(57)【要約】  本発明はＣＸ３ＣＲ１レセプタのモジュレータに関する。より詳しくは、ＣＸ３ＣＲ１レセプタのアンタゴニストとアゴニストが特定された。これ等拮抗質及び作動物質は、炎症性疾患、自己免疫疾患、心臓血管疾病、神経変性疾患、対宿主性移植片病、行動障害、瘢痕化疾患、ウイルス性感染症、癌又は疼痛の治療に用いることができる。また、ワクチン組成における添加剤として用いても良い。
2012511921.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離及び/又は純化したヒトＣＸ３ＣＲ１受容体モジュレータであって、該モジュレータは配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７(配列ＩＤ番号：１)又はＸ１−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７(配列ＩＤ番号：２)をそのＮ末端終端に含んで成り、ここで
‐Ｘ１はＩ，Ｔ，Ｆ，Ｑ，Ｓ，Ｗ，Ａ，Ｇ，Ｎ又はＶ、
‐Ｘ２はそれがある場合に、Ｌ，Ｐ又はＲ、
‐Ｘ３はＤ，Ａ，Ｑ，Ｇ，Ｌ，Ｉ，Ｐ，Ｈ，Ｆ，Ｖ又はＳ、
‐Ｘ４はＮ，Ｑ，Ｇ，Ｓ，Ｌ，Ｒ，Ｆ，Ｈ，Ｖ，Ｍ，Ｙ又はＰ、
‐Ｘ５はＶ，Ａ，Ｄ又はＧ、
‐Ｘ６はＬ，Ｍ又はＶ、
‐Ｘ７はＳ，Ｐ，Ｔ又はＡであり、
且つ、配列ＩＤ番号：２が配列ＱＨＨＧＶＴ(配列ＩＤ番号：５２)又はＱＨＬＧＭＴ（配列ＩＤ番号：５３）からは成らないモジュレータ。
【請求項２】
前記モジュレータがアンタゴニストであり、配列ＩＤ番号：１又は２の前記配列が次の（i）〜（vi）、即ち
（i）配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：１）又はＸ１−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：２），ここで
‐Ｘ１はＩ，Ｔ，Ｆ，Ｑ，Ｓ，Ｗ又はＶ、
‐Ｘ２はそれがある場合に、Ｌ，Ｐ又はＲ、
‐Ｘ３はＤ，Ａ，Ｑ，Ｇ，Ｌ，Ｉ，Ｐ又はＳ、
‐Ｘ４はＮ，Ｑ，Ｇ，Ｓ，Ｌ，Ｒ，Ｆ，Ｈ又はＰ、
‐Ｘ５はＶ，Ａ，Ｄ又はＧ、
‐Ｘ６はＬ又はＶ、
‐Ｘ７はＳ，Ｐ，Ｔ又はＡ
（ii）配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：１）、ここで
‐Ｘ１はＩ，Ｔ，Ｆ，Ｑ，Ｓ又はＷ、
‐Ｘ２はＬ，Ｐ又はＲ、
‐Ｘ３はＤ，Ａ，Ｑ，Ｇ，Ｌ，Ｉ，Ｐ又はＳ、
‐Ｘ４はＮ，Ｑ，Ｇ，Ｓ，Ｌ，Ｒ，Ｆ，Ｈ又はＰ、
‐Ｘ５はＶ，Ａ，Ｄ又はＧ、
‐Ｘ６はＬ又はＶ、
‐Ｘ７はＳ，Ｐ，Ｔ又はＡ
（iii）配列Ｘ１−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｌ−Ｘ７（配列ＩＤ番号：３）、ここで
‐Ｘ１はＱ又はＶ、
‐Ｘ３はＱ，Ｌ又はＳ、
‐Ｘ４はＳ，Ｌ又はＦ、
‐Ｘ５はＶ又はＡ
‐Ｘ７はＳ又はＰ
（iv）配列Ｘ１−Ｌ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：４）、ここで
‐Ｘ１はＩ，Ｔ，Ｆ，Ｓ又はＷ、
‐Ｘ３はＤ，Ａ，Ｑ，Ｇ，Ｉ，Ｐ又はＳ、
‐Ｘ４はＮ，Ｑ，Ｇ，Ｓ，Ｌ，Ｒ，Ｈ又はＰ、
‐Ｘ５はＶ，Ｄ又はＧ、
‐Ｘ６はＬ又はＶ、
‐Ｘ７はＳ，Ｐ，Ｔ又はＡ
（v）配列Ｑ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ａ（配列ＩＤ番号：５）、ここで
‐Ｘ２はＰ又はＲ、
‐Ｘ３はＤ又はＬ、
‐Ｘ４はＳ又はＦ、
‐Ｘ５はＶ又はＡ、
‐Ｘ６はＬ又はＶ、及び
(vi)配列Ｉ−Ｌ−Ｄ−Ｘ４−Ｇ−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：６）、ここで
‐Ｘ４は任意のアミノ酸、
‐Ｘ６はＬ又はＶ
‐Ｘ７はＡ又はＳ
から成る群から選ばれる請求項１のモジュレータ。
【請求項３】
配列ＩＤ番号：１又は２の前記配列が次のもの、即ち
‐ＩＬＤＮＧＶＳ（配列ＩＤ番号：８）
‐ＴＬＡＱＧＬＰ（配列ＩＤ番号：９）
‐ＩＬＤＧＧＶＳ（配列ＩＤ番号：１０）
‐ＦＬＱＳＤＶＡ（配列ＩＤ番号：１１）
‐ＩＬＤＬＧＬＳ（配列ＩＤ番号：１２）
‐ＩＬＤＬＧＬＴ（配列ＩＤ番号：１３）
‐ＩＬＤＮＧＶＡ（配列ＩＤ番号：１４）
‐ＩＬＧＲＤＶＡ（配列ＩＤ番号：１５）
‐ＱＰＬＦＡＶＡ（配列ＩＤ番号：１６）
‐ＱＲＤＳＶＬＡ（配列ＩＤ番号：１７）
‐ＳＬＤＨＧＬＳ（配列ＩＤ番号：１８）
‐ＳＬＩＰＶＶＰ（配列ＩＤ番号：１９）
‐ＴＬＰＱＧＬＡ（配列ＩＤ番号：２０）
‐ＷＬＳＱＧＬＡ（配列ＩＤ番号：２１）
‐ＱＳＬＶＬＰ（配列ＩＤ番号：２２）
‐ＱＬＦＡＬＳ（配列ＩＤ番号：２３）及び
‐ＶＱＳＶＬＳ（配列ＩＤ番号：２４）
から成る群より選ばれる請求項２のモジュレータ。
【請求項４】
モジュレータはアゴニストであって、配列ＩＤ番号：1又は２の前記配列が配列Ｘ１−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：２）であり、ここで
‐Ｘ１はＱ，Ａ，Ｇ又はＮ、
‐Ｘ３はＰ，Ａ，Ｈ，Ｌ，Ｓ，Ｆ又はＶ、
‐Ｘ４はＧ，Ｑ，Ｖ，Ｍ，Ｌ，Ｓ，Ｐ，Ｈ，Ｒ又はＹ、
‐Ｘ５はＡ又はＧ
‐Ｘ６はＬ，Ｍ又はＶ
‐Ｘ７はＳ，Ｐ，Ｔ又はＡ
である請求項１のモジュレータ。
【請求項５】
配列ＩＤ番号：２の前記配列が次のもの、即ち
‐ＱＰＧＧＶＳ（配列ＩＤ番号：２５）
‐ＱＰＱＡＶＳ（配列ＩＤ番号：２６）
‐ＱＰＶＡＬＡ（配列ＩＤ番号：２７）
‐ＱＰＶＧＬＳ（配列ＩＤ番号：２８）
‐ＡＡＱＧＭＳ（配列ＩＤ番号：２９）
‐ＱＰＧＡＶＳ（配列ＩＤ番号：３０）
‐ＱＰＭＧＶＡ（配列ＩＤ番号：３１）
‐ＱＰＱＧＬＡ（配列ＩＤ番号：３２）
‐ＱＰＶＡＶＡ（配列ＩＤ番号：３３）
‐ＱＨＬＧＬＳ（配列ＩＤ番号：３４）
‐ＱＬＱＧＬＡ（配列ＩＤ番号：３５）
‐ＱＰＳＡＬＳ（配列ＩＤ番号：３６）
‐ＱＳＬＧＶＳ（配列ＩＤ番号：３７）
‐ＧＰＱＡＭＳ（配列ＩＤ番号：３８）
‐ＮＰＱＡＬＳ（配列ＩＤ番号：３９）
‐ＱＦＰＧＶＳ（配列ＩＤ番号：４０）
‐ＱＬＬＧＶＳ（配列ＩＤ番号：４１）
‐ＱＰＨＧＶＡ（配列ＩＤ番号：４２）
‐ＱＰＲＡＬＰ（配列ＩＤ番号：４３）
‐ＱＰＳＡＬＴ（配列ＩＤ番号：４４）
‐ＱＰＳＧＭＳ（配列ＩＤ番号：４５）
‐ＱＰＶＡＶＳ（配列ＩＤ番号：４６）
‐ＱＰＹＧＭＳ（配列ＩＤ番号：４７）
‐ＱＰＹＧＶＳ（配列ＩＤ番号：４８）
‐ＱＳＰＧＭＳ（配列ＩＤ番号：４９）
‐ＱＶＱＧＶＴ（配列ＩＤ番号：５０）及び
‐ＱＰＱＧＶＳ（配列ＩＤ番号：５１）
から成る群より選ばれる請求項４のモジュレータ。
【請求項６】
単離及び/又は純化したヒトＣＸ３ＣＲ１受容体モジュレータであって、該モジュレータは配列Ｘ１−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７(配列ＩＤ番号：７)をそのＮ末端終端に含むアゴニストであり、ここで
‐Ｘ１は任意のアミノ酸、
‐Ｘ３は任意のアミノ酸、
‐Ｘ４は任意のアミノ酸、
‐Ｘ５はＶ，Ａ，Ｄ又はＧ、
‐Ｘ６はＬ，Ｍ又はＶ、
‐Ｘ７はＳ，Ｐ，Ｔ又はＡであり、
且つ、配列ＩＤ番号：７が配列ＱＨＨＧＶＴ(配列ＩＤ番号：５２)又はＱＨＬＧＭＴ（配列ＩＤ番号：５３）からは成らないモジュレータ。
【請求項７】
前記モジュレータが、配列ＩＤ番号：５５又は５６の少なくとも１０個のアミノ酸の断片を含むポリペプチドから成る請求項１のモジュレータ。
【請求項８】
前記ポリペプチドが配列ＩＤ番号：５５のアミノ酸１〜７７又は配列ＩＤ番号５６のアミノ酸１〜７６を含む、又はから成るモジュレータ。
【請求項９】
前記モジュレータのＮ末端終端が配列ＩＤ番号８〜５１の何れか１つの配列から成る請求項７のモジュレータ。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが更に免疫グロブリンの断片を含む請求項７のモジュレータ。
【請求項１１】
前記モジュレータがペプチドである請求項１のモジュレータ。
【請求項１２】
ヒトＣＸ３ＣＬ１ポリペプチドの単離及び／又は純化突然変異体であって、前記突然変異体の成熟同形のＮ末端終端が
配列ＩＤ番号１〜５１の何れか１つの配列から成り、
ＱＨＨＧＶＴ（配列ＩＤ番号：５２）又はＱＨＬＧＭＴ（配列ＩＤ番号：５３）からは成らない突然変異体。
【請求項１３】
請求項１〜１１の何れか１つに記載のモジュレータ又は請求項１２に記載の突然変異体、を符号化する核酸。
【請求項１４】
請求項１〜１１の何れか１つに記載のモジュレータ、請求項１２に記載の突然変異体又は請求項１３に記載の核酸、生理学的許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
前記医薬組成物が免疫抗原性分子を含むワクチンである請求項１４の医薬組成物。
【請求項１６】
前記生理学的許容可能な担体がヒドロゲルマトリックスであり、前記モジュレータ、ポリペプチド又は核酸がヒドロゲルマトリックスに共有結合で結合されている請求項１４の医薬組成物。
【請求項１７】
炎症性疾患、自己免疫疾患、心臓血管疾病、神経変性疾患、対宿主性移植片病、行動障害、瘢痕化疾患、ウイルス性感染症、癌又は疼痛から成る群から選ばれた疾病を治療又は予防する方法であって、請求項１〜１１の何れか１つに記載のモジュレータ、請求項１２に記載の突然変異体又は請求項１３に記載の核酸の有効量を、それを要する個体に投与する処置を含む方法。
【請求項１８】
前記モジュレータが非経口又は局所経路を通して投与されて成る請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記モジュレータがアンタゴニストであり、前記疾病が炎症性疾患、自己免疫疾患、心臓血管疾病、神経変性疾患、癌及び対宿主性移植片病から成る群から選ばれた疾病である請求項１７の方法。
【請求項２０】
前記疾病が多発性硬化症、リューマチ様関節炎、紅斑性狼瘡、炎症性腸疾患及び潰瘍性大腸炎から成る群から選ばれた自己免疫疾患である請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記疾病がアテローム性動脈硬化症である請求項１９の方法。
【請求項２２】
前記疾病が乳癌、結腸癌及びリンパ腫から選ばれた癌である請求項１９の方法。
【請求項２３】
前記モジュレータがアゴニストであり、前記疾病がウイルス性感染症及び活動性や注意力の障害等の行動障害から成る群より選ばれた疾病である請求項１７の方法。
【請求項２４】
前記疾病がＨＩＶ感染である請求項２３の方法。
【請求項２５】
抗癌（腫瘍）反応又は瘢痕形成を刺激する方法であって、請求項１〜１１の何れか１つに記載のモジュレータ、請求項１２に記載の突然変異体又は請求項１３に記載の核酸の有効量を、それを要する個体に投与する処置む方法。
【請求項２６】
個体にワクチン接種する方法であって、請求項１〜１１の何れか１つに記載のアゴニスト、請求項１２に記載の突然変異体又は請求項１３に記載の核酸の有効量を前記個体に投与する処置を含む方法。
【請求項２７】
請求項１〜１１の何れか１つに記載のモジュレータ又は請求項１２に記載の突然変異体を生成する方法であって、
ａ）請求項１３に記載の核酸を含む宿主細胞を用意し、
ｂ）前記宿主細胞を、前記モジュレータ又は突然変異体の発現に適した条件下で培養し、
ｃ）前記モジュレータ又は突然変異体を単離する
手順を含む方法。
【請求項２８】
更に、前記モジュレータ又は突然変異体を純化する手順を含む請求項２７の方法。
【請求項２９】
前記モジュレータ又は突然変異体を医薬組成に配合する手順を含む請求項２８の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣＸ３ＣＲ１受容体のモジュレータに関する。より詳しくは、ＣＸ３ＣＲ１受容体（レセプタ）の拮抗質（アンタゴニスト）と作動物質（アゴニスト）が特定された。これ等の拮抗質（拮抗体）及び作動物質（作動体）は、炎症性疾患、自己免疫疾患、心臓血管疾病、神経変性疾患、対宿主性移植片病、行動障害、瘢痕形成疾患、ウイルス性感染症、癌又は疼痛の治療に用いることができる。それ等はまた、ワクチン組成における添加剤として用いても良い。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは、恒常及び炎症状態に交通する白血球に含まれる一系統の微小分泌タンパク質（典型的には８−１０ｋDａ）である。それ等は、それ等のレセプタとともに、生理学的または病理学的状態における白血球移動を変調する標的として識別されている。
【０００３】
ケモカインＣＸ３ＣＬ１（フラクタルカインとも呼ばれる）は可溶性の、且つ膜アンカード形式として存在する（Imai et al. (1997) Cell 91, 521-530）と云う意味で、他のケモカインから構造的に区別できる。それは膜アンカーされて、その唯一のレセプタであるＣＸ３ＣＲ１を発現する白血球のセレクチン及びインテグリン独立接着を促進する。他方、生ＣＸ３ＣＬ１の劈開により生成される可溶性ＣＸ３ＣＬ１は有力な化学誘引物質である。
【０００４】
Koposiの肉腫ヘルペスウィルスにより符号化されるｖＭＩＰ−II（Kledal et al. 1997, Science 277(5332): 1656-9; Chen et al. 1998, J Exp Med 188 (1): 193-8）等のタンパク質及びＲＳＶ  Ｇタンパク質（Harcourt et al. 2006, J Immunol 176 (3): 1600-8）はＣＸ３ＣＲ１及びＣＸ３ＣＬ１と結合して、それ等の活性度を変調することが示されている。だが、ＣＸ３ＣＲ１及び/又はＣＸ３ＣＬ１に対するそれ等の結合性（親和力）は低く、従って適切な治療的化合物候補とはならない。
【０００５】
突然変異ＣＸ３ＣＬ１タンパク質は、Mizoue et al. (2001, J Biol Chem 276, 33906-33914)とDavis et al. (2004, Pharmacol. 66, 1431-1439)とInoue et al. (2005, Arthritis Rheum 52, 1522-33)により記述されている。即ち、Mizoue et al. (2001, J Biol Chem 276, 33906-33914)はＣＸ３ＣＬ１へのＮ末端変異が結果として生物活性の低下したタンパク質を生ずることを報告した。Davis el al. (2004)はキメラＣＸ３ＣＬ１−ＭＩＰ−II融合タンパク質と、アミノ酸９−１１が削除されている突然変異ヒトＣＸ３ＣＬ１タンパク質の両方を記述した。だが、これ等のタンパク質の示した結合性は低い。Inoue et al. (2005)は、４つのＮ端末残基を欠くネズミのＣＸ３ＣＬ1はネズミのＣＸ３ＣＬ1に対して拮抗物質として作用することを報告した。だが、この化合物がヒトＣＸＣＲ１にも結合すると云う証拠は無い。更に、ヒトＣＸ３ＣＬ１の最初の７つの残基の除去がＣＸ３ＣＲ１に対して親和性の低い不活性アナログを生成することが示されている(Mizoue el al., 2001)。
【０００６】
ＣＸ３ＣＲ１及びＣＸ３ＣＬ１は多数の炎症性疾患で暗示されていた(Umehara et al. 2001, Trends Immunol 22, 602-7; Stievano et al. 2004, Crit Rev Immunol 24, 205-28)。例えば、内皮細胞において、ストレスと炎症性サイトカインの両方がＣＸ３ＣＬ１発現を上方調整する(Umehara et al. 2004, Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 34-40)。細胞毒性ＣＴ８Ｔ細胞やＮＫ細胞等のＣＸ３ＣＲ１発現白血球の糸球体への漸増は糸球体腎炎(Chen et al. 1998, J. Exp. Med. 188, 193-198)及び狼瘡腎炎(Inoue et al. 2005, Arthritis Rheum 52, 1522-33)に関係するようである。更に、炎症性血管ＣＸ３ＣＬ１＋内皮はＣＸ３ＣＲ１＋単核細胞を捕捉して細胞蓄積の主要成分となり、これがマウス(Combadiere et al. 2003, Circulation 107, 1009-16; Lesnik et al. 2003, J Clin Invest 111, 333-40)及びヒト(Moatti et al. 2001, Blood 97, 1925-8)におけるアテローム発生を惹き起す。最後に、ＣＸ３ＣＲ１＋白血球の漸増はリウマチ様動脈炎(Ruth et al. 2001, Arthritis Rheum 44, 1568-81)及び炎症性腸疾患(Brand et al. 2006, Am J Gastroenterol 101, 99-106)において働きをする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
非特許文献１：Imai et al. (1997) Cell 91, 521-530
非特許文献２：Kledal et al. 1997, Science 277(5332): 1656-9
非特許文献３：Chen et al. 1998, J Exp Med 188 (1): 193-8
非特許文献４：Harcourt et al. 2006, J Immunol 176 (3): 1600-8
非特許文献５：Mizoue et al. 2001, J Biol Chem 276, 33906-33914
非特許文献６：Davis et al. 2004, Pharmacol. 66, 1431-1439
非特許文献７：Inoue et al. 2005, Arthritis Rheum 52, 1522-33
非特許文献８：Umehara et al. 2001, Trends Immunol 22, 602-7
非特許文献９：Stievano et al. 2004, Crit Rev Immunol 24, 205-28
非特許文献１０：Umehara et al. 2004, Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 34-40
非特許文献１１：Combadiere et al. 2003, Circulation 107, 1009-16
非特許文献１２：Lesnik et al. 2003, J Clin Invest 111, 333-40)
非特許文献１３：Moatti et al. 2001, Blood 97, 1925-8
非特許文献１４：Ruth et al. 2001, Arthritis Rheum 44, 1568-81
非特許文献１５：Brand et al. 2006, Am J Gastroenterol 101, 99-106
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、ＣＸ３ＣＲ１モジュレータは有望な抗炎症薬であり、従来、新規、且つ有力なＣＸ３ＣＲ1モジュレータを特定するニーズがあった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
作動及び拮抗ＣＸ３ＣＲ１モジュレータの両方を特定するのにファージ表示策を用いた。かなり多くの作動性及び拮抗性ＣＸ３ＣＲ１モジュレータが特定された（配列ＩＤ番号：７−５０）。これ等のＣＸＣＲ１モジュレータはＣＸＣＲ１モジュレータのコンセンサス配列を定義できた(配列ＩＤ番号：１−６、５１)。本明細書に記載のＣＸ３ＣＲ１モジュレータは生ヒトＣＸ３ＣＬ１のものに近い見掛けＣＸ３ＣＲ１結合親和性を示している。更に、これ等のＣＸ３ＣＲ１モジュレータは自然発生アミノ酸のみを含む完全組換えＣＸ３ＣＬ１類似体であり、従って低コスト生産に適している。
【００１０】
斯く特定された１つの拮抗性モジュレータ（Ｆ１と呼ぶ）が更に特徴付けられた。Ｆ１は専らＣＸ３ＣＲ１を発現するヒト細胞に結合し、生ＣＸ３ＣＬ１のものに近いＫｄ値を有した。だが、Ｆ１は化学走性、カルシウムフラックス又はＣＸ３ＣＲ１内在化を誘発しなかったので、信号伝達分子ではない。更に、それはＣＸ３ＣＬ１誘導カルシウムフラックスと、ヒト及びマウス両方のＣＸ３ＣＲ１発現一次細胞における走化性を５−５０ｎＭのＩＣ５０で有効に抑止した。それはまた、ＣＸ３ＣＬ１−ＣＸ３ＣＲ１軸を介してもたらされる細胞接着を効果的に抑止した。最後に、Ｆ１は腹膜炎の非感染ネズミのモデルにおいてＣＸ３ＣＲ１＋単核細胞（単球）の腹膜漸増を部分的に抑制した。
【００１１】
本発明は従って、ヒトＣＸ３ＣＲ１の作動体（アゴニスト）及び拮抗体（アンタゴニスト）に関する。斯かるモジュレータは、ＣＸ３ＣＲ１抑制により作用する抗炎症薬の開発のための主役化合物として用いることができる。
【００１２】
本発明によるモジュレータ
【００１３】
本発明は単離及び/又は純化したヒトＣＸ３ＣＲ１受容体モジュレータに関し、該モジュレータは配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７(配列ＩＤ番号：１)又はＸ１−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７(配列ＩＤ番号：２)を含んで成り、ここで
Ｘ１はＩ，Ｔ，Ｆ，Ｑ，Ｓ，Ｗ，Ａ，Ｇ，Ｎ又はＶ、
Ｘ２はそれがある場合に、Ｌ，Ｐ又はＲ、
Ｘ３はＤ，Ａ，Ｑ，Ｇ，Ｌ，Ｉ，Ｐ，Ｈ，Ｆ，Ｖ又はＳ、
Ｘ４はＮ，Ｑ，Ｇ，Ｓ，Ｌ，Ｒ，Ｆ，Ｈ，Ｖ，Ｍ，Ｙ又はＰ、
Ｘ５はＶ，Ａ，Ｄ又はＧ、
Ｘ６はＬ，Ｍ又はＶ、
Ｘ７はＳ，Ｐ，Ｔ又はＡであり、
ここで、配列ＩＤ番号：２は配列ＱＨＨＧＶＴ(配列ＩＤ番号：５２)又はＱＨＬＧＭＴ（配列ＩＤ番号：．５３）からは成らない。配列ＩＤ番号：１又は配列ＩＤ番号：２の前記配列は好ましくは前記モジュレータNの末端終端に位置する。
【００１４】
用語「モジュレータ」は本明細書で用いるとき、ＣＸ３ＣＲ１受容器（レセプタ）に結合し、その生物活性を変調する化合物を指す。このモジュレータは拮抗体（即ち、ＣＸ３ＣＲ１受容体の生物活性を低下又は抑制する）又は作動体（ＣＸ３ＣＲ１受容体の生物活性を誘発又は増大する）の何れに対応しても良い。
【００１５】
用語「ＣＸ３ＣＲ１受容体」は本明細書で用いるとき、ＣＸ３ＣＬ１ケモカインの受容体を指す。ＣＸ３ＣＲ１受容体は、ヒト染色体位置３ｐ２１．３にあるＣＸ３ＣＲ１遺伝子により符号化される(Entrez Gene ID: 1524)。用語「ＣＸ３ＣＲ１受容体」は配列ＩＤ番号：６３のタンパク質及びその自然発生変種、例えばスプライス変種、多形性変種及びタンパク分解処理により得られる変種を指す。斯かる自然発生変種は例えば、SwissProt Accession No. P49238に示されている。
【００１６】
用語「ＣＸ３ＣＲ１受容体の生物活性」は本明細書で用いるとき、ＣＸ３ＣＬ１ケモカインによるＣＸ３ＣＲ１の活性化、例えば細胞内カルシウムの可動化及び/又はＣＤ８＋Ｔ細胞及び/又はＮＫ細胞の誘発、を介してもたらされる生物活性の何れかを云う。ＣＸ３ＣＲ１受容体の生物活性を測る方法は従来技術で周知である。例えば、カルシウム可動化アッセイ、化学走性アッセイ又は生体内チオグリコレート誘発炎症アッセイを用いて、ＣＸ３ＣＲ１受容体の生物活性を測定することができる。斯かるアッセイは実施例１に記載されている。
【００１７】
本発明によるモジュレータはＣＸ３ＣＲ１受容体に結合する。好ましくは、それ等は明確にＣＸ３ＣＲ１受容体に結合する。最も好ましくは、それ等の見掛け結合親和性（IC５０）は１０、５、２．５、２．３、２、１．９、１．５、１、０．５、０．３、０．１６又は０．１ｎＭより少ない。その見掛け結合親和性は好ましくは、競争結合における生ＣＸ３ＣＬ１のものと比較して、トレーサとしてのＨＥＫ−ＣＸ３ＣＲ１又はＣＨＯ-ＣＸ３ＣＲ１細胞及び[１２５Ｉ]−ＣＸ３ＣＬ１で測定される。
【００１８】
拮抗体はＣＸ３ＣＲ１発現細胞に内在化されず、従ってどんな信号も送らない。作動体は逆に、ＣＸ３ＣＲ１発現細胞に内在化され、従って信号を送る。
【００１９】
より詳しくは、本発明による「拮抗体（アンタゴニスト）」は（ｉ）ＰＢＭＣ細胞においてＣＸ３ＣＬ１誘発カルシウム反応を抑制、（ii）ＮＫ細胞及びＣＤ８+Ｔ細胞のＣＸ３ＣＬ１誘発化学走性を抑制及び／又は（iii）単球（例えば、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ‐７／４＋単球、最も好ましくは７／４ｌｏ単球）漸増を、好ましくは薬用量従属的に低減することができる。拮抗体の存在は好ましくは、ＣＸ３ＣＬ１のみが存在する場合のＣＸ３ＣＲ１受容体の生物活性と比較して、ＣＸ３ＣＲ１受容体の生物活性を少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０又は５０％低下させる。
【００２０】
本発明による「作動体（アゴニスト）」は、（i）細胞、例えばＰＢＭＣ細胞においてカルシウム反応を誘発、（ii）ＮＫ細胞の及びＣＤ８＋Ｔ細胞の化学走性を誘発、（iii）単球（例えば、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−７／４＋単球、最も好ましくは７／４ｌｏ単球）漸増を、好ましくは薬用量従属的に誘発することができる。作動体は好ましくは、ＣＸ３ＣＬ１の存在下のＣＸ３ＣＲ１受容体の生物活性と比較して、ＣＸ３ＣＲ１受容体の生物活性を少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０又は５０％増大する。
【００２１】
用語「Ｎ末端終端」は別途指摘のある場合を除いて、ポリペプチドの成熟同形の末端部を指す。
【００２２】
用語「ポリペプチドの成熟同形」は、信号ペプチド、プロペプチド又はプレペプチドの劈開後のポリペプチドの同形(isoform)を指す。
【００２３】
そのＮ末端終端に所定の配列を含んで成るポリペプチドは、成熟同形の第１のアミノ酸が該配列にあるポリペプチドを指す。例えば、その末端終端に配列ＩＬＤＮＧＶＳ（配列ＩＤ番号：８）を含んで成るポリペプチドは、ポリペプチドの成熟同形の最初の７つの残基がＩＬＤＮＧＶＳであるポリペプチドを云う。換言すれば、斯かるポリペプチドの成熟同形の最（最初の）Ｎ末端アミノ酸はイソロイシンである。
【００２４】
別途指摘（配列リスティングの配列を言及することによる）のある場合を除いて、ポリペプチド内のアミノ酸の位置は該ポリペプチドの成熟同形に相対的に与えられる。
【００２５】
本明細書で用いられるとき、「単離及び／又は純化（した）」は人体及び／又は化合物ライブラリから単離及び／又は純化されている化合物を云う。
【００２６】
好適な実施態様において、本発明によるモジュレータは拮抗体（アンタゴニスト）である。斯かる拮抗体は好ましくは、以下（i）〜（vi）から成る群より選ばれる何れか１つである：
（i）配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：１）又はＸ１−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：２）を含んで成る拮抗体，ここで
Ｘ１はＩ，Ｔ，Ｆ，Ｑ，Ｓ，Ｗ又はＶ、
Ｘ２はそれがある場合に、Ｌ，Ｐ又はＲ、
Ｘ３はＤ，Ａ，Ｑ，Ｇ，Ｌ，Ｉ，Ｐ又はＳ、
Ｘ４はＮ，Ｑ，Ｇ，Ｓ，Ｌ，Ｒ，Ｆ，Ｈ又はＰ、
Ｘ５はＶ，Ａ，Ｄ又はＧ、
Ｘ６はＬ又はＶ、
Ｘ７はＳ，Ｐ，Ｔ又はＡである
（ii）配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：１）を含んで成る拮抗体、ここで
Ｘ１はＩ，Ｔ，Ｆ，Ｑ，Ｓ又はＷ、
Ｘ２はＬ，Ｐ又はＲ、
Ｘ３はＤ，Ａ，Ｑ，Ｇ，Ｌ，Ｉ，Ｐ又はＳ、
Ｘ４はＮ，Ｑ，Ｇ，Ｓ，Ｌ，Ｒ，Ｆ，Ｈ又はＰ、
Ｘ５はＶ，Ａ，Ｄ又はＧ、
Ｘ６はＬ又はＶ、
Ｘ７はＳ，Ｐ，Ｔ又はＡである
（iii）配列Ｘ１−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｌ−Ｘ７（配列ＩＤ番号：３）を含んで成る拮抗体、ここで
Ｘ１はＱ又はＶ、
Ｘ３はＱ，Ｌ又はＳ、
Ｘ４はＳ，Ｌ又はＦ、
Ｘ５はＶ又はＡ
Ｘ７はＳ又はＰである
（iv）配列Ｘ１−Ｌ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：４）を含んで成る拮抗体、ここで
Ｘ１はＩ，Ｔ，Ｆ，Ｓ又はＷ、
Ｘ３はＤ，Ａ，Ｑ，Ｇ，Ｉ，Ｐ又はＳ、
Ｘ４はＮ，Ｑ，Ｇ，Ｓ，Ｌ，Ｒ，Ｈ又はＰ、
Ｘ５はＶ，Ｄ又はＧ、
Ｘ６はＬ又はＶ、
Ｘ７はＳ，Ｐ，Ｔ又はＡである
（v）配列Ｑ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ａ（配列ＩＤ番号：５）を含んで成る拮抗体、ここで
Ｘ２はＰ又はＲ、
Ｘ３はＤ又はＬ、
Ｘ４はＳ又はＦ、
Ｘ５はＶ又はＡ、
Ｘ６はＬ又はＶである
(vi)配列Ｉ−Ｌ−Ｄ−Ｘ４−Ｇ−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：６）を含んで成る拮抗体、ここで
Ｘ４は任意のアミノ酸、
Ｘ６はＬ又はＶ
Ｘ７はＡ又はＳである。
【００２７】
当業者に直ちに明らかなように、上記（i）〜（vi）に定義の配列ＩＤ番号：１〜６の配列は、一般式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：１）又はＸ１−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：２）の配列の特定実施態様に対応し、ここで
Ｘ１はＩ，Ｔ，Ｆ，Ｑ，Ｓ，Ｗ，Ａ，Ｇ，Ｎ又はＶ、
Ｘ２はそれがある場合に、Ｌ，Ｐ又はＲ、
Ｘ３はＤ，Ａ，Ｑ，Ｇ，Ｌ，Ｉ，Ｐ，Ｈ，Ｆ，Ｖ又はＳ、
Ｘ４はＮ，Ｑ，Ｇ，Ｓ，Ｌ，Ｒ，Ｆ，Ｈ，Ｖ，Ｍ，Ｙ又はＰ、
Ｘ５はＶ，Ａ，Ｄ又はＧ、
Ｘ６はＬ，Ｍ又はＶ、
Ｘ７はＳ，Ｐ，Ｔ又はＡであり、
且つ、配列ＩＤ番号：２は配列ＱＨＨＧＶＴ(配列ＩＤ番号：５２)又はＱＨＬＧＭＴ（配列ＩＤ番号：５３）からは成らないものとする。云い換えれば、一般式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：１）又はＸ１−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：２）は好ましくは、上記（i）〜（vi）に定義の配列から選ばれる。上記（i）〜（vi）に定義の前記配列は従って、本発明によるモジュレータのＮ末端終端に位置するのが好ましい。
【００２８】
最も好ましくは、前記拮抗体は配列ＩＤ番号：８〜２４から成る群から選ばれた配列を含んで成る。この好適な実施態様において、一般式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：１）又はＸ１−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：２）の配列は配列ＩＤ番号：８〜２４の配列から選ばれる。
【００２９】
もう１つの好ましい実施態様において、本発明によるモジュレータは作動体（アゴニスト）である。斯かる作動体は好ましくは配列Ｘ１−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：２）を含んで成り、ここで
Ｘ１はＱ，Ａ，Ｇ又はＮ、
Ｘ３はＰ，Ａ，Ｈ，Ｌ，Ｓ，Ｆ又はＶ、
Ｘ４はＧ，Ｑ，Ｖ，Ｍ，Ｌ，Ｓ，Ｐ，Ｈ，Ｒ又はＹ、
Ｘ５はＡ又はＧ、
Ｘ６はＬ，Ｍ又はＶ、
Ｘ７はＳ，Ｐ，Ｔ又はＡである。
【００３０】
当業者に直ちに明らかなように、上記配列ＩＤ番号：２の配列はまた、一般式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：１）又はＸ１−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：２）の配列の特定実施態様に相当する。従って、それは本発明によるモジュレータのＮ末端終端に位置するのが好ましい。
【００３１】
最も好ましくは、前記作動体は配列ＩＤ番号：２５〜５１から成る群から選ばれた配列を含んで成る。この好適な実施態様において、一般式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：１）又はＸ１−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：２）の配列は配列ＩＤ番号：２５〜５１の配列から選ばれる。
【００３２】
或いはまた、本発明による作動体は配列Ｘ１−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列ＩＤ番号：．７）を含んで良く、ここで
Ｘ１は任意のアミノ酸、
Ｘ３は任意のアミノ酸、
Ｘ４は任意のアミノ酸、
Ｘ５はＶ，Ａ，Ｄ又はＧ、
Ｘ６はＬ，Ｍ又はＶ、
Ｘ７はＳ，Ｐ，Ｔ又はＡであり、
且つ、配列ＩＤ番号：７はＱＨＨＧＶＴ（配列ＩＤ番号：５２）又はＱＨＬＧＭＴ（配列ＩＤ番号：５３）から構成されない。配列ＩＤ番号：7の前記配列は好ましくは、前記モジュレータのＮ末端終端に位置付けられる。
【００３３】
本発明によるモジュレータはペプチド又はポリペプチドの何れかに対応しても良い。
【００３４】
好適な実施態様において、前記モジュレータはペプチド（即ち、アミノ酸５０、４０、３０、２０又は１０未満のアミノ酸分子鎖）に相当する。本発明のペプチドは要すれば、化学的改質物を含んで、その安定性及び／又はその生物学的利用性を良くすることができる。斯かる化学的改質剤は生体内の酵素劣化に対してペプチドの保護及び／又は膜障壁を超える能力が増大したペプチドを得、従ってその半減期を増大し、且つその生物活性を維持又は改良することを目的とする。本発明によれば、周知の化学的改質何れも用いることができる。斯かる化学的改質には、ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端終端に対する改質、２つのアミノ酸間のアミド結合における改質、２つのアミノ酸をリンクするアミド結合のアルファ炭素における改質、キラリティ変更、逆反転、アザペプチドを生じる改質及びベータペプチドを生じる改質が含まれるが、それ等には限定されない。
【００３５】
もう１つの好適な実施態様において、前記モジュレータはポリペプチド（即ち、５０のアミノ酸を超えるアミノ酸分子鎖）に相当する。該ポリペプチドは好ましくは、可溶性ポリペプチドに相当する。
【００３６】
本発明によるモジュレータは好ましくは、配列ＩＤ番号：５５又は５６の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０又は３００のアミノ酸の断片を含むペプチド又はポリペプチドから成る。本発明によるモジュレータは好ましくは、ＣＸＣ３ＣＬ１のケモカイン分域を含んで成る。本モジュレータは更に、ＣＸＣ３Ｌ１のムチンストーク（ｓｔａｌｋ）分域を含んでも良い。従って、より好ましいモジュレータは
i．配列ＩＤ番号：５５のアミノ酸１〜７７、１〜３１６又は〜３１８
ii．配列ＩＤ番号：５６のアミノ酸１〜７６、１〜３１５又は〜３１７
iii．（i）又は（ii）に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７又は９９％の同一性を示す配列
を含む、又はから成る。
【００３７】
本明細書に提示の実施例から得られる情報は第２世代ライブラリの構築のため用いることができる。該ライブラリでは、
‐モジュレータのＮ末端終端が配列ＩＤ番号：５５又は５６のＮ末端終端と同一である、且つ
‐第１の対の保存システインに対するＣ末端の近傍領域（Ｎループ領域）に付加的突然変異が導入される。この領域はＣＸ３ＣＬ１の残基４０〜５０に相当する。だが、付加的突然変異は好ましくは、タンパク質のコア内に明らかにある残基にも、４つの保存システイン残基にも、導入されない。
【００３８】
本発明によるモジュレータは好ましくは、配列ＩＤ番号：７〜５１の何れか１つの配列から成るＮ末端終端をもつ。本発明によるモジュレータはまた、上に定義のような配列ＩＤ番号：１〜６の何れか１つの配列から成るＮ末端終端を有しても良い。
【００３９】
本発明によるモジュレータは更に、免疫グロブリンの断片を含んでも良い。免疫グロブリンの斯かる断片は溶解度を高める、又は特定器官をモジュレータの攻撃目標にするのに有用である（例えば、Challita-Eid et al. 1998, J Immunol 161 (7): 3729-36.; Biragyn et al. 1999, Nat Biotechnol 17 (3): 253-8参照）。
【００４０】
本モジュレータは更に、タンパク質分解処理により劈開される、例えば信号ペプチド、プロペプチド又はプレペプチド等のリーダ配列を含み、本発明によるＮ末端終端を有するペプチド又はポリペプチドを発生しても良い。
【００４１】
本発明による突然変異体
【００４２】
本発明は更に、ヒトＣＸ３ＣＬ１の単離及び／又は純化した突然変異体であって、該突然変異体の成熟（ｍａｔｕｒｅ）同形のＮ末端終端が
‐配列ＩＤ番号：１〜５１の何れか１つの配列から成り、且つ
‐ＱＨＨＧＶＴ（配列ＩＤ番号：５２）又はＱＨＬＧＭＴ（配列ＩＤ番号：５３）から成らない
ものに関する。
【００４３】
本明細書で用いられるとき、用語「ＣＸ３ＣＬ１」及び「ＣＸ3ＣＬ１ポリペプチド」はヒトＣＸ３ＣＬ１ケモカインを指す。ＣＸ３ＣＬ１ケモカインは、ヒト染色体１６ｑ１３にあるＣＸ３ＣＬ１遺伝子により符号化される（Entrez GeneID: 6376）。「ＣＸ３ＣＬ１」及び「ＣＸ３ＣＬ１ポリペプチド」はより詳しくは、配列ＩＤ番号：５４のタンパク質及びその自然発生変種、例えばスプライシング変種、多形性変種及びタンパク質分解処理を通して得られる変種を云う。斯かる自然発生変種は例えば、SwissPro Accession No. P78423に示されている。
【００４４】
用語「突然変異体」は本明細書で用いられるとき、ポリペプチドの非自然発生変種を指す。
【００４５】
本発明による突然変異体は、それ等のＮ末端終端が配列ＩＤ番号：１〜５１の配列から成ることを特徴とする。
【００４６】
本発明による突然変異体はＣＸ３ＣＬ１ポリペプチドの断片に対応しても良い。突然変異体は例えば、ＣＸ３ＣＬ１ポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０又は３００のアミノ酸の断片、を含む又は、から成ることができる。突然変異体は好ましくは、ＣＸ３ＣＬ１ポリペプチドの可溶性断片に相当する。例えば、突然変異体はＣＸＣ３ＣＬ１のケモカイン分域及び／又はムチンストーク分域を含んでも良い。従って、より好ましい突然変異体は配列ＩＤ番号：５４のＣＸ３ＣＬ１のアミノ酸３１〜１００、３１〜３３９又は３１〜３４１を含む。
【００４７】
他のより好適な突然変異体は、ＣＸ３ＣＬ１ポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０又は３００のアミノ酸、例えば配列ＩＤ番号：５４のアミノ酸３１〜１００、３１〜３３９、３１〜３４１又は３１〜３９７の断片に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を示す配列を含む。
【００４８】
基準配列と「少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一な」アミノ酸配列から成る突然変異体は基準配列と比較して、削除、挿入及び／又は置換等の突然変異体を含んでも良い。置換の場合、基準配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一なアミノ酸配列から成る突然変異体は基準配列ではない、別の哺乳類種由来の相同な配列に相当しても良い。もう１つの好適な実施態様において、置換は好ましくは下の表に示されているように保存的置換に相当する。
【００４９】
【表４】
2012511921.tif 000003
【００５０】
これ等突然変異体は免疫グロブリン及び／又は先導配列の断片を含んでも良い。先導配列は生ＣＸ３ＣＬ１信号ペプチド又は異形配列の何れかに相当するものとしても良い。
【００５１】
最も好適な突然変異体は本発明によるモジュレータに対応する。より詳しくは、斯かる突然変異体はＣＸ３ＣＲ１受容体に結合し、「本発明によるモジュレータ」のタイトル下の段落で述べたようにその生物活性を変調することができる。
【００５２】
本発明による核酸
【００５３】
本発明は更に、本発明によるモジュレータ又は突然変異体を符号化する核酸に向けられている。斯かる核酸は、クローニング及び配列ＩＤ番号の有向突然変異誘発により当業者に容易に得られる。
【００５４】
本発明によるモジュレータ、突然変異体及び核酸の治療的使用
【００５５】
ＣＸ３Ｃｌ１及びその受容体ＣＸ３ＣＲ１は、多数の炎症過程で重要な役割を果たす。ＣＸ３ＣＬ１／ＣＸ３ＣＲ１の経路は、多発性硬化症(Huang et al. 2006, Faseb J 20 (7): 896-905) 等の自己免疫疾患、リウマチ様動脈炎(Sawai et al. 2007 Arthritis Rheum 56 (10): 3215-25)、紅斑性狼瘡(Inoue et al. 2005, Arthritis Rheum 52 (5): 1522-33)、心臓血管疾病(Moatti et al. 2001, Blood 97 (7): 1925-8; Combadiere et al. 2003, Circulation 107 (7): 1009-16; Lesnik et al. 2003, J Clin Invest 111 (3): 333-40; McDermott et al. 2003, J Clin Invest 111 (8): 1241-50)、黄斑変性 (Combadiere et al. 2007, J Clin Invest 117 (10): 2920-8) 及びパーキンソン症候群(Cardona et al. 2006, Nat Neurosci 9 (7): 917-24)等の神経変性疾患、対宿主性移植片病(Robinson et al. 2000, J Immunol 165 (11): 6067-72)、癌(Andre et al. 2006, Ann Oncol 17 (6): 945-51; Vitale et al. 2007, Gut 56 (3): 365-72)、ＨＩＶ感染(Faure et al. 2000, Science 287 (5461): 2274-7; Garin et al. 2003, J Immunol 171 (10): 5305-12)等のウイルス性感染症、ＲＳウイルス感染症症(Tripp et al. 2001, Nat Immunol 2 (8): 732-8)及び西ナイルウイルス感染症(Getts et al. 2008, J Exp Med 205 (10): 2319-37)の発現に含まれることが示されている。ＣＸ３ＣＬ１／ＣＸ３ＣＲ１の経路はまた、瘢痕形成(Ishida et al. 2008, J Immunol 180 (1): 569-79)、疼痛(Holmes et al. 2008, J Neurochem 106 (2): 640-9)、行動障害(Gordon Research Conference, 21-26/09/2008)に含まれることが示され、ＣＸＣ３ＣＬ１を符号化する核酸はワクチンにおける添加剤(Iga et al. 2007, Vaccine 25 (23): 4554-63)として有用である。
【００５６】
従って、本発明は、医薬として特に本明細書に記載の病気何れの治療又は予防のために用いられる、本発明によるモジュレータ、突然変異体又は核酸に向けられている。
【００５７】
本発明のより好適な側面は、
‐炎症性疾患、自己免疫疾患、心臓血管疾病、神経変性疾患、対宿主性移植片病、行動障害、瘢痕形成疾患、ウイルス性感染症、癌又は疼痛から成る群より選ばれた疾病を治療又は予防する方法であって、本発明によるモジュレータ、突然変異体又は核酸を、それを要する個体に投与する処置を含んで成る方法及び又は
‐炎症性疾患、自己免疫疾患、心臓血管疾病、神経変性疾患、対宿主性移植片病、行動障害、瘢痕形成疾患、ウイルス性感染症、癌又は疼痛から成る群より選ばれた疾病を治療又は予防するために用いられる本発明によるモジュレータ、突然変異体又は核酸
に向けられている。
【００５８】
より一般的には、本発明は新規な、効力の大きい治療化合物及び医薬物質、特に精神又は神経疾病、又は免疫系病変、感染症又は癌の治療のためのものの生成に向けられている。これ等のモジュレータはまた、特定の治療薬がいま無い病理学的状態の治療のための医薬としても用いることができる。マカクモデルを用いた出版物掲載の研究は、局部薬剤におけるケモカイン変種の潜在能力を既に強調している(Lederman, 2004, Science, 306, 485-487)。年齢関連障害の予防の分野では、成長ホルモン放出の制御の要因である稀少ＧＰＣＲの代理アゴニストが、加齢に関連する廃疾のいくつかを回復させる(Smith et al., 1999, Trends Endocrinol Metab. 10(4), 128-135)ことが期待されている。
【００５９】
「有効量」は、治療すべき病気を予防、治療又はその進行を減速できるペプチドの濃度を実現するに十分な量を意味する。斯かる濃度は当業者により所定の手順で容易に決定することができる。実際に投与される化合物の量は一般に、治療すべき状態、投与の選択ルート、実際の投与化合物、個体患者の年齢、体重及び反応、患者の症候の重篤度等を含む関連状況をみて医師により決定されるであろう。投与量は投与ペプチドの安定性にもよることも当業者には理解されるであろう。
【００６０】
「それを要する個体」は、治療又は予防すべき病気を患っている又は患いやすい個体を意味する。本発明の枠内で治療されるべき個体は好ましくは、ヒト個人である。だが、モジュレータ、突然変異体及び核酸の獣医学的使用も本発明により意図されている。
【００６１】
「治療」は治療的使用を意味し、「予防」は予防的使用を意味する。
【００６２】
好適な実施態様において、モジュレータ、突然変異体又は核酸はアンタゴニスト（拮抗体）である、又はこれを符号化する。そして、前記病気は、炎症性疾患、自己免疫疾患、心臓血管疾病、神経変性疾患、癌及び対宿主性移植片病から成る群より選ばれる。炎症性疾患は例えば、糸球体腎炎又は狼瘡性腎炎に相当することがある。自己免疫疾患は例えば多発性硬化症、リウマチ様動脈炎、狼瘡性紅斑症、炎症性腸疾患及び潰瘍性大腸炎を含む。心臓血管疾病は例えばアテローム性動脈硬化症、血栓症、アテローム血栓症及び心不全を含む。癌は例えば乳癌、結腸癌及び淋巴腫を含む。神経変性疾患は例えば、パーキンソン病に相当することがある。
【００６３】
もう１つの好適な実施態様において、モジュレータ、突然変異体又は核酸はアゴニスト（作動体）である、又はこれを符号化する。そして、前記病気は、ウイルス性感染症及び活動及び注意力障害等の行動障害から成る群より選ばれる。ウイルス性感染症は例えば、ＨＩＶ感染症に相当することがある。行動障害は好ましくは、活動過剰随伴又は非随伴注意力欠損疾患に相当する。
【００６４】
本発明はまた、
‐本発明によるアゴニスト、本発明による、アゴニスト活性をもつ突然変異体、又は本発明による、アゴニストを符号化する核酸の有効量を、それを要する個体に投与する処置を含んで成る、抗腫瘍反応又は瘢痕化を刺激する方法、及び／又は
‐抗腫瘍反応又は瘢痕化を刺激するのに用いられる、本発明によるアゴニスト、本発明による、アゴニスト活性をもつ突然変異体、又は本発明による、アゴニストを符号化する核酸
に向けられている。
【００６５】
本発明は更に、
‐本発明によるアゴニスト、本発明による、アゴニスト活性をもつ突然変異体、又は本発明による、アゴニストを符号化する核酸の有効量を含んで成るワクチン組成物を前記個体に投与する処置を含んで成る、個体にワクチン接種する方法、及び／又は
‐ワクチン組成物に添加物として用いられる本発明によるアゴニスト、本発明による、アゴニスト活性をもつ突然変異体、又は本発明による、アゴニストを符号化する核酸
に向けられている。
【００６６】
本発明によるモジュレータ、突然変異体又は核酸は任意の経路を通して、好ましくは非経口又は局所経路を通して投与することができる。
【００６７】
本発明によるモジュレータ、突然変異体及び核酸を含む組成物
【００６８】
本明細書に記載のモジュレータ、突然変異体及び核酸は医薬組成物に配合することができる。従って、本発明は、本明細書に記載のモジュレータ、突然変異体及び核酸の任意のもの及び生理的に許容し得る担体を含む医薬組成物を考える。生理的に許容し得る担体は、当業者により任意の方法によって作成することができる。
【００６９】
本発明の少なくとも１つのモジュレータ、突然変異体及び核酸を含む医薬組成物は、モジュレータ、突然変異体又は核酸が所期の目的を達成するのに有効な量含まれるあらゆる組成を含む。加えて、医薬組成物は活性化合物の、薬剤として使用可能な配合物への処理を促進する、付形剤及び補剤を含む適宜の生理的許容可能担体を含んでも良い。用語「生理的許容可能な担体」は、有効成分の生物活性の有効性を妨げず、投与されるホストに有毒でない任意の担体を含むことを意味する。適宜の生理的許容可能な担体は周知であり例えば、この分野の標準的参考文献であるRemington’s Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton, USA, 1985)に記載されている。例えば、非経口の投与では食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンガー溶液等のビヒクルでの注射のため、上記有効成分を単位投与量に調合することができる。生理的許容可能な担体の他に、本発明の組成物はまた、安定剤、付形剤、緩衝剤や防腐剤等の添加剤を少量含んでも良い。本発明の組成物は更に、第２の有効成分を含んでも良い。
【００７０】
本発明のモジュレータ、突然変異体及び核酸は、所期の目的を実現する任意の手段で投与できる。例えば、投与は皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、大腸内、髄腔内、鼻内、口腔内、直腸、経皮、頬、局部、局所、吸入又は皮下使用を含むが、これ等に限らない、多数の異なる経路によって達成しても良い。非経口及び局部経路は特に好ましい。
【００７１】
投与すべき投与量は、所望の効果に関する個々の必要及び選択投与経路による。投与される投与量は受者の年齢、性別、健康状態及び体重、他に何かあれば同時治療、治療の頻度及び所望効果の性質に依存するであろうことが分かる。各治療に要する全薬用量は複数薬用量であることも、単一薬用量であることもある。
【００７２】
狙いとする配達経路に応じて、化合物は液体（例えば溶液、懸濁液）、固体（例えばピル、錠剤、坐薬）又は半固体（例えばクリーム、ゲル）形式として配合することができる。
【００７３】
好適な実施態様において、生理的許容可能な担体はヒドロゲル基質である。本発明によるモジュレータ、ポリペプチド又は核酸は好ましくは、ヒドロゲル基質に共有結合される。斯かるヒドロゲルは局部使用に、例えば瘢痕化を強める、及び／又は刺激するために極めて好都合である。ヒドロゲル基質は例えば、Kuros Biosurgery AG (Zurich, Switzerland) により商品化されている。
【００７４】
本発明はまた、本発明のペプチドを、例えば遺伝子療法による治療の枠内で符号化する核酸を含んで成る医薬組成物を考える。この場合、核酸は好ましくは、ペプチドのコーディングが、その発現を可能にする発現信号（例えば、プロモーター、ターミネーター及び／又はエンハンサー）の制御下に置かれるベクトル上に存在する。このベクトルは例えば、アデノウイルス又はレンチウイルスベクトル等のウイルスベクトルに相当する。
【００７５】
本発明は更に、本発明によるモジュレータ、突然変異体又は核酸を含む医薬組成物と、投与様式に関する指図書を含んで成るキットを提供する。これ等指図書は医療指示、投与の経路、投与量及び／又は治療される患者のグループを指示することができる。
【００７６】
本発明はまた、
‐免疫抗原性の分子、
‐本発明によるモジュレータ、突然変異体又は核酸、及び
‐生理的許容可能な担体
を含むワクチンである医薬組成物を提供する。
【００７７】
斯かるワクチンは、有効成分としての免疫抗原性分子と、添加剤としての本発明によるモジュレータ、突然変異体又は核酸とを含んで成る。本発明によるモジュレータ、突然変異体又は核酸の役割はその場合、免疫抗原性分子に対する免疫反応を引き出すことである。この実施態様の枠内で、ワクチンは本発明による核酸を含み、該核酸がアゴニストを符号化するのが好ましい。
【００７８】
本発明によるモジュレータ及び突然変異体の生成方法
【００７９】
本発明のモジュレータ及び突然変異体は、組換技術及び化学合成技術を含む周知の手法で生成することができる。
【００８０】
本発明の好適な実施態様は、本発明によるモジュレータ又は突然変異体を生成する方法であって、
ａ）本発明による核酸を含むホスト細胞を用意し、
ｂ）モジュレータ又は突然変異体の発現に適した条件下で前記ホスト細胞を培養し、
ｃ）モジュレータ又は突然変異体を単離する
の手順を含む方法に向けられている。
【００８１】
この方法は更に、前記モジュレータ又は突然変異体を純化する、そして必要に応じて、前記モジュレータ又は突然変異体を医薬組成物に配合する手順を含んでも良い。
【００８２】
この発明の枠内で、本発明による核酸は好ましくは、発現ベクトルにクローン複写される。斯かる発現ベクトルでは、本発明の核酸がその発現を可能にする発現信号（例えば、プロモーター、ターミネーター及び／又はエンハンサー）の制御下に置かれる。
【００８３】
この発明の枠内で、本発明による核酸は好ましくは、信号ペプチド等のリーダ配列をそのＮ末端終端に含む本発明によるポリペプチド又は突然変異体を符号化する。
【００８４】
ホスト細胞は、タンパク質生成のための任意の周知ホスト細胞に相当するものとしても良い。斯かるホスト細胞はヒト細胞（例えば、293, PER. C6）や、ＣＨＯ、マウス、サル、カビ（例えば、A. niger）、イースト（例えば、S. cerevisiae）及びバクテリア（例えば、E. coli）を含む。
【００８５】
定期刊行物論文又は抄録、公開又は公告特許出願、登録特許又は他の参考文献を含む、本明細書に引用の全ての参考文献は引用により、斯かる引用文献中に提示の全てのデータ、表、図及び本分を含んで本明細書に参照として挿入される。
【００８６】
明確な意味をもつものの、用語「含んで成る」、「有する」、「含む」及び「から成る」は本明細書を通じて互いに、交換可能に用いられている。そして、互いに置き換えできる。
【００８７】
本発明を、次の実施例及び図面を考慮して更に評価する。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】ファージ表示ＣＸ３ＣＲ１アンタゴニストを選ぶのに用いる方法を示す。ファージ粒子は、多ヘッド（ｐIII‐ＣＸ３ＣＬ１突然変異体融合）をもつシリンダー（封入ファージゲノム）として描かれている。（１）：ファージ表示ＣＸ３ＣＬ１突然変異体のライブラリが、細胞表面上にＣＸ３ＣＲ１レセプタを安定に発現するＨＥＫ細胞に結合することが可能になる。（２）：これ等細胞は３７℃で培養され、アゴニストファージ粒子のリガンド誘発内在化を可能にする間、アンタゴニストは細胞内には入らない。（３）：緊縮洗浄を用いて非特定結合ファージを除去した。（４）：過剰量の可溶性ＣＸ３ＣＬ１（ｓＣＸ３ＣＬ１）が添加され、表面随伴ファージを除去した。溶出ファージをE. Coliに感染させることができ、選択ファージの株が選択を新たにもう１度行う際の使用のために用意された（手順１〜４）。
【図２】Ｆ１及びＦ１‐Ｉｇの化学走性活性度を示す。ケモカインとケモカインＩｇの両者をそれ等の、ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ａ），ＮＫ細胞（Ｂ）及びＣＤ４+Ｔ細胞（Ｃ）に対する化学走性潜在能に付いて調べた。結果は化学走性指標Ｄとして表されている。Ｄ：Ｆ１は、１ｎＭ  ＣＸ３ＣＬ１により誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞（◆）及びＮＫ細胞（◇）の化学走性を量依存的に抑制する。データは標準的用量‐応答曲線（GraphPad Prismソフトウェア）に合っている。ＩＣ５0はＣＤ８＋Ｔ細胞では６．６ｎＭ（ＬｏｇＩＣ５０＝０．８２±０．８ｎＭ）、ＮＫ細胞では、２．９ｎＭ（ＬｏｇＩＣ５０＝０．４６±０．３ｎＭ）であった。
【図３】Ｆ１のカルシウム評価分析(アッセイ)を示す。Ａ：ＨＥＫ‐ＣＸ３ＣＲ１細胞（トレースａ及びｂ）又はＰＢＭＣ（トレースｃ及びｄ）を、１００ｎＭのＣＸ３ＣＬ１に対するカルシウム応答（トレースａ及びｃ）又は指示濃度におけるＦ１に対するカルシウム応答（トレースｂ及びｄ）に付いて調べた。示されているのは、３つ中１つの代表的実験である。Ｂ：２０ｎＭのＣＸ３Ｃｌ１によりＰＢＭＣに引き出されたカルシウム応答に関するＦ１（▲）及びＦ１‐Ｉｇ（△）を評価分析した。データ（３組の１つ±ＳＤ）は標準的用量‐応答曲線（GraphPad Prismソフトウェア）に合っている。ＩＣ５０はＦ１では３４ｎＭ（ＬｏｇＩＣ５０＝１．５３±０．０８ｎＭ）、Ｆ１‐Ｉｇでは７２ｎＭ（ＬｏｇＩＣ５０＝１．８６±０．１４ｎＭ）であった。
【図４】ＣＸ３ＣＲ１安定発現細胞に付いて競合結合アッセイにより測定したＦ２及びＦ２−ＩｇのヒトＣＸ３ＣＲ１との結合を示す。Ａ：ＣＸ３ＣＲ１発現ＨＥＫ細胞との結合。Ｂ：ＣＸ３ＣＲ１発現ＣＨＯ細胞との結合。
【図５】Ｆ２及びＦ２‐Ｉｇの特性の一部を示す。Ａ：ＨＥＫ‐ＣＸ３ＣＲ１の固定ＣＸ３ＣＬ１‐Ｈｉｓ、ＣＸ３ＣＬ１‐Ｉｇ及びＦ２‐Ｉｇへの接着性。データは、各条件における最大接着％で表されている。Ｂ：安定転移ＨＥＫ細胞の面からのＣＸ３ＣＲ１のダウン調整。ＨＥＫ‐ＣＸ３ＣＲ１細胞は、ＣＸ３ＣＲ１又はＣＸ３ＣＬ１変種を用いて３７℃で３０分培養された。面ＣＸ３ＣＲ１は単一クローン性のＣＸ３ＣＲ１抗体で検出され、フローサイトメトリーにより分析された。ＣＸ３ＣＬ１及びＦ２は投与量依存レセプタのダウン変調を誘発する一方、Ｆ１でのダウン調整は観測されなかった。Ｃ：ＣＸ３ＣＬ１（△）及びＲ２（■）でのダウン調整後にＣＸ３ＣＲ１をＨＥＫ‐ＣＸ３ＣＲ１にリサイクル。細胞は始め、１００ｎＭのケモカインを用いて３７℃で３０分培養した。洗浄を数回行った後、細胞は更に３７℃で様々な時間培養され、ＣＸ３ＣＲ１発現に関して分析された。
【図６】Ｆ２（上線）及びＦ２‐Ｉｇ（下線）の化学走性を示す。Ｆ２及びＦ２‐Ｉｇの両方をそれ等の、ＣＤ３＋Ｔ細胞（左欄）、ＮＫ細胞（中欄）及びＣＤ４＋Ｔ細胞（右欄）に対する化学走性潜在能力を調べた。結果は、ケモカインが無い状態で移動する細胞数に対して、ケモカインに応答して移動する細胞数を表す化学走性指標で表わされている。
【図７】ＣＸ３ＣＲ１発現細胞に関するＦ２‐Ｉｇのカルシウム強化分析の結果を示す。ＦＫＮ‐Ｉｇ及びＦ２‐Ｉｇの種々の濃度（０、０．２、０．６、１．９、５．５、１６．７、５０及び１５０ｎＭ）に応答する細胞質ゾルのカルシウム依存蛍光の変化を、フルオ４色素の負荷されたＣＨＯ‐ＣＸ３ＣＲ１細胞に付いて特定した。
【００８９】
配列の簡単な説明
【００９０】
配列ＩＤ番号：１〜７及び６４は、本発明によるモジュレータのコンセンサス配列に対応する。
配列ＩＤ番号：８〜２４は、実施例２に記載のように特定されたアンタゴニストの配列に対応する。
【００９１】
配列ＩＤ番号：２５〜５１は、実施例２に記載のように特定されたアゴニストの配列に対応する。
配列ＩＤ番号：５２は、成熟ヒトのＣＸ３ＣＬ１の６個のＮ末端アミノ酸に対応する。
【００９２】
配列ＩＤ番号：５３は、成熟ラット及びネズミのＣＸ３ＣＬ１の６個のＮ末端アミノ酸に対応する。
配列ＩＤ番号：５４は、ヒトＣＸ３ＣＬ１（タンパク分解処理前の）の配列に対応する。
【００９３】
配列ＩＤ番号：５５及び５６は、ヒトＣＸ３ＣＬ１ポリペプチドの突然変異体に対応する。
配列ＩＤ番号：５７は、免疫グロブリンの領域に融着したヒトＣＸ３ＣＬ１の突然変異体に対応する。
【００９４】
配列ＩＤ番号：５８は、ＣＸ３ＣＬ１のＣＤＳの核酸配列に対応する。
配列ＩＤ番号：５９〜６２、６９及び７０は、実施例１に用いられるオリゴヌクレオチドに対応する。
【００９５】
配列ＩＤ番号：６３は、ヒトＣＸ３ＣＬ１の配列に対応する。
配列ＩＤ番号：６４は、実施例２のフレーム内で用いられる配列に対応する。
【００９６】
配列ＩＤ番号：６５及び６６は、ヒトＣＸ３ＣＬ１ポリペプチドの突然変異体のヌクレオチド及びポリペプチド配列に対応する。
配列ＩＤ番号：６７及び６８は、免疫グロブリンの領域に融着したヒトＣＸ３ＣＬ１ポリペプチドの突然変異体のヌクレオチド及びポリペプチド配列に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００９７】
実施例
【００９８】
実施例１：プロトコル
【００９９】
１．１細胞系
ヒト単球性白血病（ＴＨＰ-1）、ヒト胚形成腎臓（ＨＥＫ）及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ及びＣＨＯ‐Ｓ）細胞系は慣行的に、２ｍＭのＬ‐グルタミン、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸、２ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０％ＦＢＳ、ペニシリン（５０Ｕ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）補充のＤＭＥＭにて維持された。ＨＥＫ‐ＣＣＲ５及びＨＥＫ‐ＣＸ３ＣＲ１細胞は、Combadiere et al. (1996, J. Leukoc. Bio. 60, 147-152)及びCombadiere et al. (1998, J. Biol. Chem. 273, 23799-23804)により記述されている。ヒトＣＸ３ＣＲ１を発現するＣＨＯ細胞は、Dr. Jeffery K. Harrison (Department of Pharmacology and Therapeutics, College of Medicine, University of Florida, Gainesville, FL, USA)からの寄贈であった。健康なドナーから得られるヒト末梢血単核性細胞（ＰＢＭＣ）及びＣ５７Ｂ／６マウスからのマウス単核性骨細胞（ＭＢＭＣ）は、フィコール・ハイパーク勾配遠心分離法で純化された。
【０１００】
１．２．ファージ・ケモカイン及びライブラリ構築
ヒトＣＸ３ＣＬ１のＤＮＡ配列を、ｐＢｌａｓｔ‐ｈＣＸ３ＣＬ１プラスミド(Invivogen, San Diego, CA, USA)からのＰＣＲにより、Nco l-tailed順プライマー５’‐ＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＧＧＴＧＴＧＡＣ（配列ＩＣ番号：５９）及びNot I-tailed逆プライマー５’ＴＴＧＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＡＴＴＴＣＧＡＧＴＴＡＧ（配列ＩＣ番号：６０）で増幅した（エンドヌクレアーゼの認識部位に下線が付せられている）。このＰＣＲ生成物は切断され、Hoogenboom et al. (1991, Nucleic Acids Res 19, 4133-7)に記載されているようにｐＨＥＮ１ファージミド・ベクトルにサブクローン化された。Ｎ末端ＣＸ３ＣＬ１突然変異体のライブラリが、Hartley et al. (2003, J Virol 77, 6637-44)により基本的に報告されているように、ＰＣＲ突然変異誘発により、Not l-tailed 逆プライマー及び縮退上流プライマー５’‐ＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＮＮＫＣＮＡＮＮＫＮＮＫＧＮＣＮＴＧＮＣＡＡＡＡＴＧＣＡＡＣＡＴＣＡＣＧＴＧＣ（配列ＩＤ：６１）及び５’‐ＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＮＣＮＴＧＮＣＡＡＡＡＴＧＣＡＡＣＡＴＣＡＣＧＴＧＣ（配列ＩＤ番号：６９）で構成された。NCo lの認識部位に下線が付せられ、Ｎは４つの塩基の任意のものを、ＫはＧ又はＴを表す。ＰＣＲ生成物はファージミドｐＨＥＮ１カットN col l‐Not lにクローン化され、E. Coli ＴＧ１に電気穿孔された。コロニーは選択前にＰＣＲスクリーンされ、それ等のＤＮＡインサートは自動シーケンサーＡＢＩ３７７(Applied Biosystems, Parkin-Elmer, Waltham, Massachusetts, USA)で配列化されライブラリの多様性を調べた。
【０１０１】
１．３．生体細胞上のＣＸ３ＣＲ１アンタゴニストの選択
選択方法を図１に提示する。ＣＸ３ＣＬ１突然変異体（１０１０ＣＦＵ）のファージライブラリが５．１０６ＨＥＫ‐ＣＸ３ＣＲ１又はＨＥＫ‐ＣＣＲ５細胞で直接培養、細胞は２５ｃｍ２の組織培養フラスコ(Becton Dickinson, Le Pont de Claix, France)内３７℃、ＣＯ２５％、補充ＲＰＭＩ−１６４０媒体５ｍｌ中で培養した。１時間後、細胞は室温でリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）１０ｍｌを用いて１０回洗浄され，次いでプレートからＰＢＳ‐０．５％ＢＳＡ１０ｍｌ内に掻取られた。細胞は次いで、ペレット化され、過剰量の可溶性ＣＸ３ＣＬ１（１００μ中１０μＭのＰＢＳ‐ＢＳＡ）から成る溶出緩衝液内の氷上に２０分間培養された。細胞を遠心分離し（５分間１０００ｘｇ）、上澄みをログ相Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１と混合し， Hartley et al. (2003, J Virol 77, 6637-44)に記載されているように選択を更に何度も行えるようにするため株ファージを生成及び純化した。
【０１０２】
１．４．生体細胞上のＣＸ３ＣＲ１アゴニストの選択
選択方法は、細胞により細胞内に取り込まれたファージが回収される点を除いて、上記段落１．３．に記載されたものと同じである。アゴニストを選ぶのに用いられた方法は、Hartley et al. (2003, J Virol 77, 6637-442003)に記載されている。
【０１０３】
１．５．
純化ファージ・ケモカインは、抗ヒトＣＸ３ＣＬ１ポリクローン性抗体(AF365, R&D, Lille, France)をコーティングとして用い、Dorgham et al. (2005, AIDS Res Retroviruses 21, 82-92)により記述されているようにファージＥＬＩＳＡに用いられた。フローサイトメトリー分析のため、ファージ（１０１０ＣＦＵ／ｍｌ）を４℃で１０５ＨＥＫ又はＨＥＫ‐ＣＸ３ＣＲ１細胞を用いて培養した。細胞は洗浄され、Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor)により記述されているようにＦＩＴＣと表記の抗Ｍ１３抗体(Pharmacia, Saclay, France) で培養され, FACSCalibur (BD Bioscience, Le Pont de Claix, France)上にCell Questソフトウェアで分析された。
【０１０４】
１．６．
ＣＸ３ＣＬ１類似体であるＦ１及びＦ２は基本的には、Hartley et al. (2004, Proc Natl Acad Sci US A101, 16460-5)により記述されているように、全化学合成で作成された。化合物純度及び完全性は、高性能液体クロマトグラフィー分析及び質量分析法で検証された。濃度は、２８０ｎｍにおける吸収度の測定により特定された。
キメラケモカイン‐Ｉｇ構成物はLavergne et al. (2003, Cancer Res 63, 7468-74)及びIga et al. (2007, Vaccine 25, 4554-63)により既に記述されているように作成された。Ｃｌｑ結合モチーフ(E318, K320, K322)及びＦｃγＲ１部位(L235)(Altman et al. 1996, Science 274, 94-96; Zheng et al. 1995, J Immunol 154, 5590-6000) にて突然変異したネズミＦｃγ２ａ断片を用いて、非細胞溶解型のＦ１‐Ｉｇ及びＦ２‐Ｉｇを生成した。Ｆ１及びＦ２のＤＮＡ配列はファージ表示ベクトルから、ヒトＣＸ３ＣＬ１信号ペプチド５’‐ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＴＣＣＧＡＴＡＴＣＴＣＴＧＴＣＧＴＧＧＣＴＧＣＴＣＣＧＣＴＴＧＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＣＡＴＣＴＧＡＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＡＡＴＧＧＣＧＴＧＴＣＡ‐３’（配列ＩＤ番号：６２）及び５’‐ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＴＣＣＧＡＴＡＴＣＴＣＴＧＴＣＧＴＧＧＣＴＧＣＴＣＣＧＣＴＴＧＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＣＡＴＣＴＧＡＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＧＧＣＧＴＧＴＣＡＡＡＡ‐３’（配列番号：７０）をそれぞれ符号化するNot I-tailed 逆プライマー及び特定の上流プライマーで増幅された。ＰｓｔIの認識箇所には、下線が付せられている。ＰＣＲ生成物はｐＶＲＣベクトル(Lavergne et al. 2003, Cancer Res 63, 7468-74; Lavergne et al. 2004, J Immunol 173, 3755-62) にクローン化された。
低内毒素ｐＶＲＣケモカイン-Ｉｇ（５μｇ）及び空ｐブラストプラスミド（１μｇ）を、登録商標がＪｅｔＰＥＩのトランスフェクション試薬を製造者(Polyplus-transfection SA, Illkirch, France)の指示に従って含むＣＨＯ-Ｓ細胞系(Invitrogen, Cergy-Pontoise, France)に同時トランスフェクトさせた。トランスフェクタントは１０μｇ／ｍｌのブラストサイジン(Invivogen Cayla, Toulouse, France)を添加して選ばれ、５μｇ／ｍｌのブラストサイジンで管理された。高生成クローンが、捕獲ＥＬＩＳＡ(Human CX3CL1/Fractalkine, R&D, Lille, France)によりＣＸ３ＣＬ１の上澄みを篩掛けして得られた。培養物上澄み５００〜１０００ｍｌからのケモカイン-Ｉｇ融合タンパク質は、タンパク質Ｇカラム(NUNC ProPur Kit Midi G, VWR International S. A. S. Fonternay sous Bois, France) を通して純化された。タンパク質は緩衝液が交換され、ＰＢＳ中最終容積１ｍＬに濃縮された。キメラタンパク質溶液をＳＤＳ‐ＰＡＧＥ、銀染色法及び免疫ブロット法アッセイにより調べ、製剤の純度を推定した。溶液内のタンパク質濃度は、２８０ｎＭにおける吸光度及び生体内実験前の捕獲ＥＬＩＳＡで決定した。
【０１０５】
１．７．ＣＸ３ＣＲ１受容体ダウン変調実験
細胞（１０５）を、ケモカインを種々の濃度（１〜１０００ｎＭ）で含む補充培養媒体１００μｌにおいて、３７℃、３０分間培養した。媒体のみを制御として用いた。細胞は低温ＰＢＳで５回洗浄され、氷上で３０分間、５０ｎｍの抗ヒトＣＸ３ＣＲ１(clone 2A9-1 phycoerythrin-conjugated, MBL Clinisciences, Montrouge, France)で培養された。細胞は２度洗浄され、４％パラフォルムアルデヒドで固定され、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ及びＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアで分析された。少なくとも１００００の事象がサンプル毎に蓄積された。表面ＣＸ３ＣＲ１発現の百分率が、相対蛍光強度の平均チャネルにより次のように計算された：（ＭＣＦケモカイン−ＭＣＦ負制御／（ＭＣＦ媒体−ＭＣＦ負制御）(Mack et al. 1998, J Exp Med 187, 1215-24)。
【０１０６】
１．８．ＣＸ３ＣＲ１との競合放射リガンド結合
アッセイをMoatti et al. (2001, Blood 97, 1925-8)による既述のように行った。ＨＥＫ‐ＣＸ３ＣＲ1及びＣＨＯ‐ＣＸ３ＣＲ１細胞の競合結合が、５０ｐＭ[１２５Ｉ]‐ＣＸ３ＣＬ１(Amersham General Electric, Saclay, France)、而も未分類リガンド種々の量で行った。各濃度を２通り評価分析した。３７℃で２時間後、細胞は洗浄され、細胞ペレット内の放射能がγカウンター(LKB Wallac, Saint Quentin en Yvelines, France)で定量化された。
【０１０７】
１．９．カルシウム可動化評価分析
細胞質ゾル状の遊離カルシウムが、基本的にGarin et al. (2003, J Immunol 171, 5305-12)による記述のようにＦｕｒａ‐２／ＡＭ(Molecular Probes, Leiden, Netherlands)で測定された。簡単に云うと、ＰＢＭＣ（４ｘ１０６）に３７℃で３０分に亘って、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２及び１ｍＭのＣａＣｌ２が補充された１ｍｌのＨＢＳＳ緩衝液内２μＭのＦｕｒａ‐２／ＡＭ及び２μＭのプルロン酸が加えられた。細胞は遠心分離され、読取りのため石英キューベットに移された。ケモカイン及びケモカイン-Ｉｇ 融合タンパク質が、３７℃に恒温維持され、連続して攪拌されたキューベット内の種々の濃度の細胞に添加された。蛍光は分光蛍光計(SAFAS, Monaco)により３４０及び３８０ｎｍでチェックされ、５１０ｎｍで測定された。
【０１０８】
１．１０．化学走性評価分析
移動アッセイが２４トランスウェルインサート(Corning Costar, Avon, France)において、ヒトＰＢＭＣのため５μｍ孔ポリカーボネートフィルタ及びマウスＭＢＭＣのため８μｍフィルタで行われた。細胞は化学走性緩衝液で再懸濁され（０．５％ＢＳＡ及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む１００μｌのＲＰＭＩ中５．１０５細胞）、上室に入れられた。各ウェルの底部を、６００μｌの表示のケモカイン濃度の予備温化走性緩衝液で満たした。次いでプレートは５％ＣＯ２雰囲気内で３７℃にて３時間に亘って培養された。膜を通った細胞は、蛍光性抗体（抗ヒトＣＤ４５‐ＦＩＴＣ、ＣＤ８‐ＡＰＣ、ＣＤ３‐ＰＥ又は抗マウスＣＤ１１ｂ‐ＦＩＴＣ, ＢＤ, Le Pont de Claix, France）と所定数のビーズ（登録商標Flow-Count 蛍光球：Beckman Coulter, Villepinte, France）を混合させることによって免疫表現型に分類された。氷中培養３０分後に、ビーズと細胞はFACSCaliburのフローサイトメータで計数され、データはCell Quest ソフトウェアで分析された。結果は、化学的誘引物質の存在下ｖｓ非存在下で移動する細胞の比を表す化学走性指標（ＣＩ）として表される。全ての状態は２通り実施され、結果は少なくとも３つの独立実験を表すものである。
【０１０９】
１．１１．接着評価分析
ＣＸ３ＣＬ‐Ｈ６(R & D Systems, Lille, France: ウェル当たり５０μＬ中１ｎＭ)又は純化ケモカイン-Ｉｇ タンパク質（指示の量で希釈）が、２５ｍＭトリス、ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液中のＭａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルのマイクロタイタプレート(Nunc A/S, Roskild, Denmark)上で、４℃で培養された。ＣＦＤＡ‐ＳＥ(Invitron, Cergy-Pontoise, France)負荷のＨＥＫ‐ＣＸ３ＣＲ１細胞が、１％脱脂乳で予めブロックされたプレートに、指示濃度で、ＣＸ３ＣＬ１の存在又は非存在下で、室温で４５分に亘って培養された。非接着性細胞を除去するため、ウェルはＰＢＳで緩やかに満たされ、マイクロプレートはＰＢＳ内に逆様に置かれ、１時間に亘って浮動した後、Hermand et al. (2000, J Biol Chem 275, 26002-10)による記述のようにフュージョンユニバーサルマイクロプレートアナライザ (Packard Bioscience, Perkin Elmer, Villebon sur Yvette, France)で、５３５ｎｍで読取りを行った。実験は３通り行い、結果は全接着細胞の百分率（±ＳＤ）として表された。
【０１１０】
１．１２．チオグリコレートにより誘発される炎症
生後６〜１０週間のワイルドタイプ雌Ｃ５７ＢＬ／６のマウス(Janvier, Le Genest Saint Isle, France)に、無菌のＰＢＳに溶解の１ｍｌ３％（ｗｔ／ｖｏｌ）チオグリコレートを、１４時間後に５０μｌの５００ｎｍケモカイン類似体又はＰＢＳを腹腔内注射した。２日後、マウスは殺され、３ｍｌの低温ＰＢＳを腹腔内注射され、腸膜細胞を回収し、該細胞は次いで抗ＣＤ１１ｂ‐ＦＩＴＣ、抗Ｌｙ６Ｇ‐ＰＥ及び抗７／４‐ＡＰＣ(R & D Systems, Lille, France)で染色された。マウス毎に少なくとも７．１０６の細胞が数えられた。異なる細胞種の百分率及び絶対数が計算された。地方動物実験倫理委員会は実験プロトコルを是認した。
【０１１１】
１．１３．ＣＸ３ＣＲ１再生
ＣＸ３ＣＲ１の再生を検討するため、先ず１００ｎｍのＦＫＮ（ＣＸＣＬ１）、１００ｎｍのＦ２又は媒体をコントロールとして用い、ＨＥＸ‐ＣＸ３ＣＲ１細胞を３７℃で３０分間培養した。細胞を４回媒体中で室温にて洗浄し、更に３７℃で培養した。アリコットを種々の回数で取り、染色し、段落１．１３で記載のように分析した。線形回帰を解析し、グラフパッドソフトウェアを用いて傾斜を計算した。
【０１１２】
実施例２：ＣＸ３ＣＲ１モジュレータを処理する
【０１１３】
２．１．ＣＸ３ＣＲ１アンタゴニストを処理する
ファージ粒子は哺乳類細胞にレセプタ依存様に効率的にエンドサイトーシスして取り入れられ、ファージケモカインアゴニストは細胞溶解後回収が可能である。生細胞競合溶出による変調ファージ表示ベース選択方法を用いて、アンタゴニスト特性をもつＣＸ３ＣＬ１変種を優先的に選び出した。この方法では、ファージライブラリをＣＸ３Ｃｌ１発現細胞で、３７℃で培養して、アゴニストファージ特性のリガンド誘発内在化を可能にした。ファージ表示ＣＸ３ＣＲ１アンタゴニストは細胞には入らず、従って大量過剰の可溶性ＣＸ３ＣＬ１と競合溶出し易いものであろう。
【０１１４】
ヒトＣＸ３Ｃｌ１ケモカイン領域は、成熟タンパク質の初めの７７個の残基から成るが、ファージ表示によって発現のためクローン化された。ＣＸ３ＣＬ１ファージは、抗ＣＸ３ＣＬ１抗体との検出可能な結合を示したが、アイソタイプである制御抗体を示さなかった。更に、ＣＸ３ＣＬ１ファージは、ＣＸ３ＣＲ１を発現するＨＥＫ細胞に結合したが、元のＨＥＫ又はＣＣＲ５発現細胞の何れにも結合しなかった。ＣＣＬ５発現ファージは抗ＣＸ３ＣＬ１抗体又はＨＥＫ‐ＣＸ３ＣＲ１細胞の何れとも結合しなかった。これ等の結果は、ＣＸ３ＣＬ１ファージは特にＣＸ３ＣＲ１発現細胞に結合したことを示す。
【０１１５】
本発明者等の上記研究及びＣＸ３ＣＬ１がファージ上に上手く発現されると云う例証に基づいて、ＰＣＲ突然変異誘発を用いて、ＣＸ３ＣＬ１変種のファージライブラリを設計、且つ発現させ、ここで、ＣＸ３ＣＬ１のＤＮＡ配列の初めの６個の残基は完全又は部分的にランダム化された。ＣＸ３ＣＬ１変種のもう１つのファージライブラリでは、１残基Ｎ末端延長部（位置０）が我々のライブラリ設計に加えられた。最後に、ＣＸ３ＣＬ１の２つの突然変異体は組成が次の通りであった：
‐Ｘ０Ｚ１Ｘ２Ｘ３Σ４Φ５Ψ６−ＣＸ３ＣＬ１（７‐７６）（即ち、配列ＩＤ番号：５４のアミノ酸３１〜１００に融合する配列ＩＤ番号：６４）及び
‐Ｘ１Ｘ２Ｘ３Σ４Φ５Ψ６−ＣＸ３ＣＬ１（７−７６）（即ち、配列ＩＤ番号：５４のアミノ酸３１〜１００に融合する配列ＩＤ番号：７）
ここでＸは任意のアミノ酸、ＺはＬ、Ｐ、Ｑ又はＲ、ΣはＶ、Ａ、Ｄ又はＧ、ΦはＬ、Ｍ又はＶ、ΨはＳ、Ｐ、Ｔ又はＡ（表１）である。
【０１１６】
ＨＥＫ‐ＣＸ３ＣＲ１に付いて４回の選択の後、下の表１に示すアンタゴニストが特定された。
【０１１７】
【表１】
2012511921.tif 000004
【０１１８】
選択配列を比較することにより、コンセンサス配列を定義：ＩＬＤＸＧＬ／ＶＡ／Ｓ（配列ＩＤ番号：６）することができた、ここでＸは任意のアミノ酸である。
【０１１９】
このコンセンサス配列の選択がＣＸ３ＣＲ１に特有なものであるかどうかを確認するため、同一選択手続をＨＥＫ‐ＣＣＲ５細胞に付いて行った。２回のバイオパニングの後、選択ファージの殆どはＣＸ３ＣＬ１遺伝子インサートが無くなっていた。
【０１２０】
最後に、優先選択ファージクローン、即ち配列番号：８のＩＬＤＮＧＶＳ（配列ID番号：８以下、Ｆ１と云う）が固定抗ＣＸ３ＣＬ１抗体及びＣＸ３ＣＲ１発現細胞に結合したのが確認された。この結合は特有である、即ちファージＦ１は制御体ＩｇＧをも、元のＨＥＫ又はＨＥＫ‐ＣＣＲ５をも認識しなかった。
【０１２１】
更なる分析のため、化学合成を用いて、ＣＸ３ＣＬ１ケモカイン領域に対応してＦ１類似体を可溶性タンパク質として生成した。更に、免疫グロブリンのネズミＦｃ断片をもつ融合タンパク質を構築して、生体内半減期が長いＦ１の変種を生成した。
【０１２２】
２．２．ＣＸ３ＣＲ１アゴニストを工学する
エンドサトーシスで取り込まれたファージを回収して、ＣＸ３ＣＲ１アゴニストを単離した。上記段落２．１に既述のものと同じライブラリを用いた。ＨＥＲ‐ＣＸ３ＣＬ１細胞に付いて複数回の選択の後、下の表２に示すアゴニストが特定された。
【０１２３】
【表２】
2012511921.tif 000005
【０１２４】
これ等選択配列により、ＱＰＱＧＶＳ（配列ＩＤ番号：５１）コンセンサス配列を特定することができた。
【０１２５】
実施例３：Ｆ１のＣＸ３ＣＲ１リガンドとしての特徴付け
【０１２６】
ＣＸ３ＣＲ１に対するＦ１の結合親和力を、ＨＥＫ‐ＣＸ３ＣＬ１細胞及びトレーサとしての[１２５I]‐ＣＸ３ＣＬ１との競合結合において生ＣＸ３ＣＬ１のものと比較した。Ｆ１類似体はＣＸ３ＣＲ１と相互に作用したが、ＣＸ３ＣＬ１より親和度が低かった。１．９ｎＭの見掛け結合親和度（ＩＣ５０）（Ｌｏｇ  ＩＣ５０＝−８．７３±０．２１；ｎ＝３）がＦ１に付いて決定されたが、それはＣＸ３ＣＬ１のもの（ＩＣ５０＝０．１６ｎＭ；ＬｏｇＩＣ５０＝−９．７９±０．２８；ｎ＝３）より約１２倍弱かった。同様の親和度における差は、Ｆ１とＣＸ３ＣＬ１をＣＨＯ‐ＣＸ３ＣＲ１細胞に付いて調べ、且つＣＸ３ＣＬ１‐Ｉｇ の親和度をＦ１‐Ｉｇのものと比較したところ明らかになった。それと共にこれ等データは、Ｆ１類似体は特にＣＸ３ＣＲ１に結合するが、生ＣＸ３ＣＬ１より親和度が僅かに弱いことを確認させる。
【０１２７】
アンタゴニストに対するファージ選択方法は、ＣＸ３ＣＲ１発現細胞に内在化しないクローンを優先的に選択するように工夫された。ＣＸ３ＣＲ１の量依存下方変調を誘発する生のＣＸ３ＣＬ１と違って、Ｆ１はＨＥＫ細胞にＣＸ３ＣＲ１内在化を誘発しないことが確認された。０．１μＭのＣＸ３ＣＬ１は培養３０分後に４０％のＣＸ３ＣＲ１内在化を誘発したが、１μＭのＦ１は内在化効果が全く無かった。ＣＣＲ５アンタゴニストに付いての報告のように、活性の上方調整さえ観測された。同様の結果がＣＨＯ‐ＣＸ３ＣＲ１細胞でも得られた。これは、培養媒体中のＣＸ３ＣＬ１のトレースによる、又はレセプタ自身の固有の活動による、辺縁のＣＸ３ＣＲ１の活性によるものかも知れず、これはＦ１により抑制され、逆アゴニストとして機能する可能性もある。
【０１２８】
実施例４：Ｆ１はＣＸ３ＣＬ１誘発カルシウム及び走性応答を拮抗させる
【０１２９】
ＨＥＫ‐ＣＸ３ＣＲ１細胞にカルシウム応答を引き出すＦ１の能力が次いで、ＣＸ３ＣＬ１のものと比較された。生ＣＸ３ＣＬ１とは異なり、Ｆ１は応答が、ＨＥＫ‐ＣＸ３ＣＲ１細胞における濃度３００ｎｍまで（図３Ａ，トレースａとｂを比較）又はヒトＰＢＭＣにおける４００ｎＭまで（図３Ａ、トレースｃとｄを比較）及びＣＨＯ‐ＣＸ３ＣＲ１細胞において全く、観測されなかった。同様の結果がＦ１−Ｉｇキメラでも得られた。次いで、ＣＸ３ＣＬ１誘発細胞応答を抑制するＦ１の能力が調べられた。Ｆ１とＦ１−Ｉｇ両方の存在下で、２０ｎＭのＣＸ３ＣＬ１により誘発されるカルシウム応答は量依存的に、３４ｎｍ及び７２ｎｍのＩＣ５０夫々で減少した（図３Ｂ）。
【０１３０】
次いで、ＣＸ３ＣＲ１媒介走性に対するＦ１の効果を調べた（図２）。ＣＬ３ＣＬ１はＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞に有意の応答を引き出し、ＣＸ３ＣＬ１‐Ｉｇ はその結合親和度と一貫して完全効能だが効力の減少した走性を誘発した。それと対照的に、Ｆ１もＦ１‐Ｉｇ もどの検査濃度でも走性を誘発しなかった。検査リガンドの何れも、微小Ｔｈ１細胞毒性分集団を除いてＣＸ３ＣＲ１を発現しないＣＤ４＋Ｔ細胞（図２Ｃ）による検出可能な走性を全く誘発しなかった。
【０１３１】
Ｆ１及びＦ１‐Ｉｇは両方とも、２．７ｎＭ及び６．１ｎＭ夫々のＩＣ５０値(Log IC50=0.44±0.07; n=3 及び0.79±0.17; n=3)にて量依存的に、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＨ３ＣＬ１及びＣＸ３ＣＬ１‐Ｉｇ 誘発走性を抑制できた。ヒトＴＨＰ‐１及びネズミＣＤ１１ｂ＋ＭＢＭＣでも同様の結果が得られた。
【０１３２】
【表３】
2012511921.tif 000006
【０１３３】
従って、Ｆ１はヒト及びネズミＣＸ３ＣＲ１レセプタの有効なアンタゴニストである。
【０１３４】
実施例５：Ｆ１はＣＸ３ＣＬ１媒介着生を拮抗させる
【０１３５】
細胞面と粘素ストークを介して連鎖するケモカイン分域から成る完全なＣＸ３ＣＬ１分子は、そのレセプタＣＸ３ＣＲ１と対になると、特性がかなりの接着性のものとなる。ＣＸ３ＣＬ１の接着性はストークの性質と独立して報告されるべきなので、ＣＸ３ＣＬ１−Ｉｇ は接着分子として挙動するものと仮定された。
【０１３６】
静的接着アッセイでは、ＣＸ３ＣＬ１-Ｉｇ はＨＥＫ‐ＣＸ３ＣＲ１細胞を有意に捕獲したが、非特定Ｉｇ はそうでなかった。更に、親のＨＥＫ細胞はＣＸ３ＣＬ１−Ｉｇ に接着しなかった。Ｆ１‐Ｉｇ はまた、特にＣＸ３ＣＲ１発現細胞を捕獲したものの、その結合親和度が低いことに整合して、見掛け能力はＣＸ３ＣＬ１‐Ｉｇ の１／８であった。
【０１３７】
更に、可溶性のＦ１は固定ＣＸ３ＣＬ１に対するＣＸ３ＣＲ１陽性細胞の接着力をかなり減少させた、即ち接着能は可溶性ＣＸ３ＣＬ１のものの４０倍低かった。従って、Ｆ１はまた、ＣＸ３ＣＬ１／ＣＸ３ＣＲ１媒介接着を拮抗した。これ等の結果はまた、Ｆ１のアンタゴニスト能は結合アッセイ及と接着アッセイでは僅かに異なることを示している。
【０１３８】
実施例６：Ｆ１は生体内でＣＸ３ＣＲ１アンタゴニストの働きをする
【０１３９】
Ｆ１の生体内抑制作用を更に、Boring et al. (1997, J Cli Invest 100, 2552-61)のチオグリコール酸塩誘発腹膜炎モデルで評価した。
【０１４０】
チオグリコール酸塩の腹腔内注射の６２時間後、腹腔に漸増される循環単核性細胞を、それ等のＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｇ及び７／４発現についてフローサイトメトリーにより分析した。単球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ‐７／４＋）漸増は、チオグリコール酸塩注射後１４時間後、Ｆ１の１注射で治療されるマウスにおいて有意に減少した。それとは対照的に、ＣＸ３ＣＲ１陰性であるＰＭＮ母集団（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋）の移動はＦ１投与により有意には影響されなかった。減少単球漸増は、高レベルのＣＸ３ＣＲ１を発現する７／４ｌｏ分集団で特に明らかであった（図６Ｃ）。一方、７／４ｈｉ単球（ＣＸ３ＣＲ１ｌｏ）の移動は殆ど影響を受けなかった。
【０１４１】
実施例７：結論
【０１４２】
この検討では、ファージ表示方法を用いて、アゴニスト及びアンタゴニストＣＸ３ＣＬ１ケモカイン類似体を選択した。アゴニストであるリガンドはＣＸ３ＣＲ１レセプタに結合し、ＣＸ３ＣＲ１信号発信を向上させることができる。これとは違って、アンタゴニスト・リガンドは、アゴニスト誘発信号発信を起こさずに、ＣＸ３ＣＲ１レセプタに結合することができる。幾つかの斯かるアゴニスト及びアンタゴニストＣＸ３ＣＬ１類似体が選ばれた（配列ＩＤ番号：７〜５０）。これ等選択ＣＸ３ＣＬ１類似体により、ＣＸ３ＣＲ１モジュレータのコンセンサス配列の定義が可能になった（配列ＩＤ番号：１〜６及び５１）。
【０１４３】
Ｆ１アンタゴニスト類似体は更に特徴付けられた。Ｆ１はＣＸ３ＣＲ１内在化、又はカルシウム応答（図３Ａ）又は化学走性応答（図２Ａ）を全く誘発しなかった。更に、Ｆ１はＣＸ３ＣＬ１誘発カルシウム応答（図３Ｂ）、並びにＣＸ３ＣＬ１‐ＣＸ３ＣＲ１軸に媒介される化学走性（図２Ｄ）及び癒着性機能を抑制した。最後に、Ｆ１は、生体内テスト中に単球漸増の抑制を有意に促進した。従って、Ｆ１がヒトＣＸ３ＣＲ１の真実のアンタゴニストであることを意味する。
【０１４４】
Ｆ１と同様、選択ケモカイン・アンタゴニストの殆どは、生タンパク質の残基０、１及び２（残基０はＮ末端延長部を表す）に対応するＮ末端コンセンサス・モチーフＩＬＤを担う（表１）。このモチーフは脂肪Ｉ及びＬ残基の存在のため、生ＣＸ３ＣＬ1のＱＨＨＧＶＴ配列より疎水性であり、又より酸性である（Ｄ対Ｈ）。一方、位置３には明白な選択は無く、位置４〜６で選ばれた残基はヒト及びネズミＣＸ３ＣＬ１で判明されたものに類似していた（表１）。従って、タンパク質の延長Ｎ末端におけるＩＬＤモチーフはＦ１のアンタゴニスト特性に重要な働きをするであろう。
【０１４５】
選択ケモカイン・アンタゴニストの殆どは、生成熟ＣＸ３ＣＬ１タンパク質（即ち、ライブラリＸ０Ｚ１Ｘ２Ｘ３Σ４Φ５Ψ６‐ＣＸ３ＣＬ１（７〜７６））のＮ末端終端と比較して付加的１残基Ｎ末端延長部（位置０）から成るファージライブラリに由来した。これとは対照的に、全選択ケモカイン・アゴニストはＸ１Ｘ２Ｘ３Σ４Φ５Ψ６‐ＣＸ３ＣＬ１（７〜７６）ライブラリに由来した。
【０１４６】
Ｆ１類似体は、１ｎＭのＣＸ３ＣＬ１により媒介される化学走性を見掛け親和度３〜６ｎＭで拮抗させた（図２Ｄ）。それはまた、２０ｎＭのＣＸ３ＣＬ１により見掛け親和度３４ｎＭにて媒介されるカルシウム応答を首尾一貫して抑制した（図３Ｂ）。而も、細胞接着アッセイにおける見掛けＦ１親和度は１５０ｎＭに近い、即ち可溶性ＣＸ３ＣＬ１の見掛け効力より４０倍高かった。これは、固定ＣＸ３ＣＬ１に対するアビジティー（ａｖｉｄｉｔｙ）に関するＦ１の効果はＣＸ３ＣＲ１に対するその結合親和力に従わないこと、及び単純なＣＸ３ＣＬ１／ＣＸ３ＣＲ１結合と比較して、より複雑な過程がＣＸ３ＣＬ１／ＣＸ３ＣＲ１接着に多分伴うことを示している。
【０１４７】
マウスにおいては、２つの重要な単球個体群がＣＸ３ＣＲ１及びＬｙ６Ｃ又は７／４の発現レベルに従って記述された。ヒトＣＤ１４＋単球に対応する所謂古典的又は炎症性単球はＣＸ３ＣＲ１ｌｏＬＹ６Ｃｈｉ７／４ｈｉＣＣＲ２＋ＣＤ６２Ｌ＋であり、一方ヒトＣＤ１６＋単球に類似の非古典的単球はＣＸ３ＣＲ１ｈｉＬＹ６Ｃｌｏ７／４ｌｏＣＣＲ２−ＣＤ６２Ｌ−である。古典的単球はＣＸ３ＣＲ１発現とは独立して、炎症部位急速に漸増されるものと報告されている。非古典的単球に付いては余り知られていないが、常住個体マクロファージ又はＤＣに取って代わる非炎症組織に移行するためにＣＸ３ＣＲ１を用いることが提言されている。最近の報告によれば、この単球分集団は血管の管腔面を監視し、これ等組織を急速に湿潤してマクロファージに分化させる一方、古典的単球は後に炎症部位に達し、炎症性樹状突起細胞を生ずる。ＣＸ３ＣＲ１アンタゴニストＦ１がＣＸ３ＣＲ１陽性単球個体群の移動を特に低下させると云うことは、Ｆ１等のアンタゴニストが炎症経路の徹底的分析において、また広範囲の抑制物質の副作用の最終予防おける治療セットにおいて有用である可能性を示している。
【０１４８】
Ｆ１等の選択的ＣＸ３ＣＲ１抑制物質は、ＣＸ３ＣＬ１がある役割をなす種々の疾病における炎症を抑制するのに有用であることが判明するであろう。されど、炎症を起こした器官に何れかのＣＸ３ＣＲ１アンタゴニストの作用を向けることは極めて重要である。例えばアテローム発生又は糸球体腎炎等の疾患においては、アンタゴニストが主として循環及び湿潤単球を標的にし、常住細胞は到達できないであろう。他の疾病では、特定の標的化は二価のＩｇキメラを用いて得られるかも知れない。従って、細胞マーカーに特有な一抗体を本発明に従ってモジュレータに融着させ得る可能性がある。
【０１４９】
実施例８：Ｆ２のＣＸ３ＣＲ１アゴニストとしての特徴付け
【０１５０】
配列ＩＤ番号：６６（Ｆ２と云う）のポリペプチドと配列ＩＤ番号：６８のポリペプチドを化学合成により生成した。これ等２つのポリペプチドは、それ等のＮ末端終端に配列ＩＤ番号：５１の配列を含む。従って、それ等は本発明によるアゴニストである。これ等ポリペプチドがＣＸ３ＣＲ１レセプタのアゴニストの働きをすることを確認するため、実験による検討が行われた。
【０１５１】
全実験で、Ｆ２をＣＸ３ＣＬ１と比較し、Ｆ２-ＩｇをＣＸ３ＣＬ１-Ｉｇ と比較した。これ等分子は、Ｆ２及びＦ２-Ｉｇ に夫々、類似するタンパク質に対応するが、野生型Ｎ末端終端を有する。
【０１５２】
Ｆ２及びＦ２-Ｉｇ をＣＸ３ＣＲ１に結合する競合的放射リガンドを特定するアッセイが実施例１．８に記載のように行われた。図４に示すように、Ｆ２及びＦ２-Ｉｇ がＣＸ３ＣＲ１に対して、ＦＫＮ（ＣＸ３ＣＬ１）及びＦＫＮ-Ｉｇ（ＣＸ３ＣＬ１-Ｉｇ）より夫々、有意に高い親和度を示すことが分かった。ＣＸ３ＣＲ１発現ＨＥＫ細胞に関して、且つトレーサとして１２５Ｉ‐ＦＫＮの場合、僅か０．０５ｎＭのＩＣ５０がF２に対して（ＣＸ３ＣＬ１の０．５８であるＩＣ５０に対する）観測された。ＣＨＯ発現ＨＥＫ細胞に関して、且つトレーサとして１２５Ｉ‐ＦＫＮの場合、僅か０．３９ｎＭであるＩＣ５０がF２―Iｇに対して（ＣＸ３ＣＬ１-Ｉｇ の１．４７であるＩＣ５０に対する）が観測された。以上のことを纏めてみると、Ｆ２及びＦ２-Ｉｇ は、同一レセプタに対してＣＸ３ＣＬ１の親和度の約１０倍高いＣＸ３ＣＲ１親和度を示す。この結果は、２つの異なる細胞種（ＨＥＫ及びＣＨＯ）で発見された。
【０１５３】
Ｆ２及びＦ２-Ｉｇ は更に、
‐実施例１．１１に記載のような接着アッセイ、
‐実施例１．７に記載のようなダウン変調及び
‐実施例１．８に記載のような再生アッセイ
を行うことで特徴付けられる。
【０１５４】
Ｆ２-Ｉｇ はＣＸ３ＣＬ１-Ｉｇ より接着性が良好である（図５Ａ）ことが分かった。更に、Ｆ２はＣＸ３ＣＬ１と同様に効率よく膜ＣＸ３ＣＲ１レセプタの内在化を誘発できる（図５Ｂ）。更に、Ｆ２はＣＸ３ＣＬ１より効率よく内在化ＣＸ３ＣＲ１を保持する。実に、Ｆ２の存在下で培養された細胞は、ＣＸ３ＣＬ１の存在下で観測される速さより２倍遅い速さで内在化ＣＸ３ＣＲ１を再生する（図５Ｃ）。
【０１５５】
ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の走化性を誘発するＦ２及びＦ２-Ｉｇ の能力を、実施例１．１０に記載のようにして更に評価した。Ｆ２及びＦ２-Ｉｇ はこれ等全ての細胞に走化性を誘発できることが分かった（図６）。この能力は少なくともＣＸ３ＣＬ１−Iｇのものと同程度高い。
【０１５６】
ＣＨＯ−ＣＸ３ＣＲ１細胞にカルシウム応答を誘発するＦ２-Ｉｇ の能力を、実施例１．９に記載のようにして評価した。Ｆ２-Ｉｇ はＣＨＯ−ＣＸ３ＣＲ１細胞にカルシウム応答を誘発できることが分かった（図７）。この能力は少なくともＣＸ３ＣＬ１-Ｉｇ のものと同程度高い。
【０１５７】
以上のことを纏めると、上記結果はＦ２及びＦ２-Ｉｇ がＣＸ３ＣＲ１レセプタのアゴニストの働きをすることを実証している。実際、Ｆ２及びＦ２-Ｉｇ は両者共、（i）ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の走化性を誘発でき、且つ（ii）カルシウム応答を誘発できる。更に、それ等はＣＸ３ＣＲ１に対する親和性が野生型ＣＸ３ＣＬ１ケモカインより高いこと、並びに接着性も保持能力も良いことを示す。
【０１５８】
斯くして、本明細書に記載のＣＸ３ＣＲ１アゴニストを機能的に選別することにより、ＣＸ３ＣＲ１アゴニストが首尾良く単離できることが示された。
【図１】
2012511921.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2012511921.tif 000011
【図６】
2012511921.tif 000012
【図７】
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【配列表】
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