオプロセシングに有益な別のウイルスベクターはワクシニアウイルス等のポックスウイルスであり、例えば修飾されたウイルスアンカラ（ＭＶＡ）またはＮＹＶＡＣ等の弱毒化ワクシニア、ニワトリ痘またはカナリア痘等のアビポックスがある。
【０２８６】
ウイルスベクターの指向性は、ベクターを他のウイルスの外被タンパク質または他の表面抗原でシュードタイプ化することにより、または必要に応じて異なるウイルスのカプシドタンパク質に置換することにより改変できる。例えば、レンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、Ｍｏｋｏｌａ、バキュロウイルス等の表面タンパク質でシュードタイプ化できる。モノネガウイルス目、例えば、ＶＳＶまたは呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）はバキュロウイルスシュードタイプ化できる。米国特許第７，０４１，４８９号明細書。ＡＡＶベクターは、ベクターを操作して異なるカプシドタンパク質のセロタイプを発現させることにより、異なる細胞を標的とするよう作製できる。例えばＲａｂｉｎｏｗｉｔｚら、７６  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７９１−８０１（２００２）参照のこと。
【０２８７】
一実施形態において、本発明は、本明細書で記述するように、ＲＮＡエフェクター分子とおよび許容できる担体を含む組成物を提供する。ＲＮＡエフェクター分子を含んでいる組成物は、卵の細胞内の標的遺伝子の発現または活性を調節することで卵での生物由来物質の産生を増強するのに有益である。そのような組成物は送達方法に基づいて調剤される。免疫原性物質等の生物由来物質の産生を改善するのに有益な代表的なＲＮＡエフェクター分子が本明細書で提供される。一実施形態において、組成物のＲＮＡエフェクター分子はｓｉＲＮＡである。あるいは、組成物のＲＮＡエフェクター分子はｓｉＲＮＡではない。
【０２８８】
別の実施形態において、免疫応答経路および細胞内プロセス、つまりＩＮＦＡＲ１、ＩＲＦ３、ＭＡＶＳ、ＰＫＲまたはＩＦＩＴＭ１遺伝子、およびＰＴＥＮ、ＢＡＫ、ＣＤＫＮＡ２、ＦＮ１またはＬＤＨＡ遺伝子の発現を抑制できる複数のＲＮＡエフェクター分子を含む組成物が本明細書で提供される。組成物は、場合により追加の細胞内プロセスを標的にする少なくとも１つの追加のＲＮＡエフェクター分子と組み合わせられる（または投与できる）。この細胞内プロセスには、炭素代謝と輸送、アポトーシス、ＲＮＡｉ取込みおよび／または効率、活性酸素産生、細胞周期調節、タンパク質の折り畳み、ピログルタミン酸化タンパク質修飾、デアミダーゼ、グリコシル化、ジスルフィド結合形成、タンパク質分泌、遺伝子増幅、ウイルス複製、ウイルス感染、ウイルス粒子放出、ｐＨ制御およびタンパク質産生があるが、これらに限定されない。
【０２８９】
一実施形態において、本明細書に記述する組成物は複数のＲＮＡエフェクター分子を含む。この態様の一実施形態において、複数のＲＮＡエフェクター分子はそれぞれ異なる濃度で提供される。この態様の別の実施形態において、複数のＲＮＡエフェクター分子はどれも同じ濃度で提供される。この態様の別の実施形態において、複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも２つは同じ濃度で提供されるが、複数のＲＮＡエフェクター分子の他の少なくとも１つは異なる濃度で提供される。当業者は、ＲＮＡエフェクター分子と濃度の種々の組み合わせが、本明細書に記述された所望の効果を生むために発育卵の細胞に与えられることを理解する。
【０２９０】
本明細書で注目している組成物は、標的遺伝子の発現を抑制するのに十分な量で投与される。一般に、ＲＮＡエフェクター分子の適切な投与量は、単位体積一日あたり当たり０．００１〜２００．０ミリグラムの範囲となるであろう。別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、一日あたり０．００１ｎＭ〜２００ｍＭの範囲で、一般的に０．１ｎＭ〜５００ｎＭの範囲で提供される。例えば、ｄｓＲＮＡは、一用量当たり、０．０１ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．７５ｎＭ、１ｎＭ、１．５ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭまたは５００ｎＭで投与できる。
【０２９１】
組成物は、毎日１回投与でき、またはＲＮＡエフェクター分子は、１日を通して適切な間隔で２、３回以上の分割用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）で投与でき、または放出制御製剤による送達でもよい。この場合、各分割用量に含まれるＲＮＡエフェクター分子は、１日の総投与量となるように調整した用量でなくてはならない。投与ユニットは、例えば、数日間にわたりＲＮＡエフェクター分子を徐放できる従来の徐放製剤を使用して、数日にわたって送達できるよう調合できる。徐放製剤は当該技術分野において周知であり、本発明の物質にも使用するように、特定の部位への物質の送達に特に有益である。注目すべきは、複数のＲＮＡエフェクター分子を投与する場合、ＲＮＡエフェクター分子の総投与量は各々が単独で投与される場合より高くなることを考慮しなければいけないことである。例えば、３つのＲＮＡエフェクター分子を各々１ｎＭで投与する場合（例えば標的遺伝子発現の効果的な抑制のため）、必然的に細胞への総投与量は３ｎＭとなる。当業者は、各標的遺伝子の効果的な抑制をもたらすために各ＲＮＡエフェクター分子の必要量を変更できるが、ＲＮＡエフェクター分子または送達剤のいずれかが高濃度であるため引き起こされる望ましくない毒性を胚に与えない範囲での変更となる。
【０２９２】
標的遺伝子の転写レベルに対する単回投与の影響は持続し得るため、後の投与は、３、４、または５日間以下の間隔で、または１、２、３、または４週間以下の間隔で投与される。
【０２９３】
一実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子の投与は、生物由来物質を単離する、少なくとも６時間前、少なくとも１２時間前、少なくとも１８時間前、少なくとも３６時間前、少なくとも４８時間前、少なくとも６０時間前、少なくとも７２時間前、少なくとも９６時間前、または少なくとも１２０時間前、または少なくとも１週間前に終了する。したがって、一実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子の宿主細胞（例えば発育卵）への接触は、生物由来物質を単離する少なくとも６時間前、少なくとも１２時間前、少なくとも１８時間前、少なくとも３６時間前、少なくとも４８時間前、少なくとも６０時間前、少なくとも７２時間前、少なくとも９６時間前、または少なくとも１２０時間前、または少なくとも１週間前に終了させる。
【０２９４】
ある実施形態において、卵当たりのＲＮＡエフェクター分子の数が一定数（または少なくとも最少数）維持されるように、ＲＮＡエフェクター分子を卵細胞に接触させることが有益となることも注目に値する。このようにＲＮＡエフェクター分子のレベルを維持すると、標的遺伝子発現の調節が高い細胞密度でも確実に維持できる。これは例えば、当該技術分野において周知の放出制御ポリマーを使用して達成し得る。
【０２９５】
あるいは、ＲＮＡエフェクター分子は細胞密度に従った量で投与できる。このような実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、少なくとも０．０１ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも０．１ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも０．５ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも０．７５ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも１ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも２ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも５ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも１０ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも２０ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも３０ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも４０ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも５０ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも６０ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも１００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも２００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも３００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも４００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも５００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも７００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも８００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも９００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも１ｐｍｏｌ／１０６細胞、またはそれ以上の濃度で、卵の日齢および容量に基づいて投与できる。
【０２９６】
別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は細胞当たり少なくとも１０分子、細胞当たり少なくとも２０分子（分子／細胞）、少なくとも３０分子／細胞、少なくとも４０分子／細胞、少なくとも５０分子／細胞、少なくとも６０分子／細胞、少なくとも７０分子／細胞、少なくとも８０分子／細胞、少なくとも９０分子／細胞、少なくとも１００分子／細胞、少なくとも２００分子／細胞、少なくとも３００分子／細胞、少なくとも４００分子／細胞、少なくとも５００分子／細胞、少なくとも６００分子／細胞、少なくとも７００分子／細胞、少なくとも８００分子／細胞、少なくとも９００分子／細胞、少なくとも１０００分子／細胞、少なくとも２０００分子／細胞、少なくとも５０００分子／細胞、またはそれ以上の用量で投与できる。
【０２９７】
実施形態のいくつかにおいては、ＲＮＡエフェクター分子は、１０〜１００分子／細胞、１０〜９０分子／細胞、１０〜８０分子／細胞、１０〜７０分子／細胞、１０〜６０分子／細胞、１０〜５０分子／細胞、１０〜４０分子／細胞、１０〜３０分子／細胞、１０〜２０分子／細胞、９０〜１００分子／細胞、８０〜１００分子／細胞、７０〜１００分子／細胞、６０〜１００分子／細胞、５０〜１００分子／細胞、４０〜１００分子／細胞、３０〜１００分子／細胞、２０〜１００分子／細胞、３０〜６０分子／細胞、３０〜５０分子／細胞、４０〜５０分子／細胞、４０〜６０分子／細胞または、この間の任意の範囲内の投与量で投与する。
【０２９８】
本明細書に記述した方法の一実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は卵に継続投与できる。継続投与は、ゼロ日（例えば培養の１日目またはＲＮＡエフェクター分子の接種日）に開始でき、または生物的生産プロセスの間の任意の時期に開始できる。同様に、継続投与は生物的生産プロセスの間のどの時点でも止めることができる。したがって、ＲＮＡエフェクター分子または組成物は、胚発生またはウイルス複製の特定のフェーズで、生産プロセスにおける時間ウィンドウ、または  他の任意の望ましい時点で注入できかつ／または注入を止めることができる。継続投与も標的遺伝子の「所望の平均パーセント抑制」の達成のため提供され得る。
【０２９９】
一実施形態において、継続投与は、ＲＮＡエフェクター分子を卵に最初にボーラス投与した後に使用できる。この実施形態において、継続投与により、所望の期間にわたり最低水準を上回るＲＮＡエフェクター分子の濃度を維持する。継続投与は、卵／時間で０．０３ｐｍｏｌ／Ｌ、培養／時間で３ｐｍｏｌ／Ｌの速度で送達でき、例えば、０．０３ｐｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ、０．０５ｐｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ、０．０８ｐｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ、０．１ｐｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ、０．２ｐｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ、０．３ｐｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ、０．５ｐｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ、１．０ｐｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ、２ｐｍｏｌ／Ｌ／ｈｒまたは３ｐｍｏｌ／Ｌ／ｈｒで、またはこの間の任意の速度で送達できる。
【０３００】
一実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は無菌液剤として投与される。一実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は非脂質製剤に調剤される。別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子はカチオン性か、非カチオン性の脂質製剤に調剤される。また別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は卵への導入にふさわしい媒体に調剤される。別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は細胞増殖または胚発生の特定の時期に卵に投与される。
【０３０１】
ＲＮＡエフェクター分子は、日に１回投与でき、またはＲＮＡエフェクター分子の処理は生物由来物質の産生の全体にわたって適切な間隔／頻度で培地に組成物を付加することにより、繰り返すことができる（例えば２または３回以上）。本明細書で使用される場合、用語「頻度」は、細胞培養の形質移入が生じる間隔を指し、各標的遺伝子の抑制が所望のレベルで維持されるよう当業者が最適化できる。一実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は４８時間ごとの頻度で細胞に接触させる。他の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は生物由来物質の産生の間に、例えば、４時間ごと、６時間ごと、１２時間ごと、１８時間ごと、２４時間ごと、３６時間ごと、７２時間ごと、８４時間ごと、９６時間ごと、５日ごと、７日ごと、１０日ごと、１４日ごと、３週間ごと、またはそれ以上の頻度で投与される。頻度を変化させて、各投与間の間隔を変えてもよい（例えば第一の間隔３６時間；第二の間隔４８時間；第三の間隔７２時間、等）。
【０３０２】
ＲＮＡエフェクター分子処理の頻度は特定の標的遺伝子の「平均パーセント抑制」を維持するために最適化できる。本明細書で使用される場合、用語「所望の平均パーセント抑制」は、所望の効果を生むのに必要な時間にわたる標的遺伝子発現の抑制の平均の程度を指し、望ましくない、または負の効果をもたらす抑制の程度を下回る。例えば、Ｂａｘ／Ｂａｋの所望の抑制は典型的には＞８０％抑制で、アポトーシスの減少をもたらすが、ＬＤＨの平均抑制が高程度（例えば９０％）であると、細胞生存度が減少するため、ＬＤＨの所望の平均抑制は低くなりうる（例えば７０％）。実施形態のいくつかにおいて、所望の平均パーセント抑制は、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％（すなわち、発現しない）である。当業者は通例の細胞死分析を使用して、所望のパーセント抑制（例えば有害な効果を生む抑制レベル）の上限値を決定できる。卵内のＬＤ５０の測定は当該技術分野において周知であり、例えばＢａｎｋｓら、１  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２５９−６２（１９７０）を参照のこと。当業者は、さらに遺伝子調節をもたらすＲＮＡエフェクター分子の量を決定するために標的遺伝子発現を検出する方法（例えばＰＥＲＴ）を使用できる。Ｚｈａｎｇら、１０２  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．１４３８−４７（２００９）を参照のこと。抑制の量は動的で、ＲＮＡエフェクター分子の用量によりわずかに変動するため、本明細書ではパーセント抑制は経時的な平均値として記述している。
【０３０３】
本発明の組成物は、水性、非水性または細胞懸濁液の懸濁液として調剤できる。水性懸濁液には、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストラン等の懸濁液の粘性を増加させる物質をさらに含めてもよい。懸濁剤にはさらに安定剤を含めてもよい。
【０３０４】
一実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子を含む組成はさらに１つ以上の栄養補助剤を含む。栄養補助剤には、必須アミノ酸（例えばグルタミン）、２−メルカプト−エタノール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脂質濃縮製剤、コレステロール、カタラーゼ、インシュリン、ヒトトランスフェリン、スーパーオキサイドジスムターゼ、ビオチン、ＤＬα−酢酸トコフェロールおよびＤＬα−トコフェロール、ビタミン（例えばビタミンＡ（アセテート）、塩化コリン、Ｄパントテン酸カルシウム、葉酸、ニコチン酸アミド、塩酸ピリドキサール、リボフラビン、塩酸チアミン、ｉ−イノシトール）、コルチコステロン、Ｄ−ガラクトース、エタノールアミン塩酸塩、グルタチオン（還元）、Ｌ−カルニチン塩酸塩、リノール酸、リノレン酸、黄体ホルモン、プトレッシン２ＨＣｌ、亜セレン酸ナトリウム、Ｔ３（トリヨード−Ｉ−チロニン）、成長因子（例えばＥＧＦ）、鉄、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ナトリウムヒポキサンチン、アミノプテリンおよびサイミジン、アラキドン酸、酢酸、エチルアルコール１００％、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ６８（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９２００８）、ステアリン酸１０、ＴＷＥＥＮ８０（登録商標）非イオン性界面活性剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ナトリウムピルビン酸塩およびグルコースがあるが、これらに限定されない。
【０３０５】
脂質／オリゴヌクレオチド複合体
実施形態のいくつかにおいては、ＲＮＡエフェクター分子の細胞への取込みを促進する試薬には、本明細書で記述するように、荷電脂質、乳剤、リポソーム、カチオン性または非カチオン性脂質、アニオン性脂質、形質移入試薬または透過促進剤がある。一実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進する試薬は、２００９年１２月７日に出願された、米国仮特許出願第６１／２６７，４１９号明細書、２０１０年５月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／３３４，３９８号明細書に記述されるような荷電脂質を含む。
【０３０６】
本発明のＲＮＡエフェクター分子はリポソームに封入でき、またはリポソーム、特にカチオン性リポソームと複合体を形成し得る。あるいは、ＲＮＡエフェクター分子は、脂質、特にカチオン性脂質と複合体を形成し得る。適切な脂肪酸およびそのエステルには、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル−１−モノカプリン酸エステル、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリンまたＣ１−２０アルキルエステル（例えばミリスチン酸イソプロピルＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、またはその許容できる塩があるがこれに限定されない。
【０３０７】
一実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、脂質製剤で完全に被包される（例えばＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰまたは他の核酸−脂質粒子を形成する）。用語「ＳＮＡＬＰ」は安定的な核酸−脂質粒子を指し、ＲＮＡエフェクター分子等の核酸、またはＲＮＡエフェクター分子が転写されるプラスミドを含む、水の含量が少ない内部をコーティングする脂質の小胞である。ＳＮＡＬＰは例えば、米国特許出願公開第２００６／０２４００９３号、第２００７／０１３５３７２号；第２００９／０２９１１３１号明細書；米国特許出願第１２／３４３，３４２号；第１２／４２４，３６７号明細書に記述されている。用語「ＳＰＬＰ」は、脂質小胞内に被包されたプラスミドＤＮＡを含む核酸−脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰとＳＰＬＰは典型的にはカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を防ぐ脂質（例えばＰＥＧ−脂質複合物）を含む。ＳＰＬＰには「ｐＳＰＬＰ」を含み、国際公開第００／０３６８３号パンフレットに明記された被包性の縮合剤−核酸複合体を含む。この実施形態において粒子の平均粒径は典型的には、約５０ｎｍ〜約１５０、または約６０ｎｍ〜約１３０、または約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍであり、または典型的に、約７０ｎｍ〜約９０ｎｍであり、および実質上無毒である。さらに、核酸が本発明の核酸−脂質粒子の中にある場合、核酸は水溶液中で核酸分解酵素による分解に対して耐性である。核酸−脂質粒子および調製のための方法は、例えば米国特許第５，９７６，５６７号；第５，９８１，５０１号；第６，５３４，４８４号；第６，５８６，４１０号；第６，８１５，４３２号明細書；および国際公開第９６／４０９６４号パンフレットに報告されている。
【０３０８】
薬剤に対する脂質比（質量／質量比）（例えばｄｓＲＮＡに対する脂質比）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、または約６：１〜約９：１であり得る。
【０３０９】
製剤のカチオン性脂質は、４〜１５ｐＫａを有する少なくとも１つのプロトン化可能基を含む。例えば、カチオン性脂質は、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３，−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキイシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、または３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン、またはこれらの混合物であり得る。カチオン性の脂質は、粒子中の全脂質の約２０ｍｏｌ％〜約７０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、カチオン性脂質は、さらにリガンドに結合できる。
【０３１０】
非カチオン性の脂質はアニオン性脂質または中性脂質であり得、例えば、ジステアロイルフォスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルフォスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルフォスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルフォスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−フォスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−フォスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロールまたはその混合物である。コレステロールが含まれている場合、非カチオン性の脂質は、粒子中の全脂質の約５ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％〜約５８ｍｏｌ％であり得る。
【０３１１】
粒子の凝集を抑制する脂質は、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質であり、例えばＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）またはその混合物があるがこれらに限定されない。ＰＥＧ−ＤＡＡは例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）であり得る。粒子の凝集を防ぐ脂質は、粒子中の全脂質の０％〜約２０％、または約２％である。一実施形態において、ＰＥＧ脂質は、さらにリガンドに結合できる。
【０３１２】
実施形態のいくつかにおいては、核酸−脂質粒子はさらにコレステロール等のステロイドを、粒子中の全脂質の例えば約１０％〜約６０％、または約４８％含む。
一実施形態において、脂質粒子はステロイド、ＰＥＧ脂質および化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む：式（Ｉ）
【０３１３】
【化１】
2012531929.tif 000007
式中、ＸａおよびＸｂはそれぞれ、独立したＣ１−６アルキレンである；ｎは、０、１、２、３、４、または５である；各Ｒはそれぞれ独立したＨである。
【０３１４】
【化２】
2012531929.tif 000008
ｍは０、１、２、３または４である；Ｙは無し、Ｏ、ＮＲ２またはＳ；Ｒ１はアルキル、アルケニルまたはアルキニルである；それぞれは１つまたは複数の置換基と場合により置換する；および、Ｒ２はＨ、アルキル、アルケニルまたはアルキニルである；それぞれは１つまたは複数の置換基と場合により置換する。
【０３１５】
一例では、ｌｉｐｉｄｏｉｄ  ＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ１４８７）（式２）、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｃ１６（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）は脂質ＲＮＡエフェクター分子のナノ粒子（例えばＬＮＰ０１粒子）を調製するために使用できる。エタノールでの各々の貯蔵液は、以下のように調製できる：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍＬ；Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、２５ｍｇ／ｍＬ、ＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｃ１６、１００ｍｇ／ｍＬ。ＮＤ９８、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、およびＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｃ１６貯蔵液は、例えば４２：４８：１０モル比で混合できる。混合された脂質溶液は、水性のＲＮＡエフェクター分子（例えば酢酸ナトリウムｐＨ５）と最終のエタノール濃度が約３５％〜４５％および最終の酢酸ナトリウム濃度が約１００ｍＭ〜３００ｍＭとなるよう混合し得る。脂質ＲＮＡエフェクター分子のナノ粒子は典型的には混合で自発的に形成される。所望の粒径分布によるが、結果として生じるナノ粒子混合物は、例えば、Ｌｉｐｅｘ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）等のｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ  ｅｘｔｒｕｄｅｒを使用してポリカーボネート膜（例えばカットオフ１００ｎｍ）で押し出すことができる。ある場合には、押し出しステップは省略できる。エタノール除去と緩衝液交換は同時に、例えば透析またはタンジェント流（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ）ろ過により行うことができる。緩衝液は、ｐＨ７の、例えば約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、約ｐＨ７．４のリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に交換できる。
【０３１６】
【化３】
2012531929.tif 000009
ＬＮＰ０１製剤は、例えば国際公開第２００８／０４２９７３号パンフレットに記述されている。
【０３１７】
特定の実施形態において、脂質製剤が、ＲＮＡエフェクター分子組成物に、ＲＮＡエフェクター分子の取り込みを促進する試薬として加えられる。特定の実施形態において、脂質製剤は、本明細書に記載されるようなＬＮＰ製剤、ＬＮＰ０１製剤、ＸＴＣ−ＳＮＡＬＰ製剤又はＳＮＡＬＰ製剤であり得る。関連する実施形態において、ＸＴＣ−ＳＮＡＬＰ製剤は、以下のように、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＸＴＣ）を、ＸＴＣ／ＤＰＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ｃＤＭＡが５７．１／７．１／３４．４／１．４の比率で、そして約７の脂質：ｓｉＲＮＡ比率で使用する。さらに別の関連する実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子はｄｓＲＮＡであり、以下のように：２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＸＴＣ）を、ＸＴＣ／ＤＰＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ｃＤＭＡが５７．１／７．１／３４．４／１．４の比率で、そして約７の脂質：ｓｉＲＮＡ比率で使用して、ＸＴＣ−ＳＮＡＬＰ製剤に調剤される。
【０３１８】
あるいは、例えば本明細書に記載のＲＮＡエフェクター分子は、以下のように：ＸＴＣ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ２０００−Ｃ１４を５０／１０／３８．５／１．５モル％の比率で、そして脂質：ｓｉＲＮＡを約１１：１の比率で使用してＬＮＰ０９製剤に調剤される。実施形態のいくつかにおいては、ＲＮＡエフェクター分子は、以下のように：ＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ２０００−Ｃ１４を５０／１０／３８．５／１．５モル％の比率で、そして脂質：ｓｉＲＮＡを約１１：１の比率で使用してＬＮＰ１１製剤に調剤される。さらに別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、ＬＮＰ０９製剤又はＬＮＰ１１製剤に調剤され、ＰＢＳ対照群に比べて、標的遺伝子ｍＲＮＡ量を０．３ｍｇ／ｋｇの用量で約８５％〜９０％減少させる。さらに別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、ＬＮＰ０９製剤又はＬＮＰ１１製剤に調剤され、ＰＢＳ対照群に比べて、標的遺伝子ｍＲＮＡ量を０．１ｍｇ／ｋｇの用量で約５０％減少させる。さらに別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、ＬＮＰ０９製剤又はＬＮＰ１１製剤に調剤され、標的遺伝子タンパク質量を、ウェスタンブロットによって測定されるようにＰＢＳ対照群に比べて用量に依存した様式で減少させる。さらに別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、以下のように：ＤｌｉｎＤＭＡをＤＬｉｎＤＭＡ／ＤＰＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ２０００−ｃＤＭＡが５７．１／７．１／３４．４／１．４の比率で、そして約７の脂質：ｓｉＲＮＡ比率で使用して、ＳＮＡＬＰ製剤に調剤される。
【０３１９】
実施形態のいくつかにおいては、脂質製剤は、次式：
【０３２０】
【化４】
2012531929.tif 000010
（式中：
Ｒ１及びＲ２は、それぞれの存在についてそれぞれ独立して、選択的に、Ｃ１０−Ｃ３０アルキル、Ｃ１０−Ｃ３０アルコキシ、Ｃ１０−Ｃ３０アルケニル、Ｃ１０−Ｃ３０アルケニルオキシ、Ｃ１０−Ｃ３０アルキニル、Ｃ１０−Ｃ３０アルキニルオキシ、又はＣ１０−Ｃ３０アシルで置換されており：
【０３２１】
【化５】
2012531929.tif 000011
は、Ｌ２とＬ１の間の結合を表し、この結合は：
（１）Ｌ２の一つの原子とＬ１の一つの原子の間の単結合であり［この場合：
Ｌ１は、Ｃ（Ｒｘ）、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｑ）であり；
Ｌ２は、−ＣＲ５Ｒ６−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｑ）−、＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、又は−Ｃ（Ｏ）−である］；
（２）Ｌ２の一つの原子とＬ１の一つの原子の間の二重結合であり［この場合：
Ｌ１は、Ｃであり；
Ｌ２は、−ＣＲ５＝、−Ｎ（Ｑ）＝、−Ｎ−、−Ｏ−Ｎ＝、−Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝、又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝である］；
（３）Ｌ２の第一の原子とＬ１の第一の原子の間の単結合、及びＬ２の第二の原子とＬ１の第一の原子の間の単結合であり［この場合：
Ｌ１は、Ｃであり；
Ｌ２は、次式：
【０３２２】
【化６】
2012531929.tif 000012
を有し、式中のＸは、Ｌ２の第一の原子であり、Ｙは、Ｌ２の第二の原子であり、−−−−−は、Ｌ１の第一の原子に対する単結合を表し、並びにＸ及びＹは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、アルキレン、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＯ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−、及び−ＯＰ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−からなる群から選択され；
Ｚ１及びＺ４は、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、−ＣＨＲ５−、又は−ＣＲ５Ｒ５−であり；
Ｚ２は、ＣＨ又はＮであり；
Ｚ３は、ＣＨ又はＮであり；
あるいは、Ｚ２とＺ３は、一緒になって、単一のＣ原子であり；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、−ＣＨＲ５−、又は−ＣＲ５Ｒ５−であり；
それぞれのＺは、Ｎ、Ｃ（Ｒ５）、又はＣ（Ｒ３）であり；
ｋは、０、１、又は２であり；
それぞれのｍは、独立して０〜５であり；
それぞれのｎは、独立して０〜５であり；
この場合に、ｍとｎは、一緒になって３、４、５、６、７又は８員環を生じる］；
（４）Ｌ２の第一の原子とＬ１の第一の原子の間の単結合、及びＬ２の第一の原子とＬ１の第二の原子の間の単結合であり［この場合：
（Ａ）Ｌ１は、次式：
【０３２３】
【化７】
2012531929.tif 000013
を有し、式中のＸは、Ｌ１の第一の原子であり、Ｙは、Ｌ１の第二の原子であり、−−−−−は、Ｌ２の第一の原子に対する単結合を表し、並びにＸ及びＹは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、アルキレン、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＯ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−、及び−ＯＰ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−からなる群から選択され；
Ｔ１は、ＣＨ又はＮであり；
Ｔ２は、ＣＨ又はＮであり；
あるいは、Ｔ１とＴ２は、一緒になって、Ｃ＝Ｃであり；
Ｌ２は、ＣＲ５であるか；又は
（Ｂ）Ｌ１は、次式：
【０３２４】
【化８】
2012531929.tif 000014
を有し、式中のＸは、Ｌ１の第一の原子であり、Ｙは、Ｌ１の第二の原子であり、−−−−−は、Ｌ２の第一の原子に対する単結合を表し、並びにＸ及びＹは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、アルキレン、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＯ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−、及び−ＯＰ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−からなる群から選択され；
Ｔ１は、−ＣＲ５Ｒ５−、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、又は−Ｓ−であり；
Ｔ２は、−ＣＲ５Ｒ５−、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、又は−Ｓ−であり；
Ｌ２は、ＣＲ５又はＮである］；
Ｒ３は、次式：
【０３２５】
【化９】
2012531929.tif 000015
を有し、式中：
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３及びＹ４のそれぞれは、独立して、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、又はアルキニルであるか；あるいは
Ｙ１、Ｙ２及びＹ３の任意の２つは、これらを結合しているＮ原子と一緒になって３〜８員複素環を形成するか；あるいは
Ｙ１、Ｙ２及びＹ３は、全てがこれらを結合しているＮ原子と一緒になって二環式５〜１２員複素環を形成し；
それぞれのＲｎは、独立して、Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又はヘテロシクリルであり；
Ｌ３は、結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ５Ｒ６）ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、又はこれらの任意の２つの組み合わせであり；
Ｌ４は、結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ５Ｒ６）ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、又はこれらの任意の２つの組み合わせであり；
Ｌ５は、結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ５Ｒ６）ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、又はこれらの任意の２つの組み合わせであり；
Ｒ５及びＲ６のそれぞれの存在は、独立して、Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又はヘテロシクリルであり；あるいは、隣り合った２個の炭素原子上の２個のＲ５基は、一緒になってこれらのそれぞれの炭素原子の間で二重結合を形成するか；又は隣り合った２個の炭素原子上の２個のＲ５基と、同じ隣り合った炭素原子上の２個のＲ６基は、一緒になってこれらのそれぞれの炭素原子の間で三重結合を形成し；
それぞれのａは、独立して、０、１、２、又は３であり；
この場合：
Ｌ３、Ｌ４又はＬ５のいずれかに由来するＲ５又はＲ６置換基は、場合によりＬ３、Ｌ４又はＬ５のいずれかに由来するＲ５又はＲ６置換基と一緒になって、３〜８員シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリール基を形成し；及び
Ｙ１、Ｙ２及びＹ３の任意の一つは、場合により、Ｌ３、Ｌ４又はＬ５のいずれかに由来するＲ５又はＲ６基、及びこれらを結合している原子と一緒になって、３〜８員ヘテロシクリル基を形成し；
それぞれのＱは、独立して、Ｈ、アルキル、アシル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリルであり；並びに
それぞれのＱ２は、独立してＯ、Ｓ、Ｎ（Ｑ）（Ｑ）、アルキル又はアルコキシである）
を有する脂質を含んでなる。
【０３２６】
例示的な脂質−ｓｉＲＮＡ製剤は、以下に示されているとおりである。
【０３２７】
【表４】
2012531929.tif 000016
ＬＮＰ０９製剤およびＸＴＣ含有製剤は、例えば２００９年９月３日に出願された米国仮特許出願第６１／２３９，６８６号明細書内に記述されており、ＬＮＰ１１製剤およびＭＣ３含有製剤は、例えば、２００９年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／２４４，８３４号明細書内に記述されており；ＬＮＰ１２製剤およびＴｅｃｈＧ１含有製剤は、例えば、２００９年５月５日に出願された米国仮特許出願第６１／１７５，７７０号明細書内に記述されている。
【０３２８】
一実施形態において、本明細書に使用されたＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進する試薬には、２００９年１２月７日に出願された米国仮特許出願第６１／２６７，４１９号明細書、および２０１０年５月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／３３４，３９８号明細書に記載されたような荷電脂質が含まれる。様々な実施形態において、本明細書に記述されたＲＮＡエフェクター分子組成物は「脂質Ｈ」、「脂質Ｋ」（例えばＫ８）、「脂質Ｌ」（例えばＬ８）、「脂質Ｍ」、「脂質Ｐ」（例えばＰ８）または「脂質Ｒ」を含む。その化学式を以下に示す：
【０３２９】
【化１０】
2012531929.tif 000017
別の実施形態において、本明細書に記述されたＲＮＡエフェクター分子組成物は、脂質Ｈ、脂質Ｋ、脂質Ｌ、脂質Ｍ、脂質Ｐおよび脂質Ｒからなる群から選択される脂質を含む脂質製剤をさらに含み、さらに、中性脂質とステロールを含む。特定の実施形態において、脂質製剤は、脂質を約２５ｍｏｌ％〜約１００ｍｏｌ％で含む。別の実施形態において、脂質製剤はコレステロールを０ｍｏｌ％〜５０ｍｏｌ％で含む。また別の実施形態において、脂質製剤は、中性脂質を３０ｍｏｌ％〜６５ｍｏｌ％で含む。特定の実施形態において、脂質製剤は、表４に記載のように、構成成分の相対ｍｏｌ％で含む。
【０３３０】
【表５】
2012531929.tif 000018
標準法または押出フリー法のいずれかによって調製される製剤を同様の方法で特徴付けることができる。例えば、典型的には目視検査によって製剤を特徴付ける。それらは、凝集体または沈降物を含まない白っぽい透明な溶液であるはずである。脂質−ナノ粒子の粒径及び粒径分布は、例えばＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＳＡ）を用いて光散乱によって測定できる。粒子は約２０〜３００ｎｍ、例えば４０〜１００ｎｍの大きさであるはずである。粒径分布は単峰型であるはずである。製剤ならびに取り込まれた画分中の総ｓＲＮＡエフェクター分子濃度は、色素排除アッセイを用いて推定される。製剤されたＲＮＡエフェクター分子の試料を、製剤崩壊界面活性剤、例えば０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の存在下または不在下でＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）などのＲＮＡ結合色素と共にインキュベートすることができる。製剤中の総ＲＮＡエフェクター分子は、標準曲線と比較した、界面活性剤を含有する試料からのシグナルによって決定できる。取り込まれた画分は、総ＲＮＡエフェクター分子含量から「遊離」ＲＮＡエフェクター分子含量（界面活性剤の不在下でのシグナルによって測定される）を差し引くことによって決定される。取り込まれるＲＮＡエフェクター分子のパーセントは、典型的には＞８５％である。脂質ナノ粒子製剤に関して、粒径は少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍまたは少なくとも１２０ｎｍである。適切な範囲は、典型的には少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、または少なくとも約８０ｎｍ〜少なくとも約９０ｎｍ（両端を含む）である。
【０３３１】
リポソームは、親油性物質から形成される膜と水性内部とを有する単層または多重層の小胞である。水性部分は送達される組成物を含有する。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、効率的に細胞壁と融合することはできないが、インビボでマクロファージによって取り込まれる。無傷細胞膜を越えるために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、各々が直径５０ｎｍ未満の一連の微細孔を通り抜けなければならない。従って、高度に変形可能であり、そのような微細孔を通過できるリポソームを使用することが望ましい。
【０３３２】
リポソームのさらなる利点は、天然リン脂質から得られるリポソームは生体適合性及び生分解性であること；リポソームは広範囲の水溶性及び脂溶性薬剤を組み込み得ること；ならびにリポソームは、その内部区画内に封入された薬剤を代謝及び分解から保護し得ることを含む。例えば、Ｗａｎｇら、ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶ．ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ＆ＡＰＰＬ．（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ，２００５）；Ｒｏｓｏｆｆ，１９８８参照。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要な点は、脂質表面の電荷、小胞の大きさ及びリポソームの水分容量である。
【０３３３】
リポソームは、作用部位への有効成分の輸送及び送達のために有用である。リポソーム膜は構造的に生体膜に類似するので、リポソームを組織に適用した場合、リポソームは細胞膜との融合を開始し、リポソームと細胞の融合が進行すると共に、リポソームの内容物が細胞内に流入して、そこで活性物質が作用し得る。リポソーム製剤は多くの薬剤のための送達方法として広範な研究の中心となってきた。局所投与に関して、リポソームが他の製剤に比べていくつかの利点を示すことの証拠が増えつつある。かかる利点は、投与された薬剤の高い全身吸収に関連する副作用の低減、所望標的における投与薬剤の蓄積の増大、ならびに親水性及び疎水性の両方の多種多様な薬剤を皮膚内に投与できることを含む。
【０３３４】
リポソームは２つの大きなクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に荷電したポリヌクレオチド分子と相互作用して安定な複合体を形成する、正に荷電したリポソームである。正に荷電したポリヌクレオチド／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドソーム内にインターナライズされる。エンドソーム内の酸性ｐＨにより、リポソームは破裂して、その内容物を細胞質中に放出する。Ｗａｎｇら、１４７  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，９８０−８５（１９８７）。
【０３３５】
ｐＨ感受性であるかまたは負に荷電したリポソームは、ポリヌクレオチドと複合体を形成するのではなくポリヌクレオチドを取り込む。ポリヌクレオチドと脂質の両方が同様に荷電しているので、複合体形成ではなく斥力が生じる。それにもかかわらず、一部のポリヌクレオチドはこれらのリポソームの水性内部に捕捉される。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養下の細胞単層に送達するために使用されてきた。外因性遺伝子の発現が標的細胞において検出された。Ｚｈｏｕら、１９  Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２６９−７４（１９９２）。
【０３３６】
リポソーム組成物の主要なタイプの一つは、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成できる。アニオン性リポソーム組成物は、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、アニオン性の膜融合性リポソームは主としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えばダイズＰＣ及び卵ＰＣなどから形成される。別のタイプは、リン脂質及び／またはホスファチジルコリン及び／またはコレステロールの混合物から形成される。
【０３３７】
リポソームはまた、「立体的に安定化された」リポソームを含み、この用語は、本明細書で使用される場合、リポソームに組み込まれたとき、そのような特殊な脂質を欠くリポソームと比較して長い循環寿命を生じさせる１またはそれ以上の特殊な脂質を含むリポソームを指す。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１のような１もしくはそれ以上の糖脂質を含む、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分のような１またはそれ以上の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリンまたはＰＥＧで誘導体化された脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームに関しては、これらの立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の延長は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内への取込みの減少に由来すると当技術分野では考えられている。Ａｌｌｅｎら、２２３  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４２（１９８７）；Ｗｕら、５３  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３７６５（１９９３）。
【０３３８】
１またはそれ以上の糖脂質を含有する様々なリポソームが当技術分野において公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（５０７  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６４（１９８７））は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシド及びホスファチジルイノシトールがリポソームの血中半減期を改善する能力を報告した。これらの所見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（８５  ＰＮＡＳ  ６９４９（１９８８））によって詳しく説明された。いずれもＡｌｌｅｎらによる米国特許第４，８３７，０２８号及び国際公開第ＷＯ８８／０４９２４号パンフレットは、（１）スフィンゴミエリン及び（２）ガングリオシドＧＭ１または硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含むリポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開第ＷＯ９７／１３４９９号（Ｌｉｍら）パンフレットに開示されている。
【０３３９】
１またはそれ以上の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム及びその調製法が当技術分野において公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（５３  Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．２７７８（１９８０））は、ＰＥＧ部分を含む非イオン性界面活性剤２Ｃ１２１５Ｇを含有するリポソームを記載した。Ｉｌｌｕｍら（１６７  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．７９（１９８４））は、ポリスチレン粒子の高分子グリコールを用いた親水性コーティングが血中半減期を有意に延長させることを指摘した。ポリアルキレングリコール（例えばＰＥＧ）のカルボキシル基の結合によって修飾された合成リン脂質がＳｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号明細書及び同第４，５３４，８９９号明細書）に記載されている。加えて、ポリアルキレンで誘導体化されたリポソームに抗体を結合することができる（例えば、ＰＣＴ特許出願第ＵＳ２００８／００１４２５５号参照）。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（２６８  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２３５（１９９０））は、ＰＥＧまたはＰＥＧステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが血液循環半減期を有意に延長することを実証する実験を記載した。Ｂｌｕｍｅら（１０２９  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０２９，（１９９０））は、そのような所見を他のＰＥＧ誘導体化リン脂質、例えばジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧの組合せから形成されるＤＳＰＥ−ＰＥＧに拡大適用した。外表面上にＰＥＧ部分が共有結合しているリポソームがＦｉｓｈｅｒへの欧州特許第０４４５１３１Ｂ１号明細書及び国際公開第ＷＯ９０／０４３８４号パンフレットに記載されている。
【０３４０】
ＰＥＧで誘導体化された１〜２０モル％のＰＥを含有するリポソーム組成物及びその使用方法は、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５５６号明細書及び同第５，３５６，６３３号明細書）ならびにＭａｒｔｉｎら（米国特許第５，２１３，８０４号明細書及び欧州特許第０４９６８１３Ｂ１号明細書）によって記載されている。多くの他の脂質−ポリマーコンジュゲートを含むリポソームが、国際公開第ＷＯ９１／０５５４５号パンフレット及び米国特許第５，２２５，２１２号明細書及び国際公開第ＷＯ９４／２００７３号パンフレットに開示されている。ＰＥＧ修飾されたセラミド脂質を含むリポソームは、国際公開第ＷＯ９６／１０３９１号パンフレットに記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号明細書及び同第５，５５６，９４８号明細書は、表面上の官能基部分でさらに誘導体化され得るＰＥＧ含有リポソームを記載する。ＰＥＧを含むリポソームに関する方法及び組成物は、例えば米国特許第６，０４９，０９４号明細書、同第６，２２４，９０３号明細書、同第６，２７０，８０６号明細書、同第６，４７１，３２６号明細書、同第６，９５８，２４１号明細書に認められる。
【０３４１】
上述したように、リポソームは、場合により、抗体または抗体フラグメント、細胞表面受容体と相互作用するための小さなエフェクター分子、抗原及び他の同様の化合物などの表面基を含むように作製することができ、これらの基は特定の細胞集団へのリポソーム及びその内容物の送達を促進し得る。標的分子で誘導体化された脂質またはあらかじめ形成されたリポソーム中の標的分子で誘導体化され得る極性頭部化学基を有する脂質をリポソーム脂質に含めることにより、そのようなリガンドをリポソームに含めることができる。あるいは、あらかじめ形成されたリポソームをリガンド−ポリマー−脂質コンジュゲートと共にインキュベートすることにより、標的部分をあらかじめ形成されたリポソームに挿入できる。
【０３４２】
脂質は、リガンド、細胞表面受容体、糖タンパク質、ビタミン類（例えばリボフラビン）及びモノクロナール抗体などの様々な標的部分を用いて、リガンドを親水性ポリマー鎖の遊離遠位端に共有結合し、それを近位端で小胞形成脂質に結合することによって誘導体化できる。選択した親水性ポリマーを選択した脂質に結合し、選択したリガンドとの反応のためにポリマーの遊離非結合末端を活性化するための多種多様な技術が存在し、上述したように、親水性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が広く検討されてきた。Ａｌｌｅｎら、１２３７  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９９−１０８（１９９５）、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，４  Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２９６−９９（１９９３）、Ｚａｌｉｐｓｋｙら、３５３  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１−７４（１９９４）、Ｚａｌｉｐｓｋｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．７０５−０８（１９９５）、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ｉｎ  ＳＴＥＡＬＴＨ  ＬＩＰＯＳＯＭＥＳ（Ｌａｓｉｃ＆Ｍａｒｔｉｎ，ｅｄｓ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９５）。
【０３４３】
高分子量核酸をリポソームに封入するための方法のような、核酸を含有する多くのリポソームが当技術分野において公知である。国際公開第ＷＯ９６／４００６２号パンフレット。Ｔａｇａｗａらへの米国特許第５，２６４，２２１号はタンパク質結合リポソームを開示し、そのようなリポソームの内容物はｄｓＲＮＡを含み得ると主張している。Ｒａｈｍａｎらへの米国特許第５，６６５，７１０号は明細書、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソームに封入する特定の方法を記載している。Ｌｏｖｅらへの国際公開第ＷＯ９７／０４７８７号パンフレットは、ｒａｆ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含むリポソームを開示する。加えて、核酸を含有するリポソーム組成物を作製するための方法は、例えば、米国特許第６，０１１，０２０号明細書、同第６，０７４，６６７号明細書、同第６，１１０，４９０号明細書、同第６，１４７，２０４号明細書、同第６，２７１，２０６号明細書、同第６，３１２，９５６号明細書、同第６，４６５，１８８号明細書、同第６，５０６，５６４号明細書、同第６，７５０，０１６号明細書、同第７，１１２，３３７号明細書に見出される。
【０３４４】
トランスファーソーム（Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）はさらに別のタイプのリポソームであり、薬剤送達ビヒクルの魅力的な候補物である高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、高度に変形可能な脂質小滴であるため該小滴よりも小さい細孔を容易に通り抜けることができる脂質小滴と記載されている。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応性であり、例えばそれらは自己最適化性であり、自己修復性であり、多くの場合フラグメント化されることなく標的に到達し、そして多くの場合自己充填性である。トランスファーソームを作製するために、標準的なリポソーム組成物に表面端活性化剤、通常は界面活性剤を添加することが可能である。
【０３４５】
乳剤
本発明の組成物は、乳剤として調製し、調剤することができる。乳剤は、典型的には一方の液体が通常は直径０．１μｍを超える小滴の形態で他方の中に分散している不均一系である。例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ＆ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶ．ＳＹＳ．（８ｔｈ  ｅｄ．Ａｌｌｅｎら、ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，ＮＹ，２００４）、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  １  ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  １９９（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８８）、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  １  ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ２４５（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８８）、Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ２  ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ３３５（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８８）、Ｈｉｇｕｃｈｉら、ｉｎ  ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．３０１（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８５）参照。乳剤は、多くの場合、互いに十分に混合され、分散された２つの非混和性の液相を含む二相系である。
【０３４６】
一般に、乳剤は油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかであり得る。水相が大量の油相中に微細に分割され、細かい小滴として分散される場合、生じる組成物は油中水型（ｗ／ｏ）乳剤と呼ばれる。あるいは、油相が大量の水相中に微細に分割され、細かい小滴として分散される場合、生じる組成物は水中油型（ｏ／ｗ）乳剤と呼ばれる。乳剤は、分散相に加えて、付加的な成分及び、水相中に、油相中に、または分離した相としてのそれ自体が、溶液として存在し得る活性薬剤を含有し得る。乳化剤、安定化剤、染料及び酸化防止剤などの医薬賦形剤も、必要に応じて乳剤中に存在し得る。医薬乳剤はまた、例えば油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）乳剤及び水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）乳剤の場合のような、３以上の相で構成される多相乳剤であり得る。そのような複雑な製剤は、単純な２成分の乳剤にはない特定の利点を多くの場合提供する。ｏ／ｗ型乳剤の個々の油滴が小さな水滴を囲む多相乳剤は、ｗ／ｏ／ｗ型乳剤を構成する。同様に油性連続相中に安定化された水の小球に囲まれた油滴の系は、ｏ／ｗ／ｏ型乳剤を提供する。
【０３４７】
乳剤は、熱力学的安定性が、ほとんど又は全くないことを特徴とする。多くの場合、乳剤の分散相または不連続相は、外相または連続相中に十分に分散しており、乳化剤の使用または製剤の粘性によってこの形態に維持される。乳剤型の軟膏基剤及びクリームの場合のように、乳剤の相のいずれかは半固体または固体であり得る。乳剤を安定化する他の手段は、乳剤のいずれかの相に組み込むことができる乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、大きく４つのカテゴリー：合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収基剤及び微細分散固体に分類できる。例えば、ＡＮＳＥＬ’Ｓ  ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ＆ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶ．ＳＹＳ．，２００４、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ，１９８８参照。
【０３４８】
表面活性剤としても知られる合成界面活性剤は、乳剤の製剤において広い適用性が認められており、文献で総説されている。例えば、ＡＮＳＥＬ’Ｓ  ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ＆ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶ．ＳＹＳ．，２００４、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ，１９８８、Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ  ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ，１９８８参照。界面活性剤は、典型的には両親媒性であり、親水性部分と疎水性部分を含む。界面活性剤の親水性と疎水性の比率は親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称されており、製剤の調製において界面活性剤を分類し、選択するうえで有益なツールである。界面活性剤は、親水基の性質に基づいて種々のクラス：非イオン性、アニオン性、カチオン性及び両性に分類できる。例えば、ＡＮＳＥＬ’Ｓ  ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ＆ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶ．ＳＹＳ．，２００４、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ，１９８８、Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ  ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ，１９８８参照。
【０３４９】
乳剤製剤において使用される天然の乳化剤は、ラノリン、蜜ろう、ホスファチド、レシチン及びアラビアゴムを含む。無水ラノリン及び親水ワセリンなどの吸収基剤は、水分を吸収してｗ／ｏ型乳剤を形成し、それでもなおそれらの半固体粘稠度を維持できるように親水性特性を有する。微粉固体も、特に界面活性剤と組み合わせて、かつ粘性製剤において、良好な乳化剤として使用されてきた。これらは、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウム及びコロイド状ケイ酸マグネシウムアルミニウムなどの非膨潤性粘土、色素ならびに炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどの非極性固体を含む。
【０３５０】
乳化作用のない種々様々な物質も乳剤製剤中に含まれ、乳剤の特性に寄与する。これらは、脂肪、油、ろう、脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水コロイド、防腐剤及び酸化防止剤を含む。Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ  １  ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ３３５（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８８）、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ（１９８８）。
【０３５１】
親水コロイドまたはハイドロコロイドは、天然に存在するゴム及び合成ポリマー、例えば多糖類（例えばアラビアゴム、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーガム、カラヤゴム及びトラガカント）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース及びカルボキシプロピルセルロース）ならびに合成ポリマー（例えばカルボマー、セルロースエーテル及びカルボキシビニルポリマー）を含む。これらは水中で分散または膨潤し、分散相の小滴の周囲に丈夫な界面膜を形成すること及び外相の粘性を高めることによって乳剤を安定化するコロイド溶液を形成する。
【０３５２】
乳剤は多くの場合、微生物の増殖を容易に促進し得る炭水化物、タンパク質、ステロール及びホスファチドなどの多くの成分を含有するので、これらの製剤には防腐剤が組み込まれることが多い。乳剤製剤に含められる一般的に使用される防腐剤は、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル及びホウ酸を含む。酸化防止剤も、製剤の劣化を防ぐために乳剤製剤に一般的に添加される。使用される酸化防止剤は、フリーラジカル捕捉剤、例えばトコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなど、または還元剤、例えばアスコルビン酸及びメタ重亜硫酸ナトリウムなど、ならびに酸化防止相乗剤、例えばクエン酸、酒石酸及びレシチンなどであり得る。
【０３５３】
一実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子及び核酸の組成物はマイクロエマルジョンとして製剤される。マイクロエマルジョンは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定な溶液である、水、油及び両親媒性物質の系と定義され得る。例えば、ＡＮＳＥＬ’Ｓ  ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ＆ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶ．ＳＹＳ．（８ｔｈ  ｅｄ．，Ａｌｌｅｎら、ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，ＮＹ，２００４）、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ，１９８８参照。
【０３５４】
典型的には、マイクロエマルジョンは、最初に油を水性界面活性剤溶液中に分散させ、次に十分な量の第四の成分、一般には中鎖長アルコールを添加して透明な系を形成することによって調製される系である。従って、マイクロエマルジョンはまた、表面活性分子の界面膜によって安定化された２つの非混和性液体の、熱力学的に安定で等方的に透明な分散液とも記載されてきた。Ｌｅｕｎｇ＆Ｓｈａｈ，ｉｎ  ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＲＥＬＥＡＳＥ  ＤＲＵＧＳ：ＰＯＬＹＭＥＲＳ＆ＡＧＧＲＥＧＡＴＥ  ＳＹＳ．１８５−２１５（Ｒｏｓｏｆｆ，ｅｄ．，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，１９８９）。マイクロエマルジョンは一般に、油、水、界面活性剤、共界面活性剤及び電解質を含む３〜５の成分の組合せによって調製される。マイクロエマルジョンが油中水型（ｗ／ｏ）であるか水中油型（ｏ／ｗ）であるかは、使用される油及び界面活性剤の性質ならびに界面活性剤分子の極性頭部及び炭化水素尾部の構造及び幾何学的充填に依存する。Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ  ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．２７１（１９８５）。
【０３５５】
相図を利用する現象学的アプローチが広汎に検討されており、マイクロエマルジョンを調剤する方法についての包括的な知識が当業者にもたらされている。例えば、ＡＮＳＥＬ’Ｓ  ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ＆ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶ．ＳＹＳ．（８ｔｈ  ｅｄ．，Ａｌｌｅｎら、ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，ＮＹ，２００４）、Ｒｏｓｏｆｆ，１９８８、Ｂｌｏｃｋ，１９８８参照。従来の乳剤と比較して、マイクロエマルジョンは、自然に形成される熱力学的に安定な小滴の製剤中に水不溶性の薬剤を可溶化するという利点を提供する。
【０３５６】
マイクロエマルジョンは、本明細書でさらに論じる界面活性剤、例えば、限定されることなく、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）などを、単独でまたは共界面活性剤と組み合わせて含み得る。通常は、エタノール、１−プロパノール及び１−ブタノールなどの短鎖アルコールである共界面活性剤は、界面活性剤の界面膜に浸透し、その結果として界面活性剤分子の間に生じた空隙による不規則な膜を作り出すことによって界面の流動性を高める役割を果たす。しかしながら、マイクロエマルジョンは共界面活性剤を使用せずに調製され得、アルコール非含有の自己乳化型マイクロエマルジョン系が当技術分野において公知である。水相は、典型的には水、薬剤の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール及びエチレングリコールの誘導体であり得るが、これらに限定されない。油相は、Ｃａｐｔｅｘ３００、Ｃａｐｔｅｘ３５５、Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油及びシリコーン油を含み得るが、これらに限定されない。
【０３５７】
マイクロエマルジョンは、より良好な薬剤の可溶化、酵素加水分解からの薬剤の保護、界面活性剤が誘導する膜の流動性及び透過性の変化による薬剤吸収の増大の可能性、調製の容易さ、ならびに毒性の低減という利点を提供する。例えば、米国特許第６，１９１，１０５号明細書、同第７，０６３，８６０号明細書、同第７，０７０，８０２号明細書、同第７，１５７，０９９号明細書、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら、１１  Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１３８５（１９９４）、Ｈｏら、８５  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１３８−４３（１９９６）参照。多くの場合、マイクロエマルジョンはその成分を周囲温度で組み合わせた場合に自然に形成され得る。このことは、熱不安定薬剤、ペプチドまたはＲＮＡエフェクター分子を製剤する場合に特に有利であり得る。
【０３５８】
本発明のマイクロエマルジョンはまた、製剤の性質を改善し、本発明のＲＮＡエフェクター分子及び核酸の吸収を高めるために、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ及び浸透促進剤などの付加的な成分及び添加剤も含み得る。本発明のマイクロエマルジョンにおいて使用される浸透促進剤は、５つの広いカテゴリー、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤及び非キレート化非界面活性剤の一つに属すると分類され得る。Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９２（１９９１）。
【０３５９】
マイクロエマルジョン以外にも薬剤の製剤のために検討され、使用されてきた多くの組織化された界面活性剤構造体が存在する。これらは、単層、ミセル、二重層及び小胞を含む。リポソームなどの小胞は、薬剤送達の見地から、それらが提供する特異性及び作用持続時間のゆえに大きな関心を集めてきた。本発明において使用される、「リポソーム」という用語は、球状の１またはそれ以上の二重層中に配置された両親媒性脂質から成る小胞を意味する。
【０３６０】
界面活性剤
実施形態のいくつかにおいて、本発明を特徴付けるＲＮＡエフェクター分子は、１またはそれ以上の浸透促進剤、界面活性剤及び／またはキレート剤と共に調剤される。適切な界面活性剤は、脂肪酸及び／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸及び／またはその塩を含む。適切な胆汁酸／塩は、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム及びグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムを含む。適切な脂肪酸は、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリンまたはモノグリセリド、ジグリセリドまたはそれらの医薬的に許容される塩（例えばナトリウム塩）を含む。実施形態のいくつかにおいて、浸透促進剤の組合せ、例えば胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩が使用される。一つの例示的な組合せは、ラウリン酸、カプリン酸及びＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透促進剤は、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルを含む。
【０３６１】
界面活性剤は、乳剤（マイクロエマルジョンを含む）及びリポソームなどの製剤において広く適用される。天然及び合成の両方の多くの異なるタイプの界面活性剤の特性を分類し、ランクづける最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水基（「頭部」としても知られる）の性質は、製剤に使用される種々の界面活性剤を分類するために最も有用な手段を提供する。例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，ＳＵＲＦＡＣＴＡＮＴＳ＆ＰＯＬＹＭＥＲＳ  ＩＮ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶ．（Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，ＮＹ，２００２）、Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ  ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ２８５（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８８）参照。
【０３６２】
界面活性剤分子がイオン化されない場合、その分子は非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品及び化粧品に広い用途が見出され、広範囲のｐＨ値にわたって使用可能である。一般にそれらのＨＬＢ値は、それらの構造に依存して２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤は、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグルセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル及びエトキシ化エステルなどの非イオン性エステルを含む。非イオン性アルカノールアミド及びエーテル、例えば脂肪族アルコールエトキシレート、プロポキシ化アルコール及びエトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマーなどもこのクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は非イオン性界面活性剤クラスの最も一般的なものである。
【０３６３】
界面活性剤分子が、水に溶解または分散されたとき負電荷を保持する場合、その界面活性剤はアニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤は、セッケン、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミドなどのカルボキシレート、硫酸アルキル及びエトキシ化硫酸アルキルなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレート及びスルホスクシネートならびにホスフェートを含む。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要なものは硫酸アルキル及びセッケンである。
【０３６４】
界面活性剤分子が、水に溶解または分散されたとき正電荷を保持する場合、その界面活性剤はカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤は、第四級アンモニウム塩及びエトキシ化アミンを含む。第四級アンモニウム塩はこのクラスの最も広く使用されるものである。界面活性剤分子が正電荷または負電荷のいずれも保持する能力を有する場合、その界面活性剤は両性として分類される。両性界面活性剤は、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン及びホスファチドを含む。
【０３６５】
浸透促進剤
一実施形態では、本発明は、核酸、特にＲＮＡエフェクター分子の、細胞への効率的な送達を生じさせるために様々な浸透促進剤を使用する。大部分の薬剤は、イオン化形態及び非イオン化形態の両方で溶液中に存在する。通常は、脂溶性または親油性薬剤だけが容易に細胞膜を横断する。横断する細胞膜が浸透促進剤で処理されている場合、非親油性薬剤であっても細胞膜を横断し得ることが発見された。浸透促進剤はまた、非親油性薬剤が細胞膜を越えて拡散するのを助けることに加えて、親油性薬剤の透過性も向上させる。
【０３６６】
浸透促進剤は、５つの広いカテゴリー：界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤及び非キレート化非界面活性剤の一つに属すると分類され得る。例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，２００２、Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９２（１９９１）参照。
【０３６７】
本発明に関連して、浸透促進剤は界面活性剤（または「表面活性剤」）を含み、界面活性剤とは、水溶液中に溶解された場合、溶液の表面張力または水溶液と別の液体との間の界面張力を低下させ、その結果として細胞膜及び他の生物学的障壁を介するＲＮＡエフェクター分子の吸収を増大させる化学的実体である。胆汁酸塩及び脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤は、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，２００２、Ｌｅｅら、１９９１参照）、ならびにＦＣ−４３（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、４０  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２５２（１９８８））などのペルフルオロケミカル乳剤を含む。
【０３６８】
浸透促進剤として働く様々な脂肪酸及びそれらの誘導体は、例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１〜２０アルキルエステル（例えばメチル、イソプロピル及びｔ−ブチル）、ならびにそれらのモノグリセリド及びジグリセリド（すなわちオレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエート等）を含む。例えば、Ｔｏｕｉｔｏｕら、ＥＮＨＡＮＣＥＭＥＮＴ  ＩＮ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶ．（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６）、Ｌｅｅら、１９９１、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，７  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．１−３３（１９９０）、Ｅｌ  Ｈａｒｉｒｉら、４４  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６５１−５４（１９９２）参照。
【０３６９】
胆汁の生理的役割は、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の促進を含む。例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，２００２、Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔ．３８  ｉｎ  ＧＯＯＤＭＡＮ＆ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ，９ＴＨ  ＥＤ．９３４−３５（Ｈａｒｄｍａｎら、ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮＹ，１９９６）参照。様々な天然胆汁酸塩及びそれらの合成誘導体は浸透促進剤として働く。従って「胆汁酸塩」という用語は、天然に存在する胆汁の成分の任意のものならびにそれらの合成誘導体の任意のものを包含する。適切な胆汁酸塩は、例えばコール酸（またはその医薬的に許容されるナトリウム塩であるコール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロフシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム及びポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）を含む（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，２００２、Ｌｅｅら、１９９１、Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔ．３９  ｉｎ  ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．，１８ｔｈ  Ｅｄ．７８２−８３（Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０）、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，１９９０、Ｙａｍａｍｏｔｏら、２６３  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２５（１９９２）、Ｙａｍａｓｈｉｔａら、７９  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．５７９−８３（１９９０）参照）。
【０３７０】
キレート剤は、本発明に関連して使用される場合、金属イオンと複合体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、その結果として粘膜を介したＲＮＡエフェクター分子の吸収を高める化合物と定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのそれらの使用に関して、特徴付けられている大部分のＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、従ってキレート剤によって阻害されるので、キレート剤はＤＮアーゼ阻害剤としての役割も果たすという更なる利点を有する。Ｊａｒｒｅｔｔ，６１８  Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３１５−３９（１９９３）。適切なキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えばサリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレート及びホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９ならびにβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）を含むが、これらに限定されない。例えば、Ｋａｔｄａｒｅら、ＥＸＣＩＰＩＥＮＴ  ＤＥＶＥＬ．ＰＨＡＲＭ．ＢＩＯＴＥＣＨ．＆  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶ．（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６）、Ｌｅｅら、１９９１、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，１９９０、Ｂｕｕｒら、１４  Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．４３−５１（１９９０）参照。
【０３７１】
本明細書で使用される場合、非キレート化非界面活性剤である浸透促進化合物は、キレート剤としてまたは界面活性剤としては有意ではない活性を示すが、それにもかかわらず消化管粘膜を介したＲＮＡエフェクター分子の吸収を高める化合物と定義され得る。例えば、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，１９９０参照。このクラスの浸透促進剤は、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−及び１−アルケニルアザシクロアルカノン誘導体（Ｌｅｅら、１９９１）ならびにジクロフェナクナトリウム、インドメタシン及びフェニルブタゾンなどの非ステロイド系抗炎症薬を含む（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、１９８７）。
【０３７２】
細胞レベルでＲＮＡエフェクター分子の取込みを増強する物質も、本発明の医薬組成物及び他の組成物に添加し得る。例えば、リポフェクチン（米国特許第５，７０５，１８８号明細書）などのカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリリシン（国際公開第ＷＯ９７／３０７３１号パンフレット）などのポリカチオン分子も、ｄｓＲＮＡの細胞内取込みを増強することが公知である。市販のトランスフェクション試薬の例としては、例えば、数ある中でも特に、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００（商標）、２９３ＦＥＣＴＩＮ（商標）、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（商標）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）ＭＡＸ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００ＣＤ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＲＮＡｉＭＡＸ、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）及びＯＰＴＩＦＥＣＴ（商標）（上述の各々、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）トランスフェクション試薬、ならびにＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  Ｑ２トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰリポソームトランスフェクション試薬（Ａｖａｎｔｅ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）、ＤＯＳＰＥＲリポソームトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）、またはＦｕＧＥＮＥ（登録商標）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）試薬、ＴＲＡＮＳＦＡＳＴ（商標）トランスフェクション試薬、ＴＦＸ（商標）−２０試薬、もしくはＴＦＸ（商標）−５０試薬（上述の各々、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＤＲＥＡＭＦＥＣＴ（商標）（ＯＺ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ（登録商標）Ｄ１トランスフェクション試薬（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、ＬＹＯＶＥＣ（商標）／ＬＩＰＯＧＥＮ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬、ＮＥＵＲＯＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ  ２トランスフェクション試薬、ＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮトランスフェクション試薬、ＢＡＣＵＬＯＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬もしくはＴＲＯＧＡＮＰＯＲＴＥＲ（商標）トランスフェクション試薬（各々Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡより）、ＲＩＢＯＦＥＣＴ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．）、ＰＬＡＳＦＥＣＴ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、またはＵＮＩＦＥＣＴＯＲ、ＳＵＲＥＦＥＣＴＯＲもしくはＨＩＦＥＣＴ（商標）（各々Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡより）が含まれる。
【０３７３】
付加的な担体
投与した核酸の浸透を促進するために、エチレングリコール及びプロピレングリコールなどのグリコール、２−ピロールなどのピロール、アゾン、ならびにリモネン及びメントンなどのテルペンを含む他の物質を利用し得る。
【０３７４】
本発明の特定の組成物はまた、製剤中に担体化合物を組み込む。本明細書で使用される、「担体化合物」または「担体」は、不活性である（すなわちそれ自体は生物学的活性を有さない）が、例えば生物学的に活性な核酸を分解するまたはその除去を促進することにより、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティーを低下させるインビボプロセスによって核酸として認識される、核酸またはその類似体を表し得る。
【０３７５】
本発明の組成物は、他の補助成分を、添加された場合にかかる物質が本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に妨げない限り、付加的に含有し得る。製剤は、滅菌することができ、所望する場合は、製剤のＲＮＡエフェクター分子と有害な相互作用を生じない補助剤と混合し得る。
【０３７６】
水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増大させる物質を含み得る。懸濁液はまた、安定剤も含み得る。
【０３７７】
そのような化合物の毒性及び治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％を死に至らせる用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するために、卵または細胞における標準的な薬学的手順によって測定し得る。毒性作用と治療効果との間の用量比が治療指数であり、治療指数はＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物は特に有用である。インビトロ及びインビボ試験から得られたデータを、本発明の方法における使用のための用量範囲の策定に使用できる。本発明を特徴付ける組成物の用量は、一般に、毒性をほとんどまたは全く伴わないＥＤ５０を含む濃度範囲内にある。用量は、使用される剤形及び利用される投与経路に依存してこの範囲内で変動し得る。
【０３７８】
さらに別の態様では、本発明は、標的遺伝子の発現が長期間、例えば少なくとも２日間、３日間、４日間、５日間、６日間またはそれ以上、例えば１週間またはそれ以上にわたって低下するように、本発明を特徴付ける組成物を卵細胞に投与することによって発育卵の細胞における標的遺伝子の発現を抑制するための方法を提供する。標的遺伝子の発現低下の作用は、好ましくは、処置前のレベルと比較して、標的遺伝子によって影響われる標的タンパク質又は経路のレベルの少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％または少なくとも６０％またはそれ以上の低下を生じさせる。
【０３７９】
ＶＩ．キット及びアッセイ
実施形態のいくつかにおいて、卵による生物由来物質の産生への一つのＲＮＡエフェクター分子または一連のＲＮＡエフェクター分子の作用を試験するためのキットが提供され、該キットは、生物由来物質の産生を可能にする条件下で採取された細胞を培養するのに適した１またはそれ以上のアッセイ表面を有する基質を含む。実施形態のいくつかにおいて、基質の外側は、アッセイ表面に対応する位置に穴、刻み目、境界等を含む。一部の実施形態では、穴、刻み目、境界等は、アッセイ表面の上に細胞培養培地などの流体を保持する。
【０３８０】
実施形態のいくつかにおいて、基質上のアッセイ表面は無菌であり、生物由来物質の生産の間の卵における培養条件を代表する条件下で細胞を培養するのに適する。好都合には、本明細書で提供されるキットは、生物由来物質の生産に関して広い範囲の物質及び／または条件を試験するための迅速で費用効率が高い手段を提供し、生物由来物質の本格的生産に先立って卵細胞の取り扱いを確立することを可能にする。
【０３８１】
実施形態のいくつかにおいて、基質の１またはそれ以上のアッセイ表面は、アッセイ表面に適切な培地を添加することによってアッセイ表面の周囲のＲＮＡエフェクター分子の所望濃度がもたらされるように、ＲＮＡエフェクター分子などの濃縮試験物質を含有する。実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡエフェクター分子は、アッセイ表面にプリントし得るもしくは染み込ませ得るか、または、適切な量の培地を添加したときエフェクター分子が再構成され得るように、例えば穴内に、凍結乾燥形態で提供され得る。実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡエフェクター分子は、基質のアッセイ表面に採取された発育卵の細胞を塗布することによって再構成される。
【０３８２】
実施形態のいくつかにおいて、本明細書で提供されるキットは、対象とする生物由来物質の産生を可能にする条件下で卵細胞を培養するのに適した細胞培養培地をさらに含む。培地は、すぐに使用できる形態であり得るか、または濃縮され得る（例えば保存溶液として）、凍結乾燥され得るもしくは別の再構成可能な形態で提供され得る。
【０３８３】
さらなる実施形態では、本明細書で提供されるキットは、卵による生物由来物質の産生を検出するのに適した１またはそれ以上の試薬を含む。さらなる実施形態では、試薬は、所望生物由来物質の生産を示す、最大細胞密度、胚生存能等のような卵の特性を検出するのに適する。実施形態のいくつかにおいて、試薬は、生物由来物質またはその特性、例えば採取されたウイルスの感染力（例えば、ｐｆｕ／卵）のような生物由来物質のインビトロまたはインビボでの生物学的活性、均一性または構造、などを検出するのに適する。
【０３８４】
実施形態のいくつかにおいて、基質の１またはそれ以上のアッセイ表面は、卵細胞によるＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進するための担体をさらに含む。ＲＮＡエフェクター分子のための担体は当技術分野において公知であり、本明細書で説明する。例えば、実施形態のいくつかにおいて、担体は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの脂質製剤または関連製剤である。そのような担体の製剤の例は本明細書に記載されている。実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進する試薬は、本出願全体にわたって述べる荷電脂質、乳剤、リポソーム、カチオン性または非カチオン性脂質、アニオン性脂質、トランスフェクション試薬または透過促進剤を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進する試薬は、２００９年１２月７日出願の米国仮特許出願第６１／２６７，４１９号及び２０１０年５月１３日出願の米国仮特許出願第６１／３３４３９８号に記載されている荷電脂質を含む。
【０３８５】
実施形態のいくつかにおいて、基質の１またはそれ以上のアッセイ表面は、試験細胞をアッセイ表面に塗布することにより、細胞によるＲＮＡエフェクター分子の取込み及びＲＮＡエフェクター分子によって標的される１またはそれ以上の遺伝子の発現の調節を促進するために有効なＲＮＡエフェクター分子及び担体の濃度がもたらされるように、各々濃縮された形態の、１個のＲＮＡエフェクター分子または一連のＲＮＡエフェクター分子及び担体を含む。
【０３８６】
実施形態のいくつかにおいて、基質は、３次元細胞の成長及び／または細胞による生物由来物質の産生を促進するマトリックスをさらに含む。さらなる実施形態では、マトリックスは、細胞の足場依存性の成長を促進する。本明細書に記載される種々のキットとともに使用するのに適したマトリックス材料の非限定的な例は、寒天、アガロース、メチルセルロース、アルギネートヒドロゲル（例えば５％アルギネート＋５％Ｉ型コラーゲン）、キトサン、ハイドロアクティブな親水コロイドポリマーゲル、ポリビニルアルコール−ヒドロゲル（ＰＶＡ−Ｈ）、ポリラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、コラーゲンビトリゲル、ＰＨＥＭＡ（ポリ（２−ヒドロキシルメタクリレート））ヒドロゲル、ＰＶＰ／ＰＥＯヒドロゲル、ＢＤ  ＰＵＲＡＭＡＴＲＩＸ（商標）ヒドロゲル、及び２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）のコポリマーを含む。
【０３８７】
実施形態のいくつかにおいて、基質は、卵細胞による生物由来物質の産生に関する様々な試験物質、条件及び／またはそれらの組合せの高処理能力の自動検査を可能にする、マイクロアレイプレート、バイオチップ等を含む。例えば、基質は、アッセイ表面のｍ縦列とｎ横列を有する（例えば穴内に存在する）２次元マイクロアレイプレートまたはバイオチップを含み得、それらは試験物質及び／または条件のｍ×ｎの組合せの検査を可能にする（例えば２４穴、９６穴または３８４穴マイクロアレイプレート上で）。マイクロアレイ基質は、好ましくは、すべての必要な陽性及び陰性対照が試験物質及び／または条件の検査と並行して実施できるように設計される。
【０３８８】
さらなる実施形態では、生物由来物質の生産に影響を及ぼす特定の経路、機能または細胞の特性を調節するように設計された一組のＲＮＡエフェクター分子を接種した１またはそれ以上のマイクロアレイ基質を含むキットが提供される。例えば、実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡエフェクター分子は、卵細胞による発現、折りたたみ、分泌、翻訳後修飾またはウイルス分泌に関与する経路を含む標的遺伝子を対象とする。
【０３８９】
さらなる実施形態では、細胞ベースの系における免疫原性物質の生産に関連する特定の問題または問題のクラスに対処するように設計された一組のＲＮＡエフェクター分子を接種した１またはそれ以上のマイクロアレイ基質を含むキットが本明細書で提供される。例えば、実施形態のいくつかにおいて、ＲＮＡエフェクター分子は、潜在もしくは内在性ウイルスによって発現される標的遺伝子、または生物由来物質の生産もしくは精製を抑制するもしくは妨げる、細胞周期進行、細胞代謝もしくはアポトーシスなどの細胞プロセスに関与する標的遺伝子を対象とする。さらなる実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は、生物由来物質の活性、均一性、安定性及び／または他の品質を低下させる酵素分解、凝集、ミスフォールディングまたは他のプロセスを媒介する標的遺伝子を対象とする。なおさらなる実施形態では、エフェクター分子は、外因性または偶発的汚染微生物の感染性に影響を及ぼす標的遺伝子を対象とする。一実施形態では、生物由来物質は糖タンパク質を含み、ＲＮＡエフェクター分子は、グリコシル化（例えばフコシル化）及び／または宿主細胞による糖タンパク質のタンパク質分解プロセシングに関与する標的遺伝子を対象とする。別の実施形態では、生物由来物質はマルチサブユニット組換えタンパク質であり、ＲＮＡエフェクター分子は、宿主細胞によるタンパク質の折りたたみ及び／または分泌に関与する標的遺伝子を対象とする。別の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は、細胞における生物由来物質の翻訳後修飾、例えばメチオニン酸化、グリコシル化、ジスルフィド結合形成、ピログルタミン酸化及び／またはタンパク質の脱アミド化などに関与する標的遺伝子を対象とする。
【０３９０】
実施形態のいくつかにおいて、本明細書で提供されるキットは、生物由来物質の生産を増大させるための少なくとも一つの因子の選択または最適化を可能にする。例えば、キットは、一連の候補ＲＮＡエフェクター分子の中から１個のＲＮＡエフェクター分子を選択すること、または所与のＲＮＡエフェクター分子のより広い範囲の濃度から一つの濃度もしくは濃度範囲を選択することを可能にし得る。実施形態のいくつかにおいて、キットは、共通の標的遺伝子に対する一連の候補ＲＮＡエフェクター分子の中から１またはそれ以上のＲＮＡエフェクター分子を選択することを可能にする。さらなる実施形態では、キットは、２もしくはそれ以上の機能的に関連する標的遺伝子または共通の細胞経路の２もしくはそれ以上の標的遺伝子に対する一連の候補ＲＮＡエフェクター分子の中から１またはそれ以上のＲＮＡエフェクター分子を選択することを可能にする。
【０３９１】
実施形態のいくつかにおいて、本明細書で提供されるキットは、生物由来物質の生産における２またはそれ以上の因子の組合せの選択または最適化を可能にする。例えば、キットは、一連の候補ＲＮＡエフェクター分子の中から１個の適切なＲＮＡエフェクター分子を選択することならびにＲＮＡエフェクター分子の一つの濃度を選択することを可能にし得る。さらなる実施形態では、本明細書で提供されるキットは、第一シリーズの候補ＲＮＡエフェクター分子から第一ＲＮＡエフェクター分子を選択し、第二シリーズの候補ＲＮＡエフェクター分子から第二のＲＮＡエフェクター分子を選択することを可能にする。実施形態のいくつかにおいて、第一及び／または第二シリーズの候補ＲＮＡエフェクター分子は、共通の標的遺伝子を対象とする。さらなる実施形態では、第一及び／または第二シリーズのＲＮＡエフェクター分子は、２もしくはそれ以上の機能的に関連する標的遺伝子または共通の宿主細胞経路の２もしくはそれ以上の標的遺伝子を対象とする。
【０３９２】
別の実施形態では、細胞における生物由来物質の産生を増大させるためのキットは、少なくとも、その一部が少なくとも潜在または内在性ウイルスの第一標的遺伝子に相補的である第一ＲＮＡエフェクター分子、その一部が少なくとも細胞免疫応答の第二標的遺伝子に相補的である第二ＲＮＡエフェクター分子、及び、場合により、その一部が少なくとも細胞プロセスの第三標的遺伝子に相補的である第三ＲＮＡエフェクター分子を含む。例えば、第一標的遺伝子はＥＲＶ  ｅｎｖ遺伝子であり、第二標的遺伝子はＩＦＮＢ１、ＰＫＲ、ＩＲＦ３またはＩＦＮＡＲ１遺伝子であり、及び第三標的遺伝子はＰＴＥＮ、ＢＡＫ１、ＢＡＸまたはＬＤＨＡ遺伝子である。キットは、少なくとも、炭素の代謝及び輸送、アポトーシス、ＲＮＡｉの取込み及び／または効率、反応性酸素種の産生、細胞周期の制御、タンパク質の折りたたみ、ピログルタミン酸化タンパク質修飾、デアミダーゼ、グリコシル化、ジスルフィド結合の形成、タンパク質分泌、遺伝子増幅、ウイルス複製、ウイルス感染、ウイルス粒子の放出、ｐＨの制御ならびにタンパク質産生を含むがこれらに限定されない細胞プロセスを標的する付加的なＲＮＡエフェクター分子をさらに含み得る。
【０３９３】
さらに別の態様では、本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を抑制するための方法を提供する。該方法は、標的遺伝子の発現が、例えば長期間、例えば少なくとも２日間、３日間、４日間またはそれ以上にわたって低下するように、本発明を特徴付ける組成物を細胞に投与することを含む。本発明を特徴付ける方法及び組成物のために有用なＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のＲＮＡ（一次またはプロセシングされた）を特異的に標的化する。ＲＮＡエフェクター分子を使用してこれらの標的遺伝子の発現を抑制するための組成物及び方法は、本明細書に記載されているように、作製し、実施し得る。
【０３９４】
本発明は、ウイルス産物および適切な賦形剤を含むワクチン製剤を包含する。ワクチン製剤で使用されるウイルスは、天然の突然変異体または変異体、突然変異誘発されたウイルスまたは遺伝子改変ウイルスから選択できる。分節ＲＮＡウイルスの弱毒化された系統も、遺伝子リアソータント技術によって、または逆遺伝学の手法と遺伝子リアソータント技術とを組み合わせて産生できる。天然変異体には、自然界から単離したウイルスと同様、ウイルス増殖中に自発的に生じた変異体もあり、細胞のＩＦＮ応答をアンタゴナイズする能力が損なわれている。弱毒性ウイルスは、それ自体ワクチン製剤の中で活性成分として使用できる。あるいは、弱毒性ウイルスは、組換えで産生するワクチンのベクターまたは「主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅ）」として使用できる。この目的のために、逆遺伝学等の組み換え技術（または分節ウイルスに対しては、逆遺伝学と遺伝子リアソータント技術の組み合わせ）は突然変異を作成するために、または、ワクチン製剤で使用される弱毒性ウイルスへ異種抗原を導入するために使用できる。このようにして、ワクチンは、系統の変種に対する、あるいは完全に異なる感染病原体または疾病抗原に対する免疫化のために設計することができる。
【０３９５】
いかなる実用的な異種遺伝子配列も、ワクチンで使用される本発明のウイルスに挿入できる。種々の病原体または中和抗体に結合する抗原のいずれかに対する防御免疫応答を誘導する抗原決定基は、ウイルスによって、またはウイルスの一部として発現できる。例えば、ワクチンに使用される本発明のウイルスへ挿入できる異種遺伝子配列には、ｇｐ１２０等のヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）の抗原決定基；Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）；ヘルペスウイルスの糖タンパク質（例えばｇＤ、ｇＥ）；ポリオウイルスのＶＰ１；細菌や寄生生物等の非ウイルス病原体の抗原決定基があるが、これらはほんの数例であり、これらに限定されない。別の実施形態において、免疫グロブリン遺伝子のすべてまたは一部分を発現できる。例えば、そのような抗原決定基を模倣する抗イディオタイプの免疫グロブリンの可変部は本発明のウイルスへ挿入できる。さらに別の実施形態において、腫瘍に関連する抗原を発現できる。
【０３９６】
生組み換えウイルスワクチンまたは不活化組換えウイルスワクチンのいずれかを調剤できる。宿主内の増殖により、自然感染で生じるのと同様の種類と規模の長期間の刺激が誘導され、実質的に持続性免疫が付与されるため生ワクチンが好ましい。そのような生組換えウイルスワクチン製剤は、細胞培養または胚の尿膜でのウイルス増殖、その後の精製を含む従来の方法を使用して生産できる。
【０３９７】
ワクチン製剤には、ＮＳ１または相似遺伝子に突然変異がある遺伝子改変のマイナス鎖ＲＮＡウイルスを含んでいてもよく、これには下記の作業例に記載した、切断型ＮＳ１インフルエンザ突然変異体があるが、これに限定しない。さらに、ワクチン製剤を、インフルエンザＡ型の天然の変異体、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｒｅ／７１、またはインフルエンザＢ型の天然の変異体、Ｂ／２０１、およびＢ／ＡＷＢＹ−２３４等の天然の変異体を使用して調剤できる。生ウイルスワクチンとして調剤された場合、１投与当たり約１０４ｐｆｕ〜約５ｘ１０６ｐｆｕの範囲で使用できる。
【０３９８】
本明細書に記述されたワクチン製剤を導入するために多数の方法、例えば鼻腔内、気管内、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、および皮下経路の方法があるが、これらに限定されない。ワクチンが設計される病原体の自然の感染経路を経由して、または親弱毒性ウイルスの自然の感染経路を経由してウイルスワクチン製剤を導入することが好ましい。インフルエンザ生ワクチン製剤が使用される場合、インフルエンザウイルスの自然の感染経路を経由して製剤を導入することが好ましい。活発な分泌および細胞性免疫反応を誘導するインフルエンザウイルスの能力が有利に使用できる。例えば、インフルエンザウイルスによる呼吸器の感染は、例えば泌尿生殖器系において強い分泌免疫応答を誘導できるが、これは同時に特定の疾病を引き起こす物質に対する防御ともなる。
【０３９９】
本発明のワクチンを２か月〜６か月の投与間隔で１度、２度、または３度投与し得る。あるいは、本発明のワクチンは、動物またはヒトに必要な頻度で投与してもよい。
本発明は下記の番号付けされたパラグラフのいずれか１つに定義され得る。
【０４００】
１．発育卵内で生物由来物質を産生するための方法であって：
（ａ）少なくとも、標的遺伝子に対してその一部分が相補的である第一のＲＮＡエフェクター分子を卵に導入すること；
（ｂ）第一と第二の標的遺伝子の少なくとも１つの発現を調節するのに十分な時間、卵を維持すること、および；
（ｃ）卵から生物由来物質を単離することを含み；
標的遺伝子は細胞性免疫反応の遺伝子である、方法。
【０４０１】
２．標的遺伝子は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ２１、ＲＩＧ−１、ＬＰＧＰ２、ＲＩＧ−１−様受容体、ＴＲＩＭ２５、ＩＦＮＡ、ＩＦＮＢ、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＧ、ＭＡＶＳ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＲ２、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−２、ＳＴＡＴ−３、ＳＴＡＴ−４、ＪＡＫ−１、ＪＡＫ−２、ＪＡＫ−３、ＩＲＦ１、ＩＲＦ  ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ５、ＩＲＦ６、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＩＲＦ１０、２’，５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ、ＲＮａｓｅＬ、ＰＫＲ（ＥＩＦ２ＡＫ２）、ＭＸ１、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、炎症性サイトカイン、ダイサー、ＭＹＤ８８、ＴＲＩＦ、ＰＫＲ、ＣＳＫＮ２Ｂ、および前述のいずれかの調節領域からなる群から選択される宿主免疫応答に関連した遺伝子である、パラグラフ１に記載の方法。
【０４０２】
３．卵へ第二の標的遺伝子を標的とする第二のＲＮＡエフェクター分子を導入することをさらに含み、第二の標的遺伝子は、細胞生存度、増殖または細胞周期に関連した遺伝子であり、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＬＤＨＡ、ＬＤＨＢ、ＢＩＫ、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＨＲＫ、ＢＣＬＧ、ＨＲ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＯＫ、ＢＯＯ、ＢＣＬＢ、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳＰ１０、ＢＣＬ２、ｐ５３、ＡＰＡＦ１、ＨＳＰ７０、ＴＲＡＩＬ、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ１３、ＢＣＬ２Ｌ１４、ＦＡＳＬＧ、ＤＰＦ２、ＡＩＦＭ２、ＡＩＦＭ３、ＳＴＫ１７Ａ、ＡＰＩＴＤ１、ＳＩＶＡ１、ＦＡＳ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦＢＲ１、ＬＯＣ３７８９０２、ＢＣＬ２Ａ１、ＰＵＳＬ１、ＴＰＳＴ１、ＷＤＲ３３、Ｎｏｄ２、ＭＣＴ４、ＡＣＲＣ、ＡＭＥＬＹ、ＡＴＣＡＹ、ＡＮＰ３２Ｂ、ＤＥＦＡ３、ＤＨＲＳ１０、ＤＯＣＫ４、ＦＡＭ１０６Ａ、ＦＫＢＰ１Ｂ、ＩＲＦ３、ＫＢＴＢＤ８、ＫＩＡＡ０７５３、ＬＰＧＡＴ１、ＭＳＭＢ、ＮＦＳ１、ＮＰＩＰ、ＮＰＭ３、ＳＣＧＢ２Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＢ７、ＳＬＣ１６Ａ４、ＳＰＴＢＮ４、ＴＭＥＭ１４６、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＦＯＸＯ１、ＰＴＥＮ、ＦＮ１、ＣＳＫＮ２Ｂ、ｍｉＲＮＡアンタゴニスト、宿主シアリダーゼ、ＮＥＵ２シアリダーゼ２、ＮＥＵ３シアリダーゼ３、ダイサー、ＩＳＲＥ、Ｂ４ＧａｌＴ１、Ｂ４Ｇａｌｔ６、Ｃｍａｓ、Ｇｎｅ、ＳＬ３５Ａ１、および前述のいずれかの調節領域からなる群から選択される、パラグラフ１または２に記載の方法。
【０４０３】
４．卵へ、内在性ウイルス、潜伏ウイルス、および／または外来ウイルスの標的遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子を導入することをさらに含む、パラグラフ１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【０４０４】
５．卵へ、インフルエンザＮＰ、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、ＮＡから選択されるウイルス遺伝子、ＨＡまたはＮＡのグリコシル化に影響する遺伝子、および前述のいずれかの調節領域を標的とするＲＮＡエフェクター分子を導入することをさらに含む、パラグラフ１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【０４０５】
６．ＲＮＡエフェクター分子が遺伝子発現を抑制または活性化する、パラグラフ１に記載の方法。
７．遺伝子発現の調節により、卵内のウイルス感染価、ウイルス複製、細胞生存度、細胞増殖、翻訳、タンパク質産生またはウイルスの吸着が増加する、パラグラフ１に記載の方法。
【０４０６】
８．遺伝子発現の調節により、感染細胞のアポトーシスが減少する、パラグラフ１に記載の方法。
９．ＲＮＡエフェクター分子がオリゴヌクレオチドを含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０４０７】
１０．オリゴヌクレオチドが一本鎖または二本のオリゴヌクレオチドである、パラグラフ９に記載の方法。
１１．オリゴヌクレオチドが修飾される、パラグラフ９または１０に記載の方法。
【０４０８】
１２．修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、コレステリル誘導体に結合した末端のヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルフォリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および、非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される、パラグラフ１１に記載の方法。
【０４０９】
１３．オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ，リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、デコイオリゴヌクレオチド、ａｎｔｉｍｉｒ、ｓｕｐｅｒｍｉｒ、またはＲＮＡ活性化物質を含む、パラグラフ１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【０４１０】
１４．発育卵に、免疫抑制物質、成長因子、アポトーシス阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、病原体の阻害剤、およびヒストン脱メチル化物質から選択される第二の物質を投与することをさらに含む、パラグラフ１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【０４１１】
１５．ＲＮＡエフェクター分子を調剤する、パラグラフ１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
１６．ＲＮＡエフェクター分子を脂肪粒子中に調剤する、パラグラフ１５に記載の方法。
【０４１２】
１７．脂質粒子はＸＴＣ−ＭＣ３−Ｃ１２−２００ベースの脂質粒子である、パラグラフ１６に記載の方法。
１８．発育卵内で生物由来物質を産生するための方法であって：
（ａ）少なくとも、第一の標的遺伝子に対してその一部分が相補的である第一のＲＮＡエフェクター分子、および第二の標的遺伝子に対してその一部分が相補的である第二のＲＮＡエフェクター分子を卵へ導入すること；
（ｂ）第一と第二の標的遺伝子の少なくとも１つの発現を調節するのに十分な時間、卵を維持すること、および；
（ｃ）卵から生物由来物質を単離すること、を含み；
第一の標的遺伝子は細胞性免疫反応の遺伝子であり、第二の標的遺伝子は細胞内プロセスの遺伝子である、方法。
【０４１３】
１９．標的遺伝子は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ２１、ＲＩＧ−１、ＬＰＧＰ２、ＲＩＧ−１−様受容体、ＴＲＩＭ２５、ＩＦＮＡ、ＩＦＮＢ、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＧ、ＭＡＶＳ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＲ２、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−２、ＳＴＡＴ−３、ＳＴＡＴ−４、ＪＡＫ−１、ＪＡＫ−２、ＪＡＫ−３、ＩＲＦ１、ＩＲＦ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ５、ＩＲＦ６、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＩＲＦ１０、２’，５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ、ＲＮａｓｅＬ、ＰＫＲ（ＥＩＦ２ＡＫ２）、ＭＸ１、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、炎症性サイトカイン、ダイサー、ＭＹＤ８８、ＴＲＩＦ、ＰＫＲ、ＣＳＫＮ２Ｂ、および前述のいずれかの調節領域からなる群から選択される宿主免疫応答に関連した遺伝子である、パラグラフ１８に記載の方法。
【０４１４】
２０．第二標的遺伝子は、細胞生存度、増殖または細胞周期に関連した遺伝子であり、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＬＤＨＡ、ＬＤＨＢ、ＢＩＫ、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＨＲＫ、ＢＣＬＧ、ＨＲ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＯＫ、ＢＯＯ、ＢＣＬＢ、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳ１０、ＢＣＬ２、ｐ５３、ＡＰＡＦ１、ＨＳＰ７０、ＴＲＡＩＬ、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ１３、ＢＣＬ２Ｌ１４、ＦＡＳＬＧ、ＤＰＦ２、ＡＩＦＭ２、ＡＩＦＭ３、ＳＴＫ１７Ａ、ＡＰＩＴＤ１、ＳＩＶＡ１、ＦＡＳ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦＢＲ１、ＬＯＣ３７８９０２、ＢＣＬ２Ａ１、ＰＵＳＬ１、ＴＰＳＴ１、ＷＤＲ３３、Ｎｏｄ２、ＭＣＴ４、ＡＣＲＣ、ＡＭＥＬＹ、ＡＴＣＡＹ、ＡＮＰ３２Ｂ、ＤＥＦＡ３、ＤＨＲＳ１０、ＤＯＣＫ４、ＦＡＭ１０６Ａ、ＦＫＢＰ１Ｂ、ＩＲＦ３、ＫＢＴＢＤ８、ＫＩＡＡ０７５３、ＬＰＧＡＴ１、ＭＳＭＢ、ＮＦＳ１、ＮＰＩＰ、ＮＰＭ３、ＳＣＧＢ２Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＢ７、ＳＬＣ１６Ａ４、ＳＰＴＢＮ４、ＴＭＥＭ１４６、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＦＯＸＯ１、ＰＴＥＮ、ＦＮ１、ＣＳＫＮ２Ｂ、ｍｉＲＮＡアンタゴニスト、宿主シアリダーゼ、ＮＥＵ２シアリダーゼ２、ＮＥＵ３シアリダーゼ３、ダイサー、ＩＳＲＥ、Ｂ４ＧａｌＴ１、Ｂ４Ｇａｌｔ６、Ｃｍａｓ、Ｇｎｅ、ＳＬ３５Ａ１、および前述のいずれかの調節領域からなる群から選択される、パラグラフ１８に記載の方法。
【０４１５】
２１．卵にＲＮＡエフェクター分子を接触させることをさらに含み、標的遺伝子が、インフルエンザＮＰ、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、ＮＡから選択されるウイルス遺伝子、ＨＡまたはＮＡのグリコシル化に影響する遺伝子、および前述のいずれかの調節領域である、パラグラフ１８〜２０に記載の方法。
【０４１６】
２２．ＲＮＡエフェクター分子が遺伝子発現を抑制または活性化する、パラグラフ１８に記載の方法。
２３．遺伝子発現の調節により、卵内のウイルス感染価、ウイルス複製、細胞生存度、細胞増殖、翻訳、タンパク質産生またはウイルスの吸着が増加する、パラグラフ１８に記載の方法。
【０４１７】
２４．遺伝子発現の調節により、感染細胞のアポトーシスが減少する、パラグラフ１８に記載の方法。
２５．ＲＮＡエフェクター分子がオリゴヌクレオチドを含む、パラグラフ１８に記載の方法。
【０４１８】
２６．オリゴヌクレオチドが一本鎖二本鎖のオリゴヌクレオチドである、パラグラフ２５に記載の方法。
２７．オリゴヌクレオチドが修飾される、パラグラフ２５または２６に記載の方法。
【０４１９】
２８．修飾は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、コレステリル誘導体に結合した末端のヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルフォリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および、非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される、パラグラフ２７に記載の方法。
【０４２０】
２９．オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、デコイオリゴヌクレオチド、ａｎｔｉｍｉｒ、ｓｕｐｅｒｍｉｒ、またはＲＮＡ活性化物質を含む、パラグラフ１８〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【０４２１】
３０．免疫抑制物質、成長因子、アポトーシス阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、病原体の阻害剤、およびヒストン脱メチル化物質から選択される第二の物質を発育卵に投与することをさらに含む、パラグラフ１８〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【０４２２】
３１．ＲＮＡエフェクター分子を調剤する、パラグラフ１８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
３２．ＲＮＡエフェクター分子を脂肪粒子中に調剤する、パラグラフ３１に記載の方法。
【０４２３】
３３．脂質粒子はＸＴＣ−ＭＣ３−Ｃ１２−２００ベースの脂質粒子である、パラグラフ３２に記載の方法。
３４．（ａ）少なくとも、第一の標的遺伝子に対してその一部分が相補的である第一のＲＮＡエフェクター分子、および第二の標的遺伝子に対してその一部分が相補的である第二のＲＮＡエフェクター分子を発育卵へ導入するステップと；
（ｂ）少なくとも第一と第二の標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間、卵を維持するステップであって、発現の調節により卵内の生物由来物質の産生が改善されるステップと；
（ｃ）卵から免疫原性物質を単離することステップと、を含むプロセスであって；
第一の標的遺伝子は免疫応答の遺伝子であり、第二の標的遺伝子は細胞内プロセスの遺伝子であるプロセス、により産生された免疫原性物質。
【０４２４】
３５．免疫原性物質はウイルス産物であり、インフルエンザ、はしか、流行性耳下腺炎、三日ばしか、黄熱病、狂犬病、痘瘡、水疱、西ナイルウイルス、がん、肝炎、ニューカッスル病、鶏痘、アヒルペスト、ニワトリ脳脊髄炎、軟卵症候群、伝染性気管支炎、マレック病、伝染性ファブリーキウス嚢病、伝染性喉頭気管炎または牛疫に対して免疫原性である、パラグラフ３４の免疫原性物質。
【０４２５】
３６．産物はインフルエンザに対して免疫原性である、パラグラフ３５の免疫原性物質。
３７．免疫原性物質は、１投与当たり少なくとも１０６  ＥＩＤ５０（５０％胚感染用量）のウイルス力価を含む、パラグラフ３６の免疫原性物質。
【０４２６】
３８．第一の標的遺伝子は、卵細胞の免疫応答に関連した遺伝子であり、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ２１、ＲＩＧ−１、ＬＰＧＰ２、ＲＩＧ−１−様受容体、ＴＲＩＭ２５、ＩＦＮＡ、ＩＦＮＢ、ＩＦＮＧ、ＭＡＶＳ／ＶＩＳＡ／ＩＰＳ−１／Ｇａｒｄｉｆ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＲ２、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−２、ＳＴＡＴ−３、ＳＴＡＴ−４、ＪＡＫ−１、ＪＡＫ−２、ＪＡＫ−３、ＩＲＦ１、ＩＲＦ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ５、ＩＲＦ６、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＩＲＦ１０、２’，５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ、ＲＮａｓｅＬ、ｄｓＲＮＡ−ｄＰＫＲ、Ｍｘ、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、炎症性サイトカイン、ＭＹＤ８８、ＴＲＩＦ、ダイサー、ＰＫＲ、ＣＳＫＮ２Ｂ、および前述のいずれかの調節領域からなる群から選択される、パラグラフ１〜３７のいずれか一項に記載の免疫原性物質。
【０４２７】
３９．第二の標的遺伝子は、卵細胞生存度、増殖または細胞周期に関連した遺伝子であり、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＬＤＨＡ、ＬＤＨＢ、ＢＩＫ、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＨＲＫ、ＢＣＬＧ、ＨＲ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＯＫ、ＢＯＯ、ＢＣＬＢ、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳＰ１０、ＢＣＬ２、ｐ５３、ＡＰＡＦ１、ＨＳＰ７０、ＴＲＡＩＬ、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ１３、ＢＣＬ２Ｌ１４、ＦＡＳＬＧ、ＤＰＦ２、ＡＩＦＭ２、ＡＩＦＭ３、ＳＴＫ１７Ａ、ＡＰＩＴＤ１、ＳＩＶＡ１、ＦＡＳ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦＢＲ１、ＬＯＣ３７８９０２、ＢＣＬ２Ａ１、ＰＵＳＬ１、ＴＰＳＴ１、ＷＤＲ３３、Ｎｏｄ２、ＭＣＴ４、ＡＣＲＣ、ＡＭＥＬＹ、ＡＴＣＡＹ、ＡＮＰ３２Ｂ、ＤＥＦＡ３、ＤＨＲＳ１０、ＤＯＣＫ４、ＦＡＭ１０６Ａ、ＦＫＢＰ１Ｂ、ＩＲＦ３、ＫＢＴＢＤ８、ＫＩＡＡ０７５３、ＬＰＧＡＴ１、ＭＳＭＢ、ＮＦＳ１、ＮＰＩＰ、ＮＰＭ３、ＳＣＧＢ２Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＢ７、ＳＬＣ１６Ａ４、ＳＰＴＢＮ４、ＴＭＥＭ１４６、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＦＯＸＯ１、ＰＴＥＮ、ＦＮ１、ｍｉＲＮＡアンタゴニスト、宿主シアリダーゼ、ＮＥＵ２シアリダーゼ２、ＮＥＵ３シアリダーゼ３、ダイサー、ＩＳＲＥ、Ｂ４ＧａｌＴ１、Ｂ４ＧａｌＴ６、Ｃｍａｓ、Ｇｎｅ、ＳＬ３５Ａ１、および前述のいずれかの調節領域からなる群から選択される、パラグラフ１〜３８のいずれか一項に記載の免疫原性物質。
【０４２８】
４０．標的遺伝子がＨＡまたはＮＡのグリコシル化に影響し、ＲＮＡエフェクター分子を細胞に接触させる、パラグラフ１〜３９のいずれか一項に記載の免疫原性物質。
４１．標的遺伝子がＮＰ、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、ＮＡから選択されるウイルス遺伝子、または前述のいずれかの調節領域であり、ＲＮＡエフェクター分子を細胞に接触させる、パラグラフ１〜４０のいずれか一項に記載の免疫原性物質。
【０４２９】
４２．ＲＮＡエフェクター分子が遺伝子発現を抑制または活性化する、パラグラフ１〜４１のいずれか一項に記載の免疫原性物質。
４３．遺伝子発現の調節により、卵内のウイルス感染価、ウイルス複製、細胞生存度、細胞増殖、翻訳、タンパク質産生またはウイルスの吸着が増加する、パラグラフ１〜４２のいずれか一項に記載の免疫原性物質。
【０４３０】
４４．遺伝子発現の調節により、感染細胞のアポトーシスが減少する、パラグラフ１〜４３のいずれか一項に記載の免疫原性物質。
４５．ＲＮＡエフェクター分子がオリゴヌクレオチドを含む、パラグラフ１〜４４のいずれか一項に記載の免疫原性物質。
【０４３１】
４６．オリゴヌクレオチドが一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドである、パラグラフ１〜４５に免疫原性物質。
４７．オリゴヌクレオチドが修飾される、パラグラフ４５または４６に記載の免疫原性物質。
【０４３２】
４８．修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、コレステリル誘導体に結合した末端のヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルフォリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および、非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される、パラグラフ４７に記載の免疫原性物質。
【０４３３】
４９．オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ，リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、デコイオリゴヌクレオチド、ａｎｔｉｍｉｒ、ｓｕｐｅｒｍｉｒ、またはＲＮＡ活性化物質を含む、パラグラフ３４〜４８のいずれか一項に記載の免疫原性物質。
【０４３４】
５０．免疫抑制物質、成長因子、アポトーシス阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、病原体の抑制剤、およびヒストン脱メチル化物質から選択される第二の物質を発育卵に投与することをさらに含む、パラグラフ３４〜４９のいずれか一項に記載の免疫原性物質。
【０４３５】
５１．ＲＮＡエフェクター分子を調剤する、パラグラフ３４〜５０に記載の免疫原性物質。
５２．ＲＮＡエフェクター分子を脂肪粒子中に調剤する、パラグラフ５１に記載の免疫原性物質。
【０４３６】
５３．脂質粒子がＸＴＣ−ＭＣ３−Ｃ１２−２００ベースの脂質粒子である、パラグラフ５２に記載の免疫原性物質。
【実施例】
【０４３７】
実施例１  ニワトリ肺へのウイルス及びｓｉＲＮＡ播種。
各播種には、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）形質移入試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）３０μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培養液（ＧＩＢＣＯ）３０μｌで希釈した。ｓｉＲＮＡ（２．５ｎｍｏｌ（１０μｌ））をＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ３０μｌと混ぜ、希釈したＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）試薬を付加し、混合物を３０分間室温でインキュベートする。その後、混合物を、インフルエンザウイルス（５，０００プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍｌ）１００μｌと一緒にし、１０日目の発育鶏卵の尿膜腔に直ちに注入した。卵は１７時間および４８時間、３７℃でインキュベートされ、尿膜腔液はウイルス力価を、例えば血球凝集検査またはプラークアッセイで測定するために回収される。Ｇｅら（１００ＰＮＡＳ  ２７１８−２３（２００３）を参照のこと。
【０４３８】
関連出願
本出願は、２０１０年２月１７日に出願されたＰｏｌｌａｒｄらによる米国仮特許出願第６１／３０５，２８４号「ＢＩＯＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ」；２００９年７月６日に出願されたＭａｒａｇａｎｏｒｅらによる米国仮特許出願第６１／２２３，３７０号「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＥＮＨＡＮＣＩＮＧ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  Ａ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＰＲＯＤＵＣＴ」；２００９年９月２２日に出願されたＭａｒａｇａｎｏｒｅらによる米国仮特許出願第６１／２４４，８６８号「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＥＮＨＡＮＣＩＮＧ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  Ａ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＰＲＯＤＵＣＴ」；２０１０年１月１１日に出願されたＲｏｓｓｏｍａｎｄｏらによる米国仮特許出願第６１／２９３，９８０号「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＥＮＨＡＮＣＩＮＧ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  Ａ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＰＲＯＤＵＣＴ」；および、２０１０年３月３１日に出願されたＲｏｓｓｏｍａｎｄｏらによる米国仮特許出願第６１／３１９，５８９号「ＣＥＬＬ−ＢＡＳＥＤ  ＢＩＯＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ」の利益を主張し、各文献を本明細書に参照して完全に組み込む。
【０４３９】
配列に関する言及
明細書には元の主題の一部として配列リストを含む。配列番号１〜３，２９０，９３９の配列リストは、「ＣＲＦ」、「ＣＯＰＹ１」、「ＣＯＰＹ２」および「ＣＯＰＹ３」とラベルを付けた４つのコンパクトディスク（ＣＤ−Ｒ）に保存されたファイル名「５１０５８０７２．ＴＸＴ」として、電子フォーマットの形態で本明細書に提供され、この全体を参照して本明細書に組み込む。
【０４４０】
本出願は「長い」配列リストを含むが、これは印刷された紙のコピーに代わり、ＣＤ−Ｒによって提出されており、この全体を参照して本明細書に組み込む。前記ＣＤ−Ｒは、２０１０年７月１日に記録され、それぞれ「ＣＲＦ」、「ＣＯＰＹ１」、「ＣＯＰＹ２」および「ＣＯＰＹ３」とラベルを付けている。各ＣＤ−Ｒは７７４，６３５ＫＢの同一のファイル（５１０５８０７２．ＴＸＴ）のみが保存されている。
【手続補正書】
【提出日】平成24年2月29日(2012.2.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発育卵内で生物由来物質を産生するための方法であって、
（ａ）少なくとも、標的遺伝子に対してその一部分が相補的である第一のＲＮＡエフェクター分子を前記卵に導入すること、
（ｂ）第一の標的遺伝子と第二の標的遺伝子の少なくとも１つの発現を調節するのに十分な時間、前記卵を維持すること、および
（ｃ）前記卵から前記生物由来物質を単離すること、を含み、
前記標的遺伝子は細胞性免疫反応の遺伝子である、方法。
【請求項２】
前記標的遺伝子は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ２１、ＲＩＧ−１、ＬＰＧＰ２、ＲＩＧ−１−様受容体、ＴＲＩＭ２５、ＩＦＮＡ、ＩＦＮＢ、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＧ、ＭＡＶＳ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＲ２、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−２、ＳＴＡＴ−３、ＳＴＡＴ−４、ＪＡＫ−１、ＪＡＫ−２、ＪＡＫ−３、ＩＲＦ１、ＩＲＦ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ５、ＩＲＦ６、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＩＲＦ１０、２’，５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ、ＲＮａｓｅＬ、ＰＫＲ（ＥＩＦ２ＡＫ２）、ＭＸ１、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、炎症性サイトカイン、ダイサー、ＭＹＤ８８、ＴＲＩＦ、ＰＫＲ、ＣＳＫＮ２Ｂ、および前述のいずれかの調節領域からなる群から選択される、宿主免疫応答に関連した遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記卵へ第二の標的遺伝子を標的とする第二のＲＮＡエフェクター分子を導入することをさらに含み、前記第二の標的遺伝子は、細胞生存度、増殖または細胞周期に関連した遺伝子であり、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＬＤＨＡ、ＬＤＨＢ、ＢＩＫ、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＨＲＫ、ＢＣＬＧ、ＨＲ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＯＫ、ＢＯＯ、ＢＣＬＢ、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳＰ１０、ＢＣＬ２、ｐ５３、ＡＰＡＦ１、ＨＳＰ７０、ＴＲＡＩＬ、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ１３、ＢＣＬ２Ｌ１４、ＦＡＳＬＧ、ＤＰＦ２、ＡＩＦＭ２、ＡＩＦＭ３、ＳＴＫ１７Ａ、ＡＰＩＴＤ１、ＳＩＶＡ１、ＦＡＳ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦＢＲ１、ＬＯＣ３７８９０２、ＢＣＬ２Ａ１、ＰＵＳＬ１、ＴＰＳＴ１、ＷＤＲ３３、Ｎｏｄ２、ＭＣＴ４、ＡＣＲＣ、ＡＭＥＬＹ、ＡＴＣＡＹ、ＡＮＰ３２Ｂ、ＤＥＦＡ３、ＤＨＲＳ１０、ＤＯＣＫ４、ＦＡＭ１０６Ａ、ＦＫＢＰ１Ｂ、ＩＲＦ３、ＫＢＴＢＤ８、ＫＩＡＡ０７５３、ＬＰＧＡＴ１、ＭＳＭＢ、ＮＦＳ１、ＮＰＩＰ、ＮＰＭ３、ＳＣＧＢ２Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＢ７、ＳＬＣ１６Ａ４、ＳＰＴＢＮ４、ＴＭＥＭ１４６、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ，ＦＯＸＯ１、ＰＴＥＮ、ＦＮ１、ＣＳＫＮ２Ｂ、ｍｉＲＮＡアンタゴニスト、宿主シアリダーゼ、ＮＥＵ２シアリダーゼ２、ＮＥＵ３シアリダーゼ３、ダイサー、ＩＳＲＥ、Ｂ４ＧａｌＴ１、Ｂ４Ｇａｌｔ６、Ｃｍａｓ、Ｇｎｅ、ＳＬ３５Ａ１、および前述のいずれかの調節領域からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記卵へ、内在性ウイルス、潜伏ウイルス、および外来ウイルスのうちの少なくとも一つの標的遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子を導入することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記卵へ、インフルエンザＮＰ、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、ＮＡと、ＨＡまたはＮＡのグリコシル化に影響する遺伝子と、前述のいずれかの調節領域と、から選択されるウイルス遺伝子である標的遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子を導入することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡエフェクター分子が遺伝子発現を抑制する、または活性化する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子発現の調節により、卵内のウイルス感染価、ウイルス複製、細胞生存度、細胞増殖、翻訳、タンパク質産生またはウイルスの吸着が増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
遺伝子発現の調節により、感染細胞のアポトーシスが減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡエフェクター分子がオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが修飾される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、コレステリル誘導体に結合した末端のヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルフォリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および、非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、デコイオリゴヌクレオチド、ａｎｔｉｍｉｒ、ｓｕｐｅｒｍｉｒ、またはＲＮＡ活性化物質を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記発育卵に、免疫抑制物質、成長因子、アポトーシス阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、病原体の阻害剤、およびヒストン脱メチル化物質から選択される第二の物質を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＮＡエフェクター分子を調剤する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＮＡエフェクター分子を脂肪粒子中に調剤する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記脂質粒子はＸＴＣ−ＭＣ３−Ｃ１２−２００ベースの脂質粒子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
発育卵内で生物由来物質を産生するための方法であって、
（ａ）少なくとも、第一のＲＮＡエフェクター分子であって、少なくとも第一の標的遺伝子に対してその一部分が相補的である第一のＲＮＡエフェクター分子、および第二のＲＮＡエフェクター分子であって、少なくとも第二の標的遺伝子に対してその一部分が相補的である第二のＲＮＡエフェクター分子を前記卵へ導入すること、
（ｂ）前記第一の標的遺伝子と前記第二の標的遺伝子の少なくとも１つの発現を調節するのに十分な時間、前記卵を維持すること、および
（ｃ）前記卵から前記生物由来物質を単離すること、を含み、
前記第一の標的遺伝子は細胞性免疫反応の遺伝子であり、前記第二の標的遺伝子は細胞内プロセスの遺伝子である、方法。
【請求項１９】
前記標的遺伝子は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ２１、ＲＩＧ−１、ＬＰＧＰ２、ＲＩＧ−１−様受容体、ＴＲＩＭ２５、ＩＦＮＡ、ＩＦＮＢ、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＧ、ＭＡＶＳ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＲ２、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−２、ＳＴＡＴ−３、ＳＴＡＴ−４、ＪＡＫ−１、ＪＡＫ−２、ＪＡＫ−３、ＩＲＦ１、ＩＲＦ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ５、ＩＲＦ６、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＩＲＦ１０、２’，５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ、ＲＮａｓｅＬ、ＰＫＲ（ＥＩＦ２ＡＫ２）、ＭＸ１、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、炎症性サイトカイン、ダイサー、ＭＹＤ８８、ＴＲＩＦ、ＰＫＲ、ＣＳＫＮ２Ｂ、および前述のいずれかの調節領域からなる群から選択される宿主免疫応答に関連した遺伝子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第二標的遺伝子は、細胞生存度、増殖または細胞周期に関連した遺伝子であり、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＬＤＨＡ、ＬＤＨＢ、ＢＩＫ、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＨＲＫ、ＢＣＬＧ、ＨＲ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＯＫ、ＢＯＯ、ＢＣＬＢ、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳＰ１０、ＢＣＬ２、ｐ５３、ＡＰＡＦ１、ＨＳＰ７０、ＴＲＡＩＬ、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ１３、ＢＣＬ２Ｌ１４、ＦＡＳＬＧ、ＤＰＦ２、ＡＩＦＭ２、ＡＩＦＭ３、ＳＴＫ１７Ａ、ＡＰＩＴＤ１、ＳＩＶＡ１、ＦＡＳ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦＢＲ１、ＬＯＣ３７８９０２、ＢＣＬ２Ａ１、ＰＵＳＬ１、ＴＰＳＴ１、ＷＤＲ３３、Ｎｏｄ２、ＭＣＴ４、ＡＣＲＣ、ＡＭＥＬＹ、ＡＴＣＡＹ、ＡＮＰ３２Ｂ、ＤＥＦＡ３、ＤＨＲＳ１０、ＤＯＣＫ４、ＦＡＭ１０６Ａ、ＦＫＢＰ１Ｂ、ＩＲＦ３、ＫＢＴＢＤ８、ＫＩＡＡ０７５３、ＬＰＧＡＴ１、ＭＳＭＢ、ＮＦＳ１、ＮＰＩＰ、ＮＰＭ３、ＳＣＧＢ２Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＢ７、ＳＬＣ１６Ａ４、ＳＰＴＢＮ４、ＴＭＥＭ１４６、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＦＯＸＯ１、ＰＴＥＮ、ＦＮ１、ＣＳＫＮ２Ｂ、ｍｉＲＮＡアンタゴニスト、宿主シアリダーゼ、ＮＥＵ２シアリダーゼ２、ＮＥＵ３シアリダーゼ３、ダイサー、ＩＳＲＥ、Ｂ４ＧａｌＴ１、Ｂ４Ｇａｌｔ６、Ｃｍａｓ、Ｇｎｅ、ＳＬ３５Ａ１、および前述のいずれかの調節領域からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【国際調査報告】
2012531929.tif 000019
2012531929.tif 000020