(57)【要約】  本発明は、対象患者において免疫調節作用を生成し得るラクトバチルス属細菌の抽出物を含む。 本発明の実施形態は、例えば、栄養補助食品や疾患を治療する医薬品として、または抗炎症性または炎症性のサイトカイン産生の不均衡に起因する疾患などの医学的治療におけるアジュバントとして使用し得る。 本発明の抽出物が有用であり得る状態には、感染症、アレルギー症、自己免疫疾患、及び炎症が含まれるが、対象患者に健康効果を提供するアジュバントとしても有用であり得る。 また、本発明は、特に、かかる抽出物の製造法と使用法も含むものであり、 ラクトバチルス属の特定の菌株に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数のラクトバチルス属細菌菌株に記載の抽出物において、可溶性抽出物であることを特徴とし、さらに、化学的に修飾された細菌分子を含むことを特徴とする抽出物。
【請求項２】
請求項１に記載の抽出物において、化学的に修飾された細菌分子が、前記１つまたは複数のラクトバチルス属細菌菌株をアルカリ性培地に暴露される結果として生じることを特徴とする抽出物。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の抽出物において、対象患者で免疫調節活性を有することを特徴とする抽出物。
【請求項４】
請求項３に記載の抽出物において、対象患者で免疫賦活性を有することを特徴とする抽出物。
【請求項５】
請求項３に記載の抽出物において、対象患者で抗炎症活性を有することを特徴とする抽出物。
【請求項６】
請求項１〜請求項５の任意の一項に記載の抽出物において、１つまたは複数のラクトバチルス属菌株が１つまたは複数のラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ジョンソニイ、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・カゼイdefensis、ラクトバチルス・カゼイ亜種カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ラクチス、及びラクトバチルス・デルブレッキイを含むことを特徴とする抽出物。
【請求項７】
請求項１〜請求項６の任意の一項に記載の抽出物において、１つまたは複数のラクトバチルス属細菌菌株が１つまたは複数のラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９、ラクトバチルス・ラムノーサス７１.３８、ラクトバチルス・プランタルム７１.３９、ラクトバチルス・ジョンソニイ１０３７８２、及びラクトバチルス・ヘルベティカス１０３１４６を含むことを特徴とする抽出物。
【請求項８】
請求項１〜７の任意の一項に記載の抽出物において、当該抽出物に含まれる１つまたは複数のアスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、ヒスチジン、アラニン、アルギニン、チロシン、メチオニン、フェニルアラニン、及びリシンが少なくとも１０%ラセミ化されることを特徴とする抽出物。
【請求項９】
請求項１〜８の任意の一項に記載の抽出物において、ヒト末梢血単核細胞内で計算可能なＩＬ１０/ＩＬ１２比率を達成でき、当該比率は、前記抽出物が得られる生のラクトバチルス菌株によって実現されるＩＬ１０/ＩＬ１２比率と同等かまたはそれを超えることを特徴とする抽出物。
【請求項１０】
請求項１に記載のの抽出物において、喘息マウス対象で好酸球細胞数、好中球細胞数、リンパ球細胞数、またはその任意の組み合わせを、無治療の喘息対照群に対して、少なくとも１.５倍減少させることができることを特徴とする抽出物。
【請求項１１】
請求項１に記載の抽出物調製工程において、該工程が、
（ａ）１つまたは複数のラクトバチルス属細菌菌株を培地中で培養するステップ；
（ｂ）各ラクトバチルス属細菌菌株をアルカリ性培地に暴露するステップ；及び
（ｃ）不溶性物質や粒子状物質を除去するため、ステップ（ｂ）の産物を処理するステップを含むことを特徴とする工程。
【請求項１２】
請求項１１に記載の工程において、ステップ（ｃ）が接線流ろ過によって行われることを特徴とする工程。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の工程において、各ラクトバチルス属細菌菌株を９.０を超えるｐＨに暴露するだけで、細菌分子の化学修飾を十分に行うことができることを特徴とする工程。
【請求項１４】
請求項１１、１２、または１３に記載の工程であって、各菌株を４.５未満のｐＨで処理するステップを工程ステップ（ｂ）とステップ（Ｃ）とのに間にさらに含むことを特徴とする工程。
【請求項１５】
請求項１１〜１４の任意の一項に記載の工程において、化学修飾が、該抽出物中の１つまたは複数のアスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、ヒスチジン、アラニン、アルギニン、チロシン、メチオニン、フェニルアラニン、及びリシンの少なくとも１０%のラセミ化を含むことを特徴とする工程。
【請求項１６】
請求項１〜１０の任意の一項に記載の抽出物、または請求項１１〜１５の任意の１項に記載の方法に従って調製される抽出物を含む栄養補助食品組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１０の任意の一項に記載の抽出物、または請求項１１〜１５の任意の１項に記載の方法に従って調製される抽出物を含む医薬組成物。
【請求項１８】
呼吸器疾患、アレルギー状態、尿路疾患、及び消化障害から選択される少なくとも１つの状態に関連する少なくとも１つの症状を軽減する方法において、請求項１〜１５の任意の１項に記載の抽出物、または請求項１６または請求項１７の組成物、の治療有効量を対象患者に投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法において、呼吸器疾患が、上下気道感染症、鼻咽頭炎、副鼻腔炎、咽頭炎、扁桃腺炎、喉頭炎、気管炎、咽頭咽頭炎、インフルエンザ、肺炎、気管支肺炎、及びを急性増悪伴う閉塞性肺疾患から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法において、前記アレルギー状態が、アレルギー鼻炎、アレルギー喘息、及びアトピー性皮膚炎から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１８に記載の方法において、前記尿路疾患が、尿道炎、尿細管間質性腎炎、閉塞性腎盂腎炎、膀胱炎を含む慢性膀胱炎、男性骨盤痛症候群を含む前立腺炎及び慢性前立腺炎、前立腺膀胱炎、及び雌骨盤内炎症性疾患から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１８に記載の方法において、前記消化障害が、クローン病及び過敏性腸症候群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１８に記載の方法において、対象患者がヒトまたは家畜であることを特徴とする方法。 
【請求項２４】
請求項１〜請求項１５の任意の１項に記載の抽出物、または請求項１６または請求項１７に係る組成物の使用法において、呼吸器疾患、アレルギー状態、尿路疾患、及び消化障害から選択される少なくとも１つの状態に関連する少なくとも１つの症状を軽減するための薬物として使用されることを特徴とする使用法。
【請求項２５】
請求項１〜１５の任意の１項に記載の抽出物、または請求項１６または請求項１７に係る組成物の免疫調節薬剤としての使用法。
【請求項２６】
単離された微生物菌株、ラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９。
【請求項２７】
請求項２５の菌株から得られる抽出物。
【請求項２８】
請求項２６に記載の抽出物において、可溶性抽出物であることを特徴とする抽出物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、対象患者において免疫調節作用を生成し得るラクトバチルス属細菌の抽出物を含む。例えば、本発明の実施形態は、感染症、アレルギー症、自己免疫疾患、及び炎症などの抗炎症性または炎症性のサイトカイン産生の不均衡に起因する疾患などの疾患を治療する栄養補助食品や医薬品として使用することができ、対象患者に健康効果を提供するアジュバントとしても使用することができる。また、本発明は、特に、かかる抽出物の製造法と使用法も含むものであり、ラクトバチルス属の特定の菌株に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫調節とは、正常または異常な免疫応答を変更する広範囲の免疫介入治療を意味する包括的な用語である。微生物は、真核生物の免疫応答を調節できる広範囲の分子を生成・分泌する(LavelleらのCurr Top Med Chem. 2004, 4(5), 499-508).これらの微生物は、病原体のコロニー形成と残留性を促進するために、保護メカニズムを覆す因子を含む。炎症反応を阻害できるウイルス分子、細菌分子及び寄生虫由来の分子が確認されている。免疫応答を抑制し得る微生物因子に加えて、強力な免疫活性化因子もそれ自体、微生物起源であり得る。これらには、細菌性エンテロトキシン、寄生虫由来の排泄・分泌物、及びウイルス核酸が含まれる。
【０００３】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）と呼ばれ、その宿主生物により発現される少なくとも１１個の受容体のファミリーが、免疫学的検出と微生物に対する生得的反応とにおいて重要な役割を果たすと考えられている。図１はＴＬＲリガンドのリストを提供する(Gay and Gangloff, Ann. Rev. Biochem., 2007, 76：141-65)。ＴＬＲは、ウイルス、細菌及び真菌が生成する病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）としても知られている広範囲の分子を認識する(Tse and Horner, Ann Rheum Dis. 2007 Nov； 66 Suppl 3：iii77-80)。ＴＬＲ媒介免疫調節は、感染性疾患、悪性疾患、自己免疫性疾患の及びアレルギー疾患を含む幅広い病理学の新規治療の展開に適用されている。
【０００４】
ＴＬＲアゴニストとアンタゴニストは、疾患の予防と治療の潜在的な治療法として研究されている。比較的に小規模の臨床試験では、ＴＬＲアゴニストが、感染症を予防し、アレルギー過敏症を消滅させ、悪性細胞を除去することを目的に、ワクチンのアジュバントとして使用されている。また、ＴＬＲアゴニストも、感染症、アレルギー疾患及び悪性疾患の患者の治療のため、単独療法及び補助療法として検討されている。また、ＴＬＲアンタゴニストの使用も、自己免疫性の疾患や敗血症の潜在的な治療法として前臨床試験及び臨床試験で研究されている。
プロバイオティクスは、適量で投与されると、対象患者に健康利点を提供し得る生きた微生物である(MottetらのDigestive and Liver Disease, 2005, 37：3-6； EzendamらのNutr（２００６年１月改定）, 64(1)：1-14； Gill and Prasad, Adv Exp Med Biol, 2008, 606：423-54)。プロバイオティック微生物による免疫応答の刺激に関与する生物学的メカニズムと、それら微生物の特定の細胞成分とが、研究対象となっている。例えば、グラム陽性菌は、リポタイコ酸（ＬＴＡ）などの高分子を含む特徴的な細胞壁を有する。ＬＴＡは、免疫賦活性に関連し得る(例えば BhakdiらのInfect. Immun., 1991, 59：4614-4620；SetoyamaらのJ Gen Microbiol, 1985, 131(9)：2501-2503；ClevelandらのInfect Immun, 1996, 64(6)：1906-1912)。また、(DeiningerらのClin Vaccine Immunol, 2007, 14(2)：1629-1633)も参照されたい。加えて、プロバイオティック菌は、免疫調節特性を有する様々なＴＬＲリガンドを含み得る。様々なビフィズス菌株から得られる細胞壁断片は、マウス脾細胞においてｉｎ-ｖｉｔｒｏでインターフェロンガンマ（ＩＦＮ-γ）の産生を促すことがわかった(T. Ambrouche, "Contribution a l'etude du pouvoir immunomodulateur des bifidobacteries： Analyse in vitro et etude ex vivo des mecanismes moleculaires impliques," Ph.D. Thesis, Universite Laval, Quebec, 2005)。また、特定の乳酸菌の粒子状細胞壁断片製のカプセル（Del-Immune VR、米国コロラド州Pure Research Products社）も、免疫系を刺激することを意図している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】LavelleらのCurr Top Med Chem. 2004, 4(5), 499-508
【非特許文献２】Gay and Gangloff, Ann. Rev. Biochem., 2007, 76：141-65
【非特許文献３】Tse and Horner, Ann Rheum Dis. 2007 Nov； 66 Suppl 3：iii77-80
【非特許文献４】MottetらのDigestive and Liver Disease, 2005, 37：3-6
【非特許文献５】Gill and Prasad, Adv Exp Med Biol, 2008, 606：423-54
【非特許文献６】BhakdiらのInfect. Immun., 1991, 59：4614-4620
【非特許文献７】SetoyamaらのJ Gen Microbiol, 1985, 131(9)：2501-2503
【非特許文献８】ClevelandらのInfect Immun, 1996, 64(6)：1906-1912
【非特許文献９】DeiningerらのClin Vaccine Immunol, 2007, 14(2)：1629-1633
【非特許文献１０】T. Ambrouche, "Contribution a l'etude du pouvoir immunomodulateur des bifidobacteries： Analyse in vitro et etude ex vivo des mecanismes moleculaires impliques," Ph.D. Thesis, Universite Laval, Quebec, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
プロバイオティック菌の活性または不活性形態での摂取、またはかかる細菌の粒子状細胞壁断片の摂取は、免疫調節作用を対象患者に提供する最も効果的な方法でない可能性がある。現に、生細胞抽出物は、対象患者による効率的な吸収を妨げるほどに大量のタンパク質及びリポペプチドを含み得るため、被験体内におけるプロバイオティクス細菌からの有用な分子の局所濃度を限定する。また、被験体内の状態も、活性細菌成分を破壊したり、あるいはその反対に、それら成分の化学構造を修飾して該活性細菌成分を不活性化し得る。生のプロバイオティック微生物（ラクトバチルス）の経口投与に伴うリスクには、菌血症及び敗血症が含まれる(Lactobacillus Sepsis Associated With Probiotic Therapy, Pediatrics（２００５年１月）115 (1)：178-181)。それゆえ、プロバイオティック菌の有益な効果を、それを必要とする対象患者に提供する他の手段の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明はラクトバチルス抽出物に関するものであり、本発明の一部の実施形態は、強力な免疫調節活性を示し得る。例えば、本発明の実施形態は、栄養補助食品または医薬品として有用であり得る細菌菌株からの抽出物に関し、場合によっては、感染症、アレルギー症、呼吸器疾患、及び炎症性病理を治療をしたり、または治療プロトコルと関連して補助としての役割を果たし得る抽出物に関するものである。また、本発明は、前記抽出物を含む組成物と、前記抽出物の製造工程、例えば、プリオン病のリスクをもたらさない培地を用いる製造工程とに関する。本発明に係る工程は、例えば、アルカリ条件下、または酸性条件に続くアルカリ条件下の細胞溶解を含む。一部の実施形態では、本発明の抽出物は、可溶性抽出物、すなわち、有意な量の固形物または粒子状物質を含有しない抽出物である。一部の実施形態では、前記抽出物は、化学的に修飾されたＴＬＲリガンドを含有する。一部の実施形態では、アルカリ処理が、ＴＬＲリガンド、細胞壁成分、タンパク質、リポタイコ酸、リポペプチド及びリン脂質を含む細胞物質の化学修飾の原因となることがある。
【０００８】
本発明の一部の実施形態は、次の１つまたは複数の種から得られる抽出物を含み得る：
ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ジョンソニイ、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・カゼイ（defensis）、ラクトバチルス・カゼイ亜種カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ラクチス、及びラクトバチルス・デルブレッキイ。
一部の実施形態では、前記抽出物は、上記細菌種の少なくとも１個の菌株を含む一方、他の実施形態では、上記リストの１つまたは複数の特定菌株が除去されたり、１つまたは複数の異なる菌株で置換されることがあり得る。本発明の一部の実施形態は、１つまたは複数の次の細菌菌株から得られる抽出物を含む：ラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９、ラクトバチルス・ラムノーサス７１.３８、ラクトバチルス・プランタルム７１.３９、ラクトバチルス・ジョンソニイ１０３７８２、及びラクトバチルス・ヘルベティカス１０３１４６。上記菌株はブダペスト条約に従って貯蔵する。ラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９、ラクトバチルス・ラムノーサス７１.３８、ラクトバチルス・プランタルム７１.３９、ラクトバチルス・ジョンソニイ１０３７８２、及びラクトバチルス・ヘルベティカス１０３１４６は、Collection Nationale de Culture des Microorganismes at the Institut Pasteur（25 rue du Dr. Roux, 75724 Paris, France）にそれぞれ貯蔵する。ラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９は２００８年２月２７日に預けた。その他の菌株は、前記保管所のコレクションに含まれており、前記保管所に連絡することにより取得し得る。
【０００９】
また、本発明は、特に、前記菌株ラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９、その菌株から得られる抽出物、かかる抽出物の製造法、及びその使用法に関する。その菌株は、ラクトバチルス・プランタルムとラクトバチルス・ファーメンタムからの菌株の染色体交換を行い、新規ラクトバチルス属菌株を生成することにより得た。ラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９から得られた抽出物は、感染症及び免疫不全疾患に相関する一部の異なるｉｎ-ｖｉｖｏモデルとｉｎ-ｖｉｔｒｏモデルで活性であることが判明した。
【００１０】
一部の実施形態では、抽出物は、１個の特定細菌菌株のみから取得される。あるいは、１個以上の菌株を使用してもよい。他の実施形態では、非乳酸菌菌種などの異なる型の微生物からの１つまたは複数の抽出物を添加してもよい。
【００１１】
前記抽出物は、特定条件の細菌性細胞を培地中で適当な濃度に増殖させた後に溶解することにより取得し得る。一部の実施形態では、前記細菌は、プリオン関連疾患のリスクや、動物由来の培地から得た産物を摂取することにより伝達され得る他の疾患のリスクをもたらさない培地中で増殖される。例えば、一部の実施形態では、大豆由来の培地などの野菜由来の培地を用いて、前記細胞を増殖させる。
【００１２】
また、前記可溶化液（ライセート）（すなわち前記細胞溶解の産物）をろ過して、核酸や、不溶性物質や粒子状物質などの大きな細胞残屑を除去することもできる。一部の実施形態では、前記抽出物中に存在する核酸量は１００・ｇ/ｍＬ未満である。それゆえ、一部の実施形態では、結果として生じる抽出物は可溶性分子成分を含み、有意な量の不溶性物質や粒子状物質を含有しない。
【００１３】
膜分子及び細胞壁分子は、リポタンパク質、リポペプチド、ペプチドグリカン、リポオリゴ糖、リポタイコ酸、及びテイコ酸を含む抽出物中で溶解または懸濁してもよい。その溶菌処理時、膜分子や細胞壁分子などの細胞内分子は、アルカリ処理により化学的に修飾され得る（例えば小さな構造に切断される）。かかる化学修飾にかかわらず、本発明の実施形態は、全細胞に匹敵する生物学的活性を保持するか、または全細胞よりも強化された生物学的活性を発揮し得る。
【００１４】
例えば、アルカリ処理を用いて細胞を溶解するか、または、以前に別の方法で溶解された細胞にアルカリ処理を適用することもできる。本発明の一部の実施形態に係るアルカリ処理時、天然タンパク質やリポペプチドに見出されるＬ-アミノ酸は、少なくとも部分的にＤ-アミノ酸にラセミ化される。Ｄ-アミノ酸は、哺乳動物の腸管内で効果的に消化されないため、前記抽出物の有効時間を増加させる上で有益である。また、Ｄ-アミノ酸は、小さなペプチド及びタンパク質を消化時の劣化から保護し得る。Ｄ-アミノ酸の例には、タンパク質に結合したＤ-アミノ酸、より少ない程度ではリジノアラニンが挙げられる(de VreseらのJ Nutrition, 2000, 2026-2031)。かくして、一部の実施形態では、Ｄ-アミノ酸を含有するように溶解時に化学的に修飾された抽出物中の抗原分子は、患者の体内により長い時間残存して、より強力な免疫賦活作用を発揮し得る。
【００１５】
一部の実施形態では、フィルター処理が、フィルターの孔径、場合によっては、前記フィルター表面（すなわち、その極性）の化学特性が、除去され保持される材種を変更し得るため、結果として生じる抽出物の特性に影響を与えることもできる。例えば、本発明の一部の実施形態は、所定の分子を保持するが、核酸や不溶性物質または粒子状物質などの他の分子成分を除去することを目的に設計されたフィルター処理を使用する。
【００１６】
前記ろ過された抽出物は、さらに有機抽出、有機水性抽出、クロマトグラフィー、超遠心分離、限外ろ過、またはその組み合わせにより精製することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１ａ】宿主生物が発現した１１個のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリーのリガンドを示す。
【図１ｂ】図１ａの続き
【図２】細菌の溶解後の細菌抽出物調製用の接線流ろ過（ＴＦＦ）システムのダイアグラムを示す。このダイアグラムは、２つの異なるフィルター構成：すべてのフィルターが同時に作動する平行モードと、フィルターが直列モードで構成される蛇行モードと、を示す。
【図３】接線流ろ過（ＴＦＦ）の圧力制御と物質移動制御の領域を示す動作パラメータと流速間の一般相関。
【図４ａ】異なる希釈率の可溶化液（ライセート）ＡＦｅｒ３００、ＣＦｅｒ３００、及びＤＦｅｒ３００、及びＡＲａｈｒ３００、ＣＲａｈｒ３００、及びＤＲａｈｒ３００の存在下で４８時間培養された脾細胞の刺激を示す。細胞培地中で１：１に希釈された３０μｌ/ウェルのAlamar blueR溶液の添加後、細胞をさらに（ａ）８.５時間（第１実験）；（ｂ）２４時間（第２実験）インキュベートした。図に示したのは、５９０ｎｍ±重複培養標準偏差における平均発光値である。
【図４ｂ】図４ａの続き
【図５】（ａ）第１アッセイと（ｂ）第２アッセイでラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９とラクトバチルス・ラムノーサス７１.３８の抽出物により治療したマウスにおける一酸化窒素（ＮＯ）の産生の誘導を示す。結果は、平均値±標準偏差として、μＭ単位の一酸化窒素（ＮＯ）量で示した。
【図６】前回の抗原チャレンジ後１日の吸入メタコリン濃度を増加させた状態で、本発明の抽出物の気道過敏性（ＡＨＲ）に対する効果を全身プレチスモグラフィー（Ｅｍｋａ）で測定した結果。結果（Ｐｅｎｈの平均値+/-平均値の標準誤差で表示）は、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で治療した陰性対照動物（ｎ=４）、未治療のＬＡＣＫチャレンジ動物（陽性対照群、ｎ=８）、ＯＭ-１００９Ａ-治療ＬＡＣＫチャレンジマウス（ｎ=８）、及びＯＭ-１００９Ｂ-治療ＬＡＣＫチャレンジマウス（ｎ=７）に対して示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
【００１９】
【００２０】
【００２１】
【００２２】
定義
【００２３】
抽出物：抽出物は、本明細書中で定義されている通り、１つまたは複数の細菌菌株の溶解後に得られる物質を意味する。場合によっては、前記抽出物は、１個の菌株のみから取得される一方、他の場合では、前記抽出物は、一部の異なる菌株の混合物から取得される。
【００２４】
場合によっては、前記抽出物は可溶性抽出物であり、有意な量の粒子状断片や固形細胞壁断片などの粒子状物質や不溶性物質を含有しないことを意味する。その代わり、細胞壁、細胞小器官、及び細胞膜からの成分は、溶解または懸濁される範囲で、前記抽出物中に含まれ得る。例えば、前記抽出物は、ろ過、遠心分離、または別の分離技術などにより、粒子状物質や不溶性物質を除去するように処理し得る。
【００２５】
化学的溶解：これは、塩基条件、酸性条件、ないしは浸透圧条件下における細菌性細胞の溶解法である。
【００２６】
可溶化液：本明細書中で使用されている通り、この用語は細菌細胞溶解手順で取得する抽出物を意味する。
【００２７】
ろ過：フィルター処理とは、本明細書に記載のように、精密ろ過膜（すなわち、微量ろ過）ないしは限外ろ過膜（すなわち、限外ろ過）などの１つまたは複数のフィルターによる抽出物または抽出物の混合物の継代を意味する。かかるろ過は、必ずしも設計通りに前記成分を１００%除去するとは限らないが、一部の実施形態では、それらの成分を実質上含まない抽出物を提供し得る。場合によっては、ろ過は、複数の通過またはサイクルで繰り返される。
【００２８】
初期ｐＨ：この用語は、細菌の溶解やろ過などの手順開始時に測定されるｐＨ値を意味する。
【００２９】
糖類：糖類には、本明細書中で定義されている通り、単糖類、二糖類だけではなく、線形多糖類や分枝多糖類などの比較的大きな糖類も含まれる。また、糖類は、リポ多糖類（ＬＰＳ）及び化学的に修飾されたそのバリアントなどの置換または化学的に修飾された糖類も含む。
【００３０】
リポタンパク質：この用語は、タンパク質鎖またはペプチド鎖と脂質の両方を含む高分子、例えば、脂質に共有結合したタンパク質またはペプチドを意味する。また、リポタンパク質は、本明細書中で使用されている通り、リポペプチドも含む。
【００３１】
ペプチドグリカン：この用語は糖類とアミノ酸を含むポリマーを意味する。
【００３２】
リポタイコ酸（ＬＴＡ）：この用語は、グラム陽性細菌菌株内に存在する表面関連付着両親媒性分子を意味する。
【００３３】
テイコ酸：この用語は、ホスホジエステル結合を介して連接されたグリセロールリン酸またはリビトールリン酸のポリマーを意味する。
【００３４】
Ｄ-アミノ酸：この用語は、左旋性異性体内に存在する生合成的に生成されたＬ-アミノ酸とは対照的に、右旋性異性体内に存在するアミノ酸を意味する。
【００３５】
ラセミ化：この用語は、少なくとも部分的なＬ-アミノ酸のＤ-アミノ酸への化学修飾を表す。
【００３６】
プリオン疾患のリスクを回避する培地は、ウシやヒツジなどの動物、またはプリオン疾患を伝達し得る他の任意の動物から採取した血清や肉抽出物などの物質を含まない抽出物の任意の調製段階で使用される培地を意味する。かかる培地例には、野菜由来の培地や合成培地が含まれ、さらに、ウマ血清を用いる培地またはプリオン病を伝達しない動物種から採取した物質からなる培地も含まれる。プリオン疾患例には、例えば、狂牛病、スクレイピー、及びクロイツフェルトヤコブ病が含まれる。
【００３７】
非動物由来培地は、動物に由来する成分を含まない培地である。その例には、大豆培地などの野菜由来（すなわち植物性）の培地、及び合成培地が含まれる。
【００３８】
栄養補助食品は、本明細書中で使用されている通り、対象患者への投与直後に対象患者に健康効果を提供し得る任意の組成物において、その組成物が、例えば、医者の処方なしに対象患者に利用可能であることを特徴とする任意の組成物を意味する。
【００３９】
治療（Treatment）は、本明細書中で治療に関連して使用されている通り、現行の疾患や障害の治療だけではなく、新しい疾患や障害の発生の防止または保護も意味する。
【００４０】
アジュバントとは、本明細書中で本発明の実施形態を参照して使用されている通り、医療計画と併せて対象患者に提供される本発明の実施形態を意味する。
【００４１】
「免疫調節」、「免疫調節性」及び同種の用語は、本明細書中で使用されている通り、抗炎症作用や免疫賦活性作用を生成するように健康効果を提供するような方式で対象患者の免疫応答を修飾する能力を意味する。
【００４２】
抗炎症性及び同種の用語は、本明細書中で使用されている通り、炎症を軽減するように機能する免疫調節作用を意味する。
【００４３】
免疫賦活性及び同種の用語は、本明細書中で使用されている通り、免疫系の刺激作用を意味する。
【００４４】
防護免疫とは、本明細書中で使用されている通り、後続の感染体やアレルゲン暴露に対して対象患者を保護するように、一実施形態が対象患者に提供されることを意味する。結果として、暴露中、対象患者体内の感染体やアレルゲンの濃度は十分に低いため、対象患者の健康を大幅に損なうことがない。かかる暴露からの保護の有効時間は、時間数、日数、または週数などに限定し得る。
【００４５】
対象患者とは、本明細書中で使用されている通り、ヒトや家畜などの哺乳動物の対象を含む任意の動物対象を意味する。家畜には、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、または他の家畜などの哺乳類を含むこともでき、さらに鳥類などの非哺乳類、例えばニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ及び他の家畜の鳥を含むこともできる。
【００４６】
本明細書中で同定され、かつ、本発明で使用される特定の細菌菌株が、本明細書中に記載の元の保管所から得た菌株またはその遺伝子クローン（後で使用するために異なる保管コード名で再貯蔵されているが、当初に保管したバージョンと遺伝的に同じ菌株であると認められる菌株を含む）を含み得ることは当然のことながら共通認識とする。
【００４７】
本明細書中で使用したすべての数字は、測定値、４捨５入、及び有効数字に固有の誤差を考慮して近似値である。
【００４８】
抽出物の調製
本発明は、１つまたは複数のラクトバチルス属細菌菌株の抽出物を含み、該抽出物が可溶性抽出物であることを特徴とし、かつ、該抽出物が化学的に修飾された細菌分子を含むことを特徴とする。
【００４９】
本発明の抽出物は、例えば、細胞を培養してから、結果として生じるバイオマスの収集、溶解及び精製を行うことにより調製し得る。各菌株ごとに十分な量の物質を得るには、その発酵培養を有効種晶ロットから開始し、続いてそれを大型の発酵容器に播種することもできる。
【００５０】
使用培地は各菌種ごとに同じであってもよい。一部の実施形態では、プリオン疾患のリスクを回避する培地を、使用するすべての菌株の増殖に用いてもよい。
【００５１】
発酵後、１個の菌株または一連の菌株から結果として生じるバイオマスは、熱処理、濃縮、及び凍結により不活化することもできる。それゆえ、抽出物を形成するために使用する出発物質は、一部の実施形態では、不溶解の全細胞であり得る。
【００５２】
他の実施形態では、抽出物を調製するために使用する出発物質は、少なくとも部分的に機械的、酵素的、または化学的に溶解された細胞から得たバイオマスであり得る。さらに他の実施形態では、出発物質は、画分を含有する細胞壁などの、以前に溶解された細胞の画分であり得る。
【００５３】
一部の実施形態では、出発物質は、強塩基など、水酸化物など、または他の強力な無機塩基または有機塩基などからのアルカリ性培地で処理される。この溶解処理ステップまたは塩基処理ステップでは、出発物質内の不溶解細胞は、一部の実施形態で、細胞成分が化学的に修飾され得る間に溶解される。それゆえ、一部の実施形態では、化学的に修飾された細菌分子は、１つまたは複数のラクトバチルス属細菌菌株の強塩基処理などの塩基処理により得られ、該菌株からは前記抽出物が得られる（すなわち、上記で説明したように、不溶解細胞または細菌細胞の成分や画分の塩基処理）。
【００５４】
一部の実施形態では、バイオマス乾燥重量濃度２〜９０ｇ/Ｌ（例えば、約２〜約８０ｇ/Ｌ、または約３〜約４０ｇ/Ｌなど、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０ｇ/Ｌなど、または約５〜５０ｇ/Ｌ、または上記の濃度で限定される他の濃度範囲）を塩基処理の対象としてもよい。一部の実施形態では、約４０〜約８０ｇ/Ｌ（例えば、４０、５０、６０、７０、または８０ｇ/Ｌなど、または上記の濃度で限定される濃度範囲）が塩基処理の対象となる。
【００５５】
前記バイオマス乾燥重量は、ここでは、物質の乾燥重量（サンプル１リットルあたりのグラム数）で規定される。かかる乾燥重量は、サンプルを一定の質量に達するまで約１０５℃にて小さな陶器皿で乾燥することにより測定し得る。
【００５６】
前記温度は３０〜６０℃（例えば、３０〜５５℃、３０〜５０℃、３０〜４５℃、３０〜４０℃など、または３０〜３５℃）であってもよい。一部の実施形態では、前記塩基処理温度は３５〜６０℃（例えば、３５〜５５℃、３５〜５０℃、３５〜４５℃など、または３５〜４０℃）であってもよい。一部の実施形態では、塩基処理温度は、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃であってもよく、または４０℃でさえもよく、さらに、上記の温度で規定される温度範囲であってもよい。
【００５７】
塩基処理時間は２時間〜数日間（例えば、１、２、３、４、５日間または１０日間など、または３〜１２０時間、または３〜４８時間、３、５、８、１５、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３６、４０、４４、または４８時間、または１５〜１２０時間、６０〜１２０時間、６０、７２、８４、９６、１０８時間、または１２０時間、または上記の範囲で規定される時間）であってもよい。これらの時間範囲には、日、時間、または分の分数が含まれることは当然のことながら共通認識とする。
【００５８】
一部の実施形態では、強塩基濃度０.００１Ｎ〜１.０Ｎ（例えば、０.００１Ｎ〜０.６Ｎ、または０.１０Ｎ〜０.８Ｎ、または０.６Ｎ〜１.０Ｎ、または範囲の開始値または終了値が０.００１、０.００２、０.００３、または０.１Ｎの範囲、または０.１Ｎ〜０.６Ｎ、または範囲の開始値または終了値が０.６、０.７、０.８、０.９、１.０、または１.０Ｎの範囲、または上記の濃度で限定される他の範囲など）が使用される。一部の実施形態では、９.０を超える初期ｐＨ、または９.５を超える初期ｐＨ、１０.０を超えるが１３.５未満の初期ｐＨ（例えば、１１.５を超える初期ｐＨ、１２.０を超える初期ｐＨ、１２.５を超える初期ｐＨ、１３.０を超える初期ｐＨ、またはｐＨ９.０〜ｐＨ１３.５の初期ｐＨ）を達成するような塩基濃度が使用される。さらに他の実施形態では、例えば、１０.０を超えるが１３.０未満の初期ｐＨ、またはｐＨ９.０〜ｐＨ１３.０の初期ｐＨを達成するような塩基濃度を使用することもできる。
【００５９】
一部の実施形態では、塩基処理中のｐＨを可溶性成分の抽出時点で低下させることもできる。例えば、その初期ｐＨは塩基ｐＨ（例えば、ｐＨ９.０〜ｐＨ１３.０、またはｐＨ９.５〜ｐＨ１２.５）であってもよい。前記塩基処理は、一定の期間（例えば、３〜１２０時間、３〜４８時間、または上記の温度にて上記の期間）に限って行うことが許容される。次いで、一部の実施形態では、所望により、ｐＨを酸性化することもできる。例えば、２.０〜４.５ｐＨ、または２.５〜４.５ｐＨ、または２.５〜４.０ｐＨ（２.５、３.０、３.５、４.０ｐＨなど）、または上記のｐＨのいずれかで規定される範囲を達成するように塩酸を添加してもよい。第２処理は、低ｐＨで、温度範囲３０〜６０℃、３５〜５５℃、または３５〜４５℃（例えば、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃）、または４５℃にても実行することができる。酸性処理時間は、１時間〜数時間（最大７２時間まで）の範囲であってもよく、例えば、１時間〜２４時間、または１時間〜６時間、または３時間〜４８時間、または３時間〜２４時間、または４〜７２時間、または２４時間〜７２時間、または上記の時間で限定される任意の時間範囲であってもよい。
【００６０】
本発明の一部の実施形態では、アルカリ処理が、細菌バイオマス（例えば、ラクトバチルス・ファーメンタムからの物質からなり、バイオマス乾燥重量１０ｇ/Ｌ〜４０ｇ/Ｌを有する）に対して行われる。他の実施形態では、前記アルカリ処理は、ラクトバチルス属菌株の混合物を含み、バイオマス乾燥重量１０ｇ/Ｌ〜４０ｇ/Ｌを有する細菌バイオマスに対して行われる。かかる実施形態では、前記アルカリ処理は、水酸化物イオン濃度０.０２５Ｎ〜０.２５Ｎで、または温度３５〜４５℃にてｐＨ９.５〜１２.５で、３時間〜４８時間行ってもよい。一部の実施形態では、前記アルカリ処理は、１つまたは複数のラクトバチルス属菌株（水酸化物イオン濃度０.０２５Ｎ〜０.２０Ｎ、０.０２５〜０.１５Ｎ、０.０２５〜０.１０Ｎ、０.０５Ｎ〜０.２５Ｎ、０.０５Ｎ〜０.２０Ｎ、０.０５〜０.１５Ｎ、０.０５Ｎ〜０.１０Ｎ、０.１０Ｎ〜０.２５Ｎ、０.１０Ｎ〜０.２０Ｎ、０.１０Ｎ〜０.１５Ｎ、０.１５Ｎ〜０.２５Ｎ、０.１５Ｎ〜０.２０Ｎ、または０.２０Ｎ〜０.２５Ｎ）からの物質を含む細菌バイオマスに対して行われる。かかる実施形態のｐＨは、例えば、９.５〜１２.０、９.５〜１１.５、９.５〜１１.０、９.５〜１０.５、９.５〜１０.０、１０.０〜１２.５、１０.０〜１２.０、１０.０〜１１.５、１０.０〜１１.０、１０.０〜１０.５、１０.５〜１２.５、１０.５〜１２.０、１０.５〜１１.５、１０.５〜１１.０、１１.０〜１２.５、１１.０〜１２.０、１１.０〜１１.５、１１.５〜１２.５、１１.５〜１２.０、またはｐＨ１２.０〜１２.５であってもよい。かかる実施形態のアルカリ処理時間は、３時間〜３６時間、３時間〜２４時間、３時間〜１８時間、３時間〜１２時間、３時間〜６時間、６時間〜４８時間、６時間〜３６時間、６時間〜２４時間、６時間〜１８時間、６時間〜１２時間、６時間〜８時間、８時間〜４８時間、８時間〜３６時間、８時間〜２４時間、８時間〜１８時間、８時間〜１２時間、１２時間〜４８時間、１２時間〜３６時間、１２時間〜１８時間、１８時間〜４８時間、１８時間〜３６時間、１８時間〜２４時間、２４時間〜４８時間、２４時間〜３６時間、または３６時間〜４８時間であってもよい。前記アルカリ処理は、上記の時間範囲に限定される任意の期間（例えば、３、６、８、１２、１８、２４、３６、または４８時間）行い得る。かかる条件により、中等度のアルカリ処理が得られる。
【００６１】
他の実施形態では、１つまたは複数のラクトバチルス属菌株からのバイオマス乾燥重量１０ｇ/Ｌ及び４０ｇ/Ｌは、３５〜４５℃の温度にて１５時間〜１２０時間、水酸化物イオン濃度０.１５Ｎ〜０.５０ＮまたはｐＨ１１.５〜１３.５に晒され得る。例えば、一部の実施形態では、前記水酸化物濃度は、０.１５Ｎ〜０.４５Ｎ、０.１５Ｎ〜０.４０Ｎ、０.１５Ｎ〜０.３５Ｎ、０.１５Ｎ〜０.３０Ｎ、０.１５Ｎ〜０.２５Ｎ、０.１５Ｎ〜０.２０Ｎ、０.２０Ｎ〜０.５０Ｎ、０.２０Ｎ〜０.４０Ｎ、０.２０Ｎ〜０.３０Ｎ、０.２５Ｎ〜０.５０Ｎ、０.３０Ｎ〜０.５０Ｎ、０.３０Ｎ〜０.４０Ｎ、または０.４０Ｎ〜０.５０であってもよい。かかる実施形態は、例えば、ｐＨ１１.５〜１３.０、１１.５〜１２.５、１１.５〜１２.０、１２.０〜１３.５、１２.０〜１３.０、１２.０〜１２.５、１２.５〜１３.５、１２.５〜１３.０、１３.０〜１３.５を有し得る。アルカリ処理期間は、例えば、１５時間〜１００時間、１５時間〜９０時間、１５時間〜７５時間、１５時間〜６０時間、１５時間〜４８時間、１５時間〜３６時間、２４時間〜１２０時間、２４時間〜１００時間、２４時間〜９０時間、２４時間〜７５時間、２４時間〜６０時間、２４時間〜４８時間、３６時間〜１２０時間、３６時間〜１００時間、３６時間〜９０時間、３６時間〜７５時間、３６時間〜６０時間、３６時間〜４８時間、４８時間〜１２０時間、４８時間〜１００時間、４８時間〜９０時間、４８時間〜７５時間、４８時間〜６０時間、６０時間〜１２０時間、６０時間〜１００時間、６０時間〜９０時間、６０時間〜７５時間、７５時間〜１２０時間、７５時間〜１００時間、７５時間〜９０時間、９０時間〜１２０時間、または１００〜１２０時間であってもよい。また、かかる実施形態におけるアルカリ処理期間には、１５、２４、４８、６０、７５、９０、１００、及び１２０時間も考慮対象に含まれる。かかる条件により、強力なアルカリ処理を達成することができる。
【００６２】
他の実施形態では、開始バイオマス乾燥重量１０ｇ/Ｌ〜４０ｇ/Ｌは、３５〜４５℃の温度にて３時間〜４８時間水酸化物濃度０.０２５Ｎ〜０.２５ＮまたはｐＨ９.５〜１２.５で処理することもできる。次いでｐＨは、塩酸（ＨＣｌ）などの酸を添加することにより、２.５〜４.０に調整してもよい（酸処理を含む）。前記酸処理は、３５〜４５℃の温度にて１時間〜２４時間にわたって行い得る。例えば、かかる実施形態では、１つまたは複数のラクトバチルス属菌株を含む細菌バイオマスのアルカリ処理は、水酸化物濃度０.０２５Ｎ〜０.２０Ｎ、０.０２５〜０.１５Ｎ、０.０２５〜０.１０Ｎ、０.０５Ｎ〜０.２５Ｎ、０.０５Ｎ〜０.２０Ｎ、０.０５〜０.１５Ｎ、０.０５Ｎ〜０.１０Ｎ、０.１０Ｎ〜０.２５Ｎ、０.１０Ｎ〜０.２０Ｎ、０.１０Ｎ〜０.１５Ｎ、０.１５Ｎ〜０.２５Ｎ、０.１５Ｎ〜０.２０Ｎ、または０.２０Ｎ〜０.２５Ｎで行い得る。前記アルカリ処理中、かかる実施形態は、ｐＨ９.５〜１２.０、９.５〜１１.５、９.５〜１１.０、９.５〜１０.５、９.５〜１０.０、１０.０〜１２.５、１０.０〜１２.０、１０.０〜１１.５、１０.０〜１１.０、１０.０〜１０.５、１０.５〜１２.５、１０.５〜１２.０、１０.５〜１１.５、１０.５〜１１.０、１１.０〜１２.５、１１.０〜１２.０、１１.０〜１１.５、１１.５〜１２.５、１１.５〜１２.０、またはｐＨ１２.０〜１２.５を有し得る。かかる実施形態のアルカリ処理時間は、３時間〜３６時間、３時間〜２４時間、３時間〜１８時間、３時間〜１２時間、３時間〜６時間、６時間〜４８時間、６時間〜３６時間、６時間〜２４時間、６時間〜１８時間、６時間〜１２時間、６時間〜８時間、８時間〜４８時間、８時間〜３６時間、８時間〜２４時間、８時間〜１８時間、８時間〜１２時間、１２時間〜４８時間、１２時間〜３６時間、１２時間〜１８時間、１８時間〜４８時間、１８時間〜３６時間、１８時間〜２４時間、２４時間〜４８時間、２４時間〜３６時間、または３６時間〜４８時間であってもよい。前記アルカリ処理は、上記の時間範囲に限定される任意の期間（例えば、３、６、８、１２、１８、２４、３６、または４８時間）行い得る。前記ｐＨは、次いで、アルカリ溶解後の酸処理のため、酸を添加することにより、２.５〜３.５、２.５〜３.０、３.０〜４.０、３.０〜３.５、または３.５〜４.０に調整してもよい。前記酸処理は、１時間〜１８時間、１時間〜１２時間、１時間〜６時間、１時間〜３時間、３時間〜２４時間、３時間〜１８時間、３時間〜１２時間、３時間〜６時間、６時間〜２４時間、６時間〜１８時間、６時間〜１２時間、１２時間〜２４時間、１２時間〜１８時間、１８時間〜２４時間にわたって行い得る。また、１、３、６、１２、１８、及び２４時間も、前記酸処理時間の考慮対象に含まれる。
【００６３】
上記塩基処理の結果得られた可溶化液（ライセート）は、次に、粒子状成分や不溶性成分を除去するため、例えば、遠心分離ないしはろ過で精製し得る。例えば、可溶化液（ライセート）を、９０００ｘ重力で遠心分離してから、０.２ミクロンフィルターで１回または複数回のろ過することもできる。場合によっては、大孔フィルターで連続数回ろ過してから、０.２ミクロンフィルターでろ過する方法を使用してもよい。また、前記抽出物からの可溶性物質抽出を支援するために、限外ろ過方法、例えば、さらなる精密濾過のために限外ろ過透過物を再循環させる方法などを採用することもできる。
【００６４】
一部の実施形態では、接線流ろ過（ＴＦＦ）方法を用いて、可溶化液（ライセート）をろ過し、かつ、比較的大きな細胞残屑から可溶性分子を抽出することもできる（図２）。例えば、Separations Technology, Pharmaceutical and Biotechnology Applications, Wayne P. Olson（編集者）Interpharm Press, Inc.,（米国イリノイ州バッファローグローブ）、（126〜135ページ）- ISBN：0-935184-72-4を参照。かかる処理の始めに、希釈した細菌可溶化液を第１槽に保存してもよい。ＴＦＦでは、例えば、前記抽出物を、精密ろ過膜と限外ろ過膜の両方に暴露してもよい。例えば、微量ろ過（ＭＦ）ループを開始し、その生成物を汲み出す。結果として生じるＭＦ残余分が再循環される一方、前記ＭＦ透過物は第２槽に移動される。
【００６５】
適度な濃度に到達後、限外ろ過（ＵＦ）ループを開始する。前記ＵＦ残余分を第２槽内に保存すると同時に、前記可溶化液から可溶化された抽出物の連続抽出を行うため、前記ＵＦ透過物を再循環させて第１槽に戻すこともできる。前記連続抽出中、槽１と槽２内の液量は、微量ろ過透過物と限外ろ過透過物の流量を制御することにより、調整することもできる。
【００６６】
かかる複数の抽出サイクルは、ＴＦＦまたは別のろ過方法のいずれかを用いて行うことができる。ＴＦＦ法を使用する実施形態では、最終サイクルの終わりに、前記限外ろ過ループを遮断し、前記微量ろ過ループを単独で実行し、前記ＭＦ透過物を槽２に移動させることもできる。
【００６７】
クロスフローと膜間差圧の条件は、上記で説明した膜理論、例えば、M.Cheryanによる(Ultrafiltration and Microfiltration Handbook、第２版、第４章、1998)で圧力独立領域と物質移動制御領域により規定される。透過流速と抽出収率はろ過条件（膜間差圧（ＴＭＰ）、クロスフロー、温度など）によって影響される。また、フィルタータイプは、ろ過性能だけではなく、プレートシステムのタイプ（カセットフィルター）にも影響を及ぼし得る。平行モードと蛇行モードを含む様々な構成を使用することができる（図２を参照）。使用されるモードタイプとフィルタータイプの各組み合わせごとに最適化性能を実現するため、特定の条件が開発されている。
【００６８】
前記微量ろ過ループは、１.２ミクロン〜０.１ミクロンのフィルター（例えば、０.６５〜０.２ミクロン、または０.４５ミクロンのフィルターなど）に装着することもできる。前記クロス-フローは、１００〜３０００リットル/時間ｍ２（ＬＨＭ）（例えば、３００〜２５００ＬＨＭ、または０.３〜２バールのＴＭＰで２０００ＬＨＭ）であってもよい。前記限外ろ過ループは１０ＫＤａ〜１０００ＫＤａのフィルター（例えば、１０ＫＤａ〜１００ＫＤａ、または１０ＫＤａ〜３０ＫＤａ、または３０ＫＤａ〜１００ＫＤａ）に装着することもできる。前記クロス-フローは、３０〜１０００ＬＨＭ（例えば、０.２〜１.５バールのＴＭＰで２０〜５００ＬＨＭ）であってもよい。
【００６９】
５〜２０のダイアフィルトレーション容量を用いて、細菌性細胞壁から可溶性成分を抽出することもできる。一部の実施形態では、８〜１５の液量が使用される。それゆえ、例えば、一部の実施形態では、５〜１５サイクルのろ過を使用することもでき、場合によっては８〜１５サイクルのろ過を使用することもできる。
【００７０】
ろ過後、所望であれば、前記抽出物をさらに濃縮したり、遠心分離することもできる。例えば、小孔フィルター、例えば０.２ミクロンフィルターを用いてさらなる微量ろ過を行ってもよい。ろ過後、前記抽出物を、使用するための製剤に先立って、凍結乾燥してもよい。
【００７１】
一部の実施形態では、抽出物中の１つまたは複数の修飾された成分の分離、排除または濃度増加を行うために、ろ過後に前記抽出物を精製してもよい。例えば、強力なイオン性クロマトグラフィーステップを使用して荷電成分を除去することができる。ゲルろ過、クロマトグラフィー、超遠心分離、抽出及び沈殿などの他の精製工程を使用することが可能である。
【００７２】
細菌抽出物の化学特性
塩基処理により、様々な化学修飾を細胞成分に対して行うこともできる。例えば、タンパク質では：（１）ペプチド結合が部分的な切断を受けてより小さなポリペプチドを生成し得る；（２）天然Ｌ-アミノ酸を少なくとも部分的にＤ-アミノ酸にラセミ化し得る；及び（３）アスバラギン残基とグルタミン残基を脱アミノ化してタンパク質等電点に変化を引き起こし得る。リポタイコ酸、リポペプチド、及びリン脂質などの分子は、得るを受けるエステル結合ないしはアミド結合の塩基を触媒とする加水分解を受けて、新たな物理化学的特性と免疫学的特性を有し得る修飾された両親媒性構造を引き起こし得る。その他の可能な化学修飾例には、リン酸基の転位をはじめとして、細胞壁多糖類の部分的な可溶化、リボ核酸（ＲＮＡ）の個々のリボヌクレオチドへの完全加水分解が含まれる。
【００７３】
それゆえ、それらの一部またはすべての化学修飾は、本明細書で説明したように、ラクトバチルス属細胞の塩基処理中に起こり得る。かかる分子の修飾は、前記抽出物の生物学的活性に影響を及ぼし得る。
【００７４】
例えば、本発明に係る細菌の塩基処理は、タンパク質の部分的な加水分解だけではなく、アミノ酸の脱アミノ化、脱アミノ化、ないしはＬ-アミノ酸からＤ-アミノ酸への部分的なラセミ化を結果としてをもたらし得る。本発明に係る抽出物の解析的研究では、Ｄ-アスパラギン酸、Ｄ-グルタミン酸、Ｄ-セリン、Ｄ-メチオニン、Ｄ-ヒスチジン、Ｄ-アラニン、Ｄ-アルギニン、Ｄ-フェニルアラニン、Ｄ-チロシン、Ｄ-ロイシン、及びＤ-リシンのそれぞれのピークが観察された。かかる研究における菌種のＤ-アミノ酸の割合の範囲は３%〜４０%であった。それゆえ、本発明の一部の実施形態は、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アラニン、アルギニン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシン、及びリシから選択される１つまたは複数（例えば、上記アミノ酸のすべて、または上記アミノ酸のうち１つ以上、すべて未満で任意に選択されたアミノ酸など。例えば、アラニン、フェニルアラニン及びリシン）のラセミ化を許容する。一部の実施形態では、上記アミノ酸の１つまたは複数の少なくとも１０%がＤ-アミノ酸からＬ-アミノ酸にラセミ化され得る。他の実施形態では、上記アミノ酸の１つまたは複数の少なくとも４０%がラセミ化され得る。
【００７５】
かくして、本発明の抽出物は１〜９０%（例えば、１〜８０%、または１〜６０%）のＤ-アミノ酸を含み得る。一部の実施形態では、前記抽出物は１０〜４５%（例えば、２５〜３５%のＤ-アミノ酸）のＤ-アミノ酸を含む。本発明の抽出物は、Ｄ-アスパラギン酸、Ｄ-アスバラギン、Ｄ-グルタミン酸、Ｄ-グルタミン、Ｄ-セリン、Ｄ-メチオニン、Ｄ-ヒスチジン、Ｄ-アラニン、Ｄ-アルギニン、Ｄ-フェニルアラニン、Ｄ-チロシン、Ｄ-ロイシン、Ｄ-リシン、Ｄ-バリン、及びＤ-トレオニンからなる群から選択される少なくとも１個のＤ-アミノ酸を含み得る。一部の実施形態では、任意の１個のＤ-アミノ酸濃度は１〜５０%（例えば、１０〜４０%、または１５〜３５%）である。
【００７６】
本発明の一部の抽出物は、リポタイコ酸、テイコ酸、ペプチドグリカン、またはその組み合わせなどのラクトバチルス属細菌性細胞壁成分と膜成分を含む。一部の実施形態では、それらの成分は化学的に修飾されている。また、一部の抽出物は、リポタンパク質などの細胞壁成分ないしは細胞膜成分を含み、それらの成分は化学的に修飾されることもできる。一部の実施形態では、前記細胞壁成分または細胞膜成分、例えば、リポタンパク質は、前記抽出物中で溶解または懸濁されるため、粒子状または不溶性形態で存在しない。
【００７７】
加えて、本発明に係る抽出物は、例えば、１０〜１００ｍｇ/ｍＬの可溶性乾燥重量（ＳＤＷ）物質、１〜３０ｍｇ/ｍＬのタンパク質（Ｐｒｏｔ．）、０.５〜４.０ｍｇ/ｍＬの砂糖及び１００μｇ/ｍＬ未満のＤＮＡを含むこともできる。例えば、一部の実施形態は、約１５〜３５ｍｇ/ｍＬの可溶性乾燥重量、３〜７ｍｇ/ｍＬのタンパク質、１.０〜３.０ｍｇ/ｍＬの砂糖及び１０〜４０μｇ/ｍＬのＤＮＡを含有する。本発明に係る抽出物は、例えば、３０ｍｇ/ｍＬの可溶性乾燥重量、９.６ｍｇ/ｍＬタンパク質、２.４ｍｇ/ｍＬの砂糖及び３３μｇ/ｍＬのＤＮＡを含有することもでき、または３２.４ｍｇ/ｍＬの可溶性乾燥重量、５.８ｍｇ/ｍＬタンパク質、２.３ｍｇ/ｍＬの砂糖及び１００μｇ/ｍＬ未満のＤＮＡを含有する別の例もある。可溶性乾燥重量（ＳＤＷ）（ｇ/Ｌまたはｍｇ/ｍＬ単位）は、溶解処理または塩基処理を行い、１０５℃にて陶器皿で一定の質量に乾燥して得られる５ｍＬの可溶性画分を取得することにより定量される。
【００７８】
一部の実施形態では、前記抽出物は、少なくとも０.３ｍｇ/ｍＬの糖類（例えば、０.３〜４.５ｍｇ/ｍＬの糖類）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１個の糖類が、単糖類、二糖類、及び多糖類から選択される。本発明の一部の抽出物は、少なくとも１個の分枝多糖類を含む。一部の実施形態では、少なくとも１個の糖類が化学的に修飾される。
【００７９】
本発明に係る細菌の溶解処理または塩基処理は、結果として、高分子成分の平均分子量を、例えば、１ＫＤａから３００ＫＤａ〜１００ＫＤａの範囲、または１ＫＤａから６０ＫＤａ〜１０ＫＤａの範囲への減少をもたらし得る。一部の実施形態では、前記抽出物は、少なくとも１個の、分子量が５０ＫＤａ未満または３０ＫＤａ未満（例えば、１０ＫＤａ未満）のタンパク質を含む。
【００８０】
細菌抽出物の生物学的活性
本発明に係る抽出物は免疫調節活性を有し得る。例えば、一部の抽出物は免疫系を刺激することもできる。一部の抽出物は抗炎症活性を有し得る。抽出物の特定の効果は、その製造条件及びラクトバチルスの菌種または菌株、または抽出物が得られる菌種または菌株の混合物に依存し得る。よって、本発明に係る一部の抽出物は、強力な免疫賦活性を示し得るため、感染症の治療、またはかかる治療の補助に有用であり得る一方、他の実施形態は、弱い免疫賦活性を示し得るが、抗炎症活性を示すため、アレルギー症、喘息、自己免疫性の疾患、大腸炎、及び炎症性腸疾患などの炎症性障害治療、またはかかる治療の補助に有用である。
【００８１】
かくして、本発明に係る一部の抽出物は、限定するものではないが、微生物感染症、アレルギー疾患、及び消化管障害を含む障害に苦しむ患者の治療に効果的であり得る。また、本発明に係る一部の抽出物は、栄養補助食品として患者に投与し得る（例えば、限定するものではないが、微生物感染症、アレルギー疾患、及び消化管障害を含む様々な条件の治療にアジュバントとして投与し得る）。
【００８２】
前記抽出物の生物学的活性の範囲は、いくつかのｉｎ-ｖｉｔｒｏ試験法及びｉｎ-ｖｉｖｏ試験法によって定量することもできる。例えば、前記Alamar blue（商標）アッセイには、細胞増殖の結果として生じる化学的還元に応答する酸化還元（ＲＥＯＸ）指標による代謝活性の検出に基づく蛍光定量的/比色定量的増殖指標が組み込まれている（実施例４）。
【００８３】
ｉｎ-ｖｉｔｒｏ細胞アッセイは、一次マウスマクロファージからの一酸化窒素（ＮＯ）産生を試験し、侵入する細菌死滅させるために抽出物の能力をスクリーニングして免疫系を刺激する（図５）。一部の実施形態では、前記抽出物は、マウスマクロファージにおけるＮＯの産生を刺激して、測定ＮＯ濃度範囲３μＭ〜６０μＭ（例えば、５μＭ〜４０μＭ）を引き起こし得る。一部の実施形態では、一酸化窒素濃度は３０μＭ以上であり得る。また、細菌の種類はこれらの結果に影響を及ぼし得る。例えば、ラクトバチルス・ファーメンタムからの抽出物は、ラクトバチルス・ラムノサスよりも高い一酸化窒素の産生量を誘導し得る（例えば、実施例５の下を参照）。本発明の実施形態の免疫賦活または抗炎症の可能性をｉｎ-ｖｉｔｒｏでスクリーニングするために、本発明の細菌抽出物の試験を、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）で行うこともできる。Foligneらの(World J Gastroenterol, 2007, 13(2):236-243)を参照。ＩＬ１２ｐ７０（炎症性のサイトカイン）とＩＬ１０（抗炎症性のサイトカイン）の両方の発光を測定し得るとともに、前記ＩＬ１０/ＩＬ１２比率も計算され得る（実施例６）。本発明の一部の実施形態は、生のラクトバチルス・ファーメンタム制御よりも高いＩＬ１０/ＩＬ１２比率を生成するため、本発明の一部の抽出物が、ｉｎ-ｖｉｖｏで投与されると、生の親微生物と等価、またはさらに強力な抗炎症特性を示し得ることを示唆する。それゆえ、本発明は、ヒト末梢血単核細胞内で計算可能なＩＬ１０/ＩＬ１２比率を達成できる抽出物を含み、そこでは、前記比率が、前記抽出物を得られる生のラクトバチルス菌株により達成されるＩＬ１０/ＩＬ１２比率と同等か、またはそれを超えることを特徴とする。
【００８４】
また、本発明の抽出物の免疫応答は、そのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）への影響を調べることにより試験することもできる。例えば、抽出物は、ＴＬＲ２アゴニストＰａｍ３Ｃｙｓの存在下または不在下、またはＴＬＲ４アゴニストＬＰＳの存在下または不在下で、ＨＥＫ２９３細胞内で試験することもできる（実施例７）。前記ＨＥＫ２９３細胞株は、ＴＬＲ誘導ＮＦ-・Ｂ活性化を監視するＩＬ８滴定やレポーターベースシステムなどのＥＬＩＳＡ分析を用いてＴＬＲ活性の効率的な監視を可能にする。本発明の一部の実施形態は、ＨＥＫＴＬＲ２/６細胞内でＴＬＲ２/６アンタゴニストとしての役割を果たし得る。かくして、一部の実施形態は対象患者における感染と戦う上で有用であり得るが、他の実施形態を、炎症ないしは自己免疫疾患の治療に利用するために開発することもできる。
【００８５】
また、本発明で開示されている抽出物は、ＴＬＲ及びＮＯＤ２受容体の活性に対してスクリーニングし得る（実施例８）。本発明の一部の実施形態は、ＴＬＲ及びまたはＮＯＤ２受容体をｉｎ-ｖｉｔｒｏで活性化するが、これはＴＬＲないしはＮＯＤ２を介してその免疫系をを活性化することもできることを指摘するものである。
【００８６】
斑形成細胞（ＰＦＣ）技術を採用してＢリンパ球の非特定刺激を評価することもできる（実施例９）。特定のリンパ系細胞は、拡散し、補体存在下で溶解斑を形成することで隣接赤血球溶解の原因となる溶血性抗体を発光させる。本発明の一部の実施形態は、Ｂ細胞により免疫グロブリンの分泌を増加させ得るため、反復性感染に苦しむ対象患者の免疫系をプライミングするために予防的に使用することができる可能性がある。
【００８７】
本発明の抽出物の抗感染症効果は、例えば、対象患者のサルモネラ菌食中毒直後、マウスのかかる感染直後に試験し得る（実施例１０）。本発明の一部の実施形態は、細菌感染症、すなわちサルモネラ菌食中毒などの感染症に対して防護免疫を提供し得る。例えば、一部の実施形態は、ネズミチフス菌を注入投与して誘導したマウスの死亡率を低下し得る。
【００８８】
ｉｎ-ｖｉｔｒｏ活性がなく、測定されたｉｎ-ｖｉｖｏ活性の定量の組み合わせ、例えば、アレルゲン誘発喘息のマウスモデルにおける（実施例１１）は、本発明で開示されている抽出物の潜在的な臨床活性のより完全な観点を提供し得る。ＬＡＣＫ（寄生虫の大型リーシュマニアからのタンパク質）モデルでは、気管支肺胞洗浄液中に見出される好酸球の数は、喘息対照群（無治療）動物と比較すると、１〜１０倍（例えば、１.５倍〜５倍）減少し得る。よって、一部の実施形態では、前記抽出物は、喘息マウス対象において前記好酸球細胞数、好中球細胞数、リンパ球細胞数、またはその任意の組み合わせの細胞数を、無治療の喘息対照群に対して少なくとも１.５倍減少させる。本発明の一部の実施形態は、対象喘息患者において好酸球を低下し、喘息マーカーであるＴｈ２サイトカイン（ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１３など）の濃度も付随して減少し得る。かくして、かかる実施形態は、例えば、喘息を含むアレルギー障害などの免疫不全に苦しむ対象患者において抗炎症活性を有し得る。
【００８９】
細菌抽出物を含む組成物
本発明に係る抽出物は、多くの最終的な投与方法で調製し得る。例えば、経口錠剤、カプセル、ピルだけではなく、液剤またはエアロゾルでも調製することができる。また、点滴や注射用製剤も調製し得る。
【００９０】
本発明の実施形態は、例えば、固形剤形または液体剤形として調製することができる。典型的な固形剤形には、例えば、前記抽出物を含有する錠剤（例えば、コート錠剤、チュアブル錠、発泡錠、舌下錠、顆粒、粉末、またはカプセル）を含むこともできる。
【００９１】
また、固形剤形は、希釈剤、充填剤、ないしは他の賦形剤を含有することもできる。防腐剤、着色剤、調味料、及び甘味料などの他の賦形剤成分を添加することもできる。
【００９２】
前記カプセルや前記錠剤の代替品として、粉末製剤や顆粒製剤を開発することが可能である。また、液体剤形は、経口経路用に、溶液またはシロップ剤、懸濁液及びドロップ剤としても開発することができる。
【００９３】
本発明の抽出物には、栄養サプリメントないしは食事サプリメント及び食品添加物などの１つまたは複数の栄養補助食品組成物、または１つまたは複数の医薬組成物を含むこともできる。
【００９４】
細菌抽出物の対象患者への投与
本発明の少なくとも１つの抽出物を含む用量は、消化管障害、気道障害、尿路疾患、及びアレルギー状態から選択される少なくとも１つの障害に苦しむか、または発生するリスクがある対象患者に投与し得る。例えば、一部の実施形態では、前記抽出物は、上下気道感染症、下気道感染症を伴う閉塞性肺疾患急性、急性増悪を伴う閉塞性肺疾患、鼻咽頭炎、副鼻腔炎、咽頭炎、扁桃腺炎、喉頭炎、気管炎、咽頭咽頭炎、インフルエンザ、肺炎、気管支肺炎、気管支炎、鼻炎、鼻咽頭炎、咽頭炎、副鼻腔炎、扁桃腺炎、喉頭炎、咽頭気管炎、気管支炎、アレルギー鼻炎、アレルギー喘息、アトピー性皮膚炎、尿路感染症に起因する閉塞性及び逆流性尿路疾患、尿道炎、尿細管間質性腎炎、閉塞性腎盂腎炎、慢性膀胱炎を含む膀胱炎、前立腺炎及び慢性前立腺炎を含む男性の骨盤痛症候群、前立腺膀胱炎、女性の骨盤内炎症性疾患、クローン病、ないしは過敏性腸症候群に苦しむか、またはそれを発生するリスクのある対象患者に投与し得る。
【００９５】
一部の実施形態では、前記抽出物は、栄養サプリメントないしは食品添加物などの栄養補助食品組成物の形態で対象患者に投与される。他の実施形態では、前記抽出物は、医薬組成物の形態で対象患者に投与される。前記投与は、単回投与または複数回投与を含み得る。
【００９６】
一部の実施形態では、抽出物は、１つまたは複数の上記の状態に苦しむ対象患者を治療するため、治療に有効な投与量で提供され得る。一部の実施形態では、抽出物は、他の医学的処置に対する補助として提供され得る。
【実施例】
【００９７】
実施例１：細菌培養
実施例１.１：ラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９の培養
初期培養条件
次の成分を精製水中に溶解することにより培養培地を調製した：塩化ナトリウム：３ｇ/Ｌ；ナトリウム一水素リン酸：２ｇ/Ｌ；酢酸ナトリウム：１ｇ/Ｌ；大豆ペプトン、５０ｇ/Ｌ；グルコース：１２ｇ/Ｌ；塩化カルシウム：０.１ｇ/Ｌ；塩化カリウム：０.１ｇ/Ｌ；重炭酸ナトリウム：０.５ｇ/Ｌ；ピルビン酸塩：０.１ｇ/Ｌ；グルタマート：０.２ｇ/Ｌ；金属溶液（硫酸銅：３ｍｇ/Ｌ；鉄塩化物：８３０ｍｇ/Ｌ；硫酸亜鉛：８６０ｍｇ/Ｌ；硫酸：１.１ｍｇ/Ｌ）：０.５ｍＬ/Ｌ；ポリプロピレングリコール（０.０２ｍＬ/Ｌ、密度１.００５ｇ/ｍＬ）を次いで添加した。溶解後、ｐＨは調整しなかった。前記培地の滅菌後、小さなエルレンマイヤーフラスコを凍結バイアルの内容物（１.５ｍＬの凍結細菌を含有）で個別に接種し、３７℃にて８時間インキュベートした。次いでこの培養の２０ｍＬアリコートを、１０００ｍＬの培養培地を含有する大きなエルレンマイヤーフラスコに移し、同じ条件で再びインキュベートした。１６時間の増殖後、１リットルのエルレンマイヤーフラスコの内容物を前発酵槽に移した。
【００９８】
前発酵槽内の培養条件
次の成分を精製水中に溶解することにより、２０リットルの培養培地を調製した：塩化ナトリウム：３ｇ/Ｌ；ナトリウム一水素リン酸：２ｇ/Ｌ；酢酸ナトリウム：１ｇ/Ｌ；大豆ペプトン、５０ｇ/Ｌ；グルコース：１２ｇ/Ｌ；塩化カルシウム：０.１ｇ/Ｌ；塩化カリウム：０.１ｇ/Ｌ；重炭酸ナトリウム：０.５ｇ/Ｌ；ピルビン酸塩：０.１ｇ/Ｌ；グルタマート：０.２ｇ/Ｌ；金属溶液（硫酸銅：３ｍｇ/Ｌ；鉄塩化物：８３０ｍｇ/Ｌ；硫酸亜鉛：８６０ｍｇ/Ｌ；硫酸：１.１ｍｇ/Ｌ）：次いで０.５ｍＬ/Ｌのポリプロピレングリコール（０.０２ｍＬ/Ｌ）を添加した。溶解後、ｐＨは調整しなかった。１００ｒｐｍの撹拌、無通気で、インキュベーション温度を３７℃に調節した。培養中ｐＨは調整しなかった。２４時間後、７リットルを前発酵槽から発酵槽に移した（２４時間後、前発酵槽の培養、７００ｎｍで光学密度（ＯＤ）=１.２４）。滅菌条件下で前発酵槽の培養を発酵槽に移した。
【００９９】
発酵槽内の培養条件
次の成分を精製水中に溶解することにより、７０リットルの培養培地を調製した：塩化ナトリウム：３ｇ/Ｌ；ナトリウム一水素リン酸：２ｇ/Ｌ；酢酸ナトリウム：１ｇ/Ｌ；大豆ペプトン、５０ｇ/Ｌ；グルコース：１２ｇ/Ｌ；塩化カルシウム：０.１ｇ/Ｌ；塩化カリウム：０.１ｇ/Ｌ；重炭酸ナトリウム：０.５ｇ/Ｌ；ピルビン酸塩：０.１ｇ/Ｌ；グルタマート：０.２ｇ/Ｌ；金属溶液（硫酸銅：３ｍｇ/Ｌ；鉄塩化物：８３０ｍｇ/Ｌ；硫酸亜鉛：８６０ｍｇ/Ｌ；硫酸：１.１ｍｇ/Ｌ）：次いで０.５ｍＬ/Ｌのポリプロピレングリコール（０.０２ｍＬ/Ｌ）を添加した。溶解後、ｐＨは調整しなかった。
【０１００】
滅菌後、８ｇ/Ｌグルコースを前記培養に添加した。１００ｒｐｍの撹拌、無通気で、前記インキュベーション温度を３７℃に調節した。培養中にｐＨを５.７に調整した。１６時間後、前記培養（培養、７００ｎｍでＯＤ＝２.３０）を６５℃にて３５分間の熱処理により不活化し、回収槽に移した。不活化した直後、バイオマスを培地から分離するために前記培養を限外ろ過スキッドに移し、濃縮し、さらに精製水中で塩化ナトリウム（９ｇ/Ｌ）を用いて洗浄した。その回収したバイオマスをアリコート（濃縮細菌懸濁液の質量２０００ｇ、濃縮細菌懸濁液グラムあたり３１.８ｍｇのバイオマス乾燥重量）してから、-１５℃にて凍結した。
【０１０１】
実施例１.２：ラクトバチルス・ヘルベティカス１０３１４６の培養
初期培養条件
次の成分を精製水中に溶解することにより培養培地を調製した：塩化ナトリウム：３ｇ/Ｌ；ナトリウム一水素リン酸：２ｇ/Ｌ；酢酸ナトリウム：１ｇ/Ｌ；大豆ペプトン、５０ｇ/Ｌ；グルコース：１２ｇ/Ｌ；塩化カルシウム：０.１ｇ/Ｌ；塩化カリウム：０.１ｇ/Ｌ；重炭酸ナトリウム：０.５ｇ/Ｌ；ピルビン酸塩：０.１ｇ/Ｌ；グルタマート：０.２ｇ/Ｌ；金属溶液（硫酸銅：３ｍｇ/Ｌ；鉄塩化物：８３０ｍｇ/Ｌ；硫酸亜鉛：８６０ｍｇ/Ｌ；硫酸：１.１ｍｇ/Ｌ）：次いで０.５ｍＬ/Ｌのポリプロピレングリコール（０.０２ｍＬ/Ｌ）を添加した。溶解後、ｐＨは調整しなかった。前記培地の滅菌後、小さなエルレンマイヤーフラスコを凍結バイアルの内容物（１.５ｍＬの凍結細菌を含有）で個別に接種し、３７℃にて９時間インキュベートした。次いでこの培養の２０ｍｌアリコートを、１０００ｍＬの培養培地を含有する大きなエルレンマイヤーフラスコに移し、同じ条件下で再びインキュベートした。１５時間の増殖後、１リットルのエルレンマイヤーフラスコの内容物を前発酵槽に移した。
【０１０２】
前発酵槽内の培養条件
次の成分を精製水中に溶解することにより、２０リットルの培養培地を調製した：塩化ナトリウム：３ｇ/Ｌ；ナトリウム一水素リン酸：２ｇ/Ｌ；酢酸ナトリウム：１ｇ/Ｌ；大豆ペプトン、５０ｇ/Ｌ；グルコース：１２ｇ/Ｌ；塩化カルシウム：０.１ｇ/Ｌ；塩化カリウム：０.１ｇ/Ｌ；重炭酸ナトリウム：０.５ｇ/Ｌ；ピルビン酸塩：０.１ｇ/Ｌ；グルタマート：０.２ｇ/Ｌ；金属溶液（硫酸銅：３ｍｇ/Ｌ；鉄塩化物：８３０ｍｇ/Ｌ；硫酸亜鉛：８６０ｍｇ/Ｌ；硫酸：１.１ｍｇ/Ｌ）：次いで０.５ｍＬ/Ｌのポリプロピレングリコール（０.０２ｍＬ/Ｌ）を添加した。溶解後、ｐＨは調整しなかった。１００ｒｐｍの撹拌、無通気で、インキュベーション温度を３７℃に調節した。培養中ｐＨは調整しなかった。９時間後、７リットルを前発酵槽から発酵槽に移した。（９時間後、前発酵槽培養、７００ｎｍでＯＤ：0.14）.滅菌条件下で前発酵槽の培養を発酵槽に移した。
【０１０３】
発酵槽内の培養条件
次の成分を精製水中に溶解することにより、７０リットルの培養培地を調製した：塩化ナトリウム：３ｇ/Ｌ；ナトリウム一水素リン酸：２ｇ/Ｌ；酢酸ナトリウム：１ｇ/Ｌ；大豆ペプトン、５０ｇ/Ｌ；グルコース：１２ｇ/Ｌ；塩化カルシウム：０.１ｇ/Ｌ；塩化カリウム：０.１ｇ/Ｌ；重炭酸ナトリウム：０.５ｇ/Ｌ；ピルビン酸塩：０.１ｇ/Ｌ；グルタマート：０.２ｇ/Ｌ；金属溶液（硫酸銅：３ｍｇ/Ｌ；鉄塩化物：８３０ｍｇ/Ｌ；硫酸亜鉛：８６０ｍｇ/Ｌ；硫酸：１.１ｍｇ/Ｌ）：次いで０.５ｍＬ/Ｌのポリプロピレングリコール（０.０２ｍＬ/Ｌ）を添加した。溶解後、ｐＨは調整しなかった。
【０１０４】
滅菌後、８ｇ/Ｌグルコースを前記培養に添加した。１００ｒｐｍの撹拌、無通気で、前記インキュベーション温度を３３℃に調節した。ＣＨ３ＣＯＯＨで、前記培養の始めにｐＨを６.７に調整した。２４時間後、前記培養（培養、７００ｎｍでＯＤ＝４.１７）を、６５℃にて３５分間の熱処理により不活化し、回収槽に移した。不活化した直後、バイオマスを培地から分離するために前記培養を限外ろ過スキッドに移し、濃縮し、さらに精製水中で塩化ナトリウム（９ｇ/Ｌ）を用いて洗浄した。その回収したバイオマスをアリコート（濃縮細菌懸濁液の質量４４０ｇ、濃縮細菌懸濁液グラムあたり１９.１ｍｇのバイオマス乾燥重量）してから、-１５℃にて凍結した。
【０１０５】
実施例１.３：ラクトバチルス・プランタルム７１.３９の培養
初期培養条件
次の成分を精製水中に溶解することにより培養培地を調製した：塩化ナトリウム：３ｇ/Ｌ；ナトリウム一水素リン酸：２ｇ/Ｌ；酢酸ナトリウム：１ｇ/Ｌ；大豆ペプトン、５０ｇ/Ｌ；グルコース：１２ｇ/Ｌ；塩化カルシウム：０.１ｇ/Ｌ；塩化カリウム：０.１ｇ/Ｌ；重炭酸ナトリウム：０.５ｇ/Ｌ；ピルビン酸塩：０.１ｇ/Ｌ；グルタマート：０.２ｇ/Ｌ；金属溶液（硫酸銅：３ｍｇ/Ｌ；鉄塩化物：８３０ｍｇ/Ｌ；硫酸亜鉛：８６０ｍｇ/Ｌ；硫酸：１.１ｍｇ/Ｌ）：次いで０.５ｍＬ/Ｌのポリプロピレングリコール（０.０２ｍＬ/Ｌ）を添加した。溶解後、ｐＨは調整しなかった。前記培地の滅菌後、小さなエルレンマイヤーフラスコを凍結バイアルの内容物（１.５ｍＬの凍結細菌を含有）で個別に接種し、３５℃にて９時間インキュベートした。次いでこの培養の２０ｍｌアリコートを、１０００ｍＬの培養培地を含有する大きなエルレンマイヤーフラスコに移し、同じ条件下で再びインキュベートした。１５時間の増殖後、１リットルのエルレンマイヤーフラスコの内容物を前発酵槽に移した。
【０１０６】
前発酵槽内の培養条件
次の成分を精製水中に溶解することにより、２０リットルの培養培地を調製した：塩化ナトリウム：３ｇ/Ｌ；ナトリウム一水素リン酸：２ｇ/Ｌ；酢酸ナトリウム：１ｇ/Ｌ；大豆ペプトン、５０ｇ/Ｌ；グルコース：１２ｇ/Ｌ；塩化カルシウム：０.１ｇ/Ｌ；塩化カリウム：０.１ｇ/Ｌ；重炭酸ナトリウム：０.５ｇ/Ｌ；ピルビン酸塩：０.１ｇ/Ｌ；グルタマート：０.２ｇ/Ｌ；金属溶液（硫酸銅：３ｍｇ/Ｌ；鉄塩化物：８３０ｍｇ/Ｌ；硫酸亜鉛：８６０ｍｇ/Ｌ；硫酸：１.１ｍｇ/Ｌ）：次いで０.５ｍＬ/Ｌのポリプロピレングリコール（０.０２ｍＬ/Ｌ）を添加した。溶解後、ｐＨは調整しなかった。１００ｒｐｍの撹拌、無通気で、インキュベーション温度を３７℃に調節した。培養中ｐＨは調整しなかった。９時間後、７リットルを前発酵槽から発酵槽に移した。（９時間後、前発酵槽培養、７００ｎｍでＯＤ=１.６２）滅菌条件下で前発酵槽の培養を発酵槽に移した。
【０１０７】
発酵槽内の培養条件
次の成分を精製水中に溶解することにより、７０リットルの培養培地を調製した：塩化ナトリウム：３ｇ/Ｌ；ナトリウム一水素リン酸：２ｇ/Ｌ；酢酸ナトリウム：１ｇ/Ｌ；大豆ペプトン、５０ｇ/Ｌ；グルコース：１２ｇ/Ｌ；塩化カルシウム：０.１ｇ/Ｌ；塩化カリウム：０.１ｇ/Ｌ；重炭酸ナトリウム：０.５ｇ/Ｌ；ピルビン酸塩：０.１ｇ/Ｌ；グルタマート：０.２ｇ/Ｌ；金属溶液（硫酸銅：３ｍｇ/Ｌ；鉄塩化物：８３０ｍｇ/Ｌ；硫酸亜鉛：８６０ｍｇ/Ｌ；硫酸：１.１ｍｇ/Ｌ）：次いで０.５ｍＬ/Ｌのポリプロピレングリコール（０.０２ｍＬ/Ｌ）を添加した。溶解後、ｐＨは調整しなかった。
【０１０８】
滅菌後、８ｇ/Ｌグルコースを前記培養に添加した。１００ｒｐｍの撹拌、無通気で、インキュベーション温度を３５℃に調節した。２４時間後、前記培養（培養、７００ｎｍでＯＤ＝６.３６）を、６５℃にて３５分間の熱処理により不活化し、回収槽に移した。不活化した直後、バイオマスを培地から分離するために前記培養を限外ろ過スキッドに移し、濃縮し、さらに精製水中で塩化ナトリウム（９ｇ/Ｌ）を用いて洗浄した。その回収したバイオマスをアリコート（濃縮細菌懸濁液の質量６００ｇ、濃縮細菌懸濁液グラムあたり６０.７ｍｇのバイオマス乾燥重量）してから、-１５℃にて凍結した。
【０１０９】
実施例１.４：ラクトバチルス・ラムノーサス７１.３８の培養
初期培養条件
次の成分を精製水中に溶解することにより培養培地を調製した：塩化ナトリウム：３ｇ/Ｌ；ナトリウム一水素リン酸：２ｇ/Ｌ；酢酸ナトリウム：１ｇ/Ｌ；大豆ペプトン、５０ｇ/Ｌ；グルコース：１２ｇ/Ｌ；塩化カルシウム：０.１ｇ/Ｌ；塩化カリウム：０.１ｇ/Ｌ；重炭酸ナトリウム：０.５ｇ/Ｌ；ピルビン酸塩：０.１ｇ/Ｌ；グルタマート：０.２ｇ/Ｌ；金属溶液（硫酸銅：３ｍｇ/Ｌ；鉄塩化物：８３０ｍｇ/Ｌ；硫酸亜鉛：８６０ｍｇ/Ｌ；硫酸：１.１ｍｇ/Ｌ）：０.５ｍＬ/Ｌの溶解後ｐＨは調整しなかった。前記培地の滅菌後、小さなエルレンマイヤーフラスコを凍結バイアルの内容物（１.５ｍＬの凍結細菌を含有）で個別に接種し、３５℃にて９時間インキュベートした。次いでこの培養の２０ｍｌアリコートを、１０００ｍＬの培養培地を含有する大きなエルレンマイヤーフラスコに移し、同じ条件下で再びインキュベートした。１５時間の増殖後、１リットルのエルレンマイヤーフラスコの内容物を前発酵槽に移した。
【０１１０】
前発酵槽内の培養条件
次の成分を精製水中に溶解することにより、２０リットルの培養培地を調製した：塩化ナトリウム：３ｇ/Ｌ；ナトリウム一水素リン酸：２ｇ/Ｌ；酢酸ナトリウム：１ｇ/Ｌ；大豆ペプトン、５０ｇ/Ｌ；グルコース：１２ｇ/Ｌ；塩化カルシウム：０.１ｇ/Ｌ；塩化カリウム：０.１ｇ/Ｌ；重炭酸ナトリウム：０.５ｇ/Ｌ；ピルビン酸塩：０.１ｇ/Ｌ；グルタマート：０.２ｇ/Ｌ；金属溶液（硫酸銅：３ｍｇ/Ｌ；鉄塩化物：８３０ｍｇ/Ｌ；硫酸亜鉛：８６０ｍｇ/Ｌ；硫酸：１.１ｍｇ/Ｌ）：次いで０.５ｍＬ/Ｌのポリプロピレングリコール（０.０２ｍＬ/Ｌ）を添加した。溶解後、ｐＨは調整しなかった。１００ｒｐｍの撹拌、無通気で、インキュベーション温度を３５℃に調節した。培養中ｐＨは調整しなかった。９時間後、７リットルを前発酵槽から発酵槽に移した。（９時間後、前発酵槽培養、７００ｎｍでＯＤ：3.75）.滅菌条件下で前発酵槽の培養を発酵槽に移した。
【０１１１】
発酵槽内の培養条件
次の成分を精製水中に溶解することにより、７０リットルの培養培地を調製した：塩化ナトリウム：３ｇ/Ｌ；ナトリウム一水素リン酸：２ｇ/Ｌ；酢酸ナトリウム：１ｇ/Ｌ；大豆ペプトン、５０ｇ/Ｌ；グルコース：１２ｇ/Ｌ；塩化カルシウム：０.１ｇ/Ｌ；塩化カリウム：０.１ｇ/Ｌ；重炭酸ナトリウム：０.５ｇ/Ｌ；ピルビン酸塩：０.１ｇ/Ｌ；グルタマート：０.２ｇ/Ｌ；金属溶液（硫酸銅：３ｍｇ/Ｌ；鉄塩化物：８３０ｍｇ/Ｌ；硫酸亜鉛：８６０ｍｇ/Ｌ；硫酸：１.１ｍｇ/Ｌ）：次いで０.５ｍＬ/Ｌのポリプロピレングリコール（０.０２ｍＬ/Ｌ）を添加した。溶解後、ｐＨは調整しなかった。
【０１１２】
滅菌後、８ｇ/Ｌグルコースを前記培養に添加した。１００ｒｐｍの撹拌、無通気で、インキュベーション温度を３５℃に調節した。１４時間後、前記培養（培養、７００ｎｍでＯＤ＝５.４３）を、６５℃にて３５分間の熱処理により不活化し、回収槽に移した。不活化した直後、バイオマスを培地から分離するために前記培養を限外ろ過スキッドに移し、濃縮し、さらに精製水中で塩化ナトリウム（９ｇ/Ｌ）を用いて洗浄した。その回収したバイオマスをアリコート（濃縮細菌懸濁液の質量２７９８ｇ、濃縮細菌懸濁液グラムあたり５１.７ｍｇのバイオマス乾燥重量）してから、-１５℃にて凍結した。
【０１１３】
実施例１.５：ラクトバチルス・ジョンソニイ１０３７８２の培養
初期培養条件
次の成分を精製水中に溶解することにより培養培地を調製した：塩化ナトリウム：３ｇ/Ｌ；ナトリウム一水素リン酸：２ｇ/Ｌ；酢酸ナトリウム：１ｇ/Ｌ；大豆ペプトン、５０ｇ/Ｌ；グルコース：１２ｇ/Ｌ；塩化カルシウム：０.１ｇ/Ｌ；塩化カリウム：０.１ｇ/Ｌ；重炭酸ナトリウム：０.５ｇ/Ｌ；ピルビン酸塩：０.１ｇ/Ｌ；グルタマート：０.２ｇ/Ｌ；金属溶液（硫酸銅：３ｍｇ/Ｌ；鉄塩化物：８３０ｍｇ/Ｌ；硫酸亜鉛：８６０ｍｇ/Ｌ；硫酸：１.１ｍｇ/Ｌ）：次いで０.５ｍＬ/Ｌのポリプロピレングリコール（０.０２ｍＬ/Ｌ）を添加した。溶解後、ｐＨは調整しなかった。前記培地の滅菌後、小さなエルレンマイヤーフラスコを凍結バイアルの内容物（１.５ｍＬの凍結細菌を含有）で個別に接種し、３３℃にて１０時間インキュベートした。次いでこの培養の２０ｍＬアリコートを、１０００ｍＬの培養培地を含有する大きなエルレンマイヤーフラスコに移し、同じ条件で再びインキュベートした。１４時間の増殖後、１リットルのエルレンマイヤーフラスコの内容物を前発酵槽に移した。
【０１１４】
前発酵槽内の培養条件
次の成分を精製水中に溶解することにより、２０リットルの培養培地を調製した：塩化ナトリウム：３ｇ/Ｌ；ナトリウム一水素リン酸：２ｇ/Ｌ；酢酸ナトリウム：１ｇ/Ｌ；大豆ペプトン、５０ｇ/Ｌ；グルコース：１２ｇ/Ｌ；塩化カルシウム：０.１ｇ/Ｌ；塩化カリウム：０.１ｇ/Ｌ；重炭酸ナトリウム：０.５ｇ/Ｌ；ピルビン酸塩：０.１ｇ/Ｌ；グルタマート：０.２ｇ/Ｌ；金属溶液（硫酸銅：３ｍｇ/Ｌ；鉄塩化物：８３０ｍｇ/Ｌ；硫酸亜鉛：８６０ｍｇ/Ｌ；硫酸：１.１ｍｇ/Ｌ）：次いで０.５ｍＬ/Ｌのポリプロピレングリコール（０.０２ｍＬ/Ｌ）を添加した。溶解後、ｐＨは調整しなかった。１００ｒｐｍの撹拌、無通気で、インキュベーション温度を３５℃に調節した。酢酸を用いて前記培養のｐＨを５.６に調整した。２４時間後、７リットルを前発酵槽から発酵槽に移した。（２４時間後、前発酵槽培養、７００ｎｍでＯＤ：0.47）.滅菌条件下で前発酵槽の培養を発酵槽に移した。
【０１１５】
発酵槽内の培養条件
次の成分を精製水中に溶解することにより、７０リットルの培養培地を調製した：塩化ナトリウム：３ｇ/Ｌ；ナトリウム一水素リン酸：２ｇ/Ｌ；酢酸ナトリウム：１ｇ/Ｌ；大豆ペプトン、５０ｇ/Ｌ；グルコース：１２ｇ/Ｌ；塩化カルシウム：０.１ｇ/Ｌ；塩化カリウム：０.１ｇ/Ｌ；重炭酸ナトリウム：０.５ｇ/Ｌ；ピルビン酸塩：０.１ｇ/Ｌ；グルタマート：０.２ｇ/Ｌ；金属溶液（硫酸銅：３ｍｇ/Ｌ；鉄塩化物：８３０ｍｇ/Ｌ；硫酸亜鉛：８６０ｍｇ/Ｌ；硫酸：１.１ｍｇ/Ｌ）：次いで０.５ｍＬ/Ｌのポリプロピレングリコール（０.０２ｍＬ/Ｌ）を添加した。溶解後、ｐＨは調整しなかった。
【０１１６】
滅菌後、８ｇ/Ｌグルコースを前記培養に添加した。１００ｒｐｍの撹拌、無通気で、インキュベーション温度を３５℃に調節した。２４時間後、前記培養（７００ｎｍでＯＤ＝０.１７４）を、７０℃にて３０分間の熱処理により不活化し、回収槽に移した。不活化した直後、バイオマスを培地から分離するために前記培養を限外ろ過スキッドに移し、濃縮し、さらに精製水中で塩化ナトリウム（９ｇ/Ｌ）を用いて洗浄した。その回収したバイオマスをアリコート（濃縮細菌懸濁液の質量６１.５ｇ、濃縮細菌懸濁液グラムあたり２０.２ｍｇのバイオマス乾燥重量）してから、-１５℃にて凍結した。
【０１１７】
実施例２：細菌可溶化液
実施例２.１
６ｇの細菌乾燥重量を含有する実施例１.１からのラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９のバイオマスを、融解して室温にしてから、１２ｇ/Ｌの細菌バイオマス乾燥重量に達するように精製水で希釈した。アルカリ化を、０.０３Ｍの水酸化ナトリウムで行った。溶解開始時に測定したｐＨは１０.３であった。次いで、連続撹拌下でその溶菌を４０℃にて６時間インキュベートした。インキュベーション後のｐＨは９.９であった。
【０１１８】
実施例２.２
２０ｇの細菌乾燥重量を含有する実施例１.４からのラクトバチルス・ラムノーサス７１.３８のバイオマスを、融解して室温にしてから、４０ｇ/Ｌの細菌バイオマス乾燥重量に達するように精製水で希釈した。アルカリ化を、０.０３Ｍの水酸化ナトリウムで行った。溶解開始時に測定したｐＨは１０.３であった。次いで、連続撹拌下でその溶菌を４０℃にて６時間インキュベートした。インキュベーション後のｐＨは９.７であった。
【０１１９】
実施例２.３
６ｇの細菌乾燥重量を含有する実施例１.１からのラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９のバイオマスを、融解して室温にしてから、１２ｇ/Ｌの細菌バイオマス乾燥重量に達するように精製水で希釈した。アルカリ化を、０.０６Ｍの水酸化ナトリウムで行った。溶解開始時に測定したｐＨは１２.３であった。次いで、連続撹拌下でその溶菌を４０℃にて６時間インキュベートした。インキュベーション後のｐＨは１１.８であった。
【０１２０】
実施例２.４
６ｇの細菌乾燥重量を含有する実施例１.１からのラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９のバイオマスを、融解して室温にしてから、１２ｇ/Ｌの細菌バイオマス乾燥重量に達するように０.２Ｎの塩化ナトリウム溶液で希釈した。塩化ナトリウム溶液の最終濃度は０.１５Ｎであった。溶解開始時に測定したｐＨは６.４であった。次いで、連続撹拌下でその溶菌を４０℃にて６時間インキュベートした。インキュベーション後のｐＨは６.３であった。
【０１２１】
実施例２.５
実施例２.１の可溶化液のアリコートを採取して溶解処理を継続した。２５%の塩酸を用いてその液量をｐＨ３.６に調整してから、水浴中で４０℃にて１時間、静的条件下でインキュベートした。
【０１２２】
実施例２.６
実施例２.４の可溶化液のアリコートを採取して溶解処理を継続した。１０Ｎの水酸化ナトリウムでその液量をｐＨ１２.４に調整してから、水浴中で４０℃にて１時間、静的条件下でインキュベートした。
【０１２３】
実施例２.７
０.４ｇの細菌乾燥重量を含有する実施例１.３からのラクトバチルス・プランタルム７１.３９のバイオマスを、融解して室温にしてから、７ｇ/Ｌの細菌バイオマス乾燥重量に達するように精製水で希釈した。アルカリ化を、０.０６Ｍの水酸化ナトリウムで行った。溶解開始時に測定したｐＨは１２.６であった。次いで、連続撹拌下でその溶菌を４０℃にて２時間インキュベートした。インキュベーション後のｐＨは１２.４であった。
【０１２４】
実施例２.８
０.３ｇの細菌乾燥重量を含有する実施例１.５からのラクトバチルス・ジョンソニイ１０３７８２のバイオマスを、融解して室温にしてから、６ｇ/Ｌの細菌バイオマス乾燥重量に達するように精製水で希釈した。アルカリ化を、０.０６Ｍの水酸化ナトリウムで行った。溶解開始時に測定したｐＨは１２.５であった。次いで、連続撹拌下でその溶菌を４０℃にて２時間インキュベートした。インキュベーション後のｐＨは１２.３であった。
【０１２５】
実施例２.９
０.４ｇの細菌乾燥重量を含有する実施例１.２からのラクトバチルス・ヘルベティカス１０３１４６のバイオマスを、融解して室温にしてから、８ｇ/Ｌの細菌バイオマス乾燥重量に達するように精製水で希釈した。アルカリ化を、０.０６Ｍの水酸化ナトリウムで行った。溶解開始時に測定したｐＨは１２.８であった。次いで、連続撹拌下でその溶菌を４０℃にて２時間インキュベートした。インキュベーション後のｐＨは１２.２であった。
【０１２６】
実施例２.１０
６.８ｇの細菌乾燥重量を含有する実施例１.１からのラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９のバイオマスを、融解して室温にしてから、７ｇ/Ｌの細菌バイオマス乾燥重量に達するように精製水で希釈した。アルカリ化を、０.０８Ｍの水酸化ナトリウムで行った。溶解開始時に測定したｐＨは１２.２であった。次いで、連続撹拌下でその溶菌を４０℃にて７時間インキュベートした。インキュベーション後のｐＨは１２.０であった。塩酸を用いてその溶解のｐＨを９.８に調整した。
【０１２７】
その溶菌が含有した可溶性乾燥重量（ＳＤＷ）：２０.５ｍｇ/ｇ、タンパク質（Ｐｒｏｔ）：４.９ｍｇ/ｇ。
【０１２８】
実施例２.１１
６.８ｇの細菌乾燥重量を含有する実施例１.１からのラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９のバイオマスを、融解して室温にしてから、７ｇ/Ｌの細菌バイオマス乾燥重量に達するように精製水で希釈した。アルカリ化を、０.１５Ｍの水酸化ナトリウムで行った。溶解開始時に測定したｐＨは１３.０であった。次いで、連続撹拌下でその溶菌を４０℃にて６３時間インキュベートした。インキュベーション後のｐＨは１２.６であった。塩酸を用いてその溶解のｐＨを９.９に調整した。
【０１２９】
その溶菌が含有したＳＤＷ：２３.７ｍｇ/ｇ、Ｐｒｏｔ：５.０ｍｇ/ｇ。
【０１３０】
実施例２.１２
９８ｇの細菌乾燥重量を含有する実施例１.１からのラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９のバイオマスを、融解して室温にしてから、１０ｇ/Ｌの細菌バイオマス乾燥重量に達するように精製水で希釈した。アルカリ化を、０.０８Ｍの水酸化ナトリウムで行った。溶解開始時に測定したｐＨは１２.０であった。次いで、連続撹拌下でその溶菌を４０℃にて２４時間インキュベートした。インキュベーション後のｐＨは１１.１であった。水酸化ナトリウムを用いてその溶解のｐＨを１１.５に調整した。
【０１３１】
その溶菌が含有したＳＤＷ：２３.７ｍｇ/ｇ。
【０１３２】
実施例２.１３
３９ｇの細菌乾燥重量を含有する実施例１.１からのラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９のバイオマスを、融解して室温にしてから、７.６ｇ/Ｌの細菌バイオマス乾燥重量に達するように０.２Ｎの塩化ナトリウム溶液で希釈した。溶解開始時に測定したｐＨは４.４であった。次いで、連続撹拌下でその細菌浸透圧可溶化液を４０℃にて２４時間インキュベートした。インキュベーション後のｐＨは４.２であった。次いで、０.０６Ｎに達するように水酸化ナトリウムを添加することで細菌可溶化液をアルカリ性にした。アルカリ溶解開始時測定したｐＨは１０.６であった。連続撹拌下でその溶菌を４０℃にて２.２５時間再インキュベートした。インキュベーション後のｐＨは１０.２であった。
【０１３３】
実施例３：可溶化液（ライセート）の精製
実施例３.１
実施例２.５の可溶化液を３０００ｘ重力で２０分間遠心分離した。次いで、その上清を水酸化ナトリウムでｐＨ６.８１に調整し、０.４５μＭ〜０.２μＭの空隙率を有する連続フィルターによってろ過し、最終的には、０.２２μＭの滅菌フィルターでろ過した。その濃縮物が含有したタンパク質：２.８ｍｇ/ｍＬ；ＤＮＡ：１７.４μｇ/ｍＬ。Ｄ-アミノ酸の割合：１４.９%のＤ-Ala、１４.４%のＤ-Pro、１４.２%のＤ-Asp.
【０１３４】
ｍｇの乾燥重量/ｍＬでは無産生：０.００３ｍｇ/ｍＬ（Ｃ１）-０.０３ｍｇ/ｍＬ（Ｃ２）-０.３ｍｇ/ｍＬ（Ｃ３）の活性乾燥重量/ｍＬ：Ｃ１：３.３μＭ、Ｃ２：３.３μＭ、Ｃ２：５２.５μＭ。活性乾燥重量（ｇ/Ｌまたはｍｇ/ｍＬ単位）＝可溶性乾燥重量（ｇ/Ｌまたはｍｇ/ｍＬ単位）-塩化物含有量（ｇ/Ｌまたはｍｇ/ｍＬ単位）。
【０１３５】
実施例３.２
実施例２.６の可溶化液を３０００ｘ重力で２０分間遠心分離した。次いで、その上清を１０Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ７に調整し、０.４５μＭ〜０.２μＭの空隙率を有する連続フィルターによってろ過し、最終的には、０.２２μｍの滅菌フィルターでろ過した。その濃縮物が含有したタンパク質：１２.３ｍｇ/ｍＬ；ＤＮＡ：２７.７μｇ/ｍＬ。Ｄ-アミノ酸の割合：１５.９%のＤ-Ala、２４.４%のＤ-Pro、１７.４%のＤ-Asp、４５.１%のＤ-Ser、１０.１%のＤ-Met。
【０１３６】
ｍｇの活性乾燥重量/ｍＬでは無産生：０.００３ｍｇ/ｍＬ（Ｃ１）-０.０３ｍｇ/ｍＬ（Ｃ２）-０.３ｍｇ/ｍＬ（Ｃ３）の活性乾燥重量/ｍＬ：Ｃ１：８.０μＭ、Ｃ２：５６.０μＭ、Ｃ３：９４.３μＭ。
【０１３７】
実施例３.３
実施例２.１の３００ｍＬの可溶化液を、先ず、３０００ｘ重力で２０分間遠心分離した。塩酸を用いてその上清をｐＨ７.１に調整した。前記抽出物を、SartoflowRSlice 200 Benchtop Crossflow System上で３３０-３５０ｍＬ/分にて一定流量でポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）（Sartorius Stedim Biotech GmbH）の０.４５μＭ膜によって濃縮した。その収率量は７５%であった。その濃縮物は最終的に、ＰＥＳ膜０.２μＭ（Nalgene）によって滅菌ろ過した。
【０１３８】
その濃縮物が含有したＳＤＷ：３０.０ｍｇ/ｇ；Ｐｒｏｔ：９.６ｍｇ/ｍＬ；ＤＮＡ：３２.８μｇ/ｍＬ。Ｄ-アミノ酸の割合：１４.３%のＤ-Ala、１３.９%のＤ-Pro、１４.１%のＤ-Asp、３６.９%のＤ-Ser。ｍｇの活性乾燥重量/ｍＬでは無産生：０.００３ｍｇ/ｍＬ（Ｃ１）-０.０３ｍｇ/ｍＬ（Ｃ２）-０.３ｍｇ/ｍＬ（Ｃ３）の活性乾燥重量/ｍＬ：Ｃ１：５.１μＭ、Ｃ２：３０.０μＭ、Ｃ３：６４.０μＭ。
【０１３９】
実施例３.４
塩酸を用いて実施例２.２の３００ｍＬの可溶化液をｐＨ７.０に調整した。実施例３.３で説明したように、３５０ｍＬ/分にて一定流量で前記抽出物をろ過した。その収率量は７５%を超えるものだった。その濃縮物を、ＰＥＳ膜０.２μＭ（Nalgene）によって最終的に滅菌ろ過した。
【０１４０】
その濃縮物が含有したＳＤＷ：４９.２ｍｇ/ｇ；Ｐｒｏｔ：１４.２ｍｇ/ｍＬ；ＤＮＡ：３４.１・ｇ/ｍＬ。Ｄ-アミノ酸の割合：１６.０%のＤ-Ala、１３.３%のＤ-Pro、１４.２%のＤ-Asp.
【０１４１】
ｍｇの活性乾燥重量/ｍＬでは無産生：０.００３ｍｇ/ｍＬ（Ｃ１）-０.０３ｍｇ/ｍＬ（Ｃ２）-０.３ｍｇ/ｍＬ（Ｃ３）の活性乾燥重量/ｍＬ：Ｃ１：０μＭ、Ｃ２：４.１μＭ、Ｃ３：２６.３μＭ。
【０１４２】
実施例３.５
実施例２.３の３００ｍＬの可溶化液を、先ず、３０００ｘ重力で２０分間遠心分離した。塩酸を用いてその上清をｐＨ７.１に調整した。実施例３.３で説明したように、３３０〜３５０ｍＬ/分にて一定流量で前記抽出物をろ過した。その収率量は７５%を超えるものだった。その濃縮物は最終的に、ＰＥＳ膜０.２μＭ（Nalgene）によって滅菌ろ過した。
【０１４３】
その濃縮物が含んだＳＤＷ：３４.５ｍｇ/ｇ；Ｐｒｏｔ：８.９ｍｇ/ｍＬ；ＤＮＡ：１６.８μｇ/ｍＬ。Ｄ-アミノ酸の割合：１６.４%のＤ-Ala、２４.３%のＤ-Pro、１７.３%のＤ-Asp.
【０１４４】
ｍｇの活性乾燥重量/ｍＬでは無産生：０.００３ｍｇ/ｍＬ（Ｃ１）-０.０３ｍｇ/ｍＬ（Ｃ２）-０.３ｍｇ/ｍＬ（Ｃ３）の活性乾燥重量/ｍＬ：Ｃ１：３.０μＭ、Ｃ２：３６.４μＭ、Ｃ３：６９.５μＭ。
【０１４５】
実施例３.６
実施例２.１３の１０００ｍＬの可溶化液を９３８４ｘ重力にて２０分間遠心分離した。その上清を０.２２μＭの滅菌フィルターに直接通過させることでろ過した。
【０１４６】
その濃縮物が含有したＳＤＷ：３２.７ｍｇ/ｇ；Ｐｒｏｔ：６.５ｍｇ/ｇ；砂糖：２.４ｍｇ/ｇ。その砂糖濃度は、Herbertらの(Meth. Microbiol, 1971, 5B:266 以下参照)による手順に従って測定した。
【０１４７】
実施例６で説明したように様々な濃度で生物学的活性のスクリーニングをヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）上で行った。０.５ｍｇの活性乾燥重量/ｍＬにて得られた結果はＴＮＦ-α：８３ｐｇ/ｍＬ；ＩＬ６：８９８ｐｇ/ｍＬ；ＩＬ１２：１４０ｐｇ/ｍＬ（１０Ｎｇ/ｍＬのＩＦＮ-γ存在下で）；及びＩＬ１０：２２１ｐｇ/ｍＬ（ＩＦＮ-γ存在下で）であった。
【０１４８】
実施例３.７
実施例２.１０の細菌可溶化液の混合物を、ｐＨを１０.２に調整後に微量ろ過（ＭＦ）槽に移した。前記微量ろ過（ＭＦ）ユニットでは０.４５・Ｍの接線流ろ過（ＴＦＦ）フィルター（Sartocon Slice Sartorius社製）を使用した。そのクロスフローを２９０Ｌ/ｈｍ２（ＬＨＭ）に調整し、膜間差圧（ＴＭＰ）を０.４〜０.５バールに調節した。その透過物を限外ろ過（ＵＦ）槽に移した。
【０１４９】
前記微量ろ過槽内の可溶化液の液量が、その初期液量の半分に達すると、前記ＵＦユニットは始動する。ＵＦフィルターの透過物はＭＦ槽内で洗浄緩衝液として使用される。前記ＭＦ槽とＵＦ槽両方の液量を同一に維持した。１０ダイアフィルトレーション容量後、前記ＵＦを停止し、その細菌可溶化液を前記ＭＦ槽内で濃縮した。その回復容積率は８３%であった。前記ＵＦ槽内に回復された抽出物を塩酸を用いてｐＨ７.３に調整してから、０.２・Ｍの滅菌フィルターによってろ過した。
【０１５０】
その濃縮物が含有したＳＤＷ：１７.５ｍｇ/ｇ；Ｐｒｏｔ：４.３ｍｇ/ｇ.
【０１５１】
実施例３.８
実施例２.７の可溶化液を９３８４ｘ重力で１５分間遠心分離した。次いで、その上清を塩酸でｐＨ７.３に調整し、０.４５μＭ〜０.２・Ｍの空隙率を有する連続フィルターによってろ過し、最終的には、０.２２μＭの滅菌フィルターでろ過した。
【０１５２】
１０倍希釈した産物を伴う末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）：７７７ｐｇ/ｍＬのＩＬ１０、２６ｐｇ/ｍＬのＩＬ１２、１３１８３ｐｇ/ｍＬのＩＬ６。
【０１５３】
実施例３.９
実施例２.８の可溶化液を９３８４ｘ重力で１５分間遠心分離した。次いで、その上清を塩酸でｐＨ７.４に調整し、０.４５μＭ〜０.２μＭの空隙率を有する連続フィルターによってろ過し、最終的には、０.２２μＭの滅菌フィルターでろ過した。
【０１５４】
１０倍希釈した産物を伴うＰＢＭＣ：９０４ｐｇ/ｍＬのＩＬ１０、０ｐｇ/ｍＬのＩＬ１２、４９９５ｐｇ/ｍＬのＩＬ６。
【０１５５】
実施例３.１０
実施例２.９の可溶化液を９３８４ｘ重力で１５分間遠心分離した。次いで、その上清を塩酸でｐＨ７.６に調整し、０.４５μＭ〜０.２μＭの空隙率を有する連続フィルターによってろ過し、最終的には、０.２２μＭの滅菌フィルターでろ過した。
【０１５６】
１０倍希釈した産物を伴うＰＢＭＣ：４７６ｐｇ/ｍＬのＩＬ１０、０ｐｇ/ｍＬのＩＬ１２、４９２４ｐｇ/ｍＬのＩＬ６。
【０１５７】
実施例３.１１
実施例２.１１の可溶化液を、ｐＨを１０.４に調整後にＭＦ槽に移した。そのＴＦＦ設置は実施例３.７に類似した。そのクロスフローを２９０Ｌ/ｈｍ２に調整し、そのＴＭＰを０.４〜０.５バールに調節した。１０ダイアフィルトレーション容量後に前記ＵＦを停止した。その回復容積率は８６%であった。塩酸を用いて最終産物をｐＨ７.３に調整した。
【０１５８】
得られた濃縮物が含有したＳＤＷ：２４.２ｍｇ/ｇ；Ｐｒｏｔ：４.８ｍｇ/ｇ.
【０１５９】
実施例３.１２
実施例２.１２の可溶化液を、ｐＨを１１.５に調整後にＭＦ槽に移した。そのＴＦＦ設置は実施例３.７に類似した。そのクロスフローを２９０Ｌ/ｈｍ２に調整し、そのＴＭＰを０.４バールに調節した。１０ダイアフィルトレーション容量後に前記ＵＦを停止した。その回復容積率は７４%であった。塩酸を用いて最終産物をｐＨ７.２に調整した。
【０１６０】
得られた濃縮物が含有したＳＤＷ：３２.４ｍｇ/ｇ；Ｐｒｏｔ：５.８ｍｇ/ｇ；砂糖：２.３ｍｇ/ｇ.
【０１６１】
実施例６で説明したように様々な濃度で生物学的活性のスクリーニングをヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）上で行った。０.５ｍｇの活性乾燥重量/ｍＬにて得られた結果はＴＮＦ-α：３７ｐｇ/ｍＬ；ＩＬ６：１０９２ｐｇ/ｍＬ；ＩＬ１２：８１ｐｇ/ｍＬ（１０Ｎｇ/ｍＬのＩＦＮ-γ存在下で）；及びＩＬ１０：１６０ｐｇ/ｍＬ（１０Ｎｇ/ｍＬのＩＦＮ-γ存在下で）。ＤＣタンパク質アッセイによりタンパク質濃度を測定した（BioRad、ＤＣタンパク質アッセイ、キット番号５００-０１１６）。マイクロプレートアッセイプロトコルを実行した。解析サンプル（０.１ｍＬ）を１.９ｍＬの２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ１１で希釈した。２ｍｇのＢＳＡ/ｍＬ（ＢＳＡ、ピアス社参照番号２３２１０）にてウシ血清アルブミン溶液を用いてアッセイを行う度にタンパク質標準曲線を調製した。次の濃度を得るため、２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ１１を用いてＢＳＡ溶液を希釈した：０.１８、０.２４、０.３、０.３６〜０.４２ｍｇのＢＳＡ/ｍＬ。サンプル（２０μｌ）及びＢＳＡ標準液（２０μｌ）を清潔で乾燥したマイクロタイタープレートに４通りに添加した。ＤＣタンパク質アッセイキットからの試薬Ａ（２５μｌ）を各ウェルに添加した。１０分間後、２００μｌの試薬Ｂを各ウェルに添加した。前記マイクロタイタープレートを回転振盪機上で５秒間混合した。室温で２０分間放置した後、７５０ｎｍで吸光度を記録した。各サンプルのタンパク質濃度を前記タンパク質標準曲線上の線形回帰の勾配を利用して計算した：
７５０ｎｍでＯＤ=ａ*（タンパク質濃度）+ｂ
サンプル中タンパク質（ｍｇ）=［２０ｘ（７５０ｎｍでＯＤ-ｂ）］/ａ
【０１６２】
可溶性乾燥重量（ＳＤＷ）を、溶解してから１０５℃にて陶器皿で一定の質量に乾燥する結果として生じる５ｍＬの可溶性画分を取得することによって定量した。
【０１６３】
実施例４：ｉｎ-ｖｉｔｒｏにおけるマウス脾細胞の活性化
本発明の実施形態における免疫賦活作用を、マウス脾細胞の活性化を測定することにより、ｉｎ-ｖｉｔｒｏで測定した（Alamar blue アッセイ）。
【０１６４】
材料と方法
脾細胞の刺激
Alamar blue（商標）アッセイは、ヒト細胞または動物細胞の増殖を定量的に測定することを目的に設計されている。このアッセイには、細胞増殖の結果として生じる化学的還元に応答する酸化還元（ＲＥＯＸ）指標による代謝活性の検出に基づく蛍光定量的/比色定量的増殖指標が組み込まれている。増殖に関連するＲＥＯＸ指標は、酸化（非蛍光性、青色）型から還元（蛍光性、赤色）型への変化を引き起こす。
【０１６５】
マウスＢａｌｂ/ｃマウス（雌、６〜８週齢）をCharles River Laboratories（ドイツ、スールフェルト）から入手し、頸椎脱臼により屠殺した。脾臓をポッターエルベージェムホモジナイザーを用いてホモジナイズした；細胞懸濁液を遠心分離（２８０ｘ重力、４℃にて１０分間）により洗浄し、５%のＦＣＳ、１００Ｕ/ｍＬのペニシリン及び１００μｇ/ｍＬのストレプトマイシンを含有する５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０中で再懸濁した。１００μｌの脾細胞（２ｘ１０6/ｍＬ）を、９６-ウェルプレート（Falcon３０７２）中で５０μｌの細菌抽出用希釈液及び細胞培地中の５%の二酸化炭素を用いて３７℃にて４８時間インキュベートした。
【０１６６】
培地と１：１の割合で希釈した３０μｌのAlamar blue（商標）溶液添加後、５４４ｎｍの励起と５９０ｎｍの発光波長で、Fluoroskan Ascent Reader （ドイツ・フランクフルトのThermoLabsystems社）を用いてAlamar blue（商標）の化学的還元を測定した。
【０１６７】
試験物質
次の抽出物を試験した：
【０１６８】
ＡＦｅｒ３００：実施例３.５で説明したように得られたラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９（１２ｇ/Ｌ）からの抽出物（３１.６ｍｇの活性乾燥重量/ｇ）；
【０１６９】
ＣＦｅｒ３００：実施例３.３で説明したように得られたラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９（１２ｇ/Ｌ）からの抽出物（２８.４ｍｇの活性乾燥重量/ｇ）；
【０１７０】
ＤＦｅｒ３００：実施例２.４で説明したように得られ、かつ、実施例３.３と同じ条件で精製したラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９（１２ｇ/Ｌ）からの抽出物（２９.５ｍｇの活性乾燥重量/ｇ）。この実施例は非アルカリ溶解対照として使用した。
【０１７１】
ＡＲａｈｒ３００：０.０３Ｍの水酸化ナトリウムを用いて４０℃にて６時間のアルカリ溶解法により得られるラクトバチルス・ラムノーサス７１.３８（４０ｇ/Ｌ）からの抽出物（４９.３ｍｇの活性乾燥重量/ｇ）；
【０１７２】
ＣＲａｈｒ３００：実施例３.４で説明したように得られたラクトバチルス・ラムノーサス７１.３８（４０ｇ/Ｌ）からの抽出物（４６.４ｍｇの活性乾燥重量/ｇ）；
【０１７３】
ＤＲａｈｒ３００：０.１５Ｎの塩化ナトリウム溶液中で浸透圧ストレスにより、４０℃にて６時間溶解されたラクトバチルス・ラムノーサス７１.３８（４０ｇ/Ｌ）からの抽出物（４６.２ｍｇの活性乾燥重量/ｇ）。この実施例は非アルカリ溶解対照として使用した。
【０１７４】
陰性対照
蒸留水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）。
結果
脾細胞活性化を定量するｉｎ-ｖｉｔｒｏ研究
前記抽出物による治療後のマウス脾細胞の代謝活性の増加を、Alamar blueアッセイによる２つの独立した実験で定量した（図４ａ及び４ｂを参照）。
【０１７５】
前記抽出物の存在下で脾細胞を４８時間培養した。Alamar blueR溶液の添加後、発光値を測定した。図４ａ〜図４ｂに示すように、前記細菌抽出物はおよそ１：３００の希釈度において効果的であった。スチューデントのｔ検定を用いて、すべての群を対照群に対して統計学的に比較した。
【０１７６】
【表１】
2012502026.tif 000002
【０１７７】
結論
Alamar blueアッセイを用いてマウス脾細胞の活性化を測定することによりｉｎ-ｖｉｔｒｏで細菌抽出物の免疫賦活作用を測定した。ここで、２つの独立した実験において、発明者らは、浸透圧溶解により得られた、無傷の粒子状細胞壁成分を含む抽出物（ＤＦｅｒ３００）と、本発明に係る２つの抽出物（ＡＦｅｒ３００及びＣＦｅｒ３００）とを比較した。これら３つの抽出物はラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９から得た。前記ＡＦｅｒ３００抽出物、ＣＦｅｒ３００抽出物、及びＤＦｅｒ３００抽出物は、１：３００の希釈度で前記細胞の代謝を刺激する上でそれぞれ効果的であった。発明者らは、前記ＤＦｅｒ３００浸透圧溶解対照と、前記ＡＦｅｒ３００及びＣＦｅｒ３００との間には差異がないことを観察した。
【０１７８】
また、発明者らは、第２菌株、ラクトバチルス・ラムノーサス７１.３８から得られた３つの抽出物を比較した（ＡＲａｈｒ３００、ＣＲａｈｒ３００、ＤＲａｈｒ３００）。前回のセットと同様、ＡＲａｈｒ３００及びＣＲａｈｒ３００は本発明の範囲内にある一方、ＤＲａｈｒは浸透圧溶解対照である。ここで、前記ＡＲａｈｒ３００抽出物は、１：３００の希釈度で２つの独立したアッセイにおいて効果的であった一方、前記ＣＲａｈｒ３００及びＤＲａｈｒ３００抽出物は低い効果を示したが、同じ希釈度で、前記２つのアッセイのうちの１つでは有意な刺激性を示した。すべての６つの抽出物の結果の比較でも、脾細胞の増殖を刺激する上で、前記ラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９の抽出物が前記ラクトバチルス・ラムノーサス７１.３８の抽出物に比較して、より効果的であることを示した。
【０１７９】
実施例５：骨髄由来のマクロファージによる一酸化窒素の産生
本発明に係る一連の実施形態の免疫賦活可能性を、マウス骨髄由来のマクロファージを用いて一酸化窒素（ＮＯ）の産生量を測定することにより試験を行った。
【０１８０】
材料と方法
６週齢の雄Ｃ５７/ＢＬ６マウス（６週齢の雄、ＳＰＦ品質、フランスのCharles Rivier製）を二酸化炭素吸入により死滅させた。その尻、大腿、及び後肢からの脛骨を除去した。両端部を切断後、骨を介してダルベッコ改変イーグル培地（ＤＨ）を注入することにより骨髄を内腔から抽出した。洗浄後、前記幹細胞を、２０%のウマ血清と３０%Ｌの９２９細胞上清で補足したＤＨ培地中で再懸濁（４００００細胞/ｍＬ）した。その細胞懸濁液を、８%の二酸化炭素と飽和雰囲気下で、インキュベーター内で３７℃にて８日間インキュベートした。次いで、氷冷のＰＢＳを用いてマクロファージを分離し、洗浄し、５%のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、アミノ酸及び抗生物質（ＤＨＥ培地）で補足したＤＨ培地中で再懸濁した。その細胞密度を７０００００細胞/ｍＬに調整した。前記抽出物の水溶液を、マイクロタイタープレート中で直接にDHE培地中に連続的に希釈した。本発明の抽出物を３通りに試験し、前記培地を含む各マイクロタイタープレートを陰性対照とした。各ウェル中の最終液量は１００μｌであった。１００μｌの前記細胞懸濁液を前記希釈した抽出物に添加し、８%の二酸化炭素と水分飽和雰囲気下で、その細胞をインキュベーター内で３７℃にて２２時間インキュベートした。そのインキュベーション期間の終わりに、１００μｌの上清を別のマイクロタイタープレートに移し、各上清で産生した亜硝酸塩濃度を、グリース反応を実行することにより定量した。２.５%の水性リン酸中の１００μｌのグリース試薬（５ｍｇ/ｍＬのスルファニルアミド+０.５ｍｇ/ｍＬのＮ-（１-ナフチル）エチレン-ジアミン塩酸塩）を各ウェルに添加した。マイクロタイタープレートを、６９０ｎｍの参照に対して５６２ｎｍにて分光光度計（SpectraMax Plus、Molecular Devices社製）を用いて、読み込んだ。前記亜硝酸塩濃度は、形成されている一酸化窒素含有量に比例した。前記亜硝酸塩含有量を、亜硝酸ナトリウムの標準曲線に基づいて定量した（１〜７０μＭのＮａＮＯ２）。結果を、平均値±標準偏差としてμＭ単位の一酸化窒素（ＮＯ）で示し、用量反応曲線としてプロットした。
【０１８１】
試験物質
次の抽出物を試験した：
【０１８２】
第１アッセイ：
ＯＰ０７０１Ｂ４_ＣＦｅｒ３００：実施例３.３で説明したように得られたラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９（１２ｇ/Ｌ）からの抽出物；
【０１８３】
ＯＰ０７０１Ｂ４_ＤＦｅｒ３００：実施例２.４で説明したように得られ、実施例３.３と同じ条件で精製したラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９（１２ｇ/Ｌ）からの抽出物。この実施例は非アルカリ溶解対照として使用した。
【０１８４】
ＯＰ０７０１Ｂ４_ＣＲａｈｒ３００：実施例３.４で説明したように得られたラクトバチルス・ラムノーサス７１.３８（４０ｇ/Ｌ）からの抽出物
【０１８５】
ＯＰ０７０１Ｂ４_ＤＲａｈｒ３００：４０℃にて６時間の０.１５Ｎの塩化ナトリウム溶液中における浸透圧ストレスにより得られたラクトバチルス・ラムノーサス７１.３８（４０ｇ/Ｌ）からの抽出物。この実施例は非アルカリ溶解対照として使用した。
【０１８６】
第２アッセイ：
ＯＰ０７０１Ｃ_１０ｇ０.５Ｐ４Ｈ：４０℃にて４時間インキュベートした０.０３７Ｍの水酸化ナトリウムを伴う１０ｇ/Ｌのバイオマス乾燥重量におけるラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９からの抽出物。
【０１８７】
ＯＰ０７０１Ｃ_１０ｇ１Ｐ４Ｈ：４０℃にて４時間インキュベートした０.０７５Ｍの水酸化ナトリウムを伴う１０ｇ/Ｌのバイオマス乾燥重量におけるラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９からの抽出物。
【０１８８】
ＯＰ０７０１Ｃ_１０ｇ２Ｐ４Ｈ：４０℃にて４時間インキュベートした０.１５０Ｍの水酸化ナトリウムを伴う１０ｇ/Ｌのバイオマス乾燥重量におけるラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９からの抽出物。
【０１８９】
ＯＰ０７０１Ｃ_１０ｇ１Ｐ２１Ｈ：４０℃にて２１時間インキュベートした０.０７５Ｍの水酸化ナトリウムを伴う１０ｇ/Ｌのバイオマス乾燥重量におけるラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９からの抽出物。
【０１９０】
ＯＰ０７０１Ｃ_１０ｇ０.５Ｐ２１Ｈ：４０℃にて２１時間インキュベートした０.０３７Ｍの水酸化ナトリウムを伴う１０ｇ/Ｌのバイオマス乾燥重量におけるラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９からの抽出物。
【０１９１】
ＯＰ０７０１Ｃ_１０ｇ２Ｐ２１Ｈ：４０℃にて２１時間インキュベートした０.１５０Ｍの水酸化ナトリウムを伴う１０ｇ/Ｌのバイオマス乾燥重量におけるラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９からの抽出物。
【０１９２】
ＯＰ０７０１Ｃ_１０ｇ２Ｐ４５Ｈ：４０℃にて４５時間インキュベートした０.１５０Ｍの水酸化ナトリウムを伴う１０ｇ/Ｌのバイオマス乾燥重量におけるラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９からの抽出物。
【０１９３】
第１アッセイの結果
第１アッセイ（図５ａ）では、本発明に従ってアルカリ溶解法から得られた抽出物が浸透圧溶解から得られた抽出物と同じ活性を備えていることを観察した。
【０１９４】
発明者らはまた、前記免疫刺激活性が選択された菌株に関係付けられたことも観察した。前記ラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９から得られた抽出物は、前記菌株ラクトバチルス・ラムノーサス７８.３１から得られた抽出物よりも多くのＮＯ２及びＮＯ３の産生量を誘導した。
【０１９５】
第２アッセイの結果
第２アッセイ（図５ｂ）では、発明者らは、前記抽出物のｉｎ-ｖｉｔｒｏ活性はその溶解の初期条件と相関することを観察した。次の細菌抽出物の活性は、同じ菌株ラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９に対して示され、溶解の同量の１０ｇのバイオマス乾燥重量/リットルに対しても示される：ＯＰ０７０１Ｃ_１０ｇ０.５Ｐ４Ｈ、ＯＰ０７０１Ｃ_１０ｇ１Ｐ４Ｈ、ＯＰ０７０１Ｃ_１０ｇ２Ｐ４Ｈ、ＯＰ０７０１Ｃ_１０ｇ１Ｐ２１Ｈ、ＯＰ０７０１Ｃ_１０ｇ０.５Ｐ２１Ｈ、ＯＰ０７０１Ｃ_１０ｇ２Ｐ２１Ｈ、及びＯＰ０７０１Ｃ_１０ｇ２Ｐ４５Ｈ。前記ｉｎ-ｖｉｔｒｏ活性は、水酸化ナトリウムの初期濃度と溶解期間に応じて異なる。
【０１９６】
結論
これらの実験の結果は、アルカリ処理によって生成された化学修飾にかかわらず、前記実施形態の活性は、浸透圧溶解により得られるａａ対照抽出物と比較して、または前記各生細菌と比較して低下しないことを示した（この態様については下の実施例６を参照）。
【０１９７】
実施例６：炎症性と抗炎症活性に対するｉｎ-ｖｉｔｒｏスクリーニング
本発明の実施形態の免疫賦活または抗炎症の可能性をｉｎ-ｖｉｔｒｏでスクリーニングするために、試験を一連の細菌抽出物でヒトＰＢＭＣで行った。Foligneらにより説明された通り、ＩＬ１２ｐ７０（炎症性のサイトカイン）とＩＬ１０（抗炎症性のサイトカイン）の両方の発光を測定し、前記ＩＬ１０/ＩＬ１２比率を報告した。(World J Gastroenterol（２００７年１月１４日）；13(2)：236-243).
【０１９８】
その狙いは、様々な抽出/精製方法を介して得られた６つの抽出物で、ＩＬ１２ｐ７０とＩＬ１０の産生量を比較することであった。各抽出物ごとに得られた前記ＩＬ１０/ＩＬ１２ｐ７０の比率は、前記抽出物の抗炎症の可能性と相関し得る。生細菌を対照として使用し、それに対して前記抽出物（２ｘ１０７ｃｆｕ/ｍｌのラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９）の活性を比較した。
【０１９９】
材料と方法
段階的な量の前記６つの細菌抽出物を、１０Ｎｇ/ｍｌのＩＦＮ-μ（ＩＬ１２ｐ７０の産生を増強させることが分かっているサイトカイン）存在下で細胞培地中で希釈し、初期用量１ｍｇ/ｍｌから投与を開始した（試験済みの最高最終用量）。健康なドナーの血液から単離したＰＢＭＣを、１００Ｎｇ/ｍｌ〜１ｍｇ/ｍｌの活性乾燥重量抽出物の連続希釈として試験を行った。
【０２００】
可溶化液や生細菌の菌株を培地に入れる少なくとも３時間前にＩＦＮ-μを添加した。２つの独立した実験からのデータが報告されている。
【０２０１】
ヒトＰＢＭＣの調製
ＰＢＭＣを抹消液から分離した。短時間に、フィコール勾配遠心分離（Pharmacia製、スウェーデン・ウプサラ）後、単核細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地（Live technologies製、スコットランド・ペイズリー）で洗浄し、ゲンタマイシン（１５０・ｇ/ｍＬ）、Ｌ-グルタミン（２ｍｍｏｌ/Ｌ）、及び１０%の胎児子ウシ血清（ＦＣＳ）（Gibco-BRL製）で補足したＲＰＭＩ１６４０中で２・１０6細胞/ｍＬに調整した。
【０２０２】
サイトカインの誘導
ＰＢＭＣ（２×１０6細胞/ｍＬ）を２４-ウェル組織培養プレート（Corning製、米国ニューヨーク）に播種した。細胞は上記のようにを刺激した。５%の二酸化炭素を含む空気の雰囲気で３７℃にて２４時間の刺激後、その培養上清を回収し、遠心分離により精製し、サイトカイン分析を行うまで-２０℃にて保存した。製造元の推奨事項に従って、サイトカインをＩＬ１０とＩＬ１２ｐ７０に対して、Pharmingen抗体ペア（BD Biosciences製、米国カリフォルニア・サンホセ）を用いてＥＬＩＳＡ法で測定した。
【０２０３】
試験物質
ＯＰ０７０１Ｃ_１０ｇ２Ｐ４５Ｈ（Ａ）：ラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９溶解からの抽出物。１０ｇのバイオマス乾燥重量/リットル（溶解）、０.１５Ｍの水酸化ナトリウムで４０℃にて４５時間。
【０２０４】
ＯＰ０７０１Ｃ_１０ｇ１Ｐ４Ｈ（Ｂ）：ラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９溶解からの抽出物。１０ｇのバイオマス乾燥重量/リットル（溶解）、０.０７５Ｍの水酸化ナトリウムで４０℃にて４時間。
【０２０５】
ＯＰ０７０１Ｃ_５Ｇ４Ｐ２１Ｈ（Ｃ）：ラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９溶解からの抽出物。５ｇのバイオマス乾燥重量/リットル（溶解）、０.３００Ｍの水酸化ナトリウムで４０℃にて２１時間。
【０２０６】
ＯＰ０７０１Ｃ_４０ｇ０.５Ｐ４Ｈ（Ｄ）：ラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９溶解からの抽出物。４０ｇのバイオマス乾燥重量/リットル（溶解）、０.０３７Ｍの水酸化ナトリウムで４０℃にて６時間。
【０２０７】
ＯＰ０７０１Ｂ４_ＣＦｅｒ１５０（Ｅ）：実施例３.１で説明したように得られたラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９（１２ｇ/Ｌ）からの抽出物。
【０２０８】
ＯＰ０７０１Ｂ４_ＢＦｅｒ３００（Ｆ）：ラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９溶解からの抽出物。６ｇのバイオマス乾燥重量/リットル（溶解）、０.０７５Ｍの水酸化ナトリウムで４０℃にて６時間。
【０２０９】
ラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９、２０%のグリセロール中の２ｘ１０7ｃｆｕ/ｍｌで-８０℃にて凍結された生細菌。
【０２１０】
結果
この試験の狙いは、本発明の実施形態の免疫賦活または抗炎症の可能性を、生のラクトバチルス菌株とｉｎ-ｖｉｔｒｏで比較することであった。様々な抽出物及び前記生細菌を分析するために、ＰＢＭＣから放出された各サイトカインＩＬ１０及びＩＬ１２の量を比較しただけではなく、ＩＬ１０/ＩＬ１２の比率も比較した。
【０２１１】
ＩＬ１０またはＩＬ１２の濃度のいずれか、または両濃度値が、非刺激濃度（すなわち、１０ｐｇ/ｍｌ未満）に近い場合、その比率は計算可能と認められず、Ｎ．Ｃ．（非計算値）と標識した。
【０２１２】
ｐｇ/ｍｌで表現されたＰＢＭＣから得た結果を表２と表３に示す。
ＩＦＮμの存在下で、本発明の６つの細菌抽出物（抽出物Ａ〜抽出物Ｆ）の作用を、ヒトＰＢＭＣ（ＩＬ１０及びＩＬ１２ｐ７０反応、ｐｇ/ｍｌ単位）でラクトバチルス・ファーメンタムの生形態（２ｘ１０7細菌/ｍｌ、生サンプル１及び生サンプル２として２回試験済み）と比較した。ＩＬ１０/ＩＬ１２の比率は、１００μｇ/ｍｌ及び１ｍｇ/ｍｌの抽出物用量に対してのみ報告される。
【０２１３】
【表２】
2012502026.tif 000003
ＩＦＮμの存在下で、本発明の６つの細菌抽出物（抽出物Ａ〜抽出物Ｆ）の作用を、ヒトＰＢＭＣ（ＩＬ１０及びＩＬ１２ｐ７０反応、ｐｇ/ｍｌ単位）でラクトバチルス・ファーメンタムの生形態（２ｘ１０7細菌/ｍｌ、生サンプル１及び生サンプル２として２回試験済み）と比較した。ＩＬ１０/ＩＬ１２の比率は、１００μｇ/ｍｌ及び１ｍｇ/ｍｌの抽出物用量に対してのみ報告される。
【０２１４】
【表３】
2012502026.tif 000004
【０２１５】
表２及び表３に提示した結果に基づき、ＩＬ１０の産生量は次の順序で減少していた：
Ｂ≒Ｅ≒Ｄ＞Ｆ＞生のラクトバチルス＞Ａ＞Ｃ
【０２１６】
表２及び表３に提示した結果に基づき、ＩＬ１２の産生量は次の順序で減少していた：
生のラクトバチルス＞Ｅ＞Ｂ＞Ｄ＞Ｆ＞Ａ＞Ｃ
【０２１７】
前記比率を検討すると、次の一般的なパターンが観察された：
Ｂ≒Ｄ＞Ｅ≒Ｆ＞生のラクトバチルス
【０２１８】
抽出物Ａと抽出物ＣのＩＬ１０/ＩＬ１２比率結果は、これらの抽出物がサイトカインの効果的な誘導剤でないことがわかったため、示されていない。
【０２１９】
１００μｇ/ｍｌ以下の濃度では、サイトカイン濃度が低すぎて結論を出すことができないことが観察された。
【０２２０】
結論
得られた比率は、実施例６で使用された実験的条件下では、本発明の一部の細菌抽出物の免疫調節作用が生のラクトバチルス・ファーメンタムの同作用よりも大きいことを示唆し得る。例えば、抽出物Ｂ、Ｄ、Ｅ、及びＦは、生細菌対照よりも高いＩＬ１０/ＩＬ１２ｐ７０比率を示した。かくして、かかる抽出物は、生のプロバイオティック菌よりも、炎症性条件などの本明細書に記載した条件に対して活性である。
【０２２１】
実施例７：Ｔｏｌｌ様受容体に対する作用
本発明の実施形態は、グラム陽性菌から得られ、従っては、ＴＬＲ２受容体を介して作用すると考えられる。ＴＬＲ受容体は、主として、限定するものではないが、単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞などの免疫細胞によって発現され、微生物産物の重要なセンサーであり、宿主によって危険信号として認識されることができ、非特異的免疫をトリガーするが、ＴＬＲ活性化は、完全な免疫学的カスケードを開始し、その結果、抗原の存在下で、獲得免疫を育成する。
【０２２２】
所与の機能的ＴＬＲ遺伝子を発現する細胞は、ＴＬＲ認識またはシグナル伝達に関与するメカニズムの研究や新しい潜在的な治療薬の開発などの多くのアプリケーションに貴重なツールである。下記の実験では、免疫応答の重要なアダプターで、３つの細菌抽出物の活性を試験した。
【０２２３】
材料と方法
本発明の抽出物の反応を、次の２つの細胞システムで試験を行った（アゴニスト作用を確認するか、またはＴＬＲ２アゴニストＰａｍ３Ｃｙｓの存在下、またはＴＬＲ４アゴニストＬＰＳの存在下で拮抗活性の確認を行うかのいずれか）：
ａ）ＨＥＫ-ＴＬＲ２/６（２４時間後にＩＬ８のＥＬＩＳＡ）
ｂ）ＨＥＫ-ＭＤ２-ＴＬＲ４-ＣＤ１４（２４時間後にＩＬ８のＥＬＩＳＡ）
【０２２４】
ａ）ＨＥＫ-ＴＬＲ２/６
ＨＥＫ２９３細胞株を、ＴＬＲ遺伝子の無発現または低い基底発現レベルに基づいて選択した。これらの細胞は、ＩＬ８滴定や、ＴＬＲ誘導されたＮＦ-μＢ活性を監視するレポーターベースシステムなどのＥＬＩＳＡ分析を用いて、ＴＬＲ活性の効率的な監視を可能にする。
【０２２５】
ＨＥＫ-ＴＬＲ２/６細胞（Invivogen製、フランス・トゥールーズ）は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ６、及びシグナル伝達カスケードを認識するかまたは関与する遺伝子を含むＴＬＲ２/６経路からの複数の遺伝子で安定的にトランスフェクトされ、高度技術を駆使したＨＥＫ２９３細胞である。これらの細胞はＴＬＲ２/６刺激後にＩＬ８を分泌する。実験は製造者の指示に従って行った。
【０２２６】
短時間に、２ｘ１０4細胞/ウェル（２００ｕｌのＲＰＭＩ）を３７℃にて３日間インキュベートした（５%の二酸化炭素下）。前記培地を除去し、９０μＬのＲＰＭＩ+５%のＦＣＳを前記ウェルに添加した。次いで、前記アゴニストと対照を添加した（１０μｌ/ウェル）。前記細胞をインキュベーターに戻して２４時間インキュベートした。その上清を回収し、製造者の指示に従ってＩＬ８のＥＬＩＳＡを行った。
【０２２７】
試験物質
ＯＰ０７０１Ｂ４_ＡＦｅｒ５０：ラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９溶解からの抽出物。１２ｇのバイオマス乾燥重量/リットル（溶解）、０.０７５Ｍの水酸化ナトリウムで４０℃にて４時間、実施例３.６で説明したように精製。
【０２２８】
ＯＰ０７０１Ｃ-Ｂｔ１ＬＡＣ：実施例３.７で説明したように得られたラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９からの抽出物。
【０２２９】
ＯＰ０７０１Ｃ-Ｂｔ２ＬＡＣ：実施例３.１１で説明したように得られたラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９からの抽出物。
【０２３０】
結果：ＩＬ８の分泌
対照（陰性=ＬＰＳＫ１２超純粋、ＴＬＲ４アゴニスト；及びＰＡＭ３ＣＳＫ４=陽性、ＴＬＲ２アゴニスト）の結果を表４〜６に示した。この結果（ｐｇ/ｍｌ単位のＩＬ８で表現した）は対照で刺激した２４時間後にＥＬＩＳＡによって定量されたＩＬ８の分泌平均値を示す。
【０２３１】
細胞株ＨＥＫＴＬＲ２/６はＴＬＲ２アゴニストＰａｍ３Ｃｙｓに対して反応した。それとは対照的に、大腸菌（ＬＰＳＫ１２）からのＴＬＲ４アゴニストは、０.０１μｇ/ｍｌという高用量でさえも不活性であった。
【０２３２】
３つの細菌抽出物のみの実験
試験を行った３つの細菌抽出物（ＯＰ０７０１Ｂ４Ａｆｅｒ５０、ＯＰ０７０１Ｃ-Ｂｔ１ＬＡＣ、及びＯＰ０７０１Ｃ-Ｂｔ２ＬＡＣ）はＴＬＲ２アゴニストＰａｍ３Ｃｙｓよりも高い免疫賦活特性を示した。
【０２３３】
３つの細菌抽出物+Ｐａｍ３Ｃｙｓの実験
前述の通り、前記３つの細菌抽出物は、抽出直後に添加したＰａｍ３Ｃｙｓと対比して、推定拮抗性または添加物の特性に関しても試験を行った。
細菌抽出物ＯＰ０７０１Ｂ４_ＡＦｅｒ５０
【０２３４】
【表４】
2012502026.tif 000005
表４の結果は、前記ＯＰ０７０１Ｂ４_ＡＦｅｒ５０抽出物が高濃度のＩＬ８（アゴニスト（ＴＬＲ２/６））産生を誘導したことを指摘する。
細菌抽出物ＯＰ０７０１Ｃ-Ｂｔ１ＬＡＣ
【０２３５】
【表５】
2012502026.tif 000006
表５の結果は、前記ＯＰ０７０１Ｃ-Ｂｔ１ＬＡＣ抽出物が高濃度のＩＬ８（アゴニスト（ＴＬＲ２/６））の産生を誘導したことを指摘する。
細菌抽出物ＯＰ０７０１Ｃ-Ｂｔ２ＬＡＣ
【０２３６】
【表６】
2012502026.tif 000007
【０２３７】
結論
アルカリ溶解法（バイオマス乾燥重量の初期濃度、初期塩基濃度及び塩基処理期間）の条件にもよるが、前記細菌抽出物は様々なモードの作用を有し得る。
【０２３８】
ＯＰ０７０１Ｂ４_ＡＦｅｒ５０及びＯＰ０７０１Ｃ-Ｂｔ１ＬＡＣはアゴニスト（ＴＬＲ２/６）であったが、同細菌菌株に強力なアルカリ溶解法を用いると、拮抗的なＴＬＲ２/６活性が得られた（ＯＰ０７０１Ｃ-Ｂｔ２ＬＡＣ）。
【０２３９】
ｂ）ＨＥＫ-ＴＬＲ４-ＭＤ２-ＣＤ１４
ＴＬＲ４は、敗血症性ショックの原因であるリポ多糖類（ＬＰＳ）の認識に関与する主要な受容体であることから広範に研究された。
【０２４０】
ＨＥＫ-ＴＬＲ４-ＭＤ２-ＣＤ１４細胞は、ＬＰＳに対して非常に敏感であり、ＴＬＲ４、ＭＤ２及びＣＤ１４遺伝子及びＮＦ-μＢ-誘導レポーターシステムによるＨＥＫ２９３細胞の安定したトランスフェクションにより得た。これらの細胞はＩＬ８を分泌する。
【０２４１】
同実験手順は、上記の他のＨＥＫ細胞株のＴＬＲ２/６にも採用した。試験した対照と本発明の３つの細菌抽出物の結果は表７-９に示した。
【０２４２】
結果：ＩＬ８の分泌
対照（陽性=ＬＰＳＫ１２Ｃ超純粋、ＴＬＲ４アゴニスト；及びＰＡＭ３ＣＳＫ４=陰性、ＴＬＲ２アゴニスト）の結果は表７-９に示した。この結果（ｐｇ/ｍｌ単位のＩＬ８で表現した）は、対照で刺激した２４時間後のＩＬ８の分泌平均値を示す。
【０２４３】
前記細胞株は、ＴＬＲ４アゴニストＬＰＳＫ１２のみに対して明らかに反応した。それとは対照的に、予想通り、Ｐａｍ３ＣｙｓからのＴＬＲ２アゴニストは、０.０１μｇ/ｍｌという高用量でさえも不活性であった。
【０２４４】
３つの細菌抽出物のみの実験
予想通り、グラム陽性菌アゴニスト、試験を行った３つの細菌抽出物（ＯＰ０７０１Ｂ４Ａｆｅｒ５０：表７、ＯＰ０７０１Ｃ-Ｂｔ１ＬＡＣ：表８、及びＯＰ０７０１Ｃ-Ｂｔ２ＬＡＣ：表９）は、ＴＬＲ４経路を介して明らかな免疫賦活特性を示さなかった。
【０２４５】
３つの細菌抽出物+ＬＰＳＫ１２の実験
前述の通り、本発明の３つの抽出物は、抽出直後に添加したＬＰＳと対比して、推定拮抗性または添加物の特性に関しても試験を行った。再び、ＴＬＲ４受容体の濃度ではいかなる作用も観察されなかった（表７-９）。
細菌抽出物ＯＰ０７０１Ｂ４_ＡＦｅｒ５０
【０２４６】
【表７】
2012502026.tif 000008
この結果は、前記ＯＰ０７０１Ｂ４_ＡＦｅｒ５０抽出物がＴＬＲ４受容体（Ｐａｍ３Ｃｙｓ：１３８ｐｇ/ｍＬ）を活性化しなかったことを示す。
細菌抽出物ＯＰ０７０１ＣＢｔ１-ＬＡＣ
【０２４７】
【表８】
2012502026.tif 000009
細菌抽出物ＯＰ０７０１ＣＢｔ２-ＬＡＣ
【０２４８】
【表９】
2012502026.tif 000010
結論
総合すれば、ＨＥＫ細胞、及びヒトＰＢＭＣ細胞で得られた分泌物に関するこの結果は、ＡＦｅｒ５０及びＢｔ１ＬＡＣが、ＴＬＲ２経路を介して免疫系を刺激できることを示唆する。また、Ｂｔ２ＬＡＣは、ＴＬＲ２/６アンタゴニストとして機能し得る。それゆえ、本発明に係る抽出物は、ＴＬＲ２経路を介して免疫系を刺激することや、ＴＬＲ２/６アンタゴニストとしての機能を果たすこともできるため、ｉｎ-ｖｉｖｏで抗感染活性や抗炎症活性に相関する。
【０２４９】
実施例８：
所与の機能的ＴＬＲ遺伝子を発現する細胞は、ＴＬＲ認識またはシグナル伝達に関与するメカニズムの研究や新しい潜在的な治療薬の開発などの多くのアプリケーションに貴重なツールである。従って、これらの免疫応答の重要なアダプターで、４つの細菌抽出物の活性を試験することが下記の実験の狙いであった。
この試験では、本発明に係る抽出物を含む４つの細菌抽出物に対して、８ＴＬＲ受容体とＮＯＤ２受容体をスクリーニングした。
【０２５０】
方法
本発明に係る細菌抽出物を９６ウェルマイクロプレートで試験した。前記抽出物をＤＭＥＭ培地で希釈し、各希釈の２０μｌを２通りに試験した。ＤＭＥＭ培地+１０%のＦＣＳ（各ＴＬＲに特異的な、ＮＦ-ｋＢの制御下でレポーター遺伝子分泌アルカリホスファターゼを有する１個のＨＥＫ２９３細胞株）中、２５０００または５００００の細胞を含有する１８０μｌ液量のＨＥＫ２９３細胞懸濁液を２通りに各ウェルに添加した。各細胞株の１６時間のインキュベーション後、２０〜５０μｌの各上清を９６ウェルマイクロプレートに移し、２００μｌのQuantiblue（Invivogen番号REP-QB1）で完了した。細胞株を発現する様々な系列のＴＬＲに対し、分泌されたアルカリホスファターゼとの酵素反応を３０〜６０分行った。６３０ｎｍでマイクロプレートリーダーを用いて読み出しを行った。結果は、６３０ｎｍでのＯＤで表現した。
【０２５１】
物質
このスクリーニングアッセイで使用した陽性対照アゴニスト（及びそれらのそれぞれの濃度）のリスト
ＴＬＲ ＰＡＭ２ １００Ｎｇ/ｍｌ；ＴＬＲ３ポリ（Ｉ：Ｃ）１００Ｎｇ/ｍｌ；ＴＬＲ４大腸菌Ｋ１２ＬＰＳ １μｇ/ｍｌ；ＴＬＲ５ネズミチフス菌フラジェリン１μｇ/ｍｌ；ＴＬＲ７ Ｒ８４８ １０μｇ/ｍｌ；ＴＬＲ８ Ｒ８４８ １０μｇ/ｍｌ；ＴＬＲ９ＣｐＧ ＯＤＮ ２００６ １０μｇ/ｍｌ；ＮＯＤ２ムラミルジペプチド１μｇ/ｍｌ。
【０２５２】
陰性対照
レポーター遺伝子のみ（ＮＦｋＢ）の組換え体ＨＥＫ-２９３細胞株を、ＴＬＲ細胞株の陰性対照として使用した。各クローンごとの陰性対照値は、これらの非誘導クローンのバックグラウンドシグナルであった。ＴＮＦ-痾を、細胞株を発現するこの非ＴＬＲの陽性対照として使用した。
【０２５３】
試験物質
次の細菌抽出物を試験した：
【０２５４】
ＯＰ０７０１Ｂ４_ＣＦｅｒ３００：実施例３.３で説明したように得られたラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９（１２ｇ/Ｌ）からの抽出物（Ｆ）；
【０２５５】
ＯＰ０７０１Ｂ４_ＣＲａｈｒ３００：実施例３.４で説明したように得られたラクトバチルス・ラムノーサス７１.３８（４０ｇ/Ｌ）からの抽出物（Ｇ）；
【０２５６】
ＯＰ０７０１Ｄ_１０Ｌ１ＰｓｗｉｔｃｈＡ：実施例３.１２で説明したように得られたラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９（１０ｇ/Ｌ）からの抽出物（Ｉ）；及び
【０２５７】
ＯＰ０７０１Ｄ_５ＬＯＳＭＯＣｏｎｃ：０.１６Ｎの塩化ナトリウム溶液中、対照として４０℃にて２４時間の浸透圧ストレスにより得られる浸透圧溶解ラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９（７.６ｇ/Ｌ）からの抽出物（Ｈ）。
【０２５８】
細菌抽出物の調整
２００μｌの反応液量中で、試験しようとする２０μｌの各サンプルを使用してすべての細胞株を刺激した。
【０２５９】
単一濃度、通常０.５ｍｇの乾燥重量/ｍＬでスクリーニングを行った。試験を２通りに行った。
【０２６０】
結果
前記細菌抽出物と対照を、所与のＴＬＲまたはＮＯＤ２タンパク質だけではなくＮＦｋＢプロモーターで駆動されるレポーター遺伝子も機能的に発現する組換え体ＨＥＫ-２９３細胞株上で２通りに試験した。ＴＬＲとＮＯＤ２の活性化の結果は、光学密度（ＯＤ）値で示す。その結果は、表１０-１４に示し、表１５に要約した。
細菌抽出物Ｆ（ＯＰ０７０１Ｂ４ＣＦｅｒ３００）
【０２６１】
【表１０】
2012502026.tif 000011
細菌抽出物Ｆは、ｈＴＬＲ２、ｈＴＬＲ４及びｈＮＯＤ２を特異的に活性化し、より少ない程度でｈＴＬＲ５も活性化した。
細菌抽出物Ｇ（ＯＰ０７０１Ｂ４ＣＲａｈｒ３００）
【０２６２】
【表１１】
2012502026.tif 000012
細菌抽出物Ｇは、ｈＴＬＲ２、ｈＮＯＤ２を活性化し、かなり少ない程度ではｈＴＬＲ４も活性化した。
細菌抽出物Ｈ（ＯＰ０７０１Ｄ_５ＬＯＳＭＯＣｏｎｃ）
【０２６３】
【表１２】
2012502026.tif 000013
細菌抽出物Ｈは、ｈＴＬＲ２、ｈＴＬＲ４及びＮＯＤ２を特異的に活性化した。
細菌抽出物Ｉ（ＯＰ０７０１Ｄ_１０Ｌ１ＰｓｗｉｔｃｈＡ）
【０２６４】
【表１３】
2012502026.tif 000014
細菌抽出物Ｉは、ｈＴＬＲ２、ｈＴＬＲ５、ｈＮＯＤ２を強力に活性化し、より少ない程度では、ｈＴＬＲ４とｈＴＬＲ９を活性化する。
【０２６５】
【表１５】
2012502026.tif 000015
かくして、本発明に係る細菌抽出物は、様々なＴＬＲ、さらにはＮＯＤ２を介して前記免疫系の活性化に役立ち得る。従って、本発明の抽出物は、免疫応答の優れた活性化因子であり得る。
【０２６６】
抽出物Ｈを抽出物Ｇ及び抽出物Ｆと比較すると、本発明に係る抽出物が浸透圧溶解から得られた抽出物と同じＴＬＲ経路とＮＯＤ経路を有することが明らかになる。抽出物Ｈと抽出物Ｉを比較すると、発明者らは、酸溶解を添加してからアルカリ溶解を添加することにより、前記ＴＬＲ５経路が活性化され、ＴＬＲ９経路もより少ない程度ではあるが活性化されることを観察し得る。弱アルカリ処理の結果として生じる抽出物Ｆでさえも、抽出物Ｈとは対照的に、ＴＬＲ５経路の活性化を示した。
【０２６７】
抽出物Ｉは、ＴＬＲ５に作用し、放射線治療における適用の可能性を示した。実際、放射線療法は、定評のある療法であり、特定の種類の癌の治療に極めて効果的であり、その副作用は、健康な体細胞、特に骨髄細胞及び消化管細胞を破壊できることから破壊的である。Burdelyaらは、ＣＢＬＢ５０２ペプチドがＴＬＲ５に結合し、癌細胞が細胞死を回避するために頻繁に活性化する核因-・Ｂシグナル伝達経路を活性化することを細菌報告した(Burdelyaらの"An agonist of toll-like receptor 5 has radioprotective activity in mouse and primate models," Science, 2008, 320:226-30)。致死量の全身照射に暴露される直前にＣＢＬＢ５０２で治療を受けたマウスとアカゲサルは、健康な骨髄細胞や消化器細胞への損傷が少なく、対照よりも有意に長く生存することを示した。重要なことは、担癌マウスでは、ＣＢＬＢ５０２が放射線療法の抗腫瘍効果を損なわなかったことである。
【０２６８】
実施例９：マウスにおいて斑形成細胞（ヒツジ赤血球に対して）を生成する抽出物の能力
斑形成細胞（ＰＦＣ）技術は、Ｂリンパ球の非特定刺激の評価を可能にする。この技術は、CunninghamとSeenbergによって初めて説明された(Immunology, 1968, 14, 599)。溶血性抗体が抗体形成細胞周囲に存在することは下記の通り実証された。マウスリンパ系細胞だけではなく、外来（ヒツジ）赤血球の稠密母集団も、顕微鏡のスライドに同時導入された。特定のリンパ系細胞は、拡散し、補体存在下で溶解斑を形成することで隣接赤血球溶解の原因となる溶血性抗体を発光させる。本実験の終わりに、既報告のto１０6細胞または脾細胞あたりのＰＦＣ数を測定した。
【０２６９】
材料と方法
試験物質
実施例３.５で説明したように得られた細菌抽出物１、及び実施例３.４で説明したように得られた細菌抽出物２。
【０２７０】
動物
４０雄Ｂａｌｂ/ｃマウス/実験(IFFA-CREDO, St. Germain sur l'Arbresle、フランス)、５〜６週齢、平均体重２０+/-２ｇを５つの群に分け、各群あたり８匹とした。
【０２７１】
実験計画
動物は次の通り、５つの群に分けた：
群（ａ）  マウス８匹、給餌量１.２ｍｇ/マウス、実施例３.５で説明したように得られた抽出物１；液量=０.２ｍｌ
群（ｂ）  マウス８匹、給餌量０.６ｍｇ/マウス、実施例３.５で説明したように得られた抽出物１。
群（ｃ）  マウス８匹、給餌量１.２ｍｇ/マウス、実施例３.４で説明したように得られた抽出物２；液量=０.２ｍｌ
群（ｄ）  マウス８匹、給餌量０.６ｍｇ/マウス、実施例３.４で説明したように得られた抽出物２；液量=０.２ｍｌ
群（ｅ）  マウス８匹、給餌量０.２ｍｌの等張食塩水
【０２７２】
マウスに上記の抽出物を上記の用量で毎日経口投与（経口経路を介して）、５日間連続（第１日目〜第５日目）。２つの挿管を１９日目と２０日目に追加した。２９日目に、０.２ｍｌの等張食塩水（０.９%塩化ナトリウム、アルセバー液）中の抗原（１０6ヒツジ赤血球）を静脈内注入した（動物の尾静脈経由）；その４日後（３３日目）に脾細胞懸濁液を調製した。
試薬と設備機器
アルセバー液、エンドトキシンフリー（Sigma, 38299 St Quentin Fallavier, Cedex France, ref. A 3351）
イーグル基礎培地（BME、１０倍濃度）、炭酸鉛フリーのアール液(Bio-Merieux, 69280 Marcy l'Etoile, France ref: 8 210 2)
凍結乾燥モルモット血清(Bio-Merieux, Marcy l'Etoile, France ref: 7 212 2)
ヒツジ赤血球(Bio-Merieux, Marcy l'Etoile, France ref: 7214 1)
トリパンブルー、滅菌蒸留水、塩化ナトリウム０.９%、組織ホモジナイザー、遠心分離機、ノイバウアー室（細胞、ガラスチューブ用）
【０２７３】
試験物質または対照物質での治療
対照動物にはヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）のみを与えた。他の動物群には、前述の細菌抽出物を経口投与した。この目的のために、各抽出物を水に溶解した。
【０２７４】
脾細胞懸濁液
最後の抗原（ＳＲＢＣ）注入の４日間後、次の手順で各マウスごとに脾細胞懸濁液を調製した：
【０２７５】
動物はをエーテルで麻酔し、次いで頸椎脱臼により屠殺した。脾臓を除去し、ガラス組織ホモジナイザーで粉砕した（２ｍｌのＢＭＥ中、ｐＨ６.７５〜６.８０）。次いで、３ｍｌの滅菌蒸留水を添加し、その混合物を２０秒間攪拌した。得られた懸濁液をさらに１０ＢＭＥで希釈し、４℃、１２００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した。その上清を廃棄し、その沈殿物を２ｍｌのＢＭＥで懸濁した。その細胞を氷上で５〜１０分間は回復させた。その単核細胞の生細胞数を次のように測定した：
【０２７６】
細胞懸濁液のアリコートの１/２０の希釈液を、トリパンブルーの０.１%溶液を含有する生理食塩液で調製した。無色細胞、すなわち前記生細胞をノイバウアー室で計数した。
【０２７７】
その細胞懸濁液は、計数中に融解氷に保持し、計数後直ちに溶菌斑に使用した。この手法は、計数時間が長すぎる場合の生存率の低下を防止する。
【０２７８】
スライドの調整
通常の顕微鏡スライドを用い、入念に除塵し、いかなる微量の脂肪も除去し、３片の両面テープ（厚さ０.１ｍｍ）を約１.５ｃｍ間隔で平行に貼り付ける。その３片の両面テープを事前清浄されたカバーガラス（２２ｍｍｘ２２ｍｍ）で覆い、前記スライドと前記カバーガラスとの間に２つの「チャンバ」を形成する。
【０２７９】
前記脾細胞懸濁液の画分を１ｍｍ３あたり２５,０００の単核細胞に調整した。小さなガラスチューブでは、次の要素（記載の順序で添加する）からなる混合物を自動ピペットによって調製した：
１）７.５ｍｌのＢＭＥ
２）０.５ｍｌのＳＲＢＣ懸濁液（生理食塩液で洗浄し、２回遠心分離した。残基５０%）
３）０.４ｍｌの正常モルモット血清（補体源として使用）
【０２８０】
最終的に、５０μｌの前記脾細胞懸濁液（２５,０００細胞/ｍｍ３）を２００μｌの前記混合物に添加した。均質化後、パラフィンで開放側面を密閉する前に、毛管現象で前記懸濁液を「Cunningham Chambers」に導入した。次いで、そのスライドを、３７℃にて乾燥器内の湿潤室に入れた。
【０２８１】
講義
乾燥器内で１時間のインキュベーション後、前記スライドを顕微鏡で審査した（拡大率１００倍：接眼レンズ１０倍、対物レンズ１０倍）。
【０２８２】
その溶菌斑を容易に認識した。各スライド上で５片の垂直光ストリップを審査し、溶解斑数を計数した。１０6細胞あたりの直接溶解斑を形成する細胞数（N）を外挿によって計算した。ｘが観察した斑数で、Ｘが審査した細胞数の場合、直接溶解斑数は次の式で求められる：
ｎ=（ｘ/Ｘ）*１０6
ここで、Ｘ=Ｃ*Ｖ=Ｃ*（ｎ*ｅ*ｌ*Ｌ）
Ｃ=脾細胞の最終濃度
Ｖ=観察した液量
ｎ=光ストリップ数
ｅ=接着テープ厚
Ｉ=光フィールド幅
Ｌ=光ストリップ長
【０２８３】
１０6細胞あたり直接溶解斑数を次の方程式から得た：
ＰＦＣ（１０6細胞あたり）=（ｘ*１０6）/（Ｃ*ｎ*ｅ*Ｉ*Ｌ）
【０２８４】
脾臓あたりの細胞回収数を知ることにより、脾臓あたりの溶解斑を形成する細胞数を演繹することが可能である。
【０２８５】
「絶対参照」マウスでは、自発性溶解斑は観察されなかった。
【０２８６】
統計分析と結果
ｐ<０.０５の場合、結果が有意であると認められる（スチューデントのｔ検定）。結果を表１６に示した。
【０２８７】
【表１６】
2012502026.tif 000016
本発明の抽出物は、１.２ｍｇ/マウス/日または０.６ｍｇ/マウス/日の濃度で試験される場合、Ｂ細胞活性化因子であるよう思われる。わずかな用量依存性効果が観察された。それゆえ、本発明の一部の抽出物を用いて、反復性感染に苦しむ患者においてその免疫系を刺激する可能性もあり得る。
【０２８８】
実施例１０：Ｂａｌｂ/ｃマウスにおける腹腔内ネズミチフス菌感染症に対するＣＦｅｒ３００の効果
ネズミチフス菌に感染したマウスの保護を、経口投与後にラクトバチルス属由来の細菌可溶化液により試験した。
【０２８９】
材料と方法
動物及び畜産
Ｂａｌｂ/ｃマウスを、モスクワの免疫研究所に施設に収容した。ｉｎ-ｖｉｖｏ保護実験のため、Stolbovaya、Russian State Scientific Centre for Biomedical Technologies (Russian Academy of Medical Sciences)から、非近交系研究室グレードの白ネズミを購入した。入荷直後のマウスの体重は１２〜１４ｇであった。全実験を通して、標準的な齧歯類の食事と水で、マウスを無菌状態に維持した。
【０２９０】
研究群（主な実験）
２つの群（群あたり２２匹のマウス）を使用して、ネズミチフス菌感染マウスの実験モデルを用いて調製した細菌抽出物の抗感染症効果を試験した。
【０２９１】
第１群はＣＦｅｒ３００溶液を経口投与することで治療し、第２群は、陰性対照として偽治療（水）を与えた。
【０２９２】
すべてのマウスをネズミチフス菌に暴露する前の連続１０日間に０.５ｍｌの前記溶液を各マウスに１日１回経口投与した：
群１：単回用量２ｍｇ（０.５ｍｌ）のＣＦｅｒ３００を経口投与して治療したマウス。
群２：１０日間にわたって毎日０.５ｍｌの水を経口投与して偽治療したマウス。
【０２９３】
試験物質
試験した細菌抽出物はＯＰ０７０１Ｂ４ＣＦｅｒ３００（「ＣＦｅｒ３００」）；実施例３.３で説明したように得られたラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９（１２ｇ/Ｌ）からの抽出物（２８.４ｍｇの活性乾燥重量/ｇ）であった。
【０２９４】
予備実験
予備実験の目的は、細菌への暴露（チャレンジ）後３週間でおよそ５０%の死亡率を誘導する感染因子の用量を定量的に決定することであった。チャレンジとして、サルモネラ菌、血清型サルモネラ菌株４１５(I. Mechnikov, Institute for Vaccines and Sera, Russian Academy of Medical Sciences)の懸濁液を各マウスの腹腔内に注入した。チャレンジ用量は、マウスあたり１０３〜１０５ＣＦＵのサルモネラとした。
【０２９５】
観察と死亡記録
前記チャレンジ後、マウスを実験動物の標準条件下に維持した。感染後２１日間、日々の観察と死亡記録を記録した。製剤の抗感染症効果を、各実験群ごとに計算された感染後の生存率（ＳＲ）、感染後の平均寿命（ＡＤＬ）、防御率（ＤＦ）、及び製剤有効性指数（ＥＩ）、に基づいて推定した。前記ＳＲは、感染後２１日目の実験群において生存する動物の割合とした。前記ＡＤＬ、ＤＦ、及びＥＩは次の通り計算した：
ＡＤＬ=（Ｘ１+Ｘ２+．．．+Ｘｎ）/Ｎ
ここで：
ＡＤＬは、平均寿命、
Ｘ１〜Ｘｎは、実験マウス１〜ｎの感染後の寿命期間であり、
Ｎは、実験群における動物の合計数である。
ＤＦ=ＣＤ/ＥＤ
ここで：
ＤＦは防御率、
ＣＤは対照群における死亡率、及び
ＥＤは実験群における死亡率である。
ＥＩ=［（ＤＦ-１）/ＤＦ］ｘ１００%
ここで：
ＥＩは製剤有効性指数、及び
ＤＦは防御率である。
【０２９６】
結果：薬剤耐性
前記製剤は、１０日間にわたって１日１回経口投与し、薬剤耐性は良好であった。毒性または副作用の兆候は、１０日間の前治療中に観察されなかった。
【０２９７】
サルモネラ菌の滴定
予備実験は、およそ５０%の死亡率を結果としてもたらすネズミチフス菌のチャレンジ用量を決定するために行った。その結果を表１７に示した。
【０２９８】
【表１７】
2012502026.tif 000017
下線を引いた数字は、各日数（感染後）ごとに死亡が発見された動物数を表す。
【０２９９】
結論
得られたデータに基づいて、１０5ＣＦＵのネズミチフス菌菌株４１５（６７%の死亡動物、太字）を後続する研究で利用する用量として選択した。
【０３００】
主な実験：ＣＦｅｒ３００で治療したマウスのチャレンジ（細菌への暴露）
１０日間にわたって、ＣＦｅｒ３００製剤（ｎ=２２）で前治療を施したマウス、水（ｎ=２２）を与えた対照群のマウスを、前治療終了の１日後にチャレンジ（細菌暴露）した。
【０３０１】
ネズミチフス菌の懸濁液をマウスあたり１０5ＣＦＵのチャレンジ用量で腹腔内投与した。感染後２１日間にわたって経過観察を行った。各群の死亡率を表１８に示した。
【０３０２】
【表１８】
2012502026.tif 000018
イタリック体の数字は、各日数（感染後）ごとに死亡が発見された動物数を表す。これらのデータを用いてＳＲ、ＡＤＬ、ＤＦ及びＥＩを算出した（表１９）。
【０３０３】
【表１９】
2012502026.tif 000019
水で前治療を施した対照群では、観察期間中（２１日間）の生存率は５５%、及びＡＤＬは１４.７日間であった。２ｍｇ/日の用量でＣＦｅｒ３００は保護作用を示し、ＳＲ=７３%及びＡＤＬ=１７.１日間、ＤＦ=１.６７及びＥＩ=４０%であった。
【０３０４】
要約すれば、ＣＦｅｒ３００の１０日間にわたる１日あたりの単回投与量２ｍｇの経口投与は、ネズミチフス菌に感染したマウスに部分保護を提供した。この実施例に示すように、または以前にｉｎ-ｖｉｔｒｏ及びｅｘ-ｖｉｖｏで示したように、本発明で開示されている抽出物は今後の治療薬剤開発に有用であり得る。
【０３０５】
実施例１１：ＬＡＣＫ誘導喘息モデルにおける２つのラクトバチルス抽出物の効果
本発明の２つの実施形態を、経口投与後にアレルゲン誘導喘息のマウスモデルにおいて試験した(JuliaらのImmunity, 2002, 16:271-283)。
【０３０６】
材料と方法
動物及び畜産
６週齢の雌Ｂａｌｂ/ｃＢｙＪマウスを、フランス・ジャンバーから購入し、標準条件下に維持し、給餌した。
【０３０７】
研究群
合計２７匹のマウスを、次の通りに４つの群分けた：
群Ａ：未治療で、ＬＡＣＫ感作及び生理食塩液チャレンジマウス；ＬＡＣＫは、寄生虫リーシュマニアからのタンパク質である（マウス数４匹）。
群Ｂ：未治療のＬＡＣＫ感作及びチャレンジマウス（マウス数８匹）
群Ｃ：ＯＭ-１００９Ａ-治療（投与あたり８ｍｇの乾燥重量残基）、ＬＡＣＫ感作及びチャレンジマウス（マウス数８匹、）
群Ｄ：ＯＭ-１００９Ｂ-治療（投与あたり８ｍｇの乾燥重量残基）、ＬＡＣＫ感作及びチャレンジマウス（マウス数７匹）
【０３０８】
試験物質または対照物質による治療とスケジュール
マウスを３日目から２２日目まで治療した。０日目と７日目に２ｍｇのalum３存在下１０・ｇのＬＡＣＫでマウスを腹腔内注射（ｉ.ｐ.）にて感作した。１７〜２１日目に、マウスを１日あたりＬＡＣＫ溶液（０.１５%）の２０分間エアロゾルチャレンジさせるか（群Ｂ、群Ｃ、及び群Ｄ）、または対照として生理食塩液（群Ａ）を与えた。２２日目には、メタコリン吸入直後にＡＨＲを発生するマウスの能力を分析した。２３日目には、マウス屠殺し、肺炎症を評価した。
【０３０９】
方法論
マウスを上記のように３回治療的に処置した。カニューレを気管に挿入して出血させ、個々のマウスの洗浄（灌流）を行った。１ｍｌの温めたＰＢＳで肺臓を３回洗浄した。細胞をＰＢＳで洗浄し、３００μｌ中で再懸濁し、さらにBurker-Turkチャンバを用いて計数した。ＢＡＬ中細胞百分率を得るため、サイトスピン製剤を作り、ライト・ギムザ染色液で染色した。試験群は次の通りである：ＬＡＣＫ感作及びＰＢＳチャレンジ野生型（ｗｔ）マウス（対照）、ＬＡＣＫ感作及びチャレンジｗｔウス（喘息動物）、ＯＭ-１００９Ａ-処置ｗｔウス、及びＯＭ-１００９Ｂ-処置ｗｔウス。ＢＡＬ中の全細胞数を、ライト・ギムザ染色液で染色したサイトスピン製剤の顕微鏡検査により定量した。
【０３１０】
治療マウスで気道炎症の軽減が観察されたので、（結果を参照）、肺抽出物を調製し、ＩＬ４、ＩＬ５、及びＩＬ１３を多重分析（ＣＢＡアレイ）により定量化した。
【０３１１】
試験物質
試験した２つの細菌可溶化液は次の通りである：実施例３.７で説明したように得られたラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９からのＯＭ-１００９Ａ抽出物、及び実施例３.１１で説明したように得られたラクトバチルス・ファーメンタムＩ-３９２９からのＯＭ-１００９Ｂ抽出物。
【０３１２】
結果
ａ）気道過敏性
２２日目には、メタコリン吸入直後にＡＨＲを発生するマウスの能力を各用量ごとに分析した。この結果は図５で報告されており、ＰＢＳ未治療の非喘息群に類似するＯＭ-１００９-Ｂが基底Ｐｅｎｈ値を修復したことを示す。ＯＭ-１００９-Ａは、取得したＰｅｎｈ値が非喘息対照群で観察された値よりもさらに低かったため、さらに効率的であった。
【０３１３】
ｂ）気管支肺胞における全細胞数と細胞百分率
２３日目には、マウス屠殺し、肺炎症を評価した。ＢＡＬ中の全細胞数は表２０で報告されており（右カラム）、さらに細胞百分率は次の通りである：好酸球数（Ｅｏ）、好中球数（Ｎｅｕｔｒｏ）、リンパ球数（Ｌｙｍｐｈｏ）、及び他の細胞数（Ｏｔｈｅｒ）。
【０３１４】
【表２０】
2012502026.tif 000020
【０３１５】
両抽出物ともＢＡＬ中の全細胞数が有意に減少した（群Ｂと比較すると、ｐ<０.０１（ＯＭ-１００９Ａ）；及びｐ<０.０３（ＯＭ-１００９Ｂ））。好酸球数はそれぞれ３倍〜１.７倍減少した。好中球数はそれぞれ１.８倍〜３.６倍減少した。好酸球数と好中球数の減少は、前記抽出物で前治療を施した動物のＢＡＬ中炎症細胞濃度の低下を示す。
ｃ）Ｔｈ２サイトカインは、肺臓中に抽出物を検出して多重分析により定量化した（ＣＢＡアレイ）
【０３１６】
【表２１】
2012502026.tif 000021
【０３１７】
【表２２】
2012502026.tif 000022
【０３１８】
【表２３】
2012502026.tif 000023
【０３１９】
Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ４、ＩＬ５、及びＩＬ１３）濃度は、喘息対照群（Ｂ）と比較すると、ＯＭ-１００９Ａ抽出物により減少したが、ＯＭ-１００９Ｂ抽出物によっては減少しなかった。それゆえ、強塩基処理（ＯＭ-１００９-Ｂ）により得られる細菌抽出物は、中等度の塩基処理下で得られる細菌抽出物（ＯＭ-１００９-ａ）よりも低活性であり得る。たとえ、両抽出物ともにＰｅｎｈ因子アッセイにおいて活性があっても（図６）、アレルギー疾患やアトピー、またはその徴候などのＴｈ２関連疾患に関連する状態の治療または予防には、ＯＭ-１００９ＡがＯＭ-１００９Ｂよりも優れた候補であり得る。
【０３２０】
2012502026.tif 000024
【図１ａ】
2012502026.tif 000025
【図１ｂ】
2012502026.tif 000026
【図２】
2012502026.tif 000027
【図３】
2012502026.tif 000028
【図４ａ】
2012502026.tif 000029
【図４ｂ】
2012502026.tif 000030
【図５】
2012502026.tif 000031
【図６】
2012502026.tif 000032
【国際調査報告】
2012502026.tif 000033
2012502026.tif 000034
2012502026.tif 000035