(57)【要約】  本発明は、感光性化合物、化合物の使用法を記述する。本感光性化合物は、生物学的に活性であることができ、光に暴露されるとき化合物から遊離される、光遊離性リガンドを有する。幾つかの実施態様で、本感光性化合物は、標識用分子またはその活性誘導体等の、光アンテナを含む。一実施態様で、光は、遊離された有機分子が生理活性であって治療効果を有することができる、細胞や組織等の、生体試料の生存能に有害ではない、可視光線である。別の実施態様で、光遊離性リガンドは、蛍光分子等の、標識用分子であることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヒト血液癌と関係がある１つまたは複数のヒト癌遺伝子を発現するように遺伝子操作されたヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入すること；および
ｂ）前記哺乳動物を、前記哺乳動物中で前記ヒトＨＳＣにより前記非ヒト哺乳動物の血液細胞系統が再構成されて前記癌遺伝子が発現される条件下で維持すること；
を含み、
それによってヒト血液癌用モデルである非ヒト哺乳動物を作る、
ヒト血液癌用モデルである非ヒト哺乳動物を作る方法。
【請求項２】
前記免疫不全非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マウスが、重症複合免疫不全変異を担持する非肥満糖尿病マウス（ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス）；重症複合免疫不全変異を担持し、かつサイトカイン受容体γ鎖の遺伝子を欠く非肥満糖尿病マウス（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒγ−／−マウス）およびＢａｌｂ／ｃｒａｇ−／−γｃ−／−マウスからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＳＣを前記マウスに導入する前に、前記マウスが亜致死照射される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒトＨＳＣが、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋細胞またはそれらの組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記マウスが、ヒトリンパ腫またはヒト白血病のモデルである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記リンパ腫が、濾胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、およびマントル細胞リンパ腫であり；前記白血病が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞ＡＬＬ、プロＢ細胞ＡＬＬ、プレＢＡＬＬおよびナイーブＢＡＬＬ、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、および慢性骨髄性白血病である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１つまたは複数の癌遺伝子が、ｍｙｃ、ｂｃｌ−２、ＡＢＬ、ＡＫＴ、ＲＡＳ、ＢＲＡＣ１、ＢＲＡＣ２、ＣＢＬ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＰＭＬ、変異体ＩＤＨ１、変異体ＩＤＨ２またはそれらの組合せである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＳＣが、前記ｍｙｃ癌遺伝子、前記ｂｃｌ−２癌遺伝子またはそれらの組合せを発現するウイルスで形質移入される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスがレンチウイルスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記レンチウイルスが、レポーター蛋白質をコード化する遺伝子をさらに発現する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記レポーター蛋白質が、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、赤色蛍光蛋白質（ＲＦＰ）、抗生物質耐性蛋白質、ルシフェラーゼ、細胞表面蛋白質またはそれらの組合せである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌遺伝子および前記レポーター遺伝子が細胞特異的プロモーターに操作可能に連結される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞特異的プロモーターがヒトＢ細胞特異的プロモーターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヒトＢ細胞特異的プロモーターが、ヒトＣＤ１９プロモーターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記レンチウイルスが、水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶＧ）シュードタイプ化レンチウイルスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＨＳＣが、成長因子を加えた無血清培地中で前記ＨＳＣを培養することによってインビトロで増殖される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
間葉幹細胞（ＭＳＣ）の支持細胞層を導入することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記成長因子が、幹細胞因子、トロンボポエチン、線維芽細胞成長因子１、インスリン成長因子結合蛋白質２（ＩＧＦＢＰ２）、アンギオポエチン様蛋白質５（Ａｎｇｐｔｌ５）、またはそれらの組合せである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＨＳＣが、前記ＨＳＣのインビトロ増殖中に、前記レンチウイルスで形質移入される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＨＳＣが癌患者から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌患者がリンパ性癌または白血病を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記リンパ性癌が濾胞性リンパ腫であり、前記白血病が急性リンパ芽球性白血病である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記非ヒト哺乳動物の血液細胞系統の再構成を、前記非ヒト哺乳動物における前記ヒトＨＳＣによって評価することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記再構成が、前記非ヒト哺乳動物で前記１つまたは複数のヒト癌遺伝子を発現するヒト白血球を検出することによって評価される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ｃ）ステップｂ）の前記非ヒト哺乳動物から得られる前記１つまたは複数のヒト癌遺伝子を発現する前記ヒト細胞を、前記１つまたは複数の免疫不全非ヒト哺乳動物に導入すること；および
ｄ）ｃ）の前記１つまたは複数の非ヒト哺乳動物を、前記１つまたは複数の非ヒト哺乳動物中で前記ヒトＨＳＣにより前記１つまたは複数の非ヒト哺乳動物の血液細胞系統が再構成されて前記癌遺伝子が発現される条件下で維持すること；
を含み、
それによって、ヒト血液癌用モデルである１つまたは複数の非ヒト哺乳動物を作る、
ヒト血液癌用モデルである１つまたは複数の非ヒト哺乳動物を作ることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
ステップｃ）の前記非ヒト哺乳動物から得られる前記１つまたは複数のヒト癌遺伝子を発現する前記ヒト細胞が、前記非ヒト哺乳動物の脾臓、骨髄、またはそれらの組合せから得られる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が脾細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫不全非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記マウスが、重症複合免疫不全変異を担持する非肥満糖尿病マウス（ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス）；重症複合免疫不全変異を担持し、前記サイトカイン−受容体γ鎖の遺伝子を欠く非肥満糖尿病マウス（ＮＯＤ／ｓｃｉｄＩＬ２Ｒγ−／−マウス）およびＢａｌｂ／ｃｒａｇ−／−γｃ−／−マウスからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記マウスが、前記ＨＳＣを前記マウスに導入する前に亜致死照射される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記マウスがヒトリンパ腫またはヒト白血病のモデルである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記リンパ腫が、濾胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、およびマントル細胞リンパ腫であり；前記白血病が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞ＡＬＬ、プロＢ細胞ＡＬＬ、プレＢＡＬＬおよびナイーブＢＡＬＬ、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、および慢性骨髄性白血病である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
１つまたは複数の腫瘍サプレッサー遺伝子を抑制する核酸を前記ＨＳＣ、前記ＨＳＣの子孫またはそれらの組合せに含むように遺伝子操作されたＨＳＣを導入することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
ａ）１つまたは複数の腫瘍サプレッサー遺伝子を抑制する核酸を前記ＨＳＣ、前記ＨＳＣの子孫またはそれらの組合せに含むように遺伝子操作されたヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入すること；および
ｂ）前記哺乳動物を、前記哺乳動物中で前記ヒトＨＳＣにより前記非ヒト哺乳動物の血液細胞系統が再構成されて前記１つまたは複数の腫瘍サプレッサー遺伝子の発現が抑制される条件下で維持すること；
を含み、
それによって、ヒト血液癌用モデルである非ヒト哺乳動物を作る、
ヒト血液癌用モデルである非ヒト哺乳動物を作る方法。
【請求項３６】
請求項１に記載の方法で作られるヒト血液癌用モデルである、非ヒト哺乳動物。
【請求項３７】
請求項３に記載の方法で作られるヒト血液癌用モデルである、非ヒト哺乳動物。
【請求項３８】
請求項１３に記載の方法で作られるヒト血液癌用モデルである、非ヒト哺乳動物。
【請求項３９】
請求項１５に記載の方法で作られるヒト血液癌用モデルである、非ヒト哺乳動物。
【請求項４０】
請求項２３に記載の方法で作られるヒト癌用モデルである、非ヒト哺乳動物。
【請求項４１】
請求項２６に記載の方法で作られるヒト血液癌用モデルである、１つまたは複数の非ヒト哺乳動物。
【請求項４２】
前記血液癌患者の造血幹細胞（ＨＳＣ）を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入すること、および前記非ヒト哺乳動物を、前記哺乳動物中で前記ＨＳＣにより前記非ヒト哺乳動物の血液細胞系統が再構成されて前記癌患者の前記１つまたは複数の癌遺伝子が発現される条件下で維持することを含み、それによって前記血液癌患者用モデルである非ヒト哺乳動物を作る、ヒト血液癌患者用モデルである非ヒト哺乳動物を作る方法。
【請求項４３】
前記免疫不全非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記マウスが、重症複合免疫不全変異を担持する非肥満糖尿病マウス（ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス）；重症複合免疫不全変異を担持しかつサイトカイン−受容体γ鎖の遺伝子を欠く非肥満糖尿病マウス（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒ  γ−／−マウス）およびＢａｌｂ／ｃ  ｒａｇ−／−γｃ−／−マウスからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記マウスが、前記ＨＳＣを前記マウスに導入する前に亜致死照射される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記マウスが、ヒトリンパ腫またはヒト白血病のモデルである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記リンパ腫が濾胞性リンパ腫であり、前記白血病が急性リンパ芽球性白血病である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
薬剤または治療を、前記血液癌患者用モデルである前記非ヒト哺乳動物に投与することおよび前記癌患者を治療するために前記薬剤または前記治療を使用できるかどうかを決定することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
請求項４２に記載の方法で作られる非ヒト哺乳動物。
【請求項５０】
ａ）前記１つまたは複数の薬剤を、請求項３６に記載の非ヒト哺乳動物に投与すること；および
ｂ）前記非ヒト哺乳動物における前記癌が緩和されるかどうかを決定すること；
を含み、
前記非ヒト哺乳動物における前記癌が、前記非ヒト哺乳動物で緩和されるのであれば、その場合は前記１つまたは複数の薬剤または治療プロトコールを、前記ヒト血液癌の治療に使用できる、
ヒト血液癌を治療するために使用できる１つまたは複数の薬剤または治療方式を見極める方法。
【請求項５１】
前記非ヒト哺乳動物における前記癌が、コントロールと比較して緩和されるかどうかを比較することをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記コントロールが、前記薬剤または治療プロトコールを受けていない非ヒト哺乳動物である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
２つ以上の薬剤が前記非ヒト哺乳動物に投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記２つの薬剤の投与が、ヒトＢ細胞癌の前記治療に相乗効果をもたらす、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
有効量の抗ＣＤ５２抗体および１つまたは複数の化学療法剤を個体に同時に投与することを含む、必要としている個体における白血病を治療する方法。
【請求項５６】
前記抗ＣＤ５２抗体がアレムツズマブであり、前記１つまたは複数の化学療法剤がシクロホスファミドである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記アレムツズマブおよび前記シクロホスファミドの投与後、前記個体の骨髄における癌細胞負荷が１０，０００分の１に減少する、請求項５６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００９年６月２９日提出の米国仮特許出願第６１／２２１，４３８号の利益を主張する。上記出願の教示全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
政府支援
本発明は、全部的にまたは部分的に、国立衛生研究所からの助成金ＡＩ６９２０８により、支援を受けた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
癌は、心疾患に次ぐ、米国における死因の第２位である；全癌死亡のおよそ１０％は、造血システムの新生物に起因する（Ｈｅｒｏｎ，Ｍ．Ｐ．ａｎｄ  Ｂ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈ．２００７．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｉｔａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  Ｖｏｌ．５５，Ｎｏ．１０；Ｕ．Ｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ．２００６．Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２００３  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）。これらは、造血幹細胞および初期前駆細胞の播種性癌である、白血病、および、不連続の腫瘤として生じる成熟したリンパ球の癌である、リンパ腫を含む。ヒトでは、侵攻性リンパ腫および緩慢性リンパ腫の両方の大部分（８０％〜８５％）が、Ｂ細胞起源である（Ａｓｔｅｒ，Ｊ．Ｃ．２００５．Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｈｉｔｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ，Ｌｙｍｐｈ  Ｎｏｄｅｓ，Ｓｐｌｅｅｎ，ａｎｄ  Ｔｈｙｍｕｓ．Ｉｎ：Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ｃｏｔｒａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ，７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｋｕｍａｒ，Ｖ．，Ａ．Ｋ．Ａｂｂａｓ，ａｎｄ  Ｎ．Ｆａｕｓｔｏ，ｅｄｓ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ｐｐ．６６１−７０９）。
【０００４】
造血系ヒト新生物の改良されたモデルは、癌をさらに研究し、癌の治療法を見極めるために必要である。
【発明の概要】
【０００５】
一態様で、本発明は、ヒト血液癌と関係がある１つまたは複数のヒト癌遺伝子を発現するように遺伝子操作されたヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することを含む、ヒト血液癌用モデルである非ヒト哺乳動物を作る方法を対象とする。哺乳動物は、哺乳動物中でヒトＨＳＣにより非ヒト哺乳動物の血液細胞系統が再構成されて癌遺伝子が発現される条件下で維持され、それによってヒト血液癌用モデルである非ヒト哺乳動物を作る。
【０００６】
別の態様で、本発明の方法は、非ヒト哺乳動物（すなわち、ヒト血液癌用モデルであるヒト化非ヒト哺乳動物モデル；一次ヒト化非ヒト哺乳動物モデル）の血液癌を、他の非ヒト哺乳動物に逐次移植し、それによってヒト血液癌用モデル（二次ヒト化非ヒト哺乳動物モデル；後続のヒト化非ヒト哺乳動物モデル）である、１つまたは複数の追加的非ヒト哺乳動物を作ることをさらに含むことが可能である。この態様において、本方法は、ヒト血液癌用モデルであるヒト化非ヒト哺乳動物由来の１つまたは複数のヒト癌遺伝子を発現するヒト細胞（たとえば、ヒト化非ヒト哺乳動物から得たヒト血液癌細胞）を、１つまたは複数の免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することを含む。１つまたは複数の非ヒト哺乳動物は、非ヒト哺乳動物（ヒト化非ヒト哺乳動物モデル）中でヒトＨＳＣにより非ヒト哺乳動物の血液細胞系統が再構成されて癌遺伝子が発現される条件下で維持され、それによってヒト血液癌用モデルである１つまたは複数の追加的非ヒト哺乳動物を作る。
【０００７】
また別の態様で、本発明は、ヒト血液癌患者用モデルである非ヒト哺乳動物を作る方法を対象とする。この態様において、本方法は、血液癌患者の造血幹細胞（ＨＳＣ）を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することを含む。非ヒト哺乳動物は、非ヒト哺乳動物中で癌患者のヒトＨＳＣにより非ヒト哺乳動物の血液細胞系統が再構成されて１つまたは複数の癌遺伝子が発現される条件下で維持され、それによって血液癌患者用モデルである非ヒト哺乳動物を作る。
【０００８】
本発明はまた、本方法で作られる非ヒト哺乳動物も対象とする。
【０００９】
他の態様で、本明細書で提供される非ヒト哺乳動物を使用して、ヒト血液癌の治療に使用することができる１つまたは複数の薬剤または治療プロトコール（治療方式）を見極めることができる。この態様において、本方法は、１つまたは複数の薬剤または治療方式を、本明細書に記載の（１つまたは複数の）非ヒト哺乳動物に投与することを含む。次いで、非ヒト哺乳動物における癌が緩和されるかどうかが決定されるが、ここで非ヒト哺乳動物の癌が非ヒト哺乳動物で緩和される場合、その１つまたは複数の薬剤または治療方式を、ヒト血液癌の治療に使用できる。ある特定の実施態様で、本方法で使用されるモデルである非ヒト哺乳動物は、ある特定のヒト血液癌患者用のモデルのものであることが可能である。したがって、１つまたは複数の薬剤または治療プロトコールは、その癌患者独特である。
【００１０】
また別の態様で、本発明は、有効量の抗ＣＤ５２抗体および１つまたは複数の化学療法剤を個体に同時に投与することを含む、それを必要としている個体の白血病の治療方法を対象とする。ある特定の態様で、抗ＣＤ５２抗体はアレムツズマブであり、１つまたは複数の化学療法剤はシクロホスファミドである。また別の態様で、アレムツズマブおよびシクロホスファミドの投与後、個体の骨髄における癌細胞負荷が１０，０００分の１に減少する。
【００１１】
本特許または出願書類は、少なくとも１つのカラーで作成された図面を含む。１枚または複数枚のカラー図面を含めた本特許もしくは特許出願公報のコピーは、請求及び必要手数料の支払いにより、特許局から提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】（図１Ａ）Ｅｍ−エンハンサーおよびＣＤ１９プロモーターの制御下で、ＧＦＰ、ｃ−Ｍｙｃおよびｂｃｌ−２を過剰発現するレンチウイルス構築物。ヒト臍帯血由来のＨＳＣを、＞１０のＭＯＩで感染させ、亜致死照射したＮＯＤ−ＳＣＩＤ  ＩＬ−２Ｒγ−／−マウスに注入した。生着は、ネズミ対ヒトＣＤ４５発現のフローサイトメトリー検出法によって検出した。ヒト細胞の５％にＧＦＰ制御ベクターが存在し、首尾よく感染したＨＳＣから誘導されたＢ細胞を示す（図１Ｂ）。ＧＦＰ／ｍｙｃ／ｂｃｌ（本明細書で、「ＧＭＢモデル」または「ＡＬＬモデルとも呼ばれる）感染したＨＳＣは、ヒト細胞の＞９５％がＧＦＰ陽性であることを示す（図１Ｃ）。
【図２】ヒト化ＧＦＰ／ｍｙｃ／ｂｃｌ−白血病の組織形態学：脾臓の著しい浸潤および腫大（図２Ａ，図２Ｃ）；腎臓（図２Ｂ）および脳（図２Ｄ）の浸潤；浸潤性リンパ球は、ブラス様形態および高頻度の有糸分裂像を示す（図２Ｃ，矢印で指示）。
【図３】感染ＨＳＣによる再構成後のヒト化マウスの累積生存。ＧＦＰ制御は、生存の減損を示さなかった（青線）。ＨＳＣのＧＦＰ／ｍｙｃ／ｂｃｌ感染は、生存を、トランスファー後最大２カ月に制限した（赤線）。
【図４Ａ】推定上の治療標的ＣＤ３８およびＣＤ５２の発現。全脾臓由来のリンパ球を、ヒトＣＤ４５−ＰＥおよびＣＤ３８−ＡＰＣまたはＣＤ５２−ＡＰＣについてそれぞれ染色した。ヒトリンパ球は、ＦＳＣ／ＳＳＣリンパ球ゲートおよびｈＣＤ４５−ＰＥ発現陽性でゲート設定した．ＧＦＰ＋ＧＦＰ／ｍｙｃ／ｂｃｌ細胞は、類をみないほど高い腫瘍抗原の発現を示した。ＧＦＰ陰性非悪性ヒト細胞は、ＣＤ３８およびＣＤ５２発現をある程度示した。
【図４Ｂ】二次ＧＦＰ／ｍｙｃ／ｂｃｌマウスのアレムツズマブ治療：１２ＮＳＧマウスに、一次ＧＦＰ／ｍｙｃ／ｂｃｌドナーマウス由来のＧＦＰ／ｍｙｃ／ｂｃｌ細胞１０６個を移植した。白血病表現型を示している、移植の１４日後にマウスを治療した。マウスは、それぞれ、５ｍｇ／ｋｇアレムツズマブ（ｎ＝６）静脈内注射またはＰＢＳ（ｎ＝６）で治療した。治療に対する応答は７日後に評価し、白血病負荷は、フローサイトメトリーおよび器官当たりの絶対細胞数の算出によって測定した。アレムツズマブは、末梢血、脾臓および肝臓で有意な応答を誘導したが、骨髄および脳で、有意な応答は見られなかった。
【図４Ｃ】アレムツズマブ治療（ｎ＝１０）対コントロール（ｎ＝１０）の累積生存。対数順位検定は、アレムツズマブ治療マウスで有意な生存延長を示した。
【図５Ａ】補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）：ＧＦＰ／ｍｙｃ／ｂｃｌ細胞を、１〜１００μｇ／ｍｌまで漸増するアレムツズマブと共に、インビトロでインキュベートした。ヒト、ＮＳＧ由来の血清としてのネズミＢＬ６を培地に加えた。無血清培地および熱失活化血清がコントロールの役割をした。細胞生存能は、４８時間後にＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＰＥ／７−ＡＡＤフローサイトメトリーによって評価した。補体依存性細胞傷害性は、ヒト血清で検出されたが、ネズミ血清では検出されなかった。
【図５Ｂ】インビボでのアレムツズマブ分布。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識アレムツズマブをＧＦＰ／ｍｙｃ／ｂｃｌマウスに静脈内注射した。２４時間後にマウスを屠殺し、標識抗体の分布をＩＶＩＳ蛍光光度法で評価した。脾臓、肝臓および骨の強度染色。解剖全脳における高信号。
【図５Ｃ】５ｍｇ／ｋｇ  Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ７５０標識アレムツズマブによるＧＦＰ／ｍｙｃ／ｂｃｌ細胞のインビボ結合。器官をホモジナイズし、細胞への抗体結合をフローサイトメトリーで検出した。ＧＦＰ＋白血病細胞は、脾臓および骨髄でＡｌｅｘａＦＬｕｏｒ７５０信号の増加を示したが、脳由来の白血病細胞では何も検出できなかった。
【図５Ｄ】アレムツズマブのＦｃ−フラグメント依存性細胞傷害作用。移植後第１４日に、アレムツズマブのＦ（ａｂ）２フラグメントを二次ＧＦＰ／ｍｙｃ／ｂｃｌマウスに注入した。Ｆ（ａｂ）２フラグメントは、アレムツズマブコントロールと比較して、治療効果を示さなかった。
【図５Ｅ】アレムツズマブの抗体依存性細胞傷害性は、インビトロで、ＮＳＧマウス由来のチオグリコール酸誘導マクロファージを使用して評価した。マクロファージは、アレムツズマブの存在下で、１３時間以内にＧＭＢ細胞を死滅させた。抗体を添加しないＦ（ａｂ）２フラグメントおよびマクロファージでは、ＧＦＰ／ｍｙｃ／ｂｃｌ指令死滅は全く見られなかった。
【図６】移植後第１４日に、二次ＧＦＰ／ｍｙｃ／ｂｃｌで、アレムツズマブとシクロホスファミドの併用治療を実施した。マウスを、無治療（ｎ＝５）、第１日および第２日に１５０ｍｇ／ｋｇシクロホスファミド腹腔内注射（ｎ＝５）、および第１日、第４日および８日に５ｍｇ／ｋｇアレムツズマブ静脈内注射に、階層化した。加えて、併用群は、第１日および第２日に１５０ｍｇ／ｋｇシクロホスファミド腹腔内注射、ならびに第１日、第４日および第８日に５ｍｇ／ｋｇアレムツズマブ静脈内注射の両方を受けた（ｎ＝５）。器官当たりのＧＦＰ＋白血病細胞の絶対数は、ＦＡＣＳおよび絶対数算出によって評価した。併用療法は、末梢血、脾臓および肝臓で、最高の白血病細胞減少を示した（図６Ａ）。アレムツズマブ治療耐性器官では、併用療法は、極めて有意な白血病細胞減少を骨髄で示した（図６Ｂ）。
【図７】ヒトプロＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の発症を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
造血器（たとえば、リンパ性；骨髄性）悪性腫瘍は、本明細書で血液癌とも呼ばれ、身体の造血組織（たとえば、リンパ組織；骨髄組織）で発生する癌である。ｔ（１４；１８）として知られる特定の遺伝子変異が、リンパ性癌で頻繁に認められる。この変異は、プログラム細胞死（アポトーシス）の過程を抑制し、また腫瘍形成、腫瘍成長、および治療抵抗性の一因となる、Ｂｃｌ−２と呼ばれる蛋白質を、細胞に過剰に産生させる。
【００１４】
濾胞性リンパ腫（ＦＬ）は、緩慢性リンパ腫の中で最も一般的であり、全ての新たに診断される非ホジキンリンパ腫症例の２０〜４０％を占める。腫瘍は、リンパ節小胞内に並んだ多数のＢ細胞から成り；これらのＢ細胞は、形態学的および表現型的に、正常な胚中心のリンパ球に類似する。症例の大部分（〜８５％）で、ＦＬ細胞は、ｂｃｌ−２癌遺伝子を免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座と連結するｔ（１４；１８）染色体転座陽性である。したがって、これらの細胞は、Ｂｃｌ−２蛋白質について強度陽性に染色し、Ｂｃｌ−２陰性である正常な過形成性胚中心Ｂ細胞と異なる。リンパ腫は一般に、中高年の個体で、末梢リンパ節の無痛性腫脹として現れ、通常非常にゆっくり進行し、平均生存期間は１０年を超える。しかし、最終的に、進行性のリンパ節腫脹およびリンパ球浸潤は、器官の正常な機能を妨害して死をもたらすが、多くの患者（最高７０％）では、末期疾患は、致命的である侵攻性びまん性Ｂ細胞リンパ腫への組織学的変化を特徴とする（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．ａｎｄ  Ｎ．Ｌ．Ｈａｒｒｉｓ．２００７．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｉｎ：ＵｐＴｏＤａｔｅ（Ｒｏｓｅ，Ｂ．Ｄ．，ｅｄ．），ＵｐＴｏＤａｔｅ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；Ｌｏｓｓｏｓ，Ｉ．Ｓ．ａｎｄ  Ｒ．Ｌｅｖｙ．２００３．Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．１３：１９１−２０２）。
【００１５】
しかし、異所性ｂｃｌ−２発現をＥμ等のＩｇＨエンハンサーの制御下に置くことによって、ヒトＦＬに特有のＢ細胞特異的ｔ（１４；１８）転座をマウスでモデル化するとき、トランスジェニック動物は、リンパ腫がないＢ細胞過形成を示す。さらに、これらのマウスでは、過形成性Ｂ細胞はポリクローナルであり、ＩｇＭおよびＩｇＤのみを発現するが、ヒトＦＬでは、それらは単一クローンに属し、それらの４０％がＩｇＧを示す（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．ａｎｄ  Ｎ．Ｌ．Ｈａｒｒｉｓ．２００７．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｉｎ：ＵｐＴｏＤａｔｅ（Ｒｏｓｅ，Ｂ．Ｄ．，ｅｄ．），ＵｐＴｏＤａｔｅ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；ＭｃＤｏｎｎｅｌ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８９．Ｃｅｌｌ  ５７：７９−８８；Ｓｔｒａｓｓｅｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．１９９０．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：１７５−１８１）。最終的に、トランスジェニックマウスはリンパ腫を発症する（約１５カ月という平均潜伏期を有する）が、ＦＬとは違って、これらは極めて侵攻性であり、それらの約５０％は、ＩｇＨ遺伝子座を有するｍｙｃ遺伝子の二次再配列を示す（ＦＬ形質転換では非常にまれである）（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，Ｔ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ．１９９１．Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２５４−２５６；Ｋｕｐｐｅｒｓ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１（２０）：１５２０−１５２９）。
【００１６】
ネズミＢ細胞におけるｂｃｌ−２の過剰発現は、したがって、濾胞性リンパ腫の生成に十分ではないと思われる。しかし、異所性ｂｃｌ−２発現が全血球増殖性プロモーターＶａｖＰにより推進されるトランスジェニックマウスで、ＦＬにもっと類似した疾病が最近作られた（Ｅｇｌｅ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｂｌｏｏｄ  １０３：２２７８−２２８３）。健常な若いＶａｖＰ−ｂｃｌ−２マウスは、１８週齢までに、過形成性Ｂ細胞が豊富な腫大した胚中心を示し、その３０〜５０％は、クラススイッチを受けて、ＩｇＧを発現する。しかし、１８カ月までに、これらのマウスの約５０％はモノクローナルＢ細胞リンパ腫を発症し、中心細胞と有糸分裂中心芽細胞の混合物を含む腫大したリンパ節および脾臓を呈する。これらのマウスにおけるｂｃｌ−２発現はＢ細胞に限定されないため、Ｔ細胞、特に胚中心におけるＢ細胞活性化に極めて重要なＣＤ４＋Ｔ細胞の有意な増加（３〜５倍）もみられた。特に、ＶａｖＰ−ｂｃｌ−２マウスを、ＣＤ４＋Ｔ細胞を特異的に欠くマウスと交配したとき、結果として得られるバイトランスジェニック子孫は、胚中心疾病を全く示さず、この疾病におけるＣＤ４＋Ｔ細胞寄与の重要性を強く示した（Ｅｇｌｅ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｂｌｏｏｄ１０３：２２７８−２２８３）。
【００１７】
ＶａｖＰ−ｂｃｌ−２マウスで生じる疾病の幾つかの特徴は、ヒト濾胞性リンパ腫のものと異なるが（たとえば、Ｔ細胞個体群増殖）、このＦＬモデルの最も重要な欠点は、ネズミという特質である。言い換えれば、これらのマウスにおける疾病が、ヒトと同じ機序で生じるのか不明確であり、その結果、これらのマウスで確認された潜在的薬剤標的が、ＦＬ患者で適切かどうか、不明確である。さらに、リンパ腫治療における最近の進歩は、ヒトＢ−細胞特異的ＣＤ２０抗原に対するモノクローナル抗体の使用を含む。ヒト抗原に対するこれらの抗体、ならびに、他の、免疫系の小分子型モジュレーターの、安全性および有効性を、ネズミ疾病モデルで試験することはできない。この疾病および他の疾病のヒト化マウスモデルを作ることは、こうした機会を正確に提供する。
【００１８】
ヒト血液癌用モデルであるヒト化非ヒト哺乳動物を作る方法を、本明細書に記述する。本明細書で使用されるとき、「ヒト化非ヒト哺乳動物（たとえば、「ヒト化マウス」）は、ヒト細胞（たとえば、造血細胞）または組織を移植され、および／または遺伝子導入でヒト遺伝子を発現する、免疫不全非ヒト哺乳動物（たとえば、マウス）である。このようなヒト化非ヒト哺乳動物は、たとえば、ヒト免疫系およびその疾病のモデルとして使用される。
【００１９】
一態様で、本発明は、ヒト血液癌と関係がある１つまたは複数のヒト癌遺伝子を発現するように遺伝子操作されたヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することを含む、ヒト血液癌用モデルである非ヒト哺乳動物を作る方法を対象とする。哺乳動物は、ヒトＨＳＣで、またはヒトＨＳＣにより、哺乳動物中で非ヒト哺乳動物の血液細胞系統が再構成されて（たとえば、ヒトＨＳＣが、ヒト血液細胞系統を有する非ヒト哺乳動物の血液細胞系統を再構成した）癌遺伝子が発現される条件下で維持され、それによってヒト血液癌用モデルである非ヒト哺乳動物を作る。当業者に理解されるであろうが、ヒトＨＳＣによる非ヒト哺乳動物の血液細胞系統の再構成は、完全な、実質的に完全なまたは部分的な再構成であることが可能である。
【００２０】
上述の通り、造血器（たとえば、リンパ性；骨髄性）悪性腫瘍は、本明細書で血液癌とも呼ばれ、身体の造血組織で発生する癌である。当業者には明らかなように、造血組織は、リンパ性組織および骨髄性組織を含む。
【００２１】
リンパ性癌の例としては、濾胞性リンパ腫、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、特にＴ細胞性ＡＬＬ、プロＢＡＬＬ、プレＢＡＬＬ、およびナイーブＢＡＬＬなどがある。非ホジキンリンパ腫群の例としては、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、およびマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）などがある。骨髄性癌の例としては、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）または他の骨髄増殖性疾患（たとえば、骨骨髄線維症、真性多血症および本態性血小板血症）などがある。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、ＨＳＣ（たとえば、ヒトＨＳＣ）は、レシピエントに移植されるとき、「移植レシピエント（たとえば、非ヒト哺乳動物；免疫不全非ヒト哺乳動物）の造血システムを「再生息させる」または「再構成する」ことができ、またレシピエントで（たとえば、長期）造血を持続できる、自己再生幹細胞である。造血システムは、血液細胞系統の産生に関与する器官および組織（たとえば、骨髄、脾臓、扁桃、リンパ節）を指す。ＨＳＣは、骨髄性細胞系統（たとえば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹枝状細胞）およびリンパ球細胞系統（たとえば、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞、ＮＫ−細胞）を含む、血液細胞型を生じさせる（に分化する）多能性幹細胞である。
【００２３】
ＨＳＣは細胞マーカーＣＤ３４を発現するので、通例「ＣＤ３４＋」と呼ばれる。当業者には明らかなように、ＨＳＣはまた他の細胞マーカー、たとえばＣＤ１３３および／またはＣＤ９０等も発現できる（「ＣＤ１３３＋」、「ＣＤ９０＋」）。場合によっては、ＨＳＣは、発現されないマーカー、たとえば、ＣＤ３８を特徴とする（「ＣＤ３８−」）。したがって、本発明の一実施態様で、本明細書に記載の方法で使用されるヒトＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＣＤ３８−、ＣＤ１３３＋ＣＤ３８−、ＣＤ１３３＋ＣＤ９０＋ＣＤ３８−、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＣＤ９０＋ＣＤ３８−、またはそれらの任意の組合せである。ある特定の実施態様で、ＨＳＣは、本明細書で「二重陽性」細胞または「ＤＰ」細胞あるいは「ＤＰＣ」とも呼ばれる、ＣＤ３４（「ＣＤ３４＋」）とＣＤ１３３＋（「ＣＤ１３３＋」）の両方である。別の実施態様で、ＨＳＣはＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋およびＣＤ３８−および／またはＣＤ９０＋である。
【００２４】
ＨＳＣは、ドナー（たとえば、人類、霊長類、ブタ、マウス、等々を含む、哺乳動物等の脊椎動物）の大腿骨、股関節、肋骨、胸骨、および他の骨等の骨髄に見られる。臨床使用および科学的使用のための、他のＨＳＣ源としては、臍帯血、胎盤、胎仔肝臓、動員末梢血、非動員（ｎｏｎ−ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）（または不動員（ｕｎｍｏｂｉｌｉｚｅｄ））末梢血、胎仔肝臓、胎仔脾臓、胚性幹細胞、および大動脈−性腺−中腎（ＡＧＭ）、またはそれらの組合せなどがある。
【００２５】
当業者に理解されるであろうが、動員末梢血は、ＨＳＣ（たとえば、ＣＤ３４＋細胞）を強化した末梢血を指す。化学療法剤および／またはＧ−ＣＳＦ等の化学物質の投与は、幹細胞を骨髄から末梢循環に動員する。たとえば、少なくとも５日間の、または約５日間の、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の投与は、ＣＤ３４＋細胞を末梢血に動員する。循環するＣＤ３４＋細胞の３０倍富化が確認され、そのピーク値は、Ｇ−ＣＳＦ投与開始後第５日に現れる。末梢血の動員がなければ、循環するＣＤ３４＋細胞の数は非常に少なく、総単核血球の０．０１〜０．０５％と推定される。
【００２６】
本方法で使用するためのヒトＨＳＣは、単一ドナーから得ても多数のドナーから得てもよい。加えて、本明細書に記載の方法で使用されるＨＳＣは、用時単離されたＨＳＣ、凍結保存ＨＳＣＳ、またはそれらの組合せであってもよい。
【００２７】
当該技術分野で周知の通り、ＨＳＣは、当該技術分野で周知の種々の方法を使用して、これらの供給源から得ることができる。たとえば、ＨＳＣは、針と注射器を使用して、たとえば、股関節部、大腿骨、等々の骨髄から除去することにより直接得ることもでき、あるいは骨髄コンパートメントから細胞を放出させる、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）等のサイトカイン類でドナーを前処置した後、血液から得ることもできる。
【００２８】
本発明の方法で使用するためのＨＳＣは、得られたまま（たとえば、未増殖で）またはＨＳＣを非ヒト哺乳動物に導入する前に操作して（たとえば、増殖して）、非ヒト哺乳動物に直接導入することができる。一実施態様で、ＨＳＣを非ヒト哺乳動物に導入する前に、ＨＳＣを増殖する。当業者に理解されるであろうが、ＨＳＣを増殖させるために使用できる方法は種々ある（たとえば、Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１２（８）：２１６１−２１７０（２００６）；Ｚｈａｎｇ  ＣＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１１（７）：３４１５−３４２３（２００８）参照）。ある特定の実施態様で、成長因子類（たとえば、アンギオポエチン様５（Ａｎｇｐｌｔ５）成長因子、ＩＧＦ−結合蛋白質２（ＩＧＦＢＰ２）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、またはそれらの組合せ）の存在下で、ＨＳＣを間葉幹細胞（ＭＳＣ）と共培養して細胞培養をすることにより、ＨＳＣの個体群を増殖することができる。細胞培養は、増殖したＨＳＣ個体群が産生される条件下で維持される（たとえば、Ｍａｒｏｕｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，ＩＳＳＣＲ，７ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．１４０１（Ｊｕｌｙ８−１１，２００９）、国際公報_____________として公開された、２０１０年５月２８日に提出された、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３６６６４号（代理人整理番号Ｎｏ．４４７１．１０００−００１）（参照により本明細書に援用する）を参照）。
【００２９】
本明細書に記載の通り、非ヒト哺乳動物に導入されるＨＳＣは、ＨＳＣおよび／またはそれらの子孫（たとえば、Ｂ細胞子孫等のヒトＨＳＣにより再構成された血液系細胞）がヒト血液癌と関係がある１つまたは複数のヒト癌遺伝子を発現する（たとえば、過剰発現する）ように、遺伝子操作される。
【００３０】
当業者に理解されるであろうが、「ヒト血液癌と関係がある」癌遺伝子は、１つまたは複数のヒト血液癌の病因および／または進行と直接的または間接的に関わりのある癌遺伝子を含む。ヒト血液癌と関係がある多数の癌遺伝子が当業者に知られている。このような癌遺伝子の例としては、ＡＢＬ、ＡＫＴ、ＲＡＳ、ＢＲＡＣ１、ＢＲＡＣ２、ＣＢＬ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＰＭＬ、変異体ＩＤＨ１またはＩＤＨ２などがある。やはり当業者に理解されるであろうが、血液癌と関係がある融合遺伝子も、本方法で使用することができる。このような融合遺伝子の例としては、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＭＬＬ−ＡＦ４、ＭＬＬＡＦ１０およびＭＬＬ−ＥＮＯなどがある。
【００３１】
一実施態様で、ＨＳＣは、ヒトリンパ腫と関係があることが知られている。ある特定の実施態様で、その２つの癌遺伝子は、ｂｃｌ−２とｍｙｃである。Ｂ細胞特異的様式で両癌遺伝子を発現する（たとえば、過剰発現する）トランスジェニック動物は、約３週以内に白血球腫瘍を発症し、また５〜６週以内に死亡する（Ｓｔｒａｓｓｅｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．１９９０．Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：３３１−３３３；Ｍａｒｉｎ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２１７：２４０−２４７）。増殖を促進する他の癌遺伝子と違って、ｂｃｌ−２は、代わりに、カスパーゼ等のアポトーシスメディエータの活性化を抑制することにより、プログラム細胞死を防止することが分かっており；ｂｃｌ−２過剰発現は、濾胞性リンパ腫の特徴である（Ｃｈａｏ，Ｄ．Ｔ．ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ．１９９８．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：３９５−４１９；Ｃｏｒｙ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：８５９０−８６０７）。
【００３２】
一方、ｍｙｃ癌遺伝子は最終細胞分化を防止するが、プロアポトーシス促進機能も有することが知られており；その過剰発現は、極めて侵攻性のバーキットリンパ腫と強く関連している。（Ｍａｒｉｎ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ  ．２１７：２４０−２４７；Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ  Ｊ．Ｌ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ．２００３．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：９００７−９０２１；Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．１９８５．Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８）。興味深いことに、ｂｃｌ−２は、ｍｙｃ誘導性細胞増殖を抑制せずに、ｍｙｃ関連アポトーシスをブロックすることにより、ｍｙｃの腫瘤形成能を増強することが証明されている（Ｍａｒｉｎ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２１７：２４０−２４７；Ｍｅｙｅｒ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．１６：２７５−２８７）。
【００３３】
本明細書に示す通り、ｂｃｌおよびｍｙｃを発現するように遺伝子操作されたヒトＨＳＣがマウスに導入され、そのマウスが、ＨＳＣが再構成されて癌遺伝子がマウスで発現される条件下で維持されたとき、ｂｃｌ−２／ｍｙｃダブルトランスジェニックヒト化マウスでヒトリンパ性腫瘍が発症した。
【００３４】
加えて、または代わりに、ＨＳＣは、ＨＳＣおよび／またはＨＳＣの子孫（たとえば、非ヒト哺乳動物で、ヒトＨＳＣにより再構成された血液系細胞）における１つまたは複数の腫瘍サプレッサー遺伝子の発現を抑制するように遺伝子操作されていてもよい。したがって、一実施態様で、本発明は、ＨＳＣおよび／またはＨＳＣの子孫における１つまたは複数の腫瘍サプレッサー遺伝子の発現を抑制する核酸を含む（包含する）ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することを含む、ヒト血液癌用モデルである非ヒト哺乳動物を作る方法を対象とする。その哺乳動物は、哺乳動物中でヒトＨＳＣにより非ヒト哺乳動物の血液細胞系統が再構成されて１つまたは複数の腫瘍サプレッサー遺伝子の発現が抑制される条件下で維持され、それによってヒト血液癌用モデルである非ヒト哺乳動物を作る。
【００３５】
別の実施態様で、本発明は、ヒト血液癌と関係がある１つまたは複数の癌遺伝子をコード化する（たとえば、発現するように遺伝子操作された）核酸、ならびにＨＳＣおよび／またはＨＳＣの子孫における、１つまたは複数の腫瘍サプレッサー遺伝子の発現を抑制する核酸を含むヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することを含む、ヒト血液癌用モデルである非ヒト哺乳動物を作る方法を対象とする。哺乳動物は、哺乳動物中でヒトＨＳＣにより非ヒト哺乳動物の血液細胞系統が再構成されて１つまたは複数の癌遺伝子が発現され、１つまたは複数の腫瘍サプレッサー遺伝子の発現が抑制される条件下で維持され、それによってヒト血液癌用モデルである非ヒト哺乳動物を作る。
【００３６】
腫瘍サプレッサー遺伝子は、異常細胞が末期の腫瘍になるのを防止または「抑制」するのを助ける蛋白質を発現する。このような遺伝子が機能しないとき、それらは高頻度で癌細胞中にあるため、細胞は制御不能に増殖することができ、癌の特徴である腫瘍を形成する。腫瘍サプレッサー遺伝子の例としては、ｐ５３、Ｒｂ、ＡＰＣ、ＰＴＥＮ、ＣＤ９５、ＡＴＭ、およびＤＡＰＫＩなどがある。
【００３７】
当業者に理解されるであろうが、１つまたは複数の腫瘍サプレッサー遺伝子の発現を抑制および／または減少する任意の好適な核酸を、本発明の方法で使用することができる。たとえば腫瘍サプレッサー遺伝子の発現をノックアウト、ノックインおよび／またはノックダウンする核酸を、本発明の方法で使用することができる。このような核酸の一例は、腫瘍サプレッサー遺伝子内に挿入し、それによって腫瘍サプレッサー遺伝子の発現を削除または妨害（ノックダウン）する標的とされる核酸を含む。もう一例は、腫瘍サプレッサー遺伝子に取って代わり、それによって腫瘍サプレッサー遺伝子をノッックインするために標的とされる核酸（たとえば、腫瘍サプレッサー遺伝子以外の遺伝子をコード化する核酸）である。さらなる例としては、転写ブロック（遺伝子結合の場合）、ｍＲＮＡ転写物の分解（たとえば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはＲＮａｓｅ−Ｈ依存性アンチセンスによる）あるいはｍｉＲＮＡ等の他の機能的ＲＮＡの成熟に使用されるｍＲＮＡ翻訳、プレｍＲＮＡスプライシング部位またはヌクレアーゼ開裂部位のいずれかのブロッキングにより発現の減少を招く、腫瘍サプレッサー遺伝子に相補的な配列または腫瘍サプレッサー遺伝子のｍＲＮＡ転写物を有する核酸などがある（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ  （２００７），Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．，７（７）：６５１−６６０）（たとえば、モリフォリノオリゴまたは他のＲＮａｓｅ−Ｈ非依存性アンチセンスによる（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．，（１９９９）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４８９（１）：１４１-５８）。
【００３８】
当業者に理解されるであろうが、ＨＳＣは、当該技術分野で周知の種々の技術を使用して、１つまたは複数の癌遺伝子、融合遺伝子または腫瘍サプレッサー遺伝子を発現する（たとえば、過剰発現する）ように遺伝子操作することができる。たとえば、ＨＳＣによる、１つまたは複数の癌遺伝子をコード化する核酸、および／または１つまたは複数の腫瘍サプレッサー遺伝子の発現を抑制する核酸の発現は、その核酸を含む１つまたは複数の好適なベクターを使用して、ヒトＨＳＣを形質導入することにより達成される。一実施態様で、ベクターはウイルスベクターである。本明細書に記載の方法で使用するのに好適なウイルスベクターの例としては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス等々がある。
【００３９】
やはり当業者には明白なように、１つまたは複数の癌遺伝子をコード化する核酸および／または１つまたは複数の腫瘍サプレッサー遺伝子の発現を抑制する核酸を、レポーター／選択マーカーと一緒に、１つのベクターまたは多数のベクターに配列することができる。好適なレポーター／選択マーカーの例としては、ＧＦＰ、ＲＦＰ、および他の蛍光蛋白質（たとえば、ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｔｏｍａｔｏ、ｃｙａｎ、ルシフェラーゼ）および細胞表面マーカー類（たとえば、Ｔｈｙ−１、抗生物質耐性遺伝子）等がある。さらに、１つまたは複数の癌遺伝子および／または１つまたは複数の腫瘍サプレッサー遺伝子の発現を抑制する核酸を、単一のプロモーターから理論量で発現させることができる。特定の実施態様で、複数の癌遺伝子および／または１つまたは複数の腫瘍サプレッサー遺伝子の発現を抑制する核酸が使用されるとき、その癌遺伝子および／または１つまたは複数の腫瘍サプレッサー遺伝子の発現を抑制する核酸を、２Ａペプチド等のリボソーム・スキップ・誘導性ペプチドをコード化する領域により分離することができる（Ｓｚｙｍｃｚａｋ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５８９−５９４；Ｆａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５８４−５９０）。
【００４０】
１つまたは複数の癌遺伝子および／または１つまたは複数の腫瘍サプレッサー遺伝子の発現を抑制する核酸を含むベクター類は、１つまたは複数の癌遺伝子に操作可能に連結された種々のプロモーターをさらに含むことができる。たとえば、その１つまたは複数の癌遺伝子および／または１つまたは複数の腫瘍サプレッサー遺伝子の発現を抑制する核酸を、Ｅμエンハンサーに加えたＣＤ１９プロモーターまたはＥＦ１αプロモーターに、操作可能に連結することができる；前者は、Ｂ細胞における、癌遺伝子（類）および／または１つまたは複数の腫瘍サプレッサー遺伝子の発現を抑制する核酸の発現を主に指令し、後者は多くの血液系における、癌遺伝子（類）および／または１つまたは複数の腫瘍サプレッサー遺伝子の発現を抑制する核酸の発現を指令する。
【００４１】
ベクター類は、当業者に周知の追加的エレメントを含んでもよい。たとえば、ベクターは、ＩＲＥＳ駆動レポーターをさらに含んでもよい。加えて、本明細書に記載の通り、ウイルスのシュードタイプを使用して、感染をさらに最適化することができる。たとえば、エンベロープ蛋白質ＲＤ１１４、表面糖蛋白質ＶＳＶ−Ｇ（（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．ａｎｄ  Ｈ．Ｌ．Ｍａｌｅｃｈ．２００３．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１６４０：１−２４；Ｓａｎｄｒｉｎ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｂｌｏｏｄ  １００：８２３−８３２；Ｄｉ  Ｎｕｎｚｉｏ，ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１８：８１１−２０）、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＶＬ）被膜蛋白質でシュードタイプ化したウイルス（たとえば、レンチウイルス）を使用することができる。
【００４２】
本発明の方法では、１つまたは複数の癌遺伝子を発現するよう遺伝子操作されたＨＳＣが非ヒト哺乳動物に導入される。本明細書で使用されるとき、用語「哺乳動物」および「哺乳類」は、それらの子に授乳する、生存する子を出産する（真獣類または有胎盤哺乳動物）かまたは産卵する（後獣類または無胎盤哺乳動物）かいずれかの、単孔類、有袋類および有胎盤動物を含む、任意の脊椎動物を指す。本明細書に記載の方法で使用することができる哺乳類種の例としては、非ヒト霊長類（たとえば、サル、チンパンジー）、齧歯類（たとえば、ラット、マウス、モルモット）、イヌ、ネコ、および反芻動物（たとえば、ウシ、ブタ、ウマ）などがある。一実施態様において、非ヒト哺乳動物はマウスである。本明細書に記載の方法で使用される非ヒト哺乳動物は、成体、新生仔（たとえば、＜４８時間齢；子）または子宮内であってもよい。
【００４３】
特定の実施態様で、非ヒト哺乳動物は免疫不全非ヒト哺乳動物である、すなわち、その免疫系に１つまたは複数の欠損があり（たとえば、ＮＳＧまたはＮＯＤ  ｓｃｉｄ  γ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス）、結果として、ヒトＨＳＣが導入されるとき、ヒトＨＳＣによるヒト血液細胞系統の再構成を許容する、非ヒト哺乳動物である。たとえば、その非ヒト哺乳動物は、それ自身のＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞またはそれらの組合せを欠く。特定の実施態様で、非ヒト哺乳動物は、たとえば重症複合免疫不全変異を担持する非肥満糖尿病マウス（ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス）；重症複合免疫不全変異を担持し、またサイトカイン−受容体γ鎖の遺伝子を欠く非肥満糖尿病マウス（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒγ−／−マウス）；およびＢａｌｂ／ｃｒａｇ−／−γｃ−／−マウス等の、免疫不全マウスである。
【００４４】
免疫不全マウスの他の具体例としては、重症複合免疫不全（ｓｃｉｄ）マウス、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）−ｓｃｉｄマウス、ＩＬ２ｒｇ−／−マウス（たとえば、ＮＯＤ／ＬｙＳｚ−ｓｃｉｄＩＬ２ｒｇ−／−マウス、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄＩＬ２ｒｇ−／−マウス（ＮＯＧマウス）、ＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ−／−ＩＬ２ｒｇ−／−マウス、Ｈ２ｄ−Ｒａｇ−／−ＩＬ２ｒｇ−／−マウス）、ＮＯＤ／Ｒａｇ−／−ＩＬ２ｒｇ−／−マウスなどがあるが、その限りではない。
【００４５】
重症複合免疫不全（ｓｃｉｄ）変異を担持する非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスは、現在最も広くされる異種移植レシピエントである。しかし、これらのＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおけるヒト細胞の生着は未だ数パーセントを超えず、多分、これらのマウスに先天性免疫が残存するため、およびＮＫ細胞活性が低いものの存在するためであろう（Ｓｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１１８−１３０；Ｃｈｉｃｈａ  Ｌ．，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．２００５．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０４４：２３６−２４３）。それらの有用性は、胸腺リンパ腫に対する高い易罹患性、したがって比較的短い寿命（約３７週）によってさらに限定される（Ｓｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｊ．Ｉｍｍｏｎｏｌ．１７４：６４７７−６４８９）。
【００４６】
近年、Ｓｈｕｌｔｚらは、リンパ系発生に不可欠である様々なサイトカイン類の受容体の致命的なサブユニットである、共通サイトカイン受容体γ鎖の遺伝子が欠如しているＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスを発生させた（Ｓｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｊ．Ｉｍｍｏｎｏｌ．１７４：６４７７−６４８９；Ｃａｏ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２：２２３−２３８）。結果として得られるＮＯＤ／ｓｃｉｄ，γｃｎｕｌｌマウスは胸腺リンパ腫がなく、はるかに長い寿命（約９０週）を有し、またＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスよりも重大な先天性免疫欠損を有する；その結果として、それらの骨髄で、ヒト細胞の１０倍を超える大きさの生着を可能にする（それらの骨髄における細胞の約７０％がヒトであるのに対して、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスでは約６％である）（Ｓｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｊ．Ｉｍｍｏｎｏｌ．１７４：６４７７−６４８９；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｂｌｏｏｄ  １０６（５）：１５６５−１５７３）。
【００４７】
これらのマウスにおけるヒトＨＳＣは、ＮＫ細胞、骨髄性細胞、樹枝状細胞、および幹細胞と同様、Ｂ細胞前駆体および成熟したＩｇＭ＋Ｂ細胞を骨髄で生じさせた。胸腺はＴ細胞前駆体を含み、末梢血白血球は主としてＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞であった。脾細胞の大部分は濾胞構造に配列されたヒトＢ細胞であり；可溶性ヒトＩｇＭおよびＩｇＧが、末梢血中で検出され、クラススイッチの発生を示した。最終的に、若干のＴ細胞を包囲する主にＢ細胞を含む濾胞様構造が脾臓および腸管膜リンパ節で確認され、また卵アルブミンでの免疫後、Ｂ細胞は抗原特異的抗体（ＩｇＭとＩｇＧの両者）を産生できることが分かった（Ｓｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｊ．Ｉｍｍｏｎｏｌ．１７４：６４７７−６４８９；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｂｌｏｏｄ  １０６（５）：１５６５−１５７３）。
【００４８】
幾つかの実施態様で、１つまたは複数の癌遺伝子を発現するよう遺伝子操作されたＨＳＣの導入前に（たとえば、ヒトＨＳＣの再構成をさらに強化するために）、非ヒト哺乳動物を処置または操作する。たとえば、非ヒト哺乳動物を操作して、ヒトＨＳＣの生着および／または再構成をさらに強化することができる。一実施態様で、ＨＳＣおよび１つまたは複数のサイトカイン類をコード化する（１つまたは複数の）核酸の導入前に、非ヒト哺乳動物を照射する。別の実施態様で、ＨＳＣの導入前に、１つまたは複数の化学療法剤が非ヒト哺乳動物に投与される。
【００４９】
やはり当業者に理解されるであろうが、１つまたは複数の癌遺伝子をコード化するよう遺伝子操作されたＨＳＣを非ヒト哺乳動物に導入する種々の方法がある。そのような方法の例としては、皮内、筋肉内、免疫、眼内、大腿内、脳室内、頭蓋内、髄腔内、静脈内、心臓内、肝臓内、骨髄内、皮下、局所、経口および鼻腔内投与経路などがあるが、その限りではない。他の好適な導入方法としては、子宮内注入、流体力学的遺伝子送達、遺伝子療法、充電式または生分解性装置、粒子加速器（「遺伝子銃」）および徐放性ポリマー装置も挙げることができる。任意のそのような投与経路等々を使用して、ＨＳＣを非ヒトに導入することができる。
【００５０】
本発明の方法で、１つまたは複数の癌遺伝子を発現するように操作されたヒトＨＳＣを非ヒト哺乳動物に導入した後、その非ヒト哺乳動物は、哺乳動物中でヒトＨＳＣで非ヒト哺乳動物が再構成されてその癌遺伝子が発現される条件下で維持される。。本発明の非ヒト動物が維持されるこのような条件は、当業者に周知の通り、哺乳動物の基本的欲求（たとえば、食物、水、光）を満たすことを含む。特定の実施態様で、動物をそのような好適な条件下で維持することは、非ヒト哺乳動物でのリンパ性腫瘍の発生をもたらす。
【００５１】
本発明の方法は、１つまたは複数のサイトカイン類をコード化する核酸が発現されるかどうかおよび／またはＨＳＣで非ヒトが再構成されるかどうかを決定することをさらに含んでもよい。核酸が発現されるかどうかおよび／または非ヒト哺乳動物の血液細胞系統がＨＳＣにより再構成されるかどうかを決定する方法は、本明細書で提供され、また当業者に周知である。たとえば、ヒトＨＳＣの表面細胞マーカーに特異的な抗体を使用するフローサイトメトリー分析を使用して、非ヒト哺乳動物におけるヒトＨＳＣまたはヒトＨＳＣの子孫（たとえば、ヒトＨＳＣが非ヒト哺乳動物で分化した血液系細胞）の存在を検出することができる。加えて、再構成後、レシピエントマウスの全身状態を注意深く監視することができる。そのような監視は、末梢白血球数および細胞マーカー表現型を得ることを含むことができる。特定の実施態様で、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学を使用して、非ヒト哺乳動物の一次リンパ器官および二次リンパ器官の細胞組成を特性化することができる。加えて、非ヒト哺乳動物における、ヒトＨＳＣによるヒト血液細胞系統の再構成は、１つまたは複数のヒト癌遺伝子を非ヒト哺乳動物で発現するヒト白血球を検出することによって評価することができる。
【００５２】
別の態様で、本発明の方法は、非ヒト哺乳動物（すなわち、ヒトリンパ性癌用モデルであるヒト化非ヒト哺乳動物モデル；一次ヒト化非ヒト哺乳動物モデル）のリンパ性癌を、他の非ヒト哺乳動物に連続的に移植し、それによってヒトリンパ性癌用のモデル（二次ヒト化非ヒト哺乳動物モデル）である１つまたは複数の追加的非ヒト哺乳動物を作ることをさらに含むことができる。この態様で、本方法は、ヒトリンパ性癌用モデルであるヒト化非ヒト哺乳動物由来の１つまたは複数のヒト癌遺伝子を発現するヒト細胞（たとえば、ヒト化非ヒト哺乳動物から得たヒト白血球）を、１つまたは複数の免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することを含む。１つまたは複数の非ヒト哺乳動物は、第２の非ヒト哺乳動物中でヒトＨＳＣが再構成されて癌遺伝子が発現される条件下で維持され、それによってヒトリンパ性癌用モデルである１つまたは複数の追加的非ヒト哺乳動物を作る。特定の実施態様で、追加的な１つまたは複数の非ヒト哺乳動物は最初のヒト化非ヒト哺乳動物モデルと同一または同様の種である（すなわち、最初の非ヒト哺乳動物モデルはヒト化マウスモデルであり、追加的非ヒト哺乳動物モデルはマウスである）。他の実施態様で、追加的な１つまたは複数の非ヒト哺乳動物は、最初のヒト化非ヒト哺乳動物モデルと異なる種である。
【００５３】
当業者に理解されるであろうが、ヒト化非ヒト哺乳動物から得た１つまたは複数のヒト癌遺伝子を発現する数タイプの細胞を、本方法で使用することができる。たとえば、ヒト化非ヒト哺乳動物の骨髄または脾臓から得た１つまたは複数のヒト癌遺伝子を発現するヒト細胞を使用することができる。ある特定の実施態様で、その細胞は、ヒト化非ヒト哺乳動物（一次ヒト化非ヒト哺乳動物）の脾細胞である。
【００５４】
そのような細胞を得る（単離する、精製する、実質的に精製する）方法は、当業者に周知である。本明細書で使用されるとき、「単離された」（たとえば、「１つまたは複数のヒト癌遺伝子を発現する単離された細胞」）は、それが自然に存在する複雑な（たとえば、細胞の）環境、または器官、身体、または培地に関して実質的に単離されていることを指す。場合によっては、単離された材料は、組成物の一部（たとえば、他の物質を含む粗抽出物）、バッファー系、または試薬混合物を形成する。状況が違えば、材料は、本質的に均質になるまで精製することができる。単離された細胞個体群は、（全細胞数を基準として）存在する全細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％を構成する。
【００５５】
幾つかの態様で、ヒト化非ヒト哺乳動物から得た１つまたは複数のヒト癌遺伝子を発現する細胞を、１つまたは複数の非ヒト哺乳動物に直接注入することができる。他の態様で、本明細書に記載の通り、非ヒト哺乳動物に導入する前に、その細胞を増殖させることができる。
【００５６】
したがって、ヒト血液癌と関係がある１つまたは複数のヒト癌遺伝子を発現するように操作されたヒトＨＳＣを導入することによって作られた最初の（第１；一次）非ヒト哺乳動物から得たヒト癌遺伝子を発現するヒト細胞を使用して、ヒトリンパ性癌用モデルである非ヒト哺乳動物のコホート（たとえば、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００等々）を作ることができる。当業者に理解されるであろうが、これらのマウスは、１つまたは複数のコホートを連続的に移植するためにも使用される。
【００５７】
血液癌と関係がある１つまたは複数の癌遺伝子を発現するように操作されたヒトＨＳＣを導入することによってヒト血液癌用モデルであるヒト化非ヒト哺乳動物を作ることができるという発見は、種々の用途を提供する。
【００５８】
たとえば、別の態様で、本発明は、ヒト血液癌患者用モデルである非ヒト哺乳動物を作る方法を提供する。この態様で、本方法は、リンパ性癌患者の造血幹細胞（ＨＳＣ）を免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することを含む。非ヒト哺乳動物は、非ヒト哺乳動物中でヒトＨＳＣにより非ヒト哺乳動物の血液細胞系統が再構成されて癌患者の癌遺伝子が発現される条件下で維持され、それによって血液癌患者用モデルである非ヒト哺乳動物を作る。
【００５９】
他の態様で、本発明は、本明細書に記載の方法で作られた非ヒト哺乳動物を含む、構成物を提供する。
【００６０】
また別の態様で、本明細書で提供される非ヒト哺乳動物を使用して、ヒト血液癌の治療に使用することができる１つまたは複数の薬剤または治療方式（プロトコール）を見極めることができる。この態様で、本方法は、１つまたは複数の薬剤または治療方式を、本明細書に記載の（１つまたは複数の）非ヒト哺乳動物に投与することを含む。次に、非ヒト哺乳動物における癌が緩和されるかどうかが決定されるが、ここで非ヒト哺乳動物における癌が非ヒト哺乳動物で緩和されれば、その時は、その１つまたは複数の薬剤または治療方式を、ヒトリンパ性癌の治療に使用することができる。ある特定の実施態様で、本方法で使用されるモデルである非ヒト哺乳動物は、ある特定のヒトリンパ性癌患者用のモデルのものであることができる。すなわち、非ヒト哺乳動物は、その特定のリンパ性癌患者のＨＳＣを導入することによって作られたものである。したがって、１つまたは複数の薬剤または１つまたは複数の治療プロトコールは、その患者独特である。
【００６１】
当業者に理解されるであろうが、ヒトリンパ性癌の緩和としては、癌の除去、癌の寛解、癌患者の延命、または癌患者の生活の質の向上あるいはそれらの組合せ等がある。
【００６２】
やはり当業者に理解されるであろうが、本方法は、非ヒト哺乳動物における癌が、種々の好適なコントロールに比べて緩和されるかどうかを比較することをさらに含んでもよい。そのようなコントロールの一例は、薬剤または治療方式を受けていない非ヒト哺乳動物である。
【００６３】
本明細書に示す通り、リンパ性癌のヒト化非ヒト哺乳動物モデルを使用して、リンパ性癌の治療で相乗効果を生み出す治療プロトコールが特定された。具体的には、実施例３に記載の通り、表面マーカーＣＤ５２は、本明細書に記載のＡＬＬのモデルで発現されるため、これらのコホートを使用して、ヒトＣＤ５２を標的とし、再発慢性リンパ性白血病に対して使用するためにＦＤＡにより承認されている、モノクローナル抗体アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ−１）の有効性を試験した。また、アレムツズマブ治療の開始時に、広く使用される化学療法剤シクロホスファミドでマウスを治療することが、その有効性を向上するかどうかを試験した。シクロホスファミドとアレムツズマブの組合せは、血中、肝臓および脾臓で、アレムツズマブ単独よりも僅かに（約５〜１０倍）より効果的であり、また脳で、シクロホスファミドよりも僅かに（約５〜１０倍）より効果的であることが分かった。しかし、特に、シクロホスファミドとアレムツズマブの組合せでマウスを治療することにより、骨髄におけるそれらの癌細胞負荷は約１０，０００倍以上減少し、そのため、治療後、細胞は、たとえあったとしても、大腿骨骨髄試料中で、ほとんど検出可能されなかった。
【００６４】
したがって、別の態様で、本発明は、有効量の抗ＣＤ５２抗体および１つまたは複数の化学療法剤を個体に同時投与することを含む、必要とする個体における白血病を治療する方法を対象とする。ある特定の態様で、抗ＣＤ５２抗体はアレムツズマブであり、１つまたは複数の化学療法剤はシクロホスファミドである。さらに他の態様で、アレムツズマブおよびシクロホスファミドの投与後、個体の骨髄における癌細胞負荷は、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約１５０倍、約２００倍、約３００倍、約４００倍、約５００倍、約６００倍、約７００倍、約８００倍、約９００倍、約１０００倍、約２０００倍、約３０００倍、約４０００倍、約５０００倍、約６０００倍、約７０００倍、約８０００倍、約９０００倍、約１０，０００倍、約２０−０００倍減少する。ある特定の態様で、アレムツズマブおよびシクロホスファミドの投与後、個体の骨髄における癌細胞負荷は、１０，０００分の１に減少する。
【実施例】
【００６５】
例示
実施例１
免疫系の癌のヒト化マウスモデル。
リンパ性癌（たとえば、白血病およびリンパ腫）のヒト化マウスモデルの創造を、本明細書に記述する。
【００６６】
Ｂ細胞特異的プロモーター（Ｅμエンハンサーと結合したヒトＣＤ１９プロモーター）が、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）ならびに癌遺伝子Ｍｙｃおよび／またはＢｃｌ−２の発現を制御する、レンチウイルスの骨格を調製した。ＶＳＶＧ−シュードタイプ化レンチウイルスは、前述の通りに、この骨格を使用して作製し、超遠心分離を使用して濃縮した。ウイルス力価を測定した。
【００６７】
胎仔組織または臍帯から誘導された、ヒトＣＤ３４＋またはＣＤ１３３＋細胞は、磁気選別を使用して精製し、４μｇ／ｍｌポリブレンを含む培地中に再懸濁した。次いで、感染多重度（ＭＯＩ）が１０以上になるように、予め調製したヒト癌遺伝子担持レンチウイルス（上記参照）を加えた。次いで、各ウェルに２０，０００〜５０，０００個の細胞が入るように、細胞とウイルスの混合物を９６ウェルＵ底プレートに分取した。次いで、細胞を、室温（２５℃）で、１０００ｘＧで９０〜１２０分、遠心分離した。その後、細胞を３７℃で一晩インキュベートした。翌日、ウイルス含有培地を、用時調製した（無ウイルス）細胞培地と取り換え、細胞を再懸濁した。
【００６８】
上述の感染プロトコールは、既述の培養プロトコールを使用してインビトロで増殖させておいたヒトＣＤ３４＋細胞またはＣＤ１３３＋細胞にも適用することができる（Ｚｈａｎｇｅｔ  ａｌ，２００８，Ｂｌｏｏｄ  １１１（７）３４１５−２３）。増殖後、ＣＤ１３３＋細胞を再精製し、上述の通りに感染させた。
【００６９】
感染のおよそ６０時間後、細胞をプールし、ＳｔｅｍＳｐａｎ（登録商標）培地に再懸濁し、亜致死照射した免疫不全ＮＯＤ／ｓｃｉｄ／γｃｎｕｌｌ宿主マウスに注入した。次いで、視覚的およびヒト細胞の出現（たとえば、ヒトＣＤ４５抗原陽性）に関する末梢血スクリーニングの両方で、１０日ごとにおよそ１回、マウスを監視した。
【００７０】
ＧＦＰならびにＭｙｃおよびＢｃｌ−２両癌遺伝子を発現する細胞で再構成されたマウスは、再構成の２カ月以内に体重減少を経験し始めた。その後の３〜５週の間に、これらのマウスは次第に衰弱して、最終的に自力で餌を食べられなくなり；同時に、ＧＦＰ＋である（したがって、Ｍｙｃ＋およびＢｃｌ−２＋でもある）ヒト白血球は、末梢血中の白血球の９５％超を占めるまで増数した。この時点で、マウスを屠殺して検査した。図１Ａ〜１Ｃを参照されたい。
【００７１】
ＧＦＰ、Ｍｙｃ、およびＢｃｌ−２を発現する細胞で再構成された全てのマウスが、脾腫および骨髄浸潤を示し、数匹は拡張リンパ節、炎症肺、ならびに肝臓、腎臓、脳および脊柱周囲の筋肉への腫瘍浸潤の証拠も示した。図２Ａ〜２Ｄ、および図３を参照されたい。
【００７２】
実施例２
免疫系の癌は連続的に移植可能であった。
疾病は、他のＮＯＤ／ｓｃｉｄ／γｃｎｕｌｌマウスに連続的に移植できることが証明された。二次移植マウスは、一次ドナーと表現型的に類似した白血病を示した。白血病細胞の移動パターンならびに臨床症状は類似していた。これらの二次レシピエントの寿命は、最初に注入したＧＦＰ＋細胞数によって異なることが証明された。細胞は、ＭｏＦｌｏｗセルソーターを用いたフローサイトメトリーにより、ＧＦＰマーカー発現に基づいて精製した。代替法として、ＣＤ１９＋細胞の磁気陽性選択は、＞９９％という類似した純度を示した。細胞は、潜在的亜集団のインビトロ選択を避けるために、さらに増殖させずに、単離および精製の直後に注入した。一次宿主マウスの骨髄または脾臓のいずれかから採取した、（ＳｔｅｍＳｐａｎ（登録商標）培地約１００μＬに再懸濁された）およそ１００万個のＧＦＰ＋細胞を注入するとき、二次レシピエントは、初回注入の約３週後に同一の白血病を発症し、その後約１〜２週で、白血病のために死亡した。一次白血病マウス由来のＧＦＰ＋脾細胞を使用して、二次マウスの大規模コホート（たとえば、動物各５０〜１００匹）を創った。脾臓から単離される多数の悪性細胞（たとえば、最高１０９細胞）を考えると、二次移植されたコホートの大きさに妥当な制限は存在しない。
【００７３】
実施例３
ヒト特異的治療学を調査研究するためのヒト化モデルの使用
ヒト化急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）モデルは、新規なヒト特異的治療薬、特に腫瘍関連抗原を標的とするモノクローナル抗体を調査研究する機会を提供する。このモデルにおける白血病細胞は、種々の細胞表面マーカーを発現し、その一部は、たとえばＣＤ５２、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ７４、ＤＲ４、ＤＲ５、ＣＤ１２３およびＮＲＰ１等の、市場に出ているかまたは前臨床開発中であるモノクローナル抗体または生物学的製剤の標的である。
【００７４】
全脾由来のリンパ球を、ヒトＣＤ４５−ＰＥおよびＣＤ３８−ＡＰＣまたはＣＤ５２−ＡＰＣについて、それぞれ染色した。ヒトリンパ球は、ＦＳＣ／ＳＳＣリンパ球ゲートおよびｈＣＤ４５−ＰＥ発現陽性からゲート設定した。ＧＦＰ＋ＧＭＢ細胞は、他に類をみないほど高い腫瘍抗原の発現を示した。ＧＦＰ陰性非悪性ヒト細胞は、ＣＤ３８およびＣＤ５２発現をある程度示した。図４Ａを参照されたい。
【００７５】
表面マーカーＣＤ５２は、本明細書に記載のＡＬＬのモデルで発現されるため、これらのコホートを使用して、ヒトＣＤ５２を標的とし、再発慢性リンパ性白血病に対して使用するためにＦＤＡにより承認されている、モノクローナル抗体アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ−１）の有効性を試験した。二次マウスのコホート内の各マウスに、同じ一次ドナーマウス由来のＧＦＰ＋細胞約１０６個を注入した。１８〜２０日後、マウスを２群に分け、末梢血で見られるＧＦＰ＋細胞の密度で階層化した（すなわち、同（または類似した）数のＧＦＰ＋細胞／μＬ血液を有する）。次いで、１群のマウスには、マウスを群別した日を起点として、治療の第１、第４、および第７日の３回、無菌ＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに希釈したアレムツズマブ５ｍｇ／ｋｇ体重を尾静脈注入し；他群のマウスには、無菌ＰＢＳのみを注入した。注入を受ける直前に、各マウスの体重を測定し、各マウスが体重１ｇ当たり５μＬのアレムツズマブ（またはＰＢＳ）を受けるように、各注入の量を調節した。
【００７６】
治療コース完了の２日後、マウス数匹を安楽死させ、様々な器官のＧＦＰ＋細胞数を測定した。アレムツズマブ治療マウスは、ＰＢＳのみを注入したマウスより著しく少ないＧＦＰ＋細胞を、末梢血（約３０分の１に減少）、肝臓（約４００分の１に減少）、および脾臓（約３３００分の１に減少）に有していた。しかし、アレムツズマブ投与マウスおよびコントロールマウスの骨髄または脳におけるＧＦＰ＋細胞数はほぼ同じであり、これらの器官ではアレムツズマブの効果がないことを示した。それにも拘わらず、アレムツズマブ投与マウスは、ＰＢＳ投与マウスよりも有意に長く生存した。図４Ｂおよび４Ｃを参照されたい。
【００７７】
アレムツズマブ介在性白血病細胞死滅の機序を試験するために、治療効果を示さないアレムツズマブのペプシン−消化Ｆ（ａｂ）２フラグメントを使用し、Ｆｃ受容体介在性標的エフェクター細胞相互作用は、アレムツズマブ薬物作用における重要な機序であることを示した。抗体結合した白血病細胞は、補体介在性溶解によっても死滅することがある。ＮＳＧマウスは、補体Ｃ５が欠損しているため、ＮＳＧマウス由来の血清は、インビトロで、アレムツズマブ介在性腫瘍細胞殺滅を仲介しなかった（図５Ａ）。同様に、インビトロで、ＡＬＬ細胞に対する直接的な細胞傷害性は何も確認できなかった（図５Ｃ）。しかし、誘導された腹腔マクロファージは、アレムツズマブを加えている間、インビトロでＡＬＬ細胞を溶解することができた。また、Ｆｃ部分を欠くアレムツズマブのＦ（ａｂ）２フラグメントを適用するとき、何の作用も見られなかった（図５Ｄ）。
【００７８】
インビボで、マクロファージがアレムツズマブの抗白血病活性で果たす役割を解析するために、クロドロネート含有リポソームの静脈内または免疫注入によって、治療前に腫瘍担持マウスのマクロファージを枯渇させた。マクロファージ枯渇マウスを、クロドロネートリポソーム注入の２日後にアレムツズマブで治療するとき、脾臓での白血病細胞減少はみられなかった。
【００７９】
ヒト化ＡＬＬモデルは、コンパートメント特異的治療反応、特に脳および骨髄でアレムツズマブ抵抗性を示した。抵抗の機序を解明するために、アレムツズマブをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０で標識することにより、インビボで、アレムツズマブの組織分布およびエピトープ結合を評価した。５ｍｇ／ｋｇという治療量の標識アレムツズマブを注入した。マウスを２４時間後に屠殺し、ＩＶＩＳ蛍光光度計で画像化した。蛍光信号は、脾臓および骨に集中していた。器官をホモジナイズし、これらの器官由来の細胞を、アレムツズマブ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０結合について、フローサイトメトリーで直接評価した。脾臓および骨髄で強い抗体結合が見られたが、脳由来の白血病細胞では、特異的結合は何も見られなかった。骨髄におけるこのようなアレムツズマブ抵抗性機序は薬物動態学的側面と無関係であるが、脳を侵襲する細胞は、血液脳関門により大部分が遮蔽される。図５Ｂおよび５Ｃを参照されたい。
【００８０】
また、アレムツズマブ治療開始時に、広く使用される化学療法剤シクロホスファミドでマウスを治療することが、その有効性を向上させるかどうかを試験した。二次レシピエントのコホートを作り、上述の通りに治療群に分けた。群は、コントロールマウス（ＰＢＳ注入のみで治療）；アレムツズマブのみ（上記の通り、第１、第４、および第７日に注入）で治療したマウス；シクロホスファミドのみ（シクロホスファミドを、無菌ＰＢＳで１５ｍｇ／ｍｌに溶解し、第１および第２日に免疫注入で送達；各マウスが体重１グラム当たり１０μＬのシクロホスファミド溶液を受けるように、注入量を体重によって調整した）で治療したマウス；およびアレムツズマブとシクロホスファミドの組合せで治療したマウスを含んでいた。アレムツズマブ治療完了の２日後（全ての治療開始の９日後）、マウスを安楽死させ、上記の通り、様々な器官のＧＦＰ＋細胞数を測定した。
【００８１】
シクロホスファミドのみを使用した治療は、アレムツズマブのみを使用した治療と同程度に有効に末梢血中のＧＦＰ＋細胞数を減少させたが、肝臓および脾臓では、アレムツズマブはシクロホスファミドより約１５倍有効であった。しかし、アレムツズマブのみでは脳における効果がなかったが、シクロホスファミド治療は、脳で見られるＧＦＰ＋細胞数を約３００倍減少させた。それにも拘わらず、どちらの単一治療も、骨髄における白血病に対して多くの効果がなかった。シクロホスファミドとアレムツズマブの組合せは、血中、肝臓および脾臓で、アレムツズマブのみより僅かに（約５〜１０倍）より有効であり、また脳では、シクロホスファミドよりやはり僅かに（約５〜１０倍）より有効であった。しかし、特に、シクロホスファミドとアレムツズマブの組合せで治療したマウスは、骨髄におけるそれらの癌細胞負荷を約１０，０００分の１以上減少し、そのため、治療後、ＧＦＰ＋細胞は、たとえあったとしても、大腿骨骨髄試料中で、ほとんど検出可能されなかった。図６Ａおよび６Ｂを参照されたい。
【００８２】
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００９  Ｏｃｔ；１２８（２）：２６０−７０．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ５２  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．Ｈｕ  Ｙ，Ｔｕｒｎｅｒ  ＭＪ，Ｓｈｉｅｌｄｓ  Ｊ，ＧａｌｅＭＳ，Ｈｕｔｔｏ  Ｅ，Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＢＬ，Ｓｉｄｅｒｓ  ＷＭ，Ｋａｐｌａｎ  ＪＭ．
Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．２００８  Ｄｅｃ；４９（１２）：２２５６−６２．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｅｌｔｅｒ  Ｔ，Ｍｏｌｎａｒ  Ｉ，Ｋｕｈｌｍａｎｎ  Ｊ，Ｈａｌｌｅｋ  Ｍ，Ｗｅｎｄｔｎｅｒ  Ｃ．
Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２００９  Ｎｏｖ；２３（１１）：１９８０−８．Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｊｕｌ  ２３．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｏｓｔｅｒｂｏｒｇ  Ａ，Ｆｏａ  Ｒ，Ｂｅｚａｒｅｓ  ＲＦ，Ｄｅａｒｄｅｎ  Ｃ，Ｄｙｅｒ  ＭＪ，Ｇｅｉｓｌｅｒ  Ｃ，Ｌｉｎ  ＴＳ，Ｍｏｎｔｉｌｌｏ  Ｍ，ｖａｎ  Ｏｅｒｓ  ＭＨ，Ｗｅｎｄｔｎｅｒ  ＣＭ，Ｒａｉ  ＫＲ．
Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７  Ａｐｒ  ２７；３１６（５８２４）：６００−４．Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｂａｒａｂｅ  Ｆ，Ｋｅｎｎｅｄｙ  ＪＡ，Ｈｏｐｅ  ＫＪ，Ｄｉｃｋ  ＪＥ．
Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ．２００９  Ｄｅｃ；５３（６）：９７８−８３．Ａ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｌａｐｓｅｄ  ｏｒ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：  ａ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ'ｓ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  ｒｅｐｏｒｔ．Ａｎｇｉｏｌｉｌｌｏ  ＡＬ，Ｙｕ  ＡＬ，Ｒｅａｍａｎ  Ｇ，Ｉｎｇｌｅ  ＡＭ，Ｓｅｃｏｌａ  Ｒ，Ａｄａｍｓｏｎ  ＰＣ．
Ｃａｎｃｅｒ．２００６  Ｊｕｎ  １５；１０６（１２）：２６４５−５１．Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＣＤ５２−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｃｕｔｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｔｉｂｅｓ  Ｒ，Ｋｅａｔｉｎｇ  ＭＪ，Ｆｅｒｒａｊｏｌｉ  Ａ，Ｗｉｅｒｄａ  Ｗ，Ｒａｖａｎｄｉ  Ｆ，Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｎｅｒｏ  Ｇ，Ｏ'Ｂｒｉｅｎ  Ｓ，Ｃｏｒｔｅｓ  Ｊ，Ｖｅｒｓｔｏｖｓｅｋ  Ｓ，Ｂｒｏｗｎｉｎｇ  ＭＬ，Ｆａｄｅｒｌ  Ｓ．
Ｃａｎｃｅｒ．２０１０  Ｍａｒ  １；１１６（５）：１１６５−７６．Ａｄｕｌｔ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｆａｄｅｒｌ  Ｓ，Ｏ'Ｂｒｉｅｎ  Ｓ，Ｐｕｉ  ＣＨ，Ｓｔｏｃｋ  Ｗ，Ｗｅｔｚｌｅｒ  Ｍ，Ｈｏｅｌｚｅｒ  Ｄ，Ｋａｎｔａｒｊｉａｎ  ＨＭ．
Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ．２０１０  Ｍａｒ；３４（３）：３２７−４０．Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  ＩＧＨ−ＢＣＬ２  ａｎｄ  ＭＹＣ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ  ａｒｅ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ  ｗｉｔｈ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｒｏｍ  Ｂｕｒｋｉｔｔ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｓｎｕｄｅｒｌ  Ｍ，Ｋｏｌｍａｎ  ＯＫ，Ｃｈｅｎ  ＹＢ，Ｈｓｕ  ＪＪ，Ａｃｋｅｒｍａｎ  ＡＭ，Ｄａｌ  Ｃｉｎ  Ｐ，Ｆｅｒｒｙ  ＪＡ，Ｈａｒｒｉｓ  ＮＬ，Ｈａｓｓｅｒｊｉａｎ  ＲＰ，Ｚｕｋｅｒｂｅｒｇ  ＬＲ，Ａｂｒａｍｓｏｎ  ＪＳ，Ｈｏｃｈｂｅｒｇ  ＥＰ，Ｌｅｅ  Ｈ，Ｌｅｅ  ＡＩ，Ｔｏｏｍｅｙ  ＣＥ，Ｓｏｈａｎｉ  ＡＲ．
Ｂｌｏｏｄ．２００８  Ａｐｒ  １；１１１（７）：３４１５−２３．Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｊａｎ  １７．Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ５  ａｎｄ  ＩＧＦＢＰ２  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ａｓｓａｙｅｄ  ｂｙ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｚｈａｎｇ  ＣＣ，Ｋａｂａ  Ｍ，Ｉｉｚｕｋａ  Ｓ，Ｈｕｙｎｈ  Ｈ，Ｌｏｄｉｓｈ  ＨＦ．
【００８３】
全ての特許、公開された出願および本明細書に引用された参考文献の教示は、参照によりその全体を援用する。
【００８４】
本発明は具体的に示され、またその例示的な実施態様を参照しながら記述されているが、添付の請求の範囲に含まれる本発明の範囲から逸脱せずに、形状および詳細の様々な変更を加えられることを、当業者は理解するであろう。
【図１】
2012531894.tif 000002
【図２】
2012531894.tif 000003
【図３】
2012531894.tif 000004
【図４Ａ】
2012531894.tif 000005
【図４Ｂ】
2012531894.tif 000006
【図４Ｃ】
2012531894.tif 000007
【図５Ａ】
2012531894.tif 000008
【図５Ｂ】
2012531894.tif 000009
【図５Ｃ】
2012531894.tif 000010
【図５Ｄ】
2012531894.tif 000011
【図５Ｅ】
2012531894.tif 000012
【図６】
2012531894.tif 000013
【図７】
2012531894.tif 000014
【国際調査報告】
2012531894.tif 000015