(57)【要約】  本発明は、遺伝子型を同定する、並びにＢＡＮＫ１に関連するＳＮＰのみ、又は少なくとも１つの他のＳＮＰと組合せたＢＡＮＫ１に関連するＳＮＰの使用によって、ＳＬＥ及び／又はＭＳに対する感受性を予測するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子型を同定するための方法であって、
ａ．個体の試料から単離された核酸を使用する段階；
ｂ．二対立遺伝子マーカーにおける
−ｒｓ１０５１６４８６及びｒｓ９５０３５７、
−ｒｓ１０５１６４８６及びｒｓ１３４２３３７、
−ｒｓ１０５１６４８６及びｒｓ１９３７８４０、
−ｒｓ１０５１６４８３及びｒｓ１４０１３８５、
−ｒｓ１０５１６４８３及びｒｓ１７１７０４５、
−ｒｓ１０５１６４８３及びｒｓ１４７８８９５、
−ｒｓ１０５１６４８３及びｒｓ１０４９３８０、
−ｒｓ１０５１６４８３及びｒｓ１０５０７３９３、
−ｒｓ１０５１６４８３及びｒｓ１０５０８０２１、
−ｒｓ１８７２７０１及びｒｓ１０５０８０２１、又は、
−ｒｓ１０５１６４８３，ｒｓ１４７８８９５及びｒｓ１０４９８３０、あるいは１又は複数のこれらのＳＮＰと連鎖不平衡（LD）にあるＳＮＰ、又はＢＡＮＫ１、ＢＬＫ及び／又はＩＴＰＲ２のいずれかとＬＤにある１又は複数のＳＮＰにおいてヌクレオチド型を決定する段階；並びに、
ｃ．段階ｂの結果を全身性エリテマトーデス（SLE）に対する感受性のリスクと相関させる段階、
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの同定が、個体のゲノムに存在する二対立遺伝子マーカーの両方のコピーに対して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記決定が、ミクロシークエンシングアッセイによって実施される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記決定段階前に、二対立遺伝子マーカーを含んでなる配列の一部を増幅する段階をさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記増幅がＰＣＲによって実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記個体における、ｒｓ１０５１６４８６中のＣ又はＴ、ｒｓ１０５１６４８３中のＣ又はＧ、ｒｓ１８７２７０１中のＧ又はＴ、ｒｓ９５０３５７中のＡ又はＣ、ｒｓ１３４２３３７中のＡ又はＧ、ｒｓ１９３７８４０中のＣ又はＧ、ｒｓ１４０１３８５中のＴ又はＡ、ｒｓ１７１７０４５中のＡ又はＧ、ｒｓ１４７８８９５中のＣ又はＧ、ｒｓ１０４９３８０中のＴ又はＧ、ｒｓ１０５０７３９３中のＴ又はＣ、及び／或いはｒｓ１０５０８０２１中のＧ又はＣの存在が、個体がＳＬＥに対する感受性のリスクを有することを示し、ここで該リスクを有する対立遺伝子が最初に列記されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
個体がＳＬＥに対する感受性のリスクを有することを予測することにおける使用のための、ｒｓ１０５１６４８６、ｒｓ９５０３５７、ｒｓ１３４２３３７、ｒｓ１９３７８４０、ｒｓ１０５１６４８３、ｒｓ１４０１３８５、ｒｓ１７１７０４５、ｒｓ１４７８８９５、ｒｓ１０４９３８０、ｒｓ１０５０７３９３、ｒｓ１０５０８０２１、ｒｓ１８７２７０１からなる群から選択される少なくとも２個のＳＮＰ、１又は複数のこれらのＳＮＰと連鎖不平衡（LD）にあるＳＮＰ、並びにＢＡＮＫ１、ＢＬＫ及び／又はＩＴＰＲ２のいずれかとＬＤにある１又は複数のＳＮＰ。
【請求項８】
個体がＳＬＥに対する感受性のリスクを有することを予測することにおける使用のための、ｒｓ１０５１６４８６とｒｓ９５０３５７、ｒｓ１３４２３３７、又はｒｓ１９３７８４０との組合せ；又はｒｓ１０５１６４８３とｒｓ１４０１３８５、ｒｓ１７１７０４５、ｒｓ１４７８８９５、ｒｓ１０４９３８０、ｒｓ１０５０７３９３、又はｒｓ１０５０８０２１との組合せ；或いはｒｓ１８７２７０１とｒｓ１０５０８０２１との組合せ；或いはｒｓ１０５１６４８３とｒｓ１４７８８９５又はｒｓ１０４９８３０との組合せ。
【請求項９】
個体におけるＳＬＥに対する感受性のリスクを予測するための方法であって、
ａ．個体の試料から抽出された核酸を使用する段階；
ｂ．上記個体において、周知の方法によって有用な遺伝子マーカーの存在を同定する段階であって、ここで当該遺伝子マーカーが、ｒｓ１０５１６４８６とｒｓ９５０３５７、ｒｓ１３４２３３７、又はｒｓ１９３７８４０との組合せ；又はｒｓ１０５１６４８３とｒｓ１４０１３８５、ｒｓ１７１７０４５、ｒｓ１４７８８９５、ｒｓ１０４９３８０、ｒｓ１０５０７３９３、又はｒｓ１０５０８０２１との組合せ；或いはｒｓ１８７２７０１とｒｓ１０５０８０２１との組合せ；或いはｒｓ１０５１６４８３とｒｓ１４７８８９５又はｒｓ１０４９８３０との組合せ；或いはＢＡＮＫ１、ＢＬＫ及び／又はＩＴＰＲ２遺伝子のいずれかとＬＤにあるＳＮＰである段階；並びに、
ｃ．段階ｂの結果に基づき、個体のＳＬＥに対する感受性を有する可能性を予測する段階、
を含んでなる、方法。
【請求項１０】
前記遺伝子マーカーが、ｒｓ１０５１６４８３、ｒｓ１４７８８９５及びｒｓ１０４９３８０の組合せ、あるいはＢＡＮＫ１、ＢＬＫ及び／又はＩＴＰＲ２遺伝子のいずれかとＬＤにあるＳＮＰである、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢＡＮＫ１、ＢＡＮＫ１に関するＳＮＰ（一塩基多型）、ＢＡＮＫ１ ＳＮＰと他のＳＮＰとの組合せ、並びにＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）及び／又はＭＳ（多発性硬化症）の予測におけるこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子技術によって、個体における一塩基多型（SNP）を同定することができる。ＳＮＰは、１つの単一ヌクレオチドの遺伝子における変化であり、ＳＮＰの同定は特定の疾患に影響のある生物的経路と相関し得る。多型は、統計分析の適用によって疾患の素因又はリスクとも相関しうる。従って、疾患に関する特定の生物的経路を標的とすることは、このような疾患を治療するための方法である。
【０００３】
アンキリンリピートを有するＢ細胞裏打ちタンパク質（BANK1）は、Ｂ細胞で発現され、Ｂ細胞抗原受容体（BCR）刺激上でチロシンリン酸化される。ＢＡＮＫ１遺伝子は、２８４ｋｂを有する。ＢＡＮＫ１は、Ｂ細胞中に主として発現されるアダプタータンパク質である（14,15）。７８５個と７５５個のアミノ酸の２つの全長アイソフォームは、選択的エクソン１ＡによってコードされるＮ末端領域において３０個のアミノ酸だけ異なり、アンキリンリピートモチーフ、並びにＢＡＮＫ１、ＢＣＡＰ及びＤｏｆアダプタータンパク質の間で非常に類似しているコイルドコイル領域構造を含む（16）。ＢＣＲ結合を介したＢ細胞活性は、ＢＡＮＫ１のチロシンリン酸化を引き起こし、プロテインチロシンキナーゼＬｙｎ及びカルシウムチャネルＩＰ３Ｒとの結合を次々に促進する（4）。ＢＡＮＫ１は、共に架橋形成しリン酸化反応及びＬｙｎによるＩＰ３Ｒの活性化並びに小胞体ストアからのＣａ２＋の放出を促進するドッキングステーションとして機能する（4, 17）。
【０００４】
ＢＡＮＫ１及びこれが関与する経路は、炎症性及び自己免疫疾患に影響すると考えられる。特に、ＢＡＮＫ１はＢ細胞で発現され、したがってＢＡＮＫ１が関与する経路は、Ｂ細胞と関連のある疾患、例えば、全身性エリテマトーデス（SLE）に影響する。多発性硬化症（MS）はＴ細胞に関係し、しかしながら、当該疾患におけるＢ細胞の機能もまた考察されている。従って、ＢＡＮＫ１遺伝子中の多型は、ＭＳに関する素因又はリスクを診断するために使用してよい。さらに、ＢＡＮＫ１経路はＭＳに影響しうる。これによって、当該経路を標的にすること及びこの調節は、ＭＳを予防又は治療するための手段を意味しうる。
【０００５】
複合疾患、例えばＳＬＥ又はＭＳと関連がある多くの遺伝子が同定されてきたが、遺伝的感受性へのこれらの個々の寄与は小さい。遺伝的エピスタシス相互作用によって、より大きなリスク効果が説明され、且つ生物的経路が明らかとなりうる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の一態様によれば、本発明の方法は、ＢＡＮＫ１の経路が関与する自己免疫又は炎症性疾患を発症する又は患う素因、リスクに関して個体を診断するために供される。
【０００７】
本発明の他の態様によれば、本発明の方法は、１つのＢＡＮＫ１ ＳＮＰと連鎖不平衡（LD）にあるＳＮＰを使用することができ、好ましくは少なくとも１つのＢＡＮＫ１ ＳＮＰが少なくとも１つの第二のＳＮＰと結合されている、自己免疫又は炎症性疾患を発症する又は患う素因、リスクに関して個体を診断するために供される。
【０００８】
本発明の詳細な説明
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＢＡＮＫ１（rs10516483）、ＢＬＫ（rs1478895）及びＩＴＰＲ２（rs1049380）に対する、リスクを有する各対立遺伝子を有する症例（x, 太文字）及び対照（y）の割合Ｘ／Ｙを表示するベン図を示す。
【図２】図２は、３’ＵＴＲ ＳＮＰ ｒｓ１０４９３８０の遺伝子型との、ＩＴＰＲ２のレベルの相関を示す。相対的なｍＲＮＡレベルは、ＴＢＰのレベルに対して規準化された転写ｍＲＮＡの存在量を反映する。
【図３】図３は、（rs1049380と連鎖不平衡にある, 図1）３’ＵＴＲ ＳＮＰ ｒｓ４６５４の遺伝子型とＩＴＰＲ２のレベルは相関関係があり、一方３’ＵＴＲ領域外の他のＳＮＰ ｒｓ１９９４４８４は相関関係がないことを示す。相対的なｍＲＮＡレベルは、ＴＢＰのレベルに対して規準化された転写ｍＲＮＡの存在量を反映する。
【図４】図４は、ＢＡＮＫ１とＢＬＫとの間の物理的相互作用を表している免疫沈降及びウエスタンブロットを示す。ＢＡＮＫ１−ＦＬＡＧ及びＢＬＫ−Ｖ５をＨＥＫ２９３Ｔ細胞上に同時トランスフェクションし、抗ＦＬＡＧ抗体を使用して免疫沈降を行った。抗Ｖ５抗体を使用してウエスタンブロットを実施し、抗ＦＬＡＧ抗体で確認した。レーンは：１．トランスフェクトされていない細胞；２．ＦＬＡＧ ｍｏｃｋ及びＢＬＫトランスフェクションのみ；並びに３．ＦＬＡＧ−ＢＡＮＫ１及びＢＬＫ−Ｖ５の同時トランスフェクションである。
【図５】図５は、ＢＡＮＫ１及びＢＬＫの細胞共局在を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ腎細胞を、ＢＬＫ−ＧＦＰ（I）及び抗ヒトＢＡＮＫ１ポリクローナル抗体で検出されたＢＡＮＫ１（II）を含むコンストラクトで同時トランスフェクトした。細胞の核を確認するためにＤＡＰＩを使用した（III）。ＢＬＫは細胞膜及び細胞質に局在し、一方ＢＡＮＫ１は細胞質に局在化した。矢印によって示されるように、併せたものは、細胞質画分における細胞内小胞内のＢＡＮＫ１及びＢＬＫの共局在を示す（IV）。
【図６】図６は、ＢＡＮＫ１、ＢＬＫ及びＩＴＰＲ２の転写発現レベルに対するＰＢＭＣのインターフェロン−α刺激効果を示す。ＰＢＭＣを、全ＲＮＡ精製及びｑＲＴ−ＰＣＲ分析に続いて、１０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮα（Raybiotech）で６時間培養下で刺激した。
【００１０】
本発明は、遺伝子型を同定するための方法であって、
ａ．個体の試料から単離された核酸を使用する段階；及び、
ｂ．二対立遺伝子（diallelic）マーカーにおけるｒｓ１０５１６４８６、ｒｓ１０５１６４８３、ｒｓ１８７２７０１、ｒｓ１０４９６６３７、ｒｓ９５０３５７、ｒｓ１０５１６９２８、ｒｓ１３４２３３７、ｒｓ１９３７８４０、ｒｓ１０５０５７７４、ｒｓ２３０２７３３、ｒｓ７３８９８１、ｒｓ６６８３８３２、ｒｓ２３００１６６、ｒｓ１９０１７６５、ｒｓ１４０１３８５、ｒｓ１７１７０４５、ｒｓ７９０８３７、ｒｓ１０４８４３９６、ｒｓ１０４８５１３６、ｒｓ９２９４３６４、ｒｓ８８１２７８、ｒｓ７２０６１３、ｒｓ１４７８８９５、ｒｓ１９９２５２９、ｒｓ２２８９９６５、ｒｓ１０５０２２６３、ｒｓ１０４９３８０、ｒｓ１０５０６１４０、ｒｓ１０５０７３９３、ｒｓ１０５０８０２１、ｒｓ１８８６５６０、ｒｓ２１６５７３９及び／又はｒｓ１０５０８０２１、並びに／或いは１又は複数のこれらのＳＮＰと連鎖不平衡（LD）にあるＳＮＰ、及び／又はＢＡＮＫ１、ＢＬＫ及び／又はＩＴＰＲ２のいずれかとＬＤにある１又は複数のＳＮＰにおいて、ヌクレオチド型を決定する段階、
を含んでなる、方法に関する。
【００１１】
他の実施形態において、本発明は遺伝子型を同定するための方法であって：
ａ．個体の試料から単離された核酸を使用する段階；
ｂ．二対立遺伝子マーカーにおける
−ｒｓ１０５１６４８６及びｒｓ９５０３５７、
−ｒｓ１０５１６４８６及びｒｓ１３４２３３７、
−ｒｓ１０５１６４８６及びｒｓ１９３７８４０、
−ｒｓ１０５１６４８３及びｒｓ１４０１３８５、
−ｒｓ１０５１６４８３及びｒｓ１７１７０４５、
−ｒｓ１０５１６４８３及びｒｓ１４７８８９５、
−ｒｓ１０５１６４８３及びｒｓ１０４９３８０、
−ｒｓ１０５１６４８３及びｒｓ１０５０７３９３、
−ｒｓ１０５１６４８３及びｒｓ１０５０８０２１、
−ｒｓ１８７２７０１及びｒｓ１０５０８０２１、又は、
−ｒｓ１０５１６４８３、ｒｓ１４７８８９５及びｒｓ１０４９８３０、あるいは１又は複数のこれらのＳＮＰと連鎖不平衡（LD）にあるＳＮＰ、又はＢＡＮＫ１、ＢＬＫ及び／又はＩＴＰＲ２のいずれかとＬＤにある１又は複数のＳＮＰにおいてヌクレオチド型を決定する段階；並びに、
ｃ．段階ｂの結果を、全身性エリテマトーデス（SLE）に対する感受性のリスクと相関させる段階、
を含んでなる方法に関する。
【００１２】
本発明の方法において、当該二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの同定は、好ましくは、個体のゲノムに存在する二対立遺伝子マーカーの両方のコピーに対して決定される。
【００１３】
本発明の遺伝子型を同定するための方法は、好ましくはミクロシークエンシングアッセイによって実施される。当該方法は、好ましくはさらに、上記決定段階前に、二対立遺伝子マーカーを含んでなる配列の一部を増幅する段階を含んでなる。好ましくは、増幅する段階は、ＰＣＲによって実施される。本発明の方法は、遺伝子型を同定する段階の結果を自己免疫疾患又は炎症性疾患を患うリスク又は素因と相関させる段階をさらに含んでなる。
【００１４】
本発明の好適な方法において、本発明の方法は、遺伝子型を同定する段階の結果を、全身性エリテマトーデス（SLE）及び／又は多発性硬化症（MS）に対する感受性のリスクと相関させる段階をさらに含んでなる。
【００１５】
同定されている特に有用なＳＮＰ及びＳＮＰの組合せは、表１に示される。表１は、ＭＳ及び／又はＳＬＥに対して好適なＳＮＰの組合せ並びにこれらのリスクを有する対立遺伝子を示す。
【００１６】
好適なＳＮＰの配列は、次の表及び本出願明細書の最後部に含まれる配列表に示される。
【００１７】
【表１】
2012519009.tif 000002
【表２】
2012519009.tif 000003
【００１８】
ＩＵＰＡＣ ＳＮＰコード：
【００１９】
【表３】
2012519009.tif 000004
【００２０】
上記の本発明の方法において、個体における、ｒｓ１０５１６４８６中のＣ又はＴ、ｒｓ１０５１６４８３中のＣ又はＧ、ｒｓ１８７２７０１中のＧ又はＴ、ｒｓ１０４９６６３７中のＴ又はＧ、ｒｓ９５０３５７中のＡ又はＣ、ｒｓ１０５１６９２８中のＴ又はＧ、ｒｓ１３４２３３７中のＡ又はＧ、ｒｓ１９３７８４０中のＣ又はＧ、ｒｓ１０５０５７７４中のＣ又はＴ、ｒｓ２３０２７３３中のＡ又はＧ、ｒｓ７３８９８１中のＣ又はＴ、ｒｓ６６８３８３２中のＧ又はＡ、ｒｓ２３００１６６中のＧ又はＡ、ｒｓ１９０１７６５中のＴ又はＣ、ｒｓ１４０１３８５中のＴ又はＡ、ｒｓ１７１７０４５中のＡ又はＧ、ｒｓ７９０８３７中のＧ又はＡ、ｒｓ１０４８４３９６中のＴ又はＣ、ｒｓ１０４８５１３６中のＴ又はＣ、ｒｓ９２９４３６４中のＧ又はＡ、ｒｓ８８１２７８中のＡ又はＧ、ｒｓ７２０６１３中のＣ又はＴ、ｒｓ１４７８８９５中のＣ又はＧ、ｒｓ１９９２５２９中のＣ又はＴ、ｒｓ２２８９９６５中のＣ又はＴ、ｒｓ１０５０２２６３中のＴ又はＣ、ｒｓ１０４９３８０中のＴ又はＧ、ｒｓ１０５０６１４０中のＧ又はＡ、ｒｓ１０５０７３９３中のＴ又はＣ、ｒｓ１０５０８０２１中のＧ又はＣ、ｒｓ１８８６５６０中のＣ又はＴ、及び／或いはｒｓ２１６５７３９中のＡ又はＧの存在は、当該個体がＳＬＥ及び／又はＭＳに対する感受性のリスクを有することを示す。上記の列挙において、リスクを有する対立遺伝子が最初に列記されている（すなわち、「X又はYの存在」を言及する場合、リスクを有する対立遺伝子はXである）。
【００２１】
特に、本発明の上記の方法において、個体における、ｒｓ１０５１６４８６中のＣ又はＴ、ｒｓ１０５１６４８３中のＣ又はＧ、ｒｓ１８７２７０１中のＧ又はＴ、ｒｓ９５０３５７中のＡ又はＣ、ｒｓ１３４２３３７中のＡ又はＧ、ｒｓ１９３７８４０中のＣ又はＧ、ｒｓ１４０１３８５中のＴ又はＡ、ｒｓ１７１７０４５中のＡ又はＧ、ｒｓ１４７８８９５中のＣ又はＧ、ｒｓ１０４９３８０中のＴ又はＧ、ｒｓ１０５０７３９３中のＴ又はＣ、及び／或いはｒｓ１０５０８０２１中のＧ又はＣの存在は、当該個体がＳＬＥに対する感受性のリスクを有することを示す。上記の列挙において、リスクを有する対立遺伝子が最初に列記されている。
【００２２】
他の態様において、本発明は、個体がＳＬＥ及び／又はＭＳに対する感受性のリスクを有することを予測することにおける使用のための、ｒｓ１０５１６４８６、ｒｓ１０５１６４８３、ｒｓ１８７２７０１、ｒｓ１０４９６６３７、ｒｓ９５０３５７、ｒｓ１０５１６９２８、ｒｓ１３４２３３７、ｒｓ１９３７８４０、ｒｓ１０５０５７７４、ｒｓ２３０２７３３、ｒｓ７３８９８１、ｒｓ６６８３８３２、ｒｓ２３００１６６、ｒｓ１９０１７６５、ｒｓ１４０１３８５、ｒｓ１７１７０４５、ｒｓ７９０８３７、ｒｓ１０４８４３９６、ｒｓ１０４８５１３６、ｒｓ９２９４３６４、ｒｓ８８１２７８、ｒｓ７２０６１３、ｒｓ１４７８８９５、ｒｓ１９９２５２９、ｒｓ２２８９９６５、ｒｓ１０５０２２６３、ｒｓ１０４９３８０、ｒｓ１０５０６１４０、ｒｓ１０５０７３９３、ｒｓ１０５０８０２１、ｒｓ１８８６５６０及び／又はｒｓ２１６５７３９からなる群から選択される１又は複数のＳＮＰ、１又は複数のこれらのＳＮＰと連鎖不平衡（LD）にあるＳＮＰ、並びにＢＡＮＫ１、ＢＬＫ及び／又はＩＴＰＲ２のいずれかとＬＤにある１又は複数のＳＮＰに関する。
【００２３】
他の態様において、本発明は、個体がＳＬＥに対する感受性のリスクを有することを予測することにおける使用のための、ｒｓ１０５１６４８６、ｒｓ９５０３５７、ｒｓ１３４２３３７、ｒｓ１９３７８４０、ｒｓ１０５１６４８３、ｒｓ１４０１３８５、ｒｓ１７１７０４５、ｒｓ１４７８８９５、ｒｓ１０４９３８０、ｒｓ１０５０７３９３、ｒｓ１０５０８０２１、ｒｓ１８７２７０１からなる群から選択される、少なくとも２つのＳＮＰ、１又は複数のこれらのＳＮＰと連鎖不平衡（LD）にあるＳＮＰ、並びにＢＡＮＫ１、ＢＬＫ及び／又はＩＴＰＲ２のいずれかとＬＤにある１又は複数のＳＮＰに関する。
【００２４】
本発明において有用となり得ると同定された遺伝子とＬＤにあるＳＮＰの一例及び／又は発明者によって同定された１つのＳＮＰは、ｒｓ４６５４（ITPR2）である。これは、ｒｓ４６５４がＳＮＰ ｒｓ１０４９３８０とＬＤにあることを示し得る（図1及び3を参照されたい）。従って、これは、本発明の方法に従って同定することができる遺伝子及びＳＮＰとＬＤにあるＳＮＰの例を示す。
【００２５】
個体がＳＬＥ及び／又はＭＳに対する感受性のリスクを有することを予測することにおける使用のために、特に、ｒｓ１０５１６４８６と、ｒｓ１０４９６６３７、ｒｓ９５０３５７、ｒｓ１０５１６９２８、ｒｓ１３４２３３７、ｒｓ１９３７８４０、ｒｓ１０５０５７７４、ｒｓ２３０２７３３及び／又はｒｓ７３８９８１との組合せ；又はｒｓ１０５１６４８３とｒｓ６６８３８３２、ｒｓ２３００１６６、ｒｓ１９０１７６５、ｒｓ１４０１３８５、ｒｓ１７１７０４５、ｒｓ７９０８３７、ｒｓ１０４８４３９６、ｒｓ１０４８５１３６、ｒｓ９２９４３６４、ｒｓ８８１２７８、ｒｓ７２０６１３、ｒｓ１４７８８９５、ｒｓ１９９２５２９、ｒｓ２２８９９６５、ｒｓ１０５０２２６３、ｒｓ１０４９３８０、ｒｓ１０５０６１４０、ｒｓ１０５０７３９３、ｒｓ１０５０８０２１及び／又はｒｓ１８８６５６０との組合せ；或いはｒｓ１８７２７０１とｒｓ２１６５７３９及び／又はｒｓ１０５０８０２１との組合せが有用である。
【００２６】
他の態様において、本発明は、個体がＳＬＥに対する感受性のリスクを有することを予測することにおける使用のための、ｒｓ１０５１６４８６とｒｓ９５０３５７、ｒｓ１３４２３３７又はｒｓ１９３７８４０との組合せ；又はｒｓ１０５１６４８３とｒｓ１４０１３８５、ｒｓ１７１７０４５、ｒｓ１４７８８９５、ｒｓ１０４９３８０、ｒｓ１０５０７３９３、又はｒｓ１０５０８０２１との組合せ；或いはｒｓ１８７２７０１とｒｓ１０５０８０２１との組合せ；或いはｒｓ１０５１６４８３とｒｓ１４７８８９５及びｒｓ１０４９８３０との組合せに関する。
【００２７】
本発明はさらに、個体におけるＳＬＥ及び／又はＭＳに対する感受性のリスクを予測するための方法に関し：
ａ．上記個体の試料から抽出された核酸を使用する段階；
ｂ．個体において、周知の方法によって有用な遺伝子マーカーの存在を同定する段階；
ｃ．段階ｂ）の結果に基づき、個体のＳＬＥ及び／又はＭＳに対する感受性を有する可能性を予測する段階、
を含んでなる。
【００２８】
本発明の方法の好適な実施形態において、遺伝子マーカーは、ｒｓ１０５１６４８６、ｒｓ１０５１６４８３、ｒｓ１８７２７０１、ｒｓ１０４９６６３７、ｒｓ９５０３５７、ｒｓ１０５１６９２８、ｒｓ１３４２３３７、ｒｓ１９３７８４０、ｒｓ１０５０５７７４、ｒｓ２３０２７３３、ｒｓ７３８９８１、ｒｓ６６８３８３２、ｒｓ２３００１６６、ｒｓ１９０１７６５、ｒｓ１４０１３８５、ｒｓ１７１７０４５、ｒｓ７９０８３７、ｒｓ１０４８４３９６、ｒｓ１０４８５１３６、ｒｓ９２９４３６４、ｒｓ８８１２７８、ｒｓ７２０６１３、ｒｓ１４７８８９５、ｒｓ１９９２５２９、ｒｓ２２８９９６５、ｒｓ１０５０２２６３、ｒｓ１０４９３８０、ｒｓ１０５０６１４０、ｒｓ１０５０７３９３、ｒｓ１０５０８０２１、ｒｓ１８８６５６０及びｒｓ２１６５７３９からなる群から選択される１又は複数のＳＮＰ、１又は複数のこれらのＳＮＰと連鎖不平衡（LD）にあるＳＮＰ、並びにＢＡＮＫ１、ＢＬＫ及び／又はＩＴＰＲ２遺伝子のいずれかとＬＤにある１又は複数のＳＮＰである。
【００２９】
前記方法において、遺伝子マーカーが、ｒｓ１０５１６４８６とｒｓ１０４９６６３７、ｒｓ９５０３５７、ｒｓ１０５１６９２８、ｒｓ１３４２３３７、ｒｓ１９３７８４０、ｒｓ１０５０５７７４、ｒｓ２３０２７３３及び／又はｒｓ７３８９８１との組合せ；又はｒｓ１０５１６４８３とｒｓ６６８３８３２、ｒｓ２３００１６６、ｒｓ１９０１７６５、ｒｓ１４０１３８５、ｒｓ１７１７０４５、ｒｓ７９０８３７、ｒｓ１０４８４３９６、ｒｓ１０４８５１３６、ｒｓ９２９４３６４、ｒｓ８８１２７８、ｒｓ７２０６１３、ｒｓ１４７８８９５、ｒｓ１９９２５２９、ｒｓ２２８９９６５、ｒｓ１０５０２２６３、ｒｓ１０４９３８０、ｒｓ１０５０６１４０、ｒｓ１０５０７３９３、ｒｓ１０５０８０２１及び／又はｒｓ１８８６５６０との組合せ；或いはｒｓ１８７２７０１とｒｓ２１６５７３９及び／又はｒｓ１０５０８０２１との組合せから選択されるＳＮＰの組合せ；或いは上記の組合せの組合せ、である方法が、好適な実施形態において特に有用であるということを示すことができる。
【００３０】
遺伝子マーカーが、ｒｓ１０５１６４８３、ｒｓ１４７８８９５及びｒｓ１０４９３８０の組合せ、あるいはこれらのＳＮＰ、又はＢＡＮＫ１、ＢＬＫ及び／又はＩＴＰＲ２遺伝子のいずれかとＬＤにあるＳＮＰである方法が、さらに好適である。
【００３１】
本発明はさらに、個体における、ＳＬＥに対する感受性リスクを予測するための方法に関し：
ａ．上記個体の試料から抽出された核酸を使用する段階；
ｂ．上記個体において、周知の方法によって、有用な遺伝子マーカーの存在を同定する段階であって、ここで当該遺伝子マーカーが、ｒｓ１０５１６４８６とｒｓ９５０３５７、ｒｓ１３４２３３７、又はｒｓ１９３７８４０との組合せ；又はｒｓ１０５１６４８３とｒｓ１４０１３８５、ｒｓ１７１７０４５、ｒｓ１４７８８９５、ｒｓ１０４９３８０、ｒｓ１０５０７３９３、又はｒｓ１０５０８０２１との組合せ；或いはｒｓ１８７２７０１とｒｓ１０５０８０２１との組合せ；或いはｒｓ１０５１６４８３とｒｓ１４７８８９５又はｒｓ１０４９８３０との組合せ；或いはＢＡＮＫ１、ＢＬＫ及び／又はＩＴＰＲ２遺伝子のいずれかとＬＤにあるＳＮＰの組合せである段階；並びに、
ｃ．段階ｂの結果に基づき、上記個体のＳＬＥに対する感受性に関する可能性を予測する段階、
を含んでなる。
【００３２】
好適には、上記方法において、遺伝子マーカーが、ｒｓ１０５１６４８３、ｒｓ１４７８８９５及びｒｓ１０４９３８０の組合せ、或いはＢＡＮＫ１、ＢＬＫ及び／又はＩＴＰＲ２遺伝子のいずれかとＬＤにあるＳＮＰである。
【実施例】
【００３３】
本発明を達成するために、全身性エリテマトーデス（SLE）ゲノム全体の結合スキャン（GWAS）１由来のデータを使用し、エピスタシス相互作用をサーチした（エピスタシススキャン）。この目的のために、我々は、ｒ２＜．８０であるＳＮＰのペア間における、可能性のあるあらゆる遺伝子型の組合せに関する分割表に基づき、遺伝子相互作用方法を開発した。続いて、相互作用関連性（interaction association）のピアソンＳスコア及びカイ二乗Ｐ値を算出した。エピスタシスをコンピュータ処理するために、エピスタシススコア（Se）を得る目的で、独立の仮定に対して観察された各相互作用している組合せをテストし、並べ替え検定（permutation）を介してＰ値を得た（エピスタシススキャン法）。
【００３４】
１１２，４６３個のＳＮＰの中から、１３，００８個のｔａｇ ＳＮＰ｛ＬＤにある4,897個のブロック及び8,111個の単離物（isolates）｝を、テストした８４，５９７，５２８個の相互作用との分析のために選択した。記載されるように、カットオフ閾値１ｅ−５を結合Ｐ値（association p-value）に、そして1ｅ−３をエピスタシスＰ値に適用しながら（エピスタシススキャン法）、我々は１，２０６個の特徴的なＳＮＰを含む１，６２６個のＳＮＰ相互作用を選択した。これらのＳＮＰは、ＮＣＢＩ Ｂｕｉｌｄ ３６ゲノム配列上で遺伝子に対して位置づけられ、４１８個の遺伝子を含む４９７個の遺伝子相互作用のサブネットワークを作成した。得られた遺伝子相互作用ネットワークは、スケールフリーの形態的性質（topological property）を示し、遺伝子の６０％が１つの相互作用に、１７％が２つの相互作用に、並びに６個の遺伝子（「ハブ」）は＞２０個の相互作用に関与していた。最も結合するハブ遺伝子の間で、ＢＡＮＫ１は３０個の関連及びエピスタシス遺伝子相互作用に関与する（表1）。我々は最近ＢＡＮＫ１を、ＳＬＥ、複合、自己免疫疾患と関連がある遺伝子であると同定した１。ＢＡＮＫ１は、もっぱらＢ細胞において発現され、疾患原因における関連遺伝子となっている。
【００３５】
我々は、ＢＡＮＫ１が相互作用を示した２つの遺伝子に着目し、１つは、２つのＧＷＡＳにおいてＳＬＥと関連があり、且つＢ細胞で発現されると分かったＢＬＫ２，３であり、もう１つは、ＩＰ３Ｒカルシウムチャネルをコードし、小胞体ストアからのカルシウム動員を、ＢＡＮＫ１への結合上のサイトゾルへ誘発する遍在性タンパク質であって、ＩＴＰＲ遺伝子の１つであるＩＴＰＲ２である４。ＢＬＫとＢＡＮＫ１との間の相互作用は、エピスタシスＯＲ（オッズ比）＝２．３８を有した（95% c.i. 1.69〜3.36; 症例において35% vs 対照において18%）。ＢＡＮＫ１とＩＴＰＲ２との間の最も強力な相互作用は、エピスタシスＯＲ＝２．４９を有する（c.i. 1.66〜3.73; 症例において23% vs対照において11%）。我々はまた、エピスタシスオッズ比がＯＲ＝３．２０である、ＢＡＮＫ１、ＩＴＰＲ２及びＢＬＫの間の関連及びエピスタシス遺伝子相互作用を観察した（95% c.i. 2.04〜5.01; 症例において21% vs対照において8%; S=27.6; P=1.5x10-7; Se=14.67, Pe < 0.0002）（図1）。
【００３６】
我々は、４０００個体以上を含んでなる症例及び対照の２つの独立のセットを使用して、相互作用を再現した（表2）。メタ分析によって、Ｐ＝３．６×１０−６であるＢＡＮＫ１とＩＴＰＲ２との相互作用、及びＰ＝４．１１×１０−１１であるＢＡＮＫ１とＢＬＫとの相互作用が示された。しかしながら、エピスタシススコア（Se）は、より多くの相互作用遺伝子を同定することができることを示すほど有意に達しなかった。より重要なことは、各遺伝子内の全てのＳＮＰが相互作用に関与したのではないということである。例えば、ＢＬＫ上には遺伝子型が同定された５８個以上のＳＮＰが存在するにも関わらず、単に相互作用しており且つエピスタシスのＳＮＰが、５’ＵＴＲ並びにＳＮＰ ｒｓ１３２７７１１３及びｒｓ１２６８０７６２で表される遺伝子のプロモーター領域に位置し、これらはいずれもＳＬＥ２，３と関係がある。ＢＡＮＫ１において、エクソン２におけるＲ６１Ｈの変化につながるｒｓ１０５１６４８７は、ＳＮＰ ｒｓ１０５１６４８３と共に、エピスタシスに関与する主要なＳＮＰである１。ＩＴＰＲ２において、３’ＵＴＲで確認されるＳＮＰは、ＢＡＮＫ１と相互作用を示した。従って、相互作用しているＩＴＰＲ２のＳＮＰが、異なったレベルのＩＴＰＲ２ ｍＲＮＡと相関するかをテストした。実際、ＩＴＰＲ２の３’ＵＴＲ中のＳＮＰの２つ（rs1049380及びrs4654）は、この遺伝子の発現レベルと相関し、一方ＩＴＰＲ２の３’ＵＴＲ領域外のＳＮＰは、ＩＴＰＲ２の転写レベルと相関しなかった（図2及び図3）。ＢＡＮＫ１及びＩＴＰＲ２の生成物間のタンパク質相互作用は周知であり４、ＢＡＮＫ１タンパク質はＩＰ３Ｒ結合ドメインを含有する。逆に、ＢＡＮＫ１とＢＬＫの物理的相互作用は知られていない。ＬＹＮもまた結合するＳｒｃチロシンキナーゼ結合ドメインを潜在的に介して、ＢＡＮＫ１はＢＬＫと共沈殿した（図4）５，６。また、ＢＡＮＫ１及びＢＬＫ−ＧＦＰで同時トランスフェクトされた細胞において、細胞質小胞内のＢＬＫ及びＢＡＮＫ１の明確な共局在が観察され、一方でＢＡＮＫ１ではなくＢＬＫは細胞膜にもまた局在化した（図5）。全体的に見て、我々の結果はＢＡＮＫ１とＢＬＫとの間のタンパク質相互作用を明らかにし、ＢＡＮＫ１は、アダプターの役割で細胞質小胞内に部分的にＢＬＫを保持することをさらに示す。
【００３７】
我々は、遺伝子型及び基本的に優性及び劣性モデルをテストすることに基づいて、遺伝子相互作用並びにエピスタシスを検出するための方法を開発した。ＰＬＩＮＫでのロジスティック回帰分析は対立遺伝子にのみ依存し、おそらく非加算的エピスタシス相互作用の検出にあまり有力でないので、本明細書で同定された相互作用は、この分析の使用でははっきりと再現されてはいない７。我々はさらに、遺伝的に相互作用している遺伝子は、ＳＬＥの原因において重要な新規な疾患経路を明らかにしている、物理的に相互作用しているタンパク質もまたコードし、当該経路において、個々の遺伝子の効果よりも、疾患感受性において著しく重要な寄与を有するエピスタシス効果において、各遺伝子の単独作用は相乗作用を与える、ことを説明する。ＢＡＮＫ１と潜在的に相互に作用している遺伝子の一部はまた、遺伝子のＩ型インターフェロン経路に関与し、疾患原因において非常に重要であることが示される８〜１１。実際に、ＢＬＫが下方制御される間、ＰＢＭＣｓにおいてＢＡＮＫ１はＩＦＮαで誘発されることを我々は観察し、これは先天性免疫系とＢＣＲ介在活性の間の潜在的なつながりを示している（図6）。
【００３８】
ループスを含む大抵の複合疾患で同定される主要遺伝子のほとんどは、これらの間で遺伝子相互作用を呈さず、今日まで同定された相互作用は少なくともタンパク質レベルで確認されていない３，１２，１３。本発明の発見は、ループスに関するこれらの各主要遺伝子が、個体においてそれぞれ重要な発症経路であることを示す。本研究において、我々はループスを患う個体の約４分の１（21%）が相互作用遺伝子に関するリスク遺伝子型を有することを観察した。大抵のループス遺伝子感受性は、相加効果を有するいくつかの主要遺伝子（すなわち、ループスに関するHLA, IRF5, ITGAM, STAT4）によって表される４〜５個の特徴的な経路内の相互作用遺伝子の変数によって説明することができ、このような経路は個体における発症プロセスを規定することが可能である。本発明の発見は、複合疾患において表現され且つ反復される、初期のエピスタシス遺伝子相互作用を表し、これは相互作用タンパク質を含み且つ疾患原因の経路を規定する。
【００３９】
材料
１００ｋ ＧＷＡＳの被験者及び対照は、既に記載した。症例及び対照の２つの完全なる独立のセットを使用した。第一のセットは、ヨーロッパにおける多施設収集に由来するＳＬＥ症例、並びに性別、年齢及び民族性が適合した対照を含んでなり、これらは全て既に記載した。第二のセットは、ＳＬＥに関する１９８２分類基準を満たした全ての症例である。
【００４０】
遺伝子型の同定
１００ｋアレイの遺伝子型の同定は、記載されている。ＢＡＮＫ１、ＢＬＫ及びＩＴＰＲ２に関する第一の複製セットの遺伝子型の同定を、ＳＮＰ ｒｓ１０５１６４８７、ｒｓ１０５１６４８３、ｒｓ１４７８８９５、ｒｓ１０４９３８０、ｒｓ４６５４、ｒｓ１９９４４８４に関して実施した。ＢＡＮＫ１及びＢＬＫの遺伝子型を、ＢｅａｄＥｘｐｒｅｓｓ Ｉｌｌｕｍｉｎａシステム上で完全遺伝子を包含するＳＮＰに関して同定したセット２を除いて、ＳＮＰにａｓｓａｙ−ｏｎ−ｄｅｍａｎｄ ＴａｑＭａｎ ＡＢＩシステムを使用した。この遺伝子型同定は、Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎで実施し、一方ＴａｑＭａｎ遺伝子型同定はＵｐｐｓａｌａ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＲｕｄｂｅｃｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ及びスペインのグラナダにおけるＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｄｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎａ ｙ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ Ｌｏｐｅｚ−Ｎｅｙｒａ（スペイン人試料用）において実施した。遺伝子型同定の判定が５％未満である試料だけを分析に使用した。
【００４１】
エピスタシススキャン法
ＳＮＰ選択
１００ｋゲノム全体での結合スキャン由来のＳＮＰをまず品質維持した：対照におけるハーディ・ワインベルグ平衡（HWE）ｐ＜０．０１であり、ＳＮＰあたりの最大欠失データ率＜５％であった。高頻度のマーカーのみを分析のために維持した：対照における最少対立遺伝子頻度３０％、症例においては１０％であり、そして対照における最少遺伝子型頻度は１０％、症例においては５％であった。続いて、Ｇａｂｒｉｅｌ等（18）の方法を使用してゲノム全体の連鎖不平衡（LD）ブロックを測定し、それによってｔａｇ ＳＮＰを選択した（１つのランダムSNP per LDグロック、及びLDにない全SNPのブロック）。
【００４２】
遺伝子相互作用関連性
ＬＤでない（ｒ２<0.8）ＳＮＰの各対に関して、遺伝子型数の共起を、２×９の分割表（2行: 症例／対照; 9列は9個の可能性のある遺伝子型の組合せに相当, すなわち、3x3の表である）に記録する：Ｔ＝［Ｃkij］、式中Ｃｋｉｊは、ｉ第一のＳＮＰマイナー対立遺伝子のコピー（ｉ=0, 1, 2）並びに；ｊ第二のＳＮＰマイナー対立遺伝子のコピー（ｊ=0, 1, 2）を有する症例（k=0）又は対照（k=1）における患者の数を表す。この表から、我々は８つの２×２分割表を導き出し、これらは、優性及び劣性モデルの組合せを表している：ａ／Ａ及びｂ／Ｂを両方のＳＮＰの対立遺伝子とし、各２×２分割表は、左上セル中のａａ／ｂｂ（C000）、ａａ／ＢＢ（C002）、ＡＡ／ｂｂ（C020）、ＡＡ／ＢＢ（C022）、ａａ＋ａＡ／ｂｂ＋ｂＢ（C000+C001+C010+C011）、ａａ＋ａＡ／ｂＢ＋ＢＢ（C001+C002+C011+C012）、ａＡ＋ＡＡ／ｂｂ＋ｂＢ（C010+C011+C020+C021）、ａＡ＋ＡＡ／ｂＢ＋ＢＢ（C011+C012+C021+C022）の症例における数値、左下セル中の対照における同様の数値、並びに右上及び右下セル中の症例及び対照における補足値（complement count）をそれぞれ含む。これらの２×２分割表それぞれに関して、ピアソンスコアＳｔ（t=1..8）をコンピュータ処理し、Ｐ値ｐｔは１つの自由度（df）でのｃ２分布仮定（distribution assumption）を使用した近似値である。
【００４３】
エピスタシス効果の評価
ＳＮＰの各対に関して、いずれのＳＮＰからも独立（エピスタシスなし）という仮定の下で２×９分割表を導いた：Ｔ０＝［C0kij］、Ｃ０kij＝（Ck0j＋Ck1j＋Ck2j）（Cki0＋Cki1＋Cki2）／ｎｋ、式中ｎｋは、症例（k=0）又は対照（k=1）における患者の総数である。上記と同様に、８つの２×２分割表を導き出し、８つのピアソンスコアをコンピュータ処理した：Ｓ０ｔ（ｔ=1..8）。エピスタシススコアを次の通り定義した：
Ｓｅｔ＝Ｓｔ−Ｓ０ｔ
【００４４】
このスコアは、２つの依存性スコアの差であり、それぞれ漸近的に１−ｄｆｃ２に従っている。従って、これは任意の周知の統計法則に従っておらず、Ｐ値Ｐｅｔは経験的に並べ替え検定によって測定しなければならない。
【００４５】
遺伝子発現分析
ＲＮＡ精製及び遺伝子の発現分析
健常ドナーから同意の下で得られた抹消血単核球（PBMC）由来の全ＲＮＡをトリゾール試薬（Invitrogen）で精製した。５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．４Ｕのリボヌクレアーゼ阻害剤及び５μＭオリゴ−ｄＴを含有するバッファー中で、２μｇのＲＮＡを２ＵのＭｕＬＶ転写酵素で逆転写した。全試薬をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ｃＤＮＡ合成を４２℃で８０分間実施し、続いて反応を９５℃で５分間終了処理した。ＢＡＮＫ１、ＢＬＫ、及びＩＴＰＲ２発現を、シグナル検出のためのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを使用したＳＤＳ ２．２．２ソフトウェアの、７９００ＨＴ配列検出器（Applied Biosystems）上で定量リアルタイムＰＣＲで測定した。次のプライマー対を使用した：
【００４６】
【表４】
2012519009.tif 000005
【００４７】
我々は、ＰＣＲ４５サイクル（95℃で15秒間, 62℃で10秒間及び72℃で15秒間）に続いて、最初の変性を９５℃で５分間実施した。酵素を供したＰＣＲバッファーに３ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰｓ、プライマー、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Molecular Probes）、１５ｎｇのｃＤＮＡ及び０．５Ｕの白金Ｔａｑポリメラーゼ（Invitrogen）を追加した。発現レベルを同一試料におけるＴＢＰのレベルまで比較２−ΔＣｔ方法を使用して規準化し、市販試薬（Applied Biosystems）で増幅した。全実験を３通り行った。独立したｃＤＮＡ合成を２度実行した。両側ｔ検定を使用して、利用可能なオンラインのＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアで統計計算を実施した。
【００４８】
クローニグ及び発現コンストラクト
ＢＡＮＫ１及びＢＬＫ配列を、ヒト血液及びＢＪＡＢ細胞株それぞれ由来のｃＤＮＡを使用して、ＰＣＲによって増幅した。翻訳領域をｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Invitrogen）中でクローン化し、配列決定によって確認した。Ｃ末端においてＶ５及びＨｉｓエピトープでタグを付けたタンパク質を、終始コドンの欠失によって生成した。Ｎ末端のＦＬＡＧタグを付けたＢＡＮＫプラスミドをオーバーラッププライマーを使用した連続ＰＣＲによって作成した。ＢＡＮＫ１変異体へ融合されたフラッグをコードする増幅した生成物を、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩによって切除されたｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Invitrogen）中にクローン化し、ｐＩＲＥＳＳ２−ＥＧＦＰ（Clontech）に一方向性にサブクローンした：
【００４９】
【表５】
2012519009.tif 000006
【００５０】
抗体
ポリクローナルＢＡＮＫ１抗血清を産生する目的でウサギを免疫化するために、配列ＥＴＫＨＳＰＬＥＶＧＳＥＳＳＣの合成ペプチドを使用した（ET-BANK）。ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ Ｋｉｔ（Pierce）を使用して、血清をペプチドに対してアフィニティ精製した。本実験で使用した更なる抗体には、抗マウス及び抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、抗マウス及び抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、抗Ｖ５(Invitogen）；抗Ｆｌａｇ Ｍ２モノクローナル及びウサギ抗Ｆｌａｇ（Sigma）；抗ウサギ及び抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（Zymed）が含まれる。
【００５１】
免疫共沈降及び免疫ブロット
細胞を６ウェルのプレート上に播種し、リポフェクタミン２０００を使用して、全量４ｕｇの発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４０時間後、プロテアーゼ阻害剤（Roche）及び１ｍＭ ＰＭＳＦを含むトリトンＸ−１００バッファー（1%トリトンX-100, 50mM HEPES pH7.1, 150mM Nacl, 1mM EDTA, 2mM Na3VO4,10%グリセロール, 0.1%SDS）中で細胞を可溶化した。一定分量の不要物を事前に除去した可溶化液を入力分析のために保存し、可溶化液の残りを連続してウサギ抗Ｆｌａｇ及び固定化Ａ−セファロースビーズ（GE Heathcare）でインキュベートした。ビーズをＰＢＳで５回洗浄し、５分間の沸騰によりＳＤＳ試料バッファーで免疫沈降物を溶出した。標準プロトコールを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロットを実施した。｛ＩＰのための添加（Loaded）ウェルは最初の細胞抽出の２／５に相当し、一方細胞可溶化液のためのウェルは最初の細胞抽出液の１／４０を含有する｝。
【００５２】
共焦点顕微鏡
トランスフェクトした細胞を、ＰＢＳ／０．１８％トリトン−Ｘ中で３．７％パラホルムアルデヒドで２０分間室温で固定し、氷冷の５０：５０メタノールアセトン中で−２０℃で１０分間透過処理した。ＰＢＴ中の３％ＢＳＡ、３％ヤギ血清の中でのブロッキング後、ブロッキングバッファー中で抗体を希釈し、４℃でオーバーナイトでインキュベートした。蛍光色素結合二次抗体を２時間室温でインキュベートし、ＤＡＰＩを含むＳｌｏｗＦａｄｅ ａｎｔｉｆａｄｅ（Invitrogen）で対比染色した。Ｚｅｉｓｓ ５１０ Ｍｅｔａ共焦点スキャン顕微鏡を使用して共焦点顕微鏡観察を実施した。交差励起を回避するためにスキャンあたりアクティブなレーザー線１つのみ用いて、連続スキャンによって二重又は三重カラー画像を得た。
【００５３】
【表６】
2012519009.tif 000007
【００５４】
【表７】
2012519009.tif 000008
【００５５】
参考文献
【表８】
2012519009.tif 000009
【図１】
2012519009.tif 000010
【図２】
2012519009.tif 000011
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2012519009000001.app
【国際調査報告】
2012519009.tif 000016
2012519009.tif 000017
2012519009.tif 000018