(57)【要約】  本発明は、前立腺がんの診断方法、特にＬＧ、すなわち予後が良好な個体；ＨＧ、すなわち原発性腫瘍の予後が不良な個体；ＰｒＣａ  Ｍｅｔ、すなわち予後が不良で転移を有する個体；およびＣＲＰＣ、すなわち急速進行性の限局性疾患を患う、予後が不良な個体の診断方法に関する。具体的には、本発明はヒト個体において前立腺がんの有無を確定する方法であって、ａ）前記ヒト個体を起源とする試料においてＲＲＭ２、ＨＯＸＣ６、ＴＧＭ４、ＲＯＲＢ、ＨＯＸＤ１０、ＳＦＲＰ２及びＳＮＡＩ２からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を決定するステップと、ｂ）前立腺種瘍細胞若しくは前立腺腫瘍組織を含まない前記ヒト個体、又は前立腺がんを患っていない個体を起源とする試料における前記１以上の遺伝子それぞれの発現と比較して、前記１以上の遺伝子の発現のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを確定するステップと、ｃ）前記１以上の遺伝子のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションの確定に基づき前立腺がんの有無を確定するステップとを含む、方法に関する。
2012504397.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト個体において前立腺がんの有無を確定する方法であって、
ａ）前記ヒト個体を起源とする試料においてＲＲＭ２、ＨＯＸＣ６、ＴＧＭ４、ＲＯＲＢ、ＨＯＸＤ１０、ＳＦＲＰ２及びＳＮＡＩ２からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を決定するステップと、
ｂ）前立腺腫瘍細胞若しくは前立腺腫瘍組織を含まない前記ヒト個体、又は前立腺がんを患っていない個体を起源とする試料における前記１以上の遺伝子それぞれの発現と比較して、前記１以上の遺伝子の発現のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを確定するステップと、
ｃ）前記１以上の遺伝子のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションの確定に基づき前立腺がんの有無を確定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記方法がｅｘ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１以上の遺伝子の発現を決定するステップが、ｍＲＮＡ発現を決定することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記１以上の遺伝子の発現を決定するステップが、タンパク質レベルを決定することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記１以上が、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上及び７からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ヒト個体において前立腺がんの有無を確定するステップが、低悪性度ＰｒＣａ（ＬＧ）、高悪性度ＰｒＣａ（ＨＧ）、ＰｒＣａ  Ｍｅｔ及び／又はＣＲＰＣ、好ましくはＣＲＰＣを同定又は診断することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ヒト個体において前立腺がんの有無を確定するための、ＲＲＭ２、ＨＯＸＣ６、ＴＧＭ４、ＲＯＲＢ、ＨＯＸＤ１０、ＳＦＲＰ２及びＳＮＡＩ２からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現分析の使用。
【請求項８】
前記発現分析がｅｘ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記１以上が、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上及び７からなる群から選択される、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１０】
ヒト個体において前立腺がんの有無を確定するための部品のキットであって、
ＲＲＭ２、ＨＯＸＣ６、ＴＧＭ４、ＲＯＲＢ、ＨＯＸＤ１０、ＳＦＲＰ２及びＳＮＡＩ２からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を決定するための発現分析手段と、
使用説明書と、
を含む、部品のキット。
【請求項１１】
前記発現分析手段が、ｍＲＮＡ発現分析手段、好ましくはＰＣＲ、ｒｔＰＣＲ又はＮＡＳＢＡのための手段を含む、請求項１０に記載の部品のキット。
【請求項１２】
前記発現分析手段が、タンパク質発現分析手段、好ましくはＥＬＩＳＡ又は免疫組織化学的技法を含む、請求項１０に記載の部品のキット。
【請求項１３】
前記１以上が、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上及び７からなる群から選択される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の部品のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺がんの診断方法、特に低悪性度（ＬＧ）前立腺がん、すなわち予後が良好な個体；高悪性度（ＨＧ）前立腺がん、すなわち原発性腫瘍の予後が不良な個体；ＰｒＣａ  Ｍｅｔ、すなわち予後が不良で転移を有する個体；並びに去勢抵抗性の前立腺がん（ＣＲＰＣ）、すなわち内分泌療法を受けても進行性であり、急速進行性の限局性疾患を患う、予後が不良な個体の診断方法に関する。本発明はさらに前立腺がんを診断するための指定の遺伝子の発現の使用及び前立腺がんを診断するための部品のキットに関する。
【０００２】
欧米の男性集団において、前立腺がんは重大な公衆衛生学上の問題になっている。多くの先進国では、前立腺がんは最も一般的に診断される悪性腫瘍というだけでなく、男性におけるがん関連死の２番目に多い死因でもある。前立腺がんの罹患率は年齢とともに増大するため、新たに診断される症例の数は一般集団の平均余命の増大とともに上昇し続けている。米国ではおよそ１９３，０００人の男性及び、欧州連合ではおよそ１８３，０００人の男性が毎年新たに前立腺がんと診断されている。
【０００３】
疫学研究により、前立腺がんが進行の遅い疾患であり、前立腺がんが原因で死亡する男性よりも前立腺がんを患いながら死亡する男性が多いことが示されている。しかしながら、かなりの割合の腫瘍が急速進行性であり、結果として１年でおよそ３５，８００人のアメリカ人男性及びおよそ８０，０００人のヨーロッパ人男性がこの疾患で死亡している。
【０００４】
高い死亡率は、転移性の前立腺がんに効果的で治癒的な治療の選択肢がないゆえの結果である。一般的にアンドロゲン除去が転移性疾患の男性における最適な治療である。初期では、進行性疾患の患者の７０％〜８０％が治療法に応答を示すが、時間が経つにつれて腫瘍の大部分がアンドロゲン非依存性になるのが観察され、去勢抵抗性段階とも称される（従前は耐ホルモン性段階と称された）。結果として、ほとんどの患者が進行性疾患を発症する。
【０００５】
現在、前立腺がんの去勢抵抗性段階での効果的な治療は存在しない。７０％を超える去勢抵抗性患者が死亡率の主な原因である有痛性骨転移を患う。
【０００６】
根治的前立腺切除術及び放射線療法は、前立腺がんに対する治癒的な治療選択肢であるが、それらの治癒可能性は解剖学的に限局性の疾患に限定される。そのため疾患が前立腺に限局している場合、前立腺がんの早期検出が重要となる。前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は、２０年以上前に発見されて以来、前立腺がんの検出、病期分類及びモニタリングにおける最も価値のあるツールである。
【０００７】
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は前立腺腫瘍マーカーとして広く認められているが、前立腺組織特異的であるものの、前立腺がん特異的ではないことが知られている。ＰＳＡレベルは、良性の前立腺肥大症（ＢＰＨ）及び前立腺炎の男性で増大していることが報告されている。非悪性の前立腺疾患の男性と前立腺がんの男性との間の血清ＰＳＡ値のこのかなりの重複は、前立腺腫瘍マーカーとしてのＰＳＡの限定的な使用に寄与する主要因である。
【０００８】
さらに、ＰＳＡ単一での解釈は、急速進行性腫瘍を緩徐進行性腫瘍と区別するのには使用することができない。３ｎｇ／ｍｌを超える血清ＰＳＡ値を検出した場合、従来の診断アプローチは伝統的な六ヶ所ＴＲＵＳガイド前立腺生検である。しかしながら、血清ＰＳＡの特異性が低いために、陰性生検率が７０％〜８０％になる。症例によっては、生検標本は代表的なものとはいえず、幾つかのがんの検出の失敗、又は換言すると偽陰性診断の原因にもなる。
【０００９】
現在、ほとんどの大学センターは診断セットを１０個の生検まで広げることを薦めており、これにより、より多くの無痛性がんを診断する危険性が許容される。血清ＰＳＡレベルが持続的に上昇する場合には、がんを明らかにする確率が少なくとも１０％である反復生検が提案される。さらに、血清ＰＳＡ、ＤＲＥ及びＴＲＵＳ生検の併用により臨床的に限局したがんが示される場合、これらの男性のうち４０％が、根治的前立腺切除術に際して既に嚢外に疾患を有することが分かっている。
【００１０】
したがって、早期の臨床的に限局した前立腺がんを有する男性を同定することが可能な非侵襲性の分子検査が早急に必要とされ、それにより早期の根治的な治療への介入により生存期間の延長及び生活の質がもたらされる。
【００１１】
組織で同定された分子マーカーは、前立腺がんに関する新規の体液ベースの分子検査の標的として働くことができる。分子生物学の分野の近年の発展により、前立腺がんに関する多くの新規で有力なバイオマーカーの発見をもたらすツールが与えられている。これらのバイオマーカーは、前立腺がんの診断及び／又は予後診断において高い特異性を有する新規の検査を開発するのに役立ち得る。
【００１２】
好適なバイオマーカーは以下の２つの基準を満たすのが好ましい：１）（施設間で及び施設内で）再現可能でなければならず、２）臨床管理に対する影響がなければならない。
【００１３】
さらに診断の目的では、組織特異性に関して、および前立腺がんと正常な前立腺とＢＰＨとの間の識別能に関して、バイオマーカーを検査することが重要である。さらに、（複数の）バイオマーカーベースのアッセイにより、がん検出に関する特異性が高まることが期待できる。
【００１４】
上記を考慮すると、当該技術分野においてがん及び臨床転帰の生物学的挙動を示す分子予後バイオマーカーへの差し迫った需要がある。
【００１５】
前立腺がんに関する新規の候補マーカーの同定のために、好ましくは他の医療データとの関連で、悪性及び非悪性の前立腺組織の発現パターンを研究することが恩恵である。
【００１６】
分子生物学の分野における近年の発展により、広範囲かつ迅速に前立腺腫瘍の試料におけるゲノム変化及びプロテオーム変化の両方の評価を可能にするツールがもたらされた。
【００１７】
例えば蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析を用いて、細胞における染色体数、転座、欠失、転位及び重複の変化のような様々な染色体異常の同定を研究することができる。比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）も、ＤＮＡ配列コピー数の大きな変化又は１０メガ塩基対よりも大きい欠失に関して、全ゲノムをスクリーニングすることが可能である。ディファレンシャルディスプレイ分析、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、オリゴヌクレオチドアレイ及びｃＤＮＡアレイにより遺伝子発現プロファイルが特徴づけられる。これらの技法は、特異的な生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす遺伝子の同定のために、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）と組み合わせて使用することが多い。
【００１８】
遺伝子変化が突然変異又は改変タンパク質を生じさせることが多いことを考慮すると、細胞のシグナル伝達経路が影響を受け得る。最終的にはこれにより、がん細胞の増殖における有利性又は生存率の増大が引き起こされる可能性がある。
【００１９】
プロテオミクスでは構造、量及び翻訳後修飾に関する改変タンパク質の同定が研究されている。マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometer）（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を用いて無傷の全組織切片において疾患関連タンパク質を直接シークエンシング及び同定することができる。さらに、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）−ＴＯＦ質量分析法（ＭＳ）により、組織細胞及び血清又は尿のような体液から迅速にタンパク質発現プロファイルを提供することができる。
【００２０】
ここ数年、これらの分子ツールが前立腺がんの発生に関連すると考えられる数百の遺伝子の同定につながっている。これらの所見が、前立腺がんの発症及び進行におけるより多くの洞察をもたらしただけでなく、前立腺がんが非常に不均一な疾患であることも示されている。
【００２１】
前立腺がんは多病巣性であるために、一人の患者の前立腺中で複数の前立腺腫瘍が生じ得る。これらの腫瘍のそれぞれで、様々な予後に関連する遺伝子発現及び挙動の顕著な差異を示す可能性がある。したがって疾患の転帰を予測する際、様々なマーカーのセットが臨床的に重要となる可能性が高い。
【００２２】
バイオマーカーは、４つの異なる前立腺がん特異的事象、すなわち、ゲノム変異、前立腺がん特異的な生物学的プロセス、エピジェネティック遺伝子、及び前立腺がんで特徴的に発現した遺伝子、に分類することができる
【００２３】
前立腺がんに関する最も強い疫学的危険因子の１つは陽性の家族歴である。デンマーク、スウェーデン及びフィンランドにおける４４７８８組の双子の研究は、前立腺がんの症例の４２％が遺伝的形質に起因していたことを示した。同じ患者の息子と比較して罹患患者の兄弟で一貫してより高い疾患の危険性が観察された。このことが前立腺がんの危険性にかかわるＸ連鎖性又は劣性の遺伝子成分が存在するという仮説につながる。
【００２４】
罹患家族におけるゲノム規模のスキャンには、ＨＰＣ１（１ｑ２４）、ＣＡＰＢ（１ｐ３６）、ＰＣＡＰ（１ｑ４２）、ＥＬＡＣ２（１７ｐ１１）、ＨＰＣ２０（２０ｑ１３）、８ｐ２２−２３及びＨＰＣＸ（Ｘｑ２７−２８）と表される少なくとも７つの前立腺がん感受性遺伝子座が関係していた。染色体１ｑ２４−２５上のＨＰＣ１／２’−５’−オリゴアデニル酸依存性リボヌクレアーゼＬ（ＲＮＡＳＥＬ）、染色体８ｐ２２−２３上に位置するマクロファージスカベンジャー１遺伝子（ＭＳＲ１）及び染色体１７ｐ１１上のＨＰＣ２／ＥＬＡＣ２の３つの候補となる遺伝性前立腺がん遺伝子をこれらの遺伝子座にマッピングした。
【００２５】
前立腺がん感受性遺伝子は、遺伝性の前立腺がん症例のわずか１０％しか占めていないと推測されている。家族性の前立腺がんの他の３０％は、大体、共有の環境因子又はより一般的な遺伝的変異若しくは多型に関連している。このような変異は罹患集団で高頻度に起こり得るので、前立腺がんの危険性に対する影響が相当である可能性がある。
【００２６】
ＰＳＡレベルが３ｎｇ／ｍｌを超えるために、前立腺生検に適応される患者において前立腺がんの存在が予測可能であるか評価するために、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＩＩ型５α−レダクターゼ（ＳＲＤ５Ａ２）、ＣＹＰ１７、ＣＹＰ３Ａ、ビタミンＤ受容体、ＰＳＡ、ＧＳＴ−Ｔ１、ＧＳＴ−Ｍ１、ＧＳＴ−Ｐ１、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ結合タンパク質３をコードする遺伝子の多型が研究されている。アンドロゲン受容体、ＳＲＤ５Ａ２、ＣＹＰ１７、ＣＹＰ３Ａ４、ビタミンＤ受容体、ＧＳＴ−Ｍ１、ＧＳＴ−Ｐ１及びＩＧＦ結合タンパク質３遺伝子型と前立腺がんの危険性との間に相関は見られなかった。ＧＳＴ−Ｔ１及びＩＧＦ−Ｉ多型だけが、前立腺がんの危険性と或る程度関連があることが分かっていた。
【００２７】
家族性結腸がんにおける大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子とは異なり、上記の前立腺がん感受性遺伝子及び遺伝子座自体は、大部分の前立腺がんの主な原因ではない。
【００２８】
疫学研究は、ほとんどの前立腺がんが、人種、ライフスタイル及び食事等の因子に起因し得るという考えを支持している。既知のがん遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子における遺伝子突然変異の役割は、原発性の前立腺がんでは非常に小さいと考えられる。例えば、原発性の前立腺がんではｐ５３突然変異の頻度は低いことが報告されているが、進行性の前立腺がんではほぼ５０％でｐ５３突然変異が観察された。
【００２９】
がん特異的遺伝子の突然変異又は多型の存在に関して男性をスクリーニングすることには、時間及びコストがかかる。さらに、そのスクリーニングは、一般的な男性集団において原発性の前立腺がんを検出するにはとても非効率的である。そのためそのスクリーニングは前立腺がんスクリーニング試験として適用することはできない。
【００３０】
ミトコンドリアＤＮＡは、１つの細胞当たりおよそ１０００〜１００００のコピーが存在する。これらの量のために、ミトコンドリアＤＮＡの突然変異は前立腺がん患者由来の血漿及び血清のＤＮＡ分析の標的として使用されている。ミトコンドリアＤＮＡの突然変異は、原発性腫瘍中に同じミトコンドリアＤＮＡの突然変異を有する３人の前立腺がん患者中３人とも検出された。この方法の全般的な診断感度を規定するには、様々な泌尿器系腫瘍標本を研究し、かつより多くの患者群が必要となる。
【００３１】
遺伝子発現の重大な変異により、前立腺がんの進行が引き起こされる可能性がある。多型反復ＤＮＡ配列であるマイクロサテライト変異はヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）として又はマイクロサテライト不安定性として現れることが多い。特定のマイクロサテライト変異が前立腺がんにおいて知られている。今までのところ臨床的有用性は取るに足らないものであるとみなされている。全ゲノム、及びＳＮＰアレイの最も重要な利用法は有力な発見ツールであると考えられている。
【００３２】
配列における塩基の順番を変えないＤＮＡの変異により、遺伝子発現の変化が引きこされることが多い。これらのエピジェネティック修飾は、ＤＮＡメチル化及びヒストンのアセチル化又は脱アセチル化のような変化である。多くの遺伝子プロモーターはＣｐＧアイランドとしても知られる高ＧＣ領域を含有する。ＣｐＧアイランドの異常なメチル化により、遺伝子のｍＲＮＡへの転写の低減が引き起こされる。
【００３３】
栄養素又はストレスのような環境暴露により、ＤＮＡメチル化状況が幼少期に影響を受ける可能性があること、及びこれにより成人におけるがんの危険性の増大が引き起こされることが示唆されている。ＤＮＡメチル化パターンの変化が多くのヒト腫瘍で観察されている。プロモーターの過剰メチル化の検出のため、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）と称される技法が用いられる。マイクロサテライト又はＬＯＨ分析とは対照的に、この技法では正常組織に対する腫瘍の比でたった０．１％〜０．００１％しか要求されない。これは、この技法を用いると腫瘍ＤＮＡ由来の過剰メチル化対立遺伝子を正常な対立遺伝子の１０４〜１０５過剰量の存在下で検出することができることを意味する。
【００３４】
したがって、ＤＮＡメチル化はがん検出における有用なマーカーとして役立ち得る。最近、ヒト前立腺がんにおいて過剰メチル化遺伝子に関する多くの報告が為されている。これらの遺伝子の内の２つはＲＡＳＳＦ１Ａ（ｒａｓ関連ドメインファミリータンパク質アイソフォームＡ）及びＧＳＴＰ１である。
【００３５】
ＲＡＳＳＦ１Ａの過剰メチル化は、乳がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん及び前立腺がんに共通の現象である。前立腺腫瘍の６０％〜７０％で、ＲＡＳＳＦ１Ａの過剰メチル化が見られ、これは急速進行性の前立腺腫瘍との明らかな相関を示す。ＲＡＳＳＦ１Ａの過剰メチル化は正常な前立腺組織では検出されない。これらの所見は、ＲＡＳＳＦ１Ａの過剰メチル化がより急速進行性の腫瘍を緩徐進行性の腫瘍と識別することができることを示唆している。その診断的価値を評価するのには、さらなる研究が必要である。
【００３６】
前立腺がんにおいて最も頻繁に説明されるエピジェネティック変異は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ１（ＧＳＴＰ１）プロモーターの過剰メチル化である。ＧＳＴＰ１は毒性効果に対する細胞保護系に属しており、この酵素自体は多くの生体異物の解毒にかかわる。
【００３７】
ＧＳＴＰ１過剰メチル化は萎縮性増殖性炎（ＰＩＡ）病変のおよそ６％及びＰＩＮ病変の７０％において報告されている。幾つかのＰＩＡ病変は、ＰＩＮ病変及び早期癌病変と直接結び付くことが示されているが、これらの所見を確認するにはさらなる研究が必要である。ＧＳＴＰ１の過剰メチル化が前立腺腫瘍の９０％超で検出されているが、ＢＰＨ及び正常な前立腺組織では過剰メチル化は観察されていない。
【００３８】
別の研究において、ＧＳＴＰ１遺伝子の過剰メチル化が前立腺がん患者の精液の５０％で検出されているが、ＢＰＨの男性では検出されていない。精液は前立腺がん患者から常に容易に得られるわけではないため、前立腺マッサージ後の前立腺がん患者から得られる尿沈渣においてＧＳＴＰ１の過剰メチル化を求めた。これらの尿沈渣の７７％で、がんを検出することができた。
【００３９】
さらに、ＧＳＴＰ１の過剰メチル化が、早期限局（confined）疾患の患者の６８％、局所進行性疾患の患者の７８％、ＰＩＮ患者の２９％、及びＢＰＨ患者の２％において前立腺マッサージ後の尿沈渣で見出されている。これらの所見により、９８％の特異性及び７３％の感度が得られた。この試験の陰性適中率は８０％であったが、これによりこのアッセイが不必要な生検の数を減らす大きな可能性を有することが示される。
【００４０】
ＧＳＴＰ１過剰メチル化は前立腺生検を受けただけの患者から得られた尿沈渣の４０％〜５０％で検出されている。ＧＳＴＰ１過剰メチル化が陰性生検の患者（３３％）及び異型又は高悪性度のＰＩＮの患者（６７％）の尿沈渣で検出された。ＧＳＴＰ１の過剰メチル化は前立腺がんに対して高い特異性を有するため、これらの患者は肉眼で発見できない前立腺がんを有し得ることが示唆される。このことは該試験を二次生検の指標としても使用することができることを示している。ＡＰＣ及びＣｏｘ２等の他のがん関連遺伝子もメチル化されていることが知られている。
【００４１】
マイクロアレイ研究は、良性の前立腺組織と比較して、前立腺がんにおいて一貫してアップレギュレーション又はダウンレギュレーションされる遺伝子を同定するのに有用であり、また同定するための情報を与えている。これらの遺伝子は前立腺がん特異的バイオマーカーを提供し、疾患の病因に対する洞察を与えることができる。
【００４２】
前立腺がんの分子診断のためには、正常な前立腺組織における低い又は正常な発現と比較して、前立腺がんにおいて高度にアップレギュレーションされる遺伝子が特に興味深い。そのような遺伝子により正常な細胞の大きなバックグラウンドの中にある１つの腫瘍細胞の検出が可能となり、そのため前立腺がん検出における診断マーカーとして適用することができた。
【００４３】
前立腺がん細胞株ＬＮＣＡＰにおけるｃＤＮＡマイクロアレイ分析により、アンドロゲンによりアップレギュレーションされることが分かっているセリンプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２が発見された。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション研究により、ＴＭＰＲＳＳ２が正常なヒト前立腺組織の基底細胞において及び腺癌細胞において高発現されたことが示されている。ＴＭＰＲＳＳ２の低い発現が、結腸、肺、腎臓及び膵臓で見出されている。
【００４４】
４９２アミノ酸タンパク質がＴＭＰＲＳＳ２について予測されている。この予測されたタンパク質はＩＩ型内在性膜タンパク質であり、ほとんどがヘプシンファミリーに類似している。これらのタンパク質は、細胞増殖及び細胞形態の維持に重要である。ＴＭＰＲＳＳ２がＰＳＡ及びｈＫ２の前駆体型の活性因子であり得ること、及び他のセリンプロテアーゼのようにＴＭＰＲＳＳ２が前立腺の発癌において役割を果たし得ることが提案されている。ＴＭＰＲＳＳ２は低い前立腺がん特異性しか有しないので、尿沈渣における前立腺がん細胞の検出には適用することができなかった。
【００４５】
染色体５ｐ１３上でα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）をコードする遺伝子が、前立腺がんにおいて一貫してアップレギュレーションされていることが分かっている。この酵素は乳製品及び牛肉から得られる分枝鎖脂肪酸分子のペルオキシオームのβ酸化において重要な役割を果たす。興味深いことに、乳製品及び牛肉の消費は前立腺がんの危険性の増大に関連している。
【００４６】
臨床的な前立腺がん組織において、正常な前立腺組織と比較してＡＭＡＣＲのｍＲＮＡが９倍過剰発現していることが見出されている。免疫組織学的（ＩＨＣ）研究及びウェスタンブロット分析により、タンパク質レベルでのＡＭＡＣＲのアップレギュレーションが確認されている。さらに、前立腺がん症例の８８％、及び未治療の転移と去勢抵抗性の前立腺がんとの両方が、ＡＭＡＣＲに関して強陽性であったことが示されている。ＡＭＡＣＲ発現は委縮性腺、過形成した基底細胞、及び尿路上皮又は尿路上皮化生では検出されていない。ＩＨＣ研究により、針生検でのＡＭＡＣＲ発現は前立腺がん検出で９７％の感度及び１００％の特異性を有していたことも示された。
【００４７】
前立腺がんには存在しない基底細胞マーカーであるｐ６３に関する染色を組み合わせることで、ＡＭＡＣＲは悪性の前立腺細胞の同定を著しく容易にした。その高い発現及びがん細胞特異性は、ＡＭＡＣＲが非侵襲性の画像化モダリティを用いて前立腺がんの同定を容易にし得る分子プローブの開発の候補ともなり得ることに関係がある。
【００４８】
ｃＤＮＡマイクロアレイ分析を用いて、ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼであるヘプシンが、正常な前立腺組織及びＢＰＨ組織と比較して前立腺がんにおいて最も差次的に過剰発現した遺伝子の１つであることが示されている。定量的リアルタイムＰＣＲ分析を用いて、へプシンが前立腺がん組織の９０％で過剰発現していることが示されている。前立腺がんの５９％において、この過剰発現は１０倍を超えていた。
【００４９】
また、へプシンのアップレギュレーションと腫瘍悪性度との間に有意な相関が存在している。さらなる研究により、へプシンの組織特異性、及び新たな血清マーカーとしてのこのセリンプロテアーゼの診断的価値を求める必要がある。へプシンが進行性及びより急速進行性の腫瘍でアップレギュレーションしているので、へプシンは腫瘍の急速進行性を決定するための予後組織マーカーとしての役割を示唆している。
【００５０】
リボヌクレオタンパク質であるテロメラーゼは、真核生物の染色体の末端に蓋をして、末端を保護するテロメアの合成及び修復にかかわる。ヒトのテロメアはＴＴＡＧＧＧ配列のタンデムリピート及び幾つかの異なる結合タンパク質からなる。細胞分裂の際、テロメアを完全に複製することはできず、短くなる。テロメラーゼはテロメアを伸ばすことができ、このようにしてテロメア構造の短縮を防ぐ。テロメラーゼ活性の非存在下における細胞分裂により、テロメアの短縮が起こる。結果として、細胞の寿命が限界となり、これにより老化及び細胞死が起こる。
【００５１】
前立腺がん細胞を含む腫瘍細胞において、テロメアは正常細胞よりもかなり短くなっている。テロメアが短いがん細胞では、老化を回避し、不死的な増殖を可能にするためにテロメラーゼ活性が要求される。高いテロメラーゼ活性が前立腺がんの９０％では見出されているが、正常な前立腺組織では存在しないことが示されている。
【００５２】
３６個の標本での小規模研究において、テロメラーゼ活性は前立腺マッサージ後の排泄尿、又は尿道洗浄における前立腺がん細胞の検出に用いられている。この試験は５８％の感度及び１００％の特異性を有していた。この試験の陰性適中率は５５％であった。この試験は小規模で予備的な研究であるが、陰性適中率が低く、尿試料で測定されるテロメラーゼ活性が不必要な生検の数を減らすのに余り有望ではないことを示している。
【００５３】
テロメラーゼの触媒サブユニットであるｈＴＥＲＴの定量化により、正常な前立腺組織と比較して、前立腺がん組織におけるｈＴＥＲＴのｍＲＮＡの過剰発現の中央値が６倍であることが示された。ｈＴＥＲＴ発現と腫瘍の病期との間には重要な関係性が見出されたが、グリソンスコアでは見出されなかった。リアルタイムＰＣＲを用いたｈＴＥＲＴの定量化により、ｈＴＥＲＴが前立腺がん組織を非悪性の前立腺組織と十分に識別することができることが示された。しかしながら、ｈＴＥＲＴのｍＲＮＡは、通常血液及び尿等の体液に存在する白血球で発現される。このことが偽陽性を引き起こす可能性がある。このため、体液におけるｈＴＥＲＴの定量的決定は、前立腺がんの診断ツールとしては余り有望ではない。
【００５４】
前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）は、前立腺上皮細胞の表面上で発現する膜貫通糖タンパク質である。ＰＳＭＡの発現は、前立腺に限定されると考えられ、ＰＳＭＡは良性の前立腺組織と比較して前立腺がん組織でアップレギュレーションされていることが示されている。ＢＰＨと前立腺がんとの間でＰＳＭＡ発現の重複がないことが見出されており、これによりＰＳＭＡが有望な診断マーカーであることが示される。
【００５５】
前立腺がん症例での高いＰＳＭＡ発現は、腫瘍の悪性度、病理学的病期、異数性及び生化学的再発に相関していたことが示されている。さらに、原発性の前立腺がん及び転移におけるＰＳＭＡのｍＲＮＡの発現の増大は、ＰＳＭＡのタンパク質の過剰発現に相関していた。前立腺がんの診断マーカー又は予後マーカーとしてのＰＳＭＡの臨床的有用性はこのタンパク質に対する高感度免疫アッセイがないことにより妨げられてきた。
【００５６】
しかしながら、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイとＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳとの組合せにより、血清ＰＳＭＡの定量化のためのタンパク質バイオチップ免疫アッセイが与えられている。前立腺がん患者に関する平均血清ＰＳＭＡレベルは、ＢＰＨの男性及び健常な対照のものと比較して、有意に高かったことが示された。これらの所見は血清ＰＳＭＡがＢＰＨの男性を前立腺がん患者と識別する役割に関係があるが、その診断的価値を評価するにはさらなる研究が必要である。
【００５７】
ＲＴ−ＰＣＲ研究により、スプライス変異型であるＰＳＭＡ’と組み合わせたＰＳＭＡを前立腺がんの予後マーカーとして使用することができることが示されている。正常な前立腺のＰＳＭＡ’発現はＰＳＭＡ発現よりも高い。前立腺がん組織では、ＰＳＭＡの発現がより優勢である。したがって、ＰＳＭＡ’に対するＰＳＭＡの比は、疾患の進行の高度な指標である。２つのＰＳＭＡ型の間で識別する定量的ＰＣＲ分析を設計することにより、前立腺がんの診断及び予後においてＰＳＭＡに別の用途を与えることができた。
【００５８】
接着性結合関連タンパク質であるδ−カテニン（ｐ１２０／ＣＡＳ）は、ＢＰＨと前立腺がんとの間で高度に識別されることが示されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション研究により、前立腺の腺癌では、δ−カテニン転写産物が最も高く発現し、ＢＰＨ組織においては低い発現から発現が無いことが示された。ＢＰＨと比較して前立腺がんでのδ−カテニンの平均過剰発現は、１５．７倍である。
【００５９】
定量的ＰＣＲ及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析の両方では、δ−カテニン発現とグリソンスコアとの間の相関を実証することができなかった。組織特異性及びδ−カテニンの診断的価値を評価するためにはさらなる研究が必要ではあるが、前立腺がんの予後マーカーとして用いる場合に制限があることは明らかである。
【００６０】
ディファレンシャルディスプレイ分析を用いてＤＤ３ＰＣＡ３が同定されている。ノーザンブロット分析を用いて、ＤＤ３ＰＣＡ３が同じ患者の正常な前立腺組織と比較して前立腺腫瘍で高度に過剰発現することが見出された。さらに、ＤＤ３ＰＣＡ３は、原発性の前立腺がん生検の９５％超で及び前立腺がん転移で強く過剰発現することが見出された。さらに、ＤＤ３ＰＣＡ３の発現は前立腺組織に限定される、すなわち他の正常なヒト組織では発現は見出されていない。
【００６１】
ＤＤ３ＰＣＡ３をコードする遺伝子は、染色体９ｑ２１．２上に位置する。ＤＤ３ＰＣＡ３のｍＲＮＡは高密度の終止コドンを含有している。そのため、ＤＤ３ＰＣＡ３のｍＲＮＡは非コードＲＮＡを生じるオープンリーディングフレームを欠いている。最近になって、時間分解定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイ（内部標準及び外部較正曲線を用いる）が開発されている。このアッセイの正確な定量能により、正常な前立腺組織と比較して前立腺がん組織でＤＤ３ＰＣＡ３の６６倍のアップレギュレーションの中央値が示された。さらに、前立腺がん細胞を１０％未満しか含有しない前立腺組織において、アップレギュレーションの中央値が１１倍であることが見出された。これにより、ＤＤ３ＰＣＡ３が正常細胞の大きいバックグラウンドにおいて少数の腫瘍細胞を検出することができることが示された。
【００６２】
この仮説を排泄尿試料に対する定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて試験した。ＰＳＡのｍＲＮＡ発現は正常な前立腺細胞で比較的一定であることが分かっており、前立腺がん細胞では弱いＰＳＡ発現のダウンレギュレーション（約１．５倍）しか報告されていない。そのため、ＰＳＡのｍＲＮＡは尿沈渣に存在する前立腺細胞の数を補正するために「ハウスキーピング遺伝子」として用いられている。３ｎｇ／ｍｌを超える全血清ＰＳＡ値に基づき、広範な前立腺マッサージ後に、前立腺生検に適応された１０８人の男性群からこれらの尿試料を得た。腫瘍の存在に関する究極の判断基準として前立腺生検を用いて、この試験は６７％の感度及び８３％の特異性を有していた。さらにこの試験は９０％の陰性適中率を有しており、このことが広範な前立腺マッサージ後に得られた尿沈渣におけるＤＤ３ＰＣＡ３転写産物の定量が、この男性集団における侵襲的なＴＲＵＳ誘導生検の数の減少に対して大きな可能性を有することを示している。
【００６３】
前立腺腫瘍における組織特異性及び高い過剰発現は、ＤＤ３ＰＣＡ３がこれまでに記載されたうちで最も前立腺がん特異的な遺伝子であることを示している。そのため、有効なＤＤ３ＰＣＡ３アッセイは、血清又は血漿における播種性の前立腺がんの検出において価値のあるものとなり得る。有効なＤＤ３ＰＣＡ３アッセイを用いた多角的研究が臨床的な泌尿器系の診察における分子診断の初めの基礎を与えることができる。
【００６４】
細胞質タンパク質ＨＳＰ−２７、並びにＰＫＣアイソザイムファミリーのメンバー、特にＰＫＣ−β及びＰＫＣ−εの発現の変化は、前立腺がん進行に相関していた。
【００６５】
発現の変化は、その形態にかかわらず、急速進行性であるがん、したがって緊急治療が必要となり得るがんをはっきりと同定している。広くは用いられていないが、これらのタンパク質に対する抗体は証明されており、市販されており、特に二重染色した調製物として他の試薬と併せたその適用及び解釈において明確である。
【００６６】
この群のマーカーの意義は、急速進行性表現型の前立腺がんを正確に識別することである。非新生物性の前立腺組織と比較して、侵襲性のがんによりそれらの発現が変化する場合、高いレベルでＨＳＰ２７又はＰＫＣβのいずれかを発現するそれらの悪性腫瘍は常に不良臨床転帰を示す。この関連の機構は、解明及び検証されるべきである。
【００６７】
染色体６ｐ２２上に位置するＥ２Ｆ３を含むＥ２Ｆ転写因子は、直接ＥＺＨ２の発現を変化させる。ＥＺＨ２遺伝子の過剰発現は、ヒト前立腺がんの発症に重要となっている。
【００６８】
ＥＺＨ２は去勢抵抗性及び転移性の前立腺がんにおいて過剰発現する遺伝子として同定され、ＥＺＨ２を発現する臨床的に限局した前立腺がんを有する患者は、そのタンパク質を発現しない患者よりも悪化した進行を有することが示された。
【００６９】
組織マイクロアレイを用いると、大部分のヒト前立腺がんにおいて核Ｅ２Ｆ３の高レベルの発現が起こるが、これは非新生物性の前立腺上皮では稀な事象である。これらのデータと他の公開情報とを併せることで、ｐＲＢ−Ｅ２Ｆ３−ＥＺＨ２制御軸が個々のヒト前立腺がんの急速進行性を変化させるのに重要な役割を有し得ることが示唆された。
【００７０】
分子診断の主な課題は、臨床的に重要ではない前立腺がんの同定、すなわち生物学的に急速進行性のがんを緩徐進行性の腫瘍と分けることである。さらに、治療への応答性を予測及びモニタリングするマーカーが緊急に必要とされている。
【００７１】
現在の臨床背景において、過剰診断及び過剰治療が明らかになるにつれて、治療が必要な患者と、治療の必要のない患者とを正確に同定することができるバイオマーカーへの需要がさらに強調される。
【００７２】
ＡＭＡＣＲ免疫組織化学的技法は、前立腺の悪性プロセスの同定に広く用いられ、それにより前立腺がんの診断に寄与する。不運なことに、予後ツールとしての組織での分子マーカーの導入は論じられているマーカーのいずれでも有効性が認められていない。
【００７３】
ここ２０年の実験により、分子マーカーを臨床的使用に移行する際の実用上かつロジスティックな複雑性が明らかになっている。これらの課題を考慮して、多くのマーカーの臨床的有用性を確立するために、幾つかの前望的努力が現在も続けられている。明らかに、臨床経過観察データを含む、十分に裏付けられた標本の組織バイオレポジトリーは検証プロセスにおいて極めて重要な役割を果たす。
【００７４】
ＧＳＴＰ１過剰メチル化及び前立腺がんで高度に過剰発現する遺伝子ＤＤ３ＰＣＡ３に基づく新規の体液試験により、尿又は精液のような非侵襲的に得られる体液を用いた前立腺がんの検出が可能になる。
【００７５】
新たな技術の適用により、前立腺がんでは非常に多くの遺伝子がアップレギュレーションされていることが示されている。非侵襲性のスクリーニング試験のためには、正常な前立腺又はＢＰＨと比較して、前立腺がん組織の９５％超で過剰発現する遺伝子だけが重要となる。
【００７６】
さらに、尿又は精液等の体液における正常細胞の大きなバックグラウンドの中にあるたった一つの前立腺がん細胞の検出を可能にするために、がんにおけるこれらの遺伝子のアップレギュレーションが正常な前立腺と比較して前立腺がんの１０％超である必要がある。
【００７７】
上記で概説されたマーカーは、腫瘍マーカー、特に前立腺腫瘍マーカーに関して当該技術分野における需要に少なくとも一部応えているが、信頼性できる（前立腺）腫瘍マーカー、特に臨床経過及び疾患の転帰の指標となるマーカーに対しては、継続的な需要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００７８】
他の目的の中で本発明の目的は、完全ではないが少なくとも一部、当該技術分野における上記の需要、すなわち組織生検における前立腺がんの信頼性のある同定、特に疾患の臨床経過及び転帰の信頼性のある適中率を与える腫瘍マーカーの提供を満たすことである。かかる腫瘍マーカーは訓練を受けた医師が、腫瘍マーカー又は任意の他の指標を用いて前立腺がんと診断された個体の好適な治療プロトコルを決める助けとなるツールを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００７９】
本発明によれば、他の目的の中で上記の目的は、添付の特許請求の範囲で概説されたような新規の腫瘍マーカー及び方法の提供により満たされる。
【００８０】
詳細には、他の目的の中で上記の目的は、ヒト個体において前立腺がんの有無を確定する方法であって、
ａ）前記ヒト個体を起源とする試料においてＨＯＸＣ６、ｓＦＲＰ２、ＨＯＸＤ１０、ＲＯＲＢ、ＲＲＭ２、ＴＧＭ４及びＳＮＡＩ２からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を決定するステップと、
ｂ）前立腺腫瘍細胞若しくは前立腺腫瘍組織を含まない前記ヒト個体、又は前立腺がんを患っていない個体を起源とする試料における前記１以上の遺伝子それぞれの発現と比較して、前記１以上の遺伝子の発現のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを確定するステップと、
ｃ）前記１以上の遺伝子のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションの確定に基づき前立腺がんの有無を確定するステップと
を含む、方法により満たされる。
【００８１】
本発明によれば、前立腺がんの有無を確定することは、診断、予後及び／又は疾患生存率の予測を含むのが好ましい。
【００８２】
本発明によれば、発現分析は、前立腺腫瘍細胞若しくは前立腺腫瘍組織を含まない上記ヒト個体、又は前立腺がんを患っていない個体を起源とする試料において、上記の１以上の遺伝子それぞれの発現と比較した遺伝子の発現の増減を確定することを含む。換言すると、非疾患標準に対する本発明による遺伝子の発現の増減が遺伝子発現の評価基準である。例えば、非前立腺がん条件下でのＨＯＸＣ６及び／又はＲＲＭ２の発現の増大、及び／又はＲＯＲＢ、ＨＯＸＤ１０、ＳＦＲＰ２、ＳＮＡＩ２及び／又はＴＧＭ４の発現と比較した各遺伝子の発現の低減を確定することにより、本発明に基づく前立腺がんの有無の確定、好ましくは診断、予後及び／又は疾患生存率の予測が可能になる。
【００８３】
ＨＯＸＣ６：遺伝子のホメオボックススーパーファミリー及びＨＯＸサブファミリーは、空間的及び時間的発現パターンにより、発生中の複雑な機能の制御及び調整にかかわる転写因子であるメンバーを含有する。ヒトでは、クラスターＡ、Ｂ、Ｃ及びＤに分けられる３９個の古典的ＨＯＸ遺伝子が存在する。ＨＯＸＣ６がホルモンシグナルに応じた上皮細胞の発生及び増殖に極めて重要であることが実証されている。
【００８４】
ＳＦＲＰ２：分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＳＦＲＰ２）は、Ｗｎｔシグナル伝達カスケードに関連するＳＦＲＰの大きいファミリーに属する。幾つかの研究により、ＳＦＲＰ２がＷｎｔ−β−カテニン経路のインヒビターであることが示唆されている。ＳＦＰＲ２は、上皮細胞移動、管形成及び低酸素誘導性の内皮細胞アポトーシスに対する保護を含む、血管形成にかかわる細胞プロセスを調整し、血管肉腫管形成に必要とされる。
【００８５】
ＨＯＸＤ１０：ホメオボックス（Ｈｏｘ）遺伝子は、器管形成及び分化組織機能の維持に関するマスター調節遺伝子である。ＨＯＸＤ１０は、細胞外基質及び細胞移動のリモデリングにかかわる遺伝子の発現を抑制することにより、休止している分化表現型を維持するのを助ける。
【００８６】
ＲＯＲＢ：レチノイド関連オーファン受容体（ＲＯＲ）α、β及びγは、一つの核オーファン受容体遺伝子サブファミリーを含む。ＲＯＲが、モノマーとして特異的なＲＯＲ応答要素（ＲＯＲＥ）と結合する。ＲＯＲによるＲＯＲＥ依存性の転写活性は細胞型特異的であり、核補因子との相互作用により媒介される。ＲＡＲ関連オーファン受容体Ｂ（ＲＯＲＢ）の発現は非常に限定されている。ＲＯＲＢはニューロフォトエンドクリン（neurophotoendocrine）システム、松果体、網膜及び視交叉上核の様々な部分で高発現し、これにより概日リズムの制御における役割が示唆される。ＲＯＲα及びＲＯＲβの両方が網膜における光受容体の成熟に必要とされる。ＲＯＲは多様な生理学的プロセスの調節に非常に重要な役割を果たす。
【００８７】
ＲＲＭ２：リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）は、ＤＮＡ合成及び修復に必要とされるリボヌクレアーゼ還元に非常に重要な役割を果たす。ＲＮＲは、２つのサブユニットである、ＲＲＭ１及びＲＲＭ２からなる。ＲＮＲの活性、そのためＤＮＡ合成及び細胞増殖は、ＲＲＭ２サブユニットの合成及び分解により細胞周期中に制御される。
【００８８】
ＴＧＭ４：ヒト前立腺特異的トランスグルタミナーゼ（ｈＴＧＰ）は、前立腺により分泌される架橋酵素である。トランスグルタミナーゼ４（ＴＧＭ４）遺伝子は、ｈＴＧＰをコードする。ｈＴＧＰの発現は前立腺に厳密に限られる。この遺伝子の構造は他のトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）遺伝子の構造と厳密な類似性を示す。
【００８９】
ＳＮＡＩ２：Ｓｎａｉｌファミリー因子の２つの主な成員であるＳＮＡＩ１（Ｓｎａｉｌ）及びＳＮＡＩ２（Ｓｌｕｇ）は、上皮間充織転換の重要なメディエーターであり、腫瘍進行にかかわる。ＳＮＡＩ１は腫瘍の成長、浸潤及び転移において主要な役割を果たす。ＳＮＡＩ２はヌードマウスに注入する場合、いずれかの癌細胞株の腫瘍成長能の低減においてＳＮＡＩ１と協働する。データにより、ＳＮＡＩ１が局所浸潤の主なレギュレーターであり、このことが転移プロセスにおける両方の因子の階層的関与を支持することが示される。ＳＮＡＩ１（Ｓｎａｉｌ）、ＳＮＡＩ２（Ｓｌｕｇ）、ＳＮＡＩ３、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２（ＳＩＰ１）、ＫＬＦ８、ＴＷＩＳＴ１及びＴＷＩＳＴ２がＥ−カドヘリンをコードするＣＤＨ１遺伝子を表すＥＭＴ調節遺伝子である。
【００９０】
本発明の好ましい実施の形態によれば、発現を決定することは、上記１以上の遺伝子のｍＲＮＡ発現を決定することを含む。
【００９１】
ｍＲＮＡに基づく発現分析は、当該技術分野で一般的に知られており、診断研究所において世界規模で日常的に実施されている。例えば、ｍＲＮＡ分析に好適な技法はノーザンブロットハイブリダイゼーション及びＰＣＲ、特にリアルタイムＰＣＲ等の増幅に基づく技法、並びにＮＡＳＢＡである。
【００９２】
特に好ましい実施の形態によれば、発現分析はハイスループットＤＮＡアレイチップ分析を含み、これは複数の試料の同時分析だけでなく、自動分析プロセシングも可能にする。
【００９３】
本発明の別の好ましい実施の形態によれば、発現を決定することは遺伝子のタンパク質レベルを求めることを含む。好適な技法は例えば、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometer）（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）に基づく技法、ＥＬＩＳＡ及び／又は免疫組織化学的技法である。
【００９４】
本発明によれば、本方法はＨＯＸＣ６、ｓＦＲＰ２、ＨＯＸＤ１０、ＲＯＲＢ、ＲＲＭ２、ＴＧＭ４及びＳＮＡＩ２からなる群から選択される遺伝子の２以上、好ましくは３以上、より好ましくは４以上、さらにより好ましくは５以上、最も好ましくは６以上の発現分析を用いて行うのが好ましい。
【００９５】
特に好ましい実施の形態によれば、本方法をＨＯＸＣ６、ｓＦＲＰ２、ＨＯＸＤ１０、ＲＯＲＢ、ＲＲＭ２、ＴＧＭ４及びＳＮＡＩ２の発現分析により行う。
【００９６】
好ましくは、ヒト個体における前立腺がんの有無は、低悪性度ＰｒＣａ（ＬＧ）、高悪性度ＰｒＣａ（ＨＧ）、ＰｒＣａ  Ｍｅｔ及び／又はＣＲＰＣを同定、確定及び／又は診断することをさらに含む。
【００９７】
ＬＧは低悪性度ＰｒＣａ（６以下のグリソンスコア）を示し、予後が良好な患者を表す。ＨＧは高悪性度ＰｒＣａ（７以上のグリソンスコア）を示し、予後が不良な患者を表す。ＰｒＣａ  Ｍｅｔは予後が不良な患者を表す。最後に、ＣＲＰＣは去勢抵抗性の前立腺がんを示し、急速進行性の限局性疾患の患者を表す。
【００９８】
本発明の特に好ましい実施の形態によれば、本発明はＣＲＰＣを同定、確定及び／又は診断することを含む。
【００９９】
前立腺がんのバイオマーカー又は分子マーカーとしての本発明の遺伝子の診断的価値を考慮すると、本発明はヒト個体における前立腺がんの有無を確定するためのＨＯＸＣ６、ｓＦＲＰ２、ＨＯＸＤ１０、ＲＯＲＢ、ＲＲＭ２、ＴＧＭ４及びＳＮＡＩ２からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現分析の使用にも関する。
【０１００】
また前立腺がんのバイオマーカー又は分子マーカーとしての本発明の遺伝子の診断的価値を考慮すると、ヒト個体における前立腺がんの有無を確定するための部品のキットであって、
ＨＯＸＣ６、ｓＦＲＰ２、ＨＯＸＤ１０、ＲＯＲＢ、ＲＲＭ２、ＴＧＭ４及びＳＮＡＩ２からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を確定するための発現分析手段と、
使用説明書と、
を含む、部品のキットにも関する。
【０１０１】
本発明によれば、本発明の部品のキットは、好ましくは例えばＰＣＲ、ｒｔＰＣＲ及び／又はＮＡＳＢＡによる発現分析に好適であるｍＲＮＡ発現分析手段を含む。
【０１０２】
特に好ましい実施の形態によれば、本発明の部品のキットは本発明の２以上、３以上、４以上、５以上、６以上又は７以上の遺伝子の発現分析のための手段を含む。
【０１０３】
本明細書では、任意に割り当てられた名称に言及することにより、前立腺がんのバイオマーカー又は分子マーカーとして好適な遺伝子に対する言及が為されている。当業者は指定の名称に基づき本発明の遺伝子を容易に特定及び使用することができるが、添付の図面により、これらの遺伝子のｃＤＮＡ配列がアクセッション番号として与えられ、それにより、当業者が当該技術分野で一般的に知られる分析技法に基づき発現分析アッセイを開発することが可能になる。かかる分析技法は例えば、遺伝子のゲノム配列、与えられたｃＤＮＡ又はアミノ酸配列に基づき得る。この配列情報は、与えられた配列から由来することができる、又は例えば与えられたアクセッション番号を用いることにより公開データベースから容易に入手することができる。
【０１０４】
本発明は、本発明の好ましい実施形態の以下の実施例でさらに説明する。実施例では図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１−７】それぞれＨＯＸＣ６遺伝子（ＮＭ＿００４５０３．３、ＮＰ＿００４４９４．１）；ＳＦＲＰ２遺伝子（ＮＭ＿００３０１３．２、ＮＰ＿００３００４．１）;ＨＯＸＤ１０遺伝子（ＮＭ＿００２１４８．３、ＮＰ＿００２１３９．２）；ＲＯＲＢ遺伝子（ＮＭ＿００６９１４．３、ＮＰ＿００８８４５．２）；ＲＲＭ２遺伝子（ＮＭ＿００１０３４．２、ＮＰ＿００１０２５．１）；ＴＧＭ４遺伝子（ＮＭ＿００３２４１．３、ＮＰ＿００３２３２．２）；及びＳＮＡＩ２遺伝子（ＮＭ＿００３０６８．３、ＮＰ＿００３０５９．１）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す図である。
【図８−１４】それぞれＨＯＸＣ６遺伝子（ＮＭ＿００４５０３．３）；ＳＦＲＰ２遺伝子（ＮＭ＿００３０１３．２）；ＨＯＸＤ１０遺伝子（ＮＭ＿００２１４８．３）；ＲＯＲＢ遺伝子（ＮＭ＿００６９１４．３）；ＲＲＭ２遺伝子（ＮＭ＿００１０３４．２）；ＴＧＭ４遺伝子（ＮＭ＿００３２４１．３）及びＳＮＡＩ２遺伝子（ＮＭ＿００３０６８．３）のＬＧ（低悪性度）群、ＨＧ（高悪性度）群、ＣＲＰＣ（去勢抵抗性）群及びＰｒＣａ  Ｍｅｔ（前立腺がん転移）群の発現分析に基づくボックスプロットのＴＬＤＡデータを示す図である。ＮＰは前立腺がんがないこと、すなわち正常な又は標準的な発現レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【０１０６】
急速進行性の前立腺がんのマーカーを同定するために、以下のカテゴリーにおける前立腺がんの患者由来の試料の遺伝子発現プロファイル（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴアレイ、Affymetrix）を使用した：
ＬＧ：低悪性度ＰｒＣａ（６以下のグリソンスコア）。この群は予後が良好な患者を表す。
ＨＧ：高悪性度ＰｒＣａ（７以上のグリソンスコア）。この群は不良な予後を有する患者を表す；試料型、原発性腫瘍由来のｍＲＮＡ。
ＰｒＣａ  Ｍｅｔ：この群は不良な予後を有する患者を表す；試料型；ＰｒＣａ転移由来のｍＲＮＡ。
ＣＲＰＣ：去勢抵抗性の前立腺がん；内分泌療法を受けても進行性である患者由来の原発性腫瘍材料由来のｍＲＮＡ。この群は急速進行性の限局性疾患の患者を表す。
【０１０７】
標準的なプロトコルに従い発現分析を行う。簡単に説明すると、根治的前立腺切除術又はＴＵＲＰ後に、前立腺がん（４つのこれまでに言及されたカテゴリーの１つに属する）患者から組織を得た。組織を瞬間凍結し、クライオスタット切片を病理学者による分類に応じてＨＥ染色した。
【０１０８】
腫瘍領域を切開し、全ＲＮＡを製造業者の取扱説明書に従ってＴＲＩｚｏｌ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いて抽出した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニキット（Qiagen, Valencia, CA, USA）を用いて全ＲＮＡを精製した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いた電気泳動により全ＲＮＡの完全性を確認した。
【０１０９】
精製された全ＲＮＡから、１μｇの全ＲＮＡをＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｗｈｏｌｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＷＴ）Ｓｅｎｓｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ａｓｓａｙ（Affymetrix, Santa Clara, CA, USA）に用いた。このアッセイのプロトコルによれば、ＲｉｂｏＭｉｎｕｓ  Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いてリボソームＲＮＡの大部分が取り除かれた。Ｔ７プロモーターを組み込んだランダムヘキサマーを用いて、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。それからｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応により二本鎖ｃＤＮＡ鋳型からｃＲＮＡを生成し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ試料クリーンアップモジュールを用いて精製した。ｄＵＴＰを含有するｄＮＴＰミックスを用いて、ランダムプライム化逆転写により一本鎖ｃＤＮＡを生成した。ＲＮアーゼＨを用いてＲＮＡを加水分解して、ｃＤＮＡを精製した。それからＵＤＧ制限エンドヌクレアーゼ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）とＡＰＥ１制限エンドヌクレアーゼ（アプリン酸／アプリミジン酸エンドヌクレアーゼ１）との混合物とのインキュベーションによりｃＤＮＡを断片化し、最後にビオチン化ジデオキシヌクレオチドを組み込んだターミナルトランスフェラーゼ反応により末端標識した。
【０１１０】
５．５μｇの断片化したビオチン化ｃＤＮＡを、Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴ  ＧｅｎｅＣｈｉｐに充填したハイブリダイゼーション混合物に添加し、１６時間、４５℃及び６０ｒｐｍでハイブリダイズした。
【０１１１】
ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴアレイ（Affymetrix）を用いて、エキソン分析により遺伝子を間接的に測定し、この測定結果を転写産物クラスターの測定結果と組み合わせることができる。アレイ上に３００，０００個を超える転写産物クラスターが存在し、そのうち、９０，０００個のクラスターが２以上のエキソンを含有している。これらの９０，０００個のクラスターのうち、１７，０００個を超える信頼性の高い（ＣＯＲＥ）遺伝子が存在し、それらをデフォルト分析に用いる。全体では１つのアレイ当たり５５０万個を超える特徴が存在する。
【０１１２】
ハイブリダイゼーション後に、アレイを洗浄し、Affymetrixのプロトコルに従い染色した。Affymetrix製のＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００を用いて５３２ｎｍで染色したアレイをスキャンし、それぞれのアレイに対してＣＥＬファイルを作製した。
【０１１３】
Affymetrix製のＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅ（商標）ソフトウェアで実行されるようなモデルベースのＲＭＡアルゴリズムを用いて、ＣＥＬファイルのプローブレベルハイブリダイゼーション強度からエキソンレベル発現値を導く。ＲＭＡ（Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉａｒｒａｙ  Ａｖｅｒａｇｅ）により正規化、バックグラウンド補正及びデータの要約が行われる。条件間で差次的に発現する遺伝子を３つ以上の群でのＴ検定であるＡｎｏｖａ（ＡＮａｌｙｓｉｓ  Ｏｆ  Ｖａｒｉａｎｃｅ）を用いて算出する。
【０１１４】
臨床的に十分に規定されたリスク群が分析されていたので、標的の同定には偏りが生じる。がん生物学における役割に基づきマーカーをカテゴリー分けする。マーカーの同定のために、ＰｒＣａ  Ｍｅｔ群を「ＨＧ」及び「ＬＧ」と比較する。
【０１１５】
得られた発現分析に基づき、３０個の腫瘍からバイオマーカーを同定し、バイオマーカーの発現プロファイルを表１に提示する。
【０１１６】
【表１】
2012504397.tif 000003
【実施例２】
【０１１７】
実施例１のプロトコルを７０個の標本群で繰り返した。得られた結果を表２に表す。
【０１１８】
【表２】
2012504397.tif 000004
【０１１９】
表１及び表２から明らかに分かるように、ＰＴＰＲ、ＥＰＨＡ６、Ｐｌａｋｏｐｈｉｌｉｎ  １、ＨＯＸＣ６（図１）及びＨＯＸＤ３の発現のアップレギュレーションは前立腺がんに関連していた。さらに表１及び表２から明らかに分かるように、ｓＦＲＰ２（図２）及びＨＯＸＤ１０（図３）の発現のダウンレギュレーションは前立腺がんに関連していた。
【０１２０】
７０個の腫瘍試料で得られた上記の結果を考慮すると、発現データは、前立腺がんの診断のためのバイオマーカー又は分子マーカーとしてのこれらの遺伝子の適合性を明らかに示している。
【実施例３】
【０１２１】
７０個の前立腺がんにおいて遺伝子発現プロファイル（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴアレイ、Affymetrix）を用いて、前立腺がん転移及び去勢抵抗性の前立腺がん（ＣＲＰＣ）と比較して、幾つかの遺伝子が低悪性度及び高悪性度の前立腺がんにおいて差次的に発現することが見出された。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴアレイで差次的に発現した幾つかの他の遺伝子と共に、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（ＴＬＤＡ、Applied Biosystems）を用いてこれらの遺伝子の発現レベルを検証した。検証した遺伝子の概要を表３に示す。
【０１２２】
【表３】
2012504397.tif 000005
【０１２３】
以下のカテゴリーにある前立腺がん標本を用いた（表４も参照されたい）。
低悪性度の前立腺がん（ＬＧ）：根治的前立腺切除術後に得られた、６以下のグリソンスコアの原発性腫瘍由来の組織標本。この群は予後が良好な患者を表す。
高悪性度の前立腺がん（ＨＧ）：根治的前立腺切除術後に得られた、７以上のグリソンスコアの原発性腫瘍由来の組織標本。この群は予後が不良な患者を表す。
前立腺がん転移：ＬＮＤ後又は剖検後の陽性のリンパ節から組織標本を得る。この群は予後が不良な患者を表す。
去勢抵抗性の前立腺がん（ＣＲＰＣ）：内分泌療法を受けても進行性であり、前立腺の経尿道的電気切除術（ＴＵＲＰ）を受けた患者から組織標本を得る。
【０１２４】
組織試料を全て瞬間凍結し、クライオスタット切片をヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）を用いて染色した。これらのＨＥ染色した切片は、病理学者により分類された。
【０１２５】
腫瘍領域を切開した。幾つかのレベルのそれぞれの組織から回収した１０μｍ厚の連続切片からＲＮＡを抽出した。それぞれのレベルの切片のＨＥ染色により組織を評価し、顕微鏡により検証した。全ＲＮＡを製造業者の取扱説明書に従ってＴＲＩｚｏｌ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いて抽出した。ＲＮｅａｓｙミニキット（Qiagen, Valencia, CA, USA）を用いて全ＲＮＡを精製した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００分光光度計（NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA）及びＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA）でＲＮＡの質及び量を評価した。
【０１２６】
製造業者のプロトコルに従って、３７．５μｌの反応物中のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素（Invitrogen）を用いて、ＤＮアーゼ処理した２μｇの全ＲＮＡを逆転写した。反応物を２５℃で１０分間、４２℃で６０分間、及び７０℃で１５分間インキュベートした。ｃＤＮＡに、６２．５μｌのｍｉｌｌｉＱ水を添加した。
【０１２７】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（ＴＬＤＡ、Applied Biosystems）を用いて遺伝子の発現レベルを測定した。この研究に用いたアッセイのリストを表３に示す。個々のｃＤＮＡのうち３μｌを、５０μｌのＴａｑｍａｎ（登録商標）ユニバーサルプローブマスターミックス（Applied Biosystems）及び４７μｌのｍｉｌｌｉＱ水に添加した。１００μｌの各試料をＴａｑＭａｎ（登録商標）アレイの１つの試料リサーバー（３８４−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃａｒｄ）（Applied Biosystems）に充填した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アレイを２回、２８０ｇで１分間遠心分離し、ウェル間での雑菌混入を防ぐために封止した。カードを７９００  ＨＴ  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems）のマイクロ流体カード試料ブロックに入れた。熱サイクル条件は、５０℃で２分間、９４．５℃で１０分間、その後９７℃で３０秒及び５９．７℃で１分間を４０サイクルであった。
【０１２８】
機器の配列検出システム（ＳＤＳ）ソフトウェアを用いて生データを記録した。自動データ分析のためにＲＱドキュメント及びＲＱマネージャーソフトウェアを用いて、マイクロ流体カードを分析した。δサイクル閾値（Ｃｔ）の値を各試験遺伝子のＣｔとヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ）（内因性制御因子）のＣｔとの間の差異として求めた。さらに、遺伝子発現の値を比較閾値サイクル（Ｃｔ）法（ここでは正常な前立腺のＲＮＡ試料を他の試料が比較された較正因子に指定した）に基づき算出した。
【０１２９】
ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴアレイにより見出された差次的に発現した遺伝子の検証のために、７０個の前立腺がん標本をＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（ＴＬＤＡ）に用いた。これらのＴＬＤＡでは、発現レベルを目的の３３個の遺伝子で求めた。前立腺がん標本を低いグリソンスコアから、高いグリソンスコア、ＣＲＰＣ及び最後に前立腺がん転移と順番に置いた。散布図及びボックスプロットを用いて、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴアレイ及びＴＬＤＡデータの両方を分析した。
【０１３０】
第１のアプローチでは、標本を低いグリソンスコアから、高いグリソンスコア、ＣＲＰＣ及び最後に前立腺がん転移と順番に置いた散布図を作成した。第２のアプローチでは、臨床経過観察データが含まれていた。標本を６つのグループにカテゴリー分けした：根治治療を行った前立腺がん患者、生化学的再発が遅い患者（治療後、５年以上）、生化学的再発が早い患者（３年以内）、進行性になった患者、ＣＲＰＣの患者、及び最後に前立腺がん転移した患者。両方のアプローチを用いたボックスプロット及び散布図の分析の後、前立腺がん及びその予後の指標となる好適な遺伝子のリストを得た（表４、図８〜図１４）。
【０１３１】
【表４】
2012504397.tif 000006
【０１３２】
ＨＯＸＣ６（図８）：本発明のＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴアレイデータにより、ＨＯＸＣ６が原発性の高悪性度及び低悪性度の前立腺がんと比較して前立腺がん転移においてアップレギュレーションしていることが示された。ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイを用いた検証実験により、このアップレギュレーションが確認された。さらに、ＨＯＸＣ６が正常な前立腺と比較して４つ全ての前立腺がん群でアップレギュレーションしていることが見出された。そのため、ＨＯＸＣ６には診断的用途への可能性がある。
【０１３３】
臨床的経過観察データを用いて、進行性疾患の患者全て及び初期療法の３年以内に生化学的再発があった患者の５０％で、５年後に生化学的再発があった患者及び根治治療を行った患者と比較してＨＯＸＣ６発現がより強くアップレギュレーションしたことが観察された。またより強くＨＯＸＣ６を発現した、初期療法の３年以内に生化学的再発があった患者は、より低くＨＯＸＣ６を発現した患者と比較してより不良な予後を有していた。そのため、ＨＯＸＣ６発現は、前立腺がん進行と相関している。
【０１３４】
ＳＦＲＰ２（図９）：本発明のＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴアレイデータにより、ＳＦＲＰ２が原発性の高悪性度及び低悪性度の前立腺がんと比較して前立腺がん転移においてダウンレギュレーションしていることが示された。ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイを用いた検証実験により、このダウンレギュレーションが確認された。さらに、ＳＦＲＰ２が正常な前立腺と比較して４つ全ての前立腺がん群でダウンレギュレーションしていることが見出された。そのため、ＳＦＲＰ２には診断的用途への可能性がある。
【０１３５】
臨床的経過観察データを用いて、根治治療を行った患者と、初期療法後に生化学的再発があった患者と、進行性疾患の患者との間でＳＦＲＰ２発現に差異が観察された。転移の５０％超がＳＦＲＰ２の大きいダウンレギュレーションを示した。さらに、数人のＣＲＰＣ患者が、非常に小さいＳＦＲＰ２発現を示した。そのため、内分泌療法を受けても進行性の（ＣＲＰＣ）患者及び前立腺がん転移した患者の検出にＳＦＲＰ２を用いることができる。したがって、転移においてアップレギュレーションするマーカーと組み合わせて、このマーカーとＳＦＲＰ２との比を循環腫瘍細胞の検出に用いることができることが示唆される。
【０１３６】
ＨＯＸＤ１０（図１０）：本発明のＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴアレイデータにより、ＨＯＸＤ１０が原発性の高悪性度及び低悪性度の前立腺がんと比較して前立腺がん転移においてダウンレギュレーションしていることが示された。ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイを用いた検証実験により、このダウンレギュレーションが確認された。さらに、ＨＯＸＤ１０が正常な前立腺と比較して４つ全ての前立腺がん群でダウンレギュレーションしていることが見出された。そのため、ＨＯＸＤ１０には診断的用途への可能性がある。
【０１３７】
臨床的経過観察データを用いて、根治治療を行った患者と、初期療法後に生化学的再発があった患者と、進行性疾患の患者との間でＨＯＸＤ１０発現に差異が観察された。全ての転移がＨＯＸＤ１０の大きいダウンレギュレーションを示した。さらに、数人のＣＲＰＣ患者が小さいＨＯＸＤ１０発現を示した。そのため、内分泌療法を受けても進行性の（ＣＲＰＣ）患者及び前立腺がん転移した患者の検出にＨＯＸＤ１０を用いることができる。
【０１３８】
ＲＯＲＢ（図１１）：本発明のＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴアレイデータにより、ＲＯＲＢが原発性の高悪性度及び低悪性度の前立腺がんと比較して前立腺がん転移及びＣＲＰＣにおいてアップレギュレーションしていることが示された。ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイを用いた検証実験により、このアップレギュレーションが確認された。さらに、ＲＯＲＢが正常な前立腺と比較して全ての低悪性度及び高悪性度の前立腺がんでダウンレギュレーションしていることが見出された。ＣＲＰＣ及び転移において、ＲＯＲＢは正常な前立腺と同じレベルで再発現する。そのため、ＲＯＲＢには診断的用途への可能性がある。
【０１３９】
臨床的経過観察データを用いて、根治治療を行った患者と、初期療法後に生化学的再発があった患者と、進行性疾患の患者との間でＲＯＲＢ発現に差異が観察された。しかしながら、ＣＲＰＣ及び転移における多くの症例において、ＲＯＲＢのアップレギュレーションはＳＦＲＰ２のダウンレギュレーションと一致する。ＳＦＲＰ２に対するＲＯＲＢの比を用いることにより、前立腺がん転移の７５％を検出することができる。さらに、多くのＣＲＰＣ患者は高いＲＯＲＢ／ＳＦＲＰ２比を有していた。そのため、この比はＣＲＰＣ下で循環腫瘍細胞を有する患者及び進行性の患者の検出に用いることができる。
【０１４０】
ＲＲＭ２（図１２）：ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイを用いた実験により、正常な前立腺と比較して前立腺がんの４つ全ての群でＲＲＭ２のアップレギュレーションが示された。そのため、ＲＲＭ２には診断的用途への可能性がある。さらに、ＲＲＭ２の発現はＣＲＰＣ及び転移でより高く、このことがＲＲＭ２の発現が前立腺がん細胞の侵襲性及び転移能にかかわり得ることを示している。そのため、ＲＲＭ２を循環前立腺腫瘍細胞の検出に用いることができる。
【０１４１】
臨床的経過観察データを用いて、根治治療を行った患者と、初期療法後に生化学的再発があった患者と、進行性疾患の患者との間でＲＲＭ２発現に差異が観察された。
【０１４２】
ＴＧＭ４（図１３）：本発明のＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴアレイデータにより、ＴＧＭ４が原発性の高悪性度及び低悪性度の前立腺がんと比較して前立腺がん転移においてダウンレギュレーションしていることが示された。ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイを用いた検証実験により、このダウンレギュレーションが確認された。さらに、ＴＧＭ４が正常な前立腺と比較して４つ全ての前立腺がん群で極度にダウンレギュレーションしていることが見出された。そのため、ＴＧＭ４には診断的用途への可能性がある。
【０１４３】
臨床的経過観察データを用いて、進行性疾患の患者が根治治療を行った患者及び初期治療後に生化学的再発があった患者と比較してより強いＴＧＭ４（患者のサブグループ）のより強いダウンレギュレーションを示すことが観察された。転移において、ＴＧＭ４発現が完全にダウンレギュレーションしている。そのため、ＴＧＭ４には予後診断的用途への可能性がある。
【０１４４】
ＳＮＡＩ２（図１４）：本発明のＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴアレイデータにより、ＳＮＡＩ２が原発性の高悪性度及び低悪性度の前立腺がんと比較して前立腺がん転移においてダウンレギュレーションしていることが示された。ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイを用いた検証実験によりこのダウンレギュレーションが確認された。さらに、ＳＮＡＩ２が正常な前立腺と比較して４つ全ての前立腺がん群でダウンレギュレーションしていることが見出された。そのため、ＳＮＡＩ２には診断的用途への可能性がある。
【０１４５】
臨床的経過観察データを用いて、根治治療を行った患者と、初期療法後に生化学的再発があった患者と、進行性疾患の患者との間でＳＮＡＩ２発現に差異が観察された。
【図１】
2012504397.tif 000007
【図２】
2012504397.tif 000008
【図３】
2012504397.tif 000009
【図４】
2012504397.tif 000010
【図５】
2012504397.tif 000011
【図６】
2012504397.tif 000012
【図７】
2012504397.tif 000013
【図８】
2012504397.tif 000014
【図９】
2012504397.tif 000015
【図１０】
2012504397.tif 000016
【図１１】
2012504397.tif 000017
【図１２】
2012504397.tif 000018
【図１３】
2012504397.tif 000019
【図１４】
2012504397.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成23年6月2日(2011.6.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト個体において前立腺がんの有無を確定する方法であって、
ａ）前記ヒト個体を起源とする試料においてＨＯＸＣ６、ＲＲＭ２、ＴＧＭ４、ＲＯＲＢ、ＨＯＸＤ１０、ＳＦＲＰ２及びＳＮＡＩ２からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を決定するステップと、
ｂ）前立腺腫瘍細胞若しくは前立腺腫瘍組織を含まない前記ヒト個体、又は前立腺がんを患っていない個体を起源とする試料における前記１以上の遺伝子それぞれの発現と比較して、前記１以上の遺伝子の発現のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを確定するステップと、
ｃ）前記１以上の遺伝子のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションの確定に基づき前立腺がんの有無を確定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記方法がｅｘ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１以上の遺伝子の発現を決定するステップがｍＲＮＡ発現を決定することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記１以上の遺伝子の発現を決定するステップがタンパク質レベルを決定することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記１以上が、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上及び７からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ヒト個体において前立腺がんの有無を確定するステップが、低悪性度ＰｒＣａ（ＬＧ）、高悪性度ＰｒＣａ（ＨＧ）、ＰｒＣａ  Ｍｅｔ及び／又はＣＲＰＣ、好ましくはＣＲＰＣを同定又は診断することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ヒト個体において前立腺がんの有無を確定するための、ＨＯＸＣ６、ＲＲＭ２、ＴＧＭ４、ＲＯＲＢ、ＨＯＸＤ１０、ＳＦＲＰ２及びＳＮＡＩ２からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現分析の使用。
【請求項８】
前記発現分析がｅｘ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記１以上が、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上及び７からなる群から選択される、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１０】
ヒト個体において前立腺がんの有無を確定するための部品のキットであって、
ＨＯＸＣ６、ＲＲＭ２、ＴＧＭ４、ＲＯＲＢ、ＨＯＸＤ１０、ＳＦＲＰ２及びＳＮＡＩ２からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を決定するための発現分析手段と、
使用説明書と、
を含む、部品のキット。
【請求項１１】
前記発現分析手段が、ｍＲＮＡ発現分析手段、好ましくはＰＣＲ、ｒｔＰＣＲ又はＮＡＳＢＡのための手段を含む、請求項１０に記載の部品のキット。
【請求項１２】
前記発現分析手段が、タンパク質発現分析手段、好ましくはＥＬＩＳＡ又は免疫組織化学的技法を含む、請求項１０に記載の部品のキット。
【請求項１３】
前記１以上が、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上及び７からなる群から選択される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の部品のキット。
【国際調査報告】
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