(57)【要約】  リグニンを含むリグノセルロースバイオマスが、高温、アルカリ条件下でオルガノソルブなどの溶剤で処理され、ろ過され、次いで、オゾンを含むガスと接触されて、容易に糖化可能なバイオマスが生成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）リグニンを含むリグノセルロースバイオマスを備えるステップ；
（ｂ）バイオマスを、水と、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、アンモニアおよびこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種の無機塩基とを含む有機溶剤溶液と接触させ、それによりバイオマス−溶剤懸濁液を形成させるステップ；
（ｃ）バイオマス−溶剤懸濁液を約１００℃〜約２２０℃の温度に約１５分間〜約４８時間の反応時間加熱し、それによりリグニンをバイオマスから断片化させて、懸濁液中に溶解させるステップ；
（ｄ）（ｃ）において懸濁液を加熱した後に自由液体を加圧下にろ過し、それにより溶解リグニンを除去し、それにより前処理済バイオマスを形成させるステップ；
（ｅ）（ｄ）からの前処理済バイオマスを、オゾンを含むガスと約０℃〜約５０℃の温度で少なくとも約１分の反応時間接触させ、それにより容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを生産させるステップ
を含む、容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを生産する方法。
【請求項２】
（ｄ）の後かつ（ｅ）の前に、ステップ（ｄ）において生産された前処理済バイオマスを有機溶剤溶液で洗浄するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リグノセルロースバイオマスがステップ（ａ）に先立って前処理にかけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
有機溶剤溶液が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノールおよびｔ−ブタノール、ならびにこれらの混合物からなる群から選択されるアルコールをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アルコールがエタノールである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
有機溶剤溶液が、約０〜約１００パーセント（体積／体積）エタノールを含有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
無機塩基の量が、バイオマスの乾燥質量に対して、約１質量パーセント〜約１４質量パーセントである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
バイオマスの乾燥質量が、（ｂ）のバイオマス−溶剤懸濁液の質量の約１５％〜約７０％の濃度に当る、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ガスが、約０．１〜約２０体積パーセントのオゾンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ガスが、空気、窒素、酸素、アルゴンまたはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｅ）におけるオゾン対前処理済バイオマスの比が、質量基準で少なくとも約１：１２００である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｅ）に先立って、前処理済バイオマスを、水を含む第２の溶剤溶液と接触させ、それにより第２のバイオマス−溶剤懸濁液を形成させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
第２のバイオマス−溶剤懸濁液におけるバイオマスの質量パーセントが約２０〜約７０である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前処理済バイオマスが約３０〜約６０パーセントの湿分を含有する、請求項１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを酵素集合体で糖化させ、それにより発酵可能な糖類を生産させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
糖類を発酵させて標的化合物を生産するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年１２月１９日に出願の米国仮特許出願第６１／１３９１０６号明細書に基づく優先権の利益を主張する。本出願は、米国仮特許出願第６１／１３９１０６号明細書の全体を参照により援用する。
【０００２】
容易に糖化可能な、炭水化物富化リグノセルロースバイオマスを生成するための方法が提供されていると共に開示されている。具体的には、前処理済バイオマスが、アルカリ性オルガノソルブ条件下での、高温でのリグニンの同時断片化および選択的抽出を通して、次いで、オゾンを含むガスを接触させることにより調製される。次いで、前処理済バイオマス中に残留している炭水化物富化固形分が酵素糖化に供されて発酵可能な糖質が得られ得、これが、他の目標生成物の生成のためのさらなる加工に供され得る。
【背景技術】
【０００３】
農業残渣、木材、林業廃棄物、製紙由来のスラッジ、ならびに、都市および産業固体廃棄物などのセルロースおよびリグノセルロース系供給原料および廃棄物は、化学薬品、プラスチック、燃料および飼料の製造のための潜在的に大きな再生可能原材料を提供する。セルロース、ヘミセルロース、ペクチンおよびリグニンを含む炭水化物ポリマーから構成されるセルロースおよびリグノセルロース系供給原料および廃棄物は、一般に、多様な化学的、機械的および酵素的手段により処理されて第１級ヘキソースおよびペントース糖質が遊離され、次いで、これが、有用な生成物に発酵されることが可能である。
【０００４】
通常、リグノセルロースバイオマスの多糖類を、セルロース分解酵素に対してより容易にアクセス可能とするために、前処理方法が用いられる。多糖のセルロース分解酵素消化に対する主な障害の一つは、酵素の基質に対するアクセスを制限するバリアおよび酵素が非生産的に結合する表面である、リグニンの存在である。前処理プロセスにおける酵素の相当のコストのために、酵素吸着に対するリグニンの非働化、または、その完全な抽出により、酵素の使用量を最低限とすることが望ましい。他の課題は、ヘミセルロースおよびリグニンによる保護または結晶化度による保護による、酵素加水分解に対するセルロースの難アクセス性である。これらの課題の解決を試みる前処理方法としては：水蒸気爆発、熱水、希酸、アンモニア繊維爆発、アルカリ加水分解（アンモニア再利用パーコレーションを含む）、酸化脱リグニン化、オルガノソルブ、およびオゾン処理が挙げられる。
【０００５】
公開ＰＣＴ特許出願の特許文献１には、オルガノソルブパルププロセスから得られた褐色紙料パルプのオゾンでの白化ステップ；オゾン化されたパルプを低級アルキルアルコールの水溶液で洗浄してその中に溶解されたリグニンを除去するステップ；ならびに、水溶液の濾液を洗浄したパルプから除去するステップを含むオルガノソルブパルプの白化プロセスが開示されている。このプロセスは、褐色紙料パルプを、パルプをオゾン化する前に低級アルキルアルコールの水溶液で洗浄するステップをさらに含む。
【０００６】
非特許文献１には、異なる有機溶剤−水混合物および異なる条件下における自己加水分解され、続いて、加溶媒分解固体および液の両方のオゾン処理されたコーン茎に由来するリグニンの溶解度の研究が開示されている。オルガノソルブ処理のための最適な条件は、７５／２５（ｖ／ｖ）アセトン／水混合物、２１０℃、４５分間であった。有機加溶媒分解の後、この材料は、固定床反応器中で、２０分間、室温でオゾンで処理された。研究において用いられる前に、自己加水分解されたコーン茎が以下のとおり用意された：周囲温度で乾燥し、ハンマーミルで破砕し、０．２〜０．５ｍｍ径でふるいかけし、７／３（ｖ／ｖ）エタノール−トルエン混合物でソックスレー−抽出し、水でソックスレー−抽出し、水蒸気爆発デバイス中に２２０℃で３分間自己加水分解に供し、周囲温度で十分な水で抽出し、次いで、１リットルの沸騰している水で抽出した。
【０００７】
度々、既に適用されている前処理方法は欠点を有し、これは、個別のヘキソースおよびペントース流、特にリグニン含有量が高い供給原料（例えば、サトウキビバガス、軟材）における不十分なリグニン抽出または抽出されたリグニンの多糖からの分離不足、廃棄生成物（例えば、酸または塩基の中和で形成される塩）の廃棄、ならびに、洗浄ステップにおける分解または損失による炭水化物の低い回収率を含む。他の問題としては、エネルギーの高いコスト、設備投資、および、前処理触媒回収率、および、糖化酵素との比適合性が挙げられる。
【０００８】
リグノセルロースバイオマスの前処理の主な課題の一つは、炭水化物の損失（セルロース＋ヘミセルロース）を最小限としつつ、リグニンの抽出または化学的中和（セルロース分解酵素の非生産的な結合に関して）を最大化することである。保存可能な炭水化物が多いほど、前処理および酵素糖化の組み合わせに続く単糖の全収率は高くなる。
【０００９】
炭水化物富化バイオマスを費用対効果の高い方法で生成するための、バイオマスからリグニンを選択的に抽出する方法が所望されている。また、高度に酵素糖化されやすく、かつ、付加価値化学薬品および燃料への生物変換のために発酵可能な糖質（例えば、グルコースおよびキシロース）を高い収率でもたらすことが可能である、炭水化物富化バイオマスを生成する方法が所望される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第９７／３６０４０号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｊ．Ｑｕｅｓａｄａら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８年）、６８、１８６７〜１８７６ページ
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを生成する方法、ならびに、炭水化物を良好な収率で保存しつつリグニンを選択的に抽出および断片化する方法を提供する。これらの方法は、リグノセルロースバイオマスを、高温、アルカリ条件下でオルガノソルブなどの溶剤で処理するステップ、次いで、バイオマスを、オゾンを含むガスと接触させるステップを含む。前処理の後、バイオマスは、糖化酵素共同体でさらに処理されて、発酵可能な糖質が生成され得る。これらの糖質は、目標生成物を生成するためのさらなる加工ステップに供され得る。本発明の一実施形態において、方法が提供されており、この方法は以下を含む：
（ａ）リグニンを含むリグノセルロースバイオマスを提供するステップ；
（ｂ）バイオマスを、水と、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、アンモニアおよびこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種の無機塩基とを含む有機溶剤溶液と接触させて、バイオマス−溶剤懸濁液を形成するステップ；
（ｃ）バイオマス−溶剤懸濁液を約１００℃〜約２２０℃の温度に約１５分間〜約４８時間の反応時間加熱して、リグニンをバイオマスから断片化させて、懸濁液中に溶解させるステップ；
（ｄ）（ｃ）において懸濁液を加熱した後に自由液体を加圧下にろ過して、溶解リグニンを除去し、前処理済バイオマスを形成するステップ；
（ｅ）（ｄ）からの前処理済バイオマスを、オゾンを含むガスと約０℃〜約５０℃の温度で少なくとも約１分の反応時間接触させて、容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを生成するステップ。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本方法は：（ｄ）の後かつ（ｅ）の前に、ステップ（ｄ）において生成された前処理済バイオマスを有機溶剤溶液で洗浄するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、リグノセルロースバイオマスはステップ（ａ）に先立って前加工に供されるが、ただし、このような前加工は、容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスの生成には必須ではない。
【００１４】
いくつかの実施形態において、（ｃ）における温度は約１４０℃〜約１８０℃である。いくつかの実施形態において、（ｃ）における反応時間は約１時間〜約１２時間である。
【００１５】
本発明の方法によれば、有機溶剤溶液は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノールおよびｔ−ブタノール、ならびに、これらの混合物からなる群から選択されるアルコールをさらに含む。いくつかの実施形態において、アルコールはエタノールである。いくつかの実施形態において、有機溶剤溶液は約０〜約１００パーセント（体積／体積）エタノールを含有する。いくつかの実施形態において、無機塩基の量は、バイオマスの乾燥重量を基準として、約１重量パーセント〜約１４重量パーセントである。いくつかの実施形態において、無機塩基は炭酸カリウムである。いくつかの実施形態において、バイオマスの乾燥重量は、（ｂ）のバイオマス−溶剤懸濁液の重量の約１５％〜約７０％の濃度である。
【００１６】
本発明の方法によれば、ガスは約０．１〜約２０体積パーセントのオゾンを含む。いくつかの実施形態において、ガスは約０．５〜約５体積パーセントのオゾンを含む。いくつかの実施形態において、ガスは、空気、窒素、酸素、アルゴンまたはこれらの組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｅ）におけるオゾン対前処理済バイオマスの比は、重量基準で少なくとも約１：１２００である。いくつかの実施形態において、（ｅ）における温度は約０℃〜約２５℃である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本方法は、ステップ（ｅ）に先立って、前処理済バイオマスを、水を含む二次溶剤溶液と接触させて、第２のバイオマス−溶剤懸濁液を形成するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のバイオマス−溶剤懸濁液におけるバイオマスの重量パーセントは約２０〜約７０である。いくつかの実施形態において、二次溶剤溶液は緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、第２のバイオマス−溶剤懸濁液は約１〜約１０のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、本方法は、ステップ（ｅ）の後、ｐＨをバイオマスの酵素糖化に十分な第２のｐＨに調整するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、二次溶剤溶液は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノールおよびｔ−ブタノール、ならびに、これらの混合物からなる群から選択されるアルコールをさらに含む。いくつかの実施形態において、アルコールはエタノールである。いくつかの実施形態において、二次溶剤溶液は約０〜約１００パーセント（体積／体積）エタノールを含有する。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本方法は、ステップ（ｅ）の最中にエネルギーを前処理済バイオマスに適用するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ステップ（ｅ）の最中に前処理済バイオマスにエネルギーを適用するステップをさらに含み、ここで、エネルギーは、ミリング、破砕、研削、寸断、細断、ディスク精砕、超音波、マイクロ波、または、これらの組み合わせにより適用される。いくつかの実施形態において、前処理済バイオマスは、約３０〜約６０パーセントの湿分を含有する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、バイオマスを酵素共同体で糖化させて、発酵可能な糖質を生成するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、糖質を発酵させて目標生成物を生成するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、目標生成物は、エタノール、ブタノール、および１，３−プロパンジオールからなる群から選択される。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
出願人らは、本開示において引用されているすべての文献の全内容を特定的に援用する。さらに、量、濃度、または他の値またはパラメータが、範囲、好ましい範囲、または、好ましい上限値および好ましい下限値の列挙として記載されている場合、これは、範囲が別に開示されていない限りにおいて、任意の範囲上限または好ましい値と任意の範囲下限または好ましい値との任意の対から形成されるすべての範囲を特定的に開示していると理解されるべきである。本明細書において数値の範囲が言及されている場合、他に明記されていない限りにおいて、この範囲は、範囲内の両端点、ならびに、すべての整数および少数を含むことが意図されている。本発明の範囲が、範囲の定義の際に言及されている特定の値に限定されることは意図されていない。
【００２１】
本発明は、その後の酵素糖化ステップを促進させるためのバイオマスの処理のための２ステップ法を提供する。第１のステップにおいては、高温でのアルカリオルガノソルブ条件を用いて、リグニンが同時に断片化および抽出される。第２のステップにおいては、溶剤懸濁液または固体としてのバイオマスにオゾンを含むガスが接触させられる。処理されたバイオマスは、糖化酵素共同体で消化されて、発酵可能な糖質が生成され得る。
【００２２】
定義
以下の定義が本開示において用いられている。
温度に関して用いられる場合、「室温」および「周囲」とは、約１５℃〜約２５℃の任意の温度を指す。
【００２３】
「発酵可能な糖質」とは、目標生成物を生成するための発酵プロセスにおいて微生物によって炭素源として用いることが可能である単糖およびいくらかの多糖類を主に含む糖質含有物を指す。
【００２４】
「リグノセルロース」とは、リグニンおよびセルロースの両方を含む材料を指す。リグノセルロース材料はヘミセルロースをも含んでいてもよい。本明細書に記載の方法において、リグニンは酸化されると共に分解されて、発酵可能な糖質を含む炭水化物富化バイオマスをオゾン処理の最中に生成する。リグニンは溶解されて、オゾンの存在下および不在下の両方で、オルガノソルブ処理の最中にリグノセルロースバイオマスから実質的に除去されて、発酵可能な糖質を含む炭水化物富化バイオマスが生成される。
【００２５】
「溶解リグニン」とは、溶剤中に溶解されたリグニンを意味する。
【００２６】
「ＡＩリグニン」とは、酸不溶性リグニンを指す。
【００２７】
「自己加水分解」とは、加水分解酵素などのさらなる添加を伴わない、溶剤（水、または、有機溶剤＋水）＋熱の存在下でのバイオマスの加水分解を指す。
【００２８】
「セルロース系」とは、セルロースを含む組成物を指す。
【００２９】
「目標生成物」とは、発酵によって生成される薬品、燃料または化学構築ブロックを指す。生成物は、広範に用いられると共に、例えば、ペプチド、酵素および抗体を含むタンパク質などの分子を含む。目標生成物の定義には、エタノールおよびブタノールが含まれることも意図されている。
【００３０】
略記「ＥｔＯＨ」とは、エタノールまたはエチルアルコールを指す。
【００３１】
「バイオマスの乾燥重量」とは、すべての水または実質的にすべての水が除去されたバイオマスの重量を指す。乾燥重量は、典型的には、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ＡＳＴＭ）規格Ｅ１７５６−０１（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｏｌｉｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｍａｓｓ）またはＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｕｌｐ  ａｎｄ  Ｐａｐｅｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｉｎｃ．（ＴＡＰＰＩ）規格Ｔ−４１２  ｏｍ−０２（Ｍｏｉｓｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｐｕｌｐ，Ｐａｐｅｒ  ａｎｄ  Ｐａｐｅｒｂｏａｒｄ）に準拠して計測される。
【００３２】
「選択的抽出」とは、炭水化物が実質的に保存されるリグニンの除去を意味する。
【００３３】
本明細書において用いられる、「溶剤溶液」および／または「有機溶剤溶液」は、固体、液体または気体の溶質を溶解して溶液をもたらす任意の有機液体溶剤を含む水中の溶媒混合物である。本発明のために最も好適な溶剤溶液は、エタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール、ペンタノールおよびヘキサノール、ならびに、炭素数が同一であるジオールなどの有機溶剤を含む。これらはまた、非プロトン性溶剤を含んでいてもよい。溶剤溶液は、溶液との混合物で追加の成分を含んでいてもよい。
【００３４】
本明細書において用いられる、「バイオマス」および「リグノセルロースバイオマス」とは、例えば、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固体廃棄物、産業固体廃棄物、庭園廃棄物、木材、林業廃棄物およびこれらの組み合わせ、ならびに、以下にさらに記載されているものといった、セルロース系およびヘミセルロース系材料を含む任意のリグノセルロース材料を指す。バイオマスは、多糖類およびオリゴ糖を含む炭水化物含有物を有し、またタンパク質および／または脂質などの追加の成分をも含んでいてもよい。
【００３５】
本明細書において用いられる、「高度に保存された」とは、本明細書に記載の加工ステップ後のリグノセルロース材料の炭水化物含有量を指す。発明の一実施形態において、高度に保存された炭水化物含有量は、理論収率と実質的に同様である糖化後の糖質収率を提供し、および／または、本明細書に記載のプロセスによる糖質収率の最低限の損失を実証する。発明の一実施形態において、炭水化物含有量に関して高度に保存されたとは、本明細書に記載の前処理に先立つバイオマスと比してバイオマス炭水化物の８５％以上の保存を指す。
【００３６】
本明細書において用いられる、「プレ加工」とは、前処理に先立つリグノセルロースバイオマスの加工を指す。プレ加工は、機械的細断および／または適切な水分含有量への乾燥などの前処理用のバイオマスを調製するバイオマスの任意の処理である。
【００３７】
本明細書において用いられる、「バイオマス−溶剤懸濁液」とは、バイオマスと溶剤との混合物を指し、ここで、バイオマスは、溶剤溶液中の懸濁液である。バイオマス−溶剤懸濁液は、塩基または緩衝剤などの追加の成分を含んでいてもよい。本明細書において用いられる、「スラリー」は、「懸濁液」と同義に用いられる。
【００３８】
「糖化」とは、加水分解酵素の作用による多糖類からの発酵可能な糖質の生成を指す。前処理済バイオマスからの発酵可能な糖質の生成は、セルロース分解酵素およびヘミセルロース分解酵素の作用による酵素糖化によって生じる。
【００３９】
「バイオマスを前処理する」または「バイオマス前処理」とは、自然のまたは前加工されたバイオマスを化学的、物理的あるいは生物学的作用、または、いずれかのこれらの組み合わせに供して、酵素糖化に対する、または、糖化に先立つ他の加水分解手段に対するより高い感度をバイオマスに与えることを指す。例えば、本明細書において特許請求されている方法は、バイオマスを糖化のために加水分解酵素に対してよりアクセス可能とするための前処理プロセスとして称され得る。
【００４０】
本明細書において用いられる、「前処理済バイオマス」とは、酵素糖化に対する、または、糖化に先立つ他の加水分解手段に対するより高い感度をバイオマスに与える、化学的、物理的あるいは生物学的作用、または、いずれかのこれらの組み合わせに供された、自然のまたは前加工されたバイオマスを指す。
【００４１】
「ろ過されたバイオマスを空気乾燥するステップ」は、バイオマスを周囲雰囲気の空気との平衡を介して乾燥させることにより実施されることが可能である。
【００４２】
「容易に糖化可能なバイオマス」とは、炭水化物富化されていると共に、単糖およびオリゴ糖の生成のためにセルロースまたはヘミセルロース分解酵素によってより加水分解されやすくされたバイオマスを意味する。
【００４３】
本明細書において用いられる、「炭水化物富化された」とは、バイオマス炭水化物の良好な収率が保存されていると共に、バイオマス中のリグニンが選択的に酸化および分解されている（ならびに、オルガノソルブの場合には溶解および抽出されている）、本明細書に記載のプロセス処理により生成されるバイオマスを指す。一実施形態において、本明細書に記載のプロセスにより生成された容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスは、バイオマスリグニンの７５％以上が除去されつつも、本明細書に記載の前処理に先立つバイオマスに比してバイオマス炭水化物の約８５％以上の炭水化物濃度を有する。
【００４４】
「バイオマス懸濁液を加熱するステップ」とは、溶剤中に懸濁されたバイオマスを周囲温度または室温を超える温度に供するステップを意味する。
【００４５】
「自由液体を加圧下にろ過するステップ」とは、フィルタの両面にいくらかの圧力差をかけたろ過を通した自由液体の除去を意味する。
【００４６】
「アルカリ」とは、７．０を超えるｐＨを意味する。特に、７．０を超える、バイオマス−ＥｔＯＨ／水およびアルカリ混合物のｐＨが好適である。
【００４７】
「空気乾燥されたサンプル」とは、その含水量が、典型的には≧８５％乾燥物質といった、周囲空気の含水量と略平衡となるような程度の周囲温度で乾燥された前処理済バイオマスを意味する。
【００４８】
「実質的にリグニンを含まないバイオマス」とは、約≦２５％の出発リグニン組成物を含有する前処理されたサンプルを意味する。
【００４９】
「多成分溶剤」とは、有機溶剤、水、および、リグニンを化学的に攻撃可能な試薬を含有する溶剤を意味する。
【００５０】
「圧力容器」は、バイオマス／溶剤懸濁液を攪拌するための機構を備えていてもいなくてもよい、リグノセルロースバイオマスの加熱時に正圧がかけられる密閉容器である。
【００５１】
「求核剤」は、結合電子の両方を与えることによりその反応相手と共有結合を形成することが可能である化学薬品である。
【００５２】
「加水分解物」とは、バイオマスに作用する（酵素的にまたは非酵素的に）加水分解反応の生成物を含有するリグノセルロースバイオマスに接触している液体を指し、この場合単糖およびオリゴ糖を指す。
【００５３】
「オルガノソルブ」とは、有機溶剤と水との混合物を意味する。
【００５４】
「酵素共同体」または「糖化酵素共同体」は、通常微生物によって分泌される一群の酵素であって、これは、本事例においては、典型的には、１種以上のセルラーゼ、キシラナーゼ、グリコシダーゼ、リグニナーゼおよびフェルロイルエステラーゼを含有するであろう。
【００５５】
「単糖」または「単純な糖質」は、単一のペントースまたはヘキソースユニット、例えば、グルコースから構成される。
【００５６】
「脱リグニン化」は、リグノセルロースバイオマスからリグニンを除去する操作である。本出願の文脈において、脱リグニン化とは、１）高温、アルカリ条件下でオルガノソルブを用いるリグノセルロースバイオマスからのリグニンの断片化および抽出、および／または、２）オゾンを用いる前処理リグノセルロースバイオマスからのリグニンの断片化および抽出または分解を意味する。
【００５７】
「断片化」は、リグノセルロースバイオマスを、オルガノソルブ条件下で処理して、および／または、オゾンで処理して、リグニンをより小さなサブユニットに分解するプロセスである。本出願の文脈においては、リグニンの酸化がリグニンのより小さなサブユニットへの分解に寄与し得る。
【００５８】
「選択的抽出」は、リグニンをオルガノソルブまたはアルカリオルガノソルブ条件下での処理によって抽出および溶解させて、多糖を残留させるプロセスである。
【００５９】
「オゾン化」は、バイオマスのオゾンでの処理操作である。バイオマスは、バイオマス−溶剤懸濁液として、または、追加の液体相が伴わない固体として存在し得る。
【００６０】
容易に糖化可能なバイオマスを生成するリグノセルロースバイオマスの前処理方法が提供されている。これらの方法は、リグノセルロースバイオマスの成分を、酵素糖化に対してよりアクセス可能に、または、受容可能にするための経済的プロセスを提供する。この前処理は、化学的、物理的あるいは生物学的、または、前述のものの任意の組み合わせであり得る。本開示において、前処理方法は、先ず、バイオマスをアルカリオルガノソルブ条件下で処理するステップ、次いで、この処理したバイオマスをオゾンを含むガスに接触させるステップを含む。アルカリオルガノソルブおよび／またはオゾンの存在が、リグニン断片化および除去または分解、ならびに、炭水化物回収を補助する。
【００６１】
加えて、本開示に記載の方法は、前処理プロセスの最中の炭水化物の損失を最低限とし、また、糖化における単糖の収率を最大限とする。
【００６２】
上記のとおり、本明細書に記載の方法は、高温、アルカリオルガノソルブ条件下でリグノセルロース材料を前処理するステップ、次いで、処理されたバイオマスを、オゾンを含むガスと接触させて、容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを生成するステップを含む。
【００６３】
リグノセルロースバイオマス
本明細書において前処理されるリグノセルロースバイオマスとしては、特に限定されないが、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固体廃棄物、産業固体廃棄物、製紙由来のスラッジ、庭園廃棄物、木材および林業廃棄物が挙げられる。バイオマスの例としては、これらに限定されないが、コーン穂軸、コーン包葉などの作物残渣、コーン葉茎、草、コムギ、コムギわら、オオムギ、オオムギわら、干草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、モロコシ、大豆、穀粒の粉砕から得られる構成要素、高木、枝、根、葉、木片、おがくず、低木および潅木、野菜、果実、花、ならびに、動物堆肥が挙げられる。
【００６４】
一実施形態においては、本発明に有用であるバイオマスは、比較的高い炭水化物含有量を有し、比較的高密度であり、および／または、収集、輸送、保管および／または取扱が比較的容易であるバイオマスを含む。
【００６５】
本発明の一実施形態において、有用であるバイオマスとしては、コーン穂軸、コーン葉茎、サトウキビバガスおよびスイッチグラスが挙げられる。
【００６６】
他の実施形態において、リグノセルロースバイオマスとしては、コーン葉茎、コムギわら、オオムギわら、カラスムギわら、稲わら、アブラナわらおよびダイズ葉茎などの農業残渣；スイッチグラス、茅、コードグラスおよびクサヨシなどの草；トウモロコシ繊維、ビートパルプ、パルプミル微細繊維およびパルプミル廃棄物ならびにサトウキビバガスなどの繊維加工残渣；モロコシ；ハコヤナギ材、他の硬材、軟材およびおがくずなどの林業廃棄物；ならびに、消費後の紙製品；ならびに、他の作物または十分に豊富に存在するリグノセルロース材料が挙げられる。
【００６７】
リグノセルロースバイオマスは、単一の供給源に由来し得、または、バイオマスは２つ以上の供給源に由来する混合物を含み得；例えば、バイオマスは、コーン穂軸およびコーン葉茎の混合物、または、幹もしくは茎および葉の混合物を含んでいることが可能である。
【００６８】
バイオマスは、供給源から入手されたまま直接的に用いられてもよく、または、何らかの前加工に供されてもよく、例えば、エネルギーがバイオマスに適用されて、サイズが低減され、露出表面積が高められ、および／または、アルカリオルガノソルブ前処理、オゾン処理前処理および糖化酵素に対するバイオマス中に存在するリグニンのアクセス性ならびにセルロース、ヘミセルロースおよび／またはオリゴ糖のアクセス性が高められる。サイズを減少させるために、露出表面積を高めるために、および／または、アルカリオルガノソルブ前処理、オゾン処理前処理および糖化酵素に対するバイオマス中に存在するリグニンならびにセルロース、ヘミセルロースおよび／またはオリゴ糖のアクセス性を高めるために有用なエネルギー手段としては、これらに限定されないが、ミリング、破砕、研削、寸断、細断、ディスク精砕、超音波、およびマイクロ波が挙げられる。エネルギーの適用は、前処理ステップの前もしくは最中もしくはその両方、糖化の前もしくは最中、または、いずれかのこれらの組み合わせで行われ得る。
【００６９】
前処理に先立つバイオマスの乾燥ステップは、回転式乾燥機、フラッシュドライヤまたは加熱蒸気乾燥機を用いるものなどの従来の手段によっても行われ得る。
【００７０】
溶剤
本明細書に記載の方法は、バイオマスの前処理のための有機溶剤溶液の使用を含む。本方法において有用な溶剤は、頻繁に、技術分野においてオルガノソルブと称される。溶剤の使用に関連する前処理テクノロジーおよび他の前処理に関する詳細は、例えば、Ｗｙｍａｎら（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈ．９６：１９５９，２００５年）；Ｗｙｍａｎら（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈ．９６：２０２６，２００５年）；Ｈｓｕ，（「Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｉｏｍａｓｓ」，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｗｙｍａｎ，ＴａｙｌｏｒおよびＦｒａｎｃｉｓ編，１７９〜２１２ページ，１９９６年）；ならびに、Ｍｏｓｉｅｒら、（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈ．９６：６７３、２００５年）に見出すことが可能である。溶剤が、リグニンを除去するためのバイオマスの前処理のために本明細書において用いられる。脱リグニン化は、典型的には、１６５〜２２５℃の温度で、４：１〜２０：１の液体対バイオマス比で、５０％有機溶剤（体積／体積［ｖ／ｖ］）の液体組成で、および、０．５〜１２時間の反応時間で実施される。多数のモノ−およびポリヒドロキシ−アルコールが溶剤としてテストされた。エタノール、ブタノールおよびフェノールが用いられた（Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｋ．およびＰｈｉｌｌｉｐｓ，Ｊ．Ａ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｍ．，６５：１８７〜２０５ページ，１９８８年）。
【００７１】
本方法におけるオルガノソルブまたは有機溶剤前処理は、水および有機溶剤の混合物を温度、時間、圧力、溶剤対水比および固形分対液体比を含む選択された条件パラメータで含んでいてもよい。溶剤は、特に限定されないが、アルコール、有機酸およびケトンを含み得る。アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブチルアルコール、およびこれらの混合物からなる群から選択され得る。アルコールはまたグリコールであり得る。本発明における溶液（すなわち水）中の溶剤の濃度は、約０％〜約１００％、または、約５％〜約９５％、または、約１０％〜約９０％、または、約１５％〜約８５％、または、約２０％〜約８０％、または、約２５％〜約７５％、または、約３０％〜約７０％、または、約３５％〜約６５％、または、約４０％〜約６０％、または、約４５％〜約５５％、または、約５０％（ｖ／ｖ）であり得る。特に、本明細書における方法の実施形態の目的のために約５０％〜９０％（ｖ／ｖ）エタノールのＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ混合物を試験したところ、有効であることが見出された。一実施形態においては、溶剤溶液は水を含む。
【００７２】
十分な量の糖質をバイオマスから得るために、バイオマスは、アルカリオルガノソルブの条件下で、１回または２回以上前処理され得る。前処理および糖化プロセスの性能を、個別にまたは一緒に評価するために、出発バイオマスから誘導可能な糖質の理論収率が測定され、また実測した収率と比較することが可能である。
【００７３】
溶剤溶液の追加の成分としての無機塩基
本方法によれば、溶剤溶液は、溶剤溶液の追加の成分として、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、アンモニア、およびこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種の無機塩基をさらに含み得る。無機塩基は、バイオマス乾燥重量（ｗ／ｗバイオマス）を基準として、約２０重量％（重量パーセント）未満である量で添加され得る。例えば、無機塩基の量は、バイオマスの乾燥重量を基準として、約０．５重量％、または、約１重量％、または、約２重量％、または、約５重量％、または、約１０重量％、または、約１４重量％であり得る。無機塩基は、少なくとも０．５重量％〜約２０重量％の種々の濃度で用いられ得る。約１重量％〜約１４重量％の濃度がより好適である。約５重量％〜約１４重量％の濃度が最も好適である。
【００７４】
一実施形態においては、炭酸カリウムが、溶剤溶液の追加の成分である無機塩基として利用され得る。炭酸カリウムは、特に、水溶液で、または、エタノール／水溶剤溶液で用いられ得る。炭酸カリウムは、バイオマス乾燥重量（ｗ／ｗバイオマス）に対して少なくとも約０．５重量％〜約２０重量％である量など、種々の濃度で用いられ得る。約１重量％〜約１４重量％の濃度がより好適である。約５重量％〜約１４重量％の濃度が最も好適である。約５０％〜９０％エタノールを水（ｖ／ｖ）中に含有する溶剤中への約５％（ｗ／ｗバイオマス）炭酸カリウムの添加がリグニン断片化および抽出のために効果的であり得る。
【００７５】
一実施形態においては、アンモニアが、溶剤溶液の追加の成分であり得る無機塩基として利用され得る。アンモニアは、特に、水溶液で、または、エタノール／水溶剤溶液で用いられ得る。アンモニアは、少なくとも約０．５重量％〜約２０重量％（ｗ／ｗバイオマス）である量など種々の濃度で用いられ得る。約１重量％〜約１４重量％（ｗ／ｗバイオマス）の濃度がより好適である。約５重量％〜約１４重量％（ｗ／ｗバイオマス）の濃度が最も好適である。約５０％〜９０％エタノールを水（ｖ／ｖ）中に含有する溶剤に対する約８重量％（ｗ／ｗバイオマス）アンモニアの添加が、リグニン断片化および抽出のために効果的であり得る。
【００７６】
オルガノソルブ処理条件
少なくとも１種の無機塩基を含む溶剤溶液でのバイオマスの前処理は、任意の好適な容器中で実施される。典型的には、容器は、圧力に耐えることが可能であり、加熱のためのメカニズムを有し、および、内容物を混合するためのメカニズムを有するものである。市販されている容器としては、例えば、Ｚｉｐｐｅｒｃｌａｖｅ（著作権）反応器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ，Ｅｒｉｅ，ＰＡ）、Ｊａｙｇｏ反応器（Ｊａｙｇｏ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｍａｈｗａｈ，ＮＪ）、ならびに、スチームガン反応器（Ｇｅｒａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｕｔｏｃｌａｖｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ，Ｅｒｉｅ，ＰＡに記載されている）が挙げられる。同様の機能を有するより大規模の反応器が用いられ得る。あるいは、バイオマスおよびオルガノソルブ溶液を１つの容器中に組み合わせ、次いで、他の反応器に移してもよい。また、バイオマスは、１つの容器中で前処理され得、次いで、さらに、スチームガン反応器などの他の反応器中で加工され得る。
【００７７】
前処理反応は、バッチ式反応器または連続式反応器などの任意の好適な容器で実施され得る。当業者は、より高い温度（１００℃超）、圧力容器が要求されることを認識するであろう。好適な容器は、バイオマス−オルガノソルブ混合物を攪拌するためのインペラなどの手段を備えていてもよい。反応器設計は、Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｈ．およびＶａｎ  Ｎｅｓｓ，Ｈ．Ｃ．（Ｐｅｒｒｙ，Ｒ．Ｈ．およびＣｈｉｌｔｏｎ，Ｃ．Ｈ．（編），Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第５版（１９７３年）チャプター４，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮＹ）において考察されている。この前処理反応は、バッチプロセスとして、または、連続プロセスとして実施され得る。
【００７８】
バイオマスに溶剤溶液を接触させる前に、バイオマスを含有する容器を減圧してもよい。バイオマスの細孔から排気することにより、バイオマスへの溶剤溶液のより良好な浸透が達成され得る。減圧を適用する時間およびバイオマスに適用される負圧の程度はバイオマスのタイプに依存することとなり、バイオマスの最適な前処理（糖化後の発酵可能な糖質の生成により測られる）が達成されるよう経験的に判定可能である。
【００７９】
少なくとも１種の無機塩基を含む溶剤溶液とのバイオマスの加熱は、約１００℃〜約２２０℃の温度で実施され得る。次いで、加熱された溶液は室温に急速に冷却され得る。他の実施形態において、バイオマスの加熱は、約１４０℃〜約１８０℃の温度で実施される。他の実施形態において、バイオマスの加熱は、約１５０℃〜約１７０℃の温度で実施される。バイオマス−溶剤懸濁液の加熱は、約１５分間〜約４８時間、または、より好ましくは約１時間〜約１２時間、または、例えば約１時間〜約６時間行われ得る。一実施形態においては、バイオマスを接触させるステップは約１５０℃の温度で約６時間実施される。
【００８０】
バイオマスに少なくとも１種の無機塩基を含む溶剤溶液を接触させるステップは、自生圧で実施され得る。より高いまたはより低い圧力もまた用いられ得るが、一般に実用性に劣る。
【００８１】
前処理プロセスに関して、温度、前処理時間、溶剤溶液、無機塩基濃度、バイオマス濃度、バイオマスタイプおよびバイオマス粒径は関連しており；それ故、これらの可変要素は、バイオマスのタイプの各々について必要に応じて調整されて、本明細書に記載の前処理プロセスを最適化してもよい。
【００８２】
前処理、すなわち、容易に糖化可能なバイオマスの生成およびその後の糖化の性能を個別にまたは一緒に評価するために、出発バイオマスから誘導可能な糖質の理論収率が判定されると共に、実測した収率と比較され得る。
【００８３】
オゾン
本方法によれば、本明細書において処理されたバイオマスとも称されるオルガノソルブ処理されたバイオマスにオゾンを含むガスが接触させられる。オゾン処理は、リグニンの酸化および断片化を促進させると共に前処理に有益であり、酵素糖化に対する炭水化物富化バイオマスの高いアクセス性をもたらす。オゾン処理の最中に溶剤が用いられる場合、溶剤は、リグニンおよび／またはその酸化された断片の抽出をさらに促進し得る。リグニンの除去のための手段としてのオゾンの使用は比較的選択的であり、炭水化物をほとんどそのまま残留させる。加えて、オゾン（Ｏ３）は、酸素（Ｏ２）および水に容易に分解されて、その使用による残渣を残留させず、大気汚染に対する関与は最低限である。
【００８４】
オゾンは、例えば酸素または空気からといった、技術分野において公知である任意の手段によって生成され得る。本方法において、オゾンを含むガスは、約０．１〜約２０体積パーセントのオゾン、例えば約０．５〜約５体積パーセントのオゾンを含む。このガスは、窒素、酸素、アルゴンまたはこれらの組み合わせをさらに含み得る。オゾンを含むガスはまた、他の気体の存在または濃度がオゾン処理に対して有害でない範囲で１種以上の他の気体を含み得る。一般に、オゾン対前処理済バイオマスの比は、重量基準で、少なくとも約１：１２００、例えば例えば少なくとも約１：１０００、または少なくとも約１：７５０、または少なくとも約１：５００、または少なくとも約１：２００、または少なくとも約１：１００、または少なくとも約１：５０であり得る。
【００８５】
オゾン処理条件
オルガノソルブ処理されたバイオマスを、オゾンを含むガスと接触させるステップは、バッチ式反応器または連続式反応器などの任意の好適な容器中で実施され得る。典型的には、容器は、加熱または冷却のためのメカニズムを有するもの、および、内容物を混合するためのメカニズムを有するものである。任意により、この容器は、圧力に耐えることが可能であるものである。オゾン前処理反応は、例えば、または、水平回転シリンダ、または、連続攪拌タンク反応器といった固定床反応器中で実施され得る。好適な容器は、バイオマスもしくはバイオマス−溶剤懸濁液をかきまぜるためのインペラなどの手段を備えていてもよく、または、容器自体が回転またはスピンして固体バイオマスをかきまぜてもよい。反応器設計は、Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｈ．およびＶａｎ  Ｎｅｓｓ，Ｈ．Ｃ．（Ｐｅｒｒｙ，Ｒ．Ｈ．およびＣｈｉｌｔｏｎ，Ｃ．Ｈ．（編），Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第５版，（１９７３年）チャプター４，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮＹ）において検討されている。前処理反応は、バッチプロセスとして、または、連続プロセスとして実施され得る。バイオマスは、オルガノソルブ処理の実施に伴って、同一の反応器においてオゾンが接触させられ得、または、他の反応器においてオゾンが接触させられ得る。バイオマスは、１つの反応器中でオゾンと接触させられ、次いで、同一の容器中で糖化され得；あるいは、糖化は、個別の容器中で実施されてもよい。
【００８６】
バイオマスにオゾンを含むガスを接触させるステップに先立って、オルガノソルブ−前処理済バイオマスは従来の手段により乾燥され得る。乾燥オルガノソルブ−前処理済バイオマスは、約３０パーセント〜約７０パーセントの湿分、例えば約４０パーセント〜約６０パーセントの湿分を含有し得る。
【００８７】
処理されたバイオマスにオゾンを含むガスを接触させるステップは約０℃〜約５０℃の温度で実施され得る。一実施形態においては、この温度は、約０℃〜約２５℃であり得る。より高い温度を用いてもよいが、一般に、温度の上昇に伴ってオゾン分解が増加するために実用性に劣る。より低い温度を用いてもよいが、一般に、冷却の必要性のために経済性に劣ると共に、バイオマス−溶剤懸濁液が用いられる場合には、運用の観点から実用的ではない場合がある。処理されたバイオマスを、オゾンを含むガスと接触させるステップは、少なくとも約１分の反応時間、例えば約１分〜約６０分間、または、約１分〜約３０分間、または、約１分〜約２５分間、または、約１分〜約２０分間、または、約１分〜約１５分間、または、約１分〜約１０分間、または、約１分〜約５分間の反応時間で実施され得る。リグニン分解に最適な時間を越えるオゾン処理時間の延長は、おそらくは糖質分解による糖質収率の低減がもたらされ得る。
【００８８】
処理されたバイオマスを、オゾンを含むガスと接触させるステップは自生圧で実施され得る。より高いまたはより低い圧力もまた用いられ得るが、一般に実用性に劣る。
【００８９】
処理されたバイオマスは、液体相が存在しない固体状態でオゾンを含むガスと接触されてもよい。あるいは、バイオマスは、バイオマス−溶剤懸濁液としてオゾンを含むガスと接触させられてもよい。バイオマス−溶剤懸濁液を生成するために、オルガノソルブ処理されたバイオマスは、上記に開示のとおり水または水と有機溶剤との混合物（オルガノソルブ）と接触させられ得る。溶剤は、特に限定されないが、アルコール、有機酸およびケトンを含み得る。アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブチルアルコール、およびこれらの混合物からなる群から選択され得る。アルコールはまたグリコールであり得る。本発明における溶液（すなわち水）中の溶剤の濃度は、約０％〜約１００％、または、約５％〜約９５％、または、約１０％〜約９０％、または、約１５％〜約８５％、または、約２０％〜約８０％、または、約２５％〜約７５％、または、約３０％〜約７０％、または、約３５％〜約６５％、または、約４０％〜約６０％、または、約４５％〜約５５％、または、約５０％（ｖ／ｖ）である。特に、本明細書における方法の実施形態の目的のために、約０％〜７５％（ｖ／ｖ）エタノールのＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ混合物をテストしたところ、有効であることが見出された。オゾン処理の最中に用いられる溶剤は、オゾン処理前のオルガノソルブ処理において用いられる溶剤と同一であっても異なっていてもよい。
【００９０】
一実施形態においては、溶剤は水であり得る。得られるバイオマス−溶剤懸濁液は、約１〜約１０、例えば約２〜約９、または約１〜約７、または約１〜約５のｐＨを有し得る。水は、例えばクエン酸緩衝剤といった緩衝剤をさらに含み得る。適切な緩衝剤の選択は、その後の糖化におけるｐＨの制御に対する緩衝剤の好適性に基づき得る。オゾン処理が完了した後、バイオマス−溶剤懸濁液のｐＨは、所望の場合には、バイオマスの酵素糖化に十分な第２のｐＨに調整され得る。
【００９１】
オゾン前処理ステップに関して、バイオマス−溶剤懸濁液におけるバイオマスの重量パーセントは、約５重量パーセント〜約７０重量パーセント、例えば約２０重量パーセント〜約７０重量パーセント、または約３０重量パーセント〜約６０重量パーセントであり得る。
【００９２】
オゾン前処理ステップに関して、温度、前処理時間、ガスにおけるオゾン濃度、含水量、バイオマス濃度、オゾン対バイオマスの比、バイオマスタイプ、および、バイオマス粒径が関連しており；それ故、これらの可変要素は、必要に応じて、バイオマスのタイプの各々について、本明細書に記載の前処理プロセスを最適化するために調整され得る。
【００９３】
前処理（すなわち、容易に糖化可能なバイオマスの生成およびその後の糖化）の性能を個別にまたは一緒に評価するために、出発バイオマスから誘導可能な糖質の理論収率が判定されると共に、実測した収率と比較され得る。
【００９４】
さらなるプロセス
糖化
オルガノソルブおよびオゾンでの前処理の後、容易に糖化可能なバイオマスは、断片化されたリグニンおよび多糖類の混合物を含む。オゾン処理がバイオマス−溶剤懸濁液で実施される場合、容易に糖化可能なバイオマスは、溶剤、抽出されたリグニン、および、任意により緩衝剤または無機塩基をさらに含む。さらなる加工ステップに先立って、リグニン断片または酸化生成物は、サンプルのろ過により、および、任意により、サンプルのＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ（０％〜１００％ＥｔＯＨ体積／体積［ｖ／ｖ］）での洗浄により、前処理済バイオマスから除去され得る。ろ過および洗浄ステップは向上した糖質収率を達成するために必須ではなく、および、これらに関連するコストが本方法の経済性に悪影響をおよぼし得るため、バイオマスのろ過および洗浄は、溶剤が水である場合、または、溶剤が用いられていない場合には、省略されることが好ましい。バイオマスが室温で乾燥されて、容易に糖化可能なバイオマスがもたらされてもよい。容易に糖化可能なバイオマスのグルカン、キシランおよび酸不溶性リグニン含有物の濃度が技術分野において周知である分析手段を用いて測定されてもよい。
【００９５】
次いで、容易に糖化可能なバイオマスは、糖化酵素共同体の存在下にさらに加水分解されて、加水分解物中のオリゴ糖および／または単糖を遊離させ得る。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの界面活性剤が添加されて、糖化プロセスが向上され得る（米国特許第７，３５４，７４３  Ｂ２号明細書、参照により本明細書において援用される）。糖化酵素およびバイオマス処理方法が、Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，ら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６６：５０６〜５７７ページ，２００２年）において概説されている。糖化酵素共同体は１種以上のグリコシダーゼを含み得；グリコシダーゼは、セルロース加水分解グリコシダーゼ、ヘミセルロース加水分解グリコシダーゼ、およびデンプン加水分解グリコシダーゼからなる群から選択され得る。糖化酵素共同体における他の酵素は、ペプチダーゼ、リパーゼ、リグニナーゼおよびフェルロイルエステラーゼを含み得る。
【００９６】
糖化酵素共同体は、排他的ではないが、二糖、オリゴ糖および多糖類のエーテル結合を加水分解する群「グリコシダーゼ」から主に選択される１種以上の酵素を含み、これらは、一般的な群「加水分解酵素」（ＥＣ３．）の酵素分類ＥＣ３．２．１．ｘ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２年，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，追補１（１９９３年），追補２（１９９４年），追補３（１９９５年），追補４（１９９７年）および追補５［それぞれ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３：１〜５ページ，１９９４年；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３２：１〜６ページ，１９９５年；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３７：１〜５ページ，１９９６年；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０：１〜６ページ，１９９７年；ならびに、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６４：６１０〜６５０ページ，１９９９年］）に見出される。本方法において有用なグリコシダーゼは、これらによって加水分解されるバイオマス成分によって分類されることが可能である。本方法に有用なグリコシダーゼとしては、セルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ）、ヘミセルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、キシラナーゼ、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノ−キシラナーゼ、マンナーゼ、ガラクターゼ、ペクチナーゼ、グルクロニダーゼ）、および、デンプン加水分解グリコシダーゼ（例えば、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ）が挙げられる。加えて、ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．ｘ．ｙ）、リパーゼ（ＥＣ３．１．１．ｘおよび３．１．４．ｘ）、リグニナーゼ（ＥＣ１．１１．１．ｘ）、およびフェルロイルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７３）などの糖化酵素共同体の他の活性を追加して、バイオマスの他の成分からの多糖類の遊離を補助することが有用であり得る。多糖加水分解酵素を産生する微生物は、度々、セルロース分解などの活性を示し、これは、異なる基質特異性を有する数々の酵素または酵素の群によって触媒されることが技術分野において周知である。それ故、微生物由来の「セルラーゼ」は、そのすべてがセルロース−分解活性に寄与し得る酵素の群を含み得る。商業的なまたは非商業的なセルラーゼなどの酵素調製は、酵素の入手に利用される精製スキームに応じて数多くの酵素を含み得る。それ故、本方法の糖化酵素共同体は、「セルラーゼ」などの酵素活性を含み得るが、しかしながら、この活性は、２種以上の酵素によって触媒されていてもよいことが認識されている。
【００９７】
糖化酵素は、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰセルラーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）およびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）などの単離された形態で商業的に入手され得る。加えて、糖化酵素は、組み換え型微生物の使用を含む、バイオ燃料植物で宿主生物中に発現され得る。
【００９８】
当業者は、どのように、共同体において用いられる酵素の有効量を決定し、最適な酵素活性のための条件を調整するかを知っているであろう。当業者はまた、どのように、共同体内で必要とされる酵素活性のクラスを最適化して、選択された条件下で所与の前処理生成物の最適な糖化を達成するかを知っているであろう。
【００９９】
好ましくは、糖化反応は、糖化酵素に最適な温度およびｐＨで、またはその付近で実施される。本方法において糖化酵素共同体と共に用いられる至適温度は、約１５℃〜約１００℃の範囲である。他の実施形態において、至適温度は、約２０℃〜約８０℃の範囲である。最も典型的には、至適温度は、約４５〜約５０℃の範囲である。至適ｐＨは、約２〜約１１の範囲であり得る。他の実施形態において、本方法における糖化酵素共同体と共に用いられる至適ｐＨは、約４〜約５．５の範囲であり得る。
【０１００】
糖化は、約数分間〜約１２０時間、および、好ましくは約数分間〜約４８時間の時間で実施され得る。反応時間は、酵素濃度および特定の活性、ならびに、用いられた基質、ならびに、温度およびｐＨなどの環境条件に応じることとなる。当業者は、特定の基質および糖化酵素共同体と共に用いられるべき温度、ｐＨおよび時間の最適な条件を容易に決定することが可能である。
【０１０１】
糖化は、バッチ式でまたは連続プロセスとして実施され得る。糖化はまた、一つのステップで、または、多数のステップで実施され得る。例えば、糖化に必要とされる異なる酵素は、異なる至適ｐＨまたは至適温度を示し得る。第１の処理は、一つの温度およびｐＨで酵素と共に実施され、続いて、第２または第３（または、それ以上）の処理が、異なる温度および／またはｐＨで異なる酵素と共に実施され得る。加えて、逐次的ステップにおける異なる酵素での処理は、より高いｐＨおよび温度で安定であると共により活性であるヘミセルラーゼの使用、これに続く、より低いｐＨおよび温度で活性であるセルラーゼの使用など、同一のｐＨおよび／または温度であり得、または、異なるｐＨおよび温度であり得る。
【０１０２】
糖化後のバイオマスからの糖質の可溶化度は、単糖およびオリゴ糖の遊離を計測することにより監視され得る。単糖およびオリゴ糖の計測方法は技術分野において周知である。例えば、還元糖の濃度は、１，３−ジニトロサリチル（ＤＮＳ）酸アッセイ（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３１：４２６〜４２８ページ，１９５９年）を用いて測定することが可能である。あるいは、糖質は、以下に記載のとおり適切なカラムを用いるＨＰＬＣにより計測することが可能である。
【０１０３】
目標生成物への発酵
本方法によって生成される容易に糖化可能なバイオマスは、上記のとおり、酵素によって加水分解されて発酵可能な糖質を生成し得、次いで、これが、目標生成物に発酵されることが可能である。「発酵」とは、任意の発酵プロセスまたは発酵ステップを含む任意のプロセスを指す。目標生成物としては、特に限定されないが、アルコール（例えば、アラビニトール、ブタノール、エタノール、グリセロール、メタノール、１，３−プロパンジオール、ソルビトール、およびキシリトール）；有機酸（例えば、酢酸、アセトン酸、アジピン酸、アスコルビン酸、クエン酸、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸、ギ酸、フマル酸、グルカル酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタル酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、イタコン酸、乳酸、リンゴ酸、マロン酸、シュウ酸、プロピオン酸、コハク酸、およびキシロン酸）；ケトン（例えば、アセトン）；アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン、セリン、およびスレオニン）；ガス（例えば、メタン、水素（Ｈ２）、二酸化炭素（ＣＯ２）、および一酸化炭素（ＣＯ））が挙げられる。
【０１０４】
発酵プロセスはまた、飲用アルコール産業（例えば、ビールおよびワイン）、乳製品産業（例えば、発酵乳製品）、皮革産業、およびタバコ産業において用いられるプロセスを含む。
【０１０５】
上記に加えて、本明細書に記載の前処理済バイオマスの糖化により生成された糖質は、普通、キシロース、アセトン、アセテート、グリシン、リシン、有機酸（例えば、乳酸）、１，３−プロパンジオール、ブタンジオール、グリセロール、エチレングリコール、フルフラール、ポリヒドロキシアルカノエート、シス，シス−ムコン酸、および動物飼料などの有機生成物、化学薬品、燃料、汎用および特殊化学薬品の生成に用いられ得る（Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，Ｗｙｍａｎ，Ｃ．Ｅ．およびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．，Ｂｉｏｃｏｍｍｏｄｉｔｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１５：７７７〜７９３ページ，１９９９年；およびＰｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓ，Ｇ．Ｐ．，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｗｙｍａｎ，Ｃ．Ｅ．編，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１７９〜２１２ページ，１９９６年；ならびに、Ｒｙｕ，Ｄ．Ｄ．Ｙ．およびＭａｎｄｅｌｓ，Ｍ．，セルラーゼｓ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２：９１〜１０２ページ，１９８０年）。
【０１０６】
発酵可能な炭水化物由来の複数の有機生成物などの潜在的な副産物もまたもたらされ得る。前処理および発酵の後に残留する富リグニン残渣はリグニン−由来の化学薬品、化学構築ブロックに転化されるか、または、発電に用いられることが可能である。
【０１０７】
発酵および／または糖化の従来の方法は技術分野において公知であり、特にこれらに限定されないが、糖化、発酵、個別の加水分解および発酵（ＳＨＦ）、同時糖化および発酵（ＳＳＦ）、同時糖化および共発酵（ＳＳＣＦ）、ハイブリッド加水分解および発酵（ＨＨＦ）、および直接微生物性転換（ＤＭＣ）を含む。
【０１０８】
ＳＨＦは、先ず、セルロースをグルコースおよびキシロースなどの糖質に酵素加水分解し、次いで、糖質をエタノールに発酵する個別のプロセスステップを用いる。ＳＳＦにおいて、セルロースの酵素的加水分解およびグルコースのエタノールへの発酵は一つのステップに組み合わされている（Ｐｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓ，Ｇ．Ｐ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｗｙｍａｎ，Ｃ．Ｅ．編、Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１７９〜２１２ページ，１９９６年）。ＳＳＣＦは、複数種の糖質の共発酵を含む（Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｊ．およびＨｉｍｍｅｌ，Ｍ．，Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１５：８１７〜８２７ページ，１９９９年）。ＨＨＦは、異なる温度、すなわち、高温酵素糖化とこれに続く発酵菌株が許容することが可能であるより低い温度でのＳＳＦで実施される同一の反応器内での２つの異なるステップを含む。ＤＭＣは、すべての３つのプロセス（セルラーゼ生成、セルロース加水分解および発酵）を一つのステップに組み合わせる（Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，Ｗｅｉｍｅｒ，Ｐ．Ｊ．，ｖａｎ  Ｚｙｌ，Ｗ．Ｈ．およびＰｒｅｔｏｒｉｕｓ，Ｉ．Ｓ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，６６：５０６〜５７７ページ，２００２年）。
【０１０９】
これらのプロセスは、本明細書に記載の前処理方法により生成された容易に糖化可能なバイオマスから目標生成物を生成するために用いられ得る。
【０１１０】
本方法の利点
本方法の利点の一つは、炭水化物のほとんどをそのままに残留させる、バイオマスからのリグニンの断片および除去に対する高い選択性である。選択性に劣る前処理方法は、炭水化物の一部分を糖質に、例えばグルカンの一部分をグルコースに、および／または、キシランの一部分をキシロースに加水分解する。存在する場合、単糖は、前処理プロセスの最中に分解されて、糖質の全収率（すなわち、糖化ステップを経た）を低下させる可能性がある。水性バイオマススラリーが加熱される場合、バイオマス中に含有されるアセチル基のいくらかが酢酸に加水分解され得、これが炭水化物（多糖）加水分解をもたらす可能性がある。次いで、特にバイオマス洗浄ステップが前処理に続く場合、炭水化物加水分解が糖質の一部分を可溶化させ、また全糖質収率を低減させる可能性がある。炭水化物の酢酸誘起加水分解を防止するために、本方法は無機塩基を用いる。その結果、糖質回収率が向上し、全糖質回収率（前処理および糖化ステップを経た）もまた向上する。実施例によって実証されるとおり、持続的なオゾン処理は、特にキシロースといった糖質の低い収率をもたらす可能性がある。従って、オゾン処理に対する最適な反応時間が存在し、それ未満では、前処理は無効となり、それを超えた場合、前処理は非選択的となる。オゾン処理に対する最適な反応時間は、バイオマス組成および粒径に部分的に応じる。
【０１１１】
さらに、リグニンは、バイオマス中に含有されている炭水化物よりも電子リッチであり、その結果、リグニンは炭水化物よりもオゾンによって酸化されやすい。いずれかの理論に束縛されることは望まないが、オゾンによるリグニンの酸化は、リグニン断片の分子量を低減させ、次いで、これがリグニン断片を、溶剤溶液中により可溶性とし、またセルロース分解酵素が結合しにくくすると考えられている。その結果、糖化におけるより少ない酵素仕込み量の使用が可能とされ、これは、酵素使用量に関する費用削減をもたらすことが可能である。本方法は、高温、アルカリ条件下でのリグノセルロースバイオマスのオルガノソルブでの処理、これに続く、容易に糖化可能なバイオマスを生成するオゾン処理によるリグニンの選択的な酸化を有利に組み合わせる。
【０１１２】
本方法は、オゾン処理が固体バイオマスまたはバイオマス−溶剤懸濁液に実施され得るという、オゾン処理に関する有利な柔軟性を提供する。両方の選択肢が、プロセス全体の簡素化および経済的な有益性に対する機会を提供する。例えば、所望の場合には、バイオマスは、バイオマス−溶剤懸濁液としてオゾンで処理され得、ここで、懸濁液は、その後の糖化ステップのために選択された緩衝剤を含む水溶液から形成される。オゾン処理の後、酵素カクテルは、容易に糖化可能なバイオマスに直接的に添加され得ると共に、糖化が同一の反応容器で実施され得る。溶剤溶液が有機溶剤を含有する場合、容易に糖化可能なバイオマスは、オゾン処理後にろ過されて、リグニンをバイオマスからさらに除去し得る。あるいは、固体バイオマスは、液体相の不在下で、オゾンと接触され得る。
【実施例】
【０１１３】
以下に記載の実験研究の目標は、リグニン除去を最大にし、前処理における炭水化物の損失を最小にして、さらにプロセスされて酵素糖化の後に最大の単糖収率がもたらされ得る容易に糖化可能なバイオマスを生成するリグノセルロースのための前処理プロセスを開発することであった。採用したアプローチは、リグニンを、アルカリ条件下および高温でのオルガノソルブ処理で選択的に抽出および断片し、次いで、固形分残渣が伴う糖質を保存しつつ、残留しているリグニンをオゾンを含むガスの存在下で選択的に酸化および断片することである。以下の実験は、アルカリオルガノソルブ条件下でのリグノセルロースバイオマスの処理、これに続くオゾンでの処理は、リグニンを断片化、抽出および酸化させて容易に糖化可能なバイオマスをもたらしたことを示す。
【０１１４】
本発明は、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、単なる例示として提示されていることが理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の重要な特徴を確認することが可能であると共に、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の使用および条件に適合させるために本発明の種々の変形および変更を行うことが可能である。
【０１１５】
以下の材料を実施例において用いた。すべての市販試薬はそのまま用いた。
【０１１６】
グルコース、キシロース、セロビオースおよびクエン酸はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。エタノールはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。炭酸カリウムはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。酵素カクテルはＧｅｎｅｎｃｏｒ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）から入手した。
【０１１７】
コーン穂軸は、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  Ｃｏｒｎ  Ｂｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＩＣＢＰ  Ｃｏｂ），Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ，Ｉｏｗａから購入した。この販売者は、穂軸を６０℃で保存していたと共に、穂軸を１／８インチにミルおよびふるいにかけた。穂軸の乾燥質量含有量は９５％であった。ＭＤ０７穂軸と称される他の多様な穂軸は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｆａｒｍ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手、またこれをハンマーミルにかけて３／８インチ粒子とした。
【０１１８】
バイオマスの炭水化物分析
ＮＲＥＬ  ＬＡＰ法「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｌｉｇｎｉｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｍａｓｓ」の改変したものを用いて、バイオマス中の重量パーセントグルカンおよびキシランを測定した。サンプル調製は、減圧下で８０℃または雰囲気圧下で一晩１０５℃で加熱することにより簡素化した。サンプルをナイフミルにかけて、２０メッシュスクリーンを通したがふるいにはかけなかった。乾燥したミルにかけた固形分を５０ｍｇ固形分スケールで酸加水分解法に供した。固形分は、最初、水またはエタノールでは抽出されなかった。糖質のＨＰＬＣ分析をＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラムについて行い、リグニンの分析は試みなかった。
【０１１９】
糖化液中の可溶性糖質グルコース、セロビオースおよびキシロースを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を適切なガードカラムと共に用い、０．０１Ｎ水性硫酸と溶出液として用いる、ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）により計測した。サンプルｐＨを計測し、また、必要であれば硫酸で５〜６に調整した。次いで、サンプルを０．２μｍシリンジフィルタを通してＨＰＬＣバイアルに直接入れた。ＨＰＬＣの運用条件は以下のとおりであった。
Ｂｉｏｒａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ（炭水化物用）：
注入体積：濃度および検出限界に応じて１０〜５０μＬ
移動相：０．０１Ｎ水性硫酸、０．２ミクロンろ過および脱気
流量：０．６ｍＬ／分
カラム温度：５０℃、ガードカラム温度＜６０℃
検出器温度：可能な限り主カラム温度に近似
検出器：屈折率
実施時間：１５分データ回収
実施後、サンプル内の濃度を、化合物の各々に対する検量線から検出した。
【０１２０】
ＣｌｅａｒＷａｔｅｒ  Ｔｅｃｈ（Ｓａｎ  Ｌｕｉｓ  Ｏｂｉｓｐｏ，ＣＡ）製の、最大電圧に設定したオゾン発生器（モデルＣＤ１５００）を用いて空気からオゾンを生成した。オゾン処理ステップが伴う実施例の各々において用いたオゾンの量は、実験装置に出入りする富オゾン空気中のオゾン濃度を計測し、差をとることにより、示された反応時間の最中のオゾンの消費から算出した。オゾンの計測は、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）オゾンモニタ、モデル４５０Ｍを用いて行った。
【０１２１】
以下の略語が用いられている。
「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィーであり、「Ｃ」は摂氏温度または摂氏であり；「％」はパーセントであり；「ｍＬ」はミリリットルであり；「ｈ」は時間であり；「ｒｐｍ」は１分間当たりの回転数であり；「ＥｔＯＨ」はエタノールであり；「ｍｇ／ｇ」はミリグラム／グラムであり；「ｇ／１００ｍＬ」はグラム／１００ミリリットルであり；「ｇ」はグラムであり；「ＮａＯＨ」は水酸化ナトリウムであり；「ｗ／ｖ」は体積当たりの重量であり；「ｖ／ｖ」は体積に対する体積であり、「ｗ／ｗ」は重量に対する重量であり；「ｍｍ」はミリメートルであり；「ｍＬ／ｍｉｎ」はミリリットル／分であり；「ｍｉｎ」は分間であり；「ｍＭ」はミリモルであり、「Ｎ」はノルマルであり、「μＬ」はマイクロリットルである。
【０１２２】
比較例Ａ
オルガノソルブのみの対照例（無機塩基無し、オゾン処理無し）
ＩＣＢＰコーン穂軸（２４０．００ｇの９５％乾燥材料）のＥｔＯＨ（９１１．０ｍＬ）および水（２５０．０ｍＬ）中のスラリーを１８０℃に２時間加熱した。冷却の際に、反応混合物をろ過し、３×２５０ｍＬエタノールで洗浄した。残渣を減圧中に室温で乾燥させて、１３９．１ｇ残渣を得た（６１質量％回収率）。次いで、残渣を以下の手法に従って糖化した。
【０１２３】
上記手法からの前処理したコーン穂軸残渣のスラリーに（０．４９９ｇ）、４．０９３ｍＬクエン酸緩衝剤（ｐＨ＝５）、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１０００（４６．３μＬ、濃度９７．１ｍｇ／ｍＬ）およびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  １２Ｌ（２６．７μＬ、濃度５６．１ｍｇ／ｍＬ）酵素カクテルを添加し、混合物をインキュベータ／振盪機中４８℃で攪拌させた。サンプルは２４時間毎に採取し、ＨＰＬＣにより分析して、時間に対する単糖収率を測定した。結果は表１および２に示されている。
【０１２４】
比較例Ｂ
オルガノソルブ（無機塩基無し）およびオゾン処理を伴う対照例
比較例Ａのオルガノソルブ処理から得た残渣（１．７９１ｇ）をＥｔＯＨ（１０．０ｍＬ）および水（２．６９ｍＬ）の混合物中に懸濁させると共に、富オゾン空気流（流量２Ｌ／ｍｉｎ）をスラリーに３０分間、室温で導入したところ；反応時間の最中に、２３ｍｇのオゾンが消費された。次いで、このスラリーをろ過して溶解リグニン断片を含有する溶剤を除去し、固体を減圧中で乾燥させて、１．５１３ｇ（８４．５％）前処理済バイオマスを生成し、これを、以下の手法に従って糖化した。
【０１２５】
上記手法からの前処理したコーン穂軸残渣のスラリーに（０．５００ｇ）、３．４９８ｍＬクエン酸緩衝剤（ｐＨ＝５）、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１０００（４６．３μＬ、濃度９７．１ｍｇ／ｍＬ）およびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  １２Ｌ（２６．７μＬ、濃度５６．１ｍｇ／ｍＬ）酵素カクテルを添加し、また、混合物をインキュベータ／振盪機中４８℃で攪拌させた。サンプルは２４時間毎に採取し、ＨＰＬＣにより分析して、時間に対する単糖収率を測定した。結果は表１および２に示されている。
【０１２６】
比較例Ｃ
オルガノソルブ（無機塩基無し）およびオゾン処理を伴う対照例
コーン穂軸（１５ｇの９５％乾燥材料）ＥｔＯＨ（５０．０ｍＬ）中のスラリーを攪拌しながら１８０℃に１２時間加熱した。次いで、この混合物を室温に急速に冷却し、ろ過した。固体残渣をＥｔＯＨ（５０．０ｍＬ）で洗浄し、減圧中で乾燥させて、１１．２５ｇ（７５質量％回収率）の前処理済バイオマスを生成した。
【０１２７】
この材料の一部（３．５９ｇ）をＥｔＯＨ（１６．５ｍＬ）および水（７．２８ｍＬ）中に懸濁させると共に、富オゾン空気流（流量３Ｌ／ｍｉｎ）をスラリーに５分間、室温で導入したところ；反応時間の最中に、５ｍｇのオゾンが消費された。次いで、このスラリーをろ過して溶解リグニン断片を含有する溶剤を除去し、固体を減圧中で乾燥させて、３．４５ｇ（９９質量％回収率）の前処理済バイオマスを生成し、これを、以下の手法に従って糖化した。
【０１２８】
上記手法からの前処理済バイオマスのスラリー（０．４９９ｇ）に、クエン酸緩衝剤（２．９９５ｍＬ）、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１０００（４６．３μＬ、濃度９７．１ｍｇ／ｍＬ）およびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ（２６．７μＬ、濃度５６．１ｍｇ／ｍＬ）酵素カクテルを添加し、混合物をインキュベータ／振盪機中４８℃で攪拌させた。サンプルを２４時間毎に採取、ＨＰＬＣにより分析して時間に対する単糖収率を生成した。結果は表１および２に示されている。
【０１２９】
【表１】
2012512666.tif 000002
【０１３０】
【表２】
2012512666.tif 000003
【０１３１】
実施例１
アルカリ性オルガノソルブおよびオゾン処理の影響
ＭＤ０７コーン穂軸（１５ｇの９１．６％乾燥材料）のＥｔＯＨ（３７．０ｍＬ）および水（１５．０ｍＬ）中のスラリーに炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）（０．７５０ｇ）を添加し、混合物を攪拌しながら、１８０℃に１２時間加熱した。次いで、この混合物を室温に急速に冷却し、ろ過した。固体残渣をＥｔＯＨ（５０．０ｍＬ）で洗浄し、減圧中で乾燥させて、８．４０ｇ（５９質量％回収率）前処理済バイオマスを生成した。
【０１３２】
この材料の一部（３．６４ｇ）をＥｔＯＨ（１６．５ｍＬ）および水（７．２８ｍＬ）の混合物中に懸濁させると共に、富オゾン空気流（流量１．２Ｌ／ｍｉｎ）をスラリーに３０分間、室温で導入したところ；反応時間の最中に、８ｍｇのオゾンが消費された。次いで、このスラリーをろ過して溶解リグニン断片を含有する溶剤を除去し、固体を減圧中で乾燥させて、３．１７５ｇ（８８質量％回収率）の容易に糖化可能なバイオマスを生成し、これを、以下の手法に従って糖化した。
【０１３３】
上記手法からの容易に糖化可能なバイオマスのスラリー（０．４９９ｇ）に、クエン酸緩衝剤（２．９９５ｍＬ、ｐＨ＝５）、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１０００（４６．３μμＬ、濃度９７．１ｍｇ／ｍＬ）およびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  １２Ｌ（２６．７μＬ、濃度５６．１ｍｇ／ｍＬ）酵素カクテルを添加し、混合物をインキュベータ／振盪機中４８℃で攪拌させた。サンプルは２４時間毎に採取し、ＨＰＬＣにより分析して、時間に対する単糖収率を測定した。結果は表３および４に示されている。
【０１３４】
実施例２
アルカリ性オルガノソルブおよびオゾン処理の影響
ＭＤ０７コーン穂軸（１５ｇの９１．６％乾燥材料）のＥｔＯＨ（５０．０ｍＬ）中のスラリーにＫ２ＣＯ３（０．７５０ｇ）を添加し、混合物を攪拌しながら、１４０℃に１２時間加熱した。次いで、この混合物を室温に急速に冷却し、ろ過した。固体残渣をＥｔＯＨ（５０．０ｍＬ）で洗浄し、減圧中で乾燥させて、１２．６８ｇ（８８質量％回収率）の前処理済バイオマスを生成した。
【０１３５】
この材料の一部（３．６０ｇ）をＥｔＯＨ（１６．５ｍＬ）および水（２．１６ｍＬ）の混合物中に懸濁させると共に、富オゾン空気流（流量３Ｌ／ｍｉｎ）をスラリーに３０分間、室温で導入したところ；反応時間の最中に、１５ｍｇのオゾンが消費された。次いで、このスラリーをろ過して溶解リグニン断片を含有する溶剤を除去し、固体を減圧中で乾燥させて、３．４９９ｇ（９７質量％回収率）の容易に糖化可能なバイオマスを生成し、これを、以下の手法に従って糖化した。
【０１３６】
上記手法からの容易に糖化可能なバイオマスのスラリー（０．５０３ｇ）に、クエン酸緩衝剤（３．０１８ｍＬ、ｐＨ＝５）、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１０００（４６．６μＬ、濃度９７．１ｍｇ／ｍＬ）およびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  １２Ｌ（２６．９μＬ、濃度５６．１ｍｇ／ｍＬ）酵素カクテルを添加し、混合物をインキュベータ／振盪機中４８℃で攪拌させた。サンプルは２４時間毎に採取し、ＨＰＬＣにより分析して時間に対する単糖収率を生成した。結果は表３および４に示されている。
【０１３７】
実施例３
アルカリ性オルガノソルブおよびオゾン処理の影響
ＩＣＢＰコーン穂軸（１５ｇの９５％乾燥材料）のＥｔＯＨ（３７ｍＬ）および水（１５ｍＬ）中のスラリーに、Ｋ２ＣＯ３（０．７５０ｇ）を添加した。窒素を用いて２００ｐｓｉに圧力を高めると共に、混合物を攪拌しながら１８０℃に１２時間加熱した。次いで、この混合物を室温に急速に冷却し、ろ過した。固体残渣をＥｔＯＨ（５０．０ｍＬ）で洗浄し、減圧中で乾燥させて、６．６０ｇ（４４質量％回収率）の前処理済バイオマスを生成した。
【０１３８】
この材料の一部（３．６０ｇ）をＥｔＯＨ（１６．５ｍＬ）および水（２．１６ｍＬ）中に懸濁させると共に、富オゾン空気流（流量３Ｌ／ｍｉｎ）をスラリーに３０分間、室温で導入したところ；反応時間の最中に、３０ｍｇのオゾンが消費された。次いで、このスラリーをろ過して溶解リグニン断片を含有する溶剤を除去し、固体を減圧中で乾燥させて、３．４９９ｇ（９７質量％回収率）の容易に糖化可能なバイオマスを生成し、これを、以下の手法に従って糖化した。
【０１３９】
上記手法からの容易に糖化可能なバイオマスのスラリー（０．５０１ｇ）に、クエン酸緩衝剤（３．０１８ｍＬ）、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１０００（４６．６μＬ、濃度９７．１ｍｇ／ｍＬ）およびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ（２６．９μＬ、濃度５６．１ｍｇ／ｍＬ）酵素カクテルを添加し、混合物をインキュベータ／振盪機中４８℃で攪拌させた。サンプルを２４時間毎に採取し、ＨＰＬＣにより分析して時間に対する単糖収率を生成した。結果は表３および４に示されている。
【０１４０】
実施例４
アルカリ性オルガノソルブおよびオゾン処理の影響
コーン穂軸（１５ｇの９５％乾燥材料）のＥｔＯＨ（５０．０ｍＬ）中のスラリーにＫ２ＣＯ３（０．７５０ｇ）を添加し、混合物を攪拌しながら１８０℃に１時間加熱した。次いで、この混合物を室温に急速に冷却し、ろ過した。固体残渣をＥｔＯＨ（５０．０ｍＬ）で洗浄し、減圧中で乾燥させて、１２．６０ｇ（８４質量％回収率）の前処理済バイオマスを生成した。
【０１４１】
この材料の一部（３．６４ｇ）をＥｔＯＨ（１６．５ｍＬ）および水（７．２８ｍＬ）中に懸濁させると共に、富オゾン空気流（流量１．２Ｌ／ｍｉｎ）をスラリーに５分間、室温で導入したところ；反応時間の最中に、３ｍｇのオゾンが消費された。次いで、このスラリーをろ過して溶解リグニン断片を含有する溶剤を除去し、固体を減圧中で乾燥させて、３．６１ｇ（９９質量％回収率）の容易に糖化可能なバイオマスを生成し、これを、以下の手法に従って糖化した。
【０１４２】
容易に糖化可能なバイオマスのスラリー（０．４９９ｇ）に、クエン酸緩衝剤（２．９９５ｍＬ）、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１０００（４６．３μＬ、濃度９７．１ｍｇ／ｍＬ）およびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ（２６．７μＬ、濃度５６．１ｍｇ／ｍＬ）酵素カクテルを添加し、混合物をインキュベータ／振盪機中４８℃で攪拌させた。サンプルを２４時間毎に採取し、ＨＰＬＣにより分析して時間に対する単糖収率を生成した。結果は表３および４に示されている。
【０１４３】
【表３】
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【０１４４】
【表４】
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【０１４５】
上記に開示した実験は、単糖収率を最大限とするために重要な要因を明らかにするために実施した。オルガノソルブ処理ステップにおける塩基の存在は、おそらくは、オルガノソルブ前処理の最中にリグノセルロースバイオマス中に含有されているアセチル基の加水分解から生成された酸の中和により、糖質回収全体に重要であったことが見出された。データはまた、オゾン分解はリグニン分解において選択的であるが、しかしながら、持続的なオゾン処理は糖質の損失をもたらし得ることを示す。データは、オルガノソルブ前処理中の初期圧力は前処理の結果には重要でないことを示した。
【０１４６】
本発明の特定の実施形態が前述の記載において説明されているが、本発明では、本発明の基本的な特質の趣旨から逸脱しない限りにおいて、数多くの変更、置き換えおよび再構成が可能であることは、当業者には理解されているであろう。本発明の範囲の指示としては、前述の明細書ではなく添付の特許請求の範囲を参照すべきである。
【国際調査報告】
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