(57)【要約】  本発明は、核酸の送達のための放出性カチオン脂質及びナノ粒子組成物、並びにそれを用いて標的遺伝子の発現を調節する方法を対象とする。特に、本発明は、酸不安定性リンカーを含むカチオン脂質、及びそれを含有するナノ粒子組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物
【化１】
2012509272.tif 000047
［式中、
Ｒ１はコレステロール又はその類似体であり、
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ又はＮＲ４であり、
Ｙ２及びＹ５は、独立に、Ｏ、Ｓ又はＮＲ５であり、
Ｙ３〜４は、独立に、Ｏ、Ｓ又はＮＲ６であり、
Ｙ１〜２は独立に選択される二官能性リンカーであり、
Ｍは酸不安定性リンカーであり、
（ａ）、（ｄ）及び（ｆ）は、独立に、０又は１であり、
（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）は、独立に、０又は正の整数であり、
Ｘは、Ｃ、Ｎ又はＰであり、
Ｑ１は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、ＮＨ２又は−（Ｌ１１）ｄ１−Ｒ１１であり、
Ｑ２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、ＮＨ２又は−（Ｌ１２）ｄ２−Ｒ１２であり、
Ｑ３は、孤立電子対、（＝Ｏ）、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、ＮＨ２又は−（Ｌ１３）ｄ３−Ｒ１３であるが、
ただし、
（ｉ）ＸがＣであるとき、Ｑ３は孤立電子対又は（＝Ｏ）ではなく、
（ｉｉ）ＸがＮであるとき、Ｑ３は孤立電子対であり、
（ｉｉｉ）ＸがＰであるとき、Ｑ３は（＝Ｏ）であり、（ｆ）は０であり、
Ｌ１１、Ｌ１２及びＬ１３は独立に選択される二官能性スペーサーであり、
（ｄ１）、（ｄ２）及び（ｄ３）は、独立に、０又は正の整数であり、
Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は、独立に、水素、ＮＨ２、
【化２】
2012509272.tif 000048
2012509272.tif 000049
であり、
Ｙ’４は、Ｏ、Ｓ又はＮＲ’６であり、
Ｙ’５は、独立に、Ｏ、Ｓ又はＮＲ’５であり、
（ｄ’）及び（ｆ’）は、独立に、０又は１であり、
（ｅ’）は０又は正の整数であり、
Ｘ’は、Ｃ、Ｎ又はＰであり、
Ｑ’１は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、ＮＨ２又は−（Ｌ’１１）ｄ’１−Ｒ’１１であり、
Ｑ’２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、ＮＨ２又は−（Ｌ’１２）ｄ’２−Ｒ’１２であり、
Ｑ’３は、孤立電子対、（＝Ｏ）、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、ＮＨ２又は−（Ｌ１３）ｄ’３−Ｒ’１３であるが、
ただし、
（ｉ）Ｘ’がＣであるとき、Ｑ’３は孤立電子対又は（＝Ｏ）ではなく、
（ｉｉ）Ｘ’がＮであるとき、Ｑ’３は孤立電子対であり、
（ｉｉｉ）Ｘ’がＰであるとき、Ｑ’３は（＝Ｏ）であり、（ｆ’）は０であり、
Ｌ’１１、Ｌ’１２及びＬ’１３は独立に選択される二官能性スペーサーであり、
（ｄ’１）、（ｄ’２）及び（ｄ’３）は、独立に、０又は正の整数であり、
Ｒ’１１、Ｒ’１２及びＲ’１３は、独立に、水素、ＮＨ２、
【化３】
2012509272.tif 000050
であり、
Ｒ２〜３及びＲ’２〜３は水素、ヒドロキシル、アミン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１９分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ２〜６置換アルケニル、Ｃ２〜６置換アルキニル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ１〜６ヘテロアルキル及び置換Ｃ１〜６ヘテロアルキルからなる群から独立に選択され、
Ｒ４〜７及びＲ’５〜７は水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１９分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ２〜６置換アルケニル、Ｃ２〜６置換アルキニル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ１〜６ヘテロアルキル及び置換Ｃ１〜６ヘテロアルキルからなる群から独立に選択されるが、
ただし、Ｑ１〜３及びＱ’１〜３の少なくとも一つは
【化４】
2012509272.tif 000051
を含む］。
【請求項２】
Ｍが、−Ｓ−Ｓ−、ケタール含有部分又はアセタール含有部分及びイミン含有部分からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｍが、−Ｓ−Ｓ−である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｍが、−ＣＲ１６Ｒ１７−Ｏ−ＣＲ１４Ｒ１５−Ｏ−ＣＲ１８Ｒ１９−
［Ｒ１４〜１５は水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１９分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ２〜６置換アルケニル、Ｃ２〜６置換アルキニル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ１〜６ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ２〜６アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ２〜６アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ２〜６置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ２〜６置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、Ｃ２〜６置換アルカノイルオキシ、及び置換アリールカルボニルオキシからなる群から独立に選択され、
Ｒ１６〜１９は水素、アミン、置換アミン、アジド、カルボキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、シリルエーテル、スルホニル、メルカプト、Ｃ１〜６アルキルメルカプト、アリールメルカプト、置換アリールメルカプト、置換Ｃ１〜６アルキルチオ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１９分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ２〜６置換アルケニル、Ｃ２〜６置換アルキニル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ１〜６ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ２〜６アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ２〜６アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ２〜６置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ２〜６置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、Ｃ２〜６置換アルカノイルオキシ及び置換アリールカルボニルオキシからなる群から独立に選択される］
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１４及びＲ１５が、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜８分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール及びアラルキルからなる群から選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｍが、−Ｎ＝ＣＲ１０−又は−ＣＲ１０＝Ｎ−であり、Ｒ１０は水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜８分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール及び置換アリールである、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｑ１及びＱ２がいずれも
【化５】
2012509272.tif 000052
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｑ’１及びＱ’２がいずれも
【化６】
2012509272.tif 000053
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
式（Ｉａ）
【化７】
2012509272.tif 000054
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
式（Ｉｂ）
【化８】
2012509272.tif 000055
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
式（Ｉｃ）又は（Ｉｃ’）
【化９】
2012509272.tif 000056
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｙ１がＯである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｙ２がＯであり、Ｙ５がＯである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｌ１が、
−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｔ１−［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３−、
−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｔ１Ｙ１７−（ＣＲ２３Ｒ２４）ｔ２−（Ｙ１８）ａ２−［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３−、
−（ＣＲ２１Ｒ２２ＣＲ２３Ｒ２４Ｙ１７）ｔ１−［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３−、
−（ＣＲ２１Ｒ２２ＣＲ２３Ｒ２４Ｙ１７）ｔ１（ＣＲ２５Ｒ２６）ｔ４−（Ｙ１８）ａ２−［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３−、
−［（ＣＲ２１Ｒ２２ＣＲ２３Ｒ２４）ｔ２Ｙ１７］ｔ３（ＣＲ２５Ｒ２６）ｔ４−（Ｙ１８）ａ２−［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３−、
−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｔ１−［（ＣＲ２３Ｒ２４）ｔ２Ｙ１７］ｔ３（ＣＲ２５Ｒ２６）ｔ４−（Ｙ１８）ａ２−［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３−、
−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｔ１（Ｙ１７）ａ２［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３（ＣＲ２３Ｒ２４）ｔ２−、
−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｔ１（Ｙ１７）ａ２［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３Ｙ１４（ＣＲ２３Ｒ２４）ｔ２−、
−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｔ１（Ｙ１７）ａ２［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３（ＣＲ２３Ｒ２４）ｔ２−Ｙ１５−（ＣＲ２３Ｒ２４）ｔ３−、
−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｔ１（Ｙ１７）ａ２［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３Ｙ１４（ＣＲ２３Ｒ２４）ｔ２−Ｙ１５−（ＣＲ２３Ｒ２４）ｔ３−、
−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｔ１（Ｙ１７）ａ２［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３（ＣＲ２３Ｒ２４ＣＲ２５Ｒ２６Ｙ１９）ｔ２（ＣＲ２７ＣＲ２８）ｔ３−、
−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｔ１（Ｙ１７）ａ２［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３Ｙ１４（ＣＲ２３Ｒ２４ＣＲ２５Ｒ２６Ｙ１９）ｔ２（ＣＲ２７ＣＲ２８）ｔ３−、及び
【化１０】
2012509272.tif 000057
［式中、
Ｙ１６は、Ｏ、ＮＲ２８又はＳであり、
Ｙ１４〜１５及びＹ１７〜１９は、独立に、Ｏ、ＮＲ２９又はＳであり
Ｒ２１〜２７は水素、ヒドロキシル、アミン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜１２分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、フェノキシ及びＣ１〜６ヘテロアルコキシからなる群から独立に選択され、
Ｒ２８〜２９は水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜１２分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、フェノキシ及びＣ１〜６ヘテロアルコキシからなる群から独立に選択され、
（ｔ１）、（ｔ２）、（ｔ３）及び（ｔ４）は、独立に、０又は正の整数であり、
（ａ２）及び（ａ３）は、独立に、０又は１である］
からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｌ１が、
−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）４−、−（ＣＨ２）５−、−（ＣＨ２）６−、−ＮＨ（ＣＨ２）−、
−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２−、
−（ＣＨ２）４−Ｃ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）５−Ｃ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）６−Ｃ（＝Ｏ）−、
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−Ｃ（＝Ｏ）−、
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、
−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−、
−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−、
−（ＣＨ２）４−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）５−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、
−（ＣＨ２）６−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、
−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、
−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２Ｏ−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、
−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、
−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−、
【化１１】
2012509272.tif 000058
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）４−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）４−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）５−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）５−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）６−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）６−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）２−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）２−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）４−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）４−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）５−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）５−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）６−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）６−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）４−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）５−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）６−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）２−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）４−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）５−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）６−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）２−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）３−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）４−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）５−、及び
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）６−
からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｌ２が、
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２）ｔ’１−［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３（ＣＲ’２７ＣＲ’２８）ｔ’２−、
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２）ｔ’１Ｙ’１４−（ＣＲ’２３Ｒ’２４）ｔ’２−（Ｙ’１５）ａ’２−［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３（ＣＲ’２７ＣＲ’２８）ｔ’３−、
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２ＣＲ’２３Ｒ’２４Ｙ’１４）ｔ’１−［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３（ＣＲ’２７ＣＲ’２８）ｔ’２−、
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２ＣＲ’２３Ｒ’２４Ｙ’１４）ｔ’１（ＣＲ’２５Ｒ’２６）ｔ’２−（Ｙ’１５）ａ’２−［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３（ＣＲ’２７ＣＲ’２８）ｔ’３−、
−［（ＣＲ’２１Ｒ’２２ＣＲ’２３Ｒ’２４）ｔ’２Ｙ’１４］ｔ’１（ＣＲ’２５Ｒ’２６）ｔ’２−（Ｙ’１５）ａ’２−［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３（ＣＲ’２７ＣＲ’２８）ｔ’３−、
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２）ｔ’１−［（ＣＲ’２３Ｒ’２４）ｔ’２Ｙ’１４］ｔ’２（ＣＲ’２５Ｒ’２６）ｔ’３−（Ｙ’１５）ａ’２−［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３（ＣＲ’２７ＣＲ’２８）ｔ’４−
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２）ｔ’１（Ｙ’１４）ａ’２［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３（ＣＲ’２３Ｒ’２４）ｔ’２−、
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２）ｔ’１（Ｙ’１４）ａ’２［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３Ｙ’１５（ＣＲ’２３Ｒ’２４）ｔ’２−、
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２）ｔ’１（Ｙ’１４）ａ’２［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３（ＣＲ’２３Ｒ’２４）ｔ’２−Ｙ’１５−（ＣＲ’２３Ｒ’２４）ｔ’３−、
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２）ｔ’１（Ｙ’１４）ａ’２［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３Ｙ’１４（ＣＲ’２３Ｒ’２４）ｔ’２−Ｙ’１５−（ＣＲ’２３Ｒ’２４）ｔ’３−、
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２）ｔ’１（Ｙ’１４）ａ’２［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３（ＣＲ’２３Ｒ’２４ＣＲ’２５Ｒ’２６Ｙ’１５）ｔ’２（ＣＲ’２７ＣＲ’２８）ｔ’３−、
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２）ｔ’１（Ｙ’１４）ａ’２［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３Ｙ’１７（ＣＲ’２３Ｒ’２４ＣＲ’２５Ｒ’２６Ｙ’１５）ｔ’２（ＣＲ’２７ＣＲ’２８）ｔ’３−、及び
【化１２】
2012509272.tif 000059
［式中、
Ｙ’１６は、Ｏ、ＮＲ’２８又はＳであり、
Ｙ’１４〜１５及びＹ’１７は、独立に、Ｏ、ＮＲ’２９又はＳであり、
Ｒ’２１〜２７は水素、ヒドロキシル、アミン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜１２分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、フェノキシ及びＣ１〜６ヘテロアルコキシからなる群から独立に選択され、
Ｒ’２８〜２９は水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜１２分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、フェノキシ及びＣ１〜６ヘテロアルコキシからなる群から独立に選択され、
（ｔ’１）、（ｔ’２）、（ｔ’３）及び（ｔ’４）は、独立に、０又は正の整数であり、
（ａ’２）及び（ａ’３）は、独立に、０又は１である］
からなる群から独立に選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｌ２が、
−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）４−、−（ＣＨ２）５−、−（ＣＨ２）６−、−（ＣＨ２）ＮＨ−
−ＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）−、
−Ｏ（ＣＨ２）２−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）２−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）３−、
−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（ＣＨ２）３−、
−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−ＣＨ２−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｏ（ＣＨ２）３−、
−ＣＨ２−ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（ＣＨ２）３−、
−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、
−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、
−（ＣＨ２）２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、
−（ＣＨ２）２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、
−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、
−（ＣＨ２）２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２Ｏ−。
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、
−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−、
【化１３】
2012509272.tif 000060
−（ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）４−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）４−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）５−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）５−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）６−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）６−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）２−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）２−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）４−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）４−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）５−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）５−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）６−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）６−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）４−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）５−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）６−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）２−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）４−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）５−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）６−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）２−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）３−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）４−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）５−、及び
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）６−
からなる群から独立に選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｌ１１〜１３及びＬ’１１〜１３が、
−（ＣＲ３１Ｒ３２）ｑ１−及び
−Ｙ２６（ＣＲ３１Ｒ３２）ｑ１−
［式中、
Ｙ２６は、Ｏ、ＮＲ３３又はＳであり、
Ｒ３１〜３２は水素、ＯＨ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜１２分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、フェノキシ及びＣ１〜６ヘテロアルコキシからなる群から独立に選択され、
Ｒ３３は水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜１２分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、フェノキシ及びＣ１〜６ヘテロアルコキシからなる群から選択され、
（ｑ１）は０又は正の整数である］
からなる群から独立に選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｌ１１〜１３及びＬ’１１〜１３が、
−ＣＨ２−，−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）４−、−（ＣＨ２）５−、−（ＣＨ２）６−、
−Ｏ（ＣＨ２）２−、−Ｏ（ＣＨ２）３−、−Ｏ（ＣＨ２）４−、−Ｏ（ＣＨ２）５−、−Ｏ（ＣＨ２）６−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ２−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）２−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）３−、
−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（ＣＨ２）３−、
−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−ＣＨ２−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｏ（ＣＨ２）３−、
−ＣＨ２−ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（ＣＨ２）３−、
−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、
−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、
−（ＣＨ２）２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、
−（ＣＨ２）２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、
−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、及び
−（ＣＨ２）２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−
からなる群から独立に選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｘ（Ｑ１）（Ｑ２）（Ｑ３）部分が、
【化１４】
2012509272.tif 000061
からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｘ（Ｑ１）（Ｑ２）（Ｑ３）部分が、
【化１５】
2012509272.tif 000062
である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｘ’（Ｑ’１）（Ｑ’２）（Ｑ’３）部分が、
【化１６】
2012509272.tif 000063
からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｘ’（Ｑ’１）（Ｑ’２）（Ｑ’３）部分が、
【化１７】
2012509272.tif 000064
である、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
【化１８】
2012509272.tif 000065
2012509272.tif 000066
2012509272.tif 000067
2012509272.tif 000068
2012509272.tif 000069
2012509272.tif 000070
からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項２５】
請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物を含む、ナノ粒子組成物。
【請求項２６】
融合性脂質及びＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項２５に記載のナノ粒子組成物。
【請求項２７】
前記式（Ｉ）の化合物が、
【化１９】
2012509272.tif 000071
2012509272.tif 000072
からなる群から選択される、請求項２５に記載のナノ粒子組成物。
【請求項２８】
融合性脂質が、ＤＯＰＥ、ＤＯＧＰ、ＰＯＰＣ、ＤＳＰＣ、ＥＰＣ及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２６に記載のナノ粒子組成物。
【請求項２９】
ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド、Ｃ１６ｍＰＥＧ−セラミド及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２６に記載のナノ粒子組成物。
【請求項３０】
コレステロールをさらに含む、請求項２６に記載のナノ粒子組成物。
【請求項３１】
式（Ｉ）の化合物が、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質の約１０％〜約９９．９％の範囲のモル比を有する、請求項３０に記載のナノ粒子組成物。
【請求項３２】
式（Ｉ）の化合物が、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質の約１５％〜約２５％の範囲のモル比を有する、請求項３０に記載のナノ粒子組成物。
【請求項３３】
式（Ｉ）の化合物を含むカチオン脂質と、非コレステロール系融合性脂質と、ＰＥＧ脂質と、コレステロールとのモル比が、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質の約１５％〜２５％：２０〜７８％：０〜５０％：２〜１０％である、請求項３０に記載のナノ粒子組成物。
【請求項３４】
式（Ｉ）の化合物、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルエタノールアミンに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＥ）及びコレステロールの混合物、
式（Ｉ）の化合物、ジアシルホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＥ）及びコレステロールの混合物、
式（Ｉ）の化合物、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＥ）及びコレステロールの混合物、
式（Ｉ）の化合物、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミドに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−Ｃｅｒ）及びコレステロールの混合物、並びに
式（Ｉ）の化合物、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルエタノールアミンに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＥ）、セラミドに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−Ｃｅｒ）及びコレステロールの混合物
からなる群から選択される、請求項３０に記載のナノ粒子組成物。
【請求項３５】
式（Ｉ）の化合物、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＣ１６ｍＰＥＧ−セラミドが、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質の約１７％：６０％：２０％：３％のモル比で含まれる、請求項３０に記載のナノ粒子組成物。
【請求項３６】
式（Ｉ）の化合物、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＳＰＥ及びＣ１６ｍＰＥＧ−セラミドが、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質の約１８％：６０％：２０％：１％：１％のモル比で含まれる、請求項３０に記載のナノ粒子組成物。
【請求項３７】
請求項３０に記載のナノ粒子組成物中に封入された核酸を含むナノ粒子。
【請求項３８】
核酸が、一本鎖又は二本鎖のオリゴヌクレオチドである、請求項３７に記載のナノ粒子。
【請求項３９】
核酸が、デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アプタマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）、トリシクロ−ＤＮＡ、二本鎖オリゴヌクレオチド（デコイＯＤＮ）、触媒ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、アプタマー、シュピーゲルマー、ＣｐＧオリゴマー及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３７に記載のナノ粒子。
【請求項４０】
オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項３８に記載のナノ粒子。
【請求項４１】
オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル結合又はホスホロチオエート結合、及びそれらの組合せを有する、請求項３８に記載のナノ粒子。
【請求項４２】
オリゴヌクレオチドが、ＬＮＡを含む、請求項３８に記載のナノ粒子。
【請求項４３】
オリゴヌクレオチドが、約８個〜５０個のヌクレオチドを有する、請求項３８に記載のナノ粒子。
【請求項４４】
オリゴヌクレオチドが、癌遺伝子、プロ血管新生経路遺伝子、プロ細胞増殖経路遺伝子、ウイルス感染因子遺伝子及びプロ炎症経路遺伝子の発現を抑制する、請求項３８に記載のナノ粒子。
【請求項４５】
オリゴヌクレオチドが、アンチセンスｂｃｌ−２オリゴヌクレオチド、アンチセンスＨＩＦ−１αオリゴヌクレオチド、アンチセンススルビビンオリゴヌクレオチド、アンチセンスＥｒｂＢ３オリゴヌクレオチド、アンチセンスＰＩＫ３ＣＡオリゴヌクレオチド、アンチセンスＨＳＰ２７オリゴヌクレオチド、アンチセンスアンドロゲン受容体オリゴヌクレオチド、アンチセンスＧｌｉ２オリゴヌクレオチド及びアンチセンスβカテニンオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項３８に記載のナノ粒子。
【請求項４６】
オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２及び３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５並びに配列番号１６に示される８個以上の連続ヌクレオチドを含み、各核酸が天然核酸又は修飾核酸である、請求項３８に記載のナノ粒子。
【請求項４７】
核酸及び式（Ｉ）の化合物の電荷比が、約１：２０〜約２０：１の範囲である、請求項３７に記載のナノ粒子。
【請求項４８】
ナノ粒子が、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍの範囲の大きさを有する、請求項３７に記載のナノ粒子。
【請求項４９】
請求項３７に記載のナノ粒子を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における疾患を治療する方法。
【請求項５０】
細胞と請求項３７に記載のナノ粒子とを接触させることを含む、細胞にオリゴヌクレオチドを導入する方法。
【請求項５１】
ヒト細胞又はヒト組織と請求項３７に記載のナノ粒子とを接触させることを含む、ヒト細胞又はヒト組織における遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項５２】
細胞又は組織が、癌細胞又は癌組織である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
有効量の請求項３７に記載のナノ粒子を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法。
【請求項５４】
癌細胞と請求項３７に記載のナノ粒子とを接触させることを含む、癌細胞の成長又は増殖を抑制する方法。
【請求項５５】
抗癌剤を投与することをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸送達系のための放出性カチオン脂質に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を使用する療法は、様々な疾患を治療するために提案されてきた。一つのこのような提案された核酸療法は、治療遺伝子が、疾患と関連する遺伝子の発現を選択的に調節し、疾患を治療するための他の治療方式に伴い得る副作用を最小限に抑えることができるアンチセンス療法である。
【０００３】
しかし、核酸を使用する療法は、このような治療用核酸の送達及び安定性と関連した問題によりこれまでは限界があった。幾つかの遺伝子送達系が、上記の問題を克服し、インビトロ及びインビボで癌細胞若しくは他の細胞、又は癌組織等の標的領域に治療遺伝子を効果的に導入するために提案された。送達を改善し、治療遺伝子の細胞取込みを増進するための一つのこのような試みでは、送達ビヒクルとしてリポソームが使用された。残念なことに、現在利用できるリポソームは、プラスミドの送達においてはある程度進歩したが、オリゴヌクレオチドを体内に効果的に送達するものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
先の試み及び前進にもかかわらず、改良された核酸送達系を提供することが引き続き必要とされている。本発明はこの必要性に対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、核酸送達のための酸不安定性リンカーを含む放出性カチオン脂質及びそれを含有するナノ粒子組成物を提供する。オリゴヌクレオチド等のポリ核酸は、カチオン脂質、融合性脂質及びＰＥＧ脂質の混合物を含有するナノ粒子複合体中に封入される。
【０００６】
本発明のこの態様によれば、核酸（即ち、オリゴヌクレオチド）の送達のための放出性カチオン脂質は、式（Ｉ）：
【化１】
2012509272.tif 000002
【０００７】
［式中、
Ｒ１はコレステロール又はその類似体であり、
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ又はＮＲ４であり、
Ｙ２及びＹ５は、独立に、Ｏ、Ｓ又はＮＲ５であり、
Ｙ３〜４は、独立に、Ｏ、Ｓ又はＮＲ６であり、
Ｌ１〜２は独立に選択される二官能性リンカーであり、
Ｍは酸不安定性リンカーであり、
（ａ）、（ｄ）及び（ｆ）は、独立に、０又は１であり、
（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）は、独立に、０又は正の整数であり、
Ｘは、Ｃ、Ｎ又はＰであり、
Ｑ１は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、ＮＨ２又は−（Ｌ１１）ｄ１−Ｒ１１であり、
Ｑ２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、ＮＨ２又は−（Ｌ１２）ｄ２−Ｒ１２であり、
Ｑ３は、孤立電子対、（＝Ｏ）、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、ＮＨ２又は−（Ｌ１３）ｄ３−Ｒ１３であるが、
ただし、
（ｉ）ＸがＣであるとき、Ｑ３は孤立電子対又は（＝Ｏ）ではなく、
（ｉｉ）ＸがＮであるとき、Ｑ３は孤立電子対であり、
（ｉｉｉ）ＸがＰであるとき、Ｑ３は（＝Ｏ）であり、（ｆ）は０であり、
Ｌ１１、Ｌ１２及びＬ１３は独立に選択される二官能性スペーサーであり、
（ｄ１）、（ｄ２）及び（ｄ３）は、独立に、０又は正の整数であり、
Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は、独立に、水素、ＮＨ２、
【化２】
2012509272.tif 000003
【０００８】
であり、
Ｙ’４は、Ｏ、Ｓ又はＮＲ’６であり、
Ｙ’５は、独立に、Ｏ、Ｓ又はＮＲ’５であり、
（ｄ’）及び（ｆ’）は、独立に、０又は１であり、
（ｅ’）は０又は正の整数であり、
Ｘ’は、Ｃ、Ｎ又はＰであり、
Ｑ’１は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、ＮＨ２又は−（Ｌ’１１）ｄ’１−Ｒ’１１であり、
Ｑ’２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、ＮＨ２又は−（Ｌ’１２）ｄ’２−Ｒ’１２であり、
Ｑ’３は、孤立電子対、（＝Ｏ）、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、ＮＨ２又は−（Ｌ１３）ｄ’３−Ｒ’１３であるが、
ただし、
（ｉ）Ｘ’がＣであるとき、Ｑ’３は孤立電子対又は（＝Ｏ）ではなく、
（ｉｉ）Ｘ’がＮであるとき、Ｑ’３は孤立電子対であり、
（ｉｉｉ）Ｘ’がＰであるとき、Ｑ’３は（＝Ｏ）であり、（ｆ’）は０であり、
Ｌ’１１、Ｌ’１２及びＬ’１３は独立に選択される二官能性スペーサーであり、
（ｄ’１）、（ｄ’２）及び（ｄ’３）は、独立に、０又は正の整数であり、
Ｒ’１１、Ｒ’１２及びＲ’１３は、独立に、水素、ＮＨ２、
【化３】
2012509272.tif 000004
【０００９】
であり、
Ｒ２〜６、Ｒ’２〜３及びＲ’５〜６は水素、ヒドロキシル、アミン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１９分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ２〜６置換アルケニル、Ｃ２〜６置換アルキニル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ１〜６ヘテロアルキル及び置換Ｃ１〜６ヘテロアルキルの中から独立に選択され、
Ｒ７及びＲ’７は水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１９分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ２〜６置換アルケニル、Ｃ２〜６置換アルキニル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ１〜６ヘテロアルキル及び置換Ｃ１〜６ヘテロアルキルの中から独立に選択されるが、
ただし、Ｑ１〜３及びＱ’１〜３の少なくとも一つは
【化４】
2012509272.tif 000005
【００１０】
を含む］
を有する。
【００１１】
本発明は、核酸送達のためのナノ粒子組成物も提供する。
【００１２】
本発明によれば、核酸（即ち、オリゴヌクレオチド）送達のためのナノ粒子組成物は、
（ｉ）  式（Ｉ）の化合物、
（ｉｉ）融合性脂質及び
（ｉｉｉ）ＰＥＧ脂質
を含む。
【００１３】
本発明の別の態様において、インビボ及びインビトロで細胞又は組織に核酸（好ましくはオリゴヌクレオチド）を送達する方法が提供される。本明細書に記載の方法で導入されるオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の発現を調節できる。
【００１４】
本発明の別の態様は、標的遺伝子、即ち、癌遺伝子、及び哺乳動物、好ましくはヒトの疾患と関連する遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。該方法は、細胞、例えば癌細胞又は癌組織を、本明細書に記載のナノ粒子組成物から調製したナノ粒子／ナノ粒子複合体と接触させることを含む。ナノ粒子中に封入されたオリゴヌクレオチドは放出され、次いで処理される細胞又は組織においてｍＲＮＡ又はタンパク質のダウンレギュレーションに介在する。ナノ粒子での治療により、癌細胞の増殖の抑制等、悪性疾患の治療において標的遺伝子の発現の調節が可能となる（且つ、前記に伴う付帯利益が与えられる）。このような療法は、単一の治療として、又は一つ若しくは複数の有用な及び／若しくは認可された治療との併用療法の一部として行われてもよい。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は式（Ｉ）の化合物並びにそれを含有するナノ粒子を製造する方法を提供する。
【００１６】
本明細書に記載の放出性カチオン脂質は、核酸の負電荷を中和し、核酸を含有するナノ粒子の細胞取込みを促進することができる。本明細書のカチオン脂質は、コレステロール部分毎に複数単位のカチオン部分を提供し、（ｉ）核酸の負電荷を中和し、（ｉｉ）核酸との密なイオンコンプレックスを形成する際の効率を高める。この技法は、治療用オリゴヌクレオチドの送達、及び治療用オリゴヌクレオチドを用いる哺乳動物、即ちヒトの治療に有益である。
【００１７】
本明細書に記載の化合物は、核酸との複数のイオンコンプレックスを形成することによりナノ粒子の大きさを制御する手段を提供する。
【００１８】
本明細書に記載の化合物は、体液中でナノ粒子複合体及びナノ粒子複合体中の核酸を安定させる。任意の理論に拘束されずに、ナノ粒子複合体は、少なくともある程度は、分子をヌクレアーゼから保護し、それにより分解から保護することにより、封入された核酸の安定性を高めると考えられる。
【００１９】
本明細書に記載のカチオン脂質は、約１０％又は１０％未満の充填率を通常有する当技術分野で公知の中性又は負に帯電したナノ粒子と比較して、高効率（例えば、５０％超、７０％超、好ましくは８０％超）の核酸（オリゴヌクレオチド）の充填を可能にする。任意の理論に拘束されずに、高い充填率は、本明細書に記載の式（Ｉ）の放出性カチオン脂質において高ｐＫａ（１３〜１４）を有するグアニジニウム基が、核酸のリン酸基と実質的に緻密な両性イオン水素結合を形成し、それによりより多くの核酸をナノ粒子の内部コンパートメントに効果的に充填できるという事実によりある程度実現され得る。
【００２０】
ナノ粒子の凝集又は沈殿が発生する可能性が低いことから、本明細書に記載のナノ粒子により、中性又は負に帯電したナノ粒子よりも優れたさらなる利点がもたらされる。任意の理論に拘束されずに、所望の特性は、核酸との水素結合又は静電相互作用を形成するカチオン脂質がナノ粒子中に封入され、非カチオン／融合性脂質及びＰＥＧ脂質が放出性カチオン脂質及び核酸を取り囲むという事実にある程度起因する。
【００２１】
ナノ粒子は、約２〜約１２等の広いｐＨ範囲で調製できる。また、本明細書に記載のナノ粒子は、約７．２〜約７．６等の望ましい生理的ｐＨで臨床的に使用できる。
【００２２】
本明細書に記載のナノ粒子は、トランスフェクション剤の補助なしにインビトロ及びインビボで細胞をトランスフェクションできる。ナノ粒子の高いトランスフェクション効率により、治療用核酸を細胞に送達するための手段も提供される。
【００２３】
式（Ｉ）の化合物は酸不安定性リンカーを含む。このようなリンカーは、酸性環境でのナノ粒子及びエンドソームの破壊及び不安定化を促進する。酸性環境としては、細胞外環境と細胞内環境の両方を挙げることができる。細胞内酸性環境としては、例えば細胞質内のエンドソームが挙げられる。したがって、本明細書に記載の化合物は、ナノ粒子中に含有される治療薬の放出及びエンドソームから細胞質への脱出を補助する。
【００２４】
本明細書に記載のナノ粒子送達系により、十分な量の治療用オリゴヌクレオチドを、ＥＰＲ（Enhanced Permeation and Retention）効果により癌細胞等の所望の標的領域で選択的に利用することもできる。したがって、本明細書に記載のナノ粒子組成物により、癌細胞又は癌組織において特定のｍＲＮＡのダウンレギュレーションが改善される。
【００２５】
本発明によれば、本明細書に記載のナノ粒子により、一つ又は複数の同一又は異なる治療薬（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）が送達され、それにより疾患の治療において相乗効果を得ることができる。
【００２６】
他の及びさらなる利点は、以下の説明から明らかとなろう。
【００２７】
本発明の目的のために、「残基」という用語は、例えば、別の化合物との置換反応を経た後に残るコレステロール等を指す、化合物の部分を意味すると理解されるものとする。
【００２８】
本発明の目的のために、「アルキル」という用語は、直鎖、分岐鎖及び環状のアルキル基を含む飽和脂肪族炭化水素を指す。「アルキル」という用語は、アルキルチオアルキル基、アルコキシアルキル基、シクロアルキルアルキル基、ヘテロシクロアルキル基及びＣ１〜６アルキルカルボニルアルキル基も含む。アルキル基は、１〜１２個の炭素を有することが好ましい。アルキル基は、より好ましくは約１〜７個の炭素、さらにより好ましくは約１〜４個の炭素の低級アルキルである。アルキル基は、置換又は非置換であってよい。置換される場合、置換基（複数可）としては、好ましくはハロ基、オキシ基、アジド基、ニトロ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、アルコキシアルキル基、アルキルアミノ基、トリハロメチル基、ヒドロキシル基、メルカプト基、ヒドロキシ基、シアノ基、アルキルシリル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロアリール基、アルケニル基、アルキニル基、Ｃ１〜６ヒドロカルボニル基、アリール基及びアミノ基が挙げられる。
【００２９】
本発明の目的のために、「置換」という用語は、官能基又は化合物に含有される一つ又は複数の原子を、ハロ基、オキシ基、アジド基、ニトロ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、アルコキシアルキル基、アルキルアミノ基、トリハロメチル基、ヒドロキシル基、メルカプト基、ヒドロキシ基、シアノ基、アルキルシリル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロアリール基、アルケニル基、アルキニル基、Ｃ１〜６アルキルカルボニルアルキル基、アリール基及びアミノ基の群に由来する部分の一つに付加するか、又はそれと置き換えることを指す。
【００３０】
本発明の目的のために、「アルケニル」という用語は、直鎖、分岐鎖及び環状の基を含む、少なくとも一つの炭素−炭素二重結合を含有する基を指す。アルケニル基は、好ましくは約２〜１２個の炭素を有する。アルケニル基は、より好ましくは約２〜７個の炭素、さらにより好ましくは約２〜４個の炭素の低級アルケニルである。アルケニル基は、置換又は非置換であってよい。置換される場合、置換基（複数可）としては、好ましくはハロ基、オキシ基、アジド基、ニトロ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、アルコキシアルキル基、アルキルアミノ基、トリハロメチル基、ヒドロキシル基、メルカプト基、ヒドロキシ基、シアノ基、アルキルシリル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロアリール基、アルケニル基、アルキニル基、Ｃ１〜６ヒドロカルボニル基、アリール基及びアミノ基が挙げられる。
【００３１】
本発明の目的のために、「アルキニル」という用語は、直鎖、分岐鎖及び環状の基を含む、少なくとも一つの炭素−炭素三重結合を含有する基を指す。アルキニル基は、好ましくは約２〜１２個の炭素を有する。アルキニル基は、より好ましくは約２〜７個の炭素、さらにより好ましくは約２〜４個の炭素の低級アルキニルである。アルキニル基は、置換又は非置換であってよい。置換される場合、置換基（複数可）としては、好ましくはハロ基、オキシ基、アジド基、ニトロ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、アルコキシアルキル基、アルキルアミノ基、トリハロメチル基、ヒドロキシル基、メルカプト基、ヒドロキシ基、シアノ基、アルキルシリル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロアリール基、アルケニル基、アルキニル基、Ｃ１〜６ヒドロカルボニル基、アリール基及びアミノ基が挙げられる。「アルキニル」の例としては、プロパルギル、プロピン及び３−ヘキシンが挙げられる。
【００３２】
本発明の目的のために、「アリール」という用語は、少なくとも一つの芳香族環を含有する芳香族炭化水素環系を指す。芳香族環は、他の芳香族炭化水素環又は非芳香族炭化水素環と場合により縮合していてもよく、又はさもなければ結合していてもよい。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン及びビフェニルが挙げられる。アリール基の好ましい例としては、フェニル及びナフチルが挙げられる。
【００３３】
本発明の目的のために、「シクロアルキル」という用語は、Ｃ３〜８環状炭化水素を指す。シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル及びシクロオクチルが挙げられる。
【００３４】
本発明の目的のために、「シクロアルケニル」という用語は、少なくとも一つの炭素−炭素二重結合を含有するＣ３〜８環状炭化水素を指す。シクロアルケニルの例としては、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、１，３−シクロヘキサジエニル、シクロヘプテニル、シクロヘプタトリエニル及びシクロオクテニルが挙げられる。
【００３５】
本発明の目的のために、「シクロアルキルアルキル」という用語は、Ｃ３〜８シクロアルキル基で置換されたアルキル基を指す。シクロアルキルアルキルの例としては、シクロプロピルメチル及びシクロペンチルエチルが挙げられる。
【００３６】
本発明の目的のために、「アルコキシ」という用語は、酸素橋を介して親分子部分に結合した、示された数の炭素原子のアルキル基を指す。アルコキシ基の例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ及びイソプロポキシが挙げられる。
【００３７】
本発明の目的のために、「アルキルアリール」基は、アルキル基で置換されたアリール基を指す。
【００３８】
本発明の目的のために、「アラルキル」基は、アリール基で置換されアルキル基を指す。
【００３９】
本発明の目的のために、「アルコキシアルキル」基は、アルコキシ基で置換されアルキル基を指す。
【００４０】
本発明の目的のために、「アルキルチオアルキル」基という用語は、アルキル−Ｓ−アルキルチオエーテル、例えばメチルチオメチル又はメチルチオエチルを指す。
【００４１】
本発明の目的のために、「アミノ」という用語は、一つ又は複数の水素ラジカルを有機ラジカルで置き換えることによってアンモニアから誘導される当技術分野で公知の窒素含有基を指す。例えば、「アシルアミノ」及び「アルキルアミノ」という用語は、各々、アシル置換基及びアルキル置換基を有する特定のＮ−置換有機ラジカルを指す。
【００４２】
本発明の目的のために、「アルキルカルボニル」という用語は、アルキル基で置換されたカルボニル基を指す。
【００４３】
本発明の目的のために、「ハロゲン」又は「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を指す。
【００４４】
本発明の目的のために、「ヘテロシクロアルキル」という用語は、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を含有する非芳香族環系を指す。ヘテロシクロアルキル環は、他のヘテロシクロアルキル環及び／又は非芳香族炭化水素環と場合により縮合していてもよく、又はさもなければ結合していてもよい。好ましいヘテロシクロアルキル基は、３〜７員を有する。ヘテロシクロアルキル基の例としては、ピペラジン、モルホリン、ピペリジン、テトラヒドロフラン、ピロリジン及びピラゾールが挙げられる。好ましいヘテロシクロアルキル基としては、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル及びピロリジニルが挙げられる。
【００４５】
本発明の目的のために、「ヘテロアリール」という用語は、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を含有する芳香族環系を指す。ヘテロアリール環は、一つ又は複数のヘテロアリール環、芳香族若しくは非芳香族炭化水素環、又はヘテロシクロアルキル環と縮合していてもよく、又はさもなければ結合していてもよい。ヘテロアリール環の例としては、例えばピリジン、フラン、チオフェン、５，６，７，８−テトラヒドロイソキノリン及びピリミジンが挙げられる。ヘテロアリール基の好ましい例としては、チエニル、ベンゾチエニル、ピリジル、キノリル、ピラジニル、ピリミジル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、フラニル、ベンゾフラニル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、イソチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピロリル、インドリル、ピラゾリル及びベンゾピラゾリルが挙げられる。
【００４６】
本発明の目的のために、「ヘテロ原子」という用語は、窒素、酸素及び硫黄を指す。
【００４７】
幾つかの実施形態において、置換アルキルとしては、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、ヒドロキシアルキル及びメルカプトアルキルが挙げられ、置換アルケニルとしては、カルボキシアルケニル、アミノアルケニル、ジアルケニルアミノ、ヒドロキシアルケニル及びメルカプトアルケニルが挙げられ、置換アルキニルとしては、カルボキシアルキニル、アミノアルキニル、ジアルキニルアミノ、ヒドロキシアルキニル及びメルカプトアルキニルが挙げられ、置換シクロアルキルとしては、４−クロロシクロヘキシル等の部分が挙げられ、アリールとしては、ナフチル等の部分が挙げられ、置換アリールとしては、３−ブロモフェニル等の部分が挙げられ、アラルキルとしては、トリル等の部分が挙げられ、ヘテロアルキルとしては、エチルチオフェン等の部分が挙げられ、置換ヘテロアリールとしては、３−メトキシチオフェン等の部分が挙げられ、アルコキシとしては、メトキシ等の部分が挙げられ、フェノキシとしては、３−ニトロフェノキシ等の部分が挙げられる。ハロは、フルオロ、クロロ、ヨード及びブロモを含むと理解されるものとする。
【００４８】
本発明の目的のために、「正の整数」とは、１以上の整数を含むと理解されるものとし、当業者であれば、当業者の合理性の範囲内であることが理解されよう。
【００４９】
本発明の目的のために、「結合した」という用語は、一つの基の別の基への共有（好ましくは）結合又は非共有結合、即ち、化学反応による前記結合を含むと理解されるものとする。
【００５０】
本発明の目的のために、「有効量」及び「十分量」という用語は、所望の効果又は治療効果を達成する量を意味するものとし、このような量は当業者により理解されている。
【００５１】
本明細書に記載のナノ粒子組成物を使用して形成される「ナノ粒子」及び／又は「ナノ粒子複合体」という用語は、脂質系ナノ複合体を指す。ナノ粒子は、カチオン性脂質、融合性脂質及びＰＥＧ脂質の混合物に封入されたオリゴヌクレオチド等の核酸を含有する。あるいは、ナノ粒子は、核酸なしで形成されていてもよい。
【００５２】
本発明の目的のために、「治療用オリゴヌクレオチド」とは、医薬品又は診断薬として使用するオリゴヌクレオチドを指す。
【００５３】
本発明の目的のために、「遺伝子発現の調節」という用語は、投与経路に関わらず、本明細書に記載のナノ粒子での処理なしに観察された遺伝子発現と比較して、好ましくは癌及び炎症と関連する任意の種類の遺伝子のダウンレギュレーション又はアップレギュレーションを広範に含むと理解されるものとする。
【００５４】
本発明の目的のために、「標的遺伝子の発現の抑制」とは、本明細書に記載のナノ粒子での処理なしに観察されたものと比較したとき、ｍＲＮＡ発現又は翻訳されたタンパク質の量を減少させるか、又は減弱させることを意味すると理解されるものとする。このような抑制の適切なアッセイとしては、例えばドットブロット、ノーザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能、並びに当業者に公知の表現型アッセイ等の当業者に公知の技法を用いたタンパク質又はｍＲＮＡレベルの検査が挙げられる。処理した状態は、例えば細胞、好ましくは癌細胞又は癌組織のｍＲＮＡレベルの減少により確認できる。
【００５５】
大まかに言って、抑制又は処理の成功は、所望の反応が得られた場合に生じるとみなされるものとする。例えば、抑制又は処理の成功は、例えば、腫瘍増殖抑制と関連する遺伝子の１０％以上（即ち、２０％、３０％、４０％）のダウンレギュレーションを得ることと定義できる。あるいは、処理の成功は、本明細書に記載のナノ粒子での処理なしに観察されたものと比較したとき、当業者により企図される他の臨床的指標を含め、癌細胞又は癌組織における癌遺伝子ｍＲＮＡレベルの少なくとも２０％、好ましくは３０％、より好ましくは４０％以上（即ち、５０％又は８０％）の低下を得ることと定義できる。
【００５６】
さらに、説明の簡便性のための単数形の用語の使用は、それだけに限定されることは決して意図されない。したがって、例えば、オリゴヌクレオチド、コレステロール類似体、カチオン性脂質、融合性脂質、ＰＥＧ脂質等を含む組成物についての言及は、オリゴヌクレオチド、コレステロール類似体、カチオン性脂質、融合性脂質、ＰＥＧ脂質等の一つ又は複数の分子を指す。オリゴヌクレオチドは、同一又は異なる種類の遺伝子であってよいことも企図される。本明細書に開示された特定の構成、工程段階及び物質は若干変化し得るため、本発明はこのような構成、工程段階及び物質に限定されないことも理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】実施例６〜１２に記載の化合物１２を調製するための反応スキームを概略的に例示する図である。
【図２】実施例１３〜１８に記載の化合物２９を調製するための反応スキームを概略的に例示する図である。
【図３】実施例１９〜２０に記載の化合物３１を調製するための反応スキームを概略的に例示する図である。
【図４】実施例２１〜２６に記載の化合物４９を調製するための反応スキームを概略的に例示する図である。
【図５】実施例２７〜３０に記載の化合物５４を調製するための反応スキームを概略的に例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本発明の一態様において、複数のカチオン部分を含有する放出性脂質が提供される。本発明によれば、核酸の送達のための前記放出性脂質を含有するナノ粒子組成物が提供される。ナノ粒子組成物は、（ｉ）式（Ｉ）の化合物、（ｉｉ）融合性脂質及び（ｉｉｉ）ＰＥＧ脂質を含有できる。企図される核酸としては、オリゴヌクレオチド又はプラスミド、好ましくはオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書に記載のナノ粒子組成物を使用することにより調製されるナノ粒子は、脂質担体中に封入される核酸を含む。
【００５９】
Ａ．式（Ｉ）の放出性カチオン脂質
１．概要
本発明によれば、式（Ｉ）の化合物：
【化５】
2012509272.tif 000006
【００６０】
［式中、
Ｒ１はコレステロール又はその類似体であり、
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ又はＮＲ４であり、好ましくは、Ｏであり、
Ｙ２及びＹ５は、独立に、Ｏ、Ｓ又はＮＲ５、好ましくは、Ｏであり、
Ｙ３〜４は、独立に、Ｏ、Ｓ又はＮＲ６、好ましくは、Ｏ又はＮＲ６であり、
Ｌ１〜２は独立に選択される二官能性リンカーであり、
Ｍは酸不安定性リンカーであり、
（ａ）、（ｄ）及び（ｆ）は、独立に、０又は１であり、
（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）は、独立に、０又は正の整数、好ましくは０又は約１〜約１０（例えば、１、２、３、４、５、６）の整数であり、
Ｘは、Ｃ、Ｎ又はＰであり、
Ｑ１は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル）、ＮＨ２又は−（Ｌ１１）ｄ１−Ｒ１１であり、
Ｑ２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル）、ＮＨ２又は−（Ｌ１２）ｄ２−Ｒ１２であり、
Ｑ３は、孤立電子対、（＝Ｏ）、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル）、ＮＨ２又は−（Ｌ１３）ｄ３−Ｒ１３であるが、
ただし、
（ｉ）ＸがＣであるとき、Ｑ３は孤立電子対又は（＝Ｏ）ではなく、
（ｉｉ）ＸがＮであるとき、Ｑ３は孤立電子対であり、
（ｉｉｉ）ＸがＰであるとき、Ｑ３は（＝Ｏ）であり、（ｆ）は０であり、
Ｌ１１、Ｌ１２及びＬ１３は独立に選択される二官能性スペーサーであり、
（ｄ１）、（ｄ２）及び（ｄ３）は、独立に、０又は正の整数、好ましくは０又は約１〜約１０（例えば、１、２、３、４、５、６）の整数、より好ましくは０、１、２、３、４であり、
Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は、独立に、水素、ＮＨ２、
【化６】
2012509272.tif 000007
【００６１】
であり、
Ｙ’４は、Ｏ、Ｓ又はＮＲ’６、好ましくは、Ｏ又はＮＲ’６であり、
Ｙ’５は、独立に、Ｏ、Ｓ又はＮＲ’５、好ましくは、Ｏであり、
（ｄ’）及び（ｆ’）は、独立に、０又は１であり、
（ｅ’）は０又は正の整数、好ましくは０又は約１〜約１０（例えば、１、２、３、４、５、６）の整数であり、
Ｘ’は、Ｃ、Ｎ又はＰであり、
Ｑ’１は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル）、ＮＨ２又は−（Ｌ’１１）ｄ’１−Ｒ’１１であり、
Ｑ’２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル）、ＮＨ２又は−（Ｌ’１２）ｄ’２−Ｒ’１２であり、
Ｑ’３は、孤立電子対、（＝Ｏ）、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル）、ＮＨ２又は−（Ｌ１３）ｄ’３−Ｒ’１３であるが、
ただし、
（ｉ）Ｘ’がＣであるとき、Ｑ’３は孤立電子対又は（＝Ｏ）ではなく、
（ｉｉ）Ｘ’がＮであるとき、Ｑ’３は孤立電子対であり、
（ｉｉｉ）Ｘ’がＰであるとき、Ｑ’３は（＝Ｏ）であり、（ｆ’）は０であり、
Ｌ’１１、Ｌ’１２及びＬ’１３は独立に選択される二官能性スペーサーであり、
（ｄ’１）、（ｄ’２）及び（ｄ’３）は、独立に、０又は正の整数、好ましくは０又は約１〜約１０（例えば、１、２、３、４、５、６）の整数であり、
Ｒ’１１、Ｒ’１２及びＲ’１３は、独立に、水素、ＮＨ２、
【化７】
2012509272.tif 000008
【００６２】
であり、
Ｒ２〜３及びＲ’２〜３は水素、アミン、ヒドロキシル、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１９分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ２〜６置換アルケニル、Ｃ２〜６置換アルキニル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ１〜６ヘテロアルキル及び置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、好ましくは水素、ヒドロキシル、アミン、メチル、エチル及びプロピルの中から独立に選択され、
Ｒ４〜７及びＲ’５〜７は水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１９分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ２〜６置換アルケニル、Ｃ２〜６置換アルキニル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ１〜６ヘテロアルキル及び置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、好ましくは水素、メチル、エチル及びプロピルの中から独立に選択されるが、
ただし、Ｑ１〜３及びＱ’１〜３の少なくとも一つ又は複数（例えば、一つ、二つ、三つ）は、
【化８】
2012509272.tif 000009
【００６３】
を含む］
が提供される。
【００６４】
（ｂ）又は（ｃ）が２以上であるとき、Ｌ１及びＬ２は各発生時に独立に同一又は異なる。
【００６５】
（ｅ）又は（ｅ’）が２以上であるとき、−Ｃ（Ｒ２Ｒ３）−及び−Ｃ（Ｒ２Ｒ３）−は各発生時に独立に同一又は異なる。
【００６６】
（ｄ１）、（ｄ２）又は（ｄ３）が２以上であるとき、Ｌ１１、Ｌ１２及びＬ１３は各発生時に独立に同一又は異なる。
【００６７】
（ｄ’１）、（ｄ’２）又は（ｄ’３）が２以上であるとき、Ｌ’１１、Ｌ’１２及びＬ’１３は各発生時に独立に同一又は異なる。
【００６８】
本発明の範囲内で企図される二官能性リンカーと二官能性スペーサーとの組合せとしては、リンカー基及びスペーサー基の変数と置換基との組合せが許容されることにより、このような組合せにより式（Ｉ）の安定な化合物がもたらされるものが挙げられる。例えば、値と置換基との組合せは、酸素、窒素又はカルボニルをＳ−Ｓ又はイミンに直接隣接して配置することを許容しない。
【００６９】
好ましい一態様において、Ｍは−Ｓ−Ｓ−、−ＣＲ１６Ｒ１７−Ｏ−ＣＲ１４Ｒ１５−Ｏ−ＣＲ１８Ｒ１９−又は−Ｎ＝ＣＲ１０−若しくは−ＣＲ１０＝Ｎ−である。
【００７０】
ある種の実施形態において、放出性カチオン脂質は、式（Ｉａ）：
【化９】
2012509272.tif 000010
【００７１】
を有する。
【００７２】
ある種の実施形態において、放出性カチオン脂質は、式（Ｉｂ）：
【化１０】
2012509272.tif 000011
【００７３】
［式中、
Ｒ１４〜１５は水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１９分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ２〜６置換アルケニル、Ｃ２〜６置換アルキニル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ１〜６ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ２〜６アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ２〜６アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ２〜６置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ２〜６置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、Ｃ２〜６置換アルカノイルオキシ及び置換アリールカルボニルオキシの中から独立に選択され、好ましくはＲ１４及びＲ１５は水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜８分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール及びアラルキル、好ましくは水素、メチル、エチル又はプロピルの中から選択され、
Ｒ１６〜１９は水素、ヒドロキシル、アミン、置換アミン、アジド、カルボキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、シリルエーテル、スルホニル、メルカプト、Ｃ１〜６アルキルメルカプト、アリールメルカプト、置換アリールメルカプト、置換Ｃ１〜６アルキルチオ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１９分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ２〜６置換アルケニル、Ｃ２〜６置換アルキニル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ１〜６ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ２〜６アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ２〜６アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ２〜６置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ２〜６置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、Ｃ２〜６置換アルカノイルオキシ及び置換アリールカルボニルオキシ、好ましくは水素、メチル、エチル又はプロピルの中から独立に選択される］
を有する。
【００７４】
好ましくは、Ｒ１４及びＲ１５がいずれも同時に水素であることはない。
【００７５】
好ましい一実施形態において、Ｒ１４及びＲ１５は水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜８分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール及びアラルキルの中から選択される。
【００７６】
より好ましくは、Ｒ１４及びＲ１５はいずれもＣ１〜６アルキル（メチル、エチル、プロピル）及びＣ３〜８分岐アルキルの中から選択される。特定の一実施形態において、Ｒ１４及びＲ１５はいずれもメチルである。
【００７７】
ある種の実施形態において、放出性カチオン脂質は式（Ｉｃ）又は（Ｉｃ’）
【化１１】
2012509272.tif 000012
【００７８】
［式中、Ｒ１０は水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜８分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール又は置換アリール、好ましくは水素、メチル、エチル又はプロピルである］
を有する。
【００７９】
好ましい一態様において、式（Ｉ）の化合物は
【化１２】
2012509272.tif 000013
【００８０】
を二つ以上含む。
【００８１】
別の好ましい態様において、式（Ｉ）の化合物はＲ１１、Ｒ１２及びＲ１３を二つ以上含む。
【００８２】
好ましい一実施形態において、Ｙ１は酸素である。
【００８３】
別の好ましい実施形態において、Ｙ２及びＹ５はいずれも酸素である。
【００８４】
一実施形態において、（ｄ１）及び（ｄ２）がいずれも同時に０であることはない。
【００８５】
別の実施形態において、（ｄ１）、（ｄ２）、（ｄ３）、（ｄ’１）、（ｄ’２）及び（ｄ’３）が同時に０であることはない。
【００８６】
本明細書に記載の式（Ｉ）の放出性カチオン脂質は、選択されたｐＨ、例えばｐＨ＜１３（例えばｐＨ６〜１２、ｐＨ６〜８）で正味の正電荷又は中性電荷を担持できる。
【００８７】
２．二官能性リンカー：Ｌ１基及びＬ２基
本発明によれば、Ｌ１基としては、
−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｔ１−［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３−、
−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｔ１Ｙ１７−（ＣＲ２３Ｒ２４）ｔ２−（Ｙ１８）ａ２−［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３−、
−（ＣＲ２１Ｒ２２ＣＲ２３Ｒ２４Ｙ１７）ｔ１−［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３−、
−（ＣＲ２１Ｒ２２ＣＲ２３Ｒ２４Ｙ１７）ｔ１（ＣＲ２５Ｒ２６）ｔ４−（Ｙ１８）ａ２−［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３−、
−［（ＣＲ２１Ｒ２２ＣＲ２３Ｒ２４）ｔ２Ｙ１７］ｔ３（ＣＲ２５Ｒ２６）ｔ４−（Ｙ１８）ａ２−［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３−、
−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｔ１−［（ＣＲ２３Ｒ２４）ｔ２Ｙ１７］ｔ３（ＣＲ２５Ｒ２６）ｔ４−（Ｙ１８）ａ２−［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３−、
−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｔ１（Ｙ１７）ａ２［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３（ＣＲ２３Ｒ２４）ｔ２−、
−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｔ１（Ｙ１７）ａ２［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３Ｙ１４（ＣＲ２３Ｒ２４）ｔ２−、
−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｔ１（Ｙ１７）ａ２［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３（ＣＲ２３Ｒ２４）ｔ２−Ｙ１５−（ＣＲ２３Ｒ２４）ｔ３−、
−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｔ１（Ｙ１７）ａ２［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３Ｙ１４（ＣＲ２３Ｒ２４）ｔ２−Ｙ１５−（ＣＲ２３Ｒ２４）ｔ３−、
−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｔ１（Ｙ１７）ａ２［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３（ＣＲ２３Ｒ２４ＣＲ２５Ｒ２６Ｙ１９）ｔ２（ＣＲ２７ＣＲ２８）ｔ３−、
−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｔ１（Ｙ１７）ａ２［Ｃ（＝Ｙ１６）］ａ３Ｙ１４（ＣＲ２３Ｒ２４ＣＲ２５Ｒ２６Ｙ１９）ｔ２（ＣＲ２７ＣＲ２８）ｔ３−、及び
【化１３】
2012509272.tif 000014
【００８８】
［式中、
Ｙ１６はＯ、ＮＲ２８又はＳ、好ましくはＯであり、
Ｙ１４〜１５及びＹ１７〜１９は独立にＯ、ＮＲ２９又はＳ、好ましくはＯ又はＮＲ２９であり、
Ｒ２１〜２７は水素、ヒドロキシル、アミン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜１２分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、フェノキシ及びＣ１〜６ヘテロアルコキシ、好ましくは水素、メチル、エチル又はプロピルの中から独立に選択され、
Ｒ２８〜２９は水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜１２分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、フェノキシ及びＣ１〜６ヘテロアルコキシ、好ましくは水素、メチル、エチル又はプロピルの中から独立に選択され、
（ｔ１）、（ｔ２）、（ｔ３）及び（ｔ４）は独立に０又は正の整数、好ましくは０又は約１〜約１０（例えば１、２、３、４、５、６）の正の整数であり、
（ａ２）及び（ａ３）は独立に０又は１である］
等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８９】
本発明の範囲内で企図される二官能性Ｌ１リンカーとしては、変数と置換基との組合せが許容されることにより、このような組合せにより式（Ｉ）の安定な化合物がもたらされるものが挙げられる。例えば、（ａ３）が０であるとき、Ｙ１７はＹ１４に直接結合しない。
【００９０】
本発明の目的のために、二官能性リンカーの値が２以上の正の整数であるとき、同一又は異なる二官能性リンカーを使用できる。
【００９１】
（ｔ１）、（ｔ２）、（ｔ３）又は（ｔ４）が独立に２以上であるとき、各発生時にＲ２１〜Ｒ２８は独立に同一又は異なる。
【００９２】
一実施形態において、Ｙ１４〜１５及びＹ１７〜１９はＯ又はＮＨであり、Ｒ２１〜２９は独立に水素又はメチルである。
【００９３】
別の実施形態において、Ｙ１６はＯであり、Ｙ１４〜１５及びＹ１７〜１９はＯ又はＮＨであり、Ｒ２１〜２９は水素である。
【００９４】
ある種の実施形態において、Ｌ１は、
−（ＣＨ２）ｔ１−［Ｃ（＝Ｏ）］ａ３−、
−（ＣＨ２）ｔ１Ｙ１７−（ＣＨ２）ｔ２−（Ｙ１８）ａ２−［Ｃ（＝Ｏ）］ａ３−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｙ１７）ｔ１−［Ｃ（＝Ｏ）］ａ３−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｙ１７）ｔ１（ＣＨ２）ｔ４−（Ｙ１８）ａ２−［Ｃ（＝Ｏ）］ａ３−、
−［（ＣＨ２ＣＨ２）ｔ２Ｙ１７］ｔ３（ＣＨ２）ｔ４−（Ｙ１８）ａ２−［Ｃ（＝Ｏ）］ａ３−、
−（ＣＨ２）ｔ１−［（ＣＨ２）ｔ２Ｙ１７］ｔ３（ＣＨ２）ｔ４−（Ｙ１８）ａ２−［Ｃ（＝Ｏ）］ａ３−、
−（ＣＨ２）ｔ１（Ｙ１７）ａ２［Ｃ（＝Ｏ）］ａ３（ＣＨ２）ｔ２−、
−（ＣＨ２）ｔ１（Ｙ１７）ａ２［Ｃ（＝Ｏ）］ａ３Ｙ１４（ＣＨ２）ｔ２−、
−（ＣＨ２）ｔ１（Ｙ１７）ａ２［Ｃ（＝Ｏ）］ａ３（ＣＨ２）ｔ２−Ｙ１５−（ＣＨ２）ｔ３−、
−（ＣＨ２）ｔ１（Ｙ１７）ａ２［Ｃ（＝Ｏ）］ａ３Ｙ１４（ＣＨ２）ｔ２−Ｙ１５−（ＣＨ２）ｔ３−、
−（ＣＨ２）ｔ１（Ｙ１７）ａ２［Ｃ（＝Ｏ）］ａ３（ＣＨ２ＣＨ２Ｙ１９）ｔ２（ＣＨ２）ｔ３−、及び
−（ＣＨ２）ｔ１（Ｙ１７）ａ２［Ｃ（＝Ｏ）］ａ３Ｙ１４（ＣＨ２ＣＨ２Ｙ１９）ｔ２（ＣＨ２）ｔ３−
［式中、
Ｙ１４〜１５及びＹ１７〜１９は独立にＯ又はＮＨであり、
（ｔ１）、（ｔ２）、（ｔ３）及び（ｔ４）は独立に０又は正の整数、好ましくは０又は約１〜約１０（例えば１、２、３、４、５、６）の正の整数であり、
（ａ２）及び（ａ３）は独立に０又は１である］
の中から独立に選択される。
【００９５】
（ｔ１）又は（ｔ３）が２以上であるとき、各発生時にＹ１７は同一又は異なる。
【００９６】
（ｔ２）が２以上であるとき、各発生時にＹ１９は同一又は異なる。
【００９７】
さらなる実施形態及び／又は代替実施形態において、Ｌ１基の例示的例は、
−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）４−、−（ＣＨ２）５−、−（ＣＨ２）６−、−ＮＨ（ＣＨ２）−、
−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２−、
−（ＣＨ２）４−Ｃ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）５−Ｃ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）６−Ｃ（＝Ｏ）−、
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−Ｃ（＝Ｏ）−、
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、
−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−、
−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−、
−（ＣＨ２）４−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）５−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、
−（ＣＨ２）６−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、
−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、
−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２Ｏ−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、
−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、
−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−、
【化１４】
2012509272.tif 000015
【００９８】
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）４−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）４−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）５−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）５−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）６−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）６−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）２−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）２−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）４−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）４−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）５−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）５−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）６−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）６−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）４−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）５−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）６−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）２−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）４−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）５−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）６−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）２−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）３−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）４−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）５−、及び
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）６−の中から選択される。
【００９９】
ある種の実施形態において、Ｌ２としては、
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２）ｔ’１−［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３（ＣＲ’２７ＣＲ’２８）ｔ’２−、
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２）ｔ’１Ｙ’１４−（ＣＲ’２３Ｒ’２４）ｔ’２−（Ｙ’１５）ａ’２−［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３（ＣＲ’２７ＣＲ’２８）ｔ’３−、
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２ＣＲ’２３Ｒ’２４Ｙ’１４）ｔ’１−［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３（ＣＲ’２７ＣＲ’２８）ｔ’２−、
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２ＣＲ’２３Ｒ’２４Ｙ’１４）ｔ’１（ＣＲ’２５Ｒ’２６）ｔ’２−（Ｙ’１５）ａ’２−［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３（ＣＲ’２７ＣＲ’２８）ｔ’３−、
−［（ＣＲ’２１Ｒ’２２ＣＲ’２３Ｒ’２４）ｔ’２Ｙ’１４］ｔ’１（ＣＲ’２５Ｒ’２６）ｔ’２−（Ｙ’１５）ａ’２−［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３（ＣＲ’２７ＣＲ’２８）ｔ’３−、
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２）ｔ’１−［（ＣＲ’２３Ｒ’２４）ｔ’２Ｙ’１４］ｔ’２（ＣＲ’２５Ｒ’２６）ｔ’３−（Ｙ’１５）ａ’２−［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３（ＣＲ’２７ＣＲ’２８）ｔ’４−
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２）ｔ’１（Ｙ’１４）ａ’２［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３（ＣＲ’２３Ｒ’２４）ｔ’２−、
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２）ｔ’１（Ｙ’１４）ａ’２［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３Ｙ’１５（ＣＲ’２３Ｒ’２４）ｔ’２−、
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２）ｔ’１（Ｙ’１４）ａ’２［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３（ＣＲ’２３Ｒ’２４）ｔ’２−Ｙ’１５−（ＣＲ’２３Ｒ’２４）ｔ’３−、
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２）ｔ’１（Ｙ’１４）ａ’２［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３Ｙ’１４（ＣＲ’２３Ｒ’２４）ｔ’２−Ｙ’１５−（ＣＲ’２３Ｒ’２４）ｔ’３−、
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２）ｔ’１（Ｙ’１４）ａ’２［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３（ＣＲ’２３Ｒ’２４ＣＲ’２５Ｒ’２６Ｙ’１５）ｔ’２（ＣＲ’２７ＣＲ’２８）ｔ’３−、
−（ＣＲ’２１Ｒ’２２）ｔ’１（Ｙ’１４）ａ’２［Ｃ（＝Ｙ’１６）］ａ’３Ｙ’１７（ＣＲ’２３Ｒ’２４ＣＲ’２５Ｒ’２６Ｙ’１５）ｔ’２（ＣＲ’２７ＣＲ’２８）ｔ’３−、及び
【化１５】
2012509272.tif 000016
【０１００】
［式中、
Ｙ’１６はＯ、ＮＲ’２８又はＳ、好ましくはＯであり、
Ｙ’１４〜１５及びＹ’１７は独立にＯ、ＮＲ’２９又はＳ、好ましくはＯ又はＮＲ’２９であり、
Ｒ’２１〜２７は水素、ヒドロキシル、アミン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜１２分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、フェノキシ及びＣ１〜６ヘテロアルコキシ、好ましくは水素、メチル、エチル又はプロピルの中から独立に選択され、
Ｒ’２８〜２９は水素、ヒドロキシル、アミン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜１２分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、フェノキシ及びＣ１〜６ヘテロアルコキシ、好ましくは水素、メチル、エチル又はプロピルの中から独立に選択され、
（ｔ’１）、（ｔ’２）、（ｔ’３）及び（ｔ’４）は独立に０又は正の整数、好ましくは０又は約１〜約１０（例えば０、１、２、３、４、５、６）の正の整数であり、
（ａ’２）及び（ａ’３）は独立に０又は１である］
等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１０１】
本発明の範囲内で企図される二官能性Ｌ２リンカーとしては、リンカー基の変数と置換基との組合せが許容されることにより、このような組合せにより式（Ｉ）の安定な化合物がもたらされるものが挙げられる。例えば、（ａ’３）が０であるとき、Ｙ’１４はＹ’１４又はＹ’１７に直接結合しない。
【０１０２】
本発明の目的のために、二官能性Ｌ２リンカーの値が、２以上の正の整数であるとき、同一又は異なる二官能性リンカーを使用できる。
【０１０３】
一実施形態において、Ｙ’１４〜１５及びＹ’１７はＯ又はＮＨであり、Ｒ’２１〜２９は独立に水素又はメチルである。
【０１０４】
別の実施形態において、Ｙ’１６はＯであり、Ｙ’１４〜１５及びＹ’１７はＯ又はＮＨであり、Ｒ’２１〜２９は水素である。
【０１０５】
ある種の実施形態において、Ｌ２は、
−（ＣＨ２）ｔ’１−［Ｃ（＝Ｏ）］ａ’３（ＣＨ２）ｔ’２−、
−（ＣＨ２）ｔ’１Ｙ’１４−（ＣＨ２）ｔ’２−（Ｙ’１５）ａ’２−［Ｃ（＝Ｏ）］ａ’３（ＣＨ２）ｔ’３−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｙ’１４）ｔ’１−［Ｃ（＝Ｏ）］ａ’３（ＣＨ２）ｔ’２−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｙ’１４）ｔ’１（ＣＨ２）ｔ’２−（Ｙ’１５）ａ’２−［Ｃ（＝Ｏ）］ａ’３（ＣＨ２）ｔ’３−、
−［（ＣＨ２ＣＨ２）ｔ’２Ｙ’１４］ｔ’１（ＣＨ２）ｔ’２−（Ｙ’１５）ａ’２−［Ｃ（＝Ｏ）］ａ’３（ＣＨ２）ｔ’３−、
−（ＣＨ２）ｔ’１−［（ＣＨ２）ｔ’２Ｙ’１４］ｔ’２（ＣＨ２）ｔ’３−（Ｙ’１５）ａ’２−［Ｃ（＝Ｏ）］ａ’３（ＣＨ２）ｔ’４−、
−（ＣＨ２）ｔ’１（Ｙ’１４）ａ’２［Ｃ（＝Ｏ）］ａ’３（ＣＨ２）ｔ’２−、
−（ＣＨ２）ｔ’１（Ｙ’１４）ａ’２［Ｃ（＝Ｏ）］ａ’３Ｙ’１５（ＣＨ２）ｔ’２−、
−（ＣＨ２）ｔ’１（Ｙ’１４）ａ’２［Ｃ（＝Ｏ）］ａ’３（ＣＨ２）ｔ’２−Ｙ’１５−（ＣＨ２）ｔ’３−、
−（ＣＨ２）ｔ’１（Ｙ’１４）ａ’２［Ｃ（＝Ｏ）］ａ’３Ｙ’１４（ＣＨ２）ｔ’２−Ｙ’１５−（ＣＨ２）ｔ’３−、
−（ＣＨ２）ｔ’１（Ｙ’１４）ａ’２［Ｃ（＝Ｏ）］ａ’３（ＣＨ２ＣＨ２Ｙ’１５）ｔ’２（ＣＨ２）ｔ’３−、及び
−（ＣＨ２）ｔ’１（Ｙ’１４）ａ’２［Ｃ（＝Ｏ）］ａ’３Ｙ’１７（ＣＨ２ＣＨ２Ｙ’１５）ｔ’２（ＣＨ２）ｔ’３−
［式中、
Ｙ’１４〜１５及びＹ’１７は独立にＯ又はＮＨであり、
（ｔ’１）、（ｔ’２）、（ｔ’３）及び（ｔ’４）は独立に０又は正の整数、好ましくは０又は約１〜約１０（例えば１、２、３、４、５、６）の正の整数であり、
（ａ’２）及び（ａ’３）は独立に０又は１である］
の中から選択される。
【０１０６】
（ｔ’１）又は（ｔ’２）が２以上であるとき、各発生時にＹ’１４は同一又は異なる。
【０１０７】
（ｔ’２）が２以上であるとき、各発生時にＹ’１５は同一又は異なる。
【０１０８】
さらなる実施形態及び／又は代替実施形態において、Ｌ２基の例示的例は、
−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）４−、−（ＣＨ２）５−、−（ＣＨ２）６−、−ＮＨ（ＣＨ２）−、
−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２−、
−Ｏ（ＣＨ２）２−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）２−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）３−、
−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（ＣＨ２）３−、
−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−ＣＨ２−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｏ（ＣＨ２）３−、
−ＣＨ２−ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（ＣＨ２）３−、
−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、
−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、
−（ＣＨ２）２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、
−（ＣＨ２）２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、
−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、
−（ＣＨ２）２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２Ｏ−．
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、
−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−、
【化１６】
2012509272.tif 000017
2012509272.tif 000018
【０１０９】
−（ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）４−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）４−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）５−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）５−、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）６−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）６−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）２−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）２−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）４−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）４−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）５−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）５−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）６−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）６−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）４−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）５−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）６−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）２−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）４−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）５−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）６−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）２−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）３−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）４−、
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）５−、及び
−（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）６−の中から選択される。
【０１１０】
さらなる実施形態及び代替的な実施形態において、二官能性リンカーＬ１及びＬ２は、置換、飽和又は不飽和、分岐又は直鎖のＣ３〜５０アルキル（即ち、Ｃ３〜４０アルキル、Ｃ３〜２０アルキル、Ｃ３〜１５アルキル、Ｃ３〜１０アルキル等）を有するスペーサーであってよく、一つ又は複数の炭素は、ＮＲ６、Ｏ、Ｓ又はＣ（＝Ｙ）、（好ましくはＯ又はＮＨ）で場合により置き換えられるが、置き換えられる炭素は７０％を超えない（即ち、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％未満）。
【０１１１】
３．二官能性スペーサー：Ｌ１１〜１３及びＬ’１１〜１３
本発明によれば、二官能性スペーサーＬ１１〜１３及びＬ’１１〜１３は、グアニジニウム、ＤＢＵ、ＤＢＮ等のカチオン性部分に結合可能な末端二官能性リンカーである。二官能性スペーサーＬ１１〜１３及びＬ’１１〜１３は、
−（ＣＲ３１Ｒ３２）ｑ１−及び
−Ｙ２６（ＣＲ３１Ｒ３２）ｑ１−
［式中、
Ｙ２６はＯ、ＮＲ３３又はＳ、好ましくはＯ又はＮＲ３３であり、
Ｒ３１〜３２は水素、ＯＨ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜１２分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、フェノキシ及びＣ１〜６ヘテロアルコキシ、好ましくは水素、メチル、エチル又はプロピルの中から独立に選択され、
Ｒ３３は水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜１２分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、フェノキシ及びＣ１〜６ヘテロアルコキシ、好ましくは水素、メチル、エチル又はプロピルの中から選択され、
（ｑ１）は０又は正の整数であり、好ましくは０又は約１〜約１０（例えば１、２、３、４、５、６）の整数である］
の中から独立に選択される。
【０１１２】
本発明の範囲内で企図される二官能性スペーサーとしては、変数と置換基との組合せが許容されることにより、このような組合せにより式（Ｉ）の安定な化合物がもたらされるものが挙げられる。
【０１１３】
（ｑ１）が２以上であるとき、各発生時にＲ３１及びＲ３２は独立に同一又は異なる。
【０１１４】
一つの好ましい実施形態において、Ｒ’３１〜３３は水素又はメチルである。
【０１１５】
さらなる実施形態及び／又は代替実施形態において、Ｌ１１〜１３及びＬ’１１〜１３は、
−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）４−、−（ＣＨ２）５−、−（ＣＨ２）６−、
−Ｏ（ＣＨ２）２−、−Ｏ（ＣＨ２）３−、−Ｏ（ＣＨ２）４−、−Ｏ（ＣＨ２）５−、−Ｏ（ＣＨ２）６−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ２−、
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２−、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）２−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）３−、
−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（ＣＨ２）３−、
−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−ＣＨ２−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｏ（ＣＨ２）３−、
−ＣＨ２−ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（ＣＨ２）３−、
−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ（ＣＨ２）３−、
−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、
−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、
−（ＣＨ２）２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、
−（ＣＨ２）２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、
−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−、及び
−（ＣＨ２）２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２−
の中から独立に選択される。
【０１１６】
本発明によれば、Ｘ（Ｑ１）（Ｑ２）（Ｑ３）部分の幾つかの例としては、
【化１７】
2012509272.tif 000019
【０１１７】
が挙げられる。
【０１１８】
Ｘ’（Ｑ’１）（Ｑ’２）（Ｑ’３）部分の幾つかの例としては、
【化１８】
2012509272.tif 000020
【０１１９】
が挙げられる。
【０１２０】
好ましい一実施形態において、Ｒ１１及びＲ１２はいずれも
【化１９】
2012509272.tif 000021
【０１２１】
を含む。
【０１２２】
好ましくは、Ｒ’１１及びＲ’１２はいずれも
【化２０】
2012509272.tif 000022
【０１２３】
を含む。
【０１２４】
Ｂ．式（Ｉ）の化合物の調製
代表的な特定の化合物の合成を実施例に示す。しかし、一般に、本発明の化合物は、幾つかの方式で調製できる。本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物を調製する方法は、アミン官能化コレステロール（官能化コレステロール）と１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジンとを反応させて、グアニジニウム部分を得ることを含む。コレステロールに結合しているアミンは第１級及び／又は第２級アミンであってよく、１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジン中のアミンは非置換又は置換であってよい。
【０１２５】
一実施形態において、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物を調製する方法は、ジスルフィド結合を有するコレステロール誘導体とアミン含有部分とを反応させて、次いでアミンをグアニジニウムに変換し、ジスルフィド結合を有するカチオン脂質を得ることを含む。
【０１２６】
別の実施形態において、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物を調製する方法は、ケタール結合を有するコレステロール誘導体とアミン含有部分とを反応させて、次いでアミンをグアニジニウムに変換し、ケタール部分又はアセタール部分を有するカチオン脂質を得ることを含む。
【０１２７】
さらに別の実施形態において、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物を調製する方法は、アルデヒドを有するコレステロール誘導体とアミン含有部分とを反応させて、イミンを形成し、次いでアミンをグアニジニウムに変換し、イミン部分を有するカチオン脂質を得ることを含む。
【０１２８】
ジスルフィド結合を含有するコレステリルカチオン脂質を調製する一つの例示的例を図１に示す。最初に、コレステロールと２−ニトロピリジルジスルフィド基を含有するアミン保護システインとを、カップリング剤（ＥＤＣ）及び塩基（ＤＭＡＰ）の存在下で反応させて、コレステリルシステインエステル（化合物３）を形成する。エステルの２−ニトロピリジルジスルフィド基とチオール基及びアミン保護基を含有する二官能性スペーサーとを反応させて、ジスルフィド結合を形成する。二官能性スペーサーのアミン保護基の除去、次いで末端アミンを有する分岐部分との結合により、アミン官能化コレステロールが得られる。アミン官能化コレステロールの末端アミンを１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジンで処理して、ジスルフィド結合を含有するカチオン脂質を得る。
【０１２９】
ケタール含有リンカーを含有するコレステリルカチオン脂質を調製する別の例示的例を図２及び３に示す。ケタール結合を含有する二官能性リンカー（化合物２３）を調製する。ケタール含有二官能性リンカーのジアミンの一つをエチルトリフルオロアセテートで保護する。活性化されたコレステロールカーボネート、例えばコレステリルクロロホルメート、コレステリルＮＨＳカーボネート又はコレステリルＰＮＰカーボネートと二官能性リンカー中の他の求核アミンとを反応させて、次いでトリフルオロアセトアミド基を脱保護し、末端アミンを有するコレステロール誘導体を調製する。末端アミンとリジンとをさらに反応させて、分岐部分を有するコレステロール誘導体（化合物３０）を調製する。コレステロール誘導体の分岐部分上のアミンと１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジンとを反応させて、ケタール基を含有するコレステリルカチオン脂質を得る。
【０１３０】
イミンリンカーを含むコレステリルカチオン脂質を調製するさらに別の例示的例を図４に示す。アミン及び保護アミンを含有する二官能性リンカー（化合物４４）を二つのステップで化合物４１及び４２から調製する。活性化されたコレステロールカーボネート、例えばコレステリルクロロホルメート、コレステリルＮＨＳカーボネート又はコレステリルＰＮＰカーボネートとアルデヒド含有化合物（例えば、３−メトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド）とを反応させて、アルデヒドを含有するコレステリル誘導体を得る。二官能性リンカーの求核アミンと、アルデヒドを含有するコレステリル誘導体とを反応させて、イミン結合を形成し、次いで温和な塩基性条件下でアミンを脱保護し、末端アミンを含有するコレステリル誘導体を得る。末端アミンと１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジンとを反応させて、イミン基を含有するコレステリルカチオン脂質を得る。
【０１３１】
本発明によれば、該方法は、過度に実験するまでもなく、式（Ｉ）の化合物を調製するために当技術分野で公知の代替法を使用できる。
【０１３２】
アミン含有化合物のコレステロールへの結合は、当業者に公知のカップリング剤、例えば１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、ジアルキルカルボジイミド、２−ハロ−１−アルキルピリジニウムハロゲン化物、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、プロパンホスホン酸環状無水物（ＰＰＡＣＡ）及びフェニルジクロロホスフェートを用いて、塩基の存在下で標準的な有機合成法を用いて行うことができる。
【０１３３】
さらなる実施形態において、コレステロール又はアミン含有化合物がＮＨＳ、ＰＮＰ又はクロロホルメート等の離脱基で活性化される場合、カップリング剤は必要なく、反応は塩基の存在下で進められる。
【０１３４】
一般に、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物は、活性化コレステロールとアミン含有求核剤とをＤＭＡＰ又はＤＩＥＡ等の塩基の存在下で反応させることにより調製されることが好ましい。反応は、不活性溶媒、例えば塩化メチレン、クロロホルム、トルエン、ＤＭＦ又はそれらの混合物中で行われることが好ましい。反応は、塩基、例えばＤＭＡＰ、ＤＩＥＡ、ピリジン、トリエチルアミン等の存在下で、−４℃〜約７０℃（例えば、−４℃〜約５０℃）の温度で行われることも好ましい。好ましい一実施形態において、反応は、０℃〜約２５℃又は０℃〜ほぼ室温の温度で行われる。
【０１３５】
アミン含有化合物からの保護基の除去は、強酸、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ＨＣｌ、硫酸等、又は接触水素化、ラジカル反応等により行うことができる。あるいは、アミン保護基の除去は、ピペリジン等の塩基により行うことができる。一実施形態において、Ｂｏｃ基の脱保護は、ジオキサン中のＨＣｌ溶液により行われる。別の実施形態において、Ｆｍｏｃ基の脱保護は、ピペリジンにより行われる。脱保護反応は、−４℃〜約５０℃の温度で行うことができる。好ましくは、反応は０℃〜約２５℃又は室温の温度で行われる。別の実施形態において、Ｂｏｃ基の脱保護は室温で行われる。
【０１３６】
アミンのグアニジニウム部分への変換は、不活性溶媒、例えば塩化メチレン、クロロホルム、ＤＭＦ又はそれらの混合物中で、コレステロールに結合しているアミン（例えば、化合物９のアミン）と１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジンとを反応させることにより行われる。他の試薬、例えばＮ−ＢＯＣ−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジン又はＮ，Ｎ’−ジ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）チオ尿素及びカップリング試薬もアミンをグアニジン部分に変換するために使用できる。
【０１３７】
当業者に公知のカップリング剤、例えば１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、ジアルキルカルボジイミド、２−ハロ−１−アルキルピリジニウムハロゲン化物、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、プロパンホスホン酸環状無水物（ＰＰＡＣＡ）及びフェニルジクロロホスフェートは、本明細書に記載のカチオン脂質の調製で使用できる。反応は、塩基、例えばＤＭＡＰ、ＤＩＥＡ、ピリジン、トリエチルアミン等の存在下で、−４℃〜約５０℃の温度で行われることが好ましい。好ましい一実施形態において、反応は、０℃〜約２５℃又は室温の温度で行われる。
【０１３８】
本明細書に記載の方法により調製される幾つかの代表的実施形態としては、それだけに限らないが
【化２１】
2012509272.tif 000023
2012509272.tif 000024
2012509272.tif 000025
2012509272.tif 000026
2012509272.tif 000027
2012509272.tif 000028
【０１３９】
が挙げられる。
【０１４０】
Ｃ．ナノ粒子組成物／製剤
１．概要
本発明の一態様において、ナノ粒子組成物はカチオン脂質を含有する。
【０１４１】
本発明によれば、ナノ粒子組成物は式（Ｉ）の化合物、融合性脂質及びＰＥＧ脂質を含有する。
【０１４２】
本発明の好ましい一態様において、ナノ粒子組成物はコレステロールを含む。
【０１４３】
本発明のさらなる態様において、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、当技術分野で公知のカチオン脂質をさらに含有できる。異なる融合性脂質（非カチオン脂質）の混合物及び／又は異なるＰＥＧ脂質の混合物を含有するナノ粒子組成物も企図される。
【０１４４】
別の態様において、ナノ粒子組成物は、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質（医薬担体）の約１０％〜約９９．９％の範囲のモル比で式（Ｉ）の化合物を含むカチオン脂質を含有する。
【０１４５】
カチオン脂質成分は、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質の約２％〜約６０％、約５％〜約５０％、約１０％〜約４５％、約１５％〜約２５％又は約３０％〜約４０％の範囲であってよい。
【０１４６】
一実施形態において、カチオン脂質は、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質の約１５％〜約２５％（即ち１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５％）の量で存在する。
【０１４７】
本発明によれば、ナノ粒子組成物は、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質の約２０％〜約８５％、約２５％〜約８５％、約６０％〜約８０％（例えば６５、７５、７８又は８０％）のモル比で、コレステロール系及び／又は非コレステロール系融合性脂質を含む、総融合性／非カチオン脂質を含有できる。一実施形態において、総融合性／非カチオン脂質は、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質の約８０％である。
【０１４８】
ある種の実施形態において、非コレステロール系融合性／非カチオン脂質は、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質の約２５％〜約７８％（２５、３５、４７、６０又は７８％）又は約６０〜約７８％のモル比で存在する。一実施形態において、非コレステロール系融合性／非カチオン脂質は、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質の約６０％である。
【０１４９】
ある種の実施形態において、ナノ粒子組成物は、非コレステロール融合性脂質に加えて、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質の約０％〜約６０％、約１０％〜約６０％又は約２０％〜約５０％（例えば２０、３０、４０又は５０％）の範囲のモル比でコレステロールを含む。一実施形態において、コレステロールは、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質の約２０％である。
【０１５０】
ある種の実施形態において、ナノ粒子組成物中に含有されるＰＥＧ脂質は、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質の約０．５％〜約２０％、約１．５％〜約１８％のモル比の範囲である。ナノ粒子組成物の一実施形態において、ＰＥＧ脂質は、総脂質の約２％〜約１０％（例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は１０％）のモル比で含まれる。例えば、総ＰＥＧ脂質は、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質の約２％である。
【０１５１】
２．カチオン脂質
本発明の一態様において、式（Ｉ）の化合物はナノ粒子組成物中に含まれる。
【０１５２】
本発明のさらなる態様において、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、当技術分野で公知のカチオン脂質をさらに含むことができる。企図されるさらなる適切な脂質としては、例えば、
Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；
１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン又はＮ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；
１，２−ビス（ジミルストイルオキシ）−３−３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＭＴＡＰ）；
１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド又はＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；
ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド又はＮ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；
３−（Ｎ−（Ｎ’、Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−コレステロール）；
３β−［Ｎ’，Ｎ’−ジグアニジノエチル−アミノエタン）カルバモイルコレステロール（ＢＧＴＣ）；
２−（２−（３−（ビス（３−アミノプロピル）アミノ）プロピルアミノ）アセトアミド）−Ｎ，Ｎ−ジテトラデシルアセトアミド（ＲＰＲ２０９１２０）；
１，２−ジアルケノイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（すなわち、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン及び１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン）；
テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン（ＴＭＴＰＳ）；
テトラメチルテトラオレイルスペルミン（ＴＭＴＯＳ）；
テトラメトリテトララウリルスペルミン（ＴＭＴＬＳ）；
テトラメチルテトラミリスチルスペルミン（ＴＭＴＭＳ）；
テトラメチルジオレイルスペルミン（ＴＭＤＯＳ）；
２，５−ビス（３−アミノプロピルアミノ）−Ｎ−（２−（ジオクタデシルアミノ）−２−オキソエチル）ペンタンアミド（ＤＯＧＳ）；
２，５−ビス（３−アミノプロピルアミノ）−Ｎ−（２−（ジ（Ｚ）−オクタデカ−９−ジエニルアミノ）−２−オキソエチ−ｌ）ペンタンアミド（ＤＯＧＳ−９−エン）；
２，５−ビス（３−アミノプロピルアミノ）−Ｎ−（２−（ジ（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニルアミノ）−２−オキソエチル）ペンタンアミド（ＤＬｉｎＧＳ）；
Ｎ４−スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ−６７）；
（９Ｚ，９’Ｚ）−２−（２，５−ビス（３−アミノプロピルアミノ）ペンタンアミド）プロパン−１，３−ジイル−ジオクタデカ−９−エノエート（ＤＯＳＰＥＲ）；
２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；
１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン；１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン；
ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＭＡ）；
ジステアリルジメチルアンモニウム（ＤＳＤＭＡ）；
Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；
それらの薬学的に許容される塩及び混合物が挙げられる。
【０１５３】
カチオン脂質の詳細は、米国特許出願公開第２００７／０２９３４４９号明細書、並びに米国特許第４，８９７，３５５号明細書、同第５，２７９，８３３号明細書、同第６，７３３，７７７号明細書、同第６，３７６，２４８号明細書、同第５，７３６，３９２号明細書、同第５，６８６，９５８号明細書、同第５，３３４，７６１号明細書、同第５，４５９，１２７号明細書、同第２００５／００６４５９５号明細書、同第５，２０８，０３６号明細書、同第５，２６４，６１８号明細書、同第５，２７９，８３３号明細書、同第５，２８３，１８５号明細書、同第５，７５３，６１３号明細書及び同第５，７８５，９９２号明細書にも記載されている。
【０１５４】
さらなる実施形態において、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている、ＰＣＴ／ＵＳ０９／５２３９６に記載されているカチオン脂質を含有できる。例えば、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物の混合物及び以下のもの
【化２２】
2012509272.tif 000029
【０１５５】
を含むことができる。
【０１５６】
さらに、カチオン脂質を含む市販の製剤、例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥを含有するカチオンリポソーム、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ製）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥを含有するカチオンリポソーム、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ製）及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（ＤＯＧＳを含有するカチオンリポソーム、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ製）を使用できる。
【０１５７】
３．融合性／非カチオン脂質
本発明によれば、ナノ粒子組成物は、融合性脂質を含有できる。融合性脂質としては、中性で非帯電性の両性イオン性及びアニオン性の脂質等の非カチオン脂質が挙げられる。本発明の目的のために、「融合性脂質」及び「非カチオン脂質」という用語は、互換性がある。
【０１５８】
中性脂質としては、選択されたｐＨ、好ましくは生理的ｐＨで非帯電性又は中性いずれかの両性イオン形態で存在する脂質が挙げられる。このような脂質の例としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド及びジアシルグリセロールが挙げられる。
【０１５９】
アニオン性脂質としては、生理的ｐＨで負に帯電した脂質が挙げられる。これらの脂質としては、それだけに限らないが、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リジルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）及び他のアニオン性修飾基で修飾された中性脂質が挙げられる。
【０１６０】
多くの融合性脂質は、疎水性部分及び極性頭部基を一般に有する両親媒性脂質を含み、水溶液中でベシクルを形成できる。
【０１６１】
企図される融合性脂質としては、天然及び合成のリン脂質及び関連の脂質が挙げられる。
【０１６２】
非カチオン脂質の非限定的リストは、リン脂質及び非リン脂質系物質、例えばレシチン、リゾレシチン、ジアシルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、セラミド、カルジオリピン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、セレブロシド、ジセチルホスフェート、
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＬＧ）；
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＭＧ）；
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＰＧ）；
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＳＧ）；
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸（ＤＬＰＡ）；
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）；
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）；
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）；
１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＡＰＣ）；
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）；
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）；
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＰｅＰＣ）；
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）；
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン又はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）；
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）；
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン又はジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）；
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン又はジパルミトイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＰＰＥ）；
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン又はジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）；
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＬＰＧ）；
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＭＰＧ）又は１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｓｎ−１−グリセロール（ＤＭＰ−ｓｎ−１−Ｇ）；
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール又はジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）；
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＳＰＧ）又は１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｓｎ−１−グリセロール（ＤＳＰ−ｓｎ−１−Ｇ）；
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＰＰＳ）；
１−パルミトイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＬｉｎｏＰＣ）；
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン又はパルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）；
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）；
１−パルミトイル−２−ｌｙｓｏ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｐ−ｌｙｓｏ−ＰＣ）；
１−ステアロイル−２−ｌｙｓｏ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｓ−ｌｙｓｏ−ＰＣ）；
ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）；
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン又はジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）；
１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）、
ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）；
パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；
ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）；
１６−Ｏ−モノメチルＰＥ；
１６−Ｏ−ジメチルＰＥ；
１８−１−ｔｒａｎｓＰＥ；１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）；
１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホホエタノールアミン（ｔｒａｎｓＤＯＰＥ）；並びに
それらの薬学的に許容される塩及び混合物の中から選択される。融合性脂質の詳細は、米国特許出願公開第２００７／０２９３４４９号明細書及び同第２００６／００５１４０５号明細書に記載されている。
【０１６３】
非カチオン脂質としては、ステロール又はステロイドアルコール、例えばコレステロールが挙げられる。
【０１６４】
追加の非カチオン脂質としては、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレート、ヘキサデシルステアレート、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー、トリエタノールアミンラウリルサルフェート、アルキルアリールサルフェートポリエチルオキシル化脂肪酸アミド及びジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミドがある。
【０１６５】
企図されるアニオン性脂質としては、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジル−ＤＬ−グリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、リゾホスファチド、水素化リン脂質、スフィンゴ脂質、ガングリオシド、フィトスフィンゴシン、スフィンガニン、それらの薬学的に許容される塩及び混合物が挙げられる。
【０１６６】
本明細書に記載のナノ粒子組成物の調製に有用な適切な非カチオン脂質としては、ジアシルホスファチジルコリン（例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジリノレオイルホスファチジルコリン）、ジアシルホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン及びパルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、セラミド又はスフィンゴミエリンが挙げられる。好ましくは、これらの脂質中のアシル基は、飽和及び不飽和の炭素鎖を有する脂肪酸、例えばリノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エレオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル及びラウロイルである。より好ましくは、アシル基は、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル又はオレオイルである。あるいは及び／好ましくは、脂肪酸は飽和及び不飽和のＣ８〜Ｃ３０（好ましくはＣ１０〜Ｃ２４）炭素鎖を有する。
【０１６７】
本明細書に記載のナノ粒子組成物で有用な様々なホスファチジルコリンとしては、
１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＤＰＣ、Ｃ１０：０、Ｃ１０：０）；
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ、Ｃ１２：０、Ｃ１２：０）；
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ、Ｃ１４：０、Ｃ１４：０）；
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ、Ｃ１６：０、Ｃ１６：０）；
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ、Ｃ１８：０、Ｃ１８：０）；
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ、Ｃ１８：１、Ｃ１８：１）；
１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ、Ｃ２２：１、Ｃ２２：１）；
１，２−ジエイコサペンタエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＥＰＡ−ＰＣ、Ｃ２０：５、Ｃ２０：５）；
１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＨＡ−ＰＣ、Ｃ２２：６、Ｃ２２：６）；
１−ミリストイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＭＰＰＣ、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０）；
１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＭＳＰＣ、Ｃ１４：０、Ｃ１８：０）；
１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＭＰＣ、Ｃ１６：０、Ｃ１４：０）；
１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＳＰＣ、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０）；
１−ステアロイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＰＣ、Ｃ１８：０、Ｃ１４：０）；
１−ステアロイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＰＰＣ、Ｃ１８：０、Ｃ１６：０）；
１，２−ミリストイル−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＯＰＣ、Ｃ１４：０、Ｃ１８：０）；
１，２−パルミトイル−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＣ、Ｃ１６：０、Ｃ１８：１）；
１，２−ステアロイル−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＣ、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１）、並びにそれらの薬学的に許容される塩及び混合物が挙げられる。
【０１６８】
本明細書に記載のナノ粒子組成物で有用な様々なリゾホスファチジルコリンとしては、
１−ミリストイル−２−ｌｙｓｏ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｍ−ＬｙｓｏＰＣ、Ｃ１４：０）、
１−パルミトイル−２−ｌｙｓｏ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｐ−ＬｙｓｏＰＣ、Ｃ１６：０）、
１−ステアロイル−２−ｌｙｓｏ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｓ−ＬｙｓｏＰＣ、Ｃ１８：０）、並びに
それらの薬学的に許容される塩及び混合物が挙げられる。
【０１６９】
本明細書に記載のナノ粒子組成物で有用な様々なホスファチジルグリセロールとしては、
水素化大豆ホスファチジルグリセロール（ＨＳＰＧ）、
非水素化卵ホスファチジルグリセロール（ＥＰＧ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＭＰＧ、Ｃ１４：０、Ｃ１４：０）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ、Ｃ１６：０、Ｃ１６：０）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＳＰＧ、Ｃ１８：０、Ｃ１８：０）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＯＰＧ、Ｃ１８：１、Ｃ１８：１）、
１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＥＰＧ、Ｃ２２：１、Ｃ２２：１）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ、Ｃ１６：０、Ｃ１８：１）、並びにそれらの薬学的に許容される塩及び混合物の中から選択される。
【０１７０】
本明細書に記載のナノ粒子組成物で有用な様々なホスファチジン酸としては、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸（ＤＭＰＡ、Ｃ１４：０、Ｃ１４：０）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸（ＤＰＰＡ、Ｃ１６：０、Ｃ１６：０）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸（ＤＳＰＡ、Ｃ１８：０、Ｃ１８：０）、並びに
それらの薬学的に許容される塩及び混合物が挙げられる。
【０１７１】
本明細書に記載のナノ粒子組成物で有用な様々なホスファチジルエタノールアミンとしては、
水素化大豆ホスファチジルエタノールアミン（ＨＳＰＥ）、
非水素化卵ホスファチジルエタノールアミン（ＥＰＥ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ、Ｃ１４：０、Ｃ１４：０）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ、Ｃ１６：０、Ｃ１６：０）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ、Ｃ１８：０、Ｃ１８：０）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ、Ｃ１８：１、Ｃ１８：１）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ、Ｃ２２：１、Ｃ２２：１）、
１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ、Ｃ１６：０、Ｃ１８：１）、並びにそれらの薬学的に許容される塩及び混合物が挙げられる。
【０１７２】
本明細書に記載のナノ粒子組成物で有用な様々なホスファチジルセリンとしては、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＭＰＳ、Ｃ１４：０、Ｃ１４：０）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＰＰＳ、Ｃ１６：０、Ｃ１６：０）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＳＰＳ、Ｃ１８：０、Ｃ１８：０）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ、Ｃ１８：１、Ｃ１８：１）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＰＯＰＳ、Ｃ１６：０、Ｃ１８：１）、並びに
それらの薬学的に許容される塩及び混合物が挙げられる。
【０１７３】
好ましい一実施形態において、本明細書に記載のナノ粒子組成物の調製に有用な適切な中性脂質としては、例えば、
ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、
卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、
ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、
ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、
ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、
パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、
ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、
ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、
ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、コレステロール、それらの薬学的に許容される塩及び混合物が挙げられる。
【０１７４】
ある種の好ましい実施形態において、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、ＤＳＰＣ、ＥＰＣ、ＤＯＰＥ等及びそれらの混合物を含む。
【０１７５】
本発明のさらなる態様において、ナノ粒子組成物は、ステロール等の非カチオン脂質を含有する。ナノ粒子組成物は、好ましくはコレステロール又はその類似体、より好ましくはコレステロールを含有する。
【０１７６】
４．ＰＥＧ脂質
本発明によれば、本明細書に記載のナノ粒子組成物はＰＥＧ脂質を含有する。ＰＥＧ脂質は、本明細書に記載のナノ粒子の循環を延長し、身体からのナノ粒子の早期排出を防ぐ。ＰＥＧ脂質は、免疫原性を減少させ、ナノ粒子の安定性を高める。
【０１７７】
ナノ粒子組成物で有用なＰＥＧ脂質としては、ＰＥＧ化形態の融合性／非カチオン性脂質が挙げられる。ＰＥＧ脂質としては、例えばジアシルグリセロールに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ジアシルグリカミドに結合したＰＥＧ、ジアルキルオキシプロピルに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＡ）、リン脂質に結合したＰＥＧ、例えばホスファチジルエタノールアミンに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＥ）、セラミドに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−Ｃｅｒ）、コレステロール誘導体に結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−Ｃｈｏｌ）又はそれらの混合物が挙げられる。各々の内容が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，８８５，６１３号明細書及び第５，８２０，８７３号明細書、並びに米国特許出願第２００６／０５１４０５号参照。
【０１７８】
ＰＥＧは、次の構造式：
−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−
（式中、（ｎ）は、ＰＥＧ脂質のポリマー部分が約２００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約２００〜約２００００ダルトンの数平均分子量を有するように、約５〜約２３００、好ましくは約５〜約４６０の正の整数である）で一般に表される。（ｎ）は、ポリマーの重合度を表し、ポリマーの分子量に依存する。
【０１７９】
一つの好ましい態様において、ＰＥＧは約２００〜約２００００ダルトン、より好ましくは約５００〜約１００００ダルトン、さらにより好ましくは約１０００〜約５０００ダルトン（即ち、約１５００〜約３０００ダルトン）の範囲の数平均分子量を有するポリエチレングリコールである。一実施形態において、ＰＥＧは約２０００ダルトンの分子量を有する。別の実施形態において、ＰＥＧは約７５０ダルトンの分子量を有する。
【０１８０】
あるいは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基部分は、次の構造式：
−Ｙ７１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２Ｙ７１−、
−Ｙ７１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２Ｃ（＝Ｙ７２）−Ｙ７１−、
−Ｙ７１−Ｃ（＝Ｙ７２）−（ＣＨ２）ａ１２−Ｙ７３−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ７３−（ＣＨ２）ａ１２−Ｃ（＝Ｙ７２）−Ｙ７１−及び
−Ｙ７１−（ＣＲ７１Ｒ７２）ａ１２−Ｙ７３−（ＣＨ２）ｂ１２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−（ＣＨ２）ｂ１２−Ｙ７３−（ＣＲ７１Ｒ７２）ａ１２−Ｙ７１−
［式中、
Ｙ７１及びＹ７３は独立にＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＮＲ７３又は結合であり、
Ｙ７２はＯ、Ｓ又はＮＲ７４、好ましくは酸素であり、
Ｒ７１〜７４は水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１９分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ２〜６置換アルケニル、Ｃ２〜６置換アルキニル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ１〜６ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ２〜６アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ２〜６アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ２〜６置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ２〜６置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、Ｃ２〜６置換アルカノイルオキシ及び置換アリールカルボニルオキシ、好ましくは水素、メチル、エチル又はプロピルから独立に選択され、
（ａ１２）及び（ｂ１２）は独立に０又は正の整数、好ましくは０又は約１〜約６（即ち、１、２、３、４、５、６）の整数、より好ましくは１又は２であり、
（ｎ）は約５〜約２３００、好ましくは約５〜約４６０の整数である］
で表すことができる。
【０１８１】
ＰＥＧの末端部分は、Ｈ、ＮＨ２、ＯＨ、ＣＯ２Ｈ、Ｃ１〜６アルキル（例えばメチル、エチル、プロピル）、Ｃ１〜６アルコキシ、アシル又はアリールで終わることができる。一つの好ましい実施形態において、ＰＥＧの末端ヒドロキシル基は、メトキシ基又はメチル基で置換されている。一つの好ましい実施形態において、ＰＥＧ脂質で使用するＰＥＧはメトキシＰＥＧである。
【０１８２】
ＰＥＧは脂質に直接結合していてもよく、又はリンカー部分を介して結合していてもよい。脂質構造への結合のためのポリマーは、米国特許第５，１２２，６１４号明細書及び第５，８０８，０９６号明細書に記載の活性化法、並びに当業者に公知の他の技法を用いて過度に実験するまでもなく適切に活性化されたポリマーに変換される。
【０１８３】
ＰＥＧ脂質の調製に有用な活性化ＰＥＧの例としては、例えばメトキシポリエチレングリコールスクシネート、ｍＰＥＧ−ＮＨＳ、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルスクシネート、メトキシポリエチレングリコール酢酸（ｍＰＥＧ−ＣＨ２ＣＯＯＨ）、メトキシポリエチレングリコールアミン（ｍＰＥＧ−ＮＨ２）及びメトキシポリエチレングリコールトレシレート（ｍＰＥＧ−ＴＲＥＳ）が挙げられる。
【０１８４】
ある種の態様において、末端カルボン酸基を有するポリマーは、ＰＥＧ脂質の調製のために使用できる。高純度で末端カルボン酸を有するポリマーを調製する方法は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願第１１／３２８，６６２号に記載されている。
【０１８５】
別の態様において、末端アミン基を有するポリマーは、ＰＥＧ脂質を製造するために使用できる。高純度で末端アミンを含有するポリマーを調製する方法は、それらの各々の内容が参照により組み込まれている、米国特許出願第１１／５０８，５０７号及び第１１／５３７，１７２号に記載されている。
【０１８６】
ＰＥＧ及び脂質は、結合部分、即ち非エステル含有リンカー部分又はエステル含有リンカー部分を介して結合できる。適切な非エステル含有リンカーとしては、それだけに限らないが、アミドリンカー部分、アミノリンカー部分、カルボニルリンカー部分、カルバメートリンカー部分、カーボネート（ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ）リンカー部分、尿素リンカー部分、エーテルリンカー部分、スクシニルリンカー部分及びそれらの組合せが挙げられる。適切なエステルリンカー部分としては、例えばスクシノイル、ホスフェートエステル（−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−）、スルホン酸エステル及びそれらの組合せが挙げられる。
【０１８７】
一実施形態において、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、ポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）又はポリエチレン−ジアシルグリカミドを含むことができる。適切なポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール複合体又はポリエチレングリコール−ジアシルグリカミド複合体としては、約Ｃ４〜約Ｃ３０（好ましくは約Ｃ８〜約Ｃ２４）の飽和又は不飽和の炭素原子を独立に含有するアルキル鎖長を有する、ジアルキルグリセロール基又はジアルキルグリカミド基が挙げられる。ジアルキルグリセロール基又はジアルキルグリカミド基は、一つ又は複数の置換アルキル基をさらに含むことができる。
【０１８８】
本明細書で使用する「ジアシルグリセロール」（ＤＡＧ）という用語は、二つの脂肪アシル鎖Ｒ１１１及びＲ１１２を有する化合物を指す。Ｒ１１１及びＲ１１２は、約４〜約３０個（好ましくは約８〜約２４個）の炭素の長さの同一又は異なる炭素鎖を有し、エステル結合によりグリセロールに結合する。アシル基は、飽和であってもよく、又は様々な不飽和度を含む不飽和であってもよい。ＤＡＧは次の一般式：
【化２３】
2012509272.tif 000030
【０１８９】
を有する。
【０１９０】
一つの好ましい実施形態において、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール複合体は、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４、ＤＭＧ）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６、ＤＰＧ）又はＰＥＧ−ジステアリルグリセロール（Ｃ１８、ＤＳＧ）である。当業者であれば、他のジアシルグリセロールも、ＰＥＧ−ジアシルグリコール複合体で企図されることを容易に認識されよう。本明細書で使用する適切なＰＥＧ−ジアシルグリセロール複合体及びそれを製造し使用する方法は、各々の内容が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号明細書及びＰＣＴ特許出願第ＣＡ０２／００６６９号に記載されている。
【０１９１】
ＰＥＧ−ジアシルグリセロール複合体の例としては、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）、ＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８）の中から選択できる。ＰＥＧ−ジアシルグリカミド複合体の例としては、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６）及びＰＥＧ−ジステリルグリカミド（Ｃ１８）が挙げられる。
【０１９２】
別の実施形態において、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、ポリエチレングリコール−ジアルキルオキシプロピル複合体（ＰＥＧ−ＤＡＡ）を含むことができる。
【０１９３】
「ジアルキルオキシプロピル」という用語は、二つのアルキル鎖Ｒ１１１及びＲ１１２を有する化合物を指す。Ｒ１１１及びＲ１１２アルキル基は、約４〜約３０個（好ましくは約８〜約２４個）の間の炭素の同一又は異なる炭素鎖長を含む。アルキル基は飽和であってもよく、又は様々な不飽和度を有していてもよい。ジアルキルオキシプロピルは次の一般式：
【化２４】
2012509272.tif 000031
【０１９４】
（式中、Ｒ１１１及びＲ１１２アルキル基は、約４〜約３０個（好ましくは約８〜約２４個）の炭素を有する同一又は異なるアルキル基である）を有する。アルキル基は、飽和であってもよく、又は不飽和であってもよい。適切なアルキル基の例としては、それだけに限らないがラウリル（Ｃ１２）、ミリスチル（Ｃ１４）、パルミチル（Ｃ１６）、ステアリル（Ｃ１８）、オレオイル（Ｃ１８）及びイコシル（Ｃ２０）が挙げられる。
【０１９５】
一実施形態において、Ｒ１１１及びＲ１１２はいずれも同一である。即ち、Ｒ１１１及びＲ１１２はいずれもミリスチル（Ｃ１４）、いずれもステアリル（Ｃ１８）又はいずれもオレオイル（Ｃ１８）等である。別の実施形態において、Ｒ１１１及びＲ１１２は異なる。即ち、Ｒ１１１はミリスチル（Ｃ１４）であり、Ｒ１１２はステアリル（Ｃ１８）である。好ましい実施形態において、ＰＥＧ−ジアルキルプロピル複合体は同一のＲ１１１及びＲ１１２を含む。
【０１９６】
さらに別の実施形態において、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、ホスファチジルエタノールアミンに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＥ）を含むことができる。ＰＥＧ脂質の結合に有用なホスファチジルエタノールアミンは、約４〜約３０個（好ましくは約８〜約２４個）の炭素の範囲の炭素鎖長を有する飽和又は不飽和の脂肪酸を含有できる。適切なホスファチジルエタノールアミンとしては、それだけに限らないが、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）が挙げられる。
【０１９７】
さらに別の実施形態において、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、セラミドに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−Ｃｅｒ）を含むことができる。セラミドはアシル基を一つだけ有する。セラミドは、約４〜約３０個（好ましくは約８〜約２４個）の炭素の範囲の炭素鎖長を有する飽和又は不飽和の脂肪酸を有することができる。
【０１９８】
代替実施形態において、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、コレステロール誘導体に結合したＰＥＧを含むことができる。「コレステロール誘導体」という用語は、その修飾、即ち置換及び／又は欠失を含むコレステロール構造を含有する任意のコレステロール類似体を意味する。本明細書においてコレステロール誘導体という用語は、ステロイドホルモン及び胆汁酸も含む。
【０１９９】
ＰＥＧ脂質の例示的例としては、Ｎ−（カルボニルメトキシポリエチレングリコール）−１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（２ｋＤａｍＰＥＧ−ＤＭＰＥ又は５ｋＤａｍＰＥＧ−ＤＭＰＥ）、Ｎ−（カルボニルメトキシポリエチレングリコール）−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（２ｋＤａｍＰＥＧ−ＤＰＰＥ又は５ｋＤａｍＰＥＧ−ＤＰＰＥ）、Ｎ−（カルボニルメトキシポリエチレングリコール）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（７５０ｋＤａｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、２ｋＤａｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、５ｋＤａｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）並びにそれらの薬学的に許容される塩（即ち、ナトリウム塩）及びそれらの混合物が挙げられる。
【０２００】
ある種の好ましい実施形態において、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、ＰＥＧが約２００〜約２００００、好ましくは約５００〜約１００００、より好ましくは約１０００〜約５０００の分子量を有する、ＰＥＧ−ＤＡＧ又はＰＥＧ−セラミドを有するＰＥＧ脂質を含む。
【０２０１】
ＰＥＧ−ＤＡＧ及びＰＥＧ−セラミドの幾つかの例示的実施形態を表１に示す：
【表１】
2012509272.tif 000032
【０２０２】
好ましくは、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６）、ＰＥＧ−セラミド（Ｃ１６）等及びそれらの混合物の中から選択されるＰＥＧ脂質を含む。ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、ｍＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６）及びｍＰＥＧ−セラミド（Ｃ１６）の構造は以下のとおりである：
【化２５】
2012509272.tif 000033
【０２０３】
（式中、（ｎ）は、約５〜約２３００、好ましくは約５〜約４６０の整数である）。
【０２０４】
一つの好ましい実施形態において、（ｎ）は約４５である。
【０２０５】
さらなる実施形態において、及びＰＥＧ等のＰＡＯ系ポリマーの代替物として、一つ又は複数の効果的な非抗原性物質、例えばデキストラン、ポリビニルアルコール、炭水化物系ポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、ポリアルキレンオキシド及び／又はそれらのコポリマーを使用できる。ＰＥＧの代わりに使用できる適切なポリマーの例としては、それだけに限らないが、ポリビニルピロリドン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド及びポリジメチルアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸及び誘導体化セルロース、例えばヒドロキシメチルセルロース又はヒドロキシエチルセルロースが挙げられる。その内容が参照により本明細書に組み込まれている、同一出願人による米国特許第６，１５３，６５５号明細書も参照のこと。当業者であれば、同じ種類の活性化が、ＰＥＧ等のＰＡＯについても本明細書に記載されているように使用できることを理解されよう。当業者は、前記リストは単に例示であり、本明細書に記載の特性を有する全てのポリマー材料が企図されることをさらに理解されよう。本発明の目的のために、「実質的に又は効果的に非抗原性」という用語は、非毒性であり、哺乳動物において感知できるほどの免疫原性反応を誘発しないことが当技術分野で理解されている全ての物質を意味する。
【０２０６】
さらにさらなる実施形態において、本明細書に記載のナノ粒子は、ケタール又はイミン等の放出可能リンカーを有するＰＥＧ脂質を含むことができる。このような放出可能ＰＥＧ脂質により、送達系が細胞に侵入した後、核酸（オリゴヌクレオチド）を送達系から解離できる。このような放出可能ＰＥＧ脂質のさらなる詳細は、それらの各々の内容が参照により本明細書に組み込まれている、各々「Releasable Polymeric Lipids Based on Imine Moiety For Nucleic Acids Delivery System」及び「Releasable Polymeric Lipids Based on Ketal or Acetal Moiety For Nucleic Acids Delivery System」という表題の米国仮特許出願第６１／１１５，３７９号及び第６１／１１５，３７１号、並びに同日に出願された「Releasable Polymeric Lipids For Nucleic Acids Delivery Systems」という表題のＰＣＴ特許出願第＿＿＿＿号にも記載されている。
【０２０７】
５．核酸／オリゴヌクレオチド
本明細書に記載のナノ粒子組成物は、様々な核酸を細胞又は組織に送達するために使用できる。核酸としては、プラスミド及びオリゴヌクレオチドが挙げられる。好ましくは、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、オリゴヌクレオチドの送達のために使用される。
【０２０８】
本発明の範囲をより十分に理解するために、以下の用語を定義する。当業者は、「核酸」又は「ヌクレオチド」という用語が、別段の指示がない限り一本鎖であるか又は二本鎖であるデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、リボ核酸（「ＲＮＡ」）、並びにそれらの任意の化学修飾体又は類似体、例えばロックド（Locked）核酸（ＬＮＡ）に適用されることを認識されよう。当業者は、「核酸」という用語には、ポリ核酸、その誘導体、修飾体及び類似体が含まれることを容易に理解されよう。「オリゴヌクレオチド」とは、例えば約２〜約２００ヌクレオチド長、好ましくは約８〜約５０ヌクレオチド長、より好ましくは約８〜約３０ヌクレオチド長、さらにより好ましくは約８〜約２０ヌクレオチド長又は約１５〜約２８ヌクレオチド長の大きさがある、一般に比較的短いポリヌクレオチドである。本発明によるオリゴヌクレオチドは、別段の指示がない限り、一般に合成核酸であり、一本鎖である。「ポリヌクレオチド」及び「ポリ核酸」という用語は、本明細書において同義的にも使用できる。
【０２０９】
オリゴヌクレオチド（類似体）は、一種類のオリゴヌクレオチドに限定されないが、その代わり、広範なこのような部分と連携するように設計されており、リンカーは、３’−又は５’−末端、通常ヌクレオチドのＰＯ４基又はＳＯ４基の一つ又は複数に結合できることが理解される。企図される核酸分子は、ホスホロチオエート、インターヌクレオチド結合修飾、糖修飾、核酸塩基修飾及び／又はホスフェート骨格修飾を挙げることができる。オリゴヌクレオチドは、天然のホスホロジエステル骨格又はホスホロチオエート骨格、又は任意の他の修飾骨格類似体、例えばＬＮＡ（ロックド核酸）、ＰＮＡ（ペプチド骨格を有する核酸）、ＣｐＧオリゴマー等を含有でき、それらは、その内容が参照により本明細書に組み込まれている、Tides 2002, Oligonucleotide and Peptide Technology Conferences, May 6-8, 2002, Las Vegas, NV及びOligonucleotide & Peptide Technologies, 18th & 19th November 2003, Hamburg, Germanyにて開示されている。
【０２１０】
本発明で企図されるオリゴヌクレオチドの修飾は、例えば、追加の電荷、分極率、水素結合、静電相互作用及び官能性をオリゴヌクレオチドに取り込む官能性部分の付加又は置換を含む。このような修飾としては、それだけに限らないが、２’位糖修飾、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモウラシル又は５−ヨードウラシルの置換、骨格修飾、メチル化、イソ塩基のイソシチジン及びイソグアニジン等の塩基対合組合せ、並びに類似の組合せが挙げられる。本発明の範囲内で企図されるオリゴヌクレオチドとしては、３’及び／又は５’キャップ構造も挙げることができる。
【０２１１】
本発明の目的のために、「キャップ構造」は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端で取り込まれた化学修飾を意味すると理解されるものとする。キャップは、５’−末端（５’−キャップ）又は３’−末端（３’−キャップ）に存在してもよく、又は両末端に存在してもよい。５’−キャップの非限定的例としては、脱塩基残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド、１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、αヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、スレオペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆位ヌクレオチド部分、３’−３’−逆位脱塩基部分、３’−２’−逆位ヌクレオチド部分、３’−２’−逆位脱塩基部分、１，４−ブタンジオールホスフェート、３’−ホスホルアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’−ホスフェート、３’−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート又は架橋若しくは非架橋メチルホスホネート部分が挙げられる。詳細は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ９７／２６２７０に記載されている。３’−キャップとしては、例えば、４’、５’−メチレンヌクレオチド、１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、５’−アミノアルキルホスフェート、１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート、６−アミノヘキシルホスフェート、１，２−アミノドデシルホスフェート、ヒドロキシプロピルホスフェート、１，５−アンヒドロヘキトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、αヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート、スレオペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位ヌクレオチド部分、５’−５’−逆位脱塩基部分、５’−ホスホルアミデート、５’−ホスホロチオエート、１，４−ブタンジオールホスフェート、５’−アミノ、架橋及び／若しくは非架橋５’−ホスホルアミデート、ホスホロチオエート及び／又はホスホロジチオエート、架橋若しくは非架橋メチルホスホネート及び５’−メルカプト部分を挙げることができる。その内容が参照により本明細書に組み込まれている、Beaucage and Iyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925も参照のこと。
【０２１２】
ヌクレオシド類似体の非限定的リストは、次の構造式：
【化２６】
2012509272.tif 000034
2012509272.tif 000035
【０２１３】
を有する。それらの各々の内容が、参照により本明細書に組み込まれている、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及びUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213に記載のヌクレオシド類似体のさらなる例を参照のこと。
【０２１４】
本明細書で使用する場合、「アンチセンス」という用語は、遺伝子産物をコードするか、又は調節配列をコードする特定のＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列を指す。「アンチセンス鎖」という用語は、「センス」鎖に相補的である核酸鎖に関して使用される。細胞代謝の通常の動作において、ＤＮＡ分子のセンス鎖は、ポリペプチド及び／又は他の遺伝子産物をコードする鎖である。センス鎖は、メッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）転写物（アンチセンス鎖）の合成のためのテンプレートとしての役割を果たし、次いで任意のコードされた遺伝子産物の合成を導く。アンチセンス核酸分子は、合成を含む当技術分野で公知の任意の方法により調製できる。細胞へ一旦導入されると、この転写鎖は、細胞により産生される天然配列と組み合わさり、二本鎖を形成する。次いで、これらの二本鎖はｍＲＮＡのさらなる転写又はその翻訳のいずれかを阻害する。「負」又は（−）の呼称がアンチセンス鎖を指すことも当技術分野で公知であり、「正」又は（＋）がセンス鎖を指すことも当技術分野で公知である。
【０２１５】
本発明の目的のために、「相補的」とは、核酸配列が、別の核酸配列との水素結合（複数可）を形成することを意味すると理解されるものとする。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合、即ちワトソンクリック塩基対合を形成できる核酸分子中の隣接残基の割合を指す。即ち、１０の内５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％相補性である。「完全な相補性」とは、核酸配列の全ての隣接残基が、第２の核酸配列中の同数の隣接残基と水素結合を形成することを意味する。
【０２１６】
本明細書に記載のナノ粒子で有用な核酸（例えば一つ又は複数の同一又は異なるオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体）は、約５〜約１０００個の核酸、例えば好ましくは約８〜約５０ヌクレオチド長（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）の大きさがある好ましくは比較的短いポリヌクレオチドを挙げることができる。
【０２１７】
本明細書に記載のナノ粒子中に封入される有用な核酸の一態様においてとして、天然のホスホロジエステル骨格若しくはホスホロチオエート骨格又は任意の他の修飾骨格類似体を有するオリゴヌクレオチド及びオリゴデオキシヌクレオチドとしては、
ＬＮＡ（ロックド核酸）；
ＰＮＡ（ペプチド骨格を有する核酸）；
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）；
ペプチド骨格を有する核酸（ＰＮＡ）；
ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）；
トリシクロ−ＤＮＡ；
デコイＯＤＮ（二本鎖オリゴヌクレオチド）；
触媒ＲＮＡ配列（ＲＮＡｉ）；
リボザイム；
アプタマー；
シュピーゲルマー（Ｌ−立体配座オリゴヌクレオチド）；
ＣｐＧオリゴマー等、
が挙げられ、例えば、
その内容が参照により本明細書に組み込まれている、Tides 2002, Oligonucleotide and Peptide Technology Conferences, May 6-8, 2002, Las Vegas, NV及びOligonucleotide & Peptide Technologies, 18th & 19th November, 2003, Hamburg, Germanyにて開示されているものが挙げられる。
【０２１８】
ナノ粒子中に封入された核酸の別の態様において、オリゴヌクレオチドは、以下の表２に列挙されているものを含む、任意の適切な当技術分野で公知のヌクレオチド類似体及び誘導体を場合により含むことができる。
【表２】
2012509272.tif 000036
【０２１９】
一つの好ましい態様において、ナノ粒子に封入された標的オリゴヌクレオチドとしては、例えばそれだけに限らないが、癌遺伝子、プロ血管新生経路遺伝子、プロ細胞増殖経路遺伝子、ウイルス感染因子遺伝子及びプロ炎症経路遺伝子が挙げられる。
【０２２０】
一つの好ましい実施形態において、本明細書に記載のナノ粒子中に封入されたオリゴヌクレオチドは、腫瘍細胞を標的とするか、又は腫瘍細胞及び／若しくは抗癌療法に対する腫瘍細胞の耐性と関連する遺伝子若しくはタンパク質の発現のダウンレギュレートに関わる。例えば、癌と関連する任意の当技術分野で公知の細胞タンパク質をダウンレギュレートするためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばＢＣＬ−２は本発明で使用できる。その内容が参照により本明細書に組み込まれている、２００４年４月９日に出願された米国特許出願公開第１０／８２２，２０５号明細書を参照のこと。好ましい治療用オリゴヌクレオチドの非限定的例としては、アンチセンスｂｃｌ−２オリゴヌクレオチド、アンチセンスＨＩＦ−１αオリゴヌクレオチド、アンチセンススルビビンオリゴヌクレオチド、アンチセンスＥｒｂＢ３オリゴヌクレオチド、アンチセンスＰＩＫ３ＣＡオリゴヌクレオチド、アンチセンスＨＳＰ２７オリゴヌクレオチド、アンチセンスアンドロゲン受容体オリゴヌクレオチド、アンチセンスＧｌｉ２オリゴヌクレオチド及びアンチセンスβカテニンオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０２２１】
より好ましくは、本明細書に記載の本発明によるオリゴヌクレオチドとしては、ホスホロチオエート骨格及びＬＮＡが挙げられる。
【０２２２】
一つの好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、例えばアンチセンススルビビンＬＮＡ、アンチセンスＥｒｂＢ３ＬＮＡ又はアンチセンスＨＩＦ１−αＬＮＡであってよい。
【０２２３】
別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（登録商標）（別名オブリメルセンナトリウム、Ｇｅｎｔａ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＮＪ製）と同一又は実質的に同様のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドあってよい。Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（登録商標）は、１８−メルホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号４）であり、ヒトｂｃｌ−２ｍＲＮＡの開始配列の最初の六つのコドンに相補的である（ヒトｂｃｌ−２ｍＲＮＡは当技術分野で公知であり、例えば配列番号１９として参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，４１４，１３４号明細書に記載されている）。
【０２２４】
企図される好ましい実施形態は、以下を含む：
（ｉ）アンチセンススルビビンＬＮＡオリゴマー（配列番号１）
ｍＣｓ−Ｔｓ−ｍＣｓ−Ａｓ−ａｓ−ｔｓ−ｃｓ−ａｓ−ｔｓ−ｇｓ−ｇｓ−ｍＣｓ−Ａｓ−Ｇｓ−ｃ；
大文字はＬＮＡを表し、「ｓ」はホスホロチオエート骨格を表す。
【０２２５】
（ｉｉ）アンチセンスＢｃｌ２ｓｉＲＮＡ：
ＳＥＮＳＥ５’−ｇｃａｕｇｃｇｇｃｃｕｃｕｇｕｕｕｇａｄＴｄＴ−３’（配列番号２）
ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ３’−ｄＴｄＴｃｇｕａｃｇｃｃｇｇａｇａｃａａａｃｕ−５’（配列番号３）
ｄＴはＤＮＡを表す。
【０２２６】
（ｉｉｉ）Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド）：（配列番号４）
ｔｓ−ｃｓ−ｔｓ−ｃｓ−ｃｓ−ｃｓ−ａｓ−ｇｓ−ｃｓ−ｇｓ−ｔｓ−ｇｓ−ｃｓ−ｇｓ−ｃｓ−ｃｓ−ｃｓ−ａｓ−ｔ
小文字はＤＮＡを表し、「ｓ」はホスホロチオエート骨格を表す。
【０２２７】
（ｉｖ）アンチセンスＨＩＦ１αＬＮＡオリゴマー（配列番号５）
ＴｓＧｓＧｓｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｓＧｓＴｓａ
大文字はＬＮＡを表し、「ｓ」はホスホロチオエート骨格を表す。
【０２２８】
（ｖ）アンチセンスＥｒｂＢ３  ＬＮＡオリゴマー（配列番号６）
ＴｓＡｓＧｓｃｓｃｓｔｓｇｓｔｓｃｓａｓｃｓｔｓｔｓＭｅＣｓＴｓＭｅＣｓ
大文字はＬＮＡを表し、「ｓ」はホスホロチオエート骨格を表す。
【０２２９】
（ｖｉ）アンチセンスＥｒｂＢ３  ＬＮＡオリゴマー（配列番号７）
ＧｓＭｅＣｓＴｓｃｓｃｓａｓｇｓａｓｃｓａｓｔｓｃｓａｓＭｅＣｓＴｓＭｅＣ
大文字はＬＮＡを表し、「ｓ」はホスホロチオエート骨格を表す。
【０２３０】
（ｖｉｉ）アンチセンスＰＩＫ３ＣＡ  ＬＮＡオリゴマー（配列番号８）
ＡｓＧｓＭｅＣｓｃｓａｓｔｓｔｓｃｓａｓｔｓｔｓｃｓｃｓＡｓＭｅＣｓＭｅＣ
大文字はＬＮＡを表し、「ｓ」はホスホロチオエート骨格を表す。
【０２３１】
（ｖｉｉｉ）アンチセンスＰＩＫ３ＣＡ  ＬＮＡオリゴマー（配列番号９）
ＴｓＴｓＡｓｔｓｔｓｇｓｔｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｔｓＭｅＣｓＡｓＧ
大文字はＬＮＡを表し、「ｓ」はホスホロチオエート骨格を表す。
【０２３２】
（ｉｘ）アンチセンスＨＳＰ２７  ＬＮＡオリゴマー（配列番号１０）
ＣｓＧｓＴｓｇｓｔｓａｓｔｓｔｓｔｓｃｓｃｓｇｓｃｓＧｓＴｓＧ
大文字はＬＮＡを表し、「ｓ」はホスホロチオエート骨格を表す。
【０２３３】
（ｘ）アンチセンスＨＳＰ２７  ＬＮＡオリゴマー（配列番号１１）
ＧｓＧｓＭｅＣｓａｓｃｓａｓｇｓｃｓｃｓａｓｇｓｔｓｇｓＧｓＭｅＣｓＧ
大文字はＬＮＡを表し、「ｓ」はホスホロチオエート骨格を表す。
【０２３４】
（ｘｉ）アンチセンスアンドロゲン受容体ＬＮＡオリゴマー（配列番号１２）
ＭｅＣｓＭｅＣｓＭｅＣｓａｓａｓｇｓｇｓｃｓａｓｃｓｔｓｇｓｃｓＡｓＧｓＡ
大文字はＬＮＡを表し、「ｓ」はホスホロチオエート骨格を表す。
【０２３５】
（ｘｉｉ）アンチセンスアンドロゲン受容体ＬＮＡオリゴマー（配列番号１３）
ＡｓＭｅＣｓＭｅＣｓａｓａｓｇｓｔｓｔｓｔｓｃｓｔｓｔｓｃｓＡｓＧｓＭｅＣ
大文字はＬＮＡを表し、「ｓ」はホスホロチオエート骨格を表す。
【０２３６】
（ｘｉｉｉ）アンチセンスＧＬＩ２  ＬＮＡオリゴマー（配列番号１４）
ＭｅＣｓＴｓＭｅＣｓｃｓｔｓｔｓｇｓｇｓｔｓｇｓｃｓａｓｇｓＴｓＭｅＣｓＴ
大文字はＬＮＡを表し、「ｓ」はホスホロチオエート骨格を表す。
【０２３７】
（ｘｉｖ）アンチセンスＧＬＩ２  ＬＮＡオリゴマー（配列番号１５）
ＴｓＭｅＣｓＡｓｇｓａｓｔｓｔｓｃｓａｓａｓａｓｃｓＭｅＣｓＭｅＣｓＡ
大文字はＬＮＡを表し、「ｓ」はホスホロチオエート骨格を表す。
【０２３８】
（ｘｖ）アンチセンスβカテニンＬＮＡオリゴマー（配列番号１６）
ＧｓＴｓＧｓｔｓｔｓｃｓｔｓａｓｃｓａｓｃｓｃｓａｓＴｓＴｓＡ
大文字はＬＮＡを表し、「ｓ」はホスホロチオエート骨格を表す。
【０２３９】
小文字はＤＮＡ単位を表し、太字の大文字はＬＮＡ、例えばβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ単位を表す。ＬＮＡモノマー中の全てのシトシン塩基は、５−メチルシトシンである。下付き「ｓ」はホスホロチオエート結合を表す。
【０２４０】
ＬＮＡは、以下に示すような２’−Ｏ、４’−Ｃメチレンビシクロヌクレオチドを含む：
【化２７】
2012509272.tif 000037
【０２４１】
各々の内容が参照により本明細書に組み込まれている、「LNA Oligonucleotides and the Treatment of Cancer」という表題の米国特許出願第１１／２７２，１２４号及び「Oligomeric Compounds for the Modulation Survivin Expression」という表題の米国特許出願第１０／７７６，９３４号に開示されているスルビビンＬＮＡの詳細な説明を参照のこと。ＨＩＦ−１α調節については、米国特許第７，５８９，１９０号明細書及び米国特許出願公開第２００４／００９６８６４号明細書、ＥｒｂＢ３調節については米国特許出願公開第２００８／０３１８８９４号明細書及びＰＣＴ／ＵＳ０９／０６３３５７、ＰＩＫ３ＣＡ調節については米国特許出願公開第２００９／０１９２１１０号明細書、ＨＳＰ２８調節についてはＰＣＴ／ＩＢ０９／０５２８６０号、アンドロゲン受容体調節については米国特許出願公開第２００９／０１８１９１６号明細書、βカテニン調節については「RNA Antagonists Targeting GLI2」という表題の米国仮特許出願第６１／０８１，１３５号及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＢ０９／００６４０７号、並びに米国特許出願公開第２００９／０００５３３５号明細書及び第２００９／０２０３１３７号明細書も参照のこと。適切な標的遺伝子のさらなる例は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ０３／７４６５４、ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８及び米国特許出願第１０／９２３，５３６号に記載されている。
【０２４２】
さらなる実施形態において、本明細書に記載のナノ粒子は、エンドソーム放出促進群に放出可能なように結合したオリゴヌクレオチドを含むことができる。エンドソーム放出促進群、例えば富ヒスチジンペプチドは、エンドソーム膜を不安定化／破壊し、それにより治療薬の細胞質送達を促進することができる。富ヒスチジンペプチドは、細胞質へのオリゴヌクレオチドのエンドソーム放出を促進する。次いで、細胞内に放出されたオリゴヌクレオチドは、核へ移行できる。オリゴヌクレオチド−富ヒスチジンペプチド複合体のさらなる詳細は、各々の内容が参照により本明細書に組み込まれている、２００８年１１月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／１１５，３５０号及び第６１／１１５，３２６号、並びに同日に出願された「Releasable Conjugates For Nucleic Acids Delivery Systems」という表題のＰＣＴ特許出願第＿＿＿＿号に記載されている。
【０２４３】
６．標的基
場合により／好ましくは、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、特定の細胞型又は組織型に対する標的リガンドをさらに含む。標的基は、リンカー分子、例えばアミド（amide）、アミド（amido）、カルボニル、エステル、ペプチド、ジスルフィド、シラン、ヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、リン酸エステル、ホスホルアミデート、チオホスフェート、アルキルホスフェート、マレイミジルリンカー又は光解離性リンカーを用いてナノ粒子組成物（好ましくは融合性脂質及びＰＥＧ脂質）の任意の成分に結合できる。当技術分野で公知の任意の技法は、過度に実験するまでもなくナノ粒子組成物の任意の成分に標的基を結合させるのに使用できる。
【０２４４】
例えば、標的化剤を、ＰＥＧ脂質のポリマー部分に結合させて、ナノ粒子をインビボで標的領域に導くことができる。本明細書に記載のナノ粒子の標的送達は、治療用核酸を封入するナノ粒子の細胞取込みを促進し、それにより治療効果を増強させる。ある種の態様において、幾つかの細胞透過性ペプチドを、腫瘍部位への標的送達のため様々な標的ペプチドと置き換えてもよい。
【０２４５】
本発明の一つの好ましい態様において、標的部位、例えば一本鎖抗体（ＳＣＡ）又は一本鎖抗原結合抗体、モノクローナル抗体、細胞接着性ペプチド、例えばＲＧＤペプチド及びセレクチン、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、例えばＴＡＴ、ペネトラチン及び（Ａｒｇ）９、受容体リガンド、標的炭水化物分子又はレクチンにより、ナノ粒子は標的領域を特異的に対象とすることができる。その内容が参照により本明細書に組み込まれている、J Pharm Sci. 2006 Sep; 95(9): 1856-72 Cell adhesion molecules for targeted drug deliveryを参照のこと。
【０２４６】
好ましい標的部分としては、一本鎖抗体（ＳＣＡ）又は抗体の一本鎖可変フラグメント（ｓＦｖ）が挙げられる。ＳＣＡは、標的腫瘍細胞の特異的分子を結合するか、又は認識することができる抗体のドメインを含有する。抗原結合部位を維持することに加えて、ＰＥＧ脂質に結合したＳＣＡは、抗原性を低下させ、血流中のＳＣＡの半減期を増大することができる。
【０２４７】
「一本鎖抗体」（ＳＣＡ）、「一本鎖抗原結合分子又は抗体」又は「一本鎖Ｆｖ」（ｓＦｖ）という用語は、互換的に用いられる。一本鎖抗体は、抗原に対する結合親和性を有する。一本鎖抗体（ＳＣＡ）又は一本鎖Ｆｖｓは、幾つかの方法で構築でき、既に構築されている。一本鎖抗原結合タンパク質の理論及び産生の詳細は、それらの各々の内容が参照により本明細書に組み込まれている、同一出願人による米国特許出願第１０／９１５，０６９号及び米国特許第６，８２４，７８２号明細書において見出される。
【０２４８】
通常、ＳＣＡ又はＦｖドメインは、２６−１０、ＭＯＰＣ  ３１５、７４１Ｆ８、５２０Ｃ９、ＭｃＰＣ  ６０３、Ｄ１．３、マウスｐｈＯｘ、ヒトｐｈＯｘ、ＲＦＬ３．８  ｓＴＣＲ、１Ａ６、Ｓｅ１５５−４、１８−２−３、４−４−２０、７Ａ４−１、Ｂ６．２、ＣＣ４９、３Ｃ２、２ｃ、ＭＡ−１５Ｃ５／Ｋ１２ＧＯ、Ｏｘ等として文献中でそれらの略語により知られているモノクローナル抗体の中から選択できる（Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883(1988)；Huston, J. S. et al., SIM News 38(4)(Supp): 11(1988)；McCartney, J. et al., ICSU Short Reports 10: 114(1990)；McCartney, J. E. et al., unpublished results(1990)；Nedelman, M. A. et al., J. Nuclear Med. 32(Supp.): 1005(1991)；Huston, J. S. et al., In: Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications, PartB, edited by J. J. Langone, Methods in Enzymology 203: 46-88(1991)；Huston, J. S. et al., In: Advancesin the Applications of Monoclonal Antibodies in Clinical Oncology, Epenetos、A. A. (Ed.), London, Chapman & Hall(1993)；Bird, R. E. et al., Science 242: 423-426(1988)；Bedzyk, W. D. et al., J. Biol. Chem. 265: 18615-18620(1990)；Colcher, D. et al., J. Nat. Cancer Inst. 82: 1191-1197(1990)；Gibbs, R. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4001-4004(1991)；Milenic, D. E. et al., Cancer Research 51: 6363-6371(1991)；Pantoliano, M. W. et al., Biochemistry 30: 10117-10125(1991)；Chaudhary, V. K. et al., Nature 339: 394-397(1989)；Chaudhary, V. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1066-1070(1990)；Batra, J. K. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 171: 1-6(1990)；Batra, J. K. et al., J.Biol. Chem. 265: 15198-15202(1990)；Chaudhary, V. K. et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 87: 9491-9494(1990)；Batra, J. K. et al., Mol. Cell. Biol. 11: 2200-2205(1991)；Brinkmann, U. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8616-8620(1991)；Seetharam, S. et al., J. Biol. Chem. 266: 17376-17381(1991)；Brinkmann, U. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3075-3079(1992)；Glockshuber, R. et al., Biochemistry 29: 1362-1367(1990)；Skerra, A. et al., Bio/Technol. 9: 273-278(1991)；Pack, P. et al., Biochemistry 31: 1579-1534(1992)；Clackson, T. et al., Nature 352: 624-628(1991)；Marks, J. D. et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597(1991)；Iverson, B. L. et al., Science 249: 659-662(1990)；Roberts, V. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6654-6658(1990)；Condra, J. H. et al., J. Biol. Chem. 265: 2292-2295(1990)；Laroche, Y. et al., J. Biol. Chem. 266: 16343-16349(1991)；Holvoet, P. et al., J. Biol. Chem. 266: 19717-19724(1991)；Anand, N. N. et al., J. Biol. Chem. 266: 21874-21879(1991)；Fuchs, P. et al., Biol Technol. 9: 1369-1372(1991)；Breitling, F. et al., Gene 104: 104-153(1991)；Seehaus, T. et al., Gene 114: 235-237(1992)；Takkinen, K. et al., Protein Engng. 4: 837-841(1991)；Dreher, M. L. et al., J.Immunol. Methods 139: 197-205(1991)；Mottez, E. et al., Eur. J. Immunol. 21: 467-471(1991)；Traunecker, A. et al., Acad. Sci. USA 88: 8646-8650(1991)；Traunecker, A.等、EMBOJ. 10:3655-3659(1991); Hoo, W. F. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4759-4763(1993)も参照のこと）。前記刊行物は各々参照により本明細書に組み込まれている。
【０２４９】
標的基の非限定的リストは、血管内皮細胞増殖因子、ＦＧＦ２、ソマトスタチン及びソマトスタチン類似体、トランスフェリン、メラノトロピン、ＡｐｏＥ及びＡｐｏＥペプチド、フォンウィルブランド因子及びフォンウィルブランド因子ペプチド、アデノウイルスファイバータンパク質及びアデノウイルスファイバータンパク質ペプチド、ＰＤ１及びＰＤ１ペプチド、ＥＧＦ及びＥＧＦペプチド、ＲＧＤペプチド、葉酸塩、アニサミド等を含む。当業者により認識される他の任意選択の標的化剤も、本明細書に記載のナノ粒子で使用できる。
【０２５０】
一つの好ましい実施形態において、本明細書に記載の化合物に有用な標的化剤としては、一本鎖抗体（ＳＣＡ）、ＲＧＤペプチド、セレクチン、ＴＡＴ、ペネトラチン、（Ａｒｇ）９、葉酸、アニサミド等が挙げられ、これらの薬剤の好ましい構造の一部は以下のとおりである：
Ｃ−ＴＡＴ：（配列番号：１７）ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；
Ｃ−（Ａｒｇ）９：（配列番号：１８）ＣＲＲＲＲＲＲＲＲＲ；
ＲＧＤは、直鎖又は環状の
【化２８】
2012509272.tif 000038
2012509272.tif 000039
【０２５１】
であってよく、
葉酸は
【化２９】
2012509272.tif 000040
【０２５２】
の残基であり、
アニサミドは、ｐ−ＭｅＯ−Ｐｈ−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨである。
【０２５３】
Ａｒｇ９は、例えばＣＲＲＲＲＲＲＲＲＲを結合するためのシステインを含むことができ、ＴＡＴは、ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＣ等のペプチドの末端でさらなるシステインを付加できる。
【０２５４】
本発明の目的のために、明細書及び図面で使用する略語は、以下の構造を表す：
（ｉ）Ｃ−ｄｉＴＡＴ（配列番号１９）＝ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＮＨ２；
（ｉｉ）直鎖ＲＧＤ（配列番号２０）＝ＲＧＤＣ；
（ｉｉｉ）環状ＲＧＤ（配列番号２１及び配列番号２２）＝ｃ−ＲＧＤＦＣ又はｃ−ＲＧＤＦＫ；
（ｉｖ）ＲＧＤ−ＴＡＴ（配列番号２３）＝ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＧＲＧＤＳ−ＮＨ２及び
（ｖ）Ａｒｇ９（配列番号２４）＝ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ。
【０２５５】
あるいは、標的基は、糖及び炭水化物、例えばガラクトース、ガラクトサミン及びＮ−アセチルガラクトサミン；ホルモン、例えばエストロゲン、テストステロン、プロゲステロン、グルココルチゾン、アドレナリン、インスリン、グルカゴン、コルチゾール、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、レチノイン酸及び成長ホルモン；成長因子、例えばＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ及びＰＤＧＦ；神経伝達物質、例えばＧＡＢＡ、グルタメート、アセチルコリン；ＮＯＧＯ；イノシトール三リン酸；エピネフリン；ノルエピネフリン；一酸化窒素、ペプチド、ビタミン、例えば葉酸及びピリドキシン、薬物、抗体及びインビボ又はインビトロで細胞表面受容体と相互作用し得る任意の他の分子が挙げられる。
【０２５６】
Ｄ．ナノ粒子の調製
本明細書に記載のナノ粒子は、過度に実験するまでもなく当技術分野で公知の方法で調製できる。
【０２５７】
例えば、ナノ粒子は、第１の容器に水溶液（又は比較試験用に核酸なしの水溶液）中のオリゴヌクレオチド等の核酸を用意し、第２の容器に本明細書に記載のナノ粒子組成物を含有する有機脂質溶液を用意して、有機脂質溶液が水溶液と混ざり、核酸を封入するナノ粒子が製造されるように水溶液と有機脂質溶液とを混合することにより調製できる。該方法の詳細は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００４／０１４２０２５号明細書に記載されている。
【０２５８】
あるいは、本明細書に記載のナノ粒子は、有機溶媒を利用して成分の混合中に単相を得る、界面活性剤透析法又は変性逆相法等の当技術分野で公知の任意の方法により調製できる。界面活性剤透析法では、核酸（即ち、ｓｉＲＮＡ）をカチオン性脂質の洗浄溶液と接触させ、被覆核酸複合体を形成する。
【０２５９】
本発明の一実施形態において、カチオン性脂質とオリゴヌクレオチド等の核酸とを合わせて、約１：２０〜約２０：１の電荷比、好ましくは約１：５〜約５：１の比、より好ましくは約１：２〜約２：１の比を得る。
【０２６０】
本発明の一実施形態において、カチオン性脂質とオリゴヌクレオチド等の核酸とを合わせて、約１：１〜約２０：１の電荷比、約１：１〜約１２：１の比、より好ましくは約２：１〜約６：１の比を得る。あるいは、ナノ粒子組成物の窒素とホスフェート（Ｎ／Ｐ）との比は、約２：１〜約５：１（即ち、２．５：１）の範囲である。
【０２６１】
別の実施形態において、本明細書に記載のナノ粒子は、デュアルポンプシステムを用いて調製できる。一般に、該方法は、第１の容器に核酸を含有する水溶液及び第２の容器に記載のナノ粒子組成物を含有する脂質溶液を用意することを含む。二つの溶液をデュアルポンプシステムを用いて混合し、ナノ粒子を得る。次いで、得られた混合溶液を水性緩衝液で希釈し、形成したナノ粒子を透析により精製するか、且つ／又は単離することができる。ナノ粒子は、０．２２μｍのフィルターを介して濾過することにより滅菌されるようにさらに処理してもよい。
【０２６２】
核酸を含有するナノ粒子は、直径約５〜約３００ｎｍの範囲である。好ましくは、ナノ粒子は、動的光散乱法（ＤＬＳ）を用いる測定により、約１５０ｎｍ（例えば約５０〜１５０ｎｍ）未満の中位径、より好ましくは約１００ｎｍ未満の中位径を有する。ナノ粒子の大部分は、約３０〜１００ｎｍ（例えば５９．５、６６、６８、７６、８０、９３、９６ｎｍ）、好ましくは約６０〜約９５ｎｍの中位径を有する。当業者は、ＤＬＳ法と比較したとき、ＴＥＭ等の他の当技術分野で公知の技法を用いる測定により、中位径数が半分に減少し得ることを認識されよう。本発明のナノ粒子は、多分散性により示されるように、実質的にサイズが均一である。
【０２６３】
場合により、ナノ粒子は、当技術分野で公知の任意の方法によりサイジングできる。サイズは当業者により所望されるように制御できる。サイジングは、所望のサイズ範囲を得、ナノ粒子サイズの分布を比較的狭めるために行うことができる。ナノ粒子を所望のサイズにサイジングするために幾つかの技法を利用できる。その内容が参照により本明細書に組み込まれている、例えば、米国特許第４，７３７，３２３号明細書参照。
【０２６４】
本発明は、核酸（例えば、ＬＮＡ又はｓｉＲＮＡ）が脂質多重膜構造（即ち、脂質二重層）に封入され、分解から保護されるように、血清安定ナノ粒子を調製する方法を提供する。本明細書に記載のナノ粒子は、水溶液中で安定である。ナノ粒子に含まれる核酸は、体液中に存在するヌクレアーゼから保護される。
【０２６５】
さらに、本発明に従って調製されるナノ粒子は、生理学的ｐＨで中性であるか、又は正に帯電していることが好ましい。
【０２６６】
本明細書に記載のナノ粒子組成物を用いて調製されるナノ粒子又はナノ粒子複合体は、（ｉ）式（Ｉ）の化合物、（ｉｉ）中性脂質／融合性脂質、（ｉｉｉ）ＰＥＧ脂質及び（ｉｖ）オリゴヌクレオチド等の核酸を含む。
【０２６７】
一実施形態において、ナノ粒子組成物は、
式（Ｉ）の化合物、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルエタノールアミンに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＥ）及びコレステロール、
式（Ｉ）の化合物、ジアシルホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＥ）及びコレステロール、
式（Ｉ）の化合物、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＥ）及びコレステロール、
式（Ｉ）の化合物、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミドに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−Ｃｅｒ）及びコレステロール、又は
式（Ｉ）の化合物、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルエタノールアミンに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＥ）、セラミドに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−Ｃｅｒ）及びコレステロール
の混合物を含む。
【０２６８】
さらなるナノ粒子組成物は、当技術分野で公知のカチオン性脂質（複数可）を含有する組成物を修飾することにより調製できる。式（Ｉ）の化合物を含有するナノ粒子組成物は、当技術分野で公知のカチオン性脂質を加えることにより修飾できる。その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００８／００２００５８号明細書の表ＩＶに記載の当技術分野で公知の組成物を参照のこと。
【０２６９】
ナノ粒子の調製のためのナノ粒子組成物の非限定的リストを表３に示す。
【表３】
2012509272.tif 000041
【０２７０】
式（Ｉ）の化合物：化合物１２、３１、４９及び５４
一実施形態において、ナノ粒子中の式（Ｉ）の化合物：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＳＰＥ：Ｃ１６ｍＰＥＧ−セラミドのモル比は、ナノ粒子中に存在する総脂質に基づいて、各々約１８％：６０％：２０％：１％：１％のモル比である（試料番号８）。
【０２７１】
別の実施形態において、ナノ粒子は、式（Ｉ）の化合物、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＣ１６ｍＰＥＧ−セラミドをナノ粒子組成物中に存在する総脂質の約１７％：６０％：２０％：３％のモル比で含有する（試料番号７）。
【０２７２】
これらのナノ粒子組成物は、好ましくは、次の構造式を有する放出可能カチオン性脂質
【化３０】
2012509272.tif 000042
2012509272.tif 000043
【０２７３】
を含有する。
【０２７４】
本明細書で使用するモル比は、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質に対する量を指す。
【０２７５】
Ｅ．治療方法
本明細書に記載のナノ粒子は、単独で、又は他の療法と組み合わせて、細胞又は組織における標的遺伝子の発現レベルに関連しているか、又はそれに反応する任意の特質、疾患又は状態を予防するか、抑制するか、低減するか又は治療するための治療において使用できる。該方法は、本明細書に記載のナノ粒子を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む。
【０２７６】
本発明の一態様は、治療薬、例えば核酸／オリゴヌクレオチドを哺乳動物細胞にインビボ及び／又はインビトロで導入するか、又は送達する方法を提供する。
【０２７７】
本発明による方法は、細胞を本明細書に記載の化合物と接触させることを含む。送達は、インビボで適切な医薬組成物の一部として行われてもよく、又はエクスビボ環境若しくはインビトロ環境で細胞に対して直接行われてもよい。
【０２７８】
本発明は、オリゴヌクレオチドを哺乳動物に導入するのに有用である。本明細書に記載の化合物は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与できる。
【０２７９】
本発明によれば、本発明は、哺乳動物の細胞又は組織において遺伝子発現を抑制するか、又はダウンレギュレート（若しくは調節）する方法を好ましくは提供する。遺伝子発現のダウンレギュレーション又は抑制は、インビボ、エクスビボ及び／又はインビトロで実現できる。該方法は、ヒトの細胞又は組織と核酸を封入するナノ粒子とを接触させるか、又はナノ粒子をそれを必要とする哺乳動物に投与することを含む。接触が起こると、本明細書に記載のナノ粒子なしで観察されたものと比較して、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％以上（例えば、少なくとも約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％）がインビボ、エクスビボ又はインビトロで実現された場合に、例えばｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルでの遺伝子発現の抑制又はダウンレギュレーションが成功したとみなされるものとする。
【０２８０】
本発明の目的のために、「抑制する」又は「ダウンレギュレートする」は、一つ又は複数のタンパク質サブユニットをコードする標的遺伝子の発現、又はＲＮＡ若しくは等価ＲＮＡのレベル、あるいは一つ又は複数のタンパク質サブユニットの活性が、本明細書に記載のナノ粒子の不在化で観察されたものと比較して低減されることを意味すると理解されるものとする。
【０２８１】
一つの好ましい実施形態において、標的遺伝子としては、例えばそれだけに限らないが、癌遺伝子、プロ血管新生経路遺伝子、プロ細胞増殖経路遺伝子、ウイルス感染因子遺伝子及びプロ炎症経路遺伝子が挙げられる。
【０２８２】
好ましくは、標的遺伝子の遺伝子発現は、癌細胞又は癌組織、例えば脳腫瘍細胞、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞、口腔癌細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞、皮膚癌細胞又は子宮頸癌細胞において抑制される。癌細胞又は癌組織は、以下のもの：固形腫瘍、リンパ腫、小細胞肺癌、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、膵臓癌、膠芽腫、卵巣癌、胃癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、脳腫瘍、ＫＢ癌、肺癌、結腸癌、表皮癌等の一つ又は複数に由来するものであってよい。
【０２８３】
一つの特定の実施形態において、本明細書に記載の方法によるナノ粒子は、例えばアンチセンスｂｃｌ−２オリゴヌクレオチド、アンチセンスＨＩＦ−１αオリゴヌクレオチド、アンチセンススルビビンオリゴヌクレオチド、アンチセンスＥｒｂＢ３オリゴヌクレオチド、アンチセンスＰＩＫ３ＣＡオリゴヌクレオチド、アンチセンスＨＳＰ２７オリゴヌクレオチド、アンチセンスアンドロゲン受容体オリゴヌクレオチド、アンチセンスＧｌｉ２オリゴヌクレオチド及びアンチセンスβカテニンオリゴヌクレオチドを含む。
【０２８４】
本発明によれば、ナノ粒子はオリゴヌクレオチド（各核酸が天然核酸又は修飾核酸である、配列番号１、配列番号２及び３、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５並びに配列番号１６）を含むことができ、それを使用できる。本明細書で企図される療法は、前記ナノ粒子に封入された核酸を使用する。一実施形態において、８個以上の連続アンチセンスヌクレオチドを含有する治療用ヌクレオチドを治療で使用できる。
【０２８５】
あるいは、哺乳動物を治療する方法も提供される。該方法は、有効量の本明細書に記載のナノ粒子を含有する医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む。該方法の有効性は、治療される状態に対する核酸の有効性に依存するであろう。本発明は、哺乳動物における様々な医学的状態を治療する方法を提供する。該方法は、有効量の封入された治療用核酸を含有するナノ粒子を、このような治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む。本明細書に記載のナノ粒子は、とりわけ、疾患、例えば（それだけに限らないが）癌、炎症性疾患及び自己免疫疾患を治療するのに有用である。
【０２８６】
一実施形態において、有効量の本明細書に記載のナノ粒子を含有する医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、悪性腫瘍又は癌を有する患者を治療する方法も提供される。治療される癌は、以下のもの：固形腫瘍、リンパ腫、小細胞肺癌、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、膵臓癌、膠芽腫、卵巣癌、胃癌、結腸直腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、脳腫瘍、ＫＢ癌、肺癌、結腸癌、表皮癌等の一つ又は複数であってよい。ナノ粒子は、標的遺伝子の遺伝子発現をダウンレギュレートすることにより、新生物疾患を治療し、全身腫瘍組織量を減少させ、新生物の転移を予防し、哺乳動物における腫瘍／新生物の増殖の再発を予防するのに有用である。例えば、ナノ粒子は、転移性疾患（即ち、肺に転移する癌）の治療に有用である。
【０２８７】
さらに別の態様において、本発明は、インビボ又はインビトロで癌細胞の増殖又は成長を抑制する方法を提供する。該方法は、癌細胞を本明細書に記載のナノ粒子と接触させることを含む。一実施形態において、本発明は、細胞がＥｒｂＢ３遺伝子を発現するインビボ又はインビトロで癌の増殖を抑制する方法を提供する。
【０２８８】
別の態様において、本発明は、例えば核においてＥｒｂＢ３  ｍＲＮＡに結合し得る、癌細胞内に核酸（例えば、アンチセンスＥｒｂＢ３  ＬＮＡオリゴヌクレオチド）を送達させる手段を提供する。結果として、ＥｒｂＢ３タンパク質発現が抑制され、それにより癌細胞の増殖が抑制される。該方法は、オリゴヌクレオチド（例えば、ＬＮＡを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド）を癌細胞に導入し、癌細胞又は癌組織における標的遺伝子（例えばスルビビン、ＨＩＦ−１α又はＥｒｂＢ３）発現を減少させる。
【０２８９】
あるいは、本発明は、癌細胞のアポトーシスを調節する方法を提供する。さらに別の態様において、インビボ又はインビトロで化学療法剤に対する癌細胞又は癌組織の感受性を高める方法も提供される。
【０２９０】
さらに別の態様において、インビボ又はインビトロで腫瘍細胞を殺滅する方法が提供される。該方法は、本明細書に記載の化合物を腫瘍細胞に導入して、ＥｒｂＢ３遺伝子等の遺伝子発現を減少させるステップと、腫瘍細胞と、腫瘍細胞の一部を殺滅するのに十分な量の少なくとも１種の抗癌剤（例えば、化学療法剤）とを接触させるステップとを含む。したがって、殺滅される腫瘍細胞部分は、本明細書に記載のナノ粒子の不在化で同量の化学療法剤により殺滅されるであろう部分よりも大きくてよい。
【０２９１】
本発明のさらなる態様において、抗癌剤／化学療法剤は、本明細書に記載の化合物と組み合わせて、同時に又は順次に使用できる。本明細書に記載の化合物は、抗癌剤の前に、又はそれと同時に、あるいは抗癌剤の投与後に投与できる。したがって、本明細書に記載のナノ粒子は、化学療法剤の治療前、治療中又は治療後に投与できる。
【０２９２】
さらにさらなる態様は、相乗的又は付加的な利益のために本明細書に記載の本発明の化合物と他の抗癌療法とを組み合わせることを含む。
【０２９３】
あるいは、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、哺乳動物に対して負電荷又は中性電荷を好ましくは有する、医薬活性剤を送達するために使用できる。医薬活性剤／化合物を封入するナノ粒子は、それを必要とする哺乳動物に投与できる。医薬活性剤／化合物は、低分子量の分子を含む。通常、医薬活性剤は、約１５００ダルトン未満（即ち１０００ダルトン未満）の分子量を有する。
【０２９４】
さらなる実施形態において、本明細書に記載の化合物は、核酸、医薬活性剤又はそれらの組合せを送達するために使用できる。
【０２９５】
さらにさらなる実施形態において、治療と関連するナノ粒子は、相乗効果の利用のために一つ又は複数の治療用核酸（同一又は異なるいずれか、例えば同一又は異なるオリゴヌクレオチド）及び／又は一つ若しくは複数の医薬活性剤の混合物を含有できる。
【０２９６】
Ｆ．ナノ粒子の医薬組成物／医薬製剤
本明細書に記載のナノ粒子を含む医薬組成物／医薬製剤は、薬学的に使用できる製剤への活性化合物の加工を促進する賦形剤及び補助剤を含む、一つ又は複数の生理学的に許容される担体と共に製剤化できる。適切な製剤は、選択される投与経路、即ち、局所治療であるか、又は全身治療であるかに依存する。
【０２９７】
適切な形態は、ある程度、経口、経皮又は注射等の使用又は侵入経路に依存する。適切な製剤を調製する当技術分野で公知の考慮因子としては、それだけに限らないが、組成物又は製剤がその効果を発揮することを妨げるであろう毒性及び任意の欠点が挙げられる。
【０２９８】
本明細書に記載のナノ粒子の医薬組成物の投与は、経口、経肺、局所又は非経口であってよい。局所投与としては、それだけに限らないが、例えば膣送達及び直腸送達を含む、粘膜を介することを含む、表皮、経皮、眼の経路を介した投与が挙げられる。静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内の注射又は注入を含む非経口投与も企図される。
【０２９９】
一つの好ましい実施形態において、治療用オリゴヌクレオチドを含有するナノ粒子は、静脈内（ｉ．ｖ．）又は腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与される。本発明の多くの態様において、非経口経路が好ましい。
【０３００】
それだけに限らないが静脈注射、筋肉内注射及び皮下注射を含む注射について、本発明のナノ粒子は、水溶液中で、好ましくは生理学的に相容性の緩衝液、例えば生理食塩水緩衝液中で、又はそれだけに限らないがピロリドン又はジメチルスルホキシドを含む極性溶媒中で製剤化できる。
【０３０１】
ナノ粒子は、ボーラス注入又は連続注入用に製剤化されてもよい。注射用製剤は、単位剤形、例えばアンプル又は多用量容器中に存在できる。有用な組成物として、それだけに限らないが、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンが挙げられ、賦形剤、例えば懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散化剤を含有できる。非経口投与用の医薬組成物としては、水溶性形態の水溶液が挙げられる。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストラン等の懸濁液の粘度を調節する物質を含有できる。懸濁液は、溶液中のナノ粒子の濃度を増加させる適切な安定剤及び／又は薬剤も場合により含有できる。あるいは、ナノ粒子は、適当なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水により使用前に構成するために粉末形態であってもよい。
【０３０２】
経口投与について、本明細書に記載のナノ粒子は、ナノ粒子と、当技術分野で周知の薬学的に許容される担体とを合わせることにより製剤化できる。このような担体により、本発明のナノ粒子を、患者の経口摂取用に錠剤、ピル、トローチ、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、ペースト、スラリー、溶液、懸濁液、患者の飲料水での希釈用の濃縮液及び懸濁液、患者の食餌での希釈用の予混合剤等に製剤化できる。経口使用のための医薬製剤は、固体賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕して、所望される場合、他の適切な補助剤を加えた後に顆粒の混合物を加工して、錠剤又は糖衣錠の核を得ることにより製造できる。有用な賦形剤としては、特に充填剤、例えば糖（例えばラクトース、スクロース、マンニトール又はソルビトール）、セルロース製剤、例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン及びジャガイモデンプン、並びに他の物質、例えばゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）がある。所望される場合、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天又はアルギン酸を加えてもよい。塩、例えばアルギン酸ナトリウムも使用できる。
【０３０３】
吸入投与については、本発明のナノ粒子は、圧縮パック又はネブライザーを用いるエアロゾルスプレー、及び適切な噴射剤の形態で好都合に送達できる。
【０３０４】
ナノ粒子は、例えば従来の座薬基剤、例えばココアバター又は他のグリセリドを用いて、直腸組成物、例えば座薬又は停留浣腸に製剤化してもよい。
【０３０５】
先に記載の製剤に加えて、ナノ粒子は、デポー製剤として製剤化されてもよい。このような長時間作用型製剤は、移植（例えば皮下又は筋肉内）により又は筋肉内注射により投与できる。本発明のナノ粒子は、適切なポリマー材料又は疎水性材料（例えば、薬理学的に許容される油のエマルジョン）と共に、イオン交換樹脂と共に、又はそれだけに限らないが難溶性の塩等の難溶性誘導体としてこの投与経路用に製剤化できる。
【０３０６】
さらに、ナノ粒子は、持続放出系、例えばナノ粒子を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスを用いて送達できる。様々な持続放出材料が確立されており、当業者に周知である。
【０３０７】
さらに、抗酸化剤及び懸濁化剤は、本明細書に記載のナノ粒子の医薬組成物中で使用できる。
【０３０８】
Ｇ．用量
一つ又は複数の予め選択された遺伝子の発現を抑制するのに適した用量、例えば臨床状況における治療有効量の決定は、特に本明細書の開示内容に照らして、十分当業者の能力の範囲内である。
【０３０９】
本発明の方法で使用する任意の治療用核酸について、治療有効量は、最初にインビトロアッセイから推定できる。次いで、投与量は、有効な投与量を含む循環濃度範囲を得るために動物モデルでの使用に対して定式化できる。次いで、このような情報を使用して、患者に有用な投与量をより正確に決定できる。
【０３１０】
投与される医薬組成物の量は、そこに含まれる核酸の有効性に依存するであろう。一般に、治療で使用する核酸を含有するナノ粒子の量は、哺乳動物において所望の治療結果を効果的に実現する量である。必然的に、様々なナノ粒子の投与量は、そこに封入された核酸（例えばオリゴヌクレオチド）（又は医薬活性剤）に応じて若干変化するであろう。さらに、投与量は、当然ながら、剤形及び投与経路に応じて変化し得る。しかし、一般に、本明細書に記載のナノ粒子に封入された核酸は、約０．１〜約１ｇ／ｋｇ／週、好ましくは約１〜約５００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜約１００ｍｇ／ｋｇ（即ち、約３〜約９０ｍｇ／ｋｇ／用量）の範囲の量で投与できる。
【０３１１】
上に示された範囲は、例示的であり、当業者は、臨床経験及び治療指示に基づき最適な用量を決定するであろう。さらに、正確な製剤、投与経路及び投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択できる。さらに、本明細書に記載のナノ粒子の毒性及び治療有効性は、当業者に周知の方法を用いて細胞培養又は実験動物において標準医薬操作により決定できる。
【０３１２】
あるいは、約１〜約１００ｍｇ／ｋｇ／用量（０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／用量）の量を、核酸の有効性に応じて治療で使用してもよい。単位剤形は、一般に、活性剤、オリゴヌクレオチドの約１ｍｇ〜約６０ｍｇの範囲である。
【０３１３】
一実施形態において、本発明の治療は、本明細書に記載のナノ粒子を、約１〜約６０ｍｇ／ｋｇ／用量（約２５〜６０ｍｇ／ｋｇ／用量、約３〜約２０ｍｇ／ｋｇ／用量）、例えば６０、４５、３５、３０、２５、１５、５又は３ｍｇ／ｋｇ／用量（単回投与計画又は多回投与計画のいずれか）の量で哺乳動物に投与することを含む。例えば、本明細書に記載のナノ粒子は、ｑ３ｄ×９で５、２５、３０又は６０ｍｇ／ｋｇ／用量の量で静脈内に投与できる。別の例としては、治療プロトコルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、毎週約４〜約１８ｍｇ／ｋｇ／用量、又は毎週約４〜約９．５ｍｇ／ｋｇ／用量（例えば、６週間のサイクルで３週間毎週約８ｍｇ／ｋｇ／用量）で投与することを含む。
【０３１４】
あるいは、本明細書に記載のナノ粒子中に封入されたオリゴヌクレオチドの送達は、約０．１〜約１０００μＭ、好ましくは約１０〜約１５００μＭ（即ち、約１０〜約１０００μＭ、約３０〜約１０００μＭ）の濃度のオリゴヌクレオチドと腫瘍細胞又は腫瘍組織とをインビボ、エクスビボ又はインビトロで接触させることを含む。
【０３１５】
組成物は、１日１回投与してもよく、複数週の治療プロトコルの一環として与えることができる複数回投与に分けてもよい。正確な用量は、当業者に認識されるように、状態の段階及び重症度、核酸に対する腫瘍等の疾患の感受性、及び治療される患者の個々の特性に依存するであろう。
【０３１６】
ナノ粒子が投与される本発明の全ての態様において、言及された投与量は、投与されるナノ粒子の量ではなくオリゴヌクレオチドの分子量に基づいている。
【０３１７】
治療は、所望の臨床結果が得られるまで１日又は数日行われることが企図される。治療用の核酸（又は医薬活性剤）を封入するナノ粒子の投与の正確な量、回数及び期間は、当然ながら、患者の性別、年齢及び医学的状態、並びに担当臨床医により決定された疾患の重症度に応じて変化するであろう。
【０３１８】
さらにさらなる態様は、相乗的又は付加的な利益のために、本明細書に記載の本発明のナノ粒子と他の抗癌療法とを組み合わせることを含む。
【実施例】
【０３１９】
以下の実施例は、本発明のさらなる理解を得るために利用されるが、本発明の有効な範囲を制限することを何ら意味するものではない。
【０３２０】
実施例において、全ての合成反応は、乾燥窒素又は乾燥アルゴンの雰囲気下で行われる。Ｎ−（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン）、ＢＯＣ−ＯＮ、ＬｉＯＣｌ４、コレステロール及び１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジンＨＣｌをＡｌｄｒｉｃｈから購入した。全ての他の試薬及び溶媒を、さらなる精製なしで使用した。スルビビン遺伝子を標的とするＬＮＡオリゴ−１及びＥｒＢ３遺伝子を標的とするオリゴ−２を社内で調製した。その配列を表４に示す。インターヌクレオチド結合はホスホロチオエートであり、ｍＣはメチル化シトシンを表し、大文字はＬＮＡを示す。
【表４】
2012509272.tif 000044
【０３２１】
以下の略語、例えばＬＮＡ（ロックド核酸オリゴヌクレオチド）、ＢＡＣＣ（２−［Ｎ，Ｎ’−ジ（２−グアニジンプロピル）］アミノエチルコレステリルカーボネート）、Ｃｈｏｌ（コレステロール）、ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）、ＤＭＡＰ（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン）、ＤＯＰＥ（Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、ＵＳＡ又はＮＯＦ、Ｊａｐａｎ）、ＤＬＳ（動的光散乱）、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）（ＮＯＦ、Ｊａｐａｎ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（ポリエチレングリコール）２０００アンモニウム塩又はナトリウム塩、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、ＵＳＡ及びＮＯＦ、Ｊａｐａｎ）、ＫＤ（ノーンダウン）、ＥＰＣ（卵ホスファチジルコリン、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、ＵＳＡ）及びＣ１６  ｍＰＥＧ−セラミド（Ｎ−パルミトイル−スフィンゴシン−１−スクシニル（メトキシプロピルエチレングリコール）２０００、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、ＵＳＡ）は、実施例全体で使用され得る。他の略語、例えばＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＤＭＥＭ（ダルベッコの修飾イーグル培地）、ＭＥＭ（修飾イーグル培地）、ＴＥＡＡ（テトラエチルアンモニウムアセテート）、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、ＲＴ−ｑＰＣＲ（逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応）も使用できる。
【０３２２】
（実施例１）
一般的ＮＭＲ法
別段の指示がない限り、Ｖａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  ３００ＮＭＲ分光計及び溶媒として重水素化クロロホルムを用いて３００ＭＨｚで１Ｈ  ＮＭＲスペクトル及び７５．４６ＭＨｚで１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを得た。化学シフト（δ）を、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）からのダウンフィールドで１００万分の一（ｐｐｍ）で報告する。
【０３２３】
（実施例２）
一般的なＨＰＬＣ法
反応混合物、並びに中間体及び最終生成物の純度を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＨＰＬＣ装置でモニターする。１ｍＬ／分の流量で０．０５％ＴＦＡ中のアセトニトリル１０〜９０％の勾配、又は１ｍＬ／分の流量で５０ｍＭ  ＴＥＡＡ緩衝液中のアセトニトリル２５〜３５％の勾配を用いて、１６８ダイオードアレイＵＶ検出器を備えたＺＯＲＢＡＸ（登録商標）３００ＳＢ  Ｃ８逆相カラム（１５０×４．６ｍｍ）又はＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ（登録商標）３００Ａ  Ｃ１８逆相カラム（１５０×４．６ｍｍ）を使用する。アニオン交換クロマトグラフィーを、Ｗａｔｅｒｓ製のＡＰ−Ｅｍｐｔｙグラスカラムに充填したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＰｏｒｏｓ５０ＨＱ強アニオン交換樹脂を用いてＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）製のＡＫＴＡエクスプローラー１００Ａで行った。脱塩は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（ＰＥＧ−オリゴ用）を用いて達成された。
【０３２４】
（実施例３）
一般的なｍＲＮＡダウンレギュレーション法
細胞を完全培地（Ｆ−１２Ｋ又はＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳで補足）中で維持する。各ウェル中に２．５×１０５細胞を含有する１２ウェルプレートを３７℃で終夜インキュベートする。細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）で１回洗浄し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）４００μＬを各ウェルに加える。次いで、オリゴヌクレオチドを含有するナノ粒子又はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（登録商標）の溶液を各ウェルに加える。細胞を４時間インキュベートし、次いで各ウェルに培地６００μＬを加え、２４時間インキュベートする。処理の２４時間後、ヒトスルビビン遺伝子等の標的遺伝子及びＧＡＰＤＨ等のハウスキーピング遺伝子の細胞内ｍＲＮＡレベルを、ＲＴ−ｑＰＣＲで定量する。ｍＲＮＡの発現レベルを正規化する。
【０３２５】
（実施例４）
一般的なＲＮＡ調製法
インビトロｍＲＮＡダウンレギュレーションスクリーニングのために、製造業者の使用説明書に従って全ＲＮＡをＲＮＡｑｕｅｏｕｓ  Ｋｉｔ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて調製する。ＲＮＡ濃度を、ナノドロップを用いてＯＤ２６０ｎｍで決定する。
【０３２６】
（実施例５）
一般的なＲＴ−ｑＰＣＲ法
全ての試薬はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製である：  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（登録商標）（４３６８８１３）、２０×ＰＣＲマスターミックス（４３０４４３７）、並びにヒトＧＡＰＤＨ（Ｃａｔ．＃０６１２１７７）及びスルビビン（ＢＩＲＫ５  Ｈｓ００１５３３５３）用ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイキット。全ＲＮＡ２．０μｇを、最終量５０μＬでのｃＤＮＡ合成に使用する。反応を、ＰＣＲサーモサイクラーで２５℃にて１０分間、３７℃にて１２０分間、８５℃にて５秒間行い、次いで４℃で貯蔵する。リアルタイムＰＣＲを、５０℃−２分間、９５℃−１０分間及び９５℃−１５秒間／６０℃−１分間のプログラムで４０サイクル行う。各ｑＰＣＲ反応については、ｃＤＮＡ１μＬを最終量３０μＬで使用する。
【０３２７】
（実施例６）
化合物３の調製
コレステロール（化合物１）と保護システイン（化合物２）とをＥＤＣ及びＤＭＡＰの存在下で反応させて、コレステリルシステイン（化合物３）を形成する。
【０３２８】
（実施例７）
化合物５の調製
化合物３とチオール基を含有する二官能性スペーサー（化合物４）とをＤＩＰＥＡの存在下で反応させて、化合物５を得、ジスルフィド結合を形成する。
【０３２９】
（実施例８）
化合物６の調製
化合物５をピペリジン及びＤＭＦ（１：１）で処理し、Ｆｍｏｃ基を除去し、化合物６を得る。
【０３３０】
（実施例９）
化合物８の調製
化合物６とＦｍｏｃＬｙｓ−ＯＨ（化合物７）とをＥＤＣ及びＤＭＡＰの存在下で結合させて、化合物８を得る。
【０３３１】
（実施例１０）
化合物９の調製
化合物８をピペリジン及びＤＭＦ（１：１）で処理し、Ｆｍｏｃ基を除去し、化合物９を得る。
【０３３２】
（実施例１１）
化合物１１の調製
無水クロロホルム１２ｍＬ中の９（１．４８ｍｍｏｌ）の溶液に１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジンＨＣｌ（化合物１０、０．８７ｇ、５．９ｍｍｏｌ）、次いでＤＩＥＡ（１．０３ｍＬ、５．９ｍｍｏｌ）を室温で加える。反応物を１６時間還流する。溶液を室温まで冷却する。混合物をＡＣＮ１５ｍＬで沈殿させ、粗固体を遠心分離で単離する。固体を水／ＡＣＮ（１：１）の溶液１４ｍＬに溶解させる。完全に溶解させた後、ＡＣＮ１４ｍＬを加えて固体を沈殿させる。固体を遠心分離し、乾燥させて、生成物を生成する。
【０３３３】
（実施例１２）
化合物１２の調製
化合物１１をＴＦＡで処理し、ＢＯＣ基を除去し、化合物１２を得る。
【０３３４】
（実施例１３）
化合物２２の調製
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）フタルイミド（２１、２５ｇ、１３０．８ｍｍｏｌ、１等量）を乾燥ベンゼン５００ｍＬに溶解させ、１時間共沸させ、ベンゼン１２５ｍＬを除去し、次いで室温まで冷却して、ｐ−ＴｓＯＨ（０．２４０ｇ、１．２６ｍｍｏｌ、０．００９６等量）を加えた。反応混合物を０〜５℃まで冷却し、次いで２−メトキシプロペン（１０．４ｇ、１３．８ｍＬ、１４３．８ｍｍｏｌ、１．１等量）を添加漏斗から０〜５℃で１５分かけて加えた。反応混合物を０〜５℃で１時間撹拌し、次いで８９〜９５℃まで加熱し、３時間共沸させ、ＭｅＯＨ／ベンゼンを除去した。溶媒の除去後、溶液を冷却し、共沸を停止して、等量のベンゼンを加えた。３時間後、反応混合物を室温まで冷却し、ＴＥＡ３０ｍＬ及び無水酢酸５ｍＬを加え、室温で終夜撹拌させた。反応混合物を３５℃にて真空下で濃縮し、２／３量のベンゼンを除去して、粗生成物をヘキサン３００ｍＬで滴下沈殿させた。沈殿物を濾過し、ヘキサンで洗浄した。固体（８．５ｇ）を６５℃にてトルエン７０ｍＬに溶解させ、溶液を０℃まで冷却した。生成物を遠心分離で収集し、ヘキサンで洗浄し、真空下でＣＣｌ４で共蒸発させて、生成物４．９ｇを生成した：１３Ｃ  ＮＭＲ  δ  ２４．６７、３８．０９、５７．８８、１００．３９、１２３．０５、１３１．９２、１３３．６６、１６７．８８。
【０３３５】
（実施例１４）
化合物２３の調製
化合物２２（４．９ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）を６Ｍ  ＮａＯＨ（水３８ｍＬ中のＮａＯＨ９．１ｇ）に溶解させ、溶液を終夜還流した。得られた溶液を室温まで冷却し、次いで１：１（ｖ／ｖ）のクロロホルム／ＩＰＡ４０ｍＬで３回抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、３５℃にて真空下で濃縮した。固体をヘキサンに２回、ＣＣｌ４に１回懸濁し、３５℃にて真空下で乾燥させて、生成物（１．８ｇ、９５％）を得た：１３Ｃ  ＮＭＲ  δ  ２４．９９、４２．０８、４３．８１、６２．８２、６３．５８、７７．４１、９９．６４。
【０３３６】
（実施例１５）
化合物２５の調製
化合物２３（１．８ｇ、１１．１ｍｍｏｌ、１等量）を無水ＴＨＦ３６ｍＬに溶解させ、乾燥氷浴／ＩＰＡ浴中で−７８℃まで冷却し、次いでエチルトリフルオロアセテートを加えた。溶媒をヘキサンで共蒸発させることにより真空下で除去する前に、反応混合物を室温で１．５時間撹拌し、粗生成物を得た。粗生成物をＤＣＭ及びＭｅＯＨ（１００：０．１〜９８：２、ｖ／ｖ）を用いて不活性化アルミナ上でカラムクロマトグラフィーにより精製して、生成物１．３０ｇを生成した：１３Ｃ  ＮＭＲ  δ  ２４．８８、４０．６８、４１．１１、４２．１３、５７．９９、６０．２６、６２．１０、９９．８３。
【０３３７】
（実施例１６）
化合物２７の調製
化合物２６（２．８８ｍｍｏｌ）及び化合物２５（１５．０ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ６０ｍＬ及び乾燥ＤＭＦ８ｍＬに溶解させる。ＤＩＥＡ（０．６０ｇ、０．８２ｍＬ、４．６１ｍｍｏｌ、１．６等量）を加え、反応混合物を室温で終夜撹拌する。得られた反応溶液を室温にて真空下で濃縮し、次いでエーテルを加え、固体を氷浴中で０〜５℃にて沈殿させる。固体を濾過し、カラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物２７を得る。
【０３３８】
（実施例１７）
化合物２８の調製
化合物２７をＫ２ＣＯ３で処理して、化合物２８を得る。
【０３３９】
（実施例１８）
化合物２９の調製
化合物２８とＦｍｏｃＬｙｓ−ＯＨ（化合物７）とをＥＤＣ及びＤＭＡＰの存在下で結合させて、化合物２９を得る。
【０３４０】
（実施例１９）
化合物３０の調製
化合物２９をピペリジン及びＤＭＦ（１：１）で処理し、Ｆｍｏｃ基を除去し、化合物３０を得る。
【０３４１】
（実施例２０）
化合物３１の調製
無水クロロホルム１２ｍＬ中の３０（１．４８ｍｍｏｌ）の溶液に１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジンＨＣｌ（化合物１０、０．８７ｇ、５．９ｍｍｏｌ）、次いでＤＩＥＡ（１．０３ｍＬ、５．９ｍｍｏｌ）を室温で加える。反応物を１６時間還流する。溶液を室温まで冷却する。混合物をＡＣＮ１５ｍＬで沈殿させ、粗固体を遠心分離で単離する。固体を水／ＡＣＮ（１：１）の溶液１４ｍＬに溶解させる。完全に溶解させた後、ＡＣＮ１４ｍＬを加えて固体を沈殿させる。固体を遠心分離し、乾燥させて、生成物を生成する。
【０３４２】
（実施例２１）
化合物４３の調製
化合物４１と化合物４２とをＤＩＥＡの存在下で反応させて、化合物４３を得る。
【０３４３】
（実施例２２）
化合物４４の調製
化合物４３をＤＣＭ中のＴＦＡで処理して、化合物４４を得る。
【０３４４】
（実施例２３）
化合物４６の調製
コレステリルクロロホルメート（化合物２６）と２−メトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド（化合物４５）とをＤＩＥＡの存在下で反応させて、化合物４６を得る。
【０３４５】
（実施例２４）
化合物４７の調製
化合物４４と化合物４６とを分子篩の存在下で反応させて、化合物４７を得、イミン結合を形成する。
【０３４６】
（実施例２５）
化合物４８の調製
化合物４７をピペリジン及びＤＭＦ（１：１）で処理し、Ｆｍｏｃ基を除去する。反応物を３０分間撹拌し、次いで水を入れたＨｉＰｒｅｐカラムで脱塩し、化合物４８を得る。
【０３４７】
（実施例２６）
化合物４９の調製
無水クロロホルム１２ｍＬ中の４８（１．４８ｍｍｏｌ）の溶液に１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジンＨＣｌ（化合物１０、０．８７ｇ、５．９ｍｍｏｌ）、次いでＤＩＥＡ（１．０３ｍＬ、５．９ｍｍｏｌ）を室温で加える。反応物を１６時間還流する。溶液を室温まで冷却する。混合物をＡＣＮ１５ｍＬで沈殿させ、粗固体を遠心分離で単離する。固体を水／ＡＣＮ（１：１）の溶液１４ｍＬに溶解させる。完全に溶解させた後、ＡＣＮ１４ｍＬを加えて固体を沈殿させる。固体を遠心分離し、乾燥させて、生成物を生成する。
【０３４８】
（実施例２７）
化合物５１の調製
ＴＥＡ（３３．６ｇ、０．０３３ｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）及びＤＭＦ（１００ｍＬ）中のコレステリルクロロホルメート（２６、５ｇ、０．０１１ｍｏｌ）の溶液に加え、次いでシスタミンジヒドロクロリド（５０、２５ｇ、０．１１ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で５日間撹拌した。不溶性残渣を濾過し、溶離液を減圧下で濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２中で５〜１０％ＭｅＯＨを用いてフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、生成物０．９ｇ（１４％）を生成した。
【０３４９】
（実施例２８）
化合物５２の調製
化合物５１とＦｍｏｃＬｙｓ−ＯＨ（化合物７）とをＥＤＣ及びＤＭＡＰの存在下で結合させて、化合物５２を得る。
【０３５０】
（実施例２９）
化合物５３の調製
化合物５２をピペリジン及びＤＭＦ（１：１）で処理し、Ｆｍｏｃ基を除去し、化合物５３を得る。
【０３５１】
（実施例３０）
化合物５４の調製
無水クロロホルム１２ｍＬ中の５３（１．４８ｍｍｏｌ）の溶液に１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジンＨＣｌ（化合物１０、０．８７ｇ、５．９ｍｍｏｌ）、次いでＤＩＥＡ（１．０３ｍＬ、５．９ｍｍｏｌ）を室温で加える。反応物を１６時間還流する。溶液を室温まで冷却する。混合物をＡＣＮ１５ｍＬで沈殿させ、粗固体を遠心分離で単離する。固体を水／ＡＣＮ（１：１）の溶液１４ｍＬに溶解させる。完全に溶解させた後、ＡＣＮ１４ｍＬを加えて固体を沈殿させる。固体を遠心分離し、乾燥させて、生成物を生成する。
【０３５２】
（実施例３１）
核酸−ナノ粒子組成物の調製
本実施例において、様々な核酸、例えばＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドを封入するナノ粒子組成物を調製する。例えば、化合物５４、ＤＯＰＥ、Ｃｈｏｌ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ及びＣ１６ｍＰＥＧ−セラミドを、９０％エタノール（総脂質３０μｍｏｌ）１０ｍＬ中で１８：６０：２０：１：１のモル比で混合する。ＬＮＡオリゴヌクレオチド（０．４μｍｏｌ）を２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４〜７．６）１０ｍＬに溶解させる。３７℃まで加熱した後、二つの溶液をデュアルシリンジポンプにより混合し、次いで混合溶液を２０ｍＭトリス緩衝液（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４〜７．６）２０ｍＬで希釈する。混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、１０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液（１３８ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で透析する。透析により混合物からエタノールを除去した後、安定な粒子が得られる。ナノ粒子溶液を遠心分離により濃縮する。ナノ粒子溶液を１５ｍＬの遠心分離濾過装置（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）に移す。遠心分離速度は３０００ｒｐｍであり、遠心分離中の温度は４℃である。濃縮懸濁液を所与の時間後に収集し、０．２２μｍのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）により濾過することで滅菌する。
【０３５３】
ナノ粒子の直径及び多分散性を、Ｐｌｕｓ  ９０  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）で培地として水（Ｓｉｇｍａ）中で２５°にて測定する。
【０３５４】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドの封入効率をＵＶ−ＶＩＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ８４５３）で決定する。背景紫外線−ｖｉｓスペクトルは、ＰＢＳ緩衝生理食塩水（２５０μＬ）、メタノール（６２５μＬ）及びクロロホルム（２５０μＬ）からなる混合溶液である溶液を走査することにより得られる。封入された核酸の濃度を決定するために、メタノール（６２５μＬ）及びクロロホルム（２５０μＬ）をＰＢＳ緩衝生理食塩水ナノ粒子懸濁液（２５０μＬ）に加える。混合後、透明な溶液が得られ、この溶液を２６０ｎｍでの吸光度を測定する前に２分間超音波処理する。封入された核酸の濃度及び負荷効率を、方程式（１）及び（２）に従って計算する：
Ｃｅｎ（μｇ／ｍｌ）＝Ａ２６０×ＯＤ２６０単位（μｇ／ｍＬ）×希釈係数（μＬ／μＬ）（１）
希釈係数は、アッセイ体積（μＬ）を試料貯蔵体積（μＬ）で割ることにより得られる。
【０３５５】
封入効率（％）＝［Ｃｅｎ／Ｃｉｎｉｔｉａｌ］×１００（２）
Ｃｅｎは、精製後にナノ粒子懸濁液に封入された核酸（即ち、ＬＮＡオリゴヌクレオチド）の濃度であり、Ｃｉｎｉｔｉａｌは、ナノ粒子懸濁液の形成前の最初の核酸（ＬＮＡオリゴヌクレオチド）の濃度である。様々なナノ粒子組成物の例を、表５及び６に要約する。
【表５】
2012509272.tif 000045
【表６】
2012509272.tif 000046
【０３５６】
（実施例３２）
ナノ粒子の安定性
ナノ粒子の安定性を、構造的完全性をＰＢＳ緩衝液中で４℃にて経時的に保持するその能力として定義する。ナノ粒子のコロイド安定性を、平均径の変化を経時的にモニターすることにより評価する。表６の試料番号ＮＰ１で調製したナノ粒子を、１０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液（１３８  ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７  ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ  ７．４）中に分散させ、４℃にて貯蔵する。所与の時点で、ナノ粒子懸濁液約２０〜５０μＬを取り出し、最大２ｍＬの純水で希釈する。ナノ粒子の大きさを２５℃にてＤＬＳで測定する。
【０３５７】
（実施例３３）
インビトロでのナノ粒子の細胞取込み
本明細書に記載のナノ粒子に封入された核酸（ＬＮＡオリゴヌクレオチドオリゴ−２）の細胞取込み効率を、前立腺癌細胞（１５ＰＣ３細胞株）等のヒト癌細胞で評価する。試料ＮＰ２のナノ粒子を、実施例３１に記載の方法を用いて調製する。ＬＮＡオリゴヌクレオチド（オリゴ−２）を、蛍光顕微鏡試験のためにＦＡＭで標識する。
【０３５８】
ナノ粒子を１５ＰＣ３細胞株で評価する。細胞を完全培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳで補足）中で維持する。各ウェル中に２．５×１０５細胞を含有する１２ウェルプレートを、３７℃で終夜インキュベートする。細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭで１回洗浄し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ４００ｍＬを各ウェルに加える。次いで、細胞を、核酸を封入する試料番号ＮＰ２（２００ｎＭ）のナノ粒子溶液（ＦＡＭ−修飾オリゴ２）又は対照としてナノ粒子なしでの遊離核酸溶液（裸のＦＡＭ−修飾オリゴ２）で処理する。細胞を３７℃にて２４時間インキュベートする。細胞をＰＢＳで５回洗浄し、次いでウェル毎にＨｏｅｃｈｓｔ溶液（２ｍｇ／ｍＬ）３００ｍＬで３０分間染色し、次いでＰＢＳで５回洗浄する。細胞を予備冷却（−２０℃）した７０％ＥｔＯＨで−２０℃にて２０分間固定させる。細胞を蛍光顕微鏡下で検査し、本明細書に記載のナノ粒子中に封入された核酸の細胞取込みの効率を評価する。
【０３５９】
（実施例３４）
様々なヒト癌細胞におけるｍＲＮＡのダウンレギュレーションに対するナノ粒子のインビトロでの有効性
本明細書に記載のナノ粒子の有効性を、様々な癌細胞、例えばヒト表皮癌細胞（Ａ４３１）、ヒト胃癌細胞（Ｎ８７）、ヒト肺癌細胞（Ａ５４９、ＨＣＣ８２７又はＨ１５８１）、ヒト前立腺癌細胞（１５ＰＣ３、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、ＣＷＲ２２、ＤＵ１４５）、ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ７、ＳＫＢＲ３）、結腸癌細胞（ＳＷ４８０）、膵臓癌細胞（ＢｘＰＣ３）及び黒色腫（５１８Ａ２）で評価する。細胞を、以下のもの：アンチセンスＥｒｂＢ３オリゴヌクレオチドを封入するナノ粒子（試料番号ＮＰ１）又はプラセボ空ナノ粒子（試料番号ＮＰ３）の内の一つで処理する。ＥｒｂＢ３発現のダウンレギュレーションに対する各ナノ粒子のインビトロでの有効性を、実施例３に記載の手順で測定する。
【０３６０】
（実施例３５）
ヒト前立腺癌異種移植マウスモデルの腫瘍及び肝臓におけるｍＲＮＡのダウンレギュレーションに対するナノ粒子の有効性
本明細書に記載のナノ粒子のインビボでの有効性を、ヒト前立腺癌異種移植マウスにおいて評価する。１５ＰＣ３ヒト前立腺腫瘍を、５×１０６細胞／マウスを右脇腹に皮下注射することによりヌードマウスにおいて確立させる。腫瘍が平均体積１００ｍｍ３に達しとき、マウスを１グループ５匹に無作為に分類する。各グループのマウスを、アンチセンスＥｒｂＢ３オリゴヌクレオチド（試料番号ＮＰ１）又は対応する裸のオリゴヌクレオチド（オリゴ２）を封入するナノ粒子で処理する。ナノ粒子を、ｑ３ｄ×４（又はｑ３ｄ×１０）で１５ｍｇ／ｋｇ／用量、５ｍｇ／ｋｇ／用量、１ｍｇ／ｋｇ／用量又は０．５ｍｇ／ｋｇ／用量にて静脈内（ｉ．ｖ．）に投与する。投与量は、ナノ粒子中のオリゴヌクレオチドの量に基づくものである。裸のオリゴヌクレオチドを、１２日間ｑ３ｄ×４で３０ｍｇ／ｋｇ／用量にて腹腔内（ｉ．ｐ．）、又は２５ｍｇ／ｋｇ／用量若しくは４５ｍｇ／ｋｇ／用量にて静脈内に投与する。マウスを、最終投与の２４時間後に屠殺する。血漿試料をマウスから採取し、−２０℃で貯蔵する。腫瘍試料及び肝臓試料もマウスから採取する。腫瘍及び肝臓におけるｍＲＮＡのＫＤについて試料を分析する。動物の生存を観察する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2012509272.tif 000078
2012509272.tif 000079
2012509272.tif 000080