(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つのホーミングエンドヌクレアーゼ部位（ＨＥ）及び少なくとも１つの制限酵素部位（Ｘ）を含む核酸であって、ホーミングエンドヌクレアーゼ及び制限酵素の各々によって切断される際にＨＥ及びＸが適合する付着末端を生じ、ＨＥ付着末端及びＸ付着末端の連結産物がホーミングエンドヌクレアーゼによっても制限酵素によっても切断され得ないように、ＨＥ及びＸが選択される、核酸に関する。本発明の別の主題は、本発明の核酸を含むベクター、前記核酸及び／又は前記ベクターを含む宿主細胞、前記ベクター及び宿主細胞を作製して多タンパク質複合体をクローニング及び／又は発現させるためのキット、複数の発現カセットを含むベクターを製造するための方法、並びに多タンパク質複合体を製造するための方法に関する。本発明は、多数のシングルベクター（「ベクター単位」）を融合ベクターに組み立てる方法、及びそのような多数のベクター単位を含む融合ベクターをシングルベクターに解体する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのホーミングエンドヌクレアーゼ部位（ＨＥ）及び少なくとも１つの制限酵素部位（Ｘ）を含む核酸であって、ホーミングエンドヌクレアーゼ及び制限酵素の各々によって切断される際にＨＥ及びＸが適合する付着末端を生じ、ＨＥ付着末端及びＸ付着末端の連結産物がホーミングエンドヌクレアーゼ及び制限酵素によって切断され得ないように、ＨＥ及びＸ部位が選択される、核酸。
【請求項２】
以下の配列要素：
ＨＥ−Ｐｒｏｍ−ＭＣＳ−Ｔｅｒｍ−Ｘ又はＨＥ−Ｐｒｏｍ−ＭＣＳ−Ｘ
［Ｐｒｏｍはプロモーターであり；
ＭＣＳはマルチプルクローニングサイトであり；及び
Ｔｅｒｍはターミネーターである］
を有する、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記ＨＥ部位が、各ホーミングエンドヌクレアーゼによって切断される際に、４ヌクレオチドの突出を生じる認識配列である、請求項１又は２に記載の核酸。
【請求項４】
前記ＨＥ部位が、ＰＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ  Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＳｅｇＨ、Ｈｅｆ、Ｉ−ＡｐｅＩＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、チトクロームｂｍＲＮＡマチュラーゼｂｌ３、ＰＩ−ＴｌｉＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、及びＰＩ−ＴｈｙＩからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識配列である、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
前記Ｘ部位がＢｓｔＸＩ部位である、請求項３又は４に記載の核酸。
【請求項６】
前記ＭＣＳが１又は複数の相同領域を含む、請求項２から５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項７】
配列番号１、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、及び配列番号５３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８】
ベクター又は宿主細胞への核酸の組み込みのための少なくとも１つの部位をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項１０】
部位特異的リコンビナーゼのための少なくとも１つの認識配列、好ましくはｌｏｘＰ不完全反転反復又はＴｎ７結合部位をさらに含む、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７からなる群から選択される配列を有する、請求項９又は１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸の配列要素の２以上を含み、かつ、部位特異的リコンビナーゼの２以上の認識配列を含む、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
配列番号１８の配列を有する、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
ウイルス、好ましくはバキュロウイルスである、請求項９から１２のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸及び／又は請求項９から１４のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
請求項９から１４のいずれか一項に記載の少なくとも１つのベクターを、前記ベクターの増殖に適する少なくとも１つの宿主細胞とともに含む、多タンパク質複合体のクローニング及び／又は発現のためのキット。
【請求項１７】
（ａ）請求項９から１４のいずれか一項に記載の第一のベクターのＨＥ部位及びＸ部位の間に１つ又は複数の遺伝子を挿入する工程；
（ｂ）請求項９から１４のいずれか一項に記載の第二のベクターのＨＥ部位及びＸ部位の間に１つ又は複数の遺伝子を挿入する工程；
（ｃ）ＨＥ部位に特異的なホーミングエンドヌクレアーゼ及びＸ部位に特異的な制限酵素で第一のベクターを切断し、切断したＨＥ部位及びＸ部位に隣接する少なくとも１つの遺伝子を含む断片を得る工程；
（ｄ）ＨＥ部位に特異的なホーミングエンドヌクレアーゼで第二のベクターを切断する工程；
（ｅ）工程（ｃ）で得た断片を、工程（ｄ）で得た切断した第二のベクターに連結して、第三のベクターを得る工程；及び、場合によって、
（ｆ）工程（ａ）から（ｅ）を１つ又は複数のベクターで繰り返して、複数の遺伝子を含むベクターを得る工程
を含む、複数の発現カセットを含むベクターの製造方法。
【請求項１８】
（ｉ）請求項１７に記載の方法によって複数の発現カセットを含むベクターを製造する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得たベクターを宿主細胞に導入する工程；及び
（ｉｉｉ）ベクターに存在する遺伝子の同時発現を可能にする条件下において、前記宿主細胞をインキュベートする工程
を含む、多タンパク質複合体の製造方法。
【請求項１９】
複数の発現カセットのクローニング及び／又は発現のための、請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸及び／又は請求項９から１４のいずれか一項に記載のベクターの使用。
【請求項２０】
ｎ個のベクター単位を１から（ｎ−１）個の融合ベクターに組み立てるための方法であって、前記融合ベクターは２からｎ個の前記ベクター単位を含み、
（１）部位特異的組換え部位、及び他のベクター単位の耐性マーカーとは異なる個別の耐性マーカーを各々が含むｎ個のベクター単位を、前記部位特異的組換え部位に特異的なリコンビナーゼと接触させて、２からｎ個の前記ベクター単位を含むベクター単位の融合体の混合物を得る工程；
（２）前記混合物で宿主細胞を形質転換する工程；
（３）２からｎ個のベクター単位を含む１又は複数の所望の融合ベクターを選択するために、抗生物質の適当な組合せの存在下において、形質転換した細胞の１又は複数のサンプルを培養する工程；
（４）抗生物質の各組合せの存在下で生存可能である、形質転換した細胞のｎ個のシングルクローンを、工程（３）で得られた培養物から得る工程；及び
（５）前記ｎ個のベクター単位に存在するｎ個の個別の耐性マーカーに特異的なｎ個の抗生物質の各々の存在下において、前記ｎ個のシングルクローンの各々のｎ個のサンプルを培養する工程
を含み、ｎが少なくとも３の整数、好ましくは３から５である、方法。
【請求項２１】
融合しようとするベクター単位の（ｎ−１）個の各々が前記耐性マーカーとは異なる別の選択マーカーを含み、前記別の選択マーカーを含まないベクター単位と前記選択マーカーを含む１又は複数のベクター単位との間の融合体で形質転換された宿主細胞のみが工程（３）で生存可能である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ベクター単位の（ｎ−１）個が、宿主細胞における特定の遺伝子の存在又は非存在に前記ベクター単位の増殖を依存させる条件複製起点を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞が、細菌、好ましくは大腸菌であり、前記複製起点がＲ６Ｋγ又はその誘導体であり、かつ、前記細菌がｐｉｒ−である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｎ個のベクター単位の各々が、１つ又は複数の興味のある遺伝子を、好ましくは１つの発現カセット内に含む、請求項２０から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
２から（ｎ−１）個のベクター単位を含む融合ベクターからなる群から選択される１又は複数の所望の融合ベクターに、又は１又は複数のシングルベクター単位に、ｎ個のベクター単位を含む融合ベクターを解体する方法であって、
ｎ個のベクター単位を含む前記融合ベクターにおいて、前記ｎ個のベクター単位が、ｎ個の部位特異的組換え部位によって互いに隔てられ、各ベクター単位が、他のベクター単位の耐性マーカーとは異なる個別の耐性マーカーを含み、
（Ａ）２から（ｎ−１）個の前記ベクター単位を含むベクター単位の融合体及びシングルベクター単位の混合物を得るために、ｎ個のベクター単位を含む融合ベクターを前記部位特異的組換え部位に特異的なリコンビナーゼと接触させる工程；
（Ｂ）前記混合物で宿主細胞を形質転換する工程；
（Ｃ）下記：
（Ｃ１）２から（ｎ−１）個のベクター単位を含む１又は複数の所望の融合ベクターを選択するための抗生物質の適当な組合せ；及び／又は
（Ｃ２）所望のシングルベクター単位を選択するための１つの適当な抗生物質
の存在下において、形質転換した細胞の１又は複数のサンプルを培養する工程；
（Ｄ）各抗生物質又は抗生物質の組合せの各々の存在下で生存可能である、形質転換した細胞のｎ個のシングルクローンを、形質転換した細胞のサンプルから得る工程；並びに
（Ｅ）前記ｎ個のベクター単位に存在するｎ個の個別の耐性マーカーに特異的なｎ個の抗生物質の各々の存在下において、前記ｎ個のシングルクローンの各々のｎ個のサンプルを培養する工程
を含み、ｎが少なくとも３の整数、好ましくは３から５である、方法。
【請求項２６】
ｎ個のベクター単位を含む融合ベクターをシングルベクター単位に解体するために、工程（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ１）が、２から（ｎ−１）個のベクター単位を含む適当な融合ベクターを選択するために実施され、工程（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ２）から（Ｅ）が、２から（ｎ−１）個のベクター単位を含む前記選択した融合ベクターを用いて実施される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ｎ個のベクター単位を含む前記融合ベクター中のベクター単位の（ｎ−１）個の各々が、前記耐性マーカーとは異なる別の選択マーカーを含み、前記別の選択マーカーを含まないベクター単位と前記選択マーカーを含む１又は複数のベクター単位との間の融合体で形質転換された宿主細胞のみが工程（Ｃ１）で生存可能である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ベクター単位の（ｎ−１）個が、宿主細胞における特定の遺伝子の存在又は非存在に前記ベクター単位の増殖を依存させる条件複製起点を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記宿主細胞が、細菌、好ましくは大腸菌であり、前記複製起点がＲ６Ｋγ又はその誘導体であり、かつ、前記細菌がｐｉｒ−である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｎ個のベクター単位の各々が、１又は複数の興味のある遺伝子を、好ましくは１つの発現カセット内に含む、請求項２５から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ｎ個の同一の部位特異的組換え部位によって互いに隔てられたｎ個のベクター単位を含む融合ベクターであって、各ベクター単位が、他のベクター単位の耐性マーカー遺伝子とは異なる個別の耐性マーカー遺伝子を含み、ｎが少なくとも３の整数、好ましくは３から５である、融合ベクター。
【請求項３２】
以下：
−  ｎ個の同一の部位特異的組換え部位によって互いに隔てられたｎ個のベクター単位を含む融合ベクターであって、各ベクター単位が、他のベクター単位の耐性マーカー遺伝子とは異なる個別の耐性マーカー遺伝子を含む、融合ベクター、
−  部位特異的組換え部位、及び他のベクターの耐性マーカー遺伝子とは異なる個別の耐性マーカー遺伝子を各々が含む、ｎ個のベクター（ベクター単位）、並びに
−  前記部位特異的組換え部位に特異的なリコンビナーゼ、並びに／又は前記融合ベクター及び／若しくは前記ｎ個のベクターの増殖のための細胞、
を含み、ｎが少なくとも３の整数、好ましくは３から５である、ｎ個のベクターを組み立て及び／又は解体するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つのホーミングエンドヌクレアーゼ部位（ＨＥ）及び少なくとも１つの制限酵素部位（Ｘ）を含む核酸であって、ホーミングエンドヌクレアーゼ及び制限酵素の各々によって切断される際にＨＥ及びＸが適合する付着末端を生じ、ＨＥ付着末端及びＸ付着末端の連結産物がホーミングエンドヌクレアーゼ及び制限酵素によって切断され得ないように、ＨＥ及びＸが選択される、核酸に関する。本発明の別の主題は、本発明の核酸を含むベクター、前記核酸及び／又は前記ベクターを含む宿主細胞、前記ベクター及び宿主細胞を作製して多タンパク質複合体をクローニング及び／又は発現させるためのキット、複数の発現カセットを含むベクターを製造するための方法、並びに多タンパク質複合体を製造するための方法に関する。本発明は、複数のシングルベクター（「ベクター単位」）を融合ベクターに組み立てる方法、及びそのような複数のベクター単位を含む融合ベクターをより低次の融合ベクター及び／又はシングルベクターに解体する方法にも関する。本発明は、複数のベクター単位を含む融合ベクターにも関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内の複数の重要なプロセスは、高度な真核生物では１０以上のサブユニットを含む、連動的な複数の分子装置へと会合するタンパク質によって制御される（Rual, J.F. et al. Nature 437, 1173-1178 (2005); Charbonnier, S., Gallego, O. and Gavin, A.C. Biotechnol. Annu. Rev. 14, 1-28 (2008)）。これは、現在、生理的に関連する分子装置を解明することを目的とする機能及び構造研究に大きな影響を与えている。したがって、複合体の研究は、現代生物学において、次第に肝要なものとなっている。しかしながら、複数のマルチサブユニット複合体が豊富でないこと及び不均一であることが多いという性質によって、起源から抽出することが妨げられる場合が多い。
【０００３】
組換え技術による生産方法は、確かに、生命科学研究に非常に大きな影響を与えた。特に、発現宿主として大腸菌は一般的である。タンパク質の機能分析及びそれらの分子構造の解明の成功は、切り詰め、変異、及び精製タグまたは特定のプロモーター／ターミネーター因子を用いた伸長などの変化を導入することに決定的に依存する場合が多い。実験のスループットに関する次の必要条件として、単独のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を多様化させることは、すでに注目に値する。特に、構造ゲノミクスコンソーシアムは、サブクローニングのルーチンの標準化及びこれの自動化の実行を求めている。複数のＯＲＦを迅速に多様化してマルチサブユニット複合体に組み立てる必要がある際の作業負荷の指数関数的な増大がやっかいであり、未解決の課題である。
【０００４】
近年、真核生物及び原核生物の宿主において複数の遺伝子の発現のための複数の系が導入されている。例えば、Fitzgerald et al. (2006) Nat. Methods 3, 1021-1032; Tan et al. (2005) Protein Expr. Purif. 40, 385-395 (2005); Tolia, N.H. and Joshua-Tor (2006). Nat. Methods 3, 55-64; Chanda et al. (2006) Protein Expr. Purif. 47, 217-224; Scheich et al. (2007). Nucleic Acids Res. 35, e43 (2007)を参照のこと。真核生物における発現系、特に、バキュロウイルス／昆虫細胞発現（上記のFitzgerald et al. (2006)）の大きな改善にもかかわらず、低コスト及び複数の特殊化した発現株が得られることなどの複数のもっともな理由のために、大半の研究所において未だに大腸菌が主要な手段のままである。現在の大腸菌の共発現系は、本質的には、単独の発現カセット（上記Tolia et al. (2006); 上記Chanda et al. (2006)）又は同一のプロモーターの制御下で複数の遺伝子を構成するプロポリシストロン（上記Tan et al. (2005)）のいずれかとして、コードする遺伝子の連続的な主には従来どおりの（すなわち、制限／連結）サブクローニングに依存する。これは、特に構造分子生物学に典型的に必要とされるスループットにおいて、複数のサブユニットを有するタンパク質複合体の製造のためのこれらの共発現技術の適用性を大きく制限する。
【０００５】
そのような大部分が連続的な（一度に一遺伝子）構築の主な障害は、多タンパク質複合体が一度製造、精製、及び特性決定されると、発現実験を迅速に修正することに関して、柔軟性が本質的にないことに起因する。しかしながら、タンパク質サブユニットの変化を含む、そのような修正は、現代の機能及び構造研究において必須である。
【０００６】
上記Fitzgerald et al. (2006)及びWO-A-2005/085456は、発現カセットへの複数の遺伝子の反復性クローニングを可能にする特別に設計されたペアの制限酵素部位によって、２つの発現カセットがヘッドトゥーヘッド、ヘッドトゥーテール、又はテールトゥテールの配向で隣接する、いわゆるマルチプリケーションモジュール（multiplication module）を有するポリヌクレオチドを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO-A-2005/085456
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Rual, J.F. et al. Nature 437, 1173-1178 (2005)
【非特許文献２】Charbonnier, S., Gallego, O. and Gavin, A.C. Biotechnol. Annu. Rev. 14, 1-28 (2008)
【非特許文献３】Fitzgerald et al. (2006) Nat. Methods 3, 1021-1032
【非特許文献４】Tan et al. (2005) Protein Expr. Purif. 40, 385-395 (2005)
【非特許文献５】Tolia, N.H. and Joshua-Tor (2006). Nat. Methods 3, 55-64
【非特許文献６】Chanda et al. (2006) Protein Expr. Purif. 47, 217-224
【非特許文献７】Scheich et al. (2007). Nucleic Acids Res. 35, e43 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、従来の構築物の欠点からして、本発明が解決しようとする技術的課題は、多タンパク質複合体のクローニング及び発現のための用途の広い系を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述の技術的課題を解決するための手段は、特許請求の範囲に記載の発明の実施態様を提供することによって達成される。
【００１１】
特に、本発明は、少なくとも１つのホーミングエンドヌクレアーゼ部位（ＨＥ）及び少なくとも１つの制限酵素部位（Ｘ）を含む核酸（又はポリヌクレオチド）であって、ホーミングエンドヌクレアーゼ及び制限酵素の各々によって切断される際にＨＥ及びＸが適合する付着末端を生じ、ＨＥ付着末端及びＸ付着末端の連結産物がホーミングエンドヌクレアーゼ及び制限酵素によって切断され得ないように、ＨＥ及びＸが選択される、核酸（又はポリヌクレオチド）に関する。
【００１２】
本発明によれば、用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用され、かつ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は１つ若しくは複数のヌクレオチドアナログを含む種を意味する。本発明に係る好ましい核酸又はポリヌクレオチドはＤＮＡであり、最も好ましくは二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡである。
【００１３】
好ましくは、本発明の核酸は、以下の配列要素を有する：
ＨＥ−Ｐｒｏｍ−ＭＣＳ−Ｔｅｒｍ−Ｘ又はＨＥ−Ｐｒｏｍ−ＭＣＳ−Ｘ
ここで、
Ｐｒｏｍはプロモーターであり；
ＭＣＳはマルチプルクローニングサイトであり；及び
Ｔｅｒｍはターミネーターである。
【００１４】
上記の配置は、以下においては、多くの場合に「マルチプルインテグレーションエレメント」（ＭＩＥ）と称する。
【００１５】
本発明において有用なプロモーターは、原核生物、ウイルス、哺乳動物、又は昆虫細胞起源のプロモーター又はそれらの組合せを含むが、それらに限らない。同様に、本発明に係る核酸において有用なターミネーターは、原核生物、ウイルス、哺乳動物、昆虫細胞起源のターミネーター又はそれらの組合せを含むが、それらに限らない。本発明に係る用語「マルチプルクローニングサイト」は、上述の部位Ｘとは異なる少なくとも１つの制限酵素部位を有する配列を意味する。本発明に係るＭＣＳは、例えば、任意の市販のプラスミドのマルチプルクローニングサイトに由来してよい。
【００１６】
好ましい原核生物のプロモーターは、Ｌａｃ、Ｔ７、アラビノース、及びｔｒｃプロモーターである。本発明において有用な別のプロモーターは、ウイルスプロモーター、特に、バキュロウイルスプロモーター、例えば、ｐｏｌｈ、ｐ１０、及びｐＸＩＶ極後期（very late）バキュロウイルスプロモーター、ｖｐ３９バキュロウイルス後期プロモーター、ｖｐ３９ｐｏｌｈバキュロウイルス後期／極後期ハイブリッドプロモーター、ＰＣＡＰ／ｐｏｌｈ、ｐｃｎａ、ｅｔｌ、ｐ３５、ｅｇｔ、ｄａ２６バキュロウイルス早期プロモーターである。本発明において有用な別のプロモーターは、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＵｂＣ、ＥＦ−１α、ＲＳＶＬＴＲ、ＭＴ、ＰＤＳ４７、Ａｃ５、ＰＧＡＬ、及びＰＡＤＨなどのプロモーター配列である。
【００１７】
本発明において有用なターミネーター配列の例は、Ｔ７、ＳＶ４０、ＨＳＶｔｋ、又はＢＧＨである。
【００１８】
本発明に係るマルチプルクローニングサイトは、少なくとも１つの制限酵素部位（Ｘ以外）に加えて、１つ又は複数の、特に１から４の相同領域を含んでよい。ＭＣＳに含まれる制限酵素部位は、当業者が容易に選択することができ、そのような部位及びその認識配列の例は、New England Biolabs, Ipswich, MA, USAの最新の製品カタログから得ることができる。
【００１９】
本発明に係る「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、例えば１２から４０塩基対又はそれ以上の、好ましくは２０から３０塩基対の、大きな等長（isometric）認識部位を有する二本鎖ＤＮＡに特異的なＤＮアーゼである。ホーミングエンドヌクレアーゼに関する最近の概説については、Stoddard B.L. (2005) Q. Rev. Biophys. 38, 49-95を参照のこと。ＨＥ認識配列の長さのために、本発明に係る構築物に挿入される遺伝子又はポリ遺伝子のヌクレオチド配列（又は任意の起源の任意の他のヌクレオチド配列）において、対応する部位が生じる可能性が非常に低く、そのことが、このストラテジーを、より大きく及び／又は複数の興味のある遺伝子（「ＧＯＩ」）をクローニングするのに特に有用なものとする。
【００２０】
本発明に係る好ましいＨＥ部位は、各ホーミングエンドヌクレアーゼによって切断されると４ヌクレオチドの突出を生じるホーミングエンドヌクレアーゼの認識配列である。
【００２１】
そのようなＨＥ部位の例は、ＰＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ  Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩ及びＩ−ＭｓｏＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、他のＬＡＧＬＩＤＡＧグループのメンバー及びそのバリアント、ＳｅｇＨ及びＨｅｆ又は他のＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｉ−ＡｐｅＩＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、チトクロームｂｍＲＮＡマチュラーゼｂｌ３、ＰＩ−ＴｌｉＩ及びＰＩ−ＴｆｕＩＩ、並びにＰＩ−ＴｈｙＩなどの認識配列を含むが、それらに限らない。上記Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００５）を参照のこと。
【００２２】
４ｂｐ突出を生じるＨＥ部位（例は上に記載）と適合性がある本発明に係る好ましい制限酵素部位Ｘは、ＢｓｔＸＩ部位である。
【００２３】
対応する酵素は、市販のものであり、例えば、New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USAから市販されているものである。
【００２４】
原核生物プロモーター／ターミネーターを含む本発明の特に好ましいＭＩＥは、以下の構造：
Ｉ−Ｃｅｕｌ − Ｔ７ Ｐｒｏｍ − ＭＣＳ − Ｔ７ Ｔｅｒｍ − ＢｓｔＸＩ
ＰＩ−ＳｃｅＩ − Ｔ７ Ｐｒｏｍ − ＭＣＳ − Ｔ７ Ｔｅｒｍ − ＢｓｔＸＩ
の１つを有する。
【００２５】
バキュロウイルスプロモーターを含む本発明の特に好ましいＭＩＥは、以下の構造：
Ｉ−ＣＥＵＩ − ｐ１０ − ＭＣＳ − ＢｓｔＸＩ
ＰＩ−ＳｃｅＩ − ｐ１０ − ＭＣＳ − ＢｓｔＸＩ
Ｉ−ＣＥＵＩ − ｐｏｌｈ − ＭＣＳ − ＢｓｔＸＩ
ＰＩ−ＳｃｅＩ − ｐｏｌｈ − ＭＣＳ − ＢｓｔＸＩ
の１つを有する。
【００２６】
本発明に係る核酸の特に好ましい例は、配列番号１（詳細なマップは、図１３Ａ及びＢを参照のこと；配列番号１に対するアンチセンス配列は配列番号５４に記載する）、配列番号５０（制限マップ：図４２）、配列番号５１（制限マップ：図４３）、配列番号５２（制限マップ：図４４）、又は配列番号５３（制限マップ：図４５）の配列を含む。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様では、上述の核酸は、ベクター又は宿主細胞に核酸を組み込むための少なくとも１つの部位を追加で含む。組込み部位は、一過性の組込み又はゲノムへの組込みを可能にし得る。
【００２８】
ベクター、特にプラスミド又はウイルスへの組込みに関しては、組込み部位は、好ましくは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、自律性パルボウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レトロウイルス、ラジノウイルス、エプスタイン・バーウイルス、レンチウイルス、セムリキ森林ウイルス、又はバキュロウイルスに核酸を組み込むことに適合性がある。
【００２９】
本発明の核酸に組み込まれてよい特に好ましい組込み部位は、Ｔｎ７、λ−インテグラーゼ特異的結合部位、及び部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）、特にＬｏｘＰ部位又はＦＬＰリコンビナーゼ特異的組換え（ＦＲＴ）部位のトランスポゾンエレメントから選択することができる。本発明の別の好ましい核酸の組込みメカニズムは、ｌｅｆ２−６０３／Ｏｒｆ１６２９などの特定の相同組換え配列である。
【００３０】
本発明の別の好ましい実施態様では、本明細書に記載の核酸は、他の有害物質に対して選択するための、１つ又は複数の耐性マーカーを追加で含む。本発明において有用な耐性マーカーの好ましい例は、抗生物質、例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン、及びカナマイシン耐性マーカーを含むが、それらに限らない。
【００３１】
本発明の核酸は、好ましくは上述のＭＩＥに組み込まれる、１つ又は複数のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）も含んでよい。
【００３２】
本発明の別の主題は、上述の核酸を含むベクターに関する。
【００３３】
本発明の好ましいベクターは、プラスミド、発現ベクター、トランスファーベクター、より好ましくは真核生物の遺伝子トランスファーベクター、一過性又はウイルスベクター媒介遺伝子トランスファーベクターである。本発明に係る他のベクターは、ウイルス、例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、自律性パルボウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レトロウイルス、ラジノウイルス、エプスタイン・バーウイルス、レンチウイルス、セムリキ森林ウイルス、及びバキュロウイルスである。
【００３４】
（例えば、トランスファーベクターなどの適切なプラスミド上に存在する）本発明に係る核酸の組込みに適切なバキュロウイルスベクターも、本発明の主題であり、好ましくは、部位特異的組込み部位、例えば、Ｔｎ７結合部位（有効な組込みの青色／白色スクリーニングのためのｌａｃＺ遺伝子に組み込まれてよい）及び／又はＬｏｘＰ部位を含む。本発明に係る別の好ましいバキュロウイルスは、（上述の組込み部位に対して代替的又は追加的に）相同組換えのための配列に隣接した、宿主のための有毒物質を発現するための遺伝子を含む。有毒物質を発現する遺伝子の例は、ジフテリア毒素Ａ遺伝子である。相同組換えのための配列の好ましいペアは、例えば、ｌｓｆ２−６０３／Ｏｒｆ１６２９である。バキュロウイルスは、上述のとおり、蛍光マーカー、例えば、ＧＦＰ及びＹＦＰなども含むマーカー遺伝子も含むことができる。本発明の対応するバキュロウイルスの特定の例は、図３８、３９、４０、及び４１の各々に記載のスキームで開示しているＥＭＢａｃ、ＥＭＢＡｃＹ、ＥＭＢａｃ＿Ｄｉｒｅｃｔ、及びＥＭＢａｃＹ＿Ｄｉｒｅｃｔの構造を有する。
【００３５】
原核宿主細胞で有用なベクターは、好ましくは上で例示したマーカー遺伝子（その１つ又は複数）に加えて、複製起点（ｏｒｉ）を含む。例えば、ＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、及び条件複製起点、例えば、ＯｒｉＶ及びＲ６Ｋγ（後者が好ましい条件複製起点であり、本願のベクターの増殖を原核生物宿主内のｐｉｒ遺伝子に依存させる）を含む。ＯｒｉＶは、本願のベクターの増殖を原核生物宿主のｔｒｆＡ遺伝子に依存させる。
【００３６】
さらに、本発明は、本発明の核酸及び／又は本発明のベクターを含む宿主細胞に関する。
【００３７】
前記宿主細胞は、原核生物又は真核生物であってよい。真核生物宿主細胞は、例えば、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞であってよい。ヒト宿主細胞の例は、ＨｅＬａ、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ、ＩＭＲ３２、ＭＴ−２、膵臓β細胞、ケラチノサイト、骨髄線維芽細胞、ＣＨＰ２１２、初代神経細胞、Ｗ１２、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、Ｓａｏｓ−２、ＷＩ３８、初代肝細胞、ＦＬＣ４、１４３ＴＫ、ＤＬＤ−１、胚性肺線維芽細胞、初代包皮線維芽細胞、ＭＲＣ５、及びＭＧ６３細胞を含むが、それらに限らない。本発明の別の好ましい宿主細胞は、ブタ細胞、好ましくは、ＣＰＫ、ＦＳ−１３、ＰＫ−１５細胞、ウシ細胞、好ましくは、ＭＤＢ、ＢＴ細胞、ウシ細胞、例えば、ＦＬＬ−ＹＦＴ細胞である。本発明において有用な他の真核生物細胞は、線虫、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞である。別の真核生物細胞は、酵母細胞、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓを含む。さらに、本発明は、昆虫細胞、例えば、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来の細胞、より好ましくはＳｆ９、Ｓｆ２１、発現Ｓｆ＋、ハイファイブＨ５細胞、及びＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来の細胞、特に、Ｓ２ シュナイダー細胞を含む宿主細胞にも関する。別の宿主細胞は、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞及び寄生生物、例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐｅｃ由来の細胞を含む。
【００３８】
本発明に係る原核生物宿主は、細菌、特に、大腸菌、例えば、ＴＯＰ１０、ＤＨ５α、ＨＢ１０１などの市販の株を含む。
【００３９】
当業者は、本発明に係る核酸要素の適切な宿主への適当な増殖及び／又は移動のための適当なベクター構築物／宿主細胞のペアを容易に選択することができる。適当な宿主細胞に適当なベクター要素及びベクターを導入するための特定の方法が、同様に、当該技術分野で既知であり、Ausubel et al. (ed.) Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USAの最新版で確認することができる。
【００４０】
本発明の好ましい実施態様では、上述のベクターは、部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）のための部位、好ましくはＣｒｅ−ｌｏｘ特異的組換えのための１つ又は複数のＬｏｘＰ部位を追加で含む。別の好ましい実施態様では、本発明に係るベクターは、トランスポゾンエレメント、好ましくはＴｎ結合部位を含む。
【００４１】
上述の結合部位がマーカー遺伝子内に位置することも好ましい。この配置は、転位によって結合部位に成功裡に組み込まれた配列を選択することを可能にする。好ましい実施態様によれば、そのようなマーカー遺伝子は、ルシフェラーゼ、β−ＧＡＬ、ＣＡＴ、蛍光コードタンパク質遺伝子、好ましくは、ＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、及びそれらのバリアント、並びにｌａｃＺα遺伝子から選択される。
【００４２】
本発明に係るベクターの特に好ましい実施態様は、配列番号２から配列番号１７からなる群から選択される配列を有する。
【００４３】
本発明の別の好ましい実施態様は、上述の本発明の核酸の配列要素の２以上を含み、かつ、場合によって部位特異的リコンビナーゼのための２以上の組換え配列、例えば、２から６、より好ましくは２、３、又は４のそのような認識配列、好ましくは２から６、特に好ましくは１から４のｌｏｘＰ部位を追加で含むベクターである。
【００４４】
そのようなベクターの特に好ましい例は、配列番号１８の配列を有する。
【００４５】
本発明のベクターが２以上の組換え配列を含む場合は、これらが同一又は異なる部位特異的リコンビナーゼの認識配列であり得ると解されるべきである。
【００４６】
本発明の別の主題は、上述の少なくとも１つのベクターを少なくとも前記ベクターの増殖に適切な細胞とともに含む、多タンパク質複合体のクローニング及び／又は発現のためのキットである。好ましい宿主細胞は上述のとおりである。好ましくは、本発明の当該態様のキットは部位特異的リコンビナーゼ、例えば、Ｃｒｅを追加で含む。
【００４７】
本発明は、
（ａ）本発明の第一のベクターのＨＥ部位とＸ部位との間に１つ又は複数の遺伝子を挿入する工程；
（ｂ）本明細書に記載の第二のベクターのＨＥ部位とＸ部位との間に１つ又は複数の遺伝子を挿入する工程；
（ｃ）ＨＥ部位に特異的なホーミングエンドヌクレアーゼ及びＸ部位に特異的な制限酵素を使用して第一のベクターを切断し、切断したＨＥ部位及びＸ部位に隣接する少なくとも１つの遺伝子を含む断片を得る工程；
（ｄ）ＨＥ部位に特異的なホーミングエンドヌクレアーゼを使用して第二のベクターを切断する工程；
（ｅ）工程（ｄ）で得た切断された第二のベクターに工程（ｃ）で得た断片を連結して、第三のベクターを得る工程；及び、場合によって、
（ｆ）１つ又は複数のベクターを使用して工程（ａ）から（ｅ）を繰り返して、複数の遺伝子を含むベクターを得る工程
を含む、複数の発現カセットを含むベクターの製造方法にも関する。
【００４８】
本発明の好ましい実施態様によれば、当業者に既知の方法によって、例えば、ＭＣＳ内の適合する部位に制限酵素消化／連結によって、又は好ましくは場合によって存在する相同領域を使用する、好ましくはＳＬＩＣ法を使用する、組換え技術によって、本発明のベクターに１つ又は複数の遺伝子を挿入することができる。２以上の遺伝子を挿入する場合は、これらは単独の発現カセットとして提供され得る。しかしながら、（複数又は多数の）遺伝子が１つのＯＲＦ内にポリジーンとして存在できることは、当業者には明らかである。
【００４９】
本発明は、
（ｉ）上述の方法によって複数の発現カセットを含むベクターを生産する工程；
（ｉｉ）上述の宿主細胞などの適切な宿主細胞に工程（ｉ）で得たベクターを導入する工程；及び
（ｉｉｉ）前記ベクターに存在する遺伝子の同時発現を可能にする条件下で前記宿主細胞をインキュベートする工程
を含む、多タンパク質複合体の製造方法にも関する。
【００５０】
（上で例示した）適切な宿主細胞にベクターを導入する工程は、当業者に既知の方法によって実施する（例えば、上記Ausubel et al. (ed.)を参照のこと）。
【００５１】
本願の別の態様は、ｎ個の同一の部位特異的組換え部位によって互いに隔てられたｎ個のベクター単位を含む融合ベクターであって、各ベクター単位が他のベクター単位の耐性マーカー遺伝子とは異なる個別の耐性マーカー遺伝子を含み、ｎが少なくとも３の整数である、融合ベクターである。
【００５２】
本発明の当該態様に係る「シングルベクター」又は「ベクター単位」は、一般的には、外来遺伝子要素（特に、１つ又は複数の興味ある遺伝子）の宿主細胞への組込みに適切であり、かつ、増幅に適する核酸である。典型例は、プラスミド、バクミド、ウイルス、ラムダベクター、コスミドなどである。１つ又は複数の上記ベクターの分類の好ましい例は、ＨＥ／Ｘ部位を含むベクターに関して、既により詳細に概説しており、その定義は本発明の当該態様についても有効である。
【００５３】
本発明に係る融合ベクターに組み立てられる（又はそのような融合ベクターから解体される；組み立て／解体方法については下記参照のこと）ベクター単位の数は、一般的には、対応する数の耐性マーカーが得られる限り、特に制限されないことは、当業者に明らかである。実施上の観点からすれば、本発明におけるｎの数値は、好ましくは、３、４、５、又は６（若しくはそれ以上であってよい）であり、宿主で増殖し得る構築物のサイズに部分的には依存する。
【００５４】
さらに、本発明は、
ｎ個の同一の部位特異的組換え部位によって互いに隔てられたｎ個のベクター単位を含む融合ベクターであって、各ベクター単位が、他のベクター単位の耐性マーカー遺伝子とは異なる個別の耐性マーカー遺伝子を含む、融合ベクター；及び／又は
部位特異的組換え部位、及び他のベクターの耐性マーカー遺伝子とは異なる個別の耐性マーカー遺伝子を各々が含むｎ個のベクター（ベクター単位）であって
ｎが少なくとも３の整数である、融合ベクター及び／又はｎ個のベクター（ベクター単位）；並びに
前記部位特異的組換え部位に特異的なリコンビナーゼ、及び／又は前記融合ベクター及び／又は前記ｎ個のベクターの増殖のための細胞
を含む、ｎ個のベクターの組み立て及び／又は解体のためのキットにも関する。
【００５５】
上記融合ベクター及びベクターキットの好ましい実施態様は、各々、ＬｏｘＰ部位及びＣｒｅを対応するリコンビナーゼ酵素として含む、融合ベクター及び／又はベクター単位であるか又はそれらを含む。部位特異的組換え部位／リコンビナーゼの他の例は、ＦＲＴ部位及び対応する酵素（ＦＬＰリコンビナーゼ）である。
【００５６】
好ましい実施態様によれば、上記ｎ個のベクター又はベクター単位は、各々、Ｐｒｏｍ−ＭＣＳ−Ｔｅｒｍ又はＰｒｏｍ−ＭＣＳ−Ｔｅｒｍ（定義は上述のとおりであり、好ましくは上述のＨＥ及び制限酵素部位Ｘの間にある）の形態の１つ又は複数の発現カセットを含む。さらに、好ましくはベクター又はベクター単位に存在する発現カセットは、各々、１つ又は複数の興味ある遺伝子（「ＧＯＩ」）を含むことが好ましい。
【００５７】
本発明の当該態様において有用な耐性マーカー遺伝子（又は単に「耐性マーカー」）の例は、上述のとおりである。
【００５８】
上述の融合ベクターの特に好ましい例は、以下により詳細に記載するｐＡＣＫＳ（配列番号１８）ベクターである。
【００５９】
ベクター単位の好ましい例は、全て原核生物宿主における発現に適応する、ｐＡＣＥ（配列番号２）、ｐＡＣＥ２（配列番号３）、ｐＤＣ（配列番号４）、ｐＤＫ（配列番号５）、及びｐＤＳ（配列番号６）、並びにバキュロウイルスを使用する昆虫細胞における発現に合わせて作られた、ｐＩＤＣ（配列番号７）、ｐＩＤＫ（配列番号８）、ｐＩＤＳ（配列番号９）、ｐＡＣＥＢａｃ１（配列番号１０）、ｐＡＣＥＢａｃ２（配列番号１１）、ｐＡＣＥＢａｃ３（配列番号１２）、ｐＡＣＥＢａｃ４（配列番号１３）、ｐＯｍｎｉＢａｃ１（配列番号１４）、ｐＯｍｎｉＢａｃ２（配列番号１５）、ｐＯｍｎｉＢａｃ３（配列番号１６）、及びｐＯｍｎｉＢａｃ４（配列番号１７）である。ベクター単位の上述の好ましい例は、以下により詳細に記載する。
【００６０】
さらに、ベクター単位（及び／又は上記キットの個々のベクター）の少なくとも１つが、さらに、耐性マーカー遺伝子とは異なる別の選択マーカーを含むことが好ましい。１つの例は、個々のベクターの増殖を宿主の特定の遺伝的背景に依存させる、条件複製起点である。１つの例は、ベクターの増殖をｐｉｒ遺伝子に依存させる、Ｒ６ｋγ由来（又はである）Ｏｒｉである。
【００６１】
本発明は、さらに、１から（ｎ−１）個の融合ベクターにｎ個のベクター単位を組み立てるための方法であって、前記融合ベクターが２からｎ個の前記ベクター単位を含み、
（１）部位特異的組換え部位及び他のベクター単位の耐性マーカーとは異なる個別の耐性マーカーを各々が含むｎ個のベクター単位を、前記部位特異的組換え部位に特異的なリコンビナーゼに接触させて、２からｎ個の前記ベクター単位を含むベクター単位の融合体の混合物を得る工程、
（２）前記混合物で宿主細胞を形質転換する工程；
（３）２からｎ個のベクター単位を含む所望の融合ベクターを選択するために抗生物質の適当な組み合わせの存在下で形質転換した細胞の１つ又は複数のサンプルを培養する工程、
（４）抗生物質の各組み合わせの存在下で生存可能である、形質転換した細胞のｎ個のシングルコロニーを工程（３）で得た培養物から得る工程；並びに
（５）前記ｎ個のベクター単位に存在するｎ個の個別の耐性マーカーに特異的なｎ個の抗生物質の各々の存在下において、前記ｎ個のシングルコロニーの各々のｎ個のサンプルを培養する工程
を含み、ｎが上述のとおりである、方法を提供する。
【００６２】
２以上の所望のベクター融合体を選択することが望ましい場合は、上記工程（２）で得られる形質転換された細胞は、適当な数のアリコート又はサンプルに分割する。例えば、全ての可能な（ｎ！−ｎ）個のベクター融合体を選択する（上記の方法のイダクト（ｅｄｕｃｔ）としてシングルベクター単位が選択されない）ことが望ましい場合には、形質転換された宿主細胞は、（ｎ！−ｎ）個のアリコート（又はサンプル）に分割し、各アリコートを適当な抗生物質の存在下で培養する。
【００６３】
本発明では、本明細書で使用する用語「アリコート」は、必ずしも、複数のアリコートが同じ容量又は同じ数の細胞を有することを意味しない。むしろ、複数のアリコート又はサンプルの各々は、同一又は異なる容量又は数の細胞を有してよい。
【００６４】
形質転換された細胞又はアリコート（若しくはサンプル）を「培養する」という用語は、宿主細胞の生存のための適当な条件下において形質転換された細胞を培養することを意味する。例えば、形質転換された細胞を使用して一定（例えば、より大きな）容量の液体培養培地に播種してよく、又はアリコートを適当な固体培地に蒔いてよい。
【００６５】
上述のベクターの組み立て方法を使用して２以上の所望のベクター融合体を選択する場合、例えば、全ての可能な融合体が望まれる場合には、選択工程（３）は、好ましくは、９６ウェルプレートなどの典型的なウェルプレートフォーマットを使用して実施する。
【００６６】
本発明のベクター組み立て方法の好ましい実施態様によれば、（ｎ−１）個の融合されるベクター単位の各々が、耐性マーカーとは異なる別の選択可能なマーカーを含む。そのようなベクター単位は、以下において、「ドナー」ベクターと称する。これは、前記ベクター単位が、耐性マーカーとは異なる選択可能な前記マーカーを含まないベクター単位（以下において「アクセプター」と称する）に融合する際に、ドナーとアクセプターとの間の融合体において、前記ドナーが、ドナー−ドナー融合体ではなく、アクセプター−ドナー融合体の増殖のみを可能にする表現型を有する宿主細胞を提供するからである。そのような選択可能なマーカーの好ましい例は、ドナーの増殖を特定の遺伝的背景に依存させる条件複製起点である。そのような選択可能なマーカーの具体例は、大腸菌などの細菌宿主において、ドナーの増殖をｐｉｒ遺伝子の存在に依存させるＲ６ｋγ Ｏｒｉである。この場合において、上述のベクター組み立て方法の工程（ｉ）で得られる混合物で、ｐｉｒ遺伝子を有しない細菌細胞を形質転換する（そのような大腸菌株はＴＯＰ１０、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、又は他の市販のｐｉｒ−細胞である）。
【００６７】
上述のベクター組み立て方法の好ましい実施態様は、以下により詳細に記載する（ＡＣＥＭＢＬシステム；Ｃ．２．１の欄）。
【００６８】
上述の方法の好ましい実施態様によれば、ｎ個のベクター単位は、各々、（上述のとおり、好ましくは上述のＨＥと制限酵素部位Ｘとの間の）Ｐｒｏｍ−ＭＣＳ−ＴｅｒｍまたはＰｒｏｍ−ＭＣＳの形態の１つ又は複数の発現カセットを含む。さらに、好ましくはベクター又はベクター単位に存在する発現カセットの各々が、適切な宿主で発現する１つ又は複数の興味のある遺伝子（「ＧＯＩ」）を含むことが好ましい。
【００６９】
本発明に係る融合ベクターを提供するための他の方法は、第一の工程において、２つのベクター単位の組換えを実施し、宿主細胞を形質転換して、２種の抗生物質の存在下で宿主細胞を培養する、連続的な組み立て方法である。２回目は、生存クローンからの二重融合ベクター（ｎ＝２）の単離、各リコンビナーゼの存在下における第三のベクター単位との接触、宿主細胞の形質転換、及び三重融合ベクター（ｎ＝３）に存在する３つの耐性マーカーについての選択などを、所望の多重融合ベクターが得られるまで含む。
【００７０】
言うまでも無く、（例えば、ｎ＝３、４、又は５の融合ベクターを組み立てるために）上述の工程（１）から（５）のベクター組み立て方法を使用し、次いで、上の段落に記載したとおりに１つ又は複数のベクター単位を連続的に添加する複合アプローチによって、本発明に係る融合ベクター、特に、より高次（すなわち、ｎ＞３）の融合ベクターを提供することもできる。
【００７１】
融合ベクターを組み立てるための上述の方法の基礎をなす原理、すなわち、組換え反応におけるイダクトと生成物との平衡は、融合ベクターの解体にも等しく適用することができる。
【００７２】
したがって、本発明は、さらに、２から（ｎ−１）個のベクター単位を含む融合ベクターからなる群から選択される１つ又は複数の所望の融合ベクターに、又は１つ又は複数の所望のシングルベクター単位に、ｎ個のベクター単位を含む融合ベクターを解体する方法であって、ｎ個のベクター単位を含む前記融合ベクターにおいて、前記ｎ個のベクター単位がｎ個の部位特異的組換え部位によって互いに隔てられており、かつ、各ベクター単位が他のベクター単位の耐性マーカーとは異なる個別の耐性マーカーを含み、
（Ａ）２から（ｎ−１）個の前記ベクター単位を含む融合ベクターとシングルベクター単位との混合物を産生するために、ｎ個のベクター単位を含む融合ベクターを前記部位特異的組換え部位に特異的なリコンビナーゼと接触させる工程；
（Ｂ）前記混合物で宿主細胞を形質転換する工程；及び
（Ｃ）（Ｃ１）２から（ｎ−１）個のベクター単位を含む１つ又は複数の所望の融合ベクターを選択するための抗生物質の適当な組み合わせの存在下において、及び／又は（Ｃ２）所望のシングルベクター単位を選択するための単独の適当な抗生物質の存在下において、形質転換した細胞の１つ又は複数のサンプルを培養する工程；
（Ｄ）各抗生物質又は抗生物質の組み合わせの各々の存在下で生存可能である、形質転換した細胞のサンプルから形質転換した細胞のｎ個のシングルクローンを得る工程；及び
（Ｅ）前記ｎ個のベクター単位に存在するｎ個の個別の耐性マーカーに特異的なｎ個の抗生物質の各々の存在下で前記ｎ個のシングルクローンの各々のｎ個のサンプルを培養する工程
を含み、ｎが上述のとおりである、方法を提供する。
【００７３】
上記融合ベクターの解体方法を使用してシングルベクターを選択することが望ましい場合には、２から（ｎ−１）個のベクター単位を含む適当な融合ベクターを選択するために、工程（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ１）から（Ｅ）を実施し、次いで、前記選択した２から（ｎ−１）個のベクター単位を含む融合ベクターを使用して工程（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ２）から（Ｅ）を実施することが好ましい。例えばリコンビナーゼ反応平衡におけるシングルベクター単位の存在が選択工程（Ｃ２）から（Ｅ）によって前記シングルベクター単位を含む各クローンの選択をし易くするようにｎ＝２又は３の融合ベクターになるまで、連続的なアプローチを繰り返すことができ、これは、より多数のベクター単位を含む融合ベクターから出発する際には特に好ましく、すなわち、（ｎ−１）個の融合ベクターを最初に選択し、次いで、（ｎ−２）個の構築物を二回目に選択するなどとすることができると解される。
【００７４】
さらに、上述のベクター組み立て方法と同様に、本発明の融合ベクター解体方法において、ｎ個のベクター単位を含む前記融合ベクターにおける（ｎ−１）個のベクター単位の各々が、別の選択可能なマーカーを含まないベクター単位と前記選択可能なマーカーを含む１つ又は複数のベクター単位との間の融合体で形質転換された宿主細胞のみが工程（Ｃ１）で生存可能であるように、耐性マーカーとは異なる別の選択可能なマーカーを含むことが好ましい。
【００７５】
好ましい選択可能なマーカー（条件Ｏｒｉなど）、宿主細胞、マルチウェル試験プレートの使用などに関して、上述のベクター組み立て方法の好ましい実施態様が参照される。
【００７６】
本願の融合ベクター解体方法は、さらに、好ましい実施態様に関して以下に詳述する（ＡＣＥＭＢＬシステム；Ｃ．２．２節）。
【００７７】
本発明の核酸及びベクター（融合ベクター及びシングルベクター（すなわち、ベクター単位）を含む）は、さらに、典型的な配列要素、例えば、１つ又は複数の興味のある遺伝子から発現される（複数の）タンパク質の検出及び／又は精製を可能にする又は単純化する要素も含んでよい。そのような要素の典型例は、ＧＦＰ及びその誘導体、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴなどをコードする配列である。
【００７８】
本発明に係る融合ベクターは、適切な宿主における多タンパク質複合体の発現に有利に使用される。かくして、本発明は、さらに、（例えば複数若しくは単独の発現カセットの形態又は必要に応じてポリジーンの形態において、１つ又は複数の興味のある遺伝子が挿入されたベクター単位を含む）本発明の融合ベクターで適切な宿主を形質転換する工程、及び興味ある遺伝子の同時発現を可能にする条件下で形質転換した宿主を培養する工程を含む、対応する方法も提供する。
【００７９】
本発明の各種の態様の開示から、当業者は、好ましくは複数の発現カセットの反復クローニングに使用される、ＨＥ／Ｘ部位のポリヌクレオチド（特に、対応するベクター）は、複数遺伝子の構築物を作製するための上述の組み立て（又は解体）方法と組み合わせることができることを容易に理解するであろう。例えば、１つ又は複数の単独遺伝子ベクター又は複数遺伝子ベクターは上述のＨＥ／Ｘ部位要素を使用して調製することができ、本明細書に記載の組換えに基いた組み立て方法を使用して最適な融合ベクター（例えば、三重、四重、又はそれよりも高次の融合ベクター）に組み立て得る。その様な融合ベクターは、次いで、本明細書に記載のとおりに（部分的に又は完全に）解体されてよく、当業者によって予期される個々の多タンパク質の用途のために、必要に応じて次に異なる構築物を組み立てることができる。かくして、本発明の態様は、これまでには知られていなかった、多タンパク質の用途のための興味のある複数の遺伝子（又はポリジーン）を組み合わせる自由を当業者に提供するビルディングブロックシステムである。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、「ＡＣＥＭＢＬ」と称される好ましいキットに含まれる原核生物宿主における多タンパク質複合体の発現のための本発明に係る好ましいベクターの概略図である。
【図２】図２は、「マルチプルインテグレーションエレメント」（ＭＩＥ）と称される本発明の核酸の好ましい実施態様の図である。
【図３】図３は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＳＩＬＣ；Tan, S. et al. Protein Expr. Purif. 40, 385 (2005)を参照のこと）によって本発明のベクターに興味のある遺伝子（「ＧＯＩ」）を挿入するための好ましい方法の概略図である。興味のある遺伝子（ＧＯＩ１）は、特定のプライマーを用いてＰＣＲ増幅され、相補プライマー（相補領域は薄い灰色又は濃い灰色の各々で影を付けている）を用いたＰＣＲで直線化したベクター（アクセプター、ドナー）に組み込まれる。得られたＰＣＲ断片は、末端に相同領域を含む。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼは、ｄＮＴＰの非存在下においてエキソヌクレアーゼとして働き、長い付着突出をもたらす。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼエキソヌクレアーゼ処理したインサート及びベクターの混合（場合によってアニーリング）に続いて形質転換を実施し、単独遺伝子発現カセットを作製する。
【図４】図４は、ＳＬＩＣによって本発明のベクターにポリシストロンを挿入するための好ましい方法の概略図を示す。興味のある遺伝子（ＧＯＩ１、２、３）を特定のプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、ポリシストロンに組み立てられる最初（ＧＯＩ１）のフォワードプライマー及び最後（ＧＯＩ３）遺伝子のリバースプライマーの末端に相補的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅した（相補領域は薄い灰色又は暗い灰色の各々で影を付けた）。得られたＰＣＲ断片は、末端に相同領域を含む。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼは、ｄＮＴＰの非存在下においてエキソヌクレアーゼとして働き、長い粘着突出をもたらす。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼエキソヌクレアーゼ処理したインサート及びベクターの混合（場合によってアニーリング）に続いて形質転換を実施し、ポリシストロン発現カセットを作製する。
【図５】図５は、ＬｏｘＰ不完全反転反復（配列番号１９）の配列を示す。
【図６】（左図）は、本発明のベクターの好ましい実施態様（ｐＡＣＥ、ｐＤＫ、及びｐＤＳベクター）のＣｒｅを介する組み立て及び解体を示すピラミッド状の概略図を示す。ＬｏｘＰ部位は赤い丸で示し、耐性マーカー及び複製起点を示している。白色の矢印は、ＡＣＥＭＢＬベクターの発現カセット全体（プロモーター、ターミネーター、及びマルチプルインテグレーションエレメントを含む）を示す。明確にするために、全ての有り得る融合産物を示しているわけではない。多重耐性のレベルは右図に示す。
【図７】図７は、本発明に係るＣｒｅ−ｄｅＣｒｅ組み立て／解体によるベクター構築物を有する細菌コロニーの多重耐性分析の概略図である（図１２も参照のこと）。
【図８】図８は、ヒトＴＦＩＩＦの発現のための、本発明のベクターへのヒトＲＡＰ７４及びヒトＲＡＰ３０のクローニングのためのストラテジーの概略図である（左図）。ｈＲＡＰ７４はＳＬＩＣによってｐＤＣにクローニングした。ｈＲＡＰ３０はＳＬＩＣによってｐＡＣＥにクローニングした。ｐＤＣ−ＲＡＰ７４（ドナー）及びｐＡＣＥ−ＲＡＰ３０のＣｒｅ−Ｌｏｘ組換えによって、ベクターｐＡＣＥＭＢＬ−ｈＴＦＩＩＦが得られる。１１の二重耐性（Ｃｍ，Ａｐ）コロニーのＢｓｔＺ１７Ｉ／ＢａｍＨＩの二重消化による制限マップ作成の結果は、１％Ｅ−ゲル電気泳動のゲル切片によって示す（Ｍ：ＮＥＢ １ｋｂ ＤＮＡマーカー）。全ての試験したクローンは、期待されるパターンを示した（５．０＋２．８ｋｂ）（左図）。
【図９】図９は、複数断片ＳＬＩＣによってベクターｐＡＣＥにヒトＶＨＬ／エロンギンｂ／エロンギンｃ複合体（ＶＨＬｂｃ）（トリシストロン）をクローニングするためのストラテジーを示す。
【図１０】図１０は、本発明に係る好ましいホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）／制限酵素部位（Ｘ）モジュール（ＰＩ−ＳｃｅＩ／ＢｓｔＸＩ）を用いて酵母ＲＥＳ複合体（Ｐｍｌ１ｐ、Ｓｎｕ１７ｐ、Ｂｕｄ１３ｐ）の成分を反復クローニングするためのストラテジーの概略図である。
【図１１】図１１は、多重融合ベクターｐＡＣＫＳ（配列番号１８）からのシングルベクターの産生の概略図を示す。
【図１２】図１２は、ｐＡＣＫＳ Ｄｅ−Ｃｒｅ反応の９６ウェルマイクロタイター分析を示す概略図及び写真である。
【図１３】図１３は、本発明に係る好ましい核酸（「マルチプルインテグレーションエレメント」、ＭＩＥ）の配列及びマップを示す（配列番号１）。配列決定のためのフォワード及びリバースプライマーは、Ｔ７及びｌａｃのための標準的なベクタープライマーデあり得る。アダプタープライマー配列（表１参照のこと）を示す。これらの相同領域のＤＮＡ配列は、十分に施行された配列決定プライマーを含む（上記Tan et al. (2005)）。挿入部位（Ｉ１−Ｉ４）を示す。アダプター配列及びおそらく相同領域の任意の配列が、複数断片挿入のためのアダプターとして使用することができる。ＭＩＥに存在するリボソーム結合部位（ｒｂｓ）は赤い四角で囲っている。
【図１４】図１４はアクセプターベクターｐＡＣＥのプラスミドマップを示す。
【図１５】図１５はアクセプターベクターｐＡＣＥ２のプラスミドマップを示す。
【図１６】図１６はドナーベクターｐＤＣのプラスミドマップを示す。
【図１７】図１７はドナーベクターｐＤＫのプラスミドマップを示す。
【図１８】図１８はドナーベクターｐＤＳのプラスミドマップを示す。図１４から１８のプラスミドマップにおいて認められるとおり、アクセプターベクターｐＡＣＥ（図１４）及びｐＡＣＥ２（図１５）は、Ｔ７プロモーター及びターミネーターを含む。ドナーベクターｐＤＣ（図１６）、ｐＤＫ（図１７）、及びｐＤＳ（図１８）は、条件複製起点を含む。ｐＤＳ（図１８）及びｐＤＫ（図１７）はｌａｃプロモーターを有する。ｐＤＣ（図１６）はＴ７プロモーターを有する。耐性マーカー及び複製起点を示している。ＬｏｘＰ不完全反転反復配列を丸で示す。ホーミングエンドヌクレアーゼ部位及び対応するＢｓｔＸＩ部位を四角で囲んでいる。マルチプルインテグレーションエレメント（ＭＩＥ）の制限酵素部位を示す。全てのＭＩＥはＣｌａＩとＰｍｅＩとの間に同じＤＮＡ配列を有する。特有の制限部位構成における相違は、プラスミド骨格配列における相違に由来する。
【図１９】図１９は、本発明の好ましいベクターの制限マッピングの結果を示す。未消化のアクセプターベクター（ｐＡＣＥ、ｐＡＣＥ２）及びドナーベクター（ｐＤＣ、ｐＤＫ、ｐＤＳ）の双方を、ＢａｍＨＩで消化した同ベクターとともに開示している。すべての制限反応によって期待されるサイズのものが生じる。レーン１から５は、未切断のｐＡＣＥ、ｐＡＣＥ２、ｐＤＣ、ｐＤＫ、及びｐＤＳベクターであり；レーンＭはλＳｔｙｌマーカーであり；レーンＡからＥは、ＢａｍＨＩ消化したｐＡＣＥ、ｐＡＣＥ２、ｐＤＣ、ｐＤＫ、及びｐＤＳベクターを示す。
【図２０】図２０は、ｐＡＣＥ、ｐＤＣ，ｐＤＫ、及びｐＤＳの各々に挿入したＶｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ／ｅｌｏｎｇｉｎＢ／ｅｌｏｎｇｉｎＣ（ＶＨＬｂｃ）複合体（上記のTan et al. (2005)、上記図９を参照のこと）、FtsH可溶性ドメイン（Bieniossek et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 3066-3071）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、及びコイルドコイルドメインを有する緑色蛍光タンパク質（ｍＧＦＰ）（Berger et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 12177-12182）をコードする遺伝子で例示する、本発明のアクセプター／ドナー組換えのストラテジーを示す。Ｃｒｅ融合の後に、ｐｉｒ−細胞を形質転換する（ＴＯＰ１０）。２種（Ａｐ／Ｋｎ；Ａｐ／Ｃｍ；Ａｐ／Ｓｐ）、三種（Ａｐ／Ｋｎ／Ｓｐ）、及び四種（Ａｐ／Ｋｎ／Ｓｐ／Ｃｍ）の抗生物質を含む寒天にアリコートを播種した。各プレートから得られた四個のコロニーを９６ウェルマイクロタイタープレートで試験した。プレート画像の左のラベルは、横列で培地アリコートに含まれている抗生物質を示す。下の二列のウェルは、異なる試験をした（ラベルはプレート画像の下に示す）。各々１つの寒天プレートから得られた四個のコロニーを播種したものは、黒四角で囲い、寒天プレートに含まれる抗生物質を引出線の先に記載している。そのような各１６ウェルの四角の４つの縦列は、同じコロニーで播種した。下の二列は、列の四つのウェルは同じコロニーで播種した。二重、三重（ＡＤＤ）、及び四重（ＡＤＤＤ）融合の期待されるベクター構造は、プレートの画像の左若しくは右の各々（１６ウェルの四角）又は下（下の二列）に示す。赤色色素を位置マーカーとして使用している。ＡＤＤＤ融合体の解体は、逆の方法で成功裡に実施した。
【図２１】図２１は、ヒトＴＦＩＩＦ（図２１Ａ）、Ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ／ｅｌｏｎｇｉｎＢ／ｅｌｏｎｇｉｎＣ（ＶＨＬｂｃ）複合体（図２１Ｂ）、及び原核生物膜貫通ホロトランロコン（ｈｏｌｏｔｒａｎｌｏｃｏｎ：ＨＴＬ）ＹｉｄＣ−ＳｅｃＹＥＧＤＦ（図２１Ｃ）の多タンパク質複合体の発現の結果を示す。（Ａ）ヒトＴＦＩＩＦは、ＴＥＣＡＮ Ｆｒｅｅｄｏｍ Ｅｖｏｌｌ ２００ ワークステーションを使用して組み立て、精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。非誘導又は誘導した全細胞抽出物及び精製したｈＴＦＩＩＦを示し、サブユニット（ＲＡＰ７４、ＲＡＰ３０）を記した。ＲＡＰ７４はＣ末端オリゴヒスチジンタグを含んでいた。（Ｂ）図２０の全ての多遺伝子構築物を組み立て、発現させ、ｈＴＦＩＩＦと同じルーチンにしたがって細胞溶解物を同時に分析した（図２０に記した名称）。ＶＨＬｂｃ複合体は、ＶＨＬサブユニット上のオリゴヒスチジン−チオレドキシン融合体タグによって捕獲した（上記Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５））。ＦｔｓＨは、そのＣ末端にオリゴヒスチジンタグを含んでいた（上記Ｂｉｅｎｉｏｓｓｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００６））。蛍光タンパク質は、Ｒｏｃｈｅ１８１４４６０なる抗体（ＴＢＳＴ／３％ＢＳＡ中１：１０００）を使用してウエスタンブロットによって溶解物中で同定した。（Ｃ）全原核生物膜貫通ホロトランスロコン（ＨＴＬ）ＹｉｄＣ−ＳｅｃＹＥＧＤＦの生産。膜小胞生産、界面活性剤可溶化、Ｎｉ２＋親和性捕獲、及びサイズ排除クロマトグラフィーは、精製ホロトランスロコン複合体（右）をもたらした。サブユニットを記した。ＳｅｃＹの分解産物は、アスタリスクで標識した。すべてのパネルにおいて、ＭはＢｉｏｒａｄ ｂｒｏａｄ ｒａｎｇｅ ｍａｒｋｅｒ（サイズ［ｋＤａ］）である。
【図２２】図２２は、自動ＳＬＩＣ工程の作業の流れ図を示す。
【図２３】図２３は、自動Ｃｒｅ融合工程の作業の流れ図を示す。
【図２４】図２４は、ｐＩＤＣ（配列番号７）と称する、本発明の好ましいベクター（ドナーベクター）のプラスミドマップを示す。
【図２５】図２５は、ｐＩＤＫ（配列番号８）と称する、本発明の好ましいベクター（ドナーベクター）のプラスミドマップを示す。
【図２６】図２６は、ｐＩＤＳ（配列番号９）と称する、本発明の好ましいベクター（ドナーベクター）のプラスミドマップを示す。
【図２７】図２７は、ｐＡＣＥＢａｃ１（配列番号１０）と称する、本発明の好ましいベクター（アクセプターベクター）のプラスミドマップを示す。
【図２８】図２８は、ｐＡＣＥＢａｃ２（配列番号１１）と称する、本発明の好ましいベクター（アクセプターベクター）のプラスミドマップを示す。
【図２９】図２９は、ｐＡＣＥＢａｃ３（配列番号１２）と称する、本発明の好ましいベクター（アクセプターベクター）のプラスミドマップを示す。
【図３０】図３０は、ｐＡＣＥＢａｃ４（配列番号１３）と称する、本発明の好ましいベクター（アクセプターベクター）のプラスミドマップを示す。
【図３１】図３１は、ｐＯｍｎｉＢａｃ１（配列番号１４）と称する、本発明の好ましいベクター（アクセプターベクター）のプラスミドマップを示す。
【図３２】図３２は、ｐＯｍｎｉＢａｃ２（配列番号１５）と称する、本発明の好ましいベクター（アクセプターベクター）のプラスミドマップを示す。
【図３３】図３３は、ｐＯｍｎｉＢａｃ３（配列番号１６）と称する、本発明の好ましいベクター（アクセプターベクター）のプラスミドマップを示す。
【図３４】図３４は、ｐＯｍｎｉＢａｃ４（配列番号１７）と称する、本発明の好ましいベクター（アクセプターベクター）のプラスミドマップを示す。
【図３５】図３５は、ＣｏｌＥ１複製起点を有する本発明のアクセプターベクター（ｐＡＣＥＢａｃ１、ｐＡＣＥＢａｃ２、ｐＯｍｎｉＢａｃ１、ｐＯｍｎｉＢａｃ２）を使用する複合バキュロウイルスを産生することによる昆虫細胞における多タンパク質発現のスキームを示す。多遺伝子融合体は、所望のドナー／アクセプターの組合せのＣｒｅ−ＬｏｘＰ融合によって産生する（多遺伝子構築物）。融合ベクターによって、細菌人工染色体（ＢＡＣ）としてバキュロウイルスゲノム（例えば、バキュロウイルスＥＭＢａｃ又はＥＭＢＡｃＹ）を有する細菌を形質転換する。ベクター融合体は、Ｔｎ７に基づく転位によってバキュロウイルスゲノムに組み込まれる。増殖性複合ウイルスは、青色／白色スクリーニングによって選択される（ウイルスのＴ７付着部位へのベクター融合体の組込みによって、ウイルスに存在するｌａｃＺ遺伝子が破壊される）。複合ウイルスを調製し、適切な昆虫細胞をタンパク質製造のために形質転換する。
【図３６】図３６は、ＯｒｉＶ複製起点を有する本発明のアクセプターベクター（ｐＡＣＥＢａｃ３、ｐＡＣＥＢａｃ４、ｐＯｍｎｉＢａｃ３、ｐＯｍｎｉＢａｃ４）を使用して複合バキュロウイルスを産生することによる、昆虫細胞における多タンパク質発現のためのスキームを示す。多遺伝子融合体によって、所望のドナー／アクセプターの組合せのＣｒｅ−ＬｏｘＰ融合によって産生する。融合ベクターは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）としてバキュロウイルスゲノム（例えば、バキュロウイルスＥＭＢａｃ又はＥＭＢＡｃＹ）を有する細菌を形質転換する。ベクター融合体は、Ｔｎ７に基づく転位によってバキュロウイルスゲノムに組み込まれる。ｔｒｆＡ遺伝子がトランスで提供されている場合はＯｒｉＶを有するアクセプターベクターが増殖できるため、ｔｒｆＡ遺伝子を含まない細菌における非生産的な組込みは、適当な抗生物質（ここでは、ゲンタマイシン）に対する曝露による、そのような形質転換体の排除をもたらす。かくして、青色／白色スクリーニングは、この場合には必要ではない。次いで、複合ウイルスを調製し、適切な昆虫細胞をタンパク質製造のために形質転換する。
【図３７】図３７は、ｌｅｆ２−６０３及びＯｒｆ１６２９相同配列を有する本発明のアクセプターベクター（ｐＯｍｎｉＢａｃ１、ｐＯｍｎｉＢａｃ２、ｐＯｍｎｉＢａｃ３、ｐＯｍｎｉＢａｃ４）を使用して複合バキュロウイルスを産生することによる、昆虫細胞における多タンパク質発現のためのスキームを示す。多遺伝子融合体は、所望のドナー／アクセプターの組合せのＣｒｅ−ＬｏｘＰ融合によって産生する（多遺伝子構築物）。ｌｅｆ２−６０３／Ｏｒｆ１６２９相同配列に隣接するジフテリア毒素Ａ遺伝子を有するゲノムバキュロウイルスＤＮＡ及び多遺伝子構築物を、タンパク質製造のための適切な昆虫細胞に直接的に共トランスフェクトできる。バキュロウイルスゲノムを含む細菌の移入ベクターによる形質転換、複合ウイルスの青色／白色スクリーニング、及びバクテリアからの複合ウイルスの調製はもはや必要ではない。
【図３８】図３８は、ＥＭＢａｃと称する、本発明のバキュロウイルスベクターの略図を示す。
【図３９】図３９は、ＥＭＢａｃＹと称する、本発明のバキュロウイルスベクターの略図を示す。
【図４０】図４０は、ＥＭＢａｃ＿Ｄｉｒｅｃｔと称する、本発明のバキュロウイルスベクターの略図を示す。
【図４１】図４１は、ＥＭＢａｃ＿ＤｉｒｅｃｔＹと称する、本発明のバキュロウイルスベクターの略図を示す。
【図４２】図４２は、例えばｐＡＣＥＢａｃ２などのアクセプターベクターにおける、一般的な構造Ｉ−ＣｅｕＩ−ｐ１０−ＭＣＳ−ＢｓｔＸＩを有する本発明のＭＩＥの略図を示す。
【図４３】図４３は、例えばｐＩＤＳなどのドナーベクターにおける、一般的な構造ＰＩ−ＳｃｅＩ−ｐ１０−ＭＣＳ−ＢｓｔＸＩを有する本発明のＭＩＥの略図を示す。
【図４４】図４４は、例えばｐＡＣＥＢａｃ１などのアクセプターベクターにおける、一般的な構造Ｉ−ＣｅｕＩ−ｐｏｌｈ−ＭＣＳ−ＢｓｔＸＩを有する本発明のＭＩＥの略図を示す。
【図４５】図４５は、例えばｐＩＤＳなどのドナーベクターにおける、一般的な構造ＰＩ−ＳｃｅＩ−ｐｏｌｈ−ＭＣＳ−ＢｓｔＸＩを有する本発明のＭＩＥの略図を示す。
【図４６】図４６は、ｐＡＣＥＢａｃ１−ＨｉｓＩＫＫ１なるベクターの略図を示す。
【図４７】図４７は、ｐＩＤＣ−ＣＳＩＫＫ２なるベクターの略図を示す。
【図４８】図４８は、ｐＩＤＳ−ＣＳＩＫＫ３なるベクターの略図を示す。
【図４９】図４９は、ｐＡＣＥＢａｃ−ＨＡ−ＮＡなるベクターの略図を示す。
【図５０】図５０は、ｐＩＤＣ−Ｍ１−Ｍ２なるベクターの略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
「ＡＣＥＭＢＬ」システムである好ましい実施態様を参照して、以下に詳細に本発明を説明する。
【００８２】
Ａ．概要
「ＡＣＥＭＢＬ」と称される、本発明に係る好ましい実施態様は、バキュロウイルス系を使用する昆虫細胞及び大腸菌における多遺伝子発現のための多重発現系を提供する。ＡＣＥＭＢＬは、液体処理ワークステーションを使用することによって自動化された設定及び手作業の双方で使用することができる。ＡＣＥＭＢＬは、多数の遺伝子を迅速に多遺伝子発現カセットに組み立てるためのタンデム組換え工程を適用する。これらは、ポリシストロン性又は多発現モジュールであってよく、又はこれらの要素の組合せであってよい。ＡＣＥＭＢＬは、望ましい場合には、制限酵素及びリガーゼを伴う従来の方法を利用する選択肢も提供する。
【００８３】
多遺伝子の組み立て及び発現のための以下のストラテジーをＡＣＥＭＢＬシステムにおいて提供する：
（１）単独の遺伝子のベクターへの挿入（組換え又は制限／連結）
（２）多遺伝子のポリシストロンへの組み立て（組換え又は制限／連結）
（３）ホーミングエンドヌクレアーゼを使用する多遺伝子の組み立て
（４）Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ反応による多遺伝子プラスミド融合
（５）大腸菌における共形質転換による多遺伝子発現
（６）バキュロウイルス系を使用する昆虫細胞における多遺伝子発現
【００８４】
これらのストラテジーは、研究課題及び使用者に応じて、個別又は同時に使用してよい。
【００８５】
以下のＣ節において、ＡＣＥＭＢＬシステムで使用できる多遺伝子カセット組み立てのためのこれらの方法の各々のための段階的なプロトコールを提供する。
【００８６】
Ｂ．ＡＣＥＭＢＬシステム
Ｂ．１  ＡＣＥＭＢＬベクター
本発明は、好ましい例示的な実施態様として、「アクセプター」及び「ドナー」ベクタと称される小さなデノボ設計されたベクターを提供する（図１及び２０、プラスミドマップについては、図１４から１８及び２１から３１を参照のこと）。原核宿主におけるタンパク質発現のためのアクセプターベクター（例えば、ｐＡＣＥ、ｐＡＣＥ２）は、ＣｏｌＥ１由来の複製起点及び耐性マーカー（アンピシリン又はテトラサイクリン）を含む。ドナーベクターは、ｐｉｒ遺伝子を発現する宿主に依存して増殖させる、条件複製起点（Ｒ６Ｋγ由来）を含む。ドナーベクターは、カナマイシン、クロラムフェニコール、及びスペクチノマイシン耐性遺伝子を含む。好ましくは、1つのアクセプターベクターとともに３つのドナーベクターを使用する。
【００８７】
この例に係る全てのドナー及びアクセプターベクターは、ＬｏｘＰ不完全反転反復、加えて、ＭＩＥ（マルチプルインテグレーションエレメント）を含む。本発明の好ましいＭＩＥは、好ましいプロモーター（原核生物、哺乳動物、昆虫細胞に特異的なもの又はそれらの組合せ）及びターミネーター（原核生物、哺乳動物、昆虫細胞に特異的なもの又はそれらの組合せ）とともに発現カセットを含む。その中間にあるものは、従来のクローニング方法又は好ましい発現要素（さらなるプロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、及び遺伝子）の組込みのための二本鎖破壊をもたらすために使用することができる多数の制限部位を含むＤＮＡセグメントである。ＭＩＥは、プロモーター及びターミネーター（Ｂ．２を参照のこと）に隣接する特別に設計された制限酵素部位（ＢｓｔＸＩ）及びホーミングエンドヌクレアーゼ部位によって完成する。
【００８８】
原核生物宿主における発現のためのＡＣＥＭＢＬベクターの配列は、配列表に記載している（ｐＡＣＥ：配列番号２、ｐＡＣＥ２：配列番号３、ｐＤＣ：配列番号４、ｐＤＫ:配列番号５、ｐＤＳ：配列番号６、ｐＡＣＫＳ：配列番号１８）。ベクターｐＡＣＥ、ｐＡＣＥ２、ｐＤＣ、ｐＤＫ、及びｐＤＳのマップは図１４から１８に示す。
【００８９】
本発明に係るＡＣＥＭＢＬシステムは、バキュロウイルス（ｐＩＤＣ（配列番号７）、ｐＩＤＫ（配列番号８）、ｐＩＤＳ（配列番号９）、ｐＡＣＥＢａｃ１（配列番号１０）、ｐＡＣＥＢａｃ２（配列番号１１）、ｐＡＣＥＢａｃ３（配列番号１２）、ｐＡＣＥＢａｃ４（配列番号１３）、ｐＯｍｎｉＢａｃ１（配列番号１４）、ｐＯｍｎｉＢａｃ２（配列番号１５）、ｐＯｍｎｉＢａｃ３（配列番号１６）、及びｐＯｍｎｉＢａｃ４（配列番号１７））を使用する昆虫細胞における多タンパク質複合体の発現に適合するドナー及びアクセプターベクターも提供する。ベクターのプラスミドマップは図２４から３４に示す。
【００９０】
ドナーベクターであるｐＩＤＳ、ｐＩＤＫ及びｐＩＤＳは、条件複製起点（Ｒ６Ｋγファージ由来）、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）部位（ＰＩ−ＳｃｅＩ）、及び相補的なＢｓｔＸＩ部位を含む（対応する大腸菌ベクターｐＤＣ、ｐＤＫ、ｐＤＳを参照のこと）。ドナーは、ｐｉｒ遺伝子を含む細胞株において増殖する。
【００９１】
細菌における発現に適合するものとは対照的に、昆虫細胞におけるタンパク質発現のためのベクターは、原核生物プロモーター及びターミネーター構造を含まない。そのかわりに、それらは、ｐｏｌｈ発現カセット（ｐｏｌｈ ＥＣ）又はｐ１０発現カセット（ｐ１０ ＥＣ）のいずれかを有する。これらの発現カセットは、共通の多角体又はＡｃＭＮＰＶ由来のｐ１０プロモーター、制限部位をコードするオリゴヌクレオチド（原核生物ＡＣＥＭＢＬのＭＩＥとは異なる）、及びＳＶ４０又はＨＳＶｔｋポリアデニル化シグナル配列を含む。
【００９２】
言うまでもなく、ＨＥ及びＢｓｔＸＩ部位のために、発現カセットがベクター間で自由に交換することができ、挿入遺伝子を含む場合でも同様である。これは、制限連結又は制限酵素／リガーゼ非依存的な方法（例えば、ＳＬＩＣ）によって実施することができる。したがって、耐性マーカー（スペクチノマイシン、カナマイシン、又はクロラムフェニコールなど）のいずれか１つとともにｐ１０又はｐｏｌｈマーカーを含むものを、容易に作製することができる。
【００９３】
ＨＥ／ＢｓｔＸＩ部位の組合せを使用して、発現カセットを増やすことができ、又はｐ１０及びｐｏｌｈ発現カセットの組合せにベクターを適合させることができる。
【００９４】
全てのドナーは、ＬｏｘＰ不完全反転反復を含む。これは、細菌のＡＣＥＭＢＬベクターについて説明しているとおり、ＬｏｘＰを介するアクセプター／ドナー多重融合体の構築及び解体に使用することができる。
【００９５】
昆虫細胞におけるタンパク質発現に適合するベクターに関連する本発明の本実施態様は、バキュロウイルス用のＡＣＥＭＢＬにおける多数のアクセプターベクターを提供する。これらは、共通の特徴を有する：全てＬｏｘＰ部位、耐性マーカー（ゲンタマイシン）、及びｐ１０又はｐｏｌｈ発現カセットのいずれか（ドナーに存在するものと同一）を含む。
【００９６】
アクセプターの発現カセットは、ホーミングエンドヌクレアーゼ部位（Ｉ−ＣｅｕＩ）及び対応するＢｓｔＸＩ部位に隣接する。
【００９７】
前記発現カセットは、細菌のＡＣＥＭＢＬベクターについて説明したとおり、アクセプター間で交換することができ、ＨＥ／ＢｓｔＸＩの組合せを使用して増やすか又は結合させることもできる。
【００９８】
使用する複製起点の観点から２種のファミリーのアクセプターが存在する：
ｐＡＣＥＢａｃ１、ｐＡＣＥＢａｃ２、ｐＯｍｎｉＢａｃ１、及びｐＯｍｎｉＢａｃ２の全ては、全ての共通の大腸菌クローニング細胞株における増殖を可能にするＣｏｌＥＩ複製起点を含む。
【００９９】
全てのアクセプターベクターは、Ｔｎ７転位方法を使用することによって、中間領域をＴｎ７接合部位に組み込むことを可能にするＴｎ７Ｌ及びＴｎ７Ｒ配列を含む。
【０１００】
ｐＡＣＥＢａｃ３、ｐＡＣＥＢａｃ４、ｐＯｍｎｉＢａｃ３、及びｐＯｍｎｉＢａｃ４は、使用するクローニング用の株でトランスに提供される必要があるｔｒｆＡ遺伝子に依存する、Ｖ．Ｃｈｏｌｅｒａｅ（コレラ菌）由来の条件複製起点（ＯｒｉＶ）を含む。遺伝子に適合し、かつ、必要な場合にはドナーと融合されるアクセプターで、細菌人工染色体（すなわち、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＤＨ１０Ｂａｃなど）の形態でバキュロウイルスゲノムを含む細胞を形質転換する際に、バックグラウンド（青色コロニー）を除くことが、このＯｒｉＶの機能である。ここで、Ｔｎ７転位系を使用して、細胞を形質転換したＤＮＡのＴｎ７ＬとＴｎ７Ｒの間の領域を、好ましいウイルスゲノムのＴｎ７接合部位に組み込む。通常は、効果がない組込みは、青色コロニーをもたらすであろう（Ｔｎ７接合部位がバキュロウイルスゲノムのＬａｃＺα遺伝子に組み込まれている場合）。この青色コロニーは、バキュロウイルスゲノムとは別に形質転換されたプラスミドを増殖する。これら４つのＯｒｉＶ含有プラスミドと用いると、青色コロニーはゲンタマイシンに対する曝露で生存することができず（ＤＨ１０Ｂａｃ又は他の細胞はｔｒｆＡを含まないため）、形質転換されたプラスミドに与えられた異種遺伝子を有する、効果的に組み込まれた複合バクミドを含む白色コロニーのみがもたらされる。図３６のスキームも参照のこと。
【０１０１】
アクセプターベクターであるｐＯｍｉｎＢａｃ１−４は、Ｔｎ７Ｌ及びＴｎ７Ｒ領域に加えて、ｌｅｆ２−６０３及びＯｒｆ１６２９相同配列も含む。これらは、Ｎｏｖａｇｅｎ Ｂａｃｖｅｃｔｏｒシリーズ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製のＢａｃｕｌｏｇｏｌｄシステム、及びＯＥＴ社製のＦｌａｓｈＢａｃなどによって使用されるような複合バキュロウイルスの産生のための相同組換え法に使用される。かくして、これらのアクセプターベクターは、Ｔｎ７に基づくバキュロウイルス及びｌｅｆ２，６０３／１６２９相同組換え法による全てのウイルスを含む、昆虫細胞培養物で異種遺伝子を発現するために現在利用可能である全てのバキュロウイルス系に使用することができる。図３７のスキームも参照のこと。
【０１０２】
Ｂ．２  マルチプルインテグレーションエレメント（ＭＩＥ）
本発明に係る好ましいマルチプルインテグレーションエレメント（ＭＩＥ）は、ポリリンカーに由来し（上記Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５））、多遺伝子の組み立てのための複数の方法を可能にする（下記Ｃ節を参照のこと）。様々な方法、例えば、ＢＤ−ＩｎーＦｕｓｉｏｎ組換え（ＣｌｏｎＴｅｃｈ Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｅｕｒｏｐｅ，ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ）又はＳＬＩＣ（配列及び連結非依存的クローニング；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４，２５１を参照のこと）によってベクターのいずれか１つのＭＩＥに複数の遺伝子を挿入することができる。このために、ベクターは直線化する必要があり、これは、ベクターがすべて小さいため（２−３．０ｋｂ）、適当なプライマーを使用するＰＣＲ反応によって効果的に実施することもできる。超高忠実度のポリメラーゼ、例えば、Ｐｈｕｓｉｏｎ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ／Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ）を使用することが好ましい。代替的には、より従来からの方法が、例えば、ロボットなしの通常のウェットラボ環境で使用される場合は、制限消化によってベクターを直線化することができ、興味のある遺伝子を制限／連結によって組み込むことができる（本実施態様の下記のＣ節を参照のこと）。このＭＩＥのＤＮＡ配列（配列番号１）及びマップを図１３に示す。
【０１０３】
Ｂ．３  タグ、プロモーター、ターミネーター
原核生物宿主におけるタンパク質発現のために、ＡＣＥＭＢＬシステムのベクターは、初期設定で、プロモーターＴ７及びＬａｃ、並びにＴ７ターミネーター要素を含む（図１、１４）。Ｔ７系は、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子を、例えば、大腸菌ゲノムに含む、細菌株を必要とする。Ｌａｃプロモーターは、大半の株で利用することができる、強力な内在性プロモーターである。このＡＣＥＭＢＬベクターは、異種発現の抑制のためのｌａｃオペレーター要素を含む。
【０１０４】
明らかに、ＡＣＥＭＢＬドナー及びアクセプターベクターに存在する全てのプロモーター及びターミネーター、並びに実際にはマルチプルインテグレーションエレメント（ＭＩＥ）全体（ＨＥ及びＸ部位を除く）の各々が、適当な酵素（例えば、ＣｌａＩ／ＰｍｅＩ、図２）を用いる制限／連結クローニング、又はＳＬＩＣなどの配列及び連結非依存的な方法によってＭＩＥを除去する、直線化したＡＣＥＭＢＬベクターへの挿入を使用することによって、好ましい発現カセットと交換することができる。例えば、ｐＤＣのＴ７プロモーターは、ｔｒｃプロモーター（ｐＤＣｔｒｃ）で置換することができ、ｐＡＣＥのＴ７プロモーターはアラビノースプロモーター（ｐＡＣＥａｒａ）で置換することができ、そのようなバリアントは、アラビノース及びＩＰＴＧで誘導することによる共発現実験に成功裡に使用することができる。
【０１０５】
原核生物宿主における発現用のＡＣＥＭＢＬベクターとは対照的に、昆虫細胞における発現用のベクターは、原核生物プロモーター及びターミネーター構造を含まない。既に記載したとおり、それらは、ｐｏｌｈ発現カセット（ｐｏｌｈ ＥＣ）又はｐ１０発現カセット（ｐ１０ ＥＣ）のいずれかを有する。これらの発現カセットは、共通のポリへドロン又はＡｃＭＮＰＶ由来のｐ１０プロモーター、制限部位の配列、及びＳＶ４０又はＨＳＶｔｋポリアデニル化シグナル配列のいずれかを含む。
【０１０６】
本実施例のＡＣＥＭＢＬシステムベクターは、興味のあるタンパク質の精製及び可溶化を容易にするアフィニティータグをコードするＤＮＡ配列を含まない。しかしながら、典型的に使用されるＣ末端又はＮ末端のオリゴヒスチジンタグは、タグ除去のためのプロテアーゼ部位とともに又はそれなしで、ＭＩＥに挿入する前に興味のある遺伝子の増幅に使用される個々のＰＣＲプライマーを用いることによって、例えば、ＳＬＩＣ媒介挿入によって導入することができる。かくして、本発明のドナー及びアクセプターベクターは、興味のある組換え遺伝子を挿入する前に、一連の通例のタグを取り付けてよい。これは、タグの挿入の後に、ＡＣＥＭＢＬシステムを使用法の組換えに基づく原理と適合する設計によって為されることが最も良好である。
【０１０７】
Ｂ．４  複合体発現
大腸菌における発現のために、適当なプロモーター又はターミネーターを有する、ＡＣＥＭＢＬ多遺伝子発現ベクター融合体で適当な好ましい発現宿主を形質転換する。この例示のベクター（Ｔ７及びｌａｃプロモーター要素）については、広範な現在利用可能な発現株の大半を利用することができる。特定の発現株がシャペロン又はリソザイムなどをコードするＤＮＡを有するヘルパープラスミドを既に含む場合には、多遺伝子融合体の設計は、ヘルパープラスミドにも存在する耐性マーカーを含むＡＣＥＭＢＬベクターが多遺伝子ベクター構築物に含まれないようにすることが好ましい。
【０１０８】
代替的には、さらなるベクターが実験において複合体の生産に必要とされる場合、その課題は、対立を回避する耐性マーカーを含むＡＣＥＭＢＬベクターの代替的なバージョンを作製することによって解決することができる。これは、耐性マーカーを除いたベクターをＰＣＲ増幅し、得られた断片をＰＣＲ増幅した耐性マーカーと組換え（ＳＬＩＣ）又は平滑末端連結（５’リン酸化プライマーを使用する）によって結合させることによって容易に実施することができる。
【０１０９】
本発明のドナーベクターは、Ｒ６Ｋγ条件複製起点のために、ｐｉｒ遺伝子産物の宿主による発現に依存する。ドナーベクターは、通常の発現株では、有効な複製のためのアクセプターとの融合に依存する。それにもかかわらず、ドナー又はドナー−ドナー融合体は、ｐｉｒ遺伝子をゲノムに挿入した発現株を使用することによって、アクセプターと融合させない際にも発現のために使用することができる。そのような株は市販されている（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ，ＵＳＡ）。
【０１１０】
細菌における発現に適合する２つのＡＣＥＭＢＬプラスミドの共形質転換は、タンパク質複合体発現の成功をもたらし得る。原核生物宿主における発現のための当該ＡＣＥＭＢＬシステムは、耐性マーカー以外は同一である２つのアクセプターベクター、すなわち、ｐＡＣＥ及びｐＡＣＥ２を含む（図１、１４）。これらを使用して、共形質転換及び双方の抗生物質に対する同時暴露によって、ｐＡＣＥ又はｐＡＣＥ２のそれぞれに存在する遺伝子を発現させることができる。事実、アクセプターとしてのｐＡＣＥ又はｐＡＣＥ２に依存する、複数の遺伝子を含むアクセプター−ドナー融合体の全体は、原理上、必要な場合には、多重発現のために共形質転換することができる。
【０１１１】
バキュロウイルス系を使用する昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉ５など）における発現のために、本発明の適切なＡＣＥＭＢＬベクターは、バキュロウイルスゲノムに組み込まれる必要がある（複合ウイルス産生）。これは、典型的には、細菌人工染色体として所望のウイルスゲノムを含む細菌細胞を所望のＣｒｅ−ＬｏｘＰ融合体で形質転換することによって実施される。バキュロウイルスへの組込みに適合する本発明のベクター系を使用すると、図３５、３６、及び３７の各々に記載の３つの方法が可能である。
【０１１２】
Ｃ．手順
Ｃ．１．ＡＣＥＭＢＬベクターへのクローニング
原核生物の発現宿主のための好ましい実施態様のドナー及びアクセプターの全てが、ＭＩＥを取り囲むホーミングエンドヌクレアーゼ部位／ＢｓｔＸＩタンデムを除いて、同一のＭＩＥを含む（図１、１４）。ＭＩＥは、配列及び連結に非依存的な遺伝子挿入方法にあったものである。加えて、ＭＩＥは、一連の特有の制限部位も含み、そのため、制限／連結による従来の遺伝子挿入のための旧知のポリリンカーとして使用することができる。自動化された応用のために、興味のある遺伝子の挿入は、好ましくは、ＳＬＩＣなどの組換え法によって実施される。
【０１１３】
この好ましい実施態様に係る昆虫細胞における発現のためのドナーベクターは、各ベクターで異なるＭＩＥも含む（図２１、２２、及び２３の各々のベクターｐＩＤＣ、ｐＩＤＫ、及びｐＩＤＳのプラスミドマップを参照のこと）。
【０１１４】
Ｃ１．１．ＳＬＩＣによるＭＩＥへの単独遺伝子挿入
ベクターへの遺伝子の制限／連結に非依存的な挿入のための幾つかの方法が、開示又は市販されている（例えば、Ｎｏｖａｇｅｎ ＬＩＣ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＢＤ Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎなど）。これらの系は、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に依存する点において共通している。ｄＮＴＰの非存在下では、５’伸長が、３’末端の消化によって平滑末端又は突出から作製される。２つのＤＮＡ断片が反対の端においてそれらの末端に同じ〜２０から３０ｂｐの配列を含む場合は、アニーリングすることができる相補的配列を共有する突出をもたらす。これは、相同配列を含む２又は複数のＤＮＡ断片の、連結に非依存的な結合に利用することができる。
【０１１５】
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合は、これは、相同領域の配列に非依存的な態様で実施することができ（配列及び連結に非依存的なクローニング、すなわち、ＳＬＩＣ）、詳細なプロトコールは当業者には利用可能である。多タンパク質発現では、コードＤＮＡ群において、この方法は特有の制限部位の存在又は変異生成によるそれらの作製に非依存的であるため、これが特に有用である。
【０１１６】
本発明における使用のために、ＳＬＩＣ法は、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼによって増幅されたコードＤＮＡのＡＣＥＭＢＬアクセプター及びドナーベクターへの挿入に適合させた。このような方法で、発現カセットへの遺伝子の均一な挿入のみならず、多遺伝子構築物への発現カセットのコンカテマー化（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）も、容易に自動化可能な同一の単純なルーチンを適用することによって達成することができる。
【０１１７】
下記のプロトコール１は、上記のＬｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）に記載の方法に基づく改善した方法である。プロトコール１は、手作業用に設計されている。他の系を使用してもよく（例えば、ＢＤ−ＩｎＦｕｓｉｏｎなど）、その場合には、製造業者の推奨に従うべきである。このプロトコールは、ロボットによる応用にも採用されてよい。前記プロトコールの対応する修正はＤ節に概説している。
【０１１８】
プロトコール１：ＳＬＩＣによる単独遺伝子挿入
必要な試薬：
Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ
Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ用の５×ＨＦバッファー
ｄＮＴＰミックス（１０ｍＭ）
Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（及び１０×バッファー）
ＤｐｎＩ酵素
大腸菌コンピテント細胞
１００ｍＭ ＤＴＴ、２Ｍ尿素、５００ｍＭ ＥＤＴＡ
抗生物質
【０１１９】
工程１：プライマー設計
ＳＬＩＣ法のためのプライマーは、ｄＮＴＰの非存在下においてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して長い付着末端をもたらす相同領域を提供するように設計する。
【０１２０】
インサートのためのプライマーは、相同領域に対応するＤＮＡ配列（図３、差込図の「アダプター配列」）、続いて、増幅しようとするインサートに特異的にアニールする配列（図３、差込図）を含む。ＳＬＩＣのためのアダプター配列の有用な例は以下に記載する（表１）。
【０１２１】
例えば、興味のある遺伝子（ＧＯＩ）が、発現要素を既に含むベクター（例えば、ｐＥＴベクターシリーズ）から増幅される場合に、この「インサートに特異的な配列」はリボソーム結合部位（ｒｂｓ）の上流に位置する。そうでない場合は、フォワードプライマーは、リボソーム結合部位が最終的な構築物にも提供されるように設計される必要がある（図３、差込図）。
【０１２２】
ベクター骨格のＰＣＲ直線化のためのプライマーは、単純に、インサートの増幅に選択されるプライマー対に存在する２つのアダプター配列に相補的である（図３）。
【０１２３】
工程２：インサート及びベクターのＰＣＲ増幅
クローニングするＤＮＡインサート及びＰＣＲによって直線化するベクターについて、１００μｌの容量で同一の反応を準備する：
ｄｄＨ２Ｏ  ７５μｌ
５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ反応バッファー  ２０μｌ
ｄＮＴＰ（１００ｍＭストック）  ２μｌ
鋳型ＤＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）  １μｌ
５ ＳＬＩＣプライマー（１００μＭストック）  １μｌ
３ ＳＬＩＣプライマー（１００μＭストック）  １μｌ
Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（２Ｕ／μｌ）  ０．５μｌ
【０１２４】
次いで、ＰＣＲ反応を標準的なＰＣＲプログラムで実施する（非常に長いＤＮＡが増幅され、伸長時間が２倍である場合を除いて）：
１×９８℃  ２分間
３０×［９８℃  ２０秒間→５０℃  ３０秒間→７２℃  ３分間］
１０℃に維持。
寒天ゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色によるＰＣＲ反応の分析が推奨される。
【０１２５】
工程３：ＰＣＲ産物のＤｐｎＩ処理（場合によって）
次いで、親プラスミド（メチル化されている）を切断する１μｌのＤｐｎＩ酵素をＰＣＲ反応産物に添加する。インサートのＰＣＲ反応については、鋳型プラスミドの耐性マーカーがデスティネーションベクターと異なる場合に、ＤｐｎＩ処理が必要でない。
次いで、以下の反応を実施する：
インキュベーション：３７℃  １から４時間
不活化：８０℃  ２０分間
【０１２６】
工程４：ＰＣＲ産物の精製
ＰＣＲ産物から残存するｄＮＴＰを除去すべきである。そうしなければ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ反応（工程５）が妨げられる。生成物の精製が、好ましくは、市販のＰＣＲ精製キット又はＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎキット（例えば、Ｑｉａｇｅｎ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌなど）によって実施される。各製造業者によって示される最小限の取り得る容量で溶出を実施することが望ましい。
【０１２７】
工程５：Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼエキソヌクレアーゼ処理
インサート及びベクター（工程４で溶出したもの）について、同一の反応を２０μｌの容量で準備する：
１０×Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼバッファー  ２μｌ
１００ｍＭ ＤＴＴ  １μｌ
２Ｍ尿素  ２μｌ
工程３に由来するＤＮＡ溶出物（ベクター又はインサート）  １４μｌ
Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ  １μｌ
【０１２８】
次いで、以下の反応を実施する：
インキュベーション：２３℃  ２０分間
停止  １μｌの５００ｍＭ ＥＤＴＡの添加
不活化  ７５℃  ２０分間
【０１２９】
工程６：混合及びアニーリング
次いで、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼエキソヌクレアーゼ処理したインサート及びベクターを混合し、続いて、効率を高めるアニーリング工程を場合によって実施する：
Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌ処理したインサート  １０μｌ
Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌ処理したベクター  １０μｌ
アニーリング：６５℃  １０分間
冷却  ゆっくりと（ヒートブロックにおいて）ＲＴ（室温）まで
【０１３０】
工程７：形質転換
次いで、標準的な形質転換手順にしたがって、混合物でコンピテント細胞を形質転換する。
【０１３１】
ｐＡＣＥ及びｐＡＣＥ２誘導体についての反応産物でクローニング用の標準の大腸菌細胞（例えば、ＴＯＰ１０、ＤＨ５α、ＨＢ１０１）を形質転換し、回復（２から４時間）後にアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）又はテトラサイクリン（２５μｇ／ｍｌ）の各々を含む寒天に播種した。
【０１３２】
ドナー誘導体についての反応産物でｐｉｒ遺伝子を発現する大腸菌細胞（例えば、ＢＷ２３４７３、ＢＷ２３４７４、又はＰＩＲ１及びＰＩＲ２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を形質転換し、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ、ｐＤＣ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ、ｐＤＫ）、及びスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ、ｐＤＳ）を含む寒天に播種した。
【０１３３】
工程８：プラスミド分析
プラスミドは、対応する抗生物質を含むスモールスケールの培地で培養し、配列決定及び（場合によって）適当な制限酵素を用いた制限マッピングによって分析する。
【０１３４】
Ｃ１．２．ＳＬＩＣによるＭＩＥにおけるポリシストロン組み立て
本発明に係るマルチプルインテグレーションエレメントは、図４に示すマルチフラグメントＳＬＩＣ組換えを使用して、興味のある遺伝子を組み込むために使用することもできる。リボソーム結合部位（ｒｂｓ）に先行する遺伝子は、この方法でポリシストロンに組み立てることができる。
【０１３５】
詳細なプロトコールは下記のプロトコール２に概要を示している：
プロトコール２  ＳＬＩＣによるポリシストロン組み立て
必要な試薬：
Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ
Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ用の５×ＨＦバッファー
ｄＮＴＰミックス（１０ｍＭ）
Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（及び１０×バッファー）
大腸菌コンピテント細胞
１００ｍＭ ＤＴＴ、２Ｍ尿素、５００ｍＭ ＥＤＴＡ
抗生物質
【０１３６】
工程１：プライマー設計
本実施態様に係るＭＩＥ要素は、試験済みのプライマー配列からなる。これらは、単独遺伝子又は多遺伝子構築物の挿入に使用することができる「アダプター」配列を構成する。有用なアダプター配列の例は下記のものである（表１）。
【０１３７】
アダプター配列は、ＭＩＥに挿入するＤＮＡ断片を増幅するために使用されるプライマーの５’セグメントを形成する。インサートに特異的な配列は３’に付加し、リボソーム結合部位をコードするＤＮＡは、ＰＣＲ鋳型に未だ存在していない場合は、場合によって挿入することができる。
【０１３８】
工程２：インサート及びプライマーのＰＣＲ増幅
クローニングする全てのＤＮＡインサート（ＧＯＩ１、２、３）及びＰＣＲによって直線化するベクターについて、同一の反応を１００μｌの容量で準備する：
ｄｄＨ２Ｏ  ７５μｌ
５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ反応バッファー  ２０μｌ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭストック）  ２μｌ
鋳型ＤＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）  １μｌ
５’ＳＬＩＣプライマー（１００μＭストック）  １μｌ
３’ＳＬＩＣプライマー（１００μＭストック）  １μｌ
Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（２Ｕ／μｌ）  ０．５μｌ
【０１３９】
次いで、標準的なＰＣＲプログラムでＰＣＲ反応を実施する（非常に長いＤＮＡが増幅され、伸長時間が２倍である場合を除いて）：
１×９８℃  ２分間
３０×［９８℃  ２０秒間→５０℃  ３０秒間→７２℃  ３分間］
１０℃に維持。
【０１４０】
寒天ゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色によるＰＣＲ反応の分析が推奨される。
【０１４１】
工程３：ＰＣＲ産物のＤｐｎＩ処理（場合によって）
次いで、親プラスミド（メチル化されている）を切断する１μｌのＤｐｎＩをＰＣＲ反応産物に添加する。インサートのＰＣＲ反応については、鋳型プラスミドの耐性マーカーがデスティネーションベクターと異なる場合に、ＤｐｎＩ処理が必要でない。
【０１４２】
次いで、以下の反応を実施する：
インキュベーション：３７℃  １から４時間
不活化：８０℃  ２０分間
【０１４３】
工程４：ＰＣＲ産物の精製
ＰＣＲ産物から残存するｄＮＴＰを除去すべきである。そうしなければ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ反応（工程５）が妨げられる。
【０１４４】
生成物の精製が、好ましくは、市販のＰＣＲ精製キット又はＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎキット（例えば、Ｑｉａｇｅｎ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌなど）によって実施される。各製造業者によって示される最小限の取り得る容量で溶出を実施することが望ましい。
【０１４５】
工程５：Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼエキソヌクレアーゼ処理
各インサート（ＧＯＩ１、２、３）及びベクター（工程４で溶出したもの）について、同一の反応を２０μｌの容量で準備する：
１０×Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼバッファー  ２μｌ
１００ｍＭ ＤＴＴ  １μｌ
２Ｍ尿素  ２μｌ
工程３に由来するＤＮＡ溶出物（ベクター又はインサート）  １４μｌ
Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ  １μｌ
【０１４６】
次いで、以下の反応を実施する：
インキュベーション：２３℃  ２０分間
停止：  １μｌの５００ｍＭ ＥＤＴＡの添加
不活化：  ７５℃  ２０分間
【０１４７】
工程６：混合及びアニーリング
次いで、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼエキソヌクレアーゼ処理したインサート及びベクターを混合し、続いて、効率を高めるアニーリング工程を場合によって実施する：
【０１４８】
Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌ処理したインサート（ＧＯＩ１）  ５μｌ
Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌ処理したインサート（ＧＯＩ２）  ５μｌ
Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌ処理したインサート（ＧＯＩ３）  ５μｌ
Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌ処理したベクター  ５μｌ
アニーリング：６５℃  １０分間
冷却  ゆっくりと（ヒートブロックにおいて）ＲＴまで
【０１４９】
工程７：形質転換
次いで、標準的な形質転換手順にしたがって、混合物でコンピテント細胞を形質転換する。
【０１５０】
ｐＡＣＥ及びｐＡＣＥ２誘導体についての反応産物でクローニング用の標準の大腸菌細胞（例えば、ＴＯＰ１０、ＤＨ５α、ＨＢ１０１）を形質転換し、回復後にアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）又はテトラサイクリン（２５μｇ／ｍｌ）の各々を含む寒天に播種する。
【０１５１】
ドナー誘導体についての反応産物でｐｉｒ遺伝子を発現する大腸菌細胞（例えば、ＢＷ２３４７３、ＢＷ２３４７４、又はＰＩＲ１及びＰＩＲ２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を形質転換し、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ、ｐＤＣ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ、ｐＤＫ）、及びスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ、ｐＤＳ）を含む寒天に播種した。
【０１５２】
工程８：プラスミド分析
プラスミドを培養し、特定の制限消化及びインサートのＤＮＡ配列決定に基づいて、正しいクローンを選択する。
【０１５３】
【表１Ａ】
2012519476.tif 000002
【表１Ｂ】
2012519476.tif 000003
【表１Ｃ】
2012519476.tif 000004
【０１５４】
・全てのアダプタープライマー（伸長部除く）は、本実施態様に係るＭＩＥに挿入した興味ある遺伝子の配列決定用プライマーとして使用することができる。
【０１５５】
Ｃ．１．３．制限／連結による遺伝子挿入
本発明のＭＩＥは、一連の特有の制限部位を有するマルチプルクローニング部位として使用することもできる。好ましくは、原核生物宿主におけるタンパク質発現のための本明細書に記載のＭＩＥが、プロモーター及びリボソーム結合部位の後に続き、ターミネーターよりも前にある。昆虫細胞におけるタンパク質発現のための本明細書に記載の好ましい実施態様のＭＩＥは、上述のｐｏｌｈ発現カセット又はｐ１０発現カセットを含む。したがって、従来の制限／連結によるＭＩＥへのクローニングは、機能的な発現カセットももたらす。
【０１５６】
興味のある遺伝子（ＧＯＩ）は、標準のクローニング手順を使用することによって、ＡＣＥＭＢＬベクターのマルチプルインテグレーションエレメント（ＭＩＥ）にサブクローニングすることができる（例えば、図１３を参照のこと）。
【０１５７】
プロトコール３．ＭＩＥへの制限／連結クローニング
必要な試薬：
Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ
Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ用の５×ＨＦバッファー
ｄＮＴＰミックス（１０ｍＭ）
１０ｍＭ  ＢＳＡ
制限エンドヌクレアーゼ（及び１０×バッファー）
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（及び１０×バッファー）
ウシ又はエビの腸アルカリホスファターゼ
大腸菌コンピテント細胞
抗生物質
【０１５８】
工程１：プライマー設計
従来のクローニングのために、効率的な切断のための適当な突出（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログを参照のこと）の後ろ、かつ、挿入しようとする興味のある遺伝子との２０ヌクレオチド以上のオーバーラップの前に、好ましい制限部位を含むＰＣＲプライマーが設計される。
【０１５９】
細菌における発現のためのＡＣＥＭＢＬシステムの場合には、本実施態様のＭＩＥは、全てのＡＣＥＭＢＬベクターについて同一である。それらは、ＮｄｅＩ部位の前にリボソーム結合部位を含む。したがって、単独遺伝子挿入については、ｒｂｓがプライマーに含まれる必要がない。
【０１６０】
多遺伝子挿入が（例えば、ＭＩＥの挿入部位Ｉ１−Ｉ４において）必要な場合は、遺伝子の前のｒｂｓ及び３’末端の終止コドンが提供されるように、プライマーを設計すべきである。
【０１６１】
特に制限／連結によるポリシトロンクローニングについては、カスタム遺伝子合成によって鋳型を構築することが望ましい。その方法では、ＭＩＥに存在する制限部位を、コードＤＮＡから除くことができる。
【０１６２】
工程２：インサート調製
インサートのＰＣＲ：
ＭＩＥに挿入する興味のある遺伝子について、同一のＰＣＲ反応を１００μｌの容量で準備する：
ｄｄＨ２Ｏ  ７５μｌ
５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ制限バッファー  ２０μｌ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭストック）  ２μｌ
鋳型ＤＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）  １μｌ
５プライマー（１００μＭストック）  １μｌ
３プライマー（１００μＭストック）  １μｌ
Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（２Ｕ／μｌ）０．５μｌ
【０１６３】
次いで、標準的なＰＣＲプログラムでＰＣＲ反応を実施する（非常に長いＤＮＡが増幅され、伸長時間が２倍である場合を除いて）：
１×９８℃  ２分間
３０×［９８℃  ２０秒間→５０℃  ３０秒間→７２℃  ３分間］
１０℃に維持。
【０１６４】
寒天ゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色によるＰＣＲ反応の分析が推奨される。
【０１６５】
生成物の精製が、好ましくは、市販のＰＣＲ精製キット又はＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎキット（例えば、Ｑｉａｇｅｎ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌなど）によって実施される。各製造業者によって示される最小限の取り得る容量で溶出を実施することが望ましい。
【０１６６】
インサートの制限消化：
製造業者の推奨（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログなどを参照のこと）によって特定される特定の制限酵素を使用して、４０μｌの反応容量において、制限反応を実施する。
【０１６７】
ＰＣＲキット溶出液（≧１μｇ）  ３０μｌ
１０×制限酵素バッファー  ４μｌ
１０ｍＭ ＢＳＡ  ２μｌ
５’のための制限酵素  ２μｌ
３’のための制限酵素  ２μｌ（二重消化の場合、そうでなければｄｄＨ２Ｏ）
【０１６８】
制限消化は、双方の酵素を使用して１回の反応で実施するか（二重消化）、代替的には、必要なバッファー条件が適合しない場合には連続的に実施する（２回の単独消化）。
【０１６９】
インサートのゲル抽出
加工したインサートは、次いで、市販のキットを使用して寒天ゲル抽出によって精製する（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌなど）。各製造業者によって規定される最小限の容量で抽出ＤＮＡを溶出することが望ましい。
【０１７０】
工程３：ベクター調製
ＡＣＥＭＢＬプラスミドの制限消化：
製造業者の推奨（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログなどを参照のこと）によって特定される特定の制限酵素を使用して、４０μｌの反応容量において、制限反応を実施する。
【０１７１】
ｄｄＨ２Ｏ中のＡＣＥＭＢＬプラスミド（≧０．５μｇ）  ３０μｌ
１０×制限酵素バッファー  ４μｌ
１０ｍＭ ＢＳＡ  ２μｌ
５’のための制限酵素  ２μｌ
３’のための制限酵素  ２μｌ（二重消化の場合、そうでなければｄｄＨ２Ｏ）
【０１７２】
制限消化は、双方の酵素を使用して１回の反応で実施するか（二重消化）、代替的には、必要なバッファー条件が適合しない場合には連続的に実施する（２回の単独消化）。
【０１７３】
ベクターのゲル抽出
加工したベクターは、次いで、市販のキットを使用して寒天ゲル抽出によって精製する（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌなど）。各製造業者によって規定される最小限の容量で抽出ＤＮＡを溶出することが望ましい。
【０１７４】
工程４：連結
連結反応は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの供給業者の推奨にしたがって２０μｌの反応容量で実施する：
ＡＣＥＭＢＬプラスミド（ゲル抽出）  ８μｌ
インサート（ゲル抽出）  １０μｌ
１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー  ２μｌ
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ  ０．５μｌ
【０１７５】
連結反応は、２５℃（付着末端）で１時間又は１６℃（平滑末端）で一晩にわたって実施する。
【０１７６】
工程５：形質転換
次いで、標準の形質転換の手順にしたがって、混合物でコンピテント細胞を形質転換した。
【０１７７】
アクセプター誘導体についての反応産物でクローニング用の標準の大腸菌細胞（例えば、ＴＯＰ１０、ＤＨ５α、ＨＢ１０１）を形質転換し、回復後にアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）又はテトラサイクリン（２５μｇ／ｍｌ）の各々を含む寒天に播種した。
ドナー誘導体についての反応産物でｐｉｒ遺伝子を発現する大腸菌細胞（例えば、ＢＷ２３４７３、ＢＷ２３４７４、又はＰＩＲ１及びＰＩＲ２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を形質転換し、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ、ｐＤＣ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ、ｐＤＫ）、及びスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ、ｐＤＳ）を含む寒天に播種した。
【０１７８】
工程６：プラスミド分析
プラスミドを培養し、特定の制限消化及びインサートのＤＮＡ配列決定に基づいて正しいクローンを選択する。
【０１７９】
Ｃ．１．４．ＨＥ及びＢｓｔＸＩ部位を使用することによる複数化
本発明に係るＡＣＥＭＢＬシステムは、マルチプルインテグレーションエレメント（ＭＩＥ）を包囲する、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）部位及び設計ＢｓｔＸＩ部位を含む。ホーミングエンドヌクレアーゼ部位を使用して、単独遺伝子又はポリシストロンを含む発現カセット全体を、１つ又は複数の興味のある遺伝子を既に含むベクターに挿入することができる。ホーミングエンドヌクレアーゼは、長い認識部位（１２から４０塩基対以上、好ましくは２０から３０塩基対）を有する。全て等しいストリンジェントであるわけではないが、ホーミングエンドヌクレアーゼ部位は、より大きなプラスミド、又は、事実、ゲノム全体に対して特有である可能性が非常に高い。
【０１８０】
本実施態様のＡＣＥＭＢＬシステムでは、ドナーベクターは、ホーミングエンドヌクレアーゼＰＩ−ＳｃｅＩの認識部位を含む（図２）。このＨＥ部位は、切断によって、−ＣＴＧＣ配列を有する３’突出を生じる。アクセプターベクターは、切断によって−ＣＴＡＡの３’突出をもたらす、ホーミングエンドヌクレアーゼ部位Ｉ−ＣｅｕＩを含む。アクセプター及びドナー上において、各ＨＥ部位は、ＭＩＥの前にある。ＭＩＥの３’末端は、適合する突出を切断によりもたらす、特別に設計されたＢｓｔＸＩ部位を含む。これは、ＢｓｔＸＩの切断特異性に基づく。ＢｓｔＸＩの認識配列は、ＣＣＡＮＮＮＮＮ’ＮＴＧＧ（配列番号４２）と規定される（アポストロフィーは、ホスホジエステル結合の切断位置を示す）。Ｎで示した残基は自由に選択され得る。かくして、ドナーベクターは、配列ＣＣＡＴＧＴＧＣ’ＣＴＧＧ（配列番号４３）のＢｓｔＸＩ認識部位を含み、アクセプターベクターは、ＣＣＡＴＣＴＡＡ’ＴＴＧＧ（配列番号４４）を含む。各ケースにおいてＢｓｔＸＩ切断によって生じる突出は、ＨＥ切断によって生じる突出と適合するであろう。アクセプター及びドナーは異なるＨＥ部位を有することに留意すべきである。
【０１８１】
認識部位は対称ではない。したがって、ＨＥ／ＢｓｔＸＩ消化断片のＡＣＥＭＢＬベクターのＨＥ部位への連結は、（１）方向性であり、かつ、（２）ＨＥの半分の部位がＢｓｔＸＩの半分の部位に結合しているハイブリッドＤＮＡ配列をもたらすであろう。この部位は、ＨＥ及びＢｓｔＸＩで切断されない。したがって、ＨＥで消化した構築物における、１又は複数の遺伝子を有する発現カセットを含むＨＥ／ＢｓｔＸＩ消化したＤＮＡ断片の連結による挿入は、前を完全なＨＥ部位で、かつ、後をＢｓｔＸＩ部位で包囲された、全ての異種性の興味のある遺伝子を含む構築物をもたらすであろう。したがって、ＨＥ／ＢｓｔＸＩ消化及び連結によって発現カセット全体をＨＥ部位に組み込む方法は、反復して実施することができる。
【０１８２】
プロトコール４．ホーミングエンドヌクレアーゼ／ＢｓｔＸＩを使用することによる複数化
必要な試薬：
ホーミングエンドヌクレアーゼＰＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ
ホーミングエンドヌクレアーゼ用の１０×バッファー
制限酵素ＢｓｔＸＩ（及び１０×バッファー）
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（及び１０×バッファー）
大腸菌コンピテント細胞
抗生物質
【０１８３】
工程２：インサート調製
製造業者（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓなど）の推奨どおりにホーミングエンドヌクレアーゼＰＩ−ＳｃｅＩ（ドナー）又はＩ−ＣｅｕＩ（アクセプター）を使用して、４０μｌの反応容量で制限反応を実施する。
【０１８４】
ｄｄＨ２Ｏ中のＡＣＥＭＢＬプラスミド（≧０．５μｇ）  ３２μｌ
１０×制限酵素バッファー  ４μｌ
１０ｍＭ ＢＳＡ  ２μｌ
ＰＩ−ＳｃｅＩ（ドナー）又はＩ−ＣｅｕＩ（アクセプター）  ２μｌ
【０１８５】
次いで、ＰＣＲ抽出キット又は酸性エタノール沈殿によって反応物を精製し、製造業者の推奨にしたがってＢｓｔＸＩで消化する。
【０１８６】
ｄｄＨ２Ｏ中のＨＥ消化ＤＮＡ  ３２μｌ
１０×制限酵素バッファー  ４μｌ
１０ｍＭ ＢＳＡ  ２μｌ
ＢｓｔＸＩ  ２μｌ
【０１８７】
インサートのゲル抽出：
加工したインサートは、次いで、市販のキットを使用して寒天ゲル抽出によって精製する（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌなど）。各製造業者によって規定される最小限の容量で抽出ＤＮＡを溶出することが望ましい。
【０１８８】
工程３：ベクター調製
製造業者（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓなど）の推奨どおりにホーミングエンドヌクレアーゼＰＩ−ＳｃｅＩ（ドナー）又はＩ−ＣｅｕＩ（アクセプター）を使用して、４０μｌの反応容量で制限反応を実施する。
【０１８９】
ｄｄＨ２Ｏ中のＡＣＥＭＢＬプラスミド（≧０．５μｇ）  ３３μｌ
１０×制限酵素バッファー  ４μｌ
１０ｍＭ ＢＳＡ  ２μｌ
ＰＩ−ＳｃｅＩ（ドナー）又はＩ−ＣｅｕＩ（アクセプター）  ２μｌ
【０１９０】
次いで、ＰＣＲ抽出キット又は酸性エタノール沈殿によって反応物を精製し、各製造業者の推奨にしたがって腸アルカリホスファターゼで処理する。
【０１９１】
ｄｄＨ２Ｏ中のＨＥ消化ＤＮＡ  １７μｌ
１０×アルカリホスファターゼバッファー  ２μｌ
アルカリホスファターゼ  １μｌ
【０１９２】
ベクターのゲル抽出：
加工したベクターは、次いで、市販のキットを使用して寒天ゲル抽出によって精製する（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌなど）。各製造業者によって規定される最小限の容量で抽出ＤＮＡを溶出することが望ましい。
【０１９３】
工程４：連結
連結反応は２０μｌの反応容量で実施する：
ＨＥ／ホスファターゼ処理したベクター（ゲル抽出）  ４μｌ
ＨＥ／ＢｓｔＸＩ処理したインサート（ゲル抽出）  １４μｌ
１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー  ２μｌ
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ  ０．５μｌ
【０１９４】
連結反応は、２５℃で１時間又は１６℃で一晩にわたって実施する。
【０１９５】
工程５：形質転換
次いで、標準的な形質転換の手順にしたがって、混合物でコンピテント細胞を形質転換する。
【０１９６】
アクセプター誘導体についての反応産物でクローニング用の標準の大腸菌細胞（例えば、ＴＯＰ１０、ＤＨ５α、ＨＢ１０１）を形質転換し、回復後にアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）又はテトラサイクリン（２５μｇ／ｍｌ）の各々を含む寒天に播種した。
【０１９７】
ドナー誘導体についての反応産物でｐｉｒ遺伝子を発現する大腸菌細胞（例えば、ＢＷ２３４７３、ＢＷ２３４７４、又はＰＩＲ１及びＰＩＲ２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を形質転換し、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ、ｐＤＣ、ｐＩＤＣ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ、ｐＤＫ、ｐＩＤＫ）、及びスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ、ｐＤＳ、ｐＩＤＳ）を含む寒天に播種した。
【０１９８】
工程６：プラスミド分析
プラスミドを培養し、特定の制限消化及びインサートのＤＮＡ配列決定に基づいて正しいクローンを選択する。
【０１９９】
Ｃ．２．アクセプター及びドナーのＣｒｅ−ＬｏｘＰ反応
Ｃｒｅリコンビナーゼは、インテグラーゼファミリーのメンバーである（バクテリオファージＰ１由来のタイプＩトポイソメラーゼ）。Ｃｒｅリコンビナーゼは、３４ｂｐのｌｏｘＰ部位（配列番号１９；図５を参照のこと）を付属タンパク質及び補助ＤＮＡ配列なしで組換える。ｌｏｐＰ部位は、切断及び連結反応が生じる８ｂｐの中央領域に隣接する反転反復として、２つの１３ｂｐリコンビナーゼ結合要素を含んでなる。
【０２００】
Ｃｒｅリコンビナーゼに媒介される部位特異的組換えは、ホリデイジャンクション（ＨＪ）の形成を伴う。Ｃｒｅリコンビナーゼによって触媒される組換えは、ＬｏｘＰ部位の位置及び相対配向に基づく。単独のＬｏｘＰ部位を含む、２つのＤＮＡ分子、例えば、アクセプター及びドナープラスミドは、融合される。さらに、Ｃｒｅ組換えは、１５から２０％の組換え効率の平衡反応である。これは、多タンパク質複合体発現のための多遺伝子の組合せのための有用な選択肢をもたらす。
【０２０１】
複数のＤＮＡ分子、例えば、ドナー及びアクセプターがＣｒｅリコンビナーゼとインキュベートされる反応では、酵素の融合／切除活性が、シングルベクター（遊離体ベクター）及び全ての可能な融合体が共存する平衡状態をもたらすであろう。ドナーベクターは、アクセプターベクターと同様に、アクセプター及び／又はドナーと使用することができる。２を超えるベクターが融合している高次の融合体も産生される。これは図６に図示している。
【０２０２】
この例のドナーが、ｐｉｒ＋（ｐｉｒ陽性）の背景に依存する条件複製起点を含むという事実は、全ての所望のアクセプター−ドナーの組合せを反応混合物から選択することを可能にする。このために、反応混合物を使用して、ｐｉｒ陰性株（ＴＯＰ１０、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、又は他の一般的な実験クローニング株）を形質転換する。次いで、ドナーベクターは、アクセプターと融合していなければ、ドナーがコードする耐性マーカーに対応する抗生物質を含む寒天上に播種する際に、自殺ベクターとして働くであろう。適当な組合せの抗生物質を含む寒天を使用することによって、全ての所望のアクセプター−ドナー融合体を選択することができる。
【０２０３】
この方法では、２５ｋｂ又はそれよりも大きい融合ベクターが産生され得る。安定性試験（６０世代超の連続的な継代）では、そのような大きなプラスミドであっても、コードされる耐性マーカーに対応する抗生物質の１つのみが増殖培地に与えられている場合ですら、制限マッピングによって確認されるとおり、安定である。
【０２０４】
Ｃ．２．１．アクセプター及びドナーのＣｒｅ−ＬｏｘＰ融合
下記のプロトコールは、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ反応によってドナー及びアクセプターから多遺伝子融合体を産生するために設計されている。
【０２０５】
試薬：
Ｃｒｅリコンビナーゼ
標準的な大腸菌コンピテント細胞（ｐｉｒ−株）
抗生物質
９６ウェルマイクロタイタープレート
寒天／抗生物質を含む、１２ウェル組織培養プレート（又はペトリ皿）
ＬＢ培地
【０２０６】
１．  ２０μｌのＣｒｅ反応については、１から２μｇの各遊離体をおおよそ同量で混合する（５’ＤＮＡ末端）。ｄｄＨ２Ｏを添加して、全体の容量を１６から１７μｌに調節し、次いで、２μｌの１０×Ｃｒｅバッファー及び１から２μｌのＣｒｅリコンビナーゼを添加する。
【０２０７】
２．  Ｃｒｅ反応物を３７℃（又は３０℃）で１時間にわたってインキュベートする。
【０２０８】
３．  場合によって、２から５μｌのＣｒｅ反応物を分析のための寒天ゲルに試験のために載せる。７０℃で１０分間にわたって熱不活化した後にゲルに載せることが、非常に望ましい。
【０２０９】
４．  化学的形質転換については、１０から１５μｌのＣｒｅ反応物を２００μｌの化学的コンピテント細胞と混合する。混合物を氷上で１５から３０分間にわたってインキュベートする。次いで、４２度で４５から６０秒間にわたって熱ショックを実施する。
２０μｌまでのＣｒｅ反応物（化学的コンピテント細胞懸濁物の０．１倍容量）で、２００μｌの化学的コンピテント細胞を直接的に形質転換することができる。
【０２１０】
電気的形質転換については、２μｌまでのＣｒｅ反応物を１００μｌの電気的コンピテント細胞と直接混合し、１．８から２．０ｋＶでエレクトロポレーター（例えば、ＢＩＯＲＡＤ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｕｌｓｅｒ）を使用することによって形質転換できるであろう。
より大量のＣｒｅ反応物は、電気的形質転換の前に、エタノール沈殿又はＰＣＲ精製カラムによって脱塩するべきである。脱塩したＣｒｅ反応混合物は、好ましくは、電気的コンピテント細胞懸濁物の０．１倍容量を超えない。
【０２１１】
細胞／ＤＮＡ混合物は、氷上で長期間にわたってインキュベートすることなく、電気的形質転換に直ぐに使用することができるであろう。
【０２１２】
５．  形質転換（熱ショック又はエレクトロポレーション）のすぐ後に、４００μｌまでのＬＢ培地（又はＳＯＣ培地）を１００μｌの細胞／ＤＮＡ懸濁物ごとに添加する。
【０２１３】
６．  ３７℃の振盪インキュベーターで一晩又は少なくとも４時間にわたって懸濁物をインキュベートする。
【０２１４】
２を超える耐性マーカーを含む多重融合プラスミドを回収するためには、懸濁物を３７℃で１晩にわたってインキュベートすることが非常に望ましい。
【０２１５】
７．  所望の組合せの抗生物質を含む寒天上に回収した細胞懸濁物を播種する。３７℃で一晩にわたってインキュベートする。
【０２１６】
８．  一晩のインキュベートの後に現れたコロニーを、上記の工程１２から１６を参照することによって、この工程で制限消化によって直接検証してよく、特に、１つの多重融合プラスミドのみが望ましい場合に検証してよい。
【０２１７】
９６ウェルマイクロタイタープレート上における単独の抗生物質曝露によるさらなる選択については、工程９に続く。
【０２１８】
複数の様々な多重融合プラスミドが、１つの９６ウェルマイクロタイタープレート上で同時に処理され、かつ、選択され得る。
【０２１９】
９．  ９６ウェル抗生物質試験については、各抗生物質寒天プレート由来の４つのコロニーを〜５００μｌの抗生物質を含まないＬＢ培地に播種する。３７℃の振盪インキュベーターで１から２時間にわたって細胞培養物をインキュベートする。
【０２２０】
１０．  コロニーのインキュベートの間に、９６ウェルマイクロタイタープレートを各ウェルにおいて１５０μｌの抗生物質含有ＬＢ培地又は色鮮やかな色素（位置マーカー）で満たす。
【０２２１】
多重融合プラスミドを同時に選択するために使用する、溶液の典型的な配置は、図７に示す。本発明の当該態様の基礎となる原理は、単独コロニー由来の全ての細胞懸濁物は、４つの単独の抗生物質の全てに曝露される必要があるということである。
【０２２２】
１１．  前培養した細胞培養物の１μｌのアリコートを対応するウェルに添加する。次いで、播種された９６ウェルマイクロタイタープレートを３７℃の振盪インキュベーターで一晩にわたって１８０から２００ｒｐｍでインキュベートする。
プレートを覆うためにパラフィルムを使用することが望ましい。
残りの前培養した細胞培養物は、さらなる播種のために４℃の冷蔵庫で保存することができるであろう。
【０２２３】
１２．  各コロニーに由来する高密度で澄んだ細胞培養物の組合せによって、所望の多重融合プラスミドを含む形質転換体を選択する。対応する抗生物質を含む１０ｍｌのＬＢ培地に１０から２０μｌの細胞培養物を播種する。３７℃の振盪インキュベーターで一晩にわたってインキュベートする。
【０２２４】
１３．  一晩インキュベートした細胞培養物を４０００ｇで５から１０分にわたって遠心分離する。製造業者の情報にしたがってプラスミドミニプレップキットで細胞ペレットを精製する。
【０２２５】
１４．  ＵＶ吸収を使用して精製したプラスミド溶液の濃度を測定する（例えば、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）１０００）。
【０２２６】
１５．  ０．５から１μｇの精製したプラスミド溶液を２０μｌの制限消化で消化する（５から１０単位のエンドヌクレアーゼを使用する）。推奨される反応条件下で〜２時間にわたってインキュベートする。
【０２２７】
１６．  分析のための寒天ゲル（０．８から１．２％）電気泳動のために５から１０μｌの消化物を使用する。実際の制限パターンをコンピュータで（例えば、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩを使用して）予測される制限パターンと比較することによってプラスミドの完全性を検証する。
【０２２８】
Ｃ．２．２．Ｃｒｅによる融合ベクターの解体
以下のプロトコールは、ＡＣＥＭＢＬシステムキット（本実施態様の下記Ｅ節を参照のこと）の一部を好ましくは形成する、四重融合したｐＡＣＫＳプラスミド（ｐＡＣＥ−ｐＤＣ−ｐＤＫ−ｐＤＳ）を解体することによって、例えば、４つの単独ＡＣＥＭＢＬベクター（ｐＡＣＥ、ｐＤＣ、ｐＤＫ、ｐＤＳ）の回収のために使用することができる。同様に、前記プロトコールは、多重融合構築物に由来する単独遊離体の放出に適する。これは、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ反応、形質転換、及び適当に低減した抗生物質レベルの寒天への播種によって達成される（図６）。遊離体については、コード遺伝子を修飾及び多様化させることができる。次いで、多様化させた構築物は、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ反応によって再供給される。
【０２２９】
試薬：
Ｃｒｅリコンビナーゼ（及び１０×バッファー）
大腸菌コンピテント細胞（ｐｉｒ＋株、ｐｉｒ−株は部分的に解体されたアクセプター−ドナー誘導体が望ましい場合にのみ使用される）
抗生物質
【０２３０】
１．  ２０μｌのＤｅ−Ｃｒｅ反応については、〜１μｇの多重融合プラスミドを２μｌの１０×Ｃｒｅバッファー、１から２μｌのＣｒｅリコンビナーゼ、及び全反応容量を２０μｌに調節するｄｄＨ２Ｏとともにインキュベートする。
【０２３１】
２．  Ｄｅ−Ｃｒｅ反応物を３０℃で１から４時間にわたってインキュベートする。
【０２３２】
３．  場合によって、２から５μｌのＤｅ−Ｃｒｅ反応物を分析のための寒天ゲルに試験のために載せる。
【０２３３】
７０℃で１０分間にわたる熱不活化の後に、ゲルに載せることが望ましい。
【０２３４】
４．  化学的形質転換については、１０から１５μｌのＤｅ−Ｃｒｅ反応物を２００μｌの化学的コンピテント細胞と混合する。混合物を氷上で１５から３０分間にわたってインキュベートする。次いで、４２℃で４５から６０秒間にわたる熱ショックを実施する。
【０２３５】
２０μｌまでのＤｅ−Ｃｒｅ反応物（化学的コンピテント細胞懸濁物の０．１倍容量）で、２００μｌの化学的コンピテント細胞を直接的に形質転換することができる。
【０２３６】
電気的形質転換については、２μｌまでのＤｅ−Ｃｒｅ反応物を１００μｌの電気的コンピテント細胞と直接混合し、１．８から２．０ｋＶのエレクトロポレーター（例えば、ＢＩＯＲＡＤ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｕｌｓｅｒ）を使用することによって形質転換することができるであろう。
【０２３７】
より大量のＤｅ−Ｃｒｅ反応物は、電気的形質転換の前に、エタノール沈殿又はＰＣＲ精製カラムによって脱塩するべきである。脱塩したＤｅ−Ｃｒｅ反応混合物は、好ましくは、電気的コンピテント細胞懸濁物の０．１倍容量を超えない。
【０２３８】
細胞／ＤＮＡ混合物は、長期の氷上におけるインキュベートなしで、電気的形質転換にすぐに使用することができるであろう。
【０２３９】
５．  形質転換（熱ショック又はエレクトロポレーション）の直後に、４００μｌまでのＬＢ培地（又はＳＯＣ培地）を１００μｌの細胞／ＤＮＡ懸濁物ごとに添加する。
【０２４０】
６．  ３７℃の振盪インキュベーターで懸濁物をインキュベートする。
【０２４１】
部分的に解体した二重／三重融合体の回収については、３７℃の振盪インキュベーターで一晩又は少なくとも４時間にわたって懸濁物をインキュベートする。
【０２４２】
ｐＡＣＫＳプラスミドからの単独ＡＣＥＭＢＬベクターなどの個々の遊離体の回収については、３７℃のインキュベーターで１から２時間にわたって懸濁物をインキュベートする。
【０２４３】
７．  所望の組合せの抗生物質を含む寒天に回収した細胞懸濁物を播種する。３７℃で一晩にわたってインキュベートする。
【０２４４】
８．  一晩のインキュベートの後のコロニーは、工程１２から１６を参照することによって、この工程で制限消化によって直接検証することができる。
【０２４５】
これは、１つの単独遊離体又は部分的に解体された多重融合プラスミドのみが望ましい場合に、特に推奨される。
【０２４６】
９６ウェルマイクロタイタープレート上における単独抗生物質曝露によるさらなる選択については、工程９に続く。
【０２４７】
複数の様々な単独遊離体／部分的に解体された多重融合プラスミドが、１つの９６ウェルマイクロタイタープレート上で同時に処理及び選択され得る。
【０２４８】
９．  ９６ウェル抗生物質試験については、抗生物質を含まない〜５００μｌ ＬＢ培地に、各抗生物質寒天プレート由来の４つのコロニーを播種する。３７℃の振盪インキュベーターで１から２時間にわたって細胞培養物をインキュベートする。
【０２４９】
１０．  コロニーのインキュベートの間に、９６ウェルマイクロタイタープレートを１５０μｌの抗生物質含有ＬＢ培地又は色鮮やかな色素（位置マーカー）で対応するウェルにおいて満たす。
【０２５０】
図７を参照すると、４つの様々な単独遊離体／部分的に解体された多重融合プラスミドの同時選択のために使用される、溶液の類似の配置を提供することができる。本発明の当該態様の基礎となる原理は、単独コロニーに由来する全ての細胞懸濁物が、４つの抗生物質全てに別々に曝露されるべきであるということである。
【０２５１】
１１．  前培養した細胞培養物の１μｌのアリコートを対応するウェルに添加する。次いで、播種した９６ウェルマイクロタイタープレートを３７℃の振盪インキュベーターで一晩にわたって１８０から２００ｒｐｍでインキュベートする。
【０２５２】
プレートを覆うためにパラフィルムを使用することが望ましい。
残った前培養した細胞培養物は、さらなる播種のために４℃の冷蔵庫で保存することができるであろう。
【０２５３】
１２．  各コロニー由来の高密度で澄んでいる細胞培養物の組合せによって、所望の単独遊離体／部分的に解体された多重融合プラスミドを含む形質転換体を選択する。対応する抗生物質を含む１０ｍｌのＬＢ培地に、１０から２０μｌの細胞培養物を播種する。３７℃の振盪インキュベーターで一晩にわたってインキュベートする。
【０２５４】
１３．  一晩インキュベートした細胞培養物を４０００ｇで５から１０分間にわたって遠心分離する。製造業者の情報にしたがって、プラスミドミニプレップキットを使用して細胞ペレットを精製する。
【０２５５】
１４．  ＵＶ吸収を使用することによって、精製したプラスミド溶液の濃度を測定する（例えば、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）１０００）。
【０２５６】
１５．  ０．５から１μｇの精製したプラスミド溶液を２０μｌの制限消化で消化する（５から１０単位のエンドヌクレアーゼを使用する）。望ましい反応条件下において、〜２時間にわたってインキュベートする。
【０２５７】
１６．  分析のための寒天ゲル（０．８から１．２％）電気泳動のために５から１０μｌの消化物を使用する。実際の制限パターンをコンピュータで（例えば、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩを使用して）予測される制限パターンと比較することによって、プラスミドの完全性を検証する。
【０２５８】
１７．  場合によって、４つの単独ＡＣＥＭＢＬベクター全てをｐＡＣＫＳプラスミドから回収する間に、１又は複数の単独ＡＣＥＭＢＬベクターが１つのＤｅ−Ｃｒｅ反応から遊離できなかった場合に、ただ、所望の単独ＡＣＥＭＢＬベクターを含む部分的に解体された二重／三重融合体を選択し、第二のＤｅ−Ｃｒｅ反応を実施する（工程１から８を繰り返す）ことができる。
【０２５９】
典型的には、２までの連続的なＤｅ−Ｃｒｅ反応が、４つの単独ＡＣＥＭＢＬベクター全てをｐＡＣＫＳプラスミドから回収するのに十分であり、二重／三重融合体からの単独遊離体の遊離は、ｐＡＣＫＳプラスミド（四重融合体）からよりも効率的であろう。同じ原理が、本発明に係るＡＣＥＭＢＬシステムに基づく任意の他の多重融合プラスミドの解体にもあてはまる。
【０２６０】
Ｃ．３．共形質転換による細菌における共発現
タンパク質複合体は、発現株に共形質転換した２つの別個のベクターからも発現させることができる。共形質転換したベクターは、同じ又は異なる複製起点を有し得るが、それらは異なる耐性マーカーをコードする必要がある。プラスミドｐＡＣＥ（アンピシリン耐性マーカー）及びｐＡＣＥ２（テトラサイクリン耐性マーカー）は、ＣｏｌＥ１由来レプリコンを有し、そのため、全ての共通の発現株で使用することができる。ｐＡＣＥ及びｐＡＣＥ２誘導体（必要な場合には、融合したドナーも含む）は、発現株に共形質添加することができ、二重形質転換体が、アンピシリン及びテトラサイクリン抗生物質の双方を含む寒天プレートに播種することによって選択される。
【０２６１】
形質転換は、標準の形質転換プロトコール（例えば、上記Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄ．）の最新版を参照のこと）を使用して実施する。
【０２６２】
Ｄ．自動化
上述のとおり、本発明の核酸、ベクター、及び方法を使用する多タンパク質複合体のクローニング及び発現は、現在のロボット技術を利用する自動化装置に特に適している。
【０２６３】
以下の一般的なプロトコールでは、Ｔｅｃａｎ Ｆｒｅｅｄｏｍ Ｅｖｏｌｌ ２００ピペッティングデバイスの例を挙げる。前記ピペッティングデバイスは、典型的には、リキッドハンドリングアーム１（ＬｉＨａ１）、４固定チップ（鉄製ニードル）、４使い捨てチップ用コンテナ（Ｄｉｔｉ’ｓ）、２５０μｌシリンジ、リキッドハンドリングアーム２（ＬｉＨａ２）、８固定チップ（鉄製ニードル）、２．５ｍｌシリンジ、ロボットマニピュレーターアーム（ＲｏＭａ／プレートの輸送）、バージョンロング（ｖｅｒｓｉｏｎ ｌｏｎｇ）を備えている。前記ワークステーションは、通常、以下の統合装置：サーモサイクラーＰＴＣ−２００（Ｂｉｏｒａｄ）、Ｔｅ−Ｓｈａｋｅ、加熱可能なプレートシェイカー（Ｔｅｃａｎ）、Ｖａｒｉｏｍａｇサーモシェイカー、加熱及び冷却可能なプレートシェイカー（ｉｎｈｅｃｏ）、Ｔｅ−Ｖａｃｓ、フィルタープレート用デュアルバキュームステーション（Ｔｅｃａｎ）、Ｓａｆｉｒｅｌｌ、ＵＶ ＶＩＳプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）、及び冷却ユニット４００Ｗ（ＦＲＹＫＡマルチスター）を備えている。
【０２６４】
Ｄ．１．自動化ＳＬＩＣプロセス
自動化ＳＬＩＣのためのワークフローの代表例を図２２に図示する。
【０２６５】
工程１：最初のＰＣＲ
ソースプレート：ＰＣＲの鋳型（ｃＤＮＡ 約０．２μｇ／μｌ）を含む９６ウェル標準マイクロタイタープレート
リアクションプレート：９６ウェルＰＣＲプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
材料：サンプルミックスプレート（９６ウェルＰＣＲプレート；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、１％アガロースＥ−Ｇｅｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼマスターミックス、２０μＭのオリゴヌクレオチドプライマー、２×ＤＮＡローディングダイ（２×ＤＬＤ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、Ｅ−Ｇｅｌ（登録商標）Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ定量ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＢＳＡを含む１０×バッファーＴａｎｇｏ（登録商標）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、ＤｐｎＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）
ＰＣＲプログラム：
１１×［９８℃で２０秒間→６０から５０℃で３０秒間（１回おきに１℃低減させる）→７２℃で３分間］
１９×［９８℃で２０秒間→５０℃で３０秒間→７２℃で３分間］
７２度で３分間
１０度に維持
ＤｐｎＩ消化プログラム：
３７℃で３時間
１０℃で１分間
手順：
チップ洗浄→８９μｌのＰＣＲマスターミックスをリアクションプレートにピペットで入れる
チップ洗浄→ワークリストに記載の１μｌの鋳型ＤＮＡをピペットで入れる
チップ洗浄→５μｌの各プライマーをリアクションプレートにピペットで入れる
チップ洗浄→ＰＣＲプログラムを実行する
チップ洗浄→１０μｌのＢＳＡを含む１０×バッファーＴａｎｇｏ（登録商標）をリアクションプレートにピペットで入れる
チップ洗浄→５μｌのＤｐｎＩをリアクションプレートにピペットで入れる
チップ洗浄→ＤｐｎＩ消化プログラムを実行する
チップ洗浄→１０μｌの２×ＤＬＤをサンプルミックスプレートの各ウェルにピペットで入れる
チップ洗浄→１５μｌの各ＤＮＡマーカーをＥ−ｇｅｌマーカースロットにピペットで入れる
チップ洗浄→１０μｌのＰＣＲ産物をサンプルミックスプレートの２×ＤＬＤにピペットで入れる
チップ洗浄→１５μｌのサンプルミックスをＥ−ｇｅｌサンプルスロットにピペットで入れる
チップ洗浄→Ｅ−Ｇｅｌ（登録商標）を２５分間実行する
結果を評価する
【０２６６】
工程２：ＰＣＲ精製
ソースプレート：ＰＣＲサンプルを含む９６ウェルＰＣＲプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
ターゲットプレート：９６ウェルマイクロタイター溶出プレート（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）
材料：ＰＣＲ精製キット、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ９６Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）
手順：製造業者の情報（http://www.macherey-nagel.com/tabid/10887/default.aspx）にしたがう
【０２６７】
工程３：Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ反応
ソースプレート：９６ウェルマイクロタイター溶出プレート（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）
リアクションプレート：９６ウェルＰＣＲプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
材料：再蒸留（ｂｉｄｅｓｔ）水、１０×Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー（Ｎｏｖａｇｅｎ）、１００ｍＭ ＤＴＴ、２Ｍ尿素、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ ＬＩＣ正規品）、５００ｍM ＥＤＴＡ
インキュベーションプログラム：
２３℃で１０分間（プログラム１）
７５℃で２０分間（プログラム２）
手順：
チップ洗浄→６μｌの水をリアクションプレートにピペットで入れる
チップ洗浄→２μｌの１０×反応バッファーをリアクションプレートにピペットで入れる
チップ洗浄→１μｌの１００ｍＭ ＤＴＴをリアクションプレートにピペットで入れる
チップ洗浄→２μｌの２Ｍ尿素をリアクションプレートにピペットで入れる
チップ洗浄→先のＰＣＲに由来する８μｌのＤＮＡサンプルをリアクションプレートにピペットで入れる
チップ洗浄→０．５μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼをリアクションプレートにピペットで入れる
チップ洗浄→インキュベーションプログラム１を実行する
チップ洗浄→１μｌの５００ｍＭ ＥＤＴＡをリアクションプレートにピペットで入れる
チップ洗浄→インキュベーションプログラム２を実行する
【０２６８】
工程４：アニーリング
ソースプレート：Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ反応のリアクションプレート
リアクションプレート：９６ウェルＰＣＲプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
材料：再蒸留（ｂｉｄｅｓｔ）水、１０×ＤＮＡリガーゼ反応バッファー（ＮＥＢ）、直線化したベクター
インキュベーションプログラム：６５℃で８分間→０．４℃／分で３５度まで低下→１０℃で１分間
手順：
チップ洗浄→ワークリストに記載の１５０ｎｇのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理したインサートＤＮＡをリアクションプレートにピペットで入れる
チップ洗浄→ワークリストに記載の１５０ｎｇの直線化したベクターをリアクションプレートにピペットで入れる
チップ洗浄→インキュベーションプログラムを実行する
【０２６９】
工程５：大腸菌の形質転換
ソースプレート：アニーリング工程のリアクションプレート
リアクションプレート：９６ウェルＰＣＲプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
培養プレート：２ｍｌ ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）
ターゲットプレート：適当な抗生物質（標準的な濃度で使用する：アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌ）を含む２ｍｌのＬＢ寒天を備えた１２ウェル細胞培養プレート
材料：形質転換について化学的にコンピテントな大腸菌細胞（Ｘｌ１ｂｌｕｅ）、ＳＯＣ培地
形質転換プログラム：
サーモサイクラーを４２℃に加熱
４２℃で３０秒間インキュベート
冷却した（０℃）ピペッティングキャリアにすぐに移す
手順：
チップ洗浄→１００μｌのコンピテント大腸菌細胞をリアクションプレートにピペットで入れる
チップ洗浄→アニーリング工程に由来する１０μｌのＤＮＡサンプルをリアクションプレートにピペットで入れる
チップ洗浄→０℃で３０分間インキュベートする
形質転換プログラムを実行する
０℃で５分間インキュベートする
チップ洗浄→２５０μｌのＳＯＣ培地を培養プレートにピペットで入れる
チップ洗浄→形質転換ミックスを培養プレートにピペットで入れる
３７℃及び７２０ｒｐｍ（Ｔｅ−Ｓｈａｋｅ Ｓｈａｋｅｒ）で２時間インキュベートする
チップ洗浄→５０μｌの培養物をターゲットプレート（寒天プレート）にピペットで入れる
チップ洗浄→１２Ｈｚで１分間にわたってターゲットプレートを振盪する（プレートアウト）
一晩にわたって３７℃でターゲットプレートをインキュベートする
【０２７０】
工程６：クローンを選択し、一晩培養を開始する（手作業工程）
ソースプレート：大腸菌コロニーを含む１２ウェル細胞培養プレート
ターゲットプレート：２４ウェル培養プレート
材料：２×ＴＹ培養培地、培養プレートを備えたインキュベータ
手順：反応ごとに４つのコロニーを選択し、２４ウェル培養プレートの３ｍｌの２×ＴＹ培地に移す。３７℃及び約２２０ｒｐｍで一晩インキュベートする。
【０２７１】
工程７：プラスミド抽出（ミニプレップ）
ソースプレート：２４ウェル培養プレート（通常３ｍｌ培養）
ターゲットプレート：９６ウェルマイクロタイター溶出プレート（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）
材料：プラスミド抽出キット、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｒｏｂｏｔ ９６ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）
手順：製造業者（http://www.machereynagel.com/tabid/10885/default.aspxを参照のこと）にしたがう
【０２７２】
工程８：評価
プラスミド収率は、製造業者にしたがって、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）１０００分光光度計でＵＶ吸収を測定することによって定量する。プラスミドの完全性はＥ−ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって評価した。
【０２７３】
ＳＬＩＣプロトコールの有効性は、手作業及びロボットの態様で評価する。比較結果を表２に示す。結果は、調製した一連の２５の異なるドナー／アクセプター構築物に基づく。
【０２７４】
【表２】
2012519476.tif 000005
【０２７５】
Ｄ．２  自動化Ｃｒｅ融合プロセス
自動化Ｃｒｅ融合のためのワークフローの代表例を図２３に図示する。
【０２７６】
工程１：Ｃｒｅ−ＬｏｘＰプラスミド融合反応
ソースプレート：Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ融合に適するプラスミドを含む、プラスミド抽出工程に由来する９６ウェルマイクロタイター溶出プレート
リアクションプレート：９６ウェルＰＣＲプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
材料：再蒸留（ｂｉｄｅｓｔ）水、１０×Ｃｒｅ反応バッファー（ＮＥＢ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ（ＮＥＢ）
インキュベーションプログラム：３７℃で１時間→１０℃で１分間
手順：
チップ洗浄→６μｌの再蒸留（ｂｉｄｅｓｔ）水をリアクションプレートにピペットで入れる
チップ洗浄→２μｌの１０×ｃｒｅ反応バッファーをリアクションプレートにピペットで入れる。
チップ洗浄→ワークリストに記載のＣｒｅ組換えに適するプラスミドＤＮＡをリアクションプレートにピペットで入れる
チップ洗浄→２μｌのＣｒｅリコンビナーゼをリアクションプレートにピペットで入れる
チップ洗浄→インキュベーションプログラムを実行する
全反応容量：２０μｌ
【０２７７】
工程２、３、及び４：大腸菌形質転換及びプラスミド抽出：
Ｃｒｅ組換え工程に由来するリアクションプレートをソースプレートとして使用し、ＳＯＣ培地の回復時間が全体で４時間に延長した以外は、上述のＤ．１節に記載の方法と同一である。化学的コンピテントＭａｃｈ １細胞を形質転換に使用する。３及び４つのベクターを用いたＣｒｅ反応については、抗生物質濃度（標準の仕様濃度：アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール３０ｇ／ｍｌ）が半分の寒天プレートを使用する。
【０２７８】
工程５：評価
プラスミド融合体収率は、製造業者の説明書にしたがって、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）１０００分光光度計でＵＶ吸収を測定することによって定量する。プラスミドの完全性は、未消化及び消化したサンプルのＥ−ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって評価する。個々の融合体に特徴的な消化パターンをもたらす適切な制限部位が、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することによって同定し、制限マッピングに使用する。
【０２７９】
Ｃｒｅ反応の有効性は、Ｅｖｏｌｌリキッドハンドリングワークステーションを使用することによって、一連の融合反応を各々３回重複して実施することによって試験する。結果は表ＩＩＩにまとめる。
【０２８０】
【表３】
2012519476.tif 000006
【０２８１】
Ｄ．３．高速マイクロバッチＩ．ＭＡＣ
ソースプレート：２ｍｌディープウェルプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
フィルタープレート：ガラスフィルタープレート（Ｎｏｖａｇｅｎ）
ターゲットプレート：標準のマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）
材料：２０％エタノール中のＮｉ−ＮＴＡバルクビーズ５０％（Ｇｅ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、−２０℃の冷凍庫、マイクロタイタープレートに適する卓上遠心分離機、マイクロチップを備えた超音波装置、特定のタンパク質に適するＩＭＡＣ結合及び溶出バッファー（Berrow et al., Acta Cryst. (2006). D62, 1218 − 1226）
手順：
サンプル調製（オフライン）
ソースプレートで直接的に３０００ｇ（４℃）の遠心分離によって、所望のタンパク質を発現する大腸菌を回収する
細胞ペレットを３０分間、−２０℃で凍結させる
細胞ペレットを１５分、室温で融解する
フィルタープレートの調製
チップ洗浄→２００μｌで２０回上下にピペッティングすることによってＮｉ−ＮＴＡビーズ懸濁物を再懸濁する→２００μｌのビーズ懸濁物をフィルタープレートに移す
チップ洗浄→３０秒間にわたって５５０ｍｂａｒで吸引を適用する（２０％エタノールを除去する）
チップ洗浄→１ｍｌの平衡化バッファー（例えば、結合バッファー）を樹脂にピペットで入れる
チップ洗浄→６０秒間にわたって３００ｍｂａｒで吸引を適用する（平衡化）
ＩＭＡＣ精製、調製
チップ洗浄→１ｍｌの結合バッファーをソースプレートのサンプルにピペットで入れる
チップ洗浄→７５０μｌで１０回上下にピペッティングすることによって細胞ペレットを再懸濁する
チップ洗浄
サンプルの超音波処理（オフライン）
細胞の完全な溶解を確実にするためにサンプルを超音波処理する
ＩＭＡＣ精製、ローディング、及び溶出
チップ洗浄→全溶解物をフィルタープレートに移す
チップ洗浄→９０秒間にわたって３００ｍｂａｒで吸引を適用する（結合工程）
チップ洗浄→１ｍｌの洗浄バッファーをサンプルにピペットで入れる
チップ洗浄→９０秒間にわたって３００ｍｂａｒで吸引を適用する（洗浄工程）
洗浄工程を３回繰り返す
チップ洗浄→１００μｌの溶出バッファーをサンプルにピペットで入れる
チップ洗浄→室温で３分間にわたってインキュベートする
９０秒間にわたって６５０ｍｂａｒで吸引を適用する（溶出工程）
【０２８２】
評価
溶出したサンプル（１０μｌから１２μｌ）は、Ｂｉｏｒａｄ Ｍｉｎｉｇｅｌ Ｓｙｓｔｅｍを使用して１２％変性ゲルに手作業でロードし、１３５Ｖで２５分間にわたって前実行し、次いで、１８５Ｖで６５から７０分間にわたって実行する。ゲルは、標準の手順にしたがってクマシーブリリアントブルーで染色する。
【０２８３】
Ｅ．原核生物宿主におけるタンパク質発現のためのＡＣＥＭＢＬキット
原核生物宿主における発現のための好ましい実施態様に係るキットは、以下のものを含む：
-      BW23473、BW23474細胞1、及び／又はCreリコンビナーゼ
-      pACE (アクセプター)、及びpDC、pDK、pDS (ドナー)から作製したpACKS四重融合ベクター2
-      pACE2ベクター
-      pACE-VHLbc、pDK-BFP、pDS-mGFP3から作製したpACE-[VHLbc/BFP/mGFP]対照プラスミド三重融合ベクター
1 ドナー誘導体の増殖のためのpir遺伝子を発現する大腸菌株 (pir+ 背景を有する任意の他の株を使用することができる)。
2 この融合ベクターは、pACE、pDC、pDK、及びpDSのCre-LoxP反応によって作製した。これはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、及びスペクチノマイシンに耐性を有する。個々のACEMBLベクターは、プロトコールC2.2.に上述したとおり、Cre-LoxPを介する解体によって当該四重融合体から遊離することができる。本実施態様に係る単独ACEMBLベクター及びｐACKS四重融合体の配列は、配列番号２から７に提供している。
3 pDS-mGFPは、eGFPのN末端に融合したコイルドコイルを含む (Berger et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 12177-82を参照のこと)。
【０２８４】
任意の成分は以下のとおりである：
-      抗生物質: アンピリシン、クロラムフェニコール、カナマイシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン
-      酵素:
T4 DNAポリメラーゼ(遺伝子の組換え挿入用)
Phusionポリメラーゼ(DNAのPCR増幅用)
制限酵素及びT4 DNAリガーゼ(望ましい場合の従来のクローニング用)
【０２８５】
以下の非限定的な実施例によって、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【０２８６】
上述のＡＣＥＭＢＬシステムを使用することによる多タンパク質発現の実施例を、既に概説したような、以下に示す遺伝子の組合せの方法で示す。開示する反応は、上記Ｃ節に挙げたプロトコールにしたがって手作業で実施するか、又は上記Ｄ節にしたがって適合したプロトコールでＴｅｃａｎ Ｆｒｅｅｄｏｍ Ｅｖｏｌｌ ２００ロボットで実施した。
【０２８７】
実施例１：ＡＣＥＭＢＬベクターへのＳＬＩＣクローニング：ヒトＴＦＩＩＦ
Ｃ末端オリゴヒスチジンタグを有する全長ヒトＲＡＰ７４をコードする遺伝子及び全長ヒトＲＡＰ３０をコードする遺伝子を、上述のプロトコールにしたがって、Ｔ７ＩｎｓＦｏｒ（5’-TCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3’; 配列番号２０）及びＴ７Ｉｎｓｒｅｖ（5’-CCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAG-3’; 配列番号２１）のプライマー対を使用することによって、ｐＥＴ系プラスミド鋳型（Gaiser et al. (2000) J. Mol. Biol. 302, 1119-1127）から増幅した。直線化したベクター骨格は、双方のケースにおいてＴ７ＶｅｃＦｏｒ（5’CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGG-3’; 配列番号２２）及びＴ７ＶｅｃＲｅｖ（5’-CCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGCGGGA-3’; 配列番号２３）のプライマー対を使用することによって、ｐＡＣＥ及びｐＤＣからＰＣＲ増幅によって得られた。上記プロトコール１（Ｃ節）にしたがって、ｐＡＣＥ−ＲＡＰ３０及びｐＤＣ−ＲＡＰ７４ｈｉｓを生産した（図８）。これらのプラスミドは、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ反応によって融合した（上記Ｃ節を参照のこと）。１１の二重耐性（Ｃｍ、Ａｐ）コロニーのＢｓｔＺ１７Ｉ／ＢａｍＨＩ二重消化による制限マッピングの結果は、１％Ｅ−ｇｅｌ電気泳動（Ｍ：ＮＥＢ １ｋｂ ＤＮＡマーカー）からのゲル切片によって図８に示す。全ての試験したコロニーは、予測されたパターン（５．０＋２．８ｋｂ）を示した。１つのクローンでＢｌ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。発現及びＮｉ２＋捕捉及びＳ２００クロマトグラフィーによる精製によって、ヒトＴＦＩＩＦ複合体が得られた（図２１Ａ）。
【０２８８】
全長ヒトＴＦＩＩＦの高レベルの可溶性発現（図２１Ａ）は注目すべきであり、サブユニットの個々の発現では不溶性のものが常に得られる。以前は、ヒトＴＦＩＩＦ二量体化ドメインの結晶構造分析は、限定的なタンパク質分解、再クローニング、設計された断片の不溶性発現、及び共再フォールディングの多数の反復するサイクルが必要であった（上記Ｇａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００））。同様の実験状況は、過去のタンパク質複合体研究において一般的であった。これで、必要とされる大きな労力の投資は、本発明の核酸及びベクター、特に、ＡＣＥＭＢＬシステムを使用することによって顕著に低減される。
【０２８９】
実施例２：ＳＬＩＣによるポリシストロン挿入：ヒトＶＨＬ／エロンギンｂ／エロンギンｃ複合体
Ｎ末端で６ヒスチジン−チオレドキシン融合タグに融合した、Ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ Ｌｉｎｄａｕタンパク質（アミノ酸５４−２１３）をコードする遺伝子を、プライマーＴ７ＩｎｓＦｏｒ（上記表１を参照のこと）及びＳｍａＢａｍＶＨＬ（5’-GAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAGGATCCTTAATCTCCCATCCGTTGATGTGCAATG-3’; 配列番号４５）を使用することによって、プラスミドｐＥＴ３−ＨｉｓＴｒｘＶＨＬからＰＣＲ増幅した。ＳｍａＢａｍＶＨＬプライマーは、ＶＨＬ遺伝子の３’末端のインサートに特異的な配列（終止コドンを含む）によって３’で伸長した、ＳｍａＢａｍアダプター配列（表１；配列番号１７）の誘導体である。全長エロンギンｂをコードする遺伝子は、対応するアダプター（表１）の誘導体である、プライマーＢａｍＳｍａＥＢ（5’-GGATCCTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCG CTAGCTCTAGAAATAATTTTGTTTAAC-3’; 配列番号４６）及びＳａｃＨｉｎｄＥＢ（5’-GAGCTCGACTGGGAAAACCCTGGCGAAGCTTAGATCTGGATCCTTACTGCACGGCTTGTTCATTGG-3’; 配列番号４７）を使用することによって、ｐＥＴ３−エロンギンＢからＰＣＲ増幅した。エロンギンｃ（アミノ酸１７−１１２）の遺伝子は、対応するアダプター（表１）の誘導体である、プライマーＨｉｎｄＳａｃＥＣ（5’-AAGCTTCGCCAGGGTTTTCCCAGTCGAGCTCCAATTGGAATTCGCTAGCTCTAG-3’; 配列番号４８）及びＢｓｐＥｃｏ５ＥＣ（5’-GATCCGGA TGTGAAATTGTTATCCGCTGGTACCAAGCTTAGATCTGGATCCTTAACAATCTAAGAAG-3’; 配列番号４９）を使用することによって、ｐＥＴ３−エロンギンＣから増幅した。ベクター骨格は、プライマーＴｎ７ＶｅｃＲｅｖ及びＥｃｏ５Ｂｓｐ並びに鋳型としてｐＡＣＥを使用することによって、ＰＣＲ増幅した（図９）。多断片ＳＬＩＣは、上記プロトコール２（Ｃ節）にしたがって実施して、トリシストロンを含むｐＡＣＥ−ＶＨＬｂｃが得られた。アンピシリンを含む寒天プレートにクローンを播種した。配列決定によって検証された陽性クローンは、
下記の共発現実験に使用した（実施例５）。
【０２９０】
実施例３：ホーミングエンドヌクレアーゼ／ＢｓｔＸＩモジュール：酵母ＲＥＳ複合体
酵母タンパク質（全て全長）Ｐｍｌ１ｐ、Ｓｎｕ１７ｐ、及びＢｕｄ１３ｐの各々をコードする、プラスミドｐＣＤＦＤｕｅｔ−Ｐｍｌ１ｐ、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−Ｓｎｕ１７ｐ−ＮＨｉｓ、及びｐＥＴＤｕｅｔ−Ｂｕｄ１３ｐは、Ｓｉｍｏｎｏ Ｔｒｏｗｉｔｚｓｃｈ博士およびＭａｒｋｕｓ Ｗａｈｌ博士（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られた。Ｓｎｕ１７ｐは、Ｎ末端に融合した６ヒスチジンタグを含む。Ｈｉｓ６タグを有するＳｎｕ１７ｐをコードする遺伝子は、制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩを使用することによって、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−Ｓｎｕ１７ｐＮＨｉｓから切除し、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ消化したｐＡＣＥ構築物（ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ部位の間に無関係の遺伝子を含む）に連結し、ｐＡＣＥ−Ｓｎｕ１７が得られた。Ｂｕｄ１３ｐをコードする遺伝子は、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＶで制限消化することによってｐＥＴＤｕｅｔ−Ｂｕｄ１３ｐから遊離し、ＸｂａＩ／ＰｍｅＩ消化したｐＤＣに入れて、ｐＤＣ−Ｂｕｄ１３を得た。Ｐｍ１ｌｐをコードする遺伝子は、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで制限消化することによって、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−Ｐｍｌ１ｐから遊離し、ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ消化したｐＤＣに入れて、ｐＤＣ−Ｐｍｌ１を得た。次いで、Ｂｕｄ１３ｐのための発現カセットを、ＰＩ−ＳｃｅＩ及びＢｓｔＸＩで消化することによってｐＤＣ−Ｂｕｄ１３ｐから遊離した。遊離した断片は、ＰＩ−ＳｃｅＩ消化し、かつ、アルカリホスファターゼで処理したｐＤＣ−Ｐｍｌ１ｐに挿入し、ｐＤＣ−Ｂｕｄ１３ｐ−Ｐｍｌ１ｐを得た。
【０２９１】
ｐＡＣＥ−Ｓｎｕ１７及びｐＤＣ−ＢｕｄＰｍｌは、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ反応によって融合し、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含む寒天プレートに播種することによって選択した。融合プラスミドでＢｌ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。発現並びにＮｉ２＋捕捉及びＳ２００サイズ排除クロマトグラフィーによる精製によって、三量体であるＲＥＳ複合体が得られた。
【０２９２】
本発明の方法によって酵母ＲＥＳ複合体をクローニングするためのストラテジーは、図１０に図示している。
【０２９３】
実施例４：共形質転換による共発現：ヒトＮＹＢ／ＮＹＣ
タンパク質ＮＹＢ（アミノ酸４９−１４１）及びＮＹＣ（アミノ酸２７−１２）をコードする遺伝子は、ベクターｐＡＣＹＣ１８４１１−ＮＹＢ及びｐＥＴ１５−ＮＹＣの各々から切除した（Romier et al. (2003 J. Biol. Chem. 278, 1336-1345）。ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩをＮＦＹＢに使用した。ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩをＮＹＣに使用した。かくして、タンパク質のＮ末端に６ヒスチジンタグを取込んだ。ＮＹＢインサートは、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＡＣＥに連結した。ＮＹＣインサートは、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＡＣＥ２に連結した。ｐＡＣＥ−ＮＦＹＢ及びｐＡＣＥ２−ＮＦＹＣで、ｐＬｙｓＳプラスミドを含むＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。アンピシリン、テトラサイクリン、及びクロラムフェニコールを含む寒天プレート上での選択によって、三重耐性コロニーが得られた。複合体が発現し、Ｎｉ２＋捕捉（ＩＭＡＣ）及びＳ７５ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
【０２９４】
実施例５：アクセプター−ドナー融合体からの共発現
三量体のタンパク質複合体（VHLbc: VonHippel-Lindauタンパク質 アミノ酸54-213 / 全長エロンギンＢ / エロンギンＣ アミノ酸 17-112）（Stebbins et al. (1999) Science 284, 455-61）、ＡＡＡ ＡＴＰアーゼ ＦＴｓＨ（アミノ酸１４７−６１０）をコードする遺伝子、及び蛍光マーカーをコードする２つの遺伝子（ＢＦＰ及びＧＦＰ）をコードする６つの異種性遺伝子は、図２０に示すように組み立てた。１回のＣｒｅ反応において、１つのアクセプター（ｐＡＣＥ−ＶＨＬｂｃ）及び３つのドナー（ｐＤＣ−ＦｔｓＨ、ｐＤＫ−ＢＦＰ、ｐＤＳ−ｍＧＦＰ）の全ての組合せが得られ、選択した。これは、６つの異種遺伝子全てを含む四重融合体を含む（図２０を参照のこと）。クローンは、Ｃ節のＡＣＥＭＢＬシステムについて上述したとおりに９６ウェルマイクロタイタープレートによって検証する。発現及びＮｉ２＋親和性捕捉によって、タグを有しない蛍光マーカーの免疫染色と組み合わせて、多タンパク質の発現の成功を確認した（図１６及び１７Ｂ）。タンパク質は、自己誘導培地を使用し、スモールスケールにおいて、２４ウェルディープウェルプレート中のＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた（Studier (2005) Protein Expr. Purif. 41, 207-34）。制限マッピングによって、培地中において１つの抗生物質のみに曝露する場合ですら、大きな融合プラスミドであっても複数（６０超）の世代にわたって安定である
【０２９５】
実施例６：ＹｉｄＣ−ＳｅｃＹＥＧＤＦホロトランスロコンの発現
図２１Ｃに示すとおり、ＡＣＥＭＢＬシステムを使用して、全部で３３の膜貫通ヘリックスを含む大きな多タンパク質複合体であるＹｉｄＣ−ＳｅｃＹＥＧＤＦホロトランスロコンを生産した。この機構は、フォールドされていないポリペプチドを細胞膜に輸送するために使用されるか、又は細菌の周辺質への転位に使用される（Duong et al. (1997) EMBO J. 16, 2757-68）。
【０２９６】
実施例７：昆虫細胞におけるヒトＩＫＫ複合体の発現
上記Ｃ．１．節に概説した単独遺伝子のＡＣＥＭＢＬシステムへの挿入のためのプロトコールにしたがって、ＩＫＫ１（ＩＫＫαとも称される）、ＩＫＫ２（ＩＫＫβとも称される）、及びＩＫＫ３（Ｎｅｍｏとも称される）の遺伝子を、ｐＡＣＥＢａｃ１、ｐＩＤＣ、及びｐＩＤＳの各々にクローニングした（得られたプラスミドｐＡＣＥＢａｃ１−ＨｉｓＩＫＫ１、ｐＩＤＣ−ＣＳＩＫＫ２、及びｐＩＤＳ−ＩＫＫ３のマップは、図４６、４７、及び４８の各々に示す）。ＩＫＫ１−２二重融合体（ｐＩＤＣ−ＣＳＩＫＫ２とｐＡＣＥＢａｃ１−ＨｉｓＩＫＫ１）及びＩＫＫ１−２−３三重融合体（３つのベクターの全て）は、Ｃ．２節に上述したＣｒｅ−ＬｏｘＰ融合によって作製した。その融合体は、バキュロウイルスゲノム（ＥＭＢａｃ）を細菌人工染色体として有する適切な宿主細胞に導入した。前記ベクター融合体は、Ｔｎ７転位によってバキュロウイルスゲノムに組み込んだ。有効な組み込みは、青色／白色スクリーニングによって評価した。複合ウイルスのＤＮＡは、白色クローンから調製し、Ｓｆ２１細胞に感染させた。
【０２９７】
実施例８：Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス様粒子の発現
タンパク質ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、及びＭ２を含む、ブタインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１タイプのインフルエンザウイルス）のウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、以下のストラテジーによって昆虫細胞（Ｓｆ２１）で発現させた：Ｃ．１節に概説した単独遺伝子挿入によって、ＨＡ及びＮＡをｐＡＣＥＢａｃ１にクローニングした。同じ手順によって、Ｍ１及びＭ２をコードする遺伝子をｐＩＤＣにクローニングした。ＨＡ−ＮＡおよびＭ１−Ｍ２の各々の二重発現カセットを、各々のＭＩＥにおけるＨＥ−ＢｓｔＸＩ部位を使用することによって産生して（上記Ｃ１．４節を参照のこと）、プラスミドｐＡＣＥＢａｃ−ＨＡ−ＮＡ（プラスミドマップは図４９を参照のこと）及びｐＩＤＣ−Ｍ１−Ｍ２（プラスミドマップは図５０を参照のこと）を得た。完全なＨ１Ｎ１インフルエンザＶＬＰをコードするベクターは、上記Ｃ．２節のプロトコールにしたがって、ｐＡＣＥＢａｃ−ＨＡ−ＮＡをｐＩＤＣ−Ｍ１−Ｍ２とＣｒｅＬｏｘＰ融合することによって産生した。融合ベクターは、細菌人工染色体としてバキュロウイルスゲノム（ＥＭＢａｃ）を有する適切な宿主細胞に導入した。融合ベクターは、Ｔｎ７転位によってバキュロウイルスゲノムに組み込んだ。有効な組み込みは、青色／白色スクリーニングによって評価した。複合ウイルスのＤＮＡは、白色クローンから調製し、Ｓｆ２１細胞にトランスフェクトした。
【図１０】
2012519476.tif 000007
【図１３Ａ】
2012519476.tif 000008
【図１３Ｂ】
2012519476.tif 000009
【図１４】
2012519476.tif 000010
【図１５】
2012519476.tif 000011
【図１６】
2012519476.tif 000012
【図１７】
2012519476.tif 000013
【図１８】
2012519476.tif 000014
【図１９】
2012519476.tif 000015
【図２０】
2012519476.tif 000016
【図２４】
2012519476.tif 000017
【図２５】
2012519476.tif 000018
【図２６】
2012519476.tif 000019
【図３８】
2012519476.tif 000020
【図３９】
2012519476.tif 000021
【図４０】
2012519476.tif 000022
【図４１】
2012519476.tif 000023
【図４２】
2012519476.tif 000024
【図４３】
2012519476.tif 000025
【図４４】
2012519476.tif 000026
【図４５】
2012519476.tif 000027
【図４６】
2012519476.tif 000028
【図４７】
2012519476.tif 000029
【図４８】
2012519476.tif 000030
【図５０】
2012519476.tif 000031
【図１】
2012519476.tif 000032
【図２】
2012519476.tif 000033
【図３】
2012519476.tif 000034
【図４】
2012519476.tif 000035
【図５】
2012519476.tif 000036
【図６】
2012519476.tif 000037
【図７】
2012519476.tif 000038
【図８】
2012519476.tif 000039
【図９】
2012519476.tif 000040
【図１１】
2012519476.tif 000041
【図１２】
2012519476.tif 000042
【図２１】
2012519476.tif 000043
【図２２】
2012519476.tif 000044
【図２３】
2012519476.tif 000045
【図２７】
2012519476.tif 000046
【図２８】
2012519476.tif 000047
【図２９】
2012519476.tif 000048
【図３０】
2012519476.tif 000049
【図３１】
2012519476.tif 000050
【図３２】
2012519476.tif 000051
【図３３】
2012519476.tif 000052
【図３４】
2012519476.tif 000053
【図３５】
2012519476.tif 000054
【図３６】
2012519476.tif 000055
【図３７】
2012519476.tif 000056
【図４９】
2012519476.tif 000057
【配列表】
2012519476000001.app
【国際調査報告】
2012519476.tif 000058
2012519476.tif 000059
2012519476.tif 000060
2012519476.tif 000061
2012519476.tif 000062
2012519476.tif 000063