(57)【要約】本発明は、クラミジア感染の処置、予防および／または診断において使用するためのクラミジア抗原の同定を提供する。特に、本発明は、クラミジア感染の処置、予防または診断のための、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原ＣＴ７３３、ＣＴ１  ５３、ＣＴ６０１、ＣＴ２７９、ＣＴ４４３、ＣＴ３７２、ＣＴ４５６、ＣＴ３８１、ＣＴ２５５、ＣＴ３４１、ＣＴ７１６、ＣＴ７４５、ＣＴ３８７、ＣＴ８１２、ＣＴ８６９、ＣＴ１６６、ＣＴ１７５、ＣＴ１６３、ＣＴ２１４、ＣＴ７２１、ＣＴ１２７、ＣＴ０４３、ＣＴ８２３および／またはＣＴ６００を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療または診断において使用するための、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号１３６または配列番号１４０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質に対して５０％以上の配列同一性を有する、タンパク質。
【請求項３】
請求項１または請求項２のアミノ酸配列の断片を含む、タンパク質。
【請求項４】
前記断片が、請求項１または請求項２のアミノ酸配列の少なくとも８つの連続したアミノ酸を含む、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
治療または診断において使用するための、請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質に結合する抗体。
【請求項６】
治療または診断において使用するための、請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質または抗体をコードする核酸分子。
【請求項７】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号１３５または配列番号１３９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３または配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号１３５または配列番号１３９のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列の断片を含む、核酸分子。
【請求項９】
請求項６から８のいずれか一項に記載の核酸分子に対して相補性を示すヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１０】
請求項６から９のいずれか一項に記載の核酸分子に対して５０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１１】
請求項６から１０のいずれか一項に記載の核酸分子に高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることができる、核酸分子。
【請求項１２】
治療または診断において使用するための、請求項６から１１のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１３】
治療または診断において使用するための、請求項６から１２のいずれか一項に記載の核酸またはベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
治療または診断において使用するための、前述の請求項のいずれかに記載のタンパク質、抗体、核酸分子、ベクターまたは宿主細胞を含む組成物。
【請求項１５】
ワクチン組成物として使用するための、前述の請求項のいずれかに記載のタンパク質、抗体、核酸、ベクター、宿主細胞または組成物。
【請求項１６】
医薬品として使用するための、前述の請求項のいずれかに記載のタンパク質、抗体、核酸、ベクター、宿主細胞または組成物。
【請求項１７】
クラミジアの処置、予防または診断において使用するための、前述の請求項のいずれかに記載のタンパク質、抗体、核酸、ベクター、宿主細胞または組成物。
【請求項１８】
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの処置、予防または診断において使用するための、請求項１７に記載のタンパク質、抗体、核酸、ベクター、宿主細胞または組成物。
【請求項１９】
哺乳動物において免疫応答を生じさせるための、前述の請求項のいずれかに記載のタンパク質、抗体、核酸、ベクター、宿主細胞または組成物。
【請求項２０】
クラミジア感染を中和することができる抗体を誘発するための、前述の請求項のいずれかに記載のタンパク質、抗体、核酸、ベクター、宿主細胞または組成物。
【請求項２１】
前記免疫応答が、ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞媒介型応答である、請求項１から１９のいずれか一項に記載のタンパク質または核酸。
【請求項２２】
クラミジア細菌、特にＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに起因する感染の処置または予防のための薬物の製造における、請求項１から１３のいずれか一項に記載のタンパク質、抗体、核酸、ベクターまたは宿主細胞の使用。
【請求項２３】
患者のクラミジアを処置、予防または診断する方法であって、前述の請求項のいずれかに記載のタンパク質、抗体、核酸、ベクター、宿主細胞または組成物の治療有効量を投与するステップを含む、方法。
【請求項２４】
１つもしくは複数の追加のクラミジア抗原またはそれらをコードする核酸と組み合わせて薬物として使用するための、前述の請求項のいずれかに記載のタンパク質、抗体、核酸、ベクター、宿主細胞または組成物。
【請求項２５】
前記組合せが、ＣＴ２７９＋ＣＴ６０１、ＣＴ３７２＋ＣＴ４４３、ＣＴ７３３＋ＣＴ１５３、ＣＴ４５６＋ＣＴ３８１、ＣＴ２７９＋ＣＴ１５３＋ＣＴ７３３＋ＣＴ６０１、ＣＴ２７９＋ＣＴ６０１＋ＣＴ３７２＋ＣＴ４４３、ＣＴ８２３＋ＣＴ７３３＋ＣＴ０４３＋ＣＴ４５６、ＣＴ３８７＋ＣＴ８１２＋ＣＴ８６９、ＣＴ３８７＋ＣＴ８１２Ｃ＋ＣＴ８６９（またはそれらの改変体）を含む、請求項２４に記載のタンパク質、抗体、核酸、ベクター、宿主細胞または組成物。
【請求項２６】
請求項２４または請求項２５に記載のタンパク質、抗体、核酸、ベクター、宿主細胞または組成物であって、前記タンパク質、抗体、核酸、ベクター、宿主細胞または組成物および前記１つもしくは複数の追加のクラミジア抗原、またはそれらをコードする核酸が、同時、別個または順次の投与ための組合せ調製物である、タンパク質、抗体、核酸、ベクター、宿主細胞または組成物。
【請求項２７】
（ａ）請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質に対する抗体を生じさせるステップと、
（ｂ）抗体−抗原の複合体を形成させるのに適した条件下で、ステップ（ａ）の抗体を、クラミジアに感染していることが疑われる生物学的試料と接触させるステップと、
（ｃ）前記複合体を検出するステップであって、前記複合体の検出はクラミジア感染を示す、ステップと
を含む、クラミジア感染を診断するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｈｏｍａｔｉｓタンパク質およびそれらの使用の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
ワクチンの開発がＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染の制御に必須であることが特定されている。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに対するワクチンは、生殖管粘膜においてＴ細胞および／またはＢ細胞の防御免疫を誘発するようである。
【０００３】
Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに対する防御免疫は、Ｔｈ１偏向性細胞媒介型免疫応答、特に、ＩＦＮγを分泌するＣＤ４＋リンパ球に依存するようである。例えば、マウスにおいてＣＤ４＋Ｔ細胞が枯渇すると、防御免疫の喪失が生じ、クラミジアに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の養子移入は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓによるチャレンジに対する防御をもたらす。さらに、最近の研究により、マウスにおけるＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染が、ＣＤ４−Ｔｈ１防御免疫応答を誘導することが報告されており、このことは、重要な意味をもつクラミジア抗原が、ＭＨＣクラスＩＩ経路を介してプロセシングされ、提示されることを示している（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００４】
Ｂ細胞および抗体が、一次感染の消散において決定的な役割を果たすわけではないが、これらのＢ細胞および抗体は、防御的なエフェクターＴ細胞応答を増強するのに重要であり、再感染を、種々の機構、例として、抗体媒介型の中和およびオプソニン化を用いて制御するのに必要であると思われる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｒｕｎｈａｍ  ＲＣおよびＲｅｙ−Ｌａｄｉｎｏ  Ｊ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００５年）５巻：１４９〜１６１１頁
【非特許文献２】Ｓｕ  ＨおよびＣａｌｄｗｅｌｌ  ＨＤ、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ（１９９５年）６３巻：３３０２〜３３０８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＣＤ４＋Ｔ細胞の標的であり、Ｂ細胞応答を誘導することができるＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質による免疫化によって、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染に対する免疫防御が媒介されると思われることから、そのようなタンパク質の同定が、特に重要である。したがって、本発明の目的は、クラミジアワクチンにおいて使用するためのさらなる抗原を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の開示）
本発明は、クラミジア感染の処置、予防および／または診断において使用するためのクラミジア抗原の同定を提供する。特に、本発明は、クラミジア感染（特に、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染）の処置、予防または診断のための、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の以下の抗原のうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個）を提供する：ＣＴ７３３、ＣＴ１５３、ＣＴ６０１、ＣＴ２７９、ＣＴ４４３、ＣＴ３７２、ＣＴ４５６、ＣＴ３８１、ＣＴ２５５、ＣＴ３４１、ＣＴ７１６、ＣＴ７４５、ＣＴ８１２、ＣＴ８６９、ＣＴ３８７、ＣＴ１６６、ＣＴ１７５、ＣＴ１６３、ＣＴ２１４、ＣＴ７２１、ＣＴ１２７、ＣＴ０４３、ＣＴ８２３、ＣＴ６００、ＣＴ７１１、ＣＴ１１４、ＣＴ４８０、ＣＴ０８９、ＣＴ７３４およびＣＴ０１６、例えば、ＣＴ７３３、ＣＴ１５３、ＣＴ６０１、ＣＴ２７９、ＣＴ４４３、ＣＴ３７２、ＣＴ４５６、ＣＴ３８１、ＣＴ２５５、ＣＴ３４１、ＣＴ７１６およびＣＴ７４５のうちの１つまたは複数。
【０００８】
特に、本発明は、クラミジア感染（特に、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染）の処置、予防および／または診断において使用するためのタンパク質を提供する。これらのタンパク質による免疫化は、好ましくは、クラミジアに対して特異的なＣＤ４＋Ｔｈ１細胞媒介型応答を誘導することができる。
【０００９】
一実施形態では、このタンパク質の核酸配列および／またはアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１および配列番号２に示す配列を含む。また、このタンパク質は、「ＣＴ７３３」としても公知であり、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の仮定上のタンパク質とアノテート（ａｎｎｏｔａｔｅ）されている。別の実施形態では、このタンパク質の核酸配列および／またはアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号３および配列番号４に示す配列を含む。また、このタンパク質は、「ＣＴ１５３」としても公知であり、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来のＭＡＣＰＦ／細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）／パーフォリンとアノテートされている。別の実施形態では、このタンパク質の核酸配列および／またはアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号５および配列番号６に示す配列を含む。また、このタンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の「ＣＴ６０１」としても公知である。別の実施形態では、このタンパク質の核酸配列および／またはアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号７および配列番号８に示す配列を含む。また、このタンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の「ＣＴ２７９」としても公知である。別の実施形態では、このタンパク質の核酸配列および／またはアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号９および配列番号１０に示す配列を含む。また、このタンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の「ＣＴ４４３」としても公知である。別の実施形態では、このタンパク質の核酸配列および／またはアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１１および配列番号１２に示す配列を含む。また、このタンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の「ＣＴ３７２」としても公知である。別の実施形態では、このタンパク質の核酸配列および／またはアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１３および配列番号１４に示す配列を含む。また、このタンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の「ＣＴ４５６」としても公知である。別の実施形態では、このタンパク質の核酸配列および／またはアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１５および配列番号１６に示す配列を含む。また、このタンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の「ＣＴ３８１」としても公知である。別の実施形態では、このタンパク質の核酸配列および／またはアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号３９および配列番号４０に示す配列を含む。また、このタンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の「ＣＴ２５５」としても公知である。別の実施形態では、このタンパク質の核酸配列および／またはアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４１および配列番号４２に示す配列を含む。また、このタンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の「ＣＴ３４１」としても公知である。別の実施形態では、このタンパク質の核酸配列および／またはアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４３および配列番号４４に示す配列を含む。また、このタンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の「ＣＴ７１６」としても公知である。別の実施形態では、このタンパク質の核酸配列および／またはアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４５および配列番号４６に示す配列を含む。また、このタンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の「ＣＴ７４５」としても公知である。別の実施形態では、このタンパク質の核酸配列および／またはアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４７および配列番号４８に示す配列を含む。また、このタンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の「ＣＴ３８７」としても公知であり、仮定上のタンパク質とアノテートされている。別の実施形態では、このタンパク質の核酸配列および／またはアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４９および配列番号５０に示す配列を含む。また、このタンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の「ＣＴ８１２」としても公知であり、多型性外膜タンパク質とアノテートされている。別の実施形態では、このタンパク質の核酸配列および／またはアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号５１および配列番号５２に示す配列を含む。また、このタンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の「ＣＴ８６９」としても公知であり、多型性外膜タンパク質とアノテートされている。別の実施形態では、このタンパク質の核酸配列および／またはアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号５３および配列番号５４に示す配列を含む。また、このタンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の「ＣＴ１６６」としても公知である。別の実施形態では、このタンパク質の核酸配列および／またはアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号５５および配列番号５６に示す配列を含む。また、このタンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の「ＣＴ１７５」としても公知である。別の実施形態では、このタンパク質の核酸配列および／またはアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１５５および配列番号１５６に示す配列を含む。また、このタンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の「ＣＴ１６３」としても公知である。別の実施形態では、このタンパク質の核酸配列および／またはアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１５９および配列番号１６０に示す配列を含む。また、このタンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の「ＣＴ２１４」としても公知である。別の実施形態では、このタンパク質の核酸配列および／またはアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１６３および配列番号１６４に示す配列を含む。また、このタンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の「ＣＴ７２１」としても公知である。別の実施形態では、このタンパク質の核酸配列および／またはアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１６７および配列番号１６８に示す配列を含む。また、このタンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の「ＣＴ１２７」としても公知である。
【００１０】
いくつかの実施形態では、このタンパク質は、上記のタンパク質の改変体である。例えば、このタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、１３６、１４０、１５６、１６０、１６４または１６８の配列、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、４０、４２、４４または４６の配列中に、１つまたは複数の変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以上の変異）を含むことができる。本発明のタンパク質が野生型クラミジアタンパク質に対する免疫応答を誘発する能力を保持するような、好ましい変異は、このタンパク質中に顕著なコンフォメーション変化を引き起こさない変異である。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６に示す配列を有するタンパク質は、野生型タンパク質である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の変異が、このタンパク質のＮ末端部分、例えば、このタンパク質の残基１と残基２０との間、このタンパク質の残基２１と残基４０との間、残基４１と残基６０との間、残基１と残基６０との間、または残基１と残基４０との間に存在する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の変異が、このタンパク質のＣ末端部分中、例えば、このタンパク質のＣ末端の２０残基の間、このタンパク質のＣ末端からの残基２１と残基４０との間、Ｃ末端からの残基４１と残基６０との間；Ｃ末端からの残基１と残基６０との間、またはＣ末端からの残基１と残基４０との間に存在する。
【００１２】
好ましくは、これらのアミノ酸配列は、２０個未満（例えば、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ）の変異を含有する。それぞれの変異には、好ましくは、単一のアミノ酸が関与し、それぞれの変異は、好ましくは、点変異である。これらの変異はそれぞれ独立に、置換、挿入または欠失であり得る。好ましい変異は、単一のアミノ酸の置換である。また、これらのタンパク質は、クラミジア配列と比べて、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ等）の単一のアミノ酸の欠失も含むことができる。また、これらのタンパク質は、クラミジア配列と比べて、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ等）の挿入（例えば、１、２、３、４または５つ以上のアミノ酸のいずれか）も含むことができる。欠失、置換または挿入は、Ｎ末端および／もしくはＣ末端においてであってもよく、またはそれら２つの末端の間においてであってもよい。したがって、切断は、欠失の例である。切断には、Ｎ末端および／またはＣ末端における最大４０個（またはそれ以上）のアミノ酸（例えば、１〜１０、１１〜４０、４１〜７０または７１〜１００個以上のアミノ酸）の欠失が関与し得る。
【００１３】
アミノ酸の置換は、それ以外の１９個の天然に存在するアミノ酸のうちのいずれか１つへの置換であり得る。好ましくは、置換による変異は保存的置換である。あるいは、置換による変異は、非保存的置換である。保存的置換は一般に、分子の構造および生物学的機能を保存するために、十分に類似する化学的特性を示す、例えば、関連がある側鎖を有するアミノ酸を導入する置換であると定義される（例えば、塩基性の、正に荷電したアミノ酸は、別の塩基性の、正に荷電したアミノ酸で置き換えるべきである）。遺伝的にコードされるアミノ酸は一般に、４つのファミリー：（１）酸性アミノ酸、すなわち、アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性アミノ酸、すなわち、リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性アミノ酸、すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）無電荷の極性アミノ酸、すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンはまとめて、芳香族アミノ酸として時には分類される。一般に、単一のアミノ酸をこれらのファミリー内で置換しても、生物学的活性に対する大きな影響は生じない。本発明において使用することができる保存的置換のさらなる例を、表１に示す。
【００１４】
【表１−１】
2012519482.tif 000002
【００１５】
【表１−２】
2012519482.tif 000003
本発明において使用することができる非保存的置換の例は、無電荷の極性アミノ酸の、非極性アミノ酸による置換、非極性アミノ酸の、無電荷の極性アミノ酸による置換、酸性アミノ酸の、塩基性アミノ酸による置換、および塩基性アミノ酸の、酸性アミノ酸による置換を含む。
【００１６】
また、安定性を改善するために、変異を導入すること、例えば、ジスルフィド結合を挿入することもできる（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ａｋｋｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、１９９７年、６巻：２６４４〜２６４９頁）。例えば、このタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、１３６、１４０、１５６、１６０、１６４および１６８のうちのいずれか１つ、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、４０、４２、４４および４６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列に対して配列同一性を示すアミノ酸配列を含むことができる。配列同一性の程度は、好ましくは、５０％超（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％以上）である。これらのタンパク質は、相同体、オルソログ、対立遺伝子改変体、および機能性の変異体を含む。タンパク質間の同一性は、好ましくは、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）中で実行するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定し、この場合、アフィンギャップ検索を使用し、パラメータは、ギャップオープンペナルティ＝１２およびギャップ伸長ペナルティ＝１である。
【００１７】
本発明のクラミジアタンパク質は、１つまたは複数のアミノ酸誘導体を含むことができる。「アミノ酸誘導体」により、遺伝子がコードする天然に存在するアミノ酸２０個のうちの１つではないアミノ酸またはアミノ酸様化学的実体を意図する。特に、このアミノ酸誘導体は、置換または未置換、直鎖、分枝または環状のアルキル部分を含有することができ、１つまたは複数のヘテロ原子を含むことができる。これらのアミノ酸誘導体は、新規に作製してもよく、または商業的供給元（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  ＡＧ；Ｂａｃｈｅｍ）から入手してもよい。
【００１８】
いくつかの実施形態では、この改変体タンパク質は、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ．ｐｓｉｌｔａｃｉ、Ｃ．ｐｅｃｏｒｕｍ、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍまたはＣ．ｓｕｉｓに由来する相同タンパク質である。
【００１９】
本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、１３６、１４０、１５６、１６０、１６４または１６８のうちのいずれか、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、４０、４２、４４もしくは４６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなるタンパク質の断片を含むかまたはそれからなるタンパク質、またはそれらの改変体の断片をさらに提供する。この断片は、このタンパク質に由来する少なくともｎ個の連続したアミノ酸を含むべきであり、特定の配列に応じて、ｎは、６以上（例えば、８、１１、１６、３１、５１、７６、１２１、１８１、２３１、２８１、３３１、３８１、４３１、４４０、４４５、４４６、４８１、５３１、５８１、６３１、６８１、７３１、７８１、８０１、８０６または８０８以上）である。この断片は、ｎ−１以下のアミノ酸長であり、ただし、ｎ＝完全長タンパク質中のアミノ酸の数である（例えば、ｎ−５、ｎ−２０、ｎ−５０、ｎ−１１０、ｎ−１８０、ｎ−２４０、ｎ−３１０、ｎ−３８０、ｎ−４４５、ｎ−５１５、ｎ−５９５、ｎ−６７５、ｎ−７４５、ｎ−７８５、ｎ−８００以下のアミノ酸長）。好ましくは、この断片は、このタンパク質に由来する１つまたは複数のエピトープを含む。好ましくは、これらのエピトープのうちの１つまたは複数が、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープである。いくつかの実施形態では、この断片は、配列番号６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６および１７０のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１２２に記載するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるタンパク質の断片を含むかまたはそれからなるタンパク質を提供する。以下の表３は、どの断片が、どの完全長配列に対応するかを示す。
【００２０】
【表３−１】
2012519482.tif 000004
【００２１】
【表３−２】
2012519482.tif 000005
【００２２】
【表３−３】
2012519482.tif 000006
本発明のタンパク質、例えば、改変体タンパク質またはその断片は、好ましくは、免疫原性である。
【００２３】
用語「免疫原性」は、「免疫原性改変体」および「免疫原性断片」の文脈においては、野生型クラミジアタンパク質に由来するタンパク質を、例えば、被験体（好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトまたはマウス）を免疫化するために使用した場合、このタンパク質が、野生型クラミジアタンパク質に対する免疫応答、例として、細胞媒介型応答および／または抗体応答を誘発することができることを意味するために使用する。例えば、本発明のタンパク質（例えば、改変体または断片）は、好ましくは、インビトロにおいて、生のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに感染させたマウスから精製した脾細胞中のＣＤ４＋ＩＦＮγ＋細胞を、野生型クラミジアタンパク質に匹敵するレベルまで刺激することができる。本発明のタンパク質は、好ましくは、野生型タンパク質を認識する抗体を誘発する能力を保持する。例えば、本発明のタンパク質は、好ましくは、野生型タンパク質に結合し、好ましくは、その活性を中和することができる抗体を誘発する。さらなる実施形態では、本発明のタンパク質は、クラミジアの感染性および／またはビルレンスを中和することができる抗体を誘発することができる。いくつかの実施形態では、これらの抗体は、本発明のタンパク質および野生型タンパク質と交差反応することができるが、その他の（例えば、別のクラミジア種に由来する）相同タンパク質とは交差反応することができない。その他の実施形態では、これらの抗体は、野生型タンパク質に対しても、その他のクラミジア種に由来する相同タンパク質に対しても交差反応性を示す。いくつかの実施形態では、これらの抗体は、野生型タンパク質に対しても、その他の生物体に由来する（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに由来する）相同タンパク質に対しても交差反応性を示す。本発明のタンパク質により免疫化したマウスおよび野生型クラミジアタンパク質により免疫化したマウスは、好ましくは、類似の抗原特異的抗体力価を示す。抗体力価および特異性は、当技術分野で利用可能な、標準的な方法を使用して測定することができる。また、タンパク質の免疫原性を試験するその他の方法も、当技術分野で周知である。
【００２４】
例えば、この改変体または断片は、好ましくは、野生型クラミジアタンパク質に対する免疫応答、例として、細胞媒介型応答および／または抗体応答を誘発することができる。一実施形態では、この断片は、インビトロにおいて、生のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに感染させたマウスから精製した脾細胞中のＣＤ４＋ＩＦＮγ＋細胞を、野生型クラミジアタンパク質に匹敵するレベルまで刺激することができ、かつ／または野生型タンパク質を認識する抗体を誘発する能力を保持する。
【００２５】
好ましくは、この改変体または断片は、野生型クラミジアタンパク質に対して特異的なＣＤ４−Ｔｈ１細胞媒介型応答を誘導することができる。
【００２６】
本発明のタンパク質はもちろん、種々の手段（例えば、組換え発現、自然の宿主からの精製、細胞培養物からの精製、化学的合成等）により、種々の形態（例えば、自然のまま、融合物、グリコシル化状態、非グリコシル化状態、脂質付加状態、非脂質付加状態、リン酸化状態、非リン酸化状態、ミリストイル化状態、非ミリストイル化状態、単量体、多量体、粒子、変性状態等）に調製することができる。一般に、本発明の組換え融合タンパク質は、ＧＳＴ融合タンパク質および／またはＨｉｓタグ付き融合タンパク質として調製する。
【００２７】
本発明のタンパク質を、好ましくは、精製したかまたは実質的に純粋な形態で調製し（すなわち、宿主細胞タンパク質および／またはその他のクラミジアタンパク質を実質的に含有しない）、これらのタンパク質は、一般に、（重量に関して）少なくとも約５０％純粋であり、通常、少なくとも約９０％純粋である。すなわち、組成物の約５０％未満、より好ましくは、約１０％未満（例えば、５％）が、その他の発現したポリペプチドから構成される。したがって、組成物中の抗原は、そうした分子を発現させた生物体全体から分離されている。
【００２８】
本発明のタンパク質の発現は、クラミジア中で起こり得るが、本発明は、好ましくは、異種の宿主を活用する。異種の宿主は、原核生物（例えば、細菌）であっても、または真核生物であってもよい。こうした宿主は、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉであるが、その他の適切な宿主として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、マイコバクテリア（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、酵母等が挙げられる。
【００２９】
用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。このポリマーは、直鎖または分枝状態であり得、改変アミノ酸を含むことができ、このポリマーには、非アミノ酸を割り込ませることができる。また、これらの用語は、天然に、あるいは介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化または任意のその他の操作もしくは改変、例として、標識化構成成分を用いた結合体化により改変されているアミノ酸のポリマーも包含する。また、例えば、１つまたは複数のアミノ酸の類似体を含有するポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸等を含む）、および当技術分野で公知のその他の改変形態も含まれる。ポリペプチドは、単鎖または結合状態の鎖として存在することができる。
【００３０】
本発明は、配列−Ｐ−Ｑ−または−Ｑ−Ｐ−を含むポリペプチドを提供する。式中、−Ｐ−は、上記で定義したアミノ酸配列であり、−Ｑ−は、上記で定義した配列ではない。すなわち、本発明は、融合タンパク質を提供する。−Ｐ−のＮ末端コドンが、ＡＴＧではなく、このコドンが、ポリペプチドのＮ末端には存在しない場合、このコドンは、Ｍｅｔとしてではなく、そのコドンの標準アミノ酸として翻訳される。しかし、このコドンが、ポリペプチドのＮ末端にある場合には、このコドンは、Ｍｅｔとして翻訳される。−Ｑ−部分の例として、これらに限定されないが、ヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ、ただし、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９もしくは１０以上）、マルトース結合性タンパク質、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられる。
【００３１】
本発明のタンパク質を、固体の支持体に結合させることができる。これらのタンパク質は、検出可能な標識（例えば、放射性標識もしくは蛍光標識、またはビオチン標識）を含むことができる。
【００３２】
（抗体）
本発明のタンパク質は、ワクチンとして使用することができる抗体を誘導し、これらの抗体は、感染性ＥＢの活性を中和することができる。あるいは、これらの抗体を、クラミジア感染の診断のために使用することもできる。したがって、本発明は、クラミジア感染の処置、予防または診断において使用するための抗体を提供する。好ましくは、この感染は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓによるが、それに代わって、Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃ．ｐｅｃｏｒｕｍ、Ｃ．ｍｉｉｒｉｄａｒｕｍまたはＣ．ｓｕｉｓによる場合もある。
【００３３】
用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン分子および抗原に結合することができるそれらの断片を含む。これらとして、ハイブリッド（キメラ）抗体分子（Ｗｉｎｔｅｒら、（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９巻：２９３〜９９頁；ＵＳ４，８１６，５６７）；Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦ（ａｂ）断片ならびにＦｖ分子；非共有結合性のヘテロ二量体（Ｉｎｂａｒら、（１９７２年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．６９巻：２６５９〜６２頁；Ｅｈｒｌｉｃｈら、（１９８０年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９巻：４０９１〜９６頁）；単鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．８５巻：５８９７〜８３頁）；二量体性および三量体性の抗体断片構築物；ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（Ｐａｃｋら、（１９９２年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１巻、１５７９〜８４頁；Ｃｕｍｂｅｒら、（１９９２年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９Ｂ巻、１２０〜２６頁）；ヒト化抗体分子（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８年）、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２巻、３２３〜２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら、（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９巻、１５３４〜３６頁；ならびにＧＢ２，２７６，１６９）；さらに、そのような分子から得られた任意の機能性断片、その上、非従来的なプロセス、例として、ファージディスプレイにより入手した抗体が挙げられる。好ましくは、これらの抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体を得る方法は、当技術分野で周知である。ヒト化抗体または完全ヒト抗体が、好ましい。
【００３４】
これらの抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、任意の適切な手段により産生することができる。この抗体は、検出可能な標識を含むことができる。
【００３５】
また、抗体を調製するための方法も提供し、この方法は、哺乳動物（例として、マウスまたはウサギ）を本発明のタンパク質により免疫化するステップと、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を従来の技法により得るステップとを含む。例えば、免疫化した動物からガラス製またはプラスチック製の容器中に採血し、血液を２５℃で１時間インキュベートし、それに続いて、４℃で２〜１８時間インキュベートすることによって、ポリクローナル抗血清を得ることができる。血清を、遠心分離により回収する（例えば、１，０００ｇで１０分間）。モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ［Ｎａｔｕｒｅ、（１９７５年）、２５６巻：４９５〜９６頁］の標準的な方法もしくはその改変を使用して、または任意のその他の適切な方法により調製することができる。
【００３６】
（核酸）
さらなる態様によれば、本発明は、本発明のタンパク質または抗体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質をコードする核酸配列は、好ましくは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、１３５、１３９、１５５、１５９、１６３または１６７のうちのいずれか１つ、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、３９、４１、４３または４５のうちのいずれか１つを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１および１３３のうちのいずれか１つを含むかまたはそれからなる。
【００３７】
また、本発明は、そのようなヌクレオチド配列に対して配列同一性を示すヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。配列間の同一性を、好ましくは、上記のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定する。そのような核酸は、同じアミノ酸をコードする代替コドンを使用する核酸を含む。
【００３８】
また、本発明は、これらの核酸にハイブリダイズすることができる核酸も提供する。ハイブリダイゼーション反応を、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で実施することができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増加させる条件は、当技術分野では広く公知であり、公開されている（例えば、Ｋａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４年）、６巻：１４８号の７．５２頁）。適切な条件の例として（ストリンジェンシーが増加する順に）、インキュベーション温度として、２５℃、３７℃、５０℃、５５℃および６８℃；緩衝液濃度として１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ（この場合、ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸緩衝液である）、ならびにその他の緩衝液系を使用するそれらの均等物；ホルムアミド濃度として、０％、２５％、５０％および７５％；インキュベーション時間として、５分〜２４時間；１または２回以上の洗浄ステップ；洗浄インキュベーション時間として、１、２または１５分；さらに、洗浄溶液として、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣまたは脱イオン水が挙げられる。ハイブリダイゼーション技法およびそれらの最適化は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，７０７，８２９号、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年）、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０、Ｋａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４年）、６巻：１４８頁、およびＷＯ９４／０３６２２等を参照されたい）。
【００３９】
この核酸を、ハイブリダイゼーション反応（例えば、ノーザンブロットもしくはサザンブロット、または核酸マイクロアレイもしくは「遺伝子チップ」において）、あるいは増幅反応（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ）等において使用することができる。
【００４０】
また、本発明は、（例えば、アンチセンスもしくはプローブとしての、またはプライマーとして使用するための）上記の核酸に対して相補性を示す配列を含む核酸も提供する。一実施形態では、この核酸は、完全長の上記の核酸に対して相補性を示す。
【００４１】
本発明による核酸を、例えば、放射性標識または蛍光標識を用いて標識することができる。この標識化は、この核酸を、例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲまたはＴＭＡにおいて、プライマーまたはプローブとして使用しようとする場合に、特に有用である。
【００４２】
用語「核酸」は、一般的な意味として、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含み、それらのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそれらの類似体を含有する。この用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッドを含む。また、この用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、例として、改変骨格（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）もしくはホスホロチオエート）または改変塩基を含有するものも含む。したがって、本発明は、ｍＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換え核酸、分枝核酸、プラスミド、ベクター、プローブ、プライマー等を含む。本発明の核酸が、ＲＮＡの形態をとる場合、この核酸は、５’キャップを有してもまたは有さなくてもよい。
【００４３】
本発明の核酸は、種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プライマー、プローブ等）をとることができる。別段の特定または必要がない限り、核酸を活用する本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態も、二本鎖形態を構成する２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれも活用することができる。プライマーおよびプローブは一般に一本鎖であり、アンチセンス核酸も一本鎖である。
【００４４】
本発明の核酸は、好ましくは、実質的に純粋な形態で調製し（すなわち、天然に存在する核酸、特に、クラミジアまたはその他の宿主細胞の核酸を実質的に含有しない）、一般に、（重量に関して）少なくとも約５０％純粋であり、通常少なくとも約９０％純粋である。
【００４５】
本発明の核酸を、多くの方法で調製することができ、例として、全部または一部における化学的合成（例えば、ＤＮＡのホスホラミダイト合成）による調製、より長い核酸を、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を使用して消化することによる調製、より短い核酸またはヌクレオチドを（例えば、リガーゼまたはポリメラーゼを使用して）つなぐことによる調製、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーからの調製等がある。
【００４６】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）、ならびにそのようなベクターを用いて形質転換した宿主細胞を提供する。本発明の核酸は、ベクターの一部、すなわち、１つまたは複数の細胞型の形質導入／トランスフェクションのために設計した核酸構築物の一部であり得る。ベクターは、例えば、「クローニングベクター」、すなわち、挿入ヌクレオチドを単離、増殖および複製するように設計したベクター、「発現ベクター」、すなわち、宿主細胞中でヌクレオチド配列を発現するように設計したベクター、「ウイルスベクター」、すなわち、組換えウイルスもしくはウイルス様粒子を産生するように設計したベクター、または「シャトルベクター」、すなわち、２つ以上の型のベクターの特質を含むベクターであり得る。好ましいベクターは、プラスミドである。
【００４７】
また、本発明の核酸を含む宿主細胞も提供する。「宿主細胞」は、外来核酸のレシピエントとなり得るかまたはそうしたレシピエントとなっている個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含み、この子孫は、自然の、偶発的なまたは意図的な変異および／または変化に起因して、（形態または全ＤＮＡ相補体の点で）元々の親細胞と必ずしも完全には同一でなくてもよい。宿主細胞は、インビボまたはインビトロにおいて、本発明の核酸、例えば、本発明のベクターによりトランスフェクトまたは感染させた細胞を含む。
【００４８】
核酸がＤＮＡである場合、ＲＮＡ配列中の「Ｕ」は、ＤＮＡ中では「Ｔ」で置き換えられることが理解される。同様に、核酸がＲＮＡである場合、ＤＮＡ配列中の「Ｔ」は、ＲＮＡ中では「Ｕ」で置き換えられることも理解される。
【００４９】
用語「相補体」または「相補的な」は、核酸に関して使用する場合、ワトソン−クリック塩基対形成を指す。したがって、Ｃの相補体はＧであり、Ｇの相補体はＣであり、Ａの相補体はＴ（またはＵ）であり、Ｔ（またはＵ）の相補体はＡである。また、塩基、例として、Ｉ（プリンイノシン）使用して、例えば、ピリミジン（ＣまたはＴ）を相補することも可能である。
【００５０】
本発明の核酸は、例えば、ポリペプチドの産生のために；生物学的試料中の核酸の検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして；核酸の追加のコピーの生成のために；リボザイムもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドの生成のために；一本鎖ＤＮＡのプライマーもしくはプローブとして；または三本鎖を形成するオリゴヌクレオチドとして使用することができる。
【００５１】
本発明は、本発明の核酸を産生するためのプロセスを提供し、核酸の一部または全部を、化学的手段を使用して合成する。
【００５２】
本発明の特定の実施形態の場合、核酸は、好ましくは、少なくとも２４ヌクレオチド長（例えば、６０、１２０、２４０、３９０、５４０、７２０、９００、１２００、１３２０、１５００、１８００、２１００、２４００または２４１５以上のヌクレオチド長）である。
【００５３】
本発明の特定の実施形態の場合、核酸は、好ましくは、最大２４３０ヌクレオチド長（例えば、２４２７、２３９４、２２５０、２０３４、１４５０、１３００、１１５０、１０００、８５０、７００または５００以下のヌクレオチド長）である。
【００５４】
本発明のプライマーおよびプローブ、ならびにハイブリダイゼーションのために使用するその他の核酸は、好ましくは、１０ヌクレオチド長と３０ヌクレオチド長との間（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長）である。
【００５５】
（免疫原性の組成物および薬物）
このタンパク質、抗体および／もしくは核酸、または薬物は、組成物の形態をとることができる。これらの組成物は、免疫原性組成物（例えば、ワクチン）または診断試薬として適切であり得る。
【００５６】
好ましくは、この組成物は、免疫原性組成物である。本発明のタンパク質をワクチン等の免疫原性組成物中で使用するのが、特に好都合である。また、この免疫原性組成物は、本発明のタンパク質をインビボにおいて生成するように、このタンパク質をコードする核酸を含むことができることも想定される。
【００５７】
本発明の免疫原性組成物は、本発明によるタンパク質、抗体、核酸、ベクターおよび／または宿主細胞を含む。本発明による免疫原性組成物は、予防（すなわち、感染の阻止）のためのものかまたは治療（すなわち、感染の処置）のためのもののいずれかであってよいが、典型的には、予防のためのものである。この免疫原性組成物を予防のために使用する場合、ヒトは、好ましくは、小児（例えば、幼児もしくは乳児）、または十代の若者であり、この免疫原性組成物を治療のために使用する場合、ヒトは、好ましくは、十代の若者または成人である。また、小児を意図する免疫原性組成物を成人に投与して、例えば、安全性、投与量、免疫原性等を評価することもできる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、この免疫原性組成物は、クラミジア感染または関連の状態（例えば、トラコーマ、失明、子宮頚管炎、骨盤の炎症性疾患、不妊、子宮外妊娠、慢性骨盤痛、卵管炎、尿道炎、精巣上体炎、乳児肺炎、子宮頚部扁平上皮癌に罹患した患者および／またはＨＩＶ感染等）、好ましくは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染の処置または予防のためのものである。この免疫原性組成物は、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対して有効であり得る。
【００５９】
ワクチンとして使用する免疫原性組成物は、免疫学的有効量の本発明のタンパク質、および必要に応じて任意のその他の構成成分を含む。「免疫学的有効量」により、その量を単回投与または一連の投与の一部のいずれかとして個体に投与すると、処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置しようとする個体の健康状態および身体的状態、年齢、処置しようとする個体の分類学的な群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類等）、個体の免疫系の抗体を合成する能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、医学的状況の処置医の評価、ならびにその他の適切な因子に応じて変化させる。この量は、日常的な試行により決定することができる比較的広い範囲に及ぶことが予想される。
【００６０】
組成物中の抗原は典型的には、それぞれ少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００６１】
一般に、任意の所与の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を誘発するのに十分な濃度である。
【００６２】
投与処置は、単回投与スケジュールであっても、または複数回投与スケジュールであってもよい。複数回投与を、一次免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールで使用することができる。複数回投与スケジュールでは、種々の投与を、同じかまたは異なる経路、例えば、非経口による一次免疫と粘膜からの追加免疫、粘膜からの一次免疫と非経口による追加免疫等により行うことができる。複数回投与は典型的には、少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間等）の間隔を置いて投与する。いくつかの実施形態では、３回以上の投与を行う（例えば、３、４または５回の投与）。いくつかの実施形態では、３回の投与を、２週間の間隔を置いて筋肉内から行う。例えば、３回の投与は、１０〜２０μｇの各タンパク質を２週間の間隔を置いて筋肉内から投与する。
【００６３】
免疫原性組成物のｐＨは、好ましくは、６と８との間、好ましくは、約７である。ｐＨを、緩衝剤の使用により維持することができる。組成物は、無菌であり得、および／または発熱性物質を含まないであろう。組成物は、ヒトに対して等張であり得る。
【００６４】
本発明の免疫原性組成物は一般に、患者に直接投与する。直接的な送達を、非経口注射により（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内もしくは組織間質腔から）、または粘膜により、例として、直腸から、経口により（例えば、錠剤、スプレー）、膣から、局所的に、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）により（例えば、ＷＯ９９／２７９６１を参照されたい）、もしくは経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）により（例えば、ＷＯ０２／０７４２４４およびＷＯ０２／０６４１６２を参照されたい）、鼻腔内から（例えば、ＷＯ０３／０２８７６０を参照されたい）、眼球から、経耳により、肺から、あるいはその他の粘膜投与により達成することができる。
【００６５】
クラミジア感染は、身体の種々の領域を冒し、したがって、本発明の免疫原性組成物は、種々の形態で調製することができる。例えば、組成物を、注射用、すなわち、液体の溶液または懸濁物のいずれかとして調製することができる。また、注射の前に液体ビヒクル中の溶液または懸濁物となすのに適した固体の形態を調製することもできる（例えば、凍結乾燥した組成物）。組成物を、局所投与のために、例えば、軟膏剤、クリーム剤または散剤として調製することができる。組成物を、経口投与のために、例えば、錠剤もしくはカプセル剤として、またはシロップ剤（場合により矯味矯臭薬を加える）として調製することができる。組成物を、肺投与のために、例えば、微細な散剤、またはスプレーを使用する吸入物として調製することができる。組成物を、坐剤または膣坐剤として調製することができる。組成物を、経鼻投与、経耳投与または眼球投与のために、例えば、ドロップ剤として調製することができる。
【００６６】
また、本発明は、本発明の免疫原性組成物をあらかじめ充填した送達デバイスも提供する。
【００６７】
また、本発明は、第１の構成成分および第２の構成成分を含むキットも提供し、第１の構成成分も、第２の構成成分も、本明細書に記載する本発明の組成物ではないが、第１の構成成分と第２の構成成分とを組み合わせて、本明細書に記載する本発明の組成物を提供することができる。このキットは、以下のうちの１つまたは複数を含む第３の構成成分を、さらに含むことができる：指示書、シリンジもしくはその他の送達デバイス、アジュバント、または薬学的に許容できる処方溶液。
【００６８】
上記の組成物は、それに代わっておよび／またはそれに加えて、クラミジア感染の診断のために使用することもできる。
【００６９】
（その他の抗原との組合せ）
クラミジア抗原の治療または診断の効率を、異なるクラミジア抗原と組み合わせることにより改善することができる。例えば、本発明のタンパク質の免疫原性を、別の本発明のタンパク質または別の公知のクラミジア抗原と組み合わせることにより改善することができる。したがって、本発明は、クラミジア抗原の組合せを含む免疫原性組成物を含み、前記組合せは、本発明のタンパク質を、１つまたは複数の追加のクラミジア抗原と組み合わせて含む。この組成物中に存在する１つまたは複数の追加のクラミジア抗原は、タンパク質もしくは核酸の形態、または任意のその他の適切な形態をとることができる。本発明のタンパク質を、１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５もしくは２０個以上）の異なる本発明のタンパク質および／または１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５もしくは２０個以上）のその他の公知のクラミジア抗原と組み合わせることができる。例えば、２つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０個以上）の本発明のタンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。本発明のタンパク質は、それに代わっておよび／またはそれに加えて、それらの対応する核酸、ベクター、宿主細胞等の形態で組成物中に提供することもできる。また、上記の使用のために、本発明のタンパク質または核酸も提供し、このタンパク質または核酸は、１つまたは複数の追加のクラミジア抗原（またはそれらをコードする核酸）と組み合わせて使用するためのものである。こうした１つまたは複数の追加の抗原（例えば、２、３、４、５、６または７つ以上の追加の抗原）を、本発明のタンパク質または核酸と共に、例えば、組合せ調製物として、同時、別個または順次に投与することができる。
【００７０】
同様に、本発明の抗体を、クラミジア感染の診断において使用するために、１つまたは複数の追加のクラミジア抗原に特異的な１つまたは複数の抗体と組み合わせて使用することもできる。
【００７１】
一実施形態では、追加のクラミジア抗原のうちの１つまたは複数は、表２に示す抗原またはそれらの改変体から選択される。例えば、追加の抗原のうちの１つまたは複数（例えば、全て）は、表２に列挙するＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗原から選択されるが、それに代わってまたはそれに加えて、表２に列挙するＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原から選択してもよい。いくつかの実施形態では、追加の抗原のうちの１つまたは複数（例えば、全て）は、表２に列挙するＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗原および／またはＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、ならびにＣＴ３８７、ＣＴ８１２、ＣＴ８６９、ＣＴ１６６、ＣＴ１７５、ＣＴ１６３、ＣＴ２１４、ＣＴ７２１およびＣＴ１２７から選択される。一実施形態では、１つまたは複数の追加の抗原のうちの１つまたは複数は、ＣＴ３７２、ＣＴ４４３、ＣＴ０４３、ＣＴ１５３、ＣＴ２７９、ＣＴ６０１、ＣＴ７１１、ＣＴ１１４、ＣＴ４８０、ＣＴ４５６、ＣＴ３８１、ＣＴ０８９、ＣＴ７３４、ＣＴ０１６、ＣＴ６００、ＣＴ８２３、ＣＴ３８７、ＣＴ８１２、ＣＴ８６９、ＣＴ１６６、ＣＴ１７５、ＣＴ１６３、ＣＴ２１４、ＣＴ７２１およびＣＴ１２７（またはそれらの改変体）、例えば、ＣＴ３７２、ＣＴ４４３、ＣＴ０４３、ＣＴ１５３、ＣＴ２７９、ＣＴ６０１、ＣＴ７１１、ＣＴ１１４、ＣＴ４８０、ＣＴ４５６、ＣＴ３８１、ＣＴ０８９、ＣＴ７３４、ＣＴ０１６、ＣＴ６００およびＣＴ８２３から選択される。これらの追加の抗原を、表２に列挙し、それらの配列を、表２に続く「配列」のセクションに記載する。一実施形態では、１つまたは複数の本発明のタンパク質を、ＣＴ０８９と組み合わせる。別の実施形態では、１つまたは複数の本発明のタンパク質を、ＣＴ０８９およびＣＴ３８１（またはそれらの改変体）と組み合わせる。いくつかの実施形態では、ＣＴ８１２のＣ末端断片「ＣＴ８１２Ｃ」（例えば、配列番号１２２に記載するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるタンパク質、またはその断片もしくは改変体）を、完全長ＣＴ８１２の代わりに使用する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、抗原（またはそれらの改変体）の以下の組合せを使用する：ＣＴ７３３＋ＣＴ６０１、ＣＴ７３３＋ＣＴ２７９、ＣＴ７３３＋ＣＴ４４３、ＣＴ７３３＋ＣＴ３７２、ＣＴ７３３＋ＣＴ４５６、ＣＴ７３３＋ＣＴ３８１、ＣＴ１５３＋ＣＴ６０１、ＣＴ１５３＋ＣＴ２７９、ＣＴ１５３＋ＣＴ４４３、ＣＴ１５３＋ＣＴ３７２、ＣＴ１５３＋ＣＴ４５６、ＣＴ１５３＋ＣＴ３８１、ＣＴ６０１＋ＣＴ４４３、ＣＴ６０１＋ＣＴ３７２、ＣＴ６０１＋ＣＴ４５６、ＣＴ６０１＋ＣＴ３８１、ＣＴ２７９＋ＣＴ４４３、ＣＴ２７９＋ＣＴ３７２、ＣＴ２７９＋ＣＴ４５６、ＣＴ２７９＋ＣＴ３８１、ＣＴ４４３＋ＣＴ３７２、ＣＴ４４３＋ＣＴ４５６、ＣＴ４４３＋ＣＴ３８１、ＣＴ３７２＋ＣＴ４５６、ＣＴ３７２＋ＣＴ３８１、ＣＴ３８７＋ＣＴ８１２＋ＣＴ８６９、ＣＴ３８７＋ＣＴ８１２Ｃ＋ＣＴ８６９。これらの組合せを、任意のその他のクラミジア抗原の非存在下で使用してもよく、または１つもしくは複数の追加のクラミジア抗原の存在下で使用してもよい。特に好ましい組合せは、（ｉ）ＣＴ２７９＋ＣＴ６０１；（ｉｉ）ＣＴ３７２＋ＣＴ４４３；（ｉｉｉ）ＣＴ７３３＋ＣＴ１５３；（ｉｖ）ＣＴ４５６＋ＣＴ３８１；（ｖ）ＣＴ２７９＋ＣＴ６０１＋ＣＴ７３３＋ＣＴ１５３；（ｖｉ）ＣＴ２７９＋ＣＴ６０１＋ＣＴ３７２＋ＣＴ４４３；（ｖｉｉ）ＣＴ８２３＋ＣＴ７３３＋ＣＴ０４３＋ＣＴ４５６；（ｖｉｉｉ）ＣＴ３８７＋ＣＴ８１２＋ＣＴ８６９；および（ｉｘ）ＣＴ３８７＋ＣＴ８１２Ｃ＋ＣＴ８６９（またはそれらの改変体）である。
【００７３】
Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのヒトセロバリアント（ｓｅｒｏｖａｒｉａｎｔ）（「血清型」）は、２つのバイオバリアント（ｂｉｏｖａｒｉａｎｔ）（「次亜種」）に分けられる。血清型Ａ〜Ｋは、主として眼球組織（Ａ〜Ｃ）または泌尿生殖管（Ｄ〜Ｋ）において、上皮感染を誘発する。血清型Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、浸潤性の性病性リンパ肉芽腫（ＬＧＶ）の病原性因子である。いくつかの実施形態では、追加のクラミジア抗原のうちの１つまたは複数は、例えば、血清型Ａ〜ＫまたはＬ１、Ｌ２もしくはＬ３のうちのいずれかであり得る。追加のクラミジア抗原のうちの１つまたは複数は、好ましくは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ血清型Ｄまたは別の疫学的に流行している血清型に由来する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、追加のクラミジア抗原のうちの１つまたは複数は、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃ．ｐｅｃｏｒｕｍ、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍまたはＣ．ｓｕｉｓに由来する相同抗原である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ＴＣ０５５１（ＣＴ２７９のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体）を、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質の代わりに使用する。Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍは、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのマウス適応株である。Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍは、ヒト病原体ではないが、マウスをＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍに感染させると、その表現型は、ヒトにおけるＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染の多くの局面を模倣し、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに対する免疫防御応答を測定するために頻繁に使用される。いくつかの実施形態では、ＴＣ０８９０（ＣＴ６０１のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体）を、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質の代わりに使用する。いくつかの実施形態では、ＴＣ０６５１（ＣＴ３７２のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体）を、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質の代わりに使用する。いくつかの実施形態では、ＴＣ０７２７（ＣＴ４４３のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体）を、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質の代わりに使用する。いくつかの実施形態では、ＴＣ０１０６（ＣＴ７３３のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体）を、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質の代わりに使用する。いくつかの実施形態では、ＴＣ０４３１（ＣＴ１５３のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体）を、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質の代わりに使用する。いくつかの実施形態では、ＴＣ０６６０（ＣＴ３８１のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体）を、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質の代わりに使用する。いくつかの実施形態では、ＴＣ０７４１（ＣＴ４５６のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体）を、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質の代わりに使用する。いくつかの実施形態では、ＴＣ０２１０（ＣＴ８２３のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体）を、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質の代わりに使用する。いくつかの実施形態では、ＴＣ０６６６（ＣＴ３８７のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体）を、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質の代わりに使用する。ＴＣ０６６６は、仮定上のタンパク質とアノテートされている。いくつかの実施形態では、ＴＣ０１９７（ＣＴ８１２のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体）を、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質の代わりに使用する。ＴＣ０１９７は、多型性外膜タンパク質Ｄファミリーのタンパク質とアノテートされている。いくつかの実施形態では、ＴＣ０２６１（ＣＴ８６９のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体）を、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質の代わりに使用する。ＴＣ０２６１は、多型性外膜タンパク質Ｅ／Ｆファミリーのタンパク質とアノテートされている。いくつかの実施形態では、ＴＣ０３１３（ＣＴ０４３のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体）を、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質の代わりに使用する。いくつかの実施形態では、ＴＣ０８８９（ＣＴ６００のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体）を、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質の代わりに使用する。いくつかの実施形態では、ＴＣ０２１０（ＣＴ８２３のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体）を、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質の代わりに使用する。組成物が単一のクラミジア抗原を含むいくつかの実施形態では、���．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体を、単一のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗原の代わりに使用する。組成物がクラミジア抗原の組合せを含むいくつかの実施形態では、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体を、１つもしくは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個）または全てのＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗原の代わりに使用する。
【００７６】
好都合な本発明の組合せは、２つ以上の抗原（例えば、２、３または４つの抗原）が相乗的に作用する組合せである。したがって、それらを組み合わせた投与により達成されたクラミジアに対する防御は、それらの個々の防御の有効性の単なる加算から予想される防御を上回る。
【００７７】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の追加のクラミジア抗原は、（ａ）表２の抗原の改変体であるアミノ酸配列（すなわち、表２に示す配列に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％以上）の同一性を示す）、および／または（ｂ）表２に示す配列もしくは表２の抗原の改変体の少なくとも「ｎ」個の連続したアミノ酸の断片を含む｛ただし、「ｎ」は、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３５０、４５０、５５０、６５０、７５０、７８０もしくは８００以上）である｝アミノ酸配列を含むことができる。好ましい（ｂ）の断片は、表２に示す配列に由来するエピトープを含む。好ましくは、このエピトープは、ＭＨＣクラスＩＩのエピトープ、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞のエピトープである。その他の好ましい断片は、表２に示す配列のＣ末端から１つもしくは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０もしくは２５個以上）のアミノ酸、および／またはＮ末端から１つもしくは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０もしくは２５以上）のアミノ酸を欠くが、表２示す配列の少なくとも１つのエピトープは保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインが除外されている。追加のクラミジア抗原が、表２の完全配列と同一ではない配列を含む場合（例えば、追加のクラミジア抗原が、表２の完全配列に対して１００％未満の配列同一性を示す配列を含む場合、または追加のクラミジア抗原が、その断片を含む場合）、それぞれの個々の事例において、追加のクラミジア抗原が、このクラミジア抗原が由来する表２の抗原の完全配列を有するタンパク質を認識する抗体を誘発することができることが好ましい。
【００７８】
いくつかの実施形態では、２つ以上のクラミジア抗原の組合せを、同時、別個または順次の投与のための組合せ調製物として提供する。また、本発明は、同時、別個または順次の投与ための、本発明のタンパク質および１つまたは複数の追加の抗原を含むキットも提供する。
【００７９】
本発明において使用するクラミジア抗原は、組成物中に、個々の別個のポリペプチドとして存在し得る。あるいは、それらの組合せは、２つ以上（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個以上）の抗原が、単一のポリペプチド鎖として発現するハイブリッドポリペプチドとして存在し得る。ハイブリッドポリペプチドは、２つの主要な利点を提供する、すなわち、第１に、それ自体では不安定であるかまたは発現が乏しい恐れがあるポリペプチドを、この問題を克服する適切なハイブリッドパートナーを付加することによって支援することができ；第２に、共に抗原性の面で有用である２つのポリペプチド産生するために、ただ１回の発現および精製のみを必要とすることから、商業的な製造が単純になる。異なるハイブリッドポリペプチドを、単一の処方物中に一緒に混合することができる。そのような組合せの内部では、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗原は、２つ以上のハイブリッドポリペプチド中に、および／または非ハイブリッドポリペプチドとして存在することができる。しかし、抗原が、ハイブリッドとしておよび非ハイブリッドとしての両方ではなく、それらのいずれかとして存在することが好ましい。
【００８０】
ハイブリッドポリペプチドを、式ＮＨ２−Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ｛式中、少なくとも１つのＸは、上記の本発明によるクラミジアタンパク質のアミノ酸配列であり；Ｌは、任意選択のリンカーアミノ酸配列であり；Ａは、任意選択のＮ末端アミノ酸配列であり；Ｂは、任意選択のＣ末端アミノ酸配列であり；ｎは、２以上（例えば、２、３、４、５、６等）の整数である｝により示すことができる。通常ｎは、２または３である。
【００８１】
−Ｘ−部分が、その野生型の形態中ではリーダーペプチド配列を有する場合、この配列を、このハイブリッドタンパク質中に含めてもまたは除去してもよい。いくつかの実施形態では、このリーダーペプチドを、このハイブリッドタンパク質のＮ末端に位置する−Ｘ−部分のリーダーペプチドを除いて欠失させる。すなわち、Ｘ１のリーダーペプチドは保持されるが、Ｘ２〜Ｘｎのリーダーペプチドは除去される。これは、全てのリーダーペプチドを欠失させ、Ｘ１のリーダーペプチドを、部分−Ａ−として使用することと同等である。
【００８２】
｛−Ｘ−Ｌ−｝のそれぞれのｎ個の事例について、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在してもまたは存在しなくてもよい。例えば、ｎ＝２である場合、このハイブリッドは、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ等であり得る。リンカーアミノ酸配列（複数可）−Ｌ−は典型的には、短い（例えば、２０個以下、すなわち、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１つのアミノ酸である）。例は、クローニングを促進する短いペプチド配列、ポリグリシンリンカー（すなわち、Ｇｌｙｎ｛ただし、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上｝を含む）、およびヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ｛ただし、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９または１０以上｝）を含む。その他の適切なリンカーアミノ酸配列が、当業者には明らかである。有用なリンカーが、ＧＳＧＧＧＧであり、このＧｌｙ−Ｓｅｒジペプチドは、ＢａｍＨＩ制限部位から形成され、したがって、クローニングおよび操作を援助し、この（Ｇｌｙ）４テトラペプチドは、典型的なポリグリシンリンカーである。
【００８３】
−Ａ−は、任意選択のＮ末端アミノ酸配列である。これは典型的には、短い（例えば、４０個以下、すなわち、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１つのアミノ酸である）。例は、タンパク質の輸送を導くためのリーダー配列、またはクローニングもしくは精製を促進する短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｎ｛ただし、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９または１０以上｝）を含む。その他の適切なＮ末端アミノ酸配列が、当業者には明らかである。Ｘ１が、それ自体のＮ末端メチオニンを欠く場合、−Ａ−は、好ましくは、Ｎ末端メチオニンを提供するオリゴペプチドである（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８個のアミノ酸を有する）。
【００８４】
−Ｂ−は、任意選択のＣ末端アミノ酸配列である。これは典型的には、短い（例えば、４０個以下のアミノ酸、すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例は、タンパク質の輸送を導くための配列、クローニングもしくは精製を促進する短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｎ｛ただし、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９または１０以上｝）、またはタンパク質の安定性を増強する配列を含む。その他の適切なＣ末端アミノ酸配列が、当業者には明らかである。
【００８５】
ハイブリッドポリペプチドを使用する場合、このハイブリッドの内部の個々の抗原（すなわち、個々の−Ｘ−部分）は、１つまたは複数の株に由来することができる。ｎ＝２である場合、例えば、Ｘ２は、Ｘ１と同じ株に由来してもまたは異なる株に由来してもよい。ｎ＝３である場合、これらの株は、（ｉ）Ｘ１＝Ｘ２＝Ｘ３、（ｉｉ）Ｘ１＝Ｘ２≠Ｘ３、（ｉｉｉ）Ｘ１≠Ｘ２＝Ｘ３、（ｉｖ）Ｘ１≠Ｘ２≠Ｘ３、または（ｖ）Ｘ１＝Ｘ３≠Ｘ２等であり得よう。
【００８６】
また、本発明は、本発明のハイブリッドポリペプチドをコードする核酸も提供する。さらに、本発明は、この核酸に、好ましくは、「高いストリンジェンシー」条件（例えば、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ溶液中）の下でハイブリダイズすることができる核酸も提供する。
【００８７】
（組成物のさらなる構成成分）
したがって、組成物は、薬学的に許容され得る。組成物は通常、抗原に加えて、構成成分を含み、例えば、典型的には、１つまたは複数の薬学的キャリア（複数可）および／または賦形剤（複数可）を含む。そのような構成成分の綿密な考察が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙから入手可能である。
【００８８】
組成物は一般に、水性の形態で哺乳動物に投与する。しかし、投与前に、組成物は、非水性の形態をとり得る。例えば、水性の形態で製造され、次いで、充填および分配され、水性の形態で投与されるワクチンもあれば、また、製造の間に凍結乾燥され、使用時に水性の形態に再構成されるワクチンもある。したがって、本発明の組成物を、凍結乾燥処方物等として乾燥することができる。
【００８９】
組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノール等の保存剤を含むことができる。しかし、ワクチンは、水銀材料を実質的に含有すべきでなく（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）、例えば、チオメルサールを含有しないことが好ましい。水銀を全く含有しないワクチンがより好ましい。保存剤を含有しないワクチンが特に好ましい。
【００９０】
張度を制御するために、ナトリウム塩等の生理学的塩を含むのが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは、１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの間、例えば、約１０±２ｍｇ／ｍｌ  ＮａＣｌで存在することができる。存在し得るその他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム二水和物（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等がある。
【００９１】
組成物は一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは、２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の重量オスモル濃度を有し、これは、より好ましくは、２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲に属する。
【００９２】
組成物は、１つまたは複数の緩衝剤を含むことができる。典型的な緩衝剤には、リン酸緩衝剤、Ｔｒｉｓ緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤（特に、水酸化アルミニウムアジュバントを伴うもの）、またはクエン酸緩衝剤がある。緩衝剤は典型的には、５〜２０ｍＭの範囲で含める。
【００９３】
組成物のｐＨは、一般に、５．０〜８．１の間、より典型的には、６．０〜８．０の間、例えば、６．５〜７．５の間または７．０〜７．８の間である。
【００９４】
組成物は、好ましくは、無菌である。組成物は、好ましくは、非発熱性であり、例えば、＜１ＥＵ（内毒素単位、標準的尺度）／用量、好ましくは、＜０．１ＥＵ／用量を含有する。組成物は、好ましくは、グルテンを含有しない。
【００９５】
組成物は、単回の免疫化のための材料を含んでもよく、または複数回の免疫化のための材料を含んでもよい（すなわち、「複数回投与」キット）。複数回投与として準備するものの場合には、保存剤を含めることが好ましい。複数回投与組成物中に保存剤を含ませることに代わって（またはそれに加えて）、組成物を、材料を取り出すための無菌のアダプターを有する容器中に含有させてもよい。
【００９６】
ヒトワクチンは典型的には、約０．５ｍｌの投与容積で投与するが、小児には、半分の用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）を投与することができる。
【００９７】
また、本発明の免疫原性組成物は、１つまたは複数の免疫調節剤も含むことができる。好ましくは、免疫調節剤のうちの１つまたは複数は、１つまたは複数のアジュバントを含む。これらのアジュバントは、以下にさらに論じるＴＨ１アジュバントおよび／またはＴＨ２アジュバントを含むことができる。
【００９８】
本発明の組成物中で使用することができるアジュバントとして、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる。
【００９９】
（Ａ．ミネラル含有組成物）
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したミネラル含有組成物は、アルミニウム塩およびカルシウム塩等のミネラル塩（またはそれらの混合物）を含む。カルシウム塩は、リン酸カルシウム（例えば、米国特許第６３５５２７１号に開示されている「ＣＡＰ」粒子）を含む。アルミニウム塩は、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩等を含み、これらの塩は、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶性、アモルファス等）をとる。これらの塩への吸着が好ましい。また、これらのミネラル含有組成物を、金属塩の粒子として処方することもできる［ＷＯ００／２３１０５］。
【０１００】
水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントを使用することができる。これらの名前は慣用名であるが、いずれの名前も、存在する実際の化合物の正確な記載ではないことから、利便性のためのみに使用されている（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ〜の９章（１９９５年）、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ、Ｐｌｅｎｕｍを参照されたい）。本発明は、アジュバントとして一般に使用される「水酸化物」または「リン酸塩」のアジュバントのうちのいずれかを使用することができる。「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的にはオキシ水酸化アルミニウム塩であり、これらの塩は通常、少なくとも部分的に結晶性である。「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的には、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、またしばしば、少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム）も含有する。これらのアジュバントは沈殿により得ることができ、沈殿させる間の反応の条件および濃度が、この塩中のヒドロキシルがリン酸により置換される程度に影響を及ぼす。
【０１０１】
（例えば、透過型電子顕微鏡において見られるような）線維状の形態が、水酸化アルミニウムアジュバントの常である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは典型的には、約１１である。すなわち、このアジュバント自体は、生理学的ｐＨでは正の表面電荷を有する。ｐＨ７．４における１．８ｍｇ〜２．６ｍｇの間のタンパク質／ｍｇ  Ａｌ＋＋＋の吸着力が、水酸化アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【０１０２】
リン酸アルミニウムアジュバントは一般に、０．３〜１．２の間、好ましくは、０．８〜１．２の間、より好ましくは、０．９５±０．１のＰＯ４／Ａｌのモル比を有する。こうしたリン酸アルミニウムは一般に、特に、ヒドロキシリン酸塩の場合、アモルファスである。典型的なアジュバントは、０．６ｍｇ  Ａｌ３＋／ｍｌで含まれる、０．８４〜０．９２の間のＰＯ４／Ａｌのモル比を有するアモルファスのヒドロキシリン酸アルミニウムである。こうしたリン酸アルミニウムは一般に、粒子状（例えば、透過型電子顕微鏡において見られるような平板様の形態）である。任意の抗原の吸着後の典型的な粒子直径は、０．５〜２０μｍ（例えば、約５〜１０μｍ）の範囲に及ぶ。ｐＨ７．４における０．７ｍｇ〜１．５ｍｇの間のタンパク質／ｍｇ  Ａｌ＋＋＋の吸着力が、リン酸アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【０１０３】
リン酸アルミニウムのゼロ電荷（ＰＺＣ）の点は、ヒドロキシルがリン酸により置換される程度に逆相関し、この置換の程度は、この塩を沈殿により調製するために使用した反応条件および反応物濃度に応じて変化し得る。また、ＰＺＣは、溶液中の遊離のリン酸イオンの濃度を変化させること（より多くのリン酸＝より酸性のＰＺＣ）、または（ＰＺＣを、より塩基性にする）ヒスチジン緩衝剤等の緩衝剤を添加することによっても変化する。本発明に従って使用するリン酸アルミニウムは一般に、４．０〜７．０の間、より好ましくは、５．０〜６．５の間、例えば、約５．７のＰＺＣを有する。
【０１０４】
本発明の組成物を調製するために使用するアルミニウム塩の懸濁物は、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝剤またはヒスチジン緩衝剤またはＴｒｉｓ緩衝剤）を含有することができるが、これは、必ずしも必要であるとは限らない。これらの懸濁物は、好ましくは、無菌であり、発熱性物質を含有しない。懸濁物は、遊離の水性リン酸イオンを含むことができ、例えば、１．０ｍＭ〜２０ｍＭの間、好ましくは、５ｍＭ〜１５ｍＭの間、より好ましくは、約１０ｍＭの濃度で存在する。また、これらの懸濁物は、塩化ナトリウムも含むことができる。
【０１０５】
本発明は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物を使用することができる。この場合には、リン酸アルミニウムが、水酸化アルミニウムよりも多く存在し得、例えば、重量比が、少なくとも２：１、例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１等である。
【０１０６】
患者に投与するための組成物中のＡｌ＋＋＋濃度は、好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌ等である。好ましい範囲は、０．３ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの間である。最大では、０．８５ｍｇ／用量が好ましい。
【０１０７】
リン酸アルミニウムが、特に、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ糖抗原を含む組成物中では、特に好ましく、典型的なアジュバントは、０．６ｍｇ  Ａｌ３＋／ｍｌで含まれる、０．８４〜０．９２の間のＰＯ４／Ａｌのモル比を有するアモルファスのヒドロキシリン酸アルミニウムである。低用量のリン酸アルミニウムを用いた吸着、例えば、１用量当たり５０μｇ〜ｌ００μｇの間のＡｌ３＋／結合体を使用することができる。組成物中に２つ以上の結合体がある場合、全ての結合体を吸着させる必要はない。
【０１０８】
（Ｂ．油性エマルジョン）
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した油性エマルジョン組成物には、スクアレン−水のエマルジョン、例として、ＭＦ５９がある［Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ〜の１０章（１９９５年）、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ、Ｐｌｅｎｕｍ；また、ＷＯ９０／１４８３７も参照されたい］（５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０および０．５％Ｓｐａｎ８５、マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロンの粒子に処方）。また、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）も使用することができる。
【０１０９】
種々の水中油型エマルジョンアジュバントが公知であり、それらは典型的には、少なくとも１つの油および少なくとも１つの界面活性剤を含み、これらの油（複数可）および界面活性剤（複数可）は、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。エマルジョン中の油滴は、一般に直径が５μｍ未満であり、理想的にはサブミクロンの直径を有し、これらの小さなサイズを、マイクロフルイダイザーを用いて達成して、安定なエマルジョンをもたらす。２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴が好ましい。これは、そのサイズの液滴には、フィルター滅菌を行うことができるからである。
【０１１０】
このエマルジョンは、油、例として、動物（魚等）供給源または植物供給源に由来する油を含むことができる。植物油の供給源は、木の実、種子および穀物を含む。落花生油、大豆油、ヤシ油およびオリーブ油が、最も一般に入手可能であり、木の実の油の典型例である。ホホバ油、例えば、ホホバ豆から得られたものを使用することができる。種子油は、紅花油、綿実油、サンフラワー種子油、ゴマ種子油等を含む。また、穀物群中、トウモロコシ油が最も容易に入手可能であるが、その他の穀草類の穀物の油、例として、コムギ、燕麦、ライ麦、米、テフ、ライコムギ等も使用することができる。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０個の炭素の脂肪酸エステルは、種子油中に天然には存在しないが、木の実油および種子油から出発する適切な材料の加水分解、分離およびエステル化により調製することができる。哺乳類の乳汁に由来する脂肪および油は、代謝可能であり、したがって、これらを、本発明の実施において使用することができる。動物供給源から純粋な油を得るのに必要な分離、精製、けん化およびその他の手段のための手順は、当技術分野で周知である。ほとんどの魚が、容易に収集することができる代謝可能な油を含有する。例えば、タラ肝臓油、サメ肝臓油、および鯨ろう等のクジラ油が、本明細書において使用することができる魚油のうちのいくつかの例である。いくつかの分枝鎖油が、５炭素イソプレン単位において生化学的に合成され、これらは一般に、テルペノイドと呼ばれる。サメ肝臓油は、スクアレンとして公知の分枝、不飽和テルペノイド、すなわち、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンを含有するが、これが、本明細書において特に好ましい。また、スクアラン、すなわち、スクアレンの飽和類似体も、好ましい油である。スクアレンおよびスクアランを含めて、魚油は、商業的供給元から容易に入手可能であり、または当技術分野で公知の方法により得てもよい。その他の好ましい油には、トコフェロールがある（以下を参照されたい）。油の混合物を使用することができる。
【０１１１】
界面活性剤を、それらの「ΗＬＢ」（親水性／新油性バランス）により分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは、少なくとも１５、より好ましくは、少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、界面活性剤と共に使用することができ、それらの界面活性剤として、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般に、Ｔｗｅｅｎと呼ばれる）、とりわけ、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０；ＤＯＷＦＡＸＴＭの商品名の下で販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、直鎖のＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；オクトキシノール、これらは、反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数を変化させることができ、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が、特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例として、ホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例として、ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭＮＰシリーズ；ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコールおよびオレイルアルコールから誘導されたポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知である）、例として、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）；ならびにソルビタンエステル（一般に、ＳＰＡＮとして公知である）、例として、ソルビタントリオレアート（Ｓｐａｎ８５）およびソルビタンモノラウレート。非イオン性界面活性剤が好ましい。エマルジョン中に含めるのに好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、Ｓｐａｎ８５（ソルビタントリオレアート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【０１１２】
界面活性剤の混合物、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５の混合物を使用することができる。また、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例として、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（Ｔｗｅｅｎ８０）と、オクトキシノール、例として、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）との組合せも適している。別の有用な組合せは、ラウレス９と、ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールとを含む。
【０１１３】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例として、Ｔｗｅｅｎ８０）、０．０１〜１％、特に、約０．１％；オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例として、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎシリーズ中のその他の洗剤）、０．００１〜０．１％、特に、０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例として、ラウレス９）、０．１〜２０％、好ましくは、０．１〜１０％、特に、０．１〜１％または約０．５％である。
【０１１４】
好ましいエマルジョンアジュバントは、＜１μｍ、例えば、≦７５０ｎｍ、≦５００ｎｍ、≦４００ｎｍ、≦３００ｎｍ、≦２５０ｎｍ、≦２２０ｎｍまたは≦２００ｎｍ以下の平均液滴サイズを有する。これらの液滴サイズは、マイクロフルイダイゼーション等の技法により好都合に達成することができる。
【０１１５】
本発明に関して有用である特定の水中油型エマルジョンアジュバントとして、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる。
【０１１６】
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０およびＳｐａｎ８５のサブミクロンエマルジョン。このエマルジョンの組成は、容積に関して、約５％スクアレン、約０．５％ポリソルベート８０および約０．５％Ｓｐａｎ８５であり得る。重量に関していうと、これらの比は、４．３％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０および０．４８％Ｓｐａｎ８５となる。このアジュバントは、「ＭＦ５９」として公知である（ＷＯ９０／１４８３７、ＰｏｄｄａおよびＤｅｌ  Ｇｉｕｄｉｃｅ（２００３年）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２巻：１９７〜２０３頁、Ｐｏｄｄａ（２００１年）Ｖａｃｃｉｎｅ  １９巻：２６７３〜２６８０頁；Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈの１０章（ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５年（ＩＳＢＮ  ０−３０６−４４８６７−Ｘ）、ならびにＶａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓの１２章（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｓｅｒｉｅｓの４２巻）、ＩＳＢＮ：１−５９２５９−０８３−７、Ｏ’Ｈａｇａｎ編に、より詳細に記載されている）。ＭＦ５９エマルジョンは、クエン酸イオン、例えば、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤を好都合に含む。
【０１１７】
・スクアレン、トコフェロールおよびＴｗｅｅｎ８０のエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝食塩水を含むことができる。また、これは、Ｓｐａｎ８５（例えば、１％）および／またはレシチンも含むことができる。これらのエマルジョンは、２〜１０％スクアレン、２〜１０％トコフェロールおよび０．３〜３％Ｔｗｅｅｎ８０を有することができ、スクアレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは、≦１である。これは、この重量比が、より安定なエマルジョンをもたらすからである。スクアレンおよびＴｗｅｅｎ８０は、約５：２の容積比で存在することができる。１つのそのようなエマルジョンを、Ｔｗｅｅｎ８０をＰＢＳ中に溶解させて、２％溶液を得、次いで、９０ｍｌのこの溶液を（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールと５ｍｌのスクアレンの）混合物と混合し、次いで、この混合物をマイクロフルイダイズすることによって作製することができる。得られたエマルジョンは、サブミクロンの油滴を有し得、例えば、平均直径が、１００ｎｍ〜２５０ｎｍの間、好ましくは、約１８０ｎｍである。
【０１１８】
・スクアレン、トコフェロールおよびＴｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）のエマルジョン。また、このエマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬも含むことができる（以下を参照されたい）。このエマルジョンは、リン酸緩衝剤を含有することができる。
【０１１９】
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、コハク酸α−トコフェロール）を含むエマルジョン。このエマルジョンは、これら３つ構成成分を、約７５：１１：１０の質量比（例えば、７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌのコハク酸α−トコフェロール）で含むことができ、これらの濃度は、抗原からの、これらの構成成分の任意の寄与を含むべきである。また、このエマルジョンは、スクアレンも含むことができる。また、このエマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬも含むことができる（以下を参照されたい）。この水相は、リン酸緩衝剤を含有することができる。
【０１２０】
・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭＬ１２１」）のエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４中に処方することができる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドのための有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−Ｉ」アジュバント中でスレオニル−ＭＤＰと共に使用されている（ＡｌｌｉｓｏｎおよびＢｙａｒｓ（１９９２年）、Ｒｅｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４３巻：５１９〜２５頁）（０．０５〜１％Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％スクアラン、２．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。また、これは、「ＡＦ」アジュバントの場合のように、Ｔｈｒ−ＭＤＰを用いずに使用することもできる（Ｈａｒｉｈａｒａｎら、（１９９５年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５巻：３４８６〜９頁）（５％スクアラン、１．２５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。
【０１２１】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンモノオレアート（ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）または「Ｓｐａｎ８０」等のソルビタンエステルまたはマンニドエステル）を含むエマルジョン。このエマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、かつ／または２００ｎｍ未満のサイズの（容積に関して）少なくとも９０％の油滴を有する（ＵＳ−２００７／０１４８０５）。また、このエマルジョンは、アルジトール、凍結保護剤（例えば、ドデシルマルトシドおよび／もしくはスクロース等の糖）、ならびに／またはアルキルポリグリコシドのうちの１つまたは複数も含むことができる。そのようなエマルジョンを、凍結乾燥することができる。
【０１２２】
・ＵＳ−２００７／０１４８０５．ｆの、スクアレン、ポロキサマー１０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン（Ｓｕｌｉら、（２００４年）、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２巻（２５〜２６号）：３４６４〜９頁）。アジュバント添加ワクチン中のこれらの構成成分の最終濃度（重量）は、５％スクアレン、４％ポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）および２％Ａｂｉｌ−Ｃａｒｅ８５（ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）である。
【０１２３】
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。ＷＯ９５／１１７００に記載されているように、好ましいリン脂質構成成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが好都合である。
【０１２４】
・非代謝型の油（軽油等）および少なくとも１つの界面活性剤（レシチン、Ｔｗｅｅｎ８０またはＳｐａｎ８０等）のサブミクロンの水中油型エマルジョン。添加剤、例として、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性物質の結合体（米国特許第６，０８０，７２５号に記載されている、脂肪族アミンを、グルクロン酸のカルボキシル基を介して、デスアシルサポニン（ｄｅｓａｃｙｌｓａｐｏｎｉｎ）に付加することによって産生されるＧＰＩ−０１００等）、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンを含めることができる。
【０１２５】
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）とステロール（例えば、コレステロール）とを、らせん状のミセルとして結合させたエマルジョン（ＷＯ２００５／０９７１８１）。
【０１２６】
・鉱油、非イオン性親油性エトキシル化脂肪アルコール、ならびに非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン（ＷＯ２００６／１１３３７３）。
【０１２７】
・鉱油、非イオン性親水性エトキシル化脂肪アルコール、ならびに非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン（Ｗｕら、（２００４年）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．６４巻（２号）：７９〜８３頁）。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、送達時に、エマルジョンを抗原と即席で混合することができ、したがって、これらのアジュバントおよび抗原を、パッケージまたは分配されたワクチン中で別個に保ち、使用時の最終的な処方に備えることができる。その他の実施形態では、製造の間に、エマルジョンを抗原と混合し、したがって、組成物は、液体の、アジュバントを添加した形態でパッケージされる。抗原は一般に、水性の形態をとり、したがって、ワクチンは、２つの液体を混合することによって最終的に調製する。混合のための２つの液体の容積比は、（例えば、５：１〜１：５の間で）変化させることができるが、一般に、約１：１である。特定のエマルジョンの構成成分の濃度を上記に示したが、これらの濃度は典型的には、無希釈の組成物についてであり、したがって、抗原溶液と混合すると、濃度は減少する。組成物を、使用前の即席の調製を意図し（例えば、構成成分が、凍結乾燥した形態で存在し）、キットとして提示する場合、このキットは、２つのバイアルを含んでもよく、または１つの充填済みシリンジと１つのバイアルを含んでおり、注射の前に、このシリンジの内容物を使用して、このバイアルの内容物を再活性化してもよい。
【０１２９】
組成物が、トコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、εまたはξトコフェロールのうちのいずれかを使用することができるが、α−トコフェロールが好ましい。このトコフェロールは、いくつかの形態、例えば、異なる塩および／または異性体をとることができる。塩には、有機塩、例として、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩等がある。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールの両方を使用することができる。トコフェロールは、高齢（例えば、年齢６０歳以上）の患者において使用するためのワクチン中に含ませると好都合である。これは、ビタミンＥが、この患者群において、免疫応答に対して正の作用を示すことが報告されていることによる（Ｈａｎら、（２００５年）、Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ  ｏｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｇｅｄ  ａｔ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、Ｉｍｍｕｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  ＥｕｒｏＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、Ｐａｒｉｓ、２００５年６月９〜１０日）。また、トコフェロールは、このエマルジョンの安定化を支援することができる抗酸化特性も有する（ＵＳ−６６３０１６１）。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールであり、このトコフェロールの好ましい塩は、コハク酸塩である。コハク酸塩は、インビボにおいてＴＮＦ関連リガンドと連携することが見出されている。
【０１３０】
（Ｃ．サポニン処方物（Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ〜の２２章（１９９５年）ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ、Ｐｌｅｎｕｍ））
また、サポニン処方物も、本発明においてアジュバントとして使用することができる。サポニンは、広い範囲の植物種の樹皮、葉、幹、根の中にも、花の中にさえも見出される、ステロール配糖体およびトリテルペノイド配糖体の異質性の群である。樹木Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの樹皮に由来するサポニンが、アジュバントとして広く研究されている。また、サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライズベール（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））およびＳａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（ソープルート（ｓｏａｐ  ｒｏｏｔ））からも商業的に得ることができる。サポニンアジュバント処方物は、精製処方物、例として、ＱＳ２１、および脂質処方物、例として、ＩＳＣＯＭを含む。ＱＳ２１は、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとして販売されている。
【０１３１】
サポニン組成物が、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製されている。これらの技法を使用して特定の精製された画分が同定されており、それらは、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃを含む。好ましくは、サポニンは、ＱＳ２１である。ＱＳ２１を生成する方法が、ＵＳ５，０５７，５４０に開示されている。また、サポニン処方物は、コレステロール等のステロールも含むことができる（ＷＯ９６／３３７３９）。
【０１３２】
サポニンとコレステロールとの組合せを使用して、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれている独特の粒子を形成することができる（Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ〜の２３章（１９９５年）、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ、Ｐｌｅｎｕｍ）。また、ＩＳＣＯＭは典型的には、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン等のリン脂質も含む。任意の公知のサポニンを、ＩＳＣＯＭ中で使用することができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１つまたは複数を含む。ＩＳＣＯＭは、ＰｏｄｄａおよびＤｅｌ  Ｇｉｕｄｉｃｅ（２００３年）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２巻：１９７〜２０３頁；Ｐｏｄｄａ（２００１年）、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９巻：２６７３〜２６８０頁；Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５年（ＩＳＢＮ  ０−３０６−４４８６７−Ｘ）；Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｓｅｒｉｅｓの４２巻）、ＩＳＢＮ：１−５９２５９−０８３−７、Ｏ’Ｈａｇａｎ編；ＡｌｌｉｓｏｎおよびＢｙａｒｓ（１９９２年）、Ｒｅｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４３巻：５１９〜２５頁；Ｈａｒｉｈａｒａｎら、（１９９５年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５巻：３４８６〜９頁；ＵＳ−２００７／０１４８０５；Ｓｕｌｉら、（２００４年）、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２巻（２５〜２６号）：３４６４〜９頁；ＷＯ９５／１１７００；米国特許第６，０８０，７２５号；ＷＯ２００５／０９７１８１；ＷＯ２００６／１１３３７３；Ｈａｎら、（２００５年）、Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ  ｏｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｇｅｄ  ａｔ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、Ｉｍｍｕｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  ＥｕｒｏＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、Ｐａｒｉｓ、２００５年６月９〜１０日；ＵＳ−６６３０１６１；ＵＳ５，０５７，５４０；ＷＯ９６／３３７３９；ＥＰ−Ａ−０１０９９４２；ならびにＷＯ９６／１１７１１にさらに記載されている。場合により、ＩＳＣＯＭは、追加の洗剤を欠いてもよい（ＷＯ００／０７６２１）。
【０１３３】
サポニンに基づいたアジュバントの開発の総説を、Ｂａｒｒら、（１９９８年）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３２巻：２４７〜２７１頁、およびＳｊｏｌａｎｄｅｒｅｔら、（１９９８年）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３２巻：３２１〜３３８頁に見出すことができる。
【０１３４】
（Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子）
また、ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）も、本発明においてアジュバントとして使用することができる。これらの構造は一般に、ウイルスに由来する１つまたは複数のタンパク質を含有し、これらのタンパク質は場合により、リン脂質と組み合わせられるかまたはリン脂質と共に処方される。ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）の構造は、一般に、非病原性、非複製性であり、一般に、自然のままのウイルスゲノムのいずれをも含有しない。ウイルスタンパク質は、組換えにより産生することも、全ウイルスから単離することもできる。ビロソームまたはＶＬＰ中で使用するのに適したこれらのウイルスタンパク質は、インフルエンザウイルス（ＨＡまたはＮＡ等）、Ｂ型肝炎ウイルス（コアタンパク質またはキャプシドタンパク質等）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡファージ、Ｑβファージ（コートタンパク質等）、ＧＡファージ、ｆｒファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１等）から誘導されたタンパク質を含む。ＶＬＰは、Ｎｉｉｋｕｒａら、（２００２年）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２９３巻：２７３〜２８０頁；Ｌｅｎｚら、（２００１年）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６巻：５３４６〜５３５５頁；Ｐｉｎｔｏら、（２００３年）、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １８８巻：３２７〜３３８頁；Ｇｅｒｂｅｒら、（２００１年）、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５巻：４７５２〜４７６０頁；ＷＯ０３／０２４４８０、およびＷＯ０３／０２４４８１にさらに論じられている。ビロソームは、例えば、Ｇｌｕｃｋら、（２００２年）、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０巻：Ｂ１０〜Ｂｌ６頁にさらに論じられている。
【０１３５】
（Ｅ．細菌または微生物の誘導体）
本発明において使用するのに適したアジュバントは、細菌または微生物の誘導体、例として、腸内細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）の無毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ならびにＡＤＰリボシル化毒素およびそれらの解毒された誘導体を含む。
【０１３６】
ＬＰＳの無毒性誘導体は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）を含む。３ｄＭＰＬは、４、５または６つのアシル化鎖を有する３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小粒子」の形態が、ＥＰ−Ａ−０６８９４５４に開示されている。３ｄＭＰＬのそのような「小粒子」は、０．２２μｍのメンブランを通して無菌ろ過するのに十分小さい（ＵＳ−６６３０１６１）。その他の無毒性ＬＰＳ誘導体は、モノホスホリルリピドＡ模倣物、例として、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体、例えば、ＲＣ−５２９を含む（Ｊｏｈｎｓｏｎら、（１９９９年）、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ９巻：２２７３〜２２７８頁；およびＥｖａｎｓら、（２００３年）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２巻：２１９〜２２９頁）。リピドＡ誘導体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来するリピドＡの誘導体、例として、ＯＭ−１７４を含む。ＯＭ−１７４は、例えば、Ｍｅｒａｌｄｉら、（２００３年）、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１巻：２４８５〜２４９１頁、およびＰａｊａｋら、（２００３年）、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１巻：８３６〜８４２頁に記載されている。
【０１３７】
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によりグアノシンに連結されている非メチル化シトシンを含有するジヌクレオチド配列）を含有するヌクレオチド配列を含む。また、回文構造配列またはポリ（ｄＧ）配列を含有する二本鎖のＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドも、免疫刺激性を示すことが示されている。
【０１３８】
ＣｐＧは、ヌクレオチドの改変体／類似体、例として、ホスホロチオエート改変体を含むことができ、二本鎖であってもまたは一本鎖であってもよい。Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、（２００３年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１巻：２３９３〜２４００頁、ＷＯ０２／２６７５７、およびＷＯ９９／６２９２３は、可能な類似体の置換、例えば、グアノシンを２’−デオキシ−７−デアザグアノシンで交換することを開示している。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント作用が、Ｋｒｉｅｇ、（２００３年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９巻：８３１〜８３５頁；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅら、（２００２年）、ＦＥＭＳ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、３２巻：１７９〜１８５頁；ＷＯ９８／４０１００；ＵＳ６，２０７，６４６；ＵＳ６，２３９，１１６、およびＵＳ６，４２９，１９９にさらに論じられている。
【０１３９】
ＣｐＧ配列、例として、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴは、ＴＬＲ９に向けられ得る（Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、（２００３年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３１巻（ｐａｒｔ  ３）：６５４〜６５８頁）。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ等のＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答を誘導するのに特異的であり得、またはＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮ等のＣｐＧ配列は、Ｂ細胞応答を誘導するのにより特異的であり得る。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら、（２００３年）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０巻：４０６１〜４０６８頁；Ｋｒｉｅｇ、（２００２年）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３巻：６４〜６５頁；およびＷＯ０１／９５９３５に論じられている。好ましくは、ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。
【０１４０】
好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、その５’末端が、受容体認識のために接近しやすいように構築される。場合により、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を、それらの３’末端で結合させて、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成してもよい。例えば、Ｇｌｕｃｋら、（２００２年）、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０巻：Ｂ１０〜Ｂ１６頁；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、（２００３年）、ＢＢＲＣ  ３０６巻：９４８〜９５３頁；Ｂｈａｇａｔら、（２００３年）、ＢＢＲＣ  ３００巻：８５３〜８６１頁；およびＷＯ０３／０３５８３６を参照されたい。
【０１４１】
有用なＣｐＧアジュバントは、ＣｐＧ７９０９であり、これはまた、ＰｒｏＭｕｎｅＴＭ（Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても公知である。別の有用なＣｐＧアジュバントは、ＣｐＧ１８２６である。ＣｐＧ配列の使用に代わってまたは加えて、ＴｐＧ配列も使用することができ（ＷＯ０１／２２９７２）、これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含有しなくてよい。この免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ピリミジンに富む場合がある。例えば、この免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、２つ以上の連続したチミジンヌクレオチドを含んでもよく（例えば、Ｐａｊａｋら、（２００３年）、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１巻：８３６〜８４２頁に開示されているようなＴＴＴＴ）、および／または＞２５％（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％等）のチミジンを有するヌクレオチド組成を有してもよい。例えば、この免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、２つ以上の連続したシトシンヌクレオチドを含んでもよく（例えば、Ｐａｊａｋら、（２００３年）、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１巻：８３６〜８４２頁に開示されているようなＣＣＣＣ）、および／または＞２５％（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％等）のシトシンを有するヌクレオチド組成を有してもよい。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含有しなくてよい。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは典型的には、少なくとも２０個のヌクレオチドを含む。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１００個未満のヌクレオチドを含むことができる。
【０１４２】
特に有用な、免疫刺激性オリゴヌクレオチド等に基づいたアジュバントは、ＩＣ−３１ＴＭとして公知である（Ｓｃｈｅｌｌａｃｋら、（２００６年）、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４巻：５４６１〜７２頁）。したがって、本発明と共に使用するアジュバントは、（ｉ）少なくとも１つ（好ましくは、複数）のＣｐＩモチーフ（すなわち、ジヌクレオチドを形成するためにイノシンに連結されているシトシン）を含むオリゴヌクレオチド（例えば、１５個〜４０個の間のヌクレオチド）と、（ｉｉ）ポリカチオン性ポリマー、例として、少なくとも１つ（好ましくは、複数）のＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列（複数可）を含むオリゴペプチド（例えば、５個〜２０個の間のアミノ酸）との混合物を含むことができる。このオリゴヌクレオチドは、２６ｍｅｒの配列５’−（ＩＣ）１３−３’を含むデオキシヌクレオチドであり得る。このポリカチオン性ポリマーは、１１ｍｅｒのアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫを含むペプチドであり得る。
【０１４３】
細菌のＡＤＰリボシル化毒素およびそれらの解毒された誘導体を、本発明においてアジュバントとして使用することができる。好ましくは、このタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉの熱に不安定なエンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）から誘導される。解毒されたＡＤＰリボシル化毒素の使用が、粘膜アジュバントとして、ＷＯ９５／１７２１１に、非経口アジュバントとして、ＷＯ９８／４２３７５に記載されている。この毒素またはトキソイドは、好ましくは、ホロ毒素の形態をとり、ＡサブユニットおよびＢサブユニットの両方を含む。好ましくは、Ａサブユニットは、解毒性の変異を含有し、好ましくは、Ｂサブユニットは、変異していない。好ましくは、このアジュバントは、解毒されたＬＴ変異体、例として、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２およびＬＴ−Ｇ１９２である。ＡＤＰリボシル化毒素およびそれらの解毒された誘導体、特に、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の、アジュバントとしての使用を、Ｂｅｉｇｎｏｎら、（２００２年）、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７０巻：３０１２〜３０１９頁；Ｐｉｚｚａら、（２００１年）、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９巻：２５３４〜２５４１頁；Ｐｉｚｚａら、（２０００年）、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２９０巻：４５５〜４６１頁；Ｓｃｈａｒｔｏｎ−Ｋｅｒｓｔｅｎら、（２０００年）、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６８巻：５３０６〜５３１３頁；Ｒｙａｎら、（１９９９年）、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６７巻：６２７０〜６２８０頁；Ｐａｒｔｉｄｏｓら、（１９９９年）、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ６７巻：２０９〜２１６頁；Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉら、（２００３年）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２巻：２８５〜２９３頁；およびＰｉｎｅら、（２００２年）、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ８５巻：２６３〜２７０頁に見出すことができる。
【０１４４】
有用なＣＴ変異体は、ＣＴ−Ｅ２９Ｈである（Ｔｅｂｂｅｙら、（２０００年）、Ｖａｃｃｉｎｅ  １８巻：２７２３〜３４頁）。アミノ酸置換の参照番号は、好ましくは、Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉら、（１９９５年）、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １５巻：１１６５〜１１６７頁に記載されているＡＤＰリボシル化毒素のＡサブユニットおよびＢサブユニットのアラインメントに基づく。この文献はその全体が具体的に参照により本明細書に組み込まれている。
【０１４５】
（Ｆ．ヒト免疫調節物質）
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したヒト免疫調節物質は、サイトカイン、例として、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ＷＯ９９／４０９３６）等）（ＷＯ９９／４４６３６）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子を含む。好ましい免疫調節物質は、ＩＬ−１２である。
【０１４６】
（Ｇ．生体接着性物質および粘膜接着性物質）
また、生体接着性物質および粘膜接着性物質も、本発明においてアジュバントとして使用することができる。適切な生体接着性物質は、エステル化されたヒアルロン酸のマイクロスフェア（Ｓｉｎｇｈら、（２００１年）、Ｊ  Ｃｏｎｔ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７０巻：２６７〜２７６頁）、または粘膜接着性物質、例として、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｐｙｒｏｌｌｉｄｏｎｅ）、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋結合させた誘導体を含む。また、キトサンおよびその誘導体も、本発明においてアジュバントとして使用することができる（ＷＯ９９／２７９６０）。
【０１４７】
（Ｈ．微小粒子）
また、微小粒子も、本発明においてアジュバントとして使用することができる。生分解性かつ無毒性である材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトン等（ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）が好ましい））から形成された微小粒子（すなわち、約１００ｎｍ〜約１５０μｍの直径、より好ましくは、約２００ｎｍ〜約３０μｍの直径、最も好ましくは、約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径の粒子）を、場合により処理して、（例えば、ＳＤＳを用いて）負に荷電した表面、または（例えば、カチオン性洗剤、例として、ＣＴＡＢを用いて）正に荷電した表面をもたせる。
【０１４８】
（Ｉ．リポソーム（Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ〜の１３章および１４章（１９９５年）、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ、Ｐｌｅｎｕｍ））
アジュバントとして使用するのに適したリポソーム処方物の例が、ＵＳ６，０９０，４０６；ＵＳ５，９１６，５８８；およびＥＰ−Ａ−０６２６１６９に記載されている。
【０１４９】
（Ｊ．ポリオキシエチレンエーテル処方物およびポリオキシエチレンエステル処方物）
本発明において使用するのに適したアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルを含む（ＷＯ９９／５２５４９）。そのような処方物は、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７）、および少なくとも１つの追加の非イオン性界面活性剤、例として、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤またはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤をさらに含む（ＷＯ０１／２１１５２）。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１５０】
（Ｋ．ホスファゼン）
ホスファゼン、例えば、Ａｎｄｒｉａｎｏｖら、（１９９８年）、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９巻：１０９〜１１５頁、およびＰａｙｎｅら、（１９９８年）、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗ  ３１巻：１８５〜１９６頁に記載されているようなポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）等を使用することができる。
【０１５１】
（Ｌ．ムラミルペプチド）
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したムラミルペプチドの例として、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【０１５２】
（Ｍ．イミダゾキノロン化合物）
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したイミダゾキノロン化合物の例として、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ（「Ｒ−８３７」）（ＵＳ４，６８０，３３８；ＵＳ４，９８８，８１５）、Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（「Ｒ−８４８」）（ＷＯ９２／１５５８２）、ならびにそれらの類似体およびそれらの塩（例えば、塩酸塩）が挙げられる。免疫刺激性のイミダゾキノリンについてのさらなる詳述を、Ｓｔａｎｌｅｙ、（２００２年）、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２７巻：５７１〜５７７頁；Ｗｕら、（２００４年）、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．、６４巻（２号）：７９〜８３頁；Ｖａｓｉｌａｋｏｓら、（２０００年）、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０４巻（１号）：６４〜７４頁；米国特許第４６８９３３８号、同第４９２９６２４号、同第５２３８９４４号、同第５２６６５７５号、同第５２６８３７６号、同第５３４６９０５号、同第５３５２７８４号、同第５３８９６４０号、同第５３９５９３７号、同第５４８２９３６号、同第５４９４９１６号、同第５５２５６１２号、同第６０８３５０５号、同第６４４０９９２号、同第６６２７６４０号、同第６６５６９３８号、同第６６６０７３５号、同第６６６０７４７号、同第６６６４２６０号、同第６６６４２６４号、同第６６６４２６５号、同第６６６７３１２号、同第６６７０３７２号、同第６６７７３４７号、同第６６７７３４８号、同第６６７７３４９号、同第６６８３０８８号、同第６７０３４０２号、同第６７４３９２０号、同第６８００６２４号、同第６８０９２０３号、同第６８８８０００号および同第６９２４２９３号；ならびにＪｏｎｅｓ、（２００３年）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ４巻：２１４〜２１８頁に見出すことができる。
【０１５３】
（Ｎ．置換されている尿素）
アジュバントとして有用な置換されている尿素として、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物、またはそれらの塩が挙げられる。
【０１５４】
【化１】
2012519482.tif 000007
これらは、ＷＯ０３／０１１２２３に定義されており、例えば、「ΕＲ８０３０５８」、「ＥＲ８０３７３２」、「ΕＲ８０４０５３」、「ＥＲ８０４０５８」、「ＥＲ８０４０５９」、「ΕＲ８０４４４２」、「ΕＲ８０４６８０」、「ＥＲ８０４７６４」、「ＥＲ８０３０２２」または「ΕＲ８０４０５７」が挙げられ、例として、
【０１５５】
【化２】
2012519482.tif 000008
がある。
【０１５６】
（Ｏ．さらなるアジュバント）
本発明と共に使用することができるさらなるアジュバントとして、以下のものが挙げられる。
【０１５７】
・アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体、例として、ＲＣ−５２９（Ｊｏｈｎｓｏｎら、（１９９９年）、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ９巻：２２７３〜２２７８頁；Ｅｖａｎｓら、（２００３年）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２巻：２１９〜２２９頁）。
【０１５８】
・チオセミカルバゾン化合物、例として、ＷＯ２００４／０６０３０８に開示されているもの。また、処方、製造および活性化合物についてのスクリーニングの方法も、Ｂｈａｇａｔら、（２００３年）、ＢＢＲＣ  ３００巻：８５３〜８６１頁に記載されている。これらのチオセミカルバゾンは、ヒト末梢血単核球を刺激して、サイトカイン、例として、ＴＮＦ−αを産生させるのに特に有効である。
【０１５９】
・トリプタントリン化合物、例として、ＷＯ２００４／０６４７５９に開示されているもの。また、処方、製造および活性化合物についてのスクリーニングの方法も、ＷＯ０３／０３５８３６に記載されている。これらのチオセミカルバゾンは、ヒト末梢血単核球を刺激して、サイトカイン、例として、ＴＮＦ−αを産生させるのに特に有効である。
【０１６０】
・ヌクレオシド類似体、例として、（ａ）イサトラビン（Ｉｓａｔｏｒａｂｉｎｅ）（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：
【０１６１】
【化３】
2012519482.tif 000009
およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）ＵＳ６，９２４，２７１，ＵＳ２００５／００７０５５６およびＵＳ５，６５８，７３１に開示されている化合物、ロキソリビン（ｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）（７−アリル−８−オキソグアノシン）（米国特許第第５，０１１，８２８号）。
【０１６２】
・ＷＯ２００４／８７１５３に開示されている化合物、それらとして、アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドロイソキノリン（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒａｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物（ＵＳ６，６０５，６１７、ＷＯ０２／１８３８３）、ヒドロフタルアミド（Ｈｙｄｒａｐｔｈａｌａｍｉｄｅ）化合物、ベンゾフェノン化合物、イソキサゾール化合物、ステロール化合物、キナゾリノン化合物（Ｑｕｉｎａｚｉｌｉｎｏｎｅ）、ピロール化合物（ＷＯ２００４／０１８４５５）、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラゾロピリミジン（Ｐｙｒａｚａｌｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）化合物、およびベンザゾール化合物（ＷＯ０３／０８２２７２）が挙げられる。
【０１６３】
・リン酸含有非環式骨格に連結されている脂質を含有する化合物、例として、ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４（Ｗｏｎｇら、（２００３年）、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４３巻（７号）：７３５〜４２頁；ＵＳ２００５／０２１５５１７）。
【０１６４】
・ポリオキシドニウムポリマー（Ｄｙａｋｏｎｏｖａら、（２００４年）、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４巻（１３号）：１６１５〜２３頁；ＦＲ−２８５９６３３）、またはその他のＮ−酸化ポリエチレン−ピペラジン誘導体。
【０１６５】
・メチルイノシン５’−モノホスフェート（「ＭＩＭＰ」）（ＳｉｇｎｏｒｅｌｌｉおよびＨａｄｄｅｎ、（２００３年）、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３巻（８号）：１１７７〜８６頁）。
【０１６６】
・ポリヒドロキシル化（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｌａｔｅｄ）ピロリジジン化合物（ＷＯ２００４／０６４７１５）、例として、以下の式を有するもの、またはその薬学的に許容できる塩もしくは誘導体：
【０１６７】
【化４】
2012519482.tif 000010
｛式中、Ｒは、水素、直鎖状もしくは分枝、未置換もしくは置換、飽和もしくは不飽和のアシル基、アルキル（例えば、シクロアルキル）基、アルケニル基、アルキニル基およびアリール基を含む群から選択される｝。例として、これらに限定されないが、カスアリン、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリン等が挙げられる。
【０１６８】
・ＣＤ１ｄリガンド、例として、α−グリコシルセラミド（Ｄｅ  Ｌｉｂｅｒｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００５年、５巻：４８５〜４９６頁；米国特許第５，９３６，０７６号；Ｏｋｉら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．、１１３巻：１６３１〜１６４０頁；ＵＳ２００５／０１９２２４８；Ｙａｎｇら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ、２００４年、４３巻：３８１８〜３８２２頁；ＷＯ２００５／１０２０４９；Ｇｏｆｆら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｓｏｃ．、２００４年、１２６巻：１３６０２〜１３６０３頁；ＷＯ０３／１０５７６９）、例えば、α−ガラクトシルセラミド、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオール］、ＣＲＯＮＹ−１０１、３’’−Ｏ−スルホ−ガラクトシルセラミド等。
【０１６９】
・ガンマイヌリン（Ｃｏｏｐｅｒ、（１９９５年）、Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６巻：５５９〜８０頁）またはその誘導体、例として、アルガムリン（ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ）。
【０１７０】
【化５】
2012519482.tif 000011
（アジュバントの組合せ）
また、本発明は、上記で同定したアジュバントのうちの１つまたは複数の態様の組合せを含むこともできる。例えば、以下のアジュバント組成物を、本発明において使用することができる：（１）サポニンと水中油型エマルジョン（ＷＯ９９／１１２４１）；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）（ＷＯ９４／００１５３）；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（場合により、＋ステロール）（ＷＯ９８／５７６５９）；（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組合せ（欧州特許出願第０８３５３１８号、第０７３５８９８号および第０７６１２３１号）；（６）ＳＡＦ、１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０ＴＭ、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有し、マイクロフルイダイズしたサブミクロンのエマルジョンまたはボルテックスして生成したより大きな粒子サイズのエマルジョンのいずれか。（７）ＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）、２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリルリピド（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１つまたは複数の細菌細胞壁構成成分、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）を含有する；さらに（８）１つまたは複数のミネラル塩（例として、アルミニウム塩）＋ＬＰＳの無毒性の誘導体（例として、３ｄＭＰＬ）。いくつかの実施形態では、毒素（例えば、ＬＴＫ６３）と免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧ）との組合せを使用する。いくつかの実施形態では、エマルジョン（例えば、モンタニド（ｍｏｎｔａｎｉｄｅ））と免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧ）との組合せを使用する。
【０１７１】
免疫刺激剤として作用するその他の物質が、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎの７章、（１９９５年）、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ、Ｐｌｅｎｕｍに開示されている。
【０１７２】
水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムのアジュバントの使用が特に好ましく、一般に、抗原をこれらの塩に吸着させる。リン酸カルシウムは、別の好ましいアジュバントである。その他の好ましいアジュバントの組合せとして、Ｔｈ１アジュバントとＴｈ２アジュバント、例として、ＣｐＧとミョウバン、またはｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄとミョウバンとの組合せが挙げられる。リン酸アルミニウムと３ｄＭＰＬとの組合せを使用することができる。
【０１７３】
熱安定性を改善するために、組成物は、温度保護剤を含むことができる。この構成成分は、アジュバント添加組成物（特に、ミネラルアジュバント、例として、アルミニウム塩を含有する組成物）中で特に有用であり得る。ＷＯ２００６／１１０６０３に記載されているように、液体の温度保護剤を、水性ワクチン組成物に添加して、その凝固点を下げる、例えば、その凝固点を０℃未満まで低下させることができる。したがって、組成物を、０℃未満であるが、その凝固点超で保存して、熱分解を阻害することができる。また、温度保護剤により、組成物を凍結させても、ミネラル塩アジュバントを凍結および解凍の後の凝集または沈降から保護することが可能になり、また、高温、例えば、４０℃超においても組成物を保護することができる。液体の温度保護剤が、最終混合物の１〜８０容積％を形成するように、最初の水性ワクチンと液体の温度保護剤とを混合することができる。適切な温度保護剤は、ヒトへの投与に安全であり、水に対して容易に混和性／溶解性であるべきであり、組成物中のその他の構成成分（例えば、抗原およびアジュバント）を傷めてはならない。例として、グリセリン、プロピレングリコールおよび／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。適切なＰＥＧは、２００〜２０，０００Ｄａの範囲に及ぶ平均分子量を有し得る。好ましい実施形態では、ポリエチレングリコールは、約３００Ｄａの平均分子量を有し得る（「ＰＥＧ−３００」）。
【０１７４】
本発明は、（ｉ）１つまたは複数の本発明のタンパク質および（ｉｉ）温度保護剤を含む免疫原性組成物を提供する。この組成物は、（ｉ）１つまたは複数の本発明のタンパク質を含む水性組成物と、（ｉｉ）温度保護剤とを混合することによって形成することができる。次いで、この混合物を、例えば、０℃未満、０〜２０℃、２０〜３５℃、または３５〜５５℃以上で保存することができる。この混合物は、液体の形態または凍結した形態で保存することができる。この混合物は、凍結乾燥することができる。あるいは、組成物は、（ｉ）１つまたは複数の本発明のタンパク質を含む乾燥した組成物と、（ｉｉ）温度保護剤を含む液体組成物とを混合することによって形成することもできる。したがって、構成成分（ｉｉ）を使用して、構成成分（ｉ）を再構成することができる。
【０１７５】
本発明の組成物は、細胞媒介型免疫応答および体液性免疫応答のいずれかまたは両方を誘発することができる。この免疫応答は、好ましくは、持続性の（例えば、中和）抗体、およびクラミジアへの曝露に際して素早く応答することができる細胞媒介型免疫を誘導する。
【０１７６】
２つの型のＴ細胞、すなわち、ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞が一般に、細胞媒介型免疫および体液性免疫を開始および／または増強するのに必要であると考えられている。ＣＤ８Ｔ細胞は、ＣＤ８共受容体を発現することができ、一般に、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と呼ばれる。ＣＤ８Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子上に示される抗原を認識し、またはそれらと相互作用することができる。
【０１７７】
ＣＤ４Ｔ細胞は、ＣＤ４共受容体を発現することができ、一般に、Ｔヘルパー細胞と呼ばれる。ＣＤ４Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合している抗原性ペプチドを認識することができる。ＣＤ４細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用すると、サイトカイン等の因子を分泌することができる。これらの分泌されたサイトカインは、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、および免疫応答に関与するその他の細胞を活性化することができる。ヘルパーＴ細胞またはＣＤ４＋細胞は、２つの機能的に明確に異なるサブセット、すなわち、ＴＨ１表現型およびＴＨ２表現型にさらに分けることができ、これらの表現型は、それらのサイトカインおよびエフェクターの機能の点で異なる。
【０１７８】
活性化されたＴＨ１細胞は、（抗原特異的ＣＴＬの産生の増加を含めて）細胞性免疫を増強し、したがって、細胞内感染に対する応答において特に価値がある。活性化されたＴＨ１細胞は、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦ−βのうちの１つまたは複数を分泌することができる。ＴＨ１免疫応答の結果、マクロファージ、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性化により、局所炎症反応が生じ得る。また、ＴＨ１免疫応答は、ＩＬ−１２によるＢ細胞およびＴ細胞の増殖を刺激することによって、免疫応答を拡大するように作用することもできる。ＴＨ１により刺激されたＢ細胞は、ＩｇＧ２ａを分泌することができる。
【０１７９】
活性化されたＴＨ２細胞は、抗体産生を増強し、したがって、細胞外感染に対する応答において価値がある。活性化されたＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０のうちの１つまたは複数を分泌することができる。ＴＨ２免疫応答の結果、ＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび将来の防御のためのメモリーＢ細胞が生じ得る。
【０１８０】
免疫応答の増強は、ＴＨ１免疫応答の増強およびＴＨ２免疫応答の増強のうちの１つまたは複数を含むことができる。
【０１８１】
ＴＨ１免疫応答は、ＣＴＬの増加、ＴＨ１免疫応答と関連があるサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦ−β等）のうちの１つもしくは複数の増加、活性化されたマクロファージの増加、ＮＫ活性の増加、またはＩｇＧ２ａ産生の増加のうちの１つまたは複数を含むことができる。好ましくは、ＴＨ１免疫応答の増強は、ＩｇＧ２ａ産生の増加を含む。
【０１８２】
ＴＨ１免疫応答を、ＴＨ１アジュバントを使用して誘発することができる。ＴＨ１アジュバントは一般に、アジュバントなしでの抗原の免疫化と比べて、ＩｇＧ２ａの産生レベルの増加を誘発する。本発明において使用するのに適したＴＨ１アジュバントは、例えば、サポニン処方物、ビロソームおよびウイルス様粒子、腸内細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）の無毒性誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含むことができる。本発明において使用するためには、ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチド等の免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、好ましいＴＨ１アジュバントである。
【０１８３】
ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２免疫応答と関連があるサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０等）のうちの１つもしくは複数の増加、またはＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびメモリーＢ細胞の産生の増加のうちの１つまたは複数を含むことができる。好ましくは、ＴＨ２免疫応答の増強は、ＩｇＧ１産生の増加を含む。
【０１８４】
ＴＨ２免疫応答を、ＴＨ２アジュバントを使用して誘発することができる。ＴＨ２アジュバントは一般に、アジュバントなしでの抗原の免疫化と比べて、ＩｇＧ１の産生レベルの増加を誘発する。本発明において使用するのに適したＴＨ２アジュバントは、例えば、ミネラル含有組成物、油性エマルジョン、ならびにＡＤＰリボシル化毒素およびそれらの解毒された誘導体を含む。本発明において使用するためには、アルミニウム塩等のミネラル含有組成物が、好ましいＴＨ２アジュバントである。
【０１８５】
好ましくは、本発明は、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントとの組合せを含む組成物を含む。好ましくは、そのような組成物は、アジュバントなしでの免疫化と比べて、ＴＨ１応答の増強およびＴＨ２応答の増強、すなわち、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの両方の産生の増加を誘発する。さらにより好ましくは、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントとの組合せを含む組成物は、単一のアジュバントを用いた免疫化と比べて（すなわち、ＴＨ１アジュバントのみを用いた免疫化またはＴＨ２アジュバントのみを用いた免疫化と比べて）、ＴＨ１免疫応答の増加および／またはＴＨ２免疫応答の増加を誘発する。
【０１８６】
免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２応答の一方または両方であってよい。好ましくは、免疫応答は、ＴＨ１応答の増強およびＴＨ２応答の増強の一方または両方をもたらす。好ましくは、免疫応答は、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２および／またはＩｇＧＡの産生の増加を含む。
【０１８７】
好ましくは、本発明を使用して、全身性免疫および／または粘膜免疫を誘発する。増強される免疫応答は、全身性免疫応答および粘膜免疫応答の一方または両方であってよい。好ましくは、免疫応答は、全身性免疫応答の増強および粘膜免疫応答の増強の一方または両方をもたらす。好ましくは、粘膜免疫応答は、ＴＨ２免疫応答である。好ましくは、粘膜免疫応答は、ＩｇＡ産生の増加を含む。
【０１８８】
（処置方法およびワクチン投与）
また、本発明は、哺乳動物において免疫応答を生じさせるための方法も提供し、この方法は、本発明のタンパク質、抗体、核酸、ベクター、宿主細胞または組成物の有効量を投与するステップを含む。免疫応答は、好ましくは、防御的であり、これには、好ましくは、抗体および／または細胞媒介型免疫が関与する。この方法は、追加免疫応答を生じさせることができる。
【０１８９】
また、本発明は、薬物として使用するための、例えば、哺乳動物において免疫応答を生じさせることにおいて使用するための、上記で定義したタンパク質または組合せも提供する。
【０１９０】
また、本発明は、哺乳動物において免疫応答を生じさせるための薬物の製造における、本発明のタンパク質または組合せの使用も提供する。これらの使用および方法により、哺乳動物において免疫応答を生じさせることによって、哺乳動物を、クラミジア感染から防御することができる。より具体的には、哺乳動物を、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓから防御することができる。本発明は、種々の異なる血清型のクラミジアに対して有効であるが、血清型Ｄの株によるクラミジア感染により生じた疾患から防御するのに特に有用であり得る。
【０１９１】
したがって、さらなる態様によれば、本発明はまた、薬物（例えば、ワクチン）または診断試薬として使用するための、本発明による核酸、タンパク質、抗体、ベクターまたは宿主細胞も提供する。一実施形態では、このタンパク質、核酸または抗体を、哺乳動物において、クラミジア（好ましくは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）感染の処置、予防または診断のために使用する。また、本発明は、患者（好ましくは、哺乳動物）において、クラミジア感染（好ましくは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染）を、処置、予防または診断する方法も提供し、この方法は、本発明の核酸、タンパク質または抗体の治療有効量を投与するステップを含む。
【０１９２】
好ましくは、本発明による核酸、タンパク質または抗体は、クラミジア感染または関連の状態（例えば、トラコーマ、失明、子宮頚管炎、骨盤の炎症性疾患、不妊、子宮外妊娠、慢性骨盤痛、卵管炎、尿道炎、精巣上体炎、乳児肺炎、子宮頚部扁平上皮癌等）、好ましくは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染の処置または予防のためのものである。この免疫原性組成物は、それに加えてまたはそれに代わって、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対しても有効であり得る。
【０１９３】
哺乳動物は、好ましくは、ヒトである。このワクチンを予防のために使用する場合、ヒトは、好ましくは、小児（例えば、幼児もしくは乳児）または十代の若者であり；このワクチンを治療のために使用する場合、ヒトは、好ましくは、十代の若者または成人である。また、小児を意図するワクチンを成人に投与して、例えば、安全性、投与量、免疫原性等を評価することもできる。したがって、ヒト患者は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。ワクチンを投与するのが好ましい患者は、思春期の人々、十代の若者、性的に活動的な人々、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、好ましくは、≧６５歳）、若年者（例えば、≦５歳）、入院患者、医療従事者、軍部および軍事の関係者、妊婦、慢性疾患患者または免疫不全患者である。しかし、これらのワクチンは、これらの群に限って適切であるわけではなく、集団においてより一般的に使用することができる。
【０１９４】
本発明により産生するワクチンは、その他のワクチンと実質的に同時に（例えば、医療専門家またはワクチン接種センターへの医学的な相談または訪問と同時に）、例えば、ヒトパピローマウイルスワクチン、例として、ＣｅｒｖａｒｉｘＴＭもしくはＧａｒｄａｓｉｌＴＭ；破傷風ワクチン、ジフテリアワクチンおよび無細胞百日咳ワクチン、例として、ＴＤａＰ、ＤＴａＰまたはＢｏｏｓｔｒｉｘＴＭ；風疹ワクチン、例として、ＭＭＲ；または結核（ｔｕｂｅｒｃｏｌｏｓｉｓ）ワクチン、例として、ＢＣＧと実質的に同時に、患者に投与することができる。本発明により産生するワクチンと実質的に同時に投与することができるその他のワクチンの例は、麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型ワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合型ワクチン（例として、四価のＡ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、ＲＳウイルスワクチン等である。
【０１９５】
好ましい実施形態では、本発明のタンパク質を使用して、野生型クラミジアタンパク質、例えば、野生型クラミジアのＣＴ７３３、ＣＴ１５３、ＣＴ６０１、ＣＴ２７９、ＣＴ４４３、ＣＴ３７２、ＣＴ４５６、ＣＴ３８１、ＣＴ２５５、ＣＴ３４１、ＣＴ７１６、ＣＴ７４５、ＣＴ３８７、ＣＴ８１２、ＣＴ８６９、ＣＴ１６６、ＣＴ１７５、ＣＴ１６３、ＣＴ２１４、ＣＴ７２１、ＣＴ１２７、ＣＴ０４３、ＣＴ６００および／またはＣＴ８２３のうちの１つまたは複数、例えば、野生型クラミジアのＣＴ７３３、ＣＴ１５３、ＣＴ６０１、ＣＴ２７９、ＣＴ４４３、ＣＴ３７２、ＣＴ４５６および／またはＣＴ３８１のうちの１つまたは複数の活性を中和することができる抗体を誘発する。中和抗体を、感染性ＥＢが発現する自然のままのクラミジアタンパク質の活性を中和することができるワクチンとして使用することができる。一実施形態では、本発明のタンパク質を使用して、クラミジアの感染性および／またはビルレンスを中和することができる抗体を誘発する。したがってまた、本発明は、野生型クラミジアタンパク質ならびに／またはクラミジアの感染性および／もしくはビルレンスを中和するための、本発明の抗体も提供する。
【０１９６】
また、本発明は、（ｉ）細菌感染を処置もしくは予防するための薬物；（ｉｉ）細菌もしくは細菌に対して産生された抗体の存在を検出するための診断試薬；および／または（ｉｉｉ）細菌に対する抗体を産生することができる試薬の製造における本発明の核酸、タンパク質または抗体の使用も提供する。前記細菌は、好ましくは、クラミジア、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓまたはＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅであるが、好ましくは、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓである。
【０１９７】
また、クラミジア感染を診断するための方法も提供し、この方法は、
（ａ）本発明のタンパク質に対する抗体を産生させるステップと、
（ｂ）抗体−抗原の複合体の形成に適した条件下で、ステップ（ａ）の抗体を、クラミジアに感染していることが疑われる生物学的試料と接触させるステップと
（ｃ）前記複合体を検出するステップであって、前記複合体の検出が、クラミジア感染を示すステップと
を含む。
【０１９８】
また、クラミジア感染を診断するための方法も提供し、この方法は、（ａ）抗体−抗原の複合体の形成に適した条件下で、本発明のタンパク質に対して産生させた抗体を、クラミジアに感染していることが疑われる生物学的試料と接触させるステップと、（ｂ）前記複合体を検出するステップであって、前記複合体の検出が、クラミジア感染を示すステップとを含む。
【０１９９】
本発明のタンパク質をイムノアッセイ中で使用して、抗体レベルを検出することができる（または逆に、本発明の抗体を使用して、タンパク質レベルを検出することもできる）。十分に定義された組換え抗原に基づくイムノアッセイを開発して、侵襲性の診断方法にとって代わることができる。例えば、血液試料または血清試料を含めた、生物学的試料内の、タンパク質に対する抗体を検出することができる。イムノアッセイの設計には、多様な形態が存在し、これらの多様性については、当技術分野で公知である。イムノアッセイのためのプロトコールは、例えば、競合もしくは直接的な反応またはサンドイッチ型アッセイに基づくことができる。また、プロトコールは、例えば、固体の支持体を使用してもよく、または免疫沈降によってもよい。ほとんどのアッセイには、標識化した抗体またはポリペプチドの使用が関与し、これらの標識は、例えば、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識または色素分子標識であり得る。また、プローブからのシグナルを増幅するアッセイも公知であり、それらの例が、ビオチンとアビジンとを活用するアッセイ、ならびに酵素により標識および媒介されるイムノアッセイ、例として、ＥＬＩＳＡアッセイである。
【０２００】
適切な容器中の、本発明の組成物を含めた、適切な材料を、アッセイの実施に必要な残りの試薬および材料（例えば、適切な緩衝剤、塩溶液等）ならびに適切な一連のアッセイの指示書と併せてパッケージすることによって、免疫診断に適した、適切な標識化試薬を含有するキットを作り上げる。
【０２０１】
（組成物の有効性の試験）
本発明の免疫原性組成物の有効性を、宿主、例えば、ヒトに投与する前に、インビトロおよびインビボの動物モデルにおいて評価することができる。例えば、Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、（１９８８年）によるインビトロにおける中和は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに対して作られたワクチン組成物を試験するのに適している。
【０２０２】
治療処置の有効性を調べる１つの方法は、本発明の組成物の投与後に、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染をモニターすることを含む。予防処置の有効性を調べる１つの方法は、本発明の組成物中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗原に対する免疫応答を、組成物の投与後に、全身（例として、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの産生レベルのモニタリング）ならびに粘膜（例として、ＩｇＡ産生レベルのモニタリング）の両方の面からモニターすることを含む。典型的には、血清クラミジア特異的抗体応答は、チャレンジ前ではなく免疫化後に決定し、一方、粘膜クラミジア特異的抗体応答は、免疫化後およびチャレンジ後に決定する。
【０２０３】
そのようなインビトロにおける試験の１つの例を、以下に記載する。５％モルモット血清を補体供給源として含有するＰＢＳ中に、超免疫抗血清を希釈する。Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（１０４ＩＦＵ；封入体形成単位）を、この抗血清希釈物に添加する。これらの抗原−抗体の混合物を、３７℃で４５分間インキュベートし、接種前にＰＢＳを用いて２回洗浄してあるガラス製バイアル（例えば、１５×４５ｍｍ）中に含有されているコンフルエントなＨｅｐ−２細胞単層またはＨｅＬａ細胞単層に二連で接種する。これらの単層細胞を、１０００×ｇで１時間遠心分離し、それに続いて、３７℃で１時間静置してインキュベートすることによって感染させる。感染させた単層を、４８または７２時間インキュベートし、固定し、クラミジアに特異的な抗体、例として、抗ＭＯＭＰを用いて染色する。封入体含有細胞を、１０個の視野において、２００×の倍率で数える。対照の単層／ＩＦＵと比較して５０％阻害を示す希釈度に基づいて、中和力価を定める。
【０２０４】
本発明の組成物の免疫原性を評価する別の方法では、患者の血清または粘膜分泌物を、免疫ブロットおよび／またはマイクロアレイによりスクリーニングするために、これらのタンパク質を組換えにより発現させる。こうしたタンパク質と患者試料との間の陽性反応が、患者が、問題になっているタンパク質に対して免疫応答を開始したことを示す。また、この方法を使用して、免疫優性抗原および／または抗原内のエピトープを同定することもできる。
【０２０５】
また、ワクチン組成物の有効性を、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染の動物モデル、例えば、モルモットまたはマウスを、これらのワクチン組成物を用いてチャレンジすることによって、インビボにおいても決定することできる。例えば、インビボでのワクチン組成物によるチャレンジ研究を、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染のモルモットモデルにおいて実施することができる。この型のアプローチの１つの例を、以下に記載する。雌性モルモット、体重４５０〜５００ｇを、１２時間の明暗サイクルを有する、環境が制御されている部屋において飼育し、ワクチン組成物により、多様な免疫化経路を介して免疫化する。ワクチン接種後、モルモットの生殖管に、ＨｅＬａ細胞またはＭｃＣｏｙ細胞中で増殖させたモルモット封入体結膜炎（ＧＰＩＣ）の病原体を感染させる（Ｒａｎｋら、（１９８８年））。各動物に、０．０５ｍｌのスクロース−リン酸−グルタミン酸緩衝液、ｐＨ７．４中に含有させた、およそ１．４×１０７封入体形成単位（ＩＦＵ）を投与する（Ｓｃｈａｃｔｅｒ、１９８０年）。封入体含有細胞のパーセントを、ＧＰＩＣ特異的抗血清を用いる間接的な免疫蛍光法、または生殖管由来の擦過標本からのギムザ染色スメアにより決定することによって、感染の経過をモニターする（Ｒａｎｋら、１９８８年）。血清中の抗体力価を、酵素結合イムノソルベント検定法により決定する。
【０２０６】
あるいは、インビボでのワクチン組成物によるチャレンジ研究を、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのマウスモデルにおいても実施することできる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９９５年）。この型のアプローチの１つの例を、以下に記載する。雌性マウス、７〜１２週齢に、膣感染の１０および３日前に、２．５ｍｇのデポ−プロベラ（ｄｅｐｏ−ｐｒｏｖｅｒａ）を皮下から投与する。ワクチン接種後、マウスの生殖管に、５ｍｌのスクロース−リン酸−グルタミン酸緩衝液、ｐＨ７．４中に含有させた、１，５００封入体形成単位のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを感染させる。封入体含有細胞のパーセントを、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ特異的抗血清を用いる間接的な免疫蛍光法、または感染させたマウスの生殖管由来の擦過標本からのギムザ染色スメアにより決定することによって、感染の経過をモニターする。マウス血清中の抗体力価の存在を、酵素結合イムノソルベント検定法により決定する。
【０２０７】
（核酸による免疫化）
上記した免疫原性組成物は、クラミジア抗原を含む。しかし、いずれの場合も、これらのポリペプチド抗原を、それらのポリペプチドをコードする核酸（典型的には、ＤＮＡ）で置き換えて、核酸による免疫化に基づいた組成物、方法および使用をもたらすことができる。核酸による免疫化は今では、成熟した分野である（例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、（１９９７年）、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５巻：６１７〜６４８頁；Ｓｔｒｕｇｎｅｌｌら、（１９９７年）、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７５巻（４号）：３６４〜３６９頁；Ｃｕｉ、（２００５年）、Ａｄｖ  Ｇｅｎｅｔ  ５４巻：２５７〜８９頁；ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＴｏｒｒｅｓ、（１９９７年）、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９巻：２７１〜２８３頁；Ｂｒｕｎｈａｍら、（２０００年）、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １８１巻、Ｓｕｐｐｌ  ３：Ｓ５３８〜４３頁；Ｓｖａｎｈｏｌｍら、（２０００年）、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５１巻（４号）：３４５〜５３頁；ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ−Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ（１９９８年）、Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉら編、（ＩＳＢＮ  ３５４０６３３９２８）；Ｇｅｎｅ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９９８年）、Ｒａｚ編、（ＩＳＢＮ  ３５４０６４４２８８）等を参照されたい）。
【０２０８】
免疫原をコードする核酸を、患者への送達後に、インビボにおいて発現させ、次いで、この発現させた免疫原が、免疫系を刺激する。活性成分は典型的には、核酸ベクターの形態をとり、このベクターは、（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結されている、免疫原をコードする配列；および場合により、（ｉｉｉ）選択マーカーを含む。好ましいベクターは、（ｉｖ）複製開始点；および（ｖ）（ｉｉ）の下流の、かつ（ｉｉ）に作動可能に連結されている転写ターミネーターをさらに含むことができる。一般に、（ｉ）および（ｖ）は、真核生物性であり、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は、原核生物性である。
【０２０９】
好ましいプロモーターは、ウイルスプロモーターであり、これらは、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する。また、このベクターは、プロモーターに加えて、転写調節配列（例えば、エンハンサー）を含むことができ、これらの配列は、プロモーターと機能的に相互作用する。好ましいベクターは、前初期ＣＭＶエンハンサー／プロモーターを含み、より好ましいベクターは、ＣＭＶイントロンＡもまた含む。このプロモーターは、免疫原をコードする下流配列に作動可能に連結されており、したがって、免疫原コード配列の発現は、このプロモーターの制御下にある。
【０２１０】
マーカーを使用する場合、このマーカーは、好ましくは、微生物の宿主（例えば、原核生物、細菌、酵母）中で機能する。マーカーは、好ましくは、原核生物の選択可能マーカーである（例えば、原核生物のプロモーターの制御下で転写されるもの）。好都合には、典型的なマーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。
【０２１１】
本発明のベクターは、好ましくは、自律的に複製するエピソーム性または染色体外ベクター、例として、プラスミドである。
【０２１２】
本発明のベクターは、好ましくは、複製開始点を含む。この複製開始点は、原核生物中で活性を示すが、真核生物中では活性を示さないことが好ましい。
【０２１３】
したがって、好ましいベクターは、ベクターを選択するための原核生物のマーカー、原核生物の複製開始点、さらに、免疫原コード配列の転写を推進するための真核生物のプロモーターを含む。したがって、これらのベクターは、（ａ）原核生物宿主中では、ポリペプチドを発現することなく、増幅および選択されるが、（ｂ）真核生物宿主中では、増幅されることなく、発現する。この取合せが、核酸免疫化ベクターにとっては理想的である。
【０２１４】
本発明のベクターは、コード配列の下流に、真核生物の転写ターミネーター配列を含むことができる。こうすると、転写レベルを増強することができる。コード配列自体には、ポリアデニル化配列がない場合、本発明のベクターは、好ましくは、ポリアデニル化配列を含む。好ましいポリアデニル化配列は、ウシ増殖ホルモンに由来する。
【０２１５】
本発明のベクターは、複数のクローニング部位を含むことができる。
【０２１６】
免疫原およびマーカーをコードする配列に加えて、このベクターは、第２の真核生物のコード配列も含むことができる。また、免疫原と同じ転写物から第２の真核生物のポリペプチドを翻訳することを可能にするために、このベクターは、ＩＲＥＳを、前記第２の配列の上流に含むこともできる。あるいは、免疫原コード配列が、ＩＲＥＳの下流にあってもよい。
【０２１７】
本発明のベクターは、非メチル化ＣｐＧモチーフ、例えば、非メチル化ＤＮＡ配列を含むことができ、これらのＤＮＡ配列は共通して、グアノシンに先行するシトシンを有し、これらのシトシンとグアノシンには、２つの５’プリンと２つの３’ピリミジンとが隣接する。これらのＤＮＡモチーフは、それらのメチル化されていない形態では、いくつかの型の免疫細胞の強力な刺激剤となることが実証されている。
【０２１８】
ベクターを、標的化の方法で送達することができる。受容体媒介型ＤＮＡ送達の技法が、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３年）、１１巻：２０２頁；Ｃｈｉｏｕら、（１９９４年）、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｗｏｌｆｆ編；Ｗｕら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（１９８８年）、２６３巻：６２１頁；Ｗｕら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（１９９４年）、２６９巻：５４２頁；Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、（１９９０年）、８７巻：３６５５頁；およびＷｕら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（１９９１年）、２６６巻：３３８頁に記載されている。
【０２１９】
核酸を含有する治療用組成物を、遺伝子治療プロトコールにおいて、局所投与のために、ＤＮＡを約１００ｎｇ〜約２００ｍｇの範囲で投与する。また、約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇおよび約２０μｇ〜約１００μｇの濃度範囲のＤＮＡも、遺伝子治療プロトコールの間に使用することができる。作用方法（例えば、遺伝子コード産物のレベルを増強または阻害するための）および形質転換および発現の有効性等の要因が、最終的な有効性に必要な投与量に影響を及ぼす考慮すべき事項である。より高い発現が、より広い領域の組織にわたり所望される場合、明確な治療結果をもたらすためには、より多い量のベクター、もしくは連続的なプロトコールにおいて再投与される同じ量のベクターの投与、または異なる隣接する組織部分もしくは近い組織部分への複数回の投与が必要となる場合がある。いずれの場合も、臨床治験における日常的な実験により、最適な治療効果のための特定の範囲を決定する。
【０２２０】
ベクターを、遺伝子送達ビヒクルを使用して送達することができる。遺伝子送達ビヒクルの起源は、ウイルス性であってもまたは非ウイルス性であってもよい（一般に、Ｊｏｌｌｙ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、（１９９４年）、１巻：５１頁；Ｋｉｍｕｒａ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、（１９９４年）、５巻：８４５頁；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、（１９９５年）、１巻：１８５頁；およびＫａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、（１９９４頁）６巻：１４８頁を参照されたい）。
【０２２１】
所望の核酸を送達し、所望の細胞において発現させるためのウイルスに基づいたベクターが、当技術分野では周知である。例示的なウイルスに基づいたビヒクルとして、これらに限定されないが、組換えレトロウイルス（例えば、ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ９３／１１２３０；ＷＯ９３／１０２１８；米国特許第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；ＥＰ−Ａ−０３４５２４２；およびＷＯ９１／０２８０５）、アルファウイルスに基づいたベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ  １２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）；また、これらのウイルスのハイブリッドまたはキメラも使用することができる）、ポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニア、鶏痘、カナリアポックス、改変ワクシニアＡｎｋａｒａ等）、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ９３／１１２３０；ＷＯ９３／１０２１８；米国特許第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；ＥＰ−Ａ−０３４５２４２；ＷＯ９１／０２８０５；ＷＯ９４／１２６４９；ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４；およびＷＯ９５／００６５５を参照されたい）が挙げられる。また、死滅させたアデノウイルスに連結されているＤＮＡの投与（Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２年）、３巻：１４７頁）も利用することができる。
【０２２２】
また、非ウイルス性送達のビヒクルおよび方法も利用することができ、それらとして、これらに限定されないが、死滅させたアデノウイルスのみに連結または未連結のポリカチオン性濃縮ＤＮＡ（例えば、Ｄｅ  Ｌｉｂｅｒｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００５年、５巻：４８５〜４９６頁）、リガンド連結ＤＮＡ（Ｗｕ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（１９８９年）、２６４号：１６９８５頁）、真核細胞送達ビヒクル細胞（米国特許第５，８１４，４８２号；ＷＯ９５／０７９９４；ＷＯ９６／１７０７２；ＷＯ９５／３０７６３；およびＷＯ９７／４２３３８）、および核電荷中和または細胞膜との融合が挙げられる。また、裸のＤＮＡも利用することができる。例示的な裸のＤＮＡの導入方法が、ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして作用することができるリポソーム（例えば、イムノリポソーム）が、米国特許第５，４２２，１２０号；ＷＯ９５／１３７９６；ＷＯ９４／２３６９７；ＷＯ９１／１４４４５；およびＥＰ−０５２４９６８に記載されている。追加のアプローチが、Ｐｈｉｌｉｐ、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９４年）１４巻：２４１１頁、およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（１９９４年）、９１巻：１１５８１頁に記載されている。
【０２２３】
使用するのに適したさらなる非ウイルス性送達として、機械的送達システム、例として、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、（１９９７年）、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５巻：６１７〜６４８頁に記載されているアプローチが挙げられる。さらに、コード配列およびそのような配列の発現産物を、光重合（ｐｈｏｔｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ）ヒドロゲル材料の堆積または電離放射線の使用により送達することができる（例えば、米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３）。コード配列の送達のために使用することができる、遺伝子送達のその他の従来法として、例えば、携帯型の遺伝子導入粒子銃の使用（米国特許第５，１４９，６５５号）、または導入した遺伝子を活性化するための電離放射線の使用（Ｓｔｒｕｇｎｅｌｌら、（１９９７年）、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７５巻（４号）：３６４〜３６９頁、およびＣｕｉ、（２００５年）、Ａｄｖ  Ｇｅｎｅｔ  ５４号：２５７〜８９頁）が挙げられる。
【０２２４】
ＰＬＧ｛ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）｝の微小粒子を使用するＤＮＡの送達が、特に好ましい方法であり、これは、例えば、それらの微小粒子への吸着による方法であり、これらの微粒子は、場合により、処理して、（例えば、ＳＤＳを用いて）負に荷電した表面または（例えば、カチオン性洗剤、例として、ＣＴＡＢを用いて）正に荷電した表面をもたせる。
【０２２５】
（抗体による免疫化）
本発明の抗体を、例えば、野生型クラミジアタンパク質の活性を中和するために使用することができる。クラミジア抗原に対する抗体を、受動免疫のために使用することができる（Ｂｒａｎｄｔら、（２００６年）、Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５８巻（６号）：１２９１〜４頁、Ｅｐｕｂ、２００６年１０月２６日）。したがって、本発明は、治療における本発明の抗体の使用を提供する。また、本発明は、薬物の製造におけるそのような抗体の使用も提供する。また、本発明は、哺乳動物を処置するための方法も提供し、この方法は、有効量の本発明の抗体を投与するステップを含む。免疫原性組成物について上記したように、これらの方法および使用により、哺乳動物をクラミジア感染から防御することが可能になる。
【０２２６】
（プロセス）
さらなる態様によれば、本発明は、種々のプロセスを提供する。
【０２２７】
本発明のタンパク質を産生するためのプロセスを提供し、このプロセスは、本発明の宿主細胞を、タンパク質発現を誘導する条件下で培養するステップを含む。
【０２２８】
本発明のタンパク質または核酸を産生するためのプロセスを提供し、タンパク質または核酸の一部または全部を、化学的手段を使用して合成する。
【０２２９】
また、生物学的試料中のクラミジア（好ましくは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）を検出するためのプロセスも提供し、このプロセスは、本発明による核酸と生物学的試料とを、ハイブリダイズする条件下で接触させるステップを含む。このプロセスには、核酸増幅（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ等）またはハイブリダイゼーション（例えば、マイクロアレイ、ブロット、溶液中でのプローブを用いたハイブリダイゼーション等）が関与することができる。
【０２３０】
野生型クラミジア（好ましくは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）を検出するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）本発明の抗体を生物学的試料と、抗体−抗原の複合体（複数可）を形成させるのに適した条件下で接触させるステップと；（ｂ）前記複合体（複数可）を検出するステップとを含む。このプロセスを好都合に使用して、クラミジア感染を診断することができる。
【０２３１】
（一般論）
本発明の実行に際しては、別段の記載がない限り、当技術の技術分野に属する、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来法を利用する。そのような技法は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ、（２０００年）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．  ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．  Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．  Ｍ．  ＷｅｉｒおよびＣ．  Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（２００１年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．  Ｓ．編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年）；Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、（２００２年）、Ｓｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ、５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ、（Ｒｅａｍら編、１９９８年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；ならびにＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ）、２ｎｄ  ｅｄ．（ＮｅｗｔｏｎおよびＧｒａｈａｍ編、１９９７年、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）等を参照されたい。
【０２３２】
「ＧＩ」数を、本明細書においては使用する。ＧＩ数または「ＧｅｎＩｎｆｏ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ」は、配列をＮＣＢＩデータベースに加えたときに、ＮＣＢＩにより処理された各配列記録に連続的に割り当てられた一連の数字である。ＧＩ数は、配列記録のアクセッション番号に類似しない。配列をアップデートすると（例えば、補正するため、またはさらなるアノテーションもしくは情報を追加するために）、この配列には、新しいＧＩ数が与えられる。したがって、所与のＧＩ数に付随する配列は変化しない。
【０２３３】
本発明が「エピトープ」を扱う場合、エピトープは、Ｂ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープであり得る。そのようなエピトープを、（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ（Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８４年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８１巻：３９９８〜４００２頁；Ｃａｒｔｅｒ、（１９９４年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３６巻：２０７〜２３頁）もしくは類似の方法を使用して）実験的に同定することができる。あるいは、そのようなエピトープを、（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆの抗原性指数（Ｊａｍｅｓｏｎ，ＢＡら、１９８８年、ＣＡＢＩＯＳ  ４巻（１号）：１８１〜１８６頁）、マトリクスに基づいたアプローチ（ＲａｄｄｒｉｚｚａｎｉおよびＨａｍｍｅｒ、（２０００年）、Ｂｒｉｅｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ  １巻（２号）：１７９〜８９頁）、ＭＡＰＩＴＯＰＥ（Ｂｕｂｌｉｌら、（２００７年）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ６８巻（１号）：２９４〜３０４頁）、ＴＥＰＩＴＯＰＥ（Ｄｅ  Ｌａｌｌａら、（１９９９年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３巻：１７２５〜２９頁；Ｋｗｏｋら、（２００１年）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２巻：５８３〜８８頁）、ニューラルネットワーク（Ｂｒｕｓｉｃら、（１９９８年）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４巻（２号）：１２１〜３０頁）、ＯｐｔｉＭｅｒ  ＆  ＥｐｉＭｅｒ（Ｍｅｉｓｔｅｒら、（１９９５年）、Ｖａｃｃｉｎｅ  １３巻（６号）：５８１〜９１頁；Ｒｏｂｅｒｔｓら、（１９９６年）、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １２巻（７号）：５９３〜６１０頁）、ＡＤＥＰＴ（ＭａｋｓｙｕｔｏｖおよびＺａｇｒｅｂｅｌｎａｙａ、（１９９３年）、Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  ９巻（３号）：２９１〜７頁）、Ｔ部位（Ｆｅｌｌｅｒおよびｄｅ  ｌａ  Ｃｒｕｚ、（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９巻（６３１１号）：７２０〜１頁）、親水性（Ｈｏｐｐ、（１９９３年）、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６巻：１８３〜１９０頁）、抗原性指数（Ｗｅｌｌｉｎｇら、（１９８５年）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１８８巻：２１５〜２１８頁）、またはＤａｖｅｎｐｏｒｔら、（１９９５年）、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４２巻：３９２〜２９７頁；ＴｓｕｒｕｉおよびＴａｋａｈａｓｈｉ（２００７年）、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．、１０５巻（４号）：２９９〜３１６頁；Ｔｏｎｇら、（２００７年）、Ｂｒｉｅｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．、８巻（２号）：９６〜１０８頁；Ｓｃｈｉｒｌｅら、（２００１年）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．、２５７巻（１〜２号）：１〜１６頁；ならびにＣｈｅｎら、（２００７年）、Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ３３巻（３号）：４２３〜８頁に開示されている方法等を使用して）予測することができる。エピトープは、抗体またはＴ細胞受容体により認識され、それらの抗原結合部位に結合する抗原の部分であり、エプトープはまた、「抗原決定基」と呼ぶこともできる。
【０２３４】
抗原「ドメイン」が除かれると、これに伴って、シグナルペプチド、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞外ドメイン等が除かれる場合がある。
【０２３５】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘから排他的になってもよく、または追加の何らか、例えば、Ｘ＋Ｙを含んでもよい。
【０２３６】
数値Ｘに関する用語「約」は、任意選択であり、例えば、Ｘ±１０％を意味する。
【０２３７】
２つのアミノ酸配列間のパーセント配列同一性への言及は、整列させて、これら２つの配列を比較したとき、そのパーセントのアミノ酸が同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野で公知のソフトウエアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙのｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７．１８（Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年）、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０に記載されているプログラムを使用して決定することができる。好ましいアラインメントを、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定し、この場合、アフィンギャップ検索を使用し、ギャップオープンペナルティは１２であり、ギャップ伸長ペナルティは２であり、ＢＬＯＳＵＭマトリクスは６２である。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、（１９８１年）、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．、２巻：４８２〜４８９頁に開示されている。
【図面の簡単な説明】
【０２３８】
【図１】図１は、２０個の選択されたＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗原の、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生を誘導する能力を示すグラフである。
【図２Ａ】図２ａは、ＥＢ−ＣＭ  ＣＤ４＋Ｔ細胞を養子性に導入したマウスにおけるクラミジアチャレンジ後の細菌の存在（肺から回収したＩＦＵ）を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２ｂは、種々のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ抗原の、ＩＦＮγを産生する防御的ＥＢ−ＣＤ４＋Ｔ細胞系を刺激する能力を示すグラフである。
【図３】図３は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ組換え抗原ＣＴ１５３およびＣＴ７３３を用いて特異的に刺激した際に、ＩＦＮγを産生するＣＤ４＋Ｔ細胞数を示すヒストグラムである。
【図４】図４は、ＴＣ０１０６（ＣＴ７３３のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体）およびＴＣ０４３１（ＣＴ１５３のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体）の、単一抗原としての防御活性を示すグラフである。このグラフは、これら２つの抗原により免疫化し、次いで、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍを用いてチャレンジしたＢＡＬＢ／Ｃマウスにおける平均ＩＦＵ／ｍｌを示す。３つのバーは、左から右へ、アジュバント単独、免疫原としてのＴＣ０１０６、および免疫原としてのＴＣ０４３１である。
【図５】図５は、ＴＣ０１０６＋ＴＣ０４３１の組合せの防御活性を示すグラフである。このグラフは、この組合せにより免疫化したマウスの感染した肺から回収した平均ＩＦＵ／肺（Ｌｏｇ１０）を示す。３つのバーは、左から右へ、１０３個の生のＥｂ、アジュバント単独、抗原の組合せである。
【図６】図６は、ＴＣ０１０６＋ＴＣ０４３１、ＴＣ０１０６、ＴＣ０４３１およびＬＴＫ６３＋ＣｐＧにより免疫化したマウスのＰＢＭＣ中の、ＩＦＮγを産生するＣＤ４Ｔ細胞を示すグラフである。左から右へ、バーは、１）ＬＴＫ６３、ＴＣ０１０６＋ＴＣ０４３１、ＴＣ０１０６、ＴＣ０４３１（全て、ＥＢ免疫化マウス）；２）ＬＴＫ６３、ＴＣ０１０６＋ＴＣ０４３１、ＴＣ０１０６（全て、ＴＣ０１０６免疫化マウス）；３）ＬＴＫ６３、ＴＣ０１０６＋ＴＣ０４３１、ＴＣ０４３１（全て、ＴＣ０４３１免疫化マウス）；ならびに４）ＬＴＫ６３およびＴＣ０１０６＋ＴＣ０４３１（共に、ＴＣ０１０６＋ＴＣ０４３１免疫化マウス）を用いた刺激を示す。このグラフは、ＴＣ０１０６（ＣＴ７３３のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体）およびＴＣ０４３１（ＣＴ１５３のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体）による免疫化により、特異的なＣＤ４＋／ＩＦＮγ＋細胞が顕著な頻度で誘発されることを示す。Ｙ軸は、１０６個のＣＤ４における頻度を示す。
【図７】図７は、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ鼻腔内チャレンジのマウスモデルにおける、種々の組合せおよび単一抗原についての防御の結果の概要を示すグラフである。このグラフは、単一抗原または抗原の組合せにより、ＬＴＫ６３およびＣｐＧのアジュバントを添加して筋肉内から免疫化し、次いで、１０３ＩＦＵのＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍを用いて鼻腔内チャレンジしたマウスの平均ＩＦＵ／肺を示す。
【図８】図８は、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ鼻腔内チャレンジのマウスモデルにおける、抗原の種々の組合せについての防御の結果の概要を示すグラフである。このグラフは、免疫化マウスの感染した肺から回収したＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍの平均ＩＦＵ／肺（ｌｏｇ１０）を示す。
【図９】図９は、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍを用いる卵巣嚢チャレンジのマウスモデルにおける、組合せＴＣ０５５１＋ＴＣ０６５１＋ＴＣ０７２７＋ＴＣ０８９０の結果を示すグラフである。Ｙ軸は、ＩＦＵ／スワブ（ｌｏｇ１０）を示す。これら３つの群は、左から右へ、異なる免疫化抗原、すなわち、卵白アルブミン（ｏｖａｌｂｉｕｍｉｎ）、組合せ、およびｎＭＯＭＰについてである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ鼻腔内チャレンジのマウスモデルにおいて、種々の抗原の組合せを用いて達成した防御の結果を示すグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、抗原の組合せＴＣ０８９０＋ＴＣ０５５１を用いたワクチン接種により誘導されたＩＦＮｇ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示すグラフである。左から右へ、バーは、１）ＴＣ０５５１、ＴＣ０８９０、ＴＣ０５５１＋ＴＣ０８９０（アジュバント免疫化マウスの場合）、および２）ＴＣ０５５１、ＴＣ０８９０、ＴＣ０５５１＋ＴＣ０８９０（ＭＩＸ  ＴＣ０８９０＋ＴＣ０５５１免疫化マウスの場合）を用いた刺激を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、Ｌｔｋ６３＋ＣｐＧを伴うＴＣ０１０６＋ＴＣ０４３１により免疫化したマウスのＰＢＭＣ中のＴＦＮｇおよびＩＬ２／ＴＮＦを産生するＣＤ４Ｔ細胞を示すグラフである。左から右へ、バーは、ａ）ＴＣ０１０６、ＴＣ０４３１、ＴＣ０１０６＋ＴＣ０４３１、ＣＴ１５３＋ＣＴ７３３（全て、アジュバント免疫化マウス）、２）ＴＣ０１０６、ＴＣ０４３１、ＴＣ０１０６＋ＴＣ０４３１、ＣＴ１５３＋ＣＴ７３３（全て、ＭＩＸ  ＴＣ０１０６＋ＴＣ０４３１免疫化マウス）を用いた刺激を示す。
【図１１】図１１は、Ｃｔ−ＥＢおよびＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染ＨｅＬａ細胞における、ＣＴ６０１、ＣＴ２７９、ＣＴ１５３およびＣＴ７３３の、それらの特異的マウス免疫抗血清を使用した免疫ブロット分析である。
【図１２】図１２は、単独でまたは組み合わせて投与した抗原ＴＣ０３１３、ＴＣ０７４１、ＴＣ０１０６およびＴＣ０２１０の防御活性を示すグラフである。１２Ａ〜１２Ｄ中、バーは、平均ＩＦＵ／肺（Ｌｏｇ１０）を示し、左手のバーは、アジュバント単独（ＬＴＫ６１＋ＣｐＧ）であり、右手のバーは、ＴＣ抗原である。図１２Ｅは、組合せ（四角）またはアジュバント単独（ひし形）を使用した際のＩＦＵの経時的な低下（チャレンジ後の日数に対する平均ＩＦＵ／肺）を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａおよび図１３Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）一次感染後の抗原特異的ＣＤ４Ｔｈ１応答を示すヒストグラムである。結果は、４つの独立した実験の平均である。各実験、すなわち、非感染マウス（左手のバー）および一次感染マウス（右手のバー）についての２つの結果を示す。図１３Ａ中、左から右へ、結果は、ＣＴ８１２Ｃ、ＣＴ３８７、ＣＴ８６９、ＣＴ１６６およびＣＴ１７５を用いた刺激に関する。図１３Ｂ中、左から右へ、結果は、ＭＯＭＰ、ＣＴ１６３、ＣＴ８１２、ＣＴ８１２Ｃ、ＣＴ１６６、ＣＴ８６９、ＣＴ１６３、ＣＴ８１２、ＣＴ２１４、ＣＴ３８７、ＣＴ７２１、ＣＴ１２７およびＣＴ１７５を用いた刺激に関する。１０５個のＣＤ４Ｔ細胞における頻度を、Ｙ軸上に示す。
【図１３Ｂ】図１３Ａおよび図１３Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）一次感染後の抗原特異的ＣＤ４Ｔｈ１応答を示すヒストグラムである。結果は、４つの独立した実験の平均である。各実験、すなわち、非感染マウス（左手のバー）および一次感染マウス（右手のバー）についての２つの結果を示す。図１３Ａ中、左から右へ、結果は、ＣＴ８１２Ｃ、ＣＴ３８７、ＣＴ８６９、ＣＴ１６６およびＣＴ１７５を用いた刺激に関する。図１３Ｂ中、左から右へ、結果は、ＭＯＭＰ、ＣＴ１６３、ＣＴ８１２、ＣＴ８１２Ｃ、ＣＴ１６６、ＣＴ８６９、ＣＴ１６３、ＣＴ８１２、ＣＴ２１４、ＣＴ３８７、ＣＴ７２１、ＣＴ１２７およびＣＴ１７５を用いた刺激に関する。１０５個のＣＤ４Ｔ細胞における頻度を、Ｙ軸上に示す。
【図１４】図１４は、（１０３ＩＦＵを用いたＩ．Ｎ．チャレンジの１２日後に）免疫化マウスの感染した肺から回収したＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍのＩＦＵを示すヒストグラムである。免疫化群を、Ｘ軸上に示す：左手のバーは、ＬＴＫ６３＋ＣｐＧにより免疫化したマウスに関し、右手のバーは、ＴＣ０１９７＋ＴＣ０２６１＋ＴＣ０６６６＋ＬＴＫ６３＋ＣｐＧにより免疫化したマウスに関する。平均ＩＦＵ／肺（Ｌｏｇ１０）を、Ｙ軸上に示す。
【図１５】図１５は、（１０３ＩＦＵを用いたＩ．Ｎ．チャレンジの１２日後に）免疫化マウスの感染した肺から回収したＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍのＩＦＵを示すヒストグラムである。免疫化群を、Ｘ軸上に示す：左から右へ、結果は、ｉ）ＬＴＫ６３＋ＣｐＧ、ｉｉ）ＴＣ０２６１＋ＬＴＫ６３＋ＣｐＧ、ｉｉｉ）ＴＣ０１９７＋ＬＴＫ６３＋ＣｐＧ、およびｉｖ）ＴＣ０６６６＋ＬＴＫ６３＋ＣｐＧにより免疫化したマウスに関する。平均ＩＦＵ／肺（Ｌｏｇ１０）を、Ｙ軸上に示す。
【実施例】
【０２３９】
（発明を実施するための様式）
（実施例１：ＩＦＮγを産生するＣＤ４＋Ｔ細胞集団の誘導）
ＩＦＮγを産生するＣＤ４＋Ｔ細胞集団を誘導する２０個の抗原が見出されている（図１を参照されたい）。これらのうち、１７個が新たに発見された抗原である（ＣＴ０１６、ＣＴ０４３、ＣＴ１１４、ＣＴ１５３、ＣＴ２５５、ＣＴ２７９、ＣＴ３４１、ＣＴ３７２、ＣＴ４８０、ＣＴ６００、ＣＴ６０１、ＣＴ７１１、ＣＴ７１６、ＣＴ７３３、ＣＴ７３４、ＣＴ７４５、ＣＴ８２３）、一方、３つの抗原（ＣＴ６８１−ＭＯＭＰ、ＣＴ３９６−Ｈｓｐ６０およびＣＴ５８７−エノラーゼ）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の標的としての過去の記載がある（Ｇｏｏｄａｌｌ  ＪＣら、２００１年；Ｈａｓｓｅｌｌ  ＡＢら、１９９３年）。意味深いことに、いくつかの抗原は、抗原特異的ＣＤ４＋応答性Ｔ細胞を、陽性の対照抗原ＭＯＭＰを用いた場合に観察される頻度に少なくとも匹敵する頻度で誘導することができた。
【０２４０】
１７個の新しい抗原を、以下に示す。
【０２４１】
【表４】
2012519482.tif 000012
これらの１７個の新しい抗原のうち、ＣＴ３４１は、熱ショックタンパク質であることから、免疫化において使用するのには最も不適切である可能性がある。
【０２４２】
（実施例２：防御的なクラミジア特異的ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞系統の抗原特異性の特徴付け）
新たに発見された抗原の、クラミジアに対する防御免疫についての妥当性を、それらの抗原が、クラミジア特異的ＣＤ４＋／ＩＦＮγ＋細胞系に属するＴ細胞により認識されることを示すことによって裏付け、上記Ｔ細胞は、ナイーブレシピエントマウスに養子性に導入されると、防御をもたらす。この目的のため、発明者らは、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍの細胞外ＥＢ体に対して産生させた短期ＣＤ４＋Ｔ細胞系を誘導するに至り、この細胞系は、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍチャレンジから、養子性導入ナイーブマウスを防御する高い能力を示した。この防御的ＣＤ４＋細胞系は、わずか数サイクルの増殖を行ったに過ぎないが、広い特異性を示すポリクローナル細胞集団を維持した。この集団は、長期の細胞系またはクローンよりも、インビボにおける防御応答と密接に関連するはずである。このポリクローナル細胞系を、その抗原認識プロファイルについて、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの、ＣＤ４−Ｔｈ１を誘導するタンパク質に対して相同性を示すＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ抗原と比較して分析した。この防御的ＣＤ４＋Ｔ細胞ポリクローナル集団の抗原特異性の詳細分析から、感染の間に同定されたクラミジアＣＤ４＋／ＩＦＮγ＋誘導性抗原もまた、抗体の非存在下での、感染に対する防御応答における細菌の迅速なクリアランスに一部関与するＣＤ４＋Ｔ細胞の標的であることが実証された。
【０２４３】
クラミジアＴ細胞系を、Ｂａｌｂ／ｃ感染マウスから誘導し、それらの防御活性を、ナイーブマウスにおいて、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍチャレンジに対して検証した。それに続いて、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ  ＣＤ４＋Ｔ細胞系の抗原認識プロファイルを特徴付けて、防御的ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導における各Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ抗原の寄与の可能性を定義した。クラミジア特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を調製するために、１０３個のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍの生存基本小体（ＥＢ）に鼻腔内からあらかじめ感染させたドナーＢａｌｂ／ｃマウスから、脾臓ＣＤ４＋Ｔリンパ球を精製した。ＥＢ応答性ＣＤ４＋Ｔ細胞系を、インビトロにおいて、熱不活性化ＥＢを用いて短期に刺激して誘導し（ＥＢ−ＣＤ４＋細胞系と呼ぶ）、増殖させた。この系統は、ＩＦＮγを高い頻度で産生することによって、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ  ＥＢに対して応答する能力を示した（データは示していない）。感染の消散におけるＥＢ−ＣＤ４＋細胞系の有効性を決定するために、１０７個のＣＤ４＋Ｔ細胞を、４匹のＢａｌｂ／ｃレシピエントナイーブマウス内に養子性に導入した。マウスを、ＣＤ４＋Ｔ細胞のｉ．ｖ．注入の２４時間後に、１０３ＩＦＵのＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍを用いて鼻腔内からチャレンジした。養子免疫の防御効果を、クラミジアチャレンジの１０日後に採取した肺から回収したＩＦＵ数を定量化することによって評価した。図２ａに示すように、ＥＢ−ＣＭ  ＣＤ４＋Ｔ細胞を養子性に導入したナイーブマウスは、１０３ＩＦＵのＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍを用いた鼻腔内チャレンジの１０日後に、無処置マウス（ｐ値：０．００８）または無関係のＣＤ４＋Ｔ細胞系を投与したマウスのいずれと比較しても、肺において３Ｌｏｇ１０低いＩＦＵであった。同様に、１０５ＩＦＵのＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓによる膣内一次感染を消散させたマウスから単離した脾臓のＣＤ４＋Ｔ細胞も、養子性に導入したマウスにおいて、顕著なＩＦＵの低下をもたらした（データは示していない）。
【０２４４】
Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍのＣＤ４＋Ｔ細胞の抗原認識プロファイルを特徴付けるために、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染の間にＣＤ４＋Ｔｈ１誘導物質であることが同定された（図１）タンパク質の相同体であるＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍタンパク質のうちのほとんどを、組換え形態として得、ＩＦＮγを産生する防御的ＥＢ−ＣＤ４＋Ｔ細胞系を刺激するそれらの能力について試験した。この分析では、発明者らは、精製後にサイトカイン刺激アッセイに必要な純度／内毒素のレベルに到達しないタンパク質、またはヒトとの相同性に起因して、ワクチン開発には適さない細菌タンパク質（例えば、熱ショックタンパク質、エノラーゼ）の両方を除外した。防御的ＥＢ−ＣＤ４＋Ｔ細胞系を、インビトロにおいて、ＭＯＭＰを含めた、１９個のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ組換えタンパク質のパネルを用いて刺激した。これらのタンパク質のうち、１４個は、感染マウスの一次スクリーニングにおいて同定されたＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ＣＤ４＋Ｔｈ１誘導性抗原の相同体であり、５つは、陰性の対照であった。また、図２ｂに示すように、試験した１４個のＣＤ４＋誘導性抗原は全て、防御的ＥＢ−ＣＭのＣＤ４＋Ｔ細胞系の標的であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセントで示すＩＦＮγの産生を、陰性の対照抗原よりも少なくとも３倍高い頻度で誘導することができることも見出された。したがって、防御的クラミジアＥＢ−ＣＭ  Ｔ細胞系により認識されるＴ細胞抗原のパターンは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染マウスにおいて同定されたＴ細胞の認識プロファイルに類似する。
【０２４５】
（実施例３：ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ一次感染後のＣＴ７３３およびＣＴ１５３に特異的なＣＤ４＋Ｔｈ１応答）
一次感染ＢＡＬＢ／ｃマウスおよび非感染対照の脾細胞を、感染の１０日後に収集し、ＬＰＳを含有しない組換え抗原ＣＴ７３３およびＣＴ１５３（２０ｍｇ／ｍｌ）を用いて刺激した。刺激の４時間後に、５ｍｇ／ｍｌのブレフェルジンＡを細胞に添加して、その後の１２時間にわたり、サイトカインの分泌をブロックした。その後、細胞を、固定、透過処理および染色した。細胞内におけるＩＦＮγおよびＩＬ−５の発現を、ゲート（ｇａｔｅｄ）生存細胞のＣＤ４表面発現と比較して、フローサイトメトリーにより分析および評価した。
【０２４６】
図３のヒストグラムは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ組換え抗原ＣＴ１５３およびＣＴ７３３を用いた特異的刺激に際し、ＩＦＮγを産生する一次感染（濃い灰色のバー）マウスおよび非感染（明るい灰色のバー）マウスのＣＤ４＋Ｔ細胞数／１０５個のＣＤ４＋Ｔ脾細胞を示す。これらのデータを、同じプロトコールを使用する、いくつかのさらなる実験において確認した。
【０２４７】
これらの結果は、ＣＴ７３３およびＣＴ１５３は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに膣内から感染させたＢａｌｂ／ｃマウスに由来する脾細胞において、特異的なＣＤ４＋／ＩＦＮγ＋細胞を有意な頻度で誘導することができることを示しており、このことから、これらのタンパク質の抗原候補としての役割の可能性が示唆される。
【０２４８】
（実施例４：単一抗原のＴＣ０１０６およびＴＣ０４３１の、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍチャレンジに対する防御活性）
ＣＴ７３３およびＣＴ１５３を、クラミジア感染マウスモデルにおいて試験して、それらの防御特性を評価した。この試験は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｍｕｒｉｄａｒｕｍ種による肺感染のマウスモデルを採用することによって行った。
【０２４９】
ＣＴ７３３およびＣＴ１５３に対して相同性を示す、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍタンパク質ＴＣ０１０６およびＴＣ０４３１をそれぞれ、クローニングおよび精製し、マウスモデルのために使用した。
【０２５０】
ＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、ＬＴＫ６３＋ＣｐＧのアジュバントと共に処方したＴＣ０１０６組換え抗原またはＴＣ０４３１組換え抗原のいずれかにより免疫化した（１５μｇのタンパク質を、２週間の間隔で筋肉内に３回投与した）。陰性の対照として、マウスを、アジュバントのみにより免疫化した。最後の免疫化の４週間後に、動物に、１０３ＩＦＵの感染性Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍを鼻腔内感染させた。１０日後に、これら２つの抗原によりもたらされた防御活性を、チャレンジ動物の肺中の感染性ＩＦＵを計算することによって測定した。
【０２５１】
図４に示すように、これら２つの抗原（ヒストグラムの中央および右手の列）のそれぞれが、チャレンジマウスにおいては、アジュバント免疫化マウス（ヒストグラムの左手の列）と比較して、ＩＦＵ数／肺を有意に低下させることができ、このことは、ＴＣ０１０６およびＴＣ０４３１（したがって、ＣＴ７３３およびＣＴ１５３）の両方が、クラミジア感染に対する防御免疫をもたらすことを示している。
【０２５２】
（実施例５：ＴＣ０１０６＋ＴＣ０４３１の組合せの、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍチャレンジに対する防御活性）
ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（１０〜１５匹のマウス）を、ＬＴＫ６３＋ＣｐＧのアジュバントと共に処方したＴＣ０１０６組換え抗原＋ＴＣ０４３１組換え抗原の組合せにより免疫化した（１０μｇのそれぞれのタンパク質を、２週間の間隔で筋肉内に３回投与した）。陰性の対照として、マウスを、アジュバントのみにより免疫化した。最後の免疫化の４週間後に、動物に、１０３ＩＦＵの感染性Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍを鼻腔内感染させた。１０日後に、これら２つの抗原によりもたらされた防御活性を、チャレンジ動物の肺中の感染性ＩＦＵを計算することによって測定した。また、陽性の対照として、一次および二次のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ感染を施したマウスの群も含めた（図５のヒストグラムの左の列）。
【０２５３】
図５に示すように、この抗原の組合せ（ヒストグラムの右手の列）は、チャレンジマウスにおいて、アジュバント免疫化マウス（ヒストグラムの中央の列）と比較して、ＩＦＵ数／肺を有意に低下させることができた。
【０２５４】
したがって、ＣＴ７３３およびＣＴ１５３の、単独かまたは組合せのいずれかによる免疫化は、チャレンジマウスの肺中の細菌負荷を有意に低下させることができた（図４および５を参照されたい）。
【０２５５】
（実施例６：ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ＴＣ０４３１組換え抗原およびＴＣ０１０６組換え抗原の、単独または組合せによる免疫化後のＣＤ４＋Ｔｈ１細胞の誘発）
ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（１０〜１５匹のマウス）を、組換え抗原ＴＣ０４３１およびＴＣ０１０６により、単一抗原としてかまたは組み合わせて、ＬＴＫ６３＋ＣｐＧのアジュバントを使用して免疫化した（ｉ．ｍ．、１０〜１５マイクログラム／投与、２週間の間隔で３回投与）。第３の免疫化を施した１０日後に、脾細胞を収集し、ＬＰＳを含有しない組換え抗原（２０ｍｇ／ｍｌ）を用いて刺激した。陰性の対照として、アジュバント免疫化マウスの脾細胞を含めた。刺激の４時間後に、５ｍｇ／ｍｌのブレフェルジンＡを細胞に添加して、その後の１２時間にわたり、サイトカイン分泌をブロックした。その後、細胞を、固定、透過処理および染色した。細胞内ＩＦＮγを、ゲート生存細胞のＣＤ４表面発現と比較して、フローサイトメトリーにより分析および評価した。図６のヒストグラムは、ＴＣ０１０６、ＴＣ０４３１、ＴＣ０１０６＋ＴＣ０４３１の組合せにより免疫化したマウス、およびアジュバント免疫化マウスにおける、これらの組換え抗原を用いて特異的に刺激した際にＩＦＮγを産生するＣＤ４＋Ｔ細胞数／１０５個のＣＤ４＋Ｔ脾細胞を示す。
【０２５６】
これらの結果は、これらの抗原による免疫化は、ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞を高い頻度で誘発することを示している。
【０２５７】
（実施例７：クラミジアの抗原（複数可）の、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍチャレンジに対する防御効果の評価）
Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのＣＴ２７９、ＣＴ６０１、ＣＴ３７２、ＣＴ４４３、ＣＴ７３３、ＣＴ１５３、ＣＴ４５６およびＣＴ３８１から選択された２つの抗原の組合せの防御効果を、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍマウスモデルにおいて、それらのＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体のＴＣ０５５１（ＣＴ２７９）、ＴＣ０６５１（ＣＴ３７２）、ＴＣ０７２７（ＣＴ４４３）、ＴＣ０８９０（ＣＴ６０１）、ＴＣ０１０６（ＣＴ７３３）、ＴＣ０４３１（ＣＴ１５３）、ＴＣ０６６０（ＣＴ３８１）およびＴＣ０７４１（ＣＴ４５６）を使用して試験した。また、ＣＴ７３３およびＣＴ１５３の個々の防御効果も試験した。
【０２５８】
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、２つの抗原の組合せかまたは単一抗原を用いて、ＬＴＫ６３＋ＣｐＧをアジュバントとして用いて、筋肉内から３回免疫化した。最後の免疫化の２４日後に、マウスを、１０３ＩＦＵのＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍを用いて鼻腔内からチャレンジした。１０日後に、肺を採取およびホモジナイズし、生存クラミジアの数（ＩＦＵ／肺）を測定した。図７のデータは、抗原免疫化マウスおよびアジュバント免疫化対照中の平均ＩＦＵ／肺の数を示す。左から右へ、レーンは、（ａ）アジュバントのみ、（ｂ）ＴＣ０５５１＋ＴＣ０８９０（ＣＴ２７９＋ＣＴ６０１）、（ｃ）ＴＣ０６５１＋ＴＣ０７２７（ＣＴ３７２＋ＣＴ４４３）、（ｄ）ＴＣ０１０６＋ＴＣ０４３１（ＣＴ７３３＋ＣＴ１５３）、（ｅ）ＴＣ０６６０＋ＴＣ０７４１（ＣＴ４５６＋ＣＴ３８１）、（ｆ）ＴＣ０１０６（ＣＴ７３３）、（ｇ）ＴＣ０４３１（ＣＴ１５３）に関する。各抗原処方物について、総免疫化マウスのうちの感染マウスの数を、「Ｉｎｆ  Ｘ／Ｙ」の形で報告する｛ここで、Ｘは、感染マウスの数であり、Ｙは、チャレンジしたマウスの総数である｝。免疫化抗原（複数可）の統計学的有意性（Ｐ）を、スチューデントｔ検定により決定した。
【０２５９】
２つの抗原の４つの組合せが、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ鼻腔内チャレンジに対する防御をもたらすことができることを同定するに至った。それらの組合せのうちの３つ（ＴＣ０４３１＋ＴＣ０１０６、ＴＣ０７２７＋ＴＣ０６５１、ＴＣ０５５１＋ＴＣ０８９０、ＣＴ７３３＋ＣＴ１５３の相同体、ＣＴ４４３＋ＣＴ３７２の相同体、ＣＴ２７９＋ＣＴ６０１の相同体）については、多数のマウスにおいて、ＬＴＫ６３＋ＣｐＧのアジュバントを使用して、防御を確認するに至った（図７）。ＴＣ０４３１およびＴＣ０１０６（ＣＴ１５３およびＣＴ７３３）を単一抗原として用いた免疫化実験から、これら２つの抗原は共に個々に免疫原性を示し、これら２つの抗原いずれもがＣＴ１５３＋ＣＴ７３３の組合せの防御に寄与することが示されている（図７）。免疫化実験において防御を示す第４の抗原の組合せ（ＴＣ６６０＋ＴＣ０７４１、ＣＴ４５６およびＣＴ３８１の相同体）を、最近同定するに至った（１５匹のマウス）（図７）。
【０２６０】
実験を繰り返したが、プロトコールは、マウスを、最後の免疫化の３週間後に、１０３ＩＦＵのＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍを用いて鼻腔内からチャレンジしたという点で上記のプロトコールとは異なった。動物の感染期間に差が生じる恐れがあるので、肺中の感染性クラミジアの存在を、各マウスにおいて、チャレンジの１０および１２日後に決定した。統計学的に有意な数のマウスからデータを生成するように、免疫化実験を少なくとも３回繰り返した。図８に、各抗原処方物により免疫化したマウスの肺から回収した感染性クラミジアの平均数を報告する。この場合、第１０および１２日に得たデータを平均した。図８に示すように、このマウスモデルにおいて試験した４つの組合せのうちの２つ、すなわち、ＴＣ０５５１（ＣＴ２７９相同体、８２．６％の同一性）＋ＴＣ０８９０（ＣＴ０６０１相同体、８７．６％の同一性）、およびＴＣ０１０６（ＣＴ７３３相同体、８４．８％の同一性）＋ＴＣ０４３１（ＣＴ１５３相同体、６４．６％の同一性）が、免疫化群において、アジュバント注射マウスと比較して、統計学的に有意な防御効果を示し、ＩＦＵが１Ｌｏｇ超低下した（Ｐ：＜０．００１）。さらに、２つの組合せのうちのいずれかにより免疫化した動物の２０〜２５％が、第１０〜１２日までに、感染を完全に消散させ、対照的に、アジュバント群では、９％であった。
【０２６１】
（実施例８：組合せＴＣ０５５１＋ＴＣ０８９０＋ＴＣ０１０６＋ＴＣ０４３１の、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍを用いたチャレンジに対する防御活性の評価）
先行の実施例において論じた結果に基づいて、マウスの群を、４つの抗原の組合せＴＣ０５５１＋ＴＣ０８９０＋ＴＣ０１０６＋ＴＣ０４３１により、上記の実施例中のものと同じ免疫化レジメンを使用して免疫化した。図８に示すように、これら４つの抗原の組合せは、２つの抗原の組合せを上回る相加的な防御効果を示すように見え、肺中の細菌の存在の２．２Ｌｏｇの低下を示した（Ｐ：０．０００３）。さらに、３９％の動物が、感染を完全に消散させ、このことから、この抗原の組合せの、細菌クリアランスを加速させる点におけるより高い有効性が示された。
【０２６２】
免疫化マウスの肺から回収した生存クラミジア数に観察された著しい低下は、組換えクラミジアタンパク質による全身性の免疫化により誘導された高いレベルの防御の最初の実証である。また、組換え抗原の変性させた形態を使用したことから、抗原のコンフォメーションのさらなる最適化により、それらの防御活性を最大化し得るであろうことも指摘しなければならない。
【０２６３】
これら４つのうちのどの組換え抗原が、単一抗原として投与した場合、防御性を示すかを定義することを目的とした予備的なデータから、それらのいずれを用いても、より低いレベルのＩＦＵの低下（１ｌｏｇ未満）が観察されることが示された（データは示していない）。このことは、一般に、コンビナトリアルなワクチン接種のアプローチが、単一ワクチンのアプローチよりも、所与の病原体に対する防御免疫をもたらすのにより有効であるという概念に一致する。これは、誘発された免疫応答が、細菌の増殖サイクルの異なる局面を標的にするからである。
【０２６４】
（実施例９：組合せＴＣ０５５１＋ＴＣ０６５１＋ＴＣ０７２７＋ＴＣ０８９０の、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍを用いた卵巣嚢内チャレンジに対する防御活性の評価）
Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍを用いた卵巣嚢チャレンジのマウスモデルにおいて、組合せＴＣ０５５１＋ＴＣ０６５１＋ＴＣ０７２７＋ＴＣ０８９０（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのＣＴ２７９＋ＣＴ３７２＋ＣＴ４４３＋ＣＴ６０１の相同体）の防御効果を、モンタニド（ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）＋ＣｐＧのアジュバントを使用して試験した。このモデルは、自然のままのＭＯＭＰ（ｎＭＯＭＰ）、すなわち、クラミジアの主要外膜タンパク質の防御活性を評価するために、以前に記載されている（Ｐａｌ  Ｓら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．、７３巻：８１５３頁、２００５年）。このモデルでは、これらの抗原の、感染の進行に対する防御活性を、膣スワブ中のクラミジアの存在を計算することにより評価する。
【０２６５】
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、これら４つの抗原の組合せまたはＭＯＭＰにより、ＬＴＫ６３＋ＣｐＧをアジュバントとして使用して、鼻腔内から３回免疫化した。また、陰性の対照として、卵白アルブミンにより免疫化したマウスの群も含めた。最後の免疫化の４週間後に、マウスに、卵巣嚢中でＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍチャレンジを与え、クラミジアの存在を、感染させた動物の膣スワブ中のＩＦＵを計算することによって測定した。
【０２６６】
図９に示す結果は、チャレンジの２週間後のＩＦＵ数／膣スワブを示す。図９に示すように、全４抗原の組合せを投与したマウスは、陰性の対照群（卵白アルブミン）と比較して、細菌の存在の低下を示す。したがって、この組合せは、感染の進行を低下させた。興味深いことに、この組合せを用いて得られた防御のレベルは、今までに同定されている、最も高い防御性を示す抗原であるｎＭＯＭＰを用いて得られたレベルと顕著には異ならない。したがって、４つの抗原のこの組合せは、特に免疫原性を示す組合せである。
【０２６７】
（実施例１０：防御的ＣＤ４＋Ｔ細胞の抗原特異的サイトカインプロファイル）
クラミジア感染からの防御の媒介においてＣＤ４−Ｔｈ１応答が重要であることから、マウスにおいて防御を誘発する２つの抗原の組合せを用いたワクチン接種により誘導される免疫応答の型を分析した（ＴＣ０５５１＋ＴＣ０８９０およびＴＣ０１０６＋ＴＣ０４３１）。特に、発明者らは、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞からの、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２の同時の産生を測定した。こうした産生は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の最適なエフェクター機能の指標であると考えており、Ｔ細胞応答を標的とすることを目的とするワクチンについて、防御を改善する可能性がある。単一抗原に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞中でワクチン接種により誘導されたサイトカインプロファイルの評価を、免疫化マウスにおいて、マルチパラメトリックフローサイトメトリーによる分析により実施した（Ｐｅｒｆｅｔｔｏ  ＳＰら、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４巻、６４８〜６５５頁、２００４年）。末梢血を、抗原の組合せＴＣ０５５１＋ＴＣ０８９０およびＴＣ０１０６＋ＴＣ０４３１による最後の免疫化の１２日後に収集した。ＰＢＭＣを調製し、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋の抗原特異的にＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＴＮＦを産生する細胞の頻度を、細胞内サイトカインの染色およびフローサイトメトリーによる決定により評価した。図１０Ｂに示すように、抗原の組合せＴＣ０５５１−ＴＣ０８９０を用いたワクチン接種は、ＩＦＮγを産生する、ＴＣ０５５１応答性ＣＤ４＋Ｔ細胞を高い頻度で誘導し（１０５個のＣＤ４＋細胞において９３個のＴＣ０５５１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞）、一方、ＴＣ０８９０に対する応答は、非常に低く、１０５個のＣＤ４＋細胞において１６個のＩＦＮγ＋応答性Ｔ細胞の頻度であった。免疫化のために使用したこの抗原の組合せに対する応答は、１０５個のＣＤ４＋細胞において１３２個のＩＦＮγ産生Ｔ細胞を生じ、単一抗原と比較して、応答の増加を示した。さらに、ＩＦＮγおよびＴＮＦ−α、またはＩＦＮγ／ＴＮＦ−α／ＩＬ−２のいずれかを同時に産生する多機能性のＣＤ４＋Ｔ細胞も、顕著な頻度で生じた。偽の免疫化マウスの対照群においては、刺激のために使用した組換え抗原のいずれにも、サイトカインが、応答して分泌することはなく、このことから、ワクチン接種マウスにおいて観察された応答の特異性が示された。抗原の組合せＴＣ０１０６−ＴＣ０４３１に対するＣＤ４＋応答に関する限り（図１０Ｃ）、両方の抗原ＴＣ０１０６およびＴＣ０４３１は、類似の応答を誘導し、それぞれ、１０５個のＣＤ４＋において、１２０個および９８個のＩＦＮγ抗原特異的Ｔ細胞の頻度を示し、一方、これらの抗原の組合せは、１０５個のＣＤ４＋細胞において１４５個のＩＦＮγ＋応答性Ｔ細胞の頻度を示した。ＩＦＮγと同時に産生されるサイトカインのさらなる分析は、約５０％のＩＦＮγ＋細胞がＴＮＦ−αおよびＩＬ−２も産生し、一方、約３０％のＩＦＮγ＋細胞がＴＮＦ−αも産生することを示した。概して、これらのデータは、ワクチン接種が誘導した抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞により産生されたＴｈ１サイトカインは、機能の差を示すことを明確に示しており、この差は、感染を取り除く能力の差を反映し得るであろう。
【０２６８】
（実施例１１：ＣＤ４＋誘導性クラミジア抗原の発現分析）
発明者らは、次いで、ＣＴ２７９（Ｎａ（＋）−転移ＮＡＤＨ−キノンレダクターゼのサブユニットＣ）、ＣＴ６０１（インベーシンリピートファミリーホスファターゼ）、ＣＴ７３３（仮定上のタンパク質）、およびＣＴ１５３（ＭＡＣ−パーフォリンタンパク質）の発現を、免疫ブロット分析により、Ｃｔ−ＥＢ中およびＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染ＨｅＬａ細胞の内部の両方で、それらに特異的なマウス免疫抗血清を使用して調査した（図１１Ａ）。レノグラフィン（ｒｅｎｏｇｒａｆｉｎ）精製ＥＢの全タンパク質の溶解物（およそ１０７個のＥＢ／レーンに対応する）は、それぞれの試験した抗血清が、両方のＥＢ試料中の予想される分子量のタンパク質のバンドと反応することができることを示し、一般に、ＣＭ  ＥＢに対するより高い反応性が示された。クラミジア感染細胞中の抗原の発現を分析するために、全タンパク質の抽出物を、感染後の異なる時点（２４〜４８〜７２時間）におけるＨｅｌａ２２９細胞から調製し、免疫ブロットにより試験した。
【０２６９】
ゲル上にロードしたクラミジアタンパク質の量を、記載に従って、ＭＯＭＰの発現に基づいて正規化した。図１１Ｂに示すように、４つの抗原が、クラミジアの増殖の異なる相で発現するように見えた。
【０２７０】
最後にまた、発明者らは、感染ＨｅＬａ細胞内部における抗原の細胞内局在も、共焦点顕微鏡法により、感染Ｈｅｌａ細胞中で、感染の６、２４、４８および７２時間後に調査した。図１１Ｂに示すように、全ての抗原の発現が、封入体の内部に、感染の２４時間後に明らかに検出され、７２時間後においても依然として目に見えた。興味深いことに、ＣＴ１５３の染色は、封入体の膜に蓄積するように見え、一方、その他のタンパク質は、均一に分布した。ＣＴ１５３は、細胞膜を破壊することができるタンパク質ファミリーに属するＭＡＣ−パーフォリンタンパク質をコードするので、このタンパク質の封入体の膜における蓄積から、このタンパク質は、感染細胞からのクラミジアの流出に関与にすることを予期することができるであろう。
【０２７１】
これらの組合せを用いたワクチン接種後の免疫応答の分析から、これらの組換え抗原は全て、堅調な体液性応答を誘導し、Ｔｈ１が推進する免疫応答について予想されるように、ＩｇＧ１よりもより高いＩｇＧ２ａの抗体力価が産生されることを示すに至った。また、クラミジア感染の消散には、Ｔｈ１型の細胞性免疫応答が必要であることから、ワクチン接種後のＣＤ４＋Ｔｈ１エフェクター細胞およびメモリー細胞の調節も検討するに至った。個々の細胞が産生するサイトカインの型の差には、エフェクター機能を媒介する能力、メモリーＴ細胞として維持される能力、または両方の能力にとって重要な意味がある。ＩＦＮγのみを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞の、メモリーＴ細胞に発達する能力は、ＩＬ−２−ＩＦＮγ二重陽性細胞と比較して制限されている（Ｈａｙａｓｈｉ  Ｎ．ら、２００２年）。したがって、単一陽性ＩＦＮγ産生細胞を高い頻度で誘発するワクチンは、長期に及ぶ防御をもたらすそれらの能力を制限する恐れがある。さらに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦを産生するＣＤ４＋Ｔ細胞の大半は、エフェクターメモリー細胞として分類され、これらの細胞は、細胞内病原体に対する防御の媒介において必須の役割を果たす（Ｄａｒｒａｈ  ＰＡら、２００７年）。発明者らは、これらの防御的な組合せによる免疫化により誘導された抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が、主に多機能性であり、エフェクターおよびメモリー細胞のいずれかを含むＴｈ１細胞集団を確保するように分化することを実証した。維持され得るＴｈ１系列細胞と即時に防御的に機能するＴｈ１系列細胞との適切なバランスが、有効なワクチンのための処方の成功につながり得るであろう。
【０２７２】
（実施例１２：ＣＴ８２３＋ＣＴ７３３＋ＣＴ０４３＋ＣＴ４５６の組合せ）
抗原ＴＣ０１０６、ＴＣ０３１３、ＴＣ０２１０、ＴＣ０７４１およびそれらの組合せの防御活性を評価するために、マウスの群を、それら４つの抗原を単一で、または４抗原を組合せて用いて、実施例７に記載したものと同じ免疫化レジメンを使用して免疫化した。単一抗原の防御活性は、感染の１２日後に、ＩＦＵ／肺を測定することによって評価した。４抗原の組合せの防御活性は、感染の１０、１２、１４日後に測定して、感染クリアランスの動態を評価した。図１２に示すように、単一抗原により、感染動物の肺において、およそ０．５〜１ｌｏｇ  ＩＦＵの低下が生じた。
【０２７３】
これら４つの抗原の組合せは、最も高い防御特性を示し、このことは、これら４つの抗原の、防御の付与における相乗的な活性を示した。第１２日には、およそ４ｌｏｇの肺中の細菌の存在の低下を誘発し（Ｐ＜０．０００１）、第１２日には、感染を消散させる傾向を示した。さらに、多数のマウス（４２％）が、感染を完全に消散させ、このことは、これらの抗原の組合せの、細菌クリアランスの加速における有効性を示した。
【０２７４】
（実施例１３：ＣＴ８１２、ＣＴ３８７、ＣＴ８６９、ＣＴ１６６およびＣＴ１７５の抗原性の評価）
（ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）一次感染後の、抗原特異的ＣＤ４Ｔｇ１応答）
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、抗原特異的ＣＤ４Ｔｈ１応答を、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）一次感染後に評価した。ＣＴ感染ＨｅＬａ細胞の膜画分のプロテオミクス的な特徴付けにより同定したＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗原を、実験的なＣＴ感染を与えたマウスにおいて、特異的ＣＤ４＋Ｔｈ１応答を誘導するそれらの能力について試験した。一次感染ＢＡＬＢ／ｃマウスおよび非感染対照の脾細胞を、感染の１０日後に収集し、ＬＰＳを含有しない組換え抗原（２０μｇ／ｍｌ）を用いて刺激した。刺激の４時間後に、５μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡを細胞に添加して、その後の１２時間にわたり、サイトカイン分泌をブロックした。その後、細胞を、固定、透過処理および染色した。細胞内のＩＦＮ−γ発現を、ゲート生存細胞のＣＤ４表面発現と比較して、フローサイトメトリーにより分析および評価した。図１３Ａおよび図１３Ｂ中のヒストグラムは、ＣＴ組換え抗原を用いた特異的刺激に際し、一次感染マウス（右手のバー）および非感染マウス（左手のバー）の１０５個のＣＤ４＋Ｔ脾細胞当たりの、ＩＦＮγを産生するＣＤ４＋Ｔ細胞数を示す。データは、代表的な４つの異なる実験である。図１３Ａに示すように、ＣＴ８１２Ｃ、ＣＴ３８７、ＣＴ８６９およびＣＴ１６６は、感染動物の脾細胞中で、ＣＤ４＋−ＩＦＮγ＋細胞を有意な頻度で誘導した（Ｐ値＜０．０５）。図１３Ｂに示すように、ＣＴ８１２Ｃ（ＣＴ８１２のＣ末端断片）は、驚くべきことに、感染動物の脾細胞中で、ＣＤ４＋−ＩＦＮγ＋細胞を、完全長ＣＴ８１２配列の場合よりも高い頻度で誘導した。
【０２７５】
（ＴＣ０１９７＋ＴＣ０２６１＋ＴＣ０６６６の組合せの、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍチャレンジに対する防御活性）
３つのＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗原ＣＴ３８７＋ＣＴ８１２＋ＣＴ８６９の組合せの防御効果を、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍマウスモデルにおいて、それらのそれぞれのＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同分子種ＴＣ０６６６、ＴＣ０１９７およびＴＣ０２６１を使用して試験した。ＴＣ０１９７、ＴＣ０２６１およびＴＣ０６６６を、クローニングおよび精製して、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍによる鼻腔内感染のマウスモデルにおいて防御研究を行った。ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（１６匹のマウス／群）を、ＬＴＫ６３＋ＣｐＧのアジュバントと共に処方した、３つの組換え抗原ＴＣ０１９７＋ＴＣ０２６１＋ＴＣ０６６６の組合せにより免疫化した（１０μｇのそれぞれのタンパク質を、２週間の間隔で筋肉内に３回投与した）。陰性の対照として、マウスを、アジュバントのみにより免疫化した。最後の免疫化の４週間後に、動物に、１０３ＩＦＵの感染性Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍを鼻腔内感染させた。１２日後に、これら２つの抗原によりもたらされた防御活性を、チャレンジ動物の肺中の感染性ＩＦＵを計算することによって測定した。図１４に示すように、この抗原の組合せＴＣ０１９７＋ＴＣ０２６１＋ＴＣ０６６６は、チャレンジマウスにおいては、アジュバント免疫化マウスと比較して、ＩＦＵ数／肺を有意に低下させることができた（１．４ｌｏｇ  ＩＦＵの低下、Ｐ値：＜０．０５）。ＴＣ０１９７＋ＴＣ０２６１＋ＴＣ０６６６の組合せは、マウスをＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍチャレンジから防御することができるという知見（図１４）から、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の組合せＣＴ８１２＋ＣＴ８６９＋ＣＴ３８７および組合せＣＴ８１２Ｃ＋ＣＴ８６９＋ＣＴ３８７は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓによる感染に対して防御性を示すことが証明されている。
【０２７６】
（ＴＣ０１９７、ＴＣ０２６１およびＴＣ０６６６の単一抗原としての、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍチャレンジに対する防御活性）
ＴＣ０１９７、ＴＣ０２６１およびＴＣ０６６６の単一抗原としての、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍチャレンジに対する防御活性を評価した。３群のＢＡＬＢ／ｃマウス（１６匹のマウス／群）を、ＬＴＫ６３＋ＣｐＧのアジュバントと共に処方した３つの組換え抗原を個々に用いて免疫化した（２０μｇのそれぞれのタンパク質を、２週間の間隔で筋肉内に３回投与した）。陰性の対照として、マウスを、アジュバントのみにより免疫化した。最後の免疫化の４週間後に、動物に、１０３ＩＦＵの感染性Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍを鼻腔内（Ｉ．Ｎ．）感染させた。１２日後に、これら３つの単一抗原によりもたらされた防御活性を、チャレンジ動物の肺中の感染性ＩＦＵを計算することによって測定した。図１５に示すように、これら３つの抗原は個々には、チャレンジマウスにおいては、アジュバント免疫化マウスと比較して、ＩＦＵ数／肺を有意に低下させることができなかった。
【０２７７】
したがって、ＴＣ０１９７＋ＴＣ０２６１＋ＴＣ０６６６の組合せは、マウスをＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍチャレンジから防御することができる（図１４）。特に、図１４は、肺から回収したＩＦＵ数の平均の低下の観点において、防御を、免疫化マウス対アジュバント免疫化対照で示す［ｐ＝０．００２４］。対照的に、これら３つの抗原は、個々に投与する場合、防御性を示さない（図１５）。
【０２７８】
（実施例１４：材料および方法）
実施例１、２、７（反復実験）、８、１０および１１で使用した実験プロトコールを、この実施例において、さらに詳細に記載する。
【０２７９】
（細菌株、培養および試薬）
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｍｕｒｉｄａｒｕｍ  Ｎｉｇｇ、およびＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ血清型Ｄ株Ｄ／ＵＷ−３／ＣＸを、記載（Ｃａｌｄｗｅｌｌら、（１９８１年）、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ３１巻：１１６１〜１１７６頁）に従って、イーグル（Ｅａｒｌｅ）最小必須培地（ＥＭＥＭ）中、ＬＬＣＭＫ２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７）細胞またはＨｅＬａ２２９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２．１）のコンフルエントな単層において増殖させた。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍのＥＢの精製を、記載（Ｍｏｎｔｉｇｉａｎｉら、（２００２年）、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７０巻：３６８〜３７９頁）に従って、レノグラフィン密度勾配遠心分離により実施した。細菌を、スクロース−リン酸−グルタミン緩衝液（ＳＰＧ）中に分注し、使用するまで−７０℃で保存した。指定があれば、ＥＢを、５６℃で３時間熱不活性化した。
【０２８０】
Ｅ．ｃｏｌｉのＤＨ５αまたはＢＬ２１（ＤＥ３）を、ルリアブロス（ＬＢ）培地（Ｄｉｆｃｏ）中、３７℃で好気的に増殖させた。適宜、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびイソプロピル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．５ｍＭ）を、培地に添加した。
【０２８１】
別段の特定がない限り、全ての化学薬品を、Ｓｉｇｍａから購入した。制限酵素およびＤＮＡ改変酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製であった。別段の記載がない限り、細胞内サイトカイン染色のための全ての試薬および抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製であった。共焦点顕微鏡法の試薬は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ製であった。
【０２８２】
（遺伝子クローニング、タンパク質発現、および抗血清の調製）
Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ組換えタンパク質およびそれらのＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ相同体を産生するために、遺伝子を、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍの染色体ＤＮＡから、いずれかの遺伝子の５’末端および３’末端においてアニーリングする特異的プライマーを使用してＰＣＲ増幅した。それらの遺伝子を、Ｃ末端Ｈｉｓタグ融合タンパク質として、ならびにＮ末端グルタチオントランスフェラーゼコード配列およびＣ末端Ｈｉｓタグを有する二重融合タンパク質として発現させるために、これらの遺伝子を、プラスミドｐＥＴ２１ｂ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＧＥＸＫＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中にクローニングした。
【０２８３】
Ｈｉｓ融合体およびＧＳＴ融合体のクローニングおよび精製を、以前の記載（Ｍｏｎｔｉｇｉａｎｉら、２００２年）に従って実施した。ＣＴ０６８１およびＴＣ００５２は、それぞれ、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍのＭＯＭＰ（それぞれ、Ｃｔ  ＭＯＭＰおよびＣｍ  ＭＯＭＰ）をコードするが、これらを、Ｈｉｓ融合体として発現させ、不溶性タンパク質画分から精製した。ＴＣ０３１３およびＴＣ０２１０を除いて、この研究で使用したＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍタンパク質は全て、変性形態において不溶性タンパク質画分からのみ精製した。
【０２８４】
Ｔ細胞のインビトロ刺激アッセイのために、カラム固定化タンパク質を、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１１４を含有する緩衝液Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ、ｐＨ８（３５ｍｌ）を用いて４℃で洗浄することによって、ＬＰＳを含有しないタンパク質を調製した。残留内毒素の量を、Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＱＣＬ−１００、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して決定した。
【０２８５】
マウス抗血清を、記載（Ｍｏｎｔｉｇｉａｎｉら、２００２年）に従って、生成し、処理した。指定がある場合には、２０μｇのＥ．ｃｏｌｉ夾雑物タンパク質（ｐＥＴ２１ｂ＋空ベクターを含有するＥ．ｃｏｌｉ細菌由来のＩＭＡＣ精製タンパク質）により免疫化したマウスから得られた血清を、陰性の対照として使用した。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのＥＢのウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーを、記載（Ｆｉｎｃｏら、（２００５年）、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３巻：１１７８〜１１８８頁）に従って実施した。
【０２８６】
（感染マウスに由来する脾細胞中における、抗原特異的ＣＤ４−Ｔｈ１応答のスクリーニング）
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した、６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（３匹のマウス／群）に、２．５ｍｇのデポ−プロベラ（Ｄｅｐｏ−ｐｒｏｖｅｒａ）（酢酸メドロキシプロゲステロン）を用いるホルモン処置を皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｕｓ）から施し、５日後に、マウスの膣内に、１０６のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのＩＦＵを含有するＳＰＧ緩衝液１５μｌを接種した。チャレンジの７日後に、膣スワブを収集し、ＦＩＴＣ結合体化抗クラミジア抗体（Ｍｅｒｉｆｌｕｏｒ）を用いて染色し、４８時間後に、クラミジアの封入体を、ＵＶ顕微鏡を使用して数えることによって、感染レベルを分析した。
【０２８７】
スワブを、４００μｌのＳＰＧ中に収集し、９６ｗ平底プレート上に播種されているＬＬＣＭＫ２細胞の単層上に接種した。４８時間のインキュベーションの後に、感染性クラミジアの数を、クラミジアの封入体を数えることにより決定した。
【０２８８】
チャレンジの１０日後に、マウスを屠殺し、それらの脾臓を採取した。脾細胞を、ナイロン製フィルター（ＢＤ）を通してホモジナイズすることによって調製し、赤血球を、Ａｃｋ溶解用緩衝液（ＮＨ４Ｃｌ、０．１５５Ｍ、ＫＨＣＯ３、１０ｍＭ、Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ）中、ＲＴでの３分間の低張性溶解により除去し、次いで、細胞を、９６ウエルプレート中に２×１０６細胞／ウエルで蒔き、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、２０μｇ／ｍｌの、内毒素を含有しない特異的抗原、または４μｇ／ｍｌの精製ＥＢＳを用いて３７℃で４時間刺激した。次いで、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、最終濃度２．５μｇ／ｍｌで添加し、細胞を、細胞内サイトカイン染色までさらに１６時間インキュベートした。細胞を、生存率について、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）色素を用いて、製造元の指示に従って染色した。次いで、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して、細胞を固定および透過処理し、蛍光色素標識モノクローナル抗体を用いて染色して、表面上にＣＤ３、ＣＤ４、細胞内にＩＦＮγおよびＩＬ−４を発現する細胞を検出した。最後に、細胞を、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ中に再懸濁させた。細胞内サイトカイン染色のための抗体は全て、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。ＢＤ  Ｃａｎｔｏフローサイトメーターを使用して、試料の取得を行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、米国）を使用して、データを分析した。ＩＦＮγおよびＩＬ−４の細胞内発現を、形態、ＣＤ３発現および生存率についてあらかじめゲート化した、ＣＤ４を発現するシングレット（ｓｉｎｇｌｅｔ）細胞中で分析した。次いで、細胞を、収集し、ＣＤ４表面発現、およびＩＦＮγまたはＩＬ−４の細胞内産生について染色して、観察された応答が、Ｔｈ１（ＩＦＮγ）型またはＴｈ２（ＩＬ−４）型であるかどうかを調査した。陰性の対照として、非感染マウス由来の脾臓を並行して、収集および分析した。
【０２８９】
（ＣＤ４＋ＴＨ１細胞系および抗原提示細胞（ＡＰＣ）の調製）
上記の記載に従って、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｍｕｒｉｄａｒｕｍ（Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ）の１０３個の生存基本小体（ＥＢ）をあらかじめ鼻腔内感染させてあるドナーＢａｌｂ／ｃマウス由来の脾臓からの脾細胞をホモジナイズすることにより調製した。１２００ｒｐｍで遠心分離し、Ｍａｃｓ緩衝液（ＰＢＳ、ＰＨ７．２、０．５％ＢＳＡおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に懸濁させた後、細胞を、ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ）と共に１５分間インキュベートし、次いで、ＬＳカラム上にロードした。磁石に結合しているＣＤ４細胞を、回収し、２．５％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、抗生物質、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｍｉｎｅ）、２ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｉｒｕｖａｔｅ）、１ｍＭ、ＭＥＭ非必須アミノ酸、ＭＥＭビタミン（Ｇｉｂｃｏ）、およびベータ−メルカプトエタノール、０．５μＭを補ったＲＰＭＩ１６４０中で洗浄し、この培地中に懸濁させた。次いで、細胞を、６マルチウエルプレート中に１０７細胞／ウエルで蒔いた。最初の刺激の後に、以下の記載に従って、精製したＣＤ４を２回洗浄し、次いでＡＰＣと共に蒔いた。
【０２９０】
また、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓによるＣＤ４＋細胞系も、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの１０６個の生存基本小体（ＥＢ）をあらかじめ膣内感染させてあるドナーＢａｌｂ／ｃマウス由来の脾臓より得たが、この手順は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｍｕｒｉｄａｒｕｍについての上記の記載に従って実施した。
【０２９１】
ＣＤ４細胞を、ナイーブマウスの脾臓より調製したＡＰＣ（２×１０７／ウエル）と共に蒔いた（６×１０６／ウエル）。脾細胞を、上記の記載に従って調製し、次いで、培地を用いて２回洗浄し、７分間ガンマ照射し、さらに洗浄し、培地中に懸濁した。
【０２９２】
次いで、培養物を、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした。２４時間後に、Ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ  Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ２）を、２０Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。
【０２９３】
（養子移入のＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍおよびＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓマウスモデル）
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（４匹のマウス／群）に、１００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）中の１０７個のＣＤ４＋Ｔ細胞を、静脈内投与することによって養子性に導入した。マウスを、２４時間後に、１０３ＩＦＵのＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍまたは１０５ＩＦＵのＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを用いて鼻腔内からチャレンジした。養子免疫の効果を、上記の記載に従って、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍチャレンジの１０日後またはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓチャレンジの６日後に採取した肺から回収したＩＦＵ数を定量化することによって評価した。
【０２９４】
（Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ  ＣＤ４＋Ｔ細胞系の特徴付け）
養子移入の同日に、一定分量の精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を取っておき、以前のＣＤ４＋Ｔｈ１＋のスクリーニングにおいて同定したＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ抗原の、ＣＤ４＋Ｔ細胞をインビトロにおいて刺激する能力を評価した。２５００００細胞／ｗを、９６マルチウエルプレート中に、ＡＰＣとしての、１０６個のマウスＣＤ４枯渇脾細胞と共に蒔き、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、ＣＤ４＋Ｔｈ１の誘導物質であることが同定されているＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのタンパク質に対して相同性を示す２０μｇ／ｍｌのＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍタンパク質を用いて、３７℃で３時間刺激した。次いで、ＢＦＡを添加し、脾細胞についての細胞内染色を、記載に従って実施した。
【０２９５】
（マウス防御モデル）
６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（１０〜１５匹のマウス／群）を、抗原の組合せＴＣ０５５１−ＴＣ８９０（１５μｇ／用量）およびＴＣ０１０６−ＴＣ０４３１（１用量当たり１０μｇのそれぞれのタンパク質を含有する）であって、５０μｌのＰＢＳ中に溶解させた５μｇのＬＴＫ６３（Ｒｙａｎら、２０００年）＋１０μｇのＣｐＧ（ＯＤＮ１８２６）のアジュバントと共に処方した抗原の組合せを、第１、１５および２８日に３回投与して、筋肉内（ｉ．ｍ．）から免疫化した。陰性の対照として、アジュバント単独を投与するマウスの群を含め、並行して処理した。
【０２９６】
最後の免疫化の３週間後に、マウスに、１０３ＩＦＵのＣ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍを含有するＳＰＧ緩衝液４０μｌを鼻腔内（ｉ．ｎ．）接種した。接種用量の段階希釈物を、９６ウエル平底プレート上に播種したＬＬＣＭＫ２細胞単層上において三連で培養することによって、それぞれのマウスに投与したクラミジアチャレンジ用量を確認した。２４時間のインキュベーション後に、感染性クラミジアの数を、クラミジアの封入体を数えることによって決定した。チャレンジの１０〜１２日後の間の時期に、マウスを屠殺し、肺を単離し、肺のホモジネートを使用して、クラミジアの増殖を評価した。
【０２９７】
（マウスのＰＢＭＣにおける抗原特異的ＣＤ４−Ｔｈ１応答の分析）
マウス由来のＰＢＭＣを、最大２ｍｌのヘパリン添加血液から単離し、ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液）中で１／５に希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｌｉｔｅ−Ｍ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）での密度勾配遠心分離により分離した。１０６個のＰＢＭＣを、９６マルチウエルプレート中に、ＡＰＣとしての、１０６個のマウスＣＤ４枯渇脾細胞と共に二連で蒔き、マウス脾細胞についての上記に従って、１６時間刺激および染色した。この染色では、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ−２の発現を分析した。
【０２９８】
（共焦点顕微鏡法）
感染後のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質の細胞局在を調べるために、ＨｅＬａ細胞（２００００）を、ガラス製カバースライド（Φ１３ｍｍ）上に置き、２４時間後に、上記の記載に従って、ＣＴ  ＥＢに１：１の比で感染させた。感染の６、２４、４８および７２時間後に、細胞を、ＰＢＳ緩衝液中の２％パラホルムアルデヒドにおいて、室温で２０分間固定した。ＰＢＳを用いて２回洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ中の１％／サポニン−０．１％Ｔｒｉｔｏｎの溶液を用いて２０分間透過処理した。
【０２９９】
１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）を用いて２回洗浄し、ブロッキングした後、細胞試料に対して、抗体による染色および化学的染色を行った。ＴＣ６０１、ＴＣ２７９、ＴＣ７３３およびＴＣ１５３により免疫化したマウスから得られたポリクローナル抗血清であって、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１細胞の全タンパク質を含有するニトロセルロース細片上にあらかじめ４℃で一晩吸着させた抗血清と共に、試料を、ＲＴで１時間インキュベートした（標準的な希釈度、ＰＢＳ−ＢＳＡ中の１：５０００）。ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）結合体化抗体（４８８において励起）を使用して、それぞれの抗原の局在を可視化した。ヨウ化プロピジウム、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素Ａ６２０と結合体化させたファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、それぞれＤＮＡおよびアクチンを可視化した。
【０３００】
ＰＢＳ中での十分な洗浄後、Ａｎｔｉ−Ｆａｄｅ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて細胞の標本を作り、レーザー走査共焦点顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）下で、１００×の油浸対物レンズを用いて、細胞を観察した。
【０３０１】
本発明は、例証の目的でのみ記載されており、本発明の範囲および精神から逸脱することなく改変形態を作製することができることを理解されたい。
【０３０２】
【表２−１】
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【０３０３】
【表２−２】
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【０３０４】
【表２−３】
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【０３０５】
【表２−４】
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（配列表）
【０３０６】
【化６】
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【０３０７】
【化７】
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【０３０８】
【化８】
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【０３０９】
【化９】
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【０３１０】
【化１０】
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【０３１１】
【化１１】
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【０３１２】
【化１２】
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【０３１３】
【化１３】
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【０３１４】
【化１４】
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【０３１５】
【化１５】
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【０３１６】
【化１６】
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【０３１７】
【化１７】
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【０３１８】
【化１８】
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【０３１９】
【化１９】
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【０３２０】
【化２０】
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【０３２１】
【化２１】
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【０３２２】
【化２２】
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【０３２３】
【化２３】
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【０３２４】
【化２４】
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【０３２５】
【化２５】
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【０３２６】
【化２６】
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【０３２７】
【化２７】
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【０３２８】
【化２８】
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【０３２９】
【化２９】
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【０３３０】
【化３０】
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【０３３１】
【化３１】
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【０３３２】
【化３２】
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【０３３３】
【化３３】
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【０３３４】
【化３４】
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【０３３５】
【化３５】
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【０３３６】
【化３６】
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【０３３７】
【化３７】
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【０３３８】
【化３８】
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【０３３９】
【化３９】
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【０３４０】
【化４０】
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【０３４１】
【化４１】
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【０３４２】
【化４２】
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【０３４３】
【化４３】
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【０３４４】
【化４４】
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【０３４５】
【化４５】
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【０３４６】
【化４６】
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【０３４７】
【化４７】
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【図６】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年1月12日(2012.1.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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