(57)【要約】  本発明は、結核菌の存在の単純、特異的かつ／または感受性のある試験のためのオリゴヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、結核菌の試験のためのオリゴヌクレオチドを提供する。試験において有用なプローブおよび／またはプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドを含むキットも提供される。
2012531908.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または配列番号２、その断片、誘導体、または相補的配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む単離したオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
オリゴヌクレオチド配列が１３〜３５個の連結されたヌクレオチドの長さであり、配列番号１または配列番号２のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１、配列番号２、その断片、誘導体、または相補的配列からなる単離したオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
結核菌複合体と結合するおよび／またはそれから増幅されることができる、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離したオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
結核菌複合体が、結核菌、ウシ型結核菌、アフリカ型結核菌、マイコバクテリウム・カネッティ（Ｍ．ｃａｎｅｔｔｉ）、およびネズミ型結核菌からなる群から選択される、請求項４に記載の単離したオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
順方向プライマーが配列番号１、その断片、誘導体、および相補的配列を含み、逆方向プライマーが配列番号２、その断片、誘導体、および相補的配列を含む、少なくとも１つの順方向プライマーおよび少なくとも１つの逆方向プライマーを含む一対のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
順方向プライマーが配列番号１、その断片、誘導体、または相補的配列からなり、逆方向プライマーが配列番号２、その断片、誘導体、または相補的配列からなる、少なくとも１つの順方向プライマーおよび少なくとも１つの逆方向プライマーを含む一対のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項６または７のいずれかに記載の一対のオリゴヌクレオチドおよび少なくとも１つのプローブを含む、一組のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの順方向プライマーおよび配列番号２のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの逆方向プライマーを用いて結核菌から増幅した単位複製配列。
【請求項１０】
（ａ）少なくとも１つの生体試料を提供するステップと、
（ｂ）請求項１から５のいずれか一項に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを、生体試料中の少なくとも１つの核酸、ならびに／または生体試料から抽出、精製および／もしくは増幅した少なくとも１つの核酸と接触させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の接触から生じる任意の結合を検出および／または定量し、結合が検出された場合は結核菌複合体が存在するステップと
を含む、生体試料中の結核菌複合体を検出および／または定量する方法。
【請求項１１】
（ａ）少なくとも１つの生体試料を提供するステップと、
（ｂ）請求項８に記載の一組のオリゴヌクレオチドを、生体試料中の少なくとも１つの核酸、ならびに／または生体試料から抽出、精製および／もしくは増幅した少なくとも１つの核酸と接触させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の接触から生じる任意の結合を検出および／または定量し、結合が検出された場合は結核菌複合体が存在するステップと
を含む、生体試料中の結核菌複合体を検出および／または定量する方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）の後に、内部分子（ＩＣ）およびＩＣに特異的なプローブを生体試料と混合するステップをさらに含む、請求項１０または１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ＩＣが、配列番号３のヌクレオチド配列、その断片、誘導体、または相補的配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
配列番号１および配列番号２を用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含む、結核菌複合体の核酸を増幅する方法。
【請求項１５】
少なくとも１つのプローブをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、結核菌複合体を検出するためのキット。
【請求項１７】
請求項６または７のいずれかに記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド対を含む、結核菌複合体を検出するためのキット。
【請求項１８】
請求項８に記載の少なくとも１組のオリゴヌクレオチドを含む、結核菌複合体を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核菌の存在を検出するためのプライマー、プローブ、ならびにそのようなプライマーおよび／またはプローブを使用した方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
結核（ＴＢ）とは、結核菌の感染または結核菌複合体の１つもしくは複数の生物によって一般に引き起こされる慢性の感染性疾患である。ＴＢは現在、依然として大きな世界的健康問題であり、毎年約８百万件の新規症例および３百万件の死亡例が存在する。シンガポールにおけるＴＢの発生率は、年間１００，０００人あたり３５〜４０人である。これは、毎日４〜５件の新規症例に等しい。ＴＢの伝播が増加しているにもかかわらず、その診断の確立は困難である。特に、結核菌が宿主内で維持および増殖される免疫学的機構の理解は乏しい。
【０００３】
結核菌ゲノムの配列決定により、理論的には生物によって発現され得る、潜在的な結核菌タンパク質を同定するための巨大な研究努力が促進された。しかし、配列データ単独では、任意の特定のタンパク質が、ｉｎ  ｖｉｖｏで生物によってはもちろん、ヒトまたは動物の感染中に発現されていると結論づけるには不十分である。
【０００４】
結核菌桿菌の感染、または潜伏感染の再活性化は、感染部位への単球およびマクロファージの動員を含む宿主応答を誘導する。より多くの免疫細胞が蓄積されるにつれて、マクロファージの細胞毒性産物によって破壊された免疫細胞および宿主組織を含む肉芽腫の小結節が形成される。疾患が進行するにつれて、マクロファージ酵素がタンパク質、脂質および核酸の加水分解を引き起こし、その結果、周辺組織の液化および肉芽腫の形成がもたらされる。最終的に、病変は破裂し、桿菌が周辺の肺、血液およびリンパ系内に放出される。感染は相当な期間の間無症候性であり得るが、この疾患は、最も一般的には肺の急性炎症として顕在化され、発熱および湿性咳嗽がもたらされる。処置せずに放置した場合、結核菌感染症は、肺中の一次感染部位を越えて身体内の任意の臓器へと進行して、一般に重篤な合併症および死をもたらし得る。したがって、感染の初期にＴＢを診断することが重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
抗酸菌を観察するための顕微鏡観察などの慣用技術は素早く比較的安価であるが、４０〜６０％の範囲の感度の不足、およびその結果としての乏しい陰性適中率に悩まされる。ＡＩＤＳに罹患している患者などの有意なレベルの非結核性マイコバクテリア（ＮＴＭ）を有する集団では、陽性スメアがＴＢまたはＮＴＭの結果であるかは未だ確認できないため、陽性スメアの価値は低い。ＮＴＭとは、結核またはハンセン病（らい病としても知られる）を引き起こさないマイコバクテリアである。ＮＴＭの例には、それだけには限定されないが、ライ菌、トリ型結核菌、カンサシ菌などが含まれる。
【０００６】
現在、潜伏感染は、免疫化していない人ではＴＢ皮膚試験によって診断し、これは、結核菌から作製した抽出物に対して遅延型過敏の種類の応答を生じる。ＴＢについて免疫化したまたは過去にクリアランスされた感染を有する者は、現在感染状態にある者に匹敵する遅延型過敏で応答するため、試験は、特にＴＢの免疫化が一般的である国の出身の人に関しては注意して使用しなければならない。また、ツベルクリン試験は、特に患者がサルコイドーシス、ホジキンリンパ腫、栄養失調、または最も顕著には活性ＴＢ疾患を併発している場合に、偽陰性を生じる不利点も有する。インターフェロンガンマ放出アッセイはツベルクリン皮膚試験よりも特異的であるが、高レベルの潜伏性ＴＢを有する集団中では、症候性患者における「反応性」の結果の値は低く、陰性結果の適中率はＴＢを排除するために十分ではない。
【０００７】
培養が依然として最も感受性のある方法であるが、ブロスに基づく方法が大きく改善されているにもかかわらず、陽性が報告されるまでの時間は、即時の管理判断を助けるためには遅すぎる。これは、結核菌は実験室でゆっくりと成長する生物であることが原因である（血液または痰の培養には４〜１２週間かかり得る）。培養を「参照標準」として使用することは慣例である。しかし、ＭＴＢＣ培養陽性試料の２〜３％は偽陽性である。
【０００８】
ＴＢの完全な医学的評価には、病歴、身体検査、胸部Ｘ線、微生物学的スメア、および培養が含まれていなければならない。また、ツベルクリン皮膚試験および血清学的試験も含まれ得る。ツベルクリン皮膚試験の解釈は、ＴＢの他の症例または免疫抑制への曝露などの、感染およびＴＢ疾患への進行におけるその人の危険因子に依存する。これらすべての試験の後でさえも、ＴＢの診断の結果は、時折決定的でない場合がある推定の結果のみでしかあり得ない。したがって、現在の診断的な微生物学的方法は、非感受性、非特異的かつゆっくりである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、添付の独立クレーム中に定義されている。本発明の一部の任意選択の特徴は、添付の従属クレーム中に定義されている。特に、本発明は上記問題に対処し、患者の検体中の結核菌をより効率的に検出する方法において有用な、高感度かつ特異的なオリゴヌクレオチド、その断片および／または誘導体を提供する。プライマーおよび／またはプローブは、ＴＢの検出において感受性があるかつ特異的である場合があり、結核菌による感染および／またはそれに関連する病状を決定するための迅速かつ対費用効果の高い診断的および予後的試薬を提供する。これらのプライマーは、安価で素早い、より正確なＴＢ試験手段を提供する。
【００１０】
一態様によれば、本発明は、配列番号１または配列番号２、その断片、誘導体、突然変異、または相補的配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、少なくとも１つの単離したオリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチドは、結核菌複合体と結合するおよび／またはそれから増幅されることができ得る。
【００１１】
これらのプライマーは、ＴＢの診断に利用可能な慣用方法よりも感受性があり得る核酸増幅（ＮＡＡ）試験において使用し得る。
【００１２】
別の態様によれば、本発明は、少なくとも１つの順方向プライマーおよび少なくとも１つの逆方向プライマーを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチド対を提供し、順方向プライマーは、配列番号１、その断片、誘導体、突然変異、または相補的配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなり、逆方向プライマーは、配列番号２、その断片、誘導体、突然変異、または相補的配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
【００１３】
別の態様によれば、本発明は、本発明の任意の態様による一対のオリゴヌクレオチドおよび少なくとも１つのプローブを含む、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド組を提供する。
【００１４】
さらなる態様によれば、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列、その断片、誘導体、突然変異、または相補的配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる少なくとも１つの順方向プライマー、および配列番号２のヌクレオチド配列、その断片、誘導体、突然変異、または相補的配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる少なくとも１つの逆方向プライマーを用いて、結核菌複合体から増幅した少なくとも１つの単位複製配列を提供する。
【００１５】
一態様によれば、本発明は、
（ａ）少なくとも１つの生体試料を提供するステップと、
（ｂ）本発明の任意の態様による少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対またはオリゴヌクレオチド組を、生体試料中の少なくとも１つの核酸、ならびに／または生体試料から抽出、精製および／もしくは増幅した少なくとも１つの核酸と接触させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の接触から生じる任意の結合を検出し、結合が検出された場合は結核菌が存在するステップと
を含む、生体試料中の結核菌の存在を検出する少なくとも１つの方法を提供する。
【００１６】
一態様によれば、本発明は、配列番号１、その断片、誘導体、突然変異、または相補的配列、および配列番号２、その断片、誘導体、突然変異、または相補的配列を用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含む、結核菌の核酸を増幅する少なくとも１つの方法を提供する。
【００１７】
別の態様によれば、本発明は、本発明の任意の態様による少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対またはオリゴヌクレオチド組を含む、結核菌を検出するための少なくとも１つのキットを提供する。
【００１８】
特定の態様によれば、患者の検体中の結核菌ＤＮＡを検出することができるＰＣＲ方法において有用な、高感度かつ特異的なプライマー、その断片および／または誘導体が提供される。この試験を用いて、活性肺結核に罹患している患者からの検体を検査し得る。プライマーは感受性があるかつ特異的であり得る。さらに、ＰＣＲの性能を監視するために少なくとも１つのＩＣ分子をそれぞれの反応中に含め得る。
【００１９】
以下の説明から明らかなように、本発明の好ましい実施形態は、所望する場合は、ＴＢを感受的かつ特異的に検出するためのプライマーおよび／またはプローブの最適な使用を可能にする。この利点および他の関連する利点は、以下の説明から当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】試料の選択の第１のステップならびに培養およびスメアなどの慣用方法と比較した本発明（インハウス）のＰＣＲ結果を示す図である。
【図２】図１からの選択された試料の分離で得られた結果を肺および非肺試料へとさらに分類する、試料の選択の第２のステップの流れ図である。
【図３】本発明のプライマーおよびプローブを試験するための前向き試料の選択を含む第３のステップを示す流れ図である。
【図４】ＰＣＲ添加剤を用いたおよび用いない場合のＰＣＲ増幅産物の結果である。ＰＣＲ産物は臭化エチジウムで染色したアガロースゲル中で観察した。Ａ）添加剤なし、Ｂ）ＤＭＳＯ、５％、Ｃ）ホルムアミド、５％およびＤ）ベタイン、１Ｍ。濃度は、チューブ中の添加剤の最終濃度である。レーン：Ｍ：１００ｂｐのＤＮＡラダー、ＮＴＣ：非鋳型対照、５４〜５６：陽性臨床試料、６９〜７１：陰性臨床試料。予想されるＰＣＲ産物は１４５塩基対（ｂｐ）であった。９５ｂｐの予想される大きさを有するＩＣをすべての試料中に添加した。
【図５】１〜１０％の濃度のホルムアミドを用いたＰＣＲ産物のゲル画像である。ＰＣＲ産物は、１つの反応あたり５個のＴＢ  ＤＮＡクローンのコピーから作製し、臭化エチジウムで染色したアガロースゲル中で観察した。レーン：Ｍ：１００ｂｐのＤＮＡラダー、Ｃ：ホルムアミドを加えなかった対照、１〜１０：ホルムアミドのパーセンテージ。予想されるＰＣＲ産物は１４５ｂｐであった。９５ｂｐの予想される大きさを有するＩＣをすべての試料中に添加した。
【図６】臭化エチジウムで染色したアガロースゲル中で観察した、Ａ）０％、Ｂ）３％およびＣ）５％の濃度のホルムアミドを用いたＰＣＲ増幅産物のゲル画像である。レーン：Ｍ：１００ｂｐのＤＮＡラダー、１：ＮＴＣ、２〜４：それぞれ１つの反応あたり１個、３個、５個のＴＢ  ＤＮＡのコピー、２０、２３、２５：陽性臨床試料、２４、２７、５１：陰性臨床試料。予想されるＰＣＲ産物は１４５ｂｐであった。９５ｂｐの予想される大きさを有するＩＣをすべての試料中に添加した。試料２０および２３は、試料中にゲノムＤＮＡを含有する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書中で言及する書誌参照は、利便上、参考文献のリストの形態で列挙し、実施例の最後に追加されている。そのような書誌参照の内容全体が本明細書中に参考として組み込まれている。
【００２２】
定義
用語「生体試料」とは、本明細書中で、少なくとも１つの動物および／また植物からの任意の組織および／または液体の試料として定義される。生体試料は、ヒトを含めた動物の体液、固体（たとえば大便）または組織、液体および固体の食品および飼料の製品、ならびに乳製品、野菜、肉や食肉以外の部分、および廃棄物などの成分であり得る。生体試料は、それだけには限定されないが、有蹄動物、熊、魚、ウサギ目動物（ｌａｇａｍｏｒｐｈ）、げっ歯類などの動物を含めた、様々な家畜のファミリーのすべて、および自然または野生の動物から得られ得る。環境試料には、表面物質、土壌、水、空気および工業的試料などの環境物質、ならびに食品および乳業の加工機器、装置、器具、用具、使い捨ておよび使い捨てでない物品から得られた試料が含まれる。これらの例は、本明細書中に開示した方法に適用可能な試料の種類を限定するものと解釈されるべきでない。特に、生体試料は、少なくとも人間からの任意の組織および／または体液であり得る。
【００２３】
本明細書中、用語「相補的」とは、塩基対合の規則によって関連づけられたポリヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチドまたは標的核酸などのヌクレオチドの配列）に言及して使用する。たとえば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」に相補的である。核酸鎖間の相補性の度合は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に顕著な影響を与える。このことは、増幅反応、および核酸間の結合に依存する検出方法において特に重要である。特に、「相補的配列」とは、一方の配列の５’末端が他方の３’末端と対合するように核酸配列とアラインメントした場合に、「逆平行に会合」するオリゴヌクレオチドをいう。天然の核酸中に一般的に見つからない特定の塩基を、本明細書中に開示した核酸中に含めてもよく、たとえば、イノシンおよび７−デアザグアニンが含まれる。相補性は完璧である必要はなく、安定な二重鎖はミスマッチの塩基対または一致していない塩基を含有し得る。核酸技術の当業者は、たとえば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成および配列、イオン強度ならびにミスマッチの塩基対の発生率を含めたいくつかの変数を考慮して、二重鎖の安定性を経験的に決定することができる。第１のオリゴヌクレオチドが標的核酸のある領域に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドが同じ領域（またはこの領域の一部分）に対して相補的を有する場合、「重複領域」が標的核酸に沿って存在する。重複の度合は、相補性の程度に応じて変動し得る。
【００２４】
用語「含む」とは、本明細書中で、「主に含まれるが、必ずしも単独である必要はない」として定義される。さらに、用語「含む」は、当業者には、「からなる」が含まれるとして自動的に読み取られるであろう。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の変形は、対応して変動する意味を有する。
【００２５】
用語「誘導体」とは、本明細書中で、本発明のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド配列の化学修飾として定義される。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、たとえば、アルキル、アシル、またはアミノ基による水素の置換えが含まれることができる。
【００２６】
用語「断片」とは、本明細書中で、配列にオリゴヌクレオチドの特徴および機能を与える活性／結合部位を含む、オリゴヌクレオチドの完全配列の不完全または単離した部分として定義される。詳細には、これは少なくとも１つのヌクレオチドまたはアミノ酸の分短い場合がある。より詳細には、断片は、オリゴヌクレオチドが結核菌複合体と結合することを可能にする結合部位を含む。詳細には、順方向プライマーの断片は、配列番号１の少なくとも１０、１２、１５、１８もしくは１９個の連続したヌクレオチドを含んでいてもよく、および／または、逆方向プライマーは、配列番号２の少なくとも１０、１２、１５、１８、１９、２０、２２、もしくは２４個の連続したヌクレオチドを含んでいてもよい。より詳細には、プライマーの断片は少なくとも１５個のヌクレオチドの長さであり得る。
【００２７】
用語「内部対照（ＩＣ）分子」とは、本明細書中で、本発明の方法で使用する結核菌と同じプライマー組によって同時増幅される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたオリゴヌクレオチド分子として定義される。詳細には、ＩＣは、偽陰性結果を回避するために、反応混合物中に混合してＰＣＲの性能を監視し得る。このＩＣ分子を検出するためのプローブは、この分子の内部部分に特異的であり得る。この内部部分は、人工的に設計される場合があり、自然に存在しない場合がある。
【００２８】
本発明のコンテキストにおいて使用する用語「結核菌複合体」とは、結核菌、ウシ型結核菌、アフリカ型結核菌、マイコバクテリウム・カネッティ（Ｍ．ｃａｎｅｔｔｉ）、ネズミ型結核菌などの１つまたは複数の生物を意味する。
【００２９】
用語「突然変異」とは、本明細書中で、一定の長さのヌクレオチドの核酸配列中の変化として定義される。当業者は、小さな突然変異、特に置換、欠失および／または挿入の点突然変異は、特に核酸をプローブとして使用する場合に、ヌクレオチドのストレッチにわずかな影響しか与えないことを理解されよう。したがって、本発明によるオリゴヌクレオチドには、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入の突然変異が包含される。さらに、本発明によるオリゴヌクレオチドおよびその誘導体は、プローブとしても機能する場合があり、したがって、本明細書中で言及する任意のオリゴヌクレオチドには、その突然変異体および誘導体も包含される。
【００３０】
用語「生体試料中の核酸」とは、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含有する任意の試料をいう。特に、核酸源は、それだけには限定されないが、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜腔内液、乳、リンパ液、痰および精液を含めた生体試料である。
【００３１】
一態様によれば、本発明は、配列番号１または配列番号２、その断片、誘導体、突然変異または相補的配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる、少なくとも１つの単離したオリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチドは、結核菌複合体と結合するおよび／またはそれから増幅されることができ得る。結核菌複合体は、結核菌、ウシ型結核菌、アフリカ型結核菌、マイコバクテリウム・カネッティ、およびネズミ型結核菌からなる群から選択され得る。これらのプライマーは、結核菌、ウシ型結核菌、アフリカ型結核菌、マイコバクテリウム・カネッティ、またはネズミ型結核菌のうちの１つまたは複数と結合し得る。これらのプライマーは、結核菌複合体に対して感受性があるかつ特異的でありＮＴＭに対してそうでない場合がある。
【００３２】
本発明の任意の態様によるプライマーは、結核菌の遺伝子型をアフリカ型結核菌、ウシ型結核菌、ネズミ型結核菌、およびマイコバクテリウム・カネッティから区別するために使用し得る。結核菌の遺伝子型は、結核菌の薬物耐性株を含み得る。結核菌の薬物耐性株は、リファンピン、エタンブトール、イソニアジド、ジアリールキノロン、フルオロキノロン、ストレプトマイシンおよびピラジナミン（ｐｙｒａｚｉｎａｍｉｎｅ）からなる群から選択される１つまたは複数の薬物に対して耐性であり得る。結核菌の薬物耐性株は、リファンピン、エタンブトール、イソニアジド、ジアリールキノロン、フルオロキノロン、ストレプトマイシンおよびピラジナミドからなる群から選択される複数の薬物に対して耐性であり得る多剤耐性株であり得る。
【００３３】
オリゴヌクレオチド配列は１３〜３５個の連結されたヌクレオチドの長さであってよく、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を含み得る。当業者には、所定のプライマーは、増幅反応において相補的核酸鎖の合成を有効にプライミングするために１００％の相補性でハイブリダイズする必要はないことが理解されよう。プライマーは、介在または隣接するセグメントがハイブリダイゼーション現象（たとえば、ループ構造またはヘアピン構造）に関与しないように、１つまたは複数のセグメントにわたってハイブリダイズし得る。特に、オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１または配列番号２に対して８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有し得る。
【００３４】
開示した具体的なプライマー配列と比較して、７０％〜１００％、またはそれ内の任意の範囲の配列同一性の変動の程度が可能である。配列同一性の決定は、以下の実施例中に記載されている。２個の同一でない残基を有する別の２０個のヌクレオチドの長さのプライマーと同一である、２０個のヌクレオチドの長さのプライマーは、２０個のうち１８個の同一残基を有する（１８／２０＝０．９または９０％の配列同一性）。別の例では、すべての残基が２０個の核酸塩基の長さのプライマーの１５個のヌクレオチドのセグメントと同一である、１５個のヌクレオチドの長さのプライマーは、前記２０個のヌクレオチドのプライマーと１５／２０＝０．７５または７５％の配列同一性を有する。
【００３５】
パーセント相同性、配列同一性または相補性は、たとえば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１９８１、２、４８２〜４８９）のアルゴリズムを使用する、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ配列解析パッケージ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ）、ＵＮＩＸ用バージョン８、遺伝学コンピューターグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）によって、初期設定を用いて決定することができる。当業者はパーセント配列同一性またはパーセント配列相同性を計算することができ、必要以上の実験を行わずに、増幅産物を産生させるために核酸の相補鎖の合成をプライミングするその役割におけるプライマーの機能に対する、プライマーの配列同一性の変動の効果を決定することができる。
【００３６】
別の態様によれば、本発明は、少なくとも１つの順方向プライマーおよび少なくとも１つの逆方向プライマーを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチド対を提供し、順方向プライマーは、配列番号１、その断片、誘導体、突然変異、および相補的配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなり、逆方向プライマーは、配列番号２、その断片、誘導体、突然変異、および相補的配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
【００３７】
別の態様によれば、本発明は、本発明の任意の態様による一対のオリゴヌクレオチドおよび少なくとも１つのプローブを含む、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド組を提供する。
【００３８】
プローブは、その５’および３’末端で蛍光色素を用いて標識し得る。５’を標識した蛍光色素の例には、それだけには限定されないが、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、およびシアニン−５（Ｃｙ５）が含まれ得る。３’を標識した蛍光色素の例には、それだけには限定されないが、５−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）およびブラックホールクエンチャー（ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）−１、２、３（ＢＨＱ−１、２、３）が含まれる。
【００３９】
本発明の任意の態様によるオリゴヌクレオチドは、臨床または培養試料のどちらかから結核菌を検出するための方法においても使用してよく、臨床試料は、痰、気管支肺胞洗浄液、胸膜腔内液、腹水／腹膜、脳脊髄液（ＣＳＦ）、膿、糞便、尿、羊水、月経血、末梢血または他の体液、リンパ節、膿または他の吸引液および組織生検から選択され得る。
さらなる態様によれば、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの順方向プライマーおよび配列番号２のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの逆方向プライマーを用いて結核菌複合体から増幅した少なくとも１つの単位複製配列を提供する。
【００４０】
一態様によれば、本発明は、
（ａ）少なくとも１つの生体試料を提供するステップと、
（ｂ）本発明の任意の態様による少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対またはオリゴヌクレオチド組を、生体試料中の少なくとも１つの核酸、ならびに／または生体試料から抽出、精製および／もしくは増幅した少なくとも１つの核酸と接触させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の接触から生じる任意の結合を検出し、結合が検出された場合は結核菌複合体が存在するステップと
を含む、生体試料中の結核菌複合体の存在を検出する少なくとも１つの方法を提供する。
【００４１】
本方法は、試料を、本発明の任意の態様による一対のプライマーと、既知量の、較正用配列を含む較正用ポリヌクレオチドと接触させるステップと、試料中の結核菌からの核酸を一対のプライマーと同時増幅させ、試料中の較正用ポリヌクレオチドからの核酸を一対のプライマーを増幅させて、結核菌を同定する単位複製配列を含む第１の増幅産物および較正用単位複製配列を含む第２の増幅産物を得るステップと、結核菌を同定する単位複製配列および較正用単位複製配列の分子質量および存在量のデータを得るステップであって、結核菌を同定する単位複製配列および較正用単位複製配列の５’および３’末端が一対のプライマーまたはその相補体の配列であるステップと、結核菌を同定する単位複製配列を較正用単位複製配列から、そのそれぞれの分子質量に基づいて区別するステップであって、結核菌を同定する単位複製配列の分子質量により、結核菌が何であるかが示され、結核菌を同定する単位複製配列の存在量のデータおよび較正用単位複製配列の存在量のデータの比較により、試料中の結核菌の量が示されるステップとを含む、試料中の結核菌が何であるかおよびその量の決定に使用し得る。
【００４２】
一態様によれば、本発明は、配列番号１および配列番号２を用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含む、結核菌の核酸を増幅する少なくとも１つの方法を提供する。
【００４３】
本発明の任意の態様による方法は、内部分子（ＩＣ）およびＩＣに特異的なプローブを生体試料と混合するステップをさらに含み得る。ＩＣは配列番号３のヌクレオチド配列を含み得る。ＩＣの使用は結果の正確さを高めてＴＢ診断の効率を改善させ得る。
【００４４】
本発明の任意の態様による方法は、肺結核以外の結核性髄膜炎、腹部結核、胃腸管系結核、泌尿生殖系結核を具体的に診断するためのＰＣＲ増幅に使用し得る。また、ＰＣＲ増幅は、古い曝露を検出せず活性疾患のみを検出し、したがって、診断をより具体的かつ正確にするために使用し得る。
【００４５】
別の態様によれば、本発明は、本発明の任意の態様による少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対またはオリゴヌクレオチド組を含む、結核菌を検出するための少なくとも１つのキットを提供する。
【００４６】
上記は、例示目的のために提供し、本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照することで、より容易に理解されると考えられる。
【実施例】
【００４７】
当分野で知られており、具体的に記載していない標準の分子生物学技法は、一般に、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）の記載に従った。
【００４８】
実施例１
内部対照（ＩＣ）を含有する本発明による方法の診断的正確さの評価。
調査対象母集団
評価は２組の試料で実施した。第１の組は、Ｔａｎ  Ｔｏｃｋ  Ｓｅｎｇ病院（ＴＴＳＨ、シンガポール）での、１年間のＴＢ  ＰＣＲ診断依頼の処理からの４１４個の元々のＤＮＡ抽出物であり、これらは「遡及的」群を表していた。すべてのＤＮＡ抽出物を−８０℃で凍結した。
【００４９】
その後、遡及的群内の３つの部分群からの試料を図１および２に示すように選択した。結核菌複合体（ＭＴＢＣ）について培養陽性であると報告された全ての試料、ＭＴＢＣについて培養陰性であるがＮＴＭについて培養陽性であると報告されたものすべて、ならびにＭＴＢＣおよびＮＴＭのどちらについても培養陰性であったものからのランダム選択を選択した。
【００５０】
第２の試料組は、マイコバクテリアのスメアおよび培養用に処理するスメア陽性および陰性の臨床試料の混合物からアリコートを収集するように頼まれた、この評価に関与していない職員によって前向きに集められた。収集時には培養の結果は知られていなかった。ＰＣＲは、試料または患者の背景の詳細の知識を持たない１人の熟練職員メンバーによって実施した。データは収集後に匿名にした。
【００５１】
試料の処理
呼吸器試料を等体積の１％のＮ−アセチルシステインで液化し、激しく渦攪拌し、１５分間静置した。その後、これらを３０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄した。１．５ｍｌの堆積物のアリコートを−８０℃で保管し、脳脊髄液（ＣＳＦ）および胸膜腔内液の遠心分離していないアリコートならびに０．５ｍｌの無菌的生理食塩水を用いて細かく刻んだ組織／生検物質のアリコートも同様にした。
【００５２】
外部での溶解を用いて、ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ  ｅａｓｙＭＡＧ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯＭＥＲＩＥＵＸ、オランダ）を用いたＤＮＡ抽出を行った。機器が溶解緩衝液を調製した後、５００ｕｌのそれぞれの検体をクラスＩＩ生物学的安全性キャビネット内でそれぞれの容器に加え、上下にピペット操作することによって十分に混合した。その後、４０μｌのＱＩＡＧＥＮプロテイナーゼＫをそれぞれの容器に加え、上下にピペット操作することによって十分に混合した。混合物を室温で３０分間インキュベーションした後、２５μｌの溶出プロトコルを用いた自動抽出のためにＥａｓｙＭａｇ機器に戻した。溶出液は−８０℃で保管した。
【００５３】
プライマー
増幅に使用した一組のプライマーは、ＩＳ６１１０、結核菌のＩＳ様要素をコードしている遺伝子配列に由来するものであった（ＮＣＢＩ受託番号Ｘ１７３４８、配列番号４）。順方向プライマー（Ｕ）および逆方向プライマー（Ｌ）の配列は、ＴＢ１４５Ｕ：（５’−３’）ＣＧＡＴＣＧＣＴＧＡＴＣＣＧＧＣＣＡＣＡ（配列番号１）およびＴＢ１４５Ｌ：（５’−３’）ＧＣＧＴＣＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧＧＣＣＡＣＧＴＡＧＧ（配列番号２）である。
【００５４】
内部対照（ＩＣ）を反応混合物中に混合して、偽陰性結果を検出するＰＣＲの性能を監視した。このＩＣ分子は、上に示したＴＢと同じプライマー組によって同時増幅される。このＩＣ分子の内部部分は人工的に設計されており、天然に存在しない。ＩＣ分子の配列は、ＴＢ１４５ＩＣ：（５’−３’）ＣＴＧＡＴＣＣＧＧＣＣＡＣＡＴＡＴＣＧＣＧＴＴＴＡＴＧＣＧＡＧＧＴＣＧＧＧＴＧＧＧＣＧＧＧＴＣＧＴＴＡＧＴＴＴＣＧＴＴＴＴＧＧＧＣＣＴＡＣＧＴＧＧＣＣＴＴＴＧＴＣＡＣ（配列番号３）である。
【００５５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＰＣＲは、Ｆｉｎｎｚｙｍｅ  Ｐｈｉｒｅ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号Ｆ−１２０）を用いて、５μｌのＤＮＡ試料、１００個のＩＣ分子のコピー、最終濃度５％の１．２５μｌのホルムアミドおよび最終濃度０．３μＭのそれぞれのプライマーを含有する２５μｌの反応体積中、サーマルサイクラー内で行った。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ−ｅｐ−ｇｒａｄｉｅｎｔ−Ｓ（ドイツＨａｍｂｕｒｇ）を、以下のステップおよび条件を用いて使用した：９８℃で６５秒間の初期活性化、次いで、４０サイクルの、９８℃で１７秒間の変性、６９℃で２０秒間のアニーリング、および７２℃で１５秒間の伸長、ならびに７２℃で１分間の最終伸長。増幅後、ＰＣＲ産物を慣用のゲル電気泳動によって分析した。ＰＣＲアッセイはシンガポールの分子細胞生物学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）で設計および最適化した。
【００５６】
利用可能な最も高感度な方法であるために固体および液体系の培地の両方を用いて外部ＴＢ研究所によって報告されたように、感度分析用の参照標準は「ＭＴＢＣ培養陽性」であると定義された。試料を培養陰性にする、治療中の患者から提出された試料は、分析を誤った方向に導き、偽陽性率を高く推定してしまうため、特異度の分析では、ＭＴＢＣ培養は単一の参照標準として許容できない。たとえば、別の最近の試料がＭＴＢＣ培養陽性として報告された患者からのＭＴＢＣ培養陰性試料を持つことが可能である。分析目的のためにこれらを真の陰性として処理することは明らかに役に立たないため、これらを分析から排除したが、結果中に明白に同定かつ提示した。
【００５７】
ＰＣＲ陽性であるが、２カ月以内にいかなるＭＴＢＣ培養陽性試料も有さないと判明した試料を再抽出し、繰返しＰＣＲに供した。特異度を確認するためにＰＣＲ産物を配列決定した。配列決定は外部研究所によって行い、ＮＣＢＩウェブサイト上のＢＬＡＳＴ分析に供した。繰返しＰＣＲが陽性であり、配列が「ＭＴＢＣ」に一致した場合は、これらの試料の結果は偽陽性とみなされず、したがって特異度の分析から排除した。同様に、これらは感度の分析に含めなかった。
【００５８】
統計的分析はウェブベースのプログラム（ｗｗｗ．ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｓｋｉｌｌｓ．ｃｏｍ／ｓｉｓａ／ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ／ｄｉａｇｎｏｓ．ｈｔｍ）で行った。信頼区間は第１組の「臨床依頼されたＰＣＲ試料」でのみ計算した。これらは、１００％の感度の場合は計算できなかった。
【００５９】
参照の標準方法は、ルーチン的な診断作業の流れに従って試料採取の２４〜７２時間以内に外部研究所で行った、ルーチン的なマイコバクテリア培養であった。
【００６０】
第１の組（臨床ＰＣＲ依頼からの試料）の詳細および結果を図１に示し、図２にＭＴＢＣ培養陽性群を検体種類ごとにさらに提示する。第２の組（前向き収集した試料）を図３に提示する。感度の分析を表１に示し、特異度を表２に示す。真陽性であると指示されていたが明らかな偽陽性ＰＣＲ結果を有する６個の試料の詳細を表３に示す。４個は、１週間（２例）または６週間（２例）以内に採取した他の試料から単離された、ＭＴＢＣを有する患者からのものであった。２個のＰＣＲ陽性試料は、いかなる他の試料もＭＴＢＣ培養陽性でなかった患者からのものであった。これらは繰り返してＰＣＲ陽性であり、それぞれの場合のＰＣＲ産物の配列は、ｇｅｎｅｂａｎｋ（ＮＣＢＩデータベース）上の結核菌の数々の例を用いたＢＬＡＳＴ分析によって１００％一致していた（１４５／１４５個の塩基）。これらの患者は過去にＴＢに罹患していたか、または試料が汚染していた可能性があるが、いずれにせよ、ＴＢのＤＮＡが存在していた。１年間にわたる診断的ＴＢ  ＰＣＲを用いて陽性であると報告されたすべての試料は、「培養陽性」でもあったため、ＰＣＲシステムは「クリーン」であり得る。
【表１】
2012531908.tif 000003
表１．臨床依頼されたＰＣＲ（第１組）および前向きに集めたコレクション（第２組）の、肺および非肺試料における、ＭＴＢＣ培養と比較したＰＣＲの感度。
【００６１】
【表２】
2012531908.tif 000004
表２．臨床依頼されたＰＣＲ（第１組）および前向きに集めたコレクション（第２組）の試料における、培養と比較したＰＣＲの特異度。排除した試料に注意されたい。
【００６２】
【表３】
2012531908.tif 000005
表３．ＭＴＢＣ培養陰性であったが、本発明者らは真陽性であると考える６個のＰＣＲ陽性試料の詳細
【００６３】
臨床依頼されたＰＣＲ試料（第１組）では、スメアおよび培養によって陽性の試料の感度は高く、１００％であった。スメア陰性であるが培養陽性の試料では、これは、非肺および肺の試料でそれぞれ６０％から７５％と変動していた。前向き採取した試料（第２組）のデータは、「臨床」依頼されたＰＣＲを反映していなかったためより良好であり、また、感度データは、元々ＰＣＲを臨床依頼された第１組中の試料よりも正確性が低かった。この臨床依頼された群では、スメア陽性およびスメア陰性試料のどちらの全体的な感度も、前向き群である第２組の９６％と比較して、８５％であった。これは、臨床依頼された試料において性能を評価することの重要性を強調している。
【００６４】
特異度は真陰性の定義に依存する。６個の試料はＰＣＲ陽性であるがＭＴＢＣ培養陰性であった（表３）。これらは真陽性であり偽陽性でない可能性があるため、これらはすべて特異度分析から排除した。４個は、以前の試料から培養した、ＭＴＢＣを有する患者からのものであった。残りの２個は繰り返してＰＣＲ陽性であり、ＰＣＲ産物は配列決定によってＭＴＢＣであることが示された。これら６個を排除することで１００％の特異度が得られる。
【００６５】
結果によりスメア陽性試料において１００％の感度が示され、スメア陰性からは７１％（９５％ＣＩ＝５２〜９１％）が得られた。ＩＣは、第１組中の１０個の試料において阻害を検出したため、有用であると立証された。これらを１０倍希釈で再試験し、４個がＰＣＲ陽性であった。この８．７％（１０／１１５）の阻害率は、<１％の阻害を示した以前の市販のアッセイと比較して、予想よりも高かった。これは、良好なバランスのＩＣの証拠である可能性があり、より多くの真陽性を見つけることに寄与する。
【００６６】
本研究は、本アッセイの性能が良好である可能性があり、市販のアッセイを顕著に超える性能であることを示している。
【００６７】
実施例２
実施例１に言及したＰＣＲプロトコルを使用し、これにより、よりクリーンな結果が得られ、内蔵の内部対照（ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）からの利点が得られた。本プロトコルでは、アッセイの応答時間を顕著に短縮する様々な酵素を使用した。
【００６８】
プライマーおよびＩＣ分子
実施例１で言及したプライマーおよびＩＣ分子を使用した。プライマーは、結核菌ＩＳ６１１０要素および直接反復領域、株１９１、ＮＣＢＩ受託番号Ｙ１４０４８の配列を用いて設計した。
【００６９】
ＰＣＲ
ＰＣＲは、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  Ｐｈｉｒｅ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号Ｆ−１２０）を用いて、５μｌのＤＮＡ試料、１００個のＩＣ分子のコピーおよび最終濃度０．６μＭのそれぞれのプライマーを含有する２５μｌの反応体積中、サーマルサイクラー内で行い、本研究では、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ−ｅｐ−ｇｒａｄｉｅｎｔ−Ｓ（ドイツＨａｍｂｕｒｇ）を、以下のステップおよび条件を用いて使用した：９８℃で６５秒間の初期活性化、次いで、４０サイクルの、９８℃で１７秒間の変性、６９℃で２０秒間のアニーリング、および７２℃で１５秒間の伸長、ならびに７２℃で１分間の最終伸長。増幅後、ＰＣＲ産物を慣用のゲル電気泳動によって分析した。
【００７０】
ＰＣＲ添加剤
臨床評価では、顕著な非特異的増幅産物が観察された。ＰＣＲ反応の収率、特異度および一貫性を増加させるために利用可能な様々な添加剤および増強剤を試験した。特に、非特異的なプライミングを排除するために４つのＰＣＲ添加剤、すなわち、５％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、５％のホルムアミド、１Ｍのベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン）および１００ｍＭのＴＭＡＣ（テトラメチルアンモニウムクロライド）を試験した。図４に示すように、５％のホルムアミドが最良の結果を与えた。１００ｍＭのＴＭＡＣを加えることで生成物は検出されなかったため、データは示していない。
【００７１】
ホルムアミドは、ＴＢ  ＤＮＡクローンを鋳型として使用して、１〜１０％の最終濃度の範囲にわたって試験した。図５に示すように、ホルムアミドを１〜８％の濃度で加えることにで、添加剤の非存在下と比較してより多くの生成物が得られた。図６に示すように、臨床試料で試験した場合は、５％の最終濃度のホルムアミドは、非特異的プライミングを排除することにおいて３％よりも良好であった。
【００７２】
参考文献：
Ｔｈｉｅｒｒｙ，Ｄ．、Ｍ．Ｄ．Ｃａｖｅ、Ｋ．Ｄ．Ｅｉｓｅｎａｃｈ、Ｊ．Ｔ．Ｃｒａｗｆｏｒｄ、Ｊ．Ｈ．Ｂａｔｅｓ、Ｂ．Ｇｉｃｑｕｅｌ、およびＪ．Ｌ．Ｇｕｅｓｄｏｎ．１９９０．ＩＳ６１１０、ａｎ  ＩＳ−ｌｉｋｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１８：１８８。
Ｕｐｄａｔｅｄ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．ＭＭＷＲ、２００９年１月１６日／第５８巻／第１号／頁７〜１０。
Ｅｉｓｅｎａｃｈ，Ｋ．Ｄ．、Ｍ．Ｄ．Ｃａｖｅ、Ｊ．Ｈ．Ｂａｔｅｓ、およびＪ．Ｔ．Ｃｒａｗｆｏｒｄ．１９９０．Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、１６１：９７７〜８１。
Ａｎｔｏｎｉｏ  Ａｃｅｔｉ、ａ  Ｓｔｅｆａｎｉａ  Ｚａｎｅｔｔｉ、ｂ  Ｍａｒｉａ  Ｓ  Ｍｕｒａ、ａ  Ｌｅｏｎａｒｄｏ  Ａ  Ｓｅｃｈｉ、ｂ  Ｆｒａｎｃｏ  Ｔｕｒｒｉｎｉ、ｃ  Ｆｒａｎｃａ  Ｓａｂａ、ａ  Ｓｅｒｇｉｏ  Ｂａｂｕｄｉｅｒｉ、ａ  Ｆｒａｎｃａ  Ｍａｎｎｕ、ｃ  Ｇｉｏｖａｎｎｉ  Ｆａｄｄａｄ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｕｒｉｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ．Ｔｈｏｒａｘ、１９９９、５４：１４５〜１４６。
Ｇａｂｒｉｅｌａ  Ｔｏｒｒｅａ、Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  Ｖａｎ  ｄｅ  Ｐｅｒｒｅ、Ｍａｒｔｉａｌ  Ｏｕｅｄｒａｏｇｏ、Ａｌａｉｎ  Ｚｏｕｇｂａ、Ａｄｒｉａｎ  Ｓａｗａｄｏｇｏ、Ｂｅｎｏｙｔ  Ｄｉｎｇｔｏｕｍｄａ、Ｂｏｕｋａｒｉ  Ｄｉａｌｌｏ、Ｍａｒｉｅ  Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｄｅｆｅｒ、ｌｓｓｉａｋａ  Ｓｏｍｂｉｅ、Ｓｔｅｆａｎｉａ  ＺａｎｅｔｔｉおよびＬｅｏｎａｒｄｏ  Ａ．Ｓｅｃｈｉ．ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ  ｏｆ  ＨＩＶ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ａｎｄ  ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｕｒｋｉｎａ  Ｆａｓｏ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００５、５４、３９〜４４。
Ｉｒｉｎａ  Ｂｏｔｅｚａｔｕ、Ｏｌ’ｇａ  Ｓｅｒｄｙｕｋ、Ｇａｌｉｎａ  Ｐｏｔａｐｏｖａ、Ｖａｌｅｒｙ  Ｓｈｅｌｅｐｏｖ、Ｒａｉｓａ  Ａｌｅｃｈｉｎａ、Ｙｕｒｉｙ  Ｍｏｌｙａｋａ、Ｖｉｔａｌｉｙ  Ａｎａｎ’ｅｖ、Ｉｇｏｒ  Ｂａｚｉｎ、Ａｕｇｕｓｔ  Ｇａｒｉｎ、Ｍｅｈｔｉ  Ｎａｒｉｍａｎｏｖ、Ｖａｓｉｌｉｙ  Ｋｎｙｓｈ、Ｈｏｖｓｅｐ  Ｍｅｌｋｏｎｙａｎ、Ｓａｍｕｉｌ  Ｕｍａｎｓｋｙ、およびＡｎａｔｏｌｙ  Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｅｘｃｒｅｔｅｄ  ｉｎ  Ｕｒｉｎｅ：Ａ  Ｎｅｗ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｙｉｎｇ  ｉｎ  ａｎ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０００、４６：８、１０７８〜１０８４。
Ｍｅｎｇｊｕｎ  Ｗａｎｇ、Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｍ．Ｂｌｏｃｋ、Ｌａｕｒａ  Ｓｔｅｅｌ、Ｄｅａｎ  Ｅ．Ｂｒｅｎｎｅｒ、ａｎｄ  Ｙｉｎｇ−Ｈｓｉｕ  Ｓｕ．Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｍｕｔａｔｅｄ  ｋ−ｒａｓ  ＤＮＡ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４、５０、第１号、２１１〜２１３。
ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）
2012531908.tif 000006
2012531908.tif 000007
【図１】
2012531908.tif 000008
【図２】
2012531908.tif 000009
【図３】
2012531908.tif 000010
【図４】
2012531908.tif 000011
【図５】
2012531908.tif 000012
【図６】
2012531908.tif 000013
【配列表】
2012531908000001.app
【国際調査報告】
2012531908.tif 000014
2012531908.tif 000015