(57)【要約】  本発明によれば、シグナルジェネレーター（例えば、常磁性標識、放射性核種又は発蛍光団）で標識されたポリペプチドであるＰＤＧＦ−Ｒβイメージング剤であって、ＰＤＧＦＲ−βと特異的に結合するイメージング剤が提供される。また、かかるイメージング剤を用いるインビボイメージング方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナルジェネレーターで標識された配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又はその保存的変異体のいずれかのポリペプチドであって、ＰＤＧＦＲ−βと特異的に結合するポリペプチドを含んでなるＰＤＧＦ−Ｒβイメージング剤。
【請求項２】
ポリペプチドがＡ７７２細胞、Ｕ８７細胞又はＭ２３１細胞によって発現されるＰＤＧＦＲ−βに対して１０ｎＭ以上の結合親和性を有する、請求項１記載のイメージング剤。
【請求項３】
ポリペプチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９から選択される２以上のアミノ酸配列を含むことで多価ポリペプチドを形成する、請求項１又は請求項２記載のイメージング剤。
【請求項４】
多価ポリペプチドが９０％より大きい配列同一性を有する２つの反復アミノ酸配列を含むことで二価均質ポリペプチドを生成する、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のイメージング剤。
【請求項５】
シグナルジェネレーターが常磁性標識、放射性核種又は発蛍光団からなる、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のイメージング剤。
【請求項６】
シグナルジェネレーターが放射性核種であり、フッ素、ヨウ素、テクネチウム、ガリウム及びガドリニウムから選択される、請求項５記載のイメージング剤。
【請求項７】
フッ素が18Ｆからなる、請求項６記載のイメージング剤。
【請求項８】
18Ｆがアミノキシリンカーを介してポリペプチドに結合される、請求項６記載のイメージング剤。
【請求項９】
18ＦがポリペプチドのＮ末端にあるアミノキシリンカーを介してポリペプチドに結合される、請求項６記載のイメージング剤。
【請求項１０】
ヨウ素が123Ｉからなる、請求項６記載のイメージング剤。
【請求項１１】
123Ｉがアミノキシリンカーを介してポリペプチドに結合される、請求項１０記載のイメージング剤。
【請求項１２】
123ＩがポリペプチドのＮ末端にあるアミノキシリンカーを介してポリペプチドに結合される、請求項１０記載のイメージング剤。
【請求項１３】
テクネチウムが99mＴｃからなる、請求項１０記載のイメージング剤。
【請求項１４】
99mＴｃがジアミンジオキシムキレーターを介してポリペプチドに結合される、請求項１３記載のイメージング剤。
【請求項１５】
ジアミンジオキシムキレーターがｃＰｎ２１６からなる、請求項１４記載のイメージング剤。
【請求項１６】
99mＴｃがポリペプチドのＮ末端にあるジアミンジオキシムキレーターを介してポリペプチドに結合される、請求項１４記載のイメージング剤。
【請求項１７】
シグナルジェネレーターが、157Ｇｄ、55Ｍｎ、162Ｄｙ、52Ｃｒ及び56Ｆｅから選択される常磁性標識である、請求項５記載のイメージング剤。
【請求項１８】
常磁性標識が、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ及びＤＴＰＡから選択されるキレーターを介してポリペプチドに結合される、請求項１７記載のイメージング剤。
【請求項１９】
放射性核種がＧｄ−１５３、Ｇａ−６７、Ｃｏ−５５、Ｃｏ−５７、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｚｒ−８９又はＹ−８６からなる、請求項６記載のイメージング剤。
【請求項２０】
放射性核種標識が、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ及びＤＴＰＡから選択されるキレーターを介してポリペプチドに結合される、請求項１９記載のイメージング剤。
【請求項２１】
哺乳動物におけるＰＤＧＦ−Ｒβ関連疾患状態のイメージングを行う方法において、シグナルジェネレーターで標識された配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又はその保存的変異体のいずれかのポリペプチドであって、ＰＤＧＦＲ−βと特異的に結合するポリペプチドを哺乳動物中に導入する段階、該薬剤を罹患組織に移動させる段階、及び疾患状態を使用しかつ任意には疾患状態を管理しながら罹患組織のイメージングを行う段階を含んでなる方法。
【請求項２２】
哺乳動物がヒトである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ＰＤＧＦ−Ｒβ関連疾患状態が肝線維症、肝硬変又は肝機能異常或いはこれらの組合せである、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
イメージング方法が、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＭＲＩ、放射線イメージング及び光学イメージングから選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
さらに、イメージング段階の前、後又は前後に哺乳動物を処置する段階、及びその結果を用いて疾患状態を管理する段階を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
該薬剤が約６〜約８のｐＨを有する薬学的に許容される溶液中に分散している、請求項２１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的にはＰＤＧＦ−Ｒβに結合する薬剤に関する。さらに詳しくは、本発明はＰＤＧＦ−Ｒβに結合する標識薬剤及びかかる薬剤を用いる検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＤＧＦ−Ｒβは、線維症性及び腫瘍形成性疾患に関係するレセプターチロシンキナーゼであり、潜在的に有用な分子イメージング標的となっている。インビボ又はインビトロでＰＤＧＦ−Ｒβを定性的又は定量的に可視化できれば、研究者達及び臨床医達には重要な診断ツール及び治療ツールが提供されることになる。例えば、肝線維症、肝硬変又は肝機能異常のような肝臓関連疾患を目視で同定することができ、またかかる状態を有する患者においてＰＤＧＦ−Ｒβの発現パターンをインビボで測定することができれば、臨床医達及び研究者達にとって肝臓関連疾患状態を診断、予後判定及び治療する際の助けとなろう。
【０００３】
天然のブドウ球菌プロテインＡは、ＩｇＧのＦｃ領域に結合する三重らせん構造を形成するドメインを含んでいる。ブドウ球菌プロテインＡのＢドメインから導かれる５８残基のポリペプチドのＺドメインは、結合力を保有している。
【０００４】
プロテインＡのＺドメインから導かれるある種のポリペプチドは、ループによって連結された３本のαらせんからなる足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を含んでいる。これらのらせんの２本上に位置する特定の残基は、ＩｇＧのＦｃ部分に対する結合部位をなしている。タンパク質工学の分野で使用される用語に従えば、結合表面は足場上に位置する表面である。したがって、ここでいう足場は三重らせんバンドルタンパク質ドメインである。らせん１及び２上に位置する１３の表面に露出したアミノ酸残基を置換することで、ＩｇＧのＦｃ部分と結合する能力を他の分子との結合に置き換えることにより、別の結合剤分子が生み出された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
国際公開第２００９／０７７５６９号パンフレット
【発明の概要】
【０００６】
本明細書中には、シグナルジェネレーター（例えば、常磁性標識、放射性核種又は発蛍光団）で標識された配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又はその保存的変異体のいずれかのポリペプチドであって、ＰＤＧＦＲ−βと特異的に結合するポリペプチドを含んでなるＰＤＧＦ−Ｒβイメージング剤が提供される。若干の実施形態では、ポリペプチドはＡ７７２細胞、Ｕ８７細胞又はＭ２３１細胞によって発現されるＰＤＧＦＲ−βに対して１０ｎＭ以上の結合親和性を有する。
【０００７】
若干の実施形態では、ポリペプチドは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９から選択される２以上のアミノ酸配列を含むことで多価ポリペプチドを形成し得る。多価ポリペプチドは、９０％より大きい配列同一性を有する２つの反復アミノ酸配列を含むことで二価均質ポリペプチドを生成する。
【０００８】
若干の実施形態では、シグナルジェネレーターは、フッ素（例えば、Ｆ−１８）、ヨウ素（Ｉ−１２３）、テクネチウム（例えば、Ｔｃ−９９ｍ）、ガリウム及びガドリニウムから選択される放射性核種であり得る。若干の実施形態では、Ｆ−１８又はＩ−１２３はアミノキシリンカーを介してポリペプチドに結合される。若干の実施形態では、Ｆ−１８又はＩ−１２３はポリペプチドのＮ末端にあるアミノキシリンカーを介してポリペプチドに結合される。
【０００９】
若干の実施形態では、テクネチウムはＣＮＰ２１６のようなＰＮリンカーを介してポリペプチドに結合し得る。別法として、Ｔｃ−９９ｍはポリペプチドのＮ末端にあるＰＮリンカーを介してポリペプチドに結合し得る。
【００１０】
常磁性標識はＧｄ−１５７、Ｍｎ−５５、Ｄｙ−１６２、Ｃｒ−５２又はＦｅ−５６からなり得ると共に、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ及びＤＴＰＡから選択されるキレーターを介してポリペプチドに結合し得る。
【００１１】
放射性標識はＧｄ−１５３又はＧａ−６７からなり得ると共に、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ及びＤＴＰＡから選択されるキレーターを介してポリペプチドに結合し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、抗ＰＤＧＦ−Ｒβポリペプチドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を示す。図１ＡはヒトＰＤＧＦ−Ｒβに対するＺ２４６５（配列番号１６）の結合を示す。図１ＢはマウスＰＤＧＦ−Ｒβに対するＺ２４６５（配列番号１６）の結合を示す。
【図２】図２は、ヒトＰＤＧＦ−Ｒα（ｈＰＤＧＦ−Ｒα）に対するＺ２４６５（配列番号１６）のＳＰＲを示す。
【図３】図３は、４つの細胞タイプ、即ちＡ１７２（ヒト脳膠芽腫、陽性対照）、Ｕ８７（ヒト脳膠芽腫）、Ｍ２３１（ヒト乳腺癌）及びＨＴ２９（ヒト結腸直腸腺癌、陰性対照）に対する抗ヒトＰＤＧＦ−Ｒβ抗体についての定性的フローサイトメトリーの結果を示す。
【図４】図４は、腫瘍タイプのパネルに対するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図５】図５は、Ｕ８７（高ＰＤＧＦ−Ｒβ発現）、Ｍ２３１（中／低ＰＤＧＦ−Ｒβ発現）及びＨＴ２９（無ＰＤＧＦ−Ｒβ発現）腫瘍において抗ヒトＰＤＧＦ−Ｒβを用いたインビボ光学アッセイを示す。
【図６】図６は、標識Ｚ２４６５（配列番号１６）のＨＰＬＣガンマクロマトグラムを示す。図６Ａのクロマトグラムは単量体バージョンを示しており、図６Ｂは二量体バージョン（Ｚ２４６５）2（配列番号１９）を示す。
【図７】図７は、血液及び腫瘍組織におけるＺ２４６５（配列番号１６）のインビボ生体分布試験を示す。パネル７ＡはＵ８７腫瘍担持マウスにおけるＺ２４６５（配列番号１６）の分布を示す。パネル７ＢはＨＴ２９腫瘍担持マウスにおけるＺ２４６５（配列番号１６）の分布を示す。パネル７ＣはＵ８７腫瘍担持マウスにおけるＺｔａｑ（配列番号１０）の分布を示す。そして、パネル７Ｄはパネル７Ａ〜７Ｃに示した一連の実験に関する腫瘍：血液比を示す。
【図８】図８は、Ｚ２４６５（配列番号１６）のクリアランスパターンを示す。パネル８Ａは、肝臓、腎臓、脾臓、膀胱／尿及び腸におけるＺ２４６５（配列番号１６）の％ＩＤ［％注射量］を示す。パネル８Ｂは、肝臓、腎臓及び脾臓に関する％ＩＤ／ｇ［％注射量／組織１グラム］を示す。
【図９】図９Ａは、Ｕ８７腫瘍細胞株を使用した、５種のポリペプチド、即ちＺｔａｑ（配列番号１０）、Ｚ２４６５（配列番号１６）、Ｚ２４７７（配列番号２５）、Ｚ２４８３（配列番号１８）及びＺ２５１６（配列番号１７）に関する注射後２時間での腫瘍：血液比を示す。図９Ｂは、Ｕ８７腫瘍細胞株を使用した、５種のポリペプチドに関する注射後２時間での腫瘍取込み量を示す。
【図１０】図１０は、Ｚ２４６５ポリペプチドの一価及び二価バージョン（配列番号１６及び配列番号１９）に関する原子価比較を示す。図１０Ａは、血液及び腫瘍細胞中における二価（Ｚ２４６５）2（配列番号１９）のレベルを経時的に示す。図１０Ｂは、血液及び腫瘍細胞中における一価Ｚ２４６５（配列番号１６）のレベルを経時的に示す。そして、図１０Ｃは一価（配列番号１６）及び二価（配列番号１９）の化学種の比較を示す。
【図１１】図１１は、高発現（Ｕ８７）及び中／低発現（Ｍ２３１）腫瘍における腫瘍：血液比及び％ＩＤ／ｇの比較を示す。
【図１２】図１２は、高発現（Ｕ８７）及び中／低発現（Ｍ２３１）腫瘍を使用した、一価ポリペプチド（配列番号１６）及び二価ポリペプチド（配列番号１９）に関する注射後２時間での腫瘍：血液比を示す。
【図１３】図１３は、３つの細胞株（即ち、ＨＴ２９、Ｍ２３１及びＵ８７）におけるＺｔａｑ（配列番号１０）及びＺ１９８２（配列番号１４）の腫瘍：血液比を示す。
【図１４】図１４は、Ｍａｌ−ｃＰｎ２１６リンカーの化学構造を示す。
【図１５】図１５は、Ｍａｌ−ＰＥＧ−ｃＰｎ２１６の化学構造を示す。
【図１６】図１６は、ｃＰｎ２１６標識Ｚ０２４６５（配列番号２３）の逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製を示す。
【図１７】図１７は、Ｔｃ−９９ｍによるｃＰｎ２１６標識Ｚ２４６５（配列番号１６）の標識に関する濃度依存性を示す。
【図１８】図１８は、Ｔｃ−９９ｍ標識Ｚ２４６５（配列番号１６）及びｃＰｎ２１６標識Ｚ０２４６５（配列番号２３）に関する、サイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣによる保持時間の相似性を示す。
【図１９】図１９は、ｃＰｎ２１６を介してＴｃ−９９ｍで標識されたＺ０２４６５（配列番号２３）に関する、Ｕ８７及びＨＴ２９細胞での腫瘍取込みを示す。
【図２０】図２０は、ｃＰｎ２１６を介してＴｃ−９９ｍで標識されたＺ０２４６５（配列番号２３）の、肝臓及び膀胱／尿におけるクリアランスプロファイル（％ＩＤ、％注射量）を示す。
【図２１】図２１は、Ｚ０３３５８（配列番号２４）がＺ０２４６５（配列番号２３）と同様な生体分布パターンを実証することを示す。パネル２１Ａは腫瘍：血液比、腫瘍中の％ＩＤ／ｇ、及び肝臓中の％ＩＤ／ｇを示しており、パネル２１Ｂも同じモノマーを示すが、さらに血液中の％ＩＤ／ｇを含んでいる。
【図２２】図２２は、ＰＥＧ4−ｃＰｎ２１６を介してＴｃ−９９ｍで標識されたＺ０２４６５（配列番号２３）に関する、Ｕ８７及びＨＴ２９細胞での腫瘍取込みを示す。
【図２３】図２３は、マレイミド−アミノキシ（Ｍａｌ−ＡＯ）リンカーの化学構造を示す。パネルＡはｔｅｒｔ−ブチル−２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−１−イル）エチルアミノ）−２−オキソエトキシカルバメートの化学構造を示しており、パネルＢは２−（アミノキシ）−Ｎ−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−１−イル）エチル）アセトアミド塩酸塩の化学構造を示す。
【図２４】図２４は、18Ｆで標識されたＺ０２４６５（配列番号２３）を示す。
【図２５】図２５は、Ｕ８７腫瘍担持動物における、Ｆ−１８で標識されたＺ０２４６５（配列番号２３）ポリペプチドの％ＩＤ／ｇ（パネルＡ）及び腫瘍：血液比（パネルＢ）を示す。
【図２６】図２６は、パネルＡには血液、腫瘍、膀胱／尿、肝臓、腎臓、脾臓及び尾におけるＦ−１８標識Ｚ０２４６５（配列番号２３）のクリアランスプロファイル（％ＩＤ）を示しており、パネルＢには血液、腫瘍、肝臓、腎臓及び脾臓における％ＩＤ／ｇを示す。
【図２７】図２７は、粗Ｇｄ−１５３−ＤＯＴＡ標識Ｚ２４６５（配列番号１６）に関するγトレースＨＰＬＣを示す。
【図２８】図２８は、精製Ｇｄ−１５３−ＤＯＴＡ標識Ｚ２４６５（配列番号１６）に関するγトレースＨＰＬＣを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
参照付きの「ポリペプチド」という用語は、一般に、ポリペプチドの結合界面残基を標的との結合が可能になるように適切に配置するための三次元構造を与えるポリペプチドの残基をいう。同じトポロジー（ｚドメインの三重らせん折りたたみ）をもって結合部位及び結合活性を保存する配列はいずれも、そのポリペプチドに基づいている。
【００１４】
「脂肪族アミノ酸」とは、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸をいう。遺伝的にコード化された脂肪族アミノ酸には、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）及びＩｌｅ（Ｉ）がある。
【００１５】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体をいう。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってエンコードされるもの、並びに以後に修飾されたこれらのアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、Ｏ−ホスホセリン、ホスホトレオニン及びホスホチロシン）である。本明細書中に定義されるアミノ酸のカテゴリーは、互いに排他的ではない。したがって、２以上の物理化学的性質を示す側鎖を有するアミノ酸は複数のカテゴリーに含めることができる。例えば、例えば、極性置換基でさらに置換された芳香族部分を有するアミノ酸側鎖（例えば、Ｔｙｒ（Ｙ））は芳香族疎水性及び極性又は親水性の両方を示すことがあり、したがって芳香族カテゴリー及び極性カテゴリーの両方に含めることができる。
【００１６】
「酸性アミノ酸」とは、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸をいう。酸性アミノ酸は、通例、水素イオンの喪失のために生理的ｐＨで負に帯電した側鎖を有する。遺伝的にコード化された酸性アミノ酸には、Ｇｌｕ（Ｅ）及びＡｓｐ（Ｄ）がある。
【００１７】
「アミノ酸類似体」とは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（即ち、水素、カルボキシル基及びアミノ基に結合した炭素）を有するが、通常でないＲ基を含む化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド又はメチオニンメチルスルホニウム）をいう。かかる類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾ペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。
【００１８】
「芳香族アミノ酸」とは、少なくとも１つの芳香環またはヘテロ芳香環を有する側鎖を持つ疎水性アミノ酸をいう。芳香環又はヘテロ芳香環は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＮ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ2、−ＮＯ、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲなど（式中、各Ｒは独立に（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、置換（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルケニル、置換（Ｃ1〜Ｃ6）アルケニル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキニル、置換（Ｃ1〜Ｃ6）アルキニル、（Ｃ5〜Ｃ20）アリール、置換（Ｃ5〜Ｃ20）アリール、（Ｃ6〜Ｃ26）アルカリール、置換（Ｃ6〜Ｃ26）アルカリール、５〜２０員へテロアリール、置換５〜２０員へテロアリール、６〜２６員アルクヘテロアリール又は置換６〜２６員アルクヘテロアリールである。）のような１以上の置換基を含み得る。遺伝的にコード化された芳香族アミノ酸には、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）及びＴｒｐ（Ｗ）がある。
【００１９】
「塩基性アミノ酸」とは、７より大きい側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸をいう。塩基性アミノ酸は、通例、ヒドロニウムイオンとの会合のために生理的ｐＨで正に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコード化された塩基性アミノ酸には、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）及びＬｙｓ（Ｋ）がある。
【００２０】
本明細書中で使用する「結合」という用語は、所定の標的又は密接に関連する標的以外の非特異的標的（例えば、ＢＳＡ又はカゼイン）と結合するための親和性より２倍以上高い親和性をもって標的と優先的に結合するポリペプチドの能力をいう。本明細書中に示されるポリペプチドは、約５×１０-5Ｍ未満、さらに好ましくは約２×１０-7Ｍ未満、最も好ましくは約１×１０-8Ｍ未満のＫＤ値を有する親和性をもってそれぞれの標的と結合する。同様に、「特異的結合」とは、約２×１０-7Ｍ未満のＫＤ値を有する親和性をもって所定の抗原と結合するポリペプチドの性質をいう。
【００２１】
「結合界面残基」という用語は標的結合に関与するポリペプチドの残基をいい、これらは表１及び表２に示す代表的なポリペプチド中に例示される。
【００２２】
本明細書中で使用する「血中半減期」という語句は、排出が一次的又は擬一次的である場合、薬剤の血漿中濃度が１／２だけ低下するのに要する時間をいう。多重減衰相の場合、「血中半減期」という用語は、（相異なる相の減衰半減期が類似していれば）見掛けの半減期をいい、相異なる半減期が類似していなければ（クリアランスの大部分を説明する）優勢な半減期をいう。
【００２３】
本明細書中で使用する「保存的変異体」という用語は、アミノ酸配列及び核酸配列の両方に適用される。特定のアミノ酸配列に関しては、保存的変異体とは、若干のアミノ酸が同じカテゴリー（例えば、上記に概述したような酸性、塩基性、極性、疎水性、親水性、芳香族及び脂肪族）に由来する類似のアミノ酸で置き換えられている配列をいう。
【００２４】
本明細書中で使用する「疾患管理」という用語は、ＰＤＧＦＲ−βの発現又は調節不全に関連する疾患状態の医学的処置であって、本発明の薬剤を用いて容易化し得るものをいう。疾患管理には、ＰＤＧＦＲ−β関連疾患に罹患した被験体の治療経過に関して医学専門家が行う判断が含まれ、これらの判断には特に限定されないが治療の成否、罹患組織の状態及び／又は化学的又は外科的介入の適用の有無がある。外科的又は他の非全身的介入が適用される場合、疾患管理には罹患組織の空間的位置決定も含まれる。
【００２５】
本明細書中で使用する「発蛍光団」という用語は、特定波長の光への暴露によって励起された場合に（異なる波長の）光を発生する化合物をいう。発蛍光団はその発光プロファイル又は「色」を用いて記述できる。緑色の発蛍光団（例えば、Ｃｙ３、ＦＩＴＣ及びＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ）は、一般に５１５〜５４０ナノメートルの範囲内の波長での発光によって特徴づけることができる。赤色の発蛍光団（例えば、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙ５及びテトラメチルローダミン）は、一般に５９０〜６９０ナノメートルの範囲内の波長での発光によって特徴づけることができる。発蛍光団の例には、特に限定されないが、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、アクリジン、アクリジン及びアクリジンイソチオシアネートの誘導体、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５−ジスルホネート（Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ  ＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ、クマリン、クマリン誘導体、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、Ｃｏｕｍａｒｉｎ  １２０）、７−アミノ−トリフルオロメチルクマリン（Ｃｏｕｍａｒａｎ  １５１）、シアノシン、４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ  Ｒｅｄ）、７−ジメチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）、エオシン、エオシン誘導体（例えば、エオシンイソチオシアネート）、エリスロシン、エリスロシン誘導体（例えば、エリスロシンＢ及びエリスロシンイソチオシアネート）、エチジウム、フルオレセイン及び誘導体（例えば、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）、フルオレスカミン誘導体（アミンと反応して蛍光を発する）、ＩＲ  １４４、ＩＲ  １４４６、マラカイトグリーンイソチオシアネート、４−メチルウンベリフェロン、ｏ−クレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラロサニリン、Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ、Ｂ−フィコエリトリン、ｏ−フタルジアルデヒド誘導体（アミンと反応して蛍光を発する）、ピレン及び誘導体（例えば、ピレン、ピレンブチレート及びスクシンイミジル１−ピレンブチレート）、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ．ＲＴＭ．Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  ３Ｂ−Ａ）、ローダミン及び誘導体（例えば、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１及びスルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン及びテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ））、リボフラビン、ロゾール酸及びランタニドキレート誘導体、量子ドット、シアニン類並びにスクアライン類がある。
【００２６】
本明細書中で使用する「常磁性金属イオン」、「常磁性イオン」又は「金属イオン」という用語は、磁場に比例した程度で磁場に対してパラレル又はアンチパラレルに磁化する金属イオンをいう。一般に、これらは不対電子を有する金属イオンである。好適な常磁性金属イオンの例には、特に限定されないが、ガドリニウムＩＩＩ（Ｇｄ3+又はＧｄ（ＩＩＩ））、鉄ＩＩＩ（Ｆｅ3+又はＦｅ（ＩＩＩ））、マンガンＩＩ（Ｍｎ2+又はＭｎ（ＩＩ））、イットリウムＩＩＩ（Ｙｔ3+又はＹｔ（ＩＩＩ））、ジスプロシウム（Ｄｙ3+又はＤｙ（ＩＩＩ））及びクロム（Ｃｒ（ＩＩＩ）又はＣｒ3+）がある。若干の実施形態では、常磁性イオンは、高い磁気モーメント（μ２＝６３ＢＭ２）、対称的な電子基底状態（Ｓ８）及び現在承認されている哺乳動物での診断用途の点から、ランタニド原子Ｇｄ（ＩＩＩ）である。
【００２７】
「配列同一性の百分率」とは、比較窓にわたって２つの最適整列した配列を比較することで決定される値を意味し、比較窓内にあるポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の部分は２つの配列の最適整列のための（付加、置換又は欠失を含まない）参照配列と比較したときに付加、置換又は欠失（即ち、ギャップ）を含むことがある。百分率は、両配列中に同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が生じる位置の数を求めてマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較窓内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって算出される。
【００２８】
本明細書中で使用する「生理的条件」という用語は、一般に哺乳動物体内に存在する条件をいう。即ち、生理的条件とは約６．５〜約７．５のｐＨ及び約３６〜約３９℃の範囲内の温度を意味する。
【００２９】
本明細書中で使用する「シグナルジェネレーター」という用語は、１以上の検出技法（例えば、分光測定、比色定量、分光分析又は目視検査）を用いて検出可能なシグナルを生じ得る分子をいう。検出可能なシグナルの好適な例としては、光学信号、電気信号及び放射性信号が挙げられる。本発明の方法で有用なシグナルジェネレーターの例には、例えば、発色団、発蛍光団、ラマン活性タグ、放射性標識、酵素、酵素基質及びこれらの組合せがある。好適な放射性同位体には、Ｈ−３、Ｃ−１１、Ｃ−１４、Ｆ−１８、Ｐ−３２、Ｓ−３５、Ｉ−１２３、Ｉ−１２４、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｃｒ−５１、Ｃｌ−３６、Ｃｏ−５７、Ｆｅ−５９、Ｓｅ−７５及びＥｕ−１５２がある。ハロゲン（例えば、塩素、フッ素、臭素及びヨウ素）並びにテクネチウム、イットリウム、レニウム及びインジウムをはじめとする金属の同位体も有用な標識である。シグナルジェネレーターとして使用できる金属イオンの典型例には、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉ−１２３、Ｉｎ−１１１、Ｉ−１３１、Ｒｕ−９７、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｉ−１２５、Ｇａ−６８、Ａｓ−７２、Ｚｒ−８９、Ｇｄ−１５３及びＴｌ−２０１がある。ポジトロン放出断層撮影法（「ＰＥＴ」）によるインビボ診断イメージング用の放射性同位体には、Ｃ−１１、Ｆ−１８、Ｇａ−６８及びＩ−１２４がある。常磁性標識は、金属錯体又は金属酸化物粒子の形態で存在する金属イオンであり得る。好適な常磁性同位体には、Ｇｄ−１５７、Ｍｎ−５５、Ｄｙ−１６２、Ｃｒ−５２及びＦｅ−５６がある。
【００３０】
「親水性アミノ酸」とは、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ疎水性スケールの正規化コンセンサスに従ってゼロ未満の疎水性を示すアミノ酸をいう。遺伝的にコード化された親水性アミノ酸には、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌｙｓ（Ｋ）及びＡｒｇ（Ｒ）がある。
【００３１】
「疎水性アミノ酸」とは、正規化コンセンサス疎水性Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇスケールに従ってゼロより大きい疎水性を示すアミノ酸をいう。遺伝的にコード化された疎水性アミノ酸には、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、  Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）及びＴｙｒ（Ｙ）がある。
【００３２】
「非極性アミノ酸」とは、生理的ｐＨで帯電していないが、２つの原子によって共有される電子対が一般に２つの原子の各々によって等しく保持される結合を持つ側鎖を有する（即ち、側鎖は極性でない）疎水性アミノ酸をいう。遺伝的にコード化された非極性アミノ酸には、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｇｌｙ（Ｇ）及びＡｌａ（Ａ）がある。
【００３３】
「非経口投与」という語句は、被験体に物質又は化合物を導入するための任意の手段であって経口摂取又は胃腸管への直接導入を伴わないものをいい、特に限定されないが、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射、静脈内注射、鞘内注射、脳内注射、脳室内注射及び脊椎内注射並びにこれらの任意の組合せを包含する。
【００３４】
本明細書中で使用する「ＰＤＧＦＲ−β関連病態」という語句は、一般にＰＤＧＦＲ−βの発現パターンが、特に限定されないが肝線維症、肝硬変又は肝機能異常或いはこれらの任意の組合せのような症候群、疾患又は他の病理学的状態の原因となるか或いはそれに関連する任意の状態をいう。
【００３５】
「極性アミノ酸」とは、生理的ｐＨで帯電していないが、２つの原子によって共有される電子対が一方の原子により近接して保持される１以上の結合を持つ側鎖を有する親水性アミノ酸をいう。極性アミノ酸には、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）及びＴｈｒ（Ｔ）がある。
【００３６】
らせん状ポリペプチドへの参照付きの「足場」という用語は、一般に、ポリペプチドの結合界面残基を標的との結合が可能になるように適切に配置するための三次元構造を与えるポリペプチドの残基をいう。
【００３７】
本明細書中で使用する「シグナルジェネレーター」という用語は、１以上の検出技法（例えば、分光測定、比色定量、分光分析又は目視検査）を用いて検出可能なシグナルを生じ得る分子をいう。
【００３８】
本明細書中で使用する「活性化基」という用語は、求核試薬（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、酸塩化物及び尿素中間体）に対するカルボニル基の反応性を高める任意の基をいう。
【００３９】
本明細書中で使用する「アルデヒド反応性末端」という用語は、アルデヒド官能基と反応し得る任意の官能基をいう。アルデヒド反応性官能基の若干の例には、特に限定されないが、−ＯＮＨ2、−ＣＯＮＨＮＨ2、−ＮＨＮＨ2、−ＮＨＣＯＮＨ2及び−ＮＨＣＳＮＨ2がある。アルデヒド反応性官能基はまた、アルデヒドとの反応前に脱保護するか、又はアルキルとの反応中にインサイチュで脱保護することができる保護誘導体であってもよい。アルデヒド反応性末端に対する保護基の若干の例には、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、シクロアルキルオキシカルボニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、シクロアルキルスルホニル基及びホスフィノイル基がある。アルデヒド反応性末端に対する保護基の若干の具体例には、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、トリフェニルメチル、９−フルオレニルメチルカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、４−アジドベンジルカルバメート、４−ニトロベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、２，４−ジニトロベンゼンスルホニル及びジフェニルホスフィノイルがある。
【００４０】
本明細書中で使用する「脂肪族ラジカル」又は「脂肪族基」という用語は、一般に、環状でなくかつｓｐ3炭素原子である結合点を有する炭素原子配列をいう。炭素原子配列はさらに、ｓｐ3、ｓｐ2又はｓｐ混成炭素原子の任意の組合せを含み得る。さらに、炭素原子配列は一価、二価又は三価であり得る。アルキル基の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソオクチル、ベンジル、シクロヘキシルメチル、フェネチル及び１’，１’−ジメチルベンジルなどがある。
【００４１】
本明細書中で使用する「周囲温度」という用語は、一般に臨床環境又は実験室環境中に存在する温度をいう。即ち、周囲温度は約０〜約３７℃の範囲内にあり得る。
【００４２】
本明細書中で使用する「芳香族ラジカル」及び／又は「芳香族基」という用語は、ｓｐ2混成炭素原子及び共役炭素−炭素二重結合の環状配列をいい、環状炭素原子配列の一部をなす芳香族ｓｐ2混成炭素原子の位置に結合点を有する。芳香族基又はラジカルは、１乃至最大許容数の置換基を有し得る。アリール基の例には、フェニル、置換フェニル、トリル、置換トリル、キシリル、メシチル、クロロフェニル、ナフチル、フリル、チエニル、ピロリルなどがある。
【００４３】
本明細書中で使用する「シクロアルキルラジカル」又は「シクロアルキル基」という用語は、ｓｐ3混成炭素原子の環状配列をいい、環状炭素原子配列の一部をなすｓｐ3混成炭素原子の位置に結合点を有する。炭素原子配列はさらに、ｓｐ3、ｓｐ2又はｓｐ混成炭素原子の任意の組合せを含み得る。さらに、環状炭素原子配列は１乃至最大許容数の置換基で置換されていてもよい。さらに、環状炭素原子配列はＯ、Ｎ又はＳのようなヘテロ原子を含み得る。シクロアルキル基の例には、シクロヘキシル、メチルシクロヘキシル、トリメチルシクロヘキシル、フェニルシクロヘキシル、テトラヒドロピラニル、４−チアシクロヘキシル、シクロオクチルなどがある。
【００４４】
「アルキル」、「脂肪族」、「脂環式」及び「芳香族」という用語に適用される「ラジカル」及び「基」という用語は、本明細書中では互換的に使用される。
【００４５】
本明細書中で使用する「置換」という用語は、化学反応の結果として１以上の元素又はラジカルが置き換えられることをいう。好適な置換基には、アルキル基、アルキルアリール基、アリール基、アリールアルキル基及びヘテロアリール基であって、該残基の３以下のＨ原子が低級アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、ハロアルキル基、アルコキシ基、カルボニル基、カルボキシアルコキシ、カルボキサミド基、アシルオキシ基、アミジノ基、ニトロ基、ハロ基、ヒドロキシ基、ＯＣＨ（ＣＯＯＨ）2基、シアノ基、第一アミノ基、第二アミノ基、アシルアミノ基、アルキルチオ基、スルホキシド基、スルホン基、フェニル基、ベンジル基、フェノキシ基、ベンジルオキシ基、ヘテロアリール基又はヘテロアリールオキシ基で置き換えられたものがある。
【００４６】
本明細書中で使用する「チオール反応性末端」という用語は、チオール基又はメルカプタン基（即ち、−ＳＨ基）と反応し得る官能基をいう。チオール反応性官能基の例には、特に限定されないが、マレイミド基、ハロ脂肪族基、ハロ芳香族基、ハロ脂環式基、（ハロアセチル）アルキル基、（ハロアセチル）シクロアルキル基、（ハロアセチル）アリール基、α，β−不飽和スルホン基、ビニルスルホン基、α，β−不飽和カルボニル基、エポキシ基、アジリジン基、及びチオール基とチオール交換反応を行い得るジスルフィド基がある。
【００４７】
「チオール基とチオール交換反応を行い得るジスルフィド基」という用語は、生体分子のチオール基（例えば、ポリペプチドのチオール基）と反応し得る基をいう。したがって、ジスルフィドはチオール反応性基とみなすことができる。ピリジルジスルフィドはかかるジスルフィドの好適な例である。好適なマレイミド基には、母体（非置換）基並びに脂肪族基、脂環式基又は芳香族基を置換基として含む誘導体がある。好適なα，β−不飽和カルボニル基には、アクリロイル基を含むものがある。好適なα，β−不飽和カルボニル基には、α，β−不飽和エステル及びα，β−不飽和スルホンがある。ビニルスルホン基はα，β−不飽和スルホン基の具体例である。
【００４８】
本明細書中で使用する「フッ素置換アルデヒド」という用語は、１以上のフッ素置換基を有するアルデヒド含有化合物を意味する。さらに、フッ素置換基は任意の種類の同位体（例えば、Ｆ−１８及びＦ−１９）であり得る。さらに、アルデヒドは脂肪族アルデヒド、脂環式アルデヒド又は芳香族アルデヒドであり得る。さらに、脂環式アルデヒド及び芳香族アルデヒドは単環式、二環式又は多環式構造を有し得る。
【００４９】
実施形態
一般に、検出剤として使用する場合、ＰＤＧＦ−Ｒと結合するポリペプチドは標識（例えば、発蛍光団又は放射性同位体）の付加によってシグナルを発生するように修飾することができる。
【００５０】
結合ポリペプチドは、標準的な固相合成技法を用いて生成できる。別法として、ポリペプチドは組換え技法を用いて生成することもできる。ポリペプチドが組換え技法を用いて生成される実施形態では、ポリペプチド又はその保存的変異体をエンコードするＤＮＡを単離することができる。ポリペプチド又はその保存的変異体をエンコードするＤＮＡをクローニングベクター中に挿入し、宿主細胞（例えば、真核細胞、植物細胞又は原核細胞）中に導入し、当技術分野で認められている発現系を用いて発現させることができる。
【００５１】
ポリペプチドがペプチド合成技法又は組換え技法のいずれで生成されるにせよ、生成されたポリペプチドは実質的にただ１種のキラル形のアミノ酸残基からなり得る。したがって、本発明のポリペプチドは実質的にＬ−アミノ酸又はＤ−アミノ酸からなり得るが、Ｌ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸の組合せも使用できる。
【００５２】
本明細書中に示されるポリペプチドはプロテインＡのＺドメインから導かれるので、結合界面上の残基は結合活性を保存しながら保存的に置換されていてもよい。若干の実施形態では、置換される残基は２０の天然アミノ酸のいずれか又はその類似体のいずれかであり得る。
【００５３】
本明細書中に示されるポリペプチドは、本質的に長さが４９〜７１残基のポリペプチドからなる。ポリペプチドの長さは、約４９残基〜約１３０残基とすることができる。
【００５４】
【表１】
2012512233.tif 000002
【００５５】
【表２】
2012512233.tif 000003
【００５６】
【表３】
2012512233.tif 000004
表３（下記）は、ヒトＰＤＧＦ−Ｒβ及びＰＤＧＦ−Ｒβに対する選択されたポリペプチドの結合親和性測定値並びにこれらのポリペプチドの（標識条件に関係する）等電点（ｐＩ）を示す。
【００５７】
【表４】
2012512233.tif 000005
選択された官能性を付与するため、末端に追加の配列を付加することができる。即ち、ＰＤＧＦ−Ｒ結合剤の精製又は単離を容易にするため、一方又は両方の末端に追加の配列を、単独で又は（例えば、ポリペプチドにｈｉｓタグを付加することで）結合標的に連結した状態で付加することができる。
【００５８】
ポリペプチドの末端位置又は内部位置にシグナルジェネレーターを組み込むことができる。シグナルジェネレーターの好適な例には、発色団、発蛍光団、ラマン活性タグ、放射性標識、酵素、酵素基質及びこれらの組合せがある。検出可能なシグナルの好適な例としては、光学信号、電気信号及び放射性信号が挙げられる。
【００５９】
本発明の若干の実施形態では、放射性金属をポリペプチド中の特定の残基によってキレート化することができる。例えば、システインチオールがシステインの主鎖アミン基及び２つの先行残基と共に形成するＮ３Ｓキレーター中にＴｃ−９９ｍを含めることができる。
【００６０】
独立した化学的実在物（例えば、タグ又は標識）への結合を容易にするため、ポリペプチドにリンカーを付加することができる。本明細書中に開示されるポリペプチドは、薬物動態を向上させるため（例えば、ポリグリカンを付加して血中循環半減期を調整するため）さらに修飾することができる。
【００６１】
かかるリンカーは、一端ではチオール反応性末端を介してチオール含有化合物を結合し、他端ではアルデヒド反応性末端を介してアルデヒド（特にフッ素置換アルデヒド）を結合するために使用できる。リンカーの若干の例を次の構造（Ｉ）〜（ＩＶ）に示す。
【００６２】
【化１】
2012512233.tif 000006
式中、「Ｂｏｃ」は保護基ベンジルオキシカルボニルの略語である。
【００６３】
若干の実施形態では、チオール反応性末端、アルデヒド反応性末端、又はチオール反応性末端及びアルデヒド反応性末端の両方を類似の保護誘導体で置き換えることができる。かかるリンカーは、一端ではチオール反応性末端を介してチオール含有化合物を結合するため、及び／又は他端ではアルデヒド反応性末端を介してアルデヒド（例えば、フッ素置換アルデヒド）を結合するために使用できる。
【００６４】
リンカーは、チオール反応性官能基及びアルデヒド反応性官能基の両方を、それぞれ（ｉ）１以上のチオール基を有するポリペプチド及び（ｉｉ）フッ素置換アルデヒドとの反応のために利用可能にする任意の方法によって製造できる。一実施形態では、リンカーは、チオール反応性官能基を含むアミン化合物を、アルデヒド反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステルと反応させることで製造される。チオール反応性官能基を有する任意のアミン化合物が使用できる。一実施形態では、アミン化合物は次の構造（Ｖ）を有する。
【００６５】
Ｇ−Ｊ−ＮＨＲ１            （Ｖ）
式中、Ｇはチオール反応性官能基であり、Ｊは連結単位であり、Ｒ１はＨ、脂肪族基、芳香族基又は脂環式基である。二価連結単位Ｊの性質は、チオール反応性官能基及びアルデヒド反応性官能基の反応性に悪影響を及ぼすことがある立体障害を最小にするように設計すればよい。本アプローチの利点の１つは、バイオコンジュゲートの最終性質を変更するように連結単位を調整できることである。即ち、リンカーのサイズ、極性、電荷及び化学組成を変化させることにより、溶解性及びＰＫ／ＰＤ特性のような最終コンジュゲートの性質を変更することができる。さらにリンカーは、標的化及び／又は溶解性を向上させる基を結合するための追加の結合手（ｈａｎｄｌｅ）を含むことができる。
【００６６】
他の実施形態では、リンカーは、アルデヒド反応性官能基を含むアミン化合物を、チオール反応性官能基を含むカルボン酸又は活性化エステル化合物と反応させることで製造できる。
【００６７】
活性化エステルは次の構造（ＶＩ）を有する。
【００６８】
Ｌ−Ｍ−ＣＯＲ２            （ＶＩ）
式中、Ｌはアルデヒド反応性官能基、ケトン反応性官能基又はその保護誘導体からなり、Ｍは二価連結単位であり、Ｒ２はＯＨ又は活性化基である。活性化基Ｒ２は、チオール基を有するアミン化合物と構造（ＶＩ）のカルボニル炭素原子との反応を容易にする。構造（Ｘ）を有するリンカーを製造するための例示的な合成アプローチを次の反応スキーム１及び２に示す。
【００６９】
【化２】
2012512233.tif 000007
【００７０】
【化３】
2012512233.tif 000008
スキーム１中、ＥＤＡＣは１−エチレン−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを表し、スキーム２中、ＤＣＣはジシクロヘキシルカルボジイミドを表す。これらの方法を用いて製造できるリンカーの若干の例は、上記の構造（Ｉ）及び（ＩＩ）に示されている。
【００７１】
リンカーのアルデヒド反応性末端は、保護形態又は非保護形態で存在し得る。若干の特定の実施形態では、アルデヒド反応性末端は、−ＯＮＨ2−、−ＣＯＮＨＮＨ2−、−ＮＨＮＨ2−、−ＮＨＣＯＮＨ2−及び−ＮＨＣＳＮＨ2−から選択される。一実施形態では、アルデヒド反応性末端は保護形態で存在する。これは、チオール反応性末端とポリペプチドのチオール基との一層クリーンで一層選択的な反応を可能にするからである。アルデヒド反応性末端のための好適な保護基の例には、特に限定されないが、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、トリフェニルメチル、９−フルオレニルメチルカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、４−アジドベンジルカルバメート、４−ニトロベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、２，４−ジニトロベンゼンスルホニル及びジフェニルホスフィノイル基がある。
【００７２】
本明細書中に記載される方法は、フッ素標識バイオコンジュゲート、さらに詳しくは放射性フッ素（例えば、Ｆ−１８）標識バイオコンジュゲートの製造を可能にする。これらの方法の利点の１つは、ポリペプチドのチオール基をリンカーのチオール反応性官能基と選択的に反応させ得る非放射性条件下でリンカーをポリペプチドのような生体分子に選択的に結合し、得られたバイオコンジュゲートをＦ−１８又は通常のフッ素で置換されたアルデヒドとの反応前に精製できることである。別の利点は、放射性フッ素標識を最終段階で選択的に付加することができ、最終バイオコンジュゲートを特にトレーサーレベルで製造する前に時間のかかる追加の精製段階を行う必要性が排除されることである。
【００７３】
一態様では、ポリペプチド上に１以上のフッ素原子を導入するための方法が開示される。本方法は、（ｉ）チオール反応性末端及びアルデヒド反応性末端を含むリンカーを用意する段階、（ｉｉ）リンカーのチオール反応性末端を、１以上のチオール基又はその反応性誘導体を含むポリペプチドと反応させる段階、並びに（ｉｉｉ）次いでリンカーのアルデヒド反応性末端をフッ素置換アルデヒドと反応させる段階を含み得る。
【００７４】
ポリペプチド上にフッ素原子を導入するための方法の若干の実施形態では、リンカーのチオール反応性末端は、マレイミド基、ハロ脂肪族基、ハロ芳香族基、ハロ脂環式基、（ハロアセチル）アルキル基、（ハロアセチル）シクロアルキル基、（ハロアセチル）アリール基、ビニルスルホン基、アクリロイル基、エポキシ基、アジリジン基、及びチオール基とチオール交換反応を行い得るジスルフィド基から選択される。
【００７５】
さらに詳しくは、本明細書中に記載される方法は、２−（アミノキシ）−Ｎ−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−１−イル）エチル）アセトアミドをリンカーとして用いてポリペプチド上に１以上のフッ素原子を導入するために使用できる。かかる方法は、（ｉ）２−（アミノキシ）−Ｎ−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−１−イル）エチル）アセトアミドのチオール反応性基を、１以上のチオール基を含むポリペプチドと反応させる段階、及び（ｉｉ）次いで段階（ｉ）から得られた中間生成物のアミノキシ基をフッ素置換アルデヒドと反応させる段階を含んでいる。
【００７６】
保護形態のアルデヒド反応性末端を有するリンカーを使用する場合、一実施形態では、続くフッ素置換アルデヒドとの反応は、（ｉ）アルデヒド反応性末端を脱保護し、（ｉｉ）脱保護されたアルデヒド反応性末端をフッ素置換アルデヒドと反応させることで実施できる。他の実施形態では、ユーザーは、保護アルデヒド反応性末端とフッ素置換アルデヒドとの反応のための反応条件を、脱保護段階がインサイチュで起こるように選択することができる。
【００７７】
リンカーのアルデヒド反応性末端とフッ素置換アルデヒドとの反応は、ほぼ中性から酸性までの範囲内にあり得る任意の媒質中で実施できる。一実施形態では、反応は約２〜約７の範囲内のｐＨを有する媒質中で実施でき、別の実施形態では、約２〜約５のｐＨ範囲内で実施できる。反応温度は周囲温度から約７０℃まで変化し得る。反応時間は様々に変化し得るが、一般には約１０〜約６０分であり得る。若干の実施形態では、反応時間は約１０〜約３０分の範囲内で変化する。しかし、それより長い反応時間も使用できる。
【００７８】
リンカーと１以上のチオール基を有するポリペプチドとの反応から得られる生成物をバイオコンジュゲートと呼ぶ。かくして一実施形態では、バイオコンジュゲートは（ｉ）１以上のチオール基を含むポリペプチド及び（ｉｉ）リンカーから導かれる構造単位を含んでいる。ここでリンカーは、チオール反応性官能基を含むアミン化合物を、アルデヒド反応性官能基を含む活性化エステルと反応させることを含む方法によって製造される。次のスキーム３は、バイオコンジュゲート（ＸＶＩＩ）を製造するための２つの可能なアプローチを示す。
【００７９】
【化４】
2012512233.tif 000009
１つのアプローチでは、Ｂｏｃ保護リンカーを最初にチオール基を含むポリペプチドと反応させ、得られたＢｏｃ保護中間体（ＸＸＶ）を脱保護して所望のバイオコンジュゲート（ＸＸＶＩＩ）を得ることができる。別法として、Ｂｏｃ保護リンカーを最初に脱保護してリンカー（ＸＶＩ）を得、次いでこれをチオール基を含むポリペプチドと反応させて生成物（ＸＸＶＩＩ）を得ることもできる。
【００８０】
上述の技法を使用すれば、フッ素又は放射性フッ素原子（例えば、Ｆ−１８）をポリペプチド上に導入することができる。フッ素置換アルデヒドをバイオコンジュゲートと反応させた場合、フッ素置換バイオコンジュゲートが得られる。そして、放射性フッ素置換アルデヒドをバイオコンジュゲートと反応させた場合、放射性フッ素標識バイオコンジュゲートが得られる。好適なフッ素置換アルデヒドの非限定的な例を次の構造（ＸＶＩＩＩ）〜（ＸＸＶＩＩＩ）に示す。フッ素置換又は放射性標識バイオコンジュゲートを製造するためには、フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）又はＦ−１８標識ＦＤＧを使用することもできる。また、これらのアルデヒドの各々が放射性フッ素（Ｆ−１８）置換基を有することもでき、これは対応する放射性フッ素標識バイオコンジュゲートの製造を可能にする。
【００８１】
【化５】
2012512233.tif 000010
バイオコンジュゲートを製造するためには、１以上のチオール基を有する前述のポリペプチドのいずれかを使用できる。１以上のチオール基を有する骨格系タンパク質及び人工結合タンパク質のようなポリペプチドが特に有用であるが、これはかかる物質が潜在的に有用な診断学的及び治療学的価値を有するからである。かくして一実施形態では、アフィボディのような骨格系タンパク質を２−（アミノキシ）−Ｎ−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−１−イル）エチル）アセトアミドリンカーと反応させることで有用なバイオコンジュゲートを製造できる。さらに、バイオコンジュゲートをフッ素置換アルデヒドと反応させることで有用なフッ素標識バイオコンジュゲートを製造できる。
【００８２】
フッ素標識バイオコンジュゲートは、診断用途において有用な物質である。Ｆ−１８標識バイオコンジュゲートは、当技術分野で公知のイメージング技法（例えば、ＰＥＴ（ポジトロン放出断層撮影法））を用いて可視化できる。
【００８３】
本明細書中に開示される技法はまた、キレート化基を有していても有していなくてもよい各種のリンカーを製造するための広範な一般的アプローチも提供する。以下に示す実施例から明らかな通り、キレート化基を有しない構造（Ｉ）及び（ＩＩ）のリンカーを形成するための方法は、キレート化基を含むリンカー（例えば、構造（ＩＩＩ）及び（ＩＶ））を形成するためにも使用できる。さらに、キレート化基を含むリンカーは、チオール基を含む適当なポリペプチドと反応させてバイオコンジュゲートを形成することができる。次いで、これらのバイオコンジュゲートは、イメージング用途のために各種の放射性金属（例えば、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｚｒ−８９、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０５、Ｐｄ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ａｕ−１９８、Ａｕ−１９９、Ｐｂ−２０３、Ａｔ−２１１、Ｇｄ−１５３又はＢｉ−２１２）と錯体化することができる。
【００８４】
本明細書中に開示される組成物は、ヒト及び他の動物に非経口的に投与できる。非経口注射用の本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される無菌の水性又は非水性溶液、分散液、懸濁液又は乳濁液、或いは使用直前に無菌の注射用溶液又は分散液に再構成するための無菌粉末を含んでいる。好適な水性又は非水性キャリヤー、希釈剤、溶媒及び賦形剤の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）及びこれらの適当な混合物、植物油（例えば、オリーブ油）並びにオレイン酸エチルのような注射用有機エステルがある。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング材料の使用、分散液の場合には所要粒度の維持、及び界面活性剤の使用によって維持できる。
【００８５】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤のような補助剤も含むことができる。微生物の活動の予防は、各種の抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸など）を含めることで保証できる。また、ショ糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含めるのが望ましいこともある。注射用医薬製剤の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を含めることで達成できる。
【００８６】
開示された薬剤は、起こり得る毒性を最小限に抑えるため、生理学的に許容されるキャリヤー中に分散させることができる。即ち、本発明の薬剤は約６〜約８のｐＨを有する生体適合性溶液中に分散させることができる。若干の実施形態では、薬剤は約７〜約７．４のｐＨを有する生体適合性溶液中に分散させる。他の実施形態では、薬剤は約７．４のｐＨを有する生体適合性溶液中に分散させる。
【００８７】
開示された薬剤は、化合物を水性媒質中に懸濁又は溶解するために製薬業界で常用されている添加剤と混合することができ、次いで懸濁液又は溶液を当業界で公知の技法によって滅菌できる。本発明の薬剤又はその薬学的に許容される塩は、選択された投与経路に適合した各種の形態で被験体に投与できる。即ち、開示された薬剤は、局所適用（即ち、組織又は粘膜への投与）、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射又は皮下注射によって導入できる。注射のために適する形態には、無菌水溶液又は水性分散液、並びに無菌注射用溶液、分散液、リポソーム製剤又はエマルジョン製剤を調製するための無菌粉末がある。いずれの場合にも、形態は無菌でなければならず、注射器による投与を可能にする程度の流動性を有するべきである。吸入用途のために適する形態には、無菌エアゾル中に分散させた薬剤がある。局所投与のために適する形態には、クリーム、ローション、軟膏などがある。
【００８８】
若干の実施形態では、好ましい量の薬剤を被験体に簡便に送達しかつ所望形態の容器にパッケージするため、本発明の薬剤は濃縮される。かくして若干の実施形態では、薬剤は、生理学的に許容される溶液中に分散させた状態で、被験体の体重１ｋｇ当たり薬剤約０．１〜約５０ｍｇの濃度で薬剤を投与することを容易にする容器内に小分けされる。
【００８９】
薬剤を投与してから約３時間後又はそれ以内に標的組織のイメージングが行われる。別の実施形態では、薬剤を被験体に投与してから約２４時間後又はそれ以内に標的組織のイメージングが行われる。
【００９０】
別の一連の実施形態では、本発明は、ＰＤＧＦＲ−β関連疾患のイメージング方法を提供する。ＰＤＧＦＲ−βに関連する状態の管理方法は、被験体を処置してＰＤＧＦＲ−β関連疾患を治療又は軽減する前、その後又はその前後に標的組織のイメージングを行うことを含み得る。かくして、ＰＤＧＦＲ−β関連疾患の開示管理方法は、（ａ）標的組織のイメージングを行って基線情報又は診断情報を得る段階、（ｂ）被験体を処置する段階、及び（ｃ）被験体のイメージングを１回以上行って疾患状態に関する追加の情報を得る段階を含み得る。
【００９１】
医療専門家は、最初に罹患組織の特性決定を行い又は事後に罹患組織を評価するための他の技法に頼ることで、処置の前後に被験体のイメージングを行わないことを選択できる。かくして、代替実施形態では、ＰＤＧＦＲ−βに関連する状態の管理方法は、開示された薬剤を使用しない技法によって同定された疾患状態を処置し、処置に続いて標的組織のイメージングを行うことを含んでいる。同様に、別の代替実施形態では、状態の開示管理方法は、被験体又は標的組織のイメージングを行った後に処置し、続いて標的組織の再イメージングは行わないことも含み得る。
【００９２】
疾患管理が処置の効果を判定することに向けられる場合、かかる方法は、処置の適用前に対象組織のイメージングを行って処置前評価を得る段階、次いで処置を適用する段階、及び処置に続いて対象組織のイメージングを１回以上行って対象組織の処置後評価を得る段階を含んでいる。処置前評価及び処置後評価を比較することで、処置の効果を判定することができる。
【００９３】
疾患管理が処置の全体的又は全身的適用ではなく罹患組織に局限された処置（例えば、外科的介入又は放射線介入）を含む場合、疾患管理方法は、開示された薬剤を用いて罹患組織の空間位置確認を行うことで処置（例えば、切除又は照射）すべき特定領域を画定する段階を含み得る。
【実施例】
【００９４】
結合剤を試験するためのインビトロ及びインビボモデル
インビボ試験のためには、動物モデルが高レベルのＰＤＧＦ−Ｒβを確実に発現させる。ヒト標的を発現させるモデルの使用可能性を許すという理由で、腫瘍異種移植モデルを選択した。ＰＤＧＦ−Ｒβを発現させる可能性が適度に高い腫瘍形成性細胞株のパネルを利用可能な文献（Ｂｒｏｎｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８７；Ｓｔｒａｗｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９４；Ｋｈａｎａ  ｅｔ  ａｌ，２００１；Ｆｉｔｚｅｒ−Ａｔｔａｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９３）に基づいて選択した。陽性及び陰性対照と共に、このパネルを用いてインビボ実験のために適した細胞株を見つけた（表４）。
【００９５】
【表５】
2012512233.tif 000011
すべての細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、推奨された通りに培養した。使用前に細胞を＞９０％コンフルエンスまで培養した。
【００９６】
表３に示したヒト由来の細胞株に関し、抗ｈＰＤＧＦ−Ｒβ一次抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＰＮ  Ｍａｂ１２６３）及び抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてフローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００  ＭＰＬ）を実施した。表３に示した齧歯類の細胞株のフローサイトメトリーは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製一次抗体（抗ｍＰＤＧＦ−Ｒβ  Ｍａｂ１０４２）及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製二次抗体（抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８）、或いは直接に標識された一次抗ｍＣＤ１４０ｂ−ＰＥ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて実施した。いずれの場合にも、対応する販売者から適当なアイソタイプ対照を入手した。
【００９７】
細胞表面レセプターのタンパク質分解を回避するため、トリプシンではなく細胞解離緩衝液（ＰＢＳ＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて付着細胞をフラスコから遊離させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、氷冷ＦＣ緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）中に５〜１０×１０6細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。２００μｌアリコートの細胞を１．５μｇの一次抗体と混合し、氷上で４５分間インキュベートした。次いで、細胞を１ｍｌの氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、直接標識一次抗体の場合の分析のためには１ｍｌのフローサイトメトリー（ＦＣ）緩衝液（０．２％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）中に再懸濁し、或いはさらに二次抗体による染色のためには１００〜２００μｌのＦＣ緩衝液中に再懸濁した。一次抗体−二次抗体の組合せを用いて実施されるフローサイトメトリー実験のためには、３μｇの二次抗体を各管に添加し、細胞を氷上で３０分間インキュベートし、２回洗浄し、分析のため１ｍｌのＦＣ緩衝液中に再懸濁した。流動細胞の凝結を防止するため、フローサイトメトリーに先立ってすべての染色細胞を１００ミクロンフィルターに通した。染色中に広範囲にわたってクランプしたＬＳ１７４Ｔ細胞は、このフィルターを容易に通過できなかった。
【００９８】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーはＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００  ＭＰＬ上で実施した。各管について最小５×１０4のイベントを収集した。すべての分析は、ＦＬ１中のＡｌｅｘａ−４８８の検出又はＦＬ２中のＰＥの検出による単色分析であった。前方散乱（ＦＳ）及び側方散乱（ＳＳ）データは、すべての細胞集団がきっちりと分類されることを実証していた。
【００９９】
フローサイトメトリーを用いて、細胞のＰＤＧＦ−Ｒβ発現をインビトロで評価した（表５）。１つの細胞株（ＬＳ１７４Ｔ）は、広範囲なクランピングが分析を妨害したために分析されなかった。図３は、２つの最高発現細胞株並びに陽性及び陰性対照に関する代表的な結果を示す。図３の結果は再現可能であった（ｎ＝３）。
【０１００】
【表６】
2012512233.tif 000012
最高発現細胞株は、いずれもヒト由来のＵ８７及びＭ２３１であった。これら２つの株を陰性対照株（ＨＴ２９）と共に６〜１２週齢の免疫無防備マウスに注射した。腫瘍増殖曲線及び成功率は接種細胞数に依存していた。ＨＴ２９及びＵ８７細胞株に関しては、マウス１頭当たり３〜４百万個の細胞を用いると最適の腫瘍増殖が得られ、Ｍ２３１に関しては、１千万個の細胞を用いると最適の結果が得られた。
【０１０１】
８〜１５週齢の範囲内の雌ＣＤ−１ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ社、ホプキントン、米国マサチューセッツ州）を用いてインビボ試験を実施した。マウスは換気ラック内に収容し、食物及び水を随意に与えると共に、標準的な１２時間昼夜照明サイクル下に置いた。異種移植のためには、マトリゲル及びＰＢＳの５０／５０（ｖ／ｖ）混合物中の細胞１００μｌを動物に注射した。細胞は左後四半部の皮下に移植した。移植はイソフルラン麻酔下で実施した。ＨＴ２９及びＵ８７に関しては、各マウスに３〜４×１０6個の細胞を移植した。Ｍ２３１に関しては、各マウスに１×１０7個の細胞を移植した。これらの条件下では、８０％を超える注射動物において３〜４週間で使用可能な腫瘍（１００〜３００μｇ）が得られた。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡ
剔出によってマウスから腫瘍を集め、全腫瘍を処理まで−２０℃に貯蔵した。ダウンス（ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーにより、腫瘍を氷上においてプロテアーゼ阻害剤カクテルを追加したＲＩＰＡ緩衝液（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、サンタクルズ、米国カリフォルニア州＃２４９４８）１ｍｌ中で粉砕した。次に、ホモジネートを氷上で３０分間インキュベートし、次いで冷却遠心機において１００００×Ｇで１０分間遠心した。上澄み液を集め、さらなる処理まで氷上又は４℃で貯蔵した。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３２２５）を用いて、細胞溶解物中のタンパク質濃度を測定した。細胞溶解物を標準濃度に希釈することで、マイクロタイタープレート中に２０μｇ／ウェルのタンパク質を得た。製造者の指示に従い、市販のヒトＰＤＧＦ−Ｒβキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＤＹＣ３８５）を用いてＥＬＩＳＡを実施した。各試料の三重反復試験を実施し、データをｐｇ  ＰＤＧＦ−Ｒβ／μｇ総タンパク質として報告し、誤差を標準偏差として報告する。
【０１０３】
インビボでの標的発現をＥＬＩＳＡによって測定した。剔出した腫瘍をホモジナイズし、市販のマッチドペアキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、米国ミネソタ州）を用いてＰＤＧＦ−Ｒβについて分析した。図４の結果は、Ｕ８７細胞株が高発現腫瘍を増殖させ、Ｍ２３１が低発現腫瘍を増殖させ、ＨＴ２９が無発現腫瘍を増殖させたことを示す。ＧＲＣの独立した研究者（グループＢ）からの３以上のＵ８７腫瘍を含め、複数の供給源（グループＡ及びＣ）からの腫瘍に関して分析を行った。ＥＬＩＳＡ対照は、フローサイトメトリーのために使用した陽性及び陰性対照株の培養細胞溶解物であった。これらの結果は、Ｕ８７、Ｍ２３１及びＨＴ２９の腫瘍異種移植物がヒトＰＤＧＦ−Ｒβを標的化する分子のインビボ試験のために適切であることを示す。
【０１０４】
光学イメージング
抗体標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ２０１８６）を用いて、ヒトＰＤＧＦ−Ｒβに対するモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｍａｂ１２６３）又はアイソタイプ対照（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｍａｂ００２）をＡｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識した。続いて、抗体を残留する色素から分離して精製した。ＵＶ／Ｖｉｓ分光法は、平均して６個の色素／抗体を示した。
【０１０５】
標識抗体を用いて、インビボでの標的発現を確認した。Ａｌｅｘａ  ６４７官能化抗体（アイソタイプ対照又は抗ヒトＰＤＧＦ−Ｒβ抗体）を、Ｕ８７、Ｍ２３１又はＨＴ２９腫瘍を担持するマウスに注射した。結果は、Ｕ８７腫瘍で最高の抗体取込みを示し、Ｍ２３１がそれに続いた。ＨＴ２９腫瘍では顕著な取込みは見られなかった。各腫瘍の周囲に自由形式のＲＯＩを描き、平均蛍光強度を算出することで、取込みを定量化した。腫瘍：バックグラウンド蛍光比を図５に示す。
【０１０６】
結果は、Ｕ８７モデルでは腫瘍中における最高の標的発現量が見出され、Ｍ２３１モデルでは中位の量が見出されることを示す。ＨＴ２９モデルは、バックグラウンドシグナルを評価するために使用される。これらの結果は、ＥＬＩＳＡキットを用いて実証された結果を確認している。これらの結果に基づき、Ｕ８７モデルをＰＤＧＦ−Ｒβポリペプチドの生体分布試験のために選択した。ポリペプチドはまた、低発現組織を標的化するそれの能力を評価するため、Ｍ２３１モデルでも評価した。
【０１０７】
Ｈｉｓ６−ポリペプチド生体分布試験
すべてのポリペプチドはスウェーデンのＡｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＢから受け入れた。ポリペプチドは、「Ｚ」に続く内部開発番号コードによって表される。表１には、本明細書中に記載されるポリペプチドが詳しく示されている。かかるポリペプチドは、１種の対照ポリペプチドＺｔａｑ（配列番号１０）、１種の低親和性一価抗ＰＤＧＦ−Ｒβポリペプチド（Ｚ１９８２、配列番号１４）、３種の高親和性一価抗ＰＤＧＦ−Ｒβポリペプチド（Ｚ２４６５、配列番号１６）とＺ２４８３（配列番号１８）とＺ２５１６（配列番号１７）のパネル、及び１種の高親和性抗ＰＤＧＦ−Ｒβポリペプチドの二量体Ｚ（２４６５）２（配列番号１９）を含んでいる。すべてのＨｉｓ６含有配列はＣ末端システインを含み、そのチオール基はＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を用いてブロックされている。
【０１０８】
図１は、ヒト（Ａ）及びマウス（Ｂ）のＰＤＧＦ−Ｒβで官能化された表面上で実施した場合、Ｚ２４６５（配列番号１６）に関して得られた例示的な表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）データを示す。すべてのポリペプチドはヒトＰＤＧＦ−Ｒβに対して高められたが、マウス標的に対する親和性の値はマウスモデルにおける前臨床試験に関連して重要である。図１のデータは、この特定のポリペプチドに関しては、マウス標的に対する親和性はヒト標的に対するものより劣ることを示す。このような関係は、親和性が知られているすべてのポリペプチド（表２）に当てはまる。ここで、二量体Ｚ（２４６５）2（配列番号１９）に関する値は結合活性効果に基づいて推定されている。これらのポリペプチドはまた、ＰＤＧＦ−Ｒαに比べ、ＰＤＧＦ−Ｒβに対して特異的である。図２は、ヒトＰＤＧＦ−Ｒ  Ｒβで官能化されたチップ上で実施した場合のＺ２４６５（配列番号１６）に関するＳＰＲデータを示す。これらのデータは、このポリペプチドが想定される標的に対して高い親和性を有する一方、高い相同性をもったＰＤＧＦ−Ｒ  Ｒβに対しては全く親和性を有しないことを実証している。
【０１０９】
「６−ｈｉｓ」タグを介したＴｃ−６６ｍ放射性標識による99mＴｃ（ＣＯ）3（Ｈｉｓ６）−ポリペプチドの製造
ｆａｃ−［99mＴｃ（ＣＯ）3］+コアによるＨｉｓ６タグ付きポリペプチドの標識は、以前に発表された方法（Ｗａｉｂｅｌ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９，１７，８９７）の変法を用いて行った。簡単に述べれば、食塩水中のＮａ［99mＴｃＯ4］（４ｍＣｉ、２ｍＬ）をＩｓｏｌｉｎｋ（登録商標）ボラノカーボネートキット（Ａｌｂｅｒｔｏ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１，１２３，３１３５）に添加した。得られた溶液を９５℃で１５〜２０分間加熱することでｆａｃ−［99mＴｃ（ＣＯ）3（Ｈ2Ｏ）3］+を得た。溶液の一部（２ｍＣｉ、１ｍＬ）を取り出し、１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ約７に中和した。３２５μＬのアリコートを取り出し、Ｈｉｓ６−ポリペプチド（１００μｇ）に添加した。得られた溶液を３５〜３７℃の水浴中で４０分間加熱した。典型的な放射化学収率は、（ＩＴＬＣ−ＳＧ、Ｂｉｏｄｅｘ社、０．９％ＮａＣｌで測定して）８０〜９５％の範囲内にあった。粗反応生成物をＮＡＰ−５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、１０ｍＭ  ＰＢＳ）上でのクロマトグラフィーに付すことで、放射化学純度＞９９％の生成物を得た。得られた典型的な比放射能は３〜４μＣｉ／μｇであった。次いで、得られた溶液を１０ｍＭ  ＰＢＳで希釈することで、以後の生体分布試験のために適した濃度を得た。
【０１１０】
Ｇｒａｃｅ−Ｖｙｄａｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ／Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ４（４．６×２５０ｍｍ）カラム及びＲａｙｔｅｓｔ  ＧＡＢＩ放射能検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣ上でＨＰＬＣを実施した。溶媒Ａは０．１％ＴＦＡを含む９５：５の水：ＭｅＣＮであり、溶媒Ｂは０．１％ＴＦＡを含む５：９５の水：ＭｅＣＮであった。勾配は次の通りである（すべて直線的に変化する、ｔ／％Ｂ）：０／０、４／２０、１６／６０、２０／１００、２５／１００、２６／０、３１／０。
【０１１１】
精製前に、各ポリペプチドをトリカルボニルテクネチウムコアによって高収率（＞９０％）で標識した。ＮＡＰ−５クロマトグラフィーで精製したところ、Ｔｃ−９９ｍ標識ポリペプチドの試料が＞９９％の放射化学純度で得られた（表６）。
【０１１２】
【表７】
2012512233.tif 000013
ＮＡＰ−５で精製された放射性標識ポリペプチドの代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを図６に示す。各放射性標識化学種の保持時間は、（ＵＶ検出器及びγ線検出器の物理的分離に原因する時間差（データは示さず）を除けば）２２０ｎｍ  ＵＶクロマトグラム中における対応非標識ポリペプチドの保持時間から実質的に変化していなかった。次いで、これらの標識ポリペプチドを生体分布試験のために使用した。
【０１１３】
Ｈｉｓ及びＣｙｓチャレンジ試験−99mＴｃ（ＣＯ）3（Ｈｉｓ６）−ポリペプチド
Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を（Ｈｉｓ６）−Ｚ２４６５（配列番号１６）にコンジュゲートし、続いてセクション「「６−ｈｉｓ」タグを介してのＴｃ−９９ｍ放射性標識」に記載したようにして放射性標識することで、99mＴｃ（ＣＯ）3（Ｈｉｓ６）−Ｚ２４６５（配列番号１６）を得た。８００μＬの１０ｍＭ  ＰＢＳ中に５０μｇ（６．２５×１０-9ｍｏｌ）以下のＨｉｓ６−Ｚ２４６５（配列番号１６）を含む約３００μＣｉの最終精製生成物を、２つの別々の１ドラムバイアル中に等分した。第１のバイアルには９７μＬのＬ−Ｈｉｓ（食塩水中１０ｍｇ・ｍＬ-1で６．２５×１０-6ｍｏｌ）を添加し、バイアルにキャップを付け、３７℃の予熱した鉛反応ブロック上に置いた。第２の１ドラムバイアルには、１５１．４μＬのＬ−Ｃｙｓ（食塩水中５ｍｇ・ｍＬ-1で６．２５×１０-6ｍｏｌ）を添加した。この第２のバイアルにもキャップを付け、鉛反応ブロック中に置いた。両溶液を３７℃に一晩維持した。ｔ＝６時間及びｔ＝２４時間にアリコートを取り出し、ＳＥＣ  ＨＰＬＣで分析した。ＩＴＬＣによる99mＴｃ（ＣＯ）3（Ｈｉｓ６）−Ｚ２４６５（配列番号１６）の初期純度は、ほぼ定量的（９９．９％）であった。１０００倍モル過剰量のＬ−Ｈｉｓを導入することによるチャレンジでは、６時間後には９５．７％の生成物がインタクトなままに保たれ、２４時間後には９６．６％で変化していなかった。１０００倍モル過剰量のＬ−Ｃｙｓを導入した場合、６時間後には６９．０％を含む生成物混合物が得られた。これは一晩変化しないままで、最終混合物は７０．８％の99mＴｃ（ＣＯ）3（Ｈｉｓ６）−Ｚ２４６５（配列番号１６）を含んでいた。
【０１１４】
生体分布
マウスに約１μｇのＴｃ−９９ｍ標識ポリペプチド（約３μＣｉ／１μｇ）の尾静脈注射を施した。マウスは安楽死まで濾紙で内張りしたケージ内に置いた。各時点で３頭のマウスを安楽死させ、検査対象組織を剔出し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ  Ｗｉｚａｒｄ  １４８０  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ上でカウントした。血液、腎臓、肝臓、脾臓及び注射部位（尾）に関してデータを収集した。ケージからの尿を膀胱と共にプールし、やはりカウントした。残りの組織をカウントし、各動物についてすべての組織及び尿の和を合計して総注射量を得た。この総量に基づいて各器官に関する％注射量を求め、器官を秤量することで１グラム当たりの％注射量（％ＩＤ／ｇ）を求めた。データは、各時点における全部で３頭のマウスに関する平均値として、各群の標準偏差を表す誤差バーと共に報告される。
【０１１５】
Ｔｃ−９９ｍで標識されたＺ２４６５（配列番号１６）及びＺｔａｑ（配列番号１０）ポリペプチドをＵ８７マウスに注射し、またＺ２４６５（配列番号１６）ポリペプチドをＨＴ２９マウスに注射したが、収集した時点は一層限られていた。図７は、これらの実験に関する腫瘍及び血液曲線を示す。Ｚ２４６５（配列番号１６）ポリペプチドは標的発現Ｕ８７腫瘍中への高い腫瘍取込み量を示し、注射後（ＰＩ）３０分で組織１グラム当たり注射量の７％を超える最大値及び注射後１２０分で２５を超えるピーク腫瘍：血液比を有している。対照として、非標的発現ＨＴ２９腫瘍を担持するマウスにＺ２４６５（配列番号１６）ポリペプチドを注射し、標的発現Ｕ８７腫瘍を担持するマウスに非標的化Ｚｔａｑ（配列番号１０）ポリペプチドを注射した。両対照実験は、０％及び１％の公称腫瘍取込み量並びに＜５の腫瘍：血液比を有している。やはり図７に示されるこれらの結果は、Ｚ２４６５（配列番号１６）ポリペプチドがＵ８７腫瘍で発現されるＰＤＧＦ−Ｒβを特異的に標的化することを示す。
【０１１６】
ポリペプチドは、２分未満の半減期を有する血液からの単一指数関数的なクリアランスを示す。このクリアランスは、主として腎臓によって媒介される。結果として、放射能は尿中に分泌される。脾臓中へのポリペプチド取込み量は微小であり、肝臓中への可変取込み量が認められる。これらの結果は、ポリペプチドが腎臓経路を介して効果的に排除される。
【０１１７】
下位選択
Ｚ２４６５（配列番号１６）ポリペプチドは注射後１２０分で最大の腫瘍：血液比を示したので、この時点を比較試験のために選択した。４種の単量体ポリペプチドのすべてについて単点生体分布を実施し、腫瘍：血液比及び絶対腫瘍取込み量を比較した（図９）。Ｚ２４８３（配列番号１８）ポリペプチドは最高の絶対腫瘍取込み量を有していた一方、Ｚ２４６５（配列番号１６）ポリペプチドは僅かに低い血液値のために最高の腫瘍：血液比を有していた。これらの結果は、Ｚ２４６５（配列番号１６）が最も性能の良い単量体ポリペプチドであることを明確に示す。
【０１１８】
原子価
二価ポリペプチドは、恐らくは結合活性効果のため、対応する単量体より高い親和性を示す。しかし、その大きいサイズは腫瘍侵入を妨げることがある。ＰＤＧＦ−Ｒβポリペプチドに関しては、４種の高親和性ポリペプチドの各々の二価形態が入手可能であった。Ｚ２４６５（配列番号１６）の二量体である（Ｚ２４６５）2（配列番号１９）を放射性標識し、Ｕ−８７腫瘍担持マウスにおける４時間生体分布実験のために使用した。結果（図１０）が示す通り、二価ポリペプチドは対応する単量体に関して認められたほどの高い腫瘍取込み量を有していないが、いかなるウォッシュアウトも示さない。これは恐らく減少したオフレートによるものである。注射後４時間までは、一価及び二価ポリペプチドは同等な腫瘍：血液比を有している。
【０１１９】
一価及び二価ポリペプチドは他の点では同様な生体分布特性を示し、いずれについても１〜２分の範囲内に血中半減期が認められた。結果は、一価及び二価ポリペプチドの両方がインビボでＰＤＧＦ−Ｒβを標的化し得ることを明確に示している。
【０１２０】
低発現モデル
ポリペプチドが低いコピー数でそれの標的を検出し得る能力を評価するため、Ｍ２３１腫瘍担持マウスでの生体分布実験のためにＺ２４６５（配列番号１６）ポリペプチドを使用した。上述の通り、Ｍ２３１腫瘍は低レベルのＰＤＧＦ−Ｒβ発現を示す。結果（図１１）は、Ｚ２４６５（配列番号１６）ポリペプチドがなおもバックグラウンドレベルより高い取込み量及び腫瘍：血液比を示すものの、これらは高発現モデルで認められたものに比べて低下していることを示す。これは、ＰＤＧＦ−Ｒβ標的化ポリペプチドがインビボで低レベルの標的を検出するためにも使用できることを明確に実証している。
【０１２１】
二価ポリペプチドＺ（２４６５）2（配列番号１９）をＭ２３１腫瘍担持マウスで使用した場合、取込み量又は腫瘍：血液比に対する効果は認められなかった。値は高発現モデルから変化しなかった（図１２）。これらのデータは、一価ポリペプチドに関して認められる取込み量は標的濃度で限定されるが、二価ポリペプチドに関して認められる取込み量は何か他の過程（恐らくは腫瘍侵入）によって限定されることを示す。これらの結果はまた、一価及び二価ポリペプチドの両方が標的化用途のために使用でき、その選択は用途特有の性質に依存することも示している。例えば、二価ポリペプチドは低レベルの発現が予想される用途のために選択できよう。
【０１２２】
低親和性ポリペプチド
僅か４ｎｍの親和性を有するＺ１９８２（配列番号１４）ポリペプチドを、腫瘍担持マウスにおける単点生体分布のために使用した。結果（図１３）は、低発現又は無発現モデルに比べ、高発現モデルで増加した取込み量を示す。腫瘍：血液比は対照腫瘍で認められるもの又はＺｔａｑ（配列番号）対照に関して認められるものより高い。しかし、Ｚｔａｑ（配列番号１０）の場合、この差は高い血液値（約１％）によって生み出されている。
【０１２３】
ｃＰｎ２１６を介してＴｃ−９９ｍ標識されたポリペプチド
Ｚ０２４６５（配列番号２３）及びＺ０３３５８（配列番号２４）を、部位特異的標識のため、Ｈｉｓ６タグを用いずに人工Ｃ末端システイン残基で官能化した。Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＢがＢＩＡｃｏｒｅ（ＧＥＨＣ社）を用いてＺ２４６５（配列番号１６）に関するポリペプチド親和性を測定したところ、６００ｐＭのＫｄを有することが示された。かかるポリペプチドはヒトＰＤＧＦ−ＲＢβに対して高められたので、マウス標的に対する親和性は低く、約４ｎＭのＫｄ値を有する。提供される化合物はまた、インビトロ及びインビボの両方で実証される通り、高度の特異性も有している。
【０１２４】
すべての記載されたポリペプチド用のエピトープは、レセプターの天然リガンドＰＤＧＦ−βと共有されている。Ｚ２４６５（配列番号１６）は、ＢＩＡｃｏｒｅ競合実験においてＰＤＧＦ−ＢＢと完全に競合し得る。
【０１２５】
Ｚ２４６５（配列番号１６）は、好ましい生体分布特性、詳しくは微小な肝臓内の非特異的保持量と組み合わされた高い標的取込み量を実証した。Ｚ０３３５８（配列番号２４）は、Ｚ２４６５及びＺ０２４６５（それぞれ配列番号１６及び配列番号２３）の誘導体である。ポリペプチド分子の純度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって＞９５％と決定された。
【０１２６】
【表８】
2012512233.tif 000014
Ｍａｌ−ｃＰｎ２１６
Ｔｃ−９９ｍキレーターｃＰｎ２１６（図１４）を導入するため、ポリペプチドの末端システインへのコンジュゲーションのためのチオール反応性マレイミド基及びＴｃ−９９ｍをキレート化するためのアミンオキシム基からなる二官能性化合物Ｍａｌ−ｃＰｎ２１６を合成した。
【０１２７】
ｃＰｎ２１６−アミンはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から入手した。Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸はＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ロックフォード、米国イリノイ州）から購入した。Ｎ−メチルモルホリン、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｏＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、重炭酸アンモニウム及び無水ＤＭＦは、Ａｌｄｒｉｃｈ社（ミルウォーキー、米国ウィスコンシン州）から購入した。ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カールスバッド、米国カリフォルニア州）から入手した。ＨＰＬＣ精製のためには、ＨＰＬＣ用アセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）、ＨＰＬＣ用トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  １８ｍΩ水を使用した。
【０１２８】
０℃の無水ＤＭＦ中におけるＮ−β−マレイミドプロピオン酸（１０８ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）、ｃＰｎ２１６−アミン（２００ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）及びＰｙＢｏＰ（３３３ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、ＤＭＦ中の０．４Ｍ  Ｎ−メチルモルホリン（１２８μＬ、１．１６ｍｍｏｌ）を添加した。２時間後に氷浴を取り除き、混合物を室温で一晩撹拌した後、ＨＰＬＣ精製に付した。生成物は白色粉末（２３０ｍｇ、８０％収率）として得られた。1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ  １．３５（ｍ，２Ｈ）、１．４３（ｓ，１２Ｈ）、１．５６（ｍ，５Ｈ）、１．８５（ｓ，６Ｈ）、２．３３（ｄｄ，Ｊ１＝８Ｈｚ，Ｊ２＝４Ｈｚ，２Ｈ）、２．７８（ｍ，４Ｈ）、３．０４（ｍ，２Ｈ）、３．６１（ｄｄ，Ｊ１＝８Ｈｚ，Ｊ２＝４Ｈｚ，２Ｈ）、７．０２（ｓ，２Ｈ）、８．０２（ｓ，１Ｈ）、８．６８（ｓ，４Ｈ）、１１．２６（ｓ，２Ｈ）；ｍ／ｚ＝［Ｍ＋Ｈ］+に関して４９５．２（Ｃ24Ｈ43Ｎ6Ｏ5に関するＭＷ計算値＝４９５．３）。
【０１２９】
Ｍａｌ−ＰＥＧ4−ｃＰｎ２１６
ポリペプチド分子の性能に対するＰＥＧ化リンカーの効果を評価するため、末端システインへのコンジュゲーションのためのチオール反応性マレイミド基及びＴｃ−９９ｍをキレート化するためのアミンオキシム基からなる二官能性化合物Ｍａｌ−ＰＥＧ4−ｃＰｎ２１６（図１５）を合成した。マレイミド基及びアミンオキシム基はＰＥＧ4リンカーによって連結された。
【０１３０】
ｃＰｎ２１６−アミンはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から入手した。ＮＨＳ−ＰＥＧ4−マレイミドはＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ロックフォード、米国イリノイ州）から購入した。ＨＰＬＣ精製のためには、ＨＰＬＣ用アセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  １８ｍΩ水を使用した。
【０１３１】
無水ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中におけるｃＰｎ２１６−アミン（５ｍｇ、０．０１４５ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ−ＰＥＧ4−マレイミド（９ｍｇ、０．０１７４ｍｍｏｌ）の混合物を室温で１８時間撹拌した。得られた混合物をＨＰＬＣ（水中０〜３０％ＣＨ3ＣＮ）で精製することで、５．１ｍｇ（４６％）の標記化合物を白色固体として得た。1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ4）：δ  １．５５（ｍ，１５Ｈ）、１．６５−１．７８（ｍ，６Ｈ）、１．９４（ｓ，６Ｈ）、２．４８（ｑ，Ｊ＝７．２３Ｈｚ，４Ｈ）、３．０３（ｔ，Ｊ＝８．２５Ｈｚ，４Ｈ）、３．５２（ｔ，Ｊ＝５．０５Ｈｚ，２Ｈ）、３．６０−３．６６（ｍ，１４Ｈ）、３．７５（ｔ，Ｊ＝８．００Ｈｚ，２Ｈ）、３．７９（ｔ，Ｊ＝８．００Ｈｚ，２Ｈ）、６．８４（ｓ，２Ｈ）；高分解能ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ35Ｈ64Ｎ7Ｏ10［Ｍ＋Ｈ］+に関する計算値７４２．４７１５、実測値７４２．４８５３。
【０１３２】
ポリペプチド分子に対するＭａｌ−ｃＰｎ２１６及びＭａｌ−ＰＥＧ4−ｃＰｎ２１６のバイオコンジュゲーション
新鮮な脱気ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）を用いて、ポリペプチドを約１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ポリペプチド中のジスルフィド結合を、新鮮な脱気ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）中のＤＴＴ溶液の添加によって還元した。ＤＴＴの最終濃度は２０ｍＭであった。反応混合物を２時間渦動させ、脱気ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）で予備平衡化したＺｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に通して過剰のＤＴＴ試薬を除去した。溶出する還元ポリペプチド分子を集め、（ポリペプチド１当量当たり２０当量の）二官能性化合物ｍａｌ−ｃＰｎ２１６又はＭａｌ−ＰＥＧ4−ｃＰｎ２１６をＤＭＦ溶液として添加し、混合物を室温で渦動させた。ポリペプチド分子の完全な転化を保証するため、反応を一晩進行させた。ある種のポリペプチド分子（例えば、Ｚ０２４６５（配列番号２３））に関しては、液体クロマトグラフィー及びそれに続くエレクトロスプレーイオン化−飛行時間質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）で反応をモニターしたところ、ｍａｌ−ｃＰｎ２１６との反応は２時間に短縮できることが示唆された。
【０１３３】
透析又は脱塩スピンカラムによる標的生成物の初期精製は、過剰のｍａｌ−ｃＰｎ２１６を除去するには十分でなかった。また、標的生成物の回収率も低かった（約２０％）。そこで、ポリペプチド分子の高安定性に基づく精製方法として逆相ＨＰＬＣを選択した。
【０１３４】
ＨＰＬＣ精製は、ＭｉＣＨＲＯＭ  Ｍａｇｉｃ  Ｃ１８ＡＱ  ５μ  ２００Ａカラム（ＭｉＣＨＲＯＭ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ社、オーバーン、米国カリフォルニア州）上で実施した。溶媒Ａ：Ｈ2Ｏ（０．１％ギ酸を含む）、溶媒Ｂ：ＣＨ3ＣＮ（０．１％ギ酸を含む）。勾配：３０分で５〜１００％Ｂ。
【０１３５】
所望生成物を含む画分を合わせ、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液で中和し、凍結乾燥によって溶媒を除去することで、コンジュゲート化ポリペプチドを白色固体として得た。純度（図１６に示されるＨＰＬＣで測定して＞９５％）及び収率（６６〜９３％）の顕著な向上が達成された。
【０１３６】
精製生成物のＬＣ−ＭＳ分析では所望生成物の存在が確認され、ＭＷはＺ０２４６５（配列番号２３）及びＺ０３３５８（配列番号２４）を含むポリペプチド構築物にただ１つのｃＰｎ２１６又はＰＥＧ4−ｃＰｎ２１６標識が付加されていることを示唆していた（Ｚ０２４６５（配列番号２３）−ｃＰｎ２１６、Ｚ０２４６５（配列番号２３）−ＰＥＧ4−ｃＰｎ２１６及びＺ０３３５８（配列番号２４）−ｃＰｎ２１６のそれぞれに関し、ＭＷ計算値：７７３２Ｄａ、７９７９Ｄａ及び７０１１Ｄａ、実測値：７７３２Ｄａ、７９７９Ｄａ及び７０１１Ｄａ）。
【０１３７】
ｃＰｎ２１６を介してのＴｃ−９９ｍ標識：Ｌｏｗ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｃｈｅｌａｋｉｔ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ
２０ｍＬバイアルに１０．００ｍＬの蒸留脱イオン水を添加した。この溶液中に窒素ガスを約３０分間吹き込んだ後、ＮａＨＣＯ3（４５０ｍｇ、５．３６×１０-3ｍｏｌ）、Ｎａ2ＣＯ3（６０ｍｇ、５．６６×１０-4ｍｏｌ）及びｐ−アミノ安息香酸ナトリウム（２０ｍｇ、１．２６×１０-4ｍｏｌ）を添加した。図１７は、有効な標識のための濃度要件を調べるための結果を示す。すべての試薬を独立に秤量し、水を含むバイアルに添加した。塩化スズ（１．６ｍｇ、７．０９×１０-6ｍｏｌ）及びＭＤＰ（２．５ｍｇ、１．４２×１０-5ｍｏｌ）を一緒に１ドラムバイアル中に秤取し、続いて約１ｍＬの炭酸塩緩衝液混合物中への迅速な懸濁によって移送した（続いて１回洗浄した）。１０μＬアリコートを取り出し、窒素流下でシラン化バイアルに移し、直ちに凍結し、凍結乾燥まで液体窒素浴中に保存した。各バイアルをゴム隔膜で部分的に覆い、トレー式凍結乾燥機内に一晩配置した。バイアルを真空下で密封し、凍結乾燥機から取り出し、アルミニウムキャップでクリンプシールし、無水窒素で再加圧し、将来の使用までフリーザー内に貯蔵した。
【０１３８】
ポリペプチド−Ｃｙｓ−ｍａｌ−ｃＰｎ２１６のＴｃ−９９ｍ標識
テクネチウム用還元剤としての塩化第一スズ、メチレンジホスホン酸、フリーラジカルスカベンジャーとしてのｐ−アミノ安息香酸塩、及び緩衝剤としての重炭酸ナトリウム／炭酸ナトリウム（ｐＨ９．２）の凍結乾燥混合物を含む自家製造した一段階キット配合物（Ｃｈｅｌａｋｉｔ  Ａ＋）を用いて、放射性標識ポリペプチドの合成を行った。手早く続けて、ポリペプチドの２μｇ／μＬ食塩水溶液２０μＬをＣｈｅｌａｋｉｔに添加し、次いで直ちにＣａｒｄｉｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ社（オールバニー、米国ニューヨーク州）から入手した０．０８０ｍＬ食塩水（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）中のＮａ99mＴｃＯ4（０．８ｍＣｉ、２９．６ＭＢｑ）を添加した。混合物を１回撹拌し、周囲温度で２０分間静置した。完了後、粗放射化学収率をＩＴＬＣ（ＩＴＬＣ−ＳＧ、Ｂｉｏｄｅｘ社、０．９％ＮａＣｌ）によって測定した（下記表８）。
【０１３９】
【表９】
2012512233.tif 000015
０．３５ｍＬの１５０ｍＭ無菌ＮａＣｌで反応容量を０．４５ｍＬに増加させ、最終生成物をサイズ排除クロマトグラフィー（ＮＡＰ５カラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、１０ｍＭ  ＰＢＳを充填）によって精製した。粗反応混合物をＮＡＰ５カラム上に装填し、ゲルベッド中に入れ、０．８ｍＬの１０ｍＭ  ＰＢＳで溶出した後に最終精製生成物を単離した。最終放射能は、標準的な線量キャリブレーター（ＣＲＣ−１５Ｒ、Ｃａｐｉｎｔｅｃ社、ラムゼー、米国ニュージャージー州）中で評価した。放射化学収率（表８）及び純度は、ＩＴＬＣ（＞９８．５％）、Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析によって測定した。図１８は、Ｈｉｓ６構築物Ｚ２４６５（配列番号１６）と比較した、標識ポリペプチド−ｃＰｎ構築物Ｚ０２４６５（配列番号２３）の単量体に関する化学的に予測可能な挙動を示す。最終生成物（１０〜１５μＣｉ／μｇ、０．２〜０．５μＣｉ／μＬ（０．３７ＭＢｑ／μｇ、７．４ＭＢｑ／ｍＬ））を直ちに生体分布試験で使用した。
【０１４０】
対応するＺ０２４６５（配列番号２３）−Ｃｙｓ−ｃＰｎ２１６、Ｚ０２４６５（配列番号２３）−Ｃｙｓ−ＰＥＧ4−ｃＰｎ２１６及びＺ０３３５８（配列番号２４）−Ｃｙｓ−ｃＰｎ２１６誘導体を、標準的な一段階キットに基づく手順（Ｃｈｅｌａｋｉｔ  Ａ＋−自家組立）を用いて標識した。以前の研究では、ｃＰｎ含有ベクターは、ベクター濃度が１×１０−５Ｍ以上でありかつ周囲温度で作業した場合に最も良く標識されることが確認されている。適度な量のＺ０２４６５（配列番号２３）−Ｃｙｓ−ｃＰｎ２１６（ＭＷ＝７７３３ｇ・ｍｏｌ-1）及びＺ０３３５８（配列番号２４）−Ｃｙｓ−ｃＰｎ２１６（ＭＷ＝７０１１ｇ・ｍｏｌ-1）を用いてこの濃度を達成するため、反応容量を約１００〜１２０μＬ未満に保つと共に、２０〜４０μｇの材料の使用を必要とした。小さい容量に対処するため、Ｃｈｅｌａｋｉｔは減少した量のＳｎＣｌ2、メチレンジホスホン酸、ｐ−アミノ安息香酸塩、炭酸カリウム及び重炭酸カリウムを含むように変更した。０．５〜１．２ｍＣｉ（１８．５〜４４．４ＭＢｑ）のＮａ99mＴｃＯ4（１０〜２５ｍＣｉ／ｍＬ）を小容量Ｃｈｅｌａｋｉｔ中の２０μＬの２μｇ／μＬポリペプチド溶液と周囲温度で２０分間化合させることにより、Ｚ０２４６５（配列番号２３）−Ｃｙｓ−ｃＰｎ２１６及びＺ０３３５８（配列番号２４）−Ｃｙｓ−ｃＰｎ２１６をかなり高い放射化学収率（表８）で標識した。これらの誘導体のＲＰ−ＨＰＬＣは、水中の０．０６％アンモニアを移動相として用いて塩基性ｐＨで実施する場合にはチャレンジであった（下記参照）。ＮＡＰ５精製によれば、高い放射化学純度及び５４〜６７％の単離放射化学収率を有する最終生成物が得られた。
【０１４１】
この実験のために使用したＨＰＬＣ条件は次の通りであった。Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣ方法１：溶媒Ａ：９５／５  Ｈ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮ（０．０５％ＴＦＡを含む）、溶媒Ｂ：９５／５  ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ（０．０５％ＴＦＡを含む）。勾配溶出：０分，０％Ｂ、４分，２０％Ｂ、１６分，６０％Ｂ、２０分，１００％Ｂ、２５分，１００％Ｂ、２６分，０％Ｂ、３１分，０％Ｂ。
【０１４２】
Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣ方法２：溶媒Ａ：水中０．０６％ＮＨ3、溶媒Ｂ：ＣＨ3ＣＮ。勾配溶出：０分，０％Ｂ、４分，２０％Ｂ、１６分，６０％Ｂ、２０分，１００％Ｂ、２５分，１００％Ｂ、２６分，０％Ｂ、３１分，０％Ｂ。
【０１４３】
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、Ｇ１３１１Ａ  ＱｕａｔＰｕｍｐ、１００μＬシリンジ及び２．０ｍＬシートキャピラリーを有するＧ１３１３Ａオートインジェクター、Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ４カラム（Ｓ／Ｎ  Ｅ０５０９２９−２−１、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）、Ｇ１３１６Ａカラムヒーター、Ｇ１３１５Ａ  ＤＡＤ並びにＲａｍｏｎ  Ｓｔａｒ−ＧＡＢＩγ線検出器を備えたＨＰ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００上で実施した。
【０１４４】
ＳＥＣ  ＨＰＬＣ：溶媒：１×（１０ｍＭ）ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］社、ｐＨ７．４、ＣａＣｌ2及びＭｇＣｌ2含有）。３０分間のイソクラティック溶出。分析は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＳＥＣ−４溶媒環境制御装置、Ｓｅｒｉｅｓ  ４００  ＬＣポンプ、ＴＳＳ  ２００  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＬＣサンプルプロセッサー及びＳｅｒｉｅｓ  ２００ダイオードアレイ検出器上で実施した。Ｒａｙｔｅｓｔ  ＧＡＢＩ  ｗｉｔｈ  Ｓｏｃｋｅｔ  ８１０３  ０１１１ピンホール（内径０．７ｍｍで容積２５０μＬ）フローセルγ線検出器が、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＮＣＩ  ９００  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅを介してインターフェースされた。使用したカラムは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＳＥＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、コード：１７−５１７４−０１，ＩＤ  ｎｏ．０６３９０５９）であった。
【０１４５】
ポリペプチド−Ｃｙｓ−ｍａｌ−ｃＰｎ２１６の非特異的Ｔｃ−９９ｍ標識の欠如
Ｔｃ−９９ｍ金属がポリペプチド構築物上の別の部位に配位していないことを確認するため、テクネチウム用還元剤としての塩化第一スズ、メチレンジホスホン酸、フリーラジカルスカベンジャーとしてのｐ−アミノ安息香酸塩、及び緩衝剤としての重炭酸ナトリウム／炭酸ナトリウム（ｐＨ９．２）の凍結乾燥混合物を含む一段階キット配合物（Ｃｈｅｌａｋｉｔ  Ａ＋）を用いて、ポリペプチド主鎖上にＴｃ−９９ｍを組み込む試みを行った。手早く続けて、Ｚ０２４６５（配列番号２３）−Ｃｙｓ−ＮＥＭの０．６９μｇ・μＬ-1食塩水溶液５０μＬをＣｈｅｌａｋｉｔに添加し、次いで直ちにＣａｒｄｉｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ社（オールバニー、米国ニューヨーク州）から入手した０．０５０ｍＬ食塩水（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）中のＮａ［99mＴｃＯ4］（０．５ｍＣｉ、１８．５ＭＢｑ）を添加した。混合物を１回撹拌し、周囲温度で２０分間静置した。２０分後、粗反応混合物のアリコートを取り出し、ＳＥＣ  ＨＰＬＣによって分析した。
【０１４６】
Ｈｉｓ及びＣｙｓチャレンジ試験−Ｚ０２４６５（配列番号２３）−Ｃｙｓ−ｃＰｎ２１６−99mＴｃ（Ｏ）2
ポリペプチド−ｃＰｎ−99mＴｃ（Ｏ）2構築物のインビトロ安定性をシステイン及びヒスチジンチャレンジによって測定した。十分な過剰量のチャレンジ剤を確保するため、存在するポリペプチド（標識又は非標識）の総量に比べて１０００倍過剰量のいずれかのアミノ酸を１０ｍＭ  ＰＢＳ溶液に添加し、３７℃で一晩インキュベートした（Ｌ−Ｈｉｓ及びＬ−Ｃｙｓモル量）。簡単に述べれば、上記［セクション「ポリペプチド−Ｃｙｓ−ｍａｌ−ｃＰｎ２１６のＴｃ−９９ｍ標識」］に記載したようにしてＺ０２４６５（配列番号２３）−Ｃｙｓ−ｃＰｎ−99mＴｃ（Ｏ）2を得た。８００μＬの１０ｍＭ  ＰＢＳ中に４０μｇ（５．１７×１０-9ｍｏｌ）以下のＺ０２４６５（配列番号２３）−Ｃｙｓ−ｃＰｎ２１６を含む約３００μＣｉの最終精製生成物を、２つの別々の１ドラムバイアル中に等分した。第１のバイアルには９７μＬのＬ−Ｈｉｓ（食塩水中１０ｍｇ／ｍＬで６．２５×１０-6ｍｏｌ）を添加し、バイアルにキャップを付け、３７℃の予熱した鉛反応ブロック上に置いた。第２の１ドラムバイアルには、１５１．４μＬのＬ−Ｃｙｓ（食塩水中５ｍｇ／ｍＬで６．２５×１０-6ｍｏｌ）を添加した。この第２のバイアルにもキャップを付け、鉛反応ブロック中に置いた。両溶液を３７℃に一晩維持した。ｔ＝７時間及びｔ＝２４時間にアリコートを取り出し、ＩＴＬＣで分析した。ｔ＝７時間では、Ｚ０２４６５（配列番号２３）−ｃＰｎ−99mＴｃ（Ｏ）2はＬ−Ｈｉｓによって３１．５％の分解を示し、Ｌ−Ｃｙｓによって６９％の分解を示した一方、２４時間後には、それぞれ７４．１％及び９３．６％の分解が認められた。
【０１４７】
ポリペプチド構築物の可変ｐＨ分析
ｃＰｎ２１６−99mＴｃ（Ｏ）2構築物は一般に、０．０６％アンモニア水溶液を水性移動相として用いるｐＨ９での逆相ＨＰＬＣによって分析される。これは、ＨＰＬＣによる生物学的構築物の分析のために広く使用されている酸性条件（即ち、水中０．０５％トリフルオロ酢酸）下におけるｃＰｎ２１６−99mＴｃ（Ｏ）2複合体の固有の不安定性及び急速な分解のためである。99mＴｃ（ＣＯ）3（Ｈｉｓ６）−ポリペプチド構築物は一層丈夫であり、水中０．０５％ＴＦＡを水性移動相として用いて分析できる。一連の99mＴｃ（ＣＯ）3（Ｈｉｓ６）標識ポリペプチド構築物（即ち、Ｚ２４６５変異体）を使用しながら、３種の水性移動相、即ち１）水中０．０５％ＴＦＡ（ｐＨ＜２）、２）５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ約７）及び３）水中０．０６％アンモニア（ｐＨ約９）を用いて化学的に丈夫なＨｉｓ６−誘導体を分析した。結果は塩基性ｐＨにおけるポリペプチドの異常なＨＰＬＣ挙動を実証しており、分析はｐＨ７以下で実施すべきことを示す。これらの結果に基づき、我々のポリペプチド−ｃＰｎ２１６−99mＴｃ（Ｏ）2構築物は通常のｐＨ９条件でなくｐＨ７で分析した。
【０１４８】
99mＴｃ−ポリペプチド−ｃＰｎ２１６コンジュゲートを試験するために使用した動物モデル
８〜１５週齢の範囲内の雌ＣＤ−１ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ社、ホプキントン、米国マサチューセッツ州）を用いてインビボ試験を実施した。マウスは換気ラック内に収容し、食物及び水を随意に与えると共に、標準的な１２時間昼夜照明サイクル下に置いた。異種移植のためには、マトリゲル及びＰＢＳの５０／５０（ｖ／ｖ）混合物中の細胞１００μｌを動物に注射した。細胞は左後四半部の皮下に移植した。移植はイソフルラン麻酔下で実施した。ＨＴ２９及びＵ８７に関しては、各マウスに３〜４×１０6個の細胞を移植した。Ｍ２３１に関しては、各マウスに１×１０7個の細胞を移植した。これらの条件下では、８０％を超える注射動物において３〜４週間で使用可能な腫瘍（１００〜３００μｇ）が得られた。
【０１４９】
Ｔｃ−９９ｍ−ポリペプチド−ｃＰｎ２１６コンジュゲートの生体分布
マウスに約１μｇのＴｃ−９９ｍ標識ポリペプチド（約３μＣｉ／１μｇ）の尾静脈注射を施した。マウスは安楽死まで濾紙で内張りしたケージ内に置いた。各時点で３頭のマウスを安楽死させ、検査対象組織を剔出し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ  Ｗｉｚａｒｄ  １４８０  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ上でカウントした。血液、腎臓、肝臓、脾臓及び注射部位（尾）に関してデータを収集した。ケージからの尿を膀胱と共にプールし、やはりカウントした。残りの組織をカウントし、各動物についてすべての組織及び尿の和を合計して総注射量を得た。この総量に基づいて各器官に関する％注射量を求め、器官を秤量することで１グラム当たりの％注射量（％ＩＤ／ｇ）を求めた。データは、各時点における全部で３頭のマウスに関する平均値として、各群の標準偏差を表す誤差バーと共に報告される。４時間にわたって４つの時点を選択した（注射後５、３０、１２０及び２４０分）。
【０１５０】
Ｚ０２４６５（配列番号２３）−ｃＰｎ２１６−Ｔｃ−９９ｍポリペプチドは標的発現Ｕ８７腫瘍中への高い腫瘍取込み量を示し、注射後（ＰＩ）３０分で組織１グラム当たり注射量の７．１５±３．３９％（ｎ＝６）の値を有するが、これは注射後２４０分までの試験期間を通じてかなり一定に保たれている。腫瘍：血液比は、注射後３０、１２０及び２４０分でそれぞれ５、１２及び１５であった。減少する血液値が主として腫瘍：血液比を経時的に高めている。図１９は、これらの実験に関する腫瘍曲線、血液曲線及び腫瘍：血液曲線を示す。
【０１５１】
対照として、非標的発現ＨＴ２９腫瘍を担持するマウスにポリペプチドを注射した。また、セクション「Ｈｉｓ６−ポリペプチド生体分布試験」における生体分布試験では、標的発現Ｕ８７腫瘍を担持するマウスにおいて非標的化Ｚｔａｑ（配列番号１０）ポリペプチドを調べてある。対照ＨＴ２９モデルでは、顕著な取込みは認められなかった。即ち、腫瘍：血液比は試験期間を通じて１〜２であり、絶対腫瘍取込み量は試験期間を通じて約１％ＩＤ／ｇであった。ＨＴ２９株及びＵ８７株の間における血液曲線はほぼ同一であり、観測される腫瘍取込み量の一因となる血管分布の差は排除されている。標的発現Ｕ８７腫瘍を担持するマウスに注射された非標的化Ｚｔａｑ（配列番号１０）ポリペプチドに関しては、同様な挙動が認められた。両対照とも、異種移植モデルにおいて、ＰＤＧＦ−Ｒβに対するＺ０２４６５（配列番号２３）−ｃＰｎ２１６−99mＴｃの非常に高度の特異性を示唆している。
【０１５２】
ポリペプチドは、２分未満の半減期を有する血液からの単一指数関数的なクリアランスを示す。このクリアランスは主として腎臓によって媒介され、注射後（ＰＩ）２４０分で３９．３０±７．３０％（ｎ＝１０）ＩＤ／器官である。放射能は主として尿中に分泌される。脾臓中へのポリペプチド取込み量は微小であり、肝臓中には低い取込み量が認められ、注射後３０分を過ぎた試験期間を通じて約１．５％ＩＤ／器官（マウスにおける値については％ＩＤ／ｇと同等）である。
【０１５３】
Ｚ０３３５８（配列番号２４）−ｃＰｎ２１６−Ｔｃ−９９ｍに関する生体分布結果
Ｚ０３３５８（配列番号２４）−ｃＰｎ２１６−Ｔｃ−９９ｍ及びＺ０２４６５（配列番号２３）−ｃＰｎ２１６−Ｔｃ−９９ｍの生体分布の間に顕著な差は認められなかった。図２１は、試験期間中における臨界器官取込み量を示す。
【０１５４】
Ｚ０２４６５（配列番号２３）−ＰＥＧ−ｃＰｎ２１６−Ｔｃ−９９ｍに関する生体分布結果
Ｚ０２４６５（配列番号２３）−ｃＰｎ２１６−Ｔｃ−９９ｍ及びＺ０２４６５（配列番号２３）−ＰＥＧ4−ｃＰｎ２１６−Ｔｃ−９９ｍの腫瘍取込み量の間に顕著な差は認められなかったが、ＰＥＧ化バージョンに関しては高い血液及び肝臓保持量が認められた。図２２は、試験期間中における臨界器官取込み量を示す。
【０１５５】
【表１０】
2012512233.tif 000016
【０１５６】
【表１１】
2012512233.tif 000017
生体分布：代謝試験
注射後ｔ＝５、３０、６０及び１２０分で各組織中に存在する放射性化学種のサイズ及び組成を決定するため、血液、尿、腎臓ホモジネート及び腫瘍ホモジネートから組織試料を集めた。腎臓及び腫瘍は剔出し、乳鉢及び乳棒を用いる機械的摩砕によってホモジナイズした。プロテアーゼ阻害剤（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、サンタクルズ、米国カリフォルニア州＃２４９４８）を含むＲＩＰＡ緩衝液中に放射性化学種を抽出し、すべての試料を１００００ｒｐｍで５分間遠心した。得られた上澄み液を取り出し、０．２μｍ  ＰＴＦＥフィルターで濾過した。０．５〜１μＣｉの「カラム上」標的放射能で存在する正味放射能によってＨＰＬＣ注入量を決定した。
【０１５７】
４種の別々の組織（即ち、５、３０、６０及び１２０分の時点における血液、尿、腎臓及び腫瘍）を剔出し、その放射能含有量を分析した。濾過及び遠心した組織ホモジネートに関し、各時点についてＩＴＬＣ、逆相ＨＰＬＣ及びサイズ排除ＨＰＬＣ分析を実施した。血液は、経時的に減少するシグナル／ノイズ比をもって注射トレーサーＺ０２４６５（配列番号２３）−ｃＰｎ２１６−99mＴｃ（Ｏ）2の存在を示したが、これは血液からのトレースの緩徐なクリアランスを示唆している。腎臓組織中に存在する放射性化学種を分析したところ、注射したトレーサーは（たとえあっても）僅かしか存在せず、大部分の放射能は低分子量の親水性化合物として存在していた。同様に、尿の分析によっても、小さい親水性の放射性化学種のみが排泄のため尿中に侵入したことが確認された。尿分析に関するシグナル：ノイズ比は経時的に増加し、放射能の経時的なインビボ蓄積を示しているが、これは生体分布データに一致した結果である。最後に、腫瘍ホモジネートの分析は、注射したトレーサーと同様な組成の放射性化学種の存在を示すと共に、分子量がそれより大きい化合物及び小さい化合物の存在も示した。逆相ＨＰＬＣ分析は、注射したトレーサーと同様な保持時間を有するピークを与えた。
【０１５８】
アミノキシ官能基を介してＦ−１８標識されたポリペプチド
Ｚ０２４６５（配列番号２３）−システインポリペプチドを、人工Ｃ末端システインを介してアミノキシ基で官能化した。提供されたポリペプチド分子の純度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって＞９５％と測定された。
【０１５９】
Ｍａｌ−アミノキシ（Ｍａｌ−ＡＯ）の合成
ポリペプチド分子中にＦ−１８を組み込むため、２つの直交基（即ち、人工システインへのコンジュゲーションのためのチオール反応性マレイミド基及びＦ−１８−アルデヒド反応性アミノキシ基）からなる二官能性リンカーＭａｌ−ＡＯを合成した。このリンカーを製造するためには、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）媒介カップリング条件を用いてＮ−（２−アミノエチル）マレイミドを２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノキシ）酢酸と反応させてＢｏｃ保護形態のリンカーを生成した。次いで、Ｂｏｃ保護基を酸開裂により脱保護することで、最終のＭａｌ−ＡＯ生成物を定量的収率で得た。最終生成物は、それ以上精製せずに直接使用した。
【０１６０】
ジクロロメタン、２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノキシ）酢酸、トリエチルアミン、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ）、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）及びその他すべての標準合成試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（セントルイス、米国ミズーリ州）から購入した。すべての化学薬品は、それ以上精製せずに使用した。ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カールスバッド、米国カリフォルニア州）から入手した。精製のためには、ＨＰＬＣ用酢酸エチル、ヘキサン、アセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  １８ｍΩ水を使用した。
【０１６１】
二官能性化合物ｔｅｒｔ−ブチル−２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−１−イル）エチルアミノ）−２−オキソエトキシカルバメート（図２３Ａ）（「Ｍａｌ−ＡＯ−Ｂｏｃ」と略示する）の製造手順
２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノキシ）酢酸（３８２ｍｇ、２ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（３０７μＬ、２．２ｍｍｏｌ）、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドＴＦＡ塩（５０８ｍｇ、２ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（３０６ｍｇ、２ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（４２０ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）を順次に添加した。室温で２４時間撹拌した後、反応混合物を酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム溶液（３×３０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）及びブライン（３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した。濾液を濃縮して淡黄色固体とし、これをカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中７０％酢酸エチル）で精製することで、生成物を白色粉末（５００ｍｇ、８０％収率）として得た。
【０１６２】
二官能性化合物２−（アミノキシ）−Ｎ−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−１−イル）エチル）アセトアミド塩酸塩（図２３Ｂ）（「Ｍａｌ−ＡＯ」と略示する）の製造手順
メタノール中３Ｍ  ＨＣｌの１ｍＬに９．３ｍｇのＭａｌ−ＡＯ−Ｂｏｃを溶解した溶液を室温で１８時間撹拌した。真空下で溶媒を除去することで、Ｍａｌ−ＡＯを淡黄色固体として得た。
【０１６３】
ポリペプチド分子に対するＭａｌ−ＡＯのバイオコンジュゲーション
新鮮な脱気ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）を用いて、ポリペプチドを約１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ポリペプチド中のジスルフィド結合を、新鮮な脱気ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）中のジチオトレイトール（ＤＴＴ）溶液の添加によって還元した。ＤＴＴの最終濃度は２０ｍＭである。反応混合物を２時間渦動させ、脱気ＰＢＳ緩衝液で予備平衡化したＺｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に通して過剰のＤＴＴ試薬を除去した。還元ポリペプチドを集め、（ポリペプチド１当量当たり２０当量の）二官能性化合物Ｍａｌ−ＡＯをＤＭＳＯ溶液として添加した。室温で一晩渦動させた後、反応混合物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した。
【０１６４】
ＨＰＬＣ精製は、ＭｉＣＨＲＯＭ  Ｍａｇｉｃ  Ｃ１８ＡＱ  ５μ  ２００Ａカラム（ＭｉＣｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ社、オーバーン、米国カリフォルニア州）上で実施した。溶媒Ａ：Ｈ2Ｏ（０．１％ギ酸を含む）、溶媒Ｂ：ＣＨ3ＣＮ（０．１％ギ酸を含む）。勾配：３０分で５〜１００％Ｂ。所望生成物を含む画分を合わせ、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液で中和し、凍結乾燥によって溶媒を除去することで、アミノキシ修飾ポリペプチドを白色固体（６２％収率）として得た。
【０１６５】
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析によれば、予想される分子量（Ｚ０２４６５（配列番号２３）−ＯＮＨ2に関するＭＷ計算値：７４５１Ｄａ、実測値：７４５１Ｄａ）をもった標的生成物の存在が確認された。２つのＯＮＨ2標識がポリペプチド分子に付加された副生物は認められなかった。
【０１６６】
放射性標識
総論：すべての反応は、窒素雰囲気下又は窒素でパージしたクリンプトップ密封バイアル中で実施した。Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ  ２２２（Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びＫ2ＣＯ3（ＥＭＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）は購入し、受け入れたままで使用した。Ｏｐｔｉｍａ（商標）グレードのアセトニトリルをＨＰＬＣ溶媒及び反応溶媒として使用した。
【０１６７】
［Ｆ−１８］ＫＦ（精製水中で４０ｍＣｉ・ｍＬ-1（１４８０ＭＢｑ・ｍＬ-1））をＩＢＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社（オールバニー、米国ニューヨーク州）又はＰＥＴＮＥＴ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社（オールバニー、米国ニューヨーク州）から入手し、受け入れたままで使用した。［Ｆ−１８］−フッ化物をまずＣｈｒｏｍａｆｉｘ  ３０−ＰＳ−ＨＣＯ3陰イオン交換カートリッジ（ＡＢＸ社、ラーデベルク、ドイツ）上に固定化し、次いでＫｒｙｐｔｏｆｉｘ  Ｋ２２２（３７６ｇ・ｍｏｌ-1、８ｍｇ、２．１３×１０-5ｍｏｌ）及び炭酸カリウム（１３８．２ｇ・ｍｏｌ-1、２．１ｍｇ、１．５２×１０-5ｍｏｌ）を含むアセトニトリル及びＨ2Ｏの４：１混合物１ｍＬを用いてドライダウン容器内に溶出した。穏やかに加熱（約４５℃）しながら部分真空及び窒素流下で溶媒を除去した（約１５分）。次に、Ｋ２２２（８ｍｇ）を含む０．５ｍＬのアセトニトリルで供給源バイアル及び陰イオン交換カートリッジを洗浄し、再び反応混合物を部分真空及び穏やかな加熱下で乾固した（約１０分）。反応器をＮ2で再加圧し、さらに０．５ｍＬのアセトニトリルを用いて共沸ドライダウンを１回繰り返した。４−ホルミル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアニリニウムトリフレート（３１３．３０ｇ・ｍｏｌ-1、３．１ｍｇ、９．８９×１０-6ｍｏｌ）を０．３５ｍＬの無水ＤＭＳＯ（Ａｃｒｏｓ社）に溶解し、［Ｆ−１８］ＫＦ・Ｋ２２２及びＫ2ＣＯ3を含む反応器に直接添加した。反応混合物を９０℃で１５分間加熱し、直ちに３ｍＬの蒸留脱イオンＨ2Ｏ（ｄｄＨ2Ｏ）で冷却しかつ奪活した。続いて、この混合物を陽イオン交換カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ  ＳｅｐＰａｋ  Ｌｉｇｈｔ  Ａｃｃｅｌｌ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８）に通し、ｄｄＨ2Ｏで１０ｍＬに希釈し、逆相Ｃ１８  ＳｅｐＰａｋ（Ｗａｔｅｒｓ  ＳｅｐＰａｋ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８）上に装填した。ＳｅｐＰａｋを１０ｍＬのｄｄＨ2Ｏでフラッシュし、次いで３０ｍＬの空気でパージした。［Ｆ−１８］４−フルオロベンズアルデヒド（［Ｆ−１８］ＦＢＡ）を１．０ｍＬのメタノールで溶出した。
【０１６８】
別途、高回収バイアル（２ｍＬ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にＺ０２４６５（配列番号２３）−Ｃｙｓ−ＯＮＨ2（０．３５〜０．５ｍｇ）を仕込んだ。固体を２５μＬのｄｄＨ2Ｏ及び８μＬのトリフルオロ酢酸中に懸濁した。メタノール中の［Ｆ−１８］ＦＢＡ（上記参照）２５μＬを反応バイアルに移した。容器にキャップを付け、クリンプ加工し、加熱ブロック中に配置し、６０℃に１５分間保った。この時点で分析ＨＰＬＣでの分析（図１）のために小アリコート（＜５μＬ）を取り出した。半分取ＨＰＬＣ精製のための準備として、０．１％ＴＦＡを含む４５０μＬのｄｄＨ2Ｏを用いて溶液を約５００μＬに希釈した。［Ｆ−１８］ＦＢ−ポリペプチドを半分取ＨＰＬＣによって単離精製した。生成物（０．１１３ｍＣｉ／４．１８ＭＢｑ）を含むＨＰＬＣ画分をｄｄＨ2Ｏで５：１に希釈し、次いでｔＣ１８  Ｐｌｕｓ  ＳｅｐＰａｋ（Ｗａｔｅｒｓ社）上に固定化した。ＳｅｐＰａｋをまず５ｍＬのｄｄＨ2Ｏで、次いで３０ｍＬの空気でフラッシュした。まずボイド容積（約０．５ｍＬ）を溶出させ、次いで２５０〜３００μＬの溶出液を独立のフラスコ内に集めることにより、［Ｆ−１８］ＦＢ−ポリペプチド（０．０７３ｍＣｉ、２．７０ＭＢｑ）を最小量のエタノール中に単離した。放射化学純度及び化学純度を確定するため、単離した生成物に関してＲＰ−ＨＰＬＣ分析を実施した。通例、製剤化後分析のためには１０μＬの０．１μＣｉ／μＬ溶液を注入した。単離放射化学収率は１６％（［Ｆ−１８］ＦＢＡ添加からの崩壊補正値２７％）であり、放射化学純度は＞９９％であった。反応時間は変動したが、平均は１４３±４８分であった。これは図２４に示されている。
【０１６９】
【表１２】
2012512233.tif 000018
使用した分析ＨＰＬＣ条件は次の通りである。分析は、Ｇ１３１１Ａ  ＱｕａｔＰｕｍｐ、１００μＬシリンジ及び２．０ｍＬシートキャピラリーを有するＧ１３１３Ａオートインジェクター、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、５μ、１００Å（Ｓ／Ｎ  ４２０４７７−１０））、Ｇ１３１６Ａカラムヒーター、Ｇ１３１５Ａ  ＤＡＤ並びにＲａｍｏｎ  Ｓｔａｒ−ＧＡＢＩγ線検出器を備えたＨＰ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００上で実施した。９５：５  ｄｄＨ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮ（０．０５％ＴＦＡを含む）、溶媒Ｂ：ＣＨ3ＣＮ（０．０５％ＴＦＡを含む）。勾配溶出（１．０ｍＬ・ｍｉｎ-1）：０分，０％Ｂ、１分，１５％Ｂ、２１分，５０％Ｂ、２２分，１００％Ｂ、２６分，１００％Ｂ、２７分，０％Ｂ、３２分，０％Ｂ（ＴＲ約１５分）又は勾配溶出（１．２ｍＬ・ｍｉｎ-1）：０分，０％Ｂ、１分，１５％Ｂ、１０分，３１％Ｂ、１０．５分，１００％Ｂ、１３．５分，１００％Ｂ、１４分，０％Ｂ、１７分，０％Ｂ（ＴＲ約１３．２分）。
【０１７０】
使用した半分取ＨＰＬＣ条件は次の通りである。精製は、ＤＧ−２０８０−５４  ４ラインデガッサー、ＭＸ−２０８０−３２ダイナミックミキサー、２台のＰＵ−２０８６  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅｐポンプ、大容量注入キットを取り付けたＡＳ−２０５５  Ｐｌｕｓ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔオートインジェクター、ガード（Ｓ／Ｎ  ２９５８６０−１、Ｐ／Ｎ  ００Ｇ−４２５２−Ｎ０）付きのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ５μ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）１００Å，２５０×１０ｍｍ，５μカラム、ＭＤ−２０５５  ＰＤＡ、及び固体ＳｉＰＩＮフォトダイオードγ線検出器に取り付けたＣａｒｒｏｌ  ＆  Ｒａｍｓｅｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｍｏｄｅｌ  １０５Ｓアナログレートメーターを備えたＪａｓｃｏ  ＬＣ上で実施した。勾配溶出：０分，５％Ｂ、３２分，２０％Ｂ、４３分，９５％Ｂ、４６分，９５％Ｂ、４９分，５％Ｂ。溶媒Ａ：ｄｄＨ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮ（０．０５％ＴＦＡを含む）、溶媒Ｂ：ＣＨ3ＣＮ（０．０５％ＴＦＡを含む）（ＴＲ約３９．５分。
【０１７１】
Ｆ−１８−ポリペプチド−アミノキシコンジュゲートを試験するために使用した動物モデル
８〜１５週齢の範囲内の雌ＣＤ−１ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ社、ホプキントン、米国マサチューセッツ州）を用いてインビボ試験を実施した。マウスは換気ラック内に収容し、食物及び水を随意に与えると共に、標準的な１２時間昼夜照明サイクル下に置いた。異種移植のためには、マトリゲル及びＰＢＳの５０／５０（ｖ／ｖ）混合物中の細胞１００μｌを動物に注射した。細胞は左後四半部の皮下に移植した。移植はイソフルラン麻酔下で実施した。ＨＴ２９及びＵ８７に関しては、各マウスに３〜４×１０6個の細胞を移植した。Ｍ２３１に関しては、各マウスに１×１０7個の細胞を移植した。これらの条件下では、８０％を超える注射動物において３〜４週間で使用可能な腫瘍（１００〜３００μｇ）が得られた。
【０１７２】
Ｚ０２４６５（配列番号２３）−フルオロベンジル−Ｆ−１８の生体分布
マウスに約１μｇのＦ−１８標識ポリペプチド（約２μＣｉ／１μｇ）の尾静脈注射を施した。マウスは安楽死まで濾紙で内張りしたケージ内に置いた。各時点で３〜５頭のマウスを安楽死させ、検査対象組織を剔出し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ  Ｗｉｚａｒｄ  １４８０  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ上でカウントした。血液、腎臓、肝臓、脾臓及び注射部位（尾）に関してデータを収集した。ケージからの尿を膀胱と共にプールし、やはりカウントした。残りの組織をカウントし、各動物についてすべての組織及び尿の和を合計して総注射量を得た。この総量に基づいて各器官に関する％注射量を求め、器官を秤量することで１グラム当たりの％注射量（％ＩＤ／ｇ）を求めた。データは、各時点における全部で３頭のマウスに関する平均値として、各群の標準偏差を表す誤差バーと共に報告される。
【０１７３】
ポリペプチドは、Ｕ８７細胞異種移植モデルにおいて生体分布試験を受けた。４時間にわたって４つの時点を選択した（注射後５、３０、１２０及び２４０分）。完全な生体分布データは表１１（Ｕ８７腫瘍担持マウスにおけるＺ０２４６５（配列番号２３）−フルオロベンジル−Ｆ−１８の％ＩＤ／ｇ）に含まれている。
【０１７４】
図２６及び図２７は、これらの実験に関する腫瘍、血液、腫瘍：血液及びクリアランス曲線を示す。
【０１７５】
Ｚ０２４６５（配列番号２３）−フルオロベンジル−Ｆ−１８ポリペプチドは標的発現Ｕ８７腫瘍中への高い腫瘍取込み量を示し、注射後（ＰＩ）３０分で組織１グラム当たり注射量の５．５３±０．７８％（ｎ＝５）の値を有する。腫瘍：血液比は、注射後３０、１２０及び２４０分でそれぞれ約５、１０及び３２であった。
【０１７６】
ポリペプチドは、２分未満の半減期を有する血液からの単一指数関数的なクリアランスを示す。このクリアランスは主として腎臓によって媒介され、注射後（ＰＩ）２４０分で２．３２±０．３０７％（ｎ＝５）ＩＤ／器官である。放射能は主として尿中に分泌される。脾臓中へのポリペプチド取込み量は微小であり、肝臓中には低い取込み量が認められ、（注射後４時間の）試験期間を通じて約０．５％ＩＤ／器官（マウスにおける値については％ＩＤ／ｇと同等）である。
【０１７７】
【表１３】
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ポリペプチドのヨウ素（Ｉ）放射性標識
すべての反応は、窒素雰囲気下又は窒素でパージしたクリンプトップ密封バイアル中で実施した。Ｏｐｔｉｍａ（商標）グレードのアセトニトリルをＨＰＬＣ溶媒及び反応溶媒として使用した。
【０１７８】
ポリペプチド（Ｚ０２４６５、配列番号２３）−ＯＮＨ2（０．３５〜０．５ｍｇ）を含む高回収バイアル（２ｍＬ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に［123Ｉ］４−ヨードベンズアルデヒド（［123Ｉ］ＩＢＡ）を添加する。反応は、ポリペプチドを２５μＬのｄｄＨ2Ｏに溶解し、８μＬのトリフルオロ酢酸を添加し、次いでメタノール中の［123Ｉ］ＩＢＡを添加することで開始する。容器にキャップを付け、クリンプ加工し、加熱ブロック中に配置し、６０℃に１５分間保つ。反応状態を評価するため、分析ＨＰＬＣでの分析のためのアリコート（＜５μＬ）を取り出する。半分取ＨＰＬＣ精製のための準備として、０．１％ＴＦＡを含むｄｄＨ2Ｏ及びアセトニトリルの１：１混合物の最小量に希釈する。［123Ｉ］ＩＢ−ポリペプチドを半分取ＨＰＬＣ又はＮＡＰ５サイズ排除クロマトグラフィーによって単離精製する。生成物を含むＨＰＬＣ画分をｄｄＨ2Ｏでさらに希釈（５：１）し、次いでｔＣ１８  Ｐｌｕｓ  ＳｅｐＰａｋ（Ｗａｔｅｒｓ社）上に固定化した。ＳｅｐＰａｋをまず５ｍＬのｄｄＨ2Ｏで、次いで３０ｍＬの空気でフラッシュした後、まずボイド容積（約０．５ｍＬ）を溶出させ、次いで２５０〜３００μＬの溶出液を独立のフラスコ内に集めることにより、［123Ｉ］ＩＢ−ポリペプチドを最小量のエタノール中に得る。放射化学純度及び化学純度を確定するため、単離した生成物に関してＲＰ−ＨＰＬＣ分析を実施する。
【０１７９】
ポリペプチドのガドリニウム（Ｇｄ）放射性標識
ポリペプチドＺ２４６５（配列番号１６）にＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ，Ｎ"'−四酢酸）キレーターをコンジュゲートした後、ポリペプチドをＧｄ（詳しくはＧｄ−１５３）で標識した。
【０１８０】
ポリペプチド分子に対するＭａｌ−ＤＯＴＡのバイオコンジュゲーションを次のようにして実施した。新鮮な脱気ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）を用いて、ポリペプチドを約１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ポリペプチド中のジスルフィド結合を、新鮮な脱気ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）中のＤＴＴ溶液の添加によって還元した。ＤＴＴの最終濃度は２０ｍＭであった。反応混合物を２時間渦動させ、脱気ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）で予備平衡化したＺｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に通して過剰のＤＴＴ試薬を除去した。溶出する還元ポリペプチド分子を集め、（ポリペプチド１当量当たり１５当量の）二官能性化合物ｍａｌ−ＤＯＴＡをＤＭＳＯ溶液として添加し、混合物を室温で渦動させた。ポリペプチド分子の完全な転化を保証するため、反応を一晩進行させた。
【０１８１】
ＨＰＬＣ精製は、ＭｉＣＨＲＯＭ  Ｍａｇｉｃ  Ｃ１８ＡＱ  ５μ  ２００Ａカラム（ＭｉＣｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ社、オーバーン、米国カリフォルニア州）上で実施した。溶媒Ａ：Ｈ2Ｏ（０．１％ギ酸を含む）、溶媒Ｂ：ＣＨ3ＣＮ（０．１％ギ酸を含む）。勾配：３０分で５〜１００％Ｂ。
【０１８２】
所望生成物を含む画分を合わせ、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液で中和し、凍結乾燥によって溶媒を除去することで、コンジュゲート化ポリペプチドを白色固体として得た。
【０１８３】
精製生成物のＬＣ−ＭＳ分析では所望生成物の存在が確認され、ポリペプチド構築物にただ１つのＤＯＴＡキレーターが付加されていることを示唆していた（Ｚ２４６５（配列番号１６）−ＤＯＴＡに関するＭＷ計算値：８５８７Ｄａ、実測値：８５８８Ｄａ）。
【０１８４】
続いて、放射性標識を次のようにして実施した。１０μｌの酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ＝６．７５）をスクリュートップバイアルに添加し、０．１Ｍ  ＨＣｌ中の153ＧｄＣｌ3（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）９５μｌ（４．１ＭＢｑ）を添加した。次いで、５０μｌのＨ2Ｏ中のＺ２４６５（配列番号１６）−ＤＯＴＡポリペプチド４００μｇ（ＭＷ＝８５８７ｇ・ｍｏｌ-1、４．７×１０-8ｍｏｌ）を反応混合物に添加して、０．３ｍＭの最終Ｚ２４６５（配列番号１６）−ＤＯＴＡ濃度及び４．５のｐＨを得た。反応バイアルを密封し、反応物を周囲温度に保った。粗反応混合物の逆相ＨＰＬＣ分析によれば、Ｇａ−６７−ＮＯＴＡ  Ｈｅｒ２ポリペプチドの放射化学純度は９日後に６４％であることがわかった（図２９）。Ｚ２４６５（配列番号１６）−ＤＯＴＡポリペプチドをＨＰＬＣで精製したところ、０．０６５ｍＣｉ（２．４ＭＢｑ）のＺ２４６５（配列番号１６）−ＤＯＴＡ（収率＝５７％）が得られた。ＨＰＬＣ溶媒を真空下で除去することで、約０．６ｍＬの残留溶媒を含む最終溶液を得た。次いで、約０．９ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝食塩水を添加することで、０．０４３ｍＣｉ／ｍＬ（１．６ＭＢｑ／ｍＬ）の最終濃度を有するｐＨ７の最終溶液が得られた。精製して製剤化したＺ２４６５（配列番号１６）−ＤＯＴＡポリペプチドは、−７０℃で貯蔵した場合、４３日以上にわたって安定であることが判明した（図３０）。
【０１８５】
使用した分析ＨＰＬＣ条件は次の通りである。カラム：Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ  Ｃ４  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５ミクロン，３００Å，４．６×２５０ｍｍ。溶媒Ａ＝９５／５  Ｈ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮ（０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む）。溶媒Ｂ＝９５／５  ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ（０．０５％ＴＦＡを含む）。ＨＰＬＣ勾配：０分，０％Ｂ、４分，２０％Ｂ、１６分，６０％Ｂ、２０分，１００％Ｂ、２５分，１００％Ｂ、２６分，０％Ｂ。
【０１８６】
使用した半分取ＨＰＬＣ条件は次の通りである。カラム：Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ  Ｃ４  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５ミクロン，３００Å，４．６×２５０ｍｍ。溶媒Ａ＝９５／５  Ｈ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮ（０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む）。溶媒Ｂ＝９５／５  ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ（０．０５％ＴＦＡを含む）。ＨＰＬＣ勾配：０分，０％Ｂ、４分，２０％Ｂ、１６分，６０％Ｂ、２０分，１００％Ｂ、２５分，１００％Ｂ、２６分，０％Ｂ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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