(57)【要約】  ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）および１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する核酸を免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することを含む、非ヒト哺乳動物で、機能的ヒト血液細胞系統を再構成する方法を、本明細書で提供する。非ヒト哺乳動物は、非ヒト哺乳動物で核酸が発現されてヒトＨＳＣが機能的ヒト血液細胞系統に分化する条件下で維持され、それによって非ヒト哺乳動物で機能的ヒト血液細胞系統を再構成する。また、非ヒト哺乳動物で免疫原に対するヒト抗体を産生する方法、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマならびにＢ細胞により産生される抗体（たとえば、ポリクローナル抗体類；モノクローナル抗体類）および本方法で作られる非ヒト哺乳動物も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）および１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する核酸を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入すること；および
ｂ）非ヒト哺乳動物を、前記非ヒト哺乳動物で前記核酸が発現されて前記ヒトＨＳＣが機能的ヒト血液細胞系統に分化する条件下で、維持すること；
を含み、
それによって、前記非ヒト哺乳動物で、機能的ヒト血液細胞系統を再構成する、
非ヒト哺乳動物で、機能的ヒト血液細胞系統を再構成する方法。
【請求項２】
前期ＨＳＣが前記非ヒト哺乳動物導入された後に、前記１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する前記核酸が導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する前記核酸が、裸のＤＮＡとして、またはベクターで導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ベクターが、プラスミド、ウイルスベクター、またはそれらの組合せである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスウイルスまたはアデノウイルスベクターである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する前記核酸が、流体力学的注入を使用してプラスミドＤＮＡとして導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１つまたは複数のヒトサイトカイン類が、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、Ｆｌｔ３Ｌ（Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記マウスが、重症複合免疫不全変異を担持する非肥満糖尿病マウス（ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス）；重症複合免疫不全変異を担持し、かつサイトカイン受容体γ鎖の遺伝子を欠く非肥満糖尿病マウス（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒγ−／−マウス）およびＢａｌｂ／ｃｒａｇ−／−γｃ−／−マウスからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
再構成される前記機能的ヒト血液細胞系統が、機能的ヒト骨髄性細胞、機能ヒトリンパ球系細胞またはそれらの組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒト骨髄性細胞が、ヒト単球、ヒトマクロファージ、ヒト樹枝状細胞、ヒト赤血球、およびそれらの組合せであり；また前記ヒトリンパ球系細胞が、ヒトＮＫ細胞、ヒトＢ細胞、ヒトＴ細胞、およびそれらの組合せである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つまたは複数のヒトサイトカイン類が、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）およびＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）であり、前記非ヒト哺乳動物で再構成される前記機能的血液細胞系統がヒトＮＫ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つまたは複数のヒトサイトカイン類が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン４（ＩＬ−４）であり、前記非ヒト哺乳動物で再構成される前記機能的血液細胞系統が、ヒト樹枝状細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つまたは複数のサイトカイン類が、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）であり、前記非ヒト哺乳動物で再構成される前記機能的血液細胞系統が、ヒト単球／マクロファージである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つまたは複数のサイトカイン類が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）であり、前記非ヒト哺乳動物で再構成される前記機能的血液細胞系統が、ヒト赤血球である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ａ）ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）および１つまたは複数のヒトサイトカインをコード化する核酸を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することであって、前記ヒトサイトカイン類は、前記非ヒト哺乳動物で発現されるとき、前記ヒトＨＳＣの機能的ヒトＮＫ細胞への分化を促進する、核酸を導入すること；および
ｂ）前記非ヒト哺乳動物を、前記非ヒト哺乳動物で前記核酸が発現されて前記ヒトＨＳＣが前記非ヒト哺乳動物で機能的ヒトＮＫ細胞に分化する条件下で維持すること；
を含み、
それによって、前記非ヒト哺乳動物におけるヒトＮＫ細胞の再構成を強化する、
非ヒト哺乳動物で機能的ヒトＮＫ細胞を再構成する方法。
【請求項１７】
前記核酸が、ヒトＩＬ−１５およびヒトＦｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンドをコード化する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記非ヒト哺乳動物の末梢血中の白血球の約５％〜約２１％がヒトＮＫ細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヒトＮＫ細胞の発現が、前記非ヒト哺乳動物で約３０日間維持される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）および１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する核酸を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することであって、前記ヒトサイトカイン類は、前記非ヒト哺乳動物で発現されるとき、前記ヒトＨＳＣの機能的ヒト樹枝状細胞への分化を促進する、核酸を導入すること；および
ｂ）前記非ヒト哺乳動物を、前記非ヒト哺乳動物で前記核酸が発現されて前記ヒトＨＳＣが前記非ヒト哺乳動物で機能的ヒト樹枝状細胞に分化する条件下で維持すること；
を含み、
それによって、前記非ヒト哺乳動物における機能的ヒト樹枝状細胞の再構成を強化する、
非ヒト哺乳動物で機能的ヒト樹枝状細胞を再構成する方法。
【請求項２１】
前記核酸が、ヒトＧＭ−ＣＳＦおよびヒトＩＬ−４をコード化する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ヒトＦｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンドをコード化する核酸を導入することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ａ）ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）および１つまたは複数のヒトサイトカインをコード化する核酸を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することであって、前記ヒトサイトカイン類は、前記非ヒト哺乳動物で発現されるとき、前記ヒトＨＳＣの機能的ヒト単球／マクロファージへの分化を促進する、核酸を導入すること；および
ｂ）前記非ヒト哺乳動物を、前記非ヒト哺乳動物で前記核酸が発現されて前記ヒトＨＳＣが機能的ヒト単球／マクロファージに分化する条件下で維持すること：
を含み、
それによって、前記非ヒト哺乳動物における機能的ヒト単球／マクロファージの再構成を強化する、
非ヒト哺乳動物で機能的ヒト単球／マクロファージを再構成する方法。
【請求項２４】
前記核酸が、ヒトマクロファージコロニー刺激因子をコード化する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ａ）ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）および１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する核酸を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することであって、前記ヒトサイトカイン類は、前記非ヒト哺乳動物で発現されるとき、前記ヒトＨＳＣの機能的ヒト赤血球への分化を促進する、核酸を導入すること；および
ｂ）前記非ヒト哺乳動物を、前記非ヒト哺乳動物で前記核酸が発現されて前記ヒトＨＳＣが前記非ヒト哺乳動物で機能的ヒト赤血球に分化する条件下で維持すること；
を含み、
それによって、前記非ヒト哺乳動物における機能的ヒト赤血球の再構成を強化する、
非ヒト哺乳動物で機能的ヒト赤血球を再構成する方法。
【請求項２６】
前記核酸が、ヒトエリスロポエチンおよびヒトＩＬ−３をコード化する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記赤血球が、前記非ヒト哺乳動物における全赤血球の約３％〜約５％を構成する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ａ）ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）および１つまたは複数のヒトサイトカインをコード化する核酸を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することであって、前記ヒトサイトカイン類は、前記非ヒト哺乳動物で発現されるとき、前記ヒトＨＳＣの機能的ヒトＴ細胞およびヒトＢ細胞への分化を促進する、核酸を導入すること；および
ｂ）前記非ヒト哺乳動物を、前記非ヒト哺乳動物で前記核酸が発現されて前記ヒトＨＳＣが前記非ヒト哺乳動物で機能的ヒトＴ細胞およびヒトＢ細胞に分化する条件下で維持すること；
を含み、
それによって、前記非ヒト哺乳動物で、機能的ヒトＴ細胞およびヒトＢ細胞を再構成する、
非ヒト哺乳動物で機能的ヒトＴ細胞およびヒトＢ細胞を再構成する方法。
【請求項２９】
前記ＨＳＣが前記非ヒト哺乳動物に導入された後に、前記１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する前記核酸が導入される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する前記核酸が、裸のＤＮＡとして、またはベクターで、導入される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ベクターが、プラスミド、ウイルスベクター、またはそれらの組合せである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスウイルスまたはアデノウイルスベクターである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する前記核酸が、流体力学的注入を使用して、プラスミドＤＮＡとして導入される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記１つまたは複数のヒトサイトカイン類が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン−４（ＩＬ−４）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記マウスが、重症複合免疫不全変異を担持する非肥満糖尿病マウス（ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス）；重症複合免疫不全変異を担持し、サイトカイン受容体γ鎖の遺伝子を欠く非肥満糖尿病マウス（ＮＯＤ／ｓｃｉｄＩＬ２Ｒγ−／−マウス）およびＢａｌｂ／ｃｒａｇ−／−γｃ−／−マウスからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ヒト抗体が、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭまたはそれらの組合せである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
ｃ）前記非ヒト哺乳動物を免疫原で免疫すること；および
ｄ）前記非ヒト動物を、前記非ヒト哺乳動物が前記免疫原に対するヒト抗体を産生する条件下で維持すること；
をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
前記ヒト抗体を産生するヒトＢ細胞を、前記非ヒト哺乳動物から単離することをさらに含み、それによって単離されたヒトＢ細胞を作る、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記単離されたヒトＢ細胞を不死化細胞と接触させ、それによって組合せを作ること；および前記ヒトＢ細胞と前記不死化細胞が融合して、前記免疫原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを形成する条件下で、前記組合せを維持すること；をさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ヒトＢ細胞により発現されるヒト抗体の全部または機能的部分をコード化する配列をクローニングすることをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
ａ）ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）および１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する核酸を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することであって、前記ヒトサイトカイン類は、前記ヒトＨＳＣの機能的ヒトＴ細胞およびヒトＢ細胞への分化を促進する、核酸を導入すること；
ｂ）前記非ヒト哺乳動物で前記核酸が発現されて前記ＨＳＣが機能的ヒトＴ細胞およびヒトＢ細胞に分化する条件下で、前記非ヒト哺乳動物を維持すること；
ｃ）前記非ヒト哺乳動物を、前記免疫原で免疫すること；および
ｄ）前記非ヒト動物を、前記非ヒト哺乳動物で前記ヒトＢ細胞が前記免疫原に対するヒト抗体を産生する条件下で維持すること；を含み、
それによって、前記非ヒト哺乳動物で、前記免疫原に対するヒト抗体を生成する、
非ヒト哺乳動物で免疫原に対するヒト抗体を生成する方法。
【請求項４３】
前記ＨＳＣが前記非ヒト哺乳動物に導入された後に、前記１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する前記核酸が導入される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する前記核酸が、裸のＤＮＡとして、またはベクターで、導入される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ベクターが、プラスミド、ウイルスベクター、またはそれらの組合せである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスウイルスまたはアデノウイルスベクターである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する前記核酸が、流体力学的注入を使用して、プラスミドＤＮＡとして導入される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記１つまたは複数のヒトサイトカイン類が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン−４（ＩＬ−４）である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
前記マウスが、重症複合免疫不全変異を担持する非肥満糖尿病マウス（ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス）；重症複合免疫不全変異を担持し、前記サイトカイン−受容体γ鎖の遺伝子を欠く非肥満糖尿病マウス（ＮＯＤ／ｓｃｉｄＩＬ２Ｒγ−／−マウス）およびＢａｌｂ／ｃｒａｇ−／−γｃ−／−マウスからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ヒト抗体が、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭまたはそれらの組合せである、請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
前記ヒト抗体を産生するヒトＢ細胞を前記非ヒト哺乳動物から単離することをさらに含み、それによって単離されたヒトＢ細胞を作る、請求項４２に記載の方法。
【請求項５３】
前記単離されたヒトＢ細胞を不死化細胞と接触させ、それによって組合せを作ること；および前記ヒトＢ細胞および前記不死化細胞が融合して、前記免疫原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを形成する条件下で、前記組合せを維持すること；をさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記免疫原が破傷風トキソイドである、請求項４２に記載の方法。
【請求項５５】
前記ヒトＢ細胞により発現される前記ヒト抗体の全部または機能的部分をコード化する配列をクローニングすることをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
請求項１に記載の方法で作られる非ヒト哺乳動物。
【請求項５７】
請求項１６に記載の方法で作られる非ヒト哺乳動物。
【請求項５８】
請求項２０に記載の方法で作られる非ヒト哺乳動物。
【請求項５９】
請求項２３に記載の方法で作られる非ヒト哺乳動物。
【請求項６０】
請求項２５に記載の方法で作られる非ヒト哺乳動物。
【請求項６１】
請求項２８に記載の方法で作られる非ヒト哺乳動物。
【請求項６２】
請求項４０に記載の方法で作られるハイブリドーマ。
【請求項６３】
請求項６２に記載のハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体。
【請求項６４】
請求項５３に記載の方法で作られるハイブリドーマ。
【請求項６５】
請求項６４に記載のハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００９年６月２９日提出の米国仮特許出願第６１／２２１，４３８号の利益を主張する。上記出願の教示全体を参照により本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
病原体感染に対するヒト免疫応答を、小動物モデルで、体系的かつ制御された方法で研究することが強く求められている。過去２０年にわたり、Ｔリンパ球およびＢリンパ球が欠如し、ヒト血液系細胞を有する、重症複合免疫不全（ｓｃｉｄ）マウスの再構成に大変な努力が向けられてきた（Ｓｈｕｌｔｚ  ＬＤ，Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｆ，Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＤＬ（２００７）Ｎａｔ  ＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ  ７：１１８−１３０）。しかし、レシピエントマウスで、生着が不十分であり、ヒトＴ細胞およびＢ細胞が急速に消失し、あるいは造血器悪性腫瘍が急速に発症したため、初期の試みは不成功に終わった。ｓｃｉｄ変異かまたは組換え活性化遺伝子（Ｒａｇ）の変異のいずれかのためにＴ細胞およびＢ細胞が欠損しているばかりでなく、共通γ鎖（γｃまたはＩｌ２ｒｇ）欠失のためにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞も欠損しているレシピエントマウスを使用することにより、大きな進歩が達成された（Ｈｉｒａｍａｔｓｕ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：８７３−８８０；Ｔｒａｇｇｉａｉ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：１０４−１０７）。ＮＯＤ−ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ−／−（ＮＳＧ）レシピエントまたはＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ２−／−Ｉｌ２ｒｇ−／−レシピエントのいずれかへのヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）の養子移入は、レシピエント骨髄（ＢＭ）における安定したＨＳＣの長期生着および末梢における全てのヒト血液系細胞の生成（ヒト化マウスまたはヒューマウス（ｈｕｍｉｃｅ））をもたらす（Ｈｉｒａｍａｔｓｕ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：８７３−８８０；Ｔｒａｇｇｉａｉ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：１０４−１０７）。
【０００３】
既存のヒト化マウスモデルは、ヒト病原体による感染（Ｄａｖｉｓ  ＰＨ，Ｓｔａｎｌｅｙ  ＳＬ，Ｊｒ．（２００３）Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５：８４９-８６０；Ｂｅｎｔｅ  ＤＡ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９：１３７９７-１３７９９；Ｉｓｌａｓ−Ｏｈｌｍａｙｅｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７８：１３８９１-１３９００；Ｇｕｉｒａｄｏ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  ８：１２５２-１２５９；Ｋｎｅｔｅｍａｎ  ＮＭ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４３：１３４６-１３５３；Ｊｉａｎｇ  Ｑ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｌｏｏｄ  １１２：２８５８-２８６８）、特にヒト血液系細胞を感染させるものを研究するための重要なツールを提供する。これらのモデルはまた、小動物モデルでの病原体に対するヒト免疫応答の調査研究を可能にする。しかし、現在利用可能なモデルは、最適なものから程遠い。たとえば、ヒト細胞再構成のレベルは、異なる細胞系統間で著しく異なる。細胞の再構成は骨が折れ、Ｔ細胞の再構成は合理的であるが、Ｂ細胞およびＴ細胞は機能的ではない。加えて、ＮＫ細胞および骨髄系細胞の再構成は一般に不十分であり、検出不能である。
【０００４】
したがって、ヒト免疫系の改善された非ヒトモデルおよびそれらを製造する方法が強く求められている。
【発明の概要】
【０００５】
ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）によるヒト血液細胞系統の再構成不良は主として、非ヒト哺乳動物でこれらの細胞系統を発生および維持するのに必要な、適切なヒトサイトカイン類の欠乏の結果であることを、本明細書に示す。ヒトＩＬ−１５およびＦｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンドをコード化するプラスミドＤＮＡがヒト化マウスに送達されたとき（たとえば、流体力学的尾静脈注入による）、ヒトサイトカイン類の発現は２〜３週間持続し、またＮＫ細胞レベル上昇は１カ月を超える期間誘導された。サイトカイン誘導性ＮＫ細胞は、活性化受容体と抑制性受容体の両者を発現し、インビトロで標的細胞を死滅させ、またインビボでウイルス感染に強く応答した。同様に、ヒトＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４、マクロファージコロニー刺激因子、またはエリスロポエチンおよびＩＬ−３の発現は、それぞれ樹枝状細胞、単球類／マクロファージ類、または赤血球の再構成を有意に強化した（参照により本明細書に援用されるＣｈｅｎ，Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１０６：２１７８３−２１７８８（２００９）を参照されたい）。また、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４はヒトＴ細胞およびヒトＢ細胞の再構成も強化した。このように、（たとえば、流体力学的送達により）ヒトサイトカイン遺伝子発現をヒトＨＳＣと一緒に使用することは、ヒト化マウスにおける特定のヒト血液細胞系統の再構成を改善するための簡単で効率のよい方法であり、ヒト疾病およびそれらの進行をモデル化し、また小動物モデルにおけるヒト免疫応答を研究するための重要なツールを提供する。
【０００６】
したがって、本明細書では、非ヒト哺乳動物で機能的ヒト血液細胞系統を再構成し、それによってヒト化非ヒト哺乳動物を製造する方法を提供する。特定の実施態様で、ヒト化マウス（ヒューマウス）が作られる。
【０００７】
一態様で、本発明は、ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）および１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する（１つまたは複数の）核酸を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することを含む、非ヒト哺乳動物で機能的ヒト血液細胞系統を再構成する方法を対象とする。非ヒト哺乳動物は、非ヒト哺乳動物で核酸が発現されてヒトＨＳＣが機能的ヒト血液細胞系統に分化する条件下で維持され、それによって、非ヒト哺乳動物で機能的ヒト血液細胞系統を再構成する。
【０００８】
別の態様で、本発明は、ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）および１つまたは複数のヒトサイトカインをコード化する核酸を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することを含む、非ヒト哺乳動物で機能的ヒトＮＫ細胞を再構成する方法を対象とし、ここで、ヒトサイトカイン類は、非ヒト哺乳動物で発現されるとき、ヒトＨＳＣの機能的ヒトＮＫ細胞への分化を促進する。非ヒト哺乳動物は、非ヒト哺乳動物で核酸が発現されてヒトＨＳＣが機能的ヒトＮＫ細胞系統に分化する条件下で維持され、それによって、非ヒト哺乳動物におけるヒトＮＫ細胞の再構成を強化する。
【０００９】
また別の態様で、本発明は、ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）および１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する核酸を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することを含む、非ヒト哺乳動物で機能的ヒト樹枝状細胞を再構成する方法を対象とし、ここで、ヒトサイトカイン類は、非ヒト哺乳動物で発現されるとき、ヒトＨＳＣの機能的ヒト樹枝状細胞への分化を促進する。非ヒト哺乳動物は、非ヒト哺乳動物で核酸が発現されてヒトＨＳＣが機能的ヒト樹枝状細胞に分化する条件下で維持され、それによって、非ヒト哺乳動物で機能的ヒト樹枝状細胞の再構成を強化する。
【００１０】
別の態様で、本発明は、ヒトＨＳＣおよび１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する核酸を免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することを含む、非ヒト哺乳動物で機能的ヒト単球／マクロファージを再構成する方法を対象とし、ここで、ヒトサイトカイン類は、非ヒト哺乳動物で発現されるとき、ヒトＨＳＣの機能的ヒト単球／マクロファージへの分化を促進する。非ヒト哺乳動物は、非ヒト哺乳動物で核酸が発現されてヒトＨＳＣが機能的ヒト単球／マクロファージに分化する条件下で維持され、それによって、非ヒト哺乳動物で機能的ヒト単球／マクロファージを再構成する。
【００１１】
別の態様で、本発明は、ヒトＨＳＣおよび１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する核酸を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することを含む、非ヒト哺乳動物で機能的ヒト赤血球を再構成する方法を対象とし、ここで、ヒトサイトカイン類は、非ヒト哺乳動物で発現されるとき、ヒトＨＳＣの機能的ヒト赤血球への分化を促進する。非ヒト哺乳動物は、非ヒト哺乳動物で核酸が発現されてヒトＨＳＣが機能的ヒト赤血球に分化する条件下で維持され、それによって、非ヒト哺乳動物で機能的ヒト赤血球を再構成する。
【００１２】
別の態様で、本発明は、ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）および１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する核酸を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することを含む、非ヒト哺乳動物で機能的ヒトＴ細胞およびヒトＢ細胞を再構成する方法を対象とし、ここで、ヒトサイトカイン類は、非ヒト哺乳動物で発現されるとき、ヒトＨＳＣの機能的ヒトＴ細胞およびヒトＢ細胞への分化を促進する。非ヒト哺乳動物は、非ヒト哺乳動物で核酸が発現されてヒトＨＳＣが機能的ヒトＴ細胞およびヒトＢ細胞に分化する条件下で維持され、それによって、非ヒト哺乳動物で機能的ヒトＴ細胞およびヒトＢ細胞を再構成する。
【００１３】
別の態様で、本発明は、ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）および１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコードする核酸を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することを含む、非ヒト哺乳動物で、免疫原に対するヒト抗体を産生する方法を対象とし、ここで、ヒトサイトカイン類は、ヒトＨＳＣの機能的ヒトＴ細胞および機能的ヒトＢ細胞への分化を促進する。非ヒト哺乳動物は、非ヒト哺乳動物で核酸が発現されてヒトＨＳＣが機能的ヒトＴ細胞および機能的ヒトＢ細胞に分化する条件下で維持される。非ヒト哺乳動物は、免疫原で免疫され、また、ヒトＢ細胞が非ヒト哺乳動物で免疫原に対するヒト抗体を産生する条件下で維持され、それによって、非ヒト哺乳動物で免疫原に対するヒト抗体を産生する。免疫原に対する抗体を産生するＢ細胞は、さらに単離して、免疫原に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの産生に使用することができる。
【００１４】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマならびにＢ細胞により産生される抗体類（たとえば、ポリクローナル抗体類；モノクローナル抗体類）もまた、本発明に包含される。本明細書で提供される方法により作られる非ヒト哺乳動物もまた、本発明に包含される。
【００１５】
本明細書に記載の方法は、非ヒト哺乳動物（たとえば、ヒト化マウス）で機能的ヒト血液細胞系統（たとえば、骨髄性細胞；リンパ球系細胞）を再構成するため、および非ヒト哺乳動物でヒト抗体を産生するための、簡単で効率のよい方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒューマウスの骨髄（ＢＭ）由来のヒトＣＤ３４＋細胞は、インビトロで刺激してＮＫ細胞に分化させることができる。（図１Ａ）ヒューマウスのＢＭ由来（左）およびＭＡＣＳにより抗ＣＤ３４ビーズで精製した後（右）の単核細胞の、ＣＤ３４とＣＤ１３３の染色プロフィールの比較。表示されるイベントは、ヒトＣＤ４５＋細胞にプレゲート設定する。数値は、ゲートリージョン内の細胞のパーセンテージを示す。マウス４匹のうち１匹からの代表的なデーターを示す。（図１Ｂ）ＩＬ−１５およびＦＬの非存在下（Ｃｔｒｌ）または存在下で７日間培養したヒトＣＤ３４＋細胞のＮＫｐ４６の染色特性対ＣＤ５６の染色特性。数値は、ＣＤ５６＋ＮＫｐ４６＋細胞のパーセンテージを示す。
【図２】流体力学的注入介在性遺伝子送達は、マウスで、全身的ヒトサイトカイン環境を創る。ヒトＩＬ−１５およびＦＬを発現するｐｃＤＮＡベクターを混合し（各５０μｇ）、ヒューマウスに流体力学的に注入した。表示の時点に、マウス血清中のヒトＩＬ−１５およびＦＬのレベルをＥＬＩＳＡで分析した（各時点ごとにｎ＝３）。
【図３】インビボで、ＩＬ−１５およびＦＬの発現は、ヒトＮＫ細胞発生を刺激する。空のｐｃＤＮＡベクター（Ｃｔｒｌ）またはＩＬ−１５および／またはＦＬを発現するｐｃＤＮＡベクターを、ヒト化マウスに流体力学的に注入した。９日後、表示の組織から細胞を調製し、ヒトＣＤ４５、ＣＤ３、およびＣＤ５６の染色をした。（図３Ａ）ドットプロットは、ＣＤ４５＋細胞にゲート設定したＣＤ３の染色特性対ＣＤ５６の染色特性を示す。数値は、ゲートリージョンのＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞のパーセンテージを示す。群当たりマウス５匹のうち１匹からの代表的なデーターを示す。異なる３つのドナーＨＳＣで、ヒューマウスを構築した。（図３Ｂ）サイトカイン遺伝子送達の９日後の、様々な器官におけるＣＤ４５＋ヒト白血球内のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞の発生頻度（平均値±ＳＥＭ）の比較（ｎ＝５）。（図３Ｃ）経時的な、血中のＣＤ４５＋ヒト白血球のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞の発生頻度（平均値±ＳＥＭ）（ｎ＝３）。
【図４Ａ−Ｄ】ヒトＮＫ細胞は機能的である。（図４Ａ）ヒューマウスにおける、アデノウイルス感染後の、ＮＫ細胞介在性肝損傷。サイトカイン遺伝子送達の９日後、ＰＢＳまたは複製欠損−アデノウイルス（Ａｄ）を、ヒューマウスに流体力学的に注入した。感染の３日後、Ｈ＆Ｅ染色用にヒューマウスの肝臓を採取した（各群ごとにｎ＝３）。矢印は、壊死および白血球浸潤の領域を示す。Ｃｔｒｌ，サイトカイン遺伝子を送達しないヒューマウス；ＩＬ−１５／ＦＬ，サイトカイン遺伝子を送達したヒューマウス。拡大図を示す。（図４Ｂ）血清中のＡＬＴレベルの比較。注入の５日後にアデノウイルスまたはＰＢＳ処理ヒューマウスから血清を採取し、ＡＬＴ活性の分析をした（平均値±ＳＥＭ，群当たりｎ＝３）。ＩＬ−１５／ＦＬ／Ａｄと他群との間でＰ＜０．０５。（図４Ｃ）アデノウイルス感染ヒューマウスにおける血清ＩＦＮ−γレベル。アデノウイルス感染ヒューマウスから血清を採取し、ＥＬＩＳＡでＩＦＮ−γを測定した。平均値±ＳＥＭを示す（群当たりｎ＝３）。Ｐ＜０．０５。（図４Ｄ）様々なヒューマウスの肝臓におけるＭＮＣの数。アデノウイルス感染の５日後に肝臓を採取した。肝ＭＮＣ総数を計数し、フローサイトメトリー分析によりヒトＣＤ４５＋細胞数を決定した（平均値±ＳＥＭ、群当たりｎ＝３）。ＩＬ−１５／ＦＬ／Ａｄと他群との間でＰ＜０．０５。
【図４Ｅ】（図４Ｅ）ＣＤ５６＋ヒトＮＫ細胞の、肝臓における病変への局在化。肝臓組織をパラフィンに包埋し、薄切し、ＣＤ５６の染色をし、顕微鏡法で分析した。矢印は病変の領域を示す。マウス３匹のうち１匹からの代表的な画像を示す。
【図５】対応するヒトサイトカイン遺伝子送達による、特定のヒト血液系細胞の誘導。（図５Ａ）樹枝状細胞の再構成改善。空のｐｃＤＮＡベクターまたは指定されたヒトサイトカイン遺伝子を発現するｐｃＤＮＡベクターを、ヒューマウスに流体力学的に注入した。注入の９日後、様々な器官から単一細胞懸濁液を調製し、ヒトＣＤ４５、ＣＤ１１ｃ、およびＣＤ２０９の染色をした。ＣＤ４５＋ヒト細胞にゲート設定したＣＤ２０９の染色特性対ＣＤ１１ｃの染色特性を示す。マウス５匹のうち１匹からの代表的なデーターを示す。（図５Ｂ）単球／マクロファージの再構成改善。実験は、ｐｃＤＮＡ−コード化Ｍ−ＣＳＦを注入したこと、および細胞をヒトＣＤ４５およびＣＤ１４について染色したこと以外、（図５Ａ）の場合と同様に実施した。ＣＤ４５＋ヒト細胞にゲート設定したＣＤ１４の染色特性対ＣＤ４５の染色特性を示す。マウス３匹のうち１匹からの代表的なデーターを示す。（図５Ｃ）赤血球の再構成改善。実験は、ｐｃＤＮＡ−コード化ＥＰＯおよびＩＬ−３を注入したこと、および注入の７日後および３０日後に、血液をヒトＣＤ２３５ａｂについて染色したこと以外、（図５Ａ）の場合と同様に実施した。全血液細胞のＣＤ２３５ａｂの染色特性対ＤＡＰＩの染色特性を示す。マウス３匹のうち１匹からの代表的なデーターを示す。数値は、ゲートリージョン内の細胞のパーセンテージを示す。
【図６】ヒト化マウスにおけるヒトＮＫ細胞の再構成。（図６Ａ）ＨＳＣ生着の１２週後、末梢血の単核細胞におけるヒト細胞系統の再構成を、フローサイトメトリーで分析した。ドットプロットは、生存有核細胞にゲート設定したヒトＣＤ４５の染色特性対マウスＣＤ４５染色特性、あるいはＣＤ４５＋ヒト細胞にゲート設定したＣＤ３の染色特性対ＣＤ１９の染色特性またはＣＤ１４の染色特性対ＣＤ５６の染色特性を表す。（図６Ｂ）ヒト化マウスの血中、骨髄、脾臓、肺、および肝臓におけるヒトＣＤ４５＋細胞の、ＣＤ１４の染色特性対ＣＤ５６の染色特性。数値は、ゲートリージョン内の細胞のパーセンテージを示す。マウス６匹のうち１匹からの代表的なデーターを示す。
【図７】ＩＬ−２シグナルペプチド配列を使用して発現されたときの、循環におけるＩＬ−１５レベル上昇。（図７Ａ）ＩＬ−１５発現ベクターの模式図。内在性シグナル配列（ＳＰ）またはＩＬ−２ＳＰのいずれかが付いたＩＬ−１５遺伝子を、ＣＭＶプロモーターを含むｐｃＤＮＡベクターにクローニングした。（図７Ｂ）血清ＩＬ−１５レベルの比較。空のｐｃＤＮＡベクター（Ｃｔｒｌ）、ＩＬ−１５をコード化するｐｃＤＮＡベクター、およびＩＬ−２シグナル配列が付いたＩＬ−１５をコード化するｐｃＤＮＡベクターを、ＮＳＧマウスに流体力学的に注入した。注入の７日後に、血清を採取し、ＩＬ−１５レベルをＥＬＩＳＡで検定した。
【図８】ＩＬ−１５およびＦＬ発現後の、ヒト細胞数増加。（図８Ａ〜８Ｇ）空のｐｃＤＮＡベクター（Ｃｔｒｌ）、またはＩＬ−１５とＦＬの両者を発現するｐｃＤＮＡベクターを、ヒト化マウスに流体力学的に注入した。９日後、表示の組織から細胞を調製し、ヒトＣＤ４５に加えてＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１ｃ、ＩＬＴ７、ＣＤ３０３、およびＣＤ１９の染色をした。様々な器官における、ヒトＣＤ４５＋白血球、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１ｃ＋樹枝状細胞、ＩＬＴ７＋ＣＤ３０３＋形質細胞様樹状細胞、ＣＤ１４＋単球／マクロファージ、ＣＤ３＋Ｔ細胞、およびＣＤ１９＋Ｂ細胞の絶対数は、総細胞数に特定の細胞型の発生頻度を乗じることによって算出した。平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。骨髄（ＢＭ）における細胞数は大腿骨２本からであった。
【図９】ＩＬ−１５およびＦＬ処理ヒューマウスにおけるヒトＮＫ細胞の細胞表面表現型。ＩＬ−１５遺伝子およびＦＬ遺伝子の送達後９日に、表示の器官から細胞を調製し、ヒトＣＤ４５、ＣＤ５６に加えてＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ７、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ、またはＣＤ１６の染色をした。ＣＤ４５＋ヒト細胞にゲート設定した、ＣＤ５６の染色特性対ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ７、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ、またはＣＤ１６の染色特性を示す。数値は、ゲートリージョン内の細胞のパーセンテージを示す。
【図１０】ＩＬ−１５およびＦＬ処理ヒューマウス由来のヒトＮＫ細胞の細胞傷害性および刺激。（図１０Ａ）ＮＫ細胞は、細胞溶解性である。サイトカイン遺伝子送達の９日後、ヒトＮＫ細胞をＢＭおよび脾臓から精製し、異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でＫ５６２細胞と混合し、４時間培養した。ＮＫ細胞の細胞溶解活性は、上澄の乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を測定することによって決定した。（図１０Ｂ）ＮＫ細胞は、インビトロで、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激後、ＩＦＮ−γを産生する。精製ＮＫ細胞（５×１０５）を単独で、またはｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（５０μｇ／ｍｌ）の存在下で、またはｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）およびインビトロで分化したヒトＤＣ（５×１０５）の存在下で、培養した（材料と方法参照）。２４時間後に、ＥＬＩＳＡで、ヒトＩＦＮ−γについて上澄を分析した。（図１０Ｃ）ＮＫ細胞は、インビボでｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激後、ＩＦＮ−γを産生する。ヒューマウスに、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（マウス当たり２００ｐｇ）を静脈内注入した。注入の２４時間後に血清を採取し、ＥＬＩＳＡでヒトＩＦＮ−γの検定をした（ｎ＝４）。Ｐ＜０．０５。
【図１１】インビトロでの、ヒトＣＤ３４＋細胞の分化。ＣＤ３４＋ヒト細胞を、ヒューマウスのＢＭから精製し（左）、ＧＭ−ＣＳＦに加えてＩＬ−４、またはＭ−ＣＳＦの存在下で７日間、あるいはＥＰＯに加えてＩＬ−３の存在下で２０日間、培養した。次いで細胞を、ＣＤ４５に加えてＣＤ２０９およびＣＤ１１ｃ、またはＣＤ１４およびＣＤ３３、またはＣＤ２３５ａｂについて検定した。ＣＤ４５＋細胞について、ＣＤ２０９の染色特性対ＣＤ１１ｃの染色特性およびＣＤ１４の染色特性対ＣＤ３３の染色特性を示す。ＣＤ２３５ａｂ発現をヒストグラム（太線）で示す。ＥＰＯおよびＩＬ−３無しで培養した精製ＣＤ３４＋細胞をコントロールとして使用した（細線）。
【図１２】ヒト化マウスにおける、破傷風トキソイドワクチン免疫後の、ヒト細胞増殖。（図１２Ａ）免疫の実験的流れ：第０日に、類似したヒト白血球再構成（５０〜８０％）を有する１２週齢のヒト化マウスに、ヒトＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４をコード化するプラスミドまたは空のｐｃＤＮＡベクター（ベクター）を、流体力学的に注入した。７日後、これらのマウスを、破傷風トキソイド（ＴＴ）で３回、免疫した。第１回の免疫は、２ｌ．ｆ．の破傷風トキソイドワクチンの腹腔内注射で実施し、続いて２〜３週間隔でさらに２回、ブースターを実施した。第２回ブースターの２週間後、マウスを分析した。（図１２Ｂ）ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４処理マウス由来の脾臓は、有意に腫大していた。（図１２Ｃ）様々なヒューマウスの脾臓における単核細胞（ＭＮＣ）数。脾臓を、免疫後に採取した。脾臓のＭＮＣ総数を数え、フローサイトメトリー分析でヒトＣＤ４５＋細胞数を決定した（平均値±ＳＥＭ，群当たりｎ＝３）。
【図１３】ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４処理した、ＴＴ免疫ヒューマウスにおける、ヒトＢ細胞の細胞表面表現型。細胞を脾臓から調製し、ヒトＣＤ４５、マウスＣＤ４５、ＣＤ１９に加えてＩｇＭ、ＩｇＤ、ＣＤ１０、ＣＤ２６８、ＣＤ５、ＣＤ２１、ＣＤ２７、ＩｇＧ、またはＣＤ２０の染色をした。ＣＤ４５＋ヒト細胞にゲート設定した、ＣＤ１９の染色特性対ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＣＤ１０、ＣＤ２６８、ＣＤ５、ＣＤ２１、ＣＤ２７、ＩｇＧ、またはＣＤ２０の染色特性を示す。
【図１４】ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４処理した、ＴＴ免疫ヒューマウスにおける、ヒトＴ細胞の細胞表面表現型。細胞を脾臓から調製し、ヒトＣＤ４５、マウスＣＤ４５、ＣＤ１９に加えてＩｇＭ、ＩｇＤ、ＣＤ１０、ＣＤ２６８、ＣＤ５、ＣＤ２１、ＣＤ２７、ＩｇＧ、またはＣＤ２０の染色をした。ＣＤ４５＋ヒト細胞にゲート設定した、ＣＤ３の染色特性対Ｔ細胞活性化マーカー：ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ４０Ｌの染色特性を示す。
【図１５】ＴＴ免疫ヒューマウスにおける、ヒトＩｇＧ、ＩｇＭおよびＴＴ特異的ヒトＩｇＧの血清レベル。ＴＴ免疫ヒューマウスから血清を採取し、ヒトＩｇＧ、ＩｇＭおよびＴＴ特異的ヒトＩｇＧをＥＬＩＳＡで測定した。（図１５Ａ）血清中のヒト総ＩｇＧ。ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４処理マウスは、ベクター処理マウスより有意に高いヒト総ＩｇＧレベルを生じさせた。（図１５Ｂ）血清中のヒト総ＩｇＭ。ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４処理マウスはまた、より高い総ヒトＩｇＭ血清レベルを有する。（図１５Ｃ）血清中のヒトＴＴ特異的ＩｇＧ。
【図１６】サイトカイン処理マウスにおけるＴＴ特異的ヒトＴ細胞反応。第３回免疫の２週間後に、脾臓を採取し、ヒトＴ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーで測定した。ＥＬＩＳＰＯＴ検定の場合、同数（５×１０５）の、異なる試料からのヒトＴ細胞を、抗ヒトＩＦＮ−γまたは抗ヒトＩＬ−４抗体で被覆したウェルに播種し、３種類の条件下で２４時間培養した：培地のみ（ｃｔｒｌ）、ＰＭＡの存在下またはＴＴ−特異的ペプチドの存在下。ＥＬＩＳＰＯＴを現像した。（図１６Ａ）免疫マウス由来の脾細胞を含む代表的なヒトＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴウェル。（図１６Ｂ）免疫マウス由来の脾細胞を含む代表的なヒトＩＬ−４ＥＬＩＳＰＯＴウェル。２つの独立した実験の１つからのデータを示す。
【図１７】ヒトＩＬ−１５、ＦＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＭ−ＣＳＦをコード化するＤＮＡプラスミドの混合物（各５０μｇ）を、ＰＢＳに溶解し、１２週齢のヒト化マウスに注入した（ｎ＝２）。７日後、血清を採取し、ＥＬＩＳＡで、これらのヒトサイトカイン類の分析をした。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
近年、ヒト胎仔胸腺、肝臓、および自己ヒトＣＤ３４＋細胞を移植されたＮＯＤ−ｓｃｉｄマウス（ＢＬＴマウス）で、ヒト樹枝状細胞（ＤＣ）および単球／マクロファージの意義深い再構成が報告された（Ｗｅｇｅ  ＡＫ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２４：１４９−１６５）。しかしまだ、ＢＬＴマウスにヒトＮＫ細胞は存在しなかった。ＮＫ細胞および骨髄性細胞は、自然免疫反応において重要な役割を果たすため、これらの細胞型の十分な再構成レベルを有するヒト非ヒト哺乳動物、たとえばヒト化マウス等の発生は、感染病調査研究および血液系細胞を含む他の調査研究（たとえば、貧血症、免疫不全症、癌等の、血液病調査）におけるヒト化マウスモデルの可能性を十分に実現するために重要である。
【００１８】
全ての血液細胞系統は、共通のヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する。サイトカイン類は、それらの分化および維持の間、重要な役割を果たす。たとえば、ＩＬ−１５は、ＮＫ細胞の発生および生存に必要であり（Ｍｒｏｚｅｋ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｌｏｏｄ  ８７：２６３２−２６４０）、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４は樹枝状細胞（ＤＣ）発生に（Ｒｏｓｅｎｚｗａｊｇ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｌｏｏｄ  ８７：５３５−５４４）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）は単球／マクロファージの発生および維持に（Ｓｔｅｃ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ８２：５９４−６０２）、またエリスロポエチン（ＥＰＯ）およびＩＬ−３は赤血球発生に必要である（Ｇｉａｒｒａｔａｎａ  ＭＣ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：６９−７４）。しかし、ヒトとマウスとの間の進化的分岐のため、これらのサイトカイン類は種特異的である（すなわち、マウスサイトカイン類はヒト細胞に対して作用しない）。たとえば、マウスＩＬ−１５は、ヒトＮＫ細胞および前駆体に対して何の作用も持たず（Ｅｉｓｅｎｍａｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２０：１２１-１２９）、ヒューマウスにおけるヒトＮＫ細胞の再構成不良という結果に終わる（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ  ＮＤ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０６：２５−３４；Ｋａｌｂｅｒｅｒ  ＣＰ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：１２７−１３５）。同様に、マウスＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４（Ｍｅｔｃａｌｆ  Ｄ（１９８６）Ｂｌｏｏｄ  ６７：２５７−２６７；Ｍｏｓｍａｎｎ  ＴＲ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３８：１８１３−１８１６）、Ｍ−ＣＳＦ（Ｆｉｘｅ  Ｐ，Ｐｒａｌｏｒａｎ  Ｖ（１９９７）Ｅｕｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ  ８：１２５−１３６）、およびＩＬ−３（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ＬＭ，Ｊｏｎｅｓ  ＤＧ（１９９４）Ｊ  ＣｏｍｐＰａｔｈｏｌ１１１：９９−１０６）は全て、ヒト細胞に対して何の作用もないと報告されている。
【００１９】
ヒューマウスにおけるＮＫ細胞および骨髄性細胞の不十分な再構成および機能は、特定のヒトサイトカイン類の欠如に起因するのかどうかを調査研究した。再構成されたマウスにおけるヒトサイトカイン類の発現が、特定のヒト血液系細胞の分化、生存、および機能を刺激するかどうかを究明するための実験を、本明細書に記述する。
【００２０】
この調査研究が、ヒト化マウスを使用して実証されるような、ヒト化非ヒト哺乳動物における特定のヒト血液系細胞の再構成を改善するための簡単で効率のよい方法の開発につながった。ヒトＩＬ−１５およびＦｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド（ＦＬ）をコード化する核酸を送達した際に、特定のヒトサイトカイン類が、ヒューマウスの循環中に２〜３週間検出された。結果として、有意に増加した数のヒトＮＫ細胞が、様々な器官で１カ月以上確認された。サイトカイン誘導性ＮＫ細胞は、インビトロおよびインビボの両方で、完全に機能した。同じ戦略を使用して、ヒューマウスにおけるヒト樹枝状細胞、単球／マクロファージ、および赤血球の再構成レベルも大幅に強化された。従前のヒト化マウスモデルにおけるＮＫ細胞および骨髄性細胞の再構成不良は、それらの分化および維持に必要な適切なヒトサイトカイン類の欠如の結果であること、およびヒトサイトカイン遺伝子の送達（たとえば、流体力学的送達）は、これらの細胞系統の再構成不良を克服するための簡単で効率のよい方法であることを、本明細書に記載の研究は示す。
【００２１】
したがって、一態様で、本発明は、機能的ヒト血液系細胞（たとえば、単一のヒト血液系細胞（たとえば、ＮＫ細胞）；多様なヒト血液系細胞（たとえば、ＮＫ細胞、樹枝状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞等々）を、また幾つかの実施態様で、全てのヒト血液系細胞）を、非ヒト哺乳動物で再構成する方法を対象とする。この実施態様で、ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）および１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する核酸が非ヒト哺乳動物に導入される。非ヒト哺乳動物は、非ヒト哺乳動物で核酸が発現されてヒトＨＳＣで非ヒト哺乳動物が再構成される条件下で維持され、それによって、非ヒト哺乳動物でヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）を再構成する。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、ＨＳＣ（たとえば、ヒトＨＳＣ）は、レシピエントに移植されるとき、「移植レシピエント（たとえば、非ヒト哺乳動物；免疫不全非ヒト哺乳動物）の造血システムを「再生息させる」または「再構成する」ことができ、またレシピエントで（たとえば、長期）造血を持続できる、自己再生幹細胞である。ＨＳＣは、骨髄性（たとえば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹枝状細胞）およびリンパ球系（たとえば、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞、ＮＫ−細胞）を含む、血液細胞型を生じさせる（に分化する）多能性幹細胞である。本明細書に記載の方法に示す通り、再構成されたヒトＨＳＣは、非ヒト哺乳動物で、ヒトＮＫ細胞、ヒト単球、ヒトマクロファージ、ヒト樹枝状細胞、ヒト赤血球、ヒトＢ細胞、ヒトＴ細胞またはそれらの組合せに分化することができる。
【００２３】
ＨＳＣは細胞マーカーＣＤ３４を発現するので、通例「ＣＤ３４＋」と呼ばれる。当業者には明らかなように、ＨＳＣはまた他の細胞マーカー、たとえばＣＤ１３３および／またはＣＤ９０等も発現できる（「ＣＤ１３３＋」、「ＣＤ９０＋」）。場合によっては、ＨＳＣは、発現されないマーカー、たとえば、ＣＤ３８を特徴とする。したがって、本発明の一実施態様で、本明細書に記載の方法で使用されるヒトＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＣＤ３８−、ＣＤ１３３＋ＣＤ３８−、ＣＤ１３３＋ＣＤ９０＋ＣＤ３８−、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＣＤ９０＋ＣＤ３８−、またはそれらの任意の組合せである。ある特定の実施態様で、ＨＳＣは、本明細書で「二重陽性」細胞または「ＤＰ」細胞あるいは「ＤＰＣ」とも呼ばれる、ＣＤ３４（「ＣＤ３４＋」）とＣＤ１３３＋（「ＣＤ１３３＋」）の両方である。別の実施態様で、ＨＳＣはＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋であり、そしてＣＤ３８−および／またはＣＤ９０＋をさらに含んでもよい。
【００２４】
ＨＳＣは、ドナー（たとえば、人類、霊長類、ブタ、マウス、等々を含む、哺乳動物等の脊椎動物）の大腿骨、股関節、肋骨、胸骨、および他の骨等の骨髄に見られる。臨床使用および科学的使用のための、他のＨＳＣ源としては、臍帯血、胎盤、胎仔肝臓、動員末梢血、非動員（ｎｏｎ−ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）（または不動員（ｕｎｍｏｂｉｌｉｚｅｄ））末梢血、胎仔肝臓、胎仔脾臓、胚性幹細胞、および大動脈−性腺−中腎（ＡＧＭ）、またはそれらの組合せなどがある。
【００２５】
当業者に理解されるであろうが、動員末梢血は、ＨＳＣ（たとえば、ＣＤ３４＋細胞）を強化した末梢血を指す。化学療法剤および／またはＧ−ＣＳＦ等の化学物質の投与は、幹細胞を骨髄から末梢循環に動員する。たとえば、少なくとも５日間の、または約５日間の、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の投与は、ＣＤ３４＋細胞を末梢血に動員する。循環するＣＤ３４＋細胞の３０倍富化が確認され、そのピーク値は、Ｇ−ＣＳＦ投与開始後第５日に現れる。末梢血の動員がなければ、循環するＣＤ３４＋細胞の数は非常に少なく、総単核血球の０．０１〜０．０５％と推定される。
【００２６】
本方法で使用するためのヒトＨＳＣは、単一ドナーから得ても多数のドナーから得てもよい。加えて、本明細書に記載の方法で使用されるＨＳＣは、用時単離されたＨＳＣ、凍結保存ＨＳＣＳ、またはそれらの組合せであってもよい。
【００２７】
当該技術分野で周知の通り、ＨＳＣは、当該技術分野で周知の種々の方法を使用して、これらの供給源から得ることができる。たとえば、ＨＳＣは、針と注射器を使用して、たとえば、股関節部、大腿骨、等々の骨髄から除去することにより直接得ることもでき、あるいは骨髄コンパートメントから細胞を放出させる、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）等のサイトカイン類でドナーを前処置した後、血液から得ることもできる。
【００２８】
本発明の方法で使用するためのＨＳＣは、得られたまま（たとえば、未増殖で）またはＨＳＣを非ヒト哺乳動物に導入する前に操作して（たとえば、増殖して）、非ヒト哺乳動物に直接導入することができる。一実施態様で、ＨＳＣを非ヒト哺乳動物に導入する前に、ＨＳＣを増殖する。当業者に理解されるであろうが、ＨＳＣを増殖させるために使用できる方法は種々ある（たとえば、Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１２（８）：２１６１−２１７０（２００６）；Ｚｈａｎｇ  ＣＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１１（７）：３４１５−３４２３（２００８）参照）。ある特定の実施態様で、成長因子類（たとえば、アンギオポエチン様５（Ａｎｇｐｌｔ５）成長因子、ＩＧＦ−結合蛋白質２（ＩＧＦＢＰ２）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、またはそれらの組合せ）の存在下で、ＨＳＣを間葉幹細胞（ＭＳＣ）と共培養して細胞培養をすることにより、ＨＳＣの個体群を増殖することができる。細胞培養は、増殖したＨＳＣ個体群が産生される条件下で維持される（たとえば、Ｍａｒｏｕｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，ＩＳＳＣＲ，７ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．１４０１（Ｊｕｌｙ８−１１，２００９）、_____________として公開された、２０１０年５月２８日に提出された、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３６６６４号（代理人整理番号Ｎｏ．４４７１．１０００−００１）（参照により本明細書に援用する）を参照）。
【００２９】
本明細書に記載の方法では、ヒトＨＳＣの機能的ヒト細胞への分化を誘導するために１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する（１つまたは複数の）核酸（たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）も非ヒト哺乳動物に導入される。当該技術分野で周知の通り、サイトカイン類は、免疫細胞の分化、増殖または機能を刺激または抑制する蛋白質である。多数のヒトサイトカイン類の核酸配列も、当該技術分野で周知である（たとえば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。１つまたは複数のサイトカイン類をコード化する核酸を入手するための方法は、当該技術分野でルーチンであり、種々の供給源（たとえば、血清）から核酸を単離すること（たとえば、クローニング）、組換えで核酸を産生することまたは商業的供給源から核酸を入手することを含む。
【００３０】
本発明の方法で使用することができる種々のヒトサイトカイン類がある。このようなヒトサイトカイン類の例としては、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、Ｆｌｔ３Ｌ／Ｆｌｋ２リガンド（ＦＬ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびそれらの組合せなどがある。本明細書に記載の方法で使用するのに好適な他のサイトカイン類の例を一覧表にした。非ヒト哺乳動物に導入されるサイトカインのタイプおよびサイトカイン類の数は、ヒトＨＳＣの分化が非ヒト哺乳動物で起こるとき、どのヒト血液細胞系統が再構成されるべきかによって異なる。たとえば、実施例１に示す通り、ヒトＩＬ−１５およびＦｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンドをコード化する核酸が（たとえば、流体力学的尾静脈注入により）ヒト化マウスに導入されたとき、ヒトサイトカイン類の発現は２〜３週間持続し、上昇したヒトＮＫ細胞レベルは１カ月以上にわたって誘導された。サイトカイン誘導性ＮＫ細胞は、活性化受容体および抑制性受容体の両者を発現し、インビトロで標的細胞を死滅させ、インビボでウイルス感染に強く応答した。同様に、ヒトＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の発現は、ヒト樹枝状細胞の有意に強化された再構成を招き；マクロファージコロニー刺激因子の発現は、ヒト単球／マクロファージの有意に強化された再構成を招き；またエリスロポエチンおよびＩＬ−３の発現は、ヒト赤血球の有意に強化された再構成を招いた（参照により本明細書に援用される、Ｃｈｅｎ，Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１０６：２１７８３−２１７８８（２００９）参照）。実施例２に示す通り、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の発現は、機能的ヒトＴ細胞およびヒトＢ細胞の再構を強化した。
【００３１】
幾つかの態様で、少なくとも１種のサイトカイン、少なくとも２種のサイトカイン類、少なくとも３種のサイトカイン類、少なくとも４種のサイトカイン類、少なくとも５種のサイトカイン類、少なくとも６種のサイトカイン類、少なくとも７種のサイトカイン類、少なくとも８種のサイトカイン、少なくとも９種のサイトカイン類、少なくとも１０種のサイトカイン類、少なくとも１１種のサイトカイン類、少なくとも１２種のサイトカイン類、少なくとも１３種のサイトカイン類、少なくとも１４種のサイトカイン類、少なくとも１５種のサイトカイン類、少なくとも１６種のサイトカイン類、少なくとも１７種のサイトカイン類、少なくとも１８種のサイトカイン類、少なくとも１９種のサイトカイン類、または少なくとも２０種のサイトカイン類（を含む）が、非ヒト哺乳動物に導入される。他の態様で、１種のサイトカイン、２種のサイトカイン類、３種のサイトカイン類、４種のサイトカイン類、５種のサイトカイン類、６種のサイトカイン類、７種のサイトカイン類、８種のサイトカイン、９種のサイトカイン類、１０種のサイトカイン類、１１種のサイトカイン類、１２種のサイトカイン類、１３種のサイトカイン類、１４種のサイトカイン類、１５種のサイトカイン類、１６種のサイトカイン類、１７種のサイトカイン類、１８種のサイトカイン類、１９種のサイトカイン類、または２０種のサイトカイン類のみ（から成る、から本質的に成る）が、非ヒト哺乳動物に導入される。各ヒトサイトカインをコード化する核酸を同時にまたは順次導入してもよい（たとえば、複数のサイトカインを非ヒト哺乳動物で発現させるべき場合、各サイトカインをコード化する各核酸を、独自の１つのプラスミドまたはベクターで導入してもよく、または多数のプラスミド類またはベクター類で導入してもよい；あるいは、導入されるべきサイトカイン類をコード化する全ての核酸を、１種のプラスミドまたはベクターで導入してもよい）。
【００３２】
本発明の方法では、ＨＳＣおよび１つまたは複数のサイトカイン類をコード化する核酸が非ヒト哺乳動物に導入される。本明細書で使用されるとき、用語「哺乳動物」および「哺乳類」は、それらの子に授乳する、生存する子を出産する（真獣類または有胎盤哺乳動物）かまたは産卵する（後獣類または無胎盤哺乳動物）かいずれかの、単孔類、有袋類および有胎盤動物を含む、任意の脊椎動物を指す。本明細書に記載の方法で使用することができる哺乳類種の例としては、非ヒト霊長類（たとえば、サル、チンパンジー）、齧歯類（たとえば、ラット、マウス、モルモット）、イヌ、ネコ、および反芻動物（たとえば、ウシ、ブタ、ウマ）などがある。一実施態様において、非ヒト哺乳動物はマウスである。本明細書に記載の方法で使用される非ヒト哺乳動物は、成体、新生仔（たとえば、＜４８時間齢；子）または子宮内であってもよい。
【００３３】
特定の実施態様で、非ヒト哺乳動物は免疫不全非ヒト哺乳動物である、すなわち、その免疫系に１つまたは複数の欠損があり（たとえば、ＮＳＧまたはＮＯＤ  ｓｃｉｄ  γ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス）、結果として、ヒトＨＳＣが導入されるとき、ヒト血液細胞系統の再構成を許容する、非ヒト哺乳動物である。たとえば、その非ヒト哺乳動物は、それ自身のＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞またはそれらの組合せを欠く。特定の実施態様で、非ヒト哺乳動物は、たとえば重症複合免疫不全変異を担持する非肥満糖尿病マウス（ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス）；重症複合免疫不全変異を担持し、またサイトカイン−受容体γ鎖の遺伝子を欠く非肥満糖尿病マウス（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒγ−／−マウス）；およびＢａｌｂ／ｃｒａｇ−／−γｃ−／−マウス等の、免疫不全マウスである。
【００３４】
免疫不全マウスの他の具体例としては、重症複合免疫不全（ｓｃｉｄ）マウス、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）−ｓｃｉｄマウス、ＩＬ２ｒｇ−／−マウス（たとえば、ＮＯＤ／ＬｙＳｚ−ｓｃｉｄＩＬ２ｒｇ−／−マウス、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄＩＬ２ｒｇ−／−マウス（ＮＯＧマウス）、ＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ−／−ＩＬ２ｒｇ−／−マウス、Ｈ２ｄ−Ｒａｇ−／−ＩＬ２ｒｇ−／−マウス）、ＮＯＤ／Ｒａｇ−／−ＩＬ２ｒｇ−／−マウスなどがあるが、その限りではない。
【００３５】
幾つかの実施態様で、ヒトＨＳＣおよび１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する核酸の導入前に（たとえば、ヒトＨＳＣの再構成をさらに強化するために）、非ヒト哺乳動物を処置または操作する。たとえば、非ヒト哺乳動物を操作して、ヒトＨＳＣの生着および／または再構成をさらに強化することができる。一実施態様で、ＨＳＣおよび１つまたは複数のサイトカイン類をコード化する核酸の導入前に、非ヒト哺乳動物を照射する。別の実施態様で、ＨＳＣおよび１つまたは複数のサイトカイン類をコード化する核酸の導入前に、１つまたは複数の化学療法剤が非ヒト哺乳動物に投与される。
【００３６】
やはり当業者に理解されるであろうが、ＨＳＣおよびサイトカイン類をコード化する核酸を非ヒト哺乳動物に導入する種々の方法がある。そのような方法の例としては、皮内、筋肉内、免疫、眼内、大腿内、脳室内、頭蓋内、髄腔内、静脈内、心臓内、肝臓内、骨髄内、皮下、局所、経口および鼻腔内投与経路などがあるが、その限りではない。他の好適な導入方法としては、子宮内注入、流体力学的遺伝子送達、遺伝子療法、充電式または生分解性装置、粒子加速器（「遺伝子銃」）および徐放性ポリマー装置も挙げることができる。
【００３７】
任意のそのような投与経路等々を使用して、ＨＳＣを非ヒトに導入することができる。ある特定の実施態様で、ＨＳＣを非ヒト哺乳動物に心臓内注入する。
【００３８】
１つまたは複数のサイトカイン類をコード化する核酸はまた、その核酸（類）が非ヒト哺乳動物で発現される限り、任意のそのような投与経路を使用して導入することもできる。たとえば、１つまたは複数のサイトカイン類をコード化する核酸を、プラスミド（たとえば、ｐｃＤＮＡ３．１（＋））またはウイルスベクター（たとえば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス等々）で、裸の核酸（裸のＤＮＡ）として導入することができる。ある特定の実施態様で、１つまたは複数のサイトカイン類をコード化する核酸は、（たとえば、非ヒト哺乳動物の尾静脈への）流体力学的注入を使用して、プラスミドで導入される。
【００３９】
ＨＳＣおよび１つまたは複数のサイトカイン類をコード化する核酸は、同時にまたは順次導入することができ、また当業者に理解されるであろうが、使用しようとしている非ヒト哺乳動物のタイプ、発現させようとしているサイトカイン類およびヒトＨＳＣの分化が非ヒト哺乳動物で起こるとき、どのヒト血液系細胞が発現されるかおよび／または強化されるか等の因子によって異なる。ある特定の実施態様で、ＨＳＣは新生仔（たとえば、約４８時間齢）に導入され、またサイトカイン類をコード化する核酸は約１か月、約２カ月、約３カ月、約４カ月、約５カ月、約６カ月、約７カ月、約８カ月、約９カ月、約１０カ月、約１１カ月、約１２カ月後に導入される。
【００４０】
いったんＨＳＣおよび１つまたは複数のサイトカイン類をコード化する核酸が導入されると、非ヒト哺乳動物は、核酸が発現されて、ＨＳＣで非ヒトが再構成される条件下で維持される。本発明の非ヒト動物が維持されるそのような条件は、当業者に周知の通り、哺乳動物の基本的欲求を満たすこと（たとえば、食糧、水、光）である。
【００４１】
本明細書に記載の方法は、核酸が発現されるかどうか、ヒトＨＳＣが存在するかどうかおよび／またはヒトＨＳＣが、１つまたは複数のヒト血液系細胞に分化しているかどうかを究明することをさらに含む。核酸が発現されるかどうかおよび／またはＨＳＣで非ヒトが再構成されるかどうかを究明する方法は、本明細書に提供され、また当業者に周知である。たとえば、ヒトＨＳＣの表面細胞マーカーに特異的な抗体を使用するフローサイトメトリー分析法を使用して、ヒトＨＳＣが非ヒト哺乳動物に存在することを検出できる。加えて、血清を非ヒト哺乳動物から採取して、ヒトサイトカイン類の存在を検定することができる。分化したＨＳＣ（たとえば、ＮＫ細胞、樹枝状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球／マクロファージ、赤血球）の機能を評価するための検定法も使用することができる。そのような検定法は本明細書にも記述されており、また当業者に周知である。たとえば、本明細書に記載の通り、サイトカイン誘導性ヒトＮＫ細胞は、インビトロ検定法（乳酸デヒドロゲナーゼ検定法）で標的細胞を死滅させ、またインビボでウイルス感染に強く応答した。
【００４２】
１つまたは複数のヒトサイトカイン遺伝子をコード化する核酸の送達によって、１つまたは複数のヒト血液細胞系統を非ヒト哺乳動物（たとえば、ヒト化マウス）で再構成できることは、種々の方法で使用できる。
【００４３】
たとえば、一態様で、本発明は、ヒトＨＳＣおよび１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する核酸を、免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することを含む、非ヒト哺乳動物で機能的ヒトＮＫ細胞を再構成する方法を対象とし、ここで、ヒトサイトカイン類は、非ヒト哺乳動物で発現されるとき、ヒトＨＳＣの機能的ヒトＮＫ細胞への分化を促進する。非ヒト哺乳動物は、非ヒト哺乳動物で核酸が発現されてヒトＨＳＣが機能的ヒトＮＫ細胞系統に分化する条件下で維持され、それによって、非ヒト哺乳動物で機能的ヒトＮＫ細を再構成する。ある特定の実施態様で、１つまたは複数のサイトカイン類をコード化する核酸は、ヒトＩＬ−１５およびヒトＦｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンドをコード化する。
【００４４】
別の実施態様で、非ヒト哺乳動物の末梢血の白血球の約３％〜約２５％が、ヒトＮＫ細胞（たとえば、機能的ＮＫ細胞）である。他の実施態様で、非ヒト哺乳動物の末梢血の白血球の約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、または約２５％が、ヒトＮＫ細胞である。
【００４５】
さらに他の実施態様で、ヒトＮＫ細胞（たとえば、機能的ＮＫ細胞）の発現は約１〜約３０日間、維持され（また、場合によっては、たとえば好適なコントロールと比較して強化され）、そして特定の実施態様で、ヒトＮＫ細胞の発現は約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２２日間、約２３日間、約２４日間、約２５日間、約２６日間、約２７日間、約２８日間、約２９日間、約３０日間、または約３１日間維持される。
【００４６】
幾つかの実施態様で、非ヒト哺乳動物におけるヒトＮＫ細胞は、ヒトで見られる通常の（野生型）ＮＫ細胞の細胞表面マーカーの、１つまたは複数、および場合によっては全てを発現する。そのような発現は、ヒトＮＫ細胞が非ヒト哺乳動物で確かに機能することを示す。たとえば一実施態様で、ヒトＮＫ細胞はＣＤ５６＋ＮＫ細胞細胞である。他の実施態様で、ヒトＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９４、ＫＩＲ、ＮＫｐ４６、ＣＤ７、ＣＤ６９、Ｃｄ１６、またはそれらの組合せを発現する。
【００４７】
さらに他の実施態様で、非ヒト哺乳動物におけるヒトＮＫ細胞は、適切な刺激（たとえば、Ｔｏｌｌ様受容体３アゴニスト・ポリ（Ｉ：Ｃ）；ヒト樹枝状細胞；アデノウイルス）を受けて、標的細胞を死滅させたりＩＦＮ−γを発現したりすることができる。
【００４８】
別の態様で、本発明は、免疫不全非ヒト哺乳動物に、ヒトＨＳＣおよび１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する核酸を導入することを含む、非ヒト哺乳動物で機能的ヒト樹枝状細胞を再構成する方法を対象とし、ここでヒトサイトカイン類は、非ヒト哺乳動物で発現されるとき、ヒトＨＳＣの機能的ヒト樹枝状細胞への分化を促進する。非ヒト哺乳動物は、非ヒト哺乳動物で核酸が発現されてヒトＨＳＣが機能的ヒト樹枝状細胞に分化する条件下で維持され、それによって、非ヒト哺乳動物で機能的ヒト樹枝状細胞を再構成する。ある特定の実施態様で、１つまたは複数のサイトカイン類をコード化する核酸は、ヒトＧＭ−ＣＳＦおよびヒトＩＬ−４をコード化する。別の実施態様で、１つまたは複数のサイトカイン類をコード化する核酸は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＩＬ−４およびヒトＦｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンドをコード化する。
【００４９】
他の実施態様で、非ヒト哺乳動物におけるヒト樹枝状細胞は、ヒトで見られる通常の（野生型）樹枝状細胞の細胞表面マーカーの、１つまたは複数、および場合によっては全てを発現する。一実施態様で、非ヒト哺乳動物におけるヒト樹枝状細胞は、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ２０９骨髄性樹枝状細胞（たとえば、血液、脾臓、骨髄、肺、肝臓で発現される）、ＩＬＴ７＋ＣＤ３０３＋形質細胞様樹状細胞またはそれらの組合せである。
【００５０】
別の態様で、本発明は、ヒトＨＳＣおよび１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する核酸を免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することを含む、非ヒト哺乳動物で機能的ヒト単球／マクロファージを再構成する方法を対象とし、ここで、ヒトサイトカイン類は、非ヒト哺乳動物で発現されるとき、ヒトＨＳＣの機能的ヒト単球／マクロファージへの分化を促進する。非ヒト哺乳動物は、非ヒト哺乳動物で核酸が発現され、ヒトＨＳＣが機能的ヒト単球／マクロファージに分化する条件下で維持され、それによって、非ヒト哺乳動物で機能的ヒト単球／マクロファージを再構成する。ある特定の実施態様で、１つまたは複数のサイトカイン類をコード化する核酸は、ヒトマクロファージコロニー刺激因子をコード化する。
【００５１】
他の実施態様で、非ヒト哺乳動物におけるヒト単球／マクロファージは、ヒトで見られる通常の（野生型）単球／マクロファージの、１つまたは複数、および場合によっては全てを発現する。一実施態様で、ヒト単球／マクロファージはＣＤ１４＋を発現する。
【００５２】
別の態様で、本発明は、ヒトＨＳＣおよび１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する核酸を免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することを含む、非ヒト哺乳動物で機能的ヒト赤血球を再構成する方法を対象とし、ここで、ヒトサイトカイン類は、非ヒト哺乳動物で発現されるとき、ヒトＨＳＣの機能的ヒト赤血球への分化を促進する。非ヒト哺乳動物は、非ヒト哺乳動物で核酸が発現されてヒトＨＳＣが機能的ヒト赤血球に分化する条件下で維持され、それによって、非ヒト哺乳動物で機能的ヒト赤血球を再構成する。ある特定の実施態様で、１つまたは複数のサイトカイン類をコード化する核酸は、ヒトエリスロポエチンおよびＩＬ−３をコード化する。
【００５３】
別の実施態様で、非ヒト哺乳動物におけるヒト赤血球は、ヒトで見られる通常の（野生型）赤血球の細胞表面マーカーの、１つまたは複数、および場合によっては全てを発現する。一実施態様で、ヒト赤血球はＣＤ２３５ａｂ＋を発現する。
【００５４】
さらに他の実施態様で、非ヒト哺乳動物におけるヒト赤血球は、非ヒト哺乳動物における全赤血球の約１％〜約１０％、または約３％〜約５％を構成する。特定の実施態様で、非ヒト哺乳動物におけるヒト赤血球は、非ヒト哺乳動物における全赤血球の約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％または約１０％を構成する。
【００５５】
ある特定の態様で、本発明は、ヒトＨＳＣおよび１つまたは複数のヒトサイトカインをコード化する核酸を免疫不全非ヒト哺乳動物に導入することを含む、非ヒト哺乳動物で機能的ヒトＴ細胞およびヒトＢ細胞を再構成する方法を対象とし、ここでヒトサイトカイン類は、非ヒト哺乳動物で発現されるとき、ヒトＨＳＣの機能的ヒトＴ細胞およびヒトＢ細胞への分化を促進する。非ヒト哺乳動物は、非ヒト哺乳動物で核酸が発現されてヒトＨＳＣが機能的ヒトＴ細胞およびヒトＢ細胞に分化する条件下で維持され、それによって、非ヒト哺乳動物で機能的ヒトＴ細胞およびヒトＢ細胞を再構成する。一実施態様で、１つまたは複数のサイトカイン類をコード化する核酸は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４をコード化する。本方法は、非ヒト哺乳動物を免疫原で免疫すること、および非ヒト哺乳動物が免疫原に対するヒト抗体を産生する条件下で非ヒト動物を維持することを、さらに含んでもよい。
【００５６】
また別の特定の態様で、本発明は、非ヒト哺乳動物で、免疫原に対するヒト抗体を生成する方法を対象とする。本方法で、ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）および１つまたは複数のヒトサイトカイン類をコード化する核酸が非ヒト哺乳動物に導入されるが、ここでヒトサイトカイン類は、ヒトＨＳＣの機能的ヒトＴ細胞およびヒトＢ細胞への分化を促進する。非ヒト哺乳動物は、非ヒト哺乳動物で核酸が発現されてヒトＨＳＣが機能的ヒトＴ細胞および機能的ヒトＢ細胞に分化する条件下で維持される。非ヒト哺乳動物は免疫原で免疫され、またヒトＢ細胞が非ヒト哺乳動物で免疫原に対するヒト抗体を産生する条件下で維持され、それによって、非ヒト哺乳動物で免疫原に対するヒト抗体を生成する。一実施態様で、１つまたは複数のサイトカイン類をコード化する核酸は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４をコード化する。
【００５７】
当該技術分野で周知の通り、「免疫原」は、免疫応答を誘導し、抗体産生を増進することができる物質である。本法で使用するための種々の免疫原は、当該技術分野で周知である。たとえば、免疫原は、下記の全部または免疫原性部分であってもよい：ヒトまたは他種由来の蛋白質、（たとえば、正常細胞または腫瘍細胞等の疾病細胞の）細胞表面蛋白質、生物（たとえば、生物の被膜、莢膜、細胞壁、鞭毛、線毛および毒素を含む、生物の免疫原性部分）、ウイルス蛋白質、細菌蛋白質、毒素、多糖、リポ蛋白質、（たとえば、アセチル化、メチル化、グリコシル化された）修飾蛋白質、核酸（たとえば、ＤＮＡ、ペプチド、蛋白質または多糖と結合されるときのＲＮＡ）、化学的エピトープ、等々。
【００５８】
これらの方法は、ヒト抗体を産生するヒトＢ細胞を、非ヒト哺乳動物から単離することをさらに含むことができる。Ｂ細胞を非ヒト哺乳動物から単離する方法は、当該技術分野で周知である。たとえば、フローサイトメトリーまたはＢ細胞特異的蛋白質に特異的な抗体に基づく磁気精製を使用する細胞選別（たとえば、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．によるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ（著作権）２０１０参照）。
【００５９】
当該技術分野で周知の通り、「抗体」または「免疫グロブリン」は、血中を循環するＢ細胞により産生される免疫系の蛋白質成分であり、細菌やウイルスのような免疫原を認識して、それらを無力化する。免疫原への暴露後、抗体は血中を循環し続け、将来その抗原に暴露されることを防ぐ。本明細書に記載の方法を使用して、ヒトＢ細胞により産生されるあらゆるタイプの抗体を得ることができる。モノクローナル抗体はポリクローナルであってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。そのような抗体の例は当該技術分野で周知であり、ＩｇＧ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡなどがある。
【００６０】
本方法は、単離されたヒトＢ細胞を不死化細胞と接触させ、それによって組合せを作ること；およびヒトＢ細胞と不死化細胞が融合して、免疫原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを形成する条件下で、その組合せを維持することを、さらに含むことができる。
【００６１】
当該技術分野で周知の通り、免疫後適切なときに、たとえば、抗体価が最高のときに、抗体産生細胞を対象から得て、標準的な技術、たとえば最初にＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）によって記述されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）），ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６（１９８５））またはトリオーマ技術等により、モノクローナル抗体の調製に使用することができる。ハイブリドーマを作るためのテクノロジーは周知である（一般にＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９４）参照）。簡単に記述すると、上述の通り、不死化細胞株（一般に骨髄腫）を、免疫原で免疫された哺乳動物由来のリンパ球（一般に脾細胞）に融合させ、本発明のポリペプチドを結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するために、結果として得られたハイブリドーマ細胞の培養上澄をスクリーニングする。
【００６２】
リンパ球と不死化細胞株を融合させるために使用される多くの周知のプロトコールのいずれも、免疫原に対するモノクローナル抗体を生成するために利用することができる（たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｓｕｐｒａ；Ｇａｌｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２６６：５５０５２（１９７７）；Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；およびＬｅｒｎｅｒ，Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．５４：３８７−４０２（１９８１）参照）。
【００６３】
さらに、一般の当業者は、そのような方法の多くの変形ならびにヒトＢ細胞により産生される抗体を得るために使用することができる他の方法があることを理解するであろう。たとえば、ヒトＢ細胞により発現されるヒト抗体の全部または機能的部分をコード化する配列を、既知の技術を使用してクローニングすることができる。一般に、本手法は、抗原特異的Ｂ細胞の単離（たとえば、蛍光色素標識抗原で染色される、フローサイトメトリーによる選別）および変性プライマーおよび単一細胞ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する抗体遺伝子のＶＤＪ部分の増幅を含む。クローニングされ、配列決定された抗体遺伝子のＶＤＪ部分を定常領域遺伝子セグメントと結合し、ＣＨＯ細胞株等の細胞株で抗体を作る（たとえば、Ｈａｈｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．（２０００），５７（１）：９６−１０５参照）。
【００６４】
非ヒト哺乳動物により産生されるヒト抗体を産生および／または単離する方法のもう１つの例は、ヒトＢ細胞をウイルスにより不死化することを含む。本方法では、たとえば、エプスタイン−バールウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ）（ＥＢＶ）または修飾ＥＢＶを使用してＢ細胞を不死化することができる（たとえば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，Ａ．，Ｃｕｒｒ．ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７）  １８（６）：５２３−５２８参照）。
【００６５】
当業者に理解されるであろうが、サイトカイン類に加えて、成長因子等の蛋白質（たとえば、ヒト蛋白質；ヒト分泌蛋白質）、ステロイド類、および／または小分子の発現を本方法で使用して、血液系細胞以上に、ヒト細胞の再構成および／または機能を改善することができる。たとえば、ヒトサイトカイン類の１つまたは複数のアゴニストを非ヒト哺乳動物に導入して、ＨＳＣの再構成を強化することができる。
【００６６】
当業者に理解されるであろうが、「機能的（または「生物学的に活性な」または「成熟した」）ヒトＮＫ細胞」、「機能的ヒト樹枝状細胞」、「機能的ヒト単球／マクロファージ」、「機能的ヒト赤血球、「機能的ヒトＴ細胞」および「機能的ヒトＢ細胞」は全て、分化した細胞（ヒトＮＫ細胞、ヒト樹枝状細胞、ヒト単球／マクロファージ、ヒト赤血球、ヒトＴ細胞、またはヒトＢ細胞であっても）が、対応する、ヒトで見られる通常の（野生型）細胞の細胞表面マーカーの、１つまたは複数、および場合によっては全部を発現し、そして結果として、それらがヒトで機能するのと同様に非ヒト哺乳動物で機能するということを指す。
【００６７】
非ヒト哺乳動物におけるヒト血液系細胞の機能を測定するための検定法は、当業者に周知であり、また本明細書に記述されている。たとえば、ＮＫ細胞傷害性検定法を使用して、非ヒト哺乳動物におけるＮＫ細胞の機能を測定することができる。
【００６８】
本発明のある態様で、非ヒト哺乳動物におけるヒト血液細胞系統および／またはある特定のヒト細胞系統（たとえば、ＮＫ細胞、樹枝状細胞、単球／マクロファージ、赤血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞）の再構成が強化される。再構成強化は、たとえば、適当なコントロールと比較して強化された細胞型の発現（たとえば、１つまたは複数のヒト血液系細胞数の増加；細胞型が発現される期間の増加（たとえば、＞３０日））を指す。そのようなコントロールは当業者に明白である。適当なコントロールの例は、１つまたは複数のサイトカイン類をコード化する核酸ではなく、ヒトＨＳＣが導入された非ヒト哺乳動物である。
【００６９】
本発明の他の態様は、組成物を含む。一態様で、本発明は、本明細書に記載の方法により作られる非ヒト動物を含む。
【００７０】
他の態様で、本発明は、本明細書に記載の方法により産生されるハイブリドーマ（単離ハイブリドーマ）およびそのハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（単離モノクローナル抗体）を含む。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、「単離された」（たとえば、「単離されたＢ細胞」；「単離されたハイブリドーマ」、「単離されたモノクローナル抗体」）は、それが自然に存在する複雑な（たとえば、細胞の）環境、または器官、身体、組織、血液または培地に関して実質的に単離されていることを指す。場合によっては、単離された材料は、組成物の一部（たとえば、他の物質を含む粗抽出物）、バッファー系、培養系または試薬混合物を形成する。状況が違えば、材料は、本質的に均質になるまで精製することができる。単離されたＢ細胞個体群は、（全細胞数を基準として）存在する全細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％を構成する。一実施態様で、本発明は、本明細書に記載の方法で産生される、単離された、または実質的に単離された（または精製された、本質的に精製された）Ｂ細胞、ハイブリドーマおよび／またはモノクローナル抗体を対象とする。
【００７２】
したがって、本明細書に示す通り、ヒト化マウスで確認されるヒト生来の応答および適応応答が不十分な主な理由は、適切なヒトサイトカイン発現が再構成マウスで欠如しているために、特定のヒト血液系細胞の再構成が低レベル、および／または特定のヒト血液細胞系統が機能的に成熟不良であることに起因する。再構成非ヒト哺乳動物（たとえば、マウス）で様々なヒトサイトカイン類を発現し、また結果として得られる非ヒト哺乳動物におけるヒト血液系細胞の再構成を著しく改善するための、効率よくかつ汎用的な方法を、本明細書に記述する。
【００７３】
非ヒト哺乳動物でヒトサイトカイン類を発現するために、流体力学的注入（たとえば、７秒で体重の１０％）を使用して、ヒトサイトカイン類をコード化するＤＮＡベクターを哺乳動物に導入した。この実施態様で、注入されたＤＮＡの一部が肝細胞によって取り込まれ、マウスでヒトサイトカインが発現する結果となった。ヒトサイトカイン類をコード化する核酸をこのようにして導入することにより、特定のヒト細胞サブセットの発生が向上し、ヒト細胞数および免疫応答の増加がもたらされた。
【００７４】
具体的には、ヒトサイトカイン類を、ベクターにクローニングした。操作したヒトインターロイキン１５（ＩＬ−１５）遺伝子およびＦｍｓ−関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）遺伝子を、個々にｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターにクローニングした。
【００７５】
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミドをインビボ遺伝子送達用ベクターとして使用した。インビボでＮＫ細胞を誘導するために、ｐｃＤＮＡ−ＩＬ２／ＩＬ１５およびｐｃＤＮＡ−Ｆｌｔ３Ｌプラスミドを構築した。簡単に記述すると、ＩＬ−１５のシグナルペプチドは通常長く（４８ａａ）、またＩＬ−１５の分泌を制限するため、ヒトＩＬ−１５のシグナルペプチド配列を、ヒトＩＬ−２のそれで置き換えた。ＩＬ−１５に応答するＮＫ細胞前駆体の発生頻度を高めるために、速効性サイトカインｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）を使用した。これらの２つの組換え遺伝子配列をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターに挿入した。
【００７６】
流体力学に基づく遺伝子導入法で、尾静脈を介して大量の溶液を急速注入することにより、プラスミドをマウスに投与した。簡単に記述すると、８〜１２週齢のヒト化マウスに、各プラスミド５０μｇを含む生理食塩水１．８ｍｌを、７秒以内で静脈注入した。
【００７７】
注入後第７日に、これらのマウスの尾静脈から採血して、主として血中のヒト免疫細胞の再構成を分析した。次いで、数匹のマウスを第９日および第１６日に屠殺して、肝臓、肺、脾臓、骨髄、およびリンパ節におけるヒト細胞再構成の動力学を分析した。血清を異なる時点に採取し、循環血液中のヒトサイトカインレベルをＥＬＩＳＡで分析した。
【００７８】
流体力学的注入後、血清中に有意なレベルのＩＬ−１５およびＦｌｔ３Ｌが２〜３週間検出された。相応して、血中、脾臓、骨髄、肺および肝臓におけるＣＤ５６＋ＣＤ３−ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の再構成は、ヒト器官で確認されるものに匹敵するレベルまで有意に上昇した。ＣＤ４５＋ヒト細胞の絶対数も、全ての器官で増加した。
【００７９】
この方法によってヒト化マウスで生成したＮＫ細胞は、通常のＮＫ細胞表現型を有し、またインビトロでもインビボでも、ｐｏｌｙＩ：ＣおよびＬＰＳ刺激に応答したインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生に関して機能的であった。ヒト化マウスから精製されたＮＫ細胞は、インビトロで、Ｋ５６２標的細胞に対して細胞傷害活性を示した。さらに、ＮＫ細胞は、インビボで、ウイルス感染に応答した。同様の手法を使用して、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を発現することにより樹枝状細胞再構成を強化し、ＭＣＳＦを発現することによりマクロファージおよび単球再構成を強化し、ＥＰＯおよびＩＬ３を発現することによりヒト赤血球再構成を強化した。
【００８０】
裸のＤＮＡの流体力学的注入は、血清中で２〜３週間、ヒトサイトカイン類が検出される結果となった。当業者に明白な通り、ヒト遺伝子はまた、ウイルスベクター（たとえば、アデノウイルス介在性遺伝子発現；レンチウイルス介在性遺伝子発現）によって発現させることもでき、これはマウスで高レベルかつ長期にわたるヒト遺伝子発現をもたらすことができる。
【００８１】
一部の種類のヒト免疫細胞の再構成は、ヒト造血幹細胞移植ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ＩＬ２Ｒγ−／−マウスで非常に低く、これはマウスサイトカイン環境に対する反応性が不十分なためである。免疫細胞発生および成熟に不可欠な多くのサイトカイン類は、ＮＫ細胞に対するＩＬ−１５、ＤＣに対するＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４、およびマクロファージに対するＭ−ＣＳＦ等のような、種特異的活性を示す。有意に高レベルの全身性外因性ヒトサイトカインの発現をもたらし、結果としてヒト化マウスでのヒト免疫細胞発生を促進することになる、裸のサイトカイン発現プラスミドの投与を使用する流体力学に基づくインビボトランスフェクション手順を、本明細書に記述する。
【００８２】
本方法および組成物は、ヒトＨＳＣ由来の血液細胞系統を有する非ヒト哺乳動物を再構成するために使用される現行の方法に優る多数の利点を提供する。たとえば、サイトカインをコード化する核酸は、所望の結果を達成するために、一度導入しさえすればよい；サイトカイン類をコード化する核酸を使用すると、大規模調製がはるかにし易く、はるかに安定して長期保存し易く、またはるかに遺伝子操作し易い；３週間にわたる全身性ヒトサイトカイン発現で、流体力学的に基づく注入を実施することができ、またサイトカインを導入するためにアデノウイルスベクターおよび／またはレンチウイルスベクターを使用して、発現をより長く持続できると思われる；多数の遺伝子構築物を組み合わせることができる（図１７参照）；本方法は、ヒト化マウスでＨＳＣ（たとえば、骨髄性細胞）を再構成するための簡単で効率のよい方法を提供する。
【実施例】
【００８３】
例示
実施例１
ヒトサイトカイン類の発現は、ヒト化マウス（ヒューマウス）における、特定のヒト血液系細胞の再構成を劇的に改善する。
【００８４】
材料と方法
ＨＳＣ単離、ヒト化マウスの構築、および流体力学的遺伝子送達。ヒト臍帯血は、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋから入手した。臍帯血単核細胞（ＭＮＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配により分離した。ＣＤ３４＋細胞は、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（登録商標）システムで、製造業者のプロトコール（（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って精製した。ＣＤ３４＋細胞の純度は＞９５％であった。ＨＳＣを増殖させるために、精製ＣＤ３４＋細胞を、規定の因子の存在下、無血清培地で１１〜１４日間培養した（Ｚｈａｎｇ  ＣＣ，Ｋａｂａ  Ｍ，Ｉｉｚｕｋａ  Ｓ，Ｈｕｙｎｈ  Ｈ，Ｌｏｄｉｓｈ  ＨＦ（２００８）Ｂｌｏｏｄ  １１１：３４１５−３４２３）。非増殖ＨＳＣと増殖ＨＳＣの両方を使用して、ヒト化マウスを作った。
【００８５】
ＮＳＧマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、Ｎａｎｙａｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅの動物施設で、特定病原体不在条件下で維持した。マウスを再構成するために、γ線源を使用して１００ｃＧｙを新生仔（４８時間齢未満）に照射し、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋細胞（１×１０５細胞／レシピエント）を心内注入した。ヒトサイトカイン遺伝子は、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に別々にクローニングした。プラスミドＤＮＡは、Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。流体力学的遺伝子送達のために、１２週齢のヒューマウスに、各プラスミド５０μｇを含む総量１．８ｍｌの生理食塩水を、２７ゲージの針を使用して７秒以内で注入した。試料およびマウスを用いた調査研究は全て、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＳｉｎｇａｐｏｒｅおよびＮａｎｙａｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの施設ガイドラインを順守して実施した。
【００８６】
単一細胞調製、抗体、およびフローサイトメトリー。単一細胞懸濁液は、標準手順により、脾臓および骨髄（ＢＭ）から調製した。ＭＮＣをヒューマウス肝臓から単離するために、肝臓を、２００ゲージのステンレススチールメッシュを押し通し、５０ｘｇで５分間の遠心分離により残屑を除去した。ＭＮＣを含む上澄を回収し、ＰＢＳで洗浄し、４０％Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ）を含むＲＰＭＩ培地１６４０中に再懸濁した。細胞懸濁液を、７０％Ｐｅｒｃｏｌｌの上に静かに重ね、７５０ｘｇで２０分間、遠心分離した。ＭＮＣを相間から回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。ＭＮＣを肺から単離するために、肺を細かく刻み、０．０５％コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）および０．０１％ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ）を含む培地中に懸濁し、３７℃で２０分間インキュベートした。肺試料を、２００ゲージのステンレススチールメッシュを押し通し、上述の通り、Ｐｅｒｃｏｌｌ遠心分離でＭＮＣを単離した。
【００８７】
下記の抗体を使用した：Ｂｅｃｔｏｎ−ＤｉｃｋｓｏｎからのＣＤ３（ＳＫ７）、ＣＤ３４（５８１）、ＣＤ１９（ＨＩＢ１９）、ＮＫＧ２Ｄ（１Ｄ１１）、ＮＫｐ４６（９Ｅ２）、ＣＤ９４（ＤＸ２２）、ＣＤ１６（３Ｇ８）、ＣＤ５６（Ｂ１５９）、ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３）、ＣＤ１４（Ｍ５Ｅ２）、ＣＤ１１ｃ（Ｂ−ｌｙ６）、ＣＤ２０９（ＤＣＮ４６）、ＣＤ７（Ｍ−Ｔ７０１）、ＣＤ４５（２Ｄ１）、ＣＤ６９（Ｌ７８）、ＣＤ３３（ＷＭ５３）；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄからのＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３（ＤＸ２７）、ＩＬＴ７（１７Ｇ１０．２）およびＣＤ２３５ａｂ（ＨＩＲ２）；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏｔｅｃからのＣＤ３０３（ＡＣ１４４）；Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣｏｕｌｔｅｒからのＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ；Ｚ１９９）；およびｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのＣＤ１３３（ＥＭＫ０８）およびマウスＣＤ４５．１（Ａ２０）。細胞を、氷上で、０．２％ＢＳＡおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ  １００μｌ中の適切な抗体で３０分間染色した。フローサイトメトリーは、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用したＬＳＲＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．）で実施した。試料当たり１０，０００〜１，０００，０００の事象を収集し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して解析した。
【００８８】
インビトロでのヒトＣＤ３４＋細胞の分化。ＢＭ  ＭＮＣを１２週齢のヒューマウスから単離した。ＣＤ３４＋細胞を、ＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で濃縮した。精製細胞を、ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＣＳ中、３７℃および５％ＣＯ２で培養した。ＮＫ細胞、ＤＣ、単球／マクロファージ、および赤血球の分化用に、それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＦＬおよび５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１５；５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦおよび５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４；５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦおよび３０ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦ；および１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３および３Ｕ／ｍｌ  ＥＰＯを使用した。サイトカイン類は全て、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【００８９】
ＮＫ細胞細胞傷害性検定および刺激。遺伝子送達の９日後、幹細胞ＰＥ選択キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して正の選択により、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を脾臓およびＢＭから精製した。細胞を洗浄し、２％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ中に再懸濁し、ＮＫ感受性標的Ｋ５６２（ＡＴＣＣ）に対する細胞傷害性を、４時間乳酸デヒドロゲナーゼ放出検定法（ＣｙｔｏＴｏｘ９６；Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。
【００９０】
インビトロ刺激用に、精製ＮＫ細胞を、ヒトＤＣを含む、または含まない、ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、ペニシリン、およびストレプトマイシン中、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間、培養した。ヒトＤＣは、記述の通り、臍帯血ＣＤ３４＋細胞から分化させた（Ｒｏｓｅｎｚｗａｊｇ  Ｍ，Ｃａｎｑｕｅ  Ｂ，Ｇｌｕｃｋｍａｎ  ＪＣ（１９９６）Ｂｌｏｏｄ  ８７：５３５−５４４）。次に、インビトロでＮＫ細胞を刺激するために、５０ｐｇ／ｍｌ  ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（Ｓｉｇｍａ）を培養に添加した。インビボ刺激用に、ヒューマウスにｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）２００μｇを静脈内注入した。血清中または培養上澄中のＩＦＮ−γレベルを、ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。
【００９１】
アデノウイルス感染、ＡＬＴ、および組織学。複製欠損、Ｅ１およびＥ３欠失、タイプ５緑色蛍光蛋白質発現アデノ−Ｘウイルス（ＡｄＧＦＰ）は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した。ＡｄＧＦＰを、ＨＥＫ２９３細胞中で増殖させ、ＣｓＣｌ不連続密度勾配遠心分離により精製した。４×１０９ｐｆｕ  ＡｄＧＦＰウイルスを、流体力学的注入により尾静脈を介してヒューマウスに投与した。アデノウイルス感染の５日後、血清を採取し、コバス（ｃｏｂａｓ）  ｃ  １１１アナライザー（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．）を使用して、ＡＬＴ活性について分析した。
【００９２】
組織学的分析用に、肝臓を摘除し、パラフィン中に包埋して、厚さ５μｍの切片を作製した。パラフィン切片をＨ＆Ｅで染色し、光学顕微鏡で分析した。２色蛍光免疫染色用には、非特異的染色のブロッキング後、脱パラフィン処理切片を、ＰＥ−コンジュゲート抗ヒトＣＤ５６抗体（ＭＥＭ−１８８；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の最適希釈物で染色した。切片を、ＭＩＲＡＸ  ＭＩＤＩ蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で分析した。
【００９３】
統計解析。データを、平均値および平均値の標準誤差として示す。群間差をＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定で解析した。＜０．０５のＰ値を、統計学的有意と考えた。計算は全て、Ｏｒｉｇｉｎ８．０ソフトウェアパッケージを使用して実施した。
【００９４】
結果
インビトロでの、ヒトサイトカイン類によるＮＫ細胞分化の刺激。ヒト化マウスを構築するために、ヒト臍帯血から単離したＣＤ３４＋ＨＳＣを、亜致死照射したＮＳＧ仔に養子移入した。再構成の１２週間後、末梢血由来の単核細胞（ＭＮＣ）を、ヒトＣＤ４５およびマウスＣＤ４５に特異的な抗体で染色した（図６Ａ〜６Ｂ）。平均再構成率は、血液で約５０％であった［再構成率＝％ＣＤ４５＋ヒト細胞／（％ＣＤ４５＋ヒト細胞＋％ＣＤ４５＋マウス細胞）］。ＣＤ４５＋ヒト白血球の中で、ＣＤ１９＋Ｂ細胞のレベルは４０〜８５％の範囲であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞のレベルは１０〜５０％の範囲であった。ＮＫ細胞は、血中、ＢＭ、脾臓、肺、および肝臓で検出されたが、それらの発生頻度は、対応するヒト組織またはマウス組織における発生頻度より有意に低かった（図６Ａ〜６Ｂ参照）。
【００９５】
ヒューマウスにおけるＮＫ細胞再構成不良の根底となる原因を究明するために、我々は、ヒューマウスのＢＭに由来するヒトＣＤ３４＋細胞が、インビトロで、ヒトＩＬ−１５およびＦＬにより刺激されて、ＮＫ細胞に分化するかどうかを試験した。ＦＬは、ＩＬ−１５に応答できるＣＤ３４＋ＮＫ前駆細胞を含む、多様な造血細胞系統の分化を刺激する（Ｙｕ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：３６４７−３６５７）。ＦＬとＩＬ−１５の組合せは、ＣＤ３４＋前駆体の、ＮＫ細胞方向への分化を促進すると予期される。したがって、ヒューマウスＢＭ由来の精製ヒトＣＤ３４＋細胞（＞８０％）（図１Ａ）を、ＦＬおよびＩＬ−１５の存在下で７日間培養し、ＮＫ細胞マーカーＣＤ５６およびＮＫｐ４６の発現について分析した。サイトカイン類の存在下では、細胞の約１１％がＣＤ５６およびＮＫｐ４６の両者について陽性であったが、サイトカイン類の非存在下では非常に少ない細胞が陽性であった（図１Ｂ）。これらの結果から、ヒューマウスのＢＭ中のＣＤ３４＋ヒト細胞は、適切なサイトカイン環境が提供されれば、ＮＫ細胞に分化することができることが示唆される。
【００９６】
プラスミドＤＮＡの流体力学的注入による、マウスにおけるヒトサイトカイン類の発現。ＩＬ−１５およびＦＬの存在下では、インビトロでヒトＮＫ細胞が発生するという知見から、これらのヒトサイトカイン類は、ヒューマウスにおけるＮＫ細胞発生も刺激し得ることが示唆される。ヒトサイトカイン類をマウスに導入する一つの方法は、組換え蛋白質を毎日注入することによる。この方法は厄介で高価なため、我々はサイトカインコード化ＤＮＡプラスミドの流体力学的送達により、マウスで、ヒトサイトカイン類を発現させた。ヒトＩＬ−１５は、異常に長いシグナルペプチド配列を有し（４５ａａ残基）、これは、ＩＬ−１５の分泌不良につながることが知られている（Ｍｅａｚｚａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：１０４９−１０５４）。ＩＬ−１５分泌のレベルを高めるために、我々は、ＩＬ−１５シグナルペプチドがヒトＩＬ−２のシグナルペプチドに置き換えられた、ＩＬ−１５発現ベクターを構築した（図７Ａ〜７Ｂ）。この置換は、血清ＩＬ−１５レベルを約１００倍上昇させた（図７Ｂ）。ＩＬ−１５コード化プラスミド５０μｇの単回流体力学的注入で、高レベルのＩＬ−１５が、注入の１日後に血清中で検出され、有意なレベルが１４日間維持された（図２）。同様に、ＦＬコード化プラスミドの単回注入は、ＦＬが血清で２１日間発現するという結果をもたらした。したがって、サイトカイン遺伝子の流体力学的送達は、マウスでヒトサイトカイン類を導入するための簡単で効率のよい方法である。
【００９７】
ＩＬ−１５およびＦＬ遺伝子送達後のヒトＮＫ細胞の再構成強化。ＩＬ−１５およびＦＬ発現がＮＫ細胞発生に及ぼす影響を測定するために、遺伝子送達の９日後に、ヒューマウスの様々な器官におけるＮＫ細胞再構成についてフローサイトメトリーで分析した。空のｐｃＤＮＡベクターまたはＦＬコード化ベクターの注入は、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の発生頻度に有意な影響を及ぼさなかった（図３Ａ）。しかし、ＩＬ−１５の発現は、血中、脾臓、ＢＭ、肺、および肝臓におけるＣＤ５６＋ＮＫ細胞の発生頻度を有意に増加させた（図３Ａおよび３Ｂ）。ＮＫ細胞の発生頻度の増加は、ＩＬ−１５とＦＬの両者がヒューマウスで発現されたとき、さらに劇的であり、通常のヒト末梢血（白血球の５％〜２１％）（Ｍａｕｒｉｃｅ  ＲＧ，Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ  ＡＤＤ（２００８）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ））および通常のマウス組織（Ｚｈａｎｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２７１−２８０）で確認されるレベルに達した。ＮＫ細胞の発生頻度上昇に対応して、ＮＫ細胞の絶対数が脾臓およびＢＭで著しく増加した（図Ｓ３Ｂ）。さらに、血中でのＣＤ５６＋ＮＫ細胞の高い発生頻度は、遺伝子送達後少なくとも３０日間維持された（図３Ｃ）。加えて、サイトカイン誘導性ＮＫ細胞は、活性化受容体ＮＫＧ２Ｄ、抑制性受容体ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９４、およびＫＩＲ、細胞傷害誘発受容体ＮＫｐ４６、ＮＫ細胞マーカーＣＤ７、早期活性化マーカーＣＤ６９、およびＦＣ受容体ＣＤ１６を含め、ＮＫ細胞機能に重要であることが知られている細胞表面受容体の多くを発現した（図９）。これらの結果から、サイトカイン誘導性ＮＫ細胞は通常のＮＫ細胞の特徴的な表面表現型を示すことが分かる。
【００９８】
ＮＫ細胞発生の刺激に加えて、ＦＬとＩＬ−１５の両者は、他の造血細胞系統にも効果を発揮することが知られている（Ｄｉｅｎｅｒ  ＫＲ，Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ＬＭ，Ｌｙｏｎｓ  ＡＢ，Ｂｒｏｗｎ  ＭＰ，Ｈａｙｂａｌｌ  ＪＤ（２００８）Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ３６：５１−６０；Ｄｏｎｇ  Ｊ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ＣＭ，Ｓｔａｍｂｒｏｏｋ  ＰＪ（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １：４８６−４８９；Ｂｌｏｍ  Ｂ，Ｈｏ  Ｓ，Ａｎｔｏｎｅｎｋｏ  Ｓ，Ｌｉｕ  ＹＪ（２０００）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１７８５−１７９６；Ａｒｍｉｔａｇｅ  ＲＪ，Ｍａｃｄｕｆｆ  ＢＭ，Ｅｉｓｅｎｍａｎ  Ｊ，Ｐａｘｔｏｎ  Ｒ，Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ  ＫＨ（１９９５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５４：４８３−４９０）。したがって、ヒューマウスの脾臓、ＢＭ、肺、および肝臓由来の細胞を列挙し、フローサイトメトリーで分析した。ＩＬ−１５およびＦＬの発現はまた、脾臓およびＢＭにおけるＣＤ１４＋単球／マクロファージ、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１ｃ＋骨髄性樹枝状細胞、ＩＬＴ７＋ＣＤ３０３＋形質細胞様樹状細胞、およびＣＤ１９＋Ｂ細胞の有意な増加も誘導した（図８Ａ〜８Ｇ参照）。これらの結果は、ヒトＩＬ−１５およびＦＬの発現が、ヒト化マウスにおけるＮＫ細胞ならびに他の骨髄性細胞およびリンパ球系細胞の再構成を劇的に改善することを示す。
【００９９】
サイトカイン誘導性ＮＫ細胞は機能的である。我々は、サイトカイン誘導性ヒトＮＫ細胞が機能的である（すなわち、標的細胞を死滅させることができ、また適切な刺激後にＩＦＮ−γを発現できる）かどうかを調査研究した。ＣＤ５６＋ＮＫ細胞は、ＩＬ−１５およびＦＬ処理マウスのＢＭおよび脾臓から精製した。ＭＨＣクラスＩ欠損標的細胞Ｋ５６２と混合したとき、添加したＮＫ細胞が増加するにつれて、高レベルの標的細胞溶解が確認された（図１０Ａ）。ＮＫ細胞を刺激して炎症性サイトカイン類を産生させることが知られている、Ｔｏｌｌ様受容体３アゴニストｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＫＮ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：１３８−１４３）で精製ＮＫ細胞を刺激したとき、ＩＦＮ−γが培養上澄で検出された（図１０Ｂ）。ヒトＤＣの存在下で、ＩＦＮ−γ分泌レベルはさらに上昇した。ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をヒト化マウスに注入したとき、サイトカインコード化ＤＮＡを注入したヒューマウスの血清で、非注入ヒューマウスと比較して有意に高いレベルのＩＦＮ−γが検出された（図１０Ｃ）。
【０１００】
我々はまた、ＮＫ細胞依存性肝損傷を引き起こすことが知られているアデノウイルス（Ｃｈｅｎ  Ｑ，Ｗｅｉ  Ｈ，Ｓｕｎ  Ｒ，Ｚｈａｎｇ  Ｊ，Ｔｉａｎ  Ｚ（２００８）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４７：６４８−６５８）を、ヒューマウスに投与した。サイトカイン遺伝子送達の９日後、複製欠損アデノウイルスをヒューマウスに静脈内注入した。３日後、肝臓を採取し、Ｈ＆Ｅで染色した。大量の白血球浸潤および広域の壊死が、ＩＬ−１５およびＦＬ処理したアデノウイルス感染ヒューマウスの肝臓で確認された。しかし、未処理のアデノウイルス感染ヒューマウスは、軽度の細胞浸潤および損傷を示しただけであった（図４Ａ）。相応して、ＩＬ−１５およびＦＬ処理したアデノウイルス感染ヒューマウスで、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルが有意に上昇していた（図４Ｂ）。この上昇は、肝臓における、血清ＩＦＮ−γレベルの約４倍の増加（図４Ｃ）および、浸潤性ヒト白血球の約５倍の増加（図４Ｄ）と相関性があった。肝薄片の免疫組織化学分析は、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の病変内局在化を裏付けた（図４Ｅ）。これらの結果から、サイトカイン誘導性ヒトＮＫ細胞は機能的であることが強く示唆される。
【０１０１】
他のヒト血液細胞系統の再構成の改善。我々は、サイトカイン遺伝子送達が、ヒューマウスにおける特定のヒト血液細胞系統の再構成を改善するための一般的方法として使用できるかどうかを試験した。培養で、ヒューマウスのＢＭから精製したヒトＣＤ３４＋細胞を、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で刺激してＣＤ１１ｃ＋ＣＤ２０９＋ＤＣに、Ｍ−ＣＳＦで刺激してＣＤ１４＋単球／マクロファージに、またＥＰＯおよびＩＬ−３で刺激してＣＤ２３５ａｂ＋赤血球に、分化させた（図１１）。インビボで、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、およびＦＬを発現するＤＮＡベクターをヒューマウスに流体力学的に送達することにより、血中、脾臓、ＢＭ、肺、および肝臓でＤ１１ｃ＋ＣＤ２０９＋ＤＣの発生頻度が著しく増加する結果となった（図５Ａ）。同様に、Ｍ−ＣＳＦの発現は、リンパ器官と非リンパ器官の両者におけるＣＤ１４＋単球／マクロファージの再構成の改善へと導いた（図５Ｂ）。ＥＰＯおよびＩＬ−３の発現は、血中でのＣＤ２３５ａｂ＋ヒト赤血球の出現をもたらし（図５Ｃ）、全赤血球の３〜５％に達した。したがって、ＤＮＡプラスミドの流体力学的注入によるサイトカイン遺伝子発現は、ヒューマウスにおける特定のヒト血液細胞系統の再構成を改善するための一般的で効率のよい方法である。
【０１０２】
考察
ＮＫ細胞および骨髄性細胞の再構成は、ＮＳＧまたはＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ２−／−Ｉｌ２ｒｇ−／−マウスをレシピエントとして使用するヒト化マウスモデルでは、一般に不十分である。ＢＬＴマウスで、ＤＣおよび単球／マクロファージがかなり再構成されるにも拘わらず、ヒトＮＫ細胞およびＲＢＣは存在しない。ＮＫ細胞または様々な骨髄性細胞の発生および維持に必要な、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、Ｍ−ＣＳＦ、およびＩＬ−３を含む多くのサイトカイン類は、ヒトとマウスとの間で有意な配列分散を示すことが分かった。以前の研究は、これらのネズミサイトカイン類が、適切なヒト細胞型に殆ど影響しないことを証明していた。これらのサイトカイン類は、主として非造血細胞によって産生されるため、これらのヒトサイトカイン類の欠如によって、ヒューマウスにおけるＮＫ細胞および骨髄性細胞の再構成不良を説明し得るであろう。
【０１０３】
この解釈を裏付けるために、ヒューマウスのＢＭから単離されたヒトＣＤ３４＋前駆細胞を刺激して、インビトロで、ＮＫ細胞、ＤＣ、単球／マクロファージ、および赤血球に分化できることを示した。サイトカインコード化プラスミドＤＮＡの流体力学的送達により、ヒト化マウスで適切なヒトサイトカイン類が導入されるとき、有意に高いレベルのＮＫ細胞、ＤＣ、単球／マクロファージ、および赤血球が誘導される。サイトカイン類の血清レベルが低下するにつれて、再構成レベルも低下する。したがって、ヒューマウスにおけるＮＫ細胞および骨髄性細胞の再構成不良は、それらの分化および維持に通常必要な適切なヒトサイトカイン類が欠如した結果である。適切なサイトカイン類の導入は、ヒューマウスにおけるこれらのヒト血液細胞系統の再構成レベルの劇的な上昇につながる。
【０１０４】
流体力学的遺伝子送達は、マウスで、高レベルの、一過性の肝および全身性導入遺伝子発現を生じさせるために広く使用される（Ｓｕｄａ  Ｔ，ＬｉｕＤ（２００７）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １５：２０６３−２０６９）。本方法は、短時間（６〜８秒）で、大量（体重の１０％）のＤＮＡの尾静脈注入を含む。流体力学的圧力は、肝臓損傷を引き起こし、肝細胞によるＤＮＡの取り込みにつながる（Ｓｕｄａ  Ｔ，Ｌｉｕ  Ｄ（２００７）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １５：２０６３−２０６９）。転写および翻訳の後、サイトカイン類が循環内に分泌されて、ＢＭまたは他の器官の標的細胞に到達することができる。したがって、サイトカインコード化ＤＮＡの単回注入で、ＩＬ−１５は血清中で２週間にわたって検出され、ＦＬは３週間にわたって検出された。ＩＬ−１５とＦＬとの血清持続期間の差は、恐らく蛋白質の半減期の差のためであるか、またはＩＬ−１５が通常はＩＬ−１５Ｒａ鎖を介して細胞表面上に結合されているためである（Ｍｏｒｔｉｅｒ  Ｅ，Ｗｏｏ  Ｔ，Ａｄｖｉｎｃｕｌａ  Ｒ，Ｇｏｚａｌｏ  Ｓ，Ｍａ  Ａ（２００８）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０５：１２１３−１２２５）。単回のＤＮＡ注入によって産生されるＩＬ−１５およびＦＬの量は、少なくとも３０日間、ＮＫ細胞レベルの著しい上昇を誘導するのに明らかに十分である。サイトカイン類が循環中でもはや検出されなかったとき、ＮＫ細胞が存続することは、サイトカイン類の重要な役割が、分化の初期段階に発揮されることを示す。ＮＫ細胞は、いったん生成すると、サイトカイン類が循環で検出できなくなった後も、長時間にわたって生存することができる。ＮＫ細胞は、多様な血液細胞系統に影響を及ぼすため、ＦＬおよびＩＬ−１５の発現はまた、脾臓およびＢＭでの、単球／マクロファージ、ＤＣ、およびＢ細胞のレベル上昇をもたらすが、Ｔ細胞のレベル上昇はもたらさない。さらに、流体力学的遺伝子送達による適切なサイトカイン類の発現はまた、ＤＣ、単球／マクロファージ、および赤血球を含む、特定の骨髄系細胞の再構成を著しく強化し、本手法の汎用性を示す。ヒトサイトカイン遺伝子送達の７日後に明白になる、ＮＫ細胞、ＤＣおよび単球／マクロファージの改善した再構成と比較して、赤血球の改善した再構成は、サイトカイン遺伝子送達の３０日後までピークレベルに到達しなかった。これは、一方ではヒトＷＢＣとマウスＷＢＣの比率の差によって説明でき、また他方ではヒトＲＢＣとマウスＲＢＣの比率の差によって説明できる。マウスＲＢＣは大量なため、類似したパーセンテージに到達するために十分な数のヒトＲＢＣを産生するには長時間を要する。以前に、２つのグループが、組換えヒトＩＬ−１５をＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスまたはＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ２−／−Ｉｌ２ｒｇ−／−マウスに注入することによって強化されたＮＫ細胞発生について報告した（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ  ＮＤ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０６：２５−３４；Ｋａｌｂｅｒｅｒ  ＣＰ，Ｓｉｅｇｌｅｒ  Ｕ，Ｗｏｄｎａｒ−Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ  Ａ（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：１２７−１３５）。厄介で高価な、毎日のサイトカイン注入と比較して、流体力学的遺伝子送達によるサイトカイン遺伝子の発現は、単回注入で、３０日間以上にわたって特定の血液細胞系統の再構成上昇をもたらすため、手頃で、簡単、かつ効率のよい方法である。
【０１０５】
サイトカイン誘導性ＮＫ細胞は、通常の表面表現型および機能を示す。ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスで、毎日の組換えＩＬ−１５の注入後にヒトＮＫ細胞が生成された、以前の観察結果と対照的に、この細胞はＮＫｐ４６を発現したが、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ａは発現しなかった（Ｋａｌｂｅｒｅｒ  ＣＰ，Ｓｉｅｇｌｅｒ  Ｕ，Ｗｏｄｎａｒ−Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ  Ａ（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：１２７−１３５）。本研究で、サイトカイン誘導性ヒトＮＫ細胞は、活性化受容体ＮＫＧ２Ｄ、抑制性受容体ＮＫＧ２ＡおよびＫＩＲ、ならびに細胞傷害誘発受容体ＮＫｐ４６を含む、ＮＫ受容体の３つの主要なファミリー全てを発現した。一貫して、サイトカイン誘導性ＮＫ細胞は、インビトロでもインビボでも、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激のすぐ後で、ＭＨＣクラスＩ−欠損標的細胞を溶解することができ、またＩＦＮ−γを分泌することができる。さらに、ＩＬ−１５およびＦＬ処理ヒューマウスにおける、広範囲の肝臓壊死および高レベルの血清ＡＬＴで示されるように、サイトカイン誘導性ＮＫ細胞は、アデノウイルス感染に対する強い反応を開始することができる。ＩＦＮ−γ分泌により肝炎を仲介する、マウスにおける野生型ＮＫ細胞（Ｃｈｅｎ  Ｑ，Ｗｅｉ  Ｈ，Ｓｕｎ  Ｒ，Ｚｈａｎ  ｇＪ，Ｔｉａｎ  Ｚ（２００８）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４７：６４８−６５８；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒ  ＣＭ，Ｃｌａｒｋ  ＡＥ，Ｔｒｅｕｔｉｎｇ  ＰＭ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＣＤ，Ａｄｅｒｅｍ  Ａ（２００８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５：２５４４−２５４９）と同様、ＩＬ−１５およびＦＬ処理アデノウイルス感染ヒューマウスの血清ＩＦＮ−γレベルは有意に上昇していた。これらの結果から、サイトカイン誘導性ＮＫ細胞は、表面表現型でも機能でも、正常であることが示唆される。
【０１０６】
実施例２
ヒトサイトカイン類の発現は、ヒト化マウスにおけるヒトＴ細胞およびＢ細胞の再構成および機能を改善する。
ヒトＴ細胞およびＢ細胞の再構成は、ヒト化マウスで妥当であるが、最適な機能を示さない。たとえば、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞反応は、ウイルス投与後に検出されてきたが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の機能は異常である；ヒト化マウスで、ヒトＢ細胞介在性抗体反応は存在しない。本明細書に示す通り、ヒトＴ細胞およびＢ細胞応答の異常はまた、マウスにおける、マウスサイトカイン類とヒト細胞との間の不十分な交差反応にも起因する。ヒトＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４コード化プラスミドのヒューマウスへの注入が、Ｔ細胞に対する主要抗原提示細胞であると考えられる、ヒトＣＤ２０９＋樹枝状細胞の再構成改善に導いたことを、本明細書に示す。さらに、ＩＬ−４は、ヒトＢ細胞における細胞増殖、生存、ならびにＩｇＧおよびＩｇＥへの免疫グロブリンクラススイッチ、ならびにナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞によるＴｈ２表現型の獲得を促進することも証明された。トキソイド（ＴＴ）ワクチンを使用して、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４処理ヒューマウスを免疫し、これらのマウスがＴＴ特異的抗体応答を引き起こすかどうかを決定した。
【０１０７】
本明細書に記載の通り、類似したヒト白血球再構成（５０〜８０％）を有する１２週齢のヒト化マウスに、ヒトＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４をコード化するプラスミドまたは空のｐｃＤＮＡベクター（ベクター）を、流体力学的に注入した。７日後、これらのマウスに、破傷風トキソイド（ＴＴ）を、３週間の投与間隔で３回免疫した（図１２Ａ）。第３回の免疫の２週間後に、脾臓および血清を採取した。図１２Ｂは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４処理マウスからの脾臓は、ベクター処理マウスと比較して、有意に拡張したことを示す。相応して、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４処理マウスの脾臓で、ヒト単核細胞（ＭＮＣ）の劇的な増殖（約２０倍）が認められた（図１２Ｃ）。脾臓におけるヒトＢ細胞およびＴ細胞の細胞表面表現型別の結果から、ヒトＢ細胞は、サイトカイン処理および免疫の全過程を通して通常のヒト特性と同一である成熟した抗体産生期（ＣＤ１９ｌｏｗＣＤ２０−）まで成長した（図１３）；が、ヒトＴ細胞は、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ４０Ｌの発現を上方制御することにより活性化されることも分かった（図１４）。
【０１０８】
免疫した、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４処理マウス由来の血清中のヒトＩｇＧおよびＩｇＭ総レベルは、それぞれ、１．３ｍｇおよび１４０μｇという高値に達し（図１５Ａ，１５Ｂ）、ヒトでのレベル（それぞれ４ｍｇおよび１ｍｇ）に類似していた。最も重要なことは、抗原特異的ヒト抗体応答が、ヒューマウスで初めて首尾よく実証されたことである。ヒトＴＴ特異的ＩｇＧはベクター処理マウスで検出できなかったが、サイトカイン類処理マウスでは、０．１６ＩＵ／ｍｌという平均値に達した（図１５Ｃ）。免疫化後、ヒトで、０．１ＩＵ／ｍｌという抗破傷風トキソイド抗体は、個体を感染から守るのに十分である。さらに、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４処理マウスにおけるヒトＴ細胞応答も、ＴＴ抗原に対して特異性を示した（図１６Ａ〜１６Ｂ）。破傷風毒素ペプチド（８３０−８４３）を使用して、脾臓Ｔ細胞を刺激した。ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４処理マウス由来のＴ細胞は、ベクター処理マウス由来の細胞と比較して、ＴＴ特異的刺激後に、有意レベルのヒトＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を産生することができた。
【０１０９】
本明細書に記載の方法を使用して、有意レベルのヒト抗原特異的抗体応答を、マウスで実証することができた。したがって、本明細書に記載の方法は、ワクチン類を試験するため、および治療目的のヒト抗体を産生するための、有用な基盤を提供する。
【０１１０】
【表１】
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【０１１１】
【表２】
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【０１１２】
【表３】
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【０１１３】
全ての特許、公開された出願および本明細書に引用された参考文献の教示は、参照によりその全体を援用する。
【０１１４】
本発明は具体的に示され、またその例示的な実施態様を参照しながら記述されているが、添付の請求の範囲に含まれる本発明の範囲から逸脱せずに、形状および詳細の様々な変更を加えられることを、当業者は理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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