(57)【要約】  本発明は、２つ以上の相同ヌクレオチド配列を含むベクター、およびそれらを作製するための方法に関する。本発明は、コードされるアミノ酸配列を変化させない異なる塩基で相同ヌクレオチド配列における塩基を置換することに関する。本発明は、特に哺乳動物細胞における、相同ヌクレオチド配列間の分子内組換えの低減を可能にする。本発明はさらに、置換された塩基を含むヌクレオチド配列に関する。
2012509073.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれが１００アミノ酸をコードする、サイズが３００ヌクレオチドの２つのヌクレオチド配列を含むベクターであって、
２つのヌクレオチド配列のそれぞれによってコードされる１００アミノ酸が少なくとも７５％のアミノ酸同一性を有し、
２つのヌクレオチド配列の一方が他方のヌクレオチド配列と異なる少なくとも７５ヌクレオチドを有し、
異なるヌクレオチドが前記２つのヌクレオチド配列によってコードされる同一のアミノ酸を変化させない、ベクター。
【請求項２】
ａ）１００アミノ酸をコードするサイズが３００ヌクレオチドの第１のヌクレオチド配列を供給する段階、
ｂ）１００アミノ酸をコードするサイズが３００ヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列を供給する段階、
但し、２つのヌクレオチド配列のそれぞれによってコードされる１００アミノ酸が少なくとも７５％のアミノ酸同一性を有し、２つのヌクレオチド配列の一方が他方のヌクレオチド配列と異なる少なくとも７５ヌクレオチドを有し、異なるヌクレオチドが前記２つのヌクレオチド配列によってコードされる同一のアミノ酸を変化させない、
ｃ）２つの異なるヌクレオチド配列をベクターに挿入する段階
を含む、請求項１に記載のベクターを産生するための方法。
【請求項３】
それぞれが１００アミノ酸をコードする、サイズが３００ヌクレオチドの２つのヌクレオチド配列を含むベクター内での分子内組換えを低減させるための方法であって、２つのヌクレオチド配列のそれぞれによってコードされる１００アミノ酸が少なくとも７５％のアミノ酸同一性を有し、一方または両方のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドを置換して少なくとも７５ヌクレオチドにおいて相違を示す２つの相違する配列を産生する段階を含み、異なるヌクレオチドが前記２つのヌクレオチド配列によってコードされる同一のアミノ酸を変化させない、方法。
【請求項４】
ベクターがウイルスベクター、好ましくはポックスウイルスベクターである、請求項１に記載のベクター、または請求項２もしくは３に記載の方法。
【請求項５】
ａ）１００アミノ酸をコードする、サイズが３００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むウイルスを供給する段階と、
ｂ）１００アミノ酸をコードする、サイズが３００ヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列を前記ウイルスへ挿入する段階と
を含み、２つのヌクレオチド配列のそれぞれによってコードされる１００アミノ酸が少なくとも７５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、
２つのヌクレオチド配列の一方が他方のヌクレオチド配列と異なる少なくとも７５ヌクレオチドを有し、
異なるヌクレオチドが前記２つのヌクレオチド配列によってコードされる同一のアミノ酸を変化させない、
２つの相同ヌクレオチド配列を含むウイルス、好ましくはポックスウイルスを産生するための方法。
【請求項６】
ポックスウイルスがワクシニアウイルス、好ましくは、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスである、請求項４または５に記載のベクターまたは方法。
【請求項７】
少なくとも７５の異なるヌクレオチドが置換されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクターまたは方法。
【請求項８】
２つのヌクレオチド配列が２つの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）遺伝子、特にＲＳＶ−Ｆおよび／もしくはＲＳＶ−Ｇ遺伝子、または２つの、好ましくは３つのフィロウイルス遺伝子、特にフィロウイルス糖タンパク質（ＧＰ）遺伝子である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のベクターまたは方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
核酸の相同組換えの現象は、相同配列内の核酸鎖の物理的切断および交差再結合を含む。哺乳動物細胞における組換えおよび遺伝子変換は、適切に構築されたウイルス基質またはプラスミド基質の感染後の選択可能な遺伝子の再構築をモニターしている多くのグループによって研究されている（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２５２０〜２５２６、１９８６）。これらの実験の結果は、細胞が、分子内および分子間の組換えおよび遺伝子変換の両方を効率的に支援することを示している（同上）。分子間組換えは、２つの異なる核酸分子上に存在する相同配列間の組換えを指し、分子内組換えは、単一の核酸分子上に存在する相同配列間の組換えを指す。
【０００２】
“分子間”組換えは、プラスミドまたはウイルスにおける遺伝子と細胞内の相同配列との間で起こり得る（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５〜２９０２、１９８６）。この型の組換えは、弱毒性ウイルスからの感染性ウイルスの発生を引き起こし得る。Ｆｕｌｌｅｒらは、ＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子およびＨＩＶ−１ｐｏｌ遺伝子の別々の配列をコドン最適化して、哺乳動物細胞においてその発現を増加させた。これらの最適化はまた、ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子に存在する約２００塩基対の重複領域におけるヌクレオチドの同一性を低下させ、それはまた、２つの独立したプラスミドに配置されたｇａｇおよびｐｏｌオープンリーディングフレームと組換えレトロウイルスに含まれる切断型ｇａｇ遺伝子との間の分子間組換えのレベルの低下をもたらした（Ｆｕｌｌｅｒら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：２０８１〜２０９３、２００１）。
【０００３】
“分子内”組換えは、遺伝子または遺伝子断片の重複領域が介在配列によって分離されている直列反復配列として存在するベクターに関して起こり得る。この型の組換えは、一般的に、介在配列および１コピーの反復配列の欠失をもたらす。分子内組換えの頻度は、一般的に、分子間組換えより、はるかに高い。
【０００４】
プラスミドベクター内の分子内組換えのレベルは、哺乳動物細胞において定量化されている（ＲｕｂｎｉｔｚおよびＳｕｂｒａｍｉ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２２５３〜２２５８、１９８４）。相同領域のサイズに依存して、トランスフェクションされたプラスミドＤＮＡ内の分子内組換えの頻度は０．３０６％〜０．００２％と様々であった（同上）。わずか１４塩基の相同性でも、低い組換え効率が見られた（同上）。
【０００５】
相同配列間の分子内組換えはまた、ピコルナウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、およびポックスウイルスを含むいくつかの動物ウイルスにおいて実証されている（Ｇｒｉｔｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：５９４８〜５９５７、１９９０）。ワクシニアウイルスにおいて、縦列重複配列が遺伝的に不安定であることが示されている（同上）。ウイルスにおいて、プラスミドベクターに関して見られるものよりはるかに高い分子内組換えのレベルが見られている。
【０００６】
例えば、レトロウイルスにおいて、同じＲＮＡ分子における２つの同一配列間の組換え頻度は、約６２％であることが見出された（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：６３４８〜６３５８、２００１）。分子間（２つのＲＮＡ分子間）とは対照的に、これらの組換えの９９％は分子内（１つのＲＮＡ分子上の２つの配列間）であった（同上）。アデノ随伴ウイルスに関して、分子内組換えはまた、分子間組換えよりはるかに効率的であることが見出された（Ｃｈｏｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：６８０１〜６８０７、２００５）。単純ヘルペスウイルス１型もまた、高レベルの組換えを示すことが示されている（Ｄｕｔｃｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７７〜２８５）。ポックスウイルスにおいて、高頻度の相同組換えが観察されている。１．５ｋｂのＤＮＡの２つの直列反復配列の間にチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を置くことによってワクシニアウイルスにおける組換えを測定する実験系が用いられた（Ｂａｌｌ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１７８８〜１７９５、１９８７）。非選択的条件下での最初の８継代のそれぞれの間で、ｔｋ＋ワクシニアウイルスの４０％がｔｋ＋表現型を喪失した（同上）。非選択的条件下で、ｔｋ−ウイルスが総ウイルス集団の９９．３７％の量まで増加した（同上）。選択的条件下でさえも、高頻度で組換えが起こったために、単一プラークから単離することができた感染性ウイルス粒子の大部分が、すでに組換えを受けて、引き続いてｔｋ遺伝子を喪失しているＤＮＡを含んでいた（同上）。全てＶＶ  ｐ７．５プロモーターから発現される３つの異種性遺伝子を発現するように設計された組換えワクシニアウイルスを用いて、Ｈｏｗｌｅｙら（Ｇｅｎｅ  １７２：２３３〜２３７、１９９６）は、反復プロモーター配列間の組換えを示した。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＭタンパク質由来のＣ反復領域（ＣＲＲ）を含むように設計されたワクシニアウイルス組換え体は、１コピーから２０コピーを超えるＣＲＲを含む変異体の複雑な混合物を含んでいた（Ｈｒｕｂｙら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８８：３１９０〜３１９４、１９９１）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＭＶＡの異なる挿入部位に挿入された約６０〜７５％の相同性を有する複数の遺伝子が、結果として安定な多重組換えウイルスを生じることが示されているが（ＷＯ０３／０９７８４６）、しかしながら同一のより長い区間を含む複数の相同ヌクレオチド配列を含む安定なベクターの作製を可能にするための、例えば、ウイルスベクターなどのベクターにおける分子内組換えのレベルを低下させる組成物および方法が、当技術分野において必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、組換えベクター、およびそれらを作製し、用いるための方法に関する。
【０００９】
特に、本発明は、それぞれが１００アミノ酸をコードする、サイズが３００ヌクレオチドの２つのヌクレオチド配列を含むベクターであって、２つのヌクレオチド配列のそれぞれによってコードされる１００アミノ酸が少なくとも７５％のアミノ酸同一性を有し、２つのヌクレオチド配列の一方が他方のヌクレオチド配列と異なる少なくとも７５ヌクレオチドを有し、異なるヌクレオチドが前記２つのヌクレオチド配列によってコードされる同一のアミノ酸を変化させない、ベクターを含む。
【００１０】
驚くべきことに、分子内組換えのリスクを有意に低下させることに加えて、例えば、ベクターなどの１つの核酸分子内の少なくとも２つの類似または同一のヌクレオチド配列において同義のコドンを体系的に置換することによって、分子内組換えのリスクを回避することもでき、したがって、少なくとも２つ以上の類似または同一のヌクレオチド配列を含む安定なベクターの作製へとつながることが、本発明により示された。予想外に、本発明に用いられるストラテジーはまた、３つ以上の類似のヌクレオチド配列を含むベクターにも適用可能である。
【００１１】
本発明において得られた結果は、ヌクレオチド配列における多数のヌクレオチドを置換して、ベクター内の分子内組換えを低減させることが可能であるが、驚くべきことに、同時に、コードされたタンパク質の発現がなお保持されることを示している：本発明に従って行ったように多数のヌクレオチド変異体をヌクレオチド配列の長い区間へ導入した場合、当業者は、前記配列または遺伝子の発現がもはや適切に働かないであろうと予想したであろう、すなわち、変化したヌクレオチド配列が効率的な発現に適したままであろうとは予想されなかった。本明細書で用いられるストラテジーは、３００ヌクレオチドの短いヌクレオチド配列区間に適用可能であるだけでなく、例えば、主張されている３００ヌクレオチドの区間を当然ながら含む完全長遺伝子のような非常に長い区間にも適用可能である。結果は、多くの異なる遺伝子、ベクター、およびウイルスに適用可能であり、例えば、多価ワクチンの開発などのワクチン開発に非常に有利であるが、例えば、タンパク質の発現のような他のテクノロジーに、または組換え細胞株の作製にも有利であり得る。
【００１２】
他の実施形態において、本発明はまた、ウイルスおよびベクターの作製のための方法、ならびに分子内組換えを低減させるための方法も含む。
【００１３】
本発明は、ａ）１００アミノ酸をコードするサイズが３００ヌクレオチドの第１のヌクレオチド配列を供給する段階と、ｂ）１００アミノ酸をコードするサイズが３００ヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列を供給する段階と、ｃ）２つの相違するヌクレオチド配列をベクターへ挿入する段階とを含み、２つのヌクレオチド配列のそれぞれによってコードされる１００アミノ酸が少なくとも７５％のアミノ酸同一性を有し、かつ２つのヌクレオチド配列の一方が他方のヌクレオチド配列と異なる少なくとも７５ヌクレオチドを有し、異なるヌクレオチドが前記２つのヌクレオチド配列によってコードされる同一のアミノ酸を変化させない、上記のベクターを作製するための方法を含む。
【００１４】
特に好ましい実施形態において、本発明は、それぞれが１００アミノ酸をコードする、サイズが３００ヌクレオチドの２つのヌクレオチド配列を含むベクター内の分子内組換えを低減させるための方法であって、２つのヌクレオチド配列のそれぞれによってコードされる１００アミノ酸が少なくとも７５％のアミノ酸同一性を有し、一方または両方のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドを置換して少なくとも７５ヌクレオチドの相違を示す２つの相違する配列を産生する段階を含み、異なるヌクレオチドが、前記２つのヌクレオチド配列によってコードされる同一のアミノ酸を変化させない、方法を含む。
【００１５】
ウイルスベクターを用いる場合、方法は、ウイルス増殖の各世代中、分子内組換えのレベルを低下させる。好ましくは、相同ヌクレオチド配列は、世代当たり２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、または０．０１％未満の子孫ウイルスにおいて組み換わる。
【００１６】
別の好ましい実施形態において、本発明は、ａ）１００アミノ酸をコードするサイズが３００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むウイルスを供給する段階と、ｂ）１００アミノ酸をコードするサイズが３００ヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列を前記ウイルスへ挿入する段階とを含み、２つのヌクレオチド配列のそれぞれによってコードされる１００アミノ酸が少なくとも７５％のアミノ酸同一性を有し、２つのヌクレオチド配列の一方が他方のヌクレオチド配列と異なる少なくとも７５ヌクレオチドを有し、異なるヌクレオチドが前記２つのヌクレオチド配列によってコードされる同一のアミノ酸を変化させない、２つの相同ヌクレオチド配列を含むウイルス、好ましくは、ポックスウイルスを作製するための方法を含む。
【００１７】
本明細書に用いられる場合、「ベクター」は、宿主細胞または対象において核酸分子を送達し、発現する能力がある任意の媒体であってよい。したがって、ベクターは、細胞へ導入される、および／もしくは細胞ゲノムに組み込まれるＰＣＲ産物もしくは任意の核酸断片；または、挿入されたセグメントの複製を引き起こすように別のＤＮＡセグメントが挿入され得る、プラスミド、ファージ、もしくはコスミドなどのレプリコンであってもよい。一般的に、ベクターは、適切な調節エレメントを伴う場合、複製し得る。本発明に用いる適切なベクターバックボーンとして、例えば、プラスミド、ウイルス、人工染色体、ＢＡＣ、ＹＡＣ、もしくはＰＡＣなどの当技術分野において日常的に用いられるもの、またはさらに細菌および真核細胞のような組換え細胞も挙げられる。用語「ベクター」は、クローニングベクターおよび発現ベクター、ならびにウイルスベクターおよび組み込みベクターを含む。「発現ベクター」は、制御領域を含むベクターである。本発明に用いる適切な発現ベクターには、限定するものではないが、プラスミド、ならびに植物ウイルス、バクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、レトロウイルス、およびポックスウイルス由来のウイルスベクターが挙げられる。適切な非ウイルスベクターには、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ  ３２９、８４０）、ｐＶＡＸおよびｐｇＷｉｚ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ；Ｈｉｍｏｕｄｉら、２００２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６、１２７３５〜１２７４６）などのプラスミドが挙げられる。多数のベクターおよび発現系は、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）のような会社から市販されている。
【００１８】
ワクチン開発において、組換えウイルスは、遺伝物質を細胞へ送達するための媒体またはワクチンベクターとして用いることができる。いったん細胞に入れば、遺伝情報が転写され、特定の疾患を標的とする挿入された抗原を含むタンパク質へ翻訳される。ベクターによって細胞へ送達された抗原が、疾患から保護する、抗原に対する身体の免疫応答を誘導すれば、治療は成功である。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態において、ベクターはプラスミドまたはウイルスベクターである。
【００２０】
ウイルスベクターは、宿主において複製できないが、感染した細胞において外来遺伝子を導入し、発現させることができる弱毒ウイルスに基づくものであり得る。ウイルスまたは組換えウイルスは、それにより、タンパク質を生成し、それを宿主の免疫系へ提示することができる。ウイルスベクターのいくつかの重要な特徴は、それらが体液性（Ｂ細胞）および／または細胞性（Ｔ細胞）免疫応答を誘発し得ることである。
【００２１】
ウイルスベクターは、様々な異なるウイルスから得ることができる。一実施形態において、ウイルスは動物ウイルスである。ベクターは、レトロウイルス、ピコルナウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−１）、麻疹ウイルス、および泡沫状ウイルスからなる群から選択されるウイルスから特に得ることができる。
【００２２】
ウイルスベクターは、感染性疾患および癌の予防および治療のためのワクチンを開発するために、研究者によって一般的に用いられている。これらのうち、（カナリアポックスウイルス、ワクシニアウイルス、および鶏痘ウイルスを含む）ポックスウイルスは、最も一般的なベクターワクチン候補の群に属している。ポックスウイルスは、ウイルスゲノムへ配列を挿入する能力が比較的大きいため、また、核の代わりに感染細胞の細胞質においてそれらのゲノムを複製し、転写を行う能力のため、遺伝物質の新しい宿主への移入にとって好ましい選択であり、これにより他のベクター、例えば、レトロウイルスベクターに関して見られるような宿主細胞のゲノムへ遺伝物質を組み込むことによる挿入変異誘発のリスクを最小限にする。ポックスウイルスのビリオンは、たいていの他の動物ウイルスと比較して大きい（より詳細について、Ｆｉｅｌｄｓら編、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、２巻、８３章、２６３７ページ以降参照）。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、ウイルスベクターは、ポックスウイルス由来である（例えば、Ｃｏｘら、「Ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｊ．Ｍ．Ｈｏｓ編、Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ参照）。ウイルスベクターは、ポックスウイルス科の任意のメンバーから得ることができ、特に、アビポックスウイルスまたはオルソポックスウイルスであってもよい。
【００２４】
本発明に用いるのに適したアビポックスウイルスの例として、鶏痘ウイルス、カナリアポックスウイルス、ジュンコ痘ウイルス、マイナ痘ウイルス、鳩痘ウイルス、オウム痘ウイルス、ウズラ痘ウイルス、クジャク痘ウイルス、ペンギン痘ウイルス、スズメ痘ウイルス、ムクドリ痘ウイルス、および七面鳥痘ウイルスなどの任意のアビポックスウイルスが挙げられる。好ましいアビポックスウイルスは、カナリアポックスウイルスおよび鶏痘ウイルスである。
【００２５】
アビポックスウイルスは、天然では、宿主限定型であり、鳥類および鳥の細胞においてのみ増殖的に複製する（Ｔａｙｌｏｒら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｃａｎａｒｙｐｏｘ−ｒａｂｉｅｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ＡＬＶＡＣ−ＲＧ  （ｖＣＰ６５）  ｉｎ  ｎｏｎ−ａｖｉａｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ、Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：５３９〜５４９、１９９５）。ヒト細胞はアビポックスウイルスに感染した場合、異種性遺伝子がウイルスゲノムから発現する。しかしながら、アビポックスウイルスは、ヒト細胞において完全には複製せず、したがって、人間が増殖性ウイルス複製によって害されるリスクはない。例えば、レンチウイルスの遺伝子産物（ＵＳ５，７６６，５９８）、サイトカインおよび／または腫瘍関連抗原（ＵＳ５，８３３，９７５）、または狂犬病Ｇ糖タンパク質（Ｔａｙｌｏｒら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｃａｎａｒｙｐｏｘ−ｒａｂｉｅｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ＡＬＶＡＣ−ＲＧ  （ｖＣＰ６５）  ｉｎ  ｎｏｎ−ａｖｉａｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ、Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：５３９〜５４９、１９９５）を発現する様々な組換えアビポックスウイルスが構築されている。４つのＨＩＶ遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、およびｎｅｆを発現する組換えカナリアポックスウイルスはすでに、臨床試験に用いられている（Ｐｅｔｅｒｓ，Ｂ．Ｓ．、Ｔｈｅ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ＨＩＶ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：６８８〜７０５、２００１）。
【００２６】
アビポックスウイルスは鳥の細胞においてのみ増殖的に複製するため、ウイルスの増幅および組換えウイルスの作製にはこれらの細胞が用いられなければならない。
【００２７】
カナリアポックスウイルスの例は、レントシュラー（Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ）株である。ＡＬＶＡＣと呼ばれるプラーク精製カナリアポックス株（ＵＳ５，７６６，５９８）を、ブダペスト条約に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にアクセッション番号ＶＲ−２５４７として寄託した。もう１つのカナリアポックス株は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｉｎｃ．から入手することができる、ＬＦ２  ＣＥＰ  ５２４  ２４  １０  ７５と名づけられた市販のカナリアポックスワクチン株である。
【００２８】
鶏痘ウイルスの例は、ＦＰ−１株、ＦＰ−５株、およびＴＲＯＶＡＣ株（ＵＳ５，７６６，５９８）である。ＦＰ−１は、１日齢のニワトリにワクチンとして使用するために改変されたデュベット（Ｄｕｖｅｔｔｅ）株である。その株は、０  ＤＣＥＰ  ２５／ＣＥＰ６７／２３０９  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９８０と呼ばれる市販の鶏痘ウイルスワクチン株であり、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｉｎｃ．から入手することができる。ＦＰ−５は、ニワトリ胚起源の市販の鶏痘ウイルスワクチン株であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ   Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌｉｃｅｎｓｅ  Ｎｏ．１６５、ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．３０３２１から入手することができる。
【００２９】
ポックスウイルスのうち、ワクシニア種および痘瘡ウイルス種は最も知られた２つである。痘瘡ウイルスは、天然痘の原因である。痘瘡ウイルスと対照的に、ワクシニアウイルスは、免疫能力のある個体において通常は全身性疾患を引き起こさず、それゆえに、天然痘に対して免疫を与える生ワクチンとして用いられている。ワクシニアウイルスによる世界中のワクチン接種の成功は、１９８０年代、天然疾患としての天然痘をついに撲滅した（天然痘の世界的撲滅。国際天然痘撲滅認証委員会の最終報告書；Ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｎｏ．４、Ｇｅｎｅｖａ：Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、１９８０）。それ以来、ワクチン接種は、ポックスウイルス感染のリスクが高い人々（例えば、実験室研究者）を除き、何年にもわたって中断されている。しかしながら、例えば、天然痘を引き起こす痘瘡は、バイオテロ兵器として用いられる可能性がある。さらに、牛痘、ラクダ痘、およびサル痘などの他のポックスウイルスが選択機構を通して突然変異し、痘瘡と類似した表現型を獲得する可能性があるというリスクがある。それゆえに、いくつかの政府は、推定される、または実在の天然痘攻撃の曝露前（痘瘡ウイルスに遭遇する前）かまたは曝露後（痘瘡ウイルスに遭遇した後）のいずれかで用いるためのワクシニアに基づいたワクチンの備蓄を増加させつつある。
【００３０】
本発明の特に好ましい実施形態において、ベクターはワクシニアウイルスベクターである。
【００３１】
ワクシニアウイルスは、免疫刺激性が高く、それ自体の遺伝子産物、およびワクシニアゲノムに挿入された遺伝子から発現した多くの外来遺伝子産物の両方に対して強いＢ細胞媒介型（体液性）およびＴ細胞媒介型（細胞性）免疫を誘発する。したがって、ワクシニアウイルスは、組換えワクチンの形をとる、天然痘および他の感染性疾患ならびに癌に対するワクチンのための理想的なベクターと見られている。文献に記載された組換えワクシニアウイルスの多くは、完全に複製能力のあるワクシニアウイルスのウェスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ）株に基づいている。しかしながら、この株は、高い神経毒性を有することが知られており、したがって、ヒトおよび動物に用いるのにはあまり適していない（Ｍｏｒｉｔａら、１９８７、Ｖａｃｃｉｎｅ  ５、６５〜７０）。
【００３２】
適切なワクシニアウイルスは、コペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）株（Ｇｏｅｂｅｌら、１９９０、Ｖｉｒｏｌ．１７９、２４７〜２６６および５１７〜５６３；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９３、Ｖｉｒｏｌ．１９６、３８１〜４０１）、ワイエス（Ｗｙｅｔｈ）株、ＮＹＶＡＣ（ＷＯ９２／１５６７２およびＴａｒｔａｇｌｉａら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８８、２１７〜２３２）、および高度に弱毒化された改変アンカラ（Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）株（Ｍａｙｒら、１９７５、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３、６〜１６）からなる群から選択することができる。
【００３３】
適切なワクシニアウイルスの好ましい例は、高度に弱毒化されたワクシニアウイルス株、ＮＹＶＡＣであり、それは、ウイルスゲノムから１８個のＯＲＦの欠失によるコペンハーゲンワクチン株のプラーククローン化単離物由来であった（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、ＮＹＶＡＣ：Ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８８、２１７〜２３２、１９９２）。ＮＹＶＡＣは、様々なヒト組織培養細胞における複製能力の劇的低下によって特徴づけられるが、外因性抗原に対して強い免疫応答を誘導する能力を保持する。
【００３４】
上記のウイルスの全ては、本発明に用いるのに等しく適している。
【００３５】
本発明の最も好ましい実施形態において、ウイルスは、ワクチン接種において並外れて安全であることが知られている改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）である。
【００３６】
改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスは、ポックスウイルス科のオルソポックスウイルス属のメンバーであるワクシニアウイルスに関連している。ＭＶＡは、皮膚ワクシニア株アンカラ（漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ、ＣＶＡ）のニワトリ胚線維芽細胞における５１６回の連続継代によって作製された（概説として、Ｍａｙｒ，Ａ．ら、Ｐａｓｓａｇｅ  Ｈｉｓｔｏｒｙ：Ａｂｓｔａｍｍｕｎｇ，Ｅｉｇｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ  ｕｎｄ  Ｖｅｒｗｅｎｄｕｎｇ  ｄｅｓ  ａｔｔｅｎｕｉｅｒｔｅｎ  Ｖａｃｃｉｎｉａ−Ｓｔａｍｍｅｓ  ＭＶＡ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３、６〜１４、１９７５参照）。これらの長期継代の結果として、生じたＭＶＡウイルスは、そのゲノム配列の約３１キロベースを欠失しており、それゆえに、宿主細胞が鳥の細胞に非常に限定されていると記載された（Ｍｅｙｅｒ，Ｈ．ら、Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ＭＶＡ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｎ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２、１０３１〜１０３８、１９９１；Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ−Ｈｅｎｓｃｈｅｌら、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｓ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ，ｔｈｅ  ａｎｃｅｓｔｏｒ  ｏｆ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８８、３２４９〜３２５９、２００７）。生じたＭＶＡが有意に非病原性であることが様々な動物モデルにおいて示された（Ｍａｙｒ，Ａ．およびＤａｎｎｅｒ，Ｋ．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｏｘ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｕｎｄｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．４１：２２５〜３４、１９７８）。さらに、このＭＶＡ株は、ヒト天然痘疾患に対して免疫を与えるためのワクチンとして臨床試験で試験されている（Ｍａｙｒら、Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．Ｈｙｇ．Ｉ，Ａｂｔ．Ｏｒｇ．Ｂ  １６７、３７５〜３９０［１９８７］、Ｓｔｉｃｋｌら、ＭＶＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｍａｌｌｐｏｘ：ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｅｓｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｌｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  （ＭＶＡ）（著者の翻訳）、Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９、２３８６〜２３９２、１９７４）。これらの研究は、高リスク患者を含む１２０，０００人を超えるヒトが関与し、ワクシニアに基づいたワクチンと比較して、ＭＶＡが、良好な免疫原性を維持しながら、病原性または感染性を減少させていることを立証した。
【００３７】
本発明は、任意の全てのＭＶＡウイルスで作製された組換えＭＶＡウイルスを含む。ＭＶＡ株の例は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１０８、ＵＳＡに寄託された寄託ＶＲ−１５０８である。別の実施形態において、ＭＶＡ−Ｖｅｒｏ株またはその誘導体を本発明により用いることができる。株ＭＶＡ−Ｖｅｒｏは、寄託番号ＥＣＡＣＣ  Ｖ９９１０１４３１およびＥＣＡＣＣ  ０１０２１４１１としてＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託されている。本発明により用いられるＭＶＡウイルス株のさらなる例は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ（ＵＫ）に寄託された株ＭＶＡ５７２および５７５であり、それぞれ、寄託番号ＥＣＡＣＣ  Ｖ９４０１２７０７およびＥＣＡＣＣ  Ｖ００１２０７０７である。特に好ましいＭＶＡウイルスは、例えば、番号Ｖ０００８３００８としてＥＣＡＣＣに寄託されているようなＭＶＡ変異株ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）、およびＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）と同じ性質を有する誘導体である。
【００３８】
ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）は、独立型の第３世代天然痘ワクチンの製造に用いられるウイルスである。ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）は、ＭＶＡ株５７１／５７２からさらなる継代によって開発された。今まで、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）およびＨＩＶ感染を有する対象を含む１５００人を超える対象が、臨床試験においてＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）に基づいたワクチンでワクチン接種されている。
【００３９】
ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）の寄託株と同じ性質を有する誘導体は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）においてインビトロで繁殖的複製能力を有するが、ＭＶＡ５７５またはＭＶＡ５７２が繁殖的に複製することができるヒト細胞において繁殖的複製能力をもたない。最も好ましくは、ＭＶＡは、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴ、ヒト胚腎細胞株２９３、ヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂ、およびヒト子宮頚部腺癌細胞株ＨｅＬａにおいて繁殖的複製能力をもたない。
【００４０】
用語「繁殖的複製能力をもたない」とは、それぞれ、ＷＯ０２／４２４８０および米国特許第６，７６１，８９３号に定義されているように本出願で用いられる。したがって、前記用語は、米国特許第６，７６１，８９３号に記載されたアッセイを用いて感染後４日目において１未満のウイルス増幅率を有するウイルスに適用され、そのアッセイは参照により本明細書に組み入れられている。ウイルスの「増幅率」は、最初の段階で細胞を感染させるために元々用いられた量（供給量）に対する、感染した細胞から産生されたウイルス（産生量）の比率である。産生量と供給量との間の「１」という比率は、感染細胞から産生されたウイルスの量が、細胞を感染させるために最初に用いられた量と同じである、増幅状態と定義する。
【００４１】
最も好ましい実施形態において、本発明に用いられるＭＶＡ株は、上記のようなＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）または誘導体である。ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）の特徴、ＭＶＡ株がＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）またはその誘導体であるかどうかの評価を可能にする生物学的アッセイの記載、およびＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）またはＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）の性質を有するＭＶＡを得ることを可能にする方法は、ＷＯ０２／４２４８０に開示されている。この出願の内容は参照により本出願に含まれる。高度に弱毒化されたＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）ウイルスは、例えば、ＭＶＡ−５７２またはＭＶＡ−５７５などの改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）のさらなる継代によって、および任意選択で、プラークまたはクローン精製によって得ることができる。ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）は、祖先のＣＶＡウイルスと比較してゲノムの約１３％（６個の主要欠失部位および複数の非主要欠失部位の２６．５ｋｂ）を欠く。欠失は、いくつかの病原性遺伝子および宿主範囲遺伝子、加えて、Ａ型封入体タンパク質（ＡＴＩ）をコードする遺伝子の大きな断片、および成熟ウイルス粒子をＡ型封入体中へ導く構造タンパク質をコードする遺伝子に影響する。
【００４２】
特に、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）の性質ならびにＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）の誘導体の性質および定義などの、ＷＯ０２／４２４８０に記載の発明によるＭＶＡの性質の定義を参照する。前記参考文献はまた、どのようにＭＶＡおよび他のワクシニアウイルスを増殖させることができるかを開示している。簡単に述べれば、真核細胞をウイルスに感染させる。その真核細胞は、それぞれのポックスウイルスの感染を受けやすく、感染性ウイルスの複製および産生を可能にする細胞である。ＭＶＡについて、この型の細胞の例は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）およびＢＨＫ細胞（Ｄｒｅｘｌｅｒら、Ｈｉｇｈｌｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ  ｉｎ  ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ，ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｈｏｓｔ  ｆｏｒ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ａｎｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９、３４７〜３５２、１９９８）である。ＣＥＦ細胞は、当業者に知られている条件下で培養することができる。好ましくは、ＣＥＦ細胞を、固定フラスコまたはローラーボトルの無血清培地中で培養する。インキュベーションは、好ましくは、３７℃で４８〜９６時間、行われる。感染について、ＭＶＡは、好ましくは、０．０５〜１のＴＣＩＤ50の感染多重度（ＭＯＩ）で用いられ、インキュベーションは、好ましくは、３７℃で４８〜７２時間、行われる。
【００４３】
本発明により用いられるウイルスは、様々な細胞培養、特に動物細胞培養で増殖することができる。ウイルスは、感受性細胞培養物に感染し、繁殖的に複製することができる。子孫ウイルスは当技術分野における常法に従う技術によって収集される。
【００４４】
例えば、ＭＶＡウイルスおよび他のワクシニアウイルスに関して、血清含有または無血清培地中のニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）はウイルスに感染することができる。ウイルスを繁殖的に複製させた後、子孫ウイルスを収集する。
【００４５】
本発明はまた、２つ以上の相同ヌクレオチド配列、特にコード配列を発現する能力がある、組換えポックスウイルス、好ましくはワクシニアウイルス、特にＭＶＡに関する。ウイルスは、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の相同ヌクレオチドコード配列を含むことができる。
【００４６】
本発明のベクターは、サイズが３００ヌクレオチドの２つのヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態において、ベクターは、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を含み、主張されている２つのヌクレオチド配列も当然ながら含む。当然ながら、３００ヌクレオチドもまた、より長いヌクレオチド配列の一部であってもよい。
【００４７】
さらに、様々な実施形態において、２つ以上のヌクレオチド配列は、サイズが３００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１５００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、２５００ヌクレオチド、もしくは３０００ヌクレオチド、またはさらにそれ以上のヌクレオチドであり、それらは全て、より長いヌクレオチド配列の一部であってもよく、全て、主張されている３００ヌクレオチドを当然ながら含む。
【００４８】
本明細書に用いられる場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」は、交換可能に用いられ、ポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）分子もしくはポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）分子のいずれかのポリマー、またはそれらの任意の組合せと定義する。この定義は、一本鎖または二本鎖、直鎖状または環状の、天然または合成のポリヌクレオチドを含む。
【００４９】
本発明のヌクレオチド配列は、コード配列であってもよく、それぞれ、完全な遺伝子を含むことができる。本明細書で用いられる場合、用語「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。遺伝子の非コード配列は、イントロン、ならびにプロモーター、オペレーター、およびターミネーターなどの調節領域を含む。
【００５０】
ヌクレオチド配列はまた、遺伝子断片も含むことができる。ヌクレオチド配列は、アミノ酸リンカー配列またはエピトープをコードするヌクレオチド配列などの合成配列を含むことができる。ヌクレオチド配列は、遺伝子、遺伝子断片、および合成配列の混合物で構成することができる。ヌクレオチド配列はまた、ヌクレオチド類似体、リン酸エステル類似体、および／または五炭糖類似体などの擬似体を含んでもよい。ヌクレオチド類似体の定義には、リン酸エステル結合および／または糖リン酸エステル結合が、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンアミドおよび他のアミド（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７〜１５００；ＷＯ  ９２／２０７０２；米国特許第５，７１９，２６２号；米国特許第５，６９８，６８５号参照）；モルホリノ（例えば、米国特許第５，６９８，６８５号；米国特許第５，３７８，８４１号；米国特許第５，１８５，１４４号参照）；カルバメート（例えば、ＳｔｉｒｃｈａｋおよびＳｕｍｍｅｒｔｏｎ、１９８７、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５２：４２０２参照）；メチレン（メチルイミノ）（例えば、Ｖａｓｓｅｕｒら、１９９２、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：４００６参照）；３’チオホルムアセタール（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９９３、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８：２９８３参照）；スルファメート（例えば、米国特許第５，４７０，９６７号参照）；一般的にはＰＮＡと呼ばれる２−アミノエチルグリシン（例えば、Ｂｕｃｈａｒｄｔ、ＷＯ  ９２／２０７０２；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７〜１５００参照）；およびその他（例えば、米国特許第５，８１７，７８１号；ＦｒｉｅｒおよびＡｌｔｍａｎ、１９９７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：４４２９およびそこに引用される参考文献）などの他の型の結合で置換されているヌクレオチドもまた含まれる。リン酸エステル類似体には、（ｉ）Ｃ１〜Ｃ４アルキルホスホネート、例えば、メチルホスホネート；（ｉｉ）ホスホルアミデート；（ｉｉｉ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ホスホトリエステル；（ｉｖ）ホスホロチオエート；および（ｖ）ホスホロジチオエートが挙げられるが、それらに限定されない。
【００５１】
さらなる改変には、核酸のインビボ安定性を増加させ、その送達を促進し、または宿主対象からのクリアランス速度を低下させるための化学的改変（例えば、ＷＯ９２／０３５６８；ＵＳ５，１１８，６７２参照）が挙げられる。
【００５２】
さらに、一実施形態において、ヌクレオチド配列は、融合遺伝子、人工遺伝子、およびポリエピトープを含むことができる。
【００５３】
本明細書に示される場合、融合遺伝子は、前には別々であった２つの遺伝子、遺伝子断片、または人工ＤＮＡもしくはエピトープから形成されるハイブリッド遺伝子である。それは、転座、中間部欠失、または逆位の結果として起こり得る。
【００５４】
融合遺伝子は、少なくとも２つのＤＮＡ断片を連結することによって構築することができ、そのＤＮＡ断片は、同一または異なるアミノ酸配列をコードする。
【００５５】
融合タンパク質は、タンパク質の発現および／または精製を容易にすることができる。例えば、本発明のポリペプチドは、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）融合タンパク質として作製してもよい。そのようなＧＳＴ融合タンパク質を用いて、グルタチオン誘導体化マトリックスの使用などによって本発明のポリペプチドの精製を簡単にすることができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編（Ｎ．Ｙ．：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９１）参照）。別の実施形態において、組換えタンパク質の所望の部分のＮ末端におけるポリ（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列などの精製リーダー配列をコードする融合遺伝子によって、Ｎｉ２＋金属樹脂を用いるアフィニティークロマトグラフィーによる発現した融合タンパク質の精製を可能にすることができる。その後、続いて、精製リーダー配列をエンテロキナーゼでの処理によって除去し、精製タンパク質を提供することができる（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら、（１９８７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１：１７７；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：８９７２参照）。融合しているポリペプチドの検出、単離、可溶化、および／または安定化を可能にするポリペプチドをコードするさらなる異種性配列として、ポリＨｉｓタグ、ｍｙｃ、ＨＡ、プロテインＡ、プロテインＧ、カルモジュリン結合ペプチド、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質、ポリアルギニン、ポリＨｉｓ−Ａｓｐ、ＦＬＡＧ、免疫グロブリンタンパク質の一部、およびトランスサイトーシスペプチドが挙げられる。
【００５６】
融合遺伝子を作製するための技術はよく知られている。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の結合は、ライゲーションのための平滑末端または突出末端、適切な末端を提供する制限酵素消化、必要に応じての付着末端の充填、望ましくない結合を避けるためのアルカリフォスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを利用する通常の技術に従って行われる。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む通常の技術によって合成することができる。あるいは、後で２つの遺伝子断片がアニーリングされて、キメラ遺伝子配列を生じることができる２つの連続した遺伝子断片の間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：  １９９２参照）、および２つ以上のポリヌクレオチドが、ＰＣＲ反応において結果として、融合したポリヌクレオチド配列を生じることができる同一の区間を共有している融合ＰＣＲによって、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行ってもよい。
【００５７】
別の好ましい実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、ポリエピトープをコードする。ポリエピトープは、少なくとも１つのタンパク質／抗原から、好ましくは２つ以上のタンパク質／抗原から単離されたエピトープを含むキメラタンパク質である。
【００５８】
前記エピトープは、「単離されたもの」、または「生物学的に純粋」であり得る。用語「単離された」は、その天然の環境において見出されるような通常それに付随する成分を実質的に含まない材料を指す。「単離された」エピトープは、エピトープが由来した抗原またはタンパク質の全体配列の隣接するアミノ酸を含まないエピトープを指す。
【００５９】
特定のアミノ酸配列に関して、「エピトープ」は、特定の免疫グロブリンによる認識に関与する１セットのアミノ酸残基であり、またはＴ細胞との関連において、Ｔ細胞受容体タンパク質および／または主要組織適合抗原（ＭＨＣ）分子による認識に必要なアミノ酸残基である。用語「ペプチド」は、典型的には隣接したアミノ酸のアミノ基とカルボキシル基の間のペプチド結合によって、互いに接続した一連のアミノ酸を意味する。
【００６０】
エピトープは、特定の長さをもち、免疫系において機能する分子、好ましくは、ＨＬＡクラスＩおよびＴ細胞受容体に結合する。ポリエピトープ構築物におけるエピトープは、ＨＬＡクラスＩエピトープおよび任意選択で、ＨＬＡクラスＩＩエピトープであり得る。ＨＬＡクラスＩエピトープは、ＣＴＬエピトープと呼ばれ、ＨＬＡクラスＩＩエピトープは、ＨＴＬエピトープと呼ばれる。いくつかのポリエピトープ構築物は、ＨＬＡクラスＩエピトープのサブセット、およびＨＬＡクラスＩＩエピトープの別のサブセットを有し得る。ＣＴＬエピトープは、通常、長さが１３個以下のアミノ酸残基、長さが１２個以下のアミノ酸残基、または長さが１１個以下のアミノ酸残基、好ましくは長さが８〜１３個のアミノ酸、最も好ましくは、長さが８〜１１個（すなわち、８個、９個、１０個、または１１個）のアミノ酸からなる。ＨＴＬエピトープは、長さが５０個以下のアミノ酸残基、一般には６〜３０個の残基、より一般には１２〜２５個からなり、好ましくは長さが１５〜２０個（すなわち、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個）のアミノ酸からなる。本発明のポリエピトープ構築物は、好ましくは２個以上、５個以上、１０個以上、１３個以上、１５個以上、２０個以上、または２５個以上のＣＴＬエピトープを含む。より具体的には、ポリエピトープ構築物は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５５個、６０個、またはそれ以上のＣＴＬエピトープを含む。
【００６１】
本発明による相同ヌクレオチド配列は、任意のウイルス、任意の細菌、任意の真菌、または寄生虫などの任意の生物体、微生物由来であり得る。相同ヌクレオチド配列は、ベクターの配列に対して非相同であり得るだけでなく、それらと相同でもあり得る。例えば、ウイルスがベクターとして用いられる場合、ウイルス自体のヌクレオチド配列も、例えば、免疫反応性または安全性を増強させるためにウイルスのタンパク質を過剰発現するために、本発明に従って多重化することができる。好ましくは、相同ヌクレオチド配列は、感染性または病原性微生物由来、最も好ましくは前記微生物の異なる株またはクレード、変異体、サブタイプまたは血清型由来である。用語「株」または「クレード」は、当業者にとってよく知られた技術用語であり、微生物の分類を指す。分類学的体系は、これまで特徴づけられた微生物の全てを、科、属、種、株の階層的部類へ分類する（Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｂ．Ｎ．編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、第４版  ２００１）。科のメンバーについての基準はそれらの系統発生的関係であるが、属は、共通の特徴を共有する全メンバーを含み、種は、複製系統を構成し、特定の生態学的地位を占有する多形質的クラスとして定義される。用語「株」または「クレード」は、基本的形態またはゲノム構造および組織のような共通の特徴を共有するが、宿主範囲、組織親和性、地理的分布、弱毒化、または病原性のような生物学的性質の点で異なる微生物、すなわち、ウイルスを記述する。用語「変異体」または「血清型」は、同じ株のメンバー間をさらに区別し、サブタイプとも呼ばれ、小さなゲノム変異による個々の感染スペクトルまたは抗原性を示す。
【００６２】
本発明のさらなる実施形態によれば、相同ヌクレオチド配列は、好ましくは、ウイルスから選択される。ウイルスの代表的例として、限定するものではないが、ＨＩＶ（ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ１またはＨＳＶ２）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＥ型肝炎ウイルス）、フラビウイルス（例えば、黄熱病ウイルス）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、パラミクソウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザ、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、およびパピローマウイルスが挙げられる。
【００６３】
別の実施形態によれば、相同ヌクレオチド配列は、デングウイルス遺伝子から選択される。最も好ましいのは、そのウイルスの異なる血清型由来の相同遺伝子であり、前記遺伝子は、４つのデングウイルス血清型の１つ、２つ、３つ、または全部に由来し得る。
【００６４】
好ましい実施形態において、２つの相同ヌクレオチド配列は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）遺伝子をコードする。好ましい実施形態において、相同ヌクレオチド配列は、ＲＳＶ−Ｆおよび／またはＲＳＶ−Ｇタンパク質をコードする。好ましくは、ＲＳＶ遺伝子の一方は完全長であり、他方は切断されている。
【００６５】
別の好ましい実施形態において、２つ、好ましくは３つの相同ヌクレオチド配列は、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）タンパク質をコードする。エボラウイルス（ＥＢＯＶ）タンパク質をコードする３つの相同ヌクレオチド配列には、当然ながら、２つの相同ヌクレオチド配列も含まれる。好ましい実施形態において、相同ヌクレオチド配列は、ＥＢＯＶ糖タンパク質（ＧＰ）をコードする。特に好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＥＢＯＶ株のＥＢＯＶ−Ｂ（Ｂｕｎｄｉｂｕｇｙｏ）、ＥＢＯＶ−Ｓ（スーダンエボラウイルス株Ｇｕｌｕ）、およびＥＢＯＶ−Ｚ（ザイールエボラウイルス株Ｍａｙｉｎｇａ）由来の糖タンパク質前駆体タンパク質をコードする。
【００６６】
別の実施形態において、相同ヌクレオチド配列は、細菌から選択される。適切な細菌の代表的例として、限定するものではないが、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（例えば、Ｎ．ゴノレー（ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）およびＮ．メニンギティディス（ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））；ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）（例えば、Ｂ．パータシス（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、Ｂ．パラパータシス（ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）およびＢ．ブロンキセプチカ（ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ））、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）（例えば、Ｍ．ツベルクローシス（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．ボビス（ｂｏｖｉｓ）、Ｍ．レプレ（ｌｅｐｒａｅ）、Ｍ．アビウム（ａｖｉｕｍ）、Ｍ．パラツベルクローシス（ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．スメグマチス（ｓｍｅｇｍａｔｉｓ））；レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）（例えば、Ｌ．ニューモフィラ（ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ））；エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、腸毒素性Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）、腸管出血性Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）、腸病原性Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ））；シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）（例えば、Ｓ．ソネイ（ｓｏｎｎｅｉ）、Ｓ．ディゼンテリエ（ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、Ｓ．フレックスネリ（ｆｌｅｘｎｅｒｉｉ））；サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（例えば、Ｓ．チフィ（ｔｙｐｈｉ）、Ｓ．パラチフィ（ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、Ｓ．コレレスイス（ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、Ｓ．エンテリティディス（ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ））；リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）（例えば、Ｌ．モノサイトゲネス（ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））；ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、Ｈ．ピロリ（ｐｙｌｏｒｉ））；シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、Ｐ．エルギノーサ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））；スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、Ｓ．アウレウス（ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．エピデルミディス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ））；エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、Ｅ．フェカリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）、Ｅ．フェシウム（ｆａｅｃｉｕｍ））；バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、Ｂ．アントラシス（ａｎｔｈｒａｃｉｓ））；コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えば、Ｃ．ジフテリエ（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ））、およびクラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）（例えば、Ｃ．トラコマティス（ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、Ｃ．ニューモニエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｃ．シタッシ（ｐｓｉｔｔａｃｉ））が挙げられる。寄生虫の代表的例として、限定するものではないが、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）（例えば、Ｐ．ファルシパルム（ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ））；トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）（例えば、Ｔ．ゴンディ（ｇｏｎｄｉｉ））；リーシュマニア属（Ｌｅｓｈｍａｎｉａ）（例えば、Ｌ．メジャー（ｍａｊｏｒ））；ニューモシスチス属（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）（例えば、Ｐ．カリニ（ｃａｒｉｎｉｉ））；およびシストソーマ属（Ｓｃｈｉｓｏｓｔｏｍａ）（例えば、Ｓ．マンソニ（ｍａｎｓｏｎｉ））が挙げられる。真菌の代表的例として、限定するものではないが、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）（例えば、Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ））およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）が挙げられる。
【００６７】
少なくとも２つのヌクレオチド配列は、同じサイズまたは異なるサイズであり得る。好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列の一方は、他方に比べて切断されている。切断は５’末端または３’末端であり得る。
【００６８】
様々な実施形態において、２つのヌクレオチド配列の３００ヌクレオチドは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸同一性を有する１００アミノ酸をコードする。好ましい実施形態において、前記アミノ酸同一性は、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、もしくは１０００個、またはそれ以上の連続したアミノ酸の区間の範囲内である。
【００６９】
特に好ましい実施形態において、アミノ酸は、少なくとも１５０個または２００個の連続したアミノ酸の区間の範囲内で少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸同一性を有する。
【００７０】
他の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質は、３００個または５００個の連続したアミノ酸の区間の範囲内で少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸同一性を有する。他の好ましい実施形態において、少なくとも２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質は、ペアワイズ比較において１００個、２００個、４００個、６００個、または８００個の連続したアミノ酸の区間の範囲内で８５％〜１００％、特に１００％のアミノ酸同一性を有する。
【００７１】
本明細書に用いられる場合、「アミノ酸同一性」などの「パーセント配列同一性」を指す任意の用語は、任意の所与の問い合わせ配列と対象配列の間の同一性の程度を指す。
【００７２】
特に、以下の用語は、２つ以上の核酸、ポリヌクレオチド、またはアミノ酸配列の間の配列関係を記載するために用いられる：「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的な同一性」。「参照配列」は、配列比較の基準として用いられる定義済みの配列である；参照配列はより大きい配列のサブセットであってもよい。
【００７３】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の関連において、用語「同一の」またはパーセント「同一性」は、配列比較アルゴリズムを用いて、または手作業のアラインメントおよび視覚的検査によって測定する場合、比較ウィンドウまたは指定領域に対して比較し、最大限一致するように整列させたとき、同じである、または同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定のパーセンテージ（例えば、ペアワイズ比較における７５％の同一性、８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９９％の同一性、または１００％の同一性）を有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置数を決定して、マッチした位置数を出し、そのマッチした位置数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを出すことによって計算される。
【００７４】
２つの核酸またはポリペプチドの関連において、句「実質的に同一の」は、配列比較アルゴリズムを用いて、または視覚的検査によって測定する場合、比較し、最大限一致するようにペアワイズで整列させたとき、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。例示的な実施形態において、実質的な同一性は、長さが少なくとも約５０個の残基である配列の領域に対して存在する。別の例示的な実施形態において、実質的な同一性は、長さが少なくとも約１００個の残基である配列の領域にわたって存在する。さらに別の例示的な実施形態において、実質的な同一性は、長さが少なくとも約１５０個の残基またはそれ以上である配列の領域にわたって存在する。１つの例示的な実施形態において、配列は、核酸またはタンパク質配列の全長にわたって実質的に同一である。
【００７５】
配列比較について、典型的には、１つの配列が参照配列として働き、その参照配列対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列は、コンピュータに入力され、必要ならば、部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータを用いることができ、または代替のパラメータを指定することができる。その後、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータに基づいて参照配列に対する試験配列についてのパーセント配列同一性を計算する。
【００７６】
本明細書で用いられる場合、「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適に整列させた後、配列が、連続した位置の同じ数の参照配列と比較され得る、２０〜６００、一般には２０〜５０、約５０〜約１００、約１００〜約２００、より一般には約１００〜約１５０、または約２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、もしくは３０００、またはさらにそれ以上からなる群から選択される連続した位置の数の任意の１つのセグメントへの参照を含む。
【００７７】
パーセント同一性は、Ｓｅｌｌｅｒｓ（ＳＩＡＭ  Ｊ．ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ２６；７８７〜７９３（１９７４））と等価であることが示されているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアラインメント方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８；４４３〜４５３（１９７０））を用いて決定することができる。パーセント同一性は、例えば、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７、１９８４）によって記載され、このアラインメント方法を活用するＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から利用できるＧＡＰコンピュータプログラム、バージョン６．０を用いて配列情報を比較することによって決定することができる。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメータには、（１）ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ編、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、３５３〜３５８ページ、１９７９に記載されているように、ヌクレオチドについての単項比較行列（同一について１の値、非同一について０の値を含む）、ならびにＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５、１９８６の重みつき比較行列、（２）各ギャップについて３．０のペナルティ、および各ギャップにおける各シンボルについて追加の０．１０のペナルティ、ならびに（３）末端ギャップについてのペナルティなしを含む。他の適切なツールは、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅプログラム（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）からのＣｏｎｔｉｇＥｘｐｒｅｓｓ、例えば、２００７年のバージョン１０．３．１を用いることである。
【００７８】
本発明によれば、分子内組換えを防ぐために、遺伝暗号の縮重を用いて相同または同一のヌクレオチド配列をより低い相同性にする。前記の相違は、本来ヌクレオチド配列にすでに含まれていてもよく、および／または置換によって人工的に含まれる。様々な実施形態において、天然から、さらに人工的置換から得られる異なるヌクレオチドの数は、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００である。好ましくは、異なる塩基の数は、少なくとも７５、２００、または４５０である。相違の数は、当然ながら、ヌクレオチド配列のヌクレオチドの数と共に、それぞれ、変動し、増加する。
【００７９】
好ましい実施形態において、少なくとも７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、または５００個のヌクレオチドが置換される。前記置換は、例えば、サイレント突然変異によって含まれていた、すでに存在する異なるヌクレオチドの数とは無関係に人工的に導入される。
【００８０】
様々な実施形態において、置換後わずか１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、または４個の連続したヌクレオチドの同一の区間を有する２つのヌクレオチド配列が好ましい。２つより多いヌクレオチド配列の場合、置換後わずか２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、または４個の連続したヌクレオチドの同一の区間が好ましい。
【００８１】
別の実施形態において、ヌクレオチド配列は、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１００個、１１００個、１２００個、１３００個、１４００個、１５００個、もしくは１６００個、またはそれ以上のヌクレオチドの中から置換された少なくとも７５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、または４５０個のヌクレオチドを有し得る。
【００８２】
本発明の関連において、異なるヌクレオチドでのヌクレオチドの置換とは、他のヌクレオチドによるヌクレオチドの技術的または人工的置き換えを意味する。好ましくは、置換されたヌクレオチドは、コードされたアミノ酸配列を変化させない。置換は、同じアミノ酸をコードする２つの相同ヌクレオチド配列においてコドンを同定し、２つの相同ヌクレオチド配列のうちの１つにおけるコドンを、コドンがその後もなお同じアミノ酸をコードするように変化させることによって行うことができる。相同ヌクレオチド配列の１つ、両方、または全部において変化を生じさせることができる。
【００８３】
例えば、アミノ酸プロリンは、コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、およびＣＣＵ（ＤＮＡレベルにおいて、ＵはＴに置き換えられる）によってコードされる。２つの相同ヌクレオチド配列において最初は２つのプロリンをコードする単純なヌクレオチド配列、ＣＣＣＣＣＣを、２つの相同ヌクレオチド配列のうちの１つにおいて、やはり２つのプロリンをコードするＣＣＡＣＣＧに変化させることができる。あるいは、プロリン−プロリンをコードする配列の一方をＣＣＣＣＣＧへ変化させ、他方をＣＣＡＣＣＣへ変化させることができる。
【００８４】
より複雑な例は、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ、ＡＧＣ、およびＡＧＵによってコードされるアミノ酸セリンである。同様に、最初は２つの異なるセリンをコードするＵＣＡＵＣＡが複数の相同配列において、（ＵＣＡＵＣＡと共通のヌクレオチドを共有しない）ＡＧＣＡＧＣおよび（ＵＣＡＵＣＡと１つの位置のみを、またはＡＧＣＡＧＣと２つの位置を共有する）ＵＣＧＡＧＵなどへ変化させることができる。このことは、セリン−セリンをコードする２つ以上のヌクレオチド配列へ異なるヌクレオチド変異体を導入するのに、より高い融通性を可能にする。
【００８５】
好ましくは、稀なコドンがコードされたタンパク質の発現を遮断または低減する可能性があるため、本発明に記載されているコドン最適化は、所望の宿主にとって稀なコドンの使用を避ける。同様に、所望の宿主の核酸シグナルを導入する可能性のある置換は、避けることが好ましい。そのようなシグナルとして、スプライスシグナル、終結シグナル、および開始シグナルが挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、以下の配列モチーフは、用いられるベクターの型に応じて避ける場合があり、例えば、ワクシニアウイルス初期転写終結シグナルは、ポックスウイルスベクターではない多くの他のベクターにおいて避ける必要はない：
−  内部ＴＡＴＡボックス、カイ（ｃｈｉ）部位、およびリボソーム進入部位、
−  ＡＴリッチ配列およびＧＣリッチ配列区間、
−  ＡＲＥ、ＩＮＳ、およびＣＲＳ配列エレメント、
−  反復配列およびＲＮＡ二次構造、
−  （潜在性）スプライス供与部位と受容部位、および分岐点、ならびに、
−  ワクシニア初期転写終結シグナル：（ＴＴＴＴＴＮＴ）。
【００８６】
本発明は、図面を参照してより完全に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】完全長ＲＳＶ−Ｆ（Ｆ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列の、置換された切断型ＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃ（Ｆ＿ｔｒｕｎｃ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列とのアラインメントを示す図である。同一の配列は黒色で強調し、置換されたヌクレオチドは強調していない。プライマーＡ１およびＢ２の位置が示されている。
【図２】完全長ＲＳＶ−Ｆ（Ｆ）タンパク質の切断型ＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃ（Ｆ＿ｔｒｕｎｃ）タンパク質とのアラインメントを示す図である。ＲＳＶ−Ｆの完全長配列は、５０アミノ酸が切断され、結果として、切断型ＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃタンパク質を生じる。ＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃタンパク質には、完全長タンパク質の約９１％が含まれる。
【図３】ヒト細胞株における組換えＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）ウイルスのＲＳＶ−ＦおよびＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃの発現を示す図である。ＭＯＩが１０の異なるＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）に基づいたウイルスによる感染および感染後２４時間での溶解時の、感染したヒト細胞からの抽出物を用いたウェスタンブロット。ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）（空ベクター対照、レーン１）、ＭＶＡ−ｍＢＮ１７２Ｂ（完全長ＲＳＶ−Ｆを有する組換えＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）、レーン２）、ＭＶＡ−ｍＢＮ１７３Ｂ（切断型ＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃを有する組換えＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）、レーン３）、およびレーン４：ＭＶＡ−ｍＢＮ１７５Ｂ（ＲＳＶ−ＦおよびＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃを有する組換えＭＶＡ−ＢＮ（登録商標））。タンパク質の計算された分子量は、ＲＳＶ−Ｆ（６１．６ｋＤａ）およびＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃ（５６．１ｋＤａ）である。
【図４】ＭＶＡ−ｍＢＮ１７５ＢのＰＣＲ分析を示す図である。ＲＳＶ−Ｆ（Ｆ）およびＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃ（Ｆ＿ｔｒｕｎｃ）が示されている。Ａ：様々なプライマー対でのＰＣＲ結果。Ｍ＝マーカー（１ｋｂ−ラダー、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）。レーン１はＭＶＡ−ｍＢＮ１７５Ｂである。レーン２は、陽性対照プラスミド（ｐＢＮ３４５）である。レーン３は、ＭＶＡ−ｍＢＮ（登録商標）である。レーン４は水対照である。レーン５は陽性対照プラスミド（ｐＢＮ３４３）である。Ｂ：図４Ａに示されたＰＣＲに用いられたプライマーの位置を示すＭＶＡ−ｍＢＮ１７５Ｂの概略図。Ｃ：プライマーの位置を示す野生型ＭＶＡ−ｍＢＮ（登録商標）の概略図。
【図５】二重組換えＭＶＡにおける完全長ＲＳＶ−Ｆ遺伝子（Ｆ）と切断型Ｆ遺伝子（Ｆtrunc）の間の推定組換えＦ／Ｆtrunc、ならびに組換えウイルスおよび非組換えウイルスおよび対照プラスミドにおけるＰＣＲプライマーの位置を示す図である。Ａ：ＭＶＡ−ｍＢＮ１７５Ｂ。Ｂ：ｐＭＩＳＣ１７３。Ｃ：ｐＭＩＳＣ１７２。
【図６】ＭＶＡ−ｍＢＮ１７５Ｂに感染した細胞から単離されたＤＮＡのＰＣＲ分析を示す図である。レーン１および７はマーカーレーンである。レーン２はＭＶＡ−ｍＢＮ１７５Ｂである。レーン３はＦ遺伝子についてのプラスミド対照（ｐＢＮ３４３）である。レーン４は切断型Ｆ遺伝子についてのプラスミド対照（ｐＢＮ３４５）である。レーン５はＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）である。レーン６は水対照である。ＭＶＡ−ｍＢＮ１７５ＢにおけるＲＳＶ−Ｆ遺伝子と切断型Ｆ遺伝子ＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃの間の推定組換えから予想されるＰＣＲ産物は６１３塩基対である。
【図７】３つのＥＢＯＶ（エボラウイルス）ＧＰ（糖タンパク質）タンパク質配列のアラインメントを示す図である。エボラウイルス株、ＥＢＯＶ−Ｂ、ＥＢＯＶ−Ｓ、およびＥＢＯＶ−Ｚの３つのＧＰタンパク質のアミノ酸配列を整列させている。アラインメントにおいてギャップを許容しなかった。全ての３つのタンパク質配列における全体の同一性は４８．５％である。灰色の背景：全ての３つのタンパク質配列において同一。黒色の背景：２つのタンパク質において同一。
【図８】組換えＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）に基づいた構築物に用いられた３つのＥＢＯＶ  ＧＰコード配列のアラインメントを示す図である。最適化前（ｎｏｎ−ｏｐｔ、図８Ａ参照）と最適化後（ｏｐｔ、図８Ｂ参照）の３つのＥＢＯＶ株、ＥＢＯＶ−Ｂ、ＥＢＯＶ−Ｓ、およびＥＢＯＶ−Ｚに由来するＧＰ遺伝子のコード配列を整列させた。アラインメントにおいてギャップを許容しなかった。灰色の背景：３つのコード配列において同一のヌクレオチド位置。黒色の背景：２つのコード配列において同一のヌクレオチド位置。最適化前（ｎｏｎ−ｏｐｔ）の３つの遺伝子のヌクレオチド位置における同一性は４５．３％であるが、最適化後（ｏｐｔ）は４４．６％である。
【図９】組換えＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）に基づいた構築物に用いられた３つのＥＢＯＶ  ＧＰコード配列のペアワイズアラインメントを示す図である。最適化前（ｎｏｎ−ｏｐｔ、図９Ａ参照）と最適化後（ｏｐｔ、図９Ｂ参照）の３つのＥＢＯＶ株、ＥＢＯＶ−Ｂ、ＥＢＯＶ−Ｓ、およびＥＢＯＶ−Ｚに由来するＧＰ遺伝子のコード配列をペアワイズで整列させた。アラインメントにおいてギャップを許容しなかった。灰色の背景：コード配列において同一のヌクレオチド位置。最適化前（ｎｏｎ−ｏｐｔ）および最適化後（ｏｐｔ）の３つの遺伝子のヌクレオチド位置における同一性は、表Ｃに一覧にされている。
【図１０】完全長（ＲＳＶ−Ｆ）タンパク質および切断型（ＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃ）タンパク質を含むプラスミドｐＭＩＳＣ２１０の制限酵素消化およびプラスミドマップを示す図である。レーン１：ＲＳＶ−ＦおよびＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃを含むプラスミドｐＭＩＳＣ２１０、レーン２：ＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃのみを含む対照プラスミドｐＭＩＳＣ２０９、レーン３：分子量マーカー。マーカーバンドのサイズが塩基対（ｂｐ）で示されている。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００８８】
置換された切断型Ｆ遺伝子の調製
完全長ＲＳＶ−Ｆタンパク質および切断型ＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃの両方を発現する組換えＭＶＡの作製が望まれた。しかしながら、反復配列を含むＭＶＡおよび他のワクシニアウイルスでの結果に基づいて、分子内組換えが、Ｆ遺伝子の２コピー間での組換えをもたらし、結果として、Ｆ遺伝子のコピーのうちの１つの欠失を生じるであろうことが予想された。
【００８９】
２つのＦ遺伝子の間で同一のヌクレオチドの長い区間の存在を最小限にするために、ＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃ遺伝子をコードするヌクレオチド配列におけるコドンを、Ｆ遺伝子のアミノ酸配列を維持しながら、置換した。哺乳動物およびニワトリにとって稀なコドンの使用を避けた。核酸シグナルを導入する可能性がある置換も避けた。そのようなシグナルには、内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位、およびリボソーム進入部位；ＡＴリッチ配列およびＧＣリッチ配列区間；ＡＲＥ、ＩＮＳ、およびＣＲＳ配列エレメント；反復配列およびＲＮＡ二次構造；（潜在性）スプライス供与部位および受容部位、および分岐点；ならびにワクシニア終結シグナル：（ＴＴＴＴＴＮＴ）が挙げられた。置換されたヌクレオチド配列は、完全長ＲＳＶ−Ｆタンパク質のコード配列と比較して、図１に示されている。２つのコード配列の全体でかなりの同一性が残っているが、２つのコード配列内で９個の連続したヌクレオチドより長い同一の大きな区間は残っていない。２つのコード配列によってコードされるタンパク質は図２に整列させている。２つのタンパク質は、最初の５２４アミノ酸で１００％の同一性を有する（置換されたＦタンパク質はカルボキシ末端で切断されている）。したがって、これらの２つのコードヌクレオチド配列は、同一のアミノ酸の区間をコードするが、その配列の一方は、他方に対して置換されている。
【実施例２】
【００９０】
ＲＳＶ−Ｆ遺伝子を含む組換えウイルスの調製
完全長ＲＳＶ−Ｆ遺伝子をコードするＤＮＡを、ＭＶＡの２つの異なる組み込み部位に挿入し、ＭＶＡ−ｍＢＮ１７０ＢおよびＭＶＡ−ｍＢＮ１７２Ｂを作製した（ＩＧＲ８８／８９部位において）。置換されたＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃ遺伝子をＭＶＡのＩＧＲ１４８／１４９部位に挿入し、ＭＶＡ−ｍＢＮ１７３Ｂを作製した。
【００９１】
その後、ＭＶＡのＩＧＲ８８／８９部位へ挿入された完全長ＲＳＶ−Ｆ遺伝子、および同じＭＶＡのＩＧＲ１４８／１４９部位へ挿入された置換されたＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃ遺伝子を含む二重組換えＭＶＡを作製した。二重組換えウイルスをＭＶＡ−ｍＢＮ１７５Ｂと命名した。このウイルスの概略図は図４Ｂに示されている。
【実施例３】
【００９２】
組換えウイルスからのＦタンパク質の発現
タンパク質が、置換されたヌクレオチド配列から発現するかどうかを決定するために、完全長ＲＳＶ−Ｆ遺伝子をコードする組換えＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）に基づいたウイルス（ＭＶＡ−ｍＢＮ１７２Ｂ）、置換されたＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃ遺伝子をコードするウイルス（ＭＶＡ−ｍＢＮ１７３Ｂ）、および完全長とＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃ遺伝子の両方をコードする二重組換えウイルス（ＭＶＡ−ｍＢＮ１７５Ｂ）に感染したヒト細胞株からのタンパク質抽出物についてウェスタンブロット分析を行った。全ての３つのウイルスは、ウェスタンブロット分析により適切なサイズをもったＲＳＶ−Ｆタンパク質の産生を示したが（図３）、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）対照（空ベクター）は、予想通り、いかなるバンドも示さなかった。したがって、完全長タンパク質、および置換されたコードヌクレオチド配列から発現した切断型Ｆタンパク質が、ヒト細胞株において、単一組換えＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）から個々に発現したが、両方はまた、１つの二重組換えＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）ウイルス（ＭＶＡ−ｍＢＮ１７５Ｂ）からも同時発現した。
【実施例４】
【００９３】
組換えウイルスの増殖
完全長Ｆ遺伝子および置換されたＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃ遺伝子の両方を含む構築物であるＭＶＡ−ｍＢＮ１７５Ｂ、または完全長Ｆ遺伝子のみを含む構築物を、ニワトリ胚線維芽細胞に感染させ、最初のウイルス粗製ストックを得た。完全長Ｆ遺伝子のみを含むウイルスの力価（１．４６×１０7  ＴＣＩＤ５０）と比較して、完全長Ｆ遺伝子および切断型Ｆ遺伝子の両方を含む二重組換えウイルスの類似の力価（１．３４×１０7  ＴＣＩＤ５０）が見られた。これらの結果は、安定な二重組換えＭＶＡが産生されていること、およびＦ遺伝子の２つのコピー間での組換えが、配列におけるヌクレオチド塩基を置換することによって制限されていることを示した。
【実施例５】
【００９４】
組換えウイルスのＰＣＲ分析
ＭＶＡ−ｍＢＮ１７５ＢまたはＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）に感染した細胞由来のＤＮＡについて、図４Ｂおよび図４Ｃに示された挿入断片（insert）特異的および隣接領域（flank）特異的プライマー対を用いてＰＣＲ分析を行った。完全長Ｆ遺伝子に特異的であるプライマーＡ１／Ａ２でのＰＣＲ  Ａにより、予想通り、ＭＶＡ−ｍＢＮ１７５Ｂに感染した細胞、および特定のプラスミド陽性対照において６６３塩基対（ｂｐ）のサイズのバンドが検出された。このバンドは、予想通り、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）に感染した細胞、または水対照には存在しない（図４Ａ）。置換された切断型Ｆ遺伝子に特異的であるプライマーＢ１／Ｂ２でのＰＣＲ  Ｂにより、予想通り、ＭＶＡ−ｍＢＮ１７５Ｂに感染した細胞、および特定のプラスミド陽性対照において６２５ｂｐのサイズのバンドが検出された。このバンドは、予想通り、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）に感染した細胞、または水対照には存在しない（図４Ａ）。ＩＧＲ８８／８９部位への挿入断片を検出するプライマーＣ１／Ｃ２でのＰＣＲ  Ｃにより、予想通り、ＭＶＡ−ｍＢＮ１７５Ｂに感染した細胞、および特定のプラスミド陽性対照において２０４７ｂｐのサイズのバンドが検出された。このバンドは、予想通り、空ベクター対照ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）に感染した細胞には存在せず、代わりに、１６１ｂｐのバンドがＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）におけるＩＧＲ８８／８９での野生型の状況を示している（図４Ａ）。ＩＧＲ１４８／１４９部位への挿入断片を検出するプライマーＤ１／Ｄ２でのＰＣＲ  Ｄにより、予想通り、ＭＶＡ−ｍＢＮ１７５Ｂに感染した細胞、および特定のプラスミド陽性対照において２０６２ｂｐのサイズのバンドが検出された。このバンドは、予想通り、空ベクター対照ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）に感染した細胞には存在せず、代わりに、３６０ｂｐのバンドがＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）におけるＩＧＲ８８／８９での野生型の状況を示している（図４Ａ）。
【００９５】
Ｆ遺伝子間の組換えは、野生型Ｆ遺伝子の部分および切断型Ｆ遺伝子の部分を有するハイブリッドＦ遺伝子を生じたであろう（図５Ａ）。そのような組換え体の存在を検出するために、ＭＶＡ−ｍＢＮ１７５ＢまたはＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）に感染した細胞由来のＤＮＡについて、組換えＦ遺伝子に特異的な６１３塩基対産物を生成するはずであるプライマー対Ａ１／Ｂ２を用いてＰＣＲ分析を行った（図５Ｂ）。このＰＣＲの結果により、検出可能な組換え体は示されなかった（図６）。これらの結果により、安定な二重組換えＭＶＡが産生されていること、およびＦ遺伝子の２つのコピーの間の組換えが制限されたことが示された。
【実施例６】
【００９６】
３つの異なるエボラウイルス（ＥＢＯＶ）株の組換え糖タンパク質（ＧＰ）遺伝子の調製
３つのエボラウイルス（ＥＢＯＶ）糖タンパク質（ＧＰ）を発現する組換えＭＶＡの作製が望まれた。本明細書で用いられるＥＢＯＶ株はＥＢＯＶ−Ｂ（Ｂｕｎｄｉｂｕｇｙｏ）、ＥＢＯＶ−Ｓ（スーダン）、およびＥＢＯＶ−Ｚ（ザイール）であり、全て、感染したヒトにおいて高致死性を有するウイルス株に属する。前記３つのＧＰは、４８．５％の全体の同一性を共有し、全ての３つの株においてＧＰタンパク質のほぼ２つに１つのアミノ酸が同一であることを示しているが、２つの株の組合せの比較における完全長タンパク質配列のパーセント同一性は５７．０％〜６４．２％である（図７）。
【００９７】
３つのＥＢＯＶ  ＧＰ遺伝子内の同一ヌクレオチドの長い区間の存在を最小限にするために、３つのヌクレオチド配列におけるコドンを、その３つのＧＰ遺伝子のコードされたアミノ酸配列を維持しながら、置換した。哺乳動物およびニワトリにとって稀なコドンの使用、ならびに核酸シグナルを導入し得る置換を避けた。そのようなシグナルには、内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位、およびリボソーム進入部位；ＡＴリッチ配列およびＧＣリッチ配列区間；ＡＲＥ、ＩＮＳ、およびＣＲＳ配列エレメント；反復配列およびＲＮＡ二次構造；（潜在性）スプライス供与部位および受容部位、および分岐点；ならびにワクシニア終結シグナル（ＴＴＴＴＴＮＴ）が挙げられた。ＡＴＧ開始コドンの後のＧは高発現を可能にし、全ての３つのＥＢＯＶ  ＧＰ遺伝子の最初のコード配列に存在し、維持された。
【００９８】
３つの最適化ＥＢＯＶ  ＧＰコード配列のそれぞれにおけるヌクレオチドの２３．３〜２４．９％を交換したが（表Ａ参照）、３つのＧＰコード配列間の全体の同一性は、劇的には変化しなかった（表Ｂ）。２つの例では、ペアワイズ比較は、下記の表Ｂに示されているように、コード配列の最適化後、わずかに高い同一性さえ示した。
【００９９】
表Ａ：３つの最適化ＥＢＯＶ  ＧＰ遺伝子におけるヌクレオチド交換。表は、ヌクレオチドの総数に基づいた、異なるＥＢＯＶ株の非最適化（ｎｏｎ−ｏｐｔ）配列と比較して、最適化ＧＰコード配列（ｏｐｔ）における対応する位置の変化したヌクレオチドの数を［％］で示す。ヌクレオチドの総数は１１４７個である。
【０１００】
【表１】
2012509073.tif 000003
【０１０１】
表Ｂ：３つのＥＢＯＶ  ＧＰコード配列の同一のヌクレオチドの位置。表は、ヌクレオチドの総数に基づいた、異なるＥＢＯＶ株の２つのＧＰコード配列における対応する位置の同一ヌクレオチドの数を［％］で示す。
【０１０２】
【表２】
2012509073.tif 000004
【０１０３】
３つのＥＢＯＶ株、ＥＢＯＶ−Ｂ、ＥＢＯＶ−Ｓ、およびＥＢＯＶ−ＺのＧＰコード配列のペアワイズアラインメントは、ヌクレオチド位置における同一性および同一性の分布を示した（図９）。結果として、本発明の方法は、ＥＢＯＶ  ＧＰ配列においてより短い区間のヌクレオチド同一性をもたらした。同一の連続したヌクレオチドの長い区間を考えれば、そのような同一性の区間の中断または短縮が、ある程度のヌクレオチド同一性を共有する配列間の組換えを避けるためのストラテジーの重要な部分であることは明らかである。表Ｃ（下記参照）において、ＧＰコード配列のペアワイズ比較による連続した同一のヌクレオチド区間の数が示されている。最適化前、最高２３ｂｐ長の区間があり、要約すれば、１０以上の同一のヌクレオチドの４１個の区間がある。ＧＰ遺伝子の最適化バージョンにおいて、わずか１個の１３ｂｐの区間が見出され、１０以上の同一のヌクレオチドの７個の区間を見出すことができる。
【０１０４】
表Ｃ：連続した同一のヌクレオチドの長い区間。表は、最適化前（ｎｏｎ−ｏｐｔ）および最適化後（ｏｐｔ）のＥＢＯＶ  ＧＰコード配列のペアワイズ比較における特定の長さの連続した同一のヌクレオチド区間の数を示す。ペアワイズ比較の数は、「合計数」の列にまとめられている。非最適化比較における最長区間は、２３の連続した同一のヌクレオチドであるが、最適化遺伝子において、それは最大１３ヌクレオチドまで低下する。１０以上のヌクレオチドの区間だけが列挙されている。
【０１０５】
【表３】
2012509073.tif 000005
【実施例７】
【０１０６】
ＥＢＯＶ株のＧＰ遺伝子を有する組換えＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）ウイルスの調製
３つのＥＢＯＶ  ＧＰ遺伝子がＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成され、組換えベクターにクローニングされ、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）への組み込みが可能になった。３つの異なるＥＢＯＶ株由来の３つの最適化相同ＧＰ遺伝子配列を含む組換えウイルスを作製した。３つの挿入されたＧＰコード配列の転写は、異なる個々の初期−後期プロモーターによって調節される。
【０１０７】
３つの最適化ＥＢＯＶ−ＧＰ配列に特異的なＰＣＲ反応により、組換えＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）における３つの個々の遺伝子の存在が示された。
【実施例８】
【０１０８】
ＲＳＶ−Ｆ遺伝子を含むプラスミドの調製
実施例１〜５に用いられ、図１に示されたＲＳＶ−Ｆ遺伝子の２つのバージョンを、標準的なクローニング技術を用いて、１つのプラスミドにクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＺ１０１（Ｔｒｅｎｚｙｍｅ  ＧｍｂＨ、Ｋｏｎｓｔａｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に維持した。プラスミド（図１０のプラスミドマップを参照）を単離し、制限酵素Ａｌｅ  Ｉ、Ｄｒａ  ＩＩＩ、およびＳｐｅ  Ｉで消化し、１％のＴＡＥアガロースゲル上で分離した（図１０参照）。完全長ＲＳＶ−Ｆタンパク質およびＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃタンパク質をコードするｐＭＩＳＣ２１０（レーン１）、ならびにＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃタンパク質のみをコードする対照プラスミドｐＭＩＳＣ２０９（レーン２）についてのバンドパターンを、プラスミドの電子データ配列の分析の結果から予想されるパターンと比較した。ｐＭＩＳＣ２１０についてのバンドの予想されるサイズは４０４ｂｐ、５７３ｂｐ、８０９ｂｐ、１９２３ｂｐ、および４８７４ｂｐであり、一方、ｐＭＩＳＣ２０９については、５７３ｂｐ、６６１ｂｐ、８０９ｂｐ、および４８７４ｂｐのサイズを有するバンドのパターンが予想された。実験により、全ての予想されたバンドが見出され、追加のバンドは見出されなかった。ｐＭＩＳＣ２１０中でＲＳＶ−Ｆ変異体間の組換えが起こった場合には、組換え部位に応じてより小さな断片の１つまたは複数が喪失されるであろう。これは、本実施例において明らかに見出されなかった。したがって、結果は、大腸菌における、２つのＲＳＶ−Ｆ遺伝子（ＲＳＶ−ＦおよびＲＳＶ−Ｆ＿ｔｒｕｎｃ）を有するプラスミドｐＭＩＳＣ２１０の安定性を示している。
【図１ａ】
2012509073.tif 000006
【図１ｂ】
2012509073.tif 000007
【図１ｃ】
2012509073.tif 000008
【図２】
2012509073.tif 000009
【図３】
2012509073.tif 000010
【図４Ａ】
2012509073.tif 000011
【図４Ｂ】
2012509073.tif 000012
【図４Ｃ】
2012509073.tif 000013
【図５Ａ】
2012509073.tif 000014
【図５Ｂ】
2012509073.tif 000015
【図５Ｃ】
2012509073.tif 000016
【図６】
2012509073.tif 000017
【図７】
2012509073.tif 000018
【図８Ａａ】
2012509073.tif 000019
【図８Ａｂ】
2012509073.tif 000020
【図８Ａｃ】
2012509073.tif 000021
【図８Ｂａ】
2012509073.tif 000022
【図８Ｂｂ】
2012509073.tif 000023
【図８Ｂｃ】
2012509073.tif 000024
【図９Ａａ】
2012509073.tif 000025
【図９Ａｂ】
2012509073.tif 000026
【図９Ａｃ】
2012509073.tif 000027
【図９Ａｄ】
2012509073.tif 000028
【図９Ａｅ】
2012509073.tif 000029
【図９Ａｆ】
2012509073.tif 000030
【図９Ａｇ】
2012509073.tif 000031
【図９Ｂａ】
2012509073.tif 000032
【図９Ｂｂ】
2012509073.tif 000033
【図９Ｂｃ】
2012509073.tif 000034
【図９Ｂｄ】
2012509073.tif 000035
【図９Ｂｅ】
2012509073.tif 000036
【図９Ｂｆ】
2012509073.tif 000037
【図９Ｂｇ】
2012509073.tif 000038
【図１０】
2012509073.tif 000039
【国際調査報告】
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2012509073.tif 000041
2012509073.tif 000042
2012509073.tif 000043