(57)【要約】  化学式Ｉによる高感度で非放射性の脂肪酸アシルは脂肪酸アシル化基質（例、タンパク質あるいはポリペプチド）の検出や細胞イメージングをインビボ条件下で行う方法において有用である。式Ｉにおいて、記号Ｘ、Ａ、及び下付記号ｎは明細書に記載の通りである。脂肪酸アシル化合物は、とりわけ、様々な細胞の条件下での異なる生物学的状態におけるタンパク質の脂質組成を分析することに使用でき、細胞タンパク質における大規模な脂質分析への入口となる。
2012517810.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸アシル化基質を検出する方法において、
ｉ．式Ｉの脂肪酸アシルを動物細胞と共にインキュベートし、
2012517810.tif 000020
ここで、式Ｉ中、下付記号ｎは６から１５の整数であり、記号Ａはエチニル基を表し、記号Ｘは−ＯＨ又は−ＳＣｏＡを表し、上記動物細胞は基質と該基質にＩを結合させて脂肪酸アシル化基質を産生させ得る少なくとも一の酵素を含み；
ｉｉ．工程（ｉ）からの脂肪酸アシル化基質をアジドタグ付き標識基と組み合わせ、ここで、アジドタグは脂肪酸アシル化基質のＡ基と［３＋２］環化付加反応を受けて、標識された脂肪酸アシル化基質を産生し；
ｉｉｉ．脂肪酸アシル化基質の標識基を蛍光イメージング法によりインビボで動物細胞中にて検出し；これにより脂肪酸アシル化基質を検出することを含む方法。
【請求項２】
上記方法が哺乳類細胞を使用して実施される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記細胞が癌細胞を使用して実施される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記酵素がアシルトランスフェラーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記酵素がＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ、Ｓ−アシルトランスフェラーゼ及びＳ−パルミトイルトランスフェラーゼからなる群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
式Ｉにおいて、下付記号ｎが７から１４の整数である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
式Ｉにおいて、下付記号ｎが７、８、１０、１１及び１３からなる群から選択される整数である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
式Ｉにおいて、下付記号ｎが１１から１３の整数である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｘが−ＯＨである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｘが−ＳＣｏＡである請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
上記基質がタンパク質又はポリペプチドである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
上記標識基が標識酵素と蛍光標識基からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
上記標識基がローダミンアジドである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記標識基が結合ペアの一員を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の間に、工程（ｉｉ）で産生された標識脂肪酸アシル化基質を、上記結合ペアの相補員を含む検出可能な標識基で処理する工程があり、ここで上記結合ペアの上記相補員は、工程（ｉｉ）で産生された上記標識脂肪酸アシル化基質の標識基に結合する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記標識基質がアジ化ビオチンである請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
上記結合ペアの上記相補員が、フルオロフォアに結合したストレプトアビジンである請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
上記結合ペアの上記相補員が、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８に結合したストレプトアビジンである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
式Ｉの脂肪酸アシル化合物のタンパク質又はポリペプチドの脂肪酸アシル化の検出のための動物細胞におけるインビボアッセイにおける使用であって、
2012517810.tif 000021
ここで、式Ｉ中、下付記号ｎは６から１５の整数であり、記号Ａはエチニル基を表し、記号Ｘは−ＯＨ又は−ＳＣｏＡを表し、検出がインビボ条件下で起きる使用。
【請求項２０】
ｎが１１又は１３の整数である請求項１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
この出願は、２００９年２月１４日に出願され、全ての目的に対してその全体がここに援用される米国仮出願第６１／２０７５２７号に基づき優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内タンパク質の脂肪酸アシル化は生命維持に必須であり、タンパク−タンパク及びタンパク−膜間相互作用を制御している。タンパク質の脂肪酸アシル化は、脂質のタンパク質への共有結合である。これはタンパク質の物理化学的性質や生物学的機能を調節し、そのターゲティングを細胞内での活性化に向けることにつながる。而して、タンパク質の脂肪酸アシル化は、細胞内タンパク質輸送や選別、シグナル伝達経路や恒常性の調節を制御している（Resh, M.D. Trafficking and signaling by fatty-acylated and prenylated proteins. Nat. Chem. Biol. 2, 584 - 590 (2006)；Greaves, J. & Chamberlain, L.H. Palmitoylation dependent protein sorting. J. Cell Biol. 176, 249-254；Zhang, F.L. & Casey, P.J. Protein prenylation: molecular mechanisms and functional consequences. Annu Rev Biochem 65, 241-270 (1996)を参照）。
【０００３】
数種類のタンパク質脂肪酸アシル化が真核生物には存在する。これらとしては主にＮ−ミリストイル化とＳ−パルミトイル化が挙げられる（図１ａ）。典型的には、Ｎ−ミリストイル化タンパク質は、露出したＮ末端のグリシン残基に安定したアミド結合によって結合した１４個の飽和炭素のミリスチン酸基を含んでいる。これに対し、Ｓ−パルミトイル化は、１６炭素のパルミチン酸又はより長鎖の脂肪酸の、不安定なチオエルテル結合を介したシステイン残基への可逆的付加を含む。生細胞においてはＳ−パルミトイル化が優位であるが、Ｎ−パルミトイル化はハリネズミやスピッツが分泌するタンパク質で同定されており（Pepinsky, R.B.等 Identification of a palmitic acid-modified form of human Sonic hedgehog. J Biol Chem 273, 14037-45 (1998)；Miura, G.I.等 Palmitoylation of the EGFR ligand Spitz by Rasp increases Spitz activity by restricting its diffusion. Dev Cell 10, 167-76 (2006)を参照）、恐らく、パルミトイル基がシステインに転位することでアミド結合を形成している。
【０００４】
タンパク質の脂肪酸アシル化が生理学的に重要な役割を担っているにも関わらず、脂質修飾タンパク質を検出するための高感度な方法は殆ど存在していない（Drisdel, R.C.及びGreen, W.N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques 36, 276-285 (2004)；Roth, A.F.等 Global analysis of protein palmitoylation in yeast. Cell 125, 1003 - 1013)を参照）。伝統的な方法は、放射性脂肪酸による代謝標識法を含むが（Schlesinger, M.J., Magee, A.I.及びSchmidt, M.F. Fatty Acid Acylation of Proteins in Cultured Cell. J. Biol. Chem. 255, 10021- 10024 (1980)を参照）、これは長時間のオートラジオグラフ照射を要するため時間がかかり、放射性同位元素を取り扱うという危険性は言うまでも無い。近年、アジド基を持つ脂肪酸アナログを代謝的に取り込み、それを利用してＳｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション反応により脂肪酸アシル化タンパク質を検出することを記載した研究が文献で発表された。Hang, H.C.等 Chemical probes for the rapid detection of Fatty-acylated proteins in Mammalian cells. J Am Chem Soc 129, 2744-5 (2007)；Kostiuk, M.A.等 Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue. Faseb J 22, 721-32 (2008)；Martin, D.D.等 Rapid detection, discovery, and identification of post-translationally myristoylated proteins during apoptosis using a bio-orthogonal azidomyristate analog. Faseb J 22, 797-806 (2008)；及びHeal, W.P.等 Site-specific N-terminal labelling of proteins in vitro and in vivo using N-myristoyl transferase and bioorthogonal ligation chemistry. Chem Commun (Camb), 480-2 (2008)を参照。このアプローチ法は、微生物中の組換えタンパク質の標識化に（Heal, W.P., Wickramasinghe, S.R., Leatherbarrow, R.J.及びTate, E.W. N-Myristoyl transferase-mediated protein labelling in vivo. Org Biomol Chem 6, 2308-15 (2008)を参照）、またミトコンドリアに局在化し又はアポトーシス中に翻訳後修飾を受けている脂肪酸アシル化タンパク質の同定に（Kostiuk, M.A.等 Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue. Faseb J 22, 721-32 (2008)；Martin, D.D.等 Rapid detection, discovery, and identification of post-translationally myristoylated proteins during apoptosis using a bio-orthogonal azidomyristate analog. Faseb J 22, 797-806 (2008)を参照）使用されている。上記に鑑みると、特にホールセル環境下で、タンパク質アシル化の容易な機能及びプロテオミクス解析を提供する方法が当該分野で必要である。本発明は少なくともこの必要性を満たす。
【発明の概要】
【０００５】
一態様では、本発明は、脂肪酸アシル化基質を検出する方法において、（ｉ）式Ｉの脂肪酸アシルを動物細胞と共にインキュベートし、
2012517810.tif 000003
ここで、式Ｉ中、下付記号ｎは６から１５の整数であり、記号Ａはエチニル基を表し、記号Ｘは−ＯＨ又は−ＳｃｏＡを表し、上記動物細胞は、基質と該基質にＩを結合させて脂肪酸アシル化基質を生成せしめることが可能な少なくとも一の酵素とを含み；（ｉｉ）工程（ｉ）からの脂肪酸アシル化基質をアジドタグ標識基と組み合わせ、ここで、アジドタグは、脂肪酸アシル化基質のＡ基と［３＋２］環化付加反応を受けて、標識された脂肪酸アシル化基質を産生し；（ｉｉｉ）脂肪酸アシル化基質の標識基を検出し；これにより脂肪酸アシル化基質を検出する方法を提供する。ある実施態様では、工程（ｉｉｉ）において、脂肪酸アシル化基質は動物細胞中においてインビボで検出される。
【０００６】
本発明は、脂肪酸アシル化基質を検出する方法において、
2012517810.tif 000004
（ｉ）式Ｉの脂肪酸アシルを動物細胞と共にインキュベートし、ここで、式Ｉ中、下付記号ｎは６から１５の整数であり、記号Ａはエチニル基を表し、記号Ｘは−ＯＨ又は−ＳｃｏＡを表し、上記動物細胞は、基質と該基質にＩを結合させて脂肪酸アシル化基質を生成せしめることが可能な少なくとも一の酵素とを含み；（ｉｉ）工程（ｉ）からの脂肪酸アシル化基質をアジドタグ付き標識基と組み合わせ、ここで、アジドタグは、脂肪酸アシル化基質のＡ基と［３＋２］環化付加反応を受けて、標識された脂肪酸アシル化基質を産生し；（ｉｉｉ）脂肪酸アシル化基質の標識基を蛍光イメージング法により、動物細胞中においてインビボで検出し；それにより脂肪酸アシル化基質を検出する方法をまた提供する。
【０００７】
本発明は、タンパク質又はポリペプチドの脂肪酸アシル化の検出のために動物細胞を使用するインビボアッセイにおける式Ｉの脂肪酸アシル化合物の使用をまた提供し、
2012517810.tif 000005
ここで、式Ｉ中、下付記号ｎは６から１５の整数であり、記号Ａはエチニル基を表し、記号Ｘは−ＯＨ又は−ＳｃｏＡを表し、検出はインビボ設定で起きる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、天然に生じる脂肪酸アシルと本発明の所定の化合物：化合物１（Ｃ１０）、２（Ｃ１１）、３（Ｃ１３）、４（Ｃ１４）、５（Ｃ１６）及び６（Ｃ１８）による細胞タンパク質の標識化及びイメージングの戦略を示す：（Ａ）タンパク質に共有結合したＮ−ミリステート及びＳ−パルミタート基の化学構造；（Ｂ）本発明のために研究した本発明の例示的ω−アルキニル脂肪酸アシル；（Ｃ）式Ｉの例示的脂肪酸アシルで細胞性脂質修飾タンパク質を標識するスキーム。式Ｉの合成ω−アルキニル脂肪酸アシルを培養した細胞に添加し、代謝的にアシル化タンパク質に組み込んだ（工程１）。精査した後、アルキニル基をアジドタグ付きビオチン又はアジドタグ付きフルオロフォアに、第一銅触媒によるアルキン−アジド［３＋２］環化付加反応によって、化学選択的に結合させた。コンジュゲートしたタンパク質をゲル電気泳動により分離し、ストレプトアビジン結合西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）によって検出し（経路Ａ）、あるいは別法として、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ４８８フルオロフォアによって検出し、蛍光顕微鏡を使用して撮像した（経路Ｂ）。
【図２】図２は脂質修飾されたタンパク質の生化学的検出法と撮像を示す：（Ａ）ＭＤＣＫ細胞を本発明の所定のω−アルキニル脂肪酸アシル化合物（１００μＭ）により、２４時間、レーン１：Ｃ１０，レーン２：Ｃ１１，レーン３：Ｃ１３，レーン４：Ｃ１４，レーン５：Ｃ１６，レーン６：Ｃ１８と示した通りに処理した。ここに記載された方法を使用して、細胞プロテオームを調製し、アジ化ビオチンと反応させ、ゲル電気泳動で分離し、ストレプトアビジン−ＨＲＰでのウエスタンブロッティングにより検出した。新しいバンドの強さ又は出現の増加により判断されるように、星印は、ＤＭＳＯコントロール試料では無いプローブによる処理で標識されたバンドを意味する；（Ｂ）並行して、ストレプトアビジン−ＨＲＰによる検出前に、ウエスタンブロットを５％ヒドロキシルアミンで７２時間処理した。レーン１：Ｃ１０，レーン２：Ｃ１１，レーン３：Ｃ１３，レーン４：Ｃ１４，レーン５：Ｃ１６，レーン６：Ｃ１８；（Ｃ，Ｄ，Ｅ及びＦ）ω−アルキニル脂肪酸アシルの非存在下（Ｃ）又はω−アルキニル脂肪酸アシルＣ１４（Ｄ）、Ｃ１６（Ｅ）、及びＣ１８（Ｆ）の存在下で標識されたＰＣ３細胞の蛍光顕微鏡観察。細胞をＤＭＳＯ又はω−アルキニル脂肪酸（１００μＭ）により、示した通り３時間処理した。ついで細胞を固定し、透過処理し、アジ化ローダミンでクリック反応させ、落射蛍光顕微鏡により撮像した。パネル（Ｄ）、（Ｅ）、及び（Ｆ）では、ローダミン標識ω−アルキニル脂肪酸アシルの蛍光放射が、灰色の輪で示される核を囲む灰色のハローとして現れている（スケールバー，１０μｍ）；（Ｇ，Ｈ，Ｉ）ＰＣ３細胞をＣ１４、Ｃ１６及びＣ１８ω−アルキニル脂肪酸アシルで処理し（パネル（Ｃ−Ｆ）について上述した通り）、共焦点顕微鏡によって撮像し、その撮像の結果をパネル（Ｇ）、（Ｈ）及び（Ｉ）にそれぞれ示す。全ての画像は６３倍の油浸対物レンズを用いて同じ様にして得られた。ｚ軸に沿った蛍光は各共焦点切片の上に示されている（スケールバー，１０μｍ）；（Ｊ，Ｋ，Ｌ）異なった細胞状態における脂質修飾タンパク質の分布は蛍光イメージングによりモニターできる。中期の細胞は細胞膜においてＣ１６標識タンパク質の特徴的分布を示し、紡錘体の周りと組織像パネルの全体で高密度な構造をとる（Ｋ）。ｚ軸に沿った蛍光はパネルの左側に示されている（Ｋ）。細胞質分裂では、Ｃ１６標識タンパク質が細胞分裂パネルの部位である分裂溝に集中する（Ｌ）。
【図３】図３はＲＡＷ２６４７マクロファージ（Ａ）及びマウス線維芽細胞Ｌ細胞（Ｂ）における脂質修飾タンパク質の標識と検出を示す。細胞をω−アルキニル脂肪酸アシル（１００μＭ）で２４時間処理した（レーン１：Ｃ１０，レーン２：Ｃ１１，レーン３：Ｃ１３，レーン４：Ｃ１４，レーン５：Ｃ１６，レーン６：Ｃ１８）。ここに記載した方法を使用して、細胞プロテオームを調製し、アジ化ビオチンと反応させ、ゲル電気泳動で分離し、ストレプトアビジン−ＨＲＰでのウエスタンブロットにより検出した。新しいバンドの強さ又は出現の増加で判断されるように、星印はＤＭＳＯコントロール試料には無いプローブでの処理で標識されたバンドを示す。
【図４】図４は細胞タンパク質中へのＣ１４（Ａ）、Ｃ１６（Ｂ）及びＣ１８（Ｃ）ω−アルキニル脂肪酸アシルプローブの経時的取り込みを示している。図に示した通り、ＭＤＣＫ細胞をω−アルキニル脂肪酸アシルプローブで処理した。ここに記載した方法を使用して、細胞プロテオームを調製し、アジ化ビオチンと反応させ、ゲル電気泳動で分離し、ストレプトアビジン−ＨＲＰでのウエスタンブロットにより検出した。新しいバンドの強さ及び出現の増加で判断されるように、星印はＤＭＳＯコントロール試料には無いプローブでの処理で標識されたバンドを示す。
【図５】図５は細胞タンパク質中へのＣ１４（Ａ），Ｃ１６（Ｂ）及びＣ１８（Ｃ）ω−アルキニル脂肪酸アシルプローブの用量依存的取り込みを示している。図に示した通り、ＭＤＣＫ細胞をω−アルキニル脂肪酸アシルプローブで処理した。ここに記載した方法を使用して、細胞プロテオームを調製し、アジ化ビオチンと反応させ、ゲル電気泳動で分離し、ストレプトアビジン−ＨＲＰでのウエスタンブロットにより検出した。新しいバンドの強さや出現の増加で判断されるように、星印はＤＭＳＯコントロール試料には無いプローブでの処理で標識されたバンドを示す。
【図６】図６はω−アルキニル脂肪酸アシルの組み込みの特異性を示す：（Ａ）シクロヘキシイミドの存在下におけるＣ１４標識化の阻害。ＭＤＣＫ細胞をシクロヘキシイミド（１００μｇ／ｍｌ）の存在下あるいは非存在下において、Ｃ１４ω−アルキニル脂肪酸（１００μＭ）で５時間処理した。ここに記載した方法を使用して記載されたようにして、細胞プロテオームを調製し、アジ化ビオチンと反応させ、ゲル電気泳動で分離し、ストレプトアビジン−ＨＲＰでのウエスタンブロットにより検出した。星印はＤＭＳＯコントロール使用には無いプローブによる処理で標識されたバンドを示す；（Ｂ，Ｃ）Ｃ１４及びＣ１６ω−アルキニル脂肪酸のミリスチン酸（ＭＡ）及びパルミチン酸（ＰＡ）それぞれに対する用量依存的競合。ＭＤＣＫ細胞をミリスチン酸（ＭＡ）及びパルミチン酸（ＰＡ）の濃度を上げていきながら、示した通りにω−アルキニル脂肪酸プローブで処理した。試料はここで記載された通りに処理した。
【図７】図７はＰＣ３前立腺癌細胞中のω−アルキニル脂肪酸アシルで標識された細胞タンパク質の蛍光顕微鏡データを示す。細胞をＤＭＳＯ（Ａ）又は１００μＭのＣ１０（Ｂ）、Ｃ１３（Ｃ）、Ｃ１４（Ｄ）、Ｃ１６（Ｅ）、Ｃ１８（Ｆ）で２４時間処理した。その後、細胞を固定し、透過処理し、アジ化ビオチンとクリック反応させた後、ストレプトアビジン結合Ａｌｅｘａ４８８で（場合によっては核の染色のためにヘキスト染色で）処理し、ここに記載された通りに落射蛍光顕微鏡技術を使用して撮像した。
【図８】図８はマウス線維芽細胞Ｌ細胞中のω−アルキニル脂肪酸アシルで標識された細胞タンパク質の蛍光顕微鏡データを示す。細胞をＤＭＳＯ（Ａ）又は１００μＭのＣ１０（Ｂ）、Ｃ１１（Ｃ）、Ｃ１３（Ｄ）、Ｃ１４（Ｅ）、Ｃ１６（Ｆ）、Ｃ１８（Ｇ）で２４時間処理した。その後、細胞を固定し、透過処理し、アジ化ビオチンと反応させ、ストレプトアビジン結合Ａｌｅｘａ４８８で（場合によっては核の染色のためにヘキスト染色で）処理し、ここに記載された通りに落射蛍光顕微鏡技術を使用して撮像した。
【図９】図９はＲＡＷ２６４７マクロファージ中のω−アルキニル脂肪酸アシルで標識された細胞タンパク質の蛍光顕微鏡データを示す。細胞をＤＭＳＯ（Ａ）又は１００μＭのＣ１０（Ｂ）、Ｃ１１（Ｃ）、Ｃ１３（Ｄ）、Ｃ１４（Ｅ）、Ｃ１６（Ｆ）、Ｃ１８（Ｇ）で２４時間処理した。その後、細胞を固定し、透過処理し、アジ化ビオチンとクリック反応させ、ストレプトアビジン結合Ａｌｅｘａ４８８で（場合によっては核の染色のためにヘキスト染色で）処理し、ここに記載された通りに落射蛍光顕微鏡技術を使用して撮像した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
定義
ここで使用される場合、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、本出願全体を通して互換的に使用され得、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドを含む。タンパク質は天然に生じるアミノ酸とペプチド結合、又は合成ペプチド模倣構造から構成されうる。よって、ここで用いられる「アミノ酸」又は「ペプチド残基」は天然に生じるアミノ酸と合成アミノ酸の双方を意味する。例えば、ホモ−フェニルアラニン、シトルリン及びノルロイシンは本発明の目的のアミノ酸と考えられる。「アミノ酸」はまたプロリン及びヒドロキシプロリンのようなイミノ酸残基も含む。側鎖は（Ｒ）又は（Ｓ）配座の何れかでありうる。好ましい実施態様では、アミノ酸は（Ｓ）又はＬ−配座にある。非天然に生じる側鎖が使用される場合、例えばインビボでの分解を防いだり遅らせるために、非アミノ酸置換基が使用されうる。
【００１０】
ここで使用される場合、「基質」という用語は酵素に作用される物資を言う。
【００１１】
ここで使用される場合、「酵素」という用語は、典型的には化学反応を触媒しうるタンパク質である生体分子を言う。
【００１２】
ここで使用される場合、「標識」又は「標識基」は、直接的に（すなわち一次標識）、又は、間接的に（すなわち二次標識）検出される分子を意味し、例えば、標識は可視化及び／又は測定され、あるいは別の方法で同定され、その存在あるいは非存在について知ることができる。当業者には理解されるであろうが、これがなされる方法はその標識に依存するであろう。本発明において使用される適切な標識基は、とりわけ、例えば蛍光標識、ＦＲＥＴエネルギー供与体、標識酵素などの一次検出可能標識、及びとりわけ結合ペアの一員などの二次標識を含む。
【００１３】
ここで使用される場合、「標識酵素」は標識酵素基質の存在下で反応を受け、検出可能な産物を作り出す酵素を意味する。本発明において使用される適切な標識酵素には、限定されるものではないが、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリ性フォスファターゼ、及びグルコースオキシダーゼが挙げられる。そのような基質の使用方法は当該分野でよく知られており、またここに記載される。標識酵素の存在は、標識酵素の基質との反応を酵素が触媒し、同定可能な産物を生み出すことにより一般的に明らかになる。そうした産物は、西洋わさびペルオキシダーゼのテトラメチルベンジジンとの反応のように不透明であり、様々な色を呈しうる。ルミノール（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィックから購入できる）のような、蛍光反応産物を作り出す他の標識酵素基質が開発されている。標識酵素を標識酵素基質を用いて同定する方法は当該分野でよく知られており、多くの商用キットが利用できる。様々な標識酵素の例とその使用方法が、その全体が出典明示によりここに援用されるSavage等, Previews 247:6-9 (1998), Young, J. Virol. Methods 24:227-236 (1989)’に記述されている。
【００１４】
ここで使用される場合、「蛍光標識」は、その固有の蛍光特性を通じて検出されうる任意の分子を意味する。適切な蛍光標識としては、限定されるものではないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルーＴＭ、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣレッド６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣレッド７０５及びオレゴングリーンが挙げられる。適切な光学色素は、出典明示により明示的にここに援用されるリチャードＰ．ハウグランドによる２００２年版Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（第９版）に記載されている。適切な蛍光標識は、また、限定しないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Chalfie等, Science 263(5148):802-805 (Feb. 11, 1994)；及びＥＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ−Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ；１．Evrogen Inc. Miklukho-Maklaya str, 16/10, 117997, モスクワ,ロシア；２．Stauber, R. H. Biotechniques 24(3):462-471 (1998)；３．Heim, R.及びTsien, R. Y. Curr. Biol. 6:178-182 (1996)）、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ；Clontech Laboratories, Inc., 1290 Terra Bella Avenue, Mountain View, CA 94043, USA）、ルシフェラーゼ（Ichiki等, J. Immunol. 150(12):5408-5417 (1993)）、βガラクトシダーゼ；（Nolan等, Proc Natl Acad Sci USA 85(8):2603-2607 (April 1988)）、又はウミシイタケ；米国特許第５２９２６５８号；同第５４１８１５５号；同第５６８３８８８号；同第５７４１６６８号；同第５７７７０７９号；同第５８０４３８７号；同第５８７４３０４号；同第５８７６９９５号；及び同第５９２５５５８号）を含む。上に引用した文献の全てが、出典明示によりここに明示的に援用される。
【００１５】
また、標識は間接的に検出でき、そのようなものとして、標識基は、例えば、結合ペアの一員でありうる。ここで使用される場合、「結合ペアの一員」とは第一と第二の部分の一方を意味し、ここで該第一及び該第二の部分は互いに対して特異的な結合親和性を有している。本発明での使用に適切な結合ペアとしては、限定されるものではないが、ビオチン／アビジン（又はビオチン／ストレプトアビジン）、抗原／抗体（例えば、ジオキシゲニン／抗ジオキシゲニン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）／抗ＤＮＰ、ダンシル−Ｘ−抗ダンシル、フルオレセイン／抗フルオレセイン、ルシファーイエロー／抗ルシファーイエロー、及びローダミン／抗ローダミン）及びカルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）／カルモジュリンが挙げられる。他の適切な結合ペアは、ＦＬＡＧ−ペプチド（Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)）；ＫＴ３エピトープペプチド（Martin等, Science, 255:192-194 (1992)）；チューブリンエピトープペプチド（Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)）；及びＴ７遺伝子１０プロテインペプチドタグ（Lutz-Freyermuth 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6393-6397 (1990)）及びそれぞれの抗体を含む。
【００１６】
当業者には理解されるであろうが、一つの結合ペアの相補的な一員は、他の結合ペアの相補的な一員にもなり得る。例えば、抗原（第一の部分）は第一の抗体（第二の部分）、に結合し得、後者は、今度は、第二の抗体（第三の部分）の抗原となり得る。そうした状態では第一の部分と第三の部分が、それぞれに相補的な結合ペアの一員である中間の第二の部分を介して間接的に結合することが可能となることが更に理解される。
【００１７】
当業者には理解されるであろうが、上述した通り、標識基は結合ペアの一員を構成しうる。これにより、ある化合物（例えば、脂肪酸アシル化基質）が、例えばビオチン部分のような結合ペアの一員と結合することで、間接的に標識されることが可能となることが更に理解されよう。結合ペアの一員を基質（例えば、脂肪酸アシル化基質）に結合させることは、結合ペアのそのような一員が例えばストレプトアビジンのような相補的結合パートナーを有する場合、ここでは「間接的標識」と称する。
【００１８】
「アルキレン」という用語は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−及び−ＣＦ２ＣＦ２−に例示されるように、アルキル基から誘導された２価の基を意味する。典型的には、アルキル（又はアルキレン）基は、１から２４個の炭素原子を有するが、本発明では１０個又はそれより少ない炭素原子を持つ基が好ましい。明確にするために、「アルキル基」という用語は、表示された炭素数を有する（例えば、Ｃ１−６は１から６個の炭素を意味する）、直鎖状又は分岐鎖の炭化水素ラジカル及びハロゲン化バリアントを意味する。
【００１９】
「ヘテロアルキレン」という用語は、
2012517810.tif 000006
に例示されるように、ヘテロアルキルから誘導された２価基を意味する。明確にするために、「ヘテロアルキル」という用語は、記述された数の炭素原子と、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ及びＳからなる群から選択される１から３個のヘテロ原子からなり、窒素及び硫黄原子は場合によっては酸化され得、窒素ヘテロ原子は場合によっては第四級化されうる、安定した直鎖状又は分岐鎖の炭化水素基を意味する。ここで使用される場合、「ヘテロアルキレン」という用語は、またモノ−及びポリ−ハロゲン化バリアントをも意味する。
【００２０】
発明の実施態様
特にホールセル環境下で、タンパク質脂肪酸アシル化の容易な機能及びプロテオミクス解析を提供する方法が当該分野で尚も必要とされている。本発明は、式Ｉの脂肪酸アシルを含む非放射性アルキンの使用を提供することで、この必要性を満たしている：
2012517810.tif 000007
ここで、式Ｉ中、下付記号ｎは６から１５の整数であり、記号Ａはエチニル基を表し、記号Ｘは−ＯＨ又は−ＳＣｏＡを表し、これは、代謝的に基質、例えばタンパク質及びポリペプチドに代謝的に取り込まれて細胞環境中に入りうる。式Ｉの化合物は、少なくとも、動物細胞中の脂肪酸酸アシル化基質の検出と可視化に有用性が見出される。
【００２１】
ここで使用される場合、ＳＣｏＡの略語は次の構造を有するコエンザイムＡ基を示し、
2012517810.tif 000008
ここで、波線
2012517810.tif 000009
はコエンザイムＡ基の式Ｉの化合物の残りの部分への結合点を示す。
【００２２】
驚くべきことに、本出願人は、式Ｉの脂肪酸アシルを含むアルキンを、動物細胞（一実施態様では、哺乳類細胞、別の実施態様では、癌細胞）であって、該動物細胞、又はその各実施態様が式Ｉの化合物での基質の脂肪酸アシル化を触媒することが可能な酵素を含んでいるものにおいて、インビボ設定下でインキュベーションすることで、タンパク質又はペプチドのような基質の脂肪酸アシル化に使用することができることを見出した。有利なことに、式Ｉの化合物はこの目的に非常に適している。如何なる特定の理論によっても限定されるものではないが、本発明者は、式Ｉの脂肪酸アシル炭素鎖のアルキン基が脂肪酸アシル鎖の疎水性を維持し、脂肪酸アシル鎖の物理化学的な性質との干渉とその相互作用を最小にすると考える。更に、式Ｉの脂肪酸アシルを含むアルキンがひとたびタンパク質やペプチドのような基質に結合すると、そのアルキニル基は代謝的に不活性であるが、適切な化学的条件下では十分に反応性であり、そのため、アルキン部分がアジドタグを含む標識基の結合点として使用されうる。
【００２３】
アジドタグ化した部分を含む標識あるいは標識基は、アジドタグ部分と標識を連結させるリンカー基をまた含みうる。一実施態様では、標識基は直接的にアジドタグ部分に結合される。他の実施態様では、リンカー基がリンカー基を介してアジド部分に結合される。典型的には、リンカー基又はリンカーは、例えばＣ１−１２アルキレンリンカー又はＣ１−１２ヘテロアルキレンリンカーのような標識基もアジド部分を繋ぐために使用される比較的短い非反応性のカップリング部分、例えば以下の実施例において提供されるものである。
【００２４】
多くのアジドタグ標識基が商用的供給者を通じて調達できる。インビトロジェン(カールスバット, カリフォルニア)は、「クリックケミストリー試薬」として多くのアジドタグ標識を販売している。とりわけ、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴＴＭアジド試薬は本発明での使用に適している。これらは以下を含む：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒＲ４８８アジド−（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ ５−カルボキサミド−（６−アジドヘキサニル）、ビス（トリエチルアンモニウム塩）），カタログ番号Ａ１０２６６；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４アジド−（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４ カルボキサミド−（６−アジドヘキサニル）、トリエチルアンモニウム塩），カタログ番号Ａ１０２７０；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７アジド，カタログ番号Ａ１０２７７；アジ化ビオチン−ＰＥＧ４カルボキサミド−６−アジドヘキサニルビオチン，カタログ番号Ｂ１０１８４；Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８アジド−（Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）６−カルボキサミド−（６アジドヘキサニル）、トリエチルアンモニウム塩），カタログ番号Ｏ１０１８０；テトラメチルローダミンアジド−テトラメチルローダミン５−カルボキサミド−（６−アジドヘキサニル）），カタログ番号Ｔ１０１８２。その他のアジドタグ標識基は当業者に知られており、既知の合成法で調製できるか又は商品的供給源から入手できる。
【００２５】
脂肪酸アシル化基質に標識基を結合させるための特に有用な方法は、その教唆が出典明示によりここに援用される米国特許第７３７５２３４号に記載された通りに、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ等によって開発され、アルキン及びアジドタグ基の間で、第一銅触媒によるＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環化付加反応の変法を使用するものであり、以下に概説する。Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ等は「クリック反応」として、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環状付加反応のこの変法を新しく作り出した。本発明で使用されるクリック反応を以下のスキーム１に例証する：エチニル
2012517810.tif 000010
基を含む本発明の脂肪酸アシル化基質Ａ１と、アジドタグ標識基Ａ２は、組み合わせられると、標識された脂肪酸アシル基質Ａ３１及びＡ３２を生じ、通常はＡ３１異性体が多く存在する。本出願においてアルキニル含有基質とアジドタグ部分が「［３＋２］環状付加反応を受ける」と記述しているが、これは、アルキニル基とアジド基が下記のスキーム１に示した通り、環状付加反応において互いに反応し、その反応の産物がトリアゾール官能基を含んでいることを意味する。一実施態様では、［３＋２］環状付加反応を触媒するために第一銅試薬が添加される。一実施態様では、基質はタンパク質又はポリペプチドである。他の実施態様では、反応はインビボ条件下で実施される。一実施態様では、アジドタグ付き標識基はアジ化ビオチンである（インビトロジェンカタログ番号Ｂ１０１８４）。他の実施態様では、アジドタグ付き標識基は、アジ化テトラメチルローダミンである（インビトロジェンカタログ番号Ｔ１０１８２）。別の実施態様では、アジドタグ付き標識基は、アジ化ローダミンである（Speers, A.E.及びCravatt, B.F. Profiling enzyme activities in vivo using click chemistry methods. Chem. Biol. 11, 535-546 (2004)を参照）。
2012517810.tif 000011
【００２６】
式Ｉの化合物で脂肪酸アシル化された基質（例えば、タンパク質又はポリペプチド）に標識基を結合させた後、脂肪酸アシル化基質産物を、その上の標識基を検出することにより検出することが可能である。基質に結合させた標識基の検出は、限定しないが、蛍光画像、ウエスタンブロット法、質量分析法、蛍光分光法を含む当業者によく知られた方法と試薬を使用して実施される。場合によっては、脂肪酸アシル化基質（スキーム１ではＡ３１及びＡ３２と例示）に結合される標識基は、結合ペア（例、アジ化ビオチン）の一員であり、検出に先立ち、標識された脂肪酸アシル化基質は、結合ペアの相補的一員を含む化合物と共にインキュベートされ、別の標識、例えば、とりわけ蛍光基、標識酵素（例えば、インビトロジェン(カールスバット, ＣＡ)から入手できるもののような、ストレプトアビジン結合フルオロフォア、例えばとりわけ、ストレプトアビジン結合：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８，カタログ番号Ｓ３２３５４；テトラメチルローダミン，カタログ番号Ｓ８７０；フルオレシン，カタログ番号Ｓ８６９、ローダミンＢ，カタログ番号Ｓ８７１；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６６０，カタログ番号Ｓ２１３７７）に結合され、これが検出されて、脂肪酸アシル化タンパク質が検出される。
【００２７】
本発明に使用される好ましい検出方法は、蛍光放射の検出による。一実施態様では、複合体からの蛍光放射が、限定しないが、通常の光学又は蛍光顕微鏡法（落射蛍光顕微鏡法）、共焦点レーザースキャニング顕微鏡法、及びフローサイトメトリーで、場合によってはイメージ・デコンボリューションアルゴリズムを使用するものを含む、様々な蛍光イメージング法により視覚化されうる。共焦点顕微鏡法における三次元像分解能技術は、焦点のずれた光をその正しい視点に配するために、顕微鏡の点広がり関数（点光源の像）の知識を活用する。異なる標識基で標識された基質は、場合によっては、空間的に、経時的に、大きさにより、又は、検出可能に異なるスペクトルの性質（例えば励起及び発光の最大値、蛍光強度、蛍光寿命、蛍光偏光、蛍光退色率、又はそれらの組み合わせ）の使用、又はこれらの性質の組合せによって、分離されうる。
【００２８】
本発明で使用される他の好ましい検出方法はウエスタンブロット法である。
【００２９】
発明者は、式Ｉの化合物により脂肪酸アシル化されている基質をインビボ設定下で（例えば、哺乳類細胞、又は癌細胞のような動物細胞中で）検出する方法を開示し、下記に記した通り、インビボアッセイの設定下での式Ｉの化合物の使用を開示する。例えば、式Ｉの化合物は、動物細胞中における基質のタンパク質脂肪酸アシル化、例えばパルミトイル化及びミリスチル化などの常套的な生化学的検出と、放射性プローブの必要性無しに、動物細胞中の広範囲のタンパク質アシル化の蛍光イメージングのために使用するプローブとしての有用性を有する。ここに記載される式Ｉの化合物と方法は、脂肪酸アシル化を含む生物系における細胞性プロセスの解析と、脂肪酸アシル化された細胞性基質の精製に有用であり、かかる有用性は、例えば、（ａ）対象とする特定のタンパク質の脂質化状態の評価；（ｂ）標識の導入によって微量タンパク質を濃縮し、別の方法では抗体と免疫沈降させることが困難であるタンパク質の分離を容易にする；（ｃ）新たなアシル化タンパク質の同定；（ｄ）Ｎ−ミリスチルトランスフェラーゼ及びパルミトイルトランスフェラーゼ阻害剤のような薬物に反応するタンパク質のような、画像化分析において、基質の脂肪酸アシル化を解析するための診断レポーターとして；（ｅ）アシルトランスフェラーゼの候補修飾薬のスクリーニング；及び（ｆ）抗体の部位特異的タギングを含む。
【００３０】
従って、一態様において、第一の実施態様では、本発明は、脂肪酸アシル化基質を検出する方法において、
ｉ．式Ｉの脂肪酸アシルを動物細胞と共にインキュベートし、
2012517810.tif 000012
ここで、式Ｉ中、下付記号ｎは６から１５の整数であり、記号Ａはエチニル基を表し、記号Ｘは−ＯＨ又は−ＳＣｏＡを表し、上記動物細胞は基質と該基質にＩを結合させて脂肪酸アシル化基質を産生させ得る少なくとも一つの酵素を含み；
ｉｉ．工程（ｉ）からの脂肪酸アシル化基質をアジドタグ付き標識基と組み合わせ、ここで、アジドタグは脂肪酸アシル化基質のＡ基と［３＋２］環化付加反応を受けて、標識された脂肪酸アシル化基質を産生し；
ｉｉｉ．脂肪酸アシル化基質の標識基を検出し；これにより脂肪酸アシル化基質を検出する
方法を提供する。
【００３１】
第二の実施態様では、本発明は脂肪酸アシル化基質を検出する方法において、
ｉ．式Ｉの脂肪酸アシルを動物細胞と共にインキュベートし、
2012517810.tif 000013
ここで、式Ｉ中、下付記号ｎは６から１５の整数であり、記号Ａはエチニル基を表し、記号Ｘは−ＯＨ又は−ＳＣｏＡを表し、上記動物細胞は基質と該基質にＩを結合させて脂肪酸アシル化基質を産生させ得る少なくとも一つの酵素を含み；
ｉｉ．工程（ｉ）からの脂肪酸アシル化基質をアジドタグ付き標識基と組み合わせ、ここで、アジドタグは脂肪酸アシル化基質のＡ基と［３＋２］環化付加反応を受けて、標識された脂肪酸アシル化基質を産生し；
ｉｉｉ．脂肪酸アシル化基質の標識基を蛍光イメージング法により動物細胞中においてインビボで検出し；これにより脂肪酸アシル化基質を検出する
方法を提供する。
【００３２】
他の実施態様では、第一又は第二の実施態様の所定の態様において、本方法は哺乳類細胞において実施される。
【００３３】
他の実施態様では、第一又は第二の実施態様の所定の態様において、細胞は癌細胞である。
【００３４】
他の実施態様では、第一又は第二の実施態様の所定の態様において、酵素はアシルトランスフェラーゼである。所定の態様では、酵素はＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ、Ｓ−アシルトランスフェラーゼ及びＳ−パルミトイルトランスフェラーゼからなる群から選択される。
【００３５】
他の実施態様では、第一又は第二の実施態様の所定の態様において、式Ｉ中、下付記号ｎは７から１４の整数である。所定の態様では、下付記号ｎは、７、８、１０、１１及び１３からなる群から選択される整数である。所定の他の態様では、下付記号ｎは１１又は１３の整数である。
【００３６】
他の実施態様では、第一又は第二の実施態様の所定の態様において、式Ｉ中、Ｘは−ＯＨである。
【００３７】
他の実施態様では、第一又は第二の実施態様の所定の態様において、式Ｉ中、Ｘは−ＳＣｏＡである。
【００３８】
他の実施態様では、第一又は第二の実施態様の所定の態様において、基質はタンパク質又はポリペプチドである。
【００３９】
他の実施態様では、第一の実施態様の所定の態様において、標識基は、標識酵素及び蛍光標識基からなる群から選択される。所定の実施態様では、標識基はアジ化ローダミンである。所定の実施態様では、標識基はアジ化ビオチンである。
【００４０】
他の実施態様では、第一又は第二の実施態様の所定の態様において、標識基は結合ペアの一員を含む。この実施態様の所定の態様では、該方法において、工程ｉｉ及びｉｉｉの間には、工程ｉｉから産生される標識された脂肪酸アシル化基質を上記結合ペアの相補的一員を含む検出可能な標識基で処理する工程があり、ここで上記結合ペアの上記相補的一員は工程ｉｉから産生される上記標識された脂肪酸アシル化基質の標識基と結合する。この実施態様の所定の態様では、上記結合ペアの相補的一員は、フルオロフォアに結合したストレプトアビジンである。この実施態様の所定の態様では、上記結合ペアの相補的一員は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８に結合したストレプトアビジンである。
【００４１】
他の実施態様では、第一の実施態様の所定の態様において、方法の工程ｉｉｉにおいて、標識された脂肪酸アシル化基質はウエスタンブロット法、質量分析法又は蛍光イメージングで検出される。所定の態様では、標識された脂肪酸アシル化基質は蛍光イメージングにより検出される。
【００４２】
他の実施態様では、第一の実施態様の所定の態様において、標識基は哺乳類細胞中、又は癌細胞中においてインビボで検出される。
【００４３】
他の態様では、本発明は、タンパク質又はポリペプチドの脂肪酸アシル化の検出のための、動物細胞中でのインビボアッセイにおける式Ｉの脂肪酸アシル化合物の使用を提供する。
2012517810.tif 000014
【００４４】
ここで、式Ｉ中、下付記号ｎは６から１５の整数であり、記号Ａはエチレン基を表し、記号Ｘは−ＯＨ又は−ＳｃｏＡを表し、検出はインビボ設定下で起きる。第１９の実施態様の所定の態様では、アッセイは哺乳類細胞を用いて実施される。この実施態様の特定の態様では、アッセイは癌細胞を用いて実施される。この実施態様の所定の態様では、式Ｉ中、下付記号ｎは７から１４の整数である。この実施態様の所定の態様では、下付記号ｎは７、８、１０、１１、及び１３からなる群から選択される整数である。この実施態様の所定の態様では、下付記号ｎは１１又は１３から選択される整数である。
【００４５】
化合物の合成
【００４６】
以下のスキーム２に示されるように、式Ｉの化合物は、例えば、内部アルキン（Ｂ１）を持つ対応アルコールから、内部アルキンの末端アルキン（Ｂ２）への異性化を生じるジッパー反応（Brown, C.A.及びYamashita, A. Saline hydrides and superbases in organic reactions. IX. Acetylene zipper. Exceptionally facile contrathermodynamic multipositional isomeriazation of alkynes with potassium 3-aminopropylamide. J. Am. Chem. Soc. 97, 891-892 (1975)を参照）を経て合成することができる。これにジョーンズ酸化が続き、脂肪酸アシル（Ｂ３）が得られる。コエンザイムＡと脂肪酸アシル（Ｂ３）を（Ｂ３）の活性化アシル誘導体（これはMishra, P.K. and Drueckhammer, D.G. Coenzyme A Analogues and Derivatives: Synthesis and Applications as mechanistic Probes of Coenzyme A Ester-utilizing Enzymes. Chem. Rev. 100(9) 3283-3310に記載された合成法によって調製することができる）を経由してカップリングさせ、コエンザイムＡ誘導体（Ｂ４）を得る。化合物Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４において、下付記号ｍ及びｎは独立して０から１３の整数であり、但し、各化合物内のｍとｎを組み合わせた値は１３以下である。
2012517810.tif 000015
【００４７】
リンカーを介して結合されたアジド部分を含む標識基（例えばＤ３）は、スキーム３において以下に概要を示した合成法に従い調製されうる。
2012517810.tif 000016
【００４８】
例えば、リンカーは既に一末端にアジドタグを含み、アジドタグがハロゲン化物又はトリフラートあるいはカルボキシル誘導体（例えば、−ＣＣ（Ｏ）ＣＣｌ３）のような適切な離脱基である「Ｕ」官能基を含む標識基（例えば、Ｄ２）への結合を容易にするために更に少なくとも一つの官能基（例えば、化合物（Ｄ１）中にＴと表記されたアミノ基又はヒドロキシル基のような求核基）を含む。そのような反応は、典型的には、ジメチルホルムアミドのような非プロトン性溶媒中にて、例えば、トリエチルアミンのような弱塩基の存在下で実施することができる。スキーム３において、標識は、例えば、とりわけローダミン、ビオチンなどのような一次又は二次標識でありうる。
【００４９】
別法では、リンカー基は、例えば、官能基化された標識基を官能基化されたアジドタグに結合させるために使用される、少なくとも２つの官能基を持ちうる。該リンカーはまたポリマーでありうる。所定の場合、アジドタグ付き標識基はリンカーを含まない。この場合、標識基は直接アジドタグに結合している。標識基及びアジドタグは、結合の様式が標識基の機能的目的を有意には変えない限り、上に列挙されたものを含む様々な方法で結合されうる。
【００５０】
上に一般に概要を述べた通り、アジドタグが結合されるリンカー基は、これを官能化して、標識基への共有結合を容易にすることができる：他の適切な官能基は、限定するものではないが、イソシアネート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、サクシニミジルエステル、及びスルホニルハライドを含み、これらの全てがアジドタグを標識基に共有結合させるために使用されうる。当業者であれば、アジドタグ付きリンカー基が、マレイミドのような求電子基であるＴ基で官能化される例では、標識基は、適切な反応性の求核基であるＵ基で官能化されなければならないことを理解するものと期待される。例えば、インビトロジェン（カールズバット、カリフォルニア）は、リンカーの一末端に結合したアジド基を持ち、更にＰＥＧリンカーの他の末端にサクシニミジルエステル官能基を持つＰＥＧリンカーを販売している（「アジドポリエチレングリコール（ＰＥＧ４），サクシニミジルエステル」，カタログ番号Ａ１０２８０。この化合物は、結合のためのアミノ官能基を含む標識基に結合されうる。より一般的には、リンカー上の官能基の選択は、上に概説されたリンカー又は標識基の何れかへの結合部位に依存する。
【００５１】
次の実施例は単に本発明を例証する目的で提供され、特許請求の範囲に記載の発明の範囲を限定するものと決して解してはいけない。
【実施例】
【００５２】
実施例１
化学式Ｉの脂肪酸アシルの細胞タンパク質への代謝的組み込み。
【００５３】
式Ｉの合成脂肪酸アシルが細胞タンパク質へ代謝的に組み込まれたことを証明するために、Ｃ１０（１）、Ｃ１１（２）、Ｃ１３（３）、Ｃ１４（４）、Ｃ１６（５）、及び、Ｃ１８（６）炭素原子を含む（図１Ｂを参照）ω−アルキニル脂肪酸アシルを外因的に培養ＭＤＣＫ細胞に添加し、２４時間インキュベートした。細胞プロテオームの調製の際に、アシル化タンパク質に組み込まれたアルキニル基を、第一銅触媒Ｈｕｉｓｇｅｎアルキン−アジ化環状付加反応によって、化学選択的にアジドタグ付きビオチン（合成は実施例２を参照）、又はフルオロフォアに結合させた（Wang, Q.等 J. Am. Chem. Soc. 125, 3192 - 3193 (2003)を参照）（図１Ｃ）。コンジュゲートしたタンパク質をゲル電気泳動によって分離し、ストレプトアビジン結合西洋わさびペルオキシダーセを使用してウェスタンブロットにより分析した（図２Ａ）。様々なタンパク質が炭素鎖の長さに依存して標識され、Ｃ１３、Ｃ１４、及びＣ１６がタンパク質への最高の組み込み度合いを示した。このことは、細胞中における大部分のタンパク質の脂質修飾がミリストイル化とパルミトイル化を含むことを考えれれば合理的なことであった。更に、ω−アルキニル脂肪酸アシルは、ＲＡＷ２６４７マクロファージやマウスＬ細胞など他の細胞株に効率的に取りこまれ、代謝的に組み込まれたことから（図３）、これらのプローブの多用途性が証明された。
【００５４】
代謝的組み込みの特異性を証明するために、ＭＤＣＫ細胞由来のアルキン標識化タンパク質を、タンパク質にアミド結合でなくチオエステル結合を介して結合した脂肪酸アシルを選択的に除くヒドロキシルアミンで処理した（図２Ｂ）。（Drisdel, R.C.及びGreen, W.N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques 36, 276-285 (2004)を参照）。１６個の炭素原子を有するω−アルキニル脂肪酸アシルは、ヒドロキシルアミンに実質的な感受性を示し、よって大部分がチオエステル結合を介して結合する。これに対して、Ｃ１３及びＣ１４炭素脂肪酸アシル鎖は、ヒドロキシルアミン処理に対するその抵抗性から推測されるように、アミド結合を介して大部分が組み込まれた。これらの実験は、Ｃ１４及びＣ１６アルキニル脂肪酸アシルが、タンパク質ミリストイル化やパルミトイル化に対して、それぞれプローブとして有用であることを実証している。実験では、また、Ｃ１０、Ｃ１１及びＣ１８は大部分がチオエステル結合を介して結合し（図２Ｂ）、よってＳ−アシル化のプローブとしても役立つことを示している。
【００５５】
ω−アルキニル脂肪酸アシルは、時間及び用量依存的に細胞タンパク質に代謝的に組み込まれた。ＭＤＣＫ細胞をＣ１４、Ｃ１６又はＣ１８脂肪酸アシル（１００ｕＭ）で処理すると、６時間以内に標識タンパク質バンドのレベルが時間依存的に増加することを示している（図４参照）。同様の方法で、Ｃ１４、Ｃ１６又はＣ１８脂肪酸アシルの濃度を上げていく処理を行うと、４時間で投与量依存的に代謝的に組み込まれることが示され（図５参照）、ω−アルキニル脂肪酸アシルによる標識が、活性な細胞代謝に依存することを示している。タンパク質のＮ−ミリストイル化は同時翻訳現象ゆえ、本発明者は、タンパク質合成阻害薬であるシクロヘキシミドで処理すると、Ｃ１４によるタンパク質標識化を阻害することを示した（図６Ａを参照）。更に、ミリスチン酸及びパルミチン酸との競合実験では、ω−アルキニルＣ１４及びＣ１６脂肪酸アシルが、ぞれぞれ細胞におけるタンパク質Ｎ−ミリストイル化及びＳ−パルミトイル化のための特異的なプローブとなることを示している（図６Ｂ、図６Ｃ）。総合すると、これらの結果は、ω−アルキニル脂肪酸アシルが培養細胞によって十分に取り込まれ、良好に許容されると思われ、生合成機構に容易に認識され、効率的に細胞性タンパク質に組み込まれることを説明している。
【００５６】
標識された脂肪酸アシル化タンパク質の蛍光イメージングによる検出
脂肪酸アシル化タンパク質をインビボで検出するためのω−アルキニル脂肪酸アシルの広範な有用性を実証するために、我々は細胞の脂肪酸アシル化タンパク質を視覚化する蛍光顕微鏡検査法を実施した。ＰＣ３前立腺癌細胞をビヒクル（図２Ｃ）又は様々なω−アルキニル脂肪酸アナログで処理し、固定化し、アジ化ローダミン又はアジ化ビオチンによるクリック反応のために処理した後、ストレプトアビジン結合Ａｌｅｘａ４８８で処理した。ＤＭＳＯ処理されたＰＣ３細胞中の試料（図２Ｃ）の最小シグナルに比して、ω−アルキニル脂肪酸アシルで処理した試料（図２Ｄ、図２Ｅ、図２Ｆ）では、高い蛍光シグナルが観測された。シグナルとバックグランドの比率は、アジ化ビオチンに比し、ローダミンアジドで処理した試料の方がより高いことが観察され、これはバックグランドの要因となる内因性ビオチン化タンパク質によるものである。蛍光イメージングは様々なω−アルキニル脂肪酸アシルに関して、異なる細胞内分布を表した（図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、図２Ｆの記述を参照）。ω−アルキニル脂肪酸アシルで処理した試料の方が、ＰＣ３細胞（図２（Ｃ−Ｆ）図７（Ａ−Ｆ）、マウス線維芽細胞Ｌ−細胞（図８（Ａ−Ｇ）又はＲＡＷ２６４７マクロファージ（図９（Ａ−Ｇ））のＤＭＳＯ処理した試料中の最小シグナルに比して高い蛍光シグナルが観察された。シグナルとバックグランドの比率はアジ化ビオチンに比し、アジ化ローダミンで処理した試料において一般的により高く、これは、バックグランドの要因となる内因性ビオチン化タンパク質によるものである。蛍光像は、様々なω−アルキニル脂肪酸の異なる細胞内分布を明瞭に示している。興味深いことに、共焦点顕微鏡像（図２Ｇ、図２Ｈ、図２Ｉ）はＣ１４、Ｃ１６及びＣ１８脂肪酸アシルプローブが、パンクチャーなパターンで核の外部に分布し、細胞質の小胞構造中に局在し細胞膜と膜ラッフルを標識している。細胞分化を受けていて、チューブリンマーカーに加えＣ１６ω−アルキニル脂肪酸アシルで標識されたＰＣ３細胞が、イメージングによって観察された（図２Ｊ、図２Ｋ、図２Ｌ）。中期の細胞は細胞膜でＣ１６標識タンパク質の特徴的な分布を示し、紡錘体の周りと細胞全体において高密度の構造をとっている（図２Ｋ）。興味深いことに、細胞質分裂において、Ｃ１６標識タンパク質は、細胞分裂位置である分裂溝（矢印参照）に集中している（図２Ｌ）。
【００５７】
実施例２
化合物の合成
一般的な方法：
ＮＭＲスペクトルを内部基準（ＣＨＣｌ３に対して７．２６ｐｐｍ及び７７．２６ｐｐｍにおいてＣＤＣｌ３トリプレット）として１Ｈ又は１３Ｃの溶媒ピークを利用してバリアン４００分光計で記録した。エレクトロスプレイイオン化（ＥＳＩ）質量分析スペクトル（ＭＳ）をＡｇｉｌｅｎｔ ＡＰＩ１００ Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＳＣＩＥＸ単四極子質量分析計を使い、４０００Ｖエミッターボルトにて、正あるいは負のイオンモードにて得た。分析的薄層クロマトグラフィーを０．２５ｍｍのＥ.メルクシリカゲルプレート（６０Ｆ−２５４）で行い、ＫＭｎＯ４溶液に浸すことにより可視化し、加熱した。Ｅ.メルクシリカゲル６０（粒径０．０４０−０．０６３ｍｍ）をカラムクロマトグラフィーに使用した。全ての化学薬品はシグマ・アルドリッチから購入し、受け入れた状態のまま使用した。使用した溶媒は入手可能な最高の商用グレードである。反応は、特に示さない限り、不活性ガス（Ｎ２）下、無水状態で無水溶媒を用いて実施した。使用した略号は以下の通りである：ｓ（一重項），ｄ（二重項），ｔ（三重項），ｍ（多重項）。所定のω−アルキニル脂肪酸アシルは次の通り商業的に調達した：化合物１，２，６（シグマ−アルドリッチ）及び３（Ｏｔａｖａ Ｌｔｄ．，ＯＮ）（図１ｂを参照）。
【００５８】
式Ｉの化合物の代表的実施例の合成：１５−ヘキサデシン−１−カルボン酸（５）。
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ＮａＨ（鉱油中６０％，７２０ｍｇ，１７ｍｍｏｌ，Ｎ２下でヘキサンで２回洗浄）にジアミノプロパン（ＤＡＰ）（１５ｍｌ）を添加した。混合物を油浴で７０℃の一定温度で攪拌した。ガスの発生が１０分後に観察され、１時間後に溶液は茶色に変化した。フラスコを室温まで冷却し、ＤＡＰ（４ｍｌ）に溶解した７−ヘキサデシン−１−オール（５１２ｍｇ，２．１５ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。混合物を５５℃で一晩攪拌し、その間に黒色に変化した。フラスコを室温まで冷却し、注意深く氷冷水で加水分解し、水性１０％塩酸で酸性にし、ヘキサンで３回（３×１００ｍｌ）抽出した。混合した水性層をもう一度ヘキサンで抽出し、混合した油性層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液とかん水で洗い、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空下で蒸発させた。粗製の黄褐色の生成物（〜０．５ｇ）が下記に記した通り直接酸に転化された。
【００５９】
２０ｍｌのアセトンに溶けた１５−ヘキサデシ−１−オール（１５０ｍｇ，０．６３ｍｍｏｌ）の溶液に特徴的な深い橙赤色が持続するまでジョーンズ試薬溶液を液滴しながら添加した。５分間攪拌後、過剰な試薬を中性化するために２−プロパノールを色が薄緑色になるまで添加した。クロム塩を濾過し、アセトンを蒸発させ、残渣を酢酸エチルに溶かし、０．０１ＮのＨＣｌで４回洗い、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。粗生成物にクロマトグラフィーを施し（ＣＨ２Ｃｌ２，続いてヘキサン／酢酸エタノール（４：１））、−１８℃でヘキサン中にて再結晶させ、白い固体（５）（１４０ｍｇ，８８％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２．３５（ｔ，Ｊ＝７．５，２Ｈ），２．１８（ｄｔ，Ｊ＝２．６，７．１，２Ｈ），１．９４（ｔ，Ｊ＝２．６，１Ｈ），１．６９−１．５７（ｍ，２Ｈ），１．５７−１．４６（ｍ，２Ｈ），１．２６（ｓ，１８Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１８０．１５，８５．０５，６８．２４，３４．２３，２９．７９，２９．７１，２９．６４，２９．４５，２９．３２，２９．２７，２８．９８，２８．７１，２４．８９，１８．６１。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ２５３．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００６０】
１３−テトラデシン−１−カルボン酸（４）の合成。
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化合物５を調製するために、上記の合成手順に従い、出発物質として３−テトラデシン−１−オールを用いる修正を加えて、化合物４を調製した：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２．３５（ｔ，Ｊ＝７．５，２Ｈ），２．１８（ｄｔ，Ｊ＝２．６，７．１，２Ｈ），１．９４（ｔ，Ｊ＝２．６，１Ｈ），１．６９−１．５７（ｍ，２Ｈ），１．５７−１．４６（ｍ，２Ｈ），１．２７（ｓ，１４Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１８０．３９，８５．０２，６８．２６，３４．２７，２９．７１，２９．６７，２９．６０，２９．４４，２９．３０，２９．２５，２８．９６，２８．６９，２４．８７，１８．６１。ＭＳ（ＥＳＩ−）：ｍ／ｚ２２３．４（Ｍ−Ｈ）−。
【００６１】
ビオチンアジド標識基の合成：Ｎ−（３−アジドプロピル）−５−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾル−４−イル）ペンタンアミド（８）、
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３−アジド−プロピルアミン（７）の合成：  ３−ブロモプロピルアミンヒドロブロミド（９．７６ｇ，４４．６ｍｍｏｌ）とアジ化ナトリウム（６．１９ｇ，９５．３ｍｍｏｌ）を水に溶解させた（８０ｍｌ）。得られた溶液を一晩８０℃で加熱した。室温に冷却後、約５０ｍｌの水を真空下で穏やかに加熱（〜５０℃）しながら蒸発させ、残りの混合物を室温で３時間５％ＮａＯＨ（２０ｍｌ）で攪拌し、その後、トルエン（２×２５ｍｌ）で抽出した。更に５％ＮａＯＨを４０ｍｌ、水相に添加し、更にトルエンによる抽出を行った（４×２５ｍｌ）。混合した有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させて（〜４０℃）、４７ｇの溶液を得た。残留溶液には３．２ｍｏｌ％の３−アジド−プロピルアミンＮＭＲインテグレーションが含まれていることが分かり、これは所望の生成物（３４％収率）の３．２重量％（１．５ｇ）に相当する。該黄色の生成物を、更に精製することなく使用した：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ３．３８（ｔ，Ｊ＝６．７，２Ｈ），２．８１（ｔ，Ｊ＝６．８，２Ｈ），１．７３（ｐ，Ｊ＝６．８，２Ｈ），１．５２（ｓ，２Ｈ）。
【００６２】
アジ化ビオチン（８）の合成：  ＤＭＦ（１０ｍｌ）中のｄ−（＋）−ビオチン（２００ｍｇ，０．８２ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（２１２ｍｇ，１．６４ｍｍｏｌ），ＨＡＴＵ（６２２ｍｇ，１．６４ｍｍｏｌ）の溶液に７（１６４ｍｇ，１．６４ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を真空下で濃縮させ、残渣を逆相クロマトグラフィーで精製して、白色固体として８（８８ｍｇ，３３％収率）を得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ７．８０（ｔ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），６．３９（ｓ，１Ｈ），６．３３（ｓ，１Ｈ），４．３６−４．２２（ｍ，１Ｈ），４．１７−４．０７（ｍ，１Ｈ），３．３４（ｔ，Ｊ＝６．８，２Ｈ），３．１７−２．９９（ｍ，３Ｈ），２．８２（ｄｄ，Ｊ＝１２．４，５．１，１Ｈ），２．５８（ｄ，Ｊ＝１２．４，１Ｈ），２．０６（ｔ，Ｊ＝７．４，２Ｈ），１．７３−１．５６（ｍ，３Ｈ），１．５６−１．３９（ｍ，３Ｈ），１．３３（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１７２．０１，１６２．６４，６１．００，５９．１６，５５．３５，４８．４１，３５．７１，３５．１５，２８．４３，２８．１５，２５．２０。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ３２７．１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００６３】
実施例３
生化学的方法
細胞培養：  Ｒａｗ２６４．７マクロファージ（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２２７８）を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びグルタマックス（２ｍＭ）を補填した高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。ＭＤＣＫ（イヌ腎臓上皮細胞、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−３４）を、１０％ＦＢＳ（ＡＴＣＣ＃３０−２００３）を補填したＤＭＥＭ培地で増殖させた。ＰＣ−３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１４３５）を、１０％ＦＢＳ（ＡＴＣＣ＃３０−２００３）を補填したＦ−１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ＃３０−２００４）で増殖させた。マウスＬ−細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２６４８）を、１０％ＦＢＳ（ＡＴＣＣ＃３０−２００３）を補填したＤＭＥＭ培地で培養した。全ての細胞は実験の前に３７℃で２４時間、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターでインキュベートした。
【００６４】
細胞抽出物中のリポタンパク質の標識と検出：  実施例で使用されるω−アルキニル脂肪酸アシル化合物をＤＭＳＯに溶解し、５０ｍＭのストック溶液を作り、−８０℃で保管した。細胞を処理する前に、アナログを、５％ＢＳＡ（脂肪酸非含有−シグマＥＣ２３２−９３６−２）とグルタマックス（Ｒａｗ及びＭＤＣＫ細胞株用）を最終濃度１００μＭとなるように補填したＤＭＥＭ無血清培地に溶解させた。脂肪酸培地溶液を室温で１５分間超音波処理し、その後室温で１５分間事前に複合体を形成させるようにした。
【００６５】
細胞を６穴プレート上の完全培地に播種した（８×１０５細胞／２ｍｌ／ウエル）。それらを処理前に２４時間インキュベートした。次に、増殖培地を除去し、細胞を一回ＰＢＳで洗い、２ｍＬのω−アルキニル脂肪酸アシル含有培地を細胞に添加し、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで３７℃でインキュベートした。２４時間後に、細胞を、冷却したＰＢＳで３回洗浄し、細胞抽出物を、細胞を４００μＬの溶解バッファー（１％のノニデットＰ−４０／１５０ｍＭのＮａＣｌ／プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤／１００ｍＭのリン酸ナトリウム，ｐＨ７．５）中に再懸濁させて調製した。最終プロテオーム濃度２ｍｇ／ｍｌ（ＢＣＡキットで決定したタンパク質濃度）を得るために、細胞可溶化物を遠心限外濾過器（Ｐａｌｌ遠心分離装置ＭＷＣＯ ３Ｋ，ナノセップ・デバイス，カタログ＃Ｐ／Ｎ ＯＤＯＯ３Ｃ３４）により、１４０００ｒｐｍで４℃で１５分間、遠心分離により濃縮した。次に、タンパク質抽出物を２５μＬ容量にて１時間室温で、次の試薬の最終濃度にて、プローブ標識化反応に供した（Speers, A.E.及びCravatt, B.F. Profiling enzyme activities in vivo using click chemistry methods. Chem Biol 11, 535-46 (2004)；Hsu, T.L.等 Alkynyl sugar analogs for the labeling and visualization of glycoconjugates in cells. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 2614-9 (2007)を参照）：０．１ｍＭのアジ化ビオチン、水に溶解した１ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ，シグマ・アルドリッチ）、ＤＭＳＯ／ｔ−ブタノール（２０％／８０％）に溶解した０．２ｍＭのトリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ，シグマ・アルドリッチ）及びＰＢＳに溶解した１ｍＭのＣｕＳＯ４。試薬をタンパク質抽出物に添加する順序は反応に重要であり、上に記載の通りに従わねばならない。
【００６６】
ウエスタンブロット法：  標識化タンパク質の可溶化液を４−２０％のトリス−グリシンゲルを使用してＳＤＳページ（１８０Ｖにて１時間１０分）により分離した。電気泳動後のビオチン標識化タンパク質のイムノブロット法では、タンパク質をニトロセルロース膜上に移し、これをＰＢＳ、０．１％ツイーン−２０［ＰＢＳＴ］及び５％非脂肪性粉ミルクで室温にて２時間、又は４℃で一晩ブロックした。膜をＰＢＳＴで３回（それぞれ５分間）洗浄し、ストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ（インビトロジェン Ｚｙｍｅｄ＃４３−４３２３，ＰＢＳＴ中１：１２５０）と共に、室温で１時間インキュベートした。膜をＰＢＳＴで３回（それぞれ１０分間）洗浄し、製造者（アマシャム・バイオサイエンス）の推奨に従い、増強化学ルミネッセンスを用いて展開した。ヒドロキシルアミン感受性アッセイでは、タンパク質をニトロセルロース膜へ移した後、膜をＰＢＳＴ及び５％ＮＨ２ＯＨ（シグマ・アルドリッチ）と共に６５〜７２時間、室温でインキュベートした。ヒドロキシルアミンでの処理の後、膜を５％の非脂肪性粉ミルクで室温にて２時間又は４℃で一晩ブロックし、上述した通りにストレプトアビジンブロットで分析した。タンパク質負荷の同等水準を証明するために、ストレプトアビジンブロットをピアス剥離バッファーに１５分間室温で浸して取り除き、抗β−チューブリンＨＲＰ抗体により再探索し、増強化学ルミネッセンスを用いて展開した。
【００６７】
蛍光顕微鏡法：  細胞をカバーグラス付き１２穴プレート（４×１０５細胞／ウエル）に播種し、処理前に２４時間インキュベートした。増殖培地を除き、ＰＢＳで１回細胞を洗い、示された濃度のω−アルキニル脂肪酸を含む培地を１ｍＬ添加した。２４−４８時間、３７℃／５％ＣＯ２にてインキュベートした後、細胞を３回ＰＢＳで洗い、過剰のプローブ（ω−アルキニル脂肪酸）を除去し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で室温で１０分間固定した。ついで、細胞をＰＢＳ／０．１％トリトンＸ−１００で室温にて１〜２分透過処理し、次の試薬を用いて広範囲に洗浄した：０．１ｍＭアジ化ビオチン又はアジ化ローダミン、水に溶解した１ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、及びＰＢＳに溶解した１ｍＭのＣｕＳＯ４で室温にて１時間洗浄した。標識した細胞をＰＢＳで広範囲にすすぎ、ＰＢＳ／５％ＢＳＡ中で室温で４５分間ブロックした。細胞を、ＰＢＳ／５％ＢＳＡ中のストレプトアビジン結合ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（インビトロジェン カタログ＃Ｓ３２３５４，１：５００）により、室温で４５分間染色し、核をヘキスト３３３４２（ＭＰ＃Ｈ２１４９２；ＰＢＳ中に１：１００００）で、室温で１０分間染色した。アジ化ローダミンでの標識化では、細胞をヘキストで直接染色した。チューブリン染色では、細胞を、事前に冷却したメタノールにて−２０℃で５〜１０分間固定し、上述したクリック反応のために処理し、ついで抗チューブリン抗体及び適切な二次Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗体によって染色した。蛍光画像をクールスナップＣＣＤカメラ（ローパー・サイエンティフィック）を備えたツァイスＡＸ１０倒立顕微鏡にて撮影し、画像をスライドブック４．１ソフトウエア（インテリジェント・イメージング・イノベーション）により解析した。ｚセクションは０．３ｍｍ間隔で得た。一画像あたり平均で５０−７０のｚセクションを得た。
【図１Ａ−１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図２Ｃ−２Ｆ】
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【図２Ｇ−２Ｉ】
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【図２Ｊ−２Ｌ】
2012517810.tif 000027
【図３Ａ−３Ｂ】
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【図４Ａ−４Ｃ】
2012517810.tif 000029
【図５Ａ−５Ｃ】
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【図６Ａ−６Ｃ】
2012517810.tif 000031
【図７Ａ−７Ｆ】
2012517810.tif 000032
【図８Ａ−８Ｇ】
2012517810.tif 000033
【図９Ａ−９Ｇ】
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【国際調査報告】
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